(57)【要約】      （修正有）【課題】細胞膜を横切る生物活性分子の横断を容易にする新規の巨大分子伝達ドメイン（ＭＴＤ）ペプチドの提供。【解決手段】生物活性分子の細胞内への輸送を媒介することができるペプチドであって、多数のアミノ酸配列データベースからシグナル配列様ドメインを有する分泌タンパク質を同定する段階と、前記同定された分泌タンパク質から、それらのＮ末端に単一の疎水性領域を有しかつヘリックス構造を形成する疎水性ペプチドを選択単離されたＭＴＤペプチド、前記ＭＴＤペプチドをコードするポリヌクレオチド。前記ＭＴＤペプチドを同定する方法、前記ＭＴＤペプチドを用いて生物活性分子が細胞透過性を有するように遺伝的に操作する方法、前記ＭＴＤペプチドを用いて細胞内に生物活性分子を流入させる方法、およびその使用。【選択図】図１ａ−１
2014057586.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物活性分子の細胞内への輸送を媒介することができるペプチドであって、配列番号：１〜１９３からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、単離された巨大分子伝達ドメイン（ＭＴＤ）ペプチド。
【請求項２】
請求項１記載の巨大分子伝達ドメイン（ＭＴＤ）ペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項３】
配列番号：１９４〜３８６からなる群より選択されるヌクレオチド配列を有する、請求項２記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項４】
多数のアミノ酸配列データベースからシグナル配列様ドメインを有する分泌タンパク質を同定する段階と、
前記同定された分泌タンパク質から、それらのＮ末端に単一の疎水性領域を有しかつヘリックス構造を形成する疎水性ペプチドを選択する段階と、
ＭＴＤペプチドとしての使用に適したペプチドを生成するのに効果的な条件下で、前記選択された疎水性ペプチドを最適化および最小化する段階と
を含む、生物活性分子の細胞内への輸送を媒介することができる巨大分子伝達ドメイン（ＭＴＤ）ペプチドを同定する方法。
【請求項５】
前記シグナル配列様ドメインが、
2014057586.tif 000027
からなる群より選択される、請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記アミノ酸配列データベースが、ＰｕｂＭｅｄ  Ｅｎｔｒｅｚ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａｂａｓｅからなる群より選択される、請求項４記載の方法。
【請求項７】
選択された疎水性ペプチドの左側または右側で非疎水性アミノ酸を除去して、この疎水性領域は維持しながらペプチド長さを最小化する段階と、
選択された疎水性ペプチドの中間または右側で非疎水性アミノ酸を疎水性アミノ酸であるプロリンで置き換えて柔軟性を与える段階と、
繰り返される疎水性アミノ酸の数を最小化してペプチドの長さを減少させる段階と
によって、前記最適化および最小化段階が行われる、請求項４記載の方法。
【請求項８】
前記最適化および最小化の結果として生成されたＭＴＤペプチドが、細胞透過性、疎水性、および柔軟性を示し、約７〜約１７アミノ酸長を有し、かつヘリックス構造を形成する、請求項４記載の方法。
【請求項９】
前記ＭＴＤペプチドが配列番号：１〜１９３からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
配列番号：１〜１９３からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する巨大分子伝達ドメイン（ＭＴＤ）ペプチドと、生物活性分子とを含む、細胞透過性を有する単離された組換えタンパク質。
【請求項１１】
前記生物活性分子が、タンパク質、ポリペプチド、およびペプチドからなる群より選択される、請求項１０記載の単離された組換えタンパク質。
【請求項１２】
前記生物活性分子が、成長因子、酵素、転写因子、毒素、抗原性ペプチド、抗体、および抗体断片からなる群より選択される、請求項１０記載の単離された組換えタンパク質。
【請求項１３】
前記生物活性分子が、酵素、ホルモン、輸送タンパク質、免疫グロブリン、抗体、構造タンパク質、運動機能タンパク質、受容体、シグナル伝達タンパク質、貯蔵タンパク質、膜タンパク質、膜貫通タンパク質、内部タンパク質、外部タンパク質、分泌タンパク質、ウィルスタンパク質、ネイティブタンパク質、糖タンパク質、切断されたタンパク質、ジスルフィド結合を有するタンパク質、タンパク質複合体、化学的に修飾されたタンパク質、およびプリオンからなる群より選択される、請求項１２記載の単離された組換えタンパク質。
【請求項１４】
前記生物活性分子が、核酸、コード核酸配列、ｍＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ分子、糖質、脂質、および糖脂質からなる群より選択される、請求項１０記載の単離された組換えタンパク質。
【請求項１５】
前記生物活性分子が治療剤である、請求項１０記載の単離された組換えタンパク質。
【請求項１６】
前記生物活性分子が治療薬物および毒性化合物からなる群より選択される、請求項１５記載の単離された組換えタンパク質。
【請求項１７】
細胞透過性を有する生物活性分子を生成するのに効果的な条件下で巨大分子伝達ドメイン（ＭＴＤ）ペプチドを生物活性分子に付着させる段階を含む、細胞透過性を有する生物活性分子を遺伝的に操作する方法であって、前記ＭＴＤペプチドが配列番号：１〜１９３からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、方法。
【請求項１８】
前記付着させる段階が、生物活性分子のＮ末端、Ｃ末端、その両方、またはその中間にＭＴＤペプチドを付着させることを含む、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
前記付着させる段階が、ペプチド結合によってＭＴＤペプチドを生物活性分子に付着させることを含む、請求項１７記載の方法。
【請求項２０】
前記付着させる段階が、共有結合によってＭＴＤペプチドを生物活性分子に付着させることを含む、請求項１７記載の方法。
【請求項２１】
生物活性分子に付着された巨大分子伝達ドメイン（ＭＴＤ）ペプチドを含む細胞透過性組換えタンパク質を対象に投与する段階を含む、対象において細胞内に生物活性分子を輸送する方法であって、前記ＭＴＤペプチドが配列番号：１〜１９３からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、方法。
【請求項２２】
ＭＴＤペプチドが配列番号：１〜１９３からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、薬物送達のための巨大分子伝達ドメイン（ＭＴＤ）ペプチドの使用。
【請求項２３】
ＭＴＤペプチドが配列番号：１〜１９３からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、ワクチン投与のための巨大分子伝達ドメイン（ＭＴＤ）ペプチドの使用。
【請求項２４】
ＭＴＤペプチドが配列番号：１〜１９３からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、タンパク質療法のための巨大分子伝達ドメイン（ＭＴＤ）ペプチドの使用。
【請求項２５】
ＭＴＤペプチドが配列番号：１〜１９３からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、遺伝子療法のための巨大分子伝達ドメイン（ＭＴＤ）ペプチドの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞膜を横切る生物活性分子の横断を容易にする新規の巨大分子伝達ドメイン（ＭＴＤ）ペプチド、前記ＭＴＤペプチドをコードするポリヌクレオチド、前記ＭＴＤペプチドを同定する方法、前記ＭＴＤペプチドを用いて生物活性分子が細胞透過性を有するように遺伝的に操作する方法、前記ＭＴＤペプチドを用いて細胞内に生物活性分子を流入させる方法、およびこの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、オリゴヌクレオチド、およびペプチドのような巨大分子の細胞内在化は、このような分子に対して不透過性障壁を構成する原形質膜の存在によって依然として困難な課題である。このような分子を所望の標的に送達する際には、組織または細胞内への低い浸透、特定の組織または細胞を標的にする不十分な特異性により全身に送達される時の毒性、特定の標的細胞または組織で適当な局所濃度を達成するために高濃度で送達される時の副作用、および分解により不十分な量が標的に送達されかつ／又は分解の副産物が好ましくない副作用を引き起こすことを含む、数多くの問題に直面する。
【０００３】
このような問題を解決するために、いくつかの担体媒介送達システムが開発された。これらの中で、最近ペプチドベースの送達システムの使用に大いに関心が集中している。細胞透過性を有するペプチドの使用は様々な長所を有し、これは主に前記ペプチド配列になされ得る多様な改変に起因する。これは、他の細胞のサブドメインにアドレスすることができる、および／または様々なタイプの積荷分子を輸送することができる担体の操作を可能にする。
【０００４】
多くの細胞透過性ペプチドが、組換えタンパク質、シグナルペプチド、膜貫通ドメイン、および抗微生物ペプチドのような、膜相互作用タンパク質の配列から設計される。このような配列内で、タンパク質伝達ドメイン（ＰＴＤ）と呼ばれる短い配列は担体または受容体を必要とせず、生物学的膜を効果的に横切ってペプチドまたはタンパク質を細胞内区画へ送達することが立証された。数多くの研究により、ＰＴＤベースのペプチドの使用がウィルス性疾患または癌の治療に非常に重要であり得ることが提示された。前記ＰＴＤベースのペプチドの中で、ペネトラチン（ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ）と呼ばれるアンテナペディアのホメオドメインの第３のヘリックス（Ｊｏｌｉｏｔ、Ａ．およびＡ．Ｐｒｏｃｈｉａｎｔｚ、Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．６（３）：１８９−９６（２００４）（非特許文献１））、ＨＩＶ−１のトランス活性化（ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｉｎｇ）タンパク質Ｔａｔ由来Ｔａｔペプチド（Ｗａｄｉａ、Ｊ．Ｓ．およびＳ．Ｆ．Ｄｏｗｄｙ、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１３（１）：５２−６（２００２）（非特許文献２））、トランスポータン（ｔｒａｎｓｐｏｒｔａｎ）（Ｐｏｏｇａら、Ｆａｓｅｂ  Ｊ．１２（１）：６７−７７（１９９８）（非特許文献３））、およびＶＰ２２（Ｅｌｌｉｏｔｔ、Ｇ．およびＰ．Ｏ’Ｈａｒｅ、Ｃｅｌｌ  ８８（２）：２２３−３３（１９９７）（非特許文献４））がペプチド、タンパク質、およびオリゴヌクレオチドの細胞取り込みを向上させるものと示された。
【０００５】
両親媒性ペプチドと呼ばれる細胞透過性ペプチドの２番目のカテゴリーも記載されている。両親媒性分子は、簡略に、親水性（極性）ドメインおよび疎水性（非極性）ドメインの二つのドメインで構成されるものと定義できる。ペプチドに関して、両親媒性の特性は、一次構造または二次構造のいずれかに起因する。一次両親媒性ペプチドは、疎水性残基のドメインと親水性残基のドメインのシーケンシャルな集合として定義される。二次両親媒性ペプチドは、分子の反対側に疎水性および親水性残基の配置を可能にする立体配置状態によって形成される。
【０００６】
ポリアルギニン系ペプチド、カルシトニン由来ペプチド、およびオリゴマーのような他のペプチドが、治療剤の細胞内送達のための手段として更に提案されてきた。
【０００７】
しかし、現在公知となっている送達システムはそれらの効率不足および／又はそれらの毒性のために制約的なものと見られ、それらの効率を向上させるために悪条件を構成するそれらの細胞内取り込み経路については殆ど知られていない。また、数多くの送達システムが細胞膜および核膜を横切るそれらの能力において制約的である。このような送達ペプチドが細胞膜を横切る場合にも、これらはエンドソーム内のこれらの捕捉によりこれらの効率において時々制約的である。
【０００８】
本発明は、当技術分野においてこのような欠点を克服するためのものである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｊｏｌｉｏｔ、Ａ．およびＡ．Ｐｒｏｃｈｉａｎｔｚ、Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．６（３）：１８９−９６（２００４）
【非特許文献２】Ｗａｄｉａ、Ｊ．Ｓ．およびＳ．Ｆ．Ｄｏｗｄｙ、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１３（１）：５２−６（２００２）
【非特許文献３】Ｐｏｏｇａら、Ｆａｓｅｂ  Ｊ．１２（１）：６７−７７（１９９８）
【非特許文献４】Ｅｌｌｉｏｔｔ、Ｇ．およびＰ．Ｏ’Ｈａｒｅ、Ｃｅｌｌ  ８８（２）：２２３−３３（１９９７）
【発明の概要】
【００１０】
［技術的解決］
本発明は、生物活性分子の細胞内への輸送を媒介できる単離された巨大分子伝達ドメイン（ＭＴＤ）ペプチドに関する。
【００１１】
本発明の他の側面は、そのようなＭＴＤペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドに関する。
【００１２】
本発明はまた、細胞透過性を有するＭＴＤペプチドを同定する方法に関する。
【００１３】
本発明の他の側面は、ＭＴＤペプチドを生物活性分子に付着させることによって、細胞透過性を有する生物活性分子を遺伝的に操作する方法に関する。
【００１４】
本発明の他の側面は、細胞透過性を有するＭＴＤペプチドと生物活性分子とを含み細胞透過性を有する単離された組換えタンパク質に関する。
【００１５】
本発明は、ＭＴＤが生物活性分子に付着されている細胞透過性の組換えタンパク質を含む、細胞に生物活性分子を送達するための薬学的組成物に関する。
【００１６】
本発明の他の側面は、生物活性分子に付着されたＭＴＤペプチドを含む細胞透過性組換えタンパク質を対象に投与することを含む、対象において細胞内に生物活性分子を輸送する方法に関する。
【００１７】
本発明の他の側面は、薬物送達、ワクチンの投与、タンパク質療法、および遺伝子療法のためのＭＴＤペプチドの使用に関する。
［有利な効果］
【００１８】
本発明は、細胞内への生物活性分子の輸送を容易にすることができ、それによって、薬物送達、ワクチンの投与、ペプチド療法、および遺伝子療法に効果的に用いられる細胞透過性を有するＭＴＤペプチドを提供する。
[請求項101]
生物活性分子の細胞内への輸送を媒介することができるペプチドであって、配列番号:1〜193からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、単離された巨大分子伝達ドメイン(MTD)ペプチド。
[請求項102]
請求項101記載の巨大分子伝達ドメイン(MTD)ペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
[請求項103]
配列番号:194〜386からなる群より選択されるヌクレオチド配列を有する、請求項102記載の単離されたポリヌクレオチド。
[請求項104]
多数のアミノ酸配列データベースからシグナル配列様ドメインを有する分泌タンパク質を同定する段階と、
前記同定された分泌タンパク質から、それらのN末端に単一の疎水性領域を有しかつヘリックス構造を形成する疎水性ペプチドを選択する段階と、
MTDペプチドとしての使用に適したペプチドを生成するのに効果的な条件下で、前記選択された疎水性ペプチドを最適化および最小化する段階と
を含む、生物活性分子の細胞内への輸送を媒介することができる巨大分子伝達ドメイン(MTD)ペプチドを同定する方法。
[請求項105]
前記シグナル配列様ドメインが、
2014057586.tif 000003
からなる群より選択される、請求項104記載の方法。
[請求項106]
前記アミノ酸配列データベースが、PubMed Entrez Protein Databaseからなる群より選択される、請求項104記載の方法。
[請求項107]
選択された疎水性ペプチドの左側または右側で非疎水性アミノ酸を除去して、この疎水性領域は維持しながらペプチド長さを最小化する段階と、
選択された疎水性ペプチドの中間または右側で非疎水性アミノ酸を疎水性アミノ酸であるプロリンで置き換えて柔軟性を与える段階と、
繰り返される疎水性アミノ酸の数を最小化してペプチドの長さを減少させる段階と
によって、前記最適化および最小化段階が行われる、請求項104記載の方法。
[請求項108]
前記最適化および最小化の結果として生成されたMTDペプチドが、細胞透過性、疎水性、および柔軟性を示し、約7〜約17アミノ酸長を有し、かつヘリックス構造を形成する、請求項104記載の方法。
[請求項109]
前記MTDペプチドが配列番号:1〜193からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、請求項108記載の方法。
[請求項110]
配列番号:1〜193からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する巨大分子伝達ドメイン(MTD)ペプチドと、生物活性分子とを含む、細胞透過性を有する単離された組換えタンパク質。
[請求項111]
前記生物活性分子が、タンパク質、ポリペプチド、およびペプチドからなる群より選択される、請求項110記載の単離された組換えタンパク質。
[請求項112]
前記生物活性分子が、成長因子、酵素、転写因子、毒素、抗原性ペプチド、抗体、および抗体断片からなる群より選択される、請求項110記載の単離された組換えタンパク質。
[請求項113]
前記生物活性分子が、酵素、ホルモン、輸送タンパク質、免疫グロブリン、抗体、構造タンパク質、運動機能タンパク質、受容体、シグナル伝達タンパク質、貯蔵タンパク質、膜タンパク質、膜貫通タンパク質、内部タンパク質、外部タンパク質、分泌タンパク質、ウィルスタンパク質、ネイティブタンパク質、糖タンパク質、切断されたタンパク質、ジスルフィド結合を有するタンパク質、タンパク質複合体、化学的に修飾されたタンパク質、およびプリオンからなる群より選択される、請求項112記載の単離された組換えタンパク質。
[請求項114]
前記生物活性分子が、核酸、コード核酸配列、mRNA、アンチセンスRNA分子、糖質、脂質、および糖脂質からなる群より選択される、請求項110記載の単離された組換えタンパク質。
[請求項115]
前記生物活性分子が治療剤である、請求項110記載の単離された組換えタンパク質。
[請求項116]
前記生物活性分子が治療薬物および毒性化合物からなる群より選択される、請求項115記載の単離された組換えタンパク質。
[請求項117]
細胞透過性を有する生物活性分子を生成するのに効果的な条件下で巨大分子伝達ドメイン(MTD)ペプチドを生物活性分子に付着させる段階を含む、細胞透過性を有する生物活性分子を遺伝的に操作する方法であって、前記MTDペプチドが配列番号:1〜193からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、方法。
[請求項118]
前記付着させる段階が、生物活性分子のN末端、C末端、その両方、またはその中間にMTDペプチドを付着させることを含む、請求項117記載の方法。
[請求項119]
前記付着させる段階が、ペプチド結合によってMTDペプチドを生物活性分子に付着させることを含む、請求項117記載の方法。
[請求項120]
前記付着させる段階が、共有結合によってMTDペプチドを生物活性分子に付着させることを含む、請求項117記載の方法。
[請求項121]
生物活性分子に付着された巨大分子伝達ドメイン(MTD)ペプチドを含む細胞透過性組換えタンパク質を対象に投与する段階を含む、対象において細胞内に生物活性分子を輸送する方法であって、前記MTDペプチドが配列番号:1〜193からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、方法。
[請求項122]
MTDペプチドが配列番号:1〜193からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、薬物送達のための巨大分子伝達ドメイン(MTD)ペプチドの使用。
[請求項123]
MTDペプチドが配列番号:1〜193からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、ワクチン投与のための巨大分子伝達ドメイン(MTD)ペプチドの使用。
[請求項124]
MTDペプチドが配列番号:1〜193からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、タンパク質療法のための巨大分子伝達ドメイン(MTD)ペプチドの使用。
[請求項125]
MTDペプチドが配列番号:1〜193からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、遺伝子療法のための巨大分子伝達ドメイン(MTD)ペプチドの使用。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１ａ−１】図１ａ〜１ｏは、本発明の方法によって同定された巨大分子伝達ドメイン（ＭＴＤ）ペプチドのアミノ酸配列および構造的特徴を説明する表を示す。
【図１ａ−２】図１ａ−１の続きを示す図である。
【図１ａ−３】図１ａ−２の続きを示す図である。
【図１ａ−４】図１ａ−３の続きを示す図である。
【図１ｂ−１】図１ａ−４の続きを示す図である。
【図１ｂ−２】図１ｂ−１の続きを示す図である。
【図１ｂ−３】図１ｂ−２の続きを示す図である。
【図１ｂ−４】図１ｂ−３の続きを示す図である。
【図１ｃ−１】図１ｂ−４の続きを示す図である。
【図１ｃ−２】図１ｃ−１の続きを示す図である。
【図１ｃ−３】図１ｃ−２の続きを示す図である。
【図１ｃ−４】図１ｃ−３の続きを示す図である。
【図１ｄ−１】図１ｃ−４の続きを示す図である。
【図１ｄ−２】図１ｄ−１の続きを示す図である。
【図１ｄ−３】図１ｄ−２の続きを示す図である。
【図１ｄ−４】図１ｄ−３の続きを示す図である。
【図１ｅ−１】図１ｄ−４の続きを示す図である。
【図１ｅ−２】図１ｅ−１の続きを示す図である。
【図１ｅ−３】図１ｅ−２の続きを示す図である。
【図１ｅ−４】図１ｅ−３の続きを示す図である。
【図１ｆ−１】図１ｅ−４の続きを示す図である。
【図１ｆ−２】図１ｆ−１の続きを示す図である。
【図１ｆ−３】図１ｆ−２の続きを示す図である。
【図１ｆ−４】図１ｆ−３の続きを示す図である。
【図１ｇ−１】図１ｆ−４の続きを示す図である。
【図１ｇ−２】図１ｇ−１の続きを示す図である。
【図１ｇ−３】図１ｇ−２の続きを示す図である。
【図１ｇ−４】図１ｇ−３の続きを示す図である。
【図１ｈ−１】図１ｇ−４の続きを示す図である。
【図１ｈ−２】図１ｈ−１の続きを示す図である。
【図１ｈ−３】図１ｈ−２の続きを示す図である。
【図１ｈ−４】図１ｈ−３の続きを示す図である。
【図１ｉ−１】図１ｈ−４の続きを示す図である。
【図１ｉ−２】図１ｉ−１の続きを示す図である。
【図１ｉ−３】図１ｉ−２の続きを示す図である。
【図１ｉ−４】図１ｉ−３の続きを示す図である。
【図１ｊ−１】図１ｉ−４の続きを示す図である。
【図１ｊ−２】図１ｊ−１の続きを示す図である。
【図１ｊ−３】図１ｊ−２の続きを示す図である。
【図１ｊ−４】図１ｊ−３の続きを示す図である。
【図１ｋ−１】図１ｊ−４の続きを示す図である。
【図１ｋ−２】図１ｋ−１の続きを示す図である。
【図１ｋ−３】図１ｋ−２の続きを示す図である。
【図１ｋ−４】図１ｋ−３の続きを示す図である。
【図１ｌ−１】図１ｋ−４の続きを示す図である。
【図１ｌ−２】図１ｌ−１の続きを示す図である。
【図１ｌ−３】図１ｌ−２の続きを示す図である。
【図１ｌ−４】図１ｌ−３の続きを示す図である。
【図１ｍ−１】図１ｌ−４の続きを示す図である。
【図１ｍ−２】図１ｍ−１の続きを示す図である。
【図１ｍ−３】図１ｍ−２の続きを示す図である。
【図１ｍ−４】図１ｍ−３の続きを示す図である。
【図１ｎ−１】図１ｍ−４の続きを示す図である。
【図１ｎ−２】図１ｎ−１の続きを示す図である。
【図１ｎ−３】図１ｎ−２の続きを示す図である。
【図１ｎ−４】図１ｎ−３の続きを示す図である。
【図１ｏ−１】図１ｎ−４の続きを示す図である。
【図１ｏ−２】図１ｏ−１の続きを示す図である。
【図１ｏ−３】図１ｏ−２の続きを示す図である。
【図１ｏ−４】図１ｏ−３の続きを示す図である。
【図２】図２は、細胞透過性を有する本発明によって構築されたＨｉｓ−ＭＴＤ−ＥＧＦＰ組換えタンパク質を説明する模式図である。
【図３ａ】図３ａ〜３ｃは、本発明に従いＰＣＲにより増幅されたＭＴＤ−ＥＧＦＰをコードするＤＮＡ断片を示すアガロースゲル電気泳動分析の写真である。
【図３ｂ】図３ａの続きを示す図である。
【図３ｃ】図３ｂの続きを示す図である。
【図４ａ】図４ａは、本発明によるｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙベクター内へのＭＴＤ−ＥＧＦＰをコードするＤＮＡ断片のサブクローニングを説明する模式図である。
【図４ｂ】図４ｂ〜４ｄは、本発明によってｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙベクター内にサブクローニングされたＭＴＤ−ＥＧＦＰをコードするＤＮＡ断片を示すアガロースゲル電気泳動分析の写真である。
【図４ｃ】図４ｂの続きを示す図である。
【図４ｄ】図４ｃの続きを示す図である。
【図５ａ】図５ａは、本発明によるｐＥＴ  ２８（＋）ベクター内へのＭＴＤ−ＥＧＦＰをコードするＤＮＡ断片のクローニングを説明する模式図である。
【図５ｂ】図５ｂ〜５ｃは本発明によってｐＥＴ  ２８（＋）ベクター内にクローニングされたＭＴＤ−ＥＧＦＰをコードするＤＮＡ断片を示すアガロースゲル電気泳動分析の写真である。
【図５ｃ】図５ｂの続きを示す図である。
【図６ａ】図６ａおよび６ｂは、本発明によるＨｉｓ−ＭＴＤ−ＥＧＦＰ組換えタンパク質の誘導性発現を説明するＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の写真である。
【図６ｂ】図６ａの続きを示す図である。
【図７ａ】図７ａおよび７ｂは、本発明による変性条件下でＨｉｓ−ＭＴＤ−ＥＧＦＰ組換えタンパク質の純度を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の写真である。
【図７ｂ】図７ａの続きを示す図である。
【図８】図８は、本発明による復元（ｒｅｎａｔｕｒｉｎｇ）条件下でＨｉｓ−ＭＴＤ−ＥＧＦＰ組換えタンパク質の精製を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の写真である。
【図９ａ】図９ａ〜９ｇは、本発明によるフローサイトメトリーにより分析されたＨｉｓ−ＭＴＤ−ＥＧＦＰ組換えタンパク質の細胞透過性を説明するグラフである。
【図９ｂ】図９ａの続きを示す図である。
【図９ｃ】図９ｂの続きを示す図である。
【図９ｄ】図９ｃの続きを示す図である。
【図９ｅ】図９ｄの続きを示す図である。
【図９ｆ】図９ｅの続きを示す図である。
【図９ｇ】図９ｆの続きを示す図である。
【図１０ａ】図１０ａ〜１０ｉは、本発明によって共焦点レーザ走査顕微鏡によりＨｉｓ−ＭＴＤ−ＥＧＦＰ組換えタンパク質の細胞透過性を可視化した写真である。
【図１０ｂ】図１０ａの続きを示す図である。
【図１０ｃ】図１０ｂの続きを示す図である。
【図１０ｄ】図１０ｃの続きを示す図である。
【図１０ｅ】図１０ｄの続きを示す図である。
【図１０ｆ】図１０ｅの続きを示す図である。
【図１０ｇ】図１０ｆの続きを示す図である。
【図１０ｈ】図１０ｇの続きを示す図である。
【図１０ｉ】図１０ｈの続きを示す図である。
【図１１ａ】図１１ａおよび１１ｂは、本発明によるＨｉｓ−ＭＴＤ−ＥＧＦＰ組換えタンパク質の細胞透過性を陽性対照と比較したグラフである。
【図１１ｂ】図１１ａの続きを示す図である。
【図１２ａ】図１２ａ〜１２ｉは、本発明によって蛍光顕微鏡によりＨｉｓ−ＭＴＤ−ＥＧＦＰ組換えタンパク質のインビボ分布を可視化した写真である。
【図１２ｂ】図１２ａの続きを示す図である。
【図１２ｃ】図１２ｂの続きを示す図である。
【図１２ｄ】図１２ｃの続きを示す図である。
【図１２ｅ】図１２ｄの続きを示す図である。
【図１２ｆ】図１２ｅの続きを示す図である。
【図１２ｇ】図１２ｆの続きを示す図である。
【図１２ｈ】図１２ｇの続きを示す図である。
【図１２ｉ】図１２ｈの続きを示す図である。
【図１３ａ−１】図１３ａ〜１３ｋは、本発明の方法によって同定されたＭＴＤペプチドの特徴を要約した表を示す。
【図１３ａ−２】図１３ａ−１の続きを示す図である。
【図１３ａ−３】図１３ａ−２の続きを示す図である。
【図１３ｂ−１】図１３ａ−３の続きを示す図である。
【図１３ｂ−２】図１３ｂ−１の続きを示す図である。
【図１３ｂ−３】図１３ｂ−２の続きを示す図である。
【図１３ｃ−１】図１３ｂ−３の続きを示す図である。
【図１３ｃ−２】図１３ｃ−１の続きを示す図である。
【図１３ｃ−３】図１３ｃ−２の続きを示す図である。
【図１３ｄ−１】図１３ｃ−３の続きを示す図である。
【図１３ｄ−２】図１３ｄ−１の続きを示す図である。
【図１３ｄ−３】図１３ｄ−２の続きを示す図である。
【図１３ｅ−１】図１３ｄ−３の続きを示す図である。
【図１３ｅ−２】図１３ｅ−１の続きを示す図である。
【図１３ｅ−３】図１３ｅ−２の続きを示す図である。
【図１３ｆ−１】図１３ｅ−３の続きを示す図である。
【図１３ｆ−２】図１３ｆ−１の続きを示す図である。
【図１３ｆ−３】図１３ｆ−２の続きを示す図である。
【図１３ｇ−１】図１３ｆ−３の続きを示す図である。
【図１３ｇ−２】図１３ｇ−１の続きを示す図である。
【図１３ｇ−３】図１３ｇ−２の続きを示す図である。
【図１３ｈ−１】図１３ｇ−３の続きを示す図である。
【図１３ｈ−２】図１３ｈ−１の続きを示す図である。
【図１３ｈ−３】図１３ｈ−２の続きを示す図である。
【図１３ｉ−１】図１３ｈ−３の続きを示す図である。
【図１３ｉ−２】図１３ｉ−１の続きを示す図である。
【図１３ｉ−３】図１３ｉ−２の続きを示す図である。
【図１３ｊ−１】図１３ｉ−３の続きを示す図である。
【図１３ｊ−２】図１３ｊ−１の続きを示す図である。
【図１３ｊ−３】図１３ｊ−２の続きを示す図である。
【図１３ｋ】図１３ｊ−３の続きを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
詳細な説明
本発明は、細胞膜を横切る生物活性分子の横断を容易にする細胞透過性を有する新規の巨大分子伝達ドメイン（ＭＴＤ）ペプチドに関するものである。本発明のＭＴＤペプチドは、ポリペプチド、タンパク質ドメイン、または全長タンパク質を含む、細胞膜を通過する生物活性分子の流入を媒介できる細胞透過性ポリペプチドである。本発明のＭＴＤペプチドはこれらのＮ末端に単一疎水性領域を有し、ヘリックス構造を形成し、柔軟性を示し、相対的に短い長さのアミノ酸（７〜１７のアミノ酸）を有することを特徴とする（図１ａ〜１ｏ参照）。
【００２１】
本発明の一実施形態は、細胞透過性を有する単離されたＭＴＤペプチドに関し、このＭＴＤペプチドは配列番号：１〜１９３からなる群より選択されるアミノ酸配列、これらの類似体、誘導体、アミド化変種、および保存的変種を有する。
【００２２】
当業者は、より高い細胞透過性およびより広い宿主範囲を有するペプチドを得るために類似の代替物を作ることができる。例えば、本発明は、ペプチドの細胞透過性が維持される限り、これらの類似体、誘導体、およびアミド化誘導体だけでなく、配列番号：１〜１９３のアミノ酸配列に対応するペプチドを提供する。本発明のペプチドの一次アミノ酸配列に対する微少な改変は本明細書に記載した特定のペプチドと比較して、実質的に同等であるか或いは増加した細胞透過性を有するペプチドを生成することもできる。このような改変は、部位特異的突然変異によるように意図的であるか、または自然発生的であってよい。元のペプチドの細胞透過性が依然として存在しているか、または前記ペプチドのアミド化変種の場合、前記アミド化ペプチドが治療的に有用なように元のペプチドの細胞透過性が増加または改変される限り、このような改変により生成された全てのペプチドは本発明に含まれる。このような改変が特定のペプチドの細胞透過性を改変または増強させるのに有用であることが予想される。
【００２３】
さらに、一つまたは複数のアミノ酸の欠失が、その細胞透過性におけるいかなる有意な変化なく、得られた分子の構造に対する改変を引き起こすことがある。これはまた、有用性を有し得るさらに小さな活性分子の開発につながる。例えば、特定のペプチドの細胞透過性に要求されないこともあるアミノまたはカルボキシ末端アミノ酸が除去され得る。本発明のペプチドは本明細書に記載した通り、細胞透過性を維持する限り、本出願に記載したペプチドの任意の類似体、ホモログ、突然変異体、異性体、または誘導体を含む。全てのペプチドはＬ−アミノ酸を用いて合成された；しかし、全てのペプチドのＤ形態が合成的に生産できる。また、Ｃ末端メチルエステルおよびＣ末端アミド化のようなＣ末端誘導体が、本発明のペプチドの細胞透過性を増加させるために生成され得る。
【００２４】
本発明の「ペプチド」は、本明細書に具体的に例示したそのようなペプチドの保存的変種であるアミノ酸配列を含む。本明細書で用いるように、用語「保存的変種」は、一つのアミノ酸残基を生物学的に類似の他の残基で置換することを意味する。保存的変種の例には、ある疎水性残基、例えばイソロイシン、バリン、ロイシン、アラニン、システイン、グリシン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、チロシン、ノルロイシン、もしくはメチオニンの別の残基との置換、またはある極性残基の別の残基との置換、例えばリシンのアルギニンに、アスパラギン酸のグルタミン酸に、またはアスパラギンのグルタミンにといった置換が含まれる。互いに置換できる中性親水性アミノ酸にはアスパラギン、グルタミン、セリン、およびスレオニンが含まれる。また、用語「保存的変種」は置換されたポリペプチドに対して引き起こされた抗体が、非置換のポリペプチドとも免疫的に反応する条件で、非置換の親アミノ酸の代わりに置換されたアミノ酸の使用を含む。このような保存的置換は本発明のペプチドの種類の定義内に含まれる。
【００２５】
本発明の他の側面は、本発明の前記ＭＴＤペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドに関するものである。例示的なヌクレオチドは、配列番号：１〜１９３からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＭＴＤペプチド、およびこの類似体、誘導体、アミド化変種、および保存的変種をコードする。本発明のＭＴＤペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号：１９４〜３８６で表示されるヌクレオチド配列を有する。
【００２６】
本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡまたはＤＮＡの形態であり、前記ＤＮＡはｃＤＮＡおよび合成ＤＮＡを含む。ＤＮＡは単鎖であるか或いは二本鎖である。もし単鎖であれば、これはコード鎖または非コード（アンチセンス）鎖であってよい。前記コード配列は配列番号：１９４〜３８６から選択されるヌクレオチド配列と同一なこともあり、または他のコード配列であることもあり得るが、前記コード配列は、遺伝的コードの縮重（ｄｅｇｅｎｅｒａｃｙ）または重複（ｒｅｄｕｎｄａｎｃｙ）の結果として、同一のポリペプチドをコードする。
【００２７】
また、本発明のポリヌクレオチドは前記のポリヌクレオチドの変異体も含むが、これは配列番号：１〜１９３の推定アミノ酸配列を特徴とするポリヌクレオチドの断片、類似体、および誘導体をコードする。前記ポリヌクレオチドの変異体はポリヌクレオチドの天然の対立遺伝子変異体またはポリヌクレオチドの非天然の変異体であってよい。
【００２８】
本発明のポリヌクレオチドは、配列番号：１９４〜３８６から選択されるヌクレオチド配列を特徴とするコード配列の天然の対立遺伝子変異体であるコード配列を有することもできる。対立遺伝子変異体は、コードされるポリヌクレオチドの機能を実質的に変更しない、一つまたは複数のヌクレオチドの置換、欠失、または付加を有し得るポリヌクレオチド配列の代替形態である。
【００２９】
また、本明細書に記載した配列と類似するかまたは同種（例えば、少なくとも約７０％の配列の同一性）の配列が本発明の一部分である。本発明の他の実施形態において、アミノ酸レベルで配列の同一性は、約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上であってもよい。ポリヌクレオチドレベルで、配列の同一性は約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上であってもよい。代案として、ポリヌクレオチドセグメントが前記鎖の相補体に選択的なハイブリダイゼーション条件（即ち、非常に高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件）下でハイブリダイズされる時、実質的な同一性が存在する。前記ポリヌクレオチドは全細胞内に、細胞溶解物内に、または部分的に精製されるか或いは実質的に純粋な形態で存在してもよい。
【００３０】
単一アミノ酸が一つまたは複数のヌクレオチドコドンによりコードされ得る前記ポリヌクレオチドが、同一のペプチドをコードする代替ポリヌクレオチドを生成するように容易に改変され得ることは、当業界でよく知られている。従って、本発明の他の実施形態は、上記のようなアミノ酸配列を含むペプチドをコードする代替ヌクレオチド配列を含む。前記特許請求されたアミノ酸配列を含むペプチドをコードする核酸分子は、前記特許請求された配列と特許請求されたアミノ酸配列のＮ末端またはＣ末端に位置した任意のアミノ酸の任意の組み合わせをコードするヌクレオチド配列を含む。
【００３１】
本発明のアミノ酸および核酸の配列は、付加的な残基、特にＮまたはＣ末端アミノ酸または５’または３’ポリヌクレオチドを含んでもよく、前記配列が組換えタンパク質のポリペプチドまたはタンパク質モイエティ（ｍｏｉｅｔｙ）に膜透過性を与える限り、本明細書に記載した配列に開示されたように依然として本質でもあることが理解される。
【００３２】
また、本発明は、細胞透過性を有するＭＴＤペプチドを同定する方法に関するものである。
【００３３】
本発明の方法は下記の段階を含む：
１）多数のアミノ酸配列データベースからシグナル配列様ドメインを有する分泌タンパク質を同定する段階と、
２）前記同定された分泌タンパク質から、それらのＮ末端に単一疎水性領域を有しかつヘリックス構造を形成する疎水性ペプチドを選択する段階と、
３）ＭＴＤペプチドとしての使用に適したペプチドを生成するのに効果的な条件下で、前記選択された疎水性ペプチドを最適化および最小化する段階。
【００３４】
潜在的に原形質膜を通過できる特定の候補ペプチドを同定するために、段階１）に記載した通り、シグナル配列様ドメインを有する分泌タンパク質を多数のアミノ酸配列データベースから同定する。本発明の特定の実施形態で、これら分泌タンパク質は「シグナル配列の疎水性領域」、「シグナル配列疎水性領域」、「分泌タンパク質のシグナル配列」、「疎水性シグナル配列」、および「分泌タンパク質の疎水性ドメイン」のような、多様な検索語を用いてＰｕｂＭｅｄ  Ｅｎｔｒｅｚ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａｂａｓｅから選択される。その結果、シグナル配列様ドメインを有する１，５００個以上の分泌タンパク質が同定される。
【００３５】
本明細書で用いるように、用語「シグナル配列様ドメイン」は原形質膜を横切る巨大分子転移を媒介することができるペプチドを指す。
【００３６】
本明細書で用いるように、用語「シグナルペプチド」は、タンパク質の翻訳後輸送を指示する短い（３〜６０アミノ酸長）ペプチドである。また、シグナルペプチドは標的化シグナル、シグナル配列、移送（ｔｒａｎｓｉｔ）ペプチド、または局在化シグナルと呼ばれることもある。シグナルペプチドのアミノ酸配列は、タンパク質（細胞質内で合成される）を、核、ミトコンドリア基質、小胞体、葉緑体、アポプラスト、およびペルオキシソームのような特定の器官へ誘導する。一部のシグナルペプチドは前記タンパク質が輸送された後、シグナルペプチダーゼによりタンパク質から切断される。分泌タンパク質のＮ末端配列は、細胞膜を通過する輸送に要求される。
【００３７】
シグナルペプチドの例示には、これに制限されないが、核への輸送
2014057586.tif 000004
小胞体への輸送
2014057586.tif 000005
小胞体への残留（ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ）
2014057586.tif 000006
ミトコンドリア基質への輸送
2014057586.tif 000007
ペルオキシソームへの輸送（ＰＴＳ１：−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−ＣＯＯＨ）、ペルオキシソームへの輸送（ＰＴＳ２：Ｈ２Ｎ−−−−−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｘ５−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−）（前記で、Ｈ２Ｎはタンパク質のＮ末端であり、ＣＯＯＨはタンパク質のＣ末端である）を含んでもよい。
【００３８】
シグナル配列様ドメインの例示には、これに制限されないが、
2014057586.tif 000008
を含んでもよい。
【００３９】
続いて、段階２）に記載した通り、そのＮ末端に単一疎水性領域を有しかつヘリックス構造を形成する疎水性ペプチドを、段階１）で同定された分泌タンパク質から選択する。段階１）で同定されたシグナル配列様ドメインを有するすべての分泌タンパク質は、これらがそのＮ末端に単一疎水性領域（Ｈ領域）を含むかどうかを決定するためにハイドロパシー分析に供され、続いてこれらがヘリックス構造を形成するかどうかを決定するためにコンピュータ補助ゲノムおよびプロテオミクス分析に供される。疎水性領域は通常、タンパク質に膜転位活性（ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｎｇ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）を与えるヘリックス構造を形成する。
【００４０】
本発明の一実施形態で、膜タンパク質のための分類および二次予測システムとして、ＳＯＳＵＩシステムが前記コンピュータ補助ゲノムおよびプロテオミクス分析のために用いられ得る。ＳＯＳＵＩシステムはタンパク質配列から膜タンパク質の二次的な構造予測に有用なツールとしてオンライン上で自由に利用可能である（ｈｔｔｐ：／／ｂｐ．ｎｕａｐ．ｎａｇｏｙａ−ｕ．ａｃ．ｊｐ／ｓｏｓｕｉ参考）。ＳＯＳＵＩシステムは、一般的に分析されるペプチドが少なくとも約２０アミノ酸長を有することを必要とするため、増強された緑色蛍光タンパク質のＮ末端ドメインに由来する付加的なアミノ酸が前記シグナル配列様ドメインの末端に付加される。ＳＯＳＵＩシステムを用いて、それらのＮ末端に単一疎水性領域を有しかつ膜貫通ヘリックス構造を形成する２２０個の疎水性ペプチドを選択する。
【００４１】
最後に、段階２）で選択された疎水性ペプチドは、段階３）に記載された通り、これらがＭＴＤペプチドとして用いるのに適するように最適化および最小化される。選択された疎水性ペプチドを最適化するために、これらは下記の通り実験的改変がなされる：ｉ）親水性、非極性、および正または負に荷電したアミノ酸を、選択された疎水性ペプチドから除去し、ｉｉ）５つの疎水性アミノ酸、即ちアラニン（ＡｌａまたはＡ）、バリン（ＶａｌまたはＶ）、プロリン（ＰｒｏまたはＰ）、ロイシン（ＬｅｕまたはＬ）、およびイソロイシン（ＩｌｅまたはＩ）の多様な組み合わせが実験的に生成される。前記疎水性アミノ酸は、Ｈ領域に柔軟性を提供することが知られており、これはシグナル配列の疎水性領域がヘアピン様ループを形成することを可能にし、その結果リン脂質二重層の不安定化された形態学的変化を引き起こし得る。柔軟なＨ領域との接触によって誘導される非二重層の脂質構造のこのような局部的かつ一時的な形成は位相変換を引き起こす。
【００４２】
前記の通り、最適化された疎水性ペプチドの長さを最小化するために、その中からいかなるアミノ酸が除去されなければならないのかを決定するために、下記の原理を用いる：ｉ）疎水性ペプチドの左側または右側で非疎水性アミノ酸がその疎水性領域は維持しながら、サイズを最小化するために除去され、ｉｉ）柔軟性または曲げポテンシャルを提供するために疎水性ペプチドの中間または右側で非疎水性アミノ酸が疎水性アミノ酸であるプロリン（ＰｒｏまたはＰ）で置換され、ｉｉｉ）疎水性ペプチドのサイズを減らすために繰り返された疎水性アミノ酸の数を最小化する。このように、ＭＴＤ候補は疎水性および柔軟性を示し、相対的に短いアミノ酸（７〜１７個）長を有し、ヘリックス構造を形成する改変されたペプチドとして特定される。
【００４３】
前記の本発明の方法によれば、配列番号：１〜１９３からなる群より選択されるアミノ酸配列を有しかつ細胞膜を横切る生物活性分子の横断を容易にできる新規のＭＴＤペプチドを同定することができる。
【００４４】
本発明の他の実施形態によれば、新規のＭＴＤの一つである、ＪＯ−９８（配列番号：９８）は下記の過程によって同定することができる。
ｉ）ヒト由来免疫グロブリンドメイン含有４を、シグナル配列様ドメインを有する分泌タンパク質として、ＰｕｂＭｅｄ  Ｅｎｔｒｅｚ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａｂａｓｅから選択し、
ｉｉ）ハイドロパシー分析を通じ、前記タンパク質が単一Ｎ末端疎水性領域を含むかを確認し、
ｉｉｉ）前記疎水性領域（Ｈ領域）を
2014057586.tif 000009
（２３アミノ酸長）で表示されるアミノ酸配列を有する前記タンパク質の全長シグナル配列から選択し、
ｉｖ）ＳＯＳＵＩシステムを用いた構造的分析を通じ、選択された疎水性領域がヘリックス構造を形成するかを確認し、
ｖ）前記疎水性領域の左側で非疎水性アミノ酸（メチオニン：Ｍ；グリシン：Ｇ）を除去し、前記疎水性領域の最初のアミノ酸を疎水性アミノ酸にし、
2014057586.tif 000010
（２１アミノ酸長）で表示されるアミノ酸配列を有する疎水性ペプチドを取得し、
ｖｉ）塩基性（ヒスチジン：Ｈ；アルギニン：Ｒ）および親水性（スレオニン：Ｔ；アスパラギン酸：Ｄ；チロシン：Ｙ）アミノ酸を前記疎水性領域から除去して、ペプチドの長さを１５アミノ酸以下に減らし、その結果
2014057586.tif 000011
（１５アミノ酸長）で表示されるアミノ酸配列を有するペプチドを得て、
ｖｉｉ）構造分析で、前記のような、改変されたペプチドがヘリックス構造を形成することを確認し、
ｖｉｉｉ）前記ペプチドに柔軟性を付与するために、ペプチドの中間および右側で非極性アミノ酸（グリシン：Ｇ）を各々疎水性アミノ酸であるプロリン（Ｐ）で置換し、その結果
2014057586.tif 000012
（１５アミノ酸長）で表示されるアミノ酸配列を有するペプチドを得、
ｉｘ）前記ペプチド配列の極右側で繰り返される疎水性アミノ酸の一部を除去してペプチドの長さを１０アミノ酸以下に減らす。
【００４５】
従って、巨大分子伝達ドメインとして最終的に最適化されたペプチドは
2014057586.tif 000013
（９アミノ酸長；配列番号：９８）で表示されるアミノ酸配列を有し、ヘリックス構造を形成し、これは「ＪＯ−９８」と命名した。前記ＪＯ−９８ペプチドの最後のアミノ酸であるプロリンは組換えタンパク質を形成するために生物活性分子との相互作用のための柔軟性部位である。
【００４６】
本発明の他の側面は、前記ＭＴＤペプチドを用いて細胞透過性を有するように生物活性分子を遺伝的に操作する方法に関するものである。
【００４７】
生物活性分子の治療的用途は、これらの低い細胞透過性によりしばしば阻止される。生物活性分子がエンドサイトーシス過程を通じて細胞内に流入したように見られるとしても、このような方式で細胞内に入ってくる分子は一般にエンドサイトーシス小胞内に捕獲されてリソソーム内で分解される。
【００４８】
以前に調査された他の膜輸送ペプチドは約２５アミノ酸より大きいサイズの分子を輸送できないものと示されたたが、本発明のＭＴＤは、細胞膜を横切る高分子量を有する生物活性分子の効率的な輸送を提供する。本発明のＭＴＤは、ペプチドまたはポリペプチドの膜透過性を増強させるために、当業界の通常の方法を用いて、ペプチドまたはポリペプチドに付着できる。前記ＭＴＤはキットの形態で提供でき、これは標的ポリペプチドに対するペプチドの連結を容易にするために当業者に公知の必要な構成要素を含む。このような様式でＭＴＤに付着される標的タンパク質は、その後細胞内流入のためにインビトロまたはインビボで細胞に送達され得る。
【００４９】
本発明の方法によれば、前記のポリヌクレオチドは、本明細書に記載したＭＴＤペプチドの作用により細胞の外部から内部に流入することができるタンパク質を生産するように、タンパク質発現ベクター内に挿入できる。
【００５０】
発現ベクターは、生物活性分子としてペプチド、ポリペプチド、タンパク質ドメイン、または関心対象の全長タンパク質をコードする核酸配列のＮ末端および／又はＣ末端方向に、そして巨大分子伝達ドメインと標的生物活性分子からなる組換えタンパク質が発現され得るように正確な読み枠内にＭＴＤをコードする核酸配列を導入するために、遺伝的に操作される。発現ベクターは、原核生物または真核生物発現システムで用いるのに容易に利用可能なものの中から選択してもよい。
【００５１】
本明細書で用いるように、ＭＴＤは細胞の外部から内部へ標的タンパク質の細胞内輸送を指示する本発明の巨大分子伝達ドメインである。本発明の他の実施形態で、ＭＴＤは細胞膜を通過して細胞の内部へのペプチドまたはポリペプチドの流入を媒介する代替配列を含んでもよい。
【００５２】
標的タンパク質は一般に細胞膜を通過する最善ではない透過性を示すが、本発明のＭＴＤにＮ末端および／又はＣ末端が付着されれば、細胞の外部から内部へ輸送されるタンパク質である。
【００５３】
本発明の他の実施形態で、切断部位は、ＭＴＤと、標的ポリペプチド、タンパク質ドメイン、または全長タンパク質との間に位置する。この部位は、代案的に対象ペプチドまたはポリペプチドからＭＴＤを物理的に除去するために組換えタンパク質の切断と関連して当業者に公知である第Ｘ因子部位または他の部位であってもよい。
【００５４】
本発明の方法は、細胞内部への導入用の細胞透過性を有するタンパク質を生成するための手段を提供し、これらの作用は細胞調節および生合成機作をさらに解明するのに役立つ。またこの方法は、Ｂｃｌ−２の導入によるアポトーシス抑制のような、標的化された細胞の変化をもたらすように細胞内に細胞内タンパク質を導入するための手段を提供する。例えば、細胞周期の調節は、異常なｐ５３タンパク質によって腫瘍原性になるこれらの細胞内に機能性ｐ５３タンパク質を導入することによって変更できる。
【００５５】
本明細書で用いるように、用語「生物活性分子」は、細胞内に流入する場合、生物学的効果を奏することができる任意の分子を含む。約１００,０００〜約１００万の範囲の分子量を有する非常に大きいタンパク質（例えば、抗体、フィブリノーゲン、およびマクログロブリン）は細胞により流出（ｅｘｐｏｒｔ）されるため、非常に大きいタンパク質は本発明の方法により細胞内に流入することができる。従って、少数のアミノ酸から約数千個のアミノ酸範囲のサイズを有するタンパク質が用いられる。タンパク質の好ましいサイズ範囲は少数のアミノ酸から約２５０個のアミノ酸までである。任意の分子に対して、サイズは約１００万の分子量まで、具体的に約２５，０００の分子量まで、およびより具体的に約３，０００の分子量までであってもよい。また、直接的にまたは間接的に、シグナルペプチドとしてＭＴＤペプチドに付着できるそのような分子のみが本発明の範囲内に属する。
【００５６】
生物活性分子の例示には、これに制限されないが、タンパク質、ポリペプチドおよびペプチドが含まれ、これらは成長因子、酵素、転写因子、毒素、抗原ペプチド（ワクチン用）、抗体、および抗体断片のような、生物活性分子の機能的ドメインが含まれる。生物活性分子の付加的な例示にはプラスミド、コード核酸配列、ｍＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡ分子のような核酸、糖質、脂質、および糖脂質が含まれる。生物活性分子の他の例示には、治療剤、具体的に低い細胞膜透過性を有するものが含まれる。このような治療剤の一部の例示にはダウノルビシンのような抗癌剤、およびこの方法により投与される時に用いられる比較的低い投与量のため、さらに安全に投与できる毒性化合物が含まれる。生物活性分子の他の例示は抗原性ペプチドである。抗原性ペプチドは、免疫反応に関与する細胞により流入する時に、免疫学的保護を提供するように投与できる。他の例示には免疫抑制ペプチド（例えば、当業界に公知である、自己反応性のＴ細胞を遮断するペプチド）が含まれる。数多くの異なる例示が、熟練した当業者には自明である。
【００５７】
本発明に適した生物活性分子の代表的な例示には、これらの機能面で、酵素、ホルモン、輸送タンパク質免疫グロブリンまたは抗体、構造タンパク質、運動機能タンパク質、受容体、シグナル伝達タンパク質および貯蔵タンパク質；ならびにこれらの位置および役割面で、膜または膜貫通タンパク質、内部タンパク質、外部または分泌タンパク質、ウィルスタンパク質、ネイティブタンパク質、糖タンパク質、切断されたタンパク質、ジスルフィド結合を有するタンパク質、タンパク質複合体、化学的に修飾されたタンパク質、およびプリオンが含まれてもよい。
【００５８】
標準組換え核酸方法が、遺伝的に操作された組換えタンパク質を発現させるために用いられる。本発明の一実施形態で、巨大分子伝達ドメインをコードする核酸配列が例えば、適したシグナルおよびプロセッシング配列と転写および翻訳のための調節配列とを有する核酸発現ベクター内にクローニングされる。他の実施形態で、タンパク質は自動有機合成方法を用いて合成されることができる。タンパク質を生産するための合成方法は、例えば、文献［Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌｕｍｅ  ２８９：Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｂｙ  Ｇｒｅｇｇ  Ｂ．Ｆｉｅｌｄｓ（Ｅｄｉｔｏｒ）、Ｓｉｄｎｅｙ  Ｐ．Ｃｏｌｏｗｉｃｋ、Ｍｅｌｖｉｎ  Ｉ．Ｓｉｍｏｎ（Ｅｄｉｔｏｒ）、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９７）］に記載されている。
【００５９】
クローニングされた遺伝子または核酸、例えばＭＴＤペプチドをコードするｃＤＮＡの高いレベルの発現を得るために、ＭＴＤ配列は典型的に、転写を指示する強力なプロモーターと、転写／翻訳ターミネーターと、タンパク質をコードする核酸の場合には転写開始のためのリボソーム結合部位とを含む発現ベクター内にサブクローニングされる。適切な細菌性プロモーターは当業界によく知られており、例えば、文献［Ｓａｍｂｒｏｏｋ＆Ｒｕｓｓｅｌｌ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、３ｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎ．Ｙ．（２００１）；およびＡｕｓｕｂｅｌなど、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）］に開示されている。本発明のＭＴＤペプチドを発現するための細菌性発現システムは例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、バシラス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）、およびサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）（Ｐａｌｖａなど、Ｇｅｎｅ  ２２：２２９−２３５（１９８３）；Ｍｏｓｂａｃｈなど、Ｎａｔｕｒｅ  ３０２：５４３−５４５（１９８３））で利用可能である。このような発現システムのためのキットが商業的に利用可能である。哺乳動物細胞、酵母、および昆虫細胞用の真核生物発現システムが当業界によく知られており、商業的にも利用可能である。本発明の他の実施形態で、前記真核生物発現ベクターは、アデノウィルスベクター、アデノ随伴ウィルスベクター、またはレトロウィルスベクターである。
【００６０】
細胞透過性組換えタンパク質を発現するための発現ベクターは、例えば、巨大分子伝達ドメインをコードする配列に機能的に付着された、プロモーターを備含む調節配列を含むことができる。用いられる誘導性プロモーターの非限定的な例示には、ステロイドホルモン反応性プロモーター（例えば、エクジソン反応性、エストロゲン反応性、およびグルココルチコイド反応性プロモーター）、テトラサイクリン「Ｔｅｔ−Ｏｎ」および「Ｔｅｔ−Ｏｆｆ」システム、および金属反応性プロモーターが含まれる。前記構築物は、適切な宿主細胞、例えば、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、または組織培養細胞内に導入できる。また、前記構築物は、モデル対象としてトランスジェニック生物を形成するために胚芽幹細胞内に導入できる。非常に多くの適切なベクターおよびプロモーターが、当業者に公知であり、本発明の組換え構築物を形成するために商業的に利用可能である。
【００６１】
本発明のポリヌクレオチドおよび適した転写／翻訳調節シグナルを含むベクターを構築するために、公知の方法が用いられる。このような方法には、インビトロ組換えＤＮＡ技術、合成技術、およびインビボ組換え／遺伝的組換えが含まれる。例えば、このような技術は文献［Ｓａｍｂｒｏｏｋ＆Ｒｕｓｓｅｌｌ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、３ｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎ．Ｙ．（２００１）；およびＡｕｓｕｂｅｌなど、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）］に記載されている。
【００６２】
細胞透過性組換えタンパク質を生産するのに適した宿主細胞には、細菌細胞および真核細胞（例えば、真菌、昆虫、植物、および哺乳動物細胞）が含まれる。宿主細胞は、冷凍解凍サイクル、超音波処理、機械的破壊、または細胞溶解剤の使用を含む、任意の便利な方法により破壊できる。文献［Ｓｃｏｐｅｓ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ（１９９４）］は、組換え（および非組換え）タンパク質を精製するための数多くの一般的な方法を記載する。前記方法として、例えばイオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、選択的沈殿、透析、および疎水性相互作用クロマトグラフィーが含まれる。これらの方法は、細胞透過性組換えタンパク質のための精製戦略を考案するように改造できる。前記細胞透過性組換えタンパク質が、エピトープタグまたは金属がキレートする配列のような精製手段を含む場合、アフィニティクロマトグラフィーが前記タンパク質を十分に精製するのに用いられる。
【００６３】
生産されたタンパク質の量は、直接的に（例えば、ウェスタン分析利用）または間接的に（例えば、電気泳動移動度シフトアッセイによるように、特異的ＤＮＡ結合活性に対して細胞由来物質を分析することによって）、巨大分子伝達ドメインを検出することによって評価できる。タンパク質は精製前に、精製の任意の段階中に、または精製後に検出され得る。一部の実行では、精製または完璧な精製が必要ではないこともある。
【００６４】
本発明の特定の実施形態で、発現ベクターは、増強された緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）を含む組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、ｐＥＧＦＰ−Ｃ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）である。本発明によるＭＴＤをコードするポリヌクレオチドのベクターｐＥＧＦＰ−Ｃ１内（前記ベクターのＥＧＦＰ遺伝子の５’および／又は３’に）への挿入は、ＭＴＤおよびＥＧＦＰをいずれも導入する組換えタンパク質の発現を可能にする。ＥＧＦＰのＮ末端および／又はＣ末端に連結されたＭＴＤは、細胞の内部にＥＧＦＰタンパク質を輸送する。
【００６５】
本発明の方法により生成された遺伝的に操作された組換えタンパク質は細胞透過性タンパク質であり、特に死滅されたまたは弱毒化された全生物ワクチンが実用的でない場合に、タンパク質ベースのワクチンに用いられる。また、本発明の方法により生成された細胞透過性タンパク質は、疾患、特に癌の治療に用いられる。細胞透過性タンパク質は、組換えベクターに細胞をトランスフェクションまたは形質転換させる必要性を排除しながら、細胞の内部に伝達できる。本発明の細胞透過性タンパク質は、タンパク質機能を調査するためにインビトロで用いられる、または細胞を好ましい状態に維持するために用いられる。
【００６６】
本発明のＭＴＤは、インビトロまたはインビボで標的細胞の内部に、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質ドメイン、またはタンパク質を伝達するために用いられる。前記ＭＴＤは、組換えＤＮＡまたはＲＮＡ分子由来の組換えタンパク質の発現により形成されたペプチドリンケージを通じて標的タンパク質に付着できるか、またはＭＴＤに共有的に付着されるリンカーによって標的タンパク質に付着できる。共有結合は、細胞内への流入のために、ポリヌクレオチドのような、非タンパク質分子に本発明のＭＴＤを付着させるために用いられる。
【００６７】
本発明の他の側面は、ＭＴＤペプチドが生物活性分子に機能的に付着されている本発明の細胞透過性組換えタンパク質を含有する薬学的組成物に関するものである。
【００６８】
本発明の方法により生成された細胞透過性組換えタンパク質は、培養培地への前記組換えタンパク質の添加のような当業者に公知の標準的な方法の一つによって、インビトロで投与してもよい。また、この方法により生成された組換えタンパク質は、非経口投与、静脈内投与、局所投与、エアロゾル投与、もしくは吸入、経口投与（特にカプセル化された形態で提供される時）を含むタンパク質／薬物送達に用いられる標準的な方法により、または直腸または膣投与（特に座薬形態で提供される時）によって、インビボで送達することができる。
【００６９】
投与の例には、これらに制限されないが、非経口投与、例えば、局所かん流を含む静脈内の注射、エアロゾルの吸入、皮下または筋肉内の注射、皮膚の傷および病巣へのような局所投与、例えば、移植のために準備された骨髄細胞内への直接トランスフェクションとその後の対象への移植、および以後に対象に移植される器官内への直接トランスフェクションが含まれる。用いる場合、非経口投与、例えば局所かん流は、一般に注射を特徴とする。注射剤は液体溶液、懸濁剤、または乳化剤のような通常の形態で製造できる。一定のレベルの投与量の維持を可能にしながら、持続放出または徐放性システムが更に用いられる。
【００７０】
さらなる投与方法として、特に複合体がカプセル化される時は経口投与、または特に複合体が座薬形態の時は直腸投与が含まれる。薬学的に許容可能な担体には、生物学的ではないか或いは他の様式でも好ましくない任意の物質、即ち、いかなる好ましくない生物学的効果も引き起こさないか、或いは投与される薬学的組成物の他の成分のうちいかなるものとも害になる様式で相互作用せず、選択された複合体と共に個体に投与され得る物質が含まれる。
【００７１】
意図された投与方式（例えば、これに制限されないが、静脈内、非経口、経皮、皮下、筋肉内、頭蓋内、眼窩内、眼球内（ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ）、脳室内、嚢内、脊髓内、大槽内、腹腔内、鼻腔内、直腸内、膣内、エアロゾル、または経口を含む）に応じて、薬学的組成物は例えば、錠剤、座薬、丸薬、カプセル、粉末、液剤、懸濁剤、ローション、クリーム、ゲルなどのような、好ましくは正確な投与量の単一投与に適した単位投与形態で、固体、半固体、または液体投与形態であってもよい。本発明の薬学組成物は、前記に言及した通り、薬学的に許容可能な担体と併用して有効量の細胞透過性組換えタンパク質を含むものであり、追加で、他の医学的製剤、薬学的製剤、担体、アジュバント、希釈剤などを含んでもよい。
【００７２】
固体組成物のための通常の非毒性固体担体には、例えば、薬学的等級のマンニトール、ラクトース、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウムなどが含まれる。薬学的に投与可能な液体組成物は、例えば本明細書に記載したような活性化合物、および選択的な薬学的アジュバントを、例えば水、食塩水、水性デキストロース、グリセロール、エタノールなどのような賦形剤内に溶解または分散させて、溶液または懸濁剤を形成することによって製造できる。好ましいならば、投与される薬学的組成物も、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤などのような、微量の非毒性補助物質を含有してもよい。このような投薬形態を製造する実質的な方法は当業者に公知であるか、または自明である。
【００７３】
本発明の方法により生成された細胞透過性組換えタンパク質の投与は、特に前記投与がインビトロ用途で培養培地に組換えタンパク質の添加により行われる時、１０分〜７２時間の範囲の期間に行われることができる。インビボまたはインビトロ用途のために、本発明の方法により生成された細胞透過性組換えタンパク質の効果的な投与時間は関連分野の熟練者により容易に決定されることができる。
【００７４】
インビボまたはインビトロ用途のために、細胞透過性組換えタンパク質は任意の効果的な濃度で投与できる。効果的な濃度は、生物活性分子の細胞内への流入を引き起こすような濃度である。このような濃度培養培地濃度（インビトロ）または血清濃度（インビボ）は典型的に、約０．１ｎＭ〜約５００μＭであろう。特定の組換えタンパク質および／又は特定標的細胞のための最適濃度は、本明細書の教示によって容易に決定できる。従って、組換えタンパク質のインビボ投与量は、組換えタンパク質の血清濃度が約０．１ｎＭ〜約５００μＭ、より具体的には、約０．５ｎＭ〜約１００μＭになるようにする濃度である。もちろん、投与される組換えタンパク質の量は、治療される対象、対象の年齢および体重、投与方式、および熟練した管理者の判断に左右される。複合体の正確な量はさらに、対象の全身の状態、前記投与により治療される疾患／状態の重症度、および選択された特定複合体に左右される。しかし、適当な量は本明細書に提供した教示に従って、通常の最適化を用い、当業界の通常の知識を有する者によって決定できる。
【００７５】
また、本発明の方法により生成された細胞透過性組換えタンパク質は、ワクチン投与のために用いられる（Ｌｉｎｑｎａｎなど、Ｅｘｐｅｒｔ．Ｒｅｖ．Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ６：７４１−７４６、２００７；Ｏ’Ｈａｑａｎなど、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ４０：１０−１９、２００９）。
【００７６】
細胞透過性組換えタンパク質を用いたワクチンは、典型的なペプチドワクチンに比べて利点を提供する。抗原の免疫システムの認識は適当な抗原処理に左右される。以前は、全タンパク質またはタンパク質ドメインがこのような処理を引き起こすために細胞内に送達できなかった。その結果、抗原エピトープを提示するペプチドを、そのようなエピトープを提示する小さなペプチドの細胞内への送達前に、特定しなければならなかった。本発明の方法は、細胞内に全タンパク質またはタンパク質ドメインが流入することを可能にし、ここで抗原処理が起こり得る。これは１回の投与で多重抗原性エピトープを提供し、ワクチン開発のための特定エピトープの実験的確認の必要性を排除する。
【００７７】
典型的に、このようなワクチンは、ヒトまたは哺乳動物対象内への注射用として調製される。注射可能ワクチンは、液体溶液または懸濁剤で調製できる。注射の前に、液体内の溶液または懸濁剤で適当な固体形態が調製できる。また、前記調製品は乳化されてもよい。活性免疫性成分はしばしば、前記活性成分と適合性のある薬学的に許容可能な担体と混合される。適切な担体としては、これに制限されないが、水、デキストロース、グリセロール、食塩水、エタノール、およびこれらの組み合わせが含まれる。前記ワクチンは、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、または前記ワクチンの効果を増強させる抗原補助剤のような、付加的な製剤を含んでもよい。
【００７８】
前記ワクチンは通常、非経口で投与されることもある。皮下または筋肉内の注射が適している。他の投与方式として、ペプチド免疫原と、マンニトール、ラクトース、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム、または他の担体のような薬学的に許容可能な担体との併用を含むこともできる、経口投与、鼻腔投与、直腸投与、および膣投与が含まれてもよい。経口投与用組成物は溶液、懸濁剤、錠剤、丸薬、カプセル、徐放性剤形、または粉末を形成してもよい。本発明のタンパク質ベースのワクチンは、腸の管腔内への前記ポリペプチドの分泌のために、腸溶コーティングされたカプセルによって投与されてもよい。
【００７９】
本発明の細胞透過性組換えタンパク質は、中性または塩形態でワクチン内に製剤化してもよい。薬学的に許容可能な塩は、酸付加塩（ポリペプチドの遊離アミノ基を用いて形成される）を含み、これは、例えば、塩酸もしくはリン酸のような無機酸、または酢酸、マンデル酸、シュウ酸、および酒石酸のような有機酸を用いて形成される。また、ポリペプチドの遊離カルボキシル基を用いて形成された塩は例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、または水酸化鉄のような無機塩、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、およびヒスチジンのような有機塩に由来してもよい。
【００８０】
前記ワクチンは、投薬剤形と適合性の様式で、そして治療的に効果的でかつ免疫原性になるような量で投与される。投与される量は、例えば、抗体を合成する個人の免疫システムの能力および好ましい保護の程度を考慮し、治療される対象に左右される。投与される活性成分（ペプチド免疫原）の正確な量は、診療医の判断に左右される。適切な投与量の範囲は一般に、１回の接種当たり数百マイクログラムの活性成分を必要とする。初期投与および追加免疫ワクチン接種のための療法も可変的であるが、これは専門医の判断に従って決定されなければならない。ワクチンの投与量は投与経路によって左右され、宿主のサイズに応じて変わるものである。
【００８１】
さらに、本発明の細胞透過性組換えタンパク質は薬物送達システムに効果的に用いられる（ＳｐｅｎｃｅｒおよびＶｅｒｍａ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０４：７５９４−７５９９、２００７；Ｃｈｏｉなど、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１２：５７４−５７９、２００６；Ｖｉｖｅｓなど、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１６０１０−１６０１７、１９９７；Ｋｕｍａｒなど、Ｎａｔｕｒｅ  ４４８：３９−４３、２００７；Ｊｏなど、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１１：８９２−８９８、２００５）。
【００８２】
本発明によって細胞膜透過性を有するタンパク質を遺伝的に操作する方法は、細胞内に治療的タンパク質生成物を送達する手段を提供する。本発明と細胞外タンパク質送達の以前に記載された方法との組み合わせは、制御放出方式で安定化した、機能性形態で細胞内への流入のためのタンパク質を送達する方法を提供する。
【００８３】
ポリペプチドは、適切な発現ベクターおよび発現システムを用いて生成される。細胞透過性が、前記発現されたポリペプチドのＮ末端および／又はＣ末端に位置したＭＴＤと組換えタンパク質の発現により、タンパク質またはポリペプチドに付与される。安定性の低いタンパク質は、当業者に公知の先に記載された方法によって安定化する。細胞外環境への送達は、マイクロスフェア担体のような適当な担体内に、安定化した組換えタンパク質を提供することによって達成される。選択したタンパク質は、適当な安定化および送達技術だけでなく、適当なベクターおよび発現システムを指定するはずである。薬物送達システム分野の通常の知識を有する者は、記載されたものから適当な技術を選択することができる。
【００８４】
本発明の方法は、癌の治療のための細胞透過性タンパク質を生産する手段を提供する。アポトーシスおよび細胞周期制御の制御因子は、腫瘍形成に重要な役割を担当するものと明らかになり、一方、ｐ５３遺伝子をコードするアデノウィルス発現ベクターの腫瘍内注射を用いる遺伝子療法技術（Ｂａｌａｇｇａｎなど、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １３（１５）：１１５３−１１６５、２００６；Ｋｕｏなど、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０；９８（８）：４６０５−４６１０、２００１）は、一部腫瘍の制御に対する可能性を示した。しかし、ウィルスベクターの使用を通じた特定タンパク質生成物の送達は、問題があるものと判明した。本発明のＭＴＤおよび方法は、癌状態の進行に役割を担当するものと確認された他のタンパク質だけでなく、細胞周期制御因子およびアポトーシスの制御因子の中から細胞透過性タンパク質を生産する手段を提供する。
【００８５】
例えば、本発明の一実施形態で、ｐ５３遺伝子をコードするポリヌクレオチドは、適切なベクター内、本発明のＭＴＤ配列の５’または３’のいずれにも挿入できる。選択したベクターに適当で当業者に公知の発現条件下で、ＭＴＤおよびｐ５３タンパク質を含む組換えタンパク質が発現できる。ｐ５３タンパク質へのＭＴＤの付着は、ｐ５３タンパク質が細胞透過性になるようにし、このタンパク質は、腫瘍の発達を抑制するために腫瘍細胞に投与できる。細胞透過性タンパク質の投与は、これに制限されないが、腫瘍内注射、注入、および静脈内投与を含む、多様な方式で達成できる。細胞周期制御およびアポトーシスに影響を及ぼし、従って癌療法に効果的なものと決定された非常に多様なタンパク質に由来するタンパク質の他の例が、ＢａｘおよびＢｃｌ−ｘＬである。本発明の方法は、腫瘍細胞に対して抗腫瘍形成タンパク質の送達のための、さらに効率的で、比較的労働力を要さず、より安価な方法を提供する。
【００８６】
本明細書で用いるように、用語「細胞膜」は、細胞外空間から細胞または細胞集団を分離する脂質含有障壁を指す。細胞膜は、これに制限されないが、原形質膜、細胞壁、細胞内小器管膜、例えばミトコンドリア膜、核膜などを含む。
【００８７】
本明細書で用いるように、用語「生物活性分子」は、体系内で生物学的反応を触発させるか或いは改変させることができる化合物または分子を指す。生物活性分子の非限定的な例示には、抗体（例えば、単一クローン、キメラ、ヒト化等）、コレステロール、ホルモン、抗ウィルス剤、ペプチド、タンパク質、化学療法剤、小分子、ビタミン、補助因子、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、酵素的核酸、アンチセンス核酸、三重鎖形成オリゴヌクレオチド、２、５−Ａキメラ、ｓｉＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ阻害物質、ｄｓＲＮＡ、アロザイム、アプタマー、これらのデコイおよび類似体が含まれる。また、本発明の生物活性分子は、他の生物活性分子、例えば、脂質およびポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、および他のポリエーテルのような重合体の薬物動態学および／又は薬力学を調節できる分子を含む。特定の実施形態で、用語生物活性分子は、用語「巨大分子」と互換的に用いられる。
【００８８】
本明細書で用いるように、用語「巨大分子」は、これに制限されないが、ペプチド、タンパク質、ならびに生物学的または合成起源のオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドで例示される大きい分子（１０００ダルトン以上の分子量）を指す。
【００８９】
本明細書で用いるように、用語「ペプチド」は、単一鎖のＤ−またはＬ−アミノ酸またはペプチド結合により連結されたＤ−およびＬ−アミノ酸の混合物からなる化合物を指す。好ましくはペプチドは、二つ以上のアミノ酸残基を含んで長さが約５０アミノ酸以下である。
【００９０】
本明細書で用いるように、用語「タンパク質」は、ペプチド結合によって付着された直線的に配列されたアミノ酸で構成されるが、ペプチドとは異なり、明確な形態を有する。ペプチドとは対照的に、タンパク質は好ましくは５０個以上のアミノ酸鎖を含む。
【００９１】
本明細書で用いるように、用語「ポリペプチド」は、一つまたは複数のペプチド結合を含む二つ以上のアミノ酸残基の重合体を指す。ポリペプチドが明確な形態を有するかどうかに関係なく、ポリペプチドはペプチドおよびタンパク質を含む。
【００９２】
本明細書で用いるように、用語「核酸」は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およびリボ核酸（ＲＮＡ）のようなオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドと同様に、例えばそれらがいずれも単鎖または二本鎖の形態であるヌクレオチド類似体から作られるＲＮＡまたはＤＮＡの類似体も指す。
【００９３】
アミノ酸残基は、これらの標準一文字または三文字表示法により、またはこれらの完全な名称により本明細書で言及する：Ａ、Ａｌａ、アラニン；Ｃ、Ｃｙｓ、システイン；Ｄ、Ａｓｐ、アスパラギン酸；Ｅ、Ｇｌｕ、グルタミン酸；Ｆ、Ｐｈｅ、フェニルアラニン；Ｇ、Ｇｌｙ、グリシン；Ｈ、Ｈｉｓ、ヒスチジン；Ｉ、Ｉｌｅ、イソロイシン；Ｋ、Ｌｙｓ、リシン；Ｌ、Ｌｅｕ、ロイシン；Ｍ、Ｍｅｔ、メチオニン；Ｎ、Ａｓｎ、アスパラギン；Ｐ、Ｐｒｏ、プロリン；Ｑ、Ｇｌｎ、グルタミン；Ｒ、Ａｒｇ、アルギニン；Ｓ、Ｓｅｒ、セリン；Ｔ、Ｔｈｒ、スレオニン；Ｖ、Ｖａｌ、バリン；Ｗ、Ｔｒｐ、トリプトファン；Ｘ、Ｈｙｐ、ヒドロキシプロリン；およびＹ、Ｔｙｒ、チロシン。
【００９４】
本明細書で用いるように、用語「巨大分子伝達ドメイン（ＭＴＤ）」は、細胞内への巨大分子の輸送を容易にするペプチドを指す。
【００９５】
本明細書で用いるように、用語「単離された」ポリヌクレオチドは、天然にそれが関連している配列が実質的にないポリヌクレオチドを指す。実質的にないということは、天然にそれと関連している物質が５０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、およびさらに好ましくは９０％以上ないことを意味する。本明細書で用いるように、「単離された」ポリヌクレオチドはさらに、起源または操作によって：（１）天然にそれと関連しているポリヌクレオチドの全部または一部分と関連していない、（２）天然にそれに連結されるものとは異なるポリヌクレオチドに連結される、または（３）天然に発生しない、組換えポリヌクレオチドを指す。
【００９６】
本明細書で用いるように、用語「機能的に付着された」は、プロモーターのＤＮＡ断片、ＭＴＤペプチド、または他の遺伝子が、遺伝子の発現を指示して調節するのに十分に連結されることを意味する。
【００９７】
本明細書で用いるように、用語「相同性」または「類似性」は、２つの配列（例えば、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列）間の類似するまたは同一性の比率を指す。典型的に、配列における類似性が比較的高いことは、物理的または化学的特性または生物学的活性においてさらに類似していることを意味する。
【００９８】
他に定義されない限り、本明細書で用いた全ての技術的および科学的用語は、本発明の属する当業界の通常の知識を有する者に一般に理解されることと同一の意味を有する。本明細書に記載したものと類似するかまたは同等の任意の方法および物質が、本発明を実行するかまたは検査するのに用いられるとしても、特定の方法および物質を本明細書に記載する。本明細書で言及した全ての刊行物は、前記刊行物が引用されたものと関連して方法および／又は物質を開示して記載するためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００９９】
本明細書および添付の特許請求の範囲に用いるように、単数の形態「一つの（ａ）」、「一つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈が別途明確に指示しない限り、複数対象を含むものと理解しなければならない。
【０１００】
本明細書で論議した刊行物は、本出願の出願日以前にそれらの明細書に対して単独で提供される。本明細書のいかなる事項も、本発明が以前の発明によってこのような刊行物に先行しないという承認として解釈されない。また、提供される公開日は個別に確認する必要があり得る実際の公開日と異なることもある。
【実施例】
【０１０１】
［実施例］
下記実施例は、本発明の実施を助け、本発明に関する実試験的な支持を提供し、モデルプロトコルを提供するために提示される。いかなる場合にもこれらの実施例が発明を制限するものと理解されるわけではない。
【０１０２】
実施例１−新規の巨大分子伝達ドメインペプチドの同定
生きている細胞の原形質膜を潜在的に通過できる新規の巨大分子伝達ドメイン（ＭＴＤ）候補を同定するために、シグナル配列様ドメインを有する分泌タンパク質を「シグナル配列の疎水性領域」、「シグナル配列疎水性領域」、「分泌タンパク質のシグナル配列」、「疎水性シグナル配列」および「分泌タンパク質の疎水性ドメイン」を含むいくつかの検索語を用いて、ＰｕｂＭｅｄ  Ｅｎｔｒｅｚ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａｂａｓｅから選択した。その結果、シグナル配列様ドメインを有する１，５００個以上の分泌タンパク質が選択された。
【０１０３】
シグナル配列様ドメインを有する選択された全ての分泌タンパク質を、これらがそれらのＮ末端に単一疎水性領域を含むかどうかを決定するために、ハイドロパシー分析に供した。続いて、これらをコンピュータ補助ゲノムおよびプロテオミクス情報分析、即ちＳＯＳＵＩシステム（ｈｔｔｐ：／／ｂｐ．ｎｕａｐ．ｎａｇｏｙａ−ｕ．ａｃ．ｊｐ／ｓｏｓｕｉに記載されたものと同一）に供して、これらがヘリックス構造を形成するかどうかを決定した。ＳＯＳＵＩシステムは一般的に、分析しようとするペプチドが約２０個以上のアミノ酸長を有することを必要とするため、増強された緑色蛍光タンパク質のＮ末端ドメインに由来する付加的なアミノ酸を前記シグナル配列様ドメインの末端に付加した。ＳＯＳＵＩシステムを用いて、それらのＮ末端に単一疎水性領域を有しかつ膜貫通ヘリックス構造を形成する２２０個のペプチド配列を選択した。
【０１０４】
選択されたペプチド配列をシグナル配列として最適化するため、実験的変更が下記のようにこれらに遂行される：まず、親水性、非極性、および正または負に荷電されたアミノ酸を、選択されたペプチド配列から除去し、続いて、５個の疎水性アミノ酸（即ち、アラニン：Ａ、バリン：Ｖ、プロリン：Ｐ、ロイシン：Ｌ、イソロイシン：Ｉ）の多様な組み合わせを経験的に考案した。
【０１０５】
その後、前記ペプチド配列の左側または右側で非疎水性アミノ酸を除去し、これらの疎水性領域を維持しながらサイズを最小化し、続いてペプチド配列の中間または右側にプロリンを付加するか、または非疎水性アミノ酸をプロリンで置換して前記ペプチドに柔軟性を付与した。最後に、繰り返される疎水性アミノ酸の個数を最小化して前記ペプチド配列の長さを減少させた。ＭＴＤ候補としてその結果得られたペプチドは疎水性および柔軟性を示し、相対的に短いアミノ酸（７〜１７個の長さ）を有し、かつヘリックス構造を形成する。
【０１０６】
前記の方法によって、各々配列番号：１〜１９３で表示されるアミノ酸配列を有し、細胞膜を横切る生物活性分子の横断を容易にできる新規の１９３個のＭＴＤペプチドが同定された。前記１９３個のＭＴＤは各々ＪＯ−０１〜ＪＯ−１９３と命名され、これらの構造的特性および配列は図１ａ〜１ｏに示した。
【０１０７】
実施例２−ＭＴＤに融合された組換えタンパク質の発現
前記実施例１で同定されたＭＴＤペプチドの細胞流入の実行可能性を証明するために、増強された緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）を全長タンパク質積荷分子として用いた。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）は、クラゲ、オワンクラゲ（Ａｑｕｏｒｅａ  Ｖｉｃｔｏｒｉａ）からクローニングされたタンパク質である。ＧＦＰは最も幅広く用いられるリポータータンパク質の一つで、青色または紫外線光源が照射される時、緑色光を生成する（Ｉｎｏｕｙｅなど、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ３５１（２）：２１１−１４（１９９４））。本発明の一実施形態では、商業的に利用可能なＧＦＰ発現ベクター、ｐＥＧＦＰ−Ｃ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いる。ｐＥＧＦＰ−Ｃ１によりコードされるＥＧＦＰタンパク質は、野生型ＧＦＰの突然変異であり、これは一層強い緑色光を生成するように改変された。また、外来遺伝子は、ｐＥＧＦＰ−Ｃ１ベクターの多重クローニング部位内に挿入され、挿入された外来遺伝子は、ＥＧＦＰとの組換えタンパク質形態で発現される。
【０１０８】
各々の新規のＭＴＤに融合されたＥＧＦＰタンパク質（Ｈｉｓ−ＭＴＤ−ＥＧＦＰ：ＨＭＥ）の発現ベクターを構築するために（図２）、プライマー対として表１および２に記載したオリゴヌクレオチド（ＭＴＤ  ＪＯ−０１〜ＪＯ−１９３各々に対して順方向プライマーとして、配列番号：３９３〜５８５；ＭＴＤ  ＪＯ−０１〜ＪＯ−１９３に対して逆方向プライマーとして、配列番号：５８６）、およびテンプレートとしてｐＥＧＦＰ−Ｃ１プラスミドを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。ＰＣＲ条件は９５℃で５分間の初期変性後に、９５℃で４５秒、６８℃で４５秒、および７２℃で１分を３０回行い、７２℃で５分間の最終延長を行った。増幅されたＰＣＲ生成物を制限酵素ＮｄｅＩで切断してアガロースゲル電気泳動を行った。ｋＦＧＦ−４由来ＭＴＤ  １６ｍｅｒ
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ｋＦＧＦ−４由来ＭＴＤ  １２ｍｅｒ
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ＨＩＶ−Ｔａｔ由来タンパク質伝達ドメイン
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およびＨＩＶ−Ｔａｔ相同体
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を陽性対照として用い、スクランブル（ｓｃｒａｍｂｌｅ）ペプチド（配列番号：３８７）を陰性対照として用いた。図３ａ〜３ｃに示したように、ＭＴＤ−ＥＧＦＰをコードするＤＮＡ断片が成功的に増幅されたことを確認した。
【０１０９】
（表１）各々のＭＴＤ−ＥＧＦＰタンパク質に対するＰＣＲ順方向プライマーの配列
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【０１１０】
（表２）各々のＭＴＤ−ＥＧＦＰタンパク質に対するＰＣＲ逆方向プライマーの配列
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【０１１１】
図４ａを参考に、ＰＣＲ増幅された生成物各々を、ＴＡクローニング方法に従い、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用いてｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ、ＵＳＡ）内にサブクローニングし、大腸菌ＤＨ５αを形質転換させた後、形質転換体を５０μｇ／ｍＬアンピシリン、ＩＰＴＧおよびＸ−ｇａｌを含むＬＢ平板培地上で選別した。ｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙベクターに挿入された組換え断片を、制限酵素ＮｄｅＩで処理して分離した後、０．８％アガロースゲル電気泳動を行った。その結果、約１ ｋｂのＤＮＡ断片および約３ ｋｂのベクター断片が検出され、これによりＭＴＤ−ＥＧＦＰの挿入物ＤＮＡが、ｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙベクター内に適切にサブクローニングされたことが確認できる（図４ｂ〜４ｄ）。
【０１１２】
図５ａに示したように、ＭＴＤ−ＥＧＦＰをコードする各々の単離された挿入物ＤＮＡ断片を、大腸菌発現プラスミドｐＥＴ−２８ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ社から商業的に利用可能であるＭａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）内にクローニングした。前記ｐＥＴ−２８ａ（＋）プラスミドは、ＮまたはＣ末端でＨｉｓタグ融合を容易にし、かつＴ７ファージプロモーターから大腸菌内遺伝子の強力な発現を提供するように設計される。各々のＭＴＤ−ＥＧＦＰをコードする遺伝子の３’末端で、前記コード配列に、翻訳停止コドンの前にＨｉｓタグ配列を、ＮｄｅＩ部位で枠内に融合し、これによりニッケルカラム上での容易な精製のためにＣ末端に付加された６つのヒスチジン残基を有するＭＴＤ−ＥＧＦＰ組換えタンパク質が生成される。
【０１１３】
前記クローンを制限酵素ＮｄｅＩで処理してアガロースゲル電気泳動を行った後、約１ ｋｂのＤＮＡ断片および約５ ｋｂのベクター断片が検出されることが証明され、これにより図５ｂ〜５ｃに示したように、ＭＴＤ−ＥＧＦＰの挿入物ＤＮＡが、ｐＥＴ−２８ａ（＋）ベクター内にクローニングされたことが確認できる。さらに、１９３個の新規のＭＴＤの中で、１４８個のＭＴＤがＨｉｓ−ＭＴＤ−ＥＧＦＰ組換えタンパク質の発現のために成功裏にクローニングされたことが確認された。
【０１１４】
実施例３−ＭＴＤに融合された組換えタンパク質の誘導性発現および精製
前記実施例２に記載した通り調製したＭＴＤに融合された細胞透過性組換えタンパク質を発現させるために、Ｈｉｓ−ＭＴＤ−ＥＧＦＰ組換えタンパク質を含む発現ベクターを、ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＢＬ２１−Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）、ＢＬ２１−ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（ＤＥ３）、およびＢＬ２１−ＧｏｌｄｐＬｙｓＳ（ＤＥ３）菌株のそれぞれにトランスフェクトした。ｋＦＧＦ４由来ＭＴＤ（配列番号：３８７）を含むＥＧＦＰ発現ベクターを陽性対照として用い、何らの機能も有していないスクランブルペプチド（配列番号：３８９）に融合されたＥＧＦＰ発現ベクターを陰性対照として用いた。
【０１１５】
トランスフェクションの後、吸光度６００（ＯＤ６００）が０．４から０．６の間に到達するまで細胞を激しく撹拌して、カナマイシン（３０μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢ培地で３７℃で培養した。続いてＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）を０．６ｍＭの最終濃度で培養液に添加し、Ｈｉｓ−ＭＴＤ−ＥＧＦＰ組換えタンパク質の発現を誘導した。タンパク質誘導は３７℃で３時間持続した。ＩＰＴＧを用いて大腸菌で発現されたＨｉｓ−ＭＴＤ−ＥＧＦＰ組換えタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにロードし、クマシーブリリアントブルーで染色した後、脱染色した。図６ａおよび６ｂに示したように、ＢＬ２１−ＧｏｌｄｐＬｙｓＳ（ＤＥ３）菌株で発現された一部Ｈｉｓ−ＭＴＤ−ＥＧＦＰ組換えタンパク質を除いては、大部分のＨｉｓ−ＭＴＤ−ＥＧＦＰ組換えタンパク質が、ＢＬ２１−ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（ＤＥ３）で高いレベルで発現された。一部Ｈｉｓ−ＭＴＤ−ＥＧＦＰ組換えタンパク質は発現されなかった。
【０１１６】
大腸菌システムでＨｉｓ−ＭＴＤ−ＥＧＦＰ組換えタンパク質の誘導性発現は、封入体として知られている不溶性凝集体の形成を引き起こす。このような封入体を完璧に溶解させるために、前記に発現されたタンパク質をいずれも８Ｍウレアに溶解させて変性させた。変性されたＨｉｓ−ＭＴＤ−ＥＧＦＰ組換えタンパク質を、ニッケルニトリロ三酢酸樹脂（ｎｉｃｋｅｌ  ｎｉｔｒｉｌｏｔｒｉａｃｅｔａｔｅ  ｒｅｓｉｎ）（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いるヒスチジンタグアフィニティクロマトグラフィーで精製した。８Ｍウレアのような強力な変性剤は封入体を完璧に溶解させるため、この精製方法はｐＨ依存性変性条件下で行われた。
【０１１７】
前記大腸菌培養液を４,０００×ｇで２０分間遠心分離して回収し、溶解緩衝液（１００ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、８Ｍウレア、ｐＨ  ８．０）に再懸濁させ、探針（ｐｒｏｂｅ）が装着されたソニケーターを用いて氷の中で超音波処理を行った。細胞溶解物を７，０００×ｇで２０分間遠心分離し、上清と細胞細片ペレットを分離した。上清をとって前記溶解緩衝液で平衡化したＮｉ−ＮＴＡ樹脂と軽い撹拌（回転式振とう機利用）下で、２時間乃至一晩中インキュベートした。洗浄緩衝液（１００ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、８Ｍウレア、ｐＨ  ６．３）で５回洗浄した後、前記樹脂に結合したタンパク質を溶出緩衝液（１００ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、８Ｍウレア、ｐＨ  ４．５）で溶出した。前記の変性条件下で精製されたＨｉｓ−ＭＴＤ−ＥＧＦＰ組換えタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分析して、クマシーブリリアントブルーで染色し、その結果を図７ａおよび７ｂに示した。
【０１１８】
前記で精製されたＨｉｓ−ＭＴＤ−ＥＧＦＰ組換えタンパク質を、復元（ｒｅｎａｔｕｒｅ）させるために、前記変性剤を除去することによって変性されたタンパク質をリフォールディングさせた。前記タンパク質を、リフォールディング緩衝液（０．５５  ＭグアニジンＨＣｌ、０．４４ＭＬ−アルギニン、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１００ｍＭ  ＮＤＳＢ、２ｍＭ酸化型グルタシオン、および０．２ｍＭ還元型グルタシオン）の中で透析することによって、ウレアを前記タンパク質から除去した。リフォールディング組換えタンパク質を全て、細胞培養培地（例えば、ＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地））のような生理緩衝液の中で９時間透析した。リフォールディング緩衝液をＤＭＥＭに交換した後、全ての精製された組換えタンパク質の細胞透過性は、インビトロおよびインビボで決定されるように準備された。図８に示したＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析結果によれば、前記実施例２に記載したように確立された１４８個の形質転換体の中から、Ｈｉｓ−ＭＴＤ−ＥＧＦＰ組換えタンパク質の誘導性発現が１１２個の形質転換体から視覚的に検出された一方、４つのＨｉｓ−ＭＴＤ−ＥＧＦＰ組換えタンパク質は視覚的に検出されるのに十分には発現されなかったが、細胞透過性分析のためには十分に精製された。１１６個のＨｉｓ−ＭＴＤ−ＥＧＦＰ組換えタンパク質が可溶性形態で生成された。
【０１１９】
実施例４−ＭＴＤに融合された組換えタンパク質の定量的な細胞透過性の決定
Ｈｉｓ−ＭＴＤ−ＥＧＦＰ組換えタンパク質の細胞透過性を定量的に決定するために、前記実施例３に記載された通り可溶性形態で精製された１１６個の組換えタンパク質を、０．７μｇ／μｌのＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）と混合して撹拌しながら室温で１時間反応させた。ＦＩＴＣが完璧に除去されるまで前記反応溶液をＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地、ＷｅＩＧＥＮＥ  Ｉｎｃ．、Ｋｏｒｅａ）の中で２日間透析して、ＦＩＴＣ結合組換えタンパク質を得た。マウス大食細胞に由来するＲＡＷ  ２６４．７細胞を、１０μＭのＦＩＴＣで標識されたタンパク質で処理した。前記ＲＡＷ  ２６４．７細胞を、１０％ウシ胎仔血清および１％ペニシリン（５００ｍｇ／ｍｌ、ＷｅＩＧＥＮＥ  Ｉｎｃ．）が補充されたＤＭＥＭ内に維持し、空気中５％ＣＯ２の湿潤大気下で３７℃でインキュベーションした。インキュベーション後、前記細胞を前記で生成された１０μＭのＦＩＴＣ結合組換えタンパク質のそれぞれと３７℃で１時間インキュベーションした後、続いてトリプシン／ＥＤＴＡ（Ｔ／Ｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ  ＣＡ、ＵＳＡ）で処理し、細胞表面結合タンパク質を除去して冷却ＰＢＳで３回洗浄した。
【０１２０】
ＦＩＴＣ結合Ｈｉｓ−ＭＴＤ−ＥＧＦＰ組換えタンパク質を、蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）分析（ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ、Ｂｅｃｋｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡ、ＵＳＡ）に供した。各々の試料に対して、細胞（１×１０４）を、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ  Ｐｒｏサイトメトリー分析ソフトウェアを用いて分析した。各々の実験は少なくとも２回行った。新規のＭＴＤ（ＪＯ−０１〜ＪＯ−１９３）に融合されたＨｉｓ−ＭＴＤ−ＥＧＦＰ組換えタンパク質のそれぞれの細胞透過性効能を、ｋＦＧＦ４由来ＭＴＤに溶合された陽性対照タンパク質の細胞透過性と視覚的に比較した。
【０１２１】
図９ａ〜９ｇは、フローサイトメトリー分析結果を示したものであって、ここで灰色で塗られた曲線は細胞単独を示し、黒色曲線はＦＩＴＣ単独を示し、青色曲線は陰性対照（スクランブルペプチド）の細胞透過性を示し、赤色曲線は陽性対照（ｋＦＧＦ４由来ＭＴＤ）の細胞透過性を示し、緑色曲線は組換えタンパク質それぞれの細胞透過性を示す。
【０１２２】
哺乳動物細胞で各ＭＴＤの細胞透過性を評価するために、各々のＦＩＴＣ結合Ｈｉｓ−ＭＴＤ−ＥＧＦＰ組換えタンパク質とインキュベーション後に、メディアン（ｍｅｄｉａｎ）蛍光における変化を評価することによって、Ｈｉｓ−ＭＴＤ−ＥＧＦＰ組換えタンパク質の細胞取り込み効率を、ｋＦＧＦ４由来ＭＴＤに融合された陽性対照タンパク質およびスクランブルペプチドに融合された陰性対照タンパク質の効率と比較した。
【０１２３】
図９ａ〜９ｇに示された結果を参考として、１０μＭのＦＩＴＣ結合Ｈｉｓ−ＭＴＤ−ＥＧＦＰタンパク質で３７℃で１時間処理された細胞は、いずれも前記処理後にメディアン蛍光が陰性対照で処理された細胞のものより顕著に低くなるというようなメディアン蛍光における変化を伴わなかった。一方検査された１１１個のタンパク質の中で、８０個のＨｉｓ−ＭＴＤ−ＥＧＦＰ組換えタンパク質は陽性対照のものより０．５倍（５０％）以上高い蛍光シグナルを示した。このような結果は、積荷分子ＥＧＦＰと融合された新たに開発された新規のＭＴＤの一部が、タンパク質のような巨大分子を生きている細胞内に送達するのに十分に顕著に高いレベルの原形質膜浸透能力を示したことを示唆する。
【０１２４】
実施例５−ＭＴＤに融合された組換えタンパク質の細胞透過性および細胞内局在化の決定
フローサイトメトリーで検査された１１１個のＦＩＴＣ結合Ｈｉｓ−ＭＴＤ−ＥＧＦＰ組換えタンパク質の中で、６０個のＨｉｓ−ＭＴＤ−ＥＧＦＰ組換えタンパク質がこれらの細胞透過性および細胞内局在化の可視化のために選択された。これらの中から、５０個のＨｉｓ−ＭＴＤ−ＥＧＦＰ組換えタンパク質は、ｋＦＧＦ４由来ＭＴＤに融合された陽性対照タンパク質と比較して、０．５倍高い細胞透過性を示した。
【０１２５】
ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞を処理するか（細胞単独）、またはＦＩＴＣ（ＦＩＴＣ単独）、または陰性対照（Ｈｉｓ−スクランブルペプチド−ＥＧＦＰ）、陽性対照（Ｈｉｓ−ｋＦＧＦ４由来ＭＴＤ−ＥＧＦＰ）、もしくは新規ＭＴＤに融合された組換えタンパク質（Ｈｉｓ−ＭＴＤ−ＥＧＦＰ）のようなＦＩＴＣ結合組換えタンパク質で処理し、共焦点レーザ走査顕微鏡で可視化した。ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞を８ウェルチャンバスライド（ＬａｂＴｅｋ、Ｎａｌｇｅｎ  Ｎｕｎｃ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ  ＮＹ、ＵＳＡ）内で２４時間培養した。細胞を３７℃、５％ＣＯ２下で、１０％ウシ胎仔血清、１％ペニシリン、およびストレプトマイシンが補充されたＤＭＥＭで維持した。前記細胞をＰＢＳで３回洗浄した後、３７℃、５％ ＣＯ２下で、ＤＭＥＭ、ＤＭＥＭと遊離ＦＩＴＣ、または１０μＭ  ＦＩＴＣ結合組換えタンパク質含有ＤＭＥＭで１時間処理した。前記処理１時間後、観察のために細胞を室温で４％パラフォルムアルデヒド（ＰＦＡ）で２０分間固定した。
【０１２６】
内在化されたＦＩＴＣ結合組換えタンパク質の直接的な検出のため、前記細胞をＰＢＳで３回洗浄して、核蛍光染色溶液である１μｇ／ｍｌ濃度のヨウ化プロピジウム（ＰＩ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ  ＭＯ、ＵＳＡ）で対比染色を行った。５分間のＰＩ染色後、前記細胞をＰＢＳで３回洗浄し、ＤＡＢＣＯ（Ｆｌｕｃａ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ  ＭＯ、ＵＳＡ）と共にポリビニルアルコール封入剤（ｍｏｕｎｔａｉｎ  ｍｅｄｉｕｍ）で固定した。蛍光の細胞内分布を、共焦点レーザ走査顕微鏡で分析された単一細胞の中心部で決定し、その結果を図１０ａ〜１０ｉに示した。各々の蛍光色素に対して特異的なパラメーターは次の通りである：ＦＩＴＣ：４８８ｎｍ光源で励起され、５３０ｎｍバンドパスフィルタで検出される。
【０１２７】
驚くべきことに、図１０ａ〜１０ｉ、１１ａ、および１１ｂに示したように、スクランブルペプチドに融合された陰性対照タンパク質と比較し、ＦＩＴＣ結合Ｈｉｓ−ＭＴＤ−ＥＧＦＰ組換えタンパク質（ＪＯ−１３、−１８、−４９、−５８、−６８、−１０１、−１０８、−１１６、−１１８、−１２２、−１２３、−１２７、−１３２、−１３３、−１３６、−１３８、−１４０、−１４８、−１６２、−１６９、−１７０、および−１７２）は、細胞質または核内または全てに大規模で均等に分布した。陽性対照（１．０倍）と比較して０．５倍低い細胞透過性を示す１０個のＭＴＤ（ＪＯ−１７、−１８、−２１、−３１、−４１、−４９、−８８、−１０７、−１１６、および−１６９）は、１時間処理後に細胞内の局在化能力を示した。このような結果は、フローサイトメトリー分析から得た結果と完璧に一致した。
【０１２８】
実施例６−ＭＴＤに融合された組換えタンパク質のインビボ組織分布の決定
４３個の組換えタンパク質を、インビボ組織分布能力の分析のために、フローサイトメトリーで検査された１１１個のＦＩＴＣ結合組換えタンパク質から選択した。ＦＩＴＣ単独（ＤＭＥＭに遊離ＦＩＴＣ添加）、陰性対照（スクランブルペプチドに融合されたＦＩＴＣ結合組換えタンパク質）、陽性対照（ｋＦＧＦ４由来ＭＴＤに融合されたＦＩＴＣ結合組換えタンパク質）、またはＨｉｓ−ＭＴＤ−ＥＧＦＰ組換えタンパク質（選択された新規ＭＴＤに融合されたＦＩＴＣ結合組換えタンパク質）各々を、Ｂａｌｂ／ｃマウス（６週齢、雌、Ｃｅｎｔｒａｌ  Ｌａｂ．Ａｎｉｍａｌ  Ｉｎｃ．、Ｋｏｒｅａ）に、３００μｇ／５００μｌ／マウスの投与量で腹腔内に注射した。２時間後、各マウスの臓器６カ所（即ち、肝臓、腎臓、脾臓、肺、心臓、および脳）を摘出し、ＰＢＳで洗浄し、Ｏ．Ｃ．Ｔ．化合物（Ｓａｋｕｒａ、Ｊａｐａｎ）でドライアイスの中で速やかに冷凍させた。各臓器の凍結切片（２０μｍ厚さ）を、マイクロトーム冷凍切片機（ｍｉｃｒｏｔｏｍｅ  ｃｒｙｏｓｔａｔ、Ｓａｋｕｒａ）を用いて作製し、これをガラススライド上に載置した後、Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ封入剤（Ｖｅｃｔａ  ｌａｂ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ  ＣＡ、ＵＳＡ）内に封入した。選択された新規ＭＴＤのインビボ組織分布を、蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ、Ｊａｐａｎ）を用いて分析し、その結果を図１２ａ〜１２ｉに示した。
【０１２９】
陰性対照では、いかなる有意な水準の蛍光も観察されなかった。これと反対に、ｋＦＧＦ４由来ＭＴＤに融合された陽性対照タンパク質は、全ての臓器で均等に分布した蛍光活性を示した。選択された新規のＭＴＤに融合された組換えタンパク質が注射されたマウスに対しては、臓器間に若干の微少な差があるとしても、フローサイトメトリーにより決定されたように、陽性対照より０．５倍以上高い細胞透過性を有する大部分のＭＴＤは、全ての臓器で相対的に強力なインビボ組織分布能力を示した。具体的には、ＪＯ−１３（１．３倍）およびＪＯ−１３３（１．５倍）ＭＴＤが、脳を除いた全ての臓器で均等に分布した。このような結果は、フローサイトメトリーおよび共焦点レーザ走査顕微鏡によってそれらの強力な細胞透過性および／又は細胞内の局在化能力が立証された新規のＭＴＤが、インビトロおよびインビボで巨大分子細胞内伝達を効果的に媒介できることを示すものである。
【０１３０】
要約すれば、本発明の方法によって同定された巨大分子伝達ドメインは、図１３ａ〜１３ｋに示したような誘導性タンパク質の発現、精製、および細胞透過性の特性を有する。
【０１３１】
本発明は、その特定の実施形態を参考として詳細に記載した。しかし、その範囲が添付された請求項とそれらの等価物によって定義される発明の原理および要旨を逸脱せず、これらの実施形態に変化が有り得ることが、当業界に通常の知識を有する者に認識される。
【図１ａ−１】
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【図１ａ−２】
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【図１ａ−３】
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【図１ａ−４】
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【図１ｂ−１】
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【図１ｂ−２】
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【図１ｂ−３】
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【図１ｂ−４】
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【図１ｃ−１】
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【図１ｃ−２】
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【図１ｃ−３】
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【図１ｃ−４】
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【図１ｄ−１】
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【図１ｄ−２】
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【図１ｄ−３】
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【図１ｄ−４】
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【図１ｅ−１】
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【図１ｅ−２】
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【図１ｅ−３】
2014057586.tif 000046
【図１ｅ−４】
2014057586.tif 000047
【図１ｆ−１】
2014057586.tif 000048
【図１ｆ−２】
2014057586.tif 000049
【図１ｆ−３】
2014057586.tif 000050
【図１ｆ−４】
2014057586.tif 000051
【図１ｇ−１】
2014057586.tif 000052
【図１ｇ−２】
2014057586.tif 000053
【図１ｇ−３】
2014057586.tif 000054
【図１ｇ−４】
2014057586.tif 000055
【図１ｈ−１】
2014057586.tif 000056
【図１ｈ−２】
2014057586.tif 000057
【図１ｈ−３】
2014057586.tif 000058
【図１ｈ−４】
2014057586.tif 000059
【図１ｉ−１】
2014057586.tif 000060
【図１ｉ−２】
2014057586.tif 000061
【図１ｉ−３】
2014057586.tif 000062
【図１ｉ−４】
2014057586.tif 000063
【図１ｊ−１】
2014057586.tif 000064
【図１ｊ−２】
2014057586.tif 000065
【図１ｊ−３】
2014057586.tif 000066
【図１ｊ−４】
2014057586.tif 000067
【図１ｋ−１】
2014057586.tif 000068
【図１ｋ−２】
2014057586.tif 000069
【図１ｋ−３】
2014057586.tif 000070
【図１ｋ−４】
2014057586.tif 000071
【図１ｌ−１】
2014057586.tif 000072
【図１ｌ−２】
2014057586.tif 000073
【図１ｌ−３】
2014057586.tif 000074
【図１ｌ−４】
2014057586.tif 000075
【図１ｍ−１】
2014057586.tif 000076
【図１ｍ−２】
2014057586.tif 000077
【図１ｍ−３】
2014057586.tif 000078
【図１ｍ−４】
2014057586.tif 000079
【図１ｎ−１】
2014057586.tif 000080
【図１ｎ−２】
2014057586.tif 000081
【図１ｎ−３】
2014057586.tif 000082
【図１ｎ−４】
2014057586.tif 000083
【図１ｏ−１】
2014057586.tif 000084
【図１ｏ−２】
2014057586.tif 000085
【図１ｏ−３】
2014057586.tif 000086
【図１ｏ−４】
2014057586.tif 000087
【図２】
2014057586.tif 000088
【図３ａ】
2014057586.tif 000089
【図３ｂ】
2014057586.tif 000090
【図３ｃ】
2014057586.tif 000091
【図４ａ】
2014057586.tif 000092
【図４ｂ】
2014057586.tif 000093
【図４ｃ】
2014057586.tif 000094
【図４ｄ】
2014057586.tif 000095
【図５ａ】
2014057586.tif 000096
【図５ｂ】
2014057586.tif 000097
【図５ｃ】
2014057586.tif 000098
【図６ａ】
2014057586.tif 000099
【図６ｂ】
2014057586.tif 000100
【図７ａ】
2014057586.tif 000101
【図７ｂ】
2014057586.tif 000102
【図８】
2014057586.tif 000103
【図９ａ】
2014057586.tif 000104
【図９ｂ】
2014057586.tif 000105
【図９ｃ】
2014057586.tif 000106
【図９ｄ】
2014057586.tif 000107
【図９ｅ】
2014057586.tif 000108
【図９ｆ】
2014057586.tif 000109
【図９ｇ】
2014057586.tif 000110
【図１０ａ】
2014057586.tif 000111
【図１０ｂ】
2014057586.tif 000112
【図１０ｃ】
2014057586.tif 000113
【図１０ｄ】
2014057586.tif 000114
【図１０ｅ】
2014057586.tif 000115
【図１０ｆ】
2014057586.tif 000116
【図１０ｇ】
2014057586.tif 000117
【図１０ｈ】
2014057586.tif 000118
【図１０ｉ】
2014057586.tif 000119
【図１１ａ】
2014057586.tif 000120
【図１１ｂ】
2014057586.tif 000121
【図１２ａ】
2014057586.tif 000122
【図１２ｂ】
2014057586.tif 000123
【図１２ｃ】
2014057586.tif 000124
【図１２ｄ】
2014057586.tif 000125
【図１２ｅ】
2014057586.tif 000126
【図１２ｆ】
2014057586.tif 000127
【図１２ｇ】
2014057586.tif 000128
【図１２ｈ】
2014057586.tif 000129
【図１２ｉ】
2014057586.tif 000130
【図１３ａ−１】
2014057586.tif 000131
【図１３ａ−２】
2014057586.tif 000132
【図１３ａ−３】
2014057586.tif 000133
【図１３ｂ−１】
2014057586.tif 000134
【図１３ｂ−２】
2014057586.tif 000135
【図１３ｂ−３】
2014057586.tif 000136
【図１３ｃ−１】
2014057586.tif 000137
【図１３ｃ−２】
2014057586.tif 000138
【図１３ｃ−３】
2014057586.tif 000139
【図１３ｄ−１】
2014057586.tif 000140
【図１３ｄ−２】
2014057586.tif 000141
【図１３ｄ−３】
2014057586.tif 000142
【図１３ｅ−１】
2014057586.tif 000143
【図１３ｅ−２】
2014057586.tif 000144
【図１３ｅ−３】
2014057586.tif 000145
【図１３ｆ−１】
2014057586.tif 000146
【図１３ｆ−２】
2014057586.tif 000147
【図１３ｆ−３】
2014057586.tif 000148
【図１３ｇ−１】
2014057586.tif 000149
【図１３ｇ−２】
2014057586.tif 000150
【図１３ｇ−３】
2014057586.tif 000151
【図１３ｈ−１】
2014057586.tif 000152
【図１３ｈ−２】
2014057586.tif 000153
【図１３ｈ−３】
2014057586.tif 000154
【図１３ｉ−１】
2014057586.tif 000155
【図１３ｉ−２】
2014057586.tif 000156
【図１３ｉ−３】
2014057586.tif 000157
【図１３ｊ−１】
2014057586.tif 000158
【図１３ｊ−２】
2014057586.tif 000159
【図１３ｊ−３】
2014057586.tif 000160
【図１３ｋ】
2014057586.tif 000161
【配列表】
2014057586000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成25年10月30日(2013.10.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物活性分子の細胞内への輸送を媒介することができる単離された巨大分子伝達ドメイン（ＭＴＤ）ペプチドであって、
配列番号：3, 5, 8-12, 14, 15, 18, 19, 21, 22, 24, 30, 37-39, 42, 70, 74, 76, 78, 80, 88, 95, 97, 98, 102, 103, 105, 120, 122-125, 129, 130, 137, 142, 143, 145, 153, 155, 156, 158, 159, 163, 171, 173, 174, 182, 183, 188及び192からなる群より選択されるアミノ酸配列を有し、
Ｎ末端に単一疎水性領域を有し、ヘリックス構造を形成し、柔軟性を示し、７〜１７アミノ酸の長さを有することを特徴とする、前記単離された巨大分子伝達ドメイン（ＭＴＤ）ペプチド。
【請求項２】
請求項１記載の巨大分子伝達ドメイン（ＭＴＤ）ペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項３】
配列番号：196, 198, 201-205, 207, 208, 211, 212, 214, 215, 217, 223, 230-232, 235, 263, 267, 269, 271, 273, 281, 288, 290, 291, 295, 296, 298, 313, 315-318, 322, 323, 330, 335, 336, 338, 346, 348, 349, 351, 352, 356, 364, 366, 367, 375, 376, 381及び385からなる群より選択されるヌクレオチド配列を有する、請求項２記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項４】
多数のアミノ酸配列データベースからシグナル配列様ドメインを有する分泌タンパク質を同定する段階と、
前記同定された分泌タンパク質から、それらのＮ末端に単一の疎水性領域を有しかつヘリックス構造を形成する疎水性ペプチドを選択する段階と、
ＭＴＤペプチドとしての使用に適したペプチドを生成するのに効果的な条件下で、前記選択された疎水性ペプチドを最適化および最小化する段階と
を含む、生物活性分子の細胞内への輸送を媒介することができる請求項１に記載のペプチドを同定する方法。
【請求項５】
前記シグナル配列様ドメインが、
ペネトラチン(Arg-Gln-Ile-Lys- Ile-Trp-Phe-Gln-Asn-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys), HIV-1のトランス活性化タンパク質Tat由来Tatペプチド (Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Pro), トランスポータン(Gly-Trp-Thr-Leu-Asn-Ser-Ala-Gly-Tyr-Leu-Leu-Gly-Lys-Ile-Asn-Lys-Ala-Leu-Ala-Ala-Leu-Ala-Lys-Lys-Ile-Leu), Buforin II (Thr-Arg-Ser-Ser-Arg-Ala-Gly-Leu-Gln-Phe-Arg-Val-Gly-Arg-Val-His-Arg-Leu-Leu-Arg-Lys), MAP (モデル両親媒性ペプチド: Lys-Leu-Ala-Leu-Lys-Ala-Ser-Leu-Lys-Ala-Leu-Lys-Ala-Ala-Leu-Lys-Leu-Ala), k-FGF (Ala-Ala- VaI-Ala-Leu-Leu-Pro-Ala- Val-Leu-Leu-Ala-Leu-Leu-Ala-Pro), Ku 70 (Val-Pro-Met-Leu-Lys-Pro-Met-Leu-Lys-Glu), プリオン (Met-Ala-Asn-Leu-Gly-Tyr-Trp-Leu-Leu-Ala-Leu-Phe-Val-Thr-Met-Trp-Thr-Asp-Val-Gly-Leu-Cys-Lys-Lys-Arg-Pro-Lys-Pro), pVEC (Leu-Leu-Ile-Ile-Leu-Arg-Arg-Arg-Ile-Arg-Lys-Gln-Ala-His- Ala-His-Ser-Lys), pep- 1 (Lys-Glu-Thr-Trp-Trp-Glu-Thr-Trp-Tφ-Thr-Glu-Trp-Ser-Gln-Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val), SynBl (Arg-Gly-Gly-Arg-Leu-Ser-Tyr-Ser-Arg-Arg-Arg-Phe-Ser-Thr-Ser-Thr-Gly-Arg), pep-7 (Ser-Asp-Leu-Trp-Glu-Met-Met-Met-Val-Ser-Leu-Ala-Cys-Gln-Tyr), 及び HN-I (Thr-Ser-Pro-Leu-Leu-Ile-His-Asn-Gly-Gln-Lys-Leu)
からなる群より選択される、請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記アミノ酸配列データベースが、ＰｕｂＭｅｄ  Ｅｎｔｒｅｚ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａｂａｓｅからなる群より選択される、請求項４記載の方法。
【請求項７】
選択された疎水性ペプチドの左側または右側で非疎水性アミノ酸を除去して、この疎水性領域は維持しながらペプチド長さを最小化する段階と、
選択された疎水性ペプチドの中間または右側で非疎水性アミノ酸を疎水性アミノ酸であるプロリンで置き換えて柔軟性を与える段階と、
繰り返される疎水性アミノ酸の数を最小化してペプチドの長さを減少させる段階と
によって、前記最適化および最小化段階が行われる、請求項４記載の方法。
【請求項８】
前記最適化および最小化の結果として生成されたＭＴＤペプチドが、細胞透過性、疎水性、および柔軟性を示し、約７〜約１７アミノ酸長を有し、かつヘリックス構造を形成する、請求項４記載の方法。
【請求項９】
配列番号：3, 5, 8-12, 14, 15, 18, 19, 21, 22, 24, 30, 37-39, 42, 70, 74, 76, 78, 80, 88, 95, 97, 98, 102, 103, 105, 120, 122-125, 129, 130, 137, 142, 143, 145, 153, 155, 156, 158, 159, 163, 171, 173, 174, 182, 183, 188及び192からなる群より選択されるアミノ酸配列を有し、
Ｎ末端に単一疎水性領域を有し、ヘリックス構造を形成し、柔軟性を示し、７〜１７アミノ酸の長さを有することを特徴とする巨大分子伝達ドメイン（ＭＴＤ）ペプチドと、生物活性分子とを含む、細胞透過性を有する単離された組換えタンパク質。
【請求項１０】
前記生物活性分子が、タンパク質、ポリペプチド、およびペプチドからなる群より選択される、請求項９記載の単離された組換えタンパク質。
【請求項１１】
前記生物活性分子が、成長因子、酵素、転写因子、毒素、抗原性ペプチド、抗体、および抗体断片からなる群より選択される、請求項９記載の単離された組換えタンパク質。
【請求項１２】
前記生物活性分子が、酵素、ホルモン、輸送タンパク質、免疫グロブリン、抗体、構造タンパク質、運動機能タンパク質、受容体、シグナル伝達タンパク質、貯蔵タンパク質、膜タンパク質、膜貫通タンパク質、内部タンパク質、外部タンパク質、分泌タンパク質、ウィルスタンパク質、ネイティブタンパク質、糖タンパク質、切断されたタンパク質、ジスルフィド結合を有するタンパク質、タンパク質複合体、化学的に修飾されたタンパク質、およびプリオンからなる群より選択される、請求項１１記載の単離された組換えタンパク質。
【請求項１３】
前記生物活性分子が、核酸、コード核酸配列、ｍＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ分子、糖質、脂質、および糖脂質からなる群より選択される、請求項９記載の単離された組換えタンパク質。
【請求項１４】
前記生物活性分子が治療剤である、請求項９記載の単離された組換えタンパク質。
【請求項１５】
前記生物活性分子が治療薬物および毒性化合物からなる群より選択される、請求項１４記載の単離された組換えタンパク質。
【請求項１６】
細胞透過性を有する生物活性分子を生成するのに効果的な条件下で巨大分子伝達ドメイン（ＭＴＤ）ペプチドを生物活性分子に付着させる段階を含む、細胞透過性を有する生物活性分子を遺伝的に操作する方法であって、前記ＭＴＤペプチドが配列番号：3, 5, 8-12, 14, 15, 18, 19, 21, 22, 24, 30, 37-39, 42, 70, 74, 76, 78, 80, 88, 95, 97, 98, 102, 103, 105, 120, 122-125, 129, 130, 137, 142, 143, 145, 153, 155, 156, 158, 159, 163, 171, 173, 174, 182, 183, 188及び192からなる群より選択されるアミノ酸配列を有し、Ｎ末端に単一疎水性領域を有し、ヘリックス構造を形成し、柔軟性を示し、７〜１７アミノ酸の長さを有することを特徴とする、方法。
【請求項１７】
前記付着させる段階が、生物活性分子のＮ末端、Ｃ末端、その両方、またはその中間にＭＴＤペプチドを付着させることを含む、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
前記付着させる段階が、ペプチド結合によってＭＴＤペプチドを生物活性分子に付着させることを含む、請求項１６記載の方法。
【請求項１９】
前記付着させる段階が、共有結合によってＭＴＤペプチドを生物活性分子に付着させることを含む、請求項１６記載の方法。
【請求項２０】
生物活性分子に付着された巨大分子伝達ドメイン（ＭＴＤ）ペプチドを含む細胞透過性組換えタンパク質を含み、対象において細胞内に生物活性分子を輸送するための薬学的組成物であって、前記ＭＴＤペプチドが配列番号：3, 5, 8-12, 14, 15, 18, 19, 21, 22, 24, 30, 37-39, 42, 70, 74, 76, 78, 80, 88, 95, 97, 98, 102, 103, 105, 120, 122-125, 129, 130, 137, 142, 143, 145, 153, 155, 156, 158, 159, 163, 171, 173, 174, 182, 183, 188及び192からなる群より選択されるアミノ酸配列を有し、Ｎ末端に単一疎水性領域を有し、ヘリックス構造を形成し、柔軟性を示し、７〜１７アミノ酸の長さを有することを特徴とする、薬学的組成物。
【請求項２１】
ＭＴＤペプチドが配列番号：3, 5, 8-12, 14, 15, 18, 19, 21, 22, 24, 30, 37-39, 42, 70, 74, 76, 78, 80, 88, 95, 97, 98, 102, 103, 105, 120, 122-125, 129, 130, 137, 142, 143, 145, 153, 155, 156, 158, 159, 163, 171, 173, 174, 182, 183, 188及び192からなる群より選択されるアミノ酸配列を有し、Ｎ末端に単一疎水性領域を有し、ヘリックス構造を形成し、柔軟性を示し、７〜１７アミノ酸の長さを有することを特徴とする、薬物送達のための薬学的組成物の製造における、巨大分子伝達ドメイン（ＭＴＤ）ペプチドの使用。
【請求項２２】
ＭＴＤペプチドが配列番号：3, 5, 8-12, 14, 15, 18, 19, 21, 22, 24, 30, 37-39, 42, 70, 74, 76, 78, 80, 88, 95, 97, 98, 102, 103, 105, 120, 122-125, 129, 130, 137, 142, 143, 145, 153, 155, 156, 158, 159, 163, 171, 173, 174, 182, 183, 188及び192からなる群より選択されるアミノ酸配列を有し、Ｎ末端に単一疎水性領域を有し、ヘリックス構造を形成し、柔軟性を示し、７〜１７アミノ酸の長さを有することを特徴とする、ワクチンの製造における、巨大分子伝達ドメイン（ＭＴＤ）ペプチドの使用。
【請求項２３】
ＭＴＤペプチドが配列番号：3, 5, 8-12, 14, 15, 18, 19, 21, 22, 24, 30, 37-39, 42, 70, 74, 76, 78, 80, 88, 95, 97, 98, 102, 103, 105, 120, 122-125, 129, 130, 137, 142, 143, 145, 153, 155, 156, 158, 159, 163, 171, 173, 174, 182, 183, 188及び192からなる群より選択されるアミノ酸配列を有し、Ｎ末端に単一疎水性領域を有し、ヘリックス構造を形成し、柔軟性を示し、７〜１７アミノ酸の長さを有することを特徴とする、タンパク質療法のための薬学的組成物の製造における、巨大分子伝達ドメイン（ＭＴＤ）ペプチドの使用。
【請求項２４】
ＭＴＤペプチドが配列番号：3, 5, 8-12, 14, 15, 18, 19, 21, 22, 24, 30, 37-39, 42, 70, 74, 76, 78, 80, 88, 95, 97, 98, 102, 103, 105, 120, 122-125, 129, 130, 137, 142, 143, 145, 153, 155, 156, 158, 159, 163, 171, 173, 174, 182, 183, 188及び192からなる群より選択されるアミノ酸配列を有し、Ｎ末端に単一疎水性領域を有し、ヘリックス構造を形成し、柔軟性を示し、７〜１７アミノ酸の長さを有することを特徴とする、遺伝子療法のための薬学的組成物の製造における、巨大分子伝達ドメイン（ＭＴＤ）ペプチドの使用。