(57)【要約】      （修正有）【課題】ＱＣＭで微生物の検出法の感度を増幅させる人工シデロフォア錯体分子が修飾されたナノ微粒子の提供。【解決手段】１分子中に、式（１）で表される構造を有する人工シデロフォア錯体分子が表面に修飾された微粒子。2014181219.tif 000044（式中、Ｒ１〜Ｒ３は、それぞれ独立に、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数６〜１０のアリール基などを表す。またＲ４は、ニトロ基、アミノ基などを表す。ｌ、ｍは、それぞれ独立に、炭素数０〜５までのメチレン基を表す。Ｍ３＋は、３価の金属イオンを示す。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
１分子中に、一般式（１）または（２）で表される構造を有する人工シデロフォア錯体分子が表面に修飾された微粒子。
【化１】
2014181219.tif 000042
【化２】
2014181219.tif 000043
（一般式（１）および（２）中、Ｒ１〜Ｒ３、およびＲ５〜Ｒ１３は、それぞれ独立に、Ｈ、カルボニル含有基、リン酸エステル基、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数２〜６のアルケニル基、炭素数１〜６のアルコキシアルキル基、炭素数１〜６のアミノアルキル基、炭素数１〜６のパーフルオロアルキル基、炭素数６〜１０のアリール基、炭素数７〜１０のアラルキル基、またはカルボニル基を有するアルキル基、アルケニル基、アリール基もしくはアラルキル基を表す。また一般式（１）および（２）中、Ｒ４及びＲ１４は、それぞれ独立に、水酸基、ニトロ基、リン酸基、スルホ基、アミノ基、アルデヒド基、カルボキシル基、ビニル基、アリル基、アルキニル基、アジ基を表す。また一般式（１）および（２）中、ｌ、ｍ、ｎは、それぞれ独立に、炭素数０〜５までのメチレン基を表す。さらに一般式（１）および（２）中、Ｍ３＋は、３価の金属イオンを示す。）
【請求項２】
３価の金属イオンを捕捉する部位として、ヒドロキサム酸部位またはカテコール部位を分子内に３ヶ所有している請求項１に記載の人工シデロフォア錯体分子が表面に修飾された微粒子。
【請求項３】
前記微粒子が被着したセンサー用基板。
【請求項４】
前記センサーがＱＣＭセンサーである請求項３に記載のセンサー用基板。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、人工シデロフォア錯体と微粒子の複合体を用いた微生物検出システムに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ナノ微粒子は、ナノサイズの大きさを有する粒子状の材料であり、金属、金属酸化物、半導体材料、シリカ、アルミナ、高分子材料など、様々な材質による微粒子が開発・報告されている（非特許文献１、２）。また、ナノ微粒子を生体関連材料と複合化することで、様々な機能を有する材料開発を行うことが可能である（特許文献１、２）。例えば、特許文献１では抗原を金属ナノ微粒子表面に修飾することで、動物細胞に対する有効な免疫感作用抗原となることを報告している。
【０００３】
ナノ微粒子と複合化することで、機能性材料が構築可能な生体材料由来の化合物の一つとして、シデロフォアが挙げられる（非特許文献３）。シデロフォアは、細菌や真菌が鉄イオンを取り込むために体外に分泌する分子である。分泌されたシデロフォアは環境中の鉄イオンを捕捉して錯体（シデロフォア−鉄イオン複合体）を形成する。この錯体は、膜タンパク質であるシデロフォアレセプターにより認識され、該レセプター部位を透過して細胞内に取り込まれる。そして、取り込まれた錯体から鉄イオンが遊離され、細胞活動に利用される。なお、自らシデロフォアの生産及び分泌を行わない細菌等のなかにも、他の細菌等により生産され分泌された（外来性の）シデロフォアを利用して同様に鉄イオンを取り込むものがある。またシデロフォアは鉄の摂取を行うだけでなく、再脳内の様々な代謝機構の調節を行っていることも報告されている（非特許文献４）。
【０００４】
人工シデロフォアとは、上記シデロフォアの構造を一部抽出・模倣し、同様の機能を持つよう設計・合成された人工分子である（非特許文献５〜８）。天然分子であるシデロフォアと異なり、合成分子である人工シデロフォアは、分子構造が天然のものより簡便でありながら同様の機能を有し、極微量しか産出されない天然のものに比べて大量合成が可能である。また天然のものには存在しない新しい機能を人工的に付与することも可能である。特許文献３、および非特許文献９には、基板表面から少なくとも所定の長さ離して該基材表面にリンカーで繋ぎ止めた鉄イオンを結合したヒドロキサム酸型の人工シデロフォアを用いて、微生物細胞を固定する方法、などが記載されている。
【０００５】
また非特許文献１０では、水晶振動子マイクロバランス法（Ｑｕａｒｔｚ  Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂａｌａｎｃｅ；ＱＣＭ）で用いられるＱＣＭチップ上の電極部分に、人工シデロフォアの鉄錯体を修飾することで、微生物をセンシングすることが可能なこと、人工シデロフォア部分の構造の違いにより、微生物の吸着挙動に違いが見られること、更に、同一の人工シデロフォアを用いた場合でも、微生物の種類に応じて吸着挙動が異なること、などが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００６−３３５７２０号公報
【特許文献２】特開２００９−２４２５０１号公報
【特許文献３】特許第４６８６７０３号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】小泉光惠、奥山喜久夫、目義雄  著，ナノ粒子の製造・評価・応用・機器の最新技術，シーエムシー出版，２００２年．
【非特許文献２】高分子学会  編，微粒子・ナノ粒子（最先端材料システム  ＯｎｅＰｏｉｎｔ  ７），共立出版，２０１２年．
【非特許文献３】Ｊ．Ｈ．Ｃｒｏｓａ，Ａ．Ｒ．Ｍｅｙ，Ｓ．Ｍ．Ｐａｙｎｅ（編集），Ｉｒｏｎ  Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｉｎ  Ｂａｃｔｅｒｉａ，ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ），２００４年．
【非特許文献４】Ｌ．Ｄ．Ｄｅｖｉｒｅｄｄｙ，Ｃ．Ｇａｚｉｎ，Ｘ．Ｚｈｕ，Ｍ．Ｇ．Ｇｒｅｅｎ，Ｃｅｌｌ誌，２００５年，１２３巻，１２９３頁．
【非特許文献５】Ｋ．Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，Ｔ．Ｏｚａｗａ，Ｋ．Ｊｉｔｓｕｋａｗａ，Ｈ．Ｍａｓｕｄａ，Ｉｎｏｒｇｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ誌，２００４，４３巻，８５３８頁．
【非特許文献６】Ｄ．Ｉｍｂｅｒｔ，Ｆ．Ｔｈｏｍａｓ，Ｐ．Ｂａｒｅｔ，Ｇ．Ｓｅｒｒａｔｒｉｃｅ，Ｄ．Ｇａｕｄｅ，Ｊ．-Ｌ．Ｐｉｅｒｒｅ，Ｊ．-Ｐ．Ｌａｕｌｈｅｒｅ，Ｎｅｗ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０００年，２４巻，２８１頁．
【非特許文献７】Ｍ．Ａｐｏｓｔｏｌ，Ｐ．Ｂａｒｅｔ，Ｇ．Ｓｅｒｒａｔｒｉｃｅ，Ｊ．Ｄｅｓｂｒｉｅｒｅｓ，Ｊ．-Ｌ．Ｐｕｔａｕｘ，Ｊ．Ｍ．Ｓｔｅｂｅ，Ｄ．Ｅｘｐｅｒｔ，Ｊ．-Ｌ．Ｐｉｅｒｒｅ，Ａｎｇｅｗａｎｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，２００５年，４４巻，２５８０頁．
【非特許文献８】Ｅ．Ａ．Ｄｅｒｔｚ，Ｊ．Ｘｕ，Ｋ．Ｎ．；Ｒａｙｍｏｎｄ，Ｉｎｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００６年，４５巻，５４６５頁．
【非特許文献９】Ｔ．Ｉｎｏｍａｔａ，Ｈ．Ｅｇｕｃｈｉ，Ｋ．Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，Ｙ．Ｆｕｎａｈａｓｈｉ，Ｔ．Ｏｚａｗａ，Ｈ．Ｍａｓｕｄａ，Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ誌，２００７，２３巻，７５１頁．
【非特許文献１０】Ｔ．Ｉｎｏｍａｔａ，Ｈ．Ｅｇｕｃｈｉ，Ｙ．Ｆｕｎａｈａｓｈｉ，Ｔ．Ｏｚａｗａ，Ｈ．Ｍａｓｕｄａ，Ｌａｎｇｍｕｉｒ誌，２０１２年，２８巻，１６１１頁．
【非特許文献１１】Ｊ．Ｋ．Ｙｏｕｎｇ，Ｇ．Ｒ．Ｂａｋｅｒ，Ｇ．Ｒ．Ｎｅｗｋｏｍｅ，Ｋ．Ｆ．Ｍｏｒｒｉｓ，Ｃ．Ｓ．Ｊｏｈｎｓｏｎ  Ｊｒ．，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ誌，１９９４年，２７巻，３４６４頁．
【非特許文献１２】Ｓ．Ｌｅｂｒｅｔｏｎ，Ｓ．-Ｅ．Ｈｏｗ，Ｍ．Ｂｕｃｈｈｏｌｚ，Ｂ．-Ｅ．Ｙｉｎｇｙｏｎｇｎａｒｏｎｇｋｕｌ，Ｍ．Ｂｒａｄｌｅｙ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ誌，２００３年，５９巻，３９４５頁．
【非特許文献１３】Ｗ．Ｗ．Ｗｅａｒｅ，Ｓ．Ｍ．Ｒｅｅｄ，Ｍ．Ｇ．Ｗａｒｎｅｒ，Ｊ．Ｅ．Ｈｕｔｃｈｉｓｏｎ，Ｊｏｕｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ誌，２０００年，１２２巻，１２８９０頁．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
人工シデロフォア‐鉄錯体が修飾されたＱＣＭを用いた微生物の検出法は迅速・簡便であり、基盤として用いる水晶振動子の価格などを考えると低コスト化が可能な測定方法である。しかし現段階では、微生物の検出感度は１０３〜１０４ＣＦＵ／ｍＬ程度（１ｍＬ中千個から1万個の微生物を検出可能）であり、実用化に向けて求められている微生物センサーの検出感度（１０２ＣＦＵ／１００ｍＬ）に比べて、まだ２〜３桁程度足りない。
【０００９】
本発明の課題は、人工シデロフォア錯体分子が修飾されたＱＣＭを用いた微生物の検出法の感度を増幅するために、人工シデロフォア錯体分子が修飾されたナノ微粒子を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは上記した課題について、これまでに開発してきた人工シデロフォア錯体分子をベースとし、鋭意検討した結果、人工シデロフォア錯体分子をナノ微粒子上に修飾することにより、上記に挙げた微生物検出の検出感度を大幅に増幅することが可能なナノ微粒子を開発するに至った。本発明は、ナノ微粒子上に修飾された人工シデロフォア錯体分子が、微生物細胞表面のシデロフォアレセプターと相互作用により微生物同士を高度に凝集させ、それが人工シデロフォア錯体分子の修飾されたＱＣＭ上へ吸着されることにより、微生物の検出感度を大幅に向上することが可能になった。
【００１１】
すなわち、本発明は、本発明は、以下の一般式（１）または（２）で表される構造を有する人工シデロフォア錯体分子が表面に修飾されたナノ微粒子である。
【００１２】
[１]  １分子中に、一般式（１）または（２）で表される構造を有する人工シデロフォア錯体分子が表面に修飾された微粒子。
【化１】
2014181219.tif 000002
【化２】
2014181219.tif 000003
一般式（１）および（２）において、Ｒ１〜Ｒ３、およびＲ５〜Ｒ１３は、それぞれ独立に、Ｈ、カルボニル含有基、リン酸エステル基、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数２〜６のアルケニル基、炭素数１〜６のアルコキシアルキル基、炭素数１〜６のアミノアルキル基、炭素数１〜６のパーフルオロアルキル基、炭素数６〜１０のアリール基、炭素数７〜１０のアラルキル基、またはカルボニル基を有するアルキル基、アルケニル基、アリール基もしくはアラルキル基を表す。また一般式（１）および（２）中、Ｒ４及びＲ１４は、それぞれ独立に、水酸基、ニトロ基、リン酸基、スルホ基、アミノ基、アルデヒド基、カルボキシル基、ビニル基、アリル基、アルキニル基、アジ基を表す。また一般式（１）および（２）において、ｌ、ｍ、ｎは、それぞれ独立に、炭素数０〜５までのメチレン基を表す。さらに、一般式（１）および（２）において、Ｍ３＋は、３価の金属イオンを示す。
【００１３】
［２］３価の金属イオンを捕捉する部位として、ヒドロキサム酸部位またはカテコール部位を分子内に３ヶ所有している前記［１］に記載の人工シデロフォア錯体分子が表面に修飾された微粒子。
【００１４】
［３］前記微粒子が被着したセンサー用基板。
【００１５】
［４］前記センサーがＱＣＭセンサーである前記［３］に記載のセンサー用基板。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明である人工シデロフォア錯体が修飾された微粒子および基板を用いた微生物検出システムを示した概略図である。
【図２】本発明の第２実施形態における金微粒子１、３および４のＵＶ／ｖｉｓスペクトルを示した図である。
【図３】本発明の第３実施形態における人工シデロフォア錯体１が修飾された金基板２上へのＭ．ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ吸着実験における（ａ）ＱＣＭによる周波数変化、および（ｂ）基板表面のＡＦＭ像を示した図である。
【図４】本発明の第３実施形態における人工シデロフォア錯体２が修飾された金基板３上へのＥ．ｃｏｌｉ吸着実験における（ａ）ＱＣＭによる周波数変化、および（ｂ）基板表面のＡＦＭ像を示した図である。
【図５】本発明の第３実施形態における人工シデロフォア錯体１が修飾された金基板２と金微粒子３を用いたＭ．ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ吸着実験における（ａ）ＱＣＭによる周波数変化、および（ｂ）基板表面のＡＦＭ像を示した図である。
【図６】本発明の第３実施形態における人工シデロフォア錯体２が修飾された金基板３と金微粒子４を用いたＥ．ｃｏｌｉ吸着実験における（ａ）ＱＣＭによる周波数変化、および（ｂ）基板表面のＡＦＭ像を示した図である。
【図７】本発明の第３実施形態における人工シデロフォア錯体２が修飾された金基板３と金微粒子３を用いたＥ．ｃｏｌｉ吸着実験における基板表面のＡＦＭ像を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、図面を参照しつつ本発明の実施の形態について説明する。本発明は、以下の実施形態に限定されるものではなく、発明の範囲を逸脱しない限りにおいて、変更、修正、改良を加え得るものである。
【００１８】
（第１実施形態）
図１は上記人工シデロフォア錯体が修飾されたナノ微粒子およびＱＣＭチップチップ、およびそれを利用した微生物の高感度検出方法の概略図である。なお図中符号はそれぞれ、１：人工シデロフォア錯体が修飾されたナノ微粒子、２：微生物、３：人工シデロフォア錯体が修飾された微粒子により凝集した微生物、４：人工シデロフォア錯体が修飾されたセンサー基板、５：人工シデロフォア錯体が修飾されたセンサー基板上に吸着した、人工シデロフォア錯体が修飾された微粒子により凝集した微生物、を示す。
【００１９】
本実施形態の人工シデロフォア錯体分子は、１分子中に、一般式（１）または（２）で表される構造を有する化合物である。
【化１】
2014181219.tif 000004
【化２】
2014181219.tif 000005
一般式（１）および（２）において、Ｒ１〜Ｒ３、およびＲ５〜Ｒ１３は、それぞれ独立に、Ｈ、カルボニル含有基、リン酸エステル基、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数２〜６のアルケニル基、炭素数１〜６のアルコキシアルキル基、炭素数１〜６のアミノアルキル基、炭素数１〜６のパーフルオロアルキル基、炭素数６〜１０のアリール基、炭素数７〜１０のアラルキル基、またはカルボニル基を有するアルキル基、アルケニル基、アリール基もしくはアラルキル基を表す。また一般式（１）および（２）中、Ｒ４及びＲ１４は、それぞれ独立に、水酸基、ニトロ基、リン酸基、スルホ基、アミノ基、アルデヒド基、カルボキシル基、ビニル基、アリル基、アルキニル基、アジ基を表す。また一般式（１）および（２）において、ｌ、ｍ、ｎは、それぞれ独立に、炭素数０〜５までのメチレン基を表す。さらに、一般式（１）および（２）において、Ｍ３＋は、３価の金属イオンを示す。
【００２０】
上記の条件を満足する一般式（１）および（２）で表される化合物（人工シデロフォア錯体）として、３価の金属イオンを捕捉する部位としてヒドロキサム酸部位、またはカテコール部位を分子内に３ヶ所有している化合物が好ましい。３価の金属イオン捕捉部位であるヒドロキサム酸部位、またはカテコール部位は、それぞれを単独で３つ持っている化合物、また両者を併せて３ヶ所有している化合物でも良い。なお、一般式（１）または（２）で表される化合物（人工シデロフォア錯体）は、これに限定されるものではなく、一般式（３）〜（２１）で表される化合物でもよい。
【化３】
2014181219.tif 000006
【化４】
2014181219.tif 000007
【化５】
2014181219.tif 000008
【化６】
2014181219.tif 000009
【化７】
2014181219.tif 000010
【化８】
2014181219.tif 000011
【化９】
2014181219.tif 000012
【化１０】
2014181219.tif 000013
【化１１】
2014181219.tif 000014
【化１２】
2014181219.tif 000015
【化１３】
2014181219.tif 000016
【化１４】
2014181219.tif 000017
【化１５】
2014181219.tif 000018
【化１６】
2014181219.tif 000019
【化１７】
2014181219.tif 000020
【化１８】
2014181219.tif 000021
【化１９】
2014181219.tif 000022
【化２０】
2014181219.tif 000023
【化２１】
2014181219.tif 000024
【００２１】
本実施形態の人工シデロフォアの合成法について説明する。ちなみに、本実施形態の人工シデロフォア錯体は、３価の金属イオンをＭ、人工シデロフォア配位子Ｌを用いて表すと、ＭＬと表されるものである。まず、３価の金属塩原料に、配位子Ｌを反応させる方法が好ましく用いられる。３価の金属塩原料としては、塩化鉄、トリス（２，４-ペンタンジオナト）Ｆｅ（３価）等のＦｅ（３価）塩や錯体、トリス（２，４-ペンタンジオナト）Ｇａ（３価）等のＧａ（３価）錯体、およびトリス（２，４-ペンタンジオナト）Ａｌ（３価）等のＡｌ（３価）錯体が好適に用いられる。人工シデロフォア配位子Ｌとしては、まず一般式（２２）に示す様に、ヒドロキサム酸部位を金属イオン捕捉部位として含むものが好適に用いられる。
【化２２】
2014181219.tif 000025
また、一般式（２３）にカテコール部位を金属イオン捕捉部位として含むものも好適に用いられる。
【化２３】
2014181219.tif 000026
さらに、一般式（２４）、（２５）に示すようにヒドロキサム酸部位とカテコール部位を併せ持つものも好適に用いられる。
【化２４】
2014181219.tif 000027
【化２５】
2014181219.tif 000028
【００２２】
３価の金属塩原料に配位子Ｌを反応させる反応溶媒としては、水あるいは一般的な有機溶媒を用いることができ、好ましくは水、アセトン、メタノール、エタノール等のアルコール系溶媒、酢酸エチル等のエステル系溶媒が用いられる。反応温度は特に限定されないが、反応を進行させるために、加温してもよく、室温〜８０℃の範囲で行うことが特に好ましい。また加温についてはオイルバス、ウォーターバス、マイクロ波加熱装置等を使用することができる。反応時間は特に限定されないが、通常１分〜数日、好ましくは１０分〜１日であり、加温する場合は、加熱装置により時間を変更することが好ましい。
【００２３】
（第２実施形態）
次に本実施形態のナノ微粒子について説明する。本発明におけるナノ微粒子にはナノレベルの粒径（数〜数百ｎｍ）を持つ微粒子が用いられ、好適には直径１００ｎｍ以下の微粒子が用いられる。微粒子の素材は金・銀・銅・鉄・コバルトなどの金属微粒子、ポリ酸に代表される金属酸化物、硫化カドミウムや硫化亜鉛などの金属硫化物、スチレンポリマーなどの高分子に至るまで様々なものを用いることができるが、好適には金、銅、あるいは硫化亜鉛が用いられる。ナノ微粒子の製法は、還元剤による金属イオンの還元による化学還元法、プラズマを用いて金属イオンを還元するプラズマ法、レーザーにより材料となる固体からナノ微粒子を発生させるレーザーアブレーション法、有機分子の重合による高分子法などを用いることができるが、特に好適には化学還元法やレーザーアブレーション法が用いられる。
【００２４】
ナノ微粒子上へのシデロフォア分子の修飾法としては、一般的には、金属微粒子や金属硫化物微粒子上へ自己組織化法により分子を修飾する方法、シランカップリング法を利用した表面修飾法、および結合性官能基を持つポリマー上へ縮合反応により分子を結合させる化学修飾法などが用いられる。自己組織化法では、末端にチオール基、ジスルフィド基、チオエーテル基などの硫黄原子を有する官能基を持つものが用いられ、好適にはチオール基、およびジスルフィド基が用いられる。一方、シランカップリング法では、末端にシラノール基、クロロシラン基、アルコキシシラン基などのシラン系化合物を持つ分子が用いられ、メトキシシラン基、あるいはエトキシシラン基などのアルコキシシラン基が好適に用いられる。また化学修飾法では、末端にアミノ基、カルボキシル基、アルケン、アルキンなどの結合性官能基を持つ分子が用いられる。縮合剤としてはカルボジイミドやＧｒｕｂｂｓ試薬などが用いられ、特にカルボン酸とカルボジイミドが好適に用いられる。
【００２５】
（第３実施形態）
次に本実施形態の人工シデロフォア錯体分子を修飾したナノ微粒子および基板を用いた、水晶振動子マイクロバランス（ＱＣＭ）法による微生物検出測定の方法について説明する。本発明の人工シデロフォア錯体分子を修飾したナノ微粒子は、微生物細胞の細胞膜表面に存在するシデロフォアレセプターによって認識・結合される。微生物表面に固定化されたナノ微粒子は、細胞表面に固定化したまま別の微生物細胞と同様の原理で結合する。これにより微生物細胞同士を凝集させ、数〜数十個の微生物細胞が集まった状態となる。この状態の細胞を人工シデロフォア錯体分子が修飾されたＱＣＭチップ上で固定化し、周波数の変化としてモニターされる。周波数の変化は固定化された細胞の量が多いほど大きく変化するため、微粒子を使わない場合に比べて、格段に大きな周波数変化を観測することができる。
【００２６】
細胞膜上のシデロフォアレセプターで認識される人工シデロフォア錯体分子の構造は、微生物の種類によって異なるため、ナノ微粒子上およびＱＣＭチップ上に修飾する分子の構造を変化させることにより、様々な微生物を結合することが可能である。またナノ微粒子とＱＣＭチップに修飾される人工シデロフォア錯体分子の組合せを色々と変化させることにより、更に微生物の種類を絞り込むことが可能である。
【実施例】
【００２７】
以下、本発明を実施例に基づいてさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００２８】
（実施例１）
実施例１は、第１実施形態に対応する実施例である。次の反応スキームに示すように、非特許文献９、および１０を参考に、ヒドロキサム酸部位を持つ配位子Ｌの前駆体として、化合物１、化合物２、化合物３、化合物４、化合物５、化合物６、化合物７、化合物８、および化合物９を合成し、化合物２と化合物７、化合物８、または化合物９からヒドロキサム酸型の人工シデロフォア１、２、および３を合成した。
【化２６】
2014181219.tif 000029
【化２７】
2014181219.tif 000030
【化２８】
2014181219.tif 000031
【００２９】
＜化合物１の合成＞
非特許文献１１および１２を参考に、以下の様に合成を行った。ニトロメタン（０．５０ｍｏｌ）とベンジルトリメチルアンモニウムハイドロオキサイド４０％水溶液（４０％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｂ，５．０ｇ）をジオキサン（５０ｍＬ）に溶解し、アクリロニトリル（１．５０ｍｏｌ）を溶液の温度を２５〜３５℃に保ちながら徐々に加え、室温で１８時間撹拌した。反応溶液を、ロータリーエバポレーターで減圧乾固させ、黄土色の固体を得た。これにメタノールを加え、析出した沈殿を濾取することで白色粉末を得た。これを熱メタノールから再結晶することで白色針状結晶の化合物１を得た。収率２６％であった。
１Ｈ-ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，δ／ｐｐｍ  ｖｓ．ＴＭＳ）：２．５７（ｔ，６Ｈ），２．３１（ｔ，６Ｈ）．
ＦＴ-ＩＲ（ＫＢｒ法，ｃｍ−１）：２９９３，２９５４，２８８０（メチレンνＣ‐Ｈ），２２５０（シアノ基νＣ≡Ｎ），１５４２（ニトロ基νＮＯ２），１４４９（メチレンδＣＨ２），１１４２（メチレンδＣ‐Ｃ‐Ｃ骨格）
【００３０】
＜化合物２の合成＞
非特許文献１１および１２を参考に、以下の様に合成を行った。水素化ホウ素ナトリウム（９０ｍｍｏｌ）を脱水１，２-ジメトキシエタン（５０ｍＬ）に懸濁させ、Ａｒ雰囲気下、室温で三フッ化ホウ素ジエチルエーテル錯体（２５ｍＬ）を加えた。その時に発生する気体をＡｒ雰囲気下、８０℃で脱水ＴＨＦ（１２０ｍＬ）に通すことで、ＢＨ３・ＴＨＦ錯体（１２０ｍｍｏｌ）を合成した。化合物１（１３ｍｍｏｌ）を脱水ＴＨＦ（５０ｍＬ）に溶解し、Ａｒ雰囲気下、室温で、先程合成したＢＨ３・ＴＨＦ錯体のＴＨＦ溶液（１２０ｍＬ）を加えた。その後、８０℃で４時間還流し、反応物を３Ｍ塩酸（１００ｍＬ）に溶かし、ｐＨ１に調整した。この際に生じた白濁色のゲル状化合物が、全て溶け切るまで攪拌した。続いて、水酸化ナトリウム水溶液を用いて中和後、ロータリーエバポレーターにより減圧濃縮し、残渣にメタノールを加えた。不溶物を濾取した後に、濾液をロータリーエバポレーターで再び減圧濃縮した。この操作を三回繰り返した後に、脱塩装置（旭化成株式会社製、マイクロアシライザーＧ１）による脱塩操作を、数回繰り返すことで微黄色油状の化合物２を得た。収率８９％であった。
１Ｈ‐ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ‐ｄ６，δ／ｐｐｍ  ｖｓ．ＴＭＳ）：２．８２（ｔ，６Ｈ），１．９６（ｔ，６Ｈ），１．５６（ｑｕｉｎｔｅｔ，６Ｈ）．
ＦＴ-ＩＲ（ＫＢｒ法，ｃｍ−１）：３４３１（アミノ基νＮ‐Ｈ），３０３９（メチレンνＣ‐Ｈ），１６２３（アミノ基δ），１５３４（ニトロ基νＮＯ２），１１５８（メチレンδＣ‐Ｃ‐Ｃ骨格）．
【００３１】
＜化合物３の合成＞
無水フタル酸（０．３０ｍｏｌ）と塩酸ヒドロキシルアミン（０．３２ｍｏｌ）とを水（１００ｍＬ）に懸濁させた。この懸濁液に無水炭酸ナトリウム（０．１９ｍｏｌ）を徐々に加えた。その後、６０〜７０℃で一時間加熱し、室温に冷却した。得られた結晶を濾過し、熱エタノールに溶解させた。ここに濃塩酸を加え、室温に冷却することで白色針状結晶の化合物３を得た。収率８０％であった。
【００３２】
＜化合物４の合成＞
化合物３（９２．０ｍｍｏｌ）をジメチルスルホキシド（１５０ｍＬ）に溶解させた。この溶液を撹拌しつつ、無水炭酸カリウム（６９．８ｍｍｏｌ）を徐々に加え、塩化ベンジル（１８０ｍｍｏｌ）を滴下して加えた。これを室温で２４時間撹拌した後、冷水（３００ｍＬ）に注ぎ込み、０〜５℃に数分間放置した。析出した結晶を濾過し、水（１０ｍＬ）で３回洗浄した。得られた粗結晶を熱エタノールから再結晶することで、白色針状結晶の化合物４を得た。収率７５％であった。
【００３３】
＜化合物５の合成＞
化合物４（４０．０ｍｍｏｌ）とヒドラジン一水和物（５５．１ｍｍｏｌ）とをエタノール（３００ｍＬ）に溶解させた。この溶液を加熱して２時間還流した。室温まで放冷した後、濃塩酸（４．８３ｍＬ）を加え、氷冷水中に十数分間放置した。析出した沈殿物を濾取し、エタノール（１６．６ｍＬ）で３回、冷水（１００ｍＬ）で１回洗浄した。この洗浄液と濾液とを混合し、ロータリーエバポレーターで減圧乾固した。その残渣に冷水（２００ｍＬ）を加え、不溶物を濾過した。得られた濾液に粒状水酸化ナトリウムを、油相が分離してくるまで加えた。この溶液をジエチルエーテル（７０ｍＬ）で４回抽出し、エーテル相を無水硫酸マグネシウムで乾燥した。この溶液を濾過し、ロータリーエバポレーターで減圧濃縮して、油状の化合物５を得た。収率９６％であった。
【００３４】
＜化合物６の合成＞
化合物５（０．１０ｍｏｌ）と３−ブロモプロピオン酸（０．０３３ｍｏｌ）とをメタノール（８０ｍＬ）に溶解させた。この溶液を加熱して５時間還流した。その後、反応液を濃縮し、その残渣に１０％炭酸ナトリウム水溶液を加えて溶解させた。この溶液をジエチルエーテルで抽出して未反応の化合物３を除去した。水相に塩酸を加えてｐＨを１〜２とし、ジエチルエーテルで抽出して未反応の３−ブロモプロピオン酸を除去した。次いで、この水相に炭酸水素ナトリウムを加えてｐＨ３〜４に調整し、ジエチルエーテルで目的物を抽出した。そのエーテル相を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濃縮して、無色油状の化合物６を得た。収率３９％であった。
１Ｈ-ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，δ／ｐｐｍ  ｖｓ．ＴＭＳ）：７．３（ｓ，５Ｈ），４．８（ｓ，２Ｈ），３．３（ｔ，２Ｈ），２．６（ｔ，２Ｈ）．
【００３５】
＜化合物７の合成＞
化合物６（１０．７ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（１６．０ｍｍｏｌ）を酢酸エチル（１００ｍＬ）に溶解し、この溶液に氷浴中で塩化アセチル（１６．０ｍｍｏｌ）を含む酢酸エチル溶液（３０ｍＬ）を撹拌しながら滴下した。生成したトリエチルアミン塩酸塩を濾去し、濾液を１０％クエン酸水溶液（４０ｍＬ）で２回、水（４０ｍＬ）で１回、飽和食塩水（４０ｍＬ）で１回洗浄した。得られた溶液を無水硫酸マグネシウムで乾燥後、ロータリーエバポレーターで減圧乾固させることで無色油状の化合物７を得た。収率５９％であった。
１Ｈ-ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，δ／ｐｐｍ  ｖｓ．ＴＭＳ）：７．４（ｓ，５Ｈ），４．８（ｓ，２Ｈ），３．９（ｔ，２Ｈ），２．６（ｔ，２Ｈ），２．１（ｓ，３Ｈ）．
【００３６】
＜化合物８の合成＞
酢酸クロリドの代わりに塩化プロパノイルを用いることで、化合物７と同様の方法で化合物８を得た。収率７５％であった。
１Ｈ-ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，δ／ｐｐｍ  ｖｓ．ＴＭＳ）：７．４（ｓ，５Ｈ），４．８（ｓ，２Ｈ），４．０（ｔ，２Ｈ），２．６（ｔ，２Ｈ），２．４（ｑ、２Ｈ），１．１（ｔ，３Ｈ）．
【００３７】
＜化合物９の合成＞
酢酸クロリドの代わりに塩化ベンゾイルを用いることで、化合物７と同様の方法で化合物９を得た。収率６７％であった。
１Ｈ-ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，δ／ｐｐｍ  ｖｓ．ＴＭＳ）：６．８‐７．６（ｍ，１０Ｈ），４．６（ｓ，２Ｈ），４．０（ｔ，２Ｈ），２．７（ｔ，２Ｈ）．
【００３８】
＜人工シデロフォア１の合成＞
化合物２（２．５３ｍｍｏｌ）と化合物７（８．４３ｍｍｏｌ）をメタノール（２０ｍＬ）に溶解し、この溶液に１‐エチル‐３‐（３‐ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ８．４３ｍｍｏｌ）を含むメタノール溶液（２０ｍＬ）を加えた。数時間、室温で撹拌後、反応溶液をロータリーエバポレーターで減圧乾固させた。得られた残渣を酢酸エチル（１００ｍＬ）に溶解し、１０％クエン酸水溶液と飽和食塩水で洗浄した。ロータリーエバポレーターで減圧乾固することで、薄黄色オイル状の化合物を得た。これをメタノール（３０ｍＬ）に溶解し、触媒量の１０％Ｐｄ‐Ｃを加え、３気圧の水素雰囲気下で数日間、室温で撹拌した。セライトによりＰｄ‐Ｃを除去後、ロータリーエバポレーターにより減圧乾固することで、薄赤色油状のヒドロキサム酸部位を含む人工シデロフォア１を得た。収率６６％であった。
１Ｈ‐ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ，δ／ｐｐｍ  ｖｓ．ＤＳＳ）：３．９（ｔ，６Ｈ），３．２（ｔ，６Ｈ），２．５（ｔ，６Ｈ），２．２（ｓ，９Ｈ），１．６（ｍ，６Ｈ），１．５（ｔ，６Ｈ）．
【００３９】
＜人工シデロフォア２の合成＞
化合物７の代わりに化合物８を用いることで、人工シデロフォア１と同様の方法でヒドロキサム酸部位を含む人工シデロフォア２を得た。収率４７％であった。
１Ｈ-ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ，δ／ｐｐｍ  ｖｓ．ＤＳＳ）：３．９（ｔ，６Ｈ），３．１（ｂｒ，６Ｈ），２．５（ｍ，６Ｈ），２．４（ｑｕａｒｔｅｔ，６Ｈ），１．６（ｂｒ，６Ｈ），１．５（ｂｒ，６Ｈ），１．１（ｔ，９Ｈ）．
【００４０】
＜人工シデロフォア３の合成＞
化合物７の代わりに化合物９を用いることで、人工シデロフォア１と同様の方法でヒドロキサム酸部位を含む人工シデロフォア３を得た。収率３２％であった。
１Ｈ-ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ，δ／ｐｐｍ  ｖｓ．ＤＳＳ）：７．５（ｂｒ，１５Ｈ），４．０（ｔ，６Ｈ），３．１（ｂｒ，６Ｈ），２．５（ｂｒ，６Ｈ），１．４（ｂｒ，６Ｈ），１．４（ｂｒ，６Ｈ）．
【００４１】
（実施例２）
実施例２は、第１実施形態に対応する実施例である。次の反応スキームに示すように、カテコール部位を持つ配位子Ｌの前駆体として、化合物１０、化合物１１、および化合物１２を合成し、化合物１２から、カテコール型の人工シデロフォア４を合成した。
【化２９】
2014181219.tif 000032
【００４２】
＜化合物１０＞の合成
化合物２（２．１５ｍｍｏｌ）、２，３‐ジメトキシ安息香酸（１６．１ｍｍｏｌ）、および１‐ヒドロキシベンズトリアゾール（１６．１ｍｍｏｌ）をメタノール（１５ｍＬ）に溶解し、この溶液にＥＤＣ（１６．１ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（１６．１ｍｍｏｌ）を含むメタノール溶液を加え、一晩撹拌した。反応溶液をロータリーエバポレーターで減圧乾固し、クロロホルムに溶解させ、１０％クエ酸水溶液、および飽和食塩水で洗浄した。溶液を無水硫酸マグネシウムで乾燥後、ロータリーエバポレーターで減圧乾固し、残渣を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ、カラム：日本分析化学工業製ＪＡＩＧＥＬ‐１Ｈ、溶離液：クロロホルム、検出波長：２５４ｎｍ）で精製した。目的物を含むフラクションを集め、濃縮乾固することで無色油状の化合物１０を得た。収率８２％であった。
１Ｈ-ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，δ／ｐｐｍ  ｖｓ．ＴＭＳ）：８．０６（ｔ，３Ｈ），７．６４（ｄｄ，３Ｈ），７．１２（ｔ，３Ｈ），７．０２（ｄｄ，３Ｈ），３．８８（ｓ，１８Ｈ），３．４６（ｑｕａｒｔｅｔ，６Ｈ），２．０３（ｔ，６Ｈ），１．５４（ｑｕｉｎｔｅｔ，６Ｈ）．
ＦＴ-ＩＲ（ＫＢｒ法，ｃｍ-１）：３３７６（アミドνＮ‐Ｈ），３０７８（芳香環νＣ‐Ｈ），３０００，２９３８，２８８８，２８７３（メチルおよびメチレンνＣ‐Ｈ），１６５２（アミドνＣ＝Ｏ），１５３３（アミドνＣ-Ｎおよびδ，ニトロνＮ-Ｏ），１２６４（メトキシνＣ‐Ｏ），１１６９（メチレンδＣ‐Ｃ‐Ｃ骨格），１０７６（メトキシνＣ‐Ｏ），７５４（芳香環δ）．
ＥＳＩ  ＴＯＦ‐ＭＳ：ｍ／ｚ＝７２５．３［Ｍ＋Ｈ＋］＋，７４７．２［Ｍ＋Ｎａ＋］＋，７５９．４［Ｍ＋Ｃｌ−］−．
【００４３】
＜化合物１１＞の合成
化合物１０（１．３１ｍｍｏｌ）をメタノールに溶解し、触媒量の１０％Ｐｄ‐Ｃを加え、３気圧の水素雰囲気下で数日間攪拌した。セライト濾過によるＰｄ‐Ｃの除去後、反応溶液はエバポレーターにより減圧乾固させた。残渣をクロロホルムに溶解し、１０％クエン酸水溶液および水で抽出した。全ての水相を集め、水酸化ナトリウムによりｐＨを１１に調整した。得られた溶液をクロロホルムで抽出後、無水硫酸マグネシウムで乾燥させた。ロータリーエバポレーターで減圧乾固させることで、薄黄色油状の化合物１１を得た。収率５３％であった。
１Ｈ-ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，δ／ｐｐｍ  ｖｓ．ＴＭＳ）：８．０５（ｔ，３Ｈ），７．６７（ｄｄ，３Ｈ），７．１３（ｔ，３Ｈ），７．０２（ｄｄ，３Ｈ），３．８８（ｓ，１８Ｈ），３．４５（ｑｕａｒｔｅｔ，６Ｈ），１．６０（ｑｕｉｎｔｅｔ，６Ｈ），１．４３（ｔ，６Ｈ）．
ＦＴ-ＩＲ（ＫＢｒ法，ｃｍ-１）：３３７７（アミドおよびアミノνＮ‐Ｈ），３０７９（芳香環νＣ‐Ｈ），２９３７，２８６７，２８３８（メチルおよびメチレンνＣ‐Ｈ），１６５３（アミドνＣ＝Ｏ），１５３４（アミドνＣ‐Ｎおよびδ），１２６５（メトキシνＣ‐Ｏ），１１７０（メチレンδＣ‐Ｃ‐Ｃ骨格），１０７５（メトキシνＣ‐Ｏ），７５４（芳香環δ）．
ＥＳＩ  ＴＯＦ‐ＭＳ：ｍ／ｚ＝６９５．３［Ｍ＋Ｈ＋］＋，７１７．３［Ｍ＋Ｎａ＋］＋，６９３．５［Ｍ‐Ｈ＋］−，７２９．４［Ｍ＋Ｃｌ−］−．
【００４４】
＜化合物１２の合成＞
水酸化ナトリウム（２．５０ｍｍｏｌ）をミリＱ水（１０ｍＬ）に溶解し、化合物１１（０．９８ｍｍｏｌ）と二炭酸ジ-tert-ブチル（（Ｂｏｃ）２Ｏ，２．２０ｍｍｏｌ）を含む酢酸エチル（溶液１５ｍＬ）を滴下しながら、激しく撹拌した。反応後、有機相を１Ｍ塩酸、５％湾酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水の順で洗浄した。有機相を無水硫酸マグネシウムで乾燥後、ロータリーエバポレーターで減圧乾固させた。残渣をクロロホルムに溶解し、ＨＰＬＣ（カラム：日本分析化学工業製ＪＡＩＧＥＬ‐１Ｈ、溶離液：クロロホルム、検出波長：２５４ｎｍ）で精製後、ロータリーエバポレーターにより減圧乾固させることで、無色油状の化合物１２を得た。収率８１％であった。
１Ｈ-ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，δ／ｐｐｍ  ｖｓ．ＴＭＳ）：８．０２（ｔ，３Ｈ），７．６５（ｄｄ，３Ｈ），７．１２（ｔ，３Ｈ），７．０１（ｄｄ，３Ｈ），３．８９（ｓ，９Ｈ），３．８８（ｓ，９Ｈ），３．４４（ｑｕａｒｔｅｔ，６Ｈ），１．５８（ｔ，６Ｈ），１．３７（ｓ，６Ｈ）．
ＦＴ-ＩＲ（ＫＢｒ法，ｃｍ-１）：３３７６（アミドνＮ‐Ｈ），３０７７（芳香環νＣ‐Ｈ），２９３９，２８６９，２８３８（メチルおよびメチレンνＣ‐Ｈ），１７１３，１６５３（アミドνＣ＝Ｏ），１５３２（アミドνＣ‐Ｎおよびδ），１２６５（メトキシνＣ‐Ｏ），１１７０メチレンδＣ‐Ｃ‐Ｃ骨格），１０８７（メトキシνＣ‐Ｏ），７５５（芳香環δ）．
ＥＳＩ  ＴＯＦ‐ＭＳ：ｍ／ｚ＝７９５．２［Ｍ＋Ｈ＋］＋，８１７．２［Ｍ＋Ｎａ＋］＋．
【００４５】
＜人工シデロフォア４の合成＞
非特許文献６および７の合成法を参考に、以下の様に合成を行った。化合物１２（０．７９ｍｍｏｌ）を脱水ジクロロメタン（２５ｍＬ）に溶解し、アルゴン雰囲気下中、−７０℃で１Ｍの三臭化ホウ素を含むジクロロメタン溶液（１３ｍＬ）を滴下した。一晩撹拌後、反応溶液にメタノール（１０ｍＬ）を加え、更に１時間撹拌した。反応溶液をロータリーエバポレーターにより減圧乾固し、残渣にメタノールを加え、再び減圧乾固させるという操作を数回繰り返した。その後、残渣をクロロホルム／メタノール（１／１）に溶解し、ゲル濾過カラムクロマトグラフィー（充填剤：Ｓｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ‐２０、展開溶媒：クロロホルム・メタノール（１／１））により精製した。溶離液をロータリーエバポレーターにより減圧乾固させることで、白色粉末のカテコール型人工シデロフォア４を得た。収率８０％であった。
１Ｈ-ＮＭＲ（図２，３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ‐ｄ６，δ／ｐｐｍ  ｖｓ．ＴＭＳ）：８．８６（ｔ，３Ｈ），７．３０（ｄｄ，３Ｈ），６．９２（ｄｄ，３Ｈ），６．６８（ｔ，３Ｈ），３．３０（ｑｕｉｎｔｅｔ，６Ｈ），１．５７（ｂｒ，１２Ｈ）．
ＦＴ-ＩＲ（ＫＢｒ法，ｃｍ-１）：３３０５（アミドおよびアミンνＮ‐Ｈ，水酸基νＯ‐Ｈ），２９５２，２８７９（メチレンνＣ‐Ｈ），１６４０（アミドνＣ＝Ｏ），１５４５（アミドνＣ‐Ｎおよびδ），１３３１（水酸基δＯ‐Ｈ），１２６１（水酸基νＣ‐Ｏ），１１５７（メチレンδＣ‐Ｃ‐Ｃ骨格），１０８７（メトキシνＣ‐Ｏ），７５５（芳香環δ）．
ＥＳＩ  ＴＯＦ‐ＭＳ：ｍ／ｚ＝６１１．１［Ｍ＋Ｈ＋］＋．
【００４６】
（実施例３）
実施例３は、第１実施形態に対応する実施例である。次の反応スキームに示すように、人工シデロフォア１、人工シデロフォア２、および人工シデロフォア３と、３価の鉄イオン塩原料であるトリス（２，４‐ペンタンジオナト）鉄（３価）錯体から人工シデロフォア錯体１、人工シデロフォア錯体２、および人工シデロフォア錯体３を合成した。
【化３０】
2014181219.tif 000033
【００４７】
＜人工シデロフォア錯体１の合成＞
人工シデロフォア１（０．１０ｍｍｏｌ）を水（２０ｍＬ）に溶解し、トリス（２，４-ペンタンジオナト）鉄（３価）錯体（［Ｆｅ（ａｃａｃ）３］，０．１０ｍｍｏｌ）を含む酢酸エチル溶液（２０ｍＬ）を加え、室温で３時間、激しく撹拌した。水相をロータリーエバポレーターにより減圧乾固させることで、定量的に赤色油状の人工シデロフォア錯体１を得た。収率９８％であった。
ＥＳＩ  ＴＯＦ-ＭＳ：ｍ／ｚ＝６４３．４［Ｍ＋Ｈ＋］＋．
ＵＶ／ｖｉｓ（０．１Ｍ過塩素酸ナトリウム，０．０１Ｍ酢酸／酢酸ナトリウムバッファー，ｐＨ＝７）：
λｍａｘ＝４２４ｎｍ（ε＝２２００ｃｍ−１Ｍ−１）
【００４８】
＜人工シデロフォア錯体２の合成＞
人工シデロフォア１の代わりに人工シデロフォア２を用いることで、人工シデロフォア錯体１と同様の方法で人工シデロフォア錯体２を得た。収率８８％であった。
ＥＳＩ  ＴＯＦ-ＭＳ：ｍ／ｚ＝６８５．４［Ｍ＋Ｈ＋］＋．
ＵＶ／ｖｉｓ（０．１Ｍ過塩素酸ナトリウム，０．０１Ｍ酢酸／酢酸ナトリウムバッファー，ｐＨ＝７）：
λｍａｘ＝４２２ｎｍ（ε＝２４００ｃｍ−１Ｍ−１）
【００４９】
＜人工シデロフォア錯体３の合成＞
人工シデロフォア１の代わりに人工シデロフォア３を用いることで、人工シデロフォア錯体１と同様の方法で人工シデロフォア錯体３を得た。収率８１％であった。
ＥＳＩ  ＴＯＦ-ＭＳ：ｍ／ｚ＝６８５．４［Ｍ＋Ｈ＋］＋．
ＵＶ／ｖｉｓ（０．１Ｍ過塩素酸ナトリウム，０．０１Ｍ酢酸／酢酸ナトリウムバッファー，ｐＨ＝７）：λｍａｘ＝４３２ｎｍ（ε＝２５００ｃｍ−１Ｍ−１）
【００５０】
（実施例４）
実施例４は、第１実施形態に対応する実施例である。次の反応スキームに示すように、人工シデロフォア４と、３価の鉄イオン塩原料であるトリス（２，４-ペンタンジオナト）鉄（３価）錯体から人工シデロフォア錯体４を合成した。
【化３１】
2014181219.tif 000034
【００５１】
＜人工シデロフォア錯体４の合成＞
非特許文献８を参考に、以下の様に合成を行った。人工シデロフォア４（０．１７５ｍｍｏｌ）をアルゴンガスのバブリングにより脱気したメタノール（１７ｍｌ）に溶解し、［Ｆｅ（ａｃａｃ）３］（０．１７５ｍｍｏｌ）を加えた。続いて、０．１Ｍの水酸化カリウムを含むメタノール溶液（４．７３ｍｌ）を加え、６時間攪拌した。反応溶液をロータリーエバポレーターにより全量が３ｍＬとなるまで減圧乾固し、アセトン（３０ｍｌ）を加えることで沈殿が生成した。この沈殿を濾取することで、赤紫色粉末の人工シデロフォア４を得た。収率８３％であった。
ＦＴ-ＩＲ（ＫＢｒ法，ｃｍ−１）：３３９９（アミドおよびアミンνＮ‐Ｈ），２９４１，２８７４（メチレンνＣ‐Ｈ），１６０８（アミドνＣ＝Ｏ），１５４４１５４５（アミドνＣ‐Ｎおよびδ），１１５７（メチレンδＣ‐Ｃ‐Ｃ骨格），７４９（芳香環δ）．
ＥＳＩ  ＴＯＦ-ＭＳ：ｍ／ｚ＝６６２．５［Ｍ＋２Ｈ＋］−，３３０．８［Ｍ＋Ｈ＋］２−
ＵＶ／ｖｉｓ（０．１Ｍ過塩素酸ナトリウム，０．０１Ｍ酢酸／酢酸ナトリウムバッファー，ｐＨ＝７，図３）：λｍａｘ＝５００ｎｍ（ε＝４６７０ｃｍ−１Ｍ−１）
【００５２】
（実施例５）
実施例５は、第２実施形態に対応する実施例である。次の反応スキームに示す様に、金微粒子を作製した。
【化３２】
2014181219.tif 000035
【００５３】
＜金微粒子１の合成＞
非特許文献１１の方法を参考に、以下の様に合成を行った。塩化金酸（２．９３ｍｍｏｌ）とテトラオクチルアンモニウムブロミド（２．９３ｍｍｏｌ）を窒素ガスでパージしたトルエン／水混合溶液（５０／６５ｍＬ）に溶解した。続いてトリフェニルホスフィン（８．８５ｍｍｏｌ）を混合溶液に加え、有機相が白濁するまで１０分以上激しく撹拌した。水素化ホウ素ナトリウム（３７．３ｍｍｏｌ）を加えた水（１０ｍＬ）を素早く加えると有機相は直ちに暗紫色に変化した。この溶液を窒素気流下で３時間撹拌した後、有機相を分離し、水（１００ｍＬ）で２回洗浄した。減圧下で溶媒を除去することで黒い固体を得た。得られた固体をヘキサン、飽和硝酸ナトリウム水溶液、メタノール／水混合溶液（混合比２：３）で洗浄し、ペンタンから数回再沈殿を行うことで、黒色の金微粒子を得た。
【００５４】
（実施例６）
実施例６は、第２実施形態に対応する実施例である。次の反応スキームに示す様に、実施例３および４で合成された人工シデロフォア‐鉄錯体を用いて、蒸着金基板やＱＣＭチップ上の金基板上に人工シデロフォア‐鉄錯体が修飾された金基板２および３を得た。
【化３３】
2014181219.tif 000036
【化３４】
2014181219.tif 000037
【化３５】
2014181219.tif 000038
【００５５】
＜活性エステル修飾金基板１の作製＞
明電舎製基本周波数１０ＭＨｚのＡＴカットＱＣＭチップ表面の金基板上に活性エステル（３，３’-ジチオビス（プロピオン酸スクシンイミジル）、ＤＴＳＰ）を２ｍＭ含むジメチルスルホキシドを滴下し、５分間静置後、ジメチルスルホキシドおよび水の順に表面を洗浄することで、活性エステルが修飾された金基板１を得た。得られた金基板１は速やかに次の手順で使用された。
【００５６】
＜人工シデロフォア錯体修飾基板２の作製＞
上記手順で作製された金基板１上に人工シデロフォア錯体１を１ｍＭ含む水溶液を滴下し、そのまま２４時間静置した。その後、基板表面をミリＱ水で洗浄することで目的の人工シデロフォア錯体１が修飾された金基板２を得た。
【００５７】
＜人工シデロフォア錯体修飾基板３の作製＞
人工シデロフォア錯体１の代わりに人工シデロフォア錯体４を用いて上記と同様の手順を行うことで、人工シデロフォア錯体４が修飾された金基板３を得た。
【００５８】
（実施例７）
実施例７は、第２実施形態に対応する実施例である。次の反応スキームに示す様に、実施例３および４で合成された人工シデロフォア‐鉄錯体と実施例５で合成された金微粒子１を用いて、表面に人工シデロフォア‐鉄錯体が修飾された金微粒子３および４を得た。
【化３６】
2014181219.tif 000039
【化３７】
2014181219.tif 000040
【化３８】
2014181219.tif 000041
【００５９】
＜金微粒子２の合成＞
３，３’-ジチオビス（プロピオン酸スクシンイミジル）を２ｍＭ含むアセトン溶液および金微粒子１を１ｍＭ含むクロロホルム溶液をそれぞれ調製した。これらの溶液を混合し２４時間、室温で撹拌後、遠心分離を行うことにより目的の金微粒子２を回収した。
ＦＴ-ＩＲ（ＫＢｒ法，ｃｍ−１）：３０４７（メチレンνＣ-Ｈ），１７３５（アミドおよびカルボニルνＣ＝Ｏ）．
【００６０】
＜金微粒子３の合成＞
上記手順で合成された金微粒子を含むアセトン溶液および人工シデロフォア錯体１を２ｍＭ含む水溶液をそれぞれ調整し、これらの溶液を混合し２４時間、室温で撹拌後、遠心分離を行うことにより金微粒子を回収した。得られた金微粒子をアセトン、ミリＱ水で洗浄することで人工シデロフォア錯体１が修飾された金微粒子３を得た。
ＦＴ-ＩＲ（ＫＢｒ法，ｃｍ−１）：３２７６（アミドνＮ-Ｈ），２９２３，２８５２（メチレンνＣ-Ｈ），１７３３（アミドνＣ＝Ｏ），１５３５（アミドνＣ-ＮおよびアミドδＮ-Ｈ）．
ＵＶ／ｖｉｓ：λｍａｘ＝４２８ｎｍ（ＬＭＣＴ（Ｏｈｙｄｒｏｘａｍａｔｅ→Ｆｅ３＋））（図○）.
【００６１】
＜金微粒子４の合成＞
人工シデロフォア錯体１の代わりに人工シデロフォア錯体４を用いて同様の手順を行うことで、人工シデロフォア錯体４が修飾された金微粒子４を得た。
ＦＴ-ＩＲ（ＫＢｒ法，ｃｍ−１）：３３６７（アミドνＮ-Ｈ），３０７０（芳香環νＣ-Ｈ）、２９３９，２８７１（メチレンνＣ-Ｈ），１６１２（アミドνＣ＝Ｏ），１５４４（アミドνＣ-ＮおよびアミドδＮ-Ｈ），１２１９（ｔｅｒｔ‐ブチルδＮ-Ｈ）．
ＵＶ／ｖｉｓ：λｍａｘ＝２５９ｎｍ（π‐π＊），５２６ｎｍ（ＬＭＣＴ（Ｏｈｙｄｒｏｘａｍａｔｅ→Ｆｅ３＋））（図２）.
【００６２】
（実施例８）
実施例８は、第３実施形態に対応する実施例である。シデロフォア錯体修飾金基板１および２を用いて微生物の検出実験を行った。図３ａにシデロフォア錯体１が修飾された金基板２を用いた場合のＭｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓの吸着挙動をＱＣＭで測定した結果を示した。１ｍＬ当たり１０６個のＭ．ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓを含む培養液を添加することで、金基板１表面へのＭ．ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓの吸着による周波数の減少が観測された。図３ｂはその際の金基板１表面を原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）で観察した写真である。実際に基板表面にＭ．ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓが吸着していることが観察された。続いて図４aにシデロフォア錯体４が修飾された金基板２を用いた場合のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉの吸着挙動をＱＣＭで測定した結果を示した。こちらも１ｍＬ当たり１０６個のＥ．ｃｏｌｉを含む培養液を添加することで、同様の周波数の減少が観測され、Ｅ．ｃｏｌｉが金基板２の表面に吸着していることが確認された。図４ｂは金基板３表面へのＥ．ｃｏｌｉの吸着の様子をＡＦＭで観察した写真である。一方、金基板２に対してＥ．ｃｏｌｉを、また金基板３に対してＭ．ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓを滴下した場合は、何れの場合も微生物の吸着に由来する周波数変化は観測されず、金基板上の人工シデロフォア錯体の構造に応じて、選択的な微生物の吸着が起こることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００６３】
本発明は微生物検出システムに利用できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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