(57)【要約】【課題】効率的に肺炎やカンジダ症などの日和見感染症を引き起こす病原菌のＯ側鎖多糖（Ｏ抗原）のコア骨格であるβ−１，２−マンノビオース及びその誘導体を製造することを目的とする。【解決手段】本発明は、β−１，２−マンノビオースホスホリラーゼが触媒するオリゴ糖合成反応により、α−Ｄ−マンノース１−リン酸と、Ｄ−マンノース、Ｄ−アラビノース、Ｄ−リキソース、Ｄ−アロース、Ｄ−リボース、Ｌ−ラムノース、Ｄ−フルクトース又はＤ−アルトロースを出発材料として、病原菌のＯ抗原のコア骨格であるβ−１，２−マンノビオース及びその誘導体をワンステップで簡便に製造する方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の酵素学的性質を有するオリゴ糖合成酵素β−１，２−マンノビオースホスホリラーゼ：
ａ）作用
α−Ｄ−マンノース１−リン酸と、Ｄ−マンノース、Ｄ−アラビノース、Ｄ−リキソース、Ｄ−アロース、Ｄ−リボース、Ｌ−ラムノース、Ｄ−フルクトース又はＤ−アルトロースとに作用して、β−１，２−マンノビオース、Ｄ−マンノシル−β−１，４−Ｄ−アラビノース、Ｄ−マンノシル−β−１，２−Ｌ−リキソース、Ｄ−マンノシル−β−１，３−Ｄ−アロース、Ｄ−マンノシル−β−１，３−Ｄ−リボース、Ｄ−マンノシル−β−１，３−Ｌ−ラムノース、Ｄ−マンノシル−β−１，５−Ｄ−フルクトース、Ｄ−マンノシル−β−１，１−Ｄ−フルクトース、Ｄ−マンノシル−β−１，２−Ｄ−アルトロース又はＤ−マンノシル−β−１，４−Ｄ−アルトロースを生成する；
ｂ）基質特異性
α−Ｄ−マンノース１−リン酸と、Ｄ−マンノース、Ｄ−アラビノース、Ｄ−リキソース、Ｄ−アロース、Ｄ−リボース、Ｌ−ラムノース、Ｄ−フルクトース又はＤ−アルトロースとに作用する；
ｃ）至適ｐＨ
３０℃の条件下で、ｐＨ６．０；
ｄ）温度安定性
ｐＨ６．０の条件下で、５０℃まで安定；
ｅ）ｐＨ安定性
４℃、２４時間の条件下で、ｐＨ５．５−９．０で安定。
【請求項２】
α−Ｄ−マンノース１−リン酸と、Ｄ−マンノース、Ｄ−アラビノース、Ｄ−リキソース、Ｄ−アロース、Ｄ−リボース、Ｌ−ラムノース、Ｄ−フルクトース又はＤ−アルトロースと、請求項１に記載のオリゴ糖合成酵素β−１，２−マンノビオースホスホリラーゼとを含む溶液中でオリゴ糖合成反応を行うステップと、β−１，２−マンノビオース、Ｄ−マンノシル−β−１，４−Ｄ−アラビノース、Ｄ−マンノシル−β−１，２−Ｄ−リキソース、Ｄ−マンノシル−β−１，３−Ｄ−アロース、Ｄ−マンノシル−β−１，３−Ｄ−リボース、Ｄ−マンノシル−β−１，３−Ｌ−ラムノース、Ｄ−マンノシル−β−１，５−Ｄ−フルクトース、Ｄ−マンノシル−β−１，１−Ｄ−フルクトース、Ｄ−マンノシル−β−１，２−Ｄ−アルトロース又はＤ−マンノシル−β−１，４−Ｄ−アルトロースを回収するステップを含むことを特徴とするβ−１，２−マンノビオース及びその誘導体の製造方法。
【請求項３】
前記溶液は、ｐＨ５．０〜７．０であることを特徴とする請求項２に記載のβ−１，２−マンノビオース及びその誘導体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規に発見したオリゴ糖合成酵素β−１，２−マンノビオースホスホリラーゼ並びに前記酵素が触媒するオリゴ糖合成反応を用いた、病原菌のＯ抗原のコア骨格であるβ−１，２−マンノビオース及びその誘導体の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖タンパク質が有する糖鎖の生体認識（細胞接着・抗原抗体反応・情報伝達・ウイルス感染など）への重要性については近年注目が集まるところである。糖鎖は、核酸、タンパク質に次ぐ第三の鎖といわれ、近年急速にその機能解明が進められている。さらに、糖鎖工学及び糖鎖再生医療研究分野での生体内糖鎖認識性の解明が急がれている。
【０００３】
しかし、生体内での発現量が微量な糖鎖試料の調製は現在有機合成法に頼らざるを得ず、その困難さが糖鎖工学研究分野や糖鎖再生医療の進展を妨げている。例えば、肺炎やカンジダ症などの日和見感染症を引き起こす病原菌のＯ抗原のコア骨格であるβ−１，２−マンノオリゴ糖は、従来は、有機合成法による煩雑な多段階反応で製造されており（非特許文献１）、効率的な大量調製が困難であるため、非常に高額であるという問題点があった。そのため、生体認識性分子素子である糖鎖の簡便な製造法の確立は急務となっている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｄｒｏｍｅｒ，Ｆ．ら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ４６（１２）：３８６９−３８７６（２００２）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
そこで、本発明は上記問題点に鑑み、効率的に肺炎やカンジダ症などの日和見感染症を引き起こす病原菌のＯ側鎖多糖（Ｏ抗原）のコア骨格であるβ−１，２−マンノビオース及びその誘導体を製造することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記課題を達成するため鋭意検討した結果、新規に発見したβ−１，２−マンノビオースホスホリラーゼが触媒するオリゴ糖合成反応を用いて、病原菌のＯ抗原のコア骨格であるβ−１，２−マンノビオース及びその誘導体をワンステップで製造することができ、反応系のスケールアップによる大量調製も可能であることを見出し、本発明を完成させた。
【０００７】
すなわち、本発明は、以下の酵素学的性質を有するオリゴ糖合成酵素β−１，２−マンノビオースホスホリラーゼ：
ａ）作用
α−Ｄ−マンノース１−リン酸と、Ｄ−マンノース、Ｄ−アラビノース、Ｄ−リキソース、Ｄ−アロース、Ｄ−リボース、Ｌ−ラムノース、Ｄ−フルクトース又はＤ−アルトロースとに作用して、β−１，２−マンノビオース、Ｄ−マンノシル−β−１，４−Ｄ−アラビノース、Ｄ−マンノシル−β−１，２−Ｄ−リキソース、Ｄ−マンノシル−β−１，３−Ｄ−アロース、Ｄ−マンノシル−β−１，３−Ｄ−リボース、Ｄ−マンノシル−β−１，３−Ｌ−ラムノース、Ｄ−マンノシル−β−１，５−Ｄ−フルクトース、Ｄ−マンノシル−β−１，１−Ｄ−フルクトース、Ｄ−マンノシル−β−１，２−Ｄ−アルトロース又はＤ−マンノシル−β−１，４−Ｄ−アルトロースを生成する；
ｂ）基質特異性
α−Ｄ−マンノース１−リン酸と、Ｄ−マンノース、Ｄ−アラビノース、Ｄ−リキソース、Ｄ−アロース、Ｄ−リボース、Ｌ−ラムノース、Ｄ−フルクトース又はＤ−アルトロースとに作用する；
ｃ）至適ｐＨ
３０℃の条件下で、ｐＨ６．０；
ｄ）温度安定性
ｐＨ６．０の条件下で、５０℃まで安定；
ｅ）ｐＨ安定性
４℃、２４時間の条件下で、ｐＨ５．５−９．０で安定。
【０００８】
また、本発明のβ−１，２−マンノビオース及びその誘導体の製造方法は、α−Ｄ−マンノース１−リン酸と、Ｄ−マンノース、Ｄ−アラビノース、Ｄ−リキソース、Ｄ−アロース、Ｄ−リボース、Ｌ−ラムノース、Ｄ−フルクトース又はＤ−アルトロースと、前記オリゴ糖合成酵素β−１，２−マンノビオースホスホリラーゼとを含む溶液中でオリゴ糖合成反応を行うステップと、β−１，２−マンノビオース、Ｄ−マンノシル−β−１，４−Ｄ−アラビノース、Ｄ−マンノシル−β−１，２−Ｄ−リキソース、Ｄ−マンノシル−β−１，３−Ｄ−アロース、Ｄ−マンノシル−β−１，３−Ｄ−リボース、Ｄ−マンノシル−β−１，３−Ｌ−ラムノース、Ｄ−マンノシル−β−１，５−Ｄ−フルクトース、Ｄ−マンノシル−β−１，１−Ｄ−フルクトース、Ｄ−マンノシル−β−１，２−Ｄ−アルトロース又はＤ−マンノシル−β−１，４−Ｄ−アルトロースを回収するステップを含むことを特徴とするβ−１，２−マンノビオース及びその誘導体の製造方法。
【０００９】
また、前記β−１，２−マンノビオース及びその誘導体の製造方法は、前記溶液が、ｐＨ５．０〜７．０であることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、β−１，２−マンノビオースホスホリラーゼが触媒するオリゴ糖合成反応により、α−Ｄ−マンノース１−リン酸と、８種類の単糖類（Ｄ−マンノース、Ｄ−アラビノース、Ｄ−リキソース、Ｄ−アロース、Ｄ−リボース、Ｌ−ラムノース、Ｄ−フルクトース又はＤ−アルトロース）を出発材料として、β−１，２−マンノビオース及びその誘導体をワンステップで簡便に製造することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明の方法によれば、加リン酸分解反応の逆反応であるオリゴ糖合成反応により、β−１，２−マンノビオース及びその誘導体を簡便に製造できる。
【００１２】
具体的には、α−Ｄ−マンノース１−リン酸と、Ｄ−マンノースと、β−１，２−マンノビオースホスホリラーゼを含む溶液中でオリゴ糖合成反応を行うことにより、β−１，２−マンノビオースを製造することができる。
【００１３】
【化１】
2014057534.tif 000002
【００１４】
また、α−Ｄ−マンノース１−リン酸と、Ｄ−アラビノースと、β−１，２−マンノビオースホスホリラーゼを含む溶液中でオリゴ糖合成反応を行うことにより、Ｄ−マンノシル−β−１，４−Ｄ−アラビノースを製造することができる。
【００１５】
また、α−Ｄ−マンノース１−リン酸と、Ｄ−リキソースと、β−１，２−マンノビオースホスホリラーゼを含む溶液中でオリゴ糖合成反応を行うことにより、Ｄ−マンノシル−β−１，２−Ｄ−リキソースを製造することができる。
【００１６】
また、α−Ｄ−マンノース１−リン酸と、Ｄ−アロースと、β−１，２−マンノビオースホスホリラーゼを含む溶液中でオリゴ糖合成反応を行うことにより、Ｄ−マンノシル−β−１，３−Ｄ−アロースを製造することができる。
【００１７】
また、α−Ｄ−マンノース１−リン酸と、Ｄ−リボースと、β−１，２−マンノビオースホスホリラーゼを含む溶液中でオリゴ糖合成反応を行うことにより、Ｄ−マンノシル−β−１，３−Ｄ−リボースを製造することができる。
【００１８】
また、α−Ｄ−マンノース１−リン酸と、Ｌ−ラムノースと、β−１，２−マンノビオースホスホリラーゼを含む溶液中でオリゴ糖合成反応を行うことにより、Ｄ−マンノシル−β−１，３−Ｌ−ラムノースを製造することができる。
【００１９】
また、α−Ｄ−マンノース１−リン酸と、Ｄ−フルクトースと、β−１，２−マンノビオースホスホリラーゼを含む溶液中でオリゴ糖合成反応を行うことにより、Ｄ−マンノシル−β−１，５−Ｄ−フルクトース及びＤ−マンノシル−β−１，１−Ｄ−フルクトースを製造することができる。
【００２０】
また、α−Ｄ−マンノース１−リン酸と、Ｄ−アルトロースと、β−１，２−マンノビオースホスホリラーゼを含む溶液中でオリゴ糖合成反応を行うことにより、Ｄ−マンノシル−β−１，２−Ｄ−アルトロース及びＤ−マンノシル−β−１，４−Ｄ−アルトロースを製造することができる。
【００２１】
反応液中でのβ−１，２−マンノビオースホスホリラーゼの濃度は特に限定されないが、０．０８６〜１７２μＭ、好ましくは、０．４３〜８６μＭで使用することができる。
【００２２】
β−１，２−マンノビオースホスホリラーゼの３０℃における至適ｐＨは６．０付近であることから、前記溶液は、ｐＨ５．０〜７．０であることが好ましく、特にｐＨ６．０が好ましい。前記溶液としては、特に限定されるものではないが、モルホリノエタンスルホン酸−水酸化ナトリウム（ＭＥＳ−ＮａＯＨ）緩衝液が好適である。
【００２３】
また、β−１，２−マンノビオースホスホリラーゼのｐＨ６．０における温度安定性は５０℃までであることから、オリゴ糖合成反応は２５〜５０℃で行うことが好ましく、特に、３０℃が好ましい。
【００２４】
また、反応時間は、特に限定されるものではないが、１〜１００時間が好ましく、特に、２４時間が好ましい。
【００２５】
上記オリゴ糖合成反応により製造されたβ−１，２−マンノビオース及びその誘導体は、カラムクロマトグラフィーや結晶化等の公知の方法により単離することが可能であるが、高速液体クロマトグラフィーが好適である。
【００２６】
なお、本発明は上記実施形態に限定されるものではなく、本発明の思想を逸脱しない範囲で種々の変形実施が可能である。
【００２７】
次に、本発明を実施例により詳しく説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。
【実施例１】
【００２８】
リステリア・イノキュアのゲノム情報を基に、Ｌｉｎ０８５７遺伝子に対するフォーワードプライマー（配列番号３）及びリバースプライマー（配列番号４）を設計し、合成した。Ｌｉｎ０８５７遺伝子の塩基配列を配列番号２に、またこの塩基配列にコードされているアミノ酸配列を配列番号１に示す。
【００２９】
リステリア・イノキュアのゲノムＤＮＡを鋳型とし、上記のプライマー及びＫＯＤ ｐｌｕｓ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用い、９５℃に２分間保持したのち、９５℃で３０秒間、５８℃で３０秒間、６８℃で１分３０秒間のサイクルを４５回繰り返してＰＣＲ反応を行い、最後に６８℃に５分間保持した。その結果、１０８４ｂｐの増幅断片が得られた。このＰＣＲで増幅されるＤＮＡ断片は、５’末端にＮｄｅＩサイトを、３’末端にＸｈｏＩサイトをそれぞれ有するＬｉｎ０８５７をコードするＤＮＡである。
【００３０】
得られた増幅断片を制限酵素ＮｄｅＩ及びＸｈｏＩで消化後、同様に処理した市販の遺伝子発現用プラスミドｐＥＴ−２４ａ（ノバジェン社製）に高効率ライゲーション試薬Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｈｉｇｈ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いて連結した。さらに、ライゲーション反応液を用いて大腸菌コンピテントセルＤＨ５α（ＴＯＹＯＢＯ製）を形質転換し、Ｃ末端に６残基のヒスチジンからなるＨｉｓタグが付加されたＬｉｎ０８５７をコードするＤＮＡを含む発現ベクターｐＥＴ−２４ａを回収した。
【００３１】
この発現ベクターｐＥＴ−２４ａを用いて、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）をＨａｎａｈａｎらの方法（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９８３年、第１６６巻、第５５７−５８０頁）に従って形質転換した。形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ培地２００ｍＬに植菌し、ＩＰＴＧ濃度を０．１ｍＭとして誘導培養を１８℃で２４時間行った。培養液から遠心分離で回収した菌体を１０ｍＬの５００ｍＭ塩化ナトリウム及び１０％グリセロールを含む２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液ｐＨ７．５に懸濁し、超音波処理により破砕した後、遠心分離後によって粗酵素液を得た。組換えタンパク質の精製は、Ｈｉｓタグタンパク質精製用カラムＨｉｓＴｒａｐＦＦ（ＧＥヘルスケア社製）を用いたカラムクロマトグラフィーにより行った。得られた精製酵素溶液を、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液ｐＨ７．０に対して透析を行い、遠心式フィルターユニットアミコンウルトラ−１５（ミリポア社製）を用いた限外濾過によって４ｍＬに濃縮することで、精製酵素標品を調製した。
【実施例２】
【００３２】
得られた精製酵素標品を用い、以下に示す方法によって本タンパク質を新規酵素β−１，２−マンノビオースホスホリラーゼと同定し、β−１，２−マンノビオース及び９種類のβ−１，２−マンノビオース誘導体を生成した。
【００３３】
５０ｍＭのα−Ｄ−マンノース１−リン酸（糖供与体）、５０ｍＭのＤ−マンノース（糖受容体）、０．４３μＭの精製酵素を含む４０ｍＭ ＭＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．０）１ｍｌ中で酵素反応を３０℃、２４時間行った。反応液をアンバーライトＭＢ３（オルガノ社製）で脱塩後、ＴＳＫｇｅｌ  Ａｍｉｄｅ−８０カラム（ＴＯＳＯＨ社製）による７０％アセトニトリルを溶媒とした高速液体クロマトグラフィーにより、二糖画分を単離した。精製後の収量は２ｍｇであった。生成物をＮＭＲにより分析したところ、β−１，２−マンノビオース（下記式（１））であることを確認した。
【００３４】
【化２】
2014057534.tif 000003
【００３５】
５０ｍＭのα−Ｄ−マンノース１−リン酸（糖供与体）、５０ｍＭの各糖受容体（５種類：Ｄ−アラビノース、Ｄ−リキソース、Ｄ−アロース、Ｄ−リボース、Ｌ−ラムノース）、８６μＭの精製酵素を含む４０ｍＭ ＭＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．０）１ｍｌ中で酵素反応を３０℃、２４時間行った。各反応液をアンバーライトＭＢ３で脱塩後、ＴＳＫｇｅｌ  Ａｍｉｄｅ−８０カラムによる７５％アセトニトリルを溶媒とした高速液体クロマトグラフィーにより、二糖画分を単離し、各生成物をＮＭＲにより分析した結果、Ｄ−マンノシル−β−１，４−Ｄ−アラビノース（下記式（２））、Ｄ−マンノシル−β−１，２−Ｄ−リキソース（下記式（３））、Ｄ−マンノシル−β−１，３−Ｄ−アロース（下記式（４））、Ｄ−マンノシル−β−１，３−Ｄ−リボース（下記式（５））、Ｄ−マンノシル−β−１，３−Ｌ−ラムノース（下記式（６））であることを確認した。精製後の収量はそれぞれ１ｍｇ、１ｍｇ、１ｍｇ、３ｍｇ、１ｍｇであった。
【００３６】
【化３】
2014057534.tif 000004
【００３７】
【化４】
2014057534.tif 000005
【００３８】
【化５】
2014057534.tif 000006
【００３９】
【化６】
2014057534.tif 000007
【００４０】
【化７】
2014057534.tif 000008
【実施例３】
【００４１】
５０ｍＭのα−Ｄ−マンノース１−リン酸（糖供与体）、５０ｍＭのＤ−フルクトース（糖受容体）、８６μＭの精製酵素を含む４０ｍＭ ＭＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．０）１ｍｌ中で酵素反応を３０℃、２４時間行った。実施例２と同様、各反応液から二糖画分（２ｍｇ）を単離し、生成物をＮＭＲにより分析した。その結果、フルクトースを糖受容体とし、上記の条件で反応した際の生成物はＤ−マンノシル−β−１，５−Ｄ−フルクトース（下記式（７））とＤ−マンノシル−β−１，１−Ｄ−フルクトース（下記式（８））の混合物であることを確認した。同混合物は、ショウデックスアサヒパック ＮＨ２Ｐ−５０ ４Ｅカラムによる８０％アセトニトリルを溶媒とした高速液体クロマトグラフィーにより分離可能であった。
【００４２】
【化８】
2014057534.tif 000009
【００４３】
【化９】
2014057534.tif 000010
【実施例４】
【００４４】
５０ｍＭのα−Ｄ−マンノース１−リン酸（糖供与体）、５０ｍＭのＤ−フルクトース（糖受容体）、２．９μＭの精製酵素を含む４０ｍＭ ＭＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．０）１ｍｌ中で酵素反応を３０℃、２４時間行った。反応液をアンバーライトＭＢ３で脱塩後、ショウデックスアサヒパック ＮＨ２Ｐ−５０ ４Ｅカラムによる８０％アセトニトリルを溶媒とした高速液体クロマトグラフィーにより、二糖画分（１ｍｇ）を単離し、生成物をＮＭＲにより分析した結果、上記の条件で反応した際の生成物はＤ−マンノシル−β−１，５−Ｄ−フルクトース（下記式（７））のみであることを確認した。
【００４５】
【化１０】
2014057534.tif 000011
【００４６】
５０ｍＭα−Ｄ−マンノース１−リン酸（糖供与体）、５０ｍＭのＤ−アルトロース（糖受容体）、８６μＭの精製酵素を含む４０ｍＭ ＭＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．０）１ｍｌ中で酵素反応を３０℃、４時間行った。実施例２と同様、各反応液から二糖画分（３ｍｇ）を単離し、生成物をＮＭＲにより分析した結果、二糖画分の主成分はＤ−マンノシル−β−１，２−Ｄ−アルトロース（下記式（９））であり、マイナー成分として少なくともＤ−マンノシル−β−１，４−Ｄ−アルトロース（下記式（１０））が混入していることを確認した。
【００４７】
【化１１】
2014057534.tif 000012
【００４８】
【化１２】
2014057534.tif 000013
【００４９】
２５ｍＭ  ＭＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．０）中、２ｍＭのα−Ｄ−マンノース１−リン酸及びＤ−マンノースを用いて、合成反応時に生成するリン酸をモリブデンブルー法（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９４６、１６２、４２１−４２８）により定量した。上記条件下に毎分１μモルのリン酸を生成する活性を１ユニットと定義した。その結果、Ｄ−マンノースを糖受容体としたときの活性は６．１ユニット／ｍｇであった。
【００５０】
β−１，２−マンノビオースホスホリラーゼの３０℃における至適ｐＨは６．０付近であり（図１Ａ）、安定ｐＨ範囲は４℃及び２４時間の条件下でｐＨ５．５−９．０であった（図１Ｂ）。本酵素のｐＨ６．０における安定性は５０℃までであった（図１Ｃ）。
【産業上の利用可能性】
【００５１】
以上のように本発明は、糖鎖工学研究分野や糖鎖医療産業界で利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１Ａ】実施例１で調製したβ−１，２−マンノビオースホスホリラーゼの至適ｐＨを示した図である。
【図１Ｂ】実施例１で調製したβ−１，２−マンノビオースホスホリラーゼのｐＨ安定性を示した図である。
【図１Ｃ】実施例１で調製したβ−１，２−マンノビオースホスホリラーゼの温度安定性を示した図である。
【図１Ａ】
2014057534.tif 000014
【図１Ｂ】
2014057534.tif 000015
【図１Ｃ】
2014057534.tif 000016
【配列表】
2014057534000001.app