(57)【要約】【課題】  穏やか且つ短い時間で、細胞から核酸を分離する方法を提供する。【解決手段】  実施形態の細胞を破砕する方法は、細胞を含む試料とカオトロピック塩とを含む液体混合物を加熱することを含む。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞を含む試料とカオトロピック塩とを含む液体混合物を加熱すること；および
前記液体混合物中の核酸を核酸吸着性ビーズに接触させ、前記核酸を前記核酸吸着性ビーズに付着させて分離すること；
を含む、細胞の核酸を分離する方法。
【請求項２】
前記加熱が、前記試料と前記カオトロピック塩との液体混合物に対して行われ、加熱の後に前記混合物に対して核酸吸着性ビーズが添加される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記加熱が、前記試料と、前記カオトロピック塩と、前記核酸吸着性ビーズとの混合物に対して行われる請求項１に記載の方法。
【請求項４】
更に、前記核酸が吸着した前記核酸吸着性ビーズを回収することを含む請求項１〜３の何れか１項に記載の方法。
【請求項５】
更に、前記核酸が吸着した核酸吸着性ビーズをアルコールにより洗浄することを含む請求項１〜４の何れか１項に記載の方法。
【請求項６】
更に、アルコールにより洗浄された前記核酸が吸着した核酸吸着性ビーズから、核酸を抽出することを含む請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞が、単細胞生物である請求項１〜６の何れか1項に記載の方法。
【請求項８】
前記単細胞生物が、ウイルスおよび／または細菌である請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記細菌が、藻類、グラム陽性菌、グラム陰性菌および真菌から選択される少なくとも１種類である請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記カオトロピック塩が、タンパク変性剤である請求項１〜９の何れか1項に記載の方法。
【請求項１１】
前記カオトロピック塩が、尿素またはグアニジウムイオンとその対イオンとの塩である請求項１〜９の何れか1項に記載の方法。
【請求項１２】
前記カオトロピック塩が、グアニジン塩酸塩またはグアニジンチオシアン酸塩である請求項１〜９の何れか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記核酸吸着性ビーズが、シリカコーティングされた磁性ビーズである請求項１〜１２の何れか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記アルコールにより洗浄することが、２−イソプロピロアルコールおよびエタノールをそれぞれ用いて少なくとも１回行われる請求項５〜１３の何れか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記洗浄に使用される２−イソプロピロアルコールおよびエタノールの濃度が、９９％である請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記アルコールにより洗浄することが、２−イソプロピロアルコールおよびエタノールの混合物を用いて少なくとも１回行われる請求項５〜１３の何れか１項に記載の方法。
【請求項１７】
アルコールにより洗浄されたビーズからの核酸の抽出が、トリス塩酸液により行われる請求項６〜１５の何れか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記加熱が６０℃〜９５℃で１〜１０分間に亘り行われる請求項１〜１７の何れか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記加熱が７０℃〜８５℃で１〜５分間に亘り行われる請求項１〜１７の何れか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記加熱が８０℃〜８５℃で１〜５分間に亘り行われる請求項１〜１７の何れか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記液体混合物が、更に緩衝剤を含む請求項１〜２０の何れか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記液体混合物が、更に界面活性剤および／または両面活性剤を含む請求項１〜２１の何れか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記加熱することが、撹拌しながら行われる請求項１〜２２の何れか１項に記載の方法。
【請求項２４】
試料が、糞便、血液、乳および肉から選択される少なくとも１種類を含む請求項１〜２３の何れか１項に記載の方法。
【請求項２５】
細胞を含有する試料を、カオトロピック塩および磁性ビーズを含む水中に混合して液体混合物を準備すること；
前記液体混合物を加熱すること；
前記磁性ビーズを含む混合液の液体成分を除去すること；
前記磁性ビーズを２−イソプロピロアルコールおよびエタノールで少なくとも１回ずつ洗浄すること；および
前記磁性ビーズにトリス塩酸液を加えて核酸を抽出すること；
を含む、細胞の核酸を分離する方法。
【請求項２６】
細胞を含む試料とカオトロピック塩とを含む液体混合物を加熱することを特徴とする細胞を破砕する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の実施形態は、細胞を破砕する方法および細胞の核酸を分離する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞などの核酸を有する試料から核酸を分離しようとする場合、まず、細胞が破砕され、その後、核酸が抽出される。
【０００３】
現在では、細胞を破砕するために、例えば、次のような方法が一般的に使用されている。それは、核酸を含む細胞をビーティング処理若しくは超音波処理する方法、または核酸を含む細胞を酵素によって破砕する方法である。
【０００４】
ビーティング処理や超音波処理は、比較的激しい方法であるため、処理対象である試料を含む容器や装置に対する負担が大きい。他方、酵素処理による細胞の破砕には比較的長い時間を要する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明が解決しようとする課題は、従来よりも穏やか且つ短い時間で、細胞を破砕および細胞の核酸を分離する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
実施形態の細胞を破砕する方法は、細胞を含む試料とカオトロピック塩とを含む液体混合物を加熱することを含む。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】実施形態に係る反応デバイスを示す図。
【図２】グラム陽性菌とグラム陰性菌を破砕した結果を示すグラフ。
【図３】磁性ビーズの影響を検討した結果を示すグラフ。
【図４】実施例４と比較例２により得られた結果を示すグラフ。
【図５】加熱時間の影響について示すグラフ。
【図６】例８の方法のプロトコルを示す図。
【図７】ビーズ量の違いによる影響を示すグラフ。
【図８】疑似感染乳中の異なる菌腫について核酸を分離した結果を示すグラフ。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
以下、本発明の実施の形態について、詳細に説明する。
【０００９】
第１の実施形態は、細胞を破砕する方法を提供する。
【００１０】
実施形態の細胞を破砕する方法は、細胞を含む試料とカオトロピック塩とを含む液体混合物を加熱することを含む。
【００１１】
液体混合物中で、カオトロピック塩の存在する条件で細胞を加熱することによって、細胞の細胞膜および（存在する場合には）細胞壁が破砕される。
【００１２】
この方法により破砕される細胞は、それ自身公知の何れの生物に由来する細胞であってもよい。生物に由来する細胞とは、単離された細胞であってもよく、複数の細胞からなる細胞群であってもよい。処理される細胞は、数個の細胞を含む塊であってもよく、個々の細胞であってもよいが、個々の細胞が好ましい。細胞の種類は、例えば、動物細胞または植物細胞であってよい。動物の例は、例えば、ヒト、ブタおよびラットなどの哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類、昆虫および魚類などであってよい。また、処理される細胞は、単細胞動物および単細胞植物などであってもよく、それらは例えば、ウイルスおよび細菌などであってよい。細菌の例は、藻類、グラム陽性菌、グラム陰性菌および真菌などであってもよい。
【００１３】
試料は、細胞を含む液体であればよい。例えば、試料は細胞を培養して得た培養液であってもよく、単離された細胞を含む液体であってもよい。
【００１４】
或いは、試料は、細胞が存在し得る物質、例えば、糞便および尿などの排泄物、血液、唾液、涙、鼻汁、乳、リンパ液などの体液、並びに組織および細胞などの生物由来の物質、土壌、湖水、海水および雨水など環境由来の物質を含んでよい。
【００１５】
例えば、試料が、培養液、血液および尿などのような液体である場合、採取された液体試料を前処理することなく、この分離方法に供してもよい。また、糞便などのように固体に含まれる細胞の核酸を分離する場合には、予め糞便などの分散可能な固体を緩衝液に加えることにより試料を準備すればよい。
【００１６】
また、組織などの塊の場合には、塊をミンスおよび／またはホモジナイズなどの均一化手段によって前処理した後に、緩衝液に加えることにより試料が準備されてもよい。また、血液などの液体が試料として用いられる場合にも、予め緩衝剤が添加されていてもよい。
【００１７】
緩衝液は、例えば、トリス−塩酸塩、四ホウ酸ナトリウム−塩酸、リン酸二水素カリウム−四ホウ酸ナトリウム緩衝液等の緩衝液でよい。緩衝液のｐＨ値は、７．０〜１３．０、好ましくは７．０〜９．０であってよい。緩衝剤を添加された加熱前の液体混合物のｐＨ値は、７．０〜１３．０、好ましくは７．０〜９．０であってよい。
【００１８】
カオトロピック塩は、タンパク変性剤として働き、核酸と共に試料に含まれるタンパク質を変性する物質である。カオトロピック塩の例は、尿素とその対イオンからなる塩、グアニジウムイオンとその対イオンからなる塩などであってよく、例えば、グアニジン塩酸塩またはグアニジンチオシアン酸塩に代表されるグアニジムイオンを含む溶液、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウムおよび尿素、並びにそれらの組み合わせなどが挙げられる。
【００１９】
カオトロピック塩の濃度は、加熱する液体混合物の最終濃度で１０重量％〜９５重量％、好ましくは５０重量％〜９５重量％、より好ましくは８０重量％〜９５重量％であってよい。
【００２０】
細胞を含む試料とカオトロピック塩とを含む混合物を加熱することは、８０℃近辺で１分間〜１０分間行われればよい。例えば、加熱は、下限が６０℃以上、７０℃以上、８０℃以上、８１℃以上、８２℃以上、８３℃以上、８４℃以上または８５℃以上で、上限が９５℃以下、９４℃以下、９３℃以下、９２℃以下、９１℃以下、９０℃以下、８９℃以下、８８℃以下、８７℃以下、８６℃以下の範囲で行われてもよく、これらの何れかの下限値と上限値を組み合わせた範囲でおこなわれてもよい。また例えば、加熱は、下限が１分間以上、２分間以上、３分間以上、４分間以上、５分間以上、上限が１０分間以下、９分間以下、８分間以下、７分間以下、６分間以下の範囲で行われてもよく、これらの何れかの下限値と上限値を組み合わせた範囲で行われてもよい。例えば、加熱は、６０℃〜９０℃で１分間〜１０分間、７０℃〜８５℃で１〜５分間、８０℃〜８５℃で１〜５分間に亘り行われればよい。
【００２１】
第２の実施形態〜第５の実施形態は、細胞の核酸を分離する方法を提供する。この細胞の核酸を分離する方法は、第１の実施形態として上述された細胞を破砕する方法を含み、それを使用する方法である。
【００２２】
実施形態の細胞の核酸を分離する方法は、細胞を含む試料とカオトロピック塩とを含む液体混合物を加熱すること、および前記液体混合物中の核酸を核酸吸着性ビーズに接触させて、前記核酸を前記核酸吸着性ビーズに付着させて分離することを含む。
【００２３】
液体混合物中で、カオトロピック塩の存在する条件で細胞を加熱することによって、細胞の細胞膜および（存在する場合には）細胞壁が破砕される。それにより細胞は溶解し、細胞に含まれる核酸が溶出される。細胞から溶出された核酸は、捕捉体としての核酸吸着性ビーズに吸着され、捕捉される。これらの工程を含む方法によって、細胞の核酸を容易且つ短時間に分離することが可能になる。
【００２４】
言い換えれば、この方法は、細胞を溶解するための第１の工程と、細胞から溶出された核酸を捕捉体により捕捉する第２の工程とを含む。第１の実施形態では、核酸を捕捉することにより細胞を含む試料から、核酸を分離することが達成される。
【００２５】
細胞の核酸を分離する方法は、細胞を溶解するための第１の工程と、細胞から溶出された核酸を捕捉体により捕捉する第２の工程とを含む。第１の工程は、細胞を含む試料とカオトロピック塩とを含む液体混合物を加熱することにより行われる。第２の工程は、前記液体混合物中の核酸を核酸吸着性ビーズに接触させて、前記核酸を前記核酸吸着性ビーズに付着させて分離することにより行われる。
【００２６】
このように第２の実施形態は、細胞を含む試料とカオトロピック塩とを含む液体混合物を加熱する第１の工程と、液体混合物中の核酸を核酸吸着性ビーズに接触させて、前記核酸を前記核酸吸着性ビーズに付着させて分離する第２の工程を含む。
【００２７】
ここで、第１の工程と第２の工程は、この順番で順次行われてもよい。この場合、細胞を含む試料とカオトロピック塩とを含む液体混合物が準備され、この液体混合物が加熱される。その後、加熱された液体混合物に核酸吸着性ビーズが添加され、核酸が吸着される。或いは、第１の工程と第２の工程が同時期に行われてもよい。この場合、細胞を含む試料とカオトロピック塩と核酸吸着性ビーズとを含む液体混合物が準備され、この液体混合物が加熱されればよい。
【００２８】
この方法により分離される核酸は、細胞の核酸、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡであってよい。細胞の例は、上述した通りであるが、例えば、ウイルスおよび細菌などであってよい。細菌の例は、藻類、グラム陽性菌、グラム陰性菌および真菌などであってよい。
【００２９】
試料およびカオトロピック塩については、上述した通りである。
【００３０】
核酸吸着性ビーズは、その表面に核酸を吸着するビーズであればよい。核酸吸着性ビーズは、例えば、シリカビーズまたはシリカコーティングされたビーズであってもよい。核酸吸着性ビーズは、好ましくはシリカコーティングされた磁性ビーズであってよい。
【００３１】
核酸吸着性ビーズの大きさは、平均径が０．１〜２０μｍであってよい。核酸吸着性ビーズの量は、加熱される液体混合物の１ｍＬ当たり、０．０５ｍｇ〜１００ｍｇ、好ましくは５ｍｇ〜５０ｍｇ、より好ましくは５ｍｇ〜２５ｍｇであってよい。
【００３２】
細胞を含む試料とカオトロピック塩とを含む混合物を加熱することは、８０℃近辺で１分間〜１０分間、好ましくは５分間程度行われればよい。例えば、加熱温度は、下限が６０℃以上、７０℃以上、８０℃以上、８１℃以上、８２℃以上、８３℃以上、８４℃以上または８５℃以上、上限が９０℃以下、８９℃以下、８８℃以下、８７℃以下、８６℃以下の範囲であってもよく、これらの何れかの下限値と上限値を組み合わせた範囲であってもよい。また例えば、加熱時間は、下限が１分間以上、２分間以上、３分間以上、４分間以上、５分間以上、上限が１０分間以下、９分間以下、８分間以下、７分間以下、６分間以下の範囲であってもよく、これらの何れかの下限値と上限値を組み合わせた範囲であってもよい。例えば、加熱は、６０℃〜９０℃で１分間〜１０分間、７０℃〜８５℃で１〜５分間、８０℃〜８５℃で１〜５分間に亘り行われればよい。
【００３３】
当該加熱の際に、核酸吸着性ビーズが存在してもよく、存在しなくともよい。即ち、核酸吸着性ビーズは、試料とカオトロピック塩を含む混合物に、加熱前に添加されてもよい。または、核酸吸着性ビーズは、加熱の後に前記混合物に対して添加されてもよい。
【００３４】
また当該加熱の際に、液体混合液が撹拌されてもよい。撹拌するための方法は、それ自体公知の何れかの撹拌手段を利用すればよく、例えば、超音波、水晶振動子などによりおこなってもよい。
【００３５】
更に、液体混合物中に、界面活性剤、例えば、ＳＤＳなどの陰性界面活性剤、ベタインなどの両面活性剤、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、ジデシルジメチルアンモニウム塩などの陽性界面活性剤が存在してもよい。これらの界面活性剤は、加熱されるべき液体混合物に対して最終濃度１重量％〜３０重量％、好ましくは１重量％〜２０重量％、より好ましくは１重量％〜１０重量％で添加されてよい。
【００３６】
第１の工程および第２の工程は、液体を維持し、加熱することができる反応具上または反応具中で行われればよい。例えば、反応具は、容器形状または板形状であってもよい。そのような反応具は、例えば、ガラス、樹脂、金属およびその組み合わせから形成または構成されればよい。反応具の例は、マイクロチューブ、試験管、ビーカーおよびウェルプレートなどの容器、並びに流路または凹部などの反応部を具備するデバイスなどであってよい。
【００３７】
核酸を吸着させた後に、核酸吸着性ビーズを液体混合物から回収してもよい。回収の方法は、磁性ビーズの場合には、磁気を利用して回収すればよく、他のビーズの場合には、遠心および／または濾過により回収すればよい。
【００３８】
実施形態に係る方法は、ビーティング処理や超音波処理を含む従来に比べて穏やかな条件で行うことが可能である。従って、当該方法が行われるべき反応具への負荷が小さい。
【００３９】
更に、このような第２の実施形態に係る細胞の核酸を分離する方法は、以下のような更なる工程を含む方法として提供されてもよい。
【００４０】
第３の実施形態は、第１の工程および第２の工程に加えて、更に捕捉分離された核酸を洗浄する第３の工程を含む。第３の実施形態により、捕捉された核酸から、例えば、タンパク質や脂質などの他の成分が除去される。第３の実施形態により、より精製された状態で、細胞を含む試料から核酸を分離することが達成される。
【００４１】
核酸を吸着している核酸吸着性ビーズの洗浄は、例えば、核酸吸着性ビーズをアルコールと接触した後にアルコールを除去することにより行われればよい。例えば、核酸吸着性ビーズが含まれる液体混合物の液体部分を除去した後にアルコールを加え、そのアルコールを除去することにより行われればよい。
【００４２】
洗浄のためのアルコールは、例えば、メタノール、エタノール、イソプロパノール又はｎ−プロパノールおよびそれらの組み合わせなどであればよい。洗浄ためのアルコールは、好ましくは２−イソプロピロアルコールおよびエタノール、または２−イソプロピロアルコールとエタノールとの混合物である。これらのアルコールによる洗浄によって、タンパク質やその他の成分を除去することが可能である。
【００４３】
洗浄は、少なくとも１回行われればよく、好ましくは２−イソプロピロアルコールおよびエタノールで少なくともそれぞれ１回ずつ、または２−イソプロピロアルコールとエタノールとの混合物で少なくとも１回洗浄されればよい。
【００４４】
また、洗浄時のアルコールにカオトロピック塩が存在してもよい。その場合、使用されるアルコールにカオトロピック塩が溶解されればよい。その場合のカオトロピック塩の濃度は、洗浄に用いるアルコールの１０重量％〜５０重量％、好ましくは１０重量％〜３０重量％、より好ましくは１５重量％〜２５重量％であってよい。
【００４５】
第３の工程は、第１および第２の工程を行った反応具において、第１および第２の工程に続けて行われてもよく、第１および第２の工程を行った反応具とは異なる反応具において行われてもよい。
【００４６】
第４の実施形態は、第１の工程、第２の工程および第３の工程に加えて、更に捕捉され精製された核酸を抽出する第４の工程を含む。第４の実施形態により、精製され、捕捉体から抽出された状態で、細胞を含む試料から核酸を分離することが達成される。
【００４７】
核酸吸着性ビーズに吸着された核酸が抽出されてもよい。核酸吸着性ビーズに吸着された核酸の抽出は、それ自身公知の何れかの方法により行われればよい。例えば、抽出は、トリス塩酸液、ＴＥおよび／または純水を用いて行われてよいが、好ましくはＴＥが使用される。
【００４８】
第４の工程は、第３の工程を行った反応具において、第３の工程に続けて行われてもよく、第３の工程を行った反応具とは異なる反応具において行われてもよい。
【００４９】
第５の実施形態は、第１の工程、第２の工程、第３の工程に加えて、更に精製され抽出された核酸を乾燥する第５の工程を含む。第５の実施形態により、精製され抽出され乾燥された状態で、細胞を含む試料から核酸を分離することが達成される。
【００５０】
乾燥は、抽出液を乾燥するための条件で行えばよい。乾燥の温度は、例えば、５０℃〜９０℃、６０℃〜８５℃、６０℃〜７０℃で行えばよい。乾燥時間は、例えば、１分間〜１０分間、１分間〜５分間、１分間〜３分間に亘り行えばよいが。しかしながら、乾燥が省略されてもよい。
【００５１】
第５の工程は、第４の工程を行った反応具において、第４の工程に続けて行われてもよく、第４の工程を行った反応具とは異なる反応具において行われてもよい。
【００５２】
上述の第１〜第５の実施形態によって、短時間且つ簡便に分離された細胞の核酸は、効率よく分離されているため、分離された核酸が、続けて更に伸長、増幅および／またはハイブリダイズ反応などの核酸反応に供されてもよい。そのような方法が第６の実施形態として提供される。それにより、核酸の分離および抽出から、核酸の増幅および検出までを連続して、短時間且つ容易に行うことが可能になる。
【００５３】
例えば、細胞の核酸を分離する方法は、次のように行われてもよい。これは、糞便に含まれるウイルスの核酸を分離する方法の１例である。
【００５４】
試験管中で、カオトロピック塩を含む緩衝液に対して、試料である糞便を混合する。得られた混合液を加熱する。次に、加熱された混合液に磁性ビーズを添加して、磁性ビーズに対して試料に由来する核酸を吸着させる。試験管の外側から磁石を当てることによって磁性ビーズを試験管に留めながら、試験管中の液体を捨てる。その後、磁石を試験管から外した状態で、２−イソプロピロアルコールを試験管に加える。試験管の外側から磁石を当てることにより磁性ビーズを試験管に留めながら、試験管中の液体を捨てる。これにより２−イソプロピロアルコールによって核酸が吸着した磁性ビーズが洗浄される。次に、同様にしてエタノールにより核酸が吸着した磁性ビーズを洗浄する。磁石により磁性ビーズを試験管中に維持したままで、試験管内のエタノールを捨てる。試験管にトリス塩酸液を加えて撹拌し、磁性ビーズに吸着していた核酸を抽出する。試験管を遠心し、上清を採取する。このようにして、糞便中のウイルス由来の核酸が分離される。
【００５５】
更に、試験管を遠心して得られた上清をそれぞれの核酸増幅反応用のチューブに対してそれぞれ添加する。そこにプライマーセットおよびポリメラーゼを添加する。その後、核酸増幅条件下で増幅反応を行う。それにより、ウイルスの核酸の核酸が増幅される。
【００５６】
或いは、例えば細胞の核酸を分離する方法は、次のように行われてもよい。これは、血液に含まれるグラム陽性菌の核酸を分離する方法の１例である。
【００５７】
家畜から採取された血液を試験管に入れる。この試験管に対して、カオトロピック塩、緩衝剤および磁性ビーズを添加して混合する。得られた混合液を撹拌しながら加熱する。これにより、血液中のグラム陽性菌は破砕され、核酸が試験管中に放出され、更に磁性ビーズに吸着される。試験管の外側から磁石を当てることによって磁性ビーズを試験管に留めながら、試験管中の液体を捨てる。その後、磁石を試験管から外した状態で、エタノールを試験管に加える。試験管の外側から磁石を当てることにより磁性ビーズを試験管に留めながら、試験管中の液体を捨てる。これによりエタノールによって核酸が吸着した磁性ビーズが洗浄される。次に、同様にして２−イソプロピロアルコールにより核酸が吸着した磁性ビーズを洗浄する。磁石により磁性ビーズを試験管中に維持したままで、試験管内の２−イソプロピロアルコールを捨てる。次に、試験管にトリス塩酸液を加えて撹拌し、磁性ビーズに吸着していた核酸を抽出する。試験管を遠心し、上清を採取する。このようにして、血液中のグラム陽性菌の核酸が分離される。
【００５８】
更に、試験管を遠心して得られた上清をそれぞれの核酸増幅反応用のチューブに対してそれぞれ添加する。そこにプライマーセットおよびポリメラーゼを添加する。その後、核酸増幅条件下で増幅反応を行う。それにより、グラム陽性菌の核酸が増幅される。
【００５９】
以上のような実施形態により、試料に特に複雑な工程を介さずに、効率良く所望の核酸を抽出することができる。また、従来の方法に比べて穏やか且つ短い時間で細胞から核酸を分離することが可能である。
【００６０】
上記の第１の実施形態〜第６の実施形態は、閉鎖空間を反応部として具備する反応具において行われてもよい。
【００６１】
そのような反応具の１例として図１（ａ）および（ｂ）に反応デバイス１の略図を示す。図１（ａ）は反応デバイス１の平面図であり、図１（ｂ）は反応デバイス１の線Ｂ−Ｂに沿った断面図である。反応デバイス１は、第１のシリコン基板２の１つの面に凹部３を有する。第１のシリコン基板２の凹部３が配置された面に第２のシリコン基板４が密着される。第１のシリコン基板２の凹部３と、第２のシリコン基板４の面とにより流路５が規定される。流路５は中空であり、そこにおいて実施形態に従う方法が行われる。また、流路は閉鎖空間であり、流路の一端に注入口が設けられ、注入口から液体が注入される。
【００６２】
更に図１（ｃ）に更なる反応デバイス１０の例を示す。反応デバイス１０は、直線上に連通した注入口１１、流路１２、加熱および磁性ビーズ吸脱着部１３、第１のバルブ部１４および回収口１５と、更に加熱および磁性ビーズ吸脱着部１３から伸び、互いに連通する第２のバルブ部１６および廃液部１７を含む。
【００６３】
反応デバイス１０を用いて、実施形態に従う細胞の核酸を分離する方法を行う例を以下に説明する。まず、注入口１１から試料を１００μＬ添加する。添加された試料は、流路１２を通り、加熱および磁性ビーズ吸脱着部１３に送られる。図示されていないが、加熱および磁性ビーズ吸脱着部１３には、添加口が存在し、この添加口を介して外部から加熱および磁性ビーズ吸脱着部１３内部に、更なる液体および／または固体などの更なる物質が添加される。加熱および磁性ビーズ吸脱着部１３において、試料は、図示されていない添加部より添加された５Ｍのグアニジン塩溶液１００μＬと磁性ビーズ５μＬと混和される。次に加熱および磁性ビーズ吸脱着部１３において８５℃で１分間加熱される。この加熱中に核酸が磁性ビーズに吸着される。次に、磁性ビーズを加熱および磁性ビーズ吸脱着部１３の外側に配置された磁性体により吸着する。次に、注入口１１から３００μＬのＩＰＡ（２−イソプロピロアルコール）を送液する。これにより、磁性ビーズを残して液体混合物は流路１２を通り、更に、開放された第２のバルブ１６を通って廃液部１７に押し出される。このとき第１のバルブ１４は閉鎖されている。更に、ＩＰＡが流入口１１からに加熱および磁性ビーズ吸脱着部１３に送液される。ここで外側に配置された磁性体の吸着が開放される。加熱および磁性ビーズ吸脱着部１３ではＩＰＡと磁性ビーズとの撹拌が行われる。ＩＰＡと磁性ビーズが撹拌された後、流入口１１から３００μＬのＥｔＯＨ（エタノール）が送液される。それによりＩＰＡ液が廃液部へ送液され、ＥｔＯＨと磁性ビーズが撹拌される。次に、ＴＥ（トリス塩酸液）１００μＬが注入口１１から送液される。それによりＥｔＯＨは廃液部へ送られ、ＴＥと磁性ビーズが撹拌される。ＴＥに溶出された核酸を回収するために、廃液側流路の第２のバルブ１６を閉じて、回収側の第１のバルブ１４を開放する。その後、核酸が溶出されたＴＥ液が回収口１５から回収される。
【００６４】
このような反応デバイスは、更に、ＩＰＡ、ＥｔＯＨおよびＴＥ溶液などの液体を収容するための収容部を備えてもよい。
【００６５】
また、このような反応デバイスは、抽出された核酸を増幅および／または検出するための遺伝子検査を行うための反応部をさらに備えてもよい。そのような反応デバイスは、コンタミネーションを回避することが可能である。また、反応デバイスを用いて、核酸の分離回収から検出反応までを行う全自動化装置を容易に提供することも可能である。反応デバイスを用いて、核酸の分離回収から検出反応までを行う全自動化装置を小型化することも容易になる。
【００６６】
［例］
例１
グラム陽性菌とグラム陰性菌の破砕
乳汁に含まれるグラム陽性菌とグラム陰性菌をそれぞれ破砕した。グラム陽性菌として黄色ブドウ球菌を培養した菌液を用いた。グラム陰性菌として緑膿菌を培養した菌液を用いた。
【００６７】
何れの菌にも感染していないことを確認した乳汁に濃度が１×１０４コピー／ｍＬとなるように黄色ブドウ球菌および緑膿菌をそれぞれ添加した。これを擬似感染乳とした。
【００６８】
実施例１として、擬似感染乳について黄色ブドウ球菌および緑膿菌を破砕する方法を説明する。
【００６９】
２種類の擬似感染乳を３本のマイクロチューブにそれぞれ２００μＬずつ入れた。そこにＰＢＳ中で５Ｍのグアニジンチオシアン酸塩の１０００μＬを添加した。これらの６本のマイクロチューブを９５℃でそれぞれ５分間、１０分間および２０分間に亘り加熱した。
【００７０】
加熱した混合液について６１℃で６０分間に亘りＬＡＭＰ法による核酸増幅を行った。濁度により増幅の立ち上り時間を測定した。
【００７１】
結果を図２に示す。５分間、１０分間および２０分間の加熱後の混合液に含まれる核酸は、何れも３０以内に増幅が開始された。この結果から、５Ｍのグアニジンチオシアン酸塩の存在下での加熱によりグラム陽性菌とグラム陰性菌は何れも破砕されていることが明らかになった。
【００７２】
上記の方法においては、加熱中に、グアニジンチオシアン酸塩がタンパク質を変性する。このとき、加熱されていることによって、タンパク質変性効果が促進される。その結果、グラム陽性菌およびグラム陰性菌の細胞膜と細胞壁が共に容易に破砕されると考えられた。
【００７３】
例２
磁性ビーズの影響についての検討
磁性ビーズによる核酸の濃縮効果について検討した。グラム陽性菌について行った実施例１の方法と、磁性ビーズを使用したことを除いて実施例１と同様に行った実施例２の方法とを比較した。
【００７４】
使用した擬似感染乳は次のように準備した。何れの菌にも感染していないことを確認した乳汁に濃度が１×１０２、１×１０３、１×１０４コピー／ｍＬとなるように黄色ブドウ球菌液を添加した。これを擬似感染乳とした。
【００７５】
実施例２として、乳汁からの黄色ブドウ球菌を破砕する方法を説明する。
【００７６】
擬似感染乳をマイクロチューブに２００μＬ入れた。そこに純水中で５Ｍのグアニジンチオシアン酸塩の１０００μＬ、磁性ビーズＭａｇｎｅＳｉｌ（登録商標）ＢＬＵＥ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）の２５μＬ、１０％のＳＤＳ１００μＬを添加した。この混合物を９５℃で５分間に亘り加熱した。
【００７７】
核酸が吸着された磁性ビーズを磁石を用いて磁気吸着することにより、磁性ビーズに付着した黄色ブドウ球菌の核酸を濃縮した。
【００７８】
磁性ビーズに付着した核酸をＴＥ（トリス塩酸液）で溶出した。得られた抽出液を６１℃で６０分間に亘りＬＡＭＰ法による核酸増幅を行った。濁度により増幅の立ち上り時間を測定した。
【００７９】
結果を図３に示した。図３に示されるように、磁性ビーズを使用することにより、加熱のみで破砕した場合に比べて核酸を効率よく濃縮し、回収することが可能であった。
【００８０】
例３
乳汁からの黄色ブドウ球菌の核酸の分離
乳汁に含まれる黄色ブドウ球菌の核酸を分離するための時間について、実施形態に従う細胞の核酸を分離する方法と従来の方法とを比較した。
【００８１】
黄色ブドウ球菌に感染していないことを確認した乳汁に濃度が１×１０４コピー／ｍＬとなるように黄色ブドウ球菌液を添加した。これを擬似感染乳とした。
【００８２】
実施例３として、乳汁からの黄色ブドウ球菌の核酸を分離する方法を説明する。
【００８３】
擬似感染乳をマイクロチューブに２００μＬ入れた。そこに純水中で５Ｍのグアニジンチオシアン酸塩の１０００μＬ、磁性ビーズＭａｇｎｅＳｉｌ（登録商標）ＢＬＵＥ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）の２５μＬ、１０％のＳＤＳ１００μＬを添加した。この混合物を８５℃で１分間に亘り加熱した。
【００８４】
核酸が吸着された磁性ビーズを磁石を用いて磁気吸着することにより、磁性ビーズに付着した黄色ブドウ球菌の核酸を濃縮した。
【００８５】
次に、９９％のＩＰＡ（２−イソプロピロアルコール）および９９％のＥｎＯＨ（エタノール）を用いて核酸が付着した磁性ビーズを洗浄した。その後、磁性ビーズを８５℃で５分間乾燥した。次に、ＴＥ（トリス塩酸液）溶出することにより、黄色ブドウ球菌の核酸を回収した。方法を開始した時点から、ここまでの工程を終了するまでの時間は、約１５分間であった。
【００８６】
更に、回収した黄色ブドウ球菌の核酸を含有するＴＥ液について、ＬＡＭＰ法により核酸増幅を行った。濁度により増幅の立ち上り時間を測定した。この結果から、上記の方法により、簡単に所望の核酸を溶解および回収できることが示された。
【００８７】
上記の方法においては、加熱中に、グアニジンチオシアン酸塩がタンパク質を変性する。このとき、加熱されていることによって、タンパク質変性効果が促進される。その結果、黄色ブドウ球菌の細胞壁が容易に破砕され、１分間という短時間で核酸を溶解するが可能になる。また、核酸を含む混合物が加温されていることによりビーズへの吸着効果も促進される。１０％ＳＤＳを添加することにより、グアニジンチオシアン酸塩による細胞破砕が促進され、それと同時に磁性ビーズの凝集による吸着能の低下も抑制されると考えられる。
【００８８】
比較例１
上記の実施例３の方法では、乳汁から黄色ブドウ球菌の核酸を回収するまでの時間は約１５分であった。回収までに要する時間を比較するために、市販の核酸抽出キットであるＦａｓｔｌＤ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ抽出キット（日本認証サービス株式会社製）を用いて、同様の試料、即ち、感染した乳汁から黄色ブドウ球菌の核酸を次のように回収した。
【００８９】
１×１０４コピー／ｍＬの濃度で黄色ブドウ球菌を加えた乳汁を擬似感染乳として使用した。
【００９０】
まず、ビーズチューブに対してＬｙｓｅ  Ｂｕｆｆｅｒ４８０μLおよび擬似感染乳を３２０μL添加した。次にプロテイナーゼＫを添加して６５℃で３０分間加熱することにより、細胞を破砕した。これを９１００×ｇで５分間遠心し、その上澄みの４５０μＬを採取した。これを吸着カラムに添加した。吸着カラムを５７００×ｇで１分間遠心した。更に、吸着カラムに洗浄液を添加して、５７００×ｇで１分間遠心をした。次に、吸着カラムに７５％のＥｔＯＨを添加して、５７００×ｇで１分間遠心した。次に、吸着カラムに吸着された核酸をＴＥ５０μＬを用いて溶出した。
【００９１】
市販の核酸抽出キットであるＦａｓｔｌＤ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ抽出キット（日本認証サービス株式会社製）を用いて、感染した乳汁から黄色ブドウ球菌の核酸を次のように回収するために必要とされた時間は約５０分であった。
【００９２】
実施形態の方法によれば、市販の核酸抽出キットに比べて非常に短い時間で、効率的且つ簡便に黄色ブドウ球菌の核酸を乳汁から分離および回収することが可能であることが明らかになった。
【００９３】
例４
抽出精度について
実施形態に従う細胞の核酸を分離する方法および従来の方法によって、乳汁から黄色ブドウ球菌の核酸を分離する際の抽出効率を比較した。
【００９４】
黄色ブドウ球菌に感染していないことを確認した乳汁に濃度が１×１０３、１×１０４および１×１０５コピー／ｍＬとなるようにそれぞれ黄色ブドウ球菌を添加した。これを擬似感染乳とした。
【００９５】
実施例４
黄色ブドウ球菌の濃度を除いて、実施例３と同様の方法を用いて核酸を分離し、リアルタイムＰＣＲにより核酸を増幅した。各試験は、１つの濃度につき２例ずつ行い、結果は、平均値±標準誤差で示した。
【００９６】
比較例２
黄色ブドウ球菌の濃度を除いて、比較例１と同様の方法を用いて核酸を分離し、リアルタイムＰＣＲにより核酸を増幅した。各試験は、１つの濃度につき２例ずつ行い、結果は、平均値±標準誤差で示した。
【００９７】
結果
実施例４と比較例２の方法により得られた結果を図４のグラフに示した。
【００９８】
実施例４では、擬似感染乳中の菌量が１×１０３、１×１０４および１×１０５コピー／ｍＬのそれぞれの場合、抽出核酸量として約１×１０４、約１×１０５および約５×１０６コピー／ｍＬが検出された。実施例４では、濃度依存的に良好に菌の抽出ができた。
【００９９】
それに対して比較例２では、擬似感染乳中の菌量が１×１０３コピー／ｍＬの場合、誤差が大きく、このコピー数では抽出効率が悪いことが明らかとなった。擬似感染乳中の菌量が１×１０４および１×１０５コピー／ｍＬの場合では、５×１０３、５×１０４コピー／ｍＬが抽出核酸量として検出された。
【０１００】
比較例に比べて、実施形態に従う方法は、より少ない量の核酸についても良好に分離できることが明らかとなった。また抽出量についても、比較例に比べて、実施形態に従う方法はより多くの核酸を抽出することが可能であった。
【０１０１】
以上の結果から、実施形態に従う方法は、従来に比べてより抽出性能が高く、感度よく、安定して、正確且つ良好に細胞の核酸を分離できることが明らかになった。
【０１０２】
例５
加熱温度についての検討
実施例４、５および５として、加熱温度を７５℃、８５℃および９５℃とし、加熱時間を５分間行うこと、およびＳＤＳを使用しないこと以外は、実施例３と同様に擬似感染乳から黄色ブドウ球菌の核酸を分離した。
【０１０３】
１×１０４コピー／ｍＬの濃度で黄色ブドウ球菌を加えた乳汁を擬似感染乳として使用した。
【０１０４】
更に実施例８として、５Ｍのグアニジンチオシアン酸塩の１００μＬを添加し、且つＳＤＳを含まない純水中で９５℃で５分間の加熱を行うこと以外は、実施例３と同様の方法により擬似感染乳から黄色ブドウ球菌の核酸を分離した。
【０１０５】
分離した核酸をＬＡＭＰ法により増幅し、濁度を測定することにより、増幅の立ち上がり時間を測定した結果を表１に示す。
【表１】
2014060965.tif 000003
【０１０６】
８５℃と９５℃で５分間の加熱を行った場合がより良好な分離ができた。７５℃で５分間の加熱では、単離された核酸を増幅するためには長い時間が必要であった。１０分の１の量のグアニジンチオシアン酸塩での分離でも良好な分離が可能であった。
【０１０７】
例６
加熱時間についての検討
実施例９、１０、１１、１２および１３として、加熱時間を１分間、３分間、５分間、７分間および１０分間とし、加熱温度を８５℃とたこと、およびＳＤＳを使用しないこと以外は、実施例３と同様に擬似感染乳から黄色ブドウ球菌の核酸を分離した。
【０１０８】
１×１０２、１×１０３および１×１０４コピー／ｍＬの濃度で黄色ブドウ球菌を加えた乳汁を擬似感染乳として使用した。
【０１０９】
分離した核酸をＬＡＭＰ法により増幅し、濁度を測定することにより、増幅の立ち上がり時間を測定した結果を図５に示す。何れの菌量の場合であっても、１分間〜１０分間の何れの場合にも良好に核酸が分離できた。この条件では、菌量が多い場合、短時間の加熱に比べて長時間の加熱を行った方が多くの核酸を得ることができる傾向があった。
【０１１０】
例７
核酸吸着性ビーズの添加時期についての検討
核酸吸着性ビーズの添加時期と黄色ブドウ球菌の２種類の異なる菌株を用いて十指例１４〜１７を行った。
【０１１１】
実施例１４および１５は、液体混合物を加熱後に核酸吸着性ビーズを添加した。実施例１６および１７は、加熱前に液体混合物中に核酸吸着性ビーズを含ませた。実施例１４および１６は、菌株Ｎｏ．３５と称される黄色ブドウ球菌を使用した。実施例１５および１７は、菌株Ｎｏ．３５とは異なる株である菌株Ｎｏ．４２と称される黄色ブドウ球菌を使用した。
【０１１２】
１×１０４コピー／ｍＬの濃度で黄色ブドウ球菌を加えた乳汁を擬似感染乳として使用した。
【０１１３】
実施例１４および１５のプロトコル
擬似感染乳をマイクロチューブに４０μＬ入れた。そこに純水中で５Ｍのグアニジンチオシアン酸塩の５００μＬ、１０％のＳＤＳ１００μＬを添加した。この混合物を８５℃で５分間に亘り加熱した。
【０１１４】
加熱後に、磁性ビーズＭａｇｎｅＳｉｌ（登録商標）ＢＬＵＥ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）の２０μＬを加熱された混合物に添加した。
【０１１５】
核酸が吸着された磁性ビーズを磁石を用いて磁気吸着することにより、磁性ビーズに付着した黄色ブドウ球菌の核酸を濃縮した。
【０１１６】
次に、それぞれ１０００μＬの９９％のＩＰＡ（２−イソプロピロアルコール）および９９％のＥｎＯＨ（エタノール）を用いて核酸が付着した磁性ビーズを洗浄した。その後、磁性ビーズを８５℃で５分間乾燥した。次に、５０μＬのＴＥ（トリス塩酸液）溶出することにより、黄色ブドウ球菌の核酸を回収した。
【０１１７】
更に、回収した黄色ブドウ球菌の核酸を含有するＴＥ液について、ＬＡＭＰ法により核酸増幅を行った。濁度により増幅の立ち上り時間を測定した。
【０１１８】
実施例１６および１７のプロトコル
擬似感染乳をマイクロチューブに４０μＬ入れた。そこにＰＢＳ中で５Ｍのグアニジンチオシアン酸塩の５００μＬ、磁性ビーズＭａｇｎｅＳｉｌ（登録商標）ＢＬＵＥ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）の２０μＬ、１０％のＳＤＳ１００μＬを添加した。この混合物を８５℃で５分間に亘り加熱した。
【０１１９】
核酸が吸着された磁性ビーズを磁石を用いて磁気吸着することにより、磁性ビーズに付着した黄色ブドウ球菌の核酸を濃縮した。
【０１２０】
次に、それぞれ１０００μＬの９９％のＩＰＡ（２−イソプロピロアルコール）および９９％のＥｎＯＨ（エタノール）を用いて核酸が付着した磁性ビーズを洗浄した。その後、磁性ビーズを８５℃で５分間乾燥した。次に、５０μＬのＴＥ（トリス塩酸液）溶出することにより、黄色ブドウ球菌の核酸を回収した。
【０１２１】
更に、回収した黄色ブドウ球菌の核酸を含有するＴＥ液について、ＬＡＭＰ法により核酸増幅を行った。濁度により増幅の立ち上り時間を測定した。
【０１２２】
試験のプロトコルを表２に示す。
【表２】
2014060965.tif 000004
【０１２３】
実施例１４〜１７についての結果を表３に示す。
【表３】
2014060965.tif 000005
【０１２４】
表３に示すように、何れの条件においても良好に分離されていることが確認された。また、核酸増幅の立ち上がり時間は、加熱時に磁性ビーズが存在しているほうが、加熱後に磁性ビーズを添加した場合よりも短かった。
【０１２５】
例８
磁性ビーズ量と抽出量についての検討
エンテロコッカス、酵母およびストレプトコッカスからそれぞれ核酸を分離した。
【０１２６】
それぞれ１×１０４コピー／ｍＬの濃度でエンテロコッカス、酵母および黄色ブドウ球菌を加えた乳汁を擬似感染乳として使用した。
【０１２７】
核酸が分離されるべき菌種の種類と、添加した量をそれぞれ磁性ビーズの量を５μＬ添加したことを除いて実施例３と同様の方法により核酸を分離する方法を実施例１８として行った。
【０１２８】
核酸が分離されるべき菌種の種類と、添加した量をそれぞれ磁性ビーズの量を２５μＬ添加したことを除いて実施例３と同様の方法により核酸を分離する方法を実施例１９として行った。
【０１２９】
核酸が分離されるべき菌種の種類と、添加した量をそれぞれ磁性ビーズの量を２５μＬ添加したこと、および磁性ビーズに捕獲した核酸を乾燥しないことを除いて実施例３と同様の方法により核酸を分離する方法を実施例２０として行った。
【０１３０】
試験プロトコルの概要を図６に示す。
【０１３１】
何れも分離した核酸をＬＡＭＰ法により核酸増幅し、濁度を指標として立ち上がり時間を測定した。結果を図７に示す。
【０１３２】
何れの菌種についても、磁性ビーズを５μＬ使用した場合も、２５μＬ使用した場合も同様に良好に核酸を分離できた。
【０１３３】
例９
菌種についての検討
グラム陽性菌、グラム陰性菌および藻類の核酸を分離した。
【０１３４】
（１）擬似感染乳
グラム陽性菌の例として、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、連鎖球菌であるＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓおよびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｄｙｓaｇａｌａｃｔｉａｅの培養菌液を用いた。
【０１３５】
グラム陰性菌の例として、大腸菌であるＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅおよび緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の培養菌液を用いた。
【０１３６】
藻類の例としてＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｚｏｐｆｉｉの培養菌液を用いた。
【０１３７】
これらの菌をそれぞれ未感染乳汁に各培養菌液を添加して擬似感染乳を準備した。
【０１３８】
擬似感染乳を培養し、菌数を増やし、培養菌数を確認した。それぞれ最終濃度１×１０２、１×１０３、１×１０４および１×１０５ｃｆｕ／ｍＬで用いたこと以外は、実施例３と同様の方法により、各菌から核酸を分離した。分離された核酸をＬＡＭＰ法により核酸増幅し、濁度を指標とし増幅の立ち上がり時間を測定した。
【０１３９】
結果を図８に示す。何れの菌種についても良好に増幅されたことから、実施形態に従う方法により、グラム陽性菌、グラム陰性菌および藻類の何れも良好に分離できた。
【図１】
2014060965.tif 000006
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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