(57)【要約】      （修正有）【課題】血小板由来成分を徐放して優れた組織再生促進効果を発揮することができる徐放性組織再生材料の提供。【解決手段】コラーゲン及び／又はゼラチンからなる生体吸収性多孔質基材と、該生体吸収性多孔質基材に担持された血小板分解産物とからなる徐放性組織再生材料。該血小板分解産物は、濃縮されたものであることが好ましい。該生体吸収性多孔質基材は、コラーゲンとゼラチンとの複合体であることが好ましい。該徐放性組織再生材料は、生体組織が創傷や火傷によって広範囲に欠損した場合、早期に欠損部を閉鎖することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
コラーゲン及び／又はゼラチンからなる生体吸収性多孔質基材と、該生体吸収性多孔質基材に担持された血小板分解産物とからなることを特徴とする徐放性組織再生材料。
【請求項２】
血小板分解産物は、濃縮されたものであることを特徴とする請求項１記載の徐放性組織再生材料。
【請求項３】
生体吸収性多孔質基材は、コラーゲンとゼラチンとの複合体であることを特徴とする請求項１又は２記載の徐放性組織再生材料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血小板由来成分を徐放して優れた組織再生促進効果を発揮することができる徐放性組織再生材料に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体組織が創傷や火傷によって広範囲に欠損した場合、早期に欠損部を閉鎖するとともに、欠損した組織を早急に再生する必要がある。このような生体組織欠損部の閉鎖、再生を促進するために種々の組織再生材料が提案されている。このような組織再生材料としては、コラーゲン、ゼラチン等の天然高分子からなるものや、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ−ε−カプロラクトン等の合成高分子からなるものがある。なかでも、コラーゲンやゼラチンを多孔質状に加工した組織再生材料は、生体適合性に優れ、細胞増殖の足場材料としても優れていることから、創傷被覆材、人工皮膚、生体組織補綴材等の種々の組織再生材料として用いられている。
【０００３】
組織再生材料を用いて生体組織を再生を促進させる方法として、成長因子や細胞増殖因子を組織再生材料に担持させ、それを徐放させる方法も提案されている。なかでも、塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）には優れた組織再生促進効果が認められ、これをコラーゲンスポンジからなる組織再生材料に担持させた組織再生用基材も提案されている（特許文献１）。特許文献１に記載された組織再生用基材を組織欠損部に移植すれば、ｂＦＧＦが徐々に放出されることから、長期にわたって組織再生促進効果が発揮される。
【０００４】
しかしながら、本来の生体組織の治癒には、血液中の血小板が大きな役割を果たすことが知られている。従って、脳下垂体由来のｂＦＧＦよりも、血小板由来成分を用いた方が、より自然に近い治癒が期待される。また、現時点においてｂＦＧＦを医療用材料として認可している国も限られており、世界的な利用は難しい状況にある。
【０００５】
これに対して特許文献２には、多血小板血漿（Ｐｌａｔｅｌｅｔ  Ｒｉｃｈ  Ｐｌａｓｍａ、以下「ＰＲＰ」ともいう。）とゼラチンハイドロゲルとを含む徐放製剤が開示されている。ＰＲＰとは、末梢血を低速で遠心分離して赤血球を除くことにより得られる濃厚血小板血漿である。ＰＲＰには、血小板中に含まれる血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、トランスホーミング成長因子β（ＴＧＦ−β）、繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）等の成長因子が多く含まれていることから、これをゼラチンハイドロゲル中に担持させ徐放させることにより、組織再生促進効果が発揮されるとされている。
しかしながら、実際にＰＲＰを含むゼラチンハイドロゲルを組織欠損部に移植しても、期待したほどには組織再生促進効果が得られないという問題があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００７−６８８８４号公報
【特許文献２】特開２００４−１２３５７６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、血小板由来成分を徐放して優れた組織再生促進効果を発揮することができる徐放性組織再生材料を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、コラーゲン及び／又はゼラチンからなる生体吸収性多孔質基材と、該生体吸収性多孔質基材に担持された血小板分解産物とからなる徐放性組織再生材料である。
以下に本発明を詳述する。
【０００９】
本発明者は、ＰＲＰを含むゼラチンハイドロゲルが期待したほどには組織再生促進効果を有しない原因について検討した。その結果、ＰＲＰをゼラチンハイドロゲル中に含ませても、実際にはＰＲＰはほとんどゼラチンには吸着されていないか、吸着されているとしても保持力が極めて弱く、初期の段階でほとんどが流出してしまっていることを見出した。
本発明者は、更に鋭意検討の結果、ＰＲＰに代えて血小板分解産物（Ｐｌａｔｅｌｅｔ  Ｌｙｓａｔｅ、以下「ＰＬ」ともいう。）を用いることにより、コラーゲン及び／又はゼラチンからなる生体吸収性多孔質基材に容易に、かつ、比較的強い強度で吸着させることができ、長期に渡って徐放させることができることを見出し、本発明を完成した。
【００１０】
本発明の徐放性組織再生材料は、生体吸収性多孔質基材と、該生体吸収性多孔質基材に担持されたＰＬとからなる。
本明細書においてＰＬとは、血液から分離した血小板を破壊した後、遠心分離して固体成分を分離して得た上澄み分画を意味する。ＰＬは、血小板中に含まれる血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、トランスホーミング成長因子β（ＴＧＦ−β）、繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）等の成長因子を含有する一方、血小板の細胞壁に由来する固体成分を含有しない。この点においてＰＲＰとは明確に区別されるものである。
ＰＲＰに比べてＰＬが生体吸収性多孔質基材に容易に、かつ、比較的強い強度で吸着させることができる理由は不明であるが、おそらく血小板に由来する固体成分に吸着を妨げる作用があり、それを除いたＰＬの吸着性能が向上するためと考えられる。
また、ＰＬは濃縮が可能であることから、容易に高濃度で生体吸収性多孔質基材に担持させることが可能である。更に、ＰＬはＰＲＰに比べて保存安定性にも優れるという利点もある。
【００１１】
上記ＰＬは、血小板を破壊した後、遠心分離して固体成分を分離して得た上澄み分画からなる。
上記ＰＬの原料は血液であるが、効率の点から、成分献血により回収した血小板を用いることが好ましい。
上記血小板を破壊する方法は特に限定されず、液体窒素等を用いて凍結と溶融とを繰り返す方法や、トロンビンを用いる方法等が挙げられる。これらの方法は、血小板中に含まれる血小板由来成長因子等を活性化する効果もある。
上記遠心分離して固体成分を分離して得た上澄みは、更に、血小板に由来する固体成分を確実に除く目的で、フィルターを用いて濾過することが好ましい。
【００１２】
上記方法により得られたＰＬは、凍結乾燥を行った後、より少量の蒸留水、生理食塩水、緩衝液等を用いて再溶解することにより、容易に濃縮することができる。このような濃縮ＰＬを用いることにより、より高濃度で生体吸収性多孔質基材に担持させることができる。
【００１３】
上記生体吸収性多孔質基材は、コラーゲン及び／又はゼラチンからなる。
上記生体吸収性多孔質基材は、コラーゲン又はゼラチンからなるものであってもよいが、コラーゲンとゼラチンとの複合体が好適である。
【００１４】
上記ゼラチンは特に限定されず、例えば、牛、豚、鶏、鮭等の骨、腱、皮等に由来するものを用いることができる。上記ゼラチンは、酸処理又はアルカリ処理されていることが好ましい。酸処理されたゼラチンは正電荷に、アルカリ処理されたゼラチンは負電荷に帯電することから、この電荷を利用すれば、正又は負の電荷を有するゼラチンを含む生体吸収性多孔質基材に、静電結合により上記ＰＬを変性させることなく比較的強固に吸着させることができ、ＰＬの良好な徐放が可能になる。
【００１５】
上記コラーゲンは特に限定されず、牛、豚等の皮膚や腱等に由来するものを用いることができる。抗原性を排除してより安全性を高める観点から、コラーゲンをプロテアーゼやペプシン等の酵素で処理して、テロペプチドをできる限り除去したアテロコラーゲンが好ましい。アテロコラーゲンには、Ｉ〜ＩＶ型があるが、基材の用途に応じて選択することができる。培養皮膚や創傷被覆材として用いる場合、真皮の構成成分に近い、Ｉ又はＩＩＩ型を用いることが好ましい。生体吸収性多孔質基材にコラーゲンを含有させることにより、該基材への細胞の侵入が容易となる。
【００１６】
上記生体吸収性多孔質基材がコラーゲンとゼラチンとの複合体である場合、上記生体吸収性多孔質基材に含まれるゼラチンの含有量の好ましい下限は１重量％、好ましい上限は７０重量％である。ゼラチンの含有量が１重量％未満であると、静電的相互作用により上記ＰＬを吸着する性能が低くなり、得られる徐放性組織再生材料の徐放性能が低下することがあり、７０重量％を超えると、得られる徐放性組織再生材料への細胞の侵入性が低下することがある。ゼラチンの含有量のより好ましい下限は２０重量％、より好ましい上限は６０重量％であり、更に好ましい下限は３０重量％、更に好ましい上限は５０重量％である。
【００１７】
上記生体吸収性多孔質基材は、三次元的に組織を再生する基材とするため、多孔質構造を有する。なかでも、多数の連続孔（連続した微細小孔）を有していることが好ましい。このような多数の連続孔を有することにより、本発明の徐放性組織再生材料に細胞を播種したときには、細胞が微細小孔内に浸入して接着し三次元的に伸展することが可能となり、また、細胞を播種することなく移植した場合にも、周辺の細胞が容易に侵入することができる。更に、接着した細胞へ充分な栄養を供給することが可能となり、細胞を正常に増殖及び分化させることができる。
【００１８】
上記生体吸収性多孔質基材の微細小孔の平均孔径は、再生しようとする組織又は器官により最適な値を選択することができるが、好ましい下限は１０μｍ、好ましい上限は５００μｍである。上記微細小孔の平均孔径が１０μｍ未満であると、徐放性組織再生材料の内部に細胞が侵入できず細胞接着性が極端に劣ったり、接着した細胞が三次元的に伸展できなかったりすることがあり、５００μｍを超えると、細胞の密度が低くなり組織又は器官を再生できないことがある。上記微細小孔の平均孔径のより好ましい下限は５０μｍ、より好ましい上限は３００μｍである。
【００１９】
上記組織再生用基材を調製する方法は特に限定されず、例えば、コラーゲン及び／又はゼラチンを含む水性混合物を凍結乾燥した後、得られた一次凍結乾燥体に架橋処理を施す等の従来公知の方法により調製することができる。
【００２０】
即ち、まず、上記ゼラチン及び／又はコラーゲンを溶解した水溶液を調製し、これを適当な型枠の中に流延した後、−４０〜−８０℃で３０分〜２時間程度凍結する。この凍結物を凍結乾燥することにより一次凍結乾燥体が得られる。
【００２１】
次に、得られた一次凍結乾燥体に適当な架橋処理を施すことにより、生体組織欠損部に移植した場合にでも一定期間形状を保持する性能を付与することができる。
上記架橋処理の方法は特に限定されず、例えば、熱架橋法、紫外線照射法、電子線照射法、Ｘ線照射法、グルタルアルデヒド等の架橋剤を用いる化学架橋法等が挙げられる。そのうち、基材の全体が均一の架橋度となるように架橋できることから、熱架橋法や架橋剤を用いる化学架橋法が好適である。
【００２２】
上記組織再生用基材に施す架橋処理の程度は特に限定されないが、下記式にて算出される含水率が９０〜９９．８％程度となるように架橋処理を施すことが好ましい。上記含水率が９０％未満であると、得られる徐放性組織再生材料が移植に適する柔軟性を有しないことがあり、９９．８％を超えると、得られる徐放性組織再生材料が培養液や緩衝液中で強度を保つことができないことがある。上記含水率のより好ましい下限は９５％、より好ましい上限は９８％である。
含水率（％）＝［（Ｗｓ−Ｗｄ）／Ｗｓ］×１００（％）
式中、Ｗｓは、組織再生用基材を２５℃においてリン酸緩衝生理食塩水中に１時間浸漬したときの重量（湿潤重量）を表し、Ｗｄは、癒着防止材を真空乾燥機を用いて完全に乾燥したときの重量（乾燥重量）を表す。
【００２３】
上記組織再生用基材に上記ＰＬを担持させる方法は特に限定されず、例えば、上記ＰＬ又はＰＬの濃縮物を上記組織再生用基材に滴下したり、含浸させたりする方法等が挙げられる。
なお、上記組織再生用基材にＰＬを担持させた後、凍結乾燥を行うことにより、本発明の徐放性組織再生材料の保存性を著しく向上させることも可能である。
【００２４】
本発明の徐放性組織再生材料における上記ＰＬの含有量は、その再生する対象組織等に応じて適宜選択することができ特に限定はないが、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）換算での好ましい範囲は０．１〜５０ｎｇ／ｃｍ３、より好ましい範囲は１〜１０ｎｇ／ｃｍ３であり、トランスホーミング成長因子β（ＴＧＦ−β）換算での好ましい範囲は１〜１０００ｎｇ／ｃｍ３、より好ましい範囲は２０〜２００ｎｇ／ｃｍ３である。
【００２５】
生体内において血小板は、創傷等により欠損した生体組織の治癒には不可欠な役割を果たすものである。本発明の徐放性組織再生材料は、血小板由来のＰＬを長時間に渡り安定して徐放できるという、優れた徐放性能を有している。これにより、ｂＦＧＦを用いた組織再生材料と同様に優れた生体組織再生促進効果を発揮できるとともに、より自然に近い治癒が期待される。また、血小板から調製されるＰＬは、ｂＦＧＦとは異なり医療用材料としての制限も少ないことから、各国の医療行政にかかわらず世界的な利用も考えられる。更に、患者から採取した血小板から調製したＰＬを用いることも可能である。
本発明の徐放性組織再生材料は、例えば、皮膚、骨、軟骨、心筋、脂肪等の生体組織の再生に好適に用いられる。なかでも、皮膚（真皮）の組織再生用、即ち人工真皮として特に好適である。
【発明の効果】
【００２６】
本発明によれば、血小板由来成分を徐放して優れた組織再生促進効果を発揮することができる徐放性組織再生材料を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】実施例及び比較例で得られた徐放性組織再生材料からの血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）の徐放性の評価
【図２】実施例１で得られた徐放性組織再生材料からのトランスホーミング成長因子β（ＴＧＦ−β）の徐放性の評価
【図３】全創皮膚欠損創に徐放性組織再生材料を移植した後の残存創面積の評価
【図４】全創皮膚欠損創に徐放性組織再生材料を移植した後の上皮化進展距離の評価
【発明を実施するための形態】
【００２８】
以下に実施例を挙げて本発明の態様を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例にのみ限定されるものではない。
【００２９】
（実施例１）
（１）ＰＬの調製
全血液から血液成分分離装置を用いて血小板成分を採取し、濃厚血小板を調製した。得られた濃厚血小板を−８０℃で一晩凍結し、３７℃で急速に解凍した。この操作を２回繰り返した。解凍した濃厚血小板を遠心分離（３０００ｇ、３０分）して上澄みを採取した。採取した上澄みをフィルター（孔径０．２２μｍ、商品名「Ｓｔｅｒａｄｉｓｃ」、倉敷紡績社製）で濾過し、非濃縮タイプのＰＬを調製した。
得られた非濃縮タイプのＰＬは、ヘパリンを２単位／ｍＬの割合で添加したうえで、−８０℃で保管した。更に、凍結保存しておいた非濃縮タイプのＰＬを、凍結乾燥機を用いて−３０℃で凍結乾燥させて粉末ＰＬを調製した。粉末ＰＬは、４℃で保管した。
使用直前に、粉末ＰＬを元の溶液量の１／４量の生理食塩水に溶解させて４倍濃縮ＰＬを調製し、更に生理食塩水を加えてＰＬの２倍濃縮物を得た。
【００３０】
（２）生体吸収性多孔質基材の調製
豚腱由来タイプＩコラーゲンと豚皮膚由来ゼラチンとを、ゼラチンの比率が１０重量％となるように混合し、蒸留水に溶解して水溶液とした。得られた水溶液を型枠に入れて−４０℃で１時間凍結し、その後凍結乾燥することにより一次凍結乾燥体を得た。
得られた一次凍結乾燥体を真空下、１１０℃で処理することにより熱架橋を行った。更に熱架橋後、０．２％グルタルアルデヒドを含む０．０５Ｎ酢酸水溶液に浸漬し、化学架橋を行った。水洗にて余剰のグルタルアルデヒドを除去し、再度凍結乾燥することにより架橋された生体吸収性多孔質基材を得た。
【００３１】
（３）徐放性組織再生材料の製造
ＰＬの２倍濃縮物１５０μＬを、１ｃｍ×１．５ｃｍ、厚さ３ｍｍに成形した上記生体吸収性多孔質基材に滴下して、徐放性組織再生材料を得た。
【００３２】
（実施例２）
実施例１と同様の方法により粉末ＰＬを調製した。
使用直前に、粉末ＰＬを元の溶液量の１／４量の生理食塩水に溶解させて４倍濃縮ＰＬを調製し、更に生理食塩水を加えてＰＬの３倍濃縮物を得た。
得られたＰＬの３倍濃縮物を用いた以外は実施例１と同様にして徐放性組織再生材料を得た。
【００３３】
（比較例１）
（１）ＰＲＰの調製
採血により得られた抹消血末梢血３０ｍＬを５０ｍＬの遠心管に入れ、遠心機を用いて２４００ｒｐｍで１０分間遠心した後、更に３６００ｒｐｍで１０分間遠心するダブルスピン法によりＰＲＰを調製した。
【００３４】
（２）徐放性組織再生材料の製造
実施例１と同様の方法により調製した１ｃｍ×１．５ｃｍ、厚さ３ｍｍに成形した生体吸収性多孔質基材に、得られたＰＲＰを１５０μＬ含浸させて、徐放性組織再生材料を得た。
【００３５】
（評価）
実施例及び比較例で得られた徐放性組織再生材料について、以下の方法により評価を行った。
【００３６】
（１）ＰＬ及びＰＰＲの含有量の測定
実施例及び比較例で得られた徐放性組織再生材料を、コラゲナーゼを用いて生体吸収性多孔質基材を完全に溶解した溶液を得た。得られた溶液について、ＥＬＩＳＡ法によりトランスホーミング成長因子β（ＴＧＦ−β）の含有量を測定し、徐放性組織再生材料１ｃｍ３に担持されたＴＧＦ−β量を算出した。また、後述する徐放性の評価における積算値から、徐放性組織再生材料１ｃｍ３に担持されたＰＤＧＦ量を算出した。結果を表１に示した。（ただし、比較例１についてのＴＧＦ−β量は未測定。）
【００３７】
【表１】
2014030663.tif 000002
【００３８】
表１より、いずれの徐放性組織再生材料にもＴＧＦ−β及びＰＤＧＦが含まれていることが判る。また、ＰＬの場合、２倍濃縮物に比べて３倍濃縮物を用いた方が、より多くのＴＧＦ−β及びＰＤＧＦを含有させることができることが判る。
【００３９】
（２）徐放性の評価
実施例及び比較例で得られた徐放性組織再生材料を、３７℃のリン酸緩衝液中に浸漬し、０．５、１、２、４、６、８、１２、２４、２４．５、２５、２６、２８、３０、３２、３６、４８時間毎にリン酸緩衝液中に放出されたＰＤＧＦ量をＥＬＩＳＡ法により測定した。得られた測定値をもとに、各時間までに放出された徐放性組織再生材料中のＰＤＧＦの積算量（％）を求めた。結果を表２に示した。また、表２をもとに各徐放性組織再生材料からのＰＤＧＦの徐放性を比較した図を、図１に示した。
【００４０】
【表２】
2014030663.tif 000003
【００４１】
同様に、実施例１で得られた徐放性組織再生材料から各時間までに放出されたＴＧＦ−βの積算量（％）を求め、その結果を表３に示した。また、表３をもとに実施例１の徐放性組織再生材料からのＴＧＦ−βの徐放性を示した図を、図２に示した。
【００４２】
【表３】
2014030663.tif 000004
【００４３】
表２、３及び図１、２より、ＰＬを担持させた実施例１、２の徐放性組織再生材料では、浸漬後２０時間までに約５０％のＴＧＦ−β、ＰＤＧＦが放出された後も、４８時間後まで徐々にＴＧＦ−β、ＰＤＧＦが放出され続けた。これは、生体吸収性多孔質基材に吸着されていないか、吸着されているとしても極めて弱い保持力でしか吸着されていなかったＰＬが浸漬後２０時間までに放出された一方、その後は強い保持力で吸着されたＰＬが、生体吸収性多孔質基材の分解に伴い徐々に放出されたものと考えられる。
これに対して、ＰＲＰを担持させた比較例１の徐放性組織再生材料では、浸漬後の早い時間にほぼ１００％のＰＤＧＦが放出されてしまった。ＰＲＰは、ほとんど生体吸収性多孔質基材には吸着されておらず、ごく初期の段階でほとんどが流出してしまうものと考えられる。
【００４４】
（実施例３）
実施例１で調製した生体吸収性多孔質基材を直径８ｍｍ、厚さ３ｍｍの円盤状に成形し、実施例と同様の方法にて調製したＰＬ（濃縮なし）、ＰＬの２倍濃縮物、ＰＬの３倍濃縮物及びＰＬの４倍濃縮物を１５０μＬ含浸させて、徐放性組織再生材料を作製した。
麻酔薬を腹腔投与して麻酔した後に、Ｃ５７マウスの背部に直径８ｍｍの全層皮膚欠損層を作製した。得られた徐放性組織再生材料を全層皮膚欠損層に移植し、５−０ナイロン縫合糸を用いて固定した。
【００４５】
移植後１及び２週間目にマウスの腹腔に麻酔薬を過剰投与することにより犠牲死させた後に、徐放性組織再生材料を移植した部位を写真撮影し、ＮＩＨイメージングソフトウエアＶｅｒ１．６２（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ社製）を用いて残存創面積を測定した。結果を図３に示した。
【００４６】
創面積を測定した後に、背部皮膚を皮下組織を含めて切除し、常法に従ってホルマリン固定してパラフィン切片を作製し、ＨＥ染色を行った。ＨＥ染色像を観察し、全創皮膚欠損創の辺縁部間の距離、即ち、上皮化進展距離を測定した。結果を図４に示した。
【産業上の利用可能性】
【００４７】
本発明によれば、血小板由来成分を徐放して優れた組織再生促進効果を発揮することができる徐放性組織再生材料を提供することができる。
【図１】
2014030663.tif 000005
【図２】
2014030663.tif 000006
【図３】
2014030663.tif 000007
【図４】
2014030663.tif 000008