(57)【要約】【課題】  生化学的な目的で使用することを可能にする発光性官能基を定量的に結合した水溶性発光標識ポリマーを提供することを課題とする。【解決手段】  本発明は、図１に例示されるような構造を有する水溶性発光標識ポリマーであって、発光性官能基をポリマー側鎖に定量的に導入することによって、発光性官能基単体に比べ発光強度を増大させることができる。【選択図】図１
2014152248.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）で表される繰り返し単位
【化１】
2014152248.tif 000013
（式中、Ｒ1は−ＣＯＯＨ、−ＯＨ又は−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｐＲ1’（ここで、Ｒ1’は−ＣＯＯＨ、−ＯＨ、−ＣＨ＝ＣＨ２、−Ｃ≡ＣＨ又は−Ｎ３、ｐは１〜３０の整数である。）であり、ｌは１〜１０の整数である。）、
下記式（２）で表される繰り返し単位
【化２】
2014152248.tif 000014
（式中、Ｒ２は発光性官能基、−ＮＨＲ３、−ＳＲ４（ここで、Ｒ３は水素原子又はｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基、２，２，２−トリクロロエトキシカルボニル基、アリルオキシカルボニル基、フタロイル基、ｐ−トルエンスルホニル基及び２−ニトロベンゼンスルホニル基から選択されるアミノ基の保護基であり、Ｒ４は水素原子又はベンジル基、メトキシベンジル基、Ｎ−（アセチル）アミノメチル基、ｔ−ブチル基、メチルベンジル基、３、４−ジメチルベンジル基、トリフェニルメチル基、ベンズヒドリル基、アセタミドメチル基、カルボメトキシスルフェニル基、３−ニトロ−２−ピリジンスルフェニル基、エチルカルバモイル基、９−フルオレニルメチル基及びピリジルスルフィド基から選択されるチオール基の保護基である。）又は−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｐＲ２’（ここで、Ｒ２’は発光性官能基、−ＮＨＲ３又は−ＳＲ４、ｐは１〜３０の整数である。）であって、繰返し単位数ｙ中の発光性官能基を含む繰返し単位数ａ、−ＮＨＲ３を含む繰返し単位数ｂ及び−ＳＲ４を含む繰返し単位数ｃが、ｂ／ａ＋ｂ＝０〜０．９０及びｃ／ａ＋ｃ＝０〜０．９５であり、ｍは１〜１０、ｎは０〜１０の整数である。）、並びに
下記式（３）で表される繰り返し単位
【化３】
2014152248.tif 000015
を含み、式（１）の繰返し単位数ｘ、式（２）の繰返し単位数ｙ及び前記式（３）の繰返し単位数ｚが、ｘ／（ｘ＋ｙ＋ｚ）＝０．０１〜０．９０、ｙ／（ｘ＋ｙ＋ｚ）＝０．０１〜０．５０及びｚ／（ｘ＋ｙ＋ｚ）＝０．０１〜０．９０であって、前記式（１）、（２）及び（３）の繰返し単位で構成されるポリマー主鎖の少なくとも一方の末端が、−ＣＯＯＨ、−ＯＨ、−ＮＨ２、−ＳＨ、−ＮＣＯ、−ＣＨＯ、−ＣＨ＝ＣＨ２、−Ｃ≡ＣＨ、−Ｎ３及びビオチニル基からなる群から選択される少なくとも一つの官能基を含むことを特徴とする、水溶性発光標識ポリマー。
【請求項２】
前記ポリマー主鎖と前記末端官能基との間に、スペーサーとして−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｑ−（ここで、ｑは１〜１２０の整数である。）を含むことを特徴とする、請求項１に記載の水溶性発光標識ポリマー。
【請求項３】
前記発光性官能基が、アミノ基を介して結合したＢＯＤＩＰＹ、アミノ基を介して結合したＣｙ３、アミノ基を介して結合したＣｙ５、アミノ基を介して結合したユウロピウム錯体又はフルオレセインである、請求項１又は２に記載の水溶性発光標識ポリマー。
【請求項４】
前記ｘ、ｙ及びｚが、ｘ＋ｙ＋ｚ＝１０〜３５０であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の水溶性発光標識ポリマー。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の水溶性発光標識ポリマーを含有する、試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、発光性官能基及び生体分子に対し結合能を持つ末端官能基を定量的に導入した水溶性発光標識ポリマーに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、極微量の検体から検出可能な高感度バイオツールのニーズが高まりつつある。その高感度化の一環として、高発光かつ高安定性を有する新規発光体を検出用標識体として応用する研究が注目されている。発光体をバイオツールのような生化学的な系で使用するためには、その発光性能もさることながら、水に可溶であること、生体適合性が優れていること、発光能が水溶液中でも保持されていること等が必須条件として挙げられる（非特許文献１参照）。
【０００３】
中でも、有機蛍光色素はサイズが小さく発光色の選択性も豊富なため、核酸やタンパク質などの生体分子の検出用標識体としてよく使われている（特許文献１参照）。しかし、殆どの有機蛍光色素は、有機溶媒中では溶解性が良く比較的高い量子収率を持つが、水溶液中ではそれが大幅に減少する傾向が強い。これは疎水性の高い有機蛍光色素の分子同士が水溶液中で分子間会合によって分散安定性が低下し蛍光が抑えられるためであり、スルホン酸やカルボン酸のような低分子の水溶性置換基を導入しても完全に解決することは困難である。また、有機蛍光色素を検出用標識体として用いるためには、種々生体分子に対し結合可能な官能基の修飾が必須となるが、これは合成が煩雑であったり、色素分子構造に影響を及ぼし消光を起こしやすかったりするなど、様々な問題点が指摘されていた（非特許文献２参照）。
【０００４】
前述の課題を解決する手段としては、水溶性ポリマーや核酸などに複数の有機蛍光色素を標識し、総発光強度などを向上させる方法が知られている。例えば、反応性官能基を有する水溶性ポリマー鎖に沿って、ランダムな位置に有機蛍光色素を化学結合させる方法（特許文献２参照）や、有機蛍光色素を標識したモノマー（例えば、ビニル系モノマー、合成又は天然のオリゴヌクレオチド）を予め合成した後、標識部分が組み込まれていない親水性コモノマーを共重合させる方法などが知られている（非特許文献３、特許文献３参照）。しかし、前者の場合は、ラジカル重合機構によって得られるポリマーであって、ポリマー鎖長や末端官能基の制御が困難なため、ポリマー又は生体活性リガンド一個当たりの有機蛍光色素数を定量的に標識できない難点があった。後者の場合は、標識したい有機蛍光色素を結合したモノマーをその都度合成しなければならないことが多く、重合条件によっては色素分子の光学特性が保持されにくい問題があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０００−１０６８７６号公報
【特許文献２】特表２００１−５２０８９３号公報
【特許文献３】特表２００５−５２９６０６号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｄｕｂｅｒｔｒｅｔ，Ｂ．ｅｔ．ａｌ．，ＳＣＩＥＮＣＥ．２００２，２９８，１７５９−１７６２．
【非特許文献２】Ｏｗ，Ｈ．ｅｔ．ａｌ．，Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ．２００５，５，１１３−１１７．
【非特許文献３】Ｎｅｓｅ，Ａ．ｅｔ．ａｌ．，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．２０１１，４４，５９０５−５９１０．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、生化学的な目的で使用することを可能にする発光性官能基を定量的に結合した水溶性発光標識ポリマーを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、線状型ポリエチレンイミン誘導体に、親水性官能基、発光性官能基、及び生体分子に結合能を有する末端官能基を定量的に結合した水溶性発光標識ポリマーを合成できることを見出し、本発明を完成した。
【０００９】
すなわち、本発明は以下の［１］〜［５］を提供するものである。
［１］下記式（１）で表される繰り返し単位
【００１０】
【化１】
2014152248.tif 000003
【００１１】
（式中、Ｒ1は−ＣＯＯＨ、−ＯＨ又は−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｐＲ1’（ここで、Ｒ1’は−ＣＯＯＨ、−ＯＨ、−ＣＨ＝ＣＨ２、−Ｃ≡ＣＨ又は−Ｎ３、ｐは１〜３０の整数である。）であり、ｌは１〜１０の整数である。）、
下記式（２）で表される繰り返し単位
【００１２】
【化２】
2014152248.tif 000004
【００１３】
（式中、Ｒ２は発光性官能基、−ＮＨＲ３、−ＳＲ４（ここで、Ｒ３は水素原子又はｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基、２，２，２−トリクロロエトキシカルボニル基、アリルオキシカルボニル基、フタロイル基、ｐ−トルエンスルホニル基及び２−ニトロベンゼンスルホニル基から選択されるアミノ基の保護基であり、Ｒ４は水素原子又はベンジル基、メトキシベンジル基、Ｎ−（アセチル）アミノメチル基、ｔ−ブチル基、メチルベンジル基、３、４−ジメチルベンジル基、トリフェニルメチル基、ベンズヒドリル基、アセタミドメチル基、カルボメトキシスルフェニル基、３−ニトロ−２−ピリジンスルフェニル基、エチルカルバモイル基、９−フルオレニルメチル基及びピリジルスルフィド基から選択されるチオール基の保護基である。）又は−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｐＲ２’（ここで、Ｒ２’は発光性官能基、−ＮＨＲ３又は−ＳＲ４、ｐは１〜３０の整数である。）であって、繰返し単位数ｙ中の発光性官能基を含む繰返し単位数ａ、−ＮＨＲ３を含む繰返し単位数ｂ及び−ＳＲ４を含む繰返し単位数ｃが、ｂ／ａ＋ｂ＝０〜０．９０及びｃ／ａ＋ｃ＝０〜０．９５であり、ｍは１〜１０、ｎは０〜１０の整数である。）、並びに
下記式（３）で表される繰り返し単位
【００１４】
【化３】
2014152248.tif 000005
【００１５】
を含み、式（１）の繰返し単位数ｘ、式（２）の繰返し単位数ｙ及び前記式（３）の繰返し単位数ｚが、ｘ／（ｘ＋ｙ＋ｚ）＝０．０１〜０．９０、ｙ／（ｘ＋ｙ＋ｚ）＝０．０１〜０．５０及びｚ／（ｘ＋ｙ＋ｚ）＝０．０１〜０．９０であって、前記式（１）、（２）及び（３）の繰返し単位で構成されるポリマー主鎖の少なくとも一方の末端が、−ＣＯＯＨ、−ＯＨ、−ＮＨ２、−ＳＨ、−ＮＣＯ、−ＣＨＯ、−ＣＨ＝ＣＨ２、−Ｃ≡ＣＨ、−Ｎ３及びビオチニル基からなる群から選択される少なくとも一つの官能基を含むことを特徴とする、水溶性発光標識ポリマー。
［２］前記ポリマー主鎖と前記末端官能基との間に、スペーサーとして−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｑ−（ここで、ｑは１〜１２０の整数である。）を含むことを特徴とする、［１］に記載の水溶性発光標識ポリマー。
［３］前記発光性官能基が、アミノ基を介して結合したＢＯＤＩＰＹ、アミノ基を介して結合したＣｙ３、アミノ基を介して結合したＣｙ５、アミノ基を介して結合したユウロピウム錯体又はフルオレセインである、［１］又は［２］に記載の水溶性発光標識ポリマー。
［４］前記ｘ、ｙ及びｚが、ｘ＋ｙ＋ｚ＝１０〜３５０であることを特徴とする、［１］〜［３］のいずれかに記載の水溶性発光標識ポリマー。
［５］［１］〜［４］のいずれかに記載の水溶性発光標識ポリマーを含有する、試薬。
【発明の効果】
【００１６】
本発明により、複数の発光性官能基及び生体分子に対し結合能を有する官能基を合わせ持つ水溶性発光標識ポリマーの形成が可能となる。また、本発明の水溶性発光標識ポリマーは水中分散安定性であり、かつ、発光性官能基数を制御することで発光特性が増強できる特徴を有することから、生化学的な用途に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、発光性官能基を定量的に結合する水溶性発光標識ポリマーの合成スキームである。
【図２】図２は、Ｂｏｃ−ＮＨ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＥＩ（合成中間体１−４）の１Ｈ−ＮＭＲスペクトラムの説明図である。
【図３】図３は、Ｂｏｃ−ＮＨ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＥＩ（合成中間体１−４）のＧＰＣダイアグラムの説明図である。
【図４】図４は、Ｂｉｏｔｉｎ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＥＩ（合成中間体１−５Ａ）のＧＰＣダイアグラムの説明図である。
【図５】図５は、Ｂｉｏｔｉｎ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＥＩ（合成中間体１−５Ｂ）の１Ｈ−ＮＭＲスペクトラムの説明図である。
【図６】図６は、Ｂｏｃ−ＮＨ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＥＩ[ＣＯＯＨ（１８）：ＥＩ（５）]（合成中間体１−６）の１Ｈ−ＮＭＲスペクトラムの説明図である。
【図７】図７は、（Ａ）Ｂｉｏｔｉｎ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＥＩ[ＣＯＯＨ（９）：ＥＩ（１４）]（合成中間体１−７Ａ）、（Ｂ）Ｂｉｏｔｉｎ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＥＩ[ＣＯＯＨ（７）：ＥＩ（１６）]（合成中間体１−７Ｂ）及び（Ｃ）Ｂｉｏｔｉｎ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＥＩ[ＣＯＯＨ（３）：ＥＩ（２０）]（合成中間体１−７Ｃ）の１Ｈ−ＮＭＲスペクトラムの説明図である。
【図８】図８は、Ｂｏｃ−ＮＨ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＥＩ[ＣＯＯＨ（１）：ＥＩ（５）：ＣＡＳＳＰｙ（１７）]（合成中間体１−８）の１Ｈ−ＮＭＲスペクトラムの説明図である。
【図９】図９は、（Ａ）Ｂｉｏｔｉｎ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＥＩ[ＣＯＯＨ（１）：ＥＩ（１４）：ＮＨ−Ｂｏｃ（８）]（合成中間体１−１０Ａ）、（Ｂ）Ｂｉｏｔｉｎ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＥＩ[ＣＯＯＨ（３）：ＥＩ（１６）：ＮＨ−Ｂｏｃ（４）]（合成中間体１−１０Ｂ）及び（Ｃ）Ｂｉｏｔｉｎ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＥＩ[ＣＯＯＨ（１）：ＥＩ（２０）：ＮＨ−Ｂｏｃ（２）]（合成中間体１−１０Ｃ）の１Ｈ−ＮＭＲスペクトラムの説明図である。
【図１０】図１０は、（Ａ）Ｂｏｃ−ＮＨ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＥＩ[ＣＯＯＨ（１５）：ＥＩ（５）：フルオレセイン（３）] （重合体３−１Ａ）と（Ｂ）Ｂｏｃ−ＮＨ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＥＩ[ＣＯＯＨ（１７）：ＥＩ（５）：フルオレセイン（１）] （重合体３−１Ｂ）の１Ｈ−ＮＭＲスペクトラムの説明図である。
【図１１】図１１は、Ｂｉｏｔｉｎ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＥＩ［ＣＯＯＨ（１）：ＥＩ（２０）：ＮＨ２（１）：ＢＯＤＩＰＹ（１）］（重合体３−２Ａ）の１Ｈ−ＮＭＲスペクトラムの説明図である。
【図１２Ａ】図１２Ａは、水溶液中におけるＢｉｏｔｉｎ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＥＩ［ＣＯＯＨ（１）：ＥＩ（２０）：ＮＨ２（１）：ＢＯＤＩＰＹ（１）］とＢｉｏｔｉｎ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＥＩ［ＣＯＯＨ（１）：ＥＩ（１４）：ＮＨ２（４）：ＢＯＤＩＰＹ（４）］の蛍光スペクトルを表すグラフである。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、水溶液中におけるＢｉｏｔｉｎ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＥＩ［ＣＯＯＨ（１）：ＥＩ（２０）：Ｅｕ（２）］とＢｉｏｔｉｎ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＥＩ［ＣＯＯＨ（１）：ＥＩ（１４）：Ｅｕ（８）］の蛍光スペクトルを表すグラフである。
【図１３Ａ】図１３Ａは、Ｂｉｏｔｉｎ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＥＩ［ＣＯＯＨ（１）：ＥＩ（２０）：ＮＨ２（１）：ＢＯＤＩＰＹ（１）］とＢｉｏｔｉｎ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＥＩ［ＣＯＯＨ（１）：ＥＩ（１４）：ＮＨ２（４）：ＢＯＤＩＰＹ（４）］のＤＮＡチップでの発光強度の比較を表すグラフである。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、Ｂｉｏｔｉｎ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＥＩ［ＣＯＯＨ（１）：ＥＩ（２０）：Ｅｕ（２）］とＢｉｏｔｉｎ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＥＩ［ＣＯＯＨ（１）：ＥＩ（１４）：Ｅｕ（８）］のＤＮＡチップでの発光強度の比較を表すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下に、本発明を実施するための好適な形態について説明する。
【００１９】
［水溶性発光標識ポリマーの合成］
水溶性発光標識ポリマーとは、発光性官能基を水溶性ポリマーの側鎖に定量的に結合することで得られるものである。該水溶性発光標識ポリマーに複数の発光性官能基が標識されることで、発光特性を向上させる効果を有している。具体的には、水溶性ポリマーに水中分散安定性を阻害しない最適な数の発光性有機分子を結合し、水溶性発光標識ポリマーとすることで発光強度を向上させる効果を有している（図１参照）。
【００２０】
本発明の水溶性発光標識ポリマーは、前記式（１）で表される繰返し単位からなる親水性官能基を有するセグメント、前記式（２）で表される繰返し単位からなる発光特性を有する官能基（以下、「発光性官能基」という。）を含むセグメント、前記式（３）で表される繰り返し単位からなるセグメント、及び前記式（１）、（２）及び（３）の繰返し単位で構成されるポリマー主鎖の少なくとも一方の末端が、生体分子に対し結合能を有する官能基である、−ＣＯＯＨ、−ＯＨ、−ＮＨ２、−ＳＨ、−ＮＣＯ、−ＣＨＯ、−ＣＨ＝ＣＨ２、−Ｃ≡ＣＨ、−Ｎ３及びビオチニル基からなる群から選択される少なくとも一つの官能基を含むことを特徴としている。
【００２１】
前記式（１）で表される繰返し単位からなる親水性官能基を有するセグメントは、水中分散安定性を高める特性を持つ親水性官能基（Ｒ１）を有する。Ｒ１の具体例としては、−ＣＯＯＨ、−ＯＨ又は（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｐＲ1’（ここで、Ｒ1’は−ＣＯＯＨ、−ＯＨ、−ＣＨ＝ＣＨ２、−Ｃ≡ＣＨ又はＮ３、ｐは１〜３０の整数である。）が挙げられるが、好ましくは−ＣＯＯＨ、−ＯＨ又は（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｐＲ1’（ここで、Ｒ1’は−ＣＯＯＨ、−ＯＨ、ｐは１〜５の整数である。）であり、より好ましくは−ＣＯＯＨである。また、ｌは１〜１０の整数であるが、好ましくは、ｌは２〜４の整数である。
【００２２】
前記式（２）で表される繰返し単位からなるセグメントは、発光性官能基に置換可能なアミノ基又はチオール基を含む部位を有しており、その一部又は全部が、水溶性ポリマーに発光特性を付与することが可能な発光性官能基に置換される。また、発光性官能基はアミノ基又はチオール基を含むスペーサー構造を介して結合していてもよく、スペーサー構造の具体例としては、−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｐ−（ここで、ｐは１〜１２０、好ましくは１〜３０の整数である。）が挙げられる。また、アミノ基又はチオール基は一部保護基で保護されていてもよく、それにより前記式（２）で表される繰返し単位からなるセグメントに結合する発光性官能基の結合数を調節することができる。アミノ基に対する保護基の具体例としては、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基、２，２，２−トリクロロエトキシカルボニル基、アリルオキシカルボニル基、フタロイル基、ｐ−トルエンスルホニル基、２−ニトロベンゼンスルホニル基が挙げられ、チオール基に対する保護基の具体例としては、ベンジル基、メトキシベンジル基、Ｎ−（アセチル）アミノメチル基、ｔ−ブチル基、メチルベンジル基、３、４−ジメチルベンジル基、トリフェニルメチル基、ベンズヒドリル基、アセタミドメチル基、カルボメトキシスルフェニル基、３−ニトロ−２−ピリジンスルフェニル基、エチルカルバモイル基、９−フルオレニルメチル基及びピリジルスルフィド基が挙げられる。
【００２３】
発光性官能基とは、産業上の種々の利用において特に有用となる発光特性、具体的には蛍光性又は燐光性を示す有機色素分子であり、具体例として、蛍光色素又は希土類蛍光錯体が挙げられる。
【００２４】
蛍光色素とは、光などのエネルギーを吸収して励起した際、分子内での振動や回転運動などにエネルギーを費やすのではなく、光として放出する、高度にπ共役した有機色素であり、蛍光増白剤、蛍光マーカー、臨床診断試薬などに使用されることが知られている。複数の蛍光色素を水溶性ポリマーに標識することで蛍光色素単体の蛍光強度が増幅されるため、本発明により蛍光色素を蛍光試薬として適用することが可能になる。そして、本発明においては、ＢＯＤＩＰＹ、Ｃｙ３、Ｃｙ５又はフルオレセインを含む蛍光色素が好ましく用いられる。
【００２５】
希土類蛍光錯体が好ましく用いられる。希土類蛍光錯体とは、紫外光を吸収し可視光を発する有機色素の一つであり、前記蛍光色素に比べ、長い蛍光寿命（普通の蛍光色素の数ナノ秒に対し、数十〜数百マイクロ秒以上）、大きいストークスシフト、シャープな蛍光ピークという蛍光特性を有することから、時間分解蛍光測定用標識剤として使用されることが知られている。時間分解蛍光測定を用いると、励起光や生体サンプルに由来する短寿命のバックグラウンド蛍光による妨害を回避し、高感度測定が可能となる。複数の希土類蛍光錯体を水溶性ポリマーに標識することで希土類蛍光錯体単体の蛍光強度が増幅されるため、本発明により希土類蛍光錯体を蛍光試薬として適用することが可能になる。そして、本発明においてはユウロピウム錯体が好ましく用いられる。
【００２６】
なお、前記発光性官能基は、前記式（２）で表される繰り返し単位からなるセグメントにおいて、アミノ基又はチオール基を介して結合させるため、予め前記発光性官能基にアミノ基又はチオール基を介して結合しうるような官能基を付与しておく必要がある。前記発光性官能基にアミノ基を介して結合しうるような官能基としてはカルボキシル基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基などの活性エステル基、シアヌル酸クロリド、イソシアネート基、イソチオシアネート基が挙げられ、チオール基を介して結合しうるような官能基としては、マレイミド基、ヨードアセトアミド基、ハロゲン化アルキル基、ハロゲノアセチル基（例えば、ヨードアセチル基、ブロモアセチル基、クロロアセチル基）、ジスルフィド結合を形成できる官能基（例えば、チオール基、メタンチオスルフォネート（ＭＴＳ））が挙げられる。反応時には必要により反応を促進させる添加剤、触媒などを用いてもよく、例えば、前記発光性官能基にアミノ基を介して結合しうるような官能基としてカルボキシル基を用いる場合、縮合剤を用いてもよい。
【００２７】
前記式（２）で表されるセグメントにおける、前記発光性官能基を含む単位数ａ、前記発光性官能基を含まない単位数ｂ及びｃは、ｂ／ａ＋ｂ＝０〜０．９０及びｃ／ａ＋ｃ＝０〜０．９５であるが、好ましくはｂ／ａ＋ｂ＝０〜０．８８及びｃ／ａ＋ｃ＝０〜０．９４である。また、ｍは１〜１０の整数であるが、好ましくはｍは２〜４の整数であり、ｎは０〜１０の整数であるが、好ましくはｎは０〜４の整数である。
【００２８】
前記式（３）で表される繰返し単位からなるセグメントは、前記発光性官能基のポリマーへの導入量制御に有効な重合機構から得られるポリエチレンイミンで構成されるセグメントである。公知の発光性官能基を有するビニル系ポリマー又は核酸ポリマーに比べ、ポリエチレンイミン系骨格を有する本発明の水溶性発光標識ポリマーはリビングカチオン重合機構から合成されるため、ポリマーの鎖長制御及び末端官能基の選択的結合が容易であることから、複数の発光性有機分子及び生体分子を定量的に有する水溶性発光標識ポリマーの形成に有効であると推測される。
【００２９】
さらに、前記式（１）、（２）及び（３）の繰返し単位で構成されるポリマー主鎖の少なくとも一方の末端は、生体分子に対し結合能を有する官能基である、−ＣＯＯＨ、−ＯＨ、−ＮＨ２、−ＳＨ、−ＮＣＯ、−ＣＨＯ、−ＣＨ＝ＣＨ２、−Ｃ≡ＣＨ、−Ｎ３及びビオチニル基からなる群から選択される少なくとも一つの官能基を含む。これら官能基を介して結合しうる生体分子としては、ＤＮＡやＲＮＡ等の核酸、タンパク質、ペプチド、糖、脂質などが挙げられるが、好ましくは核酸、タンパク質又はペプチドであり、より好ましくは核酸である。
【００３０】
生体分子が核酸の場合、核酸の一部に反応性基を導入し、その反応性基と水溶性発光標識ポリマーの末端官能基を反応させることにより核酸への結合が可能となる。例えば、末端アミノ基を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）反応を行なうことにより、末端アミノ基を有する二本鎖核酸が作製可能である。この核酸の末端アミノ基と水溶性発光標識ポリマー末端に導入したカルボキシル基とを縮合反応させることにより、核酸への水溶性発光標識ポリマーの結合が可能となる。
【００３１】
また、生体分子がタンパク質又はペプチドの場合、タンパク質又はペプチド中のリジン残基のアミノ基と水溶性発光標識ポリマー末端のカルボキシル基と結合させることにより、水溶性発光標識ポリマーとタンパク質又はペプチドを結合することが可能となる。ビオチニル基を有する水溶性発光標識ポリマーを用いた場合、アビジン−ビオチン相互作用によりアビジン分子への固定化が可能となる。また、アビジンは１分子に４つ結合部位を持つため、例えば、ビオチニル基を導入した核酸に、まずアビジンを結合させ、さらに、末端にビオチニル基を有する水溶性発光標識ポリマーをアビジンの末結合部位に作用させることにより、核酸を水溶性発光標識ポリマーで標識することが可能となる。一方、一級アミノ基を有する水溶性発光標識ポリマーを用いた場合、ビオチニル基を介せず直接にアビジン分子を水溶性発光標識ポリマーで標識できるため、ビオチン−アビジン−ビオチンというサンドイッチ構造の染色方法における結合力低下を抑えることが可能となる。
【００３２】
さらに、生体分子が糖又は脂質の場合、水酸基の一部を活性化し、その活性化反応性基と水溶性発光標識ポリマーの末端官能基を反応させることにより糖又は脂質への結合が可能となる。例えば、糖鎖水酸基を活性化試薬により活性エステル基に変換した後、末端アミノ基を有する水溶性発光標識ポリマーと縮合反応させることにより、糖鎖への水溶性発光標識ポリマーの結合が可能となる。
【００３３】
前記各セグメントの構成比は、前記式（１）で表される繰り返し単位数をｘ、前記式（２）で表される繰り返し単位数をｙ、前記式（３）で表される繰り返し単位数をｚとする場合（ｘ、ｙ及びｚは整数）、ｘ／（ｘ＋ｙ＋ｚ）＝０．０１〜０．９０、ｙ／（ｘ＋ｙ＋ｚ）＝０．０１〜０．５０及びｚ／（ｘ＋ｙ＋ｚ）＝０．０１〜０．９０であることを特徴とし、好ましくはｘ／（ｘ＋ｙ＋ｚ）＝０．０４〜０．８０、ｙ／（ｘ＋ｙ＋ｚ）＝０．０４〜０．４０及びｚ／（ｘ＋ｙ＋ｚ）＝０．２０〜０．９０、より好ましくはｘ／（ｘ＋ｙ＋ｚ）＝０．０４〜０．７４、ｙ／（ｘ＋ｙ＋ｚ）＝０．０４〜０．３５及びｚ／（ｘ＋ｙ＋ｚ）＝０．２２〜０．８７である。ｘ、ｙ、及びｚが本数値範囲を外れてしまうと、水溶性発光標識ポリマーの水中分散安定性が悪くなってしまうため、好ましくない。なお、ｘ／（ｘ＋ｙ＋ｚ）、ｙ／（ｘ＋ｙ＋ｚ）及びｚ／（ｘ＋ｙ＋ｚ）は、水溶性発光標識ポリマーの１Ｈ−ＮＭＲスペクトラム及びＵＶ吸光度測定をもとに計算することができる（実施例参照）。
【００３４】
本発明の水溶性発光標識ポリマーの大きさを表すｘ、ｙ及びｚの合計値、すなわちポリマーの重合度（ＤＰ）については特に制限はないが、後述の水溶性発光標識ポリマーの水中分散安定性及び発光特性がｘ、ｙ及びｚの合計値によって制御されるという観点から、好ましくは１０〜３５０の範囲であり、より好ましくは２０〜３１０の範囲である。なお、水溶性発光標識ポリマーの重合度（ＤＰ）については、１Ｈ−ＮＭＲスペクトラムにより測定することができる（実施例参照）。
【００３５】
さらに、本発明の水溶性発光標識ポリマーは、前記式（１）、（２）及び（３）の繰返し単位で構成されるポリマー主鎖と前記末端官能基との間に、スペーサーとして−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｑ−（ｑは１〜１２０の整数）を含むことが好ましい。本スペーサーは親水性基として水溶性発光標識ポリマーの水中分散安定性及び前記末端官能基の生体分子との結合能を向上させる機能を有すると推測される。
【００３６】
本発明の水溶性発光標識ポリマーは、多分散度（ＰＤＩ：重量平均分子量（Ｍｗ）／数平均分子量（Ｍｎ））が１.３以下のポリオキサゾリンを重合する工程、該ポリオキサゾリン主鎖の少なくとも一方の末端に前述の官能基又は官能基を有するスペーサーを導入する工程、該ポリオキサゾリン側鎖の脱保護による線状型ポリエチレンイミンへ変換する工程、該線状型ポリエチレンイミンと親水性反応基を含む脂肪酸無水物又は脂肪酸ハライドを反応させて親水性官能基（Ｒ１）のセグメントを導入する工程、及び該線状型ポリエチレンイミンと発光性官能基を含む脂肪酸ハライドを反応させて発光性官能基（Ｒ２）を導入する工程により得ることができる。線状型ポリエチレンイミンの多分散度（ＰＤＩ）については、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）ダイアグラムにより測定することができる。
【００３７】
前記ポリオキサゾリンの重合及び該ポリオキサゾリン主鎖の少なくとも一方の末端に前述の官能基又は官能基を有するスペーサーの導入は、モノマーとしてオキサゾリン誘導体、カチオン重合開始剤及び求核停止剤を用いて下式（４）で示されるポリオキサゾリンを重合する工程、該ポリオキサゾリン主鎖の少なくとも一方の末端に前述の官能基又は官能基を有するスペーサーを導入する工程によって達成される。
【００３８】
【化４】
2014152248.tif 000006
【００３９】
（式中、Ｉｎはカチオン重合開始剤に由来する残基を表し、ＮＰは求核停止剤に由来する残基を表し、Ｒ５は直鎖もしくは分枝鎖の炭素数１〜２０のアルキル基（好ましくは、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ｔ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ヘキシル、オクチル、ドデシル、オクタデシル、エイコシル、及び１８−メチルノナデカニル）であり、ｒは前記ｘ，ｙ，ｚの合計値（好ましくは１０〜３５０の整数）である。）。
【００４０】
カチオン重合開始剤に由来する残基であるＩｎは、前記式（１）、（２）及び（３）の繰返し単位で構成されるポリマー主鎖の開始末端に前述の官能基又は官能基を有するスペーサーを導入できるカチオン重合開始剤の残基であれば特に限定されない。同様に、求核停止剤に由来する残基であるＮＰは、前記式（１）、（２）及び（３）の繰返し単位で構成されるポリマー主鎖の停止末端に官能基及びスペーサーを提供できる求核停止剤の残基であれば特に限定されない。
【００４１】
また、あらかじめ官能基又は官能基が付加したスペーサーを有するカチオン重合開始剤を使用することにより、前記式（４）で示されるポリオキサゾリンの重合工程と該ポリオキサゾリン主鎖の少なくとも一方の末端に前述の官能基又は官能基を有するスペーサーを導入する工程を一度に実施してもよい。同様に、あらかじめ官能基又は官能基が付加したスペーサーを有する求核停止剤を使用することにより、前記式（４）で示されるポリオキサゾリンの重合工程と該ポリオキサゾリン主鎖の少なくとも一方の末端に官能基又は官能基が付加されたスペーサーを導入する工程を一度に実施してもよい。
【００４２】
前記カチオン重合開始剤としては、一般式：ＴｓＯＲ６で表される、多種多様なトシラートが挙げられ、Ｒ基に該当する残基としては、限定されるものでないが、例えば、−（ＣＨ２）１−１０Ｒ６’（ここで、Ｒ６’は−ＣＯＯＨ、−ＯＨ、−ＮＨ２、−ＳＨ、−ＮＣＯ、−ＣＨＯ、−ＣＨ＝ＣＨ２、−Ｃ≡ＣＨ、−Ｎ３及びビオチニル基である。）又は−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｓＲ６’（ここで、Ｒ６’は−ＣＯＯＨ、−ＯＨ、−ＮＨ２、−ＳＨ、−ＮＣＯ、−ＣＨＯ、−ＣＨ＝ＣＨ２、−Ｃ≡ＣＨ、−Ｎ３及びビオチニル基、ｓは１〜１２０の整数である。）が具体例として挙げられる。また、Ｒ６’の一部は、オキサゾリンのカチオン開環重合に悪影響を及ぼさないよう、重合反応途中保護されてもよく、例えば、−ＣＯＯＨはメチル・エチルエステル、ベンジルエステル、ｔｅｒｔ−ブチルエステル、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル基の何れかで保護され、−ＯＨはメチル基、ベンジル基、ｐ−メトキシベンジル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、メトキシメチル基（ＭＯＭ）、２−テトラヒドロピラニル基（ＴＨＰ）、エトキシエチル基（ＥＥ）、アセチル基、ピバロイル基、ベンゾイル基、トリメチルシリル（ＴＭＳ）、トリエチルシリル（ＴＥＳ）、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＳ又はＴＢＤＭＳ）、トリイソプロピルシリル（ＴＩＰＳ）、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル（ＴＢＤＰＳ）の何れかで保護され、−ＳＨはベンジル基、メトキシベンジル基、Ｎ−（アセチル）アミノメチル基、ｔ−ブチル基、メチルベンジル基、３、４−ジメチルベンジル基、トリフェニルメチル基、ベンズヒドリル基、アセタミドメチル基、カルボメトキシスルフェニル基、３−ニトロ−２−ピリジンスルフェニル基、エチルカルバモイル基、９−フルオレニルメチル基又はピリジルスルフィド基の何れかで保護され、−ＮＨ２はｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基、２，２，２−トリクロロエトキシカルボニル基、アリルオキシカルボニル基、フタロイル基、ｐ−トルエンスルホニル基又は２−ニトロベンゼンスルホニル基の何れかで保護され、−ＣＨＯはジメチルアセタール、環状アセタール、ジチオアセタールの何れかで保護されることができる。
【００４３】
前記求核停止剤としては、前記ＮＰ残基に対応するアニオン活性末端を生じるアニオノイド化合物が挙げられ、限定されるものでないが、例えば、Ｈ２Ｏ、ＮａＯＨ、ＫＯＨ、ＮａＳＨ、ＫＳＨ、ＮＨ３、ＮＨＲ７Ｒ８（ここで、Ｒ７は水素原子もしくは炭素数１〜１０のアルキル基であり、Ｒ８は−（ＣＨ２）１−１０Ｒ８’（ここで、Ｒ８’は−ＣＯＯＨ、−ＯＨ、−ＮＨ２、−ＳＨ、−ＮＣＯ、−ＣＨＯ、−ＣＨ＝ＣＨ２、−Ｃ≡ＣＨ、−Ｎ３及びビオチニル基である。）又は−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｔＲ８’（ここで、Ｒ８’は前記定義と同じで、ｔは１〜１２０の整数である。）及び下式（５）で示される環状型２級アミン化合物の誘導体が具体例として挙げられる。なお、Ｒ８’の一部は前記の通り反応途中に保護されてもよい。
【００４４】
【化５】
2014152248.tif 000007
【００４５】
（式中、Ｒ８’は前記定義と同じ。）。
【００４６】
前記ポリオキサゾリンから線状型ポリエチレンイミンへの変換は、強酸性又は強塩基性試薬を用いた加水分解反応によって達成される。強酸性試薬としては、塩酸、硫酸、硝酸が挙げられるが、塩酸が好ましく用いられる。また、強塩基性試薬としては、水酸化カルシウム、水酸化バリウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムが挙げられるが、水酸化ナトリウム又は水酸化カリウムが好ましく用いられる。
【００４７】
前記親水性官能基（Ｒ１）を導入する工程において、親水性官能基を含む脂肪酸無水物を用いる場合、所望の構造を線状型ポリエチレンイミンに導入することができるものであれば特に限定されないが、例えば、下式（６）で表される直鎖脂肪酸無水物を挙げることができる。
【００４８】
【化６】
2014152248.tif 000008
【００４９】
（式中、Ｒ１及びｌは前記定義と同じ。）。
【００５０】
なお、Ｒ１の一部は前記の通り反応途中に保護されてもよい。
【００５１】
また、Ｒ１として−ＣＯＯＨを導入する場合、下式（７）で表される二価カルボン酸の環状無水物、好ましくはコハク酸無水物、グルタル酸無水物又はアジピン酸無水物を使用することができる。
【００５２】
【化７】
2014152248.tif 000009
【００５３】
（式中、ｌは前記定義と同じ。）。
【００５４】
前記親水性官能基（Ｒ１）を導入する工程において、親水性反応基を含む脂肪酸ハライドを用いる場合、所望の構造を線状型ポリエチレンイミンに導入することができるものであれば特に限定されないが、好適には下式（８）で表される化合物を挙げることができる。
【００５５】
【化８】
2014152248.tif 000010
【００５６】
（式中、Ｒ1及びｌは前記定義と同じ。）。
【００５７】
なお、Ｒ１の一部は前記の通り反応途中に保護されてもよい。
【００５８】
前記発光性官能基を導入するためのアミノ基又はチオール基を導入する工程において、アミノ基又はチオール基を含む脂肪酸ハライドを用いる場合、所望の構造を線状型ポリエチレンイミンに導入することができるものであれば特に限定されないが、下式（９）で表される化合物を好ましく使用することができる。
【００５９】
【化９】
2014152248.tif 000011
【００６０】
（式中、Ｒ９はアミノ基又はチオール基、ｍ及びｎは前記定義と同じ。）。
【００６１】
なお、Ｒ９は反応途中で前述のアミノ基又はチオール基の保護基によって一部保護されていてもよい。
【００６２】
また、前記親水性反応基のＲ１として−ＣＯＯＨを導入する場合、該−ＣＯＯＨと前記アミノ基又はチオール基を含むアミン化合物を反応させる工程により前記発光性官能基を導入するためのアミノ基又はチオール基を導入することができる。具体的には、下式（１０）で表されるアミン化合物、好ましくは、エチレンジアミン、プロピレンジアミン、ブチレンジアミン、２−メルカプトエチルアミン、３−メルカプトプロピルアミン、又は４−メルカプトブチルアミンを−ＣＯＯＨと縮合反応させることにより、導入された親水性反応基の一部をアミノ基又はチオール基とすることができる。
【００６３】
【化１０】
2014152248.tif 000012
【００６４】
（式中、Ｒ９及びｎは前記定義と同じ。）。
【００６５】
なお、Ｒ９は前記の通り反応途中で一部保護されていてもよい。
【００６６】
前記式（２）で表される繰返し単位からなるセグメントは、前記式（９）又は（１０）で表される繰り返し単位からなるセグメントのアミノ基又はチオール基と、予めアミノ基又はチオール基を介して結合しうるような官能基が付与された前記発光性官能基を反応させる方法、あるいは前記式（９）又は（１０）で表される繰り返し単位からなるセグメントのアミノ基又はチオール基を用いず、具体的にはＲ１として導入された親水性官能基が−ＣＯＯＨの場合において、該−ＣＯＯＨと予め−ＣＯＯＨを介して結合しうるような官能基、例えば、アミノ基が付与された前記発光性官能基を反応させる方法によっても得ることができる。
【００６７】
本発明の水溶性発光標識ポリマーにおける各セグメントの構成比、すなわちｘ（前記式（１）で表される繰返し単位数）：ｙ（前記式（２）で表される繰返し単位数）：ｚ（前記式（３）で表される繰返し単位数）は、線状型ポリエチレンイミンの主鎖２級アミンに対し、親水性反応基及び発光性官能基を含む反応基を所望とする割合に合わせて順次に反応させることによって調節することができる。詳細には、例えば、線状型ポリエチレンイミンの主鎖２級アミンに対し、前記化学式（６）で表される親水性官能基を含む直鎖脂肪酸無水物を反応させｘを導入した後、前記化学式（９）で表されるアミノ基又はチオール基を含む脂肪酸ハライドを反応させた後、予めアミノ基又はチオール基を介して結合しうるような官能基が付与された前記発光性官能基を反応させｙを導入することによってｘ：ｙ：ｚの構成比を調節する方法、又は前記化学式（８）で表される親水性官能基を含む脂肪酸ハライドを反応させｘを導入した後、前記化学式（９）で表されるアミノ基又はチオール基を含む脂肪酸ハライドを反応させた後、予めアミノ基又はチオール基を介して結合しうるような官能基が付与された前記発光性官能基を反応させｙを導入することによってｘ：ｙ：ｚの構成比を調節する方法、前記化学式（７）で表される二価カルボン酸の環状無水物を反応させｘを導入した後、前記化学式（１０）で表されるアミノ基又はチオール基を含むアミン化合物を反応させた後、予めアミノ基又はチオール基を介して結合しうるような官能基が付与された前記発光性官能基を反応させｙを導入することによってｘ：ｙ：ｚの構成比を調節する方法、又は前記化学式（７）で表される二価カルボン酸の環状無水物を反応させｘを導入した後、予め−ＣＯＯＨを介して結合しうるような官能基が付与された前記発光性官能基を反応させｙを導入することによってｘ：ｙ：ｚの構成比を調節する方法などが挙げられる。
【００６８】
本発明の水溶性発光標識ポリマーの前記式（２）で表される繰り返し単位からなるセグメントにおけるａ、ｂ及びｃの構成比は、アミノ基又はチオール基の一部を保護基で保護した後、残りのアミノ基又はチオール基に発光性官能基を反応させる方法、あるいはアミノ基又はチオール基の全部を脱保護した後、導入したい分子数の発光性官能基を反応させる方法などによって調節することができる。
【００６９】
本発明の水溶性発光標識ポリマーに結合される発光性官能基の数は、発光性有機分子の特性を向上させること及び水中分散安定性が保持されることという観点において、例えば、ポリマー鎖長（ＤＰ）＝２３に対し、２〜１７個の範囲が好ましく、２〜８個の範囲がより好ましい。
【００７０】
本発明の水溶性発光標識ポリマーの化学組成及び発光特性などについては、１Ｈ−ＮＭＲスペクトラム、ＵＶ吸収又は蛍光分光測定によって確認することができる。
【００７１】
［試薬］
本発明の水溶性発光標識ポリマーは、物質間の相互作用を検出する様々な技術（以下、「センシング技術」という。）における検出試薬として適用可能であり、体内に存在する、又は体内で生成される極微量の生体分子を高感度に検出するための試薬として好ましく使用することができるため、人の健康状態の診断・予測、創薬、その他の分野において、広範囲に活用することができる。センシング技術の検出対象となる生体分子としては、前述の通りゲノムＤＮＡ、ＲＮＡなどの核酸、タンパク質、ペプチド、糖、脂質などが挙げられる。
【００７２】
具体的には、生体内の核酸を検出する場合、該核酸検出のためのツールとして多数のプローブ核酸を基材に固定したＤＮＡチップが知られているが、生体内から抽出して前記水溶性発光標識ポリマーで標識化した核酸又はその複製物を基材上のプローブ核酸とハイブリダイゼーションさせ、前記水溶性発光標識ポリマー由来の基材上のシグナルを検出することで、生体内の核酸の有無を検出することができる。あるいは、生体内の核酸又はその複製物を非標識のまま基材上のプローブ核酸とハイブリダイゼーションさせた後に化学反応などで核酸に前記水溶性発光標識ポリマーを結合させることにより、前記水溶性発光標識ポリマー由来の基材上のシグナルを検出することができる。
【００７３】
また、生体内のタンパク質を検出する場合も、前記核酸の検出方法と同様の手法で該タンパク質と基材上に固定化されたタンパク質又は核酸との相互作用を利用することにより生体内のタンパク質の有無を検出することができる。
【実施例】
【００７４】
以下、実施例に沿って本発明の特徴を更に具体的に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。また、実施例で用いられる各種化合物については試薬として販売されているものを使用した。
【００７５】
実施例１  水溶性ポリマーの合成
（合成中間体１−１Ａ：ＯＨ−ＰＥＩ）
乾燥アルゴン雰囲気下、アセトニトリル（５０ｍＬ）の溶媒中、開始剤のメチルパラトシラート（８ｍｍｏｌ、１．２ｍＬ）とモノマーの２−エチル−２−オキサゾリン（ＥｔＯｘ）（１７６．８ｍｍｏｌ、１７．８４ｍＬ）を加え、カチオン開環重合を行った。恒温槽５０℃で７日間反応させた後、室温に冷却し、１Ｍ  水酸化ナトリウム・メタノール混合溶媒によって停止反応を行った（停止末端に水酸基（−ＯＨ）導入）。水透析により精製後、減圧乾燥にて約７ｇの重合体を回収した。得られたポリ(２−エチル−２−オキサゾリン)（ＰＥｔＯｘ）の重合度と多分散度は、それぞれ１Ｈ−ＮＭＲスペクトラムとＧＰＣダイアグラムにより確認した（重合度（ＤＰ）＝２３、多分散度（ＰＤＩ：Ｍｗ／Ｍｎ）＝１．１、水酸基（−ＯＨ）導入率＝１００％）。
【００７６】
側鎖分解反応によって線状型ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を得るため、ＰＥｔＯｘ（３ｇ）を３７％塩酸（３０ｍＬ）と水（２４ｍＬ）の混合溶媒に溶解させ、約１１０℃で２４時間還流させた。反応溶液が完全に透明になるまで水酸化ナトリウムペレットを投入しながら、ｐＨ９〜１０に調整した後、水透析、凍結乾燥にて１．２ｇのＰＥＩを回収した。得られた重合体について１Ｈ−ＮＭＲで測定した結果、ＰＥｔＯｘの骨格及び側鎖の水素由来のピークは全て消えており、ＰＥＩ骨格のエチレンイミン（−ＮＨＣＨ２ＣＨ２−）のメチレン水素由来のピークが３．２〜３．４ｐｐｍ付近に存在することから、側鎖分解反応が定量的に行われたことを確認した。
【００７７】
合成中間体１−１Ａと同様の合成操作によって得られた鎖長の異なるＯＨ−ＰＥＩ（合成中間体１−１Ｂ、１−１Ｃ、１−１Ｄ）の合成条件及び組成は以下に示す通りであった。
【００７８】
（合成中間体１−１Ｂ：ＯＨ−ＰＥＩ）
仕込み量：アセトニトリル（３０ｍＬ）、メチルパラトシラート（２ｍｍｏｌ、０．３ｍＬ）、ＥｔＯｘ（８８．４ｍｍｏｌ、８．９２ｍＬ）、収量：８ｇ、重合度（ＤＰ）＝４３、多分散度（ＰＤＩ：Ｍｗ／Ｍｎ）＝１．１、水酸基（−ＯＨ）導入率＝１００％）。
【００７９】
（合成中間体１−１Ｃ：ＯＨ−ＰＥＩ）
仕込み量：アセトニトリル（３０ｍＬ）、メチルパラトシラート（１ｍｍｏｌ、０．１５ｍＬ）、ＥｔＯｘ（８８．４ｍｍｏｌ、８．９２ｍＬ）、収量：８ｇ、重合度（ＤＰ）＝９３、多分散度（ＰＤＩ：Ｍｗ／Ｍｎ）＝１．１、水酸基（−ＯＨ）導入率＝１００％）。
【００８０】
（合成中間体１−１Ｄ：ＯＨ−ＰＥＩ）
仕込み量：アセトニトリル（３６ｍＬ）、メチルパラトシラート（０．３ｍｍｏｌ、０．０４５ｍＬ）、ＥｔＯｘ（９６ｍｍｏｌ、９．７ｍＬ）、収量：７ｇ、重合度（ＤＰ）＝３０２、多分散度（ＰＤＩ：Ｍｗ／Ｍｎ）＝１．１、水酸基（−ＯＨ）導入率＝１００％）。
【００８１】
（合成中間体１−２：ＮＨ２−ＰＥＩ）
乾燥アルゴン雰囲気下、アセトニトリル（５０ｍＬ）の溶媒中、開始剤のメチルパラトシラート（８ｍｍｏｌ、１．２ｍＬ）とモノマーの２−エチル−２−オキサゾリン（ＥｔＯｘ）（１７６．８ｍｍｏｌ、１７．８４ｍＬ）を加え、カチオン開環重合を行った。恒温槽５０℃で７日間反応させた後、停止剤として４−（Ｎ−Ｂｏｃ−アミノ）ピペリジン（１６ｍｍｏｌ、３．２ｇ）を投入した後、恒温槽５０℃で１日間停止反応を行った。水透析により精製後、減圧乾燥にて７ｇの重合体を回収した。得られた重合体（ＰＥｔＯｘ）の重合度及び停止末端へのＮ−Ｂｏｃ−アミノ基の導入率は、１Ｈ−ＮＭＲスペクトラムにより確認された（重合度（ＤＰ）＝２３、多分散度（ＰＤＩ：Ｍｗ／Ｍｎ）＝１．１、導入率＝１００％）。
【００８２】
停止末端Ｂｏｃの脱保護反応によって、一級アミノ基（−ＮＨ２）を導入すると同時に、側鎖分解反応によって線状型ＰＥＩを得るため、ＰＥｔＯｘ（７ｇ）を３７％塩酸（７０ｍＬ）と水（５６ｍＬ）の混合溶媒に溶解させ、約１１０℃で２４時間還流させた。反応溶液が完全に透明になるまで水酸化ナトリウムペレットを投入しながら、ｐＨ９〜１０に調整した後、水透析、凍結乾燥にて２．５ｇの重合体を回収した。得られた重合体の１Ｈ−ＮＭＲ測定を行ったところ、ＰＥｔＯｘの骨格及び側鎖のエチル水素由来のピークは全て消えており、ＰＥＩ骨格のエチレンイミン（−ＮＨＣＨ２ＣＨ２−）のメチレン水素由来のピークが３．２〜３．４ｐｐｍ付近に存在すること及びＰＥｔＯｘ停止末端のＮ−Ｂｏｃ保護基のメチル水素に由来するピークが完全に消えたことから、側鎖分解反応が定量的に行われたことを確認した。
【００８３】
（合成中間体１−３：Ｂｉｏｔｉｎ−ＰＥＩ）
停止末端に一級アミノ基を導入したＰＥＩ（合成中間体１−２）（０．１８ｍｍｏｌ、１８０ｍｇ）の０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３（１５ｍＬ）／ＤＭＳＯ（２５ｍＬ）混合溶媒中に、Ｂｉｏｔｉｎ−ＮＨＳ（０．８９ｍｍｏｌ、３０５ｍｇ）を入れて、室温で攪拌しながら２４時間反応させた後、エタノール透析、水透析を順次に行った。透析後に凍結乾燥にて、末端にビオチニル基を導入したＢｉｏｔｉｎ−ＰＥＩ（収量：１４６ｍｇ）を回収した。得られたポリマーの末端ビオチニル基の導入率は、１Ｈ−ＮＭＲスペクトラムのエチレンイミン骨格（−ＮＨＣＨ２ＣＨ２−）のメチレン水素とアミド結合部位のメチレン水素から算出できた（ビオチニル基の導入率は１００％）。
【００８４】
（合成中間体１−４：Ｂｏｃ−ＮＨ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＥＩ）
停止末端に一級アミノ基を導入したＰＥＩ（合成中間体１−２）（０．４５ｍｍｏｌ、５１３．７ｍｇ）を超純水（７ｍＬ）に溶解させた。また、両末端にＢｏｃ保護された一級アミノ基及び活性エステル基をあわせ持つポリエチレングリコール（Ｂｏｃ−ＮＨ−ＰＥＧ１０３−ＮＨＳ）（日本油脂株式会社製、ＢＯ−０５０ＴＳ、ＭＷ＝４５２２）（０．４５ｍｍｏｌ、２．１２ｇ）を超純水（８ｍＬ）に入れて溶解させた。次いで、両方のポリマー水溶液を混合させ、室温で攪拌しながら４８時間反応させた後、水透析及びイオン交換クロマトグラフィー精製を順次に行った。その後、凍結乾燥にて停止末端にＰＥＧスペーサーを介する保護された一級アミノ基を導入したＢｏｃ−ＮＨ−ＰＥＧ−ＰＥＩ（収量：１ｇ）を回収した。重合体の１Ｈ−ＮＭＲ測定を行ったところ、ＰＥＧ骨格のエチレンオキシド（−ＯＣＨ２ＣＨ２−）のメチレン水素由来のピーク（ｂ）が３．５〜３．７ｐｐｍ付近に存在すること、ＰＥＩ骨格のエチレンイミン（−ＮＨＣＨ２ＣＨ２−）のメチレン水素由来のピーク（ａ）が２．６〜２．７ｐｐｍ付近に存在すること及びＰＥＧ停止末端のＢｏｃ保護基のメチル水素に由来するピーク（ｃ）が１．４ｐｐｍ付近に存在することから、停止末端にＰＥＧスペーサーを介するＢｏｃ保護一級アミノ基を持つＢｏｃ−ＮＨ−ＰＥＧ（１０３）−ｂ−ＰＥＩ（２３）が得られたことを確認した（図２）。また、精製後のポリマー純度（９６％）については、水系ＧＰＣ（東ソー株式会社製の高速ＧＰＣシステム“ＨＬＣ−８３２０ＧＰＣ  ＥｃｏＳＥＣ”、ＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００ＰＷＸＬ−ＣＰ、ＴＳＫ  ｇｕａｒｄ  ｃｏｌｕｍｎ）測定によって確認された（図３）。
【００８５】
（合成中間体１−５Ａ：Ｂｉｏｔｉｎ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＥＩ）
停止末端に一級アミノ基を導入したＰＥＩ（合成中間体１−２）（０．０３ｍｍｏｌ、１２０ｍｇ）を超純水（１ｍＬ）に溶解させた。また、両末端にビオチニル基及び活性エステル基をあわせ持つポリエチレングリコール（Ｂｉｏｔｉｎ−ＰＥＧ１０３−ＮＨＳ）（日本油脂株式会社製、ＢＩ−０５０ＴＳ、ＭＷ＝５００３）（０．０２ｍｍｏｌ、１００ｍｇ）を超純水（１ｍＬ）に入れて溶解させた。次いで、両方のポリマー水溶液を混合させ、室温で攪拌しながら４８時間反応させた後、水透析及びイオン交換クロマトグラフィー精製を順次に行った。その後、凍結乾燥にて片末端にＰＥＧスペーサーを介するビオチニル基を導入したＢｉｏｔｉｎ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＥＩ（収量：２００ｍｇ）を回収した。重合体の１Ｈ−ＮＭＲ測定を行ったところ、ＰＥＧ骨格のエチレンオキシド（−ＯＣＨ２ＣＨ２−）のメチレン水素由来のピークが３．５〜３．７ｐｐｍ付近に存在すること、ＰＥＩ骨格のエチレンイミン（−ＮＨＣＨ２ＣＨ２−）のメチレン水素由来のピークが２．６〜２．７ｐｐｍ付近に存在すること及びビオチニル基の水素に由来するピークが４．６ｐｐｍに存在することから、停止末端にＰＥＧスペーサーを介するビオチニル基を導入したＢｉｏｔｉｎ−ＰＥＧ（１０３）−ｂ−ＰＥＩ（２３）が得られたことを確認した。また、精製後のポリマー純度又はビオチニル基の導入率（１００％）については、水系ＧＰＣ（東ソー株式会社製の高速ＧＰＣシステム“ＨＬＣ−８３２０ＧＰＣ  ＥｃｏＳＥＣ”、ＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００ＰＷＸＬ−ＣＰ、ＴＳＫ  ｇｕａｒｄ  ｃｏｌｕｍｎ）測定によって確認された（図４）。
【００８６】
（合成中間体１−５Ｂ：Ｂｉｏｔｉｎ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＥＩ）
停止末端にＰＥＧスペーサーを介するＢｏｃ保護一級アミノ基を持つＢｏｃ−ＮＨ−ＰＥＧ（１０３）−ｂ−ＰＥＩ（２３）（合成中間体１−４）（０．０７８ｍｍｏｌ、３００ｍｇ）を超純水（１２ｍＬ）に溶解させた後、３５％塩酸（３ｍＬ）を投入し、１時間Ｂｏｃの脱保護反応を行った。１Ｈ−ＮＭＲ測定によって、ＰＥＧスペーサーを介するＢｏｃ保護基のメチル水素に由来するピークが完全に消えたことから、フリーの一級アミノ基が１００％導入されたＮＨ２−ＰＥＧ−ｂ−ＰＥＩが得られたことを確認した。次いで、ＮＨ２−ＰＥＧ−ｂ−ＰＥＩ（３００ｍｇ）の０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３（１ｍＬ）水溶液に、両末端にビオチニル基及び活性エステル基をあわせ持つポリエチレングリコール（Ｂｉｏｔｉｎ−ＰＥＯ４−ＮＨＳ）（ＭＷ＝５８８．６７）（０．２７ｍｍｏｌ、１５７．７ｍｇ）を入れて２４時間反応させた。その後、水透析、凍結乾燥にて停止末端にＰＥＧスペーサーを介するビオチニル基を導入したＢｉｏｔｉｎ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＥＩ（収量：３５１ｍｇ）を回収した。重合体の１Ｈ−ＮＭＲ測定を行ったところ、ＰＥＧ骨格のエチレンオキシド（−ＯＣＨ２ＣＨ２−）のメチレン水素由来のピーク（ｂ）が３．６〜３．８ｐｐｍ付近に存在すること、ＰＥＩ骨格のエチレンイミン（−ＮＨＣＨ２ＣＨ２−）のメチレン水素由来のピーク（ａ）が２．９〜３．１ｐｐｍ付近に存在すること、アミド結合のメチレン水素に由来するピーク（ｃ）が２．３ｐｐｍに存在すること及びビオチニル基の水素に由来するピーク（ｄ）が４．６ｐｐｍに存在することから、停止末端にＰＥＧスペーサーを介するビオチニル基を導入したＢｉｏｔｉｎ−ＰＥＧ（１０３）−ｂ−ＰＥＩ（２３）が得られたことを確認した（図５）。また、ピーク（ｃ）、（ｄ）を基準にしたビオチニル基の導入率は、９７％であった。
【００８７】
（合成中間体１−６：Ｂｏｃ−ＮＨ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＥＩ［ＣＯＯＨ：ＥＩ］）
停止末端にＰＥＧスペーサーを介するＢｏｃ保護一級アミノ基を持つＢｏｃ−ＮＨ−ＰＥＧ（１０３）−ｂ−ＰＥＩ（２３）（合成中間体１−４）（５００ｍｇ）の水溶液（６．２ｍＬ）中に無水コハク酸（６２６ｍｇ）のアセト二トリル（４．７ｍＬ）溶液とピリジン（０．３３７ｍＬ）を入れて、室温で攪拌しながら２４時間反応させた後、エタノール透析、水透析を順次に行った。透析後に凍結乾燥にて側鎖にカルボキシル基が導入されたＢｏｃ−ＮＨ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＥＩ［ＣＯＯＨ：ＥＩ］（６２４ｍｇ）を得た。得られたポリマーの各構成成分は、１Ｈ−ＮＭＲスペクトラムのエチレンイミン骨格（−ＮＨＣＨ２ＣＨ２−）とエチレングリコール骨格（−ＯＣＨ２ＣＨ２−）に由来するメチレン水素（ｂ，ａ）、エチレンイミン側鎖のカルボキシル基に由来するメチレン水素（ｄ）及びＢｏｃ保護基に由来するメチル水素(ｃ)からそれぞれ帰属できた（図６、１Ｈ−ＮＭＲスペクトラムから側鎖のカルボキシル基の導入率は７８％、Ｂｏｃ−ＮＨ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＥＩ［ＣＯＯＨ（１８）：ＥＩ（５）］）。
【００８８】
（合成中間体１−７Ａ：Ｂｉｏｔｉｎ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＥＩ［ＣＯＯＨ：ＥＩ］）
停止末端にＰＥＧスペーサーを介するビオチニル基を持つＢｉｏｔｉｎ−ＰＥＧ（１０３）−ｂ−ＰＥＩ（２３）（合成中間体１−５Ｂ）（１００ｍｇ）の水（１５０μＬ）／アセトニトリル（１ｍＬ）混合溶媒中に無水コハク酸（１８．４ｍｇ）／アセトニトリル（２５μＬ）、ピリジン（５９．４μＬ）を入れて、室温で攪拌しながら２４時間反応させた後、エタノール透析、水透析を順次に行った。透析後に凍結乾燥にて側鎖にカルボキシル基が導入されたＢｉｏｔｉｎ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＥＩ［ＣＯＯＨ：ＥＩ］）（９４ｍｇ）を得た。得られたポリマーの各構成成分は、１Ｈ−ＮＭＲスペクトラムのエチレンイミン骨格（−ＮＨＣＨ２ＣＨ２−）とエチレングリコール骨格（−ＯＣＨ２ＣＨ２−）に由来するメチレン水素（ｂ，ａ）、側鎖のカルボキシル基のメチレン水素（ｅ）、アミド結合のメチレン水素（ｃ）及びビオチニル基の水素（ｄ）からそれぞれ帰属できた（図７Ａ、１Ｈ−ＮＭＲスペクトラムから側鎖のカルボキシル基の導入率は７３％、ＰＥＩ骨格の２級アミンユニット数２３個中、９個に相当）（Ｂｉｏｔｉｎ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＥＩ［ＣＯＯＨ（９）：ＥＩ（１４）］）。
【００８９】
（合成中間体１−７Ｂ：Ｂｉｏｔｉｎ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＥＩ［ＣＯＯＨ：ＥＩ］）
停止末端にＰＥＧスペーサーを介するビオチニル基を持つＢｉｏｔｉｎ−ＰＥＧ（１０３）−ｂ−ＰＥＩ（２３）（合成中間体１−５Ｂ）（１００ｍｇ）の水（２０μＬ）／アセトニトリル（１ｍＬ）混合溶媒中に無水コハク酸（１２．３ｍｇ）／アセトニトリル（１０μＬ）、ピリジン（５９．４μＬ）を入れて、室温で攪拌しながら２４時間反応させた後、エタノール透析、水透析を順次に行った。透析後に凍結乾燥にて側鎖にカルボキシル基が導入されたＢｉｏｔｉｎ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＥＩ［ＣＯＯＨ：ＥＩ］）（４６ｍｇ）を得た。得られたポリマーの各構成成分は、１Ｈ−ＮＭＲスペクトラムのエチレンイミン骨格（−ＮＨＣＨ２ＣＨ２−）とエチレングリコール骨格（−ＯＣＨ２ＣＨ２−）に由来するメチレン水素（ｂ，ａ）、側鎖のカルボキシル基のメチレン水素（ｅ）、アミド結合のメチレン水素（ｃ）及びビオチニル基の水素（ｄ）からそれぞれ帰属できた（図７Ｂ、１Ｈ−ＮＭＲスペクトラムから側鎖のカルボキシル基の導入率は８８％、ＰＥＩ骨格の２級アミンユニット数２３個中、７個に相当）（Ｂｉｏｔｉｎ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＥＩ［ＣＯＯＨ（７）：ＥＩ（１６）］）。
【００９０】
（合成中間体１−７Ｃ：Ｂｉｏｔｉｎ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＥＩ［ＣＯＯＨ：ＥＩ］）
停止末端にＰＥＧスペーサーを介するビオチニル基を持つＢｉｏｔｉｎ−ＰＥＧ（１０３）−ｂ−ＰＥＩ（２３）（合成中間体１−５Ｂ）（１００ｍｇ）の水（２０μＬ）／アセトニトリル（１ｍＬ）混合溶媒中に無水コハク酸（４．１ｍｇ）／アセトニトリル（３μＬ）、ピリジン（５９．４μＬ）を入れて、室温で攪拌しながら２４時間反応させた後、エタノール透析、水透析を順次に行った。透析後に凍結乾燥にて側鎖にカルボキシル基が導入されたＢｉｏｔｉｎ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＥＩ［ＣＯＯＨ：ＥＩ］）（５４ｍｇ）を得た。得られたポリマーの各構成成分は、１Ｈ−ＮＭＲスペクトラムのエチレンイミン骨格（−ＮＨＣＨ２ＣＨ２−）とエチレングリコール骨格（−ＯＣＨ２ＣＨ２−）に由来するメチレン水素（ｂ，ａ）、側鎖のカルボキシル基のメチレン水素（ｅ）、アミド結合のメチレン水素（ｃ）及びビオチニル基の水素（ｄ）からそれぞれ帰属できた（図７Ｃ、１Ｈ−ＮＭＲスペクトラムから側鎖のカルボキシル基の導入率は８５％、ＰＥＩ骨格の２級アミンユニット数２３個中、２個に相当）（Ｂｉｏｔｉｎ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＥＩ［ＣＯＯＨ（３）：ＥＩ（２０）］）。
【００９１】
（合成中間体１−８：Ｂｏｃ−ＮＨ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＥＩ［ＣＯＯＨ：ＥＩ：ＳＨ］）
Ｂｏｃ−ＮＨ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＥＩ［ＣＯＯＨ（１８）：ＥＩ（５）］（合成中間体１−６）
（５０ｍｇ）の水溶液（０．５ｍＬ）に、保護チオール誘導体の２−（２−ピリジルジチオ）エチルアミン塩酸塩（ＣＡＳＳＰｙ）（０．１６５ｍｍｏｌ、１２．７ｍｇ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＡＣ）（０．１６５ｍｍｏｌ、３１．６ｍｇ）を投入し、室温で１２時間反応させた後、水透析、凍結乾燥にてポリマー５５ｍｇを回収した。１Ｈ−ＮＭＲスペクトラムの積分値比により計算した水溶性ポリマーの各セグメントの構成比は、Ｂｏｃ−ＮＨ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＥＩ［ＣＯＯＨ（１）：ＥＩ（５）：ＣＡＳＳＰｙ（１７）］であることを確認した（図８）。その後、ポリマー側鎖ＣＡＳＳＰｙの脱保護反応を行った結果、ＣＡＳＳＰｙ保護基の２−ピリジル基の水素に由来するピーク（ｂ〜ｅ、７．０〜８．５ｐｐｍ）が完全に消えたことから、Ｂｏｃ−ＮＨ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＥＩ［ＣＯＯＨ（１）：ＥＩ（５）：ＳＨ（１７）］が得られたことを確認した。
【００９２】
（合成中間体１−９：Ｂｏｃ−ＮＨ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＥＩ［ＣＯＯＨ：ＥＩ：ＮＨ２］）
Ｂｏｃ−ＮＨ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＥＩ［ＣＯＯＨ（１８）：ＥＩ（５）］（合成中間体１−６）
（５０ｍｇ）の水溶液（０．５ｍＬ）に、エチレンジアミン（０．０３ｍｍｏｌ、１．８ｍｇ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＡＣ）（０．１５ｍｍｏｌ、２８．８ｍｇ）を投入し、室温で２４時間反応させた後、水透析、凍結乾燥にてポリマー５０ｍｇを回収した。１Ｈ−ＮＭＲスペクトラムの積分値比により計算した水溶性ポリマーの各セグメントの構成比は、Ｂｏｃ−ＮＨ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＥＩ［ＣＯＯＨ（１６）：ＥＩ（５）：ＮＨ２（２）］であることを確認した。
【００９３】
（合成中間体１−１０Ａ：Ｂｉｏｔｉｎ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＥＩ［ＣＯＯＨ：ＥＩ：ＮＨ２］）
Ｂｉｏｔｉｎ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＥＩ［ＣＯＯＨ（９）：ＥＩ（１４）］（合成中間体１−７Ａ）（９４ｍｇ）の水溶液（５ｍＬ）に、Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−１，２−ジアミノエタン（ＮＨ−Ｂｏｃ）（１．０４ｍｍｏｌ、１６６．６ｍｇ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＡＣ）（１．０４ｍｍｏｌ、１９９．４ｍｇ）を投入し、室温で２４時間反応させた後、水透析、凍結乾燥にてポリマー９０ｍｇを回収した。得られたポリマーの各構成成分は、１Ｈ−ＮＭＲスペクトラムのエチレンイミン骨格（−ＮＨＣＨ２ＣＨ２−）とエチレングリコール骨格（−ＯＣＨ２ＣＨ２−）に由来するメチレン水素（ｂ，ａ）、側鎖のカルボキシル基のメチレン水素（ｅ）、アミド結合のメチレン水素（ｃ）及びＢｏｃ基の水素（f）からそれぞれ帰属できた。また、（ｃ）と（f）の積分値比により計算した水溶性ポリマーの各セグメントの構成比は、Ｂｉｏｔｉｎ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＥＩ［ＣＯＯＨ（１）：ＥＩ（１４）：ＮＨ−Ｂｏｃ（８）］であることを確認した（図９Ａ）。その後、ポリマー側鎖Ｂｏｃの脱保護反応を行った結果、Ｂｏｃ保護基のメチル水素に由来するピーク（ｆ、１．４ｐｐｍ）が完全に消えたことから、Ｂｉｏｔｉｎ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＥＩ［ＣＯＯＨ（１）：ＥＩ（１４）：ＮＨ２（８）］が得られたことを確認した。
【００９４】
（合成中間体１−１０Ｂ：Ｂｉｏｔｉｎ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＥＩ［ＣＯＯＨ：ＥＩ：ＮＨ２］）
Ｂｉｏｔｉｎ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＥＩ［ＣＯＯＨ（７）：ＥＩ（１６）］（合成中間体１−７Ｂ）（３０ｍｇ）の水溶液（２ｍＬ）に、Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−１，２−ジアミノエタン（ＮＨ−Ｂｏｃ）（０．１６５ｍｍｏｌ、２６．４ｍｇ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＡＣ）（０．１６５ｍｍｏｌ、３１．６ｍｇ）を投入し、室温で２４時間反応させた後、水透析、凍結乾燥にてポリマー４４．６ｍｇを回収した。合成中間体１−１０Ａと同様に、１Ｈ−ＮＭＲスペクトラムの積分値比により計算した水溶性ポリマーの各セグメントの構成比は、Ｂｉｏｔｉｎ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＥＩ［ＣＯＯＨ（４）：ＥＩ（１６）：ＮＨ−Ｂｏｃ（３）］であることを確認した（図９Ｂ）。その後、ポリマー側鎖Ｂｏｃの脱保護反応を行った結果、Ｂｏｃ保護基のメチル水素に由来するピーク（ｆ、１．４ｐｐｍ）が完全に消えたことから、Ｂｉｏｔｉｎ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＥＩ［ＣＯＯＨ（３）：ＥＩ（１６）：ＮＨ２（４）］が得られたことを確認した。
【００９５】
（合成中間体１−１０Ｃ：Ｂｉｏｔｉｎ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＥＩ［ＣＯＯＨ：ＥＩ：ＮＨ２］）
Ｂｉｏｔｉｎ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＥＩ［ＣＯＯＨ（２）：ＥＩ（２１）］（合成中間体１−７Ｃ）（５５ｍｇ）の水溶液（３ｍＬ）に、Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−１，２−ジアミノエタン（ＮＨ−Ｂｏｃ）（０．１８７ｍｍｏｌ、３０ｍｇ）及び１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＡＣ）（０．１８７ｍｍｏｌ、３５．８５ｍｇ）を投入し、室温で２４時間反応させた後、水透析、凍結乾燥にてポリマー４５．１ｍｇを回収した。合成中間体１−１０Ａと同様に、１Ｈ−ＮＭＲスペクトラムの積分値比により計算した水溶性ポリマーの各セグメントの構成比は、Ｂｉｏｔｉｎ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＥＩ［ＣＯＯＨ（１）：ＥＩ（２１）：ＮＨ−Ｂｏｃ（１）］であることを確認した（図９Ｃ）。その後、ポリマー側鎖Ｂｏｃの脱保護反応を行った結果、Ｂｏｃ保護基のメチル水素に由来するピーク（ｆ、１．４ｐｐｍ）が完全に消えたことから、Ｂｉｏｔｉｎ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＥＩ［ＣＯＯＨ（１）：ＥＩ（２０）：ＮＨ２（２）］が得られたことを確認した。
【００９６】
実施例２  ユロピウム錯体（ＤＴＢＴＡ−Ｅｕ）の合成
ＡＴＢＴＡ−Ｅｕ錯体（東京化成製）１２ｍｇを酢酸緩衝溶液（０．１Ｍ，ｐＨ４．９）３６０μLに溶解させた。この溶液にシアヌル酸クロリド２．５８ｍｇをアセトン１５０μLで溶解させたものを加え３０分攪拌した。反応溶液にアセトンを加えることにより沈殿を析出させ、その沈殿を遠心分離で回収し、アセトンで２回洗浄した後、減圧乾燥により乾燥し、シアヌル酸クロリド基を有するユロピウム錯体（ＤＴＢＴＡ−Ｅｕ）を得た（収量：１２．９ｍｇ）。
【００９７】
実施例３  水溶性発光標識ポリマーの合成
（重合体３−１Ａ．Ｂｏｃ−ＮＨ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＥＩ[ＣＯＯＨ：ＥＩ：フルオレセイン]）
Ｂｏｃ−ＮＨ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＥＩ［ＣＯＯＨ（１８）：ＥＩ（５）］（合成中間体１−６）
（５０ｍｇ）／１０ｍＭ  ＮａＨＣＯ３（ｐＨ８．４）（０．４ｍＬ）溶液に、フルオレセインのアミン化合物（０．０６３ｍｍｏＬ、２１．９ｍｇ）／ＤＭＳＯ（０．１ｍＬ）及びＥＤＡＣ（０．１２６ｍｍｏｌ、２４．２ｍｇ）／１０ｍＭ  ＮａＨＣＯ３（ｐＨ８．４）（０．１ｍＬ）を投入し、室温で２４時間反応させた後、水透析、限外濾過(Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−４，ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  ｆｉｌｔｅｒ  ｄｅｖｉｃｅｓ，ＮＭＷＬ＝３，０００)にてポリマー５５ｍｇを回収した。１Ｈ−ＮＭＲスペクトラムの積分値比（フルオレセインに由来する水素（ｂ）及びポリマー末端Ｂｏｃ保護基に由来するメチル基の水素（ａ）を比較）により計算した水溶性発光標識ポリマーの各セグメントの構成比は、Ｂｏｃ−ＮＨ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＥＩ［ＣＯＯＨ（１５）：ＥＩ（５）：フルオレセイン（３）］であることを確認した（図１０Ａ）。
【００９８】
（重合体３−１Ｂ．Ｂｏｃ−ＮＨ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＥＩ[ＣＯＯＨ：ＥＩ：フルオレセイン]）
Ｂｏｃ−ＮＨ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＥＩ［ＣＯＯＨ（１８）：ＥＩ（５）］（合成中間体１−６）
（５０ｍｇ）／１０ｍＭ  ＮａＨＣＯ３（ｐＨ８．４）（０．４ｍＬ）溶液に、フルオレセインのアミン化合物（０．０２１ｍｍｏＬ、７．３ｍｇ）／ＤＭＳＯ（０．１ｍＬ）及びＥＤＡＣ（０．１２６ｍｍｏｌ、２４．２ｍｇ）／１０ｍＭ  ＮａＨＣＯ３（ｐＨ８．４）（０．１ｍＬ）を投入し、室温で２４時間反応させた後、水透析、限外濾過(Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−４，ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  ｆｉｌｔｅｒ  ｄｅｖｉｃｅｓ，ＮＭＷＬ＝３，０００)にてポリマー５０ｍｇを回収した。１Ｈ−ＮＭＲスペクトラムの積分値比（フルオレセインに由来する水素（ｂ）及びポリマー末端Ｂｏｃ保護基に由来するメチル基の水素（ａ）を比較）により計算した水溶性発光標識ポリマーの各セグメントの構成比は、Ｂｏｃ−ＮＨ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＥＩ［ＣＯＯＨ（１７）：ＥＩ（５）：フルオレセイン（１）］であることを確認した（図１０Ｂ）。
【００９９】
（重合体３−２Ａ．Ｂｉｏｔｉｎ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＥＩ[ＣＯＯＨ：ＥＩ：ＢＯＤＩＰＹ]）
Ｂｉｏｔｉｎ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＥＩ［ＣＯＯＨ（１）：ＥＩ（２０）：ＮＨ２（２）］（合成中間体１−１０Ｃ）（１０ｍｇ）／ＤＭＦ（０．１ｍＬ）溶液に、ＢＯＤＩＰＹのスクシンイミド化合物（ＢＯＤＩＰＹ６３０／６５０−ＮＨＳ）（０．００１７ｍｍｏＬ、１．１５ｍｇ）／ＤＭＦ（０．１５ｍＬ）及びＤＩＥＡ（０．０１３ｍｍｏＬ、１．７ｍｇ）を投入し、室温で２４時間反応させた後、水透析、限外濾過(Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−４，ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  ｆｉｌｔｅｒ  ｄｅｖｉｃｅｓ，ＮＭＷＬ＝３，０００)にてポリマー８ｍｇを回収した。１Ｈ−ＮＭＲスペクトラムの積分値比（ＢＯＤＩＰＹに由来する水素（ｂ）及びポリマー主鎖のアミド結合に由来するメチレン基の水素（ａ）を比較）により計算した水溶性発光標識ポリマーの各セグメントの構成比は、Ｂｉｏｔｉｎ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＥＩ［ＣＯＯＨ（１）：ＥＩ（２０）：ＮＨ２（１）：ＢＯＤＩＰＹ（１）］であることを確認した（図１１）。
【０１００】
（重合体３−２Ｂ．Ｂｉｏｔｉｎ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＥＩ[ＣＯＯＨ：ＥＩ：ＢＯＤＩＰＹ]）
Ｂｉｏｔｉｎ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＥＩ［ＣＯＯＨ（１）：ＥＩ（１４）：ＮＨ２（８）］（合成中間体１−１０Ａ）（５ｍｇ）／ＤＭＦ（０．１ｍＬ）溶液に、ＢＯＤＩＰＹのスクシンイミド化合物（ＢＯＤＩＰＹ６３０／６５０−ＮＨＳ）（０．０１５ｍｍｏＬ、１０．４８ｍｇ）／ＤＭＦ（０．１５ｍＬ）及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）（０．０１３ｍｍｏＬ、１．７ｍｇ）を投入し、室温で２４時間反応させた後、水透析、限外濾過(Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−４，ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  ｆｉｌｔｅｒ  ｄｅｖｉｃｅｓ，ＮＭＷＬ＝３，０００)にてポリマー６ｍｇを回収した。
【０１０１】
ＢＯＤＩＰＹ導入量については、ランベルト・ベールの法則に基づき、ＵＶ最大吸収波長６３０ｎｍにおける吸光度測定により求められた。以下、算出方法を簡略に示した。既知組成のＢｉｏｔｉｎ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＥＩ［ＣＯＯＨ（１）：ＥＩ（２０）：ＢＯＤＩＰＹ（２）］（重合体３−２Ａ）水溶液（１μＭ）の６３０ｎｍにおける吸光度は０．０１８であって、当水溶性発光標識ポリマー水溶液（１μＭ）の６３０ｎｍにおける吸光度は０．００４であった。ポリマーモル数当たりの吸光度を比較すると、重合体３−２Ａより約４倍高いことから、ポリマー１個あたりのＢＯＤＩＰＹ導入数は８個と計算されたため、水溶性発光標識ポリマーの各セグメントの構成比は、Ｂｉｏｔｉｎ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＥＩ［ＣＯＯＨ（１）：ＥＩ（１４）：ＮＨ２（４）：ＢＯＤＩＰＹ（４）］であることを確認した。
【０１０２】
（重合体３−３Ａ．Ｂｉｏｔｉｎ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＥＩ[ＣＯＯＨ：ＥＩ：Ｅｕ]）
Ｂｉｏｔｉｎ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＥＩ［ＣＯＯＨ（１）：ＥＩ（１４）：ＮＨ２（８）］（合成中間体１−１０Ａ）（５ｍｇ）／１０ｍＭ  ＮａＨＣＯ３（ｐＨ８．４）（０．５ｍＬ）溶液に、ユロピウム錯体のシアヌル酸クロリド化合物（ＤＴＢＴＡ−Ｅｕ）（８．８ｍｇ）／１０ｍＭ  ＮａＨＣＯ３（ｐＨ８．４）（０．１ｍＬ）を投入し、室温で２４時間反応させた後、水透析、限外濾過(Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−４，ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  ｆｉｌｔｅｒ  ｄｅｖｉｃｅｓ，ＮＭＷＬ＝３，０００)にて、ポリマー水溶液５００μＬを回収した。
【０１０３】
ＵＶ最大吸収波長３４５ｎｍにおける吸光度測定により求められたＥｕ錯体量（６．７ｍｇ）から、ポリマー１個あたりのＥｕ錯体数は８個と計算されたため、水溶性発光標識ポリマーの各セグメントの構成比は、Ｂｉｏｔｉｎ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＥＩ［ＣＯＯＨ（１）：ＥＩ（１４）：Ｅｕ（８）］であることを確認した。
【０１０４】
（重合体３−３Ｂ．Ｂｉｏｔｉｎ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＥＩ[ＣＯＯＨ：ＥＩ：Ｅｕ]）
Ｂｉｏｔｉｎ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＥＩ［ＣＯＯＨ（１）：ＥＩ（２０）：ＮＨ２（２）］（合成中間体１−１０Ｃ）（５ｍｇ）／１０ｍＭ  ＮａＨＣＯ３（ｐＨ８．４）（０．５ｍＬ）溶液に、ユロピウム錯体のシアヌル酸クロリド化合物（ＤＴＢＴＡ−Ｅｕ）（３．３ｍｇ）／１０ｍＭ  ＮａＨＣＯ３（ｐＨ８．４）（０．１ｍＬ）を投入し、室温で２４時間反応させた後、水透析、限外濾過(Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−４，ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  ｆｉｌｔｅｒ  ｄｅｖｉｃｅｓ，ＮＭＷＬ＝３，０００)にて、ポリマー水溶液５００μＬを回収した。
【０１０５】
ＵＶ最大吸収波長３４５ｎｍにおける吸光度測定により求められたＥｕ錯体量（１．６ｍｇ）から、ポリマー１個あたりのＥｕ錯体数は２個と計算されたため、水溶性発光標識ポリマーの各セグメントの構成比は、Ｂｉｏｔｉｎ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＥＩ［ＣＯＯＨ（１）：ＥＩ（２０）：Ｅｕ（２）］であることを確認した。
【０１０６】
（重合体３−４．Ｂｏｃ−ＮＨ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＥＩ[ＣＯＯＨ：ＥＩ：Ｃｙ３]
Ｂｏｃ−ＮＨ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＥＩ［ＣＯＯＨ（１６）：ＥＩ（５）：ＮＨ２（２）］（合成中間体１−９）（１ｍｇ）／ＤＭＳＯ（０．１ｍＬ）溶液に、Ｃｙ３のスクシンイミド化合物（Ｃｙ３−ＮＨＳ）（０．０００４５ｍｍｏｌ）を投入し、室温で２４時間反応させた後、水透析、限外濾過(Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−４，ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  ｆｉｌｔｅｒ  ｄｅｖｉｃｅｓ，ＮＭＷＬ＝３，０００)にてポリマー水溶液５００μＬを回収した。
【０１０７】
実施例４  水溶性発光標識ポリマーの蛍光測定
実施例３で合成された水溶性発光標識ポリマーについて蛍光スペクトルを測定した。測定は蛍光分光測定装置（“ＦｌｕｏｒｏＭａｘ−３”、ＨＯＲＩＢＡ  ＪＯＢＩＮ  ＹＶＯＮ製）を用い行った。常温下、励起波長６３０ｎｍ（ＢＯＤＩＰＹ）又は３４５ｎｍ（Ｅｕ）の光を照射することにより蛍光測定を行った。その結果、Ｂｉｏｔｉｎ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＥＩ[ＣＯＯＨ：ＥＩ：ＮＨ２：ＢＯＤＩＰＹ]において、ポリマー濃度で規格化した蛍光強度を比較した場合、Ｂｉｏｔｉｎ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＥＩ［ＣＯＯＨ（１）：ＥＩ（２０）：ＮＨ２（１）：ＢＯＤＩＰＹ（１）］（重合体３−２Ａ）に比べ、Ｂｉｏｔｉｎ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＥＩ［ＣＯＯＨ（１）：ＥＩ（１４）：ＮＨ２（４）：ＢＯＤＩＰＹ（４）］（重合体３−２Ｂ）は約１３．５倍（６５０ｎｍ基準）高いことが確認された（図１２Ａ）。同様に、Ｂｉｏｔｉｎ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＥＩ[ＣＯＯＨ：ＥＩ：Ｅｕ]において、ポリマー濃度で規格化した蛍光強度を比較した場合、Ｂｉｏｔｉｎ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＥＩ［ＣＯＯＨ（１）：ＥＩ（２０）：Ｅｕ（２）］（重合体３−３Ｂ）に比べ、Ｂｉｏｔｉｎ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＥＩ［ＣＯＯＨ（１）：ＥＩ（１４）：Ｅｕ（８）］（重合体３−２Ａ）は約３．７倍（６１７ｎｍ基準）高いことが確認された（図１２Ｂ）。
【０１０８】
実施例５  水溶性発光標識ポリマーのＤＮＡチップによる蛍光検出
実施例３で合成された水溶性発光標識ポリマー（重合体３−２、重合体３−３）について、遺伝子検出モデル系として、ＤＮＡチップ（東レ株式会社製“３Ｄ−Ｇｅｎｅ”（登録商標））を用い、ＤＮＡチップ上での蛍光検出を行った（図１３Ａ、図１３Ｂ）。３’末端にビオチンを付加した合成オリゴＤＮＡを１０ｐｍｏｌ／ｃｈｉｐ、３７℃で一晩振とうしながらハイブリダイゼーションした後、“３Ｄ−Ｇｅｎｅ”（登録商標）推奨の方法で洗浄を行った。次に、ニュートラアビジン（１０μｇ／ｍＬ、１Ｍ  ＭＥＳ、１Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０）を２０℃で１時間静置し、反応させた。洗浄方法はＰＢＳＴ溶液（１×ＰＢＳ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０）中で２５℃、５分間洗浄した。
【０１０９】
最後に、そのチップ上にビオチニル基を有する水溶性発光標識ポリマーを上記と同じバッファーで２０℃、１時間反応させた。洗浄バッファー及び温度は“３Ｄ−Ｇｅｎｅ”（登録商標）の推奨の方法を用い、洗浄時間を各２分に短縮して行った。洗浄後、Ｂｉｏｔｉｎ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＥＩ[ＣＯＯＨ：ＥＩ：ＮＨ２：ＢＯＤＩＰＹ]（重合体３−２）については、ＤＮＡチップスキャナ（“ＳｃａｎＡｒｒａｙＥｘｐｒｅｓｓ”、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｊａｐａｎ）（ｅｘ６３０ｎｍ、ｅｍ６５０ｎｍ）で、水溶性発光標識ポリマーの励起蛍光画像を取得し、ＧｅｎｅＰｉｘ  Ｐｒｏ６．０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ）により蛍光強度を数値化した。また、Ｂｉｏｔｉｎ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＥＩ[ＣＯＯＨ：ＥＩ：Ｅｕ]（重合体３−３）については、オリンパス製蛍光顕微鏡（Ｅｘ＝３４５±１０ｎｍ、Ｅｍ＝６５０±７５ｎｍ、ダイクロイックミラー＝４０９ｎｍ）で、水溶性発光標識ポリマーの励起蛍光画像を取得し、蛍光強度を数値化した。各プローブ濃度の蛍光強度は４スポットの平均値とし、合成オリゴ０μＭをバックグランド（ＢＧ）として算出した。
【０１１０】
その結果、“（ＤＮＡ）ビオチン−アビジン−ビオチン（蛍光標識体）”というサンドイッチ構造の染色方法において、Ｂｉｏｔｉｎ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＥＩ［ＣＯＯＨ（１）：ＥＩ（１４）：ＮＨ２（４）：ＢＯＤＩＰＹ（４）］で標識した場合では、Ｂｉｏｔｉｎ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＥＩ［ＣＯＯＨ（１）：ＥＩ（２０）：ＮＨ２（１）：ＢＯＤＩＰＹ（１）］で標識した場合に比べ、約１８倍以上（スポット１００とＢＬＡＮＫでの発光強度値の差）の高い発光強度を示すことが確認された。また、Ｂｉｏｔｉｎ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＥＩ［ＣＯＯＨ（１）：ＥＩ（１４）：Ｅｕ（８）］で標識した場合では、Ｂｉｏｔｉｎ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＥＩ［ＣＯＯＨ（１）：ＥＩ（２０）：Ｅｕ（２）］で標識した場合に比べ、約２倍以上（スポット１００とＢＬＡＮＫでの発光強度値の差）の高い発光強度を示すことが確認された。ポリマーに導入された発光性官能基数とＤＮＡチップ上での発光強度との相関が系によって異なる理由については、水溶性蛍光標識ポリマーのビオチン−アビジン標識時の反応性又は結合力が、発光性官能基の種類及び導入量に依存するためと推定された。
【産業上の利用可能性】
【０１１１】
本発明の発光性官能基を有する水溶性発光標識ポリマーは、発光性官能基がポリマー側鎖に定量的に結合し、かつ水中分散安定性及び蛍光強度が増大されるという特徴を有することから、センシング用試薬として、例えば、生体診断及び生体治療に応用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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