(57)【要約】      （修正有）【課題】生物学的試料由来のリボ核酸（ＲＮＡ）を試料中のリボ核酸が室温で安定に保持されるように安定化させるための組成物及び方法を提供する。【解決手段】生物学的試料由来のリボ核酸を保存するための方法であって、ａ．前記試料を対象から得るステップと、ｂ．前記試料を、アニオン系界面活性剤とｐＨ５．５〜７．５の緩衝剤とを含有する組成物と接触させ、液体混合物を形成するステップと、ｃ．前記混合物を室温で保存するステップと、ｄ．以降の処理の前に、前記混合物を５０℃以上で加熱するステップと、を含み、前記アニオン系界面活性剤が前記液体混合物において２％〜８％の濃度であり、前記組成物が前記リボ核酸を室温で安定化する、方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的試料由来のリボ核酸を保存するための方法であって、
ａ．前記試料を対象から得るステップと、
ｂ．前記試料を、アニオン系界面活性剤とｐＨ５．５〜７．５の緩衝剤とを含有する組成物と接触させ、液体混合物を形成するステップと、
ｃ．前記混合物を室温で保存するステップと、
ｄ．以降の処理の前に、前記混合物を５０℃以上で加熱するステップと、
を含み、
前記アニオン系界面活性剤が前記液体混合物において２％〜８％の濃度であり、
前記組成物が前記リボ核酸を室温で安定化する、方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本願は、米国仮特許出願第６０／８２８，５６３号明細書、米国仮特許出願第６０／８６６，９８５号明細書および米国仮特許出願第６０／９４９，７７８号明細書の優先権を主張するものであり、これらの全内容はそれら全体が参照により本明細書に援用される。
【技術分野】
【０００２】
本発明の分野は、一般に体液および／または分泌物（例えば唾液、粘液）および／または組織に由来するリボ核酸の保存および／または単離を行うための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
リボ核酸（ＲＮＡ）の検出および分析の重要性がますます顕著になりつつある。例えば、多数の病原性哺乳類ウイルス（例えばＳＡＲＳ−ＣｏＡ、インフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、狂犬病ウイルス、デング熱ウイルス、呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）、ＨＩＶおよびＡ、Ｃ〜Ｅ型肝炎ウイルス）は、ＤＮＡではなくＲＮＡに基づくゲノムを有する。かかるＲＮＡの検出および／または分析は潜在的に極めて重要であるが、ＲＮＡの採取、保存／安定化、輸送および抽出に最適な一般に認められた方法はいまだ開発されていない。
【０００４】
ＲＮＡは不安定な化合物であり、ＲＮＡの検出および分析における分析対象としてＲＮＡを日常的に幅広く用いることは、その不安定な性質ゆえに制限されている。ＲＮＡの糖−リン酸塩骨格は、アルカリ性溶液による破壊（分解、加水分解）を特に受けやすい。同様に酸性溶液による破壊も受けやすい。最も安定性があるＲＮＡのｐＨはほぼ中性であると一般に考えられるが、従来、これについての正確な測定はなされていない。
【０００５】
ＲＮＡはまた、エンドリボヌクレアーゼ（例えば膵リボヌクレアーゼ）により酵素的に分解されうる。リボヌクレアーゼ活性は既にヒト唾液中で同定されているが（バードン（Ｂａｒｄｏｎ）およびシュガー（Ｓｈｕｇａｒ）、１９８０年）、この酵素の生化学的特性は十分に特徴づけられていない。ブランドン（Ｂｒａｎｄｏｎ）およびシュガー（Ｓｈｕｇａｒ）（１９８０年）は、唾液のリボヌクレアーゼが膵リボヌクレアーゼ様であることを示唆しているが、これはいまだ証明されていない。
【０００６】
ＲＮＡは、その不安定性を少なくとも１つの原因として、診断または検出にとって不適当な分析対象として考えられることが多い。ＲＮＡウイルスの場合、ＲＮＡの直接検出を必要としない検出方法が考案されている。例えば、液体培養系を用いて十分な量のウイルス／細菌を「成長させる」ことで診断が確定される。細菌感染は、典型的には試料の直接染色および顕微鏡検査により診断される。電子顕微鏡を用いても細菌およびウイルス含有試料が同定される。血清学では、間接蛍光抗体試験および酵素結合免疫吸着アッセイによる血清中の病原体（例えばウイルス、細菌、寄生虫）に対する抗体の検出により診断が可能である。
【０００７】
逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）法は、病原体の検出に対する感度が良好であり、場合により症状の発現に先立つ。迅速なウイルス診断は、伝染病の抑制およびウイルス感染に罹った患者の管理の双方においてますます重要になるであろう。現在、免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）は、ＳＡＲＳ−ＣｏＡ感染の検出における「ゴールドスタンダード」と考えられている。しかし、この試験では、十分に訓練された技術者によるバイオセーフティレベル３（ＢＳＬ−３）の施設を備えた実験室での感染ＳＡＲＳウイルスの培養が必要である。それ故、感染性のある臨床標本の採取および処理を行うためのより便利で経済的でありかつ低リスクの方法が望まれている。
【０００８】
ＲＮＡは、（赤血球以外の）ヒト身体内の全部ではないが大部分の細胞種ならびに種々の細胞を含有する体液および／または分泌物および組織から抽出されうる。場合により、糞便、尿、脳脊髄液、動物組織、骨髄穿刺液、植物、植物抽出物、微生物、ウイルス、土壌試料、汚水、廃水、および／または（ミルクを含む）食料を含む他の供給源からＲＮＡを取得可能であることも望ましい。
【０００９】
典型的には、一旦ＲＮＡ含有試料が採取されると、ＲＮＡの抽出のため、それは（例えば液体窒素で）凍結されるかまたは４℃の未凍結状態で実験室に速やかに輸送される必要がある。迅速な輸送の必要性および／または凍結の必要性により、コストおよび保管スペースの点で問題が生じる可能性がある。さらに、遠隔地および／または大規模な試料の採取の場合、速やかな輸送および／または凍結ができない場合がある。重要なことには、伝染病の間、臨床試料の速やかな処理／試験ができない場合があり、未処理分の試料は経時でおよび／または最適でない保存条件下で分解が生じ得ることになる。試料をすぐに凍結することも、冷凍庫、冷蔵庫、遠心分離機などの機器を設置した実験室への輸送も必要としない形態のより単純なＲＮＡ採取手順があれば望ましいことになる。
【００１０】
上記のように、ＲＮＡには種々の細胞供給源が存在する。口腔由来の細胞は唾液の試料から都合良く得られる。唾液では、唾を吐くことによる「受動的な」採取、および／または道具（例えば綿棒）を活用する「能動的な」採取が可能である。鼻粘膜試料は都合よく得られ、かつ上皮および免疫細胞（例えばリンパ球）の豊富な供給源である。この手順は例えば静脈血の採血と比べて侵襲的なものではなく、唾液に基づく単純な手順であれば、本質的に事前の訓練なしで個々人による自己採取が可能となる。しかし、一旦採取されると、使用可能なＲＮＡの回収可能な時間は制限される。なぜなら、大部分の組織内および体液中にリボヌクレアーゼが存在するからである。
【００１１】
ヒトおよび獣医薬や研究における核酸に基づく試験の利用の増加に伴い、体液および／または分泌物および組織からのＲＮＡの確実な回収が可能になると思われる組成物および方法に対する要望が存在する。望ましくは、採取された体液または体組織を周囲温度で長期間、例えば数日間または数週間保存できることが可能であるべきである。例えば、これは、身体試料または体組織が精製および分析のために、特に冷凍または凍結されずに、遠隔地へ輸送される必要がある場合に有利になると思われる。
【００１２】
テトラデシルトリメチルアンモニウムシュウ酸塩（ｔｅｔｒａｄｅｃｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ  ｏｘａｌａｔｅ）などの陽イオン化合物は、核酸の精製で用いられる溶液中の成分として従来より用いられている。米国特許出願公開第２００２０１４６６７７号明細書は、血中の核酸を安定化させるためのテトラデシルトリメチルアンモニウムシュウ酸塩＋酒石酸を含む。しかし、テトラデシルトリメチルアンモニウムシュウ酸塩を含む陽イオン化合物は、ＲＮＡの使いやすさおよび長期安定性の観点で十分でないことが見出されている。一旦陽イオン界面活性剤が核酸に結合されると核酸の溶解が困難であることが見出されている。
【００１３】
さらに、採取試料中のＲＮＡの量は、メッセンジャーＲＮＡなどのコピー数の少ないＲＮＡ種および一部のウイルスの検出が可能な程度に十分に多いと望ましい。
【００１４】
この背景情報は、本出願人により本発明に関連する可能性があると考えられる既知の情報を構成する目的で提供される。先行情報のいずれかが本発明に対する先行技術であるとの承認が必ずしも意図されないばかりかそのように解釈されるべきではない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明の目的は、体液および／または組織に由来するＲＮＡを室温で長期間保存するための組成物および方法であって、できるだけ高い収量および無傷に近い状態でのＲＮＡの抽出をさらに容易にする組成物および方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明の一態様によると、試料中のリボ核酸が室温で安定状態を保持するように前記試料由来のリボ核酸を抽出しかつ保存するための組成物であって、アニオン系界面活性剤とｐＨ約５〜約８．２の緩衝剤とを含有し、前記リボ核酸を室温で安定化する組成物が提供される。
【００１７】
本発明の別の態様によると、生物学的試料由来のリボ核酸を保存するための方法であって、ａ．前記試料を対象から得るステップと、ｂ．前記試料を、アニオン系界面活性剤とｐＨ５．５〜７．５の緩衝剤とを含有する組成物と接触させ、液体混合物を形成するステップと、ｃ．前記混合物を室温で保存するステップと、ｄ．以降の処理の前に、前記混合物を５０℃以上で加熱するステップと、を含み、前記アニオン系界面活性剤が前記液体混合物において２％〜８％の濃度であり、前記組成物が前記リボ核酸を室温で安定化する方法が提供される。
【００１８】
本発明の別の態様によると、ａ．本発明に記載の組成物を含むＲＮＡ保存キットが提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本発明の組成物中に保存された唾液およびオラジーン（Ｏｒａｇｅｎｅ）（商標）内に保存された唾液に由来する核酸の電気泳動の結果を示す、臭化エチジウムで染色されて透光されたアガロースゲルの写真である。
【図２】本発明の組成物中に保存された唾液およびオラジーン（Ｏｒａｇｅｎｅ）（商標）内に保存された唾液に由来するＲＮＡの電気泳動の結果を示す、臭化エチジウムで染色されて透光されたアガロースゲルの写真である。
【図３】所定のｐＨ範囲の組成物中に保存されたＲＮＡ試料の電気泳動の結果を示す、臭化エチジウムで染色されて透光されたアガロースゲルの写真である。
【図４】唾液の細胞フリー画分と結合されたＲＮＡの電気泳動の結果を示す、臭化エチジウムで染色されて透光されたアガロースゲルの写真である。
【図５】所定のｐＨ範囲の唾液の細胞フリー画分と結合されたＲＮＡの電気泳動の結果を示す、臭化エチジウムで染色されて透光されたアガロースゲルの写真である。
【図６】所定のＳＤＳ濃度範囲における、本発明の組成物中で保存された唾液中のＲＮＡの電気泳動の結果を示す、臭化エチジウムで染色されて透光されたアガロースゲルの写真である。
【図７】本発明の組成物を用い、唾液中のＲＮＡを３７℃を対照として室温で保存した場合の電気泳動の結果を示す、臭化エチジウムで染色されて透光されたアガロースゲルの写真である。
【図８】本発明の組成物中での室温で保存された唾液中のＲＮＡの電気泳動の結果を示す、臭化エチジウムで染色されて透光されたアガロースゲルの写真である。
【図９】本発明の組成物中での室温で保存された唾液中のＲＮＡの電気泳動の結果を示す、臭化エチジウムで染色されて透光されたアガロースゲルの写真である。
【図１０】本発明の組成物中で保存されかつ室温での保存後に様々な温度で加熱されたＲＮＡ試料の電気泳動の結果を示す、臭化エチジウムで染色されて透光されたアガロースゲルの写真である。
【図１１】本発明の組成物中で保存されかつ室温での保存後に様々な温度で加熱されたＲＮＡ試料の電気泳動の結果を示す、臭化エチジウムで染色されて透光されたアガロースゲルの写真である。
【図１２】本発明の組成物中での室温で１０〜１６日間保存されたＲＮＡ試料の電気泳動の結果を示す、臭化エチジウムで染色されて透光されたアガロースゲルの写真である。
【図１３】ＲＴ−ＰＣＲ産物の電気泳動の結果を示す、臭化エチジウムで染色されて透光されたアガロースゲルの写真である。
【図１４Ａ】指示温度で１週間（パネルＡ）保存された唾液由来のＲＮＡ試料の電気泳動の結果を示す、臭化エチジウムで染色されて透光されたアガロースゲルの写真である。
【図１４Ｂ】指示温度で８週間（パネルＢ）保存された唾液由来のＲＮＡ試料の電気泳動の結果を示す、臭化エチジウムで染色されて透光されたアガロースゲルの写真である。
【図１５】対象から唾液を採取するための追随可能なステップを示す図面である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下に詳細に記載されるように、本発明は、唾液、鼻汁などの体液および／または組織由来のリボ核酸（ＲＮＡ）を長期間保存しかつ抽出するための組成物および方法に関し、ここで得られる組成物中のＲＮＡは長期間、室温で安定状態を保持する。
【００２１】
本明細書で用いられる「約」という用語は、規定された値の±１０％またはその化学的もしくは明白な等価値を示す。
【００２２】
本明細書で用いられる「体液」という用語は、ヒトまたは動物由来の天然液体を示し、限定はされないが、唾液、喀痰、血清、血漿、血液、咽頭、鼻／鼻咽頭および肛門分泌物、尿、粘液、胃液、膵液、骨髄穿刺液、脳脊髄液、糞便、精液、授乳または生理の生成物、頚管分泌物、膣液、涙、またはリンパ液を含む。
【００２３】
本明細書で用いられる「体組織」または「組織」という用語は、植物または動物の構造物質の１つを形成しかつ動物においては結合組織、上皮、粘膜、筋肉組織、および神経組織などを含む細胞間物質を伴う、通常は特定種の細胞の集合体を示す。
【００２４】
本明細書で用いられる「Ｃｔ値」という用語は、発明者らのローター−ジーン（Ｒｏｔｏｒ−Ｇｅｎｅ）（商標）６０００（リアルタイム遺伝子増幅検出システム；コルベット・ライフ・サイエンス（Ｃｏｒｂｅｔｔ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）により製造）におけるオペレーターマニュアル中の定義に準じており、増幅曲線が検出の閾値に交差する点でのフラクショナルサイクル数（ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ  ｃｙｃｌｅ  ｎｕｍｂｅｒ）を示す。閾値ラインを設定し、各試料の曲線との交点を計算することにより、各試料におけるＣｔ値が求まる。閾値ラインは、ノイズの防止を目的にバックグラウンドレベルを有意に超えかつ後期サイクルにおけるシグナルのプラトーの開始点を下回るようにラン中の指数増殖期に設定される。
【００２５】
本明細書で用いられる「核酸」という用語は、典型的には染色体、クロマチン、ミトコンドリア、リボソーム、細胞質、核、微生物（例えば細菌）またはウイルスにおいて見出されるデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）を含むヌクレオチドの鎖を示す。
【００２６】
本明細書で用いられる「リボ核酸」または「ＲＮＡ」という用語は、限定はされないが、高分子ＲＮＡ、大型および小型のリボソームＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、プレメッセンジャーＲＮＡ、小型の調節ＲＮＡ、ＲＮＡウイルス（一本鎖および二本鎖、正鎖または負鎖）などを含む広範囲のＲＮＡ種を示す。ＲＮＡは、限定はされないが、ヒト、非ヒト、ウイルス、細菌、真菌、原生動物、寄生性、単細胞、多細胞、インビトロ、インビボ、天然、および／または合成の供給源を含む種々の供給源から得られうる。
【００２７】
本明細書で用いられる「プライマー」という用語は、合成がＤＮＡ鋳型またはＲＮＡ鋳型、重合用試薬などの存在下で開始する開始点として機能するオリゴヌクレオチドを示す。プライマーは好ましくは一本鎖であるが、二本鎖プライマーも使用可能である。二本鎖プライマーが用いられる場合、増幅反応での使用前にそれをその一本鎖形態に変換することが望ましい。プライマーは、周知の方法を用いて化学的または酵素的に合成されうるかまたは生物から単離されうる。
【００２８】
本明細書で用いられる「唾液」という用語は、耳下腺、顎下腺、および舌下腺を含む唾液腺のいずれかに由来する分泌物または分泌物の複合物を示し、それは場合により口に対して直線状に並ぶ極めて多数の小さい口唇腺、頬腺、および口蓋腺に由来する分泌物と混合される。
【００２９】
本明細書で用いられる「喀痰」という用語は、唾液および肺を含む呼吸経路からの排出物を含む、哺乳動物の鼻腔内または口腔内に含まれるかまたはそれから排出される粘液性物質を示す。
【００３０】
本明細書で用いられる「対象」という用語は、限定はされないが、ヒト、非ヒト哺乳類、他の動物種、ウイルス、細菌、真菌、原生動物、寄生性、単細胞、多細胞、インビトロ、インビボ、天然、および／または合成の供給源を含む種々の生物／供給源を示す。好適な対象の非限定的な具体例として、ヒトおよびウシが挙げられる。非限定的な具体例として、肉牛、乳牛、ヒツジ、ヤギ、ブタ、家禽およびウマが挙げられる。非限定的な具体例として、ペット、例えばイヌ、ネコなども挙げられる。
【００３１】
本明細書で用いられる「長期保存」という用語は、少なくとも約１日間、２日間、３日間、４日間、６日間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、もしくは８週間、約１日間〜約８週間、または約８週間超にわたる保存を示す。
【００３２】
組成物
本発明の組成物は、ＲＮＡを体液または組織から抽出し、その中に含まれるＲＮＡを長期間、室温で安定に維持するための組成物である。
【００３３】
以下に詳述するように、本発明の組成物はアニオン系界面活性剤および緩衝液を含有する。
【００３４】
組成物の特定の成分の選択は、例えば、リボ核酸の安定化における有効性、コスト、対象および研究所職員に対する安全性、入手容易性、および下流用途との適合性を含む様々な基準に基づいて行われる。成分およびその濃度の選択は、生物学的試料中のＲＮＡを室温で安定化させるのに適切である必要がある。
【００３５】
本発明の組成物は、試料の室温での保存およびそれに続くその中に含まれるＲＮＡを単離し精製するための処理を可能にする。本明細書で用いられる「処理」という用語は、生物学的試料と混合された組成物からリボ核酸を単離または精製するのに用いられる機械的または化学的ステップを示す。
【００３６】
生物学的試料中での核酸の不安定性の主因は、デオキシリボヌクレアーゼおよびリボヌクレアーゼの存在である。デオキシリボヌクレアーゼおよびリボヌクレアーゼは各々、ＤＮＡまたはＲＮＡを分解する酵素である。消化管内のそれらの主な供給源は膵臓の分泌物であるが、これらの酵素は唾液腺および頬粘膜の分泌物および細胞の中にも存在しうる。さらに、口内に常在するかまたは消化されたばかりの食物に由来する微生物は、デオキシリボヌクレアーゼまたはリボヌクレアーゼを放出しうる。長期にわたり、水中に保存された生物学的試料（例えば唾液）中の核酸であれば、劣化または分解が想定されることになる。
【００３７】
本発明の組成物は、リボヌクレアーゼを含むヌクレアーゼの阻害およびＲＮＡの化学的安定化をもたらす。リボヌクレアーゼ阻害およびリボヌクレアーゼ含有ＲＮＡ試料の室温保存能力は、後の試料処理前に、アニオン系界面活性剤および適切なｐＨが維持された緩衝液で処理し、次いで約５０℃以上インキュベーションすることにより得られる。場合により、インキュベーションステップにはプロテイナーゼＫが含まれる。本明細書で用いられる適切なｐＨは、（ｉ）ＲＮアーゼ活性が最小化または除去されるｐＨ、および（ｉｉ）ＲＮＡが化学的安定状態を保持するｐＨである。
【００３８】
アニオン系界面活性剤
理論に拘束されたくないが、デオキシリボヌクレアーゼおよびリボヌクレアーゼの作用がそれらの複合体構造、特にそれらの触媒部位を破壊するアニオン系界面活性剤により阻害されると考えられる。それ故、アニオン系界面活性剤は本発明の組成物中に含まれうる。適切なアニオン系界面活性剤の非限定的な例として、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、サルコシンナトリウム（サルコシル）、ドデシル硫酸リチウム、１−オクタンスルホン酸ナトリウムなどが挙げられる。
【００３９】
本発明の特定の実施形態によると、組成物はアニオン系界面活性剤ＳＤＳを、それが唾液と混合される場合にＳＤＳが約０．５％〜約８％の範囲内にあるような濃度で含有する。別の例では、組成物はアニオン系界面活性剤ＳＤＳを、それが唾液と混合される場合に変性剤が約１％〜約８％または２％〜約８％の範囲内にあるような濃度で含有する。
【００４０】
一例では、組成物は変性剤サルコシルを、それが唾液と混合される場合にサルコシルが約０．５％〜約８％の範囲内にあるような濃度で含有する。別の例では、サルコシルの濃度は約２％〜約４％の範囲内にある。
【００４１】
緩衝液
本発明の一実施形態によると、組成物は、アニオン系界面活性剤および５〜８．２の範囲内のｐＨを維持するための緩衝液を含有する。本発明の別の実施形態によると、組成物は、変性剤および５．１〜７．０の範囲内のｐＨを維持するための緩衝液を含有する。一例では、組成物のｐＨは約５．５〜約７．５の範囲内にある。一例では、組成物のｐＨは約６．５〜約７．０の範囲内にある。一例では、組成物のｐＨは約６．８である。組成物のｐＨは、緩衝液を用いて所望のｐＨに維持されうる。
【００４２】
適切な緩衝剤の非限定的な例として、シクロヘキサンジアミンテトラアセテート（ＣＤＴＡ）ナトリウム、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−エタンスルホン酸（ヘペス）、酢酸または酢酸塩（例えば酢酸ナトリウム）、クエン酸またはクエン酸塩、リンゴ酸、フタル酸、コハク酸、ヒスチジン、ピロリン酸、マレイン酸、カコジル酸、ββ’−ジメチルグルタル酸、炭酸または炭酸塩、５（４）−ヒドロキシメチルイミダゾール、グリセロール２−リン酸、エチレンジアミン、イミダゾール、ヒ酸、リン酸またはリン酸塩、酢酸ナトリウム、２：４：６−コリジン、５（４）−メチルイミダゾール、Ｎ−エチルモリホリン、トリエタノールアミン、ジエチルバルビツール酸、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス）、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸；４−モルホリンプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、２−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、ピペラジン−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］−２−アミノエタンスルホン酸（ＴＥＳ）、４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−プロパンスルホン酸（ＥＰＰＳ）、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、またはこれらの組み合わせが挙げられる。他の例として、リン酸塩、炭酸塩、エチレンジアミンまたはイミダゾール緩衝液が挙げられる。
【００４３】
適切な緩衝剤のさらなる非限定的な例として、２５℃で約４．７〜約８．０のｐＫａを有する緩衝剤が挙げられる。
【００４４】
具体例では、緩衝液はＣＤＴＡである。別の例では、緩衝液はクエン酸塩／クエン酸である。
【００４５】
以下は本発明に記載の組成物の非限定的な例である。
【００４６】
具体例によると、組成物はｐＨ６．２に調節された４％  ＳＤＳ、５０ｍＭ  ＣＤＴＡを含有する。
【００４７】
具体例によると、組成物はｐＨ６．６に調節された４％  ＳＤＳ、５０ｍＭ  ＣＤＴＡを含有する。
【００４８】
具体例によると、組成物はｐＨ６．２に緩衝化された１６％  ＳＤＳもしくは１２％  ＳＤＳもしくは８％  ＳＤＳ、５０ｍＭ  ＣＤＴＡを含有する。
【００４９】
具体例によると、組成物はｐＨ６．６に調節された１％  ＳＤＳ、５０ｍＭ  ＣＤＴＡを含有する。
【００５０】
具体例によると、組成物はｐＨ６．６に緩衝化された４％  ＳＤＳ、５０ｍＭクエン酸を含有する。
【００５１】
具体例によると、組成物はｐＨ６．６に緩衝化された４％サルコシル、５０ｍＭ  ＣＤＴＡを含有する。別の例では、組成物はｐＨ６．６に緩衝化された８％サルコシル、５０ｍＭ  ＣＤＴＡを含有する。
【００５２】
具体例によると、組成物はｐＨ６．８に調節された４％  ＳＤＳ、５０ｍＭ  ＬｉＣＤＴＡ、２５０ｍＭ  ＬｉＣｌを含有する。
【００５３】
驚くべきことに、本発明の組成物が喀痰または唾液または鼻、鼻前部、および／または鼻咽頭試料などの生物学的試料中に存在するＲＮＡ、例えば高分子量ＲＮＡを室温で長期間安定化しうることが見出されている。特に、ＲＮＡは種々の方法を用いて精製可能であり、フェノール抽出物、グアニジウム塩、または任意のカラムもしくは結合マトリックスを必要とすることなく精製可能である。精製ＲＮＡの純度は、例えば相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）の調製などの下流用途における直接使用に十分である。しかし、フェノール抽出物、グアニジウム塩、または任意のカラムもしくはマトリックスは必要に応じて用いられうる。
【００５４】
理論に拘束されたくないが、上記の具体例の場合、アニオン系界面活性剤、例えばＳＤＳが唾液のリボヌクレアーゼに結合し、変性・阻害し、かつ、緩衝液、例えばＣＤＴＡが唾液試料の中性もしくは弱酸性のｐＨを維持すると考えられる。比較的狭い範囲内での試料の緩衝化により、リボヌクレアーゼ、例えば唾液のリボヌクレアーゼがこのｐＨ範囲内で潜在的に活性があるという事実に反し、ＲＮＡが化学的に安定であることが確認しやすくなる。唾液のＲＮＡがこの組成物中で長期間（例えば数週間から数か月間）安定である一方、唾液のリボヌクレアーゼ活性が一部の試料中で活発であり、永久的に不活性化される場合がないことが発見されている。一旦、ＳＤＳの制約が以降の処理／精製の間に除去されていると（例えば本願の組成物が特定の濃度未満に希釈される場合（例えば０．５％未満のＳＤＳ））、試料中のＲＮＡは実質的に分解されうる。
【００５５】
出願人は、驚くべきことに、試料を室温で保存後、また以降の処理の前に、約５０℃超の温度で加熱することで試料中のＲＮＡが実質的に無傷形態で抽出可能になることを見いだしている。さらに、理論に拘束されたくないが、この加熱ステップにより、大幅にまたは完全に唾液のリボヌクレアーゼ活性が不活性化される間、細胞由来のＲＮＡの遊離が促進されるように見られる。精製の前に、加熱ステップの間にプロテイナーゼＫをこの組成物中の生物学的試料に添加するという任意のステップにより唾液中のタンパク質の消化が促進され、それはまた唾液のリボヌクレアーゼ活性の不活性化に寄与しうる。
【００５６】
本発明の組成物の一実施形態の成分の最適化においては、出願人は、一方でＲＮＡの化学的分解の最小化において最適であり、他方ではＳＤＳによる唾液のリボヌクレアーゼ活性に対する強力な阻害を可能にするｐＨ範囲を決定している。本願の組成物は、リボヌクレアーゼ活性をほぼ完全に低下させる一方、ＲＮＡの化学的安定性を維持する。
【００５７】
本発明の具体例によると、変性剤はグアニジウム塩ではない。
【００５８】
本発明の組成物を用いて抽出および保存がなされたＲＮＡが実質的に無傷であり、ＲＴ−ＰＣＲ分析に適し、かつシリカコートした常磁性ビーズまたはシリカ系膜などの核酸結合マトリックスを使用しないで試料から回収可能であることが見出された。
【００５９】
一例では、本発明の方法は無傷の高分子量ＲＮＡの回収を促進する。
【００６０】
方法
本発明の別の態様によると、ＲＮＡを室温で長期間保存するための方法が提供される。
【００６１】
試料は、限定はされないが、ヒト、非ヒト霊長類、家畜（例えば、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、シチメンチョウ、キジ、アヒル、ガチョウなどの家禽）、狩猟動物および野生動物（例えば、シカ、ヘラジカ、ムース、魚、鳥、クマ）、実験動物およびペット（例えば、非ヒト霊長類、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、アレチネズミ、ハムスターなどの齧歯類）、ブタ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ネコ、魚、ヘビ、トカゲ、カメ、ウマなどを含む種々の供給源から得ることができる。試料は、植物、細胞系、土壌微生物、汚水微生物、病原微生物（例えば、ウイルス、細菌、寄生虫）などからも得ることができる。
【００６２】
具体例では、試料はヒト供給源から得られる。他の具体例では、試料はウシ供給源から得られる。
【００６３】
具体例では、ＲＮＡは唾液中に含まれる。前記方法は、唾液の試料を本発明の組成物と混合し、次いで唾液−組成物混合物を室温で保存するステップを含む。一例では、前記方法は、唾液の試料をほぼ等量の本発明の組成物と混合し、次いで唾液−組成物混合物を室温で保存するステップを含む。以降の処理の前に、試料は約５０℃超で短期間加熱される。
【００６４】
他の具体例では、ＲＮＡは、鼻、鼻前部および／または鼻咽頭試料の中に含まれる。方法は、鼻、鼻前部および／または鼻咽頭試料を本発明の組成物と混合し、次いで混合物を室温で保存するステップを含む。ＲＮＡは少なくとも約１日および少なくとも約４週間安定である。以降の処理の前に、試料は約５０℃超で短期間加熱される。
【００６５】
対象から、リボ核酸の供給源として血液試料ではなく唾液試料または鼻、鼻前部および／または鼻咽頭試料を採取する利点は、対象が通常出血に伴う不快さ、疼痛および不安を回避したがるという点が挙げられる。さらに、使用可能量のＤＮＡの回収には１滴の血液を得るための小さな針で十分であるが、ＲＮＡの場合、予想される採取量が少なすぎるためほとんどの目的に使用できない。唾液、喀痰、鼻、鼻前部および／または鼻咽頭試料は、採取についての専門家を必要としないことから、（例えば伝染病／流行病の間に）大量の試料採取が行われている場合でのコストが削減されるというさらなる利点を有する。しかし、唾液がＲＮＡの１つの供給源である一方、血液を含む他の体液および体組織が用いられうることは当業者にとって明らかであろう。本発明は、喀痰、唾液、鼻、鼻前部および／または鼻咽頭試料から得られるＲＮＡの採取および保存に限定されるように意図されていない。
【００６６】
唾液を対象から採取するため、口はサンプリング前にすすがれることが好ましい。食品粒子は外来ＲＮＡを導入する可能性があり、かつキスで移される唾液は外来ヒトＲＮＡまたはウイルスＲＮＡの供給源でありうる。口を、約５０ｍｌの生ぬるい湯で、勢いよく音をたててすすぐかまたは歯磨き粉なしで歯ブラシでブラッシングしてすすいでもよい。刺激されていない唾液は、通常は粘液タイプであり、穏やかに分泌される。刺激された唾液（味の良い食品、甘いかもしくは酸っぱいキャンデーを想定）は漿液（水性）タイプであり、より速やかに分泌される。口をすすぎ、口から水を除去して約５分間待機した後、対象はある容量（例えば約１〜２ｍｌ）の唾液、好ましくは刺激された唾液を受けチューブに吐くことができる。唾液の流れは、舌の上部に置かれた数粒／数つまみのテーブルシュガーまたはＲＮＡの安定性または後の増幅を妨げない任意の他の唾液刺激物質で都合良く刺激可能である。
【００６７】
唾液は、幼児、若年小児や、場合により採取デバイスに直接に唾を吐くことができない障害および／または病気を有する人々などの対象からも得られうる。この例では、道具（例えば綿棒など）を用いて唾液が採取される。
【００６８】
唾液は、場合により採取デバイスに直接に唾を吐くことができないかまたは吐こうとしない家畜、ペットなどの非ヒト動物からも得られうる。この例では、道具（例えば綿棒など）を用いて唾液が採取される。
【００６９】
対象から鼻前部または鼻咽頭試料を採取するため、種々の道具の使用が可能である。粘膜細胞を硬いもしくは軟らかいブラシ、綿棒、またはプラスチック／木製のスクレーパを用いてこすり、液体（例えば生理食塩水）を導入して液体を回収することにより細胞を鼻腔から流し出すことが可能である。例えば、硬い綿棒／ブラシを鼻の前部に、かつ軟らかい綿棒／ブラシを後部鼻咽頭腔に置き、それを用いて粘膜分泌物を採取し、細胞を粘膜から優しくこすり落としてもよい。前記液体および／または道具を用いて採取された試料を、本発明の組成物を有する採取デバイスに送達してもよい。組成物の容量より多い容量の前記液体を導入することが望ましい状況であれば、それに対応するより多量の本発明の組成物が提供されることになる。切断デバイス（例えばハサミ）を用いて綿棒／アプリケータの取っ手の長さを短くすることで、採取デバイスの閉鎖が可能になる。あるいは、加圧下で折れる取っ手を有する綿棒またはブラシ、ならびに取っ手／シャフト内に成形された切断点を有する綿棒またはブラシを用い、試料採取が容易になりうる。「完全長」の取っ手により試料の採取が容易になり、かつ改変された切断点での綿棒／ブラシの短縮により採取デバイスへのよりよい適合が可能になる。鼻腔から採取された組織試料からＲＮＡを回収することも可能である。それに続くＲＮＡ単離においては、鼻形成術または内視鏡的洞手術を受ける患者から得られた新しい組織標本／生検（例えば正常な鼻粘膜または鼻ポリープ組織）の採取が本発明の組成物中で可能である。
【００７０】
本発明の方法は、かかる方法で用いられる組成物をキットの形態で提供することにより都合良く実施される。かかるキットは、好ましくは適切な組成物を有し、試料の採取を容易にするための綿棒を含みうる。標的遺伝子または核酸配列（例えば転写産物）の検出における試料の適合性を示すための核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）鋳型でありうる少なくとも１つのタイプの陽性対照または標準が提供されうる。かかるキットは、好ましくはその使用についての使用説明書を含む。
【００７１】
場合により、キットは、例えば国際ＰＣＴ出願番号、国際公開第０３／１０４２５１号パンフレット（この内容はその全体が参照により本明細書中に援用される）に記載される容器を含む。
【００７２】
場合により、キットは、例えば米国仮特許出願第６０／７４８，９７７号明細書またはＰＣＴ／ＣＡ２００６／００２００９（これら双方の内容はそれら全体が参照により本明細書中に援用される）に記載される容器を含む。
【００７３】
場合により、キットは、例えばＰＣＴ／ＵＳ２００７／６４２４０（この内容はその全体が参照により本明細書中に援用される）に記載される採取アセンブリを含む。
【００７４】
望ましくは、容器は、診療所または病院を必要とせずに現場での採取を容易にし、採取現場および／または分析現場への送達のためにサイジングされる。
【００７５】
用途
本発明の組成物および方法は、広範囲の用途での使用に適する。
【００７６】
呼吸器ウイルス性／細菌性伝染病／流行病が常に関心の的であるのに伴い、本発明の方法および組成物が、生物学的試料、例えば鼻、鼻咽頭、喀痰および／または唾液試料の大規模な採取、輸送、保存、精製およびその後の診断実験室における分析にとって有用であることが期待される。試料が本発明の組成物中に室温で安定であることは、試験室が多数の患者試料で溢れかえる状況（例えば伝染病の場合）では非常に有用であることが期待される。
【００７７】
さらに、家畜の監視および追跡の重要性および必要性の増大に伴い、本願の組成物および方法は、疾患の監視および家畜の監視のための家畜試料の採取、保存および保管に適する。本願の組成物および方法は、イヌ、ネコなどのペットでの使用にも適する。
【００７８】
唾液は、多数の臨床診断および遺伝子試験において選択される試料として血液よりも優位であることが予想される。一般に、喀痰、唾液、鼻、鼻前部および／または鼻咽頭試料は、採取して処理する上での有害性が血液より低い標本であり、唾液の採取と鼻、鼻前部および／または鼻咽頭の採取の双方は患者に対して非侵襲性であるかまたは侵襲性が最小であり、多くの場合に容易に採取されうる。一般に、かかる試料の採取においては熟練した技術者を必要としない。
【００７９】
鼻、鼻前部および鼻咽頭試料は、本明細書中で本発明の方法および組成物での使用に適することが示されている。
【００８０】
鼻腔は上部気道の一部であると考えられる。鼻粘膜は上皮および免疫細胞（例えばリンパ球）の豊富な供給源である。気道粘膜（鼻腔および肺）は、吸入される病原体（例えば細菌およびウイルス）への暴露の第１の部位である。呼吸粘膜内に存在するＴ細胞は、粘膜表面を攻撃する外来抗原（例えば感染性微生物抗原）に対する粘膜免疫応答の調節において重要な役割を果たすと考えられる。
【００８１】
呼吸器ウイルス（例えば呼吸器多核体ウイルスＲＳＶ）は、感染し、複製し、呼吸器粘膜から落とされる、すなわち鼻および口を介して他者に伝染される。ＲＳＶは、若年小児において重篤な呼吸器感染を引き起こす。
【００８２】
本発明の組成物中で安定化された鼻試料は、種々の鼻症／炎症性疾患の病態生理を理解するための、正常な鼻粘膜および鼻ポリープ組織での遺伝子発現特性の分析にとって有用である（１）。
【００８３】
粘膜分泌物／試料（唾液および鼻試料）の評価により、感染および／または免疫により誘発される粘膜（および全身）の液性および細胞性応答への重要な洞察がもたらされうる（２、９）。
【００８４】
本発明の組成物中に採取される唾液および鼻試料の双方は、病原体、例えばＳＡＲＳ−ＣｏＡ、ＲＳＶ、麻疹ウイルス、インフルエンザウイルス、狂犬病ウイルス、デング熱ウイルス、ＨＩＶ、Ａ型肝炎、Ｃ〜Ｅ型肝炎ウイルス、マイコバクテリウムなどの診断／同定にも用いられうる。
【００８５】
動物由来のＲＮＡの検出および／または分析もますます重要かつ望ましい。本発明の方法および組成物は、家畜に感染するＲＮＡウイルスの診断および／または同定での使用に適する。非限定的な例として、（家畜および野生の反芻動物およびブタに感染し、最も一般的には感染動物の呼気中に由来する感染性飛沫の吸入を介して感染が拡大する）口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）；ウシ白血症ウイルス（ＢＬＶ）；ウシパラインフルエンザウイルス（例えばパラインフルエンザ−３ウイルス、ＰＩ−３）；ウシ呼吸器多核体ウイルス（ＢＲＳＶ）；豚繁殖・呼吸障害症候群ウイルス；水疱性口内炎ウイルス；ウシウイルス性下痢ウイルス（エアロゾル感染）；ウシコロナウイルス（例えばＳＡＲＳ随伴コロナウイルス（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ））；ＢＨＶ１ウイルス（ウシ鼻気管炎、呼吸器疾患）；ウマ動脈炎ウイルス（エアロゾル感染）；ニパウイルス（ブタ呼吸器および神経学的症候群）；ブタ呼吸器コロナウイルス感染（ＰＲＣＶ）；狂犬病ウイルス（哺乳類）；ヤーグジークテヒツジレトロウイルス（ヒツジにおける伝染性肺癌）；伝染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）（家禽）；トリニューモウイルス（ＡＰＶ）（家禽）；ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）（家禽の呼吸器系、神経系、および消化器系）；インフルエンザウイルスＡ（鳥インフルエンザ（Ａｖｉａｎ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ））サブタイプＨ５Ｎ１（「鳥インフルエンザ（ａｖｉａｎ  ｆｌｕ）」）が挙げられる。
【００８６】
本発明の方法および組成物は、細菌、真菌、ウイルスに感染された細胞、単離ウイルスや、ウイルス、細菌、原虫、真菌などに汚染されているかまたはそれらによる汚染が疑われる組織培養物、細胞系および体液および／または組織、ならびにこれらの組み合わせに由来するリボ核酸の安定化およびその後の検出／分析に適する。
【００８７】
さらに、本発明の組成物および方法は、細胞質、核および／またはミトコンドリアのＲＮＡの安定性および分析、試料（体液および／または組織）の保管（例えばバンキング）、ＲＮＡの供給源の追跡（例えば胎盤／胎児か母体由来か）、リボ核酸系の追跡（例えばウイルスの感染源およびその後の感染経路の同定および特徴づけ）における使用に適する。
【００８８】
さらに望ましくは、本発明の組成物により、病原体（ウイルスおよび細菌）が非感染性になり、臨床試料の安全な処理が行われる。これは特に試料が一旦加熱されている場合である。それに対し、「従来の」無菌輸送培地（例えばウイルス輸送培地（ＶＴＭ）（付録８）「Ｃｏｌｌｅｃｔｉｎｇ，ｐｒｅｓｅｒｖｉｎｇ  ａｎｄ  ｓｈｉｐｐｉｎｇ  ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  ａｖｉａｎ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ（Ｈ５Ｎ１）ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｆｉｅｌｄ  ｏｐｅｒａｔｉｏｎｓ」、２００６年１０月、世界保健機関（ＷＨＯ））内に採取されかつ病原体を含有すると疑われる臨床標本は、バイオセーフティレベル３または４の格納施設内で処理されなければならない。これらの施設はあまり多くなく、伝染病発生の場合には多大な負担がかかることになる。さらに、遠隔地域、例えばアフリカの一部の国はバイオセーフティレベル３または４の格納施設／実験室がない。
【００８９】
本発明の組成物および方法は、幅広い地理的領域にわたる現場での健常者および感染者に由来するＲＮＡの採取および単離に適しており、それは大規模な伝染病の予測および予防のための極めて重要な監視情報を提供しうる。かかる試料であれば、分子疫学的研究における候補ワクチン株の同定およびウイルス遺伝子型の同定にとって非常に貴重なものとなる。
【００９０】
本発明の組成物および方法は、病気の初期（例えばセロコンバージョン前）における感染の診断に適する。この態様は、１）患者ケアの管理および疾患転帰の改善と、２）伝染の予防／低減にとって重要である。（上記のように）「従来の」血清学的試験の感度は感染の早期検出にとって低すぎる。例えば、この従来の方法によると、ＳＡＲＳ−ＣｏＡは症状の発現（例えば発熱）の１４〜２８日後まで検出不能である。ＳＡＲＳ−ＣｏＡの早期の迅速な同定に対する要望に対処するため、逆転写（ＲＴ）−ＰＣＲに基づくアッセイが世界保健機関（Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ（ＷＨＯ））により提唱され、ウイルス特異的ＲＮＡを検出するために日常的に用いられている（４、５）。より最近では、重症急性呼吸器症候群コロナウイルスの迅速な検出用のループ媒介等温増幅法（ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ）が開発されている（３）。ＰＣＲに基づく診断技術における進歩が著しい一方、これらのアッセイの奏功は、臨床標本の無菌輸送培地への採取および迅速な処理のためのバイオセーフティレベル３／４の格納施設への４℃での迅速な輸送に大いに依存する。典型的には、これらの試料は既に入院した患者から採取され、細胞培養におけるウイルスの複製、その後の細胞変性効果の監視に貴重な時間（日数）が「費やされる」ことが多い。上述した通り、試料の輸送培地への採取についての「従来の」方法は、診断実験室が試料で溢れかえることになる伝染病／流行病の間では不十分なものである。実験室が有する試料の冷蔵能および／または凍結能には制限があることから、伝染病の間であれば未処理分の試料の分解が予想されることになる。その場合、試料の再採取が必要とされかつ貴重な時間が費やされることになる。
【００９１】
ＲＴ−ＰＣＲと組み合わされる本発明の組成物および方法は、無症状疾患の診断での使用にも適する。例えばオランダでは、ＲＴ−ＰＣＲ試験で、発疹の発生の５日前から１２日後に至る喉の綿棒標本中に麻疹ウイルス（ＭＶ）ＲＮＡが検出されている（７）。「口腔液はＭＶ特異的なＩｇＭ抗体とウイルスＲＮＡの同時検出にとって最も実用的な標本であることが判明した。ウイルスＲＮＡはＭＶ感染の血清学的証拠を有する健常接触者３名に由来する口腔咽頭標本中でも検出された」。それ故、鼻腔および口腔から採取された試料は、臨床的および無症状ＭＶ感染の診断において用いられうる。類似の実験結果が、１９９９年のオーストラリア、ビクトリア州における麻疹の発生について研究する別のグループにより報告された（８）。リンパ球（末梢血白血球）、尿、喉の綿棒、および血清標本については、喉の綿棒標本は、発疹後の最初の２週間での麻疹ウイルスＲＮＡの検出において最適であるかまたは好ましい標本であった。この場合、喉の綿棒の先端が３ｍＬの無菌ウイルス輸送培地内に入れられ、４℃で実験室に輸送された。
【００９２】
最近の診断試験（すなわちＲＴ−ＰＣＲ試験）の分野での進歩は著しいが、臨床標本は相変わらず「無菌輸送培地」（例えば上記のＶＴＭ）に採取されることから極めて不安定である。このタイプの培地内のＲＮＡ（ヒトおよび／または細菌および／またはウイルス転写産物）は輸送中に分解に至る可能性が高いことから、試料の発現特性は、一旦診断実験室まで達すると、採取時の患者の特性を正確に反映することにならない。また、これらの臨床試料中の病原菌が実験室への輸送後に依然として感染性を示す確率が高い。
【００９３】
本明細書中に記載の本発明についてより十分な理解を得るため、以下の実施例が示される。これらの実施例はあくまで例示目的であることは理解されるべきである。したがって、それらは本発明の範囲を決して限定すべきものではない。
【実施例】
【００９４】
実施例１：ヒト対象由来の唾液試料を得るためのプロトコル
被験者に対し、最終の食事から３０〜６０分間あけるよう指示する。可能であれば、被験者に自分の歯を（歯磨き粉を用いずに）磨いてもらう。可能であれば、被験者に自分の歯を水５０ｍｌですすいでもらう。そして被験者に５〜１０分間待機するよう指示することで、口からの水分の除去が可能になる。唾を吐くことができる被験者においては、特定の採取チューブに唾液の量が１もしくは２ｍｌの水準に達するまで唾液を吐くように指示される。最後の食事から時間をあけて口をすすいでもらうことが望ましいが、必須ではない。唾液の採取には数分かかる場合がある。被験者が十分な量の唾液をだせないばあい、その被験者に数粒のテーブルシュガーを与え、舌の上に乗せるか或いは噛んでもらう。このとき、被験者には、糖の一部がチューブ内に吐き出されてしまうかどうか気にかけないように伝えられる。吐くことができない被験者（例えば、幼児、若年小児、制限／障害を有する者）においては、試料採取のため、糖とともに道具（例えば、綿棒、ブラシ、トランスファーピペット）の使用が可能である。同様に、被験者に液体（例えばうがい薬、水、生理食塩水）を提供して自らの口および喉をうがいするかまたは生理食塩水を提供して自らの鼻腔を洗い出すことが可能である。前記液体を用いて採取した試料であれば、採取チューブ内に送達されることになる。唾液／喀痰／鼻汁が前記液体により実質的に希釈されている状況であれば、その結果より多量の本発明の組成物が提供されることになる。
【００９５】
２つの組成物を比較する目的で２種以上の試料を一人の被験者から採取する場合、被験者は唾液を少量ずつ２つ以上のチューブに各チューブが１ｍｌのマークまで満たされるまで交互に入れるように求められる。この操作は、被験者の唾液組成物が唾を吐くプロセスの間に変化しうることから必要である。
【００９６】
必要量の唾液が採取された後、直ちに等量の組成物と混合される。唾液を導入する正確な方法は、容器の設計に依存することになる。一旦唾液が導入されて組成物と混合されると、容器はしっかりとキャップされる。ＲＮＡ含有試料は室温で長時間維持されうる。ＲＮＡ含有試料の水溶液の一部を逆転写反応におけるＲＮＡ鋳型として用いて相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を生成し、次いでＰＣＲ反応で用いてもよい。
【００９７】
実施例２：本組成物とオラジーン（ＯＲＡＧＥＮＥ）（商標）との比較
試料採取
この実施例では、一人の被験者から２種の喀痰／唾液試料（各２ｍｌ）を短期間内に得た。第１の試料を採取し、４％  ＳＤＳ、５０ｍＭ  ＣＤＴＡ、ｐＨ６．６を含む本発明の組成物２ｍｌを有するバイアルに入れた。その後間もなく、同じ被験者が提供した第２の試料をオラジーン（Ｏｒａｇｅｎｅ）（商標）溶液２ｍｌを有するバイアルに入れた。核酸の精製の３日前、試料を振とうさせ、室温（ＲＴ）で放置した。
【００９８】
方法
核酸を、オラジーン（Ｏｒａｇｅｎｅ）（商標）中または本発明の組成物中でこの被験者の唾液から精製した。オラジーン（Ｏｒａｇｅｎｅ）（商標）中の被験者の試料の一部をプロテイナーゼＫと混合し５０℃で２時間加熱し、次いで９０℃で１５分のさらなる加熱を行うか（図１および２）または行わなかった（図２）。組成物中の被験者の試料の一部をプロテイナーゼＫと混合し、５０℃で２時間、次いで９０℃で１５分間加熱した（図１）。一部の唾液試料に対しては、５０℃超の温度での短時間のインキュベーションが、本発明の組成物中での採取された唾液からの無傷の高分子量ＲＮＡの抽出の促進に必要であることが見出されたが、オラジーン（Ｏｒａｇｅｎｅ）（商標）中で採取された唾液に対しては全く効果がなかった。
【００９９】
次いで試料を短時間遠心して不溶性材料を除去し、上清中に残存するＤＮＡおよびＲＮＡを２倍量の９５％エタノールで沈殿させた。沈殿物を０．１％  ＳＤＳを含有する適切な緩衝液中に溶解し、１０μｌの一定分量（約１０μｌの未希釈唾液に相当）を０．９％アガロースゲル上での電気泳動により分析し、次いで臭化エチジウム（１μｇ／ｍＬ）で染色し、ＤＮＡおよびＲＮＡを画像化した（図１および２を参照）。各精製試料の１０μＬについてゲル電気泳動前に膵リボヌクレアーゼで処理し、本発明の組成物中で安定化・抽出された高分子量物質がＲＮＡであることを実証した（図１）。なお、図１では、唾液試料中に存在する高分子量のゲノムＤＮＡを矢印（→）で示し、特徴的なリボソームＲＮＡダブレットをアスタリスク（＊）で示し、低分子量ＲＮＡをプラス記号（＋）で示した。
【０１００】
図１の試料順序は以下の通りである。
【０１０１】
【表１】
2014057590.tif 000002
【０１０２】
図２の試料順序は以下の通りである。
【０１０３】
【表２】
2014057590.tif 000003
【０１０４】
結論
この実施例は、ｉ）唾液のリボ核酸を室温で少なくとも３日間保存する本発明の組成物の能力と、ｉｉ）実質的に無傷のリボ核酸を回収するための抽出／精製手順の適合性について示す。この実施例は、ＲＮＡの安定性の観点での本発明の組成物のオラジーン（Ｏｒａｇｅｎｅ）（商標）に対する優位性について示す。
【０１０５】
リボソームＲＮＡであることを示す（図１、レーン７内の二重バンドを参照）無傷の高分子量ＲＮＡの保存および抽出は、他の形態のＲＮＡ（臭化エチジウム染色および透光により検出される存在量が少なすぎるメッセンジャーＲＮＡなど）も本発明の組成物中で採取された試料中に無傷形態で維持されることを示唆している。
【０１０６】
実施例３：喀痰／唾液から誘導される純粋ＲＮＡの安定性を維持するためのｐＨ範囲の最適化
方法
純粋ＲＮＡを６倍に希釈し、広範囲のｐＨ値（ｐＨ３．０、５．０、６．０、７．０、８．２および１０．０）にわたる緩衝化溶液を調製した。ＲＮＡのリン酸ジエステル骨格での部分加水分解の発生を可能にするため、５０℃で１６時間のインキュベーション期間後、各ｐＨ値に緩衝化されたＲＮＡの一定分量（下記）を０．９％アガロースゲル上での電気泳動により分析し、臭化エチジウムで染色した（図３）。
【０１０７】
図３の試料順序は以下の通りである。
【０１０８】
【表３】
2014057590.tif 000004
【０１０９】
結論
リボソームＲＮＡの染色二重バンド特性がｐＨ５．０〜８．２処理レーンで保たれていることから示されるように、ＲＮＡは中性から弱酸性ｐＨで化学的に安定である。上部バンドの強度低下が下部バンドの強度低下前に予想されることに注意のこと。理論に拘束されたくないが、これは短い方のＲＮＡ種（下部バンド）よりも１つのリン酸ジエステル骨格が切断される確率が高い大きい方のリボソームＲＮＡ種に起因する可能性が高い。２つのリボソームＲＮＡ種に特有のバンドパターンが、より強酸で、各々３．０および１０．０の基本的なｐＨ値で完全に消失する。
【０１１０】
実施例４：細胞を含有しない唾液画分中の強力なＲＮアーゼ活性の実証
方法
３人の被験者に、唾液１ｍＬを等量の生理食塩水を含有するチューブ内に吐いてもらった。その直後、唾液試料および生理食塩水を混合し、高速遠心分離を施し、唾液中に含有される細胞をペレット化した。得られた上清、つまり細胞を含有しない唾液画分（ＣＦＳＦ）を希釈し、次いで一定量（１．０μｇ）の純粋ＲＮＡと増加量で混合した。ＣＦＳＦと混合した純粋ＲＮＡを３７℃で３０分間インキュベートし、次いでアガロースゲル（１．０％）での電気泳動により分析した。ゲルを臭化エチジウムで染色し、ＲＮＡの完全性を画像化した（図４）。
【０１１１】
図４の試料順序は以下の通りである。
【０１１２】
【表４】
2014057590.tif 000005
【０１１３】
結論
ＲＮＡは、細胞を含有しない唾液１μｌの画分とともにインキュベートされる場合、速やかに分解される。それ故、強力なリボヌクレアーゼ活性が唾液の細胞外画分中に存在する。
【０１１４】
この実施例は、被験者ごとに含まれる唾液のリボヌクレアーゼにおいてかなりのばらつきが存在することも示す。等量のＲＮＡの分解に必要とされる被験者３由来のＣＦＳＦの容量は、被験者１および２に比べて極めて少なかった。
【０１１５】
実施例５：唾液のリボヌクレアーゼ活性における最適ｐＨ
方法
唾液のリボヌクレアーゼが活性を示すｐＨ範囲を決定するため、０．１μＬ相当のＣＦＳＦ（被験者２、実施例４）を、ｐＨ５．１、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．１および８．６に緩衝化した純粋ＲＮＡ１μｇと混合した。この実施例では、ＣＦＳＦの不在下での純粋ＲＮＡ（レーン１０）を、この実施例で用いられるＲＮＡの状態すなわち無傷性を例示するために含めた。３７℃で３０分間のインキュベーション後、試料をアガロースゲル（０．９％）での電気泳動により分析し、臭化エチジウムで染色した（図５）。ＲＮＡ分解の兆候には、１）一方もしくは両方のリボソームＲＮＡサブユニット、ゲルの中央での明確な二重バンドの消失、２）臭化エチジウムで染色された物質の細長いスミア標本の出現、および／または３）ゲル上での臭化エチジウムで染色された物質の対照ＲＮＡマーカーよりも加速された移動度が含まれる。
【０１１６】
図５の試料順序は以下の通りである。
【０１１７】
【表５】
2014057590.tif 000006
【０１１８】
結論
ｐＨ＞６．５に緩衝化された純粋ＲＮＡが、細胞を含有しない唾液０．１μＬの添加時に速やかに分解された（レーン６〜９）。ｐＨ５．１〜６．５で、純粋ＲＮＡが、細胞を含有しない唾液の存在下で無傷のままであった。これらの実験結果は、唾液に対して内因性のリボヌクレアーゼが中性（ｐＨ７．０）から弱アルカリ性ｐＨで最適な酵素活性を示すことを示唆している。酸性条件下では有意なリボヌクレアーゼ活性が全く検出されなかった（レーン２〜５）。
【０１１９】
実施例６：所定のＳＤＳ濃度範囲におけるＲＮＡの安定性
方法
５人の対象から採取した唾液から本発明の３つのうちの１つの組成物に抽出したＲＮＡの例を示す（図６）。唾液を採取し、直ちに等量の指示組成物と混合した。組成物は、ＳＤＳ（下記の表中に示される濃度でのドデシル硫酸ナトリウム）を含有し、５０ｍＭ  ＣＤＴＡ（シクロヘキサンジアミン四酢酸のナトリウム塩）を用いてｐＨ６．２に緩衝化した。唾液の各試料を等量の表示した組成物と混合し、室温で３週間保存した。各試料中に含有されるＲＮＡを調べるため、一定分量５０μｌを取り出し、９０℃で１５分間加熱し、次いで５倍希釈した。プロテイナーゼＫを一定分量の各希釈物に添加し、次いで５０℃で１時間インキュベートし、プロテアーゼによりタンパク質を消化させた。室温に冷却後、ＫＣｌの２．５Ｍ溶液１０μｌを添加してＳＤＳを沈殿させ、次いで試料を遠心して沈殿ＳＤＳを除去した。９５％冷却エタノール（２倍量）を透明な上清に添加し、核酸を沈殿させた。−２０℃で１時間放置後、沈殿核酸を希釈緩衝液２５μｌ中に溶解した。この溶液１０μｌ（元の唾液約１０μｌに相当）を０．９％アガロースゲルにアプライし、１時間電気泳動を行った。ゲルを臭化エチジウムで染色し、透光下で撮影した。各試料レーンにおける上部バンドはゲノムＤＮＡである。ゲルの中央の２つのバンドは、唾液中に存在しかつ指示組成物により保存されたリボソームＲＮＡを示す。
【０１２０】
図６の試料順序は以下の通りである。
【０１２１】
【表６】
2014057590.tif 000007
【０１２２】
結論
これらのデータは、唾液中のＲＮＡが、弱酸性性ｐＨ（６．２）に緩衝化された、アニオン系界面活性剤（濃度：８〜１６％  ＳＤＳ）を含む組成物と１：１で混合される場合、室温で少なくとも３週間安定であることを示す。これらのデータは、唾液中に存在するＲＮＡの量において被験者間でかなりのばらつきがあることも示す。
【０１２３】
実施例７：室温および３７℃で本発明の組成物を用いた、唾液中のＲＮＡの安定性
この実施例では、組成物は、ｐＨ６．２に緩衝化された１６％  ＳＤＳ、５０ｍＭ  ＣＤＴＡを含有した。唾液試料を組成物と１：１で混合し、室温（ＲＴ）または３７℃のいずかで７日間保存した。試料を３７℃でインキュベートすることにより、ＲＴと比べ、唾液のリボヌクレアーゼによるＲＮＡの分解が促進されると予想され、ＲＮＡが存在する場合には本発明の組成物中での活性が保持される必要がある。試料を９０℃で１５分間加熱し、次いで５倍に希釈し、プロテイナーゼＫとともに５０℃で１時間インキュベートした。ＳＤＳを塩化カリウムで沈殿させ、沈殿物の遠心分離による除去後、核酸を２倍量の９５％冷却エタノールで上清から沈殿させた。各沈殿核酸試料の一部をアガロースゲル電気泳動により分析し、臭化エチジウムで染色し、透光下で撮影した（図７）。
【０１２４】
図７の試料順序は以下の通りである。
【０１２５】
【表７】
2014057590.tif 000008
【０１２６】
結論
この実施例は、唾液の試料中のＲＮＡを安定化するための本発明の組成物の有効性を示す。３７℃で１週間後、４人の被験者から得た唾液試料は、高分子量ＲＮＡが大して分解されないことを示した。
【０１２７】
実施例８：異なる緩衝液を含有するＲＮＡ安定化組成物の試験
この実施例では、クエン酸ナトリウム／クエン酸緩衝液（ｐＫａ６．４、５０ｍＭ）を先の組成物中のｐＨの緩衝化に用いたＣＤＴＡと交換した。他の実施例などでは、唾液を２人の被験者から採取し、組成物（ｐＨ６．６に緩衝化された４％  ＳＤＳ、５０ｍＭクエン酸）と１：１で混合した。次いで、試料を室温で３週間保存した。唾液／組成物混合物中に存在するＲＮＡを抽出するため、試料をプロテイナーゼＫとともに５０℃で１時間インキュベートし、９０℃で１５分間加熱し、ＳＤＳを塩化カリウムで沈殿させ、沈殿物の遠心分離による除去後、核酸を２倍量の冷却エタノールで上清から沈殿させた。抽出された物質がＲＮＡであることを確認するため、沈殿核酸の一部を膵リボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）で処理した。次いで、ＲＮアーゼでの処理抽出物および未処理抽出物をアガロースゲル電気泳動により分離し、上記のように臭化エチジウムで染色した（図８）。レーン５および９における速やかに移動するＲＮアーゼ耐性材料の一部がＤＮＡである可能性が高く、９０℃での加熱期間により変性され、部分的に分解されていることに注意のこと。
【０１２８】
図８の試料順序は以下の通りである。
【０１２９】
【表８】
2014057590.tif 000009
【０１３０】
結論
この実施例は、組成物のｐＨの緩衝化にクエン酸とＣＤＴＡとの交換が適することを示す。
【０１３１】
実施例９：異なるアニオン系界面活性剤を用いたＲＮＡ安定化溶液の試験
この実施例では、サルコシル（Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム塩またはラウロイルサルコシンナトリウム）をＳＤＳと置換した。唾液を３人の被験者から採取し、ｉ）ｐＨ６．６に緩衝化された４％サルコシル、５０ｍＭ  ＣＤＴＡと、ｉｉ）ｐＨ６．６に緩衝化された８％サルコシル、５０ｍＭ  ＣＤＴＡの２つの組成物と１：１で混合した。次いで、試料を室温で３週間保存した。唾液／組成物混合物中に存在するＲＮＡを抽出するため、試料の一部をプロテイナーゼＫとともに５０℃で１時間インキュベートし、９０℃で１５分間加熱し、塩化カリウムで処理し、遠心分離した。上清中に残存する核酸を２倍量の冷却エタノールで沈殿させた。抽出された材料がＲＮＡであったことを確認するため、沈殿核酸の一部を膵リボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）で処理した。次いで、ＲＮアーゼでの処理抽出物および未処理抽出物をアガロースゲル電気泳動により分離し、臭化エチジウムで染色した（図９）。
【０１３２】
図９の試料順序は以下の通りである。
【０１３３】
【表９】
2014057590.tif 000010
【０１３４】
結論
この実験は、サルコシルという別の強力なアニオン系界面活性剤が本発明の組成物中でＳＤＳと交換可能であることを示す。実施例６および９は、アニオン系界面活性剤が適切な緩衝剤とともに唾液中のＲＮＡを有効に安定化することを示す。
【０１３５】
実施例１０：５０℃超での短時間の加熱を含むステップが唾液由来のＲＮＡの抽出において有益であることの実証
この実施例では、組成物は、ｐＨ６．６で緩衝化された４％  ＳＤＳ、５０ｍＭ  ＣＤＴＡを含有した。１人の被験者から得た唾液試料を組成物と１：１で混合し、室温で６日間インキュベートした。唾液／組成物混合物中に存在するＲＮＡを抽出するため、まず試料をプロテイナーゼＫとともに５０℃で１時間インキュベートし、タンパク質を消化した。一定分量を採取し、５０℃、５５℃、６０℃、６５℃、７０℃、７５℃、８０℃、８５℃もしくは９０℃で１５分間加熱した。ＳＤＳを塩化カリウムで加熱された一定分量から沈殿し、沈殿物の遠心分離による除去後、核酸を２倍量の冷却エタノールで上清から沈殿させた。各沈殿核酸試料の一部をアガロースゲル電気泳動により分析し、臭化エチジウムで染色し、透光下で撮影した（図１０）。
【０１３６】
図１０の試料順序は以下の通りである。
【０１３７】
【表１０】
2014057590.tif 000011
【０１３８】
結論
この実施例では、５０℃超と最大で約９０℃の温度での１５分間の加熱により、この唾液／組成物試料から抽出された高分子量ＲＮＡの収量が５０℃のみの場合と比べて改善された。これらの結果は、抽出されたＲＮＡの、最大９０℃の温度で１５分間の加熱ステップによる分解が有意でないことも示す。
【０１３９】
実施例１１：９０℃での短時間の加熱を含むステップが唾液由来のＲＮＡの抽出において有益であることの実証
この実施例では、組成物は、ｐＨ６．６で緩衝化された４％  ＳＤＳ、５０ｍＭ  ＣＤＴＡを含有した。２人の被験者から得た唾液試料を組成物と１：１で混合し、室温で４日間インキュベートした。唾液／組成物混合物中に存在するＲＮＡを抽出するため、まず試料をプロテイナーゼＫとともに５０℃で１時間インキュベートし、タンパク質を消化した。一定分量を採取し、９０℃で０、５、１５、３０もしくは６０分間加熱し、次いで水で４倍に希釈し、室温でさらに１８時間インキュベートした。試料を希釈し、ＳＤＳの濃度を通常であればＲＮアーゼ活性を許容することになるレベルまで低下させることにより、加熱ステップの効率の試験が可能になった。ＳＤＳを塩化カリウムで沈殿させ、沈殿物の遠心分離による除去後、核酸を２倍量の冷却エタノールで上清から沈殿させた。各沈殿核酸試料の一部をアガロースゲル電気泳動により分析し、臭化エチジウムで染色し、透光下で撮影した（図１１；被験者１、左パネル；被験者２、右パネル）。
【０１４０】
図１１の試料順序は以下の通りである。
【０１４１】
【表１１】
2014057590.tif 000012
【０１４２】
結論
この実施例では、９０℃での５〜１５分の加熱により、２人の被験者の試料から抽出された無傷ＲＮＡの収量が未加熱試料の場合に対して改善された。ＲＮＡの分解が９０℃で３０および６０分間加熱された試料中で観察された。
【０１４３】
さらに、試料の加熱、希釈およびその後のさらなるインキュベーション後に実質的に無傷のリボソームＲＮＡが回収されたことは、本発明の組成物および抽出プロトコルにより、リボヌクレアーゼ活性が低下した精製物質が得られることを示唆している。
【０１４４】
実施例１２：本組成物中に採取された試料からのヒトｍＲＮＡの抽出・精製
この実施例では、逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を用い、本発明の組成物中での採取された６人の被験者の唾液から回収されたＲＮＡ中でのヒト特異的なメッセンジャーＲＮＡの検出が可能であることが示される。
【０１４５】
方法
６人の被験者から得た唾液試料を組成物（４％  ＳＤＳ、５０ｍＭ  ＣＤＴＡ、ｐＨ６．６で緩衝化）と１：１で混合し、室温で１０〜１６日間保存した。室温での保存後、各唾液／組成物混合物の一部をプロテイナーゼＫとともに５０℃で１時間、次いで９０℃で１５分間加熱した。ＳＤＳを塩化カリウムで沈殿させ、沈殿物の遠心分離による除去後、核酸を２倍量の９５％冷却エタノールで上清から沈殿させた。各沈殿核酸試料の一部をアガロースゲル電気泳動により分析し、臭化エチジウムで染色し、透光下で撮影した（図１２）。
【０１４６】
シュミット−タンホイザー（Ｓｃｈｍｉｄｔ−Ｔａｎｎｈａｕｓｅｒ）法の改良法を用い、本発明の組成物中の同じ６人の被験者から採取した唾液試料中でのＲＮＡの全量を評価した（図１２）。つまり、各試料の一部を水酸化ナトリウムで処理し、ＲＮＡをオリゴヌクレオチドまたはモノヌクレオチドに選択的に分解することで（冷却塩酸による沈殿を不可にすることで）、冷却ＨＣｌで沈殿可能な未分解のＤＮＡが残存する。このようにしてＤＮＡおよびＲＮＡは分解され、２６０ｎｍでの吸光度測定により定量可能である。
【０１４７】
ヒトメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）がこれらの唾液試料から安定化され、回収されることを実証するため、各被験者から得た精製試料の一部を、β２−ミクログロブリンのメッセンジャーＲＮＡに対するヒト特異的なプライマーを用いるＲＴ−ＰＣＲ分析における鋳型として使用した（図１３）。具体的には、各被験者由来の沈殿核酸試料の一部（図１２）をＤＮアーゼで処理し、ＤＮＡを消化した。次いで、ＤＮＡを含有しない試料をランダムヘキサヌクレオチドプライマーおよびＭ−ＭＶＬ逆転写酵素と混合し、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を合成した。最後に、ｃＤＮＡを希釈し、従来のＰＣＲ（表Ｉ）のため、ヒト特異的なプライマー（β２−ミクログロブリン−フォワード５’ｃｇｃｔａｃｔｃｔｃｔｃｔｔｔｃｔｇｇｃ（配列番号１）およびβ２−ミクログロブリン−リバース５’ａａｃｔｔｃａａｔｇｔｃｇｇａｔｇｇａｔ（配列番号２））およびＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼと混合し、定量リアルタイムＰＣＲ分析（表ＩＩ）のため、サイバーグリーン（ＳｙｂｒＧｒｅｅｎ）を添加した。図１５に示されるＣｔ値は、試料中のメッセンジャーＲＮＡの量に反比例する。ヒト結腸癌細胞系ＨＣＴ−１１６から精製したＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲ分析における陽性対照として使用した。陰性対照には、Ｍ−ＭＶＬ  ＲＴもｃＤＮＡも全く添加しなかった反応が含まれる。
【０１４８】
【表１２】
2014057590.tif 000013
【０１４９】
図１３の試料順序は以下の通りである。
【０１５０】
【表１３】
2014057590.tif 000014
【０１５１】
【表１４】
2014057590.tif 000015
【０１５２】
結論
この実施例は、唾液中のヒトメッセンジャーＲＮＡが本発明の組成物により安定化され、かつ抽出物がＲＴ−ＰＣＲ分析に適することを示す。
【０１５３】
実施例１３：本発明の組成物中で採取された唾液と混合されたウイルスＲＮＡの保存、放出および精製
この実施例では、逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を用い、本発明の組成物中で採取された唾液から回収された全ＲＮＡ中でのウイルスＲＮＡの検出が可能であることが示される。
【０１５４】
方法
被験者１由来の２つの唾液（１ｍＬ）試料に、ｐＨ６．６に緩衝化された４％  ＳＤＳ、５０ｍＭ  ＣＤＴＡとの１：１の混合の前に、４．２５×１０９ｐｆｕ（プラーク形成単位）の水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）を添加し、室温で５分間インキュベートした。各唾液／組成物試料からの一定分量０．５ｍＬを取り出し、プロテイナーゼＫとともに５０℃で１時間、次いで９０℃で１５分間加熱した。ＳＤＳを塩化カリウムで沈殿させ、沈殿物の遠心分離による除去後、核酸を２倍量の９５％冷却エタノールで上清から沈殿させた。各沈殿物を適切な緩衝液（０．１Ｍ  ＮａＣｌを含有するＣＢＳ１００μｌ）中に再溶解させ、次いで核酸を、冷却エタノール２００μｌを添加し−２０℃で４０分間インキュベートすることにより再沈殿させた。沈殿核酸を水５０μｌ中にリボヌクレアーゼ阻害剤を用いて再溶解した。上記の核酸の精製の前に、被験者１由来の１つの試料を室温で４週間保存した。被験者２由来の唾液試料２ｍＬを本発明の組成物と１：１で混合し、次いで５．０×１０７ｐｆｕのＶＳＶと混合した。室温で１８時間のインキュベーション後、ＲＮＡを８０℃で４０分間インキュベートすることにより一定分量０．５ｍＬから抽出し、その後の精製におけるステップは上記の通りであった。
【０１５５】
ウイルスＲＮＡが安定化されかつこれらの唾液試料から回収可能であることを実証するため、精製核酸の一部をＲＴ−ＰＣＲにおける鋳型として用い、ランダムヘキサヌクレオチドでプライムした。具体的には、試料の一部をランダムヘキサヌクレオチドプライマーおよびＭ−ＭＶＬ逆転写酵素と混合し、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を合成した。ｃＤＮＡの一部をウイルス特異的なプライマー（ＶＳＶ−フォワード５’ｇｇａｔｔａｔｔｃｃｃｔｃｔｇｃｃ（配列番号３）およびＶＳＶ−リバース５’ｇｔｔｃｃｃｔｔｔｃｔｇｔｇｇｔａｇ（配列番号４））、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼおよびサイバーグリーン（ＳｙｂｒＧｒｅｅｎ）と混合し、定量リアルタイムＰＣＲ分析により分析した。表ＩＩＩ、ＩＶおよびＶに示されるＣｔ値は、試料中のウイルス鋳型ＲＮＡの量に反比例する。ウイルス配列（ｐＶＳＶ）をコードするプラスミドＤＮＡをＲＴ−ＰＣＲ分析における陽性対照として使用した。陰性対照には、Ｍ−ＭＶＬ  ＲＴ（−ＲＴ）もｃＤＮＡも全く添加しなかった反応が含まれる。ＲＴ−ＰＣＲ結果を３つの別々の実験に対して示す（表ＩＩＩ−Ｖ）。
【０１５６】
【表１５】
2014057590.tif 000016
【０１５７】
【表１６】
2014057590.tif 000017
【０１５８】
【表１７】
2014057590.tif 000018
【０１５９】
結論
この実施例は、唾液中のウイルスＲＮＡが本発明の組成物により安定化され、かつ抽出材料がＲＴ−ＰＣＲ分析に適することを示す。
【０１６０】
実施例１４．室温で８週間にわたる唾液中のＲＮＡの安定性
この実施例では、組成物は、ｐＨ６．８に調整された４％  ＳＤＳ、５０ｍＭ  ＬｉＣＤＴＡ、２５０ｍＭ  ＬｉＣｌを含有した。１０人の被験者由来の唾液試料（２ｍＬ）を採取し、組成物と１：１で混合した。採取の直後、試料を激しく振とうし、一定分量１００μＬを取り出した。各一定分量を室温（ＲＴ）、４℃および−２０℃で保存した。ＲＴ、４℃、および−２０℃での１週間および８週間の保存後、試料を分析した。唾液／組成物混合物からＲＮＡを抽出するため、一定分量を、プロテイナーゼＫの存在下、５０℃で１時間、次いで９０℃で１５分間加熱した。ＳＤＳを塩化カリウムで沈殿させ、沈殿物の遠心分離による除去後、核酸を２倍量の９５％冷却エタノールで上清から沈殿させた。各沈殿核酸試料の一部をアガロースゲル電気泳動により分析し、臭化エチジウムで染色し、透光下で撮影した（図１４Ａおよび１４Ｂ）。
【０１６１】
ヒトメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）が、室温で１および８週間後、安定化されかつこれらの唾液試料から回収可能であることを実証するため、各被験者由来の精製核酸の一部を、ヒト１８ＳリボソームＲＮＡに特異的なプライマーを用いる逆転写酵素−ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）分析における鋳型として用いた。具体的には、逆転写酵素ステップの前に、各被験者由来の沈殿核酸試料の一部をＤＮアーゼで処理し、ＤＮＡを除去した。次いで、ＤＮＡを含有しない試料をランダムヘキサヌクレオチドプライマーおよびＭ−ＭＶＬ逆転写酵素と混合し、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を合成した。最後に、ｃＤＮＡを希釈し、定量リアルタイムＰＣＲ分析のため、ヒト特異的なプライマー（ヒト１８Ｓ−１６５フォワード５’ｇｔｇｇａｇｃｇａｔｔｔｇｔｃｔｇｇｔｔ（配列番号５）およびヒト１８Ｓ−１６５リバース５’ｇｇａｃａｔｃｔａａｇｇｇｃａｔｃａｃａｇ（配列番号６））、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼおよびサイバーグリーン（ＳｙｂｒＧｒｅｅｎ）と混合した。表ＶＩに示されるＣｔ（交差閾値）値は、試料中の１８Ｓ  ＲＮＡの量に反比例する。ヒト結腸癌細胞系ＨＣＴ−１１６から精製したＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲ分析における陽性対照として使用した。陰性対照には、Ｍ−ＭＶＬ  ＲＴ（−ＲＴ）もｃＤＮＡ／鋳型も全く添加しなかった反応が含まれる。
【０１６２】
図１４の試料順序は以下の通りである。
【０１６３】
【表１８】
2014057590.tif 000019
【０１６４】
【表１９】
2014057590.tif 000020
【０１６５】
結論
これらの例は、唾液の試料中のＲＮＡを室温で長期間安定化させるための本発明の組成物の有効性を示す。８週間後、１０人の被験者由来の唾液試料は、（図１４Ａおよび１４Ｂに示されるように）高分子量ＲＮＡが大して分解されず、（表ＶＩに示されるように）ヒト１８ＳリボソームＲＮＡにおけるＣｔ値の変化が有意でないことが示された。
【０１６６】
実施例１５：幼児および若年小児からのヒトＲＮＡの抽出および精製
この実施例では、ＲＴ−ＰＣＲを用い、本発明の組成物中で幼児および若年小児１１名の唾液から回収されたＲＮＡ中でのヒト特異的なメッセンジャーＲＮＡの検出が可能であることが示される。唾液試料の採取は、前記被験者が唾液１〜２ｍＬを採取デバイスに直接送達できなかったことから、フォームチップ綿棒（ｆｏａｍ−ｔｉｐｐｅｄ  ｓｗａｂ）（１被験者当たり綿棒５本）を用いて容易にした。少量の糖を用い、若年小児からの唾液の分泌が刺激された。試料採取の直後、ハサミを用いて各綿棒のフォームチップを切断し、ｐＨ６．８に調整された４％  ＳＤＳ、５０ｍＭ  ＬｉＣＤＴＡ、２５０ｍＭ  ＬｉＣｌを含む本発明の組成物（２ｍＬ）を有する採取デバイスに入れた。試料を激しく振とうし、室温（ＲＴ）で保存した。試料を、ＲＴで最大で１週間保存後、プロテイナーゼＫの存在下、５０℃で１時間加熱した。唾液／組成物をフォームチップから以下の低速遠心分離により回収した。チップを、１５ｍＬのコニカルチューブ内部に配置した５ｍＬのプラスチック注射器のバレルに移し、それに対して低速遠心分離を行った。回収された液体を採取デバイス内に残存する試料とともにプールした。唾液試料からＲＮＡを抽出するため、一定分量を９０℃で１５分間加熱し、ＳＤＳを塩化カリウムで沈殿させ、沈殿物の遠心分離による除去後、核酸を２倍量の９５％冷却エタノールで上清から沈殿させた。
【０１６７】
被験者１１名に由来する各沈殿核酸試料の一部を、ヒト１８ＳリボソームＲＮＡに特異的なプライマーを用いる逆転写酵素−ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）分析における鋳型として用いた。具体的には、逆転写酵素ステップの前に、各被験者由来の沈殿核酸試料の一部をＤＮアーゼで処理し、ＤＮＡを除去した。次いで、ＤＮＡを含有しない試料をランダムヘキサヌクレオチドプライマーおよびＭ−ＭＶＬ逆転写酵素と混合し、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を合成した。最後に、ｃＤＮＡを１０倍に希釈し、定量リアルタイムＰＣＲ分析のため、ヒト特異的なプライマー（ヒト１８Ｓ−１６５フォワード５’ｇｔｇｇａｇｃｇａｔｔｔｇｔｃｔｇｇｔｔ（配列番号５）およびヒト１８Ｓ−１６５リバース５’ｇｇａｃａｔｃｔａａｇｇｇｃａｔｃａｃａｇ（配列番号６））、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼおよびサイバーグリーン（ＳｙｂｒＧｒｅｅｎ）と混合した。表ＶＩＩに示されるＣｔ（交差閾値）値は試料中の１８Ｓ  ＲＮＡの量に反比例する。ヒト結腸癌細胞系ＨＣＴ−１１６から精製したＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲ分析における陽性対照として使用させた。陰性対照には、Ｍ−ＭＶＬ  ＲＴ（−ＲＴ）もｃＤＮＡ／鋳型も全く添加しなかった反応が含まれる。
【０１６８】
【表２０】
2014057590.tif 000021
【０１６９】
結論
これらの例は、幼児および若年小児、すなわち採取デバイスに直接唾を吐けない個体から非侵襲的に採取した唾液の試料中のＲＮＡを安定化するための本発明の組成物の有効性を示す。ＲＴ−ＰＣＲ分析に適する大量のヒトＲＮＡが前記「唾を吐かない者（ｎｏｎ−ｓｐｉｔｔｅｒｓ）」の唾液から回収されうる。
【０１７０】
実施例１６：被験者の鼻腔からヒトＲＮＡの新規供給源を得るためのプロトコル
被験者から鼻前部または鼻咽頭試料を採取するため、種々の道具の使用が可能である。粘膜細胞を硬いもしくは軟らかいブラシ、綿棒、またはプラスチック／木製のスクレーパを用いてこすり、液体（例えば生理食塩水）を導入して液体を回収することにより細胞を鼻腔から流し出すことが可能である。例えば、硬い綿棒／ブラシを鼻の前部に、かつ軟らかい綿棒／ブラシを後部鼻咽頭腔に置き、それを用いて粘膜分泌物を採取し、細胞を粘膜から優しくこすり落としてもよい。前記液体および／または道具を用いて採取した試料を、本発明の組成物を有する採取デバイスに送達してもよい。組成物の容量より多い容量の前記液体を導入することが望ましい状況であれば、それに対応するより多量の本発明の組成物が提供されることになる。切断デバイス（例えばハサミ）を用いて綿棒／アプリケータの取っ手の長さを短くすることで、採取デバイスの閉鎖が可能になる。あるいは、加圧下で折れる取っ手を有する綿棒またはブラシ、ならびに取っ手／シャフト内に成形された切断点を有する綿棒またはブラシを用い、試料採取が容易になりうる。「完全長」の取っ手により試料の採取が容易になり、かつ改変された切断点での綿棒／ブラシの短縮により採取デバイスへのよりよい適合が可能になる。鼻腔から採取した組織試料からＲＮＡを回収することも可能である。それに続くＲＮＡ単離においては、鼻形成術または内視鏡的洞手術を受ける患者から得られた新しい組織標本／生検（例えば正常な鼻粘膜または鼻ポリープ組織）の採取が本発明の組成物中で可能である。
【０１７１】
幼児または小児からの鼻試料（鼻前部または鼻咽頭）の採取は、一般にヒト成人において用いられる手順に対応する。かかる試料の採取に選択される綿棒または道具は、１）対象とされる空洞（例えば鼻孔、鼻咽頭腔）の範囲内に適合しかつそれに到達するように適切なサイジングおよび成形がなされ、２）安全で（例えば化学的残基を有しない）かつ汚染のない／無菌である（例えば核酸を有しない）と考えられる材料から作製され、かつ３）試料採取を容易にする適切な軟性／硬性と長さを有する取っ手を有することが必要であることは当業者には明らかであろう。試料採取の道具が綿棒である場合、試料採取が意図された綿棒の端（例えばフォームミット）が取っ手に固く付着される必要がある。
【０１７２】
一旦、鼻汁、剥離物、および／または組織を採取し、採取デバイス／容器に導入すると、すぐに試料を本発明の組成物と混合する。ＲＮＡ含有試料は室温で数か月間維持されうる。水溶液中のＲＮＡ含有試料の一部を逆転写（ＲＴ）反応におけるＲＮＡ鋳型として用い、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）の産生が可能であり、次いでそれはＰＣＲ反応で用いられうる。
【０１７３】
実施例１７：ヒト鼻試料中のＲＮＡの室温で４週間にわたる安定性
この実施例では、組成物は、ｐＨ６．８に調整された４％  ＳＤＳ、５０ｍＭ  ＬｉＣＤＴＡ、２５０ｍＭ  ＬｉＣｌを含有した。鼻前部試料を１被験者当たりフォームチップ綿棒２本で採取した。試料採取の直後、ハサミを用いて各綿棒のフォームチップを切断して、本発明の組成物（２ｍＬ）を有する採取デバイスに入れた。試料を激しく振とうし、室温（ＲＴ）で保存した。室温での１日および４週間の保存後、各試料由来の一定分量を分析した。鼻試料からＲＮＡを抽出するため、一定分量をプロテイナーゼＫの存在下、５０℃で１時間、次いで９０℃で１５分間加熱した。ＳＤＳを塩化カリウムで沈殿させ、沈殿物の遠心分離による除去後、核酸を２倍量の９５％冷却エタノールで上清から沈殿させた。
【０１７４】
７人の被験者由来の各沈殿核酸試料の一部を、ヒト１８ＳリボソームＲＮＡに特異的なプライマーを用いる逆転写酵素−ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）分析における鋳型として用いた。具体的には、逆転写酵素ステップの前に、各被験者由来の沈殿核酸試料の一部をＤＮアーゼで処理し、ＤＮＡを除去した。次いで、ＤＮＡを含有しない試料をランダムヘキサヌクレオチドプライマーおよびＭ−ＭＶＬ逆転写酵素と混合し、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を合成した。最後に、ｃＤＮＡを１０倍に希釈し、定量リアルタイムＰＣＲ分析のため、ヒト特異的なプライマー（ヒト１８Ｓ−１６５フォワード５’ｇｔｇｇａｇｃｇａｔｔｔｇｔｃｔｇｇｔｔ（配列番号５）およびヒト１８Ｓ−１６５リバース５’ｇｇａｃａｔｃｔａａｇｇｇｃａｔｃａｃａｇ（配列番号６））、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼおよびサイバーグリーン（ＳｙｂｒＧｒｅｅｎ）と混合した。表ＶＩＩＩに示されるＣｔ（交差閾値）値は試料中の１８Ｓ  ＲＮＡの量に反比例する。ヒト結腸癌細胞系ＨＣＴ−１１６から精製したＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲ分析における陽性対照として使用した。陰性対照には、Ｍ−ＭＶＬ  ＲＴ（−ＲＴ）もｃＤＮＡ／鋳型も全く添加しなかった反応が含まれる。
【０１７５】
【表２１】
2014057590.tif 000022
【０１７６】
結論
この実施例は、鼻腔から採取した試料中のＲＮＡを室温で長期間安定化させるための本発明の組成物の有効性を示す。４週間後、（表ＶＩＩＩに示されるように）７人の被験者由来の鼻前部試料が示すヒト１８ＳリボソームＲＮＡにおけるＣｔ値の変化は全く有意でなかった。重要なことに、この実施例は、鼻腔がヒトＲＮＡの新規供給源であることを示す。
【０１７７】
実施例１８：ヒト対象から唾液を得るためのプロトコル
この実施例は、図１５に示されるように、被験者から唾液を採取するために行われうるステップの一例を提供する。
【０１７８】
糖が用いられる場合、唾液の試料を得るのに平均で約１分かかる可能性があることに注意のこと。使用者が十分な唾液を作ることが困難である場合、もう少し多量の糖を用いてもよい。試料の採取を５分以内で完了させて、試料の採取を速やかに得ることが望ましい。糖代替物の使用も可能である。一旦、唾液試料が本発明の組成物中で採取されると、試料は室温（１５〜３０℃）で保存されうる。
【０１７９】
実施例１９：ＲＮＡを精製するためのプロトコル
この実施例は、本発明の組成物を用いて保存された試料からのＲＮＡの単離のために行われうるステップの一例を提供する。この実施例では、本発明の組成物を試料（唾液など）と混合し、室温で保存する。次いで、以下のステップを用い、試料／組成物混合物を処理し、ＲＮＡが試料から精製されうる。
【０１８０】
試薬および機器
１．中和剤溶液。
２．エタノール溶液：７０％および８０％（室温）、９５％（−２０℃）。
３．キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）アールエヌイージー・マイクロキット（ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｃｒｏ  Ｋｉｔ）（カタログ番号７４００４）および使用説明書。アールエヌイージー（ＲＮｅａｓｙ）キットの成分：ＲＬＴ緩衝液、ミンエルート（ＭｉｎＥｌｕｔｅ）スピンカラム、採取チューブ、ＲＷ１緩衝液、ディーエヌアーゼＩ（ＤＮａｓｅ  Ｉ）ストック溶液、ＲＤＤ緩衝液、ＲＰＥ緩衝液およびＲＮアーゼを含有しない水。あるいは、キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）アールエヌイージー・ミニキット（ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ）（カタログ番号７４１０４）は、キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）アールエヌアーゼ−フリー・ディーエヌアーゼ・セット（ＲＮａｓｅ−Ｆｒｅｅ  ＤＮａｓｅ  Ｓｅｔ）（カタログ番号７９２５４）と併用されうる。
【０１８１】
精製に先立つステップ
１．本発明の組成物と組み合わせた試料を受け取る場合（例えば研究室内で）、８秒以上の間、非常に激しく振とうさせる。
２．試料は、室温で最大で８週間保存されうる。または−２０℃で永続的に凍結保存されうる。
３．精製の前に、全試料を、５０℃で、水槽内で１時間またはエアインキュベーター内で２時間、元のバイアル内でインキュベートする。
【０１８２】
初期精製
１．一定分量２５０〜５００μＬを１．５ｍＬのマイクロ遠心チューブに移す（２つのチューブ内で一定分量１０００μＬが処理される必要がある）。
２．一定分量を９０℃で１５分間インキュベートし、次いで室温まで冷却する。
３．１／２５倍量の中和剤溶液（例えば試料２５０μＬに対して中和剤１０μＬ）を添加する。氷上で１０分間インキュベートする。
４．最大速度（＞１３，０００×ｇ）で３分間遠心分離する。
５．ペレットを破壊しないように注意し、上清を新しいチューブに慎重に移し、ペレットを捨てる。
６．２倍量の９５％冷却ＥｔＯＨ（エタノール）を添加する。転倒攪拌、ボルテックスまたは振とうにより徹底的に混合する。
７．−２０℃で３０分間インキュベートする。
８．沈殿物を最大速度（＞１３，０００×ｇ）で３分間の遠心分離により回収する。
９．ペレットを破壊しないように注意し、上清を慎重に移して捨てる。
１０．ペレットを緩衝液ＲＬＴ（アールエヌイージー（ＲＮｅａｓｙ））３５０μＬ中に激しいボルテックスにより溶解させる。このとき、ペレットが完全に溶解されるように注意する。
１１．１倍量（３５０μＬ）の７０％エタノールを添加する。ボルテックスにより十分に混合する。
１２．直ぐにキアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）アールエヌイージー・サンプル・ピューリフィケーション（ＲＮｅａｓｙ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）の使用説明書の手順に進む。
【０１８３】
キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）アールエヌイージー（ＲＮｅａｓｙ）精製手順
キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）アールエヌイージー・マイクロキット（ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｃｒｏ  Ｋｉｔ）による「動物細胞からの全ＲＮＡ単離」プロトコルのステップ＃５（注：溶出ステップ＃１３にやや改良を加えたもの）から開始。
５．２ｍＬの採取チューブ内のアールエヌイージー・ミンエルート（ＲＮｅａｓｙ  ＭｉｎＥｌｕｔｅ）スピンカラム上に試料を移す。蓋を閉じ、＞８０００×ｇで１５秒間遠心分離する。濾過物を捨てる。ステップ６で回収チューブを再使用する。
６．３５０μＬの緩衝液ＲＷ１をアールエヌイージー・ミンエルート（ＲＮｅａｓｙ  ＭｉｎＥｌｕｔｅ）スピンカラムに添加する。蓋を閉じ、＞８０００×ｇで１５秒間遠心分離する。濾過物を捨てる。ステップ８で回収チューブを再使用する。
７．１０μＬのディーエヌアーゼＩ（ＤＮａｓｅ  Ｉ）ストック溶液を７０μＬの緩衝液ＲＤＤに添加する。チューブを静かに反転させて混合する。
８．ディーエヌアーゼＩ（ＤＮａｓｅ  Ｉ）インキュベーション混合物（８０μＬ）をアールエヌイージー・ミンエルート（ＲＮｅａｓｙ  ＭｉｎＥｌｕｔｅ）スピンカラム膜上に直接添加し、ベンチトップ上で１５分間インキュベートする。
９．３５０μＬの緩衝液ＲＷ１をアールエヌイージー・ミンエルート（ＲＮｅａｓｙ  ＭｉｎＥｌｕｔｅ）スピンカラムに添加する。蓋を閉じ、＞８０００×ｇで１５秒間遠心分離する。濾過物および回収チューブを捨てる。
１０．アールエヌイージー・ミンエルート（ＲＮｅａｓｙ  ＭｉｎＥｌｕｔｅ）スピンカラムを新しい２ｍＬの回収チューブ内に設置する。５００μＬの緩衝液ＲＰＥをスピンカラムに添加する。蓋を閉じ、＞８０００×ｇで１５秒間遠心分離する。濾過物を捨てる。ステップ１１で回収チューブを再使用する。
１１．８０％エタノール５００μＬをアールエヌイージー・ミンエルート（ＲＮｅａｓｙ  ＭｉｎＥｌｕｔｅ）スピンカラムに添加する。蓋を閉じ、＞８０００×ｇで２分間遠心分離する。濾過物および回収チューブを捨てる。
１２．アールエヌイージー・ミンエルート（ＲＮｅａｓｙ  ＭｉｎＥｌｕｔｅ）スピンカラムを新しい２ｍＬの回収チューブ内に設置する。スピンカラムの蓋を開き、全速で５分間遠心分離する。濾過物および回収チューブを捨てる。
１３．アールエヌイージー・ミンエルート（ＲＮｅａｓｙ  ＭｉｎＥｌｕｔｅ）スピンカラムを新しい１．５ｍＬの回収チューブ内に設置する。ＲＮアーゼを含有しない水２５μＬをスピンカラム膜の中央に直接添加する。室温で５分間インキュベートする。蓋を閉じ、全速で１分間遠心分離し、ＲＮＡを溶出する。
【０１８４】
実施例２０：本発明の組成物中での鼻試料からの小児由来のヒトＲＮＡの抽出および精製
この実施例では、ＲＴ−ＰＣＲを用い、本発明の組成物中で若年小児６名の鼻腔前部から回収されたＲＮＡ中のヒト特異的なメッセンジャーＲＮＡを検出した。試料を、フォームチップ綿棒２本（１鼻孔につき綿棒１本）を用いて採取した。具体的には、成人がフォームチップを小児の鼻腔前部／下部に挿入し、フォームチップで綿棒を円運動させることにより粘膜を採取した。第２の鼻孔においては新しい綿棒で手順を繰り返した。試料採取の直後、ハサミを用い、各綿棒のフォームチップを切断し、ｐＨ６．８に緩衝化された４％  ＳＤＳ、５０ｍＭ  ＬｉＣＤＴＡ、２５０ｍＭ  ＬｉＣｌからなる本発明の組成物（２ｍＬ）を有する採取デバイスに入れた。試料を激しく振とうし、室温（ＲＴ）で保存した。
【０１８５】
試料を、室温で１〜４日間保存後、プロテイナーゼＫの存在下、５０℃で１時間加熱した。フォームチップにより吸収された鼻試料／組成物混合物を以下のような低速遠心分離により回収した。フォームチップ（１小児当たり２つ）を１５ｍＬのコニカルチューブ内部に配置した５ｍＬのプラスチック注射器のバレルに移し、それに対して低速遠心分離を行った。フォームチップから１５ｍＬのコニカルチューブに回収された鼻試料／組成物を採取デバイス内に残存する鼻試料／組成物とともにプールした。鼻試料からＲＮＡを抽出するため、一定分量（５００μＬ）を９０℃で１５分間加熱し、ＳＤＳを塩化カリウムで沈殿させ、沈殿物を遠心分離により除去し、核酸を得られた上清から２倍量の９５％冷却エタノールで沈殿させた。最終的な核酸ペレットを、リボヌクレアーゼを含有しない水中に溶解した。
【０１８６】
小児６名由来の各沈殿核酸試料の一部を、ヒト１８ＳリボソームＲＮＡ（１８Ｓ  ｒＲＮＡ）に特異的なプライマーを用いる逆転写酵素−ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）分析における鋳型として用いた。具体的には、逆転写酵素ステップの前に、各被験者由来の沈殿核酸試料の一部をＤＮアーゼで処理し、ＤＮＡを除去した。次いで、ＤＮＡを含有しない試料をランダムヘキサヌクレオチドプライマーおよびＭ−ＭＶＬ逆転写酵素と混合し、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を合成した。最後に、ｃＤＮＡを１０倍に希釈し、定量リアルタイムＰＣＲ分析のため、１８Ｓ  ｒＲＮＡプライマー（１８Ｓ−１６５フォワード５’ｇｔｇｇａｇｃｇａｔｔｔｇｔｃｔｇｇｔｔ（配列番号５）および１８Ｓ−１６５リバース５’ｇｇａｃａｔｃｔａａｇｇｇｃａｔｃａｃａｇ（配列番号６））、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼおよびＳｙｔｏ９と混合した。表ＩＸに示されるＣｔ（交差閾値）値は試料中の１８Ｓ  ｒＲＮＡの量に反比例する。ヒト結腸癌細胞系ＨＣＴ−１１６から精製したＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲ分析における陽性対照として使用した。陰性対照には、Ｍ−ＭＶＬ  ＲＴ（−ＲＴ）もｃＤＮＡ／鋳型も全く添加しなかった反応が含まれる。
【０１８７】
【表２２】
2014057590.tif 000023
【０１８８】
結論
この実施例は、小児由来の鼻前部試料中のＲＮＡを抽出しかつ安定化させるための本発明の組成物の有効性を示す。ＲＴ−ＰＣＲ分析に適する大量のヒトＲＮＡは、侵襲性が最小限のこの採取方法および安定化組成物により小児から回収されうる。
【０１８９】
実施例２２：家畜の鼻腔および口腔から試料を得るためのプロトコル
鼻腔および口腔試料を、肉牛、乳牛、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ニワトリおよびウマなどの家畜から採取してもよい。非限定的な具体例としては、鼻腔または口腔試料は、乳牛（ボビダエ・ボス・タウルス（Ｂｏｖｉｄａｅ  Ｂｏｓ  ｔａｕｒｕｓ））から、ウシが搾乳室内の支柱の所に立っている間かまたは檻につながれている間、容易に採取可能である。動物の年齢、サイズ、および／または力により、鼻試料の採取における動物の頭部の制止／固定または口腔試料の採取における動物の口を開けるのに調教師の支援が必要とされる場合もあればそうでない場合もある。種々の道具を用い、家畜からの鼻腔および口腔試料の採取が可能である。例えば、上記の実施例１６における道具と同じかまたは類似の道具の使用が可能である。道具が挿入されることになる空洞の寸法を考慮し、道具を適切にサイジングする必要がある。この方法を用いると獣医の支援が必要でない場合があることは明白であろう。
【０１９０】
実施例２３：本発明の組成物を用いてホルスタイン乳牛（ボビダエ・ボス（Ｂｏｖｉｄａｅ  ｂｏｓ））由来の鼻試料中で安定化されたＲＮＡ
この実施例では、組成物は、ｐＨ６．８に緩衝化された４％  ＳＤＳ、５０ｍＭ  ＬｉＣＤＴＡ、２５０ｍＭ  ＬｉＣｌを含有した。鼻前部試料を、ウシ１頭につき大きいフォームチップ綿棒（頭長２．６ｃｍ、頭幅１．２ｃｍ、綿棒長１５．１ｃｍ）１本を用いて採取した。各々の場合、ウシの頭部を「調教師」により固定する間、「コレクター（ｃｏｌｌｅｃｔｏｒ）」により綿棒のフォームチップをウシの鼻孔、具体的には鼻前部に速やかに挿入した。フォームチップを鼻前部／鼻孔の粘膜に対して速やかにこすり、次いで回収した。通常、「調教師」は子牛からの鼻試料の採取にとって必要ではない。採取直後、ハサミを用い、綿棒のフォームチップを切断し、本発明の組成物（２ｍＬ）を有する採取デバイスに入れた。試料を激しく振とうし、室温（ＲＴ）で保存した。
【０１９１】
室温で１６日後、フォームチップにより吸収された試料／組成物混合物を以下の低速遠心分離により回収した。フォーセップス（Ｆｏｒｃｅｐｓ）を用い、フォームチップを１５ｍＬのコニカルチューブ内部に配置した５ｍＬのプラスチック注射器のバレルに移し、それに対して低速遠心分離を行った。このプロセスによりフォームチップから回収された試料／組成物を、採取デバイス内の試料／組成物とともにプールした。鼻試料からＲＮＡを抽出するため、各一定分量をプロテイナーゼＫの存在下、５０℃で１時間、次いで９０℃で１５分間加熱し、ＳＤＳを塩化カリウムで沈殿させ、沈殿物の遠心分離による除去後、核酸を２倍量の９５％冷却エタノールで上清から沈殿させた。最終的な核酸ペレットを、リボヌクレアーゼを含有しない水中に溶解した。
【０１９２】
乳牛８頭由来の各沈殿核酸試料の一部を、１８ＳリボソームＲＮＡに対するプライマーを用いる逆転写酵素−ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）分析における鋳型として用いた。具体的には、逆転写酵素ステップの前に、各乳牛由来の沈殿核酸試料の一部をＤＮアーゼで処理し、ＤＮＡを除去した。次いで、ＤＮＡを含有しない試料をランダムヘキサヌクレオチドプライマーおよびＭ−ＭＶＬ逆転写酵素と混合し、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を合成した。最後に、ｃＤＮＡを１０倍に希釈し、定量リアルタイムＰＣＲ分析のため、１８ＳリボソームＲＮＡプライマー（１８Ｓ−１６５フォワード５’ｇｔｇｇａｇｃｇａｔｔｔｇｔｃｔｇｇｔｔ（配列番号５）および１８Ｓ−１６５リバース５’ｇｇａｃａｔｃｔａａｇｇｇｃａｔｃａｃａｇ（配列番号６））、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼおよびＳｙｔｏ９と混合した。表Ｘに示されるＣｔ（交差閾値）値は、試料中の１８ＳリボソームＲＮＡの量に反比例する。ＨＣＴ−１１６  ＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲ分析における陽性対照として使用した。陰性対照には、Ｍ−ＭＶＬ  ＲＴ（−ＲＴ）もｃＤＮＡ／鋳型も全く添加しなかった反応が含まれる。
【０１９３】
【表２３】
2014057590.tif 000024
【０１９４】
結論
この実施例は、（表Ｘに示されるように）乳牛の鼻腔前部から採取した試料中のＲＮＡを抽出しかつ安定化させるための本発明の組成物の有効性を示す。重要なことには、この実施例は、鼻腔がウシにおけるメッセンジャーＲＮＡの新規の豊富な供給源であることを示す。
【０１９５】
参考文献
1. Analysis of gene expression profiles of normal human nasal mucosa and nasal polyp tissues by SAGE. Lee JY et al. (2006) J Allergy Clin Immunol 118(1): 134-142.
2. Optimization of the Weck-Cel collection method for quantitation of cytokines in mucosal secretions. Rohan LC et al. (2000) Clin Diagn Lab Immunol 7(1): 45-48.
3. Development and evaluation of a novel loop-mediated isothermal amplification method for rapid detection of severe acute respiratory syndrome coronavirus. Thai HTC et al. (2004) J Clin Microbiol 42(5): 1956-1961.
4. World Health Organization Multicentre Collaborative Network for Severe Acute Respiratory Syndrome Diagnosis (2003). A multicentre collaboration to investigate the cause of severe acute respiratory syndrome. Lancet 361: 1730-1733.
5. Evaluation of reverse transcription-PCR assays for rapid diagnosis of severe acute respiratory syndrome associated with a novel coronavirus. Yam WC et al. (2003) J Clin Microbiol 141: 4521-4524.
6. Epidemiological determinants of spread of causal agent of severe acute respiratory syndrome in Hong Kong. Donnelly CA et al. (2003) Lancet 361: 1761-1766.
7. Evaluation of serological and virological tests in the diagnosis of clinical and subclinical measles virus infections during an outbreak of measles in the Netherlands. van Binnendijk RS et al. (2003) J Infectious Dis 188: 898-903.
8. Investigation of optimal specimen type and sampling time for detection of measles virus RNA during a measles epidemic. Riddell MA et al. (2001) J Clin Microbiol 39(1): 375-376.
9. Evaluation of events occurring at mucosal surfaces: techniques used to collect and analyze mucosal secretions and cells. Guy B (2002) Clin Diagn Lab Immunol 9(4): 753-762.
10. Initial viral load and the outcomes of SARS. Chu C-M et al. (2004) CMAJ 171(11): 1349-1352.
11. Clinical progression and viral load in a community outbreak of coronavirus-associated SARS pneumonia: a prospective study. Peiris JS et al. (2003) Lancet 361: 1767-1772.
12. Development of a western blot assay for detection of antibodies against coronavirus causing severe acute respiratory syndrome. He Q et al. (2004) Clin Diagn Lab Immunol 11(2): 417-422.
【０１９６】
本明細書中に記載のあらゆる出版物、特許および特許出願は、本発明が関連する技術分野における当業者のスキルのレベルを示し、出版物、特許または特許出願の各々が具体的かつ個別に参照により援用されるように示された場合と同程度に参照により本明細書中に援用される。
【０１９７】
本発明がこのように記載されていることから、同じものが多くの方法で変形されうることは明らかであろう。かかる変形は、本発明の精神および範囲から逸脱するものとしてみなされるべきではなく、当業者にとってみれば明らかとなるあらゆるかかる改良は以下の特許請求の範囲の中に含まれるように意図されている。
【図１】
2014057590.tif 000025
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
2014057590.tif 000034
【図１１】
2014057590.tif 000035
【図１２】
2014057590.tif 000036
【図１３】
2014057590.tif 000037
【図１４Ａ】
2014057590.tif 000038
【図１４Ｂ】
2014057590.tif 000039
【図１５】
2014057590.tif 000040
【配列表】
2014057590000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成25年12月25日(2013.12.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料由来のリボ核酸を、前記試料中の前記リボ核酸が室温で安定に維持されるように抽出しかつ保存するための組成物であって、
ａ．アニオン系界面活性剤、および
ｂ．ｐＨ５．５〜７．５の緩衝剤、を含有し、
前記組成物が前記試料と混合されて液体混合物を形成したとき、前記液体混合物における前記アニオン系界面活性剤の濃度が２〜８％となるように前記試料と混合される、組成物。
【請求項２】
プロテアーゼを更に含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記プロテアーゼがプロテアーゼＫである、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記アニオン系界面活性剤が、ドデシル硫酸ナトリウム、ラウロイルサルコシン酸ナトリウム、ドデシル硫酸リチウムまたは１−オクタンスルホン酸ナトリウムである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
前記アニオン系界面活性剤がドデシル硫酸ナトリウムまたはラウロイルサルコシン酸ナトリウムである、請求項１〜３のいずれか一項に記載に記載の組成物。
【請求項６】
前記緩衝剤が、シクロヘキサンジアミンテトラアセテート（ＣＤＴＡ）ナトリウム、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−エタンスルホン酸（ヘペス）、酢酸または酢酸塩、クエン酸またはクエン酸塩、リンゴ酸、フタル酸、コハク酸、ヒスチジン、ピロリン酸、マレイン酸、カコジル酸、ββ’−ジメチルグルタル酸、炭酸または炭酸塩、５（４）−ヒドロキシメチルイミダゾール、グリセロール２−リン酸、エチレンジアミン、イミダゾール、ヒ酸、リン酸またはリン酸塩、酢酸ナトリウム、２：４：６−コリジン、５（４）−メチルイミダゾール、Ｎ−エチルモリホリン、トリエタノールアミン、ジエチルバルビツール酸、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス）、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸、４−モルホリンプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、２−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、ピペラジン−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］−２−アミノエタンスルホン酸（ＴＥＳ）、４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−プロパンスルホン酸（ＥＰＰＳ）、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、あるいはこれらの組み合わせである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
前記緩衝剤が、リン酸塩緩衝液、炭酸塩緩衝液、エチレンジアミン緩衝液またはイミダゾール緩衝液である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
前記緩衝剤がＣＤＴＡまたはクエン酸である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
前記試料が哺乳動物由来の体液または体組織である、請求項１〜８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記哺乳動物がヒトまたはウシである、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記試料が、ヒト；非ヒト霊長動物；ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ並びにニワトリ、シチメンチョウ、キジ、アヒル及びガチョウからなる群から選択される家禽からなる群から選択される家畜；シカ、ヘラジカ、ムース、魚、鳥及びクマからなる群から選択される狩猟動物または野生動物；非ヒト霊長類並びにマウス、ラット、ウサギ、モルモット、アレチネズミ及びハムスターからなる群から選択される齧歯類から選択される実験動物またはペット；イヌ；ネコ；魚；ヘビ；トカゲ；カメ；ウマ；植物；植物の一部；細胞系；土壌微生物；汚水微生物；または、ウイルス、細菌及び寄生虫からなる群から選択される病原微生物に由来する、請求項１に記載の組成物。