(57)【要約】      （修正有）【課題】１つの反応場において増幅反応とハイブリダイズ反応を行うことが可能なマルチ核酸反応具、核酸解析方法およびアッセイキットを提供する。【解決手段】検体と、基体２と、標的核酸を増幅するためのプライマーセット７と、増幅された産物を検出するための核酸プローブ６とを準備する工程；塩８を硬化油またはワックス９で被覆する工程；核酸プローブを基体の面に固定化する工程；核酸プローブと同じ位置にプライマーセットを固定化する工程；検体および被覆された塩カプセルを含む反応液を基体の核酸プローブおよびプライマーセットと接触させ、標的核酸を増幅する工程；反応液の温度を上昇させて硬化油またはワックスを融解し、塩を溶出する工程；増幅反応により得られた増幅産物を核酸プローブとハイブリダイゼーションさせる工程；および生じたハイブリダイズ信号を測定することにより、検体中の標的核酸の有無および／または量を検出する。【選択図】図１
2014060959.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸解析方法であって、
（ａ）検体と、基体と、標的核酸を増幅するためのプライマーセットと、前記プライマーセットを用いて増幅された産物を検出するための核酸プローブとを準備する工程、
（ｂ）塩を硬化油またはワックスで被覆して塩カプセルを準備する工程、
（ｃ）前記核酸プローブを前記基体の少なくとも１つの面に固定化する工程、
（ｄ）前記核酸プローブと同じ位置またはその近傍にプライマーセットを固定化する工程、
（ｅ）前記検体および前記塩カプセルを含む反応液を前記基体の前記核酸プローブおよび前記プライマーセットと接触させ、増幅反応を行って前記標的核酸を増幅する工程、
（ｆ）前記増幅反応の後に、前記反応液の温度を上昇させて前記硬化油またはワックスを融解し、塩を溶出する工程、
（ｇ）前記増幅反応により得られた増幅産物を前記核酸プローブとハイブリダイゼーションさせる工程、および
（ｈ）工程（ｇ）において生じたハイブリダイズ信号を測定することにより、検体中の標的核酸の有無および／または量を検出する工程、
を具備する方法。
【請求項２】
核酸解析方法であって、
（ａ）検体と、基体と、標的核酸を増幅するためのプライマーセットと、前記プライマーセットを用いて増幅された産物を検出するための核酸プローブとを準備する工程、
（ｂ）前記核酸プローブを前記基体の少なくとも１つの面に固定化する工程、
（ｃ）前記核酸プローブと同じ位置またはその近傍にプライマーを固定化する工程、
（ｄ）前記核酸プローブの近傍に塩を固定化する工程、
（ｅ）前記固定化された塩に硬化油またはワックスを積層して前記塩を被覆する工程、
（ｆ）前記検体を含む反応液を前記基体の前記核酸プローブ、プライマーセットおよび被覆されたと接触させ、増幅反応を行って前記標的核酸を増幅する工程、
（ｇ）増幅反応の後に、前記反応液の温度を上昇させて前記硬化油またはワックスを融解し、塩類を溶出する工程、
（ｈ）増幅後の産物を核酸プローブとハイブリダイゼーションさせる工程、および
（ｉ）工程（ｈ）において生じたハイブリダイゼーション量を測定することにより、検体中の標的核酸の有無および／または量を検出する工程、
を具備する方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の方法であって、前記硬化油またはワックスの融点が増幅温度より高いことを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項１〜３の何れか１項に記載の方法であって、前記塩が２本の核酸間のハイブリダイズ反応に必要な塩であることを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法であって、前記塩が、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、塩化カリウム、酢酸ナトリウムおよびそれらの組み合わせからなる群より選択される塩であることを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項１〜５の何れか１項に記載の方法であって、前記基体が流路を備え、前記流路内部が反応部として使用されることを特徴とする方法。
【請求項７】
基体と、
前記基体の少なくとも１つの面に配置されたプライマー固定化領域と、
前記プライマー固定化領域と同じ位置またはその近傍に配置されたプローブ固定化領域と、
前記プライマー固定化領域の近傍であり、プローブ固定化領域とは異なる位置に配置された塩固定化領域と、
前記プライマー固定化領域に遊離可能に固定化され、標的配列を増幅するように構成されたプライマーセットと、
前記プローブ固定化領域に固定化され、前記標的配列の増幅により生じた増幅産物の少なくとも一部に相補的な配列を含む核酸プローブと、
前記塩固定化領域に固定化され、硬化油またはワックスにより被覆された塩と、
を具備するＤＮＡチップ。
【請求項８】
請求項７に記載のＤＮＡチップであって、前記硬化油またはワックスの融点が増幅温度より高いことを特徴とするＤＮＡチップ。
【請求項９】
請求項７または８に記載のＤＮＡチップであって、前記塩が２本の核酸間のハイブリダイズ反応に必要な塩であることを特徴とするＤＮＡチップ。
【請求項１０】
請求項９に記載のＤＮＡチップであって、前記塩が、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、塩化カリウム、酢酸ナトリウムおよびそれらの組み合わせからなる群より選択される塩であることを特徴とするＤＮＡチップ。
【請求項１１】
請求項７〜１０の何れか１項に記載のＤＮＡチップであって、前記基体が流路を備え、前記流路内部が反応部として使用されることを特徴とするＤＮＡチップ。
【請求項１２】
請求項１〜６の何れか１項に記載の核酸解析法に使用するためのアッセイキットであって、請求項７〜１１の何れか１項に記載のＤＮＡチップ、酵素、基質および緩衝剤を含むアッセイキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の実施形態は、核酸解析方法、そのためのＤＮＡチップおよびアッセイキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡチップは、ガラスまたはシリコンの基板上に高密度に核酸プローブが固定化されたデバイスである。ＤＮＡチップで高精度に遺伝子解析を行う場合、前処理として、遺伝子増幅が必要となる。遺伝子増幅はＤＮＡチップとは別に、例えばチューブなどの別反応槽で行い、増幅後の産物に適宜塩などを添加し、ＤＮＡチップ上の核酸プローブと反応させる。チューブで反応させる場合、複数種の標的核酸をマルチ増幅させるのは難しく、実際、３〜４種以上の標的核酸のマルチ増幅は難しい。よって検出したい標的核酸の数が増えると、チューブの数が増え、操作が煩雑、且つ試薬が高価になる問題が生じていた。
【０００３】
また、増幅反応と、ＤＮＡチップにおける検出反応、即ち、ハイブリダイズ反応とでは、至適反応条件が異なる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明が解決しようとする課題は、１つの反応場において増幅反応とハイブリダイズ反応を行うことが可能な核酸解析方法、そのためのＤＮＡチップおよびアッセイキットを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
実施形態に従う核酸解析方法は、検体と、基体と、標的核酸を増幅するためのプライマーセットと、プライマーセットを用いて増幅された産物を検出するための核酸プローブとを準備する工程；塩を硬化油またはワックスで被覆する工程；核酸プローブを基体の少なくとも１つの面に固定化する工程；核酸プローブと同じ位置またはその近傍にプライマーセットを固定化する工程；検体および被覆された塩カプセルを含む反応液を基体の核酸プローブおよびプライマーセットと接触させ、増幅反応を行って標的核酸を増幅する工程；増幅反応の後に、反応液の温度を上昇させて硬化油またはワックスを融解し、塩を溶出する工程；増幅反応により得られた増幅産物を核酸プローブとハイブリダイゼーションさせる工程；および生じたハイブリダイズ信号を測定することにより、検体中の標的核酸の有無および／または量を検出する工程を含む。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】実施形態に係るＤＮＡチップの例を示す図。
【図２】実施形態に係るＤＮＡチップの例を示す図。
【図３】実施形態に係るＤＮＡチップの例を示す図。
【図４】実施形態に係るアレイ型プライマープローブチップのチップ素材を示す図。
【図５】実施形態に係るアレイ型プライマープローブチップの例を示す図。
【図６】実施形態に係るアレイ型プライマープローブチップの例の使用時の状態を示す図。
【図７】実施形態に係るアレイ型プライマープローブチップの例の使用時の状態を示す図。
【図８】実施例１の結果を示す図。
【図９】実施例１の結果を示すグラフ。
【図１０】実施例２の結果を示すグラフ。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
１．定義
「核酸」とは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ、Ｓ−オリゴ、メチルホスホネートオリゴなど、その一部の構造を塩基配列によって表すことが可能な物質を総括的に示す語である。例えば、核酸は、天然由来のＤＮＡおよびＲＮＡなど、一部分または完全に人工的に合成および／または設計された人工核酸など、並びにそれらの混合物などであってよい。
【０００８】
「検体」とは、本実施形態に従い解析方法を行なうべき対象であり、核酸を含む可能性のある試料であればよい。検体は、増幅反応および／またはハイブリダイゼーション反応を妨害しない状態であることが好ましい。例えば、生体などから得られた材料を、本実施形態に従う検体として使用するためには、それ自身公知の何れかの手段により前処理を行ってもよい。例えば、検体は液体であってもよい。
【０００９】
「核酸プローブ」とは、標的配列に対して相補的な配列を含む核酸である。核酸プローブは、それ自身公知の固相に対して固定化されてもよい。好ましい核酸プローブは、基体表面に固定化されて使用される。そのような基体と、基体に固定化された核酸プローブとを含む装置は、一般的にＤＮＡチップにより行われてよい。
【００１０】
「ＤＮＡチップ」とは、検出しようとする核酸に相補的な配列を有する核酸プローブと、検出対象の核酸との間のハイブリダイゼーション反応を利用して、核酸を解析する装置である。ＤＮＡチップの語は、一般的に使用される「核酸チップ」、「マイクロアレイ」および「ＤＮＡアレイ」などの用語と同義であり、互いに交換可能に使用される。
【００１１】
「増幅試薬一体化ＤＮＡチップ」とは、ＤＮＡチップの核酸プローブ近傍にプライマーを固定化したデバイスである。さらに必要に応じて、増幅で必要となる酵素、基質、バッファー類を固定化してある。プライマーは、該核酸プローブで検出される標的核酸を増幅するためのプライマーセットであり、増幅後はダイレクトに核酸プローブで検出される。
【００１２】
「増幅試薬、塩濃度調節機構一体化ＤＮＡチップ」とは、ＤＮＡチップの核酸プローブ近傍にプライマーセット、必要に応じて酵素、基質、バッファーが固定化してあり、さらには増幅後の塩濃度を調節する機構を備えたＤＮＡチップである。塩濃度を調節する方法としては、高塩濃度の塩を固定化し、その上に硬化油またはワックスなどの油性成分で覆う方法がある。増幅反応中には、塩は固形化した油性成分内にとどまっており、増幅後、例えば温度を上げることにより、前記油性成分を融解し、保持していた塩を溶液中にリリースする。上記塩および油性成分はＤＮＡプローブ、プライマーの近傍に固定化してある。
【００１３】
２．核酸解析方法
１つの反応場において、連続して増幅反応とハイブリダイズ反応とを行う場合、増幅反応とハイブリダイズ反応との間の反応条件の相違が問題となる。特に、反応液を移動、置換、交換および/または追加せずに、１つの反応場において連続して増幅反応とハイブリダイズ反応とを行う場合には、そのような相違が、正確なデータを得る妨げとなり、且つ検出感度を低いものにする可能性がある。
【００１４】
実施形態に係る核酸解析方法は、１つの反応場において増幅反応とハイブリダイズ反応を行うことが可能であり、更に高感度に、且つ正確な解析結果を得ることが可能な方法である。
【００１５】
増幅反応とハイブリダイズ反応の反応条件の中でも、特に、塩濃度に注目した。一般的に、遺伝子増幅の至適塩濃度は使用する酵素によって様々である。代表的な例において、核酸を増幅する反応のための至適縁濃度は、１０ｍＭ〜６０ｍＭ程度であると考えられる。一方、ハイブリダイゼーションの至適塩濃度は、３００ｍＭ〜７５０ｍＭ程度である。従って、増幅反応とハイブリダイズ反応とでは、互いに１０倍以上異なる塩濃度が、それぞれの指摘濃度となる。このために、増幅反応とハイブリダイズ反応を１つの反応場において連続して行うと、ハイブリ効率が低くなることが問題になると考え、鋭意研究の結果、本実施形態が達成された。
【００１６】
実施形態は検体についての核酸解析法に関する。この核酸解析法は、核酸の増幅反応とハイブリダイズ反応とを１つの反応場において行うことを含む反応である。そのために、核酸解析方法は、増幅反応に必要な塩濃度とハイブリダイズ反応で必要な塩濃度を両方ともに満足するための手段を含む。
【００１７】
上述したように増幅反応で必要とされる塩濃度に比べて、ハイブリダイズ反応で必要とされる塩濃度は約１０倍、または約１０倍以上高い。増幅反応に必要な反応液を反応場に存在させた場合、それに続いてハイブリダイズ反応を行うと塩が不足する。そのために、十分なハイブリダイズ反応を行うことができない。これを解消するために、予め反応液に、硬化油またはワックスにより被覆された塩を存在させる。詳細は後述するが、硬化油およびワックスは、増幅反応が行われる温度条件では融解せず、増幅後に温度を上昇させた時に融解する。
【００１８】
これにより、ある反応場において適切な塩濃度条件下で増幅反応が達成され、その同じ反応場において、適切な塩濃度条件でハイブリダイズ反応が達成される。即ち、硬化油またはワックスにより被覆された塩は、増幅反応時には被覆された状態で維持される。他方、ハイブリダイズ反応前、または反応時には、硬化油またはワックスが融解する。それにより、塩が反応液に溶出し、それにより反応場の塩濃度がハイブリダイズ反応に適した濃度に調整される。
【００１９】
このような連続する増幅反応とハイブリダイズ反応とを含む核酸検出方法は、反応容器において行われればよい。反応容器内部に添加された反応液中が反応場となる。反応容器は、例えば、チューブ、ウェル、チャンバー、流路、カップおよびディッシュ並びにそれらを複数個備えたプレート、例えば、マルチウェルプレートなどであってもよい。
【００２０】
増幅反応に必要な試薬および解析されるべき検体は、反応液に含ませることにより、解析に先駆けて反応場に持ち込まれればよい。ハイブリダイズ反応に必要な核酸プローブは、反応場を構成する容器の内側表面の反応液と接する位置に予め固定化しておけばよい。
【００２１】
解析方法では、反応場における増幅反応によって、検体に含まれる核酸が増幅される。次に、増幅により生じた増幅産物の検出または定量が、反応場に予め固定化された核酸プローブとのハイブリダイズ反応により生じるハイブリダイズ信号を検出することにより行われてよい。
【００２２】
また、増幅反応に必要な試薬、例えば、プライマーセット、ＤＮＡ合成酵素、逆転写酵素、緩衝剤、ｄＮＴＰ、硫酸アンモニウム、Ｔｗｅｅｎ２０、塩化カリウム、硫酸マグネシウムおよび/またはベタインが、解析方法に先駆けて反応場を構成するデバイスに、解析に先駆けて固定化されていてもよい。或いは、反応液に含ませて容器に添加されもよい。
【００２３】
また、ハイブリダイズ反応を至適塩濃度に調整するために、硬化油またはワックスに被覆された塩は、反応液中に含まれて反応場に持ち込まれるものであっても、解析に先駆けて反応場を構成する容器の内側表面の反応液に接する位置に、解析に先駆けて固定化されていてもよい。
【００２４】
解析に先駆けて、塩が容器の内部側面に固定化される場合、固定化は、核酸プローブが固定化される位置と異なる位置に固定化されても、同じ位置に固定化されてもよい。塩の固定化は、複数種類の核酸プローブが容器の内側表面に種類毎に固定化される場合には、各核酸プローブの近傍にそれぞれ固定化されることが好ましい。また、プライマーセットも塩が容器の内部側面に固定化される場合には、塩の固定化位置は、プライマーセットが固定化される位置とは異なる位置に固定化されてもよい。詳しくは後述するが、プライマーセットが固定化される位置と同じ位置に塩を固定化する場合には、塩を固定した後に、塩を硬化油またはワックスにより被覆し、その後にプライマーセットを遊離可能に固定化することが好ましい。
【００２５】
核酸解析方法は、例えば、次の工程を含んでもよい；
（ａ）検体と、基体と、標的核酸を増幅するためのプライマーセットと、前記プライマーセットを用いて増幅された産物を検出するための核酸プローブとを準備する工程、
（ｂ）塩を硬化油またはワックスで被覆して塩カプセルを準備する工程、
（ｃ）前記核酸プローブを前記基体の少なくとも１つの面に固定化する工程、
（ｄ）前記核酸プローブと同じ位置またはその近傍にプライマーセットを固定化する工程、
（ｅ）前記検体および前記塩カプセルを含む反応液を前記基体の前記核酸プローブおよび前記プライマーセットと接触させ、増幅反応を行って前記標的核酸を増幅する工程、
（ｆ）前記増幅反応の後に、前記反応液の温度を上昇させて前記硬化油またはワックスを融解し、塩を溶出する工程、
（ｇ）前記増幅反応により得られた増幅産物を前記核酸プローブとハイブリダイゼーションさせる工程、および
（ｈ）工程（ｇ）において生じたハイブリダイズ信号を測定することにより、検体中の標的核酸の有無および／または量を検出する工程。
【００２６】
更なる核酸解析方法は、例えば、次の工程を含んでもよい；
（ａ）検体と、基体と、標的核酸を増幅するためのプライマーセットと、前記プライマーセットを用いて増幅された産物を検出するための核酸プローブとを準備する工程、
（ｂ）前記核酸プローブを前記基体の少なくとも１つの面に固定化する工程、
（ｃ）前記核酸プローブと同じ位置またはその近傍にプライマーを固定化する工程、
（ｄ）前記核酸プローブの近傍に塩を固定化する工程、
（ｅ）前記固定化された塩に硬化油またはワックスを積層して前記塩を被覆する工程、
（ｆ）前記検体を含む反応液を前記基体の前記核酸プローブ、プライマーセットおよび被覆された塩と接触させ、増幅反応を行って前記標的核酸を増幅する工程、
（ｇ）増幅反応の後に、前記反応液の温度を上昇させて前記硬化油またはワックスを融解し、塩類を溶出する工程、
（ｈ）増幅後の産物を核酸プローブとハイブリダイゼーションさせる工程、および
（ｉ）工程（ｈ）において生じたハイブリダイゼーション量を測定することにより、検体中の標的核酸の有無および／または量を検出する工程。
【００２７】
更に、核酸解析法方法について詳細に説明する。
【００２８】
（１）鋳型核酸
実施形態の核酸解析方法を実施する前に検体が調製される。検体は、核酸を含む可能性があり、そこに含まれる核酸について解析を行うことが望まれる対象であればよい。検体は、そこにおいて増幅反応が適切に行われる必要があるため、必要に応じて解析をしようとする対象から得た粗検体について前処理を行って検体としてもよい。また、増幅反応に適切である場合には、前処理を行わずに粗検体そのまま検体として使用してもよい。検体に解析しようとする配列を有する核酸が存在した場合、それらは最初の鋳型核酸として使用される。鋳型核酸として使用される被検核酸は１本鎖でも２本鎖でもよい。
【００２９】
（２）ＤＮＡチップ
図１を参照しながら、ＤＮＡチップの１例について説明する。図１（ａ）は、ＤＮＡチップ１の平面図である。図１（ｂ）は、図（ａ）に示したＤＮＡチップ１の線Ｂ−Ｂに沿った断面図である。以下に説明するＤＮＡチップは、増幅試薬、塩濃度調節機構一体化ＤＮＡチップとも称されてよい。
【００３０】
図１（ｃ）を参照しながら、更なる実施形態である増幅試薬、塩濃度調節機構一体化ＤＮＡチップについて説明する。
【００３１】
ＤＮＡチップ１は、基体２、基体の１つの面に配置されたプローブ固定化領域３、プローブ固定化領域３の近傍に配置されたプライマー固定化４、プローブ固定化領域３の近傍であり、且つプライマー固定化領域４ではない位置に配置された塩固定化領域５、プローブ固定化領域３に固定化された核酸プローブ６、プライマー固定化領域４に遊離可能に固定化されたプライマーセット７、塩固定化領域に固定化された塩８、塩を被覆する硬化油またはワックス９を備える。
【００３２】
プローブ固定化領域３に固定化された核酸プローブ６は、各プローブ固定化領域３に種類毎に複数本が固定化されている。プライマー固定化領域４に固定化されたプライマーセット７は、各プライマー固定化領域４に種類毎に複数セットが固定化されている。
【００３３】
１つのプローブ固定化領域３には、１種類の増幅産物を検出するための核酸プローブ６が固定化されればよい。そのために、検出しようとする増幅産物の少なくとも１部分に相補的な配列を含めばよい。また、増幅産物は、標的核酸を鋳型にしてプライマーセット７により形成される。従って、増幅産物は、標的核酸の少なくとも一部分の配列と、プライマーセット７の配列とを含む。
【００３４】
プローブ固定化領域３は、核酸プローブ６と増幅産物とのハイブリダイズ信号が、複数のプローブ固定化領域３の間で独立して検出されるように配置される。
【００３５】
核酸プローブ６のプローブ固定化領域３への固定は、それ自身公知の所謂ＤＮＡチップにおいて基板表面に対して核酸プローブを固定する一般的な何れの技術を利用してもよい。
【００３６】
例えば、隣り合うプローブ固定化領域３の間の距離は、０．１μｍ〜１μｍ、１μｍ〜１０μｍ、１０μｍ〜１００μｍ、１００μｍ〜１ｍｍ、１ｍｍ〜１０ｍｍ、またはそれ以上でもよく、好ましくは、１００μｍ〜１０ｍｍであってよい。
【００３７】
１つのプライマー固定化領域には、増幅されるべき標的核酸を増幅するために必要がプライマーが固定化される。例えば、ＰＣＲ増幅用のＤＮＡチップ１の場合には、１つのプライマー固定化領域４に、１種類の特定の標的核酸を増幅するために必要なフォワードプライマーとリバースプライマーがそれぞれ複数本で含まれる。また、ＬＡＭＰ増幅用のＤＮＡチップ１の場合には、１つのプライマー固定化領域４に、１種類の特定の標的核酸を増幅するために必要なＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、必要に応じてＦ３プライマー、Ｂ３プライマー、およびＬＰプライマーがそれぞれ複数本で含まれる。
【００３８】
プライマーセット７は、反応場を提供するための液相と接触して遊離するように遊離可能な状態でプライマー固定化領域４に固定される。プライマーセット７のプライマー固定化領域４への固定化は、例えば、１組のプライマーセットを含む溶液を１つのプライマー固定化領域４に滴下し、その後乾燥させることにより達成されてもよい。これを繰り返すことにより、基体２の１つの面に独立して増幅反応が達成されるように配置される全てのプライマー固定化領域４にプライマーセット７が固定される。しかしながら、プライマーセット７の固定化領域４への固定化は、反応場を提供するための液相と接触して遊離可能な状態で固定されればよい。従って、そのような固定化が可能なそれ自身公知の何れの固定化法が使用されてもよい。プライマーセットを含む溶液を滴下する方法の場合、プライマーセットを含む溶液は、例えば、水、緩衝液または有機溶剤などであってよい。
【００３９】
基体２に配置される複数のプライマー固定化領域４は、互いに独立して配置されればよい。独立して配置されるとは、反応場においてプライマーセット７毎に開始および／または進行される増幅を妨げることのない間隔で配置されることである。例えば、隣り合うプライマー固定化領域４は、互いに接して配置されてもよく、僅かな距離を隔てて互いに近傍に配置されてもよく、或いは、通常使用される所謂ＤＮＡチップなどの検出装置において固定化される核酸プローブと同様な距離を隔てて互いに配置されてもよい。
【００４０】
例えば、隣り合うプライマー固定化領域４の間の距離は、０．１μｍ〜１μｍ、１μｍ〜１０μｍ、１０μｍ〜１００μｍ、１００μｍ〜１ｍｍ、１ｍｍ〜１０ｍｍ、またはそれ以上でもよく、好ましくは、１００μｍ〜１０ｍｍであってよい。
【００４１】
核酸プローブ６を固定化した後にプライマーセット７を固定化してもよく、プライマーセット７を固定化した後に核酸プローブ６を固定化してもよく、プライマーセット７の固定化と核酸プローブ６の固定化を同時に行ってもよい。
【００４２】
また例えば、プローブ固定化領域３とプライマー固定化領域４の間の距離は、０μｍ〜０．１μｍ、０．１μｍ〜１μｍ、１μｍ〜１０μｍ、１０μｍ〜１００μｍ、１００μｍ〜１ｍｍ、１ｍｍ〜１０ｍｍ、またはそれ以上でもよく、好ましくは、１００μｍ〜１０ｍｍであってよい。
【００４３】
例えば、プローブ固定化領域３とプライマー固定化領域４の間の距離が０μｍである場合には、プローブ固定化領域３とプライマー固定化領域４は、基体表面の同じ位置にあると解されてよい。また、プローブ固定化領域３がプライマー固定化領域４に含まれてもよく、プライマー固定化領域４がプローブ固定化領域３に含まれてもよい。また、１つのプライマー固定化領域４に対して複数のプローブ固定化領域３が配置されてもよい。
【００４４】
塩固定化領域５には、増幅反応に必要なレベルの塩濃度からハイブリダイズ反応の至適塩濃度を達成するために必要な塩８が固定化される。
【００４５】
塩８は、例えば、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、塩化カリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウムとクエン酸ナトリウムを用いて調製されたＳＳＣなどであってよいがこれに限定されるものではない。塩と共に硫酸デキストラン、サケ精子ＤＮＡ、および牛胸腺ＤＮＡ、のようなハイブリダーゼション促進剤、バッファー、ＥＤＴＡ、または界面活性剤などが、塩固定化領域５に対して塩８と一緒に固定化されてもよい。
【００４６】
硬化油またはワックス９は、塩が増幅反応時に溶出しないように、塩を完全に被覆している。塩８の固定化は、所望の塩８を溶液に溶かした後に、塩固定化領域５にスポットし、その後乾燥すればよい。塩８の固定化は、例えば、寒天、アガロース、ゼラチンなどのゲル化剤に溶解させた塩を用いて行われてもよい。スポットされた塩溶液の乾燥は、熱乾燥法、真空乾燥法、凍結乾燥などにより行われてもよい。
【００４７】
硬化油は、例えば、菜種硬化油、大豆硬化油、パーム硬化油、ヒマシ硬化油などであってもよいが、これに限定されるものではない。ワックスは、動物由来、植物由来、石油由来、鉱物由来の天然ワックスでもよく、合成ワックスでもよい。例えば、密蝋、鯨蝋、セラック蝋、カルナバ蝋、木蝋、ライスワックス、キャンデリラワックス、パラフィンワックス、ステアリン酸、マイクロクリスタリンワックス、モンタンワックスおよび/またはオゾケライトなどが使用されてよいが、これに限定されるものではない。
【００４８】
塩７を被覆する方法は、次のように行われてもよい。塩７が固定化されている位置に、これらの硬化油またはワックス９をスポットする。塩７の漏れ出しを防止するため、塩７の溶液と比較して油性物質、即ち、硬化油またはワックス９のスポット量を多くするのが好ましい。しかしながら、量比については適宜調整すればよい。これら硬化油またはワックス９の融点は増幅温度より高いものが好ましく選択される。増幅時には固形化状態である。さらに増幅後に温度を上げた時に液化する。増幅法によって、最適な増幅温度は異なるため、増幅法によって、適宜、硬化油またはワックス９が選択されればよい。
【００４９】
反応場を提供するための液相は、固定されたプライマーが遊離された後に、それらを用いて増幅反応を進行できる液相であればよく、例えば、所望の増幅に必要な反応液であってよい。
【００５０】
基体２の材質は、それ自身反応に関与しない材質であればよく、そこにおいて増幅反応を行うことが可能な材質であればよい。例えば、シリコン、ガラス、樹脂および金属などから任意に選択されてよい。
【００５１】
ＤＮＡチップ１を核酸解析方法に使用する場合、核酸プローブ６、プライマーセット７および被覆された塩７が固定化された少なくとも１面が反応のための液相、例えば、反応液と接触する。例えば、少なくとも核酸プローブ６、プライマーセット７および被覆された塩７が固定化された面に反応液が載せられてもよく、ＤＮＡチップ１が反応液を含む容器中に浸漬されてもよい。
【００５２】
このようなＤＮＡチップ１を使用方法について図１（ｃ）を参照しながら説明する。図１（ｃ）は、図１（ａ）に示されたＤＮＡチップ１に被覆体１０が取り付けられた状態を示す断面図である。
【００５３】
被覆体１０の基体２への取り付けは、そこに含まれる液体が外部に漏れずに維持されるそれ自身公知の何れの方法を利用してもよい。
【００５４】
被覆体１０は、例えば、シリコンゴムのようなシリコン樹脂および／またはフッ素樹脂などのような樹脂を用いて、そのような樹脂を、例えば、押出成形、射出成形または型押成形および／または例えば、接着剤による各部材の接着などのそれ自身公知の何れかの樹脂成形法によって形成されてもよい。
【００５５】
被覆体１０を基体２に取り付けることにより、被覆体１０と基体２の面により反応部を構成することが可能である。この反応部に、被覆体１０に任意に開口された注入部（図示せず）から、液体が注入されることにより反応液が供給されてもよい。或いは、被覆体１を鋭利な先端を持つ針で穿孔し、貫通させた後に、針に液体を送ることが可能な注入器によって反応液を注入してもよい。
【００５６】
（３）核酸解析方法
前記の一体化ＤＮＡチップ１に検体を注入する。一体化ＤＮＡチップ１に保持されていない増幅試薬がある場合には、検体と一緒に注入してもよい。増幅は、公知の増幅法で行い、反応温度も適宜選択することができる。増幅反応中、硬化油またはワックスは固形化しており、塩は内部に保持されている。増幅後、硬化油またはワックスの融点よりも増幅液の温度を高くし、硬化油またはワックスを液化させる。液化した硬化油またはワックスは上層部に移動し、内部の塩がリリースされる。その後、高塩濃度下の至適条件で増幅産物と核酸プローブのハイブリダイゼーションを行う。その後、ハイブリダイズ信号を検出する。得られた結果に基づいて、検体に含まれる被検核酸について配列情報および／または量を解析する。
【００５７】
解析される項目は、例えば、遺伝子発現量の測定、ウイルスおよび／または細菌などに由来する核酸などの定量、多型についての遺伝子型の同定および／または変異の有無の検出などであってよい。しかしながらこれらに限定されるものではない。
【００５８】
更に、以下にＤＮＡチップ１を使用する核酸解析方法について説明する。
【００５９】
＜検体注入工程＞
まず、検体を反応部に注入する。検体液は必要に応じて冷凍、冷蔵しておき、注入前に熱変性をかけてもよい。また、増幅を阻害する物質をトラップする特殊な試薬を加えてもよい。ＤＮＡチップに固定化されていない増幅試薬の一部を含有していてもよい。
【００６０】
＜増幅工程＞
増幅反応は、何れかの公知のものであればいずれでもよい。例えば、ＬＡＭＰ法、ＳＭＡＰ法、ＮＡＳＢＡ法、ＩＣＡＮ法、ＴＲＣ法、ＳＤＡ法、ＴＭＡ法、ＲＣＡ法、ＰＣＲ法があるがこれに限定されない。核酸プローブとのハイブリ効率を上げるために一本鎖を形成させるように構成されたプライマーを用いてもよい。また、所望に応じて当該増幅反応と同時に、逆転写酵素を用いる逆転写反応を組み合わせて行ってもよい。増幅反応と逆転写反応を同時に行う技術は、それ自身公知の何れの技術を利用してよい。
【００６１】
＜硬化油、ワックス溶解工程＞
増幅反応後、温度を上げることにより、硬化油、ワックスを液化する。増幅温度に近い融点を示す硬化油またはワックスであれば、すぐに液化状態となる。液化状態となった油性物質は、自然と反応槽の上部へ移動するが、移動しない場合には、チップを少し振動させたりしてもよい。さらに塩の溶出を確認するため、塩と共に色素を含有させ、色素の溶出を確認してもよい。
【００６２】
＜ハイブリダイゼーション工程＞
ハイブリダイゼーションは、硬化油またはワックス内へ内蔵した塩が十分拡散した状態で行う。反応温度は、適宜設定する。攪拌や振盪などにより、反応効率を高めてもよい。
【００６３】
＜洗浄工程＞
ハイブリダイゼーション後、ＤＮＡチップが洗浄されてもよい。ハイブリダイゼーション後、ＤＮＡチップを洗浄するための洗浄液は、イオン強度が０．０１〜５の範囲であり、ｐＨ５〜９の範囲の緩衝液が好適に用いられる。洗浄液は塩および界面活性剤などを含むことが好ましい。例えば、ＳＳＣ溶液、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ溶液、Ｔｗｅｅｎ２０溶液、またはＳＤＳ溶液などが好適に用いられる。洗浄温度は、例えば１０℃〜７０℃の範囲で行う。洗浄液は、プローブ固定化基体の表面または核酸プローブを固定化した領域に通過または滞留させる。
【００６４】
＜検出工程＞
ハイブリダイゼーション工程により生じたハイブリッドの検出は、以下のような蛍光検出方式および電気化学的検出方式を利用することができる。これらの検出方式を利用するためには、それらの検出方式にあった検出デバイスを選択し、用意すればよい。それらの検出デバイスについては後述する。
【００６５】
（ａ）蛍光検出方式
蛍光標識物質を用いて検出する。核酸の増幅工程で用いるプライマーをＦＩＴＣ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、またはローダミンなどの蛍光色素のような、蛍光学的に活性な物質で標識してもよい。或いは、それらの物質で標識したセカンドプローブを用いてもよい。複数の標識物質を同時に使用してもよい。検出装置により、標識された配列または２次プローブ中の標識を検出する。使用する標識に応じて適切な検出装置を用いる。例えば、蛍光物質を標識として用いた場合、蛍光検出器を用いて検出する。
【００６６】
（ｂ）電気化学的検出方式
当該分野で周知の２本鎖認識物質を用いる。２本鎖認識物質は、ヘキスト３３２５８、アクリジンオレンジ、キナクリン、ドウノマイシン、メタロインターカレーター、ビスアクリジン等のビスインターカレーター、トリスインターカレーターおよびポリインターカレーターから選択してよい。更に、これらの２本鎖認識物質を電気化学的に活性な金属錯体、例えばフェロセン、ビオロゲンなどで修飾してもよい。
【００６７】
２本鎖認識物質は、種類によって異なるが、一般的には１ｎｇ／ｍＬ〜１ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度で使用する。この際には、イオン強度が０．００１〜５の範囲であり、ｐＨ５〜１０の範囲の緩衝液を用いることができる。
【００６８】
測定は、例えば２本鎖認識物質が電気化学的に反応する電位以上の電位を印加し、２本鎖認識物質に由来する反応電流値を測定する。この際、電位は定速で印加するか、或いは、パルスで印加するか、或いは、定電位を印加してもよい。ポテンショスタット、デジタルマルチメーター、およびファンクションジェネレーターのような装置を用いて電流、電圧を制御してもよい。電気化学的検出は、当該分野で周知の方法によって実施することができる。電気化学的検出を行うためのＤＮＡチップについては以下において説明する。
【００６９】
＜検出デバイス＞
増幅産物の検出は、上述したようにハイブリダイズ信号を検出することにより行われればよい。そのような検出を行うための検出デバイスとしても上述したような実施形態に従うＤＮＡチップは提供される。例えば、ＤＮＡチップの基体は、電流検出型を代表とする電気化学的検出型、蛍光検出型、化学発色型および放射能検出型など、従来公知の何れの種類のマイクロアレイ用の基体であってもよい。
【００７０】
何れの種類のマイクロアレイも、それ自身公知の方法により製造することが可能である。例えば、電流検出型マイクロアレイの場合、ネガティブコントロールプローブ固定化領域および検出用プローブ固定化領域は、それぞれ異なる電極上に配置されればよい。
【００７１】
検出デバイスとしてのＤＮＡチップの例を模式図として図２に示す。しかしながら、これに限定するものではない。
【００７２】
図２に示されるように、ＤＮＡチップ１００は、基体１０１にプローブ固定化領域１０２を備える。プローブ固定化領域１０２に核酸プローブ１０３が固定化される。このようなＤＮＡチップ１００は、当該分野で周知の方法によって製造することができる。基体１０１に配置されるプローブ固定化領域１０２の数およびその配置は、当業者が必要に応じて適宜設計変更することが可能である。このようなＤＮＡチップは、蛍光を用いた検出方法のために好適に用いられてよい。
【００７３】
更なるＤＮＡチップの他の例を図３に示す。図３に示されるＤＮＡチップ２００は、基体２０１に電極２０２を備える。電極２０２に核酸プローブ２０３が固定化されている。電極２０２は、パット２０４に接続される。電極２０２からの電気的情報はパット２０４を介して取得される。
【００７４】
このようなＤＮＡチップ２００は、当該分野で周知の方法によって製造することができる。基体２０１に配置される電極２０２の数およびその配置は、当業者が必要に応じて適宜設計変更することが可能である。さらに、本例のＤＮＡチップは、必要に応じて、参照電極および対極を具備してもよい。
【００７５】
電極は、金、金の合金、銀、プラチナ、水銀、ニッケル、パラジウム、シリコン、ゲルマニウム、ガリウムまたはタングステンのような金属単体およびそれらの合金、或いは、グラファイト、グラシーカーボンのような炭素またはそれらの酸化物または化合物を用いることができるが、それらに限定されない。このようなＤＮＡチップは、電気化学的な検出方法のために好適に用いられてよい。
【００７６】
上述のような検出用デバイスに対して、更に、プライマーセットが固定化される。上述のような検出デバイスであるＤＮＡチップの基体の核酸プローブが固定化された位置の近傍にプライマーセットが固定化される。更に、プライマーセット以外の増幅試薬、例えば、酵素、基質、バッファー類が同様に固定化されていてもよい。
【００７７】
プライマーセットの固定化は、例えば、プライマーセットを水、バッファーおよび/または有機溶媒に溶かし、得られた溶液をスポットし、その後乾燥することにより行われればよい。乾燥は、例えば、熱乾燥法、真空乾燥法または凍結乾燥法などで行ってよい。プライマーセットおよび各反応試薬の濃度は適宜変えてよく、十分な増幅産物が得られる条件となるように選択されればよい。さらに核酸プローブ近傍に高塩濃度の塩を固定化し、その後、塩を硬化油またはワックスなどの油性物質で被覆する。
【００７８】
このようなＤＮＡチップにおいて、増幅反応、ハイブリダイズ反応およびハイブリダイズ信号の検出を連続して行い、それにより核酸解析方法を簡便且つ短時間に精度よく行うことが可能である。
【００７９】
また、プローブ固定化領域、プライマー固定化領域および塩固定化領域を基体に予め形成された凹部および/または凸部などにより構成された流路、または基体に被覆体を取り付けることにより形成された空間により構成される反応部において行うことにより、液体の添加および/または排出などの操作がより容易になる。
【００８０】
３．マルチ核酸反応具
上述のような核酸解析方法は、プライマーなどの増幅試薬を、核酸プローブが固定化された位置の近傍に固定化し、増幅反応からハイブリダイゼーションおよびハイブリダイズ信号の検出までを微小な反応区画でダイレクトに行う方法であってよい。そのようなＤＮＡチップは、そこにおいて複数種類の核酸を同時に反応に供することが可能なマルチ核酸反応具として提供されてもよい。
【００８１】
マルチ核酸反応具は、基体と、基体の少なくとも１つの面の互いに独立して配置された複数のプライマー固定化領域と、複数のプライマー固定化領域のそれぞれと同じ位置またはその近傍に配置された複数のプローブ固定化領域と、複数のプライマー固定化領域の近傍に複数の塩固定化領域とを備える。それぞれのプライマー固定化領域には、複数種類の標的配列をそれぞれに増幅するように構成された複数種類のプライマーセットが種類毎に遊離可能に固定化されている。それぞれのプローブ固定化領域には、増幅産物の少なくとも一部に相補的な配列を含む複数種類の核酸プローブがハイブリダイズ信号を独立して検出可能に種類毎に固定化されている。塩固定化領域には、塩とこれを被覆している硬化油またはワックスが固定化されている。
【００８２】
即ち、マルチ核酸反応具は、基体と；前記基体の少なくとも１つの面の互いに独立して配置された複数のプライマー固定化領域と；前記複数のプライマー固定化領域のそれぞれと同じ位置またはその近傍に配置された複数のプローブ固定化領域と；前記複数のプライマーおよびプローブ固定化領域近傍に複数の塩固定化領域と；前記複数のプライマー固定化領域に、遊離可能に種類毎に固定化され、複数種類の標的配列をそれぞれに増幅するように構成された複数種類のプライマーセットと；前記複数のプローブ固定化領域に、ハイブリダイズ信号を独立して検出可能に種類毎に固定化された、前記標的配列の増幅により生じた増幅産物の少なくとも一部に相補的な配列を含む複数種類の核酸プローブと；前記複数の塩固定化領域に固定化され、硬化油またはワックスにより被覆された塩と；を備えてもよい。
【００８３】
更に、マルチ核酸反応具は、基体と；前記基体の少なくとも１つの面に配置されたプライマー固定化領域と；前記プライマー固定化領域と同じ位置またはその近傍に配置されたプローブ固定化領域と；前記プライマー固定化領域の近傍に配置された塩固定化領域と；前記プライマー固定化領域に遊離可能に固定化され、標的配列を増幅するように構成されたプライマーセットと；前記プローブ固定化領域に固定化され、前記標的配列の増幅により生じた増幅産物の少なくとも一部に相補的な配列を含む核酸プローブと；前記塩固定化領域に固定化され、硬化油またはワックスにより被覆された塩と；を備えてもよい。
【００８４】
＜アレイ型プライマープローブチップ＞
マルチ核酸反応具の１例であるアレイ型プライマープローブチップを１つの実施形態として図４〜図７を参照しながら説明する。
【００８５】
（１）チップ素材
まず、電気化学的検出によりハイブリダイズ信号を検出するアレイ型プライマープローブチップのチップ素材の構成および製造方法の１例について図４（ａ）および（ｂ）を用いて説明する。図４（ａ）は、チップ素材の平面図であり、図４（ｂ）は、図４（ａ）のチップ素材の線Ｂ−Ｂに沿う断面図である。
【００８６】
チップ素材１１１は、矩形状の基板１１２上にその長手方向に沿って配置された例えば４つの電極１１３ａ〜１１３ｄを備えている。各電極１１３ａ〜１１３ｄは、第１の金属薄膜パターン１１４および第２の金属薄膜パターン１１５をこの順序で積層した構造を有する。また、各電極１１３ａ〜１１３ｄは大矩形部１１６と小矩形部１１７を細線１１８で連結した形状を有する。絶縁膜１１９は、各電極１１３ａ〜１１３ｄを含む基板１１２上に被覆されている。円形窓１２０は、大矩形部１１６に対応する絶縁膜１１９部分に開口されている。矩形窓１２１は、小矩形部１１７に対応する絶縁膜１１９部分に開口されている。電極１１３ａの円形窓１２０ａから露出する大矩形部１１６は第１の作用極１２２ａとして機能する。電極１１３ｂの円形窓１２０ｂから露出する大矩形部１１６は第２の作用極１２２ｂとして機能する。電極１１３ｃの円形窓１２０ｃから露出する大矩形部１１６は対極１２３として機能する。電極１１３ｄの円形窓１２０ｄから露出する大矩形部１１６は参照極１２４として機能する。また、電極１１３ａ〜１１３ｄの矩形窓１２１から露出する小矩形部１１７はプローバー接触部として機能する。
【００８７】
このようなチップ素材は、次のような方法により作製することができる。
【００８８】
まず、基板１１２上に第１の金属薄膜および第２の金属薄膜を例えば、スパッタリング法または真空蒸着法によりこの順序により堆積する。続いてこれらの金属薄膜を例えば、レジストパターンをマスクとして順次選択的にエッチングして、第１の金属薄膜パターン１１４および第２の金属薄膜パターン１１５をこの順序で積層した、例えば４つの電極１１３ａ〜１１３ｄを基板１１２の長手方向に沿って形成する。これらの電極１１３ａ〜１１３ｄは、大矩形部１１６と小矩形部１１７を細線１１８で連結した形状を有する。
【００８９】
次いで、電極１１３ａ〜１１３ｄを含む基板１１２上に、絶縁膜１１９を例えば、スパッタリング法またはＣＶＤ法により堆積する。続いて、各電極１１３ａ〜１１３ｄの大矩形部１１６に対応する絶縁膜１１９部分および小矩形部１１７に対応する絶縁膜１１９部分をレジストパターンをマスクとして選択的にエッチングして、大矩形部１１６に対応する絶縁膜１１９部分に円形窓１２０を、および小矩形部１１７に対応する絶縁膜１１９部分に矩形窓１２１を開口する。それにより前述したチップ素材１１１を作製する。
【００９０】
基板１１２は、例えば、パイレックス（登録商標）ガラスのようなガラスまたは樹脂から作られる。
【００９１】
第１の金属薄膜は、第２の金属薄膜を基板１１２に密着させるための下地金属膜として働き、例えば、Ｔｉから作られる。第２の金属薄膜は、例えば、Ａｕから作られる。
【００９２】
第１および第２の金属薄膜をパターニングするときのエッチングの例は、エッチングガスを用いるプラズマエッチングまたは反応性イオンエッチングを含む。
【００９３】
絶縁膜１１９は、例えば、シリコン酸化膜のような金属酸化膜、シリコン窒化膜のような金属窒化膜を挙げることができる。
【００９４】
絶縁膜１１９をパターニングするときのエッチングの例は、エッチングガスを用いるプラズマエッチングまたは反応性イオンエッチングを含む。
【００９５】
（２）アレイ型プライマープローブチップ
次に、上記（１）において製造されたチップ素材１１１にプライマーセットとプローブ核酸を固定したアレイ型プライマープローブチップの構成および製造方法の１例を図５（ａ）および図５（ｂ）を参照しながら説明する。図５（ａ）はアレイ型プライマープローブチップ１の平面図であり、図５（ｂ）は図５（ａ）のアレイ型プライマープローブチップ１の線Ｂ−Ｂに沿う断面図である。
【００９６】
チップ素材１１１上に形成された電極１１３ａの第１の作用極１２２ａを第１のプローブ固定化領域２０１ａとし、この第１のプローブ固定化領域２０１ａに第１の目的配列の相補配列を含む第１のプローブ核酸２０２ａを固定する。固定される第１のプローブ核酸２０２ａは、その複数本で１つのプローブ核酸群として固定される。同様に、電極１１３ｂの第２の作用極１２２ｂを第２のプローブ固定化領域２０１ｂとし、この第２のプローブ固定化領域２０１ｂに第１の目的配列とは異なる第２の目的配列の相補配列を含む第２のプローブ核酸２０２ｂを固定する。
【００９７】
プローブ核酸２０２ａおよび２０２ｂをプローブ固定化領域２０１に固定する方法の例は、金電極を具備したチップ素材１１１については３’末端にチオール基を第１のプローブ核酸２０２ａに導入する方法などが含まれる。
【００９８】
次いで、第１の作用極１２２ａの近傍に第１のプライマー固定化領域２０３ａを、第２の作用極１２２ｂの近傍に第２のプライマー固定化領域２０３ｂを配置する。この第１のプライマー固定化領域２０３ａ上に第１のプライマーセット２０４ａを、第２のプライマー固定化領域２０３ｂ上に第２のプライマーセット２０４ｂを固定する。それによりアレイ型プライマープローブチップ１を作製する。
【００９９】
第１のプライマーセット２０４ａは第１の標的配列を増幅するように設計された配列を有し、第２のプライマー固定化領域２０４ｂは第１の標的配列とは異なる配列からなる第２の標的配列を増幅するように設計された配列を有する。
【０１００】
第１および第２のプライマーセット２０４ａおよび２０４ｂをそれぞれ第１および第２のプライマー固定化領域２０３ａおよび２０３ｂへの固定化は例えば、水、緩衝液または有機溶剤のような液体にプライマーセット２０３を含ませて滴下して、その後、例えば、室温などの適切な温度条件下で乾燥するまでの時間、例えば、室温の場合では１０分間放置することにより行う。
【０１０１】
（３）使用時のアレイ型プライマープローブチップ
上記（２）において作製されたアレイ型プライマープローブチップ１の使用方法について図６および図７を参照しながら説明する。
【０１０２】
図６（ａ）は、使用時のアレイ型プライマープローブチップ１の平面図であり、図６（ｂ）は、図６（ａ）のアレイ型プライマープローブチップ１の線Ｂ−Ｂに沿う断面図である。
【０１０３】
本実施形態のアレイ型プライマープローブチップ１を使用する場合、電極１１３ａ〜１１３ｄにそれぞれ形成された第１の作用極１２２ａ、第２の作用極１２２ｂ、対極１２３および参照極１２４、並びに第１のプライマー固定化領域２０３ａおよび第２のプライマー固定化領域２０３ｂが同じ１つの反応場に含まれるように反応液が維持される。そのために、被覆体３０１が、アレイ型プライマープローブチップ１の使用前にアレイ型プライマープローブチップ１上に装着される。被覆体３０１は、中空でその１つの面が開放した直方体である。被覆体３０１は、例えば、シリコンゴムのようなシリコン樹脂および／またはフッ素樹脂などのような樹脂を用いて、そのような樹脂を、例えば、押出成形、射出成形または型押成形および／または例えば、接着剤による各部材の接着などのそれ自身公知の何れかの樹脂成形法によって形成される。被覆体３０１が装着された後に、反応液３０２がアレイ型プライマープローブチップ１と被覆体３０１とにより規定された空間に添加される。反応液３０２は、鋳型核酸３０３を含む。
【０１０４】
被覆体３０１が装着されたアレイ型プライマープローブチップ１において、電極１１３ａ〜１１３ｄのそれぞれの矩形窓１２１から露出する小矩形部１１７は露出している。
【０１０５】
被覆体３０１をアレイ型プライマープローブチップ１に装着する方法の例は、例えば、圧着、接着剤による接着などが含まれる。
【０１０６】
反応液３０２は被覆体３０１がアレイ型プライマープローブチップ１に装着された後に添加される。
【０１０７】
アレイ型プライマープローブチップ１と被覆体３０１とにより形成される空間に反応液などの液体を添加する方法の例は、例えば、被覆体３０１の一部に開口部を予め設けておき、その開口部から添加すること、または先端の鋭利な例えば、針のような先端を有した注入器を用い、その針で被覆体３０１を穿孔し、被覆体３０１の一部に針を差し込んで添加することなどが挙げられる。
【０１０８】
反応液３０２は、試料と、増幅試薬、例えば、ポリメラーゼなどの酵素、プライマーを起点とし新たなポリヌクレオチド鎖を形成する際に必要なでオキシヌクレオシド三リン酸などの基質、逆転写を同時に行う場合には、逆転写酵素およびそれに必要な基質など、更に、適切な増幅環境を維持するための塩類などの緩衝剤および例えば、ヘキスト３３２５８のような２本鎖核酸を認識して信号を生ずるインタカレータを含む。検査されるべき試料中に特定のプライマー固定化領域に固定されたプライマーセットにより増幅されるべき標的配列を含む鋳型核酸が存在した場合、そのプライマー固定化領域とそれに対応するプローブ固定化領域を含む反応場において増幅産物が形成される。その様子を模式的に図７に示す。
【０１０９】
図７（ａ）は、反応場である反応液３０２の領域４０１において増幅産物が形成された状態を模式的に示す。図７（ａ）は、使用時のアレイ型プライマープローブチップ１の平面図であり、図７（ｂ）は、図７（ａ）のアレイ型プライマープローブチップ１の線Ｂ−Ｂに沿う断面図である。上述のように図６において添加された試料中には、第２のプライマーセット２０４ｂが結合できる配列を含む核酸が含まれていたために、図７（ａ）および図７（ｂ）に示すように、第２のプライマーセット２０４ｂは領域４０１に遊離および拡散し、鋳型核酸３０３と出会った後に増幅反応が生じ、増幅産物が形成される。第２のプライマーセット２０４ｂによる増幅産物は、第２のプライマー固定化領域２０３ｂの周辺に拡散し、第２のプローブ固定化領域２０１ｂに到達する。到達した増幅産物が、目的配列を含む場合、第２のプローブ核酸２０２ｂと増幅産物とがハイブリダイズして２本鎖核酸を形成する。この２本鎖核酸に対して、反応液３０２に含まれるインタカレータが結合してハイブリダイズ信号を生じる。
【０１１０】
ハイブリダイズ信号は、例えば、電極１１３ａ〜１１３ｄのそれぞれの矩形窓１２１から露出する小矩形部１１７にプローバーを接触させ、ヘキスト３３２５８のようなインタカレータの電流応答を測定することにより行われる。
【０１１１】
電気化学的検出を利用するアレイ型プライマープローブチップを使用することによって、より簡単に且つ短時間に試料に含まれる標的核酸を増幅した後に、その増幅産物に含まれる目的核酸の検出を行うことが可能である。
【０１１２】
このようなアレイ型プライマープローブチップにおいて、硬化油またはワックスにより被覆された塩を反応液に含ませてもよい。或いは、チップ素材のプローブ固定化領域およびプライマー固定化領域の近傍に塩を固定化し、それを覆うように硬化油またはワックスを固定化してもよい。これにより、増幅反応およびハイブリダイズ反応を何れもより適した条件において開始および進行することが可能となる。
【０１１３】
４．アッセイキット
本実施形態は、アッセイキットの形態であってもよい。アッセイキットは、上述の何れかの実施形態のＤＮＡチップを含めばよく、更に、任意に、酵素、基質、バッファー、取扱説明書などを含んでもよい。
【０１１４】
例
例１
硬化油またはワックスを使った塩濃度調節機構について、はじめにチューブを用いて検証を行った。
【０１１５】
＜硬化油またはワックスによる塩溶液の被覆＞
２０×ＳＳＣ溶液に１．５％寒天および青色色素を添加し、２．８μＬずつチューブの底に固定化した。その後、菜種硬化油（融点６８℃）、ライスワックス（融点７３〜７７℃）、キャンデリラワックス（融点６８〜７２℃）を各々を４μＬずつ添加した。図８のａ）、ｂ）に示すように油成分である硬化油またはワックスは上層に２０×ＳＳＣ溶液は下層に位置することが確認できた。室温では硬化油は固形化しており、８０℃では液化する。
【０１１６】
＜増幅＞
増幅反応はＬＡＭＰ法を用いた。鋳型およびプライマーは表１および表２、表１および表２に記載の鋳型Ａ、プライマーセットＡを用いた。
【表１】
2014060959.tif 000003
【０１１７】
【表２】
2014060959.tif 000004
【０１１８】
増幅反応液の組成は表３に示した。
【表３】
2014060959.tif 000005
【０１１９】
この増幅液を硬化油またはワックスを添加したチューブに注入し、６２℃で１時間増幅反応を行った。増幅中、図８のｃ）に示すように硬化油およびワックスは固形化しており、色素の漏れ出しはなかった。増幅後、全ての液で増幅に伴う白濁が見られた。その後、９５℃５分熱をかけると図８のｄ）に示すように硬化油およびワックスが液化し、保持した塩がリリースされる様子が確認できた。硬化油またはワックスの増幅および検出阻害の有無を確認するため、ポジティブコントロールとして、増幅液のみをチューブで増幅したものも準備した。
【０１２０】
＜チップ検出＞
上記で増幅した産物をチップ検出するため、プローブＤＮＡ  （Ａ）を用意した。また、ネガティブコントロールとして、鋳型Ａと無関係な配列を示す核酸プローブを準備した。
【表４】
2014060959.tif 000006
【０１２１】
【表５】
2014060959.tif 000007
【０１２２】
図３、より具体的には図４に示されるような電気化学的な検出方法のＤＮＡチップを作製した。パイレックスガラス表面にチタン及び金の薄膜をスパッタリングにより形成した。その後、エッチング処理により、チタンおよび金の電極をガラス表面上に形成した。更にその上に絶縁膜を塗付して、エッチング処理により絶縁膜に円形窓および矩形窓を開口して作用極、対極、参照極およびプローバー接触部を露出させた。作用極をプローブ固定化領域として使用し、そこに３μＭのプローブＤＮＡ（Ａ）を１００ｎＬスポットし、乾燥させた。同一プローブはそれぞれ４つの電極にスポットした。乾燥後、超純水で洗浄、風乾し、プローブ固定化電極を得た。次にＤＮＡチップに対して被覆体を装着した。被覆体により構成される空間は反応容器として機能する。被覆体はシリコンゴムを用いた。ＬＡＭＰ増幅後の液を予めシリコンゴムに設けられた穴から反応容器内に注入し、その後、被覆体の穴に蓋をした。５５℃で１０分間静置させて、ハイブリダイゼーションを行った。その後、０．２×ＳＳＣ溶液に２５℃で１分間浸漬して洗浄した。次いで、洗浄液を除去し、挿入剤であるヘキスト３３２５８溶液を７５μＭ含むＰＩＰＥＳ緩衝液を注入した。次にプローブ核酸固定化作用極に電位を掃引し、プローブＤＮＡとＬＡＭＰ産物により形成された二本鎖に特異的に結合したヘキスト３３２５８分子の酸化電流を計測した。上記一連の反応は、SICE Journal of Control, Measurement, and System Integration, Vol. 1, No. 3, pp. 266-270, 2008に記載のＤＮＡ自動検査装置にて実施した。
【０１２３】
＜結果＞
試験１は、ポジティブコントロールとして準備したＬＡＭＰ増幅液をそのまま塩を添加せずに検出した場合、試験２は、２０×ＳＳＣ（終濃度２×ＳＳＣ）を後から添加して検出した場合、試験３は、２０×ＳＳＣを菜種硬化油、ライスワックスおよびキャンデリラワックスで被覆して塩濃度調節した場合（終濃度２×ＳＳＣ）について検出を行った。得られた結果を図９に示す。
【０１２４】
塩を添加せずに検出した場合には陽性シグナルが低かった（図９の１）。２０×ＳＳＣを後から添加した場合（図９の２）と、菜種硬化油（図９の３）、ライスワックス（図９の４）、キャンデリラワックス（図９の５）で塩濃度を調節した場合とではほぼ同程度の高い陽性信号が検出された。これにより、硬化油またはワックスで塩濃度を調節できること、硬化油、ワックスは増幅、検出を阻害しないことが示された。
【０１２５】
例２
塩濃度調節機構一体化ＤＮＡチップを用いて増幅から検出までを行い、塩濃度調節機構の有用性を検証した。例１と同様に、鋳型Ａ、プライマーセットＡ、プローブＤＮＡ（Ａ）に加え、鋳型Ｂ、プライマーセットＢ、プローブＤＮＡ（Ｂ）を準備した。
【表６】
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【０１２６】
＜塩濃度調節機構一体化ＤＮＡチップの作製＞
図３、より具体的には図４に示されるような電気化学的な検出方法のＤＮＡチップを作製した。例１と同様の方法でプローブＤＮＡ（Ａ）および（Ｂ）をそれぞれスポッティングと乾燥により固定化し、プローブ固定化電極を得た。その後、図５に示すように、１．６Ｕの酵素、２００μＭのＦＩＰ、ＢＩＰ、Ｆ３、Ｂ３、ＬＰプライマーを、それぞれ０．１μＬ、０．１μＬ、０．０１２５μＬ、０．００１２５μＬおよび０．０５μＬで含む溶液をスポットし、熱乾燥法にて固定化した。このとき、プライマーセットＡは核酸プローブＡの近傍に、プライマーセットＢは核酸プローブＢの近傍に固定化した。次に、それぞれの核酸プローブの近傍に２０×ＳＳＣをスポットし熱乾燥させた。その後、キャンデリラワックスで２０×ＳＳＣを被覆した。コントロールとして、２０×ＳＳＣおよびキャンデリラワックスを固定化しない同様のチップを作製した。次にＤＮＡチップに対して被覆体を装着した。被覆体により構成される空間は反応容器として機能する。被覆体はシリコンゴムを用いた。
【０１２７】
＜増幅＞
プライマー、酵素以外の増幅試薬および鋳型を予めシリコンゴムに設けられた穴から反応容器内に注入し、被覆体の穴に蓋をした後、６２℃で１時間増幅反応を行った。鋳型、増幅試薬の濃度は、例1と同様の濃度となるように調製した。その後、９５℃５分熱をかけて被覆しているワックスを溶解し、塩をリリース（即ち、溶出）させた。
【０１２８】
＜検出＞
ハイブリダイゼーションおよび検出は例１と同様の条件で行った。
【０１２９】
＜結果＞
図１０に示すように２０×ＳＳＣおよびキャンデリラワックスで塩濃度を調節する機構を備えたＤＮＡチップ（図１０の２）は、塩濃度を調製しない場合（図１０の１）と比較して、高い陽性信号が検出された。
【０１３０】
ワックスの使用により、同一の反応場において、増幅反応とハイブリダイズ反応を連続して行うことが可能となることが明らかになった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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