(57)【要約】【課題】ビールを試料として、原料である大麦、ホップ及びビール酵母の種類を判別する技術を開発することを課題とする。【解決手段】酵素法とビーズ法を複合することで、ビールに残存する極微量のＤＮＡを高度に精製し、大麦、ホップ、ビール酵母のそれぞれに特徴的なプライマーを用いて核酸増幅を行うことにより、大麦、ホップ及びビール酵母の種類を判別する方法、該ビールの品質を総合的に評価する方法、並びに該方法に使用するためのキット。【選択図】図９
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ビール原料又は製品の判別方法であって、該方法が、（ａ）ビール試料から抽出及び精製したＤＮＡを鋳型として、複数の大麦判別用プライマー、複数のホップ判別用プライマー及び複数のビール酵母判別用プライマーからなるそれぞれのプライマー群を別個に又は同時に用いて該ＤＮＡを増幅するステップ、（ｂ）ステップ（ａ）で増幅したＤＮＡを検出するステップ、（ｃ）ステップ（ｂ）でのＤＮＡの検出結果に基づいて、ビールの製造に使用された原料である大麦、ビール酵母及びホップの種類を判別するステップを含む、前記方法。
【請求項２】
複数の大麦判別用プライマーが、大麦ポリガラクチュロナーゼ遺伝子、大麦ホルデイン遺伝子、大麦澱粉合成酵素遺伝子、大麦プロテインＺ遺伝子、大麦αアミラーゼ遺伝子、大麦βアミラーゼ遺伝子、大麦リポキシゲナーゼ遺伝子、大麦黄斑モザイクウイルス由来遺伝子、大麦うどんこ病菌由来遺伝子、大麦トリプシンインヒビター遺伝子、大麦セルラーゼ遺伝子、及び大麦β―グルカナーゼ遺伝子の検出用プライマーからなる群から選択される２種以上から全種の遺伝子のプライマーである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
大麦ホルデイン遺伝子が、ホルデインＡ遺伝子、ホルデインＢ遺伝子、ホルデインＣ遺伝子、又はそれらの組み合わせである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
大麦プロテインＺ遺伝子が、プロテインＺ７遺伝子、プロテインＺ４遺伝子、又はそれらの組み合わせである、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項５】
大麦澱粉合成酵素遺伝子が、大麦澱粉粒結合性澱粉合成酵素遺伝子である、請求項２〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
複数の大麦判別用プライマーが、大麦ポリガラクチュロナーゼ遺伝子、大麦ホルデイン遺伝子、大麦澱粉合成酵素遺伝子及び大麦プロテインＺ遺伝子の検出用プライマーを少なくとも含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
大麦ポリガラクチュロナーゼ遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号１と配列番号２３の塩基配列からなり、大麦ホルデイン遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号２と配列番号２４，配列番号３と配列番号２５及び／又は配列番号４と配列番号２６の塩基配列からなり、大麦澱粉合成酵素遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号５と配列番号２７の塩基配列からなり、大麦プロテインＺ遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号６と配列番号２８、配列番号７と配列番号２９、配列番号８と配列番号３０及び／又は配列番号９と配列番号３１の塩基配列からなり、大麦αアミラーゼ遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号１０と配列番号３２の塩基配列からなり、大麦リポキシゲナーゼ遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号１１と配列番号３３の塩基配列からなり、大麦黄斑モザイクウイルス由来遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号１２と配列番号３４の塩基配列からなり、大麦うどんこ病菌由来遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号１３と配列番号３５及び／又は配列番号１４と配列番号３６の塩基配列からなり、大麦トリプシンインヒビター遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号１５と配列番号３７の塩基配列からなり、大麦セルラーゼ遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号１６と配列番号３８の塩基配列からなり、並びに大麦β―グルカナーゼ遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号１７と配列番号３９の塩基配列からなる、請求項２〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
複数のホップ判別用プライマーが、アロマに属するホップの遺伝子の検出用プライマー、ファインアロマに属するホップの遺伝子の検出用プライマー及びビターに属するホップの遺伝子の検出用プライマーから選択される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
複数のホップ判別用プライマーが、配列番号１８と配列番号４０の塩基配列からなるプライマー対、配列番号１９と配列番号４１の塩基配列からなるプライマー対及び配列番号２０と配列番号４２の塩基配列からなるプライマー対から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
複数のビール酵母判別用プライマーが、上面発酵酵母と下面発酵酵母とを識別可能にするプライマー及び酵母チオレドキシン遺伝子の検出用プライマーから選択される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
複数のビール酵母判別用プライマーが、配列番号２１と配列番号４３の塩基配列からなるプライマー対及び配列番号２２と配列番号４４の塩基配列からなるプライマー対から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
鋳型ＤＮＡが、（ａ１）ビール試料に澱粉分解酵素及びタンパク質分解酵素を作用させて澱粉、澱粉分解物及びタンパク質を分解するステップ、（ａ２）ステップ（ａ１）の処理液からＤＮＡを回収するステップ、並びに（ａ３）ＤＮＡ吸着性固相担体を用いてステップ（ａ２）からのＤＮＡを吸着し、該固相担体から該ＤＮＡを回収するステップを含む方法によって得ることができる、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
澱粉分解酵素が耐熱性アミラーゼである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
タンパク質分解酵素が、プロテイナーゼＫである、請求項１２又は１３に記載の方法。
【請求項１５】
ＤＮＡ吸着性固相担体が、ガラスビーズ又は磁性ビーズである、請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
ビールの品質の評価方法であって、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法を用いて大麦判別用プライマー、ホップ判別用プライマー及びビール酵母判別用プライマーを用いる核酸増幅法によって、ビールの製造に使用された原料である大麦、ビール酵母及びホップの種類を判別するステップ、並びに、該判別結果を用いてビールの呈味性及び泡立ち保持性からなる品質を総合的に評価するステップを含む、前記方法。
【請求項１７】
ビールの呈味性が、苦味、酸味、渋み及び旨味である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
判別結果を導くための増幅ＤＮＡバンドの有無について、有を１、無を０と２値化し、ビール品質を目的変数とする多変量解析を行うことによって該ビールの品質を推定する、請求項１６又は１７に記載の方法。
【請求項１９】
大麦判別用プライマーが、大麦ポリガラクチュロナーゼ遺伝子、大麦ホルデイン遺伝子、大麦澱粉合成酵素遺伝子、大麦プロテインＺ遺伝子、大麦αアミラーゼ遺伝子、大麦βアミラーゼ遺伝子、大麦リポキシゲナーゼ遺伝子、大麦黄斑モザイクウイルス由来遺伝子、大麦うどんこ病菌由来遺伝子、大麦トリプシンインヒビター遺伝子、大麦セルラーゼ遺伝子、及び大麦β―グルカナーゼ遺伝子の検出用プライマーからなる群から選択される２種以上から全種の遺伝子のプライマーであり、ホップ判別用プライマーが、アロマに属するホップの遺伝子の検出用プライマー、ファインアロマに属するホップの遺伝子の検出用プライマー及びビターに属するホップの遺伝子の検出用プライマーであり、並びに、ビール酵母判別用プライマーが、上面発酵酵母と下面発酵酵母とを識別可能にするプライマー及び酵母チオレドキシン遺伝子の検出用プライマーである、請求項１６〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
大麦ポリガラクチュロナーゼ遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号１と配列番号２３の塩基配列からなり、大麦ホルデイン遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号２と配列番号２４，配列番号３と配列番号２５及び／又は配列番号４と配列番号２６の塩基配列からなり、大麦澱粉合成酵素遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号５と配列番号２７の塩基配列からなり、大麦プロテインＺ遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号６と配列番号２８、配列番号７と配列番号２９、配列番号８と配列番号３０及び／又は配列番号９と配列番号３１の塩基配列からなり、大麦αアミラーゼ遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号１０と配列番号３２の塩基配列からなり、大麦リポキシゲナーゼ遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号１１と配列番号３３の塩基配列からなり、大麦黄斑モザイクウイルス由来遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号１２と配列番号３４の塩基配列からなり、大麦うどんこ病菌由来遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号１３と配列番号３５及び／又は配列番号１４と配列番号３６の塩基配列からなり、大麦トリプシンインヒビター遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号１５と配列番号３７の塩基配列からなり、大麦セルラーゼ遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号１６と配列番号３８の塩基配列からなり、並びに大麦β―グルカナーゼ遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号１７と配列番号３９の塩基配列からなり、ホップ判別用プライマーが、配列番号１８と配列番号４０の塩基配列からなるプライマー対、配列番号１９と配列番号４１の塩基配列からなるプライマー対、及び配列番号２０と配列番号４２の塩基配列からなるプライマー対であり、並びに、ビール酵母判別用プライマーが、配列番号２１と配列番号４３の塩基配列からなるプライマー対及び配列番号２２と配列番号４４の塩基配列からなるプライマー対である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法で使用するための、大麦判別用プライマー、ホップ判別用プライマー及びビール酵母判別用プライマーを含むキットであって、大麦判別用プライマーが、大麦ポリガラクチュロナーゼ遺伝子、大麦ホルデイン遺伝子、大麦澱粉合成酵素遺伝子、大麦プロテインＺ遺伝子、大麦αアミラーゼ遺伝子、大麦βアミラーゼ遺伝子、大麦リポキシゲナーゼ遺伝子、大麦黄斑モザイクウイルス由来遺伝子、大麦うどんこ病菌由来遺伝子、大麦トリプシンインヒビター遺伝子、大麦セルラーゼ遺伝子、及び大麦β―グルカナーゼ遺伝子の検出用プライマーからなる群から選択される２種以上から全種の遺伝子のプライマーであり、ホップ判別用プライマーが、アロマに属するホップの遺伝子の検出用プライマー、ファインアロマに属するホップの遺伝子の検出用プライマー及びビターに属するホップの遺伝子の検出用プライマーであり、並びに、ビール酵母判別用プライマーが、上面発酵酵母と下面発酵酵母とを識別可能にするプライマー及び酵母チオレドキシン遺伝子の検出用プライマーである、前記キット。
【請求項２２】
大麦判別用プライマーが、大麦ポリガラクチュロナーゼ遺伝子、大麦ホルデイン遺伝子、大麦澱粉合成酵素遺伝子及び大麦プロテインＺ遺伝子の検出用プライマーを少なくとも含む、請求項２１に記載のキット。
【請求項２３】
大麦ポリガラクチュロナーゼ遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号１と配列番号２３の塩基配列からなり、大麦ホルデイン遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号２と配列番号２４，配列番号３と配列番号２５及び／又は配列番号４と配列番号２６の塩基配列からなり、大麦澱粉合成酵素遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号５と配列番号２７の塩基配列からなり、大麦プロテインＺ遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号６と配列番号２８、配列番号７と配列番号２９、配列番号８と配列番号３０及び／又は配列番号９と配列番号３１の塩基配列からなり、大麦αアミラーゼ遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号１０と配列番号３２の塩基配列からなり、大麦リポキシゲナーゼ遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号１１と配列番号３３の塩基配列からなり、大麦黄斑モザイクウイルス由来遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号１２と配列番号３４の塩基配列からなり、大麦うどんこ病菌由来遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号１３と配列番号３５及び／又は配列番号１４と配列番号３６の塩基配列からなり、大麦トリプシンインヒビター遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号１５と配列番号３７の塩基配列からなり、大麦セルラーゼ遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号１６と配列番号３８の塩基配列からなり、並びに大麦β―グルカナーゼ遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号１７と配列番号３９の塩基配列からなり、ホップ判別用プライマーが、配列番号１８と配列番号４０の塩基配列からなるプライマー対、配列番号１９と配列番号４１の塩基配列からなるプライマー対、及び配列番号２０と配列番号４２の塩基配列からなるプライマー対であり、並びに、ビール酵母判別用プライマーが、配列番号２１と配列番号４３の塩基配列からなるプライマー対及び配列番号２２と配列番号４４の塩基配列からなるプライマー対である、請求項２１又は２２に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ビール原料及び製品の判別方法並びにその方法を利用したビール品質の評価方法に関する。より詳しくは、本発明は、ビールに残存するＤＮＡを適正なプライマー共存下でＰＣＲによって増幅するための鋳型ＤＮＡの調製方法及び該調製方法によって得られる鋳型ＤＮＡを用いるＰＣＲの結果に基づくビール原料及び製品の判別方法並びに該判別結果に基づくビール品質の評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ビールは大麦の麦芽の酵素活性によって大麦の澱粉を分解し、精製する糖質を酵母によって発酵させてアルコールと二酸化炭素を生成させ、添加したホップによって発酵を調整するとともに、特有の風味を付与した世界で幅広く楽しまれている飲料である。
【０００３】
ビールの品質には、原料大麦の種類と特性、麦酒酵母の種類と発酵条件、副原料であるホップの種類と品質が重要な影響を与えるとされている。
【０００４】
大麦種子を試料とするＰＣＲ法による品種識別については、内村ら（非特許文献１：内村要介・古庄雅彦・吉田智彦２００４．  国内二条大麦のＤＮＡ  マーカーによる品種識別．  日作紀７３：  ３５−４１．）や長嶺ら（非特許文献２：長嶺敬・天谷正行・池田達哉・大関美香・春山直人・加藤常夫・五月女敏範：ビール大麦の主要形質ＤＮＡマーカーの開発・評価と育種利用上の問題点、栃木農試研報Ｎｏ５９：４５〜５４  （２００７））が報告している。
【０００５】
ビール酵母の菌種判別に関しては、佐藤と土屋（特許文献１：特開２００２−２３３３８２号公報「ビール酵母の識別方法」）は、Ｌｇ−ＦＬＯ１遺伝子の特徴に注目して醸造用下面ビール酵母と野生酵母の菌種識別技術を開発し、尾形と只見（特許文献２：特開２００８−２４５６３６号公報）は、ビール酵母由来のＤＮＡのＳ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ型塩基配列とＳ．  ｂａｙａｎｕｓ型塩基配列の組み替えの起こっている箇所を特異的に増幅するＰＣＲ用プライマー対による酵母の識別技術及び香気成分生成などのビール醸造適性の推定技術について報告している。
【０００６】
ビールの副原料であるホップの品種識別については、土屋らがホップからＤＮＡを抽出してＰＣＲ法による品種判別を行う技術（非特許文献３：Ｔｓｕｃｈｉｙａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，  ８４（２），  １０３−１０７，  １９９７）を報告し、また、村上がＰＣＲ法によるホップの品種判別を行うに際して、ホップから効率よくＤＮＡを抽出する方法及びＰＣＲ用の好適プライマーについて報告している（特許文献３：特開平第１１−１０３８９５号公報）。
【０００７】
上記の大麦、ビール酵母及びホップの識別技術は、いずれも種子、菌体あるいは植物体からＤＮＡを抽出して鋳型とし、ＰＣＲを行う技術であり、ビールを試料として原料を識別する技術ではないのに対し、本発明者らは、これまでに、ワイン、日本酒、ビールなどの醸造酒の原料植物をＰＣＲ法を用いるＤＮＡ判別によって識別する技術を開発し、ビールへのトウモロコシや米の配合の有無をＰＣＲ法で識別することが可能であると報告している（特許文献４：日本特許第４９５３０５８号「醸造酒中の原料植物の判別方法」）。
【０００８】
本発明者らの報告した上記の技術は、日本酒の主原料である米の品種判別やワインの主原料であるブドウの品種判別に特に適するものであるが、ビールについては、抽出精製できる鋳型ＤＮＡの精製度と量が不十分であり、広範な原料植物の判別のためにはさらなる改良が必要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２００２−２３３３８２号公報
【特許文献２】特開平１１−１０３８９５号公報
【特許文献３】特開２００８−２４５６３６号公報
【特許文献４】日本特許第４９５３０５８号
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】内村要介・古庄雅彦・吉田智彦２００４．  国内二条大麦のＤＮＡ  マーカーによる品種識別．  日作紀７３：  ３５−４１
【非特許文献２】長嶺敬ら、「ビール大麦の主要形質ＤＮＡマーカーの開発・評価と育種利用上の問題点」、栃木農試研報Ｎｏ５９：４５〜５４  （２００７）
【非特許文献３】Ｙｏｕｉｃｈｉ  Ｔｓｕｃｈｉｙａ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｏｐ  ｖａｒｉｅｔｉｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｉｍｅｒｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ＲＡＰＤ  ｍａｒｋｅｒｓ，”  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，  ８４（２），  １０３−１０７，  １９９７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
ビールの品質には、原料大麦の種類、ビール酵母の種類と発酵条件、副原料であるホップの品質のすべてが影響するということが知られており、ＰＣＲ法を用いるＤＮＡ判別によってビールの品質を推定するためには、原料大麦、ビール酵母、ホップのそれぞれについて品質に関連するＤＮＡマーカーを開発し、好適なプライマーを開発・設計することが必要であり、複数のＰＣＲに必要とされる高純度にして大量の鋳型ＤＮＡをビールから抽出・精製しなければならず、そのためには、特許第４９５３０５８号で報告した醸造酒からのＤＮＡ抽出精製法を改良して純度の高い鋳型ＤＮＡを効率よく抽出・精製する技術、ＰＣＲプライマーの選別に関する技術などを新たに開発することが必要とされていた。
【００１２】
本発明の第１の目的は、ビール原料又は製品の判別方法を提供することである。
本発明の第２の目的は、ビール原料の判別結果に基づくビールの品質評価方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、ＤＮＡ吸着用担体（例えば、磁性担体とマグネット）を使用するＤＮＡ精製法とアルコール分配法とを併用することによって高純度のＤＮＡを簡便かつ大量に調製できるということを見いだした。
本発明者らはさらに、ビール原料又は製品の判別及びビールの品質評価に好適なＰＣＲプライマーを見出すために、これを使用して、ビールから抽出及び精製したＤＮＡを鋳型として大麦、酵母及びホップの多数の特定成分のＤＮＡを増幅し、好適なＤＮＡバンドからＤＮＡを抽出してクローニングしてそれぞれのＤＮＡの塩基配列を決定し、その結果に基づいて、もっとも好適なプライマー対群を再設計することに成功した。
【００１４】
本発明のＤＮＡ調製方法を用いることにより、高純度の鋳型ＤＮＡが大量に調製できるので、該ビールあたり、大麦、酵母、ホップのそれぞれについて各種のプライマー対の存在下でＰＣＲを行うことができ、該ビールのそれぞれの原料の判別が可能になることに加えて、大麦、酵母、ホップそれぞれがビール品質に与える影響を考慮することによって、該ビールの総合的な品質評価が可能になった。
【００１５】
本発明は、要約すると、以下の特徴を包含する。
（１）  ビール原料又は製品の判別方法であって、該方法が、（ａ）ビール試料から抽出及び精製したＤＮＡを鋳型として、複数の大麦判別用プライマー、複数のホップ判別用プライマー及び複数のビール酵母判別用プライマーからなるそれぞれのプライマー群を別個に又は同時に用いて該ＤＮＡを増幅するステップ、（ｂ）ステップ（ａ）で増幅したＤＮＡを検出するステップ、（ｃ）ステップ（ｂ）でのＤＮＡの検出結果に基づいて、ビールの製造に使用された原料である大麦、ビール酵母及びホップの種類を判別するステップを含む、前記方法。
【００１６】
（２）  複数の大麦判別用プライマーが、大麦ポリガラクチュロナーゼ遺伝子、大麦ホルデイン遺伝子、大麦澱粉合成酵素遺伝子、大麦プロテインＺ遺伝子、大麦αアミラーゼ遺伝子、大麦βアミラーゼ遺伝子、大麦リポキシゲナーゼ遺伝子、大麦黄斑モザイクウイルス由来遺伝子、大麦うどんこ病菌由来遺伝子、大麦トリプシンインヒビター遺伝子、大麦セルラーゼ遺伝子、及び大麦β―グルカナーゼ遺伝子の検出用プライマーからなる群から選択される２種以上から全種の遺伝子のプライマーである、上記（１）に記載の方法。
【００１７】
（３）  大麦ホルデイン遺伝子が、ホルデインＡ遺伝子、ホルデインＢ遺伝子、ホルデインＣ遺伝子、又はそれらの組み合わせである、上記（２）に記載の方法。
（４）  大麦プロテインＺ遺伝子が、プロテインＺ７遺伝子、プロテインＺ４遺伝子、又はそれらの組み合わせである、上記（２）又は（３）に記載の方法。
【００１８】
（５）  大麦澱粉合成酵素遺伝子が、大麦澱粉粒結合性澱粉合成酵素遺伝子である、上記（２）〜（４）のいずれかに記載の方法。
（６）  複数の大麦判別用プライマーが、大麦ポリガラクチュロナーゼ遺伝子、大麦ホルデイン遺伝子、大麦澱粉合成酵素遺伝子及び大麦プロテインＺ遺伝子の検出用プライマーを少なくとも含む、上記（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
【００１９】
（７）  大麦ポリガラクチュロナーゼ遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号１と配列番号２３の塩基配列からなり、大麦ホルデイン遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号２と配列番号２４，配列番号３と配列番号２５及び／又は配列番号４と配列番号２６の塩基配列からなり、大麦澱粉合成酵素遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号５と配列番号２７の塩基配列からなり、大麦プロテインＺ遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号６と配列番号２８、配列番号７と配列番号２９、配列番号８と配列番号３０及び／又は配列番号９と配列番号３１の塩基配列からなり、大麦αアミラーゼ遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号１０と配列番号３２の塩基配列からなり、大麦リポキシゲナーゼ遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号１１と配列番号３３の塩基配列からなり、大麦黄斑モザイクウイルス由来遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号１２と配列番号３４の塩基配列からなり、大麦うどんこ病菌由来遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号１３と配列番号３５及び／又は配列番号１４と配列番号３６の塩基配列からなり、大麦トリプシンインヒビター遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号１５と配列番号３７の塩基配列からなり、大麦セルラーゼ遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号１６と配列番号３８の塩基配列からなり、並びに大麦β−グルカナーゼ遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号１７と配列番号３９の塩基配列からなる、上記（２）〜（６）のいずれかに記載の方法。
【００２０】
（８）  複数のホップ判別用プライマーが、アロマに属するホップの遺伝子の検出用プライマー、ファインアロマに属するホップの遺伝子の検出用プライマー及びビターに属するホップの遺伝子の検出用プライマーから選択される、上記（１）〜（７）のいずれかに記載の方法。
（９）  複数のホップ判別用プライマーが、配列番号１８と配列番号４０の塩基配列からなるプライマー対、配列番号１９と配列番号４１の塩基配列からなるプライマー対及び配列番号２０と配列番号４２の塩基配列からなるプライマー対から選択される、上記（８）に記載の方法。
【００２１】
（１０）  複数のビール酵母判別用プライマーが、上面発酵酵母と下面発酵酵母とを識別可能にするプライマー及び酵母チオレドキシン遺伝子の検出用プライマーから選択される、上記（１）〜（９）のいずれかに記載の方法。
（１１）  複数のビール酵母判別用プライマーが、配列番号２１と配列番号４３のプライマー対及び配列番号２２と配列番号４４のプライマー対から選択される、上記（１０）に記載の方法。
【００２２】
（１２）  鋳型ＤＮＡが、（ａ１）ビール試料に澱粉分解酵素及びタンパク質分解酵素を作用させて澱粉、澱粉分解物及びタンパク質を分解するステップ、（ａ２）ステップ（ａ１）の処理液からＤＮＡを回収するステップ、並びに（ａ３）ＤＮＡ吸着性固相担体を用いてステップ（ａ２）からのＤＮＡを吸着し、該固相担体から該ＤＮＡを回収するステップを含む方法によって得ることができる、上記（１）〜（１１）のいずれかに記載の方法。
（１３）  澱粉分解酵素が耐熱性アミラーゼである、上記（１２）に記載の方法。
【００２３】
（１４）  タンパク質分解酵素が、プロテイナーゼＫである、上記（１２）又は（１３）に記載の方法。
（１５）  ＤＮＡ吸着性固相担体が、ガラスビーズ又は磁性ビーズである、上記（１２）〜（１４）のいずれかに記載の方法。
【００２４】
（１６）  ビールの品質の評価方法であって、上記の（１）〜（１５）のいずれかに記載の方法を用いて大麦判別用プライマー、ホップ判別用プライマー及びビール酵母判別用プライマーを用いる核酸増幅法によって、ビールの製造に使用された原料である大麦、ビール酵母及びホップの種類を判別するステップ、並びに、該判別結果を用いてビールの呈味性及び泡立ち保持性からなる品質を総合的に評価するステップを含む、前記方法。
（１７）  ビールの呈味性が、苦味、酸味、渋み及び旨味である、上記（１６）に記載の方法。
【００２５】
（１８）  判別結果を導くための増幅ＤＮＡバンドの有無について、有を１、無を０と２値化し、ビール品質を目的変数とする多変量解析を行うことによって該ビールの品質を推定する、上記（１６）又は（１７）に記載の方法。
（１９）  大麦判別用プライマーが、大麦ポリガラクチュロナーゼ遺伝子、大麦ホルデイン遺伝子、大麦澱粉合成酵素遺伝子、大麦プロテインＺ遺伝子、大麦αアミラーゼ遺伝子、大麦βアミラーゼ遺伝子、大麦リポキシゲナーゼ遺伝子、大麦黄斑モザイクウイルス由来遺伝子、大麦うどんこ病菌由来遺伝子、大麦トリプシンインヒビター遺伝子、大麦セルラーゼ遺伝子、及び大麦β―グルカナーゼ遺伝子の検出用プライマーからなる群から選択される２種以上から全種の遺伝子のプライマーであり、ホップ判別用プライマーが、アロマに属するホップの遺伝子の検出用プライマー、ファインアロマに属するホップの遺伝子の検出用プライマー及びビターに属するホップの遺伝子の検出用プライマーであり、並びに、ビール酵母判別用プライマーが、上面発酵酵母と下面発酵酵母とを識別可能にするプライマー及び酵母チオレドキシン遺伝子の検出用プライマーである、上記（１６）〜（１８）のいずれかに記載の方法。
【００２６】
（２０）  大麦ポリガラクチュロナーゼ遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号１と配列番号２３の塩基配列からなり、大麦ホルデイン遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号２と配列番号２４，配列番号３と配列番号２５及び／又は配列番号４と配列番号２６の塩基配列からなり、大麦澱粉合成酵素遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号５と配列番号２７の塩基配列からなり、大麦プロテインＺ遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号６と配列番号２８、配列番号７と配列番号２９、配列番号８と配列番号３０及び／又は配列番号９と配列番号３１の塩基配列からなり、大麦αアミラーゼ遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号１０と配列番号３２の塩基配列からなり、大麦リポキシゲナーゼ遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号１１と配列番号３３の塩基配列からなり、大麦黄斑モザイクウイルス由来遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号１２と配列番号３４の塩基配列からなり、大麦うどんこ病菌由来遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号１３と配列番号３５及び／又は配列番号１４と配列番号３６の塩基配列からなり、大麦トリプシンインヒビター遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号１５と配列番号３７の塩基配列からなり、大麦セルラーゼ遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号１６と配列番号３８の塩基配列からなり、並びに大麦β―グルカナーゼ遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号１７と配列番号３９の塩基配列からなり、ホップ判別用プライマーが、配列番号１８と配列番号４０の塩基配列からなるプライマー対、配列番号１９と配列番号４１の塩基配列からなるプライマー対、及び配列番号２０と配列番号４２の塩基配列からなるプライマー対であり、並びに、ビール酵母判別用プライマーが、配列番号２１と配列番号４３の塩基配列からなるプライマー対及び配列番号２２と配列番号４４の塩基配列からなるプライマー対である、上記（１９）に記載の方法。
【００２７】
（２１）  上記（１）〜（２０）のいずれかに記載の方法で使用するための、大麦判別用プライマー、ホップ判別用プライマー及びビール酵母判別用プライマーを含むキットであって、大麦判別用プライマーが、大麦ポリガラクチュロナーゼ遺伝子、大麦ホルデイン遺伝子、大麦澱粉合成酵素遺伝子、大麦プロテインＺ遺伝子、大麦αアミラーゼ遺伝子、大麦βアミラーゼ遺伝子、大麦リポキシゲナーゼ遺伝子、大麦黄斑モザイクウイルス由来遺伝子、大麦うどんこ病菌由来遺伝子、大麦トリプシンインヒビター遺伝子、大麦セルラーゼ遺伝子、及び大麦β―グルカナーゼ遺伝子の検出用プライマーからなる群から選択される２種以上から全種の遺伝子のプライマーであり、ホップ判別用プライマーが、アロマに属するホップの遺伝子の検出用プライマー、ファインアロマに属するホップの遺伝子の検出用プライマー及びビターに属するホップの遺伝子の検出用プライマーであり、並びに、ビール酵母判別用プライマーが、上面発酵酵母と下面発酵酵母とを識別可能にするプライマー及び酵母チオレドキシン遺伝子の検出用プライマーである、前記キット。
【００２８】
（２２）大麦判別用プライマーが、大麦ポリガラクチュロナーゼ遺伝子、大麦ホルデイン遺伝子、大麦澱粉合成酵素遺伝子及び大麦プロテインＺ遺伝子の検出用プライマーを少なくとも含む、上記（２１）に記載のキット。
【００２９】
（２３）  大麦ポリガラクチュロナーゼ遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号１と配列番号２３の塩基配列からなり、大麦ホルデイン遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号２と配列番号２４，配列番号３と配列番号２５及び／又は配列番号４と配列番号２６の塩基配列からなり、大麦澱粉合成酵素遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号５と配列番号２７の塩基配列からなり、大麦プロテインＺ遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号６と配列番号２８、配列番号７と配列番号２９、配列番号８と配列番号３０及び／又は配列番号９と配列番号３１の塩基配列からなり、大麦αアミラーゼ遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号１０と配列番号３２の塩基配列からなり、大麦リポキシゲナーゼ遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号１１と配列番号３３の塩基配列からなり、大麦黄斑モザイクウイルス由来遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号１２と配列番号３４の塩基配列からなり、大麦うどんこ病菌由来遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号１３と配列番号３５及び／又は配列番号１４と配列番号３６の塩基配列からなり、大麦トリプシンインヒビター遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号１５と配列番号３７の塩基配列からなり、大麦セルラーゼ遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号１６と配列番号３８の塩基配列からなり、並びに大麦β―グルカナーゼ遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号１７と配列番号３９の塩基配列からなり、ホップ判別用プライマーが、配列番号１８と配列番号４０の塩基配列からなるプライマー対、配列番号１９と配列番号４１の塩基配列からなるプライマー対、及び配列番号２０と配列番号４２の塩基配列からなるプライマー対であり、並びに、ビール酵母判別用プライマーが、配列番号２１と配列番号４３の塩基配列からなるプライマー対及び配列番号２２と配列番号４４の塩基配列からなるプライマー対である、上記（２１）又は（２２）に記載のキット。
【発明の効果】
【００３０】
本発明により、ビールから抽出精製したＤＮＡを鋳型とするＰＣＲなどの核酸増幅法によって、該ビールの主原料である大麦の品種判別、該ビールの発酵微生物であるビール酵母の判別、並びに該ビールの副原料であるホップの判別が可能となる。
【００３１】
本発明により、ビール製品の判別が可能となる。
本発明により、ビールから抽出精製したＤＮＡを鋳型とするＰＣＲなどの核酸増幅法により、該ビールの品質推定が可能となり、特に、ＤＮＡの増幅結果を２値化して説明変数とし、ビールの呈味性や泡の保持性を目的変数とする重回帰分析などの多変量解析を行うことによって、ビール製品のＤＮＡの増幅結果から該ビールの品質を推定することが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】この図は、ビール試料からのＰＣＲ用鋳型ＤＮＡの調製方法の手順を示す。図中、ＴＥは、Ｔｒｉｓ／ＥＤＴＡバッファー（１０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，  ｐＨ  ７．５,  １  ｍＭ  ＥＤＴＡ）を表す。図中、ＰＣＩは、フェノール−クロロホルム−イソアミルアルコール（２５：２４：１）を意味する。
【図２】この図は、抽出・精製方法の異なる鋳型ＤＮＡによるＰＣＲの結果を示す。ＰＣＲプライマーは、大麦澱粉合成酵素（Ｓｔａｒｃｈ  Ｓｙｎｔｈａｓｅ）プライマーであり、すなわち正方向プライマー（Ｆ）がｃａａ  ｔｔｃ  ａｔｃ  ｃｇａ  ｔｃａ  ｃｔｃ  ａａｔ  ｃａｔ（配列番号４５）であり、逆方向プライマー（Ｒ）がｃａｇ  ｇｃｃ  ｇａｃ  ａａｇ  ｇｔｇ  ｃｔｇ（配列番号４６）である。アニーリングは５８℃で行われた。図中、Ｍは、マーカーであり、レーン１及び２は、ｉｓｏｐｌａｎｔ  Ｉ  （Ｂｅｅｒ，  ＤＮＡ）であり、レーン３及び４は、ｉｓｏｐｌａｎｔ  ＩＩ  （Ｂｅｅｒ，  ＤＮＡ）であり、レーン５及び６は、Ｄｎｅａｓｙ  ｐｌａｎｔ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔ  （ＱＩＡＧＥＮ社）（Ｂｅｅｒ，  ＤＮＡ）であり、レーン７及び８は、本発明方法（Ｂｅｅｒ，  ＤＮＡ）であり、レーン９は、大麦澱粉合成酵素ＤＮＡである。
【図３】この図は、大麦からの鋳型ＤＮＡとする、大麦遺伝子由来のプライマー（表１の配列番号１〜１５）を用いるＰＣＲの結果を示す。図中、Ｍはマーカーであり、レーン１〜１６は、表３に示す１６種の大麦品種からの鋳型ＤＮＡを表す。また、バンド１は、ポリガラクチュロナーゼ関連のＤＮＡを表し、バンド２は、ホルデインＡ関連のＤＮＡを表し、バンド３は、ホルデインＢ関連のＤＮＡを表し、バンド４は、ホルデインＣ関連のＤＮＡを表し、バンド５は、澱粉合成酵素関連のＤＮＡを表し、バンド６、７および８は、プロテインＺ７（セルピン）関連のＤＮＡを表し、バンド９はプロテインＺ４関連のＤＮＡを表し、バンド１０は、うどん粉病耐性遺伝子（αアミラーゼ）関連のＤＮＡを表し、バンド１１は、リポキシゲナーゼ関連のＤＮＡを表し、バンド１２は、黄斑モザイクウィルス病耐性関連のＤＮＡを表し、バンド１３は、うどん粉病耐性関連のＤＮＡを表し、バンド１４は、うどん粉病耐性（プロテインＺ４）関連のＤＮＡを表し、バンド１５は、トリプシンインヒビター関連のＤＮＡを表す。
【図４】この図は、ビールからのＤＮＡを鋳型とする、大麦のリポキシゲナーゼ遺伝子（表１の配列番号１１）、β−グルカナーゼ遺伝子（配列番号１７）、ホルデインＡ（配列番号２）及びホルデインＣ（配列番号４）由来のプライマーを用いるＰＣＲによる各種ビールの判別を示す。図中、Ｍはマーカーであり、レーン１〜２３は、２２種類のビール（１〜２２）及び比較大麦試料（２３）からの鋳型ＤＮＡを表す。また、バンド１は、ポリガラクチュロナーゼ関連のＤＮＡを表し、バンド２は、ホルデインＡ関連のＤＮＡを表し、バンド４は、ホルデインＣ関連のＤＮＡを表し、バンド５は、デンプン合成酵素関連のＤＮＡを表し、バンド６、７および８は、プロテインＺ７（セルピン）関連のＤＮＡを表し、バンド９はプロテインＺ４関連のＤＮＡを表し、バンド１０は、うどん粉病耐性遺伝子（αアミラーゼ）関連のＤＮＡを表し、バンド１１は、リポキシゲナーゼ関連のＤＮＡを表し、バンド１５は、トリプシンインヒビター関連のＤＮＡを表す。
【図５】この図は、ビール試料からのＰＣＲ増幅産物の塩基配列（配列番号４７；表１のＰｒｏｔｅｉｎ  Ｚ４プライマーによる増幅産物）と大麦セルピン（Ｓｅｒｐｉｎ）の塩基配列（配列番号４８）の比較を示す。
【図６】この図は、ホップの品種判別用プライマー（表１の配列番号１８〜２０）による各種ビールのＰＣＲにより増幅されたＤＮＡの電気泳動結果を示す。レーンＭは、マーカーであり、レーンａは、ホップ品種Ｓａａｔｚｅｒであり、レーンｂは、ホップ品種Ｃａｓｃａｄｅであり、レーンｃは、ホップ品種Ｇａｌｅｎａであり、レーンｄは、ホップ品種Ｌｉｂｅｒｔｙであり、レーン１〜２２は、異なる種類のビール試料である。また、図中、ｗとyはそれぞれ、後述の表１のＨｏｐ−ａプライマー、Ｈｏｐ−ｃプライマーによる増幅産物を表す。ｘは、後述の表１のＨｏｐ−ｂプライマーによる増幅産物を表す。
【図７】この図は、ビール試料中の酵母チオレドキシン（ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ）−２遺伝子のＰＣＲ増幅産物（Ｚ−ａ）の電気泳動結果（上段、レーンＭはマーカー、レーン１から２２は表３に示した番号の２２種のビールからのＰＣＲ増幅産物、レーン２３は酵母チオレドキシン−２遺伝子由来の増幅産物を表す）及び、ＰＣＲ増幅産物の塩基配列（配列番号４９）と標準チオレドキシン−２  ＤＮＡの塩基配列（配列番号４９）との比較（中段）を示す。
【図８】この図は、味覚認識装置による各種ビール試料の呈味性測定結果の２次元表示を示す。数字１〜２２は表３に示した２２種のビールの番号を表す。図中、（１）はＬａｇｅｒ  ｂｅｅｒの特性範囲であり、（２）はＬｏｗ−ｍａｌｔ  ｂｅｅｒの特性範囲であり、（３）はＡｌｅ  ｂｅｅｒの特性範囲であり、（４）はｄｒａｆｔ  ｂｅｅｒの特性範囲である。
【図９】この図は、味覚認識装置による呈味性と表３のＰＣＲ結果との関係を示す。数字１〜２２は表３に記載の２２種のビールの番号を表す。Ｒ２は決定係数を表す。
【図１０】この図は、ビールの泡立ち保持性（安定性）の試験方法を示す。
【図１１】この図は、ビールの泡立ち保持性（安定性）のＰＣＲ法による推定を示すグラフである。Ｒ２は決定係数を表す。グラフ中の数字は、表３に示した２２種のビールの番号を表す。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
本発明をさらに詳細に説明する。
１．ビール原料又は製品の判別方法
本発明は、第一の態様において、ビール原料又は製品の判別方法であって、該方法が、（ａ）ビール試料から抽出及び精製したＤＮＡを鋳型として、複数の大麦判別用プライマー、複数のホップ判別用プライマー及び複数のビール酵母判別用プライマーからなるそれぞれのプライマー群を別個に又は同時に用いて該ＤＮＡを増幅するステップ、（ｂ）ステップ（ａ）で増幅したＤＮＡを検出するステップ、（ｃ）ステップ（ｂ）でのＤＮＡの検出結果に基づいて、ビールの製造に使用された原料である大麦、ビール酵母及びホップの種類を判別するステップを含む、方法を提供する。
【００３４】
プライマーを個別に用いるか、或いは組み合わせて用いるかは、同じ泳動条件下で増幅産物が作るラダーのサイズ位置が重なり合わないことが前提となる。そのためには、予め各プライマーを個別に用いて、目的の遺伝子を増幅し、増幅産物のサイズ位置を確認しておくことが必要である。
【００３５】
本明細書中「ビール」とは、大麦の麦芽の酵素活性によって大麦の澱粉を分解し、精製する糖質を酵母によって発酵させてアルコールと二酸化炭素を生成させ、添加したホップによって発酵を調整するとともに、特有の風味を付与した世界で幅広く楽しまれている飲料であり、ドイツ、ベルギー、イギリス、アイルランド、オーストリア、チェコ、米国、中国、韓国、日本等の世界各国で醸造され、ピルスナー、ヴィエナ、デュンケル、ボック、ホワイトエール、ランビック、ストロングエール、セゾン、ペールエール、ブラウンエール、スタウト、ケルシュ、ヴァイツェン、フルーツビール、酒イーストビ−ルなど、各種のスタイルがあり、発酵方法によって上面発酵ビール、下面発酵ビールがある。
【００３６】
本明細書中「大麦」とは、学名Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ  Ｌ．の単子葉植物の種子を指し、国内で栽培されている二条大麦の例としては、あまぎ二条、アサカゴールド、ミハルゴールド、ほうしゅん、九州二条１６号、ニシノゴールド、ダイセンゴールド、きぬゆたか、ミサトゴールデン、スカイゴールデン、なす二条、おうみゆたか、とね二条、みょうぎ二条、はるな二条、きぬか二条、ミカモゴールデン、さきたま二条、タカホゴールデン、ニューゴールデン、ニシノチカ、ニシノホシ、はるしずく、りょうふう、ほしまさり、小春二条など、外国産二条大麦の例としては、ハリントン、パラス、ボーディン、フラッグシップ、マリータイム、ハメリン、メトカーフ、スターリング、スクーナなどを挙げることができる。
【００３７】
本明細書中「ビール酵母」とは、一般にビール醸造に使用される酵母を指し、生物学的分類でいうと、例えばサッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセス・パストリアヌス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ）が挙げられ、歴史的には、「上面ビール酵母」と「下面ビール酵母」との区別は、ビール醸造過程で発酵後に見られるビール酵母の動態（表面付近に浮き上がる又は凝集して沈む）により区別されてきたが、今現在、当業者間では、下面ビール酵母と上面ビール酵母とは生物学的分類において異なる種であり、上面ビール酵母は主としてサッカロミセス・セレビシアエ（Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に分類され、下面ビール酵母はサッカロミセス・セレビシアエとサッカロミセス・バヤナス（Ｓ．  ｂａｙａｎｕｓ）との交雑体であってサッカロミセス・パストリアヌス（Ｓ．  ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ）に分類されるという見解が一般的となっており、本明細書において「ビール酵母のゲノムＤＮＡ」とは、サッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）及びサッカロミセス・パストリアヌス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ）のゲノムＤＮＡに加えて、サッカロミセス・バヤナス（Ｓ．  ｂａｙａｎｕｓ）のゲノムＤＮＡをも含むものとする。
【００３８】
本明細書中の「ホップ」について、本発明において識別対象となる世界の主な栽培ホップ品種としては、ドイツのファインアロマ、アロマに属するＨｅｒｓｂｒｕｃｋｅｒ，Ｈａｌｌｅｒｔａｕｅｒ  Ｔｒａｄｉｔｉｏｎ，Ｈａｌｌｅｒｔａｕｅｒ，Ｓｐａｌｔｅｒ  Ｓｅｌｅｃｔ，Ｐｅｒｌｅ，Ｔｅｔｔｎａｎｇｅｒ、ビターに属するＮｏｒｔｈｅｒｎ  Ｂｒｅｗｅｒ，Ｂｒｅｗｅｒｓ  Ｇｏｌｄ，Ｍａｇｎｕｍ、チェコのファインアロマに属するＳａａｚｅｒ、ビターに属するＢｏｒ、フランスのアロマに属するＳｔｔｒｉｓｓｅｌ  Ｓｐａｌｔ、ポーランドのアロマに属するＬｕｂｌｉｎ、スロベニアのアロマに属するＳａｖｉｎｊｓｋｉ．Ｇｏｌｄｉｎｇ、ビターに属するＳｕｐｅｒ  Ｓｔｙｒｉａｎ、米国のアロマに属するＦｕｇｇｌｅ，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｅｔｔｎａｎｎｇｅｒ，Ｗｉｌｌａｍｅｔｔｅ，Ｃｒｙｓｔａｌ，Ｌｉｂｅｒｔｙ、ビターに属するＮｕｇｇｅｔ，Ｃｌｕｓｔｅｒ，ｃｈｉｎｏｏｋ，Ｇａｌｅｎａ、ニュージーランドのアロマに属するＰａｃｉｆｉｃ．Ｈａｌｌｅｒｔａｕ，ＮｅｗＺｅａｌａｎｄ  Ｈａｌｌｅｒｔａｕ、ビターに属するＧｒｅｅｎ．Ｂｕｌｌｅｔ，Ｓｔｉｃｋｌｅ  Ｂｒａｃｔ、オーストラリアのＰｒｉｄｅ  ｏｆ  Ｒｉｎｇｗｏｏｄ、日本のビターに属するキリン２号，とよみどり，きたみどり，イースタンゴールドを挙げることができる。これらのホップの葉、毬花、又は毬花のペレットやベールから、ＰＣＲを適用する場合の鋳型となるゲノムＤＮＡが抽出・精製されることになるが、現在使用されているホップの殆どはペレットに加工（粉砕したのち圧縮）されている。
【００３９】
本発明の方法は、ビールの製造に使用された原料である大麦、ビール酵母及びホップの種類を判別することによって、ビール原料の判別だけでなくビール製品の判別も可能にする。これは、ビール試料から鋳型ＤＮＡを精製する技術を改良したことと、大麦、ビール酵母及びホップに関連する遺伝子群から判別に有利な特定の遺伝子群を選抜したことに基いている。
【００４０】
１．１．鋳型ＤＮＡの調製
ビール試料からの鋳型ＤＮＡの精製は、以下の（ａ１）〜（ａ３）のステップ
（ａ１）ビール試料に澱粉分解酵素及びタンパク質分解酵素を作用させて澱粉、澱粉分解物及びタンパク質を分解するステップ、
（ａ２）ステップ（ａ１）の処理液からＤＮＡを回収するステップ、並びに
（ａ３）ＤＮＡ吸着性固相担体を用いてステップ（ａ２）からのＤＮＡを吸着し、該固相担体から該ＤＮＡを回収するステップ、
を含む方法によって行うことができる。
【００４１】
この方法は、ＣＴＡＢ法、アルカリフェノール法、ＩＳＯＰＬＡＮＴキット法、キアゲンキット法、タカラキット法、及び日本特許第４９５３０５８号に記載の方法と比較して、高分子量の鋳型ＤＮＡを調製することが可能であり、しかもＤＮＡ精製度が高く、ビール中に極微量しか残存しない原料大麦、発酵微生物である酵母、副原料であるホップのＤＮＡをＰＣＲによって増幅し、判別することを可能にするという利点をもたらす。
【００４２】
ステップ（ａ１）では、核酸以外の主要成分である澱粉、澱粉分解物及びタンパク質を除去する。ビール試料を凍結乾燥して、水以外の成分を回収する。具体的には、凍結したビールの環境気圧を真空ポンプを使用して下げることにより、ビールが融解しない低温で水を昇華させて乾燥を行い、粉末を得る。その後、該粉末をＤＮＡ溶解用緩衝液に溶解して澱粉分解酵素及びタンパク質分解酵素を作用させる。
【００４３】
ＤＮＡ溶出用緩衝液として、例えば、グリシン・塩酸、クエン酸・リン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、トリス・塩酸、ホウ酸、グリシン・水酸化ナトリウム、炭酸水素ナトリウム・水酸化ナトリウムなどの各種の緩衝液、ＢｒｉｔｔｏｎとＲｏｂｉｎｓｏｎの広域緩衝液、Ｇｏｏｄの緩衝液などに、たとえば、塩酸グアニジン、イソチオシアン酸グアニジン、チオシアン酸グアニジンなどのカオトロピックイオン及び／又はラウリル硫酸ナトリウム、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、コール酸ナトリウム、Ｔｗｅｅｎ２０などの界面活性剤を０．０５重量％〜１０重量％加えた緩衝液を挙げることができる。カオトロピックイオンや界面活性剤を添加することによって、ＤＮＡ分解酵素の反応を抑制しながらタンパク質分解を行うことができる。
【００４４】
本発明における澱粉分解のために、アミラーゼ（例えばαアミラーゼ、βアミラーゼ、グルコアミラーゼ）などの澱粉分解酵素、例えばＢａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ等の耐熱性アミラーゼを用いることができる。耐熱性アミラーゼは、市販のもの、例えばαアミラーゼ（米国セントルイスのシグマアルドリッチ社製）を使用することができる。また、タンパク質分解酵素としては、ペプシン、トリプシン、キモトリプシン、ズブチリシン、パパイン、フィシン、ブロメラインなどの各種のタンパク質分解酵素を使用することができるが、ＳＤＳ存在下でタンパク質を分解できるプロテイナーゼＫが好ましい。プロテイナーゼＫは、真菌類Ｔｒｉｔｉｒａｃｈｉｕｍ  ａｌｂｕｍ由来のセリンプロテアーゼであり、タカラバイオ社、インビトロジェン社などから販売されている。これらの酵素による処理は、例えば、ビール粉末２５０ｍｇをＤＮＡ溶出用緩衝液２．５ｍＬに溶解し、澱粉分解酵素及びタンパク質分解酵素を酵素活性を発現する適量添加し、前者は温度８０℃にて、後者は温度50℃にて、それぞれ６０分間反応することによって行うことができる。
【００４５】
ステップ（ａ２）では、ステップ（ａ１）の処理液からＤＮＡを回収する。
具体的には、酵素処理した後、処理液からＤＮＡをアルコール（約９９％エタノールが好ましい）で沈殿させ、遠心分離で沈殿として回収し、氷上で７０％エタノールでＤＮＡを溶出（若しくは、抽出）し、次いでフェノール処理を施し、クロロホルム／イソアミルアルコール処理によってＤＮＡを精製する。或いは、このステップにおいて、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールに代えて、フェノール／クロロホルム（通常、容量比約１：１）溶液を用いて抽出を行うこともできる。イソアミルアルコールを使用することによって、クロロホルムだけの場合と比べて水との相容性がよくなるため、有機溶媒相と水相の分離がしやすくなる。イソアミルアルコール：クロロホルムの容量比は、通常、約１：２５でよい。さらにまた、ＤＮＡを沈殿させるためのアルコールとしては、通常、エタノール又は（イソ）プロパノールが使用される。このステップでの７０％エタノールによるＤＮＡの溶出は、以下のステップ（ａ３）（特にＤＮＡ吸着性固相担体の使用）とともに、ビールからのＤＮＡの回収にとって重要である。７０％エタノールによるＤＮＡの溶出では、色素の溶出を避けるために、３分以内の処理が望ましい。このときのエタノール濃度は、６８％〜７２％でよいが、最適濃度は７０％であり、残部は水である。
【００４６】
上記ステップの後、必要に応じてＲＮＡ分解酵素（ＲＮアーゼ）によってＲＮＡを分解除去してもよい。
【００４７】
ステップ（ａ３）では、ＤＮＡ吸着性固相担体を用いてステップ（ａ２）からのＤＮＡを吸着し、該固相担体から該ＤＮＡを回収する。このステップもまた、ビールからのＤＮＡの効率的な回収のために重要かつ必須である。
【００４８】
ＤＮＡ吸着性固相担体として、例えばガラス又は金属（例えば磁性金属）製の任意の形状体を挙げることができる。形状体として好ましいのは、操作性や回収し易さの点で、微小球状体（すなわち、ビーズ）である。
【００４９】
具体的には、ＤＮＡを磁性ビーズに吸着させ、ビーズをマグネットによって溶液部分から分離した後、塩を含むエタノール又は（イソ）プロパノール溶液で洗浄し、次いでＤＮＡ溶出液で該磁性ビーズからＤＮＡを脱着させて精製する。得られたＤＮＡは、ＴＥ（Ｔｒｉｓ／ＥＤＴＡ）バッファーに溶解して鋳型ＤＮＡとする。ＤＮＡ溶出液としては、純水、ＴＥ、０．５Ｍ以下の塩（ＮａＣｌなど）を含む緩衝液などを挙げることができる。
【００５０】
１．２．ＤＮＡの増幅及び検出
上記のステップ（ａ）では、ビール試料から得られたＤＮＡを鋳型として、複数の大麦判別用プライマー、複数のホップ判別用プライマー及び複数のビール酵母判別用プライマーからなるそれぞれのプライマー群を別個に又は同時に用いて該ＤＮＡを増幅する。
【００５１】
本発明の方法では、ビールから抽出及び精製したＤＮＡを鋳型とし、大麦判別用プライマー、ホップ判別用プライマー及びビール酵母判別用プライマーの３種類を用いるＰＣＲなどの核酸増幅法によって、原料大麦、ホップ及びビール酵母の３種類を同時に判定することを特徴とする。
【００５２】
核酸増幅法は、ＤＮＡ増幅可能な任意の方法であり、例えばＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法（Ｔ．  Ｎｏｔｏｍｉ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．  ２０００，  ２８（２）：Ｅ６３）、ＩＣＡＮ法（等温遺伝子増幅法）などを挙げることができる。
【００５３】
ＰＣＲ法は、一般的な核酸増幅法であり、プライマー群のうちの１種類又は２種類以上のプライマー共存下で、変性、アニーリング、伸長の３反応からなるサイクルを反復することによってプライマー結合部分に挟まれたＤＮＡを増幅する反応を指し、具体的には、二本鎖ＤＮＡを一本鎖にする約９４℃での変性ステップ、プライマーを鋳型ＤＮＡに結合させる約３５〜６８℃でのアニーリングステップ、及び耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（例えばＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼなど）を使用して鋳型に沿ってプライマーを伸長させる約７２℃での伸長ステップを１サイクルとして約２０〜４０サイクル繰り返すことを含む。
【００５４】
ＬＡＭＰ法は、変性反応を不要とし、６０〜６５℃の定温で増幅反応をすることができる。この方法では、最初の増幅産物のプライマー結合部位にループ構造を生じるようにプライマーが設計される。
【００５５】
ＩＣＡＮ法は、ＲＮＡ／ＤＮＡキメラプライマー、鎖置換活性と鋳型交換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮａｓｅＨを用いて等温（約５０〜６０℃）でＤＮＡを増幅する方法である。
【００５６】
プライマーの塩基数は、通常、１９〜３０塩基、好ましくは２１〜２４塩基である。
増幅反応に使用されるプラーマーは、複数の大麦判別用プライマー、複数のホップ判別用プライマー及び複数のビール酵母判別用プライマーである。各プライマーの具体例は、以下のとおりである。
【００５７】
＜大麦判別用プライマー＞
複数の大麦判別用プライマーは、大麦ポリガラクチュロナーゼ遺伝子、大麦ホルデイン遺伝子、大麦澱粉合成酵素遺伝子、大麦プロテインＺ遺伝子、大麦αアミラーゼ遺伝子、大麦βアミラーゼ遺伝子、大麦リポキシゲナーゼ遺伝子、大麦黄斑モザイクウイルス由来遺伝子、大麦うどんこ病菌由来遺伝子、大麦トリプシンインヒビター遺伝子、大麦セルラーゼ遺伝子、及び大麦β―グルカナーゼ遺伝子、大麦βアミラーゼ遺伝子の検出用プライマーからなる群から選択される２種以上から全種、好ましくは全種、の遺伝子のプライマーである。
【００５８】
ここで、大麦ホルデイン遺伝子は、ホルデインＡ遺伝子、ホルデインＢ遺伝子、ホルデインＣ遺伝子、又はそれらの組み合わせであり、好ましくは３種の遺伝子の組み合わせである。
【００５９】
また、大麦プロテインＺ遺伝子は、プロテインＺ７、プロテインＺ４遺伝子、又はそれらの組み合わせ、好ましくは２種の遺伝子の組み合わせである。
また、大麦澱粉合成酵素遺伝子は、大麦澱粉粒結合性澱粉合成酵素遺伝子である。
【００６０】
複数の大麦判別用プライマーとして、例えば、少なくとも、大麦ポリガラクチュロナーゼ遺伝子、大麦ホルデイン遺伝子（ホルデインＡ遺伝子及びホルデインＢ遺伝子、ホルデインＣ遺伝子）、大麦澱粉合成酵素遺伝子及び大麦プロテインＺ遺伝子（プロテインＺ７遺伝子及びプロテインＺ４遺伝子）の検出用プライマーを使用するときには、後述の表２の結果から明らかなように、表に示した試験した大麦品種のすべてを識別することができる。
【００６１】
上記の遺伝子を検出するためのプラマー配列は、個々の遺伝子に特徴的な配列であれば、特に制限されない。以下に上記遺伝子を検出するためのプライマー対（正方向プライマー（Ｆ）及び逆方向プライマー（Ｒ））を例示するが、遺伝子検出用プライマーは例示の特定のプライマーに限定されないものとする。
【００６２】
大麦ポリガラクチュロナーゼ遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号１と配列番号２３の塩基配列からなり、大麦ホルデイン遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号２と配列番号２４、配列番号３と配列番号２５及び／又は配列番号４と配列番号２６の塩基配列からなり、大麦澱粉合成酵素遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号５と配列番号２７の塩基配列からなり、大麦プロテインＺ遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号６と配列番号２８、配列番号７と配列番号２９、配列番号８と配列番号３０及び／又は配列番号９と配列番号３１の塩基配列からなり、大麦αアミラーゼ遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号１０と配列番号３２の塩基配列からなり、大麦リポキシゲナーゼ遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号１１と配列番号３３の塩基配列からなり、大麦黄斑モザイクウイルス由来遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号１２と配列番号３４の塩基配列からなり、大麦うどんこ病菌由来遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号１３と配列番号３５及び／又は配列番号１４と配列番号３６の塩基配列からなり、大麦トリプシンインヒビター遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号１５と配列番号３７の塩基配列からなり、大麦セルラーゼ遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号１６と配列番号３８の塩基配列からなり、並びに大麦β―グルカナーゼ遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号１７と配列番号３９の塩基配列からなる（表１）。
【００６３】
これらの特定のプライマー配列の基になった遺伝子の配列は、米国ＮＣＢＩのＤＮＡデータバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）やＤＤＢＪ（日本ＤＮＡデータバンク）等から入手可能であり、ここでＤＤＢＪによる遺伝子と登録番号（塩基配列）との関係は以下のとおりである。
大麦ポリガラクチュロナーゼ遺伝子、ＥＦ４２７９１９
大麦ホルデインＡ遺伝子、ＡＦ４７４３７３
大麦ホルデインＢ遺伝子、Ｑ４００２０
大麦ホルデインＣ遺伝子、Ｑ４００２０
大麦澱粉合成酵素遺伝子、Ｘ０７９３１
大麦プロテインＺ７遺伝子、Ｘ９５２７７
大麦プロテインＺ４遺伝子、Ｐ０６２９３
大麦αアミラーゼ遺伝子、ＡＦ４２７７９１
大麦リポキシゲナーゼ遺伝子、Ｌ３５９３１
大麦うどんこ病菌由来遺伝子、Ｑ４３４９２
大麦トリプシンインヒビター遺伝子、Ｘ６５８７５
大麦β―グルカナーゼ遺伝子、ＥＵ２６７１８１
【００６４】
上記の遺伝子を検出するためのプライマーは、上記の特定のプライマー配列以外に、登録された塩基配列に基いて上記遺伝子（上記登録番号の塩基配列）のコード領域に由来する配列から好ましく選択されてもよく、或いは、上記遺伝子を特異的に検出可能にするならば非コード領域由来の配列から選択されてもよい。非コード領域の例として、イントロン領域、３'−非翻訳領域又は５'−非翻訳領域が挙げられる。
【００６５】
＜ホップ判別用プライマー＞
ホップ判別用プライマーは、例えばアロマに属するホップの遺伝子の検出用プライマー、ファインアロマに属するホップの遺伝子の検出用プライマー及びビターに属するホップの遺伝子の検出用プライマーから選択されうる。
【００６６】
ホップ判別用プライマー対の具体例は、配列番号１８と配列番号４０のプライマー対、配列番号１９と配列番号４１のプライマー対及び配列番号２０と配列番号４２のプライマー対から選択されるが、これらのプライマーに限定されないものとする（表１）。
【００６７】
上記例示のプライマー配列の基になるホップの遺伝子は、たとえば、日本特許第４０９７２８８号に記載されており、該特許文献では、例えば配列番号１（ＣＴＡＴＴＣＴＧＧＣＴＡＧＴＴＣＴＧＣ）、配列番号２（ＣＴＡＴＴＴＴＧＧＣＣＡＧＴＴＴＴＧＴ）、配列番号３（ＡＧＣＴＧＡＧＣＡＡＧＣＴＴＣＴＴＴＧＧ）などの番号が付与されている。したがって、上記の特定のプライマー配列以外に、登録された塩基配列に基いてプライマーを設計してＰＣＲを行い、増幅するＤＮＡのコード配列又は非コード配列からプライマー配列を選択することも可能である。
【００６８】
＜ビール酵母判別用プライマー＞
ビール酵母判別用プライマーは、例えば上面発酵酵母と下面発酵酵母とを識別可能にするプライマー及び酵母チオレドキシン遺伝子の検出用プライマーから選択されうる。
【００６９】
ビール酵母判別用プライマー対の具体例は、配列番号２１と配列番号４３の塩基配列からなるプライマー対、及び、配列番号２２と配列番号４４の塩基配列からなるプライマー対から選択されるが、これらのプライマーに限定されないものとする（表１）。
【００７０】
上記例示のプライマー配列の基になるビール酵母の遺伝子は、ＤＤＢＪやＧｅｎＢａｎｋに登録されており、例えばＡＢ３００４０９、Ｕ４０８４３などの登録番号が付与されている。したがって、上記の特定のプライマー配列以外に、登録された塩基配列に基いて該遺伝子のコード配列又は非コード配列からプライマー配列を選択することも可能である。
上記ステップ（ｂ）では、ステップ（ａ）で増幅されたＤＮＡを検出する。
【００７１】
ＤＮＡの検出は、一般に、電気泳動によって行うことができる。電気泳動は、目的のＤＮＡの検出が可能であれば、いかなる泳動条件で行ってもよい。ゲルの種類としては、一般に、ポリアクリルアミドゲル、アガロースゲルなどを使用することができる。
【００７２】
泳動条件の具体例としては、２％アガロースゲルを用い、電気泳動装置はコスモバイオ（株）製ミューピッドを使用し、直流電圧１００Ｖで３０分間泳動した。
【００７３】
上記遺伝子の増幅産物を、上記のような所定の泳動条件を用いる電気泳動にかけることによって、特定の分子量サイズの位置のバンドとして検出することができる。このとき、通常、臭化エチジウム（ＥｔＢｒ）を含有する泳動バッファーを使用して電気泳動を行ったのち、ゲルを取り出し、紫外線を照射すると、バンドが視覚化可能になる。ＥｔＢｒは、ＤＮＡの二本鎖の間に入り込む性質があるため、ＤＮＡの検出を可能にする。
【００７４】
上記ステップ（ｃ）では、ビール試料中に存在すると推定される上記の大麦、ホップ及びビール酵母由来の複数の遺伝子についての検出結果に基づいて、ビールの製造に使用された原料である大麦、ホップ及びビール酵母の種類を判別する。
【００７５】
必要であれば、増幅産物の塩基配列を決定し、目的の遺伝子の既知の塩基配列とアラインメントし、増幅産物が目的遺伝子であることを確認することができる。
【００７６】
後述の表３に、市販される２２種類のビールについて、上記のプライマー（表１）を用いてＰＣＲを行ったときの、目的遺伝子の有無（＋、−）を判定した結果を示した。これによると、試験した２２種類のすべてのビールの種類を、使用されたビール原料（大麦の品種（表２）、発酵に用いるビール酵母の種類、副原料としてのホップの種類）とともに、本発明の方法によって判別することができることを、表３の結果は示している。特に、主原料である大麦の品種（１６種類）の判別を可能にする。また、ビール原料及びビール製品を判別できることから、本発明の方法は、特に原料面からビールの製造条件を推定することを可能にする。
【００７７】
２．ビールの品質評価
本発明はまた、第二の態様において、ビール品質の評価方法を提供する。この方法は、上記の方法において大麦判別用プライマー、ホップ判別用プライマー及びビール酵母判別用プライマーを用いる核酸増幅法によって決定された、ビールの製造に使用された原料である大麦、ビール酵母及びホップの種類を判別するステップ、並びに、該判別結果を用いてビールの呈味性及び泡立ち保持性（さらに、のどごしなど）からなる品質を総合的に評価するステップを含む。
【００７８】
大麦判別用プライマーが、大麦ポリガラクチュロナーゼ遺伝子、大麦ホルデイン遺伝子、大麦澱粉合成酵素遺伝子、大麦プロテインＺ遺伝子、大麦αアミラーゼ遺伝子、大麦βアミラーゼ遺伝子、大麦リポキシゲナーゼ遺伝子、大麦黄斑モザイクウイルス由来遺伝子、大麦うどんこ病菌由来遺伝子、大麦トリプシンインヒビター遺伝子、大麦セルラーゼ遺伝子、及び大麦β―グルカナーゼ遺伝子の検出用プライマーからなる群から選択される２種以上から全種の遺伝子のプライマーであり、ホップ判別用プライマーが、アロマに属するホップの遺伝子の検出用プライマー、ファインアロマに属するホップの遺伝子の検出用プライマー及びビターに属するホップの遺伝子の検出用プライマーであり、並びに、ビール酵母判別用プライマーが、上面発酵酵母と下面発酵酵母とを識別可能にするプライマー及び酵母チオレドキシン遺伝子の検出用プライマーである。
【００７９】
具体的には、大麦ポリガラクチュロナーゼ遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号１と配列番号２３の塩基配列からなり、大麦ホルデイン遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号２と配列番号２４，配列番号３と配列番号２５及び／又は配列番号４と配列番号２６の塩基配列からなり、大麦澱粉合成酵素遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号５と配列番号２７の塩基配列からなり、大麦プロテインＺ遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号６と配列番号２８、配列番号７と配列番号２９、配列番号８と配列番号３０及び／又は配列番号９と配列番号３１の塩基配列からなり、大麦αアミラーゼ遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号１０と配列番号３２の塩基配列からなり、大麦リポキシゲナーゼ遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号１１と配列番号３３の塩基配列からなり、大麦黄斑モザイクウイルス由来遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号１２と配列番号３４の塩基配列からなり、大麦うどんこ病菌由来遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号１３と配列番号３５及び／又は配列番号１４と配列番号３６の塩基配列からなり、大麦トリプシンインヒビター遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号１５と配列番号３７の塩基配列からなり、大麦セルラーゼ遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号１６と配列番号３８の塩基配列からなり、並びに大麦β―グルカナーゼ遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号１７と配列番号３９の塩基配列からなり、ホップ判別用プライマーが、配列番号１８と配列番号４０の塩基配列からなるプライマー対、配列番号１９と配列番号４１の塩基配列からなるプライマー対、及び配列番号２０と配列番号４２の塩基配列からなるプライマー対であり、並びに、ビール酵母判別用プライマーが、配列番号２１と配列番号４３の塩基配列からなるプライマー対及び配列番号２２と配列番号４４の塩基配列からなるプライマー対である。
【００８０】
大麦の品種判別又は醸造適性判別用のプライマーが、例えば表１の配列番号１〜１７のプライマーのうちの２種類以上、好ましくは７種類以上から全種類、のプライマー、ホップの品種判別又は醸造適性判別用のプライマーが、例えば表１の配列番号１８、１９，２０のうちの２種類以上のプライマー、ビール酵母の菌種判別又はビール醸造適性判別用のプライマーが、例えば表１の配列番号２１，２２のうちの２種類のプライマーである。好ましくは、大麦、ホップ及びビール酵母の表１に記載の全てのプライマーの使用がよい。
【００８１】
ビール原料及び製品を判別するために使用した、大麦、ホップ及びビール酵母由来の複数の遺伝子の存在についての増幅ＤＮＡの有無の結果を、２２種類のビールにおける苦み、酸味、渋味、旨味、泡の保持力等の特性の程度と組み合わせてグラフ化するとき、例えば図８、９及び１１に示されるような結果が得られる。このことは、本発明の上記１に記載の方法によって得られた判別結果を用いてビールの呈味性及び泡立ち保持性（さらに、のどごしなど）からなる品質を総合的に推定・評価することができることを示している。
【００８２】
すなわち、本発明におけるビールの品質評価の具体例として、ヒトによる官能検査に加えて、人工脂質膜への呈味成分の吸着にともなう膜電位の変化を電気的に検出して味覚認識データとして評価する味覚認識装置（例えば、インテリジェントセンサーテクノロジー社製）による苦み、酸味、渋味、旨味等を目的変数とする品質評価を挙げることができる。
【００８３】
さらにまた、本発明におけるビールの品質評価の例として、ビールを容器に注いだときの泡の保持力を指標とする品質評価を挙げることができる。
【００８４】
具体的には、本発明におけるビールの品質評価の例として、味覚認識装置によるビールの呈味性やビールの泡の保持力を目的変数とし、ビールから調製した鋳型ＤＮＡによるＰＣＲによるＤＮＡ増幅の有無を２値化（たとえば増幅した場合を１、増幅しなかった場合を０とする）して説明変数とし、重回帰分析や主成分分析などの多変量解析によってビールの呈味性、泡保持力などのビールの品質を評価することを挙げることができる（図８〜図１１参照）。
【００８５】
図８は、味覚認識装置による各種ビール試料の呈味性測定結果の２次元表示を示す。縦軸の数字は苦味の度合い、横軸は酸味の度合いをそれぞれ示しており、プラス（＋）の数字が大きくなるにつれて苦味又は酸味が増加し、逆にマイナス（−）の数字が大きくなるにつれて苦味又は酸味が低下する。また、数字１〜２２は表３に記載の２２種のビールの番号を表す。各ビールについて、味覚認識装置を用いて苦味及び酸味を測定して、それぞれの値をプロットしたのが、この図である。図中、（１）はＬａｇｅｒ  ｂｅｅｒの特性範囲であり、（２）はＬｏｗ−ｍａｌｔ  ｂｅｅｒの特性範囲であり、（３）はＡｌｅ  ｂｅｅｒの特性範囲であり、（４）はｄｒａｆｔ  ｂｅｅｒの特性範囲である。図８から、（１）、（２）、（３）および（４）のビールは、従来から言われているように、それぞれ酸味及び苦みにおいて特徴的な味を呈することが判る。
【００８６】
図９は、味覚認識装置による呈味性（酸味。苦味及び渋み）とＰＣＲ結果（表３の増幅結果（すなわち、＋または−））との関係を示す。３つのグラフについて、縦軸は酸味、苦味又は渋みの実測値（味覚認識装置による測定値）の度合いを示し、横軸は、酸味、苦味又は渋みの推定値の度合いを示す。プラス（＋）の数字が大きくなるにつれて酸味、苦味又は渋みが増加し、逆にマイナス（−）の数字が大きくなるにつれて酸味、苦味又は渋みが低下する。また、数字１〜２２は表３に記載の２２種のビールの番号を表す。Ｒ２は決定係数を表す。これらのグラフでの推定値は、表３のＰＣＲプライマーによる増幅結果（＋又は−）を下記の推定式に代入して算出された値である。
【００８７】
酸味の推定式は、０．５４（６）＋９．２２（７）＋３．１９（２１）＋０．６１（１５）−４．８４（９）−４．４６（１８）−３．５３（２２）−０．４９（８）−０．１１（２０）−０．５８（１９）−１．９８（１（又は１ａ若しくは１Ｆ））−０．５５（１０）−０．１７（１１）−２．６８（１７）−２．０５である。ここで、括弧内の数字は、表１のＤＮＡ  ｍａｒｋｅｒの番号又はプライマーの番号であり、ＤＮＡが増幅した場合を１、増幅しない場合を０とし、表３のＰＣＲ増幅結果がプラス（＋）の場合「１」が括弧内に代入され、マイナス（−）の場合「０」が括弧内に代入される。
【００８８】
苦味の推定式は、２．６１（１８）＋１．５９（２２）＋０．４５（２０）＋１．９１（１（又は１ａ若しくは１Ｆ））＋０．０５（１５）＋３．７２（１７）−１．４１（６）−１．８３（７）−０．３６（９）−１．８５（２１）−０．６７（８）−２．７８（１９）−２．１２（１０）−１．４７（１１）＋０．１０である。ここで、括弧内の数字は、表１のＤＮＡ  ｍａｒｋｅｒの番号又はプライマーの番号であり、ＤＮＡが増幅した場合を１、増幅しない場合を０とし、表３のＰＣＲ増幅結果がプラス（＋）の場合「１」が括弧内に代入され、マイナス（−）の場合「０」が括弧内に代入される。
【００８９】
渋みの推定式は、０．０６（９）＋０．９１（１８）＋０．４１（２２）＋０．１３（８）＋０．０６（２０）＋０．５２（１（又は１ａ若しくは１Ｆ））＋０．１３（１５）＋０．９３（１７）−０．３７（６）−０．３９（７）−０．３５（２１）−０．７８（１９）−０．０６（１０）−０．１６（１１）−０．８２である。ここで、括弧内の数字は、表１のＤＮＡ  ｍａｒｋｅｒの番号又はプライマーの番号であり、ＤＮＡが増幅した場合を１、増幅しない場合を０とし、表３のＰＣＲ増幅結果がプラス（＋）の場合「１」が括弧内に代入され、マイナス（−）の場合「０」が括弧内に代入される。
【００９０】
図９から、本発明による方法でビール試料から調製したＤＮＡを鋳型とし、本発明で示す各種のプライマーを用いるＰＣＲの結果に基づく重回帰分析によって、各種のビール試料の酸味、苦みあるいは渋みを推定することが可能であることが判る。
【００９１】
図１１は、ビールの泡立ち保持性のＰＣＲ法による推定を示すグラフである。縦軸は実測値であり、横軸は下記の推定式から算出された推定値である。Ｒ２は決定係数を表す。グラフ中の数字は、表３に示す２２種のビールの番号を表す。泡の安定性の推定式は、１４０．６５（７）＋６８．１８（１１）＋２６．２６（９）＋１２．８４（２１）＋１１．２２（２２）＋１１．００（８）＋１．３７（１５）−１．９８（６）−７．３１（１８）−２２．７５（２０）−２０．９５（１９）−１３．７０（１（又は１ａ若しくは１Ｆ））−８．８１（１０）−４０．３６（１７）＋１２２．３６であり、ここで、括弧内の数字は、表１におけるＤＮＡ  ｍａｒｋｅｒの番号又はプライマー番号を表し、ＤＮＡが増幅した場合を１、増幅しない場合を０とし、表３のＰＣＲ増幅結果がプラス（＋）の場合「１」が括弧内に代入され、マイナス（−）の場合「０」が括弧内に代入される。
【００９２】
図１１から、各種のビール試料から本発明の方法で調製したＤＮＡを鋳型とする本発明で示したプライマーを用いるＰＣＲ結果に基づく重回帰分析によって、ビールの気泡安定性を推定することが可能であることが判る。
【００９３】
これまで、大麦のプロテインＺ（ｓｅｒｐｉｎ）は、ビールの気泡性に影響すると報告されているし（Ｔ．  Ｉｉｍｕｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２０１１，  １２２：１９９−２１０）、また、リポキシゲナーゼは、脂質酸化に関係しビール風味の劣化に関係すると言われている。一方、本発明の方法によれば、大麦、ビール酵母及びホップの多数の遺伝子を対象としているため、総合的にビールの品質を評価することができる。
【００９４】
３．キット
本発明はまた、第三の態様において、上記１（ビール原料、製造条件又は製品の判別）及び上記２（ビールの品質の評価）に記載の方法で使用するための、大麦判別用プライマー、ホップ判別用プライマー及びビール酵母判別用プライマーを含むキットであって、大麦判別用プライマーが、大麦ポリガラクチュロナーゼ遺伝子、大麦ホルデイン遺伝子、大麦澱粉合成酵素遺伝子、大麦プロテインＺ遺伝子、大麦αアミラーゼ遺伝子、大麦βアミラーゼ遺伝子、大麦リポキシゲナーゼ遺伝子、大麦黄斑モザイクウイルス由来遺伝子、大麦うどんこ病菌由来遺伝子、大麦トリプシンインヒビター遺伝子、大麦セルラーゼ遺伝子、及び大麦β―グルカナーゼ遺伝子の検出用プライマーからなる群から選択される２種以上から全種の遺伝子のプライマーであり、ホップ判別用プライマーが、アロマに属するホップの遺伝子の検出用プライマー、ファインアロマに属するホップの遺伝子の検出用プライマー及びビターに属するホップの遺伝子の検出用プライマーであり、並びに、ビール酵母判別用プライマーが、上面発酵酵母と下面発酵酵母とを識別可能にするプライマー及び酵母チオレドキシン遺伝子の検出用プライマーである、キットを提供する。
【００９５】
大麦判別用プライマーは、大麦ポリガラクチュロナーゼ遺伝子、大麦ホルデイン遺伝子、大麦澱粉合成酵素遺伝子及び大麦プロテインＺ遺伝子の検出用プライマーを少なくとも含むことが好ましい。
【００９６】
上記プライマーは、具体的に、大麦ポリガラクチュロナーゼ遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号１と配列番号２３であり、大麦ホルデイン遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号２と配列番号２４，配列番号３と配列番号２５及び／又は配列番号４と配列番号２６であり、大麦澱粉合成酵素遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号５と配列番号２７であり、大麦プロテインＺ遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号６と配列番号２８、配列番号７と配列番号２９、配列番号８と配列番号３０及び／又は配列番号９と配列番号３１であり、大麦αアミラーゼ遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号１０と配列番号３２であり、大麦リポキシゲナーゼ遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号１１と配列番号３３であり、大麦黄斑モザイクウイルス由来遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号１２と配列番号３４であり、大麦うどんこ病菌由来遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号１３と配列番号３５及び／又は配列番号１４と配列番号３６であり、大麦トリプシンインヒビター遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号１５と配列番号３７であり、大麦セルラーゼ遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号１６と配列番号３８であり、並びに大麦β―グルカナーゼ遺伝子の検出用プライマー対が、配列番号１７と配列番号３９であり、ホップ判別用プライマーが、アロマに属するホップの遺伝子の検出用プライマー、ファインアロマに属するホップの遺伝子の検出用プライマー及びビターに属するホップの遺伝子の検出用プライマーであり、並びに、ビール酵母判別用プライマーが、配列番号２１と配列番号４３のプライマー対及び配列番号２２と配列番号４４のプライマー対である。
【００９７】
プライマーは、一般に１９〜３０塩基長、好ましくは２１〜２４塩基長からなり、例えばホスホロアミダイト法を利用した自動核酸合成機を使用して合成することができる。
【００９８】
キットには、上記プライマーを個々に又は適宜組み合わせて包装した形態で含み、その他に、必要に応じて、ビール試料からのＤＮＡ精製試薬（例えば、ＴＥなどの抽出用バッファー、フェノール、クロロホルム、イソアミルアルコール、エタノール、（イソ）プロパノールなどの抽出・沈殿用溶媒、磁性ビーズなどのＤＮＡ吸着性固相担体、溶出用バッファーなど）、ＰＣＲなどの核酸増幅用試薬（バッファー、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰｓ（Ｎ＝Ａ，Ｔ，Ｃ，Ｇ）など）、電気泳動用試薬（ゲル調製用試薬、泳動バッファー、臭化エチジウムなどの検出用試薬など）を適宜含むことができる。
【実施例】
【００９９】
以下に本発明の実施態様を実施例によって説明するが、本発明は、これらの実施例のみに限定されるものではない。
【０１００】
［実施例１］
＜ビールからのＰＣＲ用鋳型ＤＮＡの調製方法の優位性＞
従来のＰＣＲ用鋳型ＤＮＡの調製方法、すなわち、（１）ＣＴＡＢ法、（２）アルカリフェノール法、（３）ＩＳＯＰＬＡＮＴキット法、（４）キアゲンキット法、（５）タカラキット法、（６）日本特許第４９５３０５８号に記載の方法と比較して、本発明の鋳型ＤＮＡ調製方法である「酵素法・ビーズ法複合法」は、高分子量の鋳型ＤＮＡを調製することが可能であり、図１に示すように、糸くず状に析出した。しかもＤＮＡ精製度が高く、ビール中に極微量しか残存しない原料大麦、発酵微生物である酵母、副原料であるホップのＤＮＡをＰＣＲによって増幅し、判別することが可能であった。
【０１０１】
具体的な鋳型ＤＮＡ調製方法は以下のとおりである。各種の試料ビールを凍結乾燥した粉末をＤＮＡ溶解用緩衝液に溶解し、耐熱性アミラーゼ及びタンパク質分解酵素を作用させて澱粉、澱粉分解物及びタンパク質を分解した後、遠心分離を行い、上清部分に存在するＤＮＡをフェノール処理及びクロロホルム／イソアミルアルコール混合溶媒（２５：１）処理によって精製した後にアルコール（エタノール）沈殿させ、次いで氷水で冷却しながら７０％エタノールによって溶解するＤＮＡを再度アルコール沈殿させた後にＴＥに溶解し、磁性ビーズにＤＮＡを吸着させ、当該ビーズをマグネットによって溶液部分から分離した後、当該ビーズを塩を含む緩衝液で洗浄し、次いでＤＮＡ溶出液で該ガラスビーズ又は該磁性ビーズからＤＮＡを脱着させて鋳型ＤＮＡとし、大麦判別用プライマー（スターチシンターゼ、表１の配列番号５）共存下でＰＣＲを行った結果を図２及び図３に示す。
【０１０２】
【表１】
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【０１０３】
鋳型ＤＮＡの抽出精製方法の従来法との比較の例として、図２に、市販のＤＮＡ抽出キットであるＩＳＯＰＬＡＮＴ  Ｉ、ＩＳＯＰＬＡＮＴ  ＩＩ（以上、ニッポンジーン製）及びＤＮＥＡＳＹ（キアゲン製）によってビールから抽出した鋳型ＤＮＡと本発明の方法によってビールから抽出精製した鋳型ＤＮＡを用い、スターチシンターゼのプライマーを用いてＰＣＲを行った結果を示す。市販のＤＮＡ抽出キットを用いて調製した鋳型ＤＮＡの場合は増幅ＤＮＡが出現しないのに対し、本発明の方法で抽出精製した鋳型ＤＮＡの場合は、大麦から直接抽出精製した鋳型ＤＮＡの場合と同様に増幅ＤＮＡ（図２の矢印）が出現した。
【０１０４】
［実施例２］
＜各種の大麦タンパク質ｓｅｒｐｉｎのＤＮＡの検出＞
各種の大麦（下記表３に示す１６種の大麦品種）から調製したＤＮＡを鋳型とし、大麦判別用プライマーとして、大麦の主要タンパク質であるｓｅｒｐｉｎ遺伝子由来のプライマー（表１の配列番号６，７，８，９）共存下でＰＣＲを行った。その結果、図３に示すように、大部分の大麦にｓｅｒｐｉｎの増幅バンドが検出された。このアガロースゲルから大麦ｓｅｒｐｉｎ遺伝子に相当するＤＮＡバンドを切り出してクローニングし、塩基配列を調べた結果、図５に示すとおり、大麦ｓｅｒｐｉｎの塩基配列と一致した。
【０１０５】
［実施例３］
＜ビール中の大麦各種ＤＮＡの検出＞
実施例１と同様にして試料ビールから調製したＤＮＡを鋳型とし、ビール品質に影響する成分として、大麦のリポキシゲナーゼ遺伝子（表１の配列番号１１）、β―グルカナーゼ遺伝子（配列番号１７）、ホルデインＡ（配列番号２）及びホルデインＣ（配列番号４）由来のプライマー共存下でＰＣＲを行った。その結果、図４に示すように、数種類のビールにそれぞれの遺伝子の増幅バンドが検出された。
【０１０６】
同様にして、表２に示すように、１８種類のＤＮＡマーカーを用いることにより、１６種類の大麦のすべてを互いに識別することが可能になった。ここで、表２のプライマー１ａ及び１ｂはそれぞれ、表１の配列番号１、２３の配列からなる。
【０１０７】
【表２】
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【０１０８】
［実施例４］
＜ビール中のホップＤＮＡの増幅＞
実施例１と同様にして試料ビールから調製したＤＮＡを鋳型とし、ホップ検出用のプライマーとして、ホップの遺伝子由来のプライマー（表１の配列番号１８，１９，２０）共存下でＰＣＲを行った。その結果、表３及び図６に示すように、数種類のビールにホップの増幅バンドが検出された。
【０１０９】
【表３】
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【０１１０】
［実施例５］
＜ビール中のビール酵母のＤＮＡの増幅＞
実施例１と同様にして試料ビールから調製したＤＮＡを鋳型とし、ビール酵母の判別用プライマーとして、ビール酵母遺伝子由来のプライマー（表１の配列番号２１及び２２）共存下でＰＣＲを行った。その結果、表３に示すように、数種類のビールに酵母遺伝子由来の増幅ＤＮＡバンドが検出され、図７に示すように、ビールから抽出精製したＤＮＡを鋳型とし、酵母遺伝子チオレドキシン関連プライマー共存下のＰＣＲによって増幅したＤＮＡの塩基配列が、酵母チオレドキシンの塩基配列の文献記載配列と一致した。
【０１１１】
［実施例６］
＜世界の各種ビールの判別例＞
市販の外国産ビール、チェコ産バドヴァー、米国産ブルックリンラガー、ベルギー産ステラアルトワ、タヒチ産ヒナノ、オランダ産クローシュ、タイ産シンハー、デンマーク産カールスバーグ、英国産フラーズロンドンプライド、ドイツ産ポーラナー・ｈフェ・ヴァイス、オーストラリア産ＶＢビクトリアビター、メキシコ産ソル、米国産プリモ、ドイツ産エルディンガーヴァイスビア、英国産ダッチオリジナルオーガニックオールドルビーエール、ペルー産クリスタル、並びに、国内産サッポロビール２種、サントリービール１種及びキリンビール１種を用いた。各ビールは、図４及び表３に示すように、大麦の種類、酵母の種類、大麦の酵素、ホップの種類等で特徴的な結果を示し、供試した２２種類のビールすべてを識別することが可能であった。
【０１１２】
［実施例７］
＜味覚認識装置による呈味性評価と表３のＰＣＲ結果による呈味性の推定＞
表３に示す２２種類のビールを試料とし、インテリジェントセンサーテクノロジー社の味覚認識装置ＳＡ２０２を用いて呈味性（苦み、酸味、渋み）の評価を行った。一例として、味覚認識装置よる評価結果を酸味と苦味について２次元表示したものを図８に示す。また、味覚認識装置によって測定した酸味、苦み、渋みのそれぞれの呈味性評価結果を目的変数とし、表３に示すＰＣＲ結果を説明変数とする重回帰分析（酸味、苦み、渋みの
各推定式（重回帰式）（上記）を使用した。）を行った結果を図９に示す。酸味に対して決定係数が０．７５、苦みに対する決定係数が０．６８、渋みに対する決定係数が０．７６とそれぞれ高い値を示し、ビールから抽出精製した鋳型ＤＮＡによるＰＣＲ結果の多変量解析によって、ビールの苦み、酸味、渋みなどの呈味性を推定できることが示された。
【０１１３】
［実施例８］
＜ビールの泡立ち保持性試験とＰＣＲ結果による推定＞
表３に示す２２種類のビールを試料とし、図１０に示す方法でビールの泡立ち性を定量的に評価した。すなわち、室温２５℃でビール温度を一定にし、上部のビーカーに一定量（２５０ｍＬ）のビールを入れ、サイフォンによって一定圧力差で下部のメスシリンダーに１００ｍＬのビールを注ぎ、一定時間後の気泡の体積を測定して試料ビールの泡立ち保持性とした。
【０１１４】
このビール泡立ち性を目的変数とし、表３のＰＣＲ結果を説明変数として重回帰分析（泡の安定性の推定式（重回帰式）（上記）を使用した。）を行い、図１１に示す散布図を得た。この重回帰分析の決定係数は０．８７であり、ビールから抽出精製したＤＮＡ鋳型とするＰＣＲ結果を重回帰分析することによって、当該ビールの泡立ち保持性を推定することが可能になった。
【０１１５】
［実施例９］
＜ビールの官能検査結果とＰＣＲによる品質推定との関係＞
表３に示す各種のビールを試料として、８名の専門研究者が官能検査を行った総合評価結果を目的変数とし、表３に示すＰＣＲ結果との関係について上記と同様に重回帰分析を行った結果、決定係数０．８２が得られた。この結果、本発明におけるＰＣＲ法によるビールの品質推定は、官能検査結果についても適用が可能であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【０１１６】
本発明は、ビールを試料として、ＰＣＲ用の高純度の鋳型ＤＮＡを高効率に調製するものであり、大麦、酵母、ホップのそれぞれを判別することによって、当該ビールの品質を総合的に推定するという技術であり、ビール醸造業界や検査機関、あるいは大麦、酵母、ホップの育成・生産・販売業界にとって利用価値の高い技術である。
【配列表フリーテキスト】
【０１１７】
配列番号１〜４６：プライマー
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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