(57)【要約】【課題】汚泥、土壌等の菌叢における、ＡＯＢによる窒素化合物の代謝経路を把握することにより、当該菌叢を評価する方法を提供する。【解決手段】本発明に係る菌叢の評価方法は、菌叢にアンモニア及び酸素を供給する第１工程と、前記第１工程において、前記アンモニアが実質的に枯渇した後、１５Ｎで標識された亜硝酸を前記菌叢に供給する第２工程と、前記第２工程の後、１５Ｎで標識されたヒドロキシルアミンを前記菌叢に供給する第３工程と、を含む。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
菌叢にアンモニア及び酸素を供給する第１工程と、
前記第１工程において、前記アンモニアが実質的に枯渇した後、１５Ｎで標識された亜硝酸を前記菌叢に供給する第２工程と、
前記第２工程の後、１５Ｎで標識されたヒドロキシルアミンを前記菌叢に供給する第３工程と、
を含む、菌叢の評価方法。
【請求項２】
請求項１において、
前記菌叢から生じる気体を質量分析する工程をさらに含む、菌叢の評価方法。
【請求項３】
請求項２において、
前記気体は、亜酸化窒素である、菌叢の評価方法。
【請求項４】
請求項１ないし請求項３のいずれか１項において、
前記菌叢に発現している遺伝子を定量分析する工程をさらに含む、菌叢の評価方法。
【請求項５】
請求項４において、
前記遺伝子は、窒素の酸化及び／又は還元に関与する酵素をコードする、菌叢の評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、汚泥、土壌等の菌叢の評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
大気に放出される亜酸化窒素（Ｎ２Ｏ）は、二酸化炭素（ＣＯ２）の３００倍もの温室効果のある物質である。また、Ｎ２Ｏは、フロンガスに替わる２１世紀最大のオゾン層破壊物質の１つとして知られ、その放出量の低減は世界的な関心事となっている。
【０００３】
これまで排水処理施設は、Ｎ２Ｏの放出の温床としての寄与は低いものと考えられてきた。しかし、排水処理プロセスの省エネルギー化、低コスト化等の進展にともない、近年、Ｎ２Ｏの放出量は、増加傾向にあるとの報告がある。例えば、排水処理施設からのＮ２Ｏの放出量の評価に関して、ＩＰＰＣのレポートにおける積算値は正しくないことが指摘され、これまでの排水処理施設からのＮ２Ｏ放出量は過小評価されており、無視できるレベルにないとの注意が喚起されている（例えば、非特許文献１）。
【０００４】
一方、排水処理施設では、多種多様な微生物を排水に接触させることにより排水の汚濁成分の無害化が行われている。通常、排水処理プロセスは、汚泥として懸濁され、若しくは担体に固定化された多様な微生物を排水に接触させて行われる。
【０００５】
また一般に、排水中にはアンモニア（ＮＨ３）等の窒素化合物が含まれている。窒素化合物は、排水処理において、酸化処理されるが、特に、ＮＨ３を酸化する性質を有するアンモニア酸化細菌（ＡＯＢ）が、排水処理における窒素化合物の酸化に関して中心的役割を担っている。
【０００６】
ところが、ＡＯＢは、ＮＨ３を、アンモニア態窒素（ＮＨ４＋−Ｎ）、ヒドロキシルアミン（ＮＨ２ＯＨ）、亜硝酸態窒素（ＮＯ２−）、一酸化窒素（ＮＯ）、硝酸態窒素（ＮＯ３−）などに酸化、還元する酵素とともに、ＮＨ２ＯＨやＮＯから、Ｎ２Ｏを生成する経路に関与する酵素を有しており、副次的にＮ２Ｏを産生する場合がある。そのため、ＡＯＢは、Ｎ２Ｏの発生源として問題視されている。
【０００７】
また、Ｎ２Ｏは、脱窒細菌によっても放出されることが知られており、さらに、微生物による生物学的な経路によって放出される以外に、化学反応による非生物学的経路によっても発生するとも言われている。
【０００８】
これまで、排水処理などにおけるＮ２Ｏの放出経路に関する基礎研究は行われてきている。例えば、非特許文献２には、シミュレーションによる、独立栄養アンモニア酸化細菌のＮ２Ｏ生産経路の予測と実研究との照合が報告されている。また、実験的には、物質循環に関わる研究と微生物の代謝機構に関する研究が行われている。物質循環においては、例えば、非特許文献３に、自然界中に存在する同位体比の組み合わせを利用したアイソトポマーを用いた解析が報告されている。一方で、微生物の代謝経路に関しては、例えば、非特許文献４に、伝令ＲＮＡの転写活性に基づいた代謝経路と窒素循環に関する報告がある。さらに、特許文献１には、ＡＯＢを用いた排水処理装置及び排水処理方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２０１２−２４５４７９号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Foley J., de Hass D., de Haas D., Yuan ZG., Lant P. Water Research 2010, 44 (3), 831-844
【非特許文献２】Ni BJ, Yuan ZG, Chandran K, Vanrolleghem PA, Murthy S., Biotechnology and Bioengineering 2013, 110(1), 153-163
【非特許文献３】Wunderlin P, Lehmann MF, Siegrist H, Tuzson B, Joss A, Emmenegger L, Mohn J., Environmental Science & Technology 2012, 47(3), 1339-1348
【非特許文献４】Yu R, Chandran K., Bmc Microbiology 2010, 10-
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
近年、窒素含有排水の低コスト・省エネ型の処理法として部分硝化法が注目されている。しかし、部分硝化法はＡＯＢ及び亜硝酸酸化細菌（ＮＯＢ）の生理学的性質の違いを利用してＡＯＢの増殖に有利な条件（溶存酸素、ｐＨ、温度等）を見出すことにより達成されるものであり、従来法に比べて、Ｎ２Ｏの発生を抑制することは難しかった。
【００１２】
さらに、上述した従来の研究や検討結果においても、Ｎ２Ｏの放出経路は、必ずしも正確には把握されておらず、ＡＯＢがＮ２Ｏの排出に関して、いかに寄与しているのかについて、必ずしも十分に議論されていない。
【００１３】
本発明の幾つかの態様に係る目的の１つは、汚泥、土壌等の菌叢における、ＡＯＢによる窒素化合物の代謝経路を把握することにより、当該菌叢を評価する方法を提供することにある。また、本発明の幾つかの態様に係る目的の１つは、汚泥、土壌等の菌叢における、ＡＯＢによる、特にＮ２Ｏの生成経路を把握して当該菌叢を特徴付ける（評価する）方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は前述の課題の少なくとも一部を解決するためになされたものであり、以下の態様又は適用例として実現することができる。
【００１５】
［適用例１］本発明に係る菌叢の評価方法の一態様は、菌叢にアンモニア及び酸素を供給する第１工程と、前記第１工程において、前記アンモニアが実質的に枯渇した後、１５Ｎで標識された亜硝酸を前記菌叢に供給する第２工程と、前記第２工程の後、１５Ｎで標識されたヒドロキシルアミンを前記菌叢に供給する第３工程と、を含む。
【００１６】
本適用例によれば、菌叢における、ＡＯＢによる窒素化合物の代謝経路を把握することができ、当該菌叢を評価することができる。
【００１７】
［適用例２］適用例１において、前記菌叢から生じる気体を質量分析する工程をさらに含んでもよい。
【００１８】
本適用例によれば、菌叢における、ＡＯＢによる窒素化合物の代謝経路をより正確に把握することができ、当該菌叢を評価することができる。
【００１９】
［適用例３］適用例２において、前記気体は、亜酸化窒素であってもよい。
本適用例によれば、菌叢における、ＡＯＢによるＮ２Ｏの代謝経路を把握することができ、当該菌叢のＮ２Ｏ生成機構を評価することができる。
【００２０】
［適用例４］適用例１ないし適用例３のいずれか１例において、前記菌叢に発現してい
る遺伝子を定量分析する工程をさらに含んでもよい。
【００２１】
本適用例によれば、同位体による測定結果及び機能遺伝子の発現量による測定結果を組合わせて解析することで、菌叢におけるＡＯＢによる窒素化合物の代謝経路が、生物学的経路と化学的経路とのいずれが支配的であるかを把握することができ、当該菌叢をより正確に評価することができる。
【００２２】
［適用例５］適用例４において、前記遺伝子は、窒素の酸化及び／又は還元に関与する酵素をコードするものであってもよい。
【００２３】
本適用例によれば、菌叢における、ＡＯＢによる窒素化合物の代謝経路が生物学的経路と化学的経路とにおいていずれが優先されるかを把握することができ、当該菌叢をより正確に評価することができる。
【発明の効果】
【００２４】
本発明によれば、安定同位体の利用により、上述した複雑なＮ２Ｏ生成経路の同定を行うことができる。また、本発明によれば、窒素の関与する反応を担う酵素をコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を定量することにより、Ｎ２Ｏの生物学的経路による発生の寄与を確認することができる。したがって、本発明により評価された菌叢について、Ｎ２Ｏの発生を抑制するための対策を講じるための有効な情報を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】ＡＯＢによる窒素化合物の代謝経路の模式図。
【図２】実験例に係る窒素化合物の種類ごとの濃度のプロット。
【図３】実験例に係る１５Ｎを含むＮ２Ｏの分率の時間に対するプロット。
【図４】実験例に係る１４Ｎ２Ｏ、１５Ｎ１４ＮＯ若しくは１４Ｎ１５ＮＯ及び１５Ｎ２Ｏの時間に対する積算プロット。
【図５】実験例に係るＮ２Ｏ生成経路を模式的に示すマップ。
【図６】実験例に係る機能遺伝子の相対発現量の時間に対するプロット。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
以下に本発明のいくつかの実施形態について説明する。以下に説明する実施形態は、本発明の一例を説明するものである。本発明は以下の実施形態になんら限定されるものではなく、本発明の要旨を変更しない範囲において実施される各種の変形形態も含む。なお以下で説明される構成の全てが本発明の必須の構成であるとは限らない。
【００２７】
１．菌叢の評価方法
本実施形態に係る菌叢の評価方法は、菌叢にアンモニア及び酸素を供給する第１工程と、前記第１工程において、前記アンモニアが実質的に枯渇した後、１５Ｎで標識された亜硝酸を前記菌叢に供給する第２工程と、前記第２工程の後、１５Ｎで標識されたヒドロキシルアミンを前記菌叢に供給する第３工程と、を含む。
【００２８】
図１は、本実施形態に係る評価方法の具体的工程の一例を示すフローチャートである。
【００２９】
１．１．菌叢
本実施形態の評価方法が適用される菌叢は、特に限定されない。本明細書でいう菌叢とは、特定の環境で生育する一群の細菌の集合、あるいは、微生物叢（ｍｉｃｒｏｂｉａｌ
ｆｌｏｒａ）のことを指す。本実施形態の評価方法が適用される菌叢の具体例としては、汚泥（活性汚泥）、土壌、動物の体内や表皮の微生物叢などが挙げられ、地球環境中において、細菌の集合として存在するものであれば特に限定されない。菌叢は、その一部又
は全部を採取することができ、これを本実施形態の評価方法で評価することができる。
【００３０】
１．２．第１工程
本実施形態に係る菌叢の評価方法は、第１工程を含む。第１工程は、菌叢にアンモニア及び酸素を供給する工程である。
【００３１】
本工程は、例えば、反復回分型、連続槽型のバイオリアクターに、評価対象となる菌叢を適宜の方法により導入した状態で行われる。このようなバイオリアクターは、特に限定されないが、部分硝化型のものであることが、Ｎ２Ｏの生成に関して中心的な役割を担うＡＯＢが集積されることになるため、評価方法の正確性の点で、より好ましい。バイオリアクターの容積についても特に制限はない。バイオリアクターに導入された菌叢は、水に分散されてもよく、適宜に撹拌されてもよい。また、本実施形態のバイオリアクターは、導入された菌叢又はその分散体から発生するガス、及び菌叢の一部を採取できる構成となっていることがより好ましい。また、バイオリアクターは、適宜の気密性を有することが、採取したガス等の分析の精度を高めるという観点から、より好ましい。また、バイオリアクターは、ばっ気機構を備えてもよい。ばっ気を行う場合には、酸素、大気等を用いることができ、流量についても特に制限はない。また、本工程が行われる前に、菌叢は、バイオリアクター内で適宜、訓致されてもよい。
【００３２】
本工程では、バイオリアクターにアンモニア及び酸素を供給する。アンモニアは、アンモニア態窒素（ＮＨ４＋−Ｎ）として供給されてもよい。酸素は、純度の高い酸素ガスとして供給されても、大気として供給されてもよい。アンモニア及び酸素は、それぞれバイオリアクター内にそのまま供給されてもよいし、バブリング等の態様で供給されてもよい。また、本工程を行う際には、バイオリアクター内をできるだけ均一に撹拌することが、評価の正確さを高める観点からより好ましい。
【００３３】
本実施形態の評価方法において、本工程は、菌叢によってアンモニアが代謝されるか否かを確認する役割を有している。本工程でバイオリアクターに供給されるアンモニアの量は、例えば、菌叢１ｇに対して、１０ｍｇ−Ｎ／Ｌ以上５，０００ｍｇ−Ｎ／Ｌ以下、好ましくは１０ｍｇ−Ｎ／Ｌ以上１，０００ｍｇ−Ｎ／Ｌ以下である。本工程でバイオリアクターに供給される酸素は、連続的に供給されてもよいし、例えば、菌叢１ｇに対して、０．１ｍｇ／Ｌ以上７．０ｍｇ／Ｌ以下、好ましくは１．０ｍｇ／Ｌ以上の濃度に調整してもよい。さらに、本工程でバイオリアクターに供給されるアンモニアに対する酸素の体積分率は、例えば、２．０以上５．０以下である。体積分率が３．４３以上４．３２以下の範囲であれば、化学量論的な解析を行うことができる場合がある。
【００３４】
本工程の温度は、菌叢による代謝が期待できる限り、特に制限されないが、例えば、２５℃以上３５℃以下とすることができる。同様に、本工程の際のｐＨは、菌叢による代謝が期待できる限り、特に制限されないが、例えば、６．０以上８．８以下とすることができる。また、本工程において所定のｐＨが変動する場合には、例えば、緩衝剤（バッファー）などにより、ｐＨを調整してもよい。また、本工程では、菌叢による代謝が期待できる限り、溶存酸素（ＤＯ）の濃度を適宜調節してもよい。
【００３５】
菌叢がアンモニアを代謝する能力を有している場合には、本工程において、供給されたアンモニアは系内で減少する。
【００３６】
１．３．第２工程
本実施形態に係る菌叢の評価方法は、第２工程を含む。第２工程は、１５Ｎで標識された亜硝酸を菌叢に供給する工程である。
【００３７】
第２工程は、第１工程において、アンモニアが実質的に枯渇した後に行われる。本明細書では、アンモニアが実質的に枯渇した状態とは、アンモニアが完全に消失した状態と、菌叢による代謝が生じない又は遅い程度にアンモニアが残っている状態とを含むことを意味する。
【００３８】
上述の通り、菌叢がＮＨ４を代謝する能力を有している場合には、第１工程において、供給されたＮＨ４は系内で減少し、ＮＨ４は実質的に枯渇する。その後、第２工程が行われる。
【００３９】
本工程では、１５Ｎで標識された亜硝酸は、亜硝酸態窒素（１５ＮＯ２−）の状態で菌叢に供給されてもよい。１５Ｎで標識された亜硝酸は、例えば、試薬として、○○株式会社などから市販されているものを用いることができる。亜硝酸は、バイオリアクター内にそのまま供給されてもよいし、バブリング等の態様で供給されてもよい。また、本工程を行う際には、バイオリアクター内をできるだけ均一に撹拌することが、評価の正確さを高める観点からより好ましい。
【００４０】
本実施形態の評価方法において、本工程は、菌叢によって亜硝酸が代謝されるか否かを確認する役割を有している。本工程でバイオリアクターに供給される亜硝酸の量は、例えば、菌叢１ｇに対して、１０ｍｇ−Ｎ／Ｌ以上５，０００ｍｇ−Ｎ／Ｌ以下、好ましくは１０ｍｇ−Ｎ／Ｌ以上１，０００ｍｇ−Ｎ／Ｌ以下である。
【００４１】
本工程の温度は、菌叢による代謝が期待できる範囲で、特に制限されないが、例えば、２５℃以上３５℃以下とすることができる。同様に、本工程の際のｐＨは、菌叢による代謝が期待できる限り、特に制限されないが、例えば、６．０以上８．８以下とすることができる。また、本工程において所定のｐＨが変動する場合には、例えば、緩衝剤（バッファー）などにより、ｐＨを調整してもよい。また、本工程では、菌叢による代謝が期待できる限り、溶存酸素（ＤＯ）の濃度を適宜調節してもよい。
【００４２】
菌叢が亜硝酸を代謝する能力を有している場合には、本工程において、供給された亜硝酸は系内で減少する。また、菌叢が亜硝酸を代謝する能力を有していない場合には、本工程において、供給された亜硝酸は系内に残存する。
【００４３】
１．４．第３工程
本実施形態に係る菌叢の評価方法は、第３工程を含む。第３工程は、１５Ｎで標識されたヒドロキシルアミンを前記菌叢に供給する工程である。第３工程は、第２工程の後に行われる。
【００４４】
本工程は、第２工程で供給された亜硝酸が実質的に枯渇した状態であっても、亜硝酸が残存した状態であっても行うことができる。
【００４５】
本工程では、１５Ｎで標識されたヒドロキシルアミン（１５ＮＨ２ＯＨ）は、例えば、試薬として、○○株式会社などから市販されているものを用いることができる。ヒドロキシルアミンは、バイオリアクター内にそのまま供給されてもよいし、バブリング等の態様で供給されてもよい。また、本工程を行う際には、バイオリアクター内をできるだけ均一に撹拌することが、評価の正確さを高める観点からより好ましい。
【００４６】
本実施形態の評価方法において、本工程は、菌叢によってヒドロキシルアミンが代謝されるか否かを確認する役割を有している。本工程でバイオリアクターに供給されるヒドロキシルアミンの量は、例えば、菌叢１ｇに対して、０．００１ｍｇ−Ｎ／Ｌ以上０．１ｍｇ−Ｎ／Ｌ以下、好ましくは０．００１ｍｇ−Ｎ／Ｌ以上０．０２ｍｇ−Ｎ／Ｌである。
【００４７】
本工程の温度は、菌叢による代謝が期待できる範囲で、特に制限されないが、例えば、２５℃以上３５℃以下とすることができる。同様に、本工程の際のｐＨは、菌叢による代謝が期待できる限り、特に制限されないが、例えば、６．０以上８．８以下とすることができる。また、本工程において所定のｐＨが変動する場合には、例えば、緩衝剤（バッファー）などにより、ｐＨを調整してもよい。また、本工程では、菌叢による代謝が期待できる限り、溶存酸素（ＤＯ）の濃度を適宜調節してもよい。
【００４８】
菌叢がヒドロキシルアミンを代謝する能力を有している場合には、本工程において、供給されたヒドロキシルアミンは系内で減少する。また、菌叢がヒドロキシルアミンを代謝する能力を有していない場合には、本工程において、供給されたヒドロキシルアミンは系内に残存する。
【００４９】
１．５．その他の工程
１．５．１．質量分析する工程
本実施形態の菌叢の評価方法は、質量分析する工程をさらに含んでもよい。本工程は、菌叢から生じる気体及び液体を、質量分析機能を備えた装置に導入して行われる。本工程は、第１工程、第２工程、及び第３工程の少なくとも１つの工程で行われることができる。また、本工程は、第１工程、第２工程、及び第３工程を通じて、すべての工程と同時に行われてもよい。さらに、本工程は、例えば、第１工程ないし第３工程が連続槽型のバイオリアクターで行われる場合などには、連続的に行われてもよいし、反復回分型のバイオリアクターで行われる場合などでは、間欠的に行われてもよい。本工程を間欠的（断続的）に行う場合には、少なくとも、第１工程、第２工程及び第３工程の各工程内で、複数回行われることがより好ましい。このようにすれば、第１工程、第２工程、及び第３工程の各工程における発生ガスの変遷を追跡することがより容易となる。
【００５０】
本工程は、例えば、バイオリアクター内の気相を、適宜のサンプリング手法により採取し、これを質量分析機能を備えた装置に導入して行われることができる。質量分析機能としては、１５Ｎで標識された窒素化合物と、同種の窒素化合物であって標識されていない窒素化合物と、を分けて検出できる程度の質量分解能を有すれば、特に限定されない。また、質量分析機能を有する装置としては、質量分析機能の他に、分画機能（例えば、クロマトグラフィー）を有してもよい。このような装置によれば、質量分析の他に定量分析を行うことができる。本工程で使用する装置の具体例としては、ガスクロマトグラフィー／マススペクトロスコピー（ＧＣ／ＭＳ）が挙げられる。また、本工程で使用する装置としては、ＧＣ／ＭＳのうち、四重極型のＭＳを備えた装置であれば、高感度で多成分を一斉に定量分析することが可能なためより好ましい。
【００５１】
本工程により得られる、化学種の特定及びその存在量の情報は、例えば、時間に対してプロットされる。これにより、第１工程、第２工程及び第３工程の各工程内での化学種の変化を追跡することができる。また、本工程において測定される化学種としては、特に限定されないが、少なくとも第２工程及び第３工程において測定される化学種の種類には、Ｎ２Ｏ、１５ＮＮＯ及び１５Ｎ２Ｏが含まれることがより好ましい。すなわち、分子量（質量数）が４４、４５及び４６である亜酸化窒素を測定することにより、菌叢から発生する気体に含まれる亜酸化窒素が、第２工程で供給された亜硝酸に由来する窒素を含むのか、第３工程で供給されたヒドロキシルアミンに由来する窒素を含むのかの情報を得ることができる。これにより、亜酸化窒素の生成経路を特定するためのより有用な情報を得ることができる。
【００５２】
本工程により得られる溶存態のＮ２Ｏの定量に関しては、例えば、液体採取口から採取した５ｍＬの水サンプルを、あらかじめクロロホルム０．１ｍＬを封入した５０ｍＬのガ
スクロマトグラフィー用バイアルに入れ、激しく撹拌した後、３０℃で２時間静置したのち、気液平衡に達した気相のＮ２Ｏ濃度をガスクロマトグラフィーで測定することにより定量することができる。
【００５３】
１．５．２．遺伝子を定量分析する工程
本実施形態の菌叢の評価方法は、遺伝子を定量分析する工程をさらに含んでもよい。本工程は、菌叢に発生している遺伝子を、ＰＣＲ法（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）により増幅して定量分析を行う工程である。対象となる遺伝子は、特に限定されないが、窒素の酸化及び／又は還元に関与する酵素をコードする遺伝子であることが好ましい。また、遺伝子は、該酵素をコードするものであれば、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよい。なお、ＲＮＡを増幅する場合には、逆転写ＰＣＲ法が採用されることができる。さらに、酵素をコードする遺伝子のうち、伝令ＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ：ｍＲＮＡ）は、その量と、酵素の発現量との間に正の相関があるため、菌叢中に発現している酵素の量を、ｍＲＮＡの定量結果から測定することができる。
【００５４】
ｍＲＮＡ等の遺伝子の定量分析する工程は、第１工程、第２工程及び第３工程の少なくとも１つの工程で行われることができる。また、本工程は、第１工程、第２工程及び第３工程を通じて、すべての工程と同時に行われてもよい。さらに、本工程は、例えば、第１工程ないし第３工程が連続槽型のバイオリアクターで行われる場合などには、連続的に行われてもよいし、反復回分型のバイオリアクターで行われる場合などでは、間欠的（断続邸）に行われてもよい。本工程を間欠的に行う場合には、少なくとも、第１工程、第２工程及び第３工程の各工程内で、複数回行われることがより好ましい。このようにすれば、第１工程、第２工程、及び第３工程の各工程における酵素の発現量を追跡することがより容易となる。
【００５５】
定量される酵素としては、ＡＭＯ：アンモニア酸化酵素（アンモニアをヒドロキシルアミンに酸化する酵素）、ＨＡＯ：ヒドロキシルアミン酸化還元酵素（ヒドロキシルアミンを亜硝酸に酸化する酵素）、ＮＩＲ：亜硝酸還元酵素（亜硝酸を一酸化窒素に還元する酵素）、ＮＯＲ：一酸化窒素還元酵素（一酸化窒素を亜酸化窒素に還元する酵素）、及びＮＸＲ：亜硝酸酸化酵素（亜硝酸を硝酸に酸化する酵素）からなる群より選択される少なくとも１種とすることができる。これらの酵素のうち、ＡＭＯ：アンモニア酸化酵素（アンモニアをヒドロキシルアミンに酸化する酵素）、ＨＡＯ：ヒドロキシルアミン酸化還元酵素（ヒドロキシルアミンを亜硝酸に酸化する酵素）、ＮＩＲ：亜硝酸還元酵素（亜硝酸を一酸化窒素に還元する酵素）、及びＮＯＲ：一酸化窒素還元酵素（一酸化窒素を亜酸化窒素に還元する酵素）についての定量情報を得ることにより、例えば、Ｎ２Ｏが生物学的経路、化学的経路のいずれによって発生するのかを判定することができる。
【００５６】
本工程は、例えば、バイオリアクター内の菌叢の一部を、適宜のサンプリング手法により採取し、これに含まれるＤＮＡ、ＲＮＡ又はｍＲＮＡをＰＣＲ法により増幅することにより行われることができる。なおＰＣＲ法に用いられるプライマーや試薬は、増幅する対象となる塩基配列（対象とする酵素に対応する塩基配列）に対して相補的でありＡＯＢの機能遺伝子に対して特異的なものを適宜用いることができる。例えば、定量したい酵素に対応する塩基配列が既知であれば、これに対応する配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いることができる。増幅された遺伝子は、適宜、分光分析等により、定量することができる。
【００５７】
本実施形態の菌叢の評価方法において、本工程を採用すれば、菌叢サンプルからＲＮＡを抽出し、ＲＮＡを逆転写反応にてＤＮＡにすることにより定量を行い、発現されたｍＲＮＡ量を定量ＰＣＲ等により測定することができる。
【００５８】
本工程により得られる、酵素の発現量に関する情報は、例えば、時間に対してプロットされる。これにより、第１工程、第２工程及び第３工程の各工程内での各酵素の活性の変化を追跡することができる。また、本工程において定量される遺伝子としては、上述のＡＭＯ、ＨＡＯ、ＮＩＲ及びＮＯＲをコードするｍＲＮＡであることがより好ましい。これらのｍＲＮＡが定量されることにより、菌叢内における亜酸化窒素の生物学的な生成経路の特定や、生物学的な生成経路の活性（化学的な生成経路の活性との相対的な差）に関する情報を得ることができる。
【００５９】
１．５．３．工程の順序等
本実施形態の評価方法において、上述した第１工程、第２工程及び第３工程は、必ずしもこの順で行われる必要はない。例えば、第１工程の後に第３工程が行われてもよいし、第２工程及び第３工程の後に第１工程が行われてもよい。また、本実施形態の評価方法では、第１工程、第２工程及び第３工程は、それぞれ複数回行われてもよい。これらの工程は、所望の情報を得ることができるように、適宜の順序で組合わせて行われることができる。
【００６０】
１．６．作用効果
本実施形態に係る菌叢の評価方法によれば、安定同位体の利用により、複雑なＮ２Ｏ生成経路の同定を行うことができる。また、本実施形態の評価方法によれば、窒素の関与する反応を担う酵素をコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を用いてこれを定量することにより、Ｎ２Ｏの生物学的経路による発生の寄与を確認することができる。これらの情報を組合わせて解析することにより、Ｎ２Ｏの発生経路において、支配的な経路を特定することができる。したがって、本発明により評価された菌叢について、Ｎ２Ｏの発生を抑制するための対策を講じるための有効な情報を得ることができる。
【００６１】
２．実験例
以下に実験例を示し、本発明をさらに説明するが、本発明は以下の実験例によってなんら限定されるものではない。
【００６２】
２．１．試料
活性汚泥は、埋立地浸出水の生物処理を行っている反応槽を種汚泥として長期間アンモニア除去を行っている実験室規模反応槽から採取したものを用いた。活性汚泥は、ＡＯＢを長期間訓致して使用した。各活性汚泥によって処理される液体として、人工的に作成した排水を用いた。排水としては、（ＮＨ４）２ＳＯ４を２８３０ｍｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏを２８０ｍｇ、ＫＨ２ＰＯ４を２７ｍｇ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏを１２０ｍｇ、ＮａＣｌを６００ｍｇ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏを３．３ｍｇ、ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏを３．３ｍｇ、ＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏを０．８ｍｇ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏを１．７ｍｇ、及びＮｉＳＯ４・６Ｈ２Ｏを０．３ｍｇを、蒸留水１Ｌに溶解させたものを使用した。また、当該排水には、活性汚泥に接触させる前に、アンモニアが含有されていることを確認した。
【００６３】
２．２．バイオリアクター
反復回分型のバイオリアクターを自作した。バイオリアクターには、撹拌装置と、ガス導入口と、ばっ気機構と、気相及び液相のサンプリング機構とを備付けた。バイオリアクターの容量は５Ｌであり、以下の実験を通じて系を２８℃に保つ温度調節器を設置した。
【００６４】
２．３．分析等
サンプリングされた気相を、株式会社島津製作所製：形式ＧＣＭＳ−ＱＰ２０１０  ＰＰｌｕｓに導入し、成分の定性定量を行った。また、サンプリングされた液相に対しては、固液分離行い、汚泥からＲＮＡを抽出した後、逆転写反応を行いＤＮＡを合成した後、定量ＰＣＲにてｍＲＮＡの機能遺伝子の定量を行った。そして各酵素をコードするｍＲＮ
Ａの相対的な発現量を、実験開始前を基準として算出した。
【００６５】
２．４．窒素化合物の代謝経路
活性汚泥中にＡＯＢが存在する場合の、窒素化合物の反応経路を図１に示す。図１中、矢印はＡＯＢによる生物学的な代謝経路を、波線矢印は化学的な反応経路を、一点鎖線矢印は反応に関わる電子の流れをそれぞれ表す。また、図中略号は、ＡＭＯ：アンモニア酸化酵素（アンモニアをヒドロキシルアミンに酸化する酵素）、ＨＡＯ：ヒドロキシルアミン酸化還元酵素（ヒドロキシルアミンを亜硝酸に酸化する酵素）、ＮＩＲ：亜硝酸還元酵素（亜硝酸を一酸化窒素に還元する酵素）、ＮＯＲ：一酸化窒素還元酵素（一酸化窒素を亜酸化窒素に還元する酵素）、及びＮＸＲ：亜硝酸酸化酵素（亜硝酸を硝酸に酸化する酵素）である。また、これら略号に付記された括弧内は、それぞれの酵素に対応する機能遺伝子である。図１をみると、Ｎ２Ｏ発生の機構として，２つあるＮがどこから来ているかに着目すると、（１）２ＮＨ２ＯＨ→Ｎ２Ｏ（好気条件下）、（２）２ＮＯ２−→Ｎ２Ｏ（嫌気条件下）、（３）ＮＨ２ＯＨ＋ＮＯ２−→Ｎ２Ｏ、の３経路に着目すれば、安定性同位体を用いて部分硝化を志向した活性汚泥槽からのＮ２Ｏの発生経路を把握できる可能性があることが理解されよう。
【００６６】
２．５．実験条件
まず、活性汚泥をアンモニアを含む人工排水（４００ｍｇ−Ｎ／Ｌ）に投入し、硝化回分試験を行った。アンモニア酸化は酸素を供給しながら行った（上述の第１工程に相当する。）（図２におけるＰｈａｓｅＩ）。この間、約１時間ごとに気相を採取して発生ガス（アンモニア（ＮＨ４＋）、亜硝酸（ＮＯ２−）、硝酸（ＮＯ３−）、亜酸化窒素（Ｎ２Ｏ））の定性定量分析を行った。
【００６７】
次に、定性定量分析の結果において、ＮＨ４＋が実質的に枯渇したことを確認した後、１５Ｎで標識された１５ＮＯ２を系に供給した（上述の第２工程に相当する。）（図２におけるＰｈａｓｅＩＩ）。ＰｈａｓｅＩと同様に、この間、約１時間ごとに気相を採取して発生ガス（アンモニア（ＮＨ４＋）、亜硝酸（ＮＯ２−）、硝酸（ＮＯ３−）、亜酸化窒素（Ｎ２Ｏ））の定性定量分析を行った。
【００６８】
次に、定性定量分析の結果において、系内の窒素化合物の量が安定化した後、１５Ｎで標識された１５ＮＨ２ＯＨを系に供給した（上述の第３工程に相当する。）（図２におけるＰｈａｓｅＩＩＩ）。ＰｈａｓｅＩ、ＩＩと同様に、この間、約０．５時間ごとに気相を採取して発生ガス（アンモニア（ＮＨ４＋）、亜硝酸（ＮＯ２−）、硝酸（ＮＯ３−）、亜酸化窒素（Ｎ２Ｏ））の定性定量分析を行った。
【００６９】
これらの工程を行う間、約１時間ごとに活性汚泥を採取して、ＲＮＡ抽出、逆転写反応によるＤＮＡの合成の後、定量ＰＣＲを行い、各経路を触媒する酵素の機能遺伝子のｍＲＮＡレベルでの発現量を追跡した。
【００７０】
以上のような回分試験を、溶存酸素濃度を７．０ｍｇ／Ｌ、１．５ｍｇ／Ｌ、０．３ｍｇ／Ｌとしてそれぞれの条件で行った。なお、各試験における試料のｐＨは、連続的にモニタリングされ、各試験とも７．８となるように随時自動調整を行った。
【００７１】
２．６．実験結果
図２ないし図４は、溶存酸素濃度１．５ｍｇ／Ｌの回分試験における各窒素化合物の濃度の変化を時間に対してプロットした結果である。図２は、各窒素化合物の種類ごとの濃度のプロットであり、図３は、発生したＮ２Ｏにおける安定同位体１５Ｎを含むＮ２Ｏの分率の時間に対するプロットであり、図４は、検出されたＮ２Ｏ中の１４Ｎ２Ｏ（分子量４４）、１５Ｎ１４ＮＯ若しくは１４Ｎ１５ＮＯ（分子量４５）及び１５Ｎ２Ｏ（分子量
４６）の、時間に対する積算プロットである。また、図２ないし図４には、上述の各Ｐｈａｓｅを記載した。
【００７２】
図２をみると、ＰｈａｓｅＩにおいて、ＡＯＢが集積された活性汚泥のいずれにおいても（溶存酸素濃度１．５ｍｇ／Ｌ以外の回分試験は図示を省略している。）、ＮＯ２−の蓄積が観察され、ＮＯ３−の生成が全体の１割前後となったことがわかる。
【００７３】
また、図２より、ＮＨ４＋が消費される過程において、Ｎ２Ｏが放出されていることが判明した。このＰｈａｓｅＩの時点では１５Ｎの供給は行っていないため、生成する分子量は１４Ｎ１４ＮＯの４４である。ＮＨ４＋の枯渇後、ＰｈａｓｅＩＩにおいて１５Ｎで標識されたＮＯ２−を添加したところ、Ｎ２Ｏのピークは見られず、この時点でＮ２Ｏは発生しないことが判明した。このことから、脱窒経路によるＮ２Ｏの発生（２ＮＯ２−→Ｎ２Ｏ）は、ほとんど無いということが理解できる。
【００７４】
次に、ＰｈａｓｅＩＩＩにおいて、ＮＯ２−が十分に蓄積し、ＮＨ２ＯＨが消費された状態で、１５ＮＨ２ＯＨが添加され、Ｎ２Ｏの大きなピークが急激に観察された。また、このＰｈａｓｅＩＩＩにおけるＮ２Ｏの急激な発生は、溶存酸素濃度を７．０ｍｇ／Ｌ、１．５ｍｇ／Ｌ、０．３ｍｇ／Ｌの全ての実験系において同様に観察された。
【００７５】
図３をみると、１５ＮＨ２ＯＨを添加した際に発生したＮ２Ｏの１５Ｎの質量％は、５８．９％であった。一方、その時間のＮＨ２ＯＨの１５Ｎ比が、１００質量％、ＮＯ２−の１５Ｎ比が、１１質量％であった。この１５Ｎの質量％に関する結果は、Ｎ２Ｏの生成が、１５ＮＨ２ＯＨおよび１４ＮＯ２−が１分子ずつ反応して発生することを想定すれば、合理的に説明することができる。したがって、ターゲットとした部分硝化を志向したリアクターからのＮ２Ｏは、ＮＨ２ＯＨ及びＮＯ２−のそれぞれ１分子ずつからＮがハイブリッドに反応して生成すると説明できることが判明した。また、図をみると、ＰｈａｓｅＩＩまで分子量４４以外のＮ２Ｏは検出されていなかったものの、ＰｈａｓｅＩＩＩの開始の際に１５ＮＨ２ＯＨが供給され、分子量４５と４６のＮ２Ｏが検出されていることが分かった。以上の結果を図５にまとめた。
【００７６】
図５は、以上の結果を説明するＮ２Ｏ生成経路を模式的に示すマップである。図５に示すように、Ｎ２Ｏの生成経路の割合は、ヒドロキシルアミンの亜硝酸酸化経路（非生物学的経路）が５５．０％、ヒドロキシルアミンのＯ２酸化経路及びＮ２Ｏ２Ｈ４酸化又はＮＯＨ酸化経路の合計が３３．１％、並びに、ＮＯのＯ２酸化経路が１１．９％となっていることが判明した。これらの値は、図４に示すＰｈａｓｅＩＩＩにおける４４、４５、４６の分子量を有するＮ２Ｏの量を積算していくことにより算出することができた。
【００７７】
このようなマップが把握されたことで、用いた活性汚泥の反応経路の概要を把握することができた。
【００７８】
一方、安定同位体による評価によりハイブリッドなＮ２Ｏの生成が確認されたが、これが生物学的な経路を通ったものなのか、化学的な経路を通ったものなのかについての判断は、上記実験系では未だ十分に明らかとはいえない。すなわち、上記実験系においては、安定性同位体を用いた解析により物質の流れを追うことが出来るものの、化学的および生物学的な反応を区分するためにはさらに情報が必要である。
【００７９】
そこで、ＡＯＢの機能遺伝子（ｍＲＮＡ）の定量を行った。図６（ａ）は、溶存酸素濃度７．０ｍｇ／Ｌの回分試験における各機能遺伝子の相対発現量（アンモニア人工排水を添加して実験開始する前のｍＲＮＡ発現量を１とした）を時間に対してプロットしたグラフである。図６（ｂ）は、溶存酸素濃度７．０ｍｇ／Ｌの回分試験における各機能遺伝子
の相対発現量（アンモニア人工排水を添加して実験開始する前のｍＲＮＡ発現量を１とした）を時間に対してプロットしたグラフである。図６（ａ）及び（ｂ）共に、同じ溶存酸素濃度の試験であるが、ＡＯＢの種類と活性が互いに異なる活性汚泥を対象にしており、図６（ｂ）の試験の場合は、ＡＯＢの活性が低いときの系を対象とした。各酵素に対応するｍＲＮＡは、ぞれぞれ、ＡＭＯに対してａｍｏＡ、ＨＡＯに対してｈａｏＡ、ＮＩＲに対してｎｉｒＫ、ＮＯＲに対してｎｏｒＢとして図中に記載した。また、図６には、上述の各Ｐｈａｓｅを記載した。
【００８０】
図６（ａ）をみると、ＡＯＢの機能遺伝子に関するｍＲＮＡの相対値（アンモニア人工排水を添加して実験開始する前のｍＲＮＡ発現量を１とした）を比較すると、活性汚泥のｍＲＮＡ発現量が、よりダイナミックに変動し（最大：ｎｉｒＫで相対発現量１４８倍）、高いＮ２Ｏの発生量と挙動が一致することが判明した。一方で、ＡＯＢの活性が極めて低いケースの場合（図６（ｂ））、ｍＲＮＡの動きは極めて鈍く、大きな変化が見られなかった。このようにｍＲＮＡの働きと、Ｎ２Ｏの生成に関しては、相関性が高く、生物学的経路、非生物学的経路（化学的経路）のどちらがより支配的な実験系となっているかについての評価を行うためのツールとなることが分かった。
【００８１】
以上の実験結果より、安定同位体を用いたＮ２Ｏ生成経路の解析と、アンモニア酸化細菌の活性を表す指標となるｍＲＮＡの定量分析との融合により、菌叢の正確なＮ２Ｏ発生経路を把握することができ、生物学的または非生物学的なＮ２Ｏの生成経路を正確に知ることが可能であることが判明した。
【００８２】
以上実験例の結果から、本発明は、あらゆる排水処理施設や、土壌等の菌叢におけるＮ２Ｏの放出経路を明らかにすることができ、Ｎ２Ｏの環境への放出の抑制に向けた戦術を示すことができることが判明した。また、本発明は、例えば、発生経路に関する数式モデルの開発に適用することができる。本発明によれば、例えば、排水処理施設の運転管理や土壌の品質管理にフィードバックする情報を提供することができ、長期間の実験を要することなく、Ｎ２Ｏの生成削減に関する具体的な対策を見出すことができる。
【産業上の利用可能性】
【００８３】
本発明は、ＡＯＢによるＮ２Ｏ生成経路を正確に把握することが可能にする手法を含む。そのため、排水処理からの正確なＮ２Ｏの放出経路の特定と放出量の削減に向けた明確な戦術を打ち立てることが可能になり、排水処理施設からの温室効果ガス排出の削減に貢献することができる。また、本発明は、排水処理施設のみならず、自然環境中におけるあらゆる環境への適用が可能である。例えば、Ｎ２Ｏ生成の温床となっている土壌（畑）や、埋立地最終処分場、水田等様々な工業的、工学的及び農業的な分野に適用することができ、それら各々からのＮ２Ｏの放出経路を明確にすることが可能であり、これにより環境へのＮ２Ｏの放出抑制の戦略の組立てなどに貢献することができる。
【００８４】
本発明は、上述した実施形態に限定されるものではなく、さらに種々の変形が可能である。例えば、本発明は、実施形態で説明した構成と実質的に同一の構成（例えば、機能、方法及び結果が同一の構成、あるいは目的及び効果が同一の構成）を含む。また、本発明は、実施形態で説明した構成の本質的でない部分を置き換えた構成を含む。また、本発明は、実施形態で説明した構成と同一の作用効果を奏する構成又は同一の目的を達成することができる構成を含む。また、本発明は、実施形態で説明した構成に公知技術を付加した構成を含む。
【図１】
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【図５】
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【図６】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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