(57)【要約】【課題】報告されているフォトニック結晶を用いたセンサーは、表面へ認識素子を固定化し、被検物質との結合・解離に起因する屈折率変化を測定しているため、変化量が小さく、低分子の被検物質検出が困難であるといった問題があった。【解決手段】分子認識能を有する材料を用いてフォトニック結晶を作製し、フォトニック結晶内部への被検物質の抽出及び該材料の物性変化を検出・定量に利用することで、イオン等の被検物質を検出・定量が可能となった。【選択図】図１３
2014202574.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検物質を検出するための光学センサーであって、
フォトニック結晶として機能する凹凸構造を有する検出部位を有し、
該検出部位は、認識素子を包含していることを特徴とする、
光学センサー。
【請求項２】
前記検出部位は、ポリ塩化ビニル（PVC）、ポリメチルメタクリレート、ポリエチレン（グリコール）ジアクリレート（PEGDA）、ポリ塩化ビニリデン(PVDC)、アクリルアミド、アガロース、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、コラーゲン、ゼラチン、セルロース、ポリジメチルシロキサン(PDMS)、ポリエステル（PET）、及び／又は、ポリエチレングリコールから構成されている請求項１に記載の光学センサー。
【請求項３】
前記認識素子は、イオノフォア、キレート、酵素、DNA、RNA、糖鎖、及び／又は、タンパク質である請求項１又は２に記載の光学センサー。
【請求項４】
前記検出部位の膜厚が、0.1μm 〜8.0μmである請求項１〜３のいずれか１に記載の光学センサー。
【請求項５】
下記の工程を含む請求項１〜４のいずれか１に記載の光学センサーの作製方法、
（１）樹脂、可塑剤、認識素子を溶媒に溶解して可塑化樹脂溶液を作製する工程、
（２）該溶液を、アレイモールドを使用して、認識素子を含みかつフォトニック結晶として機能する凹凸構造を有する可塑化樹脂からなる検出部位を作製する工程。
【請求項６】
前記アレイモールドが、PVA製ピラーアレイモールドである請求項５に記載の光学センサーの作製方法。
【請求項７】
フォトニック結晶として機能する凹凸構造を有する可塑化ポリ塩化ビニルで構成している光学センサー用基板。
【請求項８】
下記の工程を含む請求項７に記載の光学センサー用基板の作製方法、
（１）ポリ塩化ビニル、可塑剤を溶媒に溶解して可塑化ポリ塩化ビニル溶液を作製する工程、
（２）該溶液を、アレイモールドを使用して、凹凸構造を有する可塑化ポリ塩化ビニルを作製する工程。
【請求項９】
前記アレイモールドが、PVA製ピラーアレイモールドである請求項８に記載の光学センサー用基板の作製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光学センサー及び該光学センサーの作製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（バイオセンサー）
医療機関、研究機関、環境分析機関において遺伝子解析、臨床診断、有害物質検出等の目的で使用される様々なバイオセンサーが開発されている。
【０００３】
（フォトニック結晶）
フォトニック結晶（Photonic Crystal: PhC）は、ナノメートルサイズの誘電体周期構造であり、周期・サイズに依存して特定波長の光を反射する。その反射特性は、PhC 周囲の屈折率に依存して鋭敏に変化するため、センサー応用が期待されている。
【０００４】
（PhCを使用したセンサー）
PhCを使用した光学センサーとして、以下が報告されている。
特開2007-271609（特許文献１）は、「水性媒体に不溶である固体物質（M）からなる周期構造体(N)から構成されるフォトニック結晶（C）を主要構成素子とし、周期構造体(N)の表面に特異的結合物質（X）を固定化されたか、又は周期構造体（N）の構成単位(L) の表面に特異的結合物質（X）が固定化されたことを特徴とするバイオセンサー（S）」を開示している。
しかし、該バイオセンサーは、本発明の光学センサーとは異なり、周期構造体(N)の表面に特異的結合物質（X）を固定化している。
【０００５】
WO2010/044274（特許文献２）は、「所定の被検出物を検出するための光学式センサーであって、所定の形状が二次元的に周期配列されフォトニック結晶として機能する凹凸構造と、前記凹凸構造の表面に形成され局在表面プラズモン共鳴を励起可能な金属層と、を具備することを特徴とする光学式センサー」を開示している。
しかし、該バイオセンサーは、本発明の光学センサーとは測定原理自体が異なり、さらにフォトニック結晶として機能する凹凸構造の表面に金属層が形成されている。
【０００６】
特開2011-80848（特許文献３）は、「周期的に配置されている粒子から構成されるフォトニック結晶（Ｃ）と、ターゲット物質と特異的に結合あるいは反応する特異的結合物質（Ｘ）を含み、前記ターゲット物質と前記特異的結合物質とが結合あるいは反応することによって体積変化する刺激応答性高分子材料（Ｍ）と、を備え、前記フォトニック結晶は、前記刺激応答性高分子材料に内包されている、バイオセンサ（Ｓ）」を開示している。
しかし、該バイオセンサーは、本発明の光学センサーとは異なり、フォトニック結晶はシリカ等により粒子化されており、多層構造になっている。該構造のために、周期構造を再現良く（均一的）に作製することは困難である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開2007-271609
【特許文献２】WO2010/044274
【特許文献３】特開2011-80848
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
報告されているPhCを用いたセンサーは、表面へ認識素子を固定化し、被検物質との結合・解離に起因する屈折率変化を測定しているため、変化量が小さく、低分子の被検物質検出が困難である並びに使用するPhC自体もSi、TiO2等の金属酸化物を電子線描画装置、エッチング等の手法で作製しているため、ひとつのセンサーをシステムとして稼動させるために多大な費用がかかり及びセンサーの構造が複雑になり作製が困難であるといった問題があった。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するために、分子認識能を有する材料を用いてPhCを作製し、PhC内部への被検物質の抽出及び該材料の物性変化を検出・定量に利用することで、イオン等の被検物質を検出・定量が可能となり、上記課題を解決できることを確認した。
【００１０】
すなわち、本発明は以下の通りである。
１．被検物質を検出するための光学センサーであって、
フォトニック結晶として機能する凹凸構造を有する検出部位を有し、
該検出部位は、認識素子を包含していることを特徴とする、
光学センサー。
２．前記検出部位は、ポリ塩化ビニル（PVC）、ポリメチルメタクリレート、ポリエチレン（グリコール）ジアクリレート（PEGDA）、ポリ塩化ビニリデン(PVDC)、アクリルアミド、アガロース、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、コラーゲン、ゼラチン、セルロース、ポリジメチルシロキサン(PDMS)、ポリエステル（PET）、及び／又は、ポリエチレングリコールから構成されている前項１に記載の光学センサー。
３．前記認識素子は、イオノフォア、キレート、酵素、DNA、RNA、糖鎖、及び／又は、タンパク質である前項１又は２に記載の光学センサー。
４．前記検出部位の膜厚が、0.1μm 〜8.0μmである前項１〜３のいずれか１に記載の光学センサー。
５．下記の工程を含む前項１〜４のいずれか１に記載の光学センサーの作製方法、
（１）樹脂、可塑剤、認識素子を溶媒に溶解して可塑化樹脂溶液を作製する工程、
（２）該溶液を、アレイモールドを使用して、認識素子を含みかつフォトニック結晶として機能する凹凸構造を有する可塑化樹脂からなる検出部位を作製する工程。
６．前記アレイモールドが、PVA製ピラーアレイモールドである前項５に記載の光学センサーの作製方法。
７．フォトニック結晶として機能する凹凸構造を有する可塑化ポリ塩化ビニルで構成している光学センサー用基板。
８．下記の工程を含む前項７に記載の光学センサー用基板の作製方法、
（１）ポリ塩化ビニル、可塑剤を溶媒に溶解して可塑化ポリ塩化ビニル溶液を作製する工程、
（２）該溶液を、アレイモールドを使用して、凹凸構造を有する可塑化ポリ塩化ビニルを作製する工程。
９．前記アレイモールドが、PVA製ピラーアレイモールドである前項８に記載の光学センサー用基板の作製方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の光学センサーは、従来のPhCセンサーと比較して、（１）多層構造を作製する必要がなく、周期構造を再現良く（均一）に再現することができ、（２）被検物質を高感度かつ特異的に検出することができ、（３）安価な樹脂材料によりPhCを作製することができ、かつ（４）ナノインプリントリソグラフィーを使用して簡単に作製することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】可塑化樹脂（PVC製）ホールアレイPhC作製工程。
【図２】PVA製ピラーアレイモールドの外観図。
【図３】（a）作製したモールドとして使用したCOP製PhCのSEM像、（b）PVA製ピラーアレイモールドのSEM像。
【図４】（a）作製した可塑化PVC製PhCの鉛直方向からの外観写真、（b）鉛直方向から30度の方向からの外観写真。
【図５】作製した可塑化PVC製PhCの表面のSEM像。
【図６】可塑化PVC製PhC及び可塑化PVC製平滑フィルムの反射スペクトル。
【図７】PVC製PhCの厚みと反射スペクトル強度の関係。
【図８】PPシートで作製した測定用フローセル｛（a）フローセル用PPシート、（b）測定中のフローセル断面図｝。
【図９】イオン応答性可塑化PVC製PhCの応答測定結果。
【図１０】10 mM KOH/100 mM HCl導入に対する応答速度の測定結果。
【図１１】イオン応答性可塑化PVC製PhCのイオン選択性の測定結果。
【図１２】イオン応答性可塑化PVC製PhCの応答変化量とイオン応答性可塑化PVCフィルムの応答変化量の比較結果。
【図１３】本発明の光学センサーの概念図。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の光学センサー（参照：図１３）は、フォトニック結晶（PhC）として機能する凹凸構造を有する検出部位を有し、該検出部位は認識素子を包含していることを特徴とする。
【００１４】
（PhC）
フォトニック結晶（PhC）は、一定の規則性、即ち、周期性を有する構造体であって、その周期構造としては、結晶性無機固体と同様の結晶構造である六方最密充填構造、立方最密充填構造、体心立方充填構造、ログパイル構造、ダイヤモンド構造、ウッドパイル構造等が挙げられる。なお、これらの周期構造のうちでは、六方最密充填構造が好ましい。
【００１５】
（PhCとして機能する凹凸構造）
本発明におけるPhCとして機能する凹凸構造は、PhCとして機能し、かつ下記で述べる認識素子を包含できる材料であれば特に限定されない。例えば、樹脂系の材料として、ポリ塩化ビニル（PVC）、ポリメチルメタクリレート、ポリエチレン（グリコール）ジアクリレート（PEGDA）、ポリ塩化ビニリデン(PVDC)、アクリルアミド、アガロース、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、コラーゲン、ゼラチン、セルロース、ポリジメチルシロキサン(PDMS)、ポリエステル（PET等）、ポリエチレングリコール等が挙げられるが、特に好ましいのがポリ塩化ビニル（PVC）である。
【００１６】
（認識素子）
本発明における認識素子は、イオン検出用イオノフォア（バリノマイシン、CCCP、FCCP、イオノマイシン、グラミシジンA、ナイジェリシン、モネンシン等）、重金属類検出キレート（EDTA、NTA、DTPA、GLDA、HEDTA、GEDTA、TTHA、HIDA、DHEG等）、疾病マーカー検出用酵素（グルコースオキシダーゼ等）、DNA、RNA、糖鎖、タンパク質等が挙げられるが特に限定されない。
【００１７】
（検出部位）
本発明における検出部位は、少なくとも被検物質と接触する表面に、PhCとして機能する凹凸構造を有し、さらに認識素子を包含している。
検出部位の厚み（膜厚）は、光学センサーとしての必要な強度を維持し、かつ下記実施例１により、0.1μm〜8.0μm、好ましくは0.15μm〜7.0μm、より好ましくは0.2μm 〜3.0μm、最も好ましくは0.3μm〜1.5μmである。
【００１８】
（被検物質）
本発明における被検物質は、認識素子に認識される物質であれば特に限定されない。例えば、イオン、重金属、疾病マーカーとなるタンパク質、DNA、RNA、糖鎖等が挙げられる。
【００１９】
（光学センサーの作製方法）
本発明の光学センサーは、下記の工程で例示しているように、好ましくはナノインプリント法を使用する。ナノインプリント法は、微細な構造を精密かつ容易に加工することができるため、作製コストが低く、非常に高感度かつ信頼性の高いセンサーを提供することが可能なためである。
また、従来のPhCを使用した光学センサーは、再現性が低く、作製されたセンサー同士の誤差が非常に大きいため、異なる光学センサー間で光学特性の比較をするということは困難であった。しかしながら、ナノインプリント技術で形成された本発明の光学センサーは、同一のものを再現性良く、安価にかつ大量生産できるため、異なる光学センサー間であっても光学特性を比較することができる。
【００２０】
（アレイモールドの作製）
（１）ピラーアレイ型PhC又はホールアレイ型PhCを、エタノール等で表面を洗浄した後、スピンコーターに設置し、スピンさせることにより乾燥させる。
（２）PVA水溶液又はPVP水溶液を、パスツールピペットを用いて、ナノ周期構造を有する面を上に向けてスピンコーターに設置したピラーアレイ型PhC又はホールアレイ型PhCに滴下し、スピンして、コーティングをする。
（３）PVA水溶液又はPVP水溶液でコーティングしたピラーアレイ型PhC又はホールアレイ型PhCを乾燥させる。
（４）ピラーアレイ型PhC又はホールアレイ型PhC上にコーティングされたフィルム状のPVAを離型用支持体（PETフィルム上に水溶性両面テープを設置している）に設置、ピンセットを用いてピラーアレイ型PhC又はホールアレイ型PhCを端から機械的に引き剥がすことで離型する。
必要に応じて、離型したPVAフィルム又はPVPフィルムには、PhCのナノ周期構造が転写されていることを、走査型電子線顕微鏡（Scanning Electron Microscope:SEM）を用いて確認する。
なお、本発明の好ましいアレイモールドは、PVA製ピラーアレイモールドである。
【００２１】
｛認識素子を含みかつ凹凸構造を有する可塑化樹脂からなる検出部位（認識素子を含む可塑化樹脂製ホールアレイ）の作製｝
（１）樹脂、可塑剤、認識素子を溶媒に溶解して、可塑化樹脂溶液を作製する。
（２）上記で作製したPVA製ピラーアレイモールド、PVA製ホールアレイモールド、PVP製ピラーアレイモールド又はPVP製ホールアレイモールドをスピンコーターに設置し、（１）の可塑化樹脂溶液をパスツールピペットで該モールド上に滴下し、スピンすることによってフィルム状に成型させて、乾燥させる。
（３）PET製支持体を設置し、水溶性両面テープごと離型用支持体から剥離し、蒸留水に浸漬することでモールドを水に溶解・離型させる。
（４）浸漬した後、認識素子を含む可塑化樹脂フィルムを水中から引き上げ、蒸留水で洗浄し、もう一方の面にもPET製支持体を設置する。
必要に応じて、離型した認識素子を含む可塑化樹脂フィルムを、SEMによって表面にナノ周期構造が転写されていることを確認する。
本発明で用いる「可塑剤」は、NPOE（2-Nitro phenyl octyl ether、2-ニトロ フェニル オクチル エーテル）、DOP（Dioctyl phthalate、フタル酸ジオクチル）、DOS（Dioctyl sebacate、セバシン酸ジ2-エチルヘキシル）、DOA（Dioctyl adipate、アジピン酸ジオクチル）、DOPP（Di-n-octyl phenylphosphonate、ジオクチルフェニルフォスフォネート）、トリメリット酸ジオクチル、クエン酸トリエステル等が挙げられるが特に限定されない。
本発明で用いる「溶媒」は、樹脂を溶解しかつ揮発性が高い溶媒であれば、特に限定されない。例えば、THF、シクロヘキサン、酢酸エチル等が挙げられる。
【００２２】
（PhCとして機能する凹凸構造を有する可塑化ポリ塩化ビニルで構成させた光学センサー用基板）
本発明では、「PhCとして機能する凹凸構造を有する可塑化ポリ塩化ビニルで構成させた光学センサー用基板」も対象とする。
従来の方法では、PhCとして機能する凹凸構造を有する可塑化ポリ塩化ビニルで構成させた光学センサー用基板を作製することができなかった。しかし、本発明では、下記の方法により、該基板を作製することができた。なお、該基板は、通常のバイオセンサー用基板として利用することができる。
【００２３】
（PhCとして機能する凹凸構造を有する可塑化ポリ塩化ビニルで構成させた光学センサー用基板の作製方法）
PhCとして機能する凹凸構造を有する可塑化ポリ塩化ビニルで構成した光学センサー用基板の作製方法は、以下の工程を含む。
（１）ポリ塩化ビニル、可塑剤を溶媒に溶解して可塑化ポリ塩化ビニル溶液を作製する工程。
（２）該溶液を、PVA製ピラーアレイモールド、PVA製ホールアレイモールド、PVP製ピラーアレイモールド又はPVP製ホールアレイモールドを使用して、PhCとして機能する凹凸構造を有する可塑化ポリ塩化ビニルを作製する工程。
【００２４】
（本発明の光学センサーの使用方法）
本発明の光学センサーの使用方法を下記で例示する。
（１）被検物質等が含まれていない試料を、本発明の光学センサーの凹凸構造上に接触させて、光を照射し、反射光の光学特性、特に、反射光のピーク波長や強度に関する情報を取得する。光源としてはどのようなものでも良いが、例えば、タングステン・ハロゲン光源や発光ダイオード、ＬＥＤ、重水素ランプ、有機ＥＬ、レーザー等を用いれば良い。また、反射光を検出する光検出手段には、例えば、マルチチャンネル分光器やＣＣＤイメージセンサー、ＣＭＯＳセンサー等を用いることができる。
（２）次に、被検物質が含まれる試料を、本発明の光学センサーの凹凸構造上に接触させた後、同様に反射光の光学特性に関する情報を取得する。
（３）最後に、上記（２）の反射光の光学特性を、上記（１）の光学特性と比較することにより、試料中に含まれる被検物質の有無や量を検出する。
【００２５】
なお、予め試料に含まれる被検物質等の濃度等を変化させた際の反射光の光学特性を光学センサーで検出してデーターベース化し、このデータと試料を接触させた後の光学センサーから反射される光の光学特性とを比較することにより、試料中に含まれる被検物質の有無や量を検出しても良い。
【００２６】
また、光学センサーに光を照射し、透過光の光学特性に関する情報を利用しても良い。この場合、下記のように使用すれば良い。
（１）被検物質等が含まれていない試料を、光学センサー１の凹凸構造上に接触させて、光を照射し、透過光の光学特性、特に、反射光のピーク波長や強度に関する情報を取得する。
（２）次に、被検物質が含まれる試料を、本発明の光学センサーの凹凸構造上に接触させた後、同様に透過光の光学特性に関する情報を取得する。
（３）最後に、上記（２）の透過光の光学特性を、上記（１）の透過光の光学特性と比較することにより、試料中に含まれる被検物質の有無や量を検出する。
【００２７】
以下に具体例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの例に限定されない。
【実施例１】
【００２８】
（可塑化樹脂製PhCの作製と特性評価）
可塑化樹脂製PhCを作製するにあたって、PhC側、オプトードメンブレン側からの要求に応える必要がある。すなわち、PhCとして十分な性能を発揮するためにナノ周期構造を支える基材部分は薄くする必要があると同時にオプトードメンブレンとして応答速度を迅速にするためには薄いほうが好ましい。
したがって、本実施例では、数百ナノメートルオーダーのフィルムの上にナノ周期構造（PhC）を作製した。
ナノ周期構造を作製する方法としてはインプリント法を選択した。この方法であればエッチングなどの複雑な工程をえることなく、モールド上に可塑化樹脂｛本実施例では、樹脂の一例としてポリ塩化ビニル（PVC）を使用した｝をスピンコートすることで容易にナノ周期構造の作製が可能であった。
今回はモールドを溶解させることで離型する方法を選択した。可塑化PVCを溶解させている有機溶媒には不溶であり、可塑化PVCが不溶な溶液には可溶な材料でモールドを作製することで、フィルム状の可塑化PVCに機械的な負荷をかけることなく離型が可能であった。
さらに、可塑化PVC製PhCの作製にあたって、PhC性能、イオンセンサー性能の両方に大きく寄与する膜厚についての検討を行った。なお、膜厚については、可塑化PVCポリマー溶液の溶媒希釈率を変化させることで粘度を調整することによって条件検討をおこなった。詳細は、以下の通りである。
【００２９】
（ナノインプリント法による可塑化樹脂製PhCの作製）
下記の工程により、可塑化樹脂ホールアレイPhCを作製した（参照：図１）。
【００３０】
１．PVA（ポリビニルアルコール）製ピラーアレイモールドの作成
シクロオレフィンポリマー（COP）製ホールアレイ型PhC（ホールサイズ230 nm、格子定数400 nm、ホール深さ200 nm、SCIVAX株式会社より提供）を、ポンチを用いて直径12 mmに切り出した。
切り出したCOP製PhCは、エタノールで表面を洗浄した後スピンコーターに設置し、8000 rpmで10秒スピンすることにより、十分に乾燥させた。
水溶性ポリマー溶液として、10%（w/w）PVA水溶液を調製した。調製の際には、PVA（165-17915、和光純薬工業社製） 10 g及び蒸留水90 gを秤量し、110 mLスクリュー菅に入れよく混和させた後、送風定温恒温機で90℃に加熱し完全に溶解させた後、室温まで放冷した。
調製したPVA水溶液（約1 mL ）を、パスツールピペットを用いて、ナノ周期構造を有する面を上に向けてスピンコーターに設置したCOP製PhCに滴下し、速やかに8000 rpmで3秒間スピンし、コーティングした。
PVA水溶液でコーティングしたCOP製PhCを送風定温恒温機で70℃、10分間乾燥した。その後、送風定温恒温機から取り出し、室温まで放冷した。
20 mm四方に裁断したPETフィルム(Black & White copier Transparency Film、3M社製）上に水溶性両面テープを設置した離型用支持体を用意し、COP製PhC上にコーティングされたフィルム状のPVAを離型用支持体に設置、ピンセットを用いてCOP製PhCを端から機械的に引き剥がすことで離型した。
離型したPVAフィルムには、COP製PhCのナノ周期構造が転写されていることをSEMにより確認した。
【００３１】
２．可塑化PVC製ホールアレイPhCの作製
可塑化PVCポリマー溶液として、PVC（high molecular weight 81387、Fluka社製） 40 mg、可塑剤として2-Nitro phenyl octyl ether（NPOE、S038、東京化成工業社製） 80 mg、Tetrahydrofuran(THF) 1080 mgを秤量し、スクリュー管内で攪拌した。THFは、480 mg、280 mgを秤量した溶液をそれぞれ別個に調製した。
上記で作製したPVA製ピラーアレイモールドをスピンコーターに設置し、可塑化PVCポリマー溶液（約1 mL）を、パスツールピペットで該モールド上に滴下し、速やかに1500 rpm、10秒でスピンすることによってフィルム状に成型した。1分間の乾燥の後、PET製支持体を設置し、水溶性両面テープごと離型用支持体から剥離し、蒸留水に約2時間浸漬することでモールドを水に溶解・離型した。
2時間浸漬した後、可塑化PVCフィルムを水中から引き上げ、蒸留水で洗浄し、もう一方の面にもPET製支持体を設置した。
離型した可塑化PVCフィルムは、乾燥後SEMによって表面にナノ周期構造が転写されていることを確認した。
さらに、可動ステージにプラスチックシャーレ製のサンプルホルダを設置し、水中での反射スペクトルを測定した。
最後に、調製した可塑化PVC溶液を同条件でSi基板｛N(100)、ニラコ社製｝上にスピンコートし、超深度顕微鏡を用いて可塑化PVC膜厚を測定した。
【００３２】
３．PVA製ピラーアレイモールド評価
作製したPVA製ピラーアレイモールドの外観を図２に示す。図２（a）は、光源を垂直から照射したもの、図２（b）は30度方向から光源を照射したものである。斜めから光を照射することで、表面のナノ周期構造が反射型回折格子として働くことによって生じる構造色が確認できた。
作製したモールドとして使用したCOP製PhC 及びPVA製ピラーアレイモールドのSEM像を図３に示す。図３（a）はモールドとして使用したCOP製PhCの表面SEM像、図３（b）はPVA製ピラーアレイモールドの表面SEM像である。
図３（b）のSEM像から明らかなように、作製したPVAモールドが直径230 nmのピラーが規則的に並んだ構造を有していることを確認した。これは、疎水性のCOP上であってもPVA溶液が表面構造に沿って密着していたことを示している。さらに、転写が不完全な部分も確認できなかった。
以上により、PVA製ピラーアレイモールドが作製できたことを確認した。
【００３３】
４．可塑化PVC製PhC評価
作製した可塑化PVC製PhCの外観を図４に示す。図４（a）は、光源を鉛直方向から、図４（b）はPhC面から斜め30度方向から照射した際の画像である。PhC表面のナノ周期構造が反射方回折格子として振舞うことによる構造色が確認できた。
作製した可塑化PVC製PhCの表面のSEM像を図５に示す。
図５のSEM像より、ホール径約230 nmの周期構造が転写されていることを確認した。さらに、PVAの残留や、周期構造の崩れがないことも確認した。
以上により、PVA製モールドが水に対して完全に溶解したこと、可塑化PVC溶液溶媒であるTHFに対して耐性があったことを示した。
なお、今回使用したPVAはけん化率80%であったが、けん化率95%に変更するとPVA中の疎水性部分である酢酸ビニルが減少するため、さらにTHFに対する耐性が増し、良好な転写性能が得られる。
【００３４】
（可塑化PVC製PhCの水中での反射スペクトルの評価）
可塑化PVC製PhCの水中での反射スペクトルを評価した。
可塑化PVC製PhCを、ポリイミドテープを用いてプラスチック製シャーレに固定し、蒸留水を該PhCが完全に水に浸かるまで加えた状態で測定を行った。比較用に、表面にナノ周期構造を持たない可塑化PVC製平滑フィルムの反射スペクトルも同時に測定した。
測定結果を図６に示す。
図６から明らかなように、作製した可塑化PVC製PhCは、570 nmに大きなピークを持つ反射スペクトルを確認した。一方、平滑フィルムの反射スペクトル強度は弱く、光源のスペクトル分布を強く反映したものとなった。なお、平滑フィルムの反射スペクトルはフレネル反射によるものと考えられる。可塑化PVC製PhCの反射スペクトルが、ナノ周期構造形成面と、その裏側である平滑な面のフレネル反射の合算であるとすると、可塑化PVC製PhCの反射強度は平滑フィルムを大きく越えるものとならない。
したがって、可塑化PVC製PhCの反射スペクトルは、ナノ周期構造で光が散乱され、逆側の平滑面との間で光が導波し、回折放射によって取り出されたものであることを確認した。
【００３５】
（可塑化PVC製PhCの厚みの相違による反射スペクトル強度の評価）
可塑化PVC製PhCの厚みの相違による反射スペクトル強度を評価した。
最初に、可塑化PVCポリマー溶液のTHF量と可塑化PVC製PhCの膜厚の関係について確認した。確認結果を下記表１に示す。
下記表１から明らかなように、THFの重量比が増えるにしたがってポリマー溶液の粘度が低下し、それに伴って膜厚も小さくなっていることがわかる。
【００３６】
【表１】
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【００３７】
さらに、異なる厚みを有する可塑化PVC製PhCの反射スペクトル強度の測定結果を図７に示す。
図７の測定結果から明らかなように、PhCの厚みが小さくなるにしたがって反射強度が大きくなることが観察された。これは、PhC厚みが小さくなるにしたがってPhC平面方向に導波する光の回折が大きくなり、それに伴って回折放射による光取り出し効率が上昇したことによる。
【００３８】
本実施例の結果から、PVA製モールドを介する可塑化PVC製PhCが作製できたことを確認した。
より詳しくは、作製した可塑化PVC製PhCは、１次モールドとして利用したCOP製ホールアレイPhCの構造（ホール径230 nm、格子定数400 nm）を正確に転写出来ていることを確認した。これは、PVAモールドを介するインプリント法が有用であることを示した。
２次モールドとして利用したPVAは、多くの疎水性材料と接着性が低いため、COP以外のシリコン、ガラス、金属素材、テフロン（登録商標）の材料で作製されたモールドからも作製可能である。
さらに、作製した可塑化PVC製PhCの反射スペクトル測定結果から、凹凸構造のポリマー製PhCに光を照射した場合、反射型回折格子として機能するのではなく、グレーティングカプラとして機能することを確認した。
以上により、可塑化PVC製PhCをオプトードメンブレン型イオンセンサーとして用いた場合、厚みを薄くすることによって応答速度と応答変化量を両立できる。
【００３９】
（結論）
ゴム状弾性を持つ軟質材料である可塑化PVCへのナノ周期構造形成は、PVAモールドを介するインプリント法によって実現できた。
本実施例では、COP製ホールアレイモールドに、PVA水溶液をスピンコートとすることによって作製したPVA製ピラーアレイモールドに、PVC、可塑剤、イオン認識素子、色素をTHFに溶解した可塑化PVCポリマー溶液をスピンコートすることで成膜し、モールドを水に溶解させて離型することで、可塑化PVC製PhCの作製ができた。
該PhCでは、厚み0.35 μmの薄膜上にホール径230 nmのナノ周期構造を作製することに成功した。
【実施例２】
【００４０】
（被検物質の検出可能な可塑化PVC製PhCの作製及び評価）
実施例１で作製した可塑化PVC製PhCに、イオン認識素子、脂溶性色素を添加することで被検物質の検出可能（イオン応答性を有する）PhCを作製した。
今回、イオン認識素子としてはバリノマイシン（カリウムイオンに対して高い選択性を持つイオノフォア）を、脂溶性色素としてはメロシアニン型色素であるKD-M11を、また対イオンとしては酸性の溶液中にあっても分解しない脂溶性アニオンであるTFPB｛（Tetrakis[3,5-bis(trifluoromethyl)phenyl]borate, sodium salt）｝を用いた。
イオン応答性の評価は、pH一定で様々な濃度のカリウム、ナトリウムを含む溶液を導入した際に測定される可塑化PVC製PhCの反射スペクトルによって行った。色素の吸収は溶液中の水素イオン/カリウム・ナトリウムイオンの比で決定されるため、pH一定条件下で各イオンに対する応答からイオンに対する選択性も同時に評価した。詳細は、以下の通りである。
【００４１】
（イオン応答性可塑化PVC製PhCの作製）
実施例１のPVC製PhC作製法に従ってイオン応答性可塑化PVC製PhCを作製した。
PVC（40 mg）、NPOE（80 mg）、THF（1174.77 mg）、バリノマイシ（4.51 mg、和光純薬工業社製）、KD-M11｛1-(dodecyl)-4-[(3',5'-dibromo-4'-oxocyclohexa-2', 5'-dienylidene)ethylidene]-1,4-dihydroquinoline、2.28 mg、参照：Analytica Chimica Acta 373 (1998) 271-289｝、TFPB（3.74 mg、東京化成工業社製）を秤量し、スクリュー管内でよく振り混ぜた。
バリノマイシン、KD-M11及びTFPBは必要量が少量であり、そのままでは正確な秤量が難しいため5倍量を秤量し、10 mLのTHFに完全に溶解させた後、2 mLずつ分注し完全にTHFを蒸発させたものを用いた、使用の際には再度THFに溶解させた。
また、比較用に、同様の方法でナノ周期構造を持たない平滑な可塑化PVCフィルム併せて作製した。作製したイオン応答性可塑化PVC製PhC及び平滑フィルムは100 mM 塩酸に浸漬して保存した。
【００４２】
（イオン応答性評価用溶液の調整）
グリシン（0.7507 g）を秤量し、1 Lの蒸留水に溶解させ、10 mM グリシン水溶液を調製した。この10 mM グリシン水溶液に対して、pHメーターでpHを測定しながら6 M HClを滴下し、pH 2.5に合わせた。このようにして調製したpH 2.5 グリシン/HCl Bufferは冷蔵保存し、測定前に室温に戻した。
約30 mL のpH 2.5 グリシン/HCl Bufferに秤量した塩化カリウム745.5 mg を完全に溶解し、100 mLメスフラスコを用いてpH 2.5 グリシン/HCl Bufferでメスアップし、pH2.5 10-1 M KCl 溶液を調製した。
次に、pH2.5 10-1 M KCl 溶液を10mL計り取り、100 mLメスフラスコを用いてpH 2.5 グリシン/HCl Bufferでメスアップし10倍に希釈することでpH2.5 10-2 M KCl 溶液を調製した。同様の手順でpH2.5 10-3 M KCl 〜 pH2.5 10-6 M KCl 溶液を調製した。
さらに、pH 2.5 グリシン/HCl Bufferに秤量した塩化ナトリウム584.4 mg を完全に溶解し、これも同様の手順でpH2.5 10-1 M NaCl 〜 pH2.5 10-6 M NaCl 溶液を調製した。
【００４３】
（イオン応答性評価方法）
イオン応答性可塑化PVC製PhCをPPシートで作製した測定用フローセル（参照：図８）に設置した。
導入する溶液は、前記したpH 2.5 10-1 M 〜 pH 2.5 10-6 M KCl・NaCl溶液と100 mM HCl、10 mM KOH 溶液である。
測定の際には各種の溶液5 mLをピペットで計り取り導入した後、その溶液をピペットを用いて取り除いてから再度ピペットを用いて5 mL溶液を導入した。
また、反射スペクトルの測定は、溶液導入後30秒後のスペクトルを測定した。
【００４４】
（イオン応答性評価）
イオン応答性可塑化PVC製PhC を100 mM HCl、10 mM KOHに浸漬した際のスペクトル変化を図９に示す。
図９の結果から明らかなように、100 mM HCl導入時は590 nm付近に反射ピークを有し、10 mM KOHを導入することで反射強度は40%低下し、反射ピークは580 nm付近へシフトした。反射強度の変化は、色素の吸収によるものであり、反射ピークシフトは、色素を添加していない可塑化PVC製PhCの反射ピークとKD-M11の極大吸収波長が合致しておらず、KD-M11の極大吸収波長がPhCの反射ピークより長波長側にあるため、シフトが起こったと考えられる。
また、反射スペクトル変化の要因としては、可塑化PVC製PhC中に含まれる色素の吸収波長変化以外にもカリウムイオンを抽出したことによる屈折率変化があると考えられる。この応答の結果から、屈折率による変化よりも色素の吸収による変化が支配的であることがわかる。
【００４５】
応答速度について測定を行った結果を図１０に示す。
図１０の結果から明らかなように、K+が可塑化PVC製PhC中に抽出される過程（KOH導入）、K+が可塑化PVCから水相に抽出される過程（HCI導入）のいずれも10秒以内に完了することを確認した。すなわち、本発明の光学センサーは非常に応答速度が非常に速いことを確認した。
この非常に速い応答速度は、膜厚が0.35μm薄いためであると考えられる。また、繰り返し溶液を交換しても同じ溶液であれば同じ反射強度変化を示すことから、応答が可逆的に行えることを確認した。
【００４６】
イオン選択性の測定結果を図１１に示す。
図１１の結果から明らかなように、導入した溶液中のカリウムイオン濃度が増加すると、イオン抽出に伴う色素の吸収波長変化によって反射強度が低下するが、ナトリウムイオン濃度が増加してもイオン抽出が生じないため反射強度の変化は小さかった。
すなわち、本発明の光学センサーは、被検物質を特異的に認識することができる。
【００４７】
イオン応答性可塑化PVC製PhCの応答変化量とイオン応答性可塑化PVCフィルムの応答変化量の比較結果を図１２に示す。
図１２の結果から明らかなように、表面にナノ周期構造を有する可塑化PVC製PhCはナノ周期構造の無い平滑フィルムに比べ変化量が20倍（40／2）大きいことがわかった。
PhCと平滑フィルムの組成は同じであるので、色素の応答に違いは生じない。したがって、この変化量の差は光路長が変化しているからである。
【００４８】
（結論）
本実施例の結果により、COP製ホールアレイモールドに、PVA水溶液をスピンコートとすることによって作製したPVA製ピラーアレイモールドに、PVC、可塑剤、イオン認識素子、色素をTHFに溶解した可塑化PVCポリマー溶液をスピンコートすることで成膜し、モールドを水に溶解させて離型することで、本発明の光学センサーの作製ができた。
本発明の光学センサーが被検物質を高感度かつ特異的に検出できることを確認した。該センサーはイオン抽出に伴う色素の吸収波長変化による反射スペクトル変化が観察できた。また、この変化には、イオン抽出に伴う可塑化PVCの屈折率変化、溶液の屈折率変化に伴うスペクトル変化も含まれていることを確認した。
加えて、本実施例で作製したイオン応答性可塑化PVC製PhC は、添加したイオノフォア、バリノマイシンのイオン選択性に由来する選択性を有することを確認した。
さらに、ナノ周期構造を有する可塑化PVC製PhCとナノ周期構造を持たない可塑化PVC製平滑フィルムとの応答変化量の比較を行ったところ、PhCは平滑フィルムに対して20倍の応答変化量を持つことが判明した。
以上により、本発明の光学センサーは、従来のPhCを用いたセンサーと比較して、被検物質を特異的かつ約20倍の高感度で検出できる。
【産業上の利用可能性】
【００４９】
新規な光学バイオセンサーを提供できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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