(57)【要約】【課題】  大豆細胞内不溶性タンパク組織の中核をなす大豆ボディ構造体を可溶化ないし分解する方法を提供する。【解決手段】  大豆ボディ構造体を唯一の炭素源とする培養液で培養して得られる中性から酸性領域で大豆ボディ構造体を可溶化ないし分解する細菌、又は当該細菌を、大豆ボディ構造体を唯一の炭素源とする培養液で培養して得られるプロテアーゼと、大豆ボディ構造体を接触させる。大豆ボディ構造体を可溶化ないし分解するプロテアーゼは、例えば、Bacillus amyloliquefaciensや受託番号P-1390又は受託番号P-1391で寄託された細菌により生産される。【選択図】図６
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
豆類細胞内不溶性タンパク組織を、中性域から酸性域で大豆ボディ構造体可溶化ないし分解活性を有するバチラス属細菌と直接又は間接に接触させることを特徴とする豆類細胞内不溶性タンパク組織の処理方法。
【請求項２】
前記大豆ボディ構造体可溶化ないし分解活性を有するバチラス属細菌は、16SrRNAに配列番号１に記載の塩基配列を有するバチラス属細菌、16SrRNAに配列番号２に記載の塩基配列を有するバチラス属細菌、Bacillus amyloliquefaciensの何れか１種若しくは２種以上の細菌である請求項１に記載の豆類細胞内不溶性タンパク組織の処理方法。
【請求項３】
豆類を加熱加圧処理した後に、前記バチラス属細菌と直接又は間接に接触させることを特徴とする請求項１又は２に記載の豆類細胞内不溶性タンパク組織の処理方法。
【請求項４】
豆類を加熱加圧処理した後に、セルラーゼ処理し、さらにペクチナーゼ処理した後に、前記バチラス属細菌と直接又は間接に接触させることを特徴とする請求項１又は２に記載の豆類細胞内不溶性タンパク組織の処理方法。
【請求項５】
前記バチラス属細菌の培養液中で接触させることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の豆類細胞内不溶性タンパク組織の処理方法。
【請求項６】
前記バチラス属細菌の培養液から得られた大豆ボディ構造体可溶化ないし分解活性を有する分画成分と接触させることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の豆類細胞内不溶性タンパク組織の処理方法。
【請求項７】
前記16SrRNAに配列番号１に記載の塩基配列を有するバチラス属細菌はバチラス属細菌Bacillus sp(NITE P-1390)であり、前記16SrRNAに配列番号２に記載の塩基配列を有するバチラス属細菌はバチラス属細菌Bacillus sp(NITE P-1391)であることを特徴とする請求項２〜６の何れか１項に記載の豆類細胞内不溶性タンパク組織の処理方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の処理方法により得られる食品素材。
【請求項９】
大豆ボディ構造体を唯一の栄養源とする培養液中で生育可能かつ可溶化ハローを形成するバチラス属細菌。
【請求項１０】
大豆ボディ構造体を唯一の栄養源とする培養液中に、pH 7以下の中性から酸性域で分子量１０kDa〜５０kDaの大豆ボディ構造体可溶化ないし分解活性を有するプロテアーゼを産生する請求項９に記載のバチラス属細菌。
【請求項１１】
16SrRNAに配列番号１又は配列番号２に記載の塩基配列を有する大豆ボディ構造体可溶化ないし分解活性を有するバチラス属細菌。
【請求項１２】
寄託番号NITE P-1390で寄託されたバチラス属細菌。
【請求項１３】
寄託番号NITE P-1391で寄託されたバチラス属細菌。
【請求項１４】
請求項９〜１３の何れか１項に記載のバチラス属細菌又はBacillus amyloliquefaciens標準株により生産される大豆ボディ可溶化ないし分解活性を有するプロテアーゼ。
【請求項１５】
酸性乃至中性域で大豆ボディ構造体を可溶化ないし分解し、次の物理化学的特性を有するプロテアーゼ。
（１）１０〜５０kDaの分子量
（２）大豆ボディ構造体に高い選択性を示し、大豆ボディ構造体の可溶化ないし分解活性の比活性が５mU/mg protein以上
（３）至適pHは約6〜７
【請求項１６】
請求項９〜１３のいずれか１項に記載のバチラス属細菌又はBacillus amyloliquefaciens標準株により生産される請求項１５に記載のプロテアーゼ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、豆類細胞内不溶性タンパク組織の処理方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
大豆はタンパク質や油を多く含む世界的に重要な油糧種子である。大豆油、醤油、豆腐をはじめ広範囲に利用される重要な食品素材であり、日本やアジア圏では古くから味噌や醤油などの発酵食品素材として利用されている。しかしその一方で、大豆加工食品の製造過程において生じるオカラや醤油粕などの副産物は十分に利用されているとは言えない。
【０００３】
オカラや醤油粕に代表される大豆副産物にも、大豆と同様に有用なタンパク質などが豊富に含まれると考えられており、その利用については多くの研究がなされている。これまで、脱脂大豆の酵素分解や酸・アルカリを用いた抽出、加圧や超音波処理による抽出の向上に関する研究は数多くの報告がなされてきた。しかし、タンパク質と糖質が複雑な構造体を形成しているため、部分的な抽出や全ての構成組織の混合物としての抽出がほとんどであり、最も基本的な利用手段の一つである可溶化や大豆細胞を構成する細胞壁といった組織ごとの単離や抽出あるいは可溶化が非常に困難である。そのため、組織構成成分の詳細な分析を行うことができず、食品加工における生産効率の向上や機能性成分の探索といった研究を行うにあたっても、十分な情報を得られていないのが現状である。
【０００４】
そこで、大豆の食品加工における生産効率の向上や、オカラや醤油粕といった副産物の有効利用を目的とし、酵素による大豆やオカラの完全可溶化について検討されている（特許文献１、非特許文献１〜５）。例えば、特許文献１には、オカラをオートクレーブ処理して単細胞化し、セルラーゼ処理、ペクチナーゼ処理と段階的に酵素分解をして、大豆処理物を得る方法が開示されている。この大豆処理物は、タンパク質を豊富に含み、栄養価値が高い。大豆を構成する主な細胞組織は、一次細胞壁、二次細胞壁からなる細胞壁、そしてプロテインボディやオイルボディを包括保持しているボディ構造体から構成されている。一次細胞壁は主にセルロース、二次細胞壁はペクチンとタンパク質とからなる不溶性ペクチンからできている。それゆえ、オカラや醤油粕では、可溶化しにくいものやセルラーゼ抵抗性組織は、難分解性繊維とされてきた。しかしながら、細胞の中にある前記ボディ構造体は難分解性の繊維から構成されたものではなく、膠着性のタンパク質組織であり、強アルカリ下におけるアルカリプロテアーゼ（プロレザーFG-F）でしか可溶化できない（非特許文献５、６）。また、特許文献２には、オカラに水を加えた湿潤状態で、耐熱性の酵素を産生するバチルス・アミロリキファシエンス属の細菌を５０〜８０℃で培養させて処理する方法が開示されている。
【０００５】
しかしながら、強アルカリ下における可溶化は、発酵食品や加工食品の製造上問題となる。例えば醤油製造において、発酵を行う前のもろみのpHは6.0前後、製品である醤油のpHは5.4前後であり、醤油の製造工程において大豆ボディ構造体を分解することができない。また、強アルカリ下で可溶化した後に分解産物を利用する際には、中性に戻す作業を行う必要がある。従って、大豆ボディ構造体をさらに有効利用するためには、中性から酸性域で大豆ボディ構造体を可溶化させる方法が望まれる。
【０００６】
また、特許文献２に開示された方法ではオカラのみでは分解が十分には進行せず、野菜くずなどのいわゆる生ゴミが必要であり、これから得られた分解産物を食品として再利用することができなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００３−１８９８１２号公報
【特許文献２】特開２００３−３０５４４４号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Kasai, N. et al., Extraction of soybean oil from single cells., J. Agric. Food Chem., 2003, 51, p.6217-6222
【非特許文献２】Kasai, N. et al., Enzymatic high digestion of soybean residue (okara)., J. Agric.Food Chem. 2004, 52, p.5709-5716
【非特許文献３】Kasai, N. et al., Isolation and enzymatic digestion of body complex of soybean seed., J Agric Food Chem.2005, 53, p.10026-10033
【非特許文献４】前川  智宏, 大豆二次細胞壁と熱水抽出物に関する研究, 大阪府立大学大学院修士論文, 2005
【非特許文献５】佐竹  良太, 大豆ボディ構造体および子葉二次細胞壁の高度酵素分解とその諸性質に関する研究, 大阪府立大学大学院修士論文, 2006
【非特許文献６】Kasai, N. et al., Isolation and enzymatic digestion of body complex of soybean seed., J Agric Food Chem.2005, 53, p.10026-10033.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は上記背景技術に鑑みてなされたものであり、中性から酸性域で、豆類の細胞内不溶性タンパク組織、特に大豆ボディ構造体を可溶化ないし分解する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明に係る豆類細胞内不溶性タンパク組織の処理方法は、新規なバチルス属細菌を利用して大豆ボディ構造体を可溶化ないし分解する方法である。
【発明の効果】
【００１１】
本発明に係る処理方法によると、中性から酸性域において大豆ボディ構造体が可溶化ないし分解される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図1は大豆ボディ構造体の製造方法を示すフローチャートである。
【図２】図２は大豆ボディ構造体の顕微鏡画像であって、（Ａ）は非染色画像、（Ｂ）はo-Toluidine Blueによる染色画像である。
【図３】図３は大豆ボディ構造体の可溶化ハローを示す画像である。
【図４】図４は大豆ボディ構造体を分解する微生物の培養液の顕微鏡観察による画像である。
【図５】図５はスクリーニングされた微生物の産生する分解酵素のpH特性を示すグラフである。
【図６】図６は26KF株の至適pHと比較対象の至適pHを対比したグラフであって、（Ａ）は遊離アミノ酸量に基づく図、（Ｂ）は相対活性に基づく図である。
【図７】図７は26KF株及び標準株並びに酵素製剤のゲルろ過クロマトグラフィーの比較を示す図である。（Ａ）26KF株について、（Ｂ）は標準株について、（Ｃ）は酵素製剤について示す。
【図８】図８は26KF株及び標準株並びに酵素製剤のゲルろ過クロマトグラフィーの比較を示す図である。（Ａ）26KF株について、（Ｂ）は標準株について、（Ｃ）は酵素製剤について示す。
【図９】図９は26KF株についてのSDS-PAGE画像である。
【図１０】図１０は標準株についてのSDS-PAGE画像である。
【図１１】図１１は酵素製剤についてのSDS-PAGE画像である。
【図１２】図１２はA21株のゲルろ過クロマトグラフィーを示す図である。
【図１３】図１３はA21株についてのSDS-PAGE画像である。レーンＡはゲルろ過クロマトグラフィーに用いたサンプル原液、レーンＢは該サンプル原液を４倍希釈にしたサンプル希釈液、レーン１〜４は各フラクション（Fr33, 41, 49, 57）の溶液について示す。
【図１４】図１４はKF26株の培養液と細胞壁が除去されていない大豆細胞内不溶性タンパク組織を接触させた後の顕微鏡画像であって、（ａ）はKF26の培養液と接触させた画像、（ｂ）はコントロールの画像である。
【図１５】図１５は大豆細胞内不溶性タンパク組織と接触させるための培地の調製法を示す流れ図である。
【図１６】図１６は、大豆エキスを懸濁した培地を用いて細胞壁が除去されていない大豆細胞内不溶性タンパク組織を接触させた後の顕微鏡画像である。
【図１７】図１７は、合成培地を用いて細胞壁が除去されていない大豆細胞内不溶性タンパク組織を接触させた後の顕微鏡画像である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明に係る処理方法は、中性域から酸性域で豆類と、豆類のボディ構造体可溶化活性を有するバチラス属細菌と直接又は間接に接触させることを特徴とする。
【００１４】
本明細書において、豆類細胞内不溶性タンパク組織とは、豆類を構成するボディ構造体を主体とする組織を意味する。豆類は前記のように一次細胞壁、二次細胞壁、そしてプロテインボディやオイルボディを包括保持しているボディ構造体から構成されており、ボディ構造体は豆から一次細胞壁、二次細胞壁が除去されて残った構造物を意味であって、豆類細胞内不溶性タンパク組織は、例えば、このような大豆を構成する細胞組織から、一次細胞壁、二次細胞壁からなる細胞壁が除去されて残ったボディ構造体であり、一次細胞壁、二次細胞壁からなる細胞壁が除去されない大豆を構成する細胞組織であり、また、大豆油、醤油、豆腐など豆類を原料とする各種食品や飼料を製造する際に発生する豆類絞り粕であり、さらには豆類に加熱処理又は加圧加熱処理を施した豆類加熱処理物であり得る。本発明において、豆類は特に限定されるものではなく、大豆であり、小豆であり、エンドウであり、緑豆であり得る。また、豆類絞り粕は、例えば、おからや醤油粕であり、大豆ミールであり得る。おからは大豆から豆乳を搾り取った後の残り粕であり、醤油粕は主原料である大豆等を麹菌などで発酵した後に醤油を搾り取った後の残り粕であり、大豆ミールは大豆から大豆油を搾り取った後の残り粕である。これらの豆類絞り粕は、セルロースから構成される一次細胞壁と、不溶性ペクチンから構成される二次細胞壁と、膠着性のタンパク質組織を有する。
【００１５】
また、本発明における処理方法では、豆類の細胞から、一次細胞壁や二次細胞壁が除去されて残ったボディ構造体が好ましく用いられる。当該ボディ構造体は、例えば、豆そのものや豆類の絞り粕に加圧加熱処理を施した後、セルラーゼ処理し、さらにペクチナーゼ処理して得られる。また、本発明における処理方法では、セルラーゼ処理やペクチナーゼ処理をせずに、豆類の細胞から、一次細胞壁や二次細胞壁が、あるいは両方の細胞壁が除去されておらず、細胞の中に存在するボディ構造体も用いることも可能である。細胞壁をセルラーゼやペクチナーゼなどの酵素により除去処理しなくても、バチラス属細菌や酵素などと接触させるために調製された処理液を細胞壁から浸透させ、細胞内部のボディ構造体に作用させることは可能であるが、この処理を効率的に処理するためには、細胞壁に孔を開けてやれば処理液が内部に入りやすくするのがよい。例えば、大豆を水に浸漬してから、凍結させて氷結により大豆細胞を破壊もしくは孔を開けても良い。あるいは、加圧処理をするときに圧力差をつくって爆砕の処理をしても良い。微生物そのものを用いて処理する場合も、機械的な方法や爆砕のような物理的方法などの適当な処理により、細胞に微生物より大きい孔を開けるか、もしくは上記のように破壊処理された細胞を用いれば、より効果的である。
【００１６】
加圧加熱処理は、豆や豆類絞り粕を構成する細胞を単細胞化する処理であり、例えば、オートクレーブ、エクストルーダー、バイブリアクターなどの加圧加熱装置を用いて行うことができる。その条件は単細胞化できれば特に制限されず、例えば、１kPａ〜３MPaの圧力下、１０５〜３００℃で、５分〜５時間、好ましくは０.１〜０.３MPaの圧力下、１０５〜２００℃、５〜３時間、より好ましくは１０５〜１２１℃、０.１〜０.３MPaの圧力下、５分から１時間の処理条件である。
【００１７】
セルラーゼ処理は、豆や豆類絞り粕の細胞を構成する一次細胞壁を分解ないし除去する処理である。セルラーゼ処理も、一次細胞壁を分解ないし除去できる方法であれば特に制限されず、例えば、セルラーゼやヘミセルラーゼ、グルカナーゼ、グルコシダーゼなどの１種又は２種以上の酵素と接触させる方法が例示される。酵素との接触方法も特に制限されず、例えば、０〜７０℃で、５〜７２時間、好ましくは２０〜５０℃、３〜２４時間、さらに好ましくは３０〜４０℃、５〜１５時間、加圧加熱処理した豆や豆類絞り粕と接触させる。接触に際しては、液体中で酵素と接触させるのが好ましく、また、必要に応じて反応液を攪拌するのが好ましい。
【００１８】
ペクチナーゼ処理は、一次細胞壁が除去された細胞から不溶性ペクチンから構成される二次細胞壁を分解ないし除去する処理である。ペクチナーゼ処理も二次細胞壁を破壊ないし除去できる方法であれば特に制限されず、例えば、前記一次次細胞壁を取り除いた細胞とペクチナーゼを接触させる方法が例示される。酵素との接触方法も特に制限されず、例えば、０〜７０℃で、５〜７２時間、好ましくは２０〜５０℃、３〜２４時間、さらに好ましくは３０〜４０℃、５〜１５時間、前記セルラーゼ処理後の豆類絞り粕処理物などと接触させる。接触に際しては、液体中で酵素と接触させるのが好ましく、また、必要に応じて反応液を攪拌するのが好ましい。
【００１９】
得られた大豆ボディ構造体は、例えば配列番号１又は配列番号２に記載された塩基配列からなるＤＮＡを16SrRNAに有するバチラス属細菌と接触させる。これらのバチラス属細菌は、上記大豆ボディ構造体を唯一の栄養源とする合成培地（培養液）で生育して、中性から酸性域において可溶化ないし分解する。つまり、当該細菌は、至適pHが７以下である大豆ボディ構造体を可溶化ないし分解する酵素を産生する。当該大豆ボディ構造体を可溶化ないし分解する能力を有するバチラス属細菌として、例えば、受託番号P-1390又は受託番号P-1391で独立行政法人  製品評価技術基盤機構、特許微生物寄託センター（〒292-0818、日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8）に、2012年7月19日付けで寄託された細菌が例示される。受託番号P-1390で寄託されたバチラス属細菌は、配列番号１に記載された塩基配列からなるDNAを16SrRNAに有する。また、受託番号P-1391で寄託されたバチラス属細菌は、配列番号２に記載された塩基配列からなるDNAを16SrRNAに有する。16SrRNA遺伝子の塩基配列に基づく分類法は、原核細胞の系統分類法として確立された方法であり、配列番号１又は２に示された塩基配列と既知の当該遺伝子の塩基配列とを比較して、全く同一であれば同一種と判断される。これまで、配列番号１又は配列番号２に示された塩基配列と同一の当該塩基配列を有する細菌は報告されておらず、寄託された２株のバチラス属細菌は新種である。また、Bacillus amyloliquefaciens（バチルス・アミロリキファシエンス）標準菌（B. amyloliquefaciens NBRC15535）のように、非特許文献２に記載されたような耐熱性の酵素を産生しないBacillus amyloliquefaciensの細菌も用いられる。当該Bacillus amyloliquefaciensの細菌も、前記大豆ボディ構造体を唯一の炭素源とする培地で増殖し、前記寄託されたバチラス属細菌と同様に、中性領域で大豆ボディ構造体を可溶化ないし分解する酵素を産生するからである（図６、図１０参照）。もっとも、本発明の処理方法においては、大豆ボディ構造体を唯一の栄養源とする培地を用いて３０〜４０℃の条件下２日〜２週間程度の培養でスクリーニングされ、コロニーの周囲に可溶化ハロー（図３に示すような大豆ボディ構造体の可溶化に伴って生じる細菌周囲の透明感のある領域）を生じる細菌であればいずれの細菌を使用することができる。
【００２０】
大豆ボディ構造体と前記バチラス属細菌との接触は、大豆ボディ構造体が可溶化ないし分解される方法であれば、細菌と直接に接触させる方法であるか、または間接に接触させる方法であるかを問わない。本明細書において、直接に接触させるとは、細菌と大豆ボディ構造体が混在した状態で大豆ボディ構造体を可溶化ないし分解させる方法を意味し、例えば、大豆ボディ構造体を唯一の栄養源とする培養液中でバチラス属細菌を増殖させる方法で有り得る。また、間接に接触させるとは、細菌が大豆ボディ構造体から分離した状態で大豆ボディ構造体を可溶化ないし分解させる方法を意味し、例えば、バチラス属細菌の培養により大豆ボディ構造体分解酵素を産生させた培養液から細菌を除去した培養液と大豆ボディ構造体を接触させる方法や当該培養液又は菌体から抽出した大豆ボディ構造体可溶化ないし分解酵素と大豆ボディ構造体を接触させる方法であり得る。
【００２１】
バチラス属細菌を増殖させる培養液（培地）は特に制限されず、バチラス属の細菌を増殖させるために用いられる一般的な培養液（培地）であり得る。また、大豆ボディ構造体を唯一の栄養源とする培養液（培地）でもあり得る。当該大豆ボディ構造体を唯一の栄養源とする培地は、大豆ボディ構造体の他に、その他の成分として細菌の増殖に必要なマグネシウム、鉄、銅、マンガン、リンを含み得る。培地のｐＨも特に制約されないが、４〜１０の範囲内であり、好ましくは５〜７.５の中性から酸性域の範囲内であり、より好ましくは前記細菌が有する大豆ボディ構造体の分解能の至適ｐＨである７付近である。また、係る培地はｐＨ調整用の緩衝剤を含んでもよい。大豆ボディ構造体を効率よく分解する観点からは、大豆ボディ構造体を唯一の栄養源とする培地が好適である。
【００２２】
また、培地中の大豆ボディ構造体の濃度も特に制約されないが、培地中０.０１〜１０％、好ましくは０.０５〜５％、より好ましくは０.１〜２％である。もっとも、大豆ボディ構造体の他に、他の栄養源、例えばグルコースやペプトンを含む培地を使用しても差し支えない。
【００２３】
バチラス属細菌と直接接触させる場合、バチラス属細菌が培養できる条件でバチラス属細菌と大豆ボディ構造体を接触させるのがよく、例えば１０〜４０℃、好ましくは３０〜３７℃で、１２時間〜７２時間接触させる。また、バチラス属細菌と間接に接触させる場合、大豆ボディ構造体分解酵素が有効に機能する条件で接触させるのがよく、例えば、例えば１０〜４０℃、好ましくは３０〜３７℃で、２、３時間〜７２時間接触させる。
【００２４】
もっとも、本発明においては、上記大豆ボディ構造体と接触させる方法のみならず、醤油や豆腐の製造工程において得られた醤油粕やオカラなどの豆類絞り粕、絞り粕や豆の加熱処理物、さらにはこれらのセルラーゼ処理物及び／又はペクチナーゼ処理物と前記バチラス属細菌を接触させて、大豆ボディ構造体を可溶化ないし分解させてもよい。また、醤油や豆腐などの製造工程、あるいは味噌などの大豆発酵食品において前記バチラス属細菌や大豆ボディ構造体分解酵素を存在させてもよい。これにより、製造工程において生成される大豆ボディ構造体が可溶化ないし分解され、栄養価の向上や絞り粕の減量化が図られる。
【００２５】
本発明に係るペプチダーゼは、酸性乃至中性域で大豆ボディ構造体を可溶化ないし分解する酵素である。当該酵素は約１０kDa〜５０kDa（SDS-PAGE法）の分子量、さらに好ましくは１５ないし２０〜３０kDaの分子量を有する。大豆ボディ構造体に対する比活性（pH 7.2）は５munits/mg protein以上、好ましくは１０munits/mg protein以上、さらに好ましくは２０munits/mg proteinであり、大豆ボディ構造体に対して高い選択性を示す。なお、本明細書において、比活性は実施例に記載の方法に求められる値を意味する。また、本明細書において、選択性が高いとは他のプロテアーゼに対する相対的な意味で用いられ、大豆ボディ構造体に対する可溶化ないし分解活性とカゼインに対する分解活性の比が、他のプロテアーゼにおける比の１０倍以上、好ましくは２０倍以上高いことを意味する。また、至適pHは７であり、pH安定性はpH５〜７で少なくとも３０％以上（至適pHに対する割合）、好ましくは５０％の活性を有する。この酵素は、前記寄託された細菌やBacillus amyloliquefaciensの細菌によって取得され得る。
【００２６】
上記の方法により得られた大豆ボディ構造体の可溶化ないし分解産物は、アミノ酸を豊富に含み、食品素材として利用される。特に、pH７以下の酸性ないしpH６程度の中性領域で大豆ボディ構造体が可溶化ないし分解されるので、中和することなくそのまま食品素材として用いることができる。また、豆類細胞内不溶性タンパク組織の中核をなすオカラや醤油粕などの大豆絞り粕が有効利用され、豆腐や醤油などの大豆製品から排出される大豆絞り粕に代表される豆類細胞内不溶性タンパク組織の減量化に貢献する。
【実施例１】
【００２７】
〔大豆ボディ構造体の作製〕
生大豆から図１に示した方法により大豆ボディ構造体（DBCSS）を作製した。50gの製油用米国産生大豆（油脂含量：ソックスレー抽出法により20.68％）に5倍容（w/w）の蒸留水（250 mL）を加え、オートクレーブ処理を121℃、20分間行って単細胞化した。抽出液を除いた後、大豆が被るほどの蒸留水を加え、ミキサーでペースト状にした。これに0.5M酢酸緩衝液（pH 5.0）を20％、セルラーゼ（ダイワ P（5000 U/g））を1％、ペクチナーゼ（ペクチネックス ウルトラ SP-L（26000 Units/ml））を1％加えて37℃で一晩反応させ、一次細胞壁、二次細胞壁を溶解した。遠心分離（2500 rpm,10 min）により上清を除いた後、酵素未分解物（残渣：BCSS）を水洗し凍結乾燥した。凍結乾燥した残渣をヘキサンで脱脂し、大豆ボディ構造体（DBCSS）を得た。収率は約２１％であった。調製したDBCSSをo-Toluidine Blueで染色し、顕微鏡観察を行った。その画像を図２に示す。疎水性のオイルボディとプロテインボディとを包含する複雑で高度な構造が観察された。
【００２８】
〔分解菌のスクリーニング〕
全国各地で市販されている大豆発酵食品をそれぞれマイクロスパテラ一杯分とり、5 mLの蒸留水に懸濁させた。また、この懸濁液を分解菌スクリーニング用のサンプルとした。次に、スクリーニング用のサンプルを表１に示すDBCSSを含む合成培地で分解菌をスクリーニングした。当該合成培地はDBCSSを唯一の栄養源とする培地であり、当該培地で生育する細菌はDBCSSを分解する能力を備える。121℃、20分の条件でオートクレーブした合成培地を滅菌シャーレに流し込み、寒天培地が固まる前に、前記サンプルを1,2滴添加してよく撹拌した。菌体の周りのDBCSSが分解することで観察されるDBCSS可溶化ハローが見られるまで30℃で培養を行った。可溶化ハローがみられた菌体を前記合成培地に再び植菌し、その後、表１の組成から寒天を除いた合成液体培地に植え継ぎ、４日間、30℃、150 rpmで振盪培養した。その培養液を顕微鏡観察して、DBCSS分解率を求めた。顕微鏡の観察視野をランダムに移動させてDBCSSの個数をカウントし、以下の式から分解率を求めた。この時、o-Toluidine Blueにより染色を行った。また、培養液のpHをコンパクトTwin pHメーターにより測定した。
分解率＝（blankのDBCSSの個数−分解されなかったDBCSSの個数）／blankのDBCSSの個数
【００２９】
【表１】
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【００３０】
その結果、15株の微生物が成育し、DBCSS可溶化ハローが観察された。また、培養液のpHが6.8前後の中性であって、これらの微生物は中性領域においてDBCSSを分解することが示唆された。生育した微生物のうち、バクテリアNo.26株（後に「26KF株」と命名）による可溶化ハローを示す画像を図３に、また、分解率の高かったバクテリアNo.8株、同No.16株、カビNo.19株の培養液の顕微鏡観察による画像を図４に示す。
【００３１】
次に生育した15株の微生物及びコンタミネーションにより生育したカビ（カビA）を使用して、5,6,7,8,9の各pHにおいて培養上清とDBCSSを反応させ、DBCSS分解により生じた遊離アミノ酸量から至適pHを求めた。微生物及びかびを前記合成液体培地に植菌し、150 rpm、30℃の条件で4日間振盪培養を行った。その培養液を遠心分離（2500 rpm,10 min）して、上清をフィルター濾過した液を粗酵素液とした。反応条件は、300 μLの粗酵素液にDBCSSを0.1％、0.5Mの酢酸緩衝液（pH 5.0）、リン酸緩衝液（pH 6.0）、Tris-HCl緩衝液（pH 7.0と8.0）、炭酸ナトリウム緩衝液（pH 9.0）をそれぞれ60 μL添加して、37℃で24時間反応させた。この時、プロレザー（アマノエンザイム社）1％溶液でも同様の条件で反応を行った。なお、Blankは培養上清の代わりに蒸留水を使用した。
【００３２】
前記培養液の上清とDBCSSとの反応液を遠心分離（13,000 rpm、5min）して得た上清をそれぞれ適宜希釈し、ニンヒドリン反応により上清中のアミノ基含量を測定した。このときDBCSSを添加していない反応前の培養上清も同様にニンヒドリン反応を行い、反応前の培養液に含まれていたアミノ基含量を測定した。そして反応後のアミノ基含量から反応前のアミノ基含量を引くことで、DBCSS分解により生じた遊離アミノ酸量を算出した。最も遊離アミノ酸量が高かったpHにおける遊離アミノ酸量を100％として相対活性を算出し、DBCSS分解酵素の至適pHを求めた。その結果、図５に示すように、バクテリアNo.16-2株、同No.26株、カビAが酸性から中性領域において高い相対活性を示した。また、その他の微生物は、No.16-1株に代表されるようにアルカリ領域において高い相対活性を示すか、ニンヒドリンによる呈色を示さなかった。
【００３３】
〔対象株の同定〕
酸性から中性領域において高い相対活性を示したバクテリアNo.16-2株、同No.26株、カビAについて同定を行った。No.16-2株、No.26株については、コロニーダイレクトPCRによりバクテリアの16SrDNAをクローニングし、16SrDNAの塩基配列の解析により同定を行った。また、カビAについては、コロニーダイレクトPCRを用いてカビのD1/D2 28S rDNA, 5.8S rDNA, internal transcribed spacer (ITS) をクローニングし、D1/D2 28S rDNA, 5.8S rDNA, ITS領域の塩基配列の解析により同定を行った。それぞれ表３、表４に示したプライマーを用いてDNA断片を増幅し、塩基配列の決定をライフテクノロジーズジャパン社により依頼し、塩基配列の解析は遺伝子解析ソフトウェア GENETYX（SOFTWARE DEVELOPMENT）を用いて行った。遺伝子の相同性についてはNCBI BLASTを用いて検索した。
【００３４】
【表２】
2014060986.tif 000004
【００３５】
【表３】
2014060986.tif 000005
【００３６】
その結果、No.26株とNo.16-2株はBacillus amyloliquefaciensと99%以上（99.7％）の相同性があったが、当該株の16SrDNAと同一の塩基配列（DNA配列）を有する細菌は存在せず、当該株は新種のBacillus sp株であることが分かった。当該菌株（26KF株）は、独立行政法人  製品評価技術基盤機構、特許微生物寄託センター（〒292-0818、千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8）に、2012年7月19日付けで、受託番号P-1390で寄託された。なお、No.16-2株はNo.26株と同じ種であった。一方、カビAはAspergillus unguisと99%の相同性があったが、A. unguisは食品汚染菌であり、発がん性化合物を生産する恐れがあるので食品への適用が困難である。そこで、カビAについてはこれ以上の検討を中止した。
【００３７】
〔酵素特性〕
次に、26KF株が産生するDBSCC分解酵素の特性を調べた。
（至適ｐＨ）
至適ｐＨを公知の酵素等との比較を適宜行いながら調べた。比較対象として、上記プロレザー、アミロリクエファシエンスプロテアーゼ酵素製剤（SIGMA社）及び26KF株と16SrDNAの相同性が最も高かったBacillus amyloliquefaciensの標準株（B. amyloliquefaciens NBRC15535）を使用した。
【００３８】
26KF株と前記Bacillus amyloliquefaciensの標準株を、前記DBCSSを含む合成液体培地（表１より固形培地のための寒天であるAgarのみ除去した培地）に植菌し、150 rpm、30℃の条件で4日間振盪培養を行った。その培養液を遠心分離（2500 rpm,10 min）して、上清を粗酵素液とした。反応条件は、300 μLの粗酵素液にDBCSSを0.1%、0.5MのMcIlvaine緩衝液（pH2.0と3.0）、酢酸緩衝液（pH4.0、5.0）、リン酸緩衝液（pH 6.0）、Tris-HCl緩衝液（pH 7.0と8.0）、炭酸ナトリウム緩衝液（pH 9.0と10.0）をそれぞれ60μL添加して、37℃で24時間反応させた。また、1％のプロレザー溶液と1％のアミロリクエファシエンスプロテアーゼ酵素製剤の溶液でも同様の条件で反応を行った。Blankは培養上清の代わりに蒸留水を使用した。
【００３９】
反応液を遠心分離（13,000 rpm、5min）して得られた上清を適宜希釈し、上記の方法に順じて、DBCSS分解により生じた遊離アミノ酸量から相対活性を算出し、DBCSS分解酵素の至適pHを求めた。その結果を図６に示した。
【００４０】
26KF株はpH 7.0で最も活性が高く、他の3種と比べてpH 6-7の条件でも活性が8割以上保持されていた。これより26KF株の合成培地培養上清には中性プロテアーゼが含まれていると考えられた。また、酵素製剤はDBCSS分解活性が低く、26KF株が生産する酵素は含まれていないと判断された。一方、標準株の至適pHは6.5であり、26KF株の場合とほぼ同様のpH分解活性を示した。
【００４１】
（ゲルろ過クロマトグラフィー）
DBCSSの含有量を0.2％に変更した合成培地（寒天を除く）の5 mLに、26KF株と前記Bacillus amyloliquefaciensの標準株を植菌し、150 rpm、30℃の条件で4日間振盪培養を行った。その培養液を0.2%のDBCSSを含む前記合成培地100 mLに植菌し、37℃で4日間、120 rpmで振盪回転培養した。以上を前培養として、1%のDBCSSを含む合成培地1Lに植菌し、37℃で4日間、120 rpmで振盪回転培養を行った。培養液を遠心分離（10,000 rpm、10 min、4℃）して得られた培養上清を、VIVAFLOW50（有効分画分子量 3,000 Da  ）の限外ろ過膜を使用して、限外ろ過を行った。1000 mLの培養上清を120 mLまで濃縮した溶液をサンプルした。なお、標準株は、300 mLの培養上清を56.6mLまで濃縮した後、26KF株によるサンプルのタンパク濃度と同じタンパク濃度となるように、0.1M Tri-HCL buffer（pH 7.0）で希釈した。また、サンプル調製後の26KF株とほぼ同じタンパク濃度（8％）となるように、10 mMのCH3COOCa中にアミロリクエファシエンスプロテアーゼ酵素製剤を溶解して、サンプルを調製した。
【００４２】
調製した各サンプルの10.0 mLを、Sephacryl S-100 HRを充填したオープンカラム（内径2.5cm×高さ90cm）を通過させ、溶出液をフラクションコレクターで10 mLずつ回収した。溶離液として、10 mM酢酸カルシウム溶液（pH 7.2）を用いた。回収したフラクションのタンパク質量をブラッドフォード法で、カゼイン分解活性をカゼイン・フォーリン法で、DBCSS分解活性を上記方法に準じて求めたアミノ酸含量から求め、1チューブ当たりのカゼイン分解活性及びDBCSS分解活性の活性を算出した。その結果を図７及び図８に示した。また、表５にはカゼイン分解活性に対するDBCSS分解活性の割合を、表６にはカゼイン分解活性及びDBCSS分解活性の各比活性を示した。
【００４３】
【表４】
2014060986.tif 000006
【００４４】
【表５】
2014060986.tif 000007
【００４５】
これらの結果から、26KF株の生産する酵素は酵素製剤と比べてDBCSS分解活性が高く、カゼイン分解活性が低いことが理解される。また、DBCSS分解活性/カゼイン分解活性の値から、26KF株は酵素製剤と比べて113〜265倍DBCSSを選択的に分解するユニークな酵素を生産し、そのカゼイン分解比活性は3〜4倍低く、DBCSS分解活性は30〜80倍高かった。なお、標準株も酵素製剤に対して26KF株と同様な傾向を示したが、標準株の生産する酵素のDBCSS分解比活性は、26KF株の生産する酵素と同等であり、カゼイン分解活性に対するDBCSS分解活性も酵素製剤に比べて21倍ほどDBCSSを選択的に分解する酵素を生産した。
【００４６】
（SDS-PAGE）
上記で得られたフラクションの溶液についてSDS-PAGEを行った。26KF株の合成培地培養液をゲルろ過カラムに供して得られたフラクションFr.38、Fr.42、Fr.47の各フラクション溶液についてそれぞれsartorius stedim社のVIVASPIN 500スピンカラム（有効分画分子量  50 k、30 k、10 k、3 kDa）を使用して5倍濃縮（13,200 rpm、約10分間、4℃）を行なった。また通過液も3 kDa 限外膜のスピンカラムで5倍濃縮を行い，濃縮液（上）と通過液（下）をそれぞれSDS-PAGEに供した。また、標準株の合成培地培養液をゲルろ過カラムに供して得られたFr.32-38の各フラクション溶液について、それぞれ3K Da 限外膜のスピンカラムで5倍濃縮（13,200 rpm、約10分間、4℃）を行なったものをSDS-PAGEに供した。また、8%酵素製剤をゲルろ過カラムに供して得られたFr.31-37の各フラクション溶液をSDS-PAGEに供した。
【００４７】
各サンプルの30 μLに対して、下記に示すサンプル処理液7.5μLを混合し、アルミブロックで5分間加熱、放冷後、その30μLをアプライし、AE-9632M/P電源一体型二連ミニスラブ電気泳動装置pageRun及び5〜20%濃度勾配ゲルを用いて、20mAで75分、SDS電気泳動を行った。タンパク質染色はBio-Safe Coomassie G-250 Stain（Bio-RAD社）を用い、蒸留水にて脱色した。
【００４８】
泳動バッファーには、25 mMのトリスヒドロキシメチルアミノメタン（Tris）と0.1％のドデシル硫酸ナトリウム（SDS）と192 mMのグリシンを含む水溶液を用いた。また、サンプル処理液として、3.75gのSDSと、2.50 mLの2-メルカプトエタノールと、8.38mLの1M Tris-HCl緩衝液（pH 6.8）と6.25 mLのグリセリンと、2.50mgのBPBを25.0 mLの蒸留水に溶解した溶液を用いた。26KF株についての結果を図９に、標準株についての結果を図１０に、酵素製剤についての結果を図１１に示す。
【００４９】
その結果、26KF株の合成培地培養液中には40 kDa付近と20〜30 kDa付近に数本のバンドが見られた。そして３つのフラクションすべて20〜30 kDa付近に数本のバンドと低分子にブロードが見られた。また、そのピークも30 kDa 限外膜を通過し、10 kDa 限外膜を通過しないことがわかった。一方、標準株の合成培地培養液中からは50〜60 kDa付近に主要なバンドが見られ、酵素製剤からは30〜50 kDaに２つの主要なバンドが見られた。これらのことから、26KF株の合成培地培養液から観察された20〜30 kDa付近の数本のバンドが活性バンドであろうと考えられた。
【実施例２】
【００５０】
チーズからDBSCCを分解する細菌をスクリーニングした。実施例１と同様にして得たDBSCCを0.1％と、寒天を1.5％含むリン酸緩衝液（pH7.0）から作製された寒天培地に、市販されている各種のナチュラルチーズの少量を置き、DBSCC可溶化ハローが観察されるまで37℃で培養を行った。可溶化ハローがみられた菌体を0.1％のDBSCCを20 mMリン酸緩衝液（pH 7.0）に溶解した合成培地に再び植菌し、３日間、37℃、150 rpmで振盪培養した。その培養液のpHをコンパクトpHメーター(アズワン社製  ラコムテスターPH計  型番  pHSpear)により測定した。
【００５１】
その結果、可溶化ハローがみられた菌株が９株スクリーニングされ、これらの細菌を植菌した培地のpHは7.5前後であった。
【００５２】
次にこれらの菌株を使用して、 pH 5,7.2,9の各pHにおいて培養上清とDBCSSを反応させ、DBCSS分解により生じた遊離アミノ酸量から至適pHを求めた。菌株を1.0％のDBSCCを20 mMリン酸緩衝液（pH 7.0）に溶解した合成培地に植菌し、150 rpm、37℃の条件で3日間振盪培養を行った。その培養液を遠心分離（2,500 rpm,10 min）して、上清をフィルター濾過した液を粗酵素液とした。反応条件は、300 μLの粗酵素液にDBCSSを0.1％、0.5Mの酢酸緩衝液（pH 5.0）、Tris-HCl緩衝液（pH 7.2）、炭酸ナトリウム緩衝液（pH 9.0）をそれぞれ60 μL添加して、37℃で24〜72時間反応させた。この時、プロレザー（アマノエンザイム社）1%溶液でも同様の条件で反応を行った。なお、Blankは培養上清の代わりに蒸留水を使用した。その後、前記培養液の上清とDBCSSとの反応液を遠心分離（13,200 rpm、5min）して得た上清をそれぞれ適宜希釈し、ニンヒドリン反応により上清中のアミノ基含量を測定し、実施例１と同様にして、相対活性からDBSCC分解酵素の至適pHを求めた。その結果、９株中４株は、pH 7.2で非常に強いDBSCC分解活性を有し、なおかつpH 5.0でも約50％以上の相対活性を示した。また、２４時間毎の相対活性を測定したところ、１株（A21株）のみが常に50％以上の相対活性を示した。
【００５３】
当該菌株を実施例１と同様の方法により同定したところ、Bacillus licheniformis DSM13株と99%以上（99.9％）の相同性があったが、当該株の16SrDNAと同一の塩基配列（DNA配列）を有する細菌は存在せず、当該株は新種のBacillus sp株であることが分かった。当該菌株（A21株）は、独立行政法人  製品評価技術基盤機構、特許微生物寄託センター（〒292-0818、千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8）に、2012年7月19日付け、受託番号P-1391で寄託された。
【００５４】
（ゲルろ過クロマトグラフィー）
A21株を用いて、実施例１と同様にしてゲルろ過クロマトグラフィーを行った。1チューブ当たりのカゼイン分解活性及びDBCSS分解活性の活性を算出し、その結果を図１２に示した。A21株からは、Fr29付近及びFr.42付近にDBCSS分解活性を示すピークが観察された。このように、前記A21株も、DBCSSを分解するプロテアーゼを産生することが分かった。
【００５５】
（SDS-PAGE）
ゲルろ過クロマトグラフィー用に調製したサンプル及びゲルろ過クロマトグラフィーで得られたフラクション溶液（Fr. 33, 41, 49, 57）を用いて、実施例１に準じてSDS-PAGEを行った。サンプル原液及びそれを４倍に希釈した溶液をそれぞれSDS-PAGEに供した。また、フラクション溶液を、VIVAFLOW50（有効分画分子量 3,000 Da  ）の限外ろ過膜を使用して４０倍に濃縮して得られた溶液をそれぞれSDS-PAGEに供した。その結果を図１３に示した。
【００５６】
その結果、A21株の培養液中には40 kDa付近と15〜30 kDa付近に数本のバンドが見られた。そしてFr. 33及びFr. 41のフラクションから15〜30 kDa付近に数本のバンドと低分子にブロードなバンドが見られた。実施例１における標準株の合成培地培養液の結果と考え合わせると、A21株の合成培地培養液から観察された15〜30 kDa付近の数本のバンドが活性酵素構成タンパク質のバンドであろうと考えられた。
【実施例３】
【００５７】
26KF株の培養液若しくは当該菌を培養して、大豆に細胞壁処理をしないで得た豆類細胞内不溶性タンパク組織を分解ないし可溶化を行った
（１）26KF株の培養液による分解ないし可溶化
表１に示す組成と同じ組成を有する培地（但しDBCSSを含まない）を用いて26KF株を培養し、遠心分離により得られた培養液に、生大豆をオートクレーブ処理して得た大豆抽出物（大豆細胞内不溶性タンパク組織）を加え、防腐剤（アジ化ナトリウム0.1%）を加えて4日間反応させ顕微鏡観察を行った。その結果を図１４に示す。図１４に示すように、培養液中の酵素によりDBCSSが分解ないし可溶化されていることが確認された。
【００５８】
（２）26KF株の培養による分解ないし可溶化
図１５に従って、生大豆をオートクレーブ処理して得た処理物を洗浄後、ミキサーによって単細胞化して得られた豆類細胞内不溶性タンパク組織を分解ないし可溶化を行った。当該大豆細胞内不溶性タンパク組織を、前記オートクレーブ処理して得た大豆エキス（大豆抽出液）に再懸濁して得た培地Ａ及びＢ、前記大豆細胞内不溶性タンパク組織を表１に示す組成と同じ組成を有する培地（但しDBCSSを含まない）に懸濁して得た培地Ｃ及びＤにそれぞれ26KF株を植菌し、30℃、150rpmで４日間振盪培養を行い、顕微鏡観察を行った。その結果を図１６及び図１７に示す。大豆エキスを栄養源とした培地Ａ及びＢ、合成培地Ｃ及びの何れの培地も、凍結の有無にかかわらず、大豆細胞内不溶性タンパク組織を構成する大豆ボディ構造体が分解ないし可溶化されていることが確認された。また、大豆エキスを再懸濁した培地の方が合成培地よりも分解ないし可溶化しており、DBCSSを唯一の栄養源として26KF株はDBCSSを分解ないし可溶化する。さらに、合成培地に懸濁した培地ＣやＤでは、凍結の有無に分解ないし可溶化の差はなかったが、大豆エキスに再懸濁した培地ＡやＢでは、凍結した方がよく分解されており、凍結することで細胞壁が破壊され、菌の侵入による分解ないし可溶化が促進されたものと考えられる。
【００５９】
以上の結果から、オカラや醤油粕にセルラーゼやペクチナーゼなどによる細胞壁処理を施さずとも、26KF株ないしA21株、又は当該菌の培養液を用いてDBCSSを主体とする大豆細胞内不溶性タンパク組織が分解ないし可溶化できると結論づけられる。
【産業上の利用可能性】
【００６０】
本発明によると、豆類細胞内不溶性タンパク組織が可溶化され、例えば、これまで産業廃棄物として処理されてきたオカラや醤油粕などとして廃棄されてきた副産物が、食品の製造工程において有効に利用される。
【図１】
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【図１５】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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