(57)【要約】【課題】細胞傷害活性、特にはＡＤＣＣ活性を、より簡便に、迅速にかつ高精度に予測する手段及び方法を提供すること。【解決手段】細胞傷害活性を予測する方法であって、（ａ）動物から採取された白血球を含む生体試料を準備するステップと、（ｂ）該生体試料と抗体とを接触させるステップと、（ｃ）該白血球における、腫瘍壊死因子スーパーファミリー１５、ケモカインＣＸＣＬ３、及びインターロイキン６からなる群より選択される少なくとも１つの発現を検出するステップと、（ｄ）該抗体を接触させた場合の発現レベルと接触させていない場合の発現レベルとを比較するステップと、（ｅ）該抗体を接触させた場合の発現レベルが、接触させていない場合の発現レベルより高い場合に、細胞傷害活性が存在すると予測するステップと、を含む方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞傷害活性を予測する方法であって、
（ａ）動物から採取された白血球を含む生体試料を準備するステップと、
（ｂ）該生体試料と抗体とを接触させるステップと、
（ｃ）該白血球における、腫瘍壊死因子スーパーファミリー１５、ケモカインＣＸＣＬ３、及びインターロイキン６からなる群より選択される少なくとも１つの発現を検出するステップと、
（ｄ）該抗体を接触させた場合の発現レベルと接触させていない場合の発現レベルとを比較するステップと、
（ｅ）該抗体を接触させた場合の発現レベルが、接触させていない場合の発現レベルより高い場合に、細胞傷害活性が存在すると予測するステップと、
を含む方法。
【請求項２】
前記細胞傷害活性が抗体依存性細胞傷害活性である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記抗体が熱凝集ＩｇＧである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記抗体が抗体医薬である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
前記抗体医薬が、アブシキシマブ、アダリムマブ、アレムツズマブ、バシリキシマブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、ダクリズマブ、エクリズマブ、エファリズマブ、ゲムツズマブオゾガマイシン、イブリツモマブチウキセタン、インフリキシマブ、ムロモナブ、ナタリズマブ、オマリズマブ、パリビズマブ、パニツムマブ、ラニビズマブ、リツキシマブ、トシツモマブ、トシリズマブ、ゴリムマブ、カナキヌマブ、ウステキヌマブ、オファツムマブ、デノスマブ、モタビズマブ、ラクシバクマブ、ベリムマブ、イピリムマブ、ブレンツキシマブベドチン、及びトラスツズマブからなる群より選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記抗体を、熱変性させて、又は該抗体に対する抗原との複合体として、前記生体試料と接触させる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記発現の検出がｍＲＮＡの検出である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記発現の検出が、腫瘍壊死因子スーパーファミリー１５の発現の検出である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
抗体医薬に対する患者の薬剤応答性の評価方法であって、
（ａ）患者から採取された白血球を含む生体試料を準備するステップと、
（ｂ）該生体試料と抗体とを接触させるステップと、
（ｃ）該白血球における、腫瘍壊死因子スーパーファミリー１５、ケモカインＣＸＣＬ３、ケモカインＣＸＣＬ１及び腫瘍壊死因子スーパーファミリー２からなる群より選択される少なくとも１つの発現を検出するステップと、
（ｄ）該抗体を接触させた場合の発現レベルと接触させていない場合の発現レベルとを比較して、細胞傷害活性を予測するステップと、
（ｅ）該患者の細胞傷害活性が高い場合に、該患者の抗体医薬に対する薬剤応答性が高いと評価するステップと、
を含む方法。
【請求項１０】
前記生体試料と接触させる前記抗体が、熱凝集ＩｇＧ、抗癌剤、抗ウイルス剤、抗炎症剤、拒絶反応抑制剤及び抗腫瘍剤からなる群から選択される１種以上である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記抗体医薬が、抗癌剤、抗ウイルス剤、抗炎症剤、拒絶反応抑制剤及び抗腫瘍剤からなる群から選択される、請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記抗体医薬がトラスツズマブである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記患者におけるＨＥＲ２タンパク質抗原の発現を検出するステップをさらに含む、請求項９〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
細胞傷害活性を有する抗体をスクリーニングする方法であって、
（ａ）被検抗体と動物から採取された白血球とを接触させるステップと、
（ｂ）該白血球における腫瘍壊死因子スーパーファミリー１５、ケモカインＣＸＣＬ３、及びインターロイキン６からなる群より選択される少なくとも１つの発現を検出するステップと、
（ｃ）被検抗体を接触させた場合の発現レベルが、接触させていない場合の発現レベルと比較して高い場合に、該被検抗体を、細胞傷害活性を有するものとして選択するステップと、
を含む方法。
【請求項１５】
腫瘍壊死因子スーパーファミリー１５、ケモカインＣＸＣＬ３、及びインターロイキン６からなる群より選択される少なくとも１つの発現を検出するための手段を含む、細胞傷害活性を予測するためのキット。
【請求項１６】
発現を検出するための手段が、プライマー及び／又はプローブである、請求項１５に記載のキット。
【請求項１７】
抗体医薬に対する患者の薬剤応答性を評価するためのデータ分析方法であって、
（ａ）患者から得られた白血球を含む生体試料を取得するステップと、
（ｂ）該生体試料と抗体とを接触させるステップと、
（ｃ）該白血球における、腫瘍壊死因子スーパーファミリー１５、ケモカインＣＸＣＬ３、ケモカインＣＸＣＬ１及び腫瘍壊死因子スーパーファミリー２からなる群より選択される少なくとも１つの発現を検出し、発現レベルのデータを取得するステップと、
（ｄ）該抗体を接触させた場合の前記発現レベルのデータと接触させていない場合の前記発現レベルのデータとを比較するステップと、
（ｅ）該抗体を接触させた場合の発現レベルが、接触させていない場合の発現レベルより高い場合に、該患者の抗体医薬に対する薬剤応答性が高いとの評価基準に基づき、該抗体を接触させた場合の前記発現レベルのデータを分析するステップと、
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞傷害活性、特には抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を予測するための方法及びキットに関する。具体的には、特定の遺伝子の発現を検出することによって細胞傷害活性を予測する方法及びキットに関する。本発明は、患者の薬剤応答性を評価する方法、及び細胞傷害活性を有する抗体のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性とは、標的細胞に結合した抗体が、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）及びマクロファージ等のエフェクター細胞上のＦｃ受容体と結合することで、抗体依存的に誘導される細胞傷害活性である（Ｍｉｔｓｕｏ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｌｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｇｌｙｃｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １８：  １２９−１３６，  ２００６）。
【０００３】
ＡＤＣＣ活性に関しては、抗癌抗体医薬であるリツキシマブ（商品名Ｒｉｔｕｘｉａｎ（登録商標））、トラスツズマブ（商品名Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））、セツキシマブ（商品名Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標））等の抗腫瘍メカニズムの１つがＡＤＣＣ活性であることが報告されている（Ｍｉｔｓｕｏ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｌｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｇｌｙｃｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １８：  １２９−１３６，  ２００６；  Ｒｅｆｆ，  Ｍ．Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｌｏｏｄ  ８３：  ４３５−４４５，  １９９４；  Ｋｕｒａｉ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  １３：  １５５２−１５６１，  ２００７；  Ｃｌｙｎｅｓ，  Ｒ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ６：  ４４３−４４６，  ２０００）。そのため、より高い臨床効果を期待して、高いＡＤＣＣ活性を示す抗体医薬を開発する試みがなされている（Ｍｉｔｓｕｏ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｌｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｇｌｙｃｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １８：  １２９−１３６，  ２００６）。
【０００４】
ある個体におけるＡＤＣＣ活性は、抗体医薬に対するその個体の応答とも相関することが知られている。例えば、抗ＨＥＲ２ヒト化抗体であるトラスツズマブの乳癌患者に対する治療の効果は、その患者のＡＤＣＣ活性と相関している（Ｇｅｎｎａｒｉ，  Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  １０：  ５６５０−５６５５，  ２００４；  Ｂｅａｎｏ，  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ６：  ２５，  ２００８）。そのため、抗体医薬を使用する前に患者のＡＤＣＣ活性を測定することによって、その抗体医薬の効果が予測できる可能性がある。
【０００５】
上述のようにＡＤＣＣ活性の概念は確立されているが、ＡＤＣＣ活性の臨床応用における生理学的役割、病理学的役割は理解されておらず、ＡＤＣＣ活性のメカニズムにどのような遺伝子が関与しているかは具体的に明らかにされていない。
【０００６】
ＡＤＣＣ活性の測定は、様々な方法で行われており、例えば、抗体及びエフェクター細胞の存在下における標的細胞からの放射性同位体（クロム等）（Ｒｅｆｆ，  Ｍ．Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｌｏｏｄ  ８３：  ４３５−４４５，  １９９４；  Ｋｕｒａｉ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  １３：  １５５２−１５６１，  ２００７；  Ｃｌｙｎｅｓ，  Ｒ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ６：  ４４３−４４６，  ２０００；  Ｇｅｎｎａｒｉ，  Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  １０：  ５６５０−５６５５，  ２００４；  Ｂｅａｎｏ，  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ６：  ２５，  ２００８）又は蛍光色素（カルセイン等）の放出を測定することによって行われている。しかしながら、従来の方法では、生存細胞の培養が必要であるため、測定に時間がかかること、培養条件等によって測定結果が変動すること等の問題点があった。
【０００７】
一方、抗体による刺激に応答して発現される遺伝子として腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）スーパーファミリー及びケモカインが存在することが報告されている（国際公開第０６／１３３３９９号）。国際公開第０６／１３３３９９号には、熱凝集したヒトＩｇＧ（熱凝集ヒトＩｇＧ、ＨＡＧ）抗体による標的細胞への刺激に応答してＴＮＦスーパーファミリー亜群２、８、１４、１５及び１８、並びに、ケモカインＣＣＬ−３、ＣＣＬ−２０、ＣＸＣＬ−１、ＣＸＣＬ−２、ＣＸＣＬ−３、ＩＬ−８及びＩＬ−１Ｂの遺伝子の発現が誘導されることが記載されている。この文献には、ＴＮＦスーパーファミリー遺伝子又はケモカイン遺伝子の発現レベルの変化から腫瘍の予後が予測できることが記載されている。そのほか、炎症性腸疾患（例えばクローン病）に対する免疫応答、医薬に対する応答に関して、抗体による標的細胞への刺激に応答して発現される遺伝子として、ＴＮＦスーパーファミリー（ＴＮＦＳＦ）、ケモカイン及びインターロイキンをコードする遺伝子が報告されている（Ｍｉｔｓｕｈａｓｈｉ，  Ｍ．  ａｎｄ  Ｔａｒｇａｎ，  Ｓ．Ｒ．，  Ｉｎｆｌａｍｍ．  Ｂｏｗｅｌ  Ｄｉｓ．  １４：  １０６１−１０６７，  ２００８；  Ｍｉｔｓｕｈａｓｈｉ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｈａｒｍ．  Ｒｅｓ．  ２５：  １１１６−１１２４，  ２００８）。しかしながら、このような遺伝子がＡＤＣＣ活性と関連していることについては記載されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第０６／１３３３９９号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｍｉｔｓｕｏ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｌｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｇｌｙｃｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １８：  １２９−１３６，  ２００６
【非特許文献２】Ｒｅｆｆ，  Ｍ．Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｌｏｏｄ  ８３：  ４３５−４４５，  １９９４
【非特許文献３】Ｋｕｒａｉ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  １３：  １５５２−１５６１，  ２００７
【非特許文献４】Ｃｌｙｎｅｓ，  Ｒ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ６：  ４４３−４４６，  ２０００
【非特許文献５】Ｇｅｎｎａｒｉ，  Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  １０：  ５６５０−５６５５，  ２００４
【非特許文献６】Ｂｅａｎｏ，  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ６：  ２５，  ２００８
【非特許文献７】Ｍｉｔｓｕｈａｓｈｉ，  Ｍ．  ａｎｄ  Ｔａｒｇａｎ，  Ｓ．Ｒ．，  Ｉｎｆｌａｍｍ．  Ｂｏｗｅｌ  Ｄｉｓ．  １４：  １０６１−１０６７，  ２００８
【非特許文献８】Ｍｉｔｓｕｈａｓｈｉ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｈａｒｍ．  Ｒｅｓ．  ２５：  １１１６−１１２４，  ２００８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、細胞傷害活性、特にはＡＤＣＣ活性を、より簡便に、迅速にかつ高精度に予測する手段及び方法を提供することを目的とする。本発明は、細胞傷害活性に基づいた作用機序の薬剤に対する応答性を評価する方法又は細胞傷害活性を有する抗体のスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討を行った結果、白血球における腫瘍壊死因子スーパーファミリー１５（ＴＮＦＳＦ１５）、ケモカインＣＸＣＬ３（ＣＸＣＬ３）、又はインターロイキン６（ＩＬ−６）の抗体刺激に応答した発現レベルの変化が、細胞傷害活性、特にＡＤＣＣ活性と相関することを見出した。このような知見は、従来ＡＤＣＣ活性に関連した遺伝子が報告されていないことから、予想外であり驚くべきものであった。本発明者らは、がん患者の末梢血中の白血球における上記の腫瘍壊死因子スーパーファミリー１５（ＴＮＦＳＦ１５）、ケモカインＣＸＣＬ３（ＣＸＣＬ３）に加えてケモカインＣＸＣＬ１（ＣＸＣＬ１）及び腫瘍壊死因子スーパーファミリー２（ＴＮＦＳＦ２）の抗体刺激に応答した遺伝子発現の変化が、細胞傷害活性に基づいた作用機序の薬剤による患者の治療結果と関連があることを見出し、細胞傷害活性の予測が様々な用途に応用できるという知見を得た。
【００１２】
すなわち、本発明は、以下の（１）〜（４）に関する。
（１）細胞傷害活性を予測する方法であって、
（ａ）動物から採取された白血球を含む生体試料を準備するステップと、
（ｂ）該生体試料と抗体とを接触させるステップと、
（ｃ）該白血球における、腫瘍壊死因子スーパーファミリー１５、ケモカインＣＸＣＬ３、及びインターロイキン６からなる群より選択される少なくとも１つの発現を検出するステップと、
（ｄ）該抗体を接触させた場合の発現レベルと接触させていない場合の発現レベルとを比較するステップと、
（ｅ）該抗体を接触させた場合の発現レベルが、接触させていない場合の発現レベルより高い場合に、細胞傷害活性が存在すると予測するステップと、
を含む方法。
【００１３】
上記方法において、細胞傷害活性は抗体依存性細胞傷害活性であってもよい。
【００１４】
上記方法において、抗体としては、例えば熱凝集ＩｇＧ、及び抗体医薬を用いることができる。かかる抗体医薬は、限定されるものではないが、例えばアブシキシマブ、アダリムマブ、アレムツズマブ、バシリキシマブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、ダクリズマブ、エクリズマブ、エファリズマブ、ゲムツズマブオゾガマイシン、イブリツモマブチウキセタン、インフリキシマブ、ムロモナブ、ナタリズマブ、オマリズマブ、パリビズマブ、パニツムマブ、ラニビズマブ、リツキシマブ、トシツモマブ、トシリズマブ、ゴリムマブ、カナキヌマブ、ウステキヌマブ、オファツムマブ、デノスマブ、モタビズマブ、ラクシバクマブ、ベリムマブ、イピリムマブ、ブレンツキシマブベドチン、及びトラスツズマブからなる群より選択されるものがある。
【００１５】
上記方法において、抗体は、熱変性させて、又は該抗体に対する抗原との複合体として、生体試料と接触させることができる。
【００１６】
上記方法において、発現の検出は、ｍＲＮＡの検出によって行うことができる。
【００１７】
上記方法では、腫瘍壊死因子スーパーファミリー１５の発現を検出してもよい。
【００１８】
（２）抗体医薬に対する患者の薬剤応答性の評価方法であって、
（ａ）患者から採取された白血球を含む生体試料を準備するステップと、
（ｂ）該生体試料と抗体とを接触させるステップと、
（ｃ）該白血球における、腫瘍壊死因子スーパーファミリー１５、ケモカインＣＸＣＬ３、ケモカインＣＸＣＬ１及び腫瘍壊死因子スーパーファミリー２からなる群より選択される少なくとも１つの発現を検出するステップと、
（ｄ）該抗体を接触させた場合の発現レベルと接触させていない場合の発現レベルとを比較して、細胞傷害活性（例えばＡＤＣＣ活性）を予測するステップと、
（ｅ）該患者の細胞傷害活性が高い場合に、該患者の抗体医薬に対する薬剤応答性が高いと評価するステップと、
を含む方法。
【００１９】
上記方法において、生体試料と接触させる抗体としては、例えば熱凝集ＩｇＧ、抗癌剤、抗ウイルス剤、抗炎症剤、拒絶反応抑制剤及び抗腫瘍剤からなる群から選択される１種以上を用いることができる。
【００２０】
上記方法において、抗体医薬は、例えば抗癌剤、抗ウイルス剤、抗炎症剤、拒絶反応抑制剤及び抗腫瘍剤からなる群から選択されるものである。具体的な抗体医薬としては、例えばトラスツズマブがある。
【００２１】
上記方法は、さらに患者におけるＨＥＲ２タンパク質抗原の発現を検出するステップを含んでもよい。
【００２２】
（３）細胞傷害活性（例えばＡＤＣＣ活性）を有する抗体をスクリーニングする方法であって、
（ａ）被検抗体と動物から採取された白血球とを接触させるステップと、
（ｂ）該白血球における腫瘍壊死因子スーパーファミリー１５、ケモカインＣＸＣＬ３、及びインターロイキン６からなる群より選択される少なくとも１つの発現を検出するステップと、
（ｃ）被検抗体を接触させた場合の発現レベルが、接触させていない場合の発現レベルと比較して高い場合に、該被検抗体を、細胞傷害活性を有するものとして選択するステップと、
を含む方法。
【００２３】
（４）腫瘍壊死因子スーパーファミリー１５、ケモカインＣＸＣＬ３、及びインターロイキン６からなる群より選択される少なくとも１つの発現を検出するための手段を含む、細胞傷害活性（例えばＡＤＣＣ活性）を予測するためのキット。
【００２４】
上記キットにおいて、発現を検出するための手段としては、例えばプライマー及び／又はプローブを用いることができる。
【００２５】
さらに本発明は、以下の（５）に関する。
【００２６】
（５）抗体医薬に対する患者の薬剤応答性を評価するためのデータ分析方法であって、
（ａ）患者から得られた白血球を含む生体試料を取得するステップと、
（ｂ）該生体試料と抗体とを接触させるステップと、
（ｃ）該白血球における、腫瘍壊死因子スーパーファミリー１５、ケモカインＣＸＣＬ３、ケモカインＣＸＣＬ１及び腫瘍壊死因子スーパーファミリー２からなる群より選択される少なくとも１つの発現を検出し、発現レベルのデータを取得するステップと、
（ｄ）該抗体を接触させた場合の前記発現レベルのデータと接触させていない場合の前記発現レベルのデータとを比較するステップと、
（ｅ）該抗体を接触させた場合の発現レベルが、接触させていない場合の発現レベルより高い場合に、該患者の抗体医薬に対する薬剤応答性が高いとの評価基準に基づき、該抗体を接触させた場合の前記発現レベルのデータを分析するステップと、
を含む方法。
【発明の効果】
【００２７】
本発明により、特定の遺伝子の発現を検出することによって、細胞傷害活性（特にはＡＤＣＣ活性）を予測するための方法及び手段が提供される。本発明に係る方法及び手段では、遺伝子発現の検出という簡便な操作のみで細胞傷害活性を予測することができるため、従来の問題点なく、簡便、迅速かつ高精度に細胞傷害活性を予測することができ、多くの分野（特に臨床分野）において有用である。
【００２８】
本発明に従って細胞傷害活性（特にはＡＤＣＣ活性）を予測することによって、患者の抗体医薬に対する薬剤応答性を評価することができ、特に臨床分野において有用である。さらに本発明に従って細胞傷害活性を予測することによって、細胞傷害活性を有する抗体をスクリーニングすることが可能となり、抗体医薬の探索及び開発の分野に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】ＴＮＦＳＦ１５、ＣＸＣＬ３及びＩＬ−６の遺伝子の発現量と、ＡＤＣＣ活性との相関関係を示すグラフである。
【図２】乳癌患者に対する術前化学療法による治療効果と、ＴＮＦＳＦ１５、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ１及びＴＮＦＳＦ２の遺伝子の発現量との相関関係を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
本発明者らは、細胞傷害活性と相関して、抗体刺激に応答して発現レベルの変化を示す遺伝子を特定することに成功した。そのため、本発明においては、抗体刺激に応答した当該遺伝子の発現レベルの変化を測定することによって、細胞傷害活性、特には抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ活性）を予測することが可能である。
【００３１】
本発明において、「細胞傷害活性」は、細胞傷害性又は細胞傷害活性とも呼ばれる。「細胞傷害活性」は、細胞を構成する物質又は構造の破壊、細胞の生存に必須な活動の阻害、細胞周期又は細胞内シグナル伝達への影響等によって、細胞に対して死、機能障害若しくは増殖傷害等の影響を与える性質又は作用を意味する。「細胞傷害活性」の１つに抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ活性）がある。「抗体依存性細胞傷害活性」又は「ＡＤＣＣ活性」とは、標的細胞に結合した抗体がエフェクター細胞（ＮＫ細胞、マクロファージ等）上のＦｃ受容体と結合することで、抗体依存的に誘導される細胞傷害活性を意味し、この技術用語は当技術分野では十分に理解されている。
【００３２】
本発明に係る細胞傷害活性の予測は、白血球を含む生体試料（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓａｍｐｌｅ）を準備し、該生体試料と抗体とを接触させ、該白血球における、腫瘍壊死因子スーパーファミリー１５（ＴＮＦＳＦ１５）、ケモカインＣＸＣＬ３（ＣＸＣＬ３）、及びインターロイキン６（ＩＬ−６）からなる群より選択される少なくとも１つの発現を検出し、該抗体を接触させた場合の発現レベルと接触させていない場合の発現レベルとを比較することによって行われる。ここで「発現レベル」とは、対象遺伝子の発現の程度を示す指標である。「発現レベル」は、例えば、対象遺伝子そのものの発現量及び対象遺伝子がコードするタンパク質の産生量によって表される。対象遺伝子自身の発現量を測定する方法としては、例えば、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ及びノーザンブロットが挙げられる。対象遺伝子自身の発現レベルを定量する方法としては、例えば、対照遺伝子に対応するＲＮＡを増幅することが挙げられる。対象遺伝子がコードするタンパク質の産生量を測定する方法としては、例えば、ウエスタンブロッティング、定量的免疫細胞化学法（quantitative  immunocytochemistry）、酵素免疫測定吸着法法（ＥＬＩＳＡ法）、抗体アレイ法、蛍光活性化細胞分類法（ＦＡＣＳ法）、マススペクトロメトリー法、及びタンパク質活性分析法等が挙げられる。
【００３３】
本発明に係る方法においては、まず、白血球を含む生体試料を準備する。生体試料は、白血球を含むものであれば特に限定されるものではなく、血液（全血等）、体液（尿、髄液、腹水等）、組織等が挙げられる。採取の容易性及び白血球の存在量の観点から、血液を生体試料として用いることが好ましい。このような生体試料は、当技術分野で公知の方法に従って調製することができる。採取源は、細胞傷害活性を予測しようとする動物であれば特に限定されるものではなく、哺乳動物、例えばヒト、マウス、ラット、サル、ウシ及びウマが挙げられ、好ましくはヒトである。採取された生体試料は、そのまま使用してもよいし、又は白血球を含む画分を更に単離して使用してもよい。
【００３４】
接触させる抗体は、エフェクター細胞上のＦｃ受容体と結合することができる抗体であれば特に限定されるものではない。抗原抗体反応は動物種に特異的に生じることが多いため、使用する抗体が白血球の採取源の動物に対して反応性である必要がある。そのような抗体の選択は、当業者であれば容易に理解することができる。例えば、ヒト患者から採取した生体試料と接触させることを意図する場合には、ヒト由来の抗体、又はキメラ抗体若しくはヒト化抗体を使用することが好ましい。用いることができる抗原非特異的な抗体として、例えば、免疫グロブリンＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ及びＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４等）が挙げられる。抗原非特異的な抗体を用いて細胞傷害活性を予測した場合には、生体試料（すなわち白血球）が由来する動物個体又は患者の総体的な細胞傷害活性を予測することができる。特定の抗原に対して特異的な抗体、例えば公知の抗体医薬（抗癌剤、抗ウイルス剤、抗炎症剤、拒絶反応抑制剤、抗腫瘍剤等）も使用することができる。米国食品医薬品局（ＦＤＡ）において現在承認されている抗体医薬を下記表１及び表２に列挙する。
【００３５】
【表１】
2014057582.tif 000002
【００３６】
【表２】
2014057582.tif 000003
【００３７】
抗体（例えば、上記表１及び表２で列挙されている抗体等）は、従来から知られている手法によって投与が可能である。投与形態としては、例えば、皮内投与、皮下投与、経皮投与、静脈内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、動脈内投与、脳内投与、くも膜下投与及び硬膜外投与が挙げられる。
抗体は、そのＦｃ領域がＦｃ受容体と結合することによってエフェクター細胞を活性化して、細胞傷害活性（すなわちＡＤＣＣ活性）を発揮する。そのため、抗体のＦｃ領域が露出した状態で白血球と接触させることが好ましい。
【００３８】
本発明においては、抗体として、熱凝集ＩｇＧ（ＨＡＧ）を用いることが好ましい。ＨＡＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４等の全てのサブクラスを含む免疫複合体のモデルであり、ＨＡＧに対する細胞傷害活性（すなわちＡＤＣＣ活性）は、あらゆる種の抗体に対する細胞傷害活性といえるためである。ＨＡＧは、当技術分野で公知の方法に従って調製することができる。例えば、ヒトＩｇＧを６３℃にて１５分間加熱することによって調製することができる（Ｏｓｔｒｅｉｋｏ，  Ｋ．Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｌｅｔｔ．  １５：  ３１１−３１６，  １９８７）。調製後のＨＡＧは、使用するまで−２０℃で保存することができる。
【００３９】
次に、白血球を含む生体試料と抗体とを接触させる。本発明において「接触」とは、抗体が生体試料に含まれる白血球を活性化するように、抗体と白血球とを近接させることを意味する。例えば、生体試料と抗体を含有する溶液（抗体含有溶液）とを混合すること、生体試料に抗体含有溶液を添加すること、抗体含有溶液に生体試料を浸漬すること等の操作が含まれる。接触は、例えば４〜４２℃（好ましくは約３７℃）にて、１分〜２４時間（好ましくは約２〜８時間）行う。
【００４０】
続いて、白血球における、腫瘍壊死因子スーパーファミリー１５（ＴＮＦＳＦ１５）、ケモカインＣＸＣＬ３（ＣＸＣＬ３）、及びインターロイキン６（ＩＬ−６）からなる群より選択される少なくとも１つの発現を検出する。本明細書中では、これらの遺伝子を総称的に「対象遺伝子」ともいう。ここで「検出」とは、対象遺伝子の発現レベルを絶対量として測定することだけではなく、相対的な量又は比として測定することも意味する。
【００４１】
ＴＮＦＳＦ１５は、ＴＮＦファミリーのメンバーであり、その受容体ＴＮＦＲＳＦ２５に結合して、アポトーシスを誘導することが知られている（Ｋｉｔｓｏｎ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ  ３８４：  ３７２−３７５，  １９９６）。ＴＮＦＳＦ１５の遺伝子配列は、ＧｅｎＢａｎｋに、ｍＲＮＡの塩基配列がアクセッション番号ＮＭ＿００５１１８として、ＴＮＦＳＦ１５の塩基配列を含むゲノムＤＮＡの塩基配列がアクセッション番号ＮＧ＿０１１４８８として、それぞれ登録されている。ＣＸＣＬ３はケモカインの１種であるが、その機能は十分に解明されていない。ＣＸＣＬ３の遺伝子配列は、ＧｅｎＢａｎｋに、ｍＲＮＡの塩基配列がアクセッション番号ＮＭ＿００２０９０として、ＣＸＣＬ３の塩基配列を含むゲノムＤＮＡの塩基配列がアクセッション番号ＮＣ＿０００００４として、それぞれ登録されている。ＩＬ−６は炎症性サイトカインの１つである。ＩＬ−６の遺伝子配列は、ＧｅｎＢａｎｋに、ｍＲＮＡの塩基配列がアクセッション番号ＮＭ＿０００６００として、ＩＬ６の塩基配列を含むゲノムＤＮＡの塩基配列がアクセッション番号ＮＧ＿０１１６４０として、それぞれ登録されている。ＣＸＣＬ１は、好中球における化学遊走物質として機能し、炎症反応等に関与していると言われている。ＣＸＣＬ１の遺伝子配列は、ＧｅｎＢａｎｋに、ｍＲＮＡの塩基配列がアクセッション番号ＮＭ＿００１５１１として、ＣＸＣＬ１の塩基配列を含むゲノムＤＮＡの塩基配列がアクセッション番号ＮＣ＿０００００４として、それぞれ登録されている。ＴＮＦＳＦ２はＴＮＦファミリーのメンバーであり、その受容体ＴＮＦＲ１Ａ及びＴＮＦＲ１Ｂと結合して、アポトーシスの誘導又は炎症を引き起こす。ＴＮＦＳＦ２の遺伝子配列は、ＧｅｎＢａｎｋに、ｍＲＮＡの塩基配列がアクセッション番号ＮＭ＿０００５９４として、ＴＮＦＳＦ２の塩基配列を含むゲノムＤＮＡの塩基配列がアクセッション番号ＮＧ＿００７４６２として、それぞれ登録されている。
【００４２】
対象遺伝子の発現の検出は、遺伝子レベルで又はタンパク質レベルで行うことができ、いずれも当業者に公知の技術を用いて行うことができる。タンパク質レベルでの検出には、抗体刺激に応答したタンパク質の産生までに時間がかかることを考慮すると、遺伝子レベルで発現を検出することが好ましい。なお、発現の検出前に白血球を単離及び溶解することが好ましいが、使用した生体試料が白血球のみを含む分画である場合には生体試料をそのまま使用することも可能である。白血球の単離及び溶解は、当技術分野で公知の方法を用いて行うことができる。
【００４３】
遺伝子レベルで発現を検出する方法としては、例えば、対象遺伝子のｍＲＮＡ又は対応するｃＤＮＡを、プライマー又はプローブを用いて検出する方法が挙げられる。具体的には、白血球の総ＲＮＡからｍＲＮＡを精製し、プライマーを用いて対象遺伝子に特異的なｍＲＮＡを増幅させ、その増幅産物を検出してもよい（ＲＴ−ＰＣＲ法）。あるいは、総ＲＮＡ若しくはｍＲＮＡ、又は総ＲＮＡ若しくはｍＲＮＡに基づいて合成されたｃＤＮＡから、プローブを用いて対象遺伝子に特異的な総ＲＮＡ若しくはｍＲＮＡ又はｃＤＮＡを検出してもよい（ハイブリダイゼーション法）。
【００４４】
総ＲＮＡ又はｍＲＮＡの調製は、当技術分野で公知の方法によって行うことができる。例えば、総ＲＮＡは、グアニジン−塩化セシウム超遠心法、ＡＧＰＣ（ａｃｉｄ  ｑｕａｎｉｄｉｕｍ−  ｐｈｅｎｏｌ−ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ）法等によって調製することができ、ｍＲＮＡはオリゴｄＴを利用して単離することができる。総ＲＮＡ又はｍＲＮＡからのｃＤＮＡの合成は、逆転写酵素を用いて行うことができ、この方法も当技術分野で公知である。これらの方法は市販のキットを用いて簡便に行うことが可能である。
【００４５】
プライマー又はプローブは、当業者に公知の手法に従って、対象遺伝子の塩基配列に基づいて設計することができる。プライマー又はプローブの設計時には、以下の点を考慮することが知られている。プライマーとして機能を有する長さとしては、１０塩基以上が好ましく、より好ましくは１５〜５０塩基であり、さらに好ましくは２０〜３０塩基である。プローブとして機能を有する長さとしては、１０塩基以上が好ましく、より好ましくは１５〜５０塩基であり、さらに好ましくは２０〜３０塩基である。プライマー又はプローブの融解温度（Ｔｍ）が適切であるかを確認する。Ｔｍの確認には、公知のプライマー又はプローブ設計用ソフトウエアを利用することができ、本発明で利用可能なソフトウエアとしては、例えばＰｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（登録商標）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  ＦＯｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，  ＣＡ）、ＨＹＢｓｉｍｕｌａｔｏｒ（商標）（ＲＮＡｔｕｒｅ，  Ｉｒｖｉｎｅ，  ＣＡ）等が挙げられる。プライマー又はプローブとして対象遺伝子に特異的なアニーリング又はハイブリダイズが可能な条件としては、その他にもＧＣ含量等があり、そのような条件は当業者に周知である。
【００４６】
本発明においては、例えば、以下のプライマー配列を用いることができる：
【表３】
2014057582.tif 000004
【００４７】
上述のように設計したプライマー及びプローブは、当業者に公知の方法に従って調製することができる。さらに、当業者には周知のように、プライマー又はプローブには、アニーリング又はハイブリダイズする部分以外の配列、例えばタグ配列等の付加配列が含まれていてもよい。プライマー又はプローブは、フィルター、メンブレン、スライドグラス、マイクロタイタープレート等の適当な固相に固定化されていてもよい。
【００４８】
白血球における対象遺伝子の発現を検出するには、上記プライマー又はプローブをそれぞれ増幅反応又はハイブリダイゼーションにおいて用い、その増幅産物又はハイブリダイゼーション産物を検出する。
【００４９】
プライマーを用いてｍＲＮＡから対象遺伝子に特異的な増幅を行う場合、任意の増幅手法を用いることができる。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法の原理を利用した公知の方法を挙げることができる。増幅手法として競合ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法等の定量的ＰＣＲ法等を採用することによって、定量的な検出が可能となる。増幅反応の最適条件は、当業者であれば容易に決定することができる。
【００５０】
増幅産物を検出するには、例えば、増幅反応の過程で取り込まれるｄＮＴＰに、放射性同位体、蛍光物質、発光物質等の標識物質を導入し、この標識物質を検出する方法を用いることができる。放射性同位体としては、３２Ｐ、１２５Ｉ、３５Ｓ等を用いることができる。蛍光物質としては、例えば、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ、フルオレセイン（ＦＩＴＣ）を用いることができる。発光物質としてはルシフェリン等を用いることができる。標識物質は、当技術分野で公知の方法又は市販のキットを用いて導入することができる。増幅産物に取り込まれた標識物質の検出も、当技術分野で公知の方法で行うことができる。例えば、標識物質として放射性同位体を用いた場合には、放射活性を、例えば液体シンチレーションカウンター、γ−カウンター等によって計測することができる。標識物質として蛍光物質を用いた場合には、蛍光物質の蛍光を蛍光顕微鏡、蛍光プレートリーダー等を用いて検出することができる。
【００５１】
プローブを用いて総ＲＮＡ若しくはｍＲＮＡ、又はそれから合成したｃＤＮＡに対するハイブリダイゼーションを行い、その特異的結合（ハイブリッド）を検出することによって、対象遺伝子の発現を検出することもできる。ハイブリダイゼーションは、プローブが対象遺伝子に由来するＲＮＡ又はＤＮＡのみと特異的に結合するような条件、すなわちストリンジェントな条件下で行う必要がある。そのようなストリンジェントな条件は当技術分野で周知である。ストリンジェントな条件としては、例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（２００１），Ｃｈａｐｔｅｒ７の８項”Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ”に記載の条件等が挙げられる。より具体的な条件としては、例えば、約４５℃において６．６×ＳＳＣでハイブリダイゼーションを行った後に、５０℃で２．０×ＳＳＣで洗浄する条件が挙げられる。ストリンジェンシーの選択のため、洗浄工程における塩濃度を、例えば低ストリンジェンシーとしての約２．０×ＳＳＣ、５０℃から、高ストリンジェンシーとしての約０．２×ＳＳＣ、５０℃まで選択することができる。さらに、洗浄工程の温度を低ストリンジェエンシー条件の室温、約２２℃から、高ストリンジェンシー条件の約６５℃まで高くすることができる。
【００５２】
ハイブリダイゼーションを行う場合には、プローブに蛍光標識（フルオレセイン、ローダミン等）、放射性標識（３２Ｐ等）、酵素標識（アルカリホスファターゼ、西洋ワサビパーオキシダーゼ等）、ビオチン標識等の適当な標識物質を付加して、ハイブリダイゼーションによる産物を検出することができる。
【００５３】
上述のようにして、プライマー又はプローブを用いて増幅反応又はハイブリダイゼーションによる産物を検出することによって、対象遺伝子の発現を検出することが可能である。
【００５４】
本発明者の研究グループは、白血球における遺伝子の発現（遺伝子発現）のわずかな変化を簡便かつ迅速に定量することができる系（Ｈｅｍ（Ａ）＋システム）を開発している（米国特許第６，８４４，１５８号、米国特許第７，２５８，９７６号、ＷＯ９９／３２６５４号、米国特許出願第１０／６９８９６７号及び米国特許出願第１０／７９６２９８号に対応する米国特許第７，７４５，１８０号、ＷＯ０３／０９１４０７号、Ｍｉｔｓｕｈａｓｈｉ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎ．  Ｃｈｅｍ．  ５２：  ６３４−６４２，  ２００６等）。本発明においては、そのような系を用いることも可能である。
【００５５】
Ｈｅｍ（Ａ）＋システムを簡単に説明する。まず、全血をフィルタープレートに添加して、白血球を捕捉する。ここで、本発明に係る方法における抗体との接触ステップは、全血のまま行ってもよいし、白血球を捕捉した後に行ってもよい。生体に近い条件での反応という点では、全血と抗体とを接触させた後、白血球を捕捉することが好ましい。次いで、フィルタープレート上で白血球を溶解させ、標準ＲＮＡ及び対象遺伝子に対するアンチセンス（リバース）プライマーを添加する。得られた細胞溶解液を、次にオリゴｄＴ固相化プレートに移し、ハイブリダイゼーションを行う。オリゴｄＴ固相化プレートに捕捉されたｍＲＮＡは、細胞溶解液に含まれるアンチセンスプライマーによって逆転写され、対応するｃＤＮＡが合成される。合成されたｃＤＮＡの量に基づいて、白血球における対象遺伝子の発現レベルを求めることができる。詳細に関しては、上記文献を参照されたい。
【００５６】
タンパク質レベルを測定する方法としては、対象遺伝子によってコードされるタンパク質を、例えば抗体を用いて検出する方法等が挙げられる。抗体を用いる検出方法は当技術分野で公知であり、例えば酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、蛍光免疫アッセイ、放射性免疫アッセイ（ＲＩＡ）、免疫沈降法、ウエスタンブロット法等が挙げられる。抗体を用いるタンパク質の検出は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，  Ｆ．Ｍ．ら編，  Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｃｈａｐｔｅｒ  １１  “ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．  １９９５の記載に従って行うことができる。
【００５７】
検出に用いる抗体は、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体である。上記抗体は、それぞれ対象遺伝子によってコードされるタンパク質のエピトープに結合することができる全体分子及びフラグメント等である。このような抗体は、例えばポリクローナル抗体の場合には、抗原ポリペプチド又はその一部断片を免疫原として動物に免疫した後、血清から得ることができる。あるいは、対象遺伝子又はその部分配列が挿入された発現ベクターを注射又は遺伝子銃によって、動物の筋肉又は皮膚に導入した後、血清を採取することによって作製することができる。免役する動物としては、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ニワトリ等が挙げられる。モノクローナル抗体は、公知のモノクローナル抗体作製法（「単クローン抗体」、長宗香明、寺田弘共著、廣川書店、１９９０年；  “Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ”  Ｊａｍｅｓ  Ｗ．  Ｇｏｄｉｎｇ，  ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  １９９６）に従い作製することができる。
【００５８】
目的のタンパク質と抗体との結合は、周知の方法に従って測定しうる。当業者であれば、採用する免疫アッセイの種類及び形式、使用する標識物質の種類及び標識の対象等に応じて、有効かつ最適な測定方法を決定することができる。例えば、白血球における対象遺伝子によってコードされるタンパク質と、それに対する抗体との反応を容易に検出するために、抗体を標識物質で標識することによってその反応を直接検出するか、又は標識二次抗体若しくはビオチン−アビジン複合体等を用いることによって間接的に検出することができる。そのような標識も当技術分野で公知であり、酵素免疫アッセイの場合には、例えばペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ等を用いることができる。蛍光免疫アッセイの場合には、例えばフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）等を用いることができる。放射性免疫アッセイの場合には、例えばトリチウム、ヨウ素１２５等を用いることができる。このような標識物質の検出も当技術分野で公知の方法に従って行うことができる。抗体は、固相（膜、フィルター、ビーズ、プレート等）に固定されていてもよいし（固相系）、溶液として用いてもよい（液相系）。
【００５９】
抗体を、例えば標識物質で直接標識して標識抗体とする場合には、白血球から調製したサンプルを標識抗体と接触させて、目的のタンパク質と抗体とを結合させる。そして未結合の標識抗体を分離して、結合した標識抗体の量又は未結合の標識抗体の量からその白血球における対象遺伝子の発現量を測定することができる。例えば標識二次抗体を用いる場合には、抗体と白血球から調製したサンプルとを反応させ（１次反応）、得られた複合体に更に標識二次抗体を反応させる（２次反応）。未結合の標識二次抗体を分離して、結合した標識二次抗体の量又は未結合の標識二次抗体の量からその白血球における対象遺伝子の発現量を測定することができる。
【００６０】
上述のようにして対象遺伝子の発現を検出した後、抗体と接触させた場合の発現レベルと接触させない場合との発現レベルとを比較する。抗体と接触させた場合との発現レベルが接触させない場合の発現レベルと比較して高い場合には、細胞傷害活性が存在することになる。具体的には、抗体と接触させた場合と接触させない場合との発現レベルの比から、細胞傷害活性を予測することができる。例えば、抗体と接触させない場合の遺伝子発現量を１として、抗体を接触させた場合の遺伝子発現量の比が、１．２以上、好ましくは２．０以上である場合、細胞傷害活性が存在すると予測する。
【００６１】
本発明はまた、細胞傷害活性、特にはＡＤＣＣ活性を予測するためのキットにも関する。かかるキットは、腫瘍壊死因子スーパーファミリー１５（ＴＮＦＳＦ１５）、ケモカインＣＸＣＬ３（ＣＸＣＬ３）、及びインターロイキン６（ＩＬ−６）からなる群より選択される少なくとも１つの発現を検出するための手段を含む。そのような発現を検出するための手段は、上述したように遺伝子レベル又はタンパク質レベルで対象遺伝子の発現を検出することができる手段であれば特に限定されるものではなく、例えばプライマー若しくはプローブ、又は抗体である。キットは、対象遺伝子の発現の検出に役立つ他の成分を含んでいてもよい。例えば、キットには、生体試料を調製するための試薬、バッファー、標識物質、反応液、説明書等を含めることができる。このようなキットを利用することによって、本発明に係る細胞傷害活性の予測を更に簡便に行うことが可能となる。
【００６２】
細胞傷害活性（ＡＤＣＣ活性）は抗体の生体細胞に対する細胞傷害性を表すため、本発明は、細胞傷害活性を指標とする様々な用途に応用することができる。
【００６３】
例えば細胞傷害活性は、抗体医薬に対する患者の薬剤応答性を示す（例えば、Ｇｅｎｎａｒｉ，  Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  １０：  ５６５０−５６５５，  ２００４；  Ｂｅａｎｏ，  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ６：  ２５，  ２００８等）。そのため、患者における細胞傷害活性を予測することによって、抗体医薬に対する患者の薬剤応答性を評価することができる。具体的には、まず、患者からの白血球を含む生体試料を準備し、該生体試料と抗体とを接触させる。次に、該白血球における、ＴＮＦＳＦ１５、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ１及びＴＮＦＳＦ２の少なくとも１つの発現を検出し、該抗体を接触させた場合の発現レベルと接触させていない場合の発現レベルとを比較して、細胞傷害活性を予測する。このとき、該患者の細胞傷害活性が高い場合に、該患者の抗体医薬に対する薬剤応答性が高いと評価する。別の言い方をすると、該抗体を接触させた場合の発現レベルが、接触させていない場合の発現レベルより高い場合に、該患者の抗体医薬に対する薬剤応答性が高いと評価する。例えば、抗体と接触させない場合の遺伝子発現量を１として、抗体を接触させた場合の遺伝子発現量の比が、１．２以上、好ましくは２．０以上である場合、該患者の細胞傷害活性が高いと予測し、該患者の抗体医薬に対する薬剤応答性が高いと評価する。生体試料と接触させる抗体は、患者に投与する予定の抗体医薬であってもよいし、あるいはＨＡＧ等の抗原非特異的な抗体であってもよい。
【００６４】
一例として、トラスツズマブ（商品名Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））に対する患者の薬剤応答性を評価する場合を説明する。患者は、乳癌患者であり、既にトラスツズマブによる治療及び／又は他の治療（外科手術、放射線治療、化学療法、免疫療法等）を行っていても行っていなくてもよい。患者は、原発性及び／又は転移性乳癌を患うもの、更には乳癌から他の組織へ転移した癌を患うものとすることができる。患者からの白血球を含む生体試料（例えば全血）を準備し、それに抗体を接触させる。接触させる抗体は、抗原非特異的な抗体（例えばＨＡＧ）であってもよいし又はトラスツズマブそのものであってもよい。抗体と接触させた後、白血球におけるＴＮＦＳＦ１５、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ１及びＴＮＦＳＦ２の少なくとも１つの発現を検出する。その後、該抗体を接触させた場合の発現レベルと接触させていない場合の発現レベルを比較する。該抗体を接触させた場合の発現レベルが接触させていない場合の発現レベルに比べて有意に高い場合には、トラスツズマブ（又は抗原非特異的な抗体を用いた場合には抗体医薬全般）に対するその患者の薬剤応答性が高いと評価することができる。例えば、抗体と接触させない場合の遺伝子発現量を１として、抗体を接触させた場合の遺伝子発現量の比が、１．２以上、好ましくは２．０以上である場合、トラスツズマブ（又は抗原非特異的な抗体を用いた場合には抗体医薬全般）に対するその患者の薬剤応答性が高いと評価することができる。
【００６５】
トラスツズマブに対する薬剤応答性は、現在、ヒト上皮細胞増殖因子受容体タイプ２（ＨＥＲ２タンパク質）抗原の発現の有無に基づいて評価され投与対象が決定される。しかしながら、トラスツズマブに不応の患者も多い。従って、本発明においては、細胞傷害活性の予測と、ＨＥＲ２抗原（又はそのＨｅｒ２／ｎｅｕ遺伝子）の発現の有無とを組み合わせて、患者のトラスツズマブに対する薬剤応答性を評価することも可能である。ＨＥＲ２抗原の発現の検出は、当技術分野で公知の免疫組織化学染色（ＩＨＣ）法、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）法等によって行うことができ、検出用キットも販売されている（例えば、ＩＨＣ法に基づくＨｅｒｃｅｐ  Ｔｅｓｔ，  ＤＡＫＯ社）。一般的には、ＨＥＲ２抗原を過剰発現する患者が、トラスツズマブに対する薬剤応答性が高いと評価されている。
【００６６】
細胞傷害活性（ＡＤＣＣ活性）は、抗体医薬そのものの効力を示すともいえる。従って、新たな抗体医薬を開発したり、既存の抗体医薬を改変する際に、本発明に従って抗体の細胞傷害活性を予測して、細胞傷害活性を有する、好ましくは高い細胞傷害活性を有する抗体をスクリーニングすることができる。具体的には、まず被検抗体を準備し、白血球と接触させる。白血球は、被検抗体の効力を試験しようとする動物種に由来するものである。白血球は、単離されていたものであってもよいし又は白血球を含む試料（例えば全血試料）であってもよい。被検抗体と接触させた後、該白血球におけるＴＮＦＳＦ１５、ＣＸＣＬ３及びＩＬ−６の少なくとも１つの発現を検出する。その結果、被検抗体を接触させた場合の発現レベルが、接触させていない場合の発現レベルと比較して高い場合に、該被検抗体を、細胞傷害活性を有するものとして選択することができる。例えば、抗体と接触させない場合の遺伝子発現量を１として、抗体を接触させた場合の遺伝子発現量の比が、１．２以上、好ましくは２．０以上である場合、該被検抗体を、細胞傷害活性を有するものとして選択することができる。
【実施例】
【００６７】
実施例  １
以下の実施例によって本発明を更に説明するが、これは本発明を例示するものであって、限定することを意図するものではない。
【００６８】
試料及び試薬類
試料には健常人８名の血液を使用した。採血は、真空採血管（テルモ製、ヘパリンナトリウム含有、商品名ベノジェクト（登録商標）ＩＩ真空採血管）を用いて行った。採取した血液（以下、単に血液という場合がある）と反応させる抗体として、Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ  Ｐｕｒｉｆｉｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ（シグマ社製、製品番号Ｉ  ４５０６）を用いた。上記抗体は、２０  ｍｇ／ｍＬの濃度になるようにＰＢＳ（−）（和光純薬製、製品番号５３１−１６６１５）に溶解した。溶解した上記抗体の溶液（抗体溶液）は、６３℃にて３０分間加熱後、上記ＰＢＳ（−）を更に加えて５  ｍｇ／ｍＬになるように調製した。得られた溶液には熱凝集した抗体が溶解していた。この溶液を熱凝集ＩｇＧ溶液とした。
【００６９】
試料と試薬との反応
上記血液と上記熱凝集ＩｇＧ溶液と反応には、２００μＬ容のマイクロチューブを使用した。チューブ内で、血液７０μＬと上記ＰＢＳ（−）２．８μＬとをピペットの吸引吐出によって穏やかに混和させた。別のチューブ内において、血液７０μＬを５  ｍｇ／ｍＬの熱凝集ＩｇＧ溶液２．８μＬとピペットの吸引吐出によって穏やかに混和させた。各条件において、ｎ＝３になるように実施した。血液と熱凝集ＩｇＧ溶液との混合液及び血液とＰＢＳ（−）との混合液は、３７℃の恒温器内に４時間静置した。以下、上記混合液を血液試料という場合がある。
【００７０】
ｍＲＮＡの精製、ｃＤＮＡの合成
上述した４時間静置培養を行った後の血液試料から、５０μＬを採り、ｍＲＮＡの精製（ｍＲＮＡ精製）及びｃＤＮＡの合成（ｃＤＮＡ合成）に用いた。ｍＲＮＡ精製及びｃＤＮＡ合成には、Ｍｉｔｓｕｈａｓｈｉ  Ｍ．  ｅｔ．ａｌ．，ＣｌｉｎＣｈｅｍ  ５２，４：  ６３４−６４２，  ２００６に記載されているＨｅｍ（Ａ）＋システムを使用して、上記血液試料からｃＤＮＡの試料（ｃＤＮＡ試料）を得た。
【００７１】
遺伝子の発現量の測定
得られた上記ｃＤＮＡを試料として、定量ＰＣＲ法によって遺伝子の発現量（遺伝子発現量）を測定した。定量ＰＣＲ法の検出は、ＳＹＢＲｇｒｅｅｎによる検出方法を用いた。検出試薬には、ｉＴａｑ  ＳＹＢＲｇｒｅｅｎ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ  ｗｉｔｈ  ＲＯＸ（バイオラッド社製、製品番号１７２−５８５３）を用いた。プライマーとしては、配列番号１〜６に示される配列をそれぞれ有するプライマーを、それぞれ終濃度５００ｎＭになるように調製して用いた。定量ＰＣＲ法に用いる機器として、ＡＢＩＰＲＩＳＭ７９００ＨＴリアルタイムＰＣＲシステム（商品名、アプライドバイオシステムズ社製）を使用した。
【００７２】
ＡＤＣＣ活性（抗体依存性細胞障害活性）の測定
ＡＤＣＣ活性は、カルセイン（Ｃａｌｃｅｉｎ）を用いた測定方法で行った。標的細胞にはＭＣＦ７細胞を用いた。上記ＭＣＦ７細胞を、１０μｇ／ｍＬのＣａｌｃｅｉｎＡＭ溶液にて３７℃下で３０分間培養した。エフェクター細胞には、血中から得た末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を用いた。以下４種類の組み合わせの反応系を作製した。下記熱処理ＰＢＭＣは、ＰＢＭＣを５６℃で、３０分間加熱することによって作製した。下記ＮＰ４０は、ポリオキシエチレン（９）オクチルフェニルエーテルを意味する。（１）実験群（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ）：  ＰＢＭＣ（１×１０５個）＋ＭＣＦ７細胞（１×１０４個）＋トラスツマブ（終濃度５μｇ／ｍＬ）、（２）自発放出群（Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ  ｒｅｌｅａｓｅ）：熱処理ＰＢＭＣ（１×１０５個）＋ＭＣＦ７細胞（１×１０４個）＋トラスツマブ（終濃度５μｇ／ｍＬ）、（３）最大放出群（Ｍａｘｉｍｕｍ  ｒｅｌｅａｓｅ）：  ０．１質量％ＮＰ４０＋  ＭＣＦ７細胞（１×１０４個）、（４）対照群（Ｃｏｎｔｒｏｌ）：  ＭＣＦ７細胞（１×１０４個）＋トラスツマブ（終濃度５μｇ／ｍＬ）
【００７３】
上記（１）〜（４）の反応系による反応は４時間行った。それぞれの反応後に得られた上清の蛍光強度を測定（励起４９０ｎｍ／吸収５１５ｎｍ）した。ＡＤＣＣの活性を示す値（ＡＤＣＣ活性値）は、（実験群の蛍光強度−自発放出群の蛍光強度）／  （最大放出群の蛍光強度−対照群の蛍光強度）の式に従って算出した。
【００７４】
ＡＤＣＣ活性と相関する挙動を示す遺伝子
上述の方法によって算出したＡＤＣＣ活性値と、定量ＰＣＲ法によって測定した遺伝子発現量の変化との相関をみた。その相関を図１に示す。図１中、Ｘ軸はＡＤＣＣ活性を、Ｙ軸はＨｅｍ（Ａ）＋法を用いて測定した遺伝子発現量を示す。その結果、ＴＮＦＳＦ１５、ＩＬ−６及びＣＸＣＬ３の３つの遺伝子において良好な相関が得られた。
【００７５】
実施例  ２
乳癌患者の末梢血を試料として、末梢血中の白血球の遺伝子発現量と術前化学療法の治療結果との関係について検討した。まず、熱凝集ＩｇＧ溶液と上記末梢血とを接触させた場合と、熱凝集ＩｇＧ溶液の溶媒（ＰＢＳ（−））のみと上記末梢血とを接触させた場合と、の遺伝子発現量の差違を求めた。次に得られた上記遺伝子発現量の差違と、術前化学療法による治療結果と、の関係について比較検討した。上記比較検討の実施に当たっては、実施施設の倫理委員会における検討実施の承認を得た後、当検討に同意を頂いた患者から末梢血である血液試料を提供頂いた。
【００７６】
対象となる症例
対象となる症例（対象症例）は、以下の（１）から（５）の４項目すべてを満たす乳癌患者とした。（１）手術可能なステージＩＩからＩＩＩＡで、腫瘍径が３ｃｍを超える症例。（２）ＨＥＲ２検査において、免疫組織化学法（ＩＨＣ法）による判定が陽性（ＨＥＲ２染色強度が３＋）である、又は、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法（ＦＩＳＨ法）による判定で、ＨＥＲ２シグナル総数とＣＥＰ１７シグナル総数との比率が２．０を超える症例。（３）術前化学療法として、エピルビシン、シクロフォスファミド、５ＦＵに続いてパクリタキセルとトラスツマブとによる治療を行った症例。（４）患者が２０歳以上である症例。（５）Ｅａｓｔｅｒｎ  Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ＧｒｏｕｐのＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｓｔａｔｕｓが０から２である症例（参考文献：Ｏｋｅｎ，  Ｍ．Ｍ．，  Ｃｒｅｅｃｈ，  Ｒ．Ｈ．，  Ｔｏｒｍｅｙ，  Ｄ．Ｃ．，  Ｈｏｒｔｏｎ，  Ｊ．，  Ｄａｖｉｓ，  Ｔ．Ｅ．，  ＭｃＦａｄｄｅｎ，  Ｅ．Ｔ．，  Ｃａｒｂｏｎｅ，  Ｐ．Ｐ．：  Ｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ａｎｄ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｃｒｉｔｅｒｉａ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｅａｓｔｅｒｎ  Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｇｒｏｕｐ．  Ａｍ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ５：６４９−６５５，  １９８２）。
【００７７】
他の腫瘍の併発、鬱血性心疾患、制御できない狭心症、不整脈、症候性感染症、重篤な下痢、心嚢水の兆候、脳転移の兆候がある症例は、対象症例から除外した。
【００７８】
試料及び試薬類
試料には乳癌患者１８名の血液を使用した。採血は、術前化学療法の実施前に、真空採血管（テルモ製、ヘパリンナトリウム含有、商品名ベノジェクト（登録商標）ＩＩ真空採血管）を用いて行った。抗体溶液及び熱凝集ＩｇＧ溶液は、実施例１と同じものをそれぞれ用いた。
【００７９】
試料と試薬との反応
試料と試薬との反応は、実施例１と同様の操作を行った。
【００８０】
ｍＲＮＡの精製、ｃＤＮＡの合成
ｍＲＮＡの精製及びｃＤＮＡの合成は、実施例１と同様の操作を行った。
【００８１】
遺伝子発現量の測定
プライマーとして配列番号１〜４及び７〜１０に示される配列を有するプライマーをそれぞれ用いたこと以外は、実施例１と同様の方法によって、各血液試料におけるＴＮＦＳＦ１５、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ１及びＴＮＦＳＦ２の遺伝子発現量を測定した。抗体（熱凝集ＩｇＧ）を接触させた場合の遺伝子発現量と接触させていない場合の遺伝子発現量とを比較して、遺伝子発現量の差異を求めた。
【００８２】
患者の治療効果の判定
術前化学療法による治療の前後の腫瘍病変の増減を測定し、治療効果を腫瘍が縮小する効果（腫瘍縮小効果）で判定した。腫瘍縮小効果の判定は、ＲＥＣＩＳＴガイドライン（Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｃｒｉｔｅｒｉａ  ｉｎ  Ｓｏｌｉｄ  Ｔｕｍｏｒｓ、参考文献：Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，  ２０００，  Ｖｏｌ  ９２，  Ｎｏ．  ３，  ２０５−２１６）に基づいて行った。ＲＥＣＩＳＴの判定基準においては、完全奏効（ＣＲ：Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ）、部分奏効（ＰＲ：Ｐａｒｔｉａｌ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ）、進行（ＰＤ：  Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  Ｄｉｓｅａｓｅ）、安定（ＳＤ：Ｓｔａｂｌｅ  Ｄｉｓｅａｓｅ）の４種類の評価がある。本実施例では、ＲＥＣＩＳＴガイドラインによる判定のうち、完全奏効と部分奏効の症例を術前化学療法による治療効果を認めた症例（ｐＣＲ）とした。その結果、治療効果を認めた症例（ｐＣＲ）は１１例であり、治療効果を認めなかった症例（ｎｏｎ−ｐＣＲ）は７例であった。
【００８３】
治療結果と関連がある遺伝子
上記によって判定した治療効果と、定量ＰＣＲ法によって測定した遺伝子発現量の変化（遺伝子発現量の差異）との関連性をみた。その結果を図２に示す。図２中、Ｘ軸は治療結果（ｐＣＲ、ｎｏｎ−ｐＣＲ）を示し、Ｙ軸はＨｅｍ（Ａ）＋法を用いて測定した遺伝子発現量に基づいた相対発現量比（Ｆｏｌｄ  Ｉｎｃｒｅａｓｅ）を示す。上記相対発現量比は、抗体に接触させていない場合の遺伝子発現量を１としたときの、抗体を接触させた場合の遺伝子発現量として示した。その結果、ＴＮＦＳＦ１５、ＴＮＦＳＦ２、ＣＸＣＬ１、及びＣＸＣＬ３の４種類の遺伝子において、治療効果を認めた症例（ｐＣＲ）の相対発現量比と、治療効果を認めなかった症例（ｎｏｎ−ｐＣＲ）の相対発現量比との間に、有意な差異が認められた。
【産業上の利用可能性】
【００８４】
本発明によって、特定の遺伝子の発現を検出することによって細胞傷害活性、特にはＡＤＣＣ活性を予測するための方法及び手段が提供される。本発明に係る方法及び手段では、遺伝子発現の検出という簡便な操作のみで細胞傷害活性を予測することができる。そのため、従来の問題点がなく、簡便、迅速かつ高精度に細胞傷害活性を予測することができ、多くの分野（特に臨床分野）において有用である。
【００８５】
本発明に従って細胞傷害活性を予測することによって、患者の抗体医薬に対する薬剤応答性を評価することができ、特に臨床分野において有用である。さらに本発明に従って細胞傷害活性を予測することによって、細胞傷害活性を有する抗体をスクリーニングすることが可能となり、抗体医薬の探索及び開発の分野に有用である。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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