(57)【要約】【課題】１つの反応場において、複数の増幅反応を行うことができるマルチ核酸反応具、その製造方法、それを用いる核酸を増幅または検出する方法を提供することである。【解決手段】実施形態に従うマルチ核酸反応具は、液相の反応場を支持するように構成された支持体；前記液相により前記反応場が形成された際に、前記反応場に接する前記支持体の少なくとも１つの面の互いに独立して配置された複数のプライマー固定化領域；前記複数のプライマー固定化領域のそれぞれと同じ位置またはその近傍に配置された複数の増幅試薬固定化領域；前記複数のプライマー固定化領域に種類毎に遊離可能に固定化された複数種類のプライマーセット；および、前記増幅試薬固定化領域に組成毎に遊離可能に固定化され、前記複数種類のプライマーセット毎の増幅反応を可能にするように構成された複数種類の組成を有する増幅試薬を備える。【選択図】図１
2014060973.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
液相の反応場を支持するように構成された支持体と、
前記液相により前記反応場が形成された際に、前記反応場に接する前記支持体の少なくとも１つの面の互いに独立して配置された複数のプライマー固定化領域と、
前記複数のプライマー固定化領域のそれぞれと同じ位置および／またはその近傍に配置された複数の増幅試薬固定化領域と、
前記複数のプライマー固定化領域に種類毎に遊離可能に固定化された複数種類のプライマーセットと、
前記増幅試薬固定化領域に組成毎に遊離可能に固定化され、前記複数種類のプライマーセット毎の増幅反応を可能にするように構成された複数種類の組成を有する増幅試薬と、
を具備するマルチ核酸反応具。
【請求項２】
更に、前記プライマー固定化領域のそれぞれと同じ位置またはその近傍であり、且つそれぞれの増幅試薬固定化領域のそれぞれと同じ位置またはその近傍に配置された複数のプローブ固定化領域と、
前記複数のプローブ固定化領域のそれぞれに、ハイブリダイズ信号を独立して検出可能に固定化され、前記標的配列と前記増幅用試薬とにより生じた増幅産物の少なくとも一部に相補的な配列を含むプローブ核酸と、
を具備する請求項１に記載のマルチ核酸反応具。
【請求項３】
前記増幅試薬が、ＤＮＡ合成酵素、逆転写酵素、緩衝剤、ｄＮＴＰ、硫酸アンモニウム、Ｔｗｅｅｎ２０、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、ベタイン、タンパク質安定化剤および増幅阻害剤、並びにその組み合わせからなる群より選択される少なくとも１を含む請求項１または２に記載のマルチ核酸反応具。
【請求項４】
前記支持体が容器形態または流路を有する支持体であり、前記容器内または流路内が反応場である請求項１〜３の何れか1項に記載のマルチ核酸反応具。
【請求項５】
複数種類の標的核酸と、前記複数種類の標的核酸をそれぞれ増幅するための複数種類のプライマーセットと、前記複数種類のプライマーセット毎の増幅反応を可能にするように構成された組成を有する複数種類の組成の増幅試薬と、液相の反応場を支持するように構成された支持体とを準備すること、
前記支持体において、前記液相により前記反応場が形成された際に、前記反応場に接する前記支持体の少なくとも１つの面に、互いに独立して複数のプライマー固定化領域を配置すること、
前記複数のプライマー固定化領域のそれぞれと同じ位置および／またはその近傍に、複数の増幅試薬固定化領域を配置すること、
前記複数のプライマー固定化領域のそれぞれに、プライマーセットを種類毎に遊離可能に固定化すること、および
前記複数の増幅試薬固定化領域のそれぞれに、組成毎に増幅試薬を固定化すること
を含むマルチ核酸反応具の製造方法。
【請求項６】
複数種類の標的核酸と、前記複数種類の標的核酸をそれぞれ増幅するためのプライマーセットと、前記複数種類のプライマーセット毎の増幅反応を可能にするように構成された組成を有する複数種類の組成の増幅試薬と、それぞれの前記標的核酸と前記プライマーセットとにより生じた増幅産物の少なくとも一部に相補的な配列を含む複数種類のプローブ核酸と、液相の反応場を支持するように構成された支持体とを準備すること、
前記支持体において、前記液相により前記反応場が形成された際に、前記反応場に接する前記支持体の少なくとも１つの面に、互いに独立して複数のプライマー固定化領域を配置すること、
前記複数のプライマー固定化領域のそれぞれと同じ位置および／またはその近傍に配置された複数の増幅試薬固定化領域を配置すること、
前記プライマー固定化領域のそれぞれと同じ位置またはその近傍であり、且つそれぞれの増幅試薬固定化領域のそれぞれと同じ位置またはその近傍に配置された複数のプローブ固定化領域を配置すること、
前記複数のプライマー固定化領域のそれぞれに、種類毎にプライマーセットを遊離可能にそれぞれ固定化すること、
前記複数の増幅試薬固定化領域のそれぞれに、組成毎に増幅試薬を遊離可能にそれぞれ固定化すること、および
前記複数のプローブ固定化領域のそれぞれに、ハイブリダイズ信号を独立して検出可能にプローブ核酸をそれぞれ固定化すること
を含むマルチ核酸反応具の製造方法。
【請求項７】
（ａ）  複数種類の標的核酸と、前記複数種類の標的核酸をそれぞれ増幅するための複数種類のプライマーセットと、それぞれの前記プライマーセットによる増幅を至適条件で行うように設計された複数種類の組成の増幅試薬と、液相の反応場を支持するように構成された支持体とを準備すること、
（ｂ）前記支持体において、前記液相により前記反応場が形成された際に、前記反応場に接する前記支持体の少なくとも１つの面に、互いに独立して複数のプライマー固定化領域を配置すること、
（ｃ）前記複数のプライマー固定化領域のそれぞれと同じ位置および／またはその近傍に、複数の増幅試薬固定化領域を配置すること、
（ｄ）前記複数のプライマー固定化領域のそれぞれに、プライマーセットを種類毎に遊離可能に固定化すること、
（ｅ）前記複数の増幅試薬固定化領域のそれぞれに、組成毎に増幅試薬を遊離可能にそれぞれ固定化すること、
（ｆ）前記支持体に対して核酸増幅を行うための反応液を添加して１つの反応場を形成すること、
（ｇ）前記反応場に試料を持ち込むこと、および
（ｈ）前記１つの反応場において前記複数種類の標的核酸について増幅反応をそれぞれ行うこと
を含む核酸を増幅する方法。
【請求項８】
（ａ）複数種類の標的核酸と、前記複数種類の標的核酸をそれぞれ増幅するためのプライマーセットと、それぞれの前記プライマーセットによる増幅を至適条件で行うように設計された複数種類の組成の増幅試薬と、それぞれの前記標的核酸と前記プライマーセットとにより生じた増幅産物の少なくとも一部に相補的な配列を含む複数種類のプローブ核酸と、液相の反応場を支持するように構成された支持体とを準備すること、
（ｂ）前記支持体において、前記液相により前記反応場が形成された際に、前記反応場に接する前記支持体の少なくとも１つの面に、互いに独立して複数のプライマー固定化領域を配置すること、
（ｃ）前記複数のプライマー固定化領域のそれぞれと同じ位置またはその近傍に配置された複数の増幅試薬固定化領域を配置すること、
（ｄ）前記プライマー固定化領域のそれぞれと同じ位置またはその近傍であり、且つそれぞれの増幅試薬固定化領域のそれぞれと同じ位置またはその近傍に配置された複数のプローブ固定化領域を配置すること、
（ｅ）前記複数のプライマー固定化領域のそれぞれに、種類毎にプライマーセットを遊離可能にそれぞれ固定化すること、
（ｆ）前記複数の増幅試薬固定化領域のそれぞれに、組成毎に増幅試薬を遊離可能にそれぞれ固定化すること、
（ｇ）前記複数のプローブ固定化領域のそれぞれに、ハイブリダイズ信号を独立して検出可能にプローブ核酸をそれぞれ固定化すること、
（ｈ）前記支持体に対して核酸増幅を行うための反応液を添加して１つの反応場を形成すること、
（ｉ）反応場に試料を持ち込むこと、
（ｊ）前記１つの反応場において前記複数種類の標的核酸について増幅反応をそれぞれ行うこと、
（ｋ）前記増幅反応により得られた増幅産物と前記プローブ核酸とのハイブリダイズの有無および／または量を、前記プライマーセットのそれぞれにより得られる増幅産物について独立して検出すること、および
（ｌ）前記（ｋ）の結果に基づいて、前記試料中の標的核酸の有無および／または量を決定すること
を含む核酸を検出する方法。
【請求項９】
前記増幅試薬が、ＤＮＡ合成酵素、逆転写酵素、緩衝剤、ｄＮＴＰ、硫酸アンモニウム、Ｔｗｅｅｎ２０、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、ベタイン、タンパク質安定化剤および増幅阻害剤、並びにその組み合わせからなる群より選択される少なくとも１を含む請求項５〜８に記載の方法。
【請求項１０】
前記支持体が容器形態または流路を有する支持体であり、前記容器内または流路内が反応場である請求項５〜９の何れか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マルチ核酸反応具、その製造方法およびそれを用いる核酸を増幅または検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、遺伝子検査技術の進展に伴い、臨床現場や衛生管理施設など、様々な場面で遺伝子検査が実施されている。これらの遺伝子検査では、複数の対象遺伝子を検出し、かつ、検体中に含まれる各遺伝子量を定量することで初めて有用なものとなる場合がある。たとえば、臨床現場における病原菌特定などの目的では、その症状から感染が疑われる複数種の細菌やウイルス、または各細菌やウイルスを検出し、必要に応じて更にそれらの型などが判定される。それらは、疾患の判定、病態の把握、薬物治療の効果判定などに利用される。そのため、複数の対象遺伝子を検出する技術は非常に重要である。
【０００３】
従来、複数の対象遺伝子を検出する場合、最初にある反応溶液中で各試料核酸を増幅した後に、その増幅産物の検出を更なる反応装置において行う。増幅は、それぞれの対象遺伝子を増幅するための反応容器を用意する方法、全ての対象遺伝子を検出するための試薬を１つの反応容器に入れ、マルチ核酸増幅反応を行なう方法、のいずれかが選択される。また、検出は、増幅産物をＤＮＡチップや電気泳動などにより一般的に行われる。
【０００４】
このような従来の方法では、それぞれの対象遺伝子を増幅するための反応容器を用意する方法の場合、対象遺伝子数の増加に伴って、必要な反応容器の数や、検査時の作業量が増加する。また、全ての対象遺伝子を検出するための試薬を１つの反応容器に入れる場合、増幅反応効率に偏りが生じるなどの原因から、対象遺伝子数に限界がある。このような事情は検出工程においても同様である。更に、反応容器の数や増幅と検出を異なる反応容器において行う必要があるために、試料の取り違えが生じる可能性があり、また、取り違えが生じたとしても気が付かない危険性もある。また、少なくとも増幅工程と検出工程を行う必要があるために、検査には長い時間が必要とされる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明が解決しようとする課題は、１つの反応場において、複数の増幅反応を行うことができるマルチ核酸反応具、その製造方法、それを用いる核酸を増幅または検出する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
実施形態によれば、マルチ核酸反応具が提供される。マルチ核酸反応具は、液相の反応場を支持するように構成された支持体；前記液相により前記反応場が形成された際に、前記反応場に接する前記支持体の少なくとも１つの面の互いに独立して配置された複数のプライマー固定化領域；前記複数のプライマー固定化領域のそれぞれと同じ位置またはその近傍に配置された複数の増幅試薬固定化領域；前記複数のプライマー固定化領域に種類毎に遊離可能に固定化された複数種類のプライマーセット；および、前記増幅試薬固定化領域に組成毎に遊離可能に固定化され、前記複数種類のプライマーセット毎の増幅反応を可能にするように構成された複数種類の組成を有する増幅試薬を備える。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】実施形態に係るマルチ核酸反応具を示す図。
【図２】実施形態に係るマルチ核酸反応具を示す図。
【図３】実施形態に係るマルチ核酸反応具の使用時の様子を示す図。
【図４】実施形態に係るマルチ核酸反応具とそれにより得られる検出信号の例を示す図。
【図５】実施形態に係るマルチ核酸反応具を示す図。
【図６】実施形態に係るマルチ核酸反応具を示す図。
【図７】実施形態のチップ素材を示す図。
【図８】実施形態に係るマルチ核酸反応具を示す図。
【図９】実施形態に係るマルチ核酸反応具の使用時の様子を示す図。
【図１０】実施形態に係るマルチ核酸反応具の使用時の様子を示す図。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
以下、本発明の実施の形態について、詳細に説明する。
【０００９】
１．定義
「マルチ核酸増幅」とは、増幅されるべき複数種類の標的配列を同時に増幅することをいう。「増幅」とは、プライマーセットを用いて鋳型核酸を連続して複製する工程をいう。使用可能な増幅法は、プライマーセットを用いて標的核酸を増幅する方法であれはよく、これらに限定するものではないが、例えば、ＰＣＲ増幅、ＬＡＭＰ増幅、ＲＴ−ＬＡＭＰ増幅、ＳＭＡＰ増幅、ＩＣＡＮ増幅、ＳＤＡ増幅、ＮＡＳＢＡ増幅、ＲＣＡ増幅、ＬＣＡ増幅、ＴＭＡ増幅、プライマーエクステンション（伸長）、Ｉｎｖａｄｅｒ、ｂＤＮＡ法およびＰＡＬＳＡＲ法などを含む。
【００１０】
「標的配列」とは、プライマーセットにより増幅しようとする配列をいい、使用されるプライマーが結合する領域をも含む。
【００１１】
「標的核酸」とは、標的配列を少なくとも含む配列であり、使用されるプライマーセットにより鋳型として使用される核酸であり、「鋳型核酸」とも称する。
【００１２】
「プライマーセット」とは、１つの標的核酸を増幅するために必要なプライマーの集合体である。例えば、ＰＣＲ増幅用のプライマーセットの場合、１つのプライマーセットは、１つの標的核酸を増幅するための１種類のフォワードプライマーと１種類のリバースプライマーとを含めばよい。また例えば、ＬＡＭＰ増幅用のプライマーセットの場合、１つのプライマーセットは、少なくとも１つの標的核酸を増幅するためのＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマーを含めばよく、必要に応じてＦ３プライマー、Ｂ３プライマー、ＬＰプライマー、即ち、ＬＦプライマーおよび／またはＬＢプライマーを含んでもよい。また例えば、プライマーエクステンション（伸長）の場合は、１種類の伸長用のプライマーを含めばよい。
【００１３】
「目的配列」とは、当該マルチ核酸反応具により検出されるべき配列をいう。検出されるべき目的核酸は「目的配列」を含む。目的配列からなる核酸、または目的配列を含む核酸を「目的配列鎖」という。目的配列鎖は、その相補配列を含むプローブ核酸とハイブリダイズし、このハイブリダイズの有無または量が検出されて、目的核酸の有無または量が検出または測定される。
【００１４】
「試料」とは、マルチ核酸反応具により増幅および／または検出されるべき核酸を含む物質であればよい。試料は、これらに限定するものではないが、例えば、血液、血清、白血球、尿、便、精液、唾液、組織、バイオプシー、口腔内粘膜、培養細胞、喀痰等であってよく、または何らかのそれ自身公知の手段によって、前記の何れかまたはその混合物から核酸成分に抽出されたものであってもよい。
【００１５】
「ハイブリダイズ信号」とは、プローブ核酸とその相補配列とのハイブリダイズにより生じる信号であり、当該マイクロアレイの検出方式により、例えば、電流値、蛍光光度、発光光度などとして検出される検出信号を総称するものである。
【００１６】
２．マルチ核酸反応具とそれを用いた目的核酸の検出方法
最初に目的核酸を検出するためのマルチ核酸反応具について説明する。
【００１７】
<第１の実施形態>
マルチ核酸反応具の１例を図１（ａ）および（ｂ）を参照しながら説明する。このマルチ核酸反応具は、複数種類の標的核酸をマルチ増幅するためのマルチ核酸増幅反応具の例である。そのために、複数の種類の増幅されるべき鋳型核酸について、鋳型核酸のそれぞれの一部の配列を標的配列として設定し、その標的配列を増幅するためのプライマーセットを設計する。そのようなプライマーセットをマルチ核酸増幅反応具は備える。
【００１８】
図１（ａ）は、マルチ核酸増幅反応具の１例の斜視図である。図１（ａ）に記載のマルチ核酸増幅反応具１は、容器形状の支持体２を有する。支持体２の内側底面３には、互いに独立した複数のプライマー固定化領域４が配置される。図１（ｂ）はプライマー固定化領域４の部分を拡大した模式図である。そこに示されるように、１つのプライマー固定化領域４には１つの種類のプライマーセット６と増幅試薬２０とが固定化される。複数のプライマー固定化領域４のそれぞれには、種類毎に複数のプライマーセット６と増幅試薬２０とがそれぞれ固定される。
【００１９】
プライマーセット６および増幅試薬２０は、目的とする複数の標的核酸をそれぞれ増幅するために複数種類が用意される。１つのプライマー固定化領域４には、特定の１つの標的核酸を増幅するための１種類のプライマーセット６および増幅試薬２０が固定化される。例えば、ＰＣＲ増幅用の反応具の場合には、１つのプライマー固定化領域４に、１種類の特定の標的核酸を増幅するために必要なフォワードプライマーとリバースプライマーがそれぞれ複数本で含まれる。また、ＬＡＭＰ増幅用の反応具の場合には、１つのプライマー固定化領域４に、１種類の特定の標的核酸を増幅するために必要なＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、必要に応じてＦ３プライマー、Ｂ３プライマー、及びＬＰプライマーがそれぞれ複数本で含まれる。
【００２０】
増幅試薬２０は、それぞれのプライマー固定化領域４に固定化されるプライマーセット６による標的配列の増幅に必要な成分を含めばよい。増幅試薬２０は、例えば、ポリメラーゼなどのＤＮＡ合成酵素、プライマーを起点とし新たなポリヌクレオチド鎖を形成する際に必要なデオキシヌクレオシド三リン酸などの基質、逆転写を同時に行う場合には、逆転写酵素、およびそれに必要な基質、増幅効率に影響を与える添加剤、ｐＨ調整剤、増幅に影響を与える塩および酵素活性に影響を与える物質、並びにこれらの組み合わせなどであってよい。
【００２１】
ここで、それぞれのプライマー固定化領域４に固定化されるプライマーセット６による標的配列の増幅に必要な成分を含む増幅試薬２０は、次のことを考慮して選択される。
【００２２】
１つの空間、即ち、１つの反応場に含まれるそれぞれの反応領域において、複数種類の標的配列について、互いに異なるプライマーセットを用いてそれぞれ増幅反応を行う場合、各プライマーセットによる増幅反応のための至適条件およびそれに基づく反応効率の違いが問題となる。１つの空間とは、例えば、図１に示すマルチ核酸反応具の場合、容器型の支持体２の内部であり、且つそこに含まれるべき反応液により規定される空間である。即ち、図１に実施形態では、マルチ核酸反応具の場合、容器型の支持体２の内部が反応部として機能する。１つの空間に複数種類のプライマーセットが固定化され、それらが互いに独立してそれぞれの標的核酸を増幅する。従って、１つの空間に含まれる複数種類のプライマーセットによる増幅反応の至適条件はそれぞれに異なる。それぞれのプライマーセットのための至適条件を考慮しない場合、１つの空間により行われるべき増幅反応の一部またはその一部が得られないこともある。従って、１つの空間により行われるべき全ての増幅反応が望まれる程度で行われるようにするためには、各プライマーセットが固定され、遊離され拡散されて規定されるそれぞれの反応領域において望まれる反応効率で増幅反応が行われる必要がある。そのためには、各プライマーセットにより行われる増幅反応が望まれる程度で行われるように調整されることが必要である。そのためには、各プライマーセットが固定化される領域と同じ領域および/またはその近傍に、増幅効率を調整するように構成された組成を有する増幅試薬がそれぞれ固定化されればよい。それにより各反応領域において生じる増幅反応の増幅効率を調整することが可能となる。
【００２３】
望まれる程度の増幅反応とは、例えば、１つの反応場に含まれる複数のプライマーセットにより行われるそれぞれの増幅反応がほぼ同程度の増幅効率で行われること、１つの反応場に含まれる複数のプライマーセットにより至適条件で増幅反応が行われること、１つの反応場に含まれる複数のプライマーセットにより行われるそれぞれの増幅反応が所望の割合で変更されるように調整された増幅効率で行われること、などであってもよい。また、１つの反応場に含まれる複数のプライマーセットにより至適条件で増幅反応が行われることとは、即ち、１つの反応場に含まれる複数のプライマーセットが至適条件で標的核酸を増幅する場合に得られるであろう増幅効率が達成されることであってもよい。
【００２４】
そのような望まれる程度の増幅反応を達成するために、各プライマーセットおよび／または標的配列に対応して固定化される増幅試薬の種類と量が選択され、プライマー固定化領域と同じ位置および／またはその近傍に固定化されればよい。プライマーセットの遊離および拡散と並行して、固定化された増幅試薬が遊離および拡散することにより、１つの反応部に対して反応溶液が添加された際に、複数の反応領域のそれぞれにおいて、望まれる反応条件が達成され、そのような反応条件下でそれぞれの増幅反応を達成することが可能となる。
【００２５】
増幅試薬の固定化により調整される反応条件は、核酸の種類、反応温度、反応に必要な物質の種類および／または濃度などの条件であってもよい。例えば、ＤＮＡとＲＮＡとを１つの反応場において増幅させる場合には、例えば、ＤＮＡを増幅するためのプライマーセットに対してポリメラーゼを固定化し、ＲＮＡを増幅するためのプライマーセットに対して逆転写酵素およびポリメラーゼが固定化されてもよい。また、それぞれの配列に依存して異なる増幅酵素を使用してもよく、その場合、酵素の種類に依存して、酵素が活性化するために必要な種類および／または量の塩および緩衝剤などの物質が酵素と共に固定化されてもよい。このような増幅試薬の組成の選択および決定は、増幅されるべき標的核酸の種類および／または配列、使用されるプライマーセットの組成、種類および／または配列に従って行われればよい。そのような選択および決定は、マルチ核酸反応具の製造に先駆けて、所望の標的核酸および／またはプライマーセットについて、特定の条件でどの程度の増幅効率が得られるか、或いは、どのような条件で望まれる増幅効率が達成できるかなどを明らかにするための予備試験を行うことを含んでもよい。
【００２６】
このような調整のための増幅試薬をプライマーセットに対応して固定化することにより、複数の増幅反応を１つの空間において行うマルチ増幅が、何れの標的核酸および／またはプライマーセットについても、予め調整された反応条件で増幅反応を行うことが可能となる。
【００２７】
増幅効率に影響を与える添加剤は、例えば、硫酸アンモニウム、ウシ血清アルブミン、ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルフォルムアミド（ＤＭＦ）、フォルムアミド、ゼラチン、グリセロール、ＰＥＧ、ＳＤＳ、スペルミジン、ＴｒｉｔｏｎＸ  −１００、尿素、ＢＳＡ、Ｔｗｅｅｎ２０、およびＲＴ−ｍａｔｅであってもよい。ｐＨ調整剤は、例えば、ＡＤＡ、ＰＥＰＥＳ、ＰＯＰＳＯ、ＡＣＥＳ、ＭＯＰＳＯ、ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＴＡＰＳＯ、ＨＥＰＰＳＯ、ＥＰＰＳ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、ＢｉｃｉｎｅおよびＴｒｉｓ−ＨＣｌなどであってよい。塩は、例えば、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、塩化カリウム、酢酸ナトリウム、グルタミン酸ナトリウム、グルタミン酸カリウムおよび酢酸カリウムであってもよい。酵素活性に影響を与える物質は、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、酢酸マグネシウム、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）および塩化マンガンなどであってよい。使用される試薬は、これらの物質を単独で使用されても、これらの物質の２種類以上を組み合わせて使用されてもよい。しかしながら、増幅試薬２０として使用される物質は、これらには限定されるものではない。
【００２８】
更にまた、ＤＮＡ合成酵素および逆転写酵素の活性を保持するため、乾燥時にタンパク質の安定化剤が増幅試薬として固定化されてもよい。安定化剤の存在により増幅酵素などのタンパク質が安定化され、安定化剤が存在しない反応領域に比べて増幅効率が高くなる。そのような安定化剤の例は、これに限定するものではないが、例えば、糖類、非イオン性界面活性剤、塩類、糖アルコール、高分子、アミノ酸、基質、オスモライトおよびBSA等のタンパク質であってもよく、好ましくはトレハロースである。
【００２９】
また更に、固定化される全てのプライマーセットについて、ほぼ等しい増幅効率を達成するために、例えば、他のプライマーセットに比べて突出した増幅効率で増幅反応が進行するプライマーセットに対して、増幅阻害剤を固定化してもよい。
【００３０】
固定化される増幅阻害剤は、それ自身公知の何れの増幅阻害剤であってもよく、例えば、ヘパリン、エタノール、尿素、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、ホルムアミド、ＳＤＳ、塩類、糖類、界面活性剤および色素などであってもよい。
【００３１】
プライマーセット６および増幅試薬２０は、反応場を提供するための液相と接触して、遊離するように遊離可能な状態で固定化領域３に固定される。例えば、互いに独立して複数のプライマーセットが固定化されているとき、それぞれのプライマーセットの遊離および拡散により規定される反応領域は互いに独立して形成および維持される。
【００３２】
プライマーセット６と増幅試薬２０のプライマー固定化領域４への固定化は、例えば、１組のプライマーセット６と増幅試薬２０を含む溶液を１つのプライマー固定化領域４に滴下し、その後乾燥させることにより達成することが可能である。更に、同様に、他のプライマー固定化領域４についても、それぞれ所望のプライマーセット６と増幅試薬２０とを含む溶液を滴下および乾燥し、所望する数の複数のプライマーセット６と増幅試薬２０とを支持体２に固定化すればよい。これにより、支持体２の１つの内側底面３に独立して配置される全てのプライマー固定化領域４にプライマーセット６と増幅試薬２０とが固定化される。しかしながら、プライマーセット６と増幅試薬２０のプライマー固定化領域４への固定化は、反応場を提供するための液相と接触して遊離可能な状態で固定されればよい。従って、そのような固定化が可能なそれ自身公知の何れの固定化法が使用されてもよい。プライマーセット６と増幅試薬２０とを含む溶液を滴下する方法の場合、プライマーセット６と増幅試薬２０とを含む溶液の溶媒は、例えば、水、緩衝液または有機溶剤などであってよいが、これらには限定されない。
【００３３】
支持体２に配置される複数のプライマー固定化領域４は、互いに独立して配置されればよい。独立して配置されるとは、１つの反応場に含まれるそれぞれの反応領域において、プライマーセット６と増幅試薬２０毎に開始および／または進行される増幅を妨げることのない間隔で配置されることである。
【００３４】
反応場を提供するための液相は、固定化されたプライマー６と増幅試薬２０とが遊離された後に、それらを用いて増幅反応を進行できる液相であればよく、例えば、所望の増幅に必要な反応液であってよい。
【００３５】
容器形態の支持体は、例えば、チューブ、ウェル、チャンバー、流路、カップおよびディッシュ並びにそれらを複数個備えたプレート、例えば、マルチウェルプレートなどであってよい。また支持体の材質は、それ自身反応に関与しない材質であればよく、そこにおいて増幅反応を行うことが可能な材質であればよい。例えば、シリコン、ガラス、樹脂および金属などから任意に選択されてよい。また、容器形態の支持体は、商業的に入手可能な何れの容器を利用してもよい。
【００３６】
図１では、プライマー固定化領域４が支持体２の内側底面３に配置された例を示したが、これに限定するものではなく、支持体２の内部側面の少なくとも一部分に配置されてもよく、内側底面および内部側面、任意の被覆体により提供される天井面などのいずれか、または全てに配置されてもよい。
【００３７】
上述では、プライマーセット６と増幅試薬２０を同時に固定化する例を示した。しかしながら、増幅試薬２０を支持体２に固定化する場合、増幅試薬２０の固定化は、プライマーセット６の固定化の前であっても、プライマーセット６の固定化と同時であっても、プライマーセット６を固定化した後であってもよい。
【００３８】
プライマーセット６の固定化と同時に増幅試薬２０を支持体２に固定化する場合、プライマーセット６を溶解した液に対して増幅試薬２０を溶解してもよい。或いは、先ず増幅試薬２０を溶液で用意し、別途調製されたプライマーセット６が溶解された溶液と混合してもよい。得られたプライマーセット６と増幅試薬２０とを含む溶液を、滴下および乾燥などにより固定すればよい。
【００３９】
また、上述では、プライマー固定化領域４に対して、プライマーセット６と増幅試薬２０とを固定化する例を示したが、プライマー固定化領域４に対してはプライマーセット６を固定化し、増幅試薬２０は、プライマー固定化領域４の近傍に固定化されてもよい。即ち、増幅試薬２０は、プライマー固定化領域４と同じ領域に固定化されてもよく、プライマー固定化領域４の近傍に固定化されてもよい。プライマー固定化領域４の近傍とは、プライマー固定化領域４から遊離され拡散されたプライマーセット６によって特定の標的核酸の増幅が独立して行われる範囲内であればよい。プライマー固定化領域４とは異なる位置に増幅試薬２０が固定化される場合、増幅試薬２０が固定化される領域が、増幅試薬固定化領域として配置されてもよい。
【００４０】
例えば、プライマー固定化領域４の近傍とは、０μｍ〜０．１μｍ、０．１μｍ〜１μｍ、１μｍ〜１０μｍ、１０μｍ〜１００μｍ、１００μｍ〜１ｍｍ、１ｍｍ〜１０ｍｍ、またはそれ以上でもよく、好ましくは、１００μｍ〜１０ｍｍであってよい。
【００４１】
また、プライマーセット６と増幅試薬２０を固定化する際に、増粘剤を一緒に用いてもよい。増粘剤を使用することにより、プライマーセット６および増幅試薬２０を安定して固定化することが可能である。増粘剤をプライマーセット６および増幅試薬２０の固定化において使用する場合、プライマーセット６と増幅試薬２０とを含む溶液に更に増粘剤を溶解して、得られた液体を支持体２にスポットし、乾燥してもよい。またはプライマーセット６と増幅試薬２０とをそれぞれ含む溶液にそれぞれ更に増粘剤を溶解して、得られた液体を支持体２にそれぞれスポットし、乾燥してもよい。或いは、プライマーセット６を含む溶液または増幅試薬２０を含む溶液の何れかに対して更に増粘剤を溶解して、得られた液体を支持体２にスポットし、乾燥してもよい。またはプライマーセット６および増幅試薬２０を固定化した後に、固定化されたプライマーセット６および増幅試薬２０を覆うように増粘剤をスポットし、乾燥してもよい。
【００４２】
増粘剤は、例えば、樹液に由来する増粘剤、豆類などの種子に由来する増粘剤、海藻に由来する増粘剤、果実類、葉および地下茎などに由来する増粘剤、微生物由来の増粘剤、並びにその他増粘安定剤であってもよく、それらの増粘剤から選択される１種類またはそれらの増粘剤から選択された２つ以上を組み合わせで使用してもよい。
【００４３】
樹液に由来する増粘剤は、例えば、アーモンドガム、エレミ樹脂、ダンマル樹脂、アラビアガム、カラヤガム、トラガントガム、アラビノガラクタン、ガティガムおよびモモ樹脂などであってもよい。豆類などの種子に由来する増粘剤は、例えば、アマシードガム、グァーガム酵素分解物、タマリンド種子ガム、カシアガム、サイリュームシードガム、タラガム、カロブビーンガム＝ローカストビーンガム、サバクヨモギシードガム、トリアカンソスガム、グァーガムおよびセスバニアガムなどであってもよい。海藻に由来する増粘剤は、例えば、アルギン酸、フクロノリ抽出物、ファーセレランおよびカラギナンなどであってもよい。果実類、葉および地下茎などに由来する増粘剤は、例えば、アロエベラ抽出物、キダチアロエ抽出物、ペクチン、オクラ抽出物およびトロロアオイなどであってもよい。微生物由来の増粘剤は、例えば、アエロモナスガム、エンテロバクターガム、納豆菌ガム、アウレオバシジウム培養液、カードラン、プルラン、アゾトバクター・ビネランジーガム、キサンタンガム、マクロホモプシスガム、ウェランガム、ジェランガム、ラムザンガム、エルウイニア・ミツエンシスガム、スクレロガム、レバン、エンテロバクター・シマナスガムおよびデキストランなどであってもよい。その他増粘安定剤は、例えば、酵母細胞膜、キチン、オリゴグルコサミン、微小繊維状セルロース、キトサン、微結晶セルロースおよびグルコサミンなどであってもよい。また、増粘剤は、一般に飲食物添加物して使用される増粘剤であってもよい。そのような増粘剤は、例えば、寒天、大豆多糖類、ナタデココ、澱粉、コンニャクイモ抽出物、ゼラチンなどであってもよい。好ましい像ね剤は、アガロースなどの寒天および/またはゼラチン、ポリエチレングリコールなどであるが、これらに限定されるものではない。
【００４４】
プライマーセット６の固定化前または後に、増幅試薬２０を固定する場合には、増幅試薬２０を滴下、スプレー、印刷、刷毛で塗布または増幅試薬２０に支持体を浸漬した後に、乾燥などによってプライマー固定化領域４を含む支持体２の表面に固定化すればよい。
【００４５】
プライマーセットと増幅試薬とを含む溶液の乾燥方法は、ヒートブロック、ホットプレートおよびインキュベータなどを用いて、室温以上の温度で加熱することによる熱乾燥を行ってもよい。または、常温で放置し、自然乾燥を行ってもよい。或いは、真空乾燥や凍結乾燥を行ってもよい。
【００４６】
プライマーセット６と増幅試薬２０とを固定化することに１つの反応部に提供することにより、マルチ増幅反応における感度の低下、増幅種類の制限などが抑制される。また、従来では、プライマーセット以外の試薬は、一律の濃度で行う必要があったが、プライマーセットおよび／または標的核酸毎に必要な試薬を必要な量だけ固定化することが可能であるので、増幅反応の特性を向上するのみならず、製造コストおよび／またはランニングコストなどの費用を削減することも可能となる。
【００４７】
＜第２の実施形態＞
（１）マルチ核酸反応具
マルチ核酸反応具の１例を図２（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を参照しながら説明する。このマルチ核酸反応具１は、複数の目的配列とそれぞれの目的配列に相補的なプローブ核酸とのハイブリダイズを、ハイブリダイズにより生じるハイブリダイズ信号を検出することによって検出し、それに基づいて、目的配列を含む標的配列を有する鋳型核酸を定量するためのものである。そのために、複数の種類の検出されるべき鋳型核酸について、それぞれの一部の配列を標的配列として設定し、その標的配列を増幅するためのプライマーセットを設計する。更に、その標的配列の一部分を目的配列として設定し、その目的配列の相補配列を有するプローブ核酸を設計する。
【００４８】
図２（ａ）は、マルチ核酸反応具の１例の斜視図である。図２（ａ）に記載のマルチ核酸反応具１は、容器形状の支持体２を有する。支持体２の内側底面３には、互いに独立した複数のプライマー固定化領域４が配置される。複数のプライマー固定化領域４の近傍に、またそれぞれのプライマー固定化領域４に対応して複数のプローブ固定化領域５が配置される。互いに独立して配置されたプライマー固定化領域４に固定化された複数のプライマーセット６は、それぞれのプライマーセット６による増幅反応が独立して行われる。例えば、互いに独立して複数のプライマーセット６が固定化されているとき、それぞれのプライマーセットの遊離および拡散により規定される反応領域は互いに独立して形成および維持される。更に、プライマー固定化領域４には、増幅試薬２０がプライマーセット６と共に固定化されている。
【００４９】
図２（ｂ）はプライマー固定化領域４を拡大した模式図である。そこに示されるように、１つのプライマー固定化領域４には１つの種類のプライマーセット６が固定され、図示されない増幅試薬２０が固定化されている。複数のプライマー固定化領域４のそれぞれには、種類毎に複数のプライマーセット６がそれぞれ固定される。
【００５０】
プライマーセット６は、目的とする複数の標的核酸をそれぞれ増幅するために複数種類が用意される。１つのプライマー固定化領域４には、特定の１つの標的核酸を増幅するための１種類のプライマーセット６が固定される。例えば、ＰＣＲ増幅用の反応具の場合には、１つのプライマー固定化領域４に、１種類の特定の標的核酸を増幅するために必要なフォワードプライマーとリバースプライマーがそれぞれ複数本で含まれる。また、ＬＡＭＰ増幅用の反応具の場合には、１つのプライマー固定化領域４に、１種類の特定の標的核酸を増幅するために必要なＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、必要に応じてＦ３プライマー、Ｂ３プライマー、及びＬＰプライマーがそれぞれ複数本で含まれる。
【００５１】
プライマーセット６および増幅試薬２０は、反応場を提供するための液相と接触して遊離するように遊離可能な状態でプライマー固定化領域４に固定される。プライマーセット６および増幅試薬２０のプライマー固定化領域４への固定化は、例えば、１組のプライマーセットと増幅試薬２０を含む溶液を１つのプライマー固定化領域４に滴下し、その後乾燥させることにより達成することが可能である。更に、同様に、他のプライマー固定化領域４について、それぞれ所望のプライマーセット６および増幅試薬２０を含む溶液を滴下および乾燥し、所望する数の複数のプライマーセット６および増幅試薬２０を支持体２に固定すればよい。これにより、支持体２の１つの面に独立して配置される全てのプライマー固定化領域４にプライマーセット６と増幅試薬２０とが固定化される。しかしながら、プライマーセット６および増幅試薬２０のプライマー固定化領域４への固定化は、反応場を提供するための液相と接触して遊離可能な状態で固定されればよい。従って、そのような固定化が可能なそれ自身公知の何れの固定化法が使用されてもよい。プライマーセット６および増幅試薬２０を含む溶液を滴下する方法の場合、プライマーセットを含む溶液の溶媒は、例えば、水、緩衝液または有機溶剤などであってよい。
【００５２】
支持体２に配置される複数のプライマー固定化領域４は、互いに独立して配置されればよい。独立して配置されるとは、反応場においてプライマーセット６毎に開始および／または進行される増幅を妨げることのない間隔で配置されることである。例えば、隣り合うプライマー固定化領域４は、互いに接して配置されてもよく、僅かな距離を隔てて互いに近傍に配置されてもよく、或いは、通常使用される所謂ＤＮＡチップなどの検出装置において固定化されるプローブ核酸と同様な距離を隔てて互いに配置されてもよい。
【００５３】
例えば、隣り合うプライマー固定化領域４の間の距離は、０．１μｍ〜１μｍ、１μｍ〜１０μｍ、１０μｍ〜１００μｍ、１００μｍ〜１ｍｍ、１ｍｍ〜１０ｍｍ、またはそれ以上でもよく、好ましくは、１００μｍ〜１０ｍｍであってよい。
【００５４】
反応場を提供するための液相は、固定されたプライマーが遊離された後に、それらを用いて増幅反応を進行できる液相であればよく、例えば、所望の増幅に必要な反応液であってよい。
【００５５】
容器形態の支持体２は、例えば、チューブ、ウェル、チャンバー、流路、カップおよびディッシュ並びにそれらを複数個備えたプレート、例えば、マルチウェルプレートなどであってよい。また支持体の材質は、それ自身反応に関与しない材質であればよく、そこにおいて増幅反応を行うことが可能な材質であればよい。例えば、シリコン、ガラス、樹脂および金属などから任意に選択されてよい。また、容器形態の支持体は、商業的に入手可能な何れの容器を利用してもよい。
【００５６】
図２では、プライマー固定化領域４が支持体２の内側底面３に配置された例を示したが、これに限定するものではなく、支持体２の内部側面の少なくとも一部分に配置されてもよく、底面および内部側面、任意の被覆体により規定される天井面のいずれか、または全てに配置されてもよい。
【００５７】
図２（ｃ）には、プライマー固定化領域４の近傍に配置されたプローブ固定化領域５の拡大図である。プローブ固定化領域５には、検出されるべき所望の配列の相補配列を含むプローブ核酸７が複数で固定される。
【００５８】
検出されるべき所望の配列は、目的配列であってよい。プローブ固定化領域５は、プローブ核酸７と目的配列鎖とのハイブリダイズ信号が、複数のプローブ固定化領域５間で独立して検出されるように配置される。
【００５９】
プローブ核酸７のプローブ固定化領域５への固定は、それ自身公知の所謂ＤＮＡチップにおいて基板表面に対してプローブ核酸を固定する一般的な何れの技術を利用してもよい。プローブ核酸７の固定した後にプライマーセット６を固定してもよく、プライマーセット６を固定した後にプローブ核酸７を固定してもよく、プライマーセット６の固定とプローブ核酸７の固定を同時に行ってもよい。
【００６０】
例えば、隣り合うプローブ固定化領域５の間の距離は、０．１μｍ〜１μｍ、１μｍ〜１０μｍ、１０μｍ〜１００μｍ、１００μｍ〜１ｍｍ、１ｍｍ〜１０ｍｍ、またはそれ以上でもよく、好ましくは、１００μｍ〜１０ｍｍであってよい。
【００６１】
また例えば、プローブ固定化領域５とプライマー固定化領域４の間の距離は、０μｍ〜０．１μｍ、０．１μｍ〜１μｍ、１μｍ〜１０μｍ、１０μｍ〜１００μｍ、１００μｍ〜１ｍｍ、１ｍｍ〜１０ｍｍ、またはそれ以上でもよく、好ましくは、１００μｍ〜１０ｍｍであってよい。
【００６２】
例えば、プローブ固定化領域５とプライマー固定化領域４の間の距離が０μｍである場合には、プローブ固定化領域５とプライマー固定化領域４は、支持体表面の同じ位置にあると解されてよい。また、プローブ固定化領域５がプライマー固定化領域４に含まれてもよく、プライマー固定化領域４がプローブ固定化領域５に含まれてもよい。また、１つのプライマー固定化領域４に対して複数のプローブ固定化領域５が配置されてもよい。
【００６３】
（２）マルチ核酸反応具を用いた核酸の増幅検出方法
図３には、第２の実施形態と同様のマルチ核酸反応具１を用いて行われた核酸増幅反応後の反応場の様子を示す模式図である。図３（ａ−１）および（ｂ−１）は、反応前のマルチ核酸反応具１である。支持体２の内側底面３に配置された複数のプライマー固定化領域４の近傍にはプローブ固定化領域５が配置される。複数のプライマー固定化領域４には、複数のプライマーセット６と増幅試薬２０がそれぞれ固定されている。それぞれのプライマー固定化領域４に対応して、それぞれの近傍に配置されたプローブ固定化領域５には、複数のプローブ核酸７が所望の種類毎に固定されている。
【００６４】
マルチ核酸反応具１に反応液８を添加し、それを収容した状態を図３（ａ−２）および（ｂ−２）に示す。
【００６５】
反応液８は、所望の増幅反応に必要な成分を含めばよい。これらに限定するものではないが、例えば、ポリメラーゼなどの酵素、プライマーを起点とし新たなポリヌクレオチド鎖を形成する際に必要なでオキシヌクレオシド三リン酸などの基質、逆転写を同時に行う場合には、逆転写酵素およびそれに必要な基質など、更に、適切な増幅環境を維持するための塩類などの緩衝剤を含んでよい。
【００６６】
反応場への試料の添加は、マルチ核酸反応具１に反応液８を添加する以前に反応液８に予め添加することにより行ってもよく、反応液８をマルチ核酸反応具１に添加した後に行ってもよく、マルチ核酸反応具１に反応液８を添加する以前に試料をマルチ核酸反応具１に添加することにより行ってもよい。
【００６７】
図３（ａ−２）および（ｂ−２）に示すように反応液８を添加された後のマルチ核酸反応具１では、図３（ａ−３）および（ｂ−３）に模式的に示すように、内側底面３に固定されたプライマーセット６が遊離し、徐々に拡散する。遊離および拡散した領域を模式的に領域９で示す。遊離し、拡散していくプライマーセット６は、その近傍に存在する鋳型核酸、ポリメラーゼおよび基質などの増幅に必要な他の成分と出会い、その後、増幅反応が開始される。種類毎に独立して複数固定されたプライマーセット６は、その種類毎に独立して鋳型核酸について増幅反応を開始および進行することが可能である。それにより、複数種類のプライマーセット６を用いた複数の鋳型配列についての増幅が、独立に、且つ同時に達成される。ここにおいて、「反応場」は、理論上、そこにおいて増幅反応の進行が可能な反応液８により規定される領域、即ち、反応液が存在する領域という。また、反応場のうち、実際にそこにおいて増幅反応が開始され進行する領域を「反応領域」という。仮に実際に増幅反応が領域９内のみで進行する場合には、領域９が反応領域１０と解される。図３（ａ−３）の図は、全てのプライマー固定化領域４に固定されたプライマーセット６により増幅反応が生じた場合の模式図である。図３（ｂ−３）は、固定されたプライマーセット６により、内側底面３に固定された全てのプライマー固定化領域のうちの一部分、図３（ｂ−３）では３つの領域のみにおいて増幅が生じた場合の模式図である。
【００６８】
プローブ固定化領域５は、領域９において増幅された増幅産物中に目的配列を含む核酸が存在した場合、その核酸とハイブリダイズする。プローブ固定化領域５に固定されたプローブ核酸７は、対応するプライマー固定化領域４における増幅産物とのみハイブリダイズするように固定される。即ち、１つのプローブ固定化領域５に固定されたプローブ核酸７は、対応するプライマー固定化領域４における増幅産物とのみハイブリダイズするように距離を維持してそれぞれのプローブ固定化領域５およびプライマー固定化領域４が配置される。
【００６９】
プローブ核酸７と目的配列鎖とのハイブリダイズの検出は、それ自身公知のハイブリダイズ信号の検出手段により行われてよい。例えば、予めプライマーセットに蛍光物質を付与してもよく、オキシヌクレオシド三リン酸などの基質に蛍光物質を付与してもよい。それらの蛍光物質からの蛍光強度を指標にハイブリダイズの有無および量が決定されてもよい。或いは、電気化学的手段によりハイブリダイズ信号が検出されてもよい。
【００７０】
ハイブリダイズの検出は、マルチ核酸反応具１内部の洗浄後に実行されてもよく、洗浄を行わずに実行されてもよい。電気化学的手段により検出する場合には、インタカレータを用いてハイブリダイズ信号を検出してもよい。この場合、例えば、予め反応液７８にインタカレータを含ませておいてもよく、ハイブリダイズ反応が開始する前、ハイブリダイズ反応中、ハイブリダイズ反応後に添加してもよい。これらの場合、何れもマルチ核酸反応具１内部の洗浄後に検出を行ってもよく、洗浄を行わずに検出を実行してもよい。ハイブリダイズ反応の開始、反応中、反応後の判定は、プライマー、プローブ核酸および鋳型核酸の配列、反応温度などの反応条件に応じて行ってもよく、予備実験により決定してもよい。
【００７１】
当該プライマーの長さは、これに制限されるものではないが、約５塩基以上、約６塩基以上、約７塩基以上、約８塩基以上、約９塩基以上、約１０塩基以上、約１５塩基以上、約２０塩基以上、約２５塩基以上、約３０塩基以上、約３５塩基以上、約４０塩基以上、約４５塩基以上または約５５塩基以上であってよく、約８０塩基以下、約７５塩基以下、約７０塩基以下、約６５塩基以下、約６０塩基以下、約５５塩基以下、約５０塩基以下、約４５塩基以下、約４０塩基以下、約３５塩基以下、約３０塩基以下、約２５塩基以下、約２０塩基以下、約２５塩基以下または約２０塩基以下であってもよく、これらの下限上限の何れかを組み合わせた範囲であってもよい。例えば、好ましい塩基長の例は、約１０塩基〜約６０塩基、約１３〜４０塩基、約１０〜３０塩基などであってよい。
【００７２】
また、１つの支持体に同時に固定されるプライマーの長さは、全てのプライマーで同じであってもよく、全てのプライマーで異なっていてもよく、一部のプライマーが同じ長さであってもよく、一部のプライマーが異なる長さであってもよい。また、プライマーセット毎に異なってもよい。また、１つの領域に固定されるプライマーセットが、種類毎に異なる長さであってもよく、１つの領域に固定されるプライマーセットが全て同じ長さであってもよい。
【００７３】
プローブ核酸の長さは、例えば、３塩基〜１０塩基、１０塩基〜２０塩基、２０塩基〜３０塩基、３０塩基〜４０塩基、４０塩基〜５０塩基、５０塩基〜６０塩基、好ましくは１０塩基〜５０塩基であってよい。プローブ核酸は、検出されるべき目的配列の相補配列を含む。プローブ核酸は、目的配列の相補配列に加えて更なる配列例えば、スペーサ配列などを含んでもよい。
【００７４】
標的配列の長さは、例えば、１０塩基〜１００塩基、１００塩基〜２００塩基、塩基２００〜３００塩基、３００塩基〜４００塩基、好ましくは１００塩基〜３００塩基であってよい。
【００７５】
目的配列の長さは、例えば、３塩基〜１０塩基、１０塩基〜２０塩基、２０塩基〜３０塩基、３０塩基〜４０塩基、４０塩基〜５０塩基、５０塩基〜６０塩基、好ましくは１０塩基〜５０塩基であってよい。
【００７６】
１つのプライマー固定化領域４に固定されるプライマーセット６の種類は、１種類の標的核酸を増幅するための１種類であってもよく、２種類以上の標的核酸をそれぞれ増幅するために複数種類であってもよい。
【００７７】
１つのプローブ固定化領域５に固定されるプローブ核酸７群の種類は、１種類の目的配列とハイブリダイズするための１種類であってもよく、２種類以上の標的核酸をそれぞれ増幅するために複数種類であってもよい。また、目的配列の部分が共通であり、更に他の目的配列とは異なる配列を含むプローブ核酸であってもよい。
【００７８】
１つのアレイ型マルチ核酸反応具１に配置されるプライマー固定化領域４の数の下限は、１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、１０以上、１５以上、２０以上、２５以上、３０以上、５０以上、７５以上、１００以上、１２５以上、１５０以上、１７５以上、２００以上、３００以上、４００以上、５００以上、１０００以上、１５００以上、２０００以上であってよく、上限は、１００００以下、５０００以下、２５００以下、２０００以下、１５００以下、１０００以下、５００以下、２５０以下、２００以下、１５０以下であってよく、これらの上限下限の何れかを組み合わせた範囲であってもよい。
【００７９】
１つのマルチ核酸反応具１に配置されるプライマー固定化領域４とプローブ固定化領域５の数は同じであっても異なっていてもよい。即ち、全てのプライマー固定化領域４に対応するように同数のプローブ固定化領域５が配置されてもよく、プライマー固定化領域４の数がプローブ固定化領域５の数よりも多くてもよく、プライマー固定化領域４の数がプローブ固定化領域５の数よりも少なくてもよい。また、増幅反応状態を確認するため、またはハイブリダイズ反応の状態を確認するためのポジティブコントロールおよび／またはネガティブコントロールを含ませてもよい。このようなポジティブコントロールおよび／またはネガティブコントロールは、プライマーセットおよび／またはプローブ核酸について設けてよい。
【００８０】
上記の例では、プライマー固定化領域４にプライマーセット６のみが固定化された例を示した。しかしながら、これに限定されるものではなく、プライマーセット６が種類毎に各固定化領域に固定される条件において、増幅に必要な他の成分、例えば、ポリメラーゼ、逆転写酵素などの酵素、基質、基質および／または緩衝剤などをプライマーセット６と共に支持体２に固定されてもよい。その場合、固定しようとする物質をプライマーセット６と一緒に所望の液体媒体に含ませて、上述の方法と同様に滴下および乾燥などにより固定すればよい。そのようなマルチ核酸反応具１において、増幅反応を行う場合には、固定された成分に応じてそこに添加される反応液の組成が選択されればよい。
【００８１】
支持体２は、容器形状に限定されるものではなく、上述したように、板状、球状、棒状およびそれらの一部分からなる形状であってよく、基体の大きさおよび形状は実施者が任意に選択してよい。また、後述する第４の実施形態のように流路を有する基板を支持体７１として使用することは好ましい。
【００８２】
＜第３の実施形態＞
次に、複数の目的核酸を検出するためのマルチ核酸反応具の原理について説明する。
【００８３】
マルチ核酸反応具の１例を図４を参照しながら説明する。
【００８４】
図４（ａ）に記載のマルチ核酸反応具１は、チップ型のマルチ核酸反応具、即ち、アレイ型プライマープローブチップ１である。このアレイ型プライマープローブチップ１は、１つの目的配列とプローブ核酸とのハイブリダイズを、ハイブリダイズにより生じるハイブリダイズ信号を検出することによって検出し、それに基づいて、目的配列を含む標的配列を有する鋳型核酸を定量するためのものである。そのために、定量されるべき鋳型核酸の一部の配列を標的配列として設定し、その標的配列を増幅するためのプライマーセットを設計する。更に、その標的配列の一部分を目的配列として設定し、その目的配列の相補配列を有するプローブ核酸を設計する。
【００８５】
アレイ型プライマープローブチップ１は、基板を支持体２として用いている。支持体２の１つの面３には、複数のプライマー固定化領域４が互いに独立して配置される。それぞれのプライマー固定化領域４に対応して、その近傍にプローブ固定化領域５が配置される。
【００８６】
プライマー固定化領域４には、１つのプライマー固定化領域４に対して１つの種類のプライマーセット６と各プライマーセットによる増幅反応が至適条件で行われるように設計された増幅試薬２０が固定化される。特定の目的配列を定量するためには、その特定の目的配列を含む特定の標的配列を増幅するためのプライマーセット６が使用される。
【００８７】
図４に示すアレイ型プライマープローブチップ１に含まれる５つのプライマー固定化領域４には、互いに異なる鋳型核酸を増幅するために必要とされる５種類のプライマーセット６がそれぞれ固定化されている。
【００８８】
各プライマーセット毎に至適条件で増幅反応が行われるように固定化される増幅試薬２０の組成および量は、各プライマーセット毎に異なる。それぞれの増幅試薬２０を固定化するための混合液をそれぞれ組成Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥと示すと、組成Ａ、組成Ｂ、組成Ｃ、組成Ｄ、組成Ｅが、それぞれのプライマーセットにより行われる増幅反応を適切にするために必要な組成である。
【００８９】
プローブ固定化領域５に固定化されるプローブ核酸７には、５種類の目的配列に相補的な配列を含む複数のプローブ核酸７が固定化される。即ち、図４のアレイ型プライマープローブチップ１に含まれる５つのプローブ固定化領域５には、互いに異なる目的配列を検出するために必要とされる５種類のプローブ核酸７がそれぞれ固定化されている。
【００９０】
このようなアレイ型プライマープローブチップ１の全てのプライマー固定化領域４と全てのプローブ固定化領域５が含まれるように、アレイ型プライマープローブチップ１の面３を試料と接触させて増幅反応およびハイブリダイズの検出を行う。
【００９１】
例えば、平らな面の上にアレイ型プライマープローブチップ１を置き、アレイ型プライマープローブチップ１の面３に試料を載せることにより増幅反応およびハイブリダイズの検出を行ってもよい。或いは、例えば、このアレイ型プライマープローブチップ１を維持できる容器内に配置してもよい。その容器内に反応液を添加することにより反応場を形成する。
【００９２】
例えば、増幅試薬２０の固定化を行わないこと以外は、上述のアレイ型プライマープローブチップ１と同様に設計された比較のためのアレイ型プライマープローブチップ、即ち、至適条件を得るように設計されていないアレイ型プライマープローブチップの場合では、それぞれの増幅効率が異なるために、図４（ｂ）のような検出信号が得られる。即ち、各プローブにより検出されるハイブリダイズ信号は、バラバラである。
【００９３】
しかしながら、上述のように至適条件を得るように設計されている実施形態のアレイ型プライマープローブチップの場合では、図４（ｃ）のように互いに略等しい大きさのハイブリダイズ信号を得ることが可能となる。この例ではハイブリダイズ信号の１例として電流値を使用している。
【００９４】
各プライマーおよび／または標的核酸についての至適条件は、アレイ型プライマープローブチップを製造するのに先駆けて、予備試験を行うことにより選択されてよい。また、そのような至適条件を得るための増幅試薬の種類および量の検討も同様に、アレイ型プライマープローブチップを製造するのに先駆けて、予備試験を行うことにより選択されてよい。
【００９５】
このように設計することにより、アレイ型プライマープローブチップを用いて複数種類の核酸を高精度で検出することが可能となる。
【００９６】
指摘条件を達成するための増幅試薬の選択は、固定化される増幅試薬の量を変えてもよく、固定化される増幅試薬の構成（即ち、使用される成分の組み合わせ）を変えてもよく、固定化される増幅試薬の種類を変えてもよく、或いは、固定化される増幅試薬に対して増幅阻害剤を添加してもよい。また、固定化される増幅試薬に対して増幅促進剤を添加してもよい。しかしながら、固定化される増幅阻害剤の量は、完全には増幅が抑制されない量である必要がある。
【００９７】
異なる量で増幅阻害剤を固定化することにより、それぞれのプライマー固定化領域における増幅効率に違いが生じる。それにより、全てのプライマーセットについて同様の増幅効率が達成されてもよい。
【００９８】
＜第４の実施形態＞
複数の標的配列を有する鋳型核酸を定量するためのマルチ核酸反応具１の例を図５を参照しながら説明する。このマルチ核酸反応具１は、複数の目的配列と、それらにそれぞれ相補的なプローブ核酸とのハイブリダイズを、ハイブリダイズにより生じるハイブリダイズ信号を検出することによって検出するためのものである。そのために、検出されるべき複数の鋳型核酸について、それぞれの一部の配列を標的配列として設定し、その標的配列を増幅するためのプライマーセットを設計する。更に、それぞれの標的配列の一部分を目的配列として設定し、それらの目的配列の相補配列をそれぞれ有するプローブ核酸を設計する。
【００９９】
図５（ａ）は、マルチ核酸反応具の１例の斜視図である。図５（ａ）に記載のマルチ核酸反応具１は、容器形状の支持体２を有する。支持体２の内側底面３には、互いに独立した複数のプライマー固定化領域４が配置される。複数のプライマー固定化領域４の近傍に、またそれぞれのプライマー固定化領域４に対応して複数のプローブ固定化領域５が配置される。
【０１００】
図５（ｂ）はプライマー固定化領域４を拡大した模式図である。そこに示されるように、１つのプライマー固定化領域４には１つの種類のプライマーセット６が固定化されている。複数のプライマー固定化領域４のそれぞれには、種類毎に複数のプライマーセット６がそれぞれ固定化されている。図示されていないが、各プライマーセット６と同時に、各プライマーセットについて至適増幅条件が達成されるように増幅試薬が固定化されている。
【０１０１】
プライマーセット６は、目的とする複数の標的核酸をそれぞれ増幅するために複数種類が用意される。更に、１つの標的核酸について３例ずつハイブリダイズ信号を得るために３つのプライマー固定化領域に同じプライマーセット６が固定化されている（これを「１つのシリーズ」と称す）。また、プライマーセット６と同時に増幅試薬２０が固定化されている。同じ、複数の増幅用試薬固定化領域４が設定される。１つのシリーズのプライマー固定化領域に対応するプローブ固定化領域５には、互いに同じ配列を有するプローブ核酸７が固定化されている。
【０１０２】
互いに異なるシリーズのプライマーセット６については、各シリーズによる増幅反応が至適条件で行われるように選択された増幅試薬が固定化されてる。増幅反応が至適条件で行われるように増幅試薬を選択することは、上述の実施形態において説明されたように、固定化される増幅試薬の種類、濃度および／または構成を変更することなどによって行われてよい。
【０１０３】
図５（ｃ）には、増幅用試薬固定化領域４の近傍に配置されたプローブ固定化領域５の拡大図である。プローブ固定化領域５には、検出されるべき所望の配列の相補配列を含むプローブ核酸７が複数で固定される。
【０１０４】
検出されるべき所望の配列は、目的配列であってよい。プローブ固定化領域５は、プローブ核酸７と目的配列鎖とのハイブリダイズ信号が、複数のプローブ固定化領域５間で独立して検出されるように配置される。
【０１０５】
プローブ核酸７のプローブ固定化領域５への固定は、それ自身公知の所謂ＤＮＡチップにおいて基板表面に対してプローブ核酸を固定する一般的な何れの技術を利用してもよい。プローブ核酸７の固定化した後にプライマーセット６と増幅試薬２０とを固定化してもよく、プライマーセット６と増幅試薬とを固定化した後にプローブ核酸７を固定化してもよく、プライマーセット６および増幅試薬２０の固定化とプローブ核酸７の固定化とを同時に行ってもよい。
【０１０６】
図５（ｄ）に固定化されたプライマーセット６および増幅試薬２０とプローブ核酸７の種類について模式的に示した。このマルチ核酸反応具１には、第１のシリーズ、第２のシリーズおよび第３のシリーズの３種類プライマーセット６が固定化される。第１のシリーズは、第１の標的核酸を定量するために、同じ種類のプライマーセット６ａが固定化され、且つそれにより生じる増幅が至適条件で行われるように固定化される増幅試薬の組成Ａが設計されている。第２のシリーズは、第２の標的核酸を定量するために、同じ種類のプライマーセット６ｂが固定化され、且つそれにより生じる増幅が至適条件で行われるように固定化される増幅試薬の組成Ｂが設計されている。第３のシリーズは、第３の標的核酸を定量するために、同じ種類のプライマーセット６ｃが固定化され、且つそれにより生じる増幅が至適条件で行われるように固定化される増幅試薬の組成Ｃが設計されている。
【０１０７】
第１のシリーズ、第２のシリーズおよび第３のシリーズのプライマーセット６がそれぞれ固定化されるプライマー固定化領域４に対応した位置には、シリーズ毎に異なる配列を有するプローブ固定化領域５が配置される。即ち、第１のシリーズのためのプローブ核酸７ａは、第１の標的核酸の少なくとも一部の配列である第１の目的配列に相補的な配列を有する。第２のシリーズのためのプローブ核酸７ｂは、第２の標的核酸の少なくとも一部の配列である第２の目的配列に相補的な配列を有する。第３のシリーズのためのプローブ核酸７ｃは、第３の標的核酸の少なくとも一部の配列である第３の目的配列に相補的な配列を有する。
【０１０８】
第１の標的核酸を増幅するためのプライマーセット６ａは、図５（ｄ）に示されるように同じ列に配置されたプライマー固定化領域４に固定される。これらに対応するプローブ固定化領域５には、第１の標的核酸が増幅されて生じる増幅産物に含まれる少なくとも一部の配列を目的配列（第１の目的配列）とし、その目的配列に相補的な配列を含むプローブ核酸７ａが固定化される。
【０１０９】
第１のシリーズのプライマー固定化領域４に対応するプローブ固定化領域５に固定化されるプローブ核酸７ａは、何れも同じ目的配列を検出するためのものである。従って、それらのプローブ固定化領域５に固定化されるプローブ核酸７ａは１つの目的配列（第１の目的配列）に相補的な配列を含む。
【０１１０】
同様に第２のシリーズに含まれる複数のプライマー固定化領域４には、第２の標的核酸を増幅するためのプライマーセット６ｂが固定化される。従って、それらのプローブ固定化領域５に固定化されるプローブ核酸７ｂは１つの目的配列（第２の目的配列）に相補的な配列を含む。
【０１１１】
更に、第３のシリーズに含まれる複数のプライマー固定化領域４には、第３の標的核酸を増幅するためのプライマーセット６ｃが固定化される。従って、それらのプローブ固定化領域５に固定化されるプローブ核酸７ｃは１つの目的配列（第３の目的配列）に相補的な配列を含む。
【０１１２】
このようなマルチ核酸反応具１を使用する３種類の鋳型核酸を検出する方法は、次のように行われる。マルチ核酸反応具１に試料と、任意の更なる増幅用試薬を含む反応液を添加する。その後増幅反応を行い、生じた増幅産物とプローブ核酸７との間のハイブリダイズ反応を行う。次に、生じたハイブリダイズ信号を検出する。
【０１１３】
以上の例では、マルチ核酸反応具１により定量される鋳型核酸の数を３つとし、それぞれ３例のハイブリダイズ信号を得るための構成を示した。しかしながら、プライマー固定化領域およびプローブ固定化領域の数を変更してもよく、検出される鋳型核酸が１種類以上、２種類以上または３種類以上であってもよい。それにより所望の数の核酸の検出を１つのマルチ核酸反応具により行うことが可能になる。
【０１１４】
このようなマルチ核酸反応具により、簡便に且つ高精度に複数の核酸を検出することが可能になる。
【０１１５】
＜第５の実施形態＞
マルチ核酸反応具の更なる１例を、図６を参照しながら説明する。図６に示すマルチ核酸反応具１は、流路を有する支持体を使用する例である。図６（ａ）はマルチ核酸反応具１の平面図であり、図６（ｂ）は、線ｍ−ｍ’で切断したマルチ核酸反応具１の断面図である。
【０１１６】
マルチ核酸反応具１は、支持体２の内部に形成された流路４１と、流路４１の底面４２に配置された互いに独立した複数のプライマー固定化領域５０と、そこに種類毎に遊離可能に固定化された複数のプライマーセット６と増幅試薬５１と、複数のプライマー固定化領域５０と同じ位置に配置されたプローブ固定化領域５と、そこに固定化されたプローブ核酸７とを含む。
【０１１７】
マルチ核酸反応具１は、複数の標的核酸を検出するためのものである。従って、複数の標的核酸のそれぞれの少なくとも一部分を増幅するための複数のプライマーセット６が用意される。更に、それらのプライマーセット６による増幅反応が至適条件で行われるように、それぞれのプライマーセット６について、複数種類の組成の増幅試薬が設計され用意される。それぞれのプライマーセット６による増幅反応が至適条件で行われるための増幅試薬の設計は、それぞれの種類のプライマーセット６毎の予備試験により行われる。至適条件を達成するためには、例えば、増幅用試薬の使用の有無、使用される増幅用試薬の種類、量および組み合わせが複数種類のプライマーセット間で調節される。
【０１１８】
複数のプライマーセット６は、増幅されるべき標的核酸の種類毎にマルチ核酸反応具１の流路４１の流れ方向に沿って固定化される。
【０１１９】
プローブ核酸７は、プライマーセット６によりそれぞれ増幅されて形成された複数種類の増幅産物とハイブリダイズするように複数種類で用意される。これらの複数のプローブ核酸７は、それぞれ対応するプライマー固定化領域５０と同じ位置に、マルチ核酸反応具１の流路４１の流れ方向に沿って固定化されている。
【０１２０】
上述したように、この実施形態では、同じ位置にプローブ核酸７と、プライマーセット６およびその他の増幅用試薬５１とが固定化されている。この場合、プローブ核酸７は反応液の添加から検出終了時まで支持体２に固定化されたままであり、プライマーセット６および増幅用試薬５１は、添加された反応液と接触することにより遊離されるように固定化される必要がある。そのためには、例えば、プローブ核酸７を先に支持体２に固定化し、その後プライマーセット６および増幅試薬５１を遊離可能に固定化すればよい。
【０１２１】
このマルチ核酸反応具は、例えば、第１の基板と第２の基板を用いて製造される。まず、第１の基板の予め決定されたプローブ固定化領域５に複数種類のプローブ核酸７が固定化される。次にプライマー固定化領域５０に、複数のプライマーセット６および増幅試薬５１が遊離可能に固定化される。プライマーセット６および増幅試薬５１はプライマーの種類毎および組成の種類毎に固定化される。
【０１２２】
一方で、第２の基板には、所望の流路４１に形状に対応させて凹部４３を形成する。凹部４３の形成は、使用される基板の材質に応じてそれ自身公知の方法により行うことが可能である。また、プライマー固定化領域５０およびプローブ固定化領域５が配置される位置は、第２の基板に形成された凹部４３および凹部４３に対向する第２の基体の表面により形成される流路内に含まれるように決定される。
【０１２３】
次に、第１の基板と第２の基板を一体化する。一体化により、凹部４３の内壁と第１の基板の面とにより流路４１が形成される。この流路４１は、流路形状の反応部である。２つの基板の一体化は、第２の基板の凹部４３が第１の基板側を向くように行われる。また、第２の基板の凹部４３の端部に対応する部分に貫通孔７２および７３が設けられてもよい。この貫通孔７２および７３は、流路４１への反応液などの出し入れ口として利用されてよい。
【０１２４】
第１の基板の材質と第２の基板の材質は同じであっても、異なってよい。また、第１の基板および第２の基板の材質は、それ自身反応に関与しない材質であればよく、そこにおいて増幅反応を行うことが可能な材質であればよい。例えば、シリコン、ガラス、樹脂および金属などから任意に選択されてよい。
【０１２５】
この実施形態では、流路を有した支持体の流路底面にプライマーセット、増幅試薬およびプローブ核酸を固定化した例を示したが、流路の配置および形状はこれに限定されるものではない。また、プローブセット、増幅試薬およびプローブ核酸を固定化する面は流路を規定する何れの面であってもよく、流路を規定する全ての面にプローブセット、増幅試薬およびプローブ核酸が固定されてもよく、また複数の面に固定されてもよい。更に、プライマーセット、増幅試薬およびプローブ核酸の固定化は、互いに異なる領域に固定化されてもよく、プライマーセットと増幅試薬とが同じ領域に固定化され、プローブ核酸のみが異なる領域に固定化されてもよい。
【０１２６】
また、マルチ核酸反応具の製造は、予め凹部または溝を形成することにより流路を形成した第１の基板に、その流路の一部の壁面に配置されたプライマー固定化領域に対して、複数のプライマーセット、増幅試薬を独立して固定してもよい。その後、シリコンゴムなどの蓋体を取り付けることにより、マルチ核酸反応具が製造されてもよい。
【０１２７】
このようなマルチ核酸反応具により、複数の標的核酸について、標的核酸毎に至適条件で増幅反応を行い、且つそれぞれの反応産物を検出し、それにより複数の標的核酸を簡便且つ高精度に検出することが可能となる。
【０１２８】
＜第６の実施形態＞
第６の実施形態のアレイ型プライマープローブチップについて図７〜図１０を参照しながら説明する。このアレイ型プライマープローブチップは、試料中の特定の２種類の核酸を検出するためのものである。
【０１２９】
（１）チップ素材
まず、電気化学的検出によりハイブリダイズ信号を検出するアレイ型プライマープローブチップのチップ素材の構成および製造方法の１例について図７（ａ）および（ｂ）を用いて説明する。図７（ａ）は、チップ素材の平面図であり、図７（ｂ）は、図７（ａ）のチップ素材の線Ｂ−Ｂに沿う断面図である。
【０１３０】
チップ素材１１１は、矩形状の基板１１２上にその長手方向に沿って配置された例えば４つの電極１１３ａ〜１１３ｄを備えている。各電極１１３ａ〜１１３ｄは、第１の金属薄膜パターン１１４および第２の金属薄膜パターン１１５をこの順序で積層した構造を有する。また、各電極１１３ａ〜１１３ｄは大矩形部１１６と小矩形部１１７を細線１１８で連結した形状を有する。絶縁膜１１９は、各電極１１３ａ〜１１３ｄを含む基板１１２上に被覆されている。円形窓１２０は、大矩形部１１６に対応する絶縁膜１１９部分に開口されている。矩形窓１２１は、小矩形部１１７に対応する絶縁膜１１９部分に開口されている。電極１１３ａの円形窓１２０ａから露出する大矩形部１１６は第１の作用極１２２ａとして機能する。電極１１３ｂの円形窓１２０ｂから露出する大矩形部１１６は第２の作用極１２２ｂとして機能する。電極１１３ｃの円形窓１２０ｃから露出する大矩形部１１６は対極１２３として機能する。電極１１３ｄの円形窓１２０ｄから露出する大矩形部１１６は参照極１２４として機能する。また、電極１１３ａ〜１１３ｄの矩形窓１２１から露出する小矩形部１１７はプローバー接触部として機能する。
【０１３１】
このようなチップ素材は、次のような方法により作製することができる。
【０１３２】
まず、基板１１２上に第１の金属薄膜および第２の金属薄膜を例えば、スパッタリング法または真空蒸着法によりこの順序により堆積する。続いてこれらの金属薄膜を例えば、レジストパターンをマスクとして順次選択的にエッチングして、第１の金属薄膜パターン１１４および第２の金属薄膜パターン１１５をこの順序で積層した、例えば４つの電極１１３ａ〜１１３ｄを基板１１２の長手方向に沿って形成する。これらの電極１１３ａ〜１１３ｄは、大矩形部１１６と小矩形部１１７を細線１１８で連結した形状を有する。
【０１３３】
次いで、電極１１３ａ〜１１３ｄを含む基板１１２上に、絶縁膜１１９を例えば、スパッタリング法またはＣＶＤ法により堆積する。続いて、各電極１１３ａ〜１１３ｄの大矩形部１１６に対応する絶縁膜１１９部分および小矩形部１１７に対応する絶縁膜１１９部分をレジストパターンをマスクとして選択的にエッチングして、大矩形部１１６に対応する絶縁膜１１９部分に円形窓１２０を、および小矩形部１１７に対応する絶縁膜１１９部分に矩形窓１２１を開口する。それにより前述したチップ素材１１１を作製する。
【０１３４】
基板１１２は、例えば、パイレックス（登録商標）ガラスのようなガラスまたは樹脂から作られる。
【０１３５】
第１の金属薄膜は、第２の金属薄膜を基板１１２に密着させるための下地金属膜として働き、例えば、Ｔｉから作られる。第２の金属薄膜は、例えば、Ａｕから作られる。
【０１３６】
第１および第２の金属薄膜をパターニングするときのエッチングの例は、エッチングガスを用いるプラズマエッチングまたは反応性イオンエッチングを含む。
【０１３７】
絶縁膜１１９は、例えば、シリコン酸化膜のような金属酸化膜、シリコン窒化膜のような金属窒化膜を挙げることができる。
【０１３８】
絶縁膜１１９をパターニングするときのエッチングの例は、エッチングガスを用いるプラズマエッチングまたは反応性イオンエッチングを含む。
【０１３９】
（２）アレイ型プライマープローブチップ
次に、上記（１）において製造されたチップ素材１１１にプライマーセットとプローブ核酸を固定したアレイ型プライマープローブチップの構成および製造方法の１例を図８（ａ）および図８（ｂ）を参照しながら説明する。図８（ａ）はアレイ型プライマープローブチップ１の平面図であり、図８（ｂ）は図８（ａ）のアレイ型プライマープローブチップ１の線Ｂ−Ｂに沿う断面図である。
【０１４０】
チップ素材１１１上に形成された電極１１３ａの第１の作用極１２２ａを第１のプローブ固定化領域２０１ａとし、この第１のプローブ固定化領域２０１ａに第１の目的配列の相補配列を含む第１のプローブ核酸２０２ａを固定化する。固定化される第１のプローブ核酸２０２ａは、その複数本で１つのプローブ核酸群として固定化される。同様に、電極１１３ｂの第２の作用極１２２ｂを第２のプローブ固定化領域２０１ｂとし、この第２のプローブ固定化領域２０１ｂに第１の目的配列とは異なる第２の目的配列の相補配列を含む第２のプローブ核酸２０２ｂを固定化する。
【０１４１】
プローブ核酸２０２ａおよび２０２ｂをプローブ固定化領域２０１に固定する方法の例は、金電極を具備したチップ素材１１１については３’末端にチオール基を第１のプローブ核酸２０２ａに導入する方法などが含まれる。
【０１４２】
次いで、第１の作用極１２２ａの近傍に第１のプライマー固定化領域２０３ａを、第２の作用極１２２ｂの近傍に第２のプライマー固定化領域２０３ｂを配置する。この第１のプライマー固定化領域２０３ａ上に第１のプライマーセット２０４ａと増幅試薬２０ａとを、第２のプライマー固定化領域２０３ｂ上に第２のプライマーセット２０４ｂと増幅試薬２０ｂとを固定化する。それによりアレイ型プライマープローブチップ１を作製する。
【０１４３】
第１のプライマーセット２０４ａは第１の標的配列を増幅するように設計された配列を有し、第２のプライマー固定化領域２０４ｂは第１の標的配列とは異なる配列からなる第２の標的配列を増幅するように設計された配列を有する。増幅試薬２０ａは、第１のプライマーセット２０４ａによる増幅反応が至適条件で行われるように組成が設計されている。増幅試薬２０ｂは、第２のプライマーセット２０４ｂによる増幅反応が至適条件で行われるように組成が設計されている。
【０１４４】
第１および第２のプライマーセット２０４ａおよび２０４ｂ、並びに増幅試薬２０ａおよび１０ｂをそれぞれ第１および第２のプライマー固定化領域２０３ａおよび２０３ｂに固定化することは、例えば、水、緩衝液または有機溶剤のような溶媒にそれぞれのプライマーセット２０４および対応する増幅試薬２０を含ませて滴下し、その後、例えば、室温などの適切な温度条件下で乾燥するまでの時間、例えば、室温の場合では１０分間放置することにより行う。
【０１４５】
（３）使用時のアレイ型プライマープローブチップ
上記（２）において作製されたアレイ型プライマープローブチップ１の使用方法について図９および図１０を参照しながら説明する。
【０１４６】
図９（ａ）は、使用時のアレイ型プライマープローブチップ１の平面図であり、図９（ｂ）は、図９（ａ）のアレイ型プライマープローブチップ１の線Ｂ−Ｂに沿う断面図である。
【０１４７】
本実施形態のアレイ型プライマープローブチップ１を使用する場合、電極１１３ａ〜１１３ｄにそれぞれ形成された第１の作用極１２２ａ、第２の作用極１２２ｂ、対極１２３および参照極１２４、並びに第１のプライマー固定化領域２０３ａおよび第２のプライマー固定化領域２０３ｂが同じ１つの反応場に含まれるように反応液が維持される。そのために、被覆体３０１が、アレイ型プライマープローブチップ１の使用前にアレイ型プライマープローブチップ１上に装着される。被覆体３０１は、中空でその１つの面が開放した直方体である。被覆体３０１は、例えば、シリコンゴムのようなシリコン樹脂および／またはフッ素樹脂などのような樹脂を用いて、そのような樹脂を、例えば、押出成形、射出成形または型押成形および／または例えば、接着剤による各部材の接着などのそれ自身公知の何れかの樹脂成形法によって形成される。被覆体３０１が装着された後に、反応液３０２がアレイ型プライマープローブチップ１と被覆体３０１とにより規定された空間に添加される。反応液３０２は、鋳型核酸３０３を含む。
【０１４８】
被覆体３０１が装着されたアレイ型プライマープローブチップ１において、電極１１３ａ〜１１３ｄのそれぞれの矩形窓１２１から露出する小矩形部１１７は露出している。
【０１４９】
被覆体３０１をアレイ型プライマープローブチップ１に装着する方法の例は、例えば、圧着、接着剤による接着などが含まれる。
【０１５０】
反応液３０２は被覆体３０１がアレイ型プライマープローブチップ１に装着された後に添加される。
【０１５１】
アレイ型プライマープローブチップ１と被覆体３０１とにより形成される空間に反応液などの液体を添加する方法の例は、例えば、被覆体３０１の一部に開口部を予め設けておき、その開口部から添加すること、または先端の鋭利な例えば、針のような先端を有した注入器を用い、その針で被覆体３０１を穿孔し、被覆体３０１の一部に針を差し込んで添加することなどが挙げられる。
【０１５２】
反応液３０２は、試料と、固定化された増幅試薬以外の増幅のために必要な試薬、例えば、ポリメラーゼなどの酵素、プライマーを起点とし新たなポリヌクレオチド鎖を形成する際に必要なでオキシヌクレオシド三リン酸などの基質、逆転写を同時に行う場合には、逆転写酵素およびそれに必要な基質など、更に、適切な増幅環境を維持するための塩類などの緩衝剤および例えば、ヘキスト３３２５８のような２本鎖核酸を認識して信号を生ずるインタカレータを含む。検査されるべき試料中に特定のプライマー固定化領域に固定されたプライマーセットにより増幅されるべき標的配列を含む鋳型核酸が存在している場合、そのプライマー固定化領域とそれに対応するプローブ固定化領域を含む反応領域において増幅産物が形成される。その様子を模式的に図１０に示す。
【０１５３】
図１０（ａ）は、反応場である反応液３０２の領域４０１において増幅産物が形成された状態を模式的に示す。図１０（ａ）は、使用時のアレイ型プライマープローブチップ１の平面図であり、図１０（ｂ）は、図１０（ａ）のアレイ型プライマープローブチップ１の線Ｂ−Ｂに沿う断面図である。上述のように図９において添加された試料中には、第２のプライマーセット２０４ｂが結合できる配列を含む核酸が含まれていたために、図１０（ａ）および図１０（ｂ）に示すように、第２のプライマーセット２０４ｂは領域４０１に遊離および拡散し、鋳型核酸３０３と出会った後に増幅反応が生じ、増幅産物が形成される。第２のプライマーセット２０４ｂによる増幅産物は、第２のプライマー固定化領域２０３ｂの周辺に拡散し、第２のプローブ固定化領域２０１ｂに到達する。到達した増幅産物が、目的配列を含む場合、第２のプローブ核酸２０２ｂと増幅産物とがハイブリダイズして２本鎖核酸を形成する。この２本鎖核酸に対して、反応液３０２に含まれるインタカレータが結合してハイブリダイズ信号を生じる。
【０１５４】
ハイブリダイズ信号は、例えば、電極１１３ａ〜１１３ｄのそれぞれの矩形窓１２１から露出する小矩形部１１７にプローバーを接触させ、ヘキスト３３２５８のようなインタカレータの電流応答を測定することにより行われる。
【０１５５】
電気化学的検出を利用するアレイ型プライマープローブチップを使用することによって、より簡単に且つ短時間に試料に含まれる標的核酸を増幅した後に、その増幅産物に含まれる目的核酸の検出を行うことが可能である。
【０１５６】
このアレイ型プライマープローブチップは、試料中の特定の２種類の核酸を増幅し、検出するためのデバイスであり、そのために電極を２つ備える。しかしながら、電極の数を増やしてプローブ固定化領域を増やし、それに対応するプライマー固定化領域を増やすことにより、２種類以上の核酸についても同様に増幅し、検出することが可能である。
【０１５７】
このような実施形態により、簡便に且つ高精度に複数の核酸を増幅し、増幅により生じた増幅産物について検出することが可能となる。
【０１５８】
＜マルチ核酸反応具の製造方法＞
また、更なる実施形態としてマルチ核酸反応具の製造方法も提供される。１つの例として製造方法は、以下を含む；
複数種類の標的核酸と、前記複数種類の標的核酸をそれぞれ増幅するための複数種類のプライマーセットと、それぞれの前記プライマーセットによる増幅を至適条件で行うように設計された複数種類の組成の増幅試薬と、液相の反応場を支持するように構成された支持体とを準備すること、
前記支持体において、前記液相により前記反応場が形成された際に、前記反応場に接する前記支持体の少なくとも１つの面に、互いに独立して複数のプライマー固定化領域を配置すること、
前記複数のプライマー固定化領域のそれぞれと同じ位置またはその近傍に、複数の増幅試薬固定化領域を配置すること、
前記複数のプライマー固定化領域のそれぞれに、プライマーセットを種類毎に遊離可能に固定化すること、および
前記複数の増幅試薬固定化領域のそれぞれに、増幅試薬を固定化すること。
【０１５９】
また更なる例として、マルチ核酸反応具の製造方法は以下を含む；
複数種類の標的核酸と、前記複数種類の標的核酸をそれぞれ増幅するためのプライマーセットと、それぞれの前記プライマーセットによる増幅を至適条件で行うように設計された複数種類の組成の増幅試薬と、それぞれの前記標的核酸と前記プライマーセットとにより生じた増幅産物の少なくとも一部に相補的な配列を含む複数種類のプローブ核酸と、液相の反応場を支持するように構成された支持体とを準備すること、
前記支持体において、前記液相により前記反応場が形成された際に、前記反応場に接する前記支持体の少なくとも１つの面に、互いに独立して複数のプライマー固定化領域を配置すること、
前記複数のプライマー固定化領域のそれぞれと同じ位置またはその近傍に、複数のプローブ固定化領域を配置すること、
前記複数のプライマー固定化領域のそれぞれに、プライマーセットと増幅試薬とを種類毎に遊離可能に固定化すること、および
前記複数のプローブ固定化領域のそれぞれに、ハイブリダイズ信号を独立して検出可能にプローブ核酸をそれぞれ固定化すること。
【０１６０】
ここにおいて、特定の標的配列を増幅すべきプライマーセットが固定化された領域と同じ位置またはその近傍に、前記特定の標的配列の少なくとも一部に相補的な配列を含むプローブ核酸が固定化される。即ち、増幅されるべき標的核酸を増幅するためのプライマーセットが固定化された位置と同じ位置またはその近傍に、標的核酸を鋳型として得られた増幅産物に含まれる目的配列とハイブリダイズすることにより標的核酸を検出するためのプローブ核酸が固定化される。言い換えれば、１つの反応領域における増幅により生じた増幅産物は、それを検出できるプローブ核酸が同じ反応領域に存在して初めて検出される。従って、互いに対応するプライマーセットとプローブ核酸とは同じ反応領域に存在できるように固定化されている。
【０１６１】
このような製造方法により、１つの反応場において複数の増幅反応を達成し、生じた増幅産物を検出することにより、試料中の核酸を定量することができるデバイスが提供される。
【０１６２】
＜核酸の増幅方法＞
例として上述したようなマルチ核酸反応具を使用して、複数の標的核酸を増幅する方法も更なる実施形態として提供される。そのような方法は、例えば、次の工程を含んでよい。
【０１６３】
（ａ）  複数種類の標的核酸と、前記複数種類の標的核酸をそれぞれ増幅するための複数種類のプライマーセットと、それぞれの前記プライマーセットによる増幅を至適条件で行うように設計された複数種類の組成の増幅試薬と、液相の反応場を支持するように構成された支持体とを準備すること、
（ｂ）前記支持体において、前記液相により前記反応場が形成された際に、前記反応場に接する前記支持体の少なくとも１つの面に、互いに独立して複数のプライマー固定化領域を配置すること、
（ｃ）前記複数のプライマー固定化領域のそれぞれと同じ位置またはその近傍に、複数の増幅試薬固定化領域を配置すること、
（ｄ）前記複数のプライマー固定化領域のそれぞれに、プライマーセットを種類毎に遊離可能に固定化すること、
（ｅ）前記複数の増幅試薬固定化領域のそれぞれに、増幅試薬を固定化すること、
（ｆ）前記支持体に対して核酸増幅を行うための反応液を添加して１つの反応場を形成すること、
（ｇ）前記反応場に試料を持ち込むこと、および
（ｈ）前記１つの反応場において前記複数種類の標的核酸について増幅反応をそれぞれ行うこと。
【０１６４】
このような増幅方法により、簡便に且つ高精度で試料中の核酸を増幅することが可能となる。
【０１６５】
＜核酸の検出方法＞
例として上述したようなマルチ核酸反応具を使用して、複数の標的核酸を増幅して、ハイブリダイズ信号を指標として核酸を定量する方法も更なる実施形態として提供される。核酸を定量する方法は、次の工程を含んでよい；
（ａ）複数種類の標的核酸と、前記複数種類の標的核酸をそれぞれ増幅するためのプライマーセットと、それぞれの前記プライマーセットによる増幅を至適条件で行うように設計された複数種類の組成の増幅試薬と、それぞれの前記標的核酸と前記プライマーセットとにより生じた増幅産物の少なくとも一部に相補的な配列を含む複数種類のプローブ核酸と、液相の反応場を支持するように構成された支持体とを準備すること、
（ｂ）前記支持体において、前記液相により前記反応場が形成された際に、前記反応場に接する前記支持体の少なくとも１つの面に、互いに独立して複数のプライマー固定化領域を配置すること、
（ｃ）前記複数のプライマー固定化領域のそれぞれと同じ位置またはその近傍に、複数のプローブ固定化領域を配置すること、
（ｄ）前記複数のプライマー固定化領域のそれぞれに、プライマーセットと増幅試薬とを種類毎に遊離可能に固定化すること、
（ｅ）前記複数のプローブ固定化領域のそれぞれに、ハイブリダイズ信号を独立して検出可能にプローブ核酸をそれぞれ固定化すること、
（ｆ）前記支持体に対して核酸増幅を行うための反応液を添加して１つの反応場を形成すること、
（ｇ）反応場に試料を持ち込むこと、
（ｈ）前記１つの反応場において前記複数種類の標的核酸について増幅反応をそれぞれ行うこと、
（ｉ）前記増幅反応により得られた増幅産物と前記プローブ核酸とのハイブリダイズの有無および／または量を、前記プライマーセットのそれぞれにより得られる増幅産物について独立して検出すること、および
（ｊ）前記（ｉ）の結果に基づいて、前記試料中の標的核酸の有無および／または量を決定すること。
【０１６６】
このような検出方法により、簡便に且つ高精度で試料中の核酸を増幅および検出することが可能となる。
【０１６７】
反応液は、マルチ核酸反応具において増幅反応およびそれに続くハイブリダイゼーションに必要な液体であればよい。増幅反応に必要な液体は、固定化されたプライマーセットと固定化された増幅用試薬のみで増幅反応が可能である場合には、水であってもよい。必要に応じて、反応液には、増幅に必要な試薬、例えば、ポリメラーゼなどの酵素、プライマーを起点とし新たなポリヌクレオチド鎖を形成する際に必要なデオキシヌクレオシド三リン酸などの基質、逆転写を同時に行う場合には、逆転写酵素およびそれに必要な基質など、更に、適切な増幅環境を維持するための塩類などの緩衝剤を含んでもよい。
【０１６８】
試料の反応場への持ち込みは、反応液に対して予め添加し、その後、マルチ核酸反応具の反応部に添加されてもよい。或いは、反応液をマルチ核酸反応具の反応部に添加する前または後に、試料を反応部に添加してもよい。
【０１６９】
また必要に応じて、例えば、当該プライマーが固定された支持体を加熱または冷却することによって、反応部内の温度調節を行ってもよい。更に、必要に応じて増幅反応を開始および／または維持するための条件を満たす操作を行ってもよい。
【０１７０】
増幅産物の検出は、それ自身公知のハイブリダイズ信号を検出する方法、例えば、蛍光標識を利用する蛍光強度の検出および／または測定、或いはインタカレータを利用する電流応答を検出および／または測定する方法を利用して行われてよい。
【０１７１】
例として実施形態に示したマルチ核酸反応具によれば、増幅されるべき複数種類の標的核酸間および／またはプライマーセット間に存在する配列の相違による影響を受けずに複数種類の標的配列についての増幅を、１つの反応場に含まれる複数の反応領域毎に独立して同時に行うことができる。また、増幅反応と同時または増幅反応に引き続いて、増幅反応を行ったのと同じ反応領域において、増幅反応により生じた増幅産物について目的核酸の有無および／または量を検出および／または測定することができる。
【０１７２】
従来の技術では、複数種類のプライマーを１つの容器内で使用してマルチプレックス増幅を行った場合、反応効率に偏りが生じ、種類の数に限りがあることが問題となっている。即ち、異なる種類のプライマー間で、必要な酵素やｄＮＴＰの取り合いが生じることがある。また、標的配列の配列やプライマーの配列により、反応特異性および／または反応効率に違いがでることもある。その場合、プライマーの種類によって増幅反応開始点が異なること、一部のプライマーセットについての増幅のみが開始され進行されること、或いは、一部のプライマーセットについての増幅が十分に達成されないことなどの問題が生じてしまう。このような問題も、本明細書において開示される実施形態により解決される。
【０１７３】
即ち、実施形態を例に示したマルチ核酸反応具を使用して増幅反応を行うと、固定化されたプライマーセットおよび増幅試薬の近傍、即ち、それぞれの反応領域でのみ増幅反応が進行する。そのために、同一容器中および／または同一溶液中でありながら、存在する複数の反応領域における増幅反応が、互いに干渉することなく、それぞれの増幅反応を独立して進行させることが可能となる。更に、そのような増幅反応と同時または引き続いて、増幅反応を行ったのと同じ反応容器において目的核酸の有無および／または量を検出および／または測定することができる。それにより、簡便に、且つ高精度で複数の増幅を行うことが可能であり、且つそれぞれの反応により生じた増幅産物を独立して高精度に検出することが可能である。従って、簡便且つ高精度に核酸の検出を行うことが可能となる。
【０１７４】
［例］  
例１
ＲＮＡとＤＮＡを同時検出
（１）チップ素材の作製
図８に示すようなマルチ核酸増幅検出反応具用のチップ素材を形成した。パイレックスガラス表面にチタン及び金の薄膜をスパッタリングにより形成した。その後、エッチング処理により、チタンおよび金の電極パターンをガラス表面上に形成した。更にその上に絶縁膜を塗付して、エッチング処理により電極、即ち、作用極、対極、参照極およびプローブ用電極を露出させた。これをマルチ核酸増幅検出反応具のためのチップ素材とした。
【０１７５】
（２）マルチ核酸増幅検出反応具の作製
上記のように作製したチップ素材の作用極上にプローブＤＮＡを固定化した。使用したプローブＤＮＡの塩基配列を表１に示す。
【表１】
2014060973.tif 000003
【０１７６】
２種類のプローブＤＮＡ（Ａ）、（Ｂ）を上記のように作製したチップ素材に固定化した。プローブＤＮＡをそれぞれ３μＭずつ含むプローブＤＮＡ溶液をそれぞれ調製した。これらの溶液の１００ｎＬを作用極上に種類毎にスポットした。４０℃で乾燥後、超純水により洗浄した。その後、作用極表面に残った超純水を除去し、プローブＤＮＡがチップ素材の電極に固定化されたＤＮＡチップを作製した。
【０１７７】
次に上記でシリコンゴム板製の被覆体を用意した。被覆体の一面には、プローブ固定化領域に対応する位置に溝が形成されている。
【０１７８】
被覆体の溝の底面に対して複数のプライマーセットと増幅試薬である、DNAポリメラーゼを固定し、加えて、RNAを検出する箇所には、逆転写酵素を固定した。プライマーセットと増幅試薬の固定化領域は、先に固定したプローブＤＮＡの位置に対応する位置となるように調整した。
【０１７９】
まず、使用するプライマーＤＮＡを用意した。使用するプライマーＤＮＡは、Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＬＡＭＰ）法による増幅のためのプライマーセットである。プライマーＤＮＡの塩基配列を表２に示す。
【表２−１】
2014060973.tif 000004
【０１８０】
【表２−２】
2014060973.tif 000005
【０１８１】
プライマーＤＮＡ（セットＡ）、（セットＢ）については、２００μＭのＦＩＰ、ＢＩＰ、Ｆ３、Ｂ３およびＬＰＦ、ＬＰＢをそれぞれ準備した。ＦＩＰ、ＢＩＰ、Ｆ３、Ｂ３、ＬＰＦ、ＬＰＢをそれぞれ０．０３６μＬ、０．０３６μＬ、０．００５μＬ、０．００５μＬおよび０．０１８μＬで含む０．１００μＬの溶液とＤＮＡポリメラーゼ０．１μＬの混合液に対して、セットＢは、逆転写酵素を０．０５０μＬ添加した。この水溶液を、被覆体であるシリコンゴムの溝部の底面のプライマーと核酸増幅に必要な固定化領域に固定した。
【０１８２】
具体的には、用意したそれぞれ０．２００μＬのそれらの溶液を、被覆体の溝部の底部にスポットし、４０℃で２分間乾燥させた。スポットは、被覆体がＤＮＡチップに取り付けられたときに、それぞれのプローブＤＮＡが対応するプライマーセットと対向する位置になるように行った。被覆体の溝部と、プローブＤＮＡが固定化された面が対向するように、被覆体と上記で作製したチップ素材とを接着した。これにより、マルチ核酸増幅検出反応具を得た。被覆体であるシリコンゴムの溝部の２つの端部には、２つの貫通孔が開口されている。
【０１８３】
（３）ＬＡＭＰ反応液の作製
ＬＡＭＰ反応液（１）の組成を表３に示す。
【表３】
2014060973.tif 000006
【０１８４】
ＬＡＭＰ反応液（１）中の鋳型の配列を表４に示す。
【表４】
2014060973.tif 000007
【０１８５】
（４）マルチ核酸増幅検出反応具上でのＬＡＭＰ増幅反応及び、プローブＤＮＡよる目的核酸の検出
被覆体であるシリコンゴム板に設けられた２つの貫通孔のうちの一方を流入口とした。シリコンゴム板に設けられた溝部とチップ素材の一面とにより構成される流路を反応部として、そこにおいて反応を行った。反応液がプライマー固定化位置上を流速２５ｍｍ／ｓｅｃで通過するよう、流入口から反応部にＬＡＭＰ反応溶液を注入した。その後速やかに、ＤＮＡ自動検査装置内にマルチ核酸増幅検出反応具を設置した。ＤＮＡ自動検査装置内のペルチェ上で６４℃６０分間ＬＡＭＰ反応を行った。
【０１８６】
６０分間のＬＡＭＰ反応の後、５５℃で１０分間ハイブリダイゼーション反応を行い、３０℃で３分間洗浄を行った。その後、洗浄溶液を除去し、３５．５μＭヘキスト３３２５８溶液を流入口から注入した。
【０１８７】
各プローブ核酸固定化作用極に電位を掃引し、プローブＤＮＡとＬＡＭＰ産物により形成された二本鎖に特異的に結合したヘキスト３３２５８分子の酸化電流を計測した。
【０１８８】
上記一連の反応は、SICE Journal of Control, Measurement, and System Integration, Vol. 1, No. 3, pp. 266-270, 2008に記載のＤＮＡ自動検査装置にて実施した。
【０１８９】
（５）検出結果
鋳型Ａ（ＤＮＡ）、鋳型Ｂ（ＲＮＡ）を含むＬＡＭＰ反応溶液（１）を添加し、測定した結果、プローブＡ、プローブＢ、両方のプローブについて、３０ｎＡ以上の電流値が得られた。この結果から、ＤＮＡとＲＮＡが混在するマルチ増幅と検出に成功したことが示された。
【０１９０】
例２
標的核酸ごとに、必要な試薬を追加固定し、特性の違うものをマルチ検出
まず、チューブ内で１つの標的核酸と１種類のプライマーセットとを反応させることにより予備試験を行った。この例では、増幅反応を可能にするために高い増幅温度が必要な標的配列とプライマーセットとの組み合わせと、低い増幅温度でも増幅反応が可能な標的配列とプライマーセットとの組み合わせについて、ほぼ等しい増幅効率で増幅反応が得られるようにするために、増幅試薬の組成を決定した。
【０１９１】
その結果を表５に示す。
【表５】
2014060973.tif 000008
【０１９２】
この予備試験により、標的配列およびプライマーセットの設計により、硫酸アンモニウムおよびベタインの至適濃度が異なることが明らかになった。この結果に基づいて、標的核酸およびプライマーセットの配列に応じて、増幅試薬の組成を設計した。
【０１９３】
（１）チップ素材の作製
図８に示すようなマルチ核酸増幅検出反応具用のチップ素材を形成した。パイレックスガラス表面にチタン及び金の薄膜をスパッタリングにより形成した。その後、エッチング処理により、チタンおよび金の電極パターンをガラス表面上に形成した。更にその上に絶縁膜を塗付して、エッチング処理により電極、即ち、作用極、対極、参照極およびプローブ用電極を露出させた。これをマルチ核酸増幅検出反応具のためのチップ素材とした。
【０１９４】
（２）マルチ核酸増幅検出反応具の作製
上記のように作製したチップ素材の作用極上にプローブＤＮＡを固定化した。使用したプローブＤＮＡの塩基配列は表１に示したものと同じである。
【０１９５】
配列番号１〜４に示す４種類のプローブＤＮＡ（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｅ）を上記のように作製したチップ素材に固定化した。プローブＤＮＡをそれぞれ３μＭずつ含むプローブＤＮＡ溶液をそれぞれ調製した。これらの溶液の１００ｎＬを作用極上に種類毎にスポットした。４０℃で乾燥後、超純水により洗浄した。その後、作用極表面に残った超純水を除去し、プローブＤＮＡがチップ素材の電極に固定化されたＤＮＡチップを作製した。
【０１９６】
次に上記でシリコンゴム板製の被覆体を用意した。被覆体の一面には、プローブ固定化領域に対応する位置に溝が形成されている。
【０１９７】
被覆体の溝の底面に対して複数のプライマーセットと増幅試薬であるDNAポリメラーゼを固定した。プライマーセットと増幅試薬の固定化領域は、先に固定したプローブＤＮＡの位置に対応する位置となるように調整した。
【０１９８】
まず、使用するプライマーＤＮＡを用意した。使用するプライマーＤＮＡは、Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＬＡＭＰ）法による増幅のためのプライマーセットである。プライマーＤＮＡの塩基配列は表２に示された配列と同じ配列である。
【０１９９】
プライマーＤＮＡ（セットＣ）、（セットＤ）、（セットＥ）については、２００μＭのＦＩＰ、ＢＩＰ、Ｆ３、Ｂ３およびＬＰＦ、ＬＰＢをそれぞれ準備した。ＦＩＰ、ＢＩＰ、Ｆ３、Ｂ３、ＬＰＦ、ＬＰＢをそれぞれ０．０３６μＬ、０．０３６μＬ、０．００５μＬ、０．００５μＬおよび０．０１８μＬで含む０．１００μＬの溶液とＤＮＡポリメラーゼ０．１μＬの混合液に対して、セットＣは、１Ｍ硫酸マグネシウムを０．１μＬ添加、セットＤは、逆転写酵素を０．０５０μＬ、３．５Ｍ硫酸アンモニウムを０．１４μＬ添加、セットＥには、２Ｍ塩化カリウムを０．５００μＬ添加した（条件１）。この水溶液を、被覆体であるシリコンゴムの溝部の底面のプライマーと核酸増幅に必要な固定化領域に固定した。また、コントロールとして、酵素を除く増幅試薬を添加しない水溶液を、用意した（条件２）。
【０２００】
具体的には、用意したそれぞれ０．２００μＬのそれらの溶液を、被覆体の溝部の底部にスポットし、４０℃で２分間乾燥させた。スポットは、被覆体がＤＮＡチップに取り付けられたときに、それぞれのプローブＤＮＡが対応するプライマーセットと対向する位置になるように行った。被覆体の溝部と、プローブＤＮＡが固定化された面が対向するように、被覆体と上記で作製したチップ素材とを接着した。これにより、マルチ核酸増幅検出反応具を得た。被覆体であるシリコンゴムの溝部の２つの端部には、２つの貫通孔が開口されている。
【０２０１】
（３）ＬＡＭＰ反応液の作製
ＬＡＭＰ反応液（２）の組成を表６に示す。
【表６】
2014060973.tif 000009
【０２０２】
ＬＡＭＰ反応液（２）に含まれる鋳型の配列を表７に示す。
【表７】
2014060973.tif 000010
【０２０３】
（４）マルチ核酸増幅検出反応具上でのＬＡＭＰ増幅反応及び、プローブＤＮＡよる目的核酸の検出
被覆体であるシリコンゴム板に設けられた２つの貫通孔のうちの一方を流入口とした。シリコンゴム板に設けられた溝部とチップ素材の一面とにより構成される流路を反応部として、そこにおいて反応を行った。反応液がプライマー固定化位置上を流速２５ｍｍ／ｓｅｃで通過するよう、流入口から反応部にＬＡＭＰ反応溶液を注入した。その後速やかに、ＤＮＡ自動検査装置内にマルチ核酸増幅検出反応具を設置した。ＤＮＡ自動検査装置内のペルチェ上で６４℃６０分間ＬＡＭＰ反応を行った。
【０２０４】
６０分間のＬＡＭＰ反応の後、５５℃で１０分間ハイブリダイゼーション反応を行い、３０℃で３分間洗浄を行った。その後、洗浄溶液を除去し、３５．５μＭヘキスト３３２５８溶液を流入口から注入した。
【０２０５】
各プローブ核酸固定化作用極に電位を掃引し、プローブＤＮＡとＬＡＭＰ産物により形成された二本鎖に特異的に結合したヘキスト３３２５８分子の酸化電流を計測した。
【０２０６】
上記一連の反応は、SICE Journal of Control, Measurement, and System Integration, Vol. 1, No. 3, pp. 266-270, 2008に記載のＤＮＡ自動検査装置にて実施した。
【０２０７】
（５）検出結果
鋳型Ｃ、鋳型Ｄ、鋳型Ｅを含むＬＡＭＰ反応溶液（２）を添加し、測定した結果、条件１では、プローブＣ、プローブＤ、プローブＥ、全てのプローブについて、３０ｎＡ以上の電流値が得られた。一方で、標的核酸ごとに増幅試薬を追加固定しなかった条件２において、Ｄは、電流値が低く、ＣとＥは、電流値が検出されず陰性となる結果となった。この結果から、標的核酸ごとに、増幅に必要な試薬を個別に追加固定することで、マルチ増幅が成功し、試薬を追加固定しない場合では、電流値が検出されない、もしくは低いものをマルチ検出できることが示された。
【０２０８】
例３
ベタインを追加して、同じ温度でマルチ検出
まず、チューブ内で１つの標的核酸と１種類のプライマーセットとを反応させることにより予備試験を行った。この例では、増幅反応を可能にするために高い増幅温度が必要な標的配列とプライマーセットとの組み合わせと、低い増幅温度でも増幅反応が可能な標的配列とプライマーセットとの組み合わせについて、ほぼ等しい増幅効率で増幅反応が得られるようにするために、増幅試薬の組成を決定した。
【０２０９】
その結果は上述した表５に示される。その結果、至適増幅温度が高い標的核酸では、ベタイン濃度は、濃い方がよいことが示された。即ち、至適増幅温度が低い標的核酸が特定の増幅効率を達成するために、０．４Ｍのベタインが必要である場合、それと同じ増幅効率を達成するために、至適増幅温度が高い標的核酸では、１．４Ｍのベタインが必要とされた。この結果から、核酸を検出する場合にも、ベタインを追加することにより、増幅特性が改善され、改善前には検出できなかった種類の核酸についても検出することが可能となった。
【０２１０】
（１）チップ素材の作製
図８に示すようなマルチ核酸増幅検出反応具用のチップ素材を形成した。パイレックスガラス表面にチタン及び金の薄膜をスパッタリングにより形成した。その後、エッチング処理により、チタンおよび金の電極パターンをガラス表面上に形成した。更にその上に絶縁膜を塗付して、エッチング処理により電極、即ち、作用極、対極、参照極およびプローブ用電極を露出させた。これをマルチ核酸増幅検出反応具のためのチップ素材とした。
【０２１１】
（２）マルチ核酸増幅検出反応具の作製
上記のように作製したチップ素材の作用極上にプローブＤＮＡを固定化した。使用したプローブＤＮＡの塩基配列は表１に示された配列と同じ配列を使用した。
【０２１２】
２種類のプローブＤＮＡ（Ａ）、（Ｆ）を上記のように作製したチップ素材に固定化した。プローブＤＮＡをそれぞれ３μＭずつ含むプローブＤＮＡ溶液をそれぞれ調製した。これらの溶液の１００ｎＬを作用極上に種類毎にスポットした。４０℃で乾燥後、超純水により洗浄した。その後、作用極表面に残った超純水を除去し、プローブＤＮＡがチップ素材の電極に固定化されたＤＮＡチップを作製した。
【０２１３】
次に上記でシリコンゴム板製の被覆体を用意した。被覆体の一面には、プローブ固定化領域に対応する位置に溝が形成されている。
【０２１４】
被覆体の溝の底面に対して複数のプライマーセットと増幅試薬である、DNAポリメラーゼを固定した。プライマーセットと増幅試薬の固定化領域は、先に固定したプローブＤＮＡの位置に対応する位置となるように調整した。
【０２１５】
まず、使用するプライマーＤＮＡを用意した。使用するプライマーＤＮＡは、Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＬＡＭＰ）法による増幅のためのプライマーセットである。プライマーＤＮＡの塩基配列は表２に示された配列と同じ配列を使用した。
【０２１６】
プライマーＤＮＡ（セットＡ）、（セットＦ）については、２００μＭのＦＩＰ、ＢＩＰ、Ｆ３、Ｂ３およびＬＰＦ、ＬＰＢをそれぞれ準備した。ＦＩＰ、ＢＩＰ、Ｆ３、Ｂ３、ＬＰＦ、ＬＰＢをそれぞれ０．０３６μＬ、０．０３６μＬ、０．００５μＬ、０．００５μＬおよび０．０１８μＬで含む０．１００μＬの溶液とＤＮＡポリメラーゼ０．１μＬの混合液に対して、セットＣは、５Ｍベタインを０．０５０μＬ添加した。
【０２１７】
この水溶液を、被覆体であるシリコンゴムの溝部の底面のプライマーと核酸増幅に必要な固定化領域に固定した。
【０２１８】
具体的には、用意したそれぞれ０．２００μＬのそれらの溶液を、被覆体の溝部の底部にスポットし、４０℃で２分間乾燥させた。スポットは、被覆体がＤＮＡチップに取り付けられたときに、それぞれのプローブＤＮＡが対応するプライマーセットと対向する位置になるように行った。被覆体の溝部と、プローブＤＮＡが固定化された面が対向するように、被覆体と上記で作製したチップ素材とを接着した。これにより、マルチ核酸増幅検出反応具を得た。被覆体であるシリコンゴムの溝部の２つの端部には、２つの貫通孔が開口されている。
【０２１９】
（３）ＬＡＭＰ反応液の作製
ＬＡＭＰ反応液（３）組成を表８に示す。
【表８】
2014060973.tif 000011
【０２２０】
ＬＡＭＰ反応液（３）に含まれる鋳型の配列を表８に示す。
【表９】
2014060973.tif 000012
【０２２１】
（４）マルチ核酸増幅検出反応具上でのＬＡＭＰ増幅反応及び、プローブＤＮＡよる目的核酸の検出
被覆体であるシリコンゴム板に設けられた２つの貫通孔のうちの一方を流入口とした。シリコンゴム板に設けられた溝部とチップ素材の一面とにより構成される流路を反応部として、そこにおいて反応を行った。反応液がプライマー固定化位置上を流速２５ｍｍ／ｓｅｃで通過するよう、流入口から反応部にＬＡＭＰ反応溶液を注入した。その後速やかに、ＤＮＡ自動検査装置内にマルチ核酸増幅検出反応具を設置した。ＤＮＡ自動検査装置内のペルチェ上で、６４℃で６０分間ＬＡＭＰ反応を行った。
【０２２２】
６０分間のＬＡＭＰ反応の後、５５℃で１０分間ハイブリダイゼーション反応を行い、３０℃で３分間洗浄を行った。その後、洗浄溶液を除去し、３５．５μＭヘキスト３３２５８溶液を流入口から注入した。
【０２２３】
各プローブ核酸固定化作用極に電位を掃引し、プローブＤＮＡとＬＡＭＰ産物により形成された二本鎖に特異的に結合したヘキスト３３２５８分子の酸化電流を計測した。
【０２２４】
上記一連の反応は、SICE Journal of Control, Measurement, and System Integration, Vol. 1, No. 3, pp. 266-270, 2008に記載のＤＮＡ自動検査装置にて実施した。
【０２２５】
（５）検出結果
鋳型Ａ、鋳型Ｆを含むＬＡＭＰ反応溶液（３）を添加し、測定した結果、ベタインを追加した条件では、プローブＡ、プローブＦ、双方のプローブについて、３０ｎＡ以上の電流値が得られた。一方で、ベタインを追加しなかった場合は、Ｆの電流値が検出されず陰性となる結果となった。この結果から、ベタインを追加固定することで、増幅不可であった標的核酸Ｆが増幅可能となり、マルチ検出できることが示された。
【図１】
2014060973.tif 000013
【図２】
2014060973.tif 000014
【図３】
2014060973.tif 000015
【図４】
2014060973.tif 000016
【図５】
2014060973.tif 000017
【図６】
2014060973.tif 000018
【図７】
2014060973.tif 000019
【図８】
2014060973.tif 000020
【図９】
2014060973.tif 000021
【図１０】
2014060973.tif 000022
【配列表】
2014060973000001.app