(57)【要約】      （修正有）【課題】骨（特に歯槽骨）の再生に好適な骨再生用材料を提供。【解決手段】骨補填材を含有する不織布であって、骨補填材は不織布を構成する繊維間に含まれ、不織布を構成する繊維は生体適合性繊維であり、また、さらに水溶性ポリマーを含有する不織布、また、生体適合性ポリマーでコーティングされた骨補填材が含有される不織布。これらの不織布は、骨再生用材料（特に歯科用の骨再生用材料）として好適に用いることができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨補填材を含有する不織布であって、
骨補填材は不織布を構成する繊維間に含まれ、
不織布を構成する繊維は生体適合性繊維であり、当該生体適合性繊維は生体適合性ポリマーを含んでなる繊維であり、
さらに水溶性ポリマーを含有する不織布。
【請求項２】
骨補填材を含有する不織布であって、
骨補填材は不織布を構成する繊維間に含まれ、
不織布を構成する繊維は生体適合性繊維であり、当該生体適合性繊維は生体適合性ポリマー及び水溶性ポリマーを含んでなる繊維である、
請求項１に記載の不織布。
【請求項３】
水溶性ポリマーが不織布を構成する繊維に付着した、請求項１又は２に記載の不織布。
【請求項４】
生体適合性ポリマーが、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸−ポリグリコール酸共重合体、ポリカプロラクトン、キチン、コラーゲン、ポリリジン、ポリアルギニン、ヒアルロン酸、セリシン、セルロース、デキストラン、及びプルランからなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１〜３いずれかに記載の不織布。
【請求項５】
骨補填材が、β-TCP（β−リン酸三カルシウム）、α-TCP（α−リン酸三カルシウム）、HA（ハイドロキシアパタイト）、 DCPD （第二リン酸カルシウム）、OCP（オクタカルシウムフォスフェート）、4CP（テトラカルシウムフォスフェート）、アルミナ、ジルコニア、カルシウムアルミネート（CaO-Al2O3）、アルミノシリケート（Na2O-Al2O3-SiO2）、生体活性化ガラス、石英、及び炭酸カルシウムからなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１〜４のいずれかに記載の不織布。
【請求項６】
水溶性ポリマーが、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、及びカルボキシビニルポリマーからなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１〜５のいずれかに記載の不織布。
【請求項７】
骨補填材の粒径が５０〜５０００μｍ程度である、請求項１〜６のいずれかに記載の不織布。
【請求項８】
不織布の空隙率が、７８．５〜９７％である、請求項１〜７のいずれかに記載の不織布。
【請求項９】
不織布の繊維部分の空隙率が、８０〜９９．９９％である、請求項１〜８のいずれかに記載の不織布。
【請求項１０】
不織布のかさ密度（ｇ／ｃｍ３）が、０．１〜０．６である、請求項１〜９のいずれかに記載の不織布。
【請求項１１】
骨補填材を含有する不織布であって、
骨補填材は不織布を構成する繊維間に含まれ、
不織布を構成する繊維は生体適合性繊維であり、当該生体適合性繊維は生体適合性ポリマーを含んでなる繊維であり、
前記骨補填材は生体適合性ポリマーでコーティングされている、不織布。
【請求項１２】
前記骨補填材は生体適合性ポリマーでコーティングされている、請求項１〜１０のいずれかに記載の不織布。
【請求項１３】
生体適合性ポリマーでコーティングされている骨補填材が、表面の３０％以上に生体適合性ポリマーが付着している骨補填材である、請求項１１又は１２に記載の不織布。
【請求項１４】
生体適合性繊維に含まれる生体適合性ポリマーと、骨補填材をコーティングしている生体適合性ポリマーとが、同じである、請求項１１〜１３のいずれかに記載の不織布。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれかに記載の不織布を含む骨再生用材料。
【請求項１６】
請求項１〜１４のいずれかに記載の不織布を含む骨芽細胞培養足場材。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は骨補填材を含有する不織布に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、加齢や歯周病等により歯牙を欠損した場合に、人工歯根を歯槽骨に埋め込み、その上に人工歯冠及び上部構造を装着する治療（いわゆる「インプラント治療」）が広く行われるようになっている。
【０００３】
歯牙が欠損すると（つまり、歯が抜けてしまうと）、それまで歯牙を支えていた歯槽骨は急速に吸収され、減少する。従って、インプラント治療では、人工歯根を歯槽骨に埋め込むには歯槽骨の厚さが不足している、という状況がしばしば起こる。歯槽骨の厚さが不足すると、人工歯根を埋め込んでも安定しない虞が大きい。このような場合には、骨を移植する、或いは骨を再生させる等の処置がとられる。
【０００４】
例えば、歯槽骨再生のために頻用される方法の一つとして、ＧＢＲ法（骨再生誘導法：guided bone regeneration）が挙げられる。当該方法は、具体的には、歯槽骨が不足している部分（患部）に、粉砕した自家骨もしくは骨補填材を置き、その上にメンブレン（遮蔽膜、ＧＢＲ膜ともいう）を置いて（即ち、骨補填材を補填した患部を包埋して）、歯肉組織の混入を防ぎつつ、歯槽骨の再生を促進させる方法である。しかし、現在用いられている骨補填材は、細胞の付着性及び増殖性は充分でなく、歯槽骨再生に長時間を要していた。また、歯槽骨への接着性や患部への留置性も良好とはいえず、骨補填材をＧＢＲ膜で包埋したとしても、患部から漏れ出ることもあった。
【０００５】
また、骨セメントが用いられる場合もあるが、骨セメントには細胞が浸潤できないという欠点がある。
【０００６】
上記のように、現在用いられる骨再生材料は、細胞付着性及び増殖性が充分でないという問題がある。
【０００７】
このような状況を改善するため、骨（特に歯槽骨）の再生に適した骨再生用材料の研究開発が続けられている（例えば特許文献１、特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】ＷＯ２００７／１３２１８６
【特許文献２】特開２００７−３２５５４３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、骨（特に歯槽骨）の再生に好適な骨再生用材料を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、骨補填材を含有する不織布であって、骨補填材は不織布を構成する繊維間に含まれ、不織布を構成する繊維は生体適合性繊維である不織布が、非常に細胞（特に骨芽細胞）の増殖効率が高い（細胞増殖能が高い）骨再生用材料となることを見出し、さらには、当該不織布が水溶性ポリマーを含むことで、骨補填材が不織布により強く吸着される（すなわち、不織布の骨補填材保持性が向上する）ことをも見出した。また、予め骨補填材を生体適合性繊維の成分である生体適合性ポリマーでコーティングしておくことによっても、不織布の骨補填材保持性が向上することを見出した。そして、さらに改良を重ねて本発明を完成させるに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は例えば以下の項に記載の主題を包含する。
項１ａ．
骨補填材を含有する不織布であって、
骨補填材は不織布を構成する繊維間に含まれ、
不織布を構成する繊維は生体適合性繊維である、
不織布。
項２ａ．
生体適合性繊維が、生体適合性ポリマーを含んでなる繊維である、項１ａに記載の不織布。
項３ａ．
生体適合性ポリマーが、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸−ポリグリコール酸共重合体、ポリカプロラクトン、キチン、コラーゲン、ポリリジン、ポリアルギニン、ヒアルロン酸、セリシン、セルロース、デキストラン、及びプルランからなる群より選択される少なくとも１種である、項２ａに記載の不織布。
項４ａ．
骨補填材が、β-TCP（β−リン酸三カルシウム）、α-TCP（α−リン酸三カルシウム）、HA（ハイドロキシアパタイト）、 DCPD （第二リン酸カルシウム）、OCP（オクタカルシウムフォスフェート）、4CP（テトラカルシウムフォスフェート）、アルミナ、ジルコニア、カルシウムアルミネート（CaO-Al2O3）、アルミノシリケート（Na2O-Al2O3-SiO2）、生体活性化ガラス、石英、及び炭酸カルシウムからなる群より選択される少なくとも１種である、項１ａ〜３ａのいずれかに記載の不織布。
項５ａ．
骨補填材の粒径が５０〜５０００μｍ程度である、項１ａ〜４ａのいずれかに記載の不織布。
項６ａ．
不織布の空隙率が、７８．５〜９７％である、請求項１ａ〜５ａのいずれかに記載の不織布。
項７ａ．
不織布の繊維部分の空隙率が、８０〜９９．９９％である、項１ａ〜６ａのいずれかに記載の不織布。
項８ａ．
不織布のかさ密度（ｇ／ｃｍ３）が、０．１〜０．６である、項１ａ〜７ａのいずれかに記載の不織布。
項９ａ．
骨補填材が、生体適合性ポリマーでコーティングされている、項１ａ〜８ａのいずれかに記載の不織布。
項１０ａ．
骨補填材をコーティングしている生体適合性ポリマーが、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸−ポリグリコール酸共重合体、ポリカプロラクトン、キチン、コラーゲン、ポリリジン、ポリアルギニン、ヒアルロン酸、セリシン、セルロース、デキストラン、及びプルランからなる群より選択される少なくとも１種である、項９ａに記載の不織布。
項１１ａ．
生体適合性繊維に含まれる生体適合性ポリマーと、骨補填材をコーティングしている生体適合性ポリマーとが、同じである、項９ａ又は１０ａに記載の不織布。
項１２ａ．
項１ａ〜１１ａのいずれかに記載の不織布を含む骨再生用材料。
項１３ａ．
項１ａ〜１１ａのいずれかに記載の不織布を含む骨芽細胞培養足場材。
【００１２】
項１ｂ．
骨補填材を含有する不織布であって、
骨補填材は不織布を構成する繊維間に含まれ、
不織布を構成する繊維は生体適合性繊維であり、当該生体適合性繊維は生体適合性ポリマーを含んでなる繊維であり、
さらに水溶性ポリマーを含有する不織布。
項２ｂ
骨補填材を含有する不織布であって、
骨補填材は不織布を構成する繊維間に含まれ、
不織布を構成する繊維は生体適合性繊維であり、当該生体適合性繊維は生体適合性ポリマー及び水溶性ポリマーを含んでなる繊維である、
項１ｂに記載の不織布。
項３ｂ．
水溶性ポリマーが不織布を構成する繊維に付着した、項１ｂ又は２ｂに記載の不織布。
項４ｂ．
生体適合性ポリマーが、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸−ポリグリコール酸共重合体、ポリカプロラクトン、キチン、コラーゲン、ポリリジン、ポリアルギニン、ヒアルロン酸、セリシン、セルロース、デキストラン、及びプルランからなる群より選択される少なくとも１種である、項１ｂ〜３ｂいずれかに記載の不織布。
項５ｂ．
骨補填材が、β-TCP（β−リン酸三カルシウム）、α-TCP（α−リン酸三カルシウム）、HA（ハイドロキシアパタイト）、 DCPD （第二リン酸カルシウム）、OCP（オクタカルシウムフォスフェート）、4CP（テトラカルシウムフォスフェート）、アルミナ、ジルコニア、カルシウムアルミネート（CaO-Al2O3）、アルミノシリケート（Na2O-Al2O3-SiO2）、生体活性化ガラス、石英、及び炭酸カルシウムからなる群より選択される少なくとも１種である、項１ｂ〜４ｂのいずれかに記載の不織布。
項６ｂ．
水溶性ポリマーが、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、及びカルボキシビニルポリマーからなる群より選択される少なくとも１種である、項１ｂ〜５ｂのいずれかに記載の不織布。
項７ｂ．
骨補填材の粒径が５０〜５０００μｍ程度である、項１ｂ〜６ｂのいずれかに記載の不織布。
項８ｂ．
不織布の空隙率が、７８．５〜９７％である、項１ｂ〜７ｂのいずれかに記載の不織布。項９ｂ．
不織布の繊維部分の空隙率が、８０〜９９．９９％である、項１ｂ〜８ｂのいずれかに記載の不織布。
項１０ｂ．
不織布のかさ密度（ｇ／ｃｍ３）が、０．１〜０．６である、項１ｂ〜９ｂのいずれかに記載の不織布。
項１１ｂ．
骨補填材を含有する不織布であって、
骨補填材は不織布を構成する繊維間に含まれ、
不織布を構成する繊維は生体適合性繊維であり、当該生体適合性繊維は生体適合性ポリマーを含んでなる繊維であり、
前記骨補填材は生体適合性ポリマーでコーティングされている、不織布。
項１２ｂ．
前記骨補填材は生体適合性ポリマーでコーティングされている、項１ｂ〜１０ｂのいずれかに記載の不織布。
項１３ｂ．
生体適合性ポリマーでコーティングされている骨補填材が、表面の３０％以上に生体適合性ポリマーが付着している骨補填材である、項１１ｂ又は１２ｂに記載の不織布。
項１４ｂ．
生体適合性繊維に含まれる生体適合性ポリマーと、骨補填材をコーティングしている生体適合性ポリマーとが、同じである、項１１ｂ〜１３ｂのいずれかに記載の不織布。
項１５ｂ
項１ｂ〜１４ｂのいずれかに記載の不織布を含む骨再生用材料。
項１６．
項１ｂ〜１４ｂのいずれかに記載の不織布を含む骨芽細胞培養足場材。
【００１３】
項Ａ−１．
項１ａ〜１１ａ、１ｂ〜１４ｂのいずれかに記載の不織布を、骨を再生させるべき部位へ適用する工程を含む、骨を再生させる方法。
項Ａ−２．
骨が歯槽骨である、項Ａ−１に記載の方法。
項Ｂ−１．
骨再生における使用のための、項１ａ〜１１ａ、１ｂ〜１４ｂのいずれかに記載の不織布。
項Ｂ−２．
骨が歯槽骨である、項Ｂ−１に記載の不織布。
項Ｃ−１．
骨再生用製剤の製造における、項１ａ〜１１ａ、１ｂ〜１４ｂのいずれかに記載の不織布の使用。
項Ｃ−２．
骨再生用製剤が、歯槽骨再生用製剤である、項Ｃ−１に記載の使用。
項Ｃ−３．
in vitroでの細胞足場材としての、項１ａ〜１１ａ、１ｂ〜１４ｂのいずれかに記載の不織布の使用。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の骨補填材を含有する不織布を細胞培養の足場として用いた場合、非常に細胞（特に骨芽細胞）の増殖効率が高まる（すなわち、細胞の増殖能を高めることができる）。また、当該不織布は骨補填材を含むため、特に骨芽細胞の培養の足場として用いた場合、骨再生効率も高めることができる。このため、当該不織布は、骨再生用材料として好適に用いることができる。具体的には、外的要因（例えば事故）により骨が損傷した場合や、内的要因（例えば骨粗鬆症、歯周病）により骨が少なく又は無くなった場合に、本発明の不織布を適用することで、（具体的には、患部に埋めたり貼付したりすることで）早期の骨の再生を達成することができる。
【００１５】
また、特に、本発明の骨補填材を含有する不織布のうち、さらに水溶性ポリマーを含有するものは、骨補填材の不織布への接着性が向上（すなわち不織布の骨補填材保持性が向上）し、好ましい。当該性質のため、例えば輸送中や、患部（骨損傷部位又は骨減少部位など）に適用するための手術中等に、骨補填材が振動等により不織布から脱落してしまう虞をより低減できる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】エレクトロスピニング法による不織布の製造方法の簡単な概要を示す。
【図２】本発明の不織布を製造する際に用いるアース電極の一例を示す。
【図３】本発明の不織布（及びエレクトロスピニング法により製造した通常の不織布）の断面図を示す。
【図４】本発明の不織布の断面図（走査型電子顕微鏡による）を示す。
【図５】本発明の不織布の例であるサンプル１〜３の細胞増殖能を検討した結果を示す。
【図６ａ】ブロック状骨補填材（オスフェリオンのブロック）をラットに移植した際の、ブロック状骨補填材への結合組織浸潤の程度を示す、組織切片観察画像である。外側の破線が移植した骨補填材の輪郭を示し、内側の点線が当該骨補填材に浸潤した組織の先端を示す。
【図６ｂ】本発明の不織布をラットに移植した際の不織布への結合組織浸潤の程度を示す、組織切片観察画像である。外側の破線が移植した不織布の輪郭を示し、内側の点線が当該不織布に浸潤した組織の先端を示す。
【図７】各不織布を足場として細胞を培養した後、ＨＥ染色して得た画像、及び当該画像から測定した細胞浸潤距離を示す。
【図８】各不織布のポアサイズ測定結果、及び各不織布を足場として細胞を培養してＨＥ染色して得た画像を示す。
【図９】不織布の繊維同士の間の距離（繊維間距離）の測定方法の概要を示す。
【図１０】各不織布のポアサイズ測定結果、並びに各不織布を足場として細胞を培養してＨＥ染色して得た画像及び当該画像から測定した細胞浸潤距離を示す。
【図１１】各不織布における骨補填材の落下率を示したグラフである。
【図１２】不織布における水溶性ポリマー（ＨＰＣ）の含有量を変化させた際の、骨補填材落下率を調べた結果を示すグラフである。
【図１３】生体適合性ポリマーでコーティングした骨補填材を用いた際に、不織布の骨補填材保持性が向上することを示す写真である。骨補填材へエレクトロスピニング法により生体適合性ポリマー（ポリ乳酸）を噴霧した場合（噴霧条件１）は骨補填材が多く剥がれ落ちているのに対し、ポリ乳酸コーティング骨補填材を用いた場合（噴霧条件２）には骨補填材はほとんど剥がれ落ちないことを示す。なお、噴霧条件３は骨補填材を加える前後に噴霧を行い、サンドイッチ状にしたものであり、これも骨補填材はほとんど剥がれ落ちなかった。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本発明について、さらに詳細に説明する。なお、「質量」は「重量」と読み替えてもよい。
【００１８】
本発明は、骨補填材を含有する不織布に係る。当該不織布において、骨補填材は不織布を構成する繊維間に含まれる。また、不織布を構成する繊維は生体適合性繊維である。さらに、好ましくは、当該不織布は水溶性ポリマーを含有する。
【００１９】
不織布に含まれる骨補填材としては、公知のものを用いることができる。公知の骨補填材としては、例えば、β-TCP（β−リン酸三カルシウム）、α-TCP（α−リン酸三カルシウム）、HA（ハイドロキシアパタイト）、 DCPD （第二リン酸カルシウム）、OCP（オクタカルシウムフォスフェート）、4CP（テトラカルシウムフォスフェート）、アルミナ、ジルコニア、カルシウムアルミネート（CaO-Al2O3）、アルミノシリケート（Na2O-Al2O3-SiO2）、生体活性化ガラス、石英、炭酸カルシウム等が例示される。具体的にはこれらの成分を含んでなる欠片（好ましくは、これらの成分からなる欠片）を用いることができる。骨補填材は、１種単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。２種以上を組み合わせて用いる場合、骨補填材１欠片の中に２種以上が組み合わされて含まれるものを用いてもよいし、１成分のみからなる欠片を２種以上組み合わせて用いてもよい。
【００２０】
また、骨補填材１欠片の大きさは、不織布中に埋没して含有される程度の大きさ以下であればよい。また、形状も特に制限されず、例えば粒子状、ブロック状、円筒状等であり得る。
【００２１】
骨補填材１欠片の粒径が、不織布の厚さより短いことが好ましく、より好ましくは５０〜５０００μｍ程度、さらに好ましくは７５〜５０００μｍ程度、よりさらに好ましくは１５０〜３０００μｍ程度、特に好ましくは５００〜１５００μｍ程度である。当該粒径は、乾式篩法で求めた値である。具体的には、ＪＩＳ８８０１で規定される篩をセットしたロータップ振とう機を用いて得られる値である。乾式篩法により、当該粒径の骨補填材を得ることができる。また、乾式篩法により、粒径未知の骨補填材の粒径の程度を測定できる。なお、ここでの「粒径」とは骨補填材の形状を粒状に限定することを意図するものではなく、前記方法で求められる値を示すにすぎない。粒状ではない形状（例えばブロック状や円筒状）の骨補填材であっても、ここでいう「粒径」の値を求めることはできる。
【００２２】
なお、本発明の不織布には、骨補填材として市販されているものを購入して用いてもよい。例えば、オスフェリオン（オリンパステルモバイオマテリアル株式会社）、ボーンセラム（オリンパステルモバイオマテリアル株式会社）、ネオボーン（（株）エム・エムティー）、オステオグラフト−Ｓ（日本メディカルマテリアル株式会社）、アパセラム（ペンタックス株式会社）等が例示される。
【００２３】
本発明の不織布では、骨補填材は不織布を構成する複数（多数）の繊維と繊維との間に存在する。つまり、骨補填材は不織布を構成する繊維間に含まれる。１本の繊維内に埋没して含まれるものではない。不織布を構成する繊維が骨補填材を絡め取るように存在するともいえる。
【００２４】
本発明の不織布を構成する繊維は生体適合性繊維である。生体適合性繊維とは、生体適合性ポリマーを含んでなる繊維をいう。生体内で生分解性を有するものが好ましい。繊維中の生体適合性ポリマーの含有率は、通常５０質量％より大きく、例えば６０質量％以上、６５質量％以上、７０質量％以上、７５質量％以上、８０質量％以上、８５質量％以上、９０質量％以上、９５質量％以上、又は実質的に１００％、であり得る。
【００２５】
生体適合性ポリマーとは、生体に接着させた場合又は埋め込んだ場合に、異物反応が無い若しくは小さい（長期間にわたって生体に悪影響も強い刺激も与えず、本来の機能を果たしながら生体と平和共存できる）ポリマーをいう。生体吸収性ポリマーや生体分解性ポリマーが例示できる。
【００２６】
より具体的には、生体適合性ポリマーとしては、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸−ポリグリコール酸共重合体、ポリカプロラクトン、ポリブチレンサクシネート、ポリエチレンサクシネート、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリヘキサメチレンカーボネート、ポリアリレート、ポリビニルイソシアネート、ポリブチルイソシアネート、ポリメチルメタクリレート、ポリエチルメタクリレート、ポリノルマルプロピルメタクリレート、ポリノルマルブチルメタクリレート、ポリメチルアクリレート、ポリエチルアクリレート、ポリブチルアクリレート、ポリアクリロニトリル、ポリビニルアセテート、ポリビニルメチルエーテル、ポリビニルエチルエーテル、ポリビニルノルマルプロピルエーテル、ポリビニルイソプロピルエーテル、ポリビニルノルマルブチルエーテル、ポリビニルイソブチルエーテル、ポリビニルターシャリーブチルエーテル、ポリビニルクロリド、ポリビニリデンクロリド、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、ポリ（Ｎ−ビニルカルバゾル）、ポリ（４−ビニルピリジン）、ポリビニルメチルケトン、ポリメチルイソプロペニルケトン、ポリエチレンオキシド、ポリプロピレンオキシド、ポリシクロペンテンオキシド、ポリスチレンサルホン、テフロン（登録商標）（ポリテトラフルオロエチレン）、ポリシアノアクリレート、ポリエーテルエーテルケトン、ポリウレタン、ポリイミド、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン（超高分子量ポリエチレン含む）、ポリプロピレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリフッ化ビニリデン（ポリビニリデンジフルオライド）、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン並びにこれらの共重合体等の合成ポリマー、再生セルロース、セルロースジアセテート、セルローストリアセテート、メチルセルロース、プロピルセルロース、ベンジルセルロース、フィブロイン、天然ゴム等の生体高分子とその誘導体が例示される。また、キチン、ゼラチン、コラーゲン、ポリアミノ酸（ポリリジン、ポリアルギニン）、ヒアルロン酸、セリシン、デキストラン、プルラン等も例示される。
【００２７】
これらのうち、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸−ポリグリコール酸共重合体、ポリヒドロキシ酪酸、ポリカプロラクトン、ポリエチレンアジペート、ポリブチレンアジペート、ポリブチレンサクシネート、ポリエチレンサクシネート及びポリシアノアクリレート、並びにこれらの共重合体などの脂肪族ポリエステル、ポリブチレンカーボネート、ポリエチレンカーボネートなどの脂肪族ポリカーボネートを好ましい例として挙げることができ、更に好ましくはポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸−ポリグリコール酸共重合体、ポリカプロラクトンが挙げられる。なかでもポリ乳酸が特に好ましい。生体適合性ポリマーは、１種単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００２８】
なお、本発明の効果を損なわない範囲で、他のポリマーや化合物（例えばポリマー共重合体、ポリマーブレンド、リン脂質、その他化合物等、及びこれらの混合物）を併用してもよい。さらには、本発明の不織布を構成する繊維（生体適合性繊維）は、水溶性ポリマーを含有してもよい。（これは、下述する不織布が水溶性ポリマーを含有する場合の形態〔１〕に当たる。）
本発明の不織布は、好ましくはさらに水溶性ポリマーを含む。どのような形態で水溶性ポリマーを含んでもよいが、例えば、〔１〕生体適合性ポリマー及び水溶性ポリマーを含んでなる繊維を生体適合性繊維として、これを不織布を構成する繊維として用いることにより、不織布に水溶性ポリマーを含有させる形態や、〔２〕生体適合性繊維の表面に水溶性ポリマーを付着させることにより、不織布に水溶性ポリマーを含有させる形態が好ましい。また、〔３〕水溶性ポリマーを繊維として、不織布を構成する生体適合性繊維とは別の繊維として不織布に含有させてもよい。なお〔３〕の場合は、生体適合性繊維のみならず水溶性ポリマー繊維も不織布を構成する繊維と呼ぶことも可能ではあるが、本明細書では、不織布を構成する繊維は生体適合性繊維であって、水溶性ポリマーは繊維の形態で当該不織布に含有されるものとして記載する。
【００２９】
本発明の不織布が水溶性ポリマーを含む場合、不織布に含まれる水溶性ポリマー量は特に制限されず、用いる水溶性ポリマーの種類等に応じて適宜設定することができる。また、特に上記〔１〕の場合、生体適合性繊維に含まれる生体適合性ポリマーと水溶性ポリマーの含有比率は、特に制限はされないが、生体適合性ポリマー含量を１０質量部とした場合、水溶性ポリマー含量は好ましくは０．５〜１０質量部、より好ましくは１〜８質量部、さらに好ましくは３〜６質量部、よりさらに好ましくは２〜５質量部である。
【００３０】
またさらに、本発明の不織布が水溶性ポリマーを含む場合、複数種の含有形態を備えてもよい。つまり、不織布を構成する生体適合性繊維が生体適合性ポリマー及び水溶性ポリマーを含んでなり、かつ当該生体適合性繊維の表面に水溶性ポリマーが付着していてもよい。（これは上記〔１〕及び〔２〕の水溶性ポリマー含有形態を備える不織布である。）  なお、水溶性ポリマーとしては、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸プロピレングリコールエステル、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、キサンタンガム、コンドロイチン硫酸ナトリウム、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール（例えば、マクロゴール１５００、マクロゴール４０００、マクロゴール６０００、マクロゴール２００００など）、メチルセルロース、アクリル樹脂アルカノールアミン液、カルボキシビニルポリマー、ゼラチン、デキストラン（例えばデキストラン７０：分子量約７００００のデキストラン）、デキストリン、バレイショデンプン、ヒアルロン酸ナトリウム、ヒドロキシエチルメチルセルロース、ポリアクリル酸ナトリウム、ポリアクリル酸部分中和物、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール（例えば、ポリオキシエチレン（１６０）ポリオキシプロピレン（３０）グリコール、ポリオキシエチレン（２００）ポリオキシプロピレン（７０）グリコールなど）、ポリソルベート（例えばポリソルベート８０など）、水アメ、メタリン酸ナトリウム、メチルビニルエーテル・無水マレイン酸共重合体などが例示される。中でも、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシビニルポリマーが好ましい。水溶性ポリマーは１種単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００３１】
さらにまた、本発明に用いる骨補填材は、生体適合性ポリマーでコーティングされているものが、より好ましい。生体適合性ポリマーでコーティングされた骨補填材は、不織布により強く吸着される（すなわち、不織布の骨補填材保持性が向上する）。
【００３２】
当該コーティングに用いられる生体適合性ポリマーとしては、上記生体適合性繊維に含まれる生体適合性ポリマーについて述べたのと同様である。すなわち、生体吸収性ポリマーや生体分解性ポリマーが例示でき、より具体的には、生体適合性ポリマーとしては、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸−ポリグリコール酸共重合体、ポリカプロラクトン、ポリブチレンサクシネート、ポリエチレンサクシネート、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリヘキサメチレンカーボネート、ポリアリレート、ポリビニルイソシアネート、ポリブチルイソシアネート、ポリメチルメタクリレート、ポリエチルメタクリレート、ポリノルマルプロピルメタクリレート、ポリノルマルブチルメタクリレート、ポリメチルアクリレート、ポリエチルアクリレート、ポリブチルアクリレート、ポリアクリロニトリル、ポリビニルアセテート、ポリビニルメチルエーテル、ポリビニルエチルエーテル、ポリビニルノルマルプロピルエーテル、ポリビニルイソプロピルエーテル、ポリビニルノルマルブチルエーテル、ポリビニルイソブチルエーテル、ポリビニルターシャリーブチルエーテル、ポリビニルクロリド、ポリビニリデンクロリド、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、ポリ（Ｎ−ビニルカルバゾル）、ポリ（４−ビニルピリジン）、ポリビニルメチルケトン、ポリメチルイソプロペニルケトン、ポリエチレンオキシド、ポリプロピレンオキシド、ポリシクロペンテンオキシド、ポリスチレンサルホン、テフロン（登録商標）（ポリテトラフルオロエチレン）、ポリシアノアクリレート、ポリエーテルエーテルケトン、ポリウレタン、ポリイミド、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン（超高分子量ポリエチレン含む）、ポリプロピレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリフッ化ビニリデン（ポリビニリデンジフルオライド）、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン並びにこれらの共重合体等の合成ポリマー、再生セルロース、セルロースジアセテート、セルローストリアセテート、メチルセルロース、プロピルセルロース、ベンジルセルロース、フィブロイン、天然ゴム等の生体高分子とその誘導体が例示される。また、キチン、ゼラチン、コラーゲン、ポリアミノ酸（ポリリジン、ポリアルギニン）、ヒアルロン酸、セリシン、デキストラン、プルラン等も例示される。
【００３３】
これらのうち、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸−ポリグリコール酸共重合体、ポリヒドロキシ酪酸、ポリカプロラクトン、ポリエチレンアジペート、ポリブチレンアジペート、ポリブチレンサクシネート、ポリエチレンサクシネート及びポリシアノアクリレート、並びにこれらの共重合体などの脂肪族ポリエステル、ポリブチレンカーボネート、ポリエチレンカーボネートなどの脂肪族ポリカーボネートを好ましい例として挙げることができ、更に好ましくはポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸−ポリグリコール酸共重合体、ポリカプロラクトンが挙げられる。なかでもポリ乳酸が特に好ましい。骨補填材をコーティングする生体適合性ポリマーは、１種単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００３４】
なお、本発明の効果を損なわない範囲で、他のポリマーや化合物（例えばポリマー共重合体、ポリマーブレンド、リン脂質、その他化合物等、及びこれらの混合物）を併用してもよい。
【００３５】
特に、生体適合性繊維に含まれる生体適合性ポリマーと、骨補填材をコーティングしている生体適合性ポリマーとが、同じであることにより、不織布の骨補填材保持性がより向上するため、好ましい。具体的な最適態様の例として、生体適合性繊維に含まれる生体適合性ポリマーと、骨補填材をコーティングしている生体適合性ポリマーとが、いずれもポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸−ポリグリコール酸共重合体、又はポリカプロラクトンであるものが挙げられる。
【００３６】
ここでいう「コーティング」は、骨補填材の表面の１００％が生体適合性ポリマーで覆われた状況のみを指すのではなく、骨補填材の表面に生体適合性ポリマーが幾分か付着しているような状況を包含する。例えば、骨補填材の表面の３０％以上（好ましくは５０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは９０％以上）に生体適合性ポリマーが付着している状況も包含する。
【００３７】
骨補填材を生体適合性ポリマーでコーティングする方法は特に制限されない。例えば、生体適合性ポリマーが溶解した溶液に骨補填材を浸漬させて取り出し、必要に応じて乾燥させるといった方法が例示される。また例えば、生体適合性ポリマーが溶解した溶液を骨補填材に対して噴霧する方法が例示される。生体適合性ポリマーを溶解させる溶剤は、特に制限されず、生体適合性ポリマーの種類に応じて公知の溶剤を適宜選択して用いることができる。
【００３８】
不織布を構成する繊維の平均繊維径は、好ましくは０．０５〜２０μｍ程度、より好ましくは０．１〜５μｍ程度、さらに好ましくは０．１〜３μｍ程度である。当該平均繊維径であれば、特に骨芽細胞が接着し易く、骨再生効率が向上するため有利である。なお、ここでの繊維径は繊維の直径をいう。また、当該平均繊維径は、該不織布の電顕撮影映像から各繊維の直径を測定し、ランダムに選択した５０本の繊維径から算出した平均値をいう。
【００３９】
不織布の厚みは、不織布が適用される患部（骨欠損部位）の大きさにあわせて、適宜設定することができる。好ましくは０．１〜５ｃｍ程度、より好ましくは０．１〜１ｃｍ程度、さらに好ましくは０．１〜０．５ｃｍ程度である。なお、ここでの不織布の“厚み”は、当該不織布の厚み方向に圧力をかけずに測定した厚みをいう。測定には厚み計（Ｄｉｇｉｔａｌ  ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ  ｇａｕｇｅ、尾崎製作所、ＤＧ−２０５Ｍ）などを用いることができる。
【００４０】
本発明の不織布のかさ密度（(ｇ／ｃｍ３)、即ち、｛不織布重量(ｇ)／不織布体積(ｃｍ３)｝）は、０．１〜０．６程度が好ましく、０．１〜０．５程度がより好ましく、０．１〜０．４程度がさらに好ましく、０．１〜０．３程度がよりさらに好ましく、０．１５〜０．２５程度がなお好ましく、０．１９〜０．２４程度が特に好ましい。含有される骨補填材がβ-TCP又はα-TCPである場合、特に、かさ密度が当該範囲であることが好ましい。なお、ここでの不織布体積は、不織布を長方形に切断（約４ｃｍ２程度）し、縦、横、及び厚みの長さを上述の厚み計で測定し、縦、横、厚みの長さを乗じて求めた体積（ｃｍ３）である。
【００４１】
本発明の不織布の空隙率は、７８．５〜９７％程度が好ましく、８０〜９７％程度、８５〜９７％程度、９０〜９７％程度、９０〜９５％程度、９１〜９５％程度、９１．５〜９５％程度、９２〜９５％程度、がこの順に好ましい。なお、空隙率（％）は、不織布を構成する繊維及び骨補填材そのものの密度（真密度）から求めることができる。すなわち、本発明の不織布１ｃｍ３あたりに含まれる繊維の重量、及び骨補填材の重量を、それぞれの真密度で除することにより、当該繊維及び当該骨補填材のそれぞれが占める体積を求めることができるので、これらの体積（ｃｍ３）の合計値を１（ｃｍ３）から減じ、これに１００を乗じることで、当該不織布の空隙率（％）を求めることができる。
【００４２】
なお、本発明の不織布が水溶性ポリマーを含有する場合、不織布の空隙率（％）は、本発明の不織布１ｃｍ３あたりに含まれる水溶性ポリマーの重量を当該ポリマーの密度で除した値（体積）を、１（ｃｍ３）からさらに減じてから計算すればよい。
不織布の空隙率（％）を求める式は次の通りである。
【００４３】
[1-{(繊維重量/繊維真密度)+(骨補填材重量/骨補填材真密度)}]×100
但し水溶性ポリマーを含む場合は、
[1-{(繊維重量/繊維真密度)+(骨補填材重量/骨補填材真密度)+(水溶性ポリマー重量/水溶性ポリマー密度)}]×100
【００４４】
また、上記繊維が占める体積（ｃｍ３）を、上記骨補填材が占める体積（ｃｍ３）を１（ｃｍ３）から減じた値で除し、これに１００を乗じることにより、不織布の繊維部分の空隙率（％）を求めることもできる。
【００４５】
なお、本発明の不織布が水溶性ポリマーを含有する場合、不織布の繊維部分の空隙率（％）は、上記繊維及び上記水溶性ポリマーが占める体積（ｃｍ３）が占める体積（ｃｍ３）を、上記骨補填材が占める体積（ｃｍ３）を１（ｃｍ３）から減じた値で除し、これに１００を乗じることにより求める。
不織布の繊維部分の空隙率（％）を求める式は次の通りである。
【００４６】
[1-(繊維重量/繊維真密度)/{1-(骨補填材重量/骨補填材真密度)}]×100
但し水溶性ポリマーを含む場合は、
[1-{(繊維重量/繊維真密度)+(水溶性ポリマー重量/水溶性ポリマー密度)}/{1-(骨補填材重量/骨補填材真密度)}]×100
【００４７】
不織布の繊維部分の空隙率は、８５〜９９．９９％程度が好ましく、９０〜９９．９９％程度がより好ましく、９７．５〜９９．９９％程度がさらに好ましく、９８〜９９．８％程度がよりさらに好ましい。
【００４８】
なお、本明細書において、真密度は、定容積膨張法で求めた値である。真密度の測定には、例えば乾湿自動密度計（アキュピック１３３０；島津製作所）を用いることできる。
【００４９】
不織布の空隙率、不織布の繊維部分の空隙率が、上記の範囲であれば、特に細胞が浸潤し易く、また体液・血液等の通液性も高く、組織再生時において新生血管が侵入し易い点で有利である。なお、本発明の不織布の繊維部分の空隙率は、通常の不織布と比べて高い空隙率となっている。限定的な解釈を望むわけではないが、骨補填材を繊維間に含むことにより、高い空隙率が生じるものと考えられる。この高い繊維部分の空隙率にもかかわらず、本発明の不織布は、圧力を加えても、当該圧力を無くせば（例えば手で押しても、その後手をのければ）厚みがある程度回復される。これも、骨補填材を繊維間に含むために奏される効果と考えられる。
【００５０】
本発明の不織布のポアサイズは、０．５〜５００μｍ程度が好ましく、１〜１００μｍ程度がより好ましく、２〜５０μｍ程度がさらに好ましく、３〜３０μｍ程度がよりさらに好ましく、６〜２０μｍ程度が特に好ましい。
【００５１】
なお、ここでの不織布のポアサイズとは、測定用サンプルとして本発明の不織布の表層を剥ぎ取ったものを用い、パーフルオロポリエステルを用いたハーフドライ法（ＡＳＴＭ  Ｅ１２９４−８９）により求められる最頻値（階級幅１μｍ）をいう。当該ポアサイズ測定には、capillary flow porometer（CFP-1200-AEL、 Porous Materials Inc）を用いることができる。
【００５２】
また、本発明の不織布では、部分によっては繊維が疎であったり密であったりする（すなわち、繊維分布の疎密構造が存在する）。繊維が密に存在する部分の繊維感距離は、５〜４０μｍ程度が好ましく、１０〜３０μm程度がより好ましく、１５〜２５μm程度がさらに好ましい。また、繊維が疎に存在する部分の繊維間距離は、約５０〜１００μｍ程度である。ここでの不織布の繊維間距離は、不織布の凍結ブロック切片を顕微鏡で観察して得た画像から繊維を検出し、検出した繊維のデータから重心間距離法により求められる値である。
【００５３】
本発明の不織布の骨補填材比率は、１０〜９８％程度が好ましく、５０〜９８％程度がより好ましく、８０〜９８％程度がさらに好ましい。
【００５４】
なお、ここでの骨補填材比率とは、
｛不織布に含まれる骨補填材（ｇ）／不織布（ｇ）｝×１００（％）
で求められる値をいう。不織布に含まれる骨補填材（ｇ）は、本発明の不織布中を構成する繊維（及び必要に応じて水溶性ポリマー）を溶媒（ジクロロメタンやエタノールなど）により溶解した後（つまり、不織布の繊維部分を溶解した後）の残渣の重量を測定して求めた値である。
【００５５】
なお、骨補填材として、生体適合性ポリマーでコーティングされた骨補填材を用いる場合、上記の骨補填材に関する数値（骨補填材重量、骨補填材真密度、骨補填材比率、骨補填材が占める体積など）は、生体適合性ポリマーのコーティング部分も含めて「骨補填材」として算出する。 
【００５６】
本発明の不織布は、エレクトロスピニング法により製造することができる。エレクトロスピニング法は、不織布を製造する手法の一つとして周知の方法である。具体的には、ポリマー（及び、必要に応じて分散補助剤）を揮発性溶媒（例えばクロロホルム、ジクロロメタン、ヘキサフルオロイソプロピルアルコール、又はこれらの混合溶液等）に溶解した溶液を、電極間で形成された静電場中に吐出し、溶液を電極（アース電極）に向けて曵糸することにより、繊維状物質を製造する方法である。エレクトロスピニング法のごく簡単な概要を図１に示す。なお、図１は例示である。公知のエレクトロスピニング法であり、本発明の不織布を製造できる方法であれば、本発明の不織布の製造に用いることができる。図１を簡単に説明する。高電圧を、シリンジ（先端にノズル装着）中のポリマー溶解溶液に付加すると、ポリマー溶液のドロップが鋭い円錐となる。そして、さらに電圧が増すと、溶液はアース電極（例えば銅、アルミ等）に向かって飛ぶ（噴霧される）ことになり、アース電極上で薄い繊維の膜（即ち不織布）を形成する。つまり、図１では、アース電極がコレクターを兼ねる。
【００５７】
本発明において、エレクトロスピニング法に使用する生体適合性ポリマー溶解溶液中の生体適合性ポリマーの濃度は、適宜設定できるが、通常１〜３０質量％程度、好ましくは２〜２５質量％程度、より好ましくは３〜２０質量％程度である。
【００５８】
また、電極間の距離（図１ではシリンジとアース電極間の距離）は、帯電量、ノズル寸法、紡糸液流量、紡糸液濃度等に依存しており、適宜設定することができるが、例えば印加電圧が１０ｋＶ程度のときには５〜５０ｃｍ程度が好ましく、１０〜３０ｃｍ程度がより好ましい。また、印加される静電気電位は、通常３〜１００ｋＶ程度、好ましくは５〜５０ｋＶ程度、さらに好ましくは５〜３０ｋＶ程度である。
【００５９】
本発明の不織布を製造工程では、エレクトロスピニング法により不織布を製造する途中で、骨補填材が供給される。具体的には、例えば、エレクトロスピニング法により、生体適合性ポリマー溶解溶液を少量噴霧して不織布を製造し、適当量の骨補填材を当該不織布上へ分散させた後、さらに生体適合性ポリマー溶解溶液を噴霧する、という工程により本発明の不織布を製造することができる。好ましくは、当該工程を数回〜数十回（具体的には２〜５０回程度、好ましくは５〜１０回程度）繰り返して本発明の不織布は製造される。言い換えれば、本発明の不織布の製造方法は、当該工程含み、好ましくは数回〜数十回の当該工程の繰り返しを含む。好ましい製造方法の一態様として、生体適合性ポリマー溶解溶液を０．５〜１．５μＬ／ｓｅｃの割合で噴霧し、１５分おきに０．１〜０．２ｇの骨補填材を添加するという方法が例示できる。当該例示方法においては、骨補填材は合計添加量が１〜２ｇ程度になるまで添加される。
【００６０】
また、例えば、生体適合性ポリマー溶解溶液を少量噴霧して不織布を製造し、適当量の骨補填材を当該不織布上へ分散させた後、さらに生体適合性ポリマー溶解溶液を噴霧する前に、当該骨補填材に生体適合性ポリマーが溶解した溶液を噴霧して、骨補填材を生体適合性ポリマーでコーティングすることもできる。
【００６１】
なお、エレクトロスピニング法では、製造される不織布の厚さが厚くなるにつれ、当該不織布が存在するためにアース電極が負に帯電しにくくなったり、あるいは、当該不織布自体が正に帯電してしまうなどする。
【００６２】
ポリマー溶解溶液に正の電圧を印加し、噴霧先の電極に負の電圧を印加して、これらの電位差によってポリマー溶解溶液を噴霧しているところ、アース電極が負に帯電しにくくなったり、あるいは、当該不織布自体が正に帯電してしまうなどすると、生体適合性ポリマー溶解溶液が噴霧されにくくなる。このため、従来エレクトロスピニング法により、比較的厚い不織布を得ることは困難であった。本発明では、比較的厚い不織布を製造するために、次のような工夫を施すことが好ましい。
【００６３】
当該工夫としては、例えば、アース電極として金属板（例えばアルミや銅の板）を用いるだけでなく、当該板上に突起（好ましくは円柱状又は円錐状）が備えられていることが好ましい。さらに、当該突起は、上下に可動であることが好ましい。このような突起を備えたアース電極であれば、不織布の厚さが厚くなり、アース電極が負に帯電しにくくなった場合に、当該突起を上昇させることにより、アース電極をさらに負に帯電させることが可能となる。当該突起は、金属板上に例えば１〜３ｃｍ程度の間隔で格子状に備えられることが好ましい。また、当該突起の断面積は、０．００１〜０．５ｃｍ２程度が好ましく、０．０１〜０．１ｃｍ２程度がより好ましい。本発明は、このような構成を備えたエレクトロスピニング用アース電極も包含する。なお、後述するように、図２は、このような構成を備えたエレクトロスピニング用アース電極（せり出し形アース電極）の一態様を示す。
【００６４】
また例えば、既に紡糸された不織布を除電処理して、正に帯電するのを防ぐのも効果的な工夫である。除電処理は、例えばイオナイザ（除電器）を用いることにより行い得る。また、例えば、エタノールをスプレーすることでも除電処理することができる。正電荷を帯びた不織布にエタノールをスプレーすると、エタノールが正電荷を帯びた状態で蒸発するため、不織布に帯電している正電荷を除去する効果があるためである。
【００６５】
また、本発明の不織布がさらに水溶性ポリマーを含む場合の製造方法としては、上記のようにして製造した骨補填材含有不織布を水溶性ポリマーが溶解した溶液に浸漬させる方法（溶液浸漬法）や、又は骨補填材含有不織布に水溶性ポリマーが溶解した溶液をスプレーしたりする方法（溶液スプレー法）の他、エレクトロスピニング法に使用する生体適合性ポリマー溶解溶液中に併せて水溶性ポリマーを溶解させておく方法（混合溶液紡糸法）や、エレクトロスピニング法により生体適合性ポリマー溶解溶液を噴霧する際、同時に水溶性ポリマー溶解溶液をも同様に噴霧する方法（溶液同時紡糸法）等が例示される。ここで括弧書きで示した方法名は本発明の発明者が名付けたものである。
【００６６】
上述した不織布が水溶性ポリマーを含有する場合の各形態のうち、例えば、形態〔１〕の不織布は混合溶液紡糸法により、形態〔２〕の不織布は溶液浸漬法や溶液スプレー法により、形態〔３〕の不織布は溶液同時紡糸法により、それぞれ製造することができる。
【００６７】
なお、混合溶液紡糸法を用いる場合は、紡糸後にエタノール（含水エタノールでもよい）を適量スプレーし、水溶性ポリマーを湿らすことで、接着性をさらに向上させる（すなわち、不織布の骨補填材保持性を向上させる）ことが可能であり、好ましい。
【００６８】
また、溶液同時紡糸法を用いる場合は、生体適合性ポリマー溶解溶液と水溶性ポリマー溶解溶液とが、いずれも正の電圧が印加されていることから電荷的に反発するため、これらの溶液のノズルをトラバース（ノズルの水平移動を意味する）することが好ましい。トラバースにより、両ポリマーの繊維がよりまんべんなく混合した不織布を得ることができる。
【００６９】
これらの方法の中でも、混合溶液紡糸法、溶液浸漬法、溶液スプレー法が好ましい。
【００７０】
本発明の不織布は、細胞培養の足場として用いた場合、非常に細胞（特に骨芽細胞）の増殖効率を高める（細胞増殖能を高める）ため、細胞培養足場材として、さらには骨再生用材料として、好適に用いることができる。具体的には、外的要因（例えば事故）により骨が損傷した場合や、内的要因（例えば骨粗鬆症、歯周病）により骨が少なく又は無くなった場合に、本発明の不織布を適用することで、（具体的には、患部に埋めたり貼付したりすることで）早期の骨の再生を達成することができる。特に、本発明の不織布は、従来の不織布では不可能であった程度の厚みを備えることができるため、従来の骨補填材と同様に、骨再生をすべき部位（患部）へ埋め込むことにより、骨再生を促進させるという用い方ができる。
【００７１】
特に、本発明の不織布では、不織布の繊維に骨補填材を絡めて保持させたことで、骨補填材の留置性が高く、また、適度な靭性を有するため、患部が複雑な形状であっても容易に適用する（埋め込む）ことができる。また、細胞通過性及び通液性にも優れる。
【００７２】
制限はされないが、本発明の不織布は、特にインプラント治療における歯槽骨の再生のために好ましく用いることができる。
【００７３】
従来、ＧＢＲ法（Guided Bone Regeneration法：骨再生誘導療法）では、歯槽骨を再生させるエリアへ骨補填材を充填した後、骨組織再生を妨げる歯肉組織や上皮組織が当該エリア内へ浸潤するのを抑制するために、遮蔽膜を適用しなければならなかった（すなわち、骨補填材と遮蔽膜を“順次”適用して併用設置しなければならなかった）。このため、当該エリアに、まず骨補填材を充填し、次に遮蔽膜を適用することとなるので、施術者の手間が大きく、また施術者には高度な技術が求められていた。一方、本発明の不織布を骨補填材の代わりに用いる場合には、遮蔽膜と一緒に“一度に”適用することができるので、施術者の手間が軽減され、また従来に比べて技術的にも簡単に適用することができる。特に、従来骨補填材が適用部位から漏れ出す場合もしばしばあったが、本発明の不織布を骨補填材の代わりに用いれば、このような問題は起こらない。また、本発明の不織布は柔軟性に優れるため、患部の形状にあわせて変形させてから適用することもできるし、あるいは患部の形状にあわせて切断してから適用することもできる。
【００７４】
さらに、本発明の不織布において、内部に含まれる骨補填材から外側までの長さを長くすることで（つまり、本発明の不織布の、歯肉組織や上皮組織に接する面の繊維層を厚くすることで）、歯肉組織や上皮組織の再生エリアへの浸潤を抑制する（つまり、遮蔽膜の機能を付加する）こともできる。この場合、本発明の不織布のみを、遮蔽膜及び骨補填材の代わりとして用いることができる。
【００７５】
また、上述のように、本発明の不織布は、エレクトロスピニング法により、“生体適合性ポリマー溶解溶液を少量噴霧して不織布を製造し、適当量の骨補填材を当該不織布上へ分散させた後、さらに生体適合性ポリマー溶解溶液を噴霧する”という工程を繰り返すことにより、製造することができるが、この製造過程を少し変更することにより、様々な形態の有用な不織布を製造することもできる。例えば、最初に生体適合性ポリマー溶解溶液を大量噴霧して広く厚めの不織布を製造し、その上の比較的狭い一部分にだけ、骨補填材を加えては生体適合性ポリマー溶解溶液を噴霧するという操作を繰り返すと、広く厚い不織布を土台として、その一部に骨補填材を含む不織布が盛り上がってなる、シルクハット状の不織布が得られる。シルクハットに見立てた場合、つばの部分が広く厚い土台の不織布であり、クラウンの部分が骨補填材を含む不織布である。このシルクハット状の不織布では、クラウン部分を、歯槽骨を再生させるべきエリアへ埋め込み、さらにつばの部分で歯肉組織や上皮組織が当該エリア内へ浸潤するのを抑制することができる。すなわち、当該シルクハット状の不織布は、遮蔽膜及び骨補填材の両方の機能を有する。
【００７６】
このように、本発明の不織布は、骨再生用材料として用いることができる。さらに、本発明の不織布に骨芽細胞等を付着させたもの又は添加したものも本発明に包含される。つまり、本発明は、上記不織布を含む骨再生用材料を包含し、当該骨再生用材料は、上記不織布からなるものであってもよいし、骨芽細胞をさらに含む上記不織布であってもよい。なお、骨芽細胞を含ませるには、例えば当該不織布を足場として短期間細胞を培養すればよい。
【００７７】
また、本発明の不織布は、骨芽細胞培養足場材として用いることができる。この場合において、上記の骨再生材料と同様の構成を有する不織布を、骨芽細胞培養足場材として用いることができる。
【００７８】
またさらに、本発明の不織布は、骨再生用材料として用い得ることから、例えば以下に記載する治療、術式又は用途に用いることができる。
＜歯周組織再生、口腔外科領域＞
骨縁下欠損、クラスII根分岐部病変、退縮型欠損、裂開型欠損における組織再生誘導法；顎堤の骨造成術、歯槽提増大術、インプラント周囲の骨造成術における骨再生誘導法；顎堤形成術；上顎洞底挙上術におけるサイナスリフト法；抜歯窩の保存におけるソケットプリザベーション法；鼻腔底挙上術；骨延長手術、骨壊死部分の掻爬後の骨充填、骨組織のがん病巣掻爬後の骨充填、外傷による骨折の治療のための骨充填における骨再建術；ブリッジ下の歯肉増大、歯肉退縮への根面被服、歯間乳頭再建、その他歯肉増大など審美目的での施術、等
＜整形外科領域＞
骨延長手術；骨壊死部分の掻爬後、骨組織のがん病巣掻爬後、外傷による骨折の治療、脊椎圧迫骨折、偽関節治療における骨再建術；骨延長手術：骨粗鬆症の治療における薬効成分のキャリアー材としての使用、等
【００７９】
なお、本発明は、上記本発明の不織布を、骨（好ましくは歯槽骨）を再生させるべき部位へ適用し、骨を再生させる方法も包含する。当該方法は、例えば上記治療、術式に用いることができる。
【実施例】
【００８０】
以下、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の例に限定されるものではない。なお、実験に際して当該技術分野の教科書等（例えばMolecular Cloning: A Laboratory Manual (3 Vol. Set) ；Cold Spring Harbor Laboratory Press）を適宜参照してもよい。
【００８１】
不織布の製造１
ポリ乳酸（三井化学、ＬＡＣＥＡ  、Ｈ−４００）７ｇに、ヘキサフルオロイソプロピルアルコール：ジクロロメタン＝８：２（質量比）の混合溶液４３ｇを加えて溶解させ、ポリ乳酸溶液を得た（１４w/w％）。当該ポリ乳酸溶液をシリンジ（Ｈｅｎｋｅ  ＳＡＳＳ  ＷＯＬＦ、５ｍＬ）に充填し、針（テルモ、ノンベベル針２１Ｇ１．１／２）をシリンジに装着して、エレクトロスピニング装置にセットした。シリンジからターゲットとなるアースとの距離を８ｃｍとし、印加電圧１０ｋＶにて、表１に示す条件で、噴霧量や噴霧時間をそれぞれ変化させ噴霧した。噴霧の間、１５分おきに骨補填材（オスフェリオン／オリンパステルモバイオマテリアル株式会社）をできるだけまんべんなく添加した。当該添加は、合計添加量が２ｇになるまで行った。なお、用いた骨補填材（オスフェリオン）の粒径は０．５〜１．５ｍｍ（規格値）である。骨補填材全量を添加終了後、さらに１５分間ポリ乳酸溶液を噴霧した。このようにして、表１に示す４種の不織布を製造した。
【００８２】
なお、製造にあたっては、アース電極（コレクターを兼ねる）として、上下可動の銅製の突起を備えたアルミ板を用いた。当該アース電極の概要を図２に示す。上記の噴霧の間、１５分おきに当該銅製突起を０．５ｍｍずつ上昇させた。
【００８３】
【表１】
2014057841.tif 000002
【００８４】
不織布の物性評価１
以下の手順により、上記４種の不織布（サンプル０、１、２、３）の厚み、かさ密度、骨補填材比率、及び不織布を構成する繊維の繊維径を測定した。
【００８５】
サンプルをそれぞれ長方形に切断（約４ｃｍ２程度）し、重量を測定した。測定サンプルの縦、横、及び厚みの長さを厚み計（Ｄｉｇｉｔａｌ  ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ  ｇａｕｇｅ、尾崎製作所、ＤＧ−２０５Ｍ）で測定し、縦、横、厚みの長さを乗じて体積（ｃｍ３）を求めた。なお、厚みは、２０箇所の測定値の平均値とした。
【００８６】
サンプル重量と体積から、かさ密度を次の式により求めた。
かさ密度（ｇ／ｃｍ３）＝サンプル重量（ｇ）／サンプル体積（ｃｍ３）
さらに、カットした各サンプルをそれぞれコニカルチューブに入れ、５０ｍＬのジクロロメタンを加え、サンプル中のポリ乳酸を溶解した。次にコニカルチューブに沈殿を残し、上清を除去した。当該沈殿のジクロロメタンを蒸発させ、残った沈殿の重量を測定し、骨補填材の重量とした。そして、骨補填材比率を次の式により求めた。
骨補填材比率(％)＝(ジクロロメタン不溶解物(沈殿)／用いたサンプル重量)×１００
【００８７】
また、走査型電子顕微鏡（株式会社日立ハイテクノロジー、Ｓ−３４００Ｎ）を用いて各サンプル断面を撮影し、５００倍の電顕撮影映像からＩｍａｇｅ  Ｊ（ｖｅｒ．１．４３ｕ）（ＮＩＨ開発の画像処理ソフトフェア）により繊維径を測定した。繊維５０本の繊維径の平均値を、各サンプルの繊維径とした。
【００８８】
なお、各サンプルの断面写真を図３に示す。図３では、Ａがサンプル０を、Ｂがサンプル１を、Ｃがサンプル２を、Ｄがサンプル３を、それぞれ示す。図３から、サンプル０に比べ、サンプル１〜３が、骨補填材を取り込むことで厚みのある不織布となっていることが確認できた。また、走査型電子顕微鏡によるサンプル３の断面の撮影図を図４に示す。図４には、あわせて模式図も示す。
【００８９】
以上の物性評価の結果を表２に示す。
【００９０】
【表２】
2014057841.tif 000003
【００９１】
またさらに、サンプル１〜３について、不織布の空隙率（％）、及び不織布の繊維部分の空隙率（％）を算出した。計算には、ポリ乳酸の真密度として１．２６ｇ／ｃｍ３、骨補填材（オスフェリン）の真密度として３．１７ｇ／ｃｍ３、の各値を用いた。結果を表３に示す。なお、当該真密度値は、乾湿自動密度計（アキュピック１３３０；島津製作所）により求めた値である。
【００９２】
【表３】
2014057841.tif 000004
【００９３】
骨補填材を含まないポリ乳酸の不織布（サンプル０）は、厚さが0.163mmと薄く、特に患部（骨欠損部）に充填して用いる骨再生用材料としては、十分な厚さとはいいがたいものであったが、骨補填材を添加したポリ乳酸不織布（サンプル１〜３）は、厚さ２〜３mmの比較的厚手の不織布であって、手で押さえても手を離せば厚みが回復するものであり、骨再生用材料としても好適なものと考えられた。
【００９４】
不織布の細胞増殖能評価
以下の手順により、各不織布（サンプル１〜３）の細胞増殖能を検討した。具体的には、各サンプルにより増殖した細胞のＤＮＡ量を測定して、細胞増殖能を検討した。
【００９５】
＜細胞培養＞
各不織布サンプル（サンプル１〜３）を４８穴シャーレ（住友ベークライト(株)、ＳＵＭＩＬＯＮ、ＭＳ−８０４８０）の底面と同じ大きさにカットし、４８穴シャーレの底に置いた。これらには、約５０ｍｇ分の骨補填材が含まれる。また、コントロールサンプルとして、骨補填材（オスフェリオン）約５０ｍｇをそのまま４８穴シャーレの底に置いた。
【００９６】
各評価サンプルの上に、ステンレス管（ペニシリンカップ）を置き、さらに１０％ＦＢＳ／ＭＥＭ培地（抗生物質とグルタミン酸を加えた１０％ＦＢＳ／ＭＥＭ培地：以下の「１０％ＦＢＳ／ＭＥＭ培地」も同様）を５００μＬ加えた。プレート遠心機にて５ｍｉｎ遠心し（２５００ｒｐｍ、室温）、減圧脱気して、さらに５ｍｉｎ遠心した（２５００ｒｐｍ、室温）。そして、２００μＬの１０％ＦＢＳ／ＭＥＭ培地を加え、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で、１ｈｒ以上インキュベートした。培地を５００μＬ吸い取って除去し、ヒト骨肉腫由来細胞ＭＧ−６３を１．６×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように１０％ＦＢＳ／ＭＥＭ培地に懸濁し、これを１００μＬずつ各ｗｅｌｌに播種した（１．６×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）。５時間インキュベートし、細胞を評価サンプルに付着させた後、２００μＬの１０％ＦＢＳ／ＭＥＭ培地を加え、培養した。培養１日、３日、８日後のサンプルを細胞増殖能評価に使用した。
【００９７】
＜細胞増殖能の測定＞
培養後、細胞の付着した各評価サンプル（不織布）を取り出し、それぞれＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）の入ったシャーレに加えた。ＰＢＳを含んだ状態の重量を測定し、乾燥重量とＰＢＳを含んだ状態の評価サンプル重量から吸水量（ＰＢＳを含んだ状態の評価サンプル重量から、評価サンプルの実験に供される前の乾燥重量（シャーレ底面と同じ大きさにカットした時点で測定）を減じた量）を求めた。
【００９８】
サンプルの吸水量とＴＥ緩衝液（Tris/Tris-HCl 10 mM、 EDTA 1mM）を合わせた溶液量が１２００μＬとなるようにＴＥ緩衝液を各シャーレに加えた。２回凍結融解（−８０℃で凍結させ、室温で融解させる操作を２回繰り返した）を行い、その後超音波処理を３０分行って、細胞を破砕した。ＴＥ緩衝液中にＤＮＡを溶出させた１００μＬの細胞溶解液（凍結融解及び超音波処理を行って得た細胞破砕液）を９６穴蛍光測定用プレート（Ｎｕｎｃ  ｂｌａｃｋ  ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ、ｃａｔ．１３７１０１）に加え測定サンプルとした。
【００９９】
ピコグリーン（インビトロジェン）をＴＥ緩衝液で希釈（１００μＬを２０ｍＬに希釈）し、測定サンプルに１００μＬ加え、５分間、室温でインキュベートした。蛍光プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｅｖｉｃｅｓ  ｓｐｅｃｔｒａ  Ｍａｘ  ｇｅｍｉｎ  ＸＰＳ）を用い、励起光４８０ｎｍ・測定波長５２０ｎｍで、蛍光強度を測定した。ピコグリーンは、２本鎖ＤＮＡ特異的染色剤であるため、得られた蛍光強度はＤＮＡ量（ひいては細胞数）を反映する。結果を図５に示す。骨補填材のみ（コントロール）を用いた場合に比べ、骨補填材を含む厚手のポリ乳酸不織布（サンプル１〜３）には、多数の細胞が付着し増殖することが確認できた。従って、これらの不織布は、骨再生材料として優れることがわかった。
【０１００】
不織布のポアサイズ測定
不織布のポアサイズ（最頻値）は、パーフルオロポリエステルを用いたハーフドライ法（ＡＳＴＭ  Ｅ１２９４−８９）により測定（直径７ｍｍの円形測定アダプターを使用）した。なお、測定機器はcapillary flow porometer（CFP-1200-AEL、 Porous Materials Inc）を用いた。また、最頻値を求める際の階級幅は１μｍとした。
【０１０１】
不織布の製造２
ポリ乳酸(エボニックデグサジャパン株式会社、RESOMER（登録商標）、L 206S)5gに、ヘキサフルオロイソプロピルアルコール：ジクロロメタン=8:2（質量比）の混合溶液45gを加えて溶解させ、ポリ乳酸溶液を得た(10重量%)。当該ポリ乳酸溶液をシリンジ(Henke SASS WOLF、5mL)に充填し、エレクトロスピニング装置(株式会社メック、NF-103A)にセットした。シリンジからターゲットとなるアース電極(4 x 4cmのアルミブロック：図２に示すものと同機構)との距離を22cmとし、印加電圧15kVにて、噴霧量1ml/hour、噴霧合計時間90minの条件で噴霧した。噴霧の間、3分おきに0.033gの骨補填材(オリンパステルモバイオマテリアル株式会社、オスフェリオンG1)、及びその骨補填材をより細かく破砕し、篩にて粒径を調節したものをまんべんなく添加した。当該添加は、30回、合計添加量が約1gになるまで行った。このようにして、表４に示す５種の不織布（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥ）を作製した。
【０１０２】
また、ブロック状（20mm×10mm×3.5mmの直方体状）のオスフェリオン（オスフェリオンＡ１）を骨補填材として用いて、同様に不織布を作製した。当該不織布を不織布Ｆとする（表４）。
【０１０３】
【表４】
2014057841.tif 000005
【０１０４】
不織布の物性評価２
以下の手順により、不織布A〜Ｆの厚み、かさ密度、骨補填材比率、及び不織布を構成する繊維の繊維径を測定及び算出した。
【０１０５】
各サンプルをそれぞれ4 x 4cmの正方形に切出し、重量を測定した。サンプルの厚みをデジマチックマイクロメータ(株式会社ミツトヨ、CLM1-15QM)で測定した。厚みは20箇所の測定値の平均値とした。
【０１０６】
次に、上記「不織布の物性評価１」と同様にして、不織布Ａ〜Ｆのかさ密度、骨補填材比率、及び不織布を構成する繊維の繊維径を測定及び算出した。但し、繊維径については、５００倍ではなく２０００倍の電顕撮影映像を用いて求めた。
以上の物性評価の結果を表５に示す。なお、不織布Ｆは、ブロック状の骨補填材を用いて製造したために、他の不織布に比べてかさ密度が大きい。
【０１０７】
【表５】
2014057841.tif 000006
【０１０８】
またさらに、各不織布の空隙率(%)、及び各不織布の繊維部分の空隙率(%)を算出した。具体的には、計算には、ポリ乳酸の真密度として1.26g/cm3、骨補填材(オスフェリオン)の真密度として3.17 g/cm3を用い、上記「不織布の物性評価１」と同様にして算出した。但し、不織布Ｆは、ブロック状の骨補填材自体が多く空隙を含むため、不織布Ｆの繊維部分の空隙率を算出するときだけ、骨補填材の真密度として0.7065g/cm3を用いた。結果を表６に示す。
【０１０９】
不織布Ｆは、ブロック状の骨補填材を用いて製造したために、他の不織布に比べて不織布の繊維部分の空隙率が低い。このため、他の不織布に比べると、若干硬めの不織布であった。
【０１１０】
【表６】
2014057841.tif 000007
【０１１１】
不織布の製造３
使用ポリ乳酸溶液濃度を５重量％とし、エレクトロスピニング装置からの噴霧条件を噴霧量1 ml/hour、噴霧合計時間195 minとし、はじめに15 min噴霧した後、6 minおきに0.03 gの骨補填材を合計添加量が約1 gになるまで添加した以外は、上記「不織布の製造２」と同様にして、不織布αを製造した。
【０１１２】
不織布の物性評価３
上記「不織布の物性評価２」と同様にして、不織布αの厚み、かさ密度、骨補填材比率、及び立体不織布を構成する繊維の繊維径を測定及び算出し、さらに立体不織布の空隙率(％)、及び立体不織布の繊維部分の空隙率(％)を算出した。結果を表７及び表８に示す。
【０１１３】
【表７】
2014057841.tif 000008
【０１１４】
【表８】
2014057841.tif 000009
【０１１５】
不織布の製造４
アース電極を6×25cmのアルミブロックとして、噴霧条件を幅16 cm、噴霧量1 ml/hour、噴霧合計時間360 minとし、噴霧の間、6 minおきに0.135 gの骨補填材(オスフェリオン)を、59 回、合計添加量が約8 gになるまで、4×16 cmにまんべんなく添加した以外は、上記「不織布の製造２」と同様にして、不織布βを製造した。
【０１１６】
不織布の物性評価４
上記「不織布の物性評価２」と同様にして、不織布βの厚み、かさ密度、骨補填材比率、及び立体不織布を構成する繊維の繊維径を測定及び算出し、さらに立体不織布の空隙率(％)、及び立体不織布の繊維部分の空隙率(％)を算出した。結果を表９及び表１０に示す。
【０１１７】
【表９】
2014057841.tif 000010
【０１１８】
【表１０】
2014057841.tif 000011
【０１１９】
不織布の移植
不織布βを以下のようにしてラットへ移植し、結合組織の浸潤の程度を検討した。なお、ブロック状骨補填材そのもの（オスフェリオンＡ１）も同様にラットへ移植し、対照とした。
【０１２０】
SD系雄性ラット（8週齢、約200g）を購入し、実験動物とした。当該ラットに2.5%イソフルラン吸入麻酔を施し、術部である背部を剃毛し、さらにイソジンおよび消毒用アルコールにて消毒した。背部の皮膚を切開し、疎性結合織内に空隙を作製した。この空隙に不織布β又は骨補填材のブロック（10 x 10 x 5 mm、オリンパステルモバイオマテリアル社、オスフェリオンA1より切出）を埋植し、縫合糸で閉創した。埋植から2週後、2.5%イソフルランの吸入麻酔下にて腹部大動脈から放血を行い、移植を施したラットを安楽死させた。当該ラットの致死確認後、埋植した検体を周辺部も含めて採取した。採取したサンプルを、10%中性緩衝ホルマリン液（マイルドホルム（登録商標）、和光純薬工業株式会社製）に浸漬して固定した。その後、当該サンプルから凍結非脱灰組織切片を作製し、ヘマトキシリン-エオジン染色を施した。得られた組織切片標本を光学顕微鏡で観察した。結果を図６ａ及び図６ｂに示す。不織布βへの結合組織浸潤は、対照であるブロック状骨補填材のそれよりも良好であった。
【０１２１】
細胞浸潤性の検討１
＜細胞培養＞
不織布A〜Ｄを、直径約1cmの大きさにカットし、２４穴シャーレ（住友ベークライト（株）、ＳＵＭＩＬＯＮ、ＭＳ−８０４８０）の底に設置した。評価サンプルをペニシリンカップ（ステンレス管）で押さえ、抗生物質とグルタミン酸を加えた１０％ＦＢＳ／ＭＥＭ培地（以下特に断らない限り、単に「１０％ＦＢＳ／ＭＥＭ培地」と標記した場合でも抗生物質とグルタミン酸を含む）を１００００μＬ加えて湿らせ、減圧脱気した。３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で、１ｈｒ以上インキュベートした。事前に培養したＭＧ−６３（由来：ヒト骨肉腫、ヒューマンサイエンス研究資源バンク、Ｌｏｔ．０５２６２００４）を３．２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように１０％ＦＢＳ／ＭＥＭ培地に懸濁し、１００μＬずつ各ｗｅｌｌに播種した（３．２×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）。一晩培養した細胞を評価サンプルとして用いた。
＜細胞浸潤性評価＞
細胞を４％パラフォルムアルデヒド溶液で１ｈｒ固定し、PBSにて洗浄をした。その後、サンプルをドライアイス冷却下のヘキサンで凍結し、４％CMCに凍結包埋した。凍結サンプルを厚さ30μLで薄切し、ヘマトキシリン・エオシン染色（HE染色）を行った。薄切サンプルを正立顕微鏡で（オリンパス株式会社、BH-2）にて観察した。また、Image J ver 1.44を用い最大の細胞浸潤距離を測定した。結果を図７に示す。空隙率、繊維部分の空隙率の上昇とともに、細胞の浸潤性が高くなることが確認できた。
【０１２２】
不織布の製造５
噴霧合計時間120 minとし、噴霧の間、3 minおきに0.135 gの骨補填材(オスフェリオンG1)を、39 回、合計添加量が約5.3 gになるまで、4×16 cmにまんべんなく添加した以外は、上記「不織布の製造４」と同様にして、不織布γを製造した。
【０１２３】
細胞浸潤性の検討２
不織布β及び不織布γの細胞浸潤性を検討した。不織布β及びγについて、次のようにして細胞培養を行った。すなわち、直径約1cmの大きさにカットし、１０％ＦＢＳ／ＭＥＭ培地中で、減圧脱気し完全に湿らせた。そして、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で、１ｈｒ以上インキュベートした。事前に培養したＭＧ−６３（由来：ヒト骨肉腫、ヒューマンサイエンス研究資源バンク、Ｌｏｔ．０５２６２００４）を１．６×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように１０％ＦＢＳ／ＭＥＭ培地に懸濁し、各評価サンプルを細胞溶液１０ｍLに６０分浸した。サンプルは１５分毎に溶液内で静かに撹拌した。細胞液からサンプルを取り出し、24穴シャーレ（住友ベークライト（株）、ＳＵＭＩＬＯＮ、ＭＳ−８０２４０）の底に設置した。培地を1mL加え、ペニシリンカップ（ステンレス管）でサンプルを押さえ、一晩培養した。この細胞を培養した不織布をサンプルとし、細胞を４％パラフォルムアルデヒド溶液で１ｈｒ固定し、PBSにて洗浄をした。その後、サンプルをドライアイス冷却下のヘキサンで凍結し、４％CMCに凍結包埋した。凍結サンプルを厚さ30μLで薄切し、HE染色を行った。薄切サンプルを顕微鏡で（オリンパス株式会社、BH-2）にて観察し、細胞浸潤性を評価した。
【０１２４】
また上記「不織布のポアサイズ測定」と同様にして各不織布のポアサイズを測定した。但し、不織布β及びγのポアサイズを測定する際には、不織布の表層を剥ぎ取り、これを測定に用いた。
【０１２５】
以上の結果を図８に示す。図８のポアサイズは最頻値を示す。
【０１２６】
さらに、各不織布の繊維同士の間の距離（繊維間距離）を、次のようにして測定した。すなわち、測定するサンプル（不織布）をＰＢＳに浸漬し、減圧脱泡する。ＰＢＳが浸潤したサンプルを4%CMC（カルボキシメチルセルロース）ゲルに沈め、凍結ブロックを作成した。作成したブロックから厚さ2μmのサンプルを作成し、スライドガラスとカバーガラスの間に樹脂で封入した。薄切サンプルを位相差顕微鏡で撮影した。撮影した画像から繊維の断面を検出し、その繊維間距離を重心間距離法にて測定を行った。重心間距離法の解析は、「A像くん」（旭化成エンジニアリング、ver 2.20）を用いて行った。当該解析の概要を図９に示す。なお、このようにして測定した繊維間距離は、不織布βでは１８．４μｍ、不織布γでは２７．２μｍ、不織布サンプル２では３３．３μｍであった。
【０１２７】
細胞浸潤性の検討３（参考例）
細胞浸潤性と、不織布のポアサイズとの関係を解析するため、通常の不織布（平面不織布（i）〜（iii）：表１１）を製造し、細胞浸潤性を検討した。
【０１２８】
【表１１】
2014057841.tif 000012
【０１２９】
具体的には、ポリ乳酸ポリ乳酸(エボニックデグサジャパン株式会社、RESOMER（登録商標）、L 206S)5gに、ヘキサフルオロイソプロピルアルコール：ジクロロメタン=8:2（質量比）の混合溶液45gを加えて溶解させ、ポリ乳酸溶液を得た(10 重量%)。当該ポリ乳酸溶液をシリンジ(Henke SASS WOLF、5mL)に充填し、エレクトロスピニング装置(株式会社メック、NF-103A)にセットした。シリンジからターゲット(3x 3cmのアルミブロック)となるアースとの距離を25cmとし、印加電圧15kVにて、噴霧量1ml/hour、噴霧合計時間60minの条件で噴霧し、不織布（i）を作製した。また不織布（ii）（iii）は、それぞれ、異なる種類の回転式のドラムをアースに用いた点以外は、不織布（i）と同様にして作製した。  不織布（i）〜（iii）について、上記「細胞浸潤性の検討２」と同様にして、細胞浸潤性を検討した。但し、不織布（i）のポアサイズ測定においてのみ、最頻値を求める際の階級幅は０．１μｍとした。結果を図１０に示す。図１０のポアサイズは最頻値を示す。なお、図１０の「最大浸潤距離」は、HE染色組織切片の観察画像から求めた。また、それぞれの不織布の繊維間距離は、不織布（i）では７．３μｍ、不織布（ii）では１３．４μｍ、不織布（iii）では１５．８μｍであった。
【０１３０】
水溶性ポリマーを含ませた不織布の検討準備
不織布に、さらに水溶性ポリマーを含ませることにより、骨補填材の接着性がどのように変化するかを検討した。
【０１３１】
以下の検討では、ポリ乳酸（ＰＬＬＡ）として、エボニックデグサジャパン株式会社製のRESOMER、L206Sを用いた。
【０１３２】
＜水溶性ポリマー＞
また、水溶性ポリマーとして、以下に列記するポリマーを用いた。
HPC：ヒドロキシプロピルセルロース（日本曹達株式会社、NISSO-HPC、L）
PEG1500：ポリエチレングリコール（三洋化成株式会社、マクロゴール1500）
PEG6000：ポリエチレングリコール（三洋化成株式会社、マクロゴール6000）
CMC：カルボキシメチルセルロース（第一工業製薬株式会社、セロゲン、PR-S）
PVA：ポリビニルアルコール（日本合成化学株式会社、ゴーセノール、EG-05）
HPMC：ヒドロキシプロピルメチルセルロース（信越化学工業株式会社、TC-5、E）
CVP：カルボキシビニルポリマー（Lubrizol、カーボポール、71GNF）
【０１３３】
＜溶媒＞
また、溶媒として、次に記載するものを用いた。
DCM：ジクロロメタン（和光純薬、特級）
HFIP/DCM：ヘキサフルオロイソプロパノール（セントラル硝子、HFIP）とジクロロメタン（和光純薬、特級）の混合溶媒（質量比8/2）
【０１３４】
＜骨補填材＞
また、骨補填材として、次のようにして製造した「ＴＰＣ粒」を用いた。
βTCP（太平化学産業株式会社、βTCP-100） 10 gにポリアクリル酸アンモニウム（東亜合成、アロンA-30SL） 10 gを添加し、20分間超音波処理を行った。さらにポリオキシエチレンステアリルエーテル（日光ケミカルズ、NIKKOL BS-20） 2 gを加え、ミキサーで発泡させながら分散させたものを40℃で一晩放置した後、3時間かけて1000℃まで加熱し1000℃で40分間保持した後、自然冷却させ、TCP多孔体を得た。当該多孔体を乳棒及び乳鉢を用いて細かく砕き、ふるいによって粒径500-1500 mmのものを選別し、TCP粒とした。
【０１３５】
各種水溶性ポリマーによる骨補填材接着性改善効果の検討
PLLA 4 gにHFIP/DCM 36 gを加えて溶解させ、PLLA溶液を得た（10w/w％）。
HPC 0.2gに水 9.8 gを加えて溶解させHPC溶液を得た（2 w/w%）。同様にCMC溶液（2 w/w %）、PEG（PEG1500）溶液（2 w/w %）、PVA溶液（2 w/w %）、HPMC溶液（2 w/w %）、CVP溶液（2 w/w %）を調製した。
【０１３６】
PLLA溶液をシリンジ(Henke SASS WOLF、5mL)に充填し、エレクトロスピニング装置(株式会社メック、NF-103A)にセットした。シリンジからターゲットとなるアース電極との距離を30 cmとし、印加電圧20 kVにて、噴霧量1 ml/hour、噴霧合計時間120 min、トラバース距離20 cmの条件で噴霧してPLLA不織布を作製した。これを4 cm×4 cmに切断したものを検討に用いた。
【０１３７】
当該PLLA不織布（4 cm×4 cm）上にTCP粒50 mgをのせ、HPC溶液2 mLをマイクロピペットで上から添加し、当該ピペットの先で均一に塗り広げるようにして塗布し、室温で一晩乾燥させた。この不織布を反転させた時（すなわちＴＣＰ粒をのせた面を下方にした時）にTCP粒が落下するか否かを調べた。CMC溶液、PEG溶液、PVA溶液、HPMC溶液、CVP溶液についても同様に行い、対照として水でも実施した。
【０１３８】
水を塗布したものは全ての顆粒が落下したのに対し、各ポリマー溶液を塗布したものは、一粒の落下も認められなかった。当該結果を次の表１２に示す。
【０１３９】
【表１２】
2014057841.tif 000013
【０１４０】
当該結果から、水溶性ポリマーにより、骨補填材と不織布との接着性が大きく向上することが確認できた。
【０１４１】
骨補填材及び水溶性ポリマーを含有する不織布の製造
下述するように、骨補填材に加え水溶性ポリマーをも含有する不織布を、種々の製造方法を用いて製造した。なお、PEＧとしてはPEG6000を用いた。
【０１４２】
＜混合溶液紡糸法による不織布の作製＞
PLLA 3 g、HPC 1.5 gにHFIP/DCM 25.5 gを加えて溶解させ、PLLA/HPC混合溶液（10%/5%）を得た。PLLA 3 g、PEG 0.6 gにHFIP/DCM 26.4 gを加えて溶解させ、PLLA/PEG混合溶液（10%/2%）を得た。同様にPLLA/PEG6000混合溶液（10%/2%）を得た。
【０１４３】
PLLA/HPC混合溶液またはPLLA/PEG混合溶液をシリンジ(Henke SASS WOLF、5mL)に充填し、エレクトロスピニング装置(株式会社メック、NF-103A)にセットした。シリンジからターゲットとなるアース電極(4×4 cmのアルミブロック)との距離を27 cmとし、印加電圧15 kVにて、噴霧量1 ml/hour、噴霧合計時間30 minの条件で噴霧した。噴霧の間、3分おきに55.6 mgのTCP粒をまんべんなく添加した。当該添加はイオナイザ（春日電機株式会社、KD-750BB）による除電環境下で9回、合計添加量が約500 mgになるまで行った。最後にエタノール（SIGMA、特級）または30%エタノール水溶液を適量スプレーした後、乾燥させて２種の不織布を作製した。
【０１４４】
＜溶液スプレー法による不織布の作製＞
PLLA 4gにHFIP/DCM 36 gを加えて溶解させ、PLLA溶液を得た（10w/w％）。HPC 0.2 gにエタノール199.8 gを加えて溶解させ、HPC溶液を得た（0.1w/w%）。CMC 0.2 gに30%エタノール水溶液199.8 gを加えて溶解させ、CMC溶液を得た（0.1w/w％）。
【０１４５】
PLLA溶液をシリンジ(Henke SASS WOLF、5mL)に充填し、エレクトロスピニング装置(株式会社メック、NF-103A)にセットした。シリンジからターゲットとなるアース電極(4 ×4cmのアルミブロック)との距離を27 cmとし、印加電圧15 kVにて、噴霧量1 ml/hour、噴霧合計時間30 minの条件で噴霧した。噴霧の間、3分おきに55.6 mgのTCP粒をまんべんなく添加した。当該添加は、9回、合計添加量が約500 mgになるまで行った。TCP粒添加の際にHPC溶液またはCMC溶液を適量スプレーした。このようにして２種の不織布を作製した。
【０１４６】
＜溶液浸漬法による不織布の作製＞
PLLA 4gにHFIP/DCM 36 gを加えて溶解させ、PLLA溶液を得た（10w/w％）。HPC 0.5 gにエタノール49.5 gを加えて溶解させ、HPC溶液（1w/w%）を得た。CMC 0.5 gに30%エタノール水溶液49.5 gを加えて溶解させ、CMC溶液（1w/w％）を得た。
【０１４７】
PLLA溶液をシリンジ(Henke SASS WOLF、5mL)に充填し、エレクトロスピニング装置(株式会社メック、NF-103A)にセットした。シリンジからターゲットとなるアース電極(4 ×4cmのアルミブロック)との距離を27 cmとし、印加電圧15 kVにて、噴霧量1 ml/hour、噴霧合計時間30 minの条件で噴霧した。噴霧の間、3分おきに55.6 mgのTCP粒をまんべんなく添加した。当該添加はイオナイザ（春日電機株式会社、KD-750BB）による除電環境下で9回、合計添加量が約500 mgになるまで行った。HPC溶液またはCMC溶液20 mLに一分間浸漬させ、乾燥させて2種の不織布を作製した。
【０１４８】
＜溶液同時紡糸法による不織布の作製＞
PLLA 4gにHFIP/DCM 36 gを加えて溶解させ、PLLA溶液を得た（10wt％）。HPC 3 gにエタノール17 gを加え溶解させ、HPC溶液を得た（15wt％）。
【０１４９】
PLLA溶液およびHPC溶液をシリンジ(Henke SASS WOLF、5 mL)に充填し、エレクトロスピニング装置(株式会社メック、NF-103A)にセットした。シリンジからターゲットとなるアース電極(4×4 cmのアルミブロック)との距離を27 cmとし、印加電圧25 kVにて、噴霧量1 ml/hour、噴霧合計時間20 min、トラバース距離14 cmの条件で噴霧した。噴霧の間、2分おきに55.6 mgのTCP粒をまんべんなく添加した。当該添加はイオナイザ（春日電機株式会社、KD-750BB）による除電環境下で9回、合計添加量が約500 mgになるまで行った。
【０１５０】
＜水溶性ポリマーを使用しない不織布の作製＞
PLLA 4gにHFIP/DCM 36 gを加えて溶解させ、PLLA溶液を得た（10w/w％）。
【０１５１】
PLLA溶液をシリンジ(Henke SASS WOLF、5mL)に充填し、エレクトロスピニング装置(株式会社メック、NF-103A)にセットした。シリンジからターゲットとなるアース電極(4 ×4cmのアルミブロック)との距離を27 cmとし、印加電圧15 kVにて、噴霧量1 ml/hour、噴霧合計時間30 minの条件で噴霧した。噴霧の間、3分おきに55.6 mgのTCP粒をまんべんなく添加した。当該添加はイオナイザ（春日電機株式会社、KD-750BB）による除電環境下で9回、合計添加量が約500 mgになるまで行った。
【０１５２】
以上のことから解るように、混合溶液紡糸法により得られる不織布では、水溶性ポリマーは当該不織布の繊維内に存在する（生体適合性ポリマーであるポリ乳酸と共存して不織布の繊維を形成する）。また、溶液スプレー法及び溶液浸漬法では、水溶性ポリマーは当該不織布の繊維外に存在する（生体適合性ポリマーであるポリ乳酸の繊維の表面に付着して存在する）。また、溶液同時紡糸法では、水溶性ポリマーは生体適合性ポリマーの繊維とは別の繊維として不織布に含まれる。
【０１５３】
上記各不織布の製造方法及び使用ポリマーを整理して次の表１３に示す。
【０１５４】
【表１３】
2014057841.tif 000014
【０１５５】
なお、これらの不織布の製造方法においては、せり出し形アース電極（図２）は用いていないが、混合溶液紡糸法、溶液浸漬法、及び溶液同時紡糸法では、イオナイザを用いて不織布が正に帯電するのを防止し、また溶液スプレー法ではＴＣＰ粒添加の際にスプレーしたＨＰＣ溶液又はＣＭＣ溶液がエタノール溶液であるために当該エタノールが正電荷を帯びた状態で蒸発して徐電がなされている。このため、いずれの方法によっても、厚みのある（立体的な）不織布を製造することが可能であった。
【０１５６】
骨補填材及び水溶性ポリマーを含有する不織布の評価
マイクロメータ（株式会社ミツトヨ、CLM1-15QM）を用い、各不織布においてランダムに10点の厚さを測定し、平均値をその不織布の厚さとした。不織布を4×1.5 cmの大きさに切断し、コニカルチューブ（ベクトンディッキンソン、50 mL）に入れ、高速振盪機（東京理科器械、CM-1000）で振盪（1500rpm×1min）した。（これにより、ＴＣＰ粒を落下させた。）切断時及び振盪時に落下したＴＣＰ粒の質量を測定し、落下率を計算した。
【０１５７】
エタノールまたは30％エタノール30 mLにサンプル中のPLLA以外のポリマー（水溶性ポリマー）を溶解した。次にコニカルチューブに沈殿を残し、上清を除去した。当該沈殿のエタノールを蒸発させ、残った沈殿の重量を測定し、さらにDCMでPLLAを溶解した。沈殿を残し、上清を除去したのち、当該沈殿のDCMを蒸発させ、残った沈殿の重量を測定し、骨補填材（ＴＣＰ粒）の重量とした。
【０１５８】
また、走査型電子顕微鏡（株式会社日立ハイテクノロジー、S-3400N）を用いて各不織布を撮影し、2000倍の電顕撮影映像からImage J（ver. 1.43u）により繊維径を測定した。繊維50本の繊維径の平均値を、各不織布を構成する繊維の繊維径とした。
【０１５９】
真密度（g/mL）は、以下の値を使用した。（TCP及びPLLAの値は乾湿自動密度計（アキュピック１３３０；島津製作所）により求めた値であり、HPC、CMC及びPEGの値はそれぞれのMSDSに記載されている値である。）
TCP：3.17、  PLLA：1.26、  
HPC：1.22、  CMC：1.60、  PEG：1.20
【０１６０】
各評価項目の算出方法をまとめて以下の表１４に示す。なお、表１４の「サンプル重量」とは「不織布の重量」を意味する。また、かさ密度、（不織布の）空隙率、（不織布の）繊維部分の空隙率の算出方法は、上述の算出方法と基本的に同じである。
【０１６１】
【表１４】
2014057841.tif 000015
【０１６２】
結果を、以下の表１５及び表１６に示す。表１６の「追加ポリマー比率」は水溶性ポリマー比率を表す。また、表１６の「落下率（％）」については、グラフ化したものを図１１に示す。なお、これらの図表においては、水溶性ポリマーを用いなかった不織布は「ＰＬＬＡのみ」と標記する。また、水溶性ポリマーを用いた不織布は、用いた水溶性ポリマー名及び不織布製造方法の略記を並記して表す。
【０１６３】
【表１５】
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【０１６４】
【表１６】
2014057841.tif 000017
【０１６５】
当該結果から、水溶性ポリマーを含ませることにより、骨補填材の不織布への接着性が向上する（すなわち不織布の骨補填材保持性が向上する）ことが確認できた。さらには、中でも混合溶液紡糸法又は溶液浸漬法により不織布に水溶性ポリマーを含ませたものが接着性が好ましく、特に混合溶液紡糸法により不織布に水溶性ポリマーを含ませたものが最も好ましいことがわかった。
【０１６６】
水溶性ポリマー量の検討
シリンジからターゲットとなるアース電極との距離を22 cmとした以外は、上記混合溶液紡糸法と同様にして、ＨＰＣ濃度を５％、１％、又は０％としたPLLA/HPC混合溶液（10%/5%、10%/1%、又は10%/0%）を用いて３種の不織布を得た。そして、上記「骨補填材及び水溶性ポリマーを含有する不織布の評価」に記載の方法と同様にして、骨補填材の落下率を調べた。なお、本検討においては、不織布を４×１．５ｃｍの大きさに切断する際に落下した骨補填材量も併せて調べた。結果を図１２に示す。なお、図１２においては、得られた３種の不織布をそれぞれ「ＨＰＣ  ５％」、「ＨＰＣ  １％」、「ＨＰＣ  ０％」と標記する。また、「before」は不織布加工時（４×１．５ｃｍの大きさへの切断時）の骨補填材落下率を示し、「after」は振盪時の骨補填材落下率を示す。
【０１６７】
生体適合性ポリマーによりコーティングされた骨補填材を用いた不織布の評価
ポリ乳酸(エボニックデグサジャパン株式会社、RESOMER（登録商標）、L 206S)5gに、ヘキサフルオロイソプロピルアルコール：ジクロロメタン=8:2（質量比）の混合溶液45gを加えて溶解させ、ポリ乳酸溶液を得た(10重量%)。当該ポリ乳酸溶液をシリンジ(Henke SASS WOLF、5mL)に充填し、エレクトロスピニング装置(株式会社メック、NF-103A)にセットした。シリンジからターゲットとなるアース電極(4×16cmのアルミブロック：図２に示すものと同機構)との距離を22cmとし、印加電圧15kVにて、噴霧量1ml/hour、噴霧合計時間90minの条件で噴霧し、以下の各条件にて骨補填材を加え、不織布を製造した。なお、骨補填材は、オスフェリオン（オリンパステルモバイオマテリアル株式会社）をそのまま、又は上記ポリ乳酸溶液（10重量%）に浸漬して取り出したもの（以下「ポリ乳酸コーティング骨補填材」ともいう）を用いた。
【０１６８】
＜噴霧条件１＞
最初にアース電極（アルミブロック）上に骨補填材を５００ｍｇまき、その上へ１０分間噴霧を行い、不織布を製造した。
＜噴霧条件２＞
骨補填材としてポリ乳酸コーティング骨補填材を用いた以外は、上記＜噴霧条件１＞と同様にして不織布を製造した。
＜噴霧条件３＞
最初にアース電極上に１０分間噴霧を行い、その上へ骨補填材を５００ｍｇまき、さらにその上へ１０分間噴霧を行い、不織布を製造した。（このことから分かるように、当該不織布では骨補填材の上下に噴霧により製造された生体適合性ポリマー繊維が存在しており、サンドイッチされている状態にある。）
以上の噴霧条件１〜３により製造した各不織布を、透明なビニール袋に入れて傾けて軽く揺すったのち、不織布から剥がれ落ちた骨補填材量を比較した。結果を図１３に示す。図１３に示されるように、噴霧条件３によりサンドイッチ状に製造された不織布では、骨補填材がほとんど剥がれ落ちなかった一方で、噴霧条件１により製造された不織布では、大量の骨補填材が剥がれ落ちた。しかし、ポリ乳酸コーティング骨補填材を用いた場合には、サンドイッチ状の不織布でなくとも、骨補填材はほとんど剥がれ落ちなかった（噴霧条件２）。このことから、生体適合性ポリマーで骨補填材をコーティングしておくことで、不織布への接着性を向上させ得ることがわかった。
【図１】
2014057841.tif 000018
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６ａ】
2014057841.tif 000023
【図６ｂ】
2014057841.tif 000024
【図７】
2014057841.tif 000025
【図８】
2014057841.tif 000026
【図９】
2014057841.tif 000027
【図１０】
2014057841.tif 000028
【図１１】
2014057841.tif 000029
【図１２】
2014057841.tif 000030
【図１３】
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