(57)【要約】      （修正有）【課題】高収率でアスコルビン酸−２−リン酸を得ることが可能なアスコルビン酸リン酸化酵素の改変体を提供する。【解決手段】以下の（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかに示すアスコルビン酸リン酸化酵素改変体：（Ａ）特定のアミノ酸配列において、１１５位のアラニン残基がアルギニン残基に置換；（Ｂ）前記（Ａ）のアミノ酸配列において、１１５位以外のアミノ酸残基の１個又は複数個が置換、付加、挿入又は欠失を含み、且つリン酸基供与体の存在下でアスコルビン酸に作用させた場合にアスコルビン酸−２−リン酸の生成を阻害しない；（Ｃ）前記（Ａ）のアミノ酸配列において、１１５位以外のアミノ酸残基のアミノ酸配列に対する配列同一性が３０％以上であるアミノ酸配列を含み、且つリン酸基供与体の存在下でアスコルビン酸に作用させた場合にアスコルビン酸−２−リン酸の生成を阻害しない。当該酵素改変体による、アスコルビン酸−２−リン酸の製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかに示すアスコルビン酸リン酸化酵素改変体：
（Ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、１１５位のアラニン残基がアルギニン残基に置換されたアミノ酸配列からなるアスコルビン酸リン酸化酵素改変体；
（Ｂ）前記（Ａ）のアミノ酸配列において、１１５位以外のアミノ酸残基の１個又は複数個が置換、付加、挿入又は欠失されたアミノ酸配列を含み、且つリン酸基供与体の存在下でアスコルビン酸に作用させた場合にアスコルビン酸−２−リン酸の生成を阻害しない、アスコルビン酸リン酸化酵素改変体；
（Ｃ）前記（Ａ）のアミノ酸配列において、１１５位以外のアミノ酸残基のアミノ酸配列に対する配列同一性が３０％以上であるアミノ酸配列を含み、且つリン酸基供与体の存在下でアスコルビン酸に作用させた場合にアスコルビン酸−２−リン酸の生成を阻害しない、アスコルビン酸リン酸化酵素改変体。
【請求項２】
更に、配列番号１で示されるアミノ酸配列において、１１６位のヒスチジン残基がグルタミン残基に置換されたアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の酵素改変体。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の酵素改変体をコードする単離されたＤＮＡ。
【請求項４】
請求項３に記載のＤＮＡを含むベクター。
【請求項５】
請求項４に記載のベクターにより宿主生物を形質転換して得られる、形質転換体。
【請求項６】
以下の（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかに示すアスコルビン酸リン酸化酵素改変体を、リン酸基供与体の存在下でアスコルビン酸に作用させ、アスコルビン酸−２−リン酸を製造する方法：
（Ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、１１５位のアラニン残基がアルギニン残基に置換されたアミノ酸配列からなるアスコルビン酸リン酸化酵素改変体；
（Ｂ）前記（Ａ）のアミノ酸配列において、１１５位以外のアミノ酸残基の１個又は複数個が置換、付加、挿入又は欠失されたアミノ酸配列を含み、且つリン酸基供与体の存在下でアスコルビン酸に作用させた場合にアスコルビン酸−２−リン酸の生成を阻害しない、アスコルビン酸リン酸化酵素改変体；
（Ｃ）前記（Ａ）のアミノ酸配列において、１１５位以外のアミノ酸残基のアミノ酸配列に対する配列同一性が３０％以上であるアミノ酸配列を含み、且つリン酸基供与体の存在下でアスコルビン酸に作用させた場合にアスコルビン酸−２−リン酸の生成を阻害しない、アスコルビン酸リン酸化酵素改変体。
【請求項７】
前記リン酸基供与体がポリリン酸である、請求項６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高収率でアスコルビン酸−２−リン酸を得ることが可能なアスコルビン酸リン酸化酵素の改変体に関する。
【背景技術】
【０００２】
アスコルビン酸−２−リン酸は、アスコルビン酸の安定化誘導体であり、医薬品、食品、化粧品等の分野で広く使用されている。アスコルビン酸−２−リン酸（本明細書においてアスコルビン酸−２−リン酸を「ＡｓＡ２Ｐ」と略記することがある）を効率よく製造する方法については従来より研究されている。このような方法としては、例えば、アスコルビン酸とリン酸基供与体から、シュードモナス属に属する微生物由来の酵素を用いてアスコルビン酸−２−リン酸を製造する方法が特許文献１等に記載されている。しかしながら、本発明者らは、特許文献１に記載される酵素（シュードモナス属菌種由来の野生型アスコルビン酸リン酸化酵素）を使用してアスコルビン酸のリン酸化について検討を行った結果、酵素濃度を上げるにつれて反応産物の分解が生じることを見出した。また、他の生物由来の酵素を用いた場合にも同様の傾向が認められることが特許文献２や非特許文献１及び２において報告されている。前述のように、アスコルビン酸−２−リン酸は、産業上の利用価値が高いことから、より一層効率よく産生することが可能な酵素及び産生方法が求められていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開平４−５３４９４号公報
【特許文献２】特開２００１−２４５６７６号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Appl Environ Microbiol. 2000 , 66(7): 2811-2816, Phosphorylation of Nucleosides by the Mutated Acid Phosphatase from Morganella morganii
【非特許文献２】Protein Eng. (2002) 15 (7): 539-543. Enhancement of nucleoside phosphorylation activity in an acid phosphatase
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、高収率でアスコルビン酸−２−リン酸を生成することが可能なアスコルビン酸リン酸化酵素の改変体を提供することを主な目的とする。また、本発明は、当該酵素改変体を用いたアスコルビン酸−２−リン酸を製造する方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、アスコルビン酸リン酸化酵素のアミノ酸配列に特定の変異を導入することによって反応産物であるアスコルビン酸−２−リン酸の分解が抑制され、高収率でアスコルビン酸−２−リン酸が得られることを見出した。本発明はこのような知見に基づいて更に研究を重ねた結果完成されたものである。即ち、本発明は下記態様のアスコルビン酸リン酸化酵素改変体、ＤＮＡ、ベクター、形質転換体及びアスコルビン酸−２−リン酸の製造方法を提供する。
項１．以下の（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかに示すアスコルビン酸リン酸化酵素改変体：
（Ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、１１５位のアラニン残基がアルギニン残基に置換されたアミノ酸配列からなるアスコルビン酸リン酸化酵素改変体；
（Ｂ）前記（Ａ）のアミノ酸配列において、１１５位以外のアミノ酸残基の１個又は複数個が置換、付加、挿入又は欠失されたアミノ酸配列を含み、且つリン酸基供与体の存在下でアスコルビン酸に作用させた場合にアスコルビン酸−２−リン酸の生成を阻害しない、アスコルビン酸リン酸化酵素改変体；
（Ｃ）前記（Ａ）のアミノ酸配列において、１１５位以外のアミノ酸残基のアミノ酸配列に対する配列同一性が３０％以上であるアミノ酸配列を含み、且つリン酸基供与体の存在下でアスコルビン酸に作用させた場合にアスコルビン酸−２−リン酸の生成を阻害しない、アスコルビン酸リン酸化酵素改変体。
項２．更に、配列番号１で示されるアミノ酸配列において、１１６位のヒスチジン残基がグルタミン残基に置換されたアミノ酸配列を有する、項１に記載の酵素改変体。
項３．項１又は２に記載の酵素改変体をコードする単離されたＤＮＡ。
項４．項３に記載のＤＮＡを含むベクター。
項５．項４に記載のベクターにより宿主細胞を形質転換して得られる、形質転換体。
項６．以下の（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかに示すアスコルビン酸リン酸化酵素改変体を、リン酸基供与体の存在下でアスコルビン酸に作用させ、アスコルビン酸−２−リン酸を製造する方法：
（Ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、１１５位のアラニン残基がアルギニン残基に置換されたアミノ酸配列からなるアスコルビン酸リン酸化酵素改変体；
（Ｂ）前記（Ａ）のアミノ酸配列において、１１５位以外のアミノ酸残基の１個又は複数個が置換、付加、挿入又は欠失されたアミノ酸配列を含み、且つリン酸基供与体の存在下でアスコルビン酸に作用させた場合にアスコルビン酸−２−リン酸の生成を阻害しない、アスコルビン酸リン酸化酵素改変体；
（Ｃ）前記（Ａ）のアミノ酸配列において、１１５位以外のアミノ酸残基のアミノ酸配列に対する配列同一性が３０％以上であるアミノ酸配列を含み、且つリン酸基供与体の存在下でアスコルビン酸に作用させた場合にアスコルビン酸−２−リン酸の生成を阻害しない、アスコルビン酸リン酸化酵素改変体。
項７．前記リン酸基供与体がポリリン酸である、項６に記載の方法。
【発明の効果】
【０００７】
本発明のアスコルビン酸リン酸化酵素は、リン酸基供与体の存在下でアスコルビン酸に作用させた場合、優れた触媒能を発揮することができる。更に、本発明のアスコルビン酸リン酸化酵素によれば、生成されたアスコルビン酸−２−リン酸の分解が抑制され、高収率でアスコルビン酸−２−リン酸を得ることが可能である。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】配列番号１で示されるアスコルビン酸リン酸化酵素のアミノ酸配列、及び該アミノ酸配列に対応する塩基配列（配列番号２）である。アミノ酸配列において、１１５位のＡｌａを丸で示す。
【図２】アスコルビン酸リン酸化酵素改変体（改変体３）のアミノ酸配列（配列番号５）及び当該アミノ酸配列をコードする塩基配列（配列番号６）を表す。図中、実線はプラスミドベクターｐＥＴ２２ｂ（＋）によりコードされるアミノ酸配列を示す。破線はスペーサー領域として挿入した配列を示す。また、Ａ１１５Ｒに相当する部分を丸で示す。
【図３】酵素改変体の作製方法を示す概略図である。
【図４】改変体１〜８を用いた場合に生成されたＡｓＡ２Ｐの量を示すグラフである。
【図５】改変体７及び８を用いた場合に生成されたＡｓＡ２Ｐの量を示すグラフである。
【図６】改変体３にさらにアミノ酸変異を導入したアスコルビン酸リン酸化酵素改変体９〜２３を用いた場合に生成されたＡｓＡ２Ｐの量を示すグラフである。
【図７】野生型のアスコルビン酸リン酸化酵素を用いてＡｓＡ２Ｐを生成した場合、経時的にＡｓＡ２Ｐが分解されることを示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本明細書において、アミノ酸、ペプチド、タンパク質は、以下に示すＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名委員会（ＣＢＮ）で採用された略号を用いて表される。
Ａ＝Ａｌａ＝アラニン、Ｃ＝Ｃｙｓ＝システイン、
Ｄ＝Ａｓｐ＝アスパラギン酸、Ｅ＝Ｇｌｕ＝グルタミン酸、
Ｆ＝Ｐｈｅ＝フェニルアラニン、Ｇ＝Ｇｌｙ＝グリシン、
Ｈ＝Ｈｉｓ＝ヒスチジン、Ｉ＝Ｉｌｅ＝イソロイシン、
Ｋ＝Ｌｙｓ＝リシン、Ｌ＝Ｌｅｕ＝ロイシン、
Ｍ＝Ｍｅｔ＝メチオニン、Ｎ＝Ａｓｎ＝アスパラギン、
Ｐ＝Ｐｒｏ＝プロリン、Ｑ＝Ｇｌｎ＝グルタミン、
Ｒ＝Ａｒｇ＝アルギニン、Ｓ＝Ｓｅｒ＝セリン、
Ｔ＝Ｔｈｒ＝トレオニン、Ｖ＝Ｖａｌ＝バリン、
Ｗ＝Ｔｒｐ＝トリプトファン、Ｙ＝Ｔｙｒ＝チロシン
【００１０】
また、特に明示しない限り、ペプチドおよびタンパク質のアミノ酸残基の配列は、左端から右端にかけてＮ末端からＣ末端となるように表される。また、参照を容易にするため、一般的に用いられている次の命名法を適用する。
【００１１】
即ち、１つは、“もとのアミノ酸；位置；置換したアミノ酸”と記述する方法であり、例えば、位置１１５におけるアラニンのアルギニンへの置換はＡｌａ１１５Ａｒｇ又はＡ１１５Ｒと表される。また、多重変異については、スラッシュ記号“／”により分けることで表記する。例えば、Ａ１１５Ｒ／Ｎ１３０Ｔとは、位置１１５のアラニンをアルギニンへ、且つ、位置１３０のアスパラギンをトレオニンへ置換することを示す。
【００１２】
１．アスコルビン酸リン酸化酵素改変体
本発明のアスコルビン酸リン酸化酵素改変体は、以下の（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかに示す特徴を有するものである：
（Ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、１１５位のアラニン残基がアルギニン残基に置換されたアミノ酸配列からなるアスコルビン酸リン酸化酵素改変体；
（Ｂ）前記（Ａ）のアミノ酸配列において、１１５位以外のアミノ酸残基の１個又は複数個が置換、付加、挿入又は欠失されたアミノ酸配列を含み、且つリン酸基供与体の存在下でアスコルビン酸に作用させた場合にアスコルビン酸−２−リン酸の生成を阻害しない、アスコルビン酸リン酸化酵素改変体；
（Ｃ）前記（Ａ）のアミノ酸配列において、１１５位以外のアミノ酸残基のアミノ酸配列に対する配列同一性が３０％以上であるアミノ酸配列を含み、且つリン酸基供与体の存在下でアスコルビン酸に作用させた場合にアスコルビン酸−２−リン酸の生成を阻害しない、アスコルビン酸リン酸化酵素改変体。
【００１３】
本明細書において、配列番号１で示されるアミノ酸配列において、１１５位のアラニン残基をアルギニン残基に置換する変異を、Ａ１１５Ｒと表記することがある。また、本明細書において当該アスコルビン酸リン酸化酵素改変体を「本発明の酵素改変体」と略記することがある。
【００１４】
配列番号１で示されるアミノ酸配列は、配列番号３で示される野生型アスコルビン酸リン酸化酵素のアミノ酸配列において２４位のプロリンから２４９位のバリンに相当する２２６個のアミノ酸残基からなる。なお、配列番号３で示される野生型アスコルビン酸リン酸化酵素のアミノ酸配列に対応する塩基配列は、配列番号４で示される。
【００１５】
野生型のアスコルビン酸リン酸化酵素の起源は特に限定されないが、例えば、クレブシエラ属、セルロモナス属、アルカリゲネス属、エアロモナス属、ブレビバクテリウム属、シュードモナス属、スフィンゴモナス属等に属するアスコルビン酸とリン酸基供与体からＬ−アスコルビン酸−２−リン酸を生成する反応を触媒し得る酵素を生産することが可能な微生物が挙げられる。このような微生物として、より具体的には、クレブシエラ・オキシトーカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ）（ＡＴＣＣ８７２４）、セルロモナス・カルテ（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ ｃａｒｔａｅ）（ＡＴＣＣ２１６８１）、アルカリゲネス・ユートロファス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）（ＡＴＣＣ１７６９７）、エアロモナス・ハイドロフィラ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）（ＡＴＣＣ１１１６３）、ブレビバクテリウム・リチカム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｙｔｉｃｕｍ）（ＡＴＣＣ１５９２１）、ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ）（ＡＴＣＣ１３８２６）、シュードモナス・リボフラビナ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｒｉｂｏｆｌａｖｉｎａ）（ＡＴＣＣ９５２６）、シュードモナス・マルトフィリア（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）（ＡＴＣＣ１７８０６）、スフィンゴモナス・トレペリ（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｔｒｕｅｐｅｒｉ）、ブレブンディモナス・ディミヌタ（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ  ｄｉｍｉｎｕｔａ）（ＡＴＣＣ１１５６８）、グルコンアセトバクター・ハンセニイ（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｈａｎｓｅｎｉｉ）（ＡＴＣＣ２３７６１）、キサントモナス・オリザエ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｏｒｙｚａｅ）（ＮＢＲＣ３３１２）等が例示され、中でもスフィンゴモナス・トレペリ（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｔｒｕｅｐｅｒｉ）が好ましい微生物として挙げられる。ここで、ＡＴＣＣはＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎによる寄託番号を表し、ＮＢＲＣはＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒによる寄託番号を表す。
【００１６】
配列番号１で示される野生型のアスコルビン酸リン酸化酵素の部分配列をコードする遺伝子は、配列番号２に示されるポリヌクレオチドに相当する。このポリヌクレオチドは、例えば、遺伝子工学の分野において従来公知の方法により前述の菌株から取得することができる。
【００１７】
より具体的には、前述の菌株のゲノムＤＮＡを作製した後、当該ゲノムＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、同一の制限酵素、又は共通の切断末端を与える制限酵素で切断したプラスミド又はファージにリガーゼ等を用いて連結することによりゲノムＤＮＡライブラリーを作製する。次いで、アスコルビン酸リン酸化酵素の塩基配列に基づき設計したプライマーセットを用いて、これらのゲノムＤＮＡライブラリーを鋳型としたＰＣＲを行うことによりアスコルビン酸リン酸化酵素をコードしている遺伝子を得ることができる。具体的なプライマーの塩基配列としては、下表２に示されるプライマー１及び２のセットが例示される。或いは、上記塩基配列に基づき設計したプローブを用いて、これらのゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによって、アスコルビン酸リン酸化酵素をコードしている遺伝子を得ることもできる。
【００１８】
また、有機合成化学的手法により、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド又は配列番号２で示される塩基配列を有するポリヌクレオチドを得ることができる。
【００１９】
本発明の酵素改変体は、配列番号１で示されるアミノ酸配列において前記所定のアミノ酸置換（Ａ１１５Ｒ）を有することにより、リン酸基供与体の存在下でアスコルビン酸を効率的にリン酸化し、ＡｓＡ２Ｐを産生することができる。また、前記所定のアミノ酸置換を有する本発明の酵素改変体は、触媒するアスコルビン酸のリン酸化反応において、従来問題となっていた反応性生成物（ＡｓＡ２Ｐ）の分解が顕著に抑制されるため、高収率でＡｓＡ２Ｐを得ることができる。
【００２０】
本発明の酵素改変体は、リン酸基供与体の存在下でアスコルビン酸に作用させた場合にアスコルビン酸−２−リン酸の生成を阻害しない限り、Ａ１１５Ｒのアミノ酸置換に加え、配列番号１で表わされるアミノ酸配列に対して、更に１個又は複数個、例えば、１個又は数個、或いは例えば１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、更に好ましくは１〜５個のアミノ酸が、置換、付加、挿入又は欠失されたアミノ酸配列を含んでいてもよい。アミノ酸の欠失又は付加はＮ末端又はＣ末端のいずれに対して行ってもよく、両方の末端に対して行ってもよい。
【００２１】
配列番号１で示されるアミノ酸配列にアミノ酸を付加する場合、付加されるアミノ酸の数は例えば１〜２０個、好ましくは１〜１０個、更に好ましくは１〜５個が挙げられる。付加されるアミノ酸配列は、配列番号３で示される野生型アスコルビン酸リン酸化酵素のアミノ酸配列の部分配列を含むものであってもよい。付加されるアミノ酸配列の具体的な例としてＤ−Ｔ−Ａの３アミノ酸残基をＮ末端に付加する場合を挙げることができる。また、本発明の酵素改変体の活性を損なわない範囲で後述するベクターに由来する配列が含まれていてもよい。更に、配列番号１で示されるアミノ酸配列のＣ末端に、Ｈｉｓタグ等のタンパク質精製用の配列が付加されていてもよい。
【００２２】
また、アミノ酸を欠失する場合、本発明の酵素改変体の活性を損なわない限り、配列番号１で示されるアミノ酸配列の例えばＮ末端又はＣ末端から、好ましくはＮ末端から例えば１〜２０個、好ましくは１〜１０、更に好ましくは１〜５個のアミノ酸を欠失させてもよい。
【００２３】
また、アミノ酸を挿入する場合、本発明の酵素改変体の活性を損なわない限り、配列番号１で示されるアミノ酸配列の任意の場所に例えば１〜２０個、好ましくは１〜１０、更に好ましくは１〜５個のアミノ酸残基を挿入することが可能であるが、後述するアスコルビン酸リン酸化酵素としての活性中心以外の部位において挿入されることが好ましい。
【００２４】
配列番号１で示されるアミノ酸配列においてアミノ酸置換を行う場合には、側鎖官能基の性質に基づく保存的置換であることが好ましい。天然アミノ酸は、側鎖官能基によって非極性アミノ酸、非電荷アミノ酸、酸性アミノ酸及び塩基性アミノ酸の各カテゴリーに分類される。保存的置換とは、もとのアミノ酸残基と置換後のアミノ酸残基が同一のカテゴリーに分類されるアミノ酸残基であることを指す。ここで、「非極性アミノ酸」として具体的には、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、メチオニン、フェニルアラニン、及びトリプトファン；「非電荷アミノ酸」として、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、及びグルタミン；「酸性アミノ酸」として、アスパラギン酸及びグルタミン酸；「塩基性アミノ酸」として、リジン、アルギニン、及びヒスチジンがそれぞれ挙げられる。
【００２５】
これらの変異は、本発明の酵素改変体のリン酸化活性を損なわないよう、活性中心以外の部位において導入されることが好ましい。本発明の酵素改変体の活性中心は配列番号1で示されるアミノ酸配列において１１５〜１３５位に相当し、好ましくは１１７〜１３２位、更に好ましくは１２１〜１２７位以外のアミノ酸残基に変異を導入することが望ましい。
【００２６】
配列番号１で示されるアミノ酸配列において、１１５位のアラニン残基をアルギニン残基に置換する変異以外に導入され得る変異について、具体的には、１１６位のヒスシジン残基がグルタミン残基に置換された改変体が例示される。更に、前記Ａ１１５Ｒ／Ｈ１１６Ｑの変異に加えて、１３０位のアスパラギン残基がトレオニン残基に置換されているもの（Ａ１１５Ｒ／Ｈ１１６Ｑ／Ｎ１３０Ｔ）又は５５位のアスパラギン酸残基がヒスチジン残基に置換されているもの（Ａ１１５Ｒ／Ｈ１１６Ｑ／Ｄ５５Ｈ）が例示される。
【００２７】
本発明の酵素改変体は、配列番号１で示されるアミノ酸配列において、１１５位のアラニン残基がアルギニン残基に置換された改変体が顕著に優れた酵素活性を有している。本発明の酵素改変体として、好ましくはＡ１１５Ｒ又はＡ１１５Ｒ／Ｈ１１６Ｑ、更に好ましくはＡ１１５Ｒのみの変異を有している酵素改変体が挙げられる。
【００２８】
配列番号１で示されるアミノ酸配列において特定のアミノ酸残基に変異を導入する方法は特に限定されず、従来公知の方法から適宜選択することができるが、例えば、部位特異的変異導入法が挙げられ、Ｉｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲに基づく手法やＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  ＩＩ  Ｋｉｔ（ストラタジーン社製）の市販キットを利用することにより実施され得る。また、２個所以上に変異を導入する場合には上記方法に準じた方法を繰り返すことにより、目的とする本発明の酵素改変体をコードするポリペプチドを得ることができる。部位特異的変異導入法によって図２に示されるアミノ酸配列を有する本発明の酵素改変体を得る場合、使用され得る具体的なプライマーセットは下表２の改変体３に使用されるものが例示される。
【００２９】
また、本発明のアスコルビン酸リン酸化酵素として、配列番号１で示されるアミノ酸配列において１１５位以外のアミノ酸残基に対する配列同一性が３０％以上、好ましくは３５％以上、より好ましくは４０％以上、更に好ましくは５０％以上であるアミノ酸配列を含み、且つリン酸基供与体の存在下でアスコルビン酸に作用させた場合にアスコルビン酸−２−リン酸の生成を阻害しないものが包含される。Ｎ末端及び／又はＣ末端にアミノ酸が付加されている場合のポリペプチドの配列同一性については、付加されたアミノ酸を除いて評価する。
【００３０】
ここで、ポリペプチドの配列同一性については、対比される２つのポリペプチドを最適に整列させ、アミノ酸が両方の配列で一致した位置の数を比較アミノ酸総数で除し、この結果に１００を乗じた数値で表わされる。具体的には、ポリペプチドの配列同一性は、「ＧＥＮＥＴＹＸ  Ｖｅｒ．１０」（ゼネティックス社）のＭａｘｉｍｕｍ  ｍａｔｃｈｉｎｇプログラムをデフォルトのパラメーターで用いることで決定することができる。
【００３１】
また、「リン酸基供与体の存在下でアスコルビン酸に作用させた場合にアスコルビン酸−２−リン酸の生成を阻害しない」とは、生成されたアスコルビン酸−２−リン酸が経時的に分解されないことを指す。より具体的には、アスコルビン酸及びリン酸供与体を含む反応液組成物に本発明の酵素改変体を添加し、３７℃で酵素反応を行って得られるアスコルビン酸−２−リン酸の収率が、野生型のアスコルビン酸リン酸化酵素に比べて１０％以上、好ましくは２０％以上、更に好ましくは３０％以上増加することを指す。アスコルビン酸−２−リン酸の収率は、ＨＰＬＣ解析により生成されたアスコルビン酸−２−リン酸を定量することにより確認できる。具体的なＨＰＬＣ解析の条件は後述する実施例において記載される。
【００３２】
前記（Ｂ）又は（Ｃ）に示される本発明の酵素改変体の好適な例として、具体的なアミノ酸配列（配列番号５）及び対応する塩基配列（配列番号６）が図２に示される。また、配列番号５で示されるアミノ酸配列において、１個又は複数個、例えば、１個又は数個、或いは例えば１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、更に好ましくは１〜５個のアミノ酸が、置換、付加、挿入又は欠失されたアミノ酸配列を含み、且つリン酸基供与体の存在下でアスコルビン酸に作用させた場合にアスコルビン酸−２−リン酸の生成を阻害しないものも本発明の酵素改変体の好適な例として包含される。例えば、配列番号５において１４２位のグルタミンがヒスチジンに置換されたアミノ酸配列を有するものが好適なものとして挙げられる。更に、配列番号５において１４１位（配列番号１の１１５位に相当する）以外のアミノ酸残基のアミノ酸配列に対する同一性が３０％以上、好ましくは３５％以上、より好ましくは４０％以上、更に好ましくは５０％以上であるアミノ酸配列を含み、且つリン酸基供与体の存在下でアスコルビン酸に作用させた場合にアスコルビン酸−２−リン酸の生成を阻害しないものも本発明の酵素改変体の好適な例として含まれる。アミノ酸残基の置換、欠失、付加又は挿入、及びアミノ酸配列の同一性については、上述の通りである。
【００３３】
本発明の酵素改変体は、これらのアミノ酸配列をコードするＤＮＡを有するベクターを宿主細胞に導入して形質転換体を作製し、当該形質転換体を培養して得ることができる。具体的には下記「形質転換体」の欄で詳述する。
【００３４】
ＤＮＡ
本発明は前記リン酸化酵素改変体をコードする単離されたＤＮＡを提供する。本発明の酵素改変体をコードするＤＮＡは、後述する方法に従って導入される宿主細胞内において、本発明の酵素改変体を発現し得るものであれば如何なるものでもよく、任意の非翻訳領域を含んでいてもよい。
【００３５】
また、本発明の酵素改変体をコードするＤＮＡとして、配列番号１で示されるアミノ酸配列に対応する塩基配列（配列番号２で示される塩基配列）からなるＤＮＡに相補的な塩基配列を含むＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、且つリン酸基供与体の存在下でアスコルビン酸に作用させた場合にアスコルビン酸−２−リン酸の生成を阻害しないアスコルビン酸リン酸化酵素の改変体をコードするＤＮＡが挙げられる。
【００３６】
ここで、「配列番号２で示される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列を含むＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ」とは、配列表の配列番号２に示した塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡをプローブとして、ストリンジェントな条件下にコロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法、あるいはサザンハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡを意味する。
【００３７】
ここで、ストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡとは、例えば、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０〜０．３ＭのＮａＣｌ存在下、５５℃でハイブリダイゼーションを行った後、２倍濃度のＳＳＣ溶液（標準食塩−クエン酸緩衝液（ｓｔａｎｄａｒｄ  ｓａｌｉｎｅ  ｃｉｔｒａｔｅ）：１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウムである）を用い、２０℃の条件下でフィルターを洗浄することにより取得できるＤＮＡを挙げることができる。好ましくは２０℃で１倍濃度のＳＳＣ溶液で洗浄、より好ましくは２倍濃度のＳＳＣ溶液で洗浄することにより取得できるＤＮＡである。
【００３８】
上記の条件にてハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、配列表の配列番号２に示されるＤＮＡとの配列相同性が好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、更に好ましくは８０％以上のＤＮＡを挙げることができ、コードされるポリペプチドが、上記の活性を有する限り、本発明の酵素改変体をコードするＤＮＡに包含される。
【００３９】
また、ＤＮＡの配列相同性は、ＧＡＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴＸ等の公知のコンピュータープログラムを用いて決定することもできる。また、前記ＤＮＡは、前述の遺伝子工学的手法や化学的な合成等により入手できる。
【００４０】
ベクター
本発明は、更に、前記ＤＮＡを宿主細胞内に導入して発現させるために用いられる、前記ＤＮＡを含むベクターを提供する。このようなベクターとしては、適切な宿主細胞内で該ＤＮＡがコードする遺伝子を発現できるものであればいずれでもよい。このようなベクターとしては、例えば、プラスミドベクター、ファージベクター、コスミドベクターなどが挙げられる。また、他の宿主株との間での遺伝子交換が可能なシャトルベクターも使用され得る。
【００４１】
本発明においてベクターは、前記本発明の酵素改変体をコードするＤＮＡと作動可能に連結された、プロモーター（Ｔ７プロモーター、ｌａｃＵＶ５プロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｔｕｆＢプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ｐＬプロモーター等の機能的プロモーター；転写要素（例えばエンハンサー、ＣＣＡＡＴボックス、ＴＡＴＡボックス、ＳＰＩ部位等）；シグナル配列（具体的には、核移行シグナル、小胞体移行シグナル、ＰＴＳ１（Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍａｌ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｓｉｇｎａｌ  １）ＰＴＳ２等）などの制御因子を含んでいてもよい。ベクターとしては当該分野において一般的に使用されるものから適宜選択して用いることができるが、具体的には、ｐＥＴ２２ｂ（＋）ベクター、ｐＥＴ３９ｂ（＋）ベクター等が例示される。
【００４２】
ここで、作動可能に連結とは、遺伝子の発現を調節するプロモーター、エンハンサー等の種々の調節エレメントと遺伝子が、宿主細胞中で作動し得る状態で連結されることをいう。制御因子のタイプおよび種類が、宿主に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。
【００４３】
形質転換体
本発明は、前記ＤＮＡを含むベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換体を提供する。宿主細胞としては、前述の本発明の酵素改変体をコードするＤＮＡを含む発現ベクターにより形質転換され、当該ＤＮＡによりコードされた酵素改変体を発現することができる細胞であれば、特に制限はされない。
【００４４】
宿主細胞としては、例えば、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属等の細菌；ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属等の放線菌；サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、クライベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、チゴサッカロマイセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属等の酵母；ノイロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、セファロスポリウム（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ）属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属等のカビなどの微生物が挙げられる。これらのうち、導入および発現効率の観点から細菌が好ましく、エシェリヒア属の細菌である大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）の細胞が特に好ましい。
【００４５】
形質転換の方法は公知であり、宿主細胞の種類等により適宜選択することができ、具体的には、コンピテントセル法、エレクトロポレーション法、ヒートショック法等が例示される。
【００４６】
形質転換体の培養は、宿主細胞として用いた細胞の種類に応じて従来公知の培養条件に基づいて行うことができる。例えば、大腸菌細胞を宿主細胞として用いた場合の培養条件としては、振盪培養又は通期培養等の好気的条件のもと、培養温度２０〜４０℃、培養期間６〜２４時間、培養液のｐＨ５〜８を挙げることができる。また、使用する培養培地についても、宿主細胞が生育可能且つ本発明の酵素改変体を産生可能あれば特に限定されず、当該分野において通常採用される、炭素源、窒素源、無機物、アミノ酸、核酸、ビタミン類等を必要量含有する培地を使用することができる。
【００４７】
例えば、大腸菌等の原核生物又は酵母等を宿主として得られる形質転換体を培養する場合、培地としては、該生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
【００４８】
炭素源としては、該生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、デンプン若しくはデンプン加水分解物等の炭水化物；酢酸、プロピオン酸等の有機酸；エタノール、プロパノール等のアルコール類等が挙げられる。培地中に含有される炭素源の濃度としては、通常０．１〜１０重量％が挙げられる。
【００４９】
また、窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸；有機酸のアンモニウム塩；その他の含窒素化合物；ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物等が例示される。培地中に含有される窒素源の濃度としては、通常０．１〜１０重量％が挙げられる。
【００５０】
無機塩類としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。培地中に含有される無機塩類の濃度としては、通常０．０１〜１重量％が挙げられる。
【００５１】
ｐＨの調整は、公知の無機または有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行うことができる。また、培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００５２】
培養終了後、培養物よりアスコルビン酸リン酸化酵素改変体を採取することができ、通常の酵素採取方法に従って行うことができる。酵素採取方法としては、例えば、培養した菌体を超音波破砕して菌体抽出液を調製し、硫安分画、イオン交換、クロマトフォーカシング、ゲル濾過等の酵素精製方法が挙げられる。
【００５３】
２．アスコルビン酸−２−リン酸を製造する方法
本発明は、前述される本発明の酵素改変体を、リン酸基供与体の存在下でアスコルビン酸に作用させ、アスコルビン酸−２−リン酸を製造する方法を提供する。本発明のＡｓＡ２Ｐを製造する方法においては、アスコルビン酸、リン酸基供与体及び酵素改変体を溶媒に添加して反応液組成物を調製し、酵素反応を行うことができる。あるいは、本発明の酵素改変体の産生能を有する微生物の培養物を、リン酸基供与体の存在下でアスコルビン酸に作用させることによりアスコルビン酸−２−リン酸を製造してもよい。
【００５４】
本発明の方法において、本発明の酵素改変体の産生能を有する微生物の培養物とは、菌体を含む培養液、培養菌体、またはその処理物を意味する。ここでその処理物とは、例えば、無細胞抽出液、凍結乾燥菌体、アセトン乾燥菌体、またはそれら菌体の磨砕物等を意味する。さらに、これらの培養物は、固定化酵素あるいは固定化菌体として用いることもできる。なお、固定化は、当業者に周知の方法（例えば物理的吸着法、包括法等）で行うことができる。
【００５５】
本発明の酵素改変体の産生能を有する微生物としては、例えば、上記本発明の酵素改変体をコードするＤＮＡを含むベクターが導入された形質転換体が挙げられる。
【００５６】
リン酸基供与体としては、本発明の酵素改変体に対するリン酸基の供給源として機能し、ＡｓＡ２Ｐが生成される限り特に限定されないが、例えば、一般式（１）：Ｈn+2ＰnＯ3n+1（式中、ｎ≧２）で表わされるポリリン酸が挙げられる。ポリリン酸の重合度は特に限定されないが、好ましくは２〜１００００個、更に好ましくは２〜１０００個の前記構成単が重合しているものが挙げられる。ポリリン酸として具体的には、ジリン酸（ｎ＝２：ピロリン酸）、トリリン酸（ｎ＝３）、テトラリン酸（ｎ＝４）等が例示される。また、一般式（１）においてｎ＝５以上のリン酸が重合したものもリン酸基供与体として好適に使用することができる。これらの重合度の異なるポリリン酸を２種以上組み合せた混合物をリン酸基供与体として使用してもよい。
【００５７】
更に、本発明で使用されるリン酸基供与体として、前記ポリリン酸のエステルや、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属塩、カルシウム等のアルカリ土類金属塩、アンモニウム塩等のポリリン酸塩を使用することもできる。ポリリン酸のエステルとして具体的には、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）等が例示される。また、ポリリン酸塩として具体的には、ピロリン酸ナトリウム（Ｎａ4Ｐ2Ｏ7）、トリポリリン酸ナトリウム（Ｎａ5Ｐ3Ｏ10）、テトラポリリン酸ナトリウム（Ｎａ6Ｐ4Ｏ13）、ピロリン酸アンモニウム塩、トリポリリン酸アンモニウム塩等が例示される。また、リン酸基供与体として前記ポリリン酸の他に、パラニトロフェニルホスフェート、アセチルリン酸等が挙げられる。
【００５８】
本発明においてリン酸基供与体として、好ましくはジリン酸、トリリン酸、テトラリン酸等のポリリン酸、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）等のポリリン酸のエステル；ピロリン酸ナトリウム、トリポリリン酸ナトリウム、テトラポリリン酸ナトリウム等のポリリン酸のアルカリ金属塩；パラニトロフェニルホスフェート、アセチルリン酸が挙げられ、より好ましくはポリリン酸、ポリリン酸のエステル、ポリリン酸塩が挙げられ、更に好ましくはポリリン酸、ポリリン酸のエステルが挙げられ、特に好ましくはポリリン酸が挙げられる。これらのリン酸基供与体を１種単独で用いてもよく、２種以上を組み合せてもよい。
【００５９】
反応に使用される本発明の酵素改変体の濃度としては、反応液組成物中、０．０００１〜１重量％、好ましくは０．００１〜０．１重量％、更に好ましくは０．００１〜０．０１重量％が挙げられる。また、リン酸基供与体の濃度としては、０．５〜２０重量％、好ましくは１〜１５重量％、更に好ましくは２〜１０重量％が挙げられる。また、アスコルビン酸の濃度としては、０．１〜５０重量％、好ましくは０．５〜２０重量％、更に好ましくは１〜１０重量％が挙げられる。
【００６０】
本発明の酵素改変体（ポリペプチド）１重量部あたりのリン酸基供与体の添加割合としては、１００〜３００００重量部、好ましくは２５０〜２００００重量部、更に好ましくは５００〜１５０００重量部が挙げられる。また、本発明の酵素改変体（ポリペプチド）１重量部あたりのアスコルビン酸の添加割合としては、１００〜４００００重量部、好ましくは５００〜３００００重量部、更に好ましくは１０００〜２５０００重量部が挙げられる。
【００６１】
また、反応温度としては、１０〜６０℃、好ましくは２０〜５０℃、更に好ましくは３０〜４０℃が挙げられる。
【００６２】
本発明の酵素改変体の至適ｐＨとしては、ｐＨ２〜７、好ましくはｐＨ３〜６、更に好ましくはｐＨ４〜５が挙げられる。ｐＨの調製は、塩酸、クエン酸、グルコン酸、コハク酸、酢酸、酒石酸、ソルビン酸、乳酸、マレイン酸、硫酸、リン酸、リンゴ酸、アルギニン、アンモニア水、ジイソプロパノールアミン、ジエタノールアミン、トリイソプロパノールアミン、トリエタノールアミン、モノエタノールアミン、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化ナトリウム、及びこれらの塩等の緩衝剤従来公知の緩衝剤を用いて行うことができる。
【００６３】
本発明のアスコルビン酸−２−リン酸を製造する方法において、反応時間は、アスコルビン酸−２−リン酸が生成され得る限り特に限定されないが、例えば、１〜５０時間、好ましくは５〜４０時間、更に好ましくは１０〜３０時間が挙げられる。
【００６４】
反応溶媒としては、通常、イオン交換水、蒸留水、超純水等の水性溶媒を使用することができる。また、水性溶媒中には、本発明の効果を損なわない範囲でメタノール、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）等の有機溶媒；ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンドデシルエーテル、ポリエチレングリコールｐ−オクチルフェニルエーテル（商品名Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（商品名Ｔｗｅｅｎ  ２０）等の非イオン界面活性剤が含まれていてもよい。反応性の向上及び酵素の安定化の観点から、溶媒中には、特に非イオン界面活性剤が含有されていることが好ましい。有機溶媒の添加量としては、通常０．１〜５０重量％、好ましくは１〜３０重量％、更に好ましくは５〜２０重量％が例示される。また、非イオン界面活性剤の添加量としては、通常０．０００１〜０．１重量％、好ましくは０．０００５〜０．０５重量％、更に好ましくは０．００１〜０．０１重量％が例示される。
【００６５】
上記反応によりＡｓＡ２Ｐが得られる。得られたＡｓＡ２Ｐは、必要に応じて、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、吸着カラムクロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー等のカラムクロマトグラフィーによる方法；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびメチルペンタンジオール（ＭＰＤ）等の沈澱剤を用いる方法；酸化マグネシウムまたは水酸化マグネシウムなどのアルカリ土類金属塩を用いて析出させる方法等を挙げることができる。
【実施例】
【００６６】
以下に試験例等を示して本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されない。
アスコルビン酸リン酸化酵素改変体の調製
アスコルビン酸リン酸化酵素への変異の導入は、下表１に示されるプライマーセットを使用して、アスコルビン酸リン酸化酵素のＮ末端側をコードする領域とＣ末端側をコードする領域の２か所をそれぞれ増幅した。この時、使用したプライマーに、目的の箇所にアミノ酸置換が生じるように変異が導入されているため、得られるＰＣＲ産物には目的の箇所に各変異が導入されている。得られたＰＣＲ産物をベクターに挿入して形質転換体を作製し、当該形質転換体により各アスコルビン酸リン酸化酵素改変体を作製した。
【００６７】
（変異の導入及び形質転換体の作製）
Ａ１１５Ｒ／Ｈ１１６Ｑ酵素改変体（改変体３）の作製方法を例に変異の導入及び形質転換体の作製について以下に記載する。
Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｔｒｕｅｐｅｒｉ  （ＪＣＭ１０２７８）からゲノムＤＮＡを調製し、特開平４−５３４９４号公報に記されるアスコルビン酸リン酸化酵素遺伝子をＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲに用いたプライマーセットは、プライマー１（フォワードプライマー）及びプライマー６（リバースプライマー）、ならびにプライマー３（フォワードプライマー）及びプライマー２（リバースプライマー）である。得られたＰＣＲ産物を制限酵素（ＮｃｏＩ及びＮｈｅＩ、又はＮｈｅＩ及びＸｈｏＩ）で消化し、ＮｃｏＩ及びＸｈｏＩで制限酵素処理したｐＥＴ２２ｂ（＋）ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）との三者ライゲーションによりこれらを連結して、アスコルビン酸リン酸化酵素発現用ベクターを得た。なお、該ベクターには、配列番号１で示されるアミノ酸配列が挿入されており、更にＴ７プロモーター、産生されるタンパク質をペリプラズムに移行するためのｐｅｌＢシグナル、タンパク質精製のためのＨｉｓタグ遺伝子、及び薬剤選択のためのアンピシリン耐性遺伝子が保持されている。ベクターに挿入された塩基配列と対応するアミノ酸配列を図２に示す。
【００６８】
上記方法により得られたベクターをヒートショック法により大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株（Ｎｏｖａｇｅｎ）に形質転換した。前記プライマー１を使用することにより、配列番号１で示されるアミノ酸配列のＮ末端にＤ−Ｔ−Ａの３アミノ酸残基が付加された配列が大腸菌のｐｅｌＢシグナル配列に組み込まれる形でベクターが構築される。しかし、酵素改変体の成熟体となった際には、シグナル配列は切断され、Ｎ末端はＡｓｐとなると考えられる。ここで、アミノ酸配列Ｄ−Ｔ−Ａは、配列番号３で示される野生型アスコルビン酸リン酸化酵素において２１〜２３位のアミノ酸配列に相当する。図３に改変体３の製造方法の概略図を示す。
【００６９】
その他の改変体についても、下表１及び２に示されるプライマーセットを用いて同様の方法により作製した。
【００７０】
【表１】
2014036612.tif 000002
【００７１】
各プライマー番号と対応する配列番号、塩基配列及び制限酵素サイト名を下表２に示す。
【００７２】
【表２】
2014036612.tif 000003
【００７３】
表２中、下線で示される塩基配列は制限酵素の切断部位を表し四角で囲まれる塩基配列は置換するアミノ酸をコードする部位を表す。
【００７４】
（形質転換体の培養）
アスコルビン酸リン酸化酵素発現用ベクターを有する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株の形質転換体の培養は、０．２重量％グルコース、０．５重量％カザミノ酸、０．１ｍｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ培地（ナカライテスク（株）製：（組成）１重量％トリプトン；０．５重量％乾燥酵母エキス；０．５重量％塩化ナトリウム）中で、培養温度２７℃にてインキュベートした。培養液の６００ｎｍにおける光学密度が０．５になったら、０．１ｍＭとなるようにイソプロピル−β−チオガラクトピラノシドを添加し、更に培養温度２７℃で１６〜２４時間、培養を行った。
【００７５】
培養後、湿菌体重量１５ｇを１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む２０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁し、超音波ホモジナイザー（ＴＯＭＹ  ＵＤ２０１）を用いて細胞抽出液を得た。この抽出液を２０，０００×ｇにて２０分間遠心分離操作を行い、上清画分を回収した。６０％飽和度となるよう硫酸アンモニウムを加え、２０，０００×ｇにて２０分間遠心分離操作を行い、沈殿を回収した。この硫安分画後の沈殿を２０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁し、５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）にて透析を行った。透析後、Ｈｉｓ−Ｔｒａｐ  ＨＰカラムを用いたアフィニティー精製を行った。アスコルビン酸リン酸化酵素を含むフラクションを回収後、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）にて透析し、アスコルビン酸リン酸化酵素を取得した。
【００７６】
精製条件
アフィニティー精製の条件は次の通りである。
カラム：Ｈｉｓ−Ｔｒａｐ  ＨＰ（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製）
平衡化緩衝液：２０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５０ｍＭ塩化ナトリウム
溶出緩衝液：２０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５０ｍＭ塩化ナトリウム、１Ｍ  イミダゾール
（溶出緩衝液を０−５０％のグラジエントで溶出）
流速：５．０ｍｌ／ｍｉｎ
精製機器：ＡＫＴＡ  ｐｒｉｍｅ  ｐｌｕｓ（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）
【００７７】
ＨＰＬＣ解析条件
後述する試験例及び比較例において採用されたＨＰＬＣ解析条件は次の通りである。
カラム：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  ＯＤＳ−Ａ（１５０×４．６ｍｍ）（ＹＭＣ社製）
溶離液：
酢酸緩衝溶液（８０ｍＭ，ｐＨ５．０）／メタノール＝９８／２（体積比）
（２．８ｍＭヘキシルアミン及び０．１ｍＭ  ＥＤＴＡを含有する）
検出波長：２５４ｎｍ
流速：０．８ｍｌ／ｍｉｎ
カラム温度：３５℃
注入量：１０μｌ
ＨＰＬＣ機器：日立ＨＰＬＣ  ＬａＣｈｒｏｍ  Ｅｌｉｔｅ  ｓｅｒｉ  Ｌ−２０００
【００７８】
［試験例１−１］
アスコルビン酸（３００ｍＭ）、リン酸基供与体としてポリリン酸（２重量％）（商品名：ポリリン酸、ナカライテスク社製）、及びＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（１重量％）を含む超純水（ＮａＯＨでｐＨ４．５に調整）に、上記表１において改変体１〜８として示されるアミノ酸変異が導入されたアスコルビン酸リン酸化酵素の改変体を各１５μｇ／ｍｌとなるよう添加し、３７℃の恒温エアーインキュベーター内で一晩反応させた。その後、反応液をＨＰＬＣに使用される溶離液（酢酸緩衝溶液）で１００倍に希釈し、ＨＰＬＣ解析に供して生成されたＡｓＡ２Ｐの量を測定した。結果を図４に示す。
【００７９】
図４に示されるように、評価に用いられた改変体のうち、Ａ１１５Ｒ／Ｈ１１６Ｑ（改変体３）及びＡ１１５Ｒ／Ｈ１１６（改変体８）を用いた場合のみ生成されたＡｓＡ２Ｐの経時的な分解が抑制されていることが示された。
【００８０】
［試験例１−２］
改変体７及び改変体８として示されるアミノ酸変異が導入されたアスコルビン酸リン酸化酵素の改変体について、産生されたＡｓＡ２Ｐ量の測定結果を図５に抜き出し比較した。図５に示されるように、改変体８（Ａ１１５Ｒ／Ｈ１１６）を用いた場合は、前記試験例１に示される改変体３（Ａ１１５Ｒ／Ｈ１１６Ｑ）と同様にＡｓＡ２Ｐの経時的な分解が抑制されていることが示された。これに対し、改変体７（Ａ１１５／Ｈ１１６Ｑ）を用いた場合はＡｓＡ２Ｐの分解が生じ、経時的にＡｓＡ２Ｐの量が低下した。即ち、第１１５位のアミノ酸残基をアラニンからアルギニンに置換することによって反応産物の分解が抑制され、第１１６位のヒスチジンのグルタミンへの置換は反応生成物の分解に影響を与えないことが示された。
【００８１】
［試験例２］
改変体３に更に一アミノ酸変異を導入したＴｒｉｐｌｅ  ｍｕｔａｎｔを作製し、ＡｓＡ２Ｐの生成について評価した。アスコルビン酸（１００ｍＭ）、リン酸基供与体としてポリリン酸（２重量％）（商品名：ポリリン酸、ナカライテスク社製）、及びＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（１重量％）を含む超純水（ＮａＯＨでｐＨ４．５に調整）に、Ａ１１５Ｒに加えて上記表１において改変体９〜２３として示されるアミノ酸変異が導入されたアスコルビン酸リン酸化酵素の改変体を各１５μｇ／ｍｌとなるよう添加し、３７℃の恒温エアーインキュベーター内で一晩反応させた。その後、反応液をＨＰＬＣに使用される溶離液（酢酸緩衝溶液）で１００倍に希釈し、ＨＰＬＣ解析に供して生成されたＡｓＡ２Ｐの量を測定した。コントロールとして改変体３（Ａ１１５Ｒ／Ｈ１１６Ｑ）を使用し、同様の条件で反応及び測定を行った。結果を図６に示す。
【００８２】
図６に示されるように、評価に用いられた改変体のうち、図６中、Ｎ１３０Ｔ（改変体９）及びＤ５５Ｈ（改変体１４）の酵素反応性は、改変体３より低いものの、他のＴｒｉｐｌｅ  ｍｕｔａｎｔに比べて明らかに高いＡｓＡ２Ｐの産生量を示した。
【００８３】
［比較例１］
野生型アスコルビン酸リン酸化酵素を用いた場合のＡｓＡ２Ｐの生成について評価した。アスコルビン酸（５０ｍＭ）、リン酸供与体としてポリリン酸（２重量％）（商品名：ポリリン酸、ナカライテスク社製）、及びＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（１重量％）を含む超純水（ＮａＯＨでｐＨ４．５に調整）に、野生型アスコルビン酸リン酸化酵素を４．５μｇ／ｍｌ、９μｇ／ｍｌ、１８μｇ／ｍｌ又は９０μｇ／ｍｌとなるよう添加し、３７℃の恒温エアーインキュベーターで反応させた。反応から０、１、２、４、６、８、及び１６時間点において、反応液をＨＰＬＣに使用される溶離液（酢酸緩衝溶液）で１００倍に希釈し、ＨＰＬＣ解析に供して生成されたＡｓＡ２Ｐの量を測定した。結果を図７に示す。
【００８４】
図７に示されるように、いずれの濃度で野生型のアスコルビン酸リン酸化酵素を添加した場合も生成されたＡｓＡ２Ｐの量が経時的に減少することが示された。
【配列表フリーテキスト】
【００８５】
配列番号１は、野生型アスコルビン酸リン酸化酵素において２４位のプロリン残基〜２４９位バリン残基に相当するアミノ酸配列である。
配列番号２は、野生型アスコルビン酸リン酸化酵素において２４位のプロリン残基〜２４９位バリン残基に相当するアミノ酸配列をコードする塩基配列である。
配列番号５は、アスコルビン酸リン酸化酵素改変体（改変体３）のアミノ酸配列である。
配列番号６は、アスコルビン酸リン酸化酵素改変体（改変体３）をコードする塩基配列である。
配列番号７は、プライマー１の塩基配列である。
配列番号８は、プライマー２の塩基配列である。
配列番号９は、プライマー３の塩基配列である。
配列番号１０は、プライマー４の塩基配列である。
配列番号１１は、プライマー５の塩基配列である。
配列番号１２は、プライマー６の塩基配列である。
配列番号１３は、プライマー７の塩基配列である。
配列番号１４は、プライマー８の塩基配列である。
配列番号１５は、プライマー９の塩基配列である。
配列番号１６は、プライマー１０の塩基配列である。
配列番号１７は、プライマー１１の塩基配列である。
配列番号１８は、プライマー１２の塩基配列である。
配列番号１９は、プライマー１３の塩基配列である。
配列番号２０は、プライマー１４の塩基配列である。
配列番号２１は、プライマー１５の塩基配列である。
配列番号２２は、プライマー１６の塩基配列である。
配列番号２３は、プライマー１７の塩基配列である。
配列番号２４は、プライマー１８の塩基配列である。
配列番号２５は、プライマー１９の塩基配列である。
配列番号２６は、プライマー２０の塩基配列である。
配列番号２７は、プライマー２１の塩基配列である。
配列番号２８は、プライマー２２の塩基配列である。
配列番号２９は、プライマー２３の塩基配列である。
配列番号３０は、プライマー２４の塩基配列である。
配列番号３１は、プライマー２５の塩基配列である。
配列番号３２は、プライマー２６の塩基配列である。
配列番号３３は、プライマー２７の塩基配列である。
配列番号３４は、プライマー２８の塩基配列である。
配列番号３５は、プライマー２９の塩基配列である。
配列番号３６は、プライマー３０の塩基配列である。
配列番号３７は、プライマー３１の塩基配列である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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