(57)【要約】【課題】反応性求電子性化合物をクエンチングする改善された方法を提供すること。【解決手段】本発明は、細胞活性度を維持しつつ好適な病原体不活化を提供する条件下で、赤血球組成物を病原体不活化化合物で処理するための改善された方法を提供する。赤血球の脱水を低減する方法ならびに処理された赤血球組成物も提供される。一局面において、本発明は、細胞脱水の増大などの副作用を低減または最小限にしながら、好適な病原体不活化および望ましくない副反応（赤血球の修飾など）の低減を提供する条件下で、病原体不活化化合物およびクエンチャーにより赤血球組成物を処理するための様々な方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
この出願は、２００８年４月９日に出願された表題「Ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｆｏｒ  Ｒｅｄ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｌｌ  Ｐａｔｈｏｇｅｎ  Ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ」の米国仮出願第６１／０４３，６６６号、および２００８年８月７日に出願された表題「Ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｆｏｒ  Ｒｅｄ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｌｌ
Ｐａｔｈｏｇｅｎ  Ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ」の米国仮出願第６１／０８７，０３４号の優先権の利益を主張する。これらの出願の両方の内容は、あたかもそれらが以下に完全に示されているように参考として本明細書に援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明の分野は、存在し得る病原体汚染物質を不活化するための血液製剤の処理に用いられる反応性求電子性化合物をクエンチング（ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）する改善された方法に関する。特に、チオールなどの求核性化合物を上昇された濃度で用いて、赤血球組成物中の反応性求電子性化合物をクエンチングし、その後、濃度を下げて、赤血球（ＲＢＣ）脱水を低減させる。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
血液製剤および他の生物学的材料による疾患の感染は、依然として深刻な健康上の問題である。血液ドナーのスクリーニングおよび血液試験は、相当進歩しているが、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）およびヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）などのウイルスは、ウイルスまたはウイルス抗体のレベルが低いため、試験の際、血液製剤中での検出から逃れ得る。ウイルスの有害性（ｈａｚａｒｄ）に加え、現在、輸血における使用が意図される血液中の非ウイルス微生物（例えば、細菌または原虫など）の存在についてスクリーニングするための適格な認可試験はない。また、これまで未知の病原体が、輸血用血液中に蔓延（ｐｒｅｖａｌｅｎｔ）した状態となり、疾患の感染の脅威を提示し得るというリスクも存在する（これは、実際、輸血によるＨＩＶ感染のリスクの認識以前に起こった）。
【０００４】
血液製剤の臨床使用の前に、病原体を不活化するための化学試薬が血液または血漿に導入されている。典型的には、赤血球含量をほとんどまたは全く有しない血液製剤、例えば、血小板および血漿には、光化学的に活性化された化合物（例えば、ソラレンなど）が使用される。赤血球含有血液製剤には、光活性化を必要としない化合物が、病原体の不活化のために開発されている。このような化合物は典型的には、病原体と、より詳しくは病原体の核酸と反応する求電子性基を有する。例えば、特許文献１には、アリールジオールエポキシドを用いた細胞およびタンパク質含有組成物中のウイルスの不活化が記載されている。インサイチュで求電子体を生成する他の化合物を使用してもよい。ＬｏＧｒｉｐｐｏらは、ウイルスの不活化のためのナイトロジェンマスタードＣＨ３−Ｎ（ＣＨ２ＣＨ２Ｃｌ）２の使用を評価した。非特許文献１。より注目すべきことに米国特許第５，６９１，１３２号；同第６，１７７，４４１号；同第６，４１０，２１９号；同第６，１４３，４９０号；および同第６，０９３，７２５号（その開示は、引用により本明細書に組み込まれる）には、病原体を不活化するために、核酸標的化成分ならびに該核酸と反応する求電子性成分を有する化合物の使用が記載されている。米国特許第６，０９３，７２５号および特許文献２（その開示は、引用により本明細書に組み込まれる）にも同様の化合物が記載されており、この場合、該化合物の核酸標的化成分が、反応性求電子性成分に加水分解性リンカーによって連結されている。特許文献３および特許文献４（その開示は、引用により本明細書に組み込まれる）には、病原体の不活化のために、エチレンイミンオリゴマーおよび関連化合物を使用することが記載されている。このようなエチレンイミンに由来する化合物は、典型的には、反応性求電子性成分を提供するアジリジン基、および該化合物の核酸標的化を提供するポリアミン成分を有する。核酸と反応性である求電子性基または同様の基を有する核酸標的化化合物の一般的類型は、血液、血液製剤および種々の生物起源の試料中の病原体を不活化するために使用される。
【０００５】
これら化合物は、核酸を特異的に標的とするように設計されているが、タンパク質または細胞膜などの血液の他成分と反応し得るというある程度の懸念が存在する。これら副反応は不利であり、免疫系によって認識され得るタンパク質および細胞膜の修飾などの有害効果を引き起こし得る。かかる処理された血液製剤が繰り返し使用される場合、それは、処理された血液製剤に対するレシピエントの免疫応答をもたらし得る。それらの開示が本明細書中に参考として援用される米国特許第６，２７０，９５２号明細書、第６，７０９，８１０号明細書、および第７，２９３，９８５号明細書は、任意のかかる副作用のレベルを低減させるために、かかる病原体不活化化合物をクエンチングする方法を記述している。その開示が本明細書中に参考として援用される米国特許出願公開第２００６／０１１５４６６号明細書は、病原体不活化化合物に対して発生した免疫応答に対処するこれらクエンチング条件への改善を記述している。しかしながら、クエンチング有効性における改善にもかかわらず、一部の場合では、処理された赤血球は、浸透圧脆弱性の低下および遠心ヘマトクリットの減少によって測定されるように、細胞脱水の増大に起因する寿命低下を示すことが見出されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第５，０５５，４８５号明細書
【特許文献２】米国特許第６，５１４，９８７号明細書
【特許文献３】米国特許第６，１３６，５８６号明細書
【特許文献４】米国特許第６，６１７，１５７号明細書
【非特許文献１】ＬｏＧｒｉｐｐｏら，「Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｉｘｔｈ  Ｃｏｎｇｒｅｓｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｂｌｏｏｄ  Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ」，Ｈｏｌｌａｎｄｅｒ編，Ｂｉｂｌｉｏｔｈｅｃａ  Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ，１９５８年，ｐｐ．２２５−２３０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、処理された血液製剤の活性度（ｖｉｔａｌｉｔｙ）および寿命に悪影響を及ぼさずに有害病原体を不活化する病原体不活化化合物の能力を維持しつつ、病原体不活化化合物の望ましくない求電子性副反応を低減する方法が必要とされている。具体的には、赤血球中の病原体不活化化合物をクエンチングする改善された方法の必要性がある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、細胞脱水の増大などの副作用を低減または最小限にしながら、好適な病原体不活化および望ましくない副反応（赤血球の修飾など）の低減を提供する条件下で、病原体不活化化合物およびクエンチャーにより赤血球組成物を処理するための様々な方法を提供する。一部の実施形態では、該クエンチャーは、適正量の塩基で中和されるグルタチオンである。一部の実施形態では、該方法は、病原体不活化後にグルタチオンの濃度を低減させることを伴う。
【０００９】
一実施態様において、本発明は、赤血球組成物を処理する方法を提供し、この方法は、ａ）ｉ）もし存在するとすれば病原体を不活化するための有効量の病原体不活化化合物（これは、反応性求電子性基であるかまたは反応性求電子性基を形成する官能基を含む）と、ｉｉ）病原体不活化化合物の反応性求電子性基と反応可能なチオール基を含む有効量のクエンチャーと、ｉｉｉ）赤血球含有組成物とを提供するステップ、ｂ）該病原体不活化化合物および該クエンチャーを、該赤血球含有組成物と混合するステップ、ならびにｃ）元の濃度のクエンチャーで該混合物を保管することから生じる赤血球脱水のレベルに比べて、該混合物を保管することから生じる赤血球脱水のレベルを低減させる量へと、該混合物中の該クエンチャーの濃度を十分に減少させるステップを含む。これら実施形態の一部では、クエンチャー濃度を減少させることには、不活化中に使用される溶液を除去すること、および最終添加剤溶液（例えば、ＳＡＧ−Ｍ、ＡＳ−５、または表２、３、もしくは４の任意の溶液などの本明細書に記載の任意の溶液）を添加することを含む。
【００１０】
一部の実施形態では、ステップ（ａ）は好適な塩基を提供することをさらに含み、ステップ（ｂ）は、該塩基と該赤血球含有組成物とを混合することをさらに含み、該塩基は、該塩基無しの混合物に比べて、該混合物中における該病原体不活化化合物と赤血球との望ましくない反応のレベルを低減するのに十分な量である。一部の実施形態では、該病原体不活化化合物と赤血球との望ましくない反応とは、該病原体不活化化合物による該赤血球の表面の修飾である。一部の実施形態では、ステップ（ａ）は好適な塩基を提供することをさらに含み、ステップ（ｂ）は、該塩基と該赤血球含有組成物とを混合することをさらに含み、該塩基は、結果として生じる混合物中の該処理された赤血球組成物と結合する該抗病原体不活化化合物抗体のレベルを、該塩基無しの混合物と比べて、少なくとも約５％（または、少なくとも約１０％、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、または少なくとも約９０％）低減するのに十分な量である。一部の実施形態では、該塩基および該クエンチャーは、該病原体不活化化合物を該赤血球組成物と混合する前、混合と同時に、または混合後約３０分以内に、該赤血球組成物と混合される。一部の実施形態では、該塩基および該クエンチャーは、該塩基または該クエンチャーのいずれかを該赤血球組成物と混合する前に一緒に混合される。一部の実施形態では、塩基はＮａＯＨである。一部の実施形態では、該塩基は塩基性緩衝液である。一部の実施形態では、該塩基は、約０．５〜１．５当量の塩基を含み、当量とは、該混合物中のクエンチャーのモル量と等価なモル量を意味する。一部の実施形態では、該塩基は、約０．７５〜１．２５当量の塩基を含む。一部の実施形態では、該塩基は、約１当量の塩基を含む。一部の実施形態では、ステップ（ｂ）の結果として生じる混合物は、３７℃で約６．０〜７．５のｐＨを有する。一部の実施形態では、ｐＨは、約６．５〜７．１である。一部の実施形態では、ｐＨは、約６．８〜６．９である。
【００１１】
一部の実施形態では、該クエンチャーは、システインまたはシステインの誘導体を含む。一部の実施形態では、該クエンチャーは、グルタチオンまたはその薬学的に許容され得る塩である。一部の実施形態では、ステップ（ｂ）の結果として生じる混合物中の該クエンチャー濃度は、２ｍＭを超える。一部の実施形態では、該クエンチャー濃度は、約５ｍＭ〜約３０ｍＭである。一部の実施形態では、該クエンチャー濃度は、約１５ｍＭ〜約２５ｍＭである。一部の実施形態では、該クエンチャーの濃度は、約２０ｍＭである。
【００１２】
一部の実施形態では、ステップ（ｃ）におけるクエンチャー濃度を減少させることには、該混合物を遠心分離し、その後上清を除去することが含まれる。一部の実施形態では、ステップ（ｃ）は、サイズ排除分離を含む。一部の実施形態では、ステップ（ｃ）の結果として生じる混合物中の該クエンチャーは、約１０ｍＭ未満の濃度である。一部の実施形態では、該クエンチャー濃度は、約８ｍＭ未満である。一部の実施形態では、該クエンチャー濃度は、約６ｍＭ未満（または約４ｍＭ未満、または約２ｍＭ未満）である。一部の実施形態では、該混合物の保管は、４℃で１０日を超える該混合物の保管である。一部の実施形態では、該混合物の保管は、４℃で４２日（または、２８日）を超える該混合物の保管である。一部の実施形態では、本方法は、添加剤溶液（例えば、表２に記載の任意の添加剤溶液、ならびに／または塩化ナトリウム、アデニン、グルコース、ホスフェート、グアノシン、シトレート、および／もしくはマンニトールを含む添加剤溶液）の添加を含む。一部の実施形態では、該混合物は、添加剤溶液（例えば、表２に記載の任意の添加剤溶液、ならびに／または塩化ナトリウム、アデニン、グルコース、ホスフェート、グアノシン、シトレート、および／もしくはマンニトールを含む添加剤溶液）中で保管される。一部の実施形態では、本方法は、処理溶液（例えば、表２、３、または４に記載の任意の溶液、ならびに／または塩化ナトリウム、アデニン、グルコース、ホスフェート、グアノシン、シトレート、および／もしくはマンニトールを含む溶液）を添加剤溶液（例えば、表２に記載の任意の添加剤溶液、ならびに／または塩化ナトリウム、アデニン、グルコース、ホスフェート、グアノシン、シトレート、および／もしくはマンニトールを含む添加剤溶液）と置換することをさらに含む。一部の実施形態では、該クエンチャーの濃度を減少させる前の該組成物のクロライド（ｃｈｌｏｒｉｄｅ）濃度は、約１００ｍＭ未満（または、約７５ｍＭ）である。一部の実施形態では、該クエンチャーの濃度を減少させた後のおよび／または添加剤溶液を添加した後の該組成物のクロライド濃度は、約１００ｍＭを超える（または、約１２５ｍＭ）。
【００１３】
先述の方法ならびに本明細書に記載の他の方法の各々の一部の実施形態では、該官能基は、マスタード、マスタード中間体、またはマスタード同等物である。一部の実施形態では、該官能基は、アジリジニウムイオンであるか、またはアジリジニウムイオンを形成可能である。一部の実施形態では、該反応性求電子性基は、核酸と反応可能である。一部の実施形態では、該病原体不活化化合物は、核酸結合リガンドをさらに含む。一部の実施形態では、該核酸結合リガンドはインターカレーターである。一部の実施形態では、インターカレーターはアクリジンである。一部の実施形態では、該病原体不活化化合物は、該官能基および該核酸結合リガンドを連結する易壊性リンカーを含む。一部の実施形態では、該病原体不活化化合物は、β−アラニン、Ｎ−（アクリジン−９−イル）、２−［ビス（２−クロロエチル（ｃｈｌｏｒｏｅｔｈｙ））アミノ］エチルエステルである。一部の実施形態では、ステップ（ｂ）の結果として生じる混合物中の該病原体不活化化合物の濃度は、約０．１μＭ〜約５ｍＭである。一部の実施形態では、該濃度は、該赤血球組成物中における、もし存在するとすれば少なくとも１ｌｏｇの病原体を不活化するのに十分である。一部の実施形態では、該濃度は、少なくとも３ｌｏｇの病原体を不活化するのに十分である。一部の実施形態では、ステップ（ｂ）とステップ（ｃ）との間の時間は、約１〜４８時間である。一部の実施形態では、該時間は、約１０〜３０時間である。一部の実施形態では、該時間は、約１５〜２５時間である。一部の実施形態では、該処理は、該赤血球組成物中における、もし存在するとすれば少なくとも１ｌｏｇの病原体を不活化する。一部の実施形態では、該処理は、少なくとも３ｌｏｇを不活化する。一部の実施形態では、該方法は、該混合物中の該病原体不活化化合物の濃度を減少させるステップをさらに含む。一部の実施形態では、該混合物中の該クエンチャーの濃度を減少させるステップ、および該混合物中の該病原体不活化化合物の濃度を減少させるステップは、同時に生じる。
【００１４】
先述の方法ならびに本明細書に記載の他の方法の各々の一部の実施形態では、ステップ（ｂ）の２０時間後に、結果として生じる混合物中の赤血球（ＲＢＣ）は、同一条件下の同一方法に由来するが塩基を使用しない赤血球の抗病原体不活化化合物抗体結合能（ａｎｔｉ−ｐａｔｈｏｇｅｎ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｃａｐａｃｉｔｙ）（ＡＢＣ）値と比較して、６５％未満のＡＢＣを有する。一部の実施形態では、該ＲＢＣは、約５０，０００未満の平均ＡＢＣを有する。一部の実施形態では、該ＲＢＣは、約４０，０００未満の平均ＡＢＣを有する。一部の実施形態では、該ＲＢＣは、約２５，０００〜７０，０００の平均ＡＢＣを有する。一部の実施形態では、該ＲＢＣは、約３５，０００〜４５，０００の平均ＡＢＣを有する。一部の実施形態では、結果として生じる混合物のＲＢＣは、ステップ（ｃ）後に１％未満の溶血を示す。一部の実施形態では、該ＲＢＣは、４℃でステップ（ｃ）の４２日後（または２８日後）の時点で１％未満の溶血を示す。一部の実施形態では、結果として生じる混合物のＲＢＣは、ステップ（ｃ）後に５０％を超える赤血球沈殿容積（ＰＣＶ）を示す。一部の実施形態では、該ＲＢＣは、４℃でステップ（ｃ）の４２日後（または２８日後）の時点で５０％を超えるＰＣＶを示す。一部の実施形態では、結果として生じる混合物のＲＢＣは、４℃でステップ（ｃ）の４２日後（または２８日後）に１４０（または１５０）を超えるメジアン血球脆弱性値を示す。一部の実施形態では、病原体不活化化合物の量は低減されず、および／または該病原体不活化化合物は、化合物吸着デバイス（ＣＡＤ）と接触しない。
【００１５】
さらなる態様において、本発明は、赤血球の脱水を低減する方法を提供し、この方法は、ａ）ｉ）病原体不活化化合物と反応可能なクエンチャーおよびｉｉ）赤血球の混合物を含む赤血球組成物を提供するステップと、ｂ）元の濃度のクエンチャーで該混合物を保管することから生じる赤血球脱水のレベルと比べて、該混合物を保管することから生じる赤血球脱水のレベルを低減させる量へと、該混合物中の該クエンチャーの濃度（ならびに、随意に該病原体不活化化合物の濃度および／またはその副産物の濃度）を、十分に減少させるステップとを含む。一部の実施形態では、該クエンチャーは、システインまたはシステインの誘導体を含む。一部の実施形態では、該クエンチャーは、グルタチオンまたはその薬学的に許容され得る塩である。一部の実施形態では、ステップ（ｂ）の結果として生じる混合物中の該クエンチャーは、約１０ｍＭ未満の濃度である。一部の実施形態では、該クエンチャー濃度は、約８ｍＭ未満である。一部の実施形態では、該クエンチャー濃度は、約６ｍＭ未満または約２ｍＭ未満である。一部の実施形態では、結果として生じる混合物の赤血球（ＲＢＣ）は、ステップ（ｂ）後に１％未満の溶血を示す。一部の実施形態では、該ＲＢＣは、４℃でステップ（ｂ）の４２日後（または２８日後）の時点で１％未満の溶血を示す。一部の実施形態では、結果として生じる混合物のＲＢＣは、ステップ（ｂ）後に５０％を超える赤血球沈殿容積（ＰＣＶ）を示す。一部の実施形態では、結果として生じる混合物のＲＢＣは、４℃でステップ（ｂ）の４２日後（または２８日後）の時点で５０％を超えるＰＣＶを示す。一部の実施形態では、結果として生じる混合物のＲＢＣは、４℃でステップ（ｂ）の４２日後（または２８日後）に１４０（または１５０）を超えるメジアン血球脆弱性値を示す。一部の実施形態では、該混合物の保管は、４℃で１０日を超える該混合物の保管である。一部の実施形態では、該混合物の保管は、４℃で４２日（または２８日）を超える該混合物の保管である。一部の実施形態では、病原体不活化化合物の量は低減されず、および／または該病原体不活化化合物は、化合物吸着デバイス（ＣＡＤ）と接触しない。
【００１６】
先述の方法の各々により生成された赤血球（ＲＢＣ）組成物が提供される。先述の方法の各々により調製可能なＲＢＣ組成物も提供される。
【００１７】
さらなる態様において、本発明は、ａ）病原体不活化化合物の求電子性基と共有結合で反応した赤血球、およびｂ）該病原体不活化化合物と反応可能であるチオール基を含むクエンチャーを含む組成物を提供し、該組成物は、４℃で４２日（または２８日）まで保管した後でヒトに注入するのに好適である。一部の実施形態では、もし存在するとすれば、少なくとも１ｌｏｇの病原体が不活化される。一部の実施形態では、少なくとも３ｌｏｇが不活化される。一部の実施形態では、該求電子性基は、マスタード、マスタード中間体、またはマスタード同等物である。一部の実施形態では、該求電子性基は、アジリジニウムイオンであるか、またはアジリジニウムイオンを形成可能である。一部の実施形態では、該求電子性基は、核酸と反応可能である。一部の実施形態では、該求電子性基を、赤血球の細胞表面と共有結合で反応させる。一部の実施形態では、該病原体不活化化合物は、核酸結合リガンドをさらに含む。一部の実施形態では、該核酸結合リガンドはインターカレーターである。一部の実施形態では、該インターカレーターはアクリジンである。一部の実施形態では、該病原体不活化化合物は、該求電子性基および該核酸結合リガンドを連結する易壊性リンカーを含む。一部の実施形態では、該病原体不活化化合物は、β−アラニン、Ｎ−（アクリジン−９−イル）、２−［ビス（２−クロロエチル）アミノ］エチルエステルである。一部の実施形態では、該クエンチャーは、システインまたはシステインの誘導体を含む。一部の実施形態では、該クエンチャーは、グルタチオンまたはその薬学的に許容され得る塩である。一部の実施形態では、該クエンチャーは、保管中の赤血球脱水を回避するかまたは最小限にするのに十分に低い濃度である。一部の実施形態では、該クエンチャー濃度は、約１０ｍＭ未満である。一部の実施形態では、該クエンチャー濃度は、約８ｍＭ未満である。一部の実施形態では、該クエンチャー濃度は、約６ｍＭ未満または約２ｍＭ未満である。一部の実施形態では、該赤血球（ＲＢＣ）は、５５％を超える赤血球沈殿容積（ＰＣＶ）を示す。一部の実施形態では、該ＲＢＣは、６０％を超えるＰＣＶを示す。一部の実施形態では、該ＲＢＣは、約５０，０００未満の平均抗体結合能（ＡＢＣ）を示す。一部の実施形態では、ＲＢＣは、約４０，０００未満の平均ＡＢＣを示す。一部の実施形態では、該ＲＢＣは、約２５，０００〜６０，０００の平均ＡＢＣを示す。一部の実施形態では、該ＲＢＣは、約２５，０００〜７０，０００の平均ＡＢＣを示す。一部の実施形態では、該ＲＢＣは、約３５，０００〜４５，０００の平均ＡＢＣを示す。一部の実施形態では、該組成物は、添加剤溶液（例えば、表２に記載の任意の添加剤溶液、ならびに／または塩化ナトリウム、アデニン、グルコース、ホスフェート、グアノシン、シトレート、および／もしくはマンニトールを含む添加剤溶液）をさらに含む。一部の実施形態では、該添加剤溶液および／または該組成物のクロライド濃度は、約１００ｍＭを超える（または、約１２５ｍＭ）。
【００１８】
さらなる態様において、本発明は、個体に赤血球を注入する方法を提供し、この方法は、ａ）先述の赤血球組成物のいずれか１つまたは本明細書に記載の方法のいずれか１つによって生成された赤血球組成物を提供するステップ、およびｂ）該赤血球組成物を該個体に注入するステップを含む。
【００１９】
一態様において、本発明は、赤血球組成物を処理する方法を提供し、この方法は、ａ）ｉ）反応性求電子性基であるかまたは反応性求電子性基を形成する官能基を含む病原体不活化化合物（例えば、もし存在するとすれば病原体を不活化するための有効量の病原体不活化化合物）、ｉｉ）該病原体不活化化合物の反応性求電子性基と反応可能であるチオール基を含むクエンチャー（例えば、有効量のクエンチャー）、およびｉｉｉ）赤血球含有組成物を混合するステップと、ｂ）元の濃度のクエンチャーで該混合物を保管することから生じる赤血球脱水のレベルと比べて、該混合物を保管することから生じる赤血球脱水のレベルを低減させる量へと、該混合物中の該クエンチャーの濃度を十分に減少させるステップとを含む。これら実施形態の一部では、該クエンチャーの濃度の減少には、不活化中に使用される溶液を除去すること、および最終添加剤溶液（例えば、ＳＡＧ−Ｍ、ＡＳ−５、または表２、３、もしくは４の任意の溶液などの本明細書に記載の任意の溶液）を添加することが含まれる。本方法は、上記で列挙されている実施形態および／または本明細書中の実施形態のいずれか１つまたは複数を含む。
【００２０】
一部の実施形態では、本方法は、好適な塩基を該赤血球含有組成物と混合するステップをさらに含み、該塩基は、塩基無しの該混合物に比べて、該混合物中における該病原体不活化化合物と赤血球との望ましくない反応のレベルを低減するのに十分な量である。一部の実施形態では、該病原体不活化化合物と赤血球との望ましくない反応とは、該病原体不活化化合物による該赤血球の表面の修飾である。一部の実施形態では、方法は、好適な塩基を該赤血球含有組成物と混合するステップをさらに含み、該塩基は、結果として生じる混合物中での該処理された赤血球組成物に結合する抗病原体不活化化合物抗体のレベルを、塩基無しの該混合物と比べて、少なくとも約５％（または、少なくとも約１０％、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、または少なくとも約９０％）低減するのに十分な量である。
【００２１】
一態様において、本発明は、赤血球組成物の脱水を低減する方法を提供し、ここで、該組成物が、病原体不活化化合物と反応可能であるクエンチャーと赤血球とを含む混合物であり、この方法は、元の濃度のクエンチャーで該混合物を保管することから生じる赤血球脱水のレベルと比べて、該混合物を保管することから生じる赤血球脱水のレベルを低減させる量に、該混合物中の該クエンチャー濃度を十分に減少させるステップを含む。
【００２２】
別の態様において、本発明は、本明細書に記載の赤血球組成物を個体に注入することを含む赤血球注入方法を提供する。
本発明は、さらに以下を提供する。
（項目１）
赤血球組成物を処理する方法であって、
（ａ）
（ｉ）反応性求電子性基であるかまたは反応性求電子性基を形成する官能基を含む有効量の病原体不活化化合物と、
（ｉｉ）前記病原体不活化化合物の前記反応性求電子性基と反応可能なチオール基を含む有効量のクエンチャーと、
（ｉｉｉ）赤血球含有組成物とを混合するステップ、および
（ｂ）元の濃度のクエンチャーで前記混合物を保管することから生じる赤血球脱水のレベルと比べて、前記混合物を保管することから生じる赤血球脱水のレベルを低減させる量へと、前記混合物中の前記クエンチャーの濃度を十分に減少させるステップを含む方法。（項目２）
ステップ（ａ）が、好適な塩基を前記赤血球含有組成物と混合することをさらに含み、前記塩基が、前記塩基無しの前記混合物に比べて、前記混合物中における前記病原体不活化化合物と赤血球との望ましくない反応のレベルを低減するのに十分な量である、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記病原体不活化化合物と赤血球との前記望ましくない反応が、前記病原体不活化化合物による前記赤血球の表面の修飾である、項目２に記載の方法。
（項目４）
前記塩基および前記クエンチャーが、前記病原体不活化化合物と前記赤血球組成物とを混合する前、混合と同時に、または混合後約３０分以内に、前記赤血球組成物と混合される、項目２または３に記載の方法。
（項目５）
前記塩基および前記クエンチャーが、前記塩基または前記クエンチャーのいずれかを前記赤血球組成物と混合する前に一緒に混合される、項目２〜４のいずれか一項に記載の方法。
（項目６）
前記塩基がＮａＯＨである、項目２〜５のいずれか一項に記載の方法。
（項目７）
前記塩基が塩基性緩衝液である、項目２〜５のいずれか一項に記載の方法。
（項目８）
前記塩基が、約０．５〜１．５当量の塩基を含み、ここで、当量とは、前記混合物中のクエンチャーのモル量と等価なモル量を意味する、項目２〜７のいずれか一項に記載の方法。
（項目９）
前記塩基が、約０．７５〜１．２５当量の塩基を含み、ここで、当量とは、前記混合物中のステップ（ａ）におけるクエンチャーのモル量と等価なモル量を意味する、項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記塩基が、約１当量の塩基を含み、ここで、当量とは、前記混合物中のステップ（ａ）におけるクエンチャーのモル量と等価なモル量を意味する、項目８に記載の方法。
（項目１１）
ステップ（ａ）の結果として生じる混合物が、３７℃で約６．０〜７．５のｐＨを示す、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２）
ステップ（ａ）の結果として生じる混合物が、３７℃で約６．５〜７．１のｐＨを示す、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
ステップ（ａ）の結果として生じる混合物が、３７℃で約６．８のｐＨを示す、項目１１に記載の方法。
（項目１４）
前記クエンチャーが、システインまたはシステインの誘導体を含む、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５）
前記クエンチャーが、グルタチオンまたはその薬学的に許容され得る塩である、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
ステップ（ａ）の結果として生じる混合物中の前記クエンチャーの濃度が２ｍＭを超える、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１７）
ステップ（ａ）の結果として生じる混合物中の前記クエンチャーが、約５ｍＭ〜約３０ｍＭの濃度である、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
ステップ（ａ）の結果として生じる混合物中の前記クエンチャーが、約１５ｍＭ〜約２５ｍＭの濃度である、項目１６に記載の方法。
（項目１９）
ステップ（ａ）の結果として生じる混合物中の前記クエンチャーが、約２０ｍＭの濃度である、項目１６に記載の方法。
（項目２０）
ステップ（ｂ）におけるクエンチャーの濃度を減少させることが、前記混合物を遠心分離し、その後前記混合物の上清を除去することを含む、項目１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
（項目２１）
ステップ（ｂ）におけるクエンチャーの濃度を減少させることが、サイズ排除分離を含む、項目１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
（項目２２）
ステップ（ｂ）の結果として生じる混合物中の前記クエンチャーが、約１０ｍＭ未満の濃度である、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目２３）
ステップ（ｂ）の結果として生じる混合物中の前記クエンチャーが、約８ｍＭ未満の濃度である、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
ステップ（ｂ）の結果として生じる混合物中の前記クエンチャーが、約６ｍＭ未満の濃度である、項目２２に記載の方法。
（項目２５）
前記官能基が、マスタード、マスタード中間体、およびマスタード同等物からなる群から選択される、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目２６）
前記官能基が、アジリジニウムイオンであるかまたはアジリジニウムイオンを形成可能である、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目２７）
前記反応性求電子性基が、核酸と反応可能である、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目２８）
前記病原体不活化化合物が、核酸結合リガンドをさらに含む、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目２９）
前記核酸結合リガンドが、インターカレーターである、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
前記インターカレーターが、アクリジンである、項目２８に記載の方法。
（項目３１）
前記病原体不活化化合物が、前記官能基と前記核酸結合リガンドとを連結する易壊性リンカーを含む、項目２８〜３０のいずれか一項に記載の方法。
（項目３２）
前記病原体不活化化合物が、β−アラニン、Ｎ−（アクリジン−９−イル）、２−［ビス（２−クロロエチル）アミノ］エチルエステルである、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
ステップ（ａ）の結果として生じる混合物中の前記病原体不活化化合物の濃度が、約０．１μＭ〜約５ｍＭである、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目３４）
ステップ（ａ）の結果として生じる混合物中の前記病原体不活化化合物の濃度が、前記赤血球組成物中における、もし存在するとすれば少なくとも１ｌｏｇの病原体を不活化するのに十分である、項目３３に記載の方法。
（項目３５）
ステップ（ａ）の結果として生じる混合物中の前記病原体不活化化合物の濃度が、前記赤血球組成物中における、もし存在するとすれば少なくとも３ｌｏｇの病原体を不活化するのに十分である、項目３３に記載の方法。
（項目３６）
ステップ（ａ）とステップ（ｂ）との間の時間が、約１〜４８時間である、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目３７）
ステップ（ａ）とステップ（ｂ）との間の時間が、約１０〜３０時間である、項目３６に記載の方法。
（項目３８）
ステップ（ａ）とステップ（ｂ）との間の時間が、約１５〜２５時間である、項目３６に記載の方法。
（項目３９）
前記処理が、前記赤血球組成物中における、もし存在するとすれば少なくとも１ｌｏｇの病原体汚染物質を不活化する、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目４０）
前記処理が、前記赤血球組成物中における、もし存在するとすれば少なくとも３ｌｏｇの病原体汚染物質を不活化する、項目３９に記載の方法。
（項目４１）
前記混合物中の前記病原体不活化化合物の濃度を減少させるステップをさらに含む、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目４２）
前記混合物中の前記クエンチャーの濃度を減少させる前記ステップ、および前記混合物中の前記病原体不活化化合物の濃度を減少させる前記ステップが、同時に生じる、項目４１に記載の方法。
（項目４３）
ステップ（ａ）の２０時間後に、結果として生じる混合物の赤血球が、同一条件下の同一方法に由来するが塩基を使用しない赤血球のＡＢＣ値と比較して、６５％未満の抗体結合能（ＡＢＣ）を示す、項目２〜４２のいずれか一項に記載の方法。
（項目４４）
前記結果として生じる混合物の赤血球が、約５０，０００未満の平均抗体結合能（ＡＢＣ）を示す、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目４５）
前記結果として生じる混合物の赤血球が、約４０，０００未満の平均抗体結合能（ＡＢＣ）を示す、項目４４に記載の方法。
（項目４６）
前記結果として生じる混合物の赤血球が、約２５，０００〜７０，０００の平均抗体結合能（ＡＢＣ）を示す、項目１〜４３のいずれか一項に記載の方法。
（項目４７）
前記結果として生じる混合物の赤血球が、約３５，０００〜４５，０００の平均抗体結合能（ＡＢＣ）を示す、項目４６に記載の方法。
（項目４８）
前記結果として生じる混合物の赤血球が、ステップ（ｂ）後に１％未満の溶血を示す、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目４９）
前記結果として生じる混合物の赤血球が、ステップ（ｂ）の４℃で４２日後の時点で１％未満の溶血を示す、項目４８に記載の方法。
（項目５０）
前記結果として生じる混合物の赤血球が、ステップ（ｂ）後に５０％を超える赤血球沈殿容積を示す、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目５１）
前記結果として生じる混合物の赤血球が、ステップ（ｂ）の４℃で４２日後の時点で５０％を超える赤血球沈殿容積を示す、項目５０に記載の方法。
（項目５２）
前記結果として生じる混合物の赤血球が、ステップ（ｂ）の４℃で４２日後に、１４０を超えるメジアン血球脆弱性値を示す、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目５３）
個体に赤血球を注入する方法であって、項目１〜５２のいずれか一項に記載の方法よって生成された赤血球組成物を個体に注入するステップを含む方法。
（項目５４）
赤血球組成物の脱水を低減する方法であって、前記組成物が、病原体不活化化合物と反応可能であるクエンチャーと赤血球とを含む混合物であり、前記方法は、元の濃度のクエンチャーで前記混合物を保管することから生じる赤血球脱水のレベルと比べて、前記混合物を保管することから生じる赤血球脱水のレベルを低減させる量へと、前記混合物中の前記クエンチャー濃度を十分に減少させるステップを含む方法。
（項目５５）
前記クエンチャーが、システインまたはシステインの誘導体を含む、項目５４に記載の方法。
（項目５６）
前記クエンチャーが、グルタチオンまたはその薬学的に許容され得る塩である、項目５５に記載の方法。
（項目５７）
前記クエンチャーの濃度が、約１０ｍＭ未満に減少される、項目５４〜５６のいずれか一項に記載の方法。
（項目５８）
前記クエンチャーの濃度が、約８ｍＭ未満に減少される、項目５７に記載の方法。
（項目５９）
前記クエンチャーの濃度が、約６ｍＭ未満に減少される、項目５７に記載の方法。
（項目６０）
前記クエンチャーの濃度を減少させた後の前記混合物の赤血球が、１％未満の溶血を示す、項目５４〜５９のいずれか一項に記載の方法。
（項目６１）
前記クエンチャーの濃度を減少させた後の前記混合物の赤血球が、４℃で４２日の時点で１％未満の溶血を示す、項目６０に記載の方法。
（項目６２）
前記クエンチャーの濃度を減少させた後の前記混合物の赤血球が、５０％を超える赤血球沈殿容積を示す、項目５４〜６１のいずれか一項に記載の方法。
（項目６３）
前記クエンチャーの濃度を減少させた後の前記混合物の赤血球が、４℃で４２日の時点で５０％を超える赤血球沈殿容積を示す、項目６２に記載の方法。
（項目６４）
前記クエンチャーの濃度を減少させた後の前記混合物の赤血球が、４℃で４２日後で１４０を超えるメジアン血球脆弱性値を示す、項目５４〜６３のいずれか一項に記載の方法。
（項目６５）
項目１〜６４のいずれか一項に記載の方法によって生成される赤血球含有組成物。
（項目６６）
項目１〜６４のいずれか一項に記載の方法によって調製可能である赤血球含有組成物。（項目６７）
（ａ）病原体不活化化合物の求電子性基と共有結合で反応する赤血球と、
（ｂ）前記病原体不活化化合物と反応可能なチオール基を含むクエンチャーとを含む、組成物であって、
４℃で４２日間の保管後にヒトへと注入するのに好適である組成物。
（項目６８）
もし存在するとすれば少なくとも１ｌｏｇの病原体が不活化される、項目６７に記載の組成物。
（項目６９）
もし存在するとすれば少なくとも３ｌｏｇの病原体が不活化される、項目６８に記載の組成物。
（項目７０）
前記求電子性基が、マスタード、マスタード中間体、およびマスタード同等物からなる群から選択される、項目６７〜６９のいずれか一項に記載の組成物。
（項目７１）
前記求電子性基が、アジリジニウムイオンであるかまたはアジリジニウムイオンを形成可能である、項目６７〜６９のいずれか一項に記載の組成物。
（項目７２）
前記求電子性基が、核酸と反応可能である、項目６７〜７１のいずれか一項に記載の組成物。
（項目７３）
前記求電子性基が、前記赤血球の細胞表面と共有結合で反応する、項目６７〜７２のいずれか一項に記載の組成物。
（項目７４）
前記病原体不活化化合物が、核酸結合リガンドをさらに含む、項目６７〜７３のいずれか一項に記載の組成物。
（項目７５）
前記核酸結合リガンドが、インターカレーターである、項目７４に記載の組成物。
（項目７６）
前記インターカレーターが、アクリジンである、項目７５に記載の組成物。
（項目７７）
前記病原体不活化化合物が、前記求電子性基と前記核酸結合リガンドとを連結する易壊性リンカーを含む、項目６７〜７６のいずれか一項に記載の組成物。
（項目７８）
前記病原体不活化化合物が、β−アラニン、Ｎ−（アクリジン−９−イル）、２−［ビス（２−クロロエチル）アミノ］エチルエステルである、項目７７に記載の組成物。
（項目７９）
前記クエンチャーが、システインまたはシステインの誘導体を含む、項目６７〜７８のいずれか一項に記載の方法。
（項目８０）
前記クエンチャーが、グルタチオンまたはその薬学的に許容され得る塩である、項目７９に記載の組成物。
（項目８１）
前記クエンチャーが、保管中の赤血球脱水を回避するのに十分に低い濃度である、項目６７〜８０のいずれか一項に記載の組成物。
（項目８２）
前記クエンチャーが、約１０ｍＭ未満の濃度である、項目８１に記載の組成物。
（項目８３）
前記クエンチャーが、約８ｍＭ未満の濃度である、項目８１に記載の組成物。
（項目８４）
前記クエンチャーが、約６ｍＭ未満の濃度である、項目８１に記載の組成物。
（項目８５）
前記赤血球が、５５％を超える赤血球沈殿容積を示す、項目６７〜８４のいずれか一項に記載の組成物。
（項目８６）
前記赤血球が、６０％を超える赤血球沈殿容積を示す、項目８５に記載の組成物。
（項目８７）
前記赤血球が、約５０，０００未満の平均抗体結合能（ＡＢＣ）を示す、項目６７〜８４のいずれか一項に記載の組成物。
（項目８８）
前記赤血球が、約４０，０００未満の平均抗体結合能（ＡＢＣ）を示す、項目８７に記載の組成物。
（項目８９）
前記赤血球が、約２５，０００〜７０，０００の平均抗体結合能（ＡＢＣ）を示す、項目６７〜８４のいずれか一項に記載の組成物。
（項目９０）
前記赤血球が、約３５，０００〜４５，０００の平均抗体結合能（ＡＢＣ）を示す、項目８９に記載の組成物。
（項目９１）
項目６７〜９０のいずれか一項に記載の赤血球組成物を個体に注入することを含む、赤血球注入の方法。
（項目９２）
前記混合物の保管が、４℃で１０日間を超える前記混合物の保管である、項目１〜５２または５４〜６４のいずれか一項に記載の方法。
（項目９３）
前記混合物の保管が、４℃で４２日間を超える前記混合物の保管である、項目９２に記載の方法。
（項目９４）
前記塩基および前記クエンチャーの混合が、前記クエンチャーの塩形態をもたらす、項目５に記載の方法。
（項目９５）
前記塩基がグルタチオンであり、前記塩形態がグルタチオンカリウムまたはグルタチオンナトリウムである、項目９４に記載の方法。
（項目９６）
ステップ（ａ）後およびステップ（ｂ）前のクロライド濃度が、約１００ｍＭ未満である、項目１〜５２および項目９２〜９５のいずれか一項に記載の方法。
（項目９７）
ステップ（ａ）後およびステップ（ｂ）前のクロライド濃度が、約７５ｍＭ未満である、項目９６に記載の方法。
（項目９８）
ステップ（ｂ）後のクロライド濃度が、約１００ｍＭを超える、項目１〜５２および項目９２〜９７のいずれか一項に記載の方法。
（項目９９）
ステップ（ｂ）後のクロライド濃度が、約１２５ｍＭを超える、項目９８に記載の方法。
（項目１００）
ステップ（ａ）の前記赤血球含有組成物が、約７０〜９０％の赤血球沈殿容積を示す、項目１〜５２および項目９２〜９９のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０１）
ステップ（ａ）の前記赤血球含有組成物が、約７５〜８５％の赤血球沈殿容積を示す、項目１００に記載の方法。
（項目１０２）
ステップ（ａ）の前記赤血球含有組成物が、約５０〜７０％の赤血球沈殿容積を示す、項目１〜５１および項目９２〜９９のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０３）
ステップ（ａ）の前記赤血球含有組成物が、約５５〜７５％の赤血球沈殿容積を示す、項目１０２に記載の方法。
（項目１０４）
ステップ（ａ）の前記赤血球含有組成物が、約３０〜５０％の赤血球沈殿容積を示す、項目１〜５１および項目９２〜９９のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０５）
ステップ（ａ）の前記赤血球含有組成物が、約３５〜４５％の赤血球沈殿容積を示す、項目１０４に記載の方法。
（項目１０６）
ステップ（ａ）の前記赤血球が、白血球除去されている、項目１〜５２および項目９２〜１０５のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０７）
ステップ（ａ）の前記赤血球が、白血球除去されていない、項目１〜５２および項目９２〜１０５のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０８）
前記クエンチャーの濃度を減少させることが、添加剤溶液の添加を含む、項目１〜５２、項目５４〜６５、および項目９２〜１０７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０９）
前記添加剤溶液が、塩化ナトリウム、アデニン、グルコース、およびマンニトールを含む、項目１０８に記載の方法。
（項目１１０）
前記添加剤溶液が、ホスフェートをさらに含む、項目１０９に記載の方法。
（項目１１１）
前記添加剤溶液が、シトレートをさらに含む、項目１０９または１１０に記載の方法。（項目１１２）
塩化ナトリウム、アデニン、グルコース、およびマンニトールをさらに含む、項目６７〜９０のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１１３）
ホスフェートをさらに含む、項目１１２に記載の組成物。
（項目１１４）
シトレートをさらに含む、項目１１２または１１３に記載の組成物。
（項目１１５）
クロライドが、約１００ｍＭを超える濃度で存在する、項目６７〜９０および１１２〜１１４のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１１６）
クロライドが、約１２５ｍＭを超える濃度で存在する、項目１１５に記載の組成物。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１は、実施例６に記載されているような初回クエンチャー投与後の、種々のレベルの塩基における赤血球の浸透圧脆弱性を示す。
【図２】図２は、２０時間のインキュベーション時の、種々のレベルの塩基における赤血球密度を示す。
【図３】図３は、インキュベーションおよび３６日保管した後の、種々のレベルの塩基における赤血球密度を示す。
【図４】図４は、クエンチャー濃度を減少させておよび減少させずに（つまり置換ステップを行って／行わずに）インキュベーションおよび３６日保管した後の、赤血球の浸透圧脆弱性を示す。
【図５】図５は、中程度の初期クエンチャー濃度（置換ステップを行わない）と比較して、様々な初期クエンチャー濃度（置換ステップを行う）でインキュベーションおよび４２日保管した後の、赤血球の浸透圧脆弱性を示す。
【図６】図６は、病原体不活化化合物と共におよび病原体不活化化合物を伴わずにインキュベーションおよび３６日保管した後の、赤血球の浸透圧脆弱性を示す。
【図７】図７は、本発明の方法を使用して、いくつかの赤血球調製物に対する抗体結合能（ＡＢＣ）値を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明は、望ましくない副反応（望まれない免疫応答に結びつく赤血球の修飾など）を低減または最小限にしながら、処理中および処理後の細胞活性度および／または寿命に対する副作用（例えば、浸透圧脆弱性の減少および／または脱水の増大）を低減または最小限にしながら、存在し得る病原体を不活化するための赤血球組成物の処理方法を提供する。本発明者らは、病原体不活化工程中に好適な量のクエンチャーを併用してｐＨを適切に調節することにより、病原体不活化化合物で処理された赤血球の初期脱水を低減することができることを見出した。その後、該工程では、初期クエンチャー濃度の低減が続き、浸透圧脆弱性を著しく変化させずに細胞保存可能である健康な病原体不活化赤血球を提供することができる。これらの方法は、特に該組成物が臨床使用前にある期間保管される場合、臨床で使用するために病原体が不活化された赤血球組成物の調製に特に好適である。
【００２５】
したがって、本発明は、一実施態様において、（１）該病原体不活化化合物およびクエンチャーを該赤血球含有組成物と混合すること、および（２）元の濃度で混合物を保管することから生じる赤血球脱水のレベルと比べて、該混合物を保管することから生じる赤血球脱水のレベルを低減するために、クエンチャー濃度を十分に減少させることにより、該病原体不活化化合物およびクエンチャーを含む赤血球組成物の処理方法を提供する。
【００２６】
他の実施態様において、本発明は、脱水を低減させる方法および／または赤血球の浸透圧脆弱性を増大させる方法、ならびに赤血球をヒトに注入する方法を提供する。また、処理された赤血球組成物が提供される。
【００２７】
赤血球
本発明の赤血球組成物には、これらに限定されないが、赤血球を含む任意の血液製剤（例えば、ヒト血液）が含まれ、該血液製剤は、例えば注入用などの、ヒト、哺乳動物、および／または脊椎動物に使用するに好適な赤血球を提供するか、または提供するように処理される。赤血球組成物には、例えば、全血、および濃縮赤血球（ｐａｃｋｅｄ  ｒｅｄ
ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌ）（ｐＲＢＣ；例えば、ヘマトクリットを増大させたおよび／または添加剤溶液を含有しない赤血球）などの赤血球濃縮物が含まれる。該赤血球組成物は、それらのヘマトクリットまたは赤血球沈殿容積（ＰＣＶ）、該組成物中の赤血球濃度の尺度により記述され得る。赤血球組成物は、約１〜１００％、より好ましくは約１０〜９０％、また約３５〜８０％、または約４０〜７０％の範囲内にあるヘマトクリットを示していてもよい。かかる赤血球組成物は、病原体不活化化合物およびクエンチャーなどの化学薬品を含んでいてもよい。また、かかる赤血球組成物は、塩または緩衝化された溶液を含む赤血球添加剤溶液（例えば、ＳＡＧ−Ｍ、ＡＳ−５、または表２、３、もしくは４の任意の溶液などの本明細書に記載の任意の溶液）などの、緩衝液および他の溶液を含んでいてもよい。一部の実施形態では、本明細書に記載の赤血球組成物は、本明細書に記載の処理方法での使用前に、約７０〜９０％、または約７５〜８５％、または約８０％の範囲内にあるヘマトクリットを示す濃縮赤血球である。一部の実施形態では、該赤血球組成物は、本明細書に記載の処理方法での使用前および／または使用中に、約５０〜７０％、または約５５〜６５％、または約６０％の範囲内にあるヘマトクリットを示す非濃縮赤血球である。一部の実施形態では、該赤血球組成物は、本明細書に記載の処理方法での使用前および／または使用中に、希釈剤溶液で希釈され、約３０〜５０％、または約３５〜４５％、または約４０％の範囲内にあるヘマトクリットを示す。一部の実施形態では、本明細書中に記載の赤血球組成物は、本明細書中に記載の処理方法での使用前に、白血球除去されている。一部の実施形態では、該赤血球組成物は、白血球除去されていない。生きているヒト、哺乳動物、または脊椎動物に接触するかまたは導入されることになり、かかる接触が、病原体の汚染により疾患を伝染するリスクをもたらす任意の赤血球組成物は、本明細書に記載されているように処理され得る。
【００２８】
血中病原体
存在する場合、本発明の方法において不活化される病原体汚染物質としては、ヒト、他の哺乳動物または脊椎動物において疾患を引き起こし得る任意の核酸含有因子が挙げられる。病原性因子は、単細胞性または多細胞性であり得る。病原体の例は、ヒト、他の哺乳動物または脊椎動物において疾患を引き起こす細菌、ウイルス、原虫、真菌、酵母、かび、およびマイコプラズマである。病原体の一般的な物質は、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得、該一般的な物質は、単鎖または二本鎖核酸として存在し得る。表１に、ウイルスの例を挙げるが、本発明をなんら限定することを意図しない。
【００２９】
（表１．ウイルスの非限定的な例）
【００３０】
【表１】
2014231528.tif 000002
存在し得る病原体汚染物質の不活化に加え、本発明の方法はまた、赤血球組成物中に存在し得る白血球を不活化し得る。白血球低減処理（ｌｅｕｋｏｒｅｄｕｃｔｉｏｎ）方法は、白血球がレシピエントにおいて望ましくない免疫応答をもたらし得るため、好ましくは、ほとんどの白血球を注入が意図される赤血球組成物から除去するために使用され得る。しかしながら、すべての血液が白血球低減処理されるわけではないか、または白血球低減処理方法により、すべての白血球が除去されるのではないかもしれない。したがって、本明細書に記載される本発明の方法によるあらゆる残留白血球の不活化により、かかる免疫応答のリスクがさらに低減され得る。
【００３１】
病原体−不活化化合物
赤血球組成物中の病原体の不活化は、赤血球組成物中の病原体を病原体不活化化合物と接触させることにより行なわれる。本明細書に記載の実施形態のいずれかでは、該病原体不活化化合物（例えば、本明細書に記載のＳ−３０３）は、有効量（例えば、該赤血球組成物中における、もし存在するとすれば、例えば少なくとも１ｌｏｇ、２ｌｏｇ、または３ｌｏｇの病原体を不活化するのに十分な量などの、病原体を不活化するために有効な量）で存在し得る。本発明の方法により使用され得る病原体不活化化合物には、求電子性基などの反応基であるか、または求電子性基などの反応基を形成可能であり、例えばインサイチュで求電子性基などの反応基を形成した官能基を含む化合物が含まれる。一部の場合において、本発明の病原体不活化化合物は、反応性とするための光活性化を必要としない。例えば、該官能基は、マスタード基、マスタード基中間体、マスタード基同等物、エポキシド、ホルムアルデヒドまたはホルムアルデヒド合成物（ｓｙｎｔｈｏｎ）であり得る。かかる官能基は、インサイチュで、反応性基、例えば、求電子性アジリジン、アジリジニウム、チイランまたはチイラニウム（ｔｈｉｉｒａｎｉｕｍ）イオンなどを形成することができるものである。マスタード基は、モノ−またはビス−（ハロエチル）アミン基またはモノ（ハロエチル）スルフィド基であり得る。マスタード同等物は、マスタードと同様の機構によって、例えば、アジリジニウムおよびアジリジン基またはチイランおよびチイラニウム基などの反応性中間体を形成することにより反応する基である。例としては、アジリジン誘導体、モノまたはビス（メシルエチル）アミン基、モノ−（メシルエチル）スルフィド基、モノまたはビス（トシルエチル）アミン基およびモノ−（トシルエチル）スルフィド基が挙げられる。ホルムアルデヒドシンソンは、ホルムアルデヒドに分解される任意の化合物であり、ヒドロキシメチルグリシンなどのヒドロキシルアミンが挙げられる。病原体不活化化合物の反応性基は、病原体の核酸と（例えば、核酸上の求核性基と）反応することができるものである。反応性基はまた、クエンチャーの求核性基と反応することができるものである。病原体不活化化合物はまた、該化合物を核酸に標的化する成分、例えばアンカー部分などを含み得る。アンカー部分は、核酸生体高分子（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡなど）に非共有結合することができる部分を含み、また、核酸結合リガンド、核酸結合基、または核酸結合部分ともいう。かかる化合物の例は、米国特許第５，６９１，１３２号、同第６，４１０，２１９号、同第６，１３６，５８６号、同第６，６１７，１５７号、および同第６，７０９，８１０号（各々は、引用により本明細書に組み込まれる）に記載されている。本発明の方法によってクエンチングされ得る病原体不活化化合物の別の類型は、米国特許第６，５１４，９８７号（引用により本明細書に組み込まれる）に記載されているような、加水分解性リンカーによって核酸結合基に連結された上記の反応性基を含むものである。病原体不活化化合物のアンカー部分は、核酸に対する親和性を有する。この親和性は、核酸と非共有結合的に結合するいくつかの様式（限定されないが、インターカレーション、副溝結合、主溝結合、静電結合（すなわち、リン酸主鎖結合）が挙げられる）いずれかによるものであり得る。該親和性は、結合の混在様式（例えば、インターカレーションおよび副溝結合）にもよる可能性がある。該結合は、配列特異的であってもよく（つまり、他の核酸配列より１つまたは複数の特定の核酸配列に対して結合親和性が増大している）、または非配列特異的であってもよい。かかる核酸結合部分の詳細な例は、上記の特許を見るとよい。
【００３２】
本明細書に記載の方法、組成物およびキットの各々の一部の実施形態では、病原体不活化化合物は、選択したクエンチャーの求核試薬と反応性である反応性求電子性基であるか、または該基を構成する官能基を含み得る。一部の実施形態では、病原体不活化基は、核酸結合リガンドと、求電子性基であるか、または該基を構成する官能基とを含む。
【００３３】
本発明における使用のための適当な病原体不活化化合物の具体的な例は、β−アラニン、Ｎ−（アクリジン−９−イル）、２−［ビス（２−クロロエチル）アミノ］エチルエステル（あるいはまた、本明細書において「Ｓ−３０３」ともいう）であり、その構造は以下の通りであり、その塩も含む。
【００３４】
【化１】
2014231528.tif 000003
一部の実施形態では、赤血球組成物およびクエンチャーを含む混合物中のＳ−３０３などの病原体不活化化合物の濃度は、約０．０５ｍＭ〜４ｍＭ、約０．０５ｍＭ〜２ｍＭ、約０．０５ｍＭ〜０．５ｍＭ、約０．１ｍＭ〜０．３ｍＭ、または約０．２ｍＭの範囲である。一部の実施形態では、病原体の不活化化合物に対するクエンチャーのモル比は、いったん両成分が赤血球組成物と混合されていると、約１０：１〜約４００：１、同様に約１０：１〜約２００：１、同様に約２０：１〜約２００：１、同様に約５０：１〜約２００：１、同様に約１００：１である。
【００３５】
クエンチャー
本発明の方法で使用するためのクエンチャーは、病原体を不活化する（例えば、望まれない免疫応答に結びつき得る、該病原体不活化化合物のＲＢＣ表面への結合）ために使用される反応性求電子種の望ましくない副反応を低減することを目的としている。本明細書に記載の実施形態のいずれかでは、該クエンチャー（例えば、本明細書に記載のグルタチオン）は、有効量（例えば、本明細書に記載の量などの、望ましくない副反応を低減するのに有効な量）で存在し得る。好適なクエンチャーは、病原体不活化化合物の該求電子性基と反応することができる求核性基を含むものである。非限定的な例は、米国特許第６，７０９，８１０号（引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）に詳細に記載されている。一部の実施形態において、クエンチャーは、赤血球組成物における望ましくない副作用を有意に低減させることができると同時に、病原体不活化化合物が、赤血球組成物を汚染状態であり得る病原体を充分に不活化するのを可能にする。一部の実施形態において、改善された本発明の方法は、細胞の浸透圧脆弱性を顕著に改変せずに（例えば、低下させずに）かつ脱水を顕著に改変せずに（例えば、増大させずに）、望ましくない副作用（例えば、病原体不活化化合物の結合）の最適な低減と充分な病原体の不活化を同時にもたらす条件下で、有効量の病原体不活化化合物との組み合わせでの有効量のクエンチャーを提供する。種々の望ましくない副作用（例えば、タンパク質および／または赤血球成分と病原体不活化化合物との反応）が低減され得る。一部の実施形態では、クエンチャーは、赤血球の修飾、例えば、赤血球へのＩｇＧの結合または赤血球への病原体不活化化合物の結合の最適な低減を提供する。本発明の方法は、エキソビボ赤血球の処理組成物を伴うが、一部のクエンチャーは、個体内への導入時に該組成物中に残留し得る。一部の実施形態において、したがって、本発明のクエンチャーは、注入に適したものである。好適なクエンチャーとしては、限定されないが、チオール基を含む化合物、例えば、アミノ酸であるシステインまたは適当なシステイン誘導体（例えば、Ｎ−アセチルシステインなど）を含むクエンチャーなどが挙げられる。かかるクエンチャーの例としては、システイン、および少なくとも１個のシステインを含むペプチド、例えばグルタチオンなどが挙げられる。一部の実施形態では、適当なクエンチャーは、さらなる化学薬品または添加酵素の使用を伴って、または該使用なしでインサイチュでチオール基を形成し得るシステイン誘導体、例えば、Ｓ−アセチルシステインまたは他の適当なシステインのチオール由来プロドラッグ、またはＳ−アセチルシステインもしくは他の適当なシステインのチオール由来プロドラッグを含むペプチドなどを含むものである。好適なシステイン誘導体は、病原体不活化化合物の該求電子性基と反応することができるシステイニルチオールを含むもの、または該システイニルチオールをインサイチュで形成することができるもののいずれかである。
【００３６】
一部の実施形態では、クエンチャーは、２〜１０個のアミノ酸のペプチドであり、該アミノ酸の少なくとも１個が、システイン、Ｎ−アセチルシステイン、Ｓ−アセチルシステインまたは他の適当なシステイン誘導体である。一部の実施形態では、クエンチャーは、少なくとも３個のアミノ酸、例えば約３〜１０個のアミノ酸、同様に約３〜６個のアミノ酸のペプチドであり、該アミノ酸の少なくとも１個が、システイン、Ｎ−アセチルシステイン、Ｓ−アセチルシステインまたは他の適当なシステイン誘導体である。一部の実施形態では、クエンチャーは、少なくとも３個のアミノ酸、例えば約３〜１０個のアミノ酸、同様に約３〜６個のアミノ酸のペプチドであり、該アミノ酸の少なくとも１個が、システイン、Ｎ−アセチルシステイン、Ｓ−アセチルシステインまたは他の適当なシステイン誘導体であり、同様に、該アミノ酸の少なくとも２個または少なくとも３個が、システイン、Ｎ−アセチルシステイン、Ｓ−アセチルシステインまたは他の適当なシステイン誘導体である。
【００３７】
好ましい実施形態では、該クエンチャーは、中和グルタチオン（Ｌ−グルタチオンおよびγ−Ｌ−グルタミル−Ｌ−システイニル−グリシンとしても公知）である。グルタチオンは、グルタチオンをクエンチャーとして特に有用にする多くの特性を有する。グルタチオンは、通常すべての細胞型で存在する。グルタチオンは、細菌および脂質エンベロープウイルスの細胞膜または脂質コートを通り抜けることによって、または非エンベロープウイルスのウイルスカプシドを通り抜けることによってなど、受動的に病原体へと透過することができるとは考えられていない。ほぼ中性ｐＨのグルタチオンは荷電されており、能動輸送の非存在下では、いかなる有意な程度でも脂質二重層を透過しない。これは、２ｍＭを超える中和グルタチオンの濃度を使用することを含む、ＨＩＶおよびＶＳＶなどの脂質エンベロープウイルスの不活化が、グルタチオンによって実質的に影響されないことと一致する。グルタチオンの使用は、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、およびＳｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓの不活化に対してある影響を及ぼす。しかしながら、これは、有効量の中和グルタチオンおよび病原体不活化化合物を使用することにより管理することができる。そのため、ウイルス性または細菌性の病原体による赤血球組成物の汚染が、少なくとも２ｌｏｇ、好ましくは少なくとも３ｌｏｇ不活化される好ましいクエンチング方法が提供される。一部の実施形態では、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓは、少なくとも３ｌｏｇ、また約４ｌｏｇ、または約５ｌｏｇまで不活化され得、ＶＳＶは、少なくとも４ｌｏｇ、また約５ｌｏｇ、または約６ｌｏｇまで不活化することができる。一部の実施形態では、Ｓ−３０３によるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓの不活化は、２ｍＭ酸性グルタチオンおよび０．２ｍＭ  Ｓ−３０３により不活化された類似組成物の不活化の約３ｌｏｇ、また約２ｌｏｇ、または約１ｌｏｇ以内である。一部の実施形態では、Ｓ−３０３によるＶＳＶの不活化は、２ｍＭ酸性グルタチオンおよび０．２ｍＭ  Ｓ−３０３により不活化された類似組成物の不活化の約２ｌｏｇ、または約１ｌｏｇ以内、またはそれと本質的に同じである。適切な条件下では、本発明により記載されているように、グルタチオンは、赤血球のｉｎ  ｖｉｔｒｏ保管とも適合しており、結果として生じる赤血球組成物は、ｉｎ  ｖｉｖｏ導入に好適である。
【００３８】
一部の実施形態では、クエンチャーが、その還元された形態においてグルタチオンである。グルタチオンの酸化された形態であるグルタチオンジスルフィドもまた、グルタチオンジスルフィドが溶液中で、該溶液を赤血球組成物を含む混合物に添加する前に溶液中で充分還元されるか、または赤血球組成物を含む混合物に添加した後に充分に還元される限り使用され得る。
【００３９】
一部の実施形態では、クエンチャーは、グルタチオンの誘導体、例えば、グルタチオンモノアルキルエステルまたはジアルキルエステルなどであり、このとき、該アルキル基は、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖または分枝鎖基である。該アルキル基の具体例としては、限定されないが、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、ｔｅｒｔ−ペンチル基、１−メチルブチル基、ヘキシル基、イソヘキシル基、２−メチルペンチル基、１−エチルブチル基、ペプチル基、オクチル基、ノニル基、およびデシル基が挙げられる。例えば、グルタチオン誘導体の非限定的な例としては、グルタチオンメチルエステル、グルタチオンモノエチルエステル、およびグルタチオンモノイソプロピルエステルが挙げられる。一部の実施形態では、グルタチオン酸化ジエチルエステル（ＧＳＳＧ−（グリシル）−ジエチルエステル）が使用される。一部の実施形態では、グルタチオンのチオエステルを、赤血球組成物への添加後に加水分解してチオールを形成する。
【００４０】
一部の実施形態では、クエンチャーが遊離の酸または塩基の形態で提供されるのに対し、他の実施形態では、クエンチャーが塩の形態で提供されることを理解されたい。クエンチャーが塩の形態である場合、該塩は、好ましくは、薬学的に許容され得る塩である。化合物の薬学的に許容され得る塩（水溶性もしくは油溶性または分散性生成物の形態）としては、例えば、無機系または有機系の酸または塩基から形成される慣用的な非毒性の塩または第４級アンモニウム塩が挙げられる。かかる酸付加塩の例としては、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、重硫酸塩、酪酸塩、クエン酸塩、ショウノウ酸塩、カンフルスルホン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプタン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシエタンスルホン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、シュウ酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバリン酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トシル酸塩、およびウンデカン酸塩が挙げられる。塩基塩としては、アンモニウム塩、アルカリ金属塩（ナトリウム塩およびカリウム塩など）、アルカリ土類金属塩（カルシウム塩およびマグネシウム塩など）、有機塩基との塩（ジシクロヘキシルアミン塩、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミンなど）、ならびにアルギニン、リシンなどのアミノ酸との塩などが挙げられる。また、塩基性窒素含有基を、低級アルキルハロゲン化物、例えば、メチル、エチル、プロピル、およびブチルの塩化物、臭化物およびヨウ化物；ジアルキル硫酸塩（ジメチル、ジエチル、ジ（ｄｉｄ）ブチルなど）；ならびにジアミル硫酸塩、長鎖のハロゲン化物（例えば、デシル、ラウリル、ミリスチルおよびステアリルの塩化物、臭化物およびヨウ化物、アラルキルハロゲン化物（例えば、ベンジルおよびフェネチル臭化物）などの薬剤で第４級化してもよい。他の薬学的に許容され得る塩としては、硫酸塩エタノレート（ｅｔｈａｎｏｌａｔｅ）および硫酸塩が挙げられる。
【００４１】
例えば、一部の実施形態では、クエンチャーが、グルタチオンから形成された薬学的に許容され得る塩の形態である。一部の実施形態では、クエンチャーが、グルタチオンおよび１種類以上のカチオン（例えば、ナトリウム、アルミニウム、カルシウム、リチウム、マグネシウム、亜鉛、またはテトラメチルアンモニウムなど）から形成された薬学的に許容され得る塩の形態である。一部の実施形態では、クエンチャーが、グルタチオン（還元型）であり、グルタチオン一ナトリウム塩（例えば、Ｂｉｏｍｅｄｉｃａ  Ｆｏｓｃａｍａ（イタリア）から入手可能である）の形態で提供される。一部の他の実施形態では、グルタチオン（還元型）が、グルタチオン塩酸塩の形態で提供される。一部の他の実施形態では、グルタチオンが、グルタチオン（還元型）二ナトリウム塩の形態で提供される。さらなる実施形態では、グルタチオンモノアルキルエステル硫酸塩が使用される。一部の実施形態では、グルタチオンが、グルタチオン酸化二ナトリウム塩の形態で提供される。
【００４２】
不活化およびクエンチングの方法
本発明の方法には、赤血球組成物を病原体不活化化合物およびクエンチャーと混合する際、結果として生じる組成物のｐＨが、適切な病原体不活化および望ましくない副反応（赤血球の修飾など）の低減を提供するのに好適な範囲内にあり、処理された血液製剤の活性度（例えば、浸透圧脆弱性および脱水）および／または寿命に対する影響が限定的であるかまたは影響がない条件下で、該組成物を該病原体不活化化合物およびクエンチャーと組み合わせることを伴う。さらに、本発明は、病原体不活化の期間後に該赤血球組成物中のクエンチャー濃度を減少させて、保管中の赤血球の活性度および寿命を維持することを支援することを記述する。本明細書に記載のような添加剤溶液も保管中の赤血球に使用することができ、病原体不活化中に使用される処理溶液および／または希釈剤溶液を置換するために使用され得る。
【００４３】
改善された方法には、クエンチングに重要であり得るいくつかの特徴が含まれる。第１の特徴は、チオール基または他の好適な求核性基である。第２は、溶液のｐＨの調整である。溶液のｐＨを適切に調整することにより、あるレベルのクエンチングを提供することが可能である。そのため、本発明のクエンチャーは、該赤血球含有組成物にいくつかの緩衝能力を提供し、該緩衝能力それ自体が、クエンチングの改善を提供する。例えば、該赤血球組成物の好適なｐＨ変化を提供するために適切に修飾する際に、クエンチャーとしてメチオニンなどのシステイン類似体を使用することは、該赤血球に対する該病原体不活化化合物の結合のあるレベルのクエンチングをもたらすだろう。メチオニンの硫黄原子が求核性でないため、メチオニンは、該溶液の必要なｐＨを提供する以外にいかなるクエンチングも提供しない。したがって、ｐＨ調整とチオール基との組み合わせは、クエンチングの改善を提供する。ｐＨおよび塩基当量の適切な調整は、不活化期間中の赤血球脱水レベルを減少させることもできる。一部の実施形態においてクエンチングの改善を提供するのに重要であり得る第３の特徴は、ウイルスおよび細菌などの病原体の内部に実質的に透過しない好ましいクエンチャーの選択である。かかるクエンチャーは、細胞外環境における適切なクエンチングを提供し、該病原体内部に透過すると、病原体不活化化合物のさらなるクエンチング無しで、赤血球表面に対する結合などの有害反応が生じる。最後に、本発明の改善されたクエンチング法には、不活化した後、および一部の場合には保管用の添加剤溶液を添加した後で、クエンチャー濃度を減少させることが含まれる。該赤血球は、クエンチャーの全体的な濃度が好適レベルに減少する場合に、保管中の寿命の改善および脱水レベルの減少を示した。
【００４４】
一実施態様において、本発明は、赤血球組成物を処理する方法であって、ａ）ｉ）反応性求電子性基であるかまたは反応性求電子性基を形成する官能基を含む病原体不活化化合物（例えば、もし存在するとすれば、病原体を不活化するための有効量の病原体不活化化合物）と、ｉｉ）該病原体不活化化合物の該反応性求電子性基と反応可能であるチオール基を含むクエンチャー（例えば、本明細書に記載されているような有効量のクエンチャー）と、ｉｉｉ）赤血球含有組成物とを提供するステップ、ｂ）該病原体不活性化合物および該クエンチャーを、該赤血球含有組成物と混合するステップ、ならびにｃ）元の濃度のクエンチャーで該混合物を保管することから生じる赤血球脱水のレベルと比べて、該混合物を保管することから生じる赤血球脱水のレベルを低減させる量へと、該混合物中の該クエンチャーの濃度を十分に減少させるステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、ステップ（ａ）は好適な塩基を提供することをさらに含み、ステップ（ｂ）は、該塩基と該赤血球含有組成物とを混合することをさらに含み、該塩基は、該塩基無しの混合物に比べて、該混合物中における該病原体不活化化合物と赤血球との望ましくない反応のレベルを低減するのに十分な量である。一部の実施形態では、該病原体不活化化合物と赤血球との望ましくない反応とは、該病原体不活化化合物による該赤血球の表面の修飾である。一部の実施形態では、ステップ（ａ）は好適な塩基を提供することをさらに含み、ステップ（ｂ）は、該塩基と該赤血球含有組成物とを混合することをさらに含み、該塩基は、結果として生じる混合物における、該処理された赤血球組成物に結合する抗病原体不活化化合物抗体のレベルを、該塩基無しの混合物と比べて、少なくとも約５％（または、少なくとも約１０％、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、または少なくとも約９０％）低減するのに十分な量である。一部の実施形態では、該混合物の保管は、４℃または室温で、７、１０、１４、２１、２８、３５、または４２日間より長い、それと同じ、またはそれ未満の保管である。一部の実施形態では、該混合物は、添加剤溶液（例えば、表２に記載の任意の添加剤溶液、ならびに／または塩化ナトリウム、アデニン、グルコース、ホスフェート、グアノシン、シトレート、および／もしくはマンニトールを含む添加剤溶液）中で保管される。一部の実施形態では、本方法は、処理中に使用される溶液を、添加剤溶液（例えば、表２に記載の任意の添加剤溶液、ならびに／または塩化ナトリウム、アデニン、グルコース、ホスフェート、グアノシン、シトレート、および／もしくはマンニトールを含む添加剤溶液）に置換することをさらに含む。
【００４５】
さらなる実施態様において、本発明は、赤血球の脱水を低減する方法であって、ａ）ｉ）病原体不活化化合物と反応可能なクエンチャーとｉｉ）赤血球を含む赤血球組成物とを提供するステップ、およびｂ）元の濃度のクエンチャーで該混合物を保管することから生じる赤血球脱水のレベルと比べて、該混合物を保管することから生じる赤血球脱水のレベルを低減させる量へと、該混合物中の該クエンチャー濃度を十分に減少させるステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、該混合物の保管は、４℃または室温で、７、１０、１４、２１、２８、３５、または４２日間より長い、それと同じ、またはそれ未満の保管である。一部の実施形態では、本方法は、例えば保管の前に、添加剤溶液（例えば、表２に記載の任意の添加剤溶液、ならびに／または塩化ナトリウム、アデニン、グルコース、ホスフェート、グアノシン、シトレート、および／もしくはマンニトールを含む添加剤溶液）の添加をさらに含む。
【００４６】
本明細書に記載の方法で使用されるクエンチャーおよび／または添加塩基（または中和クエンチャー）は、該病原体不活化化合物を該赤血球組成物に添加する前に、添加と同時に、または添加後に、該赤血球組成物と混合され得る。クエンチャーおよび塩基（または中和クエンチャー）が、該病原体不活化溶液と該赤血球組成物が混合された後で、該赤血球組成物と混合される場合、クエンチャーおよび／または塩基（または中和クエンチャー）は、好ましくは、該病原体不活化化合物と該赤血球との相当量の副反応が生じる前に該赤血球組成物に添加され、その結果、望まれない副反応の適切なクエンチングを達成することができる。一部の実施形態では、該クエンチャーおよび／または塩基（または中和クエンチャー）は、該病原体不活化化合物を該赤血球組成物と混合した後で、約１時間以内に、約３０分以内に、約２０分以内に、約１０分以内に、約５分以内に、約２分以内に、または約１分以内に該赤血球組成物と混合される。一部の実施形態では、該クエンチャーおよび塩基は、該病原体不活化化合物と同時に該赤血球組成物と混合される。
【００４７】
本明細書に記載の方法の各々の一部の実施形態では、該クエンチャーおよび該添加塩基（または中和クエンチャー）は、該病原体不活化化合物を該赤血球組成物と混合する前の約１時間未満、約３０分未満、約２０分未満、約１０分未満、約５分未満、約２分未満、または約１分未満など、該病原体不活化化合物（例えば、Ｓ−３０３）を添加する前の好適な時間間隔の間、該赤血球組成物で前処理される。一部のさらなる実施形態では、該前処理は、約１℃〜３０℃、また約１８℃〜２５℃、または約３７℃の温度、または室温においてである。
【００４８】
本明細書に記載の方法の各々の一部の実施形態では、該病原体不活化化合物（例えば、Ｓ−３０３）は、約３０分から４８時間、また約２〜３６時間、また約８〜２４時間、また約２０時間などの好適な時間間隔の間、該クエンチャーおよび該添加塩基（または中和クエンチャー）の存在下で該赤血球組成物と共にインキュベートされる。一部のさらなる実施形態では、該インキュベーションは、約１℃〜３０℃、また約１８℃〜２５℃の温度範囲、または約３７℃、または室温付近においてである。
【００４９】
該赤血球組成物のｐＨを調整する特徴に関して、かかる病原体不活化化合物をクエンチングする従来方法は、不活化中のクエンチング効率および細胞活性度の両方に関して、結果として生じる混合物のｐＨの重要性を認識していない。従来方法は、該病原体不活化化合物の望ましくない副反応を適切にクエンチングするために十分な塩基および好適なｐＨレベルの必要性を示しているが（例えば、非プロトン化グルタチオンのレベルを増大させて、ＲＢＣ表面に対する該病原体不活化化合物の結合を低減することにより）、これらの方法は、不活化工程中の細胞脱水に対する塩基増大の効果を認識および記述していない。したがって、本発明の一実施態様には、該病原体不活化化合物およびクエンチャー（例えば、有害に作用する脱水を回避する好適なレベル）のインキュベーションに好適なレベルに該赤血球組成物のｐＨを調整することが伴う。
【００５０】
一部の実施形態では、該病原体不活化化合物およびクエンチャーを該赤血球組成物と混合する際、該混合物のｐＨは、該病原体不活化化合物の望ましくない副反応（例えば、望まれない免疫応答に結びつき得る、該ＲＢＣ表面に対する該病原体不活化化合物の結合）を低減し、不活化中の細胞脱水を十分に低減するのに好適なレベルにある。一部の実施形態では、該望ましくない副反応は、該病原体不活化化合物による該赤血球の表面の修飾である。一部の実施形態では、該修飾は、該赤血球の表面に対する該病原体不活化化合物の共有結合である。一部の実施形態では、該修飾は、該赤血球の表面に対する該病原体不活化化合物の非共有結合である。
【００５１】
本明細書に記載のように、本方法の各々の一部の実施形態では、該病原体不活化化合物と該赤血球との望まれない（本明細書では「望ましくない」とも呼ばれる）副反応が低減される。一部の実施形態では、該低減される望まれない副反応は、該病原体不活化化合物による該赤血球の表面の修飾である。一部の実施形態では、副反応のレベルは、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、または少なくとも約９０％低減される。該副反応の減少は、例えば、該処理された赤血球に対する、該病原体不活化化合物に特異的な抗体の結合の量を測定することにより、および／または該処理された赤血球の寿命をｉｎ  ｖｉｖｏで測定し、これらの測定を、第２の異なる方法（例えば、十分なクエンチャーおよび／または塩基が該反応混合物に加えられない方法、クエンチャーおよび／または塩基が該反応混合物に加えられない方法、および／またはより低いｐＨでの処理）により処理された赤血球と比較することにより証明され得る。例えば、本明細書に記載の方法の一部の実施形態では、該処理された血球に結合する抗病原体不活化化合物抗体のレベルは、第２の方法（例えば、十分なクエンチャーおよび／または塩基が該反応混合物に加えられない方法、クエンチャーおよび／または塩基が該反応混合物に加えられない方法、および／またはより低いｐＨでの処理）と比べて、少なくとも約１０％、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、または少なくとも約９０％減少する。
【００５２】
一部の実施形態では、該病原体不活化化合物およびクエンチャーを該赤血球組成物と混合する際、該混合物のｐＨは、約６．０〜８．５、約６．０〜７．５、約６．５〜７．１、約６．５〜７．０、約６．６〜６．８の範囲内にあるか、または約６．６、６．７、６．８、もしくは６．９である。赤血球組成物のｐＨは時間と共に変化し得るが、クエンチャーが該赤血球組成物に添加される場合、該赤血球組成物が病原体不活化化合物を既に含有しているか否かに関わらず、ｐＨは所望の範囲内にあることが望ましい。本発明の方法には、病原体不活化化合物およびクエンチャーを赤血球組成物に添加することが伴う。所望のｐＨ範囲は、該赤血球組成物に対する該病原体不活化化合物および／またはクエンチャーの添加の順序に関わらず、該病原体不活化化合物およびクエンチャーの両方を添加する際に必要である。言いかえれば、３つの成分がすべて混合されると、ｐＨは所望の範囲内にある。一部の実施形態では、クエンチャーは、病原体不活化化合物の前に添加される。一部の実施形態では、病原体不活化化合物は、クエンチャーの前に添加される。一部の実施形態では、クエンチャーおよび病原体不活化化合物は、本質的に同時に添加される。したがって、病原体不活化化合物およびクエンチャーを添加する際とは、該クエンチャーおよび病原体不活化化合物が両方とも該赤血球組成物と混合された時点を意味する。所望のｐＨはいくつかの手段により達成することができ、該赤血球組成物のｐＨがいつ調整されるかに関しては限定されておらず、または一部の実施形態では、該血液製剤の本来のｐＨから著しく離れては調整されない。例えば、該赤血球組成物の所望のｐＨは、ｐＨの調整により達成することができる。ｐＨ調整は、例えば、該病原体不活化化合物およびクエンチャーを添加する前に、緩衝化された溶液などの好適な添加剤溶液の添加により実施され得る。一部の実施形態では、該赤血球組成物は、同じまたは他の好適な緩衝液中に懸濁する前に、好適な緩衝液で１回または複数回洗浄されてもよい。あるいは、該赤血球組成物のｐＨは、該病原体不活化化合物、該クエンチャー、またはその両方のいずれかの添加と同時に調整することができる。一部の実施形態では、ｐＨは、該クエンチャーの添加と同時に調整される。一部の実施形態では、該クエンチャーは中和され、その結果、該中和クエンチャーの添加は、該赤血球組成物の所望のｐＨ範囲をもたらす。一例として、グルタチオンの中和を使用して、必要なｐＨ調整を達成することができる。一部の実施形態では、該グルタチオンの適切なレベルの中和を使用して、例えば１当量の塩基を添加することにより、赤血球組成物の添加の際に該組成物の必要なｐＨ調整をもたらすことになるクエンチャーを提供することができる。適切な中和は、使用されるクエンチャーに依存するだろう。例えば、ペプチドが使用される場合、適切な中和は、該ペプチドのアミノ酸成分に依存し得る。一部の実施形態では、該赤血球組成物のｐＨに著しい影響を及ぼさないクエンチャーを使用することができる。例えば、１つまたは複数のアミノ酸をさらに含み得るシステインを含むペプチドの使用は、天然に単離されたペプチドの溶液のより中性のｐＨをもたらす。一部の実施形態では、該ペプチドは、アルギニンまたはリジンなどの、少なくとも１つの塩基性アミノ酸をさらに含む。
【００５３】
塩基を赤血球組成物と、病原体不活化化合物およびクエンチャーとともに混合して、混合物のｐＨを所望のレベルまで増大および／または望ましくない副作用のクエンチングを改善する本明細書に記載の方法の一部の実施形態では、塩基は塩基性の塩である。塩基性の塩は、赤血球組成物と混合する前に最初に水溶液中に溶解させてもよい。他の実施形態において、塩は、固体形態の赤血球組成物に直接添加してもよい。一部の実施形態では、塩基性の塩がクエンチャーを含み、クエンチャーおよび該塩基の両方を混合物に提供する。一部の実施形態では、該方法において使用される塩基は、ＮａＯＨなどの強塩基である。典型的には、ＮａＯＨなどの強塩基は、赤血球組成物と混合する前に最初に水溶液中に溶解させる。一部の実施形態では、強塩基（例えば、溶液状または固体形態）を、クエンチャーを赤血球組成物と混合する前にクエンチャーと混合する。一部の実施形態では、塩基は塩基性緩衝液である（充分な量で添加され、適切なｐＫａを有し、混合物が所望のｐＨ範囲に至る）。塩基性緩衝液が使用される場合、緩衝液は、一部の実施形態では、薬学的に許容され得る緩衝液である。一部の実施形態では、緩衝液は、滴定可能なプロトンを有し、ｐＫａが約７〜８の範囲である。塩基性緩衝液として使用され得る緩衝液の例としては、限定されないが、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−ピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、およびリン酸ナトリウム緩衝液が挙げられる。他の適当な塩基性緩衝液は、当業者によって容易に特定され得よう。
【００５４】
本明細書に記載の方法および組成物の各々の一部の実施形態では、赤血球、クエンチャー、病原体不活化化合物および任意の添加塩基の混合物のｐＨは、約５．５より高いか、約５．７より高いか、約６．０より高いか、約６．３より高いか、約６．５より高いか、約６．７より高いか、約７．０より高いか、または約７．２より高い。本明細書に記載の方法および組成物の各々の一部の実施形態では、赤血球、クエンチャー、病原体不活化化合物および塩基（もし、添加されていれば）の混合物のｐＨは、約６．０〜８．５、約６．０〜７．５、約６．５〜７．１、約６．５〜７．０、もしくは約６．６〜６．８の範囲であるか、または約６．６、６．７、６．８もしくは６．９である。一部の実施形態では、表示したｐＨは室温でのｐＨである。一部の実施形態では、表示したｐＨは３７℃でのｐＨである。例えば、一部の実施形態では、赤血球を含む該組成物を病原体不活化化合物で、クエンチャーおよび任意の添加塩基の存在下で処理し、このとき、混合物のｐＨは、３７℃で約６．５〜約７．０（または７．１）の範囲である。
【００５５】
一部の実施形態では、赤血球、クエンチャーおよび塩基（該方法の一部として塩基が添加される場合）の混合物のｐＨが、病原体不活化化合物と赤血球組成物との混合前で、約６．０〜８．５、約６．０〜７．５、約６．５〜７．１、約６．５〜７．０、もしくは約６．６〜６．８の範囲であるか、または約６．５、６．７、６．８もしくは６．９である。一部の他の実施形態では、該ｐＨは、病原体不活化化合物と赤血球を含む該組成物との混合と同時、または約１時間以内、約３０分以内、約２０分以内、約１０分以内、約５分以内、または約２分以内に達成される。ｐＨを調整する方法の一部の実施形態では、ｐＨを、病原体不活化化合物と赤血球を含む該組成物との混合の前、混合と同時、混合の約１時間以内、約３０分以内、約２０分以内、約１０分以内、約５分以内、または約２分以内に、所望のｐＨ範囲に調整する。クエンチャーがグルタチオンであり、病原体不活化化合物がＳ−３０３である実施形態では、赤血球組成物およびクエンチャーを含む混合物のｐＨは、好ましくは、Ｓ−３０３を赤血球組成物と混合する前に、所望のｐＨ範囲（例えば、ｐＨ６．５〜７．０）に調整される。
【００５６】
一部の実施形態では、赤血球、クエンチャーおよび塩基を混合した後の組成物で得られるｐＨは、必ずしも、最初の赤血球組成物のｐＨが調整されたものではない。例えば、赤血球組成物が、６．０〜７．５の所望の範囲のｐＨを有し得、該組成物のｐＨは、クエンチャー、続く病原体不活化化合物の添加によって有意に変化しない。かかる実施形態では、クエンチャーは、自然状態で所望のｐＨを提供するか、または所望のｐＨが提供されるようにしかるべく中和されるかのいずれかである。重要なのは、約５ｍＭ〜約４０ｍＭなどの高い初期量のクエンチャーを添加することと、所望の範囲のｐＨがもたらされることとの組合せである。例えばグルタチオンをかかる濃度で用いる公知の方法は、本発明の他の局面と組み合わせて、所望のｐＨ範囲では使用されていない。したがって、ペプチドでは、どのペプチドクエンチャーであるかにかかわらず、赤血球組成物に添加されると必要に応じて適当なｐＨ範囲をもたらすように効果的に中和され得、さらに、所望のｐＨ範囲で適当な量の緩衝がもたらされるように選択され得る。したがって、中和クエンチャーとは、クエンチャーが、赤血球組成物に添加されると、得られる混合物が、不活化の間、細胞の脱水を回避しながら、より良好な望ましくない副作用（例えば、望ましくない免疫応答を導き得るＲＢＣ表面への病原体不活化化合物の結合）のクエンチングを提供するｐＨ、例えば、約６．０〜８．５、約６．０〜７．５、約６．５〜７．０、約６．５〜７．１、もしくは約６．６〜６．８の範囲であるか、または約６．６、６．７、６．８もしくは６．９のｐＨを有するように、必要に応じて酸または塩基により適当に滴定されていることを意味する。一部の実施形態では、自然状態で単離されたペプチドが適当に中和される、すなわち、最終混合物に所望のｐＨをもたらすための酸または塩基の添加を必要としない。さらに、好ましいクエンチャーは、ｐＨを所望の範囲内に、望ましくない副作用をクエンチングするのに必要な時間、維持するための緩衝能を提供する。
【００５７】
本明細書に記載の方法および組成物の各々の一部の実施形態では、クエンチャーが中和されている。クエンチャーは、充分な量の塩基がクエンチャーと合わされており、その結果、病原体不活化化合物と赤血球間の望ましくない副作用のクエンチングが、赤血球を含む該組成物、病原体不活化化合物およびクエンチャーを含む混合物において改善される場合、塩基によって「中和されている」という。「中和クエンチャー」は、必ずしも中性ｐＨを有するとは限らず、荷電していないとも限らない。一部の実施形態において、中和クエンチャーは、その最もプロトン化された形態でもその最も脱プロトン化された形態でもない。一部の実施形態では、クエンチャーが非常に酸性である場合、中和クエンチャーのｐＨは、依然として７．０未満であり得る（例えば、約６．６、６．７、６．８または６．９）。一部の実施形態では、中和クエンチャーの溶液のｐＨは、７．０より高い場合もあり得る。一部の実施形態では、中和クエンチャーの溶液のｐＨは、塩基の添加前のクエンチャーのものより検出可能に高い。一部の実施形態では、クエンチャーを、少なくとも約０．２５当量、少なくとも約０．５当量、少なくとも約０．７５当量、少なくとも約１当量、少なくとも約１．２５当量、少なくとも約１．５当量、または少なくとも約２当量の塩基で中和する。一部の実施形態では、クエンチャーを、約２当量未満、約１．５当量未満、約１．２５当量未満、約１当量未満、または約０．７５当量未満の塩基で中和する。一部の実施形態では、クエンチャーを、約０．２５〜約２当量、約０．５〜約１．５当量、または約０．７５〜約１．２５当量の塩基で中和する。一部の実施形態では、クエンチャーを、約０．７５当量の塩基で中和する。他の実施形態において、クエンチャーを約１当量の塩基で中和する。他の実施形態では、クエンチャーを約１．２５当量の塩基で中和する。例えば、本発明の一部の実施形態では、グルタチオンを、約１当量の適当な塩基（例えば、水酸化ナトリウムなど）で中和する。この場合、プロトン化されたグルタチオンの溶液は、およそ３のｐＨを有し、１当量の水酸化ナトリウムで中和された溶液は、およそ４．５のｐＨを有し、そして２当量の水酸化ナトリウムで中和された溶液は、およそ９．５のｐＨを有する。少なくとも１個のシステインを含む任意の適切なペプチドクエンチャーが、赤血球組成物に添加されると所望のｐＨがもたらされるように、適当に調整され得る。
【００５８】
グルタチオンおよび他のクエンチャーを中和するための適切な方法は、当業者であれば容易に明白であろう。一部の実施形態では、水酸化ナトリウムを使用して、該クエンチャーを中和するか、または部分的に中和する。一部の実施形態では、ＮａＯＨの固形ペレットをまず水に溶解し、１Ｎ、５Ｎ、１０Ｎ、または２０Ｎ  ＮａＯＨ溶液などの、該塩基の濃縮溶液を生成する。一部の実施形態では、その後、該クエンチャーを該混合物に添加する前に、添加と同時に、または添加後に、適正量のそのＮａＯＨ溶液を該クエンチャーに添加する。あるいは、該クエンチャーを該混合物に添加する前に、該ＮａＯＨを、該赤血球組成物、または該病原体不活化化合物、またはその２つの組み合わせに添加する。
【００５９】
適当にｐＨ調整または中和クエンチャーを提供することに加え、一部の実施形態では、好ましいクエンチャーは、病原体内に有意に侵入し得ず、その結果、細胞外環境において望ましくない反応を最適にクエンチングするが、いったん病原体不活化化合物が病原体内部に浸透すると、病原体の不活化を妨げない。
【００６０】
本明細書に記載の方法の各々の一部の実施形態では、クエンチャーが酸性化合物である。一部の実施形態では、クエンチャーが遊離の酸の形態で提供される。一部の実施形態では、クエンチャーが酸性であり、クエンチャーを中和するのに少なくとも約１当量の塩基が添加される。かかる中和クエンチャーを含む溶液は、場合によっては、塩基性、中性またはなおも酸性であり得る。一部の実施形態では、クエンチャーを中和するかまたは部分的に中和するのに、約１当量の塩基が添加される。一部の実施形態では、約２当量の塩基が添加される。一部の実施形態では、クエンチャーが酸性であり、クエンチャーを中和するのに、約０．５〜約１．５当量の塩基が使用される。一部の実施形態では、約０．７５〜約１．２５当量の塩基が使用される。一部の実施形態では、約１当量の塩基が使用される。
【００６１】
一部の実施形態では、該クエンチャーは、該赤血球組成物および／または病原体不活化化合物の添加前に中和される。他の実施形態では、該クエンチャーは、該赤血球組成物および／または病原体不活化化合物と該クエンチャーを混合した後に中和される。一部の実施形態では、該赤血球組成物および／または病原体不活化化合物に添加する前の該中和クエンチャーのｐＨは、約２．５〜７．５、約３．０〜６．５、約３．５〜５．５、約４．０〜５．０、または約４．３〜４．５の範囲内にあるか、または約４．４である。
【００６２】
一部の実施形態では、該クエンチャーはグルタチオンであり、グルタチオン一ナトリウム塩の形態で提供されており、約１当量の塩基で中和されているか、または塩基で中和されていない。一部の他の実施形態では、該クエンチャーはグルタチオンであり、グルタチオン塩酸塩の形態で提供されており、約１当量の塩基で中和されている。
【００６３】
本明細書に記載の方法の各々の一部の実施形態では、該赤血球組成物、クエンチャー、病原体不活化化合物、および任意の添加塩基を含む混合物中の該クエンチャーの初期濃度を不活化期間中に上昇させ、次に不活化期間後に低下された濃度へと低減させる。一部の実施形態では、該クエンチャーの初期濃度は、該病原体不活化化合物の望ましくない副反応（例えば、該ＲＢＣ表面に対する該病原体不活化化合物の結合）を十分に低減するのに適切であり、その後低下した濃度に低減して、細胞保管中の活性度および／または寿命に有害に作用すること（例えば、浸透圧脆弱性および脱水）を十分に低減させる。
【００６４】
本発明は、病原体不活化期間後のクエンチャー濃度を低減するために使用される任意の数の方法を包含する。一部の実施形態では、クエンチャー（例えば、グルタチオン）の濃度は、該赤血球組成物、クエンチャー、および病原体不活化化合物を含む混合物を遠心分離し、その後該混合物の上清を除去し、次に添加剤溶液（例えば、表２に記載されている任意の添加剤溶液、ならびに／または塩化ナトリウム、アデニン、グルコース、ホスフェート、グアノシン、シトレート、および／もしくはマンニトールを含む添加剤溶液）などの新鮮な溶液を、細胞の再懸濁用に添加することにより（例えば、該細胞の洗浄により）、低減される。遠心分離、上清の除去、および新鮮な溶液の添加（例えば、表２に記載されている任意の添加剤溶液、ならびに／または塩化ナトリウム、アデニン、グルコース、ホスフェート、グアノシン、シトレート、および／もしくはマンニトールを含む添加剤溶液）の工程は、一部の実施形態では、さらに１、２、３、４、または５回以上繰り返され得る。一部の実施形態では、該クエンチャーの濃度を低減するために使用される方法は、自動化されている。一部の実施形態では、該新鮮な溶液は、該クエンチャーを含まないか、またはより低濃度の該クエンチャーを含む。一部の実施形態では、クエンチャー（例えば、グルタチオン）の濃度は、該クエンチャーを化学的に不活化することにより低減される。一部の実施形態では、クエンチャー（例えば、グルタチオン）の濃度は、バッチまたはフロー除去工程における吸着、または膜（例えば、中空糸膜または透析膜）またはサイズ排除ビーズを使用するフロー工程でのサイズ排除により低減される。一部の実施形態では、該クエンチャーは低減されず、および／または化合物吸着デバイス（ＣＡＤ）と接触しない。
【００６５】
本明細書に記載の方法および組成物の各々の一部の実施形態では、該赤血球組成物、クエンチャー、病原体不活化化合物、および任意の添加塩基を含む混合物中の該クエンチャー（例えば、グルタチオン）の初期濃度は、約２ｍＭより大きいか、または約４ｍＭより大きいか、約６ｍＭより大きいか、約８ｍＭより大きいか、約１０ｍＭより大きいか、約１５ｍＭより大きいか、または約２０ｍＭより大きい。一部の実施形態では、該混合物中の初期クエンチャー濃度は、約２ｍＭ〜１００ｍＭ、約２ｍＭ〜４０ｍＭ、約４ｍＭ〜４０ｍＭ、約５ｍＭ〜４０ｍＭ、約５ｍＭ〜３０ｍＭ、または約１０ｍＭ〜３０ｍＭの範囲内であり、または２ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、３０ｍＭ、３５ｍＭ、４０ｍＭ、４５ｍＭ、５０ｍＭ、または１００ｍＭまでである。一部の実施形態では、該混合物中の該初期クエンチャー濃度は、約２０ｍＭである。
【００６６】
本明細書に記載の方法および組成物の各々の一部の実施形態では、赤血球、クエンチャー、および該病原体不活化化合物の混合物中のクエンチャー（例えば、グルタチオン）の初期濃度は、約２ｍＭより大きいか、約４ｍＭより大きいか、約６ｍＭより大きいか、約８ｍＭより大きいか、約１０ｍＭより大きく、該混合物のｐＨは、約５．５より高いか、約５．７より高いか、約６．０より高いか、約６．３より高いか、約６．５より高いか、約６．７より高いか、約７．０より高いか、または約７．２より高い。本明細書に記載の方法および組成物の各々の一部の実施形態では、該混合物中の該クエンチャーの初期濃度は、約２ｍＭ〜４０ｍＭ、約４ｍＭ〜４０ｍＭ、約５ｍＭ〜４０ｍＭ、約５ｍＭ〜３０ｍＭ、または約１０ｍＭ〜３０ｍＭの範囲内にあるか、または約２０ｍＭであり、該混合物のｐＨは、約６．０〜８．５、約６．０〜７．５、約６．５〜７．１、約６．５〜７．０、または約６．６〜６．８の範囲内にあるか、または約６．６、６．７、６．８、または６．９である。一部の実施形態では、該混合物中の該クエンチャーの初期濃度は、約２ｍＭより大きいか、約４ｍＭより大きいか、約６ｍＭより大きいか、約８ｍＭより大きいか、または１０ｍＭより大きく、該混合物のｐＨは、約６．０〜８．５、約６．０〜７．５、約６．５〜７．１、約６．５〜７．０、または約６．６〜６．８の範囲内にあるか、または約６．６、６．７、６．８、または６．９である。一部の実施形態では、該混合物中のクエンチャー（例えば、グルタチオン）の濃度は、約１０ｍＭ〜約３０ｍＭの範囲内にあり、該混合物のｐＨは、約６．０〜７．５の範囲内にある。一部の実施形態では、該混合物中のクエンチャー（例えば、グルタチオン）の濃度は、約２０ｍＭの範囲内にあり、該混合物のｐＨは、約６．５〜７．０（または、７．１）の範囲内にある。
【００６７】
本明細書に記載の方法および組成物の各々の一部の実施形態では、該赤血球組成物、クエンチャー、病原体不活化化合物、および任意の添加塩基を含む混合物中の該クエンチャー（例えば、グルタチオン）の不活化期間後の初期濃度は、該混合物中の該クエンチャー（例えば、グルタチオン）の初期濃度と比べて、１／２、または１／３、または１／４、または１／５、または１／６、または１／７、または１／８、または１／９、または１／１０、または１／１５、または１／２０、または１／２５、または１／３０、または１／３５、または１／４０、または１／５０、または１／１００、または１／５００、または１／１０００未満にされる。
【００６８】
本明細書に記載の方法および組成物の各々の一部の実施形態では、該赤血球組成物、クエンチャー、病原体不活化化合物、および任意の添加塩基を含む混合物中の、不活化期間後の該クエンチャー（例えば、グルタチオン）の低下した濃度は、約１５ｍＭ未満、約１０ｍＭ未満約、８ｍＭ未満、約６ｍＭ未満、約５ｍＭ未満、約４ｍＭ未満、約３ｍＭ未満、約２ｍＭ未満、約１ｍＭ未満、約０．７５ｍＭ未満、約０．５ｍＭ未満、または約０．２５ｍＭ未満である。一部の実施形態では、不活化期間後の該混合物中の該クエンチャーの低下した濃度は、約１ｍＭ〜２０ｍＭ、約２ｍＭ〜１５ｍＭ、約３ｍＭ〜１０ｍＭ、約４ｍＭ〜８ｍＭ、約５ｍＭ〜６ｍＭの範囲内である。一部の実施形態では、不活化期間後の該混合物中の該クエンチャーの低下した濃度は、約０．２５ｍＭ、または０．５ｍＭ、または０．７５ｍＭ、または１ｍＭ、または１．５ｍＭ、または２ｍＭ、または３ｍＭ、または４ｍＭ、または５ｍＭ、または６ｍＭ、または７ｍＭ、または８ｍＭ、または９ｍＭ、または１０ｍＭ、または１２．５ｍＭ、または１５ｍＭ、または２０ｍＭまでの濃度である。
【００６９】
本明細書に記載の方法および組成物の各々の一部の実施形態では、該赤血球組成物、クエンチャー、病原体不活化化合物、および任意の添加塩基を含む混合物中の該クエンチャー（例えば、グルタチオン）の初期濃度は、２ｍＭより大きいか、約４ｍＭより大きいか、約６ｍＭより大きいか、約８ｍＭより大きいか、または約１０ｍＭより大きく、不活化期間後の該混合物中の該クエンチャーの低下した濃度は、約１５ｍＭ未満、約１０ｍＭ未満、約８ｍＭ未満、約６ｍＭ未満、約５ｍＭ未満、約４ｍＭ未満、約３ｍＭ未満、約２ｍＭ未満、約１．５ｍＭ未満、約１ｍＭ未満、約０．７５ｍＭ未満、約０．５ｍＭ未満、または約０．２５ｍＭ未満である。一部の実施形態では、該クエンチャーの初期濃度は、約２ｍＭ〜１００ｍＭ、約２ｍＭ〜４０ｍＭ、約４ｍＭ〜４０ｍＭ、約５ｍＭ〜４０ｍＭ、約５ｍＭ〜３０ｍＭ、または約１０ｍＭ〜３０ｍＭの範囲内にあるか、または約２０ｍＭであり、不活化期間後の該混合物中の該クエンチャーの低下した濃度は、約１ｍＭ〜２０ｍＭ、約２ｍＭ〜１５ｍＭ、約３ｍＭ〜１０ｍＭ、約４ｍＭ〜８ｍＭ、または約５ｍＭ〜６ｍＭの範囲内にある。一部の実施形態では、該クエンチャー（例えば、グルタチオン）の初期濃度は、約１０ｍＭ〜３０ｍＭの範囲内にあり、不活化期間後の該混合物中の該クエンチャーの低下した濃度は、約２ｍＭ〜１５ｍＭの範囲内にある。一部の実施形態では、該クエンチャー（例えば、グルタチオン）の初期濃度は、約２０ｍＭであり、不活化期間後の該混合物中の該クエンチャーの低下した濃度は、約４ｍＭ〜８ｍＭの範囲内にある。
【００７０】
一部の実施形態では、該赤血球組成物、クエンチャー（例えば、グルタチオン）、病原体不活化化合物、および任意の添加塩基を含む混合物中の該クエンチャー（例えば、グルタチオン）の初期濃度は、約２ｍＭより大きいか、または約４ｍＭより大きいか、約６ｍＭより大きいか、約８ｍＭより大きいか、または約１０ｍＭより大きく、該混合物のｐＨは、約５．５より高いか、約５．７より高いか、約６．０より高いか、約６．３より高いか、約６．５より高いか、約６．７より高いか、約７．０より高いか、または約７．２より高く、不活化期間後の該混合物中の該クエンチャーの低下した濃度は、約１５ｍＭ未満、約１０ｍＭ未満、約８ｍＭ未満、約６ｍＭ未満、約５ｍＭ未満、約４ｍＭ未満、約３ｍＭ未満、約２ｍＭ未満、約１．５ｍＭ未満、約１ｍＭ未満、約０．７５ｍＭ未満、約０．５ｍＭ未満、または約０．２５ｍＭ未満である。一部の実施形態では、該クエンチャーの初期濃度は、約２ｍＭ〜１００ｍＭ、約２ｍＭ〜４０ｍＭ、約４ｍＭ〜４０ｍＭ、約５ｍＭ〜４０ｍＭ、約５ｍＭ〜３０ｍＭ、または約１０ｍＭ〜３０ｍＭの範囲内にあるか、または約２０ｍＭであり、該混合物のｐＨは、約６．０〜８．５、約６．０〜７．５、約６．５〜７．０、約６．５〜７．１、または約６．６〜６．８の範囲内にあるか、または約６．６、６．７、６．８、または６．９であり、不活化期間後の該混合物中の該クエンチャーの低下した濃度は、約１ｍＭ〜２０ｍＭ、約２ｍＭ〜１５ｍＭ、約３ｍＭ〜１０ｍＭ、約４ｍＭ〜８ｍＭ、または約５ｍＭ〜６ｍＭの範囲内である。一部の実施形態では、該クエンチャー（例えば、グルタチオン）の初期濃度は、約１０ｍＭ〜３０ｍＭの範囲内にあり、該混合物のｐＨは、６．０〜７．５の範囲内にあり、不活化期間後の該混合物中の該クエンチャーの低下した濃度は、約２ｍＭ〜１５ｍＭの範囲内にある。一部の実施形態では、該クエンチャー（例えば、グルタチオン）の初期濃度は、約２０ｍＭであり、該混合物のｐＨは、約６．５〜７．０（または７．１）の範囲内にあり、不活化期間後の該混合物中の該クエンチャーの低下した濃度は、約４ｍＭ〜８ｍＭの範囲内にある。
【００７１】
本明細書に記載の方法および組成物の各々の一部の実施形態では、初期濃度の該クエンチャーの添加時点と、該赤血球組成物、クエンチャー、病原体不活化化合物、および任意の添加塩基を含む混合物中の低下した濃度へと該クエンチャーの濃度を低減させる時点との間の期間は、該病原体不活化化合物の望ましくない副反応（例えば、望まれない免疫応答に結びつき得る、該ＲＢＣ表面に対する病原体不活化化合物の結合）を低減するのに十分である。一部の実施形態では、該期間は、該病原体不活化化合物の望ましくない副反応を低減し、不活化工程中の細胞脱水を回避または低減するのに十分である。
【００７２】
一部の実施形態では、初期濃度の該クエンチャーの添加時点と、赤該血球組成物、クエンチャー、病原体不活化化合物、および任意の添加塩基を含む混合物中の低下した濃度へと該クエンチャーの濃度を低減させる時点との間の期間は、５時間、１０時間、１５時間、２０時間、２５時間、３０時間、３５時間、４０時間、または５０時間より長いか、ほぼ等しいか、またはそれ未満である。一部の実施形態では、該期間は、約１〜９６時間、約１〜７２時間、または約１〜４８時間、または約１０〜３０時間、または約１５〜２５時間、または約２０時間である。
【００７３】
本明細書に記載の方法および組成物の各々の一部の実施形態では、該赤血球組成物、クエンチャー、病原体不活化化合物、および任意の添加塩基を含む混合物中の該クエンチャー（例えば、グルタチオン）の初期濃度は、約２ｍＭより大きいか、または約４ｍＭより大きいか、約６ｍＭより大きいか、約８ｍＭより大きいか、約１０ｍＭより大きいか、または約１５ｍＭより大きく、不活化期間後の該混合物中の該クエンチャーの低下した濃度は、約２５ｍＭ未満、約２０ｍＭ未満、約１５ｍＭ未満、約１０ｍＭ未満、約８ｍＭ未満、約６ｍＭ未満、約５ｍＭ未満、約４ｍＭ未満、約３ｍＭ未満、約２ｍＭ未満、約１．５ｍＭ未満、約１ｍＭ未満、約０．７５ｍＭ未満、約０．５ｍＭ未満、または約０．２５ｍＭ未満であり、初期濃度の該クエンチャーの添加時点と、低下した濃度へと該クエンチャーの濃度を低減させる時点との間の期間は、５時間、１０時間、１５時間、２０時間、２５時間、３０時間、３５時間、４０時間、または５０時間より長いか、ほぼ等しいか、またはそれ未満である。
【００７４】
一部の実施形態では、該クエンチャーの初期濃度は、約２ｍＭ〜１００ｍＭ、約２ｍＭ〜４０ｍＭ、約４ｍＭ〜４０ｍＭ、約５ｍＭ〜４０ｍＭ、約５ｍＭ〜３０ｍＭ、または約１０ｍＭ〜３０ｍＭの範囲内にあるか、または約２０ｍＭであり、不活化期間後の該混合物中の該クエンチャーの低下した濃度は、約１ｍＭ〜２０ｍＭ、約２ｍＭ〜１５ｍＭ、約３ｍＭ〜１０ｍＭ、約４ｍＭ〜８ｍＭ、または約５ｍＭ〜６ｍＭの範囲内にあり、初期濃度の該クエンチャーの添加時点と、低下した濃度へと該クエンチャーの濃度を低減する時点との間の期間は、約１〜９６時間、または約１〜７２時間、または約１〜４８時間、または約１０〜３０時間、または約４〜３０時間、または約１０〜２５時間、または約１５〜２５時間、または約２０時間である。
【００７５】
一部の実施形態では、該クエンチャー（例えば、グルタチオン）の初期濃度は、約１０ｍＭ〜３０ｍＭの範囲内にあり、不活化期間後の該混合物中の該クエンチャーの低下した濃度は、約２ｍＭ〜１５ｍＭの範囲内にあり、初期濃度の該クエンチャーの添加時点と、低下した濃度へと該クエンチャーの濃度を低減する時点との間の期間は、約１０〜３０時間である。一部の実施形態では、該クエンチャー（例えば、グルタチオン）の初期濃度は、約２０ｍＭであり、不活化期間後の該混合物中の該クエンチャーの低下した濃度は、約４ｍＭ〜８ｍＭの範囲内にあり、初期濃度の該クエンチャーの添加時点と、低下した濃度へと該クエンチャーの濃度を低減する時点との間の期間は、約１５〜２５時間である。これらの実施形態の一部では、該混合物のｐＨは、約６．５〜７．０（または７．１）の範囲内にある。これらの実施形態のいくつかでは、該混合物のｐＨは、約６．０〜７．５の範囲内にある。
【００７６】
これらの実施形態のいずれにおいても、初期濃度の該クエンチャーの添加時点と、低下した濃度へと該クエンチャーの濃度を低減させる時点との間の期間中の、該赤血球組成物およびクエンチャーを含む混合物の温度は、約１℃〜３０℃の、また１８℃〜２５℃の温度範囲内にあり、または約３７℃、または室温付近である。
【００７７】
一部の実施形態では、本発明は、赤血球組成物を処理する方法であって、ａ）ｉ）マスタード基と核酸結合リガンドとを連結する易壊性リンカーを含む含む病原体不活化化合物（例えば、Ｓ−３０３）（例えば、もし存在するとすれば病原体を不活化する有効量の病原体不活化化合物）と、（ｉｉ）該病原体不活化化合物の反応性求電子性基と反応可能なチオール基を含むクエンチャー（例えば、有効量のクエンチャー）（例えば、グルタチオン）と、ｉｉｉ）赤血球含有組成物と、ｉｖ）好適な塩基（例えばＮａＯＨ）とを提供するステップ、ｂ）該病原体不活化化合物、クエンチャー、および好適な塩基を該赤血球含有組成物と混合するステップ、ならびにｃ）元の濃度のクエンチャーで該混合物を保管することから生じる赤血球脱水のレベルと比べて、該混合物を保管すること（例えば、４℃で１０、２８、または４２日後の）から生じる赤血球脱水のレベルを低減させる量へと、該混合物中の該クエンチャーの濃度を十分に減少させるステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、該混合物は、約０．５〜１．５当量の塩基（または約０．７５〜１．２５当量）を含み、ここで当量とは、該混合物中のクエンチャーのモル量と等しいモル量を意味し、および／またはステップ（ｂ）の結果として生じる混合物は、３７℃で約６．０〜７．５（または、約６．５〜７．０もしくは７．１、）のｐＨを有する。一部の実施形態では、ステップ（ａ）の塩基は、結果として生じる混合物における、該処理された赤血球組成物に結合する抗病原体不活化化合物抗体のレベルを、該塩基無しの混合物と比べて、少なくとも約５％（または、少なくとも約１０％、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、または少なくとも約９０％）低減するのに十分な量である。一部の実施形態では、該クエンチャーの濃度は、約５ｍＭ〜約３０ｍＭ（または、約１５ｍＭ〜約２５ｍＭ）であり、および／またはステップ（ｃ）の結果として生じる混合物中の該クエンチャーは、約１０ｍＭ未満（または約６ｍＭ未満、または約２ｍＭ未満）の濃度である。一部の実施形態では、ステップ（ｂ）の結果として生じる混合物中の該病原体不活化化合物の濃度は、約０．１μＭ〜約５ｍＭであり、および／または該赤血球組成物中における、もし存在するとすれば、少なくとも１ｌｏｇ（または３ｌｏｇ）の病原体を不活化するのに十分である。一部の実施形態では、ステップ（ｂ）とステップ（ｃ）との間の時間は、約１〜４８時間（または、１５〜２５時間）である。一部の実施形態では、ステップ（ｂ）の２０時間後、結果として生じる混合物の赤血球（ＲＢＣ）は、同一条件下の同一方法に由来するが塩基を使用しない赤血球のＡＢＣ値と比較して、６５％未満の抗体結合能（ＡＢＣ）を示し、および／または約５０，０００未満（または、約２５，０００と７０，０００との間の）の平均ＡＢＣを示し、および／またはステップ（ｃ）後（または、４℃で２８日もしくは４２日間の保管後）に１％未満の溶血を示し、および／またはステップ（ｃ）後（または、４℃で２８日もしくは４２日間の保管後）に５０％を超える赤血球沈殿容積（ＰＣＶ）を示し、および／またはステップ（ｃ）後、４℃で２８（または���２）日後に１４０（または１５０）を超えるメジアン血球脆弱性値を示す。これら実施形態の一部では、ステップ（ｃ）における該クエンチャーの濃度の減少には、不活化中に使用される溶液を除去すること、および最終添加剤溶液（例えば、ＳＡＧ−Ｍ、ＡＳ−５、または表２、３、もしくは４の任意の溶液、または塩化ナトリウム、アデニン、グルコース、ホスフェート、グアノシン、シトレート、および／またはマンニトールを含む添加剤溶液などの本明細書に記載の任意の溶液）を添加することが含まれる。
【００７８】
一部の実施形態では、本発明は、赤血球組成物を処理する方法であって、ａ）ｉ）反応性求電子性基であるかまたは反応性求電子性基を形成する官能基を含む病原体不活化化合物（例えば、もし存在するとすれば病原体を不活化するための有効量の病原体不活化化合物）（例えば、Ｓ−３０３）と、ｉｉ）該病原体不活化化合物の反応性求電子性基と反応可能なチオール基を含むクエンチャー（例えば、有効量のクエンチャー）（例えばグルタチオン）と、ｉｉｉ）赤血球含有組成物と、ｉｖ）好適な塩基（例えばＮａＯＨ）とを混合するステップ、およびｂ）元の濃度のクエンチャーで該混合物を保管する（例えば、４℃で１０、２８、または４２日後）ことから生じる赤血球脱水のレベルと比べて、該混合物を保管することから生じる赤血球脱水のレベルを低減させる量へと、該混合物中の該クエンチャーの濃度を十分に減少させるステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、該混合物は、約０．５〜１．５当量の塩基（または約０．７５〜１．２５当量）を含み、ここで当量とは、該混合物中のクエンチャーのモル量と等しいモル量を意味し、および／またはステップ（ａ）の結果として生じる混合物は、３７℃で約６．０〜７．５（または、約６．５〜７．０もしくは７．１）のｐＨを有する。一部の実施形態では、ステップ（ａ）の塩基は、結果として生じる混合物における、該処理された赤血球組成物に結合する抗病原体不活化化合物抗体のレベルを、該塩基無しの混合物と比べて、少なくとも約５％（または、少なくとも約１０％、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、または少なくとも約９０％）低減するのに十分な量である。一部の実施形態では、該クエンチャー濃度は、約５ｍＭ〜約３０ｍＭ（または、約１５ｍＭ〜約２５ｍＭ）であり、および／またはステップ（ｂ）の結果として生じる混合物中の該クエンチャーは、約１０ｍＭ未満（または約６ｍＭ未満、または約２ｍＭ未満）の濃度である。一部の実施形態では、ステップ（ａ）の結果として生じる混合物中の該病原体不活化化合物の濃度は、約０．１μＭ〜約５ｍＭであり、および／または該赤血球組成物中における、もし存在するとすれば少なくとも１ｌｏｇ（または３ｌｏｇ）の病原体を不活化するのに十分である。一部の実施形態では、ステップ（ａ）とステップ（ｂ）との間の時間は、約１〜４８時間（または、１５〜２５時間）である。一部の実施形態では、ステップ（ａ）の２０時間後、結果として生じる混合物の赤血球（ＲＢＣ）は、同一条件下の同一方法に由来するが塩基を使用しない赤血球のＡＢＣ値と比較して、６５％未満の抗体結合能（ＡＢＣ）を示し、および／または約５０，０００未満（または、約２５，０００と７０，０００との間）の平均ＡＢＣを示し、および／またはステップ（ｂ）後（または、４℃で２８日もしくは４２日間の保管後）に１％未満の溶血を示し、および／またはステップ（ｂ）後（または、４℃で２８日もしくは４２日間の保管後）に５０％を超える赤血球沈殿容積（ＰＣＶ）を示し、および／またはステップ（ｂ）後、４℃で２８（または４２）日後に１４０（または１５０）を超えるメジアン血球脆弱性値を示す。これら実施形態の一部では、ステップ���ｂ）における該クエンチャーの濃度の減少には、不活化中に使用される溶液を除去すること、および最終添加剤溶液（例えば、ＳＡＧ−Ｍ、ＡＳ−５、または表２、３、もしくは４の任意の溶液、または塩化ナトリウム、アデニン、グルコース、ホスフェート、グアノシン、シトレート、および／またはマンニトールを含む添加剤溶液などの本明細書に記載の任意の溶液）を添加することが含まれる。
【００７９】
一部の実施形態では、本発明は、赤血球の脱水を低減する方法であって、ａ）ｉ）病原体不活化化合物と反応可能なクエンチャー（例えば、グルタチオン）とｉｉ）赤血球を含む赤血球組成物とを提供するステップ、およびｂ）元の濃度のクエンチャーで該混合物を保管する（例えば、４℃で１０、２８、もしくは４２日間の保管後）ことから生じる赤血球脱水のレベルと比べて、該混合物を保管することから生じる赤血球脱水のレベルを低減させる量へと、該混合物中の該クエンチャー濃度を十分に減少させるステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、ステップ（ｂ）の結果として生じる混合物中の該クエンチャーは、約１０ｍＭ未満（または約６ｍＭ未満、または約２ｍＭ未満）の濃度である。一部の実施形態では、結果として生じる混合物の赤血球（ＲＢＣ）は、ステップ（ｂ）後（または、４℃で２８日もしくは４２日間の保管後）に１％未満の溶血を示し、および／またはステップ（ｂ）後（または、４℃で２８日または４２日間の保管後）に５０％を超える赤血球沈殿容積（ＰＣＶ）を示し、および／またはステップ（ｂ）後、４℃で２８（または、４２）日後に１４０（または、１５０）を超えるメジアン血球脆弱性値を示す。
【００８０】
本発明の方法には、病原体不活化化合物およびクエンチャーのｅｘ  ｖｉｖｏ使用が含まれる。該ｅｘ  ｖｉｖｏ使用には、該化合物を、生きているヒト、哺乳動物、または脊椎動物の外部で赤血球組成物を処理するために使用することが伴い、該処理された生物材料は、生きているヒト、哺乳動物、または脊椎動物の内部で使用するためのものである。例えば、ヒトから血液を取り出すこと、および化合物をその血液に導入して病原体を不活化することは、該血液がそのヒトまたは別のヒトへの再導入を目的としている場合、該化合物のｅｘ  ｖｉｖｏ使用として定義される。そのヒトまたは別のヒトへの該ヒト血液の再導入は、該化合物のｅｘ  ｖｉｖｏ使用とは対照的に、血液のｉｎ  ｖｉｖｏ使用になるだろう。該ヒトへの再導入の際に、該化合物が依然として該血液中に存在する場合、該化合物は、そのｅｘ  ｖｉｖｏ使用に加えて、ｉｎ  ｖｉｖｏでも導入される。該赤血球組成物がｉｎ  ｖｉｖｏ使用である場合、本発明の一部の実施形態には、クエンチャーのｅｘ  ｖｉｖｏ使用が伴う。一部の例では、ある程度のレベルのクエンチャーが該赤血球組成物に残り、その結果該クエンチャーはｉｎ  ｖｉｖｏでも導入される。該物質または化合物のｉｎ  ｖｉｔｒｏ使用には、生きているヒト、哺乳動物、または脊椎動物の外部で該物質または化合物を使用することを伴い、該物質または化合物は、生きているヒト、哺乳動物、または脊椎動物への再導入を目的としていない。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ使用の一例は、赤血球試料の成分の診断用分析であろう。該赤血球または他の成分の修飾が、該血液試料の成分のｉｎ  ｖｉｔｒｏ分析に影響を及ぼし得るため、本発明の方法は、該赤血球組成物のｉｎ  ｖｉｔｒｏ使用に応用され得る。したがって、本発明の方法は、そうでなければ試料の診断検査を妨害し得る試料の修飾を適切にクエンチングすることにより、かかるｉｎ  ｖｉｔｒｏ試料の取扱いに安全性を提供し得る。
【００８１】
塩および／または緩衝溶液を含む添加剤溶液は、本明細書に記載の方法および赤血球組成物と共に使用され得る。例えば、選択された緩衝液（例えば、ＳＡＧ−Ｍ、ＡＳ−５、または表２、３、および／または４に記載の任意の溶液）は、不活化期間の前、期間中、および／または期間後、および／または該クエンチャー濃度が減少された時点で、該赤血球組成物に添加され得る。
【００８２】
濃縮赤血球を使用する不活化方法
一部の実施形態では、濃縮赤血球（ｐＲＢＣ）（例えば、添加剤溶液を欠如しており、および／または約７０〜９０％もしくは約７５〜８５％の範囲内にあるか、もしくは約８０％のヘマトクリットを示す赤血球）を、本明細書に記載の不活化法（例えば、該組成物が、約１当量の塩基および約０．２ｍＭのＳ−３０３を有する約２０ｍＭのＧＳＨを含む方法）に供し、その後、添加剤溶液（例えば、ＳＡＧ−Ｍ、ＡＳ−５、または本明細書もしくは表２に記載の任意の溶液）中に供される（ある場合、保存される）。添加剤溶液の例は、表２に示されており、本明細書に記載されている。これらの実施形態の一部では、該添加剤溶液（例えば、本明細書または表２に記載の任意の溶液）は、該病原体不活化化合物（例えば、Ｓ−３０３）および／またはクエンチャー（例えば、ＧＳＨ）を添加した約５分〜２０時間後に、クエンチャー、病原体不活化化合物、および任意の添加塩基を含む該赤血球組成物に添加される。一部の実施形態では、添加剤溶液は、該病原体不活化化合物（例えば、Ｓ−３０３）および／またはクエンチャー（例えば、ＧＳＨ）を添加した約５分〜１０時間、または約５分〜５時間、または約５分〜６０分、または約５分〜３０分、または約１０分〜２０分、または約１５分後に、該ＲＢＣ組成物に添加される。一部の実施形態では、該クエンチャーの濃度は、該添加剤溶液（例えば、ＳＡＧ−Ｍ、ＡＳ−５、または本明細書もしくは表２に記載の任意の溶液）を添加した後で、本明細書に記載のように減少される。例えば、ｐＲＢＣは、本明細書に記載の不活化法で処理され（例えば、該組成物が、約２０ｍＭのＧＳＨ、約１当量の塩基、および約０．２ｍＭのＳ−３０３を含む処理）、その後、該病原体不活化化合物および／または該クエンチャーを添加した後の特定の時間（約５分〜５時間、または約１０分〜２０分、または約１５分など）に、添加剤溶液（例えば、ＳＡＧ−Ｍ、ＡＳ−５、または本明細書もしくは表２に記載の任意の溶液）で処理され、その後、該クエンチャー濃度が、本明細書に記載のように（例えば、約１０ｍＭ未満に、または約５ｍＭ未満に）減少される。これらの実施形態の一部では、該クエンチャー濃度を減少させることには、処理溶液および／または添加剤溶液を除去し、その後最終添加剤溶液（例えば、ＳＡＧ−Ｍ、ＡＳ−５、または本明細書もしくは表２に記載の任意の溶液）を添加して、例えば約５０〜７０％または約５５〜６５％の範囲内にあるかまたは約６０％のヘマトクリットを示す赤血球組成物を提供することが含まれる。一部の実施形態では、不活化前および／または不活化中の該赤血球組成物の塩化物イオンの濃度は、約１５０ｍＭ、または約１２０ｍＭ、または約１００ｍＭ、または約９０ｍＭ、または約８０ｍＭ、または約７０ｍＭ、または約６０ｍＭ、または約５０ｍＭ、約４０ｍＭ、約３０ｍＭ、または約２０ｍＭ、約１０ｍＭを超えるかまたは未満であり、または約２５〜２５０ｍＭ、または約４０〜１００ｍＭ、または約５０〜７５ｍＭ、または約６０〜７０ｍＭ、または約６５ｍＭである。
【００８３】
一部の実施形態では、本明細書で参照される添加剤溶液（例えば、該クエンチャー濃度を減少させる前および／または減少させた後で投与される添加剤溶液）は、下記成分の１つまたは複数を含む：デキストロース、アデニン、グアノシン、マンニトール、シトレート（例えば、クエン酸ナトリウム）、クエン酸、ホスフェート（例えば、Ｎａ２ＨＰＯ４および／またはＮａＨ２ＰＯ４）、およびクロライド（例えば、塩化ナトリウムに由来する）。一部の実施形態では、該添加剤溶液のデキストロースの濃度および／または置換後（例えば、輸血前）の該ＲＢＣ組成物のデキストロースの終濃度は、約１０ｍＭから約１５０ｍＭ、または約２０ｍＭ〜約１２０ｍＭ、または約２５ｍＭ〜約１００ｍＭ、または約３０ｍＭ〜約７５ｍＭ、または約４０ｍＭ〜約５０ｍＭの濃度である。一部の実施形態では、該添加剤溶液のアデニンの濃度および／または置換後（例えば、輸血前）の該ＲＢＣ組成物のアデニンの終濃度は、約０．５ｍＭ〜約５ｍＭ、または約０．７５ｍＭ〜約３ｍＭ、または約１ｍＭ〜約２．５ｍＭの濃度である。一部の実施形態では、該添加剤溶液のグアノシンの濃度および／または置換後（例えば、輸血前）の該ＲＢＣ組成物のグアノシンの終濃度は、約０．５ｍＭ〜約５ｍＭ、または約０．７５ｍＭ〜約３ｍＭ、または約１ｍＭ〜約２．５ｍＭ、または約１．５ｍＭ〜約２ｍＭの濃度である。一部の実施形態では、該添加剤溶液のマンニトールの濃度および／または置換後（例えば、輸血前）の該ＲＢＣ組成物のマンニトールの終濃度は、約１０ｍＭ〜約１５０ｍＭ、または約２０ｍＭ〜約１２０ｍＭ、または約２５ｍＭ〜約１００ｍＭ、または約３０ｍＭ〜約７５ｍＭ、または約４０ｍＭ〜約５０ｍＭ、または約３５ｍＭ〜約４５ｍＭの濃度である。一部の実施形態では、該添加剤溶液のシトレート（例えば、クエン酸ナトリウム）の濃度および／または置換後（例えば、輸血前）の該ＲＢＣ組成物のシトレートの終濃度は、約５ｍＭ〜約１００ｍＭ、または約１０ｍＭ〜約７５ｍＭ、または約１５ｍＭ〜約５０ｍＭ、または約１５ｍＭ〜約３５ｍＭ、または約２０ｍＭ〜約３０ｍＭの濃度である。一部の実施形態では、該添加剤溶液のホスフェート（例えば、Ｎａ２ＨＰＯ４および／またはＮａＨ２ＰＯ４）の濃度および／または置換後（例えば、輸血前）の該ＲＢＣ組成物のホスフェートの終濃度は、約１ｍＭ〜約１５０ｍＭ、または約２ｍＭ〜約１００ｍＭ、または約３ｍＭ〜約７５ｍＭ、または約４ｍＭ〜約５０ｍＭ、または約５ｍＭ〜約２５ｍＭ、または約１０ｍＭ〜約２０ｍＭの濃度である。一部の実施形態では、該添加剤溶液のクロライド濃度および／または置換後（例えば、輸血前）の該ＲＢＣ組成物のクロライドの終濃度は、約５００ｍＭ、または約２５０ｍＭ、または約２００ｍＭ、または約１５０ｍＭ、または約１００ｍＭ、約７５ｍＭ、または約５０ｍＭ、または約２５ｍＭを超えるかまたは未満であるか、または約２５〜約２５０ｍＭ、または約４０〜約１００ｍＭ、または約５０〜約７５ｍＭ、または約６０〜約７０ｍＭ、または約１００〜約２００ｍＭ、または約１２５ｍＭ〜約１７５ｍＭ、または約１５０ｍＭである。
【００８４】
一部の実施形態では、本明細書で参照される添加剤溶液（例えば、該クエンチャー濃度が減少される前および／または後で投与される添加剤溶液）および／または置換後（例えば、輸血前）の該最終ＲＢＣ組成物は、１０ｍＭ〜約１５０ｍＭ（または、約５０ｍＭ〜約９０ｍＭ）のデキストロース、０．５ｍＭ〜約５ｍＭ（または、約０．７５ｍＭ〜約３ｍＭ）のアデニン、約１０ｍＭ〜約１５０ｍＭ（または、約２５ｍＭ〜約１００ｍＭ）のマンニトール、約１０ｍＭ〜約７５ｍＭ（または、約１５ｍＭ〜約５０ｍＭ）のシトレート（例えば、クエン酸ナトリウム）、約３ｍＭ〜約７５ｍＭ（または、約５ｍＭ〜約２５ｍＭ）のホスフェート（例えば、Ｎａ２ＨＰＯ４および／またはＮａＨ２ＰＯ４）、および約５０〜約２５０ｍＭまたは（約１００〜約１７５ｍＭ）のクロライドを含む。
【００８５】
【表２】
2014231528.tif 000004
希釈赤血球を使用する不活化方法
本明細書に記載の赤血球組成物は、不活化前に希釈することができる。該赤血球を希釈剤に供することにより、本明細書に記載の方法による不活化に好適なレベルにまで、溶解されている種（例えば、Ｃｌ−などの塩）の濃度を減少させることができる。希釈剤溶液の例は、本明細書に記載されており、表３に示されている。一部の実施形態では、非濃縮赤血球（例えば、約５０〜７０％、約５５〜６５％、または約６０％の範囲内にあるヘマトクリットを示し、随意にＳＡＧ−ＭまたはＯｐｔｉｓｏｌを含む赤血球）を、本明細書に記載の不活化法（例えば、該組成物が、約１当量の塩基および約０．２ｍＭのＳ−３０３を有する約２０ｍＭのＧＳＨを含む方法）の前に、希釈剤溶液（例えば、本明細書または表３に記載の任意の溶液）に供し、その後該クエンチャー濃度を本明細書に記載のように（例えば、約１０ｍＭ未満に、または約５ｍＭ未満に）減少させる。これらの実施形態の一部では、該クエンチャー濃度を減少させることには、処理溶液（例えば、希釈処理溶液）を除去し、その後最終添加剤溶液（例えば、ＳＡＧ−Ｍ、ＡＳ−５、または上述のもしくは表２に記載の任意の溶液）を添加して、例えば約５０〜７０％または約５５〜６５％の範囲内にあるかまたは約６０％のヘマトクリットを示す赤血球組成物を提供することが含まれる。一部の実施形態では、不活化前の該赤血球組成物の塩化物イオンの濃度は、約１５０ｍＭ、または約１２０ｍＭ、または約１００ｍＭ、または約９０ｍＭ、約８０ｍＭ、または約７０ｍＭ、または約６０ｍＭ、または約５０ｍＭ、約４０ｍＭ、約３０ｍＭ、または約２０ｍＭ、約１０ｍＭを超えてまたは未満に、または約２５〜２５０ｍＭ、または約４０〜１００ｍＭ、または約５０〜７５ｍＭ、または約６０〜７０ｍＭ、または約６５ｍＭに希釈される。一部の実施形態では、該ＲＢＣ溶液に添加される希釈剤溶液の量（容積による）は、ＲＢＣ溶液の量の約０．２〜２倍、または約０．３〜１．５倍、または約０．４〜１倍、または約０．５〜０．７５倍である。これらの実施形態の一部では、該赤血球組成物は、希釈剤溶液（例えば、本明細書または表３に記載の任意の溶液）で、約３０〜５０％、または約３５〜４５％の範囲内にあるかまたは約４０％のヘマトクリットレベルに希釈される。
【００８６】
一部の実施形態では、本明細書で参照される希釈剤溶液は、下記成分の１つまたは複数を含む：デキストロース、アデニン、マンニトール、シトレート（例えば、クエン酸ナトリウム）、クエン酸、ホスフェート（例えば、Ｎａ２ＨＰＯ４および／またはＮａＨ２ＰＯ４）、およびクロライド（例えば、塩化ナトリウムに由来する）。一部の実施形態では、該希釈剤溶液のデキストロースの濃度および／または該希釈剤溶液による希釈後の該ＲＢＣ組成物のデキストロースの終濃度は、約１０ｍＭ〜約１５０ｍＭ、または約２０ｍＭ〜約１２０ｍＭ、または約２５ｍＭ〜約１００ｍＭ、または約３０ｍＭ〜約７５ｍＭ、または約４０ｍＭ〜約５０ｍＭ、または約５０ｍＭ〜約６０ｍＭの濃度である。一部の実施形態では、該希釈剤溶液のアデニンの濃度および／または該希釈剤溶液による希釈後の該ＲＢＣ組成物のアデニンの終濃度は、約０．５ｍＭ〜約５ｍＭ、または約０．７５ｍＭ〜約３ｍＭ、または約１ｍＭ〜約２．５ｍＭである。一部の実施形態では、該希釈剤溶液のマンニトールの濃度および／または希釈後の該ＲＢＣ組成物のマンニトールの終濃度は、約１０ｍＭ〜約１５０ｍＭ、または約２０ｍＭ〜約１２０ｍＭ、または約２５ｍＭ〜約１００ｍＭ、または約３０ｍＭ〜約７５ｍＭ、または約４０ｍＭ〜約６０ｍＭ、または約２５ｍＭ〜約３５ｍＭである。一部の実施形態では、該希釈剤溶液のシトレート（例えば、クエン酸ナトリウム）の濃度および／または該希釈剤溶液による希釈後の該ＲＢＣ組成物のシトレートの終濃度は、約５ｍＭ〜約１００ｍＭ、または約１０ｍＭ〜約７５ｍＭ、または約１５ｍＭ〜約５０ｍＭ、または約１５ｍＭ〜約３５ｍＭ、または約２０ｍＭ〜約３０ｍＭである。一部の実施形態では、該希釈剤溶液のホスフェート（例えば、Ｎａ２ＨＰＯ４および／またはＮａＨ２ＰＯ４）の濃度および／または該希釈剤溶液による希釈後の該ＲＢＣ組成物のホスフェートの終濃度は、約１ｍＭ〜約１５０ｍＭ、または約２ｍＭ〜約１００ｍＭ、または約３ｍＭ〜約７５ｍＭ、または約４ｍＭ〜約５０ｍＭ、または約５ｍＭ〜約２５ｍＭ、または約１０ｍＭ〜約２０ｍＭである。一部の実施形態では、該希釈剤溶液のおよび／または該希釈剤溶液による希釈後のクロライド濃度は、約５００ｍＭ、または約２５０ｍＭ、または約２００ｍＭ、または約１５０ｍＭ、または約１２０ｍＭ、または約１００ｍＭ、または約９０ｍＭ、または約８０ｍＭ、または約７０ｍＭ、または約６０ｍＭ、または約５０ｍＭ、または約４０ｍＭ、または約３０ｍＭ、または約２０ｍＭ、約１０ｍＭを超えるかまたは未満であるか、または約２５〜約２５０ｍＭ、または約４０〜約１００ｍＭ、または約５０〜約７５ｍＭ、または約６０〜約７０ｍＭ、または約１００〜約２００ｍＭ、または約１２５ｍＭ〜約１７５ｍＭである。
【００８７】
一部の実施形態では、本明細書で参照される該希釈剤溶液および／または該希釈剤溶液で希釈後の該ＲＢＣ組成物は、１０ｍＭ〜約１５０ｍＭ（または、約３５ｍＭ〜約６５ｍＭ）のデキストロース、０．５ｍＭ〜約５ｍＭ（または、約０．７５ｍＭ〜約３ｍＭ）のアデニン、約１０ｍＭ〜約１５０ｍＭ（または、約２５ｍＭ〜約７５ｍＭ）のマンニトール、約１０ｍＭ〜約７５ｍＭ（または、約１５ｍＭ〜約５０ｍＭ）のシトレート（例えば、クエン酸ナトリウム）、約３ｍＭ〜約７５ｍＭ（または、約５ｍＭ〜約２５ｍＭ）のホスフェート（例えば、Ｎａ２ＨＰＯ４および／またはＮａＨ２ＰＯ４）、および約５〜約５０ｍＭ、または（約１０〜２５ｍＭ）のクロライドを含む。
【００８８】
一部の実施形態では、非濃縮赤血球を、本明細書に記載の不活化法の前に希釈剤溶液（例えば、上述のまたは表３の任意の溶液）に供し、その後該クエンチャー濃度を本明細書に記載のように減少させ、その後、最終添加剤溶液（例えば、ＳＡＧ−Ｍ、ＡＳ−５、または上述のもしくは表２の任意の溶液）で処理して、使用に好適な（例えば、輸血に好適な）ＲＢＣ組成物を提供する。一部の実施形態では、該最終添加剤溶液は、本明細書に記載の任意の添加剤溶液、例えば、クロライドの濃度（および／または、輸血前など置換後の該ＲＢＣ組成物中のクロライドの終濃度）が、約５００ｍＭ、または約２５０ｍＭ、または約２００ｍＭ、または約１５０ｍＭ、または約１００ｍＭ、約７５ｍＭ、または約５０ｍＭ、または約２５ｍＭ未満であるか、または約２５〜２５０ｍＭ、または４０〜１００ｍＭ、または約５０〜７５ｍＭ、または約６０〜７０ｍＭ、または約１００〜２００ｍＭ、または約１２５ｍＭおよび１７５ｍＭ、または約１５０ｍＭである添加剤溶液であり得る。
【００８９】
【表３】
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再構成濃縮赤血球を使用する不活化方法
一部の実施形態では、濃縮赤血球（ｐＲＢＣ）（例えば、約７０〜９０％または約７５〜８５％の範囲内にあるかまたは約８０％のヘマトクリットを示す赤血球）を、本明細書に記載の不活化法（例えば、該組成物が、約１当量の塩基および約０．２ｍＭのＳ−３０３を有する約２０ｍＭのＧＳＨを含む方法）の前に、処理溶液に供する。処理溶液の例は、表４に示されている。一部の実施形態では、該処理溶液（例えば、表４に記載の任意の溶液）は、該クエンチャー、病原体不活化化合物、および任意の添加塩基を添加する前に、該ｐＲＢＣに添加される。これらの実施形態の一部では、該ｐＲＢＣ組成物は、非濃縮赤血球（例えば、５０〜７０％または約５５〜６５％の範囲内にあるかまたは約６０％のヘマトクリットを示す赤血球）をもたらす処理溶液で処理される。一部の実施形態では、（ａ）処理溶液がｐＲＢＣに添加され、（ｂ）本明細書に記載の不活化法（例えば、該組成物が約１当量の塩基および約０．２ｍＭのＳ−３０３を有する約２０ｍＭのＧＳＨを含む方法）が実施され、および（ｃ）該クエンチャーの濃度が、本明細書に記載のように（例えば、約１０ｍＭ未満または約５ｍＭ未満に）減少される。これらの実施形態の一部では、ステップ（ｃ）は、該処理溶液の除去および最終添加剤溶液（例えば、ＳＡＧ−Ｍ、ＡＳ−５、または表２、３、もしくは４の任意の溶液などの本明細書に記載の任意の溶液）の添加を含み、例えば、約５０〜７０％または約５５〜６５％の範囲内にあるかまたは約６０％のヘマトクリットを示す赤血球組成物をもたらす。これらの実施形態の一部では、不活化前および／または不活化中の該赤血球組成物の塩化物イオンの濃度は、約１５０ｍＭ、または約１２０ｍＭ、または約１００ｍＭ、または約９０ｍＭ、約８０ｍＭ、または約７０ｍＭ、または約６０ｍＭ、または約５０ｍＭ、約４０ｍＭ、約３０ｍＭ、または約２０ｍＭ、約１０ｍＭを超えるかまたは未満、または約２５〜２５０ｍＭ、または約４０〜１００ｍＭ、または約５０〜７５ｍＭ、または約６０〜７０ｍＭ、または約６５ｍＭである。
【００９０】
一部の実施形態では、本明細書で参照される処理溶液は、下記成分の１つまたは複数を含む：デキストロース、アデニン、マンニトール、シトレート（例えば、クエン酸ナトリウム）、クエン酸、ホスフェート（例えば、Ｎａ２ＨＰＯ４および／またはＮａＨ２ＰＯ４）、およびクロライド（例えば、塩化ナトリウムに由来する）。一部の実施形態では、該処理溶液のデキストロースの濃度および／または該ＲＢＣ組成物中の該処理溶液を除去した後の該添加剤溶液中のデキストロースの濃度は、約１０ｍＭ〜約１５０ｍＭ、または約２０ｍＭ〜約１２０ｍＭ、または約２５ｍＭ〜約１００ｍＭ、または約３０ｍＭ〜約７５ｍＭ、または約４０ｍＭ〜約５０ｍＭ、または約５０ｍＭ〜約６０ｍＭである。一部の実施形態では、該処理溶液のアデニンの濃度および／または該ＲＢＣ組成物中の該処理溶液を除去した後の該添加剤溶液中のアデニンの濃度は、約０．５ｍＭ〜約５ｍＭ、または約０．７５ｍＭ〜約３ｍＭ、または約１ｍＭ〜約２．５ｍＭである。一部の実施形態では、該処理溶液のマンニトールの濃度および／または該ＲＢＣ組成物中の該処理溶液を除去した後の該添加剤溶液中のマンニトールの濃度は、約１０ｍＭ〜約１５０ｍＭ、または約２０ｍＭ〜約１２０ｍＭ、または約２５ｍＭ〜約１００ｍＭ、または約３０ｍＭ〜約７５ｍＭ、または約４０ｍＭ〜約６０ｍＭである。一部の実施形態では、該処理溶液のシトレート（例えば、クエン酸ナトリウム）の濃度および／または該ＲＢＣ組成物中の該処理溶液を除去した後の該添加剤溶液中のシトレートの濃度は、約１ｍＭ〜約１００ｍＭ、または約２ｍＭ〜約７５ｍＭ、または約５ｍＭ〜約５０ｍＭ、または約７．５ｍＭ〜約２５ｍＭ、または約１０ｍＭ〜約１５ｍＭである。一部の実施形態では、該処理溶液のホスフェート（Ｎａ２ＨＰＯ４および／またはＮａＨ２ＰＯ４）の濃度および／または該ＲＢＣ組成物中の該処理溶液を除去した後の該添加剤溶液中のホスフェートの濃度は、約１ｍＭ〜約１５０ｍＭ、または約２ｍＭ〜約１００ｍＭ、または約３ｍＭ〜約７５ｍＭ、または約４ｍＭ〜約５０ｍＭ、または約５ｍＭ〜約２５ｍＭ、または約１０ｍＭ〜約２０ｍＭである。一部の実施形態では、該処理溶液のクロライド濃度および／または該ＲＢＣ組成物中の該処理溶液を除去した後の該添加剤溶液中のクロライド濃度は、約２５０ｍＭ、または約２００ｍＭ、または約１５０ｍＭ、または約１２０ｍＭ、または約１００ｍＭ、または約９０ｍＭ、または約８０ｍＭ、または約７０ｍＭ、または約６０ｍＭ、または約５０ｍＭ、または約４０ｍＭ、または約３０ｍＭ、または約２０ｍＭ、約１０ｍＭからであるか、または約２５〜約２５０ｍＭ、または約４０〜約１００ｍＭ、または約５０〜約７５ｍＭ、または約６０〜約７０ｍＭ、または約１００〜約２００ｍＭ、または約１２５ｍＭ〜約１７５ｍＭである。
【００９１】
一部の実施形態では、該処理溶液および／または該ＲＢＣ組成物中の該処理溶液を除去した後の該添加剤溶液は、１０ｍＭ〜約１５０ｍＭ（または、約３５ｍＭ〜約６５ｍＭ）のデキストロース、０．５ｍＭ〜約５ｍＭ（または、約０．７５ｍＭ〜約３ｍＭ）のアデニン、約１０ｍＭ〜約１５０ｍＭ（または、約２５ｍＭ〜約７５ｍＭ）のマンニトール、約５ｍＭ〜約７５ｍＭ（または、約１０ｍＭ〜約２０ｍＭ）のシトレート（例えば、クエン酸ナトリウム）、約３ｍＭ〜約７５ｍＭ（または、約５ｍＭ〜約２５ｍＭ）のホスフェート（例えば、Ｎａ２ＨＰＯ４および／またはＮａＨ２ＰＯ４）、および約５〜１００ｍＭ、または（約２５〜７５ｍＭ）のクロライドを含む。
【００９２】
【表４】
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方法の有効性の評価
上記で考察したようにｌｏｇ不活化を比較することに加えて、該改善されたクエンチング法の有効性は、その内容の全体が本明細書に参考として援用される米国特許公開第２００６／０１１５４６６号明細書に記載のような、いくつかの他の方法により評価され得る。例えば、該クエンチング法は、該赤血球組成物の修飾を該赤血球の機能、形態、および水和状態の観点で、および該処理された赤血球と抗体などの免疫系との反応性の観点から評価することにより、評価され得る。該処理された赤血球組成物が、注入などのヒト使用を目的とする場合、該クエンチング法は、赤血球機能を（例えば脱水により）実質的に損傷するべきでない。赤血球機能に対する有害効果の実質的な欠如は、赤血球機能検査の技術分野で公知の方法により測定され得る。特に、脱水レベルは、例えば、ヘマトクリット（赤血球沈殿容積、ＰＣＶ）、浸透圧脆弱性、平均ヘモグロビン濃度（ＭＣＨＣ）、溶血パーセント、およびエクタサイトメトリー（ｅｋｔａｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）により測定することができる。ＡＴＰ（アデノシン５’−３リン酸）、総２，３−ＤＰＧ（２，３−ジホスホグリセロール）、または細胞外カリウムなどの、他の機能指標のレベルを測定し、未処理対照と比較することができる。加えて、細胞内および細胞外ｐＨ、ヘモグロビン、グルコース消費、および乳酸（ｌａｃｔａｔｅ）産生を測定してもよい。本発明の改善された方法は、米国特許公開第２００６／０１１５４６６号明細書にある以前に記載された処理条件（例えば、本明細書に記載のインキュベーション後にクエンチャー濃度を低減させずに該Ｓ−３０３／赤血球混合物と組み合わせて完全にクエンチングされた（２塩基当量の）２０ｍＭグルタチオン）と比較することができる。
【００９３】
本発明の一部の実施形態では、本明細書に記載の方法および組成物の赤血球は、処理後に損傷（例えば、脱水、溶血など）を最小限に示すかまたは損傷を示さない。一部の実施形態では、該赤血球組成物、クエンチャー、病原体不活化化合物、および任意の添加塩基を含む結果として生じる混合物の赤血球（該クエンチャー濃度の低減前または低減後）は、４％未満、または３％未満、または２％未満、１％未満の溶血、または０．５％未満の溶血を示す。一部の実施形態では、結果として生じる混合物の赤血球は、該クエンチャー（例えば、グルタチオン）の濃度低減の４℃で約１０日後、または４℃で約２８日もしくは４２日後、または４℃で約４２日後の時点で、４％未満、または３％未満、または２％未満、または１％未満、または０．５％未満の溶血を示す。
【００９４】
一部の実施形態では、該赤血球組成物、クエンチャー、病原体不活化化合物、および任意の添加塩基を含む結果として生じる混合物の赤血球（該クエンチャー濃度の低減前または低減後）は、５０％を超える、または５５％を超える、または６０％を超える、または６５％を超える赤血球沈殿容積（ＰＣＶ）を示す。一部の実施形態では、結果として生じる混合物の赤血球は、該クエンチャー（例えば、グルタチオン）の濃度低減の４℃で約１０日後、または４℃で約２８日もしくは４２日後、または４℃で約４２日後の時点で、５０％を超える、または５５％を超える、または６０％を超える、または６５％を超える赤血球沈殿容積（ＰＣＶ）を示す。
【００９５】
一部の実施形態では、該赤血球組成物、クエンチャー、病原体不活化化合物、および任意の添加塩基を含む結果として生じる混合物の赤血球（該クエンチャー濃度の低減前または低減後）は、１３０を超える、または１３５を超える、または１４０を超える、または１４５を超える、または１５０を超える、または１５５を超えるメジアン血球脆弱性（ＭＣＦ；５０％の溶血が生じる容量オスモル濃度）を示す。一部の実施形態では、結果として生じる混合物の赤血球は、該クエンチャー（例えば、グルタチオン）の濃度低減の４℃で約１０日後、または４℃で約２８日もしくは４２日後、または４℃で約４２日後の時点で、１３０を超える、または１３５を超える、１４０を超える、または１４５を超える、または１５０を超える、または１５５を超えるメジアン血球脆弱性（ＭＣＦ）を示す。
【００９６】
ＡＴＰ、２，３−ＤＰＧ、グルコース、ヘモグロビン、溶血、およびカリウムを決定する方法は、当技術分野で利用可能であり、本明細書の実験セクションに記載されている。例えば、その開示が本明細書中に援用されるＤａｖｅｙら、Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ、３２巻：５２５〜５２８頁（１９９２年）を参照されたい。赤血球機能を決定する方法は、Ｇｒｅｅｎｗａｌｔら、Ｖｏｘ  Ｓａｎｇ、５８巻：９４〜９９頁（１９９０年）；Ｈｏｇｍａｎら、Ｖｏｘ  Ｓａｎｇ、６５巻：２７１〜２７８頁（１９９３年）；およびＢｅｕｔｌｅｒら、Ｂｌｏｏｄ、５９巻（１９８２年）にも記載されており、それらの開示は本明細書中に参照により援用される。例えば、総ＡＴＰおよび総２，３−ＤＰＧは、Ｓｉｇｍａ社製ＡＴＰキットまたは２，３−ＤＰＧキット（Ｓｉｇｍａ社製、セントルイス、米国ミズーリ州）を使用して測定され得る。該ＡＴＰキットは、その開示が本明細書中に参照により援用されるＳｉｇｍａ社の手順、第３６６−ＵＶに従って使用され得る。総ＡＴＰは、ルシフェラーゼに基づく酵素アッセイまたはＢｅｕｔｌｅｒ（１９８４年）により記載のプロトコールを使用して測定され得る。細胞外カリウムレベルは、Ｃｉｂａ  Ｃｏｒｎｉｎｇ社製６１４型Ｋ＋／Ｎａ＋アナライザー（Ｃｉｂａ  Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製、メドフォード、米国マサチューセッツ州）を使用して測定され得る。細胞外ｐＨは、１２，０００×ｇで１５分間４℃で細胞を遠心分離し、上清を取り除くことにより測定され得、そのｐＨは、室温で標準的ｐＨ計（例えば、Ｂｅｃｋｍａｎ社製、エポキシカロメル電極）を使用して測定され得る。細胞内ｐＨの場合、残留ペレットを、遠心分離チューブに入れて蓋をして、少なくとも２時間約−８０℃で保管することができる。その後、脱イオン水を添加することにより、これを溶解することができる。溶解試料を十分に混合することができ、溶液のｐＨは、室温で標準的ｐＨ計を使用して、または室温でＣｉｂａ  Ｃｏｒｎｉｎｇ社製２３８型血液ガスアナライザー（Ｃｉｂａ  Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製、メドフォード、米国マサチューセッツ州）を使用してのいずれででも測定され得る。測定は、処理のすぐ後で行うことができ、例えば４２日までの保管など、処理後保管の関数として行うことができる。本発明の方法は、該処理された赤血球の溶血が、２８日間の保管後に３％未満、好ましくは４２日間の保管後に２％未満、もっとも好ましくは４℃で４２日間の保管後に１％未満または１％と等しい赤血球組成物を提供する。一部の実施形態では、２ｍＭの酸性グルタチオンおよび０．２ｍＭのＳ−３０３を使用して処理された赤血球組成物と比較した際に、総ＡＴＰレベルがより高レベルであり得る赤血球組成物（例えば、本明細書に記載の方法のいずれかを使用した赤血球組成物）が提供される。一部の実施形態では、本明細書に記載のクエンチング法は、２ｍＭの酸性グルタチオンおよび０．２ｍＭのＳ−３０３を使用した方法に由来する組成物と比較した際に、約２０％、また３０％、また４０％、または約５０％、より高いＡＴＰレベルを有する赤血球組成物を提供する。一部の実施形態では、より高いＡＴＰレベルは、７、１４、２１、２８、３５、または４２日間の保管後で維持されている。一部の実施形態では、より高いレベルのＡＴＰは、保管中に減少する。
【００９７】
本発明の一部の実施形態では、本明細書に記載の方法および組成物には、該赤血球が、該病原体不活化化合物に由来する望ましくない副反応（例えば、該ＲＢＣ表面への該病原体不活化化合物の結合）数の減少を示す赤血球組成物が含まれる。一部の実施形態では、該副反応は、該病原体不活化化合物による該赤血球の表面の修飾である。本発明の方法における赤血球修飾の低減は、その内容が本明細書中に参照により援用される米国特許公開第２００６／０１１５４６６号明細書に記載のものなどの、当技術分野で公知のいくつかのアッセイにより評価することができる。該ＲＢＣ表面に結合されたアクリジンの定量化は、本明細書に記載の高感度蛍光活性化免疫フローサイトメトリーアッセイ（ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｉｍｍｕｎｅ  ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ  ａｓｓａｙ）（ＩＦＣ）を使用しても決定され得る。
【００９８】
蛍光検出アッセイに関して、本発明のクエンチング法は、塩基を使用しない同じ処理と比較した際に（例えば、中和グルタチオンを使用した方法が、非中和グルタチオンを使用した同じ方法と比較される）、少なくとも１０％、また少なくとも２５％、また少なくとも５０％、また少なくとも７５％、または少なくとも９０％のメジアン蛍光の低減をもたらし得る。例えば、塩基の使用を伴う記載の組成物のいずれか（例えば、約１５〜２５ｍＭのグルタチオン、約０．５〜１．５当量の塩基、および約０．２ｍＭのＳ−３０３を含む赤血球組成物）を使用した本発明のクエンチング法は、同一だが塩基を使用しない組成物（例えば、約１５〜２５ｍＭのグルタチオンおよび約０．２ｍＭのＳ−３０３を含むが塩基を有していない赤血球組成物）と比較した際に、より低レベルのメジアン蛍光をもたらし得る。
【００９９】
本発明のクエンチング法および組成物で該ＲＢＣ表面に結合された病原体不活化化合物のレベルは、抗体結合能（ＡＢＣ；Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製；フィッシャー、米国インディアナ州の検定ビーズ（ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ  ｂｅａｄ）の使用により決定されるような、１赤血球当たりの病原体不活化化合物またはその誘導体の分子数、実施例５および９を参照）の点でも測定され得、それには、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）に結合されたマウスモノクローナル抗アクリジン抗体、およびＦＡＣＳ−Ｃａｌｉｂｅｒフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）が関与している。本発明の方法および組成物のいずれかの一部の実施形態では、該ＲＢＣは、約７５，０００未満、または約７０，０００未満、または約６０，０００未満、または約５５，０００未満、または約５２，５００未満、または約５０，０００未満、または約４７，５００未満、または約４５，０００未満、または約４２，５００未満、または約４０，０００未満、または約３７，５００未満、または約３５，０００未満、または約３２，５００未満、または約３０，０００未満、または約２７，５００未満、または約２５，０００未満の平均ＡＢＣ値を示す。一部の実施形態では、該ＲＢＣは、約１０，０００〜８０，０００、または約２０，０００〜７０，０００、または約２５，０００〜７０，０００、または約２５，０００〜６０，０００、または約３０，０００〜５０，０００、または約３５，０００〜４５，０００の平均ＡＢＣ値を示す。一部の実施形態では、本明細書に記載の方法は、クエンチャーおよび塩基（例えば、中和グルタチオン）によるかかる類似処理と比較した際に、塩基で処理されていないＲＢＣ組成物（例えば、中和されていないグルタチオン）を使用した同一の方法と比較して、９０％未満、また７５％未満、また６５％未満、また５５％未満、また４５％未満、また３５％未満、また２５％未満、または１０％未満のＡＢＣ値をもたらし得る。
【０１００】
本発明のクエンチング法は、試料中の核酸の修飾レベルを決定することにより既存の方法と比較することもできる。典型的には、赤血球組成物は、白血球を含有していてもよく、該白血球に由来する核酸は単離することができる。放射性同位体を有する病原体不活化化合物は、該化合物と核酸との反応の際に、核酸と結合したままであろう。これを利用して、核酸と反応した化合物の量を様々なクエンチング法について評価することができ、予測される白血球不活化と直接相関し得る尺度が提供される。１，０００個の核酸塩基対当たりの形成されたＳ−３０３付加物の数は、種々の方法の病原体不活化に対する予測される効果を評価するためのモデルとして使用することができる。あるいは、好適な量の病原体を赤血球組成物に添加することができ、該病原体の核酸は、処理後に単離することができる。しかしながら、この場合、該試料は、いかなる残留白血球のレベルも病原体核酸の測定を妨害しないように、白血球除去される必要がある。
【０１０１】
望ましくない副反応（例えば、望まれない免疫応答に結びつき得る、該ＲＢＣ表面への該病原体不活化化合物の結合）および脱水のレベルを低減させつつ、適切な病原体不活化を提供することに加えて、本発明のクエンチング法は、少なくとも一部の実施形態では、病原体不活化後に反応性求電子種の濃度低減も提供する。該赤血球組成物が注入を目的としている場合、反応性求電子種のレベルは、可能な限り低く、好ましくはもはや実質的に検出可能でないことが重要である。反応性求電子種の存在は、液体クロマトグラフィー質量分析法（ＬＣ−ＭＳ−ＭＳ）を含むクロマトグラフィー法などの、当技術分野で利用可能な方法を使用して決定され得る。加えて、試料の残存活性は、Ｍａｔｔｅｓ（Ｍａｔｔｅｓ，  ＷＲ、Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １９９２年１０月；２０６巻（１号）：１６１〜７頁）に記載されている一般的なアルキル化剤アッセイの使用など、核酸のグアニン残基と反応するその能力を評価することにより評価され得る。このアッセイでは、該ＲＢＣは、該病原体不活化化合物およびクエンチャーを用いた好適なインキュベーション時間後に抽出される。任意の残留病原体不活化化合物、ならびにクエンチャーおよび他の低分子種は、タンパク質から分離される。その後、これらの種は、８−３Ｈグアニン残基を用いて合成された二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡと共にインキュベートされる。該残留病原体不活化化合物は、グアニンのＮ７位でｄｓ  ＤＮＡと反応し、それにより８−Ｈ残基が酸性化され、該３Ｈが溶液に放出され、そこで該３Ｈを単離および測定することができる。放出されたトリチウムの量は、定量化することができ、試験した抽出試料中に存在する残留アルキル化剤の量と１：１の相関性を示す。これらの方法により決定される求電子種のレベルは、本発明の改善された方法を使用し公知の方法と比較することにより評価することができる。
【０１０２】
本明細書に記載の方法の各々の一部の実施形態では、本方法は、該混合物中の化合物の濃度を低減させるステップをさらに含み、ここで、該化合物は、該病原体不活化化合物および該病原体不活化化合物の分解産物からなる群から選択される。一部の実施形態では、本方法は、該混合物中の該病原体不活化化合物の濃度を減少させるステップを含む。一部の実施形態では、本方法は、該混合物中の該求電子種の濃度を減少させるステップを含む。血液製剤などの生体試料中の該病原体不活化化合物の濃度は、例えば、バッチまたはフロー除去工程における吸着により、該処理後に低減することができる。使用し得る方法およびデバイスは、米国特許第６，５４４，７２７号明細書、第６，３３１，３８７号明細書、第６，９５１，７１３号明細書、および第７，０３７，６４２号明細書、ならびに米国特許出願第２００２／０１９２６３２号明細書（放棄）および第２００１／０００９７５６号明細書（放棄）に記載されており、それらの各々の開示は、その全体が本明細書中に参照により援用される。したがって、一部の実施形態では、該病原体不活化化合物の濃度は、該病原体不活化化合物に対する親和性を有する吸着粒子を含む吸着媒体と該混合物を接触させることにより低減される。一部の実施形態では、該吸着システムは、バッチ工程で該病原体不活化化合物を除去するように構成されるだろう。一部の実施形態では、該病原体不活化化合物は、化合物吸着デバイスを使用することによっては低減されない。一部の実施形態では、該混合物中の該病原体不活化化合物の濃度は、当技術分野で公知の技術を使用して赤血球を洗浄することにより低減される。一部の実施形態では、該混合物中の該病原体不活化化合物の濃度は、該処理溶液（例えば、ＳＡＧ−Ｍ、ＡＳ−５、または表２、３、および／または４に記載の任意の溶液）の一部またはすべてを、本明細書に記載の方法により、および／または当技術分野で公知の方法により（例えば、遠心分離および圧出デバイス、またはＴｅｒｕｍｏ（登録商法）社製のＴＡＣＳＩなどの遠心分離および圧出器の組み合わせを使用して）除去することによって低減される。一部の実施形態では、該混合物中の該病原体不活化化合物の濃度は、該処理溶液（例えば、ＳＡＧ−Ｍ、ＡＳ−５、または表２、３、および／または４に記載の任意の溶液）の一部またはすべてを除去し、その後添加剤溶液（例えば、ＳＡＧ−Ｍ、ＡＳ−５、または表２に記載の任意の溶液）を該混合物に添加することによって低減される。一部の実施形態では、該病原体不活化化合物の濃度は、該クエンチャーの濃度の低減と同時に低減される。
【０１０３】
処理された血液組成物
一部の実施形態では、本発明は、本明細書に記載の処理方法の各々に起因する赤血球組成物も提供する。一部の実施形態では、本発明は、本明細書に記載の処理方法の各々により調製可能な赤血球組成物も提供する。一実施態様において、本発明は、ａ）病原体不活化化合物の求電子性基と共有結合で反応した赤血球、およびｂ）該病原体不活化化合物と反応可能であるチオール基を含むクエンチャーを含む組成物を提供し、該組成物は、４℃で２８日または４２日間保管した後でヒトに注入するのに好適である。
【０１０４】
本明細書に記載の方法および組成物の各々の一部の実施形態では、該赤血球組成物中の赤血球は、哺乳動物血球である。例えば、該赤血球は、げっ歯動物（例えば、マウスまたはラット）、イヌ、ウサギ目の動物（例えば、ウサギ）、非ヒト霊長類（例えば、チンパンジー）、またはヒトの赤血球であり得る。例えば、一部の実施形態では、該赤血球はヒトである。一部の実施形態では、該赤血球組成物は、白血球除去されている。他の一部の実施形態では、該赤血球は、白血球除去されていない。一部の実施形態では、該赤血球含有組成物は、病原体で汚染されている可能性がある。一部の実施形態では、該赤血球組成物は、病原体で汚染されている。一部の実施形態では、もし存在するとすれば、該組成物中の病原体の少なくとも１ｌｏｇ、または少なくとも２ｌｏｇ、または少なくとも３ｌｏｇ、または少なくとも４ｌｏｇが不活化される。
【０１０５】
一部の実施形態では、本発明は、本明細書に記載のように、該赤血球が、該病原体不活化化合物（例えば、Ｓ−３０３）で修飾された赤血球組成物を包含する。一部の実施形態では、本方法の処理により生成された赤血球組成物は、該病原体不活化化合物の分解産物（例えば、該クエンチャーと該病原体不活化化合物との反応産物）を含む。一部の実施形態では、該修飾は、病原体不活化化合物の求電子性基と該赤血球表面との反応である。一部の実施形態では、該病原体不活化化合物は、該赤血球表面に共有結合で結合される。一部の実施形態では、該病原体不活化化合物は、該赤血球表面上の１つまたは複数のタンパク質と共有結合で結合される。一部の実施形態では、該修飾は、該赤血球の求核性基と該病原体不活化化合物の求電子性基との反応であり、ここで、該求電子性基はマスタード基であり、該求核性基は、該マスタード基の１つまたは複数の塩素原子を置換する。一部の実施形態では、該病原体不活化化合物は、該赤血球表面に非共有結合で結合される。一部の実施形態では、該ＲＢＣ組成物は、７５，０００未満、または７０，０００未満、または６０，０００未満、または５５，０００未満、または５２，５００未満、または５０，０００未満、または４７，５００未満、または４５，０００未満、または４２，５００未満、または４０，０００未満、または３７，５００未満、または３５，０００未満、または３２，５００未満、または３０，０００未満、または２７，５００未満、または２５，０００未満の平均ＡＢＣ値を示す。一部の実施形態では、該ＲＢＣは、約１０，０００〜８０，０００、または約２０，０００〜７０，０００、または約２５，０００〜７０，０００、または約２５，０００〜６０，０００、または約３０，０００〜５０，０００、または約３５，０００〜４５，０００の平均ＡＢＣ値を示す。
【０１０６】
一部の実施形態では、該赤血球組成物は、該病原体不活化化合物による処理を伴う他の方法により生成された赤血球と比べて、低減されたレベルの、該病原体不活化化合物による該赤血球の表面の修飾を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載の方法の処理により生成された赤血球組成物は、該病原体不活化化合物による処理を伴う別の方法（例えば、十分なクエンチャーおよび／または塩基が反応混合物に添加されない方法、クエンチャーおよび／または塩基が反応混合物に添加されず、および／またはより低いｐＨで処理される方法）により生成された赤血球組成物と比べて、低減された量の、処理完了後に該反応性求電子性基を含む病原体不活化化合物を含む。一部の実施形態では、該組成物中における該反応性求電子性基を含む病原体不活化化合物の量は、該病原体不活化化合物を伴う別の方法（例えば、十分なクエンチャーおよび／または塩基が反応混合物に添加されない方法、クエンチャーおよび／または塩基が反応混合物に添加されず、および／またはより低いｐＨで処理される方法）により処理された組成物と比べて、約１０％、約２５％、約５０％、約７５％、約９０％、約９５％、または約９９％低減される。
【０１０７】
これらの実施形態の一部では、該赤血球組成物は、残留クエンチャー化合物（例えば、グルタチオン）を含む。一部の実施形態では、該組成物は、ＲＢＣ活性度および寿命を維持し、赤血球脱水を回避し、および／または保管中の浸透圧脆弱性を低減するのに十分な程度に低い濃度のクエンチャーを含む。一部の実施形態では、該組成物は、該組成物中で以前に使用されたクエンチャーより十分に低い濃度のクエンチャーを含む。一部の実施形態では、以前に使用されたより高い濃度のクエンチャーは、ＲＢＣ活性度および寿命を減少、および／または赤血球脱水を増大、および保管中の浸透圧脆弱性を減少させ、該より低い濃度は、該組成物中で以前に使用されたクエンチャーの濃度より十分に低い。一部の実施形態では、該組成物中の該クエンチャーの濃度は、約２５ｍＭ未満、約２０ｍＭ未満、約１５ｍＭ未満、約１０ｍＭ未満、約８ｍＭ未満、約６ｍＭ未満、約５ｍＭ未満、約４ｍＭ未満、約３ｍＭ未満、約２ｍＭ未満、または約１ｍＭ未満である。一部の実施形態では、該組成物中の該クエンチャーの濃度は、約１ｍＭ〜２０ｍＭ、約２ｍＭ〜１５ｍＭ、約３ｍＭ〜１０ｍＭ、約４ｍＭ〜８ｍＭ、または約５ｍＭ〜６ｍＭの範囲内である。
【０１０８】
一部の実施形態では、該組成物は、添加剤溶液（例えば、表２に記載の溶液、または表２に記載の成分の任意の組み合わせを含む溶液）を含む。一部の実施形態では、該組成物は、塩化ナトリウム、アデニン、グルコース、ホスフェート、および／またはマンニトールを含む。一部の実施形態では、該ＲＢＣ組成物の塩化物イオンの終濃度（例えば、輸血前）は、約５００ｍＭ、または約２５０ｍＭ、または約２００ｍＭ、または約１５０ｍＭ、または約１００ｍＭ、約７５ｍＭ、または約５０ｍＭ、または約２５ｍＭ未満、または約２５〜２５０ｍＭ、または約４０〜１００ｍＭ、または５０〜７５ｍＭ、または約６０〜７０ｍＭ、または約１００〜２００ｍＭ、または約１２５〜１７５ｍＭ、または約１５０ｍＭである。
【０１０９】
一部の実施形態では、該組成物は、４℃で保管した約２日、または約５日、または約１０日、または約１５日、または約２０日、または約２８日、または約３５日、または約４２日後で、個体（例えば、ヒト）に注入するのに好適である。
【０１１０】
これらの実施形態の一部では、該組成物は、ａ）細胞表面上で病原体不活化化合物（例えば、Ｓ−３０３）の求電子性基と共有結合で反応し、およびｉ）６０％を超える赤血球沈殿容積（ＰＣＶ）を有し、および／またはｉｉ）約２５，０００〜７０，０００（または、約３５，０００〜４５，０００）の平均抗体結合能（ＡＢＣ）を有する赤血球、ならびにｂ）約８ｍＭ未満（または６ｍＭ未満、または約２ｍＭ未満）の濃度のグルタチオンクエンチャーを含む。一部の実施形態では、もし存在するとすれば、少なくとも３ｌｏｇ（または少なくとも１ｌｏｇ）の病原体が不活化される。一部の実施形態では、該組成物は、４℃で保管した２８日または４２日まで、ヒトへの注入に好適である。
【０１１１】
キット
改善されたクエンチング法に加えて、本発明は、赤血球組成物処理用の使い捨てのキットを供給し、該処理は、手作業で実施してもよく、または自動で実施してもよい。一部の実施形態では、本発明は、本明細書に記載の方法の各々で使用される病原体不活化化合物、クエンチャー、および／または塩基を含むキットを提供する。一部の実施形態では、該キットは、本明細書に記載のクエンチャー濃度を減少させた後で使用するための新鮮な溶液（細胞再懸濁用の緩衝液など）を提供する。
【０１１２】
一部の実施形態では、該キットは、その任意の塩を含むＳ−３０３およびその任意の塩を含む中和グルタチオンを含む。Ｓ−３０３は、固体形態であってもよく、または溶液であってもよい。同様に、中和グルタチオンは、固体形態であってもよく、または溶液であってもよい。これらの固体または溶液は、許容され得る賦形剤、アジュバント、希釈剤、または安定化剤をさらに含んでいてもよい。一部の実施形態では、Ｓ−３０３は塩酸塩であり、中和グルタチオンは、約１当量の水酸化ナトリウムで中和されている。一部の実施形態では、Ｓ−３０３および中和グルタチオンは固体形態であり、該キットは、Ｓ−３０３を溶解するのに好適な溶液および中和グルタチオンを溶解するのに好適な溶液をさらに含む。一部の実施形態では、本発明は、病原体不活化化合物、クエンチャー、および該クエンチャーを溶解するための溶液を含むキットを提供し、そこでは、該溶液は該クエンチャーを中和するかまたは部分的に中和する。本明細書で考察された方法およびキットは、混合物としてまたは別々に処方することができる、該病原体不活化化合物およびクエンチャーの任意の好適な医薬製剤を包含する。薬学的に許容され得る製剤は当業者に公知であり、例えば、好適な賦形剤、アジュバント、希釈剤、または安定化剤の例は、Ｇｅｎｎａｒｏ，編、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２０版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆Ｗｉｌｋｉｎｓに見出すことができる。本発明は、病原体不活化化合物の改善されたクエンチングを達成するために、該組成物が好適なｐＨ領域にある上述のような赤血球、病原体不活化化合物、およびクエンチャーを含む、上述の方法の、結果として生じる組成物も含む。
【０１１３】
別の実施態様において、本発明は、例えば、赤血球組成物を処理して病原体を不活化するのに有用なキットであって、核酸結合リガンドおよび求電子性基であるかまたは求電子性基を形成する官能基（その任意の塩を含む）を含む病原体不活化化合物と、チオール基（その任意の塩を含む）を含むクエンチャーと、約０．７５〜約１．２５当量の塩基とを含むキットを提供し、ここで当量とは、該キット中のクエンチャーのモル量と等しいモル量を意味する。一部の実施形態では、該キットは、約１当量の好適な塩基を含む。
【０１１４】
さらなる別の実施態様において、本発明は、赤血球組成物を処理して病原体を不活化するのに有用なキットであって、その任意の塩を含む核酸結合リガンドおよび求電子性基であるかまたは求電子性基を形成する官能基（例えば、Ｓ−３０３）と、その任意の塩を含む、チオール基を含む中和クエンチャー（例えば、中和グルタチオン）と、本明細書中に記載のクエンチャー濃度を減少させた後で使用するための任意選択の新鮮な溶液（細胞の再懸濁用の緩衝液など）を提供する。一部の実施形態では、該溶液は、本明細書に記載の添加剤溶液、希釈剤溶液、および／または処理溶液（例えば、ＳＡＧ−Ｍ、ＡＳ−５、上述のまたは表２、３、および／もしくは４の任意の溶液）である。
【実施例】
【０１１５】
例、物質、および方法
本発明は、以下の非限定的な例によりさらに説明される。
【０１１６】
（実施例１）生物調製
例、物質、および方法
これらの研究に使用した細菌株およびウイルス株は、カリフォルニア州保健局またはアメリカ培養細胞系統保存機関のいずれかから取得した臨床分離株であった。
【０１１７】
細菌：細菌の作業用凍結ストックを、グルコース非添加の５０％酵母エキス培地および５０％ウシ胎仔血清の混合物を含有する５００ｍＬのフラスコに接種した。該フラスコを、３７℃に設定した振とう水浴中で終夜インキュベートした。該終夜培養から直接的にグラム陽性細菌を血液産物にスパイクした。該グラム陰性細菌の終夜培養を、新鮮な培地に１：１０００希釈することによってさらに継代培養し、光学密度により決定されるような対数期に達するまで、上述のようにインキュベートした。ＰＩ実験用に、この対数期増殖を血液産物にスパイクした。
【０１１８】
ウイルス：無細胞ウイルスストックを、各ウイルスに適切な細胞系を使用して調製した。これらのストックは、ＰＩ実験用に解凍されて血液産物に直接スパイクされるまで、−８０℃で冷凍されていた。
【０１１９】
（実施例２）ＲＢＣユニットの調製
血液は、採血の当日または採血後３日までのいずれかで、４５０ｍＬまたは５００ｍＬ単位の全血として、Ｃｅｒｕｓに採取した。ほとんどの場合、ＲＢＣユニットに処理する前に、該全血を白血球フィルタリング（ｌｅｕｋｏｆｉｌｔｅｒ）した。ユニットによっては白血球フィルタリングがうまくいかない場合があり（例えば、鎌状形質を有するドナーに由来する血液）、これらのユニットは、白血球フィルタリングせずに、白血球の内部で生存することが知られていない生物のＰＩ実験用に使用した。
【０１２０】
白血球フィルタリング後、血液を遠心分離し、血漿を圧出した。その後、ＡＳ−３（Ｎｕｔｒｉｃｅｌ社製）などの所望のＲＢＣ添加剤溶液を添加し、結果として生じるＲＢＣユニットを、直ちに使用したか、または使用まで４℃で保管した。
【０１２１】
（実施例３）病原体不活化（ＰＩ）
ＰＩ工程には、ＲＢＣユニットに試験される生物培養物を接種することが伴う。ＲＢＣユニット中の生物の典型的な標的インプット力価は、１ｍＬのＲＢＣ当たりおよそ１０６ｃｆｕまたはｐｆｕだった。ほとんどの場合、生物容積（任意の培地を含む）は、ＲＢＣユニット容積のおよそ１％であり、典型的には１０％を超えなかった。より低く、より生理学的に関連性のある不活化を評価するために、細菌のレベルの、１０〜１０５ｃｆｕ／単位のインプットを使用した。低レベルインプット研究の場合、２ＲＢＣユニットをプールし、スパイクし、その後本明細書に記載のように処理した試験ユニットと、クエンチャー（例えば、ＧＳＨ）のみが添加された対照ユニット（病原体不活性化剤、例えばＳ−３０３非含有）とに分割し、試験ユニットと同じ温度状態下で保存した。
【０１２２】
ＲＢＣユニットに生物を添加した後、該ユニットを、容器の端部を持ち、８の字または自転車ペダルのような動きで、該端部を１０回動かすことにより混合した。
【０１２３】
その後、汚染されたＲＢＣを、ＲＢＣ  ＰＩ処理使い捨てセットの混合容器に移した。該セットは、プラスチックチューブによって接続されている一連のプラスチック容器およびポートから構成される。該混合容器は、デュアルポートの６００ｍＬ容量ＰＬ１８１３プラスチック容器だった。ルアー適合小児科用フィルターが１つの先端部に取り付けられているＹ型チューブセットが、該ポートの各々に接続されていた。１つのポートの未使用先端部は、別の６００ｍＬ容量ＰＬ１８１３プラスチック容器（インキュベーション容器）に接続されている。残る未使用先端部は、元のＲＢＣユニットを接続するために使用される管路だった。
【０１２４】
投与溶液を、以下のように調製し、該ユニットに添加した：１当量のＮａＯＨを有する６００ｍＭのグルタチオン（ＧＳＨ）溶液を、約１２ｍＬの０．９％生理食塩水および０．９ｍＬの１０Ｎ  ＮａＯＨ中に、２．８ｇのＧＳＨを溶解させることにより調製した。適切な容積のＧＳＨ溶液を、２０ｍＬ容積の注射器に吸引した。使用した容積は、典型的には、２８０ｍＬのＲＢＣ当たり１０ｍＬのＧＳＨ溶液＋管路喪失分の２ｍＬであり、投与ＲＢＣユニット中２０ｍＭのＧＳＨを生成した。インキュベーション容器に接続された先端部分を有するＹ型取付部を共有するフィルター付き先端部を使用して、ＧＳＨを含有した注射器を、混合容器に装着した。該ユニットを、揺動器に設置して、投与溶液の添加中の上下混合を容易にした。該ユニットを揺動器で混合している間に、ＧＳＨを該ユニットに添加した。その後、該ユニットを、上述の８の字混合法を使用して手作業で混合した。ＧＳＨの添加後、該ユニットを室温で５分間静置させた。
【０１２５】
静置期間後、少量のＲＢＣ試料を取り出して、処理前の力価を決定するために培養した。細菌試料の場合は標準的プレートアッセイを使用し、ウイルスの場合は細胞培養アッセイを使用した。
【０１２６】
６ｍＭのアムスタリン塩酸塩（Ｓ−３０３）溶液を、約１５ｍＬの０．９％生理食塩水中に４６ｍｇのＳ−３０３を溶解させることにより調製した。適切な用量のＳ−３０３溶液を、２０ｍＬ注射器に吸引した。使用した容積は、典型的には、２８０ｍＬのＲＢＣ当たり１０ｍＬのＳ−３０３溶液＋管路喪失分の２ｍＬであり、投与ＲＢＣユニット中０．２ｍＭのＳ−３０３を生成した。その後、該ユニットを、上述のような８の字混合法を使用して手作業で混合した。処理後の力価用の試料採取をする前に、該処理されたＲＢＣユニットを、病原体不活化の完了を保証するためにＳ−３０３添加後室温で最低３時間インキュベートした。
【０１２７】
ＰＩの３時間後に、試料を取り出して上述のように培養し、処理後の力価を決定した。低レベル細菌インプットの不活化を評価する研究の場合、処理後に、試験ユニットおよび対照ユニットを両方とも、室温で約２０時間インキュベートし、その後３７℃で終夜インキュベートした。３７℃のインキュベーション後、各処理された試験ユニットおよび同一の未処理対照ユニットから、試料を取り出して培養し、細菌力価の質的評価を得た。未処理対照ユニットは増殖を示した。
【０１２８】
各ユニットのｌｏｇ低減は、処理後力価に対する処理前力価の対数率を取ることにより決定し、力価は、１０×  ｃｆｕまたはｐｆｕ／ｍＬとして表された。
【０１２９】
（実施例４）ＲＢＣ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ機能実験
ヒトＲＢＣユニットを、製造業者の説明書に従って、ＡＳ−３（Ｎｕｔｒｉｃｅｌ社製）などの添加剤溶液中に調製した。ＲＢＣユニットを種々の濃度のＧＳＨで処理して、２ｍＭ〜３０ｍＭの範囲の終濃度を達成した。一部の場合では、ＧＳＨは、重炭酸ナトリウムまたは水酸化ナトリウムのいずれかによる１または２塩基当量で、処理前にｐＨが調整されていた。ＧＳＨで処理した後、ＲＢＣを、ＲＢＣ中０．２ｍＭのＳ−３０３濃度を達成するように０．９％塩化ナトリウムで溶解したＳ−３０３で処理したか、または０．９％塩化ナトリウムで擬似投与した。処理後、ユニットを２０〜２５℃で２０時間インキュベートした。インキュベーション後、いくつかのユニットを、２１℃で６分間４１００×ｇで遠心分離し、上清を圧出し、１００ｍＬの新鮮な添加剤溶液をＲＢＣに添加した。すべてのユニットは、保管のために４℃に置かれていた。未処理対照は、添加剤溶液中で調製した後４℃に置かれていた。
【０１３０】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ機能を、保管経過中の種々の時点でアッセイした。Ｃｈｉｒｏｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ血液ガスアナライザーで各ユニットのＲＢＣのｐＨを測定することにより、３７℃での細胞外ｐＨを決定した。ルシフェラーゼに基づく酵素アッセイまたはＢｅｕｔｌｅｒ（１９８４年）により記載のプロトコールを使用して、総ＡＴＰを測定した。無細胞上清を調製して、細胞外カリウム、グルコース、および乳酸塩を評価した。Ｃｈｉｒｏｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｎａ／Ｋアナライザー（６１４型）または類似のアナライザーを使用して、無細胞上清のＫ＋含有量を測定することにより、細胞外カリウムを決定した。細胞外グルコースおよび乳酸塩を、ＮｅｘＣＴアナライザーで評価した。Ａｄｖｉａ血液アナライザー（Ｓｉｅｍｅｎｓ社製）を使用して、赤血球指数を収集した。
【０１３１】
ＲＢＣを０．９％塩化ナトリウムで３回洗浄し、浸透圧脆弱性および密度プロフィールの解析前に、室温で最低１時間インキュベートした。浸透圧脆弱性用に使用した方法は、Ｂｅｕｔｌｅｒら、１９８２年（Ｂｌｏｏｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ５９巻：１１４１〜１１４７頁）に概説されており、９６ウエル形式に改変されていた（Ｌｅｗら、２００３、Ｂｌｏｏｄ  １０１巻：４１８９〜４１９４頁）。マイクロヘマトクリットチューブでフタレートエステルを使用し、ＤａｎｏｎおよびＭａｒｉｋｏｖｓｋｙ、１９６４年（Ｊ  Ｌａｂ  Ｃｌｉｎ  Ｍｅｄ  ６巻：６６８〜６７４頁）に従って、密度分布曲線を得た。
【０１３２】
（実施例５）ＲＢＣ表面に結合する病原体不活化化合物の定量化
ＲＢＣ表面に結合されたアクリジンのレベルを、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）に結合したマウス抗アクリジンモノクローナル抗体、およびＦＡＣＳ−Ｃａｌｉｂｅｒフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を使用して、高感度蛍光活性化免疫フローサイトメトリーアッセイ（ＩＦＣ）で検出した。手短に言えば、ＲＢＣを０．９％生理食塩水で３回洗浄し、フローインキュベーション緩衝液（ＨＢＳＳ、１％ＢＳＡ、０．１％ＮａＮ３、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、３％ＢＳＡ）中４％のヘマトクリットに再懸濁した。次に、ＡＰＣに結合したマウスモノクローナル抗アクリジン抗体を添加し、４℃で３０分間インキュベートし、細胞を、フロー洗浄緩衝液（ＨＢＳＳ、１％ＢＳＡ、０．１％ＮａＮ３、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）で洗浄し、同じ緩衝液に再懸濁し、計３０，０００事象を、ＦＡＣＳ−Ｃａｌｉｂｅｒを用いて適切なゲーティングで評価した。ヒトＲＢＣの細胞表面に結合されたＳ−３０３分子数の定量化（ＡＢＣ）は、Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｓｉｍｐｌｙ
Ｃｅｌｌｕｌａｒビーズキット（Ｂａｎｇ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製、フィッシャー、米国インディアナ州）を使用して実施した。
【０１３３】
（実施例６）即時的および保管に関するＲＢＣの水和および機能に対するグルタチオンｐＨ効果
ＲＢＣユニットを、Ｓ−３０３（０．２ｍＭ）、およびＧＳＨクエンチングを増強するためにＮａＯＨ（様々な塩基当量（ｂ．ｅ．））でｐＨ調整したＧＳＨ（２０ｍＭ）で処理した。試験した投与溶液のｐＨは、０ｂ．ｅ．、１ｂ．ｅ．、および２ｂ．ｅ．の場合、それぞれ２．９、４．５、および８．９だった。処理後、ＲＢＣを４℃で保管し、細胞外ｐＨ、グルコース、乳酸塩、カリウム、総ＡＴＰ、および溶血について定期的にアッセイした。ＲＢＣの物理的パラメーター（ＭＣＶ、ＭＣＨ、ＭＣＨＣ、ＨＤＷなど）は、光学フローサイトメトリーで測定し、浸透圧脆弱性測定は、Ｌｅｗら、（２００３年）により改変されたＢｅｕｔｌｅｒら、（１９８２年）のように実施した。
【０１３４】
ＲＢＣをアルカリ性ＧＳＨに曝露することは、即時性かつ持続した浸透圧脆弱性減少およびＲＢＣ密度増大を示すＨｃｔの減少をもたらした（例えば、図１を参照）。この即時性脱水は、塩基当量を減少させることにより修正され、より低いｐＨのＧＳＨ溶液をもたらした（表５を参照）。即時性脱水は改善されたが、ＲＢＣの浸透圧脆弱性は、濃度依存的様式でＧＳＨの存在により変化し続けた（表６；図２および３のさらなる実施例）。光学フローサイトメトリー（Ａｄｉｖａ血液アナライザー、Ｓｉｅｍｅｎｓ社製）を使用したＭＣＨＣおよびＭＣＨ分布の測定は、浸透圧脆弱性および密度の変化と相関した。脱水は、効果がＳ−３０３の非存在下でｐＨおよびＧＳＨでも示されたため、Ｓ−３０３非依存性であった。
【０１３５】
【表５】
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【０１３６】
【表６】
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ＲＢＣ水和変化は、ＧＳＨ、ｐＨ、および濃度と相関したが、Ｓ−３０３またはＲＢＣ機能を評価するために日常的に使用される生化学アッセイ（ＡＴＰ、乳酸塩、グルコース）とは相関しなかった。ＧＳＨの高ｐＨへの曝露を制限することにより、初期脱水効果が防止された。高レベルＧＳＨの接触制限を継続することにより、保管脱水効果が防止された。これらの研究は、水和の実質的な変化は従来基準には影響を及ぼさないが、赤血球寿命の中程度の変化に寄与し得るため、保管ＲＢＣの水和状態の評価を、ＲＢＣ品質の予測因子に含めるべきであることを示す。
【０１３７】
（実施例７）その後にクエンチャーを減少させる改善されたクエンチング法は、保管後のＲＢＣ脱水の減少をもたらす。
【０１３８】
ＲＢＣユニットを、Ｓ−３０３（０．２ｍＭ）、およびＧＳＨクエンチングを増強するために１当量のＮａＯＨでｐＨ調整したＧＳＨ（２０ｍＭ）で処理した。ＧＳＨで処理した後、ＲＢＣを、ＲＢＣ中０．２ｍＭのＳ−３０３濃度を達成するように０．９％塩化ナトリウムで溶解したＳ−３０３で処理したか、または０．９％塩化ナトリウムで擬似投与した。処理後、ユニットを２０〜２５℃で２０時間インキュベートした。インキュベーション後、いくつかのユニットを、２１℃で６分間４１００×ｇで遠心分離し、上清を圧出し、１００ｍＬの新鮮な添加剤溶液をＲＢＣに添加した。すべてのユニットは、保管のために４℃に置かれていた。未処理対照は、添加剤溶液中で調製した後４℃に置かれていた。ＲＢＣ浸透圧脆弱性測定は、Ｌｅｗら、（２００３年）により改変されたＢｅｕｔｌｅｒら、（１９８２年）のように実施した。
【０１３９】
高濃度のＧＳＨへのＲＢＣの長期曝露は、ＲＢＣ密度の増大および浸透圧脆弱性の減少をもたらした（例えば、表５、図３および４を参照）。この保管に関連する脱水は、ＲＢＣ保管前にＧＳＨを取り除くことにより修正された（例えば、図４および５を参照）。時間およびＧＳＨ濃度依存性の脱水は、効果がＳ−３０３の非存在下のＧＳＨでも示されたため、Ｓ−３０３非依存性であった（例えば、図６を参照）。
【０１４０】
ＲＢＣ水和の変化はＧＳＨと相関した。処理溶液を新鮮な添加剤溶液に置換することにより高濃度のＧＳＨへの曝露を制限することは、保管により引き起こされる脱水効果を防止した。
【０１４１】
（実施例８）改善されたクエンチング法の病原体不活化
およそ６０％のヘマトクリットを示す白血球除去されたＲＢＣユニットを、ＡＳ−３保存培地中に調製した。ＲＢＣユニットに、およそ６ｌｏｇ／ｍＬの生存可能な生物を接種し、アリコートを取り出して未処理のインプット対照として機能させた。１当量のＮａＯＨ溶液中のＧＳＨを、接種したユニットに添加して２０ｍＭの終濃度にし、十分に混合した。Ｓ−３０３を０．２ｍＭの終濃度に添加し、該ユニットを再び十分に混合し、２０〜２５℃で３時間インキュベートした。インキュベーション後、試料を取り出してアッセイし、残留した生存可能生物を検出した。対照試料は、調製直後に力価測定し、３時間のインキュベーション期間後に再び力価測定した。少なくとも２つの複製を各生物について実施した。
【０１４２】
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓを除いて、グラム陰性、グラム陽性、および１つの例示的ウイルスが、２当量のＮａＯＨによる中和と比較して、１当量のＮａＯＨで中和したＧＳＨによる処理によって効果的に不活化された（表７を参照）。
【０１４３】
１ＲＢＣユニット当たり４．４ｌｏｇまでの総接種力価を使用したＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの病原体不活化は、完全な不活性化をもたらした。
【０１４４】
【表７】
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（実施例９）置換ステップを有する改善されたクエンチング法の表面結合アクリジンレベル
実施例５に記載の方法を使用して、１当量のＮａＯＨで中和した２０ｍＭのＧＳＨおよび０．２ｍＭのＳ−３０３で処理した赤血球に対する抗アクリジン抗体結合能を決定した。いくつかのＲＢＣ調製物にわたって測定した抗体結合能は、１赤血球当たりおよそ３９，０００だった（図７を参照）。このレベルの結合は、ＲＢＣを２当量のＮａＯＨで中和した２０ｍＭのＧＳＨで処理した場合は、１８，４０７±１１９５のＡＢＣに匹敵し、ＲＢＣを２ｍＭの酸性ＧＳＨで処理した場合、１２３，７１４±５１２３のＡＢＣに匹敵する。
【０１４５】
（実施例１０）様々なヘマトクリット（Ｈｃｔ）でのＳ−３０３処理による病原体不活化
添加剤溶液（８０％遠心沈降ヘマトクリット（Ｈｃｔ））を用いずに、または添加剤溶液（６０％Ｈｃｔ）を用いて、４５０〜５００ｍＬのＷＢ採取物からＲＢＣユニットを調製した。別様の指示がなければ、該ＲＢＣを処理前に白血球除去した。４０％のＨｃｔの試験ユニットを希釈剤溶液で希釈した。ＲＢＣユニットを、約１０６生物／ｍＬの高レベルインプットまたは１ユニット当たり１０〜１０５生物の低レベルインプットのいずれかで接種した。高レベル入力の場合、Ｓ−３０３処理前に２８ｍＬの対照試料を取り出した。低レベルの細菌インプットの場合、試験および対照ユニットを、全ＲＢＣユニットをプールおよび分割することにより調製し、対照ユニットを、１ユニット当たり約１０生物で接種した。８０％および６０％のＨｃｔを有する試験ユニットを、２００μＭのＳ−３０３および１塩基当量の水酸化ナトリウム（１ｂ．ｅ．）で中和した２０ｍＭのＧＳＨで処理した。４０％のＨｃｔを有する試験ユニットを、１３０μＭのＳ−３０３および１３ｍＭのＧＳＨ（１ｂ．ｅ．）で処理した。対照試料またはユニットを、Ｈｃｔに基づいて２０ｍＭのＧＳＨまたは１３ｍＭのＧＳＨ（１ｂ．ｅ．）のいずれかで処理した。高レベルインプットを有するユニットの場合、対照試料を、試験ユニットを処理した際の生存可能な生物についてアッセイした。室温で３時間インキュベーションした後、試験ユニットおよび対照試料の両方を生存可能な生物についてアッセイし、栄養豊富なアガープレート上での増殖（細菌）、またはベロ細胞（ＶＳＶ）でのプラークアッセイにより定量化した。低レベルインプットを有するユニットの場合、対照および試験ユニットを、室温で２０時間インキュベートし、その後３７℃で約２０時間インキュベートした。その後、細菌増殖を検出するために試料を平板培養した。結果は表８に示されている。
【０１４６】
【表８】
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（実施例１１）様々なヘマトクリット（Ｈｃｔ）におけるＳ−３０３処理後のＲＢＣ水和
遠心沈降ヘマトクリットにより添加剤溶液中で測定したところ４０％または６０％Ｈｃｔの、および濃縮赤血球としては８０％Ｈｃｔの白血球除去全血からＲＢＣを調製した。それぞれ２０ｍＭおよび０．２ｍＭの終濃度のＧＳＨ（ナトリウム塩、ＢｉｏＭｅｄｉｃａ  Ｆｏｓｃａｍａ社製、イタリア）およびＳ−３０３で、ユニットを処理した。処理されたユニットはすべて、室温で２０時間までインキュベートした。処理溶液をＳＡＧ−Ｍと置換し、４℃での保管用にユニットを６０％Ｈｃｔに調整した。対照ＲＢＣユニットをＳＡＧ−Ｍ中に調製し、４℃で保管した。ユニットはすべて、物理的パラメーターを定期的に分析した；ＭＣＨＣを手作業で測定し、標準的方法で浸透圧脆弱性測定を実施した（Ｂｅｕｔｌｅｒら、およびＬｅｗら、２００３年）。メジアン血球脆弱性（ＭＣＦ）は、５０％のＲＢＣが溶血したＮａＣｌ濃度として定義した。ＭＣＦの変化は、保管中の表面対容積比（Ｓ／Ｖ）およびＲＢＣ水和の示標である。およそ６週間の保管後、すべての処理されたユニットは、処理時のＨｃｔに関わらず、未処理対照と同様のＭＣＦ値を示した。ＲＢＣ水和の別の示標であるＭＣＨＣは、保管終了時では、試験ユニットおよび対照ユニット間で類似していた。結果は表９に示されている。処理されたＲＢＣの６週間までの保管は、ＲＢＣ濃縮物の調製についての日常的な実施で使用される広範囲のＨｃｔにわたって、Ｓ／ＶおよびＲＢＣ水和を著しくは変化させなかった。
【０１４７】
【表９】
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（実施例１２）様々なヘマトクリット（Ｈｃｔ）におけるＳ−３０３処理後の保管ＲＢＣのＩｎ  Ｖｉｔｒｏ品質
遠心沈降ヘマトクリットにより添加剤溶液中で測定したところ４０％または６０％Ｈｃｔの、および濃縮赤血球として８０％Ｈｃｔの白血球除去全血からＲＢＣを調製した。それぞれ２０ｍＭおよび０．２ｍＭの終濃度のＧＳＨ（ナトリウム塩）およびＳ−３０３でユニットを処理した。処理されたユニットはすべて、室温で２０時間までインキュベートした。処理溶液をＳＡＧ−Ｍと置換し、４℃での保管用にユニットを６０％Ｈｃｔに調整した。対照ＲＢＣユニットをＳＡＧ−Ｍ中に調製し、４℃で保管した。Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ機能を、処理前に、および処理後に、保管の６週間まで定期的な間隔で分析した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＲＢＣ機能についてアッセイしたパラメーターには、ｐＨ、総ＡＴＰ、溶血、および細胞外カリウム、グルコース、および乳酸塩が含まれていた。保管のおよそ６週間後（３８日目〜４４日目）では、試験ユニットはすべて、２μｍｏｌ  ＡＴＰ／ｇＨｂを超える総ＡＴＰレベルを示し、溶血およびＭＣＨＣは、処理Ｈｃｔに関わらず対照ユニットと同様であった。保管の全体にわたって、試験ユニットの細胞外グルコースは、４０％および６０％Ｈｃｔの対照ユニットの細胞外グルコースより高かったが、８０％Ｈｃｔを有するユニットは、対照により類似していた。細胞外乳酸塩は、Ｈｃｔに関わらず、すべての試験ユニットで対照と比較してより低かった。保管の終了時では、試験ユニットの細胞外Ｋ＋は、４０％および６０％Ｈｃｔユニットの対照よりわずかに低いが、８０％Ｈｃｔユニットは対照と同様であった。すべての試験ユニットのｐＨは、保管の全体にわたって対照と類似していた。該工程に由来するヘモグロビン収率は、処理Ｈｃｔに関わらず、ＡＡＢＢ要件を満たしていた。すべての代謝パラメーターの活性は、Ｓ−３０３処理後、６週間の保管の全体にわたって、広範囲のＨｃｔにわたって対照と類似していた。結果は表１０に示されている。
【０１４８】
【表１０】
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（実施例１３）希釈ＲＢＣのｉｎ  ｖｉｔｒｏ機能および病原体不活化
ＳＡＧ−Ｍ  ＲＢＣユニットを、５００ｍＬ採取物に由来する白血球除去した全血ユニットから調製した。ＲＢＣ機能研究の場合、ＳＡＧ−Ｍ  ＲＢＣユニットをＡＢＯ型によってプールし、一致する試験ユニットおよび対照ユニットに分割した。処理前に、２８．８ｍＭマンニトール、１．３ｍＭアデニン、１６．２ｍＭリン酸ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウムを含む１５０ｍＬの希釈剤溶液、ｐＨ７．５を、試験ユニットに添加した。それぞれ２０ｍＭおよび０．２ｍＭの終濃度のＧＳＨナトリウム塩およびＳ−３０３で試験ユニットを処理した。試験ユニットを室温（ＲＴ）で２０時間までインキュベートした。室温でインキュベーションした後、ユニットを遠心分離し、上清を１００ｍＬのＳＡＧ−Ｍと置換し、該ＳＡＧ−Ｍは４℃で保管する前に添加した。対照ＲＢＣユニットをＳＡＧ−Ｍ中で調製し、４℃で保管した。ユニットはすべて、種々の時点でサンプリングすることにより、４℃でおよそ６週間の保管の全体にわたって評価した。ＲＢＣ病原体不活化研究の場合は、ＳＡＧ−Ｍ  ＲＢＣユニットを半分に分割し、処理溶液およびＧＳＨ添加の前に、該ＲＢＣユニットを病原体で接種した。処理溶液およびＧＳＨを添加した後、対照試料（５ｍＬ〜７ｍＬ）を該ユニットから取り出してインプット病原体力価を決定し、残りのユニットをＳ−３０３で処理した。処理されたユニットは、周囲温度で３時間静置インキュベーションした後で、残留生存可能病原体力価のためにサンプリングした。
【０１４９】
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ代謝示標および物理指数を、保管の全体にわたる種々の時点で、ｉｎ
ｖｉｔｒｏアッセイにより評価した。３７℃での細胞外ｐＨを、Ｓｉｅｍｅｎｓ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製血液ガスアナライザーで測定した。総ＡＴＰを、ルシフェラーゼに基づく酵素アッセイを使用して測定した。無細胞上清を調製して、細胞外カリウム（Ｋ＋）、グルコース、および乳酸塩を評価した。ＥａｓｙＬｙｔｅ（登録商標）Ｎａ／Ｋアナライザーを使用して、無細胞上清のＫ＋含有量を測定することにより、細胞外カリウムを決定した。細胞外グルコースおよび乳酸塩を、ＮｅｘＣＴ（商標）アナライザーで評価した。平均赤血球ヘモグロビン濃度（ＭＣＨＣ）および遠心沈降ヘマトクリットを、手作業で測定した。浸透圧脆弱性測定を標準的方法で実施した（Ｂｅｕｔｌｅｒら、およびＬｅｗら、２００３年）。メジアン血球脆弱性（ＭＣＦ）は、５０％のＲＢＣが溶血したＮａＣｌ濃度として定義した。
【０１５０】
細菌不活化研究の場合、ＲＢＣを、およそ６．５ｌｏｇ  ｃｆｕ／ｍＬのＥ．ｃｏｌｉ、Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、Ｙ．ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ、またはＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａで接種した。ウイルス不活化研究の場合、ウイルスに依存しておよそ４．１ｌｏｇ  ｐｆｕ／ｍＬ〜６．４ｌｏｇ  ｐｆｕ／ｍＬで、ＲＢＣを接種した。生理食塩水に溶解したＧＳＨを、２０ｍＭの終濃度になるようにユニットに添加した。アガープレート上でコロニー形成単位（ｃｆｕ）を計数することにより細菌力価を決定し、適切な細胞系統でのプラーク形成単位（ｐｆｕ）を計数することによりウイルス力価を決定した。未処理試料は、計数前に連続希釈した。処理された試料は、力価の計数前に希釈しなかった。
【０１５１】
下記の表１１および１２に示されている結果は、保管継続期間中にわたる許容され得るＲＢＣ代謝機能および生理学的パラメーター、ならびに許容され得る病原体不活化を実証する。
【０１５２】
【表１１】
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【０１５３】
【表１２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【外国語明細書】
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