(57)【要約】      （修正有）【課題】酸性アミノ酸をＮ末端にもつジペプチド等の種々のペプチドを、発酵法により効率よく製造する方法を提供すること。【解決手段】ストレプトマイセス・プランベウス由来のＰｌｍ２遺伝子をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド等のポリヌクレオチド；ストレプトマイセス・プランベウス由来のＰｌｍ２タンパク質のアミノ酸配列を含むタンパク質等のタンパク質；上記ポリヌクレオチドを含む発現ベクター；上記発現ベクターを含む形質転換細胞；上記タンパク質の存在下において、少なくとも１種のアミノ酸からペプチドを生成することを含む、ペプチドの製造方法など。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のポリヌクレオチド：
（ａ）配列番号１７で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１７で表される塩基配列と７０％以上の同一性を示す塩基配列を含み、かつリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；または
（ｃ）配列番号１７で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項２】
リガーゼ活性が、Ｎ末端側のアミノ酸残基として酸性アミノ酸を有するジペプチドを生成する活性である、請求項１記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
以下（Ａ）、（Ｂ）または（Ｃ）のタンパク質：
（Ａ）配列番号２０で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質；
（Ｂ）配列番号２０で表されるアミノ酸配列と７０％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含み、かつリガーゼ活性を有するタンパク質；または
（Ｃ）配列番号２０で表されるアミノ酸配列において１個もしくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加もしくは挿入されているアミノ酸配列を含み、かつリガーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項４】
請求項１または２記載のポリヌクレオチド、または請求項３記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項５】
請求項４記載の発現ベクターを含む形質転換細胞。
【請求項６】
形質転換細胞が大腸菌である、請求項５記載の形質転換細胞。
【請求項７】
請求項５または６記載の形質転換細胞を培地中で培養して、請求項３記載のタンパク質を生成することを含む、タンパク質の製造方法。
【請求項８】
請求項３記載のタンパク質の存在下において、少なくとも１種のアミノ酸からペプチドを生成することを含む、ペプチドの製造方法。
【請求項９】
請求項５または６記載の形質転換細胞を用いてペプチドが生成される、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
ペプチドが、Ｎ末端側のアミノ酸残基として酸性アミノ酸を有するジペプチドである、請求項８または９記載の方法。
【請求項１１】
ペプチドがホモペプチドである、請求項８〜１０のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
ペプチドがヘテロペプチドである、請求項８〜１０のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
以下（１）および（２）を含む、ペプチド性化合物の製造方法：
（１）請求項３記載のタンパク質の存在下において、少なくとも１種のアミノ酸からペプチドを生成すること；および
（２）生成したペプチドを所定の化合物と反応させてペプチド性化合物を生成すること。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リガーゼ及びそれを用いたペプチドの製造方法などに関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｌ−アミノ酸リガーゼ（Ｌａｌ、ＥＣ  ６．３．２．２８）は、ＡＴＰをエネルギー源として利用することにより、遊離アミノ酸を基質としてペプチドを合成する酵素であり、これまで数種類のＬａｌが報告されている（特許文献１〜５、非特許文献１、２）。また、Ｌａｌとしてはジペプチドだけでなく３つ以上のアミノ酸を結合するようなものも知られている（非特許文献３、４）。
しかしながら、Ｌａｌの基質特異性によって、蛋白質を構成するアミノ酸２０種から組み合わされる４００種全てのジペプチドを効率よく製造することができるわけではない。特に、ＡｓｐやＧｌｕという酸性アミノ酸をＮ末端にもつジペプチドを合成するＬａｌは報告されていない。
【０００３】
Ｌａｌ遺伝子を発現する遺伝子組換え微生物を用いることで、ペプチドを発酵法によって合成することも可能であり（特許文献１、非特許文献５）、酸性アミノ酸をＮ末端にもつジペプチドを合成するＬａｌが得られれば、その応用はさらに広がる。
【０００４】
プランベマイシン（ｐｌｕｍｂｅｍｙｃｉｎ）は、ストレプトマイセス・プランベウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｌｕｍｂｅｕｓ）由来のペプチド系抗生物質として知られている化合物であり、バチラス・サチリス（Ｂｕｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来リゾクチシン（ｒｈｉｚｏｃｔｉｃｉｎ）同様、その構造中に２−アミノ−５−ホスホノ−３−ペンテン酸（２−ａｍｉｎｏ−５−ｐｈｏｓｐｈｏｎｏ−３−ｐｅｎｔｅｎｏｉｃ  ａｃｉｄ、ＡＰＰＡ）を有するトリペプチドである（非特許文献６、７）。プランベマイシンにはプランベマイシンＡ（Ａｌａ−Ａｓｐ−ＡＰＰＡ）とＢ（Ａｌａ−Ａｓｎ−ＡＰＰＡ）という２種の誘導体が存在する。プランベマイシンＡはトリペプヂドの真ん中のアミノ酸がＡｓｐ、プランベマイシンＢではＡｓｎである。
【０００５】
プランベマイシンはその構造中に二つのペプチド結合を有するが、プランベマイシン生合成遺伝子クラスターは同定されておらず、それらペプチド結合がＬａｌによって形成されているのかは不明であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特許第４７９６４９５号公報
【特許文献２】国際公開第２００７／０７４８５８号
【特許文献３】国際公開第２００８／１２３６０７号
【特許文献４】特開２００９−１７１９４８号公報
【特許文献５】特開２０１１−２３９７０７号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１８７，５１９５−５２０２（２００５）
【非特許文献２】Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，７４，４１５−４１８（２０１０）
【非特許文献３】Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，７４，１２９−１３４（２０１０）
【非特許文献４】Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，７４，１５７２−１５７７（２０１０）
【非特許文献５】Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７３，６３７８−６３８５（２００７）
【非特許文献６】Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ．，４８，１０４３−１０４５（１９９５）
【非特許文献７】Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，１７，２８−３７（２０１０）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、酸性アミノ酸をＮ末端にもつジペプチド等の種々のペプチドを、発酵法により効率よく製造する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、鋭意検討した結果、酸性アミノ酸をＮ末端にもつジペプチド等の種々のペプチドを効率よく生成できるタンパク質を見出すことに成功し、本願発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
〔１〕以下（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のポリヌクレオチド：
（ａ）配列番号１７で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１７で表される塩基配列と７０％以上の同一性を示す塩基配列を含み、かつリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；または
（ｃ）配列番号１７で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
〔２〕リガーゼ活性が、Ｎ末端側のアミノ酸残基として酸性アミノ酸を有するジペプチドを生成する活性である、〔１〕のポリヌクレオチド。
〔３〕以下（Ａ）、（Ｂ）または（Ｃ）のタンパク質：
（Ａ）配列番号２０で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質；
（Ｂ）配列番号２０で表されるアミノ酸配列と７０％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含み、かつリガーゼ活性を有するタンパク質；または
（Ｃ）配列番号２０で表されるアミノ酸配列において１個もしくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加もしくは挿入されているアミノ酸配列を含み、かつリガーゼ活性を有するタンパク質。
〔４〕〔１〕または〔２〕のポリヌクレオチド、または〔３〕のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
〔５〕〔４〕の発現ベクターを含む形質転換細胞。
〔６〕形質転換細胞が大腸菌である、〔５〕の形質転換細胞。
〔７〕〔５〕または〔６〕の形質転換細胞を培地中で培養して、〔３〕のタンパク質を生成することを含む、タンパク質の製造方法。
〔８〕〔３〕のタンパク質の存在下において、少なくとも１種のアミノ酸からペプチドを生成することを含む、ペプチドの製造方法。
〔９〕〔５〕または〔６〕の形質転換細胞を用いてペプチドが生成される、〔８〕の方法。
〔１０〕ペプチドが、Ｎ末端側のアミノ酸残基として酸性アミノ酸を有するジペプチドである、〔８〕または〔９〕の方法。
〔１１〕ペプチドがホモペプチドである、〔８〕〜〔１０〕のいずれかの方法。
〔１２〕ペプチドがヘテロペプチドである、〔８〕〜〔１０〕のいずれかの方法。
〔１３〕以下（１）および（２）を含む、ペプチド性化合物の製造方法：
（１）〔３〕のタンパク質の存在下において、少なくとも１種のアミノ酸からペプチドを生成すること；および
（２）生成したペプチドを所定の化合物と反応させてペプチド性化合物を生成すること。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、酸性アミノ酸をＮ末端にもつジペプチド等の種々のペプチドを効率よく製造できる。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は、リガーゼをコードするポリヌクレオチドを提供する。
【００１３】
一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１７で表される塩基配列を含むポリヌクレオチドである。配列番号１７で表される塩基配列は、配列番号２０で表されるアミノ酸配列をコードする。
【００１４】
別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１７で表される塩基配列と７０％以上の同一性を示す塩基配列を含み、かつリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドである。同一性％は、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％、９７％、９８％または９９％以上であってもよい。
【００１５】
本発明では、リガーゼ活性とは、カルボン酸基を有する第１の化合物と、アミノ基を有する第２の化合物とを反応させて、当該カルボン酸基と当該アミノ基との反応から生じるアミド結合を有する目的化合物を生成する活性をいう。この反応は、ＡＴＰ加水分解反応と共役して進行し得る。
カルボン酸基を有する第１の化合物は、アミノ基をさらに有していてもよい。第１の化合物は、好ましくはアミノ酸である。アミノ基を有する第２の化合物は、さらにカルボン酸基を有していてもよい。第２の化合物は、好ましくはアミノ酸である。アミノ酸中のカルボン酸基およびアミノ基は、それぞれ、未保護であっても保護されていてもよいが、アミノ酸が未保護のカルボン酸基および未保護のアミノ基を有することもまた好ましい。アミノ酸はまた、Ｌ−アミノ酸および／またはα−アミノ酸であってもよい。アミノ酸としては、例えば、Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−システイン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−リジン、グリシンが挙げられる。第１の化合物および第２の化合物は、同じであっても異なっていてもよい。
アミド結合を有する目的化合物は、少なくとも１個のアミド結合を有するペプチド性化合物である。目的化合物は、好ましくはオリゴペプチド（例、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド）であり、より好ましくはジペプチドである。酸性アミノ酸を基質として用いた場合、Ｎ末端側のアミノ酸残基として酸性アミノ酸を有するペプチドが生成され得る。
【００１６】
好ましくは、リガーゼ活性は、酸性アミノ酸および非酸性アミノ酸（例、中性アミノ酸、塩基性アミノ酸）から、Ｎ末端側のアミノ酸残基として酸性アミノ酸、およびＣ末端側のアミノ酸残基として非酸性アミノ酸（例、中性アミノ酸、塩基性アミノ酸）からなるジペプチド〔Ｎ末端−酸性アミノ酸−非酸性アミノ酸−Ｃ末端〕を特異的に生成する活性である。目的ジペプチドの「特異的」な生成とは、目的ジペプチドの生成量が他の各ジペプチドの生成量よりも多いことを意味する。具体的には、基質として２種のアミノ酸（酸性アミノ酸および非酸性アミノ酸）を用いた場合、目的ジペプチド（Ｎ末端−酸性アミノ酸−非酸性アミノ酸−Ｃ末端）の生成量が、これらのアミノ酸から生成する可能性がある他の各ジペプチド〔ｉ）Ｎ末端−非酸性アミノ酸−酸性アミノ酸−Ｃ末端、ｉｉ）Ｎ末端−酸性アミノ酸−酸性アミノ酸−Ｃ末端、またはｉｉｉ）Ｎ末端−非酸性アミノ酸−非酸性アミノ酸−Ｃ末端〕の生成量よりも多いことが意図され、目的ジペプチドの生成量が他のジペプチド〔上記ｉ）、ｉｉ）およびｉｉｉ）〕の総生成量よりも多いことが好ましい。より好ましくは、リガーゼ活性は、未保護のカルボン酸基および未保護のアミノ基を有する酸性アミノ酸、ならびに未保護のカルボン酸基および未保護のアミノ基を有する非酸性アミノ酸（例、中性アミノ酸、塩基性アミノ酸）から、Ｎ末端側のアミノ酸残基として、未保護のＮ末端を有する酸性アミノ酸、およびＣ末端側のアミノ酸残基として、未保護のＣ末端を有する非酸性アミノ酸からなるジペプチド〔Ｎ末端（未保護）−酸性アミノ酸−非酸性アミノ酸−Ｃ末端（未保護）〕を特異的に生成する活性である。
【００１７】
塩基配列およびアミノ酸配列の相同性％（例、同一性％、類似性％）は、例えばＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，５８７３（１９９３））、またはＰｅａｒｓｏｎによるＦＡＳＴＡ（ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．，１８３，６３（１９９０））を用いて決定することができる。このアルゴリズムＢＬＡＳＴに基づいて、ＢＬＡＳＴＰおよびＢＬＡＳＴＮとよばれるプログラムが開発されているので（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ参照）、これらのプログラムをデフォルト設定で用いて、塩基配列およびアミノ酸配列の同一性％を計算してもよい。また、相同性％としては、例えば、Ｌｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法を採用している株式会社ゼネティックスのソフトウェアＧＥＮＥＴＹＸ  Ｖｅｒ７．０．９を使用し、ＯＲＦにコードされるポリペプチド部分全長を用いて、Ｕｎｉｔ  Ｓｉｚｅ  ｔｏ  Ｃｏｍｐａｒｅ＝２の設定でＳｉｍｉｌａｒｉｔｙまたはｉｄｅｎｔｉｔｙをｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ計算させた際の数値を用いてもよい。相同性％として、これらの計算で導き出される値のうち、最も低い値を採用してもよい。
【００１８】
さらに別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１７で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドである。
【００１９】
「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。このような条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、高い同一性％を示す実質的に同一のポリヌクレオチド同士、例えば上述した同一性％を有するポリヌクレオチド同士がハイブリダイズし、それより低い同一性％を示すポリヌクレオチド同士がハイブリダイズしない条件である。具体的には、このような条件としては、６×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）中、約４５℃でのハイブリダイゼーション、続いて、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、５０〜６５℃での１または２回以上の洗浄が挙げられる。
【００２０】
本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよいが、ＤＮＡであることが好ましい。本発明のポリヌクレオチドは、放線菌に由来し得る。好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する微生物に由来し得る。より好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、ストレプトマイセス・プランベウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｌｕｍｂｅｕｓ）に由来し得る。本発明のポリヌクレオチドはまた、後述する本発明のタンパク質をコードするものであってもよい。
【００２１】
本発明はまた、リガーゼ活性を有するタンパク質を提供する。リガーゼ活性は、上述したとおりである。
【００２２】
一実施形態では、本発明のタンパク質は、配列番号２０で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質である。
【００２３】
別の実施形態では、本発明のタンパク質は、配列番号２０で表されるアミノ酸配列と７０％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含み、かつリガーゼ活性を有するタンパク質である。同一性％は、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％、９７％、９８％または９９％以上であってもよい。
【００２４】
さらに別の実施形態では、本発明のタンパク質は、配列番号２０で表されるアミノ酸配列において１個もしくは数個のアミノ酸残基が変異しているアミノ酸配列を含み、かつリガーゼ活性を有するタンパク質である。アミノ酸残基の変異としては、例えば、アミノ酸残基の欠失、置換、付加および挿入が挙げられる。１個もしくは数個のアミノ酸残基の変異は、アミノ酸配列中の１つの領域に導入されてもよいが、複数の異なる領域に導入されてもよい。用語「１個もしくは数個」は、タンパク質の立体構造や活性を大きく損なわない範囲を示すものである。タンパク質の場合における用語「１もしくは数個」が示す数は、例えば、１〜１００個、好ましくは１〜８０個、より好ましくは１〜５０個、１〜３０個、１〜２０個、１〜１０個または１〜５個である。本発明のタンパク質は、ヒスチジンタグ等の精製用タグを有していてもよい。
【００２５】
本発明のタンパク質は、目的活性を保持し得る限り、触媒ドメイン中の部位、および触媒ドメイン以外の部位に変異が導入されていてもよい。目的活性を保持し得る、変異が導入されてもよいアミノ酸残基の位置は、当業者に自明である。具体的には、当業者は、１）同種の活性を有する複数のタンパク質のアミノ酸配列（例、配列番号２０により表されるアミノ酸配列、および他のリガーゼのアミノ酸配列）を比較し、２）相対的に保存されている領域、および相対的に保存されていない領域を明らかにし、次いで、３）相対的に保存されている領域および相対的に保存されていない領域から、それぞれ、機能に重要な役割を果たし得る領域および機能に重要な役割を果たし得ない領域を予測できるので、構造・機能の相関性を認識できる。したがって、当業者は、リガーゼのアミノ酸配列において変異が導入されてもよいアミノ酸残基の位置を特定できる。
【００２６】
アミノ酸残基が置換により変異される場合、アミノ酸残基の置換は、保存的置換であってもよい。本明細書中で用いられる場合、用語「保存的置換」とは、所定のアミノ酸残基を、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換することをいう。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該分野で周知である。例えば、このようなファミリーとしては、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電性極性側鎖を有するアミノ酸（例、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β位分岐側鎖を有するアミノ酸（例、スレオニン、バリン、イソロイシン）、芳香族側鎖を有するアミノ酸（例、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）、ヒドロキシル基（例、アルコール性、フェノール性）含有側鎖を有するアミノ酸（例、セリン、スレオニン、チロシン）、および硫黄含有側鎖を有するアミノ酸（例、システイン、メチオニン）が挙げられる。好ましくは、アミノ酸の保存的置換は、アスパラギン酸とグルタミン酸との間での置換、アルギニンとリジンとヒスチジンとの間での置換、トリプトファンとフェニルアラニンとの間での置換、フェニルアラニンとバリンとの間での置換、ロイシンとイソロイシンとアラニンとの間での置換、およびグリシンとアラニンとの間での置換であってもよい。
【００２７】
本発明のタンパク質は、例えば、本発明のタンパク質を産生する形質転換細胞から得ることができる。このような形質転換細胞は、本発明の発現ベクターを作製し、次いで、この発現ベクターを宿主に導入することにより作製することができる。本発明のタンパク質を産生させるための宿主としては、例えば、エスケリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）等のエスケリシア属細菌、コリネバクテリウム属細菌、およびバチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）をはじめとする種々の原核細胞、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ピヒア・スティピティス（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）をはじめとする種々の真核細胞が挙げられる。
【００２８】
形質転換される宿主としてＥ．ｃｏｌｉについて詳述すると、Ｅ．ｃｏｌｉとしては、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ１２株亜種のＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９株、ＤＨ５α株、ＨＢ１０１株、ＢＬ２１（ＤＥ３）株が挙げられる。形質転換方法、および形質転換細胞を選別する方法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ｐｒｅｓｓ  （２００１／０１／１５）などにも記載されている。以下、形質転換されたＥ．ｃｏｌｉを作製し、これを用いて本発明のタンパク質を製造する方法を、一例としてより具体的に説明する。
【００２９】
本発明の発現ベクターとしては、例えば、宿主においてタンパク質を産生させる細胞系ベクター、およびタンパク質翻訳系を利用する無細胞系ベクターが挙げられる。発現ベクターはまた、プラスミド、または組込み型（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ）ベクターであってもよい。発現ベクターはさらに、ＤＮＡベクターまたはＲＮＡベクターであってもよい。細胞系ベクターとしては、宿主に適した公知の発現ベクターが用いられる。例えば、大腸菌用の発現ベクターとしては、ｐＢＲ３２２誘導体に代表されるＣｏｌＥ系プラスミド、ｐ１５Ａオリジンを持つｐＡＣＹＣ系プラスミド、ｐＳＣ系プラスミド、Ｂａｃ系プラスミドが挙げられる。その他、ｔｒｃやｔａｃ等のトリプトファンプロモーター、ｌａｃプロモーター、Ｔ７プロモーター、Ｔ５プロモーター、Ｔ３プロモーター、ＳＰ６プロモーター、アラビノース誘導プロモーター、コールドショックプロモーター、テトラサイクリン誘導性プロモーター等を有する発現ベクターも挙げられる。
【００３０】
本発明の発現ベクターでは、本発明のタンパク質をコードする遺伝子の下流に、転写終結配列であるターミネータを連結してもよい。このようなターミネータとしては、例えば、Ｔ７ターミネータ、ｆｄファージターミネータ、Ｔ４ターミネータ、テトラサイクリン耐性遺伝子のターミネータ、大腸菌ｔｒｐＡ遺伝子のターミネータが挙げられる。
【００３１】
本発明のタンパク質をコードする遺伝子をＥ．ｃｏｌｉに導入するためのベクターとしては、いわゆるマルチコピー型のものが好ましく、ＣｏｌＥ１由来の複製開始点を有するプラスミド、例えばｐＵＣ系のプラスミドやｐＢＲ３２２系のプラスミドあるいはその誘導体が挙げられる。ここで、「誘導体」とは、塩基の置換、欠失、挿入、付加および／または逆位などによってプラスミドに改変を施したものを意味する。なお、ここでいう「改変」とは、変異剤やＵＶ照射などによる変異処理、あるいは自然変異などによる改変をも含む。
【００３２】
ベクターは、形質転換細胞の選別のため、アンピシリン耐性遺伝子等のマーカーを有することが好ましい。このようなプラスミドとして、強力なプロモータを持つ発現ベクターが市販されている（例、ｐＵＣ系（タカラバイオ社製）、ｐＰＲＯＫ系（クローンテック製）、ｐＫＫ２３３−２（クローンテック製））。
【００３３】
得られた発現ベクターを用いてＥ．ｃｏｌｉを形質転換し、得られたＥ．ｃｏｌｉを培養すると、本発明のタンパク質が発現される。
【００３４】
培地としては、例えば、Ｍ９−カザミノ酸培地、ＬＢ培地など、微生物を培養するために通常用いる培地が挙げられる。培養および生産誘導等の条件は、用いたベクターのマーカー、プロモーター、宿主菌等の種類に応じて適宜選択することができる。
【００３５】
本発明のタンパク質を回収するには、以下の方法などがある。本発明のタンパク質は、本発明のタンパク質を産生する形質転換細胞を回収した後、形質転換細胞を破砕（例、ソニケーション、ホモジナイゼーション）あるいは溶解（例、リゾチーム処理）することにより、破砕物および溶解物として得ることができる。このような破砕物および溶解物を、抽出、沈澱、濾過、カラムクロマトグラフィー等の手法に供することにより、本発明のタンパク質を得ることができる。
【００３６】
本発明はまた、ペプチドの製造方法を提供する。このような方法は、本発明のタンパク質の存在下において、少なくとも１種のアミノ酸からペプチドを生成することを含む。生成されるペプチドとしては、例えば、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド等のオリゴペプチドが挙げられる。
【００３７】
一実施形態では、ペプチドを構成するＮ末端のアミノ酸は、酸性アミノ酸（例、Ｌ−グルタミン酸またはＬ−アスパラギン酸）である。一方、ペプチドを構成するＣ末端のアミノ酸は、上述したような任意のアミノ酸である。本実施形態では、基質として、少なくとも一種の酸性アミノ酸が用いられる。
【００３８】
別の実施形態では、ペプチドは、同種のアミノ酸から構成されるホモペプチド（例、ホモジペプチド）である。本実施形態では、基質として、一種のアミノ酸を用いることができる。このようなアミノ酸としては、例えば、上述したものが挙げられる。
【００３９】
さらに別の実施形態では、ペプチドは、異種のアミノ酸から構成されるヘテロペプチド（例、ヘテロジペプチド）である。本実施形態では、基質として、二種のアミノ酸を用いることができる。このようなアミノ酸としては、例えば、上述したものが挙げられる。
【００４０】
本発明のペプチドの製造方法は、本発明のタンパク質の存在下で行われる限り特に限定されず、例えば、本発明のタンパク質自体（例、精製タンパク質）を用いる酵素反応系により、または本発明のタンパク質を産生する本発明の形質転換細胞の培養（即ち、発酵法）により行うことができる。好ましくは、本発明の形質転換細胞の培養により行われる。本発明のペプチドの製造方法において本発明の形質転換細胞を用いる場合、ペプチドの原料となるアミノ酸は、本発明の形質転換細胞により培地成分（例、炭素源および窒素源、またはペプチド成分）から生合成されたものであってもよいし、または培養系に添加されたものであってもよい。
【００４１】
酵素反応系によりペプチドが製造される場合、酵素反応は、本発明のタンパク質、および基質（アミノ酸）をそれぞれ適量含む緩衝液（例、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）中で行うことができる。緩衝液のｐＨは、例えば、中性またはアルカリ性条件に対応するｐＨに適宜設定される。酵素反応系は、適量のＡＴＰ（例、１〜１００ｍｍｏｌ／Ｌ）および適量のマグネシウム塩（例、１〜１００ｍｍｏｌ／Ｌの硫酸マグネシウム）を含むように調製される。酵素反応系は、好ましくは、酵素安定化剤（例、ジチオスレイトール、グリセロール）を含む。反応温度は、例えば、３０〜４０℃である。反応時間は、生成されるべきペプチドの量に応じて適宜設定できる。
【００４２】
発酵法によりペプチドが製造される場合、本発明の形質転換細胞の培養培地としては、適切な炭素源および窒素源を含むものが用いられる。炭素源としては、例えば、単糖類、二糖類、オリゴ糖類、多糖類等の炭水化物が挙げられる。窒素源としては、例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、大豆加水分解物などの有機窒素が挙げられる。培養培地はまた、適切なミネラル（例、マグネシウム）、他の栄養源、緩衝液などを含んでいてもよい。培養培地としてはまた、Ｌｕｒｉａ  Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）ブロス、Ｓａｂｏｕｒａｕｄ  Ｄｅｘｔｒｏｓｅ（ＳＤ）ブロス、Ｙｅａｓｔ  ｍｅｄｉｕｍ（ＹＭ）ブロス等の一般的に市販されている培地を用いることもできる。
【００４３】
本発明の形質転換細胞の培養条件としては、本発明のタンパク質の産生が可能な条件であれば、特に限定されず、標準的な条件を利用することができる。形質転換細胞の培養方法としては、例えば、バッチ培養法、流加培養法、連続培養法等の公知の発酵法が挙げられる。培養温度は、例えば、２０℃〜４０℃である。ＣＯ２濃度は、例えば、約６％〜約８４％である。ｐＨは、例えば、約５〜約９である。
【００４４】
本発明の製造方法において生成されるペプチドは、公知の分離精製手段、例えば、濃縮、減圧濃縮、溶媒抽出、晶出、再結晶、転溶、活性炭処理、イオン交換クロマトグラフィー等のクロマトグラフィーなどの処理を必要に応じて組み合せることにより単離精製することができる。本発明の製造方法において、基質として用いられるアミノ酸、および生成されるペプチドは、特に断らない限り、塩の形態であってもなくてもよい。このような塩は、それ自体公知の手段に従い、例えば、アミノ酸またはペプチドに無機酸または有機酸を加えることによって製造することができる。また、アミノ酸またはペプチドは、水和物であってもよく、水和物および非水和物のいずれも本発明の範囲に包含されるものである。塩としては、例えば、アルカリ金属（例、ナトリウム、カリウム、リチウム）塩、アルカリ土類金属（例、カルシウム、マグネシウム）塩などの塩基塩および塩酸塩、硫酸塩、硝酸鉛、リン酸塩などの酸付加塩が挙げられる。本発明の製造方法において生成されるペプチドは、例えば、医薬品、化粧品、食品、試薬もしくは工業製品として、またはそれらの製品の原料として有用である。
【００４５】
本発明はまた、ペプチド性化合物の製造方法を提供する。本発明のペプチド性化合物の製造方法は、以下（１）および（２）を含む：
（１）本発明のタンパク質の存在下において、少なくとも１種のアミノ酸からペプチドを生成すること；および
（２）生成したペプチドを所定の化合物と反応させてペプチド性化合物を生成すること。
上記（１）の工程は、上述した本発明のペプチドの製造方法と同様にして行うことができる。
【００４６】
上記（２）の工程では、（１）で生成したペプチドが所定の化合物と反応される。ペプチドと反応される所定の化合物は、ペプチドに対する反応性を示す官能基（例、カルボン酸基、アミノ基、ヒドロキシル基、またはそれらの誘導体）を有する化合物である限り特に限定されない。このような化合物は、低分子化合物であっても高分子化合物であってもよい。具体的には、このような化合物としては、例えば、アミノ酸、ペプチド（例、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド等のオリゴペプチド）、糖（例、単糖、または二糖等のオリゴ糖）、脂質（例、脂肪酸）、核酸（例、ＤＮＡ、ＲＮＡ等の天然核酸、ＰＮＡ等の人工核酸）が挙げられる。反応は、有機化学的反応（例、固相合成法）であっても生物学的反応（例、酵素法、発酵法）であってもよい。このような反応は、当該分野において公知の方法により行うことができる。
【００４７】
本発明の製造方法において生成されるペプチド性化合物は、（１）で生成したペプチドおよび上述した所定の化合物から生成される化合物である限り特に限定されない。例えば、（１）で生成したペプチドがジペプチドである場合は、ペプチド性化合物は、トリペプチド、テトラペプチド等のオリゴペプチドであってもよい。トリペプチドとしては、例えば、プランベマイシンＡ（Ａｌａ−Ａｓｐ−ＡＰＰＡ）、プランベマイシンＢ（Ａｌａ−Ａｓｎ−ＡＰＰＡ）等のプランベマイシンが挙げられる。プランベマイシンが生成される場合、（１）で生成したペプチドと反応される所定の化合物として、２−アミノ−５−ホスホノ−３−ペンテン酸が用いることができる。
【００４８】
本発明の製造方法において生成されるペプチド性化合物は、公知の分離精製手段、例えば、濃縮、減圧濃縮、溶媒抽出、晶出、再結晶、転溶、活性炭処理、イオン交換クロマトグラフィー等のクロマトグラフィーなどの処理を必要に応じて組み合せることにより単離精製することができる。本発明の製造方法において、基質として用いられるペプチドおよび所定の化合物、ならびに生成されるペプチド性化合物は、特に断らない限り、塩の形態であってもなくてもよい。このような塩は、それ自体公知の手段に従い、例えば、ペプチド若しくは所定の化合物、またはペプチド性化合物に無機酸または有機酸を加えることによって製造することができる。また、ペプチドおよび所定の化合物、ならびにペプチド性化合物は、水和物であってもよく、水和物および非水和物のいずれも本発明の範囲に包含されるものである。塩としては、例えば、アルカリ金属（例、ナトリウム、カリウム、リチウム）塩、アルカリ土類金属（例、カルシウム、マグネシウム）塩などの塩基塩および塩酸塩、硫酸塩、硝酸鉛、リン酸塩などの酸付加塩が挙げられる。本発明の製造方法において生成されるペプチド性化合物は、例えば、医薬品、化粧品、食品、試薬もしくは工業製品として、またはそれらの製品の原料として有用である。
【実施例】
【００４９】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。なお、本発明は以下の実施例により何ら限定されるものではない。
【００５０】
実施例１：プランベマイシン生合成遺伝子クラスターの推定
ストレプトマイセス・プランベウス株（ＮＢＲＣ番号：１３７０８）のプランベマイシン生合成に関与する遺伝子クラスターの推定を行なった。
【００５１】
（１−１）ストレプトマイセス・プランベウスＮＢＲＣ１３７０８株からのゲノムＤＮＡ抽出
ストレプトマイセス・プランベウスＮＢＲＣ１３７０８株を坂口フラスコ中１００  ｍＬのＧｒｏｗｔｈ  Ｍｅｄｉｕｍ（ｐｅｐｔｏｎｅ：０．５ｇ、ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ：０．３ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ：０．１ｇ）で培養２８℃、１２０  ｒｐｍで２日間培養し、該培養菌体からＰｏｗｅｒＭｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｍａｘｉ  ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＭＯ  ＢＩＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社製）を用い、マニュアルに従いゲノムＤＮＡを調製した。
【００５２】
（１−２）ホスホエノールピルビン酸ムターゼ（ＰｅｐＭ）遺伝子のコアフラグメントの取得
ＡＰＰＡの生合成の第一段階目の反応である、ホスホエノールピルビン酸からホスホノピルビン酸への変換を触媒するＰｅｐＭ遺伝子のコア配列の取得を行なった。
【００５３】
ストレプトマイセス・ロゼオスポラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓ）由来ＰｅｐＭのアミノ酸配列（配列番号１）、ストレプトマイセス・ルベロムリヌス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｒｕｂｅｌｌｏｍｕｒｉｎｕｓ）由来ＰｅｐＭのアミノ酸配列（配列番号２）、ストレプトマイセス・ルリダス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｕｒｉｄｕｓ）由来ＰｅｐＭのアミノ酸配列（配列番号３）、ストレプトマイセス・ハイグロスコピカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）由来ＰｅｐＭのアミノ酸配列（配列番号４）、ストレプトマイセス・ビリドクロモゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｓ  ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）由来ＰｅｐＭのアミノ酸配列（配列番号５）、バチラス・サチリス（Ｂｕｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来ＰｅｐＭのアミノ酸配列（配列番号６）のアライメントを基に、配列間で高度に保存されている領域を４箇所見出した。本保存領域をＮ末側から領域１から４とし、２段階の縮重ＰＣＲにより、領域２と３の間のコア配列の増幅を試みた。
【００５４】
Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ−Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ  Ｈｙｂｒｉｄ  ＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅＰｒｉｍｅｒ（ＣＯＤＥＨＯＰ、ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｗｅｉｚｍａｎｎ．ａｃ．ｉｌ／ｂｌｏｃｋｓ／ｃｏｄｅｈｏｐ．ｈｔｍｌ）を用い、保存領域のアミノ酸配列を塩基配列に変換し、縮重プライマーを作製し、日本バイオサービス社より購入した。縮重プライマーＡ（配列番号７）および縮重プライマーＢ（配列番号８）、ならびに鋳型として１−１で調製したゲノムＤＮＡを用いた一段階目のＰＣＲにより、ＰｅｐＭ遺伝子の保存領域１と４の間の増幅を行った。縮重プライマーＡは、保存領域１の塩基配列を、縮重プライマーＢは、保存領域４の配列と相補的な塩基配列を有している。ＰＣＲは、Ｅｘ  Ｔａｑポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用い、マニュアルに従って行った。
【００５５】
続いて、一段階目のＰＣＲ産物を鋳型として、二段階目のＰＣＲを行なった。縮重プライマーＣ（配列番号９）および縮重プライマーＤ（配列番号１０）、ならびに鋳型として一段階目のＰＣＲ産物を用いた二段階目のＰＣＲにより、ＰｅｐＭ遺伝子の保存領域２と３の間のコア配列の増幅を行なった。縮重プライマーＣは、保存領域２の塩基配列を、縮重プライマーＤは、保存領域３の配列と相補的な塩基配列を有している。ＰＣＲは、Ｅｘ  Ｔａｑポリメラーゼを用い、マニュアルに従って行った。
【００５６】
ＰＣＲ産物全量をアガロース電気泳動に供し、ＰｅｐＭ遺伝子コア断片に相当する約３５０ｂｐのＤＮＡ断片が増幅していることを確認した後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｕｉａｇｅｎ社製）を用いてアガロースゲルからの切り出し精製を行い、１０μｌのＢｕｆｆｅｒ  ＥＢに溶解した。得られたＰｅｐＭ遺伝子を含む約３５０ｂｐのＤＮＡ断片およびＴ−Ｖｅｃｔｏｒの約２．７ｋｂのＤＮＡ断片を、ＴａＫａＲａ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２．１（タカラバイオ社製）を用いて、１６℃で３０分間反応させ連結した。該反応液を用いてエシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（タカラバイオ社製）を、ヒートショック法により形質転換し、該形質転換細胞を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ［１０ｇ／Ｌバクトトリプトン（ディフコ社製）、５ｇ／Ｌイーストエキス（ディフコ社製）、５ｇ／Ｌ塩化ナトリウム（Ｗａｋｏ社製）］寒天培地に塗布した後、３７℃で一晩培養した。
【００５７】
生育してきた形質転換細胞のコロニーより、公知の方法によりプラスミドを抽出し、その塩基配列を公知の方法により決定した。塩基配列およびそれによりコードされるアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１１および配列番号１２に示す。本アミノ酸配列は他の主由来ＰｅｐＭ配列と高い相同性を有しており、ＰｅｐＭ遺伝子の一部が得られたものと断定した。
【００５８】
（１−３）ＰｅｐＭ遺伝子周辺配列の解読
上記ＰｅｐＭ遺伝子のコア配列を基に、ゲノムウォーキング法及びサザンブロッティングによるＰｅｐＭ遺伝子周辺配列の解読を行なった。
【００５９】
ゲノムウォーキングには、ＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いた。マニュアルに従い以下の表に示す鋳型ライブラリーとプライマーを用いてゲノムウォーキングを実施し、ＰｅｐＭ遺伝子コア配列の５’末端外側約２．５ｋｂ及び３‘末端外側約４．５ｋｂの配列を解読した。それぞれの塩基配列を、配列番号１３および１４に示す。
【００６０】
【表１】
2014057545.tif 000002
【００６１】
【表２】
2014057545.tif 000003
【００６２】
３’側の塩基配列をさらに読み進めるため、配列番号１４の３‘末端１ｋｂの配列をプローブとしてサザンブロッティングを行なった。プローブの配列を配列番号１５に示す。サザンブロッティングには、ＤＩＧ  Ｈｉｇｈ  Ｐｒｉｍｅ  ＤＮＡ  Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｔａｒｔｅｒ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ社製）を用い、ＥｃｏＲＩ及びＫｐｎＩにより制限酵素処理したゲノムＤＮＡを鋳型として、マニュアルに従って行なった。その結果、約９ｋｂの断片が得られ、この断片をｐＵＣベクターへとサブクローニングし、新たに約４．５ｋｂのゲノムＤＮＡ配列を解読した。新たに解読した塩基配列を配列番号１６に示す。
【００６３】
解読した配列をもとに、ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴサーチを行なったところ、以下の表に示すとおり、１３の全長遺伝子と、１つの部分長遺伝子が含まれていることが判明した。これらの遺伝子のコードするタンパク質のうち２つ（Ｐｌｍ１、Ｐｌｍ２）はリゾクチシン生合成に関与する既知のリガーゼと高い相同性を示し、また、これらを含めた殆どがリゾクチシン遺伝子クラスター内に存在する遺伝子のコードするタンパク質と高い相同性を有していた。このことから、これら計１４つの遺伝子は、プランベマイシンの生合成に関与する遺伝子クラスターの一部であると推定した。
【００６４】
【表３】
2014057545.tif 000004
【００６５】
実施例２：エシェリヒア・コリ用発現プラスミドｐＥＴ−ｐｌｍ２の構築
エシェリヒア・コリ用発現プラスミドｐＥＴ−ｐｌｍ２を以下の手順で構築した。
【００６６】
日本バイオサービス社より、実施例１で得られたＰｌｍ２遺伝子配列（配列番号１７）を基に作製したプライマーＥ（配列番号１８）およびプライマーＦ（配列番号１９）を購入した。プライマーＥは、Ｐｌｍ２遺伝子配列の開始コドンの次からを含む領域の５’末端にＮｄｅＩ認識配列を含む塩基配列を付加したものである。プライマーＦは、Ｐｌｍ２遺伝子配列の終止コドンより内側の塩基配列と相補的な塩基配列の５’末端にＸｈｏＩ認識配列を含む塩基配列を付加したものである。
【００６７】
プライマーＥおよびプライマーＦ、ならびに鋳型としてストレプトマイセス・プランベウスＮＢＲＣ１３７０８株ゲノムＤＮＡを用いたＰＣＲにより、Ｐｌｍ２遺伝子を含む配列の増幅を行った。ＰＣＲは、ストレプトマイセス・プランベウスＮＢＲＣ１３７０８株ゲノムＤＮＡ、０．２μｍｏｌ／Ｌの各プライマー、１．０ｕｎｉｔのＰｈｕｓｉｏｎ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＦＩＮＮＺＹＭＥＳ社製）、１０μＬの５ｘＰｈｕｓｉｏｎ  ＨＦ緩衝液、各２．５ｍｍｏｌ／ＬのｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰ）を含む反応液５０μｌを調製し、９８℃で３０秒間加温した後、９８℃で１５秒間、６０℃で１０秒間、７２℃で３０秒間の工程を３０回繰り返し、さらに７２℃で１分間加温することにより行った。
【００６８】
ＰＣＲ後の反応液の５μｌをアガロースゲル電気泳動に供し、Ｐｌｍ２遺伝子断片に相当する約１．１ｋｂのＤＮＡ断片が増幅していることを確認した後、残りの反応液からＭｉｎＥｌｕｔｅ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｃｌｅａｎｕｐ  Ｋｉｔを用いて精製し、４２μｌのＢｕｆｆｅｒ  ＥＢに溶解した。次に、得られたＤＮＡ溶液全量を用い、該ＤＮＡ断片をＮｄｅＩおよびＸｈｏＩで切断後、ＭｉｎＥｌｕｔｅ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｃｌｅａｎｕｐ  Ｋｉｔを用いて該ＤＮＡ断片を精製し、１０μｌのＢｕｆｆｅｒ  ＥＢに溶解した。
【００６９】
１μｇの発現プラスミドｐＥＴ−２１ａ（＋）を制限酵素ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩで切断後、ＭｉｎＥｌｕｔｅ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｃｌｅａｎｕｐ  Ｋｉｔを用いて該ＤＮＡ断片を精製し、１５μｌのＢｕｆｆｅｒ  ＥＢに溶解した。次に、得られたＤＮＡ溶液全量を用い、該ＤＮＡ断片をＡｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ，Ｃａｌｆ  ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ（ＣＩＡＰ）で脱リン酸化した後、ＭｉｎＥｌｕｔｅ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｃｌｅａｎｕｐ  Ｋｉｔを用いて精製し、１０μｌのＢｕｆｆｅｒ  ＥＢに溶解した。
【００７０】
上記で得られたＰｌｍ２遺伝子を含む約１．１ｋｂのＤＮＡ断片および上記で取得した発現ベクターｐＥＴ−２１ａ（＋）の約５．４ｋｂのＤＮＡ断片を、ＴａＫａＲａ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２．１を用いて、１６℃で３０分間反応させ連結した。該反応液を用いてエシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（タカラバイオ社製）を、ヒートショック法により形質転換し、該形質転換細胞を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布した後、３７℃で一晩培養した。
【００７１】
生育してきた形質転換細胞のコロニーより、公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、その塩基配列を公知の方法により決定した。得られたプラスミドは、３’末端にＨｉｓタグ配列をコードする配列が付加されたストレプトマイセス・プランベウスＮＢＲＣ１３７０８株由来Ｐｌｍ２遺伝子が、Ｔ７プロモーター下流に連結されたプラスミドであり、ｐＥＴ−ｐｌｍ２と命名した。なお、ストレプトマイセス・プランベウスＮＢＲＣ１３７０８株由来ｐｌｍ２遺伝子の塩基配列およびそれによりコードされるアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１７および配列番号２０に示す。
【００７２】
続いて、ｐＥＴ−ｐｌｍ２を用いてエシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）株コンピテントセルを、ヒートショック法により形質転換し、該形質転換細胞を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布した後、３７℃で一晩培養した。生育してきた形質転換細胞のコロニーより公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、制限酵素を用いてその構造を解析することにより、ｐＥＴ−ｐｌｍ２が保持されていることを確認した。このｐＥＴ−ｐｌｍ２を保持するエシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）株を、エシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−ｐｌｍ２と命名した。
【００７３】
実施例３：Ｐｌｍ２の精製
実施例２で得られたエシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−ｐｌｍ２を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む３ｍＬのＬＢ培地の入った試験管に接種し３７℃で１６時間振とう培養した。得られた培養液のうち２ｍｌを１００ｍｌのＬＢ培地が入った坂口フラスコに接種した。３７℃で２時間振とう培養後、終濃度が０．５ｍｍｏｌ／Ｌになるようにイソプロピル−β―Ｄ―チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加して、さらに３０℃で４時間培養した。培養液を遠心分離して湿菌体を取得した。
【００７４】
該湿菌体を、１０ｍＬの抽出バッファー（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０  ５０ｍＭ、ＮａＣｌ  １５０ｍＭ）に懸濁し超音波処理によりタンパク質を抽出した後、遠心分離して得られる上清から、Ｎｉ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗを用い、説明書に従いＨｉｓタグ付加組換え型Ｐｌｍ２を精製した。続いて、該精製酵素についてＰＤ−１０カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いて、説明書に従い脱塩を行った。この精製および脱塩されたＰｌｍ２を、精製Ｐｌｍ２として以降の実験に用いた。
【００７５】
実施例４：Ｐｌｍ２を用いたホモジペプチドの生成
実施例３で取得した精製Ｐｌｍ２を用い、Ｌ−Ｖａｌ、Ｌ−Ｌｅｕ、Ｌ−Ｉｌｅ、Ｌ−Ａｌａ及びＬ−Ｇｌｕを基質とするホモジペプチド生成を検討した。下記組成の反応液（ｐＨ９．５）４００μｌを調製し、３０℃で１６時間反応を行った。
【００７６】
〔反応液組成〕
精製Ｐｌｍ２                                      １６０μｇ／４００μｌ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．５）                    １００  ｍｍｏｌ／Ｌ
Ｌ−アミノ酸                                      １００  ｍｍｏｌ／Ｌ
アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）                      １０  ｍｍｏｌ／Ｌ
硫酸マグネシウム                                  １０  ｍｍｏｌ／Ｌ
ジチオスレイトール（ＤＴＴ）                        ２  ｍｍｏｌ／Ｌ
グリセロール                                      １５  ％（Ｖｏｌ．／Ｖｏｌ．）
【００７７】
ネガティブコントロールとして、ＡＴＰ反応組成よりＡＴＰを抜いた反応、熱処理した精製酵素を用いた反応をそれぞれ併せて行なった。
【００７８】
反応終了後、ネガティブコントロールでは生成が確認されなかった反応生成物をＨＰＬＣにより分析したところ、各反応生成物のピークはＶａｌ−Ｖａｌ、Ｌｅｕ−Ｌｅｕ、Ｉｌｅ−Ｉｌｅ、Ａｌａ−Ａｌａ及びαＧｌｕ−Ｇｌｕ（αは、アミド結合を構成するカルボニル基のグルタミン酸残基中の位置を示す）の標品のピークと保持時間が一致し、それぞれ基質アミノ酸のホモジペプチドであると判断した。定量の結果、Ｖａｌ−Ｖａｌ濃度は１０．０ｍｍｏｌ／Ｌ、Ｌｅｕ−Ｌｅｕ濃度は８．５ｍｍｏｌ／Ｌ、Ｉｌｅ−Ｉｌｅ濃度は８．９ｍｍｏｌ／Ｌ、Ａｌａ−Ａｌａ濃度は９．０ｍｍｏｌ／Ｌ、αＧｌｕ−Ｇｌｕ濃度は４．９ｍｍｏｌ／Ｌであった。
【００７９】
実施例５：Ｐｌｍ２を用いたヘテロジペプチドの生成
実施例３で取得した精製Ｐｌｍ２を用い、各アミノ酸を基質とするヘテロジペプチドの生成を検討した。下記組成の反応液（ｐＨ９．５）４００μｌを調製し、３０℃で１６時間反応を行った。
【００８０】
〔反応液組成〕
精製Ｐｌｍ２                                      １６０μｇ／４００μｌ
Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ（ｐＨ９．５）                    １００  ｍｍｏｌ／Ｌ
Ｌ−Ａｓｎ  ｏｒ  Ｌ−Ａｓｐ                      １００  ｍｍｏｌ／Ｌ
Ｌ−Ｖａｌ  ｏｒ  Ｌ−Ｌｅｕ  ｏｒ  Ｌ−Ｐｈｅ    １００  ｍｍｏｌ／Ｌ
アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）                      １０  ｍｍｏｌ／Ｌ
硫酸マグネシウム                                  １０  ｍｍｏｌ／Ｌ
ジチオスレイトール（ＤＴＴ）                        ２  ｍｍｏｌ／Ｌ
グリセロール                                      １５％（Ｖｏｌ．／Ｖｏｌ．）
【００８１】
ネガティブコントロールとして、ＡＴＰ反応組成よりＡＴＰを抜いた反応、熱処理した精製酵素を用いた反応をそれぞれ併せて行なった。
【００８２】
反応終了後、ネガティブコントロールでは生成が確認されなかった反応生成物をＨＰＬＣにより分析し、標品を用いて定量を行なった。結果は、以下の表に示されるとおりであった。
【００８３】
【表４】
2014057545.tif 000005
１）ｎ．ｄ．：検出限界以下
２）αおよびβは、アミド結合を構成するカルボニル基のアスパラギン酸残基中の位置を示す。
３）全てのアミノ酸は、Ｌ−アミノ酸である。
【配列表フリーテキスト】
【００８４】
配列番号１：ストレプトマイセス・ロゼオスポラス由来のＰｅｐＭタンパク質のアミノ酸配列
配列番号２：ストレプトマイセス・ルベロムリヌス由来のＰｅｐＭタンパク質のアミノ酸配列
配列番号３：ストレプトマイセス・ルリダス由来のＰｅｐＭタンパク質のアミノ酸配列
配列番号４：ストレプトマイセス・ハイグロスコピカス由来のＰｅｐＭタンパク質のアミノ酸配列
配列番号５：ストレプトマイセス・ビリドクロモゲネス由来のＰｅｐＭタンパク質のアミノ酸配列
配列番号６：バチラス・サチリス由来のＰｅｐＭタンパク質のアミノ酸配列
配列番号７：ストレプトマイセス・プランベウス由来のＰｅｐＭ遺伝子を増幅するための縮重フォワードプライマー（プライマーＡ）
配列番号８：ストレプトマイセス・プランベウス由来のＰｅｐＭ遺伝子を増幅するための縮重リバースプライマー（プライマーＢ）
配列番号９：ストレプトマイセス・プランベウス由来のＰｅｐＭ遺伝子を増幅するための縮重フォワードプライマー（プライマーＣ）
配列番号１０：ストレプトマイセス・プランベウス由来のＰｅｐＭ遺伝子を増幅するための縮重リバースプライマー（プライマーＤ）
配列番号１１：ストレプトマイセス・プランベウス由来のＰｅｐＭ遺伝子の部分塩基配列
配列番号１２：ストレプトマイセス・プランベウス由来のＰｅｐＭタンパク質の部分アミノ酸配列
配列番号１３：ＰｅｐＭ遺伝子コア配列の５’末端上流の塩基配列
配列番号１４：ＰｅｐＭ遺伝子コア配列の３’末端下流の塩基配列
配列番号１５：サザンブロッティングに用いたプローブの塩基配列
配列番号１６：サザンブロッティングにより取得したゲノムＤＮＡの塩基配列
配列番号１７：ストレプトマイセス・プランベウス由来のＰｌｍ２遺伝子の塩基配列
配列番号１８：ストレプトマイセス・プランベウス由来のＰｌｍ２遺伝子を増幅するためのフォワードプライマー（プライマーＥ）
配列番号１９：ストレプトマイセス・プランベウス由来のＰｌｍ２遺伝子を増幅するためのリバースプライマー（プライマーＦ）
配列番号２０：ストレプトマイセス・プランベウス由来のＰｌｍ２タンパク質のアミノ酸配列
配列番号２１：ＰｅｐＭ遺伝子の５’末端上流に位置する塩基配列の解読に用いたプライマー（Ｓｐ１−Ｒ１）
配列番号２２：ＰｅｐＭ遺伝子の５’末端上流に位置する塩基配列の解読に用いたプライマー（Ｓｐ１−Ｒ２）
配列番号２３：ＰｅｐＭ遺伝子の５’末端上流に位置する塩基配列の解読に用いたプライマー（Ｓｐ４−Ｒ１）
配列番号２４：ＰｅｐＭ遺伝子の５’末端上流に位置する塩基配列の解読に用いたプライマー（Ｓｐ４−Ｒ２）
配列番号２５：ＰｅｐＭ遺伝子の３’末端下流に位置する塩基配列の解読に用いたプライマー（Ｓｐ１−Ｆ１）
配列番号２６：ＰｅｐＭ遺伝子の３’末端下流に位置する塩基配列の解読に用いたプライマー（Ｓｐ１−Ｆ２）
配列番号２７：ＰｅｐＭ遺伝子の３’末端下流に位置する塩基配列の解読に用いたプライマー（Ｓｐ２−Ｆ１−２）
配列番号２８：ＰｅｐＭ遺伝子の３’末端下流に位置する塩基配列の解読に用いたプライマー（Ｓｐ２−Ｆ２−２）
配列番号２９：ＰｅｐＭ遺伝子の３’末端下流に位置する塩基配列の解読に用いたプライマー（Ｓｐ３−Ｆ１）
配列番号３０：ＰｅｐＭ遺伝子の３’末端下流に位置する塩基配列の解読に用いたプライマー（Ｓｐ１−Ｆ１）
配列番号３１：ＰｅｐＭ遺伝子の３’末端下流に位置する塩基配列の解読に用いたプライマー（Ｓｐ５−Ｆ１）
配列番号３２：ＰｅｐＭ遺伝子の３’末端下流に位置する塩基配列の解読に用いたプライマー（Ｓｐ５−Ｆ２）
【配列表】
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