(57)【要約】      （修正有）【課題】高い有用性を有する赤色蛍光タンパク質を提供する。【解決手段】ディスクコーラル（Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ ｓｐ．）に由来する特定ののアミノ酸配列を有する赤色蛍光タンパク質。および該アミノ酸配列との間で８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、３７℃で少なくとも１６時間培養した時点において蛍光を生じる赤色蛍光タンパク質。【選択図】図４
2014060946.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する赤色蛍光タンパク質。
【請求項２】
配列番号１に記載のアミノ酸配列との間で８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、３７℃で少なくとも１６時間培養した時点において蛍光を生じる赤色蛍光タンパク質。
【請求項３】
配列番号２、３または４に記載のアミノ酸配列を有する赤色蛍光タンパク質。
【請求項４】
配列番号２、３または４に記載のアミノ酸配列との間で８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、３７℃で少なくとも１６時間培養した時点において蛍光を生じる赤色蛍光タンパク質。
【請求項５】
沖縄県石垣島産ディスクコーラル（Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ ｓｐ．）に由来し、３７℃で少なくとも１６時間培養した時点において蛍光を生じる赤色蛍光タンパク質。
【請求項６】
請求項１から５の何れか１項に記載の赤色蛍光タンパク質をコードする遺伝子を含む核酸。
【請求項７】
配列番号５に記載の赤色蛍光タンパク質をコードする遺伝子を含む核酸。
【請求項８】
配列番号６、７または８に記載の赤色蛍光タンパク質をコードする遺伝子を含む核酸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、赤色蛍光タンパク質に関する。
【背景技術】
【０００２】
サンゴ虫ＤｉｓｃｏｓｏｍａよりクローニングされたＣｌｏｎｔｅｃｈ社のＤｓＲｅｄと称する赤色蛍光タンパク質（Ｒｅｄ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ、ＲＦＰ）は、細胞学および分子生物学における蛍光マーカーとして広く利用されている。ＲＦＰは、他のタンパク質と融合させることで、細胞内局在や発現量の変化をイメージングするレポーターとして用いられる。ＲＦＰの励起に使用される波長は、ＧＦＰの励起波長と比較して、細胞や組織で用いる際に光散乱が少なく光毒性が低い。また、赤色蛍光は組織透過性が高いことから、細胞や生体組織の観察に優れている。さらにＲＦＰは、ＧＦＰなど他の蛍光特性を有する蛍光タンパク質との併用による多色カラーイメージングに適しており、複数の生命現象を同時に可視化する解析において広く使用されている。
【０００３】
その蛍光特性の有効性からＲＦＰに対するニーズは高いが、ＲＦＰの代表であるＤｓＲｅｄは複数の問題点を有する。野生型のＤｓＲｅｄは蛍光発色団の形成が遅く、安定な４量体を形成し凝集を起こしやすい。このため、ＤｓＲｅｄを用いて蛍光を検出しようとする場合、十分な強度の蛍光が生じるまで待つ必要が生じる。
【０００４】
このような問題を克服するため、先行技術文献に説明されるように、ＤｓＲｅｄの様々な改良が行われている。中でも広く使われるＤｓＲｅｄの変異体は、特許文献１および非特許文献１に開示されるＤｓＲｅｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）およびＤｓＲｅｄ  Ｔ４である。これらは、ＤｓＲｅｄにランダムに変異を導入することで作製された、成熟が早く、野生型よりも凝集度が低い４量体型の変異体である。成熟速度の促進に最も影響するアミノ酸変異は、ＤｓＲｅｄ  ＥｘｐｒｅｓｓおよびＤｓＲｅｄ  Ｔ４が共通して有するＮ４２Ｑ（４２番目のアスパラギンがグルタミンに置換された変異）であると考えられており、その他８つのアミノ酸の置換によって野生型ＤｓＲｅｄの１７倍ほど成熟が早くなっている。
【０００５】
また、単量体化されたＤｓＲｅｄが作製されているが、そのような変異型の取得には非常に多くの変異導入が必要である。また、最も明るい現在利用可能な単量体型ＤｓＲｅｄでも、その蛍光強度は野生型の半分程度である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１１−９２１９８号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Rapidly maturing variants of the Discosoma red fluorescent protein(DsRed). Bevis BJ, Glick BS et al., Nat. Biotechnol., 20(1), 83-87(2002)
【非特許文献２】A monomeric red fluorescent protein. Campbell RE, Tour O et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 99, 7877-7882(2002)
【非特許文献３】Improved monomeric red, orange and yellow foluorescent proteins derived form Discosoma sp. red fluorescent protein Shaner NC, Campbell RE et al., Nat. Biotechnol., 22(12), 1567-1572(2004)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、高い有用性を有する赤色蛍光タンパク質を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明に係る赤色蛍光タンパク質は、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する。
【００１０】
本発明に係る赤色蛍光タンパク質は、配列番号１に記載のアミノ酸配列との間で８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、３７℃で少なくとも１６時間培養した時点において蛍光を生じる。
【００１１】
本発明に係る赤色蛍光タンパク質は、配列番号２、３または４に記載のアミノ酸配列を有する。
【００１２】
本発明に係る赤色蛍光タンパク質は、配列番号２、３または４に記載のアミノ酸配列との間で８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、３７℃で少なくとも１６時間培養した時点において蛍光を生じる。
【００１３】
本発明に係る赤色蛍光タンパク質は、沖縄県石垣島産ディスクコーラル（Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ ｓｐ．）に由来し、３７℃で少なくとも１６時間培養した時点において蛍光を生じる。
【００１４】
本発明に係る核酸は、本発明に係る赤色蛍光タンパク質をコードする。
【００１５】
本発明に係る核酸は、配列番号５に記載の赤色蛍光タンパク質をコードする遺伝子を含む。
【００１６】
本発明に係る核酸は、配列番号６、７または８に記載の赤色蛍光タンパク質をコードする遺伝子を含む。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、高い有用性を有する赤色蛍光タンパク質が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】実施形態に係る赤色蛍光タンパク質の吸収スペクトルを示す図である。
【図２】実施形態に係る赤色蛍光タンパク質の蛍光スペクトルを示す図である。
【図３】実施形態に係る赤色蛍光タンパク質の励起スペクトルを示す図である。
【図４】実施形態に係る赤色蛍光タンパク質を発現する大腸菌を、３７℃で約１６時間培養した場合、および３７℃で約２３時間培養した場合の蛍光の様子を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
実施形態に係る赤色蛍光タンパク質の例は、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する赤色蛍光タンパク質である。
【００２０】
赤色蛍光タンパク質とは、励起光を受けて励起され、赤色の光を放つタンパク質を意味する。この発光の発生には、基質を必要としない。
【００２１】
配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する赤色蛍光タンパク質は、沖縄県石垣島産ディスクコーラル（Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ ｓｐ．）に由来する。この生物は、現時点において種の同定がなされていない生物である。
【００２２】
配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する赤色蛍光タンパク質は、２２８個のアミノ酸から成り、５９３ｎｍに蛍光ピークを示し、５６８ｎｍに吸収ピークを示す。このアミノ酸配列と、赤色蛍光を呈する従来のＤｓＲＥＤ（ＡＥＴ７５７７４）のアミノ酸配列との間の相同性は約８９％である。このため、配列番号１との間で９０％以上の相同性を示すアミノ酸配列を有する赤色蛍光タンパク質、好ましくは、配列番号１との間で９５％以上の相同性を示すアミノ酸配列を有する赤色蛍光タンパク質、さらに好ましくは、そのような高い相同性を示すアミノ酸配列を有していることに加えて、日本産（とくに沖縄産）である赤色蛍光タンパク質は、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する赤色蛍光タンパク質と同様の特性が期待でき、本願発明に含まれる。
【００２３】
この赤色蛍光タンパク質のアミノ酸配列を以下に示す：
MSCSKNVIKEFMRFKVHMEGTVNGHEFEIRGEGEGRPYEGQNTVKLKVIKGGPLPFAWDILSPQFQYGSKVYVKHPPDIPDYKKLSFPEGFKWERVMNFEDGGVVTVTQDSSLIDGCFVYEVKFIGVNFPSDGPVMQKKTMGWEPSTERLYPRDGVLKGDLHMALILEDGHYLVEFKSIYRAKKPVQLPGYYYVDTKLDIISHNEDYTVVEQFERTNGRYHAFLKPPQ（配列番号１）。
【００２４】
配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する赤色蛍光タンパク質は、それ自体では、ＤｓＲｅｄといった他のＲＦＰと同様に、低温でのみ蛍光発色団の形成が促され、成熟速度が遅く、蛍光強度が低い。しかしながら、この赤色蛍光タンパク質は、ＤｓＲｅｄといった他のＲＦＰとは異なり、わずかな変異を導入することで、低温でなくても蛍光発色団の形成が促され、成熟速度が速く、蛍光強度が強い変異型の赤色蛍光タンパク質を取得できる。そのような変異型赤色蛍光タンパク質は、後述するような変異体１、２および３である。
【００２５】
以上の観点から、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する赤色蛍光タンパク質は、低温でなくても蛍光発色団の形成が促され、成熟速度が速く、蛍光強度が強い変異型の赤色蛍光タンパク質をもたらす、有用な赤色蛍光タンパク質である。
【００２６】
実施形態に係る赤色蛍光タンパク質の別の例は、配列番号１に記載のアミノ酸配列との間で８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、３７℃で少なくとも１６時間培養した時点において蛍光を生じる赤色蛍光タンパク質である。
【００２７】
この赤色蛍光タンパク質は、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する赤色蛍光タンパク質に対して変異が導入され、その結果、成熟が早くなった赤色蛍光タンパク質である。「成熟が早くなる」とは、赤色蛍光タンパク質を細胞内に発現させた後、赤色蛍光を測定できるようになるまでの時間が早くなることを意味する。早く蛍光を発するようになる理由は、例えば、蛍光発色団の形成が早くなることを含む。なお、「蛍光を生じる」とは、蛍光顕微鏡やルミノメーターといった一般的な測定装置により測定可能な十分な蛍光を生じることを含む。
【００２８】
相同性は、好ましくは、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上である。
【００２９】
実施形態に係る赤色蛍光タンパク質の別の例は、配列番号２、３または４に記載のアミノ酸配列を有する赤色蛍光タンパク質である。
【００３０】
これらの赤色蛍光タンパク質は、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する沖縄県石垣島産ディスクコーラル（Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ ｓｐ．）から取得された赤色蛍光タンパク質に対して変異を導入し、３７℃で少なくとも１６時間培養した時点において蛍光を生じる特性を獲得した赤色蛍光タンパク質である。
【００３１】
配列番号２に記載のアミノ酸配列は、配列番号１に記載のアミノ酸配列においてＮ末端から１１８番目のフェニルアラニンがロイシンに置換（Ｆ１１８Ｌ）されたものである。本願を通して、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する赤色蛍光タンパク質のことを、便宜的に「変異体１」、「ｍｕｔａｎｔ１」または「ｍｕｔ１」と称する。また、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する沖縄県石垣島産ディスクコーラル（Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ ｓｐ．）から取得された赤色蛍光タンパク質のことを、便宜的に「野生型」または「ＷＴ」と称する。
【００３２】
変異体１は、５９２ｎｍに蛍光ピークを示し、５６８ｎｍに吸収ピークを示す。変異体１の蛍光ピークにおける蛍光強度は、野生型の蛍光ピークにおける蛍光強度の１．４倍である。
【００３３】
変異体１のアミノ酸配列を以下に示す：
MSCSKNVIKEFMRFKVHMEGTVNGHEFEIRGEGEGRPYEGQNTVKLKVIKGGPLPFAWDILSPQFQYGSKVYVKHPPDIPDYKKLSFPEGFKWERVMNFEDGGVVTVTQDSSLIDGCLVYEVKFIGVNFPSDGPVMQKKTMGWEPSTERLYPRDGVLKGDLHMALILEDGHYLVEFKSIYRAKKPVQLPGYYYVDTKLDIISHNEDYTVVEQFERTNGRYHAFLKPPQ（配列番号２）。
【００３４】
配列番号３に記載のアミノ酸配列は、配列番号１に記載のアミノ酸配列においてＮ末端から４１番目のグルタミンがヒスチジンに置換され（Ｑ４１Ｈ）、１１８番目のフェニルアラニンがロイシンに置換（Ｆ１１８Ｌ）されたものである。本願を通して、配列番号３に記載のアミノ酸配列を有する赤色蛍光タンパク質のことを、便宜的に「変異体２」、「ｍｕｔａｎｔ２」または「ｍｕｔ２」と称する。
【００３５】
変異体２は、５９２ｎｍに蛍光ピークを示し、５６８ｎｍに吸収ピークを示す。変異体２の蛍光ピークにおける蛍光強度は、野生型の蛍光ピークにおける蛍光強度の１．５倍である。
【００３６】
変異体２のアミノ酸配列を以下に示す：
MSCSKNVIKEFMRFKVHMEGTVNGHEFEIRGEGEGRPYEGHNTVKLKVIKGGPLPFAWDILSPQFQYGSKVYVKHPPDIPDYKKLSFPEGFKWERVMNFEDGGVVTVTQDSSLIDGCLVYEVKFIGVNFPSDGPVMQKKTMGWEPSTERLYPRDGVLKGDLHMALILEDGHYLVEFKSIYRAKKPVQLPGYYYVDTKLDIISHNEDYTVVEQFERTNGRYHAFLKPPQ（配列番号３）。
【００３７】
配列番号４に記載のアミノ酸配列は、配列番号１に記載のアミノ酸配列においてＮ末端から７１番目のバリンがアラニンに置換（Ｖ７１Ａ）され、２２６番目のプロリンがグルタミンに置換（Ｐ２２６Ｑ）されたものである。本願を通して、配列番号４に記載のアミノ酸配列を有する赤色蛍光タンパク質のことを、便宜的に「変異体３」、「ｍｕｔａｎｔ３」または「ｍｕｔ３」と称する。
【００３８】
変異体３は、５９３ｎｍに蛍光ピークを示し、５６７ｎｍに吸収ピークを示す。変異体１の蛍光ピークにおける蛍光強度は、野生型の蛍光ピークにおける蛍光強度の１．７倍である。
【００３９】
変異体３のアミノ酸配列を以下に示す：
MSCSKNVIKEFMRFKVHMEGTVNGHEFEIRGEGEGRPYEGQNTVKLKVIKGGPLPFAWDILSPQFQYGSKAYVKHPPDIPDYKKLSFPEGFKWERVMNFEDGGVVTVTQDSSLIDGCFVYEVKFIGVNFPSDGPVMQKKTMGWEPSTERLYPRDGVLKGDLHMALILEDGHYLVEFKSIYRAKKPVQLPGYYYVDTKLDIISHNEDYTVVEQFERTNGRYHAFLKQPQ（配列番号４）。
【００４０】
実施形態に係る赤色蛍光タンパク質の別の例は、配列番号２、３または４に記載のアミノ酸配列との間で８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、３７℃で少なくとも１６時間培養した時点において蛍光を生じる赤色蛍光タンパク質である。
【００４１】
この赤色蛍光タンパク質は、すなわち、変異体１、２または３に対して更にアミノ酸配列の変異が導入されているものの、変異体１、２または３の早く成熟するという特性が維持されているものである。
【００４２】
相同性は、好ましくは、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上である。
【００４３】
実施形態に係る赤色蛍光タンパク質の別の例は、沖縄県石垣島産ディスクコーラル（Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ ｓｐ．）に由来し、３７℃で少なくとも１６時間培養した時点において蛍光を生じる赤色蛍光タンパク質である。
【００４４】
沖縄県石垣島産ディスクコーラル（Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ ｓｐ．）に由来する赤色蛍光タンパク質の１つの例は、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する赤色蛍光タンパク質であるが、配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して、例えば自然状態で変異が導入され、早く成熟するという特性が獲得されたものも実施形態に係る赤色蛍光タンパク質に含まれる。
【００４５】
実施形態に係る、３７℃で少なくとも１６時間培養した時点において蛍光を生じる赤色蛍光タンパク質は、従来の赤色蛍光タンパク質と比較して早く成熟し、早く蛍光を測定することが可能となる。従来の赤色蛍光タンパク質には、成熟のために、それを発現する細胞を低温状態に置く必要があるものも存在するが、実施形態に係る赤色蛍光タンパク質はそのような必要がなく、例えば３７℃で速やかに蛍光の検出が可能となる。したがって、実施形態に係る赤色蛍光タンパク質は、実験的な取扱いが容易であり、細胞の本来の状態により近い状態での測定を可能とする。また、実施形態に係る赤色蛍光タンパク質は、従来の赤色蛍光タンパク質と比較して、強い蛍光を示す。
【００４６】
実施形態に係る赤色蛍光タンパク質は、核酸の形態で提供されてもよい。すなわち、実施形態に係る赤色蛍光タンパク質をコードする遺伝子を含む核酸も提供される。
【００４７】
このような核酸の具体的な例は、配列番号５に記載の塩基配列を含む核酸である。この塩基配列は、野生型の遺伝子をコードしている。
【００４８】
野生型の遺伝子をコードする塩基配列を以下に示す：
ATGAGTTGTTCCAAGAATGTGATCAAGGAGTTCATGAGGTTCAAAGTTCATATGGAAGGAACGGTCAATGGGCATGAGTTTGAAATACGGGGGGAAGGTGAAGGGAGGCCTTACGAAGGCCAAAACACCGTAAAGCTGAAGGTAATCAAAGGTGGACCTTTGCCATTTGCTTGGGATATTTTGTCGCCACAATTCCAGTATGGAAGCAAGGTATATGTCAAGCATCCCCCTGACATACCAGACTACAAAAAGCTGTCATTTCCTGAGGGATTTAAATGGGAAAGGGTCATGAACTTTGAAGACGGAGGCGTGGTTACCGTAACCCAGGATTCCAGTTTGATAGACGGCTGTTTCGTCTACGAGGTCAAGTTCATTGGAGTGAACTTCCCTTCTGATGGACCTGTTATGCAGAAGAAGACTATGGGCTGGGAACCGAGCACTGAGCGTTTGTATCCTCGTGATGGGGTTCTGAAAGGAGACCTACATATGGCCCTGATTCTGGAAGATGGTCATTACCTGGTTGAATTTAAAAGTATTTACAGGGCAAAGAAGCCTGTGCAGCTCCCAGGGTACTACTACGTTGACACCAAACTGGATATAATAAGCCACAACGAAGACTACACAGTCGTTGAGCAGTTTGAAAGAACCAACGGACGATACCATGCGTTCCTGAAGCCACCGCAGTAA（配列番号５）。
【００４９】
また、このような核酸の具体的な例は、配列番号６、７および８に記載の塩基配列を含む核酸である。これらの塩基配列は、それぞれ、変異体１、２および３の遺伝子をコードしている。
【００５０】
変異体１の遺伝子をコードする塩基配列を以下に示す：
ATGAGTTGTTCCAAGAATGTGATCAAGGAGTTCATGAGGTTCAAAGTTCATATGGAAGGAACGGTCAATGGGCATGAGTTTGAAATACGGGGGGAAGGTGAAGGGAGGCCTTACGAAGGCCAAAACACCGTAAAGCTGAAGGTAATCAAAGGTGGACCTTTGCCATTTGCATGGGATATTTTGTCGCCACAATTCCAGTATGGAAGCAAGGTATATGTCAAGCATCCCCCTGACATACCAGACTACAAAAAGCTGTCATTTCCTGAGGGATTTAAATGGGAAAGGGTCATGAACTTTGAAGACGGAGGCGTGGTTACCGTAACCCAGGATTCCAGTTTGATAGACGGCTGTCTCGTCTACGAGGTCAAGTTCATTGGAGTGAACTTCCCTTCTGATGGACCTGTTATGCAGAAGAAGACTATGGGCTGGGAACCGAGCACTGAGCGTTTGTATCCTCGTGATGGGGTTCTGAAAGGAGACCTACATATGGCCCTGATTCTGGAAGATGGTCATTACCTGGTTGAATTTAAAAGTATTTACAGGGCAAAGAAGCCTGTGCAGCTCCCAGGGTACTACTACGTTGACACCAAACTGGATATAATAAGCCACAACGAAGACTACACAGTCGTTGAGCAGTTTGAAAGAACCAACGGACGATACCATGCGTTCCTGAAGCCACCGCAGTAA（配列番号６）。
【００５１】
変異体２の遺伝子をコードする塩基配列を以下に示す：
ATGAGTTGTTCCAAGAATGTGATCAAGGAGTTCATGAGGTTCAAAGTTCATATGGAAGGAACGGTCAATGGGCATGAGTTTGAAATACGGGGGGAAGGTGAAGGGAGGCCTTACGAAGGCCATAACACCGTAAAGCTGAAGGTAATCAAAGGTGGACCTTTGCCATTTGCATGGGATATTTTGTCGCCACAATTCCAGTATGGAAGCAAGGTATATGTCAAGCATCCCCCTGACATACCAGACTACAAAAAGCTGTCATTTCCTGAGGGGTTTAAATGGGAAAGGGTCATGAACTTTGAAGACGGAGGCGTGGTTACCGTAACCCAGGATTCCAGTTTGATAGACGGCTGTCTCGTCTACGAGGTCAAGTTCATTGGAGTGAACTTCCCTTCTGATGGACCTGTTATGCAGAAGAAGACTATGGGCTGGGAACCGAGCACTGAGCGTTTGTATCCTCGTGATGGGGTTCTGAAAGGAGACCTACATATGGCCCTGATTCTGGAAGATGGTCATTACCTGGTTGAATTTAAAAGTATTTACAGGGCAAAGAAGCCTGTGCAGCTCCCAGGGTACTACTACGTTGACACCAAACTGGATATAATAAGCCACAACGAAGACTACACAGTCGTTGAGCAGTTTGAAAGAACCAACGGACGATACCATGCGTTCCTGAAGCCACCGCAGTAA（配列番号７）。
【００５２】
変異体３の遺伝子をコードする塩基配列を以下に示す：
ATGAGTTGTTCCAAGAATGTGATCAAGGAGTTCATGAGGTTCAAAGTTCATATGGAAGGAACGGTCAATGGGCATGAGTTTGAAATACGGGGGGAAGGTGAAGGGAGGCCTTACGAAGGCCAAAACACCGTAAAGCTGAAGGTAATCAAAGGTGGACCTTTGCCATTTGCTTGGGATATTTTGTCGCCACAATTCCAGTATGGAAGCAAGGCATATGTCAAGCATCCCCCTGACATACCAGACTACAAAAAGCTGTCATTTCCTGAGGGATTTAAATGGGAAAGGGTCATGAACTTTGAAGACGGAGGCGTGGTTACCGTAACCCAGGATTCCAGTTTGATAGACGGCTGTTTCGTCTACGAGGTCAAGTTCATTGGAGTGAACTTCCCTTCTGATGGACCTGTTATGCAGAAGAAGACTATGGGCTGGGAACCGAGCACTGAGCGTTTGTATCCTCGTGATGGGGTTCTGAAAGGAGACCTACATATGGCCCTGATTCTGGAAGATGGTCATTACCTGGTTGAATTTAAAAGTATTTACAGGGCAAAGAAGCCTGTGCAGCTCCCAGGGTACTACTACGTTGACACCAAACTGGATATAATAAGCCACAACGAAGACTACACAGTCGTTGAGCAGTTTGAAAGAACCAACGGACGATACCATGCGTTCCTGAAGCAACCGCAGTAA（配列番号８）。
【００５３】
核酸は、プロモーターといった転写制御のための因子が結合する領域をさらに含んでよい。また、核酸は、実施形態に係る赤色蛍光タンパク質とは異なるタンパク質をコードする遺伝子をさらに含んでよい。この場合、赤色蛍光タンパク質とこの異なるタンパク質とが融合した状態で発現されるように、それらの遺伝子が核酸上に配置されている。
【００５４】
また、核酸はベクターの形態であってよい。ベクターは、抗生物質耐性遺伝子および複製起点といった一般的なベクターに含まれる要素を含んでよい。
【００５５】
このような核酸によれば、実施形態に係る赤色蛍光タンパク質の遺伝子を、核酸の形態にて安定的に保存および使用することができる。
【実施例】
【００５６】
（１）沖縄県石垣島産ディスクコーラル由来（Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ  ｓｐ．）からの野生型蛍光タンパク質遺伝子のクローニング
石垣島産ディスクコーラルから完全長ｃＤＮＡライブラリーを取得し、そのライブラリーから野生型の赤色蛍光タンパク質遺伝子をクローニングした。
【００５７】
完全長ｃＤＮＡライブラリーは次のようにして取得した。東京都武蔵村山市所在のペット販売業者から購入した沖縄県石垣島産ディスクコーラルの０．６２ｇ分を、１０ｍＬのトータルＲＮＡ抽出試薬ＴＲＩｚｏｌ  Ｒｅａｇｅｎｔ（インビトロジェン社）溶液中でガラス製ホモジナイザーを用いて細胞を破砕し、取扱説明書に従ってＴｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出した。その後、抽出したＴｏｔａｌ  ＲＮＡはＭｉｃｒｏ−ＦａｓｔＴｒａｃｋ  ２．０  ｋｉｔ（インビトロジェン社）を用いて取扱説明書に従ってｍＲＮＡを抽出した。分離精製したｍＲＮＡについて、完全長ｃＤＮＡ合成試薬ＧｅｎｅＲａｃｅｒ（インビトロジェン社）を使用し、取扱説明書に従って完全長ｃＤＮＡを合成した。
【００５８】
クローニングのためのプライマーセットを、下記４種類の刺胞動物の蛍光タンパク質においてよく保存されているアミノ酸配列ＧＴＸＮＧＨ（配列番号９）に基づいて、候補となるプライマーを作製した。Ｘは２０アミノ酸いずれのアミノ酸も含まれる。  
Ｍｏｎｔｉｐｏｒａ  ｅｆｆｌｏｒｅｓｃｅｎｓ（ＡＢＢ１７９５０）
Ｇａｌａｘｅａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ（ＡＢＢ１７９６７）
Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ  ｓｔｒｉａｔａ（ＡＡＵ０４４４５）
Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ  ｓｐ．  ＲＣ−２００４  （ＡＹ６７９１０６）
【００５９】
作製したプライマーは以下の４種である。  
ｃｏｒａｌ−ｕｎｉｖｅｒｓａｌ−Ｆ１−ｔａ、ＴＧＧＡＡＧＧｃｒｍｔＧＴａＡＡＣＧＧＧＣＡＣ（配列番号１０）
ｃｏｒａｌ−ｕｎｉｖｅｒｓａｌ−Ｆ１−ｔｔ、ＴＧＧＡＡＧＧｃｒｍｔＧＴｔＡＡＣＧＧＧＣＡＣ（配列番号１１）
ｃｏｒａｌ−ｕｎｉｖｅｒｓａｌ−Ｆ１−ｃａ、ＴＧＧＡＡＧＧｃｒｍｃＧＴａＡＡＣＧＧＧＣＡＣ（配列番号１２）
ｃｏｒａｌ−ｕｎｉｖｅｒｓａｌ−Ｆ１−ｃｔ、ＴＧＧＡＡＧＧｃｒｍｃＧＴｔＡＡＣＧＧＧＣＡＣ（配列番号１３）
【００６０】
これらのプライマーセットを用い、完全長ｃＤＮＡ合成試薬ＧｅｎｅＲａｃｅｒ（インビトロジェン社）を使用し、取扱説明書に従って完全長ｃＤＮＡライブラリーを鋳型として３’  Ｒａｃｅ  ＰＣＲを実施した。
【００６１】
３’  Ｒａｃｅ  ＰＣＲから得られた配列を基に以下の２つのプライマーセットを作成し、完全長ｃＤＮＡ合成試薬ＧｅｎｅＲａｃｅｒ（インビトロジェン社）を使用し、取扱説明書に従って完全長ｃＤＮＡライブラリーを鋳型として５’  Ｒａｃｅ  ＰＣＲを実施した。  
Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ（ＦＰ５８６）−Ｒ１、ＴＴＣＴＴＴＣＡＴＡＣＴＧＣＴＣＡＡＣＧＡＴＴＧＴ（配列番号１４）
Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ（ＦＰ５８６）−Ｒ２、ＴＴＣＡＡＣＴＡＧＧＴＡＡＴＧＡＣＣＡＣＣＧＴＣＴ（配列番号１５）
【００６２】
５’  Ｒａｃｅ  ＰＣＲから得られた配列を基に以下のプライマーを作成し、完全長ｃＤＮＡ合成試薬ＧｅｎｅＲａｃｅｒ（インビトロジェン社）を使用し、取扱説明書に従って完全長ｃＤＮＡライブラリーを鋳型として完全長取得のための３’  Ｒａｃｅ  ＰＣＲを実施した。  
Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ−Ｆｕｌｌ−ＦＰ５８６−Ｆ１，ＡＴＴＣＣＡＧＴＴＴＣＡＧＴＣＡＧＴＧＡＣＧＧＴＣＡＧＡＧＡ（配列番号１６）
【００６３】
完全長取得３’  Ｒａｃｅ  ＰＣＲにより、沖縄県石垣島産ディスクコーラル由来の赤色蛍光タンパク質の遺伝子をコードしている塩基配列を取得した。その塩基配列を以下に示す。  
GTTTCAGCCAGTGATACAGTGACAGGGTGAGCTACTTGGTATTCTAACAAAATGAGTTGTTCCAAGAATGTGATCAAGGAGTTCATGAGGTTCAAAGTTCATATGGAAGGAACGGTCAATGGGCATGAGTTTGAAATACGGGGGGAAGGTGAAGGGAGGCCTTACGAAGGCCAAAACACCGTAAAGCTGAAGGTAATCAAAGGTGGACCTTTGCCATTTGCTTGGGATATTTTGTCGCCACAATTCCAGTATGGAAGCAAGGTATATGTCAAGCATCCCCCTGACATACCAGACTACAAAAAGCTGTCATTTCCTGAGGGATTTAAATGGGAAAGGGTCATGAACTTTGAAGACGGAGGCGTGGTTACCGTAACCCAGGATTCCAGTTTGATAGACGGCTGTTTCGTCTACGAGGTCAAGTTCATTGGAGTGAACTTCCCTTCTGATGGACCTGTTATGCAGAAGAAGACTATGGGCTGGGAACCGAGCACTGAGCGTTTGTATCCTCGTGATGGGGTTCTGAAAGGAGACCTACATATGGCCCTGATTCTGGAAGATGGTCATTACCTGGTTGAATTCAAAAGTATTTACAGGGCAAAGAAGCCTGTGCAGCTCCCAGGGTACTACTACGTTGACACCAAACTGGATATAATAAGCCACAACGAAGACTACACAGTCGTTGAGCAGTTTGAAAGAACCAACGGACGATACCATGCGTTCCTGAAGCCACCGCAGTGAACTCCGCTTCACGAGTTAGGAGTAATCGTTTTTTTAGGATTGCACCCAAAAATTGTAGGACTTGACCGCAGAAATGTAACCAACAGGCTTTGCTTATTAAACATGTATTTGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA（配列番号１７）
【００６４】
この塩基配列から推定される野生型蛍光タンパク質のアミノ酸配列を以下に示す。  
MSCSKNVIKEFMRFKVHMEGTVNGHEFEIRGEGEGRPYEGQNTVKLKVIKGGPLPFAWDILSPQFQYGSKVYVKHPPDIPDYKKLSFPEGFKWERVMNFEDGGVVTVTQDSSLIDGCFVYEVKFIGVNFPSDGPVMQKKTMGWEPSTERLYPRDGVLKGDLHMALILEDGHYLVEFKSIYRAKKPVQLPGYYYVDTKLDIISHNEDYTVVEQFERTNGRYHAFLKPPQ*（配列番号２）
【００６５】
（２）Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ  ｓｐ．蛍光タンパク質遺伝子の変異体作製
上記（１）にて取得したＤｉｓｃｏｓｏｍａ  ｓｐ．由来の野生型赤色蛍光タンパク質遺子に変異を導入し、変異体を取得した。
【００６６】
上記（１）にて取得した野生型赤色蛍光タンパク質遺伝子の塩基配列に含まれる、一箇所のＥｃｏＲＩの制限酵素サイトをなくすため、一般的なキットを用いて、アミノ酸配列を変化させずにＤＮＡ配列を改変する処理を行った。そして、一般的なキットを用いて、ｐＲＳＥＴＢ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のベクターへの挿入を行った。ｐＲＳＥＴＢにおける、ＢａｍＨＩ（５’末端側）およびＥｃｏＲＩ（３’末端側）の間に、開始コドンから終止コドンまでのＤｉｓｃｏｓｏｍａ  ｓｐ．由来の蛍光タンパク質遺伝子を挿入した。
【００６７】
Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ  ｓｐ．由来の赤色蛍光タンパク質の変異体作製は、  ＧｅｎｅＭｏｒｐｈ  ＩＩ  Ｒａｎｄｏｍ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、以下の通り行った。
【００６８】
Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ  ｓｐ．由来の野生型蛍光タンパク質がクローニングされているｐＲＳＥＴ−Ｂ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のプラスミドを鋳型とし、
Ｐｒｉｍｅｒ１（ＣＴＧＴＡＣＧＡＣＧＡＴＧＡＣＧＡＴＡＡＧＧＡＴＣＣＡＡＴＧ）（配列番号１８）、および
Ｐｒｉｍｅｒ２（ＧＴＴＡＧＣＡＧＣＣＧＧＡＴＣＡＡＧＣＴＴＣＧＡＡＴＴＣＴＴＡＣ）（配列番号１９）
をプライマーとして、キットに添付されているマニュアルに準じて、ＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応後、１％アガロースゲルを用いて電気泳動を行い、目的ＰＣＲ産物をＷｉｚａｒｄ  ＳＶ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて精製した。精製後、マニュアルに準じてＰＣＲ反応を行い、ＤｐｎＩを加えて、３７度で処理した後に、エタノール沈殿を行った。沈殿後、少量の蒸留水にＤＮＡを溶かして、ＭｉｃｒｏＰｕｌｓｅｒ（ＢｉｏＲａｄ社）を用いて、エレクトロポレーション法で、ＪＭ１０９（ＤＥ３）にトランスフォームを行った。トランスフォーム後の大腸菌を２５ｃｍ四方のＬＢ（５０μｇ／ｍＬのアンピシリン入り）プレートに撒いて、３７℃で、コロニーを形成させて、スクリーニングを行った。コロニー形成後、ＶＩＳＩＲＡＹＳ（ＡＴＴＯ）のＧＲＥＥＮの光を照射して観察し、明るい蛍光を持ったコロニーを選んで、培養を行い、その大腸菌が保持していたプラスミドのＤＮＡ配列を決定した。これによって、変異体１および３を取得した。変異体２は、変異体１のプラスミドを鋳型として、上記と同様のプライマーを用いて同様の操作を行って取得した。
【００６９】
野生型および３種の変異体のプラスミドをそれぞれ保持する大腸菌を２８度で３晩培養後、溶菌して、Ｈｉｓ  Ｌｉｎｋ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いたカラムクロマトグラフィーを行って精製した。
【００７０】
（３）Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ  ｓｐ．蛍光タンパク質の野生型および変異体のスペクトル測定
精製した野生型赤色蛍光タンパク質および３種の変異体について、各スペクトルを測定した。
【００７１】
上記（２）の通り精製した野生型および３種の変異体について、分光光度計Ｕ−３０１０  ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（ＨＩＴＡＣＨＩ社）を用いて吸収スペクトルを測定し（図１）、蛍光光度計Ｆ−２５００  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｓｐｅｃｔｒｏｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（ＨＩＴＡＣＨＩ社）を用いて蛍光スペクトル（図２）および励起スペクトル（図３）を測定した。蛍光スペクトルは５６８ｎｍで励起したものであり、励起スペクトルは蛍光波長を６１０ｎｍに設定して測定したものである。
【００７２】
図１から３に示される通り、３種の変異体は、野生型と比較して高い蛍光強度および吸光度を示した。変異体１、２および３のピーク値における蛍光強度は、それぞれ、野生型のピーク値の蛍光強度の１．４倍、１．５倍および１．７倍であった。
【００７３】
（４）大腸菌における３７℃培養条件下での蛍光観察
野生型および３種の変異体を３７℃で培養したときの蛍光の様子を観察した。
【００７４】
野生型および変異体をそれぞれ発現させた大腸菌を３７℃で培養し、経過観察を行った。ＶＩＳＩＲＡＹＳ（ＡＴＴＯ）のＧＲＥＥＮの光で励起し、赤色蛍光フィルター（Ｏｌｙｍｐｕｓ）を用いてＤＰ７０（Ｏｌｙｍｐｕｓ）で蛍光画像を取得した。その結果を図４に示す。
【００７５】
図４は、培養を始めてから約１６時間後の蛍光画像（ａ）および透過光画像（ｃ）、並びに約２３時間後の蛍光画像（ｂ）および透過光画像（ｄ）を示している。図４（ａ）から、約１６時間の段階では、野生型では蛍光を検出できない一方で、変異体１から３では検出可能な蛍光を示していることがわかる。図４（ｂ）から、約２３時間の段階になると、野生型も検出可能な蛍光を示す一方で、変異体１から３は十分な強度の蛍光を示していることがわかる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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