(57)【要約】【課題】本発明は、高い分化能を保持した脂肪組織由来体性幹細胞を、再生医療に実用できる程度に多量に得ることを目的とする。【解決手段】本発明は、脂肪組織由来体性幹細胞の製造方法であって、固体相に付着した脂肪組織由来の細胞を、固体相から剥離しやすい細胞と固体相から剥離しにくい細胞とに分離し、分離した剥離しやすい細胞を低酸素培養する工程を含むことを特徴とする、製造方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂肪組織由来体性幹細胞の製造方法であって、固体相に付着した脂肪組織由来の細胞を、固体相から剥離しやすい細胞と固体相から剥離しにくい細胞とに分離し、分離した剥離しやすい細胞を低酸素培養する工程を含むことを特徴とする、製造方法。
【請求項２】
細胞内における低酸素誘導因子の発現量が所定の値を超えないことを指標として、低酸素培養の条件が設定される、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
固体相から剥離しやすい細胞と固体相から剥離しにくい細胞との分離が、脂肪組織由来の細胞が付着した固体相に細胞剥離剤を添加して、付着した細胞を部分的に剥離させ、剥離した細胞を取得することによって行われる、請求項１または２に記載の製造方法。
【請求項４】
細胞剥離剤が、ＥＤＴＡを含む、請求項３に記載の製造方法。
【請求項５】
固体相に付着した脂肪組織由来の細胞が、脂肪組織から赤血球を除く工程を含む方法によって得られたものである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の製造方法によって製造された脂肪由来体性幹細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脂肪組織由来体性幹細胞の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
再生医療に用いられる幹細胞として、体性幹細胞がある。体性幹細胞は、生体内から採取されるものであり、安全性が高いと考えられている。
【０００３】
体性幹細胞は、生体内の様々な部位から採取され、脂肪組織から採取することができる。脂肪組織から採取された体性幹細胞は、脂肪組織由来体性幹細胞などと呼ばれる。脂肪組織由来体性幹細胞は、他の組織由来の体性幹細胞とは異なり、内胚葉、中胚葉、および外肺葉からなる三胚葉への分化能を備えているといわれ、高い汎用性が期待される。従来、脂肪組織由来体性幹細胞は、各種の方法で調製されてきた（特許文献１〜７）。しかしながら、従来の方法では、脂肪組織由来体性幹細胞を培養しても、十分な量を得る前に老化が起こって増殖が停止し、高い分化能が維持されず、脂肪組織由来体性幹細胞の再生医療への実用化は困難であると考えられていた。
【０００４】
細胞を人工的に培養する条件として、低酸素培養が知られている。低酸素培養は、生体内における生理的酸素条件を模倣したものといわれており（特許文献８）、低酸素培養によって幹細胞の分化能力や増殖能力が向上したことを開示する先行技術文献が存在する（特許文献８〜１２）。しかしながら、これらの先行技術において、分化能力または増殖能力に対する低酸素培養の影響は、数倍程度の増強であり、微弱であった。脂肪組織由来体性幹細胞の場合、従来の数倍程度の数の細胞が得られても、再生医療への実用化は難しい。
【０００５】
特許文献１３は、脂肪組織由来体性幹部細胞を低酸素培養する実験を開示している。しかしながら、この文献には、高い分化能を有する細胞が再生医療に実用できるほど多量に得られたとの記載はない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１１−１７２５８６号公報
【特許文献２】国際公開第２００７／０３９９８６号
【特許文献３】国際公開第２００８／１５３１７９号
【特許文献４】国際公開第２００８／１５３１８０号
【特許文献５】特表２００７−５０９６０１号公報
【特許文献６】特表２００５−５０２３５２号公報
【特許文献７】国際公開第２０００／５３７９５号
【特許文献８】特表２００２−５３００６７号公報
【特許文献９】特開２００３−１２５７８７号公報
【特許文献１０】特開２０１１−１５６６２号公報
【特許文献１１】特表２０１１−５２９３２９号公報
【特許文献１２】特表２００２−５３００６８号公報
【特許文献１３】国際公開第２００８／０１８４５０号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、本発明は、高い分化能を保持した脂肪組織由来体性幹細胞を、再生医療に実用できる程度に多量に得ることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、固体相に付着した脂肪組織由来の細胞のうち、固体相から剥離しやすい細胞からなる細胞集団が、低酸素条件下では、極めて長期間にわたって高い分化能を維持したまま老化せずに効率よく増殖を続けるため、このような増殖を製造工程に含めることによって、再生医療に実用できる程度の多量の細胞が得られることを見出した。固体相に付着した細胞を剥離しやすい細胞と剥離しにくい細胞とに分離せずに用いる従来の方法の場合には、低酸素条件で培養しても、このような顕著な結果は観察されなかったため、この知見は、全く意外である。低酸素条件は、剥離しやすい細胞に対して、特異的な影響を有することが推測される。
【０００９】
すなわち、本発明は、脂肪組織由来体性幹細胞の製造方法であって、固体相に付着した脂肪組織由来の細胞を、固体相から剥離しやすい細胞と固体相から剥離しにくい細胞とに分離し、分離した剥離しやすい細胞を低酸素培養する工程を含むことを特徴とする、製造方法を提供する。
【００１０】
また、本発明は、細胞内における低酸素誘導因子の発現量が所定の値を超えないことを指標として、低酸素培養の条件が設定される、上記の製造方法を提供する。
【００１１】
また、本発明は、固体相から剥離しやすい細胞と固体相から剥離しにくい細胞との分離が、脂肪組織由来の細胞が付着した固体相に細胞剥離剤を添加して、付着した細胞を部分的に剥離させ、剥離した細胞を取得することによって行われる、上記の製造方法を提供する。
【００１２】
また、本発明は、細胞剥離剤が、ＥＤＴＡを含む、上記の製造方法を提供する。
【００１３】
さらに、本発明は、固体相に付着した脂肪組織由来の細胞が、脂肪組織から赤血球を除く工程を含む方法によって得られたものである、上記の製造方法を提供する。
【００１４】
また、本発明は、上記の製造方法によって製造された脂肪由来体性幹細胞を提供する。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、高い分化能を保持した脂肪組織由来体性幹細胞を、再生医療に実用できる程度に多量に取得することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、低酸素培養を用いる本発明の製造方法によって製造される細胞の増殖曲線を、通常培養の場合と対比するグラフである。図１のＰＤＬは、集団倍加レベル（Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  Ｄｏｕｂｌｉｎｇ  Ｌｅｖｅｌ）を示す。
【図２】図２は、低酸素培養を用いる本発明の製造方法によって製造された細胞集団に占めるＳ期の細胞の割合を、通常培養の場合と対比するグラフである。
【図３】図３は、本発明の製造方法によって製造された脂肪組織由来体性幹細胞に骨または脂肪への分化を誘導して得られた細胞の染色像を、通常培養の場合と対比する写真である。
【図４】図４は、本発明の製造方法によって製造された脂肪組織由来体性幹細胞の脂肪への分化効率を、通常培養の場合と対比するグラフである。
【図５】図５は、本発明の製造方法によって製造された脂肪組織由来体性幹細胞に神経細胞への分化を誘導して得られた細胞の染色像を示す写真である。
【図６】図６は、酸素濃度が異なる条件で増殖を行った場合における細胞の増殖曲線を示す。図１の縦軸は、集団倍加レベルを示す。
【図７】図７は、図６の各培養条件における測定の１２日目の倍加時間を対比するグラフである。
【図８】図８は、図６の増殖における５日目の細胞内のＨＩＦ１αタンパク質の発現量を対比する写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明の製造方法においては、固体相に付着した脂肪組織由来の細胞が用いられる。
【００１８】
固体相に付着した脂肪組織由来の細胞は、脂肪組織由来の細胞を固体相に加え、増殖させて、固体相に付着させて得てもよい。固体相に加える脂肪組織由来の細胞は、脂肪組織を液体中に分散させ、遠心分離を行い、ペレットを回収することによって得てもよい。脂肪組織を分散させる液体は、外来性のコラゲナーゼなどのタンパク質分解酵素を含んでもよい。脂肪組織は、ヒト、マウス等の哺乳類に由来するものであってよい。脂肪組織から脂肪組織由来の細胞を得る工程は、赤血球を除く工程を含んでいてもよい。赤血球を除く工程は、密度勾配遠心または比重法を用いてもよい。脂肪組織由来の細胞を付着させる固体相は、培養容器であってもよい。脂肪組織由来の細胞を固体相に加えた後の増殖は、低グルコース培地で二酸化炭素存在下、および通常酸素濃度条件下で行ってもよい。低グルコース培地中のグルコース濃度は、例えば、０．５〜３ｇ／Ｌである。増殖の際の二酸化炭素の濃度は、例えば、２〜７％である。増殖の際の酸素濃度は、例えば、１０〜２５％である。脂肪組織由来の細胞を固体相に付着させたのち、固体相の洗浄を行い、付着しなかった細胞を除去してもよい。
【００１９】
本発明の製造方法においては、固体相に付着した脂肪組織由来の細胞を、固体相から剥離しやすい細胞と固体相から剥離しにくい細胞とに分離し、分離した剥離しやすい細胞が用いられる。
【００２０】
固体相から剥離しやすい細胞と固体相から剥離しにくい細胞とを分離して、分離した剥離しやすい細胞を取得するためには、脂肪組織由来の細胞を付着させた固体相に細胞剥離剤を添加して、付着した細胞を部分的に剥離させ、剥離した細胞を取得してもよい。添加する細胞剥離剤は、培養細胞を容器から剥離させるための薬剤であり、ＥＤＴＡを含む溶液であってもよい。ＥＤＴＡを含む溶液は、溶質としてＥＤＴＡのみを含む溶液であってもよい。溶液中のＥＤＴＡの濃度は、例えば、０．０５〜１ｇ／Ｌである。細胞剥離剤の添加後に剥離した細胞の取得は、細胞剥離剤の添加の後に、固体相から浮遊した細胞を取得することによって行ってもよい。
【００２１】
本発明の製造方法においては、分離した剥離しやすい細胞が低酸素培養される。
【００２２】
分離した細胞の低酸素培養は、分離した細胞を、培地を含む容器中で５０００〜２００００細胞／ｃｍ２の細胞密度で、低酸素培養することによって行ってもよい。培養に用いられる容器は、フィブロネクチン等の糖タンパク質が被覆されていてもよい。フィブロネクチンは、細胞接着分子であり、細胞外マトリクスを形成する生体物質である。培養に用いられる培地は、ペプチドホルモンを含む細胞増殖促進剤、合成副腎皮質ホルモン、酸化防止剤、成長因子、血清等を含んでもよい。低酸素培養における酸素の濃度は、例えば、３％〜７％、好ましくは、３．５％〜６．５％、より好ましくは、４％〜６％、さらにより好ましくは、４．５％〜５．５％である。細胞の低酸素培養は、二酸化炭素存在下で行ってもよい。二酸化炭素の濃度は、例えば、４〜１０％である。低酸素培養における培養温度は、例えば、３２〜３９℃である。
【００２３】
低酸素誘導因子の発現量は、低酸素条件下で増大する傾向にあることが知られている。しかしながら、後述の実施例に示すように、本発明の製造方法は、細胞内における低酸素誘導因子の発現量が増大しない程度の低酸素条件において、より高い増殖度を実現することが明らかになった。したがって、本発明の製造方法における低酸素培養の条件は、細胞内における低酸素誘導因子の発現量が所定の値を超えないことを指標として設定することが好ましい。これにより、より確実に多量の細胞を得ることができる。設定する培養条件は、たとえば、培養時間や培養時の酸素濃度である。
【００２４】
低酸素誘導因子は、ＨＩＦ（Ｈｙｐｏｘｉａ  Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  Ｆａｃｔｏｒ）とも呼ばれる。低酸素誘導因子としては、たとえば、ＨＩＦα、ＨＩＦ１βなどが挙げられる。ＨＩＦαとしては、たとえば、ＨＩＦ１α、ＨＩＦ２α、ＨＩＦ３αなどが挙げられる。
【００２５】
細胞内における低酸素誘導因子の発現量は、たとえば、低酸素培養中の細胞の一部を分離して、分離した細胞についてウェスタンブロッティング法などを用いて低酸素誘導因子を検出することによって測定することができる。測定する低酸素誘導因子は、好ましくは、低酸素誘導因子のタンパク質である。発現量の測定は、低酸素誘導因子に付した標識をもとにして行ってもよい。
【００２６】
低酸素培養条件を設定するための指標である所定の値は、発現量を測定する実験系や、細胞を取得する目的などに応じて適宜設定すればよい。たとえば、当該所定の値は、通常酸素条件（たとえば、２０％）における発現量や、１％以下の低酸素培養条件における発現量などを参照して設定される。
【００２７】
低酸素培養の条件は、細胞の増殖過程において経時的に測定する低酸素誘導因子の発現量に基づき、経時的に調整してもよい。この場合、より繊細に条件を設定することができ、これにより、一層多量の細胞を得ることができる。
【実施例】
【００２８】
以下、実施例によって本発明を説明するが、本発明は、これに限定されるものではない。
【００２９】
実施例１  ヒト脂肪組織由来体性幹細胞の製造：
ヒト腹部より吸引法にて脂肪組織を摘出した。脂肪組織は細かく刻んだ後、０．０７５％コラゲナーゼタイプＩ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含む、ハンクス緩衝溶液（ＨＢＳＳ，ＧＩＢＣＯ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）中で３７℃１時間インキュベートし、細胞を分散させた。分散させた細胞はセルストレーナー（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を用いてフィルターにかけ、８００ｇ、１０分間遠心し、細胞を得た。細胞に含まれる赤血球は、Ｇｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（ｄ＝１．０７７；Ｎｙｃｏｍｅｄ，Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ）を用いて密度勾配遠心をして取り除いた。残りの細胞を、１０％ウシ血清（ＦＢＳ，ＧＩＢＣＯ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）含有ダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）（ＧＩＢＯ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））でＣＯ２インキュベータ中３７℃、２４時間培養した。２４時間後、接着した細胞を０．２ｇ／Ｌのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）溶液（ナカライテスク、京都、日本）で処理し、浮遊してきた細胞を１×インシュリン−トランスフェリン−セレニウム（ＩＴＳ，ＧＩＢＣＯ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１ｎＭデキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、１００μＭアスコルビン酸−２−リン酸塩（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、１０ｎｇ／ｍＬ上皮成長因子（ＥＧＦ，Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ，ＮＪ）、および５％胎児ウシ血清（Ｇｉｂｃｏ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有するＳｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（ニプロ、大阪、日本）に懸濁し、ヒトフィブロネクチンコートディッシュ（ＡＧＣ、東京、日本）上に１０，０００細胞／ｃｍ２の密度で播種し、培養を行った。培養はチャンバー内をＰｒｏＯｘ１１０（協同インターナショナル、東京、日本）を用いて５％二酸化炭素、５％酸素濃度に設定し、３７℃で行った（低酸素培養）。培地は２日おきに交換し、セミコンフルエント（細胞密度が８０〜９０％程度）な状態で継代を行った。酸素濃度を５％の代わりに２０％とした他は同様のものを比較対照として用いた（通常培養）。
【００３０】
細胞数を経時的に測定した結果を、増殖曲線として図１に示す。図１に示すように、８０日目には、通常培養の場合には増殖を停止したが、低酸素培養の場合には、増殖を続けていた。８０日目には、低酸素培養の場合には、通常培養の場合の約１３０倍の数の細胞が得られた。このことから、低酸素培養によって、ヒト脂肪組織由来体性幹細胞の増殖能力および生存能力が顕著に亢進し、多量にヒト脂肪由来体性幹細胞を製造できることが明らかになった。
【００３１】
実施例２  ヒト脂肪組織由来体性幹細胞の増殖および生存能力：
Ｃｌｉｃｋ−ｉＴ  ＥｄＵ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、実施例１で製造された５日目の細胞集団のうち、Ｓ期にある細胞の割合を調べた。
結果をグラフとして図２に示す。図２に示されるように、低酸素培養の場合には、Ｓ期にある細胞の比率が高く、ＤＮＡ複製能が亢進していることがわかる。
【００３２】
実施例３  ヒト脂肪組織由来体性幹細胞の脂肪組織への分化能：
実施例１で製造された継代培養８回後の細胞集団について、１．７μＭ  インスリン、２．５μＭ  デキサメタゾン、０．５ｍＭ  ＩＢＭＸ（Ｉｓｏｂｕｔｙｌｍｅｔｈｙｌｘａｎｔｈｉｎｅ）を含有する脂肪分化誘導培地の添加によって脂肪組織への分化を誘導し、オイルレッドO染色を行った。また、脂肪組織への分化誘導率を比色定量法によって計測した。
染色後の細胞集団の代表的な写真を、図３の左図に示し、脂肪組織への分化誘導率を、グラフとして図４に示す。図３の左図および図４に示されるように、低酸素培養の場合には、染色された細胞の割合が高く、通常培養の場合に比して、油滴形成能を持つ脂肪組織への分化効率が高いことがわかる。
【００３３】
実施例４  ヒト脂肪組織由来体性幹細胞の骨組織への分化能：
実施例１で製造された継代培養８回後の細胞集団について、０．１μＭ  デキサメタゾン、５０ｍｇ／ｍＬ  Ｌ−アスコルビン酸、１０ｍＭ  βグリセロリン酸を含有する骨分化培地の添加によって骨組織への分化を誘導し、アリザリンレッド染色を行った。
染色後の細胞集団の代表的な写真を、図３の右図に示す。図３の右図に示すように、低酸素培養の場合には、染色された細胞の割合が高く、通常培養の場合に比して、骨組織への分化効率が高いことがわかる。
【００３４】
実施例５  ヒト脂肪組織由来体性幹細胞の神経細胞への分化能：
実施例１で製造された１２日目の細胞集団について、Ｎｅｕｒａｌ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｈｙｃｌｏｎｅ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  ＭＡ，  ＵＳＡ）によって神経組織への分化を誘導し、βＩＩＩチューブリン、ＮＦ２００、およびＤＡＰＩを用いて染色を行った。
染色した細胞の代表的な写真を、図５に示す。図５に示すように、低酸素培養条件下で製造された実施例１の細胞集団は、神経細胞への分化能を有していることがわかる。
【００３５】
実施例６  低酸素誘導因子の発現量とヒト脂肪由来体性幹細胞の増殖との関係：
酸素濃度を代えたほかは実施例１と同様の実験を行い、ヒト脂肪由来体性幹細胞を増殖させた。増殖曲線を図６に示す。図６の増殖曲線における１２日目の倍加時間を図７に示す。また、５日目の細胞におけるＨＩＦ１αタンパク質の発現量を、抗ヒトＨＩＦ１αマウスモノクローナル抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いてウェスタンブロッティング法によって調べた。発現量の結果を図８に示す。
図７に示すように、５％から２％に酸素濃度が低下するにつれて、倍加時間が長くなっている。また、図８に示すように、５％から２％に酸素濃度が低下するにつれて、ＨＩＦ１αタンパク質の発現量が増大している。そして、ＨＩＦ１αタンパク質の発現量の増大傾向と、倍加時間の増大傾向は、類似している。
このように、増殖度の高さは、ＨＩＦ１αタンパク質の発現量の低さと相関関係があった。このことから、細胞内における低酸素誘導因子の発現量が所定の値を超えないことを指標として酸素濃度を設定することによって、細胞の増殖度が高い培養条件に設定することができることが分かる。
【図５】
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【図６】
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【図８】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図７】
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