(57)【要約】【課題】神経障害または神経変性障害、特に脳卒中の処置のための新規の手段を提供すること。【解決手段】本発明者らは、クリングルドメインを含むかもしくはそれからなるタンパク質またはＮＭＤＡ受容体のＮＲ１サブユニットのアミノ末端ドメインに特異的に結合する抗体（抗ＡＴＤ−ＮＲ１抗体）は、２つのｔ−ＰＡ関連標的部位、すなわち血液脳関門およびＮＭＤＡ受容体で活性であり、その結果、血管保護および神経保護活性を示すことを見出した。下に示されることになるように、動物モデルからの結果により、本発明のｔ−ＰＡインヒビターは、ｔ−ＰＡと一緒に与えられる場合だけではなく、単独で投与される場合も効果的である。さらに、ｔ−ＰＡインヒビターは、血餅形成後に与えられた場合血栓性障害において有益効果を示し、それゆえに、血栓症の急性期処置または後急性期処置が可能になる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経障害または神経変性障害の処置のための方法に関する。より具体的には、本発明は、神経障害または神経変性障害の結果、有害な影響を受ける神経細胞および／または血液脳関門の保護に関する。本発明は、欧州特許出願０９  ０１１  １４９．３の優先権を主張し、上記欧州特許出願０９  ０１１  １４９．３は、本明細書によって、開示に関して全てが援用される。
【背景技術】
【０００２】
脳卒中は、年間約６００万人が死亡している成人死および身体障害の主因であり、高齢者人口の増加によって、今後１０年間は憂慮すべき発生率が予測される。脳虚血の細胞および分子病態生理学の理解は著しく前進してきたが、組換え組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｒｔ−ＰＡ）は依然として虚血性脳卒中に対する唯一の承認された急性期処置薬である。これまで何百もの化合物が虚血性脳卒中の臨床治験において試験されているが、ｒｔ−ＰＡを除いて効果的であると判明したものは１つもない。
【０００３】
ｒｔ−ＰＡの使用は、処置ウィンドウ（ｗｉｎｄｏｗ）が短いこと（発症後４．５時間）、および脳内出血と神経毒性の両方が助長されることにより限定されている。したがって、ｒｔ−ＰＡ誘導血栓溶解の包括的利益を改善し、血栓溶解法に適格ではない脳卒中患者（すなわち、脳卒中患者のうちの８０％超）に処置を施すためには、さらに安全でさらに効果的な処置法に対する重大な必要性が存在する。
【０００４】
Ｔ−ＰＡは、血管内腔において、血液と脳の界面で、および脳実質において重要な役割を示す２つの顔を持つセリンプロテアーゼである（総説については、非特許文献１）。血管内コンパートメントにおいて、ｔ−ＰＡの主要な基質は不活性チモーゲンプラスミノーゲンであり、その主要な役割は線維素溶解を促進することである。血液由来ｔ−ＰＡは、無傷の血液脳関門（ＢＢＢ）でも損傷した血液脳関門でも通過することができ（非特許文献２、非特許文献３）、したがって、内因的に産生されるｔ−ＰＡとともに、脳実質において様々な基質と相互作用でき、こうして、ｔ−ＰＡ／プラスミン（プラスミノーゲン）駆動細胞外マトリックス分解を超えてその機能を拡張することができる。
【０００５】
ｔ−ＰＡとＮメチルＤアスパラギン酸受容体（ＮＭＤＡＲ）、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質（ＬＲＰ）、グリア細胞におけるアネキシンＩＩおよび／または神経細胞活性化細胞シグナル伝達過程と間の相互作用により、脳浮腫、出血性変化および細胞死を含む有害な結果をもたらすことを示す証拠が増えている。ｔ−ＰＡのこれら複数の病態生理学的作用に基づいて、内在性ｔ−ＰＡの関与（外因的に適用されるｒｔ−ＰＡの副作用により支持されている）が、てんかん、アルツハイマー病、多発性硬化症または髄膜炎などのいくつかの神経障害または神経変性障害について、虚血性障害における確立した役割を超えて議論されている。
【０００６】
ｔ−ＰＡの複雑な挙動に従って、ｔ−ＰＡの有害な影響を阻害するためのいくつかの分子戦略を考えることが可能である。しかし、臨床的状況に移すことが可能である戦略はまだ見あたらない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｙｅｐｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２００９；  ３２（１）：  ４８−５５
【非特許文献２】Ｂｅｎｃｈｅｎａｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ２００５，  １１１（１７）：  ２２４１−２２４９
【非特許文献３】Ｂｅｎｃｈｅｎａｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｔｒｏｋｅ  ２００５，  ３６（５）：  １０６５−１０７０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
したがって、本発明の目的は、神経障害または神経変性障害、特に脳卒中の処置のための新規の手段を提供することである。
【０００９】
この目的は、請求項１に記載の方法により解決される。本発明の追加の実施形態は、追加の独立請求項または従属請求項の主題である。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、クリングルドメインを含むかもしくはそれからなるタンパク質またはＮＭＤＡ受容体のＮＲ１サブユニットのアミノ末端ドメインに特異的に結合する抗体（抗ＡＴＤ−ＮＲ１抗体）は、２つのｔ−ＰＡ関連標的部位、すなわち血液脳関門およびＮＭＤＡ受容体で活性であり、その結果、血管保護および神経保護活性を示すことを見出した。
【００１１】
したがって、抗ＡＴＤ−ＮＲ１抗体（またはその抗原結合断片）およびクリングルドメイン含有タンパク質もしくはペプチド（以下、「クリングルタンパク質」および／または「クリングルペプチド」）はともに「ｔ−ＰＡインヒビター」と呼ばれる。
【００１２】
下に示されることになるように、動物モデルからの結果により、本発明のｔ−ＰＡインヒビターは、ｔ−ＰＡと一緒に与えられる場合だけではなく、単独で投与される場合も効果的である。さらに、ｔ−ＰＡインヒビターは、血餅形成後に与えられた場合血栓性障害において有益効果を示し、それゆえに、血栓症の急性期処置または後急性期処置が可能になる。
【００１３】
したがって、本発明は、神経障害または神経変性障害、特に脳卒中の処置のための医薬品の製造のためのタンパク質またはペプチドの使用であって、前記タンパク質またはペプチドが、
（ａ）
（ｉ）配列番号１、配列番号２もしくは配列番号３に記載のアミノ酸配列、または
（ｉｉ）配列番号３に記載のアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性、好ましくは８０％、さらに好ましくは９０％、もっとも好ましくは９５％の同一性を有するアミノ酸配列、または
（ｉｉｉ）配列「ＣＹ−Ｘ３−Ｇ−Ｘ２−ＹＲＧＴＸＳ−Ｘ２−ＥＳ−Ｘ３−Ｃ−Ｘ２−ＷＮＳ−Ｘ２−Ｌ−Ｘ４−Ｙ−Ｘ４−ＰＸＡ−Ｘ２−ＬＧＬＧＸＨＮＹＣＲＮＰ−Ｘ４−ＫＰＷＣＸＶＸＫ−Ｘ６−ＥＸＣ−Ｘ２−ＰＸＣ」（Ｘは任意のアミノ酸を示す）により定義されるプラスミノーゲン活性化因子関連クリングル（ＰＡＲＫ）モチーフと少なくとも９０％の同一性、好ましくは少なくとも９５％もしくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列、または
（ｉｖ）配列「ＣＹ−Ｘ３−Ｇ−Ｘ２−ＹＲＧＴＸＳ−Ｘ２−ＥＳＲ−Ｘ２−Ｃ−Ｘ２−ＷＮＳ−Ｘ２−ＬＸＲ−Ｘ２−Ｙ−Ｘ３−ＭＰＸＡＦＮ−ＬＧＬＧＸＨＮＹＣＲＮＰＮＸＡＸＫＰＷＣＸＶＸＫ−Ｘ３−Ｆ−Ｘ２−ＥＳＣ−Ｘ２−ＰＸＣ」（Ｘは任意のアミノ酸を示す）により定義されるＤＡＲＫモチーフと少なくとも９２％の同一性、好ましくは少なくとも９５％もしくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列
を含むかまたはそれからなる、セリンプロテアーゼ活性を示さないクリングルタンパク質またはペプチド、あるいは
（ｂ）ＮＭＤＡ受容体サブユニットＮＲ１のＮ末端ドメインに結合する単離された抗体またはその断片（抗ＡＴＤ−ＮＲ１抗体）であって、前記抗体または前記その断片の結合が前記ＮＲ１サブユニットの細胞外ドメインまたは断片の切断を妨げ、前記ＮＲ１は好ましくは
（ｉ）配列番号４もしくは５のアミノ酸配列を有する、
（ｉｉ）配列番号６もしくは７のヌクレオチド配列によりコードされる、
（ｉｉｉ）ハイブリダイゼーションが５×ＳＳＰＥ、５×デンハート液および０．５％ＳＤＳ中５５〜６０℃で終夜実施される高いストリンジェンシーの条件下で配列番号６もしくは７の核酸分子の相補体に特異的にハイブリダイズする核酸分子である、
単離された抗体またはその断片
からなる群より選択される、使用に関する。
【００１４】
本発明者らは、プラスミノーゲン活性化因子関連クリングル（ＰＡＲＫ）ドメインのみからなるタンパク質はｔ−ＰＡ輸送インヒビターでもあるという最終証拠により、クリングルドメインを、ＢＢＢを通るｔ−ＰＡ輸送の阻害のための関連ドメインとして同定することができた。それゆえに、このドメインを含むかまたはこれからなるタンパク質またはペプチドは血管保護薬（ｖａｓｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）および／または神経保護薬（ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）として使用することが可能である。これは、デスモテプラーゼ（ｄｅｓｍｏｔｅｐｌａｓｅ；Ｄｅｓｍｏｄｕｓ  ｒｏｔｕｎｄｕｓプラスミノーゲン活性化因子）ＤＳＰＡのクリングルドメインに限定されず、他のプラスミノーゲン活性化因子のクリングルドメインにも適用される。なぜならば、異なるプラスミノーゲン活性化因子のクリングルドメインがｒｔ−ＰＡのトランスＢＢＢ輸送を阻害することができることが見出されたからである。
【００１５】
それゆえに、本発明は、神経障害の処置のためのプラスミノーゲン活性化関連クリングル（ＰＡＲＫ）ドメインまたはデスモテプラーゼ活性化因子関連クリングル（ＤＡＲＫ）ドメインを有するタンパク質の使用に関する。特に、これらのタンパク質は血管保護薬および／または神経保護薬として用いることが可能である。
【００１６】
前記クリングルタンパク質の保護活性は、そのプロテアーゼ活性に起因するものではない。それゆえに、本発明のタンパク質は、プラスミノーゲン活性化因子により一般的に共有されるセリンプロテアーゼ活性を示さない。
【００１７】
このことは、ＢＢＢ進入のインビトロモデルにおいて本発明者らにより明らかにすることができた。本明細書では、ｒｔ−ＰＡの輸送は、プラスミノーゲン活性化因子デスモテプラーゼによってだけではなく、不活化されたいわゆる「クロッグ（ｃｌｏｇｇｅｄ）」ＤＳＰＡ（ｃＤＳＰＡ）によってもブロックすることが可能であることが実証された。不活化ＤＳＰＡは、ｔ−ＰＡのプラスミノーゲン活性化能力を増大することもないし、ｔ−ＰＡのプラスミノーゲン活性化、したがって血餅溶解効力を妨害することもないために、これにより新しい治療アプローチへの道が開かれた。むしろ、不活化ＤＳＰＡは、ｔ−ＰＡ関連血栓溶解物の有害な副作用のみを阻害する。さらに、不活化ＤＳＰＡは、ＮＭＤＡ受容体のＮＲ１サブユニットを切断することができず、それゆえ、自身により神経毒性の危険をもたらすことはない。
【００１８】
さらに、本発明者らは、ｒｔ−ＰＡとクロッグＤＳＰＡ（または単離され精製されたクリングルドメイン）の共インキュベーションは、血液脳関門に毒性作用を及ぼさないことを明らかにすることができた。
【００１９】
クリングルは、３つのジスルフィド結合により形成されるトリプルループポリペプチド構造体である。クリングルは、約７９から８２アミノ酸基まで長さが変動する。高度な配列相同性は、ヒトウロキナーゼの単一クリングル（Ｇｕｅｎｚｌｅｒら、Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ’ｓ  Ｚ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ３６３巻、１１５５頁、１９８２年）、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子の２つのクリングル（Ｐｅｎｎｉｃａら、Ｎａｔｕｒｅ、３０１巻、２１４頁、１９８３年）、ヒトプロトロンビンの２つのクリングル（Ｗａｌｚら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、７４巻、１９６９頁、１９７７年）およびヒトプラスミノーゲンの５つのクリングル（Ｓｏｔｔｒｕｐ−Ｊｅｎｓｅｎら、ｉｎ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｈｒｏｍｂｏｌｙｓｉｓ  （Ｄａｖｉｄｓｏｎら編）、３巻、１９１頁、１９７８年）間で共有されている。クリングル内ジスルフィド架橋に関与している６つのシステインの相対位置はすべてのクリングルで保存されている。
【００２０】
本出願において使用される用語「プラスミノーゲン活性化因子関連クリングルドメイン」（ＰＡＲＫドメイン）とは、配列「ＣＹ−Ｘ３−Ｇ−Ｘ２−ＹＲＧＴＸＳ−Ｘ２−ＥＳ−Ｘ３−Ｃ−Ｘ２−ＷＮＳ−Ｘ２−Ｌ−Ｘ４−Ｙ−Ｘ４−ＰＸＡ−Ｘ２−ＬＧＬＧＸＨＮＹＣＲＮＰ−Ｘ４−ＫＰＷＣＸＶＸＫ−Ｘ６−ＥＸＣ−Ｘ２−ＰＸＣ」（Ｘは任意のアミノ酸を示す）（図１Ｂ）により定義されるプラスミノーゲン活性化因子関連クリングル（ＰＡＲＫ）モチーフと少なくとも９０％の同一性、好ましくは少なくとも９５％もしくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質またはペプチドのことである。
【００２１】
この用語は特に、配列番号１、配列番号２および配列番号３のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるタンパク質を包含する。１つまたは複数のアミノ酸が付加されていたり、欠失していたり、または置換されていたりする場合がある、これらのタンパク質のクリングル領域における多形性形態は天然に存在しうることも理解されている。タンパク質における類似の変化はまた、遺伝子の点変異という現代技術の出現により、または任意の望ましい配列を有する遺伝子の化学的合成により、インビトロでもたらされうる。したがって、これらの改変構造（複数可）も、本出願において使用される用語、クリングル（複数可）に含まれる。
【００２２】
配列番号１および配列番号２の配列は、組換えｔ−ＰＡ（アルテプラーゼ）のクリングル１および２ドメインのアミノ酸配列を示している。配列番号３は、デスモテプラーゼ（ＤＳＰＡアルファ１）のクリングルドメインのアミノ酸配列を示している。
【００２３】
【化１】
2014231523.tif 000002
前記ペプチドまたはタンパク質に好ましい他のクリングルドメインには、ウロキナーゼおよびプロトロンビン由来のクリングルドメインが挙げられる。
【００２４】
本明細書で使用されるように、「ＤＡＲＫドメイン」は、図１Ｂに与えられるＤＳＰＡアルファ１のクリングル配列から生じる以下のアミノ酸配列モチーフ：
ＣＹ−Ｘ３−Ｇ−Ｘ２−ＹＲＧＴＸＳ−Ｘ２−ＥＳＲ−Ｘ２−Ｃ−Ｘ２−ＷＮＳ−Ｘ２−ＬＸＲ−Ｘ２−Ｙ−Ｘ３−ＭＰＸＡＦＮ−ＬＧＬＧＸＨＮＹＣＲＮＰＮＸＡＸＫＰＷＣＸＶＸＫ−Ｘ３−Ｆ−Ｘ２−ＥＳＣ−Ｘ２−ＰＸＣ（Ｘは任意のアミノ酸を示す）と少なくとも９０％の同一性、好ましくは少なくとも９５％または１００％の同一性のアミノ酸配列を有するペプチドとして定義される。
【００２５】
本発明の追加の態様では、クリングルタンパク質は、それぞれ図１Ｂまたは図１ＡのＤＡＲＫまたはＰＡＲＫドメインのいずれかのアミノ酸配列からなる。
【００２６】
【化２】
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本発明のクリングルタンパク質は、好ましくは、２００アミノ酸（ａａ）を超えない、好ましくは１５０ａａを超えない、もっとも好ましくは１００ａａを超えない長さを有し、上記のＰＡＲＫまたはＤＡＲＫモチーフを含む。これは８２ａａの長さを有する。
【００２７】
クリングルタンパク質は、さらに、本明細書で使用される８２ａａクリングルドメインの番号付けに従って、好ましくはアミノ酸Ｙ３６、Ｗ６２およびＨ６４の存在により定義されるリジン結合部位を含むことができる。
【００２８】
本発明のクリングルタンパク質は、好ましくは、少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、もっとも好ましくは少なくとも４０％または５０％（これは、本発明の実施例Ａ、第２章に記載される方法により評価できる）、哺乳動物における血液脳関門（ＢＢＢ）を通るｔ−ＰＡ輸送を阻害する。
【００２９】
前記ｔ−ＰＡインヒビターは、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体関連タンパク質（ＬＲＰ）に特異的に結合することができる。ＬＲＰは、ｔ−ＰＡ、βアミロイド前駆体タンパク質、アルファ２マクログロブリン、アポリポタンパク質Ｅエンリッチベータ超低密度（Ｅ−ｅｎｒｉｃｈｅｄ  ｂｅｔａ−ｖｅｒｙ−ｌｏｗ−ｄｅｎｓｉｔｙ）リポタンパク質および緑膿菌外毒素Ａを含む様々なリガンドに結合する多機能エンドサイトーシス受容体であり、これらの一部はアルツハイマー病などの神経疾患に関係している。ＬＲＰ結合により、前記タンパク質またはペプチドは、ｔ−ＰＡまたは他のリガンドの前記ＬＲＰへの結合をブロックし、それによってＢＢＢを越えるＬＲＰ媒介輸送を阻害することができる。
【００３０】
さらに、本発明のｔ−ＰＡインヒビターはＮＭＤＡ受容体のＮＲ１サブユニットに結合することができる。このＮＲ１結合により、前記ｔ−ＰＡインヒビターは他の基質またはリガンドの前記ＮＲ１サブユニットへの結合をブロックし、それによってそのタンパク質分解性切断を阻害することができる。
【００３１】
追加の態様では、本発明は、神経障害、特に脳卒中の処置のための、ＮＭＤＡ受容体サブユニットＮＲ１のＮ末端ドメインまたはその断片に、特に配列番号４または５を含むかまたはそれからなる抗原に、特異的に結合する単離された抗体（抗ＡＴＤ−ＮＲ１抗体）またはその抗原結合部分の使用に関する。
【００３２】
追加の実施形態では、本発明の抗体またはその断片は、高ストリンジェンシーの条件下で配列番号６または７の核酸分子の相補体に特異的にハイブリダイズする。この高ストリンジェンシー条件は、たとえば、５×ＳＳＰＥ、５×デンハート液および０．５％ＳＤＳにおいて５５〜６０℃で終夜実施されるハイブリダイゼーションにより提供することができる。
【００３３】
本発明者らは、ｔ−ＰＡとＮＭＤＡ受容体のＮＲ１サブユニットのアミノ末端ドメインの相互作用を標的にする抗体ベースの処置は、脳損傷を制限しＢＢＢの破壊を阻害することにより、脳卒中後の神経学的結果を強く恒久的に改善することができることを今や見出した。
【００３４】
抗ＡＴＤ  ＮＲ１抗体効果のこの有益な効力は、ヒトにおけるｔ−ＰＡ処置についての観察された時間ウィンドウを再現する能力を有する脳卒中の臨床的に関連するモデルにおいて示された（Ｏｒｓｅｔら、２００７年）。このモデルでは、精製されたマウストロンビンのインサイチューマイクロインジェクションが中大脳動脈において局所的血餅を引き起こし、再現性のある血餅形成、皮質脳損傷および手術関連死亡の欠如（ｌａｃｋ  ｏｆ
ｓｕｒｇｅｒｙ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｌｅｔｈａｌｉｔｙ）をもたらす。この血栓症モデルでは、ｔ−ＰＡの効力およびｔ−ＰＡ処置についての時間ウィンドウは、ヒト臨床状況に類似している。要約して言えば、この動物モデルは脳卒中治療の前臨床評価によく適している。
【００３５】
抗ＡＴＤ  ＮＲ１抗体は、ＮＭＤＡサブユニットのうちの１つの小部分だけに対するものである。このために、ＮＭＤＡ受容体の生理的機能を妨害せず、ＮＭＤＡ活性のｔ−ＰＡ誘導増強を阻害するだけである、ＮＭＤＡ受容体での特異的介入が可能になる。
【００３６】
前記抗体がｔ−ＰＡに対するものではないという事実から、治療的に投与されるｔ−ＰＡまたは他のプラスミノーゲン活性化因子は、血栓障害において有益な活性には必須であるその正常な血栓溶解機能を保持することになる。
【００３７】
抗ＡＴＤ  ＮＲ１抗体は、血栓障害のリスクを抱えているかまたは血栓障害に罹っている患者の受動免疫のために使用することが可能である。適切な抗原を用いる前処置により実現される能動免疫とは対照的に、ＮＭＤＡ受容体でのブロッキング効果は直ちに実現される。血栓障害ではタイミングの良い処置が、好結果への保証となるので、このことは極めて重要である。
【００３８】
ｔ−ＰＡおよびグルタミン酸、すなわちＮＭＤＡ受容体での内在性アゴニストは、記憶と学習過程の根底にあるシナプスの再構築および可塑性において決定的に重要な機能を発揮するので、対応する副作用のリスクは明白である。本明細書で使用される受動免疫では、空間記憶、文脈的および恐怖条件付けを含む認知機能の明白な変化はなかった。このことは、脳保護のこの戦略の優れた安全プロファイルを支持している。
【００３９】
ｔ−ＰＡの投与の有害な影響に対する前記抗体の治療効力は、その設計の論理的帰結であると考えられるが、さらに、前記抗体がｔ−ＰＡの共投与がなくても効果的であることが見出されたことは最も驚きであった。血栓塞栓性脳卒中のマウスモデルにおいて、抗体を用いて処置されたマウスは脳損傷の強い減少を見せた（図１２参照；対照と比べて４３．３％の保護）。このような保護効果は、このモデルにおける早期ｒｔ−ＰＡ処置の保護効果に匹敵することは注目すべきである。
【００４０】
これらの所見の結果として、抗ＡＴＤ  ＮＲ１抗体は内因的に発現されるｔ−ＰＡを阻害することもできる。
【００４１】
それゆえに、本発明に従って、抗ＡＴＤ  ＮＲ１抗体は、血栓障害、特に脳卒中の処置のための単独療法（ｍｏｎｏｔｈｅｒａｐｙ）（すなわち、ｔ−ＰＡ共処置または他の任意の薬物物質の共投与なし）として使用することが可能である。
【００４２】
脳卒中モデルにおける血液脳関門漏洩の分析により、抗ＡＴＤ  ＮＲ１抗体単独の早期投与と後期投与の両方が脳卒中により誘導されるＢＢＢ漏洩の程度を著しく減少することが明らかにされた。さらに、抗ＡＴＤ  ＮＲ１処置は、この脳卒中モデルにおいてＢＢＢの完全性に対するｒｔ−ＰＡの損傷効果を効率的に減少した。さらに、クリングルドメイン含有タンパク質は、ＢＢＢのｔ−ＰＡ誘導損傷を防ぐ。
【００４３】
それゆえに、本発明の好ましい実施形態では、ｔ−ＰＡインヒビターを、血液脳関門の増強された透過性と関連する神経障害または神経変性障害の処置のために使用することが可能である。これらの障害は、脳卒中またはＴＩＡなどの虚血性または血栓障害、側頭葉てんかん（ＴＬＥ）などのてんかん、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、脳腫瘍、パーキンソン病、アルツハイマー病、脳浮腫または髄膜炎もしくは脳炎などの寄生虫、細菌、真菌もしくはウイルス感染から生じるＣＮＳ合併症を含む。
【００４４】
抗体は一般的には、無傷の血液脳関門により脳から効果的に排除され、ＢＢＢ損傷の場合にのみ脳組織に接近することができると考えられている。驚くべき所見として、脳実質における蛍光抗ＡＴＤ  ＮＲ１抗体の免疫染色および定量化により（図２２参照）、前記抗体は非手術動物および偽動物において脳に到達することができ、抗体は損傷した半球が明らかに増加している虚血性動物においてはさらに速い速度で脳に到達することが明らかにされた。したがって、現在の考えに反して、本発明は、抗体をＢＢＢ損傷がない場合に使用することが可能であることを証明している。外因性ｔ−ＰＡがＢＢＢを高速で通過することができる場合、そのような損傷の存在下では、さらに、前記抗体は、脳組織により大量に到達してＮＭＤＡ受容体で前記ｔ−ＰＡをアンタゴナイズすることになる。
【００４５】
それゆえに本発明に従えば、抗ＡＴＤ  ＮＲ１抗体を、ＢＢＢの増強された透過性がない障害のために、またはＢＢＢの病態生理学的な透過性増強前でも、治療的有効量の前記抗体が脳実質に存在し、初期に神経細胞を保護する予防的処置としても使用することが可能である。
【００４６】
本発明の状況では、前記抗体は、好ましくは配列番号６もしくは７のヌクレオチド配列によりコードされているアミノ酸１９〜４８０をコードするか、または配列番号４もしくは５に開示されるアミノ酸１９〜３７１をコードするＮＲ１−１ａサブユニットのＮ末端領域、あるいは８個〜３０個、好ましくは１０個〜２０個の連続するアミノ酸を含むその断片に対するものであり、前記断片に対する抗体はｔ−ＰＡによるＮＲ１サブユニットの切断を防ぐ。
【００４７】
【化３】
2014231523.tif 000004
【００４８】
【化４】
2014231523.tif 000005
本発明に従えば、前記抗体は、プロテアーゼによる、好ましくはｔ−ＰＡによる、もっとも好ましくはアミノ酸残基Ａｒｇ２６０でのＮＲ１サブユニットの細胞外ドメインの切断を防ぐ。
【００４９】
本発明の一実施形態では、抗ＡＴＤ  ＮＲ１抗体は、モノクローナル抗体、好ましくはヒト化抗体、単一ドメイン抗体またはＶＨＨ抗体（いわゆるナノボディ）、キメラ抗体または脱免疫化（ｄｅｉｍｍｕｎｉｚｅｄ）抗体である。
【００５０】
本発明の追加の実施形態に従えば、前記抗体の抗原結合部分、好ましくはｓｃＦｖ分子またはＦａｂ断片を使用することが可能である。前記抗原結合部分はヒト化することが可能であるか、またはヒト配列を所有する。
【００５１】
血栓塞栓性脳卒中のマウスモデルにおける追加の実験により、抗ＡＴＤ  ＮＲ１抗体の治療的関連性の１つの驚くべき面が明らかにされた。後期ｔ−ＰＡ血栓溶解は、早期再灌流に匹敵するほどに脳血流量を回復するにもかかわらず、減少ではなく増加した脳損傷と関連していた。しかし、抗ＡＴＤ  ＮＲ１抗体を用いて追加で処置されたマウスでは、脳保護は、早期血栓溶解動物において観察されるのと類似する程度に回復された。
【００５２】
これらの所見に基づいて、本発明は、患者が治療的有効量の血栓溶解薬と有効量のｔ−ＰＡインヒビター、特に抗ＡＴＤ  ＮＲ１抗体を用いて処置される、神経障害および神経変性障害、特に脳卒中の処置のための方法に関する。本発明は、さらに、血栓溶解薬とｔ−ＰＡインヒビター、特にＮＭＤＡ受容体サブユニットＮＲ１のＮ末端ドメインに対する抗体を含む複合物に関する。
【００５３】
したがって、抗ＡＴＤ  ＮＲ１抗体は、血栓溶解療法の補助剤として、特に後期ｔ−ＰＡ誘導血栓溶解のために使用することができる。
【００５４】
本発明者らは、抗ＡＴＤ  ＮＲ１抗体の単回静脈内注射が血餅形成後でも高度に保護的であることも実証することができた。血栓塞栓性脳卒中モデルにおける抗ＡＴＤ  ＮＲ１抗体の早期送達（血餅形成の２０分後）は、このモデルにおける早期ｒｔ−ＰＡ処置の保護効果に匹敵する著しい脳保護（対照と比べて４４％の保護、図１６Ａ参照）を与えた。極めて驚くべきことに、抗ＡＴＤ  ＮＲ１抗体の遅延注射（血餅形成の４時間後）は、共投与されたｔ−ＰＡの有害な影響を阻害することができるだけではなく、単独で与えられた場合でも高度に保護的であった。ＭＲＩ分析により決定される抗ＡＴＤ  ＮＲ１抗体の単回後期注射のこのような保護効果は、虚血の２４時間後にはすでに目に見えるほどであり、手術の１５日後まで維持され（図１８Ａ対１８Ｂ）、それによって脳卒中後に長期の利益を与えた。
【００５５】
したがって、本発明の追加の態様では、抗ＡＴＤ  ＮＲ１抗体は、神経障害または神経変性障害、特に脳卒中の急性期処置または後急性期処置のために使用することが可能である。この急性期処置または後急性期処置は、単独療法としてあるいは追加の薬物、好ましくは抗凝固剤、抗血小板剤、もしくは血栓溶解薬と、さらに好ましくはｔ−ＰＡもしくはその改変体またはＤＳＰＡアルファ１と組み合わせて実施することが可能である。
【００５６】
内因性ｔ−ＰＡの有害な影響は外因的に適用された血栓溶解薬の有益な効果も相殺するために、前記ｔ−ＰＡインヒビターの組合せ使用は、たとえば、ＤＳＰＡアルファ１などの神経毒性のおよび／または血管毒性の副作用と関連のない血栓薬についての血栓溶解療法の結果さえ改善するはずである。
【００５７】
それゆえに、ｔ−ＰＡインヒビターは、ＢＢＢともＮＭＤＡ受容体とも不利に相互作用しないか、または脈管構造にも神経細胞にも有害な影響を与えない血栓溶解薬と組み合わせて与えることが可能である。そのような組合せでは、ＤＳＰＡアルファ１が好ましい。
【００５８】
本発明の追加の実施形態に従えば、前記血栓溶解薬と前記ｔ−ＰＡインヒビターは等モル濃度で与えられる。
【００５９】
本発明に従った複合物は、治療的有効量の少なくとも両成分（前記血栓溶解薬と前記ｔ−ＰＡインヒビター）を含む単一調製物を含むことが可能であるか、または、それぞれが少なくとも治療的有効量の成分、すなわち前記血栓溶解薬もしくは前記ｔ−ＰＡインヒビターのうちの１つを含有する２つの別々の調製物を表す。２つの別々の調製物が使用される場合、患者には、同時にまたは続けてのいずれかで投与することが可能である。したがって、両成分はコンビナトリアル調製物として、または、別々の調製物として共に投与することが可能である。適用可能であり適切な場合には、前記調製物は、単回ボーラスとして、または注入として、またはその組合せとして投与することが可能である。複数の連続注入を用いることも可能である。
【００６０】
前記ｔ−ＰＡインヒビターおよび前記血栓溶解薬、特にプラスミノーゲン活性化因子は、好ましくは非経口適用として、たとえば、静脈内または皮下適用により非経口的に与えられる。静脈内または皮下ボーラス適用が可能である。このように、本発明に従えば、非経口投与に適している薬学的組成物が提供される。
【００６１】
本発明の追加の実施形態では、ＮＲ１サブユニットのＡＴＤに特異的に結合するナノボディでは経口投与を実施することが可能である。
【００６２】
本発明に従えば、前記ｔ−ＰＡインヒビターと組み合わせて、血栓溶解薬、特にｔ−ＰＡもしくはその改変体またはＤＳＰＡアルファ１を使用する療法は、
（ａ）前記血栓溶解薬、特にプラスミノーゲン活性化因子を、脳卒中の発症から３時間超、好ましくは４．５時間超、好ましくは６時間超およびさらに９時間または１２時間超後に患者に投与することが可能であるという特徴；
（ｂ）処置のための血栓溶解薬、特にｔ−ＰＡの用量は、前記血栓溶解薬を用いた単独療法に推奨される用量と比較して、増加することが可能であるという特徴；
（ｃ）血栓溶解処置を、現在血栓溶解療法が望ましくない患者、すなわち可能な処置が提供される３時間前よりも早く、さらに好ましくは４．５時間前よりも早く脳卒中に罹った患者、または出血のリスクが増大している患者において適用することが可能であるという特徴；
のうちの１つまたは複数を含む。
【００６３】
したがって、本発明は、脳卒中の発症から３時間を越えた、好ましくは４．５時間を越えた治療時間ウィンドウ、さらにより好ましくは９時間またはさらに１２時間を越えての血栓溶解脳卒中療法を可能にする。
【００６４】
こうして、本発明の一態様では、前記ｔ−ＰＡインヒビターを使用して、血栓溶解処置の結果として起こる１つまたは複数の有害な副作用を減少、予防または遅延する。これらの副作用には、頭蓋内出血または脳内出血などの出血が挙げられる。
【００６５】
本発明の追加の態様では、前記ｔ−ＰＡインヒビターの適用により、通常それぞれの指示で与えられるレベルを超えて、好ましくは血栓溶解薬の製造業者により推奨される用量を超えて血栓溶解薬の用量を増加することが可能になる。
【００６６】
本発明は、様々な血栓溶解薬の使用を可能にする。好ましくは、血栓溶解薬はプラスミノーゲン活性化因子、さらに好ましくは組換えｔ−ＰＡ（ｒｔ−ＰＡ、たとえば、アルテプラーゼ）または、パミテプラーゼ、ラノテプラーゼ、レテプラーゼ、テネクテプラーゼもしくはモンテプラーゼなどのｔ−ＰＡの改変体、ウロキナーゼ、またはＤＳＰＡアルファ１、ＤＳＰＡアルファ２、ＤＳＰＡベータもしくはＤＳＰＡガンマなどのＤＳＰＡ改変体である。
【００６７】
上記概略のように、本発明のクリングルタンパク質は、不活化プラスミノーゲン活性化因子、好ましくは、ＤＳＰＡアルファ２、ＤＳＰＡベータもしくはＤＳＰＡガンマ、ウロキナーゼ、アルテプラーゼまたはレテプラーゼ、パミテプラーゼ、ラノテプラーゼ、レテプラーゼ、テネクテプラーゼもしくはモンテプラーゼなどのｔ−ＰＡの改変体からなる群より選択される不活化プラスミノーゲン活性化因子により構成されることが可能である。
【００６８】
ＤＳＰＡ（Ｄｅｓｍｏｄｕｓ  ｒｏｔｕｎｄｕｓプラスミノーゲン活性化因子）の改変体は、米国特許第５，８３０，８４９号および米国特許第６，００８，０１９号の主題であり、これら特許文献は参照により本明細書に完全に組み込まれている。
【００６９】
特に、不活化ＤＳＰＡアルファ１を使用することが可能であり、好ましくは上記不活化ＤＳＰＡアルファ１が自殺基質に、さらに好ましくはＤ−フェニル−プロリル−アルギニンクロロメチルケトン（ＰＰＡＣＫ）に連結されている。
【００７０】
本発明のこの態様に従えば、前記クリングルタンパク質またはペプチドには、プラスミノーゲン活性化因子または関連するタンパク質に見出される、たとえばフィンガードメイン（Ｆ）、上皮増殖因子ドメイン（ＥＧＦ）もしくはリジン結合部位などの１つもしくは複数のドメイン、領域もしくは触媒部位が含まれる。これらの配列（複数可）の供給源としては、組換えｔ−ＰＡ（ｒｔ−ＰＡ、たとえばアルテプラーゼ）またはパミテプラーゼ、ラノテプラーゼ、レテプラーゼ、テネクテプラーゼもしくはモンテプラーゼなどのｔ−ＰＡの改変体、ウロキナーゼ、またはＤＳＰＡアルファ１、ＤＳＰＡアルファ２、ＤＳＰＡベータもしくはＤＳＰＡガンマなどのＤＳＰＡ改変体が好ましい。追加の実施形態では、異なるプラスミノーゲン活性化因子タンパク質由来のドメイン、領域または触媒部位が互いに組み合わされる。
【００７１】
本発明の一つの好ましい態様では、前記クリングルタンパク質またはペプチドは、クリングルドメインまたはその断片のみからなり、前記断片はクリングルドメインの少なくとも８個、好ましくは少なくとも１５〜３０個の連続アミノ酸を含み、前記ペプチドは、ＢＢＢを通過するｔ−ＰＡ輸送を下の第２章の実施例Ａに従って評価できるように、少なくとも２０％阻害する。
【００７２】
本発明の特定の態様では、前記クリングルペプチドは、ＤＳＰＡアルファ２、ＤＳＰＡベータまたはＤＳＰＡガンマ、ウロキナーゼ、アルテプラーゼ、またはレテプラーゼ、パミテプラーゼ、ラノテプラーゼ、レテプラーゼ、テネクテプラーゼもしくはモンテプラーゼなどのｔ−ＰＡの改変体由来のクリングルドメインおよび好ましくはＤＳＰＡアルファ１由来のクリングルドメインからなる。
【００７３】
したがって、本発明はさらに、
（ａ）配列番号３に記載のアミノ酸配列（ＤＳＰＡクリングル）、または
（ｂ）配列番号３に記載のアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性、好ましくは８０％、さらに好ましくは９０％、もっとも好ましくは９５％の同一性を有するアミノ酸配列、または
（ｃ）配列「ＣＹ−Ｘ３−Ｇ−Ｘ２−ＹＲＧＴＸＳ−Ｘ２−ＥＳＲ−Ｘ２−Ｃ−Ｘ２−ＷＮＳ−Ｘ２−ＬＸＲ−Ｘ２−Ｙ−Ｘ３−ＭＰＸＡＦＮ−ＬＧＬＧＸＨＮＹＣＲＮＰＮＸＡＸＫＰＷＣＸＶＸＫ−Ｘ３−Ｆ−Ｘ２−ＥＳＣ−Ｘ２−ＰＸＣ」（Ｘは任意のアミノ酸を示す）により定義されるＤＡＲＫモチーフと少なくとも９２％の同一性、好ましくは少なくとも９５％もしくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列
を含み、
セリンプロテアーゼ活性を示さず、ただし、ｔ−ＰＡもしくはウロキナーゼのクリングルドメインではなく、自殺基質に共有結合したＤＳＰＡアルファ１タンパク質でもｔ−ＰＡでもない、タンパク質またはペプチドに関する。
【００７４】
本発明の別の態様では、単離された抗体またはその断片が、配列番号４もしくは５から選択されるアミノ酸配列により、または配列番号６もしくは７から選択される核酸配列によりコードされるＮＭＤＡ受容体サブユニットＮＲ１のＮ末端ドメインに結合するか（抗ＡＴＤ−ＮＲ１抗体）、あるいは代わりに高度にストリンジェンシーな条件下で配列番号６もしくは７の核酸分子の相補体に特異的にハイブリダイズする核酸分子によりコードされるタンパク質に結合する、単離された抗体またはその断片が提供される。高度なストリンジェンシーは、たとえば、５×ＳＳＰＥ、５×デンハート液および０．５％ＳＤＳにおいて５５〜６０℃で終夜実施されるハイブリダイゼーションにより実現することが可能である。
【００７５】
本発明に従えば、前記ｔ−ＰＡインヒビターは神経保護薬として使用することが可能である。
【００７６】
本発明の追加の態様は、血栓溶解薬を伴なうか、またはそれを伴なわない、前記ｔ−ＰＡインヒビターのうちの１つまたは複数からなる群より選択される薬学的組成物であって、１つまたは複数の薬学的に許容されるキャリアもしくは賦形剤をさらに含みうる薬学的組成物を提供する。
【００７７】
本発明の追加の態様では、神経障害または神経変性障害、特に脳卒中を処置する方法であって、治療的有効量の前記ｔ−ＰＡインヒビターを単独で、または治療的有効量の血栓薬、好ましくはプラスミノーゲン活性化因子、さらに好ましくはｔ−ＰＡと組み合わせて投与することを含む、方法が提供される。
本発明の好ましい実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
神経障害または神経変性障害、特に脳卒中の処置のための医薬品の製造のためのタンパク質またはペプチドの使用であって、該タンパク質またはペプチドは、
（ａ）
（ｉ）配列番号１、配列番号２もしくは配列番号３に記載のアミノ酸配列、または
（ｉｉ）配列番号３に記載のアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性、好ましくは８０％、さらに好ましくは９０％、もっとも好ましくは９５％の同一性を有するアミノ酸配列、または
（ｉｉｉ）配列「ＣＹ−Ｘ３−Ｇ−Ｘ２−ＹＲＧＴＸＳ−Ｘ２−ＥＳ−Ｘ３−Ｃ−Ｘ２−ＷＮＳ−Ｘ２−Ｌ−Ｘ４−Ｙ−Ｘ４−ＰＸＡ−Ｘ２−ＬＧＬＧＸＨＮＹＣＲＮＰ−Ｘ４−ＫＰＷＣＸＶＸＫ−Ｘ６−ＥＸＣ−Ｘ２−ＰＸＣ」（Ｘは任意のアミノ酸を示す）により定義されるプラスミノーゲン活性化因子関連クリングル（ＰＡＲＫ）モチーフと少なくとも９０％の同一性、好ましくは少なくとも９５％もしくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列、または
（ｉｖ）配列「ＣＹ−Ｘ３−Ｇ−Ｘ２−ＹＲＧＴＸＳ−Ｘ２−ＥＳＲ−Ｘ２−Ｃ−Ｘ２−ＷＮＳ−Ｘ２−ＬＸＲ−Ｘ２−Ｙ−Ｘ３−ＭＰＸＡＦＮ−ＬＧＬＧＸＨＮＹＣＲＮＰＮＸＡＸＫＰＷＣＸＶＸＫ−Ｘ３−Ｆ−Ｘ２−ＥＳＣ−Ｘ２−ＰＸＣ」（Ｘは任意のアミノ酸を示す）により定義されるＤＡＲＫモチーフと少なくとも９２％の同一性、好ましくは少なくとも９５％もしくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列
を含むかまたはそれからなる、セリンプロテアーゼ活性を示さないクリングルタンパク質またはペプチド、あるいは
（ｂ）ＮＭＤＡ受容体サブユニットＮＲ１のＮ末端ドメインに結合する単離された抗体またはその断片（抗ＡＴＤ−ＮＲ１抗体）であって、該抗体または該その断片の結合は、該ＮＲ１サブユニットの細胞外ドメインまたは断片の切断を妨げ、該ＮＲ１は好ましくは、
（ｉ）配列番号４もしくは５のアミノ酸配列を有する、
（ｉｉ）配列番号６もしくは７のヌクレオチド配列によりコードされる、
（ｉｉｉ）ハイブリダイゼーションが５×ＳＳＰＥ、５×デンハート液および０．５％ＳＤＳ中５５〜６０℃で終夜実施される高いストリンジェンシーの条件下で配列番号６もしくは７の核酸分子の相補体に特異的にハイブリダイズする核酸分子である、
単離された抗体またはその断片
からなる群より選択される、使用。
（項目２）
血栓溶解薬、好ましくはプラスミノーゲン活性化因子を含む医薬品と組み合わせた、項目１に記載の使用。
（項目３）
血栓溶解薬を使用する療法が、
（ａ）該血栓溶解薬、特にプラスミノーゲン活性化因子を、脳卒中の発症から３時間超、好ましくは４．５時間超、好ましくは６時間超およびさらに９時間または１２時間超後に患者に投与できるという特徴、
（ｂ）該処置のための該血栓溶解薬、特にｔ−ＰＡの用量を、該血栓溶解薬を用いた単独療法のために推奨される用量と比較して増加できるという特徴、
（ｃ）該血栓溶解処置を、現在血栓溶解療法に適格ではない患者、すなわち、可能な処置が提供される３時間よりも前に、さらに好ましくは４．５時間よりも前に脳卒中に罹った患者、または出血のリスクが増大している患者において適用できるという特徴
のうちの１つまたは複数を含む、項目２に記載の使用。
（項目４）
前記血栓溶解薬が、プラスミノーゲン活性化因子、さらに好ましくは組換えｔ−ＰＡ（ｒｔ−ＰＡ、たとえば、アルテプラーゼ）または、パミテプラーゼ、ラノテプラーゼ、レテプラーゼ、テネクテプラーゼもしくはモンテプラーゼなどのｔ−ＰＡの改変体、ウロキナーゼ、またはＤＳＰＡアルファ１、ＤＳＰＡアルファ２、ＤＳＰＡベータもしくはＤＳＰＡガンマなどのＤＳＰＡ改変体である、項目２または３に記載の使用。
（項目５）
項目１（ａ）に記載のタンパク質またはペプチドが、不活化プラスミノーゲン活性化因子、好ましくは組換えｔ−ＰＡ（ｒｔ−ＰＡ、たとえば、アルテプラーゼ）または、パミテプラーゼ、ラノテプラーゼ、レテプラーゼ、テネクテプラーゼもしくはモンテプラーゼなどのｔ−ＰＡの改変体、ウロキナーゼ、またはＤＳＰＡアルファ２、ＤＳＰＡベータもしくはＤＳＰＡガンマなどのＤＳＰＡ改変体からなる群より選択される不活化プラスミノーゲン活性化因子である、前述の項目のいずれか一項に記載の使用。
（項目６）
項目１（ａ）に記載のタンパク質またはペプチドが、好ましくは自殺基質に、さらに好ましくはＤ−フェニル−プロリル−アルギニンクロロメチルケトン（ＰＰＡＣＫ）に連結されている不活化ＤＳＰＡアルファ１である、前述の項目のいずれか一項に記載の使用。
（項目７）
項目１（ａ）に記載のタンパク質またはペプチドが、フィンガードメイン（Ｆ）または上皮増殖因子ドメイン（ＥＧＦ）などの、プラスミノーゲン活性化因子において見出され、好ましくはｔ−ＰＡまたはデスモテプラーゼ由来である、追加のドメインのうちの１つまたは複数を含む、前述の項目のいずれか一項に記載の使用。
（項目８）
項目１（ａ）に記載のタンパク質またはペプチドが、クリングルドメインまたはその断片のみからなる、前述の項目のいずれか一項に記載の使用。
（項目９）
（ａ）配列番号３に記載のアミノ酸配列（ＤＳＰＡクリングル）、または
（ｂ）配列番号３に記載のアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性、好ましくは８０％、さらに好ましくは９０％、もっとも好ましくは９５％の同一性を有するアミノ酸配列、または
（ｃ）配列「ＣＹ−Ｘ３−Ｇ−Ｘ２−ＹＲＧＴＸＳ−Ｘ２−ＥＳＲ−Ｘ２−Ｃ−Ｘ２−ＷＮＳ−Ｘ２−ＬＸＲ−Ｘ２−Ｙ−Ｘ３−ＭＰＸＡＦＮ−ＬＧＬＧＸＨＮＹＣＲＮＰＮＸＡＸＫＰＷＣＸＶＸＫ−Ｘ３−Ｆ−Ｘ２−ＥＳＣ−Ｘ２−ＰＸＣ」（Ｘは任意のアミノ酸を示す）により定義されるＤＡＲＫモチーフと少なくとも９２％の同一性、好ましくは少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列
を含むかまたはそれからなる単離されたクリングルタンパク質またはペプチドであって、セリンプロテアーゼ活性を示さず、ｔ−ＰＡもしくはウロキナーゼのクリングルドメインではなく、自殺基質に共有結合したＤＳＰＡアルファ１タンパク質でもｔ−ＰＡでもない、タンパク質またはペプチド。
（項目１０）
ＮＭＤＡ受容体サブユニットＮＲ１のＮ末端ドメインに結合する単離された抗体またはその断片（抗ＡＴＤ−ＮＲ１抗体）であって、該抗体または該その断片の結合は、該ＮＲ１サブユニットの細胞外ドメインまたは断片の切断を妨げ、該ＮＲ１は好ましくは、
（ａ）配列番号４もしくは５のアミノ酸配列を有する、
（ｂ）配列番号６もしくは７のヌクレオチド配列によりコードされる、
（ｃ）ハイブリダイゼーションが５×ＳＳＰＥ、５×デンハート液および０．５％ＳＤＳ中５５〜６０℃で終夜実施される高いストリンジェンシーの条件下で配列番号６もしくは７の核酸分子の相補体に特異的にハイブリダイズする核酸分子である、
単離された抗体またはその断片。
（項目１１）
神経保護薬としてのタンパク質またはペプチドの使用であって、該タンパク質またはペプチドは、
（ａ）
（ｉ）配列番号１、配列番号２もしくは配列番号３に記載のアミノ酸配列、または
（ｉｉ）配列番号３に記載のアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性、好ましくは８０％、さらに好ましくは９０％、もっとも好ましくは９５％の同一性を有するアミノ酸配列、または
（ｖ）配列「ＣＹ−Ｘ３−Ｇ−Ｘ２−ＹＲＧＴＸＳ−Ｘ２−ＥＳ−Ｘ３−Ｃ−Ｘ２−ＷＮＳ−Ｘ２−Ｌ−Ｘ４−Ｙ−Ｘ４−ＰＸＡ−Ｘ２−ＬＧＬＧＸＨＮＹＣＲＮＰ−Ｘ４−ＫＰＷＣＸＶＸＫ−Ｘ６−ＥＸＣ−Ｘ２−ＰＸＣ」（Ｘは任意のアミノ酸を示す）により定義されるプラスミノーゲン活性化因子関連クリングル（ＰＡＲＫ）モチーフと少なくとも９０％の同一性、好ましくは少なくとも９５％もしくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列、または
（ｖｉ）配列「ＣＹ−Ｘ３−Ｇ−Ｘ２−ＹＲＧＴＸＳ−Ｘ２−ＥＳＲ−Ｘ２−Ｃ−Ｘ２−ＷＮＳ−Ｘ２−ＬＸＲ−Ｘ２−Ｙ−Ｘ３−ＭＰＸＡＦＮ−ＬＧＬＧＸＨＮＹＣＲＮＰＮＸＡＸＫＰＷＣＸＶＸＫ−Ｘ３−Ｆ−Ｘ２−ＥＳＣ−Ｘ２−ＰＸＣ」（Ｘは任意のアミノ酸を示す）により定義されるＤＡＲＫモチーフと少なくとも９２％の同一性、好ましくは少なくとも９５％もしくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列
を含むかまたはそれからなる、セリンプロテアーゼ活性を示さないクリングルタンパク質またはペプチド、あるいは
（ｂ）ＮＭＤＡ受容体サブユニットＮＲ１のＮ末端ドメインに結合する単離された抗体またはその断片（抗ＡＴＤ−ＮＲ１抗体）であって、該抗体または該その断片の結合は、該ＮＲ１サブユニットの細胞外ドメインまたは断片の切断を妨げ、該ＮＲ１は好ましくは、
（ｉ）配列番号４もしくは５のアミノ酸配列を有する、
（ｉｉ）配列番号６もしくは７のヌクレオチド配列によりコードされる、
（ｉｉｉ）ハイブリダイゼーションが５×ＳＳＰＥ、５×デンハート液および０．５％ＳＤＳ中５５〜６０℃で終夜実施される高いストリンジェンシーの条件下で配列番号６もしくは７の核酸分子の相補体に特異的にハイブリダイズする核酸分子である、
単離された抗体またはその断片、
からなる群より選択される、使用。
（項目１２）
（ａ）項目１（ａ）に記載のタンパク質もしくはペプチド、および、または
（ｂ）項目１０に記載の単離された抗体もしくは抗原結合部分
からなる群より選択され、血栓溶解薬を伴なうか、もしくはそれを伴なわず、１つまたは複数の薬学的に許容されるキャリアもしくは賦形剤をさらに含みうる、薬学的組成物。
（項目１３）
神経障害もしくは神経変性障害、特に脳卒中を処置する方法であって、前述の項目のいずれかに記載の治療量の血栓薬、好ましくはプラスミノーゲン活性化因子、さらに好ましくはｔ−ＰＡと一緒に、もしくはそれなしで、項目１（ａ）に記載の治療的有効量の単離されたタンパク質もしくはペプチド、または項目１０に記載の単離された抗体もしくはその抗原結合部分を投与することを含む、方法。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】図１は、ＰＡＲＫドメインに相当する保存、類似のアミノ酸を示すコンピュータベースの３Ｄモデルである。緑色で強調されているアミノ酸は保存されたアミノ酸を表し、赤色は類似のアミノ酸残基を表示している。
【図２】図２は、ＤＳＰＡアルファ１のクリングル、ならびにｒｔ−ＰＡのクリングル１およびクリングル２により描かれている例示となるＰＡＲＫドメインの結合部位である。
【図３】図３は、クロッグＤＳＰＡアルファ１の３Ｄコンピュータベースのモデルである。触媒的に不活性なクロッグＤＳＰＡをもたらす、触媒に結合しているＤ−フェニル−プロリル−アルギニンクロロメチルケトンを含む、リボン表示でのインシリコ法（Ｓｗｉｓｓ  Ｍｏｄｅｌ、ＧＲＯＭＯＳ９６、ＰＯＶＲＡＹ）によるＭＤシミュレーションの４４００ピコ秒後のＤＳＰＡの構造。水色：フィンガードメイン、赤色：ＥＧＦドメイン、黄色：クリングルドメイン、緑色：触媒ドメイン。
【図４】図４は、アルテプラーゼおよびデスモテプラーゼの３Ｄモデルである。リボン表示でのインシリコ法（Ｓｗｉｓｓ  Ｍｏｄｅｌ、ＧＲＯＭＯＳ９６、ＰＯＶＲＡＹ）によるＭＤシミュレーションのそれぞれ４４００ピコ秒後および４０００ピコ秒後のＤＳＰＡおよびｒｔ−ＰＡの構造。水色：フィンガードメイン、赤色：ＥＧＦドメイン、黄色：ＤＳＰＡのクリングルドメインおよびｔ−ＰＡのクリングル１ドメイン、青色：ｔ−ＰＡのクリングル２ドメイン、緑色：触媒ドメイン。
【図５】図５は、内皮細胞およびグリア細胞の共培養の模式図である。
【図６】図６は、透過性研究の模式図である。
【図７】図７は、ＢＢＢ輸送の測定の実験手順である。
【図８】図８は、ｒｔ−ＰＡ輸送競合（０．３μＭ）についての酵素電気泳動アッセイである。指示された異なる化合物の存在下での処理の２時間後、反管腔側区画に対応するバス培地（図５参照）は回収され、プラスミノーゲンおよびカゼイン含有酵素電気泳動アッセイに供されて、そのそれぞれの分子量およびプラスミノーゲンを活性化し（３７℃で２時間のインキュベーション）続いてカゼイン消化するその能力に基づいてプラスミノーゲン様活性化因子を明らかにした。
【図９】図９は、棒グラフ、左手側軸：ＤＳＰＡ関連分子およびＫ２（ｔ−ＰＡ）有りでのおよびなしでのｒｔ−ＰＡの輸送を示す。前記輸送は、スペクトロザイムアッセイを使用して評価された。線、右手側軸：スクロースの無変化透過性（Ｐｅスクロース）である。
【図１０】図１０は、ＤＳＰＡによるＮＭＤＡ媒介神経毒のインビボアンタゴニズムである。ＮＭＤＡ（５０ｎｍｏｌ）の線条体投与により誘導される神経細胞死の程度に対するｒｔ−ＰＡおよび／またはデスモテプラーゼ（ＤＳＰＡ）（それぞれ１ｍｇ／ｋｇ）ならびにそのビヒクルの静脈内注射の効果。＊Ｐ  約０．０１、ボンフェローニ較正したＡＮＯＶＡ。
【図１１】図１１は、ＤＳＰＡによるＮＭＤＡ媒介およびｔ−ＰＡ増強神経毒のインビボアンタゴニズムである。ＮＭＤＡ（５０ｎｍｏｌ）の線条体投与により誘導される神経細胞死の程度に対するｒｔ−ＰＡおよび／またはデスモテプラーゼ（ＤＳＰＡ）（それぞれ３μｇ）の線条体内注射の効果。＊Ｐ  約０．００１、ボンフェローニ較正したＡＮＯＶＡ。
【図１２−１】図１２は、ＡＴＤ−ＮＲ１に対する能動免疫が、ｒｔ−ＰＡ誘導再灌流を伴なったインサイチュー血栓塞栓性脳卒中のモデルでは保護的であることを示す。（Ａ、Ｃ）虚血性病変は、Ｓｗｉｓｓマウス（群あたりｎ＝１０）におけるＭＣＡへのトロンビンインサイチュー注入（０．７５  Ｕ．Ｉ）により、組換えｒＡＴＤ−ＮＲ１の最後の接種の１１日後に実施した。２０分後（Ａ）または４時間後（Ｃ）、ｒｔ−ＰＡ（１０ｍｇ／ｋｇ）または生理食塩水を４０分かけて注入した（１０％ボーラス、９０％注入）。脳は２４時間後に収集し、脳病変は、チオニン染色されたクリオスタット切片を分析することにより測定した（各群の代表的切片参照）。結果は平均±ＳＤとして表されている。＊：ｐ＜０．０１。（Ｂ、Ｄ）レーザードップラーにより測定される正規化された脳血流速度は、ＮＭＤＡ受容体ＮＲ１サブユニットのＡＴＤに対する免疫化が、早期（２０分）または後期（４時間）ｒｔ−ＰＡ投与の再灌流を誘導する能力に影響を与えないことを示した（群あたりｎ＝１０、結果はベースライン値に正規化され、平均±ＳＤとして表された。＊：ｐ＜０．００１）。
【図１２−２】図１２は、ＡＴＤ−ＮＲ１に対する能動免疫が、ｒｔ−ＰＡ誘導再灌流を伴なったインサイチュー血栓塞栓性脳卒中のモデルでは保護的であることを示す。（Ａ、Ｃ）虚血性病変は、Ｓｗｉｓｓマウス（群あたりｎ＝１０）におけるＭＣＡへのトロンビンインサイチュー注入（０．７５  Ｕ．Ｉ）により、組換えｒＡＴＤ−ＮＲ１の最後の接種の１１日後に実施した。２０分後（Ａ）または４時間後（Ｃ）、ｒｔ−ＰＡ（１０ｍｇ／ｋｇ）または生理食塩水を４０分かけて注入した（１０％ボーラス、９０％注入）。脳は２４時間後に収集し、脳病変は、チオニン染色されたクリオスタット切片を分析することにより測定した（各群の代表的切片参照）。結果は平均±ＳＤとして表されている。＊：ｐ＜０．０１。（Ｂ、Ｄ）レーザードップラーにより測定される正規化された脳血流速度は、ＮＭＤＡ受容体ＮＲ１サブユニットのＡＴＤに対する免疫化が、早期（２０分）または後期（４時間）ｒｔ−ＰＡ投与の再灌流を誘導する能力に影響を与えないことを示した（群あたりｎ＝１０、結果はベースライン値に正規化され、平均±ＳＤとして表された。＊：ｐ＜０．００１）。
【図１３】図１３は、ｒＡＴＤ−ＮＲ１に対して産生されたポリクローナル抗体が、ＮＲ１の組換えＡＴＤドメインおよび脳実質におけるＮＭＤＡ受容体ＮＲ１サブユニットを認識することができることを示す。（Ａ）２０ｇのＮＲ１の組換えＮ末端ドメイン（ＡＴＤ−ＮＲ１、アミノ酸１９〜３７１）（ヒスチジンタグまたはＦｃタグに結合されている）は、抗ＡＴＤ−ＮＲ１ポリクローナル抗体、抗ヒスチジン抗体、抗Ｆｃ抗体および対照ＩＧを用いた検出に先立って、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離された。免疫ブロットは３つの独立した実験を代表している。（Ｂ）ヒトおよびマウスの脳皮質由来のタンパク質抽出物は、抗ＡＴＤ−ＮＲ１ポリクローナル抗体またはＮＭＤＡ受容体ＮＲ１サブユニットを認識することができる市販のＮＲ１−ｃｔ抗体を用いた検出に先立ってＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離された。免疫ブロットは３つの独立した実験を代表している。
【図１４−１】図１４は、ＡＴＤ−ＮＲ１に対して産生されたポリクローナル抗体が、ｔ−ＰＡ促進ＮＭＤＡ受容体媒介神経毒を防ぐことを示している。神経細胞死割合は、ＮＭＤＡへの興奮毒性曝露２４時間後に評価されるバス培地へ放出されたＬＤＨにより評価した。（Ａ）混合皮質培養物は、ＮＭＤＡ（１０μＭ）単独への、またはｒｔ−ＰＡ（２０μｇ／ｍｌ）、抗ＡＴＤ−ＮＲ１（０．０１ｍｇ／ｍｌ）もしくはその両方の存在下でＮＭＤＡへの長期曝露を受けた。ｒｔ−ＰＡは神経細胞死割合の著しい増加を引き起こし、これは抗ＡＴＤ−ＮＲ１によりアンタゴナイズされた。（Ｃ）ＮＭＤＡ（５０μＭ）に短期間曝露された混合皮質培養物、他の条件および効果はパネルＡと同じ。（Ｂ、Ｄ）対照は、対照ＩＧの存在下で実施された。実験ごとにＮ＝３；ｎ＝１２ウェル；ｐ＜０．０１。
【図１４−２】図１４は、ＡＴＤ−ＮＲ１に対して産生されたポリクローナル抗体が、ｔ−ＰＡ促進ＮＭＤＡ受容体媒介神経毒を防ぐことを示している。神経細胞死割合は、ＮＭＤＡへの興奮毒性曝露２４時間後に評価されるバス培地へ放出されたＬＤＨにより評価した。（Ａ）混合皮質培養物は、ＮＭＤＡ（１０μＭ）単独への、またはｒｔ−ＰＡ（２０μｇ／ｍｌ）、抗ＡＴＤ−ＮＲ１（０．０１ｍｇ／ｍｌ）もしくはその両方の存在下でＮＭＤＡへの長期曝露を受けた。ｒｔ−ＰＡは神経細胞死割合の著しい増加を引き起こし、これは抗ＡＴＤ−ＮＲ１によりアンタゴナイズされた。（Ｃ）ＮＭＤＡ（５０μＭ）に短期間曝露された混合皮質培養物、他の条件および効果はパネルＡと同じ。（Ｂ、Ｄ）対照は、対照ＩＧの存在下で実施された。実験ごとにＮ＝３；ｎ＝１２ウェル；ｐ＜０．０１。
【図１５−１】図１５は、ＡＴＤ−ＮＲ１に対して産生されたポリクローナル抗体が、ｔ−ＰＡ促進ＮＭＤＡ受容体媒介Ｃａ２＋流入を防ぐことを示している。ｒｔ−ＰＡ処理は、皮質神経細胞におけるＮＭＤＡ誘起Ｃａ＋＋増加を増強した。細胞内遊離Ｃａ２＋（［Ｃａ２＋］ｉ）は、ｆｕｒａ−２蛍光ビデオ顕微鏡を使用して測定された。細胞内Ｃａ＋＋撮像実験のための神経細胞を、ガラス底３５ｍｍ皿に蒔いた。実験は１２日目にインビトロで実施した。（Ａ）２５μＭのＮＭＤＡへの３０秒間曝露により、神経細胞［Ｃａ２＋］ｉは急速に増加したが、続く数分間かけて回復した。ｔ−ＰＡ（２０μｇ／ｍｌ）への１５分間曝露後、ＮＭＤＡ誘起Ｃａ２＋流入は、［Ｃａ２＋］ｉの正味の積分された増加（任意単位で表された曲線下の面積）が３７％増強される程度にまで増強された（Ｎ＝３、ｎ（細胞数）＝１０８；ｐ＜０．０５）。（Ｂ）抗ＡＴＤ−ＮＲ１抗体（０．０１ｍｇ／ｍｌ）とｒｔ−ＰＡ（２０μｇ／ｍｌ）の共投与は、ＮＭＤＡ誘導Ｃａ２＋流入のｒｔ−ＰＡ増強を完全にブロックした（Ｎ＝３、ｎ（細胞数）＝１０８；ｐ＜０．０１）。（Ｃ）対照Ｉｇ（０．０１ｍｇ／ｍｌ）とｒｔ−ＰＡ（２０μｇ／ｍｌ）の共投与は、ＮＭＤＡ誘起Ｃａ２＋流入の改変を全く引き起こさなかった（Ｎ＝３、ｎ（細胞数）＝１０９；ｐ＜０．０５）。（Ｄ）パネルＡ〜Ｃに例示される実験の定量化（ｑｕａｎｔｉｚａｔｉｏｎ）。曲線下面積の値は最初のＮＭＤＡチャレンジに対して正規化されている。
【図１５−２】図１５は、ＡＴＤ−ＮＲ１に対して産生されたポリクローナル抗体が、ｔ−ＰＡ促進ＮＭＤＡ受容体媒介Ｃａ２＋流入を防ぐことを示している。ｒｔ−ＰＡ処理は、皮質神経細胞におけるＮＭＤＡ誘起Ｃａ＋＋増加を増強した。細胞内遊離Ｃａ２＋（［Ｃａ２＋］ｉ）は、ｆｕｒａ−２蛍光ビデオ顕微鏡を使用して測定された。細胞内Ｃａ＋＋撮像実験のための神経細胞を、ガラス底３５ｍｍ皿に蒔いた。実験は１２日目にインビトロで実施した。（Ａ）２５μＭのＮＭＤＡへの３０秒間曝露により、神経細胞［Ｃａ２＋］ｉは急速に増加したが、続く数分間かけて回復した。ｔ−ＰＡ（２０μｇ／ｍｌ）への１５分間曝露後、ＮＭＤＡ誘起Ｃａ２＋流入は、［Ｃａ２＋］ｉの正味の積分された増加（任意単位で表された曲線下の面積）が３７％増強される程度にまで増強された（Ｎ＝３、ｎ（細胞数）＝１０８；ｐ＜０．０５）。（Ｂ）抗ＡＴＤ−ＮＲ１抗体（０．０１ｍｇ／ｍｌ）とｒｔ−ＰＡ（２０μｇ／ｍｌ）の共投与は、ＮＭＤＡ誘導Ｃａ２＋流入のｒｔ−ＰＡ増強を完全にブロックした（Ｎ＝３、ｎ（細胞数）＝１０８；ｐ＜０．０１）。（Ｃ）対照Ｉｇ（０．０１ｍｇ／ｍｌ）とｒｔ−ＰＡ（２０μｇ／ｍｌ）の共投与は、ＮＭＤＡ誘起Ｃａ２＋流入の改変を全く引き起こさなかった（Ｎ＝３、ｎ（細胞数）＝１０９；ｐ＜０．０５）。（Ｄ）パネルＡ〜Ｃに例示される実験の定量化（ｑｕａｎｔｉｚａｔｉｏｎ）。曲線下面積の値は最初のＮＭＤＡチャレンジに対して正規化されている。
【図１６−１】図１６は、ｒＡＴＤ−ＮＲ１を標的にする抗体ベースの免疫療法が脳を脳卒中から保護し、ｒｔ−ＰＡ誘導血栓溶解の治療ウィンドウを増加させることを示している。（Ａ、Ｃ）ｒＡＴＤ−ＮＲ１に対する抗ＡＴＤ−ＮＲ１抗体（０．８ｍｇ／ｍｌ）の単回静脈内注射は、ｒｔ−ＰＡ（１０ｍｇ／ｋｇ）による早期（Ａ：２０分）もしくは後期（Ｃ：４時間）再灌流のどちらかを用いるか（黒色バー）、または再灌流なしでの（生理食塩水注入、白色バー）、インサイチュー血栓塞栓性脳卒中後の内因性および外因性ｔ−ＰＡの増強効果を標的にする（群あたりｎ＝８〜１０マウス、ｐ＜０．０５、＊ｐ＜０．０１）。抗体は、ｔ−ＰＡまたは生理食塩水溶液のボーラス後ボリ（ｂｏｌｉ）として注入した。（Ｂ、Ｄ）ベースライン値、レーザードップラーにより測定されベースラインに正規化された脳血流速度は、ＮＭＤＡ受容体ＮＲ１サブユニットのＡＴＤに対する免疫化が、血餅発症後早期（２０分後、Ｂ）にまたは後期（４時間後、Ｄ）に実行されたｒｔ−ＰＡ誘導再灌流に影響を与えないことを示す（群あたりｎ＝８〜１０マウス、ｐ＜０．００１）。
【図１６−２】図１６は、ｒＡＴＤ−ＮＲ１を標的にする抗体ベースの免疫療法が脳を脳卒中から保護し、ｒｔ−ＰＡ誘導血栓溶解の治療ウィンドウを増加させることを示している。（Ａ、Ｃ）ｒＡＴＤ−ＮＲ１に対する抗ＡＴＤ−ＮＲ１抗体（０．８ｍｇ／ｍｌ）の単回静脈内注射は、ｒｔ−ＰＡ（１０ｍｇ／ｋｇ）による早期（Ａ：２０分）もしくは後期（Ｃ：４時間）再灌流のどちらかを用いるか（黒色バー）、または再灌流なしでの（生理食塩水注入、白色バー）、インサイチュー血栓塞栓性脳卒中後の内因性および外因性ｔ−ＰＡの増強効果を標的にする（群あたりｎ＝８〜１０マウス、ｐ＜０．０５、＊ｐ＜０．０１）。抗体は、ｔ−ＰＡまたは生理食塩水溶液のボーラス後ボリ（ｂｏｌｉ）として注入した。（Ｂ、Ｄ）ベースライン値、レーザードップラーにより測定されベースラインに正規化された脳血流速度は、ＮＭＤＡ受容体ＮＲ１サブユニットのＡＴＤに対する免疫化が、血餅発症後早期（２０分後、Ｂ）にまたは後期（４時間後、Ｄ）に実行されたｒｔ−ＰＡ誘導再灌流に影響を与えないことを示す（群あたりｎ＝８〜１０マウス、ｐ＜０．００１）。
【図１７Ａ】図１７は、ＡＴＤ−ＮＲ１に対する抗体ベースの免疫療法が、脳卒中後のｒｔ−ＰＡ誘導ＢＢＢ溢出を妨げることを示している。（Ａ）ＭＣＡＯ２４時間後のエバンズブルー色素血管外溢出は偽条件（血餅のないマウス）の平均値に正規化された。脳卒中２０分後または４時間後の抗ＡＴＤ−ＮＲ１ポリクローナル抗体（０．０１ｍｇ／ｍｌ）の単回注入は、ｒｔ−ＰＡ（１０ｍｇ／ｋｇ）と組み合わせたかまたはｒｔ−ＰＡ（１０ｍｇ／ｋｇ）のない、脳卒中誘導ＢＢＢ溢出を減少することができた（群あたりｎ＝３マウス、ｐ＜０．０５）。この能力はＭＭＰ−９活性と連結することができた。（Ｂ）ＭＭＰ−９タンパク質分解活性は、生理食塩水注入によって得られた平均値に対して正規化された。脳卒中２０分後または４時間後の抗ＡＴＤ−ＮＲ１ポリクローナル抗体の単回注入は、ｒｔ−ＰＡ（１０ｍｇ／ｋｇ）と組み合わせたかまたはｒｔ−ＰＡ（１０ｍｇ／ｋｇ）なしにおいて、同側の皮質におけるＭＭＰ−９活性を減少することができた（群あたりｎ＝３マウス、ｐ＜０．０５）。パネル（Ｃ）はＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９活性の代表的図を示している。ＭＭＰ−９は生理食塩水およびｒｔ−ＰＡ条件下で増加した。もっとも興味深いことに、ＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９活性は抗ＡＴＤ−ＮＲ１抗体の単回注入後に減少した。
【図１７Ｂ】図１７は、ＡＴＤ−ＮＲ１に対する抗体ベースの免疫療法が、脳卒中後のｒｔ−ＰＡ誘導ＢＢＢ溢出を妨げることを示している。（Ａ）ＭＣＡＯ２４時間後のエバンズブルー色素血管外溢出は偽条件（血餅のないマウス）の平均値に正規化された。脳卒中２０分後または４時間後の抗ＡＴＤ−ＮＲ１ポリクローナル抗体（０．０１ｍｇ／ｍｌ）の単回注入は、ｒｔ−ＰＡ（１０ｍｇ／ｋｇ）と組み合わせたかまたはｒｔ−ＰＡ（１０ｍｇ／ｋｇ）のない、脳卒中誘導ＢＢＢ溢出を減少することができた（群あたりｎ＝３マウス、ｐ＜０．０５）。この能力はＭＭＰ−９活性と連結することができた。（Ｂ）ＭＭＰ−９タンパク質分解活性は、生理食塩水注入によって得られた平均値に対して正規化された。脳卒中２０分後または４時間後の抗ＡＴＤ−ＮＲ１ポリクローナル抗体の単回注入は、ｒｔ−ＰＡ（１０ｍｇ／ｋｇ）と組み合わせたかまたはｒｔ−ＰＡ（１０ｍｇ／ｋｇ）なしにおいて、同側の皮質におけるＭＭＰ−９活性を減少することができた（群あたりｎ＝３マウス、ｐ＜０．０５）。パネル（Ｃ）はＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９活性の代表的図を示している。ＭＭＰ−９は生理食塩水およびｒｔ−ＰＡ条件下で増加した。もっとも興味深いことに、ＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９活性は抗ＡＴＤ−ＮＲ１抗体の単回注入後に減少した。
【図１７Ｃ】図１７は、ＡＴＤ−ＮＲ１に対する抗体ベースの免疫療法が、脳卒中後のｒｔ−ＰＡ誘導ＢＢＢ溢出を妨げることを示している。（Ａ）ＭＣＡＯ２４時間後のエバンズブルー色素血管外溢出は偽条件（血餅のないマウス）の平均値に正規化された。脳卒中２０分後または４時間後の抗ＡＴＤ−ＮＲ１ポリクローナル抗体（０．０１ｍｇ／ｍｌ）の単回注入は、ｒｔ−ＰＡ（１０ｍｇ／ｋｇ）と組み合わせたかまたはｒｔ−ＰＡ（１０ｍｇ／ｋｇ）のない、脳卒中誘導ＢＢＢ溢出を減少することができた（群あたりｎ＝３マウス、ｐ＜０．０５）。この能力はＭＭＰ−９活性と連結することができた。（Ｂ）ＭＭＰ−９タンパク質分解活性は、生理食塩水注入によって得られた平均値に対して正規化された。脳卒中２０分後または４時間後の抗ＡＴＤ−ＮＲ１ポリクローナル抗体の単回注入は、ｒｔ−ＰＡ（１０ｍｇ／ｋｇ）と組み合わせたかまたはｒｔ−ＰＡ（１０ｍｇ／ｋｇ）なしにおいて、同側の皮質におけるＭＭＰ−９活性を減少することができた（群あたりｎ＝３マウス、ｐ＜０．０５）。パネル（Ｃ）はＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９活性の代表的図を示している。ＭＭＰ−９は生理食塩水およびｒｔ−ＰＡ条件下で増加した。もっとも興味深いことに、ＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９活性は抗ＡＴＤ−ＮＲ１抗体の単回注入後に減少した。
【図１８Ａ】図１８は、ＡＴＤ−ＮＲ１を標的にする抗体ベース免疫療法は脳卒中後に長期の利益を与えることを示している。マウスを、脳卒中の４時間後に生理食塩水（Ａ）または抗ＡＴＤ−ＮＲ１抗体（０．８ｍｇ／ｍｌ）（Ｂ）を用いて処置した。虚血の２４時間、７２時間、７日および１５日後、マウスをＴ２脳撮像のために、および２４時間において見掛けの拡散係数（ＡＤＣ）のために、７Ｔ  ＭＲＩ（Ｐｈａｒｍａｓｃａｎ  Ｂｒｕｃｋｅｒ）に置いた。群あたり３動物。４つの異なる脳切片を含む代表的画像が示されている。
【図１８Ｂ】図１８は、ＡＴＤ−ＮＲ１を標的にする抗体ベース免疫療法は脳卒中後に長期の利益を与えることを示している。マウスを、脳卒中の４時間後に生理食塩水（Ａ）または抗ＡＴＤ−ＮＲ１抗体（０．８ｍｇ／ｍｌ）（Ｂ）を用いて処置した。虚血の２４時間、７２時間、７日および１５日後、マウスをＴ２脳撮像のために、および２４時間において見掛けの拡散係数（ＡＤＣ）のために、７Ｔ  ＭＲＩ（Ｐｈａｒｍａｓｃａｎ  Ｂｒｕｃｋｅｒ）に置いた。群あたり３動物。４つの異なる脳切片を含む代表的画像が示されている。
【図１９】図１９は、ＡＴＤ−ＮＲ１を標的にする抗体ベースの免疫療法は、脳卒中後の長期認知回復を改善することを示している。マウスを、脳卒中の２０分後（Ａ）または４時間後（Ｂ）に生理食塩水または抗ＡＴＤ−ＮＲ１抗体（０．８ｍｇ／ｍｌ）を用いて処置した。虚血２４時間後、マウスを恐怖条件付け部屋に置いた。結果は、５分間期間中のフリージング時間の割合で表され、ナイーブマウスを用いて得られた結果に正規化された（群あたりｎ＝１０、＊ｐ＜０．０２５；＄ｐ＜０．０５）。
【図２０】図２０は、ｒＡＴＤ−ＮＲ１に対する抗体は、興奮毒性病変モデルにおいて内因性ｔ−ＰＡの神経毒性の影響を防ぐことを示している。興奮毒性病変は、ＮＭＤＡ（１０ｎｍｏｌ）を右線条体に注入することにより生み出された（座標：ブレグマに対して０．０ｍｍ後方、２．０ｍｍ側方、４．０ｍｍ腹側）。３０分後、抗ＡＴＤ−ＮＲ１抗体または対照ＩＧを尾静脈に注射した（０．８ｍｇ／ｍｌ）。対照と比べて、抗ＡＴＤ−ＮＲ１抗体は線条体の著しい保護を与えた（ｎ＝８、ｐ＜０．０１）。
【図２１】図２１は、ｒＡＴＤ−ＮＲ１に対する抗体がＮＭＤＡ受容体のヒトＮＲ１サブユニットに特異的に結合することを示している。タンパク質抽出物を、虚血性脳卒中の２日後に死亡した患者の同側および反対側半球から死後単離し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルクロマトグラフィーに供し、ナイロン膜上にブロットし、（Ａ）抗ＡＴＤ  ＮＲ１抗体または（Ｂ）抗ヒトＮＲ１抗体を使用してウェスタンブロットにおいて分析した。
【図２２】図２２は、ｒＡＴＤ−ＮＲ１に対する抗体が非手術動物の脳に到達することを示している。（Ａ）ＸＸ、（Ｂ）ＸＸ。（Ｃ）非手術または偽動物由来の脳組織を使用した抗ＡＴＤ−ＮＲ１抗体に対する免疫組織学的分析は、脳実質における抗ＡＴＤ−ＮＲ１抗体の存在を明らかにしている。
【図２３】図２３は、ＡＴＤ−ＮＲ１に対して産生されたポリクローナル抗体が、血清欠乏により誘導される神経細胞アポトーシスをアンタゴナイズするｔ−ＰＡの能力に影響を与えないことを示している。神経細胞培養物（ＤＩＶ７）の血清欠乏により引き起こされるアポトーシスに対するｒｔ−ＰＡ（２０μｇ／ｍＬ）および抗ＡＴＤ−ＮＲ１抗体（０．０１ｍｇ／ｍｌ）の影響を試験した。上パネル：血清欠乏により引き起こされる神経細胞死、この影響をアンタゴナイズするｒｔ−ＰＡの能力（ｐ＜０．０１）、およびｒｔ−ＰＡの影響に対する抗ＡＴＤ−ＮＲ１抗体の影響の欠如。神経細胞死の割合は、トリパンブルー陽性神経細胞の比率により決定した（ウェルあたりの３ランダムフィールドにおいてトリパンブルー陽性細胞を計数する）。結果は、偽洗浄対照神経細胞において得られたそれぞれの値について補正した。下パネル：アポトーシス状態の指標としてのカスパーゼ３の切断。切断分子は、切断されたカスパーゼ３に対して産生された抗体を用いて明らかにされた。やはり、ｒｔ−ＰＡの保護効果は、抗ＡＴＤ−ＮＲ１抗体に影響されなかった（Ｎ＝３、ｎ＝１２）。
【発明を実施するための形態】
【００７９】
本明細書で使用される用語「神経障害」は、被験体の神経系の正常な機能または解剖学的形態に直接的にまたは間接的に影響を与える疾患、障害または状態と定義される。
【００８０】
本発明の文脈では、用語「神経変性障害」は、中枢神経系または末梢神経系の細胞が失われる疾患と定義される。
【００８１】
神経障害および／または神経変性障害の例は、脊髄の挫傷、透過、剪断、圧迫もしくは裂傷病変または鞭打ち揺さぶられっ子症候群を含むがこれらに限定されない脊髄損傷、頭蓋内または椎骨内（ｉｎｔｒａｖｅｒｔｅｂｒａｌ）病変である。
【００８２】
本発明の文脈では、神経障害には、虚血性事象または、細胞もしくは組織における任意の局所的もしくは領域的低酸素状態（これは、通常は、たとえば、この領域の血管の遮断または閉塞により引き起こされる不十分な血液供給（循環）に起因する）と定義することができる虚血または虚血性障害も挙げられる。
【００８３】
低酸素は、脳血管不全、脳虚血または脳梗塞（塞栓性閉塞および血栓症に由来する脳虚血もしくは梗塞を含む）、網膜虚血（糖尿病ほか）、緑内障、網膜変性、多発性硬化症、虚血性視神経障害、急性脳虚血に続く再灌流、周産期低酸素性虚血性損傷または任意の種類の頭蓋内出血（硬膜外の、硬膜下の、くも膜下のもしくは脳内出血を含むがこれらに限定されない）を含むが、これらに限定されない低酸素症および／または虚血として急性損傷を引き起こすことができる。
【００８４】
したがって、用語「虚血性障害」は、血栓症または血栓症傾向に関連するかまたはそれから生じる状態を含む血栓性障害を包含する。これらの状態は、血栓溶解薬を用いて処置することが可能な動脈または静脈血栓に関連する状態を含む。
【００８５】
本明細書で使用される用語「ｔ−ＰＡ」には、天然ｔ−ＰＡおよび組換えｔ−ＰＡの他にも天然ｔ−ＰＡの酵素活性または線維素溶解活性を保持している改変型のｒｔ−ＰＡが挙げられる。ｔ−ＰＡの酵素活性は、プラスミノーゲンをプラスミンに転換する前記分子の能力を評価することにより測定することが可能である。ｔ−ＰＡの線維素溶解活性は、当技術分野で公知の任意のインビトロ血餅溶解活性によっても決定しうる。組換えｔ−ＰＡは先行技術において広範に記載されており、当業者には公知である。ｒｔ−ＰＡはアルテプラーゼとして市販されている（Ａｃｔｉｖａｓｅ（登録商標）またはＡｃｔｉｌｙｓｅ（登録商標））。改変型のｒｔ−ＰＡ（「改変ｒｔ−ＰＡ」）はすでに特徴付けられており当業者には公知である。改変ｒｔ−ＰＡには、欠失または置換アミノ酸またはドメインを有する改変体、他の分子に結合体化されたかまたは融合した改変体、および改変グリコシル化などの化学修飾物を有する改変体が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの好ましい改変ｒｔ−ＰＡは、ＰＣＴ公開ＷＯ９３／２４６３５、欧州特許第３５２，１１９号、欧州特許第３８２，１７４号に記載されている。
【００８６】
本発明の文脈では、用語「自殺基質」は、前記酵素を阻害する産物への酵素反応を受けるのに十分なほど密接に正常基質に類似している化合物と定義される。基質類似物として、自殺基質は、多くの場合前記酵素のアミノ酸、通常は触媒アミノ酸に不可逆的に結合し、それによって他の分子に対して前記酵素の活性部位を遮断し、効果的におよび大半が不可逆的に前記酵素を阻害する。
【００８７】
本明細書に使用される用語「脳卒中」は、脳虚血の任意の事象について使用される。
【００８８】
用語「処置する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」または「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」とは、それを必要とする哺乳動物、特にヒト内において生理的障害を防ぐ、減少する、緩和するまたは治すための任意の医療措置のことである。
【００８９】
「治療的有効量」は、脳卒中などの神経疾患または神経変性疾患と関連する症状を減少することになる活性成分の量と定義される。「治療的に有効な」とは、無処置と比べた障害の重症度または発生の頻度の任意の改善のことでもある。用語「処置」は治すことまたは治癒のどちらでも、ならびに緩和、寛解または予防を包含する。
【００９０】
本明細書の文脈において使用される用語「ＮＭＤＡ受容体サブユニットＮＲ１のＮ末端ドメイン（抗ＡＴＤ−ＮＲ１）」は、ｔ−ＰＡと相互作用するＮＭＤＡ受容体のＮＲ１サブユニットの領域と定義される。これは、マウス、ラット、ブタ、ウシ、ネコ、イヌまたはサルのような異なる種のＮＭＤＡ受容体を包含する。好ましくは、ヒトＮＭＤＡ受容体が使用される。ＮＲ１サブユニットの異なるアイソフォーム、好ましくは選択的スプライシングにより産生され、アイソフォームＮＲ１−１ａ、ＮＲ１−１ｂ、ＮＲ１−２ａ、ＮＲ１−２ｂ、ＮＲ１−３ａ、ＮＲ１−３ｂ、ＮＲ１−４ａ、ＮＲ１−４ｂを含むアイソフォームもこの定義に含まれる。好ましくは、アミノ酸１９〜４８０をコードする、さらに好ましくはアミノ酸１９〜３７１（配列番号４または配列番号５参照）をコードするＮＲ１−１ａサブユニットの領域が使用される。
【００９１】
用語「抗体」は、抗体全体、ヒト抗体、ヒト化抗体、およびモノクローナル抗体、キメラ抗体または組換え抗体のような遺伝的に操作された抗体、および本発明に従った特性が保持されている限り、そのような抗体の断片を含むがこれらに限定されない様々な形態の抗体を包含する。
【００９２】
本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」とは、単一アミノ酸組成の抗体分子の調製物のことである。したがって、用語「ヒトモノクローナル抗体」とは、単一結合特異性を示し、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列由来の可変および定常領域を有する抗体のことである。一実施形態では、ヒトモノクローナル抗体は、不死化細胞に融合された、ヒト重鎖トランス遺伝子およびヒト軽鎖トランス遺伝子を含むゲノムを有するトランスジェニック非ヒト動物、たとえば、トランスジェニックマウスから得られるＢ細胞を含むハイブリドーマにより産生される。好ましくは抗ＡＴＤ
ＮＲ１抗体の種類はモノクローナル抗体である。
【００９３】
用語「キメラ抗体」とは、通常、組換えＤＮＡ技術により調製される、１つの供給源または種由来の可変領域すなわち結合領域、および異なる供給源または種由来の定常領域の少なくとも一部を含むモノクローナル抗体のことである。マウス可変領域およびヒト定常領域を含むキメラ抗体が特に好ましい。そのようなマウス／ヒトキメラ抗体は、マウス免疫グロブリン可変領域をコードするＤＮＡセグメントとヒト免疫グロブリン定常領域をコードするＤＮＡセグメントを含む発現された免疫グロブリン遺伝子の産物である。本発明により包含される他の形態の「キメラ抗体」は、クラスまたはサブクラスが元の抗体のクラスまたはサブクラスから改変または変更されている抗体のことである。そのような「キメラ」抗体は、「クラススイッチ抗体」とも呼ばれる。キメラ抗体を作製するための方法は、従来の組換えＤＮＡ技法および今や当技術分野では周知の遺伝子トランスフェクション技法を伴う。たとえば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｓ．Ｌ．ら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８１巻（１９８４年）６８５１〜６８５５頁、米国特許第５，２０２，２３８号および米国特許第５，２０４，２４４号を参照されたい。
【００９４】
用語「ヒト化抗体」とは、そのフレームワークまたは「相補性決定領域」（ＣＤＲ）が、親免疫グロブリンと比べて、特異性が異なる免疫グロブリンのＣＤＲを含むように改変されている抗体のことである。好ましい実施形態では、「ヒト化抗体」を調製するためにマウスＣＤＲがヒト抗体のフレームワーク領域に移植される。たとえば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ、Ｌ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２巻（１９８８年）３２３〜３２７頁；およびＮｅｕｂｅｒｇｅｒ、Ｍ．Ｓ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１４巻（１９８５年）２６８〜２７０頁を参照されたい。特に好ましいＣＤＲは、キメラおよび二機能性抗体について、上で述べられた抗原を認識する配列を表すＣＤＲに一致する。
【００９５】
用語「ヒト抗体」は、本明細書で使用されるように、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列由来の可変および定常領域を有する抗体を含むように意図されている。ヒト抗体は最先端の分野で周知である（ｖａｎ  Ｄｉｊｋ、Ｍ．Ａ．、ａｎｄ  ｖａｎ  ｄｅ  Ｗｉｎｋｅｌ，  Ｊ．  Ｇ．、Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ５巻（２００１年）３６８〜３７４頁）。そのような技術に基づいて、多種多様な標的に対するヒト抗体を作製することが可能である。
【００９６】
ヒト抗体の例は、たとえば、Ｋｅｌｌｅｒｍａｎｎ、Ｓ．  Ａ．ら、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １３巻（２００２年）５９３〜５９７頁に記載されている。
【００９７】
用語「組換えヒト抗体」は、本明細書で使用されるように、ＮＳＯもしくはＣＨＯ細胞などの宿主細胞から、またはヒト免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニックである動物（たとえば、マウス）から単離された抗体、あるいは宿主細胞にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを使用して発現される抗体などの、組換え手段により調製される、発現される、作製される、または単離されるすべてのヒト抗体を含むように意図されている。そのような組換えヒト抗体は、再編成された形で、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列由来の可変および定常領域を有する。
【００９８】
本明細書で使用されるように、用語「神経保護薬」は、神経保護を提供する、すなわち損傷部位、たとえば、虚血性損傷または外傷性損傷で神経細胞などの神経実体を保護することができる薬剤を意味する。
【００９９】
本発明の文脈では、用語「急性期処置」とは、通常は病院における、急性疾病もしくは損傷を有するかまたは手術から回復中の患者に対する短期医療処置のことである。用語「後急性期処置」とは、通常は病院における、急性疾病もしくは損傷を有するかまたは手術から回復中の患者に対する中期医療処置のことである。
【実施例】
【０１００】
（実施例）
（Ａ．ＰＡＲＫドメインを含有するタンパク質によるｔ−ＰＡ神経毒性の阻害）
（材料および方法）
ＰＡＲＫドメイン（ＤＳＰＡアルファ１、ｃＤＳＰＡ、レテプラーゼ、ＤＳＰＡアルファ２、ＤＳＰＡベータおよびアルテプラーゼのクリングル２（Ｋ２））を含むいくつかのタンパク質のアルテプラーゼトランスＢＢＢ輸送を阻害する能力を、下に概略される材料および方法を使用して実証した。
【０１０１】
ＤＳＰＡアルファ１、ｃＤＳＰＡ、レテプラーゼ、ＤＳＰＡアルファ２およびＤＳＰＡベータはＰＡＩＯＮ  Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ  ＧｍｂＨにより提供された。レテプラーゼは薬局において購入され、ＰＡＩＯＮ  Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ  ＧｍｂＨにより提供された。クリングル２（アルテプラーゼ由来）はＵＭＲ  ＣＮＲＳ  ６１１８５／ＩＮＳＥＲＭ−Ａｖｅｎｉｒ、Ｃａｅｎ  Ｆｒａｎｃｅにより開発され提供された化合物である。
【０１０２】
【化５】
2014231523.tif 000006
【０１０３】
【化６】
2014231523.tif 000007
ストック溶液を希釈し、リンガーＨＥＰＥＳ緩衝液で必要な濃度（０．３μＭまたは１０ｎＭ）を得た。
【０１０４】
（２．インビトロ血液脳関門モデルの説明）
（２．１  前記モデルの確立）
脳毛細血管機能を研究するためのインビトロシステムを提供するために、フィルターの一方の側で脳毛細血管内皮細胞を、もう一方の側でグリア細胞を培養することにより、インビボ状況をかなりの程度まで模倣する共培養物を開発した（図５）。内皮細胞をフィルター上の上部区画で培養し、グリア細胞を６ウェルプレートのプラスティック上の下部区画で維持した。これらの条件下では、内皮細胞はすべての内皮マーカー（第ＶＩＩＩ因子関連抗原、非血栓形成性表面、プロスタサイクリンの産生、アンギオテンシン変換酵素活性）ならびに血管脳関門の特徴（接着結合の存在、飲小胞の欠乏、モノアミン酸化酵素活性、ガンマグルタミルトランスペプチダーゼ活性およびＰ糖タンパク質）を保持していることが知られている。
【０１０５】
（２．２  細胞培養物）
ウシ脳内皮細胞を、１０％（ｖ／ｖ）熱不活化ウシ血清および１０％（ｖ／ｖ）ウマ血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ、ＵＳＡ）、２ｍＭグルタミン、５０μｇ／ｍＬゲンタマイシンならびに塩基性線維芽細胞増殖因子（１ｎｇ／ｍＬ、隔日に添加される）を補充したＤＭＥＭにおいて培養された脳毛細血管から単離した。３継代で凍結された内皮細胞のサブクローンを、６０ｍｍ径ゼラチンコートペトリ皿上で再培養し、コンフルエンスまで増殖させた。
【０１０６】
初代グリア培養物を新生ラット大脳皮質から単離した。髄膜を取り除いた後、脳組織をナイロンふるいに穏やかに通した。１０％（ｖ／ｖ）胎仔ウシ血清（ＦＣＳ）、２ｍＭグルタミンおよび５０μｇ／ｍＬのゲンタマイシンを補充したＤＭＥＭは、脳組織の解離およびグリア細胞の発生に使用した。グリア細胞を、６ウェルプレートのプラスティック上に１．２５×１０５細胞ｍｌ−１の濃度で蒔き、５％ＣＯ２を用いて３７℃でインキュベートした。培地を週２回交換した。播種の３週間後、グリア培養物はコンフルエントであり、神経膠星状細胞（約６０％）、乏突起神経膠細胞およびミクログリア細胞で構成されていた。
【０１０７】
（２．３  フィルターの調製）
培養プレートインサート（Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌ  ＰＣ  ３μｍポアサイズ）を、Ｂｏｒｎｓｔｅｉｎ（１９５８年）の方法に従って調製されたラット尾部コラーゲンを用いて上辺でコーティングした。
【０１０８】
スクロース透過および０．３μＭで試験された化合物の分析では、表面が４．２ｃｍ２のフィルターを使用した。１０ｎＭで試験された化合物では、表面が３ｃｍ２のフィルターを使用した。
【０１０９】
（２．４  ウシ脳毛細血管内皮細胞およびグリア細胞の共培養）
コーティングしたフィルターを、共培養のため、グリア細胞を含有する６ウェル皿に置いた。共培養培地は、脳毛細血管内皮細胞用の培地と同じであった。コンフルエントな内皮細胞をトリプシン処理し、４×１０５細胞／ｍｌの濃度でフィルターの上辺に蒔いた。これらの条件下で、内皮細胞は１２日以内にコンフルエント単層を形成した。実験はコンフルエンスの５日後に実施した。
【０１１０】
（４．インビトロＢＢＢモデルを使用する輸送実験）
（４．１  毒性試験）
スクロースを、ＢＢＢの完全性に対する試験化合物の考えうる効果の評価を可能にする傍細胞（ｐａｒａｃｅｌｌｕｌａｒ）マーカーとして使用した。この小親水性分子は、低い脳透過を示し、その内皮透過性係数は内皮細胞単層完全性の尺度である。
【０１１１】
実験当日、リンガーＨＥＰＥＳを６ウェルプレート（ウェルあたり２．５ｍｌ）の下の区画（反管腔側）に添加した。内皮細胞のコンフルエント単層を含有する１つのフィルターを、プレートの最初のウェルに移した。
【０１１２】
［１４Ｃ］スクロース（フィルターあたり０．５μＣｉの［１４Ｃ］スクロースの添加）との共インキュベーション中の化合物を含有する１．５ｍｌリンガーＨＥＰＥＳを上部区画（管腔側）に置いた。試験化合物の添加後の一定時間に、前記インサートを６ウェルプレートの別のウェルに移して、下の区画から上の区画への物質の考えうる逆流を最小限にした（図６参照）。各インキュベーション期間の終了時に、アリコートの反管腔側と管腔側液体を放射性分析のために収集した。
【０１１３】
６０分の実験中、クリアランス容積は時間とともに直線的に増加した。平均クリアランス容積は時間に対してプロットされ、勾配は線形回帰分析により見積もり、平均と関連標準誤差を生じた。共培養についてのクリアランス曲線の勾配はＰＳｔで表示され、ＰＳは透過性×表面積の積（１分あたりのマイクロリットルにおける）である。コラーゲンで覆われているだけのフィルターのクリアランス曲線の勾配はＰＳｆで表示される。
【０１１４】
内皮単層のＰＳ値（ＰＳｅ）は、
【０１１５】
【数１】
2014231523.tif 000008
から計算した。
【０１１６】
ＰＳｅ値をフィルターの表面積（Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌ  ＰＣおよびＣＭで４．２ｃｍ２ならびにＴｒａｎｓｗｅｌｌインサートで４．７ｃｍ２）で割って、内皮透過性係数（Ｐｅ、１分あたりのセンチメートルにおける）を得た。
【０１１７】
スクロース透過性の安定性は、三連で単層において各試験化合物を用いて試験し、ＢＢＢに対する毒性の影響の非存在を確認した。
【０１１８】
（４．２  ３７℃での化合物の輸送；完全性試験）
ｒｔ−ＰＡの移行は、スクロースについて４．１下に記載された通りに決定した。
【０１１９】
これらのおよび他のすべての実験では、ＢＢＢの完全性は、ＢＢＢの完全性に対する考えうる効果の評価を可能にする傍細胞マーカーとして［１４Ｃ］スクロースを使用してモニターした。
【０１２０】
データ評価：アルテプラーゼの通過は、プラスミノーゲンベースの酵素電気泳動（ｚｙｍｏｇｒａｐｈｙ）アッセイを用いて評価した。アルテプラーゼの通過は画像定量システムを使用して定量化した。さらに、三連の管腔側溶液および反管腔側溶液を、スペクトロザイムアッセイを用いてアルテプラーゼについてアッセイした。
【０１２１】
研究の連続的段階は図７に記載する。
【０１２２】
（５．輸送研究）
（フィルター研究）
このステップでは、フィルターによる輸送制限の可能性を排除するために、アルテプラーゼがフィルターを通過する能力を試験した。アルテプラーゼを、完全性試験で決定された非毒性濃度で適用した。
【０１２３】
（輸送研究）
ＤＳＰＡ関連分子であるレテプラーゼおよびクリングル２（アルテプラーゼ）を、プラスミノーゲンベースの酵素電気泳動アッセイおよびスペクトロザイムアッセイによる定量化を用いて評価される、アルテプラーゼ透過に影響を与えるその能力について等モル濃度で調べた。
【０１２４】
（実施例１：ＰＡＲＫ含有タンパク質と組み合わせたｒｔ−ＰＡは、インビトロでＢＢＢに毒性の影響を及ぼさない）
スクロースのみを用いて、およびアルテプラーゼのみを用いて、またはアルテプラーゼをＤＳＰＡ関連分子のレテプラーゼもしくはＫ２（アルテプラーゼ）と組み合わせて用いて得られた内皮透過性係数は、以下の表１に要約する。
【０１２５】
【表１】
2014231523.tif 000009
スクロースについて得られた内皮透過性係数により、ＤＳＰＡ関連分子との共インキュベーションのアルテプラーゼは、０．３μＭまたは１０ｎＭのそれぞれの濃度で、インビトロでＢＢＢに毒性の影響を及ぼさないことが示された。
【０１２６】
（実施例２：アルテプラーゼはコラーゲンフィルターを通過することができる）
コラーゲンコートフィルターを通るアルテプラーゼ（０．３μＭ）の輸送は１２０分の期間にわたり調べた。
【０１２７】
実験期間後、アルテプラーゼの濃度を、管腔側および反管腔側試料において、スペクトロザイムアッセイを用いて決定した（表２）。
【０１２８】
【表２】
2014231523.tif 000010
結果は、アルテプラーゼがフィルターを通過する潜在力を７．８８％の程度まで示したので、アルテプラーゼ透過は空フィルターに制限されないことを示している。この値は空フィルターを通る拡散通過の最大割合として記録され、内皮輸送研究において参照（いわゆる「対フィルター」）として使用された。
【０１２９】
（実施例３：ＢＢＢを通るｒｔ−ＰＡの輸送は、ＰＡＲＫドメインを含有するタンパク質との共インキュベーションによりインビトロでブロックされる）
アルテプラーゼ単独での、ならびにＤＳＰＡ関連分子（ＤＳＰＡα１、ｃＤＳＰＡ、ＤＳＰＡα２）、レテプラーゼおよびＫ２（アルテプラーゼ）と共インキュベーションでの移行は１２０分の期間にわたり調べた。等モル濃度（０．３μＭ）を使用した。
【０１３０】
実験期間後、アルテプラーゼの管腔側および反管腔側濃度は、プラスミノーゲン含有酵素電気泳動アッセイ（図８）を用いて決定し、画像システムを使用して定量化した。
【０１３１】
図８に示されるように、酵素電気泳動アッセイにより、ｃＤＳＰＡ、ＤＳＰＡα１、ＤＳＰＡα２およびＫ２（アルテプラーゼ）による、ならびにレテプラーゼによるＢＢＢを通るアルテプラーゼ輸送の阻害が明らかになり、これらのすべてが酵素電気泳動シグナルの減少を引き起こした。定量化されたデータは表３に要約する。
【０１３２】
【表３】
2014231523.tif 000011
追加のシリーズでは、スペクトロザイムアッセイを、ＤＳＰＡ関連分子およびＫ２（アルテプラーゼ）（すべて０．３μＭで）との共インキュベーション中のアルテプラーゼ（０．３μＭ）の通過を定量化するために管腔側と反管腔側区画の両方において実施した（表４）。
【０１３３】
【表４】
2014231523.tif 000012
レテプラーゼのプロテアーゼ活性により、アルテプラーゼとレテプラーゼに関連する活性を区別することができなかったので、スペクトロザイムアッセイを使用することはできなかった。
【０１３４】
図９に例示されるように、スペクトロザイムアッセイにより、ＤＳＰＡ関連分子およびＫ２（アルテプラーゼ）の存在下での、アルテプラーゼの包括的タンパク質分解活性の減少を明らかにした。数字も表４に示す。
【０１３５】
（実施例４：静脈内共投与後ＤＳＰＡはｒｔ−ＰＡ媒介神経毒性の影響をアンタゴナイズしたが、線条体への共投与後はアンタゴナイズしなかった）
ＰＡＲＫドメインを含むタンパク質の阻害効果は下に概説される動物モデルにも示された。
【０１３６】
ヒト組換えアルテプラーゼ（ｒｔ−ＰＡ、アルテプラーゼ）はＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ（Ｆｒａｎｃｅ）製で、ＮＭＤＡはＴｏｃｒｉｓ（Ｕ．Ｋ．）製であった。デスモテプラーゼはＰＡＩＯＮ  Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ  ＧｍｂＨ（Ｇｅｒｍａｎｙ）により提供された。
【０１３７】
（動物）
雄性Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラット（２７０〜３３０ｇ）を、１２明時間／１２暗時間サイクルで恒温室に収容し、餌と水を自由に与えた。実験は、実験動物の管理と使用についてのフランス（ａｃｔ  ｎｏ．８７  ｔｏ  ８４８；Ｍｉｎｉｓｔｅｒｅ  ｄｅ
ｌ’Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ  ｅｔ  ｄｅ  ｌａ  Ｆｏｒｅｔ）と欧州共同体評議会（Ｄｉｒｅｃｔｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  ２４、１９８６年、８６／６０９／ＥＥＣ）指針に従って実施した。
【０１３８】
（線条体興奮毒性病変）
ラットを、イソフルラン（５％、０．８  ｌ／分で、酸素／Ｎ２Ｏ（１：３）中で維持２％）を用いて麻酔した。体温を３７±０．５℃に維持した。注入ピペット（内径０．３２ｍｍおよび１５ｍｍ／μｌで較正されている；Ｈｅｃｈｔ  Ａｓｓｉｓｔｅｎｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）は、右側線条体（ブレグマに対し３．５側方と５．５腹側）に定位的に埋めこんだ。ＮＭＤＡ（５０ｎｍｏｌ）を容積１μｌで注入し、前記ピペットを３分後にはずした。第一組の実験では、アルテプラーゼ（１ｍｇ／ｋｇ）、デスモテプラーゼ（１ｍｇ／ｋｇ）、アルテプラーゼとデスモテプラーゼ（それぞれ１ｍｇ／ｋｇ）、アルテプラーゼビヒクル（Ｌ−Ａｒｇ  ３５ｍｇ／ｋｇ、リン酸１０ｍｇ／ｋｇおよびポリソルベート８０、０．２％）またはデスモテプラーゼビヒクル（グリシン４ｍｇ／ｋｇおよびマンニトール１０．６４ｍｇ／ｋｇ）の静脈内注射により１５分後に興奮毒性処置を相補した。第二組の実験では、アルテプラーゼ（３μｇ）、デスモテプラーゼ（３μｇ）、アルテプラーゼとＤＳＰＡ（それぞれ３μｇ）またはそれに対応するビヒクルと一緒に、ＮＭＤＡを線条体に共注入した（すべて容積１μｌで）。
【０１３９】
（組織学的分析）
２４時間後、ラットを安楽死させ、全脳を取り出しイソペンタンにおいて凍結させた。体積分析では、２０ごとに１冠状切片（２０μｍ）をチオニンを用いて染色し、全病変にわたって分析した。目的の領域はラットの定位的アトラス（ｓｔｅｒｅｏｔａｘｉｃ  ａｔｌａｓ）を使用して決定した（ＰａｘｉｎｏｓおよびＷａｔｓｏｎ）。画像分析システム（ＢＩＯＣＯＭ  ＲＡＧ  ２００、Ｐａｒｉｓ、Ｆｒａｎｃｅ）を使用して非染色領域により与えられる病変を測定した。
【０１４０】
この分析により、両方が静脈内に共注射された場合には、デスモテプラーゼはｒｔ−ＰＡ媒介神経毒性の影響をアンタゴナイズしたが、線条体に共投与された場合にはアンタゴナイズしない（図１０および１１）ことが示され、このことは、これら２つの血栓溶解薬剤間のＢＢＢレベルでの関連インビボ競合と一致している。
【０１４１】
（結論）
これらの結果により、ＰＡＲＫドメインを含む様々なタンパク質のアルテプラーゼトランスＢＢＢ輸送を阻害する能力が明らかにされている。
【０１４２】
単独のアルテプラーゼ、およびＤＳＰＡα１、ｃＤＳＰＡ、ＤＳＰＡα２、レテプラーゼおよびＫ２（アルテプラーゼ）と共インキュベーションしたアルテプラーゼは、すべて０．３μＭの濃度で、ＢＢＢ完全性に対する毒性の影響を有さなかった。スペクトロザイムアッセイを用いて分析したように、ＤＳＰＡα１およびＤＳＰＡα２は、ＢＢＢを通るアルテプラーゼ輸送をそれぞれ約６７および６２％まで減少することができ、ＤＳＰＡ関連分子を使用してアルテプラーゼの血管から脳移行をブロックすることが可能であることを確証している。類似の結果（約７６％までの減少）が、クロッグＤＳＰＡ、すなわちタンパク質分解活性を発揮しないＤＳＰＡ改変体について得られた。阻害は、アルテプラーゼの酵素電気泳動定量化において確認した。
【０１４３】
さらに、単離されたクリングル２は、アルテプラーゼ輸送を約５０％減少することができた（分光データ、酵素電気泳動により確認された）。
【０１４４】
アルテプラーゼ酵素電気泳動分析により実証されたように、レテプラーゼもアルテプラーゼ移行を阻害することができた。レテプラーゼはタンパク質分解活性を有しているので、その効果はスペクトロザイムアッセイを用いて定量することはできなかった。
【０１４５】
この研究で試験された分子は、おそらくＬＲＰ媒介輸送について競合することによりｒｔ−ＰＡトランスＢＢＢ輸送を阻害することができる。スペクトロザイムデータに従えば、これらの分子は以下のように、Ｋ２（ｔ−ＰＡ）＞ＤＳＰＡα２＞ＤＳＰＡα１＞ｃＤＳＰＡ順にランク付けすることが可能である。
【０１４６】
（Ｂ．抗ＡＴＤ−ＮＲ１抗体によるＴ−ＰＡ神経毒の阻害）
（材料および方法）
組換えＡＴＤ／ロイシン−イソロイシン−バリン結合タンパク質（ＬＩＶＢＰ）様ドメインの作製：ｔ−ＰＡとの相互作用のドメインとして同定された、ＮＲ１のアミノ末端ドメインに対応するアミノ酸１９〜３７１をコードするＮＲ１−１ａサブユニットの領域を、以前記載された通りに、完全長ラットＮＲ１−１ａ  ｃＤＮＡから増幅した（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｍｏｎｒｅａｌら、２００４年）。ｒＡＴＤ−ＮＤ１と命名された組換えタンパク質を、製造業者（Ｑｉａｇｅｎ、Ｆｒａｎｃｅ）により記載されたように、ニッケル親和性マトリックス上で、イソプロピル１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド誘導細菌培養物（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｍ１５株）の封入体から精製した。
【０１４７】
能動免疫：手短に述べると、わずかな改変を加えて以前記載された通りに（Ｂｅｎｃｈｅｎａｎｅら、２００７年）、マウスを、免疫原性混合物：ｒＡＴＤ−ＮＲ１（３０μｇ）を含有する完全フロイントアジュバンド（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｆｒａｎｃｅ、最初の注射に使用される）および不完全フロイントアジュバンド（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｆｒａｎｃｅ、後期注射、３週間中週に１回）の腹腔内注射により免疫化し、ｒＡＴＤ−ＮＲ１を含有しない同一混合物を対照血清として使用した。
【０１４８】
ポリクローナル抗体の作製および精製：能動免疫について記載されたように、最後の接種の２週間後に、ｒＡＴＤ−ＮＲ１または対照アジュバンドで免疫化されたマウスから血清を収集した。次に、ポリクローナル抗体（抗ＡＴＤ−ＮＲ１抗体または対照Ｉｇ）を、血清ヒドロキシアパタイトカラム（Ｐｒｏｔｅｏｇｅｎｉｘ、Ｆｒａｎｃｅ）から精製した。
【０１４９】
免疫ブロッティング：対応する図で言及されるｒＡＴＤ−ＮＲ１（２０μｇ）またはタンパク質抽出物をロードし、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ＰＶＤＦ膜に移した。膜は、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０、５％ドライミルクを含有するトリス緩衝生理食塩水（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓおよび２００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）を用いてブロックした。ブロットを、マウス抗ＡＴＤ−ＮＲ１一次抗体（１：２０００；４℃）、マウス対照Ｉｇ一次抗体（１：２０００；４℃）または対照ヤギヒスチジンタンパク質一次抗体（１：１０００；４℃、Ｑｉａｇｅｎ、Ｆｒａｎｃｅ）のいずれかを用いて終夜曝露させた。マウスまたはヤギペルオキシダーゼ結合体化二次抗体（１：５０００；Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｆｒａｎｃｅ）後、タンパク質を、増強化学発光ＥＣＬ−Ｐｌｕｓ検出システム（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ−ＮＥＮ、Ｆｒａｎｃｅ）を用いて可視化した。
【０１５０】
血栓塞栓性局所脳虚血：以前報告された通りに（Ｏｒｓｅｔら、２００７年）、雄性Ｓｗｉｓｓマウス（２８〜３０ｇ、ＣＥＲＪ、Ｐａｒｉｓ、Ｆｒａｎｃｅ）を、深く麻酔をかけ（イソフルレン５％とＮＯ２／Ｏ２の７０％／３０％混合物を使用して）、定位固定デバイスに置いた。眼窩と耳との間の皮膚を切開し、側頭筋を縮退させた。小規模な開頭手術を実施し、硬膜を切除し中大脳動脈（ＭＣＡ）を曝露させた。ピペットを前記ＭＣＡの管腔に導入し、１μＬの精製されたマウスアルファトロンビン（０．７５ＵＩ、Ｇｅｎｔａｕｒ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）を含気性（ｐｎｅｕｍａｔｉｃａｌｌｙ）に注入し（カテーテルを介してピペットに連結された注射器を用いて正圧をかけることにより）、インサイチュー血餅形成を誘導した。アルファトロンビン注入の１０分後に前記ピペットをはずし、その時間には血餅は安定化している。筋肉および軟組織を元に戻し、切開部を縫合した。脳血流速度を、レーザードップラーフローメトリー（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｏｐｔｒｏｎｉｘ、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）によりモニターし、温度を全外科手術にわたり制御した。血栓溶解を誘導するために、ｒｔ−ＰＡ（１０ｍｇ／ｋｇ、Ａｃｔｉｌｙｓｅ（登録商標）、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を、アルファトロンビン注入の２０分後または４時間後に静脈内に注射した（尾静脈、１０％ボーラス、４０分間中９０％灌流）。対照群に、同一条件下で同容積の生理食塩水を投与した。
【０１５１】
受動免疫：血餅形成の２０分後または４時間後、前記ｒＡＴＤ−ＮＲ１に対して産生された精製ポリクローナル抗体を、０．２ｍｇの抗ＡＴＤ−ＮＲ１または対照免疫グロブリンのボーラス（２００μｌ）により尾静脈に静脈内注射した。
【０１５２】
脳病変の組織学的分析：２４時間後、マウスを麻酔薬過量投与により屠殺し、脳を取り出し、イソペンタンにおいて凍結した。クリオスタットカット冠状脳切片（２０μｍ）を、チオニンを用いて染色し、画像分析機（ＢＩＯＣＯＭ  ＲＡＧ  ２００、Ｐａｒｉｓ、Ｆｒａｎｃｅ）を使用することにより分析した。体積分析では、１０のうちから２０μｍの１つの切片を染色し分析した（全病変にわたって）。目的の領域（梗塞組織に対応する非染色領域）は、マウスの定位的アトラス（ＦｒａｎｋｌｉｎおよびＰａｘｉｎｏｓ、１９９７年）を使用して決定した。梗塞体積は、式：Ｖ虚血性病変＝Ｐ（虚血性病変の面積）切片間の距離に従って、切片の非染色領域の合計×その厚みとして決定した。この方法は、虚血性病変の体積評価の優れた再現性を実証しており、すでに確証されている（Ｏｓｂｏｒｎｅら、１９８７年）。
【０１５３】
ＭＲＩ分析：ＭＲＩ分析は、血餅形成４時間後に生理食塩水またはαＡＴＤ−ＮＲ１抗体を静脈注射されたマウスにおいて実施された血栓塞栓性虚血の２４時間、７２時間、７日、１５日後に実施した。ＭＲＩ実験は、無線周波数送信には７２ｍｍ内径バードケージおよび受信には２５ｍｍ径表面コイルを使用して、Ｐａｒａｖｉｓｉｏｎ４．０ソフトウェア（Ｂｒｕｋｅｒ、Ｅｔｔｌｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いるＰｈａｒｍａｓｃａｎ  ７  Ｔ／１２ｃｍシステム上で実行した。ＭＲＩ実験中、麻酔はイソフラン（ＮＯ２／Ｏ２の７０％／３０％混合物）を使用して維持した。マウスは、麻酔濃度を調整するために、その呼吸数の変化についてモニターした。Ｔ２加重画像を、ＲＡＲＥシークエンス：４アベレージ（ａｖｅｒａｇｅ）のＴＥ／ＴＲ  ４１／３０００ｍｓ（マトリックス２５６×２５６、ＦＯＶ  ２３．７×２０ｍｍ）を使用して取得した。拡散加重画像を、６方向（ｄｉｒｅｃｔｉｏｎ）ＥＰＩ−ＤＴＩシークエンス：方向ごとに２実験（マトリックス  １２８×１２８、ＦＯＶ  ２０．５×１９．２ｍｍ）の２つのｂ値（０と８００ｓ／ｍｍ２）を使用するＴＥ／ＴＲ  ３４／３７５０ｍｓで取得した。ｍｍ２／ｓでの見掛け上の拡散係数（ＡＤＣ）を、単一指数関数モデルを使用してｐｉｘｅｌ−ｂｙ−ｐｉｘｅｌ曲線フィティングにより計算した。血管造影は２アベレージのＴＥ／ＴＲ  １２／７ｍｓ（マトリックス  ２５６×２５６、ＦＯＶ  ２０×２０ｍｍ）を用いて取得した。
【０１５４】
エバンズブルー血管外溢出：エバンズブルー（２００μｌ、２％、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）は、安楽死の３時間前に虚血マウスの静脈内に注射した。前記マウスは、その脳を収集するのに先立ってヘパリン生理食塩水を用いて平均動脈圧で灌流させた。その皮質を解剖し、ドデシル硫酸ナトリウム１％のリン酸緩衝生理食塩水中でホモジナイズし、遠心分離した（１００００ｇ、１５分）。エバンズブルーは６２０ｎｍの吸光度から上清で定量し、各半球の湿重量で割った。各観察は３回繰り返した。
【０１５５】
行動分析：マウスを、脳虚血の２４時間後に包括的神経機能試験に供した。この行動試験は、黒色メタクリル酸壁により形成され、プレキシグラス前扉を特色とするチャンバー（６７×５３×５５ｃｍ、ＢＩＯＳＥＢ（登録商標）、Ｃｈａｖｉｌｌｅ、Ｆｒａｎｃｅ）内で実施した。チャンバーの床は２２本のステンレス鋼の棒（径３ｍｍ、１．１ｃｍの間隔が開いている、中心間）からなり、無条件足ショック刺激の送達のためのスクランブラー付きのショック発生器に配線されていた。マウスの動きにより生じるシグナルを５分間にわたり記録し、高感度重量トランスデューサシステムを用いて分析した。アナログシグナルは、記録および活動／不動（フリージング）の期間により示される可動性のオフライン分析のためにロードセルユニットを通じてフリージングソフトウェアモジュールに伝えられた。対応するハードウェアに関連する追加のインターフェイスにより、フリージングソフトウェアからのショックの強度を制御することが可能であった。
【０１５６】
細胞培養：皮質神経細胞の初代培養物を、胎仔マウス（Ｅ１５−Ｅ１６）から調製した。解離した皮質細胞を、５％ウシ胎仔血清、５％ウマ血清および２ｍｍｏｌ／Ｌグルタミンが補充されたダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）に再懸濁させ、ポリ−Ｄ−リジンとラミニンで前もってコーティングされた２４ウェル皿に蒔いた。３日後、前記細胞を１０μｍｏｌ／ＬのＡｒａ−Ｃに曝露し、グリア細胞増殖を阻害した。培養物をインビトロで１２日後、使用した。
【０１５７】
興奮毒性：それぞれ、ゆっくりとまたは急速に引き起こされた興奮毒性は、神経細胞培養物を、グリシン（１０μｍｏｌ／Ｌ）が補充されたＤＭＥＭにおいて１０μｍｏｌ／Ｌ
ＮＭＤＡに２４時間および５０μｍｏｌ／Ｌ  ＮＭＤＡに１時間曝露することにより３７℃で誘導した。ＮＭＤＡへの曝露は、単独で、またはｒｔ−ＰＡ（２０μｇ／ｍＬ）および／もしくはαＡＴＤ−ＮＲ１もしくは対照Ｉｇ（０．０１ｍｇ／ｍｌ）と組み合わせて実施した。どちらの場合も、神経細胞死は、位相差顕微鏡を使用して２４時間後に評価し、損傷細胞からバス培地（ｂａｔｈｉｎｇ  ｍｅｄｉｕｍ）への乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）放出の測定により定量化した。
【０１５８】
カルシウムビデオ顕微鏡分析：皮質神経細胞の初代培養物に、５μｍｏｌ／Ｌのｆｕｒａ−２／ＡＭと０．１％プルロニックＦ−１２７（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｌｅｉｄｅｎ、ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を含有するＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水をロードし（３７℃で３０分間）、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水中さらに３０分間インキュベートした。実験は、７５ＷキセノンランプおよびＮｉｋｏｎ×４０、１．３開口数落射蛍光油浸対物レンズを備えたＮｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ倒立顕微鏡の試料台上、２２℃で実施した。Ｆｕｒａ−２（興奮：３４０、３８０ｎｍ、放出：５１０ｎｍ）比画像（ｒａｔｉｏ  ｉｍａｇｅ）はＣＣＤカメラ（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ、Ｔｒｅｎｔｏｎ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）を用いて得、Ｍｅｔａｆｌｕｏｒ４．１１ソフトウェア（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃｈｅｒｔｅｒ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）を使用してデジタル化した（２５６×５１２）。
【０１５９】
アポトーシスの誘導：血清欠乏（ＳＤ）は、１０マイクロＭのグリシンが補充された無血清ＤＭＥＭに神経細胞培養物（ＤＩＶ７）を曝露することにより誘導し、以前記載された通りに特徴付けた（Ｋｏｈら、１９９５年；Ｎｉｃｏｌｅら、２００１年ａ、Ｌｉｏｔら、２００４年）。対照は、血清含有の新鮮な培地において維持した。二次的なＮＭＤＡ受容体活性化を防ぐために、ＭＫ−８０１（１マイクロＭ）を添加した。４％パラホルムアルデヒドにおける固定化の前に、細胞を０．４％トリパンブルーを用いて１５分間染色した。ＳＤは、単独で、またはｒｔ−ＰＡ（２０μｇ／ｍＬ）および／または抗ＡＴＤ−ＮＲ１抗体（０．０１ｍｇ／ｍｌ）と組み合わせて実施した。神経細胞損傷は、ウェルあたり３ランダムフィールドにおいてトリパンブルー陽性細胞を計数することにより定量化した。神経細胞死の割合は、神経細胞の総数と比べたＳＤ後のトリパンブルー陽性神経細胞の数として判定した。偽の洗浄対照条件下でのトリパンブルー陽性神経細胞の平均値を実験値から引いた。対応する免疫ブロットの濃度測定分析データ（Ｉｍａｇｅ  Ｊソフトウェア）は、対照条件について得られた平均値に対して正規化した。
【０１６０】
ＭＭＰ−２および−９についてのゼラチン酵素電気泳動分析：ゼラチナーゼアッセイは、虚血マウス脳試料におけるＭＭＰ−９およびＭＭＭ−２レベルを評価するために実施した。手短に述べると、組織ライセート（２５μｇのタンパク質）を、電気泳動のために１ｍｇ／ｍＬゼラチン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｆｒａｎｃｅ）で共重合された１０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上にロードした。電気泳動後、ゲルを２．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で洗浄し、次に展開トリス緩衝液（ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  Ｔｒｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ）と一緒に３７℃で３６時間インキュベートし、その後クーマシーブルーを用いて染色した。次に、ゲルを脱染色し、ＭＭＰ−２および−９バンド強度を定量化した。
【０１６１】
（実施例１：ＮＭＤＡＲ上のｔ−ＰＡの相互作用部位に対する能動免疫は、ｒｔ−ＰＡ誘導後期再灌流を伴なったインサイチュー血栓塞栓性脳卒中のモデルにおいて保護的である）
血漿精製マウストロンビンのＭＣＡへのインサイチュー注入により、マウスにおいて局所虚血を誘導した（Ｏｒｓｅｔら、２００７年）。トロンビン注入直後、レーザードップラーフローメトリーにより測定される脳血流速度（ＣＢＶ）の劇的低下（８０％の平均低下）により血餅形成が証明された（図１２Ｂおよび１２Ｄ）。低灌流は、ｒｔ−ＰＡが静脈内に投与されるのでなければ（早期でも後期でも）、安定的に確立され、ｒｔ−ＰＡ注入後の２５分以内にＣＢＶは、ベースライン値の６０〜７０％まで回復した（図１２Ｂおよび１２Ｄ、ｎ＝１０、ｐ＜０．００１）。２４時間後、処置とは無関係に、すべてのマウスが皮質に限定される脳梗塞（チオニン染色）を示した。早期ｒｔ−ＰＡ誘導血栓溶解（血餅発症の２０分後に開始）は虚血性脳損傷の程度を著しく減少し、平均病変体積は１８．９４ｍｍ３±１．８５（ｎ＝１０）であり、非処置動物（２６．２２ｍｍ３±２．４７；ｎ＝１０；図１２Ａ）と比べて２７．７６％（ｐ＜０．０１）のｒｔ−ＰＡ保護効果を実証した。
【０１６２】
抗原としてＮＭＤＡＲのＮＲ１サブユニットの組換えアミノ末端ドメイン（ｒＡＴＤ−ＮＲ１）を用いたマウスの先行する能動免疫は、血餅形成もｒｔ−ＰＡ誘導再灌流も変化させなかった（図１２Ｂおよび１２Ｄ）。ｒＡＴＤ−ＮＲ１免疫マウスは、脳損傷の顕著な減少を見せた（対照と比べて４３．３％の保護、ｎ＝１０、ｐ＜０．００２）。これらのマウスでは早期（脳卒中の２０分後）ｒｔ−ＰＡ処置により再灌流が生じた場合、病変体積への付加的な有益な効果はなかった（１２Ａ）。血餅形成の４時間後の同じ処置により、ｒｔ−ＰＡは早期再灌流により誘導される程度に匹敵する程度までＣＢＶを回復させることができたが（図１２Ｄ、ｎ＝１０、ｐ＜０．００１）、ｒｔ−ＰＡがｒＡＴＤ−ＮＲ１で免疫されていないマウスに注入された場合、増加した脳損傷と関連していた（ｒｔ−ＰＡ注入動物での２８．６０ｍｍ３と比べてＰＢＳ注入マウスでは２１．５６ｍｍ３、ｎ＝１０、ｐ＜０．００１）。しかし、ｒＡＴＤ−ＮＲ１免疫マウスにおいてｔ−ＰＡを使用して後期血栓溶解を実施すると、脳保護は、免疫されているが生理食塩水を注射された対応するマウスにおいて観察されるのと類似する程度にまで、次に早期血栓溶解を受けている動物において観察されるのと類似する程度にまで回復した（それぞれ、対照およびｔ−ＰＡと比べて５４．９１％および６６．０１％の保護、ｎ＝７、ｐ＜０．０１；図１２Ｃ）。全体でこれらのデータは、ｔ−ＰＡによる早期再灌流は有益であるが、遅延したｒｔ−ＰＡ誘導再灌流は、効率的再疎通にもかかわらず、脳損傷を悪化させることを示している。第二に、前記データは、血栓塞栓性脳卒中のマウスモデルにおけるｒＡＴＤ−ＮＲ１免疫は、単独で、または後期ｔ−ＰＡ誘導血栓溶解の補助剤として脳保護を与えることを示している。
【０１６３】
（実施例２：ＡＴＤ−ＮＲ１に対して産生された抗体は、ｔ−ＰＡ促進ＮＭＤＡＲ媒介神経毒を防ぐ）
実施例１に記載の結果は、ＮＭＤＡ受容体のＮＲ１サブユニットのアミノ末端ドメインに対する抗体は急性虚血脳卒中において有益であるという考えに概念証明を与えた。しかし、能動免疫は急性障害を処置する手段としては実行可能ではないので、本発明者らは、ｒＡＴＤ−ＮＲ１ワクチン接種されたマウス由来の精製された血清免疫グロブリンに基づいて、受動免疫（抗体ベースの免疫治療）の戦略を開発した。本発明者らは先ず、免疫ブロッティングにより、精製されたポリクローナル抗ＡＴＤ−ＮＲ１抗体は免疫原性ペプチドを認識することができることを確かめた。前記抗ＡＴＤ−ＮＲ１抗体は、ヒスチジンタグ（図１３Ａ；３７ｋＤａ）またはＦｃタグ（データは示されていない）のどちらかと結合した２種類のｒＡＴＤ−ＮＲ１を独立して認識することができた。同様に、抗ＡＴＤ−ＮＲ１抗体は、ＮＭＤＡＲのＮＲ１サブユニットの予想される分子量に一致して、ヒト脳組織中の約１２０ｋＤａのタンパク質と相互作用することが見出された（図１３Ｂ）。フロイントアジュバンド混合物注入マウスから精製された対照抗体は、陽性染色を示さなかった（図１３Ａ）。
【０１６４】
次のステップは、ＮＭＤＡ毒性に対するｒｔ−ＰＡの増悪的影響を防ぐこれらの抗体の能力を検証することであった（Ｎｉｃｏｌｅら、２００１年）。高濃度のＮＭＤＡ（５０μＭ）を短期間（１時間）、または中等度濃度のＮＭＤＡ（１０μＭ）を長期間（２４時間）のどちらかに曝露されたマウス皮質神経細胞の初代培養物では、抗ＡＴＤ−ＮＲ１抗体の共投与は、ｒｔ−ＰＡ（０．３μＭ）により誘導される神経細胞消失の促進を完全に防いだ（図１４Ａ、Ｎ＝３、ｎ＝１２、ｐ＜０．０１および図１４Ｂ、Ｎ＝３、ｎ＝１２、ｐ＜０．０１）。対照抗体は、ｔ−ＰＡ促進ＮＭＤＡ誘導神経細胞死に何の効果もなかった（図１４Ｃおよび１４Ｄ）。次に、本発明者らは、興奮毒性パラダイムにおいて観察される影響が、興奮毒性ネクローシスにおける決定的に重要な事象の１つであるＮＭＤＡ誘起Ｃａ２＋流入の調節と相関しているのかどうかを調べた。Ｆｕｒａ−２蛍光ビデオ顕微鏡測定値により、ｒｔ−ＰＡ（０．３μＭ）は培養皮質神経細胞においてＮＭＤＡ誘導Ｃａ２＋流入を約３０％増加させたことが明らかにされた。抗ＡＴＤ−ＮＲ１抗体の共投与は、ＮＭＤＡ媒介カルシウム流入のｒｔ−ＰＡ誘導増強を防いだ（図１５、Ｎ＝３、ｎ＝１０８、ｐ＜０．０５）。対照抗体は効果なしであった（図１５）。興味深いことに、血清欠乏誘導ＮＭＤＡＲ非依存アポトーシス性神経細胞死に対するｔ−ＰＡの有益な非タンパク質分解活性（Ｌｉｏｔら、２００６年）は、抗ＡＴＤ−ＮＲ１抗体の共投与により妨げられず（図２３；Ｎ＝３、ｎ＝１２）、これはＮＭＤＡ受容体を抗体が標的にする際の抗体の特異性を支持する発見であった。
【０１６５】
（実施例３：ＡＴＤ−ＮＲ１を標的にする抗体ベースの免疫療法は神経学的結果を改善し、脳を脳卒中から保護し、ｒｔ−ＰＡ誘導血栓溶解の処置ウィンドウを増加させる）
次に、抗ＡＴＤ−ＮＲ１抗体の治療的価値（受動免疫）をインビボで調べた。先ず、ＮＭＤＡ（１０ｎｍｏｌ）を対照物または精製抗体の単回静脈注射と一緒に線条体に投与することにより、興奮毒性病変をマウスに誘導した。対照動物では、ＮＭＤＡは１７±２ｍｍ３の興奮毒性病変をもたらし、抗ＡＴＤ−ＮＲ１抗体処置マウスでは、病変（９±１ｍｍ３）はサイズが４７．０６％減少した（各群でｎ＝８、ｐ＜０．０１；図２０）。このように、抗ＡＴＤ−ＮＲ１抗体の単回静脈注射により、興奮毒性のこのモデルでは内因性ｔ−ＰＡの有害な影響を防ぐことができる。したがって、次に、抗ＡＴＤ−ＮＲ１抗体（０．８ｍｇ／ｍｌ、静脈内、単回ボーラス；群あたりｎ＝８〜１０）を、マウスの血栓塞栓性脳卒中のモデルにおいて試験した。抗体（対照または抗ＡＴＤ−ＮＲ１）の共投与は、再灌流を誘導する早期ｒｔ−ＰＡ注入の能力を変えなかったことに注目するのが重要である（図１６Ｂ）。早期ｒｔ−ＰＡ誘導血栓溶解は虚血性病変の体積を３１．５３％減少させた（図１６Ａ）。同様に、抗ＡＴＤ−ＮＲ１抗体の早期（発作の２０分後）送達は、著しい脳保護を与えた（対照と比べて４４％の保護、ｎ＝１０、ｐ＜０．００１）。この効果は、抗体がｒｔ−ＰＡ誘導再灌流と組み合わされた場合に改善されなかった（図１６Ａ）。血餅形成の４時間後に実施された場合には、ｒｔ−ＰＡ処置はなお、早期灌流実験の場合と同じくらい効率的にＣＢＶを回復した（図１６Ｄ）（血餅形成後、初期ＣＢＦの８０％対ｒｔ−ＰＡ処置、後８５％、ｎ＝９、ｐ＜０．０１）。しかし、脳病変はこれらの条件下では劇的に悪化した（血餅形成４時間後のｒｔ−ＰＡ注入動物での３３．０３ｍｍ３と比べてＰＢＳ注入マウスでは２４．９０ｍｍ３、ｎ＝１０、ｐ＜０．００２５；図１６Ｃ）。この有害な影響は、ｒｔ−ＰＡが抗ＡＴＤ−ＮＲ１抗体の単回ボーラスと共投与された場合には観察されなかった。むしろ、対照実験（生理食塩水のみ）およびｒｔ−ＰＡ処置と比べて、それぞれ病変体積の５０．５２％および６２．７％の減少が観察された（ｎ＝８、ｐ＜０．００５）。興味深いことに、抗ＡＴＤ−ＮＲ１抗体単独の遅延注入も高度に保護的であった（対照動物と比べた場合−４１％、ｎ＝１０、ｐ＜０．００２）。全体として、これらのデータは、ＮＭＤＡＲシグナル伝達および神経毒に対するｔ−ＰＡの増強効果を標的にする、ＡＴＤ−ＮＲ１に対する抗体の単回静脈内注射の２つの重要な可能性を示している。そのような注射は、それだけで治療的価値があり、第二に、ｒｔ−ＰＡによる血栓溶解の治療ウィンドウも延長することができる。
【０１６６】
閉塞の２４時間後、脳卒中誘導認知障害を文脈的フリージング（ｃｏｎｔｅｘｔｕａｌ
ｆｒｅｅｚｉｎｇ）タスク（ｎ＝１０）（これは不安、記憶および学習過程の包括的認知評価を可能にすると見なされている）において評価した。偽動物と比べて、虚血性マウスは、フリージングの増加（＋２１４％、ｐ＜０．０２５）を示し、これは、αＡＴＤ−ＮＲ１抗体の静脈内投与により劇的に減少する影響である（−１７０％；ｐ＜０．０５）（図１９）。
【０１６７】
（実施例４：ＡＴＤ−ＮＲ１に対する抗体ベースの免疫療法は、脳卒中後のｒｔ−ＰＡ誘導ＢＢＢ溢出を防ぐ）
虚血性脳損傷ならびにｔ−ＰＡの有益な効果または有害な影響は、血液脳関門（ＢＢＢ）と高度に関係しているために、エバンズブルー（ＥＢ）血管外溢出およびマトリックスメタロプロテイナーゼ活性化（ＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９）を上記条件下で評価した。予想通りに、ｒｔ−ＰＡは、ＭＭＰ−９の活性を誘導し、エバンズブルーの脳実質への血管外溢出を増強することができることが見出された。血餅形成後ｒｔ−ＰＡを投与するのが遅くなるに従って、ＭＭＰ−９活性（図１７Ｂおよび１７Ｃ）とＥＢの血管外溢出（図１７Ａ）に対するその効果はそれだけ強くなった。虚血性病変に対するその効果と一致して、抗ＡＴＤ−ＮＲ１抗体単独の早期投与も後期投与も脳卒中により誘導されるＢＢＢ溢出の程度を著しく減少させた（対照血餅動物と比べた場合、血餅形成２０分後、−６３％および血餅発症４時間後、−６８％、ｎ＝３、ｐ＜０．０５；図１７Ａ）。さらに、抗ＡＴＤ−ＮＲ１免疫療法は、ＢＢＢの完全性に対するｒｔ−ＰＡの損傷的影響を効率的に低下させた（対照動物と比べた場合、血餅形成２０分後２８％低下、血餅発症４時間後４２％、ｎ＝３、ｐ＜０．０５；図１７）。同様に重要なことに、ＭＭＰ−９は、ＢＢＢに対するｒｔ−ＰＡの効果における計器（ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｌ）となるが、ｒｔ−ＰＡが共投与されるされないにかかわらず、抗ＡＴＤ−ＮＲ１抗体の存在下で活性の低下を示した（図１７Ｂ）。これらの所見は、前記抗体が、内因性ｔ−ＰＡ（虚血に応答して神経細胞から放出される）から、ならびに外因性ｒｔ−ＰＡからＢＢＢの完全性を保護し、第二に、この保護はＭＭＰ−９の活性の妨害を伴うという結論を与える。
【０１６８】
（実施例５：ＡＴＤ−ＮＲＴ１を標的にする抗体ベースの免疫療法は、脳卒中後に長期の利益を与える）
急性期処置の結果の長期追跡調査は、もっとも高度に臨床的関連性がある。したがって、血餅発症の４時間後に抗ＡＴＤ−ＮＲ１抗体の単回注入を用いて処置された動物のＭＲＩベースの長期追跡調査が、３ヶ月の期間にわたって行われた。Ｔ２  ＭＲＩ分析により、前に観察されたチオニン染色のパターンが明白に確認され、これは、虚血を誘導した２４時間後にはすでに目に見えており、手術後少なくとも１５日間維持された前記抗体の脳保護効果を証明する（対照動物と比べた場合Ｘ％の減少、ｎ＝３、ｐ＜Ｘ；図１８ａ、ｂ）。さらに、ＡＤＣシークエンスにより、抗ＡＴＤ−ＮＲ１抗体を用いて処置された虚血性動物においてあらゆる時点での浮腫の非存在が明らかにされた（図１８ａ、１８ｂ）。
【０１６９】
（結論）
血栓塞栓性脳卒中のマウスモデルにおける血餅発症後の早期（２０分後）または後期（４時間後）に適用された場合、抗ＡＴＤ−ＮＲ１抗体の単回静脈注射は、劇的な神経保護を引き起こすのに十分である。注目すべきは、本発明は、ｒｔ−ＰＡ処置の利益の時間依存性消失を示している点である。早期のｒｔ−ＰＡ誘導再灌流は、この薬物の臨床使用において観察されるように、利益をもたらすが、遅延ｒｔ−ＰＡ誘導再灌流（血餅形成の４時間後）は、再灌流レベルは匹敵するけれども、有害な結果にさえ関連している。この否定的結果は、抗ＡＴＤ−ＮＲ１抗体の共投与により解決され、このことは、神経保護効果を回復させ、さらにこれによってｒｔ−ＰＡ誘導血栓溶解が治療利益を与えることができる時間ウィンドウを延長する。
【０１７０】
さらに、抗ＡＴＤ−ＮＲ１抗体を用いる本発明の免疫療法は、脳虚血に付随し、虚血状態下での後期ｒｔ−ＰＡ処置により増悪するＢＢＢにおける増加（脳内出血の前兆と見なされる）を減らす手段を提供する。これらの観察結果により、抗ＡＴＤ−ＮＲ１抗体に対する治療的関心が強化される。なぜならば、脳浮腫および出血は脳卒中患者の臨床結果不良と関連しているからである。
【０１７１】
留意するとすれば、ｔ−ＰＡは、（ｉ）シナプスの再構築および可塑性、（ｉｉ）周産期発生中の神経細胞移動、（ｉｉｉ）海馬における後期相の長期増強（Ｌ−ＬＴＰ）などの記憶および学習過程に関与する機序の制御、ならびに（ｉｖ）ＢＤＮＦへのプロＢＤＮＦの活性化において極めて重要な生理的機能を果たすことも報告されている。それゆえに、本発明の抗体は、これらの機能に対する考えうる影響について試験された場合において、無害であることが分かっていることに注目するのは重要である。虚血性病変の非存在下では、空間記憶、文脈的およびキュー恐怖条件付けを含む認知機能の変化を同定することはできず、免疫療法の提示される戦略の安全プロファイルを示唆している。
【０１７２】
【数２】
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【０１７３】
【数１】
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【数２】
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【数３】
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【数４】
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【数６】
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【数７】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１３】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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