(57)【要約】【課題】簡便で、汎用性が高く、少量の細胞でも多種の試験ができ、高効率の肝炎ウイルスの感染・増殖方法を提供する。【解決手段】ヒト初代肝細胞懸濁液と肝炎ウイルス含有液とを混合した混合液を振盪することにより前記ヒト初代肝細胞に前記肝炎ウイルスを感染させる工程と、細胞が接着する細胞接着領域がパターン状に規定された三次元培養基材に、ストローマ系のフィーダー細胞を播種し培養する工程と、このフィーダー細胞を播種し培養した三次元培養基材に、振盪した前記混合液を播種し培養する工程とを有する肝炎ウイルスの感染・増殖方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト初代肝細胞懸濁液と肝炎ウイルス含有液とを混合した混合液を振盪することにより前記ヒト初代肝細胞に前記肝炎ウイルスを感染させる工程と、
細胞が接着する細胞接着領域がパターン状に規定された三次元培養基材に、ストローマ系のフィーダー細胞を播種し培養する工程と、
このフィーダー細胞を播種し培養した三次元培養基材に、振盪した前記混合液を播種し培養する工程とを有することを特徴とする肝炎ウイルスの感染・増殖方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト初代肝細胞に肝炎ウイルスを感染させ、またヒト初代肝細胞内でこれらの肝炎ウイルスを増殖させる肝炎ウイルスの感染・増殖方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ウイルス性肝炎を誘発するＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）やＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）は、世界中でウイルス保有者が多く、肝がんなどの原因にもなる非常に重篤な疾病の原因となる。ＨＢＶでは薬剤耐性を示すウイルスが、ＨＣＶではインターフェロン投与に効果を持たない患者の存在がそれぞれ知られており、これらに効果の高い抗ウイルス薬の開発が期待されている。
【０００３】
これら新薬の開発の際には、例えば、チンパンジーやヒト肝細胞を移植したキメラマウスなどにこれらウイルスを感染させて、新薬候補化合物の評価が行われている。しかし、これらの動物は高価であることや多量の化合物を必要とすることから、汎用性に乏しく、また簡便な方法ではない。
【０００４】
チンパンジーやキメラマウス等を用いずに薬剤の評価ができる方法としては、ヒト肝由来細胞を用いた中空糸培養が開示されている（特許文献１参照）。特許文献１では、透過性を有する膜からなる中空糸の内腔に充填された細胞に、肝炎ウイルスを感染させて培養する工程を含む肝炎ウイルスの増殖方法や、細胞に肝炎ウイルスを感染させた後、透過性を有する膜からなる中空糸の内腔に当該細胞を充填して培養する工程を含む肝炎ウイルスの増殖方法が記載されている。しかしこの特許文献１の方法においては、振盪させながら培養を維持する必要があり装置上の制限があるため簡便な方法ではなく、また、中空糸を用いる必要があり中空糸のサイズによる要請から細胞を培養する領域の数が少ない１２ウェルプレートを用いる必要があるなど、少量の細胞で多種の試験を行うのが困難である。また、高い効率で肝炎ウイルスを感染・増殖できることも望まれる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第ＷＯ２００８／０３８６４１号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明はこのような事情に鑑み、簡便で、汎用性が高く、少量の細胞でも多種の試験ができ、高効率の肝炎ウイルスの感染・増殖方法を提供することを課題する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題を解決する本発明の態様は、ヒト初代肝細胞懸濁液と肝炎ウイルス含有液とを混合した混合液を振盪することにより前記ヒト初代肝細胞に前記肝炎ウイルスを感染させる工程と、細胞が接着する細胞接着領域がパターン状に規定された三次元培養基材に、ストローマ系のフィーダー細胞を播種し培養する工程と、このフィーダー細胞を播種し培養した三次元培養基材に、振盪した前記混合液を播種し培養する工程とを有することを特徴とする肝炎ウイルスの感染・増殖方法にある。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、ヒト初代肝細胞と肝炎ウイルスとを混合し振盪することによりヒト初代肝細胞に肝炎ウイルスを感染させた混合液を、細胞接着領域がパターン状に規定された三次元培養基材であってストローマ系のフィーダー細胞を培養した三次元培養基材上で培養するという簡便で汎用性が高い方法によって、肝炎ウイルスを感染・増殖することができる。そして、高効率で、例えば１桁以上さらには２桁以上、肝炎ウイルスを増殖することができる。さらに、この肝炎ウイルスの感染・増殖方法は、ヒト初代肝細胞を培養する培養基材として、細胞接着領域の面積が小さいものを用いることができ、多数の細胞接着領域がパターン状に規定された基材を用いることができるので、少量の細胞でも多種の試験（新薬候補等の化合物の肝炎ウイルスの増殖抑制効果を評価する試験）を行なうことができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】実施例及び比較例で用いた培養基材の要部拡大上面図及び断面図である。
【図２】実施例１の結果を示す図である。
【図３】実施例１の結果を示す図である。
【図４】実施例２の結果を示す図である。
【図５】実施例３の結果を示す図である。
【図６】実施例３の結果を示す図である。
【図７】実施例４の結果を示す図である。
【図８】実施例４の結果を示す図である。
【図９】比較例１の結果を示す図である。
【図１０】比較例２及び比較例３の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明の肝炎ウイルスの感染・増殖方法は、ヒト初代肝細胞懸濁液と肝炎ウイルス含有液とを混合した混合液を振盪することによりヒト初代肝細胞に肝炎ウイルスを感染させる工程と、細胞が接着する細胞接着領域がパターン状に規定された三次元培養基材に、ストローマ系のフィーダー細胞を播種し培養する工程と、このフィーダー細胞を播種し培養した三次元培養基材に、振盪した前記混合液を播種し培養する工程とを有する。
【００１１】
本発明で用いるヒト初代肝細胞懸濁液は、ヒト初代肝細胞を、市販の初代肝細胞用培地やリン酸緩衝液などの緩衝液等に懸濁させた懸濁液である。またヒト初代肝細胞としては、凍結・非凍結のいずれも使用することが可能である。ヒト初代肝細胞懸濁液の調製方法は特に制限は無く、公知の方法を用いて行うことができる。例えば、ヒトの肝臓検体からコラゲナーゼ灌流法によって得られた肝細胞を、市販の初代肝細胞用培地等に添加して所定濃度に調整することにより得られる。また、凍結保存液と共に凍結状態にされたヒト初代肝細胞を加温することにより凍結保存液を融解・除去後、市販のヒト初代肝細胞用培地等に添加して置換して、ヒト初代肝細胞を所定濃度、例えば、１×１０５〜１×１０６個／ｍＬに調整して用いることができる。
【００１２】
一方、肝炎ウイルス含有液も公知のものを用いることができる。例えば、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）やＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）等の肝炎ウイルスに感染したヒト患者由来の血清、ＨＢＶやＨＣＶ等の肝炎ウイルスに感染させたキメラマウス由来の血清や、培養細胞にＨＢＶやＨＣＶ等の肝炎ウイルス遺伝子を導入した後の培養上清などを用いることができる。
【００１３】
本発明の肝炎ウイルスの感染・増殖方法においては、まず、これらヒト初代肝細胞懸濁液と肝炎ウイルス含有液を混合する。これらヒト初代肝細胞懸濁液や肝炎ウイルス含有液は、所定の濃度に事前に調整し、任意の割合で混合することができる。例えば、初代ヒト肝細胞１個あたりの肝炎ウイルスのゲノム数を５〜１０とする（以下、初代ヒト肝細胞１個あたりの肝炎ウイルスのゲノム数をＭＯＧと記載し、例えば肝炎ウイルスのゲノム数が５の場合は「ＭＯＧ＝５」と表記する）ことができる。
【００１４】
そして、このヒト初代肝細胞懸濁液と肝炎ウイルス含有液とを混合して得た混合液を振盪する。例えば、混合液を公知の振盪機で振盪すればよく、振盪速度は例えば２０回転／分〜４０回転／分、好ましくは２５回転／分〜３０回転／分である。振盪時間は、ヒト初代肝細胞の機能低下が生じないことが好ましく、好ましくは１０分〜４時間、さらに好ましくは３０分〜２時間である。また、振盪温度は、１０℃〜４０℃が好ましく、さらに好ましくは３０℃〜３７℃である。また、ＣＯ２が１〜１０体積％で残りを大気とした環境下で行なうことが好ましい。例えば、所定の振盪温度及び所定のＣＯ２濃度に設定した培養機内に、振盪機を設置し、振盪すればよい。このような振盪操作を行うことにより、ヒト初代肝細胞と肝炎ウイルスが多く接触するためか、後述する実施例に示すように、非常に高い効率でヒト初代肝細胞に肝炎ウイルスを感染・増殖させることができる。
【００１５】
また、本発明の肝炎ウイルスの感染・増殖方法においては、細胞が接着する細胞接着領域がパターン状に規定された三次元培養基材に、ストローマ系のフィーダー細胞を播種し培養する工程を有する。
【００１６】
三次元培養基材は、細胞、具体的には、ヒト肝細胞やフィーダー細胞が接着できる領域である細胞接着領域がパターン状に規定されたものであれば特に限定されないが、好ましくは、ヒト肝細胞やフィーダー細胞が接着できる基材上に、親水性の高分子架橋体により細胞非接着領域が作成され、その細胞非接着領域の中に高分子架橋体が除去された部位である細胞接着領域が規定された基材であるのが望ましい。ここで、細胞非接着領域を規定する高分子架橋体は、好ましくは光架橋により架橋体とされたものである。
【００１７】
このような細胞非接着領域を規定する親水性の高分子は、特に限定されないが、好ましくはポリ酢酸ビニル鹸化物、ポリエチレングリコール又はポリヒドロキシエチル（メタ）アクリレートが挙げられる。この中で、ポリ酢酸ビニル鹸化物又はポリエチレングリコールがさらに好ましい。
【００１８】
このような親水性の高分子を架橋体にする光架橋は、感光基を活性化させる波長の紫外光等光を照射することで容易に進行する。その際、該光を遮蔽するパターン付きマスクなどを介することで、高分子架橋体のパターンを形成することが容易になるという利点を有する。架橋体を形成する光架橋反応は特に限定されないが、光重合開始剤を介した光重合系、スチルベンなどの光二量化反応又はアジド基の光開裂による架橋反応などが挙げられる。この中で、アジド基の光開裂反応を好適に用いることができる。
【００１９】
細胞非接着領域を規定する親水性の高分子が架橋された部位と、これら高分子が除去された細胞接着領域のパターン形状は、使用目的に合致すること以外特に限定されない。例えば、細胞接着領域は内径８０〜１５０μｍの円形ホール形状を有することが好ましい。また、細胞接着領域や細胞非接着領域のサイズの均一性についても特に制限はないが、ヒト初代肝細胞が多数凝集して三次元状態となって得られるスフェロイドの肝機能のばらつきを抑えるためには、サイズが均一になっていた方が好ましい。
【００２０】
本発明においては、細胞接着領域は少なくとも２個以上備わっていることが必要となる。２個以上の細胞接着領域を備えていれば、その個数に特に制限は無いが、例えば９６穴マルチウェルプレートを用いる場合各ウェルがそれぞれアレイ状に１００個以上の細胞接着領域を備えることが好ましい。このように、多数の細胞接着領域を有する三次元培養基材を用いることにより、複数のスフェロイドを高密度形成できるため、十分な肝炎ウイルスの感染、増殖を検出することが可能となり、また、多種の試験を行なうことができる。
【００２１】
このような高分子架橋体のパターンを形成する基材は、所望のヒト初代肝細胞やフィーダー細胞が接着することが可能であれば、特に限定は無いが、ガラス、組織培養用ポリスチレン、ポリエチレン又はポリプロピレンなどを用いることができる。特にガラス又は組織培養用ポリスチレンが好適に用いることができる。
【００２２】
これらの基材上に、細胞接着を促進する物質を固定してあってもよい。細胞接着を促進する物質としては、例えばコラーゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン又はポリ−Ｌ−リシンなどが挙げられる。
【００２３】
基材の形状についても特に限定は無いが、平板、シャーレ又は細胞培養用マルチウェルプレートなどを用いることができる。
【００２４】
このような三次元培養基材に、ストローマ系のフィーダー細胞を播種し培養する。なお、ストローマ系のフィーダー細胞は、肝炎ウイルスに感染したヒト初代肝細胞を三次元培養基材に播種する前に、あらかじめ播種する必要がある。ストローマ系のフィーダー細胞としては、血管内皮細胞や線維芽細胞の細胞株、これらの初代細胞等が挙げられる。例えば、マウス線維芽細胞株の３Ｔ３細胞に、１０％（Ｖ／Ｖ。すなわち１０体積％）牛胎児血清含有ダルベッコ変法イーグル培地等の培地を添加して作成したフィーダー細胞懸濁液を、三次元培養基材に播種し、培養する。
【００２５】
播種する際のフィーダー細胞懸濁液の濃度は、三次元培養基材の細胞接着領域においてフィーダー細胞がコンフルエントになる濃度が好ましい。増殖性を有するフィーダー細胞ではこれより１／８程度まで薄くしても特に支障は無い。またコンフルエント濃度より濃い場合であっても、接着できなかったフィーダー細胞が培地交換時に除去される限り特に支障は無い。しかし、そのような高濃度は、細胞が無駄になる点で避けた方がよい。
【００２６】
フィーダー細胞を播種した後、安定にフィーダー細胞が三次元培養基材に接着するまで、培地を用いて培養を行うことが必要となる。培養時間は、フィーダー細胞が沈降し三次元培養基材の細胞接着領域に接着することができれば特に限定は無いが、例えば、３時間以上４８時間以内、好ましくは２４時間以上４８時間以内である。なお、このフィーダー細胞の培養は、静置で行なうことができる。
【００２７】
フィーダー細胞を培養する培地は、細胞種により通常用いられる培地を用いればよい。例えば、血管内皮細胞又は線維芽細胞では、１０％（Ｖ／Ｖ）牛胎児血清含有ダルベッコ変法イーグル培地が好適に用いることができる。なお、上述したように、培地はフィーダー細胞に添加して懸濁液を作成しこれを三次元培養基材に播種してもよい。
【００２８】
このフィーダー細胞を播種し培養した三次元培養基材に、ヒト初代肝細胞懸濁液と肝炎ウイルス含有液とを混合した混合液を振盪したものを、播種し培養する。これにより、肝炎ウイルスに感染したヒト初代肝細胞を有するスフェロイドを形成することができる。
【００２９】
播種する際の振盪後のヒト初代肝細胞懸濁液と肝炎ウイルス含有液の混合液の濃度は、スフェロイドが形成される濃度であれば特に限定されないが、三次元培養基材の細胞接着領域の全面積がコンフルエントになる濃度から、その１０倍濃度が好ましい。例えば、細胞接着領域が、基材底面の２０％である三次元培養基材の場合、通常の基材のコンフルエント濃度の１／５程度の肝細胞を用いればよい。
【００３０】
振盪後のヒト初代肝細胞懸濁液と肝炎ウイルス含有液の混合液を三次元培養基材で培養する培養時間は、肝炎ウイルスの感染状態、あるいは肝炎ウイルスの増殖が起きていれば特に限定は無いが、例えば、１２時間以上８週間以内、好ましくは２４時間以上４週間以内である。なお、このヒト初代肝細胞の培養は、静置で行なうことができる。
【００３１】
肝炎ウイルスに感染したヒト初代肝細胞を培養する培地は、肝細胞培養期間、その機能を維持できれば特に制限無く市販培地を用いることができる。
【００３２】
このような、ヒト初代肝細胞懸濁液と肝炎ウイルス含有液を混合した後、一定時間振盪させ、これをストローマ系のフィーダー細胞上に播種し培養して、ヒト初代肝細胞スフェロイドを形成させる本発明の肝炎ウイルスの感染・増殖方法は、ヒトの生体内でのウイルスの生活環が、ヒト生体外で模倣できる新しい培養モデルである。そして、この肝炎ウイルス感染・増殖方法で培養されたヒト初代肝細胞では、肝炎ウイルスの感染・増殖が起こることから、この培養系に新薬候補等の化合物を暴露することで、この化合物の肝炎ウイルスの増殖抑制効果を評価できるという効果を奏する。
【００３３】
また、上記本発明の肝炎ウイルスの感染・増殖方法は、細胞接着領域がパターン状に規定された三次元培養基材にストローマ系のフィーダー細胞を培養し、この三次元培養基材で、ヒト初代肝細胞と肝炎ウイルスとを混合し振盪することによりヒト初代肝細胞に肝炎ウイルスを感染させた混合液を培養するものなので、簡便で、汎用性が高い方法である。そして、後述する実施例に示すように、高効率で、例えば１桁以上さらには２桁以上、肝炎ウイルスを増殖することができる。また、ヒト初代肝細胞を培養する培養基材として、細胞接着領域の面積が小さいものを用いることができ、多数の細胞接着領域がパターン状に規定された基材を用いることができるので、少量の細胞で、多種の試験、具体的には、新薬候補等の化合物の肝炎ウイルスの増殖抑制効果を判定する試験を行なうことができる。
【００３４】
ここで、これまで、ヒト初代肝細胞を用いた培養系で、簡便で汎用性の高い方法でウイルス感染・増殖を見ることができなかったのは、ヒト初代肝細胞などの培養そのものが難しく、肝機能が培養と共に急速に低下するためである。例えば、シャーレ等の単層で培養すると、体内との形状が著しく異なることもその原因として挙げられる。そこで、より肝機能を維持し、肝炎ウイルスの感染・増殖を成立させる培養系の試みとして、ヒト初代肝細胞を多数凝集させて三次元状態になるようにできる三次元培養法が考えられる。特許文献１の方法は、中空糸を用いた三次元培養法ともいえるため、単層培養よりは、ウイルスの感染・増殖を見ることができる。しかしながら、この特許文献１の方法においては、振盪させながら培養を維持する必要があり、装置上の制限があり簡便な方法ではない。また、中空糸のサイズによる要請から細胞を培養する領域の数が少ない１２ウェルプレートを用いる必要があるなど、少量の細胞で多種の試験を行うのが困難であった。そして、特許文献１の中空糸を用いる系は、本発明の感染・増殖方法とは全く異なるものであり、実際、特許文献１では、本発明のように、１桁以上、さらには２桁以上の向上は見られていない。
【００３５】
なお、新薬等の化合物の肝炎ウイルスの増殖抑制効果を判定する試験は、例えば、判定対象である新薬等の化合物を複数の濃度に調整した溶液を添加するいわゆる暴露試験にて行なう。具体的には、例えば、判定対象である新薬等の化合物を複数の濃度に調整した溶液を、振盪によりヒト初代肝細胞に肝炎ウイルスを感染させた混合液を三次元培養基材で培養中、または、培養後に、ヒト初代肝細胞や肝炎ウイルスに暴露すればよい。判定対象である新薬等の化合物の溶液は、水、緩衝液、培地や、これらとエチルアルコール、ジメチルスルホキシドなどの有機溶媒との混合溶媒を溶媒として用いることが好ましい。
【００３６】
新薬等の化合物を暴露する際は、それまで培養していた培地と置換して行う。その後所定時間新薬等の化合物の溶液を暴露し、上清と呼ばれる液分あるいは洗浄後の細胞を回収してサンプリングすることで、肝炎ウイルスのゲノム量を例えば定量ＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ）などを用いて定量することができる。新薬等の化合物を暴露する時間は、ヒト初代肝細胞が死滅する時間でなければ特に制限は無い。
【実施例】
【００３７】
以下、本発明について実施例に基づき説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。
（実施例１）ヒト肝スフェロイド培養によるＨＢＶの感染・増殖例  １
Ｃｅｌｌ−ａｂｌｅ  ２４ウェルプレート（トランスパレント社製）にマウス線維芽細胞株（３Ｔ３）を懸濁させた細胞懸濁液（培地：１０％（Ｖ／Ｖ）牛胎児血清含有ダルベッコ変法イーグル培地、細胞濃度：１×１０６個／ｍＬ）を各ウェルにそれぞれ５００μＬ添加し、３７℃に設定したＣＯ２インキュベーター（ＣＯ２濃度：５％）で、４８時間培養した。なお、Ｃｅｌｌ−ａｂｌｅ  ２４ウェルプレート（トランスパレント社製）は、細胞を接着する２４穴マルチウェルプレート１の各ウェル２の底面に、親水性高分子であるポリエチレングリコール誘導体を光架橋した高分子架橋体で細胞非接着領域３が作成され、この高分子架橋体（細胞非接着領域３）の一部を円形（ホール）に除去してマルチウェルプレートの各ウェル２の底面の一部を露出させることにより、ドット状のホールからなる細胞接着領域４を、各ウェルに４０００個ずつ形成したものである。なお、ホールからなる各細胞接着領域４は、内径１００μｍとなるように形成した。このＣｅｌｌ−ａｂｌｅ  ２４ウェルプレートの要部概念図を図１に示す。なお、図１（ａ）は上面図、図１（ｂ）は図１（ａ）のＡ−Ａ´断面図である。
【００３８】
凍結したヒト初代肝細胞（Ｘｅｎｏｔｅｃｈ社製  Ｌｏｔ：ＨＣ２−６  コラーゲンプレート非接着タイプ）を融解し、初代肝細胞用培地ＲＭ−１０１（トランスパレント社製）で希釈して、最終的に２×１０６個／ｍＬにヒト初代肝細胞濃度を調製することにより、ヒト初代肝細胞懸濁液を作成した。このヒト初代肝細胞懸濁液に、ＨＢＶがＭＯＧ＝１０になるように肝炎ウイルス含有液を加えた。ＭＯＧとは１細胞あたりに加えるウイルスゲノム量を示している。またこの時使用した肝炎ウイルス含有液は、ＨＢＶのＣ−ＡＴ株をＨｕＨ７／Ｋ４細胞にトランスフェクションし一過的に増幅された感染性ウイルス液である。このヒト初代肝細胞懸濁液に肝炎ウイルス含有液を加えた混合液を、初代肝細胞用培地ＲＭ−１０１（トランスパレント社製）で希釈して、ヒト初代肝細胞濃度が１×１０６個／ｍＬになるように調製後、３７℃、５％ＣＯ２、９５％大気環境下で１時間、２５回転／分で振盪させた。なお、振盪には、タイテック社製の振盪機  ＷＡＶＥ−ＰＲを用いた。その後、この振盪後の混合液のヒト初代肝細胞濃度を２.４×１０５個／ｍＬに調製し、３Ｔ３細胞播種及び培養済みの上記Ｃｅｌｌ−ａｂｌｅ  ２４ウェルプレートに５００μＬ／ｗｅｌｌで播種し、３７℃、５％ＣＯ２、９５％大気環境下で培養を行った。
【００３９】
そして、３Ｔ３細胞播種及び培養済みのＣｅｌｌ−ａｂｌｅ  ２４ウェルプレートに振盪後の混合液を播種した２日後、すなわち、ヒト初代肝細胞へのウイルス感染２日後に、４回洗浄を行った。以降２日毎に１回の頻度で半分量の培地の交換を行った。そして所定時間経過後、具体的には、３Ｔ３細胞播種及び培養済みのＣｅｌｌ−ａｂｌｅ  ２４ウェルプレートに振盪後の混合液を播種した２日後（ｄａｙ２）、４日後（ｄａｙ４）、６日後（ｄａｙ６）、８日後（ｄａｙ８）、１０日後（ｄａｙ１０）、１２日後（ｄａｙ１２）、１４日後（ｄａｙ１４）に、培養上清の一部を採取した。その後、スマイテストＥＸ−Ｒ＆Ｄ（特殊免疫化学研究所製  Ｃａｔ  Ｎｏ  ＧＳ−Ｊ０２０１）を用いて、採取した培養上清のＤＮＡを抽出し、ヒトゲノムＤＮＡに特異的なプライマーを用いＲｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ（装置名：ＰＲＩＳＭ７７００、アプライドバイオシステムズ社製）にて、培養上清中に存在するＨＢＶ  ＤＮＡの定量を行った。結果を図２に示す。また、上記の３Ｔ３細胞播種及び培養済みのＣｅｌｌ−ａｂｌｅ  ２４ウェルプレートに振盪後の混合液を播種した直後（ｄａｙ０）、２日後（ｄａｙ２）、４日後（ｄａｙ４）、６日後（ｄａｙ６）、８日後（ｄａｙ８）、１０日後（ｄａｙ１０）、１４日後（ｄａｙ１４）に、細胞の一部も採取した。その後、採取した細胞からＤＮＡを抽出し、細胞内（細胞中）に存在するＨＢＶ  ＤＮＡの定量を行った。結果を図３に示す。なお、この細胞からのＤＮＡの抽出は、上記培養上清に対する方法と同様に行った。また、細胞内に存在するＨＢＶ  ＤＮＡ量は、ヒトゲノムＤＮＡに特異的なプライマーを用いＲｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲを行って算出し、最終的にヒトＤＮＡ  １μｇ当たりに対してのＨＢＶ  ＤＮＡ存在量（図中「細胞内HBV DNA量 copies/ヒトDNA μg」と記載する）に直した。
【００４０】
この結果、培養上清中ＨＢＶ  ＤＮＡ量は、振盪後の混合液を播種した２日後から４日後まで２桁程度の増幅が確認された。また、細胞内ＨＢＶ  ＤＮＡ量は、０日後から２日後にかけて増幅が見られ、さらに８日後以降ではＨＢＶ  ＤＮＡ量は維持されている様子が認められた。
【００４１】
（実施例２）ヒト肝スフェロイド培養によるＨＢＶの感染・増殖例  ２
Ｃｅｌｌ−ａｂｌｅ  ９６ウェルプレート（トランスパレント社製）にマウス線維芽細胞株（３Ｔ３）を懸濁させた細胞懸濁液（培地：１０％（Ｖ／Ｖ）牛胎児血清含有ダルベッコ変法イーグル培地、細胞濃度：８×１０４個／ｍＬ）を各ウェルにそれぞれ１００μＬ添加し、３７℃に設定したＣＯ２インキュベーター（ＣＯ２濃度：５％）で、４８時間培養した。Ｃｅｌｌ−ａｂｌｅ  ９６ウェルプレート（トランスパレント社製）は、細胞を接着する２４穴マルチウェルプレート１の代わりに細胞を接着する９６穴マルチウェルプレートが用いられ、ドット状のホールからなり内径１００μｍの細胞接着領域４が各ウェルに８００個ずつ形成された以外は、実施例１のＣｅｌｌ−ａｂｌｅ  ２４ウェルプレートと同じ構成の三次元培養基材である。
【００４２】
凍結したヒト初代肝細胞（Ｘｅｎｏｔｅｃｈ社製  Ｌｏｔ：ＨＣ２−６  コラーゲンプレート非接着タイプ）を融解し、初代肝細胞用培地ＲＭ−１０１（トランスパレント社製）で希釈して、最終的に２×１０６個／ｍＬにヒト初代肝細胞濃度を調製することにより、ヒト初代肝細胞懸濁液を作成した。このヒト初代肝細胞懸濁液に、ＨＢＶがＭＯＧ＝１０になるように肝炎ウイルス含有液を加えた。ＭＯＧとは１細胞あたりに加えるウイルスゲノム量を示している。またこの時使用した肝炎ウイルス含有液は、ＨＢＶのＣ−ＡＴ株をＨｕＨ７／Ｋ４細胞にトランスフェクションし一過的に増幅された感染性ウイルス液である。このヒト初代肝細胞懸濁液に肝炎ウイルス含有液を加えた混合液を、初代肝細胞用培地ＲＭ−１０１（トランスパレント社製）で希釈して、ヒト初代肝細胞濃度が１×１０６個／ｍＬになるように調製後、３７℃、５％ＣＯ２、９５％大気環境下で１時間、２５回転／分で振盪させた。なお、振盪には、タイテック社製の振盪機  ＷＡＶＥ−ＰＲを用いた。その後、この振盪後の混合液のヒト初代肝細胞濃度を２×１０５個／ｍＬに調製し、３Ｔ３細胞播種及び培養済みの上記Ｃｅｌｌ−ａｂｌｅ  ９６ウェルプレートに２００μＬ／ｗｅｌｌで播種し、３７℃、５％ＣＯ２、９５％大気環境下で培養を行った。この培養後のヒト初代肝細胞及び３Ｔ３細胞を、界面活性剤を含む溶液で溶解し、ホモジナイズ後にウェスタンブロッティング（Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ；  ＷＢ）によりＨＢＶのタンパク質を検出した。３Ｔ３細胞播種及び培養済みのＣｅｌｌ−ａｂｌｅ  ９６ウェルプレートに振盪後の混合液を播種した直後（ｄａｙ０）、１日後（ｄａｙ１）、３日後（ｄａｙ３）、７日後（ｄａｙ７）のタンパク質検出結果を図４に示す。
【００４３】
この結果、図４に示すように、振盪後の混合液を播種した直後（０日後）から７日後にかけて検出されたＨＢＶのタンパク質量の増幅が認められた。
【００４４】
（実施例３）ヒト肝スフェロイド培養によるＨＢＶの感染・増殖例  ３
凍結したヒト初代肝細胞としてＬｏｔ：ＨＣ２−６の代わりにＨＣ５−２（Ｘｅｎｏｔｅｃｈ社製  コラーゲンプレート接着タイプ）を用いた以外は上記実施例１と同様の操作を行い、ＨＢＶ  ＤＮＡの定量を行った。培養上清中のＨＢＶ  ＤＮＡの定量結果を図５に、細胞内のＨＢＶ  ＤＮＡの定量結果を図６に示す。
【００４５】
この結果、実施例１と同様に、培養上清中ＨＢＶ  ＤＮＡ量は、振盪後の混合液を播種した２日後から４日後まで２桁程度の増幅が確認された。また、細胞内ＨＢＶ  ＤＮＡ量は、０日後から２日後にかけて増幅が見られた。
【００４６】
実施例２の結果から、振盪後の混合液を播種した直後（０日後）から７日後にかけてＨＢＶのタンパク質量が大きく増幅し、また、実施例１及び実施例３の結果から、培養上清中ＨＢＶ  ＤＮＡ量が２日後から４日後まで２桁程度増幅しており、且つ、０日後から２日後にかけて細胞内のＨＢＶ量が増幅していることから、本発明の肝炎ウイルスの感染・増殖方法では、様々な凍結肝細胞を用いて、ＨＢＶを高効率で感染・増殖させることができると言える。なお、図２〜３及び図５〜６において、日数が経過した時や途中で、ＨＢＶ  ＤＮＡ量が減少しているが、これは、ＨＢＶが感染・増殖していても通常生じる現象であり、タンパク質量の増幅、２日後から４日後までの培養上清中ＨＢＶ  ＤＮＡ量の２桁程度の増幅、及び、０日後から２日後にかけての細胞内のＨＢＶ量の増幅から判断すると、当然、本発明の肝炎ウイルスの感染・増殖方法では、ＨＢＶを高効率で感染・増殖させることができると言える。
【００４７】
（実施例４）ヒト肝スフェロイド培養によるＨＣＶの感染・増殖例  １
Ｃｅｌｌ−ａｂｌｅ  ９６ウェルプレート（トランスパレント社製）に、マウス線維芽細胞株（３Ｔ３）を懸濁させた細胞懸濁液（培地：１０％（Ｖ／Ｖ）牛胎児血清含有ダルベッコ変法イーグル培地、細胞濃度：８×１０４個／ｍＬ）を各ウェルにそれぞれ１００μＬ添加し、３７℃に設定したＣＯ２インキュベーター（ＣＯ２濃度：５％）で、４８時間培養した。
【００４８】
凍結したヒト初代肝細胞（Ｘｅｎｏｔｅｃｈ社製  Ｌｏｔ：ＨＣ２−６  コラーゲンプレート非接着タイプ）を融解し、初代肝細胞用培地ＲＭ−１０１で希釈して、最終的に２×１０６個／ｍＬにヒト初代肝細胞濃度を調製することにより、ヒト初代肝細胞懸濁液を作成した。このヒト初代肝細胞懸濁液にＨＣＶがＭＯＧ＝５になるように肝炎ウイルス含有液を加えた。この時使用した肝炎ウイルス含有液は、ＨＣＶのＪＦＨ−１株をＨｕＨ７／Ｋ４細胞にトランスフェクションし一過的に増幅された感染性ウイルス液である。このヒト初代肝細胞懸濁液に肝炎ウイルス含有液を加えた混合液を、初代肝細胞用培地ＲＭ−１０１で希釈して、ヒト初代肝細胞濃度が１×１０６個／ｍＬになるように調製後、３７℃、５％ＣＯ２、９５％大気環境下で１時間、３０回転／分で振盪させた。なお、振盪には、タイテック社製の振盪機  ＷＡＶＥ−ＰＲを用いた。その後、この振盪後の混合液を遠心分離操作を行なうことにより細胞を沈殿させ、ヒト初代肝細胞濃度を２×１０５個／ｍＬに調製し、３Ｔ３細胞播種及び培養済みの上記Ｃｅｌｌ−ａｂｌｅ  ９６ウェルプレートに２００μＬ／ｗｅｌｌで播種し、３７℃、５％ＣＯ２、９５％大気環境下でヒト初代肝細胞の培養を行った。
【００４９】
３Ｔ３細胞播種及び培養済みの上記Ｃｅｌｌ−ａｂｌｅ  ９６ウェルプレートに振盪後の混合液を播種した１日後、すなわち、ヒト初代肝細胞へのウイルス感染１日後に、培地の交換を１００μＬ／ｗｅｌｌで行った。以降２日毎に１回の頻度で培地交換を同様の操作により行った。そして所定時間経過後、具体的には、３Ｔ３細胞播種及び培養済みのＣｅｌｌ−ａｂｌｅ  ９６ウェルプレートに振盪後の混合液を播種した直後（ｄａｙ０）、３日後（ｄａｙ３）、５日後（ｄａｙ５）、７日後（ｄａｙ７）にそれぞれＨＣＶを感染させた細胞からＲＮＡを抽出し、Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲにて細胞内に存在するＨＣＶ  ＲＮＡの定量を行った。結果を図７に示す。なお、細胞内に存在するＨＣＶ  ＲＮＡ量は、ヒトＲＮＡに特異的なプライマーを用いＲｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲを行って算出し、最終的にヒトＲＮＡ  １μｇ当たりに対してのＨＣＶ  ＲＮＡ存在量（図中「細胞内HCV RNA量 copies/ヒト RNA  μg」と記載する）に直した。
【００５０】
また、３Ｔ３細胞播種及び培養済みのＣｅｌｌ−ａｂｌｅ  ９６ウェルプレートに振盪後の混合液を播種した３日後から５日後にかけて、抗ＨＣＶ薬として臨床適用されているインターフェロンαを、濃度０ＩＵ／ｍＬ、１ＩＵ／ｍＬ、１０ＩＵ／ｍＬ、及び、１００ＩＵ／ｍＬになるよう、それぞれ別個の細胞接着領域の培養上清中に加えた。このようにして、それぞれインターフェロンαの添加量を上記量にし、振盪後の混合液を播種してから５日間培養した細胞からＲＮＡを抽出し、Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲにて細胞内に存在するＨＣＶ  ＲＮＡの定量を行った。結果を図８に示す。細胞内に存在するＨＣＶ  ＲＮＡ量は、ヒトＲＮＡに特異的なプライマーを用いＲｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲを行って算出し、最終的にヒトＲＮＡ  １μｇ当たりに対してのＨＣＶ  ＲＮＡ存在量（図中「細胞内HCV DNA量 copies/ヒトDNA μg」と記載する）に直した。なお、上記と同様に、３Ｔ３細胞播種及び培養済みのＣｅｌｌ−ａｂｌｅ  ９６ウェルプレートに振盪後の混合液を播種した１日後、すなわち、ヒト初代肝細胞へのウイルス感染１日後に、培地の交換を１００μＬ／ｗｅｌｌで行い、以降２日毎に１回の頻度で培地交換を同様の操作により行った。インターフェロンα未添加のものであって振盪後の混合液を播種した直後（ｄａｙ０）の結果、インターフェロンα未添加のものであって振盪後の混合液を播種した３日後（ｄａｙ３）の結果、及び、インターフェロンα未添加（図においてＩＦＮ  ０ＩＵｍＬと記載する。）のものであって振盪後の混合液を播種した５日後（ｄａｙ５）の結果、インターフェロンαを１ＩＵ／ｍＬ添加したものであって振盪後の混合液を播種した５日後の結果、インターフェロンαを１０ＩＵ／ｍＬ添加したものであって振盪後の混合液を播種した５日後の結果、インターフェロンαを１００ＩＵ／ｍＬ添加したものであって振盪後の混合液を播種した５日後の結果を、順に図８の左側から記載する。
【００５１】
この結果、図７に示すように、ＨＣＶは本発明の感染・増殖方法により十分に感染していることが確認された。さらに振盪後の混合液を播種した３日後から５日後にかけて、２桁程度ＨＣＶのＲＮＡ量が増加しており、ＨＣＶの増殖が認められた。また、図８に示すように、インターフェロンα添加群は非添加群に比べ顕著にＨＣＶ  ＲＮＡが減少していた。これはインターフェロンαによる肝細胞からのＨＣＶ排除機構が惹起されていることを示唆している。また生体で当該現象が起こすインターフェロンα濃度に近い範囲でこの機構が発現していることも判明した。なお、図７及び図８において、直後（ｄａｙ０）よりも３日後のほうがＨＣＶ  ＲＮＡが減少しているが、これは、直後（ｄａｙ０）の測定においては、培地の交換が行われる前なので播種した全てのＨＣＶが検出されるため比較的高い値になるが、その後培地の交換を行う操作によって、細胞外のものが除去されるので、３日後以降では感染・増殖したもののみが検出されるためである。
【００５２】
（比較例１）
３Ｔ３細胞播種及び培養済みの上記Ｃｅｌｌ−ａｂｌｅ  ９６ウェルプレートのかわりに、コラーゲンがコートされた９６ウェルプレート（セルタイトＣ−１プレート９６Ｆ、住友ベークライト）に、振盪後の混合液を播種した以外は、実施例４と同様の操作を行った。結果を図９に示す。
【００５３】
この結果、細胞接着領域がパターン状に規定されていない単層培養においてＨＣＶ  ＲＮＡは系中に存在していることが確認された。しかしその後のＨＣＶ  ＲＮＡの増加はほとんど認められず、ＨＣＶ  ＲＮＡの増殖は認められなかった。また、インターフェロン添加群は非添加群に比べ１００ＩＵ／ｍＬ時に初めてＨＣＶ  ＲＮＡが減少していることが確認された。このことから、インターフェロンαによる肝細胞のＨＣＶ排除機構の惹起は、比較例１と比べて、実施例４ははるかに強いといえる。
【００５４】
（比較例２）
３７℃、５％ＣＯ２、９５％大気環境下で１時間、３０回転／分で振盪させる操作を行わなかった以外は、実施例４と同様の操作を行った。結果を図１０の「感染後培養  振盪無し」欄に示す。また、実施例４の結果も図１０に記載する。
【００５５】
（比較例３）
Ｃｅｌｌ−ａｂｌｅ  ９６ウェルプレート（トランスパレント社製）にマウス線維芽細胞株（３Ｔ３）を懸濁させた細胞懸濁液（培地：１０％（Ｖ／Ｖ）牛胎児血清含有ダルベッコ変法イーグル培地、細胞濃度：２×１０６個／ｍＬ）を各ウェルにそれぞれ１００μＬ添加し、３７℃に設定したＣＯ２インキュベーター（ＣＯ２濃度：５％）で、４８時間培養した。
【００５６】
凍結したヒト初代肝細胞（Ｘｅｎｏｔｅｃｈ社製  Ｌｏｔ：ＨＣ２−６  コラーゲンプレート非接着タイプ）を融解し、初代肝細胞用培地ＲＭ−１０１で希釈して、最終的に２×１０６個／ｍＬにヒト初代肝細胞濃度を調製することにより、ヒト初代肝細胞懸濁液を作成した。このヒト初代肝細胞懸濁液を、３Ｔ３細胞播種及び培養済みの上記Ｃｅｌｌ−ａｂｌｅ  ９６ウェルプレートに２００μＬ／ｗｅｌｌで播種し、３７℃、５％ＣＯ２、９５％大気環境下でヒト初代肝細胞の培養を行った。
【００５７】
この培養を行って１日後のヒト初代肝細胞に、ＨＣＶがＭＯＧ＝５になるように肝炎ウイルス含有液を加え、３７℃、５％ＣＯ２、残りを大気環境下で１時間静置して、ヒト初代肝細胞にＨＣＶを感染させた。この時使用した肝炎ウイルス含有液は、ＨＣＶのＪＦＨ−１株をＨｕＨ７／Ｋ４細胞にトランスフェクションし一過的に増幅された感染性ウイルス液である。
【００５８】
培養後のヒト初代肝細胞に肝炎ウイルス含有液を加えた１日後、すなわち、ヒト初代肝細胞へのウイルス感染１日後に、培地の交換を１００μＬ／ｗｅｌｌで行った。以降２日毎に１回の頻度で培地交換を同様の操作により行った。そして所定時間経過後、具体的には、ヒト初代肝細胞に肝炎ウイルス含有液を加えた直後（ｄａｙ０）、３日後（ｄａｙ３）、５日後（ｄａｙ５）、７日後（ｄａｙ７）にそれぞれＨＣＶを感染させた細胞からＲＮＡを抽出し、Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲにて細胞内に存在するＨＣＶ  ＲＮＡの定量を行った。細胞内に存在するＨＣＶ  ＲＮＡ量は、ヒトＲＮＡに特異的なプライマーを用いＲｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲを行って算出し、最終的にヒトＲＮＡ  １μｇ当たりに対してのＨＣＶ  ＲＮＡ存在量に直した。結果を図１０の「培養１日後感染  振盪無し」欄に示す。
【００５９】
これらの結果、ウイルス感染時に振盪しない比較例２では増殖が小さく、肝細胞を培養した後に肝炎ウイルスに感染させた比較例３では感染が成立しておらず、比較例２及び比較例３と比べて、本発明の感染・増殖方法である実施例４ではウイルスの増殖が高効率で行なわれており、２桁以上向上していた。したがって、本発明の感染・増殖方法では、低濃度でも、十分新薬のウイルス増殖抑制効果を評価できるといえる。
【符号の説明】
【００６０】
１  マルチウェルプレート
２  ウェル
３  細胞非接着領域
４  細胞接着領域
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図４】
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