(57)【要約】      （修正有）【課題】レセプタータンパク質に関する基本的物性が測定可能な走査型プローブ顕微鏡用プローブ、およびこれに用いる人工分子合成方法を提供する。【解決手段】１分子中に、下記一般式で表される構造を有する人工シデロフォア錯体分子でプローブ表面を修飾する。2014130014.tif 000040【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
１分子中に、一般式（１）または（２）で表される構造を有する人工シデロフォア錯体分子が表面に修飾されたプローブ。
【化１】
2014130014.tif 000038
【化２】
2014130014.tif 000039
（一般式（１）および（２）中、Ｒ１〜Ｒ３、およびＲ５〜Ｒ１３は、それぞれ独立に、Ｈ、カルボニル含有基、リン酸エステル基、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数２〜６のアルケニル基、炭素数１〜６のアルコキシアルキル基、炭素数１〜６のアミノアルキル基、炭素数１〜６のパーフルオロアルキル基、炭素数６〜１０のアリール基、炭素数７〜１０のアラルキル基、またはカルボニル基を有するアルキル基、アルケニル基、アリール基もしくはアラルキル基を表す。また一般式（１）および（２）中、Ｒ４及びＲ１４は、それぞれ独立に、水酸基、ニトロ基、リン酸基、スルホ基、アミノ基、アルデヒド基、カルボキシル基、ビニル基、アリル基、アルキニル基、アジ基を表す。また一般式（１）および（２）中、ｌ、ｍ、ｎは、それぞれ独立に、炭素数０〜５までのメチレン基を表す。さらに一般式（１）および（２）中、Ｍ３＋は、３価の金属イオンを示す。）
【請求項２】
３価の金属イオンを捕捉する部位として、ヒドロキサム酸部位またはカテコール部位を分子内に３ヶ所有している請求項１に記載の人工シデロフォア錯体分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、走査型プローブ顕微鏡用探針とこれを用いた微生物表面構造の解析システムに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
走査型プローブ顕微鏡（Ｓｃａｎｎｉｎｇ  Ｐｒｏｂｅ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ；ＳＰＭ）は微小な先端を有する探針（プローブ）を対象となる試料表面の近傍まで接近させ、プローブ‐試料間の距離を一定に保ちながら試料表面を走査し、プローブ‐試料に働く相互作用を検出する手法である（非特許文献１）。走査型プローブ顕微鏡としては、プローブ‐試料間に流れるトンネル電流を検出する走査型トンネル顕微鏡（Ｓｃａｎｎｉｎｇ  Ｔｕｎｎｅｌｉｎｇ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ；ＳＴＭ）、プローブ‐試料間に働く原子間力を検出する原子間力顕微鏡（Ａｔｏｍｉｃ  Ｆｏｒｃｅ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ；ＡＦＭ）などが一般的に知られている。ＳＰＭは微小領域の形状評価のほかに熱量、摩擦力、磁気力、表面電位、粘弾性などの物理量も評価でき、その機能の多様化とともに応用範囲が拡大している。
【０００３】
また微生物細胞の表面観察では、この走査型プローブ顕微鏡を用いた測定手法が広く利用されている（特許文献１〜３、非特許文献２〜７）。特に、ＡＦＭを用いた観察では、片持ちバネ（カンチレバー）の先端に取り付けられたプローブ上に、微生物細胞表面と相互作用が可能な様々な分子が修飾されたものが使用されている。これにより原子間力に加えて、分子が修飾されたプローブと微生物細胞表面の間に働く相互作用をカンチレバーのたわみとして検出することが可能となる。例えば、非特許文献７では抗体をプローブ表面に修飾し、それを抗原に近づけることで、プローブが接続されたカンチレバーの変異からサンプル中の抗原の有無を測定可能な走査型プローブ顕微鏡を提案している。
【０００４】
そうした微生物細胞表面との間に相互作用が働く化合物の一つとして、シデロフォアが挙げられる（非特許文献８）。シデロフォアは、細菌や真菌が鉄イオンを取り込むために体外に分泌する分子である。分泌されたシデロフォアは環境中の鉄イオンを捕捉して錯体（シデロフォア‐鉄イオン複合体）を形成する。この錯体は、膜タンパク質であるシデロフォアレセプターにより認識され、該レセプター部位を透過して細胞内に取り込まれる。そして、取り込まれた錯体から鉄イオンが遊離され、細胞活動に利用される。なお、自らシデロフォアの生産及び分泌を行わない細菌等のなかにも、他の細菌等により生産され分泌された（外来性の）シデロフォアを利用して同様に鉄イオンを取り込むものがある。またシデロフォアは鉄の摂取を行うだけでなく、細胞内の様々な代謝機構の調節を行っていることも報告されている（非特許文献９）。
【０００５】
人工シデロフォアとは、上記シデロフォアの構造を一部抽出・模倣し、同様の機能を持つよう設計・合成された人工分子である（非特許文献１０〜１２）。天然分子である人工シデロフォアと異なり、合成分子である人工シデロフォアは、分子構造が天然のものより簡便でありながら同様の機能を有し、極微量しか産出されない天然のものに比べて大量合成が可能である。また天然のものには存在しない新しい機能を人工的に付与することも可能である。
特許文献４、および非特許文献１０には、基板表面から少なくとも所定の長さ離して該基材表面にリンカーで繋ぎ止めた鉄イオンを結合したヒドロキサム酸型の人工シデロフォアを用いて、微生物細胞を固定する方法、などが記載されている。
【０００６】
また非特許文献１１では、水晶振動子マイクロバランス法（Ｑｕａｒｔｚ  Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂａｌａｎｃｅ；ＱＣＭ）で用いられるＱＣＭチップ上の電極部分に、人工シデロフォアの鉄錯体を修飾することで、微生物をセンシングすることが可能なこと、人工シデロフォア部分の構造の違いにより、微生物の吸着挙動に違いが見られること、更に、同一の人工シデロフォアを用いた場合でも、微生物の種類に応じて吸着挙動が異なること、などが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００５−２８３４０５号公報
【特許文献２】特開２００８−１９９９３６号公報
【特許文献３】ＷＯ２００７／１３５４８３
【特許文献４】特許第４６８６７０３号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】日本表面科学会  編，表面分析技術選書  ナノテクノロジーのための走査プローブ顕微鏡，丸善，２００２年．
【非特許文献２】Ｔ．Ｏｋａｄａ，Ｍ．Ｓａｎｏ，Ｙ．Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｈ．Ｍｕｒａｍａｔｓｕ，Ｌａｎｇｍｕｉｒ誌，２００８年，２４巻，４０５０頁．
【非特許文献３】Ｓ．Ｋａｎｇ，Ｍ．Ｅｌｉｍｅｌｅｃｈ，Ｌａｎｇｍｕｉｒ誌，２００９年，２５巻，９６５６頁．
【非特許文献４】Ｃ．Ｖｅｒｂｅｌｅｎ，Ｎ．Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｅｓ，Ｄ．Ａｌｓｔｅｅｎｓ，Ｖ．Ｄｕｐｅｒｓ，Ａ．Ｒ．Ｂａｕｌａｒｄ，Ｙ．Ｆ．Ｄｕｆｒｅｎｅ，Ｌａｎｇｍｕｉｒ誌，２００９年，２５巻，４３２４頁．
【非特許文献５】Ｔ．Ｍｏｒｉ，Ｍ．Ａｓａｋａ，Ｙ．Ｏｋａｈａｔａ，Ｊｏｕｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ誌，２０１１年，１３３巻，５７０１頁．
【非特許文献６】Ｈ．Ｋｉｍ，Ｍ．Ｎ．Ｌｅｅ，Ｓ．Ｈ．Ｒｙｕ，Ｊ．Ｗ．Ｐａｒｋ，Ａｎａｌｉｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ誌，２０１１年，８３巻，１５００頁．
【非特許文献７】Ｚ．Ｌｉ，Ｄ．Ｑｉｕ，Ｋ．Ｘｕ，Ｉ．Ｓｒｉｄｈａｒａｎ，Ｘ．Ｑｉａｎ，Ｒ．Ｗｏｎｇ，Ｌａｎｇｍｕｉｒ誌，２０１１年，２７巻，８２９４頁．
【非特許文献８】Ｊ．Ｈ．Ｃｒｏｓａ，Ａ．Ｒ．Ｍｅｙ，Ｓ．Ｍ．Ｐａｙｎｅ（編集），Ｉｒｏｎ  Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｉｎ  Ｂａｃｔｅｒｉａ，ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ），２００４年．
【非特許文献９】Ｌ．Ｄ．Ｄｅｖｉｒｅｄｄｙ，Ｃ．Ｇａｚｉｎ，Ｘ．Ｚｈｕ，Ｍ．Ｇ．Ｇｒｅｅｎ，Ｃｅｌｌ誌，２００５年，１２３巻，１２９３頁．
【非特許文献１０】Ｋ．Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，Ｔ．Ｏｚａｗａ，Ｋ．Ｊｉｔｓｕｋａｗａ，Ｈ．Ｍａｓｕｄａ，Ｉｎｏｒｇｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ誌，２００４，４３巻，８５３８頁．
【非特許文献１１】Ｔ．Ｉｎｏｍａｔａ，Ｈ．Ｅｇｕｃｈｉ，Ｋ．Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，Ｙ．Ｆｕｎａｈａｓｈｉ，Ｔ．Ｏｚａｗａ，Ｈ．Ｍａｓｕｄａ，Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ誌，２００７，２３巻，７５１頁．
【非特許文献１２】Ｔ．Ｉｎｏｍａｔａ，Ｈ．Ｅｇｕｃｈｉ，Ｙ．Ｆｕｎａｈａｓｈｉ，Ｔ．Ｏｚａｗａ，Ｈ．Ｍａｓｕｄａ，Ｌａｎｇｍｕｉｒ誌，２０１２年，２８巻，１６１１頁．
【非特許文献１３】Ｊ．Ｋ．Ｙｏｕｎｇ，Ｇ．Ｒ．Ｂａｋｅｒ，Ｇ．Ｒ．Ｎｅｗｋｏｍｅ，Ｋ．Ｆ．Ｍｏｒｒｉｓ，Ｃ．Ｓ．Ｊｏｈｎｓｏｎ  Ｊｒ．，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ誌，１９９４年，２７巻，３４６４頁．
【非特許文献１４】Ｓ．Ｌｅｂｒｅｔｏｎ，Ｓ．-Ｅ．Ｈｏｗ，Ｍ．Ｂｕｃｈｈｏｌｚ，Ｂ．-Ｅ．Ｙｉｎｇｙｏｎｇｎａｒｏｎｇｋｕｌ，Ｍ．Ｂｒａｄｌｅｙ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ誌，２００３年，５９巻，３９４５頁．
【非特許文献１５】Ｍ．Ａｐｏｓｔｏｌ，Ｐ．Ｂａｒｅｔ，Ｇ．Ｓｅｒｒａｔｒｉｃｅ，Ｊ．Ｄｅｓｂｒｉｅｒｅｓ，Ｊ．-Ｌ．Ｐｕｔａｕｘ，Ｊ．Ｍ．Ｓｔｅｂｅ，Ｄ．Ｅｘｐｅｒｔ，Ｊ．-Ｌ．Ｐｉｅｒｒｅ，Ａｎｇｅｗａｎｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，２００５年，４４巻，２５８０頁．
【非特許文献１６】Ｄ．Ｉｍｂｅｒｔ，Ｆ．Ｔｈｏｍａｓ，Ｐ．Ｂａｒｅｔ，Ｇ．Ｓｅｒｒａｔｒｉｃｅ，Ｄ．Ｇａｕｄｅ，Ｊ．-Ｌ．Ｐｉｅｒｒｅ，Ｊ．-Ｐ．Ｌａｕｌｈｅｒｅ，Ｎｅｗ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０００年，２４巻，２８１頁．
【非特許文献１７】Ｅ．Ａ．Ｄｅｒｔｚ，Ｊ．Ｘｕ，Ｋ．Ｎ．；Ｒａｙｍｏｎｄ，Ｉｎｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００６年，４５巻，５４６５頁．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
微生物の栄養補給、細胞内の代謝機構の制御などに利用されるシデロフォア分子は、鉄イオンと結合した形で細胞膜表面に存在するレセプターと呼ばれる膜タンパク質に認識され、細胞内に取り込まれる。この機構はこれまでの研究により、ある程度明らかとなっているが、実際に細胞表面上に発現しているレセプタータンパク質の位置や個数、シデロフォア分子との結合力の強さなど、基本的性質に関するデータはほとんど報告されていない。こうした経緯から、レセプタータンパク質に関する基本的物性を測定可能な手段の開発が望まれていた。
【００１０】
本発明の課題は、このように、レセプタータンパク質に関する基本的物性を測定可能な走査型プローブ顕微鏡用プローブ、およびこれに用いる人工分子合成方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは上記の課題について、これまでに開発してきた人工シデロフォア錯体分子をベースとし、鋭意検討した結果、走査型プローブ顕微鏡に用いられるカンチレバー上のプローブに人工シデロフォア錯体分子を修飾することにより、上記に挙げた微生物表面の局所構造の解析が可能な、新しいタイプのプローブを開発するに至った。本発明は、プローブ上の人工シデロフォア錯体分子が、微生物細胞表面のシデロフォアレセプターと相互作用をする際に、相互作用の大きさがカンチレバーのたわみとなって検出することが可能な走査型顕微鏡用プローブである。
【００１２】
すなわち、本発明は、以下の一般式（１）または（２）で表される構造を有する人工シデロフォア錯体分子が表面に修飾されたプローブである。
【００１３】
[１]  １分子中に、一般式（１）または（２）で表される構造を有する人工シデロフォア錯体分子が表面に修飾されたプローブ。
【化１】
2014130014.tif 000002
（１）
【化２】
2014130014.tif 000003
（２）
一般式（１）および（２）中、Ｒ１〜Ｒ３、およびＲ５〜Ｒ１３は、それぞれ独立に、Ｈ、カルボニル含有基、リン酸エステル基、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数２〜６のアルケニル基、炭素数１〜６のアルコキシアルキル基、炭素数１〜６のアミノアルキル基、炭素数１〜６のパーフルオロアルキル基、炭素数６〜１０のアリール基、炭素数７〜１０のアラルキル基、またはカルボニル基を有するアルキル基、アルケニル基、アリール基もしくはアラルキル基を表す。
また一般式（１）および（２）中、Ｒ４及びＲ１４は、それぞれ独立に、水酸基、ニトロ基、リン酸基、スルホ基、アミノ基、アルデヒド基、カルボキシル基、ビニル基、アリル基、アルキニル基、アジ基を表す。
また一般式（１）および（２）中、ｌ、ｍ、ｎは、それぞれ独立に、炭素数０〜５までのメチレン基を表す。
また一般式（１）および（２）中、Ｍ３＋は、３価の金属イオンを示す。
【００１４】
［２］３価の金属イオンを捕捉する部位として、ヒドロキサム酸部位またはカテコール部位を分子内に３ヶ所有している前記［１］に記載の人工シデロフォア錯体分子。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明である人工シデロフォア分子が修飾されたカンチレバーを示した概略図である。なお図中符号はそれぞれ、１：カンチレバー、２：プローブ、３：リンカー分子、４：人工シデロフォア、または人工シデロフォア錯体分子、５：プローブと細胞膜間の相互作用、６：細胞膜、７シデロフォアレセプター、を示す。
【図２】本発明の第１実施形態における人工シデロフォア４の１Ｈ‐ＮＭＲスペクトルを示した図である。
【図３】本発明の第１実施形態における人工シデロフォア錯体４のＵＶ／ｖｉｓスペクトルを示した図である。
【図４】本発明の第２実施形態における（ａ）通常のプローブ（Ｓｉ３Ｎ４製）と（ｂ）人工シデロフォア４を修飾したプローブ７による、チタニア基板に対するフォースカーブ測定を示した図である。
【図５】本発明の第３実施形態における（ａ）通常のプローブ（Ｓｉ３Ｎ４製）と（ｂ）人工シデロフォア錯体４を修飾したプローブ２による、ガラス基板上の大腸菌の測定を示した図である。
【図６】本発明の第３実施形態における人工シデロフォア錯体４を修飾したプローブ４による、ガラス基板上の大腸菌の測定を示した図である。
【図７】本発明の第３実施形態における（ａ）通常のプローブ（ＣＮＦ製）と人工シデロフォア錯体４を修飾したＣＮＦプローブ６による、ガラス基板上の大腸菌の測定を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、図面を参照しつつ本発明の実施の形態について説明する。本発明は、以下の実施形態に限定されるものではなく、発明の範囲を逸脱しない限りにおいて、変更、修正、改良を加え得るものである。
【００１７】
（第１実施形態）
図１は上記人工シデロフォア、およびその錯体が修飾されたプローブを有するカンチレバーの概略図である。この図において、各符号はそれぞれ、１：カンチレバー、２：プローブ、３：リンカー分子、４：人工シデロフォア、または人工シデロフォア錯体分子、５：プローブと細胞膜間の相互作用、６：細胞膜、７シデロフォアレセプター、を示している。  本実施形態の人工シデロフォア錯体分子は、１分子中に、一般式（１）または（２）で表される構造を有する化合物である。
【化１】
2014130014.tif 000004
（１）
【化２】
2014130014.tif 000005
（２）
一般式（１）および（２）中、Ｒ１〜Ｒ３、およびＲ５〜Ｒ１３は、それぞれ独立に、Ｈ、カルボニル含有基、リン酸エステル基、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数２〜６のアルケニル基、炭素数１〜６のアルコキシアルキル基、炭素数１〜６のアミノアルキル基、炭素数１〜１０のパーフルオロアルキル基、炭素数６〜１０のアリール基、炭素数７〜１０のアラルキル基、またはカルボニル基を有するアルキル基、アルケニル基、アリール基もしくはアラルキル基を表す。また一般式（１）および（２）中、Ｒ４及びＲ１４は、それぞれ独立に、水酸基、ニトロ基、リン酸基、スルホ基、アミノ基、アルデヒド基、カルボキシル基、ビニル基、アリル基、アルキニル基、アジ基を表す。また一般式（１）および（２）中、ｌ、ｍ、ｎは、それぞれ独立に、炭素数０〜５までのメチレン基を表す。なお一般式（１）および（２）中、Ｍ３＋は、３価の金属イオンを示す。
【００１８】
上記の条件を満足する一般式（１）または（２）で表される化合物（人工シデロフォア錯体）として、３価の金属イオンを捕捉する部位としてヒドロキサム酸部位またはカテコール部位を分子内に３ヶ所有している化合物が好ましい。３価の金属イオン捕捉部位であるヒドロキサム酸部位またはカテコール部位は、それぞれを単独で３つ持っている化合物、また両者を併せて３ヶ所有している化合物でも良い。なお、一般式（１）で表される化合物（人工シデロフォア錯体）は、これに限定されるものではなく、一般式（３）〜（２１）で表される化合物でもよい。
【化３】
2014130014.tif 000006
（３）
【化４】
2014130014.tif 000007
（４）
【化５】
2014130014.tif 000008
（５）
【化６】
2014130014.tif 000009
（６）
【化７】
2014130014.tif 000010
（７）
【化８】
2014130014.tif 000011
（８）
【化９】
2014130014.tif 000012
（９）
【化１０】
2014130014.tif 000013
（１０）
【化１１】
2014130014.tif 000014
（１１）
【化１２】
2014130014.tif 000015
（１２）
【化１３】
2014130014.tif 000016
（１３）
【化１４】
2014130014.tif 000017
（１４）
【化１５】
2014130014.tif 000018
（１５）
【化１６】
2014130014.tif 000019
（１６）
【化１７】
2014130014.tif 000020
（１７）
【化１８】
2014130014.tif 000021
（１８）
【化１９】
2014130014.tif 000022
（１９）
【化２０】
2014130014.tif 000023
（２０）
【化２１】
2014130014.tif 000024
（２１）
【００１９】
本実施形態の人工シデロフォアの合成法について説明する。ちなみに、本実施形態の人工シデロフォア錯体は、３価の金属イオンをＭ、人工シデロフォア配位子Ｌを用いて表すと、ＭＬと表されるものである。まず、３価の金属塩原料に、配位子Ｌを反応させる方法が好ましく用いられる。３価の金属塩原料としては、塩化鉄、トリス（２，４-ペンタンジオナト）Ｆｅ（３価）等のＦｅ（３価）塩や錯体、トリス（２，４-ペンタンジオナト）Ｇａ（３価）等のＧａ（３価）錯体、およびトリス（２，４-ペンタンジオナト）Ａｌ（３価）等のＡｌ（３価）錯体が好適に用いられる。
人工シデロフォア配位子Ｌとしては、まず一般式（２２）に示す様に、ヒドロキサム酸部位を金属イオン捕捉部位として含むものが好適に用いられる。
【化２２】
2014130014.tif 000025
（２２）
また、一般式（２３）にカテコール部位を金属イオン捕捉部位として含むものも好適に用いられる。
【化２３】
2014130014.tif 000026
（２３）
さらに、一般式（２４）、（２５）に示すようにヒドロキサム酸部位とカテコール部位を併せ持つものも好適に用いられる。
【化２４】
2014130014.tif 000027
（２４）
【化２５】
2014130014.tif 000028
（２５）
【００２０】
３価の金属塩原料に配位子Ｌを反応させる反応溶媒としては、水、および一般的な有機溶媒を用いることができ、好ましくは水、アセトン、メタノールおよびエタノール等のアルコール系溶媒、酢酸エチル等のエステル系溶媒が用いられる。反応温度は特に限定されないが、反応を進行させるために、加温してもよく、室温〜８０℃の範囲で行うことが特に好ましい。また加温についてはオイルバス、ウォーターバス、マイクロ波加熱装置等を使用することができる。反応時間は特に限定されないが、通常１分〜数日、好ましくは１０分〜１日であり、加温する場合は、加熱装置により時間を変更することが好ましい。
【００２１】
（第２実施形態）
次に本実施形態のカンチレバーについて説明する。本発明のカンチレバーは、走査型プローブ顕微鏡（ＳＰＭ）における、自由端近傍にプローブが形成された構造全体を指す。ＳＰＭにおいて、測定サンプルの最近傍に位置する部品であり、光学顕微鏡における対物レンズに相当するものである。
【００２２】
一般的なカンチレバーは、半導体プロセスを用いる方法で作製されており、構成材料や形状の異なるさまざまなカンチレバーが製作される。構成材料としては、単結晶シリコンや窒化シリコンが使われる。使用用途により、カンチレバー表面が金などでコーティングされたものが用いられる。一般的なカンチレバーの形状としては、中抜き三角形薄板や短冊形薄板が好適に用いられる。構成材料と形状の違いにより、カンチレバーは異なる機械特性（バネ定数、共振周波数、Ｑ値）を示す。一般的には、バネ定数は０．００５〜５０Ｎ／ｍ、共振周波数が５ｋＨｚ〜５００ｋＨｚであるカンチレバーが好適に用いられる。カンチレバーの長さは、５０〜５００μｍ、厚さは、０．１〜５μｍのものが用いられる。カンチレバーの先端のプローブの形状は、使用用途に応じて様々な形状、アスペクト比のものが用いられ、その長さは、０．１〜１０μｍ、直径１０〜１００ｎｍのものが好適に用いられる。
【００２３】
カンチレバー上のプローブへの分子の修飾方法としては、シランカップリング法を利用した表面修飾法、あるいは金でコーティングされたカンチレバーへ自己組織化法により分子を修飾する方法などが用いられる。シランカップリング法では、末端にシラノール基、クロロシラン基、アルコキシシラン基などのシラン系化合物を持つ分子が用いられる。特にメトキシシラン基、およびエトキシシラン基などのアルコキシシラン基が好適に用いられる。一方、自己組織化法では、末端にチオール基、ジスルフィド基、チオエーテル基などの硫黄原子を有する官能基を持つものが用いられる。好適にはチオール基、およびジスルフィド基が用いられる。分子を修飾するカンチレバーは、前処理によりヒドロキシル基を露出させたもの、および金などの金属をコーティング、あるいはドープしたものが好適に用いられる。
【００２４】
（第３実施形態）
次に、本発明の人工シデロフォア、およびその錯体分子を修飾したプローブを有するカンチレバーを用いた、走査プローブ顕微鏡による微生物細胞測定の方法について説明する。本発明のプローブは、カンチレバーの先端に取り付けられている。本発明のプローブを用いた微生物細胞の表面形状の画像化には、探針と試料表面を微小な力で接触させ、カンチレバーのたわみ量が一定になるように探針と微生物細胞の表面間の距離をフィードバック制御しながら水平方向に走査する方法が好適に用いられる。カンチレバーのたわみ量は一般的に「光梃子方式」を用いて検出される。半導体レーザーをカンチレバー背面に照射することで、反射したレーザー光を、上下左右に４分割された位置センサーで検出する。
【００２５】
検出されたカンチレバーのたわみ量を元に、微生物細胞の表面を画像化、あるいはフォースカーブと呼ばれる、プローブとサンプル間の距離とたわみ量として計測される相互作用の大きさをプロットした曲線により、プローブ上に修飾された人工シデロフォア、およびその錯体分子と微生物細胞表面のシデロフォアレセプターに働く相互作用の強さや、細胞上のレセプターの位置、数などの情報を得ることができる。観察する微生物は、平滑な基板上に置かれた状態で観察することが望ましく、好適には平滑なガラス基板、金属を蒸着した天然マイカ基板などが用いられる。微生物はぬれた状態でもある程度乾燥した状態でも良く、生きている微生物細胞、活動を停止した微生物細胞などを用いることができる。そのため、微生物の周辺環境は特に限定されない。培養直後の微生物細胞を含む培養液を、スライドガラス、および蒸着金基板などの平滑基板に滴下し、風乾したものが好適に用いられる。
【実施例】
【００２６】
以下、本発明を実施例に基づいてさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００２７】
（実施例１）
実施例１は、第１実施形態に対応する実施例である。次の反応スキームに示すように、非特許文献１１および１２を参考に、ヒドロキサム酸部位を持つ配位子Ｌの前駆体として、化合物１、化合物２、化合物３、化合物４、化合物５、化合物６、化合物７、化合物８、および化合物９を合成し、化合物２と化合物７、化合物８、または化合物９からヒドロキサム酸型の人工シデロフォア１、２、および３を合成した。
【化２６】
2014130014.tif 000029
【化２７】
2014130014.tif 000030
【化２８】
2014130014.tif 000031
【００２８】
＜化合物１の合成＞
非特許文献１３および１４を参考に、以下の様に合成を行った。ニトロメタン（０．５０ｍｏｌ）とベンジルトリメチルアンモニウムハイドロオキサイド４０％水溶液（４０％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｂ，５．０ｇ）をジオキサン（５０ｍＬ）に溶解し、アクリロニトリル（１．５０ｍｏｌ）を溶液の温度を２５〜３５℃に保ちながら徐々に加え、室温で１８時間撹拌した。反応溶液を、ロータリーエバポレーターで減圧乾固させ、黄土色の固体を得た。これにメタノールを加え、析出した沈殿を濾取することで白色粉末を得た。これを熱メタノールから再結晶することで白色針状結晶の化合物１を得た。収率２６％であった。
１Ｈ-ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，δ／ｐｐｍ  ｖｓ．ＴＭＳ）：２．５７（ｔ，６Ｈ），２．３１（ｔ，６Ｈ）．
ＦＴ-ＩＲ（ＫＢｒ法，ｃｍ−１）：２９９３，２９５４，２８８０（メチレンνＣ‐Ｈ），２２５０（シアノ基νＣ≡Ｎ），１５４２（ニトロ基νＮＯ２），１４４９（メチレンδＣＨ２），１１４２（メチレンδＣ‐Ｃ‐Ｃ骨格）
【００２９】
＜化合物２の合成＞
非特許文献１３および１４を参考に、以下の様に合成を行った。水素化ホウ素ナトリウム（９０ｍｍｏｌ）を脱水１，２-ジメトキシエタン（５０ｍＬ）に懸濁させ、Ａｒ雰囲気下、室温で三フッ化ホウ素ジエチルエーテル錯体（２５ｍＬ）を加えた。その時に発生する気体をＡｒ雰囲気下、８０℃で脱水ＴＨＦ（１２０ｍＬ）に通すことで、ＢＨ３・ＴＨＦ錯体（１２０ｍｍｏｌ）を合成した。化合物１（１３ｍｍｏｌ）を脱水ＴＨＦ（５０ｍＬ）に溶解し、Ａｒ雰囲気下、室温で、先程合成したＢＨ３・ＴＨＦ錯体のＴＨＦ溶液（１２０ｍＬ）を加えた。その後、８０℃で４時間還流し、反応物を３Ｍ塩酸（１００ｍＬ）に溶かし、ｐＨ１に調整した。この際に生じた白濁色のゲル状化合物が、全て溶け切るまで攪拌した。続いて、水酸化ナトリウム水溶液を用いて中和後、ロータリーエバポレーターにより減圧濃縮し、残渣にメタノールを加えた。不溶物を濾取した後に、濾液をロータリーエバポレーターで再び減圧濃縮した。この操作を三回繰り返した後に、脱塩装置（旭化成株式会社製、マイクロアシライザーＧ１）による脱塩操作を、数回繰り返すことで微黄色油状の化合物２を得た。収率８９％であった。
１Ｈ‐ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ‐ｄ６，δ／ｐｐｍ  ｖｓ．ＴＭＳ）：２．８２（ｔ，６Ｈ），１．９６（ｔ，６Ｈ），１．５６（ｑｕｉｎｔｅｔ，６Ｈ）．
ＦＴ-ＩＲ（ＫＢｒ法，ｃｍ−１）：３４３１（アミノ基νＮ‐Ｈ），３０３９（メチレンνＣ‐Ｈ），１６２３（アミノ基δ），１５３４（ニトロ基νＮＯ２），１１５８（メチレンδＣ‐Ｃ‐Ｃ骨格）．
【００３０】
＜化合物３の合成＞
無水フタル酸（０．３０ｍｏｌ）と塩酸ヒドロキシルアミン（０．３２ｍｏｌ）とを水（１００ｍＬ）に懸濁させた。この懸濁液に無水炭酸ナトリウム（０．１９ｍｏｌ）を徐々に加えた。その後、６０〜７０℃で一時間加熱し、室温に冷却した。得られた結晶を濾過し、熱エタノールに溶解させた。ここに濃塩酸を加え、室温に冷却することで白色針状結晶の化合物３を得た。収率８０％であった。
【００３１】
＜化合物４の合成＞
化合物３（９２．０ｍｍｏｌ）をジメチルスルホキシド（１５０ｍＬ）に溶解させた。この溶液を撹拌しつつ、無水炭酸カリウム（６９．８ｍｍｏｌ）を徐々に加え、塩化ベンジル（１８０ｍｍｏｌ）を滴下して加えた。これを室温で２４時間撹拌した後、冷水（３００ｍＬ）に注ぎ込み、０〜５℃に数分間放置した。析出した結晶を濾過し、水（１０ｍＬ）で３回洗浄した。得られた粗結晶を熱エタノールから再結晶することで、白色針状結晶の化合物４を得た。収率７５％であった。
【００３２】
＜化合物５の合成＞
化合物４（４０．０ｍｍｏｌ）とヒドラジン一水和物（５５．１ｍｍｏｌ）とをエタノール（３００ｍＬ）に溶解させた。この溶液を加熱して２時間還流した。室温まで放冷した後、濃塩酸（４．８３ｍＬ）を加え、氷冷水中に十数分間放置した。析出した沈殿物を濾取し、エタノール（１６．６ｍＬ）で３回、冷水（１００ｍＬ）で１回洗浄した。この洗浄液と濾液とを混合し、ロータリーエバポレーターで減圧乾固した。その残渣に冷水（２００ｍＬ）を加え、不溶物を濾過した。得られた濾液に粒状水酸化ナトリウムを、油相が分離してくるまで加えた。この溶液をジエチルエーテル（７０ｍＬ）で４回抽出し、エーテル相を無水硫酸マグネシウムで乾燥した。この溶液を濾過し、ロータリーエバポレーターで減圧濃縮して、油状の化合物５を得た。収率９６％であった。
【００３３】
＜化合物６の合成＞
化合物５（０．１０ｍｏｌ）と３−ブロモプロピオン酸（０．０３３ｍｏｌ）とをメタノール（８０ｍＬ）に溶解させた。この溶液を加熱して５時間還流した。その後、反応液を濃縮し、その残渣に１０％炭酸ナトリウム水溶液を加えて溶解させた。この溶液をジエチルエーテルで抽出して未反応の化合物３を除去した。水相に塩酸を加えてｐＨを１〜２とし、ジエチルエーテルで抽出して未反応の３−ブロモプロピオン酸を除去した。次いで、この水相に炭酸水素ナトリウムを加えてｐＨ３〜４に調整し、ジエチルエーテルで目的物を抽出した。そのエーテル相を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濃縮して、無色油状の化合物６を得た。収率３９％であった。
１Ｈ-ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，δ／ｐｐｍ  ｖｓ．ＴＭＳ）：７．３（ｓ，５Ｈ），４．８（ｓ，２Ｈ），３．３（ｔ，２Ｈ），２．６（ｔ，２Ｈ）．
【００３４】
＜化合物７の合成＞
化合物６（１０．７ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（１６．０ｍｍｏｌ）を酢酸エチル（１００ｍＬ）に溶解し、この溶液に氷浴中で塩化アセチル（１６．０ｍｍｏｌ）を含む酢酸エチル溶液（３０ｍＬ）を撹拌しながら滴下した。生成したトリエチルアミン塩酸塩を濾去し、濾液を１０％クエン酸水溶液（４０ｍＬ）で２回、水（４０ｍＬ）で１回、飽和食塩水（４０ｍＬ）で１回洗浄した。得られた溶液を無水硫酸マグネシウムで乾燥後、ロータリーエバポレーターで減圧乾固させることで無色油状の化合物７を得た。収率５９％であった。
１Ｈ-ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，δ／ｐｐｍ  ｖｓ．ＴＭＳ）：７．４（ｓ，５Ｈ），４．８（ｓ，２Ｈ），３．９（ｔ，２Ｈ），２．６（ｔ，２Ｈ），２．１（ｓ，３Ｈ）．
【００３５】
＜化合物８の合成＞
酢酸クロリドの代わりに塩化プロパノイルを用いることで、化合物７と同様の方法で化合物８を得た。収率７５％であった。
１Ｈ-ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，δ／ｐｐｍ  ｖｓ．ＴＭＳ）：７．４（ｓ，５Ｈ），４．８（ｓ，２Ｈ），４．０（ｔ，２Ｈ），２．６（ｔ，２Ｈ），２．４（ｑ、２Ｈ），１．１（ｔ，３Ｈ）．
【００３６】
＜化合物９の合成＞
酢酸クロリドの代わりに塩化ベンゾイルを用いることで、化合物７と同様の方法で化合物９を得た。収率６７％であった。
１Ｈ-ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，δ／ｐｐｍ  ｖｓ．ＴＭＳ）：６．８‐７．６（ｍ，１０Ｈ），４．６（ｓ，２Ｈ），４．０（ｔ，２Ｈ），２．７（ｔ，２Ｈ）．
【００３７】
＜人工シデロフォア１の合成＞
化合物２（２．５３ｍｍｏｌ）と化合物７（８．４３ｍｍｏｌ）をメタノール（２０ｍＬ）に溶解し、この溶液に１‐エチル‐３‐（３‐ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ８．４３ｍｍｏｌ）を含むメタノール溶液（２０ｍＬ）を加えた。数時間、室温で撹拌後、反応溶液をロータリーエバポレーターで減圧乾固させた。得られた残渣を酢酸エチル（１００ｍＬ）に溶解し、１０％クエン酸水溶液と飽和食塩水で洗浄した。ロータリーエバポレーターで減圧乾固することで、薄黄色オイル状の化合物を得た。これをメタノール（３０ｍＬ）に溶解し、触媒量の１０％Ｐｄ‐Ｃを加え、３気圧の水素雰囲気下で数日間、室温で撹拌した。セライトによりＰｄ‐Ｃを除去後、ロータリーエバポレーターにより減圧乾固することで、薄赤色油状のヒドロキサム酸部位を含む人工シデロフォア１を得た。収率６６％であった。
１Ｈ‐ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ，δ／ｐｐｍ  ｖｓ．ＤＳＳ）：３．９（ｔ，６Ｈ），３．２（ｔ，６Ｈ），２．５（ｔ，６Ｈ），２．２（ｓ，９Ｈ），１．６（ｍ，６Ｈ），１．５（ｔ，６Ｈ）．
【００３８】
＜人工シデロフォア２の合成＞
化合物７の代わりに化合物８を用いることで、人工シデロフォア１と同様の方法でヒドロキサム酸部位を含む人工シデロフォア２を得た。収率４７％であった。
１Ｈ-ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ，δ／ｐｐｍ  ｖｓ．ＤＳＳ）：３．９（ｔ，６Ｈ），３．１（ｂｒ，６Ｈ），２．５（ｍ，６Ｈ），２．４（ｑｕａｒｔｅｔ，６Ｈ），１．６（ｂｒ，６Ｈ），１．５（ｂｒ，６Ｈ），１．１（ｔ，９Ｈ）．
【００３９】
＜人工シデロフォア３の合成＞
化合物７の代わりに化合物９を用いることで、人工シデロフォア１と同様の方法でヒドロキサム酸部位を含む人工シデロフォア３を得た。収率３２％であった。
１Ｈ-ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ，δ／ｐｐｍ  ｖｓ．ＤＳＳ）：７．５（ｂｒ，１５Ｈ），４．０（ｔ，６Ｈ），３．１（ｂｒ，６Ｈ），２．５（ｂｒ，６Ｈ），１．４（ｂｒ，６Ｈ），１．４（ｂｒ，６Ｈ）．
【００４０】
（実施例２）
実施例２は、第１実施形態に対応する実施例である。次の反応スキームに示すように、カテコール部位を持つ配位子Ｌの前駆体として、化合物１０、化合物１１、および化合物１２を合成し、化合物１２から、カテコール型の人工シデロフォア４を合成した。
【化２９】
2014130014.tif 000032
【００４１】
＜化合物１０＞の合成
化合物２（２．１５ｍｍｏｌ）、２，３‐ジメトキシ安息香酸（１６．１ｍｍｏｌ）、および１‐ヒドロキシベンズトリアゾール（１６．１ｍｍｏｌ）をメタノール（１５ｍＬ）に溶解し、この溶液にＥＤＣ（１６．１ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（１６．１ｍｍｏｌ）を含むメタノール溶液を加え、一晩撹拌した。反応溶液をロータリーエバポレーターで減圧乾固し、クロロホルムに溶解させ、１０％クエ酸水溶液、および飽和食塩水で洗浄した。溶液を無水硫酸マグネシウムで乾燥後、ロータリーエバポレーターで減圧乾固し、残渣を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ、カラム：日本分析化学工業製ＪＡＩＧＥＬ‐１Ｈ、溶離液：クロロホルム、検出波長：２５４ｎｍ）で精製した。目的物を含むフラクションを集め、濃縮乾固することで無色油状の化合物１０を得た。収率８２％であった。
１Ｈ-ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，δ／ｐｐｍ  ｖｓ．ＴＭＳ）：８．０６（ｔ，３Ｈ），７．６４（ｄｄ，３Ｈ），７．１２（ｔ，３Ｈ），７．０２（ｄｄ，３Ｈ），３．８８（ｓ，１８Ｈ），３．４６（ｑｕａｒｔｅｔ，６Ｈ），２．０３（ｔ，６Ｈ），１．５４（ｑｕｉｎｔｅｔ，６Ｈ）．
ＦＴ-ＩＲ（ＫＢｒ法，ｃｍ-１）：３３７６（アミドνＮ‐Ｈ），３０７８（芳香環νＣ‐Ｈ），３０００，２９３８，２８８８，２８７３（メチルおよびメチレンνＣ‐Ｈ），１６５２（アミドνＣ＝Ｏ），１５３３（アミドνＣ-Ｎおよびδ，ニトロνＮ-Ｏ），１２６４（メトキシνＣ‐Ｏ），１１６９（メチレンδＣ‐Ｃ‐Ｃ骨格），１０７６（メトキシνＣ‐Ｏ），７５４（芳香環δ）．
ＥＳＩ  ＴＯＦ‐ＭＳ：ｍ／ｚ＝７２５．３［Ｍ＋Ｈ＋］＋，７４７．２［Ｍ＋Ｎａ＋］＋，７５９．４［Ｍ＋Ｃｌ−］−．
【００４２】
＜化合物１１＞の合成
化合物１０（１．３１ｍｍｏｌ）をメタノールに溶解し、触媒量の１０％Ｐｄ‐Ｃを加え、３気圧の水素雰囲気下で数日間攪拌した。セライト濾過によるＰｄ‐Ｃの除去後、反応溶液はエバポレーターにより減圧乾固させた。残渣をクロロホルムに溶解し、１０％クエン酸水溶液および水で抽出した。全ての水相を集め、水酸化ナトリウムによりｐＨを１１に調整した。得られた溶液をクロロホルムで抽出後、無水硫酸マグネシウムで乾燥させた。ロータリーエバポレーターで減圧乾固させることで、薄黄色油状の化合物１１を得た。収率５３％でった。
１Ｈ-ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，δ／ｐｐｍ  ｖｓ．ＴＭＳ）：８．０５（ｔ，３Ｈ），７．６７（ｄｄ，３Ｈ），７．１３（ｔ，３Ｈ），７．０２（ｄｄ，３Ｈ），３．８８（ｓ，１８Ｈ），３．４５（ｑｕａｒｔｅｔ，６Ｈ），１．６０（ｑｕｉｎｔｅｔ，６Ｈ），１．４３（ｔ，６Ｈ）．
ＦＴ-ＩＲ（ＫＢｒ法，ｃｍ-１）：３３７７（アミドおよびアミノνＮ‐Ｈ），３０７９（芳香環νＣ‐Ｈ），２９３７，２８６７，２８３８（メチルおよびメチレンνＣ‐Ｈ），１６５３（アミドνＣ＝Ｏ），１５３４（アミドνＣ‐Ｎおよびδ），１２６５（メトキシνＣ‐Ｏ），１１７０（メチレンδＣ‐Ｃ‐Ｃ骨格），１０７５（メトキシνＣ‐Ｏ），７５４（芳香環δ）．
ＥＳＩ  ＴＯＦ‐ＭＳ：ｍ／ｚ＝６９５．３［Ｍ＋Ｈ＋］＋，７１７．３［Ｍ＋Ｎａ＋］＋，６９３．５［Ｍ‐Ｈ＋］−，７２９．４［Ｍ＋Ｃｌ−］−．
【００４３】
＜化合物１２の合成＞
水酸化ナトリウム（２．５０ｍｍｏｌ）をミリＱ水（１０ｍＬ）に溶解し、化合物１１（０．９８ｍｍｏｌ）と二炭酸ジ-tert-ブチル（（Ｂｏｃ）２Ｏ，２．２０ｍｍｏｌ）を含む酢酸エチル（溶液１５ｍＬ）を滴下しながら、激しく撹拌した。反応後、有機相を１Ｍ塩酸、５％湾酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水の順で洗浄した。有機相を無水硫酸マグネシウムで乾燥後、ロータリーエバポレーターで減圧乾固させた。残渣をクロロホルムに溶解し、ＨＰＬＣ（カラム：日本分析化学工業製ＪＡＩＧＥＬ‐１Ｈ、溶離液：クロロホルム、検出波長：２５４ｎｍ）で精製後、ロータリーエバポレーターにより減圧乾固させることで、無色油状の化合物１２を得た。収率８１％であった。
１Ｈ-ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，δ／ｐｐｍ  ｖｓ．ＴＭＳ）：８．０２（ｔ，３Ｈ），７．６５（ｄｄ，３Ｈ），７．１２（ｔ，３Ｈ），７．０１（ｄｄ，３Ｈ），３．８９（ｓ，９Ｈ），３．８８（ｓ，９Ｈ），３．４４（ｑｕａｒｔｅｔ，６Ｈ），１．５８（ｔ，６Ｈ），１．３７（ｓ，６Ｈ）．
ＦＴ-ＩＲ（ＫＢｒ法，ｃｍ-１）：３３７６（アミドνＮ‐Ｈ），３０７７（芳香環νＣ‐Ｈ），２９３９，２８６９，２８３８（メチルおよびメチレンνＣ‐Ｈ），１７１３，１６５３（アミドνＣ＝Ｏ），１５３２（アミドνＣ‐Ｎおよびδ），１２６５（メトキシνＣ‐Ｏ），１１７０メチレンδＣ‐Ｃ‐Ｃ骨格），１０８７（メトキシνＣ‐Ｏ），７５５（芳香環δ）．
ＥＳＩ  ＴＯＦ‐ＭＳ：ｍ／ｚ＝７９５．２［Ｍ＋Ｈ＋］＋，８１７．２［Ｍ＋Ｎａ＋］＋．
【００４４】
＜人工シデロフォア４の合成＞
非特許文献１５および１６の合成法を参考に、以下の様に合成を行った。化合物１２（０．７９ｍｍｏｌ）を脱水ジクロロメタン（２５ｍＬ）に溶解し、アルゴン雰囲気下中、−７０℃で１Ｍの三臭化ホウ素を含むジクロロメタン溶液（１３ｍＬ）を滴下した。一晩撹拌後、反応溶液にメタノール（１０ｍＬ）を加え、更に１時間撹拌した。反応溶液をロータリーエバポレーターにより減圧乾固し、残渣にメタノールを加え、再び減圧乾固させるという操作を数回繰り返した。その後、残渣をクロロホルム／メタノール（１／１）に溶解し、ゲル濾過カラムクロマトグラフィー（充填剤：Ｓｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ‐２０、展開溶媒：クロロホルム・メタノール（１／１））により精製した。溶離液をロータリーエバポレーターにより減圧乾固させることで、白色粉末のカテコール型人工シデロフォア４を得た。収率８０％であった。
１Ｈ-ＮＭＲ（図２，３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ‐ｄ６，δ／ｐｐｍ  ｖｓ．ＴＭＳ）：８．８６（ｔ，３Ｈ），７．３０（ｄｄ，３Ｈ），６．９２（ｄｄ，３Ｈ），６．６８（ｔ，３Ｈ），３．３０（ｑｕｉｎｔｅｔ，６Ｈ），１．５７（ｂｒ，１２Ｈ）．
ＦＴ-ＩＲ（ＫＢｒ法，ｃｍ-１）：３３０５（アミドおよびアミンνＮ‐Ｈ，水酸基νＯ‐Ｈ），２９５２，２８７９（メチレンνＣ‐Ｈ），１６４０（アミドνＣ＝Ｏ），１５４５（アミドνＣ‐Ｎおよびδ），１３３１（水酸基δＯ‐Ｈ），１２６１（水酸基νＣ‐Ｏ），１１５７（メチレンδＣ‐Ｃ‐Ｃ骨格），１０８７（メトキシνＣ‐Ｏ），７５５（芳香環δ）．
ＥＳＩ  ＴＯＦ‐ＭＳ：ｍ／ｚ＝６１１．１［Ｍ＋Ｈ＋］＋．
【００４５】
（実施例３）
実施例３は、第１実施形態に対応する実施例である。次の反応スキームに示すように、人工シデロフォア１、人工シデロフォア２、および人工シデロフォア３と、３価の鉄イオン塩原料であるトリス（２，４‐ペンタンジオナト）鉄（３価）錯体から人工シデロフォア錯体１、人工シデロフォア錯体２、および人工シデロフォア錯体３を合成した。
【化３０】
2014130014.tif 000033
【００４６】
＜人工シデロフォア錯体１の合成＞
人工シデロフォア１（０．１０ｍｍｏｌ）を水（２０ｍＬ）に溶解し、トリス（２，４-ペンタンジオナト）鉄（３価）錯体（［Ｆｅ（ａｃａｃ）３］，０．１０ｍｍｏｌ）を含む酢酸エチル溶液（２０ｍＬ）を加え、室温で３時間、激しく撹拌した。水相をロータリーエバポレーターにより減圧乾固させることで、定量的に赤色油状の人工シデロフォア錯体１を得た。収率９８％であった。
ＥＳＩ  ＴＯＦ-ＭＳ：ｍ／ｚ＝６４３．４［Ｍ＋Ｈ＋］＋．
ＵＶ／ｖｉｓ（０．１Ｍ過塩素酸ナトリウム，０．０１Ｍ酢酸／酢酸ナトリウムバッファー，ｐＨ＝７）：
λｍａｘ＝４２４ｎｍ（ε＝２２００ｃｍ−１Ｍ−１）
【００４７】
＜人工シデロフォア錯体２の合成＞
人工シデロフォア１の代わりに人工シデロフォア２を用いることで、人工シデロフォア錯体１と同様の方法で人工シデロフォア錯体２を得た。収率８８％であった。
ＥＳＩ  ＴＯＦ-ＭＳ：ｍ／ｚ＝６８５．４［Ｍ＋Ｈ＋］＋．
ＵＶ／ｖｉｓ（０．１Ｍ過塩素酸ナトリウム，０．０１Ｍ酢酸／酢酸ナトリウムバッファー，ｐＨ＝７）：
λｍａｘ＝４２２ｎｍ（ε＝２４００ｃｍ−１Ｍ−１）
【００４８】
＜人工シデロフォア錯体３の合成＞
人工シデロフォア１の代わりに人工シデロフォア３を用いることで、人工シデロフォア錯体１と同様の方法で人工シデロフォア錯体３を得た。収率８１％であった。
ＥＳＩ  ＴＯＦ-ＭＳ：ｍ／ｚ＝６８５．４［Ｍ＋Ｈ＋］＋．
ＵＶ／ｖｉｓ（０．１Ｍ過塩素酸ナトリウム，０．０１Ｍ酢酸／酢酸ナトリウムバッファー，ｐＨ＝７）：λｍａｘ＝４３２ｎｍ（ε＝２５００ｃｍ−１Ｍ−１）
【００４９】
（実施例４）
実施例４は、第１実施形態に対応する実施例である。次の反応スキームに示すように、人工シデロフォア４と、３価の鉄イオン塩原料であるトリス（２，４-ペンタンジオナト）鉄（３価）錯体から人工シデロフォア錯体４を合成した。
【化３１】
2014130014.tif 000034
【００５０】
＜人工シデロフォア錯体４の合成＞
非特許文献１７を参考に、以下の様に合成を行った。人工シデロフォア４（０．１７５ｍｍｏｌ）をアルゴンガスのバブリングにより脱気したメタノール（１７ｍｌ）に溶解し、［Ｆｅ（ａｃａｃ）３］（０．１７５ｍｍｏｌ）を加えた。続いて、０．１Ｍの水酸化カリウムを含むメタノール溶液（４．７３ｍｌ）を加え、６時間攪拌した。反応溶液をロータリーエバポレーターにより全量が３ｍＬとなるまで減圧乾固し、アセトン（３０ｍｌ）を加えることで沈殿が生成した。この沈殿を濾取することで、赤紫色粉末の人工シデロフォア４を得た。収率８３％であった。
ＦＴ-ＩＲ（ＫＢｒ法，ｃｍ−１）：３３９９（アミドおよびアミンνＮ‐Ｈ），２９４１，２８７４（メチレンνＣ‐Ｈ），１６０８（アミドνＣ＝Ｏ），１５４４１５４５（アミドνＣ‐Ｎおよびδ），１１５７（メチレンδＣ‐Ｃ‐Ｃ骨格），７４９（芳香環δ）．
ＥＳＩ  ＴＯＦ-ＭＳ：ｍ／ｚ＝６６２．５［Ｍ＋２Ｈ＋］−，３３０．８［Ｍ＋Ｈ＋］２−
ＵＶ／ｖｉｓ（０．１Ｍ過塩素酸ナトリウム，０．０１Ｍ酢酸／酢酸ナトリウムバッファー，ｐＨ＝７，図３）：λｍａｘ＝５００ｎｍ（ε＝４６７０ｃｍ−１Ｍ−１）
【００５１】
（実施例５）
実施例５は、第２実施形態に対応する実施例である。次の反応スキームに示す様に、金がコートされた市販のオリンパス製カンチレバー（ＯＭＣＬ‐ＴＲ４００ＰＢ‐１）上に、長さの異なる２種類のリンカー分子を修飾することで、修飾プローブ１，及び２を得た。修飾プローブ１および２に人工シデロフォア錯体４を反応させることで、人工シデロフォア錯体が修飾された修飾プローブ３および４を得た。
【化３２】
2014130014.tif 000035
【００５２】
＜修飾プローブ１の合成＞
表面が金でコートされたオリンパス社のＳｉ３Ｎ４プローブ（ＯＭＣＬ‐ＴＲ４００ＰＢ‐１）を２ｍＭの３，３’‐ジチオビス（プロピオン酸スクシンイミジル）（ＤＴＳＰ）を含むＤＭＳＯ溶液に５分間浸漬させた。その後、ＤＭＳＯ、アセトンの順で洗浄し、真空ラインを用いて乾燥させることで修飾プローブ１を得た。
【００５３】
＜修飾プローブ２の合成＞
ＤＴＳＰの代わりに１１，１１’-ジチオビス（ウンデカン酸スクシンイミジル）（ＤＴＳＵ）を用いることで、修飾プローブ１と同様の方法で修飾プローブ２を得た。
【００５４】
＜修飾プローブ３の合成＞
修飾プローブ１を２ｍＭの人工シデロフォア錯体４を含む水溶液に２４時間浸漬させた。その後、ミリＱ水で洗浄し、真空ラインで乾燥させることで修飾プローブ３を得た。
【００５５】
＜修飾プローブ４の合成＞
修飾プローブ２を２ｍＭの人工シデロフォア錯体４を含む水溶液に２４時間浸漬させた。その後、ミリＱ水で洗浄し、真空ラインで乾燥させることで修飾プローブ４を得た。
【００５６】
（実施例６）
実施例６は、第２実施形態に対応する実施例である。次の反応スキームに示す様に、市販のオリンパス製カンチレバー（ＯＭＣＬ‐ＡＣ１６０ＦＳ）上に金をドープしたものに、リンカー分子としてＤＴＳＵを修飾することで、修飾プローブ５を得た。修飾プローブ５に人工シデロフォア錯体４を反応させることで、人工シデロフォア錯体が修飾された修飾プローブ６を得た。
【化３３】
2014130014.tif 000036
【００５７】
＜修飾プローブ５の合成＞
表面上に金をドープしたオリンパス社のカーボンナノファイバー（ＣＮＦ）製プローブ（ＯＭＣＬ‐ＡＣ１６０ＦＳ）を２ｍＭのＤＴＳＵを含むＤＭＳＯ溶液に５分間浸漬させた。その後、ＤＭＳＯ、アセトンの順で洗浄し、真空ラインを用いて乾燥させることで修飾プローブ５を得た。
【００５８】
＜修飾プローブ６の合成＞
修飾プローブ５を２ｍＭの人工シデロフォア錯体４を含む水溶液に２４時間浸漬させた。その後、ミリＱ水で洗浄し、真空ラインで乾燥させることで修飾プローブ６を得た。
【００５９】
（実施例７）
実施例７は、第２実施形態に対応する実施例である。次の反応スキームに示す様に、修飾プローブ１に人工シデロフォア４を反応させることで、人工シデロフォアが修飾された修飾プローブ７を得た。
【化３４】
2014130014.tif 000037
【００６０】
＜修飾プローブ７の合成＞
修飾プローブ１を２ｍＭの人工シデロフォア錯体４を含む水溶液に２４時間浸漬させた。その後、ミリＱ水で洗浄し、真空ラインで乾燥させることで修飾プローブ７を得た
【００６１】
（実施例８）
実施例８は、第２実施形態に対応する実施例である。カテコール部位がチタニア（ＴｉＯ２）表面と非常に強く相互作用することを利用して、本方法で作成された修飾プローブ上に目的分子が修飾されていることを確かめた。フォースカーブ測定には、島津製作所製走査型プローブ顕微鏡ＳＰＭ‐９６００を用いた。チタニア基板は色素増感太陽電池の電極として別途作製したものを用いた。以下に、その作製法を示した。酸化チタンペーストＰＳＴ‐１８ＮＲ（日揮触媒化成株式会社）をメタノール、アセトン、アセトニトリル（ＨＰＬＣグレード）で超音波洗浄したＦＴＯガラス（２０×２０ｍｍ）にスキージ法を用いて薄膜（５．０×５．０ｍｍ）とした。次に、この薄膜を３０分間乾燥後、更にスキージ法によりＰＳＴ‐４００Ｃ（日揮触媒化成株式会社）を上塗りした。得られた薄膜を有するガラス電極を５２０℃で１時間焼成することでチタニア基板を得た。
【００６２】
図４に通常のカンチレバー（プローブ）、および人工シデロフォア４が修飾されたプローブ７を用いた場合の、チタニア表面に対するフォースカーブ測定の結果を示した。何も修飾されていない通常のプローブを用いた場合（図４ａ）は、プローブを接近させる（アプローチ）際と、遠ざける（リリース）際のカンチレバーのたわみは、ほぼ同程度であった。一方、修飾プローブ７（図４ｂ）では、アプローチに比べて、リリースの際に大きく負側へのカンチレバーのたわみが観測された。これはプローブ上に修飾された人工シデロフォア４のカテコール部位が、チタニア表面に強く吸着していることを示している。
【００６３】
（実施例９）
実施例９は、第３実施形態に対応する実施例である。通常のカンチレバー、および人工シデロフォア錯体４が修飾されたプローブ２（リンカーのメチレン鎖の長さ：ｎ＝１）を用い、原子間力顕微鏡によって大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ，Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞を観察した。測定には、ＮＵＴＲＩＥＮＴ  ＢＲＯＴＨ培養液で培養したＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ-１２  ＲＷ１９３（ＡＴＣＣ  ＮＯ．２５０９１）を用いた。測定用サンプルは、培養したＥ．ｃｏｌｉの液体培地をピペットにより、直径１．５ｃｍのマイクロカバーガラスに滴下し、乾燥させたものを使用した。なお、サンプル調整はクリーンベンチ内で行った。使用したガラス基板、および器具類はすべてオートクレーブにより滅菌処理（１２１℃，１５ｍｉｎ）した上で使用した。
【００６４】
原子間力顕微鏡として、島津製作所製走査型プローブ顕微鏡ＳＰＭ-９６００を使用した。測定はコンタクトモードで行い、走査速度を１Ｈｚ、走査範囲を１．０´１．０μｍから３０´３０μｍとして測定した。サンプルは水平になるように、両面テープを用いて付属の試料台に固定した。通常のカンチレバーを用いた場合（図５ａ）では、各大腸菌細胞は基一つの固まりとして観測されている。一方、人工シデロフォア錯体４を修飾したカンチレバーを用いた場合（図５ｂ）では、カンチレバー上の人工シデロフォア錯体と、細胞表面のレセプタータンパク質の相互作用による、細胞上の細かな凹凸が観測された。
【００６５】
（実施例１０）
実施例１０は、第３実施形態に対応する実施例である。通常のカンチレバー、および人工シデロフォア錯体４が修飾されたプローブ４（リンカーのメチレン鎖の長さ：ｎ＝９）を用い、原子間力顕微鏡によって大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ，Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞を観察した。測定には、ＮＵＴＲＩＥＮＴ  ＢＲＯＴＨ培養液で培養したＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ-１２  ＲＷ１９３（ＡＴＣＣ  ＮＯ．３３４７５）を用いた。測定用サンプルは、培養したＥ．ｃｏｌｉの液体培地をピペットにより、直径１．５ｃｍのマイクロカバーガラスに滴下し、乾燥させたものを使用した。なお、サンプル調整はクリーンベンチ内で行った。使用したガラス基板、および器具類はすべてオートクレーブにより滅菌処理（１２１℃，１５ｍｉｎ）した上で使用した。
【００６６】
原子間力顕微鏡として、島津製作所製走査型プローブ顕微鏡ＳＰＭ-９６００を使用した。測定はコンタクトモードで行い、走査速度を１Ｈｚ、走査範囲を１．０´１．０μｍから３０´３０μｍとして測定した。サンプルは水平になるように、両面テープを用いて付属の試料台に固定した。実施例９と同様に、カンチレバー上の人工シデロフォア錯体と、細胞表面のレセプタータンパク質の相互作用による、細胞上の細かな凹凸が観測された（図６）。
【００６７】
（実施例１１）
実施例１１は、第３実施形態に対応する実施例である。通常のＣＮＦ製カンチレバー、および人工シデロフォア錯体４が修飾されたＣＮＦカンチレバー（プローブ６）（リンカーのメチレン鎖の長さ：ｎ＝９）を用い、原子間力顕微鏡によって大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ，Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞を観察した。測定には、ＮＵＴＲＩＥＮＴ  ＢＲＯＴＨ培養液で培養したＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ-１２  ＲＷ１９３（ＡＴＣＣ  ＮＯ．３３４７５）を用いた。測定用サンプルは、培養したＥ．ｃｏｌｉの液体培地をピペットにより、直径１．５ｃｍのマイクロカバーガラスに滴下し、乾燥させたものを使用した。なお、サンプル調整はクリーンベンチ内で行った。使用したガラス基板、および器具類はすべてオートクレーブにより滅菌処理（１２１℃，１５ｍｉｎ）した上で使用した。
【００６８】
原子間力顕微鏡として、島津製作所製走査型プローブ顕微鏡ＳＰＭ-９６００を使用した。測定はコンタクトモードで行い、走査速度を１Ｈｚ、走査範囲を１．０´１．０μｍから３０´３０μｍとして測定した。サンプルは水平になるように、両面テープを用いて付属の試料台に固定した。通常のＣＮＦ製カンチレバーを用いた場合の測定結果を図７ａ、一方、ＣＮＦ製カンチレバーに人工シデロフォア錯体４を修飾したプローブ６を用いた場合の測定結果を図７ｂに示した。（実施例９）と同様に、カンチレバー上の人工シデロフォア錯体と、細胞表面のレセプタータンパク質の相互作用による、細胞上の細かな凹凸が観測された。
【産業上の利用可能性】
【００６９】
本発明は走査型プローブ顕微鏡用探針に利用できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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