(57)【要約】      （修正有）【課題】結核病快速診断と薬効検知に適用される遺伝子配列構造を提供する。【解決手段】結核菌検知領域と薬剤抵抗性検知領域から構成される遺伝子配列構造であり、この結核菌検知領域は、複数の、それぞれ、所定の生物プローブが接合され、それぞれ、所定の生物分子と反応して、異なる色である遺伝子検知点を表現でき、これらの遺伝子検知点は、13個の結核菌特異性遺伝子の結核菌特異性遺伝子群が含まれ、また、上記薬剤抵抗性検知領域は、結核抵抗薬剤と反応して異なる色が表現される複数の遺伝子検知点が接合され、これらの遺伝子検知点は、6個の薬剤抵抗性遺伝子の薬剤抵抗性遺伝子群が含まれる。これにより、上記結核菌特異遺伝子と上記薬剤抵抗性遺伝子を、プローブとして、異質性反応で分析し、同時に、結核菌と薬剤抵抗性遺伝子を検知でき、快速的に、低いコストで、結核抵抗薬剤の薬剤抵抗性を検知する効果が得られる。【選択図】図１
2014057572.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
結核病快速診断と薬効検知に適用され、
複数の、それぞれ、所定の生物分子と反応して異なる色が表示される遺伝子検知点を有する所定の生物プローブが接合され、上記遺伝子検知点に、13個の結核菌特異性遺伝子の結核菌特異性遺伝子群が含まれ、その中、上記13個の結核菌特異性遺伝子が、それぞれ、hsp65やRv0577、Rv3120、Rv2073c、Rv1970、Rv3875、Rv3347c、Rv1510、Rv0186、Rv0124、TbD1、mtp40及びmpb83である結核菌検知領域と、
複数の、それぞれ、IsoniazidやRifampicin、Ofloxacin、Ethambutol及びStreptomycinの結核抵抗薬剤と反応して、異なる色が表示される遺伝子検知点が接合され、上記らの遺伝子検知点に、6個の薬剤抵抗性遺伝子の薬剤抵抗性遺伝子群が含まれ、その中、上記6個の薬剤抵抗性遺伝子が、それぞれ、katGやrpoB、gyrA、embB、rpsL及びrrsである薬剤抵抗性検知領域と、が含有される、ことを特徴とする結核病快速診断と薬効検知に適用される遺伝子配列構造。
【請求項２】
上記全ての遺伝子検知点は、アレー配列状であることを特徴とする請求項１に記載の結核病快速診断と薬効検知に適用される遺伝子配列構造。
【請求項３】
更に、陽性制御セットと陰性制御セット及び空白制御セットがることを特徴とする請求項１に記載の結核病快速診断と薬効検知に適用される遺伝子配列構造。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、結核病快速診断と薬効検知構造に関し、特に、結核菌分類と薬剤抵抗性分析を両立して、同時に、結核菌と薬剤抵抗性遺伝子の遺伝子配列を検知できる構造に関する。
【背景技術】
【０００２】
結核病（Tuberculosis, TB）は、昔からの古い伝染病であり、全地球の科学者によって、長く間、予防や控え及び治療の方法を研究しても、結核病が、今になって、依然として、全地球の重大な公共保健問題であり、また、単一の病原によって、死亡感染例が最も多い伝染病である。世界保健機関（World Health Organization, WHO）の予測によると、全地球の三分の一以上の人口が、結核菌（Mycobacterium Tuberculosis）によって感染され、統計によれば、毎年、約八百万の新しい結核病例が発生し、それに、二百万人が、結核病により、死亡した。
【０００３】
結核病の特徴は、結核菌に感染された後、一般として、直ぐに、発病しなく、感染者の約10%の確率しか発病しないため、活動性結核患者（Active TB）になる。また、大部分の患者が、結核菌によって感染された後、菌体が、長期に、宿主体内に潜めて、チャンスを見つけて発病する。結核菌と宿主との防衛機制の平衡が崩れると、潜伏病症が、活化して、活動性患者になる。そのため、全体として、潜伏性結核患者（Latent TB）が、活動性結核患者になる発病要因になり、それは、外因性再感染（Exogenous
Reinfection）である可能性でもあるが、病原菌の内因性再燃（Endogenous Reactivation）の可能性でもある。
【０００４】
結核病の臨床表現が、様々で、発病の直後、一般、明白や特異性の症状がなく、また、疾病経過の発展が遅くて、良くなって悪くなり、臨床診断が、非常に難しいことである。そのため、臨床には、結核病の診断が、患者の臨床とレントゲン写真の変化を統合して、実験室において、検査することにより、やっと正確的に判断できる。
【０００５】
結核病の実験診断の場合、主として、組織病理学や抗酸菌染色と肺結核菌培養等の技術が利用される。しかし、上記らの検査技術は、検知に制限がある。例えば、喀痰塗抹標本の顕微鏡染色検査の場合、伝統方式において、最も抗酸菌を検知する方法であるが、痰液検体に、１ミリリットル（ml）に少なくとも5000乃至10000の菌が含まれなければ、染色した塗抹標本から検査されない。また、当該技術の偽陽性が高く、それは、結核菌の他に、非結核性抗酸菌（Non-Tuberculous Mycobacteria, NTM）や少数の他の桿菌も、染色陽性になるためである。結核菌の培養方法は、伝統の、結核病の確認診断方法の一つに、感度が80乃至85%で、特異性が、98%である特性を有するが、少なくとも、4乃至8週の時間がないと、検査結果が得られなく、時間的には、臨床のニースに満足できない。
【０００６】
分子生物技術の発展に伴って、大幅に生物医学の検討に適用されるため、分子生物学関連技術は、例えば、重合酵素連鎖反応（Polymerase
Chain Reaction, PCR）と重合酵素連鎖反応-制限断片長多型（PCR-Restriction Fragment Length Polymorphism, PCR-RFLP）等で、結核病に対して、分子診断を行うことにより、結核病の臨床診断は、格差的な進歩が実現される。発展の初期において、一般の検査機関が、重合酵素連鎖反応を利用して、直接に、受檢者の痰液検体の中に、肺結核菌の分子マーク（例えば、熱ショックタンパク質65（hsp65）と、挿入寸断6110（IS6110）であるデオキシリボ核酸（Deoxyribonucleic Acid, DNA）やリボ核酸（Ribonucleic Acid, RNA））が存在するか、を検知する。また、制限断片長多型を結合して、検知した菌体の核酸に対して、分子分類を行う。しかし、上記の方法によれば、快速的に結核菌の存在を検知できるが、検知された宿主検体に含有される結核菌の所有するDNAやメッセンジャRNA（messenger
RNA, mRNA）の表現量によれば、臨床診断において、依然として、満足できる正確性が得られない。
【０００７】
最近数年以来、結核菌の全ゲノムの解読によれば、科学者らは、結核菌とBCG 菌（Mycobacterium bovis
BCG）との間に、ゲノム欠失（Genomic Deletion）の現象が存在し、それで、欠失断片位置を、RD（Regions-of-Difference）に、統合して称する。多い研究報告によれば、このようなRDによって、ゲノムのDNAを複製する時のエラーや挿入性断片の挿入により、ゲノムの欠失（Deletion）や挿入（Insertion）、倒置（Inversion）或いは複製（Replication）等が発生し、それにより、菌種間のRDが発生した。
【０００８】
RDに、多めに、重要な遺伝子や病原体が存在し、それらの断片の存在や欠失により、結核菌群の各菌種による病原性が異なる。そのため、RDを、結核菌を分類する標的とすれば、分子診断技術の高い快速感度が維持される利点が得られ、また、伝統の分子検知方式によって結核菌群の各菌株を鑑定できない欠点が補充され、結核病診断の分子マークとして利用されることの可能性が高い。
【０００９】
黄さんらは、2009年において、各RDから、総計14の特異性目標遺伝子を、結核病遺伝子診断チップの検知標的を構築するものを発表した。同時に、多遺伝子標的を検知できる微量核酸検知技術平台を利用して、その感度は、ミリリットルの血に、5個の細胞があれば、検知でき、それにより、痰液検体を検知対象とする結核病遺伝子診断チップが構築される。
【００１０】
上記実験は、まず、臨床検体から病原性マイコバクテリア群菌株を分離し、伝統の生化反応とDNA塩基配列決定で分離菌株を確認した後、各患者が感染した結核菌を標準参考データーとして記録し、そして、既存の分子検知技術PCR-RFLPと遺伝子チップ検知技術を利用して、直接に、結核患者の痰液検体から結核菌の存在を検知して、更に、二つの方法の一致性や便利性を比較した。結果として、246個の結核患者の臨床痰液検体において、直接に、PCR-RFLPで結核菌群（TB Complex, TBC）の存在を検知した割合は、62.5%になり、遺伝子チップ検知技術で、検知した割合が、85%になり、また、上記の二つの方法によって検知された菌株の種類が、完全に一致する。二つの方法で検知した結果と痰液染色の関連性を分析すれば、56の陽性培養と痰液染色陽性の検体において、PCR-RFLPで、39個を検知でき、遺伝子チップ検知技術の檢出率が、90%よりも多く、52個を検知でき、また、24個の陽性培養で、痰液染色が陰性である検体において、PCR-RFLPで、11個を検知でき、遺伝子チップ検知技術の檢出率が、67%もあり、16個を検知できる。
【００１１】
由上記の結果から分かるように、遺伝子チップ検知技術は、操作が便利で、有効に人力や時間を節約でき、その感度が、PCR-RFLP技術よりも、遥かに高くなり、未來の結核病分子診断の発展新傾向になる。
【００１２】
しかしながら、世界市場において、結核菌検知/薬効検知セットは、例えば、Spoligotyping Method（オランダ-Isogen）やTB Ag Rapid Test（台湾-Formosa Biomedical
Technology Corp.）、Amplified MTDR（米国-Gene Probe）、DR. MTBC Screen Kit（台湾-DR.Chip Biotech, Inc.）及びGenoType MTBDRplus（ドイツ-Hain
Lifescience）がある。その中、Spoligotyping Methodは、結核菌特異性m-オリゴヌクレオチドスペクトルを検知して、構築されたデーターベースを対比分類するが、菌株認識能力が、標準方法に及ばないため、鑑別率が低い欠点があり、また、薬剤抵抗性分析の薬効検知機能を有しなく、TB Ag Rapid Testは、結核菌特異性抗原を利用して、抗原抗体反応で、直接に、結核菌を検知するが、コストが高く、マイコバクテリアコロニーを培養しなければならないため、手順が複雑で、時間が掛かる欠点があって、また、薬剤抵抗性分析の薬効検知機能を有しなく、Amplified MTDRは、冷光で、結核菌リボソームリボ核酸（ribosomal RNA, rRNA）と特異性DNAプローブ異質性を、検知するが、マイコバクテリアコロニー培養を行わなければならなく、手順が複雑で、時間が掛かる欠点があって、また、同じように、薬剤抵抗性分析の薬効検知機能を有しなく、DR. MTBC Screen Kitは、結核菌内の特定遺伝子断片に対して、PCRで、拡大して、チップで、プローブ異質性反応を行わせ、痰液サンプルについて、結核菌を検知でき、結核菌群のRifampicinの薬剤抵抗性遺伝子を探し出すことができるが、各ミリリットルの痰に、10万の細菌がなければ、検知できなく、感度が、わずか、65%であるため、感度が低い欠点があり、GenoType MTBDRplusは、PCRで、結核菌薬剤抵抗性遺伝子を増幅させて、プローブと、異質性反応を行わせ、結核菌群のOfloxacin、Streptomycin及びEthambutolの薬剤抵抗性遺伝子を検知できるが、コストが高く、技術複雑度が高く、時間掛かり、また、持続的に品質管理を行わなければならない欠点があり、また、薬効検知できるだけで、結核菌検知機能を有しない。
【００１３】
また、中華民国特許願第201005098号の活動性肺結核菌チップ検知法によれば、直接に、宿主痰液検体から検知できる、結核菌感染の活動期肺結核菌診断のチップであり、結核菌をふるい分けすることだけができて、薬効分析遺伝子群の機能を有しない。その故、一般の従来のものは、快速的に結核病を診断することと、同時に、薬効の薬剤抵抗性を検知することができないため、実用的ではない。
【００１４】
本発明者は、上記欠点を解消するため、慎重に研究し、また、学理を活用して、有効に上記欠点を解消でき、設計が合理である本発明を提案する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】中華民国特許願第201005098号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明の主な目的は、従来の上記問題を解消して、結核菌分類と薬剤抵抗性分析を両立させ、同時に、結核菌と薬剤抵抗性遺伝子を検知できる遺伝子配列構造を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
上記の目的を達成するために、本発明は、結核病快速診断と薬効検知構造を提供し、それは、結核菌検知領域と薬剤抵抗性検知領域とから構成される遺伝子配列構造であり、上記結核菌検知領域は、複数の、それぞれ、所定の生物プローブが接合され、それぞれ、所定の生物分子と反応して、異なる色である遺伝子検知点を表現でき、上記らの遺伝子検知点は、13個の結核菌特異性遺伝子の結核菌特異性遺伝子群が含まれ、また、上記薬剤抵抗性検知領域は、複数の、それぞれ、Isoniazid、RifampicinやOfloxacin、Ethambutol及びStreptomycinの結核抵抗薬剤と反応して異なる色が表現される遺伝子検知点が接合され、上記らの遺伝子検知点は、6個の薬剤抵抗性遺伝子の薬剤抵抗性遺伝子群が含まれる。これにより、上記結核菌特異遺伝子と上記薬剤抵抗性遺伝子を、プローブとして、異質性反応で分析し、同時に、結核菌と薬剤抵抗性遺伝子を検知でき、快速的に、低いコストで、結核抵抗薬剤の薬剤抵抗性を検知する効果が得られる。
【００１８】
上記の13個の結核菌特異性遺伝子は、それぞれ、hsp65やRv0577、Rv3120、Rv2073c、Rv1970、Rv3875、Rv3347c、Rv1510、Rv0186、Rv0124、TbD1、mtp40及びmpb83である。
【００１９】
上記の6個の薬剤抵抗性遺伝子は、それぞれ、katGやrpoB、gyrA、embB、rpsL及びrrsである。
【００２０】
以下、図面を参照しながら、本発明の特徴や技術内容について、詳しく説明するが、それらの図面等は、参考や説明のためであり、本発明は、それによって制限されることが無い。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】本発明に係る遺伝子配列構造の検知ブロック概念図である。
【図２】本発明に係る遺伝子配列構造の遺伝子配列概念図である。
【図３】本発明のより良い実施例の結核菌検知領域判読概念図である。
【図４】本発明のより良い実施例の薬剤抵抗性検知領域判読概念図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
図１と図２は、それぞれ、本発明に係る遺伝子配列構造の検知ブロック概念図と本発明に係る遺伝子配列構造の遺伝子配列概念図である。図のように、本発明は、結核病快速診断と薬効検知構造であり、少なくとも、結核菌検知領域２１と薬剤抵抗性検知領域２２から構成される遺伝子配列構造２０があり、図において、Pが、陽性制御セットであって、Nが、陰性制御セットであって、Bが、空白制御セットである。
【００２３】
上記の結核菌検知領域２１は、それぞれ、複数の所定の生物プローブが接合され、また、それぞれ、所定の生物分子と反応して、異なる色である遺伝子検知点２ａを表現でき、上記らの遺伝子検知点２ａは、13個の結核菌特異性遺伝子の結核菌特異性遺伝子群が含まれ、その中、結核菌を診断する結核菌特異性遺伝子群は、主として、表一のような結核菌特異性遺伝子から選択された特異性オリゴヌクレオチドシーケンスが含まれ、表１から分かるように、それらの13個の結核菌特異性遺伝子の結核菌特異性遺伝子群は、それぞれ、hsp65やRv0577、Rv3120、Rv2073c、Rv1970、Rv3875、Rv3347c、Rv1510、Rv0186、Rv0124、TbD1、mtp40及びmpb83である。
【００２４】
【表１】
2014057572.tif 000003
【００２５】
上記の薬剤抵抗性検知領域２２は、それぞれ、複数のIsoniazid、RifampicinやOfloxacin、Ethambutol及びStreptomycin等の結核抵抗薬剤と反応して異なる色で表現される遺伝子検知点２ｂが接合され、上記らの遺伝子検知点２ｂは、6個の薬剤抵抗性遺伝子の薬剤抵抗性遺伝子群が含まれ、その中、結核抵抗薬剤薬効を検知する薬剤抵抗性遺伝子群は、主として、表２のような薬剤抵抗性遺伝子から選択されたシーケンスが含まれ、表二から分かるように、6個の薬剤抵抗性遺伝子を有する薬剤抵抗性遺伝子群は、それぞれ、katGやrpoB、gyrA、embB、rpsL及びrrsである。
【００２６】
【表２】
2014057572.tif 000004
【００２７】
上記全ての遺伝子検知点２ａ、２ｂは、アレーに配列される。
【００２８】
図３は、本発明のより良い実施例の結核菌検知領域判読概念図である。図のように、本発明は、13個の選択された結核菌特異性遺伝子と6個の選択された薬剤抵抗性遺伝子を利用して、ナイロンフィルムに、遺伝子配列構造を構築し、その中、上記結核菌検知領域２１は、結核菌特異遺伝子をプローブとするより良い実施例とし、異質性反応で分析し、そして、色転換で、異質性情報を検知し、色転換があれば、上記の遺伝子発現があることが示され、また、この遺伝子発現の差異により結核菌が分類される。図において、結核菌は、上記遺伝子配列構造に、色変換の結果が、hsp65（＋）やRv0577（＋）、Rv3120（−）、Rv2073c（−）、TbD1（＋）、Rv1970（−）、Rv3875（＋）、Rv3347c（＋）、Rv1510（−）、Rv0186（＋）、Rv0124（＋）、mtp40（＋）及びmpb83（＋）であり、その中、判読結果が（＋）であるは、陽性反応になる。
【００２９】
更に、詳しく比較すると、下記の表３のようである。
【００３０】
【表３】
2014057572.tif 000005
【００３１】
図４は、本発明のより良い実施例の薬剤抵抗性検知領域判読概念図である。図のように、本発明は、13個の選択された結核菌特異性遺伝子と6個の選択された薬剤抵抗性遺伝子を利用して、ナイロンフィルムにおいて、遺伝子配列構造が構築され、その中、上記薬剤抵抗性検知領域２２にあるEthambutol薬効検知を例とし、また、embB-W1により、必ず色変換するembB陽性制御セットが設定され、また、embB-W306やembB-W319及びembB-W406が、野生型プローブembB codon 306や319及び406であり、そして、embB-Q306とembB-Q319及びembB-Q406を、容易に突然変異する位点にある内制御セットembB codon 306と319及び406とする。このより良い実施例によれば、薬剤抵抗性遺伝子をプローブとし、異質性反応により分析し、そして、色転換で異質性情報を検知して、薬剤抵抗性遺伝子が突然変異したかを分析し、突然変異があれば、野生型プローブと接合しなくて、色転換しない。図において、薬剤抵抗性遺伝子embBは、上記遺伝子配列構造において、色転換の結果が、codon 306（−）やcodon 319（＋）及びcodon 306（＋）であり、その判読結果として、embB codon 306が突然変異し、その菌が、Ethambutolに対して、薬剤抵抗性がある。
【００３２】
以上のように、本発明に係る結核病快速診断と薬効検知構造は、有効的に、従来の諸欠点を解消でき、結核菌特異遺伝子と薬剤抵抗性遺伝子をプローブとし、異質性反応で分析でき、同時に、結核菌と薬剤抵抗性遺伝子を検知できるため、快速的に、低いコストで、結核抵抗薬剤の薬剤抵抗性等を検知でき、そのため、本発明は、より進歩的かつより実用的で、法に従って特許請求を出願する。
【００３３】
以上は、ただ、本発明のより良い実施例であり、本発明は、それによって制限されることが無く、本発明に係わる特許請求の範囲や明細書の内容に基づいて行った等価の変更や修正は、全てが、本発明の特許請求の範囲内に含まれる。
【符号の説明】
【００３４】
２ａ、２ｂ  遺伝子検知点
２０        遺伝子配列構造
２１        結核菌検知領域
２２        薬剤抵抗性検知領域
【図１】
2014057572.tif 000006
【図２】
2014057572.tif 000007
【図３】
2014057572.tif 000008
【図４】
2014057572.tif 000009