(57)【要約】      （修正有）【課題】細胞小器官及びタンパク質の機能及び形状を損なうことなく、大量に回収可能な、細胞から細胞小器官又はタンパク質を回収する方法を提供すること。【解決手段】細胞から細胞小器官又はタンパク質を回収する方法であって、上記細胞に電解陰極溶液を接触させる工程を備え、電解陰極溶液を生成後３０分以内に前記細胞に接触させ、電解陰極溶液を１〜１０分間接触させる方法。前記細胞が、ミドリムシ、哺乳動物細胞及び大腸菌からなる群から選択される方法。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞から細胞小器官又はタンパク質を回収する方法であって、
前記細胞に電解陰極溶液を接触させる工程を備える、方法。
【請求項２】
前記電解陰極溶液を生成後３０分以内に前記細胞に接触させる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞に前記電解陰極溶液を１〜１０分間接触させる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞が、ミドリムシ、哺乳動物細胞及び大腸菌からなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。 
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞から細胞小器官又はタンパク質を回収する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、ミドリムシ、大腸菌及び哺乳動物細胞等の細胞から有用なタンパク質を回収するためには、タンパク分解酵素処理、界面活性剤処理、超音波処理、ガラスビーズ法等を用いた上記細胞の細胞膜を破砕する方法（細胞破砕法）が採られていた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Eiichi  Nara，  Hiroaki  Kubouchi，  Tetsuya  Suzuki，  and  Kazuo  Miyashita,  J.  Oleo.  Sci.,  (2001)  50(12):  931-936
【非特許文献２】Eiichi  Nara，  Hiroaki  Kubouchi  Hidetaka  Kobayashi，Mari  Kotake，Tetsuya  Suzuki  and  Kazuo  Miyashita.  J.  Oleo.  Sci.  (2001)  50(7):  575-581
【非特許文献３】Miyashita  K.，  Yasuda  M.，  Ota  T.  and  Suzuki  T.,  Biosci.  Biotcchnol.  Biochem.  (1999)  63  (2):  121-423
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、上述のような従来から用いられている細胞破砕法では、目的とするタンパク質までも破砕されてしまう、又は、目的とするタンパク質が変性してしまい酵素活性等の機能が失われてしまう場合がある。すなわち、目的とする有用なタンパク質を状態良く、大量に回収することが困難となる場合がある。
【０００５】
さらに、従来から用いられている細胞破砕法では、上記細胞の細胞膜だけでなく、細胞小器官も破砕してしまうため、細胞小器官を回収する方法としては不向きな傾向がある。
【０００６】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、細胞小器官及びタンパク質の機能及び形状を損なうことなく、大量に回収可能な、細胞から細胞小器官又はタンパク質を回収する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、鋭意研究を行った結果、電解陰極溶液を細胞に接触させることによって、細胞膜のみを破砕できることを見出し、本発明を完成するに至った。従来、電解陰極溶液は、魚油に対して抗酸化作用を示すことが知られていた（非特許文献１〜３）。しかし、このような知見は、これまで知られていなかった。
【０００８】
すなわち本発明は、細胞から細胞小器官又はタンパク質を回収する方法であって、上記細胞に電解陰極溶液を接触させる工程を備える、方法を提供する。
【０００９】
細胞に電解陰極溶液を接触させることによって、細胞小器官及びタンパク質の機能及び形状を損なうことなく、細胞から細胞小器官又はタンパク質を大量に回収できる。
【００１０】
電解陰極溶液を生成後３０分以内に上記細胞に接触させることが好ましい。細胞膜を破砕する効率が更に向上する傾向がある。
【００１１】
上記細胞に電解陰極溶液を１〜１０分間接触させることが好ましい。細胞小器官の破砕が抑えられ、更に細胞小器官及びタンパク質の機能及び形状を維持しやすい傾向がある。
【００１２】
上記細胞は、ミドリムシ、哺乳動物細胞及び大腸菌からなる群から選択されることが好ましい。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、細胞小器官及びタンパク質の機能及び形状を損なうことなく、大量に回収可能な、細胞から細胞小器官又はタンパク質を回収する方法を提供することが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】Ｈ字管を備える電解水生成装置の模式図である。
【図２】ミドリムシを細胞破砕処理することによって得られたサンプルを示す写真である。
【図３】Ｈ字管を備える電解水生成装置の陰極槽の上部における水素濃度を示すグラフである。
【図４】哺乳動物細胞を細胞破砕処理することによって得られたサンプルの蛍光強度を示すグラフである。
【図５】大腸菌を細胞破砕処理することによって得られたサンプルの蛍光強度を示すグラフである。
【図６】細胞破砕処理によって破砕されなかった大腸菌の蛍光強度を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
【００１６】
本実施形態に係る細胞から細胞小器官又はタンパク質を回収する方法は、上記細胞に電解陰極溶液を接触させる工程を備える。
【００１７】
本実施形態において、細胞は特に制限されず公知の細胞を用いることが可能である。例えば、ミドリムシ等のプランクトン、哺乳動物細胞、大腸菌等の細菌、酵母、昆虫細胞等が挙げられる。好ましくは、ミドリムシ、哺乳動物細胞及び大腸菌からなる群から選ばれる。哺乳動物細胞としては、例えば、ヒト胎児腎臓細胞（ＨＥＫ２９３）、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、ヒト白血病細胞（ＨＬ−６０）、ヒト子宮頸癌細胞（ＨｅＬａ）、マウス胎児皮膚細胞（３Ｔ３）、ラット副腎髄質細胞（ＰＣ１２）、ｉＰＳ細胞、初代培養細胞、幹細胞等が挙げられる。また、採取された生体組織をそのまま用いてもよい。
【００１８】
本実施形態において、電解陰極溶液とはイオン交換膜によって陽極と陰極とに仕切られた電気分解装置で、電解質を含む水溶液を電気分解した際に陰極槽側に生成する溶液を意味する。電解質を含む水溶液が食塩水である場合、得られる電解陰極溶液は、強アルカリ電解水とも称される。電解陰極溶液は、通常−９００ｍＶ以下の酸化還元電位（ＯＲＰ）を有しており、高いｐＨ（１２程度）を有している。
【００１９】
上記電解質としては、特に制限はないが、例えば、塩化リチウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、酢酸リチウム等が挙げられる。
【００２０】
上記電解質を含む水溶液の電解質の濃度は、特に制限されないが、質量濃度で０．１〜１％であることが好ましく、０．１〜０．６％であることがより好ましい。
【００２１】
電気分解の方法としては、特に制限されず公知の方法を使用することが可能である。例えば、市販されている電解水生成装置を用いた方法や、Ｈ字管又はＵ字管を備える電解水生成装置を用いた方法が挙げられる。
【００２２】
市販されている電解水生成装置としては、アマノ株式会社製のＳｕｐｅｒｏｘｓｅｅｄ  Ｌａｂｏ電解水製造装置、アマノメンテナンスエンジニアリング社製Σ３０００等が挙げられる。
【００２３】
Ｈ字管を備える電解水生成装置としては、例えば図１に示される電解水生成装置１００が挙げられる。電解水生成装置１００は、陽極１を有する陽極槽１０と、陰極２を有する陰極槽２０と、イオン交換膜３０を有し、陽極槽１０と陰極槽２０とを連通させる連結部４０と、を備える。陽極１と陰極２とは電源を介して電気的に接続されている。
【００２４】
陽極１及び陰極２としては、特に制限はないが、例えば、白金電極、白金イリジウム電極が挙げられる。
【００２５】
陽極槽１０、陰極槽２０及び連結部４０は、通常、ガラス等によって構成されている。
【００２６】
イオン交換膜３０は、陽イオンのみ通過できるものであれば特に制限されないが、例えば、ナフィオン（登録商標）膜が好ましく用いられる。ナフィオン膜は、スルホ化されたテトラフルオロエチレンを基にしたフッ素樹脂の共重合体を含む膜である。
【００２７】
このような電解水生成装置１００を用いた電解陰極溶液の生成方法は、公知の方法を採用することができる。例えば、直流電圧２２〜２５ボルトで２０〜５０分間電気分解する方法が挙げられる。
【００２８】
電解水生成装置１００の陰極槽２０の内部で生成された電解陰極溶液は、陰極槽の上部２２と、陰極槽の下部２４とで性質が異なる。そのため、回収するタンパク質又は細胞内小器官に応じて、適宜、用いる電解陰極溶液を選択することが可能である。ここで、陰極槽の上部２２は、例えば、陰極２よりも上側の部分を示し、陰極槽の下部２４は、例えば、陰極２よりも下側の部分を示す。
【００２９】
例えば、ミドリムシ（ユーグレナ）から副鞭毛体（ＰＦＢ）を回収する場合、陰極槽の上部２２に生成する電解陰極溶液を用いることが好ましい。陰極槽の上部２２に生成する電解陰極溶液は、陰極槽の下部２４に生成する電解陰極溶液よりも還元作用が弱いが、細胞膜の溶解性は強い。そのため、破砕したミドリムシから分離されたＰＦＢのフラビンの蛍光を確認することができ、回収しやすいという利点がある。なお、フラビンは還元状態では蛍光が消失する性質を有する。
【００３０】
陰極槽の上部２２と陰極槽の下部２４とで、生成する電解陰極溶液の性質が異なる原因は、明らかにされていないが、陰極槽の上部２２に生成する電解陰極溶液には、陰極２において発生した水素を豊富に含んでいるためであると発明者らは考えている。
【００３１】
一方、陰極槽の下部２４に生成する電解陰極溶液は、電解質及び陰極２に由来する金属コロイドを豊富に含んでいる。陰極２が白金電極又は白金イリジウム電極である場合、白金コロイドの触媒作用によって、還元力が向上する傾向がある。
【００３２】
本実施形態において、電解陰極溶液を生成後３０分以内に細胞に接触させることが好ましく、電解陰極溶液を生成直後に細胞に接触させることがより好ましい。細胞膜を破砕する効率が更に向上する傾向がある。
【００３３】
本実施形態において、細胞に電解陰極溶液を１〜１０分間接触させることが好ましく、３〜７分間接触させることがより好ましい。細胞小器官の破砕が抑えられ、更に細胞小器官及びタンパク質の機能及び形状を維持しやすい傾向がある。
【００３４】
本実施形態において、細胞に電解陰極溶液を接触させる工程を終了させる方法としては、例えば、所定の緩衝溶液を加えて、電解陰極溶液を希釈する方法が挙げられる。このとき、加える緩衝溶液の量としては、特に制限はないが、例えば加えた電解陰極溶液と等量であることが好ましい。緩衝溶液としては、例えば、リン酸緩衝液（リン酸バッファー）、ＨＥＰＥＳ緩衝液等のグッドバッファーが挙げられる。
【００３５】
本実施形態において、細胞に電解陰極溶液を接触させる工程を終了させた後に、上記細胞膜に物理的刺激を与える工程を更に備えてもよい。このような工程を備えることで、細胞小器官及びタンパク質の機能及び形状を損なうことなく、更に大量に回収が可能になる傾向がある。
【００３６】
上記物理的刺激としては、例えば、細胞に超音波を加える方法、電気ショック法、加圧法が挙げられる。超音波を加える場合、出力１Ｗ〜２０Ｗで、２〜１５秒間行うことが好ましい。
【実施例】
【００３７】
以下、本発明について、実施例を挙げて更に詳細に説明する。ただし、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００３８】
＜電解陰極溶液を用いたミドリムシの細胞破砕によるフラビンタンパク質の単離方法＞
１．培養
２．５リットルのＫｏｒｅｎ−Ｈｕｔｎｅｒ培地に５０ｍｌのミドリムシ（１〜５×１０７細胞／ｍｌ）を植え、培養温度２６℃、明条件で５−７日の間攪拌培養を行った。
【００３９】
２．電解陰極溶液の準備
Ｎａｆｉｏｎイオン交換膜（商品名：Ｎａｆｉｏｎ（登録商標）１１７、シグマアルドリッチ社製）で、陽極槽と陰極槽とが仕切られたＨ字管型の電解水生成装置で、０．１％程度のＬｉＣｌの水溶液を白金イリジウムを電極として２２〜２５ＤＣｖｏｌｔ程度で約４０〜５０分間電気分解した。その後、陰極槽側の管上部から得られる水を電解陰極溶液として用いた。上記電解陰極溶液は、電気分解後すぐに次の工程に使用した。なお、ＬｉＣｌの代わりにＫＣｌ又はＮａＣｌを用いた場合、及び白金イリジウムの代わりに白金を電極として用いた場合も同様に電解陰極溶液が得られたことを確認している。
【００４０】
３．ミドリムシの破砕とＰＦＢの粗精製
下記（１）〜（６）の手順に従って、上述したミドリムシの培養懸濁液から、ミドリムシを集め、破砕し、ＰＦＢを含む画分を粗精製した。
【００４１】
（１）ミドリムシの収穫→（２）電解陰極溶液によるミドリムシの細胞外被構造の破壊→（３）緩衝液で上記破壊の停止→（４）低出力の超音波による細胞破砕→（５）低速遠心による破壊されていない細胞（未破砕細胞）及び大型の細胞断片の除去（８８０ｒｐｍ−１１００ｒｐｍ）及び未破砕細胞の再処理→（６）高速遠心（８５００ｒｐｍ）によるＰＦＢを含有する画分の濃縮。以下に各手順の詳細を記す。
【００４２】
３−１：細胞の収穫と水洗い（（１）の手順）
培養懸濁液を容量が１５０ｍｌである容器４本に移し、上記４本の容器をスイングローター（商品名：ｈｉｍａｃ  ＣＦ１６ＲＸ、日立工機社製）に設置して、８８０ｒｐｍ、５分間で遠心分離を行い、細胞ペレットを得た。上記細胞ペレットに５ｍｌ〜１０ｍｌの水を加えて懸濁し、容量が５０ｍｌである遠沈管（以下、５０ｍｌ遠沈管という場合がある）に得られた細胞ペレットの懸濁液を集め、遠心した後、上清の水を捨てた（１０００ｒｐｍ、３分間、スイングローター）。         
【００４３】
３−２：電解陰極溶液を用いた細胞外被構造の破壊処理（（２）及び（３）の手順）
上記上清を除去した５０ｍｌ遠沈管（３ｍｌ−４ｍｌ位の細胞ペレットを含む）に、上記電解陰極溶液（１５ｍｌ程度）を加え、ボルテックスで攪拌した。上記遠沈管を７〜１０分間静置した後、上記電解陰極溶液と等量のＢｕｆｆｅｒＡ（５０ｍＭリン酸バッファー）を加えた。得られたペレットに５ｍｌ〜１０ｍｌ位のＢｕｆｆｅｒＡを加えて攪拌した。
【００４４】
３−３：低出力の超音波による細胞破砕（（４）の手順）
５０ｍｌ遠沈管内のサンプルを６ｍｌずつ複数の１５ｍｌ遠沈管に移した。超音波破砕装置（商品名：ＴＯＭＹ  ＵＤ−２００、トミー精工社製）を用いて、上記１５ｍｌ遠沈管内にある細胞を穏やかに破砕した（最低出力（約１０Ｗ）、６秒間）。集めたサンプルを含むマイクロチューブを遠心した後の写真を図２に示す。電解陰極溶液を用いて細胞処理を行った実施例１では、ミドリムシ細胞内のパラミロン（β−１，３−グルカン）が白いペレットとして観察されるのに対し、電解陰極溶液の代わりに蒸留水を用いて細胞処理を行った比較例１では、細胞の破砕が十分行えずパラミロンのペレットは確認されなかった。
【００４５】
３−４：未破砕細胞の再処理（（５）の手順）
細胞を破砕した試料（破砕試料）からＰＦＢを分離回収し、残存する未破砕細胞に対しては再度超音波処理を行うため、低速の遠心分離を行った。破砕試料を上記１５ｍｌ遠沈管を遠心した（８８０ｒｐｍ、３分間、スイングローター）。上精にはＰＦＢが含まれるのでこれを別容器に確保したのち、未破砕細胞を多く含むペレットに５〜１０ｍｌ位のＢｕｆｆｅｒＡを再度加えて攪拌した。未破砕細胞を含む画分がほぼ無くなるまで、（４）及び（５）の手順を４回程度繰り返し、その度にＰＦＢを回収及び蓄積した。
【００４６】
３−５：  ＰＦＢ標品の粗精製（（６）の手順）
上記で回収した上清は、ＰＦＢを含む小型の細胞小器官に加え、若干の未破砕細胞、大型の細胞断片、脂質等、多様な内容物が含まれる。まず未破砕細胞、大型の細胞断片を除く目的で低速遠心を行い、未破砕細胞及び大型の細胞断片を含む沈殿物を除去した（１１００ｒｐｍ，６分間，スイングローター、３回繰り返し）。次に残った上清からＰＦＢを含む小型の細胞小器官類を沈殿及び濃縮する目的で高速遠心を行った。上清を５０ｍｌの遠沈管数本に分注し、８５００ｒｐｍ，２０分間、スイングローターで遠心した。その結果、得られた試料は最上段に脂質成分（ｗａｘ  ｅｓｔｅｒ）、中段に水溶性成分、下段に沈殿物と３段階に分離した。この中から沈殿物を回収し、超遠心用のサンプル（ショ糖密度勾配遠心用のサンプル）として確保した。
【００４７】
４．ショ糖密度勾配遠心によるＰＦＢの本精製
超遠心機ＨＩＴＡＣＨＩ  ｈｉｍａｃ  ＣＰ９０α用のスイングローターＰ２８Ｓのバケットを−３０℃フリーザに入れて冷やしておいた。上述の粗精製の工程で得られたショ糖密度勾配遠心用のサンプルに２．２Ｍのショ糖−リン酸バッファ溶液  ５−１０ｍｌを加えた。得られた懸濁液を、ピペッティングを繰り返すことでよく混ぜ込み、超遠心用遠沈管に移した。１．７５Ｍ、１．５Ｍ、０．８Ｍのショ糖−リン酸バッファ溶液を上記超遠心用遠沈管に、順に重層し、密度勾配を作成した。その後、超遠心分離を行った。（２５０００ｒｐｍ，６５分間，４℃）。遠心終了後、２．２Ｍ／２．０Ｍの界面（うす緑の）層をシリンジで余さず１５ｍｌ遠沈管に回収した。回収した高濃度ショ糖サンプルをＢｕｆｆｅｒＡで２倍に希釈し、後工程で用いるサンプルとした。
【００４８】
５．仕上げの処理と保存
サンプルをＮｕｃｌｅｐｏｒｅ  ｆｉｌｔｅｒ  （３μｍ  ｐｏｒｅ）に通し、葉緑体等のコンタミを除いた。サンプルを２ｍｌずつ容量２ｍｌのマイクロチューブに分けた。これを遠心処理することでＰＦＢを集めた（１３０００ｒｐｍ，５分間，マイクロチューブ）。上清を取り除き、少量のＢｕｆｆｅｒＡに再度懸濁してサンプルを集め、１本のマイクロチューブにまとめた。
【００４９】
電解陰極溶液から発生する水素の測定
米国Ｈ２ｓｃａｎ社製の水素検出器（商品名、Ｈ２ｓｃａｎ  Ｍｏｄｅｌ  Ｈ２−１２０２）を、Ｈ字管型電解水生成装置の陰極槽（陰極溶液が生成する管）の上部に直接設置し、電気分解を開始した。電気分解によって確かに水素が電解陰極溶液から生成していることを確認した。製品マニュアルに従い、電圧値より水素濃度（％）に変換した。結果を図３に示す。この結果は、陰極槽の上部に生成する電解陰極溶液中に水素が存在していることを示唆するものである。
【００５０】
培養細胞に対する電解陰極溶液の破砕効果の検証
上述のミドリムシの場合と同様に培養細胞（哺乳動物細胞）で電解陰極溶液の細胞を破砕する効果が得られるかを以下の手順によって確認した。
【００５１】
材料と方法
培養面積７５ｍｍ２のフラスコ２枚にヒト胎児腎臓細胞（ＨＥＫ２９３）を播種し、蛍光タンパク質ｍＣｈｅｒｒｙをコードする遺伝子をトランスフェクション試薬（プロメガ社製、商品名：ＦｕＧＥＮＥ  ＨＤ）を用いて一過性導入した。４０時間後にＨＥＫ２９３細胞（以下、単に細胞という場合がある）を回収し、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）に再懸濁し洗浄した。その後、１５ｍｌ容量のチューブ４本に等量ずつ分注し、遠心分離（８０００ｒｐｍ，２０分間）によって細胞ペレットを得た。細胞ペレットを含むチューブ４本のうち、２本には生成直後の電解陰極溶液（２５ＤＣ  ｖｏｌｔで４０分間電気分解し、Ｈ字管の陰極槽の上部から採取した電解陰極溶液）を、残りの２本には蒸留水（対照区）を、それぞれ１ｍｌ添加した。その後各チューブをボルテックスで混合後、２分間静置した。その後直ちに、４本のチューブ全てに５０ｍＭリン酸緩衝液を１ｍｌ添加し、電解陰極溶液の作用を停止させた。さらに、電解陰極溶液を添加した１本と対照区の１本には、最低出力で６秒間の超音波破砕（ＴＯＭＹ  ＵＤ−２００）を行った。超音波処理後の破砕液中の不溶性物質は遠心分離（８０００ｒｐｍ，２０分間）によって沈降させ、上澄みの蛍光強度（Ｅｘ５８７ｎｍ；  Ｅｍ６１０ｎｍ）を測定した。
【００５２】
結果
測定結果を図４に示す。電解陰極溶液添加後に超音波処理を行った実施例２では、ｍＣｈｅｒｒｙの蛍光が高く、蒸留水添加後に超音波処理を行った比較例２では蛍光強度が低かった。これは超音波処理のみの効果で細胞を破砕した場合、細胞内のタンパク質が脂質等の不溶性成分に吸着し、最後に遠心分離した際に沈殿として残ったためであると考えられる。したがって、電解陰極溶液を添加することによって、細胞内のタンパク質の性質（この場合は蛍光）を維持しながら、その後の超音波破砕の効果を高めることが可能であるといえる。
【００５３】
大腸菌に対する電解陰極溶液の破砕効果の検証
上述のミドリムシの場合と同様に大腸菌で電解陰極溶液の細胞を破砕する効果が得られるかを以下の手順によって確認した。
【００５４】
実験方法：
Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＥＧＦＰ）を発現した大腸菌を、抗生物質を含む培地で２００ｍＬ培養した。ＥＧＦＰの蛍光を目視にて確認した後、大腸菌を５０ｍｌの遠沈管４本に等分し、１５００×ｇ、１０分間の遠心分離によって回収した。上記大腸菌のペレットを含む各遠沈管に３ｍｌの蒸留水を添加し、ピペッティングによって懸濁後、１．５ｍｌマイクロチューブ３本へ１ｍｌずつ分注した（計マイクロチューブ１２本分）。マイクロチューブに入った大腸菌の懸濁液を再度遠心分離し、５０μｌ程度の大腸菌ペレットを得た。蒸留水を加えて静置した後、ＢｕｆｆｅｒＡを等量添加したもの（比較例３）、蒸留水添加し懸濁３分後にＢｕｆｆｅｒＡを等量添加し最低出力で６秒間の超音波破砕したもの（比較例４）、電解陰極溶液を加えて静置し３分間放置後にＢｕｆｆｅｒＡを等量添加したもの（実施例３）、電解陰極溶液を添加し懸濁後３分放置しＢｕｆｆｅｒＡを等量添加後に超音波破砕したもの（実施例４）の計４つの条件について、各処理を行った。処理後の全試料を３０００×ｇ、５分間の遠心分離を行い、上清をキュベットに入れ、蛍光強度を測定した（励起波長４８９ｎｍ、蛍光波長５０８ｎｍ）。結果を図５に示す。電解陰極溶液を用いて処理を行った実施例３及び４は、蒸留水を用いて処理を行った比較例３及び４よりも高い蛍光強度を示すことが分かった。また、処理後に上清を採取し、残った大腸菌ペレットについて、蛍光（Ｂ励起）顕微鏡（対物レンズ４０倍）を用いて観察した。結果を図６に示す。白く光って見えるものが、壊れずに残った大腸菌内のＥＧＦＰを示している。比較例３では、蛍光箇所が多くみられることから破砕されずに残った大腸菌が多いことが分かった。一方、実施例３では蛍光箇所が少ないことから、殆んどの大腸菌が破砕されてＥＧＦＰは上清へ移行したことがわかった。電解陰極溶液の処理によってＥＧＦＰの変性が起こっていないこともこの結果から明らかとなった。
【符号の説明】
【００５５】
１…陽極、２…陰極、１０…陽極槽、２０…陰極槽、２２…陰極槽の上部、２４…陰極槽の下部、３０…イオン交換膜、４０…連結部、１００…電解水生成装置。
【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図２】
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【図６】
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