(57)【要約】【課題】従来のＳＰＩＭ顕微鏡の利点を生かしつつ、試料の大きさの制約を受けることなく試料を観察することができる顕微鏡を提供する。【解決手段】試料（１２）を配置するための配置面（１１）および配置面に対向する下面（１３）を有する試料配置部（１０）と、観察用レンズ（３１）と、シート光を生成する光学ユニット（２０）とを備えており、シート光は、下面から試料配置部を通過して試料へ照射され、試料からの蛍光は、下面へ向けて試料配置部を通過して観察用レンズにて受光される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料を配置するための配置面および上記配置面に対向する下面を有する試料配置部と、
上記試料からの蛍光を受光するための観察用レンズと、
上記観察用レンズの観察面と平行な進行方向を有するシート光を生成するための光学ユニットと、を備えており、
上記シート光は、上記下面から上記試料配置部を通過して上記試料へ照射され、上記蛍光は、上記下面へ向けて上記試料配置部を通過して上記観察用レンズにて受光されることを特徴とする顕微鏡。
【請求項２】
前記観察用レンズと前記試料との相対的な位置関係を調整するための焦準機構をさらに備えており、
上記焦準機構は、上記観察用レンズの光軸と平行な方向である第１方向と、前記配置面を規定する第２方向および第３方向とに沿って、上記位置関係を変更することを特徴とする請求項１に記載の顕微鏡。
【請求項３】
前記観察用レンズと前記試料配置部との間に流体を保持するための流体保持器具をさらに備えており、
上記流体保持器具は、上記観察用レンズと連結するための連結部と、前記下面に対向して配置される端面と、シート光を入射するための透過窓と、内部に流体を保持するための流体保持部を有しており、
上記流体保持器具が上記観察用レンズと連結された際に、上記端面は、上記下面と略平行であり、前記シート光は、上記透過窓を通過した後に上記流体保持部を介して上記試料へ照射され、前記蛍光は、上記流体保持部を介して、上記観察用レンズにて受光されることを特徴とする請求項１または２に記載の顕微鏡。
【請求項４】
前記観察用レンズが液浸レンズであり、前記流体保持部に上記液浸レンズに対応した液体が充填されていることを特徴とする請求項３に記載の顕微鏡。
【請求項５】
前記流体保持部に水が充填されており、
前記試料配置部の屈折率が１．２８〜１．３８であることを特徴とする請求項４に記載の顕微鏡。
【請求項６】
前記観察面と前記配置面との間の角度が、１°〜７５°の範囲内であることを特徴とする請求項１〜５の何れか１項に記載の顕微鏡。
【請求項７】
前記光学ユニットは、シート光を生成するための光学素子が配置された平面を有する光学定盤を含んでおり、
上記光学定盤は、上記平面が前記観察面と平行になるように設けられていることを特徴とする請求項１〜６の何れか１項に記載の顕微鏡。
【請求項８】
前記光学素子が、光源と、光収束素子と、光分配素子とを含んでおり、必要に応じてウェッジプリズムをさらに含んでいることを特徴とする請求項７に記載の顕微鏡。
【請求項９】
試料配置部の配置面に配置された試料を観察する際に、上記配置面に対して直交しない光軸を有する観察用レンズと上記試料との相対的な位置関係を調整するための焦準器具であって、
上記観察用レンズの光軸と平行な方向である第１方向に沿って上記観察用レンズと上記試料との相対的な位置関係を変更させる第１ステージと、上記配置面を規定する第２方向および第３方向とに沿って上記観察用レンズと上記試料との相対的な位置関係を変更させる第２ステージと、上記試料配置部を固定するための治具と、を備えており、
上記治具は、第１ステージおよび第２ステージの一方に取り付けられており、
上記治具が取り付けられたステージが、上記治具が取り付けられていないステージに載置されていることを特徴とする焦準器具。
【請求項１０】
観察すべき試料を載せるための配置面および上記配置面に対向する下面を有する試料配置部と、観察用レンズとの間に流体を保持するための流体保持器具であって、
上記観察用レンズと連結するための連結部と、上記下面に対向して配置される端面と、シート光を入射するための透過窓と、内部に流体を保持するための流体保持部を有しており、
上記流体保持器具が上記観察用レンズと連結された際に、上記端面は、上記下面と略平行であり、光学ユニットからのシート光は、上記透過窓を通過した後に上記流体保持部を介して上記試料に照射され、上記試料からの蛍光は、上記流体保持部を介して、上記観察用レンズに受光されることを特徴とする流体保持器具。
【請求項１１】
シート光を生成するための光学素子が配置された平面を有する光学定盤を備えており、
上記光学定盤は、上記平面が観察用レンズの観察面と平行になるように設置されることを特徴とする正立型または倒立型の顕微鏡に用いるための光学ユニット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、顕微鏡、顕微鏡に用いる焦準器具、顕微鏡に用いる流体保持器具、及び顕微鏡に用いる光学ユニットに関する。
【背景技術】
【０００２】
試料の被観察面に対して局所的に光を照射し、試料から放射される蛍光を受光することによって、試料を断層的に観察することができる顕微鏡が知られている。このような顕微鏡は、試料における観察面以外の部分への光の照射を抑制することができるため、試料を観察する際のバックグラウンドを低減させることができるとともに、試料に励起光を照射することによる毒性や退色を低減することができる。
【０００３】
特許文献１、特許文献２、及び非特許文献１には、照明光を、対物レンズを用いて屈折させることによって、対物レンズの光軸に対して斜め方向から試料に照射することができる、光学顕微鏡用の薄層斜光照明法が記載されている。図１８は、特許文献１の薄層斜光照明法を用いた光学顕微鏡の一部の拡大図である。図１８に示すように、試料に対する照明光の入射方向を、対物レンズ光軸に対して垂直に近い角度とすることによって、対物レンズの光軸方向の厚さが薄い、層状の光を試料に対して照射することができる。特許文献１の光学顕微鏡によれば、対物レンズの焦点位置を移動させながら試料の連続画像を撮像することによって、高解像度の３次元画像を得ることができる。特に、特許文献１には、１分子レベルでのイメージングが可能である旨が記載されている。
【０００４】
しかしながら、特許文献１の方法では、対物レンズにおける照明光の入射位置を調整することによって、屈折された照明光と対物レンズ光軸との間の角度θを９０°に近づけることができたとしても、完全に９０°とすることはできない。そのため、照明光の光軸が、対物レンズの観察面と平行にならず、観察面内で程度の異なる焦点ぼけが不均一に発生し、像の均質性が低下する。また、試料における観察面以外の領域にも照明光が照射されるため、バックグラウンドが大きくなり、蛍光を画像化したときの解像度が低下してしまう。特に、３次元画像を得る場合において、対物レンズ光軸と平行な方向の分解能が低くなる。
【０００５】
非特許文献２には、試料に対して薄い層状のシート光を照射し、放射された蛍光を、シート光の光軸に対して垂直な光軸を有する対物レンズを用いて集光し、集光された蛍光をカメラによって画像化する、ＳＰＩＭ（選択的平面照明顕微鏡）が記載されている。非特許文献２のＳＰＩＭ顕微鏡を用いて試料を観察する場合、試料を埋め込んだアガロースゲルを回転させることによって様々な角度から試料にシート光を照射し、カメラによって試料を撮像することができる。図１９は非特許文献２の顕微鏡の試料の設置部を示す概略図である。特許文献３には、光を照明用レンズによって集光し、集光された光を薄い層状のシート光として試料に照射する場合、対物レンズの光軸と平行な方向におけるシート光の厚さは、照明用レンズの開口数に依存することが記載されている。ＳＰＩＭ顕微鏡において、照明用レンズの開口数を大きくすることによってシート光の厚さを薄くし、その結果、バックグラウンドを低下させることができる。
【０００６】
また、特許文献４〜６にも同様に、試料から放射される蛍光を、シート光の光軸に対して垂直な光軸を有する対物レンズを用いて集光することによって、試料の３次元画像を得ることができる顕微鏡が記載されている。
【０００７】
特許文献３〜６、及び非特許文献２に記載される顕微鏡のように、対物レンズの光軸に対して垂直な方向から試料にシート光を照射することによって、バックグラウンドを低減させることができ、その結果、分解能を高めることができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００３−１８５９３０号公報（２００３年７月３日公開）
【特許文献２】特開２００５−３９０９号公報（２００５年１月６日公開）
【特許文献３】特表２００６−５０９２４６号公報（２００６年３月１６日公表）
【特許文献４】特開２０１２−９３７５７号公報（２０１２年５月１７日公開）
【特許文献５】特開２０１２−１０８４９１号公報（２０１２年６月７日公開）
【特許文献６】米国特許公開公報ＵＳ２０１１／０３０４７２３（２０１１年１２月１５日公開）
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】M. Tokunaga et al., Nature Methods, 5, p.159-161, 2008
【非特許文献２】Jan Huisken et al., SCIENCE 2004 VOL305, p.1007-1009, 2004
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
従来のＳＰＩＭ顕微鏡では、図１９に示す非特許文献２のＳＰＩＭ顕微鏡のように、アガロースゲルに埋め込まれた試料（例えば培養細胞）を観察している。このため、例えばシャーレ培養した培養液中の細胞等の試料を、そのままの状態で観察することは難しく、計測の用途が限定される。さらに、ゲルに埋め込まれた培養細胞の挙動は培地の中での挙動と異なることがあるため、継続的に生細胞の観察を行う用途には向いていない。また、試料を決められた寸法のゲルに埋め込むことが必要であるため、試料の大きさが制限されるという問題がある。
【００１１】
そこで本発明者らは、試料をゲルに埋め込むことなく、一般的な顕微鏡観察で用いられる生物試料と同様に、平らなカバースリップに載せた試料をＳＰＩＭ顕微鏡の構成を用いて観察することを検討した。この場合、蛍光がカバースリップを透過する際に発生する収差によって蛍光像が影響を受けるのを回避するために、カバースリップ表面に対して、観察用対物レンズを垂直に配置する構成が考えられる。
【００１２】
しかしながら、シート光は、対物レンズ光軸と平行な方向に広がりを有するため、カバースリップ近傍の領域に光照射する場合は、一部の光がカバースリップの表裏及び端面を通過することになり、各々の光は屈折や反射等によって互いに異なる光路を辿るため、シート照明の品質が低下する。その結果、試料に照射されるシート光はより厚くなり、ＳＰＩＭ顕微鏡の利点を十分に生かすことができなくなる。
【００１３】
本発明は上記の課題に鑑みなされたものであって、その目的は、ＳＰＩＭ顕微鏡の利点を生かしつつ、試料の大きさの制約を受けることなく試料を観察することができ、培養液中の細胞やカバースリップ上の試料を高分解能で観察することができる顕微鏡、および当該顕微鏡を構成する部材を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
上記の課題を解決するために、本発明の顕微鏡は、試料を配置するための配置面および上記配置面に対向する下面を有する試料配置部と、上記試料からの蛍光を受光するための観察用レンズと、上記観察用レンズの観察面と平行な進行方向を有するシート光を生成するための光学ユニットと、を備えており、上記シート光は、上記下面から上記試料配置部を通過して上記試料へ照射され、上記蛍光は、上記下面へ向けて上記試料配置部を通過して上記観察用レンズにて受光されることを特徴としている。
【００１５】
上記の構成によれば、試料配置部に配置した試料をゲルに埋め込むことなくＳＰＩＭ顕微鏡の利点を生かした状態にて観察することができる。また、観察用レンズを試料配置部に関して試料とは反対側に配置するため、試料配置部に配置する試料の大きさが観察用レンズの作動距離の範囲内に限定されない。
【００１６】
試料配置部表面と垂直な軸に対物レンズを配置した状態でＳＰＩＭを行おうとすると、シート光が試料配置部に干渉し、シート照明の品質が低下する。これに対して、本発明の顕微鏡では、全ての光を試料配置部の下面から観察面に入射させることができるため、その結果、試料配置部近傍の試料を観察する場合であってもシート光の厚さを首尾よく制御することができる。
【００１７】
前記観察用レンズと前記試料との相対的な位置関係を調整するための焦準機構をさらに備えていてもよく、上記焦準機構は、上記観察用レンズの光軸と平行な方向である第１方向と、前記配置面を規定する第２方向および第３方向とに沿って、上記位置関係を変更することができる構成であることが好ましい。
【００１８】
上記の構成によれば、観察用レンズと試料配置部との相対的な位置関係を第２方向および第３方向に沿って調整することによって、試料配置部と観察用レンズとの間の距離を変化させることなく、観察する視野を変更することができる。さらに、観察する視野を変化させる際の、試料配置部と観察用レンズとの不要な接触を防止することができる。一方、観察用レンズと試料配置部との相対的な位置関係を第１方向に沿って調整することによって、観察する視野を変化させることなく、焦準することができる。そのため、第１方向に対して垂直な複数の観察面において試料を断層的に撮像することが可能になり、試料の高解像度な３次元画像を得ることができる。
【００１９】
前記観察用レンズと前記試料配置部との間に流体を保持するための流体保持器具をさらに備えており、上記流体保持器具は、上記観察用レンズと連結するための連結部と、前記下面に対向して配置される端面と、シート光を入射するための透過窓と、内部に流体を保持するための流体保持部を有しており、上記流体保持器具が上記観察用レンズと連結された際に、上記端面は、上記下面と略平行であり、前記シート光は、上記透過窓を通過した後に上記流体保持部を介して上記試料へ照射され、前記蛍光は、上記流体保持部を介して、上記観察用レンズにて受光される構成であることが好ましい。
【００２０】
より高分解能、高感度の計測を行うためには、前記観察用レンズが液浸レンズであり、前記流体保持部に上記液浸レンズに対応した液体が充填されている構成であることが好ましい。
【００２１】
観察用レンズに液浸レンズを用いる場合、試料配置部の下面とレンズとの間に、液浸レンズに対応した液体を配置しなければならない。本発明の顕微鏡の構成では、試料配置部の下面は観察用レンズの光軸と垂直でない。このため、観察用レンズと試料配置部との相対的な位置関係を変更する際に、液浸レンズに対応した液体を、移動（変形）させることなく下面とレンズとの間で保持することは容易でない。しかしながら、上記の構成によれば、流体保持器具を用いることによって観察レンズと試料配置部の間に液体をその表面形状を維持した状態で保持することができる。
【００２２】
前記流体保持部に水が充填されており、前記試料配置部の屈折率が１．２８〜１．３８であることが好ましい。
【００２３】
上記の顕微鏡においては、観察用レンズの光軸と配置面とは直交していない。この場合、流体保持部に充填された液体の屈折率と試料配置部の屈折率との差に応じて、左右非対称な収差が発生する。しかしながら、流体保持部に水を充填し、試料配置部の屈折率を水の屈折率と同程度の１．２８〜１．３８とした場合、収差を著しく低減させることができ、安定した結像を得ることができる。
【００２４】
前記観察面と前記配置面との間の角度が、１°〜７５°の範囲内であることが好ましい。
【００２５】
シート光の進行方向と平行な観察面と、配置面との間の角度は、十分な薄さのシート光を形成するのに必要な角度であることが必要である。このため、計測の用途に応じて、照明用観察面と配置面との間の角度を、１°〜７５°の範囲で調整することが好ましい。
【００２６】
前記光学ユニットは、シート光を生成するための光学素子が配置された平面を有する光学定盤を含んでおり、上記光学定盤は、上記平面が前記観察面と平行になるように設けられていることが好ましい。
【００２７】
上記の構成によれば、光学定盤の上記平面に光学素子を配置することによって、観察面と平行な進行方向を有するシート光を生成することができる。
【００２８】
前記光学素子が、光源と、光収束素子と、光分配素子とを含んでいることが好ましく、必要に応じてウェッジプリズムをさらに含んでいてもよい。
【００２９】
上記の課題を解決するために、本発明の焦準器具は、試料配置部の配置面に配置された試料を観察する際に、上記配置面に対して直交しない光軸を有する観察用レンズと上記試料との相対的な位置関係を調整するための焦準器具であって、上記観察用レンズの光軸と平行な方向である第１方向に沿って上記観察用レンズと上記試料との相対的な位置関係を変更させる第１ステージと、上記配置面を規定する第２方向および第３方向とに沿って上記観察用レンズと上記試料との相対的な位置関係を変更させる第２ステージと、上記試料配置部を固定するための治具と、を備えており、上記治具は、第１ステージおよび第２ステージの一方に取り付けられており、上記治具が取り付けられたステージが、上記治具が取り付けられていないステージに載置されていることを特徴としている。
【００３０】
上記の課題を解決するために、本発明の流体保持器具は、観察すべき試料を載せるための配置面および上記配置面に対向する下面を有する試料配置部と、観察用レンズとの間に流体を保持するための流体保持器具であって、上記観察用レンズと連結するための連結部と、上記下面に対向して配置される端面と、光学ユニットからのシート光を入射するための透過窓と、内部に流体を保持するための流体保持部を有しており、上記流体保持器具が上記観察用レンズと連結された際に、上記端面は、上記下面と略平行であり、シート光は、上記透過窓を通過した後に上記流体保持部を介して上記試料に照射され、上記試料からの蛍光は、上記流体保持部を介して、上記観察用レンズに受光されることを特徴としている。
【００３１】
上記の課題を解決するために、本発明の光学ユニットは、シート光を生成するための光学素子が配置された平面を有する光学定盤を備えており、上記光学定盤は、上記平面が観察用レンズの観察面と平行になるように設置されることを特徴としている。
【発明の効果】
【００３２】
本発明の一態様によれば、試料配置部に配置した試料をゲルに埋め込むことなくＳＰＩＭ顕微鏡の利点を生かした状態にて観察することができる。また、試料配置部に配置する試料の大きさが観察用レンズの作動距離の範囲内に限定されない。これにより、一般的な生物顕微鏡と同様に、透明な平面基板（試料配置部）の上に載せた試料を観察することができ、例えば、マウス個体のような比較的大きな生物試料を観察することができる。
【００３３】
さらに、試料配置部の配置面の近傍において照明領域を形成する場合であっても、シート光の品質の低下を抑えることができる。そのため、例えば試料配置部に固着した試料を観察する場合であっても、ＳＰＩＭ顕微鏡の利点を生かした状態にて観察することができる。例えば、シャーレの中で培養した固着性の培養細胞をそのまま観察することも可能である。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】本発明の一実施形態に係る顕微鏡の要部構成を示す概略図である。
【図２】本発明の一実施形態に係る顕微鏡の要部構成を示す概略図である。
【図３】本発明の一実施形態に係る顕微鏡の全体構成および光路を示す概略図である。
【図４】本発明の一実施形態に係る顕微鏡におけるシート光の形状を示す図である。
【図５】本発明の一実施形態に係る顕微鏡を用いて得られた試料の画像およびその蛍光強度分布を示す図である。
【図６】比較例の顕微鏡の構成を示す概略図である。
【図７】本発明の一実施形態に係る顕微鏡の構成を示す概略図である。
【図８】本発明の一実施形態に係る顕微鏡における、観察用レンズと試料配置部との位置関係を変更したときの像の変化を示す図である。
【図９】本発明の一実施形態に係る顕微鏡の要部構成を示す概略図である。
【図１０】本発明の一実施形態に係る顕微鏡の要部構成を示す概略図である。
【図１１】本発明の一実施形態に係る顕微鏡における収差補正を示す図である。
【図１２】光学ユニットにおける光線の光路および輝度分布を示す図である。
【図１３】本発明の変形例に係る顕微鏡の全体構成および光路を示す概略図である。
【図１４】光学ユニットにおいて光線を曲げるための構成を示す図である。
【図１５】光学ユニットにおいてウェッジプリズムを用いて光線を曲げたときの各波長の光線の光路を示す図である。
【図１６】本発明の顕微鏡を用いた実施例を示す図である。
【図１７】本発明の顕微鏡を用いた実施例を示す図である。
【図１８】従来の薄層斜光照明法を用いた光学顕微鏡の要部構成を示す概略図である。
【図１９】従来のＳＰＩＭ顕微鏡の要部構成を示す概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
〔実施形態１〕
以下、本発明の実施の形態について、図１〜５に基づいて詳細に説明する。
【００３６】
図１は、本実施形態の顕微鏡１の要部構成および光路を示す概略図である。図１に示すように、本実施形態の顕微鏡１は、試料を配置するための試料配置部１０と、試料に対して光を照射するための光学ユニット２０と、試料から放射される光を受光するための観察用レンズ３１とを備えている。図１においては、光学ユニット２０の一部材としての照明用レンズ２６を光学ユニット２０からの光の出射口に設けた構成を図示している。
【００３７】
試料配置部１０は、試料１２を配置するための配置面１１と、配置面１１に対向する下面１３とを有している。図１に示すように、本実施形態の顕微鏡は倒立顕微鏡に適用可能な構成を有しており、照明用レンズ２６および観察用レンズ３１は、試料配置部１０に関して（配置面１１を含む面に関して）試料１２と反対側に設けられている。試料配置部１０は、その全体または一部が光透過性材料から構成されており、単一のカバースリップであっても、培養プレート（マルチウエルプレート、マイクロ流体デバイスを含む。）の底面の全体または一部であってもよい。光学ユニット２０は、試料配置部１０の下面１３を介して、シート光を試料１２に照射する。光学ユニット２０から出射されたシート光は、下面１３において試料配置部１０に入射し、配置面１１において試料配置部１０から出射し、試料１２に照射される。観察用レンズ３１は、試料配置部１０の下面１３を介して、試料１２から放射される蛍光を受光する。試料１２から放射された蛍光は、配置面１１において試料配置部１０に入射し、下面１３において試料配置部１０から出射し、観察用レンズ３１に受光される。さらに、照明用レンズ２６および観察用レンズ３１は、照明用レンズ２６の光軸と観察用レンズ３１の光軸とが同一平面（図中ＸＺ平面）上にて互いに直交するように設けられている。これにより、光学ユニット２０は、観察用レンズ３１の観察面と平行な進行方向を有するシート光を試料に照射することができる。また、観察用レンズ３１の光軸方向（図中Ｚ’方向）は、配置面１１の鉛直方向（図中Ｚ方向）に対して傾斜している。図１において、Ｚ方向とＺ’方向との間の角度は１５°である態様を示しており、図１のＸＺ平面において、照明用レンズ２６の光軸方向は、配置面１１（図中ＸＹ平面）に対して角度φ＝１５°傾斜している。すなわち、照明用レンズ２６の光軸は、図中ＹＺ’平面に対して垂直である。
【００３８】
なお、Ｚ方向とＺ’方向との間の角度φは１５°に限定されない。Ｚ方向とＺ’方向との間の角度を１５°よりも大きくする場合、照明用レンズ２６の開口数を大きくすることによってより薄いシート光を生成することができるが、シート光の集光深度は短くなる。また、上記角度を１５°よりも小さくする場合、上記収差の発生を軽減し、かつ対物レンズの作動距離を有効に使って試料のより深部の観察を行うことができる。一方、使用できる対物レンズの開口数は小さくなるため、シート光の集光深度は長くなるのに対して、シート光の厚みはより大きくなる。このため、計測の用途に応じて、照明用レンズの光軸と配置面との間の角度を、１°〜７５°の範囲で調整することが好ましい。特に、低倍率対物（〜×２０）で観察する場合には、上記角度は１°〜１０°であることが好ましく、高倍率対物（×４０〜）で視野全体に渡って観察する場合には、上記角度は５°〜２０°であることが好ましく、高倍率対物（×４０〜）で低バックグラウンドの観察をする場合には、上記角度は３５°〜５０°であることが好ましい。
【００３９】
本実施形態の顕微鏡１は、シート光の光軸が、配置面１１に対して傾いている。そのため、試料配置部１０の上に載った他の試料１２にシート光の照射による影響を与えることなく観察できる。このため、マルチウェルディッシュやマイクロ流体デバイスを用いた計測にも向いている。
【００４０】
観察用レンズ３１の光軸を含むＹＺ’平面における試料１２と試料配置部１０との断面、およびシート光によって生成される照明領域を、図２に模式的に示す。なお、図２に示したＹ方向およびＺ’方向は図１に示したものと同じである。
【００４１】
上述したように、照明用レンズ２６はシート光を出射する。シート光はその光路上に薄層の照明領域を生成する。図２に示すように、照明用レンズの光軸に垂直な平面（図中ＹＺ’平面）における照明領域の厚さをＤ、幅をＷとした場合、ＹＺ’平面における照明領域の厚さ方向は図中Ｚ’方向である。すなわち、観察用レンズ３１は、その光軸が、照明領域の厚さ方向（図中Ｚ’方向）と平行になるように設けられている。試料１２にシート光を照射することによって、試料１２における照明領域に存在する蛍光物質が励起されて蛍光を放射する。観察用レンズ３１の焦点面（観察面）が照明領域に含まれるように、観察用レンズ３１（および、必要に応じて照明用レンズ２６）の位置を調整し、試料１２から放射される蛍光を、観察用レンズ３１を用いて受光する。
【００４２】
本実施形態の顕微鏡１は、試料配置部１０に配置した試料１２に対して、（１）微弱な光を照射して観察することができるため、試料に対する毒性や退色を低減することができる；（２）高速で３次元画像を得ることができる；（３）高分解能の観察を行うことができる、等のＳＰＩＭ顕微鏡の利点を生かした状態での観察を、試料をゲルに埋め込むことなく実現することができる。また、本実施形態の顕微鏡１において、観察用レンズ３１が、配置面１１を含む平面に関して試料１２と反対側に配置されている。そのため、試料１２の上方が開放され、試料配置部１０に配置する試料１２の大きさが観察用レンズ３１の作動距離の範囲内に限定されることがない。また、上述したように、照明用レンズ２６は、配置面１１を含む面に関して試料１２と反対側に設けられており、シート光は下面１３を介して試料１２に照射される。そのため、全てのシート光を、試料配置部１０の下面から観察面に入射させることができるため、開口数の大きな照明用レンズ２６を用いた場合であってもシート光の厚さを首尾よく制御することができる。
【００４３】
図３は、本実施形態の顕微鏡１の全体構成および光路を示す概略図である。図３に示すように、顕微鏡１は、光学ユニット２０と、観察用レンズ３１を有する観察部３０とを備えている。光学ユニット２０によって生成されたシート光が試料１２に照射され、観察部３０が、観察用レンズ３１にて試料１２からの蛍光を受光し、画像化する。本実施形態の顕微鏡１の全体構成に用いられるに好ましい光学ユニットおよび観察部の構成、ならびにこれらを用いた場合のシート光の特性を以下に説明する。
【００４４】
＜光学ユニット＞
光学ユニット２０は、可視光光源部２１と、可視光調整部２２と、ＩＲ光光源部２３と、ＩＲ光調整部２４と、ダイクロイックミラー（ＤＭ）２５と、照明用レンズ２６（照明用対物レンズ）とを備えている。
【００４５】
可視光光源部２１は、５９２ｎｍレーザー光源２１１と、５６０ｎｍレーザー光源２１２と、５１４ｎｍレーザー光源２１３と、４５０ｎｍレーザー光源２１４と、４０５ｎｍレーザー光源２１５と、ミラー２１６〜２１９と、ＤＭ１Ａ〜４Ａとを備えている。可視光光源部２１は、上記各レーザー光源２１１〜２１５から出射された各波長のレーザー光線を、ミラー２１６〜２１９または各波長の光を反射するＤＭ１Ａ〜４Ａの反射面において反射することによって、各波長のレーザー光線の光路を整列する。可視光光源部２１は、合成されたレーザー光線を、シャッター２２０およびミラー２２１を介して、可視光調整部２２へ向けて出射する。
【００４６】
可視光調整部２２は、フィルタホイル２２２と、一次元走査ミラー２２３と、レンズ２２４と、絞り２２５と、ミラー２２６と、レンズ２２７とを備えている。可視光調整部２２は、可視光光源部２１からのレーザー光線を、フィルタホイル２２２を介して一次元走査ミラー２２３に入射する。一次元走査ミラー２２３は、反射面の向きを一次元に走査するミラーであり、例えば、ＭＥＭＳミラー、ピエゾミラー、ガルバノミラーなどを用いることができる。一次元走査ミラー２２３の反射面が正弦関数に基づいて一次元において変化することによって、一次元走査ミラー２２３の反射光は、一定の幅の光路を有する光線となる。可視光調整部２２は、一次元走査ミラー２２３の反射面において反射した光線を、レンズ２２４を用いて集束し、絞り２２５を通し、ミラー２２６の反射面において反射し、レンズ２２７を用いて幅を有する平行光にした後に、ＤＭ２５へ向けて出射する。なお、多数のレーザー光源を用いる場合には、レンズ２２４およびレンズ２２７として、アクロマート（色消し）レンズを用いることが好ましい。また、シート光の幅を調節するには一次元走査ミラー２２３の代わりに、シリンドリカルレンズや音響光学偏向器、回折格子等を用いてもよい。すなわち、本発明に用いられる光学ユニット２０は、一次元走査ミラー、リンドリカルレンズ、音響光学偏向器、回折格子等を光分配素子として備えている。
【００４７】
ＩＲ光光源部２３は、ＩＲレーザー光源部２３１と、ミラー２３２とを備えている。ＩＲ光光源部２３は、ＩＲレーザー光源部２３１から出射されたＩＲレーザー光線を、ミラー２３２の反射面において反射した後に、ＩＲ光調整部２４へ向けて出射する。
【００４８】
ＩＲ光調整部２４は、一次元走査ミラー２４１と、ＩＲレンズ２４２と、ミラー２４３と、ＩＲレンズ２４４と、ミラー２４５とを備えている。ＩＲ光調整部２４は、ＩＲ光光源部２３からのＩＲレーザー光線を、一次元走査ミラー２４１の反射面において反射することによって、一定の幅の光路を有するＩＲ光線とする。ＩＲ光調整部２４は、一次元走査ミラー２４１の反射面において反射したＩＲ光線を、ＩＲレンズ２４２を用いて集束し、ミラー２４３の反射面において反射し、ＩＲレンズ２４４を用いて幅を有する平行光にした後に、ミラー２４５の反射面において反射した後に、ＤＭ２５へ向けて出射する。本実施形態の顕微鏡１は、試料を多光子励起することによって蛍光を放射させることもできる。この場合、ＩＲレンズ２４２と２４４としてもアクロマート（色消し）レンズを用いることが好ましい。多光子励起を行う場合にはＩＲの波長域の光源と色収差補正が必要となるため、可視光光源部２１および可視光調整部２２とは独立して、ＩＲ光光源部２３およびＩＲ光調整部２４を設計する必要がある。
【００４９】
ＤＭ２５は、可視光線を反射し、ＩＲ光線を透過するダイクロイックミラーである。ＤＭ２５は、一方の面から、ＩＲ光調整部２４からのＩＲ光線を透過し、かつ、他方の面において可視光調整部２２からの可視光線を反射することによって、ＩＲ光線の光路と可視光線の光路とを整列し、照明用レンズ２６へ向けて出射する。
【００５０】
照明用レンズ２６は、ＩＲ光線および可視光線を集束させたシート光を試料１２に向けて出射する。
【００５１】
また、光学ユニット２０を構成する光源、レンズ、ミラーなどの光学素子は、光学定盤の平面上に配置されていてもよい。この場合、光学定盤は、光学素子が配置された上記平面が観察面と平行になるように設置される。これにより、観察面と平行な進行方向を有するシート光を生成することができ、光学素子の配置を調整する工程を簡素化することができる。本実施形態の光学ユニット２０は、本発明を実行するために、一般的な正立型または倒立型の顕微鏡に取り付けられてもよい。
【００５２】
なお、本実施形態では、光学ユニット２０からの光の出射口に照明用レンズ２６を設けた構成を例に挙げて説明しているが、光学ユニット２０は照明用レンズ２６を用いることなく構成されてもよい。照明用レンズ２６を用いない場合には、図３中のレンズ２２７およびＩＲレンズ２４４の配置を調整することによって、光学ユニット２０から出射されるシート光の厚さを調整することができる。また、レンズの代わりに、レンズと同様に光を収束させる光学素子（光収束素子）として、円錐プリズムや回折格子を用いてシート光を生成しても良い。
【００５３】
＜観察部＞
観察部３０は、観察用レンズ３１（観察用対物レンズ）と、蛍光ミラーキューブ３２と、ミラー３３と、結像レンズ３４と、ＣＣＤカメラ３５とを備えている。観察用レンズ３１は、試料１２から放射される光を屈折し、蛍光ミラーキューブ（蛍光フィルタ）３２へ向けて出射する。蛍光ミラーキューブ３２は、観察用レンズ３１からの光のうち、試料１２の蛍光のみを透過する。観察部３０は、蛍光ミラーキューブ３２からの蛍光を、結像レンズ３４を用いて集光した後に、ミラー３３の反射面において反射し、ＣＣＤカメラ３５に入射する。これにより、観察部３０は、試料１２から放射される蛍光を画像化する。
【００５４】
＜シート光の特性＞
本実施形態の顕微鏡１におけるシート光について、以下に説明する。試料１２における観察面以外の部分から放射される蛍光は、観察用レンズ３１の観察面におけるバックグラウンドとなる。バックグラウンドを低減するために、照明領域の厚さは薄いことが好ましい。本実施形態の顕微鏡１において、照明領域の厚さＤは、３μｍ以下である。
【００５５】
図４は、本実施形態の顕微鏡におけるシート光の形状を示す図であり、図４の（ａ）は一次元走査ミラーの走査をオフにしたときのシート光の光路概略図（Ａ１）および観察部にて画像化した蛍光像（Ａ２）であり、図４の（ｂ）は一次元走査ミラーの走査をオンにしたときのシート光の光路概略図（Ｂ１）および観察部にて画像化した蛍光像（Ｂ２）である。なお、図４中のＸ’方向は、照明用レンズの光軸方向であり、Ｙ方向は、図１〜３中のＹ方向と同じである。図４の蛍光像は、蛍光分子（ローダミン）の水溶液を試料配置部とスライドガラスではさんだものに対して、レーザー光（５９２ｎｍ）を照射し、試料から放射される蛍光を、ＣＣＤカメラ３５を用いて撮像することによって得られた蛍光像である。なお、一次元走査ミラー２３３の走査幅に応じて、シート光の照明領域の幅Ｗをコントロールすることができる。図４は、一次元走査ミラー２３３を一次元に走査することによって、シート光の照明領域のＹ方向の幅Ｗを１００μｍにした際の蛍光像を表している。加えて、絞り２２５の開閉を調節することによってもシート光の照明領域の幅Ｗをコントロールできる。さらに照明用レンズに開口絞りを取り付けてもよく、開口絞りをコントロールすることによって、シート光の照明領域の厚みＤおよび集光深度を調節することが可能である。開口絞りを閉口していくにつれて、シートの厚みＤが分厚くなり、集光深度が長くなる。
【００５６】
図５は、本実施形態の顕微鏡におけるシート光の特性を説明するための図である。図５中のＸ’方向は図４中のＸ’方向と同じであり、Ｚ’方向は、図１〜３中のＺ’方向と同じである。図５の（ａ）はシート光に対して試料配置部を走査することによって得られた試料のＸ’Ｙ平面における画像であり、図５の（ｂ）は試料のＸ’Ｚ’平面における画像である。図５の（ａ）および（ｂ）は、１重量％アガロースゲルに固定した微小蛍光ビーズ（Ｄ＝０．０４μｍ）に対して、試料配置部をＺ’方向に１μｍずつ走査し、試料から放射される蛍光を、ＣＣＤカメラ３５を用いて撮像することによって得られた蛍光像である。
【００５７】
図５の（ｃ）は画像のＸ’方向における蛍光強度分布を示すグラフであり、図５の（ｄ）は画像のＺ’方向における蛍光強度分布を示すグラフである。図５の（ｃ）および（ｄ）の蛍光強度分布の解析によれば、Ｘ方向の蛍光強度の半値幅は０．８７μｍであり、Ｚ方向の蛍光強度の半値幅は２．６μｍである。すなわち、上記の解析結果によれば、顕微鏡１における照明領域のＺ方向の幅は２．６μｍである。
【００５８】
〔比較例〕
図６は、比較例の顕微鏡の構成を示す概略図であり、図６の（ａ）は、第１比較例の顕微鏡の構成を示し、図６の（ｂ）は、第２比較例の顕微鏡の構成を示し、図６の（ｃ）は、第３比較例の顕微鏡の構成を示す。
【００５９】
図６の（ａ）に示す第１比較例の顕微鏡において、観察用レンズ３１’は、その光軸が、照明用レンズ２６’の光軸と直交しておらず、また、照明用レンズ２６’の光軸に垂直な平面における照明領域の厚さ方向と平行でない。そのため、観察面内で程度の異なる焦点ぼけが不均一に発生し、像の均質性が低下する。また、試料における観察面以外の部分にもシート光が照射されるため、バックグラウンドが大きくなる。
【００６０】
図６の（ｂ）に示す第２比較例の顕微鏡において、観察用レンズ３１’は、その光軸が、照明用レンズ２６’の光軸と直交し、かつ、照明用レンズ２６’の光軸に垂直な平面における照明領域の厚さ方向と平行である。しかしながら、照明用レンズ２６’は、配置面を含む面に関して試料と同じ側に設けられている。
【００６１】
図６の（ｃ）に示す第３比較例の顕微鏡において、観察用レンズ３１’は、その光軸が、照明用レンズ２６’の光軸と直交し、かつ、照明用レンズ２６’の光軸に垂直な平面における照明領域の厚さ方向と平行である。しかしながら、照明用レンズ２６’および観察用レンズ３１’は、配置面を含む面に関して試料と同じ側に設けられている。
【００６２】
第２比較例の顕微鏡および第３比較例の顕微鏡においてはともに、照明用レンズが、配置面を含む面に関して試料と同じ側に設けられている。照明用レンズの開口数を大きくすることによってシート光の光路がＺ方向に沿って広がるため、第２比較例の顕微鏡および第３比較例の顕微鏡において、シート光の一部が観察面を照明する前に試料配置部によって分離される。その結果、得られるシート光が厚くなり、試料における観察面以外の領域にも照明光が照射されるため、バックグラウンドが大きくなる。特に、配置面の近傍にて試料を観察する場合、試料における照明領域を配置面に近づけるために、照明用レンズの光軸を、配置面を含む面に近づける必要がある。照明用レンズの光軸を配置面に近づけた場合、シート光が観察面を照明する前に配置面によって分離され易くなる。以上のように、第２比較例および第３比較例の顕微鏡においては、照明用レンズの開口数を高めることによって高分解能の観察をすることができない。特に、配置面近傍にて試料を高分解能で観察することができない。
【００６３】
〔さらなる実施形態〕
本発明の他の実施形態について、図７〜１０に基づいて説明すれば、以下のとおりである。なお、説明の便宜上、実施形態１にて説明した部材と同じ機能を有する部材については、同じ符号を付記し、その説明を省略する。
【００６４】
＜焦準機構＞
図７は、本実施形態の顕微鏡１００の構成を示す概略図である。図７に示すように、顕微鏡１００は、除振台１０１と、除振台１０１に載せられた筐体１０２と、試料１２を上方から照明するためのコンデンサ１０３とを有している。
【００６５】
また、顕微鏡１００は、試料配置部１０と観察用レンズ３１との相対的な位置関係を調整するための焦準機構として、第１ステージ１１０および第２ステージ１２０を有している。第１ステージ１１０は、第２ステージ１２０に載置されている。また、第１ステージ１１０は、試料配置部１０を固定するための治具を有しており、試料配置部１０は、治具によって第１ステージ１１０に固定されている。
【００６６】
第１ステージ１１０は、観察用レンズ３１の光軸方向である第１方向（図中Ｚ’方向）に沿って、観察用レンズ３１に対する試料配置部１０の位置を変更することができる。また、第２ステージ１２０は、試料配置部１０の配置面を規定する第２方向および第３方向（図中Ｘ方向およびＹ方向）に沿って、観察用レンズ３１に対する試料配置部１０の位置を変更することができる。
【００６７】
このように、顕微鏡１００は、第１〜第３方向のそれぞれに沿って観察用レンズ３１と試料配置部１０との相対的な位置関係を調整することができる。なお、試料配置部１０の位置を固定し、観察用レンズ３１および照明用レンズ２６を第１ステージ１１０および第２ステージ１２０に載せ、観察用レンズ３１および照明用レンズ２６の位置を変更することによって、観察用レンズ３１と試料配置部１０との相対的な位置関係を調整してもよい。
【００６８】
図７において、治具が取り付けられた第１ステージが第２ステージに載置されている態様を示したが、治具が第２ステージに取り付けられた態様であっても、その第２ステージが第１ステージに載置されていれば、本発明に好適な焦準機構として機能し得る。
【００６９】
図８は、観察用レンズと試料配置部との位置関係を変更したときの、同一視野内での像の位置の変化を示す図であり、図８の（ａ）は、配置面に垂直な方向（図７中Ｚ方向）に沿って観察用レンズに対する試料配置部の位置を変更したときの、同一視野内での像の位置の変化を示し、図８の（ｂ）は、本実施形態の顕微鏡において、観察用レンズの光軸方向（図７中Ｚ’方向）に沿って観察用レンズに対する試料配置部の位置を変更したときの、同一視野内での像の位置の変化を示す。
【００７０】
図８の（ａ）に示すように、配置面に垂直な方向に沿って試料配置部の位置を変更した場合、観察用レンズの視野内にて像の位置が変化してしまう。これに対して、顕微鏡１００は、上記焦準機構を備えていることにより、図８の（ｂ）に示すように、観察用レンズ３１の光軸方向である第１方向に沿って試料配置部の位置を変更することによって、観察する視野内にて像の位置を変化させることなく、焦準することができる。これにより、同一視野内での像の位置を固定した状態で試料を連続的に３次元で撮像することができる。
【００７１】
また、顕微鏡１００は、上記焦準機構を備えていることにより、観察用レンズ３１と試料配置部１０との相対的な位置関係を第２方向および第３方向に沿って調整することによって、試料配置部１０と観察用レンズ３１との間の距離を変化させることなく、観察する視野を変更することができる。そのため、観察する視野を変化させる際の、試料配置部１０と観察用レンズ３１との不要な接触を防止することができる。
【００７２】
なお、顕微鏡１００の一部を構成する上記焦準機構は、独立した焦準器具として、従来公知の顕微鏡に適用されてもよい。
【００７３】
＜流体保持器具＞
図９は、顕微鏡１００の要部構成を示す概略図であり、図９の（ａ）は観察用レンズに流体保持器具を連結したときの試料配置部および観察用レンズの概略図であり、図９の（ｂ）は試料配置部を観察用レンズから遠ざけたときの試料配置部および観察用レンズの概略図であり、図９の（ｃ）は試料を観察用レンズに近づけたときの試料配置部および観察用レンズの概略図である。
【００７４】
図９の（ａ）に示すように、顕微鏡１００においては、観察用レンズ３１と試料配置部１０との間に、流体保持器具４０が設けられている。図１０に流体保持器具の概略図を示す。図１０の（ａ）は斜視図であり、図１０の（ｂ）は、観察用レンズに連結したときの、観察用レンズの光軸方向の上面図であり、図１０の（ｃ）は、観察用レンズを介して顕微鏡１００に連結したときの、照明用レンズの光軸と観察用レンズの光軸によって規定される平面での断面図である。
【００７５】
図１０に示すように、流体保持器具４０の形状は、連結すべき観察用レンズ３１の形状に合わせた略円筒形状であり、その内部は中空構造である。流体保持器具４０は、観察用レンズ３１に連結するための連結部４１と、試料配置部１０を載せるために、試料配置部１０の下面１３に対向して配置される端面４２と、光を透過させることができる透過窓４３とを有しており、観察用レンズ３１に連結された状態において、中空部分は、内部に流体を保持するための流体保持部４４を形成する。
【００７６】
図９は、流体保持部４４に水４５を充填し、観察用レンズ３１として水浸レンズを用いている態様を示している。なお、流体保持部４４には、用いられるレンズに対応した流体を充填することができ、例えば、観察用レンズ３１として油浸レンズを用いる場合は、流体保持部４４に光学オイルを充填すればよく、観察用レンズ３１としてドライレンズを用いる場合は、流体保持器具４０を用いても用いなくてもよい。
【００７７】
顕微鏡１００において端面４２が下面１３に対向するように、流体保持器具４０と試料配置部１０とを配置した際に、流体保持器具４０は、下面１３とともに流体保持部４４に流体を保持することができる。このとき、端面４２が試料配置部１０の下面１３と略平行になる。なお、図９に示すように、流体保持部４４に充填された水４５の表面張力によって、水４５の一部が端面４２と下面１３との間に保持される。
【００７８】
また、顕微鏡１００において流体保持器具４０を観察用レンズ３１と連結した際に、流体保持器具４０の外部に配置されている照明用レンズ２６からのシート光を、透過窓４３と流体保持部４４とを介して試料１２に照射させることができる。すなわち、流体保持器具４０には、透過窓４３を通過した照明用レンズ２６からのシート光を試料１２に照射するように、透過窓４３から端面４２にわたって中空である流体保持部４４が設けられている。また、流体保持器具４０には、試料１２からの蛍光を観察用レンズ３１が受光するように、観察用レンズ３１と連結した際の端面４２から連結部４１にわたって中空である流体保持部４４が設けられている。このように、顕微鏡１００は、上記流体保持器具を備えていることにより、シート光が通過する経路と、蛍光が通過する経路とを確保しつつ、観察用レンズ３１と試料配置部１０との間に液体や気体などの流体を保持することができる。さらに、流体保持部４４に液体を充填することによって、試料１２を動かしたとき等の液体の表面形状の変化を生じることがなく、液体の表面は、流体保持部の形状に応じて安定した形状を維持することができる。このように、顕微鏡１００において観察用レンズ３１に液浸レンズを用いた場合、顕微鏡１００は、上記流体保持器具を備えていることにより、表面形状が安定した液体を介してシート光を試料１２に照射することができるため、所望の領域に照明領域を生成することができる。
【００７９】
なお、顕微鏡１００の一部を構成する上記流体保持器具は、独立した流体保持器具として、従来公知の顕微鏡に適用されてもよい。
【００８０】
＜試料配置部＞
図１１は、顕微鏡１００の要部構成を示す概略図であり、試料からの蛍光の光路、試料配置部と観察用レンズの光軸との間の角度、および観察部にて画像化された像を示す図である。
【００８１】
観察用レンズに液浸レンズを用いた場合、試料配置部と観察用レンズとの間の空間は所望の液体で充たされている。このとき、試料配置部の屈折率と上記液体の屈折率とが異なることにより、試料からの蛍光の光路は、屈折によって変更される。そのため、試料配置部の観察面が観察用レンズの光軸と垂直であったとしても、観察用レンズの開口数に応じて収差が生じ、結像が安定しない（図１１の（ａ））。このような収差は、観察用レンズの補正環によって取り除くことができる。しかし、試料配置部の観察面が観察用レンズの光軸と垂直でない（試料配置部を観察用レンズの光軸に垂直な面から傾斜させる）場合は、収差が左右非対称に発生するため、収差を取り除くのは極めて困難である（図１１の（ｂ））。
【００８２】
顕微鏡１００は、観察用レンズに水浸レンズを用いる場合、以下の構造式
【００８３】
【化１】
2014202967.tif 000003
【００８４】
を有するアモルファスフッ素樹脂に代表される、水と同程度の屈折率（１．２８〜１．３８）を有する素材で構成された試料配置部を用いることが好ましい。上記構成を採用することにより、試料配置部での光の屈折が抑制され、観察用レンズの開口数に応じて生じる収差を著しく低減させることができ、安定した結像を得ることができる（図１１の（ｃ））。また、試料配置部の観察面が観察用レンズの光軸と垂直でない場合であっても、左右非対称な収差が発生することを回避することができる（図１１の（ｄ））。なお、上記樹脂はＣＹＴＯＰ（登録商標）として市販されている。また、顕微鏡１００の試料配置部として、他のフッ素系の透明樹脂からなる試料配置部を用いることもできる。さらに、試料配置部として、ｌｕｍｏｘ（登録商標）を用いることもできる。この場合、水との屈折率に相違がある材質であっても、配置部の厚みを薄くすることによって屈折効果を軽減させることができる。
【００８５】
なお、試料配置部の好ましい具体例を挙げたが、これに限られることはなく、水と同程度の屈折率（１．２８〜１．３８）を有しており、透明であり、薄い平板基板状のものであれば、試料配置部として好適に用いることができる。平面基板状の試料配置部１０は、試料の保持する強度と、観察に影響がでないほどの十分な薄さと、の両方が必要であり、その厚さは、１μｍ〜２００μｍの範囲内であることが好ましい。特に、ｌｕｍｏｘ（登録商標、屈折率１．３６）を材質とした試料配置部１０を用いて観察する場合、試料配置部１０によって生じる収差を少なくして安定した観察をするためには、試料配置部１０の厚さは１０μｍ〜５０μｍの範囲内であることが好ましい。また、ＣＹＴＯＰ（登録商標、屈折率１．３４）を材質とした試料配置部１０を用いて観察する場合、試料配置部１０によって生じる収差を少なくして安定した観察をするためには、試料配置部１０の厚さは１０μｍ〜１００μｍの範囲内であることが好ましい。
【００８６】
＜さらなる構成＞
本発明の顕微鏡１、１００における他の特徴的な構成について、以下に説明する。
【００８７】
（可視光調整部）
本発明の顕微鏡１、１００においては、レーザー光源２１１〜２１５からの光を、一次元走査ミラー２３３の反射面において反射することによって、光を図１２、３で示したＹ軸方向に一様に分布させている。
【００８８】
図１２は、光学ユニットにおける光線の光路および輝度分布を示す図であり、図１２の（ａ）は、一次元走査ミラーの反射面において反射した光線および光の輝度分布を示し、図１２の（ｂ）は、一次元走査ミラーの反射面において反射し、絞りを通過したときの光線および光の輝度分布を示す。一次元走査ミラー２３３の反射面は、正弦関数に基づいて一次元で走査されるため、図１２の（ａ）に示すように、一次元走査ミラー２３３の反射光は、光線の中心部に比べて幅方向において輝度が高くなる。そこで、本実施形態の顕微鏡１、１００では、一次元走査ミラー２３３によって光を反射し、レンズ２２４によって集光した後に、絞り２２５を通して光線の幅方向における端部の光を除去することによって、図１２の（ｂ）に示すように均一な輝度を有する光としている。
【００８９】
＜変形例＞
本発明の変形例について、図１３〜１５に基づいて説明すれば、以下のとおりである。なお、説明の便宜上、実施形態１にて説明した部材と同じ機能を有する部材については、同じ符号を付記し、その説明を省略する。
【００９０】
図１３は、本発明の変形例に係る顕微鏡２００の全体構成および光路を示す概略図である。図１３に示すように、顕微鏡２００は、試料配置部１０と、光学ユニット２０Ａと、観察部３０Ａとを備えている。
【００９１】
光学ユニット２０Ａは、可視光光源部２１Ａと、可視光調整部２２Ａと、ＩＲ光光源部２３Ａと、ＩＲ光調整部２４Ａと、ダイクロイックミラー（ＤＭ）２５と、照明用レンズ２６（照明用対物レンズ）と、ウェッジプリズム５０と、を備えている。
【００９２】
可視光光源部２１Ａは、各レーザー光源２１１〜２１５から出射された各波長のレーザー光線を、ミラー２１６または各波長の光を反射するＤＭ１Ａ〜４Ａの反射面において反射することによって、各波長のレーザー光線の光路を整列する。可視光光源部２１Ａは、光路を整列された各波長のレーザー光線を、ミラー２１７の反射面において反射した後に、ファイバーカップラー６０およびファイバー６１を用いて合成する。可視光光源部２１Ａは、合成されたレーザー光線を、シャッター２２０を介して、可視光調整部２２Ａへ向けて出射する。
【００９３】
可視光調整部２２Ａは、ミラー７０〜７５と、ミラー２２１と、ＤＭ１Ｂ〜４Ｂと、ＤＭ１Ｃ〜４Ｃと、フィルタホイル２２２と、一次元走査ミラー２２３と、レンズ２２４と、絞り２２５と、ミラー２２６と、レンズ２２７とを備えている。可視光調整部２２Ａは、可視光光源部２１Ａからのレーザー光線を、ミラー７０の反射面において反射した後に、ＤＭ１Ｂ〜４Ｂ、ミラー７１〜７５、およびＤＭ１Ｃ〜４Ｃの反射面において、レーザー光線を波長ごとに互いに異なる反射角度で反射することによって、各波長のレーザー光線の光路を互いに分離する。可視光調整部２２Ａは、レーザー光線を、フィルタホイル２２２を介して一次元走査ミラー２２３に入射し、一定の幅を有する平行光をＤＭ２５へ向けて出射する。
【００９４】
ＩＲ光光源部２３ＡおよびＩＲ光調整部２４Ａは、実施形態１のＩＲ光光源部２３およびＩＲ光調整部２４と同じであり、ＩＲ光調整部２４Ａは、ＩＲ光線ＤＭ２５へ向けて出射する。
【００９５】
ＤＭ２５は、一方の面から、ＩＲ光調整部２４ＡからのＩＲ光線を透過し、かつ、他方の面において可視光調整部２２Ａからの可視光線を反射することによって、ＩＲ光線の光路と可視光線の光路とを整列し、ウェッジプリズム５０へ向けて出射する。ウェッジプリズム５０は、ＩＲ光線および可視光線を曲げて、照明用レンズ２６へ向けて出射する。
【００９６】
実施形態１の顕微鏡１は、試料配置部１０の下面１３を介して試料１２にシート光を照射するために、図３に示すように、照明用レンズ２６の光軸方向は、配置面１１に対して角度φ傾斜しており、光学ユニット２０に含まれる他の構成もまた、角度φに応じて配置されている。図３のＺ方向を鉛直方向とした場合、光学ユニット２０の各構成を、Ｚ方向から角度φだけ傾いたＺ’方向を基準に配置することは容易ではない。
【００９７】
そこで、変形例の顕微鏡２００のように、ＤＭ２５と照明用レンズ２６との間にウェッジプリズム５０を設けることによって、ＤＭ２５と照明用レンズ２６との間において光線を曲げてもよい。これにより、光学ユニット２０の各構成の配置を、角度φに応じて調整する必要がなく、容易に光学ユニット２０を構成することができる。
【００９８】
図１４は、光線を曲げるための構成を示し、図１４の（ａ）はミラーの反射面において光を反射することによって光線を曲げる構成を示し、図１４の（ｂ）はウェッジプリズムを透過させることによって光線を曲げる構成を示す。図１４の（ａ）に示すように、Ｒ文字の像を形成する光の光線を、ミラーの反射面において反射させることによって曲げた場合、光線の軸に垂直な面（照射面）に対して、像が傾く。本発明の顕微鏡１、１００の光学ユニット２０のように、一定の幅の光線を有する光を、ミラーの反射面において反射させることによって曲げた場合、光線の幅方向が変化してしまう。この場合、照明用レンズ２６から出射される光シートが生成する照明領域の厚さを首尾よく制御することができない。
【００９９】
これに対して、顕微鏡１は、ウェッジプリズム５０を透過させることによって、光線の幅方向を変化させることなく、一定の幅の光線を有する光を曲げることができる。
【０１００】
図１５は、光学ユニットにおいてウェッジプリズムを用いて光線を曲げたときの各波長の光線の光路を示す図である。図１５の（ａ）は、互いに光路が整列した複数種の波長のレーザー光線を、ウェッジプリズムを透過させたときのレーザー光線の光路の変化を示し、図１５の（ｂ）は、互いに光路を異ならせた複数種の波長のレーザー光線を、ウェッジプリズムを透過させたときのレーザー光線の光路の変化を示す。
【０１０１】
変形例の顕微鏡１の光学ユニット２０のように、ウェッジプリズム５０を用いることによって光線を曲げる場合、ウェッジプリズム５０における屈折率は光の波長によって異なるため、ウェッジプリズム５０を透過させることによって同じ光路を有する複数波長のレーザー光線を曲げた場合、図１５の（ａ）に示すように、ウェッジプリズム５０を透過後のレーザー光線の光路は、波長ごとに異なってしまう。この場合、光学ユニット２０から出射されるシート光によって生成される照明領域の厚さが厚くなってしまう。
【０１０２】
そのため、図１５の（ｂ）に示すように、互いに光路が整列した複数波長の光線を、ＤＭとミラーとレンズとを用いて波長ごとに所定の角度で曲げることによって、波長ごとに光路を異ならせた後、ウェッジプリズム５０を用いて光線を曲げることが好ましい。このとき、ウェッジプリズムを透過した後の各波長の光線の光路が整列するように、予め、ＤＭとミラーとレンズとを用いて光線の光路を波長ごとに調整する。
【０１０３】
〔実施例１〕
図１６は、本発明の顕微鏡を用いた実施例を示す図であり、図１６の（ａ）は観察面をＺ’方向に走査したときの各Ｘ’Ｙ平面おける出芽酵母細胞の画像であり、図１６の（ｂ）は出芽酵母細胞の３次元画像である。
【０１０４】
図１６の画像は、試料配置部の配置面近傍に集まった状態の出芽酵母細胞（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ：ｍＫａｔｅ２／ｐＥＳＣ−ＨＩＳ／ＢＹ４７４１）に対して、第１ステージ１１０を用いてシート光の照射領域を第１方向（Ｚ’方向）に０．２５μｍずつ走査して照射し、試料から放射される蛍光を、ＣＣＤカメラ３５を用いて撮像することによって得られた蛍光像である。
【０１０５】
本発明の顕微鏡によれば、試料配置部（カバースリップ）の配置面近傍にある試料の観察が可能であり、上記のとおり、配置面近傍にある直径６μｍ程度の出芽酵母細胞全体を画像化することができた。
【０１０６】
〔実施例２〕
図１７は、本発明の顕微鏡を用いた実施例を示す図であり、図１７の（ａ）は大腸菌の蛍光像であり、図１７の（ｂ）は大腸菌の蛍光像の輝度プロファイルである。
【０１０７】
本発明の顕微鏡では、観察用レンズ３１として、高い開口数（例えばＮＡ＝１．１）のレンズを用いることができるため、高分解能にて観察することができる。
【０１０８】
１細胞あたり平均１分子程度の蛍光タンパク質を発現する大腸菌株（Ｅ．ｃｏｌｉ：ＳＸ４）を蛍光観察した。本観察例では、大腸菌を低屈折率カバースリップに固定し、５１４ｎｍのシート光を試料に照射することによって試料を励起し、蛍光像を得た。その結果、図１７の細胞１では１分子蛍光による輝点が２ヶ所、細胞２では０ヶ所、細胞３では１ヶ所検出することができた。
【０１０９】
本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【産業上の利用可能性】
【０１１０】
本発明を用いれば、試料の大きさ等の制約を受けることなく、試料を高分解能で１分子レベルにて観察することができるため、本発明は、細胞を用いた新薬開発に好適に用いることができる。
【符号の説明】
【０１１１】
１、１００  顕微鏡
１０        試料配置部
１１        配置面
１２        試料
１３        下面
２０        光学ユニット
３１        観察用レンズ
４０        流体保持器具
４１        連結部
４２        端面
４３        透過窓
４４        流体保持部
１１０      第１ステージ（焦準機構、焦準器具）
１２０      第２ステージ（焦準機構、焦準器具）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１８】
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【図１９】
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【図４】
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【図５】
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【図１２】
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【図１６】
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【図１７】
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