(57)【要約】【課題】神経炎症又は脱髄疾患の予防又は治療用医薬組成物の提供。【解決手段】Dock8タンパク質又は該タンパク質をコードするDNAを含む、神経炎症又は脱髄疾患の予防又は治療用医薬組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Dock8タンパク質又は該タンパク質をコードするDNAを含む、神経炎症又は脱髄疾患の予防又は治療用医薬組成物。
【請求項２】
以下の（a）、（b）又は（c）のタンパク質を含む、神経炎症又は脱髄疾患の予防又は治療用医薬組成物。
（a）配列番号２、４若しくは６で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質
（b）配列番号２、４若しくは６で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ神経炎症又は脱髄疾患の症状を軽減する作用を有するタンパク質
（c）配列番号２、４若しくは６で表されるアミノ酸配列に対して80％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつ神経炎症又は脱髄疾患の症状を軽減する作用を有するタンパク質
【請求項３】
以下の（a）、（b）又は（c）のタンパク質をコードするDNAを含む、神経炎症又は脱髄疾患の予防又は治療用医薬組成物。
（a）配列番号２、４若しくは６で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質
（b）配列番号２、４若しくは６で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ神経炎症又は脱髄疾患の症状を軽減する作用を有するタンパク質
（c）配列番号２、４若しくは６で表されるアミノ酸配列に対して80％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつ神経炎症又は脱髄疾患の症状を軽減する作用を有するタンパク質
【請求項４】
以下の（a）、（b）又は（c）のDNAを含む、神経炎症又は脱髄疾患の予防又は治療用医薬組成物。
（a）配列番号１、３若しくは５で表される塩基配列を含むDNA
（b）配列番号１、３若しくは５で表される塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ神経炎症又は脱髄疾患の症状を軽減する作用を有するタンパク質をコードするDNA
（c）配列番号１、３若しくは５で表される塩基配列に対して60％以上の相同性を有する塩基配列を含み、かつ神経炎症又は脱髄疾患の症状を軽減する作用を有するタンパク質をコードするDNA
【請求項５】
神経炎症が、視神経炎、神経変性疾患、神経痛、片頭痛、虚血性脳卒中及び炎症性腸疾患からなる群から選ばれる少なくとも１種である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項６】
脱髄疾患が、多発性硬化症、急性散在性脳脊髄炎、進行性多巣性白質脳症及びギラン・バレー症候群からなる群から選ばれる少なくとも１種である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
被検物質を非ヒト哺乳動物又は哺乳動物由来の生体試料に接触させ、前記非ヒト哺乳動物又は前記生体試料におけるDock8タンパク質又はDock8遺伝子の発現量を測定することを特徴とする、神経炎症又は脱髄疾患の予防薬又は治療薬のスクリーニング方法。
【請求項８】
以下の工程を含む、神経炎症又は脱髄疾患の予防薬又は治療薬のスクリーニング方法。
（a）被検物質を非ヒト哺乳動物又は哺乳動物由来の生体試料に接触させる工程、
（b）被検物質を接触させた前記非ヒト哺乳動物又は前記生体試料におけるDock8タンパク質又はDock8遺伝子の発現量と、対照試料におけるDock8タンパク質又はDock8遺伝子の発現量とを比較する工程、及び
（c）前記比較結果を指標として、被験物質を神経炎症又は脱髄疾患の予防薬又は治療薬として選択する工程
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Dock8を含む神経炎症又は脱髄疾患の予防又は治療用医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
Dock8（Dedicator of cytokinesis 8）は、Dockファミリータンパク質の一員であり、グアニンヌクレオチド交換因子（guanine nucleotide exchange factor: GEF）である。Dock8は、Rhoファミリー低分子量Gタンパク質の活性化を介してアクチン細胞骨格の重合を制御する。アクチン細胞骨格の再構成は、細胞の分化・増殖、遊走、シグナル伝達など様々な細胞機能に関わっている（非特許文献１：行方和彦, 原田高幸, 生化学 84(5), 368-373, 2012）。
近年、ヒトDock8遺伝子の欠損が重症複合免疫不全症を引き起こすことが発見されたことをきっかけに、Dock8の免疫学的な研究成果が複数報告されている（非特許文献２：Zhang Q,et al., N Engl J Med 361(21): 2046-2055, 2009; 非特許文献３：Randall KL,et al., Nat Immunol 10(12): 1283-1291, 2009; 非特許文献４：Randall KL,et al., J Exp Med 208(11): 2305-2320, 2011）。
一方、本発明者は、長年に渡って多発性硬化症 (Multiple sclerosis: MS)の疾患モデルである実験的自己免疫性脳脊髄炎(Experimental autoimmune encephalomyelitis: EAE)の検討を行い、神経炎症性疾患の発症および重症化のメカニズムを探索してきた（非特許文献５：Guo X,et al., EMBO Molecular Medicine 2(12): 504-515, 2010）。MSは中枢神経系の脱髄疾患の一つで、脳、脊髄、視神経の病変によって視覚障害や運動障害などが起きる疾患である。国内の患者数は一万二千人を超えるが、詳しい原因は解明されておらず、治療も困難であることから、厚生労働省が指定する特定疾患の一つになっている。また、かつてMSの一種とされた視神経脊髄炎（NMO）のうち、アクアポリン4（AQP4）抗体が陽性の症例に対しては、血漿交換を行うなどの治療法が行われているが、AQP4抗体陽性の症例は限られている。
従って、現在のところ神経炎症や脱髄疾患に対してはステロイドや免疫抑制剤投与などの対症療法が中心であり、根本的な治療法は確立されているとは言い難い。また上述のように、Dockファミリー分子と免疫不全症との関係については報告があるが、MSなどで見られる神経炎症や脱髄疾患におけるDockファミリー分子の関与については調べられたことはない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】行方和彦, 原田高幸, 生化学84(5), 368-373, 2012
【非特許文献２】Zhang Q,et al., N Engl J Med 361(21): 2046-2055, 2009
【非特許文献３】Randall KL,et al., Nat Immunol 10(12): 1283-1291, 2009
【非特許文献４】Randall KL,et al., J Exp Med 208(11): 2305-2320, 2011
【非特許文献５】Guo X,et al., EMBO Molecular Medicine 2(12): 504-515, 2010
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明はこのような状況に鑑みてなされたものであり、その解決しようとする課題は、神経炎症又は脱髄疾患の予防又は治療用医薬組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、本発明者が独自に作製したDock8過剰発現マウスにおいて、EAEの発症率が減少し、かつ神経炎症及び脱髄の症状が軽減されることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の通りである。
【０００６】
（１）Dock8タンパク質又は該タンパク質をコードするDNAを含む、神経炎症又は脱髄疾患の予防又は治療用医薬組成物。
（２）以下の（a）、（b）又は（c）のタンパク質を含む、神経炎症又は脱髄疾患の予防又は治療用医薬組成物。
（a）配列番号２、４若しくは６で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質
（b）配列番号２、４若しくは６で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ神経炎症又は脱髄疾患の症状を軽減する作用を有するタンパク質
（c）配列番号２、４若しくは６で表されるアミノ酸配列に対して80％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつ神経炎症又は脱髄疾患の症状を軽減する作用を有するタンパク質
（３）以下の（a）、（b）又は（c）のタンパク質をコードするDNAを含む、神経炎症又は脱髄疾患の予防又は治療用医薬組成物。
（a）配列番号２、４若しくは６で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質
（b）配列番号２、４若しくは６で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ神経炎症又は脱髄疾患の症状を軽減する作用を有するタンパク質
（c）配列番号２、４若しくは６で表されるアミノ酸配列に対して80％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつ神経炎症又は脱髄疾患の症状を軽減する作用を有するタンパク質
（４）以下の（a）、（b）又は（c）のDNAを含む、神経炎症又は脱髄疾患の予防又は治療用医薬組成物。
（a）配列番号１、３若しくは５で表される塩基配列を含むDNA
（b）配列番号１、３若しくは５で表される塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ神経炎症又は脱髄疾患の症状を軽減する作用を有するタンパク質をコードするDNA
（c）配列番号１、３若しくは５で表される塩基配列に対して60％以上の相同性を有する塩基配列を含み、かつ神経炎症又は脱髄疾患の症状を軽減する作用を有するタンパク質をコードするDNA
（５）神経炎症が、視神経炎、神経変性疾患、神経痛、片頭痛、虚血性脳卒中及び炎症性腸疾患からなる群から選ばれる少なくとも１種である、上記（１）〜（４）のいずれかに記載の医薬組成物。
（６）脱髄疾患が、多発性硬化症、急性散在性脳脊髄炎、進行性多巣性白質脳症及びギラン・バレー症候群からなる群から選ばれる少なくとも１種である、上記（１）〜（４）のいずれかに記載の医薬組成物。
（７）被検物質を非ヒト哺乳動物又は哺乳動物由来の生体試料に接触させ、前記非ヒト哺乳動物又は前記生体試料におけるDock8タンパク質又はDock8遺伝子の発現量を測定することを特徴とする、神経炎症又は脱髄疾患の予防薬又は治療薬のスクリーニング方法。
（８）以下の工程を含む、神経炎症又は脱髄疾患の予防薬又は治療薬のスクリーニング方法。
（a）被検物質を非ヒト哺乳動物又は哺乳動物由来の生体試料に接触させる工程、
（b）被検物質を接触させた前記非ヒト哺乳動物又は前記生体試料におけるDock8タンパク質又はDock8遺伝子の発現量と、対照試料におけるDock8タンパク質又はDock8遺伝子の発現量とを比較する工程、及び
（c）前記比較結果を指標として、被験物質を神経炎症又は脱髄疾患の予防薬又は治療薬として選択する工程
【発明の効果】
【０００７】
本発明により、神経炎症又は脱髄疾患の予防又は治療に有用な医薬組成物を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】(A) Dock8過剰発現トランスジェニックマウス（Dock8 Tgマウス）の作製に使用したプラスミドの構造を示す図である。(B) 野生型マウス（WT）及びDock8 TgマウスのT細胞（T cell）及び樹状細胞（DC）におけるDock8の発現量を定量した結果を示す図である。
【図２】脾臓におけるT細胞のサブタイプの割合を測定した結果を示す図である。
【図３】CD3抗体による刺激後のT細胞活性の測定結果を示す図である。
【図４】樹状細胞の抗原提示能の測定結果を示す図である。
【図５】EAEの発症率の測定結果を示す図である。
【図６】脊髄症状の測定結果を示す図である。
【図７】EAEの病理像を示す図である。
【図８】EAEによる視機能障害の測定結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
以下、本発明を詳細に説明する。以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施の形態のみに限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、様々な形態で実施をすることができる。
【００１０】
１．概要
本発明は、Dock8タンパク質又はDock8タンパク質をコードするDNAを含む医薬組成物に関するものであり、神経炎症又は脱髄疾患の予防又は治療に有用な医薬組成物に関するものである。
これまで、ヒトDock8遺伝子の欠損により重症複合免疫不全症が引き起こされることが知られていたが、神経炎症や脱髄疾患におけるDockファミリー分子の関与は知られていなかった。
これに対し、本発明者は、ヒトDock8遺伝子を過剰に発現するマウスを作製し、Dock8の効果を検討した。その結果、意外にも当該マウスにおいてEAEの発症率が減少し、かつ神経炎症及び脱髄の症状が軽減されることが判明した。具体的には、Dock8過剰発現マウスの約40%において、EAEの発症自体が抑制され、残りの60%においても神経炎症及び脱髄の軽症化が確認された。
従って、Dock8タンパク質又はDock8タンパク質をコードするDNA（遺伝子）は、神経炎症又は脱髄疾患の予防又は治療のために有用である。本発明は、このような知見に基づいて完成されたものである。
【００１１】
２．Dock8
本発明において、Dock8は、EAEの発症率を減少させ、神経炎症及び脱髄の症状を軽減することが見出された。すなわち、Dock8は、神経炎症又は脱髄疾患の予防又は治療のために有用である。なお、本発明において、「Dock8」と称するときは、Dock8タンパク質及びDock8タンパク質をコードするDNAの双方を意味する。
【００１２】
本発明で使用されるDock8タンパク質及び該タンパク質をコードするDNAは、任意の哺乳動物に由来するものであってもよく、そのような哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、サル、ヒトが挙げられ、好ましくは、マウス、ラット、ヒトであり、より好ましくはヒトである。
【００１３】
本発明において、マウス、ラット及びヒトのDock8タンパク質のアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号２、４及び６で表される。また、マウス、ラット及びヒトのDock8タンパク質をコードするDNAの塩基配列は、それぞれ、配列番号１、３及び５で表される。各アミノ酸配列及び塩基配列は、それぞれGenBankデータベースにおいて、所定のアクセッション番号（Accession No.）により登録されている。
【００１４】
マウスDock8タンパク質のアミノ酸配列：XM_488529.2（配列番号２）
ラットDock8タンパク質のアミノ酸配列：NM_001037793（配列番号４）
ヒトDock8タンパク質のアミノ酸配列：AB191037（配列番号６）
マウスDock8タンパク質をコードするDNAの塩基配列：XM_488529.2（配列番号１）
ラットDock8タンパク質をコードするDNAの塩基配列：NM_001037793（配列番号３）
ヒトDock8タンパク質をコードするDNAの塩基配列：AB191037（配列番号５）
【００１５】
（１）Dock8タンパク質
本発明で用いられるDock8タンパク質としては、例えば、配列番号２、４若しくは６で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質が挙げられ、好ましくは、配列番号２、４若しくは６で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質である。
【００１６】
また、本発明で用いられるDock8タンパク質には、上記タンパク質のほか、配列番号２、４若しくは６で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ神経炎症又は脱髄疾患の症状を軽減する作用を有するタンパク質が含まれる。
【００１７】
「配列番号２、４若しくは６で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列」としては、例えば、
(i) 配列番号２、４又は６で表されるアミノ酸配列中の１〜１０個（例えば、１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１〜２個、さらに好ましくは１個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、
(ii) 配列番号２、４又は６で表されるアミノ酸配列中の１〜１０個（例えば、１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１〜２個、さらに好ましくは１個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、
(iii) 配列番号２、４又は６で表されるアミノ酸配列に１〜１０個（例えば、１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１〜２個、さらに好ましくは１個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、
(iv) 上記(i)〜(iii) の組合せにより変異されたアミノ酸配列
などが挙げられる。
【００１８】
本発明において、「神経炎症又は脱髄疾患の症状を軽減する作用」とは、神経炎症又は脱髄疾患、例えば視神経炎、多発性硬化症などの症状を軽減する作用をいう。神経炎症又は脱髄疾患の「症状」としては、例えば、脱髄、神経における免疫反応（例えば炎症等）、神経軸索の変性、身体の一部又は全身の麻痺、しびれ、感覚障害、視機能障害、複視、運動麻痺、歩行障害、排尿・排便障害などが挙げられるが、これらに限定されない。また、「神経炎症又は脱髄疾患の症状を軽減する作用を有する」とは、配列番号２、４又は６で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質の神経炎症又は脱髄疾患の症状を軽減する作用を100としたときと比較して、10%以上、20％以上、30%以上、40%以上、50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、好ましくは90%以上の作用を示すことを意味する。
【００１９】
神経炎症又は脱髄疾患の症状を軽減する作用は、例えば、本明細書の実施例３に記載された方法を用いて確認することができる。例えば、上記の配列番号２、４又は６で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質の変異体を過剰発現させたマウスにおいて、多発性硬化症の疾患モデルである実験的自己免疫性脳脊髄炎（Experimental autoimmune encephalomyelitis: EAE）を発症させ、EAEの症状の程度を確認することにより、そのタンパク質が神経炎症又は脱髄疾患の症状を軽減する作用を有するかどうかを確認することができる。
【００２０】
また、本発明において使用されるDock8タンパク質には、配列番号２、４又は６で表されるアミノ酸配列のほか、配列番号２、４又は６で表されるアミノ酸配列と80％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつ神経炎症又は脱髄疾患の症状を軽減する作用を有するペプチドが挙げられる。このようなペプチドとしては、配列番号２、４又は６に示されるアミノ酸配列に対して、約80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、又は99％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつ神経炎症又は脱髄疾患の症状を軽減する作用を有するもの（配列番号２、４、６で表されるアミノ酸配列と実質的に同等のアミノ酸配列）も含まれる。相同性は、インターネットを利用したホモロジー検索サイト、例えば日本DNAデータバンク（DDBJ）において、FASTA、BLAST、PSI-BLAST等の相同性検索を利用できる。また、National Center for Biotechnology Information (NCBI) において、BLASTを用いた検索を行うこともできる。
【００２１】
上記の変異を有するタンパク質を調製するために、該タンパク質をコードするDNAに変異を導入するには、Kunkel法やGapped duplex法等の部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット、例えばQuikChangeTM Site-Directed Mutagenesis Kit（ストラタジーン社製）、GeneTailorTM Site-Directed Mutagenesis System（インビトロジェン社製）、TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System（Mutan-K、Mutan-Super Express Km等：タカラバイオ社製）等を用いて行うことができる。また、「Molecular Cloning, A Laboratory Manual(4th edition)」（Cold Spring Harbor Laboratory Press (2012)）等に記載された部位特異的変異誘発法等の方法を用いることができる。
【００２２】
本発明のDock8タンパク質は、公知の手法を用いて作製することができる。具体的には以下の方法により作製することができる。
(i) 発現ベクターの作製
Dock8タンパク質を作製するための発現ベクターは、発現させる宿主細胞に保持されるものであれば特に限定されず、例えば、プラスミドベクター、ウイルスベクター、バクテリオファージ等が挙げられる。プラスミドベクターとしては、例えばpME18S、pcDNA3、pBR322、pUC18、pUC19、pUC118、pUC119、pBluescript等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、ウイルスベクターとしては、アデノウイルスベクター、エイズウイルスベクター、レンチウイルスベクター、及びこれらに由来するベクターが挙げられる。
本発明のDock8タンパク質をコードするDNAをベクターに組み込む手法は、適当な制限酵素で切断した後にリガーゼを作用させて連結する手法などが採用される（上記Molecular cloning等を参照）。
本発明のDock8タンパク質をコードするDNAは、該DNA領域を増幅させるプライマーを設計し、PCR法等を用いて当該領域を増幅した後、制限酵素やリガーゼを用いて所望の部分のみをベクターに連結させることができる。
【００２３】
(ii) 形質転換
本発明において使用される宿主は、Dock8タンパク質をコードするDNAが導入された後にDock8タンパク質をコードするDNAを発現するものであればよい。そのような宿主としては、例えば、哺乳動物細胞、ビフィズス菌、乳酸菌、大腸菌等の細菌類、昆虫細胞、酵母、カビ等を挙げることができるがこれらに限定されない。
宿主への組換えDNAの導入は、公知の方法により行うことができる。上記のベクターを宿主に導入する方法として、例えば、リン酸カルシウム法、DEAE-デキストラン法、電気穿孔法、カチオン性脂質法等を挙げることができる。
また、DNAが導入されたことの確認は、選択マーカー遺伝子（例えばアンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子等）を用いて行うことができる。
【００２４】
(iii) Dock8タンパク質の産生
本発明のDock8タンパク質は、Dock8タンパク質をコードするDNA又はその変異体を含む上記形質転換体を培養し、その培養物からタンパク質を採取することにより得ることができる。
「培養物」とは、培養上清、培養細胞、培養菌体、又は細胞若しくは菌体の破砕物のいずれをも意味するものである。形質転換体の培養は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。
培養後、Dock8タンパク質が菌体内又は細胞内に蓄積される場合には、ホモジナイザー処理などを施して菌体又は細胞を破砕することにより、Dock8タンパク質を採取する。Dock8タンパク質が菌体外又は細胞外に産生される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により菌体又は細胞を除去する。その後、硫安沈殿操作等により前記培養液中からDock8タンパク質を採取し、必要に応じてさらに各種クロマトグラフィー等を用いて単離精製する。
【００２５】
また、本発明においては、生細胞を全く使用することなく無細胞タンパク質合成系を採用して、Dock8タンパク質を産生することが可能である。
無細胞タンパク質合成系とは、細胞抽出液を用いて試験管などの人工容器内でタンパク質を合成する系であり、例えばmRNAの情報を読み取って、リボソーム上でタンパク質を合成するというものである。なお、本発明において使用される無細胞タンパク質合成系には、DNAを鋳型としてRNAを合成する無細胞転写系も含まれる。
本発明において、無細胞タンパク質合成は、市販のキットを用いて行うこともできる。そのようなキットとしては、例えば試薬キットPROTEIOSTM（東洋紡）、TNTTMSystem（プロメガ）、合成装置のPG-MateTM（東洋紡）、RTS（ロシュ・ダイアグノスティクス）などが挙げられる。
得られたDock8タンパク質は、適宜クロマトグラフィーを選択して、精製することができる。また、Dock8タンパク質が単離精製されたことの確認は、SDS-PAGE等により行うことが可能である。
【００２６】
（２）Dock8タンパク質をコードするDNA
本発明において、Dock8タンパク質をコードするDNAには、上記Dock8タンパク質又はその変異体をコードするDNAのほか、例えば、配列番号１、３若しくは５で表される塩基配列を含むDNAが挙げられ、好ましくは、配列番号１、３若しくは５で表される塩基配列からなるDNAである。
【００２７】
また、本発明に用いられるDock8タンパク質をコードするDNAには、上記DNAのほか、配列番号１、３若しくは５で表される塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ神経炎症又は脱髄疾患の症状を軽減する作用を有するタンパク質をコードするDNAが含まれる。
【００２８】
本発明において、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA」は、例えば、配列番号1の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドの全部又は一部をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法又はサザンハイブリダイゼーション法などを用いることにより得ることができる。ハイブリダイゼーションの方法としては、例えば、「Molecular Cloning, A Laboratory Manual(4th edition)」（Cold Spring Harbor Laboratory Press (2012)）などに記載されている方法を利用することができる。
【００２９】
本発明において、「ストリンジェントな条件」とは、低ストリンジェントな条件、中ストリンジェントな条件及び高ストリンジェントな条件のいずれでもよい。「低ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％SDS、50％ホルムアミド、32℃の条件である。また、「中ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％SDS、50％ホルムアミド、42℃の条件である。「高ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0．5％SDS、50％ホルムアミド、50℃の条件である。これらの条件において、温度を上げるほど高い相同性を有するDNAが効率的に得られることが期待できる。ただし、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度、プローブ濃度、プローブの長さ、イオン強度、時間、塩濃度等の複数の要素が考えられ、当業者であればこれらの要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
【００３０】
また、本発明に用いられるDock8タンパク質をコードするDNAには、配列番号１、３若しくは５で表される塩基配列に対して60％以上の相同性を有する塩基配列を含み、かつ神経炎症又は脱髄疾患の症状を軽減する作用を有するタンパク質をコードするDNAも含まれる。このようなDNAとしては、FASTA、BLASTなどの相同性検索ソフトウェアにより、デフォルトのパラメーターを用いて計算したときに、配列番号１、３若しくは５で表される塩基配列と、60％以上、70％以上、80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上又は99％以上の相同性を有するDNAを挙げることができる。
【００３１】
上記Dock8タンパク質をコードするDNA又はその変異体は、例えば、NCBI GenBankデータベースなどに記載された塩基配列に基づいて、「Molecular Cloning, A Laboratory Manual(4th edition)」（Cold Spring Harbor Laboratory Press (2012)）などに記載されている公知の遺伝子工学的手法を利用して得ることができる。
【００３２】
３．医薬組成物
本発明のDock8タンパク質は、神経炎症又は脱髄疾患に対し、予防又は治療効果を有する。従って、Dock8タンパク質又はDock8タンパク質をコードするDNAを含む医薬組成物は、神経炎症又は脱髄疾患の予防又は治療用医薬組成物として使用することができる。ここで、本発明のDock8タンパク質には、当該タンパク質の過剰発現によって発現したものが含まれる。
本発明において、「神経炎症」とは、神経系の固有細胞が重要な役割を果たす病的状態を意味し、このような疾患としては、例えば、視神経炎、神経変性疾患、神経痛、片頭痛、虚血性脳卒中、炎症性腸疾患などが挙げられる。
【００３３】
また、本発明において、「脱髄疾患」とは、神経の髄鞘が障害されることを意味し、このような疾患としては、例えば、多発性硬化症、急性散在性脳脊髄炎、進行性多巣性白質脳症、ギラン・バレー症候群などが挙げられ、好ましくは多発性硬化症である。
本発明において、「予防」とは、疾患の発症前に本発明の医薬組成物を被験者に接触させる（例えば、投与する）ことにより、接触させない場合に比べて、当該疾患の発症率を抑制（低下）させること、及び疾患の発症後の症状を軽減することを意味し、必ずしも発症を完全に抑制することを意味するものではない。
【００３４】
また、本発明において、「治療」とは、疾患の発症後に本発明の医薬組成物を被験者に接触させる（例えば、投与する）ことにより、接触させない場合に比べて、当該疾患の症状を軽減することを意味し、必ずしも疾患の症状を完全に抑制することを意味するものではない。疾患の発症とは、疾患の症状が身体に現れることを意味する。
神経炎又は脱髄疾患の「症状」としては、例えば、脱髄、神経における免疫反応（例えば炎症等）、神経軸索の変性、身体の一部又は全身の麻痺、しびれ、感覚障害、視機能障害、複視、運動麻痺、歩行障害、排尿・排便障害などが挙げられるが、これらに限定されない。
また、本発明における「神経」には、中枢神経（脳、脊髄）及び末梢神経の双方が含まれる。
【００３５】
本発明の医薬組成物は、本発明のDock8タンパク質、Dock8タンパク質をコードするDNA、Dock8タンパク質を発現するベクターのほか、薬学的に許容できる担体を含むことができる。「薬学的に許容できる担体」とは、神経炎症又は脱髄疾患の予防又は治療用医薬組成物に適する任意の担体（リポソーム、脂質小胞体、ミセル等）、希釈剤、賦形剤、湿潤剤、緩衝剤、懸濁剤、潤滑剤、アジュバント、乳化剤、崩壊剤、吸収剤、保存料、界面活性剤、着色料、着香料、又は甘味料を指す。
【００３６】
本発明の医薬組成物は、注射剤、凍結乾燥品、錠剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、顆粒剤、散剤、丸剤、シロップ剤、坐剤、バップ剤、軟膏剤、クリーム剤、点眼剤等の剤型をとることができる。注射剤などの液体製剤は、使用前に生理食塩水等で溶解する用時調製用粉末（例えば凍結乾燥粉末）の形態であってもよい。
【００３７】
本発明の医薬組成物は、当業者に既知である任意の手段によって局所的又は全身に投与することができる。本発明の医薬組成物の投与経路としては、経口投与及び非経口投与のいずれも可能であり、非経口投与の場合は、組織内投与（皮下投与、腹腔内投与、筋肉内投与、静脈内投与など）、皮内投与、局所投与（経皮投与など）又は経直腸的に投与することができる。本発明の医薬組成物は、これらの投与経路に適した投与形態で投与することができる。
【００３８】
本発明の医薬組成物の投与量は、被験者の年齢、体重、健康状態、性別、症状、投与経路、投与回数、剤型などの要因に応じて変化し、具体的な投与手順は当業者により設定することができる。例えば、成人には、本発明の医薬組成物を錠剤として投与する場合に0.1μg〜10 g、好ましくは1μg〜1 g、より好ましくは10μg〜100 mgを一日に１〜５回投与することができる。
【００３９】
投与時期は、症状に応じて適宜定めることができ、複数回分を同時に又は時間を置いて別々に投与することができる。また、本発明の医薬組成物は、疾患の発症前に被験者に投与してもよいし、疾患の発症後に投与してもよい。
【００４０】
本発明の医薬組成物は、哺乳動物を被験者として投与することができる。哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ヤギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、ウマ、サル、ヒトなどが挙げられる。
【００４１】
さらに、本発明の医薬組成物を遺伝子治療剤として使用する場合は、本発明の医薬組成物を注射により直接投与する方法のほか、Dock8タンパク質をコードするDNAが組込まれたベクターを投与する方法が挙げられる。すなわち、本発明における「Dock8タンパク質をコードするDNA」には、Dock8タンパク質をコードするDNAを含む発現ベクターが含まれる。上記ベクターとしては、プラスミドベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター等が挙げられ、ウイルスベクターを用いることにより効率よく投与することができる。
【００４２】
より具体的には、例えば、pCAGGSベクター（Niwa H. et al., Gene 108: 193-200, 1991）にDock8タンパク質をコードするDNAを挿入して作製されたDock8発現ベクターは、Dock8タンパク質をほぼ全身性に過剰発現させることができるため、好ましい。pCAGGSベクターは、いわゆるCAGプロモーター（Cytomegalovirus enhancerと Chicken β-actin promoterとをつなげた構造）と、ウサギのβ-グロビン遺伝子のpolyA signalサイトを有するベクターである。
本発明においては、Dock8タンパク質をコードするDNAを含む発現ベクター又はこれを含む医薬組成物を被験者に投与し、Dock8タンパク質を被験者において過剰発現させることにより、神経炎症又は脱髄疾患を予防又は治療することができる。すなわち、本発明の医薬組成物は、神経炎症又は脱髄疾患の予防又は治療方法に使用することができる。
【００４３】
また、本発明の医薬組成物をリポソームなどのリン脂質小胞体に導入し、その小胞体を投与することも可能である。Dock8タンパク質又はDock8タンパク質をコードするDNAを保持させた小胞体をリポフェクション法により所定の細胞に導入する。そして、得られる細胞を例えば静脈内、動脈内等に全身投与する。脳等に局所投与することもできる。例えば、成人に上記の医薬組成物を投与する場合は、一日あたり0.1μg/kg〜1000 mg/kg、好ましくは一日あたり1μg/kg〜100 mg/kgを投与することができる。また、当業者であれば、遺伝子導入に適した市販のキットを用いることもできる。
【００４４】
さらに、本発明のDock8タンパク質を発現するベクターをビフィズス菌、乳酸菌、酵母、糸状菌等の宿主に形質転換し、当該形質転換体を神経炎症又は脱髄疾患の予防又は治療に用いることができる。これらの形質転換体は、そのまま使用できるほか、上記の剤形に適宜製剤化し、本発明の医薬組成物として用いることができる。
【００４５】
４．スクリーニング方法
本発明は、Dock8の過剰発現により神経炎症又は脱髄疾患の予防又は治療が可能であるという知見に基づき完成されたものであり、Dock8タンパク質又はDock8遺伝子の発現量を指標として、Dock8タンパク質又はDock8遺伝子の発現量を増加させる物質を、神経炎症又は脱髄疾患の予防薬又は治療薬としてスクリーニングすることができる。
【００４６】
すなわち、本発明は、被検物質を非ヒト哺乳動物又は哺乳動物由来の生体試料に接触させ、前記非ヒト哺乳動物又は前記生体試料におけるDock8タンパク質又はDock8遺伝子の発現量を測定することを特徴とする、神経炎症又は脱髄疾患の予防薬又は治療薬のスクリーニング方法を提供する。
【００４７】
また別の態様において、本発明は、以下の工程を含む、神経炎症又は脱髄疾患の予防薬又は治療薬のスクリーニング方法を提供する。
（a）被検物質を非ヒト哺乳動物又は哺乳動物由来の生体試料に接触させる工程、
（b）被検物質を接触させた前記非ヒト哺乳動物又は前記生体試料におけるDock8タンパク質又はDock8遺伝子の発現量と、対照試料におけるDock8タンパク質又はDock8遺伝子の発現量とを比較する工程、及び
（c）前記比較結果を指標として、被験物質を神経炎症又は脱髄疾患の予防薬又は治療薬として選択する工程
【００４８】
本発明において、「被検物質」とは、Dock8タンパク質又はDock8遺伝子の発現に何らかの影響を与える可能性がある物質をいい、例えば、核酸（DNA、RNA、cDNA等）及びこれを含むベクター、抗体、ペプチド、タンパク質、合成化合物などが挙げられる。
【００４９】
本発明において、「非ヒト哺乳動物」とは、ヒト以外の哺乳動物を意味し、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ヤギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、ウマ、サルなどが挙げられる。非ヒト哺乳動物のなかでも、個体発生及び生物サイクルが比較的短く、また繁殖が容易なげっ歯動物、特にマウス又はラット等が好ましい。
また、非ヒト哺乳動物は、正常の動物であっても、神経炎症又は脱髄疾患を発症している動物であってもよい。
【００５０】
本発明において「哺乳動物由来の生体試料」とは、哺乳動物由来の組織、細胞、これらの破砕物又は抽出物、及び体液そのもの又はこれらを含む試料を意味し、特に限定されるものではない。ここで、「哺乳動物」には、上記非ヒト哺乳動物のほか、ヒトも含まれる。哺乳動物由来の組織としては、例えば、脳、脊髄、心臓、肺、腎臓、胆嚢、肝臓、膵臓、脾臓、腸、精巣（睾丸）、卵巣、子宮、胎盤、筋肉、血管、骨髄、甲状腺、胸腺、乳腺、リンパ節、血液等が挙げられる。
【００５１】
また、「哺乳動物由来の生体試料」には、上記の哺乳動物由来の組織、細胞、これらの破砕物又は抽出物、及び体液に対し、任意の処理、例えば希釈、分離、核酸の抽出等を行うことにより得られた試料も含まれる。
【００５２】
本発明において、哺乳動物由来の細胞には、上記組織、臓器又は体液に含まれる細胞、上記組織、臓器又は体液から単離及び培養して得られる培養細胞、哺乳動物由来の細胞株（cell line）及び人工多能性幹細胞（iPS細胞）などが含まれる。細胞には、神経細胞、免疫細胞などの体細胞のほか、幹細胞も含まれる。また、培養細胞には初代培養細胞及び継代培養細胞が含まれる。
【００５３】
本発明において、「接触」とは、非ヒト哺乳動物又は哺乳動物由来の生体試料と被検物質とを同一の反応系に存在させることを意味し、例えば、非ヒト哺乳動物に被検物質を投与すること、哺乳動物由来の生体試料に被検物質を添加すること、哺乳動物由来の生体試料が細胞である場合は、当該細胞を被検物質の存在下で培養すること、及び当該細胞内に被検物質を注入することなどが挙げられる。
【００５４】
本発明において、「対照試料」は、被検物質を接触させていない非ヒト哺乳動物又は哺乳動物由来の生体試料をいう。哺乳動物は、正常のものであっても、神経炎症又は脱髄疾患を発症したものであってもよく、当業者であれば、その目的に応じて適宜選択することができる。
【００５５】
Dock8タンパク質の発現量の測定は、例えば、免疫測定法などにより行うことができる。免疫測定法としては、放射免疫測定法（RIA）、免疫蛍光測定法（FIA）、免疫発光測定法、酵素免疫測定法（例えば、Enzyme Immunoassay(EIA)、Enzyme−linked Immunosorbent assay (ELISA)）、またはWestern blot法などが挙げられる。また、免疫組織化学により、Dock8タンパク質の発現量を測定するようにしても良い。免疫組織化学としては、具体的には、酵素標識抗体法、または蛍光抗体法などが挙げられる。
【００５６】
Dock8遺伝子の発現量の測定は、公知の方法、例えば、Dock8タンパク質をコードするDNAの塩基配列に基づいて設計されたプローブ及び/又はプライマーを用いるノーザンハイブリダイゼーション、PCR法、RT-PCR法を用いて行うことができる。本発明において、「Dock8遺伝子」には、Dock8タンパク質をコードするDNA、mRNA、cDNA、及びこれらを含む核酸が含まれる。
【００５７】
本発明では、被検物質を非ヒト哺乳動物又は哺乳動物由来の生体試料に接触させ、前記非ヒト哺乳動物又は前記生体試料におけるDock8タンパク質又はDock8遺伝子の発現量を測定し、当該測定結果と神経炎症又は脱髄疾患の予防又は治療効果とを関連付けることができる。そして、Dock8タンパク質又はDock8遺伝子の発現量における臨界値（cut-off値）を定めて、そのcut-off値以上の発現量を示す被検物質を、神経炎症又は脱髄疾患の予防薬又は治療薬として選択することもできる。
ここで、cut-off値を決定するためのDock8タンパク質又はDock8遺伝子の発現量は、例えば、次のように求めることができる。
まず、Dock8タンパク質又はDock8遺伝子の発現量を増加させる物質であって、神経炎症又は脱髄疾患に対する予防又は治療効果が確認されている物質（例えば、Dock8タンパク質発現ベクター）を、被験者（例えば非ヒト哺乳動物）に投与し、当該被験者由来の試料におけるDock8タンパク質又はDock8遺伝子の発現量を測定する。このとき、被験者の例数は２例以上であり、例えば、10例以上、50例以上、100例以上又は500例以上である。また、Dock8タンパク質又はDock8遺伝子の発現量を増加させる物質を投与していない被験者由来の試料（対照試料）におけるDock8タンパク質又はDock8遺伝子の発現量も測定しておくことが好ましい。対照試料の例数は、例えば2例以上、10例以上、50例以上、100例以上又は500例以上である。そして、Dock8タンパク質又はDock8遺伝子の発現量を増加させる物質を投与した被験者由来の生体試料群と対照試料群の両方を含む全体から、Dock8タンパク質又はDock8遺伝子の発現量のcut-off値を、統計処理により求める。統計処理としては、例えば、ROC（receiver operating characteristic）曲線を用いた解析等が挙げられる。
【００５８】
また、本発明においては、被検物質を接触させた非ヒト哺乳動物又は哺乳動物由来の生体試料におけるDock8タンパク質又はDock8遺伝子の発現量と、対照試料におけるDock8タンパク質又はDock8遺伝子の発現量とを比較し、その比較結果を指標として、被験物質を神経炎症又は脱髄疾患の予防薬又は治療薬として選択することができる。
具体的には、被検物質を接触させた非ヒト哺乳動物又は哺乳動物由来の生体試料におけるDock8タンパク質又はDock8遺伝子の発現量（A）と、対照試料におけるDock8タンパク質又はDock8遺伝子の発現量（B）とを比較した結果、発現量（A）が、発現量（B）と比較して高い場合、例えば、約20％以上、約30％以上、約40％以上、約50％以上、約60％以上、約70％以上、約80％以上、約90％以上、約95％以上、または約100％以上高い場合に、当該被検物質を、神経炎症又は脱髄疾患の予防薬又は治療薬として選択することができる。
また、被検物質を接触させた非ヒト哺乳動物又は哺乳動物由来の生体試料におけるDock8タンパク質又はDock8遺伝子の発現量が、対照試料におけるDock8タンパク質又はDock8遺伝子の発現量と比較して、統計的に有意に高い場合に、当該被検物質を、神経炎症又は脱髄疾患の予防薬又は治療薬として選択することもできる。統計的解析は、公知の方法、例えばT検定などを用いて行うことができる。
上記の場合、被検物質を接触させた非ヒト哺乳動物又は哺乳動物由来の生体試料及び対照試料は、それぞれ2例以上、例えば、3例以上、5例以上、10例以上用意し、被検物質を接触させた非ヒト哺乳動物又は哺乳動物由来の生体試料におけるDock8タンパク質又はDock8遺伝子の発現量の平均値と、対照試料におけるDock8タンパク質又はDock8遺伝子の発現量の平均値とを比較することが好ましい。
【００５９】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００６０】
Dock8過剰発現トランスジェニックマウス（Dock8 Tgマウス）の作製
１．ヒトDock8発現ベクターの構築
pCAGGSベクター（Niwa H. et al., Gene 108: 193-200, 1991）に、ヒトDock8タンパク質をコードするDNA（配列番号５）を通常の遺伝子工学的手法を用いて挿入し、ヒトDock8発現ベクターを構築した(図１Ａ)。
【００６１】
２．遺伝子導入
10週齢の雌C57/BL/6J系マウス（日本クレア社）を交配させ、当該マウスから受精卵を採取した。採取した受精卵に、上記１．で作製したヒトDock8発現ベクターをマイクロインジェクション法により注入した。ベクターを注入した受精卵を、偽妊娠マウス（C57/BL/6J系マウス（日本クレア社））の卵管内に移植した。偽妊娠マウスは、不妊の雄マウスと交配した後、プラグ陽性を確認することにより作製した。
上記受精卵を卵管内に移植した後、自然分娩により出産させ、Dock8 Tgマウスを得た。
【００６２】
３．タンパク質発現の確認
出生したマウスにおける導入遺伝子の発現の有無をPCRにより確認した後、タンパク質の発現をウェスタンブロットにより確認した。
その結果、Dock8 Tgマウスでは、免疫応答に重要な脾臓や胸腺において、ヒトDock8遺伝子の過剰発現を確認することができた（図１Ｂ）。
【実施例２】
【００６３】
Dock8 Tgマウスの機能解析
以下の実施例では、上記実施例１で作製したマウスをDock8 Tgマウスとして使用し、Dock8が遺伝子導入されていないC57/BL/6J系マウスを野生型（WT）マウスとして使用した。
【００６４】
１．Dock8 Tgマウスの脾臓におけるT細胞のサブタイプの割合の測定
正常な免疫応答が生じるためには、T細胞が各サブタイプへ正常に分化することが重要である。
まず、野生型（WT）マウス及びDock8 Tgマウスより脾臓を取り出し、脾臓細胞（splenocyte）を精製した。精製した脾臓細胞を用いて、脾臓におけるT細胞のサブタイプの割合をフローサイトメトリー（FACS）法により測定した。
その結果、Dock8 Tgマウスにおいて、各サブタイプのT細胞数に異常は見られなかった（図２）。すなわち、Dock8 Tgマウスでは、脾臓におけるT細胞の発生異常は認められなかった。Splenocytes：脾臓細胞、CD3+ T cell：全T細胞、CD3+ CD4+T cell：ヘルパーT細胞、CD3+ CD8+T cell：キラーT細胞。
【００６５】
２．Dock8 TgマウスにおけるT細胞活性の測定
上記１．と同様に精製した脾臓細胞を、抗CD3抗体を投与することにより刺激した後、3日間培養した。フローサイトメトリーを用いて、CD25又はCD69を細胞表面に発現している細胞及び発現していない細胞数をカウントした。CD25又はCD69を発現している細胞数のCD4陽性細胞に対する比率を、WTマウスとDock8 Tgマウスとで比較した。
その結果、Dock8 Tgマウス由来の脾臓細胞では、WTマウスと比較して、活性化の指標であるCD25又はCD69の陽性細胞数が減少していた。
この結果から、Dock8 Tgマウス由来の脾臓細胞では、WTマウスと比較してT細胞活性が低下していることが示された（図３）。
【００６６】
３．Dock8 Tgマウスの樹状細胞における抗原提示能の測定
トリ卵白アルブミン（OVA）特異的 T 細胞受容体トランスジェニックマウス（OT-II マウス）由来のリンパ球を精製した。OT-IIマウス (Barnden MJ et al., Immunol Cell Biol,76, 34-40,1998) は抗原提示能の解析に使用した。
WTマウスおよびDock8 Tgマウスの骨髄よりそれぞれ樹状細胞を精製し、培養後にOVAを取り込ませた。先に精製したリンパ球とOVAを取り込ませた樹状細胞とを混合し、3日間共培養した。リンパ球の活性状態を測定するため、細胞の分裂増殖の割合をフローサイトメトリーによって計測した。
その結果、樹状細胞の抗原提示能は、WTマウスとDock8マウスとで差は見られなかった（図４）。図４において、CFSEとは、carboxyfluorescein diacetatesuccinimidyl esterと呼ばれる蛍光物質を意味する。
【実施例３】
【００６７】
Dock8の神経炎症又は脱髄疾患に対する予防効果及び治療効果の検討
１．実験的自己免疫性脳脊髄炎（Experimental autoimmune encephalomyelitis: EAE）の発症率の測定
実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）は、多発性硬化症の疾患モデルである。EAEの発症にはmyelin oligodendrocyte glycoprotein（MOG）を利用した。6〜8 週齢の雄マウスに 100μg の MOG35-55 ペプチドを含む完全フロイントアジュバントを皮下投与することで免疫し、さらに免疫 0 日および 2 日目に百日咳毒素を腹腔内投与することで EAEモデルマウスを作製した。後肢麻痺を発症した個体の割合変化をグラフに示した。さらに、病態の重症度を1-5のスコアに分類した。スコア1：尾の先端に麻痺、スコア2：尾全体に麻痺、スコア3：正立反射の異常、スコア4：部分的な後肢麻痺、スコア5：完全な後肢麻痺。
その結果、WTマウスにおけるEAE発症率は100%であったのに対し、Dock8 TgマウスにおけるEAE発症率は約60%に抑制された（図５）。すなわち、Dock8 Tgマウスの約40％においては、EAEの発症自体が抑制されることが示された。
この結果から、Dock8は、神経炎症及び脱髄疾患に対して予防効果を有することが示された。
【００６８】
２．EAEによる脊髄症状の検討
上記１．においてEAEを発症した個体における脊髄症状の程度について、Dock8 TgマウスとWTマウスとで比較した。
その結果、Dock8 TgマウスのEAEを発症した個体における脊髄症状は、WTマウスに比べて軽度であった。また、Dock8 Tgマウスでは、免疫後約２週間目以降に症状が徐々に軽減される（軽症化する）傾向が見られた（図６）。
この結果から、Dock8は、神経炎症及び脱髄疾患に対して治療効果を有することが示された。
【００６９】
３．病理学的解析
EAEを発症したWTマウス及びDock8 Tgマウスから、それぞれ脊髄及び視神経を採取し、病理学的解析を行った。具体的には、脊髄のルクソールファストブルー染色、及び視神経の電子顕微鏡解析により、両組織における脱髄及び軸索変性の病理所見を観察した。
また、抗iba1抗体を用いた脊髄の組織免疫染色により、炎症の慢性化に重要な役割を持つミクログリア・マクロファージ細胞の組織への浸潤を観察した。
その結果を図７に示す。図７において、上段はWTマウスにおける結果を示し、下段はDock８ Tgマウスにおける結果を示す。また、左列は、EAEを発症したマウス脊髄のルクソールファストブルー染色結果を示し、赤点線は脱髄領域を示す。中央列は、EAEを発症したマウス脊髄の抗iba1抗体による免疫染色結果を示し、矢頭は病変部に浸潤したミクログリア／マクロファージを示す。右列は、視神経の電子顕微鏡写真を示し、矢印は変性した軸索を示す。
図７に示されるように、脊髄の病理学的解析において、Dock8 Tgマウスでは、WTマウスと比較して脱髄と神経炎症の軽減が観察された（図７の左列及び中央列）。また視神経の電子顕微鏡解析において、Dock8 Tgマウスでは、WTマウスと比較して視神経軸索の変性が顕著に抑制されていた（図７の右列）。
これらの結果から、Dock8は、病理学的解析においても、神経炎症及び脱髄疾患に対して治療効果を有することが示された。
【００７０】
４．視機能解析
Dock8マウス及びWTマウスにそれぞれEAEを発症させ、視機能障害の有無を確認した。具体的には、ヒトの視機能検査に利用されている装置（VERIS; Electro-Diagnostic Imaging, Redwood City, CA, USA）と同型の機器を使用して、多局所網膜電位の解析を行った。
マウスを全身麻酔した後、測定眼に電極付きコンタクトレンズを装着した状態で測定台に固定した。モニターへ映し出された刺激画像を７分間見せることで、網膜における電気生理学的な反応を捉えた。
その結果、WTマウスでは、EAEの発症によって視機能が低下していたのに対し、Dock 8 Tg
マウスでは、視機能が正常であることが示された（図８）。
【００７１】
以上の結果から、Dock8は、神経炎症及び脱髄疾患に対し、予防又は治療効果を有することが示された。
【産業上の利用可能性】
【００７２】
本発明により、神経炎症又は脱髄疾患の予防又は治療に有用な医薬組成物を提供することができる。
【図１】
2014156407.tif 000002
【図２】
2014156407.tif 000003
【図３】
2014156407.tif 000004
【図４】
2014156407.tif 000005
【図５】
2014156407.tif 000006
【図６】
2014156407.tif 000007
【図７】
2014156407.tif 000008
【図８】
2014156407.tif 000009
【配列表】
2014156407000001.app