(57)【要約】【課題】全HDL-C並びにApoE-containing HDL-C及びApoE-deficient HDL-CのHDL亜分画中のコレステロールを別々に又は同時に定量する方法の提供。【解決手段】ApoE containing HDLを含む全HDL中のコレステロールの定量方法であって、被検試料中に、コレステロールエステラーゼ、ペルオキシダーゼの存在下で終濃度0.9 U/ml以上のコレステロールオキシダーゼを添加することを特徴とするApoE containing HDLを含む全HDL中のコレステロールの定量方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ApoE containing HDLを含む全HDL中のコレステロールの定量方法であって、
被検試料中に、コレステロールエステラーゼ、ペルオキシダーゼの存在下で終濃度0.9 U/ml以上のコレステロールオキシダーゼを添加することを特徴とするApoE containing HDLを含む全HDL中のコレステロールの定量方法。
【請求項２】
前記コレステロールオキシダーゼが第1試薬および／または第２試薬いずれかに存在することを特徴とする請求項１記載のApoE containing HDLを含む全HDL中のコレステロールの定量方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高密度リポ蛋白（HDL）中のコレステロール（−Ｃ）の定量方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
HDLは、動脈硬化壁を含めた各組織からコレステロールを受け取るので細胞内に蓄積したコレステロールの除去作用に関係し、冠動脈硬化症をはじめとする各種動脈硬化症の危険予防因子であり、その血中レベルは動脈硬化性疾患の発症予知に有用な指針となることが知られている。
【０００３】
HDLはアポタンパクとよばれるタンパク質と、リン脂質、コレステロール、中性脂肪といった脂質成分の複合体であるが、その成分の一つであるアポリポタンパク質Ｅ（ApoE）の含量比率の違いからApoE containing HDLとApoE deficient HDLの亜分画に分類することが出来る。ApoE containing HDLは、コレステロール引き抜き能が強く、抗血小板作用もあり、HDLの中でも超善玉リポタンパクとして注目されている。最近では、スタチンに次ぐ脂質異常症治療薬として、HDL-Cを上昇させるコレステロールエステル輸送蛋白（CETP）阻害薬に期待が寄せられている。CETP阻害薬はHDLのうち特にApoE containing HDLを主に増加させることが知られている。
【０００４】
HDL中のコレステロールの測定方法としては、例えば超遠心分離によってHDLを他のリポ蛋白と分離した後、コレステロール測定に供する方法や、電気泳動によって分離した後に脂質の染色を行なってその発色強度を測定する方法等が知られている。しかしながら、これらの方法は、いずれも操作が煩雑であり、多数の検体を処理できない等の問題があり、日常的にはほとんど用いられていない。
【０００５】
HDL中のコレステロールの測定方法として、検体に沈殿剤を加えてHDL以外のリポ蛋白質を凝集させ、これを遠心分離によって取り除き、分離されたHDLのみを含む上清中のコレステロールを測定する方法がある。この方法では使用する沈殿剤の種類によってHDLの亜分画に対する反応性が異なることが知られており、リンタングステン酸−マグネシウムやデキストラン硫酸−マグネシウム、ヘパリン−カルシウムを沈殿剤として用いた方法ではApoE containing HDLはVLDL、LDL等のリポタンパクと共に凝集し、遠心分離により沈殿分画として取り除かれるため、HDL分画として測定できない。一方、ヘパリン−マンガンやポリエチレングリコール（PEG）を用いた方法ではApoE containing HDLは凝集せずHDLとして測定される。いずれにしろこの沈殿剤を使用してHDLを分離し定量する方法は、超遠心法や電気泳動法に比較して簡便であるものの、沈殿剤を加えて分離する操作を含むため、簡便性で満足できるものでなく、また比較的多量の検体量を必要とする。
【０００６】
近年ではHDL-Cを定量する簡便な方法として、沈殿剤を用いた前処理操作なく、自動分析装置でHDL-Cを定量する方法が知られており、コレステロールエステラーゼやコレステロールオキシダーゼ酵素を化学修飾し、シクロデキストリン等の包接化合物存在下においてHDL中のコレステロールを特異的に捕える方法（特許文献１を参照）やHDL以外のリポ蛋白と凝集体や複合体を形成させ、その後にHDL中のコレステロールを酵素的反応で捕える方法（特許文献２及び３を参照）、HDLに特異的に作用するHLBが１３〜１４の界面活性剤を用いる方法（特許文献４を参照）等が知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開平7-301636号公報
【特許文献２】特開平8-131197号公報
【特許文献３】特開平8-201393号公報
【特許文献４】WO98/26090
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
現在の自動分析装置でHDL−Ｃを定量する方法はHDL−Ｃを簡便に測定できるものの、粒子サイズが大きくApoE containing HDL亜分画に対する反応性が十分でなく、これらを含めた全HDL-Cを正確に測定することができない。特にCETP欠損症ではHDLが高値となる場合があるが、これらの症例では粒子サイズが大きくApoE containing HDLの割合が増加しており、これらの亜分画反応性が不十分な試薬では測定値が負誤差となる。また、CETP阻害剤のようなHDL-Cを上昇させる薬剤の治療効果を判定する場合は、結果を見誤る可能性がある。従って、これらHDL亜分画を正確に測定する全HDL−Ｃ測定技術は重要である。
【０００９】
本発明の目的は、HDLサブフラクション、特に粒子サイズが大きくApoE containing HDLを含めた全HDL-Cを簡便に定量する汎用の自動分析装置対応の方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本願発明者らは、鋭意研究の結果、特定の界面活性剤の存在下でコレステロールオキシダーゼの濃度を規定することにより、特に粒子サイズが大きくApoE containing HDLの反応性を高めることができ、全HDL−Ｃを正確に定量できることを見出した。
【００１１】
このように、本発明は、被検試料中の粒子サイズが大きくApoE containing HDLを含めた全HDL−Ｃの定量方法を提供する。
【００１２】
すなわち、本発明は以下の通りである。
[１]ApoE containing HDLを含む全HDL中のコレステロールの定量方法であって、被検試料中に、コレステロールエステラーゼ、ペルオキシダーゼの存在下で終濃度0.9 U/ml以上のコレステロールオキシダーゼを添加することを特徴とするApoE containing HDLを含む全HDL中のコレステロールの定量方法。
[２]前記コレステロールオキシダーゼが第1試薬および／または第２試薬いずれかに存在することを特徴とする[１]のApoE containing HDLを含む全HDL中のコレステロールの定量方法。
【００１３】
また、本発明は以下の通りである。
（１）ApoE-containing HDLを含むHDLとコレステロールエステラーゼ、ペルオキシダーゼ及びコレステロールオキシダーゼとを反応液中で混合する工程を含む前記HDL中の総コレステールを定量する方法であって、前記反応液中のコレステロールオキシダーゼの含有量が0.9U/ｍL以上である、前記方法。
（２）前記工程が、HDL以外の亜分画リポ蛋白を取り除く第１工程及びApoE-containing HDLを含むHDL中の総コレステロールを特異的に定量する第２工程を少なくとも含む、（１）に記載の方法。
（３）ApoE-containing HDLを含むHDL中の総コレステロールを特異的に定量する第２工程におけるコレステロールオキシダーゼの含有量が0.9U/ｍL以上である、（２）に記載の方法。
（４）ApoE-containing HDLを含むHDLが採取された血液検体に含まれるHDLである、（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
【発明の効果】
【００１４】
従来のHDL中のコレステロールを測定する方法では、ApoE containing HDL中のコレステロールを正確に定量することができず、結果として全HDL中コレステロールを正確に定量することは困難であった。本発明の方法においては、ApoE containing HDLを含むHDL中のコレステロールを酵素を用いて測定する方法において、コレステロールオキシダーゼを特定の濃度で用いることにより、ApoE containing HDLの酵素に対する反応性を高め、ApoE containing HDLを多く含むHDL中コレステロールを正確に定量することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】HDL試料に対して、本発明の実施例１の方法により測定した場合の13％PEG沈殿法に対する％バイアスを示す図である。
【図２】HDL試料に対して、本発明の実施例2の方法により測定した場合の13％PEG沈殿法に対する％バイアスを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明について詳細に説明する。
リポ蛋白中に含まれるコレステロールとしては、エステル型コレステロール（コレステロールエステル）及び遊離型コレステロールがある。本明細書において、単に「コレステロール」という場合には、これらの両者を包含する。
【００１７】
リポ蛋白は大きくVLDL、LDL及びHDLの分画に分けられる。このうち、HDLはApoEの含量比率の違いからApoE containing HDLとApoE deficient HDLの亜分画に分類することが出来る。通常、ApoE containing HDLはHDL中にApoEを含有したもの、ApoE deficient HDLはApoEを含有しないものを示す。HDLをApoE containing HDLとApoE deficient HDLに分けているのは、これらのリポ蛋白では動脈硬化に対する作用機序が異なるので、分別測定する必要があったからである。すなわち、ApoE-containing HDLはコレステロール引き抜き能が強く、抗血小板作用もあり、HDLの中でも善玉として作用している。また、脂質異常症治療薬としてHDL-Cを上昇させるCETP阻害薬でも主にApoE-containing HDLが上昇することが知られている。また、ApoEが存在するか又は含有量が多いHDLをApoE-rich HDLと呼ぶことがあるが、これもApoE-containing HDLに含まれる。HDL内部に存在するApoE含有量の分布は連続しているので、リポ蛋白中のApoE含有比により、明確にApoE containing HDLとApoE deficient HDLを区別できるものではないが、後述のように例えばApoE含有量を指標にクロマトグラフィー等によりHDLを分画した場合、特定のApoE含量を定め、その値によりApoE-containing HDLとApoE-deficient HDLを区別すればよい。
【００１８】
またHDLは密度の違いによってHDL２とHDL３に分類することができ、それぞれについてApoE 含有量の違う、ApoE containing HDL２、及びApoE containing HDL３が存在する。また粒子サイズの大きい大型のHDLには通常存在するアポリポタンパクＡ１（ApoA1）が欠損しており、ApoEが多数存在するものがあるが、これもApoE containing HDLに含まれる。リポ蛋白粒子サイズの直径は、報告者により異なるがVLDLが30nm〜80nm（30nm〜75nm）で、LDLが22nm〜28nm(19nm〜30nm)、HDLが直径７〜10nmである。比重は、VLDLが1.006以下、LDLが1.019〜1.063、HDLが1.063〜1.21である。
【００１９】
本発明の方法においては、ApoE containing HDLを含む全HDL中のコレステロール、すなわちApoE-containing HDL及びApoE-deficient HDLの両方を含む全HDL中のコレステロールの測定を目的とする。
【００２０】
本発明の方法において測定に供される被検試料としては、HDL、LDL、VLDL及びCM等のリポ蛋白を含む可能性がある試料であればいずれのものでもよく、例えば、血清、血漿等の体液やその希釈物を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。
【００２１】
本発明の方法は通常、自動分析装置を用いて行われる。本発明の方法の工程数は限定されないが、好ましくは第１工程と第２工程の２つの工程により行われる。第１工程において、VLDL、LDL等のHDL以外のリポ蛋白を反応系外に導いて、第２工程において、ApoE containing HDLを含む全HDL中のコレステロールを測定することができ、また第１工程において、VLDL、LDL等のHDL以外のリポ蛋白を反応系外に導かずに、第２工程において、ApoE containing HDLを含む全HDL中のコレステロールを測定することもできる。
【００２２】
例えば、第1工程において、CM、VLDL、LDL等のHDL以外のリポ蛋白を反応系外へ導く。その結果、ApoE-containing HDL及びApoE-deficient HDLの亜分画HDLが残り、第２工程で反応することになる。すなわち、コレステロールエステラーゼを被検体試料と反応させ、生じたコレステロールをコレステロールオキシダーゼ又はコレステロールデヒドロゲナーゼ等のコレステロール反応酵素の存在下で反応させ反応系外へ導く。この際、反応系外に導こうとするHDL以外のリポ蛋白に反応性を有する特定の界面活性剤の存在下で反応を起こさせる。この場合、第１工程にはHDLに作用する界面活性剤は添加しない。ここで、リポ蛋白のコレステロールを反応系外に導くとは、CM、VLDL及びLDLなどのリポ蛋白に含まれるコレステロールが測定対象であるApoE-containing HDL及びApoE-deficient HDLの亜分画HDLを含むHDL-Cの定量に影響を及ぼさないように、上記HDL以外のリポ蛋白に含まれるコレステロールを消去、凝集させたり、後の工程で反応しないよう阻害すること等を言う。
【００２３】
消去とは被検体試料中のリポ蛋白コレステロールを分解し、その分解物が次の工程において検出されないようにすることを意味する。リポ蛋白コレステロールを消去するための方法としては、コレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼを作用させ発生した過酸化水素を、カタラーゼを用いて水と酸素に分解する方法が挙げられる。また、ペルオキシダーゼを用いて水素供与体と発生した過酸化水素を反応させ無色キノンに転化してもよいが、これらに限定されるものではない。
【００２４】
また、第１工程において、CM、VLDL、LDL等のHDL以外のリポ蛋白を反応系外へ導かず、第２工程において、前記HDL以外のリポ蛋白が反応しない条件で、ApoE containing HDLを含む全HDLのみを反応させて、第２工程でApoE-containing HDL及びApoE-deficient HDLの亜分画HDLを反応させてもよい。
【００２５】
本発明者等は、界面活性剤の存在下でApoE containing HDLに対する反応性を上げる条件が存在することを見いだした。例えば、実施例１に示すように、HDL-C高値でApoE containing HDLを含む検体に対する反応性を検討した。その結果、コレステロールオキシダーゼを高濃度で使用することによりApoE containing HDLの反応性が増加することが確認できた。その結果、第２工程において、ApoE containing HDLを含む全HDLが反応し、ApoE containing HDLを含む全HDL中のコレステロールを定量することができる。
【００２６】
コレステロールオキシダーゼは第１試薬（第１工程で添加する）または第２試薬（第２工程で添加する）いずれかに単独で添加してもよいし、両方に存在していても良い。ただし、第1工程にて、HDL以外のリポ蛋白に反応性を有する界面活性剤の存在下でHDL以外のリポ蛋白をコレステロールエステラーゼの存在下で被検体試料と反応させ、生じたコレステロールをコレステロールオキシダーゼの存在下で反応させ反応系外へ導く場合には、第１試薬中に存在させることが必要である。
【００２７】
上記コレステロールオキシダーゼを第１工程のみで添加して用いる場合、第１試薬中のコレステロールオキシダーゼ濃度は１．２から３．２Ｕ／ｍｌ（第１試薬と第２試薬を添加したときの混合溶液中の最終濃度は０．９から２．４Ｕ/ｍｌ）が好ましく、１．６から２．０Ｕ／ｍｌ（第１試薬と第２試薬を添加したときの最終濃度は１．２から１．５Ｕ/ｍｌ）が特に好ましい。コレステロールオキシダーゼを第２工程のみで添加して用いる場合、第２試薬中のコレステロールオキシダーゼ濃度は１．２から７．２Ｕ／ｍｌ（第１試薬と第２試薬を添加したときの混合溶液中の最終濃度は０．３から１．８Ｕ/ｍｌ）が好ましく１．６から３．６Ｕ／ｍｌ（第１試薬と第２試薬を添加したときの最終濃度は０．４から０．９Ｕ/ｍｌ）が特に好ましい。第１試薬および第２試薬両方に存在させる場合、第２試薬添加後の混合溶液中の最終濃度は０．９から２．４Ｕ／ｍｌが好ましく、１．２から１．５Ｕ／ｍｌが特に好ましい。
【００２８】
本発明の反応には上記濃度のコレステロールオキシダーゼに加えて、HDLに反応する界面活性剤、すなわちApoE containing HDLおよびApoE deficient HDLの両方に反応する界面活性剤を用いる必要がある。HDLに反応する界面活性剤としては、ApoE containing HDL反応率／ApoE deficient HDL反応率比が0.7以上、1.3未満の界面活性剤、好ましくはApoE containing HDL反応率／ApoE deficient HDL反応率比が0.8以上、1.2未満の界面活性剤が挙げられる。
【００２９】
ここで、界面活性剤のリポ蛋白への反応性は、該界面活性剤の存在下でリポ蛋白にコレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼを作用させた場合に、コレステロールの反応する程度を指標に評価することができる。具体的には、例えば、後記の実施例１に示す方法で、第２試薬に種々の界面活性剤を含ませ測定を行うことによりその界面活性剤のリポ蛋白に対する反応性を測定することができる。ApoE-containing HDLに対する界面活性剤の反応量とApoE-deficient HDLに対する界面活性剤の反応量を測定し、それぞれの試料中の総コレステロール量との比（「ApoE-containing HDL反応率／ApoE-deficient HDL反応率比」と言う）を求めればよい。それより、ApoE-containing HDL反応率／ApoE-deficient HDL反応率比を算出することができる。
【００３０】
具体的には、陰イオン界面活性剤としてはアルキルベンゼンスルホン酸ナトリウムが、非イオン界面活性剤としてはポリオキシエチレンモノラウレート、ラウリルアルコールアルコキシレート、ポリオキシエチレンラウリルアミン、ポリオキシエチレンベンジルフェニルエーテル誘導体、分子量1700未満のポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックポリマー、HLB13.0以上14.5未満のポリオキシエチレンノニルフェニルエーテルが、両性界面活性剤としてはアルキルジメチルアミノ酢酸ベタイン、アルキルカルボキシメチルヒドロキシエチルイミダゾリウムベタインが挙げられる。
【００３１】
具体的な界面活性剤の例として、陰イオン界面活性剤としては、ニューレックスソフト60-N、ニューレックスパウダーF、ニューレックスペーストH（以上日本油脂社製）、ネオペレックスNo.1-F、ネオペレックス  G-65、エマール  NC-35（以上、花王社製）、非イオン界面活性剤の例として、アデカトールLB70、アデカトール  LB-103、アデカトール  LB-93（以上旭電化社製）、ディスパノールK-3、ノニオンL-4、ノニオンMN-811、ノニオンNS-210、ノニオンNS-212、ナイミーンL-202、プロノン102、プロノン204（以上日本油脂社製）、ノニポール85、ノニポール95、ノニポール100、ノニポール120（以上三洋化成社製）、エマルゲンB66（花王）、両性界面活性剤の例としてアンヒトール24B（花王社製）、ニッサンアノンBF、ニッサンアノンGLM-R-LV、ニッサンアノンLG（以上日本油脂社製）等が挙げられる。
【００３２】
本発明の方法において、上記のApoE-containing HDL及びApoE-deficient HDLの両方に反応性を有する界面活性剤は第２工程において添加し用いることができる。また、第１工程においてコレステロールオキシダーゼを添加しない場合は、第１工程でApoE-containing HDL及びApoE-deficient HDLの両方に反応性を有する界面活性剤を添加してもよい。この場合、第１工程中の濃度として0.05ｇ／L〜2.0ｇ／Lが好ましく、0.1ｇ／L〜1.0ｇ／Lがより好ましい。第２工程中の濃度としては0.15ｇ／L〜6.0ｇ／Lが好ましく、0.3ｇ／L〜3.0ｇ／Lがより好ましい。
【００３３】
さらに、上記界面活性剤を第２工程で用いる場合、第１工程でHDL以外のCM、VLDL、LDL等のリポ蛋白を消去し、HDL-Cに対する特異性を上げることができる。
【００３４】
HDL以外のリポ蛋白を消去する方法として、カタラーゼを用いる方法、及び無色キノンを形成する方法を挙げることができる。HDLに作用する界面活性剤の非存在下において、被検試料にコレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼを作用させ、生じたHDL以外のリポ蛋白由来の過酸化水素を除去する。コレステロールエステラーゼの作用により、リポ蛋白中のエステル型コレステロールが加水分解されて遊離型コレステロールと脂肪酸が生じる。次いで、この生じた遊離型コレステロールと元々リポ蛋白中に存在する遊離型コレステロールがコレステロールオキシダーゼの作用で酸化されてコレステノンと過酸化水素が生じる。この生じた過酸化水素を除去することによりリポ蛋白を消去することができる。過酸化水素を除去する方法としては、カタラーゼを作用させて水と酸素に分解する方法、及びペルオキシダーゼの作用により、例えばDAOS（Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシスルホプロピル）−３，５−ジメチオキシアニリン）のような、過酸化水素と反応して無色キノンを生じるフェノール系又はアニリン系水素供与体化合物と反応させて過酸化水素を無色キノンに転化する方法等を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。
【００３５】
上記の方法により、第１工程において、HDL以外のリポ蛋白中のコレステロールが大部分消去され、第２工程での反応によりHDL又はApoE-containing HDL及び／又はApoE-deficient HDLのHDL亜分画中のコレステロールのみがより特異的に定量される。
【００３６】
上記第１工程においては、HDLに作用する界面活性剤の非存在下において行う。こうすることによりHDL中のコレステロールはほとんど反応せず、LDL、VLDL、CM等の他のリポ蛋白中のコレステロールが反応して消去される。この結果、次の第２工程においてHDL中のコレステロールが選択的に定量される。
【００３７】
第１工程の反応液中のコレステロールエステラーゼの濃度は０．２〜１．０Ｕ／ｍｌ程度が好ましい。さらに、カタラーゼの濃度は４０〜１００Ｕ／ｍｌ程度が好ましく、ペルオキシダーゼの濃度は０．４〜１．０Ｕ／ｍｌ程度が好ましい。また、過酸化水素と反応して無色キノンを生じる化合物の濃度は０．４〜０．８mmol/l程度が好ましい。
【００３８】
第１工程の反応は、pH５〜８の緩衝液中で行なうことが好ましく、緩衝液としてはリン酸、グリシン、トリス及びグッドの緩衝液が好ましい。特にグッドの緩衝液であるBis-Tris、PIPES、MOPSO、BES、HEPES及びPOPSOが好ましく、緩衝液の濃度は１０〜５００ｍＭ程度が好ましい。
【００３９】
第１工程で、HDL以外のリポ蛋白の消去効率を高めるために、反応液中に２価の金属イオンを含ませてもよい。２価の金属イオンとしては銅イオン、鉄イオン及びマグネシウムイオンを好ましく使用することができるが、特にマグネシウムイオンが好ましい。２価の金属イオンの濃度は５〜２００ｍＭ程度が好ましい。
【００４０】
さらに、第１工程の反応液中には、任意的に、リポ蛋白加水分解酵素を加えることもできる。この酵素を加えることにより、特にVLDL中のコレステロールが反応し易くなるので好ましい。この酵素の反応液中の濃度は、５．０〜１０．０Ｕ／ｍｌ程度が好ましい。
【００４１】
第１工程の反応温度は２５℃〜４０℃程度が適当であり、３７℃が最も好ましい。また、反応時間は２〜１０分間程度でよい。
【００４２】
本発明におけるコレステロールの酵素的な定量方法自体はこの分野において周知であり、例えば第１工程と同様、コレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼの作用によりコレステロールエステル及び遊離型コレステロールから過酸化水素を発生させ、発生した過酸化水素を定量することにより行なうことができる。過酸化水素の定量は、例えば、ペルオキシダーゼの存在下で、過酸化水素と反応してキノン色素を形成する化合物と反応させ、生じたキノン色素の量を吸光度測定等により測定することにより行なうことができる。キノン色素は、例えば過酸化水素と４−アミノアンチピリン及びフェノール系若しくはアニリン系水素供与体を用いることにより形成させることができる。
【００４３】
水素供与体化合物のうちアニリン系水素供与体化合物として、N‐（2‐ヒドロキシ‐3‐スルホプロピル）‐3，5‐ジメトキシアニリン（HDAOS）、N-エチル-N-スルホプロピル-3‐メトキシアニリン（ADPS）、N-エチル-N-スルホプロピルアニリン（ALPS）、N-エチル-N-スルホプロピル-3，5‐ジメトキシアニリン（DAPS）、N‐スルホプロピル‐3，5‐ジメトキシアニリン（HDAPS）、N-エチル-N-スルホプロピル‐3，5‐ジメチルアニリン（MAPS）、N-エチル-N-スルホプロピル-3‐メチルアニリン（TOPS）、N-エチル-N‐（2‐ヒドロキシ‐3‐スルホプロピル）‐3‐メトキシアニリン（ADOS）、N-エチル-N‐（2‐ヒドロキシ‐3‐スルホプロピル）アニリン（ALOS）、N-エチル-N‐（2‐ヒドロキシ‐3‐スルホプロピル）-3，5‐ジメトキシアニリン（DAOS）、N-エチル-N‐（2‐ヒドロキシ‐3‐スルホプロピル）-3，5‐ジメチルアニリン（MAOS）、N-エチル-N‐（2‐ヒドロキシ‐3‐スルホプロピル）‐3‐メチルアニリン（TOOS）及びN‐スルホプロピルアニリン（HALPS）等が挙げられる。
【００４４】
キノン色素を生成する化合物の濃度は、特に限定されないが、反応混合物全体に対し、例えば４−アミノアンチピリンでは、好ましくは０．１〜２．０ｍＭ、さらに好ましくは０．５〜１．５ｍＭであり、フェノール系又はアニリン系水素供与体化合物では0.5〜2.0mmol/Lが好ましい。また、ペルオキシダーゼの濃度は、特に限定されないが、反応混合物全体に対し、０．４〜５Ｕ／ｍｌが好ましい。なお、第２工程の好ましい反応条件（反応温度、反応時間、緩衝液、pH）は、第１工程の好ましい反応条件と同じである。
【００４５】
なお、第１工程において、生じた過酸化水素をカタラーゼで分解する場合には、第２工程ではこのカタラーゼを阻害する必要があるので、第２工程において例えばアジ化ナトリウムのようなカタラーゼ阻害剤を用いてカタラーゼを阻害する。
【実施例】
【００４６】
以下、本発明を実施例に基づき具体的に説明するが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。なお、本実施例において、「％」は特に断りがない限り「重量％」を示す。
【００４７】
実施例１
HDL-C測定におけるコレステロールオキシダーゼの作用効果を確認する例として、下記の組成を有する試薬を調製した。
第１試薬
BES緩衝液(pH7.0)                    100 mmol/l
ＨＤＡＯＳ                          0.7 mmol/l
コレステロールエステラーゼ          1.4 U/ml
コレステロールオキシダーゼ          0.8 U/ml
カタラーゼ                          600U/ml
塩化マグネシウム                    10 mmol/l
第２試薬
BES緩衝液(pH7.0)                    100 mmol/l
４−アミノアンチピリン              4.0 mmol/l
ペルオキシダーゼ                    2.4 U/ml
コレステロールオキシダーゼ          0 U/ml，0.1，0.2，0.3，0.4，0.6，0.8，1.0，
1.2，2.4，4.8，9.6 U/ml
アジ化ナトリウム                    0.1%
界面活性剤（ポリオキシエチレンベンジルフェニル誘導体）  1.0%
【００４８】
第2試薬中のコレステロールオキシダーゼ濃度を0 U/ml 〜9.6 U/mlの範囲で変動させた試薬を用いてApoE containing HDL-C濃度54.0mg/mlを含む高HDL-C試料（Total HDL-C 195.8mg/ml）を測定した。試料２．４μｌに第１試薬１８０μｌを混和し、３７℃で５分間反応させた後に、第２試薬６０μｌを３７℃で５分間反応させ、主波長／副波長＝６００ｎｍ／７００ｎｍにおける吸光度を測定し検量線よりコレステロール濃度を求めた。比較対照としてApoE containing HDLを含めた全HDL-Cを測定できる13％PEG沈殿法（J Lipid Research 38, 1204-16: 1997）を用いて同様の試料を測定した。
【００４９】
用いる試料の容積は試薬の容積に対して微量であるので試料の容積を無視した場合、試薬第１試薬と第２試薬の容積比は３：１である。従って、第１試薬にＣ１ U/mlのコレステロールオキシダーゼが含まれ、第２試薬にＣ２ U/mlのコレステロールオキシダーゼが含まれる場合、コレステロールオキシダーゼの最終濃度はＣ１×3/4＋Ｃ２×1/4 U/mlとなる。本実施例では、第１試薬濃度が0.8 U/mlであり、第２試薬濃度が0 U/ml 〜9.6 U/mlであるので、最終濃度は0.6 U/ml〜3 U/mlとなる。
【００５０】
結果を図１に示す。図１はコレステロールオキシダーゼの最終濃度に対する結果を％バイアスで示している。％バイアスは、（実施例測定値-基準法測定値）/基準法測定値×100により求めることができる。
【００５１】
図１に示されるように、コレステロールオキシダーゼが第2試薬に未添加（終濃度0.6 U/ml）の場合、HDL-C高値検体は測定値が13％PEG沈殿法に比べて低値となる。これに対し、第2試薬にコレステロールオキシダーゼを追加した試薬では測定値の低下が改善され、第2試薬中濃度0.8 U/ml（最終濃度0.8 U/ml）以上の添加で対照法との反応差は1％未満と良好な反応性を示すようになった。
【００５２】
実施例２
実施例１におけるコレステロールオキシダーゼの添加を、第1試薬中のみとした試薬を用いて、ApoE containing HDL-C濃度54.0mg/mlを含む高HDL-C試料（Total HDL-C 195.8mg/ml）を測定した。第１試薬中のコレステロールオキシダーゼの濃度は0.8 U/ml，0.85，0.9，0.85，1.0，1.05，1.1，1.15，1.2，2.4，4.8及び9.6U/mlであり、最終濃度は0.6 U/ml, 0.638, 0.675，0.713，0.75，0.788，0.825，0.863，0.9，1.8，3.6，及び7.2 U/mlであった。その他の条件は実施例１と同様とした。
【００５３】
図２に示されるように、第1試薬中濃度1.05U/ml（最終濃度0.0.863 U/ml）以上の添加で対照法との反応差は1％未満と良好な反応性を示すようになった。
【図１】
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【図２】
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