(57)【要約】【課題】ＡＰＬ細胞を好中球様細胞等の正常細胞に分化誘導できるＡＰＬ治療薬開発のための新たな手段の提供。【解決手段】被験成分の存在下に、急性前骨髄球性白血病細胞における、ＳＩＲＴ２遺伝子産物の発現性を測定することを特徴とする急性前骨髄球性白血病治療薬のスクリーニング方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験成分の存在下に、急性前骨髄球性白血病細胞における、ＳＩＲＴ２遺伝子産物の発現性を測定することを特徴とする急性前骨髄球性白血病治療薬のスクリーニング方法。
【請求項２】
ＳＩＲＴ２遺伝子産物の発現性の測定が、ＳＩＲＴ２遺伝子からｍＲＮＡへの転写活性を測定するものである請求項１記載のスクリーニング方法。
【請求項３】
ＳＩＲＴ２遺伝子産物の発現性の測定が、ＳＩＲＴ２遺伝子からタンパク質への翻訳活性を測定するものである請求項１記載のスクリーニング方法。
【請求項４】
急性前骨髄球性白血病治療薬が、急性前骨髄球性白血病細胞から好中球様細胞への分化誘導薬である請求項１〜３のいずれか１項記載のスクリーニング方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項記載のスクリーニング方法によりスクリーニングされた被験成分を有効成分とする急性前骨髄球性白血病治療薬。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか１項記載のスクリーニング方法によりスクリーニングされた被験成分を有効成分とする、急性前骨髄球性白血病細胞から好中球様細胞への分化誘導薬。
【請求項７】
ＳＩＲＴ２遺伝子発現抑制剤を有効成分とする急性前骨髄球性白血病治療薬。
【請求項８】
ＳＩＲＴ２遺伝子発現抑制剤が、ＳＩＲＴ２ＲＮＡ干渉剤である請求項７記載の急性前骨髄球性白血病治療薬。
【請求項９】
急性前骨髄球性白血病治療薬が、急性前骨髄球性白血病細胞の好中球様細胞への分化誘導薬である請求項７又は８記載の急性前骨髄球性白血病治療薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、急性前骨髄球性白血病治療薬のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
急性白血病には、急性骨髄性白血病と急性リンパ性白血病があるが、成人では急性骨髄性白血病が８割を占める。急性骨髄性白血病のうち、急性前骨髄球性白血病（Ａｃｕｔｅ  ｐｒｏｍｙｅｌｏｃｙｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ：ＡＰＬ）は、ビタミンＡ誘導体であるレチノイン酸（Ａｌｌ−ｔｒａｎｓ  ｒｅｔｉｎｏｉｃ  ａｃｉｄ：ＡＴＲＡ）が有効である。レチノイン酸は、未分化状態に保たれているＡＰＬ細胞を、好中球様の細胞へ最終分化を誘導することにより、細胞の腫瘍性を失わせると考えられている（非特許文献１〜３）。
【０００３】
しかし、ＡＰＬ患者の中には、レチノイン酸に抵抗性を示す患者（非特許文献４）やレチノイン酸が使用できない患者（非特許文献５〜７）がいることが知られている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】臨床血液(2011) 52巻:469-483.
【非特許文献２】Nat Rev Cancer. (2010) vol.10:775-83.
【非特許文献３】Blood. (1991) vol.77:1080-6.
【非特許文献４】Leukemia. (2002) vol.16:1940-58.
【非特許文献５】Blood. (1998) vol.92:2712-8.
【非特許文献６】Blood. (2000) vol.95:90-5.
【非特許文献７】Blood. (2009) vol.113:775-83.
【非特許文献８】Nat Rev Mol Cell Biol. (2012) vol.13:225-38.
【非特許文献９】Oncogene. (2007) vol.26:5489-504.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
このようなレチノイン酸抵抗性や使用できないＡＰＬ患者の治療には、レチノイン酸とは異なる治療薬が必要である。しかし、レチノイン酸の標的であるレチノイン酸受容体を除き、細胞分化誘導に際し、ＡＰＬ細胞中のどの分子を標的にすればよいのかについては全く知られていない。
従って、本発明の課題は、ＡＰＬ細胞を好中球様細胞等の正常細胞に分化誘導できるＡＰＬ治療薬開発のための新たな手段を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
そこで本発明者は、種々の遺伝子の発現とＡＰＬ細胞の分化誘導との関係を検討してきたところ、全く意外にもエピジュネティックな制御を司る遺伝子であるＳＩＲＴ２遺伝子（非特許文献８、９）の発現性を抑制すれば、ＡＰＬ細胞が好中球様細胞へ分化誘導されることを見出し、本発明を完成した。
【０００７】
すなわち、本発明は、次の〔１〕〜〔９〕を提供するものである。
〔１〕被験成分の存在下に、ＡＰＬ細胞における、ＳＩＲＴ２遺伝子産物の発現性を測定することを特徴とするＡＰＬ治療薬のスクリーニング方法。
〔２〕ＳＩＲＴ２遺伝子産物の発現性の測定が、ＳＩＲＴ２遺伝子からｍＲＮＡへの転写活性を測定するものである〔１〕記載のスクリーニング方法。
〔３〕ＳＩＲＴ２遺伝子産物の発現性の測定が、ＳＩＲＴ２遺伝子からタンパク質への翻訳活性を測定するものである〔１〕記載のスクリーニング方法。
〔４〕ＡＰＬ治療薬が、ＡＰＬ細胞から好中球様細胞への分化誘導薬である〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載のスクリーニング方法。
〔５〕〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載のスクリーニング方法によりスクリーニングされた被験成分を有効成分とする、ＡＰＬ治療薬。
〔６〕〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載のスクリーニング方法によりスクリーニングされた被験成分を有効成分とする、ＡＰＬ細胞から好中球様細胞への分化誘導薬。
〔７〕ＳＩＲＴ２遺伝子発現抑制剤を有効成分とするＡＰＬ治療薬。
〔８〕ＳＩＲＴ２遺伝子発現抑制剤が、ＳＩＲＴ２ＲＮＡ干渉剤である〔７〕記載のＡＰＬ治療薬。
〔９〕ＡＰＬ治療薬が、ＡＰＬ細胞の好中球様細胞への分化誘導薬である〔７〕又は〔８〕記載のＡＰＬ治療薬。
【発明の効果】
【０００８】
本発明のスクリーニング方法によれば、ＡＰＬ細胞を好中球様細胞に分化誘導させるＡＰＬ治療薬がスクリーニングできる。得られたＡＰＬ治療薬は、新規な分子標的薬として有用である。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】ＲＮＡ干渉法を用いたＡＰＬ細胞におけるＳＩＲＴ２遺伝子の発現抑制を示す図である（ＡはｍＲＮＡ、Ｂはタンパク質、ｎｏｎ−ｔａｒｇｅｔはコントロール、ＳＩＲＴ２ｓｈ１、ＳＩＲＴ２ｓｈ２及びＳＩＲＴ２ｓｈ３はｓｈＲＮＡを導入）。
【図２】ＳＩＲＴ２遺伝子発現抑制によるＡＰＬ細胞の好中球様細胞への分化誘導を示す図である（ｎｏｎ−ｔａｒｇｅｔはコントロール、ＳＩＲＴ２ｓｈ１、ＳＩＲＴ２ｓｈ２及びＳＩＲＴ２ｓｈ３はｓｈＲＮＡを導入）。
【図３】ＳＩＲＴ２遺伝子発現抑制によるＡＰＬ細胞の好中球分化マーカーＣＤ１１ｂの発現誘導を示す図である（ｎｏｎ−ｔａｒｇｅｔはコントロール、ＳＩＲＴ２ｓｈ１、ＳＩＲＴ２ｓｈ２及びＳＩＲＴ２ｓｈ３はｓｈＲＮＡを導入）。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明のＡＰＬ治療薬のスクリーニング方法は、被験成分の存在下に、ＡＰＬ細胞における、ＳＩＲＴ２遺伝子産物の発現性を測定することにより実施される。
【００１１】
用いられるＡＰＬ細胞としては、臨床分離株でもよいが、ＡＰＬ細胞株として樹立された細胞を用いるのが好ましく、例えばＮＢ４細胞、ＨＬ−６０細胞、ＵＦ−１細胞等が挙げられる。
【００１２】
被験成分としては、単一化合物でも、複数の化合物の混合物でもよく、動物や植物からの抽出物でもよい。
【００１３】
後記実施例に記載のように、本発明者は、ＳＩＲＴ２遺伝子のＲＮＡ干渉剤である、ＳＩＲＴ２のｓｈＲＮＡをＡＰＬ細胞に導入すると、当該ＡＰＬ細胞はＳＩＲＴ２遺伝子の発現が抑制され、好中球様細胞へ分化誘導されることを見出した。従って、被験成分の存在下にＡＰＬ細胞を培養し、そのＡＰＬ細胞のＳＩＲＴ２遺伝子の発現が抑制されれば、ＡＰＬ細胞が分化誘導され、当該被験成分がＡＰＬ治療薬として有用であることがわかる。
【００１４】
被験成分の添加は、ＡＰＬ細胞の培養液中に行えばよく、例えば培地成分中に行えばよい。被験成分のＳＩＲＴ２遺伝子発現抑制効果を定量的に測定するには、被験成分は一定の倍率で相違する複数の濃度で添加するのが好ましい。
【００１５】
ＡＰＬ細胞の培養は、ＡＰＬ細胞を培地中に１×１０2〜１×１０6ｃｅｌｌ／ｍＬ添加し、３０〜４０℃で２４〜７２時間行えばよい。培地としては、ＲＰＭＩ１６４０、ＩＭＤＭ等が用いられる。当該培地には、ウシ血清、ブタ血清、抗生物質（１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン）などを添加するのが好ましい。
【００１６】
ＡＰＬ細胞のＳＩＲＴ２遺伝子の発現性の測定は、ＳＩＲＴ２遺伝子からｍＲＮＡへの転写活性、及びＳＩＲＴ２遺伝子からタンパク質への翻訳活性のいずれの測定で行ってもよい。転写活性の測定は、ＡＰＬ細胞からＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲ法、ノザンブロティング、マイクロアレイ法等を組み合わせることによりＳＩＲＴ２ｍＲＮＡの増減を測定すればよい。一方、翻訳活性の測定は、ＡＰＬ細胞からタンパク質を抽出し、ウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ法などによりＳＩＲＴ２タンパク質の量の増減を測定すればよい。また、ＳＩＲＴ２遺伝子の翻訳活性は、その産物がＮＡＤ依存的ヒストン脱アセチル化酵素であるから、当該酵素の脱アセチル化酵素活性を測定することによっても行うことができる。また、ＳＩＲＴ２遺伝子の脱アセチル化基質蛋白質のアセチル化の亢進を、ウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ法などにより評価することによっても行うことができる。
【００１７】
ＳＩＲＴ２遺伝子の発現が抑制されれば、ＡＰＬ細胞は好中球様細胞に分化誘導され、腫瘍性が失われるので、被験成分の存在下にＡＰＬ細胞を培養し、ＳＩＲＴ２遺伝子の発現が抑制されれば、当該被験成分はＡＰＬ細胞の分化誘導薬、すなわちＡＰＬ治療薬として有用であると判定できる。ここで、ＳＩＲＴ２遺伝子の産物がＮＡＤ依存的ヒストン脱アセチル化酵素であるから、ＮＡＤ依存的ヒストン脱アセチル酵素活性の阻害によっても、ＡＰＬ細胞が好中球様細胞に分化誘導される。
【００１８】
本発明のスクリーニング方法の好ましい態様は、（ａ）被験成分の存在下に、ＡＰＬ細胞を培養する工程、（ｂ）ＡＰＬ細胞におけるＳＩＲＴ２遺伝子の発現性を測定する工程、及び（ｃ）ＳＩＲＴ２遺伝子の発現性が抑制されている場合に当該被験成分をＡＰＬ治療薬又はＡＰＬ細胞から好中球様細胞への分化誘導薬として選択する工程を含むものである。
【００１９】
本発明のスクリーニング方法により選択された被験成分は、ＡＰＬ細胞から好中球様細胞への分化誘導薬として、またＡＰＬ治療薬として有用である。
【００２０】
ＡＰＬ細胞のＳＩＲＴ２遺伝子発現を抑制する成分（ＳＩＲＴ２遺伝子発現抑制剤）は、ＡＰＬ治療薬又はＡＰＬ細胞から好中球様細胞への分化誘導薬として有用である。このようなＳＩＲＴ２遺伝子発現抑制剤としては、ＳＩＲＴ２遺伝子からｍＲＮＡへの転写活性抑制剤、ＳＩＲＴ２遺伝子からタンパク質への翻訳活性抑制剤が挙げられる。このうち、転写活性抑制剤としては、ＳＩＲＴ２のｓｈＲＮＡ、ＳＩＲＴ２のｓｉＲＮＡ等のＳＩＲＴ２ＲＮＡ干渉剤が挙げられる。
【００２１】
本発明のＡＰＬ治療薬は、経口または非経口的に投与することができる。経口的に投与する製剤としては、錠剤、カプセル剤、散剤、細粒剤、液剤、トローチ剤、ゼリー剤等を挙げることができる。また、非経口的に投与する製剤としては、注射剤、硬膏剤、酒精剤、エキス剤、座剤、懸濁剤、チンキ剤、軟膏剤、パップ剤、点鼻剤、吸入剤、リニメント剤、ローション剤、エアゾール剤等を挙げることができる。
【００２２】
これらの製剤は当業者に公知慣用の製剤方法により製造でき、またこのような種々の剤形の医薬製剤を調製するには、他の薬学的に許容される担体を所望に応じて添加することが可能である。担体としては、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、流動化剤、乳化剤、安定化剤等を挙げることができる。
【００２３】
本発明のＡＰＬ治療薬の患者への投与量は、患者の性別、年齢、症状、投与方法、投与回数、投与時期等により異なるが、例えば、経口投与の場合、１日当たりＳＩＲＴ２遺伝子発現抑制剤を０．１〜１００ｍｇ投与することが好ましい。また、本発明のＡＰＬ治療薬を点鼻剤として投与する場合、製剤中のＳＩＲＴ２遺伝子発現抑制剤の濃度を０．０１〜５．０ｗ／ｗ％、好ましくは０．０５〜３．０ｗ／ｗ％として製したものを、１日１〜３回程度点鼻するのが好ましい。本発明のＡＰＬ治療薬を注射剤として投与する場合、製剤中のＳＩＲＴ２遺伝子発現抑制剤の濃度を０．０５〜５．０ｗ／ｗ％として製したものを、１日１回程度注射するのが好ましい。
【実施例】
【００２４】
以下に、実施例を示して本発明を説明するが、本発明はこれらにのみ限定されるべきものではない。
【００２５】
実施例１
（１）ｓｈＲＮＡの導入操作
ＳＩＲＴ２遺伝子を標的とする３つの異なるｓｈＲＮＡ（図中ｓｈ１からｓｈ３）、またはコントロールのｎｏｎ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｓｈＲＮＡとなる配列は、化学的に合成し、レンチウイルスベクターｐＬＫＯ２．０上のＵ６プロモータの下流に挿入した。これらのｓｈＲＮＡ発現ベクターは、大腸菌ＸＬ−１０ＧＯＬＤ株などに導入後、大腸菌を培養することで増幅し、大量精製した。これらのｓｈＲＮＡ発現ベクターは、１２μｇをヘルパーベクター（例えば、８μｇのｐＣＭＶＲ８．９１と５μｇのＭＤ２Ｇの組み合わせ）と混和した後、ヒト２９３Ｔ細胞などに、ＰＥＩ（ポリエチレンイミン）法などを用いてトランスフェクションし、レンチウイルス化を行なった。トランスフェクション後、トランスフェクションした細胞を１０％ウシ胎児血清、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ培地で、３７℃、５％ＣＯ2培養器を用いて３０−９０時間培養後、ウイルス粒子を含んだ培養上清の回収を行なった。培養上清からウイルス粒子を、限外濾過法などにより濃縮後、５×１０5個程度のＮＢ４細胞に感染を行なうことで、細胞内でのｓｈＲＮＡでの発現を行なった。さらに感染操作を数回繰り返すことで、高い感染効率を実現した。
【００２６】
（２）細胞培養条件
ＮＢ４細胞の培養には、ＩＭＤＭ培地やＲＭＰＩ１６４０培地に、１０％ウシ胎児非働化血清、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを添加したものを用いた。５×１０4−５×１０5／ｍＬの細胞濃度で、３７℃、５％ＣＯ2培養器を用いて、２４−７２時間、培養を行った。ウイルス産生に用いた、ヒト２９３Ｔ細胞株は、ＤＭＥＭ培地に１０％ウシ胎児非働化血清、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを添加したものを用いた。
【００２７】
（３）レンチウイルスベクターｐＬＫＯ２．０を用いて、ＡＰＬ細胞株ＮＢ４内に、ＳＩＲＴ２遺伝子を標的とする３つの異なるｓｈＲＮＡ（図中ｓｈ１からｓｈ３）、またはコントロールのｎｏｎ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｓｈＲＮＡを導入、発現させた。ウイルス感染によるｓｈＲＮＡ導入４８時間後に、一部の細胞から、ＲＮＡ抽出キットを用いてＲＮＡを抽出した。続いて、ＲＮＡ５００ｎｇ程度を鋳型としてｃＤＮＡ合成反応を行なった後、ｃＤＮＡ２μＬ程度を鋳型として、ＳＩＲＴ２もしくはコントロールのＧＡＰＤＨに特異的なプライマーを用いて、ＲＴ−ＰＣＲ法により、ＧＡＰＤＨに対するＳＩＲＴ２のＲＮＡ発現量の違いについて、検討した（図１（Ａ））。同時に、一部の細胞をＲＩＰＡバッファーに懸濁後、超音波破砕器で５から２０秒ほど破砕することで、細胞抽出液を得た。細胞抽出液は、１〜１００μｇを、ＳＩＲＴ２もしくはコントロールのアクチンに対する特異的な抗体を用いたウエスタンブロット法により、ＳＩＲＴ２タンパク質量の違いについて検討した（図１（Ｂ））。
【００２８】
（４）（３）で示した、ＳＩＲＴ２遺伝子に対する特異的なｓｈＲＮＡ（ｓｈ１からｓｈ３）、もしくはコントロールのｎｏｎ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｓｈＲＮＡをＡＰＬ細胞に導入後、４８時間経過した細胞について、好中球特異的なＮＢＴ（ｎｉｔｒｏｂｌｕｅ  ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ）還元能試験を行なった。ＮＢＴ還元能試験は、回収した２×１０4の細胞を培地１００μＬに再懸濁し、それらに１００μＬのＮＢＴ試薬（０．２μｇ／ｍＬ  Ｐｈｏｒｂｏｌ  １２−ｍｙｒｉｓｔａｔｅ  １３−ａｃｅｔａｔｅ、０．１ｍｇ／ｍＬ  ３，３’−［３，３’−Ｄｉｍｅｔｈｏｘｙ−（１，１’−ｂｉｐｈｅｎｙｌ）−４，４’−ｄｉｙｌ］−ｂｉｓ［２−（４−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ）−５−ｐｈｅｎｙｌ−２Ｈ−ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅを含む）を添加し、３７℃、５％ＣＯ2培養器で１時間、反応させた後、細胞を観察した。ＲＮＡ干渉によりＳＩＲＴ２の発現が抑制されたＡＰＬ細胞では、ＮＢＴ試薬の還元反応が起こり、細胞が濃い黒色を呈色したのに対し、コントロールのｎｏｎ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｓｈＲＮＡでは、呈色反応が起こらなかった。このことから、ＡＰＬ細胞は、ＳＩＲＴ２の遺伝子発現抑制により、成熟好中球へと分化したことが示された。
（５）（４）同様、ＳＩＲＴ２遺伝子に対する特異的なｓｈＲＮＡ（ｓｈ１からｓｈ３）、もしくはコントロールのｎｏｎ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｓｈＲＮＡをＡＰＬ細胞に導入後、４８時間経過した細胞（例えば２×１０4個）を回収した後、ＰＥ（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）などで蛍光標識された好中球分化マーカーＣＤ１１ｂと死細胞標識剤７−ＡＡＤ（７−Ａｍｉｎｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ  Ｄ）などで、氷上で約２０分間染色後、ＦＡＣＳ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ）を用いて解析した。７−ＡＡＤ陽性細胞（死細胞）を除いた生細胞のＣＤ１１ｂのシグナルについて解析を行なった．ＲＮＡ干渉によりＳＩＲＴ２の発現が抑制されたいずれのＡＰＬ細胞（灰色の塗りつぶし）は、ｎｏｎ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｓｈＲＮＡを発現するコントロールのＡＰＬ細胞（黒実線）に比べて、好中球分化マーカーＣＤ１１ｂの高発現が認められた。なお、灰色実線は、コントロールＩｇＧである。
【図１】
2014036626.tif 000002
【図２】
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【図３】
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