(57)【要約】      （修正有）【課題】ホウ素等の無機材料を含むサブミクロンサイズの粒子を、腫瘍細胞に選択的に取り込ませることができる粒子及びその製造方法の提供。【解決手段】粒径サイズ２００ｎｍ〜１０００ｎｍの無機粒子の表面をトランスフェリン（Ｔｆ）で修飾した腫瘍細胞への選択的取り込み能を備えていることを特徴とする粒子。無機粒子の表面を、ポリリジンで被覆した後にポリグルタミン酸で被覆し、該被覆表面にＴｆを修飾することを特徴とする腫瘍細胞への選択的取り込み能を備えている粒子の製造方法。特に、無機粒子が炭化ホウ素粒子であり、該炭化ホウ素サブミクロン粒子にＴｆを修飾する方法を開発し、腫瘍細胞中の核近傍への粒子取り込みを実現し、少ない投与量で効率よい熱中性子線を照射により腫瘍細胞破壊効果を得ようとするものである。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
粒径サイズ２００ｎｍ〜１０００ｎｍの無機粒子の表面をトランスフェリンで修飾した腫瘍細胞への選択的取り込み能を備えていることを特徴とする粒子。
【請求項２】
前記無機粒子がホウ素含有粒子であることを特徴とする請求項１記載の粒子。
【請求項３】
前記ホウ素含有粒子が炭化ホウ素粒子であることを特徴とする請求項２記載の粒子。
【請求項４】
前記粒子の表面に、ポリリジン及びポリグルタミン酸をこの順に被覆し、その上にトランスフェリンで修飾したことを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の粒子。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の粒子からなることを特徴とする中性子捕捉療法用薬剤。
【請求項６】
粒径サイズ２００ｎｍ〜１０００ｎｍの無機粒子の表面を、ポリリジンで被覆した後にポリグルタミン酸で被覆し、該被覆表面にトランスフェリンを修飾することを特徴とする腫瘍細胞への選択的取り込み能を備えている粒子の製造方法。
【請求項７】
前記無機粒子がホウ素含有粒子であることを特徴とする請求項６記載の粒子の製造方法。
【請求項８】
前記ホウ素含有粒子が炭化ホウ素粒子であることを特徴とする請求項７記載の粒子の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
ホウ素等の無機材料を含むサブミクロンサイズの粒子を、腫瘍細胞に選択的に取り込ませることができる（一部は核近傍に位置する粒子もある）粒子及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
粒子の細胞内へのターゲッティングに関する研究が多く進められているが、有機系や高分子系のものが多かった。しかし、生体内の粒子に対して遠隔的に何らかの局所的な効果を及ぼすためには、無機系の粒子を使えばより効率的に行えると考えられる。
例えば腫瘍細胞に無機粒子を選択的に取り込ます手法が使えるようになれば、ホウ素含有無機粒子を利用した中性子捕捉療法、磁性無機粒子を利用したハイパーサーミア、無機粒子の光吸収と活性酸素発生を利用した光線力学療法、などさまざまな新規医療応用粒子の開発が進展するものと期待される。
【０００３】
ホウ素中性子捕捉療法（Boron neutron capture therapy; ＢＮＣＴ）は、腫瘍細胞に取り込まれた１０Ｂに熱中性子線を照射し、核反応によって発生するα粒子と７Ｌｉにより腫瘍細胞を死滅させる治療法である。脳腫瘍や頭頸部の難治療ガンの治療法として最近注目を集めてきている。特にこの手法は、治療後の予後が良いことから患者の治療後の生活の質（ＱＯＬ）を維持することができることも、重要な点である。
【０００４】
このため、腫瘍細胞に特異的かつ、十分な量の１０Ｂの蓄積が必須となる（非特許文献１、２参照）。これまでに、腫瘍細胞に効率的に取り込まれるホウ素化合物（mercaptoundecahydrododecaborane、4-dihydroxyboryl phenylalanine）がＢＮＣＴに用いられてきたが、十分な量の蓄積を得ることは困難であり、大量に投与する必要があるなどの問題点があった。
【０００５】
この問題を克服するために、ドラッグデリバリーシステムが注目され、ホウ素を運ぶキャリアとしてリポソーム（非特許文献３、４参照）、低比重リポタンパク質（非特許文献５参照）、炭素ナノ粒子（非特許文献１参照）などが開発されてきたが、ホウ素濃度は低いことは上記のホウ素化合物と同様であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００８−２６６１２６号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Hwang, K. C., Lai P., D., Chiang, C-S., Wang, P-J., and Yuan, C-J. (2010) Neutron capture nuclei-containing carbon nanoparticles for destruction of cancer cells. Biomaterials 31, 8419-8425.
【非特許文献２】Mortensen, M., W., Bjorkdahl, O., Sorensen, P., G., Hansen, T., Jensen, M., R., Gundersen, H., J., G., and Bjornholm, T. (2006) Functionalization and cellular uptake of boron carbide nanoparticles. The first step toward T cell-guided boron neutron capture therapy. Bioconjug. Chem. 17, 284-290.
【非特許文献３】Ueno, M., Ban, H., S., Nakai, K., Inomata, R., Kaneda, Y., Matsumura, A., and Nakamura, H. (2010) Dodecaborate lipid liposomes as new vehicles for boron delivery system of neutron capture therapy. Bioorg. Med. Chem. 18, 3059-3065.
【非特許文献４】Doi, A., Kawabata, S., Iida, K., Yokoyama, K., Kajimoto, Y., Kuroiwa, T., Shirakawa, T., Kirihata, M., Kasaoka, S., Maruyama, K., Kumada, H., Sakurai, Y., Masunaga, S-I., Ono, K., and Miyatake, S-I. (2008) Tumor-specific targeting of sodium borocaptate (BSH) to malignant glioma by transferrin-PEG liposomes: a modality for boron neutron capture therapy. J. Neurooncol. 87, 287-294.
【非特許文献５】Laster, B., H., Kahl, S., B., Popenoe, E., A., Pate, D., W., and Fairchild, R., G. (1991) Biological efficacy of boronated low-density lipoprotein for boron neutron capture therapy as measured in cell culture. Cancer Res., 51, 4588-4593.
【非特許文献６】Mortensen, M., W., Sorensen, P., G., Bjorkdahl, O., Jensen, M., R., Gundersen, H., J., G., and Bjornholm, T. (2006) Preparation and characterization of Boron carbide nanoparticles for use as a novel agent in T cell-guided boron neutron capture therapy. Appl. Radiat. Isot. 64, 315-324.
【非特許文献７】Petersen, M., S., Petersen, C., C., Agger, R., Sutmuller, M., Jensen, M., R., Sorensen, P., G., Mortensen, M., W., Hansen, T., Bjornholm, T., Gundersen, H., J., Huiskamp, R., and Hokland, M. (2008) Boron nanoparticles inhibit tumour growth by boron neutron capture therapy in the murine B16-OVA model. Anticancer Res. 28, 571-576.
【非特許文献８】Ishikawa, Y., Shimizu, Y., Sasaki, T., and Koshizaki, N. (2007) Boron carbide spherical particles encapsulated in graphite prepared by pulsed laser irradiation of boron in liquid medium. Appl. Phys. Lett. 91, 161110.
【非特許文献９】Jani, P., Halbert, G., W., Langridge, J., and Florence., A., T. (1990) Nanoparticle uptake by the rat gastrointestinal mucosa: quantitation and particle size dependency. J. Pharm. Pharmacol. 42, 821-826.
【非特許文献１０】Qian, Z., M., Li, H., Sun, H., and Ho, K. (2002) Targeted drug delivery via the transferrin receptor-mediated endocytosis pathway. Pharmacol. Rev. 54, 561-587.
【非特許文献１１】Wagner, E., Curial, D., and Cotton, M. (1994) Delivery of drugs, proteins and genes into cells using transferrin as a ligand for receptor-mediated endocytosis. Adv. Drug Delivery Rev. 14, 113-135.
【非特許文献１２】Ryschich, E., Huszty, G., Knaebel, H., P., Hartel, M., Buchler, M., W., and Schmidt, J. (2004) Transferrin receptor is a marker of malignant phenotype in human pancreatic cancer and in neuroendocrine carcinoma of the pancreas. Eur. J. Cancer 40, 1418-1422.
【非特許文献１３】Tsuji, T., Yoshitomi, H., and Usukura, J. Endocytic mechanism of transferrin-conjugated nanoparticles and the effects of their size and ligand number on the efficiency of drug delivery. J. Electron Microsc. doi: 10.1093/jmicro/dfs080
【非特許文献１４】Lao, B., J., Tsai, W., L., P., Mashayekhi, F., Pham, E., A., Mason, A., B., and Kamei, D., T. (2007) Inhibition of transferrin iron release increases in vitro drug carrier efficacy. J. Control. Release 117, 403-412.
【非特許文献１５】Barth, R., F., Coderre, J., A., Vicente., M., G., H., and Blue, T., E. (2005) Boron neutron capture therapy of cancer: current status and future prospects. Clin. Cancer Res. 11, 3987-4002.
【非特許文献１６】Weissfloch, L., Wagner, M., Probst, T., Senekowitsch-Schmidtke, R., Tempel, K., and Molls, M. (2001) A new class of drugs for BNCT? Borylated derivatives of ferrocenium compounds in animal experiments. BioMetals 14, 43-49.
【非特許文献１７】Yamada, S., Hirao, K., Yamauchi, Y., and Kanzaki, S. (2003) Mechanical and electrical properties of B4C-CrB2 ceramics fabricated by liquid phase sintering. Ceram. Int. 29, 299-304.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
近年、大量の１０Ｂを細胞内に届けることができるホウ素粒子が注目を集めている（非特許文献２、６、７参照）。我々はこれまでにパルスレーザー光照射を用いた炭化ホウ素サブミクロン粒子（born carbide submicron particle, ＢＣＳＰ）作製法を開発した（特許文献１及び非特許文献８参照）。このサイズの粒子は大量の１０Ｂを含有するが、その大きさ故に細胞に取り込まれにくい（特許文献９参照）。そのため粒子の表面修飾が必須となる。
【０００９】
薬物をがん細胞に選択的に作用させるために、その受容体が多種のがん細胞に高発現しているトランスフェリン（Ｔｆ）が利用されている（非特許文献１０、１１、１２参照）。これまでに我々は２００ ｎｍ以上のポリスチレン粒子にＴｆ修飾を行うことにより、がん細胞へ効率良くまた選択的に積み荷を運ぶことができることを示した（非特許文献１３参照）。
本発明では、ＢＣＳＰにＴｆを修飾する方法を開発し、がん細胞中の核近傍への粒子取り込みを実現し、少ない投与量で効率よいがん細胞破壊効果を得ようとするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記課題に鑑み、ホウ素を含有する無毒で安定な粒子の合成と細胞内に効率よく取り込まれる仕組みを与える粒子表面の処理という観点から、本発明者らは、次の発明を提供するものである。
【００１１】
１）粒径サイズ２００ｎｍ〜１０００ｎｍの無機粒子の表面をトランスフェリンで修飾した腫瘍細胞への選択的取り込み能を備えていることを特徴とする粒子。
２）前記無機粒子がホウ素含有粒子であることを特徴とする上記１）記載の粒子。
３）前記ホウ素含有粒子が炭化ホウ素粒子であることを特徴とする上記２）記載の粒子。
４）前記粒子の表面に、ポリリジン及びポリグルタミン酸をこの順に被覆し、その上にトランスフェリンで修飾したことを特徴とする上記１）〜３）のいずれか一項に記載の粒子。
５）上記１）〜４）のいずれか一項に記載の粒子からなることを特徴とする中性子捕捉療法用薬剤。
【００１２】
６）粒径サイズ２００ｎｍ〜１０００ｎｍの無機粒子の表面を、ポリリジンで被覆した後にポリグルタミン酸で被覆し、該被覆表面にトランスフェリンを修飾することを特徴とする腫瘍細胞への選択的取り込み能を備えている粒子の製造方法。
７）前記無機粒子がホウ素含有粒子であることを特徴とする上記６）記載の粒子の製造方法。
８）前記ホウ素含有粒子が炭化ホウ素粒子であることを特徴とする上記７）記載の粒子の製造方法
【発明の効果】
【００１３】
ホウ素中性子捕捉療法（Boron neutron capture therapy, ＢＮＣＴ）により効率良く腫瘍細胞を死滅させるためには、腫瘍細胞に特異的かつ、十分な量の１０Ｂの蓄積（１０９原子／細胞）が有効である（非特許文献１、１５、１６参照）。ＢＣＳＰは大量の１０Ｂを含有し、１２粒子でこの条件を達成することができる（２．５ ｇ／ｃｍ３、直径２００ ｎｍ：非特許文献１７参照）。
しかし、従来中性子捕捉療法に使用されているホウ素化合物は、中性子捕捉能が高い１０Ｂの存在比を１００％に濃縮したホウ素を原料として用いる必要があり、そのためコストの大幅な上昇を強いている。
これに対し、本発明の粒子は少ない個数で、大量のホウ素原子を細胞中に導入出来るので、１０Ｂを２０％しか含まない安価な天然ホウ素で作製した場合の粒子でも、十分な治療効果が確保出来る優れた効果を有する。すなわち、上記のようにＢＣＳＰにＴｆ を修飾することにより、この粒子はがん細胞によく取り込まれ、１０９原子の１０Ｂを細胞内に届けることができる効果を有する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ＢＣＳＰ（ａ）とポリリジン修飾後にポリグルタミン酸を修飾したＢＣＳＰ（ｂ）の透過型電子顕微鏡像を示す図である。スケールバーは１００ｎｍを示す。
【図２】共焦点顕微鏡観察により得られた結果を示す図である。スケールバーは１０μｍを示す。光学切片像（上段）、maximum-intensity projection images（中段）、光学顕微鏡像（下段）。（ａ）−（ｃ）：Ｔｆ修飾ＢＣＳＰを与えたＨｅＬａ細胞、（ｄ）−（ｆ）：ＴｆとＴｆ修飾ＢＣＳＰを与えたＨｅＬａ細胞、（ｇ）−（ｉ）：ａｌｂｕｍｉｎ修飾ＢＣＳＰを与えたＨｅＬａ細胞、（ｊ）−（ｌ）：Ｔｆ修飾ＢＣＳＰを与えたＮＲＫ細胞を示す。
【図３】Ｔｆ修飾ＢＣＳＰを与えたＨｅＬａ細胞の透過型電子顕微鏡像を示す図である。（ａ）は多数のＴｆ修飾ＢＣＳＰがＨｅＬａ細胞に取り込まれていた様子を示す図であり、スケールバー１μｍである。（ｂ）は粒子の核周辺にも確認された様子を示す図、（ｃ）は小胞内のＴｆ修飾ＢＣＳＰを示す図である。スケールバー２００ ｎｍである。Ｎは核を示す。
【図４】実施例２で説明するマウス腫瘍の透過型電子顕微鏡像である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明は、腫瘍細胞への選択的取り込み能を備えている粒子を提供するものであり、粒径サイズは２００ｎｍ〜１０００ｎｍである無機粒子の表面をトランスフェリンで修飾することにより、それを達成することができる。この無機粒子としては、好適にはホウ素含有粒子であり、さらに炭化ホウ素粒子であることが望ましい。
上記の通り、現在中性子捕捉療法に使用されているホウ素化合物は、中性子捕捉能が高い１０Ｂの存在比を１００％に濃縮したホウ素を原料として用いる必要があり、そのためコストの大幅な上昇を強いている。
これに対し、今回の発明の粒子は少ない個数で大量のホウ素原子を細胞中に導入出来るので、１０Ｂを２０％しか含まない安価な天然ホウ素で作製した場合の粒子でも、十分な治療効果が確保出来ることから、製造コストの大幅な低減を図ることが可能である。
【００１６】
上記の通り、１０９原子の１０Ｂは、ホウ素中性子捕捉療法（ＢＮＣＴ）により、効率良く腫瘍細胞を死滅させるために有効であるが、同様の機能を持つ無機粒子であれば、腫瘍細胞への選択的取り込み能を備えることにより、同様に腫瘍細胞を死滅させる効果を有する。本願発明は、これらを包含するものである。
前記粒子の表面に、ポリリジン及びポリグルタミン酸をこの順に被覆し、その上にトランスフェリンで修飾することにより、上記の機能を備えた粒子を効果的に得ることができる。さらに、これらの機能を持つ材料は中性子捕捉療法用薬剤として有用である。
【００１７】
本願発明は、その多くを実験により確認しつつ、最適な条件を見出すことを前提とした。したがって、以下の具体的な説明は、実験との関連での説明が中心となる。また、特に効果があることを確認したＢＣＳＰのＴｆ修飾を中心に説明するが、他の材料への展開を制限するものではないことを、予め申し述べる。
【００１８】
（細胞培養）
ＨｅＬａ細胞（ヒト子宮頸かん由来細胞株: RIKEN BioResource Center, Tsukuba, Japan）とＮＲＫ細胞（ラット腎細胞由来: RIKEN BioResource Center, Tsukuba, Japan）を、６０ ｍｍディッシュ（BD FALCON, Flanklin Lakes. NJ, USA）に播種し、炭酸ガス培養装置内（５％ ＣＯ２, ３７°Ｃ）で培養した。培養液は１０％（Ｖ／Ｖ）fetal bovine serum（FBS; 牛胎児血清; PAA, Vienne, Austria）、１００ Ｕ／ｍｌ ペニシリン、１００ μｇ／ｍｌ ストレプトマイシン (Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japan)を添加したDulbecco’s Modified Eagle’s Medium（DMEM; Sigma-Aldrich）を使用した。
【００１９】
（ＢＣＳＰのＴｆ修飾）
１ｍｇのＢＣＳＰを１ｍｌの蒸留水中に分散させ、１ｍｇのポリリジン（poly-L-lysine, ＰＬＬ; mol. wt. 4,000-15,000, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA）を加え、室温で１０分間放置した。その後、遠心分離（6,500×g, 20 min, 25°C）により粒子を洗浄し、フリーなＰＬＬを除去した。回収した粒子を再び蒸留水中に分散させ、１０ｍｇのポリグルタミン酸（poly-γ-glutamic acid, ＰＧＡ; mol. wt. 200,000-500,000, Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japan）を加えた。同様に遠心分離（6,500×g, 20 min, 25°C）を行いフリーなＰＧＡを除去した。
【００２０】
回収したＰＧＡ−ｃｏａｔｅｄ ＢＣＳＰを０．５ｍｌのＭＥＳ緩衝液（10 mM, pH 5.5）中に分散させ、３．１７×１０−９ ｍｏｌの1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide (EDC; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) とN-hydroxysuccinimide (NHS; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)を加え、３０分間室温で反応させた。
【００２１】
１０倍濃度のＰＢＳを５０ μｌ加え反応を停止させた。続いて０．２５ｍｇのhuman holo-transferrin（Tf; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA）、他の材料として０．２１ｍｇのａｌｂｕｍｉｎ (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)を用い、粒子を室温で８時間反応させた。反応後、粒子に結合しなかったＴｆ又はａｌｂｕｍｉｎを遠心分離（6,500 × g, 20 min, 25°C, twice）により除去した。なお、ａｌｂｕｍｉｎは、比較（効果確認）のために用いたものである。
【００２２】
また、共焦点観察を行うために、粒子表面に結合したＴｆ、ａｌｂｕｍｉｎを０．１ ｍｇのＦＩＴＣ−Ｉ（Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japan）を用いて、ｃａｒｂｏｎａｔｅ緩衝液（50 mM, pH 9.5）中で蛍光標識した。２時間後、遠心分離（6,500×g, 20 min, 25°C, thrice）により粒子を洗浄し、結合していない蛍光色素を除去した。
【００２３】
（共焦点顕微鏡観察）
ＨｅＬａ細胞とＮＲＫ細胞を３５ ｍｍガラスボトムディッシュ（Matsunami Glass Ind., Ltd., Osaka, Japan）上に播種し、１２時間以上培養した。細胞が十分ディッシュ底面に接着した後、０．０５ｍｇ／ｍｌのＴｆ修飾ＢＳＣＰ、ａｌｂｕｍｉｎ修飾ＢＣＳＰを含む培養液中で２時間培養した。同様に、３５ｍｍガラスボトムディッシュに播種したＨｅＬａ細胞を０．０５ｍｇ／ｍｌのＴｆ修飾ＢＣＳＰと２ ｍｇ／ｍｌのｈｏｌｏ−Ｔｆを含む培養液中で培養した。
粒子暴露後、ＰＢＳで細胞を洗い、４％パラフォルムアルデヒトで室温において１０分間固定した。固定後、さらにＰＢＳで３回洗浄し、共焦点顕微鏡（A1Rsi; Nikon, Tokyo, Japan）を用いて観察を行った。
【００２４】
（透過型電子顕微鏡観察）
ＨｅＬａ細胞をあらかじめカーボンを蒸着したサファイアガラス（Matsunami Glass Ind., Ltd., Osaka, Japan）上に播種し、１２以時間上培養した。細胞がサファイアガラスに十分接着した後、０．０２５ｍｇ／ｍｌのＴｆ修飾ＢＣＳＰを含む培養液を与え2時間培養した。
粒子暴露後、ＨｅＬａ細胞を2%パラフォルムアルデヒド、１％グルタルアルデヒドを含むＲｉｎｇｅｒ緩衝液中で前固定し、その後１％四酸化オスミウムで後固定を行った。
【００２５】
次に、エタノールを用いて細胞を脱水し、エポキシ樹脂（Polysciences, Inc., Warrington, PA, USA）に包埋した。６０°Ｃで３０時間以上熱し、十分に硬化したサンプルをウルトラミクロトームを用いて７０ｎｍの厚さで薄切した。得られた切片を、フォルムバールを支持膜とした電顕用グリッドで回収し酢酸ウラン、クエン酸鉛により電子染色し、透過型電子顕微鏡（H-7600; Hitachi, Tokyo, Japan）で観察した。
【実施例】
【００２６】
以下、本発明を実施例および比較例に基づき、さらに詳細に説明する。なお、説明する実施例は理解を容易にするためのものであり、本願発明がこれに限定されるものではないことは言うまでもない。
【００２７】
（実施例１）
ＢＣＳＰは表面に官能基を持たず、そのままではＴｆ修飾を行えない。そこでまず始めに正電荷を持つポリペプチドであるポリリジン（ＰＬＬ）と負電荷を持ち、カルボキシル基に富むポリグルタミン酸（ＰＧＡ）により粒子表面を被覆した。ＰＧＡにより表面を被覆したＢＣＳＰの透過型電子顕微鏡像を図１に示す。ＰＧＡの層が形成され、粒子がＰＧＡにより覆われている様子がわかる。このＰＧＡ被覆ＢＣＳＰのカルボキシル基を架橋剤により活性化させ、Ｔｆを結合させた。
【００２８】
次に、Ｔｆ修飾ＢＣＳＰの腫瘍細胞選択性を評価した。Ｔｆ受容体が高発現しているＨｅＬａ細胞（上記非特許文献１４参照）とラット正常腎由来のＮＲＫ細胞に粒子を２時間暴露し、比較観察した。共焦点顕微鏡観察により得られた結果を図２に示す。
上段は代表的な光学切片像であり、中段は細胞表面から底面までの、maximum-intensity projectionである。また、下段は対応する光学顕微鏡像である。
【００２９】
図２（ａ−ｃ）はＴｆ修飾ＢＣＳＰを与えたＨｅＬａ細胞の共焦点顕微鏡像である。多数の粒子が細胞内に取り込まれていることがわかる。図２（ｄ−ｆ）は粒子に結合していないＴｆとＴｆ修飾ＢＣＳＰを同時にＨｅＬａ細胞に与えた結果である。過剰量Ｔｆにより競合阻害が起こり、粒子の取り込みが阻害された。つまりＴｆ修飾ＢＣＳＰはＴｆ受容体を介して細胞内に取り込まれることがわかった。これにより、表面修飾の効果が確認できる。
【００３０】
また、ａｌｂｕｍｉｎ修飾ＢＣＳＰを与えたＨｅＬａ細胞ではＴｆ修飾ＢＣＳＰに比べて取り込み量が著しくて低下していた（図２（ｇ−ｉ））。これにより、ａｌｂｕｍｉｎは、有効でないことが分かる。
そして、上記の一連の結果から、Ｔｆ修飾により、ＢＣＳＰが効率的にがん細胞に取り込まれることが示された。すなわち、これはＴｆ修飾の有効性を示すものである。
【００３１】
一方、ラット由来の正常細胞株であるＮＲＫ細胞ではＴｆ修飾ＢＣＳＰはほとんど細胞内に取り込まれず、細胞表面で凝集していた（図２（ｊ−ｌ））。これによって、Ｔｆ修飾ＢＣＳＰはＴｆ受容体が高発現している腫瘍細胞に選択的に取り込まれることが示された。これは、腫瘍細胞に対する選択性を意味するものである。
【００３２】
さらに、透過型電子顕微鏡によりＴｆ修飾ＢＣＳＰを暴露したＨｅＬａ細胞を観察した（図３）。２００ｎｍ以上のＴｆ修飾ＢＣＳＰはＨｅＬａ細胞に多数取り込まれ（ａ）、エンドソーム内（ｃ）や、核周辺（ｂ）に粒子が確認された。これは、細胞内核周辺に取り込まれていることの証拠と考えられる。
【００３３】
（実施例２）
（試験方法）
１）Ｈ４６０細胞（ヒト肺大細胞がん細胞）をマウス（６週齢）皮下に注射した（５×１０６ｃｅｌｌ／ｍｏｕｓｅ）。
２）５日後、Ｔｆ修飾ＢＣＳＰを尾静脈から投与した（４０ｍｇ／ｋｇ）。
３）二日後、腫瘍と肺（コントロール）を回収した。
４）回収したサンプルをそれぞれ２％グルタール、２％パラフォルムアルデヒドで３時間前固定した。
【００３４】
５）１％オスミウムで１時間後固定を行った。
６）エタノールの上昇系列により脱水した。
７）エポキシ樹脂に包埋し、ウルトラミクロトームで薄切した。
８）酢酸ウラン、クエン酸鉛により染色し、透過型電子顕微鏡で観察した。
【００３５】
（結果と観察）
尾静脈から投与されたＴｆ修飾ＢＣＳＰは腫瘍に到達し、腫瘍細胞に取り込まれていた。これらの粒子はin vitroでの結果と同様に、細胞内で膜に囲まれていた。つまり、エンドサイトーシスにより細胞内に取り込まれたことがわかった。
一方で、コントロールの肺細胞へのＴｆ修飾ＢＣＳＰの取り込みは観察されなかった。
【００３６】
この結果を図４に示す。図４はマウス腫瘍の透過型電子顕微鏡像である。左側のスケールは５００ｎｍであり、右側のスケールは２００ｎｍである。この図４から、尾静脈から投与されたＴｆ修飾ＢＣＳＰは腫瘍細胞に取り込まれているのが確認できる。
【産業上の利用可能性】
【００３７】
ホウ素中性子捕捉療法により効率良く腫瘍細胞を死滅させるためには、腫瘍細胞に特異的かつ、一定の量以上の１０Ｂの蓄積（１０９原子／細胞）が有効である。特に、ＢＣＳＰは多くの１０Ｂを含有し、直径２００ｎｍのＢＣＳＰ１２粒子でこの条件を達成することができ、上述のようにＢＣＳＰにＴｆ を修飾することにより、この粒子はがん細胞に選択的によく取り込まれ、１０９原子の１０Ｂを細胞内に届けることができる。本発明の粒子は、少ない個数で大量のホウ素原子を細胞中に導入出来るので、１０Ｂを２０％しか含まない安価な天然ホウ素で作製した場合の粒子でも、十分な治療効果が確保出来ることを確認している。これにより、製造コストの大幅な低減を図ることが可能である。
本願発明の粒径サイズ２００ｎｍ〜１０００ｎｍの無機粒子の表面をトランスフェリンで修飾した腫瘍細胞への選択的取り込み能を備えた粒子は、高効率ＢＮＣＴ用ホウ素含有薬剤、高効率ハイパーサーミア用磁性粒子薬剤、高性能光線力学治療用薬剤等の剤として有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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