(57)【要約】【課題】  脱核赤血球を効率よく安定的に生産することができる、不死化したヒト赤血球前駆細胞株の製造方法、並びに該製造方法によって得られるヒト赤血球前駆細胞株からヒト脱核赤血球を製造する方法を提供すること。【解決手段】  血液幹細胞のゲノムＤＮＡに、ＤＯＸの存在下にてＨＰＶ−Ｅ６／Ｅ７遺伝子の発現を誘導することが可能な発現カセットを導入した。そして、該血液幹細胞を、ＤＯＸ及び血液系増殖因子の存在下にて培養することにより、ヒト赤血球前駆細胞の不死化細胞株を樹立した。さらに、ＨＰＶ−Ｅ６／Ｅ７遺伝子の発現が誘導されない条件下にて、前記細胞株を培養することにより、高い比率にて脱核赤血球に分化誘導できることを見出した。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト脱核赤血球を産生するためのヒト赤血球前駆細胞株を、製造するための方法であって、
ヒトパピローマウィルス１６型Ｅ６遺伝子及びＥ７遺伝子の発現を外的刺激に応答して誘導することが可能な発現カセットを、ヒト血液幹細胞に導入する工程と、
前記発現カセットが導入されたヒト血液幹細胞を、外的刺激及び血液系増殖因子の存在下にて培養する工程と、
を含む方法。
【請求項２】
前記ヒト血液幹細胞が、ＴＡＬ１遺伝子を発現しているヒト多能性幹細胞から分化誘導して得られた細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ヒトパピローマウィルス１６型Ｅ６遺伝子及びＥ７遺伝子の発現を外的刺激に応答して誘導することが可能な発現カセットが導入されており、前記外的刺激及び血液系増殖因子の存在下にて増殖し、前記外的刺激の非存在下にて培養することによりヒト脱核赤血球の産生能を有する、ヒト赤血球前駆細胞株。
【請求項４】
ヒト脱核赤血球の製造方法であって、
請求項１若しくは２に記載の方法により得られたヒト赤血球前駆細胞株又は請求項３に記載のヒト赤血球前駆細胞株を、前記外的刺激の非存在下にて培養する工程を含む方法。
【請求項５】
ヒト脱核赤血球の製造方法であって、
ヒトパピローマウィルス１６型Ｅ６遺伝子及びＥ７遺伝子の発現を外的刺激に応答して誘導することが可能な発現カセットを、ヒト血液幹細胞に導入する工程と、
前記発現カセットが導入されたヒト血液幹細胞を、外的刺激及び血液系増殖因子の存在下にて培養してヒト赤血球前駆細胞を得る工程と、
前記外的刺激の非存在下にて、前記ヒト赤血球前駆細胞を培養する工程と、
を含む方法。
【請求項６】
前記ヒト血液幹細胞が、ＴＡＬ１遺伝子を発現しているヒト多能性幹細胞から分化誘導して得られた細胞である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ヒトパピローマウィルス１６型Ｅ６遺伝子及びＥ７遺伝子の発現を外的刺激に応答して誘導することが可能な発現カセットが導入されている、ヒト赤血球幹細胞。
【請求項８】
前記ヒト血液幹細胞が、ＴＡＬ１遺伝子を発現しているヒト多能性幹細胞から分化誘導して得られた細胞である、請求項７に記載のヒト赤血球幹細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト赤血球前駆細胞株及びヒト脱核赤血球の製造方法に関し、より詳しくは、ヒト血液幹細胞から不死化したヒト赤血球前駆細胞（ヒト赤血球前駆細胞株）を製造する方法、該製造方法によって得られるヒト赤血球前駆細胞株からヒト脱核赤血球を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
献血を基本とする輸血医療体制は、現在では確固たる体制ではあるが、問題が全く存在しない訳ではない。一つには、少子高齢化社会の進行に伴う供給者の相対的減少の問題があり、将来的には輸血用製剤が大幅に不足する事態が危惧されている。また、肝炎ウィルス、エイズウィルス等の感染の初期には、検査で必ずしも陽性と判定できないため、これらウィルスの感染者を完全に特定することは難しく、感染性ウィルス保有者が血液供給者になる可能性を完全に排除することは難しい。従って、不特定多数の供給者からの献血体制においては、感染症のリスクを完全に払拭することは難しいという現実がある。加えて、最近判明した輸血関連急性肺障害（ＴＲＡＬＩ：Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ａｃｕｔｅ  Ｌｕｎｇ  Ｉｎｊｕｒｙ）は輸血製剤中に存在する抗体が原因であると考えられている。故に、安全性を確認したリソース、例えば、幹細胞、不死化細胞株から、人工的に赤血球を生産することが可能となれば、かかる感染症のリスクやＴＲＡＬＩ等の現存する問題点を解決できる可能性が高い。
【０００３】
人工的な赤血球生産が熱望されるもう一つの理由に、きわめて稀な血液型に係る輸血医療を担保する必要性がある。例えば、世の中の大半の人間が有する赤血球抗原を有していない赤血球を持つ人（Ｒｈ−ｎｕｌｌ型、−Ｄ−型等の人）には、当該抗原を有しない赤血球の輸血が必要となる。こうした特殊な血液型の人に関しては、その人達自身から先ずはｉＰＳ細胞を樹立し、樹立したｉＰＳ細胞から必要とする血液を人工的に生産するという戦略が考えられる。
【０００４】
ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞から赤血球を生産すること、すなわち、インビトロにて多能性幹細胞から血液幹細胞に、さらに赤血球前駆細胞への分化を介して、成熟した赤血球（脱核赤血球）を生産することは可能となっている（特許文献１）。また、臍帯血由来等の血液幹細胞から赤血球前駆細胞を経て脱核赤血球を生産することも可能となっている（特許文献２）。
【０００５】
しかしながら、これらの方法において、多能性幹細胞又は血液幹細胞から脱核赤血球までに分化誘導するためには、多種かつ大量の増殖因子等を必要とするため、大きなコストが必要となる。何故ならば、多能性幹細胞から分化誘導を実施した場合には、分化誘導後初期には血液系以外の細胞も含まれているため、必要な血液細胞量を得るために多くの培養期間・培養量を必要とするからである。また、多能性幹細胞から分化誘導した血液幹細胞を使用する場合であれ、臍帯血等由来の血液幹細胞を使用する場合であれ、血液幹細胞から赤血球系細胞の分化誘導を実施する場合には、分化誘導後初期には赤血球系以外の血液系細胞も含まれているため、必要な赤血球量を得るために多くの培養期間・培養量を必要とする。従って、赤血球の人工的な生産において、効率良く安定的に脱核赤血球を生産できる方法の開発が求められていた。
【０００６】
かかる状況を鑑み、本発明者らは、赤血球に分化する直前の赤血球前駆細胞を、半永久的な増殖能を有する不死化した細胞株として樹立することを試みた。そして、試験管内における分化誘導操作により、マウスＥＳ細胞からかかる赤血球前駆細胞の不死化細胞株を得ることに成功した。さらに、該細胞株から脱核赤血球も安定的に効率よく生産できることも明らかにした（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第２００９／１３７６２９号
【特許文献２】国際公開第２００５／１１８７８０号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｈｉｒｏｙａｍａ  Ｔ．ら、「機能的赤血球を産生することができる、マウスＥＳ細胞由来の赤血球前駆細胞株の樹立（Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ  ｏｆ  ｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ａｂｌｅ  ｔｏ  ｐｒｏｄｕｃｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｒｅｄ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌｓ．）」、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ、２００８年２月６日、３巻、２号、ｅ１５４４．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
前述の通り、本発明者らは、マウスＥＳ細胞から赤血球前駆細胞の細胞株を樹立し、さらに該細胞株から脱核赤血球を得ることに成功している。しかしながら、同様の方法では、ヒト多能性幹細胞から、脱核赤血球を生産することのできる、不死化した赤血球前駆細胞の細胞株（ヒト赤血球前駆細胞株）を樹立することはできなかった。
【００１０】
本発明は、前記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、ヒト脱核赤血球を効率よく安定的に生産することができるヒト赤血球前駆細胞株の製造方法、並びに該製造方法によって得られるヒト赤血球前駆細胞株からヒト脱核赤血球を製造する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、前記目的を達成すべく鋭意研究を重ね、先ず、ヒト臍帯血由来又はｉＰＳ細胞由来の血液幹細胞のゲノムＤＮＡに、ドキシサイクリン（ＤＯＸ）の存在下にてヒトパピローマウィルス１６型のＥ６遺伝子及びＥ７遺伝子（ＨＰＶ−Ｅ６／Ｅ７遺伝子）の発現を誘導することが可能な発現カセットを導入した。次いで、ＤＯＸ存在下にてＨＰＶ−Ｅ６／Ｅ７遺伝子を安定的に発現し得るヒト血液幹細胞を、ＤＯＸ及び血液系増殖因子（ヒトステムセルファクター（ＳＣＦ）、ヒトエリスロポエチン（ＥＰＯ）及びデキサメサゾン（ＤＥＸ））の存在下にて培養することにより、本発明者らは、ヒト赤血球前駆細胞の不死化細胞株を樹立することに成功した。
【００１２】
さらに、樹立したヒト赤血球前駆細胞株の増殖に関し、ＤＯＸ（ＨＰＶ−Ｅ６／Ｅ７遺伝子の発現）及び血液系増殖因子に対する依存性を解析したところ、該細胞株の増殖には、ＨＰＶ−Ｅ６／Ｅ７の発現と、所定の血液系増殖因子とが必須であることが明らかになった。一方、赤血球の分化・成熟過程においては、赤血球前駆細胞から徐々に細胞分裂能が低下し、最終段階である脱核前の正染性赤芽球においては細胞分裂能が完全に喪失していることが明らかになっている。
【００１３】
そこで、細胞増殖能を低下させることにより、効率的に成熟した赤血球への分化誘導ができるのではないかと考え、ヒト赤血球前駆細胞株の増殖に必須であるＨＰＶ−Ｅ６／Ｅ７及び血液系増殖因子を除外した条件下にて培養することにより、成熟した赤血球系細胞（脱核赤血球を含む）への分化誘導を試みた。
【００１４】
その結果、得られた赤血球系細胞には脱核赤血球が高い比率にて含有されており、さらにはヒト赤血球前駆細胞の細胞株のヘモグロビンは、酸素結合・解離能に関し、正常赤血球と同様の機能を有していることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１５】
すなわち、本発明は以下を提供するものである。
＜１＞  ヒト脱核赤血球を産生するためのヒト赤血球前駆細胞株を、製造するための方法であって、
ヒトパピローマウィルス１６型Ｅ６遺伝子及びＥ７遺伝子の発現を外的刺激に応答して誘導することが可能な発現カセットを、ヒト血液幹細胞に導入する工程と、
前記発現カセットが導入されたヒト血液幹細胞を、外的刺激及び血液系増殖因子の存在下にて培養する工程と、
を含む方法。
＜２＞  前記ヒト血液幹細胞が、ＴＡＬ１遺伝子を発現しているヒト多能性幹細胞から分化誘導して得られた細胞である、＜１＞に記載の方法。
＜３＞  ヒトパピローマウィルス１６型Ｅ６遺伝子及びＥ７遺伝子の発現を外的刺激に応答して誘導することが可能な発現カセットが導入されており、前記外的刺激及び血液系増殖因子の存在下にて増殖し、前記外的刺激の非存在下にて培養することによりヒト脱核赤血球の産生能を有する、ヒト赤血球前駆細胞株。
＜４＞  ヒト脱核赤血球の製造方法であって、
＜１＞若しくは＜２＞に記載の方法により得られたヒト赤血球前駆細胞株又は＜３＞に記載のヒト赤血球前駆細胞株を、前記外的刺激の非存在下にて培養する工程を含む方法。
＜５＞  ヒト脱核赤血球の製造方法であって、
ヒトパピローマウィルス１６型Ｅ６遺伝子及びＥ７遺伝子の発現を外的刺激に応答して誘導することが可能な発現カセットを、ヒト血液幹細胞に導入する工程と、
前記発現カセットが導入されたヒト血液幹細胞を、外的刺激及び血液系増殖因子の存在下にて培養してヒト赤血球前駆細胞を得る工程と、
前記外的刺激の非存在下にて、前記ヒト赤血球前駆細胞を培養する工程と、
を含む方法。
＜６＞  前記ヒト血液幹細胞が、ＴＡＬ１遺伝子を発現しているヒト多能性幹細胞から分化誘導して得られた細胞である、＜５＞に記載の方法。
＜７＞  ヒトパピローマウィルス１６型Ｅ６遺伝子及びＥ７遺伝子の発現を外的刺激に応答して誘導することが可能な発現カセットが導入されている、ヒト赤血球幹細胞。
＜８＞  前記ヒト血液幹細胞が、ＴＡＬ１遺伝子を発現しているヒト多能性幹細胞から分化誘導して得られた細胞である、＜７＞に記載のヒト赤血球幹細胞。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、ヒト脱核赤血球を効率よく安定的に生産することができるヒト赤血球前駆細胞株の製造方法、並びに該製造方法によって得られるヒト赤血球前駆細胞株からヒト脱核赤血球を製造する方法を提供することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】ヒト臍帯血由来の血液幹細胞から、本発明の製造方法により得られたヒト赤血球前駆細胞の細胞株（ＨＵＤＥＰ）における、ＣＤ７１及びグライコフォリンＡの発現をフローサイトメーターにて分析した結果を示すプロット図である。
【図２】ヒトｉＰＳ細胞由来の血液幹細胞から、本発明の製造方法により得られたヒト赤血球前駆細胞の細胞株（ＨｉＤＥＰ）における、ＣＤ７１及びグライコフォリンＡの発現をフローサイトメーターにて分析した結果を示すプロット図である。
【図３】ＨＵＤＥＰの増殖における、血液系増殖因子（ＳＣＦ、ＥＰＯ及びＤＥＸ）並びにＤＯＸ（ＨＰＶ−Ｅ６／Ｅ７遺伝子の発現を誘導する外的刺激）の依存性を分析した結果を示すグラフである。
【図４】ＨｉＤＥＰの増殖における、血液系増殖因子及びＤＯＸの依存性を分析した結果を示すグラフである。
【図５】脱核赤血球への分化誘導後のＨＵＤＥＰにおける、グライコフォリンＡ陽性・核染色（ＳＹＴＯ１６）陰性の細胞（脱核赤血球）の比率を、フローサイトメーターにて分析した結果を示すプロット図である。
【図６】脱核赤血球への分化誘導後のＨｉＤＥＰにおける、グライコフォリンＡ陽性・核染色陰性の細胞（脱核赤血球）の比率を、フローサイトメーターにて分析した結果を示すプロット図である。
【図７】ＨＵＤＥＰ３株（ＨＵＤＥＰ−１、ＨＵＤＥＰ−２及びＨＵＤＥＰ−３）及びＨｉＤＥＰ２株（ＨｉＤＥＰ−１及びＨｉＤＥＰ−２）におけるＧＡＴＡ１遺伝子の発現量を分析した結果を示すグラフである。なお、図中の相対的発現量は、ヒト胎児肝臓由来の細胞（ＦＬ）における発現量を１とした際の値である。
【図８】ヘモグロビンの合成量を評価するため、ＨＵＤＥＰ−１及びＨｉＤＥＰ−１の細胞沈殿を目視にて観察した結果を示す写真である。
【図９】ＨＵＤＥＰ−１の酸素結合・解離能を分析した結果を示すグラフである。
【図１０】ＨｉＤＥＰ−１及びＨｉＤＥＰ−２の酸素結合・解離能を分析した結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
＜ヒト赤血球前駆細胞株の製造方法＞
本発明のヒト赤血球前駆細胞株の製造方法においては、先ず、外的刺激に応答してヒトパピローマウィルス（ＨＰＶ）１６型のＥ６遺伝子及びＥ７遺伝子の発現を誘導することが可能な発現カセットを、ヒト血液幹細胞に導入する。
【００１９】
本発明において、「赤血球前駆細胞」とは、成熟赤血球への分化能のみを有し、他の血液系細胞への分化能を喪失している細胞を意味する。また、「赤血球前駆細胞株」とは、細胞分裂を無制限に繰り返すことのできる、不死化した赤血球前駆細胞のことを意味する。
【００２０】
本発明において、「血液幹細胞」とは、血液系以外の細胞への分化能は有さず、ありとあらゆる種類の血液系細胞への分化能を有する幹細胞を意味し、「造血幹細胞」とも称される細胞のことである。かかる「血液幹細胞」は、臍帯血、末梢血、骨髄、胎児肝臓等の組織から、造血幹細胞表面抗原（ＣＤ３４等）に特異的に結合する抗体を用いてフローサイトメトリー法等により分離回収した細胞集団中に豊富に含まれていることが知られている。また、本発明において「血液幹細胞」は、後述の通り、ヒト多能性幹細胞から分化誘導することにより調製することもできる。
【００２１】
本発明にかかる「ヒト多能性幹細胞」としては、自己複製能を有し、血液幹細胞に分化誘導し得る細胞であればよく、かかる細胞としては、例えば、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、胚性腫瘍細胞（ＥＣ細胞）、胚性生殖細胞（ＥＧ細胞）、多能性生殖細胞（ｍＧＳ細胞）、中胚葉系幹細胞、間葉系幹細胞、ＭＵＳＥ細胞（Ｋｕｒｏｄａ  Ｙ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、２０１０年、１０７巻、１９号、８６３９〜８６４３ページ  参照）等の生体から採取され得る細胞が挙げられ、また当該細胞にはｉＰＳ細胞等のように人工的に分化多能性を持たせるよう作製された細胞も含まれる。これらの中では、胚を壊すことなく作製することができるという倫理的な観点から、さらに輸血等に用いる際に、輸血する患者と血液型（赤血球抗原）を適合させ易いという観点から、本発明にかかる多能性幹細胞としてはｉＰＳ細胞が優れており、好適に用いられる。
【００２２】
また、本発明にかかる「ヒト多能性幹細胞」としては、血液系細胞（特に赤血球系細胞）への分化誘導効率がより向上されるという観点から、ＴＡＬ１遺伝子が発現しているヒト多能性幹細胞であることが好ましい。ＴＡＬ１遺伝子が発現しているヒト多能性幹細胞の作製方法としては、例えば、ｉＰＳ細胞の作製に用いる遺伝子（例えば、Ｋｌｆ４、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、ｃ−Ｍｙｃ）と共にＴＡＬ１遺伝子を対象の体細胞に導入する方法、または既に樹立されたｉＰＳ細胞にＴＡＬ１遺伝子を導入する方法、ＴＡＬ１遺伝子が高発現している細胞にｉＰＳ細胞の作製に用いる遺伝子（例えば、Ｋｌｆ４、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、ｃ−Ｍｙｃ）を導入する方法、等が挙げられる。
【００２３】
なお、ＴＡＬ１（Ｔ細胞急性リンパ性白血病１）遺伝子は、ＳＣＬ（幹細胞白血病造血性転写因子）遺伝子及びＴＣＬ５（Ｔ細胞白血病５）遺伝子とも称される遺伝子である。典型的には、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸（例えば、配列番号：１に記載の塩基配列からなるＤＮＡ）である。
【００２４】
ヒト多能性幹細胞からヒト血液幹細胞さらには赤血球系細胞に分化誘導する方法としては特に制限はない。例えば、後述の実施例において示す通り、先ず、ヒト多能性幹細胞を、ヒトインスリン様成長因子II（ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−II，ＩＧＦ−II）とヒト血管内皮成長因子（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ，ＶＥＧＦ）との存在下にて、栄養細胞と共培養することにより、血液幹細胞を含む血液系細胞へと分化誘導する。次いで、ＩＧＦ−II及びＶＥＧＦの代わりに、ヒトステムセルファクター（ＳＣＦ）、ヒトエリスロポエチン（ＥＰＯ）及びデキサメサゾン（ＤＥＸ）の存在下にて、栄養細胞と共培養すること等により、赤血球系細胞を豊富に含む細胞集団へと分化誘導することができる。
【００２５】
かかる分化誘導において、前記ＩＧＦ−II、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＥＰＯ及びＤＥＸを添加し、用いられる培養液としては、後述の実施例に記載の「血液幹／前駆細胞分化誘導用培養液」等の公知の培養液を適宜選択して用いることができる。また、ヒト多能性幹細胞等と共培養するのに用いられる栄養細胞としても、ＯＰ９細胞等の公知の栄養細胞を適宜選択して用いることができる。
【００２６】
ヒト血液幹細胞に導入される「外的刺激に応答して、ヒトパピローマウィルス（ＨＰＶ）１６型のＥ６遺伝子及びＥ７遺伝子（ＨＰＶ−Ｅ６／Ｅ７遺伝子）の発現を誘導することが可能な発現カセット」は、外的刺激に応答して下流の遺伝子の発現を誘導できるプロモーターと、該プロモーターによって発現が制御されるＨＰＶ−Ｅ６／Ｅ７遺伝子と、ターミネーターとを含む核酸構築物である。
【００２７】
「ＨＰＶ−Ｅ６／Ｅ７遺伝子」は、典型的には、配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質（ＨＰＶ−Ｅ６タンパク質）及び配列番号：５に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質（ＨＰＶ−Ｅ７タンパク質）をコードする核酸（例えば、配列番号：３に記載の塩基配列からなるＤＮＡ）である。
【００２８】
プロモーターとしては、外的刺激に応答して下流の遺伝子の発現を誘導できるプロモーターであれば特に制限はなく、例えば、外的刺激がテトラサイクリン系抗生物質（テトラサイクリン、ドキシサイクリン等）の存在である場合には、テトラサイクリン系抗生物質とテトラサイクリントランスアクチベーターとの複合体の結合によって、下流の遺伝子の発現を誘導できるプロモーターが挙げられる。一方、外的刺激がテトラサイクリン系抗生物質の非存在である場合には、テトラサイクリンリプレッサーの解離によって、下流の遺伝子の発現を誘導できるプロモーターが挙げられる。また、外的刺激がエクジステロイド（エクジソン、ムリステロンＡ、ポナステロンＡ等）の存在である場合には、エクジステロイドと、エクジソン受容体−レチノイド受容体複合体との結合によって、下流の遺伝子の発現を誘導できるプロモーターが挙げられる。さらに、外的刺激がＦＫＣｓＡの存在である場合には、ＦＫＣｓＡと、ＦＫＢＰ１２に融合したＧａｌ４ ＤＮＡ結合ドメイン−シクロフィリンに融合したＶＰ１６アクチベータードメイン複合体との結合によって、下流の遺伝子の発現を誘導できるプロモーターが挙げられる。
【００２９】
発現カセットは、必要に応じて、エンハンサー、サイレンサー、選択マーカー遺伝子（例えば、ネオマイシン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子）、ＳＶ４０複製起点等を含んでいても良い。また、当業者であれば、利用する前記プロモーターの種類等を考慮して、エンハンサー、サイレンサー、選択マーカー遺伝子及びターミネーター等を、公知のものから適宜選択して組み合わせることにより、所望の発現レベルにてＨＰＶ−Ｅ６／Ｅ７遺伝子の発現を誘導することが可能な発現カセットを構築することができる。
【００３０】
また、必要に応じて、本発明にかかるヒト血液幹細胞には、外的刺激に応じてＨＰＶ−Ｅ６／Ｅ７遺伝子の発現を誘導する因子（例えば、テトラサイクリントランスアクチベーター、テトラサイクリンリプレッサー、エクジソン受容体−レチノイド受容体複合体、ＦＫＢＰ１２に融合したＧａｌ４ ＤＮＡ結合ドメイン−シクロフィリンに融合したＶＰ１６アクチベータードメイン複合体）を核内において恒常的に発現させることが可能な発現カセットも導入されていてもよい。
【００３１】
本発明において、前記発現カセットをヒト血液幹細胞に導入する方法としては特に制限はなく、公知の手法を適宜選択して用いることができる。例えば、前記発現カセットを適当な発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを感染、リポフェクション法、リポソーム法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム共沈殿法、ＤＥＡＥデキストラン法、マイクロインジェクション法にて細胞に導入することができる。
【００３２】
このような発現ベクターとしては、例えば、レンチウィルス、レトロウィルス、ヘルペスウィルス、アデノウィルス、アデノ随伴ウィルス、センダイウィルス等のウィルスベクター、動物細胞発現プラスミドが挙げられるが、増殖活性があまり高くない血液幹細胞のゲノムＤＮＡへの導入効率が極めて高いという観点から、レンチウィルスが好ましい。
【００３３】
このようにして得られる「前記発現カセットが導入されたヒト血液幹細胞」とは、本発明にかかる発現カセットが細胞内に導入された結果、外的刺激の存在下においてＨＰＶ−Ｅ６／Ｅ７遺伝子を安定的に発現し得るヒト血液幹細胞である。また、細胞株の樹立、さらには後述のヒト脱核赤血球への分化段階にて、核と共に本発明にかかる発現カセットが除去できるという観点から、本発明にかかる発現カセットがゲノムＤＮＡに組み込まれているヒト血液幹細胞が好ましい。
【００３４】
本発明のヒト赤血球前駆細胞株の製造方法においては、次に、前記発現カセットが導入されたヒト血液幹細胞を、前記外的刺激及び血液系増殖因子の存在下にて培養する。
【００３５】
本発明において、「血液系増殖因子」は、血液幹細胞から赤血球前駆細胞への分化誘導又は赤血球前駆細胞の増殖に寄与する因子を意味する。このような「血液系増殖因子」としては、例えば、ＳＣＦ、ＥＰＯ、ＴＰＯ（Ｔｈｒｏｍｂｏｐｏｉｅｔｉｎ、トロンボポエチン）、ＤＥＸが挙げられる。
【００３６】
後述の培養液における、ＳＣＦの好適な添加濃度としては、５０〜１００ｎｇ／ｍｌであり、ＥＰＯの好適な添加濃度としては、３〜５Ｕ／ｍｌであり、ＴＰＯの好適な添加濃度としては、５０〜１００ｎｇ／ｍｌであり、ＤＥＸの好適な添加濃度としては、１０−６Ｍオーダーである。
【００３７】
また、前記外的刺激に関しては、当業者であれば、利用する前記プロモーターの種類等を考慮して、後述の培地への添加量を適宜調製することができる。例えば、外的刺激がドキシサイクリンの存在である場合には、ドキシサイクリンの好適な添加濃度としては、１〜２μｇ／ｍｌである。
【００３８】
ヒト赤血球前駆細胞への分化誘導のために用いられ、前記外的刺激及び前記血液系増殖因子が添加される培養液としては、例えば、ＩＭＤＭ溶液、a−ＭＥＭ溶液又はＤＭＥＭ溶液が挙げられ、さらに、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒトインスリン、ヒトトランスフェリン、２−メルカプトエタノール、セレン酸ナトリウム、アスコルビン酸、アルファモノチオグリセロール、Ｌ−グルタミン等が含まれていてもよい。また、必要に応じて、無機塩類（硫酸第一鉄等）、抗生物質（例えば、ストレプトマイシン、ペニシリン等）等が添加してあっても良い。
【００３９】
「ヒト多能性幹細胞由来の血液幹細胞を含む血液系細胞集団」又は「ヒト臍帯血等由来の血液幹細胞を豊富に含む血液系細胞集団」から赤血球前駆細胞を分化誘導する際には、ＦＢＳと、ヒトインスリン、ヒトトランスフェリン、亜セレン酸ナトリウム、アスコルビン酸、アルファモノチオグリセロール及びＬ−グルタミン等を含むＩＭＤＭ溶液等が好適に用いられる。また、培養細胞の臨床応用を考慮した場合には無血清培養液（ＦＢＳを含まない培養液）が好ましい。かかる赤血球前駆細胞を分化誘導する無血清培養液としては、ＢＳＡ、ヒトインスリン、ヒトトランスフェリン（ヒト鉄飽和（ホロ）トランスフェリン）及び２−メルカプトエタノールを含むＩＭＤＭ溶液（より具体的には、ＳＴＥＭＣＥＬＬ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社製の「ＳｔｅｍＳｐａｎ  ＳＦＥＭ」）等が好適に用いられる。
【００４０】
前記外的刺激及び血液系増殖因子の存在下にて、培養液交換を行いながら赤血球前駆細胞の培養を継続し、不死化細胞株を樹立できたと考えられる培養期間としては、好ましくは３ヶ月間であり、より好ましくは６ヶ月以上培養できた時点で不死化細胞株と判断する。
【００４１】
さらに、前記発現カセットが前記血液幹細胞のゲノムＤＮＡに安定的に導入されるまでの期間を確保するという観点から、前記外的刺激及び血液系増殖因子の存在下にて培養する前に、前記発現カセットを前記血液幹細胞に導入してから、１〜７日間は、前記外的刺激の非存在下及び血液系増殖因子の存在下にて培養してもよい。
【００４２】
また、ヒト多能性幹細胞から血液幹細胞含む血液系細胞を分化誘導する際の培養、及び、ヒト多能性幹細胞から分化誘導した血液系細胞等を継代培養して不死化細胞株を得るまでの培養は、栄養細胞との共培養が好ましい。栄養細胞としては、例えば、ＯＰ９細胞、ＭＥＦ、ＳＮＬ７６／７細胞、ＰＡ６細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、Ｍ１５細胞、１０Ｔ１／２細胞等が挙げられる。これら栄養細胞は、放射線照射や細胞分裂停止薬剤（マイトマイシンＣ等）の処理により細胞分裂を停止させたものを使用する事が好ましい。
【００４３】
＜ヒト脱核赤血球の製造方法＞
後述の実施例において示す通り、ＨＰＶ−Ｅ６／Ｅ７遺伝子の発現は、樹立した赤血球前駆細胞株の増殖において必要である。一方、赤血球の分化・成熟過程においては、赤血球前駆細胞から徐々に細胞分裂能が低下し、最終段階である脱核前の正染性赤芽球においては、細胞分裂能は完全に喪失していることが明らかになっている。従って、本発明のヒト脱核赤血球の製造方法は、細胞増殖能を低下させることにより、効率的に脱核赤血球への分化が誘導されるという観点から提供されるものである。
【００４４】
すなわち、本発明のヒト脱核赤血球の製造方法は、前述の方法にて製造されたヒト赤血球前駆細胞株を、前記外的刺激の非存在下にて培養する工程を含む方法である。
【００４５】
脱核赤血球への分化誘導のために用いられ、前記外的刺激が除外された培地としては、例えば、ＩＭＤＭ溶液、α−ＭＥＭ溶液、ＤＭＥＭ溶液が挙げられ、ヒト血漿タンパク質画分、ヒト血清、Ｄ−マンニトール、アデニン、リン酸水素ナトリウム、ミフェプリストン、α−トコフェロール、リノール酸、コレステロール、亜セレン酸ナトリウム、ヒトホロトランスフェリン、ヒトインスリン、エタノールアミン、２−メルカプトエタノール、ＥＰＯ、ＴＰＯ、ＳＣＦ等が含まれていてもよい。また、必要に応じて、無機塩類、抗生物質が添加してあっても良い。
【００４６】
後述の実施例において示す通り、本発明のヒト臍帯血由来の赤血球前駆細胞の増殖には、前記外的刺激の他、ＳＣＦも必須であり、さらには、ＥＰＯは必須ではないものの、該増殖性はＥＰＯの存在下にて向上することも明らかになった。一方、赤血球の分化・成熟過程においては、赤血球前駆細胞から徐々に細胞分裂能が低下し、最終段階である脱核前の正染性赤芽球においては細胞分裂能は完全に喪失していることが明らかになっている。
【００４７】
従って、細胞増殖能を低下させることにより、効率的に脱核赤血球への分化が誘導されるという観点から、本発明のヒト臍帯血由来の赤血球前駆細胞から脱核赤血球への分化誘導においては、ＳＣＦを含有していない、例えば下記組成の培地が好適に用いられる。
ヒト血清、α−トコフェロール、リノール酸、コレステロール、亜セレン酸ナトリウム、ヒトホロトランスフェリン、ヒトインスリン、エタノールアミン、２−メルカプトエタノール、Ｄ−マンニトール及びミフェプリストンを含むＩＭＤＭ溶液。
【００４８】
さらに、分化誘導に伴う細胞死を抑制する、即ち、分化誘導段階での細胞の生存率を向上させるという観点から、当該培地には、３〜５ＩＵ／ｍｌ  ＥＰＯが含まれていても良い。
【００４９】
また、後述の実施例において示す通り、本発明のヒト多能性幹細胞由来の赤血球前駆細胞の増殖には、前記外的刺激の他、ＥＰＯも必須であることが明らかになった。従って、前述の観点から、本発明のヒト多能性幹細胞由来の赤血球前駆細胞から脱核赤血球への分化誘導においては、ＥＰＯを含有していない、例えば下記組成の培地が好適に用いられる。
ヒト血漿タンパク質画分、Ｄ−マンニトール、アデニン、リン酸水素ナトリウム及びミフェプリストンを含むＩＭＤＭ溶液。
【００５０】
また、前記外的刺激の非存在下にて、本発明のヒト赤血球前駆細胞株を培養する期間としては、細胞の生存率を維持しながら、脱核を誘導し、完結させるという観点から、通常１〜７日間であり、好ましくは３〜５日間である。
【００５１】
以上、本発明のヒト脱核赤血球の製造方法の好適な実施形態について説明したが、本発明のヒト脱核赤血球の製造方法は上記実施形態に限定されるものではない。例えば、下記方法によれば、上述のヒト赤血球前駆細胞株を樹立せずとも、ヒト血液幹細胞からヒト脱核赤血球を製造することができる。
【００５２】
ヒトパピローマウィルス１６型Ｅ６遺伝子及びＥ７遺伝子の発現を外的刺激に応答して誘導することが可能な発現カセットを、ヒト血液幹細胞に導入する工程と、
前記発現カセットが導入されたヒト血液幹細胞を、外的刺激及び血液系増殖因子の存在下にて培養してヒト赤血球前駆細胞を得る工程と、
前記外的刺激の非存在下にて、前記ヒト赤血球前駆細胞を培養する工程と、
を含む、ヒト脱核赤血球の製造方法。
【００５３】
なお、かかる製造方法についても、当業者であれば、前述の本発明に関する説明及び実施例の具体的な説明を参照しつつ、本発明にかかる発現カセットの構成、該発現カセットの導入方法、各分化段階における培養条件（例えば、培地の組成、培養期間）等を適宜選択しつつ、必要に応じてこれらの方法に適宜、修飾ないし改変を加えることにより、実施することができる。
【００５４】
＜ヒト赤血球前駆細胞、ヒト血液幹細胞＞
前述の通り、ＨＰＶ−Ｅ６／Ｅ７遺伝子の発現は、赤血球前駆細胞株の増殖においては必要であるが、赤血球前駆細胞株から脱核赤血球への分化においては阻害要因になり得ることが、本発明において初めて見出され、赤血球前駆細胞株の増殖維持から脱核赤血球に至るまでには、ＨＰＶ−Ｅ６／Ｅ７遺伝子の発現のオンからオフへの切り換えが必要であることが初めて明らかになった。
【００５５】
従って、本発明は、ＨＰＶ−Ｅ６／Ｅ７遺伝子の発現のオンオフの切り換えが可能であって、前述のヒト脱核赤血球の製造方法において有用な、下記ヒト赤血球前駆細胞株も提供するものである。
【００５６】
ヒトパピローマウィルス１６型Ｅ６遺伝子及びＥ７遺伝子の発現を外的刺激に応答して誘導することが可能な発現カセットが導入されており、外的刺激及び血液系増殖因子の存在下で増殖し、前記外的刺激の非存在下にて培養することによりヒト脱核赤血球の産生能を有する、ヒト赤血球前駆細胞株。
【００５７】
なお、「ヒトパピローマウィルス１６型Ｅ６遺伝子及びＥ７遺伝子の発現を外的刺激に応答して誘導することが可能な発現カセットが導入されているヒト赤血球前駆細胞株」とは、前述のヒト血液幹細胞と同様に、本発明にかかる発現カセットが細胞内に導入された結果、外的刺激の存在下においてＨＰＶ−Ｅ６／Ｅ７遺伝子を安定的に発現し得るヒト赤血球前駆細胞株のことであり、細胞株の樹立、さらには後述のヒト脱核赤血球への分化段階にて、核と共に本発明にかかる発現カセットが除去できるという観点から、本発明にかかる発現カセットがゲノムＤＮＡに組み込まれているヒト赤血球前駆細胞株が好ましい。
【００５８】
本発明は、前述のヒト赤血球前駆細胞株の製造方法において有用な、下記ヒト赤血球幹細胞も提供するものである。
【００５９】
ヒトパピローマウィルス１６型Ｅ６遺伝子及びＥ７遺伝子の発現を外的刺激に応答して誘導することが可能な発現カセットが導入されている、ヒト赤血球幹細胞。
【００６０】
本発明のヒト血液幹細胞及びヒト赤血球前駆細胞株としては、血液系細胞（特に赤血球系細胞）への分化誘導効率がより向上されるという観点から、ＴＡＬ１遺伝子が発現しているヒト多能性幹細胞由来の細胞であることが好ましい。また、かかるヒト赤血球前駆細胞株から分化誘導することにより得られた細胞、及び、かかるヒト血液幹細胞からヒト赤血球前駆細胞株を介して分化誘導することにより得られた細胞においては、後述の実施例において示す通り、ヒト脱核赤血球は高い比率（例えば、６２％）にて含有されている。
【００６１】
従って、本発明は、外的刺激に応答してＨＰＶ１６型のＥ６遺伝子及びＥ７遺伝子の発現を誘導することが可能な発現カセットが導入されており、ヒト脱核赤血球に分化誘導する効率が３０％以上（好ましくは４０％以上、より好ましくは５０％以上、特に好ましくは６０％以上）である、ヒト赤血球前駆細胞株又はヒト血液幹細胞も提供するものである。
【００６２】
本発明において、「ヒト脱核赤血球に分化誘導する効率」は、例えば、後述の実施例において示すような方法にて算出することができる。すなわち、脱核赤血球への分化誘導後の細胞の、成熟赤血球系細胞のマーカー（例えば、グライコフォリンＡ）と、核とを染色し、フローサイトメーターにより解析する。そして、当該細胞における、成熟赤血球系細胞のマーカーが陽性であり、かつ核染色が陰性である細胞の割合を算出することにより、「ヒト脱核赤血球に分化誘導する効率」の値を求めることができる。
【００６３】
＜本発明の方法によって得られる赤血球の利用方法１＞
上述の通り、本発明によれば、ヒト多能性幹細胞又はヒト血液幹細胞よりヒト脱核赤血球を生産することができる。従って、赤血球に関する疾患を罹患しているヒトからヒト多能性幹細胞又は血液幹細胞を調製し、さらに本発明の方法を用い、これら細胞をヒト脱核赤血球に分化誘導することにより、当該疾患のモデルとなる赤血球を大量に提供することができる。「赤血球に関する疾患」としては、例えば、遺伝性球状赤血球症、鎌状赤血球貧血、サラセミア、発作性夜間ヘモグロビン尿症、巨赤芽球性貧血が挙げられる。
【００６４】
また、こうして調製した疾患モデルとなる赤血球を被検化合物と接触させ、当該接触後の赤血球の状態（例えば、形状や大きさ、酸素に対する結合能や解離能）を検出し、赤血球の状態を改善する化合物を選択することにより、赤血球に関する疾患の治療又は予防に有効な医薬品候補化合物をスクリーニングすることができる。
【００６５】
スクリーニングに用いる「被検化合物」としては、特に制限はなく、例えば、遺伝子ライブラリーの発現産物、合成低分子化合物ライブラリー、ペプチドライブラリー、抗体、細菌放出物質、細胞（微生物、植物細胞、動物細胞）の抽出液及び培養上清、精製又は部分精製ポリペプチド、海洋生物、植物又は動物由来の抽出物、土壌、ランダムファージペプチドディスプレイライブラリーが挙げられる。
【００６６】
被検化合物と赤血球との「接触」は、例えば、本発明の方法によって得られた赤血球を培養、維持している培地中への添加や、本発明の方法によって得られた赤血球を移植した実験動物（好ましくは免疫不全動物）への投与によって行うことができる。
【００６７】
被検化合物の接触後の赤血球の状態の検出は、当業者に公知の方法で行うことができる。例えば、赤血球の形状や大きさの検出であれば、顕微鏡による観察やフローサイトメトリーによる解析によって行うことができ、赤血球の酸素に対する結合能や解離能の検出であれば、市販の解析装置を利用して行うことができる。
【００６８】
赤血球の状態が「改善」しているかどうかは、例えば、遺伝性球状赤血球症においては、赤血球の形状が球状から正常赤血球の円盤状又はそれに近い形状に変化しているかどうかで判断することができ、鎌状赤血球貧血においては、赤血球の形状が鎌状から正常赤血球の円盤状又はそれに近い形状に変化しているかどうかで判断することができ、鎌状赤血球貧血やサラセミア等においては、赤血球の酸素に対する結合能や解離能が向上しているかどうかで判断することができる。
【００６９】
＜本発明の方法によって得られる赤血球の利用方法２＞
赤血球に関連する疾患の別の態様として、感染症が知られている。特にマラリアは、マラリア原虫による感染症であり、当該原虫が赤血球中で無性生殖により分裂増殖し、さらにはその赤血球を破壊して、別の赤血球に侵入するというサイクルを繰り返すことにより、高熱や腎不全等の症状が引き起こされる。
【００７０】
前述の通り、本発明によれば、マラリア原虫の増殖の場となる赤血球を大量に提供することができる。従って、本発明は、マラリア疾患の治療又は予防に有効な医薬品候補化合物のスクリーニング方法をも提供することができる。この方法においては、被検化合物の存在下、赤血球とマラリア原虫とを接触させ、当該接触後の赤血球におけるマラリア原虫の数を検出し、被検化合物の非存在下と比較して、赤血球におけるマラリア原虫の数を減少させる化合物を選択する。
【００７１】
「マラリア原虫（ｍａｌａｒｉａｌ
ｐａｒａｓｉｔｅｓ）」としては、例えば、胞子虫類に属する熱帯熱マラリア原虫Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ
ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、三日熱マラリア原虫Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ
ｖｉｖａｘ、四日熱マラリア原虫Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｍａｌａｒｉａｅ、卵形マラリア原虫Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｏｖａｌｅが挙げられる。マラリア原虫と赤血球との接触の方法や、スクリーニングに供される被検化合物については、前記赤血球の利用方法１と同様である。
【００７２】
被検化合物の接触後の赤血球におけるマラリア原虫の数の検出は、当業者に公知の方法で行うことができる。公知の方法としては、例えば、ギムザ染色を施し、光学顕微鏡による観察する方法や、マラリア原虫特異的抗体を用いたフローサイトメトリーによる解析、マラリア原虫のゲノム特異的なプライマーを用いた定量的ＰＣＲ法が挙げられる。
【００７３】
また、赤血球に直接侵入しないマラリア以外の感染症に対する有効な化合物のスクリーニングにおいても、本発明を用いることができる。例えば、マラリア以外の感染症を引き起こす感染源と被検化合物とを接触させる際に、本発明のヒト多能性幹細胞又はヒト血液幹細胞より産生されるヒト脱核赤血球を加え、ヒト生体内の環境に近い状況を再現した状態を構築できる。当該実験系はｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏのどちらでもよく、この状況下において感染源の数を減少させる化合物をスクリーニングを行うことができる。
【００７４】
＜本発明の方法によって得られる赤血球の利用方法３＞
本発明の方法によって得られる赤血球を被検化合物と接触させ、当該接触後の赤血球の状態（例えば、形状や大きさ、酸素に対する結合能や解離能）を検出することにより、当該被検化合物が赤血球に対して悪影響を及ぼすか否かを判定することもできる。
【００７５】
かかる判定に供される「被検化合物」としては、前記の赤血球の利用方法と同様に、特に制限はない。例えば、現行又は開発中の医薬品（抗がん剤、免疫抑制剤、抗ウィルス剤等）を用いれば、これら医薬品の赤血球に対する副作用の有無を判定することができる。  被検化合物と赤血球との接触の方法、スクリーニングに供される被検化合物、赤血球の状態の検出については、前記赤血球の利用方法１と同様である。
【００７６】
被検化合物との接触により、例えば、前記接触後の赤血球が、厚さが１〜３μｍ、直径が５〜１０μｍである中央がくぼんだ円盤状から、別の形状又は大きさを有する赤血球に変形する場合には、当該被検化合物が赤血球に対して悪影響を及ぼす化合物であると判定することができる。「別の形状への変形」としては、球状等への変形のみならず、溶血を引き起こす赤血球の膜の破壊も含む意味である。
【００７７】
また、被検化合物との接触により、例えば、赤血球の酸素に対する結合能や解離能が、前記接触前の赤血球のそれよりも低下した場合には、当該被検化合物が赤血球に対して悪影響を及ぼす化合物であると判定することができる。
【実施例】
【００７８】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。また、本実施例において用いた細胞、培養液及び形質転換に用いたベクターは以下の通りである。
【００７９】
＜細胞＞
ヒト臍帯血由来血液幹／前駆細胞（ＣＤ３４陽性細胞）は、理化学研究所バイオリソースセンター細胞材料開発室より購入した（理研細胞記号：Ｃ３４）。
【００８０】
ヒトｉＰＳ細胞は、理化学研究所バイオリソースセンター細胞材料開発室にて、本発明者らが樹立した羊膜由来ｉＰＳ細胞株（ＨｉＰＳ−ＲＩＫＥＮ−３Ａ及びＨｉＰＳ−ＲＩＫＥＮ−４Ａ）を用いた。また、この細胞は、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂ−ＦＧＦ）含有霊長類ＥＳ細胞用培地中、後述の栄養細胞上にて培養することにより維持した（Ｆｕｊｉｏｋａ  Ｔ．ら、Ｈｕｍａｎ  Ｃｅｌｌ、２０１０年、２３巻、１１３〜１１８ページ  参照）。
【００８１】
ヒトｉＰＳ細胞の維持培養用の栄養細胞として用いたＳＮＬ７６／７細胞は、ＥＣＡＣＣより購入した。さらに、ヒトｉＰＳ細胞の維持培養用の栄養細胞としてはＭＥＦも用いた。このＭＥＦは、本発明者らが標準的な手技手法によりマウス胎児から調製した。また、これらヒトｉＰＳ細胞の維持培養用の栄養細胞は、１０％ＦＢＳ含有ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）溶液にて培養することにより、維持した。
【００８２】
また、血液系細胞分化誘導用の栄養細胞として用いたＯＰ９細胞は、理化学研究所バイオリソースセンター細胞材料開発室より購入した（理研細胞記号：ＲＣＢ１１２４）。この細胞は、２０％ＦＢＳ含有アルファ最少必須イーグル培地（α−ＭＥＭ）溶液にて培養することにより、維持した。
【００８３】
＜培養液＞
ヒト臍帯血由来血液幹／前駆細胞から赤血球前駆細胞株（ＨＵＤＥＰ）を樹立する過程で使用した培養液として、ヒト造血幹細胞／前駆細胞増殖用の無血清培地（製品名：ＳｔｅｍＳｐａｎ  ＳＦＥＭ培養液、ＳＴＥＭＣＥＬＬ  ＴＨＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社製）を用いた。
【００８４】
ヒトｉＰＳ細胞から血液幹／前駆細胞を分化誘導する過程と、ヒトｉＰＳ細胞から分化誘導した血液幹／前駆細胞を用いて赤血球前駆細胞株を樹立する過程とにて用いた培養液（以下、「血液幹／前駆細胞分化誘導用培養液」と称する）の組成は下記の通りである。
１５％ＦＢＳ（ＳＩＧＭＡ社製）と、ＩＴＳ液体培地サプリメント（１０μｇ／ｍｌ  ヒトインスリン、５．５μｇ／ｍｌ  ヒトトランスフェリン、５ｎｇ／ｍｌ  亜セレン酸ナトリウム）（ＳＩＧＭＡ社製）、５０ｍｇ／ｍｌ  アスコルビン酸（ＳＩＧＭＡ社製）、０．４５ｍＭ  アルファモノチオグリセロール（ＳＩＧＭＡ社製）及び２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（ＳＩＧＭＡ社製）とを含むＩＭＤＭ溶液（ＳＩＧＭＡ社製）。
【００８５】
赤血球前駆細胞株から脱核赤血球を得るために用いた培養液（２種類）の組成は下記の通りである。
［脱核赤血球産生用培養液１］
０．５％  ヒト血漿タンパク質画分（Ｂａｘｔｅｒ社製）、１４．５７ｍｇ／ｍｌ  Ｄ−マンニトール（ＳＩＧＭＡ社製）、０．１４ｍｇ／ｍｌ  アデニン（ＳＩＧＭＡ社製）、０．９４ｍｇ／ｍｌ  リン酸水素ナトリウム（ＳＩＧＭＡ社製）及び１μＭ  ミフェプリストン（グルココルチコイド受容体アンタゴニスト、ＳＩＧＭＡ社製）を含むＩＭＤＭ溶液（ＳＩＧＭＡ社製）
（Ｍｉｈａｒａｄａ  Ｋ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２００６年、２４巻、１０号、１２５５〜１２５６ページ  参照）。
［脱核赤血球産生用培養液２］
１０％  ヒトＡＢ型血清（ＫＯＨＪＩＮ  ＢＩＯ社製）、２０ｎｇ／ｍｌ  α−トコフェロール（ＳＩＧＭＡ社製）、４ｎｇ／ｍｌ  リノール酸（ＳＩＧＭＡ社製）、２００ｎｇ／ｍｌ  コレステロール（ＳＩＧＭＡ社製）、２ｎｇ／ｍｌ  亜セレン酸ナトリウム（ＳＩＧＭＡ社製）、２００μｇ／ｍｌ  ヒトホロトランスフェリン（ＳＩＧＭＡ社製）、１０μｇ／ｍｌ  ヒトインスリン（ＳＩＧＭＡ社製）、１０μＭ  エタノールアミン（ＳＩＧＭＡ社製）、０．１ｍＭ  ２−メルカプトエタノール（２−ＭＥ、ＳＩＧＭＡ社製）、１４．５７ｍｇ／ｍｌ  Ｄ−マンニトール（ＳＩＧＭＡ社製）、１μＭ  ミフェプリストン（ＳＩＧＭＡ社製）及び  ５  ＩＵ／ｍｌ  ＥＰＯを含むＩＭＤＭ溶液（ＳＩＧＭＡ社製）  （Ｍｉｈａｒａｄａ  Ｋ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２００６年、２４巻、１０号、１２５５〜１２５６ページに記載の組成を改変）。
【００８６】
＜ベクター＞
ヒトｉＰＳ細胞にＴＡＬ１遺伝子を導入するために、ＣＳＩＩ−ＥＦ−ＲｆＡレンチウィルスベクターを用いた。また、後述の赤血球前駆細胞株樹立の工程において、ヒトパピロマウィルス−Ｅ６／Ｅ７（ＨＰＶ−Ｅ６／Ｅ７）遺伝子及びテトラサイクリントランスアクチベーター（ｒｔＴＡ）をコードする遺伝子を導入するために、ＣＳＩＶ−ＴＲＥ−ＲｆＡ−ＵｂＣ−ＫＴレンチウィルスベクターを用いた。ＣＳＩＩ−ＥＦ−ＲｆＡ及びＣＳＩＶ−ＴＲＥ−ＲｆＡ−ＵｂＣ−ＫＴは、いずれも理化学研究所バイオリソースセンター細胞運命情報解析技術開発サブチームより入手した。また、これらレンチウイルスベクターを用いたレンチウイルスの調製は、標準的な手技手法を採用して行った。導入したヒトＴＡＬ１遺伝子及びＨＰＶ−Ｅ６／Ｅ７遺伝子の塩基配列は、配列番号：１及び３に各々示す。
【００８７】
なお、非ヒト霊長類ＥＳ細胞にＴＡＬ１を強制発現させることで、血液系細胞の分化誘導効率が良くなることが報告されている（Ｋｕｒｉｔａ  Ｒ.ら、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ、２００６年、２４巻、２０１４〜２０２２ページ  参照）。かかる知見に基づき、本発明者らは、後述の実施例２及び３の方法にて、ＨＰＶ−Ｅ６／Ｅ７の発現を誘導することなく、ヒトｉＰＳ細胞を赤血球前駆細胞へと分化誘導した。その結果、図には示さないが、かかる方法にて、不死化した赤血球前駆細胞株を樹立することはできたが、これら細胞株からは脱核赤血球が得ることはできなかった。
【００８８】
また、ＣＤ３６陽性赤血球前駆細胞に癌遺伝子であるＨＰＶ−Ｅ６／Ｅ７遺伝子を導入することにより、サイトカイン依存的に増殖する細胞株を得ることができることが明らかになっている。しかしながら、かかる細胞株の赤血球系細胞への分化誘導の効率は著しく低かったことも併せて報告されている（Ｗｏｎｇ．Ｓら、Ｅｘｐ  Ｈｅｍａｔｏｌ．、２０１０年、３８巻、１１号、９９４〜１００５ページ  参照）。
【００８９】
（実施例１）
ヒト臍帯血由来血液幹／前駆細胞からの赤血球前駆細胞株の樹立
１ｘ１０５個のヒト臍帯血由来血液幹／前駆細胞（ＣＤ３４陽性細胞）を血液系増殖因子（ＳＣＦ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ社製）  ５０ｎｇ／ｍｌ，ヒトトロンボポエチン（ＴＰＯ、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ社製）  ５０ｎｇ／ｍｌ，ヒトＦＬＴ３リガンド（ＦＬＴ３−Ｌ、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ社製）  ５０ｎｇ／ｍｌ）の存在下で一晩培養した（３７℃、５％ＣＯ２で培養。以下全ての培養系において同様の温度・ＣＯ２濃度条件にて培養した）。
【００９０】
その後、誘導発現系（ドキシサイクリン（ＤＯＸ）の存在下で発現が誘導され、非存在下では発現が抑制される系）にてＨＰＶ−Ｅ６／Ｅ７の発現を調節することが可能な遺伝子構造（コンストラクト）を内包する、前述のレンチウイルスを、前記ヒト臍帯血由来血液幹／前駆細胞に導入した。
【００９１】
前記導入後６日間は、５０ｎｇ／ｍｌ  ＳＣＦ、３Ｕ／ｍｌ  ＥＰＯ（ＫＩＲＩＮ  Ｂｒｅｗｅｒｙ社製）及び１０−６Ｍ  ＤＥＸ（ＳＩＧＭＡ社製）を含むＳｔｅｍＳｐａｎ  ＳＦＥＭ培養液で培養を続けた。
【００９２】
その後（前記導入後７日目以降）は、ＨＰＶ−Ｅ６／Ｅ７の発現を誘導するために、さらに１μｇ／ｍｌ  ＤＯＸを加えて培養を行った。この後は、定期的に培地交換を実施し（週２回程度）、培養を継続した。
【００９３】
かかる培養の結果、前記導入後に６ヶ月以上の継代培養（細胞増殖維持）が可能となり、ヒト赤血球前駆細胞株（ＨＵＤＥＰ：ヒト臍帯血由来赤血球前駆細胞株（Ｈｕｍａｎ  Ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  Ｃｏｒｄ  Ｂｌｏｏｄ−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ  Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ））を、再現性をもって樹立できることが明らかになった。
【００９４】
（実施例２）
ヒトｉＰＳ細胞からの赤血球前駆細胞株の樹立
先ず、ヒトｉＰＳ細胞に、前述のレンチウイルスを用いて転写因子ＴＡＬ１を強制導入し、ＴＡＬ１を恒常的に発現するヒトｉＰＳ細胞株を樹立した（ｉＰＳ−ＴＡＬ１細胞）。
【００９５】
樹立した４〜８ｘ１０４個のｉＰＳ−ＴＡＬ１細胞を、あらかじめガンマ線照射したＯＰ９細胞上に播種し、２００ｎｇ／ｍｌ  ヒトインスリン様成長因子II（ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−II，ＩＧＦ−II、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ社製）と、２０ｎｇ／ｍｌ  ヒト血管内皮成長因子（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ，ＶＥＧＦ、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ社製）とを含む前記血液幹／前駆細胞分化誘導用培養液にて１０日間培養を行い、血液系細胞を誘導した。
【００９６】
前記血液系細胞への分化誘導開始１０日後からは、ＩＧＦ−II及びＶＥＧＦは添加せず、前記血液幹／前駆細胞分化誘導用培養液に５０ｎｇ／ｍｌ  ＳＣＦ、３Ｕ／ｍｌ  ＥＰＯ及び１０−６Ｍ  ＤＥＸを添加し、さらに６日間培養することにより、赤血球系細胞を誘導した。
【００９７】
前記血液系細胞への分化誘導開始後１６日目に、前記誘導発現系にてＨＰＶ−Ｅ６／Ｅ７の発現を調節することが可能なコンストラクトを内包する、前述のレンチウイルスを導入した。
【００９８】
導入後４日間（前記血液系細胞への分化誘導開始後１６〜２０日の間）は、５０ｎｇ／ｍｌ  ＳＣＦ、３Ｕ／ｍｌ  ＥＰＯ及び１０−６Ｍ  ＤＥＸの存在下で培養を続けた。
【００９９】
その後（分化誘導開始後２０日目以降）は、ＨＰＶ−Ｅ６／Ｅ７の発現を誘導するために、さらに１μｇ／ｍｌ  ＤＯＸを加えて培養を行った。この後は、定期的に培地交換を実施し（週２回程度）、培養を継続した。
【０１００】
そして、かかる培養の結果、前記血液系細胞への分化誘導開始後に６ヶ月以上の継代培養（細胞増殖維持）が可能となり、ヒト赤血球前駆細胞株（ＨｉＤＥＰ：ヒトｉＰＳ細胞由来赤血球前駆細胞株（Ｈｕｍａｎ  ｉＰＳ  ｃｅｌｌ−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ  Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ））を、再現性をもって樹立できることが明らかになった。
【０１０１】
また、ＨｉＤＥＰは樹立過程では、上記の通り、栄養細胞（ＯＰ９細胞）の上で培養したが、得られた全てのＨｉＤＥＰに関し、前記血液系細胞への分化誘導を開始してから３カ月後には、栄養細胞非存在下にて増殖が可能な細胞になっていることが明らかになった。
【０１０２】
＜本発明のヒト赤血球前駆細胞株の特性についての評価１＞
本発明のヒト赤血球前駆細胞株に関し、赤血球系細胞に特異的な分子の発現を調べた。すなわち、実施例１にて樹立した３株のＨＵＤＥＰ及び実施例２にて樹立した５株のＨｉＤＥＰについて、市販のフローサイトメーター機器及び市販の抗体を用いて、標準的な手技手法により、ＣＤ７１（トランスフェリン受容体）及びグライコフォリンＡの発現を調べた。得られた結果の代表例として、ＨＵＤＥＰ−１及びＨｉＤＥＰ−１の結果を、各々図１及び２に示す。
【０１０３】
なお、ＣＤ７１は、赤血球前駆細胞においては発現が確認される分子であるが、成熟した赤血球系細胞においては発現していないことが明らかになっている。一方、グライコフォリンＡは、赤血球前駆細胞及び成熟した赤血球系細胞の双方において発現していることが知られている。
【０１０４】
図１及び２に示す通り、ＨＵＤＥＰ−１及びＨｉＤＥＰ−１いずれも、赤血球系細胞に特異的な分子（ＣＤ７１及びグライコフォリンＡ）を発現している分化段階にある赤血球系細胞株であることが明らかになった。特に、ＨｉＤＥＰ−１はグリコフォリンＡの発現が高い細胞であるため、ＨＵＤＥＰ−１と比較するに、ＨｉＤＥＰ−１の方がより成熟した赤血球系細胞であることが示唆された。
【０１０５】
次に、本発明のヒト赤血球前駆細胞株に関し、増殖因子の依存性を調べた。すなわち、前記３株のＨＵＤＥＰ及び前記５株のＨｉＤＥＰを、各々下記増殖因子の組み合わせを含む、ＳｔｅｍＳｐａｎ  ＳＦＥＭ培養液及び前記血液幹／前駆細胞分化誘導用培養液にて、９〜１２日間培養し、その細胞数の変化を調べた。得られた結果の代表例を各々図３及び４に示す。
ＡＬＬ…全因子（ＤＯＸ（ＨＰＶ−Ｅ６／Ｅ７）、ＳＣＦ、ＥＰＯ及びＤＥＸ）
「−ＤＯＸ」…ＤＯＸ非存在（ＳＣＦ、ＥＰＯ及びＤＥＸ）
「−ＳＣＦ」…ＳＣＦ非存在（ＤＯＸ（ＨＰＶ−Ｅ６／Ｅ７）、ＥＰＯ及びＤＥＸ）
「−ＥＰＯ」…ＥＰＯ非存在（ＤＯＸ（ＨＰＶ−Ｅ６／Ｅ７）、ＳＣＦ及びＤＥＸ）
「−ＤＥＸ」…ＤＥＸ非存在（ＤＯＸ（ＨＰＶ−Ｅ６／Ｅ７）、ＳＣＦ及びＥＰＯ）。
【０１０６】
図３及び４に示す通り、前記３株のＨＵＤＥＰ及び前記５株のＨｉＤＥＰいずれも、全てＨＰＶ−Ｅ６／Ｅ７発現条件下でのみ増殖が可能な細胞であることが明らかになった。
【０１０７】
また、図３に示す通り、ＨＵＤＥＰ−１の増殖には、ＳＣＦも必須であること、さらにはＥＰＯは必須ではないものの、ＨＵＤＥＰ−１の増殖性はＥＰＯの存在下にて向上することも明らかになった。また、図４に示す通り、ＨｉＤＥＰ−１の増殖性は、ＥＰＯにも依存していることが明らかになった。
【０１０８】
従って、本発明のヒト赤血球前駆細胞株の増殖には、ＨＰＶ−Ｅ６／Ｅ７の発現と、何らしかの少なくとも一の血液系増殖因子とが必須であることが明らかになった。
【０１０９】
（実施例３）
本発明のヒト赤血球前駆細胞株から、成熟した赤血球系細胞への分化誘導（脱核赤血球の生産）
前述の通り、ＨＵＤＥＰの増殖には、ＨＰＶ−Ｅ６／Ｅ７及びＳＣＦが必須である。また。ＨｉＤＥＰの増殖には、ＨＰＶ−Ｅ６／Ｅ７及びＥＰＯが必須である。一方、赤血球の分化・成熟過程においては、赤血球前駆細胞から徐々に細胞分裂能が低下し、最終段階である脱核前の正染性赤芽球においては細胞分裂能は完全に喪失していることが明らかになっている。従って、前述の知見に基づき、本発明のヒト赤血球前駆細胞株に関しては、これら増殖に必須であるＨＰＶ−Ｅ６／Ｅ７及び当該血液系増殖因子を除外した条件下であれば、効率的に成熟した赤血球系細胞（脱核赤血球を含む）に分化誘導できると考えた。
【０１１０】
そこで、ＨＵＤＥＰに関しては、ＨＰＶ−Ｅ６／Ｅ７の発現誘導の条件となるＤＯＸと、ＳＣＦとを除外した前記脱核赤血球産生用培養液２にて培養することにより、成熟した赤血球系細胞（脱核赤血球を含む）に分化誘導することを試みた。また、ＨｉＤＥＰに関しては、ＤＯＸとＥＰＯとを除外した前記脱核赤血球産生用培養液１にて培養することにより、成熟した赤血球系細胞（脱核赤血球を含む）に分化誘導することを試みた。
【０１１１】
その結果、樹立したヒト赤血球前駆細胞株（ＨＵＤＥＰ及びＨｉＤＥＰ）を、ＨＰＶ−Ｅ６／Ｅ７非発現条件下、かつ、各々の細胞増殖に必須の血液系増殖因子の非存在下におくことで、いずれの細胞株においても、より成熟した赤血球系細胞への分化誘導が観察された。
【０１１２】
また、成熟した赤血球系細胞への分化誘導後の、本発明のヒト赤血球前駆細胞株における脱核赤血球の割合について調べた。すなわち、成熟した赤血球系細胞へ分化誘導してから５日目のＨＵＤＥＰ−１及びＨｉＤＥＰ−１について、市販のフローサイトメーター機器、市販の抗体及び核染色液（ＳＹＴＯ１６）を用いて、標準的な手技手法により、グライコフォリンＡの発現及び核染色の有無を調べた。得られた結果を、各々図５及び６に示す。
【０１１３】
なお、グライコフォリンＡは成熟した赤血球系細胞のマ―カ−である。また、ＳＹＴＯ１６は、生細胞の膜を透過し、核を染色する染色液である。従って、ＳＹＴＯ１６陽性の細胞は核を有する細胞を意味し、陰性細胞は核を有さない細胞（脱核赤血球）を意味する。
【０１１４】
図５及び６に示した結果から明らかなように、ＨＵＤＥＰ及びＨｉＤＥＰいずれにおいても、成熟した赤血球系細胞への分化誘導数日（５日）後の細胞の中には脱核赤血球が含まれていた。特に、ＨｉＤＥＰ−１に関しては、成熟した赤血球系細胞への分化誘導後の細胞中において、約６０％という極めて高い比率にて、脱核赤血球が産生されていることが明らかになった。
【０１１５】
＜本発明のヒト赤血球前駆細胞株の特性についての評価２＞
ＧＡＴＡ１は、赤血球等の最終分化・成熟に必須の転写因子であることが明らかになっている。そこで、本発明のヒト赤血球前駆細胞株から成熟した赤血球系細胞への分化過程におけるＧＡＴＡ１遺伝子の発現量を調べた。すなわち、ＨＵＤＥＰ３株（ＨＵＤＥＰ−１、ＨＵＤＥＰ−２及びＨＵＤＥＰ−３）及びＨｉＤＥＰ２株（ＨｉＤＥＰ−１及びＨｉＤＥＰ−２）に関し、各々の細胞株の成熟した赤血球系細胞への分化誘導前及び分化誘導後の状態にある細胞から、市販試薬を用いて、標準的な手法により、ｍＲＮＡを抽出し、次いで、これらｍＲＮＡを鋳型として逆転写反応を行った。そして、得られたｃＤＮＡを鋳型として、市販の定量的ＰＣＲ機器及び試薬を用いて、定量的ＲＴ−ＰＣＲを行うことにより、各細胞におけるＧＡＴＡ１遺伝子の発現量を調べた。また、対照として、ヒト胎児肝臓由来の細胞（ＦＬ）と、臍帯血中の血液幹細胞から赤血球系細胞に分化誘導してから６、１０及び１６日目の細胞（ＣＢ  ６、１０、１６）とについても、ＧＡＴＡ１遺伝子の発現を解析した。なお、胎児肝臓には赤血球前駆細胞が豊富に含まれている事が知られている。また、臍帯血中の血液幹細胞から赤血球系細胞への分化誘導は、Ｍｉｈａｒａｄａ  Ｋ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２００６年、２４巻、１０号、１２５５〜１２５６ページに記載の方法に沿って行った。得られた結果を図７に示す。図中「Ｂ」は成熟した赤血球系細胞への分化誘導前の細胞を解析した結果を示し、「Ａ」は成熟した赤血球系細胞への分化誘導後の細胞を解析した結果を示す。
【０１１６】
図７に示す通り、ＨＵＤＥＰ−１、ＨＵＤＥＰ−２、ＨＵＤＥＰ−３、ＨｉＤＥＰ−１及びＨｉＤＥＰ−２については、赤血球系細胞への分化誘導前から、ＧＡＴＡ１遺伝子がある程度発現しており、分化誘導後にこれらの発現が上昇することが明らかになった。
【０１１７】
次に、本発明のヒト赤血球前駆細胞株から成熟した赤血球系細胞への分化過程における、ヘモグロビンの合成について調べた。すなわち、ヘモグロビンの合成が多くなると細胞沈殿はより赤色となるため、前記３株のＨＵＤＥＰ及び前記５株のＨｉＤＥＰに関し、各々の細胞株の、より成熟した赤血球系細胞への分化誘導前及び分化誘導後の状態にある細胞の細胞沈殿の色を目視にて観察した。得られた結果の代表例として、ＨＵＤＥＰ−１及びＨｉＤＥＰ−１についての結果を図８に示す。
【０１１８】
前記３株のＨＵＤＥＰ及び前記５株のＨｉＤＥＰは、合成量に関して細胞株間で差があるものの、恒常的にヘモグロビンを産生していることが明らかになった。図８に示す通り、例えば、ＨＵＤＥＰ−１に関しては、より成熟した赤血球系細胞への分化誘導前はかすかにピンク色であったが、分化誘導後には明瞭な赤色に変化し、ヘモグロビンが豊富に合成されていることが明らかになった。また、ＨｉＤＥＰ−１に関しては、より成熟した赤血球系細胞への分化誘導前（維持培養中）でも、常に明瞭な赤色の細胞沈殿が観察され、ヘモグロビンが常に豊富に合成されていることが明らかになった。
【０１１９】
次に、本発明のヒト赤血球前駆細胞株において合成されているヘモグロビンについて、酸素結合・解離能を解析した。すなわち、ＨＵＤＥＰ−１、ＨｉＤＥＰ−１及びＨｉＤＥＰ−２の各々の細胞中のヘモグロビンについて、市販の酸素結合・解離能解析装置を用いて、標準的な手技手法にて、酸素結合・解離能を解析した。また、対照として、成人末梢血（正常赤血球）中のヘモグロビンについても、酸素結合・解離能を解析した。得られた結果を図９及び１０に示す。
【０１２０】
図９及び１０に示した結果から明らかなように、低酸素状態において酸素を解離し、高酸素状態においては酸素と結合する能力は、ＨＵＤＥＰにおいても、ＨｉＤＥＰにおいても、正常な血液（図中「ＰＢ」参照）と同様なものであった。従って、本発明のヒト赤血球前駆細胞株において合成されているヘモグロビンは、正常赤血球中のそれと同様の機能を有していることが明らかになった。
【産業上の利用可能性】
【０１２１】
以上説明したように、本発明によれば、脱核赤血球を効率よく安定的に生産することができる、不死化したヒト赤血球前駆細胞株の製造方法、並びに該製造方法によって得られるヒト赤血球前駆細胞株からヒト脱核赤血球を製造する方法を提供することが可能となる。
【０１２２】
従って、本発明の製造方法によって得られる脱核赤血球は、正常な赤血球と同等の酸素結合・解離能を有するヘモグロビンを有しているため、外傷・手術中の失血、貧血、鎌形赤血球貧血や溶血性疾患等の血液疾患を処置するために有用である。
【０１２３】
特に、本発明の方法により、Ｏ型ＲｈＤ（−）のヒト赤血球前駆細胞株を樹立すれば、当該細胞株から生産した赤血球は９９％以上の人間に使用が可能である。通常の輸血でＡＢＯ型をマッチングさせる理由は、混在する抗Ａ抗体や抗Ｂ抗体によってホストの赤血球が破壊されることを考慮してのことであるが、試験管内でヒト赤血球前駆細胞株（不死化細胞株）から赤血球を生産した場合に、抗体が産生されることはないので、主要抗原（Ａ、Ｂ、ＲｈＤ）を発現していない赤血球、即ちＯ型ＲｈＤ（−）の赤血球は９９％以上の人間に使用が可能である。
【０１２４】
また、本発明の方法によれば、多能性幹細胞から脱核赤血球を生産することも可能である。従って、特殊血液型の患者の細胞（皮膚細胞、血液等）を用いてｉＰＳ細胞を調製し、さらに該ｉＰＳ細胞から本発明の方法により赤血球前駆細胞株（不死化細胞株）を樹立すれば、世の中の大半の人間が有する赤血球抗原を有していない、特殊血液型の患者（Ｒｈ−ｎｕｌｌ型、−Ｄ−型等の人）に対する、安定した血液供給体制を構築することができる。
【０１２５】
本発明のヒト赤血球前駆細胞株等には、外的刺激により発現は制御されているものの、癌遺伝子であるＨＰＶ−Ｅ６／Ｅ７遺伝子が導入されている。しかしながら、この癌遺伝子は、細胞核内に導入されており、脱核の際に喪失することになる。
【０１２６】
また、ヒト赤血球前駆細胞株から脱核赤血球を生産した場合に、脱核効率を完璧に１００％にすることは技術的に難しく、そこには有核細胞（元のヒト赤血球前駆細胞等）が多かれ少なかれ残存する。しかし、脱核赤血球は直径が１０μｍ以下と小さいので、既に汎用されている白血球除去フィルター等により、有核細胞を除去して、脱核赤血球を選別することが可能である。
【０１２７】
かかる方法にて脱核赤血球を選別した場合にも、有核細胞を１００％除去することは難しく、ある程度は残存するものと思われる。こうした残存有核細胞は、放射線照射によって滅失（細胞死誘導）することが可能である。放射線照射による有核細胞滅失（白血球除去）は、特定のケースの赤血球輸血において既に臨床で常用されている手技である。
【０１２８】
このように、本発明のヒト脱核赤血球の製造方法においては、癌遺伝子であるＨＰＶ−Ｅ６／Ｅ７遺伝子は製造の最終段階において喪失しており、さらに前述の有核細胞を除去する方法を組み合わせることにより、ヒト赤血球前駆細胞株等の腫瘍形成のリスクを完全に排除することが可能となる。
【０１２９】
さらにまた、本発明の方法により樹立した赤血球前駆細胞株に関し、感染源（肝炎ウィルス、エイズウィルス等）が混入されていないことを徹底的に検査することにより、本発明によれば、汎用性が高く、極めて安全性が高い赤血球供給体制を構築することが可能となる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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