(57)【要約】      （修正有）【課題】高い熱安定性を有する蛍光タンパク質およびそれを利用する方法を提供することにある。【解決手段】特定のアミノ酸配列を有する蛍光タンパク質であって、刺胞動物門花虫綱ウミエラ目ウミサボテン科に属す生物に由来し、１００℃以上の環境に１０分間以上置かれても発光活性を失わない。「発光活性を失わない」は、発光活性が変化しない場合だけでなく、１００℃以上の環境に１０分間以上置かれた後において、発光活性が低下するものの測定可能な発光活性を有している場合を含む。【選択図】図１
2014060947.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
刺胞動物門花虫綱ウミエラ目ウミサボテン科に属す生物に由来し、１００℃以上の環境に１０分間以上置かれても発光活性を失わない蛍光タンパク質。
【請求項２】
配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する蛍光タンパク質。
【請求項３】
配列番号１に記載のアミノ酸配列との間で８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、１００℃以上の環境に１０分間以上置かれても発光活性を失わない蛍光タンパク質。
【請求項４】
請求項１から３の何れか１項に記載の蛍光タンパク質をコードする遺伝子を含む核酸。
【請求項５】
配列番号４に記載の塩基配列を含む核酸。
【請求項６】
滅菌の対象となる対象物と、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する蛍光タンパク質および／または配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する蛍光タンパク質とを湿熱処理することと、
前記蛍光タンパク質の発光強度の前記湿熱処理前後における変化に基づいて、前記湿熱処理の程度を評価することと
を含む湿熱滅菌方法。
【請求項７】
前記湿熱処理は、前記対象物を１００℃以上の環境に１０分間以上置くことを含む請求項６に記載の方法。
【請求項８】
請求項６に記載の湿熱滅菌方法において使用するための、配列番号１または２に記載のアミノ酸配列を有する湿熱滅菌評価用蛍光タンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、熱安定性を有する蛍光タンパク質およびそれを利用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
緑色蛍光タンパク質（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ、ＧＦＰ）などの蛍光タンパク質は、生物学における基礎研究から応用研究まで、幅広く利用される重要なツールである。オワンクラゲ（Ａｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａ）由来のＧＦＰが見出され、その遺伝子を原核生物である大腸菌や真核生物である線虫で発現させることで、緑色の蛍光によるイメージングが可能となった。ＧＦＰと他のタンパク質とを融合することで、その他のタンパク質の細胞内局在や発現量の変化をイメージングすることが可能となる。さらに、ＧＦＰを動物個体の組織内で発現させることで、動物個体をｉｎ  ｖｉｖｏで非侵襲的にモニタリングすることが出来る。ＧＦＰは、このような性質を有するため、一般的な細胞研究のみならず、ガンの基礎研究や治療効果をモニターすることへの応用研究にも用いられている。
【０００３】
滅菌方法の１つとして、対象物を水分存在下で加熱する処理が存在する。このような処理は、湿熱処理と呼ばれる。特に、１００度以下の湿熱処理は、食品や医薬品等の製造過程に用いられている。湿熱処理を行うことによって、微生物の発育制御および内在性酵素の不活化が起こり、製造物の品質が守られ、より長い有効期限が保持される。湿熱処理の効果を調べるためには、製品に生存する病原菌数を知る必要がある。しかし、それを直接カウントすることは多大な手間を要する。そこで、その活性を見るだけで湿熱処理効果を簡単に評価できる、酵素などのバイオインディケーターが必要とされる。従来、バイオインディケーターとして、製品中に存在する最も耐熱性の高い酵素が選択され、それが用いられてきた。
【０００４】
ＧＦＰは、基質を加えることなく蛍光を生じるため、ＧＦＰのバイオインディケーターとしての利用は、湿熱処理の効果の評価を容易にし、そのため、従来の酵素と比較して利便性が高いと予想される。しかしながら、一般に、ＧＦＰは極端な高温条件下で蛍光活性を失う。
【０００５】
非特許文献２には、既存のＧＦＰ変異体のうち、より耐熱性の高いものについて、バイオインディケーターとしての利用可能性を調べている。食品または医薬品の分野における湿熱処理効果を調べるためには、１００度付近でもＧＦＰが蛍光を発する必要がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Penna et al. “Thermal stability of recombinant green fluorescent protein (GFPuv) at various pH values.” (2004), Appl Biochem Biotechnol, Spring;113-116:469-83
【非特許文献２】Penna et al. “Thermal characteristics of recombinant green fluorescent protein (GFPuv) extracted form Escherichia coli” (2004), Lett Appl Microbiol, 38, 135-9
【非特許文献３】Crameri et al. “Improved green fluorescent protein by molecular evolution using DNA shuffling.” (1996), Nat Biotechnol, 14(3), 315-9
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、高い熱安定性を有する蛍光タンパク質およびそれを利用する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明に係る蛍光タンパク質は、刺胞動物門花虫綱ウミエラ目ウミサボテン科に属す生物に由来し、１００℃以上の環境に１０分間以上置かれても発光活性を失わない。
【０００９】
本発明に係る蛍光タンパク質は、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する。
【００１０】
本発明に係る蛍光タンパク質は、配列番号１に記載のアミノ酸配列との間で８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、１００℃以上の環境に１０分間以上置かれても発光活性を失わない。
【００１１】
本発明に係る湿熱滅菌方法は、滅菌の対象となる対象物と、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する蛍光タンパク質および／または配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する蛍光タンパク質とを湿熱処理することと、前記蛍光タンパク質の発光強度の前記湿熱処理前後における変化に基づいて、前記湿熱処理の程度を評価することとを含む。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、高い熱安定性を有する蛍光タンパク質およびそれを利用する方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、第１実施形態に係る蛍光タンパク質を発現する大腸菌の、加熱処理前後における発光の様子を示す図である。
【図２】図２は、精製した第１実施形態に係る蛍光タンパク質の、加熱処理前後における発光の様子を示す図である。
【図３】図３は、第１実施形態に係る蛍光タンパク質の、加熱処理の温度と加熱処理後の発光強度との関係を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の第１実施形態は、刺胞動物門花虫綱ウミエラ目ウミサボテン科に属す生物に由来し、１００℃以上の環境に１０分間以上置かれても発光活性を失わない蛍光タンパク質である。
【００１５】
刺胞動物門花虫綱ウミエラ目ウミサボテン科に属す生物とは、例えば、刺胞動物門花虫綱ウミエラ目ウミサボテン科に属すカベルヌラリア・オベサ（Ｃａｖｅｒｎｕｌａｒｉａ  ｏｂｅｓａ）（和名：ウミサボテン）である。この他に、未だ分類されていない生物または未発見の生物であって、後に刺胞動物門花虫綱ウミエラ目ウミサボテン科に属すことが判明した生物も、これに含まれる。
【００１６】
蛍光タンパク質とは、励起光を受けて励起され、発光を生じるタンパク質を意味する。この発光の発生には、基質を必要としない。発光の色は、緑色、赤色、黄色等のものが存在する。
【００１７】
第１実施形態に係る蛍光タンパク質は、１００℃以上の環境に１０分間以上置かれても発光活性を失わない。本願において「発光活性を失わない」とは、１００℃以上の環境に１０分間以上置かれる前後で発光活性が変化しない場合だけでなく、１００℃以上の環境に１０分間以上置かれた後において、発光活性が低下するものの測定可能な発光を生じる程度の発光活性を有している場合も含む。例えば、第１実施形態に係る蛍光タンパク質は、１００℃以上の環境に１０分間以上置かれても、その環境に置かれる前の発光活性の２０％以上、２５％以上、３０％以上、３５％以上、４０％以上、４５％以上または５０％以上の発光活性を維持している。さらに、第１実施形態に係る蛍光タンパク質は、１００℃以上の環境に１０分間以上置かれても、蛍光顕微鏡やルミノメーターといった一般的な蛍光を測定する装置により発光が測定可能な発光活性を維持している。
【００１８】
また、第１実施形態に係る蛍光タンパク質の存在する環境の温度を上昇させた場合に、その発光活性は、急に低下することなく、温度の上昇とともに少しずつ低下する。例えば、第１実施形態に係る蛍光タンパク質は、２５℃での発光活性を１００％とした場合、７０℃で１０分間加熱した場合に９５％の発光活性を示し、８０℃で１０分間加熱した場合に７５％の発光活性を示し、９０℃で１０分間加熱した場合に６０％の発光活性を示し、１００℃で１０分間加熱した場合に５０％の発光活性を示す。なお、一般的な蛍光タンパク質では、４０℃を超えると発光活性は急激に低下するが、第１実施形態に係る蛍光タンパク質は、そのような急激な発光活性の低下を示さない。
【００１９】
第１実施形態に係る蛍光タンパク質の例は、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する蛍光タンパク質である。この蛍光タンパク質は、ウミサボテン（カベルヌラリア・オベサ）の遺伝子クローニングによって得られた２２１個のアミノ酸から成る蛍光タンパク質に対して、複数のアミノ酸残基を置換する変異を導入することにより取得することができる。具体的には、アミノ酸配列のＮ末端側から１４２番目のスレオニンをイソロイシンに置換し（Ｔ１４２Ｉ）、１５４番目のシステインをアルギニンに置換（Ｃ１５４Ｒ）することで取得することができる。この蛍光タンパク質は、大腸菌にて発現させた場合、二量体を形成する。本願を通して、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する蛍光タンパク質のことを、便宜的に「変異体１」、「ｍｕｔａｎｔ１」または「ｍｕｔ１」と称する。また、ウミサボテンの遺伝子クローニングによって得られた２２１個のアミノ酸から成る蛍光タンパク質のことを、便宜的に「野生型」または「ＷＴ」と称する。
【００２０】
変異体１のアミノ酸配列を以下に示す：
MSIPENSGLTEEMPAQMNLEGVVNGHAFSMEGIGGGNILTGIQKLDIRVTEGDPLPFSFDILSVAFQYGNRTYTSYPAKIPDYFVQSFPEGFTFERTLSFEDGAIVKVESDISIEDGKFVGKIKYNGESFPEDGPVMKKEVIKLEPSSESMYVRDDTLVGEVVLSYKTQSTHYTCHMKTIYRSKKPVENLPKFHYVHHRLEKKKVEEGNYYEQHETAIAKP（配列番号１）。
【００２１】
第１実施形態に係る蛍光タンパク質の別の例は、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する蛍光タンパク質である。この蛍光タンパク質も、変異体１と同様に、ウミサボテンの野生型蛍光タンパク質に対して、複数のアミノ酸残基を置換する変異を導入することにより取得することができる。具体的には、アミノ酸配列のＮ末端側から１２９番目のセリンをグリシンに置換し（Ｓ１２９Ｇ）、１５４番目のシステインをセリンに置換し（Ｃ１５４Ｓ）、１５６番目のアスパラギン酸をグリシンに置換し（Ｄ１５６Ｇ）、２０４番目のリジンをイソロイシンに置換し（Ｋ２０４Ｉ）、２０９番目のアスパラギンをチロシンに置換（Ｎ２０９Ｙ）することで取得することができる。この蛍光タンパク質は、大腸菌にて発現させた場合、単量体を形成する。本願を通して、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する蛍光タンパク質のことを、便宜的に「変異体２」、「ｍｕｔａｎｔ２」または「ｍｕｔ２」と称する。
【００２２】
変異体２のアミノ酸配列を以下に示す：
MSIPENSGLTEEMPAQMNLEGVVNGHAFSMEGIGGGNILTGIQKLDIRVTEGDPLPFSFDILSVAFQYGNRTYTSYPAKIPDYFVQSFPEGFTFERTLSFEDGAIVKVESDISIEDGKFVGKIKYNGEGFPEDGPVMKKEVTKLEPSSESMYVSDGTLVGEVVLSYKTQSTHYTCHMKTIYRSKKPVENLPKFHYVHHRLEKKIVEEGYYYEQHETAIAKP（配列番号２）。
【００２３】
第１実施形態に係る蛍光タンパク質のまた別の例は、配列番号１に記載のアミノ酸配列との間で８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、１００℃以上の環境に１０分間以上置かれても発光活性を失わない蛍光タンパク質である。すなわち、この蛍光タンパク質は、変異体１と比較してアミノ酸配列が変異しているものの、変異体１が有している熱に対する安定性と同様の性質を有している。この蛍光タンパク質の例は、変異体１のアミノ酸配列において、発光活性に対する影響が小さい部分のアミノ酸残基が置換され、または欠失しているタンパク質である。相同性は、好ましくは、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上である。
【００２４】
第１実施形態に係る蛍光タンパク質のさらに別の例は、配列番号２に記載のアミノ酸配列との間で８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、１００℃以上の環境に１０分間以上置かれても発光活性を失わない蛍光タンパク質である。すなわち、この蛍光タンパク質は、変異体２と比較してアミノ酸配列が変異しているものの、変異体２が有している熱に対する安定性と同様の性質を有している。この蛍光タンパク質の例は、変異体２のアミノ酸配列において、発光活性に対する影響が小さい部分のアミノ酸残基が置換され、または欠失しているタンパク質である。相同性は、好ましくは、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上である。
【００２５】
第１実施形態に係る蛍光タンパク質は、高い熱安定性を示し、その性質に基づいて様々な技術に応用することが可能となる。第１実施形態に係る蛍光タンパク質を使用することで、これまで不可能であった新たな技術を達成することも可能となる。第１実施形態に係る蛍光タンパク質は、例えば、湿熱処理に使用することが可能となる。
【００２６】
ＧＦＰといった従来の蛍光タンパク質は、基質を必要とせず単体で蛍光を発することから、湿熱処理等のバイオインディケーターとしての利用が期待される。しかしながら、一般的なＧＦＰは、極端な高温条件下では蛍光を失ってしまう。そのため、湿熱処理の効果を調べるためには、高温条件に対する耐熱性が必要とされる。従来のオワンクラゲＧＦＰ変異体を用いて、バイオインディケーターとしての利用可能性を検討することも行われたが、１００℃における耐熱性は示されていない。すなわち、従来の蛍光タンパク質を、１００℃付近の高温条件を利用する湿熱処理に利用することはできない。
【００２７】
一方、第１実施形態に係る蛍光タンパク質は、１００℃以上の環境に１０分間以上置いた後でも、測定するのに十分な明るさの蛍光活性を示すため、医薬品や食品の湿熱処理に利用することが可能となり、それらの製造過程において重要な湿熱処理の効果等を迅速に調べることができる。
【００２８】
また、第１実施形態に係る蛍光タンパク質によれば、高温環境下における生物の蛍光イメージングが可能となる。例えば、至適生育温度が４５℃以上とされている好熱菌や、至適生育温度が８０℃以上とされている超好熱菌において、従来行うことができなかった蛍光イメージングを行うことが可能となる。
【００２９】
第１実施形態に係る蛍光タンパク質は、核酸の形態で提供されてもよい。すなわち、第１実施形態に係る蛍光タンパク質をコードする遺伝子を含む核酸も提供される。
【００３０】
このような核酸の具体的な例は、配列番号１および２に記載の塩基配列を含む核酸である。これらの塩基配列は、それぞれ、変異体１および２の遺伝子をコードしている。
【００３１】
変異体１の遺伝子をコードする塩基配列を以下に示す：
ATGAGTATTCCAGAGAATTCGGGCTTAACAGAAGAGATGCCTGCTCAAATGAATTTAGAAGGAGTGGTAAATGGTCATGCCTTCTCTATGGAAGGAATTGGTGGAGGGAACATACTAACTGGAATTCAAAAGCTGGATATCCGTGTCACCGAGGGAGATCCTCTTCCGTTTTCCTTTGACATTCTCTCAGTTGCGTTTCAATATGGCAACAGAACTTACACAAGTTATCCTGCGAAGATCCCCGATTATTTCGTTCAATCATTCCCAGAAGGGTTCACCTTTGAAAGGACTCTTAGTTTTGAAGATGGTGCAATCGTAAAGGTCGAATCGGATATTAGTATTGAAGATGGCAAATTTGTTGGCAAGATTAAATATAATGGCGAAAGTTTTCCAGAGGATGGACCGGTGATGAAAAAGGAAGTTATCAAACTAGAACCGTCCAGTGAGTCAATGTATGTACGTGACGACACTTTGGTGGGAGAAGTTGTGTTGTCTTACAAGACCCAGTCGACTCATTACACTTGCCATATGAAAACAATCTACAGGTCCAAAAAGCCAGTAGAAAACCTGCCAAAGTTCCATTATGTTCATCATCGCCTCGAAAAGAAAAAAGTCGAGGAAGGCAACTACTACGAGCAACATGAGACGGCCATAGCTAAACCATGA（配列番号４）。
【００３２】
変異体２の遺伝子をコードする塩基配列を以下に示す：
ATGAGTATTCCAGAGAATTCGGGCTTAACAGAAGAGATGCCTGCTCAAATGAATTTAGAAGGAGTGGTAAATGGTCATGCCTTCTCTATGGAAGGAATTGGTGGAGGGAACATACTAACTGGAATTCAAAAGCTGGATATCCGTGTCACCGAGGGAGATCCTCTTCCGTTTTCCTTTGACATTCTCTCAGTTGCGTTTCAATATGGCAACAGAACTTACACAAGTTATCCTGCGAAGATCCCCGATTATTTCGTTCAATCATTCCCAGAAGGGTTCACCTTTGAAAGGACTCTTAGTTTTGAAGATGGTGCAATCGTAAAGGTCGAATCGGATATTAGTATTGAAGATGGCAAATTTGTTGGCAAGATTAAATATAATGGCGAAGGTTTTCCAGAGGATGGACCGGTGATGAAAAAGGAAGTTACCAAACTAGAACCGTCCAGTGAGTCAATGTATGTATCGGACGGCACTTTGGTGGGAGAAGTTGTGTTGTCTTACAAGACCCAGTCGACTCATTACACTTGCCATATGAAAACAATCTACAGGTCCAAAAAGCCAGTAGAAAACCTGCCAAAGTTCCATTATGTTCATCATCGCCTCGAAAAGAAAATAGTCGAGGAAGGCTACTACTACGAGCAACATGAGACGGCCATAGCTAAACCATGA（配列番号５）。
【００３３】
また、核酸は、プロモーターといった転写制御のための因子が結合する領域をさらに含んでよい。また、核酸は、第１実施形態に係る蛍光タンパク質とは異なるタンパク質をコードする遺伝子をさらに含んでよい。この場合、蛍光タンパク質とこの異なるタンパク質とが融合した状態で発現されるように、それらの遺伝子が核酸上に配置されている。
【００３４】
また、核酸はベクターの形態であってよい。ベクターは、抗生物質耐性遺伝子および複製起点といった一般的なベクターに含まれる要素を含んでよい。
【００３５】
このような核酸によれば、第１実施形態に係る蛍光タンパク質の遺伝子を、核酸の形態にて安定的に保存および使用することができる。
【００３６】
本発明の第２実施形態は湿熱滅菌方法である。
【００３７】
第２実施形態に係る湿熱滅菌方法は、滅菌の対象となる対象物と、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する蛍光タンパク質および／または配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する蛍光タンパク質とを湿熱処理することを含む。
【００３８】
対象物は、種々のものであってよく、例えば、食品、医薬品、培養培地、試薬、食品や医薬品の製造ための器具、試験用器具、医療用器具等である。好ましくは、対象物は、１００℃を超える温度において変性するという理由から、通常１００℃程度の湿熱処理が行われる対象物であり、例えば、食品および医薬品である。
【００３９】
配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する蛍光タンパク質（すなわち変異体１）および配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する蛍光タンパク質（すなわち変異体２）のいずれか一方が、またはそれらが同時に、対象物とともに湿熱処理に供される。これらの蛍光タンパク質と対象物とが混合された状態で湿熱処理することができる。あるいは、湿熱処理を行う装置内に、これらの蛍光タンパク質と、対象物とを独立に存在させて、湿熱処理を行うことができる。湿熱処理の際、これらの蛍光タンパク質は、好ましくは水溶液中に存在している。これらの蛍光タンパク質は、既知の方法により製造されたものを使用してよい。例えば、大腸菌にて発現させて、大腸菌から抽出または精製したものを使用してよい。
【００４０】
湿熱処理として、水分存在下で対象物を加熱する。例えば、食品や医薬品に対して一般的に行われる条件にて湿熱処理が行われる。例えば、対象物は１００℃以上の環境に１０分間以上置かれる。
【００４１】
第２実施形態に係る湿熱滅菌方法は、前記蛍光タンパク質の発光強度の前記湿熱処理前後における変化に基づいて、前記湿熱処理の程度を評価することを含む。
【００４２】
湿熱処理の後、蛍光タンパク質の発光強度が測定される。その測定値を、湿熱処理前の測定した発光強度、またはその蛍光タンパク質の常温での一般的な発光強度と比較し、発光活性の低下の程度から、対象物に対する湿熱処理が十分であったかどうかが判断される。このとき、種々の処理条件下にて蛍光タンパク質を湿熱処理し、その結果に基づいて予め作成した、処理条件と蛍光活性との関係を示す検量線に当てはめることで、実際に対象物に対して行った湿熱処理の状態をより正確に調べることもできる。
【００４３】
第２実施形態に係る湿熱滅菌方法によれば、例えば医薬品や食品の湿熱処理の効果を、直接菌体数をカウント等する必要なく、迅速に調べることが可能となる。また、第２実施形態に係る湿熱滅菌方法によれば、蛍光を測定することにより評価することが可能となるため、従来の酵素を用いた反応に比べ、容易に評価を行うことが可能となる。
【００４４】
本発明の第３実施形態は、第２実施形態に係る湿熱滅菌方法において使用するための、配列番号１または２に記載のアミノ酸配列を有する湿熱滅菌評価用蛍光タンパク質である。
【００４５】
第３実施形態に係る蛍光タンパク質は、湿熱滅菌方法への使用に特化した形態であってよい。
【００４６】
第３実施形態に係る蛍光タンパク質によれば、第２実施形態に係る湿熱滅菌方法と同様に、医薬品や食品等の湿熱処理の効果を、迅速に容易に調べることが可能となる。
【実施例】
【００４７】
（１）ウミサボテン蛍光タンパク質遺伝子の変異体作製
野生型のウミサボテンＧＦＰに対して、ランダムに変異を導入し、熱安定性を有する変異体をスクリーニングし、変異体１および２を取得した。
【００４８】
野生型のウミサボテンＧＦＰは、特開２０１１−１３５７８１号公報に開示される方法に倣って取得した。そのアミノ酸配列は配列番号３に記載のアミノ酸配列であり、それをコードする遺伝子の塩基配列は、配列番号６に記載の塩基配列である。それぞれの配列を以下に示す：
アミノ酸配列
MSIPENSGLTEEMPAQMNLEGVVNGHAFSMEGIGGGNILTGIQKLDIRVTEGDPLPFSFDILSVAFQYGNRTYTSYPAKIPDYFVQSFPEGFTFERTLSFEDGAIVKVESDISIEDGKFVGKIKYNGESFPEDGPVMKKEVTKLEPSSESMYVCDDTLVGEVVLSYKTQSTHYTCHMKTIYRSKKPVENLPKFHYVHHRLEKKKVEEGNYYEQHETAIAKP（配列番号３）
塩基配列
ATGAGTATTCCAGAGAATTCGGGCTTAACAGAAGAGATGCCTGCTCAAATGAATTTAGAAGGAGTGGTAAATGGTCATGCCTTCTCTATGGAAGGAATTGGTGGAGGGAACATACTAACTGGAATTCAAAAGCTGGATATCCGTGTCACCGAGGGAGATCCTCTTCCGTTTTCCTTTGACATTCTCTCAGTTGCGTTTCAATATGGCAACAGAACTTACACAAGTTATCCTGCGAAGATCCCCGATTATTTCGTTCAATCATTCCCAGAAGGGTTCACCTTTGAAAGGACTCTTAGTTTTGAAGATGGTGCAATCGTAAAGGTCGAATCGGATATTAGTATTGAAGATGGCAAATTTGTTGGCAAGATTAAATATAATGGCGAAAGTTTTCCAGAGGATGGACCGGTGATGAAAAAGGAAGTTACCAAACTAGAACCGTCCAGTGAGTCAATGTATGTATGTGACGACACTTTGGTGGGAGAAGTTGTGTTGTCTTACAAGACCCAGTCGACTCATTACACTTGCCATATGAAAACAATCTACAGGTCCAAAAAGCCAGTAGAAAACCTGCCAAAGTTCCATTATGTTCATCATCGCCTCGAAAAGAAAAAAGTCGAGGAAGGCAACTACTACGAGCAACATGAGACGGCCATAGCTAAACCATGA（配列番号６）。
【００４９】
変異体１は、次のように取得した。野生型ウミサボテンＧＦＰへの変異導入には、ＧｅｎｅＭｏｒｐｈ  ＩＩ  ＥＺＣｌｏｎｅ  Ｄｏｍａｉｎ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を用いた。野生型ウミサボテンＧＦＰの遺伝子がクローニングされているｐＲＳＥＴ−Ａ（インビトロジェン社）のプラスミドを鋳型として、プライマー１（ＡＴＧＡＧＴＡＴＴＣＣＡＧＡＧＡＡＴＴＣＧＧＧＣＴＴＡＡＣＡＧ）（配列番号７）およびプライマー２（ＴＣＡＴＧＧＴＴＴＡＧＣＴＡＴＧＧＣＣＧＴＣＴＣＡＴＧ）（配列番号８）を加えて、キットに添付されているマニュアルに従ってＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応後、１％アガロースゲルを用いて、電気泳動を行い、目的ＰＣＲ産物をＷｉｚａｒｄ  ＳＶ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて精製した。精製後、マニュアルに従ってＰＣＲ反応を行い、ＤｐｎＩを加えて、３７度で処理した後に、エタノール沈殿を行った。沈殿後、少量の蒸留水にＤＮＡを溶かして、ＭｉｃｒｏＰｕｌｓｅｒ（ＢｉｏＲａｄ社）を用いて、エレクトロポレーション法で、ＪＭ１０９（ＤＥ３）にトランスフォームを行った。トランスフォーム後の大腸菌を２５ｃｍ四方のＬＢ（５０ｎｇ／ｍｌのアンピシリン入り）プレートに撒いて、３７℃で、コロニーを形成させて、スクリーニングを行った。コロニー形成後、ＵＶ／ＢＬＵＥ  ＣＯＮＶＥＲＴＥＲ  ＰＬＡＴＥ（ＵＶＰ）で観察して、明るい蛍光を持ったコロニーを選んで培養を行い、その大腸菌が保持していたプラスミドのＤＮＡ配列を決定した。これによって、変異体１を得た。
【００５０】
変異体２は、特開２０１１−１３５７８１号公報に開示される方法に倣って取得した。具体的には、特開２０１１−１３５７８１号公報の実施例２から４に記載の方法に倣って取得した。変異体２と、特開２０１１−１３５７８１号公報に開示される「変異体２」とは同一のアミノ酸配列を有する。
【００５１】
２種の変異体のプラスミドをそれぞれ保持する大腸菌を３７度で培養後、溶菌させて、Ｈｉｓ  Ｌｉｎｋ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いたカラムクロマトグラフィーを行って精製した。
【００５２】
（２）大腸菌内での変異体の耐熱性評価
大腸菌内における変異体１の耐熱性を評価した。
【００５３】
野生型のウミサボテンＧＦＰおよび変異体１の遺伝子をそれぞれ形質転換した大腸菌をＬＢ培地のプレートにまき、コロニーを形成させた。野生型および変異体１をそれぞれ発現させた後、Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ＵＶ  Ｔｒａｎｓｉｌｌｕｍｉｎａｔｏｒ（フナコシ）を用いて３６５ｎｍのＵＶをあてて、ＤＰ７０（オリンパス）にて、加熱処理前の蛍光画像を取得した（図１ａ）。その後、それらのプレートをＩＮＣＵＰＥＴ（Ｐａｓｏｌｉｎａ）にて７０℃で２時間加熱処理した。加熱処理完了後、同様の方法にて、加熱処理後の蛍光画像を取得した（図１ｂ）。
【００５４】
図１ａと図１ｂとの比較から、大腸菌内で発現させた場合、野生型と比較して、変異体１は加熱処理後も明るい蛍光を示しており、耐熱性を有していることがわかった。
【００５５】
（３）精製した変異体の耐熱性評価
精製されたＥＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）（ｐＲＳＥＴ−Ｂ（インビトロジェン社）にクローニングしたものから発現）、並びにウミサボテンＧＦＰの野生型、変異体１および変異体２を含むタンパク質溶液を、いずれも０．５ｍｇ／ｍｌになるように水で希釈し、５０μｌずつ０．２ｍｌチューブに入れた。それらを、Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ＵＶ  Ｔｒａｎｓｉｌｌｕｍｉｎａｔｏｒ（フナコシ）を用いて３６５ｎｍのＵＶをあてて、ＤＰ７０（オリンパス）にて、加熱処理前の蛍光画像を取得した（図２ａ）。その後、それらに対し、サーマルサイクラー（エムジェイジャパン）を用いて１００℃で１０分の加熱処理を行った。加熱処理完了後、同様の方法にて、加熱処理後の蛍光画像を取得した（図２ｂ）。
【００５６】
また、同様の、０．５ｍｇ／ｍｌに希釈した４種のタンパク質溶液について、サーマルサイクラー（エムジェイジャパン）で加熱処理する前と後における蛍光強度を、分光蛍光光度計（日立社）を用いて測定した。加熱処理前の蛍光強度を常温時（２５℃）とし、７０℃、８０℃、９０℃および１００℃にてそれぞれ１０分間加熱処理した後の蛍光強度をそれぞれ測定しプロットした（図３）。また、測定結果を以下の表１に示す。
【００５７】
【表１】
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【００５８】
図２および３から、ＥＧＦＰおよび野生型と比較して、変異体１および２は１００℃１０分の加熱処理後も強い蛍光を保持しており、熱に対する高い安定性を有することが示された。また、図３から、ＥＧＦＰと比較して、野生型、変異体１および変異体２は、温度の上昇とともに、なだらかに発光強度が低下することが示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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