(57)【要約】【課題】特に神経変性疾患の予防又は治療を可能とするため、プロテアソーム活性化剤を提供すること。【解決手段】ＡＣＡ及び特定のＡＣＡ類似化合物からなる群より選択される、少なくとも１種の化合物を含む、プロテアソーム活性化剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）；
【化１】
2014156423.tif 000019
（式中、
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ、ＯＡｃ基、ＯＢｕ基、ヒドロキシル基又は水素原子を示し、且つ、Ｒ１がＯＡｃ基、ＯＢｕ基又はヒドロキシル基であるときＲ２は水素原子であり、Ｒ２がＯＡｃ基、ＯＢｕ基又はヒドロキシル基であるときＲ１は水素原子であり、
Ｒ３及びＲ４は、（i）Ｒ３がＯＡｃ基又はＯＢｕ基を示し、Ｒ４が水素原子を示すか、（ii）Ｒ３が水素原子を示し、Ｒ４がＯＡｃ基又はＯＢｕ基を示すか、又は（iii）Ｒ３及びＲ４ともに水素原子を示し、
Ｒ５は、
【化２】
2014156423.tif 000020
【化３】
2014156423.tif 000021
【化４】
2014156423.tif 000022
【化５】
2014156423.tif 000023
【化６】
2014156423.tif 000024
【化７】
2014156423.tif 000025
を示し、ここで、Ｒ６はＯＡｃ基又はＯＢｕ基を示し、
ＯＡｃ基はアセトキシ基を、ＯＢｕ基はイソブトキシ基を示す。）
で表される化合物を含む、プロテアソーム活性化剤。
【請求項２】
１’−アセトキシチャビコールアセテート、
１−アセトキシ−１−（２，４−ジアセトキシフェニル）−２−プロペン、
１−アセトキシ−１−（３，４−ジアセトキシフェニル）−２−プロペン、
１−アセトキシ−１−（４−アセトキシフェニル）−２−ヘプチン、
１−ヒドロキシ−３−（４−アセトキシフェニル）−２−プロペン、
１−アセトキシ−１−フェニル−２−プロペン、
１−イソブトキシ−１−（４−イソブトシキフェニル）−２−プロペン、
１−アセトキシ−１−（４−アセトシキフェニル）プロパン、
１−アセトキシ−３−（４−アセトキシフェニル）−２−プロペン、及び
３−（４−ヒドロキシフェニル）−２−プロペン酸
からなる群より選択される少なくとも１種の化合物を含む、プロテアソーム活性化剤。
【請求項３】
神経変性疾患の予防又は治療剤である、請求項１又は２に記載のプロテアソーム活性化剤。
【請求項４】
神経変性疾患が、アルツハイマー病又はパーキンソン病である、請求項３に記載のプロテアソーム活性化剤。
【請求項５】
１’−アセトキシチャビコールアセテート又は１−ヒドロキシ−３−（４−アセトキシフェニル）−２−プロペンを含む、パーキンソン病予防又は治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロテアソーム活性化剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病などの神経変性疾患においては、神経細胞内に凝集した異常タンパク質が蓄積するという共通の特徴が認められる。異常タンパク質は細胞毒性を持つため、神経細胞変性や細胞死を引き起こすこととなり、これが神経変性疾患の一因であると考えられている。
【０００３】
細胞にはプロテアソームやオートファジーといった、異常タンパク質を分解し細胞内から除去するためのシステムが備わっていることも知られている。上述のように、異常タンパク質の蓄積が神経変性疾患の一因と考えられており、よって、細胞の異常タンパク質分解システムの能力を向上させることにより、神経変性疾患の予防又は治療が可能となるのではと期待されている。例えば、プロテアソームを活性化させることにより、神経変性疾患を予防又は治療できることが期待されている（例えば非特許文献１）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】実験医学Ｖｏｌ．２９  Ｎｏ．１２  （増刊）２０１１、206(2036)−211(2041)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、特に神経変性疾患の予防又は治療を可能とするため、プロテアソーム活性化剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、１’−アセトキシチャビコールアセテート（以下「ＡＣＡ」ともいう）が、プロテアソームを活性化させることを見出し、また、ＡＣＡ類似化合物にも同様の効果があることを見出し、さらに改良を重ねて本発明を完成させるに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は例えば以下の項に記載の主題を包含する。
項１．
式（Ｉ）；
【０００８】
【化１】
2014156423.tif 000002
【０００９】
（式中、
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ、ＯＡｃ基、ＯＢｕ基、ヒドロキシル基又は水素原子を示し、且つ、Ｒ１がＯＡｃ基、ＯＢｕ基又はヒドロキシル基であるときＲ２は水素原子であり、Ｒ２がＯＡｃ基、ＯＢｕ基又はヒドロキシル基であるときＲ１は水素原子であり、
Ｒ３及びＲ４は、（i）Ｒ３がＯＡｃ基又はＯＢｕ基を示し、Ｒ４が水素原子を示すか、（ii）Ｒ３が水素原子を示し、Ｒ４がＯＡｃ基又はＯＢｕ基を示すか、又は（iii）Ｒ３及びＲ４ともに水素原子を示し、
Ｒ５は、
【００１０】
【化２】
2014156423.tif 000003
【００１１】
【化３】
2014156423.tif 000004
【００１２】
【化４】
2014156423.tif 000005
【００１３】
【化５】
2014156423.tif 000006
【００１４】
【化６】
2014156423.tif 000007
【００１５】
【化７】
2014156423.tif 000008
【００１６】
を示し、ここで、Ｒ６はＯＡｃ基又はＯＢｕ基を示し、
ＯＡｃ基はアセトキシ基を、ＯＢｕ基はイソブトキシ基を示す。）
で表される化合物を含む、プロテアソーム活性化剤。
項２．
１’−アセトキシチャビコールアセテート、
１−アセトキシ−１−（２，４−ジアセトキシフェニル）−２−プロペン、
１−アセトキシ−１−（３，４−ジアセトキシフェニル）−２−プロペン、
１−アセトキシ−１−（４−アセトキシフェニル）−２−ヘプチン、
１−ヒドロキシ−３−（４−アセトキシフェニル）−２−プロペン、
１−アセトキシ−１−フェニル−２−プロペン、
１−イソブトキシ−１−（４−イソブトシキフェニル）−２−プロペン、
１−アセトキシ−１−（４−アセトシキフェニル）プロパン、
１−アセトキシ−３−（４−アセトキシフェニル）−２−プロペン、及び
３−（４−ヒドロキシフェニル）−２−プロペン酸
からなる群より選択される少なくとも１種の化合物を含む、プロテアソーム活性化剤。
項３．
神経変性疾患の予防又は治療剤である、項１又は２に記載のプロテアソーム活性化剤。
項４．
神経変性疾患が、アルツハイマー病又はパーキンソン病である、項３に記載のプロテアソーム活性化剤。
項５．
１’−アセトキシチャビコールアセテート又は１−ヒドロキシ−３−（４−アセトキシフェニル）−２−プロペンを含む、パーキンソン病予防又は治療剤。
【発明の効果】
【００１７】
本発明のプロテアソーム活性化剤によれば、プロテアソーム（特に神経細胞のプロテアソーム）を活性化することができ、ひいては神経変性疾患の予防又は治療を行い得る。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】本発明における、特に好ましい「特定のＡＣＡ類似化合物」の化学構造式を示す。ＯＡｃ基はアセトキシ基を、ＯＢｕ基はイソブトキシ基を示す。
【図２】ＡＣＡがプロテアソーム活性へ及ぼす効果を検討した結果を示す。
【図３】ＡＣＡがプロテアソーム活性へ及ぼす効果を検討した結果を示す。
【図４】２種のＡＣＡ類似化合物の化学構造式を示す。ＯＡｃ基はアセトキシ基を、ＯＢｕ基はイソブトキシ基を示す。
【図５ａ】ＡＣＡ類似化合物がプロテアソーム活性へ及ぼす効果を検討した結果を示す。
【図５ｂ】ＡＣＡ類似化合物がプロテアソーム活性へ及ぼす効果を検討した結果を示す。
【図６】アミロイドβの細胞毒性に及ぼすＡＣＡの影響を検討した結果を、細胞生存率によって示す。
【図７ａ】マンガンの細胞毒性に及ぼすＡＣＡの影響を検討した結果を、細胞生存率によって示す。
【図７ｂ】マンガンの細胞毒性に及ぼすＡＣＡｉ−ＯＨの影響を検討した結果を、細胞生存率によって示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、本発明について、さらに詳細に説明する。
【００２０】
本発明のプロテアソーム活性化剤は、ＡＣＡ及び特定のＡＣＡ類似化合物からなる群より選択される、少なくとも１種の化合物を含む。
【００２１】
本発明で用いる、ＡＣＡ及び特定のＡＣＡ類似化合物からなる群より選択される化合物とは、次の式（Ｉ）で表される化合物である。なお、式（Ｉ）の説明中、Ａｃ基はアセチル基をし、また、Ｂｕはイソブチル基を示す。（よって、ＯＡｃはアセトキシ基を、ＯＢｕはイソブトキシ基を示す。）
【００２２】
【化８】
2014156423.tif 000009
【００２３】
（式中、
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ、ＯＡｃ基、ＯＢｕ基、ヒドロキシル基又は水素原子を示し、且つ、Ｒ１がＯＡｃ基、ＯＢｕ基又はヒドロキシル基であるときＲ２は水素原子であり、Ｒ２がＯＡｃ基、ＯＢｕ基又はヒドロキシル基であるときＲ１は水素原子であり、
Ｒ３及びＲ４は、（i）Ｒ３がＯＡｃ基又はＯＢｕ基を示し、Ｒ４が水素原子を示すか、（ii）Ｒ３が水素原子を示し、Ｒ４がＯＡｃ基又はＯＢｕ基を示すか、又は（iii）Ｒ３及びＲ４ともに水素原子を示し、
Ｒ５は、
【００２４】
【化９】
2014156423.tif 000010
【００２５】
【化１０】
2014156423.tif 000011
【００２６】
【化１１】
2014156423.tif 000012
【００２７】
【化１２】
2014156423.tif 000013
【００２８】
【化１３】
2014156423.tif 000014
【００２９】
【化１４】
2014156423.tif 000015
【００３０】
を示し、ここで、Ｒ６は、ＯＡｃ基又はＯＢｕ基を示す。）
【００３１】
なお、上記式の説明に記載の制限のうえで、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ６のなかでＯＡｃ基又はＯＢｕ基を示す基がある場合には、その基は、ＯＢｕ基よりもＯＡｃ基であることが好ましく、またその基が全てＯＡｃ基であることがより好ましい。
【００３２】
また、Ｒ３及びＲ４は、Ｒ３及びＲ４ともに水素原子であることが好ましい。ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４が全て水素原子であることは好ましくない。
【００３３】
また、Ｒ１及びＲ２は、Ｒ１がＯＡｃ基又はＯＢｕ基であり、Ｒ２が水素原子であることが好ましい。
【００３４】
また、Ｒ１又はＲ２がヒドロキシル基である場合は、Ｒ５は、
【００３５】
【化１５】
2014156423.tif 000016
【００３６】
であることが好ましい。
【００３７】
ＡＣＡは公知の物質であり、また公知の方法により容易に製造することができる。例えば、ＡＣＡはナンキョウ（タイショウガ）の根茎に含まれることが知られており、ナンキョウの抽出物を生成して得ることができる。また、公知の方法により合成したものを用いてもよい。
【００３８】
特定のＡＣＡ類似化合物として、特に好ましい化合物を次の表１に示す。表１には、それぞれの化合物の略称又は別称も併せて示す。以下、本明細書においては、当該略称を使用することがある。また、表１には、ＡＣＡも併せて記載する。さらにまた、表１に示す化合物の化学構造式を図１に示す。
【００３９】
【表１】
2014156423.tif 000017
【００４０】
上記ＡＣＡ類似化合物も公知の化合物であり、また公知の方法により容易に製造することができる。
【００４１】
ＡＣＡ及び当該特定のＡＣＡ類似化合物の製造方法については、例えば、特開２００９−７９００４号公報、特開２０１１−１７３８０３号公報、特開２０１２−５６８５７号公報、特開２０１２−５６８８６号公報等に詳説されている。また、当業者であれば、例えばこれら公知の方法を基に容易に上記特定のＡＣＡ類似化合物を製造することができる。
【００４２】
本発明のプロテアソーム活性化剤は、上述したように、特に神経変性疾患の予防又は治療に用いることができる。また、その他の用途にも（例えば研究用試薬として）用いることができる。
【００４３】
ここでの神経変性疾患は、タンパク質の蓄積が一因となって引き起こされる神経変性疾患が好ましく、例えばアルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病などが例示できる。中でもアルツハイマー病、パーキンソン病に対しての予防又は治療効果が特に好ましく期待できる。なお、アルツハイマー病、又はパーキンソン病の予防又は治療剤に用いる化合物としては、上記表１に記載される化合物の中でも、ＡＣＡ又はＡＣＡｉ−ＯＨが特に好ましい。
【００４４】
本発明のプロテアソーム活性化剤は、ＡＣＡ及び上記特定のＡＣＡ類似化合物からなる群より選択される少なくとも１種（以下「有効成分」ということがある）のみからなるものであってもよいし、その他の成文が含まれていてもよい。例えば、本発明のプロテアソーム活性化剤を特に神経変性疾患の予防又は治療剤として用いる場合、有効成分に加え、必要に応じて薬学的に許容される基剤、担体、添加剤（例えば賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、溶剤、甘味剤、着色剤、矯味剤、矯臭剤、界面活性剤、保湿剤、保存剤、ｐＨ調整剤、粘稠化剤等）等を配合することができる。このような基材、担体、添加剤等は、例えば医薬品添加物辞典２０００（株式会社薬事日報社）に具体的に記載されており、例えばこれに記載されるものを用いることができる。また、常法により、例えば錠剤、被覆錠剤、散剤、顆粒剤、細粒剤、カプセル剤、丸剤、液剤、懸濁剤、乳剤、ゼリー剤、チュアブル剤、ソフト錠剤等の製剤に調製することができる。特に、液剤、懸濁剤、乳剤等に調製し、注射剤又は点滴剤として用いる、あるいは経口剤として用いることが好ましい。
【００４５】
本発明の神経変性疾患の予防又は治療剤における有効成分の配合量は、適宜設定することができる。例えば、好ましくは、０．０００５〜１００質量％、より好ましくは０．００５〜９０質量％、さらに好ましくは０．０５〜８０質量％である。
【００４６】
本発明の神経変性疾患の予防又は治療剤の投与量は、神経変性疾患の予防又は治療効果が発揮される量（予防又は治療有効量）である限り特に制限されず、患者の年齢、患者の症状の程度、その他の条件等に応じて適宜選択され得る。通常当該剤中の有効成分の量が、好ましくは成人一日あたり1〜1000ｍｇ、より好ましくは10〜100ｍｇ、さらに好ましくは10〜50ｍｇの範囲となる量を目安とするのが好ましい。なお、１日１回又は複数回（好ましくは２〜３回）に分けて投与することができる。本発明の神経変性疾患の予防又は治療剤は、好ましくは一回の投与により比較的長時間効果を持続することができるものであり、例えば好ましくは１０時間程度効果を持続し得るものである。
【００４７】
また、本発明の神経変性疾患の予防又は治療剤を投与する対象は、ヒトのみならず、その他の哺乳類であってもよい。このような哺乳類としては例えば家畜やペット、実験動物などとして飼育されるものが想定でき、例えばイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、サル、ウサギ、マウス、ラット、ハムスター等が例示できる。
【００４８】
本発明の神経変性疾患の予防又は治療剤の投与時期は特に限定されず、例えば製剤形態、患者の年齢、患者の症状の程度等を考慮して適宜投与時期を選択することが可能である。また、投与形態も特に限定されないが、公知の投与形態を用いることができるが、特に経血管投与（経静脈投与等）又は経口投与が好適である。
【実施例】
【００４９】
以下、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の例に限定されるものではない。
【００５０】
以下の実験では、培養細胞としてラット副腎褐色細胞 (PC-12)を用いた。当該細胞は財団法人  ヒューマンサイエンス振興財団・ヒューマンサイエンス研究資源バンクより分譲頂いた。また、以下の検討において、細胞の培養、プロテアソーム活性の測定、及び細胞生存率の検討は、次のようにして行った。
〔細胞培養方法〕
10％馬血清および5％牛胎児血清を含むDMEM培地（以下、特に断らない限り、この培地を細胞培養に用いた）で80％コフルエント状態になるまで5%CO2インキュベーター内で３〜５日間３７℃で培養した。ピペッティング処理によって細胞を剥がした後、細胞数を２．５×１０５ cells/mlになるように調整した。96well plateに細胞浮遊液を１００μＬずつ添加し、1晩３７℃で細胞を付着させた。その後、神経成長因子(NGF)を50 ng/mlの濃度で添加し、2日間さらに培養して神経細胞への分化誘導を行ったものを実験に用いた。
〔プロテアソーム活性測定方法〕
プロテアソーム活性の測定は、proteasome -GloTM Cell Based Assay kit (Promega)を用いて行った。なお、当該キットにはProteasome-GloTM Cell Based Assay Reagentが備えられており、当該Reagentは、プロテアソームに対する発光基質、Suc-LLVY-aminoluciferinがバッファーに溶解したものであって、実験系に当該Reagentが添加されると、プロテアソームによる基質の切断、さらにルシフェラーゼ反応による発光シグナルの生成が直ちに起こる。この発光シグナルが細胞内のプロテアソーム活性量に比例していることを利用して、プロテアソーム活性化を測定できる。
〔細胞生存率の検討方法〕
細胞生存率の検討は、ＭＴＴ法を用いて行った。なお、当該方法は、MTT 〔3 - ( 4, 5 - Dimethylthial - 2 - yl ) - 2, 5-Diphenyltetrazalium Bromide〕は淡黄色の基質であるところ、生細胞のミトコンドリアにより開裂して（死細胞では開裂しない）晴青色のホルマザン（Formazan）を生成する性質があり、このホルマザンの生成量が生細胞数と相関していることを利用して、細胞生存率を検討する方法である。
【００５１】
検討１：ＡＣＡがプロテアソーム活性へ及ぼす効果の検討
上述したように分化誘導を行った培養細胞について、培地を交換し、これと同時にサンプル（ＡＣＡ、培地に加えた際の終濃度２．５μＭ）を添加した後、１、３、６、９又は２４時間培養を行った。また、サンプルを加えない実験（コントロール）も同時に行った。そして、プロテアソーム活性を測定した。当該結果を図２に示す。またさらに、同様の実験を、ＡＣＡ終濃度が０、１．２５、２．５又は５．０μＭとなるように調整した上で行い、プロテアソーム活性を測定した。当該結果を図３に示す。
【００５２】
これらの結果から、ＡＣＡがプロテアソームを活性化する作用を有すること、及び低濃度（少なくとも１．２５μＭ以上）のＡＣＡによってもプロテアソームの活性化が起こること、がわかった。さらに、当該プロテアソーム活性化効果は、少なくとも９時間は持続することがわかった。
【００５３】
検討２：ＡＣＡ類似化合物がプロテアソーム活性へ及ぼす効果の検討
上記表１に記載の各ＡＣＡ類似化合物（但しクマル酸は除く）、及び下記表２に記載のＡＣＡ類似化合物、計１０種類のＡＣＡ類似化合物について、上記検討１でＡＣＡについて行った検討と同様の検討を行った。なお、表２に記載の化合物の化学構造式を図４に示す。
【００５４】
【表２】
2014156423.tif 000018
【００５５】
当該検討結果をグラフ化したものを図５ａ及び図５ｂに示す。なお、これらのグラフでは、各化合物を加えなかった例をコントロールとして表示している。表１に記載の化合物は、全てプロテアソームを活性化した（有意差あり）が、表２に記載の化合物にはプロテアソーム活性化作用はほとんど認められなかった（有意差なし）。このことから、ＡＣＡ類似化合物であっても、プロテアソーム活性化効果を有する化合物と有さない化合物が存在することがわかった。
【００５６】
検討３：アミロイドβの細胞毒性に及ぼすＡＣＡの影響の検討
神経細胞にアミロイドβを曝露させることによって作製したアルツハイマー病モデル細胞において、アミロイドβの細胞毒性に及ぼすＡＣＡの影響について検討した。なお、アルツハイマー病は脳神経細胞内でのアミロイドβの蓄積により引き起こされる可能性が高いことはよく知られている。
【００５７】
具体的には、次のようにして検討した。すなわち、上述したように分化誘導を行った培養細胞について、培地を交換し、これと同時にサンプル（ＡＣＡ、培地に加えた際の終濃度が０、１．２５、又は２．５μＭ）を添加し、サンプルを添加して１時間後にアミロイドβペプチドを添加（培地へ加えた際の終濃度が１０又は２０μＭ）し、それから２０時間培養してからＭＴＴ試薬を加え、さらに４時間培養して、生成したホルマザン量を光度計にて測定し、細胞生存率を求めた。なお、アミロイドβペプチドはSigma社から購入したものを用いた。
【００５８】
結果をグラフ化したものを図６に示す。なお、図６には、アミロイドβを加えずに同様に実験した結果も併せて示す。当該結果から、アミロイドβは神経細胞の細胞生存率を著しく低下（有意差あり）させた一方、ＡＣＡを添加するとアミロイドβによる細胞毒性が抑制される（有意差あり）ことがわかった。このことから、ＡＣＡが特にアルツハイマー病の予防又は治療に有効であろうことが確認できた。
【００５９】
検討４：マンガンの細胞毒性に及び素ＡＣＡおよびＡＣＡｉ−ＯＨの影響の検討
神経細胞にマンガンを曝露させることによりパーキンソン病モデル細胞を作製し、マンガンの細胞毒性に対するＡＣＡおよびＡＣＡｉ−ＯＨの影響を検討した。なお、神経細胞にマンガンを曝露させることによりパーキンソン病モデルを作製できることは、例えばBRAIN RESEARCH (2010) 201−207や、Free Radical Biology & Medicine, 36: 1144−1154, 2004に記載されるように、公知である。
【００６０】
具体的には、サンプルとしてＡＣＡ又はＡＣＡｉ−ＯＡを用い、アミロイドβペプチドの代わりに二塩化マンガン（ＭｎＣｌ２）を添加（培地へ加えた際の終濃度が３００又は６００μＭ）した以外は、上記検討３と同様にして検討を行った。結果をグラフ化したものを図７ａ及び図７ｂに示す。当該結果から、ＡＣＡおよびＡＣＡｉ−ＯＨは、添加濃度に依存してマンガンの細胞毒性を抑制することがわかった。このことから、ＡＣＡおよびＡＣＡｉ−ＯＨが特にパーキンソン病の予防又は治療に有効であろうことが確認できた。
【図１】
2014156423.tif 000026
【図２】
2014156423.tif 000027
【図３】
2014156423.tif 000028
【図４】
2014156423.tif 000029
【図５ａ】
2014156423.tif 000030
【図５ｂ】
2014156423.tif 000031
【図６】
2014156423.tif 000032
【図７ａ】
2014156423.tif 000033
【図７ｂ】
2014156423.tif 000034