(57)【要約】【課題】ナノ炭素輻射キャリア改質方法を提供する。【解決手段】病気に対して高い専用性の磁性炭素微粒子を利用して、その接ぎ木した官能性分子により、接ぎ木した抗原／抗体の表面積が増加され、そのナノ粒子表面に結合された抗原が若干倍に増加され、検知の敏感度や正確度が向上され、また、有効に、大幅にコストダウンと便利性とが向上され、臨床大量例行生体外定量測定の癌腫診断や治療の評価及びサンプル純化が行われる方法である。【選択図】図１
2014202742.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
臨床大量例行生体外定量測定の癌腫診断と治療の評価に適用され、少なくとも、
（Ａ）溶液により複数の炭素磁気ビーズ（Magnetic Beads）が供給され、それに抗原（Antigen）/抗体（Antibody）が添加され、上記抗原が上記磁気ビーズに吸着や結合し、上記炭素磁気ビーズがナノ炭素輻射キャリア構造で、炭素ナノ粒子（Nanoparticle）や上記炭素ナノ粒子に分布される接ぎ木官能性分子及び上記ナノ粒子に分布される磁性物質とが備えられる、ステップと、
（Ｂ）磁界で上記らの磁気ビーズを集中させて吸着させ、残りの反応していない抗原とその溶液をニードル（Needle）で吸い上げて、抗原を有する磁気ビーズだけのものが得られる、ステップと、
（Ｃ）試料を上記抗原を有する磁気ビーズの溶液に添加して、上記試料中の抗体（Antibody）／抗原(Antigen)と上記抗原/抗体とを特異性反応させて、上記磁気ビーズに吸着や結合させ、その後、磁界でそれらを集中させて吸着させ、吸着されていないや結合していない試料中の他の物質を分離させる、ステップと、
（Ｄ）上記抗体を接木した磁気ビーズの溶液に、更に、二次抗体が添加されて、上記二次抗体が吸着や結合された磁気ビーズを指標としてマークして、続きのステップ（Ｅ）やステップ（Ｆ）或いはステップ（Ｇ）の測定に利用し、上記二次抗体に、それぞれ、放射性同位体（Isotope）や酵素或いは核酸分子（DNA）の三種類の異なる信号分子が接ぎ木されることができる、ステップと、
（Ｅ）放射免疫測定法（Radioimmunoassay, RIA）により、上記二次抗体にヨウ素-125放射性同位体を結合させ、上記ヨウ素-125から放射したガンマ線（Gamma Ray, γ-ray）で上記ガンマ線の強度を検知して上記試料中の抗体含量を判定する、ステップと、
（Ｆ）化学発光免疫測定法（Chemiluminescence Immunoassa, CLIA）や酵素結合免疫測定法（Enzyme-Linked
Immunosorbent Assay,ELISA）により、上記二次抗体に、化学発光/酵素結合酵素を結合させ、上記化学発光/酵素結合酵素を化学発光基質（Chemiluminescence
Substrate）/酵素結合基質に作用させ、上記光子の発光強度/酵素結合吸光値を検知して、上記試料中の抗体含量を判定する、ステップと、
（Ｇ）イムノPCR法（Immuno PCR）により、上記二次抗体にビオチン（Biotin）を接ぎ木させ、また、一つの核酸分子にもビオチンを接ぎ木させ、ストレプトアビジン（Streptavidin）で上記核酸分子と上記二次抗体とが結合され、Tag酵素でPCR反応させて信号を拡大し、分離プロセスにより核酸分子を分離して、上記試料中の抗体含量を判定する、ステップと、
が含有される、ことを特徴とするナノ炭素輻射キャリア改質方法。
【請求項２】
上記試料は、癌腫病者の血清であることを特徴とする請求項１に記載のナノ炭素輻射キャリア改質方法。
【請求項３】
上記癌腫は、鼻咽頭癌であることを特徴とする請求項２に記載のナノ炭素輻射キャリア改質方法。
【請求項４】
上記抗体は、Anti-EBV IgAであることを特徴とする請求項１に記載のナノ炭素輻射キャリア改質方法。
【請求項５】
上記二次抗体は、Anti-Human IgAであることを特徴とする請求項１に記載のナノ炭素輻射キャリア改質方法。
【請求項６】
上記ステップ（Ｄ）においては、上記二次抗体を吸着や結合した後、磁界で、それらを集中させて吸着させ、吸着されていないや結合されていない二次抗体を分離することを特徴とする請求項１に記載のナノ炭素輻射キャリア改質方法。
【請求項７】
上記ステップ（Ｆ）においては、化学発光/酵素結合酵素が、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（Horse Radish
Peroxidase,HRP）やアルカリホスファターゼ（Alkaline
Phosphatase, AP）であることを特徴とする請求項１に記載のナノ炭素輻射キャリア改質方法。
【請求項８】
上記ステップ（Ｆ）においては、自動化血清免疫測定器で、化学発光/酵素結合免疫測定法を行うことを特徴とする請求項１に記載のナノ炭素輻射キャリア改質方法。
【請求項９】
上記ステップ（Ｆ）においては、光電子増倍管（Photomultiplier Tube, PMT）検知器で、光子の発光強度/酵素結合吸光値を検知することを特徴とする請求項１に記載のナノ炭素輻射キャリア改質方法。
【請求項１０】
上記ステップ（Ｇ）の分離プロセスは、ゲル電気泳動（Gel Electrophoresis）であることを特徴とする請求項１に記載のナノ炭素輻射キャリア改質方法。
【請求項１１】
上記ナノ粒子は、ナノ炭素玉であることを特徴とする請求項１に記載のナノ炭素輻射キャリア改質方法。
【請求項１２】
上記接ぎ木官能性分子は、酸及びアルカリによって処理されて、電離放射線によって照射されることにより形成された官能基を有することを特徴とする請求項１に記載のナノ炭素輻射キャリア改質方法。
【請求項１３】
上記官能基は、カルボキシル基（-COOH）やアミノ基（-NH2）、チオール基（-SH）、ヒドロキシ基（-OH）、アルデヒド基（-COH）或いはエステル基（-COO-）であることを特徴とする請求項１２に記載のナノ炭素輻射キャリア改質方法。
【請求項１４】
上記磁性物質は、鉄やコバルト、ニッケル及び四三酸化鉄（Fe4O3）の磁石粉（Magnet）であることを特徴とする請求項１に記載のナノ炭素輻射キャリア改質方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ナノ輻射キャリア改質方法に関し、特に、病気について、高い専用性の磁性炭素微粒子を利用して、特に、高精度の敏感度と正確度で検知でき、また、大幅にコストダウン且つ便利になる方法に関し、そして、サンプル純化や臨床大量例行生体外定量測定の癌腫診断や治療の評価に適用できる。
【背景技術】
【０００２】
従来の酵素結合免疫吸着測定法（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA）は、図９のように、容器８の底部に、一層の抗原９を塗布するだけであるため、上記抗原９の表面積の使用が制限され、また、有効的に検知の敏感度を向上できない。そのため、一般の従来のものは、ユーザーにとって実用的ではない。
【０００３】
本発明者は、上記欠点を解消するため、慎重に研究し、また、学理を活用して、有効に上記欠点を解消でき、設計が合理である本発明を提案する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の主な目的は、従来技術の上記問題点を解消するため、病気に対して高い専用性の磁性炭素微粒子を利用して、その接ぎ木した官能性分子により、接ぎ木した抗原／抗体の表面積が増加され、そのナノ粒子表面に結合された抗原が、若干倍に増加され、検知の敏感度や正確度が向上され、また、有効に大幅にコストダウンと便利性とが向上され、臨床大量例行生体外定量測定の癌腫診断や治療の評価及びサンプル純化が行われる方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、上記目的を達成するためのナノ炭素輻射キャリア改質方法で、溶液により複数の炭素磁気ビーズ（Magnetic Beads）が供給され、それに抗原（Antigen）／抗体（Antibody）が添加され、上記抗原／抗体が上記磁気ビーズに吸着や結合し、磁界により上記磁気ビーズが集中されて吸着され、また、残りの反応していない抗原／抗体とその溶液をニードル（Needle）で吸い上げ、純粋な抗原／抗体を有する磁気ビーズだけのものが形成され、そして、試料を上記抗原を有する磁気ビーズの溶液に添加して、上記試料の抗体（Antibody）/抗原（Antigen）と上記抗原／抗体とを特異性反応させて、上記磁気ビーズに吸着或いは結合させ、その後、磁界でそれらを集中させて吸着させ、吸着されていないや結合されていない試料中の他の物質を分離させ、上記抗体を接ぎ木した磁気ビーズの溶液において、更に、二次抗体が添加されて、上記二次抗体が吸着や結合された磁気ビーズを指標としてマークして、続きの放射免疫測定法（Radioimmunoassay, RIA）や化学発光免疫測定法（Chemiluminescence Immunoassa,
CLIA）、酵素結合免疫測定法（Enzyme-Linked Immunosorbent
Assay,ELISA）或いはイムノPCR法（Immuno PCR）の測定を行い、また、上記二次抗体が吸着や結合された後、同じように、磁界でそれらを集中させて吸着させ、吸着されていないや結合されていない二次抗体が分離され、
放射免疫測定法を行うことにより、上記二次抗体にヨウ素-125放射性同位体が結合され、上記ヨウ素-125から放射したガンマ線（Gamma Ray, γ-ray）により、上記ガンマ線の強度を検知して、上記試料中の抗体含量を判定し、
化学発光/酵素結合免疫測定法を行う時、上記二次抗体に化学発光/酵素結合酵素を結合させ、上記化学発光/酵素結合酵素を化学発光基質（Chemiluminescence Substrate）/酵素結合基質に作用させ、上記光子の発光強度/酵素結合吸光値を検知して、上記試料中の抗体含量を判定し、
イムノPCR法を行う時、上記二次抗体にビオチン（Biotin）を接ぎ木させ、また、一つの核酸分子にもビオチンを接ぎ木させ、ストレプトアビジン（Streptavidin）で上記核酸分子と上記二次抗体とが結合され、Tag酵素でPCR反応させて信号を拡大し、分離プロセスにより核酸分子を分離して、上記試料中の抗体含量を判定する。
【０００６】
以下、図面を参照しながら、本発明の特徴や技術内容について詳しく説明するが、それらの図面等は参考や説明のためであり、本発明はそれによって制限されることが無い。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】本発明のナノ炭素輻射キャリアの改質流れ概念図である。
【図２】本発明の改質流れ一概念図である。
【図３】本発明の改質流れ二概念図である。
【図４】本発明の改質流れ三概念図である。
【図５】本発明の改質流れ四概念図である。
【図６】本発明の改質流れ五概念図である。
【図７】本発明の改質流れ六概念図である。
【図８】本発明の改質流れ七概念図である。
【図９】従来の酵素結合免疫吸着測定法概念図である。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
図１〜図８は、それぞれ、本発明に係るナノ炭素輻射キャリアの改質流れ概念図と本発明の改質流れ一概念図、本発明の改質流れ二概念図、本発明の改質流れ三概念図、本発明の改質流れ四概念図、本発明の改質流れ五概念図、本発明の改質流れ六概念図及び本発明の改質流れ七概念図である。図のように、本発明に係るナノ炭素輻射キャリア改質方法は、少なくとも、
（Ａ）磁気ビーズに抗原を接ぎ木するステップ１１：
図２のように、溶液２０が収納された容器２に対して、複数の炭素磁気ビーズ（Magnetic Beads）３を供給し、また、それに抗原（Antigen）／抗体（Antibody）４０を添加し、上記抗原４０が上記磁気ビーズ３に吸着や結合され、その中、上記磁気ビーズ３がナノ炭素輻射キャリア構造で、ナノ粒子（Nanoparticle）３１や上記ナノ粒子３１に分布された接ぎ木官能性分子３２及び上記ナノ粒子３１に分布された磁性物質３３とが備えられ、
（Ｂ）磁性吸着清浄ステップ１２：
図３のように、上記容器２の下方に磁石（Magnet）２１がセットされ、磁界で上記らの磁気ビーズ３を集中させて吸着させ、また、残りの反応していない抗原／抗体４０とその溶液２０をニードル（Needle）５で吸い上げ、純粋な抗原／抗体４０を有する磁気ビーズ３が形成され、
（Ｃ）磁気ビーズに抗体を接ぎ木するステップ１３：
図４のように、試料４を上記抗原／抗体４０を有する磁気ビーズ３の溶液２０に添加し、上記試料４中の抗体（Antibody）／抗原（Antigen）４１と上記抗原４０とが特異性反応して、上記磁気ビーズ３に吸着や結合され、その後、ステップ（Ｂ）のように、磁界でそれらを、集中させて吸着させ、吸着や結合されていない試料４中の他の物質を分離させ、
（Ｄ）磁気ビーズに二次抗体を接ぎ木するステップ１４：
図５のように、上記抗体４１を接ぎ木した磁気ビーズ３の溶液２０に、更に、二次抗体４２を添加することにより、上記二次抗体４２が吸着や結合された磁気ビーズ３を指標としてマークして、続きのステップ（Ｅ）やステップ（Ｆ）或いはステップ（Ｇ）の測定に利用し、その中、上記二次抗体４２に、それぞれ、放射性同位体（Isotope）や酵素或いは核酸分子（DNA）の三種類の異なる信号分子６を接ぎ木することができ、
（Ｅ）放射免疫測定ステップ１５：
図６のように、放射免疫測定法（Radioimmunoassay, RIA）を行い、上記二次抗体４２にヨウ素-125放射性同位体６aを結合させ、上記ヨウ素-125から放射したガンマ線（Gamma Ray, γ-ray）で、上記ガンマ線の強度を検知して上記試料４中の抗体４１含量を判定し、
（Ｆ）化学発光/酵素結合免疫測定ステップ１６：
図７のように、化学発光免疫測定法（Chemiluminescence Immunoassa, CLIA）/酵素結合免疫測定法（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay,ELISA）を行い、上記二次抗体４２に化学発光/酵素結合酵素６bを結合させ、上記化学発光/酵素結合酵素６bを化学発光基質（Chemiluminescence Substrate）/酵素結合基質に作用させ、上記光子の発光強度/酵素結合吸光値を検知して、上記試料４中の抗体４１含量を判定し、
（Ｇ）イムノPCRステップ１７：
図８のように、イムノPCR法（Immuno PCR）を行い、上記二次抗体４２にビオチン（Biotin）６１cを接ぎ木させ、また、核酸分子６cにもビオチン６１cを接ぎ木させ、ストレプトアビジン（Streptavidin）６２cで上記核酸分子６cと上記二次抗体４２とが結合され、それから、Tag酵素でPCR反応させて信号を拡大し、分離プロセスにより核酸分子６cを分離して、上記試料４中の抗体４１含量を判定する。
【０００９】
上記ナノ粒子３１はナノ炭素玉であり、上記接ぎ木官能性分子３２は酸及びアルカリ処理や電離放射線照射によって形成された、カルボキシル基（-COOH）やアミノ基（-NH2）、チオール基（-SH）、ヒドロキシ基（-OH）、アルデヒド基（-COH）或いはエステル基（-COO-）の官能基が備えられ、上記磁性物質３３は、鉄やコバルト、ニッケル及び四三酸化鉄（Fe4O3）の磁石粉である。
【００１０】
本発明のより良い実施例中によれば、上記磁気ビーズ３をキャリアとする構造で、接ぎ木官能性分子３２により、抗原４０を上記ナノ粒子３１の表面に結合させ、また、容器２の底部に磁石２１を設置することにより、上記磁気ビーズ３中の磁性物質３３が磁界により、上記磁石２１の方向へ移動して集中され、また、上記ニードル５により残りの溶液が吸い上げられ、これにより、簡単に反応していない抗原４０が清浄除去されて、純粋な抗原４０を有する磁気ビーズ３が形成され、また、試料４をそれに添加し、本実施例において、鼻咽頭癌患者の血清を使用する。病気に対して、専用性的に吸着する磁気ビーズ３を利用して、上記血清中のAnti-EBV IgA抗体４１だけを上記磁気ビーズ３に接ぎ木させることができ、また、同じように、磁界で上記磁気ビーズ３を集中して吸着し、吸着されていない血清中の他の物質が分離除去され、最後に、EBV IgAが接ぎ木された磁気ビーズ３に、更に、Anti-Human IgA二次抗体４２が接ぎ木され、磁界で集中させて吸着させ、吸着されていない二次抗体４２が分離除去され、その後、上記二次抗体４２に、それぞれ、選択的に三種類の異なる信号分子６が接ぎ木されて、放射免疫測定法や化学発光免疫測定法、酵素結合免疫測定法或いはイムノPCR法の測定が行われる。
【００１１】
放射免疫測定法を行う時、上記二次抗体４２にヨウ素-125放射性同位体６aが結合され、上記ヨウ素-125から放射したガンマ線により、ガンマ線検知器（Gamma-ray Detector）７aで上記ガンマ線の強度を検知すると、上記試料４中のAnti-EBV IgA抗体４１含量を判定でき、高い正確性且つ低コストの検知方法になる。
【００１２】
化学発光/酵素結合免疫測定法を行う時、上記二次抗体４２に、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（Horse
Radish Peroxidase,HRP）やアルカリホスファターゼ（Alkaline Phosphatase, AP）等の化学発光/酵素結合酵素６bが結合され、上記両種類の化学発光/酵素結合酵素を化学発光/酵素結合基質に作用させ、光電子増倍管（Photomultiplier Tube, PMT）検知器で、上記光子の発光強度/酵素結合吸光値を検知して、上記試料４中の抗体４１含量を判定する。上記方法による信号と比べると、上記放射免疫測定法の方が大幅に拡大され、より良い正確度が得られるだけでなく、既存の自動化血清免疫測定器に合わせて使用すると、より良い便利性が得られる。
【００１３】
イムノPCR法を行う時、上記二次抗体４２にビオチン６１cを接ぎ木させ、また、上記核酸分子６cにもう一つのビオチン６１cを接ぎ木させ、上記ストレプトアビジン６２cがビオチンに対して強い吸着力があって、また、各ストレプトアビジンに四つのビオチンが接ぎ木されることができるため、上記核酸分子６cと上記二次抗体４２とが結合され、その後、Tag酵素を利用してPCR反応させ、そして、ゲル電気泳動（Gel Electrophoresis）７cにより核酸分子６cを分離して、上記試料４中の抗体４１含量を判定する。また、30循環（Cycle）に反応すれば得られる信号が10億倍に拡大され、そのため、上記方法は、最も敏感の検知方法になり、約580分子の濃度まで検知できる。
【００１４】
以上のように、本発明に使用された磁気ビーズが、病気に対して、高い専用性を有し、その接ぎ木官能性分子により、抗原を接ぎ木するための表面積が増加され、上記ナノ粒子表面に結合される抗原が、従来の酵素結合免疫吸着測定法（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA）に比較すると、明白に若干倍に増加され、検知の敏感度や正確度が向上され、大幅にコストダウン且つ便利になり、従来方法の代わりに利用でき、また、病気の純化医療に適用でき、臨床大量例行生体外定量測定の癌腫診断と治療の評価に適合する。
【００１５】
以上のように、本発明に係るナノ炭素輻射キャリア改質方法は、有効に従来の諸欠点を解消でき、病気に対して高い専用性を有し、その接ぎ木官能性分子により抗原を接ぎ木するための表面積が増加され、上記ナノ粒子表面に結合される抗原が明白に若干倍に増加され、検知の敏感度や正確度が向上され、また、有効に大幅にコストダウンと便利性が向上され、サンプル純化や臨床大量例行生体外定量測定の癌腫診断と治療の評価に適用でき、そのため、本発明は、より進歩的かつより実用的で、法に従って特許請求を出願する。
【００１６】
以上は、ただ、本発明のより良い実施例であり、本発明は、それによって制限されることが無く、本発明に係わる特許請求の範囲や明細書の内容に基づいて行った等価の変更や修正は、全てが、本発明の特許請求の範囲内に含まれる。
【符号の説明】
【００１７】
（本発明部分）
ステップ（Ａ）  炭素磁気ビーズに抗原を接ぎ木する１１
ステップ（Ｂ）  磁性吸着清浄１２
ステップ（Ｃ）  炭素磁気ビーズに抗体を接ぎ木する１３
ステップ（Ｄ）  炭素磁気ビーズに二次抗体を接ぎ木する１４
ステップ（Ｅ）  放射免疫測定１５
ステップ（Ｆ）  化学発光/酵素結合免疫測定１６
ステップ（Ｇ）  イムノPCR１７
２      容器
２０    溶液
２１    磁石
３      炭素磁気ビーズ
３１    ナノ粒子
３２    接ぎ木官能性分子
３３    磁性物質
４      試料
４０    抗原/抗体
４１    抗体/抗原
４２    二次抗体
５      ニードル
６      信号分子
６a      放射性同位体
６b      化学発光/酵素結合酵素
６c      核酸分子
６１c    ビオチン
６２c    ストレプトアビジン
７a      ガンマ線検知器
７b      光電子増倍管検知器
７c      ゲル電気泳動
（従来部分）
８        容器
９        抗原
【図１】
2014202742.tif 000003
【図２】
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【図３】
2014202742.tif 000005
【図４】
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【図５】
2014202742.tif 000007
【図６】
2014202742.tif 000008
【図７】
2014202742.tif 000009
【図８】
2014202742.tif 000010
【図９】
2014202742.tif 000011