(57)【要約】【課題】呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）療法並びにウイルス複製を調節する組成物及び方法を提供すること。【解決手段】本発明は、ＲＳＶがｉＲＮＡ剤の鼻腔内投与及び同ｉＲＮＡ剤の非経口投与により阻害されるインビボの検証に基づいている。更に、１つ以上のウイルスを同時に治療して効果的なウイルスの低減が達成できることも示されている。そのような知見に基づいて、本発明は、対象、例えばヒトのような哺乳動物におけるＲＳＶｍＲＮＡレベル、ＲＳＶタンパク質レベル及びウイルス価を低減するのに有用な一般的かつ特殊な組成物及び方法を提供する。これらの知見はその他の呼吸器系ウイルスにも適用され得る。【選択図】図１
2014156491.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）療法並びにウイルス複製を調節する組成物及び方法の分野に関し、より詳細には、吸入／鼻腔内投与を介して肺及び鼻腔に局所投与されるか或いは注射／静脈を介して全身的に投与されるＲＮＡ干渉を介してオリゴヌクレオチドにより呼吸器合胞体ウイルスの遺伝子を下方制御することに関する。
【背景技術】
【０００２】
本願は、２００５年１月７日に出願された米国特許仮出願第６０／６４２３６４号の利益を主張するものであり、同出願の全体が参照により本明細書に援用される。
その生来の機能により、気道は空気中にある多量の病原菌にさらされ、種々の呼吸器疾患を引き起こす。気道のウイルス感染は先進国において小児が入院を必要とする最も一般的な原因であり、アメリカ合衆国においては一年間に推定９１０００人が入院してその費用は３億ドルである。ヒト呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）及びパラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）は呼吸器疾患の２つの主たる病原であり、共に上気道及び下気道を感染し、クループ、肺炎及び細気管支炎を引き起こす（非特許文献１及び非特許文献２）。ＲＳＶ単独では、全ての新生児の６５％までが最初の１年の間に感染し、最初の２年の間にはほぼ全ての乳児が感染する。それは、高齢者においても疾病及び死亡の深刻な原因となる。ＲＳＶ感染後の免疫は完全ではなく、永続的なものではないために、感染が全ての年代において繰り返される。ＲＳＶ細気管支炎を経験した乳児は後において喘鳴及び喘息を引き起こしやすくなる。ＲＳＶに対する効果的な治療及びワクチンに関する研究はほぼ４０年にわたって続けられているが、ほとんど成果を挙げていない（非特許文献１及び非特許文献３）。現在、いずれのＲＳＶに対するワクチンも臨床的には承認されていない。両ウイルスの菌株は、ウシ、ヤギ、ブタ及び羊のような非ヒト動物にも存在しており、農業及び乳業及び食肉産業の損失の原因となっている（非特許文献２）。
【０００３】
両ＲＳＶは非分節マイナス鎖ＲＮＡゲノムを含んでおり、パラミクソウイルス科に属している。これらのウイルスの種々の特徴が予防及び治療を困難にしている。ウイルスゲノムは、ＲＮＡゲノムの複製プルーフリーディング機構の欠如により高い確率にて突然変異し、再現性のあるワクチン及び抗ウイルスの構築において重要な課題となっている（非特許文献４）。ＲＳＶ融合タンパク質（Ｆ）の有望な阻害剤は、１つにはＦ遺伝子にマッピングされた耐性の突然変異をウイルスが生じたことから断念された（非特許文献５及び非特許文献６）。両ウイルスは細胞性のタンパク質に関連しており、それはワクチン化のための細胞フリーのウイルス材料を入手することを困難にしている（非特許文献７、非特許文献８、非特許文献９）。最後に、両者の免疫学、特にＲＳＶの免疫学は、極めて複雑である（非特許文献１０、非特許文献１１）。ワクチンとして変性したＲＳＶタンパク質を使用することは、「免疫増強」又はワクチン−増強疾患をきたす（非特許文献１２）。全体の問題は、種々の抗−ＲＳＶ生物薬剤学的プログラムの最近の撤退により強調される。
【０００４】
ＲＳＶゲノムは、１本鎖のマイナスセンスＲＮＡからなり、１５２２２ヌクレオチド長であり、１１個の主要なタンパク質を生ずる（非特許文献１３）。これらのタンパク質のうちの２つ、Ｆ（融合）糖タンパク及びＧ（接合）糖タンパク質は主要な表面タンパク質であり、感染防御免疫を誘導するために最も重要である。ＳＨ（小さな疎水性の）タンパク質、Ｍ（マトリックス）タンパク質及びＭ２（２２ｋＤａ）タンパク質はウイルスのエンベロープと結合するが、感染防御免疫応答を誘導しない。Ｎタンパク質（主たるヌクレオカプシドと会合したタンパク質）、Ｐタンパク質（リンタンパク）及びＬタンパク質（主たるポリメラーゼタンパク質）は、ビリオンＲＮＡに結合されていることが確認されている。２つの非構造タンパク質であるＮＳ１及びＮＳ２は、宿主ウイルス相互作用に寄与していると推定されているが、感染性ビリオンには存在していない。
【０００５】
ヒトＲＳＶ菌株は、２つの主たる群、Ａ及びＢに分類されてきた。Ｇ糖タンパク質は、ＲＳＶタンパク質のうちで最も分岐しているものであるとして示されてきた。２つのＲＳＶ群の間の、そしてＲＳＶ群内におけるＲＳＶ  Ｇ糖タンパク質の可変性は、疾病を毎年発生させるＲＳＶの能力に対して重要であると考えられている。Ｇ糖タンパク質は２８９−２９９のアミノ酸（ＲＳＶ菌株に依存する）からなり、９０ｋＤａの細胞内、膜透過性かつ高度にグリコシル化したストーク構造とヘパリン結合ドメインとを有する。糖タンパク質は、分泌型かつ膜結合型にて存在する。
【０００６】
ＲＳＶ感染を治療する有効な方法は、現在のところは利用できない（非特許文献３）。下気道のＲＳＶ感染は多くの場合自己限定的症状である。どのように治療するか、あるいは、疾病に感染した乳児及び子供が何時退院できるかに関して明確なガイドライン又は基準が存在していない。ＲＳＶ感染に伴って起こり得る低酸素症は鼻のカニューレを介する酸素によって治療され得る。呼吸不全、ショック状態又は再発性の無呼吸を伴う子供に対する機械的人工換気法は死亡率を低減することができる。ある医師はステロイド剤を処方する。しかしながら、ステロイド療法は、細気管支炎により入院している乳児及び子供の臨床経過に影響を与えないことを幾らかの研究が示している。従って、コルチコステロイド単独又は気管支拡張薬との組み合わせは、その他の点では健康で、かつ換気を必要としない患者における細気管支炎の管理においては有用ではない。潜在的な心肺疾患、例えば気管支肺不全及び喘息を伴う乳児及び子供では、ステロイドは使用されてきた。
【０００７】
抗ウイルス活性を有するグアノシン類似体であるリバビリンは１９８０年代半ばからＲＳＶ細気管支炎に罹患した乳児及び小児を治療するために使用されてきたが、その使用を評価する多くの研究では矛盾する結果が示されてきた。多くの施設において、リバビリンの使用は現在では、免疫無防備状態の患者及び重篤な疾病の患者における使用に制限されている。
【０００８】
ＲＳＶ細気管支炎の重篤度は、低血清レチノール濃度に関連しているが、ＲＳＶ細気管支炎を伴う入院中の小児における治験では、ビタミンＡの補給に効果の無いことが示された。ＲＳＶ下気道の感染に対して１５００ｍｇ／ｋｇのＲＳＶ免疫グロブリンの静注、或いは１００ｍｇ／ｋｇの免疫グロブリンの吸入の治験では実質的な効果は示されなかった。
【０００９】
先進国において、ＲＳＶ下気道感染の治療は、一般的には対症療法に限られている。抗ウイルス療法は、それが高コストであるとともに効果に対する統一見解が得られていないことから、生命の危機に関わる状況のみに限られている。発展途上国では酸素が主たる治療法（可能な場合のみ）であり、死者を減らす唯一の方法は予防である。
ＲＮＡ干渉、もしくは「ＲＮＡｉ」は、２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が線虫の体内に導入された際に遺伝子発現をブロックすることがあるという観察を説明するのに、ファイヤー（Ｆｉｒｅ）および共同研究者らによって最初に造られた用語である（非特許文献１４）。短いｄｓＲＮＡは、脊椎動物を含めた多くの生物において遺伝子特異的な転写の後にサイレンシングを引き起こすものであり、遺伝子機能を研究するための新たなツールを提供している。ＲＮＡｉは新たなクラスの治療剤を開発するための方法として提案されてきた。しかしながら、現在のところ、提案されたように、ＲＮＡｉが治療において使用され得ることを立証したものはない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】オープンショウ，ピー．ジェイ．エム．（Ｏｐｅｎｓｈａｗ，Ｐ．Ｊ．Ｍ．）、Ｒｅｓｐｉｒ．Ｒｅｓ．３（Ｓｕｐｐｌ  １）、Ｓ１５−Ｓ２０、２００２年
【非特許文献２】イーストン，エイ．ジェイ．（Ｅａｓｔｏｎ，Ａ．Ｊ．）ら、Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．、第１７巻、３９０−４１２頁、２００４年
【非特許文献３】マゴン，ケイ．（Ｍａｇｇｏｎ，Ｋ．）ら、Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．、第１４巻、１４９−１６８頁、２００４年。
【非特許文献４】スレンダー，ダブリュ．エム．（Ｓｕｌｌｅｎｄｅｒ，Ｗ．Ｍ．）、Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．、第１３巻、１−１５頁、２０００年
【非特許文献５】ラジンコフ，ブイ．（Ｒａｚｉｎｋｏｖ，Ｖ．）ら、Ａｎｔｉｖｉｒ．Ｒｅｓ．、第５５巻、１８９−２００頁、２００２年
【非特許文献６】モートン，シー．ジェイ．（Ｍｏｒｔｏｎ，Ｃ．Ｊ．）ら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第３１１巻、２７５−２８８頁、２００３年
【非特許文献７】ビュルケ，イー．（Ｂｕｒｋｅ，Ｅ．）ら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第２５２巻、１３７−１４８頁、１９９８年
【非特許文献８】ビュルケ，イー．（Ｂｕｒｋｅ，Ｅ．）ら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第７４巻、６６９−６７５頁、２０００年
【非特許文献９】グプタ，エス．（Ｇｕｐｔａ，Ｓ．）ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、第７２巻、２６５５−２６６２頁、１９９８年
【非特許文献１０】ピーブルズ，アール．エス．ジュニア（Ｐｅｅｂｌｅｓ，Ｒ．Ｓ．，Ｊｒ．）ら、Ｖｉｒａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、第１６巻、２５−３４頁、２００３年
【非特許文献１１】ハイネス，エル．エム．（Ｈｙｎｅｓ，Ｌ．Ｍ．）ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、第７７巻、９８３１−９８４４頁、２００３年
【非特許文献１２】ポラック，エフ．ピー．（Ｐｏｌａｃｋ、Ｆ．Ｐ．）ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、第１９６巻、８５９−８６５頁、２００２年
【非特許文献１３】ファルゼイ，エイ．アール．（Ｆａｌｓｅｙ，Ａ．Ｒ．）及びイー．イー．ワルシュ（Ｅ．Ｅ．Ｗａｌｓｈ）、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、第１３巻、３７１−３８４頁、２０００年
【非特許文献１４】ファイヤー（Ｆｉｒｅ）ら、Ｎａｔｕｒｅ、第３９１巻、８０６−８１１頁、１９９８年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
従って、ＲＳＶに対して、特に乳児及び小児に対する安全かつ効果的なワクチンの必要性が存在する。また、全ての年齢において、かつ免疫無防備状態の患者におけるＲＳＶ感染を治療するための治療剤及び方法の必要性が存在している。また、疾病の病原を研究し、かつ治療剤及びワクチンのスクリーニングを容易にするように、ＲＳＶに対する保護免疫応答を特徴づける科学的な方法の必要性が存在する。本発明は、ＲＳＶ感染を調整又は予防するのに効果的な方法及び組成物を提供することにより、当該技術分野における上記課題を解決する。特に、本発明は、インビトロ及びインビボにてＲＳＶレベルを低減することが示されているとともにＲＳＶの主要なサブタイプのいずれに対しても効果的であり、かつこのクラスの分子の治療活性を示すｉＲＮＡ剤を提供することによりこの技術分野を前進させる。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、ＲＳＶがｉＲＮＡ剤の鼻腔内投与及び非経口投与を介して阻害され得ることに関するインビトロ及びインビボの検証、並びにＲＳＶのサブタイプＡ及びサブタイプＢのいずれのサブタイプのＲＮＡレベルをも低減する、ＲＳＶのＰ、Ｎ及びＬ遺伝子からの可能性のあるｉＲＮＡ剤の同定、に基づいている。これらの知見に基づき、本発明は、対象、例えばヒトのような哺乳動物における、ＲＳＶｍＲＮＡレベル、ＲＳＶタンパク質レベル及びＲＳＶウイルス価を低減するのに有用な特殊な組成物及び方法を提供する。
【００１３】
本発明は、ＲＳＶ遺伝子、特にＲＳＶのＰ、Ｎ及びＬ遺伝子のうちの１つの１５以上の連続したヌクレオチドから構成されるか、ほぼ構成されるか、或いは含むｉＲＮＡ剤を特に提供し、より詳細には、表１（ａ−ｃ）に記載された配列の１つからの１５以上の連続したヌクレオチドからなる薬剤を提供する。ｉＲＮＡ剤は鎖につき３０未満のヌクレオチド、例えば、表１（ａ−ｃ）に提供されているように２１−２３個のヌクレオチドから構成されていると好ましい。２本鎖のｉＲＮＡ剤は、平滑末端或いはより好ましくは、同剤の一方又は両方の３’末端からの１乃至４個のヌクレオチドの突出部分（ｏｖｅｒｈａｎｇ）を有している。
【００１４】
更に、ｉＲＮＡ剤は、天然に由来するリボヌクレオチドサブユニットのみを含んでいるか、或いは同剤に含まれるリボヌクレオチドサブユニットの１つ以上の糖又は塩基に対して１つ以上の修飾部を含むように合成され得る。ｉＲＮＡ剤は更に、安定性、分布又は同剤の細胞への取り込みを改善するために選択されたリガンド、例えばコレステロールに付着されるように、修飾され得る。ｉＲＮＡ剤は更に、単離された形態であり得るか、或いは本明細書にて記載された方法に使用される製薬組成物、特に肺又は鼻腔への送達のために処方化されるか、又は非経口投与用に処方化される製薬組成物としての一部であり得る。製薬組成物は、１つ以上のｉＲＮＡ剤を含み得、ある実施形態においては２つ以上のｉＲＮＡ剤を含んでおり、各々がＲＳＶ遺伝子の異なるセグメントに指向するか、或いは２つの異なるＲＳＶ遺伝子に指向する。
【００１５】
本発明は更に、細胞中においてＲＳＶウイルス性ｍＲＮＡのレベルを低減するための方法を提供する。同方法は、本発明のｉＲＮＡ剤の１つを以下に更に述べるように、対象に投与する工程を含む。本発明の方法は、細胞中におけるウイルス性ｍＲＮＡを選択的に低減するためにＲＮＡ干渉に関与する細胞機構を使用し、かつ本発明の抗ウイルスｉＲＮＡ剤の１つを細胞と接触させる工程を含む。当該方法は細胞上にて直接実施され得るか、或いは本発明のｉＲＮＡ剤／製薬組成物の１つを哺乳動物の対象に投与することにより、同対象にて実施され得る。細胞におけるウイルス性ｍＲＮＡの低減は生成されるウイルス性タンパク質の量を低減し、かつ生物体において、（実施例に示されるように）複製ウイルス価を低減する。
【００１６】
本発明の方法及び組成物、例えば方法及びｉＲＮＡ剤組成物は、本明細書に記載された任意の用量及び／又は製剤として、並びに、本明細書に記載された任意の投与経路にて使用され得る。特に重要なものとして、本明細書においては、ｉＲＮＡ剤の鼻腔内投与及び呼吸器組織におけるウイルス複製の阻害能力を示す。
本発明の１つまたは複数の実施形態の詳細を、添付図面および以下の説明に記載する。本発明の他の特徴、目的、および利点は、この説明、図面、および特許請求の範囲から明らかになるであろう。引用されたすべての参考文献、特許、および特許出願を、あらゆる目的に、全体として本願明細書に援用する。
例えば、本発明は、以下の項目を提供する。
（項目１）
対象の細胞中のウイルスタンパク質、ウイルスｍＲＮＡ又はウイルス価のレベルを低減するための方法であって、
前記方法は、ｉＲＮＡ剤を前記対象に投与する工程を含み、前記ｉＲＮＡ剤は第１の哺乳動物呼吸器系ウイルスからの遺伝子と相補的な少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを有するセンス鎖と、前記センス鎖と相補的な少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを有するアンチセンス鎖とを含み、前記遺伝子はＲＳＶのＰ、Ｎ又はＬ遺伝子からなる群より選択される、方法。
（項目２）
前記ｉＲＮＡ剤は表１（ａ−ｃ）の薬剤の１つから選択される１５個以上のヌクレオチドを含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記ｉＲＮＡ剤は対象へ鼻腔内投与される項目１に記載の方法。
（項目４）
前記ｉＲＮＡ剤は対象に対して、吸入又は噴霧により投与される、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記ｉＲＮＡ剤は前記対象のウイルス価を低減する、項目１に記載の方法。
（項目６）
項目１に記載の方法は前記対象に第２のｉＲＮＡ剤を同時に投与する工程を更に含み、
前記第２のｉＲＮＡ剤は前記呼吸器系ウイルスの第２の遺伝子と相補的な少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを有するセンス鎖と、前記センス鎖と相補的な少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを有するアンチセンス鎖とを含む、方法。
（項目７）
前記ｉＲＮＡ剤は表１（ａ−ｃ）に記載の薬剤の１つから選択された１５個以上のヌクレオチドを含む、項目６に記載の方法。
（項目８）
前記対象は、前記第１及び第２の哺乳動物の呼吸器系ウイルスでウイルス感染していると診断されている、項目６に記載の方法。
（項目９）
対象の細胞中の呼吸器系ウイルスの第１の遺伝子及び第２の遺伝子からのウイルスタンパク質のレベルを低減するための方法であり、
前記方法は、前記対象に第１及び第２のｉＲＮＡ剤を同時に投与する工程を含み、前記第１のｉＲＮＡ剤は哺乳動物の呼吸器系ウイルスからの第１の遺伝子と相補的な少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを有するセンス鎖と、前記センス鎖と相補的な少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを有するアンチセンス鎖とを含み、かつ前記第２のｉＲＮＡ剤は哺乳動物の呼吸器系ウイルスからの第２の遺伝子と相補的な少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを有するセンス鎖と、前記センス鎖と相補的な少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを有するアンチセンス鎖とを含む、方法。
（項目１０）
前記ｉＲＮＡ剤は、表１（ａ−ｃ）の薬剤の１つから選択された１５個以上のヌクレオチドを含む、項目９に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】ｉＲＮＡ剤を使用したＲＳＶのインビトロの阻害を示す。表１（ａ−ｃ）に示されたｉＲＮＡ剤について、実施例に記載されているプラーク形成試験法にて抗ＲＳＶ活性を試験した。各カラム（バー）は、表１（ａ−ｃ）に示されたｉＲＮＡ剤を示す。例えば、カラム１は、表１ａ等の１番目の薬剤である。活性ｉＲＮＡ剤が特定できた。
【図２】ｉＲＮＡ剤を使用したＲＳＶのインビトロの用量反応阻害を示す。図１の活性を示す薬剤の複数の例について、４種類の濃度にて、実施例に記載されたようにプラーク形成試験法にて抗ＲＳＶ活性を試験した。用量依存性反応は、試験された活性を有するｉＲＮＡ剤において見られた。
【図３】ｉＲＮＡ剤を使用したＲＳＶサブタイプＢのインビトロ阻害を示す。図２に示されたｉＲＮＡ剤について、実施例に記載されたプラーク形成試験法にてサブタイプＢに対する抗ＲＳＶ活性を試験した。サブタイプＢは試験したｉＲＮＡ剤により阻害された。
【図４】ｉＲＮＡ剤を使用したＲＳＶのインビボの阻害を示す。図面に記載された薬剤について、実施例に記載されたマウスのモデルにて抗ＲＳＶ活性を試験した。ｉＲＮＡ剤はインビボにおけるウイルス価を低減するのに効果的であった。
【図５】ＡＬ−ＤＰ−１７３０を使用したＲＳＶのインビボの阻害を示す。ＡＬ−ＤＰ−１７３０は実施例に提供された方法を使用して用量依存活性を試験した。薬剤は、用量依存反応を示した。
【図６】ｉＲＮＡ剤を使用したＲＳＶのインビボの阻害を示す。図面に示されたｉＲＮＡ剤は、実施例に記載されたように、インビボにおける抗ＲＳＶ活性を試験した。
【図７】ｉＲＮＡ剤を使用したＲＳＶのインビボの阻害を示す。図面に示されたｉＲＮＡ剤は、実施例に記載されたように、インビボにおける抗ＲＳＶ活性を試験した。
【図８Ａ】局所的に送達されたｉＲＮＡ剤を使用したＲＳＶのインビボの阻害を示す。
【図８Ｂ】エアロゾルにて送達されたｉＲＮＡ剤を使用したＲＳＶのインビボの阻害を示す。図面に示されたｉＲＮＡ剤は実施例に記載されたように、インビボにおける抗ＲＳＶ活性を試験した。
【図９】ｉＲＮＡ剤を使用したＲＳＶ感染に対するインビボの予防を示す。図面に示されたｉＲＮＡ剤は予防活性を試験するために、ＲＳＶ攻撃の前に試験した。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
解説を容易にするために、本明細書では時として、「ヌクレオチド」または「リボヌクレオチド」という用語を、ＲＮＡ剤の１つまたは複数の単量体サブユニットに関して使用する。本明細書では、「リボヌクレオチド」または「ヌクレオチド」という用語の使用は、修飾ＲＮＡまたはヌクレオチド代替物に関する場合、以下で更に記載するように、１つまたは複数の位置における、修飾ヌクレオチドまたは代替置換部分も指すことがあると理解されよう。
【００１９】
本明細書で使用される場合、「ＲＮＡ剤」は、無修飾ＲＮＡ、修飾ＲＮＡ、またはヌクレオシド代替物であり、これらはすべて本明細書に記載されているか、又はＲＮＡ合成の技術分野では周知である。多数の修飾ＲＮＡおよびヌクレオチド代替物が記載されているが、好ましいものの例には、ヌクレアーゼ分解に対して、無修飾ＲＮＡが有するものより大きな抵抗性を有するものが含まれる。好ましいものの例には、２’糖修飾、単一鎖突出部分内、好ましくは３’単一鎖突出部分内の修飾、あるいは、特に１本鎖の場合、１つもしくは複数のリン酸基または１つもしくは複数のリン酸基類似体を含有する５’修飾を有するものが含まれる。
【００２０】
本明細書で使用される場合、「ｉＲＮＡ剤」（「干渉ＲＮＡ剤」の略）は、標的遺伝子、例えばＲＳＶの発現を下方制御できるＲＮＡ剤である。理論に拘泥するものではないが、ｉＲＮＡ剤は、当技術分野では時にＲＮＡｉと呼ばれる標的ｍＲＮＡの転写後の切断、または転写前もしくは翻訳前の機構を含めた多数の機構のうちの１つまたは複数によって作用し得る。ｉＲＮＡ剤は、２本鎖ｉＲＮＡ剤であり得る。
【００２１】
「ｄｓ  ｉＲＮＡ剤」（「２本鎖ｉＲＮＡ剤」の略）は、本明細書で使用される場合、複数、好ましくは２本の鎖を含み、その中で鎖間ハイブリダイゼーションが２本鎖構造領域を形成できるｉＲＮＡ剤である。本明細書では、「鎖」は、連続したヌクレオチド（天然には存在しないヌクレオチドおよび修飾ヌクレオチドも含まれる）の配列を指す。２本以上の鎖が別々の分子であっても、それらの各鎖が別々の分子の一部を形成してもよく、また、それらが、例えばリンカー、例えばポリエチレングリコールリンカーによって共有結合で相互連結され、１分子のみを形成していてもよい。少なくとも１本の鎖は、標的ＲＮＡに十分に相補的な領域を含むものであり得る。そのような鎖は「アンチセンス鎖」と称される。アンチセンス鎖に相補的な領域を含むｄｓＲＮＡ剤中に含まれている第２の鎖は「センス鎖」と称されている。しかしながら、ｄｓ  ｉＲＮＡ剤は、少なくとも一部が自己相補的であり、２本鎖領域を含む、例えばヘアピンまたはフライパンハンドル構造を形成する単一のＲＮＡ分子から形成されていてもよい。そのような場合、「鎖」という用語は、同一ＲＮＡ分子の別の領域に相補的なＲＮＡ分子の領域の１つを指す。
【００２２】
哺乳動物細胞では、長いｄｓ  ｉＲＮＡ剤によってインターフェロン応答が誘導されることがあり、それがしばしば有害であるが、短いｄｓ  ｉＲＮＡ剤は、インターフェロン応答を、少なくとも細胞および／または宿主に有害となる程度までには誘導しない。本発明のｉＲＮＡ剤は、十分に短い分子を含有しており、それらは正常な哺乳動物細胞において有害な非特異的インターフェロン応答を誘発しない。したがって、哺乳動物細胞へのｉＲＮＡ剤組成物（例えば本明細書に記載の通り製剤化されたもの）の投与を用いて、有害なインターフェロン応答を回避しながら、ＲＳＶ遺伝子の発現をサイレンシングすることができる。十分に短くて、有害なインターフェロン応答を誘発しない分子を、本明細書では、ｓｉＲＮＡ剤またはｓｉＲＮＡと称する。「ｓｉＲＮＡ剤」または「ｓｉＲＮＡ」は、本明細書で使用される場合、十分に短くて、ヒト細胞で有害なインターフェロン応答を誘導しないｉＲＮＡ剤、例えばｄｓ  ｉＲＮＡ剤を指し、それは例えば３０ヌクレオチド対未満の２本鎖領域を有する。
【００２３】
ｄｓ  ｉＲＮＡ剤およびｓｉＲＮＡ剤を含めた、本明細書に記載の単離されたｉＲＮＡ剤は、例えばＲＮＡ分解による遺伝子のサイレンシングを媒介することができる。便宜のために、そのようなＲＮＡは、本明細書では、サイレンシングされるＲＮＡとも称される。そのような遺伝子は、標的遺伝子とも称される。サイレンシングされるＲＮＡは、ＲＳＶ遺伝子の遺伝子産物、特にＰ、Ｎ又はＬ遺伝子産物であることが好ましい。
【００２４】
本明細書で使用される場合、「ＲＮＡｉを媒介する」という用語は、薬剤が標的遺伝子を配列特異的な様式でサイレンシングする能力を指す。「標的遺伝子をサイレンシングする」とは、それによって、上記薬剤に接触していないときに標的遺伝子の特定の産物を含有および／または分泌する細胞が、上記薬剤に接触しているときに、上記薬剤に接触していない同様な細胞と比較して、そのような遺伝子産物を少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％少なく含有および／または分泌するであろう過程を意味する。標的遺伝子のそのような産物は、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、タンパク質、または調節エレメントであり得る。
【００２５】
本発明の抗ウイルスの用途において、標的遺伝子のサイレンシングは、細胞或いは対象における「ウイルス価」を低減する。本明細書に使用されるように、「ウイルス価の低減」は、細胞により生成されるか、またはウイルス標的遺伝子のサイレンシングを受けている生物に見出される生存ウイルスの数の減少を示す。生成されるウイルスの細胞数の減少は、好ましくは、治療を受けている対象の組織において生成される測定可能なウイルスの数の減少及びウイルス感染の症状の重篤度の低減をもたらす。本発明のｉＲＮＡ剤は、「抗ウイルスｉＲＮＡ剤」として参照される。
【００２６】
本明細書にて使用されるように、「ＲＳＶ」遺伝子は、ＲＳＶウイルスゲノムにて特定される遺伝子の任意の１つを参照する（非特許文献１３）。これらの遺伝子は当該技術分野では周知であり、本明細書において例示されるＮ、Ｐ及びＬ遺伝子を含む。
【００２７】
本明細書で使用される場合、「相補的」という用語は、本発明の化合物と標的ＲＮＡ分子、例えばＲＳＶウイルスｍＲＮＡ分子との間で安定かつ特異的な結合が生じるのに十分な程度の相補性を示すのに使用される。特異的な結合は、特異的な結合が望ましい条件下で、すなわちインビボ試験または治療処置の場合には生理条件下で、あるいはインビトロ試験の場合では同試験が実施される条件下で、非標的配列へのオリゴマー化合物の非特異的結合を回避するのに十分な程度の相補性を必要とする。非標的配列は、通常、少なくとも４ヌクレオチドの相違を有する。
【００２８】
本明細書で使用される場合、ｉＲＮＡ剤が標的ＲＮＡ、例えば標的ｍＲＮＡ（例えば標的ＲＳＶｍＲＮＡ）に「十分に相補的である」のは、上記ｉＲＮＡ剤によって、細胞内での、上記標的ＲＮＡによってコードされたタンパク質の産生が減少する場合である。上記ｉＲＮＡ剤は、標的ＲＮＡに「正確に相補的」であってもよく、例えば上記標的ＲＮＡと上記ｉＲＮＡ剤とがアニールするものでもよい。正確に相補的な領域では、ワトソンクリック塩基対のみでハイブリット形成されていることが好ましい。「十分に相補的な」ｉＲＮＡ剤は、標的ウイルスＲＮＡに正確に相補的な内部領域（例えば少なくとも１０ヌクレオチド）を含み得る。さらに、一部の実施形態では、上記ｉＲＮＡ剤が単一ヌクレオチドの相違を特異的に識別する。この場合、上記ｉＲＮＡ剤は、単一ヌクレオチド相違の（例えば７ヌクレオチド以内の）領域で正確な相補性が存在する場合にのみＲＮＡｉを媒介する。好ましいｉＲＮＡ剤は、実施例に示すセンス配列およびアンチセンス配列に基づいているか、もしくはそれからなるか、もしくはそれを含むであろう。
【００２９】
本明細書での使用において、「本質的には同一」は、第２のヌクレオチド配列と比較して第１のヌクレオチド配列に関して使用される場合、最大１、２、または３ヌクレオチドまでの置換（例えばアデノシンがウラシルで置換されている）を除いて、第１のヌクレオチド配列が第２のヌクレオチド配列に同一であることを意味する。
【００３０】
本明細書で使用される場合、「対象」は、ＲＳＶ感染のようなウイルス発現により媒介された障害の治療を受けている、又はウイルス感染を回避するために予防的に治療を受けている哺乳類生物を指す。対象は、霊長類、ウシ、ウマ、マウス、ラット、イヌ、ブタ、又はヤギなど、いかなる哺乳動物でもよい。好ましい実施形態では、対象はヒトである。
【００３１】
本明細書で使用される場合、ＲＳＶ感染を治療することは、１）、対象におけるウイルスの存在によって一部媒介され、かつ２）存在している、ウイルス遺伝子産物のレベルを低減することによって結果に影響を与えることができるいかなる生物学的または病理学的状態も指す。
【００３２】
（ｉＲＮＡ剤の設計および選択）
本発明は、ｉＲＮＡ剤を経鼻投与／吸入のいずれかを介して肺及び鼻腔に局所投与するか、或いは注射により全身的／非経口的に投与した後の、インビボにおける呼吸器系ウイルス遺伝子の標的遺伝子サイレンシングの検証及び得られるウイルス感染の治療法に基づいている。本発明は更に、ｉＲＮＡ剤の治療を１つ以上の呼吸器系ウイルスに対して使用すること、及び２つ以上のｉＲＮＡ剤を同時に投与することを伴う両方のウイルス感染の治療にまで拡張する。
【００３３】
これらの結果に基づいて、本発明は、以下に記載されているように単離した形態にて、かつ製薬組成物として、ウイルス感染、特に呼吸器系ウイルス、とりわけＲＳＶ感染を治療するために使用され得るｉＲＮＡ剤を特に提供する。そのような薬剤は、ウイルス遺伝子と相補的な少なくとも１５の連続したヌクレオチドを有するセンス鎖と、同センス鎖配列と相補的な少なくとも１５の連続したヌクレオチドを有するアンチセンス鎖とを含有するであろう。特に有用なものは、表１（ａ−ｃ）に記載されているような、ＲＳＶのＰ、Ｎ及びＬ遺伝子からのヌクレオチド配列から構成されるか、ほぼ構成されるか、又は同配列を含むｉＲＮＡ剤である。
【００３４】
本発明のｉＲＮＡ剤は、表１（ａ−ｃ）において活性を示すｉＲＮＡ剤の１つからの少なくとも１５の連続したヌクレオチドに基づいており、かつ同ヌクレオチドを含む。そのような薬剤において、同薬剤は、表に提供された配列全体から構成されるか、ほぼ構成されるか、又は同配列を含むか、或いは、標的遺伝子からの連続的な領域からの更なるヌクレオチドとともに表１（ａ−ｃ）に提供された少なくとも１５の連続的な残基を含み得る。
【００３５】
ｉＲＮＡ剤は、配列情報、所望の特性及び表１（ａ−ｃ）に提供された情報に基づいて合理的に設計され得る。例えば、ｉＲＮＡ剤は、表に提供された薬剤の配列に従って、並びに標的遺伝子のコード化全配列を考慮して設計され得る。
【００３６】
従って、本発明は、各々が、少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１又は２３個のヌクレオチドの配列を含むセンス鎖とアンチセンス鎖とを含み、同配列は、上記したように、呼吸器系ウイルス、特にＲＳＶのＰ、Ｎ又はＬタンパク質遺伝子からの遺伝子の一部と本質的に同一である。例示的なｉＲＮＡ剤は、表１（ａ−ｃ）に提供された薬剤の１つからの１５以上の連続したヌクレオチドからなるものを含む。
【００３７】
ｉＲＮＡ剤のアンチセンス鎖は、長さが１５、１６、１７、１８、１９、２５、２９、４０または５０ヌクレオチド以上であるべきである。上記アンチセンス鎖は、長さが５０、４０、または３０ヌクレオチド以下であるべきである。好ましい長さの範囲は、１５〜３０、１７〜２５、１９〜２３、および１９〜２１ヌクレオチドである。例示的なｉＲＮＡ剤は、表１（ａ−ｃ）の薬剤の１つのアンチセンス鎖の１つからの１５個以上のヌクレオチドを含むものを含む。
【００３８】
ｉＲＮＡ剤のセンス鎖は、長さが１５、１６、１７、１８、１９、２５、２９、４０または５０ヌクレオチド以上であるべきである。上記センス鎖は、長さが５０、４０または３０ヌクレオチド以下であるべきである。好ましい長さの範囲は、１５〜３０、１７〜２５、１９〜２３、および１９〜２１ヌクレオチドである。例示的なｉＲＮＡ剤は、表１（ａ−ｃ）の薬剤の１つのセンス鎖の１つからの１５個以上のヌクレオチドを含むものを含む。
【００３９】
ｉＲＮＡ剤の２本鎖部分は、長さが１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２９、４０または５０ヌクレオチド対以上であるべきである。上記２本鎖部分は、長さが５０、４０または３０ヌクレオチド対以下であるべきである。好ましい長さの範囲は、１５〜３０、１７〜２５、１９〜２３、および１９〜２１ヌクレオチド対である。
【００４０】
表１（ａ−ｃ）に提供された薬剤は、各鎖が２１ヌクレオチド長である。ｉＲＮＡ剤は１９個のヌクレオチドからなる２本鎖領域を含み、薬剤の３’末端の各々が２個のヌクレオチドの突出部分を備えている。これらの薬剤は、本明細書において記載されているように、これらの配列の少なくとも一部（１５個以上の連続したヌクレオチド）を含む同等の薬剤、又はオリゴヌクレオチド塩基及び結合部に対する修飾を得るために、本明細書に記載されているように修飾され得る。
【００４１】
通常、本発明のｉＲＮＡ剤は、ウイルス遺伝子、例えば、ＲＳＶのＰ、Ｎ又はＬタンパク質と十分な相補性を有する領域を含み、上記ｉＲＮＡ剤またはその断片が特定のウイルス遺伝子の下方制御を媒介できる十分なヌクレオチドの長さを有する。本発明のｉＲＮＡ剤のアンチセンス鎖は、好ましくはウイルス遺伝子、本明細書において示されるようなＲＳＶのＰ、Ｌ又はＮタンパク質のｍＲＮＡ配列に完全に相補的である。しかしながら、上記ｉＲＮＡ剤と上記標的との間に完全な相補性が存在している必要はないが、それらの対応性は、上記ｉＲＮＡ剤またはそれの切断産物が、例えばＲＳＶ  ｍＲＮＡのＲＮＡｉ切断による配列特異的なサイレンシングを誘導することを可能にするのに十分でなければならない。
【００４２】
したがって、本発明のｉＲＮＡ剤には、培養ヒト細胞におけるＲＳＶ発現を阻害する能力を本質的に保持しながら、それぞれ、鎖当たり１、２、または３個以下のヌクレオチドが他のヌクレオチドで置換されている（例えばアデノシンがウラシルで置換されている）ことを除いて、下記に定義する通り、それぞれが、表１（ａ−ｃ）に提供された薬剤のようなウイルス遺伝子、特にＲＳＶのＰ、Ｎ又はＬタンパク質の配列の１つに本質的に同一である少なくとも１６、１７または１８ヌクレオチドの配列からなるセンス鎖およびアンチセンス鎖からなる薬剤が含まれる。したがって、これらの薬剤は、標的ウイルスｍＲＮＡ配列に関して、もしくはセンス鎖とアンチセンス鎖との間に、１、２または３塩基のミスマッチが導入されているウイルス遺伝子、特にＲＳＶのＰ、Ｎ又はＬタンパク質の配列の１つに本質的に同一である少なくとも１５ヌクレオチドを有するものであろう。標的ウイルスｍＲＮＡ配列とのミスマッチ、特にアンチセンス鎖におけるミスマッチは、末端領域で最もよく許容され、存在する場合には、１箇所または複数の端末領域内、例えば５’および／または３’末端の６、５、４、または３ヌクレオチド以内にあることが好ましく、センス鎖の５’末端またはアンチセンス鎖の３’末端の６、５、４、または３ヌクレオチド以内にあることが最も好ましい。上記センス鎖は、分子の全体的な２本鎖特性を維持するのに十分なだけアンチセンス鎖に相補的であればよい。
【００４３】
上記センス鎖およびアンチセンス鎖は、上記ｉＲＮＡ剤が、例えば表１（ａ−ｃ）に例示されたような分子の一端または両端に単一鎖または不対領域を含有するように選択されることが好ましい。したがって、ｉＲＮＡ剤は、好ましくは突出部分、例えば１または２つの５’または３’突出部分、但し好ましくは２〜３ヌクレオチドの３’突出部分１つを含有するように対合されたセンス鎖およびアンチセンス鎖を含有する。ほとんどの実施形態は、３’突出部分を有するであろう。好ましいｓｉＲＮＡ剤は、上記ｉＲＮＡ剤の一端又は両端に長さが１〜４ヌクレオチド、好ましくは２または３ヌクレオチドの１本鎖の突出部分、好ましくは３’突出部分を有するであろう。上記突出部分は、一方の鎖がもう一方より長い結果、または同じ長さの２本の鎖がずれている結果であり得る。５’末端はリン酸化されていることが好ましい。
【００４４】
２本鎖領域の好ましい長さは、１５から３０ヌクレオチドの間、最も好ましくは１８、１９、２０、２１、２２および２３ヌクレオチドの長さ、例えば上記に論じたｓｉＲＮＡ剤の範囲である。ｓｉＲＮＡ剤の２本の鎖が、例えば共有結合によって、連結されている実施形態も含まれる。ヘアピン構造、または必要な２本鎖領域と、好ましくは３’突出部分とを提供する他の１本鎖構造も本発明に包含される。
【００４５】
（候補となるｉＲＮＡ剤の評価）
候補となるｉＲＮＡ剤を、それが標的遺伝子発現を下方制御する能力に関して評価することができる。例えば、候補となるｉＲＮＡ剤を用意し、興味のあるウイルス、例えば標的遺伝子を含むウイルスに感染されたか、又は感染されるであろう細胞、例えばヒト細胞と接触させることができる。代替的に、細胞は、標的ウイルス遺伝子をそれから発現することができるコンストラクトでトランスフェクションさせ、それにより、ウイルス感染価モデルの必要性を回避できる。上記候補となるｉＲＮＡ剤との接触の前および後の標的遺伝子発現のレベルを、例えばｍＲＮＡまたはタンパク質レベル或いはウイルス価で比較することができる。標的遺伝子から発現されたＲＮＡ、タンパク質又はウイルスの量が、上記ｉＲＮＡ剤と接触した後に低下していると判定された場合、上記ｉＲＮＡ剤が標的遺伝子発現を下方制御すると結論付けることができる。細胞中の標的ウイルスＲＮＡまたはウイルスタンパク質のレベル、或いは細胞又は組織中のウイルス価は、いかなる望ましい方法でも測定できる。例えば、標的ＲＮＡのレベルは、ノーザンブロット解析、逆転写連結ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、ｂＤＮＡ分析、またはＲＮアーゼプロテクションアッセイで測定することができる。タンパク質のレベルは、例えば、ウェスタンブロット解析または免疫蛍光によって測定することができる。ウイルス価はプラーク形成試験法にて検出できる。
【００４６】
（ｉＲＮＡ剤の安定性試験、修飾、および再試験）
候補となるｉＲＮＡ剤を、そのｉＲＮＡ剤が対象の体内に導入された際などの安定性、例えばエンドヌクレアーゼまたはエクソヌクレアーゼによる切断に対する感受性に関して評価することができる。同方法は、修飾、特に切断、例えば対象の体内に存在する成分による切断の影響を受けやすい部位を同定する方法を利用することができる。
【００４７】
切断の影響を受けやすい部位が同定された場合、例えば切断部位への２’修飾、例えば２’−Ｏ−メチル基の導入によって、上記潜在的切断部位が切断に抵抗性を有するように作製された更なるｉＲＮＡ剤を設計および／または合成することができる。この更なるｉＲＮＡ剤を、安定性に関して再試験することができ、あるｉＲＮＡ剤が望ましい安定性を示すことが見出されるまで、この工程を繰り返すことができる。
【００４８】
（インビボ試験）
ウイルス遺伝子発現を阻害できるものとして同定されたｉＲＮＡ剤を、動物モデル（例えばマウス、ラット又は霊長類などの哺乳動物）中でのインビボでの機能に関して試験することができる。例えば、上記ｉＲＮＡ剤を動物に投与して、同ｉＲＮＡ剤を、その生体内分布、安定性、およびそれがウイルス遺伝子発現、例えばＲＳＶ遺伝子発現を阻害するか或いはウイルス価を低減する能力に関して評価した。
【００４９】
上記ｉＲＮＡ剤は、注射などによって標的組織に直接投与することができ、あるいは上記ｉＲＮＡ剤を、それがヒトに投与されるのと同じ様に動物モデルに投与することもできる。本明細書において示されるように、同剤は、ウイルス感染を治療する手段として、吸入により投与されると好ましい。
【００５０】
上記ｉＲＮＡ剤を細胞内分布に関して評価することもできる。この評価には、上記ｉＲＮＡ剤が細胞内に摂取されたかどうかの判定も含めることができる。この評価には、上記ｉＲＮＡ剤の安定性（例えば半減期）の測定も含めることができる。ｉＲＮＡ剤のインビボ評価は、追跡可能なマーカー（例えば、フルオレセインなどの蛍光マーカー：３５Ｓ、３２Ｐ、３３Ｐ、もしくは３Ｈなどの放射性標識；金粒子；または免疫組織化学用抗原粒子）に結合されたｉＲＮＡ剤の使用、或いはその他の適切な検出方法によって容易に行うことができる。
【００５１】
上記ｉＲＮＡ剤を、それがウイルス遺伝子発現を下方制御する能力に関して評価することができる。インビボでのウイルス遺伝子発現のレベルは、例えば、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、または上記ｉＲＮＡ剤への組織の曝露の前および後における同組織からのＲＮＡの単離によって測定することができる。組織を採取するために動物を屠殺する必要がある場合、未処置のコントロール動物が比較対象となろう。標的ウイルスｍＲＮＡは、限定されるものではないが、ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロット、分岐ＤＮＡアッセイ、またはＲＮアーゼプロテクションアッセイを含めたいかなる望ましい方法でも検出することができる。代替的又は付随的に、上記ｉＲＮＡ剤で処理された組織抽出物のウェスタンブロット解析を行うことによって、或いはＥＬＩＳＡによって、ウイルス遺伝子発現をモニタリングすることもできる。ウイルス価はｐｆｕアッセイを使用して決定され得る。
【００５２】
（ｉＲＮＡ化学）
ここでは、ＲＮＡｉを媒介して、ウイルス遺伝子、例えば、ＲＳＶのＰタンパク質の発明を阻害する、単離されたｉＲＮＡ剤、例えばｄｓＲＮＡ剤について述べる。
【００５３】
ここで論じるＲＮＡ剤には、他には無修飾のＲＮＡに加えて、例えば効力を向上させるために修飾されたＲＮＡ、およびヌクレオチド代替物のポリマーも含まれる。無修飾のＲＮＡは、その中で、核酸成分、すなわち、糖、塩基、およびリン酸部分が天然に存在しているもの、好ましくはヒト体内に生来的に存在しているものと同じであるか、もしくは本質的に同じである分子を指す。当技術分野は、まれであるか、もしくは一般的でないが、天然に存在するＲＮＡを修飾ＲＮＡと称することがある。例えば、リンバッハ（Ｌｉｍｂａｃｈ）ら（１９９４年）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．第２２巻、２１８３〜２１９６頁を参照されたい。しばしば修飾ＲＮＡと称される（明らかに、それらが通常は転写後修飾の結果であるため）、そのようなまれであるか、もしくは一般的でないＲＮＡは、本明細書で使用される場合、無修飾ＲＮＡという用語の範囲内にある。本明細書で使用される場合、修飾ＲＮＡは、その中で、１つまたは複数の核酸成分、すなわち、糖、塩基、およびリン酸部分が、天然に存在しているもの、好ましくはヒト体内に生来的に存在しているものと異なる分子を指す。それらは修飾「ＲＮＡ」と称されるが、それらには修飾によりＲＮＡではない分子も当然ながら含まれる。ヌクレオチド代替物は、その中で、ハイブリダイゼーションが実質的にリボリン酸骨格で見られるものと類似するように、それらの塩基の正しい空間的関係での提示が可能となっている非リボリン酸骨格構造物、例えばリボリン酸骨格の非荷電模倣体で、リボリン酸骨格が置換されている分子である。上記のすべての例が本明細書に論じられている。
【００５４】
本明細書に記載の修飾は、本明細書に記載のいかなる２本鎖ＲＮＡおよびＲＮＡ様分子、例えばｉＲＮＡ剤にも組み入れら得る。上記修飾は、ｉＲＮＡ剤のアンチセンス鎖およびセンス鎖の一方または両方を修飾することが望ましい。核酸が重合体のサブユニットまたは単量体である場合には、下記の修飾の多くは核酸中で反復される位置で起こり、例えば、塩基もしくはリン酸部分、またはリン酸部分の非結合性Ｏの修飾である。一部の場合には、上記修飾が核酸中の対象となる位置のすべてで起こるであろうが、多くの場合、そして実際にはほとんどの場合には、そうならないであろう。一例として、修飾は、３’または５’末端位置でのみ起こることもあり、あるいは末端領域、例えば鎖の末端ヌクレオチドの位置または最終２、３、４、５、または１０ヌクレオチドでのみ起こることもある。修飾は、２本領域に起こっても、１本鎖領域に起こっても、あるいはそれら両方に起こってもよい。例えば、非結合性Ｏの位置でのホスホロチオエート修飾は、一方または両方の末端で起こることも、あるいは末端領域、例えば鎖の末端ヌクレオチドの位置または最終２、３、４、５、または１０ヌクレオチドでのみ起こることも、あるいは２本鎖および１本鎖領域、特に末端で起こることもある。同様に、修飾は、センス鎖で起こることも、アンチセンス鎖で起こることも、それら両方で起こることもある。一部の場合には、センス鎖およびアンチセンス鎖が同じ修飾または同じクラスの修飾を有するであろう。しかしながら、他の場合には、センス鎖およびアンチセンス鎖は異なった修飾を有するであろう。例えば、一部の場合には、一方の鎖、例えばセンス鎖のみを修飾することが望ましい場合がある。
【００５５】
ｉＲＮＡ剤に修飾を導入する２つの主要な目的は、生物学的環境における分解に対するそれらの安定化、および下記に詳細に論じる薬理学的特性、例えば薬動力学的特性の改良である。ｉＲＮＡ剤の糖、塩基、または骨格への他の適当な修飾は、共有されている２００４年１月１６日出願の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１１９３号パンフレットに記載されている。ｉＲＮＡ剤は、共有されている２００４年４月１６日出願の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１１８２２号パンフレットに記載の塩基のような天然に存在しない塩基を含有することもできる。ｉＲＮＡ剤は、非糖質環状担体分子のような天然に存在しない糖を含むこともできる。ｉＲＮＡ剤で使用する天然に存在しない糖の例示的特性は、共有されている２００３年４月１６日出願の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／１１８２９号パンフレットに記載されている。
【００５６】
ｉＲＮＡ剤は、ヌクレアーゼ抵抗性の増強に有用なヌクレオチド間結合（例えばキラルホスホロチオエート結合）を含有できる。付随的に、又は代替的に、ヌクレアーゼ抵抗性を増強させるために、ｉＲＮＡ剤にリボース摸倣体を含有させることができる。ヌクレアーゼ抵抗性を増強させるための例示的ヌクレオチド間結合およびリボース模倣体は、共有されている２００４年３月８日出願の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０７０７０号パンフレットに記載されている。
【００５７】
ｉＲＮＡ剤は、リガンド結合単量体サブユニットおよびオリゴヌクレオチド合成用の単量体を含有できる。例示的な単量体は、共有されている２００４年８月１０日出願の米国特許出願第１０／９１６１８５号明細書に記載されている。
【００５８】
ｉＲＮＡ剤は、共有されている２００４年３月８日出願の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０７０７０号パンフレットに記載されているようなＺＸＹ構造を有することができる。
【００５９】
ｉＲＮＡ剤は、両親媒性部分と複合体形成され得る。ｉＲＮＡ剤と共に使用するための例示的な両親媒性部分は、共有されている２００４年３月８日出願の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０７０７０号パンフレットに記載されている。
【００６０】
別の実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、モジュール複合体の特性を有する送達薬剤と複合体形成され得る。この複合体は、（ａ）濃縮剤（例えば、核酸を、例えばイオンまたは静電気相互作用を介して、誘引、例えば結合できる薬剤）；（ｂ）融合誘導剤（例えば、細胞膜に融合し、かつ／またはそれを通って輸送される性能を有する薬剤）：および、（ｃ）標的化化学基、例えば細胞または組織標的化剤、例えば特定の細胞型に結合するレクチン、糖タンパク、脂質、またはタンパク質（例えば抗体）、のうちの１つまたは複数（好ましくは２つ以上、より好ましくは３つすべて）に結合される担体物質を含み得る。送達物質と複合体形成されるｉＲＮＡ剤は、共有されている２００４年３月８日出願の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０７０７０号パンフレットに記載されている。
【００６１】
ｉＲＮＡ剤は、ｉＲＮＡ２本鎖のセンス配列とアンチセンス配列との間などに、非標準的な対合を備え得る。非標準的なｉＲＮＡ剤の例示的特徴は、共有されている２００４年３月８日出願の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０７０７０号パンフレットに記載されている。
【００６２】
（ヌクレアーゼ抵抗性の強化）
ｉＲＮＡ剤、例えばＲＳＶを標的とするｉＲＮＡ剤は、同薬剤が有するヌクレアーゼ抵抗性を強化することができる。
【００６３】
ヌクレアーゼ抵抗性を強化する、及び／又は標的との結合親和性を強化するために、ｉＲＮＡ剤、例えばｉＲＮＡ剤のセンス鎖及び／又はアンチセンス鎖は、２’−修飾リボース単位及び／又はホスホロチオエート結合を含み得る。例えば、２’ヒドロキシル基（ＯＨ）は種々の異なる「オキシ」又は「デオキシ」置換基で修飾され得るか或いは置換され得る。
【００６４】
「オキシ」−２’ヒドロキシ基修飾の例には、アルコキシもしくはアリールオキシ（ＯＲ、例えばＲ＝Ｈ、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、または糖）；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、すなわちＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２ＯＲ；例えばメチレン架橋によって２’ヒドロキシ基が同じリボース糖の４’炭素に連結されている「ロックト」核酸（ＬＮＡ）、Ｏ−ＡＭＩＮＥ、およびアミノアルコキシ、すなわちＯ（ＣＨ２）ｎＡＭＩＮＥ（例えば、ＡＭＩＮＥ＝ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、またはジへテロアリールアミノ、エチレンジアミン、ポリアミノ）が含まれる。メトキシエチル基（ＭＯＥ）（ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、ＰＥＧ誘導体）のみを含有するオリゴヌクレオチドは、強固なホスホロチオエート修飾で修飾されたものに匹敵するヌクレアーゼ安定性を示すことは、注目に値する。
【００６５】
「デオキシ」修飾には、水素（すなわち、デオキシリボース糖、これらは部分的ｄｓＲＮＡの突出部分に特に重要である）；ハロ（例えばフルオロ）；アミノ（例えば、ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジへテロアリールアミノ、またはアミノ酸）；ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）ｎＣＨ２ＣＨ２−ＡＭＩＮＥ（ＡＭＩＮＥ＝ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、またはジへテロアリールアミノ）、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ（Ｒ＝アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリールまたは糖）、シアノ；メルカプト；アルキル−チオ−アルキル：チオアルコキシ；及びアルキル、シクロアルキル、アリール、アルケニル、およびアルキニルが含まれ、これらは、選択的に、例えばアミノ官能基で置換することができる。
【００６６】
好ましい置換基は、２’−メトキシエチル、２’−ＯＣＨ３、２’−Ｏ−アリル、２’−Ｃ−アリル、および２’−フルオロである。
抵抗性を強化する方法の１つは、共有されている２００４年５月４日に出願の米国特許仮出願第６０／５５９９１７号明細書に記載の通り、切断部位を同定し、そのような部位を修飾して、切断を阻害することである。例えば、ジヌクレオチド５’−ＵＡ−３’、５’−ＵＧ−３’、５’−ＣＡ−３’、５’−ＵＵ−３’、又は５’−ＣＣ−３’を切断部位として利用できる。ヌクレアーゼ抵抗性の強化は、ウリジンが２’修飾ヌクレオチドである、少なくとも１つの５’−ウリジン−アデニン−３’（５’−ＵＡ−３’）ジヌクレオチド；５’−ウリジンが２’修飾ヌクレオチドである、少なくとも１つの５’−ウリジン−グアニン−３’（５’−ＵＧ−３’）ジヌクレオチド；５’−シチジンが２’修飾ヌクレオチドである、少なくとも１つの５’−シチジン−アデニン−３’（５’−ＣＡ−３’）ジヌクレオチド；５’−ウリジンが２’修飾ヌクレオチドである、少なくとも１つの５’−ウリジン−ウリジン−３’（５’−ＵＵ−３’）ジヌクレオチド；または５’−シチジンが２’修飾ヌクレオチドである、少なくとも１つの５’−シチジン−シチジン−３’（５’−ＣＣ−３’）ジヌクレオチドをもたらす５’ヌクレオチド修飾を行うことによって実現できる。上記ｉＲＮＡ剤は、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または少なくとも５つのそのようなジヌクレオチドを含み得る。特定の実施形態では、ｉＲＮＡ剤のすべてのピリミジンが、２’修飾を有し、そのため、そのｉＲＮＡ剤は、エンドヌクレアーゼに対する抵抗性が強化される。
【００６７】
ヌクレアーゼ抵抗性を最大にするために、２’修飾は、１つ以上のリン酸塩リンカー修飾（例えば、フォスフォロチオエート）と組み合わせて使用され得る。いわゆる「キメラ」オリゴヌクレオチドは２つ以上の異なる修飾を含むものである。
【００６８】
オリゴヌクレオチド骨格におけるフラノース糖の包含も、エンドヌクレオチド鎖切断を低減できる。ｉＲＮＡ剤は、さらに３’陽イオン基を包含させることによって、あるいは３’−３’連結を伴う３’末端でのヌクレオシドの反転によって修飾され得る。別の代替法では、アミノアルキル基、例えば、３’Ｃ５−アミノアルキルｄＴで３’末端をブロックすることができる。他の３’結合体も、３’−５’エキソヌクレオチド分解性の切断を阻害できる。理論に拘泥するものではないが、ナプロキセンまたはイブプロフェンなどの３’結合体は、エクソヌクレアーゼがオリゴヌクレオチドの３’末端に結合するのを立体的にブロックすることによって、エキソヌレオチド分解性の切断を阻害し得る。小さなアルキル鎖、アリール基、または複素環式結合もしくは修飾糖（Ｄ−リボース、デオキシリボース、グルコースなど）でさえも、３’−５’エクソヌクレアーゼをブロックすることができる。
【００６９】
同様に、５’−結合は、５’−３’−エキソヌクレオレチド分解性の切断を阻害する。理論に拘泥するものではないが、ナプロキセンまたはイブプロフェンなどの５’結合体は、エクソヌクレアーゼがオリゴヌクレオチドの５’末端に結合するのを立体的にブロックすることによって、エキソヌクレオレチド分解性の切断を阻害し得る。小さなアルキル鎖、アリール基、または複素環式結合もしくは修飾糖（Ｄ−リボース、デオキシリボース、グルコースなど）でさえも、３’−５’−エクソヌクレアーゼをブロックすることができる。
【００７０】
ｉＲＮＡ剤は、２本鎖ｉＲＮＡ剤が少なくとも一方の末端に１本鎖ヌクレオチド突出部分を含有している場合に、ヌクレアーゼに対する抵抗性を増大させることができる。好ましい実施形態では、上記ヌクレオチド突出部分は、１乃至４個の、好ましくは２乃至３個の不対ヌクレオチドを含有する。好ましい実施形態では、末端ヌクレオチド対に直接隣接している上記１本鎖の突出部分の不対ヌクレオチドがプリン塩基を含有し、上記末端ヌクレオチド対がＧ−Ｃ対であるか、もしくは相補的な最終４ヌクレオチド対のうち少なくとも２対がＧ−Ｃ対である。さらに別の実施形態では、上記ヌクレオチド突出部分は、１または２つの不対ヌクレオチドを有することがあり、例示的実施形態では、上記ヌクレオチド突出部分が５’−ＧＣ−３’である。好ましい実施形態では、上記ヌクレオチド突出部分が、上記アンチセンス鎖の３’端にある。一実施形態では、上記ｉＲＮＡ剤は、２ｎｔの突出部分５’−ＧＣ−３’が形成されるように、上記アンチセンス鎖の３’末端に５’−ＣＧＣ−３’というモチーフを含有する。
【００７１】
したがって、ｉＲＮＡ剤は、例えば対象の体内に存在するヌクレアーゼ、例えば、エンドヌクレアーゼまたはエクソヌクレアーゼによる分解を阻害するように修飾された単量体を含有できる。これらの単量体は、本明細書ではＮＲＭすなわちヌクレアーゼ抵抗性促進単量体と称され、対応する修飾は、ＮＲＭ修飾と称される。多くの場合、これらの修飾は、ｉＲＮＡ剤の他の特性、例えばタンパク質、例えば運搬体タンパク質、例えば血清アルブミンまたはＲＩＳＣのメンバー、と相互作用する能力、または第１の配列および第２の配列の、お互いと２本鎖を形成する能力、もしくは別の配列、例えば標的分子と２本鎖を形成する能力、も調節するであろう。
【００７２】
１つまたは複数の異なったＮＲＭ修飾を、ｉＲＮＡ剤の中、または、ｉＲＮＡ剤の配列の中に導入することができる。１つの配列中またはｉＲＮＡ剤中で１つのＮＲＭ修飾を複数回用いることができる。
【００７３】
ＮＲＭ修飾には、末端にのみ配置できる一部のものも、いかなる位置にも配置できる他のものも含めることができる。一部のＮＲＭ修飾は、ハイブリダイゼーションを抑制する可能性があり、したがって、それらは末端領域のみで使用するのが好ましく、それらを切断部位、または対象の配列もしくは遺伝子を標的とする配列、特にアンチセンス鎖上の切断領域にて用いないことが好ましい。それらは、上記ｄｓ  ｉＲＮＡ剤の２つの鎖の間で十分なハイブリダイゼーションが維持される場合に、センス鎖の任意の場所にて使用できる。一部の実施形態では、ＮＲＭが標的外のサイレンシングを最小にし得るので、ＮＲＭを切断部位またはセンス鎖の切断領域に配置するのが望ましい。
【００７４】
ほとんどの場合、ＮＲＭ修飾は、それらがセンス鎖に含まれるか、もしくはアンチセンス鎖に含まれるかに応じて異なって分配されるであろう。アンチセンス鎖に含まれる場合には、エンドヌクレアーゼ切断を妨害または阻害する修飾は、ＲＩＳＣ媒介の切断を受ける領域、例えば切断部位または切断領域に挿入されるべきでない（本願明細書に援用する、エルバシル（Ｅｌｂａｓｈｉｒ）ら、２００１年、Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖ．第１５巻、１８８頁に記載されている）。標的の切断は、２０または２１ｎｔのアンチセンス鎖のほぼ中央、すなわち上記アンチセンス鎖に相補的な標的ｍＲＮＡの最初のヌクレオチドの上流のほぼ１０または１１ヌクレオチドで起こる。本明細書で使用される場合、切断部位は、標的ｍＲＮＡまたはそれにハイブリダイズするｉＲＮＡ剤の鎖における、切断部位のいずれかの側のヌクレオチドを指す。切断領域は、いずれかの方向における、上記切断部位の１、２、または３ヌクレオチド以内にあるヌクレオチドを意味する。
【００７５】
そのような修飾は、標的となる配列、或いは対象の配列を標的としない配列の末端領域、又は同末端の２、３、４、もしくは５番目の位置を含めた位置に導入することができる。
【００７６】
（テザーリガンド）
薬理学的特性を含めたｉＲＮＡ剤の特性は、リガンド、例えば、テザーリガンドを導入することによって、影響を受け、調整され得る。
【００７７】
多種多様な構成要素、例えば、リガンドを、ｉＲＮＡ剤、例えば、リガンド結合単量体サブユニットの担体に連結することができる。リガンド結合単量体サブユニットの場合について以下にその例を説明するが、これは単に好適な例に過ぎず、同構成要素はｉＲＮＡ剤のその他の点にも結合することができる。
【００７８】
好ましい部分は、干渉テザー（ｔｅｔｈｅｒ）を介して直接的または間接的に担体に、好ましくは共有結合するリガンドである。好ましい実施形態では、このリガンドは干渉テザーを介して担体に結合される。リガンド結合単量体が伸長する鎖に取り込まれるとき、リガンドまたはテザーリガンドは、リガンド結合単量体上に存在し得る。いくつかの実施形態では、このリガンドは、「前駆体」リガンド結合単量体サブユニットが伸長する鎖に取り込まれた後で、同「前駆体」リガンド結合単量体サブユニットに取り込まれる。例えば、ＴＡＰ−（ＣＨ２）ｎＮＨ２などのアミノ末端テザーなどを有する単量体は、伸長するセンスまたはアンチセンス鎖に取り込まれてよい。その後の操作において、すなわち、前駆体単量体サブユニットが鎖に取り込まれた後で、求電子基、例えば、ペンタフルオロフェニルエステルまたはアルデヒド基を有するリガンドは、リガンドの求電子基と前駆体リガンド結合単量体サブユニットテザーの末端求核基との結合によって、その後前駆体リガンド結合単量体に結合され得る。
【００７９】
好ましい実施形態では、リガンドは、取り込まれたｉＲＮＡ剤の分布、標的化または寿命を改変する。好ましい実施形態では、リガンドは、例えば、このようなリガンドを備えていない種と比較して、選択した標的、例えば、分子、細胞または細胞種、細胞区画もしくは器官区画などの区画、組織、器官または身体の領域に対する親和性を増強する。
【００８０】
好ましいリガンドは、輸送、ハイブリダイゼーションおよび特異性の特性を改善することができ、得られた天然もしくは修飾オリゴリボヌクレオチド、または本明細書で説明した単量体および／または天然もしくは修飾リボヌクレオチドの任意の組合せを含むポリマー分子のヌクレアーゼ抵抗性も改善することができる。
【００８１】
一般的に、リガンドは、例えば、取り込みを高めるための治療調節剤、例えば、分布をモニタリングするための診断用化合物もしくはレポーター群、架橋剤、ヌクレアーゼ抵抗性を付与する部分および天然もしくは通常にはない核塩基を含むことができる。一般的な例には、脂溶性分子、脂質、レクチン、ステロイド（例えば、ウバオール、ヘシゲニン（ｈｅｃｉｇｅｎｉｎ）、ジオスゲニン）、テルペン（例えば、トリテルペン、例えば、サルササポゲニン、フリーデリン、エピフリーデラノール誘導体化リトコール酸）、ビタミン、炭水化物（例えば、デキストラン、プルラン、キチン、キトサン、イヌリン、シクロデキストリンまたはヒアルロン酸）、タンパク質、タンパク質結合剤、インテグリン標的化分子、ポリカチオン、ペプチド、ポリアミンおよびペプチド模倣体が含まれる。
【００８２】
リガンドは、天然物質または組換えもしくは合成分子、例えば、合成ポリアミノ酸などの合成ポリマーであり得る。ポリアミノ酸の例には、ポリリジン（ＰＬＬ）、ポリＬ−アスパラギン酸、ポリＬ−グルタミン酸、スチレン−無水マレイン酸コポリマー、ポリ（Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）コポリマー、ジビニルエーテル−無水マレイン酸コポリマー、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミドコポリマー（ＨＭＰＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリウレタン、ポリ（２−エチルアクリル酸）、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドポリマーまたはポリホスファジンが含まれる。ポリアミンの例には、ポリエチレンイミン、ポリリジン（ＰＬＬ）、スペルミン、スペルミジン、ポリアミン、シュードペプチドポリアミン、ペプチド様ポリアミン、デンドリマーポリアミン、アルギニン、アミジン、プロタミン、陽イオン部分、例えば、陽イオン性脂質、陽イオン性ポルフィリン、ポリアミンの４級塩またはアルファヘリックスペプチドが含まれる。
【００８３】
リガンドにはまた、標的化化学基、例えば、細胞または組織標的化剤、例えば、甲状腺刺激ホルモン、メラノトロピン、サーファクタントタンパク質Ａ、ムチン炭水化物、グリコシル化ポリアミノ酸、トランスフェリン、ビスホスホン酸、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、またはＲＧＤペプチドもしくはＲＧＤペプチド模倣体が含まれる。
【００８４】
リガンドは、例えば糖タンパク質、例えば低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）のようなリポタンパク質、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）のようなアルブミン、又はペプチドのようなタンパク質、コ−リガンドに対して特異的な親和性を有する分子、或いは癌細胞、内皮細胞又は骨細胞のような特定のタイプの細胞に結合する抗体のような抗体であり得る。リガンドはまた、ホルモン及びホルモン受容体を含み得る。それらはまた、補因子、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、Ｎ−アセチル−グルコサミン、多価マンノース又は多価フコースのような非ペプチド種を含み得る。リガンドは、例えばリポ多糖体、ｐ３８ＭＡＰキナーゼのアクチベータ又はＮＦ−κＢのアクチベータであり得る。
【００８５】
リガンドは、例えば、細胞骨格を破壊することによって、例えば、細胞の微小管、微小繊維および／または中間径繊維を破壊することによって、細胞へのｉＲＮＡ剤の取り込みを増加させることができる物質、例えば、薬剤であり得る。この薬剤は、例えば、タキソン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、サイトカラシン、ノコダゾール、ジャプラキノリド（ｊａｐｌａｋｉｎｏｌｉｄｅ）、ラトランクリンＡ、ファロイジン、スウィンホライドＡ、インダノシンまたはミオセルビン（ｍｙｏｓｅｒｖｉｎ）であり得る。
【００８６】
一態様では、リガンドは脂質または脂質をベースにした分子である。このような脂質または脂質をベースにした分子は、血清タンパク質、例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に結合することが好ましい。ＨＳＡに結合できるその他の分子もリガンドとして使用できる。例えば、ネプロキシン（ｎｅｐｒｏｘｉｎ）またはアスピリンを使用できる。脂質または脂質をベースにしたリガンドは、（ａ）結合体の分解に対する抵抗性を増強し、（ｂ）標的細胞または細胞膜への標的化または輸送を増強し、および／または（ｃ）血清タンパク質、例えば、ＨＳＡへの結合を調節するために使用することができる。
【００８７】
脂質をベースにしたリガンドは、標的組織に対する結合体の結合を調節するために、例えば、制御するために使用され得る。例えば、ＨＳＡに一層強力に結合する脂質または脂質をベースにしたリガンドは、腎臓を標的とする傾向が少なく、したがって、身体から排出される傾向が低い。ＨＳＡにあまり強く結合しない脂質または脂質をベースにしたリガンドは、結合体を腎臓に対する標的とするために使用することができる。
【００８８】
好ましい実施形態では、脂質をベースにしたリガンドはＨＳＡに結合する。これは、結合体が好ましくは腎臓以外の組織に分布するような十分な親和性で同ＨＳＡに結合することが好ましい。しかしながら、この親和性はＨＳＡリガンドの結合が離れることできないほど強力ではないことが好ましい。
【００８９】
別の態様では、リガンドは、標的細胞によって、例えば増殖細胞によって取り込まれる部分、例えば、ビタミンまたは栄養素である。これらは、例えば、悪性型または非悪性型の、例えば、癌細胞の、望ましくない細胞増殖を特徴とする障害を治療するために特に有用である。ビタミンの例には、ビタミンＡ、ＥおよびＫが含まれる。その他のビタミンの例は、ビタミンＢ群、例えば、葉酸、Ｂ１２、リボフラビン、ビオチン、ピリドキサールまたは癌細胞によって取り込まれるその他のビタミンもしくは栄養素である。
【００９０】
別の態様では、リガンドは、細胞透過性薬剤、好ましくはヘリックス細胞透過性薬剤である。この薬剤は両親媒性であることが好ましい。薬剤の例は、ｔａｔまたはアンテナペディアなどのペプチドである。この薬剤がペプチドの場合、修飾可能であり、ペプチジル模倣体、反転異性体（ｉｎｖｅｒｔｏｍｅｒ）、非ペプチドまたは偽ペプチド結合が含まれ、Ｄアミノ酸も使用できる。ヘリックス剤は、親油性相および疎油性相を有するアルファヘリックス剤であることが好ましい。
【００９１】
（５’−リン酸修飾）
好ましい実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、５’がリン酸化されているか、または５’プライム末端にホスホリル類似体を含む。アンチセンス鎖の５’−リン酸修飾には、ＲＩＳＣ媒介遺伝子サイレンシングに適合したものが含まれる。適切な修飾には、５’−モノホスファート（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｏ−５’）；５’−ジホスファート（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）；５’−トリホスファート（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｏ−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）；５’−グアノシンキャップ（７−メチル化または非メチル化）（７ｍ−Ｇ−Ｏ−５’−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）；５’−アデノシンキャップ（Ａｐｐｐ）、および任意の修飾または非修飾ヌクレオチドキャップ構造が含まれる。その他の適切な５’リン酸塩修飾は当業者に周知であろう。
【００９２】
センス鎖は、同センス鎖を不活性化し、活性型ＲＩＳＣの形成を阻止し、それによって標的外効果を潜在的に減少させるために修飾され得る。これは、センス鎖の５’−リン酸化を阻止する修飾によって、例えば、５’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドで修飾することによって実現することができる（ニカネン（Ｎｙｋａｅｎｅｎ）ら、２００１年、「ＡＴＰ  ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ
ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｐａｔｈｗａｙ．」Ｃｅｌｌ、第１０７巻、３０９〜３２１頁を参照のこと）。リン酸化を阻止するその他の修飾、例えば、Ｏ−ＭｅよりもＨによる５’−ＯＨの簡単な置換も使用され得る。代替的に、大きな嵩高い基を５’−リン酸塩に添加して、ホスホジエステル結合に変更してもよい。
【００９３】
（ｉＲＮＡ剤の組織及び細胞への送達）
（処方化）
本明細書に記載されているｉＲＮＡ剤は対象へ投与するために、好ましくは吸入又は鼻腔内投与を介して肺及び鼻腔（呼吸組織）へ局所投与するために、又は注射のような非経口投与をするために、処方化され得る。
【００９４】
説明を容易にするために、この項における製剤、組成物および方法は、ほとんどは無修飾ｉＲＮＡ剤に関して論じる。しかしながら、これらの製剤、組成物および方法は、その他のｉＲＮＡ剤、例えば、修飾ｉＲＮＡ剤で実施することができ、このような実施は本発明の範囲内であることを理解されたい。
【００９５】
製剤化されたｉＲＮＡ剤組成物は、様々な状態をとることができる。いくつかの例では、この組成物は少なくとも部分的な結晶、均一な結晶、および／または無水物（例えば、水分が８０、５０、３０、２０または１０％未満）である。他の例では、ｉＲＮＡ剤は水相、例えば、水を含む溶液に含まれており、この形態は吸入を介する投与においては好ましい形態である。
【００９６】
水相または結晶組成物を、例えば、送達媒体、例えば、リポソーム（特に水相用）または粒子（例えば、結晶組成物に適し得る微粒子）に取り込むことができる。一般的に、ｉＲＮＡ剤組成物は、企図した投与方法に適合する方法で製剤化される。
【００９７】
ｉＲＮＡ剤調製物は、他の薬剤、例えば、他の治療剤またはｉＲＮＡ剤を安定化する薬剤、例えば、ｉＲＮＰを形成するためにｉＲＮＡ剤と複合体化するタンパク質と、組み合わせて、製剤化することができる。さらに他の薬剤には、キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ（例えば、Ｍｇ２＋などの２価陽イオンを除去するため）、塩、ＲＮアーゼ阻害剤（例えば、ＲＮＡｓｉｎなどの特異性の広いＲＮアーゼ阻害剤）などが含まれる。
【００９８】
一実施形態では、ｉＲＮＡ剤調製物には、別のｉＲＮＡ剤、例えば、第２の遺伝子に関してＲＮＡｉを媒介する第２のｉＲＮＡ剤を含む。更に他の調製物には、少なくとも３個、５個、１０個、２０個、５０個または１００個以上の異なるｉＲＮＡ剤種を含めることができる。幾らかの実施形態において、同剤は、同一のウイルスであるが異なる標的配列に指向され得る。別の実施形態において、各ｉＲＮＡ剤は異なるウイルスに指向する。実施例に示されるように、１つ以上のウイルスが２つのｉＲＮＡ剤を同時に投与する、又は非常に近い時間間隔にて同時に投与することにより阻害され得、各々が治療されるべきウイルスの１つに指向する。
【００９９】
（治療方法および送達経路）
本発明のｉＲＮＡ剤、例えば、ＲＳＶを標的とするｉＲＮＡ剤を含む組成物は、様々な経路によって対象に送達することができる。例示的な経路には、吸入、静脈内、経鼻又は経口送達が含まれる。本発明のｉＲＮＡ剤を投与する好ましい手段は、肺及び鼻腔への直接投与によるもの、又は非経口投与による全身的な投与によるものである。
【０１００】
ｉＲＮＡ剤は、投与に適した医薬組成物に取り込むことができる。例えば、組成物は、１種または複数種のｉＲＮＡ剤および薬学的に許容される担体を含むことができる。本明細書では、「薬学的に許容される担体」という用語は、医薬品投与に適合した任意の、およびすべての溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張化剤及び吸収遅延剤などを含むものとする。薬学的に活性のある物質のためにこのような媒体および作用物質を使用することは、当該技術分野では周知である。従来の媒体または作用物質が活性化合物に不適合である場合を除いて、それらは組成物に使用されるものとする。補充的な活性化合物もこの組成物に組み入れることができる。
【０１０１】
本発明の医薬品組成物は、局所治療または全身治療が望ましいかどうかに応じて、および治療する部位に応じていくつかの方法で投与することが可能である。投与は、局所投与（経鼻又は経肺を含む）、経口投与又は非経口投与であり得る。非経口投与には、静脈点滴、皮下、腹腔内もしくは筋肉内注射が含まれる。
【０１０２】
一般的に、本発明のｉＲＮＡの送達は、対象の感染部位への送達を実現するために実施される。これを実現する好ましい手段は、肺又は鼻腔、例えば吸入、噴霧或いは鼻腔投与を介する呼吸器系組織への局所投与、或いは非経口投与のような全身投与を介するものである。
【０１０３】
吸入又は非経口投与用製剤は当業者には周知である。そのような製剤は、緩衝剤、希釈剤およびその他の適切な添加物も含有できる滅菌水性溶液が含まれ、例えばＰＢＳ又は５％デキストロース水溶液である。静脈内での使用のために、溶質の全濃度は調製物を等張にするように制御されるべきである。
【０１０４】
本明細書に開示されている活性化合物は、好ましくは任意の適切な手段によって対象の肺又は鼻腔に投与される。活性化合物は、同対象が吸入する１つ又は複数の活性化合物からなる呼吸に適した粒子のエアロゾル懸濁液を投与することにより投与される。活性化合物は、限定されるものではないが、乾燥粉末吸入薬、定量吸入薬、又は液体／液体懸濁液のような種々の形態にてエアロゾル化され得る。呼吸に適した粒子は液体又は固体であり得る。同粒子は、選択的に、アミロリド、ベンザミル又はフェナミルのようなその他の治療剤を、米国特許第４５０１７２９号に記載されているような水の再吸収を気道粘膜分泌物から阻害するのに効果的な量にて含まれている選択された化合物とともに含み得る。
【０１０５】
粒子状の製薬組成物は、分散又は輸送を容易にするために、選択的に担体と結合され得る。糖（即ち、デキストロース、ラクトース、スクロース、トレハロース、マニトール）のような適切な担体は、任意の適切な比率（例えば、１：１の重量比）にて１つ又は複数の活性化合物と混合され得る。
【０１０６】
本発明を実施するための活性化合物からなる粒子は、呼吸に適したサイズの粒子、即ち、吸入によって口又は鼻と咽頭とを通過し、気管支及び肺胞に到達するのに十分小さいサイズの粒子を含むべきである。一般に、約１乃至１０ミクロンのサイズの粒子（より詳細には、約５ミクロン未満のサイズ）が呼吸に適している。エアロゾルに含まれる呼吸に適していないサイズの粒子は喉に堆積して飲み込まれる傾向にあり、エアロゾル中の呼吸に適していない粒子の量は最小限に留めることが好ましい。経鼻投与に対しては、１０−５００ミクロンの範囲の粒子径が、鼻腔内にて確実に保持されるためには好ましい。
【０１０７】
エアロゾルを製造するための活性化合物の液体製薬組成物は、滅菌した発熱物質を含まない水のような適切な担体と同活性化合物とを組み合わせることにより調製され得る。本発明を実施するために使用される高張生理食塩水は、生理学的に許容可能な塩を好ましくは１乃至１５重量％含み、より好ましくは生理学的に許容可能な塩を３乃至７重量％含む、滅菌された発熱物質を含まない溶液である。
【０１０８】
活性化合物からなる液体粒子のエアロゾルは、圧力駆動式のジェット噴霧器又は超音波噴霧器のような任意の適切な手段により製造され得る。例えば、米国特許第４５０１７２９号明細書を参照されたい。噴霧器は市販された装置であり、典型的には空気又は酸素である圧縮ガスを、狭いベンチュリオリフィスを介して加速させることにより、又は超音波撹拌手段によって、治療用エアロゾルミストに変換する。
【０１０９】
噴霧器にて使用するのに適した製剤は、液体担体中の活性成分から構成され、製剤中に４０ｗ／ｗ％までであるが、好ましくは２０ｗ／ｗ％未満である活性成分を含む。担体は、典型的には水（そして、最も好ましくは滅菌した発熱物質を含まない水）であるか、又は好ましくは等張であるが、例えば塩化ナトリウムを加えることにより体液で高張となり得る希釈されたアルコール水溶液である。選択的な添加物は、同製剤が滅菌されていない場合には、例えばメチルヒドロベンゾエート、抗酸化剤、香料添加剤、揮発性オイル、緩衝剤及び界面活性剤のような保存剤を含んでいる。
【０１１０】
活性化合物を含む固体粒子のエアロゾルも同様に、任意の固体粒子治療用エアロゾル発生器を用いて製造され得る。固体粒子治療剤を対象に投与するためのエアロゾル発生器は呼吸に適し、かつヒトへの投与に適した割合にて治療剤を所定量含む一定量のエアロゾルを発生する粒子を製造する。１つの例示的なタイプの固体粒子エアロゾル発生器は吸入器である。吸入投与に適した製剤は、吸入器により送達され得るか、或いは嗅ぐことによって鼻腔に取り入れられる微粉砕された粉末を含む。吸入器において、粉末（例えば、本明細書に記載された治療を実施するのに有効な所定量）は、典型的にはゼラチン又はプラスチックにより形成されるカプセル又はカートリッジに包含され、それらはその位置にて穿孔されるか又は開口され、そして、粉末は吸入装置を介して空気により導入されるか又は手動ポンプにより送達される。吸入器に使用される粉末は活性成分のみから構成されているか、又は活性成分とラクトースのような適切な粉末の賦形剤と選択的な界面活性剤とからなる粉末混合物から構成されている。活性成分は典型的には、製剤の０．１乃至１００ｗ／ｗ％からなる。
【０１１１】
第２のタイプの例示的なエアロゾル発生器は、定量吸入器を含む。定量吸入器は圧縮されたエアロゾルディスペンザーであり、典型的には液状の推進剤中に活性成分を含んだ懸濁液製剤又は溶液製剤を含んでいる。使用時にこれらの装置は、所定量、典型的には１０乃至２００μｌを送達するように構成されたバルブより同製剤が放出され、活性成分を含む微細な流体スプレーを形成する。適切な推進剤は、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン及びそれらの混合物である、ある種のクロロフルオロカーボン化合物を含む。同製剤は、付随的に、例えばエタノールのような一つ以上の共溶媒、オレイン酸又はソルビタントリオレエートのような界面活性剤、抗酸化剤及び適切な香料添加剤を含んでいる。
【０１１２】
投与は、対象によって提供され得るか、または例えば治療奉仕者のような別の人によって提供され得る。治療奉仕者は、人に治療を提供することに関与する任意の存在、例えば、病院、ホスピス、診療所、外来患者向け診療所で医療に従事する人、例えば、医者、看護師もしくはその他の専門家などの医療従事者、または配偶者または親などの保護者であり得る。投薬は、測定された用量で、または計測された用量を送達する分配器で提供され得る。
【０１１３】
「治療有効量」という用語は、望ましい生理学的応答をもたらすために、治療する対象において所望するレベルの薬剤を提供するのに必要な、組成物中に存在する量のことである。一実施形態において、２つ以上のｉＲＮＡ剤であって各々がＲＳＶのような異なる呼吸器系ウイルスに指向するｉＲＮＡ剤の治療上有効な量が同時に対象に投与される。
【０１１４】
「生理学的有効量」という用語は、所望とする緩和または治療的効果を与えるために対象に送達される量である。
「薬学的に許容される担体」という用語は、その担体が肺に著しく有害な毒性効果を与えず肺に取り込まれることが可能であることを意味する。
【０１１５】
「共投与」という用語は、２種以上の薬剤、特に２種以上のｉＲＮＡ剤を対象に投与することである。薬剤は、単一の医薬組成物に含有され、同時に投与され得るか、または薬剤は別々の製剤に含有され、順番に対象に投与され得る。２種の薬剤が同時に対象にて検出されることができる限り、２種の薬剤は共投与されたと言える。
【０１１６】
担体として有用な医薬賦形剤の種類には、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）などの安定化剤、炭水化物、アミノ酸およびポリペプチドなどの賦形剤、ｐＨ調整剤または緩衝剤；塩化ナトリウムなどの塩などがある。これらの担体は、結晶形であっても、アモルファス形であってもよく、２つの混合物であってもよい。
【０１１７】
特に有用である賦形剤には、適合性のある炭水化物、ポリペプチド、アミノ酸またはそれらの組合せが含まれる。適切な炭水化物には、ガラクトース、Ｄ−マンノース、ソルボースなどの単糖類、ラクトース、トレハロースなどの２糖類、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンなどのシクロデキストリン、およびラフィノース、マルトデキストリン、デキストランなどの多糖類、マンニトール、キシリトールなどのアルジトール類が含まれる。好ましい炭水化物群には、ラクトース、トレハロース、ラフィノース、マルトデキストリンおよびマンニトールが含まれる。適切なポリペプチドには、アスパルテームが含まれる。アミノ酸には、アラニンおよびグリシンが含まれ、グリシンが好ましい。
【０１１８】
適切なｐＨ調整剤または緩衝剤には、クエン酸ナトリウム、アスコルビン酸ナトリウムなどの有機酸および塩基から調製された有機塩が含まれ、クエン酸ナトリウムが好ましい。
【０１１９】
投与量。ｉＲＮＡ剤は、体重１ｋｇ当たり約７５ｍｇ未満、または体重１ｋｇ当たり約７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、５、２、１、０．５、０．１、０．０５、０．０１、０．００５、０．００１または０．０００５ｍｇ未満の単位用量で、および体重１ｋｇ当たりｉＲＮＡ剤２００ｎｍｏｌ未満（例えば、約４．４×１０１６コピー）の単位用量で、または体重１ｋｇ当たりｉＲＮＡ剤１５００、７５０、３００、１５０、７５、１５、７．５、１．５、０．７５、０．１５、０．０７５、０．０１５、０．００７５、０．００１５、０．０００７５、０．０００１５ｎｍｏｌ未満の単位用量で投与され得る。例えば、この単位用量は、吸入された用量若しくは噴霧によって、或いは注射によって投与され得る。一実施例において、０．０２−２５ｍｇ／ｋｇの用量範囲が使用され得る。
【０１２０】
肺又は鼻腔へのｉＲＮＡ剤の直接の送達は、鼻腔当たり約１ｍｇ〜約１５０ｍｇの投与量にて実施され得る。
投与量は、疾患または障害を治療または予防するのに有効な量であり得る。
【０１２１】
一実施形態では、単位用量は１日１回投与される。その他の用法において、単位用量は最初の日は２回、その後は１日１回投与される。代替的に、単位用量は１日１回より少ない頻度で、例えば、２日、４日、８日または３０日毎に１回より少ない頻度で投与する。別の実施形態では、単位用量は一定頻度（例えば、規則正しい頻度）では投与されない。例えば、単位用量を１回で投与することが可能である。ｉＲＮＡ剤が媒介するサイレンシングは、ｉＲＮＡ剤組成物を投与した後、数日間維持され得るので、多くの場合、１日１回より少ない頻度で、場合によっては全治量期間中１回のみ組成物を投与することが可能である。
【０１２２】
一実施形態では、例えば、２本鎖ｉＲＮＡ剤、またはｓｉＲＮＡ剤（例えば、前駆体、例えば、ｓｉＲＮＡ剤中に処理されることができるより大きなｉＲＮＡ剤、またはｉＲＮＡ剤、例えば、２本鎖ｉＲＮＡ剤、もしくはｓｉＲＮＡ剤、もしくはそれらの前駆体をコードするＤＮＡ）の初回量および１回または複数の維持用量が対象に投与される。１回又は複数回の維持用量は、一般的に初回量よりも少なく、例えば、初回量の２分の１より少ない。維持治療計画は、１日当たり体重１ｋｇに対して０．０１μｇ〜７５ｍｇの範囲、例えば、１日当たり体重１ｋｇに対して７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、５、２、１、０．５、０．１、０．０５、０．０１、０．００５、０．００１または０．０００５ｍｇの１回又は複数回の用量で対象を治療することを含み得る。維持用量は、５乃至１４日毎に１回以下投与することが好ましい。さらに、治療計画は、特定の疾患の性質、重症度および患者の全体的状態に応じて変化し得る期間の間、維持され得る。好ましい実施形態では、投与量は１日１回以下、例えば、２４、３６、４８時間以上に１回以下、例えば、５日または８日毎に１回以下にて送達され得る。処置後、患者の状態の変化および疾患状態の徴候の軽減をモニタリングすることができる。化合物の投与量は、患者が現在の用量レベルに有意に応答しない場合増加させることができ、あるいは疾患状態の徴候の軽減が認められた場合、疾患状態が消失した場合、または望ましくない副作用が認められた場合、用量を減少させることができる。
【０１２３】
一実施形態において、ｉＲＮＡ剤の製薬組成物は複数のｉＲＮＡ剤種を含む。ｉＲＮＡ剤種は、例えばＲＳＶ遺伝子の標的配列のような天然の標的配列に対して重複せずかつ隣接しない配列を有する。別の実施形態において、複数のｉＲＮＡ剤種は天然由来の異なる標的遺伝子に特異的である。例えば、ＲＳＶのＰタンパク質遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤は、異なる遺伝子、例えばＮタンパク質遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤と同じ製薬組成物中に存在し得る。別の実施形態において、ｉＲＮＡ剤は例えばＲＳＶのような異なるウイルスに特異的である。
【０１２４】
ｉＲＮＡ剤組成物の濃度は、障害を治療もしくは予防するのに有効であるか、またはヒトの生理学的状態を調節するために十分な量である。投与するｉＲＮＡの薬剤の濃度または量は、薬剤について測定されたパラメータ、および経鼻、頬側または肺投与などの投与方法に依存される。例えば、経鼻用製剤は、鼻孔の刺激または灼熱感を回避するために、いくつかの成分をはるかに低い濃度にしなければならない傾向がある。適切な経鼻用製剤を提供するために、経口用製剤を１０〜１００倍希釈することが時として望ましい。
【０１２５】
非限定的ではあるが、疾患もしくは障害の重症度、以前の治療法、対象の一般的健康状態および／または年齢、その他の既存の疾患を含めたある種の因子が、対象を効果的に治療するために必要な投与量に影響を及ぼし得る。治療に使用するｓｉＲＮＡなどのｉＲＮＡ剤の効果的投与量は、特定の治療の期間中、増加または減少し得ることも理解されたい。投与量の変化は、診断試験法の結果から得られ、明らかとなり得る。例えば、ｉＲＮＡ剤組成物投与後に対象をモニタリングすることができる。モニタリングからの情報に基づいて、ｉＲＮＡ剤組成物の追加量を投与することができる。
【０１２６】
本発明は、以下の実施例によってさらに例示されるが、それらはさらに限定するものではない。
【実施例】
【０１２７】
（ＲＳＶｍＲＮＡに対する抗ウイルスｓｉＲＮＡの設計）
ＲＳＶ  Ｐ、Ｎ及びＬｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡは公知の手法を使用して化学的に合成した。ｓｉＲＮＡの配列、幾らかの阻害の交叉サブタイプ活性及びＩＣ５０値を列挙した（表１（ａ−ｃ））。
【０１２８】
（インビトロアッセイ及びウイルス感染）
ベロ（Ｖｅｒｏ）Ｅ６細胞は、１０％の熱不活性化ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中にて８０％コンフルエンシーまで培養した。ｓｉＲＮＡを導入するために、４μｌのＴｒａｎｓｉｔ−ＴＫＯを５０μｌの血清を含まないＤＭＥＭに加え、室温にて１０分間インキュベートした。次に、所定の濃度のｓｉＲＮＡを培地／ＲＫＯ試薬にそれぞれ加え、室温にて１０分間インキュベートした。ＲＮＡ混合物を１０％のＦＢＳを含む２００μｌのＤＭＥＭに加え、次に細胞単層に加えた。細胞は３７℃かつ５％ＣＯ２にて６時間インキュベートした。ＲＮＡ混合物は１ｘハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）で緩やかに洗浄することにより除去され、ＲＳＶ／Ａ２の３００プラーク形成単位（ｐｆｕ）／ウェルを同ウェルに加え（ＭＯＩ＝３０）、３７℃、５％ＣＯ２にて１時間吸着させた。ウイルスを除去し、細胞を１ｘＨＢＳＳで洗浄した。細胞を、１０％ＦＢＳ培地を含むＤＭＥＭ中の１％メチルセルロースで積層し、３７℃かつ５％ＣＯ２にて６日間インキュベートした。細胞は抗Ｆタンパク質モノクロナール抗体１３１−２Ａを使用して、プラークに対して免疫染色した。
【０１２９】
（ｓｉＲＮＡの送達及びインビボにおけるウイルス感染）
病原菌に感染していない４週齢の雌のＢＡＬＢ／ｃマウスをハーラン（Ｈａｒｌａｎ）より購入した。感染時及び鼻腔内点滴注入時（ｉ．ｎ．）にはマウスは麻酔状態にした。マウスへの鼻腔内点滴注入により、所定量のｓｉＲＮＡを５μｌのＴｒａｎｓｉｔＴＫＯと複合体化しない状態又はした状態にて同マウスを免疫化した。１５０μｇのＳｙｎａｇｉｓ（モノクロナール抗体クローン１４３−６Ｃ、抗ＲＳＶ  Ｆタンパク質）及びマウスイソタイプ対照（ＩｇＧ１）をＲＳＶ攻撃（ＲＳＶ／Ａ２の１０６ＰＦＵ）の４時間前に、腹腔内投与（ｉ．ｐ．）した。１群１０匹のマウスを使用した。動物の体重は、感染後０日、２日、３日及び６日に測定した。感染の６日後に肺を採取し、免疫染色プラーク試験法によりＲＳＶを試験した。
【０１３０】
（免疫染色プラーク試験法）
２４−ウェルプレートのベロＥ６細胞を１０％の熱不活性化ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中にて９０％コンフルエンシーまで培養した。マウスの肺を、１ｍｌの滅菌したＤｕｌｂｅｃｃｏのＰＢＳ（Ｄ−ＰＢＳ）中にて手持ち式のホモジナイザーでホモジナイズし、血清を含まないＤＭＥＭにて１０倍に希釈した。ウイルスを含む肺溶解物の希釈物を２４ウェルプレート上に３重に接種し、３７℃かつ５％ＣＯ２にて１時間吸着させた。１０％のＦＢＳを含むＤＭＥＭ中の１％メチルセルロースをウェルに積層した。次にプレートを３７℃かつ５％ＣＯ２にて６日間インキュベートした。６日後、積層した培地を除去し、細胞をアセトン：メタノール（６０：４０）中にて１５分間固定した。細胞を５％の粉乳／ＰＢＳで３７℃で１時間ブロックした。１：５００で希釈した抗−ＲＳＶ  Ｆタンパク質抗体（１３１−２Ａ）をウェルに加え、３７℃にて２時間インキュベートした。細胞をＰＢＳ／０．５％Ｔｗｅｅｎ２０で２回洗浄した。１：５００で希釈したヤギ抗マウスＩｇＧ−アルカリフォスファターゼをウェルに加え、３７℃で１時間インキュベートした。細胞をＰＢＳ／０．５％Ｔｗｅｅｎ２０で２回洗浄した。Ｖｅｃｔｏｒのアルカリフォスファターゼ基質キットＩＩ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｂｌａｃｋ）を使用して反応を展開し、ヘマトキシリンで対比染色した。プラークが視認され、オリンパス（Ｏｌｙｍｐｕｓ）社の倒立顕微鏡を用いてカウントした。
【０１３１】
（治療試験法）
マウスを鼻腔内点滴注入により０日目にＲＳＶで攻撃し（ＲＳＶ／Ａ２の１０６ＰＦＵ）、鼻腔内点滴注入にて送達される５０μｇの所定のｓｉＲＮＡを所定の時間（ウイルス攻撃後１乃至４日）にて治療した。１群３乃至５匹のマウスを使用し、ウイルス価を、既に述べたように、ウイルス攻撃後５日目に肺溶解物から測定した。
【０１３２】
（ｉＲＮＡ剤を使用するＲＳＶのインビトロ阻害）
表１（ａ−ｃ）に示されたｉＲＮＡ剤は、既に記載したように、プラーク形成試験法にて抗ＲＳＶ活性を試験した（図１）。各カラム（バー）は、表１（ａ−ｃ）に示されたｉＲＮＡ剤を示す。例えば、カラム１は、表１ａの最初の薬剤であり、２番目のカラムは２番目の薬剤であるなど。活性ｉＲＮＡ剤は残存したウイルスの％にて確認した。数種の薬剤については、ほぼ９０％の阻害を示した。結果を表１（ａ−ｃ）に要約した。
【０１３３】
ｉＲＮＡ剤を使用してＲＳＶのインビトロ用量反応阻害を決定した。表１からの活性剤の例について、４種類の濃度にて、既に述べたようにプラーク形成試験法にて抗ＲＳＶ活性を試験した。用量依存反応は、試験した活性ｉＲＮＡ剤にて見出され（図２）、表１（ａ−ｃ）に要約した。
【０１３４】
ｉＲＮＡ剤を使用したＲＳＶ  Ｂサブタイプのインビトロの阻害を既に記載したように試験した。図２に示されたｉＲＮＡ剤を、サブタイプＢに対する抗ＲＳＶ活性について試験した（図３）。ＲＳＶサブタイプＢは試験されたｉＲＮＡ剤により種々の程度にて阻害され、表１（ｑ−ｃ）に要約した。
【０１３５】
（ｉＲＮＡ剤を使用したＲＳＶのインビボ阻害）
ＡＬ１７２９及びＡＬ１７３０を用いたＲＳＶのインビボ阻害を既に述べたように試験した。図４に記載された薬剤を、マウスモデルにおける抗ＲＳＶ活性について試験した。ｉＲＮＡ剤はインビボにおけるウイルス価を低減するのに効果的であり、対照抗体（Ｍａｂ１４３−６ｃ、ＲＳＶ治療に対して承認されているマウスＩｇＧ１Ａｂ）よりも効果的であった。
【０１３６】
ＡＬ１７３０は、既に提供された方法を用いて用量依存活性が試験された。同薬剤は用量依存反応を示した（図５）。
インビトロでの活性を示すｉＲＮＡ剤を、既に概説したようにインビボにおける抗ＲＳＶ活性について試験した。数種の薬剤は、予防的に与えられた場合、４ログ（ｌｏｇｓ）超のウイルス価の低減を示した（図６）。
【０１３７】
インビトロ及び／又はインビボにて活性を示すｉＲＮＡ剤は既に概説した治療プロトコルにおいてインビボにおける抗ＲＳＶ活性を試験した。数種の薬剤は、ウイルス感染後１−２日にて２−３ログのウイルス価の低減を示した（図７）。
【０１３８】
（標的配列を超える分離株の配列解析）
（方法）
分離株の成長及びＲＮＡの単離：ＲＳＶ感染患者からの臨床的な分離株をジョージア州アトランタに所在のＣＤＣのＬａｒｒｙ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ氏から（４菌株）、メンフィスに所在のテネシー大学のＪｏｈｎ  ＤｅＶｉｎｃｅｎｚｏ氏から（１５菌株）入手した。これらはＨＥｐ−２、ヒト上皮細胞（ＡＴＣＣ、Ｃａｔ＃  ＣＣＬ−２３）中にて培養したとき、ジョージアの４つの分離株はテネシーの１５の分離株よりも成長が遅かったのでこれらは別々に加工及び分析したことを明記したい。手順を以下に簡単に記載する。
【０１３９】
サル肝臓上皮細胞であるベロＥ６（ＡＴＣＣ、Ｃａｔ＃  ＣＲＬ−１５８６）を９５％コンフルエンシーまで培養し、初代分離株の１／１０希釈物で感染させた。ウイルスを３７℃にて１時間吸収させ、細胞をＤ−ＭＥＭで補充し、３７℃にてインキュベートした。毎日の頻度にて、光学顕微鏡により細胞の細胞変性効果（ＣＰＥ）をモニタリングした。９０％のＣＰＥにて細胞を擦り取って採取し、３０００ｒｐｍにて１０分間の遠心分離によりペレット化した。ＲＮＡの調製は製造業者のプロトコルに従って標準的な手順により実施した。
【０１４０】
ＲＳＶ  Ｎ遺伝子の増幅：ウイルスのＲＮＡを感染後に回収し、約４５０塩基対のフラグメントを増殖するためにＡＬＤＰ−２０１７標的部位の上流側及び下流側をハイブリダイズするプライマーを使用するＰＣＲ反応におけるテンプレートとして使用した。全ＲＮＡを、ＲＳＶ  Ｎ遺伝子の前進方向プライマー及び逆方向のプライマーの存在下にて６５℃にて５分間変性させ、氷上にて保存し、ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩＩ（インビトローゲン社）を使用して５５℃にて６０分間、７０℃にて１５分間逆転写した。ＰＣＲ産物を１％のアガロースゲル上のゲル電気泳動により分析し、標準的なプロトコルにて精製した。
【０１４１】
結果：最初の１５の分離株の配列分析は、ＡＬＤＰ−２０１７の標的部位がそれぞれの菌株にわたって完全に保存されたことを確認した。重要なことに、この保存は多様な個体群にわたり維持されており、そのような個体群はＲＳＶのＡ及びＢサブタイプの両方からの分離株も含まれている。興味深いことに、４個のゆっくりと成長する分離株を分析すると、４つのうちの１つ（ＬＡＰ６８２４）はＡＬＤＰ−２０１７の認識部位にひとつの塩基の変異を有することが観察された。この変異は、この分離株のＲＳＶ  Ｎ遺伝子の１３番目のコード配列がＡからＧへと変化していた。
【０１４２】
（結論）
１９の患者の分離株から、ＡＬＤＰ−２０１７の標的部位のＲＳＶ  Ｎ遺伝子の配列を決定した。１９例のうちの１８例（９５％）において、ＡＬＤＰ−２０１７の認識要素が１００％保存されている。分離株のうちの１つにおいて、ＲＳＶ  Ｎ遺伝子内の１３番目のヌクレオチドがＡからＧへと変化している１つの塩基の変更が存在している。この変化は、ＡＬＤＰ−２０１７のアンチセンス鎖と標的配列との間の１つのＧ：Ｕウォッブルを作出する。そのようなＧ：Ｕウォッブルのハイブリダイズ化の可能性の理解に基づいて、ＡＬＤＰ−２０１７はこの分離株のＲＳＶ  Ｎ遺伝子のサイレンシングに有効であることが予測される。
【０１４３】
（分離株のサイレンシングデータ）
（方法）
ベロＥ６細胞を１０％の熱不活性化ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中にて８０％コンフルエンシーまで培養した。ｓｉＲＮＡを導入するために、４μｌのＴｒａｎｓｉｔ−ＴＫＯを５０μｌの血清を含まないＤＭＥＭ中に加え、室温にて１０分間インキュベートした。次に、所定の濃度のｓｉＲＮＡを培地／ＲＫＯ試薬にそれぞれ加え、室温にて１０分間インキュベートした。ＲＮＡ混合物を１０％のＦＢＳを含む２００μｌのＤＭＥＭに加え、次に細胞単層に加えた。細胞は３７℃かつ５％ＣＯ２にて６時間インキュベートした。ＲＮＡ混合物は１ｘハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）で緩やかに洗浄することにより除去され、ＲＳＶ／Ａ２の３００プラーク形成単位（ｐｆｕ）／ウェルを同ウェルに加え（ＭＯＩ＝３０）、３７℃かつ５％ＣＯ２にて１時間吸着させた。ウイルスを除去し、細胞を１ｘＨＢＳＳで洗浄した。細胞を、１０％ＦＢＳ培地を含むＤＭＥＭ中の１％メチルセルロースで積層し、３７℃かつ５％ＣＯ２にて６日間インキュベートした。細胞は抗Ｆタンパク質モノクロナール抗体１３１−２Ａを使用して、プラークに対して免疫染色した。
【０１４４】
結果：サイレンシングは全ての分離株に対して見られた（表２）。
【０１４５】
【表１】
2014156491.tif 000003
結論：試験された全ての臨床上の分離株は、ｓｉＲＮＡ２０１７により８５％以上にて特異的に阻害された。ミスマッチ対照であるｓｉＲＮＡ２１５３を顕著に阻害した分離株はなかった。
【０１４６】
（プラスミドに基づく試験法におけるサイレンシング）
（方法）
２４ウェルプレートにＨｅＬａＳ６細胞を接種し、８０％コンフルエンスまで成長させた。各ウェルに対して、１μｇのＲＳＶ  Ｎ−Ｖ５プラスミドをｓｉＲＮＡ（所定の濃度にて）と５０μｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭ中にて混合し、製造業者の指示に従って調製されたＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（インビトローゲン社）−Ｏｐｔｉｍｅｍ混合物に加え、室温にて２０分間静置し、複合体を形成した。複合体を細胞に加え、３７℃にて一晩インキュベートした。培地を除去し、細胞をＰＢＳにて洗浄し、５０μｌのＬｙｓｉｓ緩衝液（ＲＩＰＡ緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０．１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．５％のデオキシコレートナトリウム、１％のＮＰ−４０、１％のＮＰ−４０、０．０５％のＳＤＳ）で１乃至２分間溶解した。阻害は、細胞溶解物中のＲＳＶタンパク質のレベルを測定することにより定量化され、抗−Ｖ５抗体を用いたウェスタンブロッティングにより検出した。
【０１４７】
結果：一過性のプラスミドの発現は、ＲＮＡｉ剤に対する効果的な試験法であることが示された（表３）。
【０１４８】
【表２】
2014156491.tif 000004
（結論）
ｓｉＲＮＡ２０１７は、ＲＳＶ  Ｎ遺伝子を発現するプラスミドで一時的にコトランスフェクトした場合、ＲＳＶ  Ｎタンパク質の産生を特異的かつ用量依存的に阻害した。この阻害は、ミスマッチ対照であるｓｉＲＮＡ２１５３では観察されていない。
【０１４９】
（ｓｉＲＮＡのエアロゾル送達を介するＲＳＶのサイレンシング）
（方法）
２ｍｇ／ｍｌのＡＬＤＰ−１７２９又はＡＬＤＰ−１７３０溶液をエアロゾル装置を使用して全部で６０秒間噴霧療法にて送達した。ウイルスは既に記載されたように肺から調製され、かつプラーク試験法に変えてＥＬＩＳＡにより測定した。ＥＬＩＳＡはマウス肺溶解物から得られたウイルスに感染した細胞中のＲＳＶ  Ｎタンパク質の濃度を測定する。
【０１５０】
（ＥＬＩＳＡ）
肺溶解物は、作用濃度である６−１０μｇ／１００μＬまで炭酸塩−重炭酸塩の緩衝液（ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．６）で１：１に希釈し、各試験ウェルに加え、３７℃にて１時間、或いは４℃にて一晩インキュベートした。ウェルをＰＢＳ／０．５％Ｔｗｅｅｎ２０を用いて３回洗浄し、５％の粉乳／ＰＢＳで３７℃で１時間、又は４℃で一晩ブロックした。初代抗体（Ｆタンパク質の陽性対照＝クローン１３１−２Ａ；Ｇタンパク質の陽性対照＝１３０−２Ｇ；陰性対照＝標準ＩｇＧ１（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｃａｔ．＃５５３４５４、試験用血清、或いはハイブリドーマ上澄液）をウェルに１：１０００の比率にて加え、３７℃にて１時間又は４℃にて一晩、インキュベートした。ＰＢＳ／０．５％Ｔｗｅｅｎ２０を用いてウェルを３回洗浄した。１：１０００に希釈された二次抗体（ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）全分子−アルカリフォスファターゼ結合体）をウェル（１００μｌ／ウェル）に加え、３７℃にて１時間、又は４℃にて一晩、インキュベートした。ＰＢＳ／０．５％Ｔｗｅｅｎ２０を用いて３回洗浄し、次に製造業者の指示に従ってＮｐｐ（Ｓｉｇｍａｆａｓｔ）基質，Ｓｉｇｎａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｎ２７７０を加えた。２００μｌの基質／ウェルを加え、１０−１５インキュベートした。ＯＤ４０５／４９５にて吸光度を測定した。
【０１５１】
（結論）
ＲＳＶ特異的ｓｉＲＮＡの送達は、ミスマッチ対照ｓｉＲＮＡと比較して、マウス肺におけるＲＳＶ  Ｎタンパク質のレベルを低減する（図８ａ−ｂ）。
【０１５２】
（３日の予防におけるインビボ阻害）
（方法）
インビボの予防は、上記のインビボ法を用いて試験したが、例外的に、ＲＳＶで感染する前に、３日前から４時間前の異なる時間にてｓｉＲＮＡを送達した。
【０１５３】
（結果）
ウイルス攻撃の３日前までに鼻腔内に送達されたｓｉＲＮＡはインビボにおいて顕著なサイレンシングを示す（図９）。
【０１５４】
【表３】
2014156491.tif 000005
2014156491.tif 000006
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【配列表】
2014156491000001.app
【外国語明細書】
2014156491000001.pdf