(57)【要約】【課題】新規ながん転移マーカーの提供。【解決手段】被検者より採取した生体試料中の、（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるペプチド；（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、連続する２０個以上のアミノ酸の配列からなるペプチド；および（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１〜３個のアミノ酸が付加、欠失又は置換されているペプチドからなる群より選択されるがん転移の判定のためのバイオマーカーとなりうるペプチドの量を測定することを含む、該被検者におけるがん転移の判定方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検者より採取した生体試料中の、
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるペプチド；
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、連続する２０個以上のアミノ酸の配列からなるペプチド；および
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１〜５個のアミノ酸が付加、欠失又は置換されているペプチド；
からなる群より選択されるがん転移の判定のためのバイオマーカーとなりうるペプチドの量を測定することを含む、該被検者におけるがん転移の判定方法。
【請求項２】
前記ペプチドの量が、ある閾値以上である場合に、がん転移陽性であると判定する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記閾値は健常者の測定値に基づいて決定されるカットオフ値である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ペプチドの量を測定することは、前記ペプチドを特異的に認識する抗体を用いて前記ペプチドの量を測定することからなる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるペプチド；
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、連続する２０個以上のアミノ酸の配列からなるペプチド；および
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１〜５個のアミノ酸が付加、欠失又は置換されているペプチド；
からなる群より選択されるペプチドを含むがん転移の判定のためのバイオマーカー。
【請求項６】
配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるペプチドを含む、がん転移の判定のためのバイオマーカー。
【請求項７】
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるペプチド；
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、連続する２０個以上のアミノ酸の配列からなるペプチド；および
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１〜５個のアミノ酸が付加、欠失又は置換されているペプチド；
からなる群より選択されるペプチドからなるがん転移の判定のためのバイオマーカー。
【請求項８】
配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるペプチドからなるがん転移の判定のためのバイオマーカー。
【請求項９】
がん転移の判定方法であって、
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるペプチド；
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、連続する２０個以上のアミノ酸の配列からなるペプチド；および
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１〜５個のアミノ酸が付加、欠失又は置換されているペプチド；
からなる群より選択されるがん転移の判定のためのバイオマーカーとなりうるペプチドを特異的に認識する抗体を用いた方法。
【請求項１０】
抗体を含むがん転移診断剤であって、当該抗体が、
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるペプチド；
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、連続する２０個以上のアミノ酸の配列からなるペプチド；および
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１〜５個のアミノ酸が付加、欠失又は置換されているペプチド；
からなる群より選択されるがん転移の判定のためのバイオマーカーとなりうるペプチドを特異的に認識する抗体である、がん転移診断剤。
【請求項１１】
抗体を含むがん転移診断キットであって、当該抗体が、
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるペプチド；
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、連続する２０個以上のアミノ酸の配列からなるペプチド；および
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１〜５個のアミノ酸が付加、欠失又は置換されているペプチド；
からなる群より選択されるがん転移の判定のためのバイオマーカーとなりうるペプチドを特異的に認識する抗体である、がん転移診断キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規のがん転移マーカー、並びにそれを利用したがん転移の判定方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
がんは世界の主な死因の一つであり、これまでのがん撲滅戦略は、早期発見と治療薬の開発に焦点が当てられてきた。がんの臨床進行度別の5年相対生存率をみると、臨床病期が「限局」の生存率は、胃、結腸、直腸、乳房、子宮、前立腺では96-99.7%に分布した。所属リンパ節や隣接臓器に転移がある「領域」の生存率は、胃、結腸、直腸、子宮、前立腺では43-87%に低下し、さらにがんが進展した「遠隔」の生存率は、乳房、子宮、前立腺、甲状腺を除けばいずれも11%以下ときわめて不良である（非特許文献１）。
【０００３】
がんは、原発巣に限局する限り、治療効果も高く患者の生活機能が保たれ、人間らしい生活（QOL; Qaulity of Life）を続けられる。しかしがんが進行し現在のCT撮影等の画像診断で転移巣を確認できるステージまで達すると、もはやがんを押し止める治療法はなく、極めて短期間にQOLが低下し死に至る。現在の画像診断によるがん転移の判定は、がんが１cm位の大きさになって初めて転移ありと判定でき、たとえコンピュータ断層撮影（CT）や核磁気共鳴画像（MRI）の条件が良くて１mm以下のものが見つかっても、それががんであるかどうかを決めるには経過観察が必要になり、そのうちにがんが大きくなり、手遅れになるという問題を抱えている。従って、がん患者のQOLを長く良好に維持するために、転移を早期に発見し、治療対策に生かす必要がある。
【０００４】
一方、ヒトの血清中には何十万ものタンパク質の分解産物であるペプチドが含まれている。健常者はホメオスタシスのバランスが取れているためこれらのペプチドは一定であるが、プロテアーゼとプロテアーゼ阻害剤のバランスが病態において破綻した際に、生体内に親タンパク質に由来する多様なペプチド断片が存在することになり、このペプチドの一斉解析（ペプチドーム解析）により該病態の診断が可能となると考えられている。本願発明者らは、ペプチドーム解析により、BLOTCHIP（登録商標）-MS法（非特許文献２，３）により、クロウ・フカセ症候群（ＣＦＳ）のＤＩＣ（播種性血管内凝固症候群）患者の血清を分析したところ、クロウ・フカセ症候群（ＣＦＳ）のＤＩＣ（播種性血管内凝固症候群）患者に特徴的に現れる分子マーカーEDP-24を同定した（非特許文献４、特にFig.1）。α-1-アンチトリプシン（A1AT）は細胞や臓器に障害を与えるタンパク質分解酵素の攻撃から生体を防御する役割を担う血清中の代表的なプロテアーゼインヒビターであり（非特許文献５）、EDP-24はA1ATの１〜２４番目のアミノ酸であるEDPQGDAAQKTDTSHHDQDHPTFNからなるA1ATのペプチド断片である。
しかしながら、EDP-24とがん転移との関連については何ら報告されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】公益財団法人がん研究振興財団：がんの統計’11, p19, 2011
【非特許文献２】Tanaka K.ら、Biochem. Biophys. Res. Commun. 379, 110-114. (2009)
【非特許文献３】Araki Y.ら、Proteomics 11 (13), 2727-2737, (2011)
【非特許文献４】Hashiguchi T.ら、Medical Hypotheses 73, 760-763. (2009)
【非特許文献５】Edwin K.ら、N. Engl. J. Med. 360(26), 2749-57, 2009
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、本発明の目的は、がん転移の新規な診断マーカー、並びにそれを利用したがん転移の有効な診断、判定または検出方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記の目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、EDP-24が、がん種を問わずがん転移の判定の有効な診断マーカーであることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は以下の通りである。
［１］被検者より採取した生体試料中の、
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるペプチド；
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、連続する２０個以上のアミノ酸の配列からなるペプチド；および
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１〜５個のアミノ酸が付加、欠失又は置換されているペプチド；
からなる群より選択されるがん転移の判定のためのバイオマーカーとなりうるペプチドの量を測定することを含む、該被検者におけるがん転移の判定方法。
[２] 前記ペプチドの量が、ある閾値以上である場合に、がん転移陽性であると判定する［１］に記載の方法。
[３] 前記閾値は健常者の測定値に基づいて決定されるカットオフ値である、［２］に記載の方法。
［４］前記ペプチドの量を測定することは、前記ペプチドを特異的に認識する抗体を用いて前記ペプチドの量を測定することからなる［１］〜［３］のいずれか一項に記載の方法。
［５］  （ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるペプチド；
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、連続する２０個以上のアミノ酸の配列からなるペプチド；および
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１〜５個のアミノ酸が付加、欠失又は置換されているペプチド；
からなる群より選択されるペプチドを含むがん転移の判定のためのバイオマーカー。
［６］配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるペプチドを含む、がん転移の判定のためのバイオマーカー。
［７］  （ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるペプチド；
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、連続する２０個以上のアミノ酸の配列からなるペプチド；および
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１〜５個のアミノ酸が付加、欠失又は置換されているペプチド；
からなる群より選択されるペプチドからなるがん転移の判定のためのバイオマーカー。
［８］配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるペプチドからなるがん転移の判定のためのバイオマーカー。
［９］がん転移の判定方法であって、
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるペプチド；
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、連続する２０個以上のアミノ酸の配列からなるペプチド；および
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１〜５個のアミノ酸が付加、欠失又は置換されているペプチド；
からなる群より選択されるがん転移の判定のためのバイオマーカーとなりうるペプチドを特異的に認識する抗体を用いた方法。
［１０］抗体を含むがん転移診断剤であって、当該抗体が、
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるペプチド；
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、連続する２０個以上のアミノ酸の配列からなるペプチド；および
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１〜５個のアミノ酸が付加、欠失又は置換されているペプチド；
からなる群より選択されるがん転移の判定のためのバイオマーカーとなりうるペプチドを特異的に認識する抗体である、がん転移診断剤。
［１１］抗体を含むがん転移診断キットであって、当該抗体が、
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるペプチド；
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、連続する２０個以上のアミノ酸の配列からなるペプチド；および
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１〜５個のアミノ酸が付加、欠失又は置換されているペプチド；
からなる群より選択されるがん転移の判定のためのバイオマーカーとなりうるペプチドを特異的に認識する抗体である、がん転移診断キット。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、がん転移を簡便かつ的確に判定できるので、がん転移の早期発見および早期治療が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】EDP-24の濃度と吸収度との関係を示すELISA法の検量線。
【図２】食道扁平上皮癌患者の臨床病理学的因子を示す。
【図３】EDP-24濃度のカットオフ値を示すグラフ。食道癌患者群と健常者群間でWilcoxon検定を行い、統計学的有意差はなかった。
【図４】EDP-24値と臨床病理学的因子との関係を示す。
【図５】深達度とEDP-24値との関係を示すグラフ。T1,T2群、T3,T4群、および健常者群間でWilcoxon検定を行い、統計学的有意差はなかった（P=0.2803）。
【図６】リンパ節転移の有無とEDP-24値との関係を示すグラフ。食道癌患者のうちリンパ節転移が見られなかった群、食道癌患者のうちリンパ節転移が見られた群、および健常者群間でWilcoxon検定を行い、統計学的有意差はなかった（P=0.6873）。
【図７】リンパ管侵襲の有無とEDP-24値との関係を示すグラフ。食道癌患者のうちリンパ管侵襲転移陰性の群、食道癌患者のうちリンパ管侵襲陽性の群、および健常者群間でWilcoxon検定を行い、統計学的有意差はなかった（P=0.6873）。
【図８】静脈侵襲の有無とEDP-24値との関係を示すグラフ。食道癌患者のうち静脈侵襲陰性の群、食道癌患者のうち静脈侵襲陽性の群、および健常者群間でWilcoxon検定を行い、統計学的有意差はなかった（P=0.4003）。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は、新規かつ有用ながん転移の診断マーカーペプチドを提供する。
【００１２】
配列番号１は公知のα-1-アンチトリプシン（A1AT）のアミノ酸配列であり、本発明のペプチドは、このα-1-アンチトリプシン（A1AT）のアミノ酸配列の１〜２４番目のアミノ酸からなるペプチド（配列番号２）である。以下、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるペプチドをEDP-24と称する。
EDPQGDAAQKTDTSHHDQDHPTFN（配列番号２）
【００１３】
本願発明者らは、EDP-24ペプチドの血清レベルが、意外にも、食道癌を初めとする癌患者において高値であることを見出した。さらに、期せずして、EDP-24ペプチドの血清レベルが、がん転移の所見が見られる患者では、EDP-24の濃度が閾値以上である割合が高いことを見出した。
【００１４】
ここで、被験対象となる患者が、EDP-24ペプチドのアミノ酸配列内に１もしくは２以上、特には１〜３個のアミノ酸の置換、欠失、挿入もしくは付加またはそれらの組合せを含む多型もしくはアレル変異を有する場合、検出すべきペプチドのアミノ酸配列は、「配列番号２で表される各アミノ酸配列において、当該多型もしくはアレル変異を有するアミノ酸配列」と解すべきであることは、当業者にとって自明である。
【００１５】
さらに、EDP-24ペプチドが、がん転移の早期発見・早期治療のマーカーとして有用であるので、EDP-24のアミノ酸残基の一部または全部を含むペプチドも、同様にがん転移の判定のためのマーカーとなることが考えられ、かかるペプチドも本発明のペプチドに含まれる。ここでアミノ酸残基の一部とは、各ペプチドのアミノ酸残基のうち、連続する２０個以上のアミノ酸を意味し、好ましくは連続する２３個以上のアミノ酸を意味する。
【００１６】
また、本発明のペプチドには、上記のEDP-24のアミノ酸配列の一部または全部のアミノ酸配列を有するぺプチドに加えて、EDP-24のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するペプチドも含まれる。実質的に同一とは、EDP-24のアミノ酸配列と比較して、１個もしくは少数個のアミノ酸が修飾されているが、なおがん転移の診断マーカーとなり得るものを意味する。ここで修飾とは、アミノ酸が欠失、付加、もしくは他のアミノ酸により置換されているか、またはこれらの組み合わせによりアミノ配列が変更されていることを意味する。さらに修飾には、糖鎖および／または脂肪酸の付加やリン酸化も含まれる。
【００１７】
ここで、少数個とは、例えば各ペプチドにおいて全アミノ酸数に対して約２０％以下、好ましくは約１０％以下を意味する。よって、５個以下、好ましくは３個以下、より好ましくは２個以下を意味する。従って、本発明において実質的に同じアミノ酸配列には、１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１〜２個のアミノ酸が付加、欠失または置換されてもよく、なおがん転移のマーカーとなりうるアミノ酸配列が包含される。
【００１８】
本発明はまた、上記のごとき種々のアミノ酸配列を有するペプチドは、かかるペプチドを検出するための抗体の製造のための免疫原として有用である。
【００１９】
本発明はまた、がん転移が疑われる被検者由来の生体試料中の、本発明のペプチドの量を測定することによる、該被検者におけるがん転移の判定方法を提供する。ここで「がん転移が疑われる被検者」には、被検者本人が主観的に疑いを抱く者（何らかの自覚症状がある者に限らず、単に予防検診の受診を希望する者を含む）であっても、何らかの客観的な根拠に基づく者（例えば、従来公知の臨床検査（例、画像診断）および／または診察の結果、がん転移の合理的な可能性があると医師が判断した者）であってもよい。
【００２０】
本発明のペプチドの量がある閾値以上であるか否かを、がん転移の判定の指標とし得る。判定において、かかる閾値を、ペプチドの量がある閾値以上である場合に、がん転移陽性であると判定する。かかる判定のための閾値としては、通常、カットオフ値が使用される。カットオフ値は、病気の診断の分野において、その値以上であると該病気の罹患のリスクが高いと予測される判定基準値であり、カットオフ値以上は陽性、カットオフ値未満は陰性と判定される。カットオフ値を低く設定すれば感度が高く特異度が低くなり、カットオフ値を高く設定すれば感度が低く特異度が高くなる。カットオフ値は健常者の測定値に基づいて決定される。一実施形態では、カットオフ値は、健常者の測定値である基準値を、個体数ぶん測定し、そのうちの95％を含む中央部の数値を求めた基準範囲（９５％信頼区間、正規分布の場合は健常者の測定平均値±２標準偏差）の上限値である。しかしながら、カットオフ値は該基準範囲の上限値よりも高い値としてもよく、別の実施形態では、カットオフ値は、健常者のうちの最高値である。別の実施形態では、カットオフ値は上記基準範囲の上限値と健常者のうちの最高値との間の範囲の値であり、さらに別の実施形態では、判定で求められる感度と特異度が満たされる限り、基準範囲の上限値よりも低い値であってもよい。
【００２１】
「がん」には、脳腫瘍を初めとする脳および中枢神経系（ＣＮＳ）の癌ならびに腫瘍、基底細胞癌腫、甲状腺癌、口腔癌（例えば、唇、舌、口腔および咽頭癌）、肺癌、骨癌、食道癌（食道扁平上皮癌含む）、胃癌、大腸癌、肝臓癌、腎臓癌、膵臓癌、乳癌、子宮体癌、絨毛上皮腫卵巣癌、子宮頸癌、絨毛上皮腫、前立腺癌、精巣癌、胆道癌、皮膚癌、膀胱癌、白血病、黒色腫、骨髄腫、神経芽細胞腫リンパ腫、網膜芽腫、横紋筋肉腫、肉腫、ならびにその他の癌腫および肉腫が含まれる。一実施形態では、食道癌（食道扁平上皮癌含む）、胃癌、および大腸癌を含む消化器系の癌である。
「がん転移」とは、局所転移（原発巣付近への転移）、領域転移（リンパ節転移）、および遠隔転移（原発巣より離れた遠隔部位への転移）の少なくともいずれかを含み、「陽性であると判定する」とは、がん転移の臨床所見において陽性であると認められる状態に対応すること、例えばがんの深達度がT３以上に進んでいること、リンパ節転移が陽性であること、リンパ管侵襲が陽性であること、および血管侵襲が陽性であることから選択される少なくともいずれか一つに該当する状態に対応することを意味する。また、「陽性であると判定する」場合、判定は１００％の確率で陽性であることを示すわけではなく、約６０％以上の確率、好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上の確率で陽性であることを意味する。かかる本発明のペプチドを用いた診断により、がん転移の早期発見・早期治療に寄与し得る。がんの深達度、リンパ節転移の有無、リンパ管侵襲の有無、および血管侵襲の有無は、食道造影、ＣＴおよびＰＥＴ等の画像診断、内視鏡検査、ならびに免疫組織化学的方法等の当業者に周知の方法により医師により診断可能であり、通常、日本の癌取り扱い規約または国際対がん連合 (UICC)によって定められたTNM分類により分類される。
【００２２】
被験試料となる被検者由来の生体試料は特に限定されないが、被検者への侵襲が少ないものであることが好ましく、例えば、血液、血漿、血清、唾液、尿、涙液など生体から容易に採取できるものや、髄液、骨髄液、胸水、腹水、関節液、眼房水、硝子体液など比較的容易に採取されるものが挙げられる。生体試料は、一実施形態では、血液、血漿、または血清である。血清や血漿を用いる場合、常法に従って被検者から採血し、液性成分を分離することにより調製することができる。検出対象である本発明のペプチドは必要に応じて、スピンカラムなどを用いて、予め高分子量の蛋白質画分などを分離除去しておくこともできる。
【００２３】
生体試料中の、本発明のペプチドの検出は、例えば、生体試料を各種の分子量測定法、例えば、ゲル電気泳動や、各種の分離精製法（例：イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーなど）、表面プラズモン共鳴法、イオン化法（例：電子衝撃イオン化法、フィールドディソープション法、二次イオン化法、高速原子衝突法、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（MALDI）法、エレクトロスプレーイオン化法など）、および質量分析計（例：二重収束質量分析計、四重極型分析計、飛行時間型質量分析計、フーリエ変換質量分析計、イオンサイクロトロン質量分析計、免疫質量分析計、安定同位体ペプチドを内部標準にした質量分析計など）を組み合わせる方法等に供し、該ペプチドの分子量と一致するバンドもしくはスポット、あるいはピークを検出することにより行うことができるが、これらに限定されない。
【００２４】
好ましい実施態様において、質量分析に使用するプレートの表面に被験試料を接触させ、該プレート表面に捕捉された成分の質量を質量分析計で測定する場合、質量分析用プレートとして用いられる支持体は、ポリビニリデンジフロリド（PVDF）、ニトロセルロースまたはシリカゲル、特に好ましくはPVDFで薄層コーティングされた基材である（WO 2004/031759を参照）。かかる基材は、質量分析用プレートにおいて使用されているものであれば、特に限定されず、例えば、絶縁体、金属、導電性ポリマー、それらの複合体などが挙げられる。かかるPVDFで薄層コーティングされた質量分析用プレートとして、好ましくはプロトセラ社のブロットチップ（BLOTCHIP，登録商標）などが挙げられる。代わりに、質量分析用プレートは、支持体表面を塗布、噴霧、蒸着、浸漬、印刷、スパッタリング等の公知の手段でコーティングすることにより、公知の方法により調製することもできる。また、質量分析用プレート上の分子を質量分析する方法自体は公知である（例えばWO 2004/031759）。WO 2004/031759に記載の方法を、必要に応じて適宜改変して使用することができる。
【００２５】
被験試料の質量分析用プレート（支持体）への移行は、被験試料となる被検者由来の生体試料を未処理のままで、あるいは抗体カラムその他の方法で高分子タンパク質を除去、濃縮した後に、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動もしくは等電点電気泳動に付し、泳動後ゲルをプレートと接触させて転写（ブロッティング）することにより行われる。転写の方法自体は公知であり、好ましくは電気転写が用いられる。電気転写時に使用する緩衝液としては、pH 7〜9、低塩濃度の公知の緩衝液を用いることが好ましい（例えばトリス緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、酢酸緩衝液など）。
【００２６】
上記の方法により支持体表面上に捕捉された被験試料中の分子を質量分析することにより、分子量に関する情報から、標的分子である本発明のペプチドの存在および量を同定することができる。質量分析装置からの情報を、任意のプログラムを用いて、非がん転移患者もしくは健常者由来の生体試料における質量分析データと比較して、示差的な（differential）情報として出力させることも可能である。そのようなプログラムは周知であり、また、当業者は、公知の情報処理技術を用いて、容易にそのようなプログラムを構築もしくは改変することができることが理解されよう。
【００２７】
上記の質量分析による検出において、タンデム質量分析（MS/MS）法を用いてペプチドを同定することができ、かかる同定法としては、MS/MSスペクトルを解析してアミノ酸配列を決定するde novo sequencing法と、MS/MSスペクトル中に含まれる部分的な配列情報（質量タグ）を用いてデータベース検索を行い、ペプチドを同定する方法等が挙げられる。また、MS/MS法を用いることにより、直接本発明のペプチドのアミノ酸配列を同定し、該配列情報に基づいて該ペプチドの全部もしくは一部を合成し、これを以下の抗体に対する抗原（ハプテン）として利用することもできる。
【００２８】
本発明のペプチドの測定は、本発明のペプチドを特異的に認識する抗体を用いて行うこともできる。抗体を用いて、ELISA法、RIA法、イムノクロマト法、ウェスタンブロッティング、免疫質量分析法や各種イムノアッセイにより該ペプチドを検出する方法は、生体試料中のペプチドが低濃度であっても高感度に検出できる点で、好ましい。
【００２９】
よって、本発明は、本発明のペプチドを特異的に認識する抗体を用いたがん転移の判定方法、かかる抗体を含む抗体を含むがん転移診断剤、ならびにかかる抗体を含むがん転移診断キットを含む。抗体を用いた最適化されたイムノアッセイ系を構築してこれをキット化すれば、上記質量分析装置のような特殊な装置を使用することなく、高感度かつ高精度に該ペプチドを検出することができる点で、特に有用である。
【００３０】
本発明のペプチドに対する抗体は、例えば、本発明のペプチドを、これを発現する患者由来の生体試料から単離・精製し、該ペプチドを抗原として動物を免疫することにより調製することができる。あるいは、得られるペプチドの量が少量である場合は、RT-PCRによる該ペプチドをコードするcDNA断片の増幅等の周知の遺伝子工学的手法によりペプチドを大量に調製することができ、あるいはかかるcDNAを鋳型として、無細胞転写・翻訳系を用いて本発明のペプチドを取得することもできる。さらに有機合成法により大量に調製することも可能である。
【００３１】
本発明のペプチドに対する抗体（以下、「本発明の抗体」と称する場合がある）は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれであってもよく、周知の免疫学的手法により作製することができる。また、該抗体は完全抗体分子だけでなくそのフラグメントをも包含し、例えば、Fab、F(ab')2、ScFv、およびminibody等が挙げられる。
【００３２】
例えば、ポリクローナル抗体は、本発明のペプチドを抗原として、市販のアジュバント（例えば、完全または不完全フロイントアジュバント）とともに、動物の皮下あるいは腹腔内に2〜3週間おきに2〜4回程度投与し、最終免疫後に全血を採取して抗血清を精製することにより取得できる。抗原を投与する動物としては、ラット、マウス、ウサギ、ヤギ、モルモット、ハムスターなど、目的の抗体を得ることができる哺乳動物が挙げられる。
【００３３】
また、モノクローナル抗体は、細胞融合法により作成することができる。モノクローナル抗体を調製するための技法の説明は、Stites et al, Basic and Clinical Immunology. (Lang Medical Publications Los Altos. CA. 4th Edition） and references therein, 、in particular Koehler, G. & Milstein, C. Nature 256, 495-497 (1975).に見出され得る。例えば、本発明のペプチドを市販のアジュバントと共にマウスに2〜4回皮下あるいは腹腔内に投与し、最終投与後に脾臓あるいはリンパ節を採取し、白血球を採取する。この白血球と骨髄腫細胞（例えば、NS-1, P3X63Ag8など）を細胞融合して該ペプチドに対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得る。所望のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、周知のEIAまたはRIA法等を用いて抗原と特異的に結合する抗体を、培養上清中から検出することにより選択できる。モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの培養は、インビトロ、またはマウスもしくはラット、このましくはマウス腹水中等のインビボで行うことができ、抗体はそれぞれハイブリドーマの培養上清および動物の腹水から取得することができる。
【００３４】
抗体を用いる本発明の判定方法は、特に制限されるべきものではなく、被験試料中の抗原量に対応した抗体、抗原もしくは抗体−抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線（検量線）より算出する測定法であれば、いずれの測定法を用いてもよい。例えば、ELISA法、ネフロメトリー、競合法、イムノメトリック法およびサンドイッチELISA法等が好適に用いられる。測定に際し、抗体または抗原は、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、または発光物質等の標識剤と結合されてもよい。さらに、抗体あるいは抗原と標識剤との結合にビオチン-アビジン系を用いることもできる。これら個々の免疫学的測定法は、当業者の通常の技能により、本発明の定量方法に適用可能である。サンドイッチELISA法においては、不溶化した本発明の抗体に被験試料を反応させ（1次反応）、さらに標識化した別の本発明の抗体を反応させた（2次反応）後、不溶化担体上の標識剤の量（活性）を測定することにより、被験試料中の本発明のペプチド量を定量することができる。1次反応と2次反応は逆の順序に行っても、また、同時に行なってもよいし時間をずらして行なってもよい。
【００３５】
上記のいずれかの方法により測定された被検者由来試料中の本発明のペプチドのレベルが、健常者由来の対照試料中の該ペプチドレベルに比べて有意に変動し、かつ閾値以上である場合、該被検者はがん転移の可能性が高いと診断または判定することができる。
【００３６】
被験者の生体試料中の本発明のペプチドの量は、がん転移と相関付けられる。まず、医師は、相当サンプル数の既知のがん転移患者および非がん転移対照由来試料中の各ペプチドの測定値を2次元もしくは3次元座標にプロットして散布図を作成することにより、がん転移と非がん転移とがどの領域に分布するかを可視化する。次いで、被検者由来試料中の各ペプチドの測定値を該散布図上にプロットし、散布図に基づいて各ペプチドのカットオフ値を決定することにより、被検者にてがん転移が陽性であるか否かを容易に判定することができる。
【００３７】
本発明の判定方法は、患者から時系列で生体試料を採取し、各試料における本発明のペプチドの発現の経時変化を調べることにより行うこともできる。生体試料の採取間隔は特に限定されないが、患者のQOLを損なわない範囲で頻繁にサンプリングすることが望ましく、例えば、血漿もしくは血清を試料として用いる場合、約1分〜約1週間の間隔で採血を行うことが好ましい。
【００３８】
さらに、上記時系列的なサンプリングによるがん転移の判定方法は、前回サンプリングと当回サンプリングとの間に、被検者である患者に対して該疾患の治療措置が講じられた場合に、当該措置による治療効果を評価するのに用いることができる。即ち、治療の前後にサンプリングした試料について、治療後の状態が治療前の状態と比較して病態の改善が認められると判定された場合に、当該治療の効果があったと評価することができる。一方、治療後の状態が治療前の状態と比較して病態の改善が認められない、あるいはさらに悪化していると判定された場合には、当該治療の効果がなかったと評価することができる。
【００３９】
従って、本発明のペプチドは、がん転移を診断または判定するマーカーのみならず、がんの予後を予測するマーカー、ならびに治療効果判定のエンドポイントのためのマーカーともなり得る。
【００４０】
以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明がこれらに限定されないことは言うまでもない。
本明細書中に引用されているすべての特許出願および文献の開示は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれるものとする。
【実施例】
【００４１】
実施例１：抗体の作製およびELISA測定系の確立
配列番号２のEDP-24ペプチドのN末端の１０個のアミノ酸配列EDPQGDAAQK（配列番号３）と、C末端の１０個のアミノ酸配列HHDQDHPTFN（配列番号４）とを、各々KLH(keyhole limpet hemocyanin)に結合させたもの（各々2.0mg/mL, 全量3ml）を抗原ペプチドとして用い、これを日本白色ウサギ二羽に免疫した。初回感作は抗原をフロイント完全アジュバンドと共に皮下投与した。初回投与後2週間後に抗原をフロイント不完全アジュバンドと共に皮下投与した。さらに2週間後、4週間後、6週間後に同様に感作し計５回感作した。最終感作の1週間後に全採血し血清を得た。血清は0.05%アジ化ナトリウムを添加し、使用時まで冷蔵保存した。途中、初回感作の5週目と7週目に各ウサギから1.5mLの血液を採血し、抗体の力価をELISA法で確認した。
全採血で得られた血清を精製して得られたポリクローナル抗体を用いて、サンドイッチELISA測定系を常法により構築した。
【００４２】
図１は、上記ELISA測定系における、EDP-24の標準品の各種濃度と吸光度の関係を示す検量線である（y=1.31x + 0.2292, R2 = 0.9998）。EDP-24の標準品は0.1%アルブミン溶液に希釈した。このELISA測定系では、1ng/ml 以下の低濃度のEDP-24でも測定できることが確認された。
【００４３】
実施例２  被験者におけるEDP-24測定および臨床試験における知見との関連の検討
実施例１で確立したELISA測定系により、2006年9月から2007年9月までの期間に鹿児島大学病院で外科手術を受けた食道扁平上皮癌患者（26例）と健常者（10例）から血液を採取し、0.1%アルブミン溶液で希釈し、血清中のEDP-24濃度を測定した。
【００４４】
一方、食道扁平上皮癌の病理学的所見を、本願発明者である医師が組織染色し、病理組織学的判定基準（日本食道学会  食道癌取扱い規約  第１０版）により診断した。食道扁平上皮癌患者の臨床病理学的因子は図２に示した通りである。深達度のステージは以下の通りである：T1a：癌が粘膜内にとどまる病変 、T1b：癌が粘膜下層にとどまる病変 、T2：癌が固有筋層にとどまる病変、T3：癌が食道外膜に浸潤している、およびT4：癌が食道周囲臓器に浸潤している。リンパ節は無しをpN0、有りをpN1とした。
【００４５】
ELISA測定キットにより測定した血清EDP-24の濃度と、リンパ節転移の所見との関連を検討した結果、健常者の測定結果から、EDP-24濃度の最高値である1.0ng/mLをカットオフ値と設定した（図３）。食道癌患者群と健常者群間でWilcoxon検定を行い、統計学的有意差はなかった。カットオフ値1.0ng/ml以上の値を陽性とすると、食道扁平上皮癌患者の38.5%（10/26例）でEDP-24ペプチド断片陽性であった。
【００４６】
次に、食道癌患者26例と健常者10例における臨床病理学的因子を調べた（図４）。がん転移の指標となる深達度、リンパ節転移、リンパ管侵襲、および血管侵襲と、EDP-24濃度との関係を示すプロットを図５、図６、図７、および図８にさらに詳しく示す。
【００４７】
図５では、食道癌患者26例（臨床所見で深達度T1, T2が12例と深達度T3, T4が14例）のうち、EDP-24濃度がカットオフ値の1ng/mL以上である全10症例に着目すると、10症例中7症例で深達度がT3またはT4であった(深達度T3/4が70%)。よって、EDP-24濃度が閾値以上の範囲にあることと、深達度のステージの進行度とには相関が認められた。
【００４８】
図６では、食道癌患者26例（臨床所見でリンパ節に転移が見られなかった8例とリンパ節に転移が見られた18例）のうち、EDP-24濃度がカットオフ値の1ng/mL以上である全10症例に着目すると、10症例中8症例にリンパ節転移が認められた（有病正診率80%）。よって、EDP-24濃度が閾値以上の範囲にあることと、リンパ節転移の存在とには相関が認められた。
【００４９】
図７では、食道癌患者26例（臨床所見でリンパ管侵襲陰性8例とリンパ管侵襲陽性18例）のうち、EDP-24濃度がカットオフ値の1ng/mL以上である全10症例に着目すると、10症例中8症例にリンパ節転移が認められた（有病正診率80%）。よって、EDP-24濃度が閾値以上の範囲にあることと、リンパ管侵襲の存在とには相関が認められた。
【００５０】
図８では、食道癌患者26例（臨床所見で静脈侵襲陰性9例と静脈侵襲陽性17例）のうち、EDP-24濃度がカットオフ値の1ng/mL以上である全10症例に着目すると、10症例中6症例にリンパ節転移が認められた（有病正診率60%）。よって、EDP-24濃度が閾値以上の範囲にあることと、静脈侵襲の存在とには相関が認められた。
【００５１】
以上より、EDP-24値が1以上の症例では、深達度が深く、また、リンパ節転移・脈管侵襲陽性の頻度が高いことが分かった。
【００５２】
上記試験によれば、放射線被爆の恐れがある画像診断によらずとも、少量の血液から安全かつ確実にがん転移を判定できることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００５３】
本発明の新規ながん転移診断マーカーを利用したがん転移の判定方法は、がん転移を簡便且つ的確に判断できるので、がん転移の早期発見および早期治療が可能となる点で有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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