(57)【要約】【課題】血液中に存在する血球以外の細胞へのダメージを抑制しつつ、赤血球及び白血球にダメージを与える簡便な処理方法の提供。【解決手段】一態様において、血液成分を含む試料と界面活性剤Ａを含む液とを混合することを含み、前記界面活性剤Ａが、一般式Ｒ1-Ｏ-(ＥＯ)n-Ｒ2  （I）で表される非イオン性界面活性剤である、血液成分含有試料の処理方法に関する。その他の態様において、血液成分を含む試料と、界面活性剤Ａ及び界面活性剤Ｂを含む液、又は、界面活性剤Ａを含む液及び界面活性剤Ｂを含む液とを混合することを含み、前記界面活性剤Ａが、一般式Ｒ1-Ｏ-(ＥＯ)n-Ｒ2  （I）で表される非イオン性界面活性剤であり、前記界面活性剤Ｂの赤血球に対する溶解性が、前記界面活性剤Ａのそれよりも高い、血液成分含有試料の処理方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液成分を含む試料と、界面活性剤Ａ及び界面活性剤Ｂを含む液、又は、界面活性剤Ａを含む液及び界面活性剤Ｂを含む液とを混合することを含み、
前記界面活性剤Ａが、下記一般式（I）で表される非イオン性界面活性剤であり、前記界面活性剤Ｂの赤血球に対する溶解性が、前記界面活性剤Ａのそれよりも高い、血液成分含有試料の処理方法。
Ｒ1-Ｏ-(ＥＯ)n-Ｒ2      （I）
［前記式（Ｉ）中、Ｒ1は分岐鎖を有する炭素数１２〜４０の炭化水素基であり、ＥＯはオキシエチレン基を示し、ｎはＥＯの平均付加モル数であって２３〜５０であり、Ｒ2は水素原子又は炭素数１〜３の炭化水素基である。］
【請求項２】
血液成分を含む試料と、界面活性剤Ａを含む液とを混合することを含み、固定化剤を用いず、
前記界面活性剤Ａが、下記一般式（I）で表される非イオン性界面活性剤である、血液成分含有試料の処理方法。
Ｒ1-Ｏ-(ＥＯ)n-Ｒ2      （I）
［前記式（Ｉ）中、Ｒ1は分岐鎖を有する炭素数１２〜４０の炭化水素基であり、ＥＯはオキシエチレン基を示し、ｎはＥＯの平均付加モル数であって２３〜５０であり、Ｒ2は水素原子又は炭素数１〜３の炭化水素基である。］
【請求項３】
前記界面活性剤Ａが、ポリオキシエチレンアルキレンエーテル（ＥＯ＝２３〜５０）である、請求項１又は２に記載の血液成分含有試料の処理方法。
【請求項４】
前記界面活性剤Ｂが、ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキレンエーテル（ＥＯ＝８〜２２）、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される非イオン性界面活性剤である、請求項１又は３に記載の血液成分含有試料の処理方法。
【請求項５】
前記界面活性剤Ｂが、下記一般式（III）で表される非イオン性界面活性剤である、請求項１、３及び４のいずれかに記載の血液成分含有試料の処理方法。
Ｒ3-Ｏ-(ＡＯ)m/(ＥＯ)n-Ｒ4    （III）
［前記式（III）中、Ｒ3は炭素数１〜２４のアルキル基であり、Ｒ4は水素原子又は炭素数1〜３のアルキル基を示し、ＡＯは炭素数３〜６のオキシアルキレン基を示し、ＥＯはオキシエチレン基を示し、ｍ及びｎはそれぞれＡＯ及びＥＯの平均付加モル数である。ｍは１〜１００の数であり、ｎは０〜５０の数である。"／"はＡＯ基及びＥＯ基が、順序に関係なく、ランダム又はブロックのいずれに付加したものであってもよいことを示す。］
【請求項６】
前記界面活性剤Ｂが、下記式（IV）で表される非イオン性界面活性剤である、請求項１及び３から５のいずれかに記載の血液成分含有試料の処理方法。
Ｒ5-Ｏ-(ＥＯ)n-Ｒ6        （IV）
［前記式（IV）中、Ｒ5は炭素数１２〜４０の炭化水素基を示し、ＥＯはオキシエチレン基を示し、ｎはＥＯの平均付加モル数であって８〜２２であり、Ｒ6は水素原子又は炭素数１〜３の炭化水素基である。］
【請求項７】
前記界面活性剤Ｂが、下記式（VI）で表される非イオン性界面活性剤である、請求項１及び３から６のいずれかに記載の血液成分含有試料の処理方法。
Ｒ7-ＣＯＯ-(ＥＯ)n-Ｒ8        （VI）
［前記式（VI）中、Ｒ7は炭素数１０〜４０の炭化水素基を示し、ＥＯはオキシエチレン基を示し、ｎはＥＯの平均付加モル数であって６〜１６０であり、Ｒ8は水素原子又は炭素数１〜３の炭化水素基である。］
【請求項８】
前記界面活性剤Ｂが、親水性部として、糖残基を有し、疎水性部として、脂肪鎖又はアルキル鎖を有する界面活性剤である、請求項１及び３から７のいずれかに記載の血液成分含有試料の処理方法。
【請求項９】
前記界面活性剤Ｂが、ショ糖ラウリン酸エステルである、請求項１及び３から８のいずれかに記載の血液成分含有試料の処理方法。
【請求項１０】
血液成分を含む試料と、界面活性剤Ａ及び界面活性剤Ｂを含む液、又は、界面活性剤Ａを含む液及び界面活性剤Ｂを含む液とを混合することを含み、
前記界面活性剤Ａが、ポリオキシエチレンオクチルドデシルエーテル（ＥＯ＝２３〜５０）であり、
前記界面活性剤Ｂが、その赤血球に対する溶解性が前記界面活性剤Ａのそれよりも高い非イオン性界面活性剤であって、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンオクチルドデシルエーテル（ＥＯ＝８〜２２）、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される非イオン性界面活性剤である、血液成分含有試料の処理方法。
【請求項１１】
前記界面活性剤Ａ及び前記界面活性剤Ｂの混合する量比（Ａ／Ｂ）（重量比）が、５０／５０以上１００／０未満である、請求項１及び３から１０のいずれかに記載の血液成分含有試料の処理方法。
【請求項１２】
前記界面活性剤Ａを含む液が、下記（１）の血球除去効果を有する、請求項２から１１のいずれかに記載の血液成分含有試料の処理方法：
（１）所定量の血液を、マイクロプレートリーダと６００ｎｍ以上の波長の光を用いて吸光光度法で測定した吸光度値が１以上２未満になるように蒸留水で希釈することにより、基準サンプルを調製し、
前記基準サンプルにおける蒸留水に代えて、前記界面活性剤Ａを２．５〜５ｗ／ｖ％含む液を用いて被検サンプルを調製し、
６００ｎｍ以上の波長の光を用いて吸光光度法で測定した前記被検サンプルの吸光度値が、前記基準サンプルの吸光度値の２分の１になる時間が、１時間以内である。
【請求項１３】
前記界面活性剤Ａ及び界面活性剤Ｂを含む液、又は界面活性剤Ａを含む液及び界面活性剤Ｂを含む液が、下記（２）の血球除去効果を有する、請求項１から１２のいずれかに記載の血液成分含有試料の処理方法：
（２）所定量の血液を、マイクロプレートリーダと６００ｎｍ以上の波長の光を用いて吸光光度法で測定した吸光度値が１以上２未満になるように蒸留水で希釈することにより、基準サンプルを調製し、
前記基準サンプルにおける蒸留水に代えて、前記界面活性剤Ａ及び界面活性剤Ｂを２．５〜５ｗ／ｖ％含む液を用いて被検サンプルを調製し、
６００ｎｍ以上の波長の光を用いて吸光光度法で測定した前記被検サンプルの吸光度値が、前記基準サンプルの吸光度値の２分の１になる時間が、０．５時間以内である。
【請求項１４】
前記血液成分含有試料の処理方法は、前記試料に含まれ得る稀少細胞の生存率低下を抑制しつつ赤血球を溶解させ、かつ／又は、白血球の生存率を低下させる方法である、請求項１から１３のいずれかに記載の血液成分含有試料の処理方法。
【請求項１５】
請求項１から１４のいずれかに記載の処理方法で血液成分を含む試料を処理すること、及び、処理後の試料から稀少細胞又は核酸を分離又は検出することを含む、血液成分含有試料中の稀少細胞又は核酸を分離又は検出する方法。
【請求項１６】
前記稀少細胞又は核酸の分離又は検出が、アフィニティーを用いた分離、密度分離、遠心分離、接着分離、サイズ分離、フローサイトメトリー、電気的分離、磁性分離、培地への播種、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される方法で行われることを含む、請求項５に記載の血液成分含有試料中の稀少細胞又は核酸を分離又は検出する方法。
【請求項１７】
前記稀少細胞が、がん細胞、循環腫瘍細胞、血管内皮細胞、血管内皮前駆細胞、がん幹細胞、上皮細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、胎児細胞、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される細胞である、請求項１５又は１６に記載の血液成分含有試料中の稀少細胞又は核酸を分離又は検出する方法。
【請求項１８】
前記核酸が、血液成分中のＲＮＡ及びＤＮＡ、がん細胞、循環腫瘍細胞、血管内皮細胞、血管内皮前駆細胞、がん幹細胞、上皮細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、胎児細胞のＲＮＡ及びＤＮＡ、並びに、これらの組み合わせからなる群から選択される核酸である、請求項１５から１７のいずれかに記載の血液成分含有試料中の稀少細胞又は核酸を分離又は検出する方法。
【請求項１９】
前記稀少細胞について、放射性物質を利用した検出方法、発光現象を利用した検出方法、色素を用いた検出方法、磁性を利用した検出方法、電気的検出方法、光学的検出方法、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される検出方法に付随する標識方法を用いて標識すること含む、請求項１５から１８のいずれかに記載の血液成分含有試料中の稀少細胞又は核酸を分離又は検出する方法。
【請求項２０】
請求項１から１４のいずれかに記載の処理方法で血液成分を含む試料を処理すること、又は、請求項１５から１９のいずれかに記載の分離又は検出方法により血液成分を含む試料から稀少細胞又は核酸を分離又は検出することを含む、血液成分を含む試料中のＣＴＣ（循環腫瘍細胞）数又はＣＴＣの核酸を測定する方法。
【請求項２１】
請求項１から１４のいずれかに記載の処理方法で血液成分を含む試料を処理した後、細胞の動態の観察又は活性測定を含む方法で分析することを含む、血液成分含有試料中の稀少細胞の分析方法。
【請求項２２】
請求項１から１４のいずれかに記載の処理方法、請求項１５から１９のいずれかに記載の分離又は検出方法、請求項２０記載のＣＴＣ数測定方法、及び／又は請求項２１に記載の分析方法に用いるための、前記界面活性剤Ａ及び前記界面活性剤Ｂを含む、試薬キット。
【請求項２３】
請求項２から１４のいずれかに記載の処理方法、請求項１５から１９のいずれかに記載の分離又は検出方法、請求項２０記載のＣＴＣ数測定方法、及び／又は請求項２１に記載の分析方法に用いるための、前記界面活性剤Ａを含む、試薬キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、血液を含む試料の処理方法、血液を含む試料中の稀少細胞及び核酸を分離する方法、ＣＴＣ数測定方法、及び試薬キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
血液の細胞成分は、赤血球、白血球、血小板であるが、稀に血液中にこれら以外の細胞が存在することがある。その一例として、血中循環腫瘍細胞／ＣＴＣ（Circulating Tumor Cell）が挙げられる。がんの転移はがん細胞が血管やリンパ管を通って体内の他の部位に運ばれて増殖することにより起こると考えられている。そして、血液中のＣＴＣ数と、がんの転移の可能性及び予後とは相関することが報告されており、がん（特に乳がんなどの転移性のがん）の診断、予後診断、及び治療効果の予測又は判定の指標とするために、血液中のＣＴＣ数の計数、ＣＴＣの核酸を測定することが知られている（非特許文献１）。
【０００３】
血液中のＣＴＣの分離、検出技術として、ＣＴＣ特異的表面抗原に対する抗体により血液中のＣＴＣを捕捉分離する方法（特許文献１、２）や、接着を利用した分離方法(特許文献３、４)、密度勾配を利用した分離方法（特許文献５、６）、フィルターを利用した分離方法（特許文献７、８）、ＣＴＣのテロメラーゼ活性を測定する方法（特許文献９）、低張溶液を用いた溶血による分離方法（特許文献１０）、フローサイトメトリーを利用した方法（特許文献１１）等がある。上記で分離したものを検出、定量、計数するために、ＰＣＲや親和性のある物質を利用した核酸の測定が行われ、また、抗体や蛍光色素を組み合わせた光学的なＣＴＣの測定が行われることが一般的である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特許３８３４３２６号
【特許文献２】特開２００７−１７８１９３
【特許文献３】ＷＯ２００５／０４３１２１
【特許文献４】ＷＯ２００６／０７８９９４
【特許文献５】特開２０１０―０７５０７３
【特許文献６】ＷＯ９５／２０４２９
【特許文献７】ＷＯ２００６／１１６３２７
【特許文献８】ＷＯ２００８／１５５３９８
【特許文献９】ＷＯ２０１０／０７１１１４
【特許文献１０】ＷＯ２００４／０５６９７８
【特許文献１１】ＷＯ２００８／０５７４３７
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Circulating Tumor cell;Evolving Evidence and Future Challenges. The oncologist 2009;14;1070-1082
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
血液成分が含まれる試料中の稀少細胞を生きたまま分析したり、分離して培養したりするには、前記稀少細胞に大きなダメージを与えることなく、血液中の細胞成分（とりわけ、赤血球及び白血球）を効率的に除去する必要がある。
【０００７】
そこで、本開示は、血液成分が含まれる試料中の血球以外の細胞へのダメージを抑制しつつ、迅速な血球の排除を可能とする簡便な処理方法を提供する。また血球等を除去にすることによりＣＴＣの純度を高めＣＴＣの計数や核酸測定時のノイズを抑制、ＣＴＣの検出を可能とする簡便な処理方法、又は分離若しくは検出方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本開示は、一態様において、血液成分を含む試料と界面活性剤Ａを含む液とを混合すること含み、固定化剤を用いず、前記界面活性剤Ａが、下記一般式（I）で表される非イオン性界面活性剤である、血液成分含有試料の処理方法に関する。
Ｒ1-Ｏ-(ＥＯ)n-Ｒ2      （I）
［前記式（Ｉ）中、Ｒ1は分岐鎖を有する炭素数１２〜４０の炭化水素基であり、ＥＯはオキシエチレン基を示し、ｎはＥＯの平均付加モル数であって２３〜５０であり、Ｒ2は水素原子又は炭素数１〜３の炭化水素基である。］
【０００９】
本開示は、その他の態様において、血液成分を含む試料と、界面活性剤Ａ及び界面活性剤Ｂを含む液、又は、界面活性剤Ａを含む液及び界面活性剤Ｂを含む液とを混合することを含み、前記界面活性剤Ａが、下記一般式（I）で表される非イオン性界面活性剤であり、前記界面活性剤Ｂの赤血球に対する溶解性が、前記界面活性剤Ａのそれよりも高い、血液成分含有試料の処理方法に関する。
Ｒ1-Ｏ-(ＥＯ)n-Ｒ2      （I）
［前記式（Ｉ）中、Ｒ1は分岐鎖を有する炭素数１２〜４０の炭化水素基であり、ＥＯはオキシエチレン基を示し、ｎはＥＯの平均付加モル数であって２３〜５０であり、Ｒ2は水素原子又は炭素数１〜３の炭化水素基である。］
【００１０】
本開示は、その他の態様において、血液成分を含む試料と、界面活性剤Ａ及び界面活性剤Ｂを含む液、又は、界面活性剤Ａを含む液及び界面活性剤Ｂを含む液とを混合することを含み、前記界面活性剤Ａが、ポリオキシエチレンオクチルドデシルエーテル（ＥＯ＝２３〜５０）であり、前記界面活性剤Ｂが、その赤血球に対する溶解性が前記界面活性剤Ａのそれよりも高い非イオン性界面活性剤であって、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンオクチルドデシルエーテル（ＥＯ＝８〜２２）、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される非イオン性界面活性剤である血液成分含有試料の処理方法に関する。
【００１１】
本開示は、その他の態様において、本開示にかかる処理方法で血液成分を含む試料を処理すること、及び、処理後の試料から稀少細胞又は核酸を分離又は検出することを含む、血液成分含有試料中の稀少細胞又は核酸を分離又は検出する方法に関する。
【００１２】
本開示は、その他の態様において、本開示にかかる処理方法で血液成分を含む試料を処理すること、又は、本開示にかかる分離又は検出方法により血液成分の稀少細胞又は核酸を分離又は検出することを含む、血液成分を含む試料中のＣＴＣ（循環腫瘍細胞）数又はＣＴＣの核酸を測定する方法に関する。
【００１３】
本開示は、その他の態様において、本開示にかかる処理方法で血液成分を含む試料を処理した後、細胞の動態の観察又は活性測定を含む方法で分析することを含む、血液成分含有試料中の稀少細胞の分析方法に関する。
【００１４】
本開示は、その他の態様において、本開示にかかる処理方法、本開示にかかる分離又は検出方法、本開示にかかるＣＴＣ数又はＣＴＣの核酸の測定方法、及び／又は、本開示かかる分析方法に用いるための試薬キットであって、前記界面活性剤Ａ及び／又は前記界面活性剤Ｂを含む試薬キットに関する。
【発明の効果】
【００１５】
本開示によれば、血液を含む試料に存在する血球以外の細胞へのダメージを抑制しつつ、赤血球を溶解し白血球にダメージを与えることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、界面活性剤Ｎｏ．２と界面活性剤Ｎｏ．１との混合物の混合比と、がん細胞の生存率との関係を示すグラフの一例である。
【図２】図２は、界面活性剤Ｎｏ．３と界面活性剤Ｎｏ．１との混合物の混合比と、がん細胞の生存率との関係を示すグラフの一例である。
【図３】図３は、界面活性剤混合物の処理後に遠心分離で回収されたがん細胞を培養した結果の顕微鏡観察写真の一例である。
【図４】図４は、界面活性剤混合物の処理を行ってない（Ａ）及び行った（Ｂ）試料をフィルター処理した後の試料を顕微鏡観察した写真の一例である。
【図５】図５は、緑色蛍光染色したがん細胞（ＳＮＵ−１）と青色蛍光染色した白血球細胞を含むがん細胞含有血液試料に対して界面活性剤混合物の処理を行った後の蛍光顕微鏡観察の結果の一例である。
【図６】図６は、がん細胞（ＳＮＵ−１）懸濁液又は白血球細胞を含む血液成分含有試料に対し、界面活性剤混合物の処理を行った後（Ａ）及び行ってない（Ｂ）の試料をコールター式のフローサイトメトリー解析した結果の一例である。
【図７】図７は、がん細胞（ＳＮＵ−１）及び白血球細胞を含む血液成分含有試料に対し、界面活性剤混合物の処理を行った後（Ａ）及び行ってない（Ｂ）の試料をコールター式のフローサイトメトリー解析した結果の一例である。
【図８】図８は、生理食塩水に懸濁されたがん細胞（ＳＮＵ−１）、又は白血球細胞を含む血液成分含有試料に対し、さまざまなｐＨの界面活性剤混合物で処理した後の生存率を示すグラフの一例である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
循環腫瘍細胞（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｔｕｍｏｒ Ｃｅｌｌ：ＣＴＣ）等の血液中の稀少細胞の分析は、今後さらに盛んに行われることが予想され、より簡便でロスの少ない方法が求められている。１０ｍｌの血液中には、通常、赤血球が数百億個、白血球は数千万個が含まれているが、ＣＴＣは、０〜数千個程度である。したがって、ＣＴＣをそのまま解析するには技術的課題が多く、例えば、分離、濃縮などの処理が必要となる。そのため、血液の中から、より効率的及び／又は簡便にＣＴＣを濃縮、分離する技術の開発が期待されている。
【００１８】
抗原抗体反応を利用した分離方法では、抗体を付加した磁性ビーズと磁場を用いて血液から細胞を濃縮する方法（特許文献１、２）がある。しかし、血液中には抗体が目的の細胞に接触するのに障害となる血球が密に存在し、反応時間や細胞の回収時間を必要とする。さらに血球の存在下では、反応体積が大きく、体積あたりの試薬量も増えるため、コストがかかる。またビーズを用いて濃縮する際には、血球を多く巻き込んでしまうため純度が低く偽陽性の要因となる。さらに血球を除去する洗浄を繰り返す際、目的の細胞をロスする可能性がある。
【００１９】
接着を利用した分離方法（特許文献３、４）は、血液存在下では、一般的な細胞培養用のシャーレや担体の底面に対し血球や血小板が堆積するため、がん細胞がシャーレに接着できずがん細胞を分離できない。このためシャーレや担体に抗体などの親和性の高い物質を固定化して細胞を接着させる方法があるが、これも同様に細胞と親和性のある物質とが底面で接触する必要があり、血球が障害になる。そのため、接触回数を増やすための担体側の構造の工夫や攪拌が必要になり、構造工夫や攪拌方法などが加わり複雑になる。
【００２０】
遠心分離法では、血液において遠心後に下から赤血球層、白血球層と順に細胞の層をつくる。白血球細胞中にはがん細胞は密度及びサイズをもつものも多いため、多くの白血球が混入し、遠心分離は純度が得られず、偽陽性の原因になる。また各層が非常に近接しているため、赤血球が多く混入し高い回収率と純度は得られない。
【００２１】
密度勾配遠心法による分離（特許文献５、６）は、血液から細胞を回収方法として汎用される。しかし、細胞の密度を利用した分離は、がん細胞と白血球の単核球のサイズと密度が似ているため、単核球が多く混入し、偽陽性の原因になる。また、密度分離遠心法は、分離後に各層が混ざらないよう液を乱さず、細胞の層を回収しなければならないなど煩雑である。
【００２２】
フィルターを用いた分離（特許文献７、８）は、稀少細胞のサイズの差と血球の変形能を用いた分離であるが、血球とがん細胞を分離するのに利用されている。多くの赤血球や白血球はフィルターを通過していくが、一部の赤血球、白血球がメンブレン上に残る。さらに、孔サイズが８μｍのメンブレンより小さな孔を使用すれば、目詰まりを起こしやすくなり、逆に血球のフィルターの通過の効率を上げるためにろ過時の圧力を高くすると、流速が大きくなり稀少細胞がダメージを受ける、或いは孔を通過してしまい回収率も下がる。
【００２３】
フローサイトメトリーでは、血液１μＬ中に赤血球が数百万個、白血球が数千〜1万個程度存在しているため、一般的にはそのまま計数できない。そのため、赤血球の除く溶血剤の添加、及び、測定時には各細胞を検出するために稀釈が必要になる。１０ｍＬの血液を稀釈し、数百億個の赤血球、数億〜数千個の白血球の中から、各細胞を計数し、がん細胞を分離、計数することは非常に難しい。電気抵抗式にいたっては、がん細胞と同程度の大きさの白血球が存在するため、分離後には多くの白血球が混入し、偽陽性の原因になる。
【００２４】
このように、稀少細胞を検出、計数するには従来の分離濃縮技術では、血球細胞の残存により必要な感度、効率、及び特異性において不十分と言える。もし試料中の血球細胞の処理（分離、除去、排除等）ができれば、抗原抗体反応を用いた分離おいては、溶解後に遠心し、再懸濁した少量の体積の溶液で反応させ、試薬コストと反応時間を短縮できる。また、接着を利用した分離においても、培養用のシャーレを用いて培養と接着分離が可能になる。さらに、遠心分離、密度勾配遠心法を用いた分離では、稀少細胞の回収が容易になる。さらにまた、フィルターを用いた場合では、解析を容易にする。すなわち、血液が含まれる試料中の血球細胞を処理することで、稀少細胞の計数及び定量における誤差要因（偽陽性）を減らし、迅速に測定できるようになる。
【００２５】
また、血液が含まれる試料中の稀少細胞を生きたまま分析したり、分離して培養したりできれば、より詳細に稀少細胞を分析・解析することが可能となる。しかし、一般的に血球除去に溶血試薬として利用される非イオン界面活性剤のサポニンやトリトンは、がん細胞等の稀少細胞にもダメージを与え死に至らしめ、細胞が破壊される。そのため、一般的には界面活性剤を用いて目的の細胞を解析する場合には、特許文献９に記載のように、予めホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒドのような架橋試薬(固定試薬)で血液を含む試料中の稀少細胞を固定化したあとに溶血試薬と反応させる。前記のようなホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒドのような架橋試薬は、通常、フリーのアミノ基を介して分子間架橋を形成することにより、細胞膜、細胞構造が維持される。しかしながら、細胞の構造維持は期待できるが、この固定化の操作によって生きた稀少細胞の分離培養、観察、活性測定、薬効評価などのさらなる解析が困難になる。
【００２６】
また、特許文献９記載の界面活性剤の濃度では直接血液を溶解できず、がん細胞にダメージを与えものもある。また多くの白血球も生存する。
【００２７】
溶血試薬を使用する場合に一般的に併用される固定化剤であるホルムアルデヒドやパラホルムアルデヒドは劇物であるため、使用者の健康に影響を及ぼす可能性がある。特許文献９、１０に記載されているような塩化アンモニウム塩や低張溶液による血球除去方法があるが、これらは、反応条件に大きな稀釈倍率を要するため、反応槽が大きくなる問題がある。また界面活性剤ほど溶解力がないため、細胞片など凝集物ができやすい。
【００２８】
本開示は、一又は複数の実施形態において、赤血球に対する溶解性及び細胞に対するダメージが低い界面活性剤Ａを使用することで、赤血球を溶解しつつ、血液中に存在する稀少細胞に対するダメージを抑制できるという知見に基づく。本開示は、また、一又は複数の実施形態において、赤血球に対する溶解性及び細胞に対するダメージが高い界面活性剤Ｂと、赤血球に対する溶解性及び細胞に対するダメージが低い界面活性剤Ａとを組み合わせて血液試料を処理すると、赤血球を溶解し白血球にダメージを与えつつ、血液中に存在する稀少細胞に対するダメージを抑制できるという知見に基づく。また、これらの処理は低コストで行えるといる利点がある。
【００２９】
界面活性剤Ａによって血液中の稀少細胞に対するダメージを抑制しつつ血球の排除が可能となるメカニズムの詳細は明らかではないが、以下のように考えられる。細胞の観点からは、細胞の骨格や膜の違いが要因と考えられる。体内を循環する血球は、毛細血管などを通るため細胞の骨格が変形しやすく、また細胞膜のリン脂質二重層の流動性が大きくリン脂質の疎水部同士の相互作用が弱い。そのために界面活性剤の作用を受けると破壊されやすい。一方で稀少細胞は、サイトケラチンなどの特徴的なフィラメントが細胞内に張り巡らされ細胞膜等に結合し、また脂質二重層の流動性も血球と比較して小さく破壊されにくいと考えられる。また、界面活性剤の観点からは、界面活性剤が細胞膜上のタンパク質や、コレステロール、リン脂質と相互作用し、細胞を溶解していると考えられる。界面活性剤Ａは、リン脂質の疎水基の構造に近い分岐鎖をもつ分子構造がよく、また疎水基と親水基、たとえばアルキル基とエチレンオキサイドの付加数のバランスで、溶解力と親水基による立体障害の影響をコントロールすることによって稀少細胞を破壊することなく血球を溶解させる。ただし、本開示はこれらのメカニズムに限定されて解釈されなくてもよい。
【００３０】
界面活性剤ＡとＢとの組み合わせによって血液中の稀少細胞に対するダメージを抑制しつつ血球の排除が可能となるメカニズムの詳細は明らかではないが、以下のように考えられる。界面活性剤Ａに、血球への溶解性の高い界面活性剤Ｂが組み合わされることにより、界面活性剤Ａ及びＢが混合ミセルを形成し、この混合ミセルが、その割合によって界面活性剤Ａの血球への選択性を邪魔することなく血球に選択的に作用し、界面活性剤Ｂの高い溶解性により接触した血球を迅速に溶解する。すなわち、血球のすばやく排除を可能とすることで、がん細胞へのダメージがより抑制されると考えられる。ただし、本開示はこれらのメカニズムに限定されて解釈されなくてもよい。
【００３１】
本開示の処理方法によれば、血液を含む試料中の血球以外の細胞に対するダメージを抑制しつつ血球の排除を簡便にすることができる。したがって、一又は複数の実施形態においては、本開示の処理方法を行うことにより、例えば、血液中の稀少細胞、とりわけＣＴＣ（循環腫瘍細胞）の分離、濃縮、測定、及び／又は培養、分析を簡便に行うことができる。また、例えば、ＣＴＣの染色や標識を行った場合に白血球が染色されたとしても、本開示の処理方法による処理後に、白血球は死細胞となって、あるいは、ダメージを受けているため染色物等が外に漏れ、白血球からのシグナル（ノイズ）が低下する。したがって、細胞内に蓄積する蛍光物質や、代謝を利用して蛍光物質に変換される物質、たとえば、CellTracker  （Green   CMFDA/C7025インビトロジェン）を用いた非特異的な染色方法であっても一又は複数の実施形態においては、本開示の処理方法を行うことにより、ＣＴＣの検出、測定、観察等の偽陽性を抑制できる。
【００３２】
［血液成分を含む試料］
本明細書において「血液成分を含む試料」とは、「血液成分含有試料」ともいい、本開示の処理方法を適用されうる試料であって、血液、赤血球成分を含む血液由来物、血液又は血液由来物が混在する体液、及び、これらから調製された試料等が挙げられる。「体液」は、一又は複数の実施形態において、血液、リンパ液、腹水、胸膜液、髄液、唾液、尿、及び母乳を含みうる。血液としては、生体から採取された血液が挙げられ、前記生体としては、ヒト又はヒト以外の動物（例えば、哺乳類）が挙げられる。赤血球成分を含む血液由来物としては、血液から分離又は調製されたものであって赤血球成分を含むもの又はそれらの希釈／濃縮物が挙げられ、例えば、血漿が除かれた血球画分や、血球濃縮物、血液又は血球の凍結乾燥物、全血を溶血処理した溶血試料、遠心分離血液、自然沈降血液、洗浄血球、特定の画分などを含む。これらのなかでも、限定されない一又は複数の実施形態においては、簡便かつ迅速な処理の観点及び血液中の稀少細胞に対するダメージ抑制の観点から、前記血液を含む試料としては血液又は血球成分を含む血液由来の血球が好ましい。
【００３３】
本明細書において「血液中の稀少細胞」又は「血液成分を含む試料中の稀少細胞」とは、ヒト又はヒト以外の動物の血液中に含まれ得る細胞成分（赤血球、白血球、及び血小板）以外の細胞をいい、腫瘍細胞及び／又はがん細胞を含む。一般に血液中に循環する腫瘍細胞やがん細胞をＣＴＣという。血液中の稀少細胞数としては、一般に、血液１０ｍｌ中に０〜数千個含まれている。「血液中の稀少細胞」又は「血液成分を含む試料中の稀少細胞」とは、一又は複数の実施形態において、がん細胞、循環腫瘍細胞、血管内皮細胞、血管内皮前駆細胞、がん幹細胞、上皮細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、胎児細胞、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される細胞をいう。また、本明細書において、分離又は検出対象となる「核酸」は、一又は複数の実施形態において、血液成分中のＲＮＡ及びＤＮＡ、がん細胞、循環腫瘍細胞、血管内皮細胞、血管内皮前駆細胞、がん幹細胞、上皮細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、胎児細胞のＲＮＡ及びＤＮＡ、並びに、これらの組み合わせからなる群から選択される核酸である。
【００３４】
本明細書において「血球の排除」とは、赤血球の溶血、及び／又は、白血球の生育阻害をいう。赤血球の溶解及び白血球の生育阻害は、例えば、実施例の方法で確認することができる。なお、本明細書において「白血球の生育阻害」は、白血球細胞の死滅（生存率の低下）、溶解、及び／又は白血球細胞の増殖阻害を含みうる。一又は複数の実施形態において、赤血球の溶血は、血液を含む試料において、濁度の変化を測定することによって観察できる。一又は複数の実施形態において、測定セルのサイズによって値は多少変化するが、初期濁度から値が１／２に以下になることを溶血の基準としてもよい。具体的には、血液を含む試料を３０μlと溶血試薬３０μlを混合し、マイクロプレートリーダを用いて測定で確認できる。例えば、前記条件で血液とＰＢＳや蒸留水を混合した溶液では波長６５０ｎｍの吸光度値で２〜１．５であったものが、０．８以下、０．６以下、又は、０．５以下とすることを含む。また、一又は複数の実施形態において、白血球の生育阻害は、血液を含む試料において、白血球の生存率を５０％以下、５０％未満、４０％以下、４０％未満、又は３０％以下とすることを含む。
【００３５】
前記界面活性剤Ａを含む液は、下記（１）の血球除去効果を有することが好ましい。
（１）所定量の血液を、マイクロプレートリーダと６００ｎｍ以上の波長の光を用いて吸光光度法で測定した吸光度値が１以上２未満になるように蒸留水で希釈することにより、基準サンプルを調製し、
前記基準サンプルにおける蒸留水に代えて、前記界面活性剤Ａを２．５〜５ｗ／ｖ％含む液を用いて被検サンプルを調製し、
６００ｎｍ以上の波長の光を用いて吸光光度法で測定した前記被検サンプルの吸光度値が、前記基準サンプルの吸光度値の２分の１になる時間が、１時間以内である。
なお、前記界面活性剤Ａを含む液は、上記（１）の血球除去効果に関し、６００ｎｍ以上の波長の光を用いて吸光光度法で測定した前記被検サンプルの吸光度値が、前記基準サンプルの吸光度値の２分の１になる時間が、６０分以内であることがより好ましく、４０分以内であることがいっそう好ましく、３０分以内であることがさらにいっそう好ましい。
【００３６】
前記界面活性剤Ａ及び界面活性剤Ｂを含む液、又は、界面活性剤Ａを含む液及び界面活性剤Ｂを含む液若しくはそれら２液の混合物は、下記（２）の血球除去効果を有することが好ましい。
（２）所定量の血液を、マイクロプレートリーダと６００ｎｍ以上の波長の光を用いて吸光光度法で測定した吸光度値が１以上２未満になるように蒸留水で希釈することにより、基準サンプルを調製し、
前記基準サンプルにおける蒸留水に代えて、前記界面活性剤Ａ及び界面活性剤Ｂを２．５〜５ｗ／ｖ％含む液を用いて被検サンプルを調製し、
６００ｎｍ以上の波長の光を用いて吸光光度法で測定した前記被検サンプルの吸光度値が、前記基準サンプルの吸光度値の２分の１になる時間が、０．５時間以内である。
なお、前記界面活性剤Ａ及び界面活性剤Ｂを含む液、界面活性剤Ａを含む液及び界面活性剤Ｂを含む液若しくはそれら２液の混合物は、上記（２）の血球除去効果に関し、６００ｎｍ以上の波長の光を用いて吸光光度法で測定した前記被検サンプルの吸光度値が、前記基準サンプルの吸光度値の２分の１になる時間が、３０分以内であることがより好ましく、２０分以内であることがいっそう好ましく、１５分以内であることがさらにいっそう好ましい。
【００３７】
なお、前記血球除去効果評価のための前記被検サンプルに関し、前記界面活性剤Ａを含む液における前記界面活性剤Ａの濃度は、例えば、０．００１ｗ／ｖ％〜１０ｗ／ｖ％である。また、前記界面活性剤Ａ及び界面活性剤Ｂを含む液における、前記界面活性剤Ａ及び前記界面活性剤Ｂのトータル濃度は、例えば、０．００１ｗ／ｖ％〜１０ｗ／ｖ％である。
【００３８】
本明細書において、ｎ個の要素からなる群の「これらの組み合わせ」とは、前記群から２〜ｎ個の要素の組み合わせを含みうる。
【００３９】
［界面活性剤Ａ］
本開示の処理方法に使用する界面活性剤Ａは、下記式（I）で表される非イオン性界面活性剤である。界面活性剤Ａは、単独で、或いは、赤血球に対する溶解性がより高い界面活性剤Ｂと組み合わせることにより、赤血球及び白血球に対するダメージを維持しながら、界面活性剤Ｂによる血液中の稀少細胞に対するダメージを抑制できる。処理時間を短縮し、稀少細胞に対するダメージをより抑制する観点からは、界面活性剤Ａと赤血球に対する溶解性がより高い界面活性剤Ｂ（後述）と組み合わせることが好ましい。
Ｒ1-Ｏ-(ＥＯ)n-Ｒ2      （I）
［前記式（Ｉ）中、Ｒ1は分岐鎖を有する炭素数１２〜４０の炭化水素基であり、ＥＯはオキシエチレン基を示し、ｎはＥＯの平均付加モル数であって２３〜５０であり、Ｒ2は水素原子又は炭素数１〜３の炭化水素基である。］
【００４０】
前記式（I）のＲ1は、血液中の稀少細胞に対するダメージを抑制しつつ血球の排除をする観点から、分岐鎖を有する炭素数１２〜４０の炭化水素基であって、好ましくは分岐鎖を有する炭素数１２〜３０のアルキル基である。一又は複数の実施形態において、前記炭化水素基及びアルキル基の炭素数は、血液中の稀少細胞に対するダメージを抑制しつつ血球の排除をする観点から、１２〜２８が好ましく、より好ましくは１４〜２６、さらに好ましくは１６〜２４、さらにより好ましくは１８〜２２、さらにより好ましくは２０である。前記式（I）のＲ1の好ましい実施形態として、イソヘキシル基、イソノニル基、イソデシル基、イソドデシル基、イソヘキサデシル基、ヘキシルデシル基、ヘキシルドデシル基、ヘキシルヘキサデシル基、オクチルデシル基、オクチルドデシル基、オクチルヘキサデシル基、ノニルデシル基、ノニルドデシル基、ノニルヘキサデシル基が、同様の観点から、オクチルドデシル基が好ましい。前記式（I）のＲ2は、水素原子又は炭素数１〜３の炭化水素基であって、一又は複数の実施形態において、血液中の稀少細胞に対するダメージを抑制しつつ血球の排除をする観点から、水素原子又は炭素数１〜３のアルキル基であり、前記アルキル基は、一又は複数の実施形態において、メチル基、エチル基、プロピル基、又はイソプロピル基である。前記式（I）として、血液中の稀少細胞に対するダメージを抑制しつつ血球の排除をする観点から、下記式（II）がより好ましい。
【００４１】
【化１】
2014025918.tif 000002
【００４２】
式（I）及び（II）におけるＥＯの平均付加モル数ｎは、一又は複数の実施形態において、血液中の稀少細胞に対するダメージを抑制しつつ血球の排除をする観点から、２３〜５０であって、２４以上が好ましく、２５以上がより好ましい。また、ｎの上限としては、同様の観点から、４５以下が好ましく、より好ましくは４０以下、さらに好ましくは３０以下、さらにより好ましくは２８以下である。
【００４３】
前記界面活性剤Ａは、血液中の稀少細胞に対するダメージを抑制しつつ血球の排除をする観点から、一又は複数の実施形態において、下記化学式（１）で表される非イオン性界面活性剤である。
【化２】
2014025918.tif 000003
【００４４】
一又は複数の実施形態において、本開示の処理方法に使用する界面活性剤Ａの形態は、界面活性剤Ａを含む液、又は、界面活性剤Ａ及びＢを含む液である。界面活性剤Ａを含む液、又は、界面活性剤Ａ及びＢを含む液は、一又は複数の実施形態において、界面活性剤Ａを含む水溶液、又は、界面活性剤Ａ及びＢを含む水溶液である。水は、蒸留水、イオン交換水、又は超純水等が使用され得る。前記水溶液は、一又は複数の実施形態において、稀少細胞の生存率を抑制しないバッファー及び／又はｐＨを選択してもよい。
【００４５】
［界面活性剤Ｂ］
本開示の処理方法に使用する界面活性剤Ｂは、赤血球を溶解する能力が前記界面活性剤Ａのそれよりも高い非イオン性界面活性剤である。本明細書において、「赤血球の溶解」とは、赤血球を含む試料と混合した場合の溶血が生じる現象をいい、例えば、同じ濃度及び／又は混合比で処理した場合に溶血させるまでの時間が速いほど赤血球を溶解する能力が高いと判断できる。溶血とは赤血球の細胞膜が、物理的又は化学的、生物学的など様々な要因によって損傷や溶解し、ヘモグロビン等が細胞外に漏出し赤血球が死に至る現象のことを言う。本開示の処理方法に使用する界面活性剤Ｂは、一又は複数の実施形態において、血液中の稀少細胞に対するダメージを抑制しつつ血球の排除をする観点から、その白血球の成育阻害の能力が前記界面活性剤Ａのそれよりも高いことが好ましい。
【００４６】
界面活性剤Ｂは、血液中の稀少細胞に対するダメージを抑制しつつ血球の排除をする観点から、非イオン性界面活性剤であって、一又は複数の実施形態において、ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル（ＥＯ＝１３〜２２）、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される非イオン性界面活性剤が挙げられる。
【００４７】
ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルエーテル型の界面活性剤Ｂは、一又は複数の実施形態において、血液中の稀少細胞に対するダメージを抑制しつつ血球の排除をする観点から、好ましくは下記式（III）で表わされる非イオン性界面活性剤である。
Ｒ3-Ｏ-(ＡＯ)m/(ＥＯ)n-Ｒ4    （III）
［前記式（III）中、Ｒ3は炭素数１〜２４のアルキル基であり、Ｒ4は水素原子又は炭素数1〜３のアルキル基を示し、ＡＯは炭素数３〜６のオキシアルキレン基を示し、ＥＯはオキシエチレン基を示し、ｍ及びｎはそれぞれＡＯ及びＥＯの平均付加モル数である。ｍは１〜１００の数であり、ｎは０〜５０の数であり、"／"はＡＯ基及びＥＯ基が、順序に関係なく、ランダム又はブロックのいずれに付加したものであってもよいことを示す。］
【００４８】
前記式（III）のＲ3は、一又は複数の実施形態において、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル（ラウリル）、トリデシル、テトラデシル（ミリスチル）、ペンタデシル、ヘキサデシル（セチル）、ヘプタデシル、オクタデシル（ステアリル）、ノナデシル、イコシル、ヘネイコシル、ドコシル（ベヘニル）、トリコシル、テトラコシル等が挙げられる。前記式（III）のＲ4は、水素原子又は炭素数１〜３の炭化水素基であって、一又は複数の実施形態において、血液中の稀少細胞に対するダメージを抑制しつつ血球の排除をする観点から、水素原子又は炭素数１〜３のアルキル基であり、前記アルキル基は、一又は複数の実施形態において、メチル基、エチル基、プロピル基、又はイソプロピル基である。前記式（III）中、ＡＯとしては、一又は複数の実施形態において、ポリオキシポリオキシプロピレン、ポリオキシブチレン等が挙げられる。前記式（III）中、一又は複数の実施形態において、血液中の稀少細胞に対するダメージを抑制しつつ血球の排除をする観点から、ｍは、１〜６０が好ましく、１〜３０がより好ましい。同様に、ｎは、１〜５０が好ましく、１〜２５がより好ましい。
【００４９】
前記式（III）の界面活性剤Ｂは、一又は複数の実施形態において、血液中の稀少細胞に対するダメージを抑制しつつ血球の排除をする観点から、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテルが好ましい。前記ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテルは、一又は複数の実施形態において、血液中の稀少細胞に対するダメージを抑制しつつ血球の排除をする観点から、ＨＬＢ値（親水性−親油性バランス値）が、１０．０〜１８．０のものが好ましく、より好ましくは１２．０〜１５．０、さらに好ましくは１２．５〜１３．５である。さらに、前記ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテルは、同様の観点から、曇点（℃／２％水溶液）が、３４℃〜８８℃のものが好ましく、より好ましくは４０℃〜７５℃、さらに好ましくは５０℃〜６０℃である。
【００５０】
前記式（III）の界面活性剤Ｂは、一又は複数の実施形態において、市販品として、ＥＭＡＬＥＸ  ＤＡＰＥ−２０７、ＥＭＡＬＥＸ  ＤＡＰＥ−２１０、ＥＭＡＬＥＸ  ＤＡＰＥ−２１２、ＥＭＡＬＥＸ  ＤＡＰＥ−２１５、ＥＭＡＬＥＸ  ＤＡＰＥ−２２０、ＥＭＡＬＥＸ  ＤＡＰＥ−２３０(以上、日本エマルジョン社製)、プルラファックＬＦ３００、プルラファックＬＦ４００、プルラファックＬＦ４３１、プルラファックＬＦ７１１、プルラファックＬＦ９００、プルラファックＬＦ９０１、プルラファックＬＦ１３００〔ＢＡＳＦジャパン（株）製〕及びエマルゲンＬＳ−１０６、エマルゲンＬＳ−１１０、エマルゲンＬＳ１１４、エマルゲンＭＳ１１０〔花王（株）製〕として市販され、ワンダーサーフＲＬ−８０、ワンダーサーフＲＬ−１００、ワンダーサーフＲＬ−１４０、ワンダーサーフＳ−８００、ワンダーサーフＳ−１０００、ワンダーサーフＳ−１４００（以上、青木油脂社製）、ユニセーフＰＫＡ−５０１５、ユニセーフＰＫＡ−５０１６、ユニセーフＰＫＡ−５０１７、ユニセーフＬＭ−２（以上、日本油脂社製）等が挙げられる。
【００５１】
ポリオキシエチレンアルキルエーテル（ＥＯ＝１３〜２２）型の界面活性剤Ｂは、一又は複数の実施形態において、血液中の稀少細胞に対するダメージを抑制しつつ血球の排除をする観点から、好ましくは下記式（IV）で表わされる非イオン性界面活性剤である。
Ｒ5-Ｏ-(ＥＯ)n-Ｒ6        （IV）
［前記式（IV）中、Ｒ5は炭素数１２〜４０の炭化水素基を示し、ＥＯはオキシエチレン基を示し、ｎはＥＯの平均付加モル数であって８〜２２であり、Ｒ6は水素原子又は炭素数１〜３の炭化水素基である。］
【００５２】
前記式（IV）のＲ5は、一又は複数の実施形態において、血液中の稀少細胞に対するダメージを抑制しつつ血球の排除をする観点から、分岐鎖を有する炭素数１２〜４０の炭化水素基であることが好ましく、より好ましくは分岐鎖を有する炭素数１２〜３０のアルキル基である。前記炭化水素基及びアルキル基の炭素数は、一又は複数の実施形態において、血液中の稀少細胞に対するダメージを抑制しつつ血球の排除をする観点から、１２〜２８が好ましく、より好ましくは１４〜２６、さらに好ましくは１６〜２４、さらにより好ましくは１８〜２２、さらにより好ましくは２０である。前記式（IV）のＲ5の好ましい実施形態として、イソヘキシル基、イソノニル基、イソデシル基、イソドデシル基、イソヘキサデシル基、ヘキシルデシル基、ヘキシルドデシル基、ヘキシルヘキサデシル基、オクチルデシル基、オクチルドデシル基、オクチルヘキサデシル基、ノニルデシル基、ノニルドデシル基、ノニルヘキサデシル基が挙げられ、一又は複数の実施形態において、同様の観点から、オクチルドデシル基が好ましい。前記式（IV）のＲ6は、水素原子又は炭素数１〜３の炭化水素基であって、一又は複数の実施形態において、血液中の稀少細胞に対するダメージを抑制しつつ血球の排除をする観点から、水素原子又は炭素数１〜３のアルキル基であり、前記アルキル基は、一又は複数の実施形態において、メチル基、エチル基、プロピル基、又はイソプロピル基である。前記式（IV）として、血液中の稀少細胞に対するダメージを抑制しつつ血球の排除をする観点から、下記式（V）がより好ましい。
【００５３】
【化３】
2014025918.tif 000004
【００５４】
式（IV）及び（V）におけるＥＯの平均付加モル数ｎは、一又は複数の実施形態において、血液中の稀少細胞に対するダメージを抑制しつつ血球の排除をする観点から、１０〜２２が好ましく、より好ましくは１３〜２２、さらに好ましくは１５〜２１、さらにより好ましくは１８〜２１、さらにより好ましくは２０である。
【００５５】
ポリオキシエチレン脂肪酸エステル型の界面活性剤Ｂは、一又は複数の実施形態において、であって、下記式（VI）で表される非イオン性界面活性剤である。
Ｒ7-ＣＯＯ-(ＥＯ)n-Ｒ8        （VI）
［前記式（VI）中、Ｒ7は炭素数１０〜４０の炭化水素基を示し、ＥＯはオキシエチレン基を示し、ｎはＥＯの平均付加モル数であって６〜１６０であり、Ｒ8は水素原子又は炭素数１〜３の炭化水素基である。］
【００５６】
前記式（VI）のＲ7は、血液中の稀少細胞に対するダメージを抑制しつつ血球の排除をする観点から、炭素数１０〜４０の炭化水素基であって、一又は複数の実施形態において、炭素数１０〜３０のアルキル基である。前記炭化水素基及びアルキル基の炭素数は、一又は複数の実施形態において、血液中の稀少細胞に対するダメージを抑制しつつ血球の排除をする観点から、１０〜２０、１０〜１８、１０〜１６、又は１２である。前記式（VI）のＲ8は、水素原子又は炭素数１〜３の炭化水素基であって、一又は複数の実施形態において、血液中の稀少細胞に対するダメージを抑制しつつ血球の排除をする観点から、水素原子又は炭素数１〜３のアルキル基であり、前記アルキル基は、一又は複数の実施形態において、メチル基、エチル基、プロピル基、又はイソプロピル基である。前記式（VI）におけるＥＯの平均付加モル数ｎは、血液中の稀少細胞に対するダメージを抑制しつつ血球の排除をする観点から、一又は複数の実施形態において、６〜２０、８〜１８、１０〜１６、又は１２である。前記式（VI）の界面活性剤Ｂは、一又は複数の実施形態において、血液中の稀少細胞に対するダメージを抑制しつつ血球の排除をする観点から、ポリオキシエチレン（１２）モノラウレートである。
【００５７】
界面活性剤Ｂは、一又は複数の実施形態において、親水性部として糖残基を有し、疎水性部として脂肪鎖又はアルキル鎖を有する非イオン性界面活性剤である。
【００５８】
前記糖残基としては、特に限定されず、例えば、単糖、二糖、オリゴ糖等の糖残基があげられる。前記糖残基における単糖の数は、特に限定されないが、例えば、１〜２０個の範囲であってもよい。前記単糖の糖残基としては、特に限定されないが、例えば、グルコース残基、ガラクトース残基、マンノース残基、チオグルコース残基、アラビノース残基、キシロース残基、グルクロン酸残基、グルコサミン残基等があげられる。前記二糖の糖残基としては、特に制限されないが、例えば、スクロース残基（ショ糖残基）、ラクトース残基、マルトース残基、チオマルトース残基等があげられ、好ましくは、スクロース残基である。
【００５９】
前記脂肪鎖としては、特に限定されず、例えば、脂肪酸残基、アルキル基等があげられる。前記脂肪酸残基としては、特に限定されず、例えば、飽和脂肪酸残基であってもよいし、不飽和脂肪酸残基であってもよい。また、前記脂肪酸残基は、例えば、直鎖脂肪酸残基、分岐脂肪酸残基、環状脂肪酸残基等があげられ、特に制限されない。前記脂肪酸残基の炭素数は、特に限定されず、例えば、４〜２８の範囲であり、好ましくは、１０〜２２の範囲である。前記飽和脂肪酸残基としては、特に制限されないが、例えば、カプリン酸残基、ラウリン酸残基、ミリスチン酸残基、ペンタデシル酸、パルミチン酸残基、ステアリン酸残基、アラキジン酸残基、べへニン酸残基等があげられ、これらは、例えば、デカノイル基、ドデカノイル基、テトラデカノイル基、ペンタデカノイル基、ヘキサデカノイル基、オクタデカノイル基、イコサノイル基、ドコサノイル基等のアシル基であることが好ましい。前記不飽和脂肪酸残基としては、特に制限されないが、例えば、オレイン酸残基、リノール酸残基等があげられ、これらは、例えば、ｃｉｓ−９−オクタデセノイル基、ｃｉｓ，ｃｉｓ−９，１２−オクタデカジエノイル基等のアシル基が好ましい。前記脂肪酸残基としては、血液中の稀少細胞に対するダメージを抑制しつつ血球の排除をする観点から、好ましくは、カプリン酸残基、ラウリン酸残基である。
【００６０】
前記アルキル基としては、特に限定されず、例えば、直鎖状アルキル基であってもよいし、分岐状アルキル基であってもよい。前記アルキル基の炭素数は、特に限定されず、例えば、１〜１８個の範囲であってもよい。前記アルキル基の具体例としては、特に限定されず、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ウンデシル基、ドデシル基、トリデシル基、テトラデシル基、ペンタデシル基、ヘキサデシル基、ヘプタデシル基、オクタデシル基、ノナデシル基、イコシル基等があげられる。
【００６１】
糖残基を有する非イオン性界面活性剤の具体例としては、特に限定されず、例えば、ショ糖（スクロース）脂肪酸エステル、アルキルグルコシド、アルキルオリゴ糖等があげられる。
【００６２】
前記ショ糖（スクロース）脂肪酸エステルとしては、特に制限されないが、例えば、スクロースカプレート、スクロースラウレート、スクロースミリステート、スクロースパルミテート、スクロースステアレート、スクロースベヘニレート、スクロースオレエート、スクロースリノレート等があげられ、好ましくは、スクロースカプレート、スクロースラウレートである。前記ショ糖（スクロース）脂肪酸エステルは、例えば、モノエステル、ジエステル、トリエステル等があげられ、特に制限されない。前記ショ糖脂肪酸モノエステルとしては、特に制限されないが、例えば、スクロースモノカプレート、スクロースモノラウレート、スクロースモノミリステート、スクロースモノパルミテート、スクロースモノステアレート、スクロースモノベヘニレート、スクロースモノオレエート、スクロースモノリノレート等があげられ、好ましくは、スクロースモノカプレート、スクロースモノラウレートである。前記ショ糖脂肪酸ジエステルとしては、特に制限されないが、例えば、スクロースジカプレート、スクロースジラウレート、スクロースジミリステート、スクロースジパルミテート、スクロースジステアレート、スクロースジベヘニレート、スクロースジオレエート、スクロースジリノレート等があげられ、好ましくは、スクロースジカプレート、スクロースジラウレートである。前記ショ糖脂肪酸トリエステルとしては、特に制限されないが、例えば、スクローストリカプレート、スクローストリラウレート、スクローストリミリステート、スクローストリパルミテート、スクローストリステアレート、スクローストリベヘニレート、スクローストリオレエート、スクローストリリノレート等があげられ、好ましくは、スクローストリカプレート、スクローストリラウレートである。
【００６３】
前記ショ糖脂肪酸エステルは、例えば、モノエステル、ジエステル、トリエステル等のいずれであってもよく、また、これらの混合物であってもよい。前記ショ糖脂肪酸エステルは、例えば、前記モノエステルを含むことが好ましく、前記ショ糖脂肪酸モノエステルの割合は、特に制限されないが、例えば、５０〜１００重量％の範囲、好ましくは、７０〜１００重量％の範囲である。
【００６４】
前記アルキルグルコシドとしては、特に制限されないが、例えば、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコシド、ｎ−ドデシル−β−マルトシド、ｎ−デシル−β−マルトシド、ｎ−オクチル−β−Ｄ−マルトシド、３−オキサトリデシル−α−Ｄ−マンノシド、ｎ−ヘプチル−β−チオグルコシド、ｎ−ノニル−β−Ｄ−チオマルトシド、ｎ−オクチル−β−Ｄ−チオグルコシド等があげられる。
【００６５】
一又は複数の実施形態において、本開示の処理方法に使用する界面活性剤Ｂの形態は、界面活性剤Ｂを含む液、又は、界面活性剤Ａ及びＢを含む液である。界面活性剤Ｂを含む液、又は、界面活性剤Ａ及びＢを含む液は、一又は複数の実施形態において、界面活性剤Ｂを含む水溶液、又は、界面活性剤Ａ及びＢを含む水溶液である。水は、蒸留水、イオン交換水、又は超純水等が使用され得る。前記水溶液は、一又は複数の実施形態において、稀少細胞の生存率を抑制しないバッファー及び／又はｐＨを選択してもよい。
【００６６】
前記非イオン性界面活性Ａ及びＢは、それぞれ、いずれか一種類でもよいし、二種類以上を併用してもよい。
【００６７】
［血液成分を含む試料の処理方法］
本開示は、一又は複数の実施形態において、血液成分を含む試料と、界面活性剤Ａ又は界面活性剤Ａ及びＢとを混合する血液成分を含む試料の処理方法に関する。本開示にかかる血液成分を含む試料の処理方法は、一又は複数の実施形態において、前記試料に含まれ得る稀少細胞の生存率低下を抑制しつつ赤血球を溶解させ、かつ／又は、白血球の生存率を低下させる処理方法である。したがって、本開示にかかる血液成分を含む試料の処理方法は、稀少細胞を固定化しないこと、又は、稀少細胞の生存にダメージを与え得る固定化剤を用いないことが好ましい。本開示において「固定化」とは、細胞や細胞小器官の構造を生きているときに近い形態で動かなくさせることを含む。よって、「固定化しないこと」とは、一又は複数の実施形態において、形態変化が可能な状態を維持すること、及び／又は、形態変化ができなくなることを抑制することが挙げられる。
【００６８】
前記固定化剤は、架橋試薬を含む。前記架橋試薬とは、フリーのアミノ基を介して分子間架橋を形成することにより、細胞膜、細胞の構造を維持できる試薬をいう。前記固定化剤の限定されない具体例としては、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド、トリオキサン、グルタールアルデヒドなどが挙げられる。また架橋試薬以外には、アセトンなどの有機溶媒、メタノールやエタノールなどのアルコールなどが挙げられる。
【００６９】
本開示にかかる血液成分を含む試料の処理方法は、一又は複数の実施形態において、血液成分を含む試料と界面活性剤Ａを含む液、又は、界面活性剤Ａ及びＢを含む液若しくは界面活性剤Ａを含む液及び界面活性剤Ｂを含む液とを混合することを含み、その方法は、限定されない一又は複数の実施形態において、血液成分を含む試料に界面活性剤Ａを含む水溶液、又は、界面活性剤Ａ及びＢを含む水溶液若しくは界面活性剤Ａを含む水溶液及び界面活性剤Ｂを含む水溶液を添加して混合することが挙げられる。界面活性剤Ａを含む液及び界面活性剤Ｂを含む液の添加は、一又は複数の実施形態において、いずれか一方を含む液を先に添加してその後他方を含む液を添加する実施形態であってもよく、両者と同時に添加する実施形態であってもよい。これらのなかでも、血液成分を含む試料と界面活性剤Ａ及びＢとを混合する方法の一又は複数の実施形態において、血液中の稀少細胞に対するダメージを抑制しつつ血球の排除をする観点から、すばやく血液成分を含む試料と界面活性剤Ａ及びＢを均一になるように混合することが好ましい。
【００７０】
本開示の処理方法の温度としては、一又は複数の実施形態において、血液中の稀少細胞に対するダメージを抑制しつつ血球の排除をする観点、及び、より簡便かつ迅速な処理の観点から、０〜５０℃が好ましく、より好ましくは４〜４０℃、さらに好ましくは１０〜３７℃である。なお前記温度は、好ましくは血液成分を含む試料と界面活性剤Ａ又は界面活性剤Ａ及びＢとを反応させるときの温度を指す。
【００７１】
本開示の処理方法は、一又は複数の実施形態において、血液成分を含む試料と界面活性剤Ａ又は界面活性剤Ａ及びＢとを混合した後、血球を排除するために、所定時間静置又は撹拌することが好ましい。前記所定時間としては、一又は複数の実施形態において、血液中の稀少細胞に対するダメージを抑制しつつ血球の排除をする観点、及び、より簡便かつ迅速な処理の観点から０〜６０分が好ましく、より好ましくは１〜３０分、さらに好ましくは１〜１５分である。
【００７２】
血液成分を含む試料と混合する界面活性剤Ｂ水溶液の濃度としては、前記界面活性剤Ｂ水溶液を単独で血液成分を含む試料と混合した場合に、１０〜０．０１ｗ／ｖ％、室温２５℃の条件下で、一般的なマイクロプレートリーダで測定する際、血液成分を含む試料３０μＬと等量を反応させた場合に２０分以内に吸光度が６５０ｎｍ波長において０．８以下になるように赤血球を溶解させる量であることが好ましく、より好ましくは０．６以下、さらに好ましくは０．５以下になるように赤血球を溶解させる量である。
【００７３】
血液試料と混合する前の前記界面活性剤Ｂ水溶液の濃度としては、一又は複数の実施形態において、血液試料が血液の場合、血液中の稀少細胞に対するダメージを抑制しつつ血球の排除をする観点、及び、より簡便かつ迅速な処理の観点から、０．０１〜１０ｗ／ｖ％が好ましく、より好ましくは０．０１〜５ｗ／ｖ％、さらに好ましくは０．０１〜２．５ｗ／ｖ％である。そして、血液試料と界面活性剤Ａ及びＢとを混合したときの前記界面活性剤Ｂの最終濃度としては、一又は複数の実施形態において、血液試料が血液の場合、血液中の稀少細胞に対するダメージを抑制しつつ血球の排除をする観点、及び、より簡便かつ迅速な処理の観点から、０．０１〜５ｗ／ｖ％が好ましく、より好ましくは０．０１〜１．２５ｗ／ｖ％、さらに好ましくは０．０１〜０．５ｗ／ｖ％である。血液試料が血液を濃縮又は希釈させたものである場合、上記濃度を目安に適宜調節できる。本開示において、ｗ／ｖ％とは、溶液１００ｍｌ中に溶質が溶けている重さ（グラム）を表す単位である。たとえば、溶液１００ｍｌ中に５ｇの溶質が溶けている場合、５ｗ／ｖ％と記載する。
【００７４】
血液試料と混合する前の前記界面活性剤Ａ水溶液の濃度としては、一又は複数の実施形態において、血液試料が血液の場合、血液中の稀少細胞に対するダメージを抑制しつつ血球の排除をする観点、及び、より簡便かつ迅速な処理の観点から、０．０１〜１０ｗ／ｖ％が好ましく、より好ましくは０．０５〜５ｗ／ｖ％、さらに好ましくは０．５〜５ｗ／ｖ％である。そして、血液試料と界面活性剤Ａ又は界面活性剤Ａ及びＢとを混合したときの前記界面活性剤Ａの最終濃度としては、一又は複数の実施形態において、血液試料が血液の場合、血液中の稀少細胞に対するダメージを抑制しつつ血球の排除をする観点、及び、より簡便かつ迅速な処理の観点から、０．０１〜１０ｗ／ｖ％が好ましく、より好ましくは０．０５〜５ｗ／ｖ％、さらに好ましくは０．５〜５ｗ／ｖ％である。血液試料が血液を濃縮又は希釈させたものである場合、上記濃度を目安に適宜調節できる。
【００７５】
血液試料と混合する界面活性剤Ａと界面活性剤Ｂの量比としては、血液中の稀少細胞に対するダメージを抑制しつつ血球の排除をする観点から適宜調節できるが、一又は複数の実施形態において、界面活性剤Ａ及び界面活性剤Ｂの混合する量比（Ａ／Ｂ）（重量比）が例えば５０／５０以上であって、血液中の稀少細胞に対するダメージを抑制する観点から６０／４０以上が好ましく、より好ましく７０／３０以上、さらに好ましくは８０／２０以上である。また、一又は複数の実施形態において、血球を迅速に排除する観点から、界面活性剤Ａ及び界面活性剤Ｂの混合する量比（Ａ／Ｂ）（重量比）が１００／０未満であることが好ましく、より好ましくは９９／１以下である。したがって、血液試料と混合する界面活性剤Ａと界面活性剤Ｂの量としては、血液中の稀少細胞に対するダメージを抑制しつつ血球の排除をする観点から、一又は複数の実施形態において、界面活性剤Ａ及び界面活性剤Ｂの混合する量比（Ａ／Ｂ）（重量比）が、例えば、５０／５０以上１００／０未満であって、６０／４０〜９９／１が好ましく、より好ましくは７０／３０〜９９／１、さらに好ましくは８０／２０〜９５／５である。ここで、「１００／０未満」とは、界面活性剤Ｂが０を超えて含まれることを意味する。
【００７６】
血液試料との混合した時における、界面活性剤Ａと界面活性剤Ｂの合計の濃度は、一又は複数の実施形態において、血液中の稀少細胞に対するダメージを抑制する観点から、１０ｗ／ｖ％以下が好ましく、より好ましくは５ｗ／ｖ％以下、さらに好ましくは２．５ｗ／ｖ％以下、さらにより好ましくは１．２５ｗ／ｖ％以下、さらにより好ましくは０．７５ｗ／ｖ％以下である。前記濃度の下限は特に制限されないが、血球の排除ができる濃度を適宜設定でき、一又は複数の実施形態において、例えば０．００２ｗ／ｖ％以上、０．０２ｗ／ｖ％以上、又は、０．０４ｗ／ｖ％以上である。
【００７７】
血液成分を含む試料と形態によって、界面活性剤溶液（界面活性剤Ａを含む水溶液、界面活性剤Ａ及びＢを含む水溶液、及び界面活性剤Ｂを含む水溶液からなる群から選択される水溶液、以下同じ）に緩衝剤及び浸透圧調製剤を含ませることができる。例えば、血液から稀少細胞の分離後に、混入した血球を除去する目的で前記界面活性剤溶液と反応させる場合は、前記界面活性剤溶液に公知の緩衝剤、浸透圧剤をがん細胞にダメージを与えない程度に添加して調製することができる。一又は複数の実施形態において、血液中の稀少細胞が生理食塩水や緩衝液等の血清を含まない溶液に懸濁されている場合、前記界面活性剤溶液を混合させた後の反応溶液前記界面活性剤溶液のｐＨは、血液中の稀少細胞に対するダメージを抑制する観点から、５．０〜９．０、５．５〜８．４、６．０〜８．４、５．５〜８．０、６．０〜８．０、６．０〜７．７、６．０〜７．５、又は、６．０〜７．４が好ましい。前記界面活性剤溶液は、一又は複数の実施形態においてｐＨ６〜９、浸透圧０〜４００ｍＯｓｍが挙げられる。また、血液成分を含む試料と直接反応させる場合は、一又は複数の実施形態において、界面活性剤のみを含有する前記界面活性剤溶液を混合することが挙げられるが、ｐＨを上述の範囲に調整された形態も挙げられる。。上記緩衝剤としては、特に限定されず、例えば、リン酸生理緩衝液（ＰＢＳ）、クエン酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液  ＡＤＡ（Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸）緩衝液、ＭＥＳ（２−モルフォリノエタンスルホン酸）緩衝液、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ（ビス−（２−ヒドロキシエチル）イミノ−トリス−（ヒドロキシメチルメタン）緩衝液、ＰＩＰＥＳ（ピペラジン−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸））緩衝液、ＡＣＥＳ（Ｎ−（２−アセタミド）−２−アミノエタンスルホン酸）緩衝液、ＭＯＰＳＯ（２−ヒドロキシ−３−モルフォリノプロパンスルホン酸）緩衝液、ＢＥＳ（Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸）緩衝液、ＨＥＰＥＳ（２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸）緩衝液等があげられる。また浸透圧調整剤としては、エチレングリコール、塩化ナトリウムなどを用いることができる。また破壊された白血球から得られた核酸を公知の技術を用いて測定、分解処理、除去処理してもよい。
【００７８】
［血液中の稀少細胞又は核酸の分離又は検出方法］
本開示の処理方法を行った後の血液成分を含む試料は、血液中の稀少細胞（もし存在すれば）に対するダメージが抑制されつつ、赤血球が溶解し白血球が生育阻害を受けている状態である。この状態の試料から前記稀少細胞又は核酸を分離又は検出してもよい。したがって、本開示はその態様において、本開示の処理方法で血液成分を含む試料を処理すること、及び、処理後の血液成分を含む試料から前記稀少細胞又は核酸を分離又は検出することを含む、血液中の稀少細胞の分離又は検出方法に関する。
【００７９】
前記稀少細胞の分離又は検出は、一又は複数の実施形態において、アフィニティーを用いた分離、密度分離、遠心分離、接着分離、サイズ分離、フローサイトメトリー、電気的分離、磁場分離、培地への播種、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される方法などを用いて行うことができる。前記分離の前に、必要に応じて、溶液の粘度や密度を下げる目的で本開示の処理方法による処理後の血液成分を含む試料を希釈してもよい。なお、本開示の分離又は検出方法は、一又は複数の実施形態において、前記稀少細胞を単離すること、及び／又は、前記稀少細胞を濃縮することを含みうる。
【００８０】
また、本開示は、その他の一又は複数の実施形態において、血液成分を含む試料から稀少細胞又は核酸を含む画分を分離すること、及び、分離した前記画分を本開示の処理方法で処理すること、処理後の画分から前記稀少細胞又は核酸を分離又は検出することを含む、血液成分含有試料中の稀少細胞又は核酸を分離又は検出する方法に関する。
【００８１】
前記アフィニティー用いた分離方法としては、一又は複数の実施形態において、稀少細胞の表面抗原に対する抗体やプローブが固定化された固相（例えば、ビーズやプレート）を用いて前記稀少細胞を分離する方法が挙げられる。また、前記接着を利用した分離方法としては、一又は複数の実施形態において、稀少細胞の表面接着分子と接着する分子が固定化された固相（例えば、ビーズやプレート）を用いて前記稀少細胞を分離する方法が挙げられる。前記密度を利用した分離方法としては、一又は複数の実施形態において、各種密度勾配遠心法により稀少細胞の密度に依存して分離することが挙げられる。また、前記遠心分離としては、一又は複数の実施形態において、稀少細胞を遠心沈降させて分離することが挙げられる。前記サイズ分離としては、一又は複数の実施形態において、適切なポアサイズのフィルターを用いたろ過により稀少細胞を分離することが挙げられる。また、前記フローサイトメトリーとしては、一又は複数の実施形態において、稀少細胞の表面マーカーを蛍光標識及び／又は免疫染色し、そのシグナルに基づき分離することが挙げられる。さらに、一又は複数の実施形態において、本開示の処理方法を行った後の血液成分を含む試料を培地上で培養し、成育する細胞を選択することで分離してもよい。このようにして分離される稀少細胞は、分析やさらなる培養に供することができる。また、一又は複数の実施形態において、前記分離後の稀少細胞をさらに、電気的、磁気的な性質に基づいて分離してもよい。これらの分離方法に適した検出方法を用いることにより、血液成分含有試料中の稀少細胞又は核酸を検出できる。検出方法としては、一又は複数の実施形態において、放射性物質を利用した検出方法、発光現象を利用した検出方法、色素を用いた検出方法、磁性を利用した検出方法、電気的検出方法、光学的検出方法、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される検出方法に付随する標識方法を用いて標識すること含む検出方法が挙げられる。
【００８２】
また、本開示の一又は複数の実施形態において、本開示の処理方法を施した血液成分を含む試料、及び／又は、従来の分離方法により分離した稀少細胞を含む分画若しくは稀少細胞が除かれた分画に対し、さらに本開示の処理方法及び／又は本開示の分離又は検出方法を行うこともできる。これらの処理により、稀少細胞の回収率を向上、あるいは、稀少細胞の純度の向上が可能となる。
【００８３】
［血液中の稀少細胞に対する標識処理］
本開示の処理方法において、血液中の稀少細胞に対する標識処理を並行して行ってもよい。稀少細胞の標識は、上述した本開示の分離又は検出方法、及び、後述するＣＴＣ数測定方法に有用であり、また、分離後の稀少細胞の分析に有用となりうる。したがって、本開示の処理方法は、一又は複数の実施形態において、標識処理を含む。また、稀少細胞の標識は、後述するＣＴＣ数測定方法に有用であり、また、分離後の稀少細胞の分析に有用となりうる。したがって、本開示の分離又は検出方法は、一又は複数の実施形態において、標識処理を含む。
【００８４】
前記標識処理は、例えば、公知の標識試薬を稀少細胞に接触することにより行うことができ、典型的には、前記標識試薬を血液成分を含む試料と混合することにより行うことができる。前記標識試薬を前記血液成分を含む試料に混合するタイミングは、前記界面活性剤Ａ及びＢの添加の前であってもよく、同時であってもよく、後であってもよく、前記稀少細胞の分離後であってもよい。これらの中でも、試薬のコストの観点から、分離し濃縮後のタイミングが好ましい。前記標識としては、特に限定されないが、一又は複数の実施形態において、放射性標識、蛍光色素標識、色素染色又は標識、磁気的標識、電荷的標識、及びこれらの組み合わせが挙げられ、それぞれに適した標識試薬により行うことができる。
【００８５】
［血液成分含有試料中の稀少細胞の分析方法］
本開示は、その他の態様において、本開示の処理方法で血液成分を含む試料を処理した後、細胞の動態の観察又は活性測定を含む方法で分析することを含む、血液成分含有試料中の稀少細胞の分析方法に関しうる。
【００８６】
［ＣＴＣ数測定方法］
血液中のＣＴＣ数と、がんの転移の可能性及び予後とは相関することが報告されており、がんの診断、予後診断、及び治療効果の予測又は判定の指標とするために血中ＣＴＣ数を測定することが知られている。本開示の処理方法及び／又は本開示の分離又は検出方法によれば、稀少細胞であるＣＴＣへのダメージを抑制して分離することができる。またＣＴＣの核酸を測定してもよい。したがって、本開示はその他の態様において、血液成分を含む試料を本開示の処理方法で処理すること、及び／又は、本開示の分離又は検出方法により前記血液成分を含む試料からＣＴＣを分離することを含む、前記血液成分を含む試料中のＣＴＣ数の測定方法に関する。なお、ＣＴＣ数の計測又はＣＴＣの核酸の測定は、例えば、適切な標識処理をした後にフローサイトメトリーにより分離と同時に行ってもよし、分離した細胞を顕微鏡下で観察して計測してもよい。また、がん細胞の形態学的、ＤＮＡやＲＮＡの量の点から、蛍光値から測定してもよい。
【００８７】
［試薬キット］
本開示は、さらにその他の態様において、本開示の処理方法、本開示の分離又は検出方法、及び／又は本開示のＣＴＣ数測定方法に用いる試薬キットであって、前記界面活性剤Ａ又は界面活性剤Ａ及びＢを含む試薬キットに関する。本開示の試薬キットは、一又は複数の実施形態において、さらに、前記稀少細胞又はＣＴＣを標識するための標識試薬を含んでもよい。前記標識試薬としては、上述のものが使用できる。本開示の試薬キットは、その他の実施形態において、本開示の処理方法、本開示の分離又は検出方法、及び／又は本開示のＣＴＣ数測定方法が記載された取扱い説明書を含んでもよい。本開示の試薬キットは、前記説明書が本開示の試薬キットに同梱されることなくウェブ上で提供される場合も含みうる。
【００８８】
すなわち、本開示は以下の一又は複数の実施形態に関しうる；
［Ａ１］  血液成分を含む試料と界面活性剤Ａとを混合すること、或いは、前記試料と前記界面活性剤Ａを含む液とを混合することを含み、稀少細胞に対するダメージ抑制の観点から好ましくは選択的に固定化剤を用いず、前記界面活性剤Ａが、下記一般式（I）で表される非イオン性界面活性剤である、血液成分含有試料の処理方法；
Ｒ1-Ｏ-(ＥＯ)n-Ｒ2      （I）
［前記式（Ｉ）中、Ｒ1は分岐鎖を有する炭素数１２〜４０の炭化水素基であり、ＥＯはオキシエチレン基を示し、ｎはＥＯの平均付加モル数であって２３〜５０であり、Ｒ2は水素原子又は炭素数１〜３の炭化水素基である。］
［Ａ２］  血液成分を含む試料と、界面活性剤Ａ及び界面活性剤Ｂとを混合することを含み、或いは、前記試料と前記界面活性剤Ａ及び前記界面活性剤Ｂを含む液若しくは界面活性剤Ａを含む液及び界面活性剤Ｂを含む液とを混合することを含み、稀少細胞に対するダメージ抑制の観点から好ましくは選択的に固定化剤を用いず、前記界面活性剤Ａが、下記一般式（I）で表される非イオン性界面活性剤であり、前記界面活性剤Ｂの赤血球に対する溶解性が、前記界面活性剤Ａのそれよりも高い、血液成分含有試料の処理方法；
Ｒ1-Ｏ-(ＥＯ)n-Ｒ2      （I）
［前記式（Ｉ）中、Ｒ1は分岐鎖を有する炭素数１２〜４０の炭化水素基であり、ＥＯはオキシエチレン基を示し、ｎはＥＯの平均付加モル数であって２３〜５０であり、Ｒ2は水素原子又は炭素数１〜３の炭化水素基である。］
［Ａ３］  前記界面活性剤Ａが、ポリオキシエチレンアルキレンエーテル（ＥＯ＝２３〜５０）である、［Ａ１］又は［Ａ２］に記載の血液成分含有試料の処理方法；
［Ａ４］  前記界面活性剤Ｂが、ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキレンエーテル（ＥＯ＝１３〜２２）、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される非イオン性界面活性剤である、［Ａ２］又は［Ａ３］に記載の血液成分含有試料の処理方法；
［Ａ５］  前記界面活性剤Ｂが、下記一般式（III）で表される非イオン性界面活性剤である、［Ａ２］から［Ａ４］のいずれかに記載の血液成分含有試料の処理方法；
Ｒ3-Ｏ-(ＡＯ)m/(ＥＯ)n-Ｒ4    （III）
［前記式（III）中、Ｒ3は炭素数１〜２４のアルキル基であり、Ｒ4は水素原子又は炭素数1〜３のアルキル基を示し、ＡＯは炭素数３〜６のオキシアルキレン基を示し、ＥＯはオキシエチレン基を示し、ｍ及びｎはそれぞれＡＯ及びＥＯの平均付加モル数である。ｍは１〜１００の数であり、ｎは０〜５０の数である。"／"はＡＯ基及びＥＯ基が、順序に関係なく、ランダム又はブロックのいずれに付加したものであってもよいことを示す。］
［Ａ６］  前記界面活性剤Ｂが、下記式（IV）で表される非イオン性界面活性剤である、［Ａ２］から［Ａ５］のいずれかに記載の血液成分含有試料の処理方法；
Ｒ5-Ｏ-(ＥＯ)n-Ｒ6        （IV）
［前記式（IV）中、Ｒ5は炭素数１２〜４０の炭化水素基を示し、ＥＯはオキシエチレン基を示し、ｎはＥＯの平均付加モル数であって８〜２２であり、Ｒ6は水素原子又は炭素数１〜３の炭化水素基である。］
［Ａ７］  前記界面活性剤Ｂが、下記式（VI）で表される非イオン性界面活性剤である、［Ａ２］から［Ａ６］のいずれかに記載の血液成分含有試料の処理方法；
Ｒ7-ＣＯＯ-(ＥＯ)n-Ｒ8        （VI）
［前記式（VI）中、Ｒ7は炭素数１０〜４０の炭化水素基を示し、ＥＯはオキシエチレン基を示し、ｎはＥＯの平均付加モル数であって６〜１６０であり、Ｒ8は水素原子又は炭素数１〜３の炭化水素基である。］
［Ａ８］  前記界面活性剤Ｂが、親水性部として、糖残基を有し、疎水性部として、脂肪鎖又はアルキル鎖を有する界面活性剤である、［Ａ２］から［Ａ７］のいずれかに記載の血液成分含有試料の処理方法；
［Ａ９］  前記界面活性剤Ｂが、ショ糖ラウリン酸エステルである、［Ａ２］から［Ａ８］のいずれかに記載の血液成分含有試料の処理方法；
［Ａ１０］  血液成分を含む試料と、界面活性剤Ａ及び界面活性剤Ｂとを混合すること、或いは、前記試料と前記界面活性剤Ａ及び前記界面活性剤Ｂを含む液若しくは界面活性剤Ａを含む液及び界面活性剤Ｂを含む液とを混合することを含み、稀少細胞に対するダメージ抑制の観点から好ましくは固定化剤を用いず、前記界面活性剤Ａが、ポリオキシエチレンオクチルドデシルエーテル（ＥＯ＝２３〜５０）であり、前記界面活性剤Ｂが、その赤血球に対する溶解性が前記界面活性剤Ａのそれよりも高い非イオン性界面活性剤であって、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンオクチルドデシルエーテル（ＥＯ＝８〜２２）、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される非イオン性界面活性剤である、血液成分含有試料の処理方法；
［Ａ１１］  前記界面活性剤Ａ及び前記界面活性剤Ｂの混合する量比（Ａ／Ｂ）（重量比）が、５０／５０以上１００／０未満である、［Ａ２］から［Ａ１０］のいずれかに記載の血液成分含有試料の処理方法；
[Ａ１２]  前記界面活性剤Ａを含む液が、下記（１）の血球除去効果を有する、［Ａ１］から［Ａ１１］のいずれかに記載の血液成分含有試料の処理方法；
（１）所定量の血液を、マイクロプレートリーダと６００ｎｍ以上の波長の光を用いて吸光光度法で測定した吸光度値が１以上２未満になるように蒸留水で希釈することにより、基準サンプルを調製し、前記基準サンプルにおける蒸留水に代えて、前記界面活性剤Ａを含む液を用いて被検サンプルを調製し、６００ｎｍ以上の波長の光を用いて吸光光度法で測定した前記被検サンプルの吸光度値が、前記基準サンプルの吸光度値の２分の１になる時間が、１時間以内である。
[Ａ１３]  前記界面活性剤Ａ及び界面活性剤Ｂを含む液、又は、界面活性剤Ａを含む液及び界面活性剤Ｂを含む液若しくはそれら２液の混合物が、下記（２）の血球除去効果を有する、［Ａ１］から［Ａ１２］のいずれかに記載の血液成分含有試料の処理方法；
（２）所定量の血液を、マイクロプレートリーダと６００ｎｍ以上の波長の光を用いて吸光光度法で測定した吸光度値が１以上２未満になるように蒸留水で希釈することにより、基準サンプルを調製し、前記基準サンプルにおける蒸留水に代えて、前記界面活性剤Ａ及び界面活性剤Ｂを含む液、又は、界面活性剤Ａを含む液及び界面活性剤Ｂを含む液若しくはそれら２液の混合物を用いて被検サンプルを調製し、６００ｎｍ以上の波長の光を用いて吸光光度法で測定した前記被検サンプルの吸光度値が、前記基準サンプルの吸光度値の２分の１になる時間が、０．５時間以内である。
［Ａ１４］  前記血液成分含有試料の処理方法は、前記試料に含まれ得る稀少細胞の生存率低下を抑制しつつ赤血球を溶解させ、かつ／又は、白血球の生存率を低下させる方法である、［Ａ１］から［Ａ１３］のいずれかに記載の血液成分含有試料の処理方法；
［Ａ１５］  ［Ａ１］から［Ａ１４］のいずれかに記載の処理方法で血液成分を含む試料を処理すること、及び、処理後の試料から稀少細胞又は核酸を分離又は検出することを含む、血液成分含有試料中の稀少細胞又は核酸を分離又は検出する方法；
［Ａ１６］  血液成分を含む試料から稀少細胞又は核酸を含む画分を分離すること、分離した前記画分を［Ａ１］から［Ａ１４］のいずれかに記載の処理方法で処理すること、及び、処理後の画分から稀少細胞又は核酸を分離又は検出することを含む、血液成分含有試料中の稀少細胞又は核酸を分離又は検出する方法；
［Ａ１７］  前記稀少細胞又は核酸の分離が、アフィニティーを用いた分離、密度分離、遠心分離、接着分離、サイズ分離、フローサイトメトリー、電気的分離、磁性分離、培地への播種、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される方法で行われることを含む、［Ａ１５］又は［Ａ１６］のいずれかに記載の血液成分含有試料中の稀少細胞又は核酸を分離又は検出する方法；
［Ａ１８］  前記稀少細胞が、がん細胞、循環腫瘍細胞、血管内皮細胞、血管内皮前駆細胞、がん幹細胞、上皮細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、胎児細胞、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される細胞である、［Ａ１５］から［Ａ１７］のいずれかに記載の血液成分含有試料中の稀少細胞又は核酸を分離又は検出する方法；
［Ａ１９］  前記核酸が、血液成分中のＲＮＡ及びＤＮＡ、がん細胞、循環腫瘍細胞、血管内皮細胞、血管内皮前駆細胞、がん幹細胞、上皮細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、胎児細胞のＲＮＡ及びＤＮＡ、並びに、これらの組み合わせからなる群から選択される核酸である、［Ａ１５］から［Ａ１８］のいずれかに記載の血液成分含有試料中の稀少細胞又は核酸を分離又は検出する方法；
［Ａ２０］  前記稀少細胞について、放射性物質を利用した検出方法、発光現象を利用した検出方法、色素を用いた検出方法、磁性を利用した検出方法、電気的検出方法、光学的検出方法、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される検出方法に付随する標識方法を用いて標識すること含む、［Ａ１５］から［Ａ１９］のいずれかに記載の血液成分含有試料中の稀少細胞又は核酸を分離又は検出する方法；
［Ａ２１］  ［Ａ１］から［Ａ１４］のいずれかに記載の処理方法で血液成分を含む試料を処理すること、又は、［Ａ１５］から［Ａ２０］のいずれかに記載の分離又は検出方法により血液成分を含む試料から稀少細胞又は核酸を分離又は検出することを含む、血液成分を含む試料中のＣＴＣ（循環腫瘍細胞）数又はＣＴＣの核酸を測定する方法；
［Ａ２２］  ［Ａ１］から［Ａ１４］のいずれかに記載の処理方法で血液成分を含む試料を処理した後、細胞の動態の観察又は活性測定を含む方法で分析することを含む、血液成分含有試料中の稀少細胞の分析方法；
［Ａ２３］  ［Ａ１］から［Ａ１４］のいずれかに記載の処理方法、［Ａ１５］から［Ａ２０］のいずれかに記載の分離又は検出方法、［Ａ２１］記載のＣＴＣ数測定方法、及び／又は［Ａ２２］に記載の分析方法に用いるための、前記界面活性剤Ａ及び前記界面活性剤Ｂを含む、試薬キット；
［Ａ２４］  ［Ａ２］から［Ａ１４］のいずれかに記載の処理方法、［Ａ１５］から［Ａ２０］のいずれかに記載の分離又は検出方法、［Ａ２１］記載のＣＴＣ数測定方法、及び／又は［Ａ２２］に記載の分析方法に用いるための、前記界面活性剤Ａ含む、試薬キット。
【実施例】
【００８９】
以下、実施例により本開示をさらに詳細に説明するが、これらは例示的なものであって、本開示はこれら実施例に制限されるものではない。
【００９０】
［１．ポリオキシエチレンオクチルドデシルエーテル(EO=25)による処理(実施例１、２)］
前記化学式（１）で表されるポリオキシエチレンオクチルドデシルエーテル（ＥＯ＝２５）（商品名：エマルゲン２０２５Ｇ、花王社製、下記表１の界面活性剤Ｎｏ．１）の２．５ｗ／ｖ％水溶液を調製した。この水溶液と接触させた時の赤血球の溶解時間を測定した。また、この水溶液と接触させた１０分後（実施例１）又は３０分後（実施例２）における白血球の生存率、及び、がん細胞の生存率を測定した。具体的には、下記の条件で行った。
【００９１】
〔赤血球の溶解時間測定〕
赤血球を含む試料として、健常人の静脈血から真空採血管（ＥＤＴＡ・２Ｋ入り）を用いて採血した血液を使用した。９６ウェルのマイクロプレートに前記血液を含む試料３０μＬを分注し、前記界面活性剤水溶液３０μＬを混合してピペッティングで５回攪拌し、反応溶液を均一して反応させた。マイクロプレートリーダで吸光度を１分ごとに測定した。血液が溶解し、吸光度が６５０ｎｍの波長で０．５以下になった時を血液の溶解とした。その結果を下記表３に示す（実施例１及び２）。実施例１及び２では、３０分を経過後６０分以内に吸光度が０．５に到達した。一方、前記界面活性剤水溶液に換えて蒸留水を使用した比較例９は、６０分経過しても吸光度が０．５に達することはなかった。なお、使用したマイクロプレートリーダは、Thermo labsystems社製のThermo Labsystems Multiskan Ascent 35である。
【００９２】
〔白血球のダメージ評価〕
白血球は、HetaSepプロトコル（STEMCELL Technologies社製）に従って新鮮血１０ｍｌから分離し、ＰＢＳ（−）１ｍｌに懸濁し１．５ｍｌのディスポーザルマイクロチューブ（ニチリョー/DSP-MC-15A  以下エッペンチューブと略す）に回収した。分離した白血球と少量の赤血球は塩化アンモニウム（STEMCELL社）を用いて添付文書に従い赤血球を除去し、遠心して白血球を回収し、ＰＢＳ（−）で洗浄し、その後血清入り培地に１ｍｌに懸濁した。血清入り培地中の白血球懸濁液５０μＬと前記界面活性剤水溶液５０μＬとを１．５ｍｌのエッペンチューブ内で混合し、5回程度ピペッティングで溶液が均一になるように攪拌した。その後、室温２３度、１０分〜３０分ほど静置で反応させた。その後、このエッペンチューブの反応液をピペッティングで攪拌し、細胞を分散させた後に５０μＬを別のエッペンチューブに分注し、０．４％トリパンブルー染色液（インビトロジェン）５０μＬを混合した。これを血算板（セルカウンタープレート 改良ノイバウエルタイプ177-112C/ワトソン社製  以下  血算板と略す）に注入してトリパンブルーに染まらなかった生細胞を計測した。試薬の代わりに蒸留水を添加した反応液の細胞数を１００％として、前記界面活性剤水溶液との反応後１０分後（実施例１）及び３０分後（実施例２）に生存した細胞数から生存率を求めた。その結果を下記表３に示す。
【００９３】
〔がん細胞へのダメージ評価〕
がん細胞試料として、胃がん、乳がん、大腸がん、前立腺がん、肺がん由来のＳＮＵ−１、ＭＣＦ−７、ＳＷ６２０、ＰＣ３、ＮＣＩ−３５８細胞を２×１０6Cellｓ/ｍｌになるように調製して使用した。がん細胞の調製方法は下記のとおりとした。血清入り培地中のがん細胞懸濁液５０μＬと前記界面活性剤水溶液５０μＬとを１．５ｍｌのエッペンチューブ内に添加し、ピペッティングで攪拌し、溶液を均一にした。その後、室温２３度、１０分ほど静置で反応させた。その後、エッペンチューブ入った反応液をピペッティングで攪拌し、細胞を分散させた後に５０μＬを別のエッペンチューブに分注し、０．４％トリパンブルー染色液（インビトロジェン）５０μＬを混合した。これを血算板に注入してトリパンブルーに染まらなかった生細胞を計測した。試薬の代わりに蒸留水を添加した反応液の細胞数を１００％として、前記界面活性剤水溶液との反応後１０分後（実施例１）及び３０分後（実施例２）に生存した細胞数から生存率を求めた。その結果を下記表３に示す。
【００９４】
（がん細胞の調製方法）
常法に従い、ＴＣシャーレ（グライナー社）に培養したヒト乳腺上皮癌（細胞株名  ＭＣＦ−７：ＤＳファーマバイオメディカル社）、ヒト結腸腺癌（細胞株名  ＳＷ６２０：ＤＳファーマバイオメディカル社）、ヒト前立腺癌（細胞株名  ＰＣ３：ＤＳファーマバイオメディカル社）、ヒト肺胞上皮癌（細胞株名  ＮＣＩ−Ｈ３５８：ＤＳファーマバイオメディカル社）の培地上清を除去後、ＰＢＳ（−）で洗浄して、さらに上清を除去後、トリプシン（インビトロジェン社）処理（３７℃、３分）を行った。これに血清入り培地を加えて１５ｍｌ遠沈管に回収した。これを遠心機（CR20F：日立）遠心でし、上清を除去した。これを再度血清入り培地に懸濁して回収した。なお、浮遊系であるヒト胃癌細胞株（ＳＮＵ−１：ＡＴＣＣ）は、トリプシン処理を行うことなく、１５ｍｌ遠沈管に回収した。これを遠心後、血清入り培地を添加し懸濁し回収した。
【００９５】
表３の実施例１及び２に示すとおり、界面活性剤Ｎｏ．１（ポリオキシエチレンオクチルドデシルエーテル(EO=25)）の水溶液は、赤血球を溶解し、かつ、がん細胞よりも白血球をより選択的に生存率を低下させることができ、その効果は、界面活性剤Ｎｏ．１と接触後３０分後に顕著となった。
【００９６】
［２．２種類の界面活性剤の組み合わせを用いた処理（実施例３−７）］
下記表１に記す１４種類の界面活性剤（花王社製、ナカライテスク社製、同仁化学研究所社製、ライオン・アクゾ株式会社）を用いて、下記表３に示す実施例３〜７、比較例１〜８の組み合わせを設定して混合物を調製した。実施例３〜７、比較例１〜８の界面活性剤混合物において、２つの界面活性剤混合比（重量比）は２：８（界面活性剤Ｎｏ．１が８割）とした。また、前記界面活性剤混合物における界面活性剤の合計濃度は２．５ｗ／ｖ％とした。比較例９は、界面活性剤を使用しない蒸留水の例である。これらの界面活性剤混合物を用い、実施例１と同様に、これらの界面活性剤混合物と接触させた時の赤血球の溶解時間を測定し、これらの界面活性剤混合物と接触させた１０分後における白血球の生存率、及び、がん細胞の生存率を測定した。具体的条件は、実施例１の界面活性剤水溶液を前記界面活性剤混合物と換えた以外は、実施例１と同様に行った。それらの結果を表３に示す。なお、下記表１のＮｏ．１〜Ｎｏ．６の界面活性剤単独の２．５ｗ／ｖ％水溶液の赤血球溶解時間の測定結果を表２に示す。
【００９７】
【表１】
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【００９８】
【表２】
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【００９９】
【表３】
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【０１００】
表３に示すとおり、Ｎｏ．１の非イオン性界面活性剤のみを使用した実施例１及び２では、赤血球を溶解でき、さらに、比較例１〜８に比べ、がん細胞の高い生存率が維持された。Ｎｏ．１とＮｏ．２〜Ｎｏ．６との界面活性剤混合物で処理した実施例３〜７では、実施例１に比べ赤血球の溶血時間が短縮され、また、比較例１〜８に比べ、がん細胞の少なくとも１種類について高い生存率が維持された。同じ時間（１０分）で白血球の生存率を下げるという点では、Ｎｏ．２〜Ｎｏ．５を含む実施例３〜６が、実施例１及び７よりも優れていた。より多くの種類のがん細胞の生存率を高く維持するという点では、実施例２〜５及び７が実施例６よりも優れ、なかでも実施例３、４及び７、とりわけ実施例３及び４が優れていた。
【０１０１】
［３．２種類の界面活性剤の混合比とがん細胞ダメージとの関係］
界面活性剤Ｎｏ．２又はＮｏ．３と界面活性剤Ｎｏ．１との混合物を、１０：０〜０：１０の混合比（重量比、界面活性剤の合計濃度は２．５ｗ／ｖ％）で調製した。これらの混合物を用いて胃がん細胞（SNU-1）へのダメージ評価を行った。ダメージ評価は上述と同様に行った。すなわち、血清入り培地中のがん細胞懸濁液（２×１０6Cellｓ/ｍｌ）５０μＬと前記混合物５０μＬとを１．５ｍｌのエッペンチューブ内で混合し、ピペッティングで５回程度攪拌し溶液を均一にした。その後、室温２３度、１０分ほど静置で反応させた。反応後、前記エッペンチューブ内の反応液をピペッティングで攪拌し、細胞を分散させた後に５０μＬを別の１．５ｍｌエッペンチューブに分注し、０．４％トリパンブルー染色液（インビトロジェン）５０μＬと混合した。これを血算板に注入してトリパンブルーに染まらなかった生細胞を倒立顕微鏡（オリンパス）をもちいて計数した。試薬の代わりに蒸留水を添加した反応液の細胞数を１００％として、前記界面活性剤混合物との反応後の生存した細胞数から生存率を求めた。界面活性剤Ｎｏ．２と界面活性剤Ｎｏ．１との混合物の結果を図１に、そして、界面活性剤Ｎｏ．３と界面活性剤Ｎｏ．１との混合物の結果を図２に示す。
【０１０２】
図１及び２に示すとおり、界面活性剤Ｎｏ．２及びＮｏ．３の混合比（重量比）が５０％を超える場合には、がん細胞の生存率が著しく低下した。また、界面活性剤Ｎｏ．１の混合比（重量比）が５０％を超えるとがん細胞の生存率が著しく向上し、界面活性剤Ｎｏ．１の混合比（重量比）が６０％以上ではさらにがん細胞の生存率向上が顕著であった。
【０１０３】
［４．がん細胞含有血液を含む試料からのがん細胞の接着分離］
乳がん細胞であるＭＣＦ−７細胞をＰＢＳ（−）（ダルベッコＰＢＳ（−）/日水製薬）で細胞表面を洗浄後トリプシン処理（３７℃、３分）で細胞をはがし、血清入りの培地に懸濁した。血算板で細胞を計数し、１×１０6個ずつになるよう遠沈管にいれ、遠心し、上清を除いたあと血液１ｍｌを添加し懸濁し、がん細胞含有血液を含む試料を調製した。このがん細胞含有血液を含む試料１ｍｌに実施例３又は４の界面活性剤混合物（界面活性剤Ｎｏ．２又はＮｏ．３と界面活性剤Ｎｏ．１との混合物、界面活性剤の合計濃度は２．５ｗ／ｖ％）１ｍｌを混合し、ピペットで５回攪拌し、１０分間反応させた。
【０１０４】
前記反応中に血球が溶解し、反応溶液の密度が上昇する。そのため、細胞の遠心分離に際してバッファーを適量添加し密度を下げて遠心分離をする。具体的には、遠沈管に反応物及びバッファーを１０ｍｌ入れて遠心機（CR20F/日立製）で１５００ｒｐｍ、室温（２４℃）、３分間遠心した。上清を除き、１０ｍｌの血清入りの培地で懸濁し、１０ｃｍＴＣシャーレ（グライナー）に細胞を播き、５％，３７℃のＣＯ2インキュベーターの中に保管した。２４時間後、培地交換を行い、再度同インキュベーターの中に保管した。６０時間の写真及び１００時間後の生育状況の写真を図３に示す。図３に示す通り、がん細胞含有血液を含む試料から実施例３又は４の界面活性剤混合物を用いてがん細胞を回収でき、かつ、前記がん細胞は培養シャーレに接着し増殖した。すなわち、前記反応処理及び遠心分離後にがん細胞のさらなる分離及び／又は濃縮が可能となった。なお、前記反応処理をせずに細胞を播種した場合、血球、血小板等の血液成分が邪魔をして、がん細胞が接着できず、生育できなかった。
【０１０５】
［５．蛍光染色がん細胞を含有する血液試料のフィルター処理］
予め蛍光染色したがん細胞を血液と混合してがん細胞含有血液試料を調製し、これを界面活性剤混合物で処理を施した後、フィルターを使用してろ過し、フィルター上に回収された細胞を観察した。具体的は、以下のようにした。
【０１０６】
〔がん細胞含有血液試料〕
がん細胞含有血液を含む試料として、事前に下記手順で染色した胃がん細胞（ＳＮＵ−１）を６０００個ほど添加した血液１ｍｌを準備した。
（がん細胞の染色）
上記１と同様に調製したがん細胞（ＳＮＵ−１）を培養液から回収した後、遠心機（ＣＲ２０Ｆ/日立製）で１５００ｒｐｍ、室温（２４℃）、３分間遠心した。上清を除去し、ＰＢＳ（−）を添加して細胞を懸濁する。このＰＢＳ（−）に懸濁した細胞を蛍光染色する。染色試薬としてＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ（インビトロジェン）を使用した。ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ（インビトロジェン）は生細胞の細胞膜も通過することができる試薬で、細胞内物質と反応し、蛍光物質に変換される。ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒを１０ｍＭとなるようにＤＭＳＯに溶解させ、反応時の濃度を最終濃度０．５〜０．２５μＭになるように使用する。ＰＢＳ（−）中で３０〜４０分反応させた。がん細胞（ＳＮＵ−１）を、緑色蛍光を発するセルトラッカー（CellTracker Green CMFDA/C7025）で染色した。
【０１０７】
〔界面活性剤混合物〕
界面活性剤混合物として実施例４の界面活性剤混合物（界面活性剤Ｎｏ．３と界面活性剤Ｎｏ．１との混合物、界面活性剤の合計濃度は２．５ｗ／ｖ％）を準備した。
【０１０８】
〔フィルター〕
φ１３ｍｍ、孔径８μｍのニュークリポア・トラックエッチメンブレン（ＧＥヘルスケア社）をスウィネクス  フィルターホルダー（ヤマト科学：ＳＸ０００１３００）で固定してフィルターを作製した。ピストンを外したプラスチックのシリンジをフィルターホルダー上部に装着した。フィルター下部はシリコンチューブでつなぎ、逆側の先端を廃液ビンの中に固定して使用した。
【０１０９】
〔ろ過〕
前記がん細胞含有血液を含む試料１ｍｌに実施例２の界面活性剤混合物１ｍｌを混合し、ピペットで５回攪拌し、１０分間反応させた。反応物を前記フィルターの上部に接続したシリンジに添加して、ろ過した。その後、フィルターを血液が抜けきる前にＰＢＳ（−）溶液を静かに添加し、フィルターの洗浄を行った。その後、４％のパラホルムアルデヒド／ＰＢＳ緩衝液（和光純薬）で３０分ほど固定した。フィルターのメンブレン上に固定された細胞を顕微鏡で観察した。その結果を図４Ｂに示す。なお、図４Ａは、界面活性剤混合物による処理を行なわず、血液をろ過した場合の結果である。
【０１１０】
図４に示す通り、界面活性剤混合物による処理を行った図４Ｂでは、図４Ａで観察されるたくさんの血球がほとんど観察されない。なお、図４Ｂにおいて丸く観察されるのはフィルターの穴である。図４Ｂで光っている細胞は、事前に染色して血液に混ぜたがん細胞である。界面活性剤と作用させたあとでも、血球が破壊されがん細胞がフィルター上に捕捉されているのが確認できる。これはフィルター上に残ったがん細胞の純度が高くなり、検出やその後の解析が容易になる。
【０１１１】
以上のデータは、界面活性剤混合物による処理により、該血液を含む試料中の稀少細胞（がん細胞）に対して稀少細胞に対して少ないダメージで血球等を破壊するため、その後に純度の高い接着分離と培養、フィルター分離、蛍光標識などを行うことができるから、回収された稀少細胞（がん細胞）の精度の高い分析が可能であることを示す。
【０１１２】
［６．がん細胞含有血液試料中のがん細胞視覚化におけるノイズ除去］
予め蛍光染色したがん細胞を予め染色した白血球と混合してがん細胞含有血液試料を調製し、これを界面活性剤混合物で処理を施した後、蛍光顕微鏡観察を行った。具体的は、以下の条件で行った。
〔がん細胞含有血液試料の調製〕
上記５と同様に、緑色蛍光を発するセルトラッカー（CellTracker Green CMFDA/C7025）で染色したがん細胞（ＳＮＵ−１）を調製し、青色の蛍光発するセルトラッカー（CellTracker Blue CMF2HC/C12881）で染色した白血球細胞を調製した。血清入り培地２００μＬ中にがん細胞を６７００個、白血球を１.４×１０6個となるようにエッペンチューブの中に添加してがん細胞含有血液試料を調製した。これを３０μＬずつ別のエッペンチューブに分注した。
【０１１３】
〔界面活性剤混合物による処理と蛍光顕微鏡観察〕
がん細胞含有血液試料を下記表４に示す条件で処理した（実施例８−１０、及び比較例１０）。なお記載の濃度は調製時の濃度であり、細胞懸濁液と反応させる際は、等量の３０μLを添加し混合している。反応温度は室温（２３℃）であった。反応後、培地６４０μＬ加え、遠心機（日立製  CF15D）で２５００ｒｐｍ３分間遠心した。再度ＰＢＳ（−）６００μｌで懸濁し、再度前記遠心機、同条件で遠心した。その後、ＰＢＳ（−）１００μｌに懸濁し、５０μｌを３８４プレートに分注した。これをクボタのプレート遠心機（M20484-A000)で４００×ｇで５分間遠心し、下記表５の条件で蛍光顕微鏡観察をした。蛍光顕微鏡観察の結果を図５に示す。また、図５中の細胞数をカウントした結果を表４に示す。
【表４】
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【表５】
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【０１１４】
図５及び表４に示すとおり、実施例８−１０では、処理を行うことにより白血球の数を大幅に低減することができ、顕微鏡観察におけるノイズが比較例１０に比べて大幅に低減された。
【０１１５】
［７．フローサイトメトリーによる検出と分離］
１０ｍｌの血液から上記１と同様に単離した白血球細胞を用いる。またがん細胞はＳＮＵ−１細胞を用いた。測定にはＭｏｘｉＺ／ＯＲＦＬＯ社の電気的検知帯法（コールター原理）を用いた自動セルカウンターを使用した。電気的検知帯法とは、細孔に電流を流し、その細孔の中を通過する粒子の体積に比例して電気抵抗が変化するのを電圧パルス等の変化として測定し検出することができる。電圧パルス高を１個ずつ計測処理して、粒子の体積分布ヒストグラムが得られる。細胞の大きさ（体積）と数を測定できる。
【０１１６】
界面活性剤Ｎｏ．２と界面活性剤Ｎｏ．１との混合物を、２：８混合比（重量比、界面活性剤の合計濃度は２．５ｗ／ｖ％）で調製した。これらの界面活性剤混合物を用いて胃がん細胞（ＳＮＵ−１）と白血球の粒度分布を測定した。血清入り培地中のがん細胞懸濁液（１×１０5 Cells／ｍｌ）又は白血球（３×１０5 Cells／ｍｌ）５０μＬと前記界面活性剤混合物５０μＬとを１．５ｍｌのエッペンチューブ内で混合し、ピペッティングで５回程度攪拌し溶液を均一にした。その後、室温２３度、１０分ほど静置で反応させた。反応後、前記エッペンチューブ内の反応液をピペッティングで攪拌し、細胞を分散させた後に７５μＬをＭｏｘｉＺ専用のカセットを注入して粒度分布を測定した。（実施例１１）。比較例として前記界面活性剤混合物の代わりに蒸留水を使用した（比較例１１）。
【０１１７】
次にがん細胞＋白血球を混合し、前記細胞数と同じになるように細胞試料を調製した。前記細胞試料を、実施例１１と同様に前記界面活性剤混合物と反応させ粒度分布を測定した（実施例１２）。比較例として前記界面活性剤混合物の代わりに蒸留水を使用した（比較例１２）。
【０１１８】
測定後に得られたデータはＣＳＶファイルとして出力でき、各大きさで得られたデータについて、７点単純移動平均でスムージングを行った。図６のＡおよびＢは、がん細胞と白血球の各細胞の粒度分布のデータを重ね合わせた結果である。図７のＡおよびＢは、がん細胞と白血球とを混合した懸濁液の粒度分布である。
【０１１９】
図６及び図７に示すとおり、比較例１１及び１２（図６Ｂ及び図７Ｂ）では、セルカウンターで白血球の大きい側の粒度分布とがん細胞の小さい側の粒度分布が重なっている（図６Ｂの「重なり部分」及び図７Ｂ）。このため白血球とＳＮＵ−１の切り分けが難しく、ＳＮＵ−１を回収しようとすると多くの白血球が混入する。一方、実施例１１（図６Ａ及び図７Ａ）では重なりあっている部分の白血球が溶解し、重なり部分がないか少ない。重なり部分がなくなる又は減少するため、がん細胞の純度が高くなる。例えば、点線（5.5 (au）)で指し示す溶解後の白血球以上のサイズをもつ細胞を回収することで、白血球の分布とがん細胞の分布とを分離できる。このように電気的に大きさを判別して任意の大きさを分離、検出できようになる。また光学的には、蛍光標識と散乱光で検出、分離できるようになる。
【０１２０】
［８．生理食塩水に懸濁されたがん細胞及び白血球と界面活性剤混合物のｐＨの関係］
界面活性剤Ｎｏ．２と界面活性剤Ｎｏ．１を２：８の混合比（重量比、界面活性剤の合計濃度は２．５ｗ／ｖ％）で含有する界面活性剤混合物を、ｐＨ４〜ｐＨ１０となるように各ＰＢＳ（−）溶液で調製した。これらの界面活性剤混合物を用いて胃がん細胞（ＳＮＵ−１）へのダメージ評価を行った。
ダメージ評価は血清入り培地で懸濁していた細胞を、今回は生理食塩水で懸濁したこと以外は上述と同様に行った。すなわち、生理食塩水のがん細胞懸濁液（２×１０6Ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）５０μＬと前記混合物５０μＬとを１．５ｍｌのエッペンチューブ内で混合し、ピペッティングで５回程度攪拌し溶液を均一にした。その後、室温２３℃、１０分ほど静置で反応させた。反応後、前記エッペンチューブ内の反応液をピペッティングで攪拌し、細胞を分散させた後に５０μＬを別の１．５ｍｌエッペンチューブに分注し、０．４％トリパンブルー染色液（インビトロジェン）５０μＬと混合した。これを血算板に注入してトリパンブルーに染まらなかった生細胞を倒立顕微鏡（オリンパス）を用いて計数した。試薬の代わりに界面活性剤を含まないＰＢＳ（−）を添加した反応液の細胞数を１００％として、前記界面活性剤混合物との反応後の生存した細胞数から生存率を求めた。
白血球も同様に生理食塩水で懸濁（８．２ｘ１０6ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）に対し、同様に反応させた。界面活性剤混合物の代わりに界面活性剤を含まないＰＢＳ（−）を添加した反応液の細胞数を１００％として、前記界面活性剤混合物との反応後の生存した細胞数から生存率を求めた。
その結果を図８及び下記表６に示す。図８及び表６に示すとおり、がん細胞の生存率を高くする観点及び白血球の生存率を低くする観点から、界面活性剤混合物のｐＨは中性に近いｐＨが好ましいことが示された。
【表６】
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【産業上の利用可能性】
【０１２１】
本開示は、血液中の稀少細胞の回収、測定、分析の分野で有用であり、例えば、医学や薬学の学術分野、及び／又は治療・診断等の医療の分野で有用である。
【図１】
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【図２】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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