(57)【要約】【課題】繰り返し評価する場合に、再現性の高いヌメリ評価方法を提供する。【解決手段】本発明は、多孔質性の対象物を、基板に載置する載置工程と、細菌を含む液体を上記対象物に接触させ、該細菌の増殖環境下に上記基板を保持し、バイオフィルムを形成させる形成工程と、染色液を用いて、上記基板の面に形成された上記バイオフィルム及び上記対象物上に形成された上記バイオフィルムの少なくとも何れか一方を染色する染色工程とを含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
多孔質性の対象物のヌメリ抑制効果を調べるヌメリ評価方法であって、
多孔質性の対象物を、基板に載置する載置工程と、
細菌を含む液体を上記対象物に接触させ、該細菌の増殖環境下に上記基板を保持し、バイオフィルムを形成させる形成工程と、
染色液を用いて、上記基板の面に形成された上記バイオフィルム及び上記対象物上に形成された上記バイオフィルムの少なくとも何れか一方を染色する染色工程とを含むことを特徴とするヌメリ評価方法。
【請求項２】
上記染色工程の後に、上記バイオフィルムを上記基板又は上記対象物から剥離する剥離工程と、
剥離した上記バイオフィルムの吸光度を測定する測定工程とをさらに含むことを特徴とする請求項１に記載のヌメリ評価方法。
【請求項３】
上記剥離工程において、上記基板又は上記対象物を蒸留水に入れ、超音波洗浄により上記バイオフィルムを上記基板又は上記対象物から剥離し、
上記測定工程において、上記蒸留水中の上記バイオフィルムの吸光度を測定することを特徴とする請求項２に記載のヌメリ評価方法。
【請求項４】
上記形成工程では、少なくとも、上記基板において上記対象物と接している面に上記バイオフィルムを形成させ、
上記染色工程では、上記基板の面に形成された上記バイオフィルムを染色することを特徴とする請求項１〜３の何れか１項に記載のヌメリ評価方法。
【請求項５】
上記形成工程の後、上記染色工程の前に、上記対象物を上記基板から取り外すことを特徴とする請求項４に記載のヌメリ評価方法。
【請求項６】
上記形成工程において、上記基板及び上記対象物は、滅菌された水を含んだ、放水性を有する材料の上に配置されることを特徴とする請求項１〜５の何れか一項に記載のヌメリ評価方法。
【請求項７】
上記形成工程において、上記細菌の増殖環境下に上記基板を２日以上保持することを特徴とする請求項１〜６の何れか一項に記載のヌメリ評価方法。
【請求項８】
上記細菌は、シュードモナス属、バチルス属、メチロバクテリウム属又はブレバンディモナス属に含まれる細菌であることを特徴とする請求項１〜７の何れか一項に記載のヌメリ評価方法。
【請求項９】
上記基板における上記対象物と接する面と、上記対象物における上記基板と接する面とは同じ大きさであることを特徴とする請求項１〜８の何れか一項に記載のヌメリ評価方法。
【請求項１０】
上記基板は、ガラスであることを特徴とする請求項１〜９の何れか一項に記載のヌメリ評価方法。
【請求項１１】
上記対象物は、不織布、織布、紙又は、多孔質性若しくはメッシュ状のプラスチック、金属、フィルム、シート若しくはガラスであることを特徴とする請求項１〜１０の何れか一項に記載のヌメリ評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、対象物のヌメリ抑制効果を調べるヌメリ評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
浴室、台所、洗面所、及びトイレ等の常にわずかな水が滞留している部分又は水の通り道には、ヌメリと呼ばれる粘性物質が発生する。ヌメリが発生した部分に水を流す程度では、ヌメリを剥離することは困難である。
【０００３】
また、ヌメリは、水と空気との界面近くに出来やすく、絶えず水の張った場所、又は湿度が高く、しかも通気が不十分な場所に発生しやすい。ヌメリは淡紅色を呈していることが多く、異臭はない。ヌメリの周囲にはカビの発生が認められるところが多い。
【０００４】
ヌメリは、細菌などの微生物が細胞外に産生した多糖類を主成分とするバイオフィルムであるといわれている。バイオフィルムは、固体表面に接着した微生物が形成する高次構造体である。バイオフィルムは、細胞外多糖類（ＥＰＳ：Ectracellular polysaccharides）の産生により維持される。なお、環境中にバイオフィルムが形成されるのは、菌数が１０８以上に達したときであると考えられている。
【０００５】
発生したバイオフィルムを定量すべく、様々なバイオフィルム評価方法が研究されており、例えば、台所や洗面台などの一般的な生活環境におけるバイオフィルム形成菌を定量可能なバイオフィルム評価方法が、特許文献１に記載されている。
【０００６】
台所における排水口のステンレスカゴ、流し台の三角コーナー等に使用される水切り袋等の対象物は使用中にヌメリが発生しないことが望ましい。そこで、例えば、ＪＩＳＺ２８０１の規定による抗菌性評価を行うことによって、対象物の抗菌性の有無が評価されている。この評価により対象物が抗菌性を有していればヌメリの発生も抑制されると考えられているからである。ヌメリ抑制効果は専ら対象物の抗菌性の有無によって判断されている。
【０００７】
さらに、ヌメリ抑制効果の別の判断手法としては、家庭で生じる実際の食品を使って、水切り袋のヌメリの発生等に関して実用評価を行っている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００６−３１３１２３号公報（２００６年１１月６日公開）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
特許文献１については、バイオフィルム担体でバイオフィルムを形成し、形成したバイオフィルムを定量することが可能であるが、ある対象物がバイオフィルムの形成にどのように影響するかを評価することはできない。
【００１０】
抗菌性評価のみでは、対象物が抗菌性を有しているかを判定可能であるが、バイオフィルムの発生を抑制できるか否か、すなわちヌメリ抑制効果があるか否かを直接評価できるものではない。
【００１１】
また、上記実用評価においては、食品による差をなくすために無菌化されたレトルト食品を使用した場合であっても、周囲の環境、温度、湿度又は周囲の菌の存在によって評価結果が変わってしまうという問題がある。
【００１２】
本発明は、繰り返し評価する場合に再現性がより高いヌメリ評価方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明に係るヌメリ評価方法は、上記の課題を解決するために、多孔質性の対象物のヌメリ抑制効果を調べるヌメリ評価方法であって、多孔質性の対象物を、基板に載置する載置工程と、細菌を含む液体を上記対象物に接触させ、該細菌の増殖環境下に上記基板を保持し、バイオフィルムを形成させる形成工程と、染色液を用いて、上記基板の面に形成された上記バイオフィルム及び上記対象物上に形成された上記バイオフィルムの少なくとも何れか一方を染色する染色工程とを含むことを特徴としている。
【００１４】
上記構成によれば、まず、多孔質性の対象物を基板に載置し、細菌を含む液体を当該対象物に接触させる。細菌の増殖環境下に基板が保持されていることにより、当該対象物に付着した細菌が増殖し、バイオフィルムが形成される。ここで、当該対象物は多孔質性であるため、当該対象物における細菌を含む液体を接触させた面のみならず、対象物と基板との間、および基板における当該対象物と接している面にもバイオフィルムが形成される。そして、染色液を用いて、基板上に形成されたバイオフィルム及び対象物上に形成されたバイオフィルムの少なくとも何れか一方を染色することにより、当該バイオフィルムの形成度合いを認識することができる。
【００１５】
これにより、多孔質性の対象物に応じて、基板及び対象物の少なくとも何れか一方に形成されるバイオフィルムの形成度合いを把握することができ、多孔質性の対象物のヌメリ抑制効果を繰り返し評価する場合に、再現性よく評価することができる。
【００１６】
本発明に係るヌメリ評価方法は、上記染色工程の後に、上記バイオフィルムを上記基板又は上記対象物から剥離する剥離工程と、剥離した上記バイオフィルムの吸光度を測定する測定工程とをさらに含むことが好ましい。
【００１７】
本発明に係るヌメリ評価方法は、上記剥離工程において、上記基板又は上記対象物を蒸留水に入れ、超音波洗浄により上記バイオフィルムを上記基板又は上記対象物から剥離し、上記測定工程において、上記蒸留水中の上記バイオフィルムの吸光度を測定することがより好ましい。
【００１８】
本発明に係るヌメリ評価方法は、上記形成工程では、少なくとも、上記基板において上記対象物と接している面に上記バイオフィルムを形成させ、上記染色工程では、上記基板の面に形成された上記バイオフィルムを染色することが好ましい。
【００１９】
本発明に係るヌメリ評価方法は、上記形成工程の後、上記染色工程の前に、上記対象物を上記基板から取り外すことが好ましい。
【００２０】
本発明に係るヌメリ評価方法では、上記形成工程において、上記基板及び上記対象物は、滅菌された水を含んだ、放水性を有する材料の上に配置されることが好ましい。
【００２１】
本発明に係るヌメリ評価方法は、上記形成工程において、上記細菌の増殖環境下に上記基板を２日以上保持することが好ましい。
【００２２】
本発明に係るヌメリ評価方法では、上記細菌は、シュードモナス属、バチルス属、メチロバクテリウム属又はブレバンディモナス属に含まれる細菌であることが好ましい。
【００２３】
本発明に係るヌメリ評価方法は、上記基板における上記対象物と接する面と、上記対象物における上記基板と接する面とは同じ大きさであることが好ましい。
【００２４】
本発明に係るヌメリ評価方法では、上記基板は、ガラスであることが好ましい。
【００２５】
本発明に係るヌメリ評価方法では、上記対象物は、不織布、織布、紙又は、多孔質性若しくはメッシュ状のプラスチック、金属、フィルム、シート若しくはガラスであることが好ましい。
【発明の効果】
【００２６】
本発明に係るヌメリ評価方法は、繰り返し評価する場合に再現性を確保できるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】各基板に形成され、染色されているバイオフィルムを示す図である。
【図２】各基板に形成され、染色されているバイオフィルムを示す図である。
【図３】染色したバイオフィルムを含む洗浄液における吸光度を示す図である。
【図４】染色したバイオフィルムを含む洗浄液における吸光度を示す図である。
【図５】染色したバイオフィルムを含む洗浄液における吸光度及び糖量を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
〔ヌメリ評価方法〕
以下、本発明に係るヌメリ評価方法の一実施形態について、詳細に説明する。本実施形態に係るヌメリ評価方法は、多孔質性の対象物のヌメリ抑制効果を調べる方法であって、多孔質性の対象物を、基板に載置する載置工程と、細菌を含む液体を上記対象物に接触させ、該細菌の増殖環境下に上記基板を保持し、バイオフィルムを形成させる形成工程と、染色液を用いて、上記基板の面に形成された上記バイオフィルム及び上記対象物上に形成された上記バイオフィルムの少なくとも何れか一方を染色する染色工程とを含んでいる。
【００２９】
また、本実施形態に係るヌメリ評価方法は、上記染色工程の後に、上記バイオフィルムを上記基板又は上記対象物から剥離する剥離工程と、剥離した上記バイオフィルムの吸光度を測定する測定工程とをさらに含んでいる。
【００３０】
（多孔質性の対象物）
多孔質性の対象物は、その物におけるヌメリ抑制効果を調べるサンプルである。多孔質性の対象物としては、水透過性を有しており、好適には、ヌメリが発生し得る場所に設けられるものである。ここで、「多孔質性」とは、細菌を含む液体（以下、「菌液」という。）を透過する穴径（貫通孔）を有していれば、その大きさ、および形状等に制限はない。多孔質性の対象物としては、例えば、台所、洗面所等で使用する水切り袋、フキン、水切り受け皿及び排水口受け皿等、これらの一部分、ならびにこれらを製造するための材料が挙げられる。
【００３１】
多孔質性の対象物のより具体的な例としては、不織布、織布及び紙が挙げられ、また、多孔質性若しくはメッシュ状のプラスチック、金属、フィルム、シート及びガラス等が挙げられる。なお、不織布、織布及び多孔質性若しくはメッシュ状のフィルム等は、水切り袋等に好適に用いられる。
【００３２】
多孔質性の対象物の材料としては、合成繊維、再生繊維、無機繊維、生分解性繊維、樹脂、金属、ガラス等が挙げられる。合成繊維としては、以下に限定されないが、ポリエステル系合成繊維、ポリアミド系合成繊維、ポリウレタン系合成繊維、ポリオレフィン系合成繊維、アクリル系合成繊維が挙げられる。また、再生繊維としては、セルロース系再生繊維が挙げられ、例えば、レーヨン、パルプ、キュプラ、セロファン等が挙げられる。また、無機繊維としては、ガラス繊維、炭素繊維等が挙げられる。また、生分解性繊維としては、ＰＬＡ（ポリ乳酸）、ＰＧＡ（ポリグリコール酸）等が挙げられる。これら材料は、単独で用いてもよく、また、２種類以上を組み合わせて用いてもよい。また、多孔質性の対象物は、抗菌性、および耐久性等の機能を付加するための物質が添加されていたり、被覆していたりするものであってもよい。
【００３３】
（基板）
基板は、多孔質性の対象物を載置するためものであり、細菌が増殖し得る形態のものが意図されている。また、細菌の増殖により、基板における多孔質性の対象物と接している面にバイオフィルムが形成される。
【００３４】
基板としては、多孔質性の対象物を載置することができるものであれば限定されず、例えば、ガラス、プラスチック、セラミック、ステンレス及びアルミ等によって形成されたものが挙げられる。中でもガラスを用いることが好ましい。ガラスを基板として用いた場合には、ガラス上に形成されたバイオフィルムを染色する場合にガラスが染色されることはなく、染色されたバイオフィルムを目視する際に、バイオフィルムの形成度合いをより正確に評価できる。
【００３５】
（細菌）
本実施形態において、菌液は、多孔質性の対象物と接触し、基板において対象物と接している面及び対象物上にバイオフィルムを形成させるために用いられる。
【００３６】
細菌としては、バイオフィルム形成能を有する細菌であれば限定されず、例えば、シュードモナス（Pseudomonas）属、バチルス（Bacillus）属、メチロバクテリウム（Methylobacterium）属、ブレバンディモナス（Brevundimonas）属等に含まれる細菌が挙げられる。シュードモナス属に含まれる細菌としては、蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)、シュードモナス・ベシキュラリス（Pseudomonas vesicularis）等が挙げられる。短時間で多くのバイオフィルムを形成することができるため、シュードモナス属に含まれる細菌がより好ましく、特に、蛍光菌を用いることが好ましい。
【００３７】
以下、本実施形態に係るヌメリ評価方法の各工程について、詳細に説明する。なお、本実施形態の一連の操作は、対象物に接触させる細菌を含む液体以外、滅菌処理した器具を用いてすべて無菌環境下で行う。
【００３８】
（載置工程）
載置工程では、基板上に多孔質性の対象物を載置する。本実施の形態では、まず、シャーレ等の容器に滅菌処理した水を含んだ放水性を有する材料を容器の底全面に敷く。そして、シャーレに敷きつめた当該材料の上に、一枚又は複数枚の基板を並べる。
【００３９】
シャーレに敷きつめる材料としては、放水性を有するものであればよい。本明細書における「放水性」とは、材料の内部又は表面に保持している水分を基板及び多孔質性の対象物に供給できる性質をいう。放水性を有する材料としては、例えば、ガーゼ、スポンジ、綿、布、紙等が挙げられる。
【００４０】
（形成工程）
形成工程では、菌液を、基板上の対象物に滴下し、一定条件下でこれらを保持することにより、バイオフィルムを形成させる。ここで、対象物は多孔質性であるため、当該対象物における細菌を含む液体を接触させた面のみならず、対象物と基板との間、および基板における当該対象物と接している面にもバイオフィルムが形成される。
【００４１】
シャーレ内には水を含んだ放水性を有する材料が存在し、当該材料から水分が基板及び多孔質性の対象物に供給される。そのため、細菌の増殖環境下に基板は保持され、細菌は、基板において多孔質性の対象物と接している面に粘性を有する物質（バイオフィルム）を形成する。また、シャーレに蓋をすることにより、湿度、温度等が一定で、かつ外部から他の細菌が入らない条件にて細菌は増殖する。
【００４２】
保持条件は、増殖させる細菌に応じて適宜決定すればよい。具体的には、増殖させる細菌に適した条件に設定すればよい。例えば、細菌として蛍光菌を用いる場合には、シャーレに蓋をした状態で、３０℃で保持すればよい。
【００４３】
細菌を多孔質性の対象物に滴下した後の保持期間に制限はなく、細菌に応じて適宜決定すればよいが、同一環境下で２日以上保持することが好ましい。細菌の増殖環境下に、菌液を滴下したサンプルを２日以上保持することにより、基板上及び多孔質性の対象物上にバイオフィルムが形成される場合に、バイオフィルムの形成を容易に確認することができる。評価をするためにより十分なバイオフィルムを形成させる観点からは、シャーレを３日以上保持することが好ましい。なお、細菌の増殖環境下にて、密閉したシャーレを保持する期間に上限はないが、評価方法の実施に要する時間を短くする観点から、１０日以内とすることが好ましく、７日以内とすることがより好ましい。細菌として蛍光菌を用いる場合には、４日間保持することが特に好ましい。
【００４４】
さらに、基板及び多孔質性の対象物は、滅菌処理した水を含んだ、放水性を有する材料の上に配置されているため、乾燥により十分なバイオフィルムが基板に形成されないことを防止できる。
【００４５】
また、基板において多孔質性の対象物と接する面（以下、「基板の面」ともいう。）と当該対象物において基板と接する面（以下、「対象物の面」ともいう。）とは同じ大きさであることが好ましい。基板の面が対象物の面よりも大きい場合には、対象物に十分な量の水分が供給されず、その結果、細菌が十分に増殖できず、評価をするのに十分な量のバイオフィルムが形成されないおそれがある。一方、基板の面が対象物の面よりも小さい場合には、対象物に滴下された菌液あるいは菌液に含まれる細菌が、基板の面以外の場所に流れ出てしまい、その結果、意図していない領域にバイオフィルムが形成されるおそれがある。よって、基板の面と対象物の面とを同じ大きさにすることにより、多くのバイオフィルムを基板の面に形成させることができるとともに、基板の所望する面にのみバイオフィルムを形成させることができる。なお、本明細書において「同じ大きさ」とは、完全に一致する場合のほかに、完全に同じ大きさである場合に奏する効果と同等の効果を奏することができれば、実質的に同じ大きさである場合も含むものである。
【００４６】
一実施形態において、シャーレを一定温度で４日保持した場合において、基板及び多孔質性の対象物に形成されたバイオフィルムを後述の工程により確認するため、シャーレから基板及び多孔質性の対象物を取り出す。
【００４７】
（染色工程）
染色工程では、染色液を用いて、基板の面に形成されたバイオフィルム及び多孔質性の対象物上に形成されたバイオフィルムの少なくとも何れか一方を染色する。バイオフィルムを染色することにより、形成されたバイオフィルムを明確に確認することができ、後の測定工程にてバイオフィルムを含む液体の吸光度を測定することができる。
【００４８】
バイオフィルムを染色する染色液としては、特に限定されないが、クリスタルバイオレット、メチレンブルー等が挙げられる。
【００４９】
基板の面に形成されたバイオフィルムを染色する前に、多孔質性の対象物を基板から取り外すことが好ましい。予め多孔質性の対象物を取り外しておくことによって、多孔質性の対象物が染色液に染色され、バイオフィルムの形成度合いの確認が困難になることを防止できる。また、多孔質性の対象物を基板から取り外した後に、基板を蒸留水等で洗浄し、余分な菌液を除去することが好ましい。
【００５０】
バイオフィルムを染色することにより、基板及び多孔質性の対象物に形成されるバイオフィルムを目視にて評価することができる。つまり、基板上又は対象物において染色されている面積が大きいほど、バイオフィルムの形成量が多く、染色されている面積が小さいほど、バイオフィルムの形成量が少ないことがわかる。また、バイオフィルムは３次元的に積みあがって形成される構造であるため、基板上又は対象物において染色度合いが濃いほど、バイオフィルムの形成量が多く、染色度合いが淡いほど、バイオフィルムの形成量が少ないことがわかる。よって、多孔質性の対象物の種類に応じて、ガラス等の特定の基板及び当該対象物に形成されるバイオフィルムの形成度合いを把握することができ、多孔質性の対象物のヌメリ抑制効果を繰り返し評価する場合に、再現性よく評価することができる。
【００５１】
（剥離工程）
剥離工程では、染色済みバイオフィルムが形成された基板又は染色済みバイオフィルムが形成された多孔質性の対象物を、蒸留水の入った容器に入れ、超音波洗浄機を用いてバイオフィルムを基板又は当該対象物から剥離する。バイオフィルムは基板等に強固に付着しているため、水を吹き付けて洗浄するだけでバイオフィルムを基板等から剥離することは困難である。超音波洗浄を行うことによって、強固に付着しているバイオフィルムであっても、剥離することができる。
【００５２】
（測定工程）
測定工程では、蒸留水中のバイオフィルムの吸光度を測定する。例えば、クリスタルバイオレットを用いて、バイオフィルムを染色している場合には、分光光度計を用いて当該液体の吸光度を測定すればよい。また、測定する波長は、用いる染色液に応じて適宜決定することができる。
【００５３】
蒸留水中のバイオフィルムの吸光度を測定し、吸光度の大小によってバイオフィルム形成度合いを数値化することが可能である。よって、多孔質性の対象物に応じて、ガラス等の基板又は当該対象物に形成されるバイオフィルムの形成度合いを数値で把握することができる。そのため、バイオフィルムの形成度合いを客観的に評価することができる。したがって、例えば、ヌメリを抑制する処理を施したサンプルと、処理を施していないサンプルとの間で数値を比較することにより、ヌメリを抑制する処理を施したサンプルにおいてヌメリが抑制されているか否かを、客観的に判定することができる。また、再現性よく、客観的評価ができるため、本実施形態の評価方法を用いて、ヌメリ抑制効果の評価方法の標準化を実現することができる。例えば、標準化したヌメリ抑制効果の評価方法として、後述する実施例１における条件による評価方法を用いることができる。
【００５４】
複数の多孔質性の対象物を用いて当該対象物のヌメリ抑制効果を比較するとき、当該対象物の材質が同じであれば、多孔質性の対象物が染色液で染色されるものであっても、対象物に形成されるバイオフィルムの量の評価を適切に行うことができる。複数ある対象物のそれぞれの材質が同じであれば、染色液で染色されたとしても、複数の対象物のそれぞれの染色量はほとんど変わらない。そのため、対象物上に形成されたバイオフィルムの多少によるバイオフィルムの染色度合いの相違に基づき、目視で各対象物のバイオフィルムの形成度合いを確認することができる。さらに、バイオフィルムが形成された対象物をそれぞれ蒸留水に入れて剥離し、バイオフィルムの吸光度を測定する場合であっても、その吸光度を比較することでバイオフィルムの量を適切に評価できる。適切に評価できる理由は、各対象物の染色量がほとんど変わらず、かつ材質が同一であるため、染色された対象物に含まれる染色液（染色物質）が蒸留水に溶解したとしても、その溶解の度合いは、対象物間でほぼ同一であり、そのため、これによる影響が対象物間でほとんど変わらないためである。
【００５５】
一方、多孔質性の対象物が、ガラス製品等、染色液（例えば、クリスタルバイオレット）で染色されないものである場合、当該対象物に形成されたバイオフィルムを染色しても当該対象物は染色されない。そのため、対象物間の染色のばらつき、対象物からの染色液の溶解等といった問題が生じないため、目視によっても、吸光度の測定によっても、対象物に形成されるバイオフィルムの量の評価を適切に行うことができる。
【００５６】
本実施形態の評価方法は、複数の多孔質性の対象物を用いて各対象物のヌメリ抑制効果を比較する、相対的な評価に好適に用いられる。なお、複数の多孔質性の対象物を用いた相対的な評価を行う場合には、同じ菌液を使用し、比較する複数の対象物をほぼ同時に評価することが好ましい。複数の対象物をほぼ同時に評価することにより、菌液の活性等が変化することなく、同様の条件で対象物のヌメリ抑制効果を比較することができる。
【００５７】
（多糖類の定量）
また、基板の面及び多孔質性の対象物に形成される粘性を有する物質がバイオフィルムである裏づけをするために、バイオフィルム（粘性を有する物質）を剥離洗浄した液体に含まれる多糖類を定量してもよい。バイオフィルムの主成分は、細菌などの微生物が細胞外に産生した多糖類であるため、剥離洗浄した液体に含まれる多糖類の量を測定し、測定した多糖類の量と蒸留水中のバイオフィルムの吸光度とをそれぞれ評価することにより、吸光度による定量法がバイオフィルムの量を正確に測定できているかどうかを確認することができる。例えば、測定した多糖類の量の大小と上記吸光度の大小とが一致していることを確認することにより、吸光度は形成されたバイオフィルムの量と相関があると判断できる。
【００５８】
液体中の多糖類を定量する方法としては、これに限定されないが、フェノール−硫酸法を用いることが好ましい。フェノール−硫酸法は、全糖の測定法で微量の試料の分析に適している。硫酸を用いるためデンプン、セルロースのような高分子物質も予め加水分解することなく試料にすることが可能である。
【００５９】
以上のように本実施形態における評価方法によれば、対象物に細菌を接触させたときのバイオフィルムの形成度合いを調べることができ、これにより対象物のヌメリ抑制効果を評価することができる。
【００６０】
ところで、例えば、台所、及び洗面所等で水切り袋等が用いられる環境においては、水切り袋にヌメリが生じるばかりでなく、水切り袋が取り付けられた、水切り袋の使用対象物（例えば、排水口のステンレスカゴ、および三角コーナー等）にもヌメリが生じる。したがって、水切り袋等におけるヌメリ抑制効果は、水切り袋そのものにヌメリが生じることを防ぐとともに、水切り袋の使用対象物においてもヌメリが生じることを防ぐことができることが望まれる。本実施形態における評価方法においては、対象物に形成されたバイオフィルムではなく、基板上に形成されたバイオフィルムを調べることで、対象物のヌメリ抑制効果を評価してもよい。この場合には、本実施形態における評価方法は、実使用における望ましい効果についての好適な評価方法でもある。
【００６１】
台所等での水切り袋及び食品を使用した実用評価では、周囲の環境、温度、湿度又は周囲の菌の存在によって評価結果が変わってしまうという問題があり、当該評価を繰り返し行った場合に、同一のデータを得ることは困難であり、データの再現性が不十分である。
【００６２】
一方、本実施形態に係るヌメリ評価方法は、周囲の環境、温度、湿度等を一定にし、菌液以外の菌が基板等に付着しないようにしているため、再現性のあるデータを得ることができる。さらに、基板に形成されたバイオフィルム及び対象物上に形成されたバイオフィルムの少なくとも何れか一方を染色し、当該バイオフィルムを含む液体の吸光度を測定することで、バイオフィルムの形成度合いを数値化することができ、客観的なデータを得ることができる。
【００６３】
以下に実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。さらに、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、それぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された文献の全てが参考として援用される。
【実施例】
【００６４】
〔サンプル１〜３〕
まず、多孔質性の対象物として、以下のサンプル１〜３を用意した。
【００６５】
＜サンプル１：抗菌成分を有する水切り袋＞
サンプル１は、抗菌性を有する銅ゼオライト（商品名、セルガイア（登録商標）、レンゴー株式会社製）を配合した水切りゴミ袋（パルプ３０％、ポリエステル７０％）であり、以下の抗菌性試験（試験例１）にて抗菌性があることを確認した。
【００６６】
＜サンプル２：抗菌成分を含まない水切り袋＞
サンプル２は、抗菌成分を含まない不織布からなる水切りゴミ袋（レーヨン３５％、ポリエステル６５％）であり、以下の試験例１にて抗菌性がないことを確認した。
【００６７】
＜サンプル３：抗菌成分を有する水切り袋から抗菌成分を除去した水切り袋＞
サンプル３は、サンプル１から抗菌成分を洗い流したサンプルであり、以下の試験例１にて抗菌性がないことを確認した。
【００６８】
〔試験例１：抗菌性試験（ＪＩＳ  Ｚ２８０１）〕
（サンプル１、３の抗菌性試験）
サンプル１、３について、細菌として大腸菌（Escherichia coli NBRC No.3301）と黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus subsp.aureus NBRC No.12732）を用い、日本工業規格のＪＩＳ  Ｚ２８０１「抗菌加工製品−抗菌性試験法・抗菌加工効果」に記載の方法を参考にして、抗菌性試験を行った。この試験では、サンプル１は抗菌性を有しており、かつ、サンプル３は抗菌性を消失していることを確認した。
【００６９】
まず、１／５００ＮＢ培地に大腸菌又は黄色ブドウ球菌を懸濁させ、１０５〜１０６ｃｆｕ／ｍｌの菌液を作成し、その菌液０．４ｍｌをサンプル１の上に滴下した。そして、４ｃｍ×４ｃｍの無菌フィルム（オレガノ株式会社製の無菌パウチ：ストマッカー用ポリ袋を４０ｍｍ×４０ｍｍにカットし、エタノールを用いて清浄化したもの）でサンプル１を覆い、３５℃、１００％ＲＨで、２４時間保存した。その後、ＳＣＤＬＰ培地１０ｍｌを加えてサンプル１の菌液を洗い出し、混釈平板法にて細菌検査を行った。使用培地は標準寒天培地とし、３７℃、４８時間後の生菌数をカウントした。下記の式（１）に従って抗菌活性を算出し、抗菌活性が２．０以上のときに抗菌効果ありと判断した。
【００７０】
抗菌活性＝〔ｌｏｇ（無加工片の２４時間後の生菌数／抗菌加工片の２４時間後の生菌数）〕・・・（１）
また、サンプル３についても、上記の試験を行い、抗菌効果の有無を判断した。サンプル１、３について、細菌として大腸菌を用いた場合の結果を表１、黄色ブドウ球菌を用いた場合の結果を表２に示す。なお、サンプル１、３ともに実験を三回行い、サンプル１については、接種から２４時間後の菌数、サンプル３については、接種直後の菌数及び接種から２４時間後の菌数をそれぞれ記載している。なお、菌数の単位は、ｃｆｕ／０．４ｍｌであった。
【００７１】
【表１】
2014011964.tif 000002
【００７２】
【表２】
2014011964.tif 000003
（評価結果）
抗菌性能を洗い出したサンプル３に１０５オーダーの大腸菌を接種し細菌検査した結果、２４時間培養後には１０７オーダーに増菌していた。そのため、サンプル３においては抗菌性能が消失しているものと判断した。
【００７３】
一方、抗菌性能を有するサンプル１において抗菌性を評価した結果、大腸菌を使用した場合の抗菌活性は７．５、黄色ブドウ球菌を使用した場合の抗菌活性は６．１であった。そのため、サンプル１は抗菌性能を有していると判断した。
【００７４】
（サンプル１、２の抗菌性試験）
サンプル１、２について、抗菌性試験を行った。抗菌性試験の方法は上記サンプル１、３の抗菌性試験と同様であるため、その説明を省略する。サンプル１、２について、細菌として大腸菌を用いた場合の結果を表３、黄色ブドウ球菌を用いた場合の結果を表４に示す。
【００７５】
【表３】
2014011964.tif 000004
【００７６】
【表４】
2014011964.tif 000005
（評価結果）
抗菌成分を含まないサンプル２に１０５オーダーの大腸菌を接種し細菌検査した結果、２４時間培養後には１０６オーダーに増菌していた。そのため、サンプル２は抗菌性能を有していないと判断した。
【００７７】
一方、抗菌成分を有するサンプル１において抗菌性を評価した結果、大腸菌を使用した場合の抗菌活性は７．０、黄色ブドウ球菌を使用した場合の抗菌活性は３．４であった。そのため、サンプル１は抗菌性能を有していると判断した。
【００７８】
〔実施例１：バイオフィルム評価〕
（バイオフィルム形成）
バイオフィルム形成菌である蛍光菌（Pseudomonas fluorescens NBRC No.14160）を用いて、以下の手順で評価を行った。一連の操作は、菌液以外は滅菌処理した器具を用いて全て無菌環境下で行った。
【００７９】
まず、角シャーレ（８０ｍｍ×２３０ｍｍ）に滅菌水２０ｍｌを含んだガーゼを敷き、スライドガラス（７６ｍｍ×２６ｍｍ）３枚をガーゼ上に並べた後、各スライドガラス上に同サイズに切断したサンプル１（７６ｍｍ×２６ｍｍ）を載置した。各サンプル１上に、Pseudomonas fluorescens懸濁液（蒸留水にポリペプトン、イーストエキストラクトおよび硫酸マグネシウムを加え滅菌した液体培地にPseudomonas fluorescensを懸濁した）１ｍｌを滴下した後、角シャーレに蓋をして、３０℃の恒温層にてシャーレを保持した。４日間保持した後、サンプル１が載置されたスライドガラスをそれぞれ取り出し、バイオフィルム形成度合いを目視と吸光度測定との二種類で評価した。
【００８０】
サンプル２、３についても、上記サンプル１と同様の方法でそれぞれ評価を行った。
【００８１】
（目視評価）
サンプル１〜３をスライドガラスから取り外し、余分な菌液を洗浄するためにスライドガラスを蒸留水で洗浄した。そして、スライドガラス上に形成された白く濁ったバイオフィルムを確認した。バイオフィルムの形成をより明確に確認するため、スライドガラスに付着したバイオフィルムをクリスタルバイオレット溶液で３分間染色した。染色したバイオフィルムを蒸留水で再度洗浄した後に、バイオフィルムの染色度合いからバイオフィルム形成度合いを目視で評価した。
【００８２】
（吸光度測定）
４５ｍｌの蒸留水が入っている試験管（３０ｍｍφ）に、目視で評価した染色済みバイオフィルムをスライドガラスとともに入れた。そして、超音波洗浄機を用いてバイオフィルムをスライドガラスから剥離洗浄した。次に、バイオフィルムを剥離洗浄した洗浄液の５００ｎｍにおける吸光度を測定し、吸光度の大小によってバイオフィルム形成度合いを数値化した。数値化した値を表５に示す。
【００８３】
【表５】
2014011964.tif 000006
（目視評価の結果）
染色済みバイオフィルムの目視評価の結果を図１に示す。図１は、各スライドガラス上に形成され、染色されているバイオフィルムを示す図である。図１に示すように、サンプル１を用いて形成されたバイオフィルム（図１の（ａ）を参照）は、サンプル２を用いて形成されたバイオフィルム（図１の（ｂ）を参照）及びサンプル３を用いて形成されたバイオフィルム（図１の（ｃ）を参照）に比べて、染色度合いが小さく、バイオフィルムの形成が抑制されていた。
【００８４】
（吸光度測定の結果）
染色後のバイオフィルムの吸光度をそれぞれ測定した結果、表５、図３に示されるように、優位な差が見られた。つまり、抗菌性を有するサンプル１は、抗菌性を有しないサンプル２、３と比較して、吸光度が小さく、バイオフィルムの形成が抑制されていた。
【００８５】
また、各サンプルについて実験を３回行ったが、バラツキが少なく、再現性のあるデータをそれぞれのサンプルで得ることができた。
【００８６】
〔実施例２：バイオフィルム評価〕
サンプル１、２について、上記実施例１のバイオフィルム形成と同様の条件でバイオフィルムを形成させた。
【００８７】
まず、角シャーレ（８０ｍｍ×２３０ｍｍ）に滅菌水２０ｍｌを含んだガーゼを敷き、スライドガラス（７６ｍｍ×２６ｍｍ）４枚をガーゼ上に並べた後、各スライドガラス上に同サイズに切断したサンプル１（７６ｍｍ×２６ｍｍ）を載置した。各サンプル上に、Pseudomonas fluorescens懸濁液（蒸留水にポリペプトン、イーストエキストラクトおよび硫酸マグネシウムを加え滅菌した液体培地にPseudomonas fluorescensを懸濁した）１ｍｌを滴下した後、角シャーレに蓋をして、３０℃の恒温層にてシャーレを保持した。シャーレを保持してから２日目、３日目、４日目、及び７日目にサンプル１が載置されたスライドガラスをそれぞれ取り出し、バイオフィルム形成度合いを目視と吸光度測定との二種類で評価した。サンプル２についても上記と同様の方法でバイオフィルムを形成した。また、実施例１と同様の評価方法にてサンプル１、２の評価を行った。
【００８８】
（目視評価の結果）
目視評価の結果を図２に示す。図２は、各基板に形成され、染色されているバイオフィルムを示す図である。図２に示すように、いずれの保持日数においても、サンプル１を用いて形成されたバイオフィルム（図２の（ｂ）を参照）は、サンプル２を用いて形成されたバイオフィルム（図２の（ａ）を参照）に比べて、染色の度合いが小さかった。よって、抗菌性を有するサンプル１を用いた場合には、抗菌性を有していないサンプル２を用いた場合と比較して、バイオフィルムの形成が抑制されていたと判断した。
【００８９】
（吸光度測定の結果）
吸光度測定の結果を図４に示す。図４は、染色したバイオフィルムを含む洗浄液における吸光度を示す図である。図４に示されるように、何れの保持日数においてもサンプル１を用いた場合には、サンプル２を用いた場合と比較して、吸光度が小さくなっており、バイオフィルムの形成が抑制されていることがわかった。よって、バイオフィルムの形成度合いを数値化することができ、これにより再現性のあるヌメリ（バイオフィルム）評価方法を提供できた。
【００９０】
〔試験例２：糖の定量〕
次に、フェノール−硫酸法を用いて、バイオフィルムを剥離洗浄した洗浄液に含まれる多糖類を定量した。細菌が増殖環境下に保持されてから２日目及び４日目のサンプル１、２に基づくバイオフィルムを剥離洗浄した洗浄液を試験対象とした。
【００９１】
まず、洗浄液をメンブレンフィルターで濾過した。そして、濾過した後の試料溶液１ｍｌを試験管（１．５ｃｍ×１５ｃｍ）にとり５％フェノール溶液１ｍｌを添加し、よく混合した。混合した溶液に先端を切ったピペットを用いて濃硫酸５ｍｌを速やかに（１０〜２０秒間）液面に直接滴下するように加え、できる限り激しい発熱をさせた。
【００９２】
次に、よく混合した後、室温にて２０〜３０分放置し、分光光度計を用いて４７０ｎｍにおける吸光度を測定した。標準溶液（マルトース）を用いた検量線から試料中の糖量を求めた。
【００９３】
（糖の定量の結果）
糖の定量の結果を図５に示す。図５は、染色したバイオフィルムを含む洗浄液における吸光度及び糖量を示す図である。図５の（ａ）及び（ｂ）に示されるように、洗浄液の吸光度及び試料中の糖量は、同様の傾向を示した。バイオフィルムの主成分は多糖類であることから、測定された糖量が多い場合には、バイオフィルムの量が多くなることが示され、また、洗浄液の吸光度も大きくなることが示された。よって、糖の量を測定することにより、バイオフィルムがスライドガラス上に形成されていたことの裏づけができ、洗浄液の吸光度は上記バイオフィルムの量と相関があると判断できた。つまり、洗浄液の吸光度を測定することでバイオフィルムの定量が可能であり、客観的で再現性のあるヌメリ評価方法を提供することができた。
【００９４】
〔参考例：実用評価〕
次に、以下の３つの方法にて、実用評価によるヌメリ抑制効果を確認した。
【００９５】
（方法１）
排水口ステンレスカゴにサンプル１、２をそれぞれセットし、半日ごとに市販のレトルトカレーとレトルトの豚汁を交互に流し入れ、３０℃で３日間保存し、ヌメリ（バイオフィルム）の発生状況を目視にて評価した。
【００９６】
（方法２）
排水口ステンレスカゴにサンプル１〜３をそれぞれセットし、市販のレトルトカレー（２００ｇ）を流し入れ、３０℃で２日間保存し、ヌメリの発生状況を目視にて計２回評価した。
【００９７】
（方法３）
方法２にて、食品の腐敗及びネバリの発生を確認した後、サンプリングし、細菌検査を行った。まず、サンプル１、２の側面より腐敗したレトルトカレーを１０ｇ採取し、細菌検査１を行った。また、滅菌された水２００ｍｌを用いて、サンプル１、２に付着したカレーを濾過し、サンプル１、２及びステンレスカゴに付着したカレーを濾過し、濾過液についてそれぞれ細菌検査２、３を行った。
【００９８】
（方法１の結果）
サンプル２については、評価２日目にネバリが発生し、評価３日目にカビ様物質及び粘性物質が発生した。つまりヌメリの発生を確認した。
【００９９】
サンプル１については、サンプル２と同様の方法により保存したが、粘性物質は確認されなかった。つまりヌメリの発生を確認できなかった。
【０１００】
（方法２の結果）
レトルトカレーによるヌメリの発生を比較した結果、サンプル２、３に対して、サンプル１は、外観上、優位な差を得ることはできなかった。２回目の評価において、外観上若干の違いは認められるものの、サンプル１〜３の全てでカビ様物質が認められた。この結果により、評価実施時の温度、浮遊菌などの環境要因を制御することは困難なため、同一条件での繰り返し評価は難しいと判断した。
【０１０１】
（方法３の結果）
以下に、サンプル１、２の細菌検査の結果を表６に示す。
【０１０２】
【表６】
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細菌検査１〜３の結果、サンプル２は、内容物（カレー）及び濾過水ともに１０８ｃｆｕ／ｍｌの菌数を有し、バイオフィルムが十分に形成される状態であることを確認した。一方、サンプル１は１０５ｃｆｕ／ｍｌの菌数を有し、菌数の抑制が認められた。この結果からサンプル１は、ヌメリの発生を抑制する効果があることがわかるが、周囲の環境要因、食品等により結果は変動するため、再現性が不十分な評価だと判断した。
【産業上の利用可能性】
【０１０３】
本発明により、例えば、台所用品、洗面所用品等のヌメリ抑制効果を調べることができる。
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図１】
2014011964.tif 000011
【図２】
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