(57)【要約】      （修正有）【課題】サーチュイン遺伝子発現増強作用又はＩＤＯ遺伝子発現抑制作用を有し、個体の寿命延長、並びに老化に伴い発症する各種疾患及びサーチュイン又はＩＤＯが介在する各種疾患の予防／治療に有用な老化抑制剤の提供。【解決手段】化合物１又は化合物２。化合物１は、（４ａＳ，６ａＳ，７Ｓ，１１ａＲ，１１ｂＳ）−４，４，１１ｂ−トリメチル−７−ヒドロキシ−１，２，３，４，４ａ，５，６，７，８，１１，１１ａ，１１ｂ−ドデカヒドロ−６ａＨ−シクロヘプタ［ａ］ナフタレン−６ａ，９−ジカルボアルデヒド〔慣用名：ガラナールＡ（Galanal A）〕、若しくはその７Ｒ異性体であるガラナールＢ（Galanal B）、又はこれらの混合物（含むラセミ体）。化合物２は、（８Ｓ）−１４，２０−シクロラブダン−１２，１４（２０）−ジエン−１５，１６−ジアール〔慣用名：ミョウガナール（Mioganal）〕。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（Ｉ）で表される化合物若しくはその塩又は下記一般式（ＩＩ）で表される化合物若しくはその塩を有効成分として含有する老化抑制剤。
【化１】
2014152118.tif 000003
【請求項２】
サーチュイン遺伝子発現増強作用を有する請求項１に記載の老化抑制剤。
【請求項３】
インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ遺伝子発現抑制作用を有する請求項１又は２に記載の老化抑制剤。
【請求項４】
前記有効成分はショウガ科植物の抽出物である請求項１〜３の何れか１項に記載の老化抑制剤。
【請求項５】
請求項１〜４の何れか１項に記載の老化抑制剤を含有する寿命延長剤。
【請求項６】
請求項１〜４の何れか１項に記載の老化抑制剤を含有する神経変性抑制剤。
【請求項７】
請求項１〜４の何れか１項に記載の老化抑制剤を含有する飲食品又は動物用飼料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サーチュイン遺伝子発現増強作用又はインドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）遺伝子発現抑制作用を有し、個体の寿命延長、神経変性に起因する障害の抑制、免疫疾患及び眼疾患の改善等に有効な老化抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトを含む動物においては、加齢と共に個体の機能低下、例えば、視力又は聴力の低下、運動能力の低下、免疫機能の低下、記憶障害、生体内の各臓器の機能低下等が引き起こされる。このような個体の機能低下を老化と称する。老化は、個体の様々な組織や器官で徐々に進行する多面的な現象である。老化が進行すると、個体はその恒常性を維持することができなくなり、最終的には死に到る。
【０００３】
現在、先進諸国では、医療技術の発達によって人々の寿命そのものは顕著に延長しているが、その一方で、高齢者らは、老化に伴う心身の機能低下により生活に支障が生じたり、様々な疾患に罹患したりする等の問題を抱えている。高齢者らのための福祉や医療の費用の増加は、先進諸国における深刻な問題となっている。従って、個体の恒常性を維持し、老化に伴う心身の機能低下や疾患を引き起こすことなく寿命を延長させることができれば、福祉や医療費の抑制及び個人のQOL（Quality of life）の観点から有用である。老化を抑制し又は寿命を延長する効果を有する薬剤として、いくつかの化合物がこれまでに報告されている。例えば、ワインに含まれているポリフェノールの１種であるレスベラトロールが、高カロリー食を摂取したマウスの寿命を延長させることができることが報告されている（非特許文献１）。しかしながら、より効果の高い老化抑制剤の開発が所望されている。
【０００４】
サーチュイン遺伝子は、その活性化により生物の寿命の延長に貢献することが報告されている遺伝子であり、長寿遺伝子とも呼ばれている。サーチュイン遺伝子は、酵母のＳｉｒ２や哺乳類のＳＩＲＴ１〜７等が知られており、タンパク質サーチュイン（Ｓｉｒｔｕｉｎ）をコードしている。サーチュインは、ＮＡＤ依存的ヒストン脱アセチル化酵素として働き、ヒストンやｐ５３等の転写因子上のアセチル化タンパク質のアセチル基を脱離する。サーチュイン遺伝子が活性化されると、サーチュイン発現が上昇し、その結果様々な遺伝子の発現が調節されることで、寿命が延長すると考えられている。サーチュイン遺伝子の活性化による寿命延長効果は、酵母、線虫、ショウジョウバエ、マウスで報告されている。サーチュインの寿命延長効果は、サーチュイン発現の増強又はサーチュイン蛋白の活性化によってもたらされる種々の作用、例えば、加齢による生理学的な機能低下を抑制する作用、自己免疫による障害を回復する作用、テロメア遺伝子の不具合に起因する細胞増殖障害を回復する作用、神経変性に起因する障害（例えば、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、エイズ認知症やうつ病）を回復する作用、脳における神経栄養因子遺伝子の機能低下を回復し、学習、記憶能力を改善する作用等によるものと考えられている。
【０００５】
サーチュイン遺伝子発現の増強によって、寿命の延長や、神経変性の抑制が期待できる。サーチュイン遺伝子発現を増強させ、老化を抑制する因子としては、カロリー制限やレスベラトロールが以前より知られている。更に最近、レスベラトロールよりも強いサーチュイン活性化作用を有する化合物として、グネツム科植物メリンジョの実もしくは種子の抽出物又はグネチンＣ（特許文献１）、及びε−ビニフェリン（特許文献２）が報告されている。
【０００６】
一方、インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）は、生体の多くの細胞で発現しているヘム含有酵素であり、トリプトファン代謝のキヌレニン経路の律速酵素である。ＩＤＯが活性化されると、トリプトファンの代謝が促進され、結果としてトリプトファンから産生される脳内伝達物質であるセロトニンが減少する。セロトニンが減少し、神経毒であるキヌレニン経路産物のキヌリン酸が増加することにより、気分障害や、前記のような神経変性に起因する障害の発症に関与することが示唆されている。また、ＩＤＯはトリプトファンの枯渇による細胞増殖の抑制、キヌレニン経路産物によるＴ細胞のアポトーシス誘導によって、免疫寛容に関与している。Ｔ細胞系の免疫寛容は、自己免疫疾患、同種拒絶反応、神経変性疾患等に関与することが示唆されている。更に、ＩＤＯによって生成するキヌレニンは、眼の水晶体でのＵＶフィルター物質として機能するが、同時に水晶体の蛋白質を変性させる。加齢と共にＵＶフィルター物質が増加、蓄積し、加齢性核性白内障が起こるとされている。
【０００７】
ＩＤＯの阻害によって、神経変性疾患、免疫疾患、眼疾患の改善が期待できる。ＩＤＯ阻害剤は、インターフェロンγ、１−メチル−Ｌ−トリプトファン（１ＭＴ）やβ−（３−ベンゾフラニル）−ＤＬ−アラニン等の特定のトリプトファン類似体が知られている。最近では、置換ナフトキノン、ナフタレン誘導体がＩＤＯの阻害作用を有することが開示されている（特許文献３）。
【０００８】
ところで、ジテルペンは４つのイソプレン単位を含む化合物であり、様々な構造のジテルペンが天然に分布している。ラブダン型の基本骨格を有するジテルペンは、ショウガ科の植物に含まれていることが知られており、特許文献４には、ショウガ科植物のミョウガに含まれるラブダン型ジテルペンアルデヒドであるミョウガトリアールが抗菌作用、血小板凝集抑制作用、５−リポキシゲナーゼ阻害作用を有することが開示されている。また、特許文献５には、ショウガ科植物のアルビニアガランガに含まれるガラナールが抗腫瘍剤となる可能性が開示されている。また、特許文献６には、ミョウガの花序又は蕾からの抽出物が降圧作用、中枢神経抑制作用、コリン作動性神経興奮作用、心臓抑制作用及び抗炎症作用を示すことが開示されている。しかし、ラブダン型ジテルペンアルデヒドあるいはショウガ科植物の抽出物が、サーチュイン遺伝子発現増強作用又はＩＤＯ遺伝子発現抑制作用を有し、老化抑制に有効であることはこれまで知られていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２０１１−０７９７９７号公報
【特許文献２】特開２０１１−０５７５８０号公報
【特許文献３】特表２００８−５０５９３７号公報
【特許文献４】特開２００６−２４１０６８号公報
【特許文献５】特開昭６３−１６２６４４号公報
【特許文献６】特開昭５５−００９０２１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の課題は、サーチュイン遺伝子発現増強作用又はＩＤＯ遺伝子発現抑制作用を有し、個体の寿命延長、並びに老化に伴い発症する各種疾患及びサーチュイン又はＩＤＯが介在する各種疾患の予防／治療に有用な老化抑制剤を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、ショウガ科植物であるミョウガの花蕾から単離された特定構造のラブダン型ジテルペンアルデヒドが、サーチュイン遺伝子発現増強作用及びＩＤＯ遺伝子発現抑制作用を有し、個体の寿命延長、神経変性に起因する障害の抑制、免疫疾患及び眼疾患等の予防／治療に効果をもたらすことを見出し、本発明を完成した。
【００１２】
即ち、本発明は、下記一般式（Ｉ）で表される化合物若しくはその塩又は下記一般式（ＩＩ）で表される化合物若しくはその塩を有効成分として含有する老化抑制剤である。
【化１】
2014152118.tif 000002
【００１３】
また、本発明は、前記老化抑制剤を含有する寿命延長剤、神経変性抑制剤又は飲食品若しくは動物用飼料である。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の老化抑制剤は、ヒトを含む動物（特に哺乳類）に対し、生体の恒常性維持に有効であり、個体の老化を防止して寿命を延長することができると共に、老化に伴い発症する各種疾患、又はサーチュイン若しくはＩＤＯが介在する各種疾患を予防又は治療することができる。また、本発明の老化抑制剤の有効成分は、古来より食用とされてきたミョウガに含まれる成分であり、継続的に服用しても有害な副作用がなく安全性が高いため、本発明の老化抑制剤は、寿命延長剤、神経変性抑制剤等の医薬としてのみならず、飲食品、動物用飼料としても利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、マウス由来細胞におけるサーチュイン遺伝子（SIRT1）発現量の変化を示すグラフである。
【図２】図２は、マウス由来細胞におけるサーチュイン遺伝子（SIRT3）発現量の変化を示すグラフである。
【図３】図３は、ヒト由来細胞におけるサーチュイン遺伝子（SIRT1）発現量の変化を示すグラフである。
【図４】図４は、ヒト由来細胞におけるサーチュイン遺伝子（SIRT3）発現量の変化を示すグラフである。
【図５】図５は、マウス由来細胞におけるＩＤＯ遺伝子（IDO-1）発現量の変化を示すグラフである。
【図６】図６は、マウス由来細胞におけるＩＤＯ遺伝子（IDO-2）発現量の変化を示すグラフである。
【図７】図７は、ヒト由来細胞におけるＩＤＯ遺伝子（IDO-1）発現量の変化を示すグラフである。
【図８】図８は、ヒト由来細胞におけるＩＤＯ遺伝子（IDO-2）発現量の変化を示すグラフである。
【図９】図９は、マウス由来細胞におけるサーチュイン遺伝子発現によるヒストンの脱アセチル化の変化を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明において、「老化抑制」とは、老化（加齢）に伴って生じる生理学的変化（機能低下）を抑制することを意味し、具体例として個体（特にヒトを含む哺乳類）の寿命延長が挙げられる。また、ここでいう「生理学的変化（機能低下）」には、記憶・学習能力低下、持久力低下、容易疲労、代謝機能低下、ミトコンドリア機能低下等が含まれる。
【００１７】
本発明の老化抑制剤は、上記一般式（Ｉ）で表される化合物（以下、化合物Ｉともいう）若しくはその塩、又は上記一般式（ＩＩ）で表される化合物（以下、化合物ＩＩともいう）若しくはその塩を有効成分として含有する。本発明の老化抑制剤は、「化合物Ｉ又はその塩」及び「化合物ＩＩ又はその塩」の何れか一方のみを含有していても良く、両方を含有していても良い。また、本発明の老化抑制剤は、有効成分（化合物Ｉ若しくはＩＩ又はそれらの塩）のみからなる形態でも良く、有効成分に加えて他の成分を含む形態でも良い。
【００１８】
本発明の老化抑制剤の有効成分である化合物Ｉ及びＩＩは、何れもラブダン型ジテルペンアルデヒドである。化合物Ｉは、（４ａＳ，６ａＳ，７Ｓ，１１ａＲ，１１ｂＳ）−４，４，１１ｂ−トリメチル−７−ヒドロキシ−１，２，３，４，４ａ，５，６，７，８，１１，１１ａ，１１ｂ−ドデカヒドロ−６ａＨ−シクロヘプタ［ａ］ナフタレン−６ａ，９−ジカルボアルデヒド〔ＣＡＳ登録番号：１０４０８６−７４−０、化学式：Ｃ20Ｈ30Ｏ3、慣用名：ガラナールＡ（Galanal A）〕、若しくは（４ａＳ，６ａＳ，７Ｒ，１１ａＲ，１１ｂＳ）−４，４，１１ｂ−トリメチル−７−ヒドロキシ−２，３，４，４ａ，５，６，６ａ，７，８，１１，１１ａ，１１ｂ−ドデカヒドロ−１Ｈ−シクロヘプタ［ａ］ナフタレン−６ａ，９−ジカルボアルデヒド〔ＣＡＳ登録番号：１０４１１３−５２−２、化学式：Ｃ20Ｈ30Ｏ3、慣用名：ガラナールＢ（Galanal B）〕、又はこれらの混合物（含むラセミ体）であり、上記一般式（Ｉ）に示す化学構造を有する。化合物ＩＩは、（８Ｓ）−１４，２０−シクロラブダン−１２，１４（２０）−ジエン−１５，１６−ジアール〔化学式：Ｃ20Ｈ28Ｏ2、慣用名：ミョウガナール（Mioganal）〕であり、上記一般式（ＩＩ）に示す化学構造を有する。
【００１９】
化合物Ｉの塩及び化合物ＩＩの塩に関しては、種類は特に限定されないが具体的に挙げると、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属の付加塩；マグネシウム塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属の付加塩等が挙げられる。好ましくは薬学的に許容できる塩である。
【００２０】
化合物Ｉ及びＩＩは、ミョウガ等のショウガ科植物から公知の方法により単離（抽出・精製）して得ることができる。即ち、本発明の老化抑制剤の有効成分は、ショウガ科植物の抽出物であっても良い。しかしながら、本発明で用いる化合物Ｉ及びＩＩ並びにそれらの塩は、そのような植物由来の天然物質に限定されず、公知の化学合成技術若しくは遺伝子組換技術等を使用して生産される化学合成物質若しくは遺伝子組換物質であっても良い。化合物Ｉ及びＩＩを植物から単離する場合、化合物Ｉについては、例えば特許文献２に記載の方法に準じて植物から単離可能であり、化合物ＩＩについては、例えばBiosci. Biotechnol. Biochem (72) 10, 2181-2186, 2008に記載の方法に準じて植物から単離可能である。
【００２１】
化合物Ｉ及びＩＩを含有する植物としては、ショウガ科に属する植物が挙げられ、より具体的には、ショウガ科ショウガ属のミョウガ、ショウガ科ハナミョウガ属のナンキョウ（学名：Alpinia galanga）、ハナミョウガ、ゲットウ等が挙げられる。これらのショウガ科植物の中でも、特に、ミョウガ（とりわけ、その可食部である花蕾）及びナンキョウ（とりわけ、その可食部である地下茎部）は、化合物Ｉ及びＩＩを比較的多量に含有しているため、これらの給源として本発明で好ましく用いられる。
【００２２】
化合物Ｉ及びＩＩは、後述の〔実施例〕の項に記載の試験結果から明らかなように、サーチュイン遺伝子発現増強作用及びインドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）遺伝子発現抑制作用を有し、これらの作用による優れた老化抑制作用を示す。本発明の老化抑制剤の効果は、単に個体（特にヒトを含む哺乳類）の寿命が延長して長生きできるという、寿命延長効果にとどまらず、老化に伴う生体の機能低下を抑制し、健康な状態で個体の寿命が延長する効果を含む。本発明の老化抑制剤が予防／治療に有効に作用する疾患としては、サーチュインの活性化又はＩＤＯの抑制が有効な疾患を例示でき、より具体的には例えば、神経変性に起因する障害（例えば、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、エイズ認知症、うつ病）、気分障害、白内障等の眼疾患が挙げられる。
【００２３】
また、化合物Ｉ及びＩＩは、食経験が豊富なミョウガやナンキョウ等のショウガ科植物に含まれている成分であることから、長期間継続的に摂取しても生体に有害な作用をもたらす懸念が少ない、安全な化合物である。従って、化合物Ｉ若しくはＩＩ又はそれらの塩を含有する本発明の老化抑制剤は、健常者や成人だけでなく、高齢者や病弱者にも、安全且つ継続的に摂取され得るものであり、ヒト又は動物用の医薬の他、ヒト用飲食品若しくは動物用飼料等として、又はそれらを製造するための原料として有用である。本発明には、上述した本発明の老化抑制剤を含有する医薬、飲食品及び動物用飼料が含まれる。ここでいう「動物」には、ヒト以外の哺乳類が含まれる。
【００２４】
本発明の医薬としては、上述した老化抑制剤そのものの他に、例えば、寿命延長剤、神経変性抑制剤を例示できる。医薬としての老化抑制剤並びにこれを含有する寿命延長剤及び神経変性抑制剤の剤型は、特に制限されず、化合物Ｉ若しくはＩＩ又はそれらの塩を含有可能な全ての剤型が含まれ、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤、ドライシロップ剤、液剤、懸濁剤等の経口剤；吸入剤、経皮製剤、坐剤、点滴剤、注射剤等の非経口剤が挙げられる。
【００２５】
本発明の医薬は、有効成分である化合物Ｉ若しくはＩＩ又はそれらの塩に加えて、必要に応じて薬学的に許容される種々の担体、例えば賦形剤、安定化剤、その他の添加剤等を含有していても良く、あるいは、更に他の薬効成分、例えば各種ビタミン類、ミネラル類、生薬等を含有していても良い。本発明の医薬は、化合物Ｉ若しくはＩＩ又はそれらの塩、あるいはこれらを含有する植物抽出物に、上述の担体及び他の薬効成分を配合し、常法に従って製造することができる。
【００２６】
また、本発明の飲食品及び動物用飼料としては、例えば、老化抑制、機能低下の予防／改善効果を企図して、その旨を表示した健康食品、機能性飲食品、特定保健用飲食品、病者用飲食品、家畜・競走馬・鑑賞動物等のための飼料、ペットフードを例示できる。本発明の飲食品及び動物用飼料の形態は、特に制限されず、化合物Ｉ若しくはＩＩ又はそれらの塩を含有可能な全ての形態が含まれ、例えば、固形、半固形又は液状であり得、あるいは、錠剤、チュアブル錠、粉剤、カプセル、顆粒、ドリンク、ゲル、シロップ、経管経腸栄養用流動食等の各種形態であり得る。
【００２７】
本発明の飲食品の形態の具体例としては、緑茶、ウーロン茶や紅茶等の茶飲料、コーヒー飲料、清涼飲料、ゼリー飲料、スポーツ飲料、乳飲料、炭酸飲料、果汁飲料、乳酸菌飲料、発酵乳飲料、粉末飲料、ココア飲料、アルコール飲料、精製水等の飲料、バター、ジャム、ふりかけ、マーガリン等のスプレッド類、マヨネーズ、ショートニング、クリーム、ドレッシング類、パン類、米飯類、麺類、パスタ、味噌汁、豆腐、牛乳、ヨーグルト、スープまたはソース類、菓子（例えばビスケットやクッキー類、チョコレート、キャンディ、ケーキ、アイスクリーム、チューインガム、タブレット）等が挙げられる。尚、動物用飼料は、飲食品とほぼ同様の組成や形態で利用できることから、本明細書における飲食品に関する記載は、特に断らない限り、動物用飼料についても同様に適用される。
【００２８】
本発明の飲食品及び動物用飼料は、化合物Ｉ若しくはＩＩ又はそれらの塩、あるいはこれらを含有する植物抽出物に、通常食されている一般の飲食品や動物用飼料の製造に用いられる他の飲食品素材、各種栄養素、各種ビタミン、ミネラル、アミノ酸、各種油脂、種々の添加剤（例えば呈味成分、甘味料、有機酸等の酸味料、界面活性剤、ｐＨ調整剤、安定剤、酸化防止剤、色素、フレーバー）等を配合して、常法に従って製造することができる。あるいは、通常食されている一般の飲食品又は動物用飼料に、化合物Ｉ若しくはＩＩ又はそれらの塩、あるいはこれらを含有する植物抽出物を配合することにより、本発明の飲食品又は動物用飼料を製造することができる。
【００２９】
本発明の医薬、飲食品又は動物用飼料における有効成分である、化合物Ｉ若しくはＩＩ又はそれらの塩の含有量（両化合物を含有する場合は各化合物の含有量の合計）は、所望の効果が期待できる量であれば良く、医薬の剤型、飲食品若しくは動物用飼料の形態、投与若しくは摂取する個体の種、症状、年齢、性別等に応じて適宜変更され得る。ヒトを対象とする場合、通常、化合物Ｉ若しくはＩＩ又はそれらの塩の投与量（両化合物を含有する場合は各化合物の含有量の合計）は、成人１人（６０ｋｇ換算で）１日当たり１０ｍｇ〜１０ｇであり得る。当該１日投与量は、１回で投与されても良く、数回に分けて投与されても良い。本発明の医薬の剤型若しくは投与レジメン、又は本発明の飲食品若しくは動物用飼料の形態は、当該投与量を適切に管理できるような形であることが望ましい。
【実施例】
【００３０】
本発明を具体的に説明するために実施例を挙げるが、本発明は以下の実施例によって制限されるものではない。
【００３１】
〔実施例１及び２〕
下記（有効成分の単離方法）に従い、ショウガ科植物であるミョウガの花蕾から上記一般式（Ｉ）で表される化合物（ガラナールラセミ体）及び上記一般式（ＩＩ）で表される化合物（ミョウガナール）をそれぞれ単離し、前者を実施例１、後者を実施例２とした。
【００３２】
（有効成分の単離方法）
１．抽出処理
新鮮なミョウガの花蕾を準備し、これを良く水洗して水切りした後スライスし、抽出用試料とした。この抽出用試料６００ｇに３倍量のヘキサンを加えてホモジナイズした後、常温・常圧下で、マグネチックスターラー上で攪拌しながら３０分間抽出処理（１回目抽出処理）を行った。１回目抽出処理で得られた固形分と抽出液とを分離し、該固形分に対して更に同様の条件でヘキサンにて抽出処理（２回目抽出処理）を行い、１回目抽出処理で得られた抽出液と２回目抽出処理で得られた抽出液とを混合した。
２．精製処理
上記抽出処理で得られた抽出液を濾過及び脱水し、ロータリーエバポレーターで濃縮乾固したものを、１５％アセトン−ヘキサン２ｍｌに溶解し、ヘキサンで平衡化したシリカゲル７７２９（メルク製）フラッシュクロマトカラム５０ｇにアプライした。その後１５％アセトン−ヘキサン３００ｍｌで溶出した。その溶出画分をロータリーエバポレーターで１／１０量に濃縮し、分取用ＨＰＬＣ（島津製作所製）で精製した。分取用ＨＰＬＣに関し、カラムは silica-60（ＴＯＳＯＨ）７．８×３００ｍｍを用い、移動相は３．５％アセトン−ヘキサンを用いて流速４．０ｍｌ／ｍｉｎ．で行い、検出波長は２３２ｎｍとした。上記一般式（Ｉ）で表される化合物（ガラナールラセミ体）は、特許文献５に記載の方法で別途単離した標準品のＨＰＬＣの溶出パターンを参考にし、また、上記一般式（ＩＩ）で表される化合物（ミョウガナール）は、Biosci. Biotechnol. Biochem (72) 10, 2181-2186, 2008に記載の方法で別途単離した標準品のＨＰＬＣの溶出パターンを参考にして、画分を分取した。分取した画分を窒素気流下にて濃縮乾固し、純度９５〜９８％の油状物質を得た。
【００３３】
〔試験例１：サーチュイン（マウスSIRT1、マウスSIRT3）遺伝子の発現確認試験〕
細胞としてマウス由来マクロファージ様細胞RAW264.7細胞を用いた。細胞は各Wellあたり１×１０6個／ｍｌとなるよう培養プレートに０．５ｍｌずつ分注し、１０％ＦＢＳを含むRPMI1640培地で培養した。被験物質として実施例１（ガラナールラセミ体）又は実施例２（ミョウガナール）を、終濃度で１．２５μｇ／ｍｌ、２．５μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌとなるよう添加し、被験物質無添加の細胞と共に３７℃、５％炭酸ガスの存在下、６時間培養した。培養した細胞から全ＲＮＡをTaKaRa FastPure（登録商標） RNA Kit（タカラバイオ株式会社製）を用いて抽出し、この全ＲＮＡを鋳型にPrimeScript RT reagent Kit（タカラバイオ株式会社製）を用い逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを作成した。作成したｃＤＮＡを鋳型に定量的ＰＣＲによりｍＲＮＡ量を定量した。定量的ＰＣＲにはSYBR（登録商標） Premix Ex Taq TM II（タカラバイオ株式会社製）を用い、９５℃５秒、６０℃３０秒の2-Step PCRを用いN=2で測定した。プライマーは以下の配列のものを、終濃度０．４μＭで使用した。定量結果はβアクチンの定量結果で補正した。結果を図１及び図２に示す。
マウスSIRT1：5'-CCCCATGAAGTGCCTCAAAT-3'/  5'-GATTACCCTCAAGCCGCTTA-3'
マウスSIRT3：5'-CTGGATGGACAGGACAGATAAG-3'/  5'-TCTTGCTGGACATAGGATGATC-3'
β-Actin： 5'-TGCACCACACCTTCTACAATGA-3'/ 5'-CAGCCTGGATAGCAACGTACAT-3' 
【００３４】
〔試験例２：サーチュイン（ヒトSIRT1、ヒトSIRT3）遺伝子の発現確認試験〕
細胞としてヒト由来単球様細胞THP-1を用いた。細胞は各Wellあたり１×１０6個／ｍｌとなるよう培養プレートに０．５ｍｌずつ分注し、１０％ＦＢＳを含むRPMI1640培地で培養した。被験物質として実施例１（ガラナールラセミ体）又は実施例２（ミョウガナール）を、終濃度で１．２５μｇ／ｍｌ、２．５μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌとなるよう添加し、被験物質無添加の細胞と共に３７℃、５％炭酸ガスの存在下、６時間培養した。培養した細胞から全ＲＮＡをTaKaRa FastPure（登録商標） RNA Kit（タカラバイオ株式会社製）を用いて抽出し、この全ＲＮＡを鋳型にPrimeScript RT reagent Kit（タカラバイオ株式会社製）を用い逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを作成した。作成したｃＤＮＡを鋳型に定量的ＰＣＲによりｍＲＮＡ量を定量した。定量的ＰＣＲにはSYBR（登録商標） Premix Ex Taq TM II（タカラバイオ株式会社製）を用い、９５℃５秒、６０℃３０秒の2-Step PCRを用いN=2で測定した。プライマーは以下の配列のものを、終濃度０．４μＭで使用した。定量結果はβアクチンの定量結果で補正した。結果を図３及び図４に示す。
ヒトSIRT1：5'-TAGAGCCTCACATGCAAGCTCTA-3'/  5'-GCCAATCATAAGATGTTGCTGAAC-3'
ヒトSIRT3：5'-AAGAGATGCGGGACCTTGTG-3'/  5'-ACCTGCCCAAGCTGTCTTCA-3'
β-Actin： 5'-TGCACCACACCTTCTACAATGA-3'/ 5'-CAGCCTGGATAGCAACGTACAT-3' 
【００３５】
図１〜図４から明らかなように、ガラナールラセミ体（実施例１）添加群及びミョウガナール（実施例２）添加群は、これら被験物質無添加の対照（ネガティブコントロール）に比べて、マウス及びヒトの両方においてサーチュイン（SIRT1、SIRT3）遺伝子発現量が顕著に増大した。このことから、上記一般式（Ｉ）で表される化合物（ガラナール）及び上記一般式（ＩＩ）で表される化合物（ミョウガナール）が、サーチュイン遺伝子発現増強作用を有することが明らかであり、サーチュイン遺伝子の活性化が有効に作用する哺乳類の状態改善（寿命延長等）や各種疾患の予防／治療剤として有望であることが確認された。
【００３６】
〔試験例３：ＩＤＯ（マウスIDO-1、マウスIDO-2）遺伝子の発現確認試験〕
プライマーとして以下の配列のものを終濃度０．４μＭで使用した以外は、前記試験例１と同様にして試験を行った。結果を図５及び図６に示す。
マウスIDO-1：5'-GGACCCAGACACGTTTTTCC-3'/  5'-ATTCTTTGCCAGCCTCGTGT-3'
マウスIDO-2：5'-CGGGGCTTCATCCTAGTGAC-3'/  5'-GGATTGTCCTTCCACCCAGA-3'
β-Actin： 5'-TGCACCACACCTTCTACAATGA-3'/ 5'-CAGCCTGGATAGCAACGTACAT-3' 
【００３７】
〔試験例４：ＩＤＯ（ヒトIDO-1、ヒトIDO-2）遺伝子の発現確認試験〕
被験物質（ガラナールラセミ体又はミョウガナール）を終濃度で１．２５μｇ／ｍｌ、２．５μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌとなるよう添加し、且つプライマーとして以下の配列のものを終濃度０．４μＭで使用した以外は、前記試験例２と同様にして試験を行った。結果を図７及び図８に示す。
ヒトIDO-1：5'-GCATTTTTCAGTGTTCTTCGCATA-3'/  5'-CATACACCAGACCGTCTGATAGCT-3'
ヒトIDO-2：5'-GTCCTGCCAAGGAATCTTGC-3'/  5'-TTGCAGTGAGCCGAGATCAT-3'
β-Actin： 5'-TGCACCACACCTTCTACAATGA-3'/ 5'-CAGCCTGGATAGCAACGTACAT-3' 
【００３８】
図５〜図８から明らかなように、ガラナールラセミ体（実施例１）添加群及びミョウガナール（実施例２）添加群は、これら被験物質無添加の対照（ネガティブコントロール）に比べて、マウス及びヒトの両方においてＩＤＯ（IDO-1、IDO-2）遺伝子発現量が顕著に減少した。このことから、上記一般式（Ｉ）で表される化合物（ガラナールラセミ体）及び上記一般式（ＩＩ）で表される化合物（ミョウガナール）が、ＩＤＯ遺伝子発現抑制作用を有することが明らかであり、ＩＤＯ遺伝子の抑制が有効に作用する哺乳類の状態改善（寿命延長等）や各種疾患の予防／治療剤として有望であることが確認された。
【００３９】
〔試験例５：ヒストンの脱アセチル化確認試験〕
サーチュイン遺伝子発現によるヒストンの脱アセチル化を測定した。細胞としてマウス由来マクロファージ様細胞RAW264.7細胞を用いた。細胞は各Wellあたり１×１０6個／ｍｌとなるよう培養プレートに０．５ｍｌずつ分注し、１０％ＦＢＳを含むRPMI1640培地で培養した。被験物質として実施例１（ガラナールラセミ体）若しくは実施例２（ミョウガナール）又はポジティブコントロールとしてのレスベラトロール（Resveratrol）を、終濃度で１０μｇ／ｍｌとなるよう添加し、被験物質無添加の細胞と共に３７℃、５％炭酸ガスの存在下、１８時間培養した。培養した細胞からヒストンを抽出キット（エピジェンテック社製キット）により抽出した。抽出ヒストン量を定量後、ヒストン中のアセチル基の量を定量キット（エピジェンテック社製キット）により定量した。結果を図９に示す。
【００４０】
図９から明らかなように、ガラナールラセミ体（実施例１）添加群及びミョウガナール（実施例２）添加群は、レスベラトロールと略同程度のヒストン脱アセチル化を示した。このことから、上記一般式（Ｉ）で表される化合物（ガラナール）及び上記一般式（ＩＩ）で表される化合物（ミョウガナール）が、レスベラトロールと同程度のサーチュイン遺伝子発現増強作用を有することが明らかである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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