(57)【要約】      （修正有）【課題】容易な修飾による均質な機能性を発揮でき、水系溶液に高分散な診断用・治療用などの磁性粒子含有医薬を生成できる磁性微粒子及び該磁性微粒子を含有する分散体を提供する。【解決手段】一次粒子径が３〜１５０ｎｍの磁性ナノ粒子の粒子表面が一層目、二層目及び三層目の順で被覆されており、前記一層目がカルボキシル基を有するポリマーであり、前記二層目はアミノ基、カルボキシキル基、水酸基からなる群から選ばれた官能基を有するアミノ酸、又は、多糖類であり、前記三層目は、二層目の官能基とアミド結合、エステル結合で修飾可能なアミノ基、カルボキシル基、水酸基、ＮＯ類、蛍光色素、標準タンパク質からなる群から選ばれた官能基を有するアミノ酸、多糖類、イミン類である複合磁性微粒子粉末である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
一次粒子径が３〜１５０ｎｍの磁性ナノ粒子の粒子表面が一層目、二層目及び三層目の順で被覆されており、前記一層目がカルボキシル基を有するポリマーであり、前記二層目はアミノ基、カルボキシキル基、水酸基からなる群から選ばれた官能基を有するアミノ酸、又は、多糖類の一種以上であり、前記三層目は、二層目の官能基とアミド結合、エステル結合で修飾可能なアミノ基、カルボキシル基、水酸基、ＮＯ類、蛍光色素、標準タンパク質からなる群から選ばれた官能基を有するアミノ酸、多糖類、イミン類の一種以上であることを特徴とする複合磁性微粒子粉末。
【請求項２】
請求項１の磁性ナノ粒子がマグネタイト、マグヘマイト、ウスタイト、金属鉄のうち少なくとも１種以上である複合磁性微粒子粉末。
【請求項３】
請求項１又は２記載の複合磁性微粒子粉末の飽和磁化値が１５〜２３０Ａｍ２／ｋｇである複合磁性微粒子粉末。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の複合磁性微粒子を含有する分散体。
【請求項５】
請求項４記載の分散体において、分散媒体が、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、トリスバッファー塩水溶液、ヘペスバッファー塩水溶液、血清及び細胞培養培地から選ばれる少なくとも一種である分散体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医療技術分野において、薬物の送達法であるドラッグデリバリーシステム（以降、ＤＤＳと記す）、ＭＲＩ（磁気共鳴）診断及び温熱治療法などの治療用の磁性粒子含有医薬に用いる磁性材料に関するものである。
【０００２】
詳述すれば、本発明は、磁性微粒子の病変組織や細胞への送達指向性、ＭＲＩ診断時の造影感度及び温熱治療時の発熱性等の性能を向上させることを目的とする磁性微粒子含有医薬用原薬に関する。
【背景技術】
【０００３】
近年、磁性体として磁性酸化鉄微粒子を用い、酸性多糖、タンパク質及び水溶性ポリマー等の生体適応物質と複合化した磁性粒子含有医薬品が検討されている。
【０００４】
また、磁性酸化鉄微粒子の単分散水溶液を調製するために、アミノ酸を粒子表面に固定する方法、酸性多糖を被覆する方法、または有機金属ポリマーで被覆する方法、あるいはタンパク質及びペプチドを固定し単分散水溶液を調製する方法等が知られている。
【０００５】
さらに、生体分子との結合を容易にするために、アミノ基やカルボキシル基、スルホン基等の官能基を有する表面修飾分子を磁性酸化鉄粒子の表面に被覆したものが報告されている。
【０００６】
これらはいずれも一旦酸化鉄の水性ゾルを調製した後に、それぞれ高分子や多糖類と混合して調製している。よって、磁性粒子の粒子径が凝集により大きくなってしまうことや、磁性粒子とこれら表面修飾分子との結合が弱く、血液中で解離しやすく、加熱滅菌時の安定性や経時安定性も良くない。
【０００７】
また、磁性粒子の粒子径が凝集により大きくなってしまうことは、安定した分散状態を保つことができない。
【０００８】
また、血液安定性、血中対流性に優れ、さらに腫瘍集積性を考慮し、特定のターゲット分子に対して特異的な親和結合を形成するような診断用及び治療用の磁性粒子含有医薬を再現性良く生成できる磁性粒子を含有する医薬原薬の開発が求められている。
【０００９】
酸化鉄の合成と同時に酸化鉄表面に高分子を修飾する方法も知られている。この表面はカルボキシル基に覆われており、反応点は多く存在するが、微粒子サイズが小さいため使用用途が限定される。
【００１０】
医療用途として酸化鉄微粒子の安全性は高いが、飽和磁化が小さいことから扱いは限定されることより、シリカで酸化鉄を被覆し、内部の酸化鉄を還元鉄にすることにより磁化を高める手法もある。
【００１１】
これまで、種々の化合物を表面に付着させた磁性粒子が知られている（特許文献１〜６）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】国際公開第９５／３１２２０号パンフレット
【特許文献２】特開２００３−１１２９２５号公報
【特許文献３】特開２００７−２１６１３４号公報
【特許文献４】特開２００７−２２０８６７号公報
【特許文献５】特開２００７−２１７３３１号公報
【特許文献６】特開２０１１−１２６８７６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
上述したように、均質な特性を有した磁性粒子を再現性良く得るためには、磁性粒子を含有する医薬の製薬時において、生体適応性物質と磁性微粒子とを均一に分散混合させることが不可欠な条件であり、そのためには原薬中の磁性微粒子は微細で粒度が均一な磁性微粒子からなる単分散コロイド水溶液であることが必要である。
【００１４】
また、血液中での安定性を保つために、中性ｐＨ領域での分散安定性が必要である。
【００１５】
さらに、抗体等の生体分子と強い結合をつくるように、磁性粒子表面に官能基を持たせることが必要である。
【００１６】
本発明は、上記従来の問題点に鑑みてなされたものであり、磁性微粒子の粒子表面が表面修飾層にはアニオン性、カチオン性もしくは中性からなるポリマーで粒子表面が修飾されており、均一な粒度からなる磁性微粒子の分散コロイド水溶液を提供することを技術的課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
即ち、本発明は、一次粒子径が３〜１５０ｎｍの磁性ナノ粒子の粒子表面が一層目、二層目及び三層目の順で被覆されており、前記一層目がカルボキシル基を有するポリマーであり、前記二層目はアミノ基、カルボキシキル基、水酸基からなる群から選ばれた官能基を有するアミノ酸、又は、多糖類の一種以上であり、前記三層目は、二層目の官能基とアミド結合、エステル結合で修飾可能なアミノ基、カルボキシル基、水酸基、ＮＯ類、蛍光色素、標準タンパク質からなる群から選ばれた官能基を有するアミノ酸、多糖類、イミン類の一種以上であることを特徴とする複合磁性微粒子粉末である（本発明１）。
【００１８】
また、本発明は、本発明１の磁性ナノ粒子がマグネタイト、マグヘマイト、ウスタイト、金属鉄のうち少なくとも１種以上である複合磁性微粒子粉末である（本発明２）。
【００１９】
また、本発明は、本発明１又は２記載の複合磁性微粒子粉末の飽和磁化値が１５〜２３０Ａｍ２／ｋｇである複合磁性微粒子粉末である（本発明３）。
【００２０】
また、本発明は、本発明１〜３のいずれかに記載の複合磁性微粒子を含有する分散体である（本発明４）。
【００２１】
また、本発明は、本発明４記載の分散体において、分散媒体が、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、トリスバッファー塩水溶液、ヘペスバッファー塩水溶液、血清及び細胞培養培地から選ばれる少なくとも一種である分散体である（本発明５）。
【発明の効果】
【００２２】
本発明に係る複合磁性微粒子粉末は、毒性が低く、水溶液中での分散性に優れたものである。また、本発明に係る複合磁性微粒子を含有する分散体は、毒性が低く、水溶液中で複合磁性微粒子が安定に分散できるものである。さらに複合磁性微粒子の粒子表面の電位を自在に調節できる官能基を有することにより、磁性粒子を生体適合物質に均質に分散させた複合物からなる医薬を容易に合成することができる。さらに、液媒が界面活性剤などを含有しない原薬であるので、生体への安全性に与える影響は極めて少ないものである。
また、用途に合わせ製薬造粒工程において、微粒子の集合状態を調節することにより造粒粒子に強磁性体の機能を付与することができる。
また、微粒子は投与後体内から排泄を容易にすることができる。さらに、大きな粒子が有する高い磁化は、外部磁場による効果的な温熱療法、薬剤を目的の場所に輸送するＤＤＳ技術に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】実施例１で得られた複合磁性微粒子の適用例の結果を示したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明の構成をより詳しく説明すれば次のとおりである。
【００２５】
本発明に係る複合磁性微粒子粉末は、一次粒子径が３〜１５０ｎｍの磁性ナノ粒子の粒子表面が一層目、二層目及び三層目の順で被覆されている。前記一層目がカルボキシル基を有するポリマーである。前記二層目はアミノ基、カルボキシキル基、水酸基からなる群から選ばれた官能基を有するアミノ酸、又は、多糖類である。前記三層目は、二層目の官能基とアミド結合、エステル結合で修飾可能なアミノ基、カルボキシル基、水酸基、ＮＯ類、蛍光色素、標準タンパク質からなる群から選ばれた官能基を有するアミノ酸、多糖類、イミン類である。
【００２６】
磁性ナノ粒子の一次粒子径（一次粒子の平均粒子径）は３ｎｍ〜１５０ｎｍである。一次粒子の平均粒子径が３ｎｍ未満では非晶質であり好ましくない。また、一次粒子径が１５０ｎｍを超えると、磁気的凝集点で好ましくない。一次粒子径は５〜１２０ｎｍがこのましく、より好ましくは７〜１００ｎｍである。
【００２７】
本発明における磁性ナノ粒子は、マグネタイト（Ｆｅ３Ｏ４）、マグヘマイト（γ−Ｆｅ２Ｏ３）、金属鉄から選ばれる１種以上である。より好ましくはマグネタイトである。前記各化合物は異種金属元素を含有してもよい。金属鉄類とは、金属鉄又は鉄との他の金属元素との合金（ＦｅＣｏ、ＦｅＰｔ等）を指す。金属鉄は表面酸化層を有していてもよい。
【００２８】
本発明における磁性ナノ粒子は超常磁性体、強磁性体であることが好ましいが、飽和磁化値は５〜２３０Ａｍ２／ｋｇであることが好ましい。磁性酸化鉄微粒子の飽和磁化値σｓは１０〜２００Ａｍ２／ｋｇである。５Ａｍ２／ｋｇ未満の飽和磁化値では磁性が不足している。より好ましい飽和磁化値σｓは２０〜１８０Ａｍ２／ｋｇである。
【００２９】
本発明における磁性ナノ粒子は、一層目、二層目、三層目の順で磁性ナノ粒子の粒子表面から外側に向かって表面被覆されている。
【００３０】
前記一層目がカルボキシル基を有するポリマーである。具体的には、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリアミノ酸等多くの種類が存在する。中でもポリアクリル酸を用いた場合には、磁性酸化鉄微粒子の粒度および粒度分布の面で好ましい。
【００３１】
さらに、カルボキシル基を有するポリマーの分子量は、１５００〜１００００のものが好ましい。カルボキシル基を有するポリマーの分子量が１５００未満では、磁性粒子の一次粒子径が大きくなってしまい、一方、分子量が１００００を越えるものについては、磁性粒子同士の凝集が多く、二次粒子径が大きくなってしまう。
【００３２】
前記一層目の被覆量は、磁性ナノ粒子に対して５〜６０ｗｔ％が好ましい。磁性ナノ粒子の一次粒子径が２０ｎｍ未満であれば４０〜６０ｗｔ％がより好ましく、２０〜１５０ｎｍであれば５〜１５ｗｔ％がより好ましい。
【００３３】
前記二層目はアミノ基、カルボキシキル基、水酸基からなる群から選ばれた官能基を有するアミノ酸、又は、多糖類である。
【００３４】
具体的には、ポリエチレンイミン、デキストラン、カルボキシメチルデキストリン、カルボン酸シランカップリング剤などである。より好ましくはポリエチレンイミン、デキストラン、カルボキシメチルデキストリンである。なお、結合剤としてカルボジイミドなどを含有させてもよい。
【００３５】
前記二層目の被覆量は、磁性ナノ粒子に対して５〜１５ｗｔ％が好ましい。
【００３６】
前記三層目は、二層目の官能基とアミド結合、エステル結合で修飾可能なアミノ基、カルボキシル基、水酸基、ＮＯ類、蛍光色素、標準タンパク質からなる群から選ばれた官能基を有するアミノ酸、多糖類、イミン類である。
【００３７】
具体的には、カルボキシメチルデキストリン、デキストラン、ポリエチレンイミン、ＮａＮＯ２、フルオレセインイソチオシアネート、５（ａｎｄ  ６）‐Ｃａｒｂｏｘｙ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｄｉａｃｅｔａｔｅ．  Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  Ｅｓｔｅｒ、アルブミンなどである。なお、結合剤としてカルボジイミドなどを含有させてもよい。
【００３８】
前記三層目の被覆量は、磁性ナノ粒子に対して５〜１５ｗｔ％が好ましい。
【００３９】
本発明に係る複合磁性微粒子粉末の飽和磁化値は１５〜２３０Ａｍ２／ｋｇが好ましい。複合磁性微粒子粉末の飽和磁化値が１５Ａｍ２／ｋｇ未満の場合には、磁性が不足しているので好ましくない。また、複合磁性微粒子粉末の飽和磁化値が２３０Ａｍ２／ｋｇを超えるナノ粒子は工業的に生産することが困難である。より好ましい飽和磁化値は２０〜１８０Ａｍ２／ｋｇである。
【００４０】
本発明に係る磁性酸化鉄微粒子の二次粒子の平均粒子径は１０〜２００ｎｍが好ましい。二次粒子の平均粒子径が１０ｎｍ未満の場合には、癌の温熱療法に用いた場合に交番磁場による発熱性が低くなる。一方、二次粒子の平均粒子径が２００ｎｍではクッパー細胞の貪食作用により細胞内に効率的に取り込まれる。好ましい二次粒子の平均粒子径は１５ｎｍ〜２００ｎｍである。
【００４１】
次に、本発明に係る複合磁性ナノ粒子の製造方法について述べる。
【００４２】
本発明においては、まず、磁性ナノ粒子を製造した後、順に、被覆層を形成していく。
【００４３】
本発明におけるマグネタイト（Ｆｅ３Ｏ４）は、鉄塩水溶液とアルカリ水溶液とを用いる水溶液反応（湿式法という。）で合成することができる。
【００４４】
一般的に、水溶液反応には、共沈法と酸化反応法がよく用いられる。
【００４５】
共沈法とは、第一鉄塩水溶液Ｆｅ（ＩＩ）１モルと第二鉄塩水溶液Ｆｅ（ＩＩＩ）２モルとの混合水溶液にアルカリ水溶液を攪拌しながら加えると、Ｆｅ（ＩＩ）と２Ｆｅ（ＩＩＩ）の共沈反応が生起して黒色スピネル型磁性酸化鉄であるマグネタイト粒子が生成する反応である。この反応においてＦｅ以外の２価金属、例えば、Ｍｇを添加した場合にはＭｇを含有したスピネル型磁性酸化鉄微粒子が得られる。また、鉄塩濃度や混合温度などの反応条件により生成粒子の大きさが制御できるので、これらの反応条件を組み合わせることにより磁性酸化鉄微粒子を合成することができる。
【００４６】
本発明においては、ポリアクリル酸などのカルボキシル基を有するポリマーを溶解した水溶液を所定の温度に加熱し、そこに第一鉄塩及び第二鉄塩の混合水溶液およびアンモニア水溶液などのアルカリ水溶液を素早く添加し、反応させる。前記反応によって磁性酸化鉄微粒子を作製することで、反応により生成するマグネタイト粒子の粒子表面に直ぐにポリアクリル酸が被覆され、粒子同士の凝集を抑制できると考えられる。
【００４７】
本発明における第一鉄塩水溶液としては、硫酸第一鉄水溶液又は塩化第一鉄水溶液等を使用することができる。本発明における第二鉄塩としては、硫酸第二鉄水溶液又は塩化第二鉄水溶液等を使用することができる。
【００４８】
本発明におけるアルカリ水溶液としては、アンモニア水、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等のアルカリ金属の水酸化物の水溶液、水酸化マグネシウム、水酸化カルシウム等のアルカリ土類金属の水酸化物の水溶液を使用することができる。より好ましくはアンモニア水である。
【００４９】
本発明においては、第一鉄及び第二鉄に対して当量となる量のアルカリ水溶液を添加すればよい。
【００５０】
本発明においては、マグネタイトの反応にあたり、反応溶液にあらかじめポリアクリル酸などのカルボキシル基を有するポリマーを溶解しておくことが肝要である。反応溶液に事前にカルボキシル基を有するポリマーを存在させておくことによって、反応により生成するマグネタイト粒子の粒子表面が直ぐにポリアクリル酸によって被覆され、粒子同士の凝集を抑制できる。
【００５１】
反応溶液中のカルボキシル基を有するポリマーの濃度は、反応溶液中の全ての鉄（Ｆｅ）に対するモル比で０．３〜３．０となる量を存在させておく。ポリマーの濃度が０．３未満の場合、濃度が希薄なため磁性酸化鉄微粒子の凝集を抑制できる程度にポリマーを被覆することができない。ポリマーの濃度が３．０を超える場合、効果が飽和するため、必要以上に存在させる意味がない。より好ましいポリマーの濃度は０．８〜２．５である。反応溶液中のカルボキシル基を有するポリマーの濃度を前記範囲とすることによって、ゼータ電位を−２０ｍＶ以下とすることができる。
【００５２】
本発明における反応温度は９０〜１００℃が好ましい。９０℃未満である場合には、ゲータイトが混在してくる。１００℃を越える場合もマグネタイト粒子は生成するが、オートクレーブ等の装置を必要とするため工業的に容易ではない。
【００５３】
本発明においては、磁性粒子含有水分散体の水洗は、次のように行なう。すなわち、室温まで冷却した反応後の溶液をビーカーなどに移し、スターラー攪拌しながら沈殿が生じるまでほぼ等量のエタノールを添加する。上澄みを捨て、イオン交換水を添加し分散させる。再度、エタノールを添加し、遠心分離で上澄みを除去する。この操作を再度繰り返し、最終的に得られた沈殿物をイオン交換水に分散させる。必要に応じて、エバポレーターで濃縮する。
【００５４】
次に、水に可溶した塩類を除去するために透析膜を用いて透析を行なう。エバポレーターで濃縮した後、遠心分離機で上澄みを回収し、残った凝集粒子を除去する。
【００５５】
次に、上澄みの磁性粒子含有水分散体を−２０℃以下の冷凍庫内に５時間以上放置することで凍結させ、減圧下での凍結乾燥を行うことで、本発明に係る磁性酸化鉄微粒子を得ることができる。
【００５６】
一方、磁性粒子含有水分散体の濃度を５〜５０ｍｇ／ｍｌに希釈調整して磁性酸化鉄微粒子がイオン交換水に分散している磁性粒子含有水分散体を得ることができる。
【００５７】
また、得られた磁性酸化鉄微粒子はアミノ基を有するポリエチレンイミンとの架橋反応により表面電位を変化させ、さらに水酸基を有し毒性の比較的低いポリエチレングルコールとも反応することができ、表面電位を自在に扱えることができる。
【００５８】
さらに、本発明におけるマグネタイトは、脂肪酸第二鉄と有機溶媒とを用いる反応で合成することができる。
【００５９】
合成方法は、例えば、脂肪酸第二鉄Ｆｅ７．９ミリモルと有機溶媒９１．５ミリモル、脂肪酸４．２ミリモルとの混合水溶液を攪拌しながら加熱すると、Ｆｅ（ＩＩＩ）が生起して黒色スピネル型磁性酸化鉄であるマグネタイト粒子が生成する反応である。また、脂肪酸鉄濃度や混合温度などの反応条件により生成粒子の大きさが制御できるので、これらの反応条件を組み合わせることによりマグネタイトを合成することができる。
【００６０】
本発明における脂肪酸第二鉄Ｆｅ（ＩＩＩ）としては、ラウリン酸鉄（ＩＩＩ）、ステアリン酸鉄（ＩＩＩ）、オレイン酸鉄（ＩＩＩ）等を使用することができる。
【００６１】
本発明における有機溶媒としては、トリｎオクチルアミン、ｎ−オクチルエーテルが好ましい。
【００６２】
本発明における脂肪酸は、オレイン酸を使用することが好ましい。
【００６３】
本発明における反応温度は３００〜３７０℃が好ましい。３００℃未満である場合には、粒子サイズが均一にならない。３７０℃を越える場合もマグネタイト粒子は生成するが、有機溶媒の沸点よりも高いため現実的ではない。
【００６４】
本発明においては、磁性粒子の回収は、次のように行なう。すなわち、５０℃まで冷却した反応後の溶液にクロロホルムを添加し遠枕管などに移し、遠心分離にて上澄みを捨て、ヘキサン、シクロヘキサンなどに分散させる。
【００６５】
得られた磁性ナノ粒子は、反応中で、カルボキシル基を有する化合物を用いているので、磁性ナノ粒子の表面上にカルボキシル基が露出した状態となっている。
【００６６】
本発明における金属鉄は、前記マグネタイトを常法によって還元して得ることもできる。
【００６７】
磁性ナノ粒子を含有する分散液を用いて、第二層、第三層の形成を行う。
【００６８】
第二層は、第一層を形成した磁性ナノ粒子を所定の溶媒に分散させ、第二層を形成する化合物を添加して加熱・撹拌することで形成することができる。例えば、カルボン酸シランカップリング剤をヘキサン溶媒に添加し、６０℃でリフラックスさせ第二層を形成できる。
本発明においては第一層であるカルボキシル基を有する化合物と架橋反応が進行し、層状に表面修飾することができる。
【００６９】
第三層は、第二層を形成した磁性ナノ粒子を酸性水溶液に分散させ、第三層を形成する化合物を添加し、必要により、更に、架橋剤を添加し混合・撹拌して、第三層を形成することができる。必要により、反応溶液のｐＨを調整してもよい。架橋剤としては、例えば、カルボジイミド、ヒドロキシスクシンイミドなどを用いることができる。
本発明においては第三層の化合物と第二層の化合物との架橋反応が進行し、層状に表面修飾することができる。
【００７０】
本発明においては、前記複合磁性微粒子を含有する分散体とすることが好ましい。
【００７１】
本発明に係る分散体は、分散媒体が、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、トリスバッファー塩水溶液、ヘペスバッファー塩水溶液、血清及び細胞培養培地から選ばれる少なくとも一種であることが好ましい。
【００７２】
本発明に係る磁性ナノ粒子を含有する水分散体のｐＨ６〜８の範囲におけるゼータ電位は−６０ｍＶ〜６０ｍＶである。
【００７３】
本発明に係る磁性粒子含有水分散体の複合磁性微粒子の濃度は、５〜５０ｍｇ／ｍｌが好ましい。５０ｍｇ／ｍｌを越える場合には、粒子間に働くファンデアワールス力の影響が大きくなって凝集が生起し易くなり好ましくない。５ｍｇ／ｍｌ未満では濃度が希薄すぎて実用的でない。好ましい濃度は１０〜４０ｍｇ／ｍｌである。
【００７４】
本発明に係る複合磁性微粒子又は分散体は、生体医療用として、ドラッグデリバリーシステム、ＭＲＩ造影剤、ハイパーサーミアシステムなどに用いることができる。
【００７５】
このように得られた磁性酸化鉄微粒子や磁性微粒子は、さらにリン脂質、多糖類、蛋白質あるいはデキストリン類との複合体の形で、種々の用途に用いることができ、例えば、薬物の送達法であるＤＤＳ、レントゲンやＭＲＩ（磁気共鳴）等で用いられるＣＴ診断及び温熱治療法などの治療用等である。
【００７６】
＜作用＞
本発明者は、鋭意研究を重ねた結果、磁性ナノ粒子の表面がカルボキシル基、アミノ基、水酸基を有するポリマーで被覆された超常磁性酸化鉄微粒子、磁性微粒子からなる磁性粒子含有水分散体の分散安定条件を見出した。
【００７７】
また、磁性粒子として磁性酸化鉄微粒子を用いるのは、酸化鉄には生体適応性があるからであり、微粒子ほど生体内からの排泄が容易となる。
【実施例】
【００７８】
以下、実施例により本発明を具体的に説明する。但し、本発明は、これらの実施例のみに限定されるものではない。
【００７９】
尚、生成物の構造解析にはＸ線回折装置を用いた。
【００８０】
一次粒度のサイズは透過型電子顕微鏡ＴＥＭで観測した。
【００８１】
二次粒子の平均粒子径は動的光散乱法による粒度分布計Ｍｉｃｒｏｔｒａｃ  ＵＰＡ−ＵＴ１５１（日機装製）により測定した。
【００８２】
磁気特性の測定にはＰＰＭＳ−ＶＭＳを用い３００ｋ（５０ｋＯｅ）の磁場で測定した。
【００８３】
ゼータ電位はＺｅｔａｓｉｚｅｒ−２（ＭＡＬＶＥＲＮ製）により測定した。
【００８４】
撹拌装置及び加熱装置を備えた１０００ｍｌの反応容器を用い、原料鉄塩と苛性ソーダは試薬特級を用い、また水はミリＱ水を用いた。
【００８５】
実施例１
＜（１）磁性酸化鉄微粒子の合成工程＞
分子量５０００のポリアクリル酸７．８３ｇとイオン交換水７１３．２ｍｌを反応容器に入れ、窒素ガスを吹き込み、そのまま９５℃まで昇温させる。次に、１．６ｍｍｏｌ／ｌの硫酸第一鉄水溶液１０ｍｌと、３．２ｍｍｏｌ／ｌの塩化第二鉄水溶液１０ｍｌを反応容器に投入し（ＣＯＯＨ／Ｆｅ比率＝２．２７）、さらに１４．８ｍｍｏｌ／ｌのアンモニア水５９．４ｍｌを添加し、２時間撹拌して反応させる。水溶液を６５℃まで冷却させる。反応液をエバポレーターにて、約１００ｍｌまで濃縮する。室温まで冷却した後、濃縮液をビーカーに移し、スターラー攪拌しながら沈殿が生じるまでほぼ等量のエタノールを添加する。上澄みを捨て、全量が１００ｇ程度になるようにイオン交換水を添加し、攪拌しながら分散させる。再度、エタノールを等量添加し、１０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離機で処理を行なう。上澄み液を除去し、再度、この操作を繰り返し、最終的に得られた沈殿物をイオン交換水で分散させる。さらにエバポレーターで４０ｇ程度に濃縮する。
ここに得たコロイド水溶液の一部を採取し、水洗ろ過したペーストを凍結乾燥して得られた粉末を分析した結果、ＴＥＭによる一次粒子の平均粒子径が５ｎｍ、動的光散乱法による二次粒子の平均粒子径が４．０ｎｍであった。また、磁気特性は飽和磁化値σｓが１５．５Ａｍ２／ｋｇの磁性酸化鉄微粒子であった。
【００８６】
＜（２）分散粒子の精製工程＞
得られたコロイド水溶液に対し透析膜を使用して精製を行なった。得られた透析液をエバポレーターで２００ｍｌに濃縮し、１２０００Ｇ、３０分間遠心分離を行い、上澄み液を回収する。この操作で凝集粒子は除去される。このようにして、黒色のコロイド水溶液を精製した。
得られた磁性粒子含有水分散体の濃度は１０ｍｇ／ｍｌであり、磁性粒子含有水分散体のｐＨは６．５でありゼータ電位は−６０ｍＶであった。
【００８７】
＜（３）  磁性酸化鉄微粒子への表面修飾＞
次に、分子量１００００のポリエチレンイミン０．５ｇを加え、カルボジイミドを１６０ｍｇとｐＨ４．５の塩酸溶液を２０ｍＬ添加し一晩撹拌した。撹拌後、１２０００×ｇの遠心分離にて上清を取り除き沈降物を水に分散させた。このときのゼータ電位は６０ｍＶであった（第二層の形成）。
さらに、牛血清アルブミンを加え一晩撹拌した。撹拌後、１２０００×ｇの遠心分離にて上清を取り除き沈降物を水に分散させた。このときのゼータ電位は１０ｍＶであった（第三層の形成）。
【００８８】
実施例２
＜磁性酸化鉄微粒子への表面修飾＞
実施例１の（２）分散粒子の精製工程まで同様にして、精製した磁性酸化鉄微粒子の分散液を得た。次に、分子量１００００のポリエチレンイミン０．５ｇを加え、カルボジイミドを１６０ｍｇとｐＨ４．５の塩酸溶液を２０ｍＬ添加し一晩撹拌した。撹拌後、１２０００×ｇの遠心分離にて上清を取り除き沈降物を水に分散させた。この時のゼータ電位は６０ｍＶであった（第二層の形成）。さらに、カルボキシルメチルデキストランとカルボジイミドを加え一晩撹拌した。撹拌後、１２０００×ｇの遠心分離にて上清を取り除き沈降物を水に分散させた。この時のゼータ電位は−５０ｍＶであった（第三層の形成）。
【００８９】
実施例３
＜磁性酸化鉄微粒子の合成工程＞
ステアリン酸鉄７．２ｇとオレイン酸１．１４ｇ、トリ−ｎ−オクチルアミンをフラスコに入れ、攪拌しながら３７０℃まで加熱させる。その後、５０℃まで冷却しクロロホルムを加え、生成した酸化鉄微粒子の分散体を得たのち、遠心分離にて上清を除去し沈降物をヘキサンに分散させた。
得られた酸化鉄微粒子のＴＥＭによる一次粒子の平均粒子径は２０ｎｍ、また、磁気特性は飽和磁化値が４３Ａｍ２／ｋｇの磁性酸化鉄微粒子であった。
【００９０】
＜磁性酸化鉄微粒子への表面修飾＞
次に、得られた酸化鉄微粒子、カルボン酸シランカップリング剤をヘキサン３０ｍＬに添加し、６０℃でリフラックスさせ修飾した。この時のゼータ電位は−５０ｍＶであった（第二層の形成）。さらに分子量１００００のポリエチレンイミンと１６０ｍｇのカルボジイミドを添加し、ｐＨ４．５で一晩撹拌し、１２０００×ｇの遠心分離にて上清を取り除き沈降物を水に分散させた。この時のゼータ電位は５０ｍＶであった（第三層の形成）。
【００９１】
実施例４
＜磁性酸化鉄微粒子の表面修飾＞
実施例３の第二層の形成まで同様の方法で行って得られた酸化鉄微粒子に、カルボキシメチルデキストランとカルボジイミドを添加し、ｐＨ４．５で一晩撹拌し、１２０００×ｇの遠心分離にて上清を取り除き沈降物を水に分散させた。この時のゼータ電位は−５０ｍＶであった。
【００９２】
比較例１
＜磁性酸化鉄微粒子の合成工程＞
分子量５０００のポリアクリル酸７．８３ｇとイオン交換水７１３．２ｍｌを反応容器に入れ、窒素ガスを吹き込み、そのまま９５℃まで昇温させる。次に、１．６ｍｍｏｌ／ｌの硫酸第一鉄水溶液１０ｍｌと、３．２ｍｍｏｌ／ｌの塩化第二鉄水溶液１０ｍｌを反応容器に投入し（ＣＯＯＨ／Ｆｅ比率＝２．２７）、さらに１４．８ｍｍｏｌ／ｌのアンモニア水５９．４ｍｌを添加し、２時間撹拌して反応させる。水溶液を６５℃まで冷却させる。反応液をエバポレーターにて、約１００ｍｌまで濃縮する。室温まで冷却した後、濃縮液をビーカーに移し、スターラー攪拌しながら沈殿が生じるまでほぼ等量のエタノールを添加する。上澄みを捨て、全量が１００ｇ程度になるようにイオン交換水を添加し、攪拌しながら分散させる。再度、エタノールを等量添加し、１０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離機で処理を行なう。上澄み液を除去し、再度、この操作を繰り返し、最終的に得られた沈殿物をイオン交換水で分散させる。さらにエバポレーターで４０ｇ程度に濃縮する。
ここに得たコロイド水溶液の一部を採取し、水洗ろ過したペーストを凍結乾燥して得られた粉末を分析した結果、ＴＥＭによる一次粒子の平均粒子径が５ｎｍ、動的光散乱法による二次粒子の平均粒子径が４．０ｎｍであった。また、磁気特性は飽和磁化値σｓが１５．５Ａｍ２／ｋｇの磁性酸化鉄微粒子であった。
【００９３】
＜分散粒子の精製工程＞
透析膜を使用して精製を行なった。得られた透析液をエバポレーターで２００ｍｌに濃縮し、１２０００Ｇ、３０分間遠心分離を行い、上澄み液を回収する。この操作で凝集粒子は除去される。このようにして、黒色のコロイド水溶液を精製した。得られた磁性粒子含有水分散体の濃度は１０ｍｇ／ｍｌであり、磁性粒子含有水分散体のｐＨは６．５でありゼータ電位は−６０ｍＶであった。
【００９４】
＜磁性酸化鉄微粒子への表面修飾＞
次に、蛍光を発するフルオレセインイソチオシアネートを加え、カルボジイミドを１６０ｍｇとｐＨ４．５の塩酸溶液を２０ｍＬ添加し一晩撹拌した。撹拌後、１２０００×ｇの遠心分離にて上清を取り除き沈降物を水に分散させた。しかしながら、フルオレセインイソチオシアネートは結合していなかった。
【００９５】
比較例２
＜磁性酸化鉄微粒子の合成工程＞
ステアリン酸鉄７．２ｇとオレイン酸１．１４ｇ、トリｎオクチルアミンをフラスコに入れ、攪拌しながら３７０℃まで加熱させる。その後、５０℃まで冷却しクロロホルムを加え、生成した酸化鉄微粒子の分散体を得たのち、遠心分離にて上清を除去し沈降物をヘキサンに分散させた。得られたこの酸化鉄微粒子のＴＥＭによる一次粒子の平均粒子径は２０ｎｍ、また、磁気特性は飽和磁化値が４３Ａｍ２／ｋｇの磁性酸化鉄微粒子であった。
【００９６】
＜磁性酸化鉄微粒子への表面修飾＞
次に、得られた酸化鉄微粒子、ポリエチレンイミンをヘキサン３０ｍＬに添加し、６０℃でリフラックスさせたが、修飾できなかった。
【００９７】
使用例
実施例１で得られた複合磁性ナノ粒子を用いて、ＣＨＯ：チャイニーズハムスター卵巣細胞に対する適用実験を行った。その結果を図１に示す。実験の条件は、以下のとおりである。
【００９８】
Ｈａｍ‘ｓ  Ｆ−１２液体培地（Ｗａｋｏ）に抗生物質のＰＳＧ（Ｗａｋｏ）を１ｗｅｔ％、牛胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）を１０ｗｅｔ％添加した液体培地にＣＨＯを加え、９６穴プレートの１穴毎にＣＨＯを１．０×１０４  個添加し、３７℃で２０時間前培養した。次に実施例１で得られた複合磁性ナノ粒子はＨａｍ’  Ｆ−１２液体培地で０．１ｍＭ、１．０ｍＭに調整し、前培養したＣＨＯが入っている９６穴プレートに加え、２０時間３７℃で培養した。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）キットを用いて、実施例１で得られた複合磁性ナノ粒子の細胞毒性評価を行い、実施例１で得られた複合磁性ナノ粒子を加えていない対照を生存率１００％として比較した。
【００９９】
この結果、実施例１で得られた複合磁性ナノ粒子は、医療用のナノ材料として好適であることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【０１００】
本発明に係る複合磁性微粒子及び該複合磁性微粒子を含有する分散体は、磁性微粒子の容易な修飾によって均質な機能性を発揮でき、水系溶液に高分散な診断用・治療用などの磁性粒子含有医薬を生成することができる。
【図１】
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