(57)【要約】      （修正有）【課題】リチウム試薬組成物を発色反応試液とし、目視又は比色計で観測するリチウム測定方法を提供する。【解決手段】テトラフェニルポルフィリンの炭素に結合している水素を全部フッ素に置き換えた構造式2014095567.tif 000007で表される化合物と、ｐＨ調節剤及びｐＨ緩衝剤とを包含する水溶液であることを特徴とするリチウム試薬組成物と被検体を接解し、その反応液に白色光を照射、または露光させ、このときの明瞭な色調変化を目視による検出、又は比色計で簡便に検出し、血清及び血漿試験試料を含む生体試料や環境試料を被検体とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
テトラフェニルポルフィリンの炭素に結合している水素を全部フッ素に置き換えた構造式
【化１】
2014095567.tif 000006
で表される化合物と、ｐＨ調節剤及びｐＨ緩衝剤とを包含する水溶液であることを特徴とするリチウム試薬組成物と被検体を接解し、その反応液に白色光を照射、または露光させ、それにより生じた色調の変化を目視により検出、又は比色計によりその感度を検出することを特徴とするリチウム測定方法
【請求項２】
前記発色の色調は、リチウム呈色錯体が存在しない場合は緑色であり、リチウム呈色錯体の量が増えるに従い黄色から橙色を経て赤色に変化することを特徴とする請求項１に記載のリチウム測定方法。
【請求項３】
前記の色調の変化は、リチウム濃度が０.０mＭから４.５mＭの範囲で起こることを特徴とする請求項２に記載のリチウム測定方法。
【請求項４】
前記被検体は、血清及び血漿試験試料を含む生体試料であることを特徴とする請求項１乃至３に記載から選択されるリチウム測定方法。
【請求項５】
前記被検体は、環境試料であることを特徴とする請求項１乃至３に記載から選択されるリチウム測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、尿、血清、血漿、血液試験試料を含む生体試料や、飲料水を含む環境試料等の水溶液中のリチウム測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来よりリチウム含有の気分安定薬は、躁うつ病、てんかん、双極性障害の治療に有効であるため多用されているが、投与に際しては血清中のリチウム濃度を適正な範囲にコントロールする必要がある。
一般的には、双極性障害(躁うつ病)の治療薬、或いは抗うつ薬とともに気分安定薬として炭酸リチウム錠(経口投与)が広く処方されている。炭酸リチウム(Li2CO3）はリチウム中毒となる血中濃度近辺まで処方しないと投与効果が現れないという特徴を有しており、治療域と中毒域とが極めて近いため、薬物血中濃度モニタリングが必要項目(ＴＤＭ)に指定されている。
【０００３】
さらに詳しくは、常時、投薬患者の試料血漿内のリチウム濃度が0.6〜1.2 mEq/Lとなるように調節しなければ成らないが、これは血清中のリチウム濃度が0.6mEq以下で余り少なすぎると気分安定効果がなく、逆に、これが必要以上に投与され、その濃度が１.５ mEq/Lを超え、さらに過剰に投与されるとリチウム中毒を引き起こし、振戦、構語障害、眼振、腎障害、痙攣を含む重篤な副作用が現れる。もし潜在的にこれらの兆候が見られた際には、治療を中止し、血漿あるいは血清中のリチウム濃度を再測定し、リチウム中毒を緩和する措置を行わなければならない。
このように、リチウム塩の気分安定薬は鬱病、双極性障害、てんかん等の患者の治療等に効果があるものの、過剰投与の場合には重大な障害が生じるので、これをを投与する場合は、常に血清中のリチウム濃度を0.6〜1.2 mEq/Lになるように監視することが必須事項である。
【０００４】
このことから、従来、血清中のリチウムの定量測定が必要とされ、リチウムの比色測定を可能にさせる臨床検査用の液状試薬組成物の開発が進められている。
この先行技術として、特許文献１にはクリプタンドイノフォアを用いた生物学的検体中のリチウムの濃度を測定する試薬組成物が開示されている。
また、特許文献２には、ピロール環を持つ大環状化合物であって、ピロール環のβ位に８個の臭素(Ｂr)原子を結合させたリチウムイオンと反応する分析試薬が開示されている。
【０００５】
なお、非特許文献１として、テトラフェニルポルフィリンの炭素に結合している水素を全部フッ素に置き換えた化合物で、リチウムイオンの検出・分離ができることが開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開平７−１１３８０７号公報
【特許文献２】欧州特許１２８３９８６号公報(Ｂ１)
【特許文献３】特許５１００９０３号公報
【非特許文献１】分析化学 Vol.51,No.9,PP.803-807(2002)[Ｆ２８テトラフェニルポルフィリンの合成とリチウムイオンの分離・検出への応用]小柳健治・田端正明
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従来のリチウム試薬組成物がいくつか知られているが、その組成が毒劇物であったり、原薬が供給不安定で高価であり、ほとんどの原薬が水に溶解しないか、或いは水に溶解すると失活し発色せず、発色反応が遅い。
これらを克服したとされる特許文献２に開示された技術は、発色法を可能としているが、発色感度が大きすぎるため検体の希釈処理が必要であり、試薬組成物の仕様がｐＨ１１以上であるため空気中のＣＯ2により変質しやすく、測定データが不安定で、更に、ｐＨ１１以上となると、もはや水酸化ナトリウムや水酸化カリウムのような濃厚な水酸化物溶液しか使えないのでｐＨを一定に維持していくことができず、また、これらは劇物であるので使用者にとっても忌避的なもので取り扱いが厄介であることや、実際の保存には汎用ではなく専用容器が必要であり、これらの欠陥を補うため機械的設備が大型かつ専用機器が必要で汎用性に欠くといった問題点があった。このため、オンサイトモニタリング、ＰＯＣＴ(Point Of Care Testing)に適用させることが困難であるといった問題点もあった。
【０００８】
ところで、前述の特許文献１のリチウムの定量を目的とする試薬組成物は、本発明とは全く異なった化合物を使用しており、ｐＨ１２でしか使用できず、前述したように、ｐＨ１１以上となると、もはや水酸化ナトリウムや水酸化カリウムのような濃厚な水酸化物溶液しか使えず、これらは劇物であるので使用者にとっても取り扱いが厄介であり、更に、これらを補うために大型の専用機器が必要で、汎用性に欠くといった問題点があった。
また、非特許文献１である小柳らの論文は、Ｆ２８テトラフェニルポルフィリンを用いてリチウムイオンの分離・検出ができることが開示されているが、油性、且つ毒劇物であるクロロホルムを用いた溶媒抽出を行わなければ、リチウムの検出・分離はできなかった。何よりも、水溶液中のリチウムを煩雑な前処理なしに直接定量することはできず、特に、血清中のリチウムを迅速、且つ定量的に測定することはできないといった問題点があった。このように、Ｆ２８テトラフェニルポルフィリンを用いて水溶液中のリチウムの検出は難しく、定量的に濃度を測定することは困難で今までに実現されていなかった。
【０００９】
従来のリチウム試薬組成物は生化学自動分析機のような電源を必要とする大型の計測機器が必要であった。これらを克服するために本発明者らは特許文献３の技術を開発した。特許文献３は生体試料や環境試料等の水溶液中のリチウムの濃度(定量)を測定できるリチウム試薬組成物であり、常温、常圧下における用手法を基本とした比色計のような小型機器による測定や目視検出を可能としているが、これは単に同じ色調における濃淡度合により濃度レベルを検出しているため、意義のあるリチウム濃度範囲においては明瞭さに欠け、例えば、朱色と赤色のような赤色濃淡による比較であり、リチウム中毒が疑われる患者例えば、救急搬送患者等の緊急検査、即ち機器を用いない迅速検査に対して適用するには検出明瞭さの点で問題があった。
本発明は、上述した問題点に鑑みてなされたもので、尿、血清、血漿、血液等の生体試料や環境試料等の水溶液を被検体とし、リチウム試薬組成物を発色反応試液とし、目視或いは簡単な比色計でリチウム濃度を測定・検査でき、特に医療現場での緊急検査においても明瞭、且つ簡便迅速なリチウム検出・測定・検査方法を提供しようとするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記課題を解決するために、請求項１の発明は、テトラフェニルポルフィリンの炭素に結合している水素を全部フッ素に置き換えた構造式
【化１】
2014095567.tif 000002
で表される化合物と、ｐＨ調節剤及びｐＨ緩衝剤とを包含する水溶液であることを特徴とするリチウム試薬組成物と被検体を接解し、その反応液に白色光を照射、または露光させ、それにより生じた明瞭な色調の変化を目視により検出、又は比色計によりその感度を検出することを特徴とするリチウム測定方法である。
請求項２の発明は、前記発色の色調が、リチウム錯体が存在しない場合は緑色であり、リチウム錯体の量が増えるに従い黄色から橙色を経て赤色に変化することを特徴とする請求項１に記載のリチウム測定方法である。
請求項３の発明は、前記の色調の変化が、リチウム濃度が０.０mＭから４.５mＭの範囲で起こることを特徴とする請求項２に記載のリチウム測定方法である。
請求項４の発明は、前記被検体が、尿、血清、血漿、血液等の生体試料又は血漿試験試料であることを特徴とする請求項１乃至３に記載から選択されるリチウム測定方法である。
請求項５の発明は、前記被検体が、環境試料であることを特徴とする請求項１乃至３に記載から選択されるリチウム測定方法である
【００１１】
すなわち、本発明のリチウム試薬組成物はテトラフェニルポルフィリンの炭素に結合している水素を全部フッ素に置き換えた前記構造式で表される化合物をキレート剤とし、水に混合し得る有機溶剤と、ｐＨ調節剤とを包含した水溶液として構成され、血清、血漿などを含む血液由来の試料、尿、細胞抽出液等の生物学的試料、環境試料等を検体として、これと接解し、検体中のリチウムイオンとキレート呈色錯体を生成させることでリチウム濃度依存的に黄色から赤色の呈色に至らしめる。さらにこの反応検液に所定の光量を照射、露光して未反応のキレート配位子の光化学互変異体を出現させ、その濃度依存的に緑色の呈色に至らしめることを原理とするもので、この結果として、被検液中のリチウム濃度が０.０mＭから４.５mＭの範囲では、明瞭に緑色から黄色を経て赤へ呈色変化が生じ、このときの明瞭な色調変化を目視による検出、又は比色計で簡便に検出し、血清及び血漿試験試料のような水溶液を被検体とすることを特徴とするリチウム測定方法である。
【発明の効果】
【００１２】
本発明のリチウム測定方法によれば、前記のテトラフェニルポルフィリンの炭素に結合している水素を全部フッ素に置き換えた構造式である化合物Ｆ２８テトラフェニルポルフィリンと、ｐＨ調節剤及びｐＨ緩衝剤とを包含する水溶液であることを特徴とするリチウム試薬組成物と被検体を接解し、その反応液に白色光(反応すれば単色光でもよい)を照射、または露光させると、被検体中のリチウム濃度が０.０mＭから４.５mＭの範囲において、その反応液がリチウム濃度依存的に鮮やかな緑色から黄色を経て赤へ呈色変化をすることを見出し、この変化を目視又は比色計で読み取ることにより、被検体を混入した水溶液に含まれるリチウム濃度が測定できる。
即ち、前述したように、発色が鮮やかであるので、目視で生体試料である血清検体のリチウム濃度を迅速に検出あるいは判定でき、普及型の分光光度計で生体試料である血清検体のリチウム濃度を迅速に定量でき、その情報を例えばＴＤＭ治療の管理指標とすることもできる。また、臨床化学自動分析装置への応用で多検体を短時間で定量分析することもできる。
従って、従来のリチウム濃度の測定には大型の専用機器を必要としていたが、本発明の測定方法により、尿、血清、血漿、血液等の生体試料や環境試料等の水溶液を被検体とリチウム試薬組成物を発色反応試液とすることで、その色調を目視により検出、あるいは簡単な携帯型比色計でリチウム濃度を計測することができ、特に、医療現場での緊急検査では被検体として血清を採取した直後、簡便迅速にリチウム濃度を判定することが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明のＦ２８テトラフェニルポルフィリンの適量濃度の参考計算表の図である。
【図２】本発明に実施例１の紫外−可視分光光度計での実験結果のグラフ、
【図３】本発明に実施例１での測光波長別のリチウム濃度検量線のグラフの図、
【図４】本発明に実施例１でのＦ２８テトラフェニルポルフィリン−リチウム錯体生成のスペクトル変化(発色反応)のグラフ、
【図５】本発明に実施例１の血清試料測定値と原子吸光法（従来法）測定値との相関試験結果のグラフ、
【図６】本発明に管理血清を試料とした自動分析装置による測定値の比較の[表１]、
【図７】本発明での副波長補正による容血ヘモグロビンによる測定値への影響を表す[表２]
【図８】先行技術での目視によるリチウム濃度判定の[表３]、
【図９】本発明での目視によるリチウム濃度判定の[表４]、
【図１０】本発明での検体に白色光を照射する装置の概略図、
【図１１】本発明の光化学互変異性化反応の完結時間における照度の影響のグラフ、
【図１２】Ｆ２８テトラフェニルポルフィリン由来の光化学互異性体の電子吸収スペクトルのグラフ、
【図１３】Ｆ２８テトラフェニルポルフィリン錯体への光照射後の電子吸収スペクトルのグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明者らは、血清及び血漿中のリチウム濃度をより簡単に定量測定できるリチウム試薬組成物を鋭意研究し、前掲の非特許文献１で製法が開示された、ピロール環を持つ大環状化合物を用い、テトラフェニルポルフィリンの炭素に結合している水素を全部フッ素に置き換えてフッ素を２８個とした下記の構造式(以下、Ｆ２８テトラフェニルポルフィリンと称す)に着目して、本発明の測定方法に使用するリチウム試薬組成物に想到した。
【化１】
2014095567.tif 000003
【００１５】
ピロール環を持つ大環状化合物を利用したリチウム試薬組成物として前掲特許文献２に、ピロール環を持つ大環状化合物であってピロール環のβ位に８個の臭素(Ｂr)原子を結合させ、リチウムイオンと反応する分析試薬が開発されているが、ｐＨ１１以上のアルカリ性でなければリチウムイオンと反応しづらい。一方、前掲特許文献３にあるＦ２８テトラフェニルポルフィリンであれば、ｐＨ５からｐＨ１２でも反応するので、本発明の測定方法で使用するリチウム試薬組成物は、このＦ２８テトラフェニルポルフィリンをキレート剤として、水溶液系でのリチウムイオンの定量測定に使用でき、また、目視でも明確に判定できるようにしたものであり、先ず、このリチウム定量測定試薬組成物について説明する。
【００１６】
生体試料や環境試料等の水溶液中のリチウムイオンが前記リチウム試薬組成物、特にテトラフェニルポルフィリンの炭素に結合している水素を全部フッ素に置き換えた化合物がキレート剤(発色剤)となってリチウムキレート発色錯体を形成し、所定の輝度の白色光を照射、または露光させることにより、未反応のキレート配位子のみを光化学互変異性体としての構造異性体に変化せしめる。この結果、被検体中のリチウム濃度において、０.５ mＥq/L（= mol/L）以下では緑色、０.５ mＥq/Lから１.５ meq/Lでは黄色、１.５ mＥq/L以上では赤色を呈した。この呈色変化は管理域、中毒域における閾値レベルに都合よく合致しており、目視並びに比色により明瞭に検出できる。
本発明で使用する検体では、上記のリチウム試薬組成物中の、F２８テトラフェニルポルフィリンの濃度を０.１〜１.０g/Lとし、好ましくは、０.５g/Lとすれば管理域と中毒域に相当するリチウム濃度を判別する場合に最適であることも見出した。
【００１７】
本発明のｐＨ調節剤について、それが、ｐＨ５.０未満の酸性側では、本発明の発色剤(キレート剤)であるＦ２８テトラフェニルポルフィリン化合物とリチウムイオンは結合しないため、呈色変化が起こらず、リチウムの定量は困難である。また、ｐＨが５〜７の間では前記発色剤とリチウムイオンは特異的に反応するが、発色速度が緩やかである。
一方、ｐＨ８〜１１では前記発色剤とリチウムイオンは速やかに反応し、且つ安定な発色錯体を得られる。ｐＨ１１を越えるアルカリ性側では、前記キレート剤、生成した発色錯体の色調の経時的な安定性が悪い。これは、空気中の二酸化炭素を吸収することによるｐＨの変動が生じやすいことに起因する。したがって、リチウム試薬組成物のｐＨ調節剤としてはｐＨを７から１２の範囲とするｐＨ調節剤、或いはｐＨ調節剤としてのｐＨ緩衝剤が必要であり、より好ましくは、ｐＨ８〜１１となるようなｐＨ調節剤、ｐＨ緩衝剤の使用が必要である。
前記ｐＨ調節剤は、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニアを含むアルカリ剤、酢酸、リン酸、くえん酸、炭酸、重炭酸、しゅう酸、塩酸、硝酸を含む酸剤、及び、これらの塩類から選択されるものを使用し、前記ｐＨ調節剤はｐＨ緩衝剤でもよく、クエン酸、炭酸、重炭酸、りん酸、コハク酸、フタル酸、塩化アンモニウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、Goodの緩衝剤としてMES、Bis-Tris、ADA、PIPES、ACES、MOPSO、BES、MOPS、TES、HEPES、DIPSO、TAPSO、POPSO、HEPPSO、EPPS、Tricine、Bicine、TAPS、CHES、CAPSO、CAPS、及び、これらの塩類から選択されるものを使用する。
これらの含有によって前記リチウム試薬組成物は、ｐＨ５からｐＨ１２の範囲でリチウムに対して、特異的な発色反応が可能である。
【００１８】
本発明のリチウム試薬組成物に包含させる溶剤は、水に混合し得る有機溶剤（極性溶媒）であることが必須であるが、被検体である血清、血漿、または細胞由来の溶出液等の水溶液と均一に混合できれば、有機溶媒を主とした溶液であっても、或いは、有機溶媒が添加された水溶液であってもよい。これは、汎用型の自動分析装置、紫外可視分光光度計により検体中のリチウム濃度を測定する場合はその被検体が水溶液であるため、その試薬組成物も同様に水溶液であることが望ましいからである。
前記有機溶剤は、水に混合し得る有機溶剤（極性溶媒）であればよく、ジメチルスルホキシド（DMSO）、ジメチルホルムアミド（DMF）、ジメチルアセトアミド(ＤＭＡ)等から選択される。
【００１９】
本発明で使用する試薬組成物において、実際の製品では安定剤を混入させるが、本発明では安定剤として界面活性剤を使用している。この界面活性剤はＦ２８テトラフェニルポルフィリンの分散性を高め、さらに、発色反応時における試料由来の懸濁を防止させる作用があるので、これらの作用を得るために安定剤を混入することが必要である。
これらの安定剤は、非イオン性界面活性剤又は陰イオン性界面活性剤であり、非イオン性界面活性剤は、ソルビタン脂肪酸エステル、ペンタエリスリトール脂肪酸部分エステル、プロピレングリコールモノ脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸モノエステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール、ポリオキシエチレン脂肪酸部分エステル、ポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸部分エステル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、脂肪酸ジエタノールアミド、脂肪酸モノエタノールアミド、ポリオキシエチレン脂肪酸アミド、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル(商標登録：TritonX-100 ) 、p−ノニルフェノキシポリグリシドール及び、これらの塩類から選択されるものを使用する。
好ましい非イオン性界面活性剤としては、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル(Triton X-100(登録商標)等) 、p-ノニルフェノキシポリグリシドールなどである。
【００２０】
また、安定剤としての陰イオン性界面活性剤は、アルキル硫酸エステル塩、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸エステル塩、ポリオキシエチレンフェニルエーテル硫酸エステル塩、アルキルベンゼンスルホン酸塩、アルカンスルホン酸塩等がある。代表的なものとして、ドデシル硫酸ナトリウム、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル硫酸エステルナトリウム及び、これらの塩類から選択されるものを使用する。
【００２１】
本発明のリチウム試薬組成物は、試料中に共存するリチウムイオン以外のイオンによりリチウム濃度の測定が妨害されるのを回避し、或いは試薬組成物の酸化を抑制し、その保存安定性を付与するためにマスキング剤を1種類、あるいは複数の種類を含有させてもよい。もっとも、リチウム以外のイオンが少ないのであれば、必ずしも包含する必要がない。
これらリチウム試薬組成物に加えるマスキング剤としては、トリエタノールアミン、エチレンジアミン、N,N,N',N'-テトラキス(2-ピリジルメチル)エチレンジアミン（TPEN）、ピリジン、２,２-ビピリジン、プロピレンジアミン、 ジエチレントリアミン、ジエチレントリアミン−N,N,N',N",N"-五酢酸（DTPA）、トリエチレンテトラアミン、トリエチレンテトラミン-N,N,N',N",N"',N"'-六酢酸（TTHA）、１,１０-フェナントロリン、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）、O,O'-ビス(2-アミノフェニル)エチレングリコール-N,N,N',N'-四酢酸（BAPTA）、N,N-ビス(2-ハイドロキシエチル)グリシン（Glycine）、トランス-1,2-ジアミノシクロヘキサン-N,N,N',N'-四酢酸（CyDTA）、O,O'-ビス(2-アミノエチル)エチレングリコール-N,N,N',N'-四酢酸（EGTA）、N-(2-ハイドロキシル)イミノ二酢酸（HIDA）、イミノ二酢酸（IDA）、ニトリロ三酢酸（NTA）、 ニトリロトリスメチルりん酸（NTPO）及び、これらの塩類から選択されるものを使用する。好ましくは、トリエタノールアミンが最適である。
【００２２】
本発明のリチウム試薬組成物は、微生物による劣化を防ぐために防腐剤を包含しても良い。防腐剤は特に限定されず、例えばアジ化ナトリウム、Ｐrocline(登録商標)等を使用することができる。防腐剤の濃度も特に限定されず、アジ化ナトリウムを使用する場合、一般的に防腐剤として用いられる濃度、例えば反応溶液に対し０.１重量％程度でよい。もっとも、長期保存を目的とした製品とする場合は、防腐剤が処方されるのが普通である。
【００２３】
また、リチウム試薬組成物の機能を長期保存可能にするために、本発明のリチウム試薬組成物の組成のうち、前記ｐＨ調節剤と、前記マスキング剤を第一試薬とし、
前記テトラフェニルポルフィリンの炭素に結合している水素を全部フッ素に置き換えた構造式
【化１】
2014095567.tif 000004
で表される化合物と、前記水に混合し得る有機溶剤と前記ｐＨ調節剤と、前記マスキング剤を第二試薬とし、これら両試薬をセパレートにして保存し、測定直前に両試薬を混合してリチウム試薬組成物として使用するリチウム測定試薬キットとすることができる。
【００２４】
本発明の測定方法に使用するリチウム試薬組成物はテトラフェニルポルフィリンの炭素に結合している水素を全部フッ素に置き換えた前記構造式で表される化合物をキレート剤とし、水に混合し得る有機溶剤と、ｐＨ調節剤とを包含した水溶液であり、血清及び血漿試験試料のリチウムイオンと接触せしめることによって生成したリチウム錯体による色調の変化が出現するが、これに所定の光量の光を照射すると、更に、リチウムイオンとは未反応のＦ２８テトラフェニルポルフィリンが鮮やかな緑色に変化し、一方、Ｆ２８ポルフィリンとリチウムイオンとの発色錯体は赤色のまま変化しない。その結果、リチウム濃度が０.０mＭから４.５mＭの範囲では鮮やかな緑色から黄色を経て赤へと呈色変化が生じることの発見を原理するもので、このときの明瞭な色調変化を目視による検出、又は比色計で簡便に検出し、血清及び血漿試験試料を混入した水溶液を被検体とすることを特徴とするリチウム測定方法である。  
なお、目視によるリチウム測定方法によらず、リチウム試薬組成物によるリチウム錯体の吸光度、及びそのスペクトルを測定してもよく、同様に濃度既知のリチウム標準試料のそれを基準濃度として未知試料の定量値を算出することも可能で、特に、リチウム錯体の発色、及びそのスペクトルにおいて、波長550nm、或いはその近傍の波長530nmから560nmの波長帯を測定波長としてその感度を測定し、又は、波長570nm、或いはその近傍の波長565nmから650nmの波長帯の感度を測定してリチウムの濃度を算出することも可能である。
【００２５】
上記の先行技術の波長の測定方法では、血清及び血漿試験試料を前述したリチウム試薬組成物と接解し、リチウム錯体の発色、及びその吸光度、或いはそのスペクトルを測定して、そのスペクトルにおいて波長550nm、或いはその近傍の波長530nmから560nmの波長帯を測定波長としてその感度を測定し、又は、波長570nm、或いはその近傍の波長565nmから650nmの波長帯の感度を測定してリチウムの定量値を算出することが好ましい。
上述した波長550nm、或いは、その近傍の波長530nmから560nmの波長帯はソーレー帯（波長400nmから500nmの極大吸収を生じる波長帯）を測光波長とした場合よりも検量線の直線性が良好であるので、簡単な比色計や分光光度計での濃度の演算が容易であり、色調が黄色から赤色に鮮やかに変化するので、目視による濃度レベル判定も可能である。従って、従来のリチウム濃度の測定には大型の専用機器を必要としていたが、携帯型比色計や汎用されている紫外可視分光光度計でリチウム濃度を計測することができ、ＰＯＣＴ（Point Of Care Testing）キットとして構成することもできる。
【００２６】
次に、実際に本発明に使用するリチウム試薬組成物の実施例１を説明する。
[ 実施例１(リチウム試薬組成試料１)]
本発明の使用するリチウム試薬組成物は、ｐＨ緩衝液としての第１試薬を作製し、発色試液として第２試薬を作製し、測定直前に両液を混合してリチウム試薬組成物を作製した。これは、両液を最初から作製しておいても良いが、長時間の保存により試薬が劣化することを避けるためである。
ここで、試薬組成物の作製方法を説明する。
先ず、主に、ｐＨ緩衝液としての第１試薬を作製するが、その組成は次のとおりである。
【００２７】
[ 実施例1(リチウム試薬組成試料１）]
（１）第一試薬（安定剤・緩衝液として）
キレート剤：なし
有機溶剤：なし
安定剤(分散剤：非イオン性界面活性剤）：
TritonX-100(登録商標)
(ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル)       １.０ 重量％
マスキング剤：トリエタノールアミン                     １０ ｍＭ
以上に、７重量％の塩化アンモニウムを加えてｐＨ１０に調節し精製水で１Lとして汎用の保存容器に保管した。
なお、TritonX-100(登録商標)(ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル)を１.０重量％としたが、少なすぎると測定時に希に濁りが発生したり、多すぎると、反応容器内で泡が発生したり、両因とも再現性に影響する可能性があるため０.１〜５.０重量％の範囲がよく、好ましくは、１.０ 重量％である。
また、マスキング剤はトリエタノールアミンを１０ｍＭ)としたが、少なすぎるとリチウムイオン以外の夾雑イオンが過剰に含まれた試料においてそのマスキング効果が低下したり、多すぎるとリチウムイオン自体をマスキングしてしまったり、測定誤差の原因になり得るため、１.０〜１００ｍＭの範囲が良く、好ましくは、１０ｍＭである
【００２８】
次に、主に、発色試液としての第２試薬を作製するが、その組成は次のとおりである。
（２）第二試薬（発色試液として）
キレート剤：Ｆ２８テトラフェニルポルフィリン         ０.５ g/L
有機溶剤：ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）           ２０ 重量％
安定剤(分散剤：非イオン性界面活性剤）：TritonX-100(登録商標)
(ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル)       １.０ 重量％
マスキング剤：トリエタノールアミン                   １０ｍＭ
これに、０.０５Ｍ(mol/L)になるようにＭＯＰＳ(Good緩衝剤)を加えｐＨ７.０に調節し、精製水で１Lとして汎用の保存容器に保管した。
【００２９】
ところで、臨床検査での血清中のリチウム定量において、その濃度が広くは０.６ ｍＭ〜３ ｍＭの範囲での正確さが求められている。本発明の実施例１では、上記のリチウムの濃度範囲においては、Ｆ２８テトラフェニルポルフィリンの化合物の濃度を、０.１〜１.０g/Lとすれば、好ましくは、０.５g/Lとすれば正確に測定できることも見出した。
リチウム濃度が０.６ｍＭ〜３ｍＭの範囲では、Ｆ２８テトラフェニルポルフィリンを最終的な試薬組成物での濃度を１Ｌ当たり０.１〜１.０g/Lの範囲で測定可能で、好ましくは０.５ g/Lが良い。少なすぎるとＦ２８テトラフェニルポルフィリンとリチウムイオンとの反応が十分に起こらず、多すぎると、Ｆ２８テトラフェニルポルフィリン由来のブランクの吸光度が増加してしまうといった不都合が生じるため、好ましくは０.５ g/Lである。 
この点を、更に詳しく説明すると、Ｆ２８テトラフェニルポルフィリンとリチウムイオンはモル比で１：１のキレート錯体を形成する反応である。ここで、検体中のリチウム濃度が３ｍＭ含まれた検体を、本試薬組成物を用いた実施例１の条件で反応させる場合は、その反応系でのリチウム濃度は約０.０２ ｍＭとなる。従って、１:１で反応するＦ２８テトラフェニルポルフィリン濃度も反応系内で０.０２ｍＭ 以上存在していないと、検体中のリチウムを過不足なく反応させることができない。
【００３０】
一般に、キレート剤と金属イオンとの錯体形成反応（発色反応）は被反応物質（リチウム）に対して等倍〜１０倍のモル濃度のキレート剤（Ｆ２８テトラフェニルポルフィリン）が必要とされており、図１のＦ２８テトラフェニルポルフィリンの適量濃度の参考計算表の図に示すように、反応時のＦ２８テトラフェニルポルフィリンの濃度を等倍から１０倍となるように試薬組成物を構成することになるが、現実的に試薬組成物の添加量、検体量のいわゆる測定反応時の用量におけるパラメータは、その測光機種や目的とする閾値により若干の差があるため、その試薬組成物でのキレート剤濃度は等倍である０.１g/Lよりも５倍量である０.５g/Lの方がより広い測定条件に耐えうる。例えば、検体量の微量化技術が低い機種での測定の場合、検体量を実施例１のそれらに対して２倍〜５倍程度増量することが予想されるので、あらかじめ５倍量としての試薬組成物を０.５g/Lとしておけば不足はない。一方、キレート剤をモル比で１０倍以上仕込んでも発色反応に与える速度論的な有意性はなく、試薬ブランク値の増大が懸念されるのみであり、これを採用する利点はない。
以上のように、キレート剤とリチウムとの反応モル比の条件さえ達成できればよいので、例えば、第二試薬のキレート剤（Ｆ２８テトラフェニルポルフィリン）の濃度を１.０ g/Lとした場合は反応時の第二試薬添加量を半量にすることができる。あるいは、その検体量を半減させた場合は同様にキレート剤濃度を半分量とすることもできる。
このように、本実施例１では、Ｆ２８テトラフェニルポルフィリンを０.５ g/Lとしたが、反応モル量を満たし、且つ試薬ブランク値を最小限にすることを考慮した結果、０.１〜１.０ g/Lの範囲が最適である。
【００３１】
また、ジメチルスルホキシド(ＤＭＳＯ）は５〜３０重量％としたが、少なすぎるとＦ２８テトラフェニルポルフィリンの溶液中での分散性が低下し、多すぎると試薬組成物中における有機溶媒の割合が増加してしまうため、好ましくは、２０ 重量％である。ただし、溶剤としてのＤＭＳＯ濃度を低減させたい場合は１０重量％以下としても全く差支えない。
ここで、本実施例１でのＦ２８テトラフェニルポルフィリンは、テトラフェニルポルフィリンの炭素に結合している水素を全部フッ素に置き換えた下記に示すような構造式である。
【化１】
2014095567.tif 000005
【００３２】
（３）上記の第一試薬と第二試薬を混合したリチウム試薬でのリチウム濃度既知試料を用いた検量線の作成を説明する。
実施例１では、試料６μLに第一試薬（緩衝液）７２０μL、第二試薬（発色試液）２４０μLを加えた。この場合に第一試薬はｐＨ１０における緩衝能があり、試験時の第一試薬、第二試薬、試料を混合した時の試験液のｐＨはほぼｐＨ＝１０となる。
このように、キレート剤としてＦ２８テトラフェニルポルフィリンを使用することにより、ｐＨ５〜１０の範囲で発色反応を達成することができるため、ｐＨ１２以下の強いｐＨ緩衝作用をもつリチウム測定試薬を構成するので、空気中のＣＯ2の吸収によるｐＨ変動を減らすことができ、結果として測定値への悪影響を回避することができる。また、これにより汎用の容器に保存可能となった。
なお、第一試薬と第二試薬は使用直前に同じ割合で混合し、混合液を試料に同様の容量で添加してもよく、この場合は、試料６μLに混合液９４０μLを加えて測定対象の試験液としてもよい。
【００３３】
この混合試薬に試料を加えたｐＨ１０の試験液を、常温で１０分間反応後、紫外−可視分光光度計（日立U-3900形）を用いて試薬ブランクを対照として550nmの吸光度を測定した。その結果を図２のＬｉ濃度mg/dLと吸光度のグラフ、及び、図４のＦ２８テトラフェニルポルフィリン−リチウム錯体生成における可視部のスペクトル変化のグラフである。
テトラフェニルポルフィリン金属錯体に典型的なソーレー帯（380nmから460nm近傍）と呼ばれる最大感度が得られる波長ではなく、血清検体中リチウム濃度範囲に対して最適な感度が得られる波長550nm、或いは、その近傍の波長530nmから560nmの波長帯を測光波長とすることにより、希釈操作、或いは希釈装置等の煩雑な操作、それに伴う付帯設備が不必要となる。
さらに、図３のＬｉ濃度mg/dLと吸光度のグラフ(光波長*405nm,×415nm,●550nm)に示すように、上述した波長550nm、或いは、その近傍の波長530nmから560nmの波長帯はソーレー帯を測光波長とした場合よりも検量線の直線性が良好であるので、簡単な比色計や分光光度計での濃度の演算が容易であり、色調が黄色から赤色に鮮やかに変化するので、目視による濃度レベル判定も可能である。従って、従来のリチウム濃度の測定には大型の専用機器を必要としていたが、本発明により携帯型比色計や汎用されている紫外可視分光光度計でリチウム濃度を計測することができ、ＰＯＣＴキットとして構成することもできる。
ただし、図３のグラフでは、波長●550nmは実施例１そのもの、ソーレー帯の測光波長である*405nm,×415nmは、実施例１と同様に第１試薬、第２試薬を添加したが、感度が高すぎるため、試料を５倍に希釈して測定反応を実施し、405nmと415nmの波長を使用した。図３のグラフから判るように、405nmと415nmの波長の検量線は直線にはならないが、本実施例の550nmを測光波長とした場合は、直線性が良好な検量線が得られる。
【００３４】
また、図４に示すＦ２８テトラフェニルポルフィリン−リチウム錯体生成のスペクトル変化のグラフのように、リチウムの濃度０.６mg/dL、１.２mg/dL、１.８mg/dL、２.４mg/dL、３.０mg/dLと吸光度が直線的に増加していることが、かなり明瞭に確認できる。リチウム濃度に比例して、ポルフィリン-金属錯体に典型的な415nm（ソーレー帯）のピークと、図中に示される550nmの吸収ピークが増大し、570nmの吸収ピークが減少するので、いずれも測光波長として吸光度差を求めることが可能であるが、上述したように直線性が良好な検量線が得られることから550nmを測光波長とすることが好ましい。
もっとも、本実施例１では550nmの吸光度としたが、波長540nmから560nmの波長帯を測光範囲としても良い。これは、測定機器によっては550nmの測光フィルターがない場合があり、この場合はその近傍として感度が生じている540nmとか560nmとかを測光波長に設定すればよい。図４の実施例１でのリチウム濃度による吸光度のグラフに示すように、570nmの感度の減少もリチウム濃度に対して定量的なので、これも試薬ブランクを対照として吸光度差（ΔAbs）を求めることが可能で、測光波長として利用できる。
更に、稀に患者検体の試料によっては、波長550nmに干渉する夾雑物質が生じ、550nm波長ではデータに誤差を生じてしまう場合は、それを回避するため波長570nm、或いはその近傍の565nmから650nmの範囲から測光波長を選択し、感度の減少を吸光度差として用いてリチウム濃度を算出してもよい。
【００３５】
また、上記のリチウム濃度測定方法による誤差の補正、及び修正方法の１つを説明する。
溶血している血清等の検体においては妨害因子としてヘモグロビン由来の540nm付近、560nmから650nm付近の二つの吸収ピーク（各々、βバンド、αバンド）が生じることが一般的に知られているが、このようなヘモグロビンを高濃度に含む検体と本発明の試薬組成物とを接解させた場合、本発明の測光波長である550nmとヘモグロビンのβ、αバンド由来の540nmの吸収が重複するため、実際の測定値に対して正の誤差が生じることが判った。
すなわち、（リチウム・Ｆ２８テトラフェニルポルフィリン錯体由来の550nmの感度）＋（ヘモグロビン由来550nmの感度）＝ 550nmの測定感度（∴ヘモグロビン由来の正の誤差が生じる。）
ここで、本発明では、ヘモグロビンの550nmと600nmの二つの感度比がほぼ同一であることに注目した。即ち、ヘモグロビンの550nmの感度＝ヘモグロビンの600nmの感度であることに注目し、ヘモグロビンの550nmの感度を600nmの感度で相殺することができることに想到した。
したがって、550nmの感度 ＝ リチウム・F28テトラフェニルポルフィリン錯体の550nm感度 ＋ ヘモグロビンの550nm感度 − ヘモグロビンの600nm感度  とすれば、ヘモグロビン由来の550nmの感度を相殺して、より正しい550nmの感度を得ることができる。
【００３６】
以下の実験結果から、本発明の実施例１のリチウム試薬でほぼ正確にリチウム濃度を測定できることを説明する。
[紫外-可視分光光度計（日立U-3900形）での実験結果]
図２のグラフは、紫外-可視分光光度計（日立U-3900形）での測定試験結果である。横軸Ｘに予め調剤した既知のリチウム濃度(Ｌi濃度mg/dL)、縦軸Ｙは紫外可視分光光度計による550nmの吸光度差をプロットし、直線回帰した結果である。
この図２のグラフから判ることは、得られた吸光度はリチウム濃度に比例し、直線性良好な検量線が描かれることである。
【００３７】
[血清を試料とした場合の原子吸光法（従来法）と本発明による方法との相関試験結果]
図５のグラフは、図２に説明した実施例１での測定法、同じ血清を試料とした従来の原子吸光法（従来法）でのリチウム濃度測定値との相関試験結果である。縦軸Ｙは本発明によるリチウム濃度測定値で、横軸Ｘは原子吸光法（従来法）によるリチウム濃度測定値であるが、図２に示す回帰線から両測定値は95％以上の良好な相関を示した。従って、同じ血清試料に対し本発明の試薬組成物による紫外−可視吸光光度定量法でも、正しく血清試料中のリチウムを定量できていることが示された。
【００３８】
[管理血清を試料とした自動分析による測定値の比較]
リチウム濃度が値付けされた管理血清としてプレチノルムU(PrecinormU)(ロシュ製）、プレチパスU(PrecipathU)(ロシュ製）、パソノルムH(PathonormH)(SERO AS製）、オートノルム(Auto norm)(SERO AS製）を試料として生化学自動分析装置（日立H-7700形）にて546nm（550nmに近い波長で本機に実装されている波長）を測光波長として1ポイントエンド法により測定した。
（装置パラメータ）
試薬：0.24 mL
試料：0.005 mL
測光波長（主/副）：546 nm / 700 nm
測光時間：10  分
温度：37℃
1ポイントエンド・増加法
上記の設定条件での実験結果を図６の[表１]に示すが、本発明の実施例での測定値が、保証値に対して良好に一致しており、臨床検査用自動分析装置でも血清中リチウムを十分に測定できることが判る。
以上は、第一試薬と第二試薬を混合したリチウム試薬の２液型の実施例で説明したが、後述するマイクロプレートリーダーによるリチウム測定方法と、目視によるリチウム検出法においては、両者とも９６穴ウエルを試料容器として用いるため、実施例１を基本とした組成の１液型試料として、実施例２(リチウム試薬組成試料２)を調製して実験した。
なお、念のため実施例１のリチウム試薬組成試料１においても、被検体の分量を調製し、後述する実施例２と同じ目視によるリチウム検出方法を実験したが、白色光を照射すると、被検体中のリチウム濃度において、０.５ mEq/L（＝ mol/L）以下では緑色、０.５ meq/Lから１.５ mEq/Lでは黄色、１.５ mEq/L以上では赤色を呈した。この呈色変化は管理域、中毒域における閾値レベルに都合よく合致しており、目視又は比色計により明瞭に検出でき、ほぼ同じ結果が得られた。詳細は実施例２と同じであるで説明は省略する。
【００３９】
[ 実施例２(リチウム試薬組成試料２）]
ここで、実施例２を説明するが、本実施例２の組成は実施例１と実質的に同じであるが、実施例２は、実施例１の２液型ではなく、発色液を１液型として構成しているが、これは以下の理由による。
マイクロプレートリーダー用の９６穴ウエルに分注する場合に、１液の場合では、試料と発色液のみの操作で容易に済むが、２液の場合では、試料、第１試薬、第２試薬の３種を容量の小さいウエル上で混合する操作が必要である。実施例１のような容量の大きな１mLサイズの分光光度計用のキュベット容器を使用する場合は、この操作は容易であるが、９６穴ウエルの場合はこの操作が煩雑になりやすいため、本実施例２では操作がより簡便な１液型を採用した。また、このときの試薬組成はウエルの材質であるポリスチレン樹脂に悪影響を与えないようにするため、界面活性剤、ｐＨ緩衝剤を前述のように選択したものである。
図７の[表２]には、前述したように、リチウム濃度測定方法による誤差の補正、及び修正方法を採用し、実際にマイクロプレートリーダー（CORONA SH1200形）による、溶血における干渉試験の結果を示す。使用した試薬組成物、試験方法は以下の通りである。
[ 実施例２(リチウム試薬組成試料２）]
（１）発色試薬 （リチウム試薬組成物２）
キレート剤：  Ｆ２８テトラフェニルポルフィリン  ０.１７g/L
有機溶剤：ジメチルスルホキシド（DMSO）      ５重量％
安定剤（分散剤）：  ドデシル硫酸ナトリウム    １ 重量％
Triton X-100    １重量％
マスキング剤：トリエタノールアミン  １０ g/L
エチレンジアミン四酢酸二カリウム  ０.５ g/L
これに所定のｐＨ１０になるようにｐＨ緩衝剤、及びｐＨ調節剤を加え、精製水で1Lとして汎用の保存容器に保管した。
（２）試  料
１.５ mMのリチウムを含むベース血清に所定濃度の溶血ヘモグロビンとして干渉チェックＡ＋（登録商標, シスメックス製）を添加し、溶血試料を調製した。
上記の試料４μLに発色試薬２４０μLを加え、５分間反応させ、主波長550 nm、副波長600 nmとし、その吸光度をマイクロプレートリーダー（CORONA SH-1200形）で観測し標準物質の吸光度を基準にリチウム濃度を算出した。
上述したように、測光波長を550nmのみで測定した場合、溶血検体ではヘモグロビンの550nmが測定値に正の妨害を与えることから、補正方法として、550nmと600nmの二波長を測定し、550nm−600 nm として演算すると、互いに相殺され、溶血の影響がない。自動分析法の場合は、主波長550nm、副波長600 nmとパラメーターを入力すれば良い。
この図７の[表２]から判ることは、ヘモグロビンが１０００mg/dLでは、補正したものが１０２％と僅か２％の誤差であるものが、補正しないと１２５％と２５％の誤差が生じており、この本発明に開示したリチウム濃度測定方法の補正手段が極めて有効な補正方法である。
【００４０】
[目視によるリチウム検出方法」
ここで、本発明の目視によるリチウム濃度の測定方法及び検査方法について説明する。
まず、本発明者らによる前掲の特許文献３に開示した先行技術である試験液を目視により観察した結果を図８の[表３]に示す。
前記リチウム試薬組成試料２を発色試薬として、試料４μLに発色試薬２４０μLを加え、５分間反応させ、常温で５分間反応後、その呈色を目視により観測した。試料は色調見本として所定濃度のリチウム標準液、濃度レベル別の管理血清を用いて比較した。
各、濃度域において黄色から赤へ呈色変化が確認され、管理血清の呈色は色調見本とも良い一致を示す。特別な装置を用いなくても迅速かつ簡便に血清中のリチウム濃度を判定できることが判る。
ただし、黄色から赤への呈色変化なので、管理域であるオートノルム１ｍＭの黄色、及び、危険域である模擬血清３.５ｍＭの赤色では、２５人による判定者の正解率は１００％であるが、準中毒域のパソノルムＨの１.６ｍＭ、及び、中毒域のプレチノルムＵの２.５ｍＭでの正解率は５２％と若干劣る。
【００４１】
そこで、本発明者らは、改良を重ねて本発明に想到した。
この発明の実施例は、前記先行技術で得た被検体（：試薬組成物と試料を混合した測定検体）に所定の輝度の白色光を照射、または露光させることにより、リチウムイオンと未反応のF28テトラフェニルポルフィリンのみを光化学互変異性体として構造異性体に変化せしめ、この結果、被検体中のリチウム濃度において、０.５ mEq/L（= mol/L）以下では緑色、０.５ meq/Lから１.５ mEq/Lでは黄色、１.５ mEq/L以上では赤色を呈した。この呈色変化は管理域、中毒域における閾値レベルに都合よく合致しており、目視又は比色計により明瞭に検出できることを見出した。
【００４２】
本発明の目視検出により試験液中のリチウム濃度レベルを判定した結果を図９の[表４]に示す。この試験結果は、管理域であるオートノルム１ｍＭの緑色、及び、危険域である模擬血清３.５ｍＭの赤色では、２５人による判定者の正解率は１００％であり、準中毒域のパソノルムＨの１.６ｍＭ、及び、中毒域のプレチノルムＵの２.５ｍＭでの正解率は９６％と良好であった。
つまり、リチウムと未反応のＦ２８テトラフェニルポルフィリンのみが白色光の照射により光化学互変異体が生成し緑色に変色するが、リチウム濃度が４.３ｍＭの場合は、Ｆ２８テトラフェニルポルフィリンのほとんどがリチウムイオンと反応したため、未反応化学種(生成する光化学互変異体）は僅かであり、赤色のままである。その中間のリチウムの濃度では、同様の原理で緑と赤の中間色として黄色を呈する。
このように、目視や比色計においては、呈色濃淡による濃淡検出は一般的であるが、色調自体が緑色から黄色、橙色、赤色に変化し、この色調を明瞭に検出できることは、極めて希で高性能である。
【００４３】
この方法を、試料調製から詳細に説明すると、図１０は、透明容器に入れた被検体を所定の輝度の白色光を照射、または露光させることにより、リチウムイオンと未反応のＦ２８テトラフェニルポルフィリンのみを光化学互変異性体としての構造異性体に変化させる装置の概略図である。
図１０の被検液の照射装置において、実施例２のリチウム試薬組成試料２は前述の実施例１とほぼ同じ試薬組成物を調製し、これを分光用キュベットの透明容器の反応部１に１ｍＬを添加し、ＬＥＤ光源２により白色光を当て、図１１に示すように、光異性化反応が完了するまでに要する時間（：反応完結時間）を測定した。
ＬＥＤ光源の強さは分光キュベットの近位に設置された照度計により測定し、光異性化反応の終点（：反応完結時間）については電子吸収スペクトルの測定における400nmから600nm（：反応前のスペクトル）が、600nmから800nm（：光異性化後のスペクトル）の波長帯へのスペクトルシフトを観測することで決定した。
【００４４】
この結果を図１０に示すが、４２０ルクスの照度においては反応に３分程度を要するが、１４３０ルクス以上の照度においては４０秒以内に光異性化が完了することが判った。一般的なオフィス、病院の診察室、検査室の照度は３００ルクスから７５０ルクスであることから、特殊な光源がなくても、通常の施設における通常の室内照明下で迅速に本発明の測定方法を適用することが可能であることが判る。
さらに、より速やかに反応を完結させる場合として、１４３０ルクス以上の照度を得るにはＬＥＤ光源との距離を被検液に近接させる程度でも十分に達することが可能である。
このようにして、光異性化反応に要する時間、即ち色相変化（光異性化）に要する時間における、光源の定量的指標である照度（Lux）が与える影響を検討したのが図１１のグラフである。
なお、図１０で光源部２の反応部２(透明容器)への照射角度θを任意としているのは、容器が透明であれば光が容器自体を経て透過でき、その透過光が被検体まで達することができるので、照射角度θ自体があまり影響しないことや、また、反応完了時間が次の図１１に示すように、例えば５００ルクスでも１５０secと比較的短時間でも、速やかに光化学互変異性体としての構造異性体に変換させることが可能である特徴を有するからである。また、この光化学互変異性体は暗闇に放置すると緩やかな時間を経てもとの状態に戻る。
【００４５】
図１０の被検液の照射装置では、リチウムイオンと未反応のＦ２８テトラフェニルポルフィリンのみを光化学互変異性体としての構造異性体に変化せしめ、この結果、図１２に示すように、被検体中のリチウム濃度において、０.５ mEq/L（= mol/L）以下では緑色に変化した。これを図１０のグラフに示して説明するが、照射前の波長に対する４００nmから８００nmの可視光線範囲での吸収スペクトルは実線であるが、上記の白色光を３分程度照射すると破線の吸収スペクトルに変化した。この変化を目視により観測すると各々、黄橙色から緑色に変化した。
また、図１３の拡大図に示すように、リチウムイオン濃度において、０.５ mEq/L（= mol/L）以下での５００nmから６００nmの可視光線範囲での吸収スペクトルは太い破線に変わるが、１.５ mEq/L以上での吸収スペクトルは細かい点線で示され、目視により観測すると赤色である。
この原理により管理血清中のリチウム濃度を目視判定された結果が、図８の[表３]であるが、簡便且つ迅速な目視検出より、被検体中のリチウム濃度を明瞭に判定することができる。
【００４６】
ここで、本発明の使用するリチウム試薬組成物としては実施例１及び実施例２を説明したが、これは特許文献３で開示されるものあり、以下に示す実施例３でも前述した実施例１や実施例２と同様の結果が得られ、被検体の色の濃淡や色調を目視することにより、被検体中のリチウム濃度が測定できることを追試によって確認した。
[ 実施例３(リチウム試薬組成試料３）]
（１）第一試薬（安定剤・緩衝液として）
キレート剤：なし
有機溶剤：なし
安定剤(分散剤：非イオン性界面活性剤）：TritonX-100(商標登録)
(ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル)     １.０ 重量％
マスキング剤：トリエタノールアミン                   １０ｍＭ
以上に、０.１ＭとなるようにMOPSを加えてｐＨ８に調節し精製水で１Lとして汎用の保存容器に保管した。
【００４７】
（２）第二試薬（発色試液として）
キレート剤：Ｆ２８テトラフェニルポルフィリン         ０.５ g/L
有機溶剤：ジメチルスルホキシド(DMSO）                ２０ 重量％
安定剤(分散剤：非イオン性界面活性剤）：TritonX-100
(登録商標)(ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル)１.０ 重量％
マスキング剤：トリエタノールアミン                    １０ ｍＭ
これに、０.０５ＭになるようにＭＯＰＳ（緩衝剤）を加え、ｐＨ７.０に調節し、精製水で１Lとして汎用の保存容器に保管した。
【００４８】
リチウム濃度の測定には、実施例１と同様に試料 ６μLに第一試薬（緩衝液）７２０ μL、第二試薬（発色試液）２４０μLを加えて、所定時間、発色反応させた。
ここで実施例１や実施例２と同様に、前記チウム試薬組成物に被検体を混合して、所定の輝度の白色光で照射、または露光させることにより、リチウムと未反応のF28テトラフェニルポルフィリンのみを光化学互変異性体としての構造異性体に変化せしめ、この結果、被検体中のリチウム濃度において、０.５ mEq/L（= mol/L）以下では緑色、０.５ mEq/Lから１.５ mEq/Lでは黄色、１.５ mEq/L以上では赤色を呈した。この呈色変化は管理域、中毒域における閾値レベルに合致しており、目視又は比色計により明瞭に検出できた。勿論、実施例１と実施例２の関係と同様に、１液型としてもよい。
【００４９】
以上、本発明の各実施例では、被検体は血清試験試料で説明したが、これ以外の被検体として尿、血液、血漿試験試料を含む生体試料でもよく、勿論、工業用水、飲料水、環境試料等でも良く、水溶液中のリチウム濃度を、簡便な比色計により即座に測定でき、かつ、目視による判定が可能である。
また、本発明の特徴から、例えば、リチウムイオンと反応する、ピロール環のβ位に８個の臭素(Ｂr)原子を結合させたポルフィリンによる分析試薬でも、明瞭ではないが、光感受による電子吸収スペクトルへの影響があり、本発明と同様なリチウム検出系にも適用されることが示唆された。
【図１】
2014095567.tif 000008
【図２】
2014095567.tif 000009
【図３】
2014095567.tif 000010
【図４】
2014095567.tif 000011
【図５】
2014095567.tif 000012
【図６】
2014095567.tif 000013
【図７】
2014095567.tif 000014
【図８】
2014095567.tif 000015
【図９】
2014095567.tif 000016
【図１０】
2014095567.tif 000017
【図１１】
2014095567.tif 000018
【図１２】
2014095567.tif 000019
【図１３】
2014095567.tif 000020
【手続補正書】
【提出日】平成25年2月1日(2013.2.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
テトラフェニルポルフィリンの炭素に結合している水素を全部フッ素に置き換えた構造式
【化１】
2014095567.tif 000021
で表される化合物と、ジメチルスルホキシド(ＤＭＳＯ)、ジメチルホルムアミド(ＤＭＦ)、ジメチルアセトアミド(ＤＭＡ)から選択される水に混合し得る有機溶剤と、ｐＨ５からｐＨ１２の範囲でのリチウムに対して発色可能とするｐＨ調節剤とを包含した水溶液としたリチウム試薬組成物と被検体を接解し、その反応液に白色光を照射、または露光させ、それにより生じた色調の変化を目視により検出、又は比色計によりその感度を検出することを特徴とするリチウム測定方法。
【請求項２】
前記発色の色調は、リチウム呈色錯体が存在しない場合は緑色であり、リチウム呈色錯体の量が増えるに従い黄色から橙色を経て赤色に変化することを特徴とする請求項１に記載のリチウム測定方法。
【請求項３】
前記の色調の変化は、リチウム濃度が０.０mＭから４.５mＭの範囲で起こることを特徴とする請求項２に記載のリチウム測定方法。
【請求項４】
前記被検体は、血清及び血漿試験試料を含む生体試料であることを特徴とする請求項１乃至３に記載から選択されるリチウム測定方法。
【請求項５】
前記被検体は、環境試料であることを特徴とする請求項１乃至３に記載から選択されるリチウム測定方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００３】
さらに詳しくは、常時、投薬患者の試料血漿内のリチウム濃度が0.6〜1.2 mEq/Lとなるように調節しなければ成らないが、これは血清中のリチウム濃度が0.6mEq以下で余り少なすぎると気分安定効果がなく、逆に、これが必要以上に投与され、その濃度が１.５ mEq/Lを超え、さらに過剰に投与されるとリチウム中毒を引き起こし、振戦、構語障害、眼振、腎障害、痙攣を含む重篤な副作用が現れる。もし潜在的にこれらの兆候が見られた際には、治療を中止し、血漿あるいは血清中のリチウム濃度を再測定し、リチウム中毒を緩和する措置を行わなければならない。
このように、リチウム塩の気分安定薬は鬱病、双極性障害、てんかん等の患者の治療等に効果があるものの、過剰投与の場合には重大な障害が生じるので、これを投与する場合は、常に血清中のリチウム濃度を0.6〜1.2 mEq/Lになるように監視することが必須事項である。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
上記課題を解決するために、請求項１の発明は、テトラフェニルポルフィリンの炭素に結合している水素を全部フッ素に置き換えた構造式
【化１】
2014095567.tif 000022
で表される化合物と、ジメチルスルホキシド(ＤＭＳＯ)、ジメチルホルムアミド(ＤＭＦ)、ジメチルアセトアミド(ＤＭＡ)から選択される水に混合し得る有機溶剤と、ｐＨ５からｐＨ１２の範囲でのリチウムに対して発色可能とするｐＨ調節剤とを包含した水溶液としたリチウム試薬組成物と被検体を接解し、その反応液に白色光を照射、または露光させ、それにより生じた色調の変化を目視により検出、又は比色計によりその感度を検出することを特徴とするリチウム測定方法である。
請求項２の発明は、前記発色の色調が、リチウム錯体が存在しない場合は緑色であり、リチウム錯体の量が増えるに従い黄色から橙色を経て赤色に変化することを特徴とする請求項１に記載のリチウム測定方法である。
請求項３の発明は、前記の色調の変化が、リチウム濃度が０.０mＭから４.５mＭの範囲で起こることを特徴とする請求項２に記載のリチウム測定方法である。
請求項４の発明は、前記被検体が、尿、血清、血漿、血液等の生体試料又は血漿試験試料であることを特徴とする請求項１乃至３に記載から選択されるリチウム測定方法である。
請求項５の発明は、前記被検体が、環境試料であることを特徴とする請求項１乃至３に記載から選択されるリチウム測定方法である
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
【図１】本発明のＦ２８テトラフェニルポルフィリンの適量濃度の参考計算表の図である。
【図２】本発明に実施例１の紫外−可視分光光度計での実験結果のグラフ、
【図３】本発明に実施例１での測光波長別のリチウム濃度検量線のグラフの図、
【図４】本発明に実施例１でのＦ２８テトラフェニルポルフィリン−リチウム錯体生成のスペクトル変化(発色反応)のグラフ、
【図５】本発明に実施例１の血清試料測定値と原子吸光法（従来法）測定値との相関試験結果のグラフ、
【図６】本発明に管理血清を試料とした自動分析装置による測定値の比較の[表１]、
【図７】本発明での副波長補正による容血ヘモグロビンによる測定値への影響を表す[表２]
【図８】先行技術での目視によるリチウム濃度判定の[表３]、
【図９】本発明での目視によるリチウム濃度判定の[表４]、
【図１０】本発明での検体に白色光を照射する装置の概略図、
【図１１】本発明の光化学互変異性化反応の完結時間における照度の影響のグラフ、
【図１２】Ｆ２８テトラフェニルポルフィリン由来の光化学互変異性体の電子吸収スペクトルのグラフ、
【図１３】Ｆ２８テトラフェニルポルフィリン錯体への光照射後の電子吸収スペクトルのグラフである。