(57)【要約】【課題】安価で簡易であり、１日で判定できる細菌用迅速試験培地を提供する。【解決手段】（１）糖分解試験用培地、アミノ酸分解試験用培地、運動性試験用培地、からなる群から選択される基礎培地；ならびに、（２）酵母エキス、を含有する、細菌用試験培地であって、糖分解試験、アミノ酸分解試験、および、運動性試験からなる群から選択される試験のための、細菌用試験培地を提供することによって、安価であり、かつ、簡便に細菌（特に通性嫌気性細菌）を試験することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）糖分解試験用培地、アミノ酸分解試験用培地、および、運動性試験用培地、からなる群から選択される基礎培地；ならびに
（２）酵母エキス
を含有する、細菌用試験培地であって、糖分解試験、アミノ酸分解試験、および、運動性試験からなる群から選択される試験のための、試験培地。
【請求項２】
前記細菌が、通性嫌気性細菌である、請求項１に記載の試験培地。
【請求項３】
前記通性嫌気性細菌が、大腸菌、サルモネラ属菌、赤痢菌、サイトロバクター属菌、プロテウス属菌、クレブジエラ属菌、モルガネラ属菌、エルシニア属菌、腸炎ビブリオ、コレラ菌、エロモナス属菌、および、腸球菌からなる群から選択される細菌である、請求項２に記載の試験培地。
【請求項４】
前記糖分解試験が、イヌリン、ソルボース、ラフィノース、アラビノース、ラムノース、ソルビトール、マンニトール、ラクトース、キシロース、スクロース、セロビオース、イノシット、および、グルコースからなる群から選択される糖の分解試験である、請求項２または３に記載の試験培地。
【請求項５】
前記アミノ酸分解試験が、リジン、オルニチン、および、アルギニンからなる群から選択されるアミノ酸の分解試験である、請求項２または３に記載の試験培地。
【請求項６】
０．０５（ｗ／ｗ）％〜０．１（ｗ／ｗ）％の酵母エキスを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の試験培地。
【請求項７】
さらに寒天を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の試験培地。
【請求項８】
前記培地が、０．３％の寒天を含有する、請求項７に記載の試験培地。
【請求項９】
前記糖分解試験用培地が、糖分解用半流動培地、および、ハートインフュージョン培地からなる群から選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の試験培地。
【請求項１０】
通性嫌気性細菌について、糖分解試験、アミノ酸分解試験、および、運動性試験からなる群から選択される試験を行う方法であって：
（１）請求項１〜３のいずれか一項に記載の試験培地で細菌を培養する工程
を包含する、方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法であって、ここで、前記培養する工程が、２４時間以内の培養である、方法。
【請求項１２】
請求項１０に記載の方法であって、さらに：
（２）培地の呈色を観察する工程；
を包含する、方法。
【請求項１３】
細菌について、糖分解試験、アミノ酸分解試験、および、運動性試験からなる群から選択される試験を行うための多項目性状試験培地の組み合わせ物であって、少なくとも２種類の請求項１〜３のいずれか一項に記載の試験培地を含有する、多項目性状試験培地の組み合わせ物。
【請求項１４】
細菌について、糖分解試験、アミノ酸分解試験、および、運動性試験からなる群から選択される試験を行うための培地セットであって、少なくとも２種類の請求項１〜３のいずれか一項に記載の試験培地を含有する、培地セット。
【請求項１５】
請求項１０に記載の方法に使用するためのマルチウェルプレートであって、該マルチウェルプレートは、行または列に切り取り線を含む、マルチウェルプレート。
【請求項１６】
請求項１５に記載のマルチウェルプレートであって、両端部に把持部を備える、マルチウェルプレート。
【請求項１７】
請求項１５に記載のマルチウェルプレートを収容するための凹部を備えるウェルガード。
【請求項１８】
請求項１５に記載のマルチウェルプレートと請求項１７に記載のウェルガードを備える、システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細菌の分類ないし同定用の試験培地の分野に属する。
【背景技術】
【０００２】
現在、医療・検査機関では、細菌の同定試験には、簡易同定キットや全自動細菌同定装置が多く使用されている。しかしながら、これらの試験では、同定コストが高くなるというデメリットもある。
【０００３】
これらによらない、従来法（試験管に培地を入れて検査する方法）による細菌の同定試験、例えば、糖分解能に基づく試験においては、炭水化物分解による酸の生産による培地ｐＨの変化を指標としていた（非特許文献１）。そのため、同定対象でない糖類や炭水化物の混入は、試験結果を誤らせる原因となる。また、炭水化物の分解反応は菌の発育に比例するが、菌の発育を促進する肉エキスは、量を増やすと含有するグリコーゲンの分解により試験結果を誤らせる原因となる。そのため、大腸菌など一般細菌の同定用に使用される、従来法の細菌同定培地、例えば、糖分解試験培地では、肉エキスの量は細菌試験の成績に影響しない量に留められている。酵母エキスも菌の発育を促進するが、従来法（特に、好気性菌または通性嫌気性細菌の試験）の糖分解試験培地またはアミノ酸分解試験培地には使用されていなかった。その理由は必ずしも明らかではないが、好気性菌または通性嫌気性細菌のように酸素存在下で増殖する細菌の場合には、酵母エキス成分に起因する培地の酸性化による細菌試験の成績への悪影響が予測されていたためと考えられる。
【０００４】
従来法では、特に通性嫌気性細菌の試験において分解反応の判定に長時間（通常、２日〜４日）を要していた。また、培地の使用量も多く，簡易同定キットや全自動細菌同定装置とともに、同定コストが高いというデメリットもある。そのため、医療・検査機関では、安価で簡易であり、かつ、簡易同定キットや全自動細菌同定装置のように、１日で判定できる細菌用迅速試験培地が求められている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】坂崎利一ら著、「新  細菌培地学講座」、第二版、近代出版、１９８６年１１月
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
安価で簡易であり、かつ、簡易同定キットや全自動細菌同定装置のように、１日で判定できる細菌用迅速試験培地を提供することを本発明の解決課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題は、酵母エキスを添加した細菌用試験培地を提供することによって解決された。
【０００８】
例えば、本発明は以下を提供する。
（項目１）
（１）糖分解試験用培地、アミノ酸分解試験用培地、および、運動性試験用培地、からなる群から選択される基礎培地；ならびに
（２）酵母エキス
を含有する、細菌用試験培地であって、糖分解試験、アミノ酸分解試験、および、運動性試験からなる群から選択される試験のための、試験培地。
（項目２）
前記細菌が、通性嫌気性細菌である、項目１に記載の試験培地。
（項目３）
前記通性嫌気性細菌が、大腸菌、サルモネラ属菌、赤痢菌、サイトロバクター属菌、プロテウス属菌、クレブジエラ属菌、モルガネラ属菌、エルシニア属菌、腸炎ビブリオ、コレラ菌、エロモナス属菌、および、腸球菌からなる群から選択される細菌である、項目２に記載の試験培地。
（項目４）
前記糖分解試験が、イヌリン、ソルボース、ラフィノース、アラビノース、ラムノース、ソルビトール、マンニトール、ラクトース、キシロース、スクロース、セロビオース、イノシット、および、グルコースからなる群から選択される糖の分解試験である、項目２または３に記載の試験培地。
（項目５）
前記アミノ酸分解試験が、リジン、オルニチン、および、アルギニンからなる群から選択されるアミノ酸の分解試験である、項目２または３に記載の試験培地。
（項目６）
０．０５（ｗ／ｗ）％〜０．１（ｗ／ｗ）％の酵母エキスを含む、項目１〜５のいずれか一項に記載の試験培地。
（項目７）
さらに寒天を含む、項目１〜６のいずれか一項に記載の試験培地。
（項目８）
前記培地が、０．３％の寒天を含有する、項目７に記載の試験培地。
（項目９）
前記糖分解試験用培地が、糖分解用半流動培地、および、ハートインフュージョン培地からなる群から選択される、項目１〜４のいずれか一項に記載の試験培地。
（項目１０）
通性嫌気性細菌について、糖分解試験、アミノ酸分解試験、および、運動性試験からなる群から選択される試験を行う方法であって：
（１）項目１〜３のいずれか一項に記載の試験培地で細菌を培養する工程
を包含する、方法。
（項目１１）
項目１０に記載の方法であって、ここで、前記培養する工程が、２４時間以内の培養である、方法。
（項目１２）
項目１０に記載の方法であって、さらに：
（２）培地の呈色を観察する工程；
を包含する、方法。
（項目１３）
細菌について、糖分解試験、アミノ酸分解試験、および、運動性試験からなる群から選択される試験を行うための多項目性状試験培地の組み合わせ物であって、少なくとも２種類の項目１〜３のいずれか一項に記載の試験培地を含有する、多項目性状試験培地の組み合わせ物。
（項目１４）
細菌について、糖分解試験、アミノ酸分解試験、および、運動性試験からなる群から選択される試験を行うための培地セットであって、少なくとも２種類の項目１〜３のいずれか一項に記載の試験培地を含有する、培地セット。
（項目１５）
項目１０に記載の方法に使用するためのマルチウェルプレートであって、該マルチウェルプレートは、行または列に切り取り線を含む、マルチウェルプレート。
（項目１６）
項目１５に記載のマルチウェルプレートであって、両端部に把持部を備える、マルチウェルプレート。
（項目１７）
項目１５に記載のマルチウェルプレートを収容するための凹部を備えるウェルガード。
（項目１８）
項目１５に記載のマルチウェルプレートと項目１７に記載のウェルガードを備える、システム。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の培養培地を用いることによって、細菌（例えば、通性嫌気性細菌）の同定試験を簡便かつ安価に、しかも短時間に行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１Ａは、本発明において使用する例示的なマルチウェルプレートを示す。図１Ｂは、本発明において使用する例示的なマルチウェルプレートであって、切り取り線を含むマルチウェルプレートを示す。
【図２】図２Ａは、本発明において使用する例示的な帯状のプレートを示す。図２Ｂは、本発明において使用する例示的な帯状のプレートを収容するウェルガードを示す。図２Ｃは、帯状のプレートを収容したウェルガードを示す。
【図３】図３は、糖分解試験用試験管培地での反応性を示す結果である。使用した培地は、（１）市販培地、（２）改良培地１（酵母エキス０．１％含有培地）、（３）改良培地１（酵母エキス０．２％含有培地）、（４）ＨＩ培地（改良培地２の基礎培地）、および、（５）改良培地２（酵母エキス０．１％含有培地）である。図３Ａは、（１）、（２）、および、（３）の菌接種２４時間後の結果を示す。図３Ｂは、（１）、（２）、および、（３）の菌接種４８時間後の写真である。図３Ｃは、（１）、（４）、および、（５）の菌接種２４時間後の結果を示す。
【図４】図４は、マルチウェルプレートに腸球菌６株を接種し、（Ａ）運動性試験培地、（Ｂ）イヌリン分解性試験培地、（Ｃ）ソルボース分解性試験培地、（Ｄ）ラフィノース分解性試験培地、（Ｅ）アラビノース分解性試験培地、（Ｆ）ラムノース分解性試験培地、（Ｇ）ソルビトール分解性試験培地、および、（Ｈ）アルギニン分解性試験培地にて３７℃、２４時間（図４Ａ）、および、７２時間（図４Ｂ）培養した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。
【００１２】
本発明の細菌用試験培地が試験対象とする細菌は、糖を発酵的に分解する任意の細菌であるが、好ましくは、通性嫌気性菌である。本発明の試験対象である通性嫌気性菌は、代表的には、大腸菌、サルモネラ属菌、赤痢菌、サイトロバクター属菌、プロテウス属菌、クレブジエラ属菌、モルガネラ属菌、エルシニア属菌、腸炎ビブリオ、コレラ菌、および、エロモナス属菌からなる群から選択されるグラム陰性桿菌、ならびに、腸球菌のようなグラム陽性球菌が挙げられるがこれらに限定されない。
【００１３】
（用語の定義）
本明細書において使用される用語「基礎培地」とは、試験対象となる糖またはアミノ酸を含まない試験用の培地、あるいは、試験対象となる糖またはアミノ酸を実質的に含まない（すなわち、試験または同定に影響を与える程度には含まない）培地をいう。基礎培地としては、糖分解試験用培地、アミノ酸分解試験用培地、および、運動性試験用培地が挙げられるがこれらに限定されない。
【００１４】
本明細書において使用される用語「糖分解試験用培地」とは、糖を含まない試験用の培地、あるいは、糖を実質的に含まない（すなわち、試験または同定に影響を与える程度には含まない）培地をいう。糖分解試験用培地としては、種々の培地が市販されている。糖分解試験用培地としては、糖分解用半流動培地（栄研化学株式会社から市販されている）、ハートインヒュージョン培地（例えば、Ｂａｃｔｏ（登録商標）  Ｈｅａｒｔ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ  Ｂｒｏｔｈ、日本ベクトン・ディッキンソン株式会社から市販されている）が挙げられるがこれらに限定されない。好ましくは、糖分解試験用培地は、約０．３％の寒天を含む。
【００１５】
本明細書において使用される用語「糖分解用半流動培地」とは、糖分解試験とガスの産生性を試験するための軟寒天培地をいう。糖分解用半流動培地としては、市販の糖分解用半流動培地（日水製薬）を使用することができる。
【００１６】
本明細書において使用される用語「ハートインヒュージョン培地」とは、ウシなどの動物の心筋の浸出液を含む培地をいう。ハートインヒュージョン培地としては、例えば、Ｂａｃｔｏ（登録商標）  Ｈｅａｒｔ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ  Ｂｒｏｔｈとして市販されている培地を使用することもできる。代表的なハートインヒュージョン培地は、ウシ心筋浸出液（心筋５００ｇからの浸出液）１，０００ｍｌ、ペプトン１０ｇ、および、塩化ナトリウム５ｇを含み、ｐＨは約７．４である。
【００１７】
本明細書において使用される用語「アミノ酸分解試験用培地」とは、アミノ酸を含まない試験用の培地、あるいは、アミノ酸を実質的に含まない（すなわち、試験または同定に影響を与える程度には含まない）培地をいう。アミノ酸分解試験用培地としては、例えば、Ｄｉｆｃｏ（登録商標）Ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ  Ｂａｓｅ  Ｍｏｅｌｌｅｒ（日本ベクトン・ディッキンソン株式会社から市販されている）が挙げられるがこれに限定されない。好ましくは、アミノ酸分解試験用培地は、約０．３％の寒天を含む。
【００１８】
本明細書において使用される用語「運動性試験用培地」とは、０．２％〜０．３％の寒天を含む半流動培地である。運動性試験用培地の基礎培地としては、トリプチケースソイ培地（例えば、ＢＢＬ（登録商標）  Ｔｒｉｐｔｉｃａｓｅ（登録商標）  Ｓｏｙ  Ｂｒｏｔｈ、日本ベクトン・ディッキンソン株式会社から市販されている）、ハートインヒュージョン培地（例えば、Ｂａｃｔｏ（登録商標）  Ｈｅａｒｔ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ  Ｂｒｏｔｈ、日本ベクトン・ディッキンソン株式会社から市販されている）が挙げられるがこれらに限定されない。好ましくは、運動性試験用培地は、０．３％の寒天を含む。
【００１９】
本発明の培地を用いる糖分解試験は、例えば、イヌリン、ソルボース、ラフィノース、アラビノース、ラムノース、ソルビトール、マンニトール、ラクトース、キシロース、スクロース、セロビオース、イノシット、および、グルコースからなる群から選択される糖の分解試験である。糖分解試験のための本発明の培地には、例えば、イヌリン、ソルボース、ラフィノース、アラビノース、ラムノース、ソルビトール、マンニトール、ラクトース、キシロース、スクロース、セロビオース、イノシット、および、グルコースからなる群から選択される糖を添加する。
【００２０】
本発明の培地を用いるアミノ酸分解試験は、例えば、リジン、オルニチン、および、アルギニンからなる群から選択されるアミノ酸の分解試験である。アミノ酸分解試験のための本発明の培地には、例えば、リジン、オルニチン、および、アルギニンからなる群から選択されるアミノ酸を添加する。酵母エキスは、これらアミノ酸含量が少ないため、これらアミノ酸分解試験の培地に添加しても、分解試験結果に悪影響を与えない。
【００２１】
本明細書において使用される用語「酵母エキス」とは、酵母を自己消化、酵素処理、および／または、熱水処理することによって抽出されたエキスをいう。酵母エキスとしては、一般に市販されている酵母エキス（例えば、Ｂａｃｔｏ（登録商標）  Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ、日本ベクトン・ディッキンソンから市販されている）を使用することができる。
【００２２】
（培地の調製）
本発明に使用する例示的な培地は、例えば、以下の手順で調製することができる。
【００２３】
（糖分解試験用改良培地１  １，０００ｍｌ中）
蒸留水９５０．０ｍｌに基礎培地（糖分解用半流動培地「栄研」）２１．０ｇ、および、酵母エキス（Ｂａｃｔｏ（登録商標）  Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ）０．５ｇ〜１．０ｇを加えて滅菌（１２１℃、１５分間）し５０℃に保温する。保温した培地に糖類を１．０（ｗ／ｗ）％の濃度に加える。なお、糖類は蒸留水５０．０ｍｌに溶解し、培地とは別に滅菌（１２１℃、１５分間。ただし、アラビノース、および、キシロースは０．２０μｍ滅菌フィルターでろ過滅菌。）しておく。糖類を加えた培地をｐＨ７．４±０．２に調整する。
【００２４】
（糖分解試験用改良培地２  １，０００ｍｌ中）
蒸留水９５０．０ｍｌに基礎培地（Ｂａｃｔｏ（登録商標）  Ｈｅａｒｔ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ  Ｂｒｏｔｈ）２５．０ｇ、酵母エキス（Ｂａｃｔｏ（登録商標）  Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ）０．５ｇ〜１．０ｇ、ブロモクレゾールパープル０．０２ｇ、および、寒天（Ｂａｃｔｏ（登録商標）  Ａｇａｒ）３．０ｇを加えて滅菌（１２１℃、１５分間）し５０℃に保温する。保温した培地に糖類を１．０（ｗ／ｗ）％の濃度に加える。なお、糖類は蒸留水５０．０ｍｌに溶解し、培地とは別に滅菌（１２１℃、１５分間。ただし、アラビノース、および、キシロースは０．２０μｍ滅菌フィルターでろ過滅菌。）しておく。糖類を加えた培地をｐＨ７．４±０．２に調整する。
【００２５】
（アミノ酸分解試験用改良培地  １，０００ｍｌ中）
蒸留水９５０．０ｍｌに基礎培地（Ｄｉｆｃｏ（登録商標）  Ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ  Ｂａｓｅ  Ｍｏｅｌｌｅｒ）１０．５ｇ、酵母エキス（Ｂａｃｔｏ（登録商標）  Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ）０．５ｇ〜１．０ｇ、および、寒天（Ｂａｃｔｏ（登録商標）  Ａｇａｒ）３．０ｇを加えて滅菌（１２１℃、１５分間）し５０℃に保温する。保温した培地にアミノ酸を１．０（ｗ／ｗ）％の濃度に加える。なお、アミノ酸は蒸留水５０．０ｍｌに溶解し、培地とは別に０．２０μｍ滅菌フィルターでろ過滅菌しておく。アミノ酸を加えた培地をｐＨ６．０±０．２に調整する。
【００２６】
（運動性試験用培地１  １，０００ｍｌ中）
蒸留水１．０００ｍｌに基礎培地（ＢＢＬ（登録商標）  Ｔｒｉｐｔｉｃａｓｅ（登録商標）  Ｓｏｙ  Ｂｒｏｔｈ）３０．０ｇ、酵母エキス（Ｂａｃｔｏ（登録商標）  Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ）０．５ｇ〜１．０ｇ、および、寒天（Ｂａｃｔｏ（登録商標）  Ａｇａｒ）３．０ｇを加えて滅菌（１２１℃、１５分間）する。
【００２７】
（運動性試験用培地２  １，０００ｍｌ中）
蒸留水１，０００ｍｌに基礎培地（Ｂａｃｔｏ（登録商標）  Ｈｅａｒｔ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ  Ｂｒｏｔｈ）２５．０ｇ、酵母エキス（Ｂａｃｔｏ（登録商標）  Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ）０．５ｇ〜１．０ｇ、および、寒天（Ｂａｃｔｏ（登録商標）  Ａｇａｒ）３．０ｇを加えて滅菌（１２１℃、１５分間）する。
【００２８】
（マルチウェルプレート）
本発明の培地を用いる試験は、試験管のみならず、例えば、マルチウェルプレートを用いて行うことができる。マルチウェルにおける各ウェルの大きさ、および、プレート１枚あたりのウェルの数は、当業者が適宜選択することができる。代表的には、マルチウェルプレート（１０）における各ウェル（１１）の直径は１ｃｍであり容量は１．５ｍｌであり、プレート１枚につき、６×８のウェルが配置されるがこれに限定されない（図１Ａ）。
【００２９】
必要に応じて、プレートの列毎に切り取り線（１２）を入れ、列毎に切り離して用いることができる（図１Ｂ）。あるいは、必要に応じて、プレートの行毎に切り取り線を入れ、行毎に切り離して用いることができる。例えば、列毎に切り取り線を入れたマルチウェルプレートから、プレートの列のウェルを切り離し、各ウェルに同一または異なる試験培地を添加し、同一のサンプルを添加して培養することによって、同一サンプルについての複数種類の試験を簡便に行うことができる。必要に応じて、プレートの列のウェルの両端に把持部を設けてもよい。
【００３０】
あるいは、一列に整列したウェルを備える帯状のプレート（２０）の両端に把持部（２１）を設け（図２Ａ）、そのプレートを、ウェルガード（３０）（図２Ｂ）に配置して使用することもできる（図２Ｃ）。ウェルガード（３０）は、プレートを収容するための凹部（３１）を備える。
【実施例】
【００３１】
（材料）
１．実験材料
１．１．試薬
以下の試薬を用いた。
１）糖分解用半流動培地「栄研」（栄研化学株式会社）
２）Ｂａｃｔｏ（登録商標）  Ｈｅａｒｔ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ  Ｂｒｏｔｈ（日本ベクトン・ディッキンソン株式会社）
３）ＢＢＬ（登録商標）  Ｔｒｉｐｔｉｃａｓｅ（登録商標）  Ｓｏｙ  Ｂｒｏｔｈ（日本ベクトン・ディッキンソン株式会社）
４）Ｄｉｆｃｏ（登録商標）  Ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ  Ｂａｓｅ  Ｍｏｅｌｌｅｒ（日本ベクトン・ディッキンソン株式会社）
５）Ｂａｃｔｏ（登録商標）  Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ（日本ベクトン・ディッキンソン株式会社）
６）Ｂａｃｔｏ（登録商標）  Ａｇａｒ（日本ベクトン・ディッキンソン株式会社）
７）ＢＢＬ（登録商標）  Ｂｒａｉｎ  Ｈｅａｒｔ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ（日本ベクトン・ディッキンソン株式会社）
８）ブロモクレゾールパープル（和光純薬工業株式会社）
９）アルギニン一塩酸塩（ナカライテスク株式会社）
１０）マンニトール（和光純薬工業株式会社）
１１）ソルビトール（和光純薬工業株式会社）
１２）アラビノース（和光純薬工業株式会社）
１３）ラフィノース（和光純薬工業株式会社）
１４）ソルボース（和光純薬工業株式会社）
１５）ラムノース（和光純薬工業株式会社）
１６）イヌリン（和光純薬工業株式会社）。
【００３２】
１．２．器材
以下の器材を用いた。
１）４８穴滅菌マルチウエルプレート
ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ（登録商標）  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｐｌａｔｅ（日本ベクトン・ディッキンソン株式会社）。
【００３３】
１．３．供試菌株
医療・検査機関で分離された患者由来の腸球菌８８株を使用した。各菌株は、Ｂｒａｉｎ  Ｈｅａｒｔ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ寒天培地で３７℃、１８時間培養したものを使用した。
【００３４】
２．糖分解試験用培地
２．１．改良培地１
市販の糖分解用半流動培地「栄研」（以下、市販培地）を基礎培地として表１の組成で調製した。培地と糖類は別々に滅菌（１２１℃、１５分）して混合した。ただし、アラビノースは０．２０μｍ滅菌フィルターでろ過滅菌して混合した。
【００３５】
【表１】
2014011986.tif 000002
２．２．改良培地２
市販のＢａｃｔｏ（登録商標）  Ｈｅａｒｔ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ  Ｂｒｏｔｈ（以下、ＨＩ培地）を基礎培地として表２の組成で調整した。培地と糖類は別々に滅菌（１２１℃、１５分）して混合した。ただし、アラビノースは０．２０μｍ滅菌フィルターでろ過滅菌して混合した。
【００３６】
【表２】
2014011986.tif 000003
３．運動性試験用培地
培地の組成を表３に示した。培地は滅菌（１２１℃、１５分）して使用した。
【００３７】
【表３】
2014011986.tif 000004
４．アミノ酸分解試験用培地
培地の組成を表４に示した。培地とアミノ酸は別々に滅菌（培地；１２１℃、１５分間、アミノ酸類；０．２０μｍ滅菌フィルターでろ過滅菌）して添加した。
【００３８】
【表４】
2014011986.tif 000005
５．実験用培地の作成
５．１．糖分解試験用試験管培地
市販培地、ＨＩ培地、改良培地１及び改良培地２の各培地を滅菌小試験管に３ｍｌづつ分注して使用した。改良培地１は酵母エキス濃度が０．１％と０．２％のものを調製した。
【００３９】
５．２．マルチウエルプレート培地
調製した各培地を滅菌マルチウエルプレート（４８ウエル；縦６列×横８列）に１ｍｌずつ分注してプレート培地を作成した。マルチウエルプレートは、１検体について横８列を使用し、１列目に運動性試験用培地、２列〜７列目に糖分解試験用培地、８列目にアミノ酸分解試験用培地を分注した。
【００４０】
（実施例１）
糖分解試験用試験管培地での反応性について以下の手順で実験を行った。
【００４１】
（方法）
試験管にマンニトール分解試験用の（１）市販培地、（２）改良培地１（酵母エキス０．１％含有培地）、（３）改良培地１（酵母エキス０．２％含有培地）、（４）ＨＩ培地（改良培地２の基礎培地）、または、（５）改良培地２（酵母エキス０．１％含有培地）を添加し、腸球菌（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）を接種し、３７℃、２４時間および／または４８時間培養した。
【００４２】
（結果）
結果を図３に示す。図３Ａは、（１）、（２）、および、（３）の菌接種２４時間後の写真である。図３Ｂは、（１）、（２）、および、（３）の菌接種４８時間後の写真である。図３Ｃは、（１）、（４）、および、（５）の菌接種２４時間後の写真である。
【００４３】
ア）改良培地１の反応性について
・改良培地１の基礎培地である市販培地（１）は、２４時間培養では反応は弱かったが、改良培地１（酵母エキス０．１％）（２）は、培地の中間まで反応が認められた。
・酵母エキス濃度を０．２％にした改良培地１（３）も反応の程度は変わらなかった。
・４８時間培養では、市販培地（１）は培地の中間まで反応が認められた。一方、改良培地１（１、２）は、いずれも培地全体に反応が認められた。
【００４４】
イ）改良培地２の反応性について
・改良培地２の基礎培地であるＨＩ培地（４）は、２４時間培養では培地の中間まで反応が認められたが、改良培地２（５）は、培地全体に反応が認められた。
【００４５】
ウ）まとめ
・市販培地及びＨＩ培地に酵母エキスを加えると反応性が高まった。酵母エキスの添加濃度は０．１％以上で効果が認められた。
【００４６】
（実施例２）
マルチウエルプレートによる糖分解試験用培地の反応性について以下の手順で実験を行った。
【００４７】
（方法）
マルチウェルプレートに糖分解試験用培地を添加し、腸球菌６株を接種し、（Ａ）運動性試験培地、（Ｂ）イヌリン分解性試験培地、（Ｃ）ソルボース分解性試験培地、（Ｄ）ラフィノース分解性試験培地、（Ｅ）アラビノース分解性試験培地、（Ｆ）ラムノース分解性試験培地、（Ｇ）ソルビトール分解性試験培地、および、（Ｈ）アルギニン分解性試験培地にて３７℃、２４時間培養し、呈色反応に基づいて判定を行った。その後、さらに、７２時間培養した。
【００４８】
（結果）
結果を図４に示す。（１）〜（６）は、使用した菌株の番号である。図４Ａは、菌接種２４時間後の写真である。図４Ｂは、菌接種７２時間後の写真である。
【００４９】
ア）改良培地１及び改良培地２（いずれも酵母エキス０．１％含有）の反応性について
・両培地とも反応性の相関が認められた。
・試験管法と同様に改良培地２の方が反応性は早かったが、改良培地２は４８時間以上の培養を行うと自然分解の進行が認められた。そのため、２４時間以上培養するときには改良培地１の方が適していた。
・培地の色調は菌株によるが、改良培地１の方が明瞭であった。
・イヌリンの反応は改良培地１及び改良培地２とも陰性の色調が悪かったが、判定をするには十分であった。
【００５０】
イ）まとめ
改良培地１及び改良培地２とも、マルチウエルプレートにおいて試験管法と同様に糖分解試験が可能であった。また、大腸菌など発育性の高い菌種については、自然分解が起こる可能性が示唆されるため、改良培地１の方が適していると思われた。
【００５１】
（実施例３）
臨床由来株の同定検査を以下の手順で行った。
【００５２】
（材料及び方法）
ア）供試菌株
医療・検査機関で分離された腸球菌８８株を使用した。
【００５３】
イ）検査方法
改良培地１及び改良培地２を用いてマルチウエルプレート培地で検査を行った。
【００５４】
ウ）菌種の同定方法
表５に示す生化学的性状で判定した。
【００５５】
【表５】
2014011986.tif 000006
（実験結果）
供試した８８株はＥ．ｆａｅｃａｌｉｓが７１株、Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍが４株、Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍが１株、Ｅ．ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓが１株であると分類され、１１株が型別不能であった。
【００５６】
本試験法において腸球菌の菌種の同定が可能であった。
【産業上の利用可能性】
【００５７】
本発明の培養培地を用いることによって、細菌（例えば、通性嫌気性細菌）の同定試験を簡便かつ安価に、しかも短時間に行うことができる。
【符号の説明】
【００５８】
１０  マルチウェルプレート
１１  ウェル
１２  切取り線
２０  帯状のプレート
２１  把持部
３０  ウェルガード
３１  ウェルガードの凹部
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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