(57)【要約】【課題】  抗ウイルス剤を提供する。【解決手段】  ヘアリーベッチ（Viciavillosa）レクチン，フジ（Wisteria floribunda）レクチン，ヒイロチャワンタケ（Aleuria aurantia）レクチン，又は麹菌（Aspergillusoryzae）レクチンを有効成分として含む抗ウイルス剤，抗ウイルス剤がインフルエンザの治療剤である抗ウイルス剤，又はこの抗ウイルス剤を含む，飲食品。【選択図】  図１
2014201587.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘアリーベッチ（Vicia villosa）レクチン，フジ（Wisteria floribunda）レクチン，ヒイロチャワンタケ（Aleuria
aurantia）レクチン，又は麹菌（Aspergillus oryzae）レクチンを有効成分として含む抗ウイルス剤。
【請求項２】
請求項１に記載の抗ウイルス剤であって，
前記抗ウイルス剤がインフルエンザの治療剤である抗ウイルス剤。
【請求項３】
請求項１に記載の抗ウイルス剤を含む，
鼻腔又は経口投与用のインフルエンザの治療剤。
【請求項４】
請求項１に記載の抗ウイルス剤を含む，飲食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は，レクチンを含む抗ウイルス剤に関する。より詳しく説明すると，本発明は，例えば植物や菌類から抽出及び精製されたレクチンを有効成分として含むインフルエンザの治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
インフルエンザウイルスは，オルソミクソウイルス科に属するＲＮＡウイルスで，Ａ，Ｂ及びＣ型の３種の型に分類される（非特許文献１）。インフルエンザウイルスは，忠実度の低いＲＮＡポリメラーゼによりゲノム複製される。これにより，インフルエンザウイルスのウイルスゲノム中に高頻度で変異が導入される。そのような変異が蓄積した結果として，抗原性の連続的変化を生じる。この現象は，抗原ドリフトとよばれる。インフルエンザウイルスは，抗体や薬剤等の外圧下においても抗原ドリフトによって抗原性の変化を起こすことで外圧を回避し，耐性を獲得する。このため，毎年冬季に主にＡ及びＢ型インフルエンザウイルスが流行する（非特許文献２及び３）。
【０００３】
例えば，特許４７４４５３３号公報（下記特許文献１）には，マンノース結合型レクチンを含むコレクチン属タンパク質を有する微生物感染性疾患治療及び予防用噴霧乾燥粉末組成物が開示されている。そして，この組成物は，インフルエンザの治療に有効であるとされている。すなわち，特許文献１にはインフルエンザの治療に有効なレクチンが開示されている。特許文献１の実施例では，大韓民国ドビール（Ｄｏｂｅｅｌ）社製の組換えマンノース結合型レクチン（ＭＢＬ）が用いられている。マンノース結合型レクチン（ＭＢＬ）を得る方法は公知である。例えば，特許４０５１０３０号公報（下記特許文献２）には，マンノース結合型レクチンを，ヒト血漿から精製する方法が開示されている。
【０００４】
上記のようにレクチン類は公知である。たとえば，特許第４５１４１６３号公報（特許文献３）には，担子菌から抽出されたフコースα１→６特異的レクチンが開示されている。特開２００９−１３１３８号公報（特許文献４）には，ヌメリガサ属（Hygrophorus）担子菌に由来するレクチンが開示されている。特開２００９−２０９０７０号公報（特許文献５）には，カヤタケ属担子菌に由来するレクチンが開示されている。特開２０１２−２１９０６４号公報（特許文献６）には，羅漢果より抽出されたレクチンが開示されている。
【０００５】
特許第５０７２１５９号公報（特許文献７）には，粘膜アジュバンドとして用いられる植物レクチンが開示されている。植物レクチンの例として，ヘアリーベッチ（Vicia villosa）が開示されている（段落［００１２］）。
【０００６】
再表０３／０８４５６９号公報（特許文献８）には，レクチンの例として，ＷＧＡ（Ｔ．ｖｕｌｇａｒｉｓ由来の
ｗｈｅａｔ−ｇｅｒｍ ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ），ＣｏｎＡ（Ｃ．ｅｎｓｉｆｏｒｍｉｓ由来のｃｏｎｃａｎａｖａｌｉｎ Ａ），ＲＩＣ（Ｒ．ｃｏｍｍｕｎｉｓ由来の毒素），Ｌ−ＰＨＡ（Ｐ．ｖｕｌｇａｒｉｓ由来のｌｅｕｋｏａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ），ＬＣＡ（Ｌ．ｃｕｌｉｎａｒｉｓ由来のｌｅｎｔｉｌ
ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ），ＰＳＡ（Ｐ．ｓａｔｉｖｕｍ由来のＰｅａ ｌｅｃｔｉｎ），ＡＡＬ（Ａｌｅｕｒｉａ ａｕｒａｎｔｉａ Ｌｅｃｔｉｎ），ＡＣＬ（Ａｍａｒａｎｔｈｕｓ
ｃａｕｄａｔｕｓ Ｌｅｃｔｉｎ），ＢＰＬ（Ｂａｕｈｉｎｉａ ｐｕｒｐｕｒｅａ Ｌｅｃｔｉｎ），ＤＳＬ（Ｄａｔｕｒａ ｓｔｒａｍｏｎｉｕｍ Ｌｅｃｔｉｎ），ＤＢＡ（Ｄｏｌｉｃｈｏｓ
ｂｉｆｌｏｒｕｓ Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ），ＥＢＬ（Ｅｌｄｅｒｂｅｒｒｙ Ｂａｌｋ Ｌｅｃｔｉｎ），ＥＣＬ（Ｅｒｙｔｈｒｉｎａ ｃｒｉｓｔａｇａｌｌｉ Ｌｅｃｔｉｎ），ＥＥＬ（Ｅｕｏｎｙｍｕｓ
ｅｕｒｏｐａｅｕｓ Ｌｅｃｔｉｎ），ＧＮＬ（Ｇａｌａｎｔｈｕｓ ｎｉｖａｌｉｓ Ｌｅｃｔｉｎ），ＧＳＬ（Ｇｒｉｆｆｏｎｉａ ｓｉｍｐｌｉｃｉｆｏｌｉａ Ｌｅｃｔｉｎ），ＨＰＡ（Ｈｅｌｉｘ
ｐｏｍａｔｉａ Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ），ＨＨＬ（Ｈｉｐｐｅａｓｔｒｕｍ Ｈｙｂｒｉｄ Ｌｅｃｔｉｎ），Ｊａｃａｌｉｎ，ＬＴＬ（Ｌｏｔｕｓ ｔｅｔｒａｇｏｎｏｌｏｂｕｓ
Ｌｅｃｔｉｎ），ＬＥＬ（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ Ｌｅｃｔｉｎ），ＭＡＬ（Ｍａａｃｋｉａ ａｍｕｒｅｎｓｉｓ Ｌｅｃｔｉｎ），ＭＰＬ（Ｍａｃｌｕｒａ
ｐｏｍｉｆｅｒａ Ｌｅｃｔｉｎ），ＮＰＬ（Ｎａｒｃｉｓｓｕｓ ｐｓｅｕｄｏｎａｒｃｉｓｓｕｓ Ｌｅｃｔｉｎ），ＰＮＡ（Ｐｅａｎｕｔ Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ），Ｅ−ＰＨＡ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ
ｖｕｌｇａｒｉｓ Ｅｒｙｔｈｒｏａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ），ＰＴＬ（Ｐｓｏｐｈｏｃａｒｐｕｓ ｔｅｔｒａｇｏｎｏｌｏｂｕｓ Ｌｅｃｔｉｎ），ＲＣＡ（Ｒｉｃｉｎｕｓ
ｃｏｍｍｕｎｉｓ Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ），ＳＴＬ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ Ｌｅｃｔｉｎ），ＳＪＡ（Ｓｏｐｈｏｒａ ｊａｐｏｎｉｃａ Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ），ＳＢＡ（Ｓｏｙｂｅａｎ
Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ），ＵＥＡ（Ｕｌｅｘ ｅｕｒｏｐａｅｕｓ Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ），ＶＶＬ（Ｖｉｃｉａ ｖｉｌｌｏｓａ Ｌｅｃｔｉｎ），ＷＦＡ（Ｗｉｓｔｅｒｉａ
ｆｌｏｒｉｂｕｎｄａ Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）が開示されている。
【０００７】
特公平８−２５８９０号公報には，Ａｂｒｕｓ  ｐｒｅｃａｔｏｒｉｕｓ，Ｃａｌｐｕｒｉａ  ａｅｇｇｐｔｉａｎａ，Ｆｏｍｅｓ  ｆｏｒｍｅｎｔａｒｉｕｓ（ツリガネタケ）,Ｍａａｃｋｉａ ａｍｕｒｅｎｓｉｓ（イヌエンジュ）,Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｌｕｎａｔａｓ（リママメ）,Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ（インゲンマメ），及び， Ｃａｎａｖａｌｉａ ｅｎｓｉｆｏｒｍｉｓ（タチナタマメ）,Ｊａｃｋ ｂｅａｎ（ナタマメ）,Ｃｅｒａｓｔｒｉｕｍ ｆｏｍｅｎｔｏｓｕｓから得られるレクチン類を有効成分として含有する抗ウイルス剤が開示されている。
【０００８】
インフルエンザに感染した後，１日程度経過した後でなければインフルエンザを診断及び治療することができない。このため，インフルエンザは，患者が高熱となるといった重篤な症状を経験した後に，治療剤を用いて治癒される。このため，患者がインフルエンザに感染した初期の段階で投与でき，患者が重篤となることを防止できる治療剤の開発が望まれる。
【０００９】
後述するとおり，本発明の有効成分はレクチンである。レクチンには様々な種類が存在する。例えば，レクチンのひとつにヘアリーベッチ（Ｖｉｃｉａ  ｖｉｌｌｏｓａ）由来のレクチンがある。このレクチンの製造方法は，例えば，Ｓ．Ｅ．Ｔｏｌｌｅｆｓｅｎ，ｅｔ．ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９８３  ２５８  ５１６５−５１７１（非特許文献４）に開示されている。
【００１０】
また，レクチンの上記とは別の例は，フジ（Ｗｉｓｔｅｒｉａ  ｆｌｏｒｉｂｕｎｄａ）由来のレクチンである。このレクチンの製造方法は，例えば，Ｋｕｒｏｋａｗａ  Ｔ，ｅｔ．ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９７６  ２５１  ５６８６−５６９３（非特許文献５）に開示されている。
【００１１】
また，レクチンの上記とは別の例は，ヒイロチャワンタケ（Ａｌｅｕｒｉａ  ａｕｒａｎｔｉａ）由来のレクチンである。このレクチンの製造方法は，例えば，Ｋｏｃｈｉｂｅ  Ｎ，ｅｔ．ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９８０  １９  ２８４１−２８４６（非特許文献６）に開示されている。
【００１２】
また，レクチンの上記とは別の例は，麹菌（Aspergillus oryzae）由来のレクチンである。このレクチンの製造方法は，例えば，Ｍｕｒａｋａｗａ  Ｔ，ｅｔ．ａｌ．，Ｂｉｏｓｃｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００２  ６６  １００２−１００８（非特許文献７）に開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】特許４７４４５３３号公報
【特許文献２】特許４０５１０３０号公報
【特許文献３】特許第４５１４１６３号公報
【特許文献４】特開２００９−１３１３８号公報
【特許文献５】特開２００９−２０９０７０号公報
【特許文献６】特開２０１２−２１９０６４号公報
【特許文献７】特許第５０７２１５９号公報
【特許文献８】再表０３／０８４５６９号公報
【特許文献９】特公平８−２５８９０号公報
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】清水一史，「インフルエンザウイルスの抗原性変異機序」，日本臨床，日本臨牀社，55，p.2610-2616 (1997)
【非特許文献２】飛田清毅，「インフルエンザウイルスの分類の基準と命名法」，日本臨床，日本臨牀社，55，p.2512-2514 (1997)
【非特許文献３】西村秀一，「最近のA型，B型インフルエンザウイルスの抗原変異」，日本臨床，日本臨牀社，55，p.2617-2626 (1997)
【非特許文献４】Ｓ．Ｅ．Ｔｏｌｌｅｆｓｅｎ，ｅｔ．ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９８３  ２５８  ５１６５−５１７１
【非特許文献５】Ｋｕｒｏｋａｗａ  Ｔ，ｅｔ．ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９７６  ２５１  ５６８６−５６９３
【非特許文献６】Ｋｏｃｈｉｂｅ  Ｎ，ｅｔ．ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９８０  １９  ２８４１−２８４６
【非特許文献７】Ｍｕｒａｋａｗａ  Ｔ，ｅｔ．ａｌ．，Ｂｉｏｓｃｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００２  ６６  １００２−１００８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明は，抗ウイルス剤を提供することを目的とする。
【００１６】
本発明は，インフルエンザの治療剤を提供することを目的とする。特に本発明は，インフルエンザ感染の初期の段階で患者が重篤となる現象を防止できるインフルエンザの治療剤を提供することを目的とする。
【００１７】
本発明は，インフルエンザに罹患していない患者に対しても投与できる抗ウイルス剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明の第１の側面は，抗ウイルス剤に関する。この抗ウイルス剤は，ヘアリーベッチ（Vicia villosa）レクチン，フジ（Wisteria floribunda）レクチン，ヒイロチャワンタケ（Aleuria aurantia）レクチン，又は麹菌（Aspergillus
oryzae）レクチンを有効成分として含む。これらのレクチンを本明細書では本発明のレクチンとよぶ。これらは，抗ウイルス剤に１種又は２種含まれても良い。抗ウイルス剤には，本発明のレクチン以外のレクチンや，そのほかの成分が含まれても良い。本発明の抗ウイルス剤は，上記した本発明のレクチンがその機能を発揮するよう，本発明のレクチンを有効成分として有効量含む。
【００１９】
本発明の抗ウイルス剤の好ましい態様は，インフルエンザの治療剤である。インフルエンザの治療剤は，インフルエンザに感染することを予防する予防剤や，インフルエンザに罹患した患者が重篤となる事態を防止する重篤化を防ぐための剤のほか，インフルエンザからの治癒を促進する剤のいずれであっても良い。
【００２０】
本発明の抗ウイルス剤の好ましい態様は，鼻腔又は経口投与用のインフルエンザの治療剤である。
【００２１】
本発明の抗ウイルス剤の好ましい態様は，先に説明した抗ウイルス剤を含む，飲食品である。
【発明の効果】
【００２２】
本発明によれば，実施例により実証されたとおり，特定の種類のレクチンを含む抗ウイルス剤を提供できる。
【００２３】
本発明によれば，実施例により実証されたとおり，特定の種類のレクチンを含む，インフルエンザの治療剤を提供できる。特に本発明は，インフルエンザ感染の初期の段階で患者が重篤となる現象を防止できるインフルエンザの治療剤を提供できる。
【００２４】
本発明によれば，例えば，植物や菌類から抽出及び精製されたレクチンを有効成分として含むため，副作用が少ない。このため，本発明は，インフルエンザに罹患していない患者に対しても問題がない。よって，本発明によれば，患者がインフルエンザに罹患しているか検出できない時期においても，患者に対して投与できるインフルエンザの治療剤を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１は，実施例１に関する各レクチンの抗インフルエンザウイルス活性について培養細胞を用いた感染系にて評価した結果をグラフ化した図面に替わるグラフである。
【図２】図２は，実施例２に関するマウス感染モデル系を用いた抗インフルエンザウイルス活性評価系の試験概要を示す図である。
【図３】図３は，実施例２に関するマウス感染モデル系を用いた抗インフルエンザウイルス活性評価系において，各レクチン接種時の感染後マウス体重推移をグラフ化した図面に替わるグラフである。
【図４Ａ】図４は，実施例３に関するマウス体重減少の程度を定量化し「感染阻害率（%）」として算定する方法を概説した図である。図４Ａは，マウス感染モデル系による薬剤の抗ウイルス活性評価試験結果例を示す。
【図４Ｂ】図４は，実施例３に関するマウス体重減少の程度を定量化し「感染阻害率（%）」として算定する方法を概説した図である。図４Ｂは，現象面積相対値グラフを示す。
【図４Ｃ】図４は，実施例３に関するマウス体重減少の程度を定量化し「感染阻害率（%）」として算定する方法を概説した図である。図４Ｃは，感染阻害率グラフを示す。
【図５】図５は，実施例３に関するマウス感染モデル系での各レクチンの抗インフルエンザウイルス活性評価試験の結果を感染阻害率（%）としてグラフ化した図面に替わるグラフである。
【図６】図６は，実施例４に関するレクチン２種（AAL，AOL）接種時のマウス生存率推移をグラフ化した図面に替わるグラフである。
【図７】図７は，実施例５に関するプラーク形成試験法にもとづくレクチンの作用点解析方法について概説した図である。
【図８】図８は，実施例５に関するレクチン前処理時のプラーク形成試験結果をグラフ化した図面に替わるグラフである。
【図９】図９は，実施例５に関するレクチン後処理時のプラーク形成試験結果について出現プラーク像を写真撮影しレクチンごとに示した図面に替わる写真である。
【図１０】図１０は，実施例５に関するレクチン後処理時のプラーク形成試験結果をグラフ化した図面に替わるグラフである。
【図１１】図１１は，実施例６に関する有効レクチンのインフルエンザウイルス亜型間での抗ウイルス活性比較試験の結果を亜型ごとにグラフ化した図面に替わるグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本発明の第１の側面は，レクチンを有効成分として含む抗ウイルス剤に関する。抗ウイルス剤の例は，インフルエンザの治療剤である。本発明の抗ウイルス剤の好ましい例は，インフルエンザに感染してから２４時間以内（好ましくは１時間以上１２時間以下）に投与されるインフルエンザの治療剤である。本発明の抗ウイルス剤は，インフルエンザの潜伏期において投与することで，インフルエンザの発症を抑えるために用いることもできる。また，本発明の抗ウイルス剤は，例えば，患者の体温が平熱より２℃以上高くなった状態において投与することでインフルエンザの感染が進行する事態を効果的に防止することができる。本発明の抗ウイルス剤の有効成分であるレクチンは，後述する通り，例えば，植物由来のレクチンが含まれ，これらは副作用が少ない。このため，インフルエンザに罹患したか否か診断することができる状態となる前に，本発明の抗ウイルス剤を患者に投与することができる。その結果，患者がインフルエンザに罹患していた場合は，患者が重篤となる事態を効果的に防止できる。
【００２７】
本発明の抗ウイルス剤の有効成分であるレクチンは，ヘアリーベッチ（Vicia villosa）レクチン，フジ（Wisteria floribunda）レクチン，ヒイロチャワンタケ（Aleuria aurantia）レクチン，又は麹菌（Aspergillus
oryzae）レクチンである。これらは，アリーベッチ，フジ，ヒイロチャワンタケ，又は麹菌を用いて得られるこれら由来のレクチンでも良いし，これら天然物由来のレクチンと同一又は類似した配列を有し，天然物由来のレクチンと同様の機能を有する遺伝子組み換え技術など公知の方法を用いて製造されたレクチンであっても良い。本発明の抗ウイルス剤は，これらを１種又は２種以上含んでもよい。本発明の抗ウイルス剤は，細胞毒性濃度を感染阻害濃度で除した選択指数の結果から，好ましくはフジレクチン，ヘアリーベッチレクチン又はヒイロチャワンタケレクチンを１種又は２種以上含む抗ウイルス剤であり，さらに好ましくはフジレクチンを含む抗ウイルス剤である。また，上記したレクチンは，公知のレクチンであり市販されている。このため本発明の抗ウイルス剤の有効成分であるレクチンとして市販されているものを適宜用いてもよい。
【００２８】
以下に，本発明の有効成分であるレクチンについて説明する。なお本発明におけるレクチンの製造方法等は特に限定されず，遺伝子組み換え技術等により植物等から抽出等したレクチンと実質的に相同のポリペプチドや，人工物であってもよい。
【００２９】
ヘアリーベッチ（Vicia villosa）レクチンは、Ｓ．Ｅ．Ｔｏｌｌｅｆｓｅｎ，ｅｔ．ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９８３  ２５８  ５１６５−５１７１（非特許文献４）に記載の精製方法に従って得ることができる。ヘアリーベッチ（Vicia villosa）レクチンの分子量の例は、沈降平衡法でおよそ１０９，５００であり，サブユニットの分子量の例は，ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動法でおよそ３３，６００である。ヘアリーベッチ（Vicia villosa）レクチンは，Ｎ−アセチルガラクトサミンに親和性を有する。本発明におけるヘアリーベッチ（Vicia villosa）レクチンの分子量は，例えば，沈降平衡法を用いて測定した場合，５万以上２０万以下のものであり，９万以上１２万以下でもよく，１０万以上１２万以下でもよい。
【００３０】
フジ（Wisteria floribunda）レクチンは、Ｋｕｒｏｋａｗａ  Ｔ，ｅｔ．ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９７６  ２５１  ５６８６−５６９３（非特許文献５）に記載の精製方法に従って得ることができる。その分子量は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動法でおよそ６８，０００であり，Ｎ−アセチルガラクトサミンに親和性を有する。本発明におけるフジレクチンの分子量は，例えば，ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動法を用いて測定した場合，４万以上１２万以下のものであり，５万以上８万以下でもよく，６万以上７万５０００以下でもよい。
【００３１】
ヒイロチャワンタケ（Aleuria aurantia）レクチンは、Ｋｏｃｈｉｂｅ  Ｎ，ｅｔ．ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９８０  １９  ２８４１−２８４６（非特許文献６）に記載の精製方法に従って得ることができる。その分子量は、沈降平衡法でおよそ７２，０００であり，フコースに親和性を有する。本発明におけるフジ由来のレクチンの分子量は，例えば，沈降平衡法を用いて測定した場合，４万以上１２万以下のものであり，６万以上９万以下でもよく，７万以上８万以下でもよい。
【００３２】
麹菌（Aspergillus oryzae）レクチンは、Ｍｕｒａｋａｗａ  Ｔ，ｅｔ．ａｌ．，Ｂｉｏｓｃｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００２  ６６  １００２−１００８（非特許文献７）に記載の精製方法に従って得ることができる。その分子量は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動法でおよそ３５，０００であり，フコースに親和性を有する。本発明における麹菌由来のレクチンの分子量は，例えば，ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動法を用いて測定した場合，２万以上６万以下のものであり，３万以上４万以下でもよい。
【００３３】
先に説明したとおり，本発明の有効成分であるレクチンは，市販されている。一方，本発明の有効成分であるレクチンは，植物から抽出し，精製したものを用いることができる。また，植物から抽出し，精製したレクチンの誘導体を用いても構わない。レクチンを抽出する際に，水系溶媒又は有機溶媒を用いることが好ましい。そのような溶媒の例は，水又は水に可溶な有機溶媒，酸，塩基又は塩のいずれかを少量（例えば１０％程度以下）含む水溶液から選択される１種又は２種以上の組合せよりなるものである。有機溶媒の例は，メタノール，エタノール，イソプロピルアルコールである。酸の例は，塩酸，硫酸，酢酸などである。塩基の例は，アンモニア，苛性ソーダ，苛性カリ，および炭酸である。
【００３４】
抽出の例は，原料（乾燥基準）に対して５倍から２００倍量の抽出液を使用し，通常は４℃〜１５０℃で２０分〜２０時間処理するものである。精製の例は，塩析，アフィニティクロマトグラフィー，透析，限外濾過，逆滲透処理，ゲル濾過，有機溶媒による沈澱処理などの１種又は２種以上の方法の適用により低分子物を除去するものである。精製が終った後は，噴霧乾燥又は凍結乾燥といった乾燥工程を経てレクチンを粉末化した後に，製品化することが好ましい。
【００３５】
レクチンは，抗ウイルス剤として用いる場合，任意の剤型にすることができる。抗ウイルス剤の投与も各経路で行なわれる。本発明の抗ウイルス剤は人間及び動物に経口的または非経口的に投与される。経口的投与は舌下投与を包含する。非経口的投与は注射例えば皮下，筋肉，静脈注射，点滴などを含む。本発明の抗ウイルス剤の投与量は動物か人間により，また年齢，個人差，病状などに影響されるので，場合によっては下記範囲外の量を投与する場合も生ずるが，一般に人間を対象とする場合，本発明のレクチンの投与量の例は，体重1kg，１日当り0.1〜1000mg，好ましくは１〜100mgを１回から３回に分けて投与するものである。
【００３６】
抗ウイルス剤が経口投与される場合は，それに適用される錠剤，顆粒剤，散剤，カプセル剤などは，それらの組成物中に製剤上一般に使用される結合剤，包含剤，賦形剤，潤滑剤，崩壊剤，湿潤剤のような添加物を含有していてもよく，又経口用液体製剤として用いる場合は，内用水剤，振盪合剤，懸濁液剤，乳剤，シロップ剤の形態であってもよく，又使用する前に再溶解させる乾燥生成物の形態であってもよい。さらに，このような液体製剤は普通用いられる添加剤，保存剤のいずれを含有してもよい。注射用の場合には，その組成物は安定剤，緩衝剤，保存剤，等張化剤などの添加剤を含んでいてもよく，単位投与量アンプル，又は多投与量容器中で提供される。なお，上記組成物は水溶液，懸濁液，溶液，油性または水性ベヒクル中の乳液のような形態であってもよく，一方活性成分は使用する前に適当なベヒクル例えば発熱物質不含の滅菌した水で再溶解させる粉末であってもよい。
【００３７】
本発明の抗ウイルス剤は，鼻腔投与又は経口投与されることが好ましい。鼻腔投与の場合，レクチンを粉末化して，キャリアとなる粉体とともに粉末投与されるものが好ましい。
【００３８】
上記したとおり，本発明のレクチンは，例えばウイルスの感染予防に有効である。特に本発明のレクチンは，インフルエンザの感染予防や，インフルエンザが重篤となる事態を効果的に防止できる。本発明は，上記した本発明のレクチンを用い，公知の製剤化工程を適用した抗ウイルス剤（例えば，インフルエンザの治療剤）や，抗ウイルス剤（例えば，インフルエンザの治療剤）を製造するための本発明のレクチンの使用をも提供する。さらに，本発明のレクチンは，対象となる患者に対して投与することで，ウイルスの感染予防（例えば，インフルエンザの感染予防やインフルエンザが重篤化することを防止すること）に有効である。よって，本発明は，本発明のレクチンを対象となる患者に投与する工程を含む，ウイルスの感染予防方法や，ウイルス系疾患の治療方法をも提供する。
【００３９】
本発明の好ましい態様は，抗ウイルス剤を含む，飲食品である。先に説明したとおり，本発明の抗ウイルス剤の有効成分であるレクチンは，植物由来であるため副作用が少ない。このため本発明の抗ウイルス剤を飲食品に添加しても副作用が少ない。このため，本発明の飲食品は，インフルエンザといったウイルス性疾患の予防に有効である。
【００４０】
本発明における飲食品の例は，サプリメント，菓子，清涼飲料，果汁飲料，乳酸飲料，及び乳製品である。
【００４１】
次に本発明を実施例により詳細に説明する。以下に，記載された発明の実施の形態及び実施例は本発明の好ましい実施形態を示すものであり，本発明はそれらに限定されるものではない。
【００４２】
本明細書における実施例に使用した試薬・材料を示す。培地として，和光純薬工業製品のEagle’s Minimum Essential Medium (ＭＥＭ)を使用した。ウシ胎児血清(FBS)として，アウスジーンエックス（AusGeneX）社製品のLot：30108-7006を使用した。オセルタミビル（Oseltamivir）としてホフマンラロッシュ（F. Hoffmann-La
Roche Ltd. (Basel, Switzerland)）社の製剤品を使用した。イヌ腎臓細胞（Madin-Darby
canine kidney(MDCK)）として，長崎大学薬学部感染分子薬学研究室で維持培養されている細胞を使用し，Eagle’s Minimum Essential Medium
(MEM)＋5%ウシ胎児血清で培養した。Ａ型ヒトインフルエンザウイルス：Ａ/ＷＳＮ/３３（Ｈ1Ｎ1），Ａ/Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ/８/３４ (Ｈ１Ｎ１)，Ａ/Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ/８/６８ (Ｈ３Ｎ２)は国立感染症研究所より分与された株を使用した。Ａ型トリインフルエンザウイルス株：Ａ/Ｄｕｃｋ/Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ/８４ (Ｈ５Ｎ２)は国立大学法人筑波大学大学院人間総合科学研究科感染生物学分子ウイルス学分野永田研究室より分与頂いた株を使用した。いずれのウイルス株もＭＤＣＫ細胞又は発育鶏卵に増幅し使用した。新型インフルエンザウイルス流行株（2009年）：Ａ/Ｎａｇａｓａｋｉ/ＨＡ-４/２００９ (Ｈ１Ｎ１)並びにタミフル耐性Ａ/Ｎａｇａｓａｋｉ/ＨＡ-５８/２００９ (Ｈ１Ｎ１)は長崎県下で採取された患者検体よりMDCK細胞にて分離・増幅した。Ｂ型インフルエンザウイルス：Ｂ/Ｌｅｅ/４０はＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）より購入した。Ａ/Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ/８/６８ (Ｈ３Ｎ２)においては，ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ ｍｅｄｉｕｍ（Ｍ.Ｍ.）の組成であるｖｉｔａｍｉｎはＧｉｂｃｏ社製品を，グルタミンは和光純薬工業製品を，ウシ血清アルブミン（bovine
serum albumin (BSA)）はナカライテスク社製品をそれぞれ使用した。細胞染色剤のクリスタルバイオレットはナカライテスク社製品を使用した。
【００４３】
ヒイロチャワンタケレクチン（AAL），コンカナバリンA（ConA），麹菌レクチン（AOL），フジレクチン（WFL），ヘアリーベッチレクチン（VVA-G）及びアマリリスレクチン（HHA）は株式会社J-オイルミルズ社製のものを使用した。
【００４４】
粉末状のレクチンを溶解する際に使用したジメチルスルフォキシド（DMSO）は和光純薬工業製品を使用した。
【実施例１】
【００４５】
培養細胞を用いたレクチンの抗インフルエンザウイルス活性評価試験
計６種のレクチンについて培養細胞を用いた感染系にて抗インフルエンザウイルス活性を評価した。以降に示す全ての操作は全てクリーンベンチ内で無菌的に行った。１０％ＦＢＳ含有のＭＥＭ培地でＭＤＣＫ細胞を２．５×105
cells/mLに調製し，96-well
plateに100μL/wellで播種後，37℃，5% CO2インキュベーターで24時間培養した。培地をアスピレーターで除去し，無血清MEM培地で細胞を１回洗浄した。その後，vitamin含有無血清MEM培地(MEM+vitamin)にて調製した各レクチンの200μg/mLを最高濃度とする４倍段階希釈系列を100μL/wellで添加した。更に，非感染細胞のwellには100μL/wellでMEM＋vitaminを加え，感染細胞のwellにはvitamin含有の無血清MEM培地で 1000 TCID50/mLに調製したインフルエンザウイルス液（A/WSN/33株）を100μL/wellで加えた。プレートは37℃，5% CO2インキュベーター内に入れ72時間培養した。培地をアスピレーターで除き，200μL/wellの70% エタノール（EtOH）を加えて5分間室温に置き細胞を固定した。固定後，エタノールをデカンテーションで除き，200μL/wellで0.5%クリスタルバイオレット染色液を加えて5分間室温に置き，染色を行った。染色後，染色液をデカンテーションで除き，水道水で軽く洗浄した。室温下にてプレートを乾燥させた後，マイクロプレートリーダーで560
nmの波長の吸光度を測定した。測定は各well内に均等に分散させた計37カ所の測定ポイントについて行い，各測定ポイントにおける吸光度の平均値を各wellの測定値とした（Sara W.
Rothman, et. Al., J Clin Pathol., 1986 39 672-676）。各測定値は非感染群の測定値を100%としたCV相対値（%）に換算し，レクチン濃度を横軸としてグラフ化した。その結果を図１に示す。
【００４６】
図１は，実施例１に関する各レクチンの抗インフルエンザウイルス活性について培養細胞を用いた感染系にて評価した結果をグラフ化した図面に変わるグラフである。横軸はレクチン濃度，縦軸はクリスタルバイオレット液により染色された残存細胞の染色値（吸光度）を非感染群に対する相対値として算出したCV相対値（%）示す。図中の白色バーはウイルス非添加群;
(-) virusを，黒色バーはウイルス感染群;
(+) virusを示す。
【００４７】
測定値に基づき被験物質のIC50値（Half maximal
(50%) inhibitory concentration，50%
感染阻害濃度）を統計解析ソフト（GrapPad
Prism 5.0, GraphPad社製）を用いて算出した。細胞毒性が見られた場合は，同ソフトを用いてCC50値（Half maximal
(50%) cytotoxicity concentration，50% 細胞毒性濃度）を求め，CC50/IC50からSI（Selectivity index，選択指数）を算出して抗ウイルス活性を評価した。その結果，フジレクチン(WFL)，ヘアリーベッチレクチン（VVA-G），ヒイロチャワンタケレクチン（AAL），麹菌レクチン（AOL）の計４種に抗インフルエンザウイルス活性が認められた。WFL及びVVA-Gは試験濃度域で細胞毒性は認められなかった。AAL及びAOLは高濃度域で毒性が認められたもののSI値は高値（各々193.9，32.8）を示した。アマリリスレクチン（HHA）並びにコンカナバリンA（タチナタマメ由来レクチン）（ConA）に顕著な抗ウイルス活性は認められなかった（表１）。
【００４８】
【表１】
2014201587.tif 000003
【実施例２】
【００４９】
マウス感染モデル系におけるレクチンの抗インフルエンザウイルス活性評価試験
培養細胞系で抗インフルエンザウイルス活性の確認されたレクチン４種（WFL，VVA-G，AAL，AOL）についてマウスを用いたインフルエンザウイルス感染モデル系で抗ウイルス活性を評価した。これらのレクチンとインフルエンザウイルス（A/Puerto
Rico/8/34株）を等量で混合し，４℃下で１時間反応させた後，マウスへ50μL/匹で経鼻接種した。接種後３週間，マウス体重変化を観察した。その結果を図３に示す。
【００５０】
図２は，実施例２に関するマウス感染モデル系を用いた抗インフルエンザウイルス活性評価系の試験概要を示す図である。レクチン投与量はWFL:250μg/匹，VVA-G:250μg/匹，AAL:25μg/匹，AOL:62.5μg/匹とした。ウイルス接種量はいずれの試験群も250
pfu(plaque forming units)/匹とした。インフルエンザウイルス接種後のマウス体重の経時変化を接種時の体重を100%とした相対値（%）に換算しグラフ化した。その結果を図３に示す。
【００５１】
図３は，実施例２に関するマウス感染モデル系を用いた抗インフルエンザウイルス活性評価系において，各レクチン接種時の感染後マウス体重推移をグラフ化した図面に替わるグラフである。横軸は感染後の経過時間（日），縦軸は感染時の体重を100%とした相対値（%）を示す。図中の「mock」はウイルス非感染群，「Virus alone」はウイルス感染のみのレクチン未接種群を示す。ウイルス非感染群（mock）では時間経過に伴い緩やかな体重増加が認められるが，インフルエンザウイルス接種群（Virus
alone）では接種後7-8日経過時点で最大約70%まで体重減少が認められた。この感染に伴うマウスの体重減少がVVA-G， WFL，AOL接種群では顕著に抑制された。一方，AAL接種群では顕著な抑制効果は認められなかった。
【実施例３】
【００５２】
マウス体重減少の定量化
インフルエンザウイルス感染に伴うマウス体重減少をより定量的に評価する為，体重減少の程度について数値化を行った。具体的には，マウス体重推移のグラフにおいて接種時のマウス体重（100%）を上限とし，その値を下回った領域について画像解析ソフトにより面積値を算出した。その概説を図４に示す。更に，減少域の面積値を感染阻害率（%）に換算しグラフ化した。その結果を図５に示す。
【００５３】
図４は，実施例３に関するマウス体重減少の程度を定量化し「感染阻害率（%）」として算定する方法を概説した図である。図５は，実施例３に関するマウス感染モデル系での各レクチンの抗インフルエンザウイルス活性評価試験の結果を感染阻害率（%）としてグラフ化した図面に替わるグラフである。図４及び図５から，VVA-G，WFL，AOLでは60%を超える感染阻害率が認められ，特にWFLについて99.5%と極めて高い感染阻害効果が確認された。
【実施例４】
【００５４】
マウス生存率での抗ウイルス活性評価
ヒイロチャワンタケレクチン（AAL），麹菌レクチン（AOL）についてウイルス感染に伴うマウス生存率低下に与える影響を検討した。その結果を図６に示す。図６は，実施例４に関するレクチン２種（AAL，AOL）接種時のマウス生存率推移をグラフ化した図面に替わるグラフである。横軸はウイルス感染後の経過日数（日），縦軸はマウス生存率（%）を示している。グラフ中の「Virus alone」はウイルス感染のみのレクチン未接種群を示す。インフルエンザウイルスのみ接種群（Virus
alone）で生存率が約30％となる感染条件下において，AAL（25μg/匹）は生存率の低下を遅延させる効果が確認された。また，AOL（62.5μg/匹）では一例の死亡例も確認されなかった。体重減少に関して抑制効果の認められなかったAALについてもマウス生存率低下に対しては一定の効果が確認された。
【実施例５】
【００５５】
レクチンの作用点解析
図７は，実施例５に関するプラーク形成試験法にもとづくレクチンの作用点解析方法について概説した図である。抗インフルエンザウイルス活性の確認されたレクチンの作用点について解析を行った。一般に感染性ウイルス１粒子が細胞に感染すると，感染細胞から多数の子孫ウイルス粒子が培養液中に放出され自由拡散する。この自由拡散をアガロース等を細胞に重層することで制限すると産生された子孫粒子は，隣接している細胞へと同心円状に感染拡大する。その結果，細菌のコロニー（集落）のように感染細胞のコロニーが形成され，アミドブラックなどの染色剤で非感染細胞を染め分けることによりプラークを可視化できる。各出現プラークは感染性粒子1つに由来する為，形成されたプラークの数を数えることでプラーク形成単位(plaque
forming unit；PFU)という単位でウイルスの力価を表すことができる。このプラーク形成試験に抗ウイルス剤を共存させると，プラークの数が減少するか，またはプラークのサイズが減少する事が期待される。更に，抗ウイルス剤を入れるタイミングを変えることで，抗ウイルス剤の作用機序を推定することができる。
【００５６】
レクチンをウイルス粒子と予め混合し前処理した後MDCK細胞へ感染させる場合と，ウイルス感染後に各レクチンを含有するアガロースをMDCK細胞に重層する後処理の場合とでプラーク形成に生じる影響（数・サイズの減少）について検討した。試験の概要を図７に示した。レクチンの前処理によってプラーク形成に抑制効果が認められた場合には，インフルエンザウイルスの宿主細胞への吸着過程以前にレクチンが作用していることが示唆され，予防的効果を有することが期待される。一方，レクチン後処理の場合に抑制効果が認められた場合には，ウイルス吸着以降の過程，すなわち細胞内におけるウイルス複製過程や新生粒子の出芽・放出過程に作用していることが示唆され，治療的効果を有することが期待される（図７）。
【００５７】
以降に示す全ての操作は全てクリーンベンチ内で無菌的に行った。6-well
plateに10%含有MEM培地で調製したMDCK細胞を1.0 × 106 cells/well（2mL/well）で播種し，37℃，5% CO2インキュベーターで1日間培養した。無血清MEM培地2 mL/wellで細胞単層を1回洗浄した。レクチンによる前処理の場合には，レクチン（40μg/mL）とインフルエンザウイルス（A/WSN/33株，2.0×106 TCID50/mL）を等量で混合し，4℃下で1時間反応させた後，残存レクチンの影響を排除するため，反応液を無血清MEM培地で1000倍に希釈した後，MDCK細胞へ500μL/wellで添加した。37℃，5% CO2下で1時間静置させた後，反応液を除去し無血清MEM培地で細胞を1回洗浄後，0.8%アガロース含有の維持培地（M.M.）を3 mL/wellで重層した。アガロース固化後，37℃，5% CO2インキュベーターに倒置しプラークが出現するまで3日間培養した。培養後，酢酸-エタノール溶液（1:1）を3 mL/wellで添加し室温下で1時間静置し細胞を固定した。アガロース含有M.M.をwellから剥離させ，0.5%(w/v)アミドブラック溶液を3 mL/wellで添加し室温下で1時間静置し，残存細胞を染色した。プレートを水道水で軽く洗浄後，室温下で風乾させ，出現プラーク数の算定を行った。レクチン後処理の場合には，インフルエンザウイルスイルス（A/WSN/33株）を無血清MEM培地で400 pfu/mLに調製し，洗浄済みのMDCK細胞へ500μL/wellで添加した。37℃，5% CO2下で1時間静置させた後，反応液を除去し無血清MEM培地で細胞を1回洗浄後，レクチンを0.2μg/mLになるよう添加した0.8%アガロース含有M.M.を3 mL/wellで重層した。また，陽性対照としてOseltamivirを10μMで添加した群も調製した。以降の処理は上述のレクチン前処理時と同様に行った。尚，培養細胞系において抗インフルエンザウイルス活性の低かったアマリリス由来レクチン（HHA）を陰性対照として設定し同様の試験に供した。レクチン前処理の結果を図８に示した。
【００５８】
図８は，レクチン前処理時のプラーク形成試験結果をグラフ化した図面に替わるグラフである。各レクチンについてレクチン未処理群の出現プラーク数を100%とした場合の相対値（%）を算出し縦軸に示した。図８から前処理によりAAL並びにAOLに顕著なプラーク数減少効果が確認された。レクチン未処理群の出現プラーク数に対する相対値（%）に換算しグラフ化した結果，AAL，AOLは各々21.1%，15.8%まで出現プラーク数を減少させた。その他のレクチン種にAALやAOLに比して高い減少効果を示すものは認められなかった。これにより，AAL並びにAOLにはインフルエンザウイルスに対して直接作用し吸着過程以前で感染抑制効果を示すことが示唆され，予防的用途への適応性が示された。
【００５９】
レクチン後処理の結果を図９及び図１０に示す。図９は，レクチン後処理時のプラーク形成試験結果について出現プラーク像を写真撮影しレクチンごとに示した図面に替わる写真である。図１０は，レクチン後処理時のプラーク形成試験結果をグラフ化した図面に替わるグラフである。各レクチンについてレクチン未処理群の出現プラーク数を100%とした場合の相対値（%）を算出し縦軸に示した。陽性対照として使用したオセルタミビル（Oseltamivir）はノイラミニターゼ(NA)阻害剤として知られ，その作用点はウイルス由来NA活性を抑制することによる出芽後の新生ウイルス粒子放出過程の阻害にある。図９から同薬剤をアガロースゲルに含有させた結果，プラーク数の激減とサイズの減少が確認された。図１０から同条件にて試験に供した5種のレクチン中で，VVA-G並びにWFL添加群においてオセルタミビルと同様の顕著なプラーク数並びにサイズの減少が確認された。その他のレクチン添加群ではウイルスのみ添加群（Virus
alone）と比してプラーク数・サイズ共に大差なかった。各試験群の出現プラーク数をウイルスのみ添加群の出現プラーク数に対する相対値（%）に換算しグラフ化した結果，VVA-G及びWFLは各々9.6%，16.9%まで出現プラーク数が減少した。これにより，VVA-G並びにWFLはインフルエンザウイルス吸着以降の過程において感染抑制効果を示すことが示唆され，治療的用途への適応可能性が示された。
【実施例６】
【００６０】
他型インフルエンザウイルス株に対するレクチンの抗ウイルス活性評価
培養細胞系，マウス感染モデル系のいずれの評価系においても特に高い抗インフルエンザウイルス活性を示したフジレクチン（WFL）を対象に，種々のインフルエンザウイルス亜型に対する感染抑制効果について検討した。10%FBS含有MEM培地にてMDCK細胞を3.0×104 cells/mLに調製し，96-well plateに100μL/wellで播種した。37℃，5% CO2インキュベーターで24時間培養した後，培地をアスピレーターで除去し，無血清MEM培地で細胞を１回洗浄した。洗浄後のMDCK細胞に対して，ビタミン（vitamin）含有無血清MEM培地(MEM+vitamin)にて調製した各レクチンの40μg/mLを最高濃度とする4倍段階希釈系列を100μL/wellで添加した。更に，非感染細胞のwellには100μL/wellでMEM＋vitaminを加え，感染細胞のwellにはトリプシン(5.0μg/mL)及びvitamin含有の無血清MEM培地で 1000 TCID50/mLに調製した各インフルエンザウイルス液（A/Puerto
Rcio/8/34株，A/Hong
Kong/8/68株，A/Duck/Pennsylvania/84株，A/Nagasaki/HA-4/2009株，A/Nagasaki/HA-58/2009株，B/Lee/40株）を100μL/wellで加えた。プレートは37℃，5% CO2インキュベーター内に入れ72時間培養した。以降は実施例１に示した方法と同様にして実施した。各測定値を非感染群の測定値を100%としたCV相対値（%）に換算し，レクチン濃度を横軸としてグラフ化した。その結果を図１１に示す。
【００６１】
図１１は，有効レクチンのインフルエンザウイルス亜型間での抗ウイルス活性比較試験の結果を亜型ごとにグラフ化した図面に替わるグラフである。横軸はレクチン（WFL）濃度，縦軸は非感染群及び感染のみのレクチン非添加群の測定値から算出した感染阻害率（%）を示す。測定値に基づき被験物質のIC50値（Half maximal
(50%) inhibitory concentration，50%
感染阻害濃度）を統計解析ソフト（GrapPad
Prism 5.0, GraphPad社製）を用いて算出し表２に示した。この結果から，WFLは亜型に依らず広範なインフルエンザウイルス株に対して抗ウイルス活性を示すことが明らかとなった。また，Tamiflu耐性株であるA/Nagasaki/HA-58/2009株に対しても，同系のTamiflu感受性株：A/Nagasaki/HA-4/2009と同等の効果を示したことから，現在市中に広く流行しているTamiflu耐性株に有効である可能性が示唆された。
【００６２】
【表２】
2014201587.tif 000004
【産業上の利用可能性】
【００６３】
本発明は抗ウイルス剤に関するため，医薬産業において利用されうる。
【図１】
2014201587.tif 000005
【図２】
2014201587.tif 000006
【図３】
2014201587.tif 000007
【図４Ａ】
2014201587.tif 000008
【図４Ｂ】
2014201587.tif 000009
【図４Ｃ】
2014201587.tif 000010
【図５】
2014201587.tif 000011
【図６】
2014201587.tif 000012
【図７】
2014201587.tif 000013
【図８】
2014201587.tif 000014
【図９】
2014201587.tif 000015
【図１０】
2014201587.tif 000016
【図１１】
2014201587.tif 000017