(57)【要約】【課題】概日リズムに対する影響を正確にアッセイすることができる方法とそれに使用する抗体を提供すること。【解決方法】新たに抗−Ｓ９７７リン酸化ＰＥＲ２特異的抗体を見出し、この抗体を用いて、抗気分障害治療薬の候補化合物をスクリーニングする方法であって、試験化合物と学習性無力（learned  helplessness、LH）動物の細胞とを培地中でインキュベートし、その後、該細胞中のPER2タンパク質の特定のアミノ酸配列ポジションのセリン残基のリン酸化量を測定し；試験化合物不存在下でインキュベートしたLH動物細胞中のPER2タンパク質の特定のアミノ酸配列ポジションのセリン残基のリン酸化量を測定し；ついで試験化合物不存在下でインキュベートしたLH動物細胞中のPER2タンパク質のリン酸化量と比較して、試験化合物とインキュベートした細胞中のPER2タンパク質のリン酸化量が少ない場合に、該試験化合物を抗気分障害関連治療薬の候補化合物と判定することを含む該方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗気分障害治療薬の候補化合物をスクリーニングする方法であって、
（１）試験化合物と学習性無力（learned  helplessness、LH）動物の細胞とを培地中でインキュベートし、その後、該細胞中のPER2タンパク質の特定のアミノ酸配列ポジションのセリン残基のリン酸化量を測定し；
（２）試験化合物不存在下でインキュベートしたLH動物細胞中のPER2タンパク質の特定のアミノ酸配列ポジションのセリン残基のリン酸化量を測定し；ついで
（３）試験化合物不存在下でインキュベートしたLH動物細胞中のPER2タンパク質のリン酸化量と比較して、試験化合物とインキュベートした細胞中のPER2タンパク質のリン酸化量が少ない場合に、該試験化合物を抗気分障害治療薬の候補化合物と判定することを含む該方法。
【請求項２】
該LH動物がLHラットまたはLHマウスである請求項１記載の方法。
【請求項３】
該PER2タンパク質の特定のアミノ酸配列ポジションがポジション977である請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
該細胞が線維芽細胞または神経細胞である請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
配列番号：1のアミノ酸配列においてポジション977のセリンがリン酸化されたマウスPER2タンパク質。
【請求項６】
請求項５記載のリン酸化マウスPER2タンパク質を特異的に認識するモノクローナル抗体。
【請求項７】
配列番号：1のアミノ酸配列のポジション968−986のエピトープを認識する請求項６記載のモノクローナル抗体。
【請求項８】
請求項７記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
【請求項９】
PER2タンパク質のセリン残基のリン酸化量を請求項６または７記載のモノクローナル抗体を用いて測定する請求項３記載の方法。
【請求項１０】
配列番号：1のアミノ酸配列のポジション977のセリンが他のアミノ酸残基に置換された変異PER2を発現するノックインマウス。
【請求項１１】
該他のアミノ酸残基がトレオニンおよびチロシン以外のアミノ酸残基である請求項１０記載のノックインマウス。
【請求項１２】
該他のアミノ酸残基がアラニンである請求項１０または１１記載のノックインマウス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新たに見出したリン酸化PER2タンパク質に対するモノクローナル抗体（抗−Ｓ９７７リン酸化ＰＥＲ２特異的抗体）とこの抗体を用いた抗気分障害治療薬の候補化合物のスクリーニング方法に関し、更には、該抗体を産生するハイブリドーマ、ならびに、変異PER2タンパク質を発現するノックインマウスに関する。
【背景技術】
【０００２】
うつ病のような気分障害は、抑うつ気分、気力の損失、食欲の低下、睡眠障害、精神機能制止などを含む特異的な症状を示す複雑な精神疾患である。ヒトゲノムがマッピングされ、最近は多くの最先端の技術が開発されているにもかかわらず、気分障害を含む精神病と関連する分子および細胞レベルの機構はほとんどわかっていない。
【０００３】
ほぼ24時間の周期を有する概日リズムは、ほぼすべての生物がその生理機能を24時間の自転周期を有する地球の環境に適合させることにおいて重要である。過去10年間にわたる概日時計の分子機構に関する多くの研究により、Per2およびBmal1のような時計遺伝子の連動したフィードバック・ループが明らかにされている。例えば、Per突然変異はショウジョウバエにおいて概日リズムの異常を誘導し、PER2のリン酸化部位の点突然変異は睡眠相前進症候群(ASPS)と呼ばれる睡眠障害を誘導する。これらの知見は、遺伝子と行動とがこの生物系において密接にリンクしているという明確な証拠を提供している。哺乳動物の概日時計の一次入力刺激は光であるが、哺乳動物における摂食および温度ならびにヒトにおける社会的なきっかけも誘引要素になり得る。哺乳動物の概日中心は視床下部前部の視交叉上核（SCN）に位置し、視床下部と脳の残りの部分との間には直接的および間接的な両方の解剖学的な連結が存在する。視床下部の解剖学的なアウトプットは、就寝−起床の周期およびホルモン分泌を含む多様な現象に関連している。生物時計または時計遺伝子の機能不全はジェットラグおよび交代勤務の問題のみならず、肥満および癌にも寄与している。
【０００４】
幾つかの系統の間接事実は、気分障害と概日時間における機能不全との間に関係が存在することを示唆している。例えば、睡眠障害のような概日リズムの異常が気分障害患者において観察される場合がある。事実、光療法は季節性気分障害および他の気分障害に有効である場合がある。さらに、患者を規則正しい睡眠および社会スケジュールに維持する対人関係・社会リズム療法も、双極性障害の軽減に有効である。気分障害のヒトに共通する概日リズムを含む一定範囲の恒常性の兆候を評価に取り込むことは、動物モデルへ有用な対象を加えることとなり得る。
【０００５】
以前、本発明者は、重篤な生体ストレスは概日リズムに影響しないことを示した。現在の研究においては、より多くの時計遺伝子が同定され、概日リズムの定量的アッセイも改良されているため、本発明者は、気分の分裂が概日時計にリンクしているのか、またどのようにリンクしているのかをさらに評価した。初期の実験において、本発明者は、気分障害の動物モデルであるLH（学習性無力）ラットが概日活動リズムの周期短縮と関連していることを見出した。また、気分安定薬であるリチウムは、イン・ビトロ(in  vitro)およびイン・ビボ(in  vivo)の両方においてLHラットの概日リズム周期を延長することによって概日リズムを回復した。本発明者は、GSK3βに対するリチウムの作用、ならびにリン酸化したGSK3βがLHラットにおいては減少していることを示した。また、生化学、細胞生物学および行動の一連の解析により、GSK3βの下流エフェクターとしてPer2を同定した。
【０００６】
本発明者は、先に、概日活動リズムの周期を末梢細胞の概日リズム遺伝子のプロモーター活性をモニターすることによりイン・ビトロ(in  vitro)で示し得ることを見出し、その知見に基づいて、生物時計調節遺伝子のプロモーターを利用したプロモーターアッセイ系を確立している（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００７−３３０２２０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
かかる発明においては、気分障害のモデル動物である学習性無力（LH）ラットの概日リズムが正常ラットよりも短く、またそのイン・ビボ(in  vivo)における現象を、生物時計調節遺伝子プロモーターに連結したレポーター遺伝子で形質転換した末梢細胞レベルでもモニターできることが開示されている。また、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３βタンパク質（GSK3β）が生物時計調節遺伝子の発現活性に作用して、概日リズムに関与することが示唆されている。
しかしながら、GSK3βタンパク質は生体における多様な細胞機能の制御に関与していることから、GSK3βタンパク質レベルのモニターでは概日リズムに対する影響を正確にアッセイすることができないという課題があった。
また、一般的に、対象とする遺伝子の機能を解析する手段としてノックアウト動物が利用され、それを詳細に解析することにより対象としている遺伝子の生体内での機能を明らかにすることができる。しかしながら、破壊した遺伝子の産物の機能は、しばしばノックアウト動物の別の遺伝子産物によって代替される場合があるため、ノックアウト動物自体に目的とする表現型が現れてこない場合がある。また、破壊した遺伝子の産物が動物の発生／成育上必須であるために致死となり、目的とする遺伝子の機能の詳細な解析が事実上不可能な場合があるという課題もあった。
【０００９】
本発明者は、かかる課題に鑑みて鋭意検討した結果、抗気分障害治療薬または気分障害改善物質が概日リズムに影響して発揮される抗気分障害または気分障害改善作用には、GSK3βの不活性化（リン酸化）増大によるPER2の特定のセリン残基のリン酸化の抑制が関与することを見出し、本発明を解決するに至った。
すなわち、本発明は、
［１］抗気分障害治療薬の候補化合物（以下、候補薬剤ということがある。）をスクリーニングする方法であって、
（１）試験化合物と学習性無力（learned  helplessness、LH）動物の細胞とを培地中でインキュベートし、その後、該細胞中のPER2タンパク質の特定のアミノ酸配列ポジションのセリン残基のリン酸化量を測定し；
（２）試験化合物不存在下でインキュベートしたLH動物細胞中のPER2タンパク質の特定のアミノ酸配列ポジションのセリン残基のリン酸化量を測定し；ついで
（３）試験化合物不存在下でインキュベートしたLH動物細胞中のPER2タンパク質のリン酸化量と比較して、試験化合物とインキュベートした細胞中のPER2タンパク質のリン酸化量が少ない場合に、該試験化合物を抗気分障害治療薬の候補化合物と判定することを含む該方法；
［２］該LH動物がLHラットまたはLHマウスである前記［１］記載の方法；
［３］該PER2タンパク質の特定のアミノ酸配列ポジションが、アミノ酸配列ポジション977である前記［１］または［２］記載の方法；
［４］該細胞が線維芽細胞または神経細胞である前記［１］ないし［３］いずれか１に記載の方法；
［５］配列番号：1のアミノ酸配列においてポジション977のセリンがリン酸化されたマウスPER2タンパク質；
［６］前記［５］記載のリン酸化マウスPER2タンパク質を特異的に認識するモノクローナル抗体；
［７］配列番号：1のアミノ酸配列のポジション968−986のエピトープを認識する前記［６］記載のモノクローナル抗体；
［８］前記［７］記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ；
［９］PER2タンパク質のセリン残基のリン酸化量を前記［６］または［７］記載のモノクローナル抗体を用いて測定する前記［３］記載の方法；
［１０］配列番号：1のアミノ酸配列のポジション977のセリンが他のアミノ酸残基に置換された変異PER2を発現するノックインマウス；
［１１］該他のアミノ酸残基がトレオニンおよびチロシン以外のアミノ酸残基である前記［９］記載のノックインマウス；
［１２］該他のアミノ酸残基がアラニンである前記［９］または［１０］記載のノックインマウス
を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】Aは学習性無力（LH）状態を作り出すためのラット不可避フット電気ショックのスケジュールであり、Bは処理直後および処理4週間後のLHラットのLH（%）を示すグラフである。
【図２−１】Aは対照、LHおよび非学習性無力（NLH）ラットの自発運動活性の代表的な二重プロット・アクトグラムである。暗所の時間は灰色で網掛けしている。矢印は不可避フット電気ショック（IS）訓練を行った日を示す。Bは対照、LHおよびNLHラットにおける実験の開始から終了までの概日リズム周期の変化を示す。値は平均値±標準誤差（SEM）として示す。データは1要因ANOVAにつづくシェッフェF−検定（*p<0.05）によって分析した。Cは自発運動条件下の周期の長さに対する繰り返しISの効果を数値化した表である。値は条件付け前後の平均差±SEMとして示す。
【図２−２】Dは15の逃避試験（ET）試行の間の成功した逃避の平均回数（±SEM）として表した、リチウムの効果を示す。データは、繰り返しANOVA（*p<0.05）によって解析した。Eは水またはリチウムを投与したラットにおける自発運動活性の代表的な二重プロット・アクトグラムを示す。暗所の時間は灰色で網掛けしている。Fは対照またはリチウム処理したラットにおける周期の変化を示すグラフである。データはスチュデントt−検定（*p<0.05）によって解析した。Gは自発運動条件下の周期の長さに対するリチウム処理の効果を数値化した表である。値は条件付け前後の平均差±SEMとして示す。
【図３】対照およびLHラットの脳から調製したGSK3βのウェスタンブロットである。対照およびLHラットのSCN（A）およびPFC（B）におけるGSK3βについてのウェスタンブロットの定量的分析である。
【図４】Aはイン・ビトロ(in  vitro)バイオルミネセンス系によりモニターしたLHまたは対照ラット線維芽細胞の概日リズムを示す。Bmal1−lucカセットの転写振幅を示す。発光は15分間隔で1分間積算した（縦軸：1分間当たりの相対的カウント；横軸：時間）。得られたシグナルの線形トレンドを除去した。3回の独立して行った実験のうちの代表的な結果を示す。周期データは、3回実験試料の平均±SEMを表す。Bは周期の長さのヒストグラムである。黒色および灰色のバーは、各々、対照およびLHラットを示す。データは二標本Kolmogorov-Smirnov検定につづくMann−Whitney  U検定によって解析した。Cは対照およびLHラットの線維芽細胞におけるGSK3βおよびリン酸化GSK3βの代表的なウェスタンブロットである。Dは対照およびLHラットの線維芽細胞におけるリン酸化GSK3β／GSK3βのウェスタンブロットの定量分析を表すグラフである。データはスチュデントt−検定（*p<0.05）によって解析した。
【図５−１】AはGSK3β-/-およびGSK3β+/+マウス胚性線維芽細胞（MEF）における、イン・ビトロ(in  vitro)バイオルミネセンス系によってモニターした概日周期に対するリチウム処理の効果を示す。Bmal1−lucカセットの転写振幅を示す。発光は15分間隔で1分間積算した（縦軸：1分間当たりの相対的カウント；横軸：時間）。得られたシグナルの線形トレンドは除去した。独立して行った3回の実験のうちの代表的な結果を示す。BおよびCはリチウム処理したまたは無処理の線維芽細胞（野生型およびGSK3β-/-）の概日周期を示す。データは2要因ANOVAにつづくシェッフェF−検定（*p<0.05、**p<0.01）によって解析した。
【図５−２】リチウムの効果に対する種々のGSK3βシグナル伝達経路に沿った鍵分子のインヒビターの影響を示す。
【図６】時計タンパク質に結合し、それをリン酸化するGSK3βを示す。Aは種々の基質を用いたイン・ビトロ(in  vitro)キナーゼ・アッセイを示す。上段パネル：オートラジオグラフィー；下段パネル：クーマシーブリリアントブルー（CBB）−染色。オートラジオグラフィーについては、分子量をキロダルトンで示し、リン酸化された基質の位置にアスタリスクを付す。CBB染色については、アスタリスクは各基質を示し、GSK3βを矢印によって示す。Bは種々の基質を用いたイン・ビトロ(in  vitro)・プルダウン・アッセイを示す。アスタリスクは各タンパク質を示す。上段パネル：抗−GST抗体；下段パネル：抗−GSK3β抗体。CはCOS−7細胞におけるGSK3βまたはベクターと特定の基質の同時トランスフェクションを示す。アスタリスクは、予想分子量に検出されたタンパク質を示す。DはGSK3β（G）、PER2（P）、BMAL1（B）、CLOCK（C）、NAPS2（N）、REV−ERBα（R）、CRY1（C）およびCRY2（C）に対する各抗体を用いて免疫沈降し、ついで各抗体によってイムノブロットしたマウス脳抽出物を示す。アスタリスクは各タンパク質を示す。
【図７−１】野生型、Cry1-/-、Cry2-/-およびRev-erbα-/-マウスの自発運動活性リズムに対するリチウム投与の効果を示す。Aは恒暗条件下で得られた代表的な二重−プロット・アクトグラムを示す。Bは野生型、Cry1-/-およびCry2-/-マウスにおける概日周期に対するリチウム（20mM）の効果を示すグラフである。データは、スチュデントt−検定（*p<0.05）によって解析した。Cは自発運動条件下における周期の長さに対するリチウム処理の効果を数値化した表である。値は条件付け前後の平均差±SEMとして示す。
【図７−２】DはBmal1−lucを発現するCry1-/-、Cry2-/-およびRev−erbα-/-マウス胚性線維芽細胞における概日周期に対するリチウム処理の効果を示す。Eはリチウム処理がCry1、Cry2およびRev−erbα−欠損線維芽細胞の概日周期に及ぼす影響を示す。
【図８−１】LHおよびPER2突然変異体のリチウム効果を示す。野生型およびmPer2Brdm1マウスにおける自発運動活性リズムの周期に対するリチウム投与の効果を示す。Aは恒暗条件下で得られた自発運動活性の代表的な二重プロット・アクトグラムを示す。Bは野生型およびmPer2Brdm1マウスにおける概日周期の変化に対するリチウムの効果を示すグラフである。データはスチュデントt−検定（*p<0.05）によって解析した。CはBmal1−Elucの転写振幅を示す。ルシフェリン存在下で、発光を15分間隔で1分間積算した（縦軸スケール：1分間当たりの相対的カウント；横軸スケール：1440分=1日）。曲線のピーク値を1に設定した。独立した3回の実験のうちの代表的な結果を示す。データは3回実験試料の平均±SEMを表す。得られたシグナルの線形トレンドは除去した。最初のピークの位置を相マーカーとして位置調整した（平均±SEM；n=3）。
【図８−２】Dは各種マウスの15回逃避試行にわたる逃避遅延を示すグラフである。データは平均値±SEMとして示す。Eは15回逃避試行にわたる平均逃避遅延のドット・プロットを示す。中央値分割を線で記載する（n=4-10）。データは、2要因ANOVAにつづくシェッフェF−検定（*p<0.01）によって解析した。Fは非抑うつ状態および抑うつ状態の発生比率を示す（*p<0.05）。片側χ二乗検定（n=16、野生型；10、mPer2Brdm1）
【図９】GSK3βによるPER2のリン酸化部位を示す。AはmPER2のGSK3βターゲット領域の位置を示す。AおよびBはPAS−AおよびPAS−Bドメインを示し；NESは核外移行シグナルを示し；NLSは核局在化シグナルを示す。BはGSK3βによりリン酸化されたPER2の領域を同定するためのイン・ビトロ(in  vitro)キナーゼ・アッセイを示す。アッセイに使用した基質は以下のとおりである：完全長mPER2（レーン1）、アミノ酸残基（aa）1-246（F1；レーン2）、aa  247-488（F2；レーン3）、aa  489-753（F3；レーン4）、aa  625-883（F4；レーン5）、aa  884-1257（F5；レーン6）およびGST−CRY1（レーン7）に対応するGST−mPER2フラグメント。上段パネル：オートラジオグラフィー；下段パネル：CBB染色。オートラジオグラフィーについては、分子量をキロダルトンで示し、リン酸化された基質の位置にアスタリスクを付す。CBB染色については、アスタリスクは各基質を示し、GSK3βを矢印によって示す。GSK3βリン酸化モチーフ中に見出されたSer残基は太字で表す。CはGSK3βによりリン酸化されたPER2の領域を同定するためのイン・ビトロ(in  vitro)キナーゼ・アッセイを示す。PER2突然変異アッセイに使用した基質は以下のとおりである：GSK3βのみ（レーン1）、完全長mPER2（レーン2）、GST−mPER2野生型F2フラグメント（レーン3）、GST−mPER2  S[253]G  F2フラグメント（レーン4）、GST−mPER2  S[420]G  F2フラグメント（レーン5）、GST−mPER2  S[478]G  F2フラグメント（レーン6）、GST−mPER2野生型F5フラグメント（レーン7）、GST−mPER2  S[977]A  F5フラグメント（レーン8）、GST−mPER2  S[1041]G  F5フラグメント（レーン9）、GST−mPER2  S[1061]A  F5フラグメント（レーン10）、GST−mPER2  S[1091]G  F5フラグメント（レーン11）、GST−mPER2  S[1095]G  F5フラグメント（レーン12）およびGST−mPER2  S[1107]G  F5フラグメント（レーン13）。オートラジオグラフィーについては、分子量をキロダルトンで示し、リン酸化が減少した位置にアスタリスクを付す。GSK3βリン酸化モチーフ中に見出されたSer残基は太字で表す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は、第１の実施態様において、抗気分障害治療薬の候補化合物をスクリーニングする方法を提供し、この方法には、
（１）試験化合物と学習性無力（learned  helplessness、LH）動物の細胞とを培地中でインキュベートし、その後、該細胞中のPER2タンパク質の特定のアミノ酸配列ポジションのセリン残基のリン酸化量を測定し；
（２）試験化合物不存在下でインキュベートしたLHマウス細胞中のPER2タンパク質の特定のアミノ酸配列ポジションのセリン残基のリン酸化量を測定し；ついで
（３）試験化合物不存在下でインキュベートした細胞中のPER2タンパク質のリン酸化量と比較して、試験化合物とインキュベートした細胞中のPER2タンパク質のリン酸化量が少ない場合に、該試験化合物を抗気分障害治療薬の候補化合物と判定することが含まれる。
１の形態において、本発明のスクリーニング方法に用いるLH動物の細胞は、例えば、LHラットまたはLHマウスの線維芽細胞または神経細胞が挙げられる。
また、１の形態において、本発明のスクリーニング方法においてリン酸化量を測定するセリン残基は、配列番号：1に示すマウスPER2タンパク質のアミノ酸配列ポジジョン977のセリン残基である。
１の形態において、試験化合物不存在下でインキュベートした細胞中のPER2タンパク質のリン酸化量が、試験化合物とインキュベートした細胞中のPER2タンパク質のリン酸化量の好ましくは１.１倍以上、より好ましくは１.３倍以上、さらに好ましくは１.４倍以上、最も好ましくは１.５倍以上である場合に、該試験化合物を抗気分障害治療薬の候補化合物と判定することができる。ここで、本発明で言うところの試験化合物とは、本発明の発明のスクリーニング方法に供する化合物を意味し、抗気分障害治療薬の候補化合物とは、このスクリーニングによって、試験に供した多数の試験化合物の中から抗気分障害治療薬になる可能性の高いと思われる選別された化合物を意味し、該候補化合物はうつ病等の気分障害を抑制できる抗気分障害の作用を有する化合物、あるいはその逆の作用を有する化合物の両者を含めた一群の化合物を意味する。このような化合物は気分障害の病状を改善する治療薬を研究開発する上で有用な化合物となり得る。
PER2タンパク質のリン酸化量の定量は、例えば、イン・ビトロ(in  vitro)キナーゼ・アッセイを用いてオートラジオグラフィーによるデンシトメトリーにより行うことができる。
【００１２】
本発明は、第２の実施態様において、リン酸化PER2タンパク質およびその抗気分障害治療薬の候補化合物をスクリーニングするための使用も包含する。１の形態において、リン酸化PER2タンパク質はリン酸化ラットPER2タンパク質またはリン酸化マウスPER2タンパク質であり、PER2タンパク質のアミノ酸配列のポジション977がリン酸化されている。リン酸化PER2タンパク質は、哺乳動物由来のリン酸化PER2タンパク質が好ましく、マウスまたはラット由来のリン酸化PER2タンパク質がより好ましい。あるいは、遺伝子工学技術を用いてPER2タンパク質を作製した後に、公知の方法に従ってその特定部位にリン酸基を付加して作製することもできる。
リン酸化PER2タンパク質は、好ましくは配列番号：1のアミノ酸配列においてポジション977のセリンがリン酸化されたタンパク質であり、配列番号：1において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつPER2と同様の作用／活性を有するタンパク質も包含される。
配列番号：1のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、好ましくは配列番号：2で示されるポリヌクレオチドである。
【００１３】
本発明は、第３の実施態様において、リン酸化PER2タンパク質を特異的に認識するモノクローナル抗体を提供する。本発明のモノクローナル抗体は、公知の方法に従って生成することができ、好ましくは、配列番号：1のアミノ酸ポジション968−986のエピトープを特異的に認識するモノクローナル抗体である。また、本発明は、該モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマにも関する。
【００１４】
本発明は、第４の実施形態において、配列番号：1のアミノ酸配列のポジション977のセリン残基が他のアミノ酸残基に置換された変異PER2タンパク質を発現するノックインマウスを提供する。他のアミノ酸残基としては、好ましくはアミノ酸のリン酸化を生じ得るトレオニンおよびチロシン以外のアラニン等のアミノ酸残基である。
本発明のノックインマウスにおいては、マウスPER2のアミノ酸配列のポジション977のセリンが、リン酸化を生じないアミノ酸残基に置換されているため、学習性無力（LH）表現型を示さない。
【００１５】
動物
オスの3週齢Sprague−Dawleyラット（体重120−150g）をSLC（浜松）から購入した。ラットは、明所12時間/暗所12時間のサイクル（LD）下、1ケージ当たり3匹を飼育し、その間は自由に飼料および水を与えた。
Cry1-/-マウスおよびCry2-/-マウスは大阪大学の藤堂博士から分譲を受けた。mPer2Brdm1マウス（C57BL/6−TyrC−Brd）はJackson研究所から購入した。Bmal1−ELucマウスは以前報告しているように作製した（Nakajimaら，2010）。この実験において動物を用いるすべてのプロトコルは、財団法人  大阪バイオサイエンス研究所および国立大学法人  広島大学の動物研究委員会によって承認されている。
【００１６】
行動解析
活動リズムは以前報告したように測定した。LD拘束後に、赤外線活動記録装置（Biotex社、京都）を備えた個々のケージに入れ、LD下の活動リズムをモニターした。2週間後に、ラットを恒暗条件（DD）下で飼育し、その活動を1分間の活動を記録することによってモニターし続けた。ダブルプロット・アクトグラムはClockLab社（Actimetrics，IL）で作製した。ここではχ2ペリオドグラムを用いて、自発運動時間を推定した。
【００１７】
学習性無力
学習性無力（LH）は不可避ショック（IS）によって誘導し、逃避試験（ET）試行によって評価した。1および2日目に、ラットをステンレス鋼バーからなる格子床を備えたPlexiglasチャンバー（横460mm×深さ200mm×高さ180mm）に入れてIS条件付け（0.5mA、時間10秒、180試行）に付した。各々の試行は1−5秒の間隔で行った。つぎに、7および8日目に、これらのラットを再度ISに付した。対照ラットは45分間同じチャンバーに入れたが、ISには付さなかった。9日目にET（0.5mA、時間3秒、15試行）を行って、すべてのラットを評価した。各試行は30秒の間隔で行った。すべての処理は、恒暗条件下で行った。このETにおいては、ラットには2のチャンバーのうちの1のみにフット電気ショックを与えた。すなわち、もう1のチャンバーに飛び移れば、ラットは電気ショックを回避することができる。条件付けしたラットは、それらの逃避の遅延に基づいて2の群に分かれた。逃避しなかったことを、LHの測定としてカウントした。5回以下しか逃避しなかったラットはLHラットとして分類した。一方、6回以上逃避したラットは非学習性無力（NLH）ラットに分類した。すべてのラットの自発運動活性は4週間モニターした。4週間後に、すべてのラットをさらなるETに付した。ラットはこの実験の後に殺し、脳を取り出し、解剖して特定の脳領域を単離し、分析するまで直ちに−80℃で保存した。
【００１８】
Bertonおよび共同研究者の方法に従ってマウスを用いてLH試験を行った。簡単には、1日目および2日目に、野生型およびPer2Brdm1マウスをPlexiglasチャンバー（横140mm×深さ100mm×高さ150mm）に入れ、不可避フット電気ショック（IS；格子状の床を通す120回の不可避フット電気ショック、0.4mA、時間5秒間）に付した。ISは25−30秒の間隔をおいてほぼ1時間にわたってランダムに付した。「不可避フット電気ショックに付さなかった」動物は、同じ装置に1時間置いた。3日目に、マウスを逃避試験用のシャトルボックスに入れた。ETには15の連続する逃避試行を含めた。マウスを入れた1のコンパートメントに電気ショックを与え、もう1のコンパートメントには電気ショックを与えなかった。マウスが反対側のコンパートメントに逃避した場合は電気ショックを止め、逃避の遅延を記録した。電気ショックを与えていないコンパートメントにマウスが25秒以内に逃避しない場合は、試行を終了し、「逃避しなかった」とした。LH（5回未満の非逃避）および非LH（その他）の状態に分類し、各状態の発生比率を計算した。
【００１９】
長期リチウム療法
LHラットを2の群にランダムに分けた。対照群には水を与え（対照）、試験群にはその飲料水中に20mMのLiClまたはその飼料ペレット上に20mMのLi2CO3を4週間与えた。すべてのラットの運動活性を4週間モニターした。4週間後に、すべてのラットをさらなるETに付した。
【００２０】
フィーダー細胞（MEF）はE16.5の胎芽を収穫することによって収集した。頭部およびすべての赤色器官を取り除いた後に、残りの組織を手術用メスで細片に切断した。これらの細片をトリプシン処理し、3%CO2中、10%ダルベッコ修飾イーグル培地（DMEM）を用いて培養した。
【００２１】
Rev−erbα-/-およびGSK3β-/-のMEFは各々、Schibler博士およびWoodgett博士から分譲を受けた。対照およびLHラットの線維芽細胞は鼠径部真皮の切片から収集した。この切片はトリプシン処理し、3%CO2中、10%のDMEMを用いて培養した。
【００２２】
イン・ビトロ(in  vitro)キナーゼ・アッセイ
組換えGSK3βをイン・ビトロ(in  vitro)キナーゼ・アッセイに使用した。完全長タンパク質をコードするcDNAをpGEX6P-1（Qiagen社，Venlo，Netherland）のベクターにサブクローニングした。この発現ベクターをBL21（DE3）E．coli発現系（Invitrogen社，CA）に形質転換した。グルタチオンSepharose  4B（GE  Healthcare，UK）を用いて、製造業者プロトコルに従ってGST−GSK3βを精製した。GST−GSK3βはPre  Scissionプロテアーゼによって切断した。PER2、BMAL1、CLOCK、NPAS2、REV−ERBα、CRY1およびCRY2のGST融合タンパク質をキナーゼ・アッセイ用の基質として使用した。これらのGST−融合タンパク質は、GST−GSK3βについての記載と同様にして作製した。
キナーゼ反応は、50mM  Tris−HCl、pH7.4、10mM  MgCl2、1mM  β−メルカプトエタノールおよび50μM  ATPを含む緩衝液中、30℃にて60分間行った。SDS−PAGEサンプル緩衝液を添加することによって反応を終了させ、10%ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付した。また、これらの試料はクーマシーブリリアントブルー（CBB）染色に付して、基質の分子量を確認した。
【００２３】
イン・ビトロ（in  vitro）プルダウン・アッセイ
GSK3β、PER2、BMAL1、CLOCK、NPAS2、REV−ERBα、CRY1およびCRY2のGST融合タンパク質は、イン・ビトロ(in  vitro)キナーゼ・アッセイについて記載したのと同様にして作製した。GST−GSK3βタンパク質はPre  Scissionプロテアーゼを用いて切断した。GST融合タンパク質をグルタチオンSepharose  4B（GE  Healthcare社）に結合させ、GSK3βタンパク質と混合した。ついで、その混合物を20mM  Tris-HCl(pH7.4)、1mM  EDTA、150mM  NaCl、1%  Nonidet  P-40、5%  グリセリン、5mM  β-メルカプトエタノール、10mg/ml  アプロチニン、10mg/ml  ロイペプチンおよび1mM  フェニルメチルスルホニルフルオリド（PMSF）を含むTNE緩衝液で3回洗浄し、SDSサンプル緩衝液に再懸濁した。その試料をイムノブロット・アッセイによって分析した。
【００２４】
イムノブロット分析
COS−7細胞は10%  ウシ胎児血清を補充したDMEM中に維持した。細胞を、製造業者プロトコルに従ってLipofectAmine  2000（Invitrogen社）を用いてmPer1-3、mGSK3β、mBmal1、mClock、mNpas2、mRev-erbα、mCry1およびmCry2配列を含む発現ベクターでトランスフェクトした。トランスフェクトしたCOS−7細胞はTNE緩衝液中で溶解した。免疫沈降のために、そのライセートを、プロテインA−Sepharoseビーズ（GE  Healthcare社，WI）に結合した抗−HA抗体（Invitrogen社）、抗−Flag抗体（Sigma−Aldrich社，MO）または抗−GSK3β抗体（Cell  signaling  technology社，MA）と一緒に、4℃にて2時間インキュベートした。ラットの器官を切除し、液体窒素中で瞬間冷凍した。組織は10倍量のTNE緩衝液中でホモジナイズし、そのホモジネートを4℃、15,000×gにて20分間遠心した。上清（sup）画分のタンパク質濃度をBradford法により測定した。免疫沈降のため、組織または細胞から調製したsup画分を、プロテインA−Sepharoseビーズに結合した抗−CRY1抗体（ABNOVA社，台北市、台湾）、抗−CRY2抗体（Alpha  Diagnostic社，TX）、抗−PER2抗体、抗−BMAL1抗体、抗−REV−ERBα抗体（Cell  signaling  technology社）または抗−NPAS2抗体と一緒に4℃にて2時間インキュベートした。ついで、沈澱物をTNE緩衝液で3回洗浄し、SDSサンプル緩衝液に再懸濁した。試料は8%ポリアクリルアミドゲル上のSDS−PAGEによって分離し、ニトロセルロース膜に電気転写した。ニトロセルロース膜は、抗−GSK3β抗体（1：5,000）または抗−HA抗体（1：2,000）とインキュベートした後に、二次抗体としての西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗−ウサギIgG（1：5,000）またはマウスIgG（1：2,000）抗血清（Cell  signaling  technology社）とインキュベートした。Odysseyシステム（LI−COR社，NE）を用いて、免疫反応性のバンドを視覚化した。
【００２５】
抗体
ウサギPER2ポリクローナル抗体は、PER2のアミノ末端（アミノ酸1−99）に融合したグルタチオンS−トランスフェラーゼ（GST）に対して生起した。抗血清はGSTおよびGST−PER2カラムを通して精製した。
【００２６】
モノクローナル抗体
本発明のモノクローナル抗体は、マウスPER2タンパク質のアミノ酸配列のポジション968−986のエピトープ部分に対する特異性を有し、ポジション977のセリン残基のリン酸化を特異的に認識する。
【００２７】
部位特異的突然変異
部位特異的突然変異の導入は、特定のmPER2のセリン残基をアラニンまたはグリシンに置換するポリメラーゼ連鎖反応を用いてワンステップで行った。突然変異DNAはヘミメチル化DNAについてのDpnI選抜によって同定し、配列を確認した。使用したオリゴヌクレオチド・プライマーを配列番号：3−11に示す。
【００２８】
In  vitro  real-time  oscillation  monitoring  system（IV−ROMS）
ルシフェラーゼ活性をモニターするシステムは以前に報告している（特許文献１）。NIH3T3細胞をhBmal1−lucでトランスフェクトし、24時間インキュベートした。培地を血清リッチな培地（50%  新生仔ウシ血清を補充したDMEM）に交換した。2時間後に、この培地を通常の培地（1%ウシ胎児血清を補充したDMEM）に置き換えた。0.1mM  ルシフェリン存在下の発光を測定し、微弱発光計数装置（浜松ホトニクス，浜松市）の光増倍管を用いて1分間の発光を15分間隔で積算した。相および周期の測定は以前の実験と同様にして計算した。一連のデータは、生データから24時間の運動の平均を差し引くことによってトレンド除去した。各サイクルについて、滑らかにした曲線間の最大の差（ピークと谷）を用いて各サイクルの増幅を計算した。
【００２９】
Per2プロモーター−Per2野生型または突然変異プラスミドの構築
mPer2プロモーター領域（-661）は、以前の実験と同様にしてpGL3−Basicベクターにクローニングした。pGL3  Per2−プロモーターベクターのルシフェラーゼ遺伝子部位（NcoI−XbaI）を、Per2野生型または突然変異ORFフラグメントのN−末端c−mycタグ形に置き換えた。
【実施例】
【００３０】
学習性無力（LH）状態を作り出すために、図1に示すスケジュールでラットを不可避フット電気ショック（IS）に4回付した。片側半分の床を通電可能にしたケージ内にラットを拘束し、以下に示すスケジュールで不可避フット電気ショック（IS）に4回付した。10日後、逃避試験（ET）でラットを評価し、LHを獲得しているかまたは非LH（NLH）表現型であるかを判定した（図1A）。15試行のうち5未満しか逃避を試みなかったラットをLHラットと定義した。72.6±3.4%のラットしかLHを獲得していなかった（図1B）。繰り返して不可避フット電気ショックに付することにより、その運動活動リズムを測定するのに十分に長期間（少なくとも4週間）にわたってラットをLHに維持することが可能であることが示された。すなわち、条件付けを受けたラットの62.3±4.2%が4週間後にもなおLHを示した（図1B）。
この実験結果により、LHラットの活動リズムを非学習性無力（NLH）および対照ラットのものと比較できることが示された。ここで、驚くべきことには、LHラットは、NLHまたは対照ラットと比較してより短時間の自発運動を示した（図2−1A）。図2−1Aにおいて、横軸は2日間（48時間）のスケールを、縦軸は日付を示す。黒色部分はラットが活動している時間を表し、白色部分はラットが静止している時間を表す。通常、ラットの体内時計周期は24時間よりも長いため、恒暗（DD）条件下の活動時間は日々後退している（グラフにおいては、活動時間（黒色部分）が徐々に右にシフトする）。
【００３１】
不可避電気ショックが概日リズムに影響することを調べるために、12時間/12時間（暗所／明所）サイクルで2週間拘束（LD）した後に、暗所に常時拘束（DD）した際の内因性の活動リズムを測定した。
不可避フット電気ショックを施した後は、NLHラットよりもLHラットにおいて活動リズムの概日周期が短縮し、NLHラットの周期は対照ラットと区別できなくなった（図2−1A）。LHラットにおける電気ショック処理の前後の概日周期の差の平均は-0.16±0.02時間であり、NLHラット（+0.06±0.03時間；p<0.01）および対照ラット（+0.09±0.02時間；p<0.01）よりも有意に短くなることを示した（図2−1B）。すなわち、LHラットの平均概日周期は24.03±0.01時間となり、これはNLHラット（24.30±0.02時間）または対照ラットの平均概日周期（24.40±0.03時間）よりも有意に短くなった（p<0.01）（図2−1C）。
【００３２】
リチウムは双極性障害における気分障害を治療するために広く使用されている気分安定剤である。リチウムを用いた長期療法はLHを予防する。また、リチウムは概日時計に影響することも知られている。これらの知見に基づいて、リチウムがLHラットの行動および活動リズムに影響するかを調べた。
LHラットには、飲料水に混ぜて20mMの塩化リチウム（LiCl）を4週間経口投与し、逃避行動を上記した逃避試験で評価した。
その結果、リチウムを投与したLHラットは、対照として水のみを与えたLHラットと比較して逃避試行回数が顕著に増加した（図2−2D）。また、リチウム投与LHラットは水のみを与えたLHラットと比較してより長い活動周期を示した（図2−2EおよびF）。リチウム処理後のLHラットの活動周期は、対照ラットおよびNLHラットのレベル近くまで延長した（処理前：24.00±0.01時間；処理後：24.22±0.06時間、p=0.047）。一方、水処理ではLHラットの周期は顕著に変化しなかった（処理前：24.02±0.03時間；処理後：24.05±0.07時間；p=0.26）（図2−2G）。
これらの結果を総合すると、リチウムはLHを有効に低下し、活動リズムの概日周期を回復することが示された。
【００３３】
GSK3βのオーソログであるshaggy（sgg）はショウジョウバエ（Drosophila）における活動リズムの概日周期を短縮することが報告されている。リチウムはGSK3βのインヒビターであるため、GSK3β、および不活性型キナーゼであるそのリン酸化アイソフォーム（Stambolicら，1996）の発現レベルを調べた。その結果、対照ラットにおいては、SCNおよび前頭前皮質（PFC）の両方において概日様式でGSK3βはリン酸化されていた。一方、LHラットはSCNまたはPFCのいずれにおいてもリン酸化GSK3β（pGSK3β）の概日発現はなく、その発現レベルは調べた全期間において対照ラットよりも低かった（図3）。
【００３４】
本発明者らは、ルシフェラーゼ・レポーターと測光技術IV-ROMS（in  vitro  real-time  oscillation  monitoring  system）を組み合わせることにより、連続して細胞の概日リズムをモニターすることができる系を開発している。そこで、LHまたは対照ラット由来の線維芽細胞中のBmal1の概日周期を比較した。LHラット線維芽細胞の概日周期は対照ラット線維芽細胞のものよりも短い傾向があり（図4AおよびB）、その効果は特定の群において特に顕著であった（図5−1）。SCNおよびPFCに見られるように、リン酸化GSK3βは対照と比較してLH線維芽細胞において減少していた（図4CおよびD）。したがって、線維芽細胞におけるGSK3βのリン酸化は、特定のイン・ビボ(in  vivo)表現型と相関しているように考えられた。
【００３５】
GSK3βが細胞の概日リズムに対するリチウムの効果に実際に関与しているかを調べるために、GSK3β欠損マウス由来の線維芽細胞の細胞リズムに対するリチウムの効果を調べた。リチウムは、リチウムで処理していない線維芽細胞と比較して、野生型（WT）線維芽細胞の概日周期を延長した。一方、リチウムは、GSK3β欠損ラットからの線維芽細胞の概日周期には影響しなかった（図5−1AおよびB）。野生型ラットからの線維芽細胞の概日周期は、リチウム処理前の25.55±0.43時間と比較して、リチウム処理後は27.26±0.73時間であった（図5−1C）。一方、リチウム処理後のGSK3β欠損細胞における平均周期は23.89±0.34時間で、リチウム処理前の23.70±0.31と変化がなかった。また、PKC（BIS−1）、MEK（U0126）およびPI3キナーゼ（LY294002）などのGSK3βシグナル伝達経路に沿った鍵分子のインヒビターは、周期を延長するリチウムの効果を変化させなかった。しかしながら、GSK3βのインヒビターであるSB212676はこれらの周期を延長した（図5−2）。このことは、リチウムはGSK3βを不活性化することによって概日周期を直接的に延長することを示している。これらの結果は、GSK3βがリチウムのシグナル伝達経路の直接的なターゲットであることを示している。
【００３６】
GSK3βは概日リズムと気分障害のような気分状態との間をつなぐ分子のようである。本発明者の研究の経緯より、GSK3βはLHラットの短縮された概日周期に寄与している可能性が示された。そこで、ターゲット時計タンパク質やGSK3βの下流にあるタンパク質ターゲットが何であるかを調べた。この問題を取り扱うために、一連の標準的な時計タンパク質を用いて生化学的分析を体系的に行った。
イン・ビトロ(in  vitro)キナーゼ・アッセイの結果は、PER2、BMAL1、REV−ERBα、CRY1およびCRY2タンパク質はGSK3βによってリン酸化されるが、CLOCKまたはNPAS2タンパク質はリン酸化バンドが認められず、GSK3βによってリン酸化されないことを示した（図6A）。
また、GST融合時計タンパク質を用いたイン・ビトロ(in  vitro)プルダウン・アッセイの結果は、PER2、BMAL1、CRY1およびCRY2タンパク質はGSK3βと結合するが、CLOCK、NPAS2およびREV−ERBαタンパク質はGSK3βバンドを示さなかった（図6B）。
時計遺伝子とGSK3βの両方をマウスNIH3T3線維芽細胞に同時トランスフェクトした場合、PER1、PER2、CRY1、CRY2およびBMAL1はGSK3β存在下でリン酸化したが、PER3、CLOCK、NPAS2およびREV−ERBαについてリン酸化バンドは見られなかった（図6C）。
さらに、GSK3βによって免疫沈降したマウス脳抽出物がPER2、CRY1およびCRY2抗体で検出され（図6D）、このことは、実際の脳においてはこれら3の時計タンパク質がGSK3βと結合していることを示している。
これらの生化学的分析は、PER2、CRY1およびCRY2がGSK3βのターゲット時計タンパク質の有力な候補であることを示している。
【００３７】
これらの候補タンパク質がリチウムシグナル伝達経路に実際に関与しているかを確認するために、各時計遺伝子についてのノックアウトマウスおよびその細胞を調べた。活動リズム実験においては、リチウムは野生型マウスで認められたようにCry1ノックアウトマウスおよびCry2ノックアウトマウスの両方の周期を延長した（図7−1A）。詳細には、Cry1ノックアウトマウスおよびCry2ノックアウトマウスの活動の周期は、各々22.35±0.32時間および24.51±0.15時間であり、これらは以前に報告されているデータと一致した。リチウム処理後は、Cry1ノックアウトマウスおよびCry2ノックアウトマウスの周期は、各々23.58±0.02時間および24.95±0.17時間まで延長した（図7−1BおよびC）。イン・ビボ(in  vivo)のデータと同様に、リチウムはCry1欠損線維芽細胞およびCry2欠損線維芽細胞の両方の周期も延長した（図7−2D）。また、リチウムを添加した場合は、Rev−erbα−欠損線維芽細胞の概日周期も延長した（図7−2D）。
これらの結果は、CRY1、CRY2およびREV−ERBαはリチウムシグナル伝達経路のGSK3βのターゲットではなさそうなことを示している。Cry1、Cry2およびRev−erbα−欠損線維芽細胞の概日周期は、各々23.39±0.49時間、24.14±0.64時間および23.57±0.53時間であり、リチウム処理はそれらの周期を各々28.40±0.70時間、28.55±0.98時間および26.55±0.92時間まで延長した（図7−2E）。
【００３８】
それに対して、リチウムは、PASドメイン中の87アミノ酸が欠損しているPer2欠損マウス（mPer2Brdm1）の活動リズムの周期には影響しなかった（Zhengら，1999）。これらのアミノ酸はGSK3βの結合部位に含まれ（Iitakaら，2005）、したがって、それらを除去するとGSK3βによるリン酸化が妨害される（BiondiおよびNebreda，2003）。これらの条件下におけるリチウムを考慮すると、PER2がGSK3βの合理的な機能候補ターゲットである。リチウムは野生型マウスにおける活動の概日リズムを顕著に延長したが、mPerBrdm1マウスにおいては顕著な差は認められなかった。（図8−1AおよびB）。
【００３９】
GSK3βによるリン酸化部位を確認するために、一連のPER2フラグメント（F1−F5、図9A）を用いて実験を行った。
イン・ビトロ(in  vitro)キナーゼ・アッセイでは、PER2のF2およびF5フラグメントならびに完全長PER2はGSK3βによってリン酸化されるが、F1、F3およびF4フラグメントはリン酸化されないことが示された（図9B）。
さらにリン酸化部位を詳細に同定するために、GSK3βリン酸化についての潜在的な共通配列のサーチを行った。潜在的なリン酸化部位の突然変異体を用いたイン・ビトロ(in  vitro)キナーゼ・アッセイにより、PER2ポジション478、977および1107のセリン残基がGSK3βによってリン酸化される部位である可能性が示された（図9C）。
【００４０】
これらのリン酸化部位が機能的であるかを調べるために、野生型または突然変異PER2を導入したBmal1−ELucマウス（Nakajimaら，2010）由来のマウス胎児線維芽細胞（MEF）の細胞概日リズムを調べた。
その結果、リチウムにより、野生型、S478AおよびS1107Aの突然変異PER2ならびに対照線維芽細胞の細胞リズムの周期は延長されたが、S977A突然変異PER2においては概日周期の顕著な変化は認められなかった（図8−1C）。
【００４１】
これらの結果は、PER2がGSK3βの下流分子ターゲットであることを示し、PER2のポジション977のセリン残基は、GSK3βがリチウムシグナル伝達経路を変化させる機能的なリン酸化部位であることを示している。
【００４２】
上記したように、LHはPER2のリン酸化を阻止することによって概日リズムに影響することが示された。そこで、PER2のリン酸化がLHに影響するかを、LH試験にmPer2Brdm1マウスを用いて、その逆の現象が生じるかを確認した。
以前の研究結果と同様に、野生型マウスの個体反応はIS群の中で非常に変動が大きい：野生型LH群は逃避時間の遅延によって示される逃避欠陥を示し、またこれは全ての試行で持続し、野生型非LH群は、区別できない逃避時間の遅延によって定量化されるように、不可避フット電気ショックに付していない野生型群と同様に中程度の逃避挙動を示した（図8−2DおよびE）。
一方、興味深いことに、不可避フット電気ショックに付したmPer2Brdm1群は、不可避フット電気ショックに付していないmPer2Brdm1群、不可避フット電気ショックに付していない野生型群および非学習性無力野生型群と同じように、変動が小さい中程度の逃避挙動を示した。ここで、mPer2Brdm1マウスにLHが存在しないことは非常に重要であり（図8−2F）、このことはPER2が気分状態の少なくとも1のモデルであるLHに影響することを意味している。
これらの結果から、PER2のポジション977のセリン残基のリン酸化が気分および概日リズムの両方に機能的に関与していることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００４３】
本発明は、気分障害をはじめとする精神疾患のイン・ビトロ(in  vitro)のスクリーニング系およびスクリーニング方法を提供し、気分障害患者の治療薬や、軽微な気分障害症状を発症している患者を改善する物質や、気分障害の発症を予防するための予防薬をスクリーニングすることができる。また、本発明によりスクリーニングされる治療薬、予防薬または改善物質は、様々な程度の気分障害の治療、予防または改善のために仕様することができ、医薬品のほか食品、サプリメントなど簡便に摂取できる形態とすることができる。
【００４４】
参考文献
Biondi, R.M., and Nebreda, A.R. (2003). Signalling specificity of Ser/Thr protein kinases through docking-site-mediated interactions. Biochem J 372, 1-13.
Iitaka, C., Miyazaki, K., Akaike, T., and Ishida, N. (2005). A role for glycogen synthase kinase-3beta in the mammalian circadian clock. J Biol Chem 280, 29397-29402.
Nakajima, Y., Yamazaki, T., Nishii, S., Noguchi, T., Hoshino, H., Niwa, K., Viviani, V.R., and Ohmiya, Y. (2010). Enhanced beetle luciferase for high-resolution bioluminescence imaging. PLoS One 5, e10011.
Stambolic, V., Ruel, L., and Woodgett, J.R. (1996). Lithium inhibits glycogen synthase kinase-3 activity and mimics wingless signalling in intact cells. Curr Biol 6, 1664-1668.
Zheng, B., Larkin, D.W., Albrecht, U., Sun, Z.S., Sage, M., Eichele, G., Lee, C.C., and Bradley, A. (1999). The mPer2 gene encodes a functional component of the mammalian circadian clock. Nature 400, 169-173.
【配列表フリーテキスト】
【００４５】
SEQ ID NO: 1
Amino acid sequence of PER2 protein.
SEQ ID NO: 2
Polynucleotide sequence of per2 gene.
SEQ ID NO: 3
Primer for site-directed mutagenesis using a polymerase chain reaction for specific mPer2 serine residues.
SEQ ID NO: 4
Primer for site-directed mutagenesis using a polymerase chain reaction for specific mPer2 serine residues. 
SEQ ID NO: 5
Primer for site-directed mutagenesis using a polymerase chain reaction for specific mPer2 serine residues. 
SEQ ID NO: 6
Primer for site-directed mutagenesis using a polymerase chain reaction for specific mPer2 serine residues. 
SEQ ID NO: 7
Primer for site-directed mutagenesis using a polymerase chain reaction for specific mPer2 serine residues. 
SEQ ID NO: 8
Primer for site-directed mutagenesis using a polymerase chain reaction for specific mPer2 serine residues.
SEQ ID NO: 9
Primer for site-directed mutagenesis using a polymerase chain reaction for specific mPer2 serine residues.
SEQ ID NO: 10
Primer for site-directed mutagenesis using a polymerase chain reaction for specific mPer2 serine residues.
SEQ ID NO: 11
Primer for site-directed mutagenesis using a polymerase chain reaction for specific mPer2 serine residues.
【図１】
2014019658.tif 000002
【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９】
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【配列表】
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