(57)【要約】【課題】百日咳の早期診断のための方法及びキットの提供。【解決手段】被験体から採取した血液、血清又は血漿試料中の百日咳菌のVag8に対するIgM抗体を測定することにより、百日咳菌の感染を検出する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体から採取した血液、血清又は血漿試料中の百日咳菌のVag8に対するIgM抗体を測定することにより、百日咳菌の感染を検出する方法。
【請求項２】
配列番号２に表されるアミノ酸配列からなるVag8の第36〜636番目のアミノ酸からなる断片に対するIgM抗体を測定する、請求項１記載の百日咳菌の感染を検出する方法。
【請求項３】
抗ヒトIgM抗体を固相化した担体を被験体から採取した血液、血清又は血漿試料と接触させ試料中のIgM抗体を担体に捕捉させる工程、捕捉させた抗体にタグタンパク質とVag8又はその断片の融合タンパク質を結合させる工程、並びに標識抗タグ抗体をタグタンパク質に結合させる工程を含む、請求項１又は２に記載の百日咳菌の感染を検出する方法。
【請求項４】
抗ヒトIgM抗体を固相化した担体を被験体から採取した血液、血清又は血漿試料と接触させ試料中のIgM抗体を担体に捕捉させる工程、捕捉させた抗体にタグタンパク質とVag8又はその断片の融合タンパク質を結合させる工程、ビオチン標識抗タグタンパク質抗体をタグタンパク質に結合させる工程、並びに標識化ストレプトアビジン若しくはアビジンをビオチンに結合させる工程を含む、請求項１又は２に記載の百日咳菌の感染を検出する方法。
【請求項５】
タグタンパク質がマルトース結合タンパク質である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の百日咳菌の感染を検出する方法。
【請求項６】
感度85％以上、特異性75％以上で検出する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の百日咳菌の感染を検出する方法。
【請求項７】
ROC解析により決定したカットオフ値を基準として、百日咳菌の感染の有無を決定する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の百日咳菌の感染を検出する方法。
【請求項８】
抗ヒトIgM抗体を固相化した担体、タグタンパク質とVag8若しくはその断片との融合タンパク質、標識抗タグタンパク質抗体若しくはビオチン化抗タグ抗体と標識ストレプトアビジン（アビジン）を含む、試料中の百日咳菌のVag8に対するIgM抗体を検出するためのキット。
【請求項９】
Vag8又はその断片が配列番号２に表されるアミノ酸配列からなるVag8の第36〜636番目のアミノ酸からなる断片である、請求項８記載のキット。
【請求項１０】
タグタンパク質がマルトース結合タンパク質である、請求項８又は９に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は百日咳の血清診断方法に関し、より詳細には百日咳患者の診断のための抗体価測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
百日咳は百日咳菌（Bordetella pertussis）の感染によって引き起こされる急性呼吸器感染症である。2008年に世界で発生した百日咳患者数は1,600万人、死亡数は約195,000人と見積もられており、罹患者の多くは発展途上国の乳幼児である。2010年におけるわが国の報告患者数は5,388名であり、年間罹患数は5万人程度と推定される。百日咳はワクチン予防可能疾患の一つであり、ワクチン未接種の乳幼児やワクチン効果が減弱した青年・成人が感染する。
【０００３】
百日咳の診断方法については種々の報告がある（非特許文献１及び２を参照）。
百日咳の確定診断には菌培養検査又は血清学的検査を必要とするが、青年・成人患者では保菌量が少ないため菌培養検査で陽性となることは稀である。一方、血清学的検査として、わが国では百日せき凝集反応用抗原「生研」N及び百日せき抗体EIA「生研」が体外診断薬として利用可能である。一般に、凝集反応抗原を用いた菌凝集素価法は特異度・感度ともに低いという欠点を持つ。百日せき抗体EIAは百日咳毒素ならびに繊維状赤血球凝集素に対するIgG抗体を測定するが、百日せきワクチンがこれらの抗原を含むことから、WHOではワクチン接種後3年経過していることを適用条件としている。さらに、IgG抗体の誘導は感染後数週間を要するため、百日せきEIA法は感染初期の患者を診断できないという問題点がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】菌凝集素価法を用いた百日咳血清診断について．病原微生物検出情報IASR Vol.32.p.236-237:2011年8月号
【非特許文献２】Guiso N, Berbers G, Fry NK, He Q, Riffelmann M, Wirsing von Konig CH, EU Perstrain group. What to do and what not to do in serological diagnosis of pertussis: recommendations from EU reference laboratories. Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 2011, 30:307-312.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
現行の血清学的検査では百日咳患者を早期かつ正確に診断することは困難な状況にある。この問題を解決するためには、高い免疫原性を持ち、さらにはワクチン抗原に含まれない診断用抗原が必要となる。また、多くの感染症ではIgG抗体に先駆けてIgM抗体が誘導されることから、百日咳の早期診断にはIgM抗体の測定が有用と考えられる。そこで、本発明は、高い免疫原性を持つ診断用抗原を同定するとともに、同定された診断用抗原に対するIgM抗体の測定方法を提供することを目的とする。さらに、本発明は上記IgM測定方法を用いた血清診断用キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、百日咳菌が産生するvirulence-associated gene 8 (Vag8)を診断用抗原とし、特に抗Vag8 IgM抗体を測定することにより、従来法よりも優れた感度・特異度を持つ血清診断方法を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
[１]  被験体から採取した血液、血清又は血漿試料中の百日咳菌のVag8に対するIgM抗体を測定することにより、百日咳菌の感染を検出する方法。
[２]  配列番号２に表されるアミノ酸配列からなるVag8の第36〜636番目のアミノ酸からなる断片に対するIgM抗体を測定する、[１]の百日咳菌の感染を検出する方法。
[３]  抗ヒトIgM抗体を固相化した担体を被験体から採取した血液、血清又は血漿試料と接触させ試料中のIgM抗体を担体に捕捉させる工程、捕捉させた抗体にタグタンパク質とVag8又はその断片の融合タンパク質を結合させる工程、並びに標識抗タグ抗体をタグタンパク質に結合させる工程を含む、[１]又は[２]の百日咳菌の感染を検出する方法。
[４]  抗ヒトIgM抗体を固相化した担体を被験体から採取した血液、血清又は血漿試料と接触させ試料中のIgM抗体を担体に捕捉させる工程、捕捉させた抗体にタグタンパク質とVag8又はその断片の融合タンパク質を結合させる工程、ビオチン標識抗タグタンパク質抗体をタグタンパク質に結合させる工程、並びに標識化ストレプトアビジン若しくはアビジンをビオチンに結合させる工程を含む、[１]又は[２]の百日咳菌の感染を検出する方法。
[５]  タグタンパク質がマルトース結合タンパク質である、[１]〜[４]のいずれかの百日咳菌の感染を検出する方法。
[６]  感度85％以上、特異性75％以上で検出する、[１]〜[５]のいずれかの百日咳菌の感染を検出する方法。
[７]  ROC解析により決定したカットオフ値を基準として、百日咳菌の感染の有無を決定する、[１]〜[６]のいずれかの百日咳菌の感染を検出する方法。
[８]  抗ヒトIgM抗体を固相化した担体、タグタンパク質とVag8若しくはその断片との融合タンパク質、標識抗タグタンパク質抗体若しくはビオチン化抗タグ抗体と標識ストレプトアビジン（アビジン）を含む、試料中の百日咳菌のVag8に対するIgM抗体を検出するためのキット。
[９]  Vag8又はその断片が配列番号２に表されるアミノ酸配列からなるVag8の第36〜636番目のアミノ酸からなる断片である、[８]のキット。
[１０]  タグタンパク質がマルトース結合タンパク質である、[８]又は[９]のキット。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、百日咳患者を従来法よりも高精度に診断することができる。また、診断用抗原に用いたVag8は現行の百日せきワクチンに含まれないため、ワクチン接種後の被験体にも適用可能という利点を有している。さらに、抗Vag8 IgM抗体を測定することにより感染早期の診断が可能となり、迅速な治療や感染の拡大防止に有用となる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】診断用抗原MBP-Vag8の発現方法を示す図である。
【図２】MBP-Vag8診断用抗原を用いたIgM捕捉ELISA法の測定原理を示す図である。
【図３】ジフテリア・破傷風・百日せき三種混合（DTaP）ワクチンによる抗Vag8 IgG抗体の誘導の結果を示す図である。
【図４】健常成人における抗Vag8抗体の分布を示す図である。
【図５】百日咳患児における抗Vag8抗体の誘導の結果を示す図である。
【図６】百日咳患者における抗Vag8 IgM抗体価の分布を示す図である。
【図７】抗Vag8 IgM捕捉ELISA法の診断精度評価結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１１】
本発明は、百日咳菌の感染を検出する方法であり、百日咳菌（Bordetella pertussis）が産生するvirulence-associated gene 8 (Vag8)に対するIgM抗体を測定することにより感染を検出する。本発明において、Vag8という場合、Vag8タンパク質を意味する。本発明においては、被験体（患者）から採取した試料中の抗Vag8 IgM抗体を測定する。試料は血液、血清又は血漿を用いる。本発明の方法においては、抗ヒトIgM抗体を結合させた担体に被験体から採取した試料を添加し、担体と試料を接触させる。この際、ヒト試料中にIgM抗体が存在する場合、担体に結合させた抗IgM抗体に結合し、捕捉される。次いで、百日咳菌のVag8又はその断片とタグを結合したタグ-Vag8融合タンパク質を添加する。抗IgM抗体に結合したIgMが抗Vag8 IgM抗体である場合、タグ-Vag8融合タンパク質のVag8と抗Vag8 IgM抗体が結合し、担体上で抗ヒトIgM抗体と抗Vag8 IgM抗体とタグ-Vag8融合タンパク質の複合体を形成する。次いで、二次抗体である抗タグ抗体を添加する。抗タグ抗体がタグ-Vag8融合タンパク質のタグに結合し、担体上に抗ヒトIgM抗体と抗Vag8 IgM抗体とタグ-Vag8融合タンパク質と抗タグ抗体の複合体を形成する。抗タグ抗体は蛍光色素、化学発光物質、酵素等の標識物質で直接標識しておいてもよいし、ビオチンで標識しビオチン化抗タグ抗体として用いてもよい。抗タグ抗体を直接標識した場合、抗タグ抗体に結合させた標識物質からのシグナルを測定することにより被験体試料中の抗Vag8 IgM抗体を検出することができる。また、抗タグ抗体をビオチンで標識した場合、さらに、蛍光色素、化学発光物質、酵素等の標識物質で標識したアビジン又はストレプトアビジンを添加する。標識物質はアビジン又はストレプトアビジンとビオチンとの結合により抗タグ抗体に結合し、標識物質からのシグナルを測定することにより被験体試料中の抗Vag8 IgM抗体を検出することができる。本発明において、蛍光色素、化学発光物質、酵素等の標識物質で標識した抗体もビオチンで標識した抗体も標識抗体と呼ぶ。被験体試料中に抗Vag8 IgM抗体が検出された場合、該被験体は、百日咳菌に感染していると判断することができる。
【００１２】
本発明の方法は、百日咳の感染症を診断するための検査方法でもあり、また百日咳の感染症を診断するための補助的データを取得する方法でもある。
【００１３】
本発明の方法は、試料中のIgM抗体を捕捉することを含む方法であり、IgM捕捉法とも呼ぶ。本発明の方法は、好ましくはELISA（Enzume-Linked ImmunoSorbent Assay）法であり、その場合は、IgM捕捉ELISA法と呼ぶ。
【００１４】
１．IgM捕捉法に用いる試薬の調製
本発明において、「タグ」とは、測定しようとする被験体試料の抗Vag8 IgM抗体が特異的に結合するVag8又はその断片と結合させた物質であって、標識二次抗体が特異的に結合するタンパク質をいい、タグタンパク質とも呼ぶ。
【００１５】
Vag8は高い免疫原性を有する抗原であり、百日咳に感染した患者に認識され、患者において早期に抗体、特にIgM抗体が誘導される。Vag8は、全長Vag8タンパク質を用いてもその一部断片を用いてもよい、Vag8をコードするDNAの配列を配列番号１に示し、Vag8のアミノ酸配列を配列番号２に示す。Vag8の断片は、特に免疫原性が高い断片が望ましく、例えば、Vag8の断片として、配列番号２に示すアミノ酸配列の第36〜636番目のアミノ酸からなる断片タンパク質が挙げられる。Vag8は膜タンパク質であり、そのままでは難溶性である。Vag8を可溶性である他のタグタンパク質と融合することにより、可溶化するので、免疫学的アッセイに用いることができるようになる。
【００１６】
なお、Vag8は一般に用いられている百日せきワクチンに含まれていないので、ワクチン接種を受けた被験体であって、百日咳に感染していない被験体において、抗Vag8抗体が産生されることはなく、Vag8抗体を有する被験体は、百日咳菌に感染したと判断することができる。
【００１７】
タグはそれ自体が抗原性を有し、標識二次抗体と抗原抗体反応により結合し得る物質であれば使用することができるが、本発明にはMBP（マルトース結合タンパク質）、His6（ヒスチジン６量体）、GST（Glutathione S-Transferase）、ガラクトース結合タンパク質、チオレドキシン等遺伝子組換えにより抗原タンパク質との融合タンパク質を作製できるタンパク質、ペプチドを好適に用いることができる。
【００１８】
タグは、Vag8又はその断片と結合させる。タグとVag8又はその断片との結合は、化学的に又は酵素的に結合させてもよいし、また、タグタンパク質をコードするDNAとVag8又はその断片をコードするDNAの融合遺伝子を発現させ融合タンパク質として作製することもできる。本発明においては、タグとVag8又はその断片とを化学的、酵素的に結合させた場合も融合タンパク質と呼ぶ。
【００１９】
タグタンパク質をコードするDNAとVag8又はその断片をコードするDNAの融合は、通常の遺伝子組換えの手法により行うことができる。この際、適当な制限酵素の認識切断配列を導入して行うことができる。タグタンパク質は、Vag8又はその断片のC末端側に付加されても、N末端側に付加されてもよい。この際、タグタンパク質をコードする遺伝子とVag8又はその断片をコードするDNAの間にストップコドンが現れないようにする。タグタンパク質とVag8又はその断片の間の距離は限定されず、両者の間にリンカーが含まれていてもよい。リンカーの構成アミノ酸やアミノ酸数は限定されないが、例えば、グリシン、セリン、アラニン、トレオニン又はメチオニンの１以上のアミノ酸により構成されるものを用いることができる。また、アミノ酸数は、一般的には2〜20残基であり、好ましくは2〜15残基であり、より好ましくは2〜10残基であり、さらに好ましくは2〜5残基である。タグタンパク質とVag8又はその断片が翻訳されるためには、両DNAのオープンリーディングフレームを合わせるようにする。また両DNAの間に、特定のアミノ酸がリンカー部位に含まれるような塩基配列を有していてもよい。
【００２０】
本発明で用いるタグに対する抗体は、タグを免疫原として動物に免疫して抗血清を採取しそこから精製することにより得ることができ、また細胞融合法を用いてモノクローナル抗体として得ることができる。また、市販のものを用いることもできる。
【００２１】
抗タグ抗体又はビオチン-ストレプトアビジン結合若しくはビオチン-アビジン結合を介して抗タグ抗体に結合させる標識物質としてはフルオレセインイソチオシアネート（FITC）等の蛍光色素、西洋わさびペルオキシダーゼ（HRP)、アルカリフォスファターゼ（ALP)等の酵素、発光物質、放射性同位体等が用いられる。酵素を用いる場合、発色基質として、HRPに対してはTMB（テトラメチルベンゼン）、ALPに対してはp-ニトロフェニルフォスフェート（pNPP)を用いればよい。タグに対する抗体への標識物質の結合方法は、当業者に知られた方法により行うことができるが、例えば、酵素標識の場合は、マレイミド法等（石川栄治著「超高感度酵素免疫測定法」（学会出版センター等に記載））の方法を用いることができる。
【００２２】
抗ヒトIgM抗体を適当な担体に結合させて、本発明のIgMを捕捉し得る固相担体を作製することができる。抗ヒトIgM抗体をELISA用タイタープレート、ビーズ等の担体に固定して本発明に用いる抗体固相担体を得ることができる。抗ヒトIgM抗体は、市販のものを用いることもできるし、ヒトIgM（μ鎖）を動物に免疫して作製することもできる。抗ヒトIgM抗体はタイタープレート等の担体に物理吸着や化学結合により固相化する。固相化量は、特に限定されないが、担体がマイクロタイタープレートの場合、1ウェル当たり数ngから数十μgが望ましい。固相化は固相化すべき抗体を適切なバッファーに溶解し、担体と接触させ行うことができる。例えば、マイクロタイターウェルを用いる場合、抗体溶液をマイクロタイタープレートのウェルに分注し一定時間置くことにより固相化することができる。
【００２３】
２．IgM捕捉法によるIgM抗体の免疫学的測定
上述の抗ヒトIgM抗体を固相化した担体、タグを結合したVag8若しくはその断片、並びにタグに対する標識二次抗体若しくはビオチン化抗タグ抗体と標識ストレプトアビジン（アビジン）を用いて、目的とする抗Vag8 IgM抗体を測定することができる。
【００２４】
例えば、ヒトIgM抗体に対する抗体を結合させたマイクロプレート、タグとしてのMBP(マルトース結合タンパク質）、ビオチン化抗MBP抗体、標識物質としての酵素と結合させたストレプトアビジンを用いるIgM捕捉法によるELISAによる抗Vag8 IgM抗体測定を以下に示す方法により行うことができる。
【００２５】
被験体から採取した血清を緩衝液で希釈後、抗ヒトIgM抗体固相プレートに添加、15〜30℃で0.5〜８時間反応させる。反応後、緩衝液又は生理食塩水で洗浄し、MBPとVag8若しくはその断片の融合体（MBP-Vag8）を添加し、15〜30℃で0.5〜８時間反応させる。反応後、緩衝液又は生理食塩水で洗浄し、ビオチン化抗MBP抗体を添加し、15〜30℃で0.5〜８時間反応させる。反応後、緩衝液又は生理食塩水で洗浄し、ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジンを添加する。15〜30℃で0.1〜４時間反応させ、発色基質液（TMB)を添加し、0.1〜２時間発色させ、発色停止液を添加し、450nmの吸光度を測定する。あらかじめ検量線を作成しておき、得られた吸光度から試料中の抗体濃度を算出してもよい。
【００２６】
被験体から採取した試料中に抗Vag8抗体が存在している、すなわち陽性である場合、該被験体は百日咳に感染していると判断することができる。試料中の抗Vag8抗体が陽性か否かは、あらかじめ吸光度又は抗体測定値についてカットオフ値を定めておき、該カットオフ値を基準としカットオフ値を超えた場合に、陽性であると判断することができる。
【００２７】
カットオフ値は、例えば、ROC（receiver operating characteristic curve：受信者動作特性曲線）解析により定めることができる。また、ROC解析により本発明の方法による診断精度（感度及び特異性）を決定することができる。ROC解析は、試料として百日咳患者から採取した試料と健常者から採取した試料について抗Vag8 IgM抗体を測定し、各カットオフ値での感度及び偽陽性率（１−特異性）を算出し、横軸と１−特異性とし、縦軸を感度とした座標上にプロットする。本発明の方法で測定した測定値のROC曲線の一例を図７に示す。
【００２８】
本発明の方法の測定結果についてROC解析により診断精度を解析した場合の、曲線下面積（AUC：area under the curve）は0.9以上と高く、感度は80％以上、好ましくは85％以上、さらに好ましくは90％以上であり、特異性は75％以上、好ましくは80％以上である。本発明の方法により、非常に高い精度で百日咳菌の感染を検出することができる。
【００２９】
３．抗Vag8 IgM抗体測定試薬
本発明は抗Vag8 IgM抗体測定試薬をも包含する。該試薬は、抗ヒトIgM抗体を固相化した担体、MBP等のタグとVag8若しくはその断片との融合タンパク質、標識抗タグ抗体若しくはビオチン化抗タグ抗体と標識ストレプトアビジン（アビジン）を含む。該試薬は、さらに、ブロッキング溶液、反応溶液、反応停止液等を含んでいてもよい。
【実施例】
【００３０】
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【００３１】
実施例１  マルトース結合タンパク質と百日咳のVag8の一部の融合タンパク質の作製
百日咳菌東浜株DNAを鋳型にして、PCRによりvag8遺伝子の一部（position 112-1908, 1797 bp）を増幅した。この遺伝子を発現ベクターpMAL-c2Xに挿入し、マルトース結合タンパク質との融合タンパク質（MBP-Vag8）として発現させた。
【００３２】
具体的には、百日咳菌東浜株DNAを鋳型にしてPCRによりVag8遺伝子の一部（position 112-1908）を増幅し、infusion法により発現ベクターpMAL-c2XのBamHI-HindIIIサイトに挿入した（参考文献： Finn & Amsbaugh, Infect Immun, 1998）。構築したpMAL-c2X Vag8を大腸菌E. coli BL21に形質転換し、常法に従ってMBP-Vag8を発現させた。菌体を6 M 尿素を含むカラムバッファー（20 mM Tris-HCl, 0.2 M NaCl, 1 mM EDTA, pH 7.5）に懸濁し、超音波処理により菌体を破砕した。次いで、遠心操作により上清を回収し、4 M、2 M、0 M尿素を含むカラムバッファーに順次透析した。透析後、遠心操作により不溶性物質を除去し、上清をアミロースレジンカラムに添加し、カラムバッファーで洗浄し、10 mMマルトースを含むカラムバッファーでMBP-Vag8を溶出した。MBP-Vag8画分を25 mM Tris-HCl (pH 7.5)に透析後、イオン交換カラム（Resource Q）に添加し、0から0.5 M NaClの濃度勾配によりMBP-Vag8を溶出した。このMBP-Vag8を最終精製物とした。
【００３３】
図１にvag8遺伝子の一部を挿入した発現ベクターpMAL-c2Xの構造及び得られた融合タンパク質MBP-Vag8の構造を示す。
【００３４】
実施例２  抗Vag8 IgM抗体測定のためのIgM捕捉ELISA法の開発
ELISAプレートに抗ヒトIgM抗体を結合させ、患者血清中のIgM抗体を捕捉する。捕捉された抗Vag8 IgM抗体にMBP-Vag8を結合させた後、ビオチン標識抗MBP IgG抗体をMBPに結合させる。続いて、ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジンを反応させ、TMB基質を用いて発色を行う。
【００３５】
詳細には、市販の96穴ELISAプレートに抗ヒトIgM抗体を固相化し、洗浄後、適当な緩衝液で100倍希釈した患者血清100μlをウエルに添加した。25℃で1時間静置した後、200 μlの洗浄液（0.05% Tween-20を含む生理食塩水）でウエルを3回洗浄した。MBP-Vag8を緩衝液で0.5μg/μlに希釈し、その100μlをウエルに添加した。25℃で1時間静置後、ウエルを3回洗浄し、緩衝液により希釈されたビオチン標識抗MBP IgG抗体100μlをウエルに添加した。25℃で1時間静置した後、ウエルを3回洗浄し、緩衝液により希釈されたペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン溶液100μlを添加した。25℃で30分間静置後、洗浄液でウエルを5回洗浄し、100μlのTMB発色基質液（3, 3', 5, 5'-tetramethylbenzidine）を添加し、25℃の暗所で発色した。30分後、100μlの発色停止液（0.3 M硫酸液）を添加し、450 nmの吸光度を測定した（参照波長650 nm）。
図２に本実施例のIgM捕捉ELISA法の原理を示す。
【００３６】
実施例３  ジフテリア・破傷風・百日せき三種混合（DTaP）ワクチンによる抗Vag8 IgG抗体の誘導
国内4製造所のDTaPワクチンをマウス（n = 3）に接種し、14日と28日後にマウスより血清を採取し、血清中の抗Vag8 IgG抗体とワクチン抗原であるPT（百日咳毒素）、Prn（パータクチン）、FHA（繊維状赤血球凝集素）に対するIgG抗体を測定した。IgG測定は従来の間接ELISA法により実施した。まず96穴ELISAプレートに抗原タンパク質を固相化し、マウス血清を加えた。抗原に結合したマウス血清中のIgG抗体は、2次抗体であるアルカリフォスファターゼ標識抗マウスIgGおよびpNPPを用いた発色系で検出した（参考文献：WHO Laboratory manual for the diagnosis of whooping cough caused Bordetella pertussis/Bordetella parapertussis. WHO, WHO/IVB/04/14 (http://www.who.int/immunization/documents/WHO_IVB_04.14/en/index.html)）。結果を図３に示す。図３Aは抗PT IgG抗体の測定結果を、図３Bは抗FHA IgG抗体の測定結果を、図３Cは抗Prn IgG抗体の測定結果を、図３Dは抗Vag8 IgG抗体の測定結果を示す。図３Dに示すように、4製造所のDTaPワクチンで抗Vag8 IgGの誘導が認められなかったことから、現行ワクチンにはVag8は含まれず、Vag8を用いた血清診断はワクチン接種の影響を受けないものと判断された。
【００３７】
実施例４  健常成人における抗Vag8抗体の分布
健常者80名の血清について、従来の間接ELISA法により抗Vag8 IgG抗体と抗Vag8 IgM抗体を測定した。結果を図４に示す。図４Aは抗Vag8 IgG抗体の測定結果を示し、図４Bは抗Vag8 IgM抗体の測定結果を示す。図４A及びBに示すように、抗Vag8 IgG抗体は健常者でも高値を示すものが多数認められたが、一方、抗Vag8 IgM抗体で高値を示すものはほとんど認められなかった。このことから、Vag8を診断用抗原に用いた場合、抗Vag8 IgM抗体の測定が必要と考えられた。
【００３８】
実施例５  百日咳患児における抗Vag8抗体の誘導
百日咳菌が分離された乳児患者6名について、経時的に血清を採取し、血清中の抗Vag8 IgMと抗Vag8 IgGを測定した。抗Vag8 IgM抗体はIgM捕捉ELISA法、抗Vag8 IgG抗体は従来の間接ELISA法により測定した。結果を図５に示す。図５Aは抗Vag8 IgM抗体の測定結果を示し、図５Bは抗Vag8 IgG抗体の測定結果を示す。図５A及びBに示すように、抗Vag8 IgM抗体は抗Vag8 IgG抗体よりも早い病日に誘導されることが示され、抗Vag8 IgM抗体を用いた診断は感染初期の患者に有用と考えられた。
【００３９】
実施例６  百日咳患者における抗Vag8 IgM抗体価の分布
遺伝子検査（LAMP法）により確定診断された百日咳患者21名について、血清中の抗Vag8 IgM抗体を測定した（IgM捕捉ELISA法）。結果を図６に示す。図６に示すように、百日咳患者は健常者に比較して有意に高い抗Vag8 IgM抗体を保有することが示された（P < 0.001）。コントロールには健常人血清（n = 29）を用いた。
【００４０】
実施例７  抗Vag8 IgM捕捉ELISA法の診断精度評価
遺伝子検査（LAMP法）により確定診断された百日咳患者21名と健常者29名の血清を用いて、抗Vag8 IgM捕捉ELISA法の診断精度をROC解析により評価した。結果を図７に示す。図７に示すように、抗Vag8 IgM捕捉ELISA法の感度は90％、特異度は83％（カットオフ値  A450 = 0.291）、曲線下面積(AUC)は0.92 (95%信頼区間：0.84-1.00)と算出され、高い診断精度を持つことが示された。
【産業上の利用可能性】
【００４１】
本発明による血清診断方法は、百日咳感染症の体外診断薬としての実用化が期待できる。
【図１】
2014202535.tif 000002
【図２】
2014202535.tif 000003
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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