(57)【要約】【課題】脂肪酸、又はグリセロール等のアルコールを原料として、エシェリヒア・コリを用いて効率よくＬ−アミノ酸を製造する方法を提供する。【解決手段】Ｌ−アミノ酸生産能を有する腸内細菌科に属する細菌を、脂肪酸及びアルコールから選ばれる炭素源を含む培地で培養し、該培地からＬ−アミノ酸を採取する、Ｌ−アミノ酸の製造法において、前記細菌として、ｏｘｙＳ遺伝子の発現増強、もしくはｆｉｘＡＢＣ遺伝子の発現の増強、又はこれらの組合わせのいずれかの改変がなされている細菌を用いるか、又は、前記細菌の細胞内の過酸化水素濃度を低下させる物質を培地に添加する。。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｌ−アミノ酸生産能を有する腸内細菌科に属する細菌を、脂肪酸及びアルコールから選ばれる炭素源を含む培地で培養し、該培地からＬ−アミノ酸を採取する、Ｌ−アミノ酸の製造法であって、
前記細菌の細胞内の過酸化水素濃度を低下させることを特徴とする方法。
【請求項２】
前記細菌は、細胞内の過酸化水素濃度が低下するように改変されていることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細菌の細胞内の過酸化水素濃度を低減させる物質を培地に添加することを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記細菌がエシェリヒア属、パントエア属、又はエンテロバクター属に属する細菌である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記細菌がエシェリヒア・コリ、パントエア・アナナティス、又はエンテロバクター・アエロゲネスである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記細菌は、ｏｘｙＳ遺伝子の発現の増強、もしくはｆｉｘＡＢＣ遺伝子の発現の増強、又はこれらの組合わせのいずれかの改変がなされている、請求項２〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記ｏｘｙＳ遺伝子は、配列番号９に示す塩基配列を有するＲＮＡ又はその保存的バリアントをコードする、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ｆｉｘＡＢＣ遺伝子は、配列番号１１、１３、及び１５に示すアミノ酸配列を有するタンパク質又はそれらの保存的バリアントをコードする、請求項６又は７に記載の方法。
【請求項９】
細胞内の過酸化水素濃度を低減させる物質がチオ尿素である、請求項３〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記炭素源が脂肪酸である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記脂肪酸がオレイン酸である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記脂肪酸が油脂由来の脂肪酸の混合物である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記炭素源がアルコールである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記アルコールがグリセロールである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記アルコールがエタノールである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記炭素源が油脂を加水分解することによって得られる脂肪酸とグリセロールの混合物である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記細菌がエシェリヒア・コリであり、かつ、好気的にエタノールを資化できるように改変された、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記Ｌ−アミノ酸がＬ−リジンである、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記細菌がジヒドロジピコリン酸レダクターゼ、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ、フォスフォエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、アスパルテートアミノトランスフェラーゼ、ジアミノピメリン酸エピメラーゼ、アスパルテートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、テトラヒドロジピコリン酸スクシニラーゼ、及び、スクシニルジアミノピメリン酸デアシラーゼからなる群より選択される１種または２種以上の酵素の活性が増強されている、及び／または、リジンデカルボキシラーゼの活性が弱化されている、請求項１８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細菌を用いたＬ−アミノ酸の製造法に関し、特に脂肪酸、又はエタノールやグリセロール等のアルコールを原料とするＬ−アミノ酸の製造法、及び該方法に用いる細菌に関する。Ｌ−アミノ酸は、動物飼料用の添加物、健康食品の成分、又はアミノ酸輸液等として、産業上有用である。
【背景技術】
【０００２】
発酵法によるＬ−アミノ酸の工業生産においては、炭素源として糖類、すなわち、グルコース、フラクトース、スクロース、廃糖蜜、澱粉加水分解物等が使用されている。また、炭素源として脂肪酸（特許文献１）、グリセロール（特許文献２）、及びエタノール（特許文献３）を用いたＬ−アミノ酸の製造法が開示されている。
【０００３】
一般的に、種々の生物では、脂肪酸資化時にAcyl-CoAデヒドロゲナーゼ（Acyl-CoA dehydrogenase）によってAcyl-CoAから引き抜かれた電子は、FADH2を経て酸化型電子伝達フラボタンパク質（oxidized electron transferring flavoprotein：ETFox）へ渡され、還元型ETFredになり、さらにETFユビキノンオキシドレダクターゼ（ETF ubiquinone oxidoreductase）によってETFredからユビキノンに電子が渡され、呼吸鎖へと電子が伝達される（非特許文献１）。しかしながら、腸内細菌科に属する細菌においては、電子伝達フラボタンパク質（ETF）やETFユビキノンオキシドレダクターゼについての報告はこれまでにない。
【０００４】
また、腸内細菌科に属する細菌のエタノール資化時には、菌体内に著量に発生すると考えられるNADHから、又はNADHからNADPHを介して電子がFADに伝達され、著量のFADH2が蓄積することが非特許文献２、３などから推察される。
【０００５】
エシェリヒア・コリには、FADH2から電子伝達を行なえるETFホモログをコードする遺伝子としてfixA (yaaQ)、fixB (yaaR)が報告されている（非特許文献４）。fixA、fixB遺伝子は、fixC、fixX遺伝子とともにfixABCXオペロンを形成し、嫌気条件下かつカルニチン存在下で発現が誘導される（非特許文献５、６）。これらの遺伝子がコードするタンパク質は、カルニチン代謝に関与するクロトノベタインレダクターゼに電子を渡していることを示唆する報告がある（非特許文献７）。そして、fixAは電子伝達フラボタンパク質（electron transfer flavoprotein）βサブユニットを、fixBは同タンパク質のαサブユニットを、fixCは電子伝達フラボタンパク質−キノンオキシドレダクターゼを、そして、fixXはフェレドキシン様タンパク質（ferredoxin like protein）をコードすると予測されている（非特許文献６）。前記のように、fixA、fixB及びfixCのカルニチン代謝への関与が示唆される報告はあるが、今までにAcyl-CoAデヒドロゲナーゼから呼吸鎖への電子伝達に関与しているという報告はない。
【０００６】
sodAはスーパーオキシドから過酸化水素への反応を触媒するスーパーオキシドデスムターゼをコードしている（非特許文献８）。しかしながら、スーパーオキシドデスムターゼ活性とアミノ酸の生産の関連性に関する報告はない。
【０００７】
腸内細菌科に属する細菌における菌体内の過酸化水素への防御機構として、酸化ストレスを除去する遺伝子群を活性化する転写因子OxyRの働きが報告されている（非特許文献９）。これらのOxyRによって活性化される遺伝子群のうち、低分子RNAコード遺伝子oxySが菌体からの過酸化水素の排出を制御すること報告されている（非特許文献１０）。しかしながら、oxyS遺伝子の発現を増強した微生物を用いたＬ−アミノ酸の生産の報告はない。
【０００８】
チオ尿素は、エシェリヒア・コリに対して過酸化水素を含む酸化ストレスを抑制する効果があることが報告されている（非特許文献１１）。しかし、チオ尿素とＬ−アミノ酸生産との関連は知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】WO2009/142286
【特許文献２】米国特許出願公開第2009093029号
【特許文献３】WO2008/010565
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Voet, D. et al.,  1995, Biochemistry, Second edition, John Wiley & Sons, Inc., New York
【非特許文献２】Coves, J. et al., 1993, J. Biol. Chem., 268(25):18604-18609
【非特許文献３】Fontecave, M. et al., 1987, J. Biol. Chem. 262(25).12325-12331
【非特許文献４】Tsai, M.H. et al., 1995, Res. Microbiol., 146:397-404
【非特許文献５】Eichler, K. et al., 1995, J. Basic Microbiol., 35: 217-227
【非特許文献６】Buchet, A. et al., 1998, J. Bacteriol., 180:2599-2608
【非特許文献７】Walt, A. et al., 2002, J. Bacteriol., 184:4044-4047
【非特許文献８】Keele, B.B., et al. 1970, J. Biol. Chem., 245(22):6176-6181
【非特許文献９】Christman, M.F. et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 86(10):3484-3488
【非特許文献１０】Gonzalez-Flecha, B. et al., 1999, J. Bacteriol., 181(12):3833-3836
【非特許文献１１】Kohanski, M.A. et al, 2010, Molecular Cell, 37:311-320
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、炭素源、特に脂肪酸、又はエタノールやグリセロール等のアルコールを原料として、腸内細菌科に属する細菌を用いて効率よくＬ−アミノ酸を製造する方法、及び該方法に用いる細菌を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
前記のように、腸内細菌科に属する細菌の脂肪酸資化時には、Acyl-CoAデヒドロゲナーゼによってAcyl-CoAから引き抜かれた電子がFADH2を経て呼吸鎖へ伝達されることが知られている。本発明者は、この電子は最終的にフリーの酸素に渡され、過酸化水素が発生し、結果として脂肪酸資化時に生じた過酸化水素によって細胞が障害を受けていると推察した。そこで、oxyS遺伝子の発現増強により、菌体内に生じた過酸化水素の排出が促進され、過酸化水素による障害が低下すると推察した。そこで、腸内細菌科に属する細菌においてoxyS遺伝子の発現を増強したところ、細胞内の過酸化水素濃度の低減及び生育の向上が確認され、さらにＬ−アミノ酸の生産能が向上することを見出した。
【００１３】
また、本発明者は、腸内細菌科に属する細菌では脂肪酸資化時のみならず、エタノール資化時においてもFADH2由来の電子と酸素により発生した過酸化水素により細胞が障害を受けるが、この傷害はETFの発現増強により低下させ得ると推察した。そこで、腸内細菌科に属する細菌において、ETFの発現を増強したところ、Ｌ−アミノ酸の生産能が向上することを見出した。
【００１４】
さらに、本発明者は、腸内細菌科に属する細菌ではスーパーオキシドデスムターゼにより過酸化水素が発生し、その結果、傷害が生じていると推察した。そして、腸内細菌科に属する細菌においてsodA遺伝子を増幅したところ、細胞内の過酸化水素濃度が増加し、生育が悪化することを見出した。さらに、チオ尿素を添加した培地で腸内細菌科に属する細菌を培養することにより、細菌細胞内の過酸化水素濃度が低下し、Ｌ−アミノ酸生産能が向上することを見出した。
【００１５】
本発明は、上記知見に基づき、腸内細菌科に属する細菌の細胞内の過酸化水素濃度を低下させることによって、Ｌ−アミノ酸生産能を向上させることができることを見出し、完成されたものである。
すなわち本発明は、以下のとおりである。
【００１６】
（１）Ｌ−アミノ酸生産能を有する腸内細菌科に属する細菌を、脂肪酸及びアルコールから選ばれる炭素源を含む培地で培養し、該培地からＬ−アミノ酸を採取する、Ｌ−アミノ酸の製造法であって、前記細菌の細胞内の過酸化水素濃度を低下させることを特徴とする方法。
（２）前記細菌は、細胞内の過酸化水素濃度が低下するように改変されていることを特徴とする、前記方法。
（３）前記細菌の細胞内の過酸化水素濃度を低減させる物質を培地に添加することを特徴とする、前記方法。
（４）前記細菌がエシェリヒア属、パントエア属、又はエンテロバクター属に属する細菌である、前記方法。
（５）前記細菌がエシェリヒア・コリ、パントエア・アナナティス、又はエンテロバクター・アエロゲネスである、前記方法。
（６）前記細菌は、ｏｘｙＳ遺伝子の発現の増強、もしくはｆｉｘＡＢＣ遺伝子の発現の増強、又はこれらの組合わせのいずれかの改変がなされている、前記方法。
（７）前記ｏｘｙＳ遺伝子は、配列番号９に示す塩基配列を有するＲＮＡ又はその保存的バリアントをコードする、前記方法。
（８）前記ｆｉｘＡＢＣ遺伝子は、配列番号１１、１３、及び１５に示すアミノ酸配列を有するタンパク質又はそれらの保存的バリアントをコードする、前記方法。
（９）細胞内の過酸化水素濃度を低減させる物質がチオ尿素である、前記方法。
（１０）前記炭素源が脂肪酸である、前記方法。
（１１）前記脂肪酸がオレイン酸である、前記方法。
（１２）前記脂肪酸が油脂由来の脂肪酸の混合物である、前記方法。
（１３）前記炭素源がアルコールである、前記方法。
（１４）前記アルコールがグリセロールである、前記方法。
（１５）前記アルコールがエタノールである、前記方法。
（１６）前記炭素源が油脂を加水分解することによって得られる脂肪酸とグリセロールの混合物である、前記方法。
（１７）前記細菌がエシェリヒア・コリであり、かつ、好気的にエタノールを資化できるように改変された、前記方法。
（１８）前記Ｌ−アミノ酸がＬ−リジンである、前記方法。
（１９）前記細菌がジヒドロジピコリン酸レダクターゼ、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ、フォスフォエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、アスパルテートアミノトランスフェラーゼ、ジアミノピメリン酸エピメラーゼ、アスパルテートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、テトラヒドロジピコリン酸スクシニラーゼ、及び、スクシニルジアミノピメリン酸デアシラーゼからなる群より選択される１種または２種以上の酵素の活性が増強されている、及び／または、リジンデカルボキシラーゼの活性が弱化されている、前記方法。
【発明の効果】
【００１７】
本発明により、脂肪酸又はアルコールを炭素源として、Ｌ−アミノ酸を効率よく発酵生産することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】エシェリヒア・コリの、グルコース（○）又はオレイン酸（△）を炭素源とする最少培地での（生育）を示す図。
【図２】エシェリヒア・コリの、グルコース（○）又はオレイン酸（△）を炭素源とする最少培地での生育（OD600）と生菌数との関係を示す図。
【図３】エシェリヒア・コリの、グルコース（○）又はオレイン酸（△）を炭素源とする最少培地での生育（OD600）と菌体内過酸化水素濃度を示す図。
【図４】エシェリヒア・コリのoxyS遺伝子増幅株（oxyS overexpression）及びsodA遺伝子増幅株（sodA overexpression）の、グルコースを炭素源とする最少培地での生育（OD600）を示す図。
【図５】エシェリヒア・コリのoxyS遺伝子増幅株（oxyS overexpression）及びsodA遺伝子増幅株（sodA overexpression）の、グルコースを炭素源とする最少培地で培養したときの細胞内過酸化水素濃度を示す図。
【図６】エシェリヒア・コリのoxyS遺伝子増幅株（oxyS overexpression）及びsodA遺伝子増幅株（sodA overexpression）の、オレイン酸を炭素源とする最少培地での生育（OD600）を示す図。
【図７】エシェリヒア・コリのoxyS遺伝子増幅株（oxyS overexpression）及びsodA遺伝子増幅株（sodA overexpression）の、オレイン酸を炭素源とする最少培地で培養したときの細胞内過酸化水素濃度を示す図。
【図８】グルコース又は脂肪酸を炭素源とするL-リジン生産培養において、チオ尿素または尿素を添加したときの細胞内過酸化水素濃度を示す図。  １：炭素源グルコース、無添加  ２：炭素源グルコース、1mM尿素添加  ３：炭素源グルコース、1mMチオ尿素添加  ４：炭素源オレイン酸、無添加  ５：炭素源オレイン酸、1mM尿素添加  ６：炭素源オレイン酸、1mMチオ尿素添加
【発明を実施するための形態】
【００１９】
＜１＞本発明の細菌
本発明に用いる細菌は、Ｌ−アミノ酸生産能を有する腸内細菌科に属する細菌である。本発明の細菌は、一形態においては、Ｌ−アミノ酸生産能を有する腸内細菌科に属する細菌であって、かつ、細胞内の過酸化水素濃度が低下するように改変されている細菌である。
【００２０】
Ｌ−アミノ酸生産能とは、本発明に用いる細菌（以下、「本発明の細菌」ともいう）を培地中で培養したときに、Ｌ−アミノ酸を生成し、培地中または菌体内に蓄積する能力をいう。好ましくは、目的とするＬ−アミノ酸を好ましくは0.5g/L以上、より好ましくは1.0g/L以上の量を培地に蓄積させることができる能力をいう。Ｌ−アミノ酸の生産能を有する細菌としては、本来的にＬ−アミノ酸の生産能を有するものであってもよいが、後述の細菌を、変異法や組換えDNA技術を利用して、Ｌ−アミノ酸の生産能を有するように改変したものであってもよい。
【００２１】
Ｌ−アミノ酸の種類は特に制限されないが、Ｌ−リジン、Ｌ−オルニチン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−シトルリン等の塩基性アミノ酸、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−グリシン等の脂肪族アミノ酸、Ｌ−スレオニン、Ｌ−セリン等のヒドロキシモノアミノカルボン酸であるアミノ酸、Ｌ−プロリン等の環式アミノ酸、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−トリプトファン等の芳香族アミノ酸、Ｌ−システイン、Ｌ−シスチン、Ｌ−メチオニン等の含硫アミノ酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アスパラギン酸等の酸性アミノ酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アスパラギン等の側鎖にアミド基を持つアミノ酸が挙げられる。本発明の細菌は２種類以上のＬ−アミノ酸の生産能を有するものであってもよい。
【００２２】
本発明においてＬ−アミノ酸とは、フリー体のＬ−アミノ酸とＬ−アミノ酸塩、たとえば硫酸塩、塩酸塩、炭酸塩を含む。
【００２３】
本発明の細菌を得るために用いる腸内細菌科に属する細菌としては、特に限定されないが、エシェリヒア、エンテロバクター、エルビニア、クレブシエラ、パントエア、フォトルハブドゥス、プロビデンシア、サルモネラ、セラチア、シゲラ、モルガネラ、イェルシニア等の属に属する細菌を含む。特に、NCBI (National Center for Biotechnology Information)のデータベース(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?id=91347)で用いられている分類法により腸内細菌科に分類されている細菌が好ましい。
【００２４】
エシェリヒア属に属する細菌とは、特に制限されないが、当該細菌が微生物学の専門家に知られている分類により、エシェリヒア属に分類されていることを意味する。例えば、ナイトハルトらの著書（Neidhardt, F. C. Ed. 1996. Escherichia coli and Salmonella: Cellular and Molecular Biology/Second Edition pp. 2477-2483. Table 1. American
Society for Microbiology Press, Washington, D.C.）に記述されている系統のものが含まれる。具体的には、プロトタイプの野生株Ｋ１２株由来のエシェリヒア・コリ W3110
（ATCC 27325）、エシェリヒア・コリ MG1655 (ATCC 47076)等が挙げられる。
【００２５】
これらの菌株は、例えばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（住所 P.O. Box 1549 Manassas, VA 20108, United States of America）より分譲を受けることが出来る。すなわち各菌株に対応する登録番号が付与されており、この登録番号を利用して分譲を受けることが出来る。各菌株に対応する登録番号は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログに記載されている。以下に記載する他のATCC菌株も同様である。
【００２６】
パントエア属に属する細菌とは、当該細菌が微生物学の専門家に知られている分類により、パントエア属に分類されていることを意味する。エンテロバクター・アグロメランスのある種のものは、最近、16S rRNAの塩基配列分析等に基づき、パントエア・アグロメランス、パントエア・アナナティス、パントエア・ステワルティイその他に再分類された(Int. J. Syst. Bacteriol., 43, 162-173 (1993))。本発明において、パントエア属に属する細菌には、このようにパントエア属に再分類された細菌も含まれる。
【００２７】
パントエア・アナナティスとしては、パントエア・アナナティスAJ13355株（FERM BP-6614）、AJ13356株（FERM BP-6615）、AJ13601株（FERM BP-7207）及びそれらの誘導体を用いることができる。これらの株は、分離された当時はエンテロバクター・アグロメランスと同定され、エンテロバクター・アグロメランスとして寄託されたが、上記のとおり、16S rRNAの塩基配列解析などにより、パントエア・アナナティスに再分類されている。
【００２８】
エンテロバクター属細菌とは、特に制限されないが、当該細菌が微生物学の専門家に知られている分類により、エンテロバクター属に分類されていることを意味する。例えば、エンテロバクター・アグロメランス（Enterobacter agglomerans）、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）等が挙げられる。具体的には欧州特許出願公開EP952221号に例示された菌株を使用することが出来る。エンテロバクター属の代表的な株としては、エンテロバクター・アグロメランスATCC12287株やエンテロバクター・アエロゲネスATCC13048株、エンテロバクター・アエロゲネスNBRC12010株（Biotechonol Bioeng.2007 Mar 27; 98(2) 340-348）、エンテロバクター・アエロゲネスAJ110637(FERM BP-10955)株が挙げられる。
【００２９】
＜１−１＞Ｌ−アミノ酸生産菌、及びＬ−アミノ酸生産能の付与又は増強
以下、腸内細菌科に属するＬ−アミノ酸生菌、並びに細菌にＬ−アミノ酸生産能を付与する方法、又は細菌のＬ−アミノ酸生産能を増強する方法について述べる。
【００３０】
Ｌ−アミノ酸生産能を付与するには、栄養要求性変異株、Ｌ−アミノ酸のアナログ耐性株又は代謝制御変異株の取得や、Ｌ−アミノ酸の生合成系酵素の発現が増強された組換え株の創製等、従来、エシェリヒア属細菌等のアミノ酸生産菌の育種に採用されてきた方法を適用することができる（アミノ酸発酵、（株）学会出版センター、1986年５月30日初版発行、第７７〜１００頁参照）。ここで、Ｌ−アミノ酸生産菌の育種において、付与される栄養要求性、アナログ耐性、代謝制御変異等の性質は、単独でもよく、２種又は３種以上であってもよい。また、発現が増強されるＬ−アミノ酸生合成系酵素も、単独であっても、２種又は３種以上であってもよい。さらに、栄養要求性、アナログ耐性、代謝制御変異等の性質の付与と、生合成系酵素の増強が組み合わされてもよい。
【００３１】
Ｌ−アミノ酸生産能を有する栄養要求性変異株、アナログ耐性株、又は代謝制御変異株を取得するには、親株又は野生株を通常の変異処理、すなわちＸ線や紫外線の照射、またはＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン等の変異剤処理などによって処理し、得られた変異株の中から、栄養要求性、アナログ耐性、又は代謝制御変異を示し、かつＬ−アミノ酸生産能を有するものを選択することによって得ることができる。
【００３２】
また、Ｌ−アミノ酸生産能の付与又は増強は、遺伝子組換えによって、酵素活性を増強することによっても行うことが出来る。酵素活性の増強は、例えば、Ｌ−アミノ酸の生合成に関与する酵素をコードする遺伝子の発現が増強するように細菌を改変する方法を挙げることができる。遺伝子の発現を増強するための方法としては、遺伝子を含むＤＮＡ断片を、適当なプラスミド、例えば微生物内でプラスミドの複製増殖機能を司る遺伝子を少なくとも含むプラスミドベクターに導入した増幅プラスミドを導入すること、または、これらの遺伝子を染色体上で接合、転移等により多コピー化すること、またこれらの遺伝子のプロモーター領域に変異を導入することにより達成することもできる（国際公開パンフレットWO95/34672号参照）。
【００３３】
上記増幅プラスミドまたは染色体上に目的遺伝子を導入する場合、これらの遺伝子を発現させるためのプロモーターは腸内細菌科において機能するものであればいかなるプロモーターであっても良く、用いる遺伝子自身のプロモーターであってもよいし、改変したものでもよい。腸内細菌科で強力に機能するプロモーターを適宜選択することや、プロモーターの−35、−10領域をコンセンサス配列に近づけることによっても遺伝子の発現量の調節が可能である。以上のような、酵素遺伝子の発現を増強する方法は、WO00/18935号パンフレット、欧州特許出願公開1010755号明細書等に記載されている。
【００３４】
以下、細菌にＬ−アミノ酸生産能を付与する方法、及びＬ−アミノ酸生産能が付与された細菌について例示する。
【００３５】
Ｌ−リジン生産菌
エシェリヒア・コリのＬ−リジン生産菌の例としては、Ｌ−リジンアナログに耐性を有する変異株が挙げられる。Ｌ−リジンアナログはエシェリヒア・コリの生育を阻害するが、この阻害は、Ｌ−リジンが培地に共存するときには完全にまたは部分的に解除される。Ｌ−リジンアナログの例としては、オキサリジン、リジンヒドロキサメート、Ｓ−（２−アミノエチル）−Ｌ−システイン(AEC)、γ−メチルリジン、α−クロロカプロラクタムなどが挙げられるが、これらに限定されない。これらのリジンアナログに対して耐性を有する変異株は、エシェリヒア・コリを通常の人工変異処理に付すことによって得ることができる。Ｌ−リジンの生産に有用な細菌株の具体例としては、E. coli AJ11442 (FERM BP-1543, NRRL B-12185; 米国特許第4,346,170号参照)及びE. coli VL611が挙げられる。これらの微生物では、アスパルトキナーゼのＬ−リジンによるフィードバック阻害が解除されている。
【００３６】
WC196株は、E. coliのＬ−リジン生産菌として使用できる。この菌株は、E. coli K-12に由来するW3110株から取得された株で、352位のスレオニンをイソロイシンに置換することによりＬ−リジンによるフィードバック阻害が解除されたアスパルトキナーゼIIIをコードする変異型lysC遺伝子（米国特許第5,661,012号）でW3110株の染色体上の野生型lysC遺伝子を置き換えた後、AEC耐性を付与することにより育種された（米国特許第5,827,698号）。同株は、Escherichia coli AJ13069と命名され、1994年12月6日、工業技術院生命工学工業技術研究所（現 独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に受託番号FERM P-14690として寄託され、1995年9月29日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-5252が付与されている（米国特許第5,827,698号）。
【００３７】
Ｌ−リジン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、Ｌ−リジン生合成系酵素の１種又は２種以上の活性が増強されている株も挙げられる。かかる酵素の例としては、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ(dapA)、アスパルトキナーゼ(lysC)、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ(dapB)、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ(lysA)、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ(ddh) (米国特許第6,040,160号)、フォスフォエノールピルビン酸カルボキシラーゼ(ppc)、アスパルテートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（asd）、ジアミノピメリン酸エピメラーゼ(dapF)、テトラヒドロジピコリン酸スクシニラーゼ(dapD)、スクシニルジアミノピメリン酸デアシラーゼ(dapE)及びアスパルターゼ(aspA) (EP 1253195 A)が挙げられるが、これらに限定されない。これらの酵素の中では、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ、フォスフォエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、アスパルテートアミノトランスフェラーゼ、ジアミノピメリン酸エピメラーゼ、アスパルテートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、テトラヒドロジピコリン酸スクシニラーゼ、及び、スクシニルジアミノピメリン酸デアシラーゼが特に好ましい。また、親株は、エネルギー効率に関与する遺伝子(cyo) (EP 1170376 A)、ニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼをコードする遺伝子(pntAB) (米国特許第5,830,716号)、ybjE遺伝子(WO2005/073390)、または、これらの組み合わせの発現レベルが増大していてもよい。なお、カッコ内は、それらの遺伝子の略記号である。
【００３８】
エシェリヒア・コリ由来の野生型ジヒドロジピコリン酸合成酵素はＬ−リジンによるフィードバック阻害を受けることが知られており、エシェリヒア・コリ由来の野生型アスパルトキナーゼはＬ−リジンによる抑制及びフィードバック阻害を受けることが知られている。したがって、dapA遺伝子及びlysC遺伝子を用いる場合、これらの遺伝子は、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害を受けない変異型遺伝子であることが好ましい。
【００３９】
Ｌ−リジンによるフィードバック阻害を受けない変異型ジヒドロジピコリン酸合成酵素をコードするＤＮＡとしては、118位のヒスチジン残基がチロシン残基に置換された配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。また、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害を受けない変異型アスパルトキナーゼをコードするＤＮＡとしては、352位のスレオニン残基がイソロイシン残基に置換、323位のグリシン残基がアスパラギン残基に置換、318位のメチオニンがイソロイシンに置換された配列を有するAKIIIをコードするＤＮＡが挙げられる（これらの変異体については米国特許第5661012号及び第6040160号明細書参照）。変異型ＤＮＡはＰＣＲなどによる部位特異的変異法により取得することができる。
【００４０】
なお、変異型変異型ジヒドロジピコリン酸合成酵素をコードする変異型dapA及び変異型アスパルトキナーゼをコードする変異型lysCを含むプラスミドとして、広宿主域プラスミドRSFD80、pCAB1、pCABD2が知られている（米国特許第6040160号明細書）。RSFD80で形質転換されたエシェリヒア・コリ JM109株（米国特許第6040160号明細書）は、AJ12396と命名され、同株は1993年10月28日に通産省工業技術院生命工学工業技術研究所（現 独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター）に受託番号FERM P-13936として寄託され、1994年11月1日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、FERM BP-4859の受託番号のもとで寄託されている。RSFD80は、AJ12396株から、公知の方法によって取得することができる。
【００４１】
Ｌ−リジン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、Ｌ−リジンの生合成経路から分岐してＬ−リジン以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素の活性が低下または欠損している株も挙げられる。Ｌ−リジンの生合成経路から分岐してＬ−リジン以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素の例としては、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、リジンデカルボキシラーゼ(米国特許第5,827,698号)、及び、リンゴ酸酵素(WO2005/010175)が挙げられる。ここで、リジンデカルボキシラーゼ活性を低下または欠損させるためには、リジンデカルボキシラーゼをコードするcadA遺伝子とldcC遺伝子の両方の発現を低下させることが好ましい（国際公開第WO2006/038695号パンフレット）。
【００４２】
cadA遺伝子とldcC遺伝子が破壊された菌株としては、エシェリヒア・コリWC196LC（WC196ΔcadAΔldcC）（US5,827,698、US20060160191）が挙げられる。WC196LC株は、AJ110692と命名され、2008年10月7日に独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に国際寄託され、受託番号FERM BP-11027が付与されている。
【００４３】
Ｌ−スレオニン生産菌
Ｌ−スレオニン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、E. coli TDH-6/pVIC40 (VKPM B-3996) (米国特許第5,175,107号、米国特許第5,705,371号)、E. coli 472T23/pYN7 (ATCC 98081) (米国特許第5,631,157号)、E. coli NRRL-21593 (米国特許第5,939,307号)、E. coli FERM BP-3756 (米国特許第5,474,918号)、E. coli FERM BP-3519及びFERM BP-3520 (米国特許第5,376,538号)、E. coli MG442 (Gusyatiner et al., Genetika (in Russian), 14, 947-956 (1978))、E. coli VL643及びVL2055 (EP 1149911 A)などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４４】
TDH-6株はthrC遺伝子を欠損し、スクロース資化性であり、また、そのilvA遺伝子がリーキー(leaky)変異を有する。この株はまた、rhtA遺伝子に、高濃度のスレオニンまたはホモセリンに対する耐性を付与する変異を有する。B-3996株は、RSF1010由来ベクターに、変異thrA遺伝子を含むthrA*BCオペロンを挿入したプラスミドpVIC40を保持する。この変異thrA遺伝子は、スレオニンによるフィードバック阻害が実質的に解除されたアスパルトキナーゼホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードする。B-3996株は、1987年11月19日、オールユニオン・サイエンティフィック・センター・オブ・アンチビオティクス(Nagatinskaya Street 3-A, 117105 Moscow, Russia)に、受託番号RIA 1867で寄託されている。この株は、また、1987年4月7日、ルシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオルガニズムズ(VKPM)に、受託番号B-3996で寄託されている。
【００４５】
E. coli VKPM B-5318 (EP 0593792B)も、Ｌ−スレオニン生産菌又はそれを誘導するための親株として使用できる。B-5318株は、イソロイシン非要求性であり、プラスミドpVIC40中のスレオニンオペロンの制御領域が、温度感受性ラムダファージC1リプレッサー及びPRプロモーターにより置換されている。VKPM B-5318は、1990年5月3日、ルシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオルガニズムズ(VKPM) (1 Dorozhny proezd., 1 Moscow 117545, Russia)に、受託番号VKPM B-5318で寄託されている。
【００４６】
好ましくは、本発明に用いる細菌は、さらに、下記の遺伝子の１種以上の発現が増大するように改変されたものである。
−スレオニンによるフィードバック阻害に耐性のアスパルトキナーゼホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードする変異thrA遺伝子
−ホモセリンキナーゼをコードするthrB遺伝子
−スレオニンシンターゼをコードするthrC遺伝子
−推定トランスメンブランタンパク質をコードするrhtA遺伝子
−アスパルテート−β−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードするasd遺伝子
−アスパルテートアミノトランスフェラーゼ（アスパルテートトランスアミナーゼ）をコードするaspC遺伝子
【００４７】
E. coliのアスパルトキナーゼホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードするthrA遺伝子は明らかにされている(ヌクレオチド番号337〜2799, GenBank accession NC_000913.2, gi: 49175990)。thrA遺伝子は、E. coli K-12の染色体において、thrL遺伝子とthrB遺伝子との間に位置する。E. coliのホモセリンキナーゼをコードするthrB遺伝子は明らかにされている(ヌクレオチド番号2801〜3733, GenBank accession NC_000913.2, gi: 49175990)。thrB遺伝子は、E. coli K-12の染色体において、thrA遺伝子とthrC遺伝子との間に位置する。E. coliのスレオニンシンターゼをコードするthrC遺伝子は明らかにされている(ヌクレオチド番号3734〜5020, GenBank accession NC_000913.2, gi: 49175990)。thrC遺伝子は、E. coli K-12の染色体において、thrB遺伝子とyaaXオープンリーディングフレームとの間に位置する。これら三つの遺伝子は、全て、単一のスレオニンオペロンとして機能する。スレオニンオペロンの発現を増大させるには、転写に影響するアテニュエーター領域を、好ましくは、オペロンから除去する(WO2005/049808, WO2003/097839)。
【００４８】
スレオニンによるフィードバック阻害に耐性のアスパルトキナーゼホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードする変異thrA遺伝子、ならびに、thrB遺伝子及びthrC遺伝子は、スレオニン生産株E. coli VKPM B-3996に存在する周知のプラスミドpVIC40から一つのオペロンとして取得できる。プラスミドpVIC40の詳細は、米国特許第5,705,371号に記載されている。
【００４９】
rhtA遺伝子は、グルタミン輸送系の要素をコードするglnHPQ オペロンに近いE. coli染色体の18分に存在する。rhtA遺伝子は、ORF1 (ybiF遺伝子, ヌクレオチド番号764〜1651,
GenBank accession number AAA218541, gi:440181)と同一であり、pexB遺伝子とompX遺伝子との間に位置する。ORF1によりコードされるタンパク質を発現するユニットは、rhtA遺伝子と呼ばれている(rht: ホモセリン及びスレオニンに耐性)。また、rhtA23変異が、ATG開始コドンに対して-1位のG→A置換であることが判明している(ABSTRACTS of the 17th
International Congress of Biochemistry and Molecular Biology in conjugation with Annual Meeting of the American Society for Biochemistry and Molecular Biology,
San Francisco, California August 24-29, 1997, abstract No. 457, EP 1013765 A)。
【００５０】
E. coliのasd遺伝子は既に明らかにされており(ヌクレオチド番号3572511〜3571408, GenBank accession NC_000913.1, gi:16131307)、その遺伝子の塩基配列に基づいて作製されたプライマーを用いるPCRにより得ることができる(White, T. J., Arnheim, N., and Erlich, H. A. 1989. Trends Genet. 5: 185-189参照)。他の微生物のasd遺伝子も同様に得ることができる。
【００５１】
また、E. coliのaspC遺伝子も既に明らかにされており(ヌクレオチド番号983742〜984932, GenBank accession NC_000913.1, gi:16128895)、PCRにより得ることができる。他の微生物のaspC遺伝子も同様に得ることができる。
【００５２】
Ｌ−システイン生産菌
Ｌ−システイン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、フィードバック阻害耐性のセリンアセチルトランスフェラーゼをコードする異なるcysEアレルで形質転換されたE. coli JM15(米国特許第6,218,168号、ロシア特許出願第2003121601号)、細胞に毒性の物質を排出するのに適したタンパク質をコードする過剰発現遺伝子を有するE. coli W3110 (米国特許第5,972,663号)、システインデスルフォヒドラーゼ活性が低下したE. coli株 (JP11155571A2)、cysB遺伝子によりコードされる正のシステインレギュロンの転写制御因子の活性が上昇したE. coli W3110 (WO0127307A1)などの菌株が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５３】
Ｌ−ロイシン生産菌
Ｌ−ロイシン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、ロイシン耐性のE. coli株 (例えば、57株 (VKPM B-7386, 米国特許第6,124,121号))またはβ−２−チエニルアラニン、３−ヒドロキシロイシン、４−アザロイシン、5,5,5-トリフルオロロイシンなどのロイシンアナログ耐性のE. coli株(特公昭62-34397号及び特開平8-70879号)、WO96/06926に記載された遺伝子工学的方法で得られたE. coli株、E. coli H-9068 (特開平8-70879号)など株が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５４】
本発明に用いる細菌は、Ｌ−ロイシン生合成に関与する遺伝子の１種以上の発現が増大されることにより改良されていてもよい。このような遺伝子の例としては、好ましくはＬ−ロイシンによるフィードバック阻害が解除されたイソプロピルマレートシンターゼをコードする変異leuA遺伝子(米国特許第6,403,342号)に代表される、leuABCDオペロンの遺伝子が挙げられる。さらに、本発明に用いる細菌は、細菌の細胞からＬ−アミノ酸を排出するタンパク質をコードする遺伝子の１種以上の発現が増大されることにより改良されていてもよい。このような遺伝子の例としては、b2682遺伝子及びb2683遺伝子(ygaZH遺伝子) (EP 1239041 A2)が挙げられる。
【００５５】
Ｌ−ヒスチジン生産菌
Ｌ−ヒスチジン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、E. coli 24株 (VKPM B-5945, RU2003677)、E. coli 80株 (VKPM B-7270, RU2119536)、E. coli NRRL B-12116 - B12121 (米国特許第4,388,405号)、E. coli H-9342 (FERM BP-6675)及びH-9343 (FERM BP-6676) (米国特許第6,344,347号)、E. coli H-9341 (FERM BP-6674) (EP1085087)、E. coli AI80/pFM201 (米国特許第6,258,554号)など株が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５６】
Ｌ−ヒスチジン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、Ｌ−ヒスチジン生合成系酵素をコードする遺伝子の１種以上の発現が増大した株も挙げられる。かかる遺伝子の例としては、ATPフォスフォリボシルトランスフェラーゼ遺伝子(hisG)、フォスフォリボシルAMPサイクロヒドロラーゼ遺伝子(hisI)、フォスフォリボシル-ATPピロフォスフォヒドロラーゼ遺伝子(hisI)、フォスフォリボシルフォルミミノ-5-アミノイミダゾールカルボキサミドリボタイドイソメラーゼ遺伝子(hisA)、アミドトランスフェラーゼ遺伝子(hisH)、ヒスチジノールフォスフェイトアミノトランスフェラーゼ遺伝子(hisC)、ヒスチジノールフォスファターゼ遺伝子(hisB)、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ遺伝子(hisD)などが挙げられる。
【００５７】
hisG及びhisBHAFIにコードされるＬ−ヒスチジン生合成系酵素はＬ−ヒスチジンにより阻害されることが知られており、従って、Ｌ−ヒスチジン生産能は、ATPフォスフォリボシルトランスフェラーゼ遺伝子(hisG)にフィードバック阻害への耐性を付与する変異を導入することにより効率的に増大させることができる(ロシア特許第2003677号及び第2119536号)。
【００５８】
Ｌ−ヒスチジン生産能を有する株の具体例としては、Ｌ−ヒスチジン生合成系酵素をコードするDNAを保持するベクターを導入したE. coli FERM-P 5038及び5048 (特開昭56-005099号)、アミノ酸輸送の遺伝子を導入したE. coli株(EP1016710A)、スルファグアニジン、DL-1,2,4-トリアゾール-3-アラニン及びストレプトマイシンに対する耐性を付与したE.
coli 80株(VKPM B-7270, ロシア特許第2119536号)などの菌株が挙げられる。
【００５９】
Ｌ−グルタミン酸生産菌
Ｌ−グルタミン酸生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、E. coli VL334thrC+ (EP 1172433)などの菌株が挙げられるが、これらに限定されない。E. coli VL334 (VKPM B-1641)は、thrC遺伝子及びilvA遺伝子に変異を有するＬ−イソロイシン及びＬ−スレオニン要求性株である(米国特許第4,278,765号)。thrC遺伝子の野生型アレルは、野生型E. coli K12株 (VKPM B-7)の細胞で増殖したバクテリオファージP1を用いる一般的形質導入法により導入された。この結果、Ｌ−イソロイシン要求性のＬ−グルタミン酸生産菌VL334thrC+ (VKPM B-8961) が得られた。
【００６０】
Ｌ−グルタミン酸生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、Ｌ−グルタミン酸生合成系酵素をコードする遺伝子の１種以上の発現が増大した株が挙げられるが、これらに限定されない。かかる遺伝子の例としては、グルタメートデヒドロゲナーゼ（gdhA）、グルタミンシンテターゼ(glnA)、グルタメートシンテターゼ(gltAB)、イソシトレートデヒドロゲナーゼ(icdA)、アコニテートヒドラターゼ(acnA, acnB)、シトレートシンターゼ(gltA)、フォスフォエノールピルベートカルボシラーゼ(ppc)、ピルベートデヒドロゲナーゼ(aceEF, lpdA)、ピルベートキナーゼ(pykA, pykF)、フォスフォエノールピルベートシンターゼ(ppsA)、エノラーゼ(eno)、フォスフォグリセロムターゼ(pgmA, pgmI)、フォスフォグリセレートキナーゼ(pgk)、グリセルアルデヒド-3-フォスフェートデヒドロゲナーゼ(gapA)、トリオースフォスフェートイソメラーゼ(tpiA)、フルクトースビスフォスフェートアルドラーゼ(fbp)、フォスフォフルクトキナーゼ（pfkA, pfkB）、グルコースフォスフェートイソメラーゼ(pgi)などが挙げられる。
【００６１】
シトレートシンテターゼ遺伝子、フォスフォエノールピルベートカルボキシラーゼ遺伝子、及び／またはグルタメートデヒドロゲナーゼ遺伝子の発現が増大するように改変された株の例としては、EP1078989A、EP955368A及びEP952221Aに開示されたものが挙げられる。
【００６２】
Ｌ−グルタミン酸生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、Ｌ−グルタミン酸の生合成経路から分岐してＬ−グルタミン酸以外の化合物の合成を触媒する酵素の活性が低下または欠損している株も挙げられる。このような酵素の例としては、イソシトレートリアーゼ(aceA)、α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ(sucA)、フォスフォトランスアセチラーゼ(pta)、アセテートキナーゼ(ack)、アセトヒドロキシ酸シンターゼ(ilvG)、アセトラクテートシンターゼ(ilvI)、フォルメートアセチルトランスフェラーゼ(pfl)、ラクテートデヒドロゲナーゼ(ldh)、グルタメートデカルボキシラーゼ(gadAB)、γ-グルタミル転移酵素(ggt)、γ-グルタミルシステイン合成酵素(gshA)、γ-グルタミン酸プトレシン合成酵素(ycjK)などが挙げられる。α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ活性が欠損した、または、α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ活性が低下したエシェリヒア・コリ、及び、それらの取得方法は米国特許第5,378,616 号及び第5,573,945号に記載されている。
【００６３】
具体例としては下記のものが挙げられる。
E. coli W3110sucA::Kmr
E. coli AJ12624 (FERM BP-3853)
E. coli AJ12628 (FERM BP-3854)
E. coli AJ12949 (FERM BP-4881)
【００６４】
E. coli W3110sucA::Kmr は、E. coli W3110のα-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ遺伝子（以下、「sucA遺伝子」ともいう）を破壊することにより得られた株である。この株は、α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼを完全に欠損している。
【００６５】
Ｌ−グルタミン酸生産菌の他の例としては、アスパラギン酸代謝拮抗物質に耐性を有するエシェリヒア・コリが挙げられる。このような株は、α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼを欠損していてもよく、例えば、E. coli AJ13199 (FERM BP-5807) (米国特許第5.908,768号)、さらにＬ−グルタミン酸分解能が低下したFFRM P-12379(米国特許第5,393,671号); AJ13138 (FERM BP-5565) (米国特許第6,110,714号)などの菌株が挙げられる。
【００６６】
パントアエ・アナナティスのＬ−グルタミン酸生産菌の例としては、パントエア・アナナティスAJ13355株が挙げられる。同株は、静岡県磐田市の土壌から、低pHでＬ−グルタミン酸及び炭素源を含む培地で増殖できる株として分離された株である。パントエア・アナナティスAJ13355は、1998年2月19日に、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（住所  〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に、受託番号FERM P-16644として寄託され、1999年1月11日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-6614が付与されている。尚、同株は、分離された当時はエンテロバクター・アグロメランス（Enterobacter agglomerans）と同定され、エンテロバクター・アグロメランスAJ13355として寄託されたが、近年16S rRNAの塩基配列解析などにより、パントエア・アナナティス（Pantoea ananatis）に再分類されている。
【００６７】
また、パントアエ・アナナティスのＬ−グルタミン酸生産菌として、α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ（αKGDH）活性が欠損した、または、αKGDH活性が低下したパントエア属に属する細菌が挙げられる。このような株としては、AJ13355株のαKGDH-E1サブユニット遺伝子（sucA）を欠損させたAJ13356(米国特許第6,331,419号)、及びAJ13355株から粘液質低生産変異株として選択されたSC17株由来のsucA遺伝子欠損株であるSC17sucA(米国特許第6,596,517号)がある。AJ13356は、1998年2月19日、工業技術院生命工学工業技術研究所（現 独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に受託番号FERM P-16645として寄託され、1999年1月11日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-6616が付与されている。AJ13355及びAJ13356は、上記寄託機関にEnterobacter agglomeransとして寄託されているが、本明細書では、Pantoea ananatisとして記載する。また、SC17sucA株は、ブライベートナンバーAJ417株が付与され、2004年2月26日に産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号FERM BP-08646として寄託されている。
【００６８】
さらに、パントエア・アナナティスのＬ−グルタミン酸生産菌として、SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB株、AJ13601株、NP106株、及びNA1株が挙げられる。SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB株は、SC17sucA株に、エシェリヒア・コリ由来のクエン酸シンターゼ遺伝子（gltA）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子（ppsA）、およびグルタメートデヒドロゲナーゼ遺伝子（gdhA）を含むプラスミドRSFCPG、並びに、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム由来のクエン酸シンターゼ遺伝子（gltA）を含むプラスミドpSTVCBを導入して得た株である。AJ13601株は、このSC17sucA/RSFCPG+pSTVCB株から低pH下で高濃度のＬ−グルタミン酸に耐性を示す株として選択された株である。また、NP106株は、AJ13601株からプラスミドRSFCPG+pSTVCBを脱落させた株である。AJ13601株は、1999年8月18日に、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に受託番号FERM P-17516として寄託され、2000年7月6日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-7207が付与されている。
【００６９】
Ｌ−フェニルアラニン生産菌
Ｌ−フェニルアラニン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、E. coli AJ12739 (tyrA::Tn10, tyrR) (VKPM B-8197)、変異型pheA34遺伝子を保持するE. coli HW1089 (ATCC 55371) (米国特許第 5,354,672号)、E. coli MWEC101-b (KR8903681)、E.coli NRRL B-12141, NRRL B-12145, NRRL B-12146及びNRRL B-12147 (米国特許第4,407,952号)などの菌株が挙げられるが、これらに限定されない。また、親株として、E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHAB] (FERM BP-3566)、E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHAD] (FERM BP-12659)、E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHATerm] (FERM BP-12662)及びAJ 12604と命名されたE. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pBR-aroG4, pACMAB] (FERM BP-3579)も使用できる(EP 488424 B1)。さらに、yedA遺伝子またはyddG遺伝子にコードされるタンパク質の活性が増大したエシェリヒア・コリのＬ−フェニルアラニン生産菌も使用できる(米国特許出願公開2003/0148473 A1及び2003/0157667 A1)。
【００７０】
Ｌ−トリプトファン生産菌
Ｌ−トリプトファン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、変異trpS遺伝子によりコードされるトリプトファニル-tRNAシンテターゼが欠損したE. coli JP4735/pMU3028 (DSM10122)及びJP6015/pMU91 (DSM10123) (米国特許第5,756,345号)、セリンによるフィードバック阻害を受けないフォスフォグリセリレートデヒドロゲナーゼをコードするserAアレル及びトリプトファンによるフィードバック阻害を受けないアントラニレートシンターゼをコードするtrpEアレルを有するE. coli SV164 (pGH5) (米国特許第6,180,373号)、トリプトファナーゼが欠損したE. coli AGX17 (pGX44) (NRRL B-12263)及びAGX6(pGX50)aroP (NRRL B-12264) (米国特許第4,371,614号)、フォスフォエノールピルビン酸生産能が増大したE. coli AGX17/pGX50,pACKG4-pps (WO9708333, 米国特許第6,319,696号)などの菌株が挙げられるが、これらに限定されない。yedA遺伝子またはyddG遺伝子にコードされるタンパク質の活性が増大したエシェリヒア・コリのＬ−トリプトファン生産菌も使用できる(米国特許出願公開2003/0148473 A1及び2003/0157667 A1)。
【００７１】
Ｌ−トリプトファン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、アントラニレートシンターゼ(trpE)、フォスフォグリセレートデヒドロゲナーゼ(serA)、及び、トリプトファンシンターゼ(trpAB)から選ばれる酵素の活性の一種以上が増大した株も挙げられる。アントラニレートシンターゼ及びフォスフォグリセレートデヒドロゲナーゼは共にＬ−トリプトファン及びＬ−セリンによるフィードバック阻害を受けるので、フィードバック阻害を解除する変異をこれらの酵素に導入してもよい。このような変異を有する株の具体例としては、脱感作型アントラニレートシンターゼを保持するE. coli SV164、及び、フィードバック阻害が解除されたフォスフォグリセレートデヒドロゲナーゼをコードする変異serA遺伝子を含むプラスミドpGH5 (WO 94/08031)をE. coli SV164に導入することにより得られた形質転換株が挙げられる。
【００７２】
Ｌ−トリプトファン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、阻害解除型アントラニレートシンターゼをコードする遺伝子を含むトリプトファンオペロンが導入された株(特開昭57-71397号, 特開昭62-244382号, 米国特許第4,371,614号)も挙げられる。さらに、トリプトファンオペロン(trpBA)中のトリプトファンシンターゼをコードする遺伝子の発現を増大させることによりＬ−トリプトファン生産能を付与してもよい。トリプトファンシンターゼは、それぞれtrpA及びtrpB遺伝子によりコードされるα及びβサブユニットからなる。さらに、イソシトレートリアーゼ-マレートシンターゼオペロンの発現を増大させることによりＬ−トリプトファン生産能を改良してもよい(WO2005/103275)。
【００７３】
Ｌ−プロリン生産菌
Ｌ−プロリン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、ilvA遺伝子が欠損し、Ｌ−プロリンを生産できるE. coli 702ilvA (VKPM B-8012) (EP 1172433)などの菌株が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７４】
本発明に用いる細菌は、Ｌ−プロリン生合成に関与する遺伝子の一種以上の発現を増大することにより改良してもよい。Ｌ−プロリン生産菌に好ましい遺伝子の例としては、Ｌ−プロリンによるフィードバック阻害が解除されたグルタメートキナーゼをコードするproB遺伝子(ドイツ特許第3127361号)が挙げられる。さらに、本発明に用いる細菌は、細菌の細胞からＬ−アミノ酸を排出するタンパク質をコードする遺伝子の一種以上の発現が増大することにより改良してもよい。このような遺伝子としては、b2682 遺伝子及びb2683遺伝子(ygaZH遺伝子) (EP1239041 A2)が挙げられる。
【００７５】
Ｌ−プロリン生産能を有するエシェリヒア・コリの例としては、NRRL B-12403及びNRRL
B-12404 (英国特許第2075056号)、VKPM B-8012 (ロシア特許出願2000124295)、ドイツ特許第3127361号に記載のプラスミド変異体、Bloom F.R. et al (The 15th Miami winter symposium, 1983, p.34)に記載のプラスミド変異体などのE. coli 株が挙げられる。
【００７６】
Ｌ−アルギニン生産菌
Ｌ−アルギニン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、E. coli 237株 (VKPM B-7925) (米国特許出願公開2002/058315 A1)、及び、変異N-アセチルグルタメートシンターゼを保持するその誘導株(ロシア特許出願第2001112869号)、E. coli 382株 (VKPM B-7926) (EP1170358A1)、N-アセチルグルタメートシンテターゼをコードするargA遺伝子が導入されたアルギニン生産株(EP1170361A1)などの菌株が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７７】
Ｌ−アルギニン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、Ｌ−アルギニン生合成系酵素をコードする遺伝子の１種以上の発現が増大した株も挙げられる。かかる遺伝子の例としては、N-アセチルグルタミルフォスフェートレダクターゼ遺伝子(argC)、オルニチンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子(argJ)、N-アセチルグルタメートキナーゼ遺伝子(argB)、アセチルオルニチントランスアミナーゼ遺伝子(argD)、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ遺伝子(argF)、アルギノコハク酸シンテターゼ遺伝子(argG)、アルギノコハク酸リアーゼ遺伝子(argH)、カルバモイルフォスフェートシンテターゼ遺伝子(carAB)が挙げられる。
【００７８】
Ｌ−バリン生産菌
Ｌ−バリン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、ilvGMEDAオペロンを過剰発現するように改変された株(米国特許第5,998,178号)が挙げられるが、これらに限定されない。アテニュエーションに必要なilvGMEDAオペロンの領域を除去し、生産されるＬ−バリンによりオペロンの発現が減衰しないようにすることが好ましい。さらに、オペロンのilvA遺伝子が破壊され、スレオニンデアミナーゼ活性が減少することが好ましい。
【００７９】
Ｌ−バリン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、アミノアシルt-RNAシンテターゼの変異を有する変異株(米国特許第5,658,766号)も挙げられる。例えば、イソロイシンtRNAシンテターゼをコードするileS 遺伝子に変異を有するE. coli VL1970が使用できる。E. coli VL1970は、1988年6月24日、ルシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオルガニズムズ(VKPM) (1 Dorozhny proezd., 1 Moscow 117545, Russia)に、受託番号VKPM B-4411で寄託されている。
さらに、生育にリポ酸を要求する、及び／または、H+-ATPaseを欠失している変異株(WO96/06926)を親株として用いることができる。
【００８０】
Ｌ−イソロイシン生産菌
Ｌ−イソロイシン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、６−ジメチルアミノプリンに耐性を有する変異株(特開平5-304969号)、チアイソロイシン、イソロイシンヒドロキサメートなどのイソロイシンアナログに耐性を有する変異株、さらにDL-エチオニン及び／またはアルギニンヒドロキサメートに耐性を有する変異株(特開平5-130882号).が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、スレオニンデアミナーゼ、アセトヒドロキシ酸シンターゼなどのＬ−イソロイシン生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子で形質転換された組換え株もまた親株として使用できる(特開平2-458号, FR 0356739, 及び米国特許第5,998,178号)。
【００８１】
Ｌ−アスパラギン酸生産菌
Ｌ−アスパラギンは、アスパラギン酸へアミノ基を付与することにより生産される（Boehlein, S. K., Richards, N. G. J., & Schuster, S. M. (1994a) J. Biol. Chem. 269,
7450-7457.）。したがって、エシェリヒア・コリのＬ−アスパラギン生産菌として、Ｌ−アスパラギン酸生産菌のアスパラギンシンテターゼが増強されたエシェリヒア・コリ菌株が挙げられる。
【００８２】
本発明の細菌は、脂肪酸、又はグリセロール等のアルコールを資化する能力が高められていてもよい。
脂肪酸資化能は、例えば、fadR遺伝子の発現を弱化させること、もしくは同遺伝子を欠損させること、fadI、fadJ、fadL、fadE、fadD、fadB、又はfadA遺伝子等の脂肪酸資化に関与する遺伝子の発現を増強することにより、高めることができる（WO2009/142286）。
【００８３】
グリセロール資化能は、glpR遺伝子（EP1715056）の発現を弱化するか、glpA、glpB、glpC、glpD、glpE、glpF、glpG、glpK、glpQ、glpT、glpX、tpiA、gldA、dhaK、dhaL、dhaM、dhaR、fsa及びtalC遺伝子等のグリセロール代謝遺伝子（EP1715055A）の発現を増強すること、又は、グリセロールデヒドロゲナーゼ（gldA）、ジハイドロキシアセトンキナーゼ(dhaKLM, dak)遺伝子、フルクトースー６−リン酸アルドラーゼ（fsaB）の発現を強化すること（WO2008/102861）によって、高めることができる。
【００８４】
本発明に用いる細菌は、エタノール資化性を有する細菌であり、元来エタノールの資化性を有する細菌、エタノールの資化性を付与された組換え株、又はエタノールの資化性が高まった変異株でもよい。
【００８５】
エシェリヒア・コリに関しては、嫌気条件でエタノールを生成する酵素として、以下の反応を可逆的に触媒するアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼとアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するAdhEの存在が知られている。エシェリヒア・コリのAdhEをコードするadhE遺伝子の配列は、WO2009/031565、米国特許出願公開第2009068712号に開示されている。
【００８６】
アセチル-CoA + NADH + H+ → アセトアルデヒド + NAD+ + CoA
アセトアルデヒド + NADH + H+ → エタノール + NAD+
【００８７】
エタノールを炭素源に用いる場合は、好気的にエタノールを資化できる細菌を用いることが好ましい。エシェリヒア・コリは、好気条件ではエタノールは資化できないが、好気的にエタノールを資化できるように改変された株を用いてもよい。元来好気的にエタノールを資化できない細菌を、好気的にエタノールを資化できるように改変するには、例えば、好気条件で機能する非天然型プロモーターの制御下で発現するように改変されたadh遺伝子を保持させること、又は、好気的にエタノールを資化できることを可能にする変異をコード領域内に有する変異型adhE遺伝子を保持させることが挙げられる（Clark D. P., and Cronan, J. E. Jr. 1980. J. Bacteriol. 144: 179-184; Membrillo-Hernandez, J. et al. 2000. J. Biol. Chem. 275: 33869-33875）。さらに、この変異型adhE遺伝子は、好気条件で機能する非天然型プロモーターの制御下で発現するものであってもよい。
【００８８】
エシェリヒア・コリは、アルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の上流のプロモーターを好気的に機能するプロモーターに置換することによって、好気条件でアルコールデヒドロゲナーゼが発現し、好気的にエタノールを資化できるようになる（WO2008/010565号パンフレット）。好気条件で機能する非天然型プロモーターとして、好気条件で或る特定レベルを超えてadhE遺伝子を発現することができる任意のプロモーターを用いることができる。好気条件は、振盪、通気及び撹拌等の方法によって酸素が供給される細菌の培養に通常用いられるものであり得る。具体的には、好気条件で遺伝子を発現することが知られている任意のプロモーターを用いることができる。例えば、解糖、ペントースリン酸経路、ＴＣＡサイクル、アミノ酸生合成経路等に関与する遺伝子のプロモーターを用いることができる。さらに、λファージのPtacプロモーター、lacプロモーター、trpプロモーター、trcプロモーター、PRプロモーター、又はPLプロモーターは全て、好気条件で機能する強いプロモーターであることが知られており、これらを用いることが好ましい。
【００８９】
前記のような変異を有するAdhE変異体として具体的には、エシェリヒア・コリのAdhEの568位のグルタミン酸残基がグルタミン酸及びアスパラギン酸以外のアミノ酸残基、例えばリジンで置換された変異体（Glu568Lys、E568K）がある（国際公開パンフレットWO2008/010565号公報）。
【００９０】
さらに、前記AdhE変異体は、以下の追加的変異を含んでいてもよい。
Ａ）560位のグルタミン酸残基の他のアミノ酸残基、例えばリジン残基への置換
Ｂ）566位のフェニルアラニン残基の他のアミノ酸残基、例えばバリン残基への置換、
Ｃ）22位のグルタミン酸残基、236位のメチオニン残基、461位のチロシン残基、554位のイソロイシン残基、及び786位のアラニン残基の他のアミノ酸残基、例えばそれぞれグリシン残基、バリン残基、システイン残基、セリン残基、及びバリン残基への置換、又は
Ｄ）上記変異の組合わせ。
【００９１】
「好気的にエタノールを資化できる」とは、エタノールを単一炭素源とする最少液体培地もしくは固体培地にて、好気条件で生育可能であることを意味する。「好気条件」は前記と同様に、振盪、通気及び撹拌等の方法によって酸素が供給される細菌の培養に通常用いられるものであり得る。また、「好気的にエタノールを資化できる」とは、ＡｄｈＥタンパク質のレベルに関して、Clark及びCronan（J. Bacteriol., 141, 177-183 (1980））の方法によって測定された無細胞抽出物におけるアルコールデヒドロゲナーゼ活性は、タンパク質１ｍｇ当たり１．５ユニット以上、好ましくは５ユニット以上、及びより好ましくは１０ユニット以上であることを意味する。
【００９２】
また、本発明の細菌は、特にエタノールを炭素源とする場合、リボヌクレアーゼＧの活性が低下するように改変されていてもよい。
【００９３】
また、本発明の細菌は、ピルビン酸シンターゼ、または、ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼの活性が増大するように改変された菌株であってもよい。ピルビン酸シンターゼの、あるいは、ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼ活性が増大するように改変するには、ピルビン酸シンターゼ、または、ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼ活性が、親株、例えば野生株や非改変株と比べて増大するように改変することが好ましい。尚、微生物が元来ピルビン酸シンターゼ活性を有していない場合、同酵素活性を有するように改変された微生物は、ピルビン酸シンターゼ、または、ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼ活性が、非改変株に比べて増大している。
【００９４】
本発明における「ピルビン酸シンターゼ」とは、アセチル-CoAとCO2からピルビン酸を生成する下記の反応を、電子供与体存在下、例えばフェレドキシンあるいはフラボドキシン存在下で可逆的に触媒する酵素（EC 1.2.7.1）を意味する。ピルビン酸シンターゼは、ＰＳと略称されることもあり、ピルビン酸オキシドレダクターゼ、ピルビン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼ、ピルビン酸フラボドキシンオキシドレダクターゼ、または、ピルビン酸オキシドレダクターゼと命名されている場合もある。電子供与体としては、フェレドキシンまたはフラボドキシンを用いることが出来る。
【００９５】
還元型フェレドキシン + アセチル-CoA + CO2 → 酸化型フェレドキシン + ピルビン酸 +
ＣｏＡ
【００９６】
ピルビン酸シンターゼの活性が増強されたことの確認は、増強前の微生物と、増強後の微生物より粗酵素液を調製し、そのピルビン酸シンターゼ活性を比較することにより達成される。ピルビン酸シンターゼの活性は、例えば、Yoonらの方法（Yoon, K. S. et al. 1997. Arch. Microbiol. 167: 275-279）に従って測定できる。例えば、電子受容体としての酸化型メチルビオロゲンとＣｏＡと粗酵素液を含む反応液にピルビン酸を添加した際に、ピルビン酸の脱炭酸反応によって増大する還元型メチルビオロゲンの量を分光学的に測定することによって、測定可能である。酵素活性１ユニット（U）は１分間あたり１μmolのメチルビオロゲンの還元量で表される。親株がピルビン酸シンターゼ活性を有している場合、親株と比較して、好ましくは1.5倍以上、より好ましくは2倍以上、さらに好ましくは3倍以上酵素活性が上昇していることが望ましい。また親株がピルビン酸シンターゼ活性を有していない場合には、ピルビン酸シンターゼ遺伝子を導入することにより、ピルビン酸シンターゼが生成されていればよいが、酵素活性が測定できる程度に強化されていることが好ましく、好ましくは0.001U/mg（菌体タンパク質）以上、より好ましくは0.005U/mg以上、さらに好ましくは0.01U/mg以上が望ましい。ピルビン酸シンターゼは、酸素に対して感受性であり、一般的に活性発現や測定は困難であることも多い（Buckel, W.and Golding, B. T. 2006. Ann. Rev. of Microbiol. 60: 27-49）。したがって、酵素活性の測定に際しては、反応容器中の酸素濃度を低下させて酵素反応を行うことが好ましい。
【００９７】
ピルビン酸シンターゼをコードする遺伝子は、クロロビウム・テピダム(Chlorobium tepidum)、ハイドロジェノバクター・サーモファイラス（Hydrogenobacter thermophilus）等、還元的ＴＣＡサイクルを持つ細菌のピルビン酸シンターゼ遺伝子を利用することが可能である。また、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）をはじめとする、腸内細菌群に属する細菌由来のピルビン酸シンターゼ遺伝子を利用することも可能である。さらに、ピルビン酸シンターゼをコードする遺伝子は、メタノコッカス・マリパルディス（Methanococcus maripaludis）、メタノカルドコッカス・ジャナスチ（Methanocaldococcus jannaschii）、メタノサーモバクター・サーマトトロフィカス（Methanothermobacter thermautotrophicus）などの独立栄養性メタン生成古細菌（autotrophic methanogens）のピルビン酸シンターゼ遺伝子を利用することが可能である。
【００９８】
具体的には、クロロビウム・テピダム（Chlorobium tepidum）のピルビン酸シンターゼ遺伝子として、クロロビウム・テピダムのゲノム配列（GenBank Accession No. NC_002932）の塩基番号1534432〜1537989に位置する塩基配列を有する遺伝子を例示することができる。同遺伝子がコードするアミノ酸配列はGenBank Accession No. AAC76906に開示されている。また、ハイドロジェノバクター・サーモファイラスのピルビン酸シンターゼは、δサブユニット（GenBank Accession No. BAA95604）、αサブユニット（GenBank Accession No. BAA95605）、βサブユニット（GenBank Accession No. BAA95606）、γサブユニット（GenBank Accession No. BAA95607）の４つのサブユニットによる複合体を形成していることが知られている（Ikeda, T. et al. 2006. Biochem. Biophys. Res. Commun. 340: 76-82）。さらに、ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）のゲノム配列（GenBank Accession No. NC 000915）の塩基番号1170138〜1173296番に位置するHP1108、HP1109、HP1110、HP1111の4つの遺伝子からなるピルビン酸シンターゼ遺伝子、スルフォロバス・ソルファタリカス（Sulfolobus solfataricus）のゲノム配列（GenBank Accession
No. NC 002754）の塩基番号1047593〜1044711番で示されるSSO1208、SSO7412、SSO1207、SSO1206の4つの遺伝子でコードされるピルビン酸シンターゼ遺伝子を例示することができる。さらに、ピルビン酸シンターゼ遺伝子は、上記で例示された遺伝子との相同性に基づいて、クロロビウム（Chlorobium）属、デスルホバクター（Desulfobacter）属、アクイフェクス（Aquifex）属、ハイドロジェノバクター（Hydrogenobacter）属、サーモプロテウス（Thermoproteus）属、パイロバキュラム（Pyrobaculum）属細菌等からクローニングされるものであってもよい。
【００９９】
エシェリヒア・コリにおいては、K-12株のゲノム配列（GenBank Accession No. U00096）の塩基番号1435284〜1438808に位置する塩基配列を有するydbK遺伝子（b1378）が、配列上の相同性からピルビン酸フラボドキシンオキシドレダクターゼ、すなわちピルビン酸シンターゼをコードしていると予想されている。同遺伝子がコードするアミノ酸配列はGenBank Accession No. AAC76906に開示されている。さらに、ピルビン酸シンターゼ遺伝子は、エシェリヒア・コリのピルビン酸シンターゼ遺伝子（ydbK）と高い相同性を有する、エシェリヒア属、サルモネラ属（Salmonella）、セラチア属（Serratia）、エンテロバクター属（Enterobacter）、シゲラ属（Shigella）、サイトロバクター属（Citrobacter）などの腸内細菌群に属するピルビン酸シンターゼ遺伝子であってもよい。
【０１００】
メタノコッカス・マリパルディス（Methanococcus maripaludis）のピルビン酸シンターゼは、メタノコッカス・マリパルディスのゲノム配列（GenBank Accession No. NC_005791）（Hendrickson, E. L. et al. 2004. J. Bacteriol. 186: 6956-6969）の塩基番号1462535〜1466397に位置するporCDABEFオペロンにコードされている（Lin, W. C. et al. 2003. Arch. Microbiol. 179: 444-456）。このピルビン酸シンターゼは、γ、α、β、及びδの４つのサブユニットを含んでおり、これらのサブユニットに加えて、PorE及びPorFもピルビン酸シンターゼの活性に重要であることが知られている（Lin, W. and Whitman, W. B. 2004. Arch. Microbiol. 181: 68-73）。γサブユニットは、前記ゲノム配列の塩基番号1465867〜1466397（相補鎖）のporA遺伝子にコードされており、同遺伝子がコードするアミノ酸配列はGenBank Accession No. NP_988626に開示されている。δサブユニットは、前記ゲノム配列の塩基番号1465595〜1465852（相補鎖）porB遺伝子にコードされており、同遺伝子がコードするアミノ酸配列はGenBank Accession No. NP_988627に開示されている。αサブユニットは、前記ゲノム配列の塩基番号1464410〜1465573（相補鎖）のporC遺伝子にコードされており、同遺伝子がコードするアミノ酸配列はGenBank Accession No. NP_988625に開示されている。βサブユニットは、ゲノム配列の塩基番号1463497〜1464393（相補鎖）のporD遺伝子にコードされており、同遺伝子がコードするアミノ酸配列はGenBank Accession No. NP_988624に開示されている。PorEは、ゲノム配列の塩基番号1462970〜1463473（相補鎖）のporE遺伝子にコードされており、同遺伝子がコードするアミノ酸配列はGenBank Accession No. NP_988623に開示されている。PorFは、ゲノム配列の塩基番号1462535〜1462951（相補鎖）のporF遺伝子にコードされており、同遺伝子がコードするアミノ酸配列はGenBank Accession No. NP_988622に開示されている。
【０１０１】
独立栄養性のメタン生成古細菌のメタノカルドコッカス・ジャナスチ（Methanocaldococcus jannaschii）、メタノサーモバクター・サーマトトロフィカス（Methanothermobacter thermautotrophicus）なども同じ遺伝子構造のピルビン酸シンターゼ遺伝子を有していることが知られており、これらを利用することが可能である。
【０１０２】
本発明における「ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼ」とは、アセチル-CoAとCO2からピルビン酸を生成する下記の反応を、電子供与体存在下、例えばＮＡＤＰＨあるいはＮＡＤＨ存在下で可逆的に触媒する酵素（EC 1.2.1.15）を意味する。ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼは、ＰＮＯと略称されることもあり、ピルビン酸デヒドロゲナーゼと命名されている場合もある。しかしながら、本発明において「ピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性」というときは、後述するように、ピルビン酸を酸化的に脱炭酸し、アセチル-CoAを生成する反応を触媒する活性であり、この反応を触媒するピルビン酸デヒドロゲナーゼ（PDH）は、ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼとは別の酵素である。ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼは、電子供与体としては、ＮＡＤＰＨあるいはＮＡＤＨを用いることが出来る。
【０１０３】
ＮＡＤＰＨ + アセチル-CoA + CO2 → ＮＡＤＰ+ + ピルビン酸 + CoA
【０１０４】
ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼの活性が増強されたことの確認は、増強前の微生物と、増強後の微生物より粗酵素液を調製し、そのピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼ活性を比較することにより達成される。ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼの活性は、例えば、Inuiらの方法（Inui, H. et al. 1987. J. Biol. Chem. 262: 9130-9135）に従って測定できる。例えば、電子受容体としての酸化型メチルビオロゲンとCoAと粗酵素液を含む反応液に、ピルビン酸を添加した際にピルビン酸の脱炭酸反応によって増大する還元型メチルビオロゲンの量を分光学的に測定することによって、測定可能である。酵素活性１ユニット（U）は１分間あたり１μmolのメチルビオロゲンの還元量で表される。親株がピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼ活性を有している場合、親株と比較して、好ましくは1.5倍以上、より好ましくは2倍以上、さらに好ましくは3倍以上酵素活性が上昇していることが望ましい。また親株がピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼ活性を有していない場合には、ピルビン酸シンターゼ遺伝子を導入することにより、ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼが生成されていればよいが、酵素活性が測定できる程度に強化されていることが好ましく、好ましくは0.001U/mg（菌体タンパク質）以上、より好ましくは0.005U/mg以上、さらに好ましくは0.01U/mg以上が望ましい。ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼは、酸素に対して感受性であり、一般的に活性発現や測定は困難であることも多い（Inui, H. et al. 1987. J. Biol. Chem. 262: 9130-9135; Rotte, C. et al. 2001. Mol. Biol. Evol. 18: 710-720）。
【０１０５】
ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼをコードする遺伝子は、光合成真核微生物で原生動物にも分類されるユーグレナ・グラシリス（Euglena gracilis）のピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼ遺伝子（Nakazawa, M. et al. 2000. FEBS Lett. 479:
155-156）、原生生物クリプトスポルジウム・パルバム（Cryptosporidium parvum）のピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼ遺伝子（Rotte, C. et al. 2001. Mol. Biol.
Evol. 18: 710-720）の他、珪藻タラシオシラ・スードナナ（Tharassiosira pseudonana）にも相同な遺伝子が存在することが知られている（Ctrnacta, V. et al. 2006. J. Eukaryot. Microbiol. 53: 225-231）。
【０１０６】
具体的には、ユーグレナ・グラシリス（Euglena gracilis）のピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼ遺伝子として、GenBank Accession No. AB021127に示す塩基配列を有する遺伝子が挙げられる。同遺伝子がコードするアミノ酸配列はGenBank Accession No. BAB12024に開示されている。
【０１０７】
本発明の微生物は、ピルビン酸シンターゼの活性に必要な電子供与体の酸化型を還元型にリサイクルする活性が、親株、例えば野生株や非改変株と比べて増大するように改変することによって、ピルビン酸シンターゼの活性が増大するように改変された微生物でもよい。電子供与体の酸化型を還元型にリサイクルする活性としては、フェレドキシン-ＮＡＤＰ+レダクターゼ活性を挙げることができる。また、電子供与体のリサイクル活性の増強に加えて、ピルビン酸シンターゼ活性が増大するように改変することによって、ピルビン酸シンターゼの活性が増大するように改変された微生物でもよい。なお、上記親株は、本来内在的に電子供与体のリサイクル活性をコードする遺伝子を有しているものであってもよいし、本来は電子供与体のリサイクル活性を有さないが、当該活性をコードする遺伝子を導入することにより活性が付与され、Ｌ-アミノ酸生産能が向上するものであってもよい。
【０１０８】
「フェレドキシン-ＮＡＤＰ+レダクターゼ」とは、以下の反応を可逆的に触媒する酵素（EC 1.18.1.2）をいう。
【０１０９】
還元型フェレドキシン + NADP+ → 酸化型フェレドキシン + NADPH + H+
【０１１０】
本反応は、可逆反応であり、ＮＡＤＰＨと酸化型フェレドキシン存在下で、還元型フェレドキシンを産生することが可能である。フェレドキシンはフラボドキシンと代替可能でありフラボドキシン-ＮＡＤＰ+レダクターゼと命名されているものも同等の機能を有する。フェレドキシン-ＮＡＤＰ+レダクターゼは微生物から高等生物まで幅広く存在が確認されており（Carrillo, N. and Ceccarelli, E. A. 2003. Eur. J. Biochem. 270: 1900-1915; Ceccarelli, E. A. et al. 2004. Biochim. Biophys. Acta. 1698: 155-165参照）、フェレドキシン-ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼ、ＮＡＤＰＨ-フェレドキシンオキシドレダクターゼと命名されているものもある。
【０１１１】
フェレドキシン-ＮＡＤＰ+レダクターゼの活性が増強されたことの確認は、改変前の微生物と、改変後の微生物より粗酵素液を調製し、そのフェレドキシン-ＮＡＤＰ+レダクターゼ活性を比較することにより達成される。フェレドキシン-ＮＡＤＰ+レダクターゼの活性は、例えば、Blaschkowskiらの方法（Blaschkowski, H. P. et al. 1982. Eur. J. Biochem. 123: 563-569）に従って測定できる。例えば、基質としてフェレドキシンを用い、減少するNADPH量を分光学的に測定することによって測定可能である。酵素活性１ユニット（U）は１分間あたり１μmolのNADPHの酸化量で表される。親株がフェレドキシン-ＮＡＤＰ+レダクターゼ活性を有している場合、親株の活性が十分高ければ、増強する必要はないが、親株と比較して、好ましくは1.5倍以上、より好ましくは2倍以上、さらに好ましくは3倍以上酵素活性が上昇していることが望ましい。
【０１１２】
フェレドキシン-ＮＡＤＰ+レダクターゼをコードする遺伝子は、多くの生物種で見出されており、目的のＬ-アミノ酸生産株中で活性を有するものであれば使用することが可能である。エシェリヒア・コリではフラボドキシン-ＮＡＤＰ+レダクターゼとしてfpr遺伝子が同定されている（Bianchi, V. et al. 1993. J. Bacteriol. 175:1590-1595）。また、シュードモナス・プチダ(Psuedomonas putida)には、ＮＡＤＰＨ-プチダレドキシンレダクターゼ（Putidaredoxin reductase）遺伝子とプチダレドキシン（Putidaredoxin）遺伝子がオペロンとして存在することが知られている(Koga, H. et al. 1989. J. Biochem.
(Tokyo) 106: 831-836）。
【０１１３】
エシェリヒア・コリのフラボドキシン-ＮＡＤＰ+レダクターゼとしては、エシェリヒア・コリK-12株のゲノム配列（GenBank Accession No. U00096）の塩基番号4111749〜4112495（相補鎖）に位置する塩基配列を有するfpr遺伝子を例示することができる。Fprのアミノ酸配列は、GenBank Accession No. AAC76906に開示されている。また、コリネバクテリウム・グルタミカムのゲノム配列（GenBank Accession No. BA00036）の塩基番号2526234〜2527211にフェレドキシン-ＮＡＤＰ+レダクターゼ遺伝子が見出されている（GenBank Accession No. BAB99777）。
【０１１４】
ピルビン酸シンターゼの活性には、フェレドキシン又はフラボドキシンが電子供与体として存在することが必要である。従って、フェレドキシン又はフラボドキシンの産生能が向上するように改変することによって、ピルビン酸シンターゼの活性が増大するように改変された微生物であってもよい。
また、ピルビン酸シンターゼ活性、又は、フラボドキシン-ＮＡＤＰ+レダクターゼ及びピルビン酸シンターゼ活性が増強するように改変することに加えて、フェレドキシン又はフラボドキシンの産生能が向上するように改変してもよい。
【０１１５】
本発明における「フェレドキシン」とは、非ヘム鉄原子（Fe）と、硫黄原子を含み、4Fe-4S、3Fe-4S、あるいは、2Fe-2Sクラスターと呼ばれる鉄-硫黄クラスターを結合したタンパク質で1電子の伝達体として機能するものを指す。「フラボドキシン」とはFMN（Flavin-mononucleotide）を補欠分子属として含む1あるいは2電子の伝達体として機能するものタンパク質を指す。フェレドキシンとフラボドキシンについては、McLeanらの文献に記載されている（McLean, K. J. et al. 2005. Biochem. Soc. Trans. 33: 796-801）。
【０１１６】
なお、改変に用いる親株は、本来内在的にフェレドキシン又はフラボドキシンをコードする遺伝子を有しているものであってもよいし、本来はフェレドキシン又はフラボドキシン遺伝子を有さないが、フェレドキシン又はフラボドキシン遺伝子を導入することにより活性が付与され、Ｌ-アミノ酸生産能が向上するものであってもよい。
【０１１７】
フェレドキシン又はフラボドキシンの産生能が親株、例えば野生株や非改変株と比べて向上していることの確認は、フェレドキシン又はフラボドキシンのmRNAの量を野生型、あるいは非改変株と比較することによって確認できる。発現量の確認方法としては、ノーザンハイブリダイゼーション、RT-PCRが挙げられる（Sambrook, J. et al. 1989. Molecular CloningA Laboratory Manual/Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York）。発現量については、野生株あるいは非改変株と比較して、上昇していればいずれでもよいが、例えば野生株、非改変株と比べて1.5倍以上、より好ましくは2倍以上、さらに好ましくは3倍以上上昇していることが望ましい。
【０１１８】
また、フェレドキシン又はフラボドキシンの産生能が親株、例えば野生株や非改変株と比べて向上していることの確認は、SDS-PAGEや二次元電気泳動あるいは、抗体を用いたウェスタンブロットによって検出することが出来る（Sambrook, J. et al. 1989. Molecular Cloning A Laboratory Manual/Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York）。生産量については、野生株あるいは非改変株と比較して、向上していればいずれでもよいが、例えば野生株、非改変株と比べて1.5倍以上、より好ましくは2倍以上、さらに好ましくは3倍以上上昇していることが望ましい。
【０１１９】
フェレドキシン及びフラボドキシンの活性は、適切な酸化還元反応系に加えることで測定することが可能である。例えば、Boyerらにより、産生されたフェレドキシンをフェレドキシン-ＮＡＤＰ+レダクターゼにより還元し、生じた還元型フェレドキシンによるチトクロームCの還元を定量する方法が開示されている（Boyer, M. E. et al. 2006. Biotechnol. Bioeng. 94: 128-138）。また、フラボドキシンの活性は、フラボドキシン-ＮＡＤＰ+レダクターゼを用いることで、同じ方法で測定が可能である。
【０１２０】
フェレドキシン、又はフラボドキシンをコードする遺伝子は、広く分布しており、コードされるフェレドキシン又はフラボドキシンがピルビン酸シンターゼと電子供与体再生系が利用可能なものであれば、どのようなものでも用いることができる。例えば、エシェリヒア・コリには、2Fe-2Sクラスターを有するフェレドキシンをコードする遺伝子としてfdx遺伝子が存在し（Ta, D. T. and Vickery, L. E. 1992. J. Biol. Chem. 267:11120-11125）、4Fe-4Sクラスターを有するフェレドキシン遺伝子としてyfhL遺伝子が予想されている。また、フラボドキシン遺伝子としては、fldA遺伝子（Osborne, C. et al. 1991. J. Bacteriol. 173: 1729-1737）とfldB遺伝子（Gaudu, P. and Weiss, B. 2000. J. Bacteriol. 182:1788-1793）の存在が知られている。コリネバクテリウム・グルタミカムのゲノム配列（GenBank Accession No. BA00036）においては、塩基番号562643〜562963番に複数のフェレドキシン遺伝子fdx（GenBank Accession No. BAB97942）及び塩基番号1148953〜1149270番にfer（GenBank Accession No. BAB98495）が見出されている。また、クロロビウム・テピダムにおいては、多くのフェレドキシン遺伝子が存在するが、ピルビン酸シンターゼの電子受容体となる4Fe-4S型のフェレドキシン遺伝子としてフェレドキシンＩ及びフェレドキシンIIが同定されている（Yoon, K. S. et al. 2001. J. Biol. Chem. 276:
44027-44036）。ハイドロジェノバクター・サーモファイラス等、還元的ＴＣＡサイクルを持つ細菌由来のフェレドキシン遺伝子あるいはフラボドキシン遺伝子を用いることもできる。
【０１２１】
具体的には、エシェリヒア・コリのフェレドキシン遺伝子として、エシェリヒア・コリK-12株のゲノム配列（GenBank Accession No. U00096）の塩基番号2654770〜2655105番（相補鎖）に位置するfdx遺伝子、及び塩基番号2697685〜2697945番に位置するyfhL遺伝子を例示することができる。Fdx及びYfhLのアミノ酸配列は、それぞれ、GenBank Accession
No. AAC75578及びAAC75615に開示されている。エシェリヒア・コリのフラボドキシン遺伝子としては、エシェリヒア・コリK-12株のゲノム配列（GenBank Accession No. U00096）の塩基番号710688〜710158番（相補鎖）に位置するfldA遺伝子、及び塩基番号3037877〜3038398 番に位置するfldB遺伝子を例示することができる。fldA遺伝子及びfldB遺伝子がコードするアミノ酸配列は、それぞれ、GenBank Accession No. AAC73778及びAAC75933に開示されている。
【０１２２】
クロロビウム・テピダム(Chlorobium tepidum)のフェレドキシン遺伝子としては、クロロビウム・テピダムのゲノム配列（GenBank Accession No. NC_002932）の塩基番号1184078〜1184266番に位置するフェレドキシンＩ遺伝子、及び塩基番号1184476〜1184664番に位置するフェレドキシンII遺伝子を例示することができる。フェレドキシンＩ及びフェレドキシンIIのアミノ酸配列は、それぞれ、GenBank Accession No. AAM72491及びAAM72490に開示されている。また、ハイドロジェノバクター・サーモファイラス（Hydrogenobacter thermophilus）のフェレドキシン遺伝子（GenBank Accession No. BAE02673）やスルフォロバス・ソルファタリカス（Sulfolobus solfataricus）のゲノム配列中の塩基番号2345414〜2345728番で示されるスルフォロバス・ソルファタリカスのフェレドキシン遺伝子を例示することができる。さらに、上記で例示された遺伝子との相同性に基づいて、クロロビウム（Chlorobium）属、デスルホバクター（Desulfobacter）属、アクイフェクス（Aquifex）属、ハイドロジェノバクター（Hydrogenobacter）属、サーモプロテウス（Thermoproteus）属、パイロバキュラム（Pyrobaculum）属細菌等からクローニングされるものであってもよく、さらにはエンテロバクター属、クレブシエラ属、セラチア属、エルビニア属、エルシニア属等のγ-プロテオバクテリア、コリネバクテリウム・グルタミカム、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム等のコリネ型細菌、シュードモナス・アエルジノーサ等のシュードモナス属細菌、マイコバクテリウム・ツベルクロシス等のマイコバクテリウム属細菌等からクローニングされるものであってもよい。
また、本発明の微生物は、ピルビン酸シンターゼ、又はピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼの活性の増強に加えて、マリックエンザイムの活性が低下していることが好ましい。本発明の微生物がエシェリヒア属、エンテロバクター属、パントエア属、クレブシエラ属、又はセラチア属に属する細菌である場合は、特にマリックエンザイムの活性を低下させることが好ましい。
【０１２３】
本発明において、マリックエンザイムの活性とは、リンゴ酸を酸化的に脱炭酸し、ピルビン酸を生成する反応を可逆的触媒する活性を意味する。上記反応は、ＮＡＤＰを電子受容体とするＮＡＤＰ型マリックエンザイム（malate dehydrogenase (oxaloacetate-decarboxylating) (NADP+)とも表記される）（EC:1.1.1.40 b2463遺伝子（maeB遺伝子とも表記される））、あるいは、ＮＡＤを電子受容体とするＮＡＤ型マリックエンザイム（malate
dehydrogenase (oxaloacetate-decarboxylating) (NAD+) とも表記される）（EC:1.1.1.38 sfcA遺伝子（maeA遺伝子とも表記される））の２種の酵素によって触媒される。マリックエンザイム活性の確認は、Bolognaらの方法（Bologna, F. P. et al. 2007. J. Bacteriol. 2007 189: 5937-5946）に従って測定することができる。
【０１２４】
NADP-dependent malic enzyme : NADP+ + malate → NADPH + CO2 + pyruvate
NAD-dependent malic enzyme：NAD+ + malate → NADH + CO2 + pyruvate
【０１２５】
本発明においては、ＮＡＤＰ型マリックエンザイムとＮＡＤ型マリックエンザイムの両方の活性を低下させることがより好ましく、特に、本発明の微生物がエシェリヒア属、エンテロバクター属、パントエア属、クレブシエラ属、又はセラチア属に属する細菌である場合に、両方の型のマリックエンザイムの活性を低下させることが好ましい。
【０１２６】
また、本発明の微生物は、ピルビン酸シンターゼ、又はピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼの活性の増強に加えて、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性が低下していることが好ましい。
【０１２７】
本発明において、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（以下、「ＰＤＨ」ということがある）活性とは、ピルビン酸を酸化的に脱炭酸し、アセチル-CoA(acetyl-CoA)を生成する反応を触媒する活性を意味する。上記反応は、PDH（E1p：pyruvate dehydrogenase, EC:1.2.4.1、aceE遺伝子によってコードされる）、ジヒドロリポイルトランスアセチラーゼ（E2p：dihydrolipoyltransacetylase, EC:2.3.1.12、aceF遺伝子によってコードされる）、ジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼ（E3：dihydrolipoamide dehydrogenase; EC:1.8.1.4、lpdA遺伝子によってコードされる）の３種の酵素によって触媒される。すなわち、これらの３種類のサブユニットはそれぞれ以下の反応を触媒し、これら３つの反応を合わせた反応を触媒する活性をPDH活性という。PDH活性の確認は、VisserとStratingの方法（Visser, J. and Strating, M. 1982. Methods Enzymol. 89: 391-399）に従って測定することができる。
【０１２８】
E1p: pyruvate + [dihydrolipoyllysine-residue succinyltransferase] lipoyllysine
→ [dihydrolipoyllysine-residue acetyltransferase] S-acetyldihydrolipoyllysine + CO2
E2p：CoA + enzyme N6-(S-acetyldihydrolipoyl)lysine → acetyl-CoA + enzyme N6-(dihydrolipoyl)lysine
E3: protein N6-(dihydrolipoyl)lysine + NAD+ → protein N6-(lipoyl)lysine + NADH + H+
【０１２９】
また、本発明の細菌は、マレートシンターゼ・イソシトレートリアーゼ・イソシトレートデヒドロゲナーゼキナーゼ／フォスファターゼオペロン（aceオペロン）が構成的に発現するか、又は同オペロンの発現が強化されるように改変された菌株であってもよい。マレートシンターゼ・イソシトレートリアーゼ・イソシトレートデヒドロゲナーゼキナーゼ／フォスファターゼオペロン（aceオペロン）が構成的に発現するとは、aceオペロンのプロモーターが、リプレッサータンパク質であるiclRにより抑制を受けないこと、抑制が解除されていることを意味する。
【０１３０】
aceオペロンを構成的に発現していること、また同オペロンの発現が強化していることは、aceオペロンがコードするタンパク質であるマレートシンターゼ(aceB)、イソシトレートリアーゼ(aceA)、イソシトレートデヒドロゲナーゼキナーゼ／フォスファターゼ（aceK）の酵素活性が非改変株、あるいは野生株と比べて増大していることによって確認出来る。
【０１３１】
酵素活性の測定は、マレートシンターゼに関してはグリオキシル酸に依存するアセチルCoAのチオエステル結合の分解をA232の減少で測定する方法(Dixon,G.H.,Kornberg,H.L., 1960, Biochem.J, 1;41:p217-233）、イソシトレートリアーゼに関してはイソシトレートから生じるグリオキシル酸を２，４−ジニトロフェニルヒドラゾン誘導体として測定する方法(Roche,T.E..Williams J.O., 1970, Biochim.Biophys.Acta, 22;206(1):p193-195)、イソシトレートデヒドロゲナーゼキナーゼに関してはイソシトレートデヒドロゲナーゼに対するリン酸の脱着を32Pを使用して測定する方法（Wang, J.Y.J. and Koshland, D.E., Jr., 1982, Arch  Biochem. Biophys., 218, p59-67）などで確認出来る。
【０１３２】
抑制を解除するためには、例えば、aceオペロン上のリプレッサー（iclR）の結合部位を、iclRが結合できないように改変すればよい。また、同オペロンのプロモーターを、iclRによって発現抑制を受けない強力なプロモーター（lacプロモーターなど）に置換することによって、抑制を解除することもできる。
【０１３３】
また、iclR遺伝子の発現が低下又は欠失するように細菌を改変することによって、aceオペロンの発現を構成的にすることもできる。具体的には、iclRをコードする遺伝子の発現調節配列を同遺伝子が発現しないように改変するか、同リプレッサーの機能が失われるようにコード領域を改変することによって、aceオペロンの発現の抑制を解除することができる。
【０１３４】
＜１−２＞細胞内の過酸化水素濃度を低下させる方法
本発明の細菌の一形態である、Ｌ−アミノ酸生産能を有し、かつ細胞内の過酸化水素濃度が低下するように改変されている腸内細菌は、上述したようなＬ−アミノ酸生産能を有する腸内細菌を、細胞内の過酸化水素濃度が低下するように改変することによって取得できる。また、本発明の細菌は、細胞内の過酸化水素濃度が低下するように改変された細菌に、Ｌ−アミノ酸生産能を付与することによっても、取得できる。
【０１３５】
尚、「細胞内の過酸化水素濃度が低下する」とは、親株又は野生株等の非改変株に比べて過酸化水素の濃度が相対的に低下している場合、及び、細胞内に過酸化水素が実質的に存在しない場合の両方が含まれる。
【０１３６】
細菌を、細胞内の過酸化水素濃度が低下するように改変するには、例えば、oxyS遺伝子の発現を増強するか、電子伝達フラボタンパク質（ETF）の発現量を増大させるか、又はこれらの組合わせによって、行うことができる。
ETFの発現量を増大させるには、例えば、fixABCオペロンの発現を増強させることが挙げられる。
【０１３７】
「oxyS」とは腸内細菌群に豊富に発現している低分子RNAであるoxySをコードする遺伝子を意味する。oxySをコードする遺伝子としては、具体的には、エシェリヒア・コリのoxyS遺伝子として、エシェリヒア・コリのゲノム配列（GenBank Accession No. U00096）の塩基番号4,156,308〜4,156,417に位置する、配列番号９に示す塩基配列を有する遺伝子を例示することができる。
【０１３８】
本発明における「fixABC」とは、fixABCXオペロンのうち、少なくともfixA、fixB、及びfixCを含むものをいう。fixX遺伝子は含まれていなくてもよいが、含まれていてもよい。具体的には、エシェリヒア・コリのfixA遺伝子として、エシェリヒア・コリのゲノム配列（GenBank Accession No. U00096）の塩基番号42403〜43173に位置する、配列番号１０に示す塩基配列を有する遺伝子を例示することができる。配列番号１１には、同遺伝子がコードするアミノ酸配列を示した。
【０１３９】
fixBをコードする遺伝子としては、具体的には、エシェリヒア・コリのfixB遺伝子として、エシェリヒア・コリのゲノム配列（GenBank Accession No. U00096）の塩基番号43188〜44129に位置する、配列番号１２に示す塩基配列を有する遺伝子を例示することができる。配列番号１３には、同遺伝子がコードするアミノ酸配列を示した。
【０１４０】
fixCをコードする遺伝子としては、具体的には、エシェリヒア・コリのfixC遺伝子として、エシェリヒア・コリのゲノム配列（GenBank Accession No. U00096）の塩基番号44180〜45466に位置する、配列番号１４に示す塩基配列を有する遺伝子を例示することができる。配列番号１５には、同遺伝子がコードするアミノ酸配列を示した。
【０１４１】
「sodA」とは、腸内細菌群に存在するスーパーオキシドディスムターゼのうち、マンガンを補因子とするSodAをコードする遺伝子を意味する。sodAをコードする遺伝子としては、具体的には、エシェリヒア・コリのsodA遺伝子として、エシェリヒア・コリのゲノム配列（GenBank Accession No. U00096）の塩基番号4,098,833〜4,099,453に位置する、配列番号１６に示す塩基配列を有する遺伝子を例示することができる。配列番号１６の塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を配列番号１７に示す。
【０１４２】
また、oxyS遺伝子がコードするRNA、又はfixA遺伝子、fixB遺伝子、もしくはfixC遺伝子がコードするタンパク質は、これらの遺伝子の発現を増強したときに細胞内の過酸化水素濃度が低下する限り、それらのホモログや人為的改変体等、又は保存的変異を有するRNA又はタンパク質であってもよい。
【０１４３】
上記のようなホモログ、人為的改変体、又は保存的変異を有するRNA又はタンパク質を、保存的バリアントと記載する。
【０１４４】
fixA、fixB、又はfixC遺伝子がコードするタンパク質の保存的バリアントとしては、例えば配列番号１１、１３、又は１５のアミノ酸配列において、１若しくは数個の位置での１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加等を含む配列を有するタンパク質であってもよい。
【０１４５】
「１若しくは数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置やアミノ酸残基の種類によっても異なるが、具体的には好ましくは1〜20個、より好ましくは1〜10個、さらに好ましくは1〜5個を意味する。また、保存的変異の代表的なものは、保存的置換である。保存的置換とは、置換部位が芳香族アミノ酸である場合には、Phe、Trp、Tyr間で、置換部位が疎水性アミノ酸である場合には、Leu、Ile、Val間で、極性アミノ酸である場合には、Gln、Asn間で、塩基性アミノ酸である場合には、Lys、Arg、His間で、酸性アミノ酸である場合には、Asp、Glu間で、ヒドロキシル基を持つアミノ酸である場合には、Ser、Thr間でお互いに置換する変異である。保存的置換とみなされる置換としては、具体的には、AlaからSer又はThrへの置換、ArgからGln、His又はLysへの置換、AsnからGlu、Gln、Lys、His又はAspへの置換、AspからAsn、Glu又はGlnへの置換、CysからSer又はAlaへの置換、GlnからAsn、Glu、Lys、His、Asp又はArgへの置換、GluからGly、Asn、Gln、Lys又はAspへの置換、GlyからProへの置換、HisからAsn、Lys、Gln、Arg又はTyrへの置換、IleからLeu、Met、Val又はPheへの置換、LeuからIle、Met、Val又はPheへの置換、LysからAsn、Glu、Gln、His又はArgへの置換、MetからIle、Leu、Val又はPheへの置換、PheからTrp、Tyr、Met、Ile又はLeuへの置換、SerからThr又はAlaへの置換、ThrからSer又はAlaへの置換、TrpからPhe又はTyrへの置換、TyrからHis、Phe又はTrpへの置換、及び、ValからMet、Ile又はLeuへの置換が挙げられる。また、上記のようなアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、または逆位等には、遺伝子が由来する微生物の個体差、種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（mutant又はvariant）によって生じるものも含まれる。このようなタンパク質は、例えば、部位特異的変異法によって、コードされるタンパク質の特定の部位のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入または付加を含むように野生型fixA、fixB、又はfixC遺伝子の塩基配列を改変することによって取得することができる。
【０１４６】
さらに、上記のような保存的変異を有するタンパク質は、アミノ酸配列全体に対して、例えば80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、特に好ましくは99%以上の相同性を有し、かつ、野生型タンパク質と同等の機能を有するタンパク質であってもよい。尚、本明細書において、「相同性」（homology）」は、「同一性」（identity）を指すことがある。
【０１４７】
野生型fixA、fixB、又はfixCR遺伝子は、上記のようなアミノ酸配列をコードするものであれば、エシェリヒア・コリ、パントエア・アナナティス、及びエンテロバクター・アエロゲネス等の遺伝子に限らず、任意のコドンをそれと等価のコドンに置換したものであってもよい。
【０１４８】
また、野生型fixA、fixB、又はfixC遺伝子は、配列番号１０、１２、１４、１６、又は１８の相補配列又はその相補配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、配列番号１１、１３、又は１５のアミノ酸配列を有するタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするDNAであってもよい。ここで、「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。一例を示せば、相同性が高いDNA同士、例えば80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、特に好ましくは99%以上の相同性を有するDNA同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いDNA同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である60℃、1×SSC、0.1% SDS、好ましくは、0.1×SSC、0.1% SDS、さらに好ましくは、68℃、0.1×SSC、0.1% SDSに相当する塩濃度、温度で、１回、より好ましくは２〜３回洗浄する条件が挙げられる。
【０１４９】
プローブとしては、各遺伝子の相補配列の一部を用いることもできる。そのようなプローブは、公知の遺伝子配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、これらの塩基配列を含むDNA断片を鋳型とするPCRによって作製することができる。例えば、プローブとして、300 bp程度の長さのDNA断片を用いる場合には、ハイブリダイゼーションの洗いの条件は、50℃、2×SSC、0.1% SDSが挙げられる。
【０１５０】
上記した各タンパク質の保存的バリアント及びそれをコードする遺伝子に関する記載は、前記のＬ−アミノ酸生産菌について記載した他の遺伝子についても同様に適用される。
【０１５１】
oxyS遺伝子がコードするRNAの保存的バリアントとしては、配列番号１の相補配列又はその相補配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、細胞内の過酸化水素濃度を低下させ得るRNAが挙げられる。「ストリンジェントな条件」は、前記と同様である。
さらに、oxyS遺伝子がコードするRNAの保存的バリアントは、塩基配列全体に対して、例えば80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、特に好ましくは99%以上の相同性を有し、かつ、細胞内の過酸化水素濃度を低下させ得るRNAであってもよい。
【０１５２】
上記のようなRNA又はタンパク質の保存的バリアントをコードする遺伝子も、野生型遺伝子の「保存的バリアント」である。
【０１５３】
以下、細胞内の過酸化水素濃度を低下させる改変について、具体的に説明する。尚、oxyS遺伝子の発現増強、及びfixABC遺伝子の発現増強は、任意の順で行うことができる。
【０１５４】
＜１−２−１＞遺伝子の発現増強
以下に、目的遺伝子の発現を増強する方法について説明する。これらの方法は、前記のＬ−アミノ酸生産菌について記載した遺伝子についても、適用することができる。
【０１５５】
１つ目の方法は、目的遺伝子のコピー数を高める方法である。例えば、目的遺伝子を適当なベクター上にクローニングし、得られたベクターを用いて宿主細菌を形質転換することにより、該遺伝子のコピー数を高めることができる。
形質転換に用いるベクターとしては、使用する微生物で自律複製可能なプラスミドが挙げられる。例えば、腸内細菌群に属する微生物の中で自律複製可能なプラスミドとして、pUC19、pUC18、pBR322、RSF1010、pHSG299、pHSG298、pHSG399、pHSG398、pSTV28、pSTV29（pHSG、pSTVはタカラバイオ社より入手可能）、pMW119、pMW118、pMW219、pMW218（pMWはニッポンジーン社より入手可能）等が挙げられる。なお、プラスミドの代わりにファージDNAをベクターとして用いてもよい。
【０１５６】
形質転換法としては、例えば、エシェリヒア・コリ K-12について報告されているような、受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してDNAの透過性を増す方法（Mandel, M. and Higa, A.,J. Mol. Biol. 1970, 53, 159-162）、及び、電気パルス法（特開平2-207791号公報）等が挙げられる。
【０１５７】
遺伝子のコピー数を高めることは、目的遺伝子を微生物の染色体DNA上に多コピー導入することによっても達成できる。微生物の染色体DNA上に遺伝子を多コピーで導入するには、染色体DNA上に多コピー存在する配列を標的に利用して、相同組換え法（MillerI, J.
H. Experiments in Molecular Genetics, 1972, Cold Spring Harbor Laboratory）により行うことができる。染色体DNA上に多コピー存在する配列としては、レペティティブDNA、転移因子の端部に存在するインバーテッド・リピートが利用できる。あるいは、特開平2-109985号公報に開示されているように、目的遺伝子をトランスポゾンに搭載してこれを転移させて染色体DNA上に多コピー導入することも可能である。さらに、Muファージを用いる方法（特開平2-109985号）で宿主染色体に目的遺伝子を組み込むこともできる。染色体上に目的遺伝子が転移したことの確認は、その遺伝子の一部をプローブとして、サザンハイブリダイゼーションを行うことによって確認出来る。
【０１５８】
尚、遺伝子のコピー数を高める場合、目的遺伝子の産物の活性を増強できれば、コピー数は特に制限されないが、微生物がもともと目的遺伝子を有している場合は、２以上であることが好ましい。また、微生物が本発明の遺伝子をもともと有していない場合は、導入される遺伝子のコピー数は１であってもよいが、２以上であってもよい。
【０１５９】
２つ目の方法は、染色体DNA上またはプラスミド上において、目的遺伝子のプロモーター等の発現調節配列を適切な強さのものに置換することによって目的遺伝子の発現を増強させる方法である。例えば、thrプロモーター、lacプロモーター、trpプロモーター、trcプロモーター、pLプロモーター、tacプロモーター等がよく用いられるプロモーターとして知られている。プロモーターの強度の評価法および強力なプロモーターの例は、GoldsteinとDoiの論文（Goldstein, M. A. and Doi R. H. 1995. Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1, 105-128）等に記載されている。
【０１６０】
また、国際公開WO00/18935に開示されているように、遺伝子のプロモーター領域に数塩基の塩基置換を導入し、適切な強度のものに改変することも可能である。発現調節配列の置換は、例えば、温度感受性プラスミドを用いた遺伝子置換と同様にして行うことができる。エシェリヒア・コリや、パントエア・アナナティスに用いることが出来る、温度感受性複製起点を有するベクターとしては、例えばWO 99/03988号国際公開パンフレットに記載の温度感受性プラスミドpMAN997やその誘導体等が挙げられる。また、λファージのレッド・リコンビナーゼ（Red recombinase）を利用した「Redドリブンインテグレーション(Red-driven integration)」と呼ばれる方法（Datsenko, K. A. and Wanner, B. L., 2000. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97: 6640-6645）や、Redドリブンインテグレーション法とλファージ由来の切り出しシステム（Cho, E. H. et al. Bacteriol. 184: 5200-5203 (2002)）とを組合わせた方法（WO2005/010175号参照）等の直鎖状ＤＮＡを用いる方法によっても、発現調節配列の置換を行うことができる。なお、発現調節配列の改変は、上述したような遺伝子のコピー数を高める方法と組み合わせてもよい。
【０１６１】
さらに、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）と開始コドンとの間のスペーサ、特に開始コドンのすぐ上流の配列における数個のヌクレオチドの置換がmRNAの翻訳効率に非常に影響を及ぼすことが知られており、これらを改変することによって、翻訳量を向上させることが可能である。
【０１６２】
oxyS遺伝子、又はfixABC遺伝子の発現が親株、例えば野生株や非改変株と比べて向上していることの確認は、これらの遺伝子のmRNAの量を野生型、あるいは非改変株と比較することによって確認出来る。発現量の確認方法としては、ノーザンハイブリダイゼーション法、RT-PCR法が挙げられる（Molecular cloning（Cold spring Harbor Laboratory Press,Cold spring Harbor(USA),2001））。発現量については、野生株あるいは非改変株と比較して、上昇していればいずれでもよいが、例えば野生株、非改変株と比べて１．５倍以上、より好ましくは２倍以上、さらに好ましくは３倍以上上昇していることが望ましい。
【０１６３】
fixA、fixB、及びfixCの各々の遺伝子の発現は、別個に増強してもよく、ポリシストロンとして同時に増強してもよい。また、遺伝子をベクターを用いて微生物に導入する場合、各サブユニットをコードする遺伝子は、単一のベクター分子に同時に担持させてもよく、異なるベクター分子に別個に担持させてもよい。また、遺伝子を染色体に挿入する場合も、各サブユニットをコードする遺伝子は、染色体上の同一部位に同時に挿入してもよく、異なる位置に別個に挿入してもよい。
【０１６４】
＜１−２−２＞遺伝子の発現低下
目的遺伝子の発現の低下は、野生型RNA又は野生型タンパク質が発現しないように染色体上の目的遺伝子を改変すること、例えば目的遺伝子を破壊することによって取得することができる。このような遺伝子破壊を行う方法としては、例えば「Redドリブンインテグレーション(Red-driven integration)」と呼ばれる方法（Datsenko, K. A, and Wanner, B. L. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97:6640-6645 (2000)）や、Redドリブンインテグレーション法とλファージ由来の切り出しシステム（Cho, E. H., Gumport, R. I., Gardner, J. F. J. Bacteriol. 184: 5200-5203 (2002)）とを組合わせた方法（WO2005/010175号参照）等の直鎖状DNAを用いる方法や、温度感受性複製起点を含むプラスミド、接合伝達可能なプラスミドを用いる方法、宿主内で複製起点を持たないスイサイドベクターを利用する方法などがある（米国特許第6303383号明細書、または特開平05-007491号公報）。
【０１６５】
＜２＞Ｌ−アミノ酸の製造法
本発明の方法は、Ｌ−アミノ酸生産能を有する腸内細菌科に属する細菌を、脂肪酸及びアルコールから選ばれる炭素源を含む培地で培養し、該培地からＬ−アミノ酸を採取する、Ｌ−アミノ酸の製造法であって、前記細菌の細胞内の過酸化水素濃度を低下させることを特徴とする方法である。
【０１６６】
細菌の細胞内の過酸化水素濃度を低下させるには、例えば、細胞内の過酸化水素濃度が低下するように改変された細菌を用いること、及び、細菌の細胞内の過酸化水素濃度を低減させる物質を培地に添加することが挙げられる。
【０１６７】
すなわち、本発明の方法には、
Ｌ−アミノ酸生産能を有する腸内細菌科に属する細菌を、脂肪酸及びアルコールから選ばれる炭素源を含む培地で培養し、該培地からＬ−アミノ酸を採取する、Ｌ−アミノ酸の製造法であって、前記細菌は、細胞内の過酸化水素濃度が低下するように改変されていることを特徴とする方法、及び
Ｌ−アミノ酸生産能を有する腸内細菌科に属する細菌を、脂肪酸及びアルコールから選ばれる炭素源を含む培地で培養し、該培地からＬ−アミノ酸を採取する、Ｌ−アミノ酸の製造法であって、前記培地は細菌の細胞内の過酸化水素濃度を低減させる物質を含むことを特徴とする方法を含む。
また、本発明の方法は、細菌が細胞内の過酸化水素濃度が低下するように改変されていることに加えて、細菌の細胞内の過酸化水素濃度を低減させる物質が培地に含まれていてもよい。
【０１６８】
細菌の細胞内の過酸化水素濃度を低減させる物質としては、過酸化水素の不均化反応を触媒する物質が挙げられる。そのような物質としては、例えば、チオ尿素等が挙げられる。
【０１６９】
脂肪酸とは、一般式 CnHmCOOH（n+1、m+1は、それぞれ、脂肪酸に含まれる炭素数、水素数を表す）で表わすことができる長鎖炭化水素の１価のカルボン酸を指す。一般的に炭素数が12以上のものを長鎖脂肪酸と呼ぶことが多い。脂肪酸は、その炭素数と不飽和度によって様々な種類が存在する。また、脂肪酸は、油脂の構成成分であり、油脂の種類によって脂肪酸の組成も異なることが知られている。ミリスチン酸（C13H27COOH）は炭素数14の飽和脂肪酸であり、ヤシ油、パーム油に含まれる。パルミチン酸（C15H31COOH）は炭素数16の飽和脂肪酸であり、植物油脂一般に多く含まれる。ステアリン酸（C17H35COOH）は、炭素数18の飽和脂肪酸であり、動物性脂肪・植物性油に多く含まれる。オレイン酸（C17H33COOH）は、炭素数18の一価の不飽和脂肪酸であり、動物性脂肪や植物油に多く含まれる。リノール酸（C17H31COOH）は炭素数18で9位と12位にシス型二重結合を2つ持っている多価不飽和脂肪酸である。脂肪酸としては、上記の長鎖脂肪酸の混合物を用いることも出来る。脂肪酸の混合物を炭素源として用いる場合、脂肪酸の混合比率は、本発明の方法に使用する細菌が炭素源として資化できる濃度比率であればいずれでもかまわない。油脂の加水分解物から、グリセロールを除いた脂肪酸の混合物を利用することも可能である。
【０１７０】
アルコールとしては、グリセロール、エタノール、ブタノール、プロパノール、脂肪族アルコール、芳香族アルコール等が挙げられる。
グリセロールは、正式名称Propane-1,2,3-triolである物質を指す。グリセロールは、純粋なグリセロールであってもよいが、粗グリセロールであってもよい。粗グリセロールとは、工業的に生産される不純物を含むグリセロールをいう。粗グリセロールは、油脂を高温、高圧下で水と接触させ加水分解することによって、あるいは、バイオディーゼル燃
料生産のためのエステル化反応によって、工業的に生産される。バイオディーゼル燃料とは、油脂とメタノールからエステル交換反応により生成する脂肪酸メチルエステルのことであり、この反応の副生物として粗グリセロールが生成する（Fukuda, H., Kondo, A., and Noda, H. 2001, J. Biosci. Bioeng. 92, 405-416を参照のこと）。バイオディーゼル燃料生産プロセスでは、エステル交換にはアルカリ触媒法が用いられることが多く、中和時に酸を加えるため、水と不純物を含んだ純度７０〜９５重量％程度の粗グリセロールが生成する。バイオディーゼル燃料生産において産生される粗グリセロールは、水に加えて、残存メタノールや触媒であるNaOH等のアルカリとその中和に用いられるK2SO4等の酸との塩を不純物として含んでいる。メーカーや製法により差はあるが、このような塩類やメタノールは数パーセントに達する。ここでナトリウム、カリウム、塩化物イオン、硫酸イオン等の、アルカリやその中和に用いられた酸に由来するイオン類は、粗グリセロールの重量に対し、2〜7％、好ましくは3〜6%、さらに好ましくは4〜5.8%含まれていることが好ましい。メタノールは、不純物として含まれていなくてもよいが、望ましくは0.01%以下含まれていることが好ましい。
【０１７１】
さらに、粗グリセロール中には、微量の金属、有機酸、リン、脂肪酸などを含むことがある。含まれる有機酸としては、蟻酸、酢酸等が挙げられ、不純物として含まれていなくてもよいが、望ましくは0.01%以下含まれていることが好ましい。粗グリセロールに含まれる微量の金属としては、微生物の生育に必要な微量金属が好ましく、例えばマグネシウム、鉄、カルシウム、マンガン、銅、亜鉛等が挙げられる。マグネシウム、鉄、カルシウムは、粗グリセロールの重量に対し、合計で0.00001〜0.1%、好ましくは0.0005〜0.1%、より好ましくは0.004〜0.05％、さらに好ましくは0.007〜0.01%含まれていることが好ましい。マンガン、銅、亜鉛としては、合計で0.000005〜0.01%、より好ましくは0.000007〜0.005%、さらに好ましくは0.00001〜0.001%含まれていることが好ましい。
【０１７２】
粗グリセロールのグリセロールの純度としては１０％以上であればよく、好ましくは５０％以上であり、さらに好ましくは７０％以上、特に好ましくは８０％以上である。不純物の含有量が上記の範囲を満たす限り、グリセロールの純度は９０％以上であってもよい。
粗グリセロールを用いる場合は、グリセロールの純度に応じて、グリセロールの量として上記濃度となるように粗グリセロールを培地に添加すればよい。また、グリセロール及び粗グリセロールの両方を培地に添加してもよい。
【０１７３】
炭素源は、油脂の加水分解物であってもよい。脂肪酸及び／又はグリセロールを含む限り、油脂の加水分解物を含む培地は、「脂肪酸又はアルコールを含む培地」に相当する。
油脂は、脂肪酸とグリセロールのエステルであり、トリグリセリド（triglyceride）とも呼ばれる。油脂としては、加水分解反応が可能であれば、常温で液体のものを指す脂肪油（oil）、固体のものを指す脂肪（fat）など、どのようなものも使用することが出来る。また、動物由来（魚類を含む）油脂と植物由来油脂のすべてが使用可能であり、１種または２種以上を組み合わせて使用することも出来る。原料として用いる油脂は、純粋な油脂であってもよいし、油脂以外の物質を含む混合物であってもよい。例えば、油脂が植物由来のものである場合は、油脂を含む植物抽出物又はその分画物が挙げられる。
【０１７４】
動物油脂として、バター、豚脂、牛脂、羊脂等、クジラ油、イワシ油、ニシン油等をあげることができる。植物油脂としては、パーム油、オリーブ油、菜種油、大豆油、米糠油、クルミ油、ゴマ油、ピーナッツ油等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。パーム油はアブラヤシの果実からとれる油脂であり、近年バイオディーセル（biodiesel）燃料としての利用が盛んになり、生産量が高まっている。アブラヤシ（oil palm）は、ヤシ科アブラヤシ属（Elaeis）に分類される植物の総称である。粗パーム油（crude palm oil）は、一般的に搾油工場で生産される未精製のパーム油を指し、粗パーム油として取引が行われている。また、微細藻類にも油脂を蓄積するものが知られており（Chisti, Y. 2007. Biotechnol Adv. 25: 294-306）、藻体から抽出することも可能である。藻体内には油脂以外にも糖類、タンパク質、アミノ酸などの有機物が含まれているが、これらを含む混合物を加水分解して炭素源として用いても構わない。
【０１７５】
油脂としては、加水分解により生じる脂肪酸種が、本発明の方法に使用する細菌が炭素源として資化できるものであり、それらの含量がより高い油脂が望ましい。Ｌ−アミノ酸生産能を有する細菌が資化できる長鎖の脂肪酸種としては、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸などが挙げられる。
【０１７６】
油脂の加水分解物とは、上記油脂を化学的あるいは酵素により加水分解したものを指し、脂肪酸とグリセロールの混合物を指す。工業的な加水分解法としては、高温（250-260℃）、高圧（5-6MPa）下で油脂と水を交流接触させる連続高温加水分解法が一般的に行われている。また、酵素を用いて低温（30℃前後）で反応を行うことも工業的に行われている（Jaeger, K. E. et al. 1994. FEMS Microbiol. Rev. 15: 29-63）。前記酵素としては、油脂の加水分解反応を触媒する酵素リパーゼを用いることが出来る。リパーゼは工業的に重要な酵素であり、様々な産業的利用がなされている（Hasan, F. etal. 2006. Enzyme and Microbiol. Technol. 39: 235-251）。油脂の加水分解物は、脂肪酸とグリセロールの混合物であり、パーム油等の一般的な油脂の加水分解物に含まれる脂肪酸に対するグリセロールの重量比は10%程度であることが知られている。油脂の加水分解物としては、脂肪酸及び／又はグリセロールを含む限り特に制限されない。例えば、油脂の加水分解物をそのまま用いることも出来るが、脂肪酸、グリセロールの一部を除いて使うことも可能であるし、脂肪酸やグリセロールを加えて使用することも出来る。この時のグリセロールの脂肪酸に対する重量比は、好ましくは5〜20：100、より好ましくは7.5〜15：100である。
【０１７７】
なお、脂肪酸の濃度は、ガスクロマトグラフィ（Hashimoto, K. et al. 1996. Biosci.Biotechnol. Biochem. 70:22-30）やHPLC（Lin, J. T. et al. 1998. J. Chromatogr. A.
808: 43-49）により測定することが可能である。
【０１７８】
培地に加える脂肪酸、または油脂の加水分解物に含まれる脂肪酸は、水にミセル化するナトリウムやカリウムなどとのアルカリ金属塩として用いることが望ましい。しかしながら、脂肪酸のナトリウム塩やカリウム塩の溶解度も発酵原料として用いるのには十分ではない場合がある。そこで、Ｌ−アミノ酸生産能を有する細菌が炭素源として脂肪酸をより効率よく資化できるようにするために、乳化を行う等、均一化を促進する工程を加えることが好ましい。例えば乳化方法として、乳化促進剤や界面活性剤を加える等が考えられる。ここで乳化促進剤としては、リン脂質やステロールが挙げられる。また界面活性剤としては、非イオン界面活性剤では、ポリ（オキシエチレン）ソルビタンモノオレイン酸エステル（Tween 80）などのポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、n-オクチルβ-D-グルコシドなどのアルキルグルコシド、ショ糖ステアリン酸エステルなどのショ糖脂肪酸エステル、ポリグリセリンステアリン酸エステルなどのポリグリセリン脂肪酸エステル等が挙げられる。両性イオン界面活性剤としては、アルキルベタインであるN,N-ジメチル-N-ドデシルグリシンベタインなどが挙げられる。これ以外にも、トライトンX-100（Triton X-100）、ポリオキシエチレン(20)セチルエーテル（Brij-58）やノニルフェノールエトキシレート（Tergitol NP-40）等の一般的に生物学の分野で用いられる界面活性剤が利用可能である。
【０１７９】
さらに、脂肪酸の乳化や均一化を促進するための操作も有効である。この操作は、脂肪酸の乳化や均一化を促進する操作であれば、どのような操作でも構わない。具体的には、ホモジナイザー処理、ホモミキサー処理、超音波処理、高圧処理、高温処理などが挙げら
れるが、ホモジナイザー処理、超音波処理およびこれらの組合せがより好ましい。
【０１８０】
上記界面活性剤による処理と、ホモジナイザー処理及び／または超音波処理を組み合わせることが特に好ましく、これらの処理は、脂肪酸がより安定なアルカリ条件下で行われることが望ましい。アルカリ条件としては、pH9以上が望ましく、より望ましくはpH10以上である。
【０１８１】
本発明の方法で使用する培地に含まれる、脂肪酸、又はアルコールの量は、本発明の方法に使用する細菌が炭素源として資化できる限り幾らでもよいが、培地中に単独の炭素源として添加する場合、１０w/v%以下、好ましくは５w/v%以下、さらに好ましくは２w/v%以下含まれることが好ましい。また、培地中に単独の炭素源として添加する場合、０．２w/v%以上、好ましくは０．５w/v%以上、さらに好ましくは１．０w/v%以上含まれていることが望ましい。
【０１８２】
さらに、本発明の方法に使用する培地には、脂肪酸、又はアルコールに加え、他の炭素源を添加してもよい。好ましいのは、グルコース、フラクトース、スクロース、ラクトース、ガラクトース、廃糖蜜、澱粉加水分解物やバイオマスの加水分解により得られた糖液などの糖類、フマール酸、クエン酸、コハク酸等の有機酸類である。なお他の炭素源を用いる場合には、炭素源中の脂肪酸、又はアルコールの比率が１０重量％以上、好ましくは３０重量％以上、より好ましくは５０重量％以上であることが好ましい。なお、シュクロース資化能を持たない株については、シュクロース資化遺伝子を導入することにより、シュクロースを炭素源として使用できるようになる（米国特許第5,175,107号）。
【０１８３】
また、流加培地として使用する場合は、流加培地に単独の炭素源として添加する場合、流加後の培地中の濃度が５w/v%以下、好ましくは２w/v%以下、さらに好ましくは１w/v%以下で含まれることが好ましい。また、流加培地に単独の炭素源として添加する場合、０．０１w/v%以上、好ましくは０．０２w/v%以上、さらに好ましくは０．０５w/v%以上の量にて制御することが好ましい。
【０１８４】
なお、本発明において、脂肪酸又はアルコールは、培養の全工程において一定濃度含まれてもよいし、流加培地のみあるいは初発培地のみに添加されていてもよく、その他の炭素源が充足していれば、一定時間脂肪酸及び／又はアルコールが不足している期間があってもよい。一定時間とは、例えば発酵全体の時間のうち１０％、２０％、最大で３０％の時間で脂肪酸及び／又はアルコールが不足していてもよい。このように一時的に脂肪酸及び／又はアルコールの濃度が０になることがあっても、脂肪酸又はアルコールを含む培地での培養期間が存在する場合は、本発明の「脂肪酸又はアルコールを含む培地で培養する」との文言に含まれる。
【０１８５】
培地中に添加する炭素源以外の成分としては、窒素源、無機イオン及び必要に応じその他の有機成分を用いることができる。本発明の培地中に含まれる窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、ウレア等のアンモニウム塩または硝酸塩等が使用することができ、pH調整に用いられるアンモニアガス、アンモニア水も窒素源として利用できる。また、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、麦芽エキス、コーンスティープリカー、大豆加水分解物等も利用出来る。培地中にこれらの窒素源が１種のみ含まれていてもよいし、２種以上含まれてもよい。これらの窒素源は、初発培地にも流加培地にも用いることができる。また、初発培地、流加培地とも、同じ窒素源を用いてもよいし、流加培地の窒素源を初発培地の窒素源と変更してもよい。
【０１８６】
本発明の培地には、炭素源、窒素源の他にリン酸源、硫黄源が含まれていることが好ま
しい。リン酸源としては、リン酸２水素カリウム、リン酸水素２カリウム、ピロリン酸などのリン酸ポリマー等が利用出来る。また、硫黄源とは、硫黄原子を含んでいるものであればいずれでもよいが、硫酸塩、チオ硫酸塩、亜硫酸塩等の硫酸塩、システイン、シスチン、グルタチオン等の含硫アミノ酸が望ましく、なかでも硫酸アンモニウムが望ましい。
【０１８７】
また、培地には、上記成分の他に、増殖促進因子（増殖促進効果を持つ栄養素）が含まれていてもよい。増殖促進因子とは、微量金属類、アミノ酸、ビタミン、核酸、更にこれらのものを含有するペプトン、カザミノ酸、酵母エキス、大豆たん白分解物等が使用できる。微量金属類としては、鉄、マンガン、マグネシウム、カルシウム等が挙げられ、ビタミンとしては、ビタミンB1、ビタミンB2、ビタミンB6、ニコチン酸、ニコチン酸アミド、ビタミンB12等が挙げられる。これらの増殖促進因子は初発培地に含まれていてもよいし、流加培地に含まれていてもよい。
【０１８８】
また、生育にアミノ酸などを要求する栄養要求性変異株を使用する場合には、培地に要求される栄養素を補添することが好ましい。Ｌ-リジン生産菌は、後述のようにＬ-リジン生合成経路が強化されており、Ｌ-リジン分解能が弱化されているものが多いので、Ｌ-スレオニン、Ｌ-ホモセリン、Ｌ-イソロイシン、Ｌ-メチオニンから選ばれる１種又は２種以上を添加することが望ましい。初発培地と流加培地は、培地組成が同じであってもよく、異なっていてもよい。また、初発培地と流加培地は、硫黄濃度が同じであってもよく、異なっていてもよい。さらには、流加培地の流加が多段階で行われる場合、各々の流加培地の組成は同じであってもよく、異なっていてもよい。
【０１８９】
培地に細菌の細胞内の過酸化水素濃度を低減させる物質を添加する場合、同物質は、培養の全工程において含まれてもよいし、流加培地のみあるいは初発培地のみに添加されていてもよい。前記物質の培地中の濃度は、0.01mMから25mMで加えることが望ましい。
【０１９０】
培養は、発酵温度２０〜４５℃、特に好ましくは３３〜４２℃で通気培養を行うことが好ましい。ここで酸素濃度は、５〜５０％に、望ましくは１０％程度に調節して行う。また、ｐＨを５〜９に制御し、通気培養を行うことが好ましい。培養中にｐＨが下がる場合には、例えば、炭酸カルシウムを加えるか、アンモニアガス、アンモニア水等のアルカリで中和することができる。このような条件下で、好ましくは１０時間〜１２０時間程度培養することにより、培養液中に著量のＬ-アミノ酸が蓄積される。
【０１９１】
本発明においては、Ｌ-アミノ酸蓄積を一定以上に保つために、細菌の培養を種培養と本培養とに分けて行ってもよく、種培養をフラスコ等を用いたしんとう培養、又は回分培養で行い、本培養を流加培養、又は連続培養で行ってもよく、種培養、本培養ともに回分培養で行ってもよい。
【０１９２】
本発明において、流加培養あるいは、連続培養を行う際には、一時的に脂肪酸もしくはアルコール、またはその他の炭素源の流加が停止するように間欠的に流加培地を流加してもよい。また、流加を行う時間の最大で30％以下、望ましくは20％以下、特に望ましくは10％以下で流加培地の供給を停止することが好ましい。流加培養液を間欠的に流加させる場合には、流加培地を一定時間添加し、2回目以降の添加はある添加期に先行する添加停止期において発酵培地中の炭素源が枯渇するときのpH上昇または溶存酸素濃度の上昇がコンピューターで検出されるときに開始するように制御を行い、培養槽内の基質濃度を常に自動的に低レベルに維持してもよい（米国特許5,912,113号明細書）。
【０１９３】
流加培養に用いられる流加培地は、脂肪酸又はアルコールとその他の炭素源及び増殖促進効果を持つ栄養素（増殖促進因子）を含む培地が好ましく、発酵培地中の脂肪酸濃度が一定以下になるように制御してもよい。
流加培地に加えるその他の炭素源としては、グルコース、スクロース、フルクトースが好ましく、増殖促進因子としては、窒素源、リン酸、アミノ酸等が好ましい。窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、ウレア等のアンモニウム塩または硝酸塩等を使用することができる。またリン酸源としては、リン酸２水素カリウム、リン酸水素２カリウムが使用でき、アミノ酸としては、栄養要求性変異株を使用する場合には要求される栄養素を補添することが好ましい。また、流加培地は１種でもよく、２種以上の培地を混合してもよい。２種以上の流加培地を用いる場合、それらの培地は混合して１つのフィード缶により流加させてもよいし、複数のフィード缶で流加させてもよい。
【０１９４】
本発明で連続培養法を用いる場合には、引き抜きは流加と同時に行ってもよいし、一部引き抜いたあとで流加を行ってもよい。また培養液をＬ-アミノ酸と細胞を含んだまま引き抜いて、細胞だけ発酵槽に戻す菌体を再利用する連続培養法でもよい（フランス特許2669935号明細書参照）。連続的あるいは間欠的に栄養源を流加する方法は流加培養と同様の方法が用いられる。
【０１９５】
菌体を再利用する連続培養法とは、予定したアミノ酸濃度に達したときに、発酵培地を間欠的にあるいは連続して引き抜き、Ｌ-アミノ酸のみを取り出し、菌体を含むろ過残留物を発酵槽中に再循環させる方法であり、例えばフランス特許2669935号明細書を参照にして実施することができる。
【０１９６】
ここで、培養液を間欠的に引き抜く場合には、予定したＬ-アミノ酸濃度に到達したときに、Ｌ-アミノ酸を一部引き抜いて、新たに培地を流加して培養を行うとよい。また、添加する培地の量は、最終的に引き抜く前の培養液量と同量になるように設定することが好ましい。ここで同量とは、引き抜く前の培養液量と９３〜１０７％の程度の量を意味する。
【０１９７】
培養液を連続的に引き抜く場合には、栄養培地を流加させると同時に、あるいは流加させたあとに引き抜きを開始することが望ましく、例えば引き抜き開始時間としては流加を始めてから5時間以内、望ましくは3時間以内、さらに望ましくは1時間以内である。また引き抜く培養液量としては、流加させる量と同量で引き抜くことが好ましい。
【０１９８】
また、Ｌ−リジン等の塩基性アミノ酸を製造する際には、培養中のｐＨが６．５〜９．０、培養終了時の培地のｐＨが７．２〜９．０となるように制御し、培地中の重炭酸イオン及び／又は炭酸イオンが少なくとも２０ｍＭ以上存在する培養期があるようにし、前記重炭酸イオン及び／又は炭酸イオンを塩基性アミノ酸のカウンタイオンとする方法で発酵し、目的の塩基性アミノ酸を回収する方法で製造を行ってもよい（特開2002-65287、US2002-0025564A、EP 1813677A）。
【０１９９】
塩基性アミノ酸を生産する能力を有する微生物を培地中で好気培養するに際して、炭酸イオンもしくは重炭酸イオン又はこれらの両方を、塩基性アミノ酸の主なカウンタイオンとして利用することができる。塩基性アミノ酸のカウンタイオンとして必要な量の重炭酸イオン及び／又は炭酸イオンを培地中に存在させる方法としては、培養中の培地のｐＨが６．５〜９．０、好ましくは６．５〜８．０、培養終了時の培地のｐＨが７．２〜９．０となるように制御し、さらに、発酵中の発酵槽内圧力が正となるように制御するか、又は、炭酸ガスもしくは炭酸ガスを含む混合ガスを培地に供給することが知られている（特開2002-65287、米国特許出願公開第20020025564号、EP1813677A）。
【０２００】
本発明においては、発酵中の発酵槽内の圧力が正となるように制御すること、及び、炭酸ガスもしくは炭酸ガスを含む混合ガスを培地に供給することの両方を行ってもよい。い
ずれの場合も、培地中の重炭酸イオン及び／又は炭酸イオンが、好ましくは20mM以上、より好ましくは30mM以上、特に好ましくは40mM以上存在する培養期があるようにすることが好ましい。発酵槽内圧力、炭酸ガス又は炭酸ガスを含む混合ガスの供給量、又は制限された給気量は、例えば培地中の重炭酸イオン又は炭酸イオンを測定することや、pHやアンモニア濃度を測定することによって、決定することができる。
【０２０１】
上記態様においては、培養中の培地のｐＨが６．０〜９．０、好ましくは６．５〜８．０、培養終了時の培地のｐＨが７．２〜９．０となるように制御する。上記態様によれば、従来の方法に比べて、カウンタイオンとして必要な量の重炭酸イオン及び／又は炭酸イオンを培地中に存在させるための培地のpHを低く抑えることが可能となる。アンモニアでｐＨを制御する場合、ｐＨを高めるためにアンモニアが供給され、塩基性アミノ酸のＮ源となり得る。培地に含まれる塩基性アミノ酸以外のカチオンとしては、培地成分由来のＫ、Ｎａ、Ｍｇ、Ｃａ等が挙げられる。これらは、好ましくは総カチオンの５０％以下であることが好ましい。
【０２０２】
また、発酵中の発酵槽内圧力が正となるようにするには、例えば、給気圧を排気圧より高くすればよい。発酵槽内圧力を正にすることによって、発酵により生成する炭酸ガスが培養液に溶解し、重炭酸イオン又は炭酸イオンを生じ、これらは塩基性アミノ酸のカウンタイオンとなり得る。発酵槽内圧力として具体的には、ゲージ圧（大気圧に対する差圧）で、０．０３〜０．２ＭＰａ、好ましくは０．０５〜０．１５ＭＰａ、さらに好ましくは０．１〜０．３ＭＰａが挙げられる。また、培養液に炭酸ガス、又は炭酸ガスを含む混合ガスを供給することによって、培養液に炭酸ガスを溶解させてもよい。さらには、培養液に炭酸ガス又は炭酸ガスを含む混合ガスを供給しつつ、発酵槽内圧力が正となるように調節してもよい。
【０２０３】
発酵槽内圧力を正に調節するには、例えば、給気圧を排気圧よりも高くするように設定すればよい。また、培養液に炭酸ガスを供給する場合は、例えば、純炭酸ガス、又は炭酸ガスを５体積％以上含む混合ガスを吹き込めばよい。
【０２０４】
尚、培地に重炭酸イオン及び／又は炭酸イオンを溶解させる上記の方法は、単独でもよいし、複数を組み合わせてもよい。
【０２０５】
従来法では、通常、生成する塩基牲アミノ酸のカウンタアニオンとすべく、十分量の硫酸アンモニウムや塩化アンモニウムが、又、栄養成分として蛋白等の硫酸分解物もしくは塩酸分解物が培地に添加され、これらから与えられる硫酸イオン、塩化物イオンが培地に含まれる。従って、弱酸性である炭酸イオン濃度は培養中極めて低く、ppm単位である。上記態様では、これら硫酸イオン、塩化物イオンを減じ、微生物が発酵中に放出する炭酸ガスを上記発酵環境にて培地中に溶解せしめ、カウンタイオンとすることに特徴がある。したがって、上記態様においては、硫酸イオンや塩化物イオンを生育に必要な量以上培地に添加する必要はない。好ましくは、培養当初は硫酸アンモニウム等を培地に適当量フィードし、培養途中でフィードを止める。あるいは、培地中の炭酸イオン又は重炭酸イオンの溶存量とのバランスを保ちつつ、硫酸アンモニウム等をフィードしてもよい。また、塩基性アミノ酸の窒素源として、アンモニアを培地にフィードしてもよい。アンモニアは、単独で、又は他の気体とともに培地に供給することができる。
【０２０６】
培地に含まれる重炭酸イオン及び／又は炭酸イオン以外の他のアニオンの濃度は、微生物の生育に必要な量であれば、低いことが好ましい。このようなアニオンには、塩化物イオン、硫酸イオン、リン酸イオン、イオン化した有機酸、及び水酸化物イオン等が挙げられる。これらの他のイオンのモル濃度の合計は、好ましくは通常は９００ｍＭ以下、より好ましくは７００ｍＭ以下、特により好ましくは５００ｍＭ以下、さらに好ましくは３０
０ｍＭ以下、特に好ましくは２００ｍＭ以下である。
【０２０７】
上記態様においては、硫酸イオン、及び／又は、塩化物イオンの使用量を削減することが目的の一つであり、培地に含まれる硫酸イオンもしくは塩化物イオン、又はこれらの合計は、通常、７００ｍＭ以下、好ましくは５００ｍＭ以下、より好ましくは３００ｍＭ以下、さらに好ましくは２００ｍＭ以下、特に好ましくは１００ｍＭ以下である。
【０２０８】
通常は、塩基性アミノ酸のカウンタイオン源として培地に硫酸アンモニウムを添加すると、硫酸イオンによって培養液中の炭酸ガスが放出してしまう。それに対して、上記態様においては、過剰量の硫酸アンモニウムを培地に添加する必要がないので、炭酸ガスを発酵液中に容易に溶解させることができる。
【０２０９】
また、上記態様においては、「塩基性アミノ酸の生産を阻害しない」程度に培地中の総アンモニア濃度を制御することが好ましい。そのような条件としては、例えば、最適な条件において塩基性アミノ酸を生産する場合の収率及び／又は生産性に比べて、好ましくは５０％以上、より好ましくは７０％以上、特に好ましくは９０％以上の収率及び／又は生産性が得られる条件が含まれる。具体的には、培地中の総アンモニア濃度としては、好ましくは３００ｍＭ以下、より好ましくは２５０ｍＭ、特に好ましくは２００ｍＭ以下の濃度が挙げられる。アンモニアの解離度はｐＨが高くなると低下する。解離していないアンモニアは、アンモニウムイオンよりも菌に対して毒性が強い。そのため、総アンモニア濃度の上限は、培養液のｐＨにも依存する。すなわち、培養液のｐＨが高いほど、許容される総アンモニア濃度は低くなる。したがって、前記「塩基性アミノ酸の生産を阻害しない」総アンモニア濃度は、ｐＨ毎に設定することが好ましい。しかし、培養中の最も高いｐＨにおいて許容される総アンモニア濃度範囲を、培養期間を通じての総アンモニア濃度の上限値範囲としてもよい。
【０２１０】
一方、微生物の生育及び塩基性物質の生産に必要な窒素源としての総アンモニア濃度としては、培養中にアンモニアが継続して枯渇しない窒素源が不足することにより微生物による目的物質の生産性を低下させない限り特に制限されず、適宜設定することができる。例えば、培養中にアンモニア濃度を経時的に測定し、培地中のアンモニアが枯渇したら少量のアンモニアを培地に添加してもよい。アンモニアを添加したときの濃度としては、特に制限されないが、例えば、総アンモニア濃度として好ましくは１ｍＭ以上、より好ましくは１０ｍＭ以上、特に好ましくは２０ｍＭ以上の濃度が挙げられる。
【０２１１】
発酵液からのＬ−アミノ酸の回収は通常イオン交換樹脂法（Nagai,H.et al., Separation Science and Technology, 39(16),3691-3710）、沈殿法、膜分離法（特開平9-164323号、特開平9-173792号）、晶析法(WO2008/078448、WO2008/078646）、その他の公知の方法を組み合わせることにより実施できる。なお、菌体内にＬ−アミノ酸が蓄積する場合には、例えば菌体を超音波などにより破砕し、遠心分離によって菌体を除去して得られる上清からイオン交換樹脂法などによって、Ｌ−アミノ酸を回収することができる。
【０２１２】
尚、回収されるＬ−アミノ酸は、Ｌ−アミノ酸以外に細菌菌体、培地成分、水分、及び細菌の代謝副産物を含んでいてもよい。採取されたＬ−アミノ酸の純度は、50％以上、好ましくは85％以上、特に好ましくは95%以上である (JP1214636B, USP 5,431,933, 4,956,471, 4,777,051, 4946654, 5,840,358, 6,238,714, US2005/0025878))。
【０２１３】
また、Ｌ−アミノ酸が培地中に析出する場合は、遠心分離又は濾過等により回収することができる。また、培地中に析出したＬ−アミノ酸は、培地中に溶解しているＬ−アミノ酸を晶析した後に、併せて単離してもよい。
【実施例】
【０２１４】
以下、本発明を実施例により更に具体的に説明する。
〔実施例１〕脂肪酸を唯一の炭素源とする最少培地でのエシェリヒア・コリの培養と菌体内過酸化水素濃度の測定
【０２１５】
エシェリヒア・コリMG1655(ATCC 47076)にプラスミドpTWV228(タカラバイオ社製)を常法に従い導入して得られたMG1655/pTWV228株を、50mg/Lのアンピシリンを含むＬ培地にて終OD600≒0.6となるように37℃にて培養した後、培養液と等量の40％グリセロール溶液を加えて攪拌した後、適当量ずつ分注し-80℃に保存した。これをグリセロールストックと呼ぶ。
【０２１６】
MG1655/pTWV228株のグリセロールストックをエーゼで1ループ掻き取り、M9グルコース寒天培地上に塗布した後、24時間静置培養した。生育した細胞を掻き取り、0.85% NaCl水溶液にけん濁して、M9オレイン酸ナトリウム試験管用液体培地またはM9グルコース試験管用液体培地10mLを入れたL字試験管に、波長600nmの濁度が0.02となるように植菌した。恒温振とう培養装置TN-2612(アドバンテック社製)を用いて、37℃、70rpmの条件で連続44時間培養を行なった。濁度の測定は分光光度計U-2000（日立社製）を用いた（以下、同様）。
上記培地の組成を以下に示す。濃度単位は全て終濃度を示す。
【０２１７】
〔M9グルコース寒天培地組成〕
グルコース                           2g/L
Na2HPO4                              6g/L
KH2PO4                               3g/L
NaCl                                 0.5g/L
NH4Cl                                1g/L
MgSO4・7H2O                          0.246g/L
チアミン                             0.5mg/L
寒天                                 15g/L
【０２１８】
〔M9オレイン酸ナトリウム試験管用液体培地組成〕
オレイン酸ナトリウム（純正化学社製） 1g/L
Tween 80*（ナカライテスク社製）       0.5%(v/v)
Na2HPO4                              6g/L
KH2PO4                               3g/L
NaCl                                 0.5g/L
NH4Cl                                1g/L
MgSO4・7H2O                          0.246g/L
チアミン                             0.5mg/L
＊：ポリ（オキシエチレン）ソルビタンモノオレイン酸エステル
【０２１９】
〔M9グルコース試験管用液体培地組成〕
グルコース                             1g/L
Tween 80（ナカライテスク社製）       0.5%(v/v)
Na2HPO4                              6g/L
KH2PO4                               3g/L
NaCl                                 0.5g/L
NH4Cl                                1g/L
MgSO4・7H2O                          0.246g/L
チアミン                             0.5mg/L
【０２２０】
培養途中、適量の液体培地をサンプリングし、適宜希釈してLB培地にまいて生菌数の測定を行い、波長600nmの濁度を測定した。また、液体培地中の菌体の過酸化水素濃度を下記文献に従って測定した。BEATRIZ GONZALEZ-FLECHA と BRUCE DEMPLE著JOURNAL OF BACrERIOLOGY, 1994, Vol. 176, p. 2293-2299、文献Ken-ichi Setsukinaiら著THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, 2003  ,Vol. 278,  p. 3170-3175。
【０２２１】
具体的には、前記の培養液を400μL分取し、13800×g、4℃の条件で2分間遠心して集菌した菌体から上清360μLを除き、pH7.3 100mM リン酸緩衝液を360μL加えてけん濁し、10分間静置した後、13800×g、4℃の条件で2分間遠心して得られた上清10μLをサンプリングして96穴プレート上で190μLの下記(i)または(ii)の反応液を加えた。
反応液(i) Horseradish Peroxidase（終濃度2μM和光純薬工業製）、蛍光発色基質HPF  10μM（積水メディカル製）、リン酸緩衝液（終濃度100mM、pH7.3）
反応液(ii) カタラーゼ（終濃度2μM和光純薬工業製）、蛍光発色基質HPF  10μM（積水メディカル製）、リン酸緩衝液（終濃度100mM、pH7.3）
【０２２２】
96穴プレート上で反応液を暗所、37℃の条件で75分間処理し、励起波長490nmで励起して得られた515nmの蛍光を測定し、反応液(i)が示した蛍光から反応液(ii)が示した蛍光を差し引くことにより、菌体内の過酸化水素濃度を測定した。
【０２２３】
エシェリヒア・コリが界面活性剤Tween80を資化できないことは、M9最小培地にTween80を添加した培地を用いて別途確認した。培地中に添加したグルコースを全て消費したことをバイオテックアナライザーAS310を用いて別途確認した。また、培地中に添加したオレイン酸を全て消費したことを、ガスクロマトグラフィGC-2014(Shimadzu社製)を用いて別途確認した。
【０２２４】
培養結果を図１〜３に示す。図１〜３からわかるように、MG1655/pTWV228株が示す1以下の波長600nmの濁度と生菌数には、高い正の相関関係が見られた。また、M9オレイン酸ナトリウム試験管用液体培地で培養したMG1655/pTWV228株は、M9グルコース試験管用液体培地で培養したMG1655/pTWV228株と比較して有意に高い菌体内過酸化水素濃度を示した。この培養結果により、グルコースを資化した場合と比較して、脂肪酸を資化した場合に、エシェリヒア・コリにはより大きな過酸化水素を中心とする酸化ストレスがかかっていると推察された。
【０２２５】
〔実施例２〕脂肪酸を唯一の炭素源とする最少培地での過酸化水素排出を促進したエシェリヒア・コリの培養と菌体内過酸化水素濃度の測定
（１）oxyS遺伝子増幅エシェリヒア・コリの構築
oxyS遺伝子の増幅について、脂肪酸を炭素源とした培養でのエシェリヒア・コリの生育に寄与する効果を確認するために、oxySを増幅するためのプラスミドを構築した。配列番号１及び２に示した塩基配列の合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて、エシェリヒア・コリMG1655株の染色体ＤＮＡを鋳型としてPCRを行った。精製したＰＣＲ産物を、SalIで消化したベクターpTWV228（タカラバイオ社製）に連結して、oxyS増幅用プラスミドpTWV228-oxySを構築した。
【０２２６】
MG1655株にプラスミドpTWV228-oxySを常法に従い導入して得られたMG1655/pTWV228-oxyS株を、50mg/Lのアンピシリンを含むＬ培地にて終OD600≒0.6となるように37℃にて培養した後、グリセロールストックを作製して保存した。グリセロールストックは、培養液と等量の40％グリセロール溶液を加えて攪拌した後、適当量ずつ分注し-80℃で保存したものである（以下、同様）。
【０２２７】
（２）sodA遺伝子増幅エシェリヒア・コリの構築
配列番号９に示したsodA遺伝子の増幅について、脂肪酸を炭素源とした培養でのエシェリヒア・コリの生育に寄与する効果を確認するために、sodAを増幅するためのプラスミドを構築した。配列番号３及び４に示した塩基配列の合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて、エシェリヒア・コリMG1655株の染色体ＤＮＡを鋳型としてPCRを行った。精製したＰＣＲ産物を、HindIII、SalIで消化したベクターpTWV229（タカラバイオ社製）に連結して、sodA増幅用プラスミドpTWV229-sodAを構築した。
【０２２８】
MG1655株にpTWV229-sodAを導入して、MG1655/pTWV229-sodA株を構築した。MG1655/pTWV228-sodA株を50mg/Lのアンピシリンを含eむＬ培地にて終OD600≒0.6となるように37℃にて培養した後、MG1655/pTWV229-sodA株のグリセロールストックを作製して保存した。
【０２２９】
（３）sodA遺伝子増幅株を脂肪酸を炭素源とする培地で培養したときの過酸化水素濃度の測定
MG1655/pTWV228株、MG1655/pTWV228-oxyS株、MG1655/pTWV229-sodA株のグリセロールストックをそれぞれエーゼで1ループ掻き取り、M9グルコース寒天培地上に塗布した後、24時間静置培養した。生育した細胞を掻き取り、0.85% NaCl水溶液にけん濁して、前述のM9オレイン酸ナトリウム試験管用液体培地またはM9グルコース試験管用液体培地10mLを入れたL字試験管に、波長600nmの濁度が0.02となるように植菌した。恒温振とう培養装置TN-2612(アドバンテック社製)を用いて、37℃、70rpmの条件で連続44時間培養を行なった。
【０２３０】
培養途中、適量の液体培地をサンプリングし、適宜希釈して、波長600nmの濁度を測定した。また、波長600nmの濁度が0.6程度となる対数増殖期の液体培地中の菌体の過酸化水素濃度を前述の方法にて測定した。
【０２３１】
培養に用いたエシェリヒア・コリが界面活性剤Tween80を資化できないことは、M9最小培地にTween80を添加した培地を用いて別途確認した。培地中に添加したグルコースを全て消費したことをバイオテックアナライザーAS310を用いて別途確認した。また、培地中に添加したオレイン酸を全て消費したことを、ガスクロマトグラフィGC-2014(Shimadzu社製)を用いて別途確認した。
【０２３２】
培養結果を図４〜７に示す。図４〜７からわかるように、オレイン酸を炭素源とする培養において、oxyS増幅により菌体内過酸化水素濃度の有意な低減と生育の有意な向上が見られた。また、sodA増幅により菌体内過酸化水素濃度の有意な増加と生育の有意な悪化が見られた。
【０２３３】
〔実施例３〕oxyS発現増強株によるＬ−リジン生産
＜１＞Ｌ−リジン生産菌へのoxyS発現増強プラスミドの導入
oxyS遺伝子増幅のＬ−リジン生産能に寄与する効果を確認するために、米国特許出願公開第2006/0160191号公報に記載の方法で構築したＬ−リジン生産菌WC196ΔcadAΔldcC/pCABD2株に、実施例２で作製したpTWV228-oxySを導入して、WC196ΔcadAΔldcC/pCABD2,pTWV228-oxyS株を構築した。WC196ΔcadAΔldcC（「WC196LC」とも記載する）株は、エシェリヒア・コリWC196のリジンデカルボキシラーゼ遺伝子cadA及びldcCを、Red-driven integration法（Datsenko, K. A. and Wanner, B. L., 2000. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97: 6640-6645）とλファージ由来の切り出しシステム（Cho, E. H., Gumport, R. I., Gardner, J. F. J. Bacteriol. 184: 5200-5203 (2002)）とを組合わせた方法（WO2005/010175号参照）により、破壊した株である。この株に、pCABD2を導入したのがWC196ΔcadAΔldcC/pCABD2（WC196LC/pCABD2）株である。pCABD2は、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が解除された変異を有するE. coli由来のジヒドロジピコリン酸合成酵素（DDPS）をコードする変異型dapA遺伝子と、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が解除された変
異を有するE. coli由来のアスパルトキナーゼIIIをコードする変異型lysC遺伝子と、E. coli由来のジヒドロジピコリン酸レダクターゼをコードするdapB遺伝子と、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム由来ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼをコードするddh遺伝子を含んでいる。WC196LC/pCABD2,pTWV228-oxyS株を、20mg/Lのストレプトマイシンと50mg/Lのアンピシリンを含むＬ培地にて終OD600≒0.6となるように37℃にて培養した後、グリセロールストックを作製し、-80℃で保存した。
【０２３４】
＜２＞oxyS発現を増強したＬ−リジン生産菌の脂肪酸を炭素源とするＬ−リジン生産能の評価
前記グリセロールストックを融解し、各100μLを、20 mg/Lのストレプトマイシンと50mg/Lのアンピシリンを含むLプレートに均一に塗布し、37℃にて24時間静置培養した。得られたプレートのおよそ1/4量の菌体を、0.5mLの生理食塩水にけん濁し、波長600nmの濁度を測定した。得られた菌を含むけん濁液を、500 mL容バッフル付三角フラスコの、20 mg/Lのストレプトマイシンを含む発酵培地（下記に示す）の40 mLに、波長600nmの濁度が0.2になる液量で接種し、ロータリー振とう培養装置InnOva 4430 (New Brunswick Scientific社製)で回転攪拌数200rpm、37℃において48時間培養した。
【０２３５】
本培養における炭素源としては、オレイン酸ナトリウムを用い、乳化促進剤としてTween 80を終濃度0.5%（v/v）となるように添加したものを用いた。総炭素源量は10g/Lとした。エシェリヒア・コリがTween80を資化できないことは、M9最小培地にTween80を添加した培地を用いて別途確認した。
【０２３６】
上記の条件で、48時間培養を行い、培地中に蓄積したＬ−リジンの量をバイオテックアナライザーAS310（サクラ精機社製）を用いて測定した。また、培地中に添加したオレイン酸を全て消費したことを、ガスクロマトグラフィGC-2014(Shimadsu社製)を用いて確認した。さらに、培養終了直後にTween80溶液を終濃度1.0%（v/v）となるように添加して、適宜希釈して波長600nmの濁度を測定することにより、培養終了時の菌体量を測定した。
また、培養終了時に、培地中の菌体の過酸化水素濃度を前述の方法にて測定した。培地中の生菌数については波長600nmの濁度が１の培養液1mL中に109 個細胞のエシェリヒア・コリの菌体が存在するという一般的な概算に基づいて推定した。
【０２３７】
WC196LCpCABD2にpTWV228を導入して得た株WC196LC/pCABD2,pTWV228株についても、同様の培養を行った。
【０２３８】
本培養に用いたオレイン酸を炭素源とする発酵培地の組成を以下に示す（単位g/Lおよび%(volume/volume換算)全て終濃度を示す）。
【０２３９】
〔オレイン酸を炭素源とする発酵培地〕
オレイン酸ナトリウム（純正化学社製  一級品）  10 g/L
Tween 80                                      0.5 %
MgSO4・7H2O                                   1 g/L
PIPES                                         20g/L
(NH4)2SO4                                     16 g/L 
KH2PO4                                        1 g/L
FeSO4・7H2O                                   0.01 g/L
MnSO4・7H2O                                   0.082 g/L
Yeast Extract（Difco社製）                    2 g/L
オレイン酸ナトリウムは、HClでpH7.5に調整し、115℃で10分オートクレーブした。
Tween 80は、Nalgene 0.45μmフィルター(Nalgene社製)でフィルター滅菌した。
MgSO4・7H2Oは、115℃で10分オートクレーブした。
PIPESは、NaOHでpH7.5に調整し、115℃で10分オートクレーブした。
上記以外の成分は、それらを混合した後 KOHでpH7.5に調整し、115℃で10分オートクレーブした。
上記のように各成分を５つの区に分けて別殺菌した後、それらを混合した。
【０２４０】
培養結果のＬ−リジン蓄積とオレイン酸に対する収率、菌体濁度(OD)、及び菌体内過酸化水素濃度を表１に示す。表１から分かるように、WC196LC/pCABD2,pTWV228-oxyS株は、oxyS遺伝子の発現を増強しないWC196LC/pCABD2,pTWV228株と比較して、有意に高い生育の向上とＬ−リジン生産を示した。また、WC196LC/pCABD2,pTWV228-oxyS株は、oxyS遺伝子の発現を増強しないWC196LC/pCABD2,pTWV228株と比較して、有意に低い菌体内科酸化水素濃度を示した。
【０２４１】
【表１】
2014036576.tif 000003
【０２４２】
〔実施例４〕fixABCオペロン発現増強株によるＬ−リジン生産
＜１＞fixABCオペロン増幅株の構築
配列番号５及び６に示したプライマーを用いて、W3110株の染色体DNAを鋳型としたPCRを行い、fixABCオペロンを含むPCR産物を得た。得られたPCR産物と、SalIで消化したpTWV228ベクター（タカラバイオ社製）をIn-FusionTM Advantage PCRクローニングキット（クロンテック社製）を用いて連結し、fixABCオペロン増幅用プラスミドpTWV-fixABCを構築した。
【０２４３】
実施例３と同様にして、WC196LC/pCABD2株を、プラスミドpTWV-fixABC及び対照ベクターpTWV228で形質転換して、それぞれ、WC196LC/pCABD2/pTWV-fixABC及びWC196LC/pCABD2/pTWV228を得た。
【０２４４】
上記菌株を、50 mg/Lのアンピシリンと20 mg/Lのストレプトマイシンを含むLB培地にてOD600が約0.6となるまで37℃にて培養した後、培養液と等量の40%グリセロール溶液を加えて攪拌した後、適当量ずつ分注、-80℃に保存し、グリセロールストックとした。
【０２４５】
＜２＞fixABCオペロン増幅株によるＬ−リジン生産
前記fixABCオペロン増幅株のグリセロールストックを融解し、各100μLを、50 mg/Lのアンピシリンと20 mg/Lのストレプトマイシンを含むLBプレートに均一に塗布し、37℃にて24時間培養した。得られたプレートのおよそ1/4量の菌体を、1.0mLの生理食塩水にけん濁し、波長600nmの濁度を測定した。得られた菌を含むけん濁液を、500 mL容バッフル付三角フラスコの、50 mg/Lのアンピシリンと20 mg/Lのストレプトマイシンを含む実施例３に記載の発酵培地（但し、(NH4)2SO4は24g/Lに変更）40 mLに波長600nmの濁度が0.25になるような液量を接種し、ロータリー型培養装置Innova 4430 (New Brunswick Scientific社製)で攪拌速度200rpm、37℃において47時間培養した。
【０２４６】
47時間後に、培養上清のＬ−リジンの量をバイオテックアナライザーAS-310（サクラエ
スアイ株式会社）により測定した。また、培地中に添加したオレイン酸を全て消費したことを、ガスクロマトグラフィGC-2014(Shimadzu社製)を用いて別途確認した。さらに、培養終了直後にTween80溶液を終濃度1.0%（v/v）となるように添加して、適宜希釈して波長600nmの濁度を測定することにより、培養終了時の菌体量を測定した。さらに、培養終了時に培地中の菌体の過酸化水素濃度を前述の方法にて測定した。
培地中の生菌数については波長600nmの濁度が１の培養液1mL中に109 個細胞のエシェリヒア・コリの菌体が存在するという一般的な概算に基づいて推定した。
Ｌ−リジン蓄積、菌体濁度(OD)、及び菌体内過酸化水素濃度をを表２に示す。ベクターpTWV228を導入した対照株に対し、fixABCオペロン導入株は、有意に高いＬ-リジン生産を示した。また、ベクターpTWV228を導入した対照株に対し、fixABCオペロン導入株は、有意に低い菌体内過酸化水素濃度を示した。
【０２４７】
【表２】
2014036576.tif 000004
【０２４８】
〔実施例５〕エタノール資化性菌のfixABC発現増強株によるＬ−リジン生産
＜１＞WC196LC株へのエタノール資化性の付与
Ｌ−リジン生産菌にエタノール資化性を付与するため、変異型アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子（adhE*）の導入を行った。変異型アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子として、MG1655::PL-tacadhE*（WO2008/010565参照）由来の遺伝子を用いた。MG1655::PL-tacadhE*株は、クロラムフェニコール耐性遺伝子（cat）と、PL-tacプロモーターにより制御される変異型adhE遺伝子が連結したＤＮＡ断片を、エシェリヒア・コリMG1655株のゲノムに挿入して得た株である。前記変異型adhE遺伝子は、568位のグルタミン酸残基がリジンで置換された変異体をコードしている。この変異型アルコールデヒドロゲナーゼを保持するエシェリヒア・コリは、好気条件でエタノールを資化することができる。
【０２４９】
cat遺伝子をMG1655::PL-tacadhE*株のゲノムから除去できるようにするため、cat遺伝子を、ラムダファージのアタッチメントサイトとテトラサイクリン耐性遺伝子を連結したＤＮＡ断片（att-tet）へ置き換えた。
【０２５０】
cat遺伝子のatt-tet遺伝子への置き換えは、λ-red法（Datsenko, K. A. and Wanner, B. L., 2000. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97: 6640-6645）を用いた。cat遺伝子をatt-tet遺伝子で置換えるためのプライマーとして、配列番号７及び８の合成オリゴヌクレオチドを使用して行った。こうして、MG1655::PL-tacadhE*のcat遺伝子がatt-tet遺伝子に置き換えられたMG1655-att-tet-PL-tacadhE*株を得た。
【０２５１】
Ｌ-リジン生産菌にエタノール資化性を付与するため、MG1655-att-tet-PL-tacadhE*株から常法に従いP1ライセートを取得し、Ｌ−リジン生産菌WC196LC株を宿主としてP1形質導入法を用いて、WC196LC-att-tet-PL-tacadhE*株を得た。
次に、PL-tacプロモーター上流に導入されたatt-tet遺伝子を除去するために、ヘルパープラスミドpMW-intxis-ts(米国特許出願公開20060141586）を使用した。pMW-intxis-tsは、λファージのインテグラーゼ（Int）をコードする遺伝子、エクシジョナーゼ(Xis)をコードする遺伝子を搭載し、温度感受性の複製能を有するプラスミドである。
【０２５２】
上記で得られたWC196LC-att-tet-PL-tacadhE*株のコンピテントセルを常法に従って作製し、ヘルパープラスミドpMW-intxis-tsにて形質転換し、30℃で50 mg/Lのアンピシリンを含むLB寒天培地上にて平板培養し、アンピシリン耐性株を選択した。pMW-intxis-tsプラスミドを除去するために、LB寒天培地上、42℃で培養し、得られたコロニーのアンピシリン耐性、及びテトラサイクリン耐性を試験し、att-tet及びpMW-intxis-tsが脱落しているPL-tacadhE*導入株であるテトラサイクリン、アンピシリン感受性株を取得した。この株をWC196LC PL-tacadhE*株と名づけた。
【０２５３】
＜２＞WC196LC PL-tacadhE*株へのfixABC発現増強プラスミドpTWV228-fixABCおよびリジン生産用プラスミド(pCABD2)の導入
Ｌ−リジン生産菌WC196LC PL-tacadhE*株に、pCABD2を導入して、WC196LC PL-tacadhE*/pCABD2株を構築した。この株に、pTWV228およびpTWV-fixABCを導入し、WC196LC PL-tacadhE*/pCABD2,pTWV228-fixABC株、及びWC196LC PL-tacadhE*/pCABD2,pTWV228を得た。これらの株についてグリセロールストックを作製した。
【０２５４】
＜３＞fixABC発現増強株のエタノールからのＬ−リジン生産能の評価
前記の株のグリセロールストックを融解し、各100μLを、20mg/Lのストレプトマイシンを含むLプレートに均一に塗布し、37℃にて15時間培養した。得られた菌体を0.85%の食塩水に懸濁し、初発OD=0.25となるように、太試験管(内径18 mm)の、20mg/Lのストレプトマイシンと50mg/Lのアンピシリンを含む発酵培地の5 mLに接種し、往復振とう培養装置で、攪拌120rpmの条件下、37℃において培養した。
エタノールを炭素源とする発酵培地の組成を以下に示す。
【０２５５】
〔エタノール炭素源発酵培地〕
エタノール                           10 ml/L
(NH4)2SO4                            24 g/L
KH2PO4                               1.0 g/L
MgSO4・7H2O                          1.0 g/L
FeSO4・7H2O                          0.01 g/L
MnSO4・5H2O                          0.082 g/L
Yeast Extract(Difco社製)             2.0 g/L
CaCO3（日本薬局方）                  30 g/L
蒸留水                               最終量1L
(NH4)2SO4 、KH2PO4 、FeSO4・7H2O 、MnSO4・7H2O、 Yeast Extractはこれらを混合した後、KOHでpH5.7に調整し、115℃で10分オートクレーブを行った。MgSO4・7H2Oは別に殺菌し、エタノールはフィルターろ過により滅菌した。CaCO3は、180℃で２時間乾熱滅菌したものを培地に加えた。
【０２５６】
16時間培養後、20μLのエタノールを添加した。21時間培養後、培地中に蓄積したＬ−リジンの量をバイオテックアナライザーAS210（サクラ精機）を用いて測定し、培養液中のエタノール濃度をハイオセンサ（王子計測機器バイオセンサBF-5）を用いて測定した。fixABC発現増強株（WC196LC PL-tacadhE*/pCABD2,pTWV228-fixABC株）は対照株（WC196LC PL-tacadhE*/pCABD2,pTWV228株）と比較して、有意に高い生育の向上とＬ−リジン生産を示した。
【０２５７】
【表３】
2014036576.tif 000005
【０２５８】
〔実施例６〕培地に酸化防止剤チオ尿素を添加した条件でのＬ−リジン生産菌の脂肪酸を炭素源とするＬ−リジン生産能の評価
＜１＞前培養
Ｌ−リジン生産菌WC196LC/pCABD2株のグリセロールストックを、ストレプトマイシン20mg/Lを添加したLB寒天培地（トリプトン1%、酵母抽出液0.5%、塩化ナトリウム0.5%、アガロース1.5%）に１エーゼ植菌し、37℃で24時間、静地培養した。
【０２５９】
＜２＞全容1Lの小型発酵槽を用いた主培養
前述の前培養で生育した細胞を培地から掻き取り、0.85% NaCl水溶液にけん濁して、全容1Lの小型発酵槽を用いて、波長600nmの濁度が0.04となるように下記組成を有する300mlのMSグルコース液体発酵培地またはMS脂肪酸液体発酵培地に植菌し、培養を開始した。MSグルコース液体発酵培地においては、20mg/Lのストレプトマイシンを添加し、培養温度37℃、攪拌速度300rpmで、滅菌フィルターにより滅菌した圧縮空気を1vvm通気しながら、16時間培養した。また、pHはアンモニアガスで6.7に保持した。MS脂肪酸液体発酵培地においては、20mg/Lのストレプトマイシンを添加し、培養温度37℃、攪拌速度700rpmで、滅菌フィルターにより滅菌した圧縮空気を1vvm通気しながら、42時間培養した。また、pHはアンモニアガスで6.7に保持した。
【０２６０】
培養開始時に抗酸化物質として、チオ尿素を1mMまたは5mM添加して培養を行なった。また、比較対照として、チオ尿素を添加しない条件（チオ尿素無添加条件と呼ぶ）と、チオ尿素と同じ濃度の尿素を添加した条件（尿素添加条件と呼ぶ）で培養を行なった。
【０２６１】
培養途中、適量の液体培地をサンプリングし、培養上清のＬ−リジンの量をバイオテックアナライザーAS-310（サクラエスアイ株式会社）により測定した。また、培地中に添加したオレイン酸を全て消費したことを、ガスクロマトグラフィGC-2014(Shimadzu社製)を用いて別途確認した。また、培地中に添加したグルコースを全て消費したことをバイオテックアナライザーAS310を用いて別途確認した。さらに、培養終了直後にTween80溶液を終濃度1.0%（v/v）となるように添加して、適宜希釈して波長600nmの濁度を測定することにより、培養終了時の菌体量を測定した。
また、培養終了時に、培地中の菌体の過酸化水素濃度を前述の方法にて測定した。培地中の生菌数については、波長600nmの濁度が１の培養液1mL中に109 個細胞のエシェリヒア・コリの菌体が存在するという一般的な概算に基づいて推定した。
【０２６２】
〔MSグルコース液体発酵発酵培地〕
グルコース                                    10 g/L
Tween 80                                      0.5 %
MgSO4・7H2O                                   1 g/L
(NH4)2SO4                                     24 g/L 
KH2PO4                                        1 g/L
FeSO4・7H2O                                   0.01 g/L
MnSO4・7H2O                                   0.082 g/L
Yeast Extract（Difco社製）                    2 g/L
【０２６３】
〔MS脂肪酸液体発酵発酵培地〕
オレイン酸ナトリウム（純正化学社製  一級品）  10 g/L
Tween 80                                      0.5 %
MgSO4・7H2O                                   1 g/L
(NH4)2SO4                                     24 g/L 
KH2PO4                                        1 g/L
FeSO4・7H2O                                   0.01 g/L
MnSO4・7H2O                                   0.082 g/L
Yeast Extract（Difco社製）                    2 g/L
【０２６４】
各々の培養条件における、培養終了時のＬ−リジン蓄積、及び菌体濁度(OD)、並びに培養液中の炭素源を消費しつくした培養時間を、各々表４、５、６に示し、菌体内過酸化水素濃度測定結果を図８に示す。脂肪酸を炭素源とするL-リジン生産培養において、対照条件（チオ尿素無添加条件または尿素添加条件）に対し、チオ尿素添加条件は、有意に高いＬ-リジン生産と菌体濁度を示した。また、脂肪酸を炭素源とするL-リジン生産培養において、対照条件（チオ尿素無添加条件または尿素添加条件）に対し、チオ尿素添加条件は、有意に短い時間での培地に添加した脂肪酸の消費を示した。また、グルコースを炭素源とするL-リジン生産培養と脂肪酸を炭素源とするL-リジン生産培養において、対照条件（チオ尿素無添加条件または尿素添加条件）に対し、チオ尿素添加条件は、有意に低い菌体内科酸化水素濃度を示した。
【０２６５】
【表４】
2014036576.tif 000006
【０２６６】
【表５】
2014036576.tif 000007
【０２６７】
【表６】
2014036576.tif 000008
【０２６８】
〔配列表の説明〕
配列番号１：oxyS遺伝子増幅用プライマー
配列番号２：oxyS遺伝子増幅用プライマー
配列番号３：sodA遺伝子増幅用プライマー
配列番号４：sodA遺伝子増幅用プライマー
配列番号５：fixABCオペロン増幅用プライマー
配列番号６：fixABCオペロン増幅用プライマー
配列番号７：cat遺伝子のatt-tet遺伝子への置換用プライマー
配列番号８：cat遺伝子のatt-tet遺伝子への置換用プライマー
配列番号９：oxyS遺伝子の塩基配列
配列番号10：fixA遺伝子の塩基配列
配列番号11：fixA遺伝子によってコードされるアミノ酸配列
配列番号12：fixB遺伝子の塩基配列
配列番号13：fixB遺伝子によってコードされるアミノ酸配列
配列番号14：fixC遺伝子の塩基配列
配列番号15：fixC遺伝子によってコードされるアミノ酸配列
配列番号16：sodA遺伝子の塩基配列
配列番号17：sodA遺伝子によってコードされるアミノ酸配列
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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