(57)【要約】      （修正有）【課題】被験者が固形癌を有するか又はそれを発生する危険性があるかを、固形癌における特定のｍｉＲの発現レベルから測定する方法の提供。【解決手段】少なくとも１種のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）遺伝子産物のレベルは、周知の技法（例えば、定量的又は半定量的ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロット分析、溶液ハイブリダイゼーション検出）を使用して測定することができる。特定の態様において、少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物のレベルは、被験者から得た試験試料からＲＮＡを逆転写することにより１揃いの標的オリゴデオキシヌクレオチドを提供し、その標的オリゴデオキシヌクレオチドを１種又は２種以上のｍｉＲＮＡ特異的プローブオリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせて、試験試料についてのハイブリダイゼーションプロファイルを提供し、その試験試料のハイブリダイゼーションプロファイルと対照試料のハイブリダイゼーションプロファイルとを比較する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者が固形癌を有するか又はそれを発生する危険性があるかどうかを診断する方法であって、被験者からの試験試料中の少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物のレベルを測定することを含み、対照試料中の対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルと比較した試験試料中の少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物のレベルの変化が、被験者は固形癌を有するか又はそれを発生する危険性があるかのいずれかであることを示す方法。
【請求項２】
前記の少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物が、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−１７−５ｐ及びそれらの組合せからなる群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記の少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物が、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−２９ｂ−２、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−１２８ｂ、ｍｉＲ−１９９ａ−１、ｍｉＲ−２４−１、ｍｉＲ−２４−２、ｍｉＲ−１４６、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１８１ｂ−１、ｍｉＲ−２０ａ、ｍｉＲ−１０７、ｍｉＲ−３２、ｍｉＲ−９２−２、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−３０ｃ、ｍｉＲ−２５、ｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−１０６ａ及びそれらの組合せからなる群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記固形癌が、前立腺癌、胃癌、膵癌、肺癌、乳癌及び大腸癌からなる群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記固形癌は乳癌又は肺癌であり、且つ前記の少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−２１３及びそれらの組合せからなる群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記固形癌は、大腸癌、胃癌、前立腺癌又は膵癌であり、且つ前記の少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物はｍｉＲ−２１８−２である請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記固形癌は乳癌であり、且つ前記の少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物がｍｉＲ−１２５ｂ−１、ｍｉＲ−１２５ｂ−２、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−２１及びそれらの組合せからなる群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記固形癌が膵癌であり、且つ前記の少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物がｍｉＲ−１０３−１、ｍｉＲ−１０３−２、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−２０４及びそれらの組合せからなる群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記固形癌及び前記の少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物が、
（ｉ）前記固形癌が乳癌であり、且つ前記のｍｉＲ遺伝子産物が、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２９ｂ−２、ｍｉＲ−１４６、ｍｉＲ−１２５ｂ−２、ｍｉＲ−１２５ｂ−１、ｍｉＲ−１０ｂ、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１８１ａ、ｍｉＲ−１４０、ｍｉＲ−２１３、ｍｉＲ−２９ａ  ｐｒｅｃ、ｍｉＲ−１８１ｂ−１、ｍｉＲ−１９９ｂ、ｍｉＲ−２９ｂ−１、ｍｉＲ−１３０ａ、ｍｉＲ−１５５、ｌｅｔ−７ａ−２、ｍｉＲ−２０５、ｍｉＲ−２９ｃ、ｍｉＲ−２２４、ｍｉＲ−１００、ｍｉＲ−３１、ｍｉＲ−３Ｏｃ、ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−１２２ａ、ｍｉＲ−１６−２及びそれらの組合せからなる群から選択される組合せ；
（ｉｉ）前記固形癌は大腸癌であり、且つ前記のｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ−２４−１、ｍｉＲ−２９ｂ−２、ｍｉＲ−２Ｏａ、ｍｉＲ−１０ａ、ｍｉＲ−３２、ｍｉＲ−２０３、ｍｉＲ−１０６ａ、ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｃ、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−１２６＊、ｍｉＲ−１２８ｂ、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２４−２、ｍｉＲ−９９ｂ  ｐｒｅｃ、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−２１３、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１０７、ｍｉＲ−
１９１、ｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−９−３及びそれらの組合せからなる群から選択される組合せ；
（ｉｉｉ）前記固形癌は肺癌であり、且つ前記のｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２０５、ｍｉＲ−２００ｂ、ｍｉＲ−９−１、ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−１４８、ｍｉＲ−１４１、ｍｉＲ−１３２、ｍｉＲ−２１５、ｍｉＲ−１２８ｂ、ｌｅｔ−７ｇ、ｍｉＲ−１６−２、ｍｉＲ−１２９−１／２ｐｒｅｃ、ｍｉＲ−１２６＊、ｍｉＲ−１４２−ａｓ、ｍｉＲ−３０ｄ、ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−７−２、ｍｉＲ−１９９ａ−１、ｍｉＲ−１２７、ｍｉＲ−３４ａ  ｐｒｅｃ、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−１３６、ｍｉＲ−２０２、ｍｉＲ−１９６−２、ｍｉＲ−１９９ａ−２、ｌｅｔ−７ａ−２、ｍｉＲ−１２４ａ−１、ｍｉＲ−１４９、ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｍｉＲ−１９６−１ｐｒｅｃ、ｍｉＲ−１０ａ、ｍｉＲ−９９ｂ  ｐｒｅｃ、ｍｉＲ−１９６−１、ｍｉＲ−１９９ｂ、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−１９５、ｍｉＲ−１５５及びそれらの組合せからなる群から選択される組合せ；
（ｉｖ）前記固形癌は膵癌であり、且つ前記のｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ−１０３−２、ｍｉＲ−１０３−１、ｍｉＲ−２４−２、ｍｉＲ−１０７、ｍｉＲ−１００、ｍｉＲ−１２５ｂ−２、ｍｉＲ−１２５ｂ−１、ｍｉＲ−２４−１、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−２３ａ、ｍｉＲ−２６ａ−１、ｍｉＲ−１２５ａ、ｍｉＲ−１３０ａ、ｍｉＲ−２６ｂ、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−１２６＊、ｍｉＲ−１６−２、ｍｉＲ−１４６、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−９９ｂ、ｍｉＲ−１２８ｂ、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−２９ｂ−２、ｍｉＲ−２９ａ、ｍｉＲ−２５、ｍｉＲ−１６−１、ｍｉＲ−９９ａ、ｍｉＲ−２２４、ｍｉＲ−３０ｄ、ｍｉＲ−９２−２、ｍｉＲ−１９９ａ−１、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−２９ｃ、ｍｉＲ−３０ｂ、ｍｉＲ−１２９−１／２、ｍｉＲ−１９７、ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｃ、ｍｉＲ−７−１、ｍｉＲ−９３−１、ｍｉＲ−１４０、ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１３２、ｍｉＲ−１８１ｂ−１、ｍｉＲ−１５２ｐｒｅｃ、ｍｉＲ−２３ｂ、ｍｉＲ−２０ａ、ｍｉＲ−２２２、ｍｉＲ−２７ａ、ｍｉＲ−９２−１、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１２９−１／２ｐｒｅｃ、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−３２、ｍｉＲ−１０６ａ、ｍｉＲ−２９ｂ−１及びそれらの組合せからなる群から選択される組合せ；
（ｖ）前記固形癌は前立腺癌であり、且つ前記のｍｉＲ遺伝子産物は、ｌｅｔ−７ｄ、ｍｉＲ−１２８ａ  ｐｒｅｃ、ｍｉＲ−１９５、ｍｉＲ−２０３、ｌｅｔ−７ａ−２ｐｒｅｃ、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−２０ａ、ｍｉＲ−２１８−２、ｍｉＲ−２９ａ、ｍｉＲ−２５、ｍｉＲ−９５、ｍｉＲ−１９７、ｍｉＲ−１３５−２、ｍｉＲ−１８７、ｍｉＲ−１９６−１、ｍｉＲ−１４８、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−２１、ｌｅｔ−７ｉ、ｍｉＲ−１９８、ｍｉＲ−１９９ａ−２、ｍｉＲ−３０ｃ、ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｍｉＲ−９２−２、ｍｉＲ−１４６、ｍｉＲ−１８１ｂ−１ｐｒｅｃ、ｍｉＲ−３２、ｍｉＲ−２０６、ｍｉＲ−１８４ｐｒｅｃ、ｍｉＲ−２９ａ  ｐｒｅｃ、ｍｉＲ−２９ｂ−２、ｍｉＲ−１４９、ｍｉＲ−１８１ｂ−１、ｍｉＲ−１９６−１ｐｒｅｃ、ｍｉＲ−９３−１、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−１６−１、ｍｉＲ−１０１−１、ｍｉＲ−１２４ａ−１、ｍｉＲ−２６ａ−１、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−２７ａ、ｍｉＲ−２４−１、ｍｉＲ−１０６ａ、ｍｉＲ−１９９ａ−１及びそれらの組合せからなる群から選択される組合せ；及び
（ｖｉ）前記固形癌は胃癌であり、且つ前記のｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２１８−２、ｍｉＲ−１０３−２、ｍｉＲ−９２−２、ｍｉＲ−２５、ｍｉＲ−１３６、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−１２５ｂ−２、ｍｉＲ−１０３−１、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−２２２、ｍｉＲ−２１２ｐｒｅｃ、ｍｉＲ−１２５ｂ−１、ｍｉＲ−１００、ｍｉＲ−１０７、ｍｉＲ−９２−１、ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１９２、ｍｉＲ−２３ａ、ｍｉＲ−２１５、ｍｉＲ−７−２、ｍｉＲ−１３８−２、ｍｉＲ−２４−１、ｍｉＲ−９９ｂ、ｍｉＲ−３３ｂ、ｍｉＲ−２４−２及びそれらの組合せからなる群から選択される組合せ；
からなる群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
被験者が固形癌を有するか又はそれを発生する危険性があるかどうかを診断する方法であって、
（１）被験者から得た試験試料からのＲＮＡを逆転写して、１揃いの標的オリゴデオキシヌクレオチドを提供するステップ；
（２）ｍｉＲＮＡ特異的プローブオリゴヌクレオチドを含むマイクロアレイに前記標的オリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせて試験試料についてのハイブリダイゼーションプロファイルを提供するステップ；
（３）試験試料のハイブリダイゼーションプロファイルと対照試料から生じさせたハイブリダイゼーションプロファイルとを比較するステップ
を含み、
少なくとも１種のｍｉＲＮＡのシグナルにおける変化が、被験者は固形癌を有するか又はそれを発生する危険性があるかのいずれかであることを示している方法。
【請求項１１】
少なくとも１種のｍｉＲＮＡのシグナルが、対照試料からのシグナルと比較して、減少する請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
少なくとも１種のｍｉＲＮＡのシグナルが、対照試料からのシグナルと比較して、増加する請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
マイクロアレイが、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−２９ｂ−２、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−１２８ｂ、ｍｉＲ−１９９ａ−１、ｍｉＲ−２４−１、ｍｉＲ−２４−２、ｍｉＲ−１４６、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１８１ｂ−１、ｍｉＲ−２０ａ、ｍｉＲ−１０７、ｍｉＲ−３２、ｍｉＲ−９２−２、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−３０ｃ、ｍｉＲ−２５、ｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−１０６ａからなる群から選択された１種又は２種以上のｍｉＲＮＡに対するｍｉＲＮＡ特異的プローブオリゴヌクレオチドを含む請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
被験者の癌細胞中で、少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物が、対照の細胞と比較して下方制御されているか又は上方制御されている、固形癌を有するか又は有すると疑われる被験者における腫瘍形成を抑制する方法であって、
（１）前記癌細胞中で、少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物が下方制御されているときに、被験者における腫瘍形成が抑制されるように、前記ｍｉＲ遺伝子産物はｍｉＲ−１５ａ又はｍｉＲ−１６−１ではないという条件で、被験者に、有効量の少なくとも１種の単離されたｍｉＲ遺伝子産物又はその単離された変異種若しくは生物活性フラグメントを投与するステップ；又は
（２）前記癌細胞中で、少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物が上方制御されているときに、被験者における腫瘍形成が抑制されるように、前記の少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物の発現を抑制するための有効量の少なくとも１種の化合物を被験者に投与するステップを含む方法。
【請求項１５】
ステップ（１）における少なくとも１種の単離されたｍｉＲ遺伝子産物が、ｍｉＲ−１４５，ｍｉＲ−１５５，ｍｉＲ−２１８−２及びそれらの組合せからなる群から選択される請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ステップ（２）における少なくとも１種の単離されたｍｉＲ遺伝子産物が、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−２９ｂ−２、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−１２８ｂ、ｍｉＲ−１９９ａ−１、ｍｉＲ−２４−１、ｍｉＲ−２４−２、ｍｉＲ−１４６、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１８１ｂ−１、ｍｉＲ−２０ａ、ｍｉＲ−１０７、ｍｉＲ−３２、ｍｉＲ−９２−２、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−３０ｃ、ｍｉＲ−２５、ｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−１０６ａ及びそれらの組合せからなる群から選択される請求項１４
に記載の方法。
【請求項１７】
前記固形癌が、前立腺癌、胃癌、膵癌、肺癌、乳癌及び大腸癌からなる群から選択される請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
固形癌を有する被験者における腫瘍形成を抑制する方法であって、
（１）被験者からの癌細胞中の少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物の量を、対照細胞と比較して測定するステップ；及び
（２）被験者における腫瘍形成が抑制されるように、
（ｉ）癌細胞中で発現された前記ｍｉＲ遺伝子産物の量が、対照細胞中で発現された前記ｍｉＲ遺伝子産物の量未満であれば、被験者に、有効量の少なくとも１種の単離されたｍｉＲ遺伝子産物、又はその変異種若しくは生物活性フラグメントを投与すること（ただし、前記ｍｉＲ遺伝子産物はｍｉＲ−１５ａ又はｍｉＲ−１６−１ではない）；又は
（ｉｉ）前記癌細胞中で発現された前記ｍｉＲ遺伝子産物の量が、対照細胞中で発現された前記ｍｉＲ遺伝子産物の量を超えていれば、前記被験者に、少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物の発現を抑制するための有効量の少なくとも１種の化合物を投与すること
により、癌細胞中で発現されるｍｉＲ遺伝子産物の量を変化させるステップ
を含む方法。
【請求項１９】
ステップ（ｉ）における少なくとも１種の単離されたｍｉＲ遺伝子産物が、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−２１８−２及びそれらの組合せからなる群から選択される請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ステップ（ｉｉ）における少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物が、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−２９ｂ−２、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−１２８ｂ、ｍｉＲ−１９９ａ−１、ｍｉＲ−２４−１、ｍｉＲ−２４−２、ｍｉＲ−１４６、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１８１ｂ−１、ｍｉＲ−２０ａ、ｍｉＲ−１０７、ｍｉＲ−３２、ｍｉＲ−９２−２、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−３０ｃ、ｍｉＲ−２５、ｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−１０６ａ及びそれらの組合せからなる群から選択される請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
少なくとも１種の単離されたｍｉＲ遺伝子産物、又はその単離された変異種若しくは生物活性フラグメント及び薬学的に許容される担体を含む、固形癌を治療するための医薬組成物。
【請求項２２】
請求項２１に記載の医薬組成物であって、その中の少なくとも１種の単離されたｍｉＲ遺伝子産物が、適当な対照細胞と比較して癌細胞において下方制御されたｍｉＲ遺伝子産物に相当する組成物。
【請求項２３】
単離されたｍｉＲ遺伝子産物が、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−２１８−２及びそれらの組合せからなる群から選択される請求項２２に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
固形癌が、前立腺癌、胃癌、膵癌、肺癌、乳癌及び大腸癌からなる群から選択される請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
少なくとも１種のｍｉＲ発現抑制化合物及び薬学的に許容される担体を含む、固形癌を治療するための医薬組成物。
【請求項２６】
少なくとも１種のｍｉＲ発現抑制化合物が、適当な対照細胞と比較して癌細胞において上方制御されているｍｉＲ遺伝子産物に対して特異的である請求項２５に記載の医薬組成
物。
【請求項２７】
請求項２６に記載の医薬組成物であって、その中の少なくとも１種のｍｉＲ発現抑制化合物が、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−２９ｂ−２、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−１２８ｂ、ｍｉＲ−１９９ａ−１、ｍｉＲ−２４−１、ｍｉＲ−２４−２、ｍｉＲ−１４６、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１８１ｂ−１、ｍｉＲ−２０ａ、ｍｉＲ−１０７、ｍｉＲ−３２、ｍｉＲ−９２−２、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−３０ｃ、ｍｉＲ−２５、ｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−１０６ａ及びそれらの組合せからなる群から選択されるｍｉＲ遺伝子産物に対して特異的である組成物。
【請求項２８】
試験薬剤を細胞に与えて、固形癌において低下した発現レベルに関連する少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物のレベルを測定することを含む、適当な対照細胞と比較した前記細胞中の前記ｍｉＲ遺伝子産物のレベルの上昇が、前記試験薬剤は腫瘍形成抑制剤であることを示す、腫瘍形成抑制剤を同定する方法。
【請求項２９】
前記ｍｉＲ遺伝子産物が、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−２１８−２及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３０】
前記固形癌が、前立腺癌、胃癌、膵癌、肺癌、乳癌及び大腸癌からなる群から選択される請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
試験薬剤を細胞に与えて、固形癌において上昇した発現レベルに関連する少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物のレベルを測定することを含む、適当な対照細胞と比較した前記細胞中の前記ｍｉＲ遺伝子産物のレベルの低下が、前記試験薬剤は腫瘍形成抑制剤であることを示す、腫瘍形成抑制剤を同定する方法。
【請求項３２】
前記ｍｉＲ遺伝子産物が、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−２９ｂ−２、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−１２８ｂ、ｍｉＲ−１９９ａ−１、ｍｉＲ−２４−１、ｍｉＲ−２４−２、ｍｉＲ−１４６、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１８１ｂ−１、ｍｉＲ−２０ａ、ｍｉＲ−１０７、ｍｉＲ−３２、ｍｉＲ−９２−２、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−３０ｃ、ｍｉＲ−２５、ｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−１０６ａ及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３３】
前記固形癌が、前立腺癌、胃癌、膵癌、肺癌、乳癌及び大腸癌からなる群から選択される請求項３２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、その全体又は一部を、米国国立癌研究所のプログラムプロジェクト助成金番号ＰＯ１ＣＡ７６２５９、Ｐ０１ＣＡ８１５３４及びＰ３０ＣＡ５６０３６により支援された。米国政府は本発明に一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００２】
悪性細胞の無制御増殖である癌は、現代医学時代の主要な健康問題であり、先進国における主要な死亡原因の一つである。米国においては死亡の四分の一は癌が原因である（Ｊｅｍａｌ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，ＣＡ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ．Ｃｌｉｎ．５２：２３−４７（２００２））。癌の中でも、器官及び固体組織から発生する、固形癌（例えば、大腸癌、肺癌、乳癌、胃癌、前立腺癌、膵癌）として知られているものは、最も一般的に同定されているヒトの癌に入る。
【０００３】
例えば、前立腺癌は工業国における男性中に最も頻繁に診断される非皮膚性の悪性腫瘍であり、米国においては、８人に１人の男性が一生の間に前立腺癌を発生させるであろう（Ｓｉｍａｒｄ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １４３（６）：２０２９−４０（２００２））。前立腺癌の発生率は過去数十年間に劇的に増加して、今や前立腺癌は米国及び西ヨーロッパにおける主要な死亡原因である（Ｐｅｓｃｈｅｌ，Ｒ．Ｅ．及びＪ．Ｗ．Ｃｏｌｂｅｒｇ，Ｌａｎｃｅｔ  ４：２３３−４１（２００３）；Ｎｅｌｓｏｎ，Ｗ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４９（４）:３６６−８
１（２００３））。前立腺癌を有する男性は、平均余命における平均４０％の減少に見舞われる。転移及び莢膜を越えた局所的広がりに先立って早期に検出されれば、前立腺癌はしばしば治癒させることができる（例えば、手術を使用して）。しかしながら、前立腺から広がり及び転移した後で診断されたならば、前立腺癌は通常致命的疾患で治癒率は低い。前立腺特異抗原（ＰＳＡ）に基づくスクリーニングは前立腺癌の早期診断の助けになってきたが、それは高感度でも特異的でもない（Ｐｕｎｇｌｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４９（４）：３３５−４２ （２００３））。このことは高率（％
）の偽陰性及び偽陽性がこの試験に伴っていることを意味する。その結果、癌でない人々に対する誤った癌の示唆及び不必要な追跡生検の両方が多く行われる。
【０００４】
乳癌は依然として女性における癌関連死の首位から２番目の原因であり、米国において毎年１８０，０００人を超える女性を冒している。北米の女性にとって、乳癌に罹る生涯の確率は現在八分の一である。ＢＲＣＡ１及びＢＲＣＡ２の発見は乳癌に関与するキー遺伝因子を同定するのに重要なステップであるが、ＢＲＣＡ１及びＢＲＣＡ２の変異は乳癌に対する遺伝的かかり易さの一部を説明するに過ぎないことが明らかになった（Ｎａｔｈａｎｓｏｎ，Ｋ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．１０（７）：７１５−７２０（２００１）；Ａｎｇｌｉｃａｎ  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｔｕｄｙ
Ｇｒｏｕｐ．  Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｔｕｄｙ  Ｇｒｏｕｐ．Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ８３（１０）：１３０１−０８（２０００）；及びＳｙｒｊａｋｏｓｋｉ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．９２：１５２９−３１（２０００））。乳癌に対する治療法の相当の研究にも拘わらず、乳癌は依然として効果的に診断及び治療することが困難であり、乳癌患者で観察される高い死亡率は、この疾患の診断、治療及び予防において改善が必要であることを示している。
【０００５】
皮膚癌を除いて、結直腸癌は米国及びカナダにおいて３番目の頻度で診断される癌である（女性における肺及び乳癌並びに男性における肺及び前立腺癌に次ぐ）。米国癌協会（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｏｃｉｅｔｙ）は、２００５年に米国で診断された
新しい結直腸癌は約１４５，０００症例であろうと推定している（Ｃａｎｃｅｒ  Ｆａｃｔｓ  ａｎｄ  Ｆｉｇｕｒｅｓ  ２００５．Ａｔｌａｎｔａ，ＧＡ：Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，２００５。ｗｗｗ.ｃａｎｃｅｒ.ｏｒｇ／ｄｏｃｒｏｏｔ／ＳＴＴ／ｓｔｔ＿０．ａｓｐで利用可能、２００５年１２月１９日に接続した）。結直腸癌は米国及びカナダにおける男性及び女性の間で、癌死の首位から２番目の原因である（肺癌に次ぐ）。
【０００６】
膵癌の年間発生数は年間死亡数にほぼ等しく、２００４年に米国でそれぞれ３１，８６０及び３１，２７０と推定される（Ｃａｎｃｅｒ  Ｆａｃｔｓ  ａｎｄ  Ｆｉｇｕｒｅｓ
２００４．Ａｔｌａｎｔａ，ＧＡ：Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，２００４。ｗｗｗ.ｃａｎｃｅｒ.ｏｒｇ／ｄｏｃｒｏｏｔ／ＳＴＴ／ｓｔｔ＿０．ａｓｐで利用可能、２００５年８月２１日に接続した）。局所的進行及び転移膵癌の患者の予後は悪く、診断がつくのは、治癒可能な手術又は放射線療法には通常遅すぎる（Ｂｕｒｒ，Ｈ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ  １０（３）：１８３−１９０，（２００５））。化学療法は若干の進行膵癌患者に対して症状の軽減を提供することができるが、生存に対するその効果は、今日までのところささやかである。
【０００７】
米国において、毎年２０，０００を超える人々が胃癌と診断されている。米国癌協会は、２００４年に米国で診断された新しい結直腸癌は２２，７１０症例であろうと推定している（Ｃａｎｃｅｒ  Ｆａｃｔｓ  ａｎｄ  Ｆｉｇｕｒｅｓ  ２００４．Ａｔｌａｎｔａ，ＧＡ：Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，２００４。ｗｗｗ.ｃａｎ
ｃｅｒ.ｏｒｇ／ｄｏｃｒｏｏｔ／ＳＴＴ／ｓｔｔ＿０．ａｓｐで利用可能、２００５年
８月２１日に接続した）。胃癌は無症状で生じ得るので、診断される時までに進行したステージになっている可能性がある。それで、治療は患者をより楽にして生活の質を改善することに向けられる。
【０００８】
肺癌は世界中で如何なる他の形態の癌よりも多くの死の原因となっている（Ｇｏｏｄｍａｎ，Ｇ．Ｅ．，Ｔｈｏｒａｘ  ５７：９９４−９９９（２００２））。米国において、肺癌は男性及び女性両方の間で主要な癌死の原因である。２００２年に、肺癌による死亡は１３４，９００例と推定され、乳、前立腺及び大腸癌の合計を超えた。Ｉｄ．肺癌は全ヨーロッパ諸国においても癌死の主たる原因であり、肺癌関連の死亡数は開発途上国においても同様に急速に増加しつつある。
【０００９】
全肺癌患者の５年生存率は、診断における疾患のステージを無視しておよそ１３％に過ぎない。これは、この疾患が未だ局所的である間に検出された症例の５年生存率４６％と対照をなす。しかしながら、肺癌の僅か１６％が疾患の拡大してしまう前に発見されるに過ぎない。疾患が進行したステージに達するまで臨床症状がしばしば認められないので、早期の検出は困難である。この癌及び他の癌のための療法の研究にも拘わらず、肺癌は効果的に診断し治療することが困難なままにとどまっている。
【００１０】
明らかに、固形癌の特定の形態（例えば、前立腺癌、乳癌、肺癌、胃癌、大腸癌、膵癌）に対する罹り易さに関連するマーカー及び遺伝子の同定は、今日腫瘍学に向かい合う主要な挑戦の一つである。癌の早期検出及び治療に対して、より積極的なスクリーニング及び処置計画が制定され得るように、癌に対する遺伝的羅病性を有する個々人の早期検出のための手段を確認する必要がある。癌遺伝子により、（例えば、低又は高分子量薬剤を使用して）操作し得るキーとなる分子的経路が解明され、特定の癌が最初に診断されたときの癌ステージに無関係なより効果的な治療がもたらされる可能性もある。
【００１１】
マイクロＲＮＡは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）標的にハイブリダイズしてその翻訳抑制又はそれより頻度は少ないが分解のいずれかを作動させることにより、遺伝子発
現を制御する低分子量の非コードＲＮＡの１クラスである。ｍｉＲＮＡの発見及び研究により、細胞分化、細胞増殖及び細胞死などの生物発生並びに種々の細胞過程において重要な役割を演ずるｍｉＲＮＡ媒介遺伝子調節機構が明らかになった（Ｃｈｅｎｇ，Ａ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３３：１２９０−１２９７（２００５））。最近の研究は特定のｍｉＲＮＡの異常発現が、神経疾患（Ｉｓｈｉｚｕｋａ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．７５：２４９７−２５０８（２００２））及び癌などのヒトの疾患に関与し得ることを示唆している。特に、ｍｉＲＮＡ−１６−１及び／又はｍｉＲＮＡ−１５ａの誤発現が、ヒト慢性リンパ球性白血病で見出されている（Ｃａｌｉｎ，Ｇ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９９：１５５２４−１５５２９（２００２））。
【００１２】
明らかに、固形癌（例えば、前立腺癌、乳癌、肺癌、胃癌、大腸癌、膵癌）を検出し治療するための改良された方法のための技術に大なる必要性がある。本発明は、固形癌の診断及び治療のための新規な方法及び組成物を提供する。
【発明の開示】
【００１３】
本発明は、特定の固形癌における発現レベルを変化させた特定のｍｉＲの同定に、一部基づく。
したがって、本発明は、被験者が固形癌を有するか又はそれを発生する危険性があるかを診断する方法を包含する。本発明の方法によれば、被験者の試験試料中の少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物のレベルは、対照試料中の対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルと比較される。対照試料中の対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルと比較した、試験試料中のｍｉＲ遺伝子産物のレベルの変化（例えば、上昇、低下）は、被験者が固形癌を有するか又は発生する危険性があるかのいずれかであることを示す。固形癌は、器官及び固体組織から生ずる如何なる癌でもよい。ある態様において、固形癌は胃癌、乳癌、膵癌、大腸癌、肺癌又は前立腺癌である。特定の態様において、固形癌は乳癌、肺癌、前立腺癌、膵癌又は胃腸癌ではない。
【００１４】
１態様において、試験試料中の測定される少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−１７−５ｐ及びそれらの組合せからなる群から選択される。他の態様において、試験試料中の測定される少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−２９ｂ−２、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−１２８ｂ、ｍｉＲ−１９９ａ−１、ｍｉＲ−２４−１、ｍｉＲ−２４−２、ｍｉＲ−１４６、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１８１ｂ−１、ｍｉＲ−２０ａ、ｍｉＲ−１０７、ｍｉＲ−３２、ｍｉＲ−９２−２、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−３０ｃ、ｍｉＲ−２５、ｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−１０６ａ及びそれらの組合せからなる群から選択される。
【００１５】
１態様において、固形癌は、乳癌又は肺癌であり、試験試料中の測定される少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−２１３及びそれらの組合せからなる群から選択される。
【００１６】
特定の態様において、固形癌は、大腸癌、胃癌、前立腺癌又は膵癌であり、且つ試験試料中の測定される少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物はｍｉＲ−２１８−２である。
【００１７】
ある態様において、固形癌は乳癌であり、且つ試験試料中の少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ−１２５ｂ−１、ｍｉＲ−１２５ｂ−２、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−２１及びそれらの組合せからなる群から選択される。関連する態様において、固形癌は乳癌であり、且つ試験試料中の少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物はｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２９ｂ−２、ｍｉＲ−１４６、ｍｉＲ−１２５ｂ−２、ｍｉＲ−１２５ｂ−１、ｍｉＲ
−１０ｂ、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１８１ａ、ｍｉＲ−１４０、ｍｉＲ−２１３、ｍｉＲ−２９ａ  ｐｒｅｃ、ｍｉＲ−１８１ｂ−１、ｍｉＲ−１９９ｂ、ｍｉＲ−２９ｂ−１、ｍｉＲ−１３０ａ、ｍｉＲ−１５５、ｌｅｔ−７ａ−２、ｍｉＲ−２０５、ｍｉＲ−２９ｃ、ｍｉＲ−２２４、ｍｉＲ−１００、ｍｉＲ−３１、ｍｉＲ−３０ｃ、ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−１２２ａ、ｍｉＲ−１６−２及びそれらの組合せからなる群から選択される。
【００１８】
他の態様において、固形癌は大腸癌であり、且つ試験試料中の少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ−２４−１、ｍｉＲ−２９ｂ−２、ｍｉＲ−２０ａ、ｍｉＲ−１０ａ、ｍｉＲ−３２、ｍｉＲ−２０３、ｍｉＲ−１０６ａ、ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｃ、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−１２６＊、ｍｉＲ−１２８ｂ、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２４−２、ｍｉＲ−９９ｂ  ｐｒｅｃ、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−２１３、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１０７、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−９−３及びそれらの組合せからなる群から選択される。
【００１９】
さらに他の態様において、固形癌は肺癌であり、且つ試験試料中の少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２０５、ｍｉＲ−２００ｂ、ｍｉＲ−９−１、ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−１４８、ｍｉＲ−１４１、ｍｉＲ−１３２、ｍｉＲ−２１５、ｍｉＲ−１２８ｂ、ｌｅｔ−７ｇ、ｍｉＲ−１６−２、ｍｉＲ−１２９−１／２ｐｒｅｃ、ｍｉＲ−１２６＊、ｍｉＲ−１４２−ａｓ、ｍｉＲ−３０ｄ、ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−７−２、ｍｉＲ−１９９ａ−１、ｍｉＲ−１２７、ｍｉＲ−３４ａ  ｐｒｅｃ、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−１３６、ｍｉＲ−２０２、ｍｉＲ−１９６−２、ｍｉＲ−１９９ａ−２、ｌｅｔ−７ａ−２、ｍｉＲ−１２４ａ−１、ｍｉＲ−１４９、ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｍｉＲ−１９６−１ｐｒｅｃ、ｍｉＲ−１０ａ、ｍｉＲ−９９ｂ  ｐｒｅｃ、ｍｉＲ−１９６−１、ｍｉＲ−１９９ｂ、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−１９５、ｍｉＲ−１５５及びそれらの組合せからなる群から選択される。
【００２０】
さらなる態様において、固形癌は膵癌であり、且つ試験試料中の少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ−１０３−１、ｍｉＲ−１０３−２、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−２０４及びそれらの組合せからなる群から選択される。関連する態様において、固形癌は膵癌であり、且つ試験試料中のｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ−１０３−２、ｍｉＲ−１０３−１、ｍｉＲ−２４−２、ｍｉＲ−１０７、ｍｉＲ−１００、ｍｉＲ−１２５ｂ−２、ｍｉＲ−１２５ｂ−１、ｍｉＲ−２４−１、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−２３ａ、ｍｉＲ−２６ａ−１、ｍｉＲ−１２５ａ、ｍｉＲ−１３０ａ、ｍｉＲ−２６ｂ、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−１２６＊、ｍｉＲ−１６−２、ｍｉＲ−１４６、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−９９ｂ、ｍｉＲ−１２８ｂ、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−２９ｂ−２、ｍｉＲ−２９ａ、ｍｉＲ−２５、ｍｉＲ−１６−１、ｍｉＲ−９９ａ、ｍｉＲ−２２４、ｍｉＲ−３０ｄ、ｍｉＲ−９２−２、ｍｉＲ−１９９ａ−１、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−２９ｃ、ｍｉＲ−３０ｂ、ｍｉＲ−１２９−１／２、ｍｉＲ−１９７、ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｃ、ｍｉＲ−７−１、ｍｉＲ−９３−１、ｍｉＲ−１４０、ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１３２、ｍｉＲ−１８Ｉｂ−Ｉ、ｍｉＲ−１５２ｐｒｅｃ、ｍｉＲ−２３ｂ、ｍｉＲ−２０ａ、ｍｉＲ−２２２、ｍｉＲ−２７ａ、ｍｉＲ−９２−１、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１２９−１／２ｐｒｅｃ、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−３２、ｍｉＲ−１０６ａ、ｍｉＲ−２９ｂ−１及びそれらの組合せからなる群から選択される。
【００２１】
他の態様において、固形癌は前立腺癌であり、且つ試験試料中のｍｉＲ遺伝子産物は、１ｅｔ−７ｄ、ｍｉＲ−１２８ａ  ｐｒｅｃ、ｍｉＲ−１９５、ｍｉＲ−２０３、１ｅｔ−７ａ−２ｐｒｅｃ、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−２０ａ、ｍｉＲ−２１８−２、ｍｉＲ−２９ａ、ｍｉＲ−２５、ｍｉＲ−９５、ｍｉＲ−１９７、ｍｉＲ−１３５−２、ｍｉＲ−１８７、ｍｉＲ−１９６−１、ｍｉＲ−１４８、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−２１、１ｅｔ
−７ｉ、ｍｉＲ−１９８、ｍｉＲ−１９９ａ−２、ｍｉＲ−３０ｃ、ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｍｉＲ−９２−２、ｍｉＲ−１４６、ｍｉＲ−１８１ｂ−１ｐｒｅｃ、ｍｉＲ−３２、ｍｉＲ−２０６、ｍｉＲ−１８４ｐｒｅｃ、ｍｉＲ−２９ａ  ｐｒｅｃ、ｍｉＲ−２９ｂ−２、ｍｉＲ−１４９、ｍｉＲ−１８１ｂ−１、ｍｉＲ−１９６−１ｐｒｅｃ、ｍｉＲ−９３−１、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−１６−１、ｍｉＲ−１０１−１、ｍｉＲ−１２４ａ−１、ｍｉＲ−２６ａ−１、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−２７ａ、ｍｉＲ−２４−１、ｍｉＲ−１０６ａ、ｍｉＲ−１９９ａ−１及びそれらの組合せからなる群から選択される。
【００２２】
さらに他の態様において、固形癌は胃癌であり、且つ試験試料中のｍｉＲ遺伝子産物は、且つ試験試料中のｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２１８−２、ｍｉＲ−１０３−２、ｍｉＲ−９２−２、ｍｉＲ−２５、ｍｉＲ−１３６、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−１２５ｂ−２、ｍｉＲ−１０３−１、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−２２２、ｍｉＲ−２１２ｐｒｅｃ、ｍｉＲ−１２５ｂ−１、ｍｉＲ−１００、ｍｉＲ−１０７、ｍｉＲ−９２−１、ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１９２、ｍｉＲ−２３ａ、ｍｉＲ−２１５、ｍｉＲ−７−２、ｍｉＲ−１３８−２、ｍｉＲ−２４−１、ｍｉＲ−９９ｂ、ｍｉＲ−３３ｂ、ｍｉＲ−２４−２及びそれらの組合せからなる群から選択される。
【００２３】
少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物のレベルは、当業者に周知の技法（例えば、定量的又は半定量的ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロット分析、溶液ハイブリダイゼーション検出）を使用して測定することができる。特定の態様において、少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物のレベルは、被験者から得た試験試料からＲＮＡを逆転写することにより１揃いの標的オリゴデオキシヌクレオチドを提供し、その標的オリゴデオキシヌクレオチドを１種又は２種以上のｍｉＲＮＡ特異的プローブオリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせて（例えば、数種類のｍｉＲＮＡ特異的プローブオリゴヌクレオチドを含むマイクロアレイにハイブリダイズさせて）、試験試料についてのハイブリダイゼーションプロファイルを提供し、その試験試料のハイブリダイゼーションプロファイルと対照試料のハイブリダイゼーションプロファイルとを比較することにより測定される。対照細胞と比較した試験試料中の少なくとも１種のｍｉＲＮＡのシグナルの変化は、被験者が固形癌を有するか又は発生する危険性があるかのいずれかを示す。特定の態様においては、標的オリゴデオキシヌクレオチドを、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−２９ｂ−２、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−１２８ｂ、ｍｉＲ−１９９ａ−１、ｍｉＲ−２４−１、ｍｉＲ−２４−２、ｍｉＲ−１４６、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１８１ｂ−１、ｍｉＲ−２０ａ、ｍｉＲ−１０７、ｍｉＲ−３２、ｍｉＲ−９２−２、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−３０ｃ、ｍｉＲ−２５、ｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−１０６ａ又はそれらの組合せからなる群から選択される１種又は２種以上のｍｉＲＮＡに対するｍｉＲＮＡ特異的プローブオリゴヌクレオチドを含むマイクロアレイにハイブリダイズさせる。
【００２４】
本発明は、被験者の癌細胞中で少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物が異常に制御（例えば、下方制御、上方制御）されている固形癌（例えば、前立腺癌、胃癌、膵癌、肺癌、乳癌、大腸癌）を有するか又は有すると疑われる被験者における腫瘍形成を抑制する方法も包含する。少なくとも１種の単離されたｍｉＲ遺伝子産物が、癌細胞中で下方制御されているとき、本発明の方法は、被験者中の癌細胞の増殖が抑制されるように、有効量の単離されたｍｉＲ遺伝子産物、単離された変異種又はｍｉＲ遺伝子産物若しくは変異種の生物活性フラグメントを投与することを包含する。さらなる態様において、少なくとも１種の単離されたｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−２１８−２及びそれらの組合せからなる群から選択される。特定の態様において、ｍｉＲ遺伝子産物はｍｉＲ−１５又はｍｉＲ−１６−１ではない。少なくとも１種の単離されたｍｉＲ遺伝子産物が、癌細胞中で上方制御されているとき、本発明の方法は、被験者中の癌細胞の増殖が抑制されるように、少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物の発現を抑制する化合物（本
明細書中では「ｍｉＲ発現抑制化合物」と称する）の有効量を被験者に投与することを包含する。特定の態様において、少なくとも１種のｍｉＲ発現抑制化合物は、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−２９ｂ−２、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−１２８ｂ、ｍｉＲ−１９９ａ−１、ｍｉＲ−２４−１、ｍｉＲ−２４−２、ｍｉＲ−１４６、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１８１ｂ−１、ｍｉＲ−２０ａ、ｍｉＲ−１０７、ｍｉＲ−３２、ｍｉＲ−９２−２、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−３０ｃ、ｍｉＲ−２５、ｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−１０６ａ及びそれらの組合せからなる群から選択されるｍｉＲ遺伝子産物に対して特異的である。
【００２５】
関連する態様において、被験者における腫瘍形成を抑制する方法は、被験者からの癌細胞中の少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物の量を測定して、癌細胞中のｍｉＲ遺伝子産物のレベルを対照細胞中の対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルと比較するステップをさらに含む。癌細胞中でｍｉＲ遺伝子産物の発現が異常に制御されていれば（例えば、下方制御、上方制御）、本発明の方法は、癌細胞中で発現される少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物の量を変化させることをさらに含む。１態様において、癌細胞中で発現されるｍｉＲ遺伝子産物の量は、対照細胞（例えば、２種以上の対照細胞）中で発現されるｍｉＲ遺伝子産物の量未満であり、下方制御されたｍｉＲ遺伝子産物、単離された変異種又は該ｍｉＲ遺伝子産物若しくは変異種の生物活性フラグメントの有効量が被験者に投与される。この態様に適当なｍｉＲ遺伝子産物は、とりわけｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−２１８−２及びそれらの組合せを含む。特定の態様において、ｍｉＲ遺伝子産物はｍｉＲ−１５ａ、又はｍｉＲ−１６−１ではない。他の態様において、癌細胞中で発現されるｍｉＲ遺伝子産物の量は対照細胞（例えば、２種以上の対照細胞）中で発現されるｍｉＲ遺伝子産物の量を超えており、少なくとも１種の上方制御されたｍｉＲ遺伝子産物の発現を抑制する少なくとも１種の化合物の有効量が、被験者に投与される。少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物の発現を抑制するための適当化合物には、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−２９ｂ−２、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−１２８ｂ、ｍｉＲ−１９９ａ−１、ｍｉＲ−２４−１、ｍｉＲ−２４−２、ｍｉＲ−１４６、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１８１ｂ−１、ｍｉＲ−２０ａ、ｍｉＲ−１０７、ｍｉＲ−３２、ｍｉＲ−９２−２、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−３０ｃ、ｍｉＲ−２５、ｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−１０６ａ及びそれらの組合せの発現を抑制する化合物が含まれるが、これらに限定されない。
【００２６】
本発明は、固形癌（例えば、前立腺癌、胃癌、膵癌、肺癌、乳癌、大腸癌）を治療するための医薬組成物をさらに提供する。１態様において、医薬組成物は、少なくとも１種の単離されたｍｉＲ遺伝子産物及び薬学的に許容される担体を含む。特定の態様において、少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物は、対照細胞と比較して癌細胞中における発現の減少したレベルを有するｍｉＲ遺伝子産物に相当する。ある態様において、単離されたｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−２１８−２及びそれらの組合せからなる群から選択される。
【００２７】
他の態様において、本発明の医薬組成物は、少なくとも１種のｍｉＲ発現抑制化合物及び薬学的に許容される担体を含む。特定の態様において、少なくとも１種のｍｉＲ発現抑制化合物は、発現が対照細胞におけるよりも癌細胞における方が大であるｍｉＲ遺伝子産物に対して特異的である。ある態様において、ｍｉＲ発現抑制化合物は、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−２９ｂ−２、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−１２８ｂ、ｍｉＲ−１９９ａ−１、ｍｉＲ−２４−１、ｍｉＲ−２４−２、ｍｉＲ−１４６、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１８１ｂ−１、ｍｉＲ−２０ａ、ｍｉＲ−１０７、ｍｉＲ−３２、ｍｉＲ−９２−２、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−３０ｃ、ｍｉＲ−２５、ｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−１０６ａ及びそれらの組合せからなる群から選択される１種又は２種以上のｍｉＲ遺伝子産物に対して特異的である。
【００２８】
本発明は、試験薬剤を細胞に与えて細胞中の少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物のレベルを測定することを含む、腫瘍形成抑制剤を同定する方法も包含する。１態様において、本発明の方法は、試験薬剤を細胞に与えて、固形癌（例えば、前立腺癌、胃癌、膵癌、肺癌、乳癌、大腸癌）において低下した発現レベルに関連する少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物のレベルを測定することを含む。適当な対照細胞と比較した細胞中のｍｉＲ遺伝子産物のレベルの増加は、試験薬剤が腫瘍形成抑制剤であることを示す。特定の態様において、固形癌において低下した発現レベルと関連する少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−２１８−２及びそれらの組合せからなる群から選択される。
【００２９】
他の態様において、本発明の方法は、試験薬剤を細胞に与えて、固形癌において上昇した発現レベルと関連する少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物のレベルを測定することを含む。適当な対照細胞と比較した細胞中のｍｉＲ遺伝子産物のレベルの減少は、試験薬剤が腫瘍形成抑制剤であることを示す。特定の態様において、固形癌において上昇した発現レベルと関連する少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−２９ｂ−２、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−１２８ｂ、ｍｉＲ−１９９ａ−１、ｍｉＲ−２４−１、ｍｉＲ−２４−２、ｍｉＲ−１４６、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１８１ｂ−１、ｍｉＲ−２０ａ、ｍｉＲ−１０７、ｍｉＲ−３２、ｍｉＲ−９２−２、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−３０ｃ、ｍｉＲ−２５、ｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−１０６ａ及びそれらの組合せからなる群から選択される。
【００３０】
本発明は、大腸、胃、膵臓、肺、乳及び前立腺癌などの異なった固形癌に関連する癌細胞中の、発現が正常対照細胞と比較して変化した特定のマイクロＲＮＡの同定に一部基づく。
【００３１】
本明細書において区別なく使用する「ｍｉＲ遺伝子産物」、「マイクロＲＮＡ」、「ｍｉＲ」、又は「ｍｉＲＮＡ」は、ｍｉＲ遺伝子からのプロセシングされていない（例えば、前駆体）又はプロセシングされた（例えば成熟した）ＲＮＡ転写物を指す。ｍｉＲ遺伝子産物はタンパク質に翻訳されないので、「ｍｉＲ遺伝子産物」という用語はタンパク質を含まない。プロセシングされていないｍｉＲ遺伝子転写物は「ｍｉＲ前駆体」又は「ｍｉＲｐｒｅｃ」とも称され、通常鎖長約７０〜１００ヌクレオチドのＲＮＡ転写物を含む。ｍｉＲ前駆体はリボヌクレアーゼ（例えば、ダイサー、アルゴノート（Ａｒｇｏｎａｕｔ）、又はリボヌクレアーゼＩＩＩ（例えば、大腸菌リボヌクレアーゼＩＩＩ））で消化することにより活性な１９〜２５ヌクレオチドＲＮＡ分子にプロセシングすることができる。この活性な１９〜２５ヌクレオチドＲＮＡ分子は「プロセシングされた」ｍｉＲ遺伝子転写物又は「成熟」ｍｉＲＮＡとも称される。
【００３２】
活性な１９〜２５ヌクレオチドＲＮＡ分子は、ｍｉＲ前駆体から天然のプロセシング経路により（例えば完全細胞又は細胞溶解産物を使用して）又は合成プロセシング経路により（例えば、単離されたダイサー、アルゴノート（Ａｒｇｏｎａｕｔ）、又はリボヌクレアーゼＩＩＩなどの単離されたプロセシング酵素を使用して）、得ることができる。活性な１９〜２５ヌクレオチドＲＮＡ分子は、ｍｉＲ前駆体からプロセシングされずに、生物学的又は化学的に直接作製することもできることがわかっている。本明細書中でマイクロＲＮＡが名称で参照されるとき、その名称は、特に断らない限り前駆体及び成熟形の両方に対応する。
【００３３】
表１ａ及び１ｂは特定の前駆体及び成熟ヒトマイクロＲＮＡのヌクレオチド配列を示す。
【００３４】
【表１】
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【表２】
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【表３】
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【表４】
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【表５】
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【表６】
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【表７】
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【表８】
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【表９】
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【表１０】
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【表１１】
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【表１２】
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【表１３】
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【表１４】
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【表１５】
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【表１６】
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【表１７】
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【表１８】
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【表１９】
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【表２０】
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【表２１】
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【表２２】
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【表２３】
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【表２４】
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【００３５】
【表２５】
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【表２６】
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【表２７】
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【表２８】
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【表２９】
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【表３０】
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【表３１】
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【表３２】
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【表３３】
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【００３６】
本発明は、被験者からの試験試料中の少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物のレベルを測定して、試験試料中のｍｉＲ遺伝子産物のレベルを対照試料中の対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルと比較することを含む、被験者が固形癌を有するか又はそれを発生する危険性があるかを示す方法を包含する。本明細書中で使用する「被験者」は固形癌を有する、又は有することが疑われる任意の動物であってよい。好ましい態様において、被験者は固形癌を有する、又は有することが疑われるヒトである。
【００３７】
１態様において、試験試料中で測定される少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−２９ｂ−２、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−１２８ｂ、ｍｉＲ−１９９ａ−１、ｍｉＲ−２４−１、ｍｉＲ−２４−２、ｍｉＲ−１４６、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１８１ｂ−１、ｍｉＲ−２０ａ、ｍｉＲ−１０７、ｍｉＲ−３２、ｍｉＲ−９２−２、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−３０ｃ、ｍｉＲ−２５、ｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−１０６ａ及びそれらの組合せからなる群から選択される。特
定の態様において、ｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１９１又はｍｉＲ−１７−５ｐである。他の態様において、ｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ−１５ａ又はｍｉＲ−１６−１ではない。さらなる態様において、ｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ−１５９−１又はｍｉＲ−１９２ではない。さらなる態様において、ｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ−１８６、ｍｉＲ−１０１−１、ｍｉＲ−１９４、ｍｉＲ−２１５、ｍｉＲ−１０６ｂ、ｍｉＲ−２５、ｍｉＲ−９３、ｍｉＲ−２９ｂ、ｍｉＲ−２９ａ、ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１８２ｓ、ｍｉＲ−１８２ａｓ、ｍｉＲ−１８３、ｍｉＲ−１２９−１、ｌｅｔ−７ａ−１、ｌｅｔ−７ｄ、ｌｅｔ−７ｆ−１、ｍｉＲ−２３ｂ、ｍｉＲ−２４−１、ｍｉＲ−２７ｂ、ｍｉＲ−３２、ｍｉＲ−１５９−１、ｍｉＲ−１９２、ｍｉＲ−１２５ｂ−１、ｌｅｔ−７ａ−２、ｍｉＲ−１００、ｍｉＲ−１９６−２、ｍｉＲ−１４８ｂ、ｍｉＲ−１９０、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−３０１、ｍｉＲ−１４２ｓ、ｍｉＲ−１４２ａｓ、ｍｉＲ−１０５−１、又はｍｉＲ−１７５ではない。さらなる態様において、ｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−３０１、ｍｉＲ−１４２ａｓ、ｍｉＲ−１４２ｓ、ｍｉＲ−１９４、ｍｉＲ−２１５、又はｍｉＲ−３２ではない。他の態様において、ｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ−１４８、ｍｉＲ−１０ａ、ｍｉＲ−１９６−１、ｍｉＲ−１５２、ｍｉＲ−１９６−２、ｍｉＲ−１４８ｂ、ｍｉＲ−１０ｂ、ｍｉＲ−１２９−１、ｍｉＲ−１５３−２、ｍｉＲ−２０２、ｍｉＲ−１３９、ｌｅｔ−７ａ、ｌｅｔ−７ｆ、又はｌｅｔ−７ｄではない。さらに他の態様において、ｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１６−１、ｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ−１８１、ｍｉＲ−３０、ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１６−１、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１６−２、ｍｉＲ−１９５、ｍｉＲ−３４、ｍｉＲ−１５３、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２１７、ｍｉＲ−２０５、ｍｉＲ−２０４、ｍｉＲ−２１１、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１０３、ｍｉＲ−１０７、ｍｉＲ−１２９、ｍｉＲ−９、ｍｉＲ−１３７、ｍｉＲ−２１７、ｍｉＲ−１８６ではない。
【００３８】
固形癌は器官及び固形組織から生ずる任意の癌であってよい。そのような癌は通常腫瘍塊の形成及び／又は存在を伴い、癌腫、肉腫及びリンパ腫であり得る。本発明の方法により診断することができる固形癌の具体的な例には、大腸癌、直腸癌、胃癌、膵癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、気管支癌、精巣癌、卵巣癌、子宮癌、陰茎癌、悪性黒色腫及び他の皮膚癌、肝癌、食道癌、口腔及び咽頭の癌（例えば、舌癌、口腔癌）、消化系の癌（例えば、腸癌、胆嚢癌）、骨及び関節の癌、内分泌系の癌（例えば甲状腺癌）、脳癌、眼癌、泌尿器系の癌（例えば、腎臓癌、膀胱癌）、ホジキン病及び非ホジキンリンパ腫が挙げられるが、これらに限定されない。特定の態様において、固形癌は乳癌、肺癌、前立腺癌、膵癌又は胃腸の癌の１種又は２種以上ではない。
【００３９】
１態様において、固形癌は乳癌又は肺癌であり、且つ試験試料中の測定される少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−２１３及びそれらの組合せからなる群から選択される。
【００４０】
さらに他の態様において、固形癌は大腸癌、胃癌、前立腺癌又は膵癌であり、且つ試験試料中の測定される少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ−２１８−２である。
【００４１】
本発明のある態様において、固形癌は乳癌であり、試験試料中の測定される少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ−１２５ｂ−１、ｍｉＲ−１２５ｂ−２、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−２１及びそれらの組合せからなる群から選択される。関連する態様において、固形癌は乳癌であり、試験試料中の測定される少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２９ｂ−２、ｍｉＲ−１４６、ｍｉＲ−１２５ｂ−２、ｍｉＲ−１２５ｂ−１、ｍｉＲ−１０ｂ、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１８１ａ、ｍｉＲ−１４０、ｍｉＲ−２１３、ｍｉＲ−２９ａ  ｐｒｅｃ、ｍｉＲ−１８１ｂ−１、ｍｉＲ−１９９ｂ、ｍｉＲ−２９ｂ−１、ｍｉＲ−１３０ａ、ｍｉＲ−１５５、ｌｅｔ−７ａ−２、ｍｉＲ−２０５、ｍｉＲ−２９ｃ、ｍｉＲ−２２４、ｍｉＲ−１００、ｍｉＲ−３１、ｍｉＲ
−３０ｃ、ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−１２２ａ、ｍｉＲ−１６−２及びそれらの組合せからなる群から選択される。
【００４２】
関連する態様において、固形癌は乳癌であり、少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ−１５ａ又はｍｉＲ−１６−１ではない。さらに他の態様において、固形癌は乳癌であり、少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１０ｂ、ｍｉＲ−１２５ｂ−１、ｍｉＲ−１２５ｂ−２、ｌｅｔ７ａ−２、ｌｅｔ７ａ−３、ｌｅｔ−７ｄ、ｍｉＲ−１２２ａ、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−２０６、ｍｉＲ−２１０、ｌｅｔ−７ｉ、ｍｉＲ−００９−１（ｍｉＲ１３１−１）、ｍｉＲ−３４（ｍｉＲ−１７０）、ｍｉＲ−１０２（ｍｉＲ−２９ｂ）、ｍｉＲ−１２３（ｍｉＲ−１２６）、ｍｉＲ−１４０−ａｓ、ｍｉＲ−１２５ａ、ｍｉＲ−１９４、ｍｉＲ−２０４、ｍｉＲ−２１３、ｌｅｔ−７ｆ−２、ｍｉＲ−１０１、ｍｉＲ−１２８ｂ、ｍｉＲ−１３６、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−１４９、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−１９６−１、ｍｉＲ−１９６−２、ｍｉＲ−２０２、ｍｉＲ−１０３−１、又はｍｉＲ−３０ｃではない。他の態様において、固形癌は乳癌であり、ｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１２５ｂ−１、ｌｅｔ−７ａ−２、ｌｅｔ−７ｉ、ｍｉＲ−１００、Ｉｅｔ−７ｇ、ｍｉＲ−３１、ｍｉＲ−３２ａ−１、ｍｉＲ−３３ｂ、ｍｉＲ−３４ａ−２、ｍｉＲ−１０１−１、ｍｉＲ−１３５−１、ｍｉＲ−１４２ａｓ、ｍｉＲ−１４２ｓ、ｍｉＲ−１４４、ｍｉＲ−３０１、ｍｉＲ−２９ｃ、ｍｉＲ−３０ｃ、ｍｉＲ−１０６ａ、又はｍｉＲ−２９ｂ−１ではない。さらに他の態様において、固形癌は乳癌であり、ｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ−１５９−１又はｍｉＲ−１９２ではない。さらに加わる態様において、固形癌は乳癌であり、ｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ−１８６、ｍｉＲ−１０１−１、ｍｉＲ−１９４、ｍｉＲ−２１５、ｍｉＲ−１０６ｂ、ｍｉＲ−２５、ｍｉＲ−９３、ｍｉＲ−２９ｂ、ｍｉＲ−２９ａ、ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１８２ｓ、ｍｉＲ−１８２ａｓ、ｍｉＲ−１８３、ｍｉＲ−１２９−１、ｌｅｔ−７ａ−ｌ、ｌｅｔ−７ｄ、ｌｅｔ−７ｆ−１、ｍｉＲ−２３ｂ、ｍｉＲ−２４−１、ｍｉＲ−２７ｂ、ｍｉＲ−３２、ｍｉＲ−１５９−１、ｍｉＲ−１９２、ｍｉＲ−１２５ｂ−１、ｌｅｔ−７ａ−２、ｍｉＲ−１００、ｍｉＲ−１９６−２、ｍｉＲ−１４８ｂ、ｍｉＲ−１９０、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−３０１、ｍｉＲ−１４２ｓ、ｍｉＲ−１４２ａｓ、ｍｉＲ−１０５−１、又はｍｉＲ−１７５ではない。さらなる態様において、固形癌は乳癌であり、ｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−３０１、ｍｉＲ−１４２ａｓ、ｍｉＲ−１４２ｓ、ｍｉＲ−１９４、ｍｉＲ−２１５又はｍｉＲ−３２ではない。他の態様において、固形癌は乳癌であり、ｍｉＲ遺伝子産物はｍｉＲ−１４８、ｍｉＲ−１０ａ、ｍｉＲ−１９６−１、ｍｉＲ−１５２、ｍｉＲ−１９６−２、ｍｉＲ−１４８ｂ、ｍｉＲ−１０ｂ、ｍｉＲ−１２９−１、ｍｉＲ−１５３−２、ｍｉＲ−２０２、ｍｉＲ−１３９、ｌｅｔ−７ａ、ｌｅｔ−７ｆ、又はｌｅｔ−７ｄではない。さらに他の態様において、固形癌は乳癌であり、ｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ−１８１ｂ、ｍｉＲ−１８１ｃ、ｍｉＲ−１８１ｄ、ｍｉＲ−３０、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１６−２、ｍｉＲ−１５３−１、ｍｉＲ−２１７、ｍｉＲ−２０５、ｍｉＲ−２０４、ｍｉＲ−１０３、ｍｉＲ−１０７、ｍｉＲ−１２９−２、ｍｉＲ−９又はｍｉＲ−１３７ではない。
【００４３】
他の態様において、固形癌は大腸癌であり、試験試料中の少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ−２４−１、ｍｉＲ−２９ｂ−２、ｍｉＲ−２０ａ、ｍｉＲ−１０ａ、ｍｉＲ−３２、ｍｉＲ−２０３、ｍｉＲ−１０６ａ、ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｃ、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−１２６＊、ｍｉＲ−１２８ｂ、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２４−２、ｍｉＲ−９９ｂ  ｐｒｅｃ、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−２１３、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１０７、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−９−３及びそれらの組合せからなる群から選択される。
【００４４】
他の態様において、固形癌は大腸癌であり、ｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ−１５９−１
又はｍｉＲ−１９２ではない。付け加わる態様において、固形癌は大腸癌であり、ｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ−１８６、ｍｉＲ−１０１−１、ｍｉＲ−１９４、ｍｉＲ−２１５、ｍｉＲ−１０６ｂ、ｍｉＲ−２５、ｍｉＲ−９３、ｍｉＲ−２９ｂ、ｍｉＲ−２９ａ、ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１８２ｓ、ｍｉＲ−１８２ａｓ、ｍｉＲ−１８３、ｍｉＲ−１２９−１、ｌｅｔ−７ａ−１、ｌｅｔ−７ｄ、ｌｅｔ−７ｆ−１、ｍｉＲ−２３ｂ、ｍｉＲ−２４−１、ｍｉＲ−２７ｂ、ｍｉＲ−３２、ｍｉＲ−１５９−１、ｍｉＲ−１９２、ｍｉＲ−１２５ｂ−１、ｌｅｔ−７ａ−２、ｍｉＲ−１００、ｍｉＲ−１９６−２、ｍｉＲ−１４８ｂ、ｍｉＲ−１９０、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−３０１、ｍｉＲ−１４２ｓ、ｍｉＲ−１４２ａｓ、ｍｉＲ−１０５−１、又はｍｉＲ−１７５ではない。さらなる態様において、固形癌は大腸癌であり、ｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−３０１、ｍｉＲ−１４２ａｓ、ｍｉＲ−１４２ｓ、ｍｉＲ−１９４、ｍｉＲ−２１５、又はｍｉＲ−３２ではない。他の態様において、固形癌は大腸癌であり、ｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ−１４８、ｍｉＲ−１０ａ、ｍｉＲ−１９６−１、ｍｉＲ−１５２、ｍｉＲ−１９６−２、ｍｉＲ−１４８ｂ、ｍｉＲ−１０ｂ、ｍｉＲ−１２９−１、ｍｉＲ−１５３−２、ｍｉＲ−２０２、ｍｉＲ−１３９、ｌｅｔ−７ａ、ｌｅｔ−７ｆ、又はｌｅｔ−７ｄではない。さらに他の態様において、固形癌は大腸癌であり、ｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ−１８１ｂ、ｍｉＲ−１８１ｃ、ｍｉＲ−１８１ｄ、ｍｉＲ−３０、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１６−２、ｍｉＲ−１５３−１、ｍｉＲ−２１７、ｍｉＲ−２０５、ｍｉＲ−２０４、ｍｉＲ−１０３、ｍｉＲ−１０７、ｍｉＲ−１２９−２、ｍｉＲ−９又はｍｉＲ−１３７ではない。
【００４５】
さらに他の態様において、固形癌は肺癌であり、試験試料中のｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２０５、ｍｉＲ−２００ｂ、ｍｉＲ−９−１、ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−１４８、ｍｉＲ−１４１、ｍｉＲ−１３２、ｍｉＲ−２１５、ｍｉＲ−１２８ｂ、ｌｅｔ−７ｇ、ｍｉＲ−１６−２.ｍｉＲ−１２９−１／２ｐｒｅｃ、ｍｉＲ−１２６＊
、ｍｉＲ−１４２−ａｓ、ｍｉＲ−３０ｄ、ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−７−２、ｍｉＲ−１９９ａ−１、ｍｉＲ−１２７、ｍｉＲ−３４ａ  ｐｒｅｃ、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−１３６、ｍｉＲ−２０２、ｍｉＲ−１９６−２、ｍｉＲ−１９９ａ−２、ｌｅｔ−７ａ−２、ｍｉＲ−１２４ａ−１、ｍｉＲ−１４９、ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｍｉＲ−１９６−１ｐｒｅｃ、ｍｉＲ−１０ａ、ｍｉＲ−９９ｂ  ｐｒｅｃ、ｍｉＲ−１９６−１、ｍｉＲ−１９９ｂ、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−１９５、ｍｉＲ−１５５及びそれらの組合せからなる群から選択される。
【００４６】
関連する態様において、固形癌は肺癌であり、少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ−１５ａ又はｍｉＲ−１６−１ではない。さらなる態様において、固形癌は肺癌であり、少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−１２６＊、ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−２０５、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１４０、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−２１８−２、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１０６ａ、ｍｉＲ−１９２、ｍｉＲ−２０３、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−２２０、ｍｉＲ−１９２、ｍｉＲ−２２４、ｍｉＲ−２４−２、ｍｉＲ−２１２、ｍｉＲ−９、ｍｉＲ−１７、ｍｉＲ−１２４ａ−１、ｍｉＲ−９５、ｍｉＲ−１９８、ｍｉＲ−２１６、ｍｉＲ−２１９−１、ｍｉＲ−１９７、ｍｉＲ−１２５ａ、ｍｉＲ−２６ａ−１、ｍｉＲ−１４６、ｍｉＲ−１９９ｂ、ｌｅｔ７ａ−２、ｍｉＲ−２７ｂ、ｍｉＲ−３２、ｍｉＲ−２９ｂ−２、ｍｉＲ−３３、ｍｉＲ−１８１ｃ、ｍｉＲ−１０１−１、ｍｉＲ−１２４ａ−３、ｍｉＲ−１２５ｂ−１又はｌｅｔ７ｆ−１ではない。他の態様において、固形癌は肺癌であり、少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ−１８１、ｍｉＲ−３０、ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−２０５、ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１０３、ｍｉＲ−１０７、ｍｉＲ−１２９、ｍｉＲ−１３７、ｍｉＲ−１８６、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１６−２、ｍｉＲ−１９５、ｍｉＲ−３４、ｍｉＲ−１５３、ｍｉＲ−２１７、ｍｉＲ−２０４、ｍｉＲ−２１１
、ｍｉＲ−９、ｍｉＲ−２１７、ｌｅｔ−７ａ−２又はｍｉＲ−３２ではない。さらなる態様において、固形癌は肺癌であり、ｍｉＲ遺伝子産物は、ｌｅｔ−７ｃ、ｌｅｔ−７ｇ、ｍｉＲ−７−３、ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−３１、ｍｉＲ−３４ａ−１、ｍｉＲ−ａ−２、ｍｉＲ−９９ａ、ｍｉＲ−１００、ｍｉＲ−１２５ｂ−２、ｍｉＲ−１３２、ｍｉＲ−１３５−１、ｍｉＲ−１９５、ｍｉＲ−３４、ｍｉＲ−１２３、ｍｉＲ−２０３ではない。他の態様において、固形癌は肺癌であり、ｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ−１５９−１又はｍｉＲ−１９２ではない。付け加わる態様において、固形癌は肺癌であり、ｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ−１８６、ｍｉＲ−１０１−１、ｍｉＲ−１９４、ｍｉＲ−２１５、ｍｉＲ−１０６ｂ、ｍｉＲ−２５、ｍｉＲ−９３、ｍｉＲ−２９ｂ、ｍｉＲ−２９ａ、ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１８２ｓ、ｍｉＲ−１８２ａｓ、ｍｉＲ−１８３、ｍｉＲ−１２９−１、ｌｅｔ−７ａ−１、ｌｅｔ−７ｄ、ｌｅｔ−７ｆ−１、ｍｉＲ−２３ｂ、ｍｉＲ−２４−１、ｍｉＲ−２７ｂ、ｍｉＲ−３２、ｍｉＲ−１５９−１、ｍｉＲ−１９２、ｍｉＲ−１２５ｂ−１、ｌｅｔ−７ａ−２、ｍｉＲ−１００、ｍｉＲ−１９６−２、ｍｉＲ−１４８ｂ、ｍｉＲ−１９０、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−３０１、ｍｉＲ−１４２ｓ、ｍｉＲ−１４２ａｓ、ｍｉＲ−１０５−１、又はｍｉＲ−１７５ではない。さらなる態様において、固形癌は肺癌であり、ｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−３０１、ｍｉＲ−１４２ａｓ、ｍｉＲ−１４２ｓ、ｍｉＲ−１９４、ｍｉＲ−２１５、又はｍｉＲ−３２ではない。他の態様において、固形癌は肺癌であり、ｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ−１４８、ｍｉＲ−１０ａ、ｍｉＲ−１９６−１、ｍｉＲ−１５２、ｍｉＲ−１９６−２、ｍｉＲ−１４８ｂ、ｍｉＲ−１０ｂ、ｍｉＲ−１２９−１、ｍｉＲ−１５３−２、ｍｉＲ−２０２、ｍｉＲ−１３９、ｌｅｔ−７ａ、ｌｅｔ−７ｆ、又はｌｅｔ−７ｄではない。さらに他の態様において、固形癌は肺癌であり、ｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ−１８１ｂ、ｍｉＲ−１８１ｃ、ｍｉＲ−１８１ｄ、ｍｉＲ−３０、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１６−２、ｍｉＲ−１５３−１、ｍｉＲ−２１７、ｍｉＲ−２０５、ｍｉＲ−２０４、ｍｉＲ−１０３、ｍｉＲ−１０７、ｍｉＲ−１２９−２、ｍｉＲ−９又はｍｉＲ−１３７ではない。
【００４７】
さらなる態様において、固形癌は膵癌であり、試験試料中の測定される少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ−１０３−１、ｍｉＲ−１０３−２、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−２０４及びそれらの組合せからなる群から選択される。関連する態様において、固形癌は膵癌であり、試験試料中のｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ−１０３−２、ｍｉＲ−１０３−１、ｍｉＲ−２４−２、ｍｉＲ−１０７、ｍｉＲ−１００、ｍｉＲ−１２５ｂ−２、ｍｉＲ−１２５ｂ−１、ｍｉＲ−２４−１、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−２３ａ、ｍｉＲ−２６ａ−１、ｍｉＲ−１２５ａ、ｍｉＲ−１３０ａ、ｍｉＲ−２６ｂ、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−１２６＊、ｍｉＲ−１６−２、ｍｉＲ−１４６、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−９９ｂ、ｍｉＲ−１２８ｂ、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−２９ｂ−２、ｍｉＲ−２９ａ、ｍｉＲ−２５、ｍｉＲ−１６−１、ｍｉＲ−９９ａ、ｍｉＲ−２２４、ｍｉＲ−３０ｄ、ｍｉＲ−９２−２、ｍｉＲ−１９９ａ−１、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−２９ｃ、ｍｉＲ−３０ｂ、ｍｉＲ−１２９−１／２、ｍｉＲ−１９７、ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｃ、ｍｉＲ−７−１、ｍｉＲ−９３−１、ｍｉＲ−１４０、ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１３２、ｍｉＲ−１８１ｂ−１、ｍｉＲ−１５２ｐｒｅｃ、ｍｉＲ−２３ｂ、ｍｉＲ−２０ａ、ｍｉＲ−２２２、ｍｉＲ−２７ａ、ｍｉＲ−９２−１、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１２９−１／２ｐｒｅｃ、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−３２、ｍｉＲ−１０６ａ、ｍｉＲ−２９ｂ−１及びそれらの組合せからなる群から選択される。１態様において、固形癌は膵癌であり、ｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ−１５ａ又はｍｉＲ−１６−１ではない。他の態様において、固形癌は膵癌であり、ｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ−１５９−１又はｍｉＲ−１９２ではない。付け加わる態様において、固形癌は膵癌であり、ｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ−１８６、ｍｉＲ−１０１−１、ｍｉＲ−１９４、ｍｉＲ−２１５、ｍｉＲ−１０６ｂ、ｍｉＲ−２５、ｍｉＲ−９３、ｍｉＲ−２９ｂ、ｍｉＲ−２９ａ、ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１８２ｓ、ｍｉＲ−１８２ａｓ、ｍｉＲ−１８３、ｍｉＲ−１２９−１、ｌｅｔ−７ａ−１、ｌｅｔ−７ｄ、ｌｅｔ−７ｆ−１、ｍｉＲ−２３ｂ、ｍｉ
Ｒ−２４−１、ｍｉＲ−２７ｂ、ｍｉＲ−３２、ｍｉＲ−１５９−１、ｍｉＲ−１９２、ｍｉＲ−１２５ｂ−１、ｌｅｔ−７ａ−２、ｍｉＲ−１００、ｍｉＲ−１９６−２、ｍｉＲ−１４８ｂ、ｍｉＲ−１９０、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−３０１、ｍｉＲ−１４２ｓ、ｍｉＲ−１４２ａｓ、ｍｉＲ−１０５−１、又はｍｉＲ−１７５ではない。さらなる態様において、固形癌は膵癌であり、ｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−３０１、ｍｉＲ−１４２ａｓ、ｍｉＲ−１４２ｓ、ｍｉＲ−１９４、ｍｉＲ−２１５、又はｍｉＲ−３２ではない。他の態様において、固形癌は膵癌であり、ｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ−１４８、ｍｉＲ−ｌ０ａ、ｍｉＲ−１９６−１、ｍｉＲ−１５２、ｍｉＲ−１９６−２、ｍｉＲ−１４８ｂ、ｍｉＲ−１０ｂ、ｍｉＲ−１２９−１、ｍｉＲ−１５３−２、ｍｉＲ−２０２、ｍｉＲ−１３９、ｌｅｔ−７ａ、ｌｅｔ−７ｆ、又はｌｅｔ−７ｄではない。さらに他の態様において、固形癌は膵癌であり、ｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ−１８１ｂ、ｍｉＲ−１８１ｃ、ｍｉＲ−１８１ｄ、ｍｉＲ−３０、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１６−２、ｍｉＲ−１５３−１、ｍｉＲ−２１７、ｍｉＲ−２０５、ｍｉＲ−２０４、ｍｉＲ−１０３、ｍｉＲ−１０７、ｍｉＲ−１２９−２、ｍｉＲ−９又はｍｉＲ−１３７ではない。
【００４８】
他の態様において、固形癌は前立腺癌であり、試験試料中のｍｉＲ遺伝子産物は、ｌｅｔ−７ｄ、ｍｉＲ−１２８ａ  ｐｒｅｃ、ｍｉＲ−１９５、ｍｉＲ−２０３、ｌｅｔ−７ａ−２ｐｒｅｃ、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−２０ａ、ｍｉＲ−２１８−２、ｍｉＲ−２９ａ、ｍｉＲ−２５、ｍｉＲ−９５、ｍｉＲ−１９７、ｍｉＲ−１３５−２、ｍｉＲ−１８７、ｍｉＲ−１９６−１、ｍｉＲ−１４８、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−２１、ｌｅｔ−７ｉ、ｍｉＲ−１９８、ｍｉＲ−１９９ａ−２、ｍｉＲ−３０ｃ、ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｍｉＲ−９２−２、ｍｉＲ−１４６、ｍｉＲ−１８１ｂ−１ｐｒｅｃ、ｍｉＲ−３２、ｍｉＲ−２０６、ｍｉＲ−１８４ｐｒｅｃ、ｍｉＲ−２９ａ  ｐｒｅｃ、ｍｉＲ−２９ｂ−２、ｍｉＲ−１４９、ｍｉＲ−１８１ｂ−１、ｍｉＲ−１９６−１ｐｒｅｃ、ｍｉＲ−９３−１、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−１６−１、ｍｉＲ−１０１−１、ｍｉＲ−１２４ａ−１、ｍｉＲ−２６ａ−１、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−２７ａ、ｍｉＲ−２４−１、ｍｉＲ−１０６ａ、ｍｉＲ−１９９ａ−１及びそれらの組合せからなる群から選択される。関連する態様において、固形癌は前立腺癌であり、ｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ−１５ａ又はｍｉＲ−１６−１ではない。他の態様において、固形癌は前立腺癌であり、ｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ−１５９−１又はｍｉＲ−１９２ではない。付け加わる態様において、固形癌は前立腺癌であり、ｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ−１８６、ｍｉＲ−１０１−１、ｍｉＲ−１９４、ｍｉＲ−２１５、ｍｉＲ−１０６ｂ、ｍｉＲ−２５、ｍｉＲ−９３、ｍｉＲ−２９ｂ、ｍｉＲ−２９ａ、ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１８２ｓ、ｍｉＲ−１８２ａｓ、ｍｉＲ−１８３、ｍｉＲ−１２９−１、ｌｅｔ−７ａ−１、ｌｅｔ−７ｄ、ｌｅｔ−７ｆ−１、ｍｉＲ−２３ｂ、ｍｉＲ−２４−１、ｍｉＲ−２７ｂ、ｍｉＲ−３２、ｍｉＲ−１５９−１、ｍｉＲ−１９２、ｍｉＲ−１２５ｂ−１、ｌｅｔ−７ａ−２、ｍｉＲ−１００、ｍｉＲ−１９６−２、ｍｉＲ−１４８ｂ、ｍｉＲ−１９０、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−３０１、ｍｉＲ−１４２ｓ、ｍｉＲ−１４２ａｓ、ｍｉＲ−１０５−１、又はｍｉＲ−１７５ではない。さらなる態様において、固形癌は前立腺癌であり、ｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−３０１、ｍｉＲ−１４２ａｓ、ｍｉＲ−１４２ｓ、ｍｉＲ−１９４、ｍｉＲ−２１５、又はｍｉＲ−３２ではない。他の態様において、固形癌は前立腺癌であり、ｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ−１４８、ｍｉＲ−１０ａ、ｍｉＲ−１９６−１、ｍｉＲ−１５２、ｍｉＲ−１９６−２、ｍｉＲ−１４８ｂ、ｍｉＲ−１０ｂ、ｍｉＲ−１２９−１、ｍｉＲ−１５３−２.ｍｉＲ−２０２、ｍｉＲ−１３９、ｌｅｔ−７ａ、ｌｅｔ−
７ｆ、又はｌｅｔ−７ｄではない。さらに他の態様において、固形癌は前立腺癌であり、ｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ−１８１ｂ、ｍｉＲ−１８１ｃ、ｍｉＲ−１８１ｄ、ｍｉＲ−３０、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１６−２、ｍｉＲ−１５３−１、ｍｉＲ−２１７、ｍｉＲ−２０５、ｍｉＲ−２０４、ｍｉＲ−１０３、ｍｉＲ−１０７、ｍｉＲ−１２９−２、ｍｉＲ−９又はｍｉＲ−１３７ではない。
【００４９】
さらに他の態様において、固形癌は胃癌であり、試験試料中のｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２１８−２、ｍｉＲ−１０３−２、ｍｉＲ−９２−２、ｍｉＲ−２５、ｍｉＲ−１３６、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−１２５ｂ−２、ｍｉＲ−１０３−１、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−２２２、ｍｉＲ−２１２ｐｒｅｃ、ｍｉＲ−１２５ｂ−１、ｍｉＲ−１００、ｍｉＲ−１０７、ｍｉＲ−９２−１、ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１９２、ｍｉＲ−２３ａ、ｍｉＲ−２１５、ｍｉＲ−７−２、ｍｉＲ−１３８−２、ｍｉＲ−２４−１、ｍｉＲ−９９ｂ、ｍｉＲ−３３ｂ、ｍｉＲ−２４−２及びそれらの組合せからなる群から選択される。関連する態様において、固形癌は胃癌であり、ｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ−１５ａ又はｍｉＲ−１６−１ではない。他の態様において、固形癌は胃癌であり、ｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ−１５９−１又はｍｉＲ−１９２ではない。付け加わる態様において、固形癌は胃癌であり、ｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ−１８６、ｍｉＲ−１０１−１、ｍｉＲ−１９４、ｍｉＲ−２１５、ｍｉＲ−１０６ｂ、ｍｉＲ−２５、ｍｉＲ−９３、ｍｉＲ−２９ｂ、ｍｉＲ−２９ａ、ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１８２ｓ、ｍｉＲ−１８２ａｓ、ｍｉＲ−１８３、ｍｉＲ−１２９−１、ｌｅｔ−７ａ−１、ｌｅｔ−７ｄ、ｌｅｔ−７ｆ−１、ｍｉＲ−２３ｂ、ｍｉＲ−２４−１、ｍｉＲ−２７ｂ、ｍｉＲ−３２、ｍｉＲ−１５９−１、ｍｉＲ−１９２、ｍｉＲ−１２５ｂ−１、ｌｅｔ−７ａ−２、ｍｉＲ−１００、ｍｉＲ−１９６−２、ｍｉＲ−１４８ｂ、ｍｉＲ−１９０、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−３０１、ｍｉＲ−１４２ｓ、ｍｉＲ−１４２ａｓ、ｍｉＲ−１０５−１、又はｍｉＲ−１７５ではない。さらなる態様において、固形癌は胃癌であり、ｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−３０１、ｍｉＲ−１４２ａｓ、ｍｉＲ−１４２ｓ、ｍｉＲ−１９４.、ｍｉＲ−２１５、又はｍｉＲ−３２ではない。
他の態様において、固形癌は胃癌であり、ｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ−１４８、ｍｉＲ−１０ａ、ｍｉＲ−１９６−１、ｍｉＲ−１５２、ｍｉＲ−１９６−２、ｍｉＲ−１４８ｂ、ｍｉＲ−１０ｂ、ｍｉＲ−１２９−１、ｍｉＲ−１５３−２、ｍｉＲ−２０２、ｍｉＲ−１３９、ｌｅｔ−７ａ、ｌｅｔ−７ｆ、又はｌｅｔ−７ｄではない。さらに他の態様において、固形癌は胃癌であり、ｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ−１８１ｂ、ｍｉＲ−１８１ｃ、ｍｉＲ−１８１ｄ、ｍｉＲ−３０、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１６−２、ｍｉＲ−１５３−１、ｍｉＲ−２１７、ｍｉＲ−２０５、ｍｉＲ−２０４、ｍｉＲ−１０３、ｍｉＲ−１０７、ｍｉＲ−１２９−２、ｍｉＲ−９又はｍｉＲ−１３７ではない。
【００５０】
少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物のレベルは、被験者から得られた生体試料（例えば、細胞、組織）で測定することができる。例えば、組織試料（例えば腫瘍から）は、従来の生検技法により固形癌を有すると疑われる被験者から取り出すことができる。他の態様においては、血液試料を被験者から取り出すことができ、また、血液細胞（例えば白血球）を、ＤＮＡ抽出の目的で標準的技法により単離することができる。血液又は組織試料は、放射線療法、化学療法又は他の治療処置の開始前に被験者から得ることが好ましい。対応する組織又は血液試料は、被験者の冒されていない組織から、正常なヒト個体又は正常個体集団から、又は被験者試料中の大部分の細胞に対応する培養細胞から得ることができる。次に、被験者の試料からの細胞中の所与のｍｉＲ遺伝子から生じたｍｉＲ遺伝子産物のレベルを、対照試料の細胞からの対応するｍｉＲ遺伝子産物と比較できるように、対照の組織又は血液試料を被験者からの試料と同様に処理する。生体試料のための参照ｍｉＲ発現標準も、対照として使用することができる。
【００５１】
対照試料中の対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルと比較して、被験者から得た試料中のｍｉＲ遺伝子産物のレベルが変化（例えば、上昇又は低下）していることは、被験者中に固形癌が存在することを示す。１態様において、試験試料中の少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物のレベルは、対照試料中の対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルを超える（即ち、ｍｉＲ遺伝子産物の発現は「上方制御」されている）。被験者の細胞又は組織中のｍｉＲ遺伝子産物の量が対照細胞又は組織中のｍｉＲ遺伝子産物の量を超えているとき、本明細
書においては、ｍｉＲ遺伝子の発現が「上方制御」されているという。他の態様においては、試験試料中の少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物のレベルが対照試料中の対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベル未満である（即ち、ｍｉＲ遺伝子産物の発現は「下方制御」されている）。被験者の細胞又は組織中のその遺伝子から生じたｍｉＲ遺伝子産物の量が対照細胞又は組織中の同じ遺伝子から生じた量未満であるとき、本明細書においては、ｍｉＲ遺伝子の発現が「下方制御」されているという。対照及び正常試料中における相対的ｍｉＲ遺伝子発現は１種又は２種以上のＲＮＡ発現標準を基準にして測定することができる。標準は、例えば、ゼロｍｉＲ遺伝子発現レベル、標準細胞系におけるｍｉＲ遺伝子発現レベル、被験者の冒されていない組織におけるｍｉＲ遺伝子発現レベル、又は正常ヒト集団について以前に得られたｍｉＲ遺伝子発現の平均レベルを含むことができる。
【００５２】
試料中のｍｉＲ遺伝子産物のレベルは、生体試料中のＲＮＡ発現レベルを検出するのに適当な任意の技法を使用して測定することができる。生体試料中（例えば、細胞、組織）のＲＮＡ発現レベルを測定するのに適当な任意の技法（例えば、ノーザンブロット分析、ＲＴ−ＰＣＲ、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション）は、当業者に周知である。特定の態様において、少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物のレベルは、ノーザンブロット分析を使用して検出される。例えば全細胞ＲＮＡは核酸抽出緩衝液の存在下でホモジナイズし、続いて遠心分離することにより精製することができる。核酸が沈澱し、ＤＮＡはデオキシリボヌクレアーゼ処理及び沈澱により除去することができる。次に標準的技法にしたがって、ＲＮＡ分子をアガロースゲル上のゲル電気泳動により分離して、ニトロセルロースフィルターに移す。次に加熱によりＲＮＡをフィルター上に固定する。特定のＲＮＡの検出及び定量は、問題にしているＲＮＡに相補的な適当に標識されたＤＮＡ又はＲＮＡプローブを使用して達成される。例えば、その開示全体を参照により組み込む、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９，Ｃｈａｐｔｅｒ  ７を参照されたい。
【００５３】
所与のｍｉＲ遺伝子産物のノーザンブロットハイブリダイゼーションに適したプローブは、表１ａ及び表１ｂに示した核酸配列から作製することができて、関心のあるｍｉＲ遺伝子産物に少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％。９９％の又は完全な相補性を有するプローブを含むがこれらに限定されない。標識されたＤＮＡ及びＲＮＡプローブの調製方法並びに標的ヌクレオチド配列の対するそれらのハイブリダイゼーション条件は、その開示全体を参照により本明細書に組み込む、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９，Ｃｈａｐｔｅｒ  １０及び１１に記載されている。
【００５４】
例として、核酸プローブは、例えば、３Ｈ、３２Ｐ、３３Ｐ、１４Ｃ、又は３５Ｓなどの放射性核種；重金属；標識されたリガンドに対する特異的結合対因子として機能し得るリガンド（例えば、ビオチン、アビジン又は抗体）；蛍光性分子；化学発光性分子；酵素等で標識することができる。
【００５５】
プローブは、その開示全体を参照により本明細書に組み込むＲｉｇｂｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９７７），Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．１１３：２３７−２５１のニックトランスレーション法又はＦｉｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３），Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３２：６−１３のランダムプライミング法のいずれかにより、高特異的活性で標識することができる。
後者は、一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡ鋳型から高特異的活性３２Ｐ標識プローブの合成を選択
する方法である。例えば、ニックトランスレーション法により、予め存在するヌクレオチドを高放射性ヌクレオチドで置き換えることにより、１０８ｃｐｍ／マイクログラムを超える十分な特異的活性を有する３２Ｐ標識核酸プローブを調製することが可能である。次に、ハイブリダイズさせたフィルターを写真フィルムに露光させることにより、ハイブリダイゼーションのオートラジオグラフィ検出を実施することができる。ハイブリダイズさせたフィルターにより露光させた写真フィルムをデンシトメトリー走査して、ｍｉＲ遺伝子転写レベルを正確に測定できる。ｍｉＲ遺伝子転写レベルは、他の手法を使用して、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪから入手できるＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  ４００−Ｂ  ２Ｄ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒなどのコンピューター画像処理システムにより定量することができる。
【００５６】
ＤＮＡ又はＲＮＡプローブの放射性核種標識が実際的でない場合には、プローブ分子中に類似体、例えば、ｄＴＴＰ類似体５−（Ｎ−（Ｎ−ビオチニル−ε−アミノカプロイル）−３−アミノアリル）デオキシウリジン三リン酸を組み込むランダムプライマー法を使用することができる。ビオチン化されたプローブオリゴヌクレオチドは、蛍光色素又は発色反応を生ずる酵素と結合させたアビジン、ストレプトアビジン、及び抗体（例えば抗ビオチン抗体）などのビオチン結合タンパク質との反応により検出することができる。
【００５７】
ノーザン及び他のＲＮＡハイブリダイゼーション技法に加えて、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション技法を使用して、ＲＮＡ転写レベルの測定を実施することができる。この技法は、ノーザンブロット技法よりも必要とされる細胞が少なく、顕微鏡カバーグラス上に細胞を丸ごと付着させて、放射性又は他の方法で標識された核酸（例えばｃＤＮＡ又はＲＮＡ）プローブを含む溶液で、細胞の核酸含有量を調べることを含む。この技法は、被験者からの組織生検試料の分析に特に適している。ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション技法の実行法は、その開示全体を参照により本明細書に組み込む米国特許第５，４２７，９１６号中により詳細に記載されている。所与のｍｉＲ遺伝子産物のｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション技法に適したプローブは、表１ａ及び表１ｂに示した核酸配列から作製することができ、上記のように、関心のあるｍｉＲ遺伝子産物に少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％。９９％の又は完全な相補性を有するプローブを含むが、これらに限定されない。
【００５８】
細胞中のｍｉＲ遺伝子転写物の相対的数は、ｍｉＲ遺伝子転写物の逆転写とそれに続くポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）による逆転写された転写物の増幅より測定することもできる。ｍｉＲ遺伝子転写物のレベルは、内部標準、例えば、同一試料中に存在する「ハウスキーピング」遺伝子からのｍＲＮＡのレベルと比較して定量することができる。内部標準として適当な「ハウスキーピング」遺伝子は、例えば、ミオシン又はグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ３ＰＤＨ）を含む。定量的及び半定量的ＲＴ−ＰＣＲ、及びその変法を実施する方法は、当業者に周知である。
【００５９】
ある場合に、試料中の複数の異なるｍｉＲ遺伝子産物の発現レベルを同時に測定することが望ましいことがある。他の場合に、癌に関係するすべての既知のｍｉＲ遺伝子の転写物の発現レベルを測定することが望ましいことがある。数百のｍｉＲ遺伝子又は遺伝子産物に対する癌特異的発現レベルを評価することは、時間がかかり、大量の全ＲＮＡ（例えば、各ノーザンブロットについて少なくとも２０μｇ）を必要とし、放射性同位体を必要とするオートラジオグラフ技法が必要となる。
【００６０】
これらの制限を乗り越えるために、マイクロチップフォーマット（即ちマイクロアレイ）における、１揃いのｍｉＲ遺伝子に特異的な１揃いのオリゴヌクレオチド（例えばオリゴデオキシヌクレオチド）を含むオリゴライブラリーを構築することができる。そのようなマイクロアレイを使用して、ＲＮＡを逆転写して１揃いの標的オリゴデオキシヌクレオ
チドを生じさせてそれをハイブリダイズさせてマイクロアレイ上のオリゴヌクレオチドを調べ、ハイブリダイゼーション又は発現プロファイルを生じさせることにより、生体試料中の多数のマイクロＲＮＡの発現レベルを測定することができる。次に、試験試料のハイブリダイゼーションプロファイルを対照試料のものと比較して、固形癌細胞中でどのマイクロＲＮＡが変化した発現レベルを有するかを決定することができる。本明細書で使用する「プローブオリゴヌクレオチド」又は「プローブデオキシオリゴヌクレオチド」は、標的オリゴヌクレオチドとハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドを指す。「標的オリゴヌクレオチド」又は「標的オリゴデオキシヌクレオチド」は、（例えば、ハイブリダイゼーションにより）検出されるべき分子を指す。「ｍｉＲ特異的プローブオリゴヌクレオチド」又は「ｍｉＲに対して特異的なプローブオリゴヌクレオチド」は、特定のｍｉＲ遺伝子産物又は特定のｍｉＲ遺伝子産物の逆転写物にハイブリダイズするように選択された配列を有するプローブオリゴヌクレオチドを意味する。
【００６１】
特定試料の「発現プロファイル」又は「ハイブリダイゼーションプロファイル」は、本質的に試料の状態の指紋であり、２つの状態が、何らかの特定の遺伝子を同様に発現させ得るが、多数の遺伝子を同時に評価することは、細胞の状態に固有の遺伝子発現プロファイルの生成を可能にする。即ち、正常組織を癌性の（例えば腫瘍）組織と区別することができて、また癌性組織において、異なる予後の状態（例えば、良好又は不良の長期生存予想）を決定することができる。異なった状態の固形癌組織の発現プロファイルを比較することにより、これらの状態の各々においてどの遺伝子が重要であるか（遺伝子の上方及び下方制御の両方を含めて）に関する情報が得られる。固形癌組織中で差次的に発現している配列並びに異なる予後の結果を生ずる差次的発現の同定は、多くの方法でのこの情報の使用を可能にする。例えば、特定の治療計画を評価することができる（例えば、特定の患者で化学療法の薬剤が長期予後を改善するように作用するかどうか決定すること）。同様に、患者の試料と既知の発現プロファイルとを比較することにより、診断をすること又は確認することができる。さらに、これらの発現プロファイル（又は個々の遺伝子）は、固形癌発現プロファイルを抑制し又は不良の予後プロファイルをより良い予後プロファイルに変換する薬剤候補のスクリーニングを可能にする。
【００６２】
したがって、本発明は、被験者から得た試験試料からのＲＮＡを逆転写して、１揃いの標的オリゴデオキシヌクレオチドを提供し、標的オリゴデオキシヌクレオチドを、ｍｉＲＮＡ特異的プローブを含むマイクロアレイにハイブリダイズさせて試験試料についてのハイブリダイゼーションプロファイルを提供し、試験試料のハイブリダイゼーションプロファイルと対照試料又は参照標準から生じさせたハイブリダイゼーションプロファイルとを比較することを含む、少なくとも１種のｍｉＲＮＡのシグナルの変化が、被験者は固形癌を有するか又は発生させる危険性があるかのいずれかであることを示す、被験者が固形癌を有する又は発生させる危険性があるかどうかを診断する方法を提供する。１態様において、マイクロアレイは、全ての既知のヒトｍｉＲＮＡの実質的部分に対するｍｉＲＮＡ特異的プローブを含む。特定の態様において、マイクロアレイは、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−２９ｂ−２、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−１２８ｂ、ｍｉＲ−１９９ａ−１、ｍｉＲ−２４−１、ｍｉＲ−２４−２、ｍｉＲ−１４６、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１８１ｂ−１、ｍｉＲ−２０ａ、ｍｉＲ−１０７、ｍｉＲ−３２、ｍｉＲ−９２−２、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−３０ｃ、ｍｉＲ−２５、ｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−１０６ａ及びそれらの組合せからなる群から選択される１種又は２種以上のｍｉＲＮＡに対するｍｉＲＮＡ特異的プローブオリゴヌクレオチドを含む。
【００６３】
マイクロアレイは、既知のｍｉＲＮＡ配列から生成させた遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブから調製することができる。アレイは、各ｍｉＲＮＡについて、１つは活性な成熟配列を含む、他方はｍｉＲＮＡの前駆体に対して特異的である、２つの異なったオリゴヌクレオチドプローブを含むことができる。アレイはヒトのオルソログと２〜３塩基
だけ相違する１種又は２種以上のマウス配列などの対照を含むことができ、それはストリンジェントな条件のハイブリダイゼーションのための対照として役立ち得る。両方の種からのｔＲＮＡ又は他のＲＮＡｓ（例えば、ｒＲＮＡｓ、ｍＲＮＡｓ）をマイクロチップ上にプリントして、特異的ハイブリダイゼーションのための比較的安定な陽性内部標準として提供することもできる。非特異的ハイブリダイゼーションのための１つ又は２つ以上の適当な対照を、マイクロチップ上に含ませることもできる。この目的のために、配列は、如何なる既知のｍｉＲＮＡとも何らの相同性もないことを根拠に選択される。
【００６４】
マイクロアレイは、当技術分野において既知の技法を使用して作製することができる。例えば、適当な鎖長、例えば、４０ヌクレオチドのプローブオリゴヌクレオチドは、Ｃ６位で５’アミン修飾され、市販で入手可能なマイクロアレイシステム、例えば、ＧｅｎｅＭａｃｈｉｎｅ  ＯｍｎｉＧｒｉｄ（登録商標）１００Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｅｒ及びＡｍｅｒｓｈａｍ  ＣｏｄｅＬｉｎｋ（登録商標）活性化スライドを使用してプリントされる。標的ＲＮＡに対応する標識されたｃＤＮＡオリゴマーは、標識されたプライマーを用いて標的ＲＮＡを逆転写することにより調製することができる。第一鎖合成に続き、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを変性して、ＲＮＡ鋳型を分解する。このようにして調製された標識標的ｃＤＮＡは、次にハイブリダイズ条件下、例えば、６×ＳＳＰＥ／３０％ホルムアミド中２５℃で１８時間マイクロアレイチップにハイブリダイズさせ、続いて０．７５×ＴＮＴ（トリスＨＣｌ／ＮａＣｌ／ツイーン２０）中３７℃で４０分間洗浄する。固定化されたプローブＤＮＡが試料中の相補性の標的ｃＤＮＡを認識するマイクロアレイ上の位置で、ハイブリダイゼーションが起こる。標識された標的ｃＤＮＡは結合が起こるアレイ上の正確な位置をマークして、自動検出及び定量を可能にする。出力はハイブリダイゼーション事象のリストからなり、特異的ｃＤＮＡ配列の相対的存在量、したがって患者試料中の対応する相補性ｍｉＲの相対的存在量を示す。１態様によれば、標識されたｃＤＮＡオリゴマーは、ビオチン標識されたプライマーから調製されたビオチン標識ｃＤＮＡである。次に、マイクロアレイは、例えば、Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−Ａｌｅｘａ６４７複合体を使用してビオチン含有転写物の直接検出により処理され、従来の走査法を使用して走査される。アレイ上の各スポットの像強度は、患者試料中の対応するｍｉＲの存在量に比例する。
【００６５】
アレイの使用は、ｍｉＲＮＡ発現検出について幾つかの利点を有する。第一に、数百種の遺伝子の全体的発現を、同一試料で１時点で同定することができる。第二に、オリゴヌクレオチドプローブの注意深い設計を通して成熟及び前駆体分子両者の発現を同定することができる。第三に、ノーザンブロット分析と比較して、チップに必要なＲＮＡは少量で、２．５μｇの全ＲＮＡを使用して再現性ある結果が得られる。比較的限られた数のｍｉＲＮＡ（種当たり２００〜３００）で、各々に対して別々のオリゴヌクレオチドプローブを使用して、数種類の種に対する共通のマイクロアレイの構築が可能である。そのような手段は、種々の条件下における既知の各ｍｉＲについての種を越えた発現の分析を可能にするであろう。
【００６６】
特定のｍｉＲの定量的発現レベルアッセイのための使用に加えて、ｍｉＲ発現パターン分析のために、ｍｉＲＮｏｍｅの実質的部分、好ましくは全ｍｉＲＮｏｍｅに対応するｍｉＲＮＡ特異的プローブオリゴヌクレオチドを含むマイクロチップを使用して、ｍｉＲ遺伝子発現プロファイリングを実施することができる。別々のｍｉＲサインが、確立された疾患マーカー、又は直接的に疾患状態と関連し得る。
【００６７】
本明細書に記載した発現プロファイル法により、癌（例えば固形癌）を有すると疑われる被験者の試料からの全ＲＮＡは、定量的に逆転写されて、試料中のＲＮＡに相補性の１揃いの標的オリゴヌクレオチドを提供する。次に、標的オリゴデオキシヌクレオチドをｍｉＲＮＡ特異的プローブオリゴヌクレオチドを含むマイクロアレイにハイブリダイズさせ
て、試料についてのハイブリダイゼーションプロファイルを提供する。結果は、試料中のｍｉＲＮＡの発現パターンを表す、試料についてのハイブリダイゼーションプロファイルである。ハイブリダイゼーションプロファイルは、試料からの標的オリゴデオキシヌクレオチドの、マイクロアレイ中のｍｉＲＮＡ特異的プローブオリゴヌクレオチドへの結合からのシグナルを含む。プロファイルは結合の存在の有無（シグナル対ゼロシグナル）として記録することができる。より好ましくは、記録されたプロファイルは、各ハイブリダイゼーションからのシグナル強度を含む。プロファイルは、正常、即ち非癌性の対照試料から生成させたハイブリダイゼーションプロファイルと比較される。シグナルの変化は被験者における癌の存在、又は癌を発生させる傾向を示す。
【００６８】
ｍｉＲ遺伝子発現を測定する他の技法も、当技術分野内であり、ＲＮＡ転写及び分解の速度を測定する種々の技法を含む。
【００６９】
本発明は、被験者からの試験試料中の、固形癌における特定の予後（例えば、良好即ち肯定的な予後又は不良即ち不利な予後）に関連する少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物のレベルを測定することを含む、固形癌を有する被験者の予後を決定する方法も提供する。これらの方法により、対照試料中の対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルと比較した、試験試料中の特定の予後に関連するｍｉＲ遺伝子産物のレベルの変化は、被験者が特定の予後の固形癌を有することを示す。１態様において、ｍｉＲ遺伝子産物は、不利な（即ち不良の）予後に関連する。不利な予後の例には、低い生存率及び急速な疾患の進行が挙げられるが、これらに限定されない。ある態様において、少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物のレベルは、被験者から得た試験試料からのＲＮＡを逆転写して１揃いの標的オリゴヌクレオチドを提供し、その標的オリゴヌクレオチドをｍｉＲＮＡ特異的プローブオリゴヌクレオチドを含むマイクロアレイにハイブリダイズさせて試験試料に対するハイブリダイゼーションプロファイルを提供し、試験試料のハイブリダイゼーションプロファイルと対照試料から生成させたハイブリダイゼーションプロファイルとを比較することにより測定される。
【００７０】
如何なる１つの学説にも拘束されることは望まず、細胞中における１種又は２種以上のｍｉＲ遺伝子産物のレベルの変化は、これらのｍｉＲに対する１つ又は２つ以上の意図された標的の異常制御を生じ、それは固形癌の形成に至り得ると信じられる。したがって、ｍｉＲ遺伝子産物のレベルを変化させることにより（例えば、固形癌細胞中で上方制御されているｍｉＲ遺伝子産物のレベルを低下させることにより、固形癌細胞中で下方制御されているｍｉＲ遺伝子産物のレベルを上昇させることにより）、固形癌の治療に成功するかもしれない。
【００７１】
したがって、本発明は、被験者の癌細胞中で異常制御（例えば、下方制御、上方制御）されている固形癌を有する又は有すると疑われる被験者における腫瘍形成を抑制する方法を包含する。少なくとも１種の単離されたｍｉＲ遺伝子産物が癌細胞中で下方制御されているとき（例えば、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−２１８−２）、本発明の方法は、被験者中の癌細胞の増殖が抑制されるように、少なくとも１種の単離されたｍｉＲ遺伝子産物又はその単離された変形種若しくは生物活性フラグメントの有効量を投与することを含む。１態様において、投与される単離されたｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ−１５ａ又はｍｉＲ−１６−１ではない。他の態様において、ｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ−１５９−１又はｍｉＲ−１９２ではない。付け加わる態様において、ｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ−１８６、ｍｉＲ−１０１−１、ｍｉＲ−１９４、ｍｉＲ−２１５、ｍｉＲ−１０６ｂ、ｍｉＲ−２５、ｍｉＲ−９３、ｍｉＲ−２９ｂ、ｍｉＲ−２９ａ、ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１８２ｓ、ｍｉＲ−１８２ａｓ、ｍｉＲ−１８３、ｍｉＲ−１２９−１、ｌｅｔ−７ａ−１、ｌｅｔ−７ｄ、ｌｅｔ−７ｆ−１、ｍｉＲ−２３ｂ、ｍｉＲ−２４−１、ｍｉＲ−２７ｂ、ｍｉＲ−３２、ｍｉＲ−１５９−１、ｍｉＲ−１９２、ｍｉＲ−１２５
ｂ−１、ｌｅｔ−７ａ−２、ｍｉＲ−１００、ｍｉＲ−１９６−２、ｍｉＲ−１４８ｂ、ｍｉＲ−１９０、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−３０１、ｍｉＲ−１４２ｓ、ｍｉＲ−１４２ａｓ、ｍｉＲ−１０５−１、又はｍｉＲ−１７５ではない。さらなる態様において、ｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−３０１、ｍｉＲ−１４２ａｓ、ｍｉＲ−１４２ｓ、ｍｉＲ−１９４、ｍｉＲ−２１５、又はｍｉＲ−３２ではない。他の態様において、ｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ−１４８、ｍｉＲ−１０ａ、ｍｉＲ−１９６−１、ｍｉＲ−１５２、ｍｉＲ−１９６−２、ｍｉＲ−１４８ｂ、ｍｉＲ−１０ｂ、ｍｉＲ−１２９−１、ｍｉＲ−１５３−２、ｍｉＲ−２０２、ｍｉＲ−１３９、ｌｅｔ−７ａ、ｌｅｔ−７ｆ、又はｌｅｔ−７ｄではない。さらに他の態様において、ｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ−３０、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１６−２、ｍｉＲ−２１７、ｍｉＲ−２０５、ｍｉＲ−２０４、ｍｉＲ−１０３、ｍｉＲ−１０７、ｍｉＲ−９、及びｍｉＲ−１３７ではない。さらなる態様において、ｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１０ｂ、ｍｉＲ−１２５ｂ−１、ｍｉＲ−１２５ｂ−２、Ｉｅｔ７ａ−２、ｌｅｔ７ａ−３、ｌｅｔ−７ｄ、ｍｉＲ−１２２ａ、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−２０６、ｍｉＲ−２１０、ｌｅｔ−７ｉ、ｍｉＲ−００９−１（ｍｉＲ１３１−１）、ｍｉＲ−３４（ｍｉＲ−１７０）、ｍｉＲ−１０２（ｍｉＲ−２９ｂ）、ｍｉＲ−１２３（ｍｉＲ−１２６）、ｍｉＲ−１４０−ａｓ、ｍｉＲ−１２５ａ、ｍｉＲ−１９４、ｍｉＲ−２０４、ｍｉＲ−２１３、ｌｅｔ−７ｆ−２、ｍｉＲ−１０１、ｍｉＲ−１２８ｂ、ｍｉＲ−１３６、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−１４９、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−１９６−１、ｍｉＲ−１９６−２、ｍｉＲ−２０２、ｍｉＲ−１０３−１、又はｍｉＲ−３０ｃではない。他の態様において、ｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１２５ｂ−１、ｌｅｔ−７ａ−２、ｌｅｔ−７ｉ、ｍｉＲ−１００、ｌｅｔ−７ｇ、ｍｉＲ−３１、ｍｉＲ−３２ａ−１、ｍｉＲ−３３ｂ、ｍｉＲ−３４ａ−２、ｍｉＲ−１０１−１、ｍｉＲ−１３５−１、ｍｉＲ−１４２ａｓ、ｍｉＲ−１４２ｓ、ｍｉＲ−１４４、ｍｉＲ−３０１、ｍｉＲ−２９ｃ、ｍｉＲ−３０ｃ、ｍｉＲ−１０６ａ、又はｍｉＲ−２９ｂ−１ではない。
【００７２】
例えば、被験者中の癌細胞でｍｉＲ遺伝子産物が下方制御されているとき、有効量の単離されたｍｉＲ遺伝子産物を被験者に投与することにより、癌細胞の増殖を抑制できる。被験者に投与される単離されたｍｉＲ遺伝子産物は、癌細胞中で下方制御されている内因性野生型ｍｉＲ遺伝子産物（例えば、表１ａ又は表１ｂに示したｍｉＲ遺伝子産物）と同一であってよく、又はその変形種若しくは生物活性フラグメントであってよい。本明細書において定義するｍｉＲ遺伝子産物の「変形種」は、対応する野生型ｍｉＲ遺伝子産物と１００％未満の同一性を有し、対応する野生型ｍｉＲ遺伝子産物の１種又は２種以上の生物活性を有するｍｉＲＮＡを指す。そのような生物活性の例には、標的ＲＮＡ分子の発現の抑制（例えば、標的ＲＮＡ分子の翻訳の抑制、標的ＲＮＡ分子の安定性の変調、標的ＲＮＡ分子のプロセシングの抑制）及び固形癌に関連する細胞過程（例えば、細胞分化、細胞増殖、細胞死）の抑制が挙げられるが、これらに限定されない。これらの変形種は、種の変形種及びｍｉＲ遺伝子における１つ又は２つ以上の変異（例えば、置換、欠失、挿入）の結果である変形種を含む。ある態様において、変形種は、対応する野生型ｍｉＲ遺伝子産物と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％同一である。
【００７３】
本明細書において定義するｍｉＲ遺伝子産物の「生物活性フラグメント」は、対応する野生型ｍｉＲ遺伝子産物の１種又は２種以上の生物活性を有するｍｉＲ遺伝子産物のＲＮＡフラグメントを指す。上記のように、そのような生物活性の例には、標的ＲＮＡ分子の発現の抑制及び固形癌に関連する細胞過程の抑制が挙げられるが、これらに限定されない。ある態様において、生物活性フラグメントは、鎖長が少なくとも約５、７、１０、１２、１５、又は１７ヌクレオチドである。特定の態様において、単離されたｍｉＲ遺伝子産物は、１種又は２種以上の追加の抗癌治療と組み合わせて被験者に投与することができる。適当な抗癌治療は、化学療法、放射線療法及びそれらの組合せ（例えば化学放射線治療
）を含むが、これらに限定されない。
【００７４】
少なくとも１種の単離されたｍｉＲ遺伝子産物が癌細胞中で上方制御されているとき、本発明の方法は、固形癌細胞の増殖を抑制するように、少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物の発現を抑制するための有効量の少なくとも１種の、本明細書においてｍｉＲ遺伝子抑制化合物と称する化合物を被験者に投与することを含む。特定の態様において、少なくとも１種のｍｉＲ発現抑制化合物は、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−２９ｂ−２、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−１２８ｂ、ｍｉＲ−１９９ａ−１、ｍｉＲ−２４−１、ｍｉＲ−２４−２、ｍｉＲ−１４６、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１８１ｂ−１、ｍｉＲ−２０ａ、ｍｉＲ−１０７、ｍｉＲ−３２、ｍｉＲ−９２−２、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−３０ｃ、ｍｉＲ−２５、ｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−１０６ａ及びそれらの組合せからなる群から選択されるｍｉＲ遺伝子産物に対して特異的である。ｍｉＲ遺伝子発現抑制化合物は、１種又は２種以上の追加の抗癌治療と組み合わせて被験者に投与することができる。適当な抗癌治療は、化学療法、放射線療法及びそれらの組合せ（例えば化学放射線治療）を含むが、これらに限定されない。
【００７５】
本明細書で使用する「治療する」、「治療すること」及び「治療」は、疾患又は状態、例えば固形癌に関連する症状を寛解させることを指し、  疾患の症状の発症を防止し又は遅延させること、及び／又は疾患又は状態の症状の重症度又は頻度を軽減することを含む。用語「被験者」、「患者」及び「個体」は、本明細書では、霊長類、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギ、モルモット、ラット、マウス又は他のウシ類、ヒツジ類、ウマ類、イヌ類、ネコ類、齧歯類、又はネズミ類の種を含むと定義されるが、これらに限定されない哺乳動物などの動物を含む。好ましい態様において、動物はヒトである。
【００７６】
本明細書で使用する、単離されたｍｉＲ遺伝子産物の「有効量」は、固形癌に罹患している被験者中の癌細胞の増殖を抑制するのに十分な量である。当業者は、被験者のサイズ及び体重、疾患侵入の程度、被験者の年齢、健康状態及び性などの要因；投与経路；並びに投与が局所的か全身的かを考慮に入れることにより、所与の被験者に投与されるべきｍｉＲ遺伝子産物の有効量を容易に決定することができる。
【００７７】
例えば、単離されたｍｉＲ遺伝子産物の有効量は、治療されるべき腫瘍塊の概略の重量を基準にすることができる。腫瘍塊の概略の重量は、１立方センチメートルの体積が、ほぼ１グラムに等しいとき、腫瘍塊の概略の体積を計算することにより決定することができる。腫瘍塊の重量に基づいた単離されたｍｉＲ遺伝子産物の有効量は、約１０〜５００マイクログラム／グラム（腫瘍塊）の範囲であるとしてよい。ある態様において、腫瘍塊は、少なくとも約１０マイクログラム／グラム（腫瘍塊）、少なくとも約６０マイクログラム／グラム（腫瘍塊）又は少なくとも約１００マイクログラム／グラム（腫瘍塊）であり得る。
【００７８】
単離されたｍｉＲ遺伝子産物の有効量は、治療されるべき被験者の概略の又は推定体重量を基準にすることもできる。好ましくは、そのような有効量は、本明細書に記載したように、非経口的に又は経腸的に投与される。例えば、被験者に投与される単離されたｍｉＲ遺伝子産物の有効量は、約５〜３０００マイクログラム／ｋｇ（体重）、約７００〜１０００マイクログラム／ｋｇ（体重）、又は約１０００マイクログラム／ｋｇ（体重）を超える範囲であり得る。
【００７９】
当業者は、所与の被験者に対して、単離されたｍｉＲ遺伝子産物の概略の投与計画を容易に決定することもできる。例えば、ｍｉＲ遺伝子産物を被験者に１回で投与することができる（例えば、単回注射又はデポとして）。あるいは、ｍｉＲ遺伝子産物は、被験者に、約３から約２８日、より特別には約７から約１０日の期間、１日に１回又は２回投与す
ることができる。特定の投与計画では、ｍｉＲ遺伝子産物は７日間１日１回投与される。投与計画が多数回投与を含む場合、被験者に投与されるｍｉＲ遺伝子産物の有効量は、投与計画全体にわたって投与される遺伝子産物の合計量を含み得ると理解される。
【００８０】
本明細書で使用する「単離された」ｍｉＲ遺伝子産物は、合成された、又は改変された又は天然の状態からヒトが関与して取り出されたものである。例えば、合成ｍｉＲ遺伝子産物、又は天然状態の共存物質から部分的に若しくは完全に分離されたｍｉＲ遺伝子産物は、「単離された」と見なされる。単離されたｍｉＲ遺伝子産物は、実質的に精製された形態で存在することが可能であり、又はｍｉＲ遺伝子産物が送達された細胞内に存在することができる。したがって、細胞内に、意図的に送達された又は発現されたｍｉＲ遺伝子産物は、「単離されたｍｉＲ遺伝子産物と見なされる。ｍｉＲ前駆体分子から細胞内で産生されたｍｉＲ遺伝子産物も、「単離された」分子と見なされる。本発明により、本明細書に記載された単離されたｍｉＲ遺伝子産物は、被験者（例えばヒト）の固形癌を治療するための医薬の製造のために使用することができる。
【００８１】
単離されたｍｉＲ遺伝子産物は、多くの標準的技法を使用して得ることができる。例えば、ｍｉＲ遺伝子産物は、当技術分野において既知の方法を使用して、化学的に合成され、又は組換えにより産生させることができる。１態様において、ｍｉＲ遺伝子産物は、適当に保護されたリボヌクレオシドホスホルアミダイト及び従来のＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置を使用して、化学的に合成される。合成ＲＮＡ分子又は合成試薬の市販業者としては、例えば、Ｐｒｏｌｉｇｏ（ドイツ、Ｈａｍｂｕｒｇ）、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（米国、コロラド州Ｌａｆａｙｅｔｔｅ）、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｐｅｒｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅの部門、米国、イリノイ州Ｒｏｃｋｆｏｒｄ）、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（米国、バージニア州Ｓｔｅｒｌｉｎｇ）、ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ（米国、マサチューセッツ州Ａｓｈｌａｎｄ）及びＣｒｕａｃｈｅｍ（英国、Ｇｌａｓｇｏｗ）が挙げられる。
【００８２】
あるいは、ｍｉＲ遺伝子産物は、任意の適当なプロモーターを使用して、組換え環状又は線状ＤＮＡプラスミドから発現させることができる。プラスミドからＲＮＡを発現させる適当なプロモーターは、例えば、Ｕ６若しくはＨ１  ＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーター配列、又はサイトメガロウイルスプロモーターを含む。他の適当なプロモーターの選択は、当技術分野の内である。本発明の組換えプラスミドは、癌細胞中にｍｉＲ遺伝子産物の発現を誘導し得る又は調節し得るプロモーターを含むこともできる。
【００８３】
組換えプラスミドから発現されたｍｉＲ遺伝子産物は、標準的技法により、培養細胞発現系から単離することができる。  組換えプラスミドから発現されるｍｉＲ遺伝子産物は、癌細胞中に送達することも、及び癌細胞内で直接発現させることもできる。癌細胞にｍｉＲ遺伝子産物を送達する組換えプラスミドの使用は、下でより詳細に論ずる。
【００８４】
複数のｍｉＲ遺伝子産物は、別々の組換えプラスミドから発現させることができ、又はそれらは同一の組換えプラスミドから発現させることもできる。１態様において、ｍｉＲ遺伝子産物は、単一のプラスミドからＲＮＡ前駆体分子として発現させられて、その前駆体分子が、癌細胞中の現存するプロセシング系を含むが、これらに限定されない適当なプロセシング系により機能性ｍｉＲ遺伝子産物にプロセスされる。他の適当なプロセシング系には、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏショウジョウバエ細胞溶解物系（例えば、その開示全体を参照により本明細書に組み込むＴｕｓｃｈｌらの米国特許出願公開番号２００２／００８６３５６号に記載されているような）及び大腸菌リボヌクレアーゼＩＩＩ系（例えば、その開示全体を参照により本明細書に組み込むｙｏｕｎｇらの米国特許出願公開番号２００４／００１４１１３号に記載されているような）が含まれる。
【００８５】
ｍｉＲ遺伝子産物を発現させるために適したプラスミド、遺伝子産物を発現させるためにプラスミド中に核酸を挿入する方法、及び組換えプラスミドを関心ある細胞へ送達する方法の選択は、当技術分野の内である。例えば、その開示全体を参照により本明細書に組み込む、Ｚｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００２），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  ９：１３２７−１３３３；Ｔｕｓｃｈｌ（２００２），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：４４６−４４８；Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ  ｅｔ  ａｌ．（２００２），Ｓｃｉｅｎｃｅ
２９６：５５０−５５３；Ｍｉｙａｇｉｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００２），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：４９７−５００；Ｐａｄｄｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００２），Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１６：９４８−９５８；Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００２），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：５００−５０５；及びＰａｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００２），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：５０５−５０８を参照されたい。
【００８６】
１態様において、ｍｉＲ遺伝子産物を発現させるプラスミドは、ＣＭＶ即時初期プロモーターの制御下にｍｉＲ前駆体ＲＮＡをコードする配列を含む。本明細書で使用する、プロモーターの「制御下」は、ｍｉＲ遺伝子産物をコードする核酸配列が、プロモーターの３’に位置して、その結果プロモーターがｍｉＲ遺伝子産物をコードする配列の転写を開始し得ることを意味する。
【００８７】
ｍｉＲ遺伝子産物は、組換えウイルスベクターから発現させることもできる。ｍｉＲ遺伝子産物は、２つの別の組換えウイルスベクターから、又は同一のウイルスベクターから発現させることができることが考慮される。組換えウイルスベクターから発現されたＲＮＡは、培養細胞系から標準的技法により単離することができ、又は癌細胞内で直接発現させることができる。ｍｉＲ遺伝子産物を癌細胞に送達する組換えウイルスベクターの使用は下でより詳細に論ずる。
【００８８】
本発明の組換えウイルスベクターは、ｍｉＲ遺伝子産物をコードする配列及びＲＮＡ配列を発現させるための任意の適当プロモーターを含む。適当なプロモーターは、Ｕ６若しくはＨ１  ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーター配列、又はサイトメガロウイルスプロモーターを含むが、これらに限定されない。他の適当なプロモーターの選択は当技術分野の内である。本発明の組換えウイルスベクターは、癌細胞中でｍｉＲ遺伝子産物を発現させるための誘導可能な又は制御可能なプロモーターを含むこともできる。
【００８９】
ｍｉＲ遺伝子産物をコードする配列を受け入れられる任意のウイルスベクターを使用することができる；例えば、アデノウイルス（ＡＶ）；アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）；レトロウイルス（例えば、レンチウイルス（ＬＶ）、ラブドウイルス、マウス白血病ウイルス）；ヘルペスウイルス等に由来するベクターである。ウイルスベクターの指向性は、適宜、ベクターを他のウイルスからのエンベロープタンパク質若しくは他の表面抗原で偽型にすることにより、又は異なったウイルスのカプシドタンパク質を代わりに用いることにより改変することができる。
【００９０】
例えば、本発明のレンチウイルスベクターは、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、狂犬病、エボラ、モコラ等からの表面抗原で偽型にすることができる。本発明のＡＡＶベクターは、異なるカプシドタンパク質血清型を発現するようにベクターを操作することにより、異なった細胞を標的にするようにできる。例えば、血清型２ゲノム上の血清型２のカプシドを発現させるＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２／２と称される。ＡＡＶ２／２ベクター中のこの血清型２のカプシド遺伝子は、ＡＡＶ２／５ベクターを作製するために、血清型５のカプシド遺伝子により置き換えることができる。異なったカプシドタンパク質血清型を発現させるＡＡＶベクターを構築する技法は当技術分野の内である；例えば、その開示全体を参照により本明細書に組み込むＲａｂｉｎｏｗｉｔｚ，Ｊ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．（２
００２），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７６：７９１−８０１を参照されたい。
【００９１】
本発明で使用するために適当な組換えウイルスベクター、ＲＮＡを発現させるための核酸をベクター中に挿入する方法、ウイルスベクターを関心ある細胞に送達する方法、及び発現されたＲＮＡ産物を回収する方法の選択は、当技術分野の内である。例えば、その開示全体を参照により本明細書に組み込むＤｏｒｎｂｕｒｇ（１９９５），Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２:３０１−３１０；Ｅｇｌｉｔｉｓ（１９８８），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑ
ｕｅｓ６:６０８−６１４；Ｍｉｌｌｅｒ（１９９０），Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａ
ｐｙ  １:５−１４；及びＡｎｄｅｒｓｏｎ（１９９８），Ｎａｔｕｒｅ  ３９２：２５
−３０を参照されたい。
【００９２】
特に適当なウイルスベクターは、ＡＶ及びＡＡＶに由来するものである。ｍｉＲ遺伝子産物を発現させるための適当なＡＶベクター、組換えＡＶベクターを構築する方法、及びベクターを標的細胞に送達する方法は、その開示全体を参照により本明細書に組み込むＸｉａ  ｅｔ  ａｌ．（２００２），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ  ２０：１００６−１０１０に記載されている。ｍｉＲ遺伝子産物を発現させるための適当なＡＡＶベクター、組換えＡＡＶベクターを構築する方法、及びベクターを標的細胞に送達する方法は、その開示全体を参照により本明細書に組み込むＳａｍｕｌｓｋｉｅｔ  ａｌ．（１９８７），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１:３０９６−３１０１；Ｆｉｓｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６），Ｊ．
Ｖｉｒｏｌ．７０:５２０−５３２；Ｓａｍｕｌｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９），Ｊ
．Ｖｉｒｏｌ．６３:３８２２−３８２６；米国特許第５，２５２，４７９号；米国特許
第５，１３９，９４１号；国際特許出願ＷＯ９４／１３７８８号；及び国際特許出願ＷＯ
９３／２４６４１号記載されている。１態様において、ｍｉＲ遺伝子産物はＣＭＶ即時
初期プロモーターを含む単一の組換えＡＡＶベクターから発現される。
【００９３】
ある態様において、本発明の組換えＡＡＶウイルスベクターは、ヒトＵ６ＲＮＡプロモーターの制御下のポリＴ終止配列と作動接続しているｍｉＲ前駆体ＲＮＡをコードする核酸配列を含む。本発明で使用する「ポリＴ終止配列と作動接続している」は、センス又はアンチセンス鎖をコードする核酸配列が、ポリＴ終止シグナルに５’方向に直接隣接していることを意味する。ベクターからのｍｉＲ配列の転写中に、ポリＴ終止シグナルは、転写を終止させるように作用する。
【００９４】
本発明の治療方法の他の態様において、ｍｉＲ発現を抑制する少なくとも１種の化合物の有効量を被験者に投与することができる。本明細書で使用する「ｍｉＲ発現を抑制する」は、治療後のｍｉＲ遺伝子産物の前駆体及び／又は活性成熟形態の産生が治療の前に産生されていた量未満であるということを意味する。当業者は、例えば、診断方法について上で論じたｍｉＲ転写物レベルを測定する技法を使用して、癌細胞中でｍｉＲ発現が抑制されているかどうかを容易に測定することができる。抑制は、遺伝子発現のレベルで（即ち、ｍｉＲ遺伝子産物をコードするｍｉＲ遺伝子の転写を抑制することにより）又はプロセシングのレベルで（例えば、ｍｉＲ前駆体の成熟活性ｍｉＲへのプロセシングを抑制することにより）起こり得る。
【００９５】
本明細書で使用する、ｍｉＲ発現を抑制する化合物の「有効量」は、癌（例えば、固形癌）に罹患している被験者中の癌細胞の増殖を抑制するために十分な量である。当業者は、被験者のサイズ及び体重、疾患侵入の程度、被験者の年齢、健康状態及び性；投与経路；並びに投与が局所的か全身的かなどの要因を考慮に入れることにより、所与の被験者に投与されるべきｍｉＲ発現抑制化合物の有効量を容易に決定することができる。
【００９６】
例えば、発現抑制化合物の有効量は、本明細書に記載したように、治療されるべき腫瘍塊の概略の重量を基準にすることができる。ｍｉＲ発現を抑制する化合物の有効量は、本
明細書に記載したように、治療されるべき被験者の概略の又は推定体重も基準にすることができる。
【００９７】
当業者は、ｍｉＲ発現を抑制する化合物を所与の被験者に投与するための概略の投与計画も容易に決定することができる。
【００９８】
ｍｉＲ遺伝子発現を抑制する適当な化合物には、二本鎖ＲＮＡ（短鎖又は低分子干渉ＲＮＡ即ち「ｓｉＲＮＡ」など）、アンチセンス核酸、及びリボザイムなどの酵素的ＲＮＡ分子が含まれる。これらの化合物の各々は、所与のｍｉＲ遺伝子産物を標的とすることができて、標的ｍｉＲ遺伝子産物の発現に干渉する（例えば、その転写を抑制し、分解又は破壊を誘発する）ことができる。
【００９９】
例えば、所与のｍｉＲ遺伝子の発現は、ｍｉＲ遺伝子の少なくとも一部と少なくとも９０％、例えば、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列相同性を有する単離された二本鎖ＲＮＡ（「ｄｓＲＮＡ」）分子とｍｉＲ遺伝子とのＲＮＡ干渉を誘導することにより抑制することができる。特定の態様において、ｄｓＲNA分子は、「単鎖又は低分子干渉ＲＮＡ」即ち「ｓｉＲＮＡ」である。
【０１００】
本発明の方法で有用なｓｉＲＮＡは、鎖長約１７ヌクレオチドから約２９ヌクレオチド、好ましくは、約１９から約２５ヌクレオチドの短い二本鎖ＲＮＡ鎖を含む。このｓｉＲＮＡは、標準的なワトソン・クリック塩基対形成相互作用によりアニールされて一緒になった（以後「塩基対を形成した」）、センスＲＮＡ鎖及び相補性アンチセンスＲＮＡを含む。センス鎖は、標的ｍｉＲ遺伝子産物内に含まれる核酸配列に実質的に同一である核酸配列を含む。
【０１０１】
本明細書で使用する、標的ｍＲＮＡ内に含まれる標的配列に「実質的に同一」であるｓｉＲＮＡ中の核酸配列は、標的配列と同一である、又は標的配列と１又は２ヌクレオチドだけ相違する核酸配列である。ｓｉＲＮＡのセンス及びアンチセンス鎖は、２分子の相補性短鎖ＲＮＡを含むことができ、又は２つの相補性部分が塩基対を形成して短鎖「ヘアピン」領域により共有結合で結合され得る単一の分子を含むことができる。
【０１０２】
ｓｉＲＮＡは、１つ又は２つ以上のヌクレオチドの付加、欠失、置換及び／又は変異により、天然に生ずるＲＮＡと異なる変異ＲＮＡであってもよい。そのような変異は、ｓｉＲＮＡの末端への若しくはｓｉＲＮＡの１つ若しくは２つ以上の内部ヌクレオチドへの非ヌクレオチド物質の付加、又はｓｉＲＮＡをヌクレアーゼ消化に対して耐性にする改変、又はｓｉＲＮＡ中の１つ又は２つ以上のヌクレオチドのデオキシリボヌクレオチドによる置換を含み得る。
【０１０３】
ｓｉＲＮＡの一方又は両方の鎖は、３’オーバーハングも含み得る。本明細書で使用する「３’オーバーハング」は、デュープレックス化したＲＮＡ鎖の３’末端から伸びた少なくとも１つの不対ヌクレオチドを指す。したがって、ある態様において、ｓｉＲＮＡは、鎖長１から約６ヌクレオチド（リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドを含む）の、鎖長１から約５ヌクレオチドの、鎖長１から約４ヌクレオチドの、又は鎖長約２から約４ヌクレオチドの、少なくとも１つの３’オーバーハングを含む。特定の態様において、３’オーバーハングは、ｓｉＲＮＡ中の両方の鎖に存在し、鎖長２ヌクレオチドである。例えば、ｓｉＲＮＡ中の各鎖はジチミジン酸（「ＴＴ」）又はジウリジン酸（「ｕｕ」）の３’オーバーハングを含み得る。
【０１０４】
ｓｉＲＮＡは、単離されたｍｉＲ遺伝子産物について上で説明したように、化学的若しくは生物学的に産生させることができ、又は組換えプラスミド若しくはウイルスベクター
から発現させることができる。ｄｓＲＮＡ又はｓｉＲＮＡ分子を作製し、及び使用する代表的な方法は、Ｇｅｗｉｒｔｚの米国特許出願公開第２００２／０１７３４７８号及びＲｅｉｃｈらの米国特許出願第２００４／００１８１７６号に記載されており、これら両特許の開示全体を参照により本明細書に組み込む。
【０１０５】
所与のｍｉＲ遺伝子の発現は、アンチセンス核酸により抑制することもできる。本明細書で使用する「アンチセンス核酸」は、ＲＮＡ−ＲＮＡ、ＲＮＡ−ＤＮＡ又はＲＮＡ−ペプチド核酸相互作用により標的ＲＮＡに結合して、標的ＲＮＡの活性を変化させる核酸分子を指す。本発明の方法において使用するために適当なアンチセンス核酸は、通常、ｍｉＲ遺伝子産物中の隣接核酸配列に相補性の核酸配列を含む単鎖核酸（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡ−ＤＮＡキメラ、ペプチド核酸（ＰＮＡ））である。アンチセンス核酸は、ｍｉＲ遺伝子産物中の隣接核酸配列に５０〜１００％相補性、７５〜１００％相補性、又は９５〜１００％相補性の核酸配列を含む単鎖核酸を含み得る。ｍｉＲ遺伝子産物に対する核酸配列は、表１ａ及び表１ｂに示す。如何なる学説に捉われることも望まず、アンチセンス核酸は、ｍｉＲ遺伝子産物／アンチセンス核酸デュープレックスを消化するリボヌクレアーゼＨ又は他の細胞ヌクレアーゼを活性化すると信じられる。
【０１０６】
アンチセンス核酸は、核酸骨格又は糖及び塩基部分（又はそれらの等価体）の改変を含み、標的特異性、ヌクレアーゼ耐性、送達又は分子の有効性に関する他の特性を向上させることもできる。そのような改変は、コレステロール部分、アクリジンなどのデュープレックスのインターカレーター、又は１つ又は２つ以上のヌクレアーゼ耐性基を含む。
【０１０７】
アンチセンス核酸は、単離されたｍｉＲ遺伝子産物について上で説明したように、化学的若しくは生物学的に産生させることができ、又は組換えプラスミド若しくはウイルスベクターから発現させることができる。作製し及び試験する代表的な方法は、当技術分野の内である；例えば、その開示全体を参照により本明細書に組み込むＳｔｅｉｎ及びＣｈｅｎｇ（１９９３），Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１：１００４並びにＷｏｏｌｆらの米国特許第５，８４９，９０２号を参照されたい。
【０１０８】
所与のｍｉＲ遺伝子の発現は、酵素的核酸により抑制することもできる。本明細書で使用する「酵素的核酸」は、ｍｉＲ遺伝子産物の隣接核酸配列に相補性を有する基質結合領域を含み、且つｍｉＲ遺伝子産物を特異的に分解することができる核酸を指す。酵素的核酸の基質結合領域は、例えば、ｍｉＲ遺伝子産物の隣接核酸配列に、５０〜１００％相補性、７５〜１００％相補性、又は９５〜１００％相補性であってよい。酵素的核酸は、塩基、糖、及び／又はリン酸基に改変を含んでいてもよい。本発明の方法で使用する代表的な酵素的核酸はリボザイムである。
【０１０９】
酵素的核酸は、単離されたｍｉＲ遺伝子産物について上で説明したように、化学的若しくは生物学的に産生させることができ、又は組換えプラスミド若しくはウイルスベクターから発現させることができる。ｄｓＲＮＡ又はｓｉＲＮＡ分子を作製し、及び使用する代表的な方法は、それらの開示全体を参照により本明細書に組み込むＷｅｒｎｅｒ及びＵｈｌｅｎｂｅｃｋ（１９９５），Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３：２０９２−９６；Ｈａｍｍａｎｎ  ｅｔ ａｌ．（１９９９），Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．９：２５−３１；及びＣｅｃｈらの米国特許第４，９８７，０７１号に記載されている。
【０１１０】
少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物の、又はｍｉＲ発現を抑制する少なくとも１種の化合物の投与は、固形癌を有する被験者中の癌細胞の増殖を抑制するであろう。本明細書で使用する「癌細胞の増殖を抑制する」は、癌細胞を死滅させる、又は癌細胞の増殖を永久的に若しくは一時的に停止させるか若しくは遅延させることを意味する。ｍｉＲ遺伝子産
物又はｍｉＲ遺伝子発現抑制化合物の投与後に、被験者中の上記の細胞の数が一定に留まるか又は減少すれば、癌細胞の増殖の抑制を推定することができる。癌細胞増殖の抑制は、そのような細胞の絶対数が増加しても細胞増殖の速度が低下したならば、推定される。
【０１１１】
被験者の体内中の癌細胞の数は、直接測定により、又は原発若しくは転移腫瘍塊のサイズからの推定により測定することができる。例えば、被験者中の癌細胞の数は、免疫組織学的方法、フローサイトメトリー、又は癌細胞の特徴的な表面マーカーを検出するために考案された他の技法により、測定することができる。
【０１１２】
腫瘍塊のサイズは、直接的視覚観察により、又はＸ線、磁気共鳴イメージング、超音波、及びシンチグラフィーなどの診断用イメージング法により確認することができる。腫瘍塊のサイズを確認するために使用される診断用イメージング法は、当技術分野で既知の造影剤を用いて又は用いずに使用することができる。腫瘍塊のサイズは、組織塊の触診、カリパーなどの測定器による組織塊の測定などの物理的手段により確認することもできる。
【０１１３】
ｍｉＲ遺伝子産物又はｍｉＲ遺伝子発現抑制化合物は、これらの化合物を被験者の癌細胞に送達するために適した任意の手段により、被験者に投与することができる。例えば、ｍｉＲ遺伝子産物又はｍｉＲ遺伝子発現抑制化合物は、これらの化合物で又はこれらの化合物をコードする配列を含む核酸で、被験者の細胞をトランスフェクトするのに適当な方法により投与することができる。１態様において、細胞は、少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物をコードする配列を含むプラスミド若しくはウイルスベクター又はｍｉＲ遺伝子発現抑制化合物でトランスフェクトされる。
【０１１４】
真核細胞に対するトランスフェクションの方法は、当技術分野において周知であり、例えば、細胞の核又は前核中への核酸直接注入法；電気穿孔法；リポソーム移入又は親油性物質により媒介される移入法；受容体媒介核酸送達法；バイオバリスチック（ｂｉｏｂａｌｌｉｓｔｉｃ）即ち粒子加速法；リン酸カルシウム沈澱法、及びウイルスベクターにより媒介されるトランスフェクションが含まれる。
【０１１５】
例として、細胞はリポソーム移入化合物、例えば、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮなどのＤＯＴＡＰ（メチル硫酸Ｎ−［ｌ−（２，３−ジオレイロキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル−アンモニウム、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）又は等価体によりトランスフェクトすることができる。使用される核酸の量は、本発明の実施にとって決定的に重要なことではなく、０．１〜１００マイクログラム／１０５細胞の核酸で、一応満足できる結果を達成することができる。例えば、１０５細胞当たり３マイクログラムのＤＯＴＡＰ中に約０．５マイクログラムのプラスミドの比を使用することができる。
【０１１６】
ｍｉＲ遺伝子産物又はｍｉＲ遺伝子発現抑制化合物は、任意の適当な経腸若しくは非経口経路により被験者に投与することもできる。本発明の方法の適当な経腸経路は、例えば、経口、直腸内、又は鼻内送達を含む。適当な非経口経路には、例えば、血管内投与（例えば、静脈内大量瞬時注射、静脈内注入、動脈内大量瞬時注射、動脈内注入及び血管網へのカテーテル点滴注入）；組織周囲及び組織内注射（例えば、腫瘍周囲及び腫瘍内注射；網膜内注射；又は網膜下注射）；皮下注入（浸透圧ポンプによるなど）を含む皮下注射又はデポ；例えば、カテーテル又は他の留置デバイスによる対象組織への直接適用（例えば、多孔性、非多孔性、又はゼラチン状材料を含む、網膜ペレット剤又は座剤又はインプラント）；及び吸入が含まれる。特に適当な投与経路は、注射、注入及び腫瘍への直接注射である。
【０１１７】
本発明の方法において、ｍｉＲ遺伝子産物又はｍｉＲ遺伝子発現抑制化合物は、送達剤と組み合わせて裸のＲＮＡとして、又はｍｉＲ遺伝子産物若しくはｍｉＲ遺伝子発現抑制
化合物を発現する配列を含む核酸（例えば、組換えプラスミド又はウイルスベクター）としてのいずれかで、被験者に投与することができる。適当な送達剤には、例えば、Ｍｉｒｕｓ  Ｔｒａｎｓｉｔ  ＴＫＯ親油性試薬；リポフェクチン；リポフェクタミン；セルフェクチン；ポリカチオン（例えばポリリジン）、及びリポソームが含まれる。
【０１１８】
ｍｉＲ遺伝子産物又はｍｉＲ遺伝子発現抑制化合物を発現する配列を含む組換えプラスミド及びウイルスベクター、及びそのようなプラスミド及びベクターを送達する技法は、本明細書において論じられ及び／又は当技術分野において周知である。
【０１１９】
特定の態様において、ｍｉＲ遺伝子産物又はｍｉＲ遺伝子発現抑制化合物（又はそれらをコードする配列を含む核酸）を被験者に送達するために、リポソームが使用される。リポソームは、遺伝子産物又は核酸の血中半減期を増大させることもできる。本発明において使用するために適当なリポソームは、中性又は負に荷電したリン脂質及びコレステロールなどのステロールを通常含む標準的小胞形成脂質から形成させることができる。脂質の選択には、所望のリポソームサイズ及び血流中の半減期などの要因を考慮することが、一般に指針となる。リポソームを調製するために、種々の方法が知られており、例えば、それらの開示全体を参照により本明細書に組み込む、Ｓｚｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８０），Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．９：４６７；及び米国特許第４，２３５，８７１号、第４，５０１，７２８号、第４，８３７，０２８号及び第５，０１９，３６９号に記載されている。
【０１２０】
本発明の方法において使用されるリポソームは、リポソームを癌細胞に向かわせるリガンド分子を含むことができる。腫瘍細胞抗原に結合するモノクローナル抗体などの、癌細胞に優勢な受容体に結合するリガンドが好ましい。
【０１２１】
本発明の方法で使用するリポソームは、単核マクロファージ系（「ＭＭＳ」）及び細網内皮系（「ＲＥＳ」）によるクレアランスを回避するように改変することもできる。そのような改変リポソームは、表面上に又はリポソーム構造中に組み込まれたオプソニン化抑制部分を有する。特定の好ましい態様において、本発明のリポソームは，オプソニン化抑制部分及びリガンドの両方を含むことができる。
【０１２２】
本発明のリポソームの調製に使用するオプソニン化抑制部分は、リポソーム膜に結合された通常高分子量の親水性ポリマーである。オプソニン化抑制部分が、例えば、脂質に可溶性のアンカーのインターカレーションにより膜自体中に、又は膜脂質の活性基に直接結合することにより、膜に化学的に又は物理的に結びついているとき、本明細書では、オプソニン化抑制部分はリポソーム膜に「結合」しているという。これらのオプソニン化抑制親水性ポリマーは、例えばその開示全体を参照により本明細書に組み込む米国特許第４，９２０，０１６号に記載されているように、ＭＭＳ及びＲＥＳによるリポソームの取込みを顕著に減少させる保護表面層を形成する。
【０１２３】
リポソームを改変するために適したオプソニン化抑制部分は、約５００から約４０，０００ダルトン、より好ましくは約２，０００から約２０，０００ダルトンの数平均分子量を有する好ましくは水溶性のポリマーである。そのようなポリマーには、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又はポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）誘導体；例えば、メトキシＰＥＧ又はＰＰＧ、及びＰＥＧ又はＰＰＧステアレート；ポリアクリルアミド又はポリＮ−ビニルピロリドンなどの合成ポリマー； 線状、分岐、又はデンドリマー状ポリアミド
アミン；ポリアクリル酸；ポリアルコール、例えば、カルボキシル又はアミノ基が化学的に結合したポリビニルアルコール及びポリキシリトール並びにガングリオシドＧＭ１などのガングリオシドが含まれる。ＰＥＧのコポリマー、メトキシＰＥＧ、又はメトキシＰＰＧ、又はそれらの誘導体も適当である。それらに加えて、オプソニン化抑制ポリマーは、
ＰＥＧとポリアミノ酸、多糖、ポリアミドアミン、ポリエチレンアミン、又はポリヌクレオチドのいずれかとのブロックコポリマーであってよい。オプソニン化抑制ポリマーは、アミノ酸若しくはカルボン酸を含む天然多糖、例えば、ガラクツロン酸、グルクロン酸、マンヌロン酸、ヒアルロン酸、ペクチン酸、ノイラミン酸、アルギン酸、カラゲナン；アミノ化多糖若しくはオリゴ糖（線状又は分岐）；又は例えば、カルボン酸誘導体と反応した結果カルボキシル基が結合したカルボキシル化多糖若しくはオリゴ糖であってもよい。好ましくは、オプソニン化抑制部分は、ＰＥＧ、ＰＰＧ、又はそれらの誘導体である。ＰＥＧ又はＰＰＧ誘導体で改変されたリポソームは、「ＰＥＧ化されたリポソーム」と呼ばれることがある。
【０１２４】
オプソニン化抑制部分は、多くの周知の技法のいずれか１つにより、リポソーム膜に結合することができる。例えば、ＰＥＧのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルをホスファチジル−エタノールアミン脂質可溶性アンカーに結合し、次に膜に結合することができる。同様に、デキストランポリマーは、Ｎａ（ＣＮ）ＢＨ３と３０：１２の比のテトラヒドロフラン及び水の混合溶媒とを使用する、６０℃での還元的アミノ化により、ステアリルアミン脂質可溶性アンカーで誘導体化することができる。
【０１２５】
オプソニン化抑制部分により改変されたリポソームは、改変されていないリポソームよりもずっと長く循環中に留まる。この理由で、そのようなリポソームは、「ステルス」リポソームと呼ばれることがある。ステルスリポソームは、多孔性の即ち「洩れ易い」微小血管系により供給されて組織に蓄積することが知られている。したがって、そのような微小血管系の欠陥により特徴づけられる組織、例えば、固形腫瘍は、これらのリポソームを効率的に蓄積するであろう；Ｇａｂｉｚｏｎ，ｅｔ  ａｌ．（１９８８），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．，１８：６９４９−５３を参照されたい。それに加えて、ＲＥＳによる取込みの減少は、肝臓及び脾臓中へのリポソームの顕著な蓄積を防止することにより、ステルスリポソームの毒性を低下させる。このように、オプソニン化抑制部分により改変されたリポソームは、ｍｉＲ遺伝子産物又はｍｉＲ遺伝子発現抑制化合物（又はそれらをコードする配列を含む核酸）を腫瘍細胞に送達するのに、特に適している。
【０１２６】
ｍｉＲ遺伝子産物又はｍｉＲ遺伝子発現抑制化合物は、被験者にそれらを投与する前に、当技術分野で知られている技法によって、「医薬」と呼ばれることがある医薬組成物として製剤化することできる。したがって、本発明は、固形癌を治療する医薬組成物を包含する。１態様において、その医薬組成物は少なくとも１種の単離されたｍｉＲ遺伝子産物、又はその単離された変形種若しくは生物活性フラグメント、及び薬学的に許容される担体を含む。特定の態様において、少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物は、適当な対照と比較して固形癌中において低下した発現レベルを有するｍｉＲ遺伝子産物に相当する。ある態様において、単離されたｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−２１８−２、それらの組合せからなる群から選択される。
【０１２７】
他の態様において、本発明の医薬組成物は、少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子抑制化合物を含む。特定の態様において、少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子発現抑制化合物は、発現が対照細胞を超えるｍｉＲ遺伝子に対して特異的である。ある態様において、ｍｉＲ遺伝子発現抑制化合物は、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−２９ｂ−２、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−１２８ｂ、ｍｉＲ−１９９ａ−１、ｍｉＲ−２４−１、ｍｉＲ−２４−２、ｍｉＲ−１４６、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１８１ｂ−１、ｍｉＲ−２０ａ、ｍｉＲ−１０７、ｍｉＲ−３２、ｍｉＲ−９２−２、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−３０ｃ、ｍｉＲ−２５、ｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−１０６ａ及びそれらの組合せからなる群から選択される１種又は２種以上のｍｉＲ遺伝子産物に対して特異的である。
【０１２８】
本発明の医薬組成物は、少なくとも無菌的で発熱物質を含まないとして特徴づけられる。本明細書で使用する「医薬組成物」は、ヒト及び獣医学用の製剤を含む。本発明の医薬組成物を調製する方法は、当技術分野の内であり、例えば、その開示全体を参照により本明細書に組み込むＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，１７ｔｈ  ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．（１９８５）に記載されている。
【０１２９】
本発明の医薬組成物は、薬学的に許容される担体と混合された、少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物又はｍｉＲ遺伝子発現抑制化合物（又はそれらをコードする配列を含む少なくとも１つの核酸）（例えば、０．１から９０重量％）、又はそれらの生理学的に許容されるそれらの塩を含む。ある態様において、本発明の医薬組成物は、１種又は２種以上の抗癌剤（例えば化学療法剤）を追加して含む。本発明の医薬製剤も、リポソームによりカプセル化された、少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物又はｍｉＲ遺伝子発現抑制化合物（又はそれらをコードする配列を含む少なくとも１つの核酸）及び薬学的に許容される担体を含み得る。１態様において、医薬組成物は、ｍｉＲ−１５及び／又はｍｉＲ−１６ではないｍｉＲ遺伝子産物を含む。
【０１３０】
特に適当な薬学的に許容される担体は、水、緩衝水、通常の食塩水、０．４％食塩水、０．３％グリシン、ヒアルロン酸等である。
【０１３１】
特定の態様において、本発明の医薬組成物は、ヌクレアーゼによる分解に耐性である、少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物又はｍｉＲ遺伝子発現抑制化合物（又はそれらをコードする配列を含む少なくとも１つの核酸）を含む。当業者は、例えば、２’−位で改変された１つ又は２つ以上のリボヌクレオチドをｍｉＲ遺伝子産物組み入れることにより、ヌクレアーゼ耐性である核酸を容易に合成することができる。適当な２’−位改変リボヌクレオチドは、２’−位で、フルオロ、アミノ、アルキル、アルコキシ及びＯ−アリルにより改変されたものを含む。
【０１３２】
本発明の医薬組成物は、従来の医薬賦形剤及び／又は添加剤を含むこともできる。適当な医薬賦形剤は、安定剤、抗酸化剤、浸透圧調節剤、緩衝剤、及びｐＨ調節剤を含む。適当な添加剤には、例えば、生理学的に生体適合性の緩衝剤（例えば、トロメタミン塩酸塩）、キレート剤（例えば、ＤＴＰＡ又はＤＴＰＡ−ビスアミドなど）若しくはカルシウムキレート錯体（例えば、カルシウムＤＴＰＡ、ＣａＮａＤＴＰＡ−ビスアミドなど）の添加、又は場合により、カルシウム若しくはナトリウム塩（例えば、塩化カルシウム、アスコルビン酸カルシウム、グルコン酸カルシウム又は乳酸カルシウム、）の添加が含まれる。本発明の医薬組成物は、液剤剤形で使用するようにパックすることができ、又は凍結乾燥することができる。
【０１３３】
本発明の固体の医薬組成物に対して、従来の無毒性の薬学的に許容される担体を使用することができる；例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウム等である。
【０１３４】
例えば、経口投与のための固体医薬組成物は、上で列挙した任意の担体及び賦形剤及び１０〜９５％、好ましくは、２５％〜７５％の少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物又はｍｉＲ遺伝子発現抑制化合物（又はそれらをコードする配列を含む少なくとも１つの核酸）を含み得る。エアロゾル（吸入）投与のための医薬組成物は、重量で０．０１〜２０％、好ましくは、重量で１％〜１０％の、上記のリポソームにカプセル化された少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物又はｍｉＲ遺伝子発現抑制化合物（又はそれらをコードする配列を含む少なくとも１つの核酸）及び噴射剤を含み得る。担体も、所望により含まれてよく、
例えば鼻内送達のためのレシチンである。
【０１３５】
本発明の医薬組成物は、１種又は２種以上の抗癌剤をさらに含んでよい。特定の態様において、該組成物は、少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物又はｍｉＲ遺伝子発現抑制化合物（又はそれらをコードする配列を含む少なくとも１つの核酸）及び少なくとも１種の化学療法剤を含む。本発明の方法に適した化学療法剤には、ＤＮＡアルキル化剤、抗腫瘍性抗生物質、抗代謝剤、チューブリン安定剤、チューブリン不安定化剤、ホルモン拮抗剤、トポイソメラーゼ抑制剤、タンパク質キナーゼ抑制剤、ＨＭＧ−ＣｏＡ抑制剤、ＣＤＫ抑制剤、サイクリン抑制剤、カスパーゼ抑制剤、メタロプロテイナーゼ抑制剤、アンチセンス核酸、三重へリックスＤＮＡ、核酸アプタマー、並びに分子改変されたウイルス、細菌及び外毒素の薬剤が含まれるが、これらに限定されない。本発明の組成物に適した薬剤の例には、シチジンアラビノシド、メトトレキセート、ビンクリスチン、エトポシド（ＶＰ−１６）、デキソルビシン（アドリアマイシン）、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、デキサメタゾン、アルグラビン、シクロホスファミド、サルコリシン、メチルニトロソウレア、フルオロウラシル、５−フルオロウラシル（５ＦＵ）、ビンブラスチン、カンプトテシン、アクチノマイシン−Ｄ、ミトマイシンＣ、過酸化水素、オキサリプラチン、イリノテカン、トポテカン、ロイコボリン、カルムスチン、スプレプトゾシン、ＣＰＴ−１１、タキソール、タモキシフェン、デカルバジン、リツキシマブ、ダウノルビシン、１−β−Ｄ−アラビノフラノシルシトシン、イマチニブ、フルダラビン、ドセタキセル、ＦＯＬＦＯＸ４が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３６】
本発明は、試験薬剤を細胞に与えて細胞中の少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物のレベルを測定することを含む腫瘍形成抑制剤を同定する方法も包含する。１態様において、該方法は細胞に試験薬剤を与えて癌細胞中の低下した発現に関連する少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物のレベルを測定することを含む。適当な対照細胞（例えば、薬剤を与えない）と比較して、薬剤を与えられた後の細胞中のｍｉＲ遺伝子産物のレベルの上昇は試験薬剤が腫瘍形成の抑制剤であることを示す。特定の態様において、癌細胞中の低下した発現に関連する少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−２１８−２及びそれらの組合せからなる群から選択される。
【０１３７】
他の態様において、本発明の方法は、試験薬剤を細胞に与えて癌細胞中の上昇した発現に関連する少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物のレベルを測定することを含む。適当な対照細胞（例えば、薬剤を与えない）と比較して、薬剤を与えられた後の細胞中のｍｉＲ遺伝子産物のレベルの低下は試験薬剤が腫瘍形成の抑制剤であることを示す。特定の態様において、癌細胞中の上昇した発現に関連する少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−２９ｂ−２、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−１２８ｂ、ｍｉＲ−１９９ａ−１、ｍｉＲ−２４−１、ｍｉＲ−２４−２、ｍｉＲ−１４６、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１８１ｂ−１、ｍｉＲ−２０ａ、ｍｉＲ−１０７、ｍｉＲ−３２、ｍｉＲ−９２−２、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−３０ｃ、ｍｉＲ−２５、ｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−１０６ａからなる群から選択される。
【０１３８】
適当な薬剤は、薬品（例えば、低分子、ペプチド）及び生体高分子（例えば、タンパク質、核酸）を含むが、これらに限定されない。薬剤は組換えにより、合成により作製することができ、又は天然資源から単離（即ち精製）することができる。そのような薬剤を細胞に与える種々の方法（例えばトランスフェクション）が当技術分野において周知であり、そのような方法の幾つかは本明細書で上に記載した。少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物の発現を検出する方法（例えば、ノーザンブロット、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ＲＴ−ＰＣＲ、発現プロファイリング）も、当技術分野において周知である。これらの方法の幾つかも、本明細書で上に記載した。
ここで、本発明を、次の限定するものではない実施例により例示することにする。
【実施例】
【０１３９】
次の材料及び方法が実施例で使用される：
試料
３６３個の原発腫瘍試料及び１７７個の正常組織を含む合計５４０個の試料が本研究で使用された（表２）。次の固形が表された：肺癌、乳癌、前立腺癌、大腸癌及び膵内分泌腫瘍。全ての試料は、患者からインフォームドコンセントを得て入手し、病理学的に確認した。正常試料は、肺及び胃癌に罹患した個体からの試料、並びに正常個体からの残余の組織の試料と組み合わせた。全ての正常乳房試料は、５個の無関係な正常組織をプールすることにより得た。全ＲＮＡを組織から、ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をメーカーの処方により使用して単離した。
【０１４０】
マイクロＲＮＡマイクロアレイ
マイクロアレイ分析は前に記載されたようにして実施した（Ｌｉｕ，Ｃ−Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０１：１１７５５−１１７６０（２００４））。簡単に述べると、５μｇの全ＲＮＡをｍｉＲＮＡマイクロアレイチップ上のハイブリダイゼーションのために使用した。これらのチップは、接触技法によりスポットされ、ポリマーマトリックスに共有結合で結合された遺伝子特異的な４０量体オリゴヌクレオチドプローブを含む。マイクロアレイは、６×ＳＳＰＥ（０．９Ｍ  ＮａＣｌ／６０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ／８ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）／３０％ホルムアミド中２５℃で１８時間ハイブリダイズさせ、０．７５×ＴＮＴ（トリスＨＣｌ／ＮａＣｌ／ツイーン２０）中３７℃で４０分間洗浄し、ストレプトアビジン−Ａｌｅｘａ６４７（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）複合体によるビオチン標識転写物の直接検出を使用して処理した。処理されたスライドは、マイクロアレイスキャナー（ＧｅｎｅＰｉｘ
Ｐｒｏ、Ａｘｏｎ）を使用して、レーザーを６３５ｎｍに設定し、固定ＰＭＴ設定及び１０ｎｍの走査分解で走査した。データは文献に記載されているようにして（Ｃａｌｉｎ，Ｇ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０１：１１７５５−１１７６０（２００４）；Ｉｏｒｉｏ，Ｍ．Ｖ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６５：７０６５−７０７０ （２００５））、ノーザンブロッティングに
より確認した。
【０１４１】
【表３４】
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【０１４２】
コンピューター分析
マイクロアレイのイメージをＧｅｎｅＰｉｘ  Ｐｒｏ（Ａｘｏｎ）を使用して分析した。各ｍｉＲＮＡの複製スポットの平均値は、バックグラウンドを差し引き、正規化してさらなる分析にかけた。正規化は、中央値アレイを参照として使用し、チップ毎の中央値正規化法を使用することにより実施した。最後に、データセット中の２クラスの少なくとも最少のものに存在するとして測定されたｍｉＲＮＡが選択された。統計分析に先立って、非存在の判定の閾値は４．５とした。このレベルが、実験において検出された最小強度レベル平均値である。マイクロＲＮＡの命名法はＧｅｎｏｍｅ  Ｂｒｏｗｓｅｒ（ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ）及びＳａｎｇｅｒ  ＣｅｎｔｅｒのマイクロＲＮＡデータベース（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓ，Ｓ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３２：Ｄ１０９−１１（２００４））に従い、不一致の場合はマイクロＲＮＡに従った。差次的に発現したマイクロＲＮＡは、マイクロアレイの有意性分析（ＳＡＭ）においてｔ検定法を使用することにより同定した（Ｔｕｓｈｅｒ，Ｖ．Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９８：５１１６−２１（２００１））。ＳＡＭにより、全測定の標準偏差と比較した発現の変化を基準にして各遺伝子のスコアが計算される。ＳＡＭにおいて、ｔ検定を使用した。マイクロＲＮＡサインは、最短収縮重心法（ｎｅａｒｅｓｔ  ｓｈｒｕｎｋｅｎ  ｃｅｎｔｒｏｉｄｓ  ｍｅｔｈｏｄ）を適用することにより測定した。この方法は、その各々の正常対応物から各固形癌を最もよく特徴づける遺伝子のサブグループを同定する。予測誤差は、１０倍交差検証法により計算し、各癌に対して、最小予測誤差を生ずるｍｉＲサインを得た。リサンプリング試験を、ランダム順列解析により実施して、共有されたサインのｐ値を計算した。
【０１４３】
実施例１：ヒト固形癌におけるマイクロＲＮＡ発現サインの同定
統計
癌／正常組織を合わせた比較は、合計４０４試料になる異なった組織を数的に均衡させる目的で、減少させた数の肺試料（８０の癌及び４０の正常組織）を使用して、実施した
。
統計分析のために、発現値が試料の少なくとも５０％で２５６（閾値）を超える１３７のｍｉＲを、測定した２２８のｍｉＲから確保した。差次的に発現したマイクロＲＮＡを同定するために、Ｔ検定を使用した（表３）。Ｔ検定のｐ値は、多くの試験手順のため、及び第一種の過誤率を制御するために補正した。調整ｐ値は、５００，０００通りの順列でリサンプリングを実施することにより得た（Ｊｕｎｇ，Ｓ．Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  ６：１５７−６９（２００５））。この分析は、結果を評価する目的で、Ｌｕ及び共同研究者と同じ方法（Ｌｕ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４３５：８３４−８（２００５））を使用することにより実施した。
【０１４４】
Ｔ検定に代わるものとして、マイクロアレイの有意性分析（ＳＡＭ）を差次的に発現したマイクロＲＮＡを同定するために使用した。この方法は、偽検出率（ＦＤＲ）の制御を可能にする。ＦＤＲが０．０１以下になるようにデルタを選択した。続いて、最良の分類を生ずる、即ち、２クラス（癌及び正常）を最もよく予測するマイクロＲＮＡサブセットを、ＰＡＭ（マイクロアレイの予測分析）で実行したように、最短収縮重心法を使用して同定した。予測誤差は１０倍交差検証法により計算した。交差検証後に最少の誤分類を生ずるマイクロＲＮＡを選択した。
【０１４５】
結果
Ｔ検定により、０．０５未満の調整ｐ値を有する４３種の差次的に発現したｍｉＲが得られた（表３）。６種の癌（乳、大腸、肺、膵、前立腺、胃）を一緒にしてグループ化したとき、対応する正常組織と比較して、２６種のｍｉＲが過剰発現であり、１７種が過小発現であった。これらの結果は、固形癌において発現されたｍｉＲＮＡのスペクトルは、正常細胞のものとは非常に異なることを示した（１３７ｍｉＲＮＡの内４３、３１％）。ＳＡＭを使用して、４９種のｍｉＲＮＡが差次的に発現したと同定され、その内３４種は下方制御されていた（表４）。ＰＡＭを使用して、癌における３６種の過剰発現したｍｉＲＮＡ（正の癌スコアにより示された）及び２１種の下方制御されたｍｉＲ（負の癌スコアにより指示された）は、差次的に発現したと同定された（表５）。しかしながら、これらの分析は、ｍｉＲの発現が非常に組織特異的であるので、一貫して形質転換を生ずるｍｉＲ発現の変化を同定する目的に合わせたものではない（Ｈｅ，Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ４３５：８２８−８３３（２００５）；図１及び図２も参照されたい）。
【０１４６】
２２８種のｍｉＲを使用する３６３個の固形癌及び１７７個の正常試料に由来する発現プロファイルに基づくｍｉＲのクラスター化を、図１に示す。異なった組織間の非常に良好な分離を示すツリーは、本研究で使用した試料の少なくとも５０％で発現された１３７種
の異なるｍｉＲＮＡを用いて構築された。
【０１４７】
【表３５】
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【０１４８】
【表３６】
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【０１４９】
【表３７】
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【０１５０】
実施例２：種々のヒト固形癌に関連するマイクロＲＮＡ発現サインの同定
結果
組織特異性に基づいて陥る偏りなしに、固形癌に関連する癌の状態の予後経過を示すマイクロＲＮＡを同定するために、別のアプローチを使用した。第一に、６種の組織特異的サインを各癌の組織タイプについて１つずつ、独立のＰＡＭ試験を実施することにより得た（表６及び７にまとめた）。各癌に対する特異的サインは、表８〜１３に示す：例えば、乳癌は表８、大腸癌は表９、肺癌は表１０、膵癌は表１１、前立腺癌は表１２、胃癌は表１３である。これらのデータを使用して、異なる組織タイプのｍｉＲＮＡサインの間で共有され、異常制御されたマイクロＲＮＡを同定した（表１４）。この比較分析のｐ値を計算するために、ｍｉＲＮＡ同一性について１，０００，０００のランダム順列でリサンプリングを実施した。ｐ値は真のスコアを超えるシミュレーションスコア（ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｓｃｏｒｅｓ）の相対頻度と定義された。少なくとも３種の固形癌に共通であった２１種の誤制御されたマイクロＲＮＡ（ｐ値＝２．５×１０−３）が同定された（表１４）。
【０１５１】
【表３８】
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【０１５２】
【表３９】
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【０１５３】
【表４０】
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【０１５４】
【表４１】
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【０１５５】
【表４２】
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【０１５６】
【表４３】
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【０１５７】
【表４４】
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【０１５８】
【表４５】
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【０１５９】
【表４６】
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【０１６０】
【表４７】
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【０１６１】
【表４８】
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【０１６２】
最も簡単にするために、６種類の癌／正常対について異常制御されたｍｉＲの平均絶対発現レベルを計算した。網羅的なサブセットにおけるｍｉＲの発現レベルを使用して、疾患の状態に関わらず、異なる組織が正しく分類された（図３）。
【０１６３】
図４は、正常組織に対して、異なる腫瘍組織にまたって共通のマイクロＲＮＡの差次的発現を示す。このツリーは、ｍｉＲＮＡサブセット中の変化倍数（ｆｏｌｄ  ｃｈａｎｇｅｓ）による異なる癌タイプを表す。前立腺、大腸、胃及び膵の組織はそれらの間で最も類似しているが、肺及び乳組織はかなり異なるサインにより表わされる（図４）。このツリーは、どのｍｉＲＮＡが特定の癌の組織タイプに関連しているかを明確に示す。
【０１６４】
驚いたことに、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１９１及びｍｉＲ−１７−５ｐは、考慮された腫瘍タイプの全て、又は６種類中の５種類で顕著に過剰発現している。ｍｉＲ−２１は、神経膠芽腫で過剰発現し、抗アポトーシス性を有すると報告されている（Ｃｈａｎ，Ｊ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６５：６０２９−６０３３（２００５））。肺癌は、ｍｉＲ−１７／２０／９２を含むそのサインの一部を乳癌と及び一部を他の固形癌と共有し、これら３つのｍｉＲの全ては、ｃ−Ｍｙｃと能動的に協調してリンパ腫形成を促進するマイクロＲＮＡクラスターのメンバーである（Ｈｅ，Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４３５：８２８−８３３（２００５））。過剰発現されるものとしてのこれらのマイクロＲＮＡの同定は、本発明者らのアプローチの優れた確認である。活性化される第二のｍｉＲＮＡ群は、大細胞リンパ腫（Ｅｉｓ，Ｐ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ.，Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０２：３６２７−３６３２（２００５））、小児及びバーキットリンパ腫（Ｍｅｔｚｌｅｒ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ  Ｃａｎｃｅｒ  ３９：１６７−１６９（２００４））及び種々のＢ細胞リンパ腫（Ｋｌｕｉｖｅｒ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，ｅ−ｐｕｂ
ｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ，Ｊｕｌｙ  ２２，２００５）で増幅されると既に報告され
ているｍｉＲ−１５５と一緒にｍｉＲ−２１０及びｍｉＲ−２１３を含む。これらのマイクロＲＮＡは、乳癌及び肺癌で上方制御される、他にはないものである。ｍｉＲ−２１８−２は、大腸、胃、前立腺及び膵癌で一貫して下方制御されるが、肺及び乳癌ではされない。
【０１６５】
幾つかの観察がこれらの結果を補強する。第一に、本研究において、前駆体ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ及び成熟ｍｉＲＮＡ両方の発現レベルが多数の遺伝子について測定された。注目すべきことに、ｍｉＲ−２１２及びｍｉＲ−１２８ａを例外として、他の全ての場合に、異常に発現された領域は、活性遺伝子産物に対応するものであった。第二に、図３に示したように、網羅的サブセットにおけるｍｉＲＮＡ発現の変動は、異なるタイプの癌にまたがってしばしば一義的（即ち、下方又は上方制御）であり、ヒトの腫瘍形成における共通の機構を示唆する。第三に、マイクロアレイのデータは、１２例の乳房試料（ｍｉＲ−１２５ｂ、ｍｉＲ−１４５及びｍｉＲ−２１；Ｉｏｒｉｏ、Ｍ．Ｖ．，ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６５：７０６５−７０７０（２００５））並びに１７例の内分泌膵及び正常試料（ｍｉＲ−１０３、ｍｉＲ−１５５及びｍｉＲ−２０４；データは示されていない）について溶液イブリダイゼーションにより検証され、マイクロアレイのデータの正確さが強く確認された。
【０１６６】
実施例３：固形腫瘍において異常制御されたマイクロＲＮＡに対する予測された標的の同定
材料及び方法：
腫瘍抑制因子及びオンコジーン標的予測
最も新しいＴａｒｇｅｔＳｃａｎ予測（２００５年４月）を、想定されるマイクロＲＮＡ標的を同定するために使用した。これらはＬｅｗｉｓらにより報告された３’非翻訳領域標的（Ｌｅｗｉｓ，Ｂ．Ｐ．，ｅｔ  ａｌ，Ｃｅｌｌ  １２０：１５−２０（２００５））を本質的に含み、ｈｇ１７ヒトゲノムアセンブリーに、ＲｅｆＳｅｑ  ｍＲＮＡの２００５年４月のＵＣＳＣ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｒｏｗｓｅｒマッピングからの更新されたゲノム境界定義（ｇｅｎｅ  ｂｏｕｎｄａｒｙ  ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎｓ）から生ずる若干の変化が加えられている。想定される標的の中で、知られている癌遺伝子（腫瘍抑制因子及びオンコジーン）は、インターネットサイトｗｗｗ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ｇｅｎｅｔｉｃｓ／ＣＧＰ／Ｃｅｎｓｕｓ／でアクセスできる、又はＯＭＩＭによりｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖで報告されるＣａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｃｅｎｓｕｓにおけるそれらの同定により特定された。
【０１６７】
標的ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ
ルシフェラーゼレポーターの実験については、特異的癌関連マイクロＲＮＡと相互作用すると予測されるＲｂ１、ＴＧＦＢＲ２及びＰｌａｇ１の３’非翻訳領域セグメントをヒトゲノムＤＮＡからＰＣＲにより増幅し、ルシフェラーゼの終止コドンのすぐ下流のＸｂａＩサイトを使用してｐＧＬ３コントロールベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）中に挿入した。ヒト巨核球細胞ライン、ＭＥＧ−０１を、５％ＣＯ２の加湿雰囲気中で、１×非必須アミノ酸及び１ｍｍｏｌピルビン酸ナトリウムで補完した１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ培地１６４０中３７℃で増殖させた。細胞は、１２ウェルプレート中で、メーカーのプロトコルに従いｓｉＰＯＲＴ  ｎｅｏＦＸ（Ａｍｂｉｏｎ、テキサス州Ａｕｓｔｉｎ）を使用して、ホタルルシフェラーゼレポーターベクター０．４μｇ及びウミシイタケルシフェラーゼを含むコントロールベクター、ｐＲＬ−ＴＫ（Ｐｒｏｍｅｇａ）０．０８μｇで、コトランスフェクトした。各ウェルに対して、マイクロＲＮＡオリゴヌクレオチド（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、コロラド州Ｌａｆａｙｅｔｔｅ）及びアンチセンス又はスクランブルオリゴヌクレオチド（Ａｍｂｉｏｎ）を１０ｎＭの濃度で使用した。ホタル及びウミシイタケルシフェラーゼ活性は、二重ルシフェラーゼアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を
使用して、トランスフェクション２４時間後に続けて測定した。
【０１６８】
ＲＢ１のウェスターンブロッティング
ＲＢ１タンパク質のレベルは、ウェスターンブロッティングの標準的手順を使用し、マウスモノクローナル抗ＲＢ１抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、カリフォルニア州）を使用して定量した。正規化は、マウスモノクローナル抗アクチン抗体（Ｓｉｇｍａ）を用いて実施した。
【０１６９】
結果
癌におけるマイクロＲＮＡ異常制御の機能的意味は、理解される必要がある。固形腫瘍において、最も普通のマイクロＲＮＡ事象は発現の増大であるが、一方、癌における発現の減少はより限られた事象であり、より組織特異的であるように思われる。本発明者らは、３段階の継続する手法を次の順で使用した：最初に、「ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ」（コンピューター内で）標的予想、次に、癌関連標的の最初の検証のためのルシフェラーゼアッセイ、最後に、特異的ｍｉＲＮＡ：ｍＲＮＡ相互作用体（ｉｎｔｅｒａｃｔｏｒ）対に対するｍｉＲＮＡ発現（マイクロアレイによる）と標的タンパク質発現（ウェスターンブロッティングによる）との間の生体外腫瘍での相関関係。癌ｍｉＲＮＡに対して関連のある標的は、劣性（例えば、腫瘍抑制因子）又は優性（例えばオンコジーン）いずれかの癌遺伝子であり得る。固形腫瘍で異常制御されているマイクロＲＮＡが既知のオンコジーン又は腫瘍抑制因子を標的とするという仮説を試すために、これらのｍｉＲＮＡの予測標的を、保存された３’非翻訳領域マイクロＲＮＡ標的のデータベースＴａｒｇｅｔＳｃａｎ（Ｌｅｗｉｓ，Ｂ．Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １２０：１５−２０（２００５））を使用して決定した。ＴａｒｇｅｔＳｃａｎは、合計２２，４０２の予測中に固形腫瘍で異常制御される１８種のｍｉＲＮＡに対して５，１２１の予測を含んでいた（２６．５％）。周知の癌遺伝子２６３種の内１１５種（４４％）がこれら１８種のｍｉＲＮＡに対する標的として予測された（表１５）。癌遺伝子の高率（％）が、固形腫瘍で異常制御されたｍｉＲＮＡにより標的とされるので、これらの予測が起こることはありそうでない（フィッシャーの抽出検定でＰ＜０．０００１）。
【０１７０】
３種の異なる癌遺伝子、網膜芽細胞腫（Ｒｂ）、ＴＧＦ−β−受容体（ＴＧＦＢＲ２）、及び多形性腺腫遺伝子１（ＰＬＡＧ１）のｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ予測は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにより実験的に確認された。ルシフェラーゼレポーターアッセイを使用して、試験された３種のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ−１０６ａ、ｍｉＲ−２０ａ及びｍｉＲ−２６ａ−ｌ）は、トランスフェクトされたＭＥＧ−０１細胞中で、スルランブル対照オリゴＲＮＡと比較してタンパク質翻訳の顕著な減少を惹起した（図６）。例えば、網膜芽細胞腫３’非翻訳領域は、ｍｉＲ−１０６ａと機能的に相互作用することが見出された。このｍｉＲＮＡ：ｍＲＮＡ相互作用の生物学的意味は、Ｒｂ１遺伝子は大腸癌では正常に転写されるが、細胞の種々のフラクションがＲｂ１タンパク質を発現しないことを示す以前の報告（Ａｌｉ，Ａ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，ＦＡＳＥＢ  Ｊ．７：９３１−９３７（１９９３））によって強化される。この発見は、大腸癌において同時に起こるｍｉＲ−１０６ａの過剰発現（図４）により説明することができるＲｂ１を制御する転写後機構の存在を示唆する。さらに、ｍｉＲ−２０ａは乳癌で下方制御されており（図４）、ＴＦＧＢＲ２タンパク質は、乳癌細胞の上皮中で発現される（Ｂｕｃｋ，Ｍ．Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．７０：４９１−４９８（２００４））。反対に、大腸癌におけるｍｉＲ−２０ａの過剰発現は、相互不活性化に加えてＴＧＦＢＲ２を下方制御する新しい機構を表している可能性がある（Ｂｉｓｗａｓ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ
Ｒｅｓ．６４：６８７−６９２（２００４））。
【０１７１】
最後に、ＲＢ１タンパク質発現がｍｉＲ−１０６ａ発現と相関しているかどうかを確認するために、１揃いの患者試料を試験した（図５及び図６Ｂ）。予想通り、胃、前立腺及
び肺腫瘍の試料で、ＲＢ１は下方制御され（対にした正常試料に対して）、且つｍｉＲ−１０６ａは過剰発現していることが見出されたが、一方乳腫瘍試料では、ｍｉＲ−１０６ａは僅かに下方制御され（図５及び図６Ｂ）、ＲＢ１は、対にした正常対照におけるよりも僅かに高く発現される。
【０１７２】
これらの実験的証拠は、固形癌において、最重要癌遺伝子がｍｉＲの異常発現により制御されているという仮説を補強する。これらのデータは、以前にｌｅｔ−７：Ｒａｓ相互作用についてＪｏｈｎｓｏｎら（Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｓ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １２０：６３５−６４７（２００５））、ｍｉＲ−１７−５ｐ：ｃＭｙｃ相互作用についてＯ’Ｄｏｎｎｅｌｌら（Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌ，Ｋ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ
４３５：８３９−８４３（２００５））、及びｍｉＲ−１６：Ｂｃｌ２相互作用についてＣｉｍｍｉｎｏら（Ｃｉｍｍｉｎｏ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７０２：１３９４４−１３９４９（２００５））により示された重要な癌遺伝子標的とマイクロＲＮＡのリストに新しい例を追加する。注目すべきことに、ｍｉＲ−１７−５ｐ及びｍｉＲ−１６は、本明細書に記載したｍｉＲＮＡ固形癌サインのメンバーである。
【０１７３】
【表４９】
2014060993.tif 000050
【表５０】
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【表５１】
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【表５２】
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【表５３】
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【表５４】
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【０１７４】
これまで明白には参照により組み込まれなかった本明細書に引用された全ての出版物の関連ある教示は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。本発明はその好ましい態様を参照して具体的に示され且つ説明されたが、付記した請求項により包含される本発明の範囲から逸脱せずに、形態及び詳細における種々の変更がその中でなされ得ることは、当業者により理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１７５】
本特許又は出願書類はカラーで作成された少なくとも１つの図面を含む。カラー図面を含む本特許又は特許出願公開は、請求及び必要な手数料に基づき当事務所により提供されるであろう。
【図１】図１は、６種類の固形癌（最上段）及びそれぞれの正常組織を代表する５４０個の試料のクラスター分析を図示する。ツリーに含まれるｍｉＲＮＡ（ｎ＝１３７）は、分析された試料の少なくとも５０％の中で、発現レベル（バックグラウンドを差し引いた強度）が閾値（２５６）よりも高かったものを表す。アレイは中央値中心化され、Ｇｅｎｅ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  ２．０を使用して正規化された。平均連結クラスター化法は、中心化されない相関計量（ｕｎｃｅｎｔｅｒｅｄ  ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｍｅｔｒｉｃ）を使用して実施した。カラーは各試料におけるマイクロＲＮＡの中央値からの発現レベルの差異を示す。
【図２】図２は、マイクロＲＮＡ発現データの教師なしクラスター分析を示す。乳、大腸、肺、膵、前立腺及び胃（正常組織及び腫瘍）を含む５４０個の試料（パネル上部に示した）のマイクロＲＮＡプロファイリングを、各特徴についてフィルターし、中心化し、正規化した。データは試料（水平方向）及び特徴（垂直方向）の両者に対して、類似性の尺度として平均連結及びピアソン相関を用いて階層的クラスター化法にかけた。試料名を図の上に及びｍｉＲＮＡ名を左に示す。同一のマイクロＲＮＡが異なるオリゴヌクレオチドにより測定され得るので、プローブＩＤを括弧内に示す。カラーは各試料におけるマイクロＲＮＡの中央値からの発現レベルにおける相違を示す。
【図３】図３は、固形癌（上）を横断して差次的に調節されるｍｉＲＮＡ発現を示す。組織固形癌の少なくとも９０％に存在する６１種のマイクロＲＮＡを示す（パネルの右）。このツリーは掲載したマイクロＲＮＡの各々についてｌｏｇ２変換後の平均した絶対発現値を示す。この平均値は、同一の組織又は腫瘍組織型からの全試料を含めて計算した。Ｇｅｎｅ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  ２．０を使用して、遺伝子を平均値で中心化し、正規化した。平均連結クラスター化法はユークリッド距離を使用して実施した。
【図４】図４は、異なる癌試料（最上段）で、対照試料と比較して２より高い腫瘍絶対値を少なくとも１つ有する固形癌の少なくとも７５％に存在するｍｉＲＮＡの発現における倍数変化（ｆｏｌｄ  ｃｈａｎｇｅｓ）を示す。ツリーは平均倍数変化（癌対正常）のｌｏｇ２変換を示す。平均値は、同一の組織又は腫瘍組織型からの全試料を含めて計算した。Ｇｅｎｅ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  ２．０を使用して、アレイを平均値で中心化し、正規化した。平均連結クラスター化法は中心化されない相関計量を使用して実施した。
【図５】図５は、癌における少なくとも５０％の固形腫瘍のサイン（ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ）に存在するｍｉＲＮＡ発現の、正常試料に対する倍数変化を示す。ツリーは平均倍数変化（癌対正常）のｌｏｇ２変換を示す。平均値は、同一の組織又は腫瘍組織型からの全試料を含めて計算した。Ｇｅｎｅ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  ２．０を使用して、アレイを平均値で中心化し、正規化した。平均連結クラスター化法は中心化されない相関計量を使用して実施した。
【図６Ａ】図６Ａは、癌タンパク質をコードする異なる遺伝子の３’非翻訳領域がマイクロＲＮＡによる癌制御を可能にすることを示す棒グラフの図である。ウミシイタケ（ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼ対照に対して標準化したホタルルシフェラーゼ発現の相対的抑制（倍数変化）。多形腺腫遺伝子１ＰＬＡＧ１；トランスホーミング増殖因子β受容体ＩＩ  ＴＧＦＢＲ２、網膜芽腫遺伝子Ｒｂ。ｐＧＬ−３（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を空ベクターとして使用した。ｍｉＲ−２０ａ、ｍｉＲ−２６ａ−ｌ及びｍｉＲ−１０６オリゴＲＮＡ（センス及びスクランブル）をトランスフェクションに使用した。５’ｍｉＲＮＡ末端相補性部位を欠く、各標的ｍＲＮＡの変異型（ＭＵＴ）を対照として使用した第２の実験を下側のパネルに示す。全ての実験は３回ずつを２回行った（ｎ＝６）。
【図６Ｂ】図６Ｂは、ある種の癌（例えば、肺、乳、大腸、胃）において、ＲＢ１（Ｒｂ）タンパク質のレベルがｍｉＲ−１０６ａ発現レベルと逆相関を示すことを示すウェスタンブロットの図である。βアクチンを正規化のための対照として使用した。Ｎ１は正常試料、Ｔ１及びＴ２は腫瘍試料である。
【図７】図７は、乳癌試料（Ｐシリーズ及び番号付シリーズ）におけるｍｉＲ−１４５の下方制御（上）及びｍｉＲ−２１の上方制御（下）発現を、正常試料と比較して示すノザンブロットの図である。正規化はＵ６特異的プローブを使用して実施した。
【図８】図８は、異なる膵内分泌癌試料（高分化膵内分泌腫瘍ＷＤＥＴ、高分化膵内分泌癌ＷＤＥＣ及び膵腺房細胞癌ＡＣＣ）におけるｍｉＲ−１０３の上方制御及びｍｉＲ−１５５の下方制御された発現を、正常試料（Ｋシリーズ）と比較して（上）、並びに膵島細胞腺腫（Ｆシリーズ）におけるｍｉＲ−２０４の上方制御を正常試料（Ｋシリーズ）及び非分泌／非機能性（ＮＦシリーズ）と比較して（下）示すノザンブロットの図である。正規化は５ＳＲＮＡに対する特異的プローブを使用して実施した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【手続補正書】
【提出日】平成25年11月18日(2013.11.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者の癌細胞中で、少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物が、対照の細胞と比較して下方制御されているか又は上方制御されている、固形癌を有するか又は有すると疑われる被験者における腫瘍形成を抑制するための医薬組成物であって、
（１）前記癌細胞中で、少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物が下方制御されているときは、前記ｍｉＲ遺伝子産物はｍｉＲ−１５ａ又はｍｉＲ−１６−１ではないという条件で、少なくとも１種の単離されたｍｉＲ遺伝子産物又はその単離された変異種若しくは生物活性フラグメント；又は
（２）前記癌細胞中で、少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物が上方制御されているときは、前記の少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物の発現を抑制するための少なくとも１種の化合物
を含む、前記医薬組成物。