(57)【要約】【課題】ＧＡＢＡＡ受容体に対しＧＡＢＡ様活性を示すＧＡＢＡ様組成物を提供する。【解決手段】ＧＡＢＡＡ受容体に対しＧＡＢＡ様活性を示すＧＡＢＡ様組成物は、少なくともＧＡＢＡ、バルビツール酸誘導体、ベンゾジアゼピン誘導体、ムシモール、THIP、イソグバシン、及び、ガバペンチンの７物質を除くヒドロキシ基又はカルボキシル基を有する化合物を含有し、この化合物は、ピルビン酸、2-オキソグルタル酸、2-ヒドロキシ-4-メチル吉草酸、クエン酸、リンゴ酸、2-ヒドロキシ吉草酸、キナ酸、グルコン酸、グリコール酸、3-ヒドロキシ酪酸、メバロン酸、乳酸、パントテン酸、及び、2-ヒドロキシ吉草酸エチルエステルの化合物のうち少なくともいずれか一つを含有する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくともＧＡＢＡ（Gamma-aminobutyric acid）、バルビツール酸誘導体、ベンゾジアゼピン誘導体、ムシモール（Muscimol）、THIP (4,5,6,7-tetrahydroisoxazolo[5,4-c]pyridin-3-ol)、イソグバシン（Isoguvacine）、及び、ガバペンチン(Gabapentin)の７物質を除くヒドロキシ基又はカルボキシル基を有する化合物を含有する、ＧＡＢＡＡ受容体に対しＧＡＢＡ様活性を示すことを特徴とするＧＡＢＡ様組成物。
【請求項２】
前記化合物は、ピルビン酸（Pyruvic acid）、2-オキソグルタル酸（2-Oxoglutaric acid）、2-ヒドロキシ-4-メチル吉草酸（2-Hydroxy-4-methylvaleric acid; DL-leucic acid）、クエン酸（Citric acid）、リンゴ酸（Malic acid）、2-ヒドロキシ吉草酸（2-Hydroxyvaleric acid）、キナ酸（Quinic acid）、グルコン酸（Gluconic acid）、グリコール酸（Glycolic acid）、3-ヒドロキシ酪酸（3-Hydroxybutyric acid）、メバロン酸（Mevalonic acid）、乳酸（Lactic acid）、パントテン酸（Pantothenic acid）、2-ヒドロキシ吉草酸エチルエステル（2-Hydroxyvaleric acid ethyl ester；2-エチルヒドロキシ吉草酸（Ethyl 2-hydroxyvalerate））、p-ヒドロキシフェニル酢酸（p-Hydroxyphenylacetic acid）、シキミ酸（Shikimic acid）、シトラマル酸（Citramalic acid）、シトラコン酸（Citraconic acid）、2-イソプロピルリンゴ酸（2-Isopropylmalic acid）、フマル酸（Fumaric acid）、N-アセチルムラミン酸（N-Acetylmuramic acid）、グリセリン酸（Glyceric acid）、安息香酸（Benzoic acid）、ホモバニリン酸（Homovanillic acid）、グルタル酸（Glutaric acid）、6-ヒドロキシヘキサン酸（6-Hydroxyhexanoic acid）、グルクロン酸（Glucuronic acid）、ガラクツロン酸（Galacturonic acid）、2-ヒドロキシ酪酸（2-Hydroxybutyric acid）、5-オキソ-2-テトラヒドロフランカルボン酸（5-Oxo-2-tetrahydrofurancarboxylic acid）、フタル酸（Phthalic acid）、テレフタル酸（Terephthalic acid）、コハク酸（Succinic acid）、イソクエン酸（Isocitric acid）、トレオン酸（Threonic acid）、クロトン酸（Crotonic acid）、マロン酸（Malonic acid）、イセチオン酸（Isethionic acid）、シス-アコニット酸（cis-Aconitic acid）、N-アセチルアスパラギン酸（N-Acetylaspartic acid）、マレイン酸（Maleic acid）、プロピオン酸（Propionic acid）、バニリン酸（Vanillic acid）、3-ヒドロキシ-3-メチルグルタル酸（3-Hydroxy-3-methylglutaric acid）、ジガラクツロン酸（Digalacturonic acid）、6-ホスホグルコン酸（6-Phosphogluconic acid）、イソ酪酸（Isobutyric acid）、システイン酸（Cysteic acid）、メタンスルホン酸（Methanesulfonic acid）、グリオキシル酸（Glyoxylic acid）、N-アセチルメチオニン（N-Acetylmethionine）、ビオチン（Biotin）、p-スルホ安息香酸（p-Sulfobenzoic acid）、N-アセチルグルコサミン-1-リン酸（N-Acetylglucosamine 1-phosphate）、5-オキソプロリン（5-Oxoproline）、N-アセチル-β-アラニン（N-Acetyl-β-alanine）、グリセロール3-リン酸（Glycerol 3-phosphate）、N-アセチルグルタミン酸（N-Acetylglutamic acid）、グルコース6-リン酸（Glucose 6-phosphate）、O-スクシニルホモセリン（O-Succinylhomoserine）、N-アセチルロイシン（N-Acetylleucine）、フルクトース6-リン酸（Fructose 6-phosphate）、コハク酸セミアルデヒド（Succinic semialdehyde）、トレハロース6-リン酸（Trehalose 6-phosphate）、及び、グルコース1-リン酸（Glucose 1-phosphate）の化合物のうち少なくともいずれか一つを含有する、ことを特徴とする請求項１に記載のＧＡＢＡ様組成物。
【請求項３】
前記化合物の濃度は１０μＭから１０ｍＭである、ことを特徴とする請求項１又は２に記載のＧＡＢＡ様組成物。
【請求項４】
前記化合物は日本酒から分離精製される、ことを特徴とする請求項１乃至３のいずれか１項に記載のＧＡＢＡ様組成物。
【請求項５】
前記化合物は前記日本酒の有機酸画分から分離精製される、ことを特徴とする請求項４に記載のＧＡＢＡ様組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＧＡＢＡ（Gamma-aminobutyric acid）Ａ受容体に対しＧＡＢＡ様活性を示すＧＡＢＡ様組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
脳神経系の神経伝達は、神経細胞の興奮によって行われることはよく知られている。この伝達は興奮性神経伝達物質の受容体の活性化により引き起こされ、神経興奮の度合いは抑制性や興奮性の神経伝達物質によって調節されている。興奮性神経伝達物質には、アセチルコリンやグルタミン酸などがよく知られている。抑制性神経伝達物質としては、γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）やグリシンが挙げられる。脳内の神経抑制は、ＧＡＢＡによるシグナル伝達が大部分を占めている。ＧＡＢＡ受容体は、このＧＡＢＡを選択的に受容する受容体で、ＧＡＢＡＡ(イオンチャネル型)、ＧＡＢＡＢ(代謝型)、ＧＡＢＡＣ(イオンチャネル型)受容体の３種類が確認されている（非特許文献１参照）。ＧＡＢＡＡ受容体には、リガンドであるＧＡＢＡ結合部位の他に、バルビツール結合部位、ベンゾジアゼピン結合部位、糖質コルチコイド結合部位、ペニシリン結合部位、フロセミド結合部位などが知られており、ＧＡＢＡとの反応性の調節を行っている。ＧＡＢＡＡ受容体にはさまざまな薬物が作用するため、その程度に応じて、安らぎ、精神安定、睡眠、麻酔効果などが生じることが知られており、気分に影響する物質の主要な作用対象である。ＧＡＢＡＡ受容体の機能発現を欠損させると、てんかんや不安障害、認識障害、統合失調症、うつ、薬物依存などになることから、ＧＡＢＡ受容体に作用する物質は鎮静・催眠薬、抗痙攣薬や抗不安薬、鎮静型の神経作用薬の開発のターゲットになるため、この受容体に作用する新たな物質の研究が望まれている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Bormann J., "The 'ABC' of GABA receptors", Trends Pharmacol Sci. 2000 Jan;21(1):16-9.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ＧＡＢＡＡ受容体に作用し、ＧＡＢＡＡ受容体活性を示す物質として、バルビツール酸誘導体、ベンゾジアゼピン誘導体、ムシモール（Muscimol）、THIP（4,5,6,7-Tetrahydroisoxazolo[5,4-c]pyridin-3-ol)、イソグバシン（Isoguvacine）、及び、ガバペンチン(Gabapentin)が知られている。しかし、ＧＡＢＡＡ受容体には、ＧＡＢＡ結合部位、バルビツール結合部位、ベンゾジアゼピン結合部位、糖質コルチコイド結合部位、ペニシリン結合部位、フロセミド結合部位などがあり、これらの結合部位に結合する物質によってＧＡＢＡとの反応性は異なる。このため、ＧＡＢＡＡ受容体に作用し、ＧＡＢＡＡ受容体活性を示す、あるいは亢進させる新たな組成物が求められている。
【０００５】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、ＧＡＢＡＡ受容体に対しＧＡＢＡ様活性を示すＧＡＢＡ様組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記目的を達成するため、本発明の第１の観点に係るＧＡＢＡ様組成物は、
少なくともＧＡＢＡ（Gamma-aminobutyric acid）、バルビツール酸誘導体、ベンゾジアゼピン誘導体、ムシモール（Muscimol）、THIP (4,5,6,7-Tetrahydroisoxazolo[5,4-c]pyridin-3-ol)、イソグバシン（Isoguvacine）、及び、ガバペンチン(Gabapentin) の７物質を除くヒドロキシ基又はカルボキシル基を有する化合物を含有する、ＧＡＢＡＡ受容体に対しＧＡＢＡ様活性を示すことを特徴とするＧＡＢＡ様組成物である。
【０００７】
前記化合物は、ピルビン酸（Pyruvic acid）、2-オキソグルタル酸（2-Oxoglutaric acid）、2-ヒドロキシ-4-メチル吉草酸（2-Hydroxy-4-methylvaleric acid; DL-leucic acid）、クエン酸（Citric acid）、リンゴ酸（Malic acid）、2-ヒドロキシ吉草酸（2-Hydroxyvaleric acid）、キナ酸（Quinic acid）、グルコン酸（Gluconic acid）、グリコール酸（Glycolic acid）、3-ヒドロキシ酪酸（3-Hydroxybutyric acid）、メバロン酸（Mevalonic acid）、乳酸（Lactic acid）、パントテン酸（Pantothenic acid）、2-ヒドロキシ吉草酸エチルエステル（2-Hydroxyvaleric acid ethyl ester；2-エチルヒドロキシ吉草酸（Ethyl 2-hydroxyvalerate））、p-ヒドロキシフェニル酢酸（p-Hydroxyphenylacetic acid）、シキミ酸（Shikimic acid）、シトラマル酸（Citramalic acid）、シトラコン酸（Citraconic acid）、2-イソプロピルリンゴ酸（2-Isopropylmalic acid）、フマル酸（Fumaric acid）、N-アセチルムラミン酸（N-Acetylmuramic acid）、グリセリン酸（Glyceric acid）、安息香酸（Benzoic acid）、ホモバニリン酸（Homovanillic acid）、グルタル酸（Glutaric acid）、6-ヒドロキシヘキサン酸（6-Hydroxyhexanoic acid）、グルクロン酸（Glucuronic acid）、ガラクツロン酸（Galacturonic acid）、2-ヒドロキシ酪酸（2-Hydroxybutyric acid）、5-オキソ-2-テトラヒドロフランカルボン酸（5-Oxo-2-tetrahydrofurancarboxylic acid）、フタル酸（Phthalic acid）、テレフタル酸（Terephthalic acid）、コハク酸（Succinic acid）、イソクエン酸（Isocitric acid）、トレオン酸（Threonic acid）、クロトン酸（Crotonic acid）、マロン酸（Malonic acid）、イセチオン酸（Isethionic acid）、シス-アコニット酸（cis-Aconitic acid）、N-アセチルアスパラギン酸（N-Acetylaspartic acid）、マレイン酸（Maleic acid）、プロピオン酸（Propionic acid）、バニリン酸（Vanillic acid）、3-ヒドロキシ-3-メチルグルタル酸（3-Hydroxy-3-methylglutaric acid）、ジガラクツロン酸（Digalacturonic acid）、6-ホスホグルコン酸（6-Phosphogluconic acid）、イソ酪酸（Isobutyric acid）、システイン酸（Cysteic acid）、メタンスルホン酸（Methanesulfonic acid）、グリオキシル酸（Glyoxylic acid）、N-アセチルメチオニン（N-Acetylmethionine）、ビオチン（Biotin）、p-スルホ安息香酸（p-Sulfobenzoic acid）、N-アセチルグルコサミン-1-リン酸（N-Acetylglucosamine 1-phosphate）、5-オキソプロリン（5-Oxoproline）、N-アセチル-β-アラニン（N-Acetyl-β-alanine）、グリセロール3-リン酸（Glycerol 3-phosphate）、N-アセチルグルタミン酸（N-Acetylglutamic acid）、グルコース6-リン酸（Glucose 6-phosphate）、O-スクシニルホモセリン（O-Succinylhomoserine）、N-アセチルロイシン（N-Acetylleucine）、フルクトース6-リン酸（Fructose 6-phosphate）、コハク酸セミアルデヒド（Succinic semialdehyde）、トレハロース6-リン酸（Trehalose 6-phosphate）、及び、グルコース1-リン酸（Glucose 1-phosphate）の化合物のうち少なくともいずれか一つを含有してもよい。
【０００８】
前記化合物の濃度は１０μＭから１０ｍＭであってもよい。
【０００９】
前記化合物は日本酒から分離精製されてもよい。
【００１０】
前記化合物は前記日本酒の有機酸画分から分離精製されてもよい。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、ＧＡＢＡＡ受容体に対して、ＧＡＢＡと同様の活性をもたせることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ＧＡＢＡＡ受容体の構造を示す図である。
【図２】日本酒の画分方法を説明するための図である。
【図３】各Ａ画分のＧＡＢＡＡ受容体活性を示す図である。
【図４】Ａ画分と１０倍希釈のＡ画分とのＧＡＢＡＡ受容体活性を示す図である。
【図５】Sephadex G-10分画物のＧＡＢＡＡ受容体活性を示す図である。
【図６】ＧＡＢＡＡ受容体の標準的な測定状態を示す図である。
【図７】ＧＡＢＡのα１／β１サブタイプＧＡＢＡＡ受容体に対するＧＡＢＡの濃度反応曲線を示す図である。
【図８】化合物の濃度が２００μＭのときのＧＡＢＡＡ受容体活性を示す図である。
【図９】化合物の濃度が５００μＭのときのＧＡＢＡＡ受容体作動活性を示す図である。
【図１０】高架式十字迷路試験装置を示す図である。
【図１１】オープンアームの滞在時間を示す図である。
【図１２】オープンアームへの進入回数を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の実施形態について説明をする前に、ＧＡＢＡＡ受容体について詳しく説明し、この受容体の活性に作用を及ぼすとどのような効果があるかについて説明をする。
【００１４】
ＧＡＢＡ受容体は、ＧＡＢＡを選択的に受容する受容体であり、ＧＡＢＡＡ(イオンチャネル型)、ＧＡＢＡＢ(代謝型)、ＧＡＢＡＣ(イオンチャネル型)受容体の３種類が確認されている。これらの受容体のうちＧＡＢＡＡ受容体は、α、β、γ、δ、ε、θ、πの７つのサブファミリーがあり、そのうち５種類のサブユニットで５量体を形成している。図１は、ＧＡＢＡＡ受容体の構造を示す図である。脳内で発現するＧＡＢＡＡ受容体は、同図に示すように、２つのαサブユニットと２つのβサブユニット、１つのγサブユニットから成ると考えられている。このα、βサブユニットの間にＧＡＢＡが結合することでチャネルが開口し、Ｃｌ−イオンを透過する。このＣｌ−イオンが細胞外から細胞内に流入することにより、神経細胞が過分極して興奮が抑制される。
【００１５】
ＧＡＢＡＡ受容体には、５種類のサブユニットの一部が組み合わされて形成された、リガンドであるＧＡＢＡ結合部位がある。このＧＡＢＡ結合部位の他に、バルビツール結合部位、ベンゾジアゼピン結合部位、糖質コルチコイド結合部位、ペニシリン結合部位、フロセミド結合部位などが知られており、ＧＡＢＡとの反応性の調節を行っている。例えば、βサブユニットの孔側にはピクロトキシンが結合し、非競合的に活性を阻害する。睡眠鎮静作用や抗不安作用などの薬理作用で知られているベンゾジアゼピンは、αサブユニットに結合し、ＧＡＢＡの作用を増強する。また、γサブユニットに結合するエタノールはＧＡＢＡの作用を増強する。このように、ＧＡＢＡＡ受容体にはさまざまな薬物が作用するため、その程度に応じて、安らぎ、精神安定、睡眠、麻酔効果などが生じることが知られており、ＧＡＢＡＡ受容体は気分に影響する物質の主要な作用対象である。ＧＡＢＡＡ受容体の機能発現を欠損させると、てんかんや不安障害、認識障害、統合失調症、うつ、薬物依存などになることから、ＧＡＢＡ受容体に作用する物質は鎮静・催眠薬、抗痙攣薬や抗不安薬などの鎮静型の神経作用薬の開発のターゲットになる。以上のことから、ＧＡＢＡＡ受容体に作用する物質（組成物）が重要となる。
【００１６】
以上の知見に基づいて、本発明の実施形態を図面に基づいて詳細に説明する。なお、以下に述べる実施形態は本発明の例示であり、本発明はこの例に限定されない。
【００１７】
まず、ＧＡＢＡＡ受容体の活性を測定する方法について説明する。
【００１８】
本発明では、ＧＡＢＡＡ受容体を発現させたアフリカツメガエル卵母細胞に本実施形態の組成物（化合物）を還流しＧＡＢＡＡ受容体に作用させ、この受容体が作動するとＣｌ−イオンが受容体チャネルを通過し電流が生じるため、二電極膜電位固定法による電流測定の方法を用いて受容体活性を測定する。アフリカツメガエル卵母細胞発現系では、外来のｍＲＮＡを注入すると効率よくそのタンパク質を発現できることが知られている。ＧＡＢＡＡ受容体はすべて神経細胞に発現しており、ＧＡＢＡによって活性化するＧＡＢＡＢ(代謝型)、ＧＡＢＡＣ(イオンチャネル型)受容体などがある。よって、神経細胞への直接的なＧＡＢＡの投与ではＧＡＢＡＡ受容体単独の活性をみることは非常に難しい。そこで、アフリカツメガエル卵母細胞発現系を用いることで、目的であるＧＡＢＡＡ受容体のタンパク質のみを卵母細胞内に発現させ、効率よく活性を測定することができる。
【００１９】
本実施形態に係るＧＡＢＡ様組成物（ＧＡＢＡＡ受容体のアゴニスト）について、上述した活性測定方法により、ＧＡＢＡＡ受容体活性を測定できる。ＧＡＢＡＡ受容体を活性化（亢進）させることが示されるＧＡＢＡ様組成物は、ピルビン酸（Pyruvic acid）、2-オキソグルタル酸（2-Oxoglutaric acid）、2-ヒドロキシ-4-メチル吉草酸（2-Hydroxy-4-methylvaleric acid; DL-leucic acid）、クエン酸（Citric acid）、リンゴ酸（Malic acid）、2-ヒドロキシ吉草酸（2-Hydroxyvaleric acid）、キナ酸（Quinic acid）、グルコン酸（Gluconic acid）、グリコール酸（Glycolic acid）、3-ヒドロキシ酪酸（3-Hydroxybutyric acid）、メバロン酸（Mevalonic acid）、乳酸（Lactic acid）、パントテン酸（Pantothenic acid）、2-ヒドロキシ吉草酸エチルエステル（2-Hydroxyvaleric acid ethyl ester；2-エチルヒドロキシ吉草酸（Ethyl 2-hydroxyvalerate））、p-ヒドロキシフェニル酢酸（p-Hydroxyphenylacetic acid）、シキミ酸（Shikimic acid）、シトラマル酸（Citramalic acid）、シトラコン酸（Citraconic acid）、2-イソプロピルリンゴ酸（2-Isopropylmalic acid）、フマル酸（Fumaric acid）、N-アセチルムラミン酸（N-Acetylmuramic acid）、グリセリン酸（Glyceric acid）、安息香酸（Benzoic acid）、ホモバニリン酸（Homovanillic acid）、グルタル酸（Glutaric acid）、6-ヒドロキシヘキサン酸（6-Hydroxyhexanoic acid）、グルクロン酸（Glucuronic acid）、ガラクツロン酸（Galacturonic acid）、2-ヒドロキシ酪酸（2-Hydroxybutyric acid）、5-オキソ-2-テトラヒドロフランカルボン酸（5-Oxo-2-tetrahydrofurancarboxylic acid）、フタル酸（Phthalic acid）、テレフタル酸（Terephthalic acid）、コハク酸（Succinic acid）、イソクエン酸（Isocitric acid）、トレオン酸（Threonic acid）、クロトン酸（Crotonic acid）、マロン酸（Malonic acid）、イセチオン酸（Isethionic acid）、シス-アコニット酸（cis-Aconitic acid）、N-アセチルアスパラギン酸（N-Acetylaspartic acid）、マレイン酸（Maleic acid）、プロピオン酸（Propionic acid）、バニリン酸（Vanillic acid）、3-ヒドロキシ-3-メチルグルタル酸（3-Hydroxy-3-methylglutaric acid）、ジガラクツロン酸（Digalacturonic acid）、6-ホスホグルコン酸（6-Phosphogluconic acid）、イソ酪酸（Isobutyric acid）、システイン酸（Cysteic acid）、メタンスルホン酸（Methanesulfonic acid）、グリオキシル酸（Glyoxylic acid）、N-アセチルメチオニン（N-Acetylmethionine）、ビオチン（Biotin）、p-スルホ安息香酸（p-Sulfobenzoic acid）、N-アセチルグルコサミン-1-リン酸（N-Acetylglucosamine 1-phosphate）、5-オキソプロリン（5-Oxoproline）、N-アセチル-β-アラニン（N-Acetyl-β-alanine）、グリセロール3-リン酸（Glycerol 3-phosphate）、N-アセチルグルタミン酸（N-Acetylglutamic acid）、グルコース6-リン酸（Glucose 6-phosphate）、O-スクシニルホモセリン（O-Succinylhomoserine）、N-アセチルロイシン（N-Acetylleucine）、フルクトース6-リン酸（Fructose 6-phosphate）、コハク酸セミアルデヒド（Succinic semialdehyde）、トレハロース6-リン酸（Trehalose 6-phosphate）、及び、グルコース1-リン酸（Glucose 1-phosphate）の化合物のうち少なくともいずれか一つを含有する組成物である。
ＧＡＢＡＡ受容体のアゴニストとしてより好ましくは、ピルビン酸、2-オキソグルタル酸、2-ヒドロキシ-4-メチル吉草酸、クエン酸、リンゴ酸、2-ヒドロキシ吉草酸、キナ酸、グルコン酸、グリコール酸、3-ヒドロキシ酪酸、メバロン酸、乳酸、パントテン酸、2-ヒドロキシ吉草酸エチルエステル、p-ヒドロキシフェニル酢酸、シキミ酸、シトラマル酸、シトラコン酸、2-イソプロピルリンゴ酸、フマル酸、N-アセチルムラミン酸、グリセリン酸、安息香酸、ホモバニリン酸、グルタル酸、6-ヒドロキシヘキサン酸、グルクロン酸、ガラクツロン酸、2-ヒドロキシ酪酸、5-オキソ-2-テトラヒドロフランカルボン酸、フタル酸、テレフタル酸、コハク酸、イソクエン酸、トレオン酸、クロトン酸、マロン酸、イセチオン酸、シス-アコニット酸、N-アセチルアスパラギン酸、マレイン酸、プロピオン酸、バニリン酸、3-ヒドロキシ-3-メチルグルタル酸、ジガラクツロン酸、6-ホスホグルコン酸、イソ酪酸、システイン酸、メタンスルホン酸、及び、グリオキシル酸の化合物のうち少なくともいずれか一つを含有する組成物である。
ＧＡＢＡＡ受容体のアゴニストとしてさらに好ましくは、ピルビン酸、2-オキソグルタル酸、2-ヒドロキシ-4-メチル吉草酸、クエン酸、リンゴ酸、2-ヒドロキシ吉草酸、キナ酸、グルコン酸、グリコール酸、3-ヒドロキシ酪酸、メバロン酸、乳酸、パントテン酸、及び、2-ヒドロキシ吉草酸エチルエステルの化合物のうち少なくともいずれか一つを含有する組成物である。
【００２０】
ここで、下記の構造式（１）〜（１４）に係る化合物は、ピルビン酸、2-オキソグルタル酸、2-ヒドロキシ-4-メチル吉草酸、クエン酸、リンゴ酸、2-ヒドロキシ吉草酸、キナ酸、グルコン酸、グリコール酸、3-ヒドロキシ酪酸、メバロン酸、乳酸、パントテン酸、2-ヒドロキシ吉草酸エチルエステル（2-エチルヒドロキシ吉草酸）である。これら構造式（１）〜（１４）に係る化合物を含む６５のすべての化合物は、ヒドロキシ基又はカルボキシル基を有する化合物である。このため、ＧＡＢＡＡ受容体を亢進させる効果がある組成物は、ＧＡＢＡＡ受容体活性がすでに知られているＧＡＢＡ、バルビツール酸誘導体、ベンゾジアゼピン誘導体、ムシモール、THIP、イソグバシン、及び、ガバペンチンの少なくとも７物質を除くヒドロキシ基又はカルボキシル基を有する化合物を含有する組成物であってもよい。
【化１】
2014019649.tif 000002
【化２】
2014019649.tif 000003
【化３】
2014019649.tif 000004
【化４】
2014019649.tif 000005
【化５】
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【化６】
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【化７】
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【化８】
2014019649.tif 000009
【化９】
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【化１０】
2014019649.tif 000011
【化１１】
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【化１２】
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【化１３】
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【化１４】
2014019649.tif 000015
【００２１】
また、下記の表１は、ＧＡＢＡ及び構造式（１）〜（１４）に係る化合物の分子量を示す表である。構造式（１）〜（１４）に係る化合物の分子量は、同表に示すように、ＧＡＢＡの分子量（１０３．１２）からかけ離れていない。このため、ＧＡＢＡＡ受容体活性を示す組成物の分子量は、ＧＡＢＡの分子量からかけ離れていないことが好ましく、より好ましくは、７５から２２０である。
【表１】
2014019649.tif 000016
【００２２】
ＧＡＢＡＡ受容体活性を示す組成物の濃度は、好ましくは１０μＭから１０ｍＭであり、より好ましくは１３μＭから６．７ｍＭである。
【実施例】
【００２３】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、実施例は本発明を限定するものでない。
【００２４】
（化合物の精製抽出）
まず、日本酒から、ＧＡＢＡＡ受容体活性を示す組成物（化合物）を精製抽出する方法について説明する。日本酒、ウィスキー、ビールなどの酒類には、リラックス効果があることが動物行動実験で示されている。例えば、日本酒には、アミノ酸、有機酸をはじめ１０００種類以上の様々な成分が含まれており、その中にはＧＡＢＡＡ受容体活性を示す成分も含まれると考えられる。そこで、該当する化合物を日本酒から精製抽出した。本実施例では、純米酒３点：Ａ１、Ａ２、Ａ３、純米吟醸酒１点：Ａ４、山廃純米酒１点：Ａ５、普通酒１点：Ａ６から化合物を精製抽出した。
【００２５】
図２は、日本酒の画分方法を説明するための図である。化合物を精製抽出するために、日本酒を３種類のイオン交換樹脂(オルガノ株式会社製)を用いて分画し（佐藤信” 光線および貯蔵による清酒の変化に関する研究 醸造協会誌” 65巻 p 255 1970参照）、凍結乾燥後、Ｈ２Ｏに溶解しＡ画分（有機酸等）、Ｒ画分（中世・酸性アミノ酸、ペプチド等）、Ｃ画分（塩基性アミノ酸、ペプチド等）、Ｎ画分（糖等）の５０倍濃縮液を得た。そして、このうちのＡ画分の５０倍濃縮液を日本酒本来の濃度に戻し、各画分のＧＡＢＡＡ受容体活性を測定した。その際、ｐＨは測定に用いた緩衝溶液と同じｐＨ７．５に調整し測定を行った。
【００２６】
図３は、各Ａ画分のＧＡＢＡＡ受容体活性を示す図である。同図では、ＧＡＢＡ２００μＭのＧＡＢＡＡ受容体活性を１００％として、各純米酒（Ａ１、Ａ２、Ａ３）、純米吟醸酒（Ａ４）、山廃純米酒（Ａ５）、普通酒（Ａ６）のＡ画分のＧＡＢＡＡ受容体活性を比較した。その結果、有機酸等を含むＡ画分には、ＧＡＢＡＡ受容体活性を示す化合物が含まれることが示された。
【００２７】
なお、Ａ画分を分析したところ、Ａ画分にはＧＡＢＡは含まれていないことが判明した。このため、Ａ画分には、ＧＡＢＡ以外のＧＡＢＡＡ受容体活性をもつ化合物が含まれることが確認された。
【００２８】
次に、活性化成分の精製を進め、その存在差を明らかにするために、Ａ画分を１０倍希釈したものとＡ画分の活性を比較した。図４は、Ａ画分と１０倍希釈のＡ画分とのＧＡＢＡＡ受容体活性を示す図である。図３と同様に、ＧＡＢＡ２００μＭのＧＡＢＡＡ受容体活性を１００％として、活性を比較した。なお、図中における「Ａ画分」は、Ａ画分単独の活性を示した。その結果、Ａ画分を１０倍希釈した場合（図中における「Ａ１（×１０）、Ａ２（×１０）、Ａ３（×１０）、Ａ４（×１０）」）であっても、３銘柄（Ａ１、Ａ２、Ａ３）のＡ画分は活性を示した。従って、日本酒のＡ画分には、低濃度でもＧＡＢＡ活性をもつ化合物が含まれることが明らかとなった。
【００２９】
次に、日本酒のＡ画分に含まれるＧＡＢＡＡ受容体活性を示す化合物の同定を試みた。まず、低分子ふるいSephadex G-10（GEヘルスケア株式会社製）を用いて、一度分画した日本酒をさらに分画した。分画には１０ｍｌのテルモシリンジ（テルモ株式会社製）を用いた。シリンジの先に点滴チューブの先を接続し、カラムを作成した。１ｍｌの目盛りまで綿を詰め、７ｍｌの目盛りまで樹脂（Sephadex G-10）を入れ、緩衝溶液ND96を使用し、流速10ml/minで分画を行った。その際に、分子量の指標としてp-ニトロフェノール（分子量：１３９．１１）を用いて分画を行った。５０倍濃縮の日本酒を５００μｌ使用し、エッペン１４本に１ｍｌずつに採取した。それぞれを２０倍希釈し、ｐＨを７．５に調節し測定に用いた。その結果、図５に示すようにＡ２、Ａ３、Ａ４はｐ-ニトロフェノールと同じフラクション６で最大活性を示した。
【００３０】
なお、緩衝溶液ND96については、９５０ ｍｌのＭＱ水に、純度99 % NaCl 5.61 g（最終濃度：96 mM）、1M KCl 2.0 ml（最終濃度：2 mM）、1M CaCl21.8 ml（最終濃度:1.8 mM）、1M MgCl2 1.0 mL（最終濃度：1 mM）、1M HEPES 5.0 ml（最終濃度：5 mM）を溶かし、2M NaOH（特級）を用いてｐＨを７．５に調整後、１０００ ｍｌにメスアップすることにより、作成した。
【００３１】
下記の表２は、日本酒のＡ画分（純米酒３点：Ａ１、Ａ２、Ａ３、純米吟醸酒１点：Ａ４、山廃純米酒１点：Ａ５、普通酒１点：Ａ６）についてメタボローム解析（ヒューマン・メタボローム・テクノロジーズ株式会社に依頼）した結果で、内部標準物質の面積値で標準化した各化合物におけるピークの相対面積値を示す表である。なお、表中のN.D.はNot Detectedを意味する。同表に示すように、日本酒のＡ画分から６４の化合物が同定された。これら６４の化合物はヒドロキシ基又はカルボキシル基を有し、分子量はＧＡＢＡの分子量１０３．１２からかけ離れていないという特徴を有していた。ＧＡＢＡＡ受容体を亢進させることが明らかになっているムシモールは、ヒドロキシ基を有し、分子量は１１４．１であるため、ＧＡＢＡの分子量からかけ離れていないという特徴を有している。また、ＧＡＢＡは、カルボキシル基を有している。このため、６４の化合物は、ＧＡＢＡＡ受容体活性を示すムシモール及びＧＡＢＡと同様の特徴を有していた。そして、日本酒のＡ画分には、図３及び４に示すように、ＧＡＢＡＡ受容体に対しＧＡＢＡと同様の活性を示す化合物が含まれることがわかっている。これらのことから、メタボローム解析で同定された６４の化合物は、ＧＡＢＡ作用をもつ化合物であると考えられる。
【表２】
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【００３２】
下記の表３は、メタボローム解析した結果から得られたＡ画分に含まれる化合物の濃度を示した表である。同表に示すように、化合物の濃度は、１０μＭから１０ｍＭの範囲内であった。このため、ＧＡＢＡＡ受容体活性を示す化合物の濃度は、好ましくは１０μＭから１０ｍＭであり、より好ましくは１３μＭから６．７ｍＭであった。濃度の範囲１３μＭから６．７ｍＭは、後述する図８、図９において高いＧＡＢＡＡ受容体活性を示したグルコン酸や乳酸の濃度で示される範囲である。
【表３】
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【００３３】
次に、アフリカツメガエル卵母細胞にＧＡＢＡＡ受容体を発現させる方法と、ＧＡＢＡＡ受容体の活性を測定する方法について説明する。このＧＡＢＡＡ受容体の活性を測定する方法を用いて、それぞれの化合物における活性を測定した。
【００３４】
（アフリカツメガエル卵母細胞の摂取）
アフリカツメガエル（Xenopus laevis）を氷中で約３０分間放置し眠らせた後、注射針と手術用ハサミを使って腹部に約３〜５ｍｍの穴を開け、その週の測定量から必要な量の卵母細胞を取り出した。摘出した卵母細胞はコラゲナーゼ溶液に入れ、約２時間放置した後、顕微鏡下でピンセットを用いて卵胞膜を取り除いた。その週の測定量から必要な量の卵をむき、色や形、傷のないものをピックアップしてシャーレに入れ、Barth液中、２０℃に設定したサーモプレート（FTP-28190 アズワン製）内で保存した。
【００３５】
ここで、Barth液及びコラゲナーゼ溶液は以下のように調整した。
超純水（ＭＱ水）を１?ビーカーに約９５０ｍｌ入れ、それぞれの試薬（試薬 濃度 必要量／１?；NaCl 88 mM 51.4 g、KCl 1.0 mM 0.75 g、MgSO4 0.82 mM 2.0 g、Tris 5.0 mM 6.0 g、NaHCO3 2.4 mM 2.0 g）を必要量計りとり、ｐＨ７．５にして，１０００ｍｌにメスアップして、Barth 10A液を生成した。Barth 10A液を５００ｍｌメスシリンダーに５０ｍｌに入れ、ＭＱ水で１０倍希釈した。１０倍希釈した溶液を培養ビンに入れ、アルミホイルで蓋を包み、オートクレーブにかけ、Barth A液を生成した。ＭＱ水を１００ｍｌビーカーに約９５ｍｌ入れ、それぞれの試薬（試薬 濃度 必要量／１?；CaCl 0.41 mM 0.6 g、Ca(NO3)2 0.31 mM 0.78 g）を必要量計り取って加え、１００ｍｌまでメスアップ後、培養ビンに保存し、オートクレーブにかけ、Barth 100B液を生成した。オートクレーブしたBarth A液に、PnicillinG 25 mg、Streptomycin 12.5 mgをアルコール消毒したスパーテルで計りとり、滅菌したメスピペットでBarth 100B液を５ｍｌ加え、Barth液を作成した。
コラゲナーゼ（SIGMA製）３５ｍｇをビーカーに取り、Barth A液を１０ｍｌ加え、コラゲナーゼ溶液を生成（調整）した。
【００３６】
（ｍＲＮＡの合成と調整）
牛の脳からクローニングしたＧＡＢＡＡ受容体のα１とβ１とを含むpSP6プラスミドを鋳型にし、in vitroでSP6 RNAポリメラーゼ（RiboMAX Promega製）を用いてＧＡＢＡＡ受容体のｍＲＮＡを合成した。合成したＧＡＢＡＡ受容体のα１、β１のｍＲＮＡを予め設定しておいた濃度（α１：０．８μｇ／μｌ、β１：０．８μｇ／μｌ）に希釈した。ＭＱ水、エッペンドルフチューブ、チップ等はすべて滅菌したものを使用した。
【００３７】
（ｍＲＮＡインジェクション）
インジェクション用ガラス管をNARISHIGE PP-83（株式会社ナリシゲ製）で作成し、２００℃で約１時間乾熱滅菌した。滅菌したガラス管は、ミネラルオイルを入れてインジェクション用マニピレーター（NARISHIGE MMN-8：株式会社ナリシゲ製）にセットし、調整したｍＲＮＡをガラス菅内に吸い込んだ。網を敷いたシャーレにBarth液を満たし、卵胞膜を取り除いた卵を置き、１つずつインジェクションした（α1: 30.0 ng/oocyte、β1: 30.0 ng/oocyte）。α１、β１をそれぞれ１μｌずつ混合し、ｍＲＮＡは卵１個あたりにつき、約５０ｎｌずつ注入した。インジェクションした卵は、２０℃に設定したサーモプレート内で約１８〜２４時間インキュベートした。
【００３８】
（二電極膜電位固定法）
二電極膜電位固定法で膜電位を−７０ｍＶに固定し、細胞膜を通過するイオンを電流測定電極で測定した。アンプはオーサイトクランプ装置 (TEV-200A:DAGAN製)を用い、電流値をPower Lab/200でＡＤ（Analog to Digital）変換し、ソフトチャートで取り込んだ。図６は、ＧＡＢＡＡ受容体の標準的な測定状態を示した図であり、横軸が時間（ｓ）、縦軸が電流（Ａ）を表しており、計測開始後５秒目から２５秒目まで、リガンドであるＧＡＢＡを還流した。ここでは、ＧＡＢＡの代わりにＡ画分（に含まれる化合物）を還流することにより、ＧＡＢＡＡ受容体の活性を測定した。
【００３９】
（ＧＡＢＡＡ受容体の活性測定）
図７は、ＧＡＢＡＡ受容体のアゴニストであるＧＡＢＡのα１／β１サブタイプＧＡＢＡＡ受容体に対するＧＡＢＡの濃度反応曲線を表したものである。５０％効果濃度（EC50）は６５．１μＭを示した。同図の結果から、ＧＡＢＡＡ受容体を亢進させる組成物は、ＧＡＢＡの濃度が６５μＭから５００μＭ、より好ましくは１００μＭから５００μＭの下で活性を示すことがわかった。また、この図からＧＡＢＡの最大活性を示す濃度は２００μＭであることがわかった。この結果をもとにＧＡＢＡ２００μＭをコントロールとして、Ａ画分に含まれる化合物のＧＡＢＡＡ受容体活性を調べた。また、Ａ画分に含まれていた2-ヒドロキシ吉草酸の代わりに、構造式、分子量が類似している化合物（ヒドロキシ基又はカルボキシル基を有し、ＧＡＢＡの分子量からかけ離れていない化合物）である2-ヒドロキシ吉草酸エチルエステル（2-エチルヒドロキシ吉草酸（Ethyl 2-hydroxyvalerate））についてもＧＡＢＡＡ受容体活性を調べた。
【００４０】
図８は、化合物の濃度が２００μＭのときのＧＡＢＡＡ受容体活性を示す図である。同図では、ＧＡＢＡ２００μＭのＧＡＢＡＡ受容体活性を１００％として、各化合物のＧＡＢＡＡ受容体活性を比較した。この結果、同図に示すように、乳酸、キナ酸、グリコール酸、ピルビン酸、3-ヒドロキシ酪酸が高いＧＡＢＡＡ受容体活性を示した。また、2-ヒドロキシ吉草酸エチルエステル、グルコン酸、リンゴ酸、2-ヒドロキシ-4-メチル吉草酸、クエン酸、2-オキソグルタル酸、パントテン酸、メバロン酸についても、ＧＡＢＡＡ受容体活性があることが示された。
【００４１】
次に、図９は、化合物の濃度が５００μＭのときのＧＡＢＡＡ受容体活性を示す図である。同図に示すように、キナ酸、グルコン酸、リンゴ酸、ピルビン酸、3-ヒドロキシ酪酸が高いＧＡＢＡＡ受容体活性を示した。また、2-ヒドロキシ吉草酸エチルエステル、2-ヒドロキシ-4-メチル吉草酸、クエン酸、グリコール酸、2-オキソグルタル酸についても、ＧＡＢＡＡ受容体活性があることが示された。
【００４２】
以上の結果から、ピルビン酸、2-オキソグルタル酸、2-ヒドロキシ-4-メチル吉草酸、クエン酸、リンゴ酸、2-ヒドロキシ吉草酸エチルエステル、キナ酸、グルコン酸、グリコール酸、3-ヒドロキシ酪酸、メバロン酸、乳酸、及び、パントテン酸は、ＧＡＢＡＡ受容体に対してアゴニスト活性を持っていることが示された。また、キナ酸、ピルビン酸、3-ヒドロキシ酪酸は、２００μＭ、５００μＭのいずれの濃度であっても、高いＧＡＢＡＡ受容体活性があることが示された。また、キナ酸、グルコン酸、リンゴ酸、ピルビン酸、3-ヒドロキシ酪酸は、濃度が上がるにつれて、ＧＡＢＡＡ受容体活性が上がることが示された。また、Ａ画分に含まれていない化合物であっても、構造式、分子量が類似している化合物であれば、ＧＡＢＡＡ受容体に対してアゴニスト活性を持っていることが示された。
【００４３】
（高架式十字迷路試験）
次に、高架式十字迷路試験により、キナ酸及びグルコン酸によるＧＡＢＡＡ受容体活性への作動作用を検討した。
【００４４】
図１０は、実験に使用した高架式十字迷路試験装置を示す図である。高架式十字迷路試験装置は、床上４０ｃｍにあり、直行する４本のアーム（6×30 cm）とそれらが交差する部分のプラットホーム（9×9 cm）から構成されている。２本のオープンアーム（壁のない道）は、高さ２ｃｍのふちが付いているが側壁がなく、２本のクローズアーム（壁のある道）は、高さ１０ｃｍの灰色不透明の側壁があり、その他の床も灰色不透明になっている。この試験では、マウスが壁際を好むという性質を利用して、オープンアームを恐れずに探索するかを観察した。マウスに抗不安剤を投与するとオープンアームを探索することが多くなるため、オープンアームに滞在した時間、及び、進入した回数を指標として、ＧＡＢＡＡ受容体活性への作動作用を検討した。
【００４５】
９週齢のC57BL/6NCrlCrlj 雄性マウス（日本チャールスリバー社から購入）を動物飼育室で飼育順応させて後、高架式十字迷路試験を行った。マウスは５匹ずつ、ペーパーチップ床敷を敷いたポリカーボネート製ケージ（30×20×15 cm）に入れ、飼料と水道水を自由に摂取させて飼育した。飼料は、動物用固型飼料MF（オリエンタル酵母工業株式会社製）を用いた。動物実験室内は、１２時間毎の明暗（明期：8時より20時、暗期：20時より8時）、室温２３℃及び湿度６０％に調節した。
【００４６】
高架式十字迷路試験を行うに当たり、マウスには水を自由摂取させたが、化合物の投与前から高架式十字迷路試験終了まで、３〜５時間マウスは絶食とした。生理食塩水、ジアゼパム、ムシモール、キナ酸、グルコン酸をマウスにそれぞれ投与するときは、エッペンドルフチューブ、チップ、注射針、注射器等はすべて滅菌した新品を使用した。それぞれの化合物のマウスへの腹腔内投与量（mg/kg体重）は、ジアゼパム＝１、ムシモール＝０．３、キナ酸＝１、グルコン酸＝１０とした。マウスを高架式十字迷路試験装置のプラットホーム部分に置き、頭をオープンアーム方向に向けて試験を開始し、１０分間、オープンアームとクローズアームとのそれぞれのアームへの侵入回数と滞在時間とを観察し、記録した。プラットホームから四肢全部がアーム部分に出た場合を、アームへの移行として記録した。
【００４７】
図１１及び１２は、生理食塩水、ジアゼパム、ムシモール、キナ酸、グルコン酸をマウスにそれぞれ投与したときの、オープンアームの滞在時間及び進入回数の割合を比較した図である。キナ酸及びグルコン酸をマウスに投与した場合、同図に示すように、オープンアームの滞在時間及び進入回数は、生理食塩水を投与した場合と比べて上回っている。この結果、キナ酸及びグルコン酸は、ＧＡＢＡＡ受容体活性への作動作用があり、抗不安剤としての機能を有することがわかった。また、同図に示すように、ＧＡＢＡＡ受容体活性への作動作用が知られているジアゼパム、ムシモールを投与した場合では、生理食塩水を投与した場合と比較して、オープンアームの滞在時間及び進入回数が上回っている。このことから、本高架式十字迷路試験が適正に行われたことがわかった。
【００４８】
以上の結果から、キナ酸及びグルコン酸は、ＧＡＢＡＡ受容体に対してアゴニスト活性を持っていることが示された。
【００４９】
なお、本発明は上記の実施形態及び実施例に限定されず、種々の変形及び応用が可能である。
【００５０】
上記の実施形態に係るＧＡＢＡＡ受容体に対しＧＡＢＡ様活性を示すＧＡＢＡ様組成物（化合物）は、日本酒から精製・抽出したものに限定されず、ウィスキーやビールなどの他の酒類から精製・抽出してもよく、また、化学合成により生成してもよい。また、日本酒は、吟醸酒、純米酒、山廃、普通酒など任意である。
【００５１】
ＧＡＢＡＡ受容体活性を示す組成物の剤形は、内服薬、注射薬、座薬、吸入薬などを挙げることができる。当該組成物は、常法に従って、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味矯臭剤、溶解補助剤、懸濁剤、コーティング剤等の医薬の製剤技術分野において通常使用し得る既知の補助剤を用いて、経口投与、組織内投与（皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与など）、局所投与（経皮投与など）、経直腸的投与などに適した剤型に製剤化することができる。また、上記の補助剤のほか、必要に応じて着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤などの補助剤、および他の医薬品を含有させることもできる。当該組成物は、これらの投与方法に適した剤型で投与されることは当然である。医薬の用量は任意であり、年齢、体重などの患者の状態、投与経路などを考慮した上で決定することができる。
【００５２】
ＧＡＢＡＡ受容体活性を示す組成物は、液体、固形物、スラリー状物、粉末物などの形態が考えられ、食べやすいように種々の既知の食材と混ぜ合わせられていることが好ましい。当該食材には、必要に応じ、甘味料、旨味調味料、無機塩、酸味料、アミノ酸類、核酸、糖類、賦形剤、香辛料、旨味以外の調味料、抗酸化剤、着色料、保存料、強化剤、乳化剤、ハーブ、スパイス、エタノール等の食品に使用可能な各種添加物を使用することができる。
【００５３】
ＧＡＢＡＡ受容体活性を示す組成物を投与・摂取できる患者、患蓄としては、例えば、ヒト、ヒト以外の哺乳類（マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシ及びサル等）を例示することができるが、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、無脊椎動物等、任意である。
【００５４】
ＧＡＢＡＡ受容体活性を示す６５の化合物（Ａ画分に含まれる６４の化合物＋2-ヒドロキシ吉草酸エチルエステル）の組み合わせ方や割合は任意であり、例えば、ピルビン酸と2-オキソグルタル酸とを１：１の割合で組み合わせたり、ピルビン酸とキナ酸とグルコン酸とを１：２：３の割合で組み合わせたりすることもできる。
【産業上の利用可能性】
【００５５】
以上説明したように、本発明に係るＧＡＢＡ様組成物は、ＧＡＢＡＡ受容体を作用させることにより、精神安定、睡眠、麻酔効果などが生じるため、神経保護効果等を発揮する鎮静・催眠薬、抗痙攣薬、抗不安薬、鎮静型の神経作用組成物として有用である。
【図１】
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【図２】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図９】
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【図１１】
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【図１２】
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【図３】
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【図４】
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【図８】
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【図１０】
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