(57)【要約】【課題】中枢神経ループスの診断のための検査方法および診断キットなどの提供。【解決手段】被験者由来の試料から回収された免疫複合体における、suprabasinおよび／またはRictorを検出することを含む、中枢神経ループスの検査方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者由来の試料から回収された免疫複合体における、suprabasinおよび／またはRictorを検出することを含む、中枢神経ループスの検査方法。
【請求項２】
suprabasinがsuprabasin isoform 1 precursorである、請求項１の検査方法。
【請求項３】
試料が脳脊髄液である、請求項１または２の検査方法。
【請求項４】
プロテインＧまたはプロテインＡを用いて免疫複合体を回収する請求項１〜３の何れか１項に記載の検査方法。
【請求項５】
治療中または治療を受けた中枢神経ループス患者から経時的に採取された試料から回収した免疫複合体における、suprabasinおよび／またはRictorを検出することを含む、中枢神経ループス患者に対する治療効果の評価方法。
【請求項６】
suprabasinがsuprabasin isoform 1 precursorである、請求項５の評価方法。
【請求項７】
試料が脳脊髄液である、請求項４または５の評価方法。
【請求項８】
プロテインＧまたはプロテインＡを用いて免疫複合体を回収する請求項５〜７の何れか１項に記載の評価方法。
【請求項９】
suprabasinを特異的に認識する抗体および／またはRictorを特異的に認識する抗体を含む、中枢神経ループスの検査用キット。
【請求項１０】
suprabasinがsuprabasin isoform 1 precursorである、請求項９の検査用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は中枢神経ループスの新規バイオマーカーを標的とした、中枢神経ループスの検査方法、薬効評価方法および検査キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
抗体はＢリンパ球から産生されるタンパク質の１種であり、体外から侵入する非自己（細菌、ウイルス等）を認識し、これらと結合することで白血球やマクロファージを活性化することによって生態防御に大きな役割を果たしている。このように抗体は、本来、非自己である生体異物を認識し、排除する働きをもつ。しかし、なんらかの契機で自己の正常な細胞や組織を認識する抗体が産生されると免疫複合体（イムノコンプレックス）が形成され、臓器や血管壁などの組織に沈着して障害を起こすことがある。このような疾患は自己免疫疾患と呼ばれ、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、バセドウ病を始めとする非常に多くの疾患が知られている。また、このほか、免疫複合体はウイルスや細菌感染、腫瘍などでも高値を示すことが知られている。このことから、液性免疫が関わる多くの感染症・自己免疫疾患では、産生される抗体の有無や量をもとに病態解明、診断および重症度判定が一般的に行われている。
【０００３】
近年、プロテオーム解析が多くの生命分析科学研究領域において利用され始め、疾患の原因や発症のメカニズムの解明手段として有望視されてきている。特に全てのタンパク質を酵素分解によりペプチド断片化し、これを高速液体クロマトグラフィー／タンデム質量分析計（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）で解析するショットガンプロテオミクスが開発され（非特許文献１）、疾患マーカーの探索などが迅速、効率的かつ再現性良く行えるようになってきた。また、特定疾患の解明を目的として、抗体を用いて抗原を精製し、その同定をＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって行った例も報告されている（非特許文献２）。以前、本発明者らは、免疫複合体を捕集してプロテオミクスによって免疫複合体中の抗原を網羅的に同定する“イムノコンプレキソーム解析法”を開発し、該方法を用いて関節リウマチ（RA）患者、変形性関節症患者および健常人の比較を行った結果、RA患者でのみ特異的に検出される2種類の自己抗原タンパク質（トロンボスポンジン-1、血小板第4因子）を特定することに成功した（特許文献１）。さらに、既存の血液検査では陰性で臨床診断が困難な早期RA患者の解析を行ったところ、トロンボスポンジン-1が患者の約50%で検出され、RAの早期診断に有望なバイオマーカーになることを見出した（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１２−１０３２３８号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｄ．Ｆｉｇｅｙｓ，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，７５，２８９１−２９０５，２００３
【非特許文献２】Ｈ．Ｔｊａｌｓｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  Ｃｌｉｎ．Ａｐｐｌ．，２，１６７−１８０，２００８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、中枢神経ループスの診断のための検査、薬効評価方法および検査キットなどを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、中枢神経ループス患者の脳脊髄液から網羅的に回収した免疫複合体をトリプシン分解し、高速液体クロマトグラフィー／タンデム質量分析計に供試することで抗原解析を行い、それによって中枢神経ループスの新規マーカーを見出した。
本発明者らは、これらの知見に基づいてさらに研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち本発明は、
［１］被験者由来の試料から回収された免疫複合体における、suprabasinおよび／またはRictorを検出することを含む、中枢神経ループスの検査方法；
［２］suprabasinがsuprabasin isoform 1 precursorである、前記［１］の検査方法；
［３］試料が脳脊髄液である、前記［１］または［２］の検査方法；
［４］プロテインＧまたはプロテインＡを用いて免疫複合体を回収する前記［１］〜［３］の何れか１つに記載の検査方法；
［５］治療中または治療を受けた中枢神経ループス患者から経時的に採取された試料から回収した免疫複合体における、suprabasinおよび／またはRictorを検出することを含む、中枢神経ループス患者に対する治療効果の評価方法；
［６］suprabasinがsuprabasin isoform 1 precursorである、前記［５］の評価方法；
［７］試料が脳脊髄液である、前記［４］または［５］の評価方法；
［８］プロテインＧまたはプロテインＡを用いて免疫複合体を回収する前記［５］〜［７］の何れか１つに記載の評価方法；
［９］suprabasinを特異的に認識する抗体および／またはRictorを特異的に認識する抗体を含む、中枢神経ループスの検査用キット；
［１０］suprabasinがsuprabasin isoform 1 precursorである、前記［９］の検査用キット；
を提供する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明では、中枢神経ループス患者において免疫複合体として存在するsuprabasinおよび／またはRapamycin-insensitive companion of mTOR (Rictor)の存在を調べることにより、迅速かつ簡便に中枢神経ループスの検査、治療評価が可能になる。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明は、被験者由来の試料から回収された免疫複合体における、suprabasinおよび／またはRictorを検出することを含む、中枢神経ループスの検査方法に関する。本発明において検出対象となるsuprabasinとしては、成熟タンパク質として３種類のアイソフォーム（suprabasin isoform 1, suprabasin isoform 2, suprabasin isoform 3）が存在し、さらにそれぞれの前駆体タンパク質（suprabasin isoform 1 precursor, suprabasin isoform 2 precursor, suprabasin isoform 3 precursor）が存在する。検出されるsuprabasinはいずれのアイソフォームであってもよいが、アイソフォーム１が好ましい。また、検出されるsuprabasinは、前駆体タンパク質であっても成熟タンパク質であってもよいが、前駆体タンパク質が好ましい。従って、本発明において検出対象となるsuprabasinは、suprabasin isoform 1 precursorが最も好ましい。それぞれのsuprabasin isoform 1 precursor, suprabasin isoform 2 precursor, suprabasin isoform 3 precursorのアミノ酸配列は、GenBankにアクセッション番号NP_001159506、NP_940940、NP_001159507としてそれぞれ登録されている。また、本発明において検出対象となるRictorは、GenBankにアクセッション番号NP_689969として登録されている。
【００１１】
本発明の中枢神経ループスの検査方法は、例えば、以下の工程を含む。
（１）被験者由来の試料から免疫複合体を回収する工程、
（２）該免疫複合体を分解し、分解産物を分離する工程、
（３）分離した分解産物を質量分析することによって、該免疫複合体中に含まれるsuprabasinおよび／またはRictorを検出する工程
【００１２】
本発明の検査方法が適用できる被験者は特に制限されないが、例えば、中枢神経ループスに罹患するおそれがあるか、もしくは罹患していることが疑われる被験者が挙げられる。
【００１３】
本発明の検査方法に用いられる試料としては、被験者から採取されるものであって、検出対象である抗原（即ち、suprabasinおよびRictor）と該抗原に結合する抗体からなる免疫複合体を含有するものであれば特に制限されない。そのような試料としては、例えば、全血、血漿、血清、リンパ液、唾液、脳脊髄液、関節液等の体液もしくはそのフラクション、粘膜、生検により得られる組織標本などが挙げられる。試料中の夾雑物が少ないという利点から、脳脊髄液が好ましい。
【００１４】
上記試料中の免疫複合体は、自体公知の方法を用いて分離精製することができる。例えば、免疫グロブリンの分離精製法［例：塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体（例：ＤＥＡＥ）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、プロテインＡあるいはプロテインＧなどの活性吸着剤により免疫複合体及び抗体のみを採取し、活性吸着剤との結合を解離させて免疫複合体を得る特異的精製法］に従って分離精製することができる。具体的には、下記実施例に記載の通り、プロテインＡあるいはプロテインＧなどの活性吸着剤が結合した担体（セファロースカラム、磁性ビーズなど）により脳脊髄液中から直接、免疫複合体及び抗体のみを捕集することができる。また、試料が組織である場合であっても、公知の方法に基づき、タンパク質画分を調製し、該画分中に含まれる免疫複合体を上記の手法に従い、分離精製することができる。また、免疫複合体を構成する抗体はいずれのサブクラスであってもよく、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤまたはＩｇＥが含まれ、さらにＩｇＧにはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４が含まれてよい。
【００１５】
試料から捕集された免疫複合体は、そのまま分離してもよいが、抗体のジスルフィド結合を還元するために予め還元アルキル化してもよい。還元剤としては、例えば、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）等が挙げられる。さらに、プロテアーゼまたはペプチターゼによって免疫複合体を形成する抗体と抗原をペプチド断片に分解し、分解産物を分離することが好ましい。ペプチターゼ（プロテアーゼ）としては、例えば、トリプシンまたはペプシンが挙げられる。
【００１６】
前記分解産物の分離は、自体公知の方法に従って行うことができる。このような方法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。これらの方法は、適宜組み合わせることもできる。本発明の分解産物を分離するには、分解産物がペプチドであること、次に質量分析に供試する際に容易であることから、液体クロマトグラフィーを用いることが好ましい。
【００１７】
分離の際に用いられる液体クロマトグラフィー用充填剤の担体は、シリカゲル又は、ポリビニルアルコール等の合成樹脂の球状又は破砕状のものが好ましい。また、その平均粒径は、約０．５μｍから約１００μｍのものが好ましく、より好ましくは約１μｍから約５０μｍ、さらに好ましくは約３μｍから約５μｍのものである。当業者であれば、平均粒径が小さいほど単位長あたりのカラム理論段数は大きくなるが、カラムの圧力損失も大きくなることなどを考慮して、適した粒径を選択することができる。また、本発明において用いられる液体クロマトグラフィー用充填剤の担体は、該担体に、置換又は未置換の炭化水素基を結合させたものであり、特に鎖長が炭素数８以上のものを用いることが好ましい。そのような炭化水素基の例としては、特に制限をされるものではないが、オクチル基、オクタデシル基、およびこれらの末端を改変した官能基等が挙げられ、オクタデシル基が好ましく用いられる。また、保持力は炭化水素基の鎖長に依存するので、当業者であれば、炭化水素基の鎖長の炭素数を調節することで、固定相における保持力を調節することができる。また、官能基として、フェニル基、ジオール基、ニトリル基、アミノ基などを用いて固定相の極性を調節することもできる。
【００１８】
鎖長が炭素数８以下の置換又は未置換の炭化水素基としては、例えばトリメチル基、ブチル基、フェニル基、シアノプロピル基、アミノプロピル基等が挙げられる。
【００１９】
本発明の液体クロマトグラフィー用充填剤に適するものとして、例えば市販されているオクチル基をシリカゲルに化学的に結合させた液体クロマトグラフィー用充填剤〔Ａｃｃｌａｉｍ(R)  ＰｅｐＭａｐ１００  Ｃ８〕、オクタデシル基をシリカゲルに化学的に結合させた液体クロマトグラフィー用充填剤〔Ａｃｃｌａｉｍ(R)  ＰｅｐＭａｐ３００  Ｃ１８〕、〔Ａｃｃｌａｉｍ(R)  ＰｅｐＭａｐ１００  Ｃ１８〕などが挙げられる。これらの充填剤は、品質が安定しており、かつ入手が容易である点で適しているが、これらに制限されるものではない。
【００２０】
液体クロマトグラフィー用充填剤に接触させる溶媒としては、水及び有機溶媒、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、アセトニトリル、酢酸エチル、ジオキサン、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）もしくはＤＭＳＯなどの混合溶媒系に塩を含むものを用いる。本発明の場合、例えば、後述の実施例においては、アセトニトリル中にギ酸を混合した溶媒を液体クロマトグラフィー用充填剤に接触させているが、これに限定されない。また、溶媒に濃度勾配（グラディエント）を付与し、例えば後述の実施例のように、アセトニトリル濃度が低い溶媒で極性の高い分子を溶出させ、順次アセトニトリル濃度を高めることによって、極性の低い分子を溶出させることができる。また溶出する際の溶出時間についても当業者は適宜設定することができる。
【００２１】
また、分離の際に必要に応じて、硫安、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、リン酸カリウム、リン酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム等の塩を用いて、溶媒のｐＨを調節することができるが、これらに制限されるものではない。
【００２２】
溶媒のｐＨを調整することにより、溶質のイオン化を制御することができるが、本発明の場合、イオンモードとして、陽イオンを対象として検出するポジティブイオンモードを選択するため、ｐＨは、２〜６が好ましく、２〜３がより好ましい。また、温度を一定にすることにより安定した成績を得ることが可能であるが、本実施形態における温度は０〜４０℃が好ましく、より好ましくは１０〜３０℃がよい。
【００２３】
質量分析は、イオン化された分析物を気相で測定する方法であり、該分析装置は大別すると、イオン源、イオン化された分析物の質量対電荷比（ｍ／ｚ）を測定する質量分析部、及びそれぞれのｍ／ｚ値におけるイオンの数を記録するイオン検出部からなる。タンパク質やペプチド等の試料をイオン化するために最も一般的に用いられる技術として、例えば、エレクトロスプレーイオン化法（ＥＳＩ）、大気圧化学イオン化法（ＡＰＣＩ）及びマトリクス支援レーザー脱着／イオン化法（ＭＡＬＤＩ）等が挙げられる。ＥＳＩはキャピラリーに溶液状の試料を導入し、高電圧を印加することによって噴霧・イオン化させる方法であり、クロマトグラフィーや電気泳動などの分離手段と組み合わせて分析することができる。ＡＰＣＩは、４００〜５００℃の高温加熱によって試料溶液を強制的に気化させた後、コロナニードルの放電を利用してイオンを生成させる方法である。ＭＡＬＤＩは、マトリックス（芳香族有機化合物など）中に試料を混在させて得られる結晶をレーザーパルスによって、試料を昇華及びイオン化する方法である。本発明の場合、抗原となるタンパク質が分析対象であるため、適用可能な分子量範囲が大きいほうが好ましい。従って、本発明の試料のイオン化にはＥＳＩまたはＭＡＬＤＩを用いるのがよいが、高価イオンを発生させやすい点でＥＳＩがより好ましい。
【００２４】
前記イオン源でイオン化された試料は、質量分析部に高電圧で印加され引き込まれる。かかる電圧は、試料を分析できる範囲であれば当業者が適宜設定できるが、電圧が低すぎた場合、イオン化された試料の質量分析部への移動が不十分となり、電圧が高すぎた場合、イオン化された試料にフラグメンテーションが生じる。本発明を実施する際には、例えば、電圧１．０ｋＶ〜２．５ｋＶ、好ましくは１．２ｋＶ〜２．０ｋＶで印加することができる。
【００２５】
質量分析部は、選択された質量対電荷比（ｍ／ｚ）内においてイオンを分離する。分析データの感度や分解能、質量の正確さやマススペクトルデータから得られる情報の豊富さに重要な役割を果たしている。イオンの分離方法としては、６種類の基本的なタイプに分類することができ、それらは、磁場型、電場型、イオントラップ型、飛行時間（ＴＯＦ）型、四重極型、及びフーリエ変換サイクロトロン型である。これらはそれぞれ長所と短所があり、単独で又は互いに連結して用いることができる。
【００２６】
また、質量分析の途中で試料を断片化し、断片化されたイオンを分析する質量分析方法として、タンデム質量（ＭＳ／ＭＳ）分析法が用いられる。本発明の方法を実施するためには上記いずれの質量分析法を用いてもよく、当業者であればこれらと実質的に同一か又は類似の方法により本発明の方法を実施することができる。本発明では、タンデム質量分析法が好ましく用いられ、例えば、後述の実施例ではイオントラップ型タンデム質量分析法が用いられる。
【００２７】
質量分析によって得られたスペクトル（例えば、タンデム質量分析によって得られたＭＳ／ＭＳスペクトル）は、公知の方法で解析できるが、公共のタンパク質／ペプチドデータベースと比較して抗原を決定することもできる。そのようなデータベースとしては、例えば、Ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅによって提供されているＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｎｄｅｘのタンパク質データベース、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）に公開されているタンパク質データベース、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔに公開されているタンパク質データベース等が挙げられる。従って、質量分析によって得られたスペクトルデータと前記データベースを比較することによって、試料から回収した免疫複合体にsuprabasinおよび／またはRictorが含まれているかを決定することができる。
【００２８】
あるいは、本発明の中枢神経ループスの検査方法は、以下の工程を含む。
（１）被験者由来の試料から免疫複合体を回収する工程、
（２）免疫学的測定法によって該免疫複合体中に含まれるsuprabasinおよび／またはRictorを検出する工程
【００２９】
前記方法に用いられる試料、免疫複合体の捕集方法は前記の通りに従う。被験者由来の試料から回収された免疫複合体におけるsuprabasinおよび／またはRictorの検出は、それぞれsuprabasinを特異的に認識する抗体およびRictorを特異的に認識する抗体を用いて、免疫学的測定法（例：ＥＬＩＳＡ、ＦＩＡ、ＲＩＡ、ウェスタンブロット等）によって行うことができる。
【００３０】
被験者がヒトである場合、suprabasinを特異的に認識する抗体およびRictorを特異的に認識する抗体は、suprabasin、Rictorポリペプチドやそれらの抗原性を有する部分ペプチド、具体的には、suprabasinについてGenBankにアクセッション番号NP_001159506、NP_940940またはNP_001159507、RictorについてGenBankにアクセッションNP_689969に示されるペプチド配列の全部またはエピトープに当たる部分を有する部分ペプチドを免疫原として用い、既存の一般的な製造方法によって製造することができる。本明細書において、抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）等の天然型抗体、遺伝子組換技術を用いて製造され得るキメラ抗体、ヒト化抗体や一本鎖抗体、およびこれらの結合性断片が含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、抗体はポリクローナル抗体、モノクローナル抗体又はこれらの結合性断片である。結合性断片とは、特異的結合活性を有する前述の抗体の一部分の領域を意味し、具体的には例えばＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓＦｖ、ｄｓＦｖ、ｓｄＡｂ等が挙げられる（Ｅｘｐ．Ｏｐｉｎ．Ｔｈｅｒ．Ｐａｔｅｎｔｓ，Ｖｏｌ．６，Ｎｏ．５，ｐ．４４１−４５６，１９９６）。抗体のクラスは、特に限定されず、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤあるいはＩｇＥ等のいずれのアイソタイプを有する抗体をも包含する。好ましくは、ＩｇＧ又はＩｇＭであり、精製の容易性等を考慮するとより好ましくはＩｇＧである。
【００３１】
個々の免疫学的測定法を本発明の検査方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えてsuprabasinおよびRictorの測定系を構築すればよい。これらの一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照することができる。例えば、入江寛編「ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和４９年発行）、入江寛編「続ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和５４年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（医学書院、昭和５３年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第２版）（医学書院、昭和５７年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第３版）（医学書院、昭和６２年発行）、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ」Ｖｏｌ．７０（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ  Ａ））、同書Ｖｏｌ．７３（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ  Ｂ））、同書Ｖｏｌ．７４（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ  Ｃ））、同書Ｖｏｌ．８４（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ  Ｄ：Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ））、同書Ｖｏｌ．９２（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ  Ｅ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ））、同書Ｖｏｌ．１２１（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ  Ｉ：Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ））（以上、アカデミックプレス社発行）などを参照することができる。
【００３２】
本発明の検査方法は、上記手法により、被験者由来の試料から回収した免疫複合体における、suprabasinおよび／またはRictorを検出することによって、被験者が中枢神経ループスに罹患しているか否かの検査を行うことができる。例えば、被験者由来の試料から回収した免疫複合体にsuprabasinおよび／またはRictorを検出した場合、被験者が中枢神経ループスに罹患している可能性が高いと判断することができる。特に免疫複合体にsuprabasinとRictorの両者を検出できた場合は、どちらか一方のみを検出した場合よりも、中枢神経ループスに罹患している可能性がより高いと判断できる。
【００３３】
あるいは、中枢神経ループスに罹患していないことが確認されている個体（ネガティブコントロール）及び、中枢神経ループスに罹患していると臨床的に判断されている個体（ポジティブコントロール）由来の試料から免疫複合体を回収し、被験者由来の試料から回収された免疫複合体におけるsuprabasinおよび／またはRictorの検出レベルがポジティブコントロール及びネガティブコントロールのそれと比較される。
【００３４】
そして、suprabasinおよび／またはRictorの検出レベルの比較結果より、測定対象のsuprabasinおよび／またはRictorの検出レベルが相対的に高い場合には、中枢神経ループスである確率が相対的に高いと判定することができる。逆に、測定対象のsuprabasinおよび／またはRictorの検出レベルが相対的に低い場合には、中枢神経ループスである確率が相対的に低いと判定することができる。
【００３５】
上記中枢神経ループスの検査方法を、中枢神経ループスに対する治療を施された患者や中枢神経ループス治療薬候補化合物を投与された実験動物（例、サル、イヌ、ラット、マウス等）に適用することにより、治療効果の評価を行うことができる。即ち、治療中または治療を受けた中枢神経ループス患者から経時的に採取した試料から回収した免疫複合体におけるsuprabasinおよび／またはRictorをそれぞれ測定・比較し、治療前と比較して治療後のsuprabasinおよび／またはRictorを含む免疫複合体のレベルが抑制される傾向を示すか、もしくは検出できなくなれば、治療効果が認められると判定することができる。
【００３６】
本発明はまた、上記本発明の検査方法において好ましく使用され得る、中枢神経ループスを検査するための検査キットを提供する。該検査キットは、suprabasinを特異的に認識する抗体および／またはRictorを特異的に認識する抗体を含有してなる。該検査するための剤が２以上の上記抗体を含む場合、各抗体は互いにsuprabasinおよびRictorの異なるエピトープを特異的に認識し得るものである。なお、免疫複合体を形成していない遊離抗原を検出対象から除外するため、suprabasinを特異的に認識する抗体および／またはRictorを免疫複合体として捕集した後、検出を行うことが好ましい。また、suprabasinを特異的に認識する抗体およびRictorを特異的に認識する抗体としては、本発明の検査方法において前記した抗体が挙げられる。
【００３７】
本発明の検査キットを構成する試薬として、suprabasinを特異的に認識する抗体および／またはRictorを特異的に検出し得る抗体に加えて、suprabasinおよび／またはRictorを検出するための反応において必要な他の物質であって、共存状態で保存することにより反応に悪影響を及ぼさない物質をさらに含有することができる。あるいは、該試薬は、suprabasinおよび／またはRictorを検出するための反応において必要な他の物質を含有する別個の試薬とともに提供されてもよい。例えば、suprabasinおよび／またはRictorを検出するための反応が抗原抗体反応の場合、当該他の物質としては、例えば、反応緩衝液、ｃｏｍｐｅｐｔｉｔｏｒ抗体、標識された二次抗体（例えば、一次抗体がウサギ抗ヒトsuprabasinおよび／またはウサギ抗ヒトRictor抗体の場合、ペルオキシダーゼやアルカリホスファターゼ等で標識されたマウス抗ウサギＩｇＧなど）、ブロッキング液等が挙げられる。また、該検査キットは、免疫複合体の捕集のためのプロテインＡまたはプロテインＧを試薬として含有していてもよく、それらは担体（セファロースカラム、磁性ビーズなど）に固相化されていてもよい。
【００３８】
以下に、実施例により本発明をより具体的に説明するが、この発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例】
【００３９】
試料の回収
中枢神経ループス（Neuropsychiatric Systemic Lupus Erythematosus: NPSLE）患者２６名（女性、２０−５０歳）から脳脊髄液を回収した。また、多発性硬化症（Multiple Sclerosis: MS）患者１５名（男性：５名、女性：１０名、２８−７０歳）、視神経脊髄炎（Neuromyelitis Optica: NMO）患者１６名（男性：４名、女性：１２名、２９−８０歳）からも脳脊髄液を回収し、コントロールとして用いた。
【００４０】
免疫複合体（ＩＣ）の捕集と消化
プロテインＧが固定化された磁性ビーズ（ＰｕｒｅＰｒｏｔｅｏｍｅ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて免疫複合体を精製した。ビーズ４０μｌをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ，  Ｗａｋｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）５００μｌで洗浄し、ＰＢＳで希釈した脳脊髄液（脳脊髄液：ＰＢＳ＝１：９，ｖ／ｖ）１００μｌと共にゆっくり攪拌しながら３０分間インキュベートした。免疫複合体が結合したビーズを磁石で回収し、ＰＢＳ５００μｌで３回洗浄した。ビーズを１０ｍＭジチオスレイトール１００μｌ中に再懸濁し、５６℃で４５分間インキュベートした後、５５ｍＭヨードアセトアミド１００μｌを加え、暗所、室温で３０分間インキュベートした。続いて、トリプシン溶液（２５ｍＭ重炭酸アンモニウム）を終濃度０．５ｍｇ／ｍｌで添加し、混合液を３７℃で一晩培養した。ＴＦＡ（１０％，ｖ／ｖ）を加えて、消化を停止させた後、抗原および抗体由来のペプチド消化物を含む上清を磁石を用いて回収した。最終的に、この混合液を減圧下、約８０μｌに濃縮した。
【００４１】
ナノ−ＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳによるタンパク質同定
ＬＣフロースプリッター（Ａｃｃｕｒａｔｅ，Ｄｉｏｎｅｘ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）付きのＬＣポンプ（Ｓｕｒｖｅｙｏｒ  ＭＳ  ｐｕｍｐ，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｈｓｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）およびＨＣＴ  ＰＡＬオートサンプラー（ＣＴＣ  Ａｎａｌｙｔｉｃｓ，Ｚｗｉｎｇｅｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）からなるカスタムナノＬＣシステムを搭載したＬＣ−エレクトロスプレーイオン化−タンデムＭＳ（ＬＣＱ  Ｆｌｅｅｔ，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）にペプチド混合物（１μｌ）を供試した。インジェクションループ中のナノ−プレカラム（３００μｍ  ｉ．ｄ．×５．０ｍｍ，Ｌ−Ｃ−１８，Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ａｎｄ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）に試料を注入し、２％アセトニトリル中の１％ＴＦＡを用いて洗浄した。ペプチドをナノＨＰＬＣカラム（７５μｍ，ｉ．ｄ．，Ａｃｃｌａｉｍ  ＰｅｐＭａｐ１００Ｃ１８，３μｍ，Ｄｉｏｎｅｘ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）で分離し、スプレー電圧１．２から２．０ｋＶでＭＳにイオン噴霧した。移動相のグラディエント条件を以下のように設定し、分離を行った：移動相中の移動相Ｂ含量を１０分間で５から２３％に増加（９０％アセトニトリル中に０．１％ギ酸［Ｋａｎｔｏ  Ｋａｇａｋｕ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ］）（移動相Ａ：０．１％ギ酸）；移動相Ｂ含量を７０分間で２４から３４％に増加；移動相Ｂ含量を１６分間で３４から５０％に増加；移動相Ｂ含量を０．１分間で５０から１００％に増加；移動相Ｂ含量１００％を９分間維持（総分離時間：１１５分）。試料の全解析から最も強度の高い３つの前駆体質量の３つのタンデムＭＳスキャンにプロセスする（Ｘｃａｌｉｂｅｒ(R)ソフトウェアー［Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ］によってリアルタイムに決定）ことによって得られるデータの質を有するデュティサイクル長を最適化するように質量分析計を設定した。衝突エネルギーは３５％とした。全体質量／電荷比の範囲を４００−１５００で全スペクトルを計測した。トランスファーキャピラリー温度を２００℃に設定した。ＭＳ／ＭＳデータをＢｉｏｗｏｒｋｓ  Ｖ３．３（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）を用いて抽出した。欧州バイオインフォマティクス研究所（ＥＢＩ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）によって提供されるＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｎｄｅｘ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ３．６７（ダウンロード日；２００９年１２月１０日）の公開されている非重複タンパク質データベースからヒトサブデータベースに対して以下のサーチパラメータでスペクトルを検索した：質量型、モノアイソトピック前駆体および断片；酵素、トリプシン（ＫＲ）；酵素限界、２つまでの誤開裂を許容する全酵素的開裂；ペプチド許容、２．０原子質量単位；断片イオン許容、１．０原子質量単位；スコア結果数、２５０；計測されるイオンおよびイオンシリーズ、ＢおよびＹイオン；静的修正、Ｃ（カルボキシメチル化）；特異的修飾、Ｍ（酸化）；ＮおよびＱ（アミド分解）。経験的に決定されるタンパク質誤発見率（ＦＤＲ）０、すなわちランダムヒットがゼロとなるようにフィルター基準値（関連ファクター［ＸＣｏｒｒ］およびタンパク質確率［Ｐ］を有するシングル、ダブル、トリプル電荷ペプチド）を調整した。リバースデータベースの固有ペプチドの数をフォワードデータベースの重要な固有ペプチドの数で割って、ＦＤＲを計算した。タンパク質は６アミノ酸長以上のペプチドについて同定した。仮に複数のタンパク質が見出されたペプチドを有するアミノ酸配列を共有していれば、それらのうち最も低い確率のタンパク質が最も一致すると判断され、ケラチンやトリプシンは潜在的な一致として除外された。
【００４２】
結果
NPSLE患者およびコンロトール患者に対するプロテオーム解析によって同定されたタンパク質を表１に略記する。
【００４３】
【表１】
2014181967.tif 000002
【００４４】
同定された抗原タンパク質のうち、Rapamycin-insensitive companion of mTOR(Rictor)およびSuprabasin isoform 1 precursorがNPSLE患者で特異的に検出され、コントロールとして用いたMS患者およびMNO患者では検出できなかった。結果として、本発明者らは、suprabasinを含む免疫複合体およびRictorを含む免疫複合体が中枢神経ループスに特異的な信頼性のある疾患マーカーであることを見出した。
【産業上の利用可能性】
【００４５】
本発明によれば、中枢神経ループスにおいて見出された免疫複合体中の新規バイオマーカーを調べることにより、迅速かつ簡便に中枢神経ループスの検査が可能になる。