(57)【要約】【課題】アレルギーのペプチド免疫療法においては、ＨＬＡ型を考慮したＴ細胞エピトープを選ぶことが重要となるが、全てのＨＬＡ型に対応することは困難である。【解決手段】本発明においては、シラカンバ花粉症患者の免疫療法を目的として、シラカンバ花粉のメジャーアレルゲンＢｅｔ  ｖ１の全配列を３分割し１０残基オーバーラップさせた長鎖合成ペプチドを作成した。これら３つのペプチドの好塩基球活性化能を評価するためにＢＡＴを行ったところ、これらの合成ペプチドには全ての患者において反応を示さず、イムノＣＡＰ特異的ＩｇＥ抑制試験で、これらの合成ペプチドのＩｇＥ結合活性が低下していることを確認した。よって、これらの３つのペプチドの混合物をシラカンバ花粉症の免疫療法に用いることにより、安全で有効な抗原となりうることを見出した。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｂｅｔ  ｖ１ａ長鎖ペプチドを少なくとも３分割したペプチド断片の混合物を有効成分とするシラカンバの免疫療法剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アレルギー性花粉症の免疫療法剤に関する発明であり、より詳細にはシラカンバ花粉症の免疫療法剤として用いることが可能なペプチド混合物に関する発明である。
【背景技術】
【０００２】
スギ花粉症は日本に特有の風土病であり、日本人に頻度の高いＭＨＣを考慮したＴ細胞エピトープを選ぶことで治療に用いることができるため、T細胞エピトープペプチドを用いた治療が検討されている。またスギ花粉の舌下免疫療法も、まもなく臨床に応用されることが期待されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
一方、シラカンバは日本以外に世界に広く分布し、患者の人種も多様であることから、Ｔ細胞エピトープの種類も非常に多くなり、これらをすべて網羅したＴ細胞エピトープ連結ペプチドを作成するのはコストの面で困難である。また以前より欧米では、シラカンバの粗抗原を用いた舌下免疫療法がおこなわれているが、アレルゲンコンポーネント以外の不純物が含まれることを原因として、抗原活性を高めることができないため、最近ではリコンビナント抗原を用いた臨床試験が行われ良好な成績が報告されている。また舌下免疫療法は非飛散期にも治療を継続しなければならないため、治療期間が長く患者のモチベーションが保たれないことが懸念される。臨床の現場で免疫療法を普及させるためには、アナフィラキシーショックなどの副作用が起きるリスクを低下させ、なおかつ花粉飛散開始前から短期間で治療が完結できる免疫療法が理想である。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
そのため本発明者は、Ｂｅｔ  ｖ１ａ長鎖合成ペプチド（配列番号１）を作成し、現行の粗抗原よりもＩｇＥ結合能、好塩基球活性化能を低下させうるか検討を行った。その結果、Ｂｅｔ  ｖ１ａ長鎖合成ペプチドを３分割したペプチド断片の混合物が所望の性質を有することを見出して、本発明を提供するに至った。
【０００５】
すなわち、本発明は、Ｂｅｔ  ｖ１ａ長鎖ペプチドを少なくとも３分割したペプチド断片の混合物を有効成分とするシラカンバの免疫療法剤を提供するものである。
【発明の効果】
【０００６】
本発明により、副作用の少ないシラカンバの免疫療法剤が提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】既存のシラカンバ抗原と本発明に係わる分割ペプチドにおけるＢＡＴの結果を示した図面である。
【図２】既存のシラカンバ抗原におけるイムノＣＡＰ特異的ＩｇＥ抑制試験の結果を示した図面である。
【図３】本発明に係わる分割ペプチドにおけるイムノＣＡＰ特異的ＩｇＥ抑制試験の結果を示した図面である。
【図４】既存のシラカンバ抗原と本発明に係わる分割ペプチドにおけるＡＬＳＴの結果を示す図面である。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
１．対象と方法
患者同意を得たシラカンバ花粉症患者８症例の末梢血を用いて解析を行った。対象はすべて花粉飛散時期に症状を発現し、鼻汁好酸球陽性かつシラカンバ花粉のイムノＣＡＰスコア２以上である。Ｂｅｔ  ｖ１ａのアミノ酸配列の１番から６０番、５１番から１１０番、１０１番から１６０番の３種類のペプチドをGenScript社に合成を依頼し、それぞれペプチドＡ，Ｂ，Ｃとした（配列番号２〜４）。またシラカンバ花粉コンポーネント解析のため、Ｂｅｔ  ｖ１ａ，Ｂｅｔ  ｖ２のイムノＣＡＰ、またはＩＳＡＣを行った。
【０００９】
ペプチドのＩｇＥ結合能の評価は、固相Ｂｅｔ  ｖ１ａによるイムノＣＡＰ特異的ＩｇＥ抑制試験をファディア社に依頼し行った。その内容は、Ｂｅｔ  ｖ１ａに対する抗体価が最も高値であった症例１の検体を用いて、固相にイムノＣＡＰ特異的ＩｇＥ  ｔ２１５  Ｂｅｔ  ｖ１ａを、添加抗原溶液にＢｅｔ  ｖ１ａ、Ｂｅｔ  ｖ２（各５０ｎｇ／ｍＬ）、ペプチドＡ、Ｂ、Ｃ（各５０μｇ／ｍＬ）の原液およびこれを０．１Ｍリン酸緩衝液で１０、１０２および１０３倍希釈したものを用いて抑制試験を実施した。検体と各抗原溶液を混合比１：９容となるよう混合し、２５℃で２時間振とうした。振とう後、各試料をイムノＣＡＰ特異的ＩｇＥ  ｔ２１５  Ｂｅｔ  ｖ１ａで測定した。得られた蛍光強度より抑制率を求めた。
【００１０】
ペプチドの安全性を評価する目的でBAT、またペプチドのリンパ球刺激能を評価する目的でＡＬＳＴを行った。ＡＬＳＴは症例３を除く7例で行った。リコンビナントＢｅｔ  ｖ１ａ、Ｂｅｔ  ｖ２はBiomay社より購入した。
【００１１】
２．結果
今回検討した８症例すべてで、イムノＣＡＰ、またはＩＳＡＣでＢｅｔ  ｖ１ａに対するＩｇＥが陽性であった（表１）。
【００１２】
【表１】
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【００１３】
ＢＡＴでは、全症例でシラカンバ花粉およびＢｅｔ  ｖ１ａに陽性であったが（表１）、３種類の合成ペプチドはいずれもＢｅｔ  ｖ１ａと有意差をもって反応が低下していた（図１）。またイムノＣＡＰ特異的ＩｇＥ抑制試験において、患者血清とイムノＣＡＰ（Ｂｅｔ  ｖ１ａ）との反応時にＢｅｔ  ｖ１ａそのものを添加することによって特異的ＩｇＥの結合抑制がみられるが（図２）、３種類のペプチドではいずれもその抑制がなかったため、各合成ペプチドはＢｅｔ  ｖ１ａと比較して特異的ＩｇＥとの結合能が低下していることが確認された（図３）。ＡＬＳＴでは、ペプチドＢ、Ｃでリンパ球刺激能を有していた（図４）。
【００１４】
３．考察
免疫療法に用いる抗原は、Ｔ細胞エピトープのみを用いるのが最も安全性が高いと考えられる。Ｔ細胞エピトープは通常１２から１５アミノ酸残基程度の長さであり、抗原提示細胞表面でＭＨＣと結合した複合体としてＴ細胞に認識される。一方ＩｇＥエピトープは、タンパク質の三次構造を認識する場合が多く、タンパク質の変性、分解などにより失活しやすい。免疫療法はアナフィラキシー発症の危険性から、治療に用いる抗原量が少ないところから始め、増量には時間がかかるという欠点があるが、投与抗原を最初から高濃度で投与できれば、治療期間の短縮が可能である。しかし、そのためには現在臨床で使用されている抗原から、可能な限りＩｇＥエピトープを除去する必要がある。
【００１５】
そこで今回我々は、シラカンバ花粉のメジャーアレルゲンＢｅｔ  ｖ１ａの全配列を３分割し１０残基オーバーラップさせた長鎖合成ペプチドを作成した。これらの合成ペプチドは、理論上ほぼすべてのＴ細胞エピトープを含み、Ｂｅｔ  ｖ１ａの立体構造とは大きく異なっていることから、ＩｇＥエピトープも大幅に減少しているため、安全性が高いと推測される。結果に示したように、今回合成したペプチドはいずれも粗抗原よりＩｇＥ結合能、好塩基球活性化能が低下していた。
【００１６】
Normanらはネコの主要抗原であるＦｅｌｄ１の２７残基のエピトープペプチド(Allervax)の臨床試験２４名中６名で副作用が見られたと報告している。Ｔ細胞エピトープのなかには、アミノ酸配列依存的なＩｇＥエピトープが含まれる可能性があることから、今回の長鎖合成ペプチドにおいても症例を増やして検討すると、同様の事例が起こる可能性があると思われる。しかし、その危険性は今回行ったＢＡＴ試験をペプチド投与前に行うことで回避できるのではないかと考えている。ＢＡＴは、現在行われているヒスタミン遊離試験と同様、アレルギー反応のeffector phaseを見るのに適しており、食物アレルギーなどの分野で抗原同定を目的として近年盛んに行われている検査である。また、任意の抗原使用が可能で、短時間で測定できるため、スクリーニング検査に有用である。免疫療法の抗原は、ＢＡＴによるin vitro検査で安全性を確認してから投与を始めることにより、治療全体の安全性が高まることが予想される。また、投与経路に関しても、鼻誘発反応で陰性であれば、皮下注射または舌下ではなく実際のアレルギーが起こっている部位である経鼻投与も可能と考えられる。また、今回用いたペプチドのうち２つがリンパ球活性化能を有していることをＡＬＳＴにて確認したことから、これらペプチドの混合物は免疫療法に有効であることが分かった。
【００１７】
最近、高井らは、ハウスダストアレルゲンにＴｈ２サイトカインの産生を誘導するアジュバント活性があることを報告している。今回われわれが用いた長鎖ペプチドでは、このアジュバント活性が失われて粗抗原に比べて効果が劣る可能性があることは否定できない。従って、ペプチド投与の際にアジュバントを同時に投与するなどの工夫が必要となるかもしれない。
【００１８】
今回の我々の検討により、Ｂｅｔ  ｖ１ａの3種の長鎖合成ペプチドの混合物は、シラカンバ花粉症の安全で有効な免疫療法のツールになることが示唆された。今後、その有用性についてさらなる検討をおこなっていきたい。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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