(57)【要約】【課題】  スクロース及びＮ−アセチルグルコサミンを基質としたβ−フルクトフラノシダーゼによる糖転移反応によるＮ−アセチルスクロサミンの合成反応溶液に例示される糖質混合溶液から、簡便、効率的、低コストかつ安全にＮ−アセチルスクロサミンを精製することを課題とする。【解決手段】  下記ステップＡからＣを少なくとも含む、糖質混合溶液からのＮ−アセチルスクロサミンの精製方法を提供すること等。ステップＡ：Ｎ−アセチルスクロサミンを含む糖質混合溶液中で酵母を培養するステップ、ステップＢ：前記培養後の溶液から酵母を分離するステップ、ステップＣ：カラムクロマトグラフィーによりＮ−アセチルグルコサミン精製画分を得るステップ。【選択図】図８
2014030399.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記ステップＡからＣを少なくとも含む、糖質混合溶液からのＮ−アセチルスクロサミンの精製方法；
ステップＡ：Ｎ−アセチルスクロサミンを含む糖質混合溶液中で酵母を培養するステップ、
ステップＢ：前記培養後の溶液から酵母を分離するステップ、
ステップＣ：カラムクロマトグラフィーによりＮ−アセチルスクロサミン精製画分を得るステップ。
【請求項２】
糖質混合溶液が、スクロース及びＮ−アセチルグルコサミンを基質としたβ−フルクトフラノシダーゼによる糖転移反応によるＮ−アセチルスクロサミンの合成反応溶液である、請求項１に記載のＮ−アセチルスクロサミンの精製方法。
【請求項３】
スクロース及びＮ−アセチルグルコサミンを基質としたβ−フルクトフラノシダーゼによる糖転移反応によるＮ−アセチルスクロサミンの合成が、少なくとも下記ステップａ及びｂを含む、請求項２に記載のＮ−アセチルスクロサミンの精製方法；
ステップａ：β−フルクトフラノシダーゼを保持するコウジ菌菌糸固定化担体に、スクロース及びＮ−アセチルグルコサミンを接触させるステップ、
ステップｂ：前記接触後のコウジ菌菌糸固定化担体において、菌糸に保持されたβ−フルクトフラノシダーゼによる糖転移反応を行い、スクロース及びＮ−アセチルグルコサミンからＮ−アセチルスクロサミンを生成するステップ。
【請求項４】
ステップＣにおけるカラムクロマトグラフィーが活性炭カラムクロマトグラフィーである、請求項１から３のいずれか１項に記載のＮ−アセチルスクロサミンの精製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｎ−アセチルスクロサミンの精製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来から、各種タイプの生理的に役に立つ機能を発揮する単糖及びオリゴ糖類が開発されてきた。これら糖類のほとんどは機能性甘味料として使用され、その多くはバイオマス多糖類の酵素分解または自然界に豊富に存在するオリゴ糖類の酵素的変換で調製されている。最近、バイオマス多糖類であるキチンの加水分解により得られる単糖であるＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）に関し、この糖類の摂取がヒアルロン酸及びコンドロイチンなどのムコ多糖の生産を増加させることが動物実験により確認された。このことから、本単糖の摂取による皮膚の老化防止や変形性関節症の改善が期待されている。
ＧｌｃＮＡｃを構成糖として含むオリゴ糖としては、Ｄ−フルクトースとＧｌｃＮＡｃからなる二糖類であるＮ−アセチルスクロサミン［β−Ｄ−フルクトフラノシル−（２→１）−α−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミニド］が知られている。本発明者らは、β−フルクトフラノシダーゼを保持するコウジ菌固定化担体を用い、ＧｌｃＮＡｃ及びスクロースを基質として、Ｎ−アセチルスクロサミンを合成する方法を報告した（非特許文献１、２）。
しかしながら、この合成反応溶液からＮ−アセチルスクロサミンを精製するためには、活性炭カラムクロマトグラフィーや中圧カラムクロマトグラフィーなど複数のカラムクロマトグラフィーを組み合わせて行なわなければならず、コストや手間がかかるという問題があった。特に中圧カラムクロマトグラフィーは大量の高濃度有機溶媒（エタノールやイソプロパノールなど）を使わなければならいないことや樹脂が大変高価であることから、オリゴ糖の安価な大量精製には適していないという問題があった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】平野ら、「Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ乾燥菌糸を全細胞触媒として用いたＮ−アセチルスクロサミンの合成」、日本応用糖質科学学会誌 応用糖質科学、第１巻、第３号、３９−４０頁（２０１１）
【非特許文献２】平野ら、‘Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ β−Ｄ−ｆｒｕｃｔｏｆｕｒａｎｏｓｙｌ−（２→１）−２−ａｃｅｔａｍｉｄｏ−２−ｄｅｏｘｙ−α−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（Ｎ−ａｃｅｔｙｌｓｕｃｒｏｓａｍｉｎｅ） ｕｓｉｎｇ β−ｆｒｕｃｔｏｆｕｒａｎｏｓｉｄａｓｅ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ｍｙｃｅｌｉａ ａｓ ａ ｗｈｏｌｅ−ｃｅｌｌ ｃａｔａｌｙｓｔ’、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、３５３、２７−３２（２０１２）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、スクロース及びＧｌｃＮＡｃを基質としたβ−フルクトフラノシダーゼによる糖転移反応によるＮ−アセチルスクロサミンの合成反応溶液に例示される糖質混合溶液から、簡便、効率的、低コストかつ安全にＮ−アセチルスクロサミンを精製することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは上記の課題を解決するため、酵母を用いた糖質混合溶液の処理法を検討した。検討に当たり、まずは上記の単糖類やオリゴ糖類に対する酵母の資化性を調べた。これにより、Ｎ−アセチルスクロサミンは酵母(Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ)には資化されないが、糖質混合溶液に含まれる夾雑糖質の多くは資化されることが明らかになり、本発明を完成させるに至った。
本発明は下記のＮ−アセチルスクロサミンの精製方法を提供する。
（１）下記ステップＡからＣを少なくとも含む、糖質混合溶液からのＮ−アセチルスクロサミンの精製方法；
ステップＡ：Ｎ−アセチルスクロサミンを含む糖質混合溶液中で酵母を培養するステップ、
ステップＢ：前記培養後の溶液から酵母を分離するステップ、
ステップＣ：カラムクロマトグラフィーによりＮ−アセチルスクロサミン精製画分を得るステップ。
（２）糖質混合溶液が、スクロース及びＧｌｃＮＡｃを基質としたβ−フルクトフラノシダーゼによる糖転移反応によるＮ−アセチルスクロサミンの合成反応溶液である、上記（１）に記載のＮ−アセチルスクロサミンの精製方法。
（３）スクロース及びＧｌｃＮＡｃを基質としたβ−フルクトフラノシダーゼによる糖転移反応によるＮ−アセチルスクロサミンの合成が、少なくとも下記ステップａ及びｂを含む、上記（２）に記載のＮ−アセチルスクロサミンの精製方法；
ステップａ：β−フルクトフラノシダーゼを保持するコウジ菌菌糸固定化担体に、スクロース及びＧｌｃＮＡｃを接触させるステップ、
ステップｂ：前記接触後のコウジ菌菌糸固定化担体において、菌糸に保持されたβ−フルクトフラノシダーゼによる糖転移反応を行い、スクロース及びＧｌｃＮＡｃからＮ−アセチルスクロサミンを生成するステップ。
（４）ステップＣにおけるカラムクロマトグラフィーが活性炭カラムクロマトグラフィーである、上記（１）から（３）のいずれか１項に記載のＮ−アセチルスクロサミンの精製方法。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によれば、糖質混合溶液から、簡便、効率的、低コストかつ安全にＮ−アセチルスクロサミンを精製することができる。特に、β−フルクトフラノシダーゼを保持するコウジ菌固定化担体を用い、ＧｌｃＮＡｃ及びスクロースを基質として、Ｎ−アセチルスクロサミンを合成する結果得られる合成反応溶液中には、多くの夾雑糖質が存在するが、夾雑糖質の多くを酵母によって資化させることで、活性炭カラムクロマトグラフィーのみによってＮ−アセチルスクロサミンを単一に精製できる。この操作は非常に簡便であり、大量処理が可能であると共に低コストで行える優れた精製法である。また、酵母は繰り返し使用することができ、さらに操作の過程で純粋なＧｌｃＮＡｃも回収できることから、それを再利用することもできる。
本方法を用いることにより、Ｎ−アセチルスクロサミンの製造コストは飛躍的に低減される。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】Ａ．ｏｒｙｚａｅ ＮＢＲＣ１００９５９株乾燥菌糸とセライト５３５からなる顆粒によるスクロースとＧｌｃＮＡｃの間の糖転移反応の概略。図中、化合物の量、濃度、収率は一例である。
【図２】カラムリアクターを用いたＮ−アセチルスクロサミンの連続生産。Ａ：カラムリアクター装置の図を示す。Ｂ：反応液中のＮ−アセチルスクロサミン濃度のＨＰＬＣによる定量結果。
【図３】Ｎ−アセチルスクロサミン製造用リアクターカラム溶出液中に含まれている糖質のＨＰＬＣ分析データ
【図４】Ｎ−アセチルスクロサミンの結晶
【図５】酵母による各種糖質の資化試験の結果
【図６】Ｎ−アセチルスクロサミン製造用リアクターカラム溶出液の酵母処理後の溶液に含まれている糖質のＨＰＬＣ分析データ
【図７】活性炭カラムクロマトグラフィーによって精製されたＮ−アセチルスクロサミンのＨＰＬＣ分析データ
【図８】Ｎ−アセチルスクロサミン製造・精製のスキーム
【発明を実施するための形態】
【０００８】
１．Ｎ−アセチルスクロサミンの精製方法
本発明のＮ−アセチルスクロサミンの精製方法は、下記ステップＡからＣを少なくとも含む、糖質混合溶液からのＮ−アセチルスクロサミンの精製方法である。
ステップＡ：Ｎ−アセチルスクロサミンを含む糖質混合溶液中で酵母を培養するステップ、
ステップＢ：前記培養後の溶液から酵母を分離するステップ、
ステップＣ：カラムクロマトグラフィーによりＮ−アセチルスクロサミン精製画分を得るステップ。
本発明のＮ−アセチルスクロサミンの精製方法は、酵母によって資化される１又は２以上の糖質及びＮ−アセチルスクロサミンが少なくとも含まれる糖質混合溶液からのＮ−アセチルスクロサミンの精製に利用できる。本発明者らは、後述する実施例に記載の通り、スクロース、グルコース、フルクトース及びフラクトオリゴ糖は酵母によって資化されるが、Ｎ−アセチルスクロサミンは全く資化されないことを初めて見出した。スクロース及びＧｌｃＮＡｃを基質としたβ−フルクトフラノシダーゼによる糖転移反応によるＮ−アセチルスクロサミンの合成反応は、例えば後述するコウジ菌菌糸固定化担体を用いたＮ−アセチルスクロサミンの合成方法により行なうことができる。コウジ菌菌糸固定化担体を用いたＮ−アセチルスクロサミンの合成方法によって得られる合成反応溶液には、Ｎ−アセチルスクロサミンと過剰に加えているＧｌｃＮＡｃのほか、基質であるスクロースとスクロース分解物であるグルコースとフルクトース、および糖転移反応副生物であるフラクトオリゴ糖が若干含まれている。したがって、この合成反応溶液は、本発明における糖質混合溶液として好適である。
用いる酵母の種類は特に限定されないが、食用酵母が安全性の観点から特に好ましい。酵母は出芽酵母であっても分裂酵母であってもよい。出芽酵母としては、例えばパン酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ビール酵母、ワイン酵母、清酒酵母等が例示される。分裂酵母としては例えばＳｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ等が例示される。
酵母の培養条件は、夾雑する糖を所望の程度に除去できる程度に酵母が成育する条件である限り特に限定されないが、例えば緩衝液中で約３０℃、１２から２４時間培養することが例示される。
酵母の培養処理により、上述したスクロース及びＧｌｃＮＡｃを基質としたβ−フルクトフラノシダーゼによる糖転移反応によるＮ−アセチルスクロサミンの合成反応溶液の場合、酵母処理溶液中に存在する糖を、ＧｌｃＮＡｃとＮ−アセチルスクロサミンのみにすることができる。
次に、酵母処理溶液から酵母を分離する。分離の方法は特に限定されないが、例えばろ過、遠心分離の方法により行うことができる。なお、分離した酵母はステップＡにおいて再利用することもできる。
ステップＣでは、カラムクロマトグラフィーによりＮ−アセチルスクロサミンの精製画分を得る。糖質混合溶液が、スクロース及びＧｌｃＮＡｃを基質としたβ−フルクトフラノシダーゼによる糖転移反応によるＮ−アセチルスクロサミンの合成反応溶液の場合、酵母処理によってＧｌｃＮＡｃとＮ−アセチルスクロサミンの混合溶液が得られる。この混合溶液から、カラムクロマトグラフィーによりＧｌｃＮＡｃを除去し、Ｎ−アセチルスクロサミン精製画分を得ることができる。カラムクロマトグラフィーは、大量かつ安価にオリゴ糖を精製するために有効な、活性炭カラムクロマトグラフィーが好ましい。活性炭にはＧｌｃＮＡｃ、グルコース、およびフルクトースなどの単糖類は吸着しないが、オリゴ糖であるスクロース、Ｎ−アセチルスクロサミン、およびフラクトオリゴ糖は吸着する。吸着したこれらのオリゴ糖は、例えば５％（ｖ／ｖ）イソプロパノール水溶液で脱着させることができる。つまり、単糖類とオリゴ糖類は活性炭カラムクロマトグラフィーを用いて容易に分離することができる。したがって、カラムリアクター溶出液中に含まれているＮ−アセチルスクロサミン以外のオリゴ糖類を、活性炭カラムクロマトグラフィー精製操作の前段階で取り除くことができれば、Ｎ−アセチルスクロサミンの単離は飛躍的に簡素化される。
２．コウジ菌菌糸固定化担体を用いたＮ−アセチルスクロサミンの合成方法
コウジ菌菌糸固定化担体を用いたＮ−アセチルスクロサミンの合成は、下記ステップａ及びｂを少なくとも含むことを特徴とする。
ステップａ：β−フルクトフラノシダーゼを保持するコウジ菌菌糸固定化担体に、スクロース及びＧｌｃＮＡｃを接触させるステップ、
ステップｂ：前記接触後のコウジ菌菌糸固定化担体において、菌糸に保持されたβ−フルクトフラノシダーゼによる糖転移反応を行い、スクロース及びＧｌｃＮＡｃからＮ−アセチルスクロサミンを生成するステップ。
ステップａにおいて、コウジ菌菌糸固定化担体とは、例えば珪藻土やパーライト粒等、表面に凹凸がある多孔性物質にコウジ菌菌糸を反応しやすい状態に保持した担体を意味し、例えば、担体を含む培地中でコウジ菌を培養するステップ、前記培養後の培地からコウジ菌菌糸固定化担体を分取するステップ、及びコウジ菌菌糸固定化担体を乾燥するステップにより製造することができる。
コウジ菌菌糸固定化担体は、例えば珪藻土を担体として用いる場合、コウジ菌胞子の懸濁液を珪藻土含有培養液に加え、菌糸を適温にて増殖させ、コウジ菌糸と珪藻土から成る顆粒（コウジ菌菌糸固定化珪藻土）を得、培養液をろ過してコウジ菌菌糸固定化珪藻土を分取し、アセトン処理等に例示される脱水処理、乾燥処理を行い、コウジ菌菌糸固定化担体を製造することができる。
コウジ菌菌糸固定化担体に糖基質を接触させる方法は特に限定されないが、例えばバッチ法、カラムリアクター法が例示される。連続生産によるＮ−アセチルスクロサミンの大量生産を行う観点ではカラムリアクター法が特に望ましく、この場合、担体としては例えばパーライト粒等、物理的に強固なものを用いることが望ましい。
ステップｂにおいて、酵素反応は、例えばクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）に例示される緩衝液を酵素反応溶液として適宜選択し、当該酵素反応溶液中に糖基質及びコウジ菌菌糸固定化担体を、適当な条件下で共存させることにより行うことができる。基質溶液中に添加するコウジ菌菌糸固定化担体の量は、反応時間の都合によって当業者が適宜調節することができる。酵素反応の条件は特に限定されないが、例えば２５℃から３０℃で穏やかな震とうさせる等、当業者が適宜選択することができる。
セライトを用いて製造したコウジ菌菌糸固定化担体を用いたＮ−アセチルスクロサミンの合成方法の一例を図１に示す。
本発明者らは、日本応用糖質科学学会誌 応用糖質科学、第１巻、第３号、３９−４０頁（２０１１）、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、３５３、２７−３２（２０１２）において上記方法によるＧｌｃＮＡｃの合成方法を報告した。これら報告により公表された合成方法によって得られる、Ｎ−アセチルスクロサミンを含む糖質混合溶液は、いずれも本発明のＮ−アセチルスクロサミンの精製方法の適用対象として好ましい。また、本発明者らは、糖転移型β−フルクトフラノシダーゼを含有するコウジ菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）の固定化菌糸を充填したカラムリアクターに、高濃度のＧｌｃＮＡｃとスクロースを含む溶液を流すことによって、同酵素の糖転移反応によりＮ−アセチルスクロサミンを長期間にわたり効率良く生産させることに成功した。カラムリアクター法を用いたＮ−アセチルスクロサミンの連続生産については、後述する実施例１を参照されたい。
以下、本発明を実施例により詳述するが、本発明の範囲はこれにより限定されるものではない。
【実施例１】
【０００９】
カラムリアクターを用いたＮ−アセチルスクロサミンの連続生産
（１）コウジ菌菌糸固定化担体の調製
Ａ．ｏｒｙｚａｅ ＮＢＲＣ４２９０の胞子懸濁液 0.1 mLを1 gのパーライト粒を含む9.9 mLの培地（重量／容量にして2％のスクロース、0.5％のペプトン、0.2％のNaNO3、0.1％のK2HPO4、0.05％のMgSO4・7H2O、0.05％のKCl及び0.001％のFeSO4・7H2Oを含む液体培地）に加え、80回転／分の震とう条件下、混合物を3日間28℃でインキュベーションした。インキュベーションの後、表面にA. oryzae菌糸が繁殖したパーライト粒は、No.5A濾紙(桐山製作所、東京、日本)を用いた吸引濾過で回収した。次に、これを30分間冷アセトン 50 mLに浸し、濾紙を用いて吸引濾過で回収した。この操作は二度繰り返した。得られた脱水A. oryzae菌糸が付着したビーズは、室温で吸引器を用いて減圧乾燥し、Ａ．ｏｒｙｚａｅ ＮＢＲＣ４２９０菌糸固定化パーライト粒を得た。乾燥菌糸固定化パーライト中の乾燥菌糸の含有量は、20％であった。
（２）Ｎ−アセチルスクロサミンの連続生産
Ａ．ｏｒｙｚａｅ ＮＢＲＣ４２９０菌糸固定化パーライト粒を詰めたカラム（直径２ ｃｍ×高さ２０ ｃｍ）に１０％（重量／容量）のスクロースと１９．４％（重量／容量）のＧｌｃＮＡｃを含む２０ ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ５．５）を約１００ ｍＬ／日の流速で流し、カラムリアクターによるＮ−アセチルスクロサミンの連続生産を行なった。図２Ａにカラムリアクター装置の図を示す。反応液中のＮ−アセチルスクロサミンは高速液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)にて定量した。その結果、上記の小カラムでもＮ−アセチルスクロサミンの生産量は約２．５〜４．０ ｇ／日となり、少なくとも３０日以上の安定した連続生産が可能であった（図２Ｂ）。このことは、本システムを用いることによりＮ−アセチルスクロサミンの大量生産が可能であることを示す。
Ｎ−アセチルスクロサミンを含むリアクターカラム溶出液中には、原料として過剰に加えたＧｌｃＮＡｃ、未反応のスクロース、スクロース分解物であるグルコースとフルクトース、および副生成物としてのフルクトオリゴ糖（１−ケストース及びニストース）などが含まれている。リアクターカラム溶出液に含まれる糖質のＨＰＬＣ分析データを図３に示す。
なお、リアクターカラム溶出液中には、４２．１ｍｇのＮ−アセチルスクロサミンが溶解している事がＨＰＬＣ定量分析によって確認された。ＨＰＬＣ分析条件は下記に示す。
（ＨＰＬＣ分析条件）
ポンプ；ＬＣ−１０ＡＳ（島津製作所）
検出器；Ｓｈｏｄｅｘ ＲＩ−７１（昭和電工）
カラム；ＣＯＳＭＯＳＩＬ Ｓｕｇａｒ−Ｄ（カラムサイズ；φ４．６ｘ２５０ｍｍ、ナカライテスク社製）
移動相溶媒；７７％（ｖ／ｖ）アセトニトリル水溶液
流速；０．８ｍＬ／分
【実施例２】
【００１０】
Ｎ−アセチルスクロサミンを熱メタノールから結晶化させると、図４Ａに示すように非常に細長い針状の結晶が得られた。また、熱エタノールから結晶化させると、図４Ｂに示すようにやや太い針状結晶が得られた。これらの結晶について融点を測定したところ、いずれも１５６〜１５８℃であった。本二糖の水に対する溶解性は、スクロースと同様に極めて高かった。水を溶媒として用いたときの本二糖の比旋光度［α］D23  （ｃ ０．９７）は８０．７oであった。Ｎ−アセチルスクロサミンのｐＨ ３〜ｐＨ ９における安定性と熱に対する安定性について、スクロースとの比較を行った。その結果、両二糖ともｐＨ  ５、７、９の緩衝液中１００℃で１時間放置しても全く分解しなかったが、ｐＨ ３の緩衝液中では７５、１００℃で１時間放置した場合に単糖への分解が見られた。しかし、Ｎ−アセチルスクロサミンの分解の程度は、スクロースと比べるとかなり低かった。このことから、Ｎ−アセチルスクロサミンはスクロースよりも酸性溶液中で安定であることが分かった。次に、種々のスクロース加水分解酵素に対するＮ−アセチルスクロサミンの分解性を調べた。酵素としては、酵母のβ−フルクトフラノシダーゼ(三菱化学フーズ社製)、ラット小腸のスクラーゼ(シグマ社製)およびＣａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、３５３、２７−３２（２０１２）に記載の方法により調製したコウジ菌の糖転移型β−フルクトフラノシダーゼおよび加水分解型β−フルクトフラノシダーゼを用いた。その結果、これらの二糖の希薄溶液中で、スクロースは用いた全ての酵素によって速やかに加水分解されたが、Ｎ−アセチルスクロサミンはコウジ菌の糖転移型β−フルクトフラノシダーゼによってのみ加水分解が確認された。このことは、Ｎ−アセチルスクロサミンは、スクラーゼや加水分解型β−フルクトフラノシダーゼの基質にならないことを示している。
【実施例３】
【００１１】
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来の乾燥酵母粉末（日清フーズ社製、商品名；スーパーカメリア・ドライイースト）１０ ｍｇを、１４６ ｍＭ濃度で各々の糖が溶解した２０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液に添加し、１００回転／分で震盪させながら３０℃で培養を行なった。酵母による培養液中の各糖の資化の様子は、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）とＨＰＬＣによって経時的に確認した。
ＴＬＣ及びＨＰＬＣの条件を下記に示す。
（ＴＬＣ分析条件）
ＴＬＣプレート；シリカゲル６０、メルク社製
展開溶媒；ｎ−ブタノール／ピリジン／水  ８：３：１（ｖ／ｖ／ｖ）
展開回数；２回
展開温度；３０℃
試料発色；２．４％リンモリブデン酸、５％硫酸、１．５％リン酸を含む水溶液を噴霧した後、ヒートガンにて加熱して試料スポットを発色させた。
（ＨＰＬＣ分析条件）
ポンプ；ＬＣ−１０ＡＳ（島津製作所）
検出器；Ｓｈｏｄｅｘ ＲＩ−７１（昭和電工）
カラム；ＣＯＳＭＯＳＩＬ Ｓｕｇａｒ−Ｄ（カラムサイズ；φ４．６ ｘ ２５０  ｍｍ、ナカライテスク社製）
移動相溶媒；７７％（ｖ／ｖ）アセトニトリル水溶液
流速；０．８ ｍＬ／分
以上の実験の結果、図５−Ａに示されるように、グルコース、フルクトース、スクロース、１−ケストース、およびニストースは培養２４時間目には全て酵母によって資化されたが、ＧｌｃＮＡｃとＮ−アセチルスクロサミンについては培養２４時間目においても残存していることが分かった。また、ＧｌｃＮＡｃとＮ−アセチルスクロサミンについてＨＰＬＣ定量分析を行なったところ、培養２４時間目においてもこれらの糖質は全く減少していなかった（図５−Ｂ）。
以上の実験結果を受けて、リアクターカラム溶出液に乾燥酵母を添加し、ＧｌｃＮＡｃとＮ−アセチルスクロサミン以外の糖質を全て酵母によって資化させることで取り除くことを検討した。
【実施例４】
【００１２】
実施例１と同様の方法により得たリアクターカラム溶出液１００ ｍＬに２ ｇのＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来の乾燥酵母（日清フーズ社製、商品名；スーパーカメリア・ドライイースト）を添加し、１００回転／分で震盪させながら３０℃で培養を行なった。培養２４時間後、酵母細胞はセライトを濾過助材として用いた濾過によって取り除き、得られた濾液中の糖質についてはＨＰＬＣによって確認した。
（ＨＰＬＣ分析条件）
ポンプ；ＬＣ−１０ＡＳ（島津製作所）
検出器；Ｓｈｏｄｅｘ ＲＩ−７１（昭和電工）
カラム；ＣＯＳＭＯＳＩＬ Ｓｕｇａｒ−Ｄ（カラムサイズ；φ４．６ ｘ ２５０ ｍｍ、ナカライテスク社製）
移動相溶媒；７７％（ｖ／ｖ）アセトニトリル水溶液
流速；０．８ ｍＬ／分
以上の実験の結果、ＧｌｃＮＡｃとＮ−アセチルスクロサミン以外のリアクターカラム溶出液中の糖質（グルコース、フルクトース、スクロース、１−ケストース、ニストース、および未確認オリゴ糖）は、培養２４時間目には全て酵母によって資化されていることがＨＰＬＣ分析データから分かった（図６）。
次に、得られた濾液からＮ−アセチルスクロサミンを活性炭カラムクロマトグラフィーによって精製した。
【実施例５】
【００１３】
実施例４によって得られた濾液を活性炭カラム（φ５．５ ｘ １８ ｃｍ、移動相溶媒；水）に負荷し、水を流すことによってＧｌｃＮＡｃを全て溶出させた後、活性炭に吸着しているＮ−アセチルスクロサミンを５％（ｖ／ｖ）イソプロパノール水溶液を流すことによって脱着・溶出させた。得られたＮ−アセチルスクロサミンの溶液は、エバポレーターによって濃縮・乾固させた。その後、少量の水を加えて再びＮ−アセチルスクロサミンを溶解し、凍結乾燥を行うことで白色粉末状のＮ−アセチルスクロサミンを得た。
得られたＮ−アセチルスクロサミン溶出液についてＨＰＬＣ分析を行って純度を確認したところ、図７に示したように単一であることが確認された。
（ＨＰＬＣ分析条件）
ポンプ；ＬＣ−１０ＡＳ（島津製作所）
検出器；Ｓｈｏｄｅｘ ＲＩ−７１（昭和電工）
カラム；ＣＯＳＭＯＳＩＬ Ｓｕｇａｒ−Ｄ（カラムサイズ；φ４．６ ｘ ２５０ ｍｍ、ナカライテスク社製）
移動相溶媒；７７％（ｖ／ｖ）アセトニトリル水溶液
流速；０．８ ｍＬ／分
また、上記の実験により、３．０８ ｇのＮ−アセチルスクロサミン粉末を得ることができた。用いたリアクターカラム溶出液１００ ｍＬ中には、３.４ ｇのＮ−アセチルスクロサミンが溶解していることが先のＨＰＬＣ定量分析によって確認されているので、リアクターカラム溶出液から実施例４および実施例５の操作により９０.６％のモル収率でＮ−アセチルスクロサミンを単離することができたことになる。また、純粋なＧｌｃＮＡｃを回収することもできた。以上の操作について、図８にまとめて示した。
Ａ．ｏｒｙｚａｅ ＮＢＲＣ１００５３７菌糸固定化担体のカラムリアクターの溶出液を用い、実施例４および５と同様の操作により４．０８ｇのＮ−アセチルスクロサミンを単離した。
Ｎ−アセチルスクロサミン製造用リアクターカラムの溶出液中に含まれている夾雑糖質の多くを酵母によって資化させることで、活性炭カラムクロマトグラフィーのみによってＮ−アセチルスクロサミンを単一に精製できた。この操作は非常に簡便であり、大量処理が可能であると共に低コストで行える優れた精製法である。また、酵母は繰り返し使用することができ、さらに操作の過程で純粋なＧｌｃＮＡｃも回収できることから、それを再利用することもできる。
本方法を用いることにより、Ｎ−アセチルスクロサミンの製造コストは飛躍的に低減された。
【産業上の利用可能性】
【００１４】
本発明は、簡便、効率的、低コストかつ安全なＮ−アセチルスクロサミンの精製に利用できる。
【図３】
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【図６】
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【図７】
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【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図８】
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