(57)【要約】【課題】滑膜変性のメカニズムに着目した変形性関節症の新規治療予防剤を提供する。【解決手段】VEGF（Vascular Endothelial Growth Factor）アンタゴニストが、変形性関節症に伴う水腫を軽減し、滑膜の変化を抑制し、臨床症状を改善しうる。OA患者の滑膜においてMMP-1、MMP-2及びMMP-3やプラスミン等の強力なタンパク分解酵素の発現が観察された。これらのタンパク分解酵素の発現は、VEGF-Aによって直接に、又はVEGF-Aによるウロキナーゼの発現誘導によって間接的に誘導されると考えられた。そこで、VEGFを抑制しうる物質、即ちVEGFアンタゴニスト、より具体的には抗VEGF抗体を有効成分とする製剤により、これらのタンパク分解酵素の発現を抑制し、関節軟骨の変性及び／又は破壊を抑制し、変形性関節症を治療及び／又は予防することができる。【選択図】図１０
2014156398.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
VEGF（Vascular Endothelial Growth Factor）アンタゴニストを有効成分とする、変形性関節症の治療及び／又は予防剤。
【請求項２】
VEGFアンタゴニストが、抗VEGF抗体である、請求項１に記載の変形性関節症の治療及び／又は予防剤。
【請求項３】
変形性関節症が、変形性膝関節症である、請求項１又は２に記載の変形性関節症の治療及び／又は予防剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、変形性関節症の治療及び／又は予防剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
変形性関節症（OA：Osteoarthritis）は、加齢又は力学的ストレスに伴い、軟骨変性及び骨棘形成を生じ、また滑膜炎を伴う疾患である。OAは、慢性に経過する関節疾患で、関節の構成要素の退行変性により、軟骨の破壊と骨、軟骨の増殖性変化をきたす。OAでみられる滑膜炎については、上記変化に伴う二次的（続発性）な変化という見方が一般的であるが、一方で滑膜炎もOAの症状や疾患の進行に密接に関連する可能性も報告されている。OAは、年齢とともに増加する疾患で、日本国内で症状のある患者は約1000万人、レントゲン上の変化が見られる者は、約3000万人以上と推定される。リスクファクターとしては、加齢以外に、性別（女性）、肥満、外傷（靭帯や半月板損傷など）が挙げられているが、病因については不明な点が多い。今後高齢化が進むに従い、より患者数が増加するものと考えられる。
【０００３】
OAの保存的治療としては、内服薬としては非ステロイド性抗炎症剤が一般的に用いられる。また、関節内注入療法としては、高分子のヒアルロン酸が使用される。しかしながら、OAの病態には不明な点が多く、軟骨変性を抑制することで、あるいは軟骨再生を促進することによって疾患の進行を抑止しうることができる薬剤は未だにない。
【０００４】
骨を形成する骨芽細胞と軟骨細胞は、間葉系幹細胞より分化する。発生の過程において骨組織は膜性骨化(intramembranous ossification)又は内軟骨性骨化(endochondral ossification)により形成される。膜性骨化では、未分化間葉細胞が骨芽細胞に分化し、類骨(osteoid)、骨小柱(bone trabecula)を経て骨細胞となる。内軟骨性骨化では、間葉系細胞からまず軟骨原器が形成され、軟骨細胞は中心部に向かって増殖・成熟し、静止軟骨細胞層、増殖軟骨細胞層、肥大軟骨細胞層からなる成長板を形成する。肥大軟骨細胞層では軟骨細胞の肥大化とともに基質の石灰化が起こり、やがて軟骨細胞はアポトーシスを起こして死滅する。このような変化とともに石灰化した軟骨基質中に血管が侵入し、単球系の血液細胞から分化した破骨細胞が現れて基質を変性させる。基質が変性・消失したあとには未分化間葉系幹細胞から分化した骨芽細胞が入り込み、骨基質を形成する。軟骨はこのように発生の過程でほとんどが骨組織に置換される。しかし関節軟骨や椎間板などでは軟骨は骨組織に置換されないまま残り、細胞も一生軟骨細胞の性質を維持し、身体に可動性を与えている。このように、軟骨と骨は発生の段階では起源が共通であるが組織として異なる機能を持つものである。また、上述のごとく軟骨変性を明確に抑制し、又は軟骨再生を促進するような薬剤は未だにないのが、現状である。
【０００５】
骨欠損に対する治療として血管内皮増殖因子(Vascular Endothelial Growth Factor：VEGF)の使用について開示がある（特許文献１）。骨欠損の修復過程は上述の内軟骨性骨化の機序と基本的には同じである。特許文献１では、内軟骨性骨化のモデルを用いて、内因性VEGFが正常な骨修復に必要であることが報告されている。上述のごとく内軟骨性骨化では、石灰化軟骨層に血管が侵入することで破骨細胞が基質内に現れ、これが軟骨基質を融解する。このため骨形成においては血管新生が重要で、VEGFはこの過程を司ると考えられている。
【０００６】
抗VEGF抗体製剤であるベバシズマブ（アバスチン(R)）は、治癒切除不能な進行結腸癌・治癒切除不能な再発結腸癌・治癒切除不能な進行直腸癌・治癒切除不能な再発直腸癌等に対する抗腫瘍剤として市販されている（特許文献２）。しかしながら、先述のようにOAにおいて、軟骨変性を抑制し、又は軟骨再生を促進するような薬剤は未だになく、抗VEGF抗体製剤がOAにおいて軟骨の変性を阻止するという報告もない。また抗VEGF抗体製剤がOAに対して何らかの治療効果を持つとする報告もない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特表2005-524710号公報（国際公開パンフレットWO2003/094617）
【特許文献２】特表2010-501498号公報（国際公開パンフレットWO2008/022746）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、滑膜病変のメカニズムに着目したOAの新規治療予防剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、VEGFアンタゴニストが、OAに伴う水腫を軽減し、滑膜病変を抑制して臨床症状を改善しうることを見出し、本発明を完成した。
【００１０】
即ち、本発明は以下よりなる。
１．VEGFアンタゴニストを有効成分とする、OAの治療及び／又は予防剤。
２．VEGFアンタゴニストが、抗VEGF抗体である、前項１に記載のOAの治療及び／又は予防剤。
３．OAが、変形性膝関節症（膝OA)である、前項１又は２に記載のOAの治療及び／又は予防剤。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のVEGFアンタゴニストを有効成分とするOAの治療及び／又は予防剤によると、OAに伴う水腫を軽減化し、滑膜の変化を抑制し、臨床症状を改善しうる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】OA患者と対照例の軟骨組織片から荷重によって遊離されるFGF-2のタンパク量を示す図である。（参考例１）
【図２】OA患者と対照例の軟骨組織片から荷重によって遊離されるVEGF-Aのタンパク量を示す図である。（参考例１）
【図３】OA患者と対照例の滑膜組織片におけるCD34及びCD146の遺伝子の発現レベルを示す図である。（参考例２）
【図４】OA患者と対照例の滑膜組織片におけるPLAU及びPLAURの遺伝子の発現レベルを示す図である。（参考例３）
【図５】OA患者と対照例の滑膜組織片におけるプラスミン活性を示す図である。（参考例４）
【図６】OA患者と対照例の滑膜組織片におけるMMP-1, 2, 3の遺伝子の発現レベルを示す図である。（参考例５）
【図７】OA患者から採取した関節液におけるMMP-1, 2, 3のタンパクとしての含有量を示す図である。（参考例５）
【図８】末期OA患者の滑膜組織片におけるVEGFとそれに関連する遺伝子の発現レベルの相関を確認した図である。（参考例６）
【図９】OA患者の滑膜組織片におけるMMP-1, 3とVEGF、ウロキナーゼの遺伝子の発現レベルの相関を確認した図である。（参考例７）
【図１０】OA患者に対して抗VEGF抗体を有効成分とする製剤を投与したときの膝関節のMRI検査結果を示す図である。（実施例１）
【図１１】OA患者に対して抗VEGF抗体を有効成分とする製剤を投与したときの膝関節のMRI検査結果を示す図である。（実施例２）
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、血管内皮増殖因子(Vascular Endothelial Growth Factor：VEGF)アンタゴニストを有効成分とする変形性関節症(OA)の治療及び／又は予防剤に関する。本発明において、OAにおけるVEGF-A及び線維芽細胞増殖因子(Fibroblast growth factor 2: FGF-2)の関与を初めて確認し、さらにVEGF-Aが滑膜においてプラスミンやMMP(Matrix Metalloproteinase)-1、MMP-2及びMMP-3等の強力なタンパク分解酵素を誘導する機序についても初めて確認した。そこで、VEGFを抑制しうる物質、即ちVEGFアンタゴニスト用いることで、これらのタンパク分解酵素の発現を抑制し、関節軟骨の変性及び／又は破壊を抑制し、OAを治療及び／又は予防することができることを初めて見出した。本発明のVEGFアンタゴニストとして、好適には抗VEGF抗体が挙げられる。
【００１４】
本発明を完成するに至った経緯は、次のとおりである。まず、OAに罹患した軟骨に荷重を加えることによって多量のVEGF-A及びFGF-2が遊離されることを初めて確認した。VEGF-A及びFGF-2はともに血管新生を誘導する因子であるが、特にVEGF-Aはその作用が強く、また血管新生に伴いウロキナーゼ、MMP-2、MMP-9、MMP-14などのタンパク分解酵素の発現を誘導する作用を持つ。このうちウロキナーゼはタンパク分解酵素の１種であるプラスミンの活性を上昇させる。プラスミンは自身が強力なタンパク分解作用を持つだけでなく種々のMMPを活性化することによっても組織の破壊をもたらす。OAでは変性した軟骨から荷重に伴ってVEGF-A及びFGF-2が遊離し、これらの作用によって滑膜において血管新生とそれに伴うタンパク分解酵素の活性が上昇し、それによって滑膜組織の損傷が生じる。その結果、滑膜では組織の修復反応が誘導され、滑膜中の線維芽細胞が活性化されることでMMP-1及びMMP-3の発現も上昇する。このような一連の変化の結果、OAでは滑膜から関節液中に多量のMMP-1、MMP-2及びMMP-3が遊離され、これが軟骨変性を推し進める。
【００１５】
本発明のOAの治療及び／又は予防剤が適用されるOAは、膝、脊椎、頸椎、腰椎、足指、手指、股関節等、いずれの部位のOAであってもよい。特に好適には、膝OAが挙げられる。
【００１６】
本発明のOAの治療及び／又は予防剤は、有効成分としてのVEGFアンタゴニストを有効量含む他、一般に医薬に使用される添加剤を含んでいてもよい。添加剤としては、賦形剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、着色剤、矯味矯臭剤、乳化剤、界面活性剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、防腐剤、抗酸化剤、安定化剤、吸収促進剤等を挙げることができ、所望により、これらを適宜組み合わせて使用することもできる。
【００１７】
具体的には、上記賦形剤としては、例えば乳糖、白糖、ブドウ糖、コーンスターチ、マンニトール、ソルビトール、デンプン、α化デンプン、デキストリン、結晶セルロース、軽質無水ケイ酸、ケイ酸アルミニウム、ケイ酸カルシウム、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、リン酸水素カルシウム等を挙げることができる。上記結合剤としては、例えばポリビニルアルコール、メチルセルロース、エチルセルロース、アラビアゴム、トラガント、ゼラチン、シェラック、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリビニルピロリドン、マクロゴール等を挙げることができる。上記滑沢剤としては、例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、フマル酸ステアリルナトリウム、タルク、ポリエチレングリコール、コロイドシリカ等を挙げることができる。上記崩壊剤としては、例えば結晶セルロース、寒天、ゼラチン、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、クエン酸カルシウム、デキストリン、ペクチン、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチ、カルボキシメチルスターチナトリウム等を挙げることができる。上記着色剤としては、例えば三二酸化鉄、黄色三二酸化鉄、カルミン、カラメル、β−カロチン、酸化チタン、タルク、リン酸リボフラビンナトリウム、黄色アルミニウムレーキ等、医薬品に添加することが許可されているものを挙げることができる。上記矯味矯臭剤としては、例えばココア末、ハッカ脳、芳香散、ハッカ油、メントール、竜脳、桂皮末等を挙げることができる。上記乳化剤又は界面活性剤としては、例えばステアリルトリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルアミノプロピオン酸、レシチン、モノステアリン酸グリセリン、ショ糖脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル等を挙げることができる。上記溶解補助剤としては、例えばポリエチレングリコール、プロピレングリコール、安息香酸ベンジル、エタノール、コレステロール、トリエタノールアミン、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、ポリソルベート８０、ニコチン酸アミド等を挙げることができる。上記懸濁化剤としては、前記界面活性剤のほか、例えばポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース等の親水性高分子を挙げることができる。上記等張化剤としては、例えばブドウ糖、塩化ナトリウム、マンニトール、ソルビトール等を挙げることができる。上記緩衝剤としては、例えばリン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、クエン酸塩などの緩衝液を挙げることができる。上記防腐剤としては、例えばメチルパラベン、プロピルパラベン、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸等を挙げることができる。上記抗酸化剤としては、例えば亜硫酸塩、アスコルビン酸、α−トコフェロール等を挙げることができる。上記安定化剤としては、アスコルビン酸、エデト酸ナトリウム、エリソルビン酸、トコフェロール等を挙げることができる。上記吸収促進剤としては、ミリスチン酸イソプロピル、トコフェロール、カルシフェロール等を挙げることができる。
【００１８】
本発明のVEGFアンタゴニストが、抗VEGF抗体であれば、市販の抗VEGF抗体製剤であるベバシズマブ（アバスチン(R)）を用いることもできる。
【００１９】
本発明のOAの治療及び／又は予防剤の投与方法としては注射等による局所投与、静脈内注射投与の他、経皮投与、経口投与等を行うことができる。治療及び／又は予防剤の剤形としては、注射剤や軟膏剤、テープ剤、パップ剤、ローション剤などの外用剤とすることができる。最も好適には、注射等による局所投与、特に関節内投与が挙げられる。
【００２０】
本発明のOA治療及び／又は予防剤の投与量は、有効成分としてのVEGFアンタゴニストが、レシピエントに対して毒性を示さない範囲の値で適宜設定することができる。例えば、レシピエントの体格や年齢、性別等により、至適量を適宜決定することができる。例えば、本発明のVEGFアンタゴニストが抗VEGF抗体であって、市販の抗VEGF抗体製剤を用いる場合であれば、安全性が確認されている範囲の投与量を適宜選択して投与することができる。また投与間隔、回数についても同様である。
【実施例】
【００２１】
以下、参考例及び実施例に基づいて本発明を詳細に説明する。なお、OA治療及び／又は予防剤に関する発明を完成するに至った経緯を参考例に記載し、OA治療及び／又は予防剤の使用例を実施例に記載する。本実施例の試験は、独立行政法人国立病院機構相模原病院の倫理委員会の承認を得て同院において厚生労働省の定める臨床研究（平成２０年７月３１日改正厚生労働省「臨床研究に関する倫理指針」参照）として行ったものである。以下の各参考例及び実施例において、変形性関節症患者を「OA患者」ということとする。以下の各例では、OA患者のうち特に膝OA患者について検討したが、膝関節のOAに限定して解釈することはない。
【００２２】
（参考例１）OA患者における各種マーカーの確認（１）
OAは軟骨への荷重によって症状が悪化する。このことからOA患者１１例及びOAの既往のない剖検例６例の膝関節から軟骨組織片を採取し、組織片に対して荷重を加えて遊離する各種因子を計測した。剖検例から採取した軟骨はほぼ正常な軟骨２例と軽度変性のある軟骨４例に分けて解析し、またOA患者から得られた軟骨も、変性の比較的軽い部位からの軟骨と変性の明らかな部位からの軟骨に分けて解析した。実際の計測では採取した組織片をリン酸緩衝生理食塩水（phosphate buffered saline, PBS）中においてそれぞれに1 MPaの荷重を60回繰り返して加え、PBS中に遊離された各種因子の量を計測したところ、OAの病態と関連する因子として、FGF-2及びVEGF-Aが浮かび上がった。これらの因子の測定はサスペンションアレイテクノロジー(suspension array technology: SAT)によって行われ、具体的にはR&D Systems社より発売されている蛍光ビーズ(Fluorokine(R) MAP kit)を用いてBioRad社製のBioPlexTM200システムによって計測した。
【００２３】
上記の結果、FGF-2については剖検例から採取した軟骨のうちほぼ正常な軟骨片からの遊離量は低く抑えられていたが、軽度の変性のある軟骨片並びにOA患者からの軟骨片からは、高い値が計測された（図１）。一方、VEGF-Aについては、剖検例から採取したほぼ正常な軟骨片と軽度変性のある軟骨片では遊離量は低かったが、OA患者からの軟骨、とりわけ変性の明らかな軟骨からは、非常に高い値で遊離されることが分かった（図２）。VEGF-A及びFGF-2はいずれも血管新生を誘導する因子として知られている。またVEGF-Aは血管内皮細胞に対してMMP-2、9、14やウロキナーゼ(Urokinase)等のタンパク分解酵素の発現を誘導する作用を有する。ウロキナーゼは、プラスミノーゲン(plasminogen)をプラスミン(plasmin)に変換する。プラスミンは、それ自身が強力なタンパク分解酵素で種々のタンパクを分解するが、また種々のMMPを活性化する作用を有し、それによってもタンパクの分解を引き起こす。
【００２４】
（参考例２）OA患者における各種マーカーの確認（２）
OA患者２１例と病的所見のない剖検例（対照例）８例から滑膜組織を採取し、組織からRNAを抽出してcDNAを合成した。血管内皮細胞のマーカーであるCD34とCD146、及び内部標準としてのグリセルアルデヒド3リン酸脱水素酵素（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase: GAPDH）について遺伝子発現のレベルをRoche Applied Science社製LightCycler(R)を用いた定量的PCRによって調べた。CD34（gene symbol: CD34）とCD146（gene symbol: MCAM）の発現レベルをGAPDHの発現レベルで標準化したうえで対照例とOA患者の間で比較した。この計測に用いたプライマーの塩基配列は以下の配列番号１〜６に示すとおりである。
CD34  (gene symbol: CD34) 
フォワードプライマー：5'- TACTGCTACCCCAGAGTTACCTAC-3'（配列番号１）
リバースプライマー：5'- CAGAGGTAGATGTGAATTTGACTG-3'（配列番号２）
CD146 (gene symbol: MCAM) 
フォワードプライマー：5'- CATTCCTCAAGTCATCTGGTACA-3'（配列番号３）
リバースプライマー：5'- AGTTGAGCTCACAGTAAAACTGG-3'（配列番号４）
GAPDH (gene symbol: GAPDH) 
フォワードプライマー：5'-CAGGGACTCCCCAGCAGT-3'（配列番号５）
リバースプライマー：5'-GGGATTGCCCTCAACGACCA-3'（配列番号６）
【００２５】
上記の結果、CD34及びCD146の何れについても、対照例に比べてOA患者の滑膜において有意に高いレベルでの発現が認められた（図３）。CD34は、骨髄や血液中に存在する未分化な細胞で、血管再生幹細胞に発現するといわれている。CD146は、内皮細胞、平滑筋細胞、濾胞樹状細胞、メラノーマ細胞、及び活性化T細胞の一部など限られた組織に発現し、循環血中の内皮前駆細胞 (cEPCs) や、骨髄間質細胞 (MSCs) にも発現する。これらにより、OA患者の滑膜では、血管新生が実際に亢進していると考えられた。
【００２６】
（参考例３）OA患者における各種マーカーの確認（３）
CD34やCD146と同様にウロキナーゼ(gene symbol: PLAU)及びウロキナーゼ受容体(receptor for urokinase plasminogen activator、gene symbol: PLAUR)についても遺伝子レベルを定量的PCRによって測定し、計測値をGAPDHの発現レベルで標準化したうえで対照例とOA患者の間で比較した。計測の方法は参考例２と同様であり、計測に用いたプライマーの塩基配列は以下の配列番号７〜１０に示すとおりである。またGAPDHについて、配列番号５、６に示すとおりである。
ウロキナーゼ(gene symbol: PLAU) 
フォワードプライマー: 5'- TGCTCACCACAACGACATT-3'（配列番号７）
リバースプライマー: 5'- TTCCAAAGCCAGTGATCTCA-3'（配列番号８）
ウロキナーゼ受容体(gene symbol: PLAUR)
フォワードプライマー: 5'- CTGAAGAGACTTTCCTCATTGACT-3'（配列番号９）
リバースプライマー: 5'- TTACAGCCACTTTTAGTACAGCAG-3'（配列番号１０）
【００２７】
上記の結果、PLAU及びPLAURの何れについても、対照例に比べてOA患者の滑膜において発現レベルが有意に高いという結果を得た（図４）。特にPLAUはOA患者で発現が顕著に亢進していた。上述のようにウロキナーゼは、プラスミノーゲンをプラスミンに変換する作用を有する。この結果産生されたプラスミンは、それ自身が強力なタンパク分解作用を持つ酵素であるが、また種々のMMPを活性化する作用も併せ持つ。以上の結果からOA患者の滑膜ではウロキナーゼの発現に伴ってプラスミンやMMPの活性が上昇し、それによって滑膜組織の障害が生じている可能性が示された。
【００２８】
（参考例４）OA患者における各種マーカーの確認（４）
上記の推察を裏付けるためにOA患者１８例とOAの既往のない剖検例の膝関節（対照例）９例から滑膜を採取し、PBS中で組織を破砕してタンパク抽出液を得て、この抽出液中のプラスミンの活性を確認した。対照例からの滑膜組織は軟骨に変性所見が全くない関節から得たもの（４例）と軽い軟骨変性のある関節から得たもの（５例）に分けて解析を行った。プラスミンの活性はAnaSpec社のプラスミン活性測定キット(SensoLyte(R) Rh110 Plasmin Activity Assay Kit)を用いて行い、計測にはLabsystems社製Fluoroskan Ascent(R) FLを用いた。個々の検体について計測値はタンパク抽出に用いた滑膜組織の質重量で標準化した。
【００２９】
上記の結果、対照例に比べてOA患者の滑膜においてプラスミン活性の顕著な亢進が認められた（図５）。また、対照例の滑膜のうち、軟骨に軽度の変性がある関節から得た滑膜では変性所見が全くない関節からの滑膜よりプラスミン活性が高値である傾向がみられた。すなわち滑膜中のプラスミン活性は軟骨変性の程度に応じて上昇する傾向が見られ、これは軟骨変性の程度に応じて荷重によるVEGFの遊離量が増加するとする上述の結果（図２）と対応する結果であった。
【００３０】
（参考例５）OA患者における各種マーカーの確認（５）
OA患者では関節液中に多量のMMP-1、 MMP-2、 MMP-3が含まれ、軟骨の変性に関与していることが知られている。参考例２と同様にOA患者２１例と病的所見のない剖検例（対照例）８例から滑膜組織を採取し、組織からRNAを抽出してcDNAを合成した。MMP-1、 MMP-2、 MMP-3及び内部標準としてのGAPDHの発現レベルを定量的PCRによって調べ、３種のMMPの発現レベルをGAPDHの発現レベルで標準化したうえで、対照例とOA患者の間で比較した。この計測に用いたプライマーの塩基配列は以下の配列番号１１〜１６に示すとおりである。またGAPDHについて、配列番号５、６に示すとおりである。
MMP-1 (gene symbol: MMP1) 
フォワードプライマー: 5'-GTCTGAAGTCTGTGCCCAAAGAGA-3'（配列番号１１）
リバースプライマー: 5'-ACCAGGTGGTTCTTGGAGATGTAG-3'（配列番号１２）
MMP-2 (gene symbol: MMP2) 
フォワードプライマー: 5'- TTCTTTGCAGGGAATGAATACT-3' （配列番号１３）
リバースプライマー: 5'- ATCCATTTTCTTCTTCACCTCA-3'（配列番号１４）
MMP-3 (gene symbol: MMP3) 
フォワードプライマー: 5'-GGAGACTTTTACCCTTTTGATGGA-3'（配列番号１５）
リバースプライマー: 5'-CATGAGCAGCAACGAGAAATAAAT-3'（配列番号１６）
【００３１】
上記の結果、MMP-1、MMP-2及びMMP-3のいずれについても、対照例に比べてOA患者の滑膜において発現が顕著に上昇していることが認められた（図６）。
【００３２】
既に報告されている事実を確認するために、進行期にあるOA患者４２例と進行期が過ぎて末期に至ったOA患者３８例からそれぞれ関節液を採取してMMP-1、 MMP-2、 MMP-3の濃度を測定したところ、以前の報告と一致して関節液中には多量のMMP-1、 MMP-2、 MMP-3が含まれていることが確認された（図７）。これらのMMPの値はいずれも末期の患者より進行期の患者で高く、疾患進行との関連が示唆された。これらのMMPは参考例５に示すように滑膜で高発現したものが関節液中に放出されると考えられた。これらのMMPは関節液を介して関節軟骨に作用し、軟骨基質の変性をもたらして疾患の進行に関与すると考えられた。
【００３３】
（参考例６）OA患者における各種マーカー発現レベルの相関関係（１）
OA患者８４例より滑膜組織を採取し、VEGF-A、ウロキナーゼ、MMP-2、MMP-9又はMMP-14の発現レベルを参考例２に述べたようにGAPDHとともに定量PCRで計測した。GAPDHの発現レベルで標準化したのち遺伝子間の発現レベルの相関を検討した。この計測に用いたプライマーの塩基配列は以下の配列番号１７〜２０及び上述の参考例に示すとおりである。
MMP-9 (gene symbol: MMP9) 
フォワードプライマー: 5'- AAGGAGTACTCGACCTGTACCA-3'（配列番号１７）
リバースプライマー: 5'- AGCGGTACATAGGGTACATGAG-3'（配列番号１８）
MMP-14 (gene symbol: MMP14)
フォワードプライマー: 5'- ACAAGTACTACCGTTTCAACGAA-3'（配列番号１９）
リバースプライマー: 5'- TGTTCCCCTTGTAGAAGTAAGTG-3'（配列番号２０）
【００３４】
上記の結果、VEGF-Aの発現と、ウロキナーゼ、MMP-2又はMMP-14の発現については相関関係が認められ、OA患者の滑膜では発現したVEGF-Aによってウロキナーゼ、MMP-2又はMMP-14等の発現が誘導されることが検証された（図８）。
【００３５】
（参考例７）OA患者における各種マーカー発現レベルの相関関係（２）
VEGF-A又はウロキナーゼが滑膜において、MMP-1若しくはMMP-3の発現に実際に関連しているかを検討した。OA患者８４例より滑膜組織を採取し、VEGF又はウロキナーゼの発現と、MMP-1若しくはMMP-3の発現レベルを参考例２に述べたようにGAPDHとともに定量PCRで計測した。GAPDHの発現レベルで標準化したのち遺伝子間の発現レベルの相関を検討した。この計測に用いたプライマーの塩基配列はすでに記述したとおりである。
【００３６】
上記の結果、VEGFの発現と、MMP-1及びMMP-3の発現レベルの間に相関関係が認められた（図９）。またウロキナーゼと、MMP-1及びMMP-3の発現レベルの間にも相関関係が認められた。従って、参考例５及び本参考例の結果より、OA患者の滑膜においてVEGFはウロキナーゼとMMP-2の発現を誘導すること、また誘導されたウロキナーゼによりMMP-1及びMMP-3の発現が誘導されることが示された。
【００３７】
上記、参考例１〜８の結果より、以下のことが示されたことになる。OA患者の関節では変性した軟骨から遊離したVEGF-A、FGF-2が滑膜に作用して血管新生を引き起こし、VEGF-Aの発現を誘導する。滑膜において発現したVEGF-Aはウロキナーゼ、MMP-2及びMMP-14の発現を誘導する。このうちウロキナーゼはプラスミンの活性を上昇させる。プラスミンは自身が強力なタンパク分解作用を持つほか種々のMMPを活性化することによって滑膜組織の損傷をもたらす。滑膜組織が損傷された結果、滑膜では組織の修復反応が誘導され、滑膜中の線維芽細胞が活性化されてMMP-1及びMMP-3の発現も誘導される。これら一連の変化の結果、OAでは滑膜においてMMP-1、MMP-2、MMP-3の発現が高度に上昇し、滑膜から関節液中に多量のMMP-1、MMP-2及びMMP-3が遊離され、これが軟骨変性を推し進める。このような機序を考えると、軟骨から遊離した、又は滑膜内で発現するVEGFを抑制しうる物質、即ちVEGFアンタゴニスト、より具体的には抗VEGF抗体を用いることで、これら一連のタンパク分解酵素の発現を抑制し、関節軟骨の変性及び／又は破壊を抑制しうることが推定された。
【００３８】
（実施例１）OA患者に対する抗VEGF抗体の効果（１）
OA患者に、有効成分として10 mg/mlの抗VEGF抗体を含む製剤を、生理食塩水により3 mlに調整して膝関節内に１回のみ投与したときの経過を観察した。その結果、臨床症状は軽快した。また、膝についてMRI（Magnetic Resonance Imaging：磁気共鳴画像）検査を行ったところ、膝の水腫が明らかに軽減した（図１０参照）。
【００３９】
（実施例２）OA患者に対する抗VEGF抗体の効果（２）
OA患者に、有効成分として10 mg/mlの抗VEGF抗体を含む製剤を、生理食塩水により3 mlに調整して膝関節内に１回のみ投与して経過を観察した。その結果、臨床症状は軽快した。また、膝についてMRI検査を行ったところ、膝の水腫が投与後徐々に軽減した（図１１参照）。
【産業上の利用可能性】
【００４０】
以上詳述したように、本発明のOAの治療及び／又は予防剤によると、関節軟骨の変性及び／又は破壊を抑制することができる。また、実際の使用においても、関節部位での水腫を抑制することができる。さらにOAにおける滑膜病変を防止し、症状の改善ももたらすことができる。これにより、本発明のOAの治療及び／又は予防剤は、膝、脊椎、頸椎、腰椎、足指、手指、股関節等、いずれの部位のOAに対しても、予防的、治療的に利用することができる。
【図１】
2014156398.tif 000003
【図２】
2014156398.tif 000004
【図３】
2014156398.tif 000005
【図４】
2014156398.tif 000006
【図５】
2014156398.tif 000007
【図６】
2014156398.tif 000008
【図７】
2014156398.tif 000009
【図８】
2014156398.tif 000010
【図９】
2014156398.tif 000011
【図１０】
2014156398.tif 000012
【図１１】
2014156398.tif 000013
【配列表】
2014156398000001.app