(57)【要約】【課題】本発明の目的は、様々な色の発光を生じさせるルシフェラーゼを提供することにある。【解決手段】本発明に係るルシフェラーゼの変異体を製造する方法は、ルシフェラーゼのアミノ酸配列において、保存配列：Ｄ−Ｙ−Ｋ−Ｘ１−Ｘ２−Ｓ−Ｘ３−Ｘ４−Ｌ−Ｖ−Ｐ（配列番号５５）（Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４は、それぞれ独立に、タンパク質構成アミノ酸の１つである）を特定することと、前記保存配列のＮ末端側から６番目のセリン残基が、セリンを除くタンパク質構成アミノ酸の何れか１つに置換されるように、前記ルシフェラーゼをコードする核酸の塩基配列に変異を導入することとを含む。【選択図】図２
2014060941.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ルシフェラーゼのアミノ酸配列において、保存配列：Ｄ−Ｙ−Ｋ−Ｘ１−Ｘ２−Ｓ−Ｘ３−Ｘ４−Ｌ−Ｖ−Ｐ（配列番号５５）（Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４は、それぞれ独立に、タンパク質構成アミノ酸の１つである）を特定することと、
前記保存配列のＮ末端側から６番目のセリン残基が、セリンを除くタンパク質構成アミノ酸の何れか１つに置換されるように、前記ルシフェラーゼをコードする核酸の塩基配列に変異を導入することと
を含む前記ルシフェラーゼの変異体を製造する方法。
【請求項２】
前記ルシフェラーゼはホタル由来のルシフェラーゼである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記Ｘ１は、イソロイシンまたはシステインであり、
前記Ｘ２は、グルタミンまたはスレオニンであり、
前記Ｘ３は、アラニンまたはバリンであり、および
前記Ｘ４は、ロイシンまたはイソロイシンである
請求項１に記載の方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法により製造されたルシフェラーゼの変異体。
【請求項５】
配列番号６に記載のアミノ酸配列のＮ末端側から２８５番目のセリン残基が、セリンを除くタンパク質構成アミノ酸の何れか１つに置換されたアミノ酸配列を有するルシフェラーゼの変異体。
【請求項６】
配列番号７に記載のアミノ酸配列のＮ末端側から２８５番目のセリン残基が、セリンを除くタンパク質構成アミノ酸の何れか１つに置換されたアミノ酸配列を有するルシフェラーゼの変異体。
【請求項７】
配列番号８に記載のアミノ酸配列のＮ末端側から２８３番目のセリン残基が、セリンを除くタンパク質構成アミノ酸の何れか１つに置換されたアミノ酸配列を有するルシフェラーゼの変異体。
【請求項８】
配列番号９に記載のアミノ酸配列のＮ末端側から２８３番目のセリン残基が、セリンを除くタンパク質構成アミノ酸の何れか１つに置換されたアミノ酸配列を有するルシフェラーゼの変異体。
【請求項９】
配列番号１０に記載のアミノ酸配列のＮ末端側から２８３番目のセリン残基が、セリンを除くタンパク質構成アミノ酸の何れか１つに置換されたアミノ酸配列を有するルシフェラーゼの変異体。
【請求項１０】
請求項４から９の何れか１項に記載のルシフェラーゼの変異体をコードする遺伝子を含む核酸。
【請求項１１】
配列番号６から１０の何れか１つのアミノ酸配列を有するルシフェラーゼ。
【請求項１２】
配列番号１から５の何れか１つの塩基配列を含む核酸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ルシフェラーゼの変異体を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
種々の生物に由来するルシフェラーゼが多数知られている。異なる生物に由来するルシフェラーゼ同士は、互いに固有の色の発光を生じさせる場合が多い。しかしながら、所望の色の発光を生じさせるルシフェラーゼを多数揃えることは困難である。
【０００３】
一方、単一のルシフェラーゼに対して添加物を加えて発光の色を変化させることも試みられている。この場合、色ごとに添加物の成分や濃度等が異なる場合がある。
【０００４】
また、ルシフェラーゼのペプチドの構造やルシフェラーゼ遺伝子の塩基配列を、試行錯誤して改変することで、発光の色が異なる変異体を取得しようとする試みも存在する。この場合、ペプチドや塩基配列の改変部位が色ごとに異なる場合があり、色のバリエーションを増やすことは困難であり、また、改変後のルシフェラーゼ同士の特性が異なることがある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平３−２８５６８３号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Structural Basis for Spectral Difference in Luciferase Bioluminescence., Nakatsu, T., Ichiyama, S., Hiratake, J., Saldanha, A., Kobashi, N., Sakata, K. and Kato, H.: Nature, 440, 372-376 (2006)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、様々な色の発光を生じさせるルシフェラーゼを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明に係るルシフェラーゼの変異体を製造する方法は、ルシフェラーゼのアミノ酸配列において、保存配列：Ｄ−Ｙ−Ｋ−Ｘ１−Ｘ２−Ｓ−Ｘ３−Ｘ４−Ｌ−Ｖ−Ｐ（配列番号５５）（Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４は、それぞれ独立に、タンパク質構成アミノ酸の１つである）を特定することと、前記保存配列のＮ末端側から６番目のセリン残基が、セリンを除くタンパク質構成アミノ酸の何れか１つに置換されるように、前記ルシフェラーゼをコードする核酸の塩基配列に変異を導入することとを含む。
【０００９】
本発明に係るルシフェラーゼの変異体は、配列番号６に記載のアミノ酸配列のＮ末端側から２８５番目のセリン残基が、セリンを除くタンパク質構成アミノ酸の何れか１つに置換されたアミノ酸配列を有する。
【００１０】
本発明に係るルシフェラーゼの変異体は、配列番号７に記載のアミノ酸配列のＮ末端側から２８５番目のセリン残基が、セリンを除くタンパク質構成アミノ酸の何れか１つに置換されたアミノ酸配列を有する。
【００１１】
本発明に係るルシフェラーゼの変異体は、配列番号８に記載のアミノ酸配列のＮ末端側から２８３番目のセリン残基が、セリンを除くタンパク質構成アミノ酸の何れか１つに置換されたアミノ酸配列を有する。
【００１２】
本発明に係るルシフェラーゼの変異体は、配列番号９に記載のアミノ酸配列のＮ末端側から２８３番目のセリン残基が、セリンを除くタンパク質構成アミノ酸の何れか１つに置換されたアミノ酸配列を有する。
【００１３】
本発明に係るルシフェラーゼの変異体は、配列番号１０に記載のアミノ酸配列のＮ末端側から２８３番目のセリン残基が、セリンを除くタンパク質構成アミノ酸の何れか１つに置換されたアミノ酸配列を有する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、様々な色の発光を生じさせるルシフェラーゼが提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、４種のホタルから取得されたルシフェラーゼのアミノ酸配列の一部を比較する図である。
【図２】図２は、４種のホタルから取得されたルシフェラーゼから作製した変異体の発光の様子を示す図である。
【図３】図３は、ミナミボタル（久米島産）から取得されたルシフェラーゼおよびその変異体の発光スペクトルを示す図である。
【図４】図４は、ムネクリイロボタルから取得されたルシフェラーゼおよびその変異体の発光スペクトルを示す図である。
【図５】図５は、クロイワボタルから取得されたルシフェラーゼおよびその変異体の発光スペクトルを示す図である。
【図６】図６は、オキナワスジボタルから取得されたルシフェラーゼおよびその変異体の発光スペクトルを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の第１実施形態はルシフェラーゼの変異体を製造する方法に関する。
【００１７】
第１実施形態に係る方法は、ルシフェラーゼのアミノ酸配列において、保存配列：Ｄ−Ｙ−Ｋ−Ｘ１−Ｘ２−Ｓ−Ｘ３−Ｘ４−Ｌ−Ｖ−Ｐ（配列番号５５）（Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４は、それぞれ独立に、タンパク質構成アミノ酸の１つである）を特定することを含む。
【００１８】
ルシフェラーゼとは、一般に、発光が生じる化学反応を触媒する酵素を指す。この酵素の基質となる物質はルシフェリンと呼ばれる。ＡＴＰの存在下、ルシフェラーゼの触媒作用により、ルシフェリンが酸化する際に発光する。
【００１９】
この方法において使用されるルシフェラーゼは、配列が既知のものであってよく、または配列が未知のものであってよい。
【００２０】
ルシフェラーゼの由来となる生物の例は、ホタル、ヒカリコメツキムシおよびバクテリアである。ルシフェラーゼの由来となる生物の好ましい例は、ホタルである。ルシフェラーゼの由来となるホタルの例は、ミナミボタル（久米島産）（Ｄｒｉｌａｓｔｅｒ  ｋｕｍｅｊｉｍｅｎｓｉｓ）、ムネクリイロボタル（Ｃｙｐｈｏｎｏｃｅｒｕｓ  ｒｕｆｉｃｏｌｌｉｓ）、クロイワボタル（Ｌｕｃｉｏｌａ  ｋｕｒｏｉｗａｅ）、オキナワスジボタル（Ｃｕｒｔｏｓ  ｏｋｉｎａｗａｎｕｓ）およびキイロスジボタル（Ｃｕｒｔｏｓ  ｃｏｓｔｉｐｅｎｎｉｓ）である。
【００２１】
保存配列として、Ｄ−Ｙ−Ｋ−Ｘ１−Ｘ２−Ｓ−Ｘ３−Ｘ４−Ｌ−Ｖ−Ｐ（配列番号５５）というアミノ酸配列が、ルシフェラーゼのアミノ酸配列中において特定される。なお、この配列では、アミノ酸は一文字略号にて表記されている。すなわち、Ｄはアスパラギン酸を、Ｙはチロシンを、Ｋはリジンを、Ｓはセリンを、Ｌはロイシンを、Ｖはバリンを、Ｐはプロリンをそれぞれ意味する。また、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４は、それぞれ独立に、タンパク質構成アミノ酸の１つであってよい。好ましくは、Ｘ１は、イソロイシンまたはシステインを意味し、Ｘ２は、グルタミンまたはスレオニンを意味し、記Ｘ３は、アラニンまたはバリンを意味し、Ｘ４は、ロイシンまたはイソロイシンを意味する。
【００２２】
本願において「タンパク質構成アミノ酸」とは、生物の生体中に存在する一般的なタンパク質を構成するアミノ酸を意味する。タンパク質構成アミノ酸とは、具体的には、アラニン（Ａ）、アルギニン（Ｒ）、アスパラギン（Ｎ）、アスパラギン酸（Ｄ）、システイン（Ｃ）、グルタミン（Ｑ）、グルタミン酸（Ｅ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、リジン（Ｋ）、メチオニン（Ｍ）、フェニルアラニン（Ｆ）、プロリン（Ｐ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）またはバリン（Ｖ）である。
【００２３】
上述した配列番号５５に係る保存配列を特定する代わりに、Ｌ−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｑ−Ｄ−Ｙ−Ｋ−Ｘ１−Ｘ２−Ｓ−Ｘ３−Ｘ４−Ｌ−Ｖ−Ｐ−Ｔ−Ｌ−Ｆ−Ｘ１４−Ｘ１５（配列番号５６）という配列を特定してもよい。この配列において、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４は、上記と同様である。Ｘ１１、Ｘ１２、Ｘ１３、Ｘ１４およびＸ１５は、それぞれ独立に、タンパク質構成アミノ酸の１つであってよい。好ましくは、Ｘ１１は、アルギニンまたはリジンを意味し、Ｘ１２は、セリンまたはスレオニンを意味し、Ｘ１３は、ロイシンまたはイソロイシンを意味し、Ｘ１４は、セリンまたはアラニンを意味し、Ｘ１５は、フェニルアラニンまたはイソロイシンを意味する。
【００２４】
上述した配列番号５５および５６に係る保存配列を特定する代わりに、Ｘ２１−Ｘ２２−Ｅ−Ｘ２３−Ｘ２４−Ｌ−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｑ−Ｄ−Ｙ−Ｋ−Ｘ１−Ｘ２−Ｓ−Ｘ３−Ｘ４−Ｌ−Ｖ−Ｐ−Ｔ−Ｌ−Ｆ−Ｘ１４−Ｘ１５−Ｘ２５−Ｘ２６−Ｘ２７−Ｓ−Ｘ２８（配列番号５７）という配列を特定してもよい。この配列において、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ１１、Ｘ１２、Ｘ１３、Ｘ１４およびＸ１５は、上記と同様である。Ｘ２１、Ｘ２２、Ｘ２３、Ｘ２４、Ｘ２５、Ｘ２６、Ｘ２７およびＸ２８は、それぞれ独立に、タンパク質構成アミノ酸の１つであってよい。好ましくは、Ｘ２１は、グルタミン酸またはアスパラギン酸を意味し、Ｘ２２は、グルタミン酸またはアスパラギン酸を意味し、Ｘ２３は、ロイシン、バリンまたはイソロイシンを意味し、Ｘ２４は、フェニルアラニンまたはロイシンを意味し、Ｘ２５は、フェニルアラニンまたはロイシンを意味し、Ｘ２６は、アラニンまたはアスパラギンを意味し、Ｘ２７は、リジンまたはアルギニンを意味し、Ｘ２８は、スレオニンまたはグルタミン酸を意味する。
【００２５】
保存配列の特定は、ルシフェラーゼのアミノ酸配列において目視により判断して行うことができる。あるいは、保存配列の特定は、配列を検索するためのコンピュータープログラムを使用して行うことができる。
【００２６】
第１実施形態に係る方法は、前記保存配列中の特定のセリン残基が、セリンを除くタンパク質構成アミノ酸の何れか１つに置換されるように、前記ルシフェラーゼをコードする核酸の塩基配列に変異を導入することを含む。
【００２７】
置換されるセリン残基は、保存配列が配列番号５５に示されるアミノ酸配列である場合には、Ｎ末端側から６番目のセリン残基であり、保存配列が配列番号５６に示されるアミノ酸配列である場合には、Ｎ末端側から１１番目のセリン残基であり、保存配列が配列番号５７に示されるアミノ酸配列である場合には、Ｎ末端側から２１番目のセリン残基である。
【００２８】
核酸の塩基配列に対する変異の導入は、既知の一般的な変異導入方法を用いて行うことができる。例えば、変異導入用のプライマーを使用して、部位特異的に突然変異を導入することができる。
【００２９】
第１実施形態に係るルシフェラーゼの変異体を製造する方法によれば、発光の色が互いに異なる種々の変異体を容易に取得することができる。しかも、これらの変異体は、互いに１つのアミノ酸しか違わないため、立体構造といったタンパク質の特性に殆ど差がでない。そのため、これらのルシフェラーゼを同一の条件の下で使用することが可能となり、それぞれから得られた結果を直接比較することが可能となる。また、これらのルシフェラーゼに対して、単一のルシフェリンを使用することができるため、これらのルシフェラーゼを単一の被験試料中に同時に発現させることができ、同時に多色の測定を行うことが可能となる。
【００３０】
また、ホタル由来のルシフェラーゼを使用することで、そのアミノ酸配列中に相同配列が存在する確率が高まり、発光色のバリエーションが高い種々の変異体を取得することが可能となる。
【００３１】
また、Ｘ１は、イソロイシンまたはシステインであり、Ｘ２は、グルタミンまたはスレオニンであり、Ｘ３は、アラニンまたはバリンであり、およびＸ４は、ロイシンまたはイソロイシンである保存配列を特定することで、置換すべきセリン残基を適切に選択することが可能となり、発光色のバリエーションが高い種々の変異体を取得することが可能となる。
【００３２】
本発明の第２実施形態は、ルシフェラーゼおよびその変異体、並びにそれらをコードする遺伝子を含む核酸である。
【００３３】
第２実施形態に係るルシフェラーゼの例は、配列番号６から１０の何れか１つのアミノ酸配列を有するルシフェラーゼである。これらはそれぞれ、ミナミボタル（久米島産）、ムネクリイロボタル、クロイワボタル、オキナワスジボタルおよびキイロスジボタルから新規に取得されたルシフェラーゼである。
【００３４】
これらの具体的な配列を以下に示す。  
ミナミボタル（久米島産）：
MNMEDKNVVHGPASFYPVDDGTAGQQLHKTILRYAQLPGTIAFTDAHTEQNLTYAEYFDLTCRLAESMKRYGLGLKHAIAVCSENSLNFFAPVIAALYLGVAVAPTNDIYNERELYNSLNISQPTIVFCSKRALLKIMEVQKKLPVIQKIIVLDHKEDFQGLHSMHSFIKHYLPSHFNEHDFKPEEFDRNDQVALIMNSSGSTGLPKGVMLTHKNVVVRFSHCKDPVFGNQIIPDTAILTVIPFHHGFGMFTTLGYLTCGFRIVVMHKFEEELFLRSLQDYKIQSALLVPTLFSFFAKSTLVDKYDLSNLKEIASGGAPLAKEVGEAVAKRFKLPGVRQGYGLTETTSAVIITPEGEDKAGSTGKVVPFFSAKIIDLDTRQSLGPHQKGELCLKGDMIMKGYANNPEATNALIDKDGWLHSGDIAYYDEDGHFFIVDRLKSLIKYKGYQVAPAELESVLLQHPYIFDAGVTGIPDEVAGELPAACVVLEKGKHLTEKEVMDYVASQVSSSKKLRGGVRFIDEIPKGLTGKIDSRGLKEILKRPQSKM（配列番号６）、
ムネクリイロボタル：
MEMEDKNVVRGPAPFYPVDDGTAGEQLHKTILRYAQLSGTIAFTDAHTEVNVTYAEYYDATCRLAEAMKRYGLDLKHRIAVCSENSLEFFVPVIAALYLGVAVAPTNDIYNERELFNSLNISQPTIVFTSKRALHKILEVQKQLPVIKKIVVLDSKDDFMGMQSMHSFIKHYLPADFNELDYKPESFDRNEQVALIMNSSGSTGLPKGVQLTHKNVVVRFSHCKDPVFGNQIIPDTAILTVIPFHHGFGMFTTLGYVTCGFRIVVMHKFEEELFLRSLQDYKIQSALLVPTLFSFFAKSTLVDKYDLSNLHEIASGGAPLAKEVGEAVAKRFKLPGVRQGYGLTETTSAVIITPEGDDKPGSTGKIVPFFYAKILDLDTKKSLGPNQRGELCLKGDMIMKGYVNNPEATNALIDKDGWLHSGDIAYYDEDGHFFIVDRLKSLIKYKGYQVPPAELESVLLQHPYIFDAGVAGVPDEDAGELPGACVVLEKGKHLTAKEVMDYVAGQVSSYKRLRGGVRFIDEIPKGLTGKIDGKALREILKKPQAKL（配列番号７）、
クロイワボタル：
MEKEENVIYGPEPFYPVEEGSAGTQLHRFMERYAKMGAICFSNALTGQDVTYAEYFDRSVRLAEALRRHGLTPEKKIGICSENCLEFFIPVLSGAYIASPVAPTNEIYTIRELVHSFGISEPMIVFSSKKGLDKVLEVQKTVHSIKTIVIIDSSTTYRGYDSMDAFVKKYVPANFNLSEFKTVEVDNETHTLLIMNSSGSTGLPKGVLVRHCGAVTRFSHCRDPIFGNQVSPGTAILTVVPFHHGFGMFTTLGYFVCGYRIVMLTKFDDEVLLKTLQDYKCTSVILVPTLFAILNRSELLEKFDLSNLTEIASGGAPLAKEVGEAVARRFNLPGVRQGYGLTETTSAFIITPEGDDKPGASGKVVPLMKVKVIDLDTKKTLGPNRRGEICVKGPMLMTGYEKNPTETKEIIDEDGWLHSGDIGYWDEDHHFFIVDRLKSLIKYKGYQVPPAELESVLLQHPNIFDAGVAGIPDPEAGELPGAVVVLEKGKHLTEQEVLDYVAGQVYNAKRLRGGVRFVDEVPKGLTGKIDAKAIREILKKPQAKM（配列番号８）、
オキナワスジボタル：
MVMEGNIVAGPQPYYPIEKGSAGMQLHRFMGEYAKLGAIAVSNALTGVDISYAEYFDLSCRLGEALKRFGIKVDGRIALCSENCEEFFIPVLAGLFIGAGVAPTNEIYTLRELVHSLGISKPTIIFSSKKGLDKVLEVQKTVTVIKTIVILDSKADYRGYQCLQTFIKKNTPLGFKATSFQCVDVDREKQVALIMNSSGSTGLPKGVQLTHENTVTRFSHCRDPIFGNQVSPGTAILTVVPFHHGFGMFTTLGYFVCGYRVVMLNRFEEEIFLKTIQDYKCTSVILVPTLFAILAKSELLDKYDLSNLTEIASGGAPLAKEVGEVVARRFNLPGVRQGYGLTETTSAFIITPEGEDKPGASGKVVPLMRCKVVDLDTKKTLGVNQRGEICVRGPLLMKGYIDNPEATREIIDDEGWMHTGDIGYFDQDEHFFVVDRLKSLIKYKGYQVPPAELESILLQHPDIFDAGVAGVPDPDAGELPGAVVVLDKGKTMTEQQILDYVAGQVSNAKRLRGGVRFVDEVPKGLTGKIDGKAIREILKQPRAKM（配列番号９）、
キイロスジボタル：
MVMEGNIVAGPQPYYPIEKGSAGMQLHRFMGEYAKLGAIAVSNALTGVDISYAEYFDLSCRLGEALKRFGIKVDGRIALCSENCEEFFIPVLAGLFIGAGVAPTNEIYTLRELVHSLGISKPTIIFSSKKGLDKVLEVQKTVTVIKTIVILDSKADYRGYQCLQTFIKKNTPLGFKASSFQCVDVDRENQVALIMNSSGSTGLPKGVQLTHENTVTRFSHCRDPIFGNQVSPGTAILTVVPFHHGFGMFTTLGYFVCGYRVVMLNRFEEEIFLKTIQDYKCTSVILVPTLFAILAKSELLDKYDLSNLTEIASGGAPLAKEVGEVVARRFNLPGVRQGYGLTETTSAFIITPEGDDKPGASGKVVPLMRCKVVDLDTKKTLGVNQRGEICVRGPLLMKSYIDNPEATREIIDDEGWMHTGDIGYFDEDEHFFVVDRLKSLIKYKGYQVPPAELESILLQHPDIFDAGVAGVPDPDAGELPGAVVVLDKGKKMTEQQILDYVAGQVSNAKRLRGGVRFVDEVPKGLTGKIDGKAIREILKKPQAKM（配列番号１０）。
【００３５】
これらのルシフェラーゼを第１実施形態に係る変異体の製造方法に使用することで、発光の色が互いに異なる種々の変異体の作製が可能となる。また、これらのルシフェラーゼは、取得された変異体と併せて、種々の発光色を示すルシフェラーゼのセットを構成することができる。
【００３６】
第２実施形態に係るルシフェラーゼの変異体の例は、第１実施形態に係る方法により製造されたルシフェラーゼの変異体である。
【００３７】
第２実施形態に係るルシフェラーゼの変異体の他の例は、配列番号６に記載のアミノ酸配列のＮ末端側から２８５番目のセリン残基が、セリンを除くタンパク質構成アミノ酸の何れか１つに置換されたアミノ酸配列を有するルシフェラーゼの変異体である。すなわち、第１実施形態に係る方法において、ミナミボタル（久米島産）に由来するルシフェラーゼを使用して製造された変異体である。
【００３８】
第２実施形態に係るルシフェラーゼの変異体の他の例は、配列番号７に記載のアミノ酸配列のＮ末端側から２８５番目のセリン残基が、セリンを除くタンパク質構成アミノ酸の何れか１つに置換されたアミノ酸配列を有するルシフェラーゼの変異体である。すなわち、第１実施形態に係る方法において、ムネクリイロボタルに由来するルシフェラーゼを使用して製造された変異体である。
【００３９】
第２実施形態に係るルシフェラーゼの変異体の他の例は、配列番号８に記載のアミノ酸配列のＮ末端側から２８３番目のセリン残基が、セリンを除くタンパク質構成アミノ酸の何れか１つに置換されたアミノ酸配列を有するルシフェラーゼの変異体である。すなわち、第１実施形態に係る方法において、クロイワボタルに由来するルシフェラーゼを使用して製造された変異体である。
【００４０】
第２実施形態に係るルシフェラーゼの変異体の他の例は、配列番号９に記載のアミノ酸配列のＮ末端側から２８３番目のセリン残基が、セリンを除くタンパク質構成アミノ酸の何れか１つに置換されたアミノ酸配列を有するルシフェラーゼの変異体である。すなわち、第１実施形態に係る方法において、オキナワスジボタルに由来するルシフェラーゼを使用して製造された変異体である。
【００４１】
第２実施形態に係るルシフェラーゼの変異体の他の例は、配列番号１０に記載のアミノ酸配列のＮ末端側から２８３番目のセリン残基が、セリンを除くタンパク質構成アミノ酸の何れか１つに置換されたアミノ酸配列を有するルシフェラーゼの変異体である。すなわち、第１実施形態に係る方法において、キイロスジボタルに由来するルシフェラーゼを使用して製造された変異体である。
【００４２】
変異体の他の例は、上述したようなルシフェラーゼ変異体のアミノ酸配列との間で、例えば、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有する変異体である。
【００４３】
このような変異体は、それぞれ、１つのセリン残基しか違わないのにもかかわらず、互いに異なる発光の色を示す種々の変異体から成るセットを構成することができる。このようなセットを構成する変異体同士は、ほぼ同一の化学的特性および生化学的特性を有しているため、このような変異体セットを使用することで、個々の変異体から得られた結果を直接比較することが可能となり、また、同時に多色の測定を行うことが可能となる。
【００４４】
第２実施形態に係るルシフェラーゼの変異体をコードする遺伝子を含む核酸の例は、上記のような変異体をコードする遺伝子を含む核酸である。
【００４５】
第２実施形態に係るルシフェラーゼをコードする遺伝子を含む核酸の例は、配列番号１から５の何れか１つの塩基配列を含む核酸である。これらはそれぞれ、ミナミボタル（久米島産）、ムネクリイロボタル、クロイワボタル、オキナワスジボタルおよびキイロスジボタルから新規に取得されたルシフェラーゼをコードする遺伝子を含む核酸である。
【００４６】
これらの具体的な配列を以下に示す。  
ミナミボタル（久米島産）：
ATGAATATGGAAGATAAAAATGTTGTACACGGACCTGCATCATTTTATCCTGTTGATGATGGAACTGCAGGACAACAACTACATAAAACTATTTTAAGATATGCTCAGTTACCTGGTACTATAGCTTTTACGGATGCACATACTGAACAAAACCTAACATATGCAGAATATTTTGATCTTACTTGTCGTTTGGCTGAAAGTATGAAGAGATACGGACTTGGTCTAAAACATGCAATAGCAGTTTGTAGTGAAAATAGTTTAAATTTTTTTGCACCGGTAATTGCTGCATTGTATTTGGGCGTAGCTGTTGCTCCAACRAATGATATTTACAATGAACGGGAACTATATAATAGTTTAAATATTTCACAACCCACMATAGTATTTTGTTCCAAAAGAGCMTTACTTAAAATTATGGAAGTTCAGAAGAAATTGCCAGTTATTCAAAAAATTATAGTCCTAGATCATAAAGAAGACTTTCAAGGATTACATTCAATGCATTCGTTTATTAAGCATTATTTACCATCACACTTTAACGAACATGATTTTAAACCTGAAGAATTTGACCGCAATGATCAAGTGGCACTAATAATGAATTCCTCTGGATCTACAGGTTTACCAAAGGGAGTWATGTTAACACACAAAAACGTTGTTGTTAGATTTTCTCATTGCAAAGACCCTGTATTTGGGAATCAAATTATTCCCGATACTGCAATTTTAACGGTAATTCCTTTCCACCACGGTTTTGGTATGTTTACAACATTGGGTTATTTRACCTGCGGATTTCGTATTGTCGTAATGCATAAATTTGAAGAAGAACTATTTTTAAGATCACTTCAAGATTATAAAATTCAAAGTGCATTACTAGTTCCAACTTTATTTTCATTCTTTGCAAAAAGTACTTTAGTAGATAAATATGACTTGTCAAATCTAAAAGAAATAGCTTCCGGTGGTGCACCTCTCGCTAAAGAAGTTGGAGAAGCAGTTGCAAAACGATTTAAACTTCCTGGAGTTAGACAAGGTTATGGATTGACCGAAACGACATCAGCGGTAATAATTACTCCTGAAGGTGAAGATAAAGCAGGCTCTACAGGAAAAGTAGTACCATTTTTCTCTGCTAAAATTATTGATCTTGACACACGTCAAAGTCTGGGACCACATCAAAAAGGCGAACTATGTCTTAAAGGTGATATGATTATGAAAGGTTATGCAAATAATCCTGAGGCCACAAATGCATTAATTGATAAAGATGGATGGTTGCATTCAGGCGATATTGCATACTATGATGAAGATGGACATTTTTTCATAGTAGATCGATTGAAATCGTTAATTAAATATAAAGGTTATCAGGTTGCACCAGCTGAATTAGAATCTGTACTTTTGCAACATCCTTATATCTTTGATGCTGGTGTAACTGGAATTCCTGATGAAGTTGCTGGCGAACTACCCGCTGCTTGTGTTGTCCTTGAAAAAGGCAAACATTTAACGGAAAAGGAAGTAATGGATTATGTTGCAAGTCAAGTTTCTTCATCGAAGAAGTTGCGTGGAGGAGTGCGTTTYATAGATGAAATACCTAAAGGTCTCACTGGAAAGATAGATAGCAGAGGYCTRAAAGAAATTCTTAAAAGACCACARTCCAAAATGTAA（配列番号１）、
ムネクリイロボタル：
ATGGAGATGGAAGATAAAAATGTGGTACGTGGTCCAGCGCCATTTTACCCTGTGGATGATGGAACAGCAGGTGAACAACTCCACAAAACGATTTTAAGATATGCCCAACTATCTGGAACTATCGCATTTACGGATGCACATACTGAAGTAAACGTTACATATGCAGAGTATTATGATGCAACATGTCGCTTGGCAGAAGCCATGAAAAGGTATGGACTTGATTTAAAACATAGAATTGCAGTATGTAGTGAAAATAGTCTGGAGTTCTTTGTGCCAGTAATTGCTGCTCTATACCTTGGGGTAGCCGTAGCTCCAACAAATGACATTTACAATGAACGGGAATTGTTTAATAGTTTAAATATATCGCAACCTACTATAGTTTTCACTTCCAAAAGAGCTTTACATAAAATTTTGGAAGTGCAAAAGCAATTGCCGGTTATTAAGAAGATCGTAGTATTAGATAGCAAAGATGACTTTATGGGAATGCAATCAATGCACTCATTCATCAAGCATTACTTACCAGCAGATTTTAACGAACTAGATTATAAACCTGAAAGCTTTGATCGAAATGAACAAGTTGCGCTTATAATGAATTCATCTGGATCAACAGGATTACCAAAAGGAGTGCAATTAACGCATAAAAATGTAGTAGTCAGATTTTCCCACTGCAAAGATCCTGTATTTGGTAATCAAATTATTCCTGATACTGCTATTTTAACTGTTATACCATTTCATCATGGTTTTGGTATGTTTACTACATTAGGATATGTCACTTGTGGATTTCGTATAGTGGTAATGCACAAATTTGAGGAAGAACTATTTTTACGATCCCTTCAAGATTACAAAATCCAAAGTGCATTACTGGTACCGACATTGTTTTCGTTCTTTGCTAAAAGTACACTTGTGGATAAATATGATTTATCAAATTTACACGAAATTGCTTCTGGTGGAGCACCTCTAGCAAAGGAAGTCGGGGAGGCTGTTGCAAAACGGTTTAAACTACCAGGTGTAAGACAAGGGTACGGATTAACAGAAACGACATCAGCTGTAATAATTACTCCTGAAGGAGACGACAAACCTGGTTCAACGGGAAAAATTGTTCCATTCTTTTATGCCAAAATTCTGGACCTTGACACTAAGAAAAGTTTGGGGCCTAACCAAAGAGGAGAATTATGTCTTAAAGGAGATATGATTATGAAAGGTTATGTTAATAATCCCGAAGCCACAAATGCGTTGATTGACAAGGATGGGTGGTTGCATTCCGGTGATATAGCATATTATGATGAGGATGGTCACTTCTTTATTGTCGATCGATTAAAATCTTTAATTAAATACAAGGGTTATCAGGTACCTCCTGCTGAGTTAGAATCTGTGCTTTTACAACATCCATACATATTTGATGCCGGTGTTGCCGGTGTTCCTGATGAAGATGCAGGTGAACTACCTGGCGCATGTGTGGTACTTGAGAAAGGCAAACATTTAACTGCGAAAGAAGTAATGGATTATGTAGCAGGGCAAGTGTCTTCATACAAACGATTACGTGGAGGAGTGCGTTTTATAGACGAAATACCTAAAGGTCTGACTGGAAAAATTGACGGAAAAGCGTTAAGGGAAATTCTGAAGAAACCACAAGCCAAATTGTAA（配列番号２）、
クロイワボタル：
ATGGAAAAAGAAGAAAATGTGATATACGGTCCCGAGCCGTTTTACCCCGTCGAAGAGGGATCTGCAGGAACGCAACTGCACAGATTTATGGAGCGATACGCCAAAATGGGGGCTATATGTTTTTCTAACGCCCTCACGGGCCAAGATGTAACGTATGCCGAATATTTTGACCGATCGGTTCGTTTAGCGGAAGCTTTGAGAAGGCACGGCTTAACGCCAGAGAAAAAAATCGGTATTTGCAGCGAAAATTGCTTAGAATTTTTCATTCCGGTGCTTTCGGGAGCGTATATCGCTTCACCCGTCGCTCCAACTAACGAAATTTACACTATACGCGAATTGGTTCACAGTTTTGGAATATCCGAGCCAATGATCGTGTTTAGCTCAAAGAAAGGATTGGATAAAGTCTTGGAAGTACAAAAAACAGTGCACTCTATTAAAACAATAGTCATTATTGATAGCTCAACTACTTATCGAGGATATGACAGCATGGATGCGTTTGTTAAAAAATACGTACCCGCAAATTTCAATTTATCCGAATTCAAAACTGTAGAAGTCGATAATGAAACTCACACTCTTCTTATAATGAACTCGTCCGGTTCCACCGGTCTACCGAAAGGTGTGCTAGTCCGTCATTGTGGGGCAGTTACAAGATTTTCTCATTGCAGGGATCCGATTTTTGGTAATCAAGTTTCACCAGGCACAGCAATTTTAACGGTCGTTCCGTTCCATCATGGCTTTGGTATGTTCACTACTTTAGGATACTTTGTTTGTGGATACCGAATCGTAATGTTAACAAAATTTGATGACGAAGTATTGTTGAAAACCCTACAAGATTATAAGTGTACTAGTGTTATCCTAGTACCAACTTTGTTCGCTATCCTTAATAGAAGTGAACTACTGGAGAAATTCGACTTGTCTAATCTGACTGAAATTGCATCTGGTGGTGCCCCATTAGCAAAAGAAGTTGGGGAAGCCGTTGCCAGAAGATTTAATCTTCCTGGTGTTCGCCAAGGTTACGGTTTAACTGAAACCACATCCGCTTTTATTATCACCCCAGAAGGGGATGACAAACCAGGGGCTTCTGGAAAAGTTGTGCCTTTAATGAAAGTTAAAGTGATTGATCTTGACACTAAGAAAACGCTTGGTCCTAACCGTCGTGGAGAAATTTGCGTTAAGGGTCCTATGTTGATGACAGGTTACGAGAAGAATCCTACAGAAACTAAAGAAATTATCGACGAAGATGGTTGGCTGCACAGTGGAGATATTGGGTATTGGGACGAAGATCATCACTTCTTTATTGTAGATCGTCTCAAATCCTTAATCAAATACAAAGGATATCAAGTACCACCTGCTGAATTGGAATCCGTACTTTTACAACATCCAAATATATTTGATGCCGGTGTTGCCGGAATTCCCGATCCCGAAGCCGGGGAGCTTCCGGGTGCTGTGGTTGTATTAGAGAAAGGAAAACATCTAACTGAACAAGAAGTATTGGATTACGTTGCCGGACAAGTTTACAACGCAAAACGTTTACGCGGTGGCGTTCGTTTTGTAGACGAGGTACCTAAAGGTCTCACTGGAAAAATTGACGCAAAGGCAATTAGAGAAATTCTTAAGAAGCCGCAAGCTAAGATGTGA（配列番号３）、
オキナワスジボタル：
ATGGTTATGGAAGGTAATATTGTAGCTGGCCCTCAGCCATATTATCCTATTGAAAAAGGATCTGCCGGAATGCAACTGCACAGGTTTATGGGAGAATATGCCAAACTTGGAGCAATTGCGGTTAGTAACGCACTTACTGGTGTCGATATTTCATACGCCGAATATTTTGACCTGTCGTGCCGTTTAGGCGAAGCCTTAAAAAGGTTCGGCATAAAAGTCGATGGAAGAATTGCTTTGTGCAGTGAAAATTGTGAAGAATTCTTTATACCGGTACTTGCAGGATTATTCATAGGGGCAGGTGTTGCACCGACTAACGAAATCTACACTTTACGTGAACTGGTTCACAGCTTAGGTATCTCCAAACCCACAATTATTTTCAGTTCCAAAAAAGGCTTGGACAAAGTTTTAGAAGTACAGAAAACTGTAACAGTCATTAAAACAATTGTTATACTTGATAGCAAAGCTGATTATAGAGGATATCAATGCTTGCAAACTTTTATTAAAAAAAATACGCCACTGGGTTTTAAAGCAACAAGCTTCCAATGCGTTGACGTTGATCGTGAAAAACAAGTTGCTCTCATCATGAATTCTTCTGGTTCTACCGGTTTACCAAAAGGTGTACAGCTGACTCATGAAAATACCGTTACTAGATTCTCTCATTGCAGGGATCCAATTTTTGGCAATCAAGTTTCACCCGGCACTGCTATTTTAACCGTCGTTCCCTTCCACCACGGTTTTGGTATGTTCACCACTTTAGGATACTTCGTTTGTGGATACCGCGTCGTGATGTTAAATAGATTTGAAGAAGAAATATTTTTAAAGACTATTCAAGATTACAAATGCACTAGTGTCATTCTTGTACCAACTTTGTTCGCCATTCTTGCAAAGAGTGAATTACTCGACAAGTACGATTTATCCAATCTTACCGAAATTGCTTCTGGCGGAGCTCCTTTAGCTAAAGAAGTGGGCGAAGTAGTTGCCAGAAGATTTAATCTACCGGGTGTACGTCAGGGATACGGTTTAACAGAAACAACGTCTGCATTTATTATTACCCCAGAAGGCGAAGACAAGCCAGGTGCGTCAGGAAAAGTAGTCCCACTGATGAGATGTAAAGTTGTTGATCTSGATACCAAAAAAACCTTGGGYGTYAACCAACGAGGAGAAATCTGCGTTCGAGGTCCTTTGCTAATGAAAGGCTACATTGACAATCCAGAAGCAACTAGAGAAATTATCGATGACGAAGGCTGGATGCACACTGGAGACATCGGCTATTTTGACCAGGATGAACATTTCTTCGTTGTTGATCGTCTAAAGTCTCTAATAAAATACAAAGGATATCAAGTACCTCCTGCCGAATTAGAATCCATACTTTTGCAACATCCCGATATTTTTGATGCGGGAGTTGCTGGTGTTCCTGATCCTGATGCTGGGGAACTTCCAGGGGCTGTGGTTGTATTAGACAAAGGGAAAACAATGACCGAACAGCAAATACTCGATTACGTTGCAGGCCAAGTTTCTAACGCGAAACGTTTGCGTGGTGGAGTTCGGTTTGTGGATGAAGTACCTAAAGGTCTCACTGGCAAAATTGACGGTAAAGCTATTCGAGAAATTCTTAAGCAACCACGAGCTAAGATGTAA（配列番号４）、
キイロスジボタル：
ATGGTTATGGAAGGTAACATCGTAGCTGGCCCGCAGCCATATTATCCTATTGAAAAAGGATCTGCCGGAATGCAACTGCACAGGTTCATGGGAGAATATGCCAAACTTGGGGCAATTGCGGTTAGTAACGCACTTACTGGTGTCGATATTTCATACGCCGAATATTTTGACTTGTCGTGCCGTTTAGGAGAAGCCTTAAAAAGGTTTGGCATAAAAGTCGATGGAAGAATTGCTTTGTGTAGTGAAAATTGTGAAGAATTCTTTATACCGGTGCTTGCAGGATTATTCATAGGGGCAGGTGTTGCACCAACTAACGAAATCTACACTTTACGTGAACTGGTTCACAGCTTAGGTATCTCCAAACCCACAATTATTTTCAGCTCCAAAAAAGGCTTGGACAAAGTTTTAGAAGTACAGAAAACTGTAACAGTCATTAAAACAATTGTTATTCTTGATAGCAAAGCTGATTATAGAGGATATCAATGCTTGCAAACTTTTATAAAAAAAAATACACCGCTGGGTTTTAAAGCGTCAAGCTTCCAATGCGTTGATGTTGATCGTGAAAATCAAGTTGCTCTCATTATGAATTCTTCGGGTTCAACCGGTTTACCAAAAGGTGTACAACTGACTCATGAAAATACCGTTACTAGGTTCTCTCATTGCAGGGATCCAATTTTTGGCAATCAAGTTTCGCCMGGTACTGCTATTTTAACTGTCGTTCCTTTCCACCACGGTTTTGGCATGTTCACCACCTTAGGTTACTTTGTTTGTGGATACCGTGTCGTGATGTTAAATAGATTTGAGGAAGAAATATTTTTAAAGACCATTCAAGATTACAAGTGCACTAGTGTCATTCTTGTACCAACCTTGTTCGCCATTCTTGCAAAGAGTGAATTGCTCGACAAGTACGATTTATCCAATCTTACCGAAATTGCTTCTGGCGGAGCTCCTTTAGCTAAAGAAGTGGGCGAAGTAGTTGCCCGAAGATTTAATCTACCGGGTGTACGTCAGGGATACGGTTTAACAGAAACAACATCTGCGTTTATTATTACCCCAGAAGGTGACGACAAACCAGGCGCGTCAGGAAAAGTAGTCCCACTGATGAGATGTAAAGTTGTKGATCTCGATACCAAAAAAACTTTGGGTGTTAACCAACGGGGAGAAATTTGCGTTCGAGGTCCTTTRCTAATGAAAAGCTACATTGACAATCCAGAAGCAACTAGAGAAATTATCGATGACGAAGGCTGGATGCACACTGGAGACATCGGCTATTTCGACGAAGATGAACATTTCTTCGTTGTTGATCGTCTAAAGTCCCTAATAAAATACAAAGGGTATCAAGTACCTCCTGCSGAATTAGAATCCATACTTTTGCAACATCCCGATATTTTTGATGCGGGAGTTGCTGGTGTTCCCGATCCTGATGCTGGAGAACTTCCAGGGGCCGTGGTCGTATTAGACAAAGGGAAAAAAATGACCGAACAGCAAATACTCGATTACGTAGCCGGTCAAGTTTCTAATGCGAAACGTTTGCGTGGTGGAGTTCGGTTTGTGGATGAAGTACCTAAAGGTCTCACTGGCAAAATTGACGGTAAAGCTATCCGCGAAATTCTTAAGAAACCGCAAGCTAAGATGTAA（配列番号５）。
【００４７】
核酸は、プロモーターといった転写制御のための因子が結合する領域をさらに含んでよい。また、核酸は、ルシフェラーゼおよびその変異体とは異なるタンパク質をコードする遺伝子をさらに含んでよい。この場合、この異なるタンパク質とルシフェラーゼまたはその変異体とが融合した状態で発現されるように、それらの遺伝子が核酸上に配置されている。
【００４８】
また、核酸はベクターの形態であってよい。ベクターは、抗生物質耐性遺伝子および複製起点といった一般的なベクターに含まれる要素を含んでよい。
【００４９】
このような核酸によれば、ルシフェラーゼおよびその変異体の遺伝子を、核酸の形態にて安定的に保存および使用することができる。
【実施例】
【００５０】
（１）野生型ルシフェラーゼ遺伝子の取得
ミナミボタル（久米島産）、ムネクリイロボタル、クロイワボタル、オキナワスジボタルおよびキイロスジボタルから、それぞれ野生型ルシフェラーゼの遺伝子を取得した。
【００５１】
遺伝子の取得は、特開２０１１−１６７０７９号に開示される方法に倣った。すなわち、各種ホタルから作製した完全長ｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、適宜設定したプライマーセットを用いてＰＣＲ法により野生型ルシフェラーゼ遺伝子をクローニングした。
【００５２】
完全長ｃＤＮＡライブラリーは次のようにして取得した。ホタルの幼虫から発光器を採取し、Ｌｙｓｉｎｇ  Ｍａｔｒｉｘ  Ｄチューブ（ＭＰ−Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社）に１ｍＬのトータルＲＮＡ抽出試薬ＴＲＩｚｏｌ  Ｒｅａｇｅｎｔ（インビトロジェン社）とともに入れた。このチューブを組織細胞破砕装置ＦａｓｔＰｒｅｐ  ２４（ＭＰ−Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社）またはＦａｓｔＰｒｅｐ  ＦＰ１００Ａ（ＭＰ−Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社）に装着して、ホタルの発光器を試薬中にて破砕した。破砕した溶液からトータルＲＮＡを分離精製した後、完全長ｃＤＮＡ合成試薬ＧｅｎｅＲａｃｅｒ（インビトロジェン社）を使用して、沈殿濃縮したトータルＲＮＡから完全長ｃＤＮＡを合成した。
【００５３】
プライマーセットは、ホタルに由来する野生型ルシフェラーゼの遺伝子に基づいて適宜作製した。ＰＣＲ法によって増幅された遺伝子を含む核酸をベクターに挿入した。
【００５４】
以上の操作によって、配列番号１から５に示される塩基配列をそれぞれ有する、５つのルシフェラーゼの遺伝子を取得した。
【００５５】
（２）哺乳細胞での発現への最適化
取得されたミナミボタル（久米島産）、ムネクリイロボタル、クロイワボタルおよびオキナワスジボタルのルシフェラーゼ遺伝子の塩基配列を、哺乳細胞での発現に最適となるように塩基配列を改変した。得られた具体的配列を以下に示す。  
ミナミボタル（久米島産）：
ATGAACATGGAAGATAAGAACGTGGTGCACGGCCCTGCCAGCTTCTACCCTGTGGATGATGGCACAGCCGGCCAGCAGCTGCACAAGACCATCCTGAGATACGCCCAGCTGCCCGGCACAATCGCCTTTACCGATGCCCACACCGAGCAGAACCTGACCTACGCCGAGTACTTCGACCTGACCTGCAGACTGGCCGAGAGCATGAAGAGATACGGCCTGGGCCTGAAGCACGCCATTGCCGTGTGCAGCGAGAACAGCCTGAACTTCTTCGCCCCCGTGATCGCCGCCCTGTATCTGGGAGTGGCCGTGGCCCCCACCAACGACATCTACAACGAGAGAGAGCTGTACAACTCCCTGAACATCAGCCAGCCCACCATCGTGTTCTGCAGCAAGCGGGCCCTGCTGAAGATCATGGAAGTGCAGAAAAAGCTGCCCGTGATCCAGAAAATCATCGTGCTGGACCACAAAGAGGACTTCCAGGGCCTGCACAGCATGCACAGCTTCATCAAGCACTACCTGCCCAGCCACTTCAACGAGCACGACTTCAAGCCCGAAGAGTTCGACCGGAACGACCAGGTGGCCCTGATCATGAACAGCAGCGGCAGCACCGGCCTGCCTAAAGGCGTGATGCTGACCCACAAGAATGTGGTCGTGCGGTTCAGCCACTGCAAGGACCCCGTGTTCGGCAACCAGATCATCCCCGACACCGCTATCCTGACCGTGATCCCTTTCCACCACGGCTTCGGCATGTTCACCACCCTGGGCTACCTGACCTGTGGCTTCCGGATCGTGGTCATGCACAAGTTCGAGGAAGAACTGTTCCTGCGGAGCCTGCAGGACTACAAGATCCAGAGCGCCCTGCTGGTGCCTACCCTGTTCAGCTTCTTCGCCAAGAGCACCCTGGTGGATAAGTACGACCTGAGCAACCTGAAAGAGATCGCCAGCGGCGGAGCCCCCCTGGCTAAAGAAGTGGGAGAGGCCGTCGCCAAGCGGTTTAAGCTGCCTGGCGTGCGGCAGGGCTACGGACTGACAGAGACAACCAGCGCCGTGATCATCACACCCGAGGGCGAAGATAAGGCCGGCTCTACAGGCAAGGTGGTGCCATTCTTCAGCGCCAAGATCATCGACCTGGACACCAGACAGAGCCTGGGCCCTCACCAGAAAGGCGAGCTGTGCCTGAAGGGCGACATGATCATGAAGGGCTACGCCAACAACCCCGAGGCCACCAACGCCCTGATCGACAAGGATGGCTGGCTGCACAGCGGCGACATTGCCTACTACGACGAGGACGGCCACTTCTTCATCGTGGACCGGCTGAAGTCCCTGATCAAGTACAAGGGCTATCAGGTGGCCCCTGCCGAGCTGGAAAGCGTGCTGCTGCAGCATCCCTACATCTTCGACGCTGGCGTGACCGGCATCCCTGATGAAGTGGCAGGCGAACTGCCTGCCGCCTGTGTGGTGCTGGAAAAGGGCAAGCACCTGACCGAGAAAGAAGTGATGGACTACGTCGCCAGCCAGGTGTCCAGCAGCAAGAAACTGAGAGGCGGCGTGCGCTTCATCGACGAGATCCCTAAGGGCCTGACCGGCAAGATCGACAGCAGAGGCCTGAAAGAAATCCTGAAGCGGCCCCAGAGCAAGATGTGA（配列番号１１）、
ムネクリイロボタル：
ATGGAAATGGAAGATAAGAACGTCGTGCGGGGACCCGCCCCTTTCTACCCTGTGGATGATGGAACAGCCGGCGAGCAGCTGCACAAGACCATCCTGAGATACGCCCAGCTGAGCGGCACAATCGCCTTCACCGACGCCCACACCGAAGTGAACGTGACCTACGCCGAGTACTACGACGCCACCTGTAGACTGGCCGAGGCCATGAAGAGATACGGCCTGGACCTGAAGCACCGGATCGCCGTGTGCAGCGAGAACAGCCTGGAATTTTTCGTGCCCGTGATCGCCGCCCTGTATCTGGGAGTGGCCGTGGCCCCCACCAACGACATCTACAACGAGAGAGAGCTGTTCAACAGCCTGAACATCAGCCAGCCCACCATCGTGTTCACCAGCAAGCGGGCCCTGCACAAGATCCTGGAAGTGCAGAAACAGCTGCCCGTCATCAAGAAAATCGTGGTGCTGGACAGCAAGGACGACTTCATGGGCATGCAGAGCATGCACAGCTTCATCAAGCACTACCTGCCCGCCGACTTCAACGAGCTGGACTACAAGCCCGAGAGCTTCGACCGGAACGAACAGGTGGCCCTGATCATGAACAGCAGCGGCAGCACCGGCCTGCCTAAAGGCGTGCAGCTGACCCACAAGAACGTGGTCGTGCGGTTCAGCCACTGCAAGGACCCCGTGTTCGGCAACCAGATCATCCCCGACACCGCTATCCTGACCGTGATCCCTTTCCACCACGGCTTCGGCATGTTCACCACCCTGGGCTACGTGACCTGCGGCTTCCGGATCGTGGTCATGCACAAGTTCGAGGAAGAACTGTTCCTGCGGAGCCTGCAGGACTACAAGATCCAGAGCGCCCTGCTGGTGCCTACCCTGTTCAGCTTCTTCGCCAAGAGCACCCTGGTGGATAAGTACGACCTGAGCAACCTGCACGAGATCGCCTCTGGCGGAGCCCCTCTGGCCAAAGAAGTGGGAGAGGCCGTCGCCAAGCGGTTTAAGCTGCCTGGCGTGCGGCAGGGCTACGGACTGACAGAGACAACCAGCGCCGTGATCATCACCCCCGAGGGCGACGATAAGCCTGGCAGCACAGGCAAGATCGTGCCATTCTTCTACGCCAAGATTCTGGACCTGGACACCAAGAAGTCCCTGGGCCCCAATCAGAGGGGCGAGCTGTGTCTGAAGGGCGACATGATCATGAAGGGCTATGTGAACAACCCCGAGGCCACCAACGCCCTGATCGACAAGGATGGCTGGCTGCACTCCGGCGACATTGCCTACTACGACGAGGACGGCCACTTCTTCATCGTGGACCGGCTGAAGTCCCTGATCAAGTACAAGGGCTACCAGGTGCCCCCTGCCGAGCTGGAATCTGTGCTGCTGCAGCATCCCTACATCTTCGACGCTGGCGTGGCCGGCGTGCCAGATGAAGATGCTGGCGAACTGCCTGGCGCCTGCGTGGTCCTGGAAAAGGGCAAACACCTGACCGCTAAAGAAGTGATGGACTACGTCGCCGGCCAGGTGTCCAGCTACAAGAGACTGAGAGGCGGCGTGCGCTTCATCGACGAGATCCCTAAGGGCCTGACCGGCAAGATCGACGGCAAGGCCCTGAGAGAGATCCTGAAGAAGCCCCAGGCCAAGCTCTGA（配列番号１２）、
クロイワボタル：
ATGGAAAAAGAGGAAAACGTCATCTACGGCCCCGAGCCCTTCTACCCTGTGGAAGAAGGCAGCGCCGGCACCCAGCTGCACCGGTTCATGGAAAGATACGCCAAGATGGGCGCCATCTGCTTCAGCAATGCCCTGACCGGCCAGGACGTGACCTACGCCGAGTACTTCGACAGAAGCGTGCGGCTGGCCGAGGCCCTGAGAAGGCATGGACTGACCCCCGAGAAGAAGATCGGCATCTGCAGCGAGAACTGCCTGGAATTTTTCATCCCCGTGCTGAGCGGCGCCTATATCGCCTCTCCTGTGGCCCCCACCAACGAGATCTACACCATCCGCGAGCTGGTGCACAGCTTCGGCATCAGCGAGCCCATGATCGTGTTCAGCAGCAAGAAAGGCCTGGACAAGGTGCTGGAAGTGCAGAAAACCGTGCACAGCATCAAGACCATCGTGATCATCGACAGCAGCACCACCTACCGGGGCTACGACAGCATGGACGCCTTCGTGAAGAAATACGTGCCCGCCAACTTCAACCTGAGCGAGTTCAAGACCGTGGAAGTGGACAACGAGACACACACCCTGCTGATCATGAACAGCTCCGGCAGCACCGGCCTGCCTAAAGGCGTGCTCGTCAGACATTGTGGCGCCGTGACCCGGTTCAGCCACTGCAGAGATCCCATCTTCGGAAACCAGGTGTCCCCCGGCACCGCCATTCTGACCGTGGTGCCTTTCCACCACGGCTTCGGCATGTTCACCACCCTGGGCTACTTCGTGTGCGGCTACCGGATCGTGATGCTGACCAAGTTCGACGACGAGGTGCTGCTGAAAACCCTGCAGGACTACAAGTGCACCAGCGTGATCCTGGTGCCCACCCTGTTCGCCATCCTGAACAGAAGCGAGCTGCTGGAAAAGTTCGACCTGAGCAACCTGACCGAGATCGCCTCTGGCGGAGCCCCTCTGGCCAAAGAAGTGGGAGAAGCCGTCGCCAGACGGTTCAATCTGCCCGGCGTGCGGCAGGGCTACGGACTGACAGAGACAACCAGCGCCTTCATCATCACCCCCGAGGGCGACGATAAGCCTGGCGCCTCTGGAAAGGTGGTGCCCCTGATGAAGGTCAAAGTGATCGACCTGGACACCAAGAAAACCCTGGGCCCCAACAGACGGGGCGAGATCTGTGTGAAGGGCCCCATGCTGATGACCGGCTACGAGAAGAACCCCACCGAGACAAAAGAGATCATCGACGAGGACGGCTGGCTGCACTCTGGCGACATCGGCTACTGGGACGAGGACCACCACTTCTTCATCGTGGACCGGCTGAAGTCCCTGATCAAGTACAAGGGCTACCAGGTGCCCCCTGCCGAGCTGGAATCTGTGCTGCTGCAGCATCCCAACATCTTCGATGCCGGCGTGGCCGGCATCCCTGATCCTGAAGCTGGCGAACTGCCAGGCGCTGTGGTGGTGCTGGAAAAAGGCAAGCACCTGACAGAGCAGGAAGTGCTGGACTACGTCGCCGGCCAGGTGTACAACGCCAAGAGACTGAGAGGCGGCGTGCGCTTCGTGGATGAAGTGCCTAAGGGCCTGACCGGCAAGATCGACGCCAAGGCCATCAGAGAGATCCTGAAGAAACCCCAGGCCAAGATGTGA（配列番号１３）、
オキナワスジボタル：
ATGGTCATGGAAGGCAACATCGTGGCCGGACCCCAGCCCTACTACCCTATCGAGAAGGGCAGCGCCGGCATGCAGCTGCACAGATTCATGGGCGAGTACGCCAAGCTGGGCGCCATTGCCGTGTCCAATGCCCTGACAGGCGTGGACATCAGCTACGCCGAGTACTTCGACCTGAGCTGCAGACTGGGCGAGGCCCTGAAGAGATTCGGCATCAAGGTGGACGGCCGGATCGCCCTGTGCAGCGAGAACTGCGAAGAGTTCTTCATCCCCGTGCTGGCCGGCCTGTTTATTGGAGCTGGCGTGGCCCCCACCAACGAGATCTACACCCTGCGGGAACTGGTGCACAGCCTGGGCATCAGCAAGCCCACCATCATCTTCAGCAGCAAGAAAGGCCTGGACAAGGTGCTGGAAGTGCAGAAAACCGTGACCGTGATCAAGACCATCGTGATCCTGGACAGCAAGGCCGACTACCGGGGCTACCAGTGCCTGCAGACCTTCATCAAGAAGAACACCCCCCTGGGCTTCAAGGCCACCAGCTTCCAGTGCGTGGACGTGGACCGCGAGAAACAGGTGGCCCTGATCATGAACAGCAGCGGCAGCACCGGCCTGCCTAAAGGCGTGCAGCTGACCCACGAGAACACCGTGACCCGGTTCAGCCACTGCCGGGACCCCATCTTCGGAAACCAGGTGTCCCCTGGCACCGCCATCCTGACCGTGGTGCCTTTCCACCACGGCTTCGGCATGTTCACCACCCTGGGATACTTCGTGTGCGGCTACCGGGTGGTCATGCTGAACAGATTCGAGGAAGAGATCTTCCTGAAAACCATCCAGGACTACAAGTGCACCTCTGTGATCCTGGTGCCCACCCTGTTCGCCATCCTGGCCAAGAGCGAGCTGCTGGATAAGTACGACCTGAGCAACCTGACCGAGATCGCCTCTGGCGGAGCCCCTCTGGCCAAAGAAGTGGGAGAGGTCGTCGCCAGACGGTTCAATCTGCCCGGCGTGCGGCAGGGCTACGGACTGACAGAGACAACCAGCGCCTTCATCATCACCCCCGAGGGCGAGGATAAGCCTGGCGCCTCTGGAAAGGTGGTGCCCCTGATGCGGTGCAAGGTGGTGGACCTGGACACCAAGAAAACCCTGGGCGTGAACCAGCGGGGCGAGATCTGTGTCAGAGGCCCCCTGCTGATGAAGGGCTACATCGACAACCCCGAGGCCACCAGAGAGATCATCGACGACGAGGGCTGGATGCACACCGGCGACATCGGCTACTTCGACCAGGACGAGCACTTCTTCGTGGTGGACCGGCTGAAGTCCCTGATCAAGTACAAGGGCTATCAGGTGCCCCCTGCCGAGCTGGAATCCATTCTGCTGCAGCACCCCGACATCTTCGATGCTGGGGTGGCAGGCGTGCCCGATCCTGATGCTGGCGAACTGCCTGGCGCTGTGGTGGTCCTGGATAAGGGCAAGACCATGACCGAGCAGCAGATCCTGGACTACGTGGCCGGACAGGTGTCAAACGCCAAGAGACTGAGAGGCGGCGTGCGCTTCGTGGATGAAGTGCCTAAGGGCCTGACCGGCAAGATCGACGGCAAGGCCATCCGCGAGATCCTGAAGCAGCCCAGAGCCAAGATGTGA（配列番号１４）。
【００５６】
（３）相同配列の特定
取得されたミナミボタル（久米島産）、ムネクリイロボタル、クロイワボタルおよびオキナワスジボタルのルシフェラーゼ遺伝子から、アミノ酸配列を予測し、それらの４つの配列を比較した。
【００５７】
図１は、これら４種のホタルから取得されたルシフェラーゼのアミノ酸配列の一部を比較する図である。ミナミボタル（久米島産）およびムネクリイロボタルについては、Ｎ末端側から２７０番目から３００番目のアミノ酸配列を示しており、クロイワボタルおよびオキナワスジボタルについて、Ｎ末端側から２６８番目から２９８番目のアミノ酸配列を示している。すべてのアミノ酸残基は一文字略号にて示されている。
【００５８】
図１から、４つの配列において、Ｎ末端側から３番目、６番目、１０〜１３番目、１６番目、１９〜２４番目および３０番目のアミノ酸残基が共通していることがわかる（３番目、６番目、１０〜１３番目、１９〜２４番目および３０番目のアミノ酸残基については網掛けを付し、１６番目のアミノ酸残基については四角で囲っている）。その他のアミノ酸残基についても、一定の共通性が存在することがわかる。共通するアミノ酸残基をそのアミノ酸の一文字略号で表記し、その他のアミノ酸残基を「Ｘ」で表記した場合、その配列は、Ｘ−Ｘ−Ｅ−Ｘ−Ｘ−Ｌ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｑ−Ｄ−Ｙ−Ｋ−Ｘ−Ｘ−Ｓ−Ｘ−Ｘ−Ｌ−Ｖ−Ｐ−Ｔ−Ｌ−Ｆ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｓ−Ｘ（配列番号５７）となる。
【００５９】
（４）変異型ルシフェラーゼ遺伝子の作製
図１の比較に基づいて、１６番目のセリン残基が、セリン以外の種々のアミノ酸に置換されるように、４つのルシフェラーゼ遺伝子に対して変異を導入した。すなわち、このセリン残基が、アラニン（Ａ）、アルギニン（Ｒ）、アスパラギン（Ｎ）、アスパラギン酸（Ｄ）、システイン（Ｃ）、グルタミン（Ｑ）、グルタミン酸（Ｅ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、リジン（Ｋ）、メチオニン（Ｍ）、フェニルアラニン（Ｆ）、プロリン（Ｐ）、スレオニン（Ｔ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）またはバリン（Ｖ）に置換されるように変異を、一般的な部位特異的突然変異導入法により導入した。具体的には、多比良和誠編「遺伝子の機能阻害実験法―簡単で確実な遺伝子機能解析から遺伝子治療への応用まで」（羊土社、２００１年発行、ｐ．１７−２５）に記載される方法に倣って行った。
【００６０】
この変異導入のために、変異導入用オリゴヌクレオチド（配列番号１５から５４）を作製した。配列番号１５から３４に係るオリゴヌクレオチドは、ミナミボタル（久米島産）およびムネクリイロボタルに対して変異を導入するためのものであり、配列番号３５から５４に係るオリゴヌクレオチドは、クロイワボタルおよびオキナワスジボタルに対して変異を導入するためのものである。なお、変異導入後もセリン残基が維持されるようなオリゴヌクレオチドも作製し（配列番号２０および４０）、その他のオリゴヌクレオチドと同様に使用した。
【００６１】
作製した遺伝子は、それぞれ発現用ベクターｐＲＳＥＴ−Ｂに挿入した。
【００６２】
（５）大腸菌におけるルシフェラーゼの発現
上記の通り作製した発現用ベクターｐＲＳＥＴ−Ｂを大腸菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）株にそれぞれ形質転換し、コロニーを形成させた。得られたコロニーを培養し、ＬＢ寒天培地に塗布し、２４時間かけて再度コロニーを形成させた。そして、５５℃で１時間熱処理し、１時間室温で放置した後に、２ｍＭのＤ−ルシフェリン（クエン酸緩衝液ｐＨ５．６）を含む液体を噴霧した後、ＣＣＤカメラ（ＤＰ７０、オリンパス製）で５分間、発光する様子を撮影した。
【００６３】
取得された画像を図２に示す。但し、この図は、カラーにて取得された画像をモノクロで示したものである。図２（ａ）において、縦に並ぶ４つの列には、それぞれ左から、ミナミボタル（久米島産）由来のルシフェラーゼを発現する菌体、ムネクリイロボタル由来のルシフェラーゼを発現する菌体、クロイワボタル由来のルシフェラーゼを発現する菌体およびオキナワスジボタル由来のルシフェラーゼを発現する菌体が示されている。横に並ぶ４つの菌体は、同一の変異が導入されたルシフェラーゼをそれぞれ発現しており、その変異の内容は左端に示されている。例えば、「Ｓ ｔｏ Ｎ」とは、セリン残基をアスパラギンに置換した変異を意味する。
【００６４】
また、図２（ａ）中、「１５」、「３２」、「４２」、「６６」および「７０」と付した位置に対応する菌体については、その他の菌体とは別に発光の測定を行っており、これら５種の発光の様子は図２（ｂ）に示されている。
【００６５】
図２から、セリン残基を置換することで、発光量が変化することがわかる、例えば、ミナミボタル（久米島産）の「Ｓ ｔｏ Ｔ」は「Ｓ ｔｏ Ｓ」に比べて発光量が低下している一方で、「Ｓ ｔｏ Ａ」は発光量が増大している。さらに、取得されたカラーの画像によると、４種のルシフェラーゼそれぞれにおいて、セリン残基を置換することで発光の色が変化していることが分かる。特に、「Ｓ ｔｏ Ｓ」が緑色の発光を示しているのに対し、変異を導入することで黄色から赤色の発光に変化していることがわかる。
【００６６】
（６）発光スペクトルの測定
上記の通り作製した４×２０種のルシフェラーゼについて、それぞれ大腸菌に発現させ、Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、発光スペクトルを測定した。
【００６７】
ルシフェラーゼ遺伝子が挿入された発現ベクターを含む大腸菌を、４ｍＬのＳＢ培地に播種し、２５℃にて、２００ｒｐｍで撹拌しながら、２晩培養した。培養後、遠心分離機にて菌体を回収し、発光スペクトルの測定まで−８０℃にて保存した。
【００６８】
その後、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）および５０ｍＭのＮａＣｌを含む２５０μｌの溶液に、回収した菌体を懸濁させた。この懸濁液の１００μｌを、発光測定のための９６ウェルプレートの各ウェルに入れた。さらに、それらのウェルに対して、発光測定機器の分注システムを用いて、Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）の発光基質を１００μｌずつ分注した。その後、発光を測定した。測定条件の詳細は以下の通りとした。  
Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ：  Ｔｅｃａｎ  ｉ−ｃｏｎｔｒｏｌ
Ｄｅｖｉｃｅ：  ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ１０００Ｐｒｏ
Ｐｌａｔｅ：Ｎｕｎｃｌｏｎ  ９６  Ｆｌａｔ  Ｂｏｔｔｏｍ  Ｂｌａｃｋ
Ｍｏｄｅ：Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ｓｃａｎ  Ｔｏｐ  Ｒｅａｄｉｎｇ
Ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ  Ｓｔａｒｔ：４６０ｎｍ
Ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ  Ｅｎｄ：７４０ｎｍ
Ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ  Ｓｔｅｐ  Ｓｉｚｅ：１ｎｍ
Ｂａｎｄｗｉｄｔｈ：５ｎｍ
Ｇａｉｎ：１４０から１６０
Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  Ｔｉｍｅ：５０から１０００ｍｓ
Ｚ−Ｐｏｓｉｔｉｏｎ  （Ｄｅｆａｕｌｔ）：２２０００μｍ
【００６９】
測定結果を図３から６に示す。
【００７０】
図３は、ミナミボタル（久米島産）から取得されたルシフェラーゼおよびその変異体の発光スペクトルを示す図である。作製した１９種の変異体をランダムに３つのグループに分けて、それらのスペクトルを図３（ａ）から（ｃ）にそれぞれ表示した。なお、図３（ａ）から（ｃ）の全てにおいて、比較として野生型ルシフェラーゼ（Ｓ２８５Ｓ）の発光スペクトルを示した。
【００７１】
同様に、ムネクリイロボタルのルシフェラーゼの結果は図４に、クロイワボタルのルシフェラーゼの結果は図５に、オキナワスジボタルのルシフェラーゼの結果は図６にそれぞれ示した。
【００７２】
図３から６の結果から、いずれのルシフェラーゼにおいても、セリン残基を置換することで、最大発光波長の値が長波長側にシフトする傾向があることがわかった。そのシフトの長さは、置換するアミノ酸の違いにより様々であることがわかった。すなわち、セリン残基を置換することで、種々の発光の色を示すルシフェラーゼ変異体を取得できることがわかった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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