(57)【要約】      （修正有）【課題】微生物の生合成により高分子量のγ-PGAを得ることを課題とする。【解決手段】特定の配列で表されるアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有し、且つγ-ポリグルタミン酸の平均分子量を増大させる機能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにより上記の課題を解決する。該ポリペプチドは、γ-PGAの平均分子量を５,０００,０００〜２０,０００,０００に増大させる機能を有し、更にγ-PGAの産生量を増大させる機能を有する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で表されるアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有し、且つγ-ポリグルタミン酸(γ-PGA)の平均分子量を増大させる機能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項２】
ポリペプチドが、γ-PGAの平均分子量を５,０００,０００〜２０,０００,０００に増大させる機能を有する請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
ポリペプチドが、γ-PGAの産生量を増大させる機能を更に有する請求項１又は２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする請求項１〜３のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１つに記載のポリペプチド。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドを有する組換えベクター。
【請求項７】
(i)PgsB又はこれと同等の機能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
(ii)PgsC又はこれと同等の機能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び
(iii)PgsA又はこれと同等の機能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
を更に含む請求項６に記載の組換えベクター。
【請求項８】
請求項６又は７に記載の組換えベクターを有する形質転換体。
【請求項９】
請求項１〜４のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド又は請求項６若しくは７に記載の組換えベクターを含むキット。
【請求項１０】
請求項８に記載の形質転換体を培養する工程を含む、γ-PGAの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、γ-ポリグルタミン酸の平均分子量を増大させる機能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド及びその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
γ-ポリグルタミン酸(以下、「γ-PGA」ともいう)は、L体及び／又はD体のグルタミン酸がγ-アミド結合により結合した鎖状高分子であり、納豆に含まれる粘稠性物質の主な成分として知られている。γ-PGAは、生分解性であり、高い粘性及び保水性を有することから、食品、化粧品、医療品等の多くの分野で、種々の用途に用いられている。
【０００３】
現時点では、化学合成によりγ-PGAを大量に製造することは困難であるので、γ-PGAは、主にγ-PGA産生能を有する微生物、例えばバシラス属(Bacillus)の菌株の培養物から採取することにより製造されている。そのような微生物としては、例えば、特許文献１(特開平１−１７４３９７号公報)に開示されるバシラス・エスピー(Bacillus sp.) F-2-01株が大阪市立大学構内の土壌から分離されている。このF-2-01株は、他のバシラス属の菌株と比較して、優れたγ-PGA産生能を有している。
【０００４】
近年、バシラス属の菌によるγ-PGA産生のメカニズムが分子生物学の観点から研究されている。例えば、非特許文献１(Biotechnology and Bioengineering, Vol. 108, No. 1, January 1, 2011)には、バシラス属の一種であるバシラス・サチリス(Bacillus subtilis)においてγ-PGA合成を担う遺伝子群は、pgsB、pgsC、pgsA(又はpgsAA)及びpgsE遺伝子を含むことが記載されている。各遺伝子がコードしているタンパク質分子の機能については、次のようなことが知られている。
可溶性の形態にあるPgsBは、L-グルタミン酸の存在下でATPをADPに加水分解する機能を有する。PgsCは、N-アセチルグルタミン酸シンセターゼのN-アセチルトランスフェラーゼドメインによく似た構造を有している。この構造が細胞外ポリ-ε-L-リジンのような細胞外ポリマーの産生において重要な役割を担っていることが示唆されている。PgsAは、D-グルタミン酸を含むγ-PGAの産生又は輸送において機能し得ることが示唆されている。
このように、γ-PGAの生合成には、PgsB、PgsC及びPgsAの３つのタンパク質分子が必須であると考えられている。しかし、pgsE遺伝子がコードするPgsEの機能については知られていなかった。
【０００５】
このような背景において、非特許文献１には、γ-PGA合成におけるPgsEの機能について報告がなされている。すなわち、同文献には、亜鉛の存在下でPgsEを誘導することにより、バシラス・サチリス亜種の菌株(B. subtilis subsp. chungkookjang)のγ-PGA産生量を約３倍に向上させることができたことが開示されている。つまり、同文献には、PgsEがバシラス・サチリスのγ-PGA産生量を増大させる因子であることが示唆されている。
【０００６】
他方で、γ-PGAは、その平均分子量が高ければ高いほど、保湿性、粘性及びカルシウム吸収促進性に優れたものとなることが知られている。そこで、当該技術分野においては、従来、微生物から得られたγ-PGAに架橋を施すことにより高分子量のγ-PGAを製造していた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開平１−１７４３９７号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Yamashiro D.ら、Biotechnology and Bioengineering, Vol. 108, No. 1, January 1, 2011
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかし、γ-PGAの製造におけるコスト及び安全性の観点から、架橋工程を省略し、微生物の生合成により高分子量のγ-PGAを得ることが望まれていた。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記のような背景から、本発明者らは、優れたγ-PGA産生能を有するF-2-01株のPgsEの機能について研究を重ねた。その結果、意外なことに、F-2-01株のPgsEがγ-ポリグルタミン酸の平均分子量を増大させる機能を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
かくして、本発明によれば、配列番号１で表されるアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有し、且つγ-ポリグルタミン酸の平均分子量を増大させる機能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが提供される。また、該ポリヌクレオチドを有する組換えベクター、形質転換体、キットが提供される。さらに、前記形質転換体を得る方法及び平均分子量が増大されたγ-PGAの製造方法が提供される。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、平均分子量が増大されたγ-ポリグルタミン酸を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明の形質転換体により産生されたγ-PGAの平均分子量が増大されていることを示すHPLCデータである。
【図２】本発明の形質転換体により産生されたγ-PGA全量に対する平均分子量１１,０００,０００のγ-PGAの含有率を示すグラフである。
【図３】本発明の形質転換体により、金属イオン非添加時に産生されたγ-PGAの産生量を示すグラフである。
【図４】本発明の形質転換体により、金属イオン添加時に産生されたγ-PGAの産生量を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本明細書において、配列番号１で表されるアミノ酸配列とは、バシラス・エスピーF-2-01株のpgsE遺伝子によりコードされるタンパク質であるPgsEのアミノ酸配列である。また、pgsE遺伝子の塩基配列を、配列番号２に示す。
【００１５】
本発明のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドは、配列番号１で表されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、更に好ましくは少なくとも９５％、より一層好ましくは少なくとも９８％、の同一性を有するか、又は配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる。
また、本発明のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドは、後述するγ-PGAの平均分子量を増大させる機能を有する限り、配列番号１で表されるアミノ酸配列に１又は複数のアミノ酸残基が欠失、置換及び／又は付加されたものであってもよい。
なお、アミノ酸及び塩基配列の同一性とは、BLASTN、BLASTP、BLASTX又はTBLASTN（例えば、http://www.ncbi.nlm.nih.govから利用可能）を標準設定で用いて算出される値を意味する。
【００１６】
本発明のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドは、γ-PGAの平均分子量を増大させる機能を有する。
【００１７】
本明細書において、「γ-PGAの平均分子量を増大させる」とは、PgsB、PgsC及びPgsAからなる３つの分子により産生されるγ-PGAの平均分子量よりも増大させることを意図する。
本発明のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドがγ-PGAの平均分子量を増大させる機能を有しているか否かを調べる方法は、例えば、以下のとおりである。
本発明者らは、γ-PGA産生能を有していない菌種である大腸菌にバシラス属の菌由来のpgsB、pgsC及びpgsA遺伝子を有する組換えベクターを導入するとγ-PGAを産生するようになることを確認している。そこで、まず、pgsB、pgsC及びpgsA遺伝子を有する組換えベクターと、pgsB、pgsC及びpgsA遺伝子並びに本発明のポリヌクレオチドを有する組換えベクターとをそれぞれ大腸菌に導入して形質転換体を作製する。得られた形質転換体を、遺伝子の発現に適した公知の条件下で培養する。それぞれの形質転換体により産生されたγ-PGAの平均分子量を、後述の方法により測定し、得られたデータを比較することにより、本発明のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドがγ-PGAの平均分子量を増大させる機能を有しているか否かを調べることができる。
【００１８】
なお、本明細書においては、γ-PGAの平均分子量は、DNA(λ-Hind III digest、タカラバイオ株式会社製)、及び１４７の分子量を有するL-グルタミン酸（L-グルタミン酸ナトリウム、和光純薬工業株式会社製）を分子量マーカーとして用いて、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)により測定して得られた重量平均分子量として示される。なお、分子量マーカーとして用いる上記のDNAは、約１４,０００,０００、５，８００，０００、４，０００，０００、１，４３０，０００、１，２５０，０００、３５０，０００、７７，０００の各分子量を有することが公知であるDNA断片の混合物である。具体的なγ-PGAの平均分子量の測定手順を、以下に述べる。
本発明のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドにより産生されたγ-PGAを含む溶液を用いてHPLCを行う。得られたHPLCデータから、約１４,０００,０００、５，８００，０００、４，０００，０００、１，４３０，０００、１，２５０，０００、３５０，０００、７７，０００の分子量を有するDNA、及び１４７の分子量を有するL-グルタミン酸を分子量マーカーとして、γ-PGAの分子量の分布を求める。得られた分子量分布からγ-PGAの重量平均分子量を算出する。なお、重量平均分子量の算出法は当該技術において公知である。
【００１９】
本発明の実施形態において、γ-PGAの平均分子量は、通常５,０００,０００〜２０,０００,０００、好ましくは８,０００,０００〜１５,０００,０００、より好ましくは９,０００,０００〜１２,０００,０００、特に好ましくは１０,０００,０００〜１１,０００,０００に増大されている。
なお、γ-PGAは、L体若しくはD体のグルタミン酸からなっていてもよいし、L体及びD体のグルタミン酸が混在する形態であってもよい。
【００２０】
本発明のポリヌクレオチドの取得方法は、特に限定されず、当業者に公知の方法を用いればよい。例えば、本発明のポリヌクレオチドは、バシラス・エスピーF-2-01株から抽出したゲノムDNAを鋳型とするPCRにより得てもよいし、配列番号２の塩基配列に基づいて、公知の核酸合成法により得てもよい。
【００２１】
本発明のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドは、γ-PGAの産生量を増大させる機能を更に有することが好ましい。
【００２２】
本明細書において、「γ-PGAの産生量を増大させる」とは、PgsB、PgsC及びPgsAからなる３つの分子により産生されるγ-PGAの産生量よりも増大させることを意図する。
本発明のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドのγ-PGA産生量を増大させる機能を有しているか否かを調べる方法は、例えば、以下のとおりである。
まず、pgsB、pgsC及びpgsA遺伝子を有する組換えベクターと、pgsB、pgsC及びpgsA遺伝子並びに本発明のポリヌクレオチドを有する組換えベクターとをそれぞれ大腸菌に導入して形質転換体を作製する。得られた形質転換体を、遺伝子の発現に適した公知の条件下で培養する。それぞれの形質転換体により産生されたγ-PGAの産生量を、後述の方法に従って算出することにより、本発明のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドのγ-PGA産生量を増大させる機能を有しているか否かを調べることができる。
【００２３】
本明細書において、γ-PGAの産生量とは、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)により、測定した産生量を意味する。具体的には、以下のようにして測定する。
本発明のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドにより産生されたγ-PGAを含む溶液を用いてHPLCを行う。得られたHPLCデータに基づいて、γ-PGAの産生量を算出する。
γ-PGAの産生量の測定方法は、特に限定されず、当業者に公知の方法に従って産生量を測定することができる。具体的な例としては、クロマトグラフィー(高速液体クロマトグラフィー(HPLC)等)を用いる方法、γ-PGAの溶液の重量を測定する方法、γ-PGAの末端基の赤外線吸収を用いる方法、アガロースゲル電気泳動による方法等が挙げられる。
【００２４】
本発明の範囲には、本発明のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドも含まれる。なお、当該ポリペプチドの特徴についてはこれまでに述べたことと同じである。
【００２５】
本発明の組換えベクターは、上記の本発明のポリヌクレオチドを有する。
ベクターは、特に限定されず、当業者に公知のものから選択することができる。具体的な例としては、大腸菌由来のプラスミド(例えば、pBR322、pBR325、pTV119N、pBluescript、pHSG298、pHSG396又はpTrc99A等のColE系プラスミド；pACYC177又はpACYC184等のp1A系プラスミド；pMW118、pMW119、pMW218又はpMW219等のpSC101系プラスミド等)、枯草菌由来のプラスミド(例えばpUB110、pTP5等)、YCp型大腸菌−酵母シャトルベクター、YIp型大腸菌−酵母シャトルベクター、大腸菌−枯草菌シャトルベクター(例えばpHT01、pAL10等)、ファージベクター(例えばλファージ、ψX174、M13mp18、M13mp19等)、レトロトランスポゾン(例えばTy因子等)、融合タンパク質として発現する発現ベクター(例えばpGEXシリーズ、pMALシリーズ等)等が挙げられる。ベクターは、好ましくは、pET28a(タカラバイオ株式会社製)、pTV118N(Merck, Germany)である。
【００２６】
上記のベクターに含まれるプロモーターは、特に限定されず、後述の宿主細胞の種類に応じて当業者に公知のものから選択することができる。具体的な例としては、lacプロモーター、trpプロモーター、tacプロモーター及びPLプロモーター等の大腸菌での発現に適したプロモーター、アルコール脱水素酵素(ADH)プロモーター、トリオースホスフェートイソメラーゼ(TPI)プロモーター、グリセロアルデヒド脱水素酵素(GPD)プロモーター及びガラクトース発光酵素(GAL1)プロモーター等の酵母での発現に適したプロモーター、低温発現誘導性不飽和化酵素(DES)のプロモーター等の枯草菌での発現に適したプロモーター等が挙げられる。プロモーターは、好ましくは、T7プロモーター、lacプロモーターである。
【００２７】
本発明の組換えベクターは、選択マーカー遺伝子、ターミネーター、及びエンハンサー等のその他の因子を機能的に含有してもよい。その他の因子としては、特に限定されず、組換えベクター及び宿主細胞の性質等に基づいて、当業者に公知のものから選択することができる。
【００２８】
本発明の組換えベクターは、例えば、適当な制限酵素で予め消化したベクターに、上記のポリヌクレオチドをライゲーションすることにより作製することができる。
ライゲーション方法は、特に限定されず、当業者に公知の任意の方法に従って行うことができる。具体的な例としては、T4リガーゼを用いる方法等が挙げられる。本発明の実施形態においては、DNAライゲーションキット Mighty Mix (タカラバイオ株式会社製)を用いて行われる。
【００２９】
本発明の組換えベクターは、
(i)PgsB又はこれと同等の機能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
(ii)PgsC又はこれと同等の機能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び
(iii)PgsA又はこれと同等の機能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
を更に含んでいてもよい。
【００３０】
ここで、PgsB、PgsC及びPgsAの由来は特に限定されない。すなわち、本発明の実施形態では、組換えベクターは、これらの３つの分子が互いに協働することでγ-PGAを産生することが知られている菌株(例えば、市販の納豆菌等)に由来するPgsB、PgsC及びPgsAをコードするポリヌクレオチドを含んでいてもよい。
好ましくは、バシラス・エスピーF-2-01株のpgsB、pgsC及びpgsAの各遺伝子によりコードされるタンパク質である。F-2-01株のPgsB、PgsC及びPgsAのアミノ酸配列を、それぞれ配列番号３〜５に示す。また、F-2-01株のpgsB、pgsC及びpgsAの各遺伝子の塩基配列を、それぞれ配列番号６〜８に示す。
なお、同等の機能とは、PgsB、PgsC及びPgsAが互いに協働してγ-PGAを産生するときの各分子が担う機能をいう。
【００３１】
(i)〜(iii)のポリヌクレオチドは、本発明のポリヌクレオチドと同一のベクター中にライゲーションされることによって、本発明の組換えベクターにおいてγ-PGA産生遺伝子群又はオペロンとして存在していてもよい。
【００３２】
本発明の形質転換体は、上記の本発明の組換えベクターを有する。この形質転換体は、組換えベクターを用いて、宿主細胞を形質転換することによって得ることができる。
宿主細胞を形質転換する方法は、特に限定されず、当業者に公知の方法から選択できる。具体的な例としては、コンピテント細胞法、プロトプラスト法、リン酸カルシウム共沈法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、ウイルス感染法、リポフェクション法等が挙げられる。
【００３３】
宿主細胞としては、特に限定されず、当業者に公知のものから選択することができる。例えば、真正細菌(グラム陽性菌又はグラム陰性菌)であってもよいし、古細菌又は植物細胞であってもよい。これらのうち、工業的な組換えタンパク質の製造に適することが示されている生物種の細胞であって、高い細胞密度まで培養することが可能な性質を有するものが好ましい。具体的な例としては、大腸菌、バチルス・サチリス(Bacillus subtilis)、バチルス・ブレビス(Bacillus brevis)、ブレビバチルス・チョウシネンシス(Brevibacillus choshinensis)、シュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属及びラクトコッカス・ラクティス(Lactococcus lactis)等が挙げられる。形質転換の容易性の観点からは、大腸菌が特に好ましい。
【００３４】
本発明のキットは、上記の本発明のポリヌクレオチド又は上記の組換えベクターを含む。
また、キットは、上記の(i)〜(iii)のポリヌクレオチドを更に含んでいてもよい。(i)〜(iii)のポリヌクレオチドは、本発明のポリヌクレオチドと同一のベクター中にライゲーションされることによって本発明の組換えベクターにおいてγ-PGA産生遺伝子群又はオペロンとして存在していてもよいし、本発明の組換えベクターとは別のベクター中にライゲーションすることによって、１種又は複数種類のベクターを含む形態として存在していてもよい。また、キットは、無細胞タンパク質合成系であってもよい。
【００３５】
本発明のγ-PGAの製造方法は、上記の本発明の形質転換体を培養する工程を含む。好ましい実施形態では、当業者に公知の培養プロセスに従って、上記の形質転換体を培養する工程により、平均分子量が増大されたγ-PGAを得ることができる。ここで、培養プロセスとは、バイオリアクター中で形質転換体を増殖させることにより、増殖の制御を可能にする培養方法を意味する。そのような培養プロセスとしては、特に限定されず、当業者に公知の任意のプロセスを用いることができる。具体的な例としては、流加培養、回分培養、反復回分培養、連続培養(例えばケモスタット又はタービドスタット)、半連続培養等の培養プロセス及びこれらの組合せが挙げられる。培養条件は、形質転換体の宿主細胞の種類、使用するバイオリアクター等の様々な要因を考慮して、当業者が適宜決定することができる。
バイオリアクターとしては、特に限定されず、形質転換体の宿主細胞の種類等に基づいて、当業者に公知のものから選択できる。具体的な例としては、気泡塔型培養槽、通気撹拌培養槽等が挙げられる。
【００３６】
培地は、形質転換体の培養に適するものであれば特に限定されず、当業者に公知のものから選択できる。具体的な例としては、半合成培地、すなわち複合化合物(例えば酵母抽出物、大豆ペプトン、カザミノ酸)を含む培地(例えばLB培地等)、複合化合物を含まない化学的に定義された物質(例えば、グルコース、塩(NaCl)等の重量に基づいて分子量を算出できる物質)からなる合成培地(例えばDavis培地等)、天然培地等が挙げられる。
培地の供給量は、形質転換体の宿主細胞の種類、使用するバイオリアクター、培養時間等の様々な要因を考慮して、当業者が適宜決定することができる。
【００３７】
培地は、ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの発現を誘導するための誘導物質を含んでいてもよい。誘導物質としては、特に限定されないが、使用するプロモーターの性質等に基づいて、当業者が適宜決定することができる。例えば、IPTG等が挙げられる。
【００３８】
培地は、金属イオンを含んでいてもよい。金属イオンとしては、特に限定されないが、二価の金属イオン、例えばZn2+、Mn2+、Mg2+、Co2+等が挙げられる。それらの中でも、Zn2+及びMn2+が好ましい。金属イオンの添加量は、γ-PGAの産生に関与するタンパク質の性質、使用するプロモーターの性質等の様々な要因を考慮して、当業者が適宜決定することができる。
【００３９】
本発明のγ-PGAの製造方法は、分離工程及び回収工程を含んでいてもよい。分離方法及び回収方法は、特に限定されず、当業者に公知の任意の方法を用いることができる。分離工程及び回収工程は、例えば、以下のようにして行われ得る。
まず、培養液と形質転換体細胞とを分離する。分離方法としては、特に限定されず、当業者に公知の任意の方法を用いることができる。具体的な例としては、フィルター濾過、遠心分離等が挙げられる。
【００４０】
得られた培養液からγ-PGAを回収する方法としては、特に限定されず、当業者に公知の任意の方法を用いることができる。具体的な例としては、エタノールを用いて沈殿させる方法、酸を用いて沈殿させる方法等が挙げられる。次いで、透析により培地成分等の夾雑物を除去し、その後、凍結乾燥により乾燥粉末を得る。
【００４１】
上記のようにして得られる平均分子量が増大されたγ-PGAは、本発明の形質転換体により天然に合成されるので、人為的な架橋による高分子化工程の省略を可能にする。したがって、平均分子量が増大されたγ-PGAを従来よりも安価に提供することが期待できる。高分子量のγ-PGAは優れた保湿性、粘性及びカルシウム吸収促進性を有するので、食品、化粧品及び医薬品等に用いることが期待できる。また、平均分子量が増大されたγ-PGAは免疫亢進作用を有するので、食品又は医薬品等の用途に用いることにより、対象の免疫力を高める効果が期待される。さらに、特開２００４−２０２４４１号公報に開示されるように、平均分子量が増大されたγ-PGAは、汚染水の浄化に用いることも期待される。
【００４２】
以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００４３】
実施例１：ゲノムDNAの抽出及びポリヌクレオチドの増幅
バシラス・エスピーF-2-01株を５mLのLB液体培地中で、37℃で16時間前培養した後、５mLの新たなLB液体培地にOD660が0.1となるように細胞を懸濁して、37℃、120 rpmにて6.5時間培養した。培養液を遠心分離(7500 rpm、10分間、室温)し、上清を捨て、ペレットを得た。得られたペレットから、ゲノムDNA抽出キット(DNeasy Blood & Tissue, QIAGEN, Germany)を用いて、ゲノムDNAを抽出した。
【００４４】
得られたゲノムDNA、並びにNcoI及びBamHI制限部位をそれぞれ付加した配列番号９及び配列番号１０のプライマー (Invitrogen, USA)及びDNAポリメラーゼKOD-Plus-Neo (東洋紡績株式会社製)を用いるPCR(アニーリング温度53.5℃、サイクル数２６、PCRサーマルサイクラー Mastercycler gradient (eppendorf, Germany))により、pgsB、pgsC、pgsA及びpgsE遺伝子を含むポリヌクレオチドを増幅した。PCR産物を制限酵素NcoI(タカラバイオ株式会社製)及びBamHI(タカラバイオ株式会社製)を用いて消化し、pgsB、pgsC、pgsA及び配列番号２で表される塩基配列からなるpgsE遺伝子を含むDNA断片(以下、pgsBCAEとも呼ぶ)を得た。
また、得られたゲノムDNA、並びにNcoI及びBamHI制限部位をそれぞれ付加したプライマー配列番号９及び配列番号１１(Invitrogen, USA)及びDNAポリメラーゼKOD-Plus-Neo (東洋紡績株式会社製)を用いるPCRにより、pgsB、pgsC及びpgsA遺伝子を含むポリヌクレオチドを増幅した。制限酵素NcoI及びBamHIを用いて消化し、pgsB、pgsC及びpgsA遺伝子を含むDNA断片(以下、pgsBCAとも呼ぶ)を得た。
【００４５】
実施例２：形質転換体の作製
得られたpgsBCAE及びpgsBCAを、NcoI及びBamHIを用いて消化したpET28aベクター(Merck, Germany)にそれぞれライゲーションし、組換えベクターpET28/pgsBCAE及びpET28/pgsBCAを得た。得られた組換えベクターを大腸菌BL21株(タカラバイオ株式会社製)に導入し、形質転換体を得た。以下、得られた形質転換体を、便宜上、下記の表１に示すように表記する。
【００４６】
【表１】
2014060988.tif 000002
【００４７】
実施例３：HPLC解析によるγ-PGAの平均分子量及び産生量の測定
(１)サンプル調製
実施例２で得られた形質転換体BL21-pgsBCAE株及びBL21-pgsBCA株を、30μg/mLのカナマイシンを含有する５mLのLB液体培地中で、37℃で16時間前培養した。前培養して得られた細胞を２００mLの表２に示される組成を有する培地にOD660が0.1となるように懸濁し、37℃、140 rpmで振盪培養した。OD660が0.8となったところで、IPTGを１mMとなるように加えて、30℃、140 rpmで振盪培養し、γ-PGA産生を誘導した。
得られた培養液５mLを遠心分離(8000 rpm、３分間、室温)して、上清を回収した後、３倍量のエタノールを加えてボルテックスし、４℃で16時間静置した。その後、遠心分離(8000 rpm、30分間、４℃)して、上清を捨てて沈殿物を得た。得られた沈殿物を３mLの脱イオン滅菌水に溶解させ、HPLCのサンプルとした。
【００４８】
【表２】
2014060988.tif 000003
【００４９】
一方、実施例２で得られた形質転換体BL21-pgsBCAE株及びBL21-pgsBCA株を、30μg/mlのカナマイシンを含有する５mLのLB液体培地中で、37℃で16時間前培養した。前培養して得られた細胞を30μg/mlのカナマイシンを含有する200 mLのLB液体培地にOD660が0.1となるように植菌し、OD660が2.1となるまで、37℃、140 rpmで振盪培養した。得られた培養液を遠心分離(8000 rpm, 20分間, 4℃)し、１mMのMnSO4及び30μg/mLのカナマイシンを含有し、且つ１mMのZnSO4を含むか又は含まない100 mLの表３に示される組成を有する培地に植菌し、30℃で１時間振盪培養し、L-グルタミン酸(L-グルタミン酸ナトリウム、和光純薬工業株式会社製)を取り込ませた後、IPTG(イソプロピル-β-チオガラクトピラノシド、和光純薬工業株式会社製)を１mMとなるように加えて、30℃で24時間振盪培養し、γ-PGA産生を誘導した。
培養液100 mLを遠心分離(8000 rpm、３分間、室温)し、上清を回収し、得られた沈殿物に脱イオン滅菌水100 mLを加えてボルテックスし、遠心分離(8000 rpm、３分間、室温)し、上清を回収した。上記で回収した上清を合わせ、エバポレーターで濃縮し、HPLCのサンプルとした。
【００５０】
【表３】
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【００５１】
得られたHPLCサンプルを用いてHPLC解析を行い、形質転換体により生産されたPGAの分子量を分析した。分子量マーカーとしては、DNA(λ-Hind III digest、タカラバイオ株式会社製)、及び１４７の分子量を有するL-グルタミン酸（L-グルタミン酸ナトリウム、和光純薬工業株式会社製）を用いた。また、分析用機器としては、HPLCシステムLC-10A（島津製作所製）を用いた。分析条件は、ゲル濾過カラム：昭和電工Shodex Asahipak GS-620HQ カラム長7.5 × 300 ｍｍ、移動相：50 mMリン酸バッファ（pH 6.8）、流速：0.6 ml/分、カラム温度：30℃、UV波長：210 nmとした。
【００５２】
(２)γ-PGAの平均分子量の測定
HPLC解析の結果に基づいてγ-PGAの平均分子量を測定した。結果を図１に示す。単量体であるグルタミン酸は、リテンションタイム15.1分で溶出された。Mn2+及びZn2+を加えた培地で培養されたBL21-pgsBCAE株においては、γ-PGAは8.1分で溶出された。このγ-PGAの平均分子量は、DNA換算で約１１,０００,０００に相当する大きさであった。一方、Mn2+及びZn2+を加えた培地で培養されたBL21-pgsBCA株においては、γ-PGAは、8.1分及び10.6分のリテンションタイムで検出され、分子量の異なる２種類のγ-PGAが混在していることがわかった。なお、リテンションタイム10.6分で溶出したγ-PGAの平均分子量は、２１０,０００であった。以上の結果より、BL21-pgsBCAE株により産生されるγ-PGAの平均分子量は、BL21-pgsBCA株により産生されるγ-PGAの平均分子量よりも増大していたことが示された。
【００５３】
上記の結果に基づいて算出したγ-PGA全量に対する平均分子量１１,０００,０００のγ-PGAの含有率を図２に示す。平均分子量１１,０００,０００のγ-PGAの含有率は、培地にMn2+のみを添加した場合には37.8％であり、培地にMn2+及びZn2+を添加した場合には49.8％であった。
【００５４】
(３)γ-PGAの産生量の測定
HPLC解析の結果に基づいて金属イオン非添加時のγ-PGAの産生量を測定した。結果を図３に示す。BL21-pgsBCAE株のγ-PGAの産生量は、BL21-pgsBCA株のγ-PGAの産生量の約４倍に増大した。
【００５５】
(４)γ-PGA産生における金属イオンの効果
HPLC解析の結果に基づいてγ-PGA産生における金属イオンの効果を調べた。結果を図４及び表４に示す。
【００５６】
【表４】
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【００５７】
Mn2+のみを添加した場合並びにMn2+及びZn2+を添加した場合のいずれにおいても、BL21-pgsBCAE株のγ-PGAの産生量は、BL21-pgsBCA株のγ-PGAの産生量よりも大きく増大した。また、Mn2+及びZn2+を添加した場合のγ-PGAの産生量は、BL21-pgsBCAE株及びBL21-pgsBCA株のいずれにおいても、Mn2+のみを添加した場合のγ-PGAの産生量よりも増大した。非特許文献１によれば、PgsEは、Zn2+に依存的に機能すると記載されているが、図４及び表４の結果からは、非特許文献１に示されるような顕著なZn2+依存性は認められなかった。
以上の結果より、本発明のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド(PgsE)が、γ-PGAの平均分子量を増大させ、またγ-PGAの産生量を増大させることが示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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