(57)【要約】【課題】活性型リーリンを不活性型に分解する酵素を同定し、当該酵素やその遺伝子を利用して、活性型リーリン減少に基づくアルツハイマー病等の疾患に対する有効な治療、研究の手段を提供する。【解決手段】活性型リーリンを不活性型リーリンに分解するために用いるものであるＡＤＡＭＴＳ−３及びその機能的誘導体。リーリンの生理的機能、あるいはその促進又は抑制に関連する医療又は研究の目的にＡＤＡＭＴＳ−３又はその機能的誘導体を用いるＡＤＡＭＴＳ−３の使用方法。【選択図】図２
2014036607.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
活性型リーリンを不活性型リーリンに分解するために用いるものであることを特徴とするＡＤＡＭＴＳ−３及びその機能的誘導体。
【請求項２】
リーリンの生理的機能、あるいはその促進又は抑制に関連する医療又は研究の目的にＡＤＡＭＴＳ−３又はその機能的誘導体を用いることを特徴とするＡＤＡＭＴＳ−３の使用方法。
【請求項３】
ＡＤＡＭＴＳ−３又はその機能的誘導体を用いて、そのリーリン分解活性の制御物質をスクリーニングすることを特徴とするスクリーニング方法。
【請求項４】
ＡＤＡＭＴＳ−３又はその機能的誘導体を含んで構成され、そのリーリン分解活性の制御物質をスクリーニングするために用いるものであることを特徴とするスクリーニング用キット。
【請求項５】
ＡＤＡＭＴＳ−３又はその機能的誘導体を含んで構成され、活性型リーリンの生理的活性を抑制又は失活させるために用いるものであることを特徴とするリーリン機能抑制用キット。
【請求項６】
ヒト又は非ヒト動物のＡＤＡＭＴＳ−３遺伝子に対して、少なくとも遺伝子ノックアウト、遺伝子サイレンシングを包含する遺伝子治療の方法を用いることにより、ヒト又は非ヒト動物におけるＡＤＡＭＴＳ−３遺伝子の発現量を減少させることを特徴とする遺伝子治療。
【請求項７】
ＡＤＡＭＴＳ−３遺伝子のｍＲＮＡに対する相補鎖を用いる方法により、ヒト又は非ヒト動物におけるＡＤＡＭＴＳ−３遺伝子の発現量を減少させることを特徴とするノックダウン治療。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、活性型リーリンがＡＤＡＭＴＳ−３によって不活性型に分解されると言う新規な知見に基づく、ＡＤＡＭＴＳ−３を用いたリーリン分解に関する。更に詳しくは本発明は、リーリンを分解するために用いるＡＤＡＭＴＳ−３、ＡＤＡＭＴＳ−３のそのような使用方法、リーリン分解活性制御物質をスクリーニングする方法とそのために用いるスクリーニング用キット、リーリン機能抑制用キット、及びＡＤＡＭＴＳ−３のリーリン分解活性に着目した遺伝子治療とノックダウン治療に関する。
【背景技術】
【０００２】
（リーリン）
リーリンは、脳の機能に重要な、３４００を超えるアミノ酸からなる巨大な分泌タンパク質である。リーリンが脳の特徴的な層構造の形成に必須であること、ヒトでもリーリンが欠損すると脳構造形成不全が起こることが報告されている。一方、リーリンは成体の脳でも発現しており、その発現量の低下や分解亢進が統合失調症、アルツハイマー病、気分障害等の疾患（以下、これらの疾患を一括して「アルツハイマー病等の疾患」と呼ぶ）の一因となることが明らかになってきている。
【０００３】
リーリンに関して、例えば下記の特許文献１では、リーリンのエピトープ領域ポリペプチド及びこれをコードするポリヌクレオチドを開示し、これによってリーリンの機能を更に研究すると共に、リーリン遺伝子の異常並びにニューロンの配置異常に起因する脳障害に対する診断・治療手段を提供できるとしている。又、下記の特許文献２では、中枢神経系の他の重要成分におけるＤＩＩＡレベルを非破壊的に評価又は予想するためのバイオマーカーとしてのリーリンを測定する方法を提案している。
【０００４】
リーリンについては、更に、リーリンが未知の酵素により分子内で特異的な分解を受けること、その分解部位として、リーリンタンパク質のアミノ酸配列におけるＮ末端側に近い未知のサイト（以下、このサイトを「N-t site」と呼ぶ）とＣ末端側に近い未知のサイト（以下、このサイトを「C-t site」と呼ぶ）があること、リーリンの分子内分解の大部分はN-t siteで起こり、かつ、N-t siteで分解されたリーリンは生理的に不活性であることが分かっている。換言すれば、N-t site非分解型リーリンは活性型であり、これには全長リーリンとC-t siteでの分子内分解のみを受けた分解型リーリンとが包含される。なお、C-t siteで起こる分解は少ないため、C-t siteでの分子内分解のみを受けた分解型リーリンは測定誤差の範囲内として無視することも可能である。
【０００５】
（ＡＤＡＭＴＳ−３）
一方、従来よりＡＤＡＭファミリーに属するタンパク質や、そのサブファミリーであるＡＤＡＭＴＳファミリーに属するタンパク質が知られている。
【０００６】
ＡＤＡＭファミリーのタンパク質としては３０種以上が知られ、構造的には、Ｎ末端のシグナル配列の後に、プロドメイン、メタロプロテアーゼドメイン、ディスインテグリンドメイン及びＥＧＦリピートを含むシステインに富んだ領域が続き、そのファミリーのほとんどのメンバーは膜貫通性ドメインを有し、その後にＣ末端細胞質テールを含むことが分かっている。
【０００７】
ＡＤＡＭＴＳ（トロンボスポンジンモチーフを有するディスインテグリンおよびメタロプロテアーゼ）ファミリーは、ＡＤＡＭのサブファミリーであり、哺乳動物等に見いだされる細胞外プロテアーゼファミリーである。哺乳動物のＡＤＡＭＴＳファミリーとして１０種以上のメンバーが知られている。このファミリーのメンバーは、構造的には、トロンボスポンジン１様の繰り返し配列を複数コピー含み、Ｃ末端領域の膜貫通性ドメインが欠けている等の、他のＡＤＡＭファミリーメンバーとは異なる構造を持つ。このため、ほとんどが細胞表面に局在するＡＤＡＭファミリーメンバーとは異なり、ＡＤＡＭＴＳファミリーメンバーは細胞外マトリックスタンパク質を構成している、との報告もある。
【０００８】
ＡＤＡＭＴＳ−３は公知であって、そのアミノ酸配列は例えば下記の非特許文献１で報告されており、又、NCBI受託番号「NM 001081401.2」によってコードされるタンパク質である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２００２−１７３６１号公報
【特許文献２】特開２００７−５２４６７４号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】J Biol Chem. 2001 276:31502-9.ProcollagenII amino propeptide processing by ADAMTS-3. Insightson dermatosparaxis3.  Fernandes RJ, Hirohata S, Engle JM, Colige A, Cohn DH, Eyre DR, ApteSS.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
リーリンに関して前記した従来の知見を踏まえれば、リーリンの発現量低下や分解亢進に基づくアルツハイマー病等の疾患の予防、診断、治療手段の開発のため、あるいはリーリンの機能についての多様なアプローチによる研究の手段として、活性型リーリンを不活性型に分解する未知の酵素を同定することが強く望まれる。しかし、このような酵素を特定したとする報告は未だ見られない。
【００１２】
本願発明者は、鋭意研究した結果、活性型リーリンタンパク質のアミノ酸配列において未解明であったN-t siteの分解部位を具体的に突き止めた。即ち、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列は、未解明であったリーリンタンパク質のN-t siteの分解部位を中心とする８個のアミノ酸配列を示す。N-t siteでの分解は、このアミノ酸配列中において起こる。特に、このアミノ酸配列中のプロリン（Pro）とアラニン（Ala）との間で起こる。なお、配列表において後述するように、この８個のアミノ酸配列及びその分解部位は、実際にはマウスのリーリンから割り出したものであるが、ヒトのリーリンにおいても上記のアミノ酸配列及びその分解部位は全く同一である。
【００１３】
そこで本発明は、活性型リーリンを不活性型に分解する酵素を同定し、更には、その酵素を有効に活用する手段を提供することを、解決すべき技術的課題とする。本願発明者は、上記の新規な知見に基づき、活性型リーリンを不活性型に分解する酵素がＡＤＡＭＴＳ−３であることを同定するに至り、本発明を完成した。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
（第１発明の構成）
上記課題を解決するための第１発明の構成は、活性型リーリンを不活性型リーリンに分解するために用いるものである、ＡＤＡＭＴＳ−３及びその機能的誘導体である。
【００１５】
上記の第１発明において、「活性型リーリン」とは、分解を受けていない全長リーリンの他、活性型の分解リーリン、即ち、全長リーリンの一部が分解を受けているが前記したリーリンの生理的活性を維持しているものも包含する。C-t siteでの分解を受けているリーリンは、このような「活性型の分解リーリン」である可能性がある。
【００１６】
前記したように、ＡＤＡＭＴＳ−３自体はアミノ酸配列等も含めて公知であるため、配列表におけるＡＤＡＭＴＳ−３のアミノ酸配列等の記載を省略する。又、「その機能的誘導体」とは、ＡＤＡＭＴＳ−３の誘導体であって、活性型リーリンをN-t siteにおいて分解する活性を有するものを言う。
【００１７】
（第２発明の構成）
上記課題を解決するための第２発明の構成は、リーリンの生理的機能、あるいはその促進又は抑制に関連する医療又は研究の目的にＡＤＡＭＴＳ−３又はその機能的誘導体を用いる、ＡＤＡＭＴＳ−３の使用方法である。
【００１８】
上記の第２発明において、「用いる」とは、ＡＤＡＭＴＳ−３等を人為的に用いることを意味し、ヒト及び非ヒト動物の体内において自然現象として起こっている活性型リーリンのＡＤＡＭＴＳ−３による分解を包含しない。
【００１９】
（第３発明の構成）
上記課題を解決するための第３発明の構成は、ＡＤＡＭＴＳ−３又はその機能的誘導体を用いて、そのリーリン分解活性の制御物質をスクリーニングする、スクリーニング方法である。
【００２０】
上記の第３発明において、「リーリン分解活性」とは、ＡＤＡＭＴＳ−３又はその機能的誘導体における、活性型リーリンを不活性型リーリンに分解する活性を言う。又、「リーリン分解活性の制御物質」とは、リーリン分解活性を阻害する物質と、リーリン分解活性を増強又は促進する物質とを含む。
【００２１】
（第４発明の構成）
上記課題を解決するための第４発明の構成は、ＡＤＡＭＴＳ−３又はその機能的誘導体を含んで構成され、そのリーリン分解活性の制御物質をスクリーニングするために用いるものである、スクリーニング用キットである。
【００２２】
（第５発明の構成）
上記課題を解決するための第５発明の構成は、ＡＤＡＭＴＳ−３又はその機能的誘導体を含んで構成され、活性型リーリンの生理的活性を抑制又は失活させるために用いるものである、リーリン機能抑制用キットである。
【００２３】
（第６発明の構成）
上記課題を解決するための第６発明の構成は、ヒト又は非ヒト動物のＡＤＡＭＴＳ−３遺伝子に対して少なくとも遺伝子ノックアウト、遺伝子サイレンシングを包含する遺伝子治療の方法を用いることにより、ヒト又は非ヒト動物におけるＡＤＡＭＴＳ−３遺伝子の発現量を減少させる、遺伝子治療である。
【００２４】
（第７発明の構成）
上記課題を解決するための第７発明の構成は、ＡＤＡＭＴＳ−３遺伝子のｍＲＮＡに対する相補鎖を用いる方法によりヒト又は非ヒト動物におけるＡＤＡＭＴＳ−３遺伝子の発現量を減少させる、ノックダウン治療である。
【発明の効果】
【００２５】
本願発明者によって、活性型リーリンを不活性型に分解する酵素としてＡＤＡＭＴＳ−３が同定された。従って、第１発明の活性型リーリン分解用ＡＤＡＭＴＳ−３及びその機能的誘導体により、活性型リーリンを不活性型に分解する酵素が提供される。その結果、リーリンの発現量低下や分解亢進に基づくアルツハイマー病等の疾患の有効な予防・治療手段の開発が可能になった。又、リーリンの機能についての多様なアプローチの研究における有効な研究手段が提供された。
【００２６】
このようなＡＤＡＭＴＳ−３の同定には、活性型リーリンタンパク質のアミノ酸配列において未解明であったN-t siteの分解部位を本願発明者が具体的に突き止めた点が関与している。即ち、活性型リーリンは、具体的には未知であったN-t siteで分解されると不活性型となることが分かっている。従って活性型リーリンのアミノ酸配列におけるN-t siteが具体的に解明されたことで、活性型リーリンを不活性型に分解する酵素を単離し同定する方法、例えば実施例において用いたような手法を確立することが可能になった。
【００２７】
第２発明によってＡＤＡＭＴＳ−３の新規かつ有用な各種使用方法が提供される。即ち、ＡＤＡＭＴＳ−３が活性型リーリンを不活性型リーリンに分解する機能を有すると言う知見に基づけば、ＡＤＡＭＴＳ−３を研究の手段として、あるいはその機能を制御する物質を探索する手段として、アルツハイマー病等の疾患の研究や、それらの疾患の予防又は治療、更にはそれらの疾患に対処するための遺伝子工学的な処置等の分野における多様な使用方法に供することができる。
【００２８】
第３発明又は第４発明によって、ＡＤＡＭＴＳ−３又はその機能的誘導体のリーリン分解活性の制御物質をスクリーニングすることができる。制御物質がリーリン分解活性を阻害する物質である場合は、リーリン機能を維持するのに有効な物質が得られたことになり、この物質を有効成分とする医薬を提供してアルツハイマー病等の疾患の予防又は治療を行うことができる。この物質をアルツハイマー病等の疾患の病理や病態の基礎研究に用いることもできる。制御物質がリーリン分解活性を増強又は促進する物質である場合は、リーリン機能を阻害し低下させる物質が得られたことになり、この物質をアルツハイマー病等の疾患の病理、病態の基礎研究に用いることができる。
【００２９】
第５発明によって、リーリンの生理的機能を抑制するためのキットが提供されるので、リーリン自体や、その生理的機能や、リーリンの分解亢進時におけるアルツハイマー病等の疾患の病理、病態等の基礎研究に有用である。
【００３０】
第６発明又は第７発明によって、アルツハイマー病等の疾患の遺伝子工学的な予防、治療手段が提供される。即ち、ヒト又は非ヒト動物のＡＤＡＭＴＳ−３遺伝子に対して遺伝子ノックアウト、遺伝子サイレンシング等の遺伝子治療あるいはノックダウン治療を行うと、ＡＤＡＭＴＳ−３遺伝子の発現量が減少し、ひいては活性型リーリンの分解が阻止ないしは抑制されるので、アルツハイマー病等の疾患の予防又は治療に有効である。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】ＡＤＡＭＴＳ−３の同定を示す図である。
【図２】ＡＤＡＭＴＳ−３によるリーリン分解を実証する図である。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
次に本発明の実施形態を、その最良の形態を含めて説明する。
【００３３】
〔活性型リーリン分解用ＡＤＡＭＴＳ−３〕
本発明においては、活性型リーリンを不活性型に分解するため、ＡＤＡＭＴＳ−３又はその機能的誘導体を用いる。
【００３４】
ＡＤＡＭＴＳ−３はＡＤＡＭファミリーのサブファミリーであるＡＤＡＭＴＳファミリーに属する公知のタンパク質の１種であって、従来、その生理的機能は必ずしも解明されていないが、本願発明者により、活性型リーリンを不活性型に分解する酵素であることが同定された。
【００３５】
ＡＤＡＭＴＳ−３の機能的誘導体として、少なくともＡＤＡＭＴＳ−３メタロプロテアーゼ触媒ドメインを含む誘導体を例示できる。又、ＡＤＡＭＴＳ−３ディスインテグリン様ドメイン及び／又はＡＤＡＭＴＳ−３中央トロンボスポンジンＩ型リピートを更に含むことができる。又、機能的誘導体として、活性型ＡＤＡＭＴＳ−３のアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、挿入又は置換されたものを例示することができる。この分野の専門家であれば、活性型ＡＤＡＭＴＳ−３において１〜数個のアミノ酸残基を選択して欠失させ、挿入し、又は置換する操作によってＡＤＡＭＴＳ−３の変異体を調製し、これらの変異体について活性型リーリンを不活性型に分解する機能の有無を検定して機能的誘導体を得ることは容易である。
【００３６】
〔ＡＤＡＭＴＳ−３の使用方法〕
本発明に係るＡＤＡＭＴＳ−３の使用方法は、リーリンの生理的機能あるいはその促進又は抑制に関連する医療又は研究の目的にＡＤＡＭＴＳ−３又はその機能的誘導体を用いる方法である。
【００３７】
「リーリンの生理的機能」には、少なくとも、その欠損により脳構造形成不全が起こるとされる点の機能、脳における発現量の低下や分解亢進が統合失調症、アルツハイマー病、気分障害等の疾患の一因となるとされる点の機能等の既知の機能に加え、今後解明される可能性のある未知の機能も含まれる。
【００３８】
ＡＤＡＭＴＳ−３の使用方法のカテゴリーとして、具体的には、ＡＤＡＭＴＳ−３又はその機能的誘導体の、例えば、in vitroにおける使用、組み換え微生物における使用、アルツハイマー病等の疾患をシミュレートできるマウス等のモデル動物における使用、通常の実験用動物における使用、ヒト又は非ヒト動物の細胞、組織又は器官での使用、人為的に調製されたＡＤＡＭＴＳ−３又はその機能的誘導体のヒト又は非ヒト動物の体内（受精卵、胚を含む）での使用、等を例示することができるが、これらに限定されない。
【００３９】
「医療又は研究の目的」としては、ＡＤＡＭＴＳ−３のリーリン分解機能を阻害又は促進する制御物質の探索、ヒト及び非ヒト動物におけるリーリンに関連する各種疾患の研究、これらの疾患の予防、診断、治療への前記制御物質の使用、前記各種疾患に対処するための遺伝子治療や遺伝子ノックダウン、リーリンの生理的機能の研究、リーリンの生理的機能の低下又は増強が前記各種疾患の病態に及ぼす影響、ＡＤＡＭＴＳ−３のリーリン分解機能のより詳細な研究、等を例示することができるが、これらに限定されない。
【００４０】
〔スクリーニング方法及びスクリーニング用キット〕
本発明のスクリーニング方法は、ＡＤＡＭＴＳ−３又はその機能的誘導体を用いて、そのリーリン分解活性の制御物質、即ちリーリン分解活性を阻害する物質及び／又はリーリン分解活性を増強、促進する物質をスクリーニングする方法であり、スクリーニング用キットは、上記したスクリーニング方法を実施するためのキットであって、ＡＤＡＭＴＳ−３又はその機能的誘導体を含んで構成され、そのリーリン分解活性の制御物質をスクリーニングするために用いるものである。
【００４１】
キットを構成するＡＤＡＭＴＳ−３又はその機能的誘導体の剤型については、例えば凍結乾燥状態、緩衝液の溶液の状態、あるいは緩衝液の溶液を凍結乾燥した状態等としておくこともできる。
【００４２】
このスクリーニング用キットは、この種のキットが備えることがある必要又は有益な他の任意の構成要素、例えば希釈用の緩衝液やｐＨ調整液その他の構成要素を備えることができる。緩衝液の種類は限定されないが、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、ベロナール緩衝液、ホウ酸緩衝液、グッド緩衝液等を例示できる。
【００４３】
〔リーリン機能抑制用キット〕
本発明のリーリン機能抑制用キットは、ＡＤＡＭＴＳ−３又はその機能的誘導体を含んで構成され、活性型リーリンの生理的活性を抑制又は失活させるために用いるものである。このリーリン機能抑制用キットについても、必要又は有益な他の構成要素、例えば希釈用の緩衝液やｐＨ調整液その他の構成要素を備えることができる。
【００４４】
〔遺伝子治療及びノックダウン治療〕
遺伝子治療及びノックダウン治療は一般論としては周知である。本発明に係る遺伝子治療は、ヒト又は非ヒト動物のＡＤＡＭＴＳ−３遺伝子に対して少なくとも遺伝子ノックアウト、遺伝子サイレンシングを包含する遺伝子治療の方法を用いることにより、ヒト又は非ヒト動物におけるＡＤＡＭＴＳ−３遺伝子の発現量を減少させるものである。
【００４５】
ヒト又は非ヒト動物のＡＤＡＭＴＳ−３遺伝子に対する遺伝子治療は、リーリンの発現量低下や分解亢進に基づくアルツハイマー病等の疾患の予防又は治療目的のために、あるいは、そのような疾患又はその病理、病態の研究目的のために行われる。
【００４６】
「遺伝子ノックアウト」とは、ヒト又は非ヒト動物に機能欠損型のＡＤＡＭＴＳ−３遺伝子を導入する遺伝子治療の手法である。ここに、「機能欠損型」とは、活性型リーリンを不活性型リーリンに分解すると言う機能を欠損させたＡＤＡＭＴＳ−３をコードするものを言う。「遺伝子サイレンシング」とは、分裂間期の細胞核内で脱凝縮した状態にある染色体（クロマチン）への後天的な修飾により、ＡＤＡＭＴＳ−３遺伝子の機能を抑制する遺伝子治療の手法である。
【００４７】
ノックダウン治療は一般論としては周知である。本発明に係るノックダウン治療は、ＡＤＡＭＴＳ−３遺伝子のｍＲＮＡに対する相補鎖を用いる方法により、ヒト又は非ヒト動物におけるＡＤＡＭＴＳ−３遺伝子の発現量を減少させるものであり、その目的は上記の遺伝子治療の場合と同様である。
【００４８】
「ノックダウン治療」の具体的内容としては、例えば、ＡＤＡＭＴＳ−３遺伝子のｍＲＮＡのアンチセンス鎖に相当するＲＮＡを導入するアンチセンス法、ｓｉＲＮＡやｍｉｃｒｏＲＮＡ等を用いてＲＮＡｉ（ＲＮＡ干渉）と呼ばれる現象を利用するＲＮＡｉ法等が例示される。
【実施例】
【００４９】
次に本発明の実施例を説明する。本発明の技術的範囲は以下の実施例によって限定されない。
【００５０】
〔第１実施例：ＡＤＡＭＴＳ−３の同定〕
（第１実施例の概要）
第１実施例では、マウス大脳皮質神経細胞の培養上清をヘパリンカラムクロマトグラフィー及びMono Qカラムクロマトグラフィーで分画し、リーリン分解活性を指標に精製した。Mono Qカラムの溶出画分のうち、リーリン分解活性の強いフラクション（A8、A9）を図１に示すように電気泳動した後、質量分析を行った。
【００５１】
例えば、非特許文献「Exp. Neurol. 156, 214-217, (1999) Reelin, the extracellular matrix protein deficient in reeler mutant mice, is processed by metalloproteinase」等に報告された先行研究から、リーリン分解酵素はメタロプロテアーゼであることが分かっている。そこで図１に示す各バンドを質量分析に供した結果、矢印で示す１３番のバンド（83kDa）がメタロプロテアーゼの一種であるＡＤＡＭＴＳ−３であることが判明した。一方、他のバンドは、得られたペプチドの分子量をデータベース検索により解析したところ、メタロプロテアーゼではないと判断された。
【００５２】
（第１実施例の具体的説明）
（１）大脳皮質神経細胞培養上清の調製
解剖前日からUntreated Polystyrene Surface 10 cm dishを0.005％Poly-L-Lysineで一晩コートした。翌日、滅菌水を用いて well を４回洗い乾燥させた。麻酔した妊娠 15 日目母親マウス (ICR) を頸椎脱臼により殺し、胎児（9−18匹/1腹）を取り出した。断頭後、クリーンベンチ内で実体顕微鏡下、海馬を除いた大脳皮質を摘出した。摘出した大脳皮質はNeurobasal medium (NB) 15 mLが入った15 mLチューブ中に氷上で保存した。1,000 rpmで1分間遠心して大脳皮質を沈殿させ、アスピレーターでNBを除き、ペレットに0.25％ Trypsin/HBSSを加え、37℃で5分間インキュベートした。その後、20％ FCSを含むNBを加え、反応を停止した。1,000 rpmで1分間遠心し皮質を沈殿させ、ピペットを用いて上清を除いた。ペレットに0.1％ DNase + 12mM MgSO4 を1mL加え、3分間、室温でインキュベートした後、NBを12mL加え、混合した。1,000 rpmで1分間遠心し皮質を沈殿させ、上清をピペットを用いて除いた。先を丸め細くしたパスツールピペットを用いてペレットに2％ B27、1％ Penicillin/Streptomycin、2mM L-Glutamineを含むNB (NB(+)) を2mL加え、ピペッティングにより細胞を完全に分散させた。その後、NBを12 mL加え1,500 rpm で3分間遠心した。遠心後、上清をピペットを用いて除き、NBを12 mL加え、同様に遠心して上清を除いた。 NB(+) 5-10 mLで懸濁し、細胞数をTrypan blue stain (Invitrogen) を用いて計測した。コートを施した12 well 、24 well もしくは10 cm dishに0.5 - 1.3x106 cell / well となるように播種した。培養は37℃、5％CO2 存在下で行った。数時間後、培地をB27を含まないものに交換し、さらに3から5日間培養後、培養上清を回収し、0.2μmのフィルターで濾過滅菌した。以下の実験に使用するまで、4℃で保存した。
【００５３】
（２）リーリン分解活性の強いフラクションの精製
（１）で得た培養上清を、GE社のAktaシステムカラムクロマトグラフィによって分画した。まず、HiTrap Heparin Sepharoseカラムに培養上清を添加し、続いて10mM Tris (pH7.5)で洗浄した。その後、塩化ナトリウム溶液の濃度勾配によって溶出した。リーリン分解活性（下記の第２実施例の方法を用いて測定）は塩化ナトリウム濃度がおよそ600mMのところに溶出された。この画分を回収し、20mM Tris (pH8.0)に対して透析した。以上の操作を、１回あたり150mlの培養上清を用いて行い、6回行った（計900mlの培養上清を使用）得た活性画分を合わせ、これをMonoQカラムに供し、20mM Tris (pH8.0)で洗浄後、塩化ナトリウム溶液の濃度勾配によって溶出した。リーリン分解活性は塩化ナトリウム濃度がおよそ600mMのところに溶出された。この画分を1レーンあたり30μL注ぎ、SDS-ポリアクリルアミド電気泳動（SDS-PAGE）により分離し、銀染色を行った。
【００５４】
〔第２実施例：ＡＤＡＭＴＳ−３によるリーリン分解の実証〕
（第２実施例の概要）
第２実施例に係る図２の説明
図２は第２実施例の概要を示すものである。図２の右半部の上段には図案化した全長リーリンと、そのN-t site（「N-t分解」と表記）が示されている。全長リーリンのすぐ下部に示した「ＮＲ６断片」とは全長リーリンがC-t siteで分解された場合におけるアミノ末端側の断片であり、更に下段に示す「ＮＲ２断片」とは全長リーリンがN-t siteで切断された場合におけるアミノ末端側の断片である。これらについては、G10抗体の結合部位も付記されている。
【００５５】
図２の左半部には第２実施例に係るウエスタンブロッティングの結果を示す。左側のレーンは後述するコントロールの結果を示す。右側の「ＡＤＡＭＴＳ−３」と表記したレーンは、後述するようにＡＤＡＭＴＳ−３を発現させたHEK293T細胞の培養上清を用いた場合の結果を示す。そして、分子量マーカーを指標として、ウエスタンブロッティングで現れたバンドと図２の右半部に示す「リーリン全長」、「ＮＲ６断片」及び「ＮＲ２断片」との対応関係が矢印によって示されている。
【００５６】
第２実施例の概要
第２実施例では、下記（ａ）の培養上清を下記（ｂ）の培養上清と混合した後にウエスタンブロッティングに供した場合（図２の「ＡＤＡＭＴＳ−３」のレーン、即ち本発明の実施例）と、下記（ａ）の培養上清を下記（ｃ）の培養上清と混合した後にウエスタンブロッティングに供した場合（図２の「control」のレーン、即ち対照例）とについて、リーリンの分解を対比して調べた。
【００５７】
（ａ）リーリンを発現させたHEK293T細胞の培養上清
（ｂ）ＡＤＡＭＴＳ−３を発現させたHEK293T細胞の培養上清
（ｃ）何も発現させていないHEK293T細胞の培養上清
その結果、図２から分かるように、本発明の実施例の場合にのみ、全長リーリンとＮＲ６断片が減少し、ＮＲ２断片が増加した。つまり、リーリンのN-t siteでの分解が増加した。これにより、ＡＤＡＭＴＳ−３が活性型リーリンを不活性型に分解する酵素がＡＤＡＭＴＳ−３であることが実証された。
【００５８】
（第２実施例の具体的説明）
（１）リーリンとＡＤＡＭＴＳ−３の発現
70〜80％コンフルエント状態のHEK293T細胞（10cm dishで培養）の培地をOpti-MEM（Invitrogen）に置換し、ADAMTS-3発現プラスミド15μgと30μLのLipofectamine 2000（Invitrogen）を用いてトランスフェクションを行った。5時間後、50 Units/mL Penicillin + 50 mg/mL Streptomycinを含むOpti-MEMに培地を交換し、37℃、5％CO2存在下で培養した。48h後に0.45μm滅菌フィルターおよび、5mLシリンジを用いて上清を回収した。
【００５９】
（２）リーリンとＡＤＡＭＴＳ−３の反応と、N-t siteでの分解の実証
上記（１）で得たADAMTS-3を含む培養上清と、同様の方法で得たリーリンを1：1の割合で混合し、37℃で5時間-24時間インキュベートした。この反応液を4×SDS sumpling bufferと3：1で混合しサンプル化し、1レーンあたり25μL注ぎ、SDS-ポリアクリルアミド電気泳動（SDS-PAGE）により分離し、セミドライ式転写機を用いてPVDF膜に転写した。転写後のPVDF膜は5％スキムミルクin TBSTで30分間ブロッキングを行った。ブロッキング後、PVDF膜と、抗リーリン抗体（G10, ミリポア社より購入）を含む5％スキムミルク in TBSTとを室温で2時間インキュベートした。その後、PVDF膜をTBSTで5分間×4回洗浄し、HRP標識された二次抗体を含む5％スキムミルク in TBSTを室温で1時間インキュベートした。そして、PVDF膜をTBSTで5分間×4回洗浄し、Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate（ミリポア）を用い可視化し、LAS4000（GE Healthcare）にて発光を検出した。その結果、図２に示すように、特異的なN-t siteでの切断産物が増加したことが判明した。従って、ADAMTS-3がリーリンのN-t siteでの切断を担う酵素であることが判明した。
【産業上の利用可能性】
【００６０】
本発明により、活性型リーリンを不活性型に分解する酵素が同定され、当該酵素やその遺伝子を利用して、活性型リーリン減少に基づくアルツハイマー病等の疾患に対する有効な治療、研究の手段が提供される。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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