(57)【要約】【課題】収容されている固相状試薬の試薬組成の識別がより容易にできる化学反応用マイクロチップ及び当該化学反応用マイクロチップの製造方法を提供すること。【解決手段】試薬組成が外観的に識別可能な固相状の試薬が収容されている化学反応用マクロチップ；試薬組成が外観的に識別可能な固相状の試薬を収容することを含む化学反応用マクロチップの製造方法。これにより、マイクロチップのウェル内に収容されている固相状試薬の試薬組成の識別がより容易することが可能である。【選択図】図１
2014011974.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試薬組成が外観的に識別可能な固相状の試薬が収容されている化学反応用マクロチップ。
【請求項２】
前記固相状の試薬が、化学反応を行う反応領域に少なくとも２つ以上収容されている請求項１記載の化学反応用マクロチップ。
【請求項３】
前記固相状の試薬は、その形状及び／又は色調にて試薬組成が識別可能なものである請求項１又は２記載の化学反応用マクロチップ。
【請求項４】
前記固相状の試薬は、その外周部分及び／又は表面部分にて試薬組成が識別可能なものである請求項３記載の化学反応用マクロチップ。
【請求項５】
前記外周部分が、試薬の角及び／又は辺の数である請求項４記載の化学反応用マクロチップ。
【請求項６】
前記固相状の試薬は、着色料を含有させることにて試薬組成が識別可能なものである請求項３記載の化学反応用マイクロチップ。
【請求項７】
前記着色料が、色素及び／又はｐＨ指示薬である請求項６記載の化学反応用マクロチップ。
【請求項８】
前記固相状の試薬が、型枠成形されたものであるか、又は加圧成形さえたものである請求項３記載の化学反応用マクロチップ。
【請求項９】
前記化学反応が、核酸増幅反応、ハイブリダイゼーション反応、ＰＣＲ伸長反応、又は抗原抗体反応である請求項３記載の化学反応用マイクロチップ。
【請求項１０】
試薬組成が外観的に識別可能な固相状の試薬を収容することを含む化学反応用マクロチップの製造方法。
【請求項１１】
化学反応の反応領域に少なくとも２つ以上の固相状の試薬を収容する請求項１０記載の化学反応用マクロチップの製造方法。
【請求項１２】
形状及び／又は色調で識別可能な固相状の試薬を収容する請求項１０又は１１記載の化学反応用マクロチップの製造方法。
【請求項１３】
外周部分及び／又は表面部分にて試薬組成を識別可能な固相状の試薬を収容する請求項１２記載の化学反応用マクロチップの製造方法。
【請求項１４】
着色料にて試薬組成を識別可能な固相状の試薬を収容する請求項１２記載の化学反応用マクロチップの製造方法。
【請求項１５】
型枠成形された又は加圧成形された固相状の試薬を収容する請求項１２記載の化学反応用マクロチップの製造方法。
【請求項１６】
収容された固相状の試薬をその外観にて試薬の組成を判定することを含む請求項１０記載の化学反応用マイクロチップの製造方法。
【請求項１７】
前記外観が、固相状の試薬の形状及び／又は色調である請求項１６記載の化学反応用マイクロチップの製造方法。
【請求項１８】
収容された固相状の試薬の角及び／又は辺の数にて、試薬の組成を判定する請求項１７記載の化学反応用マイクロチップの製造方法。
【請求項１９】
収容された固相状の試薬の着色料にて、試薬の組成を判定する請求項１７記載の化学反応用マイクロチップの製造方法。
【請求項２０】
前記化学反応が、核酸増幅反応、ハイブリダイゼーション反応、ＰＣＲ伸長反応、又は抗原抗体反応である請求項１２記載の化学反応用マイクロチップの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、化学反応用マイクロチップの製造方法に関する。より詳しくは、核酸増幅反応等の化学反応の反応場となるウェル内に、反応に必要な１種類以上の物質を含む固化された試薬が収容された化学反応用マイクロチップに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、半導体産業における微細加工技術を応用し、シリコンやガラス製の基板上に化学的及び生物学的分析を行うためのウェルや流路を設けたマイクロチップが開発されてきている。これらのマイクロチップは、例えば、液体クロマトグラフィーの電気化学検出器や医療現場における小型の電気化学センサなどに利用され始めている。
【０００３】
このようなマイクロチップを用いた分析システムは、μ−ＴＡＳ（ｍｉｃｒｏ−Ｔｏｔａｌ−Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ）やラボ・オン・チップ、バイオチップ等と称され、化学的及び生物学的分析の高速化や高効率化、集積化あるいは、分析装置の小型化を可能にする技術として注目されている。μ−ＴＡＳは、少量の試料で分析が可能なことや、マイクロチップのディスポーザブルユーズ（使い捨て）が可能なことから、特に貴重な微量試料や多数の検体を扱う生物学的分析への応用が期待されている。
【０００４】
μ−ＴＡＳの応用例として、マイクロチップ上に配設された複数の領域内に物質を導入し、該物質を化学的に検出する光学検出装置がある。このような光学検出装置としては、例えば、マイクロチップ上のウェル内で核酸増幅反応等の複数の物質間の反応を進行させ、生成する物質を光学的に検出する反応装置（例えばリアルタイムＰＣＲ装置）などがある。
【０００５】
従来、マイクロチップ型の核酸増幅装置では、核酸増幅反応に必要な試薬及び鋳型ＤＮＡを予め全て混合し、この混合液をマイクロチップに配設された複数のウェル内に導入して反応を行う方法が取られている。しかし、この方法では、ウェル内に混合液が導入されるまでに一定の時間が必要であるため、その間に混合液内で反応が進行し、非特異的な核酸増幅を容易にし、定量性を低下させてしまう問題が生じていた。
この問題に対し、例えば、特許文献１には、ウェルに核酸増幅反応に必要な複数の試薬が所定の順序で積層されて固着化されたマイクロチップが提案されている。一例として、基板層ａ１の成形、ウェルへの酵素固着化、ウェルへのプライマーの固着化、基板層ａ１，ａ２表面の活性化、これら基板層の貼り合わせにて、固相状の試薬が各ウェルに収容されたマイクロチップが製造されることが開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１１−１６０７２８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、ウェルに収容されている各試薬の試薬組成の識別が難しくなる。そこで、本開示は、収容されている固相状試薬の試薬組成の識別がより容易にできるマイクロチップ及び当該マイクロチップの製造方法を提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題解決のため、本開示は、試薬組成が外観的に識別可能な固相状の試薬が収容されている化学反応用マクロチップを提供する。
前記固相状の試薬が、化学反応を行う反応領域に少なくとも２つ以上収容されてもよい。
前記固相状の試薬は、その形状及び／又は色調にて試薬組成が識別可能なものでもよい。
前記固相状の試薬は、その外周部分／又は表面部分にて試薬組成が識別可能なものでもよい。
前記外周部分が、試薬の角及び／又は辺の数でもよい。
前記固相状の試薬は、着色料を含有させることにて試薬組成が識別可能なものでもよい。
前記着色料が、色素及び／又はｐＨ指示薬でもよい。
前記固相状の試薬が、型枠成形されたものであるか、又は加圧成形さえたものでもよい。
前記化学反応が、核酸増幅反応、ハイブリダイゼーション反応、ＰＣＲ伸長反応、抗原抗体反応のいずれかでもよい。
【０００９】
また、本開示は、試薬組成が外観的に識別可能な固相状の試薬を収容することを含む化学反応用マクロチップの製造方法を提供する。
化学反応の反応領域に少なくとも２つ以上の固相状の試薬を収容してもよい。
形状及び／又は色調で識別可能な固相状の試薬を収容してもよい。
外周部分／又は表面部分にて試薬組成を識別可能な固相状の試薬を収容してもよい。
着色料にて試薬組成を識別可能な固相状の試薬を収容してもよい。
型枠成形された又は加圧成形された固相状の試薬を収容してもよい。
【００１０】
また、本開示は、収容された固相状の試薬をその外観にて試薬の組成を識別する方法を提供する。当該識別方法を、前記酸増幅反応用マクロチップの製造方法に含んでもよい。
前記外観が、固相状の試薬の形状及び／又は色調でもよい。
収容された固相状の試薬の角及び／又は辺の数にて、試薬の組成を判定してもよい。
収容された固相状の試薬の着色料にて、試薬の組成を判定してもよい。
前記化学反応が、核酸増幅反応、ハイブリダイゼーション反応、ＰＣＲ伸長反応、抗原抗体反応のいずれかでもよい。
【発明の効果】
【００１１】
本開示により、収容されている固相状試薬の試薬組成の識別がより容易にできる化学反応用マイクロチップ及び当該化学反応用マイクロチップの製造方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本開示の第一実施形態に係るマイクロチップ１の構成を説明するための模式図である。
【図２】マイクロチップ１のウェル４内の試薬Ｒの例示を説明するための模式図である。
【図３】マイクロチップ１の製造方法を説明するためのフローチャートである。
【図４】マイクロチップ１に収容されている固相状の試薬Ｒの識別方法を示すフローチャートである。
【図５】マイクロチップの製造方法におけるマイクロチップ１に収容されている固相状の試薬Ｒの識別方法Ｓ４を示すフローチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本開示を実施するための好適な形態について説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本開示の代表的な実施形態を示したものであり、これにより本開示の範囲が狭く解釈されることはない。説明は以下の順序で行う。
１．本開示の第一実施形態に係る化学反応用マイクロチップの構成
２．本開示の第一実施形態に係る化学反応用マイクロチップの製造方法
【００１４】
１．本開示の第一実施形態に係る化学反応用マイクロチップの構成
図１は、本開示の第一実施形態に係るマイクロチップ１ａの構成を説明する模式図である。図１Ａは上面模式図であり、図１Ｂは、図１ＡのＰ−Ｐ断面に対応する断面模式図である。
【００１５】
図中符号１ａで示す化学反応用マイクロチップ（以下、「マイクロチップ」ともいう）には、導入部２と、核酸増幅反応等の化学反応を行う反応場を有する各反応領域４と、導入部２と各反応領域４とを接続する流路３が設けられている。当該反応領域４には、後述するように、核酸増幅反応等の化学反応に必要な物質の少なくとも一部を含む固相状の試薬Ｒが収容されている。また、当該反応領域内に、流体が移動可能な間仕切り等を設けることで、核酸増幅反応等の化学反応を行う反応場を複数設けることも可能である。例えば、これら複数の反応場に、目的とする検出対象を検出可能な試薬組成を含む固相状試薬を収容する。試薬組成として、例えば、目的とする検出対象と特異的に結合又は反応する同一の物質（抗原抗体やプライマー等）が挙げられる。これにより、同じ反応領域内に同一又は別々の固相状試薬を複数収容する場合でも、反応領域での固相状試薬の偏りが少なくなり、測定の際に試薬が均一に溶解しやすくなる。
上述の構成により、外部からの試料溶液等の液体を、導入部２から導入させ、流路３１〜３５を通過させ、各反応領域４に流入させることが可能となる。そして、流入させた液体により試薬を溶解させた後、核酸増幅反応等の化学反応を行い、核酸増幅反応等の化学反応の測定を行う。この測定に際し、反応領域４に光を照射し、所望の光検出（例えば、蛍光検出、濁度検出、光透過検出等）を行うことも可能である。
なお、図１及びその説明においては、流路３１により試料溶液が供給される複数の反応領域（以下、「ウェル」ともいう）４を一群としてウェル４１とする。同様に流路３２，３３，３４，３５により試料溶液が供給される複数のウェル４のそれぞれの一群を、ウェル４２，４３，４４，４５として説明する。また、試料溶液とは、核酸増幅反応において増幅の対象となる鋳型核酸であるＤＮＡやＲＮＡ等の核酸を含む溶液を指す。
また、長手方向（Ｘ正負方向）、短手方向（Ｙ正負方向）及び厚み方向（Ｚ正負方向）を定義する。
【００１６】
本開示に係るマイクロチップを用いて行う「化学反応」については、化学的及び／又は生物学的分析が可能な化学反応が望ましい。
この化学反応において、化学物質（生理活性物質等）、タンパク質、ペプチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、抗原、抗体、微生物、ウイルス及びホルモン等並びに各断片等の、あらゆる物質が測定対象となり得る。測定試料としては、細胞、培養物、核酸増幅物、組織、体液、尿、血清及び生検試料等の生体に関連する試料が望ましい。
「化学反応」は、測定対象を反応させて検出することが可能な公知の化学反応方法を用いて行えばよい。「化学反応」として、例えば、核酸増幅反応、相補的な核酸同士のハイブリダイゼーション反応、ＰＣＲ伸長反応、抗原抗体反応等が挙げられる。また、化学反応における標識法は特に限定されないが、例えば、蛍光物質、放射性物質、酵素等から選ばれる１種又は２種以上のものを用いる標識法が挙げられる。
なお、「核酸増幅反応」については、温度サイクルを実施する従来のＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）法や、温度サイクルを伴わない各種等温増幅法が含まれる。等温増幅法としては、例えば、ＬＡＭＰ（Loop-Mediated Isothermal Amplification）法、ＳＭＡＰ（SMartAmplification Process）法、ＮＡＳＢＡ（Nucleic Acid Sequence-Based Amplification）法、ＩＣＡＮ（Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids）法（登録商標）、ＴＲＣ（Transcription-Reverse transcription Concerted）法、ＳＤＡ（Strand Displacement Amplification）法、ＴＭＡ（Transcription-Mediated Amplification）法、ＲＣＡ（Rolling Circle Amplification）法等が挙げられる。この他、「核酸増幅反応」には核酸の増幅を目的とする、変温あるいは等温による核酸増幅反応が広く包含されるものとする。また、これらの核酸増幅反応には、リアルタイムＰＣＲ法などの増幅核酸の定量を伴う反応も包含される。
【００１７】
本開示で使用する固相状の試薬Ｒは、試薬組成が外観的に識別可能であり、各ウェル４に収容されている。これにより、固相状の試薬に含まれる目的とする化学反応に必要な試薬（反応試薬、検出試薬等）の種類、測定対象及び化学反応条件（反応及び検出法、反応温度、検出限界等）等の試薬情報を、より容易に視覚的に識別することが可能となる。
例えば、核酸増幅反応の場合、固相状の試薬に含まれるプライマーの種類、測定対象及び核酸増幅反応条件（増幅法、検出法、反応温度、検出限界等）等の試薬情報を、より容易に視覚的に識別することが可能となる。
なお、「視覚的に識別できる」とは、目視で識別できることの他、撮像装置等の装置にてモノの形状及び／又は色調を識別できることをいう。
【００１８】
近年、測定対象が数多くなる傾向にあることから、測定対象に応じた反応試薬をウェルごとに収容した化学反応用マイクロチップがユーザに望まれている。また、作業効率を向上させることから、複数の測定対象が同じチップで一緒に検出可能なように、ウェルごとで異なる反応試薬（特に異なるプライマー）を収容した化学反応用マイクロチップもユーザに望まれている。このように、ユーザの目的に応じて、化学反応用マイクロチップの種類を数多く幅広く提供することが求められている。
そして、作業効率向上や生産コスト低減のために、ウェル内に試薬液を入れて乾燥しているのが一般的であり、そのウェル形状に近い固相状の試薬がウェル内に収容されているのが一般的である。
このため、ウェル内に収容された反応試薬の試薬組成がどのようなものであるかの判断については、マイクロチップを製造する際では、製造の全工程をモニタリングすることや製造ラインを適宜変更すること等のような間接的な確認方法が用いられているのが実状である。さらに、エンドユーザが使用する際では、チップの包装容器などの組成表示の確認によって、この判断を行っているため、目的の測定対象と異なる反応試薬が収容されているマイクロチップを単純に取り違いすることもあるのが実状である。
このようなことから、化学反応用マイクロチップを製造する際に、又ユーザが使用する際に、マイクロチップのウェルに収容されている反応試薬の試薬組成の識別がより容易にできることが望まれている。
【００１９】
そこで、本発明者は、ウェルに収容される固相状の試薬はウェルの形状と同じにするのが一般的であったが、敢えて固相状の試薬の外観を変化させることに着目した。この外観的な変化に着目したことにより、収容されている固相状の試薬の組成を視覚的により容易に識別可能となった。このため、反応試薬をマイクロチップに封入する際に反応試薬の誤収容を判定することも可能となった。この試薬の外観の変化は、一見作業の手間を増やし、作業効率の低下等と思えるが、視覚的識別を可能としたことで誤収容の確認を容易とし、却って作業効率が向上し、また生産コストも低減する。また、製品の品質管理も容易となり、向上する。また、ユーザのマイクロチップの取り違いも、視覚的に確認可能となったため、低減させることができる。
さらに、製造ラインや反応装置・分析装置に、撮像装置又は撮像部と、反応試薬の試薬組成が外観的に識別可能とするプログラムを格納し、この識別方法を実現可能な制御部とを設けることも可能である。これにより、収容された反応試薬の試薬情報を取得することが可能となり、その試薬組成も容易に識別することが可能となる。そして、製造者やエンドユーザ等にその旨を表示することも可能となる。また、収容された反応試薬に応じた核酸増幅反応条件等の各種化学反応条件を、取得した試薬情報から反応装置等に自動的に設定し、作動させることも可能となる。
【００２０】
前記固相状の試薬Ｒは、固相状の試薬の形状及び／又は色調が視覚的に識別可能なものであることが好適である。
前記固相状の試薬Ｒには、測定対象を反応させて検出することができる必要な物質の少なくとも一部が含まれている。
また、本開示の核酸増幅反応の場合、固相状の試薬Ｒには、増幅核酸鎖を得るために必要な物質の少なくとも一部が含まれていることが好ましい。具体的には、増幅の対象であるＤＮＡ、ＲＮＡ等の塩基配列の少なくとも一部に相補的なオリゴヌクレオチドプライマー（以下「プライマー」ともいう）、核酸モノマー（ｄＮＴＰｓ）、酵素、反応緩衝液に含まれる成分などである。また、核酸増幅反応に直接必要ではないが、増幅した核酸鎖を検出するための蛍光標識等の標識を備えたプローブや、二本鎖の核酸にインターカレートする検出用試薬なども、増幅核酸鎖の検出に必要な物質として、試薬Ｒに含まれる成分とできる。
なお、この核酸増幅反応に使用可能な固相状の試薬Ｒは、ハイブリダイゼーション反応及び伸長反応の場合にも適宜利用することが可能である。
また、本開示の抗原抗体反応の場合には、免疫測定方法に使用可能な試薬組成を含む固相状の試薬Ｒであればよい。免疫測定方法としては、蛍光物質を含んでいる抗体と抗原を結合させる直接蛍光抗体法、蛍光物質を含んでいる抗体を抗原と結合している抗体に結合させる間接蛍光抗体法、エライザ法等が挙げられる。エライザ法には、競合法、サンドイッチ法、直接吸収法等が挙げられる。なお、本開示の抗原抗体反応において、目的とする測定対象が抗体等の場合には、これに反応する蛍光物質を含んでいる抗原又はその断片等にて検出してもよい。また、酵素で標識した抗体や抗原等と、酵素と反応して反応物質が発色する発色基質を使用にて検出してもよい。
【００２１】
視覚的に識別可能な固相状の試薬Ｒの「形状」は、特に限定されない。好ましくは、固相状の試薬の角及び／又は辺の数等の外周部分の形状；溝や印字等の表面部分の形状にて試薬組成を判定可能な固相状の試薬がウェル内に収容されていることが好適である。
ここでいう「角」とは、二つの線や面が出会って生じる外側に又は内側に尖った部分であるが、直角でなくても良く、丸み（Radius）がついていても良く、また星型の窪み部分でも良い。また、異なる形状とは、回転しても一致しない形状、上下反転しても一致しない形状が望ましい。
【００２２】
前記固相状の試薬Ｒの形状の例示として、図２に厚み方向からみた例示Ａ〜Ｉを示す。
前記固相状の試薬Ｒの外周部分の形状として、例えば、円状、楕円状、半円状、半楕円状、多角形状、Ｌ字状、Ｔ字状、Ｕ字状等が挙げられる。多角形状として、例えば、三角形、四角形、五角形、六角形、星型多角形等が挙げられる。
このように、固形状の試薬Ｒの外周部分の角及び／又は辺の数を異なるようにすることで、識別が容易に行い易くなるので好適である。
さらに前記固相状の試薬Ｒの表面（好適には厚み方向の表面）部分に、貫通又は未貫通の空間を単数又は複数形成してもよい。例えば、図２Ｊ及びＫに示すような、ドーナッツ形状の試薬や表面に溝を有する試薬等が挙げられる。また、図２Ｌに示すような、バーコード、文字、数字、記号等を、印刷や溝等によって試薬の表面に形成しても良い。
このように、外周部分及び表面部分に、それぞれ異なる識別のための情報を試薬に設けることができる。さらに、これらのうちから異なる２種以上の外観の形状を選択し、これら試薬をウェル内に収容することで、視覚的に多くの識別情報を設けることが可能となることから、試薬組成及び反応条件等をより容易に判断することが可能となる。
【００２３】
視覚的に識別可能な固相状の試薬Ｒの「色調」は、特に限定されない。当該色調調整のために、着色料を固相状の試薬に含ませることが好ましい。当該着色料としては、例えば色素（食用色素等）、ｐＨ指示薬等が挙げられる。これらを単独で又は組み合わせてもよい。これにより、表面に色調がある固相状の試薬をウェル内に収容することで、視覚的に試薬組成及び反応条件等をより容易に判断することが可能となる。
さらに、上述した形状と組み合わせることで、色調という異なる識別のための情報を試薬に設けることができるので、さらに視覚的に試薬組成及び反応条件等をより容易に判断することが可能となる。当該固相状の試薬を型枠成形又は加圧成形して得ることが、形状や色調を調整しやすいので、好適である。
【００２４】
前記色素としては、例えば、下記のような物質があるが、これらに限定されるものではない。
【００２５】
【表１】
2014011974.tif 000003
【００２６】
ｐＨ指示薬としては、例えば、下記のような物質があるが、これらに限定されるものではない。
【００２７】
【表２】
2014011974.tif 000004
【００２８】
前記着色料は、凍結乾燥前の液体状態の試薬に混合させてもよく、凍結乾燥後の粉体に混合させてもよい。また、前記着色料は、粉体の状態で試薬粉体と混合させてもよい。また、固相状の試薬Ｒの表面に、浸漬、噴霧等にて付着させてもよい。
常時、同じ色調を呈する色素であれば、その色調からマイクロチップのウェル内に収容された試薬の種類を視覚的に識別することが可能である。これにより、試薬組成及び反応条件等をより容易に判断することが可能となる。
また、ｐＨ指示薬であれば、成形後の固相状の試薬の状態と、測定時の試料溶液添加後のｐＨを相違する条件に設定することも可能となる。これにより、マイクロチップ内に試料溶液が注入されたことをより容易に判断することも可能となる。
【００２９】
さらに、前記着色料が吸収する波長を、核酸増幅反応等の化学反応に用いられる蛍光色素の検出波長に被らないように選択することが、核酸増幅反応等の化学反応の光学的な検出において望ましく、使用する蛍光色素に応じて前記着色料を適宜選択することも可能である。
蛍光色素の候補としては例えば下記のような物質があるが、これらに限定されるものではない。
【００３０】
【表３】
2014011974.tif 000005
【００３１】
例えば、Pacific BlueやLightCycler Cyan 500等（検出波長が４５０〜５００ｎｍ程度）の核酸増幅反応等の化学反応の検出用蛍光物質を用いる場合には、Brilliant Blue FCF、Indigo carmine、Xylene cyanol FFの紫色〜青色系の着色料を用いることが好ましい。
また、例えば、SYBR GreenIやBODIPY FL、FAM、Rhodamine等（検出波長が５００〜５７０ｎｍ程度）の核酸増幅反応等の化学反応の検出用蛍光物質を用いる場合には、Fast Green FCFの緑色系の着色料を用いることが好ましい。
また、例えば、TAMRAやx-rhodamine、Texas red等（検出波長が５７０〜６２０ｎｍ程度）の核酸増幅反応等の化学反応の検出用蛍光物質を用いる場合には、Tartrazine、Sunset Yellow FCF等の黄色〜橙色系の着色料を用いることが好ましい。
また、例えば、LightCycler Red 640やCy5等（検出波長が６２０〜７５０ｎｍ程度）の核酸増幅反応等の化学反応の検出用蛍光物質を用いる場合には、Amaranth、Erythrosine、Allura Red AC、Phloxine、rose bengal、Acid red 52、New Coccineの赤色系の着色料を用いることが好ましい。
【００３２】
また、ｐＨ指示薬を用いる場合、例えばＬＡＭＰ法（栄研化学）の場合、ｐＨは８．８程度（ｐＨ８．５〜９．０程度）で色調が変化する固相状の試薬をウェルに収容することが好ましい。そのとき、固相状の試薬を複数として、それぞれの試薬のｐＨを調整することが好ましい。
一例として、プライマーを含むＰＭ試薬をｐＨ８．０以下になるように調製し、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼを含むＲＭ試薬をｐＨ８．８又はそれ以上のｐＨになるように調製する。そして、試料溶液を導入後に、ＰＭ試薬、ＲＭ試薬及び試料溶液が混合した際にｐＨを８．８程度になるように固相状の試薬Ｒ１，Ｒ２・・・を設計する。これにより、ＰＭ試薬に含まれるｐＨ指示薬はｐＨが変化することによって色調の変化を生じる。
例えば、ＰＭ試薬をｐＨ７．５になるように調整し、指示薬としてThymol Blueを含有させておくと、ＰＭ試薬は黄色を呈する。この黄色のｐＭ試薬と、例えばTris-HClを用いてｐＨ８．８に調整したＲＭ試薬と一緒に、固相状の試薬Ｒ１，Ｒ２として、マイクロチップのウェルに収容する。これにより、試薬組成及び反応条件等をより容易に判断することが可能となる。
そこへ試料溶液を導入することで、サンプルとウェル内にあるＰＭ試薬及びＲＭ試薬とが混合され、ウェル内のｐＨが８．８程度になるとＰＭ試薬に含まれていたThymol Blueは緑色を呈するようになる。これにより、マイクロチップ内に試料溶液が注入されたことをより容易に判断することも可能となる。
なお、このとき、BODIPY FLやSYBR GreenIなどの（検出波長が５００〜５７０ｎｍ程度）ＬＡＭＰ法検出用の蛍光色素を用いれば、光学的な検出の妨げとなりにくいので、好ましい。
さらに、一例として、プライマーを含むＰＭ試薬およびまたはＢｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼを含むＲＭ試薬をｐＨ７．５もしくはそれ以下またはｐＨ９．５もしくはそれ以上のｐＨになるように調製する。そして、塩基性または酸性試料溶液を導入後に、ＰＭ試薬、ＲＭ試薬及び試料溶液が混合した際にｐＨを８．８程度になるように固相状の試薬Ｒ１，Ｒ２・・・を設計する。これにより、ＰＭ試薬に含まれるｐＨ指示薬はｐＨが変化することによって色調の変化を生じる。
例えば、ＰＭ試薬およびＲＭ試薬をｐＨ７．５になるようにTri-HClで調整し、指示薬としてThymol Blueを含有させておくと、ＰＭ試薬は黄色を呈する。
そこへ塩基性試料溶液を導入することで、サンプルとウェル内にあるＰＭ試薬及びＲＭ試薬とが混合され、ウェル内のｐＨが８．８程度になるとＰＭ試薬に含まれていたThymol Blueは緑色を呈するようになる。
また、ＰＭ試薬およびＲＭ試薬をｐＨ９．５になるようにTri-HClで調整し、指示薬としてThymol Blueを含有させておくと、ＰＭ試薬は青色を呈する。
そこへ酸性試料溶液を導入することで、サンプルとウェル内にあるＰＭ試薬及びＲＭ試薬とが混合され、ウェル内のｐＨが８．８程度になるとＰＭ試薬に含まれていたThymol Blueは緑色を呈するようになる。
【００３３】
このように、固相状の試薬の色調を調整すること（例えば、着色料にて着色して色調を調整すること等）によって、製造時に固相状の試薬の組成が容易に識別でき、マイクロチップ内の試薬配置も容易に確認できるようになる。さらに、試料溶液のマイクロチップへの注入時における試薬の混合状態も容易に確認することができる。
また、含有させる着色料の濃度は、視覚的に認識することができ、かつ核酸増幅法等の化学反応を阻害しない濃度であれば特に限定されない。核酸増幅反応等の化学反応用マイクロチップのウェルにおける最終濃度が、０．０１〜０．０００１質量％となること好ましいが、これに限定されるものではない。
【００３４】
さらに、前記固相状の試薬Ｒは、核酸増幅反応等の化学反応の反応領域内に少なくとも２つ以上収容されていることが好適である。このとき、例えば、図１のウェル４５に示すように、各ウェル４内に、厚み方向に固相状の試薬Ｒ１，Ｒ２が積層されている状態でもよい。また、図１のウェル４２に示すように、各ウェル４内に、平面方向で固相状の試薬Ｒ３，Ｒ４が複数配置されている状態でもよい。なお、本開示のマイクロチップは、核酸増幅等の化学反応の反応場である反応領域で核酸増幅等の化学反応の反応と検出を行うことは可能であり、反応と検出を同じ場で行うことにより、リアルタイム測定の精度が良好となる。
さらに、反応領域内には、同一の試薬組成の固相状の試薬及び／又は異なる試薬組成の固相状の試薬が、複数収容されていることが好適である。これにより、さらに、固相状の試薬に含まれる目的とする化学反応に必要な試薬（反応試薬、検出試薬等）の種類、測定対象及び化学反応条件（反応法、検出法、反応温度、検出限界等）等の試薬情報を、より容易に視覚的に識別することが可能となる。また、核酸増幅反応等のプライマーを用いる反応の場合、固相状の試薬に含まれるプライマーの種類、測定対象及び核酸増幅反応条件（増幅方法、反応温度、検出限界等）も視覚的に識別することが容易となる。また、測定時の反応進行状況も、２つ以上の試薬の組み合わせによる溶液の色調変化にて、視覚的に識別しやすくなる。
なお、本開示において固相状の試薬に使用するプライマーの数は、ある塩基配列からなるプライマーに対し、異なる塩基配列を含むプライマーは、一対のプライマーセットであっても別の種類のプライマーとしてカウントする。
【００３５】
前記固相状の試薬Ｒを１つの反応領域に複数収容する際に、１つの核酸増幅反応等の化学反応を目的としてその核酸増幅反応等の化学反応に必要な試薬組成の成分を２つ又はそれ以上に分けた固相状の試薬Ｒ１，Ｒ２，・・・を配置してもよい。
例えば、組み合わせることで反応を起こす各成分を分けて、それぞれ固相状の試薬Ｒ１，Ｒ２，・・・と２つ以上の固相状の試薬になるように調製して同一の反応場であるウェル内に収容することが望ましい。
核酸増幅反応の場合、プライマーを含んで酵素を含まない固相状の試薬Ｒ１と、酵素を含んでプライマーを含まない固相状の試薬Ｒ２とを調製して同一の反応場であるウェル内に収容することが可能である。
これにより、試料溶液がウェル内に導入されるまでに２つ以上の試薬が混合されないため、混合による副生成物の発生を抑制することが可能となり、これにより精度の高い分析が可能となる。例えば、副生成物として、酵素とダイマーが混合することによって発生するライマーダイマーが挙げられるが、２つ以上の試薬に分けることでプライマーダイマーによる核酸の非特異的な増幅が抑えられるため、精度の高い分析が可能となる。
【００３６】
前記固相状の試薬Ｒを１つの反応場に複数収容する際に、複数の測定対象を検出することを目的として異なる試薬組成の固相状の試薬を２種類又はそれ以上配置してもよい。これにより、視覚的にどのようなターゲットであるかを識別することが容易となる。なお、副生成物の発生を抑制するために、試薬組成をプライマーと酵素等とに分けてもよい。
【００３７】
通常であれば、ウェル内に固相状の試薬を複数収容した場合、これらがどのような試薬組成であるか理解することは困難である。これに対し、本開示の固相状の試薬を用いることによって、視覚的にどのような試薬組成から構成されているかを識別することが容易となる。そして、本開示であれば、複数の試薬が存在しても、マイクロチップの厚み方向（例えば上方及び／又は下方）から識別することが可能である。これにより、目視にて試薬組成を識別することも可能であるし、予め試薬組成及び反応条件等を判断するためのプログラミング等を制御部に格納することで、マイクロチップ製造の際や核酸増幅反応等の化学反応の際に試薬組成や反応条件等を判断することも可能である。
【００３８】
本開示で使用する固相状の試薬Ｒを製造するには、試薬液を乾燥して固化して成形するか、粉体の試薬原料から成形すること等が可能である。
乾燥方法としては、例えば、凍結乾燥が好適である。また、凍結乾燥には、予備凍結、一次乾燥（昇華凍結）、二次乾燥（結合水の除去）の各工程を含むことが好ましい。
予備凍結においては、凍結温度は共晶点（試薬液が凍結する温度）以下であれば良いが、酵素の失活の防止や試薬液を完全に凍結させる目的のために−４０℃程度で凍結させることが望ましい。一次乾燥においては、予備凍結工程で凍結させた試薬液を乾燥させる。この時、試薬液を共晶点以下で乾燥させることにより、乾燥途中での溶解が防止され、試薬液に含まれる水分を昇華させることが可能となる。一次乾燥における真空度は、例えば１００Ｐａ以下であることが望ましい。１００Ｐａにおける水の沸点は約−２０℃であるため、上述した試薬液の共晶点に近く、乾燥途中の試薬液の溶解が防止される。一次乾燥の真空度は、調製した試薬液の共晶点に応じて、適切な値を選択すれば良い。二次乾燥では、一次乾燥後の試薬液に含まれる成分に付いている分子状態の水を除去する。試薬液に含まれる成分の失活、変性等が起こらない程度の温度まで加熱し、試薬液の乾燥度を高めても良い。
【００３９】
また、凍結乾燥後に、溶解速度が低下しない程度に、打錠機等で圧力を加えることで押し固めても良い。
溶解性を維持しつつ成型するために、試薬液に、賦形剤、崩壊剤、結合剤、潤沢剤など通常錠剤に使用される添加剤を加えてもよい。賦形剤として、Ｄ−マンニトール、グリセリン、乳糖、デンプン、デキストリン、白糖、結晶セルロースが挙げられる。結合剤として、デンプン糊、ヒドロキシプロピルセルロースが挙げられる。崩壊剤として、クロスポビドン、カルメロース、カルメロースカルシウム、ヒドロキシプロピルセルロース、結晶セルロース、粉末セルロース、トウモロコシデンプン、キシリトール、潤沢剤として、ステアリン酸マグネシウムなどが挙げられる。これらの添加物は核酸増幅反応等の化学反応に影響を与えないものが適する。
【００４０】
また、固相状の試薬Ｒは、粉体にした試薬から打錠機等で成形してもよい。
粉体にする手法としては、流動層造粒、高速撹拌造粒、乾式造粒、噴霧乾燥（スプレードライ）、凍結乾燥等が挙げられる。粉体の成型には打錠法やモールディング法が考えられる。粉体にする際に、核酸増幅反応等の化学反応に必要な物質を少なくとも含む試薬に、上述の通常錠剤に使用される添加剤を混ぜ合わせることが望ましい。
直接打錠法では、上述した異なる平面形状の鋳型に一定量入れ、最適な圧力を加えることで固形化させる。固形化後も溶解性を維持するために、上述の賦形剤、崩壊剤、糖類等を加えてもよい。
モールディング法においては、薬物を含む混合末を水または水／アルコールバインダーで造粒し、湿潤したまま低圧打錠する。その後、溶剤を蒸発させて細孔を多くする。
【００４１】
なお、図１のウェル４１及び４３に示すように、ウェル群全てを同じ外観の固相状の試薬Ｒ５，Ｒ６にしてもよく、またウェル４４に示すように、ウェル４ごとに異なる固相状の試薬Ｒ７，Ｒ８としてもよい。これにより、同じ測定対象で検体数を数多くする場合や異なる測定対象を数多くする場合に対応することが可能である。
また、図１のウェル４５に示すように、異なる形状の固相状試薬Ｒ１，Ｒ２を積層してウェル４に収容してもよい。また、ウェル４２に示すように、異なる色調の固相状試薬Ｒ３，Ｒ４を平面方向に配置してウェル４に収容してもよく、また、異なる色調及び／又は形状の固相状の試薬Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３，Ｒ４，・・・を厚み方向及び／平面方向でウェルに配置してもよい。これにより、複数の測定対象を測定する場合や測定対象に応じて細かな条件設定を行う場合でも対応することが可能となる。なお、便宜上、図１において、固相状の試薬Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３，Ｒ４，・・・としているが、これにより固相状の試薬Ｒの外観が限定されるものではない。
【００４２】
マイクロチップ１ａは、導入部２、流路３１〜３５及びウェル４１〜４５が形成された基板層１２に基板層１１が貼り合わされ、さらに基板層１１に基板層１３が貼り合わされることにより構成されている（図１（Ｂ）参照）。マイクロチップ１ａでは、基板層１１と基板層１２との貼り合わせを大気圧に対して負圧下で行った場合、導入部２、流路３１〜３５、ウェル４１〜４５の内部を大気圧に対して負圧（１／１００気圧）となるように気密に封止することができる。マイクロチップ１ａにおいて、試料溶液が導入される領域を大気圧に対し負圧とすることにより、試料溶液の導入時にマイクロチップ内部の陰圧によって試料溶液が吸引され、微細な流路構造が形成されたマイクロチップ１ａの内部への試料溶液の導入が、より短時間で行えるようになる。
【００４３】
基板層１１，１２，１３の材料は、ガラスや各種プラスチック類が挙げられる。好ましくは、基板層１２，１３をガス不透過性を備える材料で構成する。マイクロチップ１ａの外面を構成する基板層１２，１３をＰＣなどのガス不透過性を備える材料とすることで、ウェル４１〜４５内に導入された試料溶液が、核酸増幅反応等の化学反応における加熱によって気化し、基板層１１を透過して消失（液抜け）するのを防止できる。また、マイクロチップ１ａの試料溶液が導入される領域を、大気圧に対し負圧として気密に封止した場合には、マイクロチップ１ａ外からの空気の浸透を防いで内部の負圧を保持するためにも、基板層１２，１３をガス不透過性を備える材料で構成することが好ましい。
【００４４】
ガス不透過性を備える基板層の材料は、ガラス、プラスチック類、金属類及びセラミック類などが採用できる。プラスチック類としては、ＰＭＭＡ（ポリメチルメタアクリレート：アクリル樹脂）、ＰＣ（ポリカーボネート）、ＰＳ（ポリスチレン）、ＰＰ（ポリプロピレン）、ＰＥ（ポリエチレン）、ＰＥＴ（ポリエチレンテレフタレート）、ジエチレングリコールビスアリルカーボネート、ＳＡＮ樹脂（スチレン−アクリロニトリル共重合体）、ＭＳ樹脂（ＭＭＡ−スチレン共重合体）、ＴＰＸ（ポリ（４−メチルペンテン−１
））、ポリオレフィン、ＳｉＭＡ（シロキサニルメタクリレートモノマー）−ＭＭＡ共重合体、ＳｉＭＡ−フッ素含有モノマー共重合体、シリコーンマクロマー（Ａ）−ＨＦＢｕＭＡ（ヘプタフルオロブチルメタクリレート）−ＭＭＡ３元共重合体、ジ置換ポリアセチレン系ポリマー等が挙げられる。金属類としては、アルミニウム、銅、ステンレス（ＳＵＳ）、ケイ素、チタン、タングステン等が挙げられる。セラミック類としては、アルミナ（Ａｌ２Ｏ３）、窒化アルミ（ＡｌＮ）、炭化ケイ素（ＳｉＣ）、酸化チタン（ＴｉＯ２）、酸化ジルコニア（ＺｒＯ２）、石英等が挙げられる。
【００４５】
基板層１１は、弾性を有する材料で構成されることが好ましい。マイクロチップ１ａにおいて、導入部２を封止する基板層１１を、弾性を有する材料とすることによって、針などの穿刺部材の一部をマイクロチップ１ａ外部から導入部２に穿通することが可能となる。針を接続したシリンジ等に予め試料溶液を充填しておき、基板層１１をその針で穿通すると、封止されていた導入部２がシリンジ内部とだけ接続されて、気泡を生じることなく試料溶液のマイクロチップ１ａ内への導入が可能となる。
【００４６】
また、試料溶液が導入される領域を、大気圧に対し負圧として気密に封止した場合には、針の先が導入部２に到達した時点で、マイクロチップ１ａ外部と導入部２との圧力差によって、シリンジ内の試料溶液は、導入部２へ自動的に吸引される。
【００４７】
基板層１１を弾性を有する材料により形成しておくことで、試料溶液導入後、針を導入部２から抜いた際、基板層１１の自己封止性により穿刺箇所が自然に封止されるようにできる。本開示においては、基板層の弾性変形による針の穿刺箇所の自然封止を、基板層の「自己封止性」と定義するものである。
【００４８】
弾性を有する基板層の材料としては、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）等のシリコーン系エラストマーの他、アクリル系エラストマー、ウレタン系エラストマー、フッ素系エラストマー、スチレン系エラストマー、エポキシ系エラストマー、天然ゴムなどが挙げられる。
【００４９】
なお、本開示に係るマイクロチップ１ａの各ウェルに保持された物質を、光学的に分析する場合においては、各基板層の材質には、光透過性を有し自家蛍光が少なく波長分散が小さいことで光学誤差の少ない材料を選択することが好ましい。
【００５０】
２．本開示の第一実施形態に係る化学反応用マイクロチップの製造方法
マイクロチップ１ａの製造方法について、図３に示すフローチャートを参照して説明する。本開示の製造方法は、固相状の試薬Ｒを収容すること、及び基板層を貼り合わせることを含むものである。そして、収容される固相状の試薬Ｒは、予め調製されたものを収容させてもよく、基板層のウェル部分で調製して収容させてもよいが、前者の方が、所望に応じて、固相状の試薬の形状及び色調を調整しやすいので好適である。
さらに、収容後又は貼り合わせ後に、反応領域内に存在する固相状の試薬Ｒの外観から、この試薬組成を識別することを含むことが好ましい。これにより、収容された試薬に誤りがないか否かを判定することが可能となる。
上記のプロセスから、本開示の化学反応用マイクロチップを得ることができる。
なお、以下に、基板層の成形、固相状の試薬Ｒの調製、固相状の試薬Ｒの収容、基板層の貼り合わせの順に説明するが、収容前に、基板層の成形及び固相状の試薬Ｒの調製が出来ていれば良いので、これらの順序はいずれが先でも良い。
【００５１】
（１）基板層の成形
図３中、符号Ｓ１は、基板層を成形することである。本Ｓ１では、基板層１２に、導入部２、流路３１〜３５、ウェル４１〜４５を成形する。基板層１２への導入部２等の成形は、公知の手法によって行うことができる。例えば、ガラス製基板層のウェットエッチング又はドライエッチングによって、あるいはプラスチック製基板層のナノインプリント、射出成型又は切削加工である。また、導入部２等は、基板層１１に成形されても良く、あるいは基板層１１に一部を、基板層１２に残りの部分を成形させても良い。
【００５２】
（２）固相状の試薬の調製
図３中、符号Ｓ２は、固相状の試薬Ｒを調製することである。本Ｓ２は、試薬原料の調製、試薬の固化成形を含む。試薬原料の調製として、試薬液を調製すること及び試薬粉末を調製すること等が挙げられる。また、試薬の固化成形として、例えば、凍結乾燥・型枠成形すること及び加圧成形すること等が挙げられる。
【００５３】
（i）試薬原料の調製
（i-a）試薬液の調製では、マイクロチップ１ａに収容する試薬Ｒの組成に合わせ、液状又はゲル状の試薬液を調製する。試薬液には、核酸増幅反応等の化学反応に必要な物質のうち少なくとも一部が含まれていれば良い。また、上述の、着色料、賦形剤、結合剤、崩壊剤、潤沢剤等を含ませても良い。試薬液や、そこに加えられるプライマー溶液や酵素溶液は、冷温に保持されることが好ましい。
（i-b）試薬粉体の調製では、上述の調製した試薬を乾燥等して粉体にしてもよく、また粉体状の各原料（着色料、賦形剤、結合剤、崩壊剤、潤沢剤等）を混合して調製してもよい。
【００５４】
（ii）試薬の成形
試薬の成形は、所望の外観になるように成形できれば特に限定されないが、型枠成形及び加圧成形が好ましい。
（ii-a）乾燥・型枠成形では、上述で調製された試薬液を固化用型枠容器に入れて乾燥させ、試薬液を固化させ、本開示の外観にて識別可能な固相状態の試薬Ｒを作製することが好適である。当該固化用の型枠容器の材質は、後述の乾燥に耐えうるものが好ましい。
乾燥・型枠成形では、前記試薬液を固化用型枠容器に滴下すること、及び、当該型枠容器内の試薬液を乾燥することを含む。さらに、凍結乾燥後に所望の形状にするため、加圧成形を行うことを含んでも良い。
【００５５】
前記乾燥方法としては、特に限定されず、例えば、風乾燥、加熱乾燥、凍結乾燥等が挙げられ、このうち試薬の変性等が生じにくい凍結乾燥が好適である。また、凍結乾燥には、予備凍結、一次乾燥（昇華凍結）、二次乾燥（結合水の除去）の各工程を含むことが好ましい。予備凍結においては、凍結温度は共晶点（試薬液が凍結する温度）以下であれば良いが、酵素の失活の防止や試薬液を完全に凍結させる目的のために−４０℃程度で凍結させることが望ましい。一次乾燥においては、予備凍結工程で凍結させた試薬液を乾燥させる。この時、試薬液を共晶点以下で乾燥させることにより、乾燥途中での溶解が防止され、試薬液に含まれる水分を昇華させることが可能となる。一次乾燥における真空度は、例えば１００Ｐａ以下であることが望ましい。１００Ｐａにおける水の沸点は約−２０℃であるため、上述した試薬液の共晶点に近く、乾燥途中の試薬液の溶解が防止される。一次乾燥の真空度は、調製した試薬液の共晶点に応じて、適切な値を選択すれば良い。二次乾燥では、一次乾燥後の試薬液に含まれる成分に付いている分子状態の水を除去する。試薬液に含まれる成分の失活、変性等が起こらない程度の温度まで加熱し、試薬液の乾燥度を高めても良い。
その後、固化用型枠容器内に形成された固形状の試薬Ｒを型枠から取出す。
【００５６】
（ii-ｂ）粉末・加圧成形
上述で調製された試薬に、上述の着色料及び通常錠剤に使用される添加剤などを適宜含ませた後に粉体に調製した後、加圧成形し、本開示の外観にて識別可能な固相状態の試薬Ｒを作製することが好適である。
【００５７】
（３）固相状の試薬の収容
図３中、符号Ｓ３は、本開示の固相状の試薬Ｒを収容することである。本Ｓ３では、単数又は複数の固形状の試薬Ｒを、基板層を成形する際に形成された反応場であるウェル４内に収容する。このとき、１つのウェル内に複数の固相状の試薬Ｒ１，Ｒ２，・・・を収容してもよい。本開示の固相状の試薬Ｒは、上述「１．本開示の第一実施形態に係る化学反応用マイクロチップの構成」で説明したとおりである。
【００５８】
（４）固相状の試薬の組成の識別
図３中、符号Ｓ４は、固相状の試薬Ｒをその外観にて視覚的に試薬組成を識別することである。この視覚的に識別することは、例えば、目視又は撮像装置等にて確認し、その試薬の組成を識別しても良い。本開示の固相状の試薬Ｒの外観（形状、色調）の定義は、上述「１．本開示の第一実施形態に係る化学反応用マイクロチップの構成」で説明したとおりである。
固相状の試薬Ｒの試薬組成の識別方法及びこの試薬情報の取得方法について、図４及び５を参照し説明するが、これに限定されるものではない。また、当該識別方法及び取得方法は、マイクロチップの製造方法以外に使用することが可能である。
撮像装置等の装置にて、マイクロチップのウェル４に収容された固相状の試薬Ｒの撮像画像データを取得することが可能となる。この撮像画像データに基づき、その試薬組成を識別する場合、固相状の試薬Ｒの外観（形状及び／又は色調）のマスターとなる画像データ及びその試薬情報を予め装置の記憶部等に登録しておく（Ｓ４１）。試薬形状と試薬色調のマスターとなる画像データ及び試薬情報は分けて登録しておき、必要に応じて制御部等にて合成すればよい。
なお、試薬情報とは、「１．本開示の第一実施形態に係る化学反応用マイクロチップの構成」で説明したとおりである。上述のとおり核酸増幅反応の場合には、固相状の試薬に含まれるプライマーの種類、測定対象及び核酸増幅反応条件（増幅方法、反応温度、検出限界等）等が挙げられる。
【００５９】
そして、基板層の貼り合わせ前に、各ウェルに収容された固相状の試薬Ｒを撮像装置にて撮影し、各固相状の試薬Ｒの撮像画像データを取得する（Ｓ４２）。この撮像画像データを、登録されているマスターの画像データと照合する（Ｓ４３）。この照合で一致したマスターの画像データに対応する試薬情報を取り出し、収容された各固相状の試薬Ｒの試薬情報とする。これにより、収容された各固相状の試薬Ｒの試薬組成等を識別する（Ｓ４４）。
収容された固相状の試薬Ｒの形状で試薬組成等を識別する場合には、試薬の角及び／又は辺の数等の試薬の外周部分の形状に基づき、また、試薬の表面部分の印字及び溝等の形状に基づき行う。撮像画像データの形状と、登録されたマスター画像データの形状と一致しているものを検索し、そのマスター画像データに対応する試薬情報を記憶部等から取り出す。そして、その試薬情報を固相状の試薬Ｒの試薬組成等としてモニター等に表示する。
収容された固相状の試薬の色調で識別する場合には、試薬表面の色調に基づき行う。撮像画像データの色調と、登録されたマスター画像データの色調と一致しているものを検索し、そのマスター画像データに対応する試薬情報を記憶部等から取り出す。そして、その試薬情報を固相状の試薬Ｒの試薬組成等としてモニター等に表示する。
さらに、撮像画像データの形状及び色調と、登録されているマスターの画像データの形状及び色調に基づき、そのマスター画像データの形状及び色調にそれぞれ対応する試薬情報を取り出す。それぞれの試薬情報を制御部等にて合成して、固相状の試薬Ｒの試薬組成等として表示することも可能である。
この判定結果に基づき、マイクロチップの基板表面、マイクロチップを包装する容器、取扱説明書等に、その試薬情報を印刷又は記録することも可能である。
【００６０】
また、製品の品質管理等をマイクロチップの製造の際に行う場合には、予めユーザが、判定装置等に、入力情報を入力し（Ｓ４００）、この入力情報に応じて、それに対応する試薬情報が読み出される（Ｓ４１０）。
当該入力情報としては、化学反応用マイクロチップを製造する際に収容する予定の固相状の試薬の外観（形状及び／又は色調）、それに対応する試薬組成等の試薬情報が挙げられる。そして、この入力情報は、各ウェルやウェル群ごとに適宜設定することも可能である。また、ユーザの入力情報に応じて、登録されているマスターデータから入力情報に合致するような試薬情報を合成してもよい。
ウェル内に収容された固相状の試薬Ｒを撮像し、この撮像画像データを取得する（Ｓ４２０）。この撮像画像データに基づき、ユーザの入力情報に基づき読み出されたマスター画像データとの照合を行う（Ｓ４３０）。ユーザの入力情報に基づく試薬の外観と、撮像された画像データの試薬の外観が一致するか否かを判定する（Ｓ４４０）。
入力情報の試薬の外観と撮像画像データの試薬の外観とが一致しない場合には、目的とする固相状の試薬がウェル内に収容されていないと判定する（ＮＯ）。そして、このマイクロチップを、後述の貼り合わせを行わずに、製造ラインから排除する（Ｓ４５０）。
また、入力情報の試薬の外観と撮像画像データの試薬の外観とが一致する場合には（ＹＥＳ）、目的とする固相状の試薬がウェル内に収容されていると判定する。そして、後述のように基板層を貼り合わせて、本開示の化学反応用マイクロチップを得る（Ｓ４６０）。
なお、上述した収容した固相状の試薬Ｒの正誤の判定は、基板を貼り合わせた後やマイクロチップを包装した後に行うことも可能であるが、製造コストや作業効率向上の点から、固相状の試薬がウェルに収容された後、基板を貼り合わせる前に行うことが望ましい。
【００６１】
また、上述の識別方法、取得方法及び手順を、ＣＰＵ、ＲＡＭ、ＲＯＭ等を含む制御部及び記憶媒体（ＵＳＢメモリ、ＨＤＤ、ＣＤ等）等を備えるハードウエア資源に、プログラムとして格納し、制御部等によってこのプログラムを実行させることも可能である。そして、上述の識別方法、取得方法及び手順を、化学反応用マイクロチップ検査用装置や生産ライン等に組み込むことで、本開示の核酸増幅反応用等の化学反応用マイクロチップを効率良く製造することが可能となる。
【００６２】
（５）基板層の貼り合わせ
図３中、符号Ｓ５は、基板層を貼り合わせることである。本Ｓ５では、固相状の試薬Ｒが収容されたいずれかの基板層に、他の基板層を貼り合わせる。基板層１１，１２，１３の貼り合わせには、例えば、熱融着、接着剤、陽極接合、粘着シートを用いた接合、プラズマ活性化結合、超音波接合等の公知の手法により行うことができる。また、基板層１１，１２，１３の貼り合わせを、大気圧に対して負圧下で行うことにより、試料溶液が導入される、導入部２、流路３１〜３５、ウェル４１〜４５の各領域を大気圧に対して負圧（例えば１／１００気圧）とすることができる。ウェル４１〜４５を封止する基板層１１に、ＰＤＭＳ等の弾性に加えてガス透過性を有する材料を用いた場合には、基板層１１，１２を貼り合わせた後、負圧（真空）下に静置すれば、導入部２等の各領域に存在する空気が基板層１１を透過して排出されるため、マイクロチップ１ａ内部を大気圧に対して負圧（真空）にできる。なお、マイクロチップ１ａの内部を大気圧に対し負圧とする工程は、本開示に係るマイクロチップの製造方法において、必須ではない。
【００６３】
また、本開示の化学反応用マイクロチップのウェルに収容された固相状の試薬Ｒの外観に連動するように、核酸増幅反応装置、核酸ハイブリダイゼーション装置、抗原抗体反応検出装置、光検出装置、分析装置等の装置に、撮像部及びこれを制御する制御部を備えることが好ましい。そして、上述の「（４）固相状の試薬の組成の識別」の識別方法、取得方法及び手順を、核酸増幅反応装置や光検出装置等の制御部及び記憶媒体等を備えるハードウエア資源にプログラムとして格納し、当該制御部によってこのプログラムを実行させることも可能である。当該制御部には、少なくともＣＰＵが備えられ、適宜ＲＡＭ、ＲＯＭ等が備えられる。また、当該記憶媒体として、特に限定されないが、ＵＳＢメモリ、ＨＤＤ、ＣＤ等が挙げられる。
これにより、当該マイクロチップを反応装置や分析装置等の装置にセッティングし、撮像することで、上述した「（４）固相状の試薬の組成の識別」（例えば図４及び５）が行われる。そして、各ウェルに収容されている固相状の試薬Ｒの試薬情報が読み出され、この試薬情報が装置の制御部や記憶部に設定され、この反応又は分析が行われる。この試薬情報としては、「１．本開示の第一実施形態に係る化学反応用マイクロチップの構成」で説明したとおりである。上述のとおり核酸増幅反応の場合には、例えば、固相状の試薬に含まれるプライマーの種類、測定対象及び核酸増幅反応条件（増幅方法、反応温度、検出限界等）等が挙げられる。
これにより、ユーザの煩雑な反応条件入力を行わなくともよい。また、ユーザが視認確認しなくとも、装置にてどのような化学反応（例えば、核酸増幅反応等）であるかをディスプレイ等に表示されるので、ユーザのチップの取り違いを軽減することも可能となる。
【００６４】
なお、本開示は、以下のような構成もとることができる。
〔１〕  試薬組成が外観的に識別可能な固相状の試薬が収容されている化学反応用マクロチップ。
〔２〕  前記固相状の試薬が、化学反応を行う反応領域に少なくとも２つ以上収容されている前記〔１〕記載の化学反応用マクロチップ。
〔３〕  前記固相状の試薬は、その形状及び／又は色調にて試薬組成が識別可能なものである前記〔１〕又は〔２〕記載の化学反応用マクロチップ。
〔４〕  前記固相状の試薬は、その外周部分／又は表面部分にて試薬組成が識別可能なものである前記〔１〕〜〔３〕の何れか１項記載の化学反応用マクロチップ。
〔５〕  前記外周部分が、試薬の角及び／又は辺の数である前記〔４〕の何れか１項記載の化学反応用マクロチップ。
〔６〕  前記固相状の試薬は、着色料を含有させることにて試薬組成が識別可能なものである前記〔１〕〜〔５〕の何れか１項記載の化学反応用マイクロチップ。
〔７〕  前記着色料が、色素及び／又はｐＨ指示薬である前記〔６〕記載の化学反応用マクロチップ。
〔８〕  前記固相状の試薬が、型枠成形されたものであるか、又は加圧成形さえたものである前記〔１〕〜〔７〕の何れか１項記載の化学反応用マクロチップ。
〔９〕  前記化学反応が、核酸増幅反応、ハイブリダイゼーション反応、ＰＣＲ伸長反応、抗原抗体反応のいずれかである前記〔３〕記載の化学反応用マイクロチップ。
【００６５】
〔１０〕  試薬組成が外観的に識別可能な固相状の試薬を収容することを含む化学反応用マクロチップの製造方法。
〔１１〕  化学反応の反応領域に少なくとも２つ以上の固相状の試薬を収容する前記〔１０〕記載の化学反応用マクロチップの製造方法。
〔１２〕  形状及び／又は色調で識別可能な固相状の試薬を収容する前記〔１０〕又は〔１１〕記載の化学反応用マクロチップの製造方法。
〔１３〕  外周部分にて試薬組成を識別可能な固相状の試薬を収容する前記〔１２〕記載の化学反応用マクロチップ。
〔１４〕  着色料にて試薬組成を識別可能な固相状の試薬を収容する前記〔１２〕記載の化学反応用マクロチップの製造方法。
〔１５〕  型枠成形された又は加圧成形された固相状の試薬を収容する前記〔１２〕記載の化学反応用マクロチップの製造方法。
〔１６〕  収容された固相状の試薬をその外観にて試薬の組成を判定することを含む前記〔１２〕記載の化学反応用マイクロチップの製造方法。
〔１７〕  前記外観が、固相状の試薬の形状及び／又は色調である前記〔１６〕記載の化学反応用マイクロチップの製造方法。
〔１８〕  収容された固相状の試薬の角及び／又は辺の数にて、試薬の組成を判定する前記〔１７〕記載の化学反応用マイクロチップの製造方法。
〔１９〕  収容された固相状の試薬の着色料にて、試薬の組成を判定する前記〔１７〕記載の化学反応用マイクロチップの製造方法。
〔２０〕  前記化学反応が、核酸増幅反応、ハイブリダイゼーション反応、ＰＣＲ伸長反応、抗原抗体反応のいずれかである前記〔１２〕記載の化学反応用マイクロチップの製造方法。
【実施例】
【００６６】
以下、本技術を具体的に説明するために実施例等を挙げるが、これに限定されるものではない。
【００６７】
＜固相状の試薬の成型方法＞
１）溶液分注からの成形：溶液分注→凍結乾燥→（打錠）
固形化方法に凍結乾燥を用いた。凍結乾燥は、予備凍結、一次乾燥（昇華乾燥）、二次乾燥（結合水の除去）の工程からなる。
予備凍結において、凍結温度は共晶点（サンプルが凍結する温度）以下である必要である。サンプルを完全に凍結させるためにも−４０℃程度で凍結させることが望ましい。多成分溶液では凍結温度は低く、凍り方も複雑であるためである。
一次乾燥では、共晶点以下で乾燥させることで乾燥途中でのサンプルの溶解を防ぎながら昇華させる。この時の真空度は１００Ｐａ以下であることがのぞましい。１００Ｐａにおける水の沸点は約−２０℃である。
二次乾燥では、結合水を除去する（試薬成分についている分子状態の水を除去する）工程であり、試薬の許容温度付近まで加熱し、真空度を良くして（試薬の乾燥度を高める。
【００６８】
反応に必要な試薬を、必要な量だけ各固化用チューブに分注する。固化用チューブは薄肉で温度が伝わりやすいものが適する。チューブに分注した溶液を急冷して凍結させるため、アルミブロックをあらかじめ冷凍庫（−４０℃）に入れて冷やしておく。
アルミブロックには、固化用チューブが入る大きさのくぼみがあり、そこに試薬を分注したチューブを置いた。冷やされたアルミブロックによって、効率よく凍結ができる。凍結時間は、６時間以上とした。
なお、今回用いた試薬は、ＥＢウイルスのプライマーを含む試薬（ＰＭ）とＢｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼを含む試薬（ＲＭ）である。今回は、ＰＭとＲＭを氷上で混合し、それを各チューブに氷上で分注した。その後すぐに−４０℃冷凍庫に入れ凍結させた（予備凍結）。凍結時間は６時間以上とした。
【００６９】
核酸増幅にはＬＡＭＰ法（栄研化学）を用いた。ＦｌｕＡには４種のプライマー（FIP[Forward Inner Primer]，Ｆ３プライマー，BIP[Backward Inner Primer]，Ｂ３プライマー）が含まれる。ＲＭには鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ、基質（ｄＮＴＰｓ）と反応バッファーが含まれる。
【００７０】
凍結した試薬をアルミブロックごと凍結乾燥機（FDU-2200,EYELA）のドライチャンバーに入れ、減圧する。アルミブロックごと入れた理由は、昇華が始まる真空度に到達する前に、凍結した試薬が溶解するのを防ぐためである。凍結乾燥機の冷却トラップ温度は約−８７℃である。昇華した水分は、この冷却トラップで再び凍結するため、真空ポンプに水分が入ることは無い。今回の到達真空度は約４〜８Ｐａである。この状態を約１２時間以上行った（一次乾燥）。その後、ドライチャンバーの棚温度を３０℃にして約６時間以上乾燥させた（二次乾燥）。
【００７１】
凍結乾燥した試薬は、凍結時の形状のまま固形化する。これにより、異なる形状の容器に分注して凍結乾燥させた試薬は、容器の形状のまま固形化する。
マイクロチップのウェル内に封入した際に、上方または下方から識別可能な形状とすることが望ましい。したがって、試薬ごとに平面形状が異なる容器で固形化させる。平面形状の大きさはウェルよりも小さくする必要がある。固形化試薬の高さは試薬量によって決まるが、ウェルの高さよりも低いことが望ましい。
異なる形状の固形化試薬をマイクロチップに入れたイメージ図を、図１に示す。
試薬形状は、画像等で識別可能な形状であれば良い。画像識別のアルゴリズムとしては、マスターとなる画像をあらかじめ登録し、それとの形状一致度等で判断することが可能である。
形状の一例として、角の数または辺の数が異なる形状が挙げられる（図２Ａ〜Ｆ）。角または辺の数が同じでも識別可能な形状であれば良い（図２Ｇ〜Ｉ）。
【００７２】
凍結乾燥後に打錠機等で圧力を加えることで、溶解速度が低下しない程度で、押し固めても良い。
溶解性を維持しつつ成型するために、賦形剤、崩壊剤、結合剤、潤沢剤等を加えてもよい。これらの添加物は核酸増幅反応に影響を与えないものが適する。
容器内で固形化させた試薬は、形を崩さないようにピンセットで軽くはさんで取り出してもよいし、真空ピンセット等による真空吸着で取り出して、マイクロチップのウェルに移してもよい。
【００７３】
２）粉体からの成形：造粒→打錠
粉体にした試薬を打錠機等で成型する手法。
試薬の中に賦形剤などを混ぜ合わせ、試薬を粉体にする。粉体にする手法としては、流動層造粒、高速撹拌造粒、乾式造粒、噴霧乾燥（スプレードライ）、凍結乾燥等が挙げられる。粉体の成型には打錠法やモールディング法が考えられる。
直接打錠法では、上述した異なる平面形状の鋳型に一定量入れ、最適な圧力を加えることで固形化させる。固形化後も溶解性を維持するために、賦形剤、崩壊剤、糖類等を加えてもよい。
モールディング法においては、薬物を含む混合末を水または水／アルコールバインダーで造粒し、湿潤したまま低圧打錠する。その後、溶剤を蒸発させて細孔を多くする。
【００７４】
＜着色料を添加した凍結乾燥試薬＞
成型した凍結乾燥試薬に着色料を添加する手法。
試薬の中に着色料、例えば食用色素、ｐＨ指示薬を添加する。着色料は凍結乾燥前の液体の状態で混合してもよいが、凍結乾燥後に粉末状の色素を添加してもよい。
常時、同じ色調を呈する色素であれば、その色調からマイクロチップ上に配置された試薬の種類を目視又はカメラにて識別することが可能である。
さらに、ｐＨ指示薬を用いれば、凍結乾燥試薬の状態とサンプル添加後のｐＨを相違する条件に設定しておくことで、マイクロチップ内にサンプルが注入されたことを容易に判定することができるようになる。
【００７５】
また、ｐＨ指示薬を用いる場合、例えばＬＡＭＰ法（栄研化学）の場合、ｐＨは８．８程度が好ましい。そのためプライマーを含む試薬（ＰＭ）をｐＨ８．０以下で調製し、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼを含む試薬（ＲＭ）をｐＨ８．８またはそれ以上のｐＨで調製し、サンプル注入後のＰＭ，ＲＭ，サンプルの混合時にｐＨを８．８程度にするように設計する。これにより、ＰＭ試薬に含まれるｐＨ指示薬はｐＨが変化することによって色調の変化を生じる。
例えば、ＰＭにｐＨ６．５にしてPhenol Redを添加しておくと、ＰＭ試薬は黄色を呈する。これに例えばTris-HClを用いてｐＨ８．８に調製したＲＭの凍結乾燥試薬と一緒にマイクロチップのウェルに配置する。そこへサンプルを注入することでサンプルとウェル内ＰＭ，ＲＭが混合され、ウェル内のｐＨが８．８程度になるとＰＭに含まれていたＰｈｅｎｏｌ  Ｒｅｄは赤色を呈するようになる。この時、ＬＡＭＰ法検出用の蛍光色素には光学的な検出時に妨げることがないように、Pacific Blue,BODIPY FLやRhodamine 6G,TAMRA,SYBR GreenIなどを用いることができる。
【符号の説明】
【００７６】
Ｒ，Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３，Ｒ４：試薬、１ａ：マイクロチップ、１１，１２，１
３：基板層、２：導入部、３１，３２，３３，３４，３５：流路、４１，４２，４３，４
４，４５：ウェル
【産業上の利用可能性】
【００７７】
本技術は、例えば、ＰＣＲ伸長反応技術、ハイブリダイゼーション検出技術（ＤＮＡチップ技術を含む）、ＰＣＲ増幅産物の検出物や定量に関する技術、遺伝子発現解析技術（ＳＮＰ解析技術を含む）、イムノアッセイ技術（エンザイムイムノアッセイ技術等）等に利用できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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