(57)【要約】      （修正有）【課題】上皮増殖因子レセプター（ＥＧＦＲ）における変異と、そのような変異を検出する方法並びに化学療法及び／又はキナーゼインヒビター治療法のような抗癌治療法に感受性である腫瘍を同定する方法、予後予測方法の提供。【解決手段】腫瘍試料中における変異したＥＧＦＲ遺伝子又は変異したＥＧＦＲタンパク質の存在を決定することを含み、変異したＥＧＦＲ遺伝子又はタンパク質の存在が、腫瘍が治療に感受性であることを示す方法。【選択図】図１
2014057587.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト患者において治療に対して感受性である腫瘍を同定する方法において、上記腫瘍の試料中の突然変異したＥＧＦＲ遺伝子又は突然変異したＥＧＦＲタンパク質の存在を決定することを含み、上記突然変異がＥＧＦＲのエキソン１８−２１に位置しており、Ｔ７９０Ｍ以外の突然変異ＥＧＦＲ遺伝子又は突然変異ＥＧＦＲタンパク質の存在が、腫瘍が治療に対して感受性であることを示す方法。
【請求項２】
上記治療が化学療法剤である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上記化学療法剤が、シタラビン、フルダラビン、５-フルオロ-２'-デオキシウリジン、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、メトトレキセート；ブレオマイシン、クロラムブシル、シスプラチン、シクロホスファミド、ドキソルビシン、ミトキサントロン；カンプトセシン、トポテカン；テニポシド；コルセミド、コルヒチン、パクリタキセル、ビンブラスチン、ビンクリスチン又はタモキシフェンの一又は複数である請求項２に記載の方法。
【請求項４】
上記化学療法剤がカルボプラチン及び／又はパクリタキセルである請求項２に記載の方法。
【請求項５】
上記治療がＥＧＦＲ阻害剤である請求項１に記載の方法。
【請求項６】
上記ＥＧＦＲ阻害剤がセツキシマブ、パニツムマブ、エルロチニブ又はゲフィチニブの一又は複数である請求項５に記載の方法。
【請求項７】
上記ＥＧＦＲ阻害剤がエルロチニブである請求項５に記載の方法。
【請求項８】
上記突然変異がＥＧＦＲのキナーゼドメインに位置している請求項１に記載の方法。
【請求項９】
上記突然変異が、Ｇ７１９Ａ、Ｇ７１９Ｃ、Ｇ７１９Ｓ、Ｅ７４６Ｋ、Ｌ７４７Ｓ、Ｅ７４９Ｑ、Ａ７５０Ｐ、Ａ７５５Ｖ、Ｖ７６５Ｍ、Ｈ７７３Ｙ、Ｓ７６８Ｉ、Ｓ７８４Ｆ、Ｌ８５８Ｒ、Ｌ８５８Ｐ、Ｌ８６１Ｑ、Ｅ７４６−Ａ７４８ｄｅｌ、Ｅ７４６−Ａ７５０ｄｅｌ、Ｅ７４６−Ｒ７４８ｄｅｌ、Ｌ７４７−Ｅ７４９ｄｅｌ、Ｒ７４８−Ｐ７５３ｄｅｌ、Ｌ７４７−Ｓ７５２ｄｅｌ、Ｅ７４６Ｖ、Ｌ７４７−Ｔ７５１ｄｅｌ、Ｌ７４７−Ｐ７５３ｄｅｌ、Ｓ７５２−Ｉ７５９ｄｅｌ、Ｍ７６６−Ａ７６７ＡＩｉｎｓ、Ｓ７６８−Ｖ７６９ＳＶＡｉｎｓ、Ｐ７７２−Ｈ７７３ＮＳｉｎｓ及びＰ７７２−Ｈ７７３Ｖｉｎｓの少なくとも一つである請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
上記突然変異が、Ｇ７１９Ａ、Ｅ７４６Ｋ、Ｌ７４７Ｓ、Ｅ７４９Ｑ、Ａ７５０Ｐ、Ａ７５５Ｖ、Ｖ７６５Ｍ、Ｓ７６８Ｉ、Ｌ８５８Ｐ、Ｅ７４６−Ａ７４８ｄｅｌ、Ｒ７４８−Ｐ７５３ｄｅｌ、Ｍ７６６−Ａ７６７ＡＩｉｎｓ、Ｓ７６８−Ｖ７６９ＳＶＡｉｎｓ及びＰ７７２−Ｈ７７３ＮＳｉｎｓの少なくとも一つである請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
上記突然変異が、２４０２Ｇ＞Ｃ；２４０１Ｇ＞Ｔ；２４０１Ｇ＞Ａ；２４８２Ｇ＞Ａ；２４８６Ｔ＞Ｃ；２４９１Ｇ＞Ｃ；２４９４Ｇ＞Ｃ；２５１０Ｃ＞Ｔ；２５３９Ｇ＞Ａ；２５５６Ｃ＞Ｔ；２５６３Ｃ＞Ｔ；２５７６Ｔ＞Ａ；２８１９Ｔ＞Ｇ；２８１９Ｔ＞Ｃ；２４８２−２４９０ｄｅｌ；２４８１−２４９５ｄｅｌ；２４８２−２４９０ｄｅｌ；２４８５−２４９３ｄｅｌ；２４９４Ｇ＞Ｃ；２４８６−２５０３ｄｅｌ；２４８５−２５０２ｄｅｌ；２４８３Ａ＞Ｔ；２４８６−２４９４ｄｅｌ；２４９９−２５２２ｄｅｌ；２５４４−２５４５ｉｎｓＧＣＣＡＴＡ；２５５４−２５５５ｉｎｓＣＣＡＧＣＧＴＧＧ；２５６１−２５６２ｉｎｓＧＧＴ；及び２５６２−２５６３ｉｎｓＡＡＣＴＣＣの少なくとも一つである請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
上記突然変異が、２４０２Ｇ＞Ｃ；２４８２Ｇ＞Ａ；２４８６Ｔ＞Ｃ；２４９１Ｇ＞Ｃ；２４９４Ｇ＞Ｃ；２５１０Ｃ＞Ｔ；２５３９Ｇ＞Ａ；２５４９Ｇ＞Ｔ；２５６３Ｃ＞Ｔ；２８１９Ｔ＞Ｃ；２４８２−２４９０ｄｅｌ；２４８６−２５０３ｄｅｌ；２５４４−２５４５ｉｎｓＧＣＣＡＴＡ；２５５４−２５５５ｉｎｓＣＣＡＧＣＧＴＧＧ；及び２５６２−２５６３ｉｎｓＡＡＣＴＣＣの少なくとも一つである請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
試料中のＥＧＦＲ突然変異を同定する方法において、上記試料からの核酸を、突然変異したＥＧＦＲタンパク質をコードする核酸、又は突然変異を含むその断片に特異的にハイブリダイズ可能な核酸プローブと接触させ、上記ハイブリダイゼーションを検出することを含む方法。
【請求項１４】
上記突然変異がＥＧＦＲのキナーゼドメインに存在している請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
上記ＥＧＦＲ突然変異が、２４０２Ｇ＞Ｃ；２４０１Ｇ＞Ｔ；２４０１Ｇ＞Ａ；２４８２Ｇ＞Ａ；２４８６Ｔ＞Ｃ；２４９１Ｇ＞Ｃ；２４９４Ｇ＞Ｃ；２５１０Ｃ＞Ｔ；２５３９Ｇ＞Ａ；  ２５５６Ｃ＞Ｔ；２５６３Ｃ＞Ｔ；２５７６Ｔ＞Ａ；２８１９Ｔ＞Ｇ；２８１９Ｔ＞Ｃ；２４８２−２４９０ｄｅｌ；２４８１−２４９５ｄｅｌ；２４８２−２４９０  ｄｅｌ；２４８５−２４９３ｄｅｌ；２４９４Ｇ＞Ｃ；２４８６−２５０３  ｄｅｌ；２４８５−２５０２ｄｅｌ；２４８３Ａ＞Ｔ；２４８６−２４９４ｄｅｌ；２４９９−２５２２ｄｅｌ；２５４４−２５４５ｉｎｓＧＣＣＡＴＡ；２５５４−２５５５ｉｎｓＣＣＡＧＣＧＴＧＧ；２５６１−２５６２ｉｎｓＧＧＴ；及び２５６２−２５６３ｉｎｓＡＡＣＴＣＣの少なくとも一つである請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
上記ＥＧＦＲ突然変異が、２４０２Ｇ＞Ｃ；２４８２Ｇ＞Ａ；２４８６Ｔ＞Ｃ；２４９１Ｇ＞Ｃ；２４９４Ｇ＞Ｃ；２５１０Ｃ＞Ｔ；２５３９Ｇ＞Ａ；２５４９Ｇ＞Ｔ；２５６３Ｃ＞Ｔ；  ２８１９Ｔ＞Ｃ；２４８２−２４９０ｄｅｌ；２４８６−２５０３ｄｅｌ；２５４４−２５４５ｉｎｓＧＣＣＡＴＡ；２５５４−２５５５ｉｎｓＣＣＡＧＣＧＴＧＧ；及び２５６２−２５６３ｉｎｓＡＡＣＴＣＣの少なくとも一つである請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
上記プローブが検出可能に標識される請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
上記プローブがアンチセンスオリゴマーである請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
上記試料中の上記核酸中のＥＧＦＲ遺伝子又はその断片が増幅され、上記プローブと接触せしめられる請求項１３に記載の方法。
【請求項２０】
ＥＧＦＲ突然変異を有する腫瘍の治療のための医薬の調製における抗癌剤の使用であって、上記腫瘍中の上記ＥＧＦＲ突然変異が、Ｇ７１９Ａ、Ｇ７１９Ｃ、Ｇ７１９Ｓ、Ｅ７４６Ｋ、Ｌ７４７Ｓ、Ｅ７４９Ｑ、Ａ７５０Ｐ、Ａ７５５Ｖ、Ｖ７６５Ｍ、Ｈ７７３Ｙ、Ｓ７６８Ｉ、Ｓ７８４Ｆ、Ｌ８５８Ｒ、Ｌ８５８Ｐ、Ｌ８６１Ｑ、Ｅ７４６−Ａ７４８ｄｅｌ、Ｅ７４６−Ａ７５０ｄｅｌ、Ｅ７４６−Ｒ７４８ｄｅｌ、Ｌ７４７−Ｅ７４９ｄｅｌ、Ｒ７４８−Ｐ７５３ｄｅｌ、Ｌ７４７−Ｓ７５２ｄｅｌ、Ｅ７４６Ｖ、Ｌ７４７−Ｔ７５１ｄｅｌ、Ｌ７４７−Ｐ７５３ｄｅｌ、Ｓ７５２−Ｉ７５９ｄｅｌ、Ｍ７６６−Ａ７６７ＡＩｉｎｓ、Ｓ７６８−Ｖ７６９ＳＶＡｉｎｓ、Ｐ７７２−Ｈ７７３ＮＳｉｎｓ及びＰ７７２−Ｈ７７３Ｖｉｎｓの少なくとも一つである使用。
【請求項２１】
上記抗癌剤が化学療法剤である請求項２０に記載の使用。
【請求項２２】
上記抗癌剤がＥＧＦＲ阻害剤である請求項２０に記載の使用。
【請求項２３】
上記化学療法剤が、シタラビン、フルダラビン、５-フルオロ-２'-デオキシウリジン、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、メトトレキセート、ブレオマイシン、クロラムブシル、シスプラチン、シクロホスファミド、ドキソルビシン、ミトキサントロン、カンプトセシン、トポテカン；テニポシド；コルセミド、コルヒチン、パクリタキセル、ビンブラスチン、ビンクリスチン又はタモキシフェンの一又は複数である請求項２１に記載の使用。
【請求項２４】
上記化学療法剤が、メトトレキセート；ブレオマイシン、シスプラチン、シクロホスファミド、ドキソルビシン、ミトキサントロン、パクリタキセル、ビンブラスチン、ビンクリスチン又はタモキシフェンの一又は複数である請求項２１に記載の使用。
【請求項２５】
上記化学療法剤が、セツキシマブ、パニツムマブ、エルロチニブ又はゲフィチニブの一又は複数である請求項２２に記載の使用。
【請求項２６】
上記ＥＧＦＲ突然変異が、Ｇ７１９Ａ、Ｅ７４６Ｋ、Ｌ７４７Ｓ、Ｅ７４９Ｑ、Ａ７５０Ｐ、Ａ７５５Ｖ、Ｖ７６５Ｍ、Ｓ７６８Ｉ、Ｌ８５８Ｐ、Ｅ７４６−Ａ７４８ｄｅｌ、Ｒ７４８−Ｐ７５３ｄｅｌ、Ｍ７６６−Ａ７６７ＡＩｉｎｓ、Ｓ７６８−Ｖ７６９ＳＶＡｉｎｓ及びＰ７７２−Ｈ７７３ＮＳｉｎｓの少なくとも一つである請求項２０に記載の使用。
【請求項２７】
突然変異したＥＧＦＲタンパク質をコードする核酸又は突然変異を含むその断片に特異的にハイブリダイズ可能な核酸プローブ。
【請求項２８】
上記プローブが、突然変異したＥＧＦＲをコードする上記核酸又はその上記断片に相補的である請求項２７に記載のプローブ。
【請求項２９】
約１０から約５０のヌクレオチド長を有する請求項２７に記載のプローブ。
【請求項３０】
検出可能な標識を更に含む請求項２７に記載のプローブ。
【請求項３１】
上記突然変異が、Ｇ７１９Ａ、Ｇ７１９Ｃ、Ｇ７１９Ｓ、Ｅ７４６Ｋ、Ｌ７４７Ｓ、Ｅ７４９Ｑ、Ａ７５０Ｐ、Ａ７５５Ｖ、Ｓ７６８Ｉ、Ｌ８５８Ｒ、Ｌ８５８Ｐ、Ｌ８６１Ｑ、Ｅ７４６−Ａ７４８ｄｅｌ、Ｅ７４６−Ａ７５０ｄｅｌ、Ｅ７４６−Ｒ７４８ｄｅｌ、Ｌ７４７−Ｅ７４９ｄｅｌ、Ｒ７４８−Ｐ７５３ｄｅｌ、Ｌ７４７−Ｓ７５２ｄｅｌ、Ｅ７４６Ｖ、Ｌ７４７−Ｔ７５１ｄｅｌ、Ｌ７４７−Ｐ７５３ｄｅｌ、Ｓ７５２−Ｉ７５９ｄｅｌ、Ｍ７６６−Ａ７６７ＡＩｉｎｓ、Ｓ７６８−Ｖ７６９ＳＶＡｉｎｓ、及びＰ７７２−Ｈ７７３Ｖｉｎｓの少なくとも一つである請求項２７に記載のプローブ。
【請求項３２】
上記突然変異が、Ｇ７１９Ａ、Ｅ７４６Ｋ、Ｌ７４７Ｓ、Ｅ７４９Ｑ、Ａ７５０Ｐ、Ａ７５５Ｖ、Ｖ７６５Ｍ、Ｓ７６８Ｉ、Ｈ７７３Ｙ、Ｓ７８４Ｆ、Ｔ７９０Ｍ、Ｌ８５８Ｐ、Ｅ７４６−Ａ７４８ｄｅｌ、Ｒ７４８−Ｐ７５３ｄｅｌ、Ｍ７６６−Ａ７６７ＡＩｉｎｓ、Ｐ７７２−Ｈ７７３ＮＳｉｎｓ及びＳ７６８−Ｖ７６９ＳＶＡｉｎｓの少なくとも一つである請求項２７に記載の使用。
【請求項３３】
試料中の突然変異したＥＧＦＲ遺伝子を検出する方法において、上記ＥＧＦＲ遺伝子のキナーゼドメインに対応する核酸又は突然変異を含むことが疑われるその断片を上記試料から増幅させ、増幅させた核酸の電気泳動移動度を、対応する野生型ＥＧＦＲ遺伝子又はその断片の電気泳動移動度と比較することを含む方法。
【請求項３４】
電気泳動移動度がポリアクリルアミドゲルで測定される請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
ＥＧＦＲ阻害剤での治療に対して感受性であるヒト患者における腫瘍を同定する方法であって、（ｉ）上記腫瘍の試料中の野生型ＲＡＳタンパク質又は遺伝子の存在を決定し、ここで、野生型ＲＡＳタンパク質又は遺伝子の存在が、腫瘍がＥＧＦＲ阻害剤での治療に感受性であることを示し、又は（ｉｉ）上記腫瘍の試料中の突然変異したＲＡＳタンパク質又は遺伝子の存在を決定し、突然変異したＲＡＳタンパク質又は遺伝子の不在が、腫瘍がＥＧＦＲ阻害剤での治療に感受性であることを示すことを含む方法。
【請求項３６】
上記ＲＡＳ突然変異が、Ｇ１２Ｃ；Ｇ１２Ａ；Ｇ１２Ｄ；Ｇ１２Ｒ；Ｇ１２Ｓ；Ｇ１２Ｖ；Ｇ１３Ｃ；Ｇ１３Ｄの少なくとも一つである請求項３６に記載の方法。
【請求項３７】
腫瘍を有する患者の予後を決定する方法において、上記腫瘍の試料中におけるＴ７９０ＭのＥＧＦＲ突然変異の有無を決定し、上記Ｔ７９０ＭのＥＧＦＲ突然変異の存在が上記Ｔ７９０ＭのＥＧＦＲ突然変異がない場合と比較してより乏しい予後を示す方法。
【請求項３８】
ＥＧＦＲ阻害剤での治療に対して耐性がある腫瘍を同定する方法であって、上記腫瘍の試料中においてＴ７９０ＭのＥＧＦＲ突然変異の有無を決定し、上記突然変異の存在が、腫瘍がＥＧＦＲ阻害剤での治療に対して耐性であることを示す方法。
【請求項３９】
Ｔ７９０Ｍ突然変異を含む突然変異型ＥＧＦＲタンパク質のシグナル伝達を阻害する化合物のスクリーニング方法であって、リン酸化基質とＡＴＰの存在下で上記突然変異型ＥＧＦＲを試験化合物と接触させ、上記基質のリン酸化量の変化を検出し、コントロールと比較した、又は試験化合物の不在下での基質のリン酸化と比較した上記基質のリン酸化の減少が、上記試験化合物が突然変異型ＥＦＧＲシグナル伝達の阻害剤であることを示す方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は癌の診断及び治療、特に診断及び／又は予後に供される突然変異の検出に関する。
【０００２】
（発明の背景）
上皮成長因子レセプター（ＥＧＦＲ）は、細胞の成長、分化、及び生存において重要な役割を担う成長因子レセプターの１型チロシンキナーゼファミリーのメンバーである。これらのレセプターの活性化は典型的には特異的リガンド結合を介して起こり、レセプターファミリーメンバー間でのヘテロ又はホモ二量体形成と、それに引き続いてのチロシンキナーゼドメインの自己リン酸化を生じさせる。この活性化は細胞増殖（ｒａｓ／ｒａｆ／ＭＡＰキナーゼ経路）と生存（ＰＩ３キナーゼ／Ａｋｔ経路）の双方に関与している細胞内シグナル伝達経路カスケードを惹起する。ＥＧＦＲ及びＨＥＲ２を含むこのファミリーのメンバーは細胞形質転換に直接関係している。
【０００３】
多くのヒト悪性腫瘍は、ＥＧＦＲの異常又は過剰発現及び／又はその特異的リガンド、例えばトランスフォーミング増殖因子αの過剰発現に関係している（Gullick, Br Med Bull 1991, 47:87-98；Modijtahedi及びDean, Int J Oncol 1994, 4:277-96；Salomon等, Crit Rev Oncol Hematol 1995;19:183-232）。ＥＧＦＲ過剰発現は、ＮＳＣＬＣを含む多くのヒト癌における有害な予後に関連している。ある場合には、腫瘍ＥＧＦＲの過剰発現は薬剤耐性と予後不良の双方と相関している(Lei等, Anticancer Res 1999; 19:221-8；Veale等, Br J Cancer 1993;68:162-5)。これらの知見は、ＥＧＦＲレセプター活性化とこれに続く下流のシグナル伝達を効果的に阻害する薬剤が、ＮＳＣＬＣを含む様々なヒト癌において臨床上の活性を有している可能性があることを示唆している。
【０００４】
タルセバＴＭ（エルロチニブ；ＯＳＩ-７７４としても知られている）、つまりキナゾリンは、ＥＧＦＲチロシンキナーゼの経口活性の強力な選択的阻害剤である。エルロチニブはインビトロ酵素アッセイにおいて２ｎＭ（０．７８６ｍｇ／ｍＬ）のＩＣ５０でヒトＥＧＦＲチロシンキナーゼを阻害する。この阻害は ＥＧＦＲチロシンキナーゼに対して選択的で、Ｇ１で細胞周期停止を生じ、可逆的である。マウスへのエルロチニブの経口投与はヒト異種移植片におけるＥＧＦＲ自己リン酸化の＞７０％減少を実証し、ヌードマウスにおけるＨＮ５及びＡ４３１異種移植片の顕著な成長阻害が証明された。インビボアッセイ系での単剤活性に加えて、エルロチニブは起こりうる相互作用を判定するために多くの化学療法剤と併用して評価した。エルロチニブ及びパクリタキセル、シスプラチン、ゲムシタビン、及びドキソルビシンの間に相加的相互作用があった。
【０００５】
肺癌は合衆国において男性と女性の双方に対する癌関連死亡率の主要な死因である。２０００年において、１６４０００例の新しい症例が診断され、１５７０００人の患者がこの疾患で死亡したと見積もられた（Greenlee等, CA Cancer J Clin 2001, 51:15-36）。これらの患者のおよそ７５％が非小細胞癌組織を有しているとされ、大部分が手術不能のステージＩＩＩＢ又はステージＩＶ疾患である。症状がより限られた疾患の患者（ステージＩ−ＩＩＩＡ）では、アジュバント又はネオアジュバント化学及び／又は放射線療法を伴うか又は伴わない標準的な外科治療後に再発するのが一般的である。これらの知見は、結果として非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）で〜１２％の５年生存率を示すものであり、この疾患における未達成の医療的必要性を強調するものである。
【０００６】
白金化合物のシスプラチンは局所的な進行型又は転移性ＮＳＣＬＣへの対処において臨床上の効果を示す最初の化学療法剤であった。無作為臨床試験で、最善の支持的看護の場合と比較して改善された奏効率、生活の質及び生存率が実証された（Rapp等 1988）。しかしながら、この改善の大きさは、週数で測定して、小幅であった。続いて、多くの新しい化学療法剤が第一線の場面において単剤としてまた白金塩と併用されて評価された。これらの研究からの結論は、現代の「二重の(doublet)」化学療法は１５％−２０％の奏効率、３−４ヶ月の平均無増悪期間、及び７−８ヶ月の平均生存期間を達成すると思われるということである。シスプラチンを用いて得られた結果に対して併用療法を用いた場合に得られる効果の小幅な改善が、これらの治療法を、進行型ＮＳＣＬＣに罹患し許容できる一般状態にある患者に対する標準的な治療法として確立した（Non-Small Cell Lung Cancer Cooperative Group, Br Med J 1995, 311:899-909；American Society of Clinical Oncology, J Clin Oncol 1997, 15:2996-3018；Breathnach等, J Clin Oncol 2001;19:1734-42）。 
【０００７】
（発明の概要）
本発明の一側面によれば、ヒト患者において治療に対して感受性である腫瘍を同定する方法において、上記腫瘍の試料中の突然変異したＥＧＦＲ遺伝子又は突然変異したＥＧＦＲタンパク質の存在を決定することを含み、上記突然変異がＥＧＦＲのエキソン１８−２１に位置しており、突然変異したＥＧＦＲ遺伝子又は突然変異したＥＧＦＲタンパク質の存在が、腫瘍が治療に対して感受性であることを示す方法が提供される。
本発明の他の側面では、哺乳動物における腫瘍を治療する方法において、上記腫瘍におけるＥＧＦＲ突然変異の存在を同定し、上記哺乳動物を抗癌剤で治療することを含む方法が提供される。
本発明の他の側面では、試料中のＥＧＦＲ突然変異を同定する方法において、上記試料からの核酸を、突然変異したＥＧＦＲタンパク質をコードする核酸又は突然変異を含むその断片に特異的にハイブリダイズ可能なプローブと接触させ、上記ハイブリダイゼーションを検出することを含む方法が提供される。
【０００８】
本発明の他の側面では、突然変異したＥＧＦＲタンパク質をコードする核酸又は突然変異を含むその断片に特異的にハイブリダイズ可能な核酸プローブが提供される。
本発明の他の側面では、試料中の突然変異したＥＧＦＲ遺伝子を検出する方法において、ＥＧＦＲ遺伝子のキナーゼドメインに対応する核酸又は突然変異を含むことが疑われるその断片を上記試料から増幅させ、増幅させた核酸の電気泳動移動度を、対応する野生型ＥＧＦＲ遺伝子又はその断片の電気泳動移動度と比較することを含む方法が提供される。
本発明の他の側面では、ＥＧＦＲ阻害剤での治療に対して感受性であるヒト患者における腫瘍を同定する方法であって、（ｉ）上記腫瘍の試料中の野生型ＫＲＡＳタンパク質又は遺伝子の存在を決定し、ここで、野生型ＫＲＡＳタンパク質又は遺伝子の存在が、腫瘍がＥＧＦＲ阻害剤での治療に感受性であることを示し、又は（ｉｉ）上記腫瘍の試料中の突然変異したＫＲＡＳタンパク質又は遺伝子の存在を決定し、突然変異したＫＲＡＳタンパク質又は遺伝子の不存在が、腫瘍がＥＧＦＲ阻害剤での治療に感受性であることを示すことを含む方法が提供される。
【０００９】
（好ましい実施態様の詳細な説明）
腫瘍形成に伴う変異性イベントが上皮成長因子レセプター（ＥＧＦＲ）において生じることは本発明の発見である。異常なＥＧＦＲ活性が様々な癌に伴うことはこれまでに知られていたが、ＥＧＦＲキナーゼドメイン領域（ＫＤＲ）に、ある種の癌に伴う異常なシグナル伝達活性を引き起こす突然変異が存在していたことは知られていなかった。意外にもＥＧＦＲのＫＤＲ突然変異を有する腫瘍に罹患している患者は野生型ＥＧＦＲの患者よりも良好な予後を有している。ＥＧＦＲ遺伝子のＫＤＲ突然変異は、挿入及び欠失のような再配列並びに点突然変異を含みうる。
【００１０】
Ｔｒｉｂｕｔｅと称される無作為化二重盲式フェーズＩＩＩ臨床試験に参加したおよそ２５０名の患者の試料について配列決定し、ＥＧＦＲのエキソン１８−２１に生じる突然変異を調べた。Ｔｒｉｂｕｔｅは、前に化学療法を受けていない組織学的に確認されたＮＳＣＬＣに罹患している合衆国の約１５０箇所のセンターにおける１０７９名の患者を研究し、エルロチニブ＋化学療法（カルボプラチン／パクリタキセル）を化学療法単独と比較した。患者には、エルロチニブ（１００ｍｇ／日の経口投与で、耐性のある患者では１５０ｍｇ／日まで増大）を伴うか伴わないで、パクリタキセル（２００ｍｇ／ｍ２を３時間 、静脈内注入）と、続くカルボプラチン (ＡＵＣ＝カルバート処方を使用して６ｍｇ／ｍｌ×分の１５−３０分の注入) を投与した。Ｔｒｉｂｕｔｅ治験から収集したおよそ２５０名の患者の、ホルマリン固定パラフィン包埋ブロック又は汚れのないスライドの腫瘍試料を、レーザ捕獲顕微解剖と続くＤＮＡ抽出によって腫瘍細胞について濃縮した。エキソン１８−２１をネステッドＰＣＲによって増幅させ、蛍光染料−ターミネーター化学を使用して各ＰＣＲ産物から両方向配列を得た。配列決定から発見された突然変異を表１に示す。
【００１１】
2014057587.tif 000003
2014057587.tif 000004
突然変異に対するヌクレオチド番号付けは図２ａ−２ｄに示した参照配列に基づいている。
【００１２】
ＥＧＦＲ突然変異及び野生型ＥＧＦＲを有する腫瘍の患者の臨床結果を、奏効（完全＋部分）利点（奏効＋安定）及び進行に応じて分析した。病巣は固形癌の効果判定(RECIST)規準を使用して評価したが、これによれば、「完全奏効」（ＣＲ）は全ての標的病巣の消失として定義され；「部分奏効」（ＰＲ）は、ベースライン最長径和を規準として、標的病巣の長径和の少なくとも３０％の減少として定義され；「進行（ＰＤ）」は、治療開始又は一又は複数の病巣の出現時から記録された最小の長径和を規準とした、標的病巣の長径和の少なくとも２０％の増加として定義され、「安定」（ＳＤ）は、治療開始からの最小の長径和を規準として、部分奏効として認定されるのに十分な縮小でも進行として認定されるのに十分な増大でもないものとして定義される。
【００１３】
分析の結果を表２にまとめる。
2014057587.tif 000005
【００１４】
臨床結果の分析により、ＥＧＦＲのエキソン１８−２１に突然変異を発現する腫瘍の患者は野生型ＥＧＦＲを発現する腫瘍の患者よりも良好な予後を有していることが明らかになった。突然変異ＥＧＦＲの患者は化学療法又は化学療法＋エルロチニブで治療した場合、より大なる奏効率、利益率及び生存期間を示した。これらの結果は、腫瘍がエキソン１８から２１の何れか又は全てにＥＧＦＲ突然変異を有する患者が、腫瘍がそのような突然変異を持たない患者よりもより好ましい予後を有しているような結果を予測するのに有用である。
【００１５】
従って、本発明は、腫瘍を有する患者の予後を決定する方法において、上記腫瘍の試料中においてエキソン１８−２１（又はエキソン１８−２１に対応するアミノ酸配列）中の一又は複数のＥＧＦＲ突然変異の有無を決定し、上記一又は複数のＥＧＦＲ突然変異の存在が上記一又は複数のＥＧＦＲ突然変異がない場合と比較してより良好な予後を示す方法を提供する。「予後」とは奏効及び／又は利益及び／又は生存を意味する。「ＥＧＦＲ突然変異」とは、一つの対立遺伝子（ヘテロ接合性）又は双方の対立遺伝子（ホモ接合性）にそれぞれ見出される野生型ＥＧＦＲタンパク質又は核酸とは異なり、体細胞性又は生殖系列でありうるアミノ酸又は核酸配列を意味する。特定の実施態様では、上記突然変異はＥＧＦＲのキナーゼドメイン領域（ＫＤＲ）に見出される。他の特定の実施態様では、突然変異は、表１に示されるようなアミノ酸置換、欠失又は挿入である。一実施態様では、アミノ酸突然変異は次のものの一又は複数である：Ｇ７１９Ａ、Ｅ７４６Ｋ、Ｌ７４７Ｓ、Ｅ７４９Ｑ、Ａ７５０Ｐ、Ａ７５５Ｖ、Ｓ７６８Ｉ、Ｌ８５８Ｐ、Ｅ７４６−Ｒ７４８ｄｅｌ、Ｒ７４８−Ｐ７５３ｄｅｌ、Ｍ７６６−Ａ７６７ＡＩ ｉｎｓ、及びＳ７６８−Ｖ７６９ＳＶＡ ｉｎｓ。他の特定の実施態様では、突然変異は、表１に示すような核酸点突然変異、欠失又は挿入である。一実施態様では、核酸突然変異は、次のものの一又は複数である：２４０２Ｇ＞Ｃ；２４８２Ｇ＞Ａ；２４８６Ｔ＞Ｃ；２４９１Ｇ＞Ｃ；２４９４Ｇ＞Ｃ；２５１０Ｃ＞Ｔ；２５４９Ｇ＞Ｔ；２８１９Ｔ＞Ｃ；２４８２−２４９０ｄｅｌ；２４８６−２５０３ｄｅｌ；２５４４−２５４５ｉｎｓＧＣＣＡＴＡ；及び２５５４−２５５５ｉｎｓＣＣＡＧＣＧＴＧＧ。
【００１６】
エルロチニブでの治療に対して耐性を示したＨ１９７５腫瘍細胞株からのＥＧＦＲエキソン１８−２１を配列決定し、Ｌ８５８Ｒ突然変異と組み合わされた突然変異Ｔ７９０Ｍを含むことが見出された。従って、本発明は、腫瘍を有する患者の予後を決定する方法において、上記腫瘍の試料中においてＴ７９０ＭのＥＧＦＲ突然変異の有無を決定し、上記Ｔ７９０ＭのＥＧＦＲ突然変異の存在が上記Ｔ７９０ＭのＥＧＦＲ突然変異がない場合と比較してより乏しい予後を示す方法を更に提供する。更に、化学療法との併用でであろうとなかろうと、エルロチニブ又はゲフィチニブのようなＥＧＦＲ阻害剤の治療法に対して応答性が少ない腫瘍の患者を同定する方法であって、患者の腫瘍中のＴ７９０ＭのＥＧＦＲ突然変異の有無を決定し、上記突然変異の存在が、患者が上記Ｔ７９０ＭのＥＧＦＲ突然変異がない腫瘍の患者と比較して上記治療法に対して応答性が少ないことを示す方法が提供される。更に、化学療法との併用でであろうとなかろうと、例えばキナーゼドメイン結合阻害剤（例えば、エルロチニブ又はゲフィチニブ）のようなＥＧＦＲ阻害剤での治療に耐性がある腫瘍を同定する方法であって、腫瘍の試料中のＴ７９０ＭのＥＧＦＲ突然変異の有無を決定し、上記突然変異の存在が、腫瘍が上記治療に耐性があることを示す方法が提供される。突然変異の決定はタンパク質レベル又は核酸レベル（ゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡ）においてであり、ここに記載されたもののような技術を使用して達成される。特定の実施態様では、上記ＥＧＦＲ阻害剤はＥＧＦＲキナーゼドメインにおいてＡＴＰと競合する。特定の実施態様では、ＥＧＦＲ阻害剤はエルロチニブである。
【００１７】
他の側面では、Ｔ７９０Ｍ突然変異型ＥＧＦＲタンパク質又は遺伝子を含む腫瘍を有する患者を治療する（又はＴ７９０Ｍ突然変異型ＥＧＦＲタンパク質又は遺伝子を含む腫瘍を治療する）方法であって、上記Ｔ７９０Ｍ突然変異型ＥＧＦＲに結合し、及び／又はそのシグナル伝達を阻害する第一化合物を、野生型ＥＧＦＲ又は活性化突然変異を含むＥＧＦＲに結合し、及び／又はそのシグナル伝達を阻害する第二化合物と組み合わせて上記患者に同時投与する（又は上記腫瘍に接触させる）ことを含む方法が提供される。特定の実施態様では、上記活性化突然変異は表１に記載されたもの（Ｔ７９０Ｍ以外）の一又は複数である。特定の実施態様では、上記第一及び第二化合物は連続的に又は同時に投与される。特定の実施態様では、上記第二化合物はエルロチニブである。
本発明の他の側面では、Ｔ７９０Ｍ突然変異を含む突然変異型ＥＧＦＲタンパク質のシグナル伝達を阻害する化合物のスクリーニング方法であって、リン酸化基質及びＡＴＰの存在下で試験化合物に上記突然変異型ＥＧＦＲを接触させ、上記基質のリン酸化の量の変化を検出することを含み、コントロールと比較した、又は試験化合物の不存在下で基質のリン酸化と比較した上記基質のリン酸化の減少が、上記試験化合物が突然変異型ＥＧＦＲシグナル伝達の阻害剤であることを示す方法が提供される。一実施態様では、上記方法は、ＥＧＦ又はＴＧＦ-αのような上記突然変異型ＥＧＦＲのリガンドの存在下でインビトロで実施される。
【００１８】
特定の実施態様では、試験化合物の阻害活性を、コントロールに対する試験化合物による上皮成長因子レセプターキナーゼによるチロシン上の外因性基質（例えばＬｙｓ３-ガストリン又はポリＧｌｕＴｙｒ(４：１)ランダムコポリマー（I. Posner等, J. Biol. Chem. 267 (29), 20638-47 (1992)）のリン酸化阻害の量によってインビトロで決定することができる。精製された可溶型ヒトＴ７９０ＭのＥＧＦＲ突然変異ＥＧＦＲ（９６ｎｇ）を、室温で２０−３０分間、１０μｌの全容量で、リン酸化バッファー＋バナジン酸塩（ＰＢＶ：５０ｍＭのＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．４；１２５ｍＭのＮａＣｌ；２４ｍＭのＭｇＣｌ２；１００μＭのオルトバナジン酸ナトリウム）中でＥＧＦ（２μｇ／ｍｌ）と共にマイクロチューブ中でプレインキュベートする。ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解させた試験化合物をＰＢＶに希釈し、１０μｌを突然変異型ＥＧＦＲ／ＥＧＦ混合物と混合し、３０℃で１０−３０分間インキュベートする。突然変異型ＥＧＦＲ／ＥＧＦ混合物に、２０μｌ３３Ｐ-ＡＴＰ／基質混合物（１２０μＭ Ｌｙｓ３-ガストリン(アミノ酸に対する一文字コードでの配列、KKKGPWLEEEEEAYGWLDF - 配列番号３８)、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ ｐＨ７．４、４０μＭのＡＴＰ、２μＣｉγ-[３３Ｐ]-ＡＴＰ）を添加することにより、リン酸化反応を開始させ、室温で２０分間インキュベートする。その反応を、１０μｌの停止液（０．５ＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８；２ｍＭのＡＴＰ）及び６μｌの２Ｎ ＨＣｌの添加により停止させる。チューブを４℃、１４０００ＲＰＭで１０分間、遠心分離する。各チューブから３５μｌの上清をワットマンＰ８１ペーパーの２．５ｃｍ円上にピペットで取り、洗浄当り１リットルの５％酢酸中で４回バルク洗浄した後、空気乾燥させる。これにより、洗浄で遊離ＡＴＰが消失してペーパーに基質が結合する。取り込まれた[３３Ｐ]は液体シンチレーション計数によって測定する。基質（例えばｌｙｓ３-ガストリン）の不存在下での取り込み量をバックグラウンドとして全ての値から減じ、試験化合物が存在しないコントロールに対する阻害パーセントを計算する。ある範囲の用量の試験化合物を用いて実施されるそのようなアッセイは、Ｔ７９０Ｍ突然変異ＥＧＦＲキナーゼ活性のインビトロでの阻害に対するおよそのＩＣ５０値の決定を可能にする。
【００１９】
本発明の他の側面では、ヒト患者において治療に対して感受性である腫瘍を同定する方法において、上記腫瘍の試料中の突然変異ＥＧＦＲ遺伝子又は突然変異ＥＧＦＲタンパク質の存在を決定することを含み、上記突然変異がＥＧＦＲのエキソン１８−２１に位置しており、突然変異ＥＧＦＲ遺伝子又は突然変異ＥＧＦＲタンパク質の存在が、腫瘍が抗癌剤での治療に対して感受性であることを示す方法が提供される。特定の実施態様では、抗癌剤は、細胞毒性又は細胞分裂阻害性でありうる化学療法剤である。腫瘍には、神経芽細胞腫、腸癌、例えば直腸癌、大腸癌、家族性大腸ポリポーシス癌及び遺伝性非ポリポーシス大腸癌、食道癌、口唇癌、喉頭癌、下咽頭癌、舌癌、唾液腺癌、胃癌、腺癌、甲状腺髄様癌、甲状腺動脈乳頭癌、腎臓癌、腎実質癌、卵巣癌、頸癌、子宮体癌、子宮内膜癌、絨毛癌、膵臓癌、前立腺癌、精巣癌、乳癌、尿管癌、メラノーマ、脳腫瘍、例えば膠芽細胞腫、星状細胞腫、髄膜腫、髄芽細胞腫及び末梢神経外胚葉性腫瘍、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性骨髄性白血病骨（ＡＭＬ）、慢性髄性白血病（ＣＭＬ）、成人Ｔ 細胞白血病、肝細胞癌、胆嚢癌、気管支癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、多発性骨髄腫、基底細胞腫、奇形腫、網膜芽細胞腫、脈絡膜メラノーマ、精上皮腫、横紋筋肉腫、頭蓋咽頭腫（craniopharyngeoma）、骨肉腫、軟骨肉腫、筋肉腫、脂肪肉腫、線維肉腫、ユーイング肉腫及び形質細胞腫が含まれる。特定の腫瘍には、脳、肝臓、腎臓、膀胱、乳房、胃、卵巣、結腸直腸、前立腺、膵臓、乳房、肺、外陰部、甲状腺、結腸直腸、食道、肝臓の癌、肉腫、膠芽細胞腫、頭頸部、白血病及びリンパ性悪性疾患が含まれる。
【００２０】
特定の化学療法剤には、限定されるものではないが、（ｉ）代謝拮抗剤、例えばシタラビン、フルダラビン、５-フルオロ-２'-デオキシウリジン、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア又はメトトレキセート；（ｉｉ）ＤＮＡ断片化剤、例えばブレオマイシン、（ｉｉｉ）ＤＮＡ架橋剤、例えばクロラムブシル、シスプラチン、シクロホスファミド又はナイトロジェンマスタード；（ｉｖ）インターカレート剤、例えばアドリアマイシン（ドキソルビシン）又はミトキサントロン；（ｖ）タンパク合成阻害剤、例えばＬ-アスパラギナーゼ、シクロヘキシミド、ピューロマイシン又はジフテリア毒素；（ｖｉ）トポイソメラーゼＩ毒、例えばカンプトセシン又はトポテカン；（ｖｉｉ）トポイソメラーゼＩＩ毒、例えばエトポシド（ＶＰ-１６）又はテニポシド；（ｖｉｉｉ）微小管関連剤、例えばコルセミド、コルヒチン、パクリタキセル、ビンブラスチン又はビンクリスチン；（ｉｘ）キナーゼ阻害剤、例えば フラボピリドール、スタウロスポリン、ＳＴＩ５７１（ＣＰＧ５７１４８Ｂ）又はＵＣＮ-０１（７-ヒドロキシスタウロスポリン）；（ｘ）様々な治験薬、例えばチオプラチン(thioplatin)、ＰＳ-３４１、フェニルブチレート、ＥＴ-１８-ＯＣＨ３、又はファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤（Ｌ-７３９７４９、Ｌ-７４４８３２）；ポリフェノール類、例えばケルセチン、レスベラトロール、ピセタノール、エピガロカテキン没食子酸塩、テアフラビン類、フラバノール類、プロシアニジン類、ベツリン酸及びその誘導体；（ｘｉ）ホルモン、例えばグルココルチコイド又はフェンレチニド；（ｘｉｉ）抗ホルモン、例えばタモキシフェン、フィナステライド又はＬＨＲＨアンタゴニストが含まれる。一実施態様では、化学療法化合物はゲムシタビン、シスプラチン、ドキソルビシン、ダウナルビシン、パクリタキセル(paclitexel)、タキソテール及びマイトマイシンＣの一又は複数が含まれる。特定の実施態様では、化学療法化合物はゲムシタビン、シスプラチン及びパクリタキセルの一又は複数である。他の実施態様では、治療はＥＧＦＲの阻害剤である。一実施態様では、ＥＧＦＲ阻害剤は例えばエルビツツクス(Erbitutux)ＴＭ（セツキシマブ, Imclone Systems Inc.）及びＡＢＸ-ＥＧＦ（パニツムマブ, Abgenix, Inc.）のような抗体である。他の実施態様では、ＥＧＦＲ阻害剤は、ＡＴＰと競合する低分子、例えばタルセバ(Tarceva)TM(エルロチニブ, OSI Pharmaceuticals)、イレッサ(Iressa)TM(ゲフィチニブ, Astra-Zeneca)、Dvir等, J Cell Biol., 113:857-865 (1991)により記載されたチロホスチン類；米国特許第５６７９６８３号に開示された三環系ピリミジン化合物；Panek等, Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics 283, 1433-1444 (1997)に開示された化合物６-(２,６-ジクロロフェニル)-２-(４-(２-ジエチルアミノエトキシ)フェニルアミノ)-８-メチル-８Ｈ-ピリド(２,３-ｄ)ピリミジン-７-オン（ＰＤ１６６２８５として知られている）である。
【００２１】
本発明の他の側面では、試料中のＥＧＦＲ突然変異を同定する方法において、上記試料からの核酸を、突然変異したＥＧＦＲタンパク質をコードする核酸又は突然変異を含むその断片に特異的にハイブリダイズ可能な核酸プローブと接触させ、上記ハイブリダイゼーションを検出することを含む方法が提供される。特定の実施態様では、上記プローブは例えば放射性同位元素（３Ｈ、３２Ｐ、３３Ｐ等）、蛍光剤（ローダミン、フルオレセン等）又は発色剤で検出可能に標識される。特定の実施態様では、プローブはアンチセンスオリゴマー、例えばＰＮＡ、モルホリノ-ホスホロアミデート類、ＬＮＡ又は２’-アルコキシアルコキシである。プローブは約８ヌクレオチドから約１００ヌクレオチド、又は約１０から約７５、あるいは約１５から約５０、又は約２０から約３０でありうる。他の側面では、本発明の上記プローブは試料中においてＥＧＦＲ突然変異を同定するためのキットとして提供され、該キットはＥＧＦＲ遺伝子に又は該遺伝子の突然変異の部位に隣接して特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含む。該キットはキットを使用してハイブリダイゼーション試験の結果に基づいてＥＧＦＲ阻害剤でＥＧＦＲ突然変異を含む腫瘍を有する患者を治療するための指図書を更に含みうる。
本発明の他の側面では、試料中の突然変異ＥＧＦＲ遺伝子を検出する方法において、上記ＥＧＦＲ遺伝子のキナーゼドメインに対応する核酸、又はエキソン１８−２１、又は突然変異を含むことが疑われるその断片を上記試料から増幅させ、増幅させた核酸の電気泳動移動度を、対応する野生型ＥＧＦＲ遺伝子又はその断片の電気泳動移動度と比較することを含む方法が提供される。移動度の差異は、増幅された核酸配列中に突然変異が存在していることを示している。電気泳動移動度はポリアクリルアミドゲルで測定することができる。
【００２２】
あるいは、増幅されたＥＧＦＲ遺伝子又は断片核酸を、酵素突然変異検出法(Enzymatic Mutation Detection (EMD))(Del Tito等, Clinical Chemistry 44:731-739, 1998)を使用して突然変異の検出について分析することができる。ＥＭＤはバクテリオファージリゾルベースＴ４エンドヌクレアーゼＶＩＩを使用し、これは、点突然変異、挿入及び欠失から生じる塩基対ミスマッチによって引き起こされる構造的歪みを検出し切断するまで二本鎖ＤＮＡに沿ってスキャンする。例えばゲル電気泳動によってリゾルベース切断により形成された二つの短い断片の検出は突然変異の存在を示している。ＥＭＤ法の利点は、ＰＣＲ反応から直接アッセイされた点突然変異、欠失及び挿入を同定する単一のプロトコルであり、試料精製の必要性を排除し、ハイブリダイゼーション時間を短縮し、信号対雑音比を増大させる。２０倍までの過剰な正常ＤＮＡ及び４ｋｂのサイズまでの断片を含む混合試料をアッセイすることができる。しかしながら、ＥＭＤスキャンは突然変異陽性試料中に起こる特定の塩基変化を同定せず、必要ならば突然変異を同定するために更なる配列決定手順を必要とする。ＣＥＬ Ｉ酵素は米国特許第５８６９２４５号に実証されているようにリゾルベースＴ４エンドヌクレアーゼＶＩＩと同様にして使用することができる。
【００２３】
本発明のＥＧＦＲ突然変異を検出するための他の簡単なキットは、ヘモクロマトーシスを引き起こすＨＦＥ、ＴＦＲ２及びＦＰＮ１遺伝子における多重突然変異の検出のためのヘマクロマトーシス試験紙アッセイ(Haemochromatosis  StripAssayTM)(Viennalabs http://www.bamburghmarrsh.com/pdf/4220.pdf)に類似したリバースハイブリダイゼーション試験紙である。そのようなアッセイは、ＰＣＲによる増幅に続く配列特異的ハイブリダイゼーションに基づいている。単一突然変異アッセイに対しては、マイクロプレートベースの検出系を適用することができる一方、多重突然変異アッセイに対しては、試験紙は「マクロ-アレイ」として使用することができる。キットは試料調製、増幅及び突然変異検出のための直ぐに使用できる試薬を含みうる。多重増幅プロトコルは利便性を提供し、非常に限られた体積の試料の試験を可能にする。直接的な試験紙アッセイ態様を使用して、２０及びそれ以上の突然変異の試験を、高価な装置を用いないで５時間未満で完了させることができる。ＤＮＡが試料から単離され、ＥＧＦＲ遺伝子（又はエキソン１８−２１又はＫＤＲ又はそのセグメント）がインビトロで増幅され（例えばＰＣＲ）、好ましくは単一（「多重(multiplex)」）増幅反応においてビオチン標識される。ＰＣＲ産物は、プローブが平行線又はバンドとして固定されている試験紙のような固体担体上に固定されたオリゴヌクレオチドプローブ（野生型及び変異型特異的）に選択的にハイブリダイズされたものである。結合したビオチン標識単位複製配列はストレプトアビジン-アルカリホスファターゼ及び有色基質を使用して検出される。そのようなアッセイは表１の突然変異の全て又は任意のサブセットを検出することができる。特定の突然変異プローブバンドに対しては３種のシグナル伝達パターンの一つが可能である：（ｉ）正常なＥＧＦＲを示す野生型プローブに対してのみのバンド（ｉｉ）ヘテロ接合遺伝子型を示す野生型及び突然変異双方のプローブに対するバンド及び（ｉｉｉ）ホモ接合突然変異ＥＧＦＲ遺伝子型を示す突然変異プローブだけに対するバンド。従って、本発明のＥＧＦＲ突然変異を検出する方法であって、試料から核酸を単離し、ＥＧＦＲ遺伝子、又はその断片（例えばＫＤＲ又はエキソン１８−２１又はより小さいもの）を、増幅された核酸がリガンドを含むように増幅させ、増幅されたＥＧＦＲ遺伝子又は断片を、リガンドに対する検出可能な結合対を含むプローブであってＥＧＦＲ突然変異体に特異的にハイブリダイズ可能なプローブに接触させ、ついで上記増幅ＥＧＦＲ遺伝子又は断片に対する上記プローブのハイブリダイゼーションを検出する方法が更に提供される。特定の実施態様では、リガンドはビオチンであり、結合対はアビジン又はストレプトアビジンを含む。特定の実施態様では、結合対は、有色基質で検出可能なストレプトアビジン-アルカリ性である。特定の実施態様では、プローブは例えば試験紙上に固定され、そこで、異なった突然変異に相補的であるプローブが互いに分離される。あるいは、増幅された核酸は、放射性同位元素で標識され、その場合、プローブはリガンドを含む必要はない。
【００２４】
腫瘍試料はまたＫＲＡＳ中の突然変異（ｐ２１ａと称する）について分析した。エキソン１において検出される特定の突然変異は、化学療法並びにエルロチニブ療法と併用した化学療法に対して不良な予後と相関しているＧ１２Ｃ；Ｇ１２Ａ；Ｇ１２Ｄ；Ｇ１２Ｒ；Ｇ１２Ｓ；Ｇ１２Ｖ；Ｇ１３Ｃ；Ｇ１３Ｄである。従って、本発明はＥＧＦＲ阻害剤、例えばエルロチニブ又は化学療法と併用したエルロチニブの療法に対して反応性ではない患者を同定する方法であって、ＫＲＡＳ突然変異の存在又は不存在を決定することを含み、上記突然変異の存在が上記療法に患者が応答しないであろうことを示す方法を更に提供する。あるいは、ＥＧＦＲ阻害剤での治療に感受性であるヒト患者における腫瘍を同定する方法であって、（ｉ）上記腫瘍の試料中における野生型ＫＲＡＳタンパク質又は遺伝子の存在を決定し、野生型ＫＲＡＳタンパク質又は遺伝子の存在が、その腫瘍がＥＧＦＲ阻害剤での治療に感受性であることを示し、あるいは（ｉｉ）上記腫瘍の試料中における突然変異ＫＲＡＳタンパク質又は遺伝子の存在を決定し、突然変異ＫＲＡＳタンパク質又は遺伝子の不存在が、その腫瘍がＥＧＦＲ阻害剤での治療に感受性であることを示す方法が提供される。特定の実施態様では、突然変異はＫ-Ｒａｓのエキソン１にある。他の実施態様ではＫ-Ｒａｓ突然変異は、Ｇ１２Ｃ；Ｇ１２Ａ；Ｇ１２Ｄ；Ｇ１２Ｒ；Ｇ１２Ｓ；Ｇ１２Ｖ；Ｇ１３Ｃ；Ｇ１３Ｄの少なくとも一つである。あるいは、突然変異Ｋ-Ｒａｓを持つ腫瘍を有する個体は、Ｋ-Ｒａｓ阻害剤と併用した場合は、ＥＧＦＲ阻害剤で治療することができる。Ｋ-Ｒａｓ突然変異の存在を決定する方法はここに詳細に記載するＥＧＦＲ突然変異を同定するために使用されるものと同様である。
【００２５】
本発明の診断及び予後方法によれば、野生型ＥＧＦＲ遺伝子の改変が検出される。本発明による野生型遺伝子の改変は、例えば挿入、逆位、欠失、及び／または点突然変異のような全ての形態の突然変異を包含する。体細胞突然変異はある種の組織、例えば腫瘍組織でのみ生じるものであり、生殖細胞系列で遺伝するものではない。生殖系列突然変異は体組織の任意のもので見出すことができる。単一のアレルのみが体細胞的に突然変異する場合、初期の腫瘍状態が示される。しかしながら、双方のアレルが突然変異すると、ついで後期腫瘍状態が示される。ＥＧＦＲ突然変異の発見は、よって、ここに記載されるように診断及び予後の指標である。
【００２６】
腫瘍組織に見出されるＥＧＦＲ突然変異は癌性状態に導く野生型ＥＧＦＲに対して増加したシグナル伝達活性を生じうる。野生型ＥＧＦＲ遺伝子の改変を検出するために、腫瘍の特定のタイプ及び位置に対して適切な当該分野でよく知られた方法によって腫瘍の試料又はバイオプシーが得られる。例えば、肺癌病巣の試料は、切除、気管支鏡検査法、微細針吸引、気管支ブラッシングによって、又は血痰、胸腔内液又は血液から得ることができる。組織調製物を腫瘍細胞について濃縮する手段は当該分野で知られている。例えば、組織をパラフィン又はクリオスタット切片から単離することができる。癌細胞はまたフローサイトメトリー又はレーザ捕獲顕微解剖によって正常細胞から分離することもできる。これらの技術と正常細胞から腫瘍を分離するための他の技術は当該分野でよく知られている。腫瘍組織が正常細胞で高度に汚染されている場合、突然変異の検出はより困難である。
点突然変異の検出は、当該分野でよく知られている技術を使用してＥＧＦＲアレル（又はアレル群）を分子クローニングしそのアレルを配列決定することによって達成することができる。あるいは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して、腫瘍組織からのゲノムＤＮＡ調製物から直接的に遺伝子配列を増幅させることができる。ついで、増幅された配列のＤＮＡ配列を決定し、それから突然変異を同定することができる。ポリメラーゼ連鎖反応は当該分野でよく知られており、Saiki等, Science 239:487, 1988；米国特許第４６８３２０３号；及び米国特許第４６８３１９５号に記載されている。 
【００２７】
ＥＧＦＲエキソン１８−２１のＰＣＲ増幅に使用することができる特異的プライマー対には次のものが含まれる：
<5pEGFR.ex18.out> CAAATGAGCTGGCAAGTGCCGTGTC (配列番号３９)
<3pEGFR.ex18.out> GAGTTTCCCAAACACTCAGTGAAAC (配列番号４０)
<5pEGFR.ex19.out> GCAATATCAGCCTTAGGTGCGGCTC (配列番号４１)
<3pEGFR.ex19.out> CATAGAAAGTGAACATTTAGGATGTG (配列番号４２)
<5pEGFR.ex20.out> CCATGAGTACGTATTTTGAAACTC (配列番号４３)
<3pEGFR.ex20.out> CATATCCCCATGGCAAACTCTTGC (配列番号４４)
<5pEGFR.ex21.out> CTAACGTTCGCCAGCCATAAGTCC (配列番号４５)
<3pEGFR.ex21.out> GCTGCGAGCTCACCCAGAATGTCTGG (配列番号４６)
<5pEGFR.ex18.in.m13f> TGTAAAACGACGGCCAGTCAAGTGCCGTGTCCTGGCACCCAAGC
(配列番号４７)
<3pEGFR.ex18.in.m13r> CAGGAAACAGCTATGACCCCAAACACTCAGTGAAACAAAGAG
(配列番号４８)
<5pEGFR.ex19.in.m13f> TGTAAAACGACGGCCAGTCCTTAGGTGCGGCTCCACAGC
(配列番号４９)
<3pEGFR.ex19.in.m13r> CAGGAAACAGCTATGACCCATTTAGGATGTGGAGATGAGC
(配列番号５０)
<5pEGFR.ex20.in.m13f> TGTAAAACGACGGCCAGTGAAACTCAAGATCGCATTCATGC
(配列番号５１)
<3pEGFR.ex20.in.m13r> CAGGAAACAGCTATGACCGCAAACTCTTGCTATCCCAGGAG
(配列番号５２)
<5pEGFR.ex21.in.m13f> TGTAAAACGACGGCCAGTCAGCCATAAGTCCTCGACGTGG
(配列番号５３)
<3pEGFR.ex21.in.m13r> CAGGAAACAGCTATGACCCATCCTCCCCTGCATGTGTTAAAC
(配列番号５４)
Ｋ-Ｒａｓエキソン１のＰＣＲ増幅に使用することができる特異的プライマー対には次のものが含まれる：
<5pKRAS-out>  TACTGGTGGAGTATTTGATAGTG (配列番号５５)
<3pKRAS-out> CTGTATCAAAGAATGGTCCTG (配列番号５６)
<5pKRAS-in.m13f> TGTAAAACGACGGCCAGTTAGTGTATTAACCTTATGTG (配列番号５７)
<3pKRAS-in.m13r> CAGGAAACAGCTATGACCACCTCTATTGTTGGATCATATTCG 
(配列番号５８)
【００２８】
当該分野で知られているリガーゼ連鎖反応を、ＥＧＦＲ配列を増幅させるために使用することができる。Wu等, Genomics, Vol. 4, pp.560-569 (1989)を参照。また、アレル特異的ＰＣＲとして知られている技術を使用することができる。（Ruano及びKidd, Nucleic Acids Research, Vol. 17, p. 8392, 1989を参照。）この技術によれば、特定のＥＧＦＲ突然変異にその３’末端でハイブリダイズするプライマーが使用される。特定のＥＧＦＲ突然変異が存在していない場合は、増幅産物は観察されない。欧州特許出願公開第０３３２４３５号及び Newton等, Nucleic Acids Research, Vol. 17, p.7, 1989に開示されたAmplification Refractory Mutation System (ARMS) もまた使用することができる。遺伝子の挿入及び欠失もまたクローニング、配列決定及び増幅によって検出することができる。また、遺伝子又は周りのマーカー遺伝子に対する制限断片長多型（ＲＦＬＰ）プローブを、多型断片におけるアレルの改変又は挿入をスコア付けするために使用することができる。一本鎖ＤＮＡ高次構造多型（ＳＳＣＰ）解析もまたアレルの塩基変化変異体を検出するために使用することができる。（Orita等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol. 86, pp. 2766-2770, 1989,及びGenomics, Vol. 5, pp. 874-879, 1989。）当該分野で知られているような挿入及び欠失を検出する他の方法を使用することができる。 
野生型遺伝子の改変はまた遺伝子の野生型発現産物の改変に基づいて検出することもできる。そのような発現産物にはＥＧＦＲｍＲＮＡ並びにＥＧＦＲタンパク質産物の双方が含まれる。点突然変異は、ｍＲＮＡから作製されたｃＤＮＡの分子クローニングを介して又はｍＲＮＡを増幅し配列決定することによって、検出することができる。クローン化ｃＤＮＡの配列は当該分野でよく知られたＤＮＡ配列決定法を使用して決定することができる。ｃＤＮＡはまたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を介して配列決定することもできる。
【００２９】
本発明によれば、ミスマッチは、１００％相補的ではないハイブリダイズした核酸二本鎖である。完全な相補性の欠如は欠失、挿入、逆位、又は置換又はフレームシフト突然変異によりうる。ミスマッチの検出は遺伝子又はそのｍＲＮＡ産物中における点突然変異を検出するために使用することができる。これらの技術は配列決定よりも感受性が低いが、多数の腫瘍試料に対して実施するのがより簡単である。ミスマッチ切断方法の一例はリボヌクレアーゼ保護法であり、これは、Winter等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 82, p.7575, 1985及びMeyers等, Science, Vol. 230, p.1242, 1985に詳細に記載されている。本発明の実施において、その方法は、ヒト野生型ＥＧＦＲ遺伝子コード配列（又はエキソン１８−２１又はそのＫＤＲ）に相補的である標識リボプローブの使用を含む。リボプローブと腫瘍組織から単離されたｍＲＮＡ又はＤＮＡの何れかは一緒にアニール（ハイブリダイズ）され、続いて二本鎖ＲＮＡ構造中の幾らかのミスマッチを検出することができる酵素リボヌクレアーゼＡで消化される。ミスマッチがリボヌクレアーゼＡによって検出される場合、それはミスマッチ部位で切断する。よって、アニールされたＲＮＡ調製物が電気泳動ゲルマトリックスで分離されるとき、ミスマッチがリボヌクレアーゼＡによって検出され切断された場合、リボプローブとｍＲＮＡ又はＤＮＡに対する完全長二本鎖ＲＮＡよりも小さいＲＮＡ産物が見られる。リボプローブはＥＧＦＲｍＲＮＡ又は遺伝子の完全長である必要はないが、エキソン１８から２１又はＥＧＦＲ ＫＤＲ又はそのセグメントでありうる。リボプローブがＥＧＦＲｍＲＮＡ又は遺伝子のセグメントのみを含む場合、多くのこれらプローブを使用してミスマッチに対する全ｍＲＮＡ配列をスクリーニングすることが望ましい。
【００３０】
同様な形で、ＤＮＡプローブを用いて、酵素的又は化学的切断を介して、ミスマッチを検出することができる。例えば、Cotton等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 85, 4397, 1988；及びShenk等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 72, p. 989, 1975を参照のこと。あるいは、ミスマッチは、マッチした二本鎖に対するミスマッチの二本鎖の電気泳動移動度シフトによって検出することができる。例えば、Cariello, Human Genetics, Vol. 42, p.726, 1988を参照のこと。リボプローブかＤＮＡプローブの何れかを用いて、突然変異を含むかもしれない細胞性ｍＲＮＡ又はＤＮＡはハイブリダイゼーション前にＰＣＲを使用して増幅させることができる。ＥＧＦＲ遺伝子のＤＮＡの変化は、例えば欠失及び挿入のように特に変化が全体的な再配列である場合は、サザンハイブリダイゼーションを使用して検出することもできる。
【００３１】
ポリメラーゼ連鎖反応の使用によって増幅されたＥＧＦＲ遺伝子のＤＮＡ配列を、アレル特異的プローブを使用してスクリーニングすることもまたできる。これらのプローブは核酸オリゴマーであり、その各々が既知の突然変異を有するＥＧＦＲ遺伝子配列の領域を含む。例えば、一つのオリゴマーは、ＥＧＦＲ遺伝子配列の一部に相当して、約３０ヌクレオチド長でありうる。そのようなアレル特異的プローブのバッテリーの使用によって、ＰＣＲ増幅産物をスクリーニングし、ＥＧＦＲ遺伝子中における過去に同定された突然変異の存在を同定することができる。増幅されたＥＧＦＲ配列とのアレル特異的プローブのハイブリダイゼーションは例えばナイロンフィルターで実施することができる。ストリンジェントなハイブリダイズ条件下での特定のプローブのハイブリダイゼーションは、アレル特異的プローブにおけるものと同じ突然変異が腫瘍組織に存在していることを示している。
野生型ＥＧＦＲ遺伝子の改変はまた野生型ＥＧＦＲタンパク質の改変についてスクリーニングすることによっても検出することができる。例えば、ＥＧＦＲと免疫反応性であるモノクローナル抗体を用いて組織をスクリーニングすることができる。同族抗原の欠如がＥＧＦＲ突然変異を示すであろう。突然変異アレル産物に特異的な抗体をまた突然変異ＥＧＦＲ遺伝子産物の検出に使用することができる。抗体はファージディスプレイライブラリーから同定することができる。そのような免疫学的アッセイは当該分野で知られている任意の簡便な形態で行うことができる。これらには、ウェスタンブロット、免疫組織化学的アッセイ及びエライザアッセイが含まれる。改変されたＥＧＦＲタンパク質を検出するための任意の手段を、野生型ＥＧＦＲ遺伝子の改変を検出するために使用することができる。
【００３２】
突然変異ＥＧＦＲ遺伝子又は遺伝子産物は腫瘍から又は尿、痰又は血清のような他の身体の試料から検出することができる。腫瘍試料中の突然変異ＥＧＦＲ遺伝子又は遺伝子産物の検出に対して上で検討されたものと同じ技術を他の身体の試料に対して適用することができる。癌細胞は腫瘍から脱落しそのような身体の試料中に現れる。そのような身体の試料をスクリーニングすることによって、単純な初期の診断を多くのタイプの癌に対して達成することができる。また、化学療法又は放射線療法の進行を、突然変異ＥＧＦＲ遺伝子又は遺伝子産物についてそのような身体の試料を試験することによってより簡単にモニターすることができる。
本発明の診断方法は、例えば肺、乳房、大腸、神経、膀胱、肝臓、胃及び前立腺のような腫瘍形成にＥＧＦＲがある役割を担っている任意の腫瘍に適用できる。本発明の診断方法は臨床医に有用であり、彼らは適切な治療過程において決定することができる。例えば、双方のＥＧＦＲアレルの改変を示す腫瘍は、一つのみのＥＧＦＲアレルの改変を示す腫瘍よりもより積極的な治療レジメンを示唆するかも知れない。
【００３３】
本発明のプライマー対はポリメラーゼ連鎖反応を使用する特定のＥＧＦＲアレルのヌクレオチド配列の決定のために有用である。一本鎖ＤＮＡプライマーの対はＥＧＦＲ遺伝子自体のＤＮＡ合成を刺激増幅するためにＥＧＦＲ遺伝子内又は該遺伝子を囲む配列にアニーリングすることができる。これらのプライマーの集合によりＥＧＦＲエキソン１８から２１のヌクレオチドの全ての合成が可能になる。アレル特異的プライマーをまた使用することができる。このようなプライマーは特定のＥＧＦＲ突然変異体アレルにのみアニーリングし、よって鋳型としての突然変異体アレルの存在下で産物を増幅だけする。引き続いての増幅配列のクローニングを容易にするために、プライマーはその末端に付属した制限酵素部位配列を有しうる。よって、プライマーの全てのヌクレオチドは、制限酵素部位を形成するのに必要な数個のヌクレオチドを除いてＥＧＦＲエキソン１８−２１又はそれに隣接する配列から誘導される。そのような酵素及び部位は当該分野でよく知られている。そのプライマー自体は、当該分野でよく知られている技術を使用して合成することができる。一般に、プライマーは、商業的に入手できるオリゴヌクレオチド合成機を使用して作製することができる。特定のプライマーの設計は十分に当業者の技量の範囲内である。
【００３４】
本発明によって提供される核酸プローブは多くの目的に対して有用である。それらはゲノムＤＮＡへのサザンハイブリダイゼーションにおいて、また上で既に検討した点突然変異を検出するためのリボヌクレアーゼ保護法において使用することができる。プローブはＰＣＲ増幅産物を検出するために使用することができる。それらはまた他の技術を使用してＥＧＦＲ遺伝子又はｍＲＮＡとのミスマッチを検出するために使用することもできる。ミスマッチは酵素（例えばＳ１ヌクレアーゼ）か、化学物質（例えばヒドロキシルアミン又は四酸化オスミウム及びピペリジン）か、又は完全にマッチしたハイブリッドと比較した場合のミスマッチハイブリッドの電気泳動移動度の変化の何れかを使用して検出することができる。これらの技術は当該分野で知られている。Novack等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.83, p.586, 1986を参照。一般に、プローブはＥＧＦＲエキソン１８−２１配列に相補的であるが、但し、一般にキナーゼドメイン及びそのセグメントに対するプローブもまた考えられる。核酸プローブの全バッテリーを用いて、野生型ＥＧＦＲ遺伝子の改変を検出するためのキットを構成することができる。そのキットにより、ＥＧＦＲ遺伝子の全エキソン１８−２１配列へのハイブリダイゼーションが可能になる。プローブは互いにオーバーラップしていてもよいし又は近接していてもよい。
【００３５】
リボプローブをｍＲＮＡとのミスマッチを検出するために使用する場合、それはＥＧＦＲ遺伝子のｍＲＮＡに相補的である。よって、リボプローブは、センス鎖に相補的であるためＥＧＦＲタンパク質をコードしていない点でアンチセンスプローブである。リボプローブは一般に放射性、比色性、又は蛍光定量物質で標識され、これは当該分野で知られている任意の手段によって達成することができる。リボプローブがＤＮＡとのミスマッチを検出するために使用される場合、それは何れの極性でも、センス又はアンチセンスでもありうる。同様に、ＤＮＡプローブを、ミスマッチを検出するために使用することもまたできる。 
【００３６】
癌の素因はＥＧＦＲ遺伝子の突然変異についてヒトの任意の組織を試験することによって確認することができる。例えば、生殖系列ＥＧＦＲ突然変異を受け継いだ人は癌になる傾向があると思われる。これは、身体の任意の組織からのＤＮＡを試験することによって決定することができる。例えば、血液を採り、血液の細胞からＤＮＡを抽出することができる。また、ＥＧＦＲ遺伝子の突然変異について胎児細胞、胎盤細胞、又は羊水を試験することによって出生前診断を達成することができる。例えば点突然変異によろうと又は欠失によろうと、野生型ＥＧＦＲアレルの改変は、上で検討した手段の任意のものによって検出することができる。
【実施例】
【００３７】
（実施例１）スライドの調製−脱パラフィン処理及び染色
次の溶液に切片を浸した：  
１．新鮮なキシレン（切片の脱パラフィン処理のため）−５分
２．新鮮なキシレン−５分
３．１００％エタノール−１５秒
４．９５％エタノール−１５秒
５．７０％エタノール−１５秒
６．脱イオン水−１５秒
７．メイヤーのヘマトキシリン−３０秒
８．脱イオン水−洗浄（×２）−１５秒
９．７０％エタノール−１５秒
１０．エオシンＹ−５秒
１１．９５％エタノール−１５秒
１２．９５％エタノール−１５秒
１３．１００％エタノール−１５秒
１４．１００％エタノール−１５秒
１５．キシレン（切片の脱水を完全にするため）−６０秒
１６．およそ２分間空気乾燥させるかエアースプレーを軽く使用してキシレンを完全に除去した。
１７．ついで、組織はＬＣＭの準備が整った。
【００３８】
（実施例２）レーザ捕獲顕微解剖及びＤＮＡ抽出
材料：
ＰｉｘＣｅｌｌ ＩＩ ＬＣＭシステム
ＣａｐＳｕｒｅ ＨＳ又はＣａｐＳｕｒｅ Ｍａｃｒｏ ＬＣＭキャップ
ＥｘｔｒａｃｔＳｕｒｅ装置（ＨＳのみ）
カミソリの刃（工場殺菌）
０．５ｍｌ試験管
０．２ｍｌ試験管
ＰｉｃｏＰｕｒｅＤＮＡ抽出キット
６５℃インキュベータ
手順：
１．集められる組織の領域にＣａｐＳｕｒｅキャップを配した
２．所望の領域にレーザを当てた
２．組織からキャップを持ち上げた
３．０．５ｍｌの試験管中にプロテイナーゼＫと共に２０ｕｌのＰｉｃｏＰｕｒｅ消化バッファーを分配した
４．切った材料と共にキャップを試験管中に配して密封シールを形成した
５．消化バッファーがキャップを覆うように試験管を逆さにした
６．６５℃で２４時間インキュベートした
７．キャップと共に試験管をスピンさせて消化された材料を試験管の底に集めた
８．消化物を０．２ｍｌの細長い試験管に移した
９．加熱した蓋を備えたサーモサイクラーで１０分間９５℃にてプロテイナーゼＫを不活化させた
１０．５０ｕｌのＰＣＲ反応で１−２ｕｌの試料を使用した。清浄化は必要ではなかった。
【００３９】
（実施例３）ＰＣＲ増幅
ＰＣＲプライマー：
配列決定をする各エキソン（ＥＧＦＲエキソン１８、１９、２０及び２１）に対してプライマー対を設計した。プライマー配列は次の通りであった：
<5pEGFR.ex18.out> CAAATGAGCTGGCAAGTGCCGTGTC (配列番号３９)
<3pEGFR.ex18.out> GAGTTTCCCAAACACTCAGTGAAAC (配列番号４０)
<5pEGFR.ex19.out> GCAATATCAGCCTTAGGTGCGGCTC (配列番号４１)
<3pEGFR.ex19.out> CATAGAAAGTGAACATTTAGGATGTG (配列番号４２)
<5pEGFR.ex20.out> CCATGAGTACGTATTTTGAAACTC (配列番号４３)
<3pEGFR.ex20.out> CATATCCCCATGGCAAACTCTTGC (配列番号４４)
<5pEGFR.ex21.out> CTAACGTTCGCCAGCCATAAGTCC (配列番号４５)
<3pEGFR.ex21.out> GCTGCGAGCTCACCCAGAATGTCTGG (配列番号４６)
<5pEGFR.ex18.in.m13f> TGTAAAACGACGGCCAGTCAAGTGCCGTGTCCTGGCACCCAAGC
(配列番号４７)
<3pEGFR.ex18.in.m13r> CAGGAAACAGCTATGACCCCAAACACTCAGTGAAACAAAGAG
(配列番号４８)
<5pEGFR.ex19.in.m13f> TGTAAAACGACGGCCAGTCCTTAGGTGCGGCTCCACAGC
(配列番号４９)
<3pEGFR.ex19.in.m13r> CAGGAAACAGCTATGACCCATTTAGGATGTGGAGATGAGC
(配列番号５０)
<5pEGFR.ex20.in.m13f> TGTAAAACGACGGCCAGTGAAACTCAAGATCGCATTCATGC
(配列番号５１)
<3pEGFR.ex20.in.m13r> CAGGAAACAGCTATGACCGCAAACTCTTGCTATCCCAGGAG
(配列番号５２)
<5pEGFR.ex21.in.m13f> TGTAAAACGACGGCCAGTCAGCCATAAGTCCTCGACGTGG
(配列番号５３)
<3pEGFR.ex21.in.m13r> CAGGAAACAGCTATGACCCATCCTCCCCTGCATGTGTTAAAC
(配列番号５４)
ＰＣＲ用のＫ-Ｒａｓオリゴ
<5pKRAS-out>  TACTGGTGGAGTATTTGATAGTG (配列番号５５)
<3pKRAS-out> CTGTATCAAAGAATGGTCCTG (配列番号５６)
<5pKRAS-in.m13f> TGTAAAACGACGGCCAGTTAGTGTATTAACCTTATGTG
(配列番号５７)
<3pKRAS-in>.m13r CAGGAAACAGCTATGACCACCTCTATTGTTGGATCATATTCG
(配列番号５８)
【００４０】
一次ＰＣＲ産物のネステッド増幅を、一次ＰＣＲ産物内に位置しているイントロン特異的プライマー対を使用して実施した。これらのネステッドプライマー対はＭ１３ｆ及びＭ１３ｒｅｖ配列でタグ付けした。
ＰＣＲの第一回目：
ＰＣＲ反応：
ＤＮＡ          ０．５から３０ｎｇ
プライマー      ２５０ｎＭ／各外側プライマー
ｄＮＴＰｓ      各０．２ｍＭ（ロッシュカタログ番号1581295）
ＭｇＣｌ２       １．５ｍＭ（１５ｍＭ  １０×バッファー）
酵素            １．５Ｕ／ＲＸ Expand High fidelity Taq 
(ロッシュカタログ番号1759078)
５０ｕｌ反応容積
サーモサイクラー条件：
９５℃−３分
９４℃−３０秒  ３５回反復
５８℃−３０秒
７２℃−１分
７２℃−８分
４℃−永久
ＰＣＲの第二回目：
ＰＣＲ反応：
ＤＮＡ          第一回目のＰＣＲ反応から１ｕｌ
プライマー      ２５０ｎＭ／各内側プライマー
ｄＮＴＰｓ      各０．２ｍＭ（ロッシュカタログ番号1581295）
ＭｇＣｌ２       １．５ｍＭ（１５ｍＭ  １０×バッファー）
酵素            １．５Ｕ／ＲＸ Expand High fidelity Taq 
(ロッシュカタログ番号1759078)
５０ｕｌ反応容積
サーモサイクラー条件：
９５℃−３分
９４℃−３０秒  ３０回反復
５８℃−３０秒
７２℃−１分
７２℃−８分
４℃−永久
【００４１】
ＰＣＲ産物の単離：
ＰＣＲ反応産物を、品質管理のためにＥ-ゲル２％アガロースゲル（Invitrogen, カタログ番号G6018-02）に流した。ＰＣＲ産物は必要に応じてQiaquick 96ＰＣＲ精製キット（Qiagen, カタログ番号28181）を使用して直接精製するか又はゲル精製した。ゲル精製では、ＰＣＲ産物をＥ-ゲルから切り取り、ＤＮＡをゲル抽出プロトコル（Qiagen, カタログ番号28181）でQiaquick 96ＰＣＲ精製キットを使用して精製した。
【００４２】
（実施例４）配列決定
タグ付けＰＣＲ産物に対してネステッド配列決定プライマー又は標準Ｍ１３ｆ及びＭ１３ｒｅｖ配列決定プライマーを使用して、精製されたＰＣＲ産物の配列決定を行った。配列は次の通りであった：
<m13f> TGTAAAACGACGGCCAGT (配列番号５９)
<m13r> CAGGAAACAGCTATGACC (配列番号６０)
精製したＰＣＲ産物を希釈し、BigDyeターミネーターキット（ABI, Foster City, CA）を製造者の指示書に従って使用してサイクル配列決定した。
反応混合物：
５ｕｌのＤＮＡ（２５−１００ｎｇのＰＣＲ産物）
６ｕｌの水
水で．２５ＯＤ／１００ｕｌに希釈した１ｕｌプライマー（ｍ１３ｆ又はｍ１３ｒ又は配列特異的プライマー）
２ｕｌのBigDye v3.1
６ｕｌの希釈バッファー（ＡＢＩ ５×希釈バッファーの等価物）
サイクル配列決定：
条件：
９６℃−２．５分−初期変性
９６℃−１０秒
５０℃−５秒
６０℃−４分
全２５から５０サイクルを繰り返す
反応洗浄：
次のものを使用して取り込まれていないヌクレオチドを除去：
８％セファデックス
Edge BioSystem９ウェルブロック中５００ｕｌ
７５０ｇで２分間スピン
分析：
反応産物を、ＡＢＩ３７００又はＡＢＩ３７３０配列決定機器で電気泳動させた。電気泳動図を、Sequencher (Gene Codes, Corp)のような市販の解析プログラムを使用し、また特注ツールを用いて突然変異について解析した。
【００４３】
（実施例５）用量応答
この研究に使用したヒト上皮成長因子レセプター（ＥＧＦＲ）野生型及び変異コンストラクトのＮ末端にｇＤの単純ヘルペスウイルスシグナル配列でエピトープタグを付け、内因性ＥＧＦＲシグナル配列を置換した（Schaefer等 1999 J. Biol. Chem. 274, 859-866）。Ｃｏｓ７細胞を、形質移入の２４時間前に通常の成長培地の１２ウェル皿に播種した。LipofectAMINE 2000 を製造者の推奨するプロトコル(Invitrogen)を用いて発現プラスミドＤＮＡ（pRK5.gD.EGFR野生型、pRK5.gD.EGFR. L858R、又はpRK5.gD.EGFR.del(E746-S752)）を用いてウェル当り０．２５ｕｇを形質移入した。形質移入の２４時間後、無血清ＤＭＥＭ中で６時間の間、細胞を血清不足にした。刺激の１時間前に、形質移入した細胞を標示濃度のエルロチニブと共にプレインキュベートした。形質移入した細胞を１ｎＭのＴＧＮαで１０分間刺激した。還元Laemmliバッファーを使用してウェル中で細胞を直接溶解させた。成長因子刺激によるＥＤＦＲレセプター活性化の指標であるレセプターの自己リン酸化を、ＨＲＰ結合抗ホスホチロシン抗体（Oncogene Sciences, AB-4）を使用してウェスタンブロット法によって検出した。形質移入効率をｇＤエピトープタグに対して特異的な抗体（5B6）を使用して評価した。レセプター活性化レベルを、ＮＩＨイメージソフトウェアを使用してオートラジオグラムから評価した。ついでこれらのデータを用いてグラフを作成し、それから４パラメータフィット関数を使用してＩＣ５０を計算した。以下の結果に示すように、エルロチニブは野生型ＥＧＦＲと比較して変異を含むＥＧＦＲに対してより大なる親和性を有している。
EGFRコンストラクト          阻害 (IC50)
WT EGFR-gD                    50 nM
L858R EGFR-gD                 20 nM
del(746-752) EGFR-gD          5 nM   
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】野生型ＥＧＦＲ１のアミノ酸配列（配列番号１）を示し、ここで、シグナル配列は残基１−２４であり、細胞外ドメインは残基２４−６４５を含み、膜貫通ドメインは残基６４６−６６８を含み、細胞質ドメインは残基６６９−１２１０を含む。チロシンキナーゼドメイン領域は残基７１８−９６４であり、スレオニンリン酸化部位は残基６７８である。
【図２ａ】野生型ＥＧＦＲのｃＤＮＡ配列（配列番号２）であり、エキソン１８はヌクレオチド２３０８−２４３０に対応し；エキソン１９はヌクレオチド２４３１−２５２９に対応し；エキソン２０はヌクレオチド２５３０−２７１５に対応し、エキソン２１は２７１６−２８７１に対応する。
【図２ｂ】野生型ＥＧＦＲのｃＤＮＡ配列（配列番号２）であり、エキソン１８はヌクレオチド２３０８−２４３０に対応し；エキソン１９はヌクレオチド２４３１−２５２９に対応し；エキソン２０はヌクレオチド２５３０−２７１５に対応し、エキソン２１は２７１６−２８７１に対応する。
【図２ｃ】野生型ＥＧＦＲのｃＤＮＡ配列（配列番号２）であり、エキソン１８はヌクレオチド２３０８−２４３０に対応し；エキソン１９はヌクレオチド２４３１−２５２９に対応し；エキソン２０はヌクレオチド２５３０−２７１５に対応し、エキソン２１は２７１６−２８７１に対応する。
【図２ｄ】野生型ＥＧＦＲのｃＤＮＡ配列（配列番号２）であり、エキソン１８はヌクレオチド２３０８−２４３０に対応し；エキソン１９はヌクレオチド２４３１−２５２９に対応し；エキソン２０はヌクレオチド２５３０−２７１５に対応し、エキソン２１は２７１６−２８７１に対応する。
【図３】ＥＧＦＲの細胞外（上方）及び細胞内（下方）領域の模式図である。
【図４】野生型ＥＧＦＲ（実線）及び突然変異ＥＧＦＲ（破線）を発現するＮＳＣＬＣ腫瘍の患者の無増悪期間を示すKaplan-Meier曲線である。
【図５】野生型ＥＧＦＲ（実線）及び突然変異ＥＧＦＲ（破線）を発現するＮＳＣＬＣ腫瘍の患者の生存時間を示すKaplan-Meier曲線である。
【図６】一過性に形質移入したＣＯＳ７細胞中でエルノチニブの濃度を変化させての突然変異ＥＧＦＲ（Ｌ８５８Ｒ及びｄｅｌ７４６−７５２）及び野生型ＥＧＦＲの自己リン酸化の阻害を示すオートラジオグラフである。
【図７】一過性に形質移入したＣＯＳ７細胞中でエルノチニブの濃度を変化させての突然変異ＥＧＦＲ（Ｌ８５８Ｒ及びｄｅｌ７４６−７５２）及び野生型ＥＧＦＲの自己リン酸化の阻害を示すグラフである。
【図８】ＥＧＦＲ遺伝子及びタンパク質配列のエキソン１８及び１９における突然変異を示す。アミノ酸及びヌクレオチド変化、及び挿入は太字の下線を付したフォントであり、欠失はダッシュ(-)で示す。
【図９】ＥＧＦＲ遺伝子及びタンパク質配列のエキソン２０及び２１における突然変異を示す。アミノ酸及びヌクレオチド変化、及び挿入は太字の下線を付したフォントであり、欠失はダッシュ(-)で示す。
【図１】
2014057587.tif 000006
【図２ａ】
2014057587.tif 000007
【図２ｂ】
2014057587.tif 000008
【図２ｃ】
2014057587.tif 000009
【図２ｄ】
2014057587.tif 000010
【図３】
2014057587.tif 000011
【図４】
2014057587.tif 000012
【図５】
2014057587.tif 000013
【図６】
2014057587.tif 000014
【図７】
2014057587.tif 000015
【図８】
2014057587.tif 000016
【図９】
2014057587.tif 000017
【配列表】
2014057587000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成25年10月31日(2013.10.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト患者において治療に対して感受性である腫瘍を同定する方法において、上記腫瘍の試料中の突然変異したＥＧＦＲ遺伝子又は突然変異したＥＧＦＲタンパク質の存在を決定することを含み、上記突然変異がＥＧＦＲのエキソン１８−２１に位置しており、Ｔ７９０Ｍ以外の突然変異ＥＧＦＲ遺伝子又は突然変異ＥＧＦＲタンパク質の存在が、腫瘍が治療に対して感受性であることを示す方法。
【外国語明細書】
2014057587000001.pdf
2014057587000002.pdf
2014057587000003.pdf
2014057587000004.pdf