(57)【要約】【課題】乳酸菌をスターターとしたイソフラボンアグリコンを増加させる味噌の製造方法を開発する。【解決手段】乳酸菌をセロオリゴ糖などのβ―グルコシル基をもつ糖類を含む培地で前培養し、β-グルコシダーゼ活性の高い菌体を得、これを味噌製造のスターターとして添加することで、迅速にイソフラボンのアグリコン含有量の多い味噌を製造することができる。好ましくは、セロオリゴ糖含有MRS液体培地で前培養したラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）HOKKAIDO株（独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−１９６４５）をスターターとして用いるのが良い。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳酸菌をスターターとしたイソフラボンアグリコンを増加させる味噌の製造方法。
【請求項２】
乳酸菌スターターとして、セロオリゴ糖などのβ―グルコシル基をもつ糖類を含む培地で前培養した乳酸菌を用いる請求項１。
【請求項３】
乳酸菌スターターとして、ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）HOKKAIDO（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９６４５）を用いる請求項１および２。
【請求項４】
請求項１〜３により得られる味噌。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、乳酸菌をスターターとしたイソフラボンアグリコンを増加させる味噌の製造方法およびそれにより得られる味噌に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
味噌は日本の食文化を代表する発酵調味料である。味噌には原料成分の他に発酵熟成過程で生成した様々な成分が含まれるが、その1つにイソフラボンがある。大豆のイソフラボンにはアグリコンのゲニステイン、ダイゼイン、グリシテイン、それらのグルコシル配糖体であるゲニスチン、ダイジン、グリシチン、さらにはアセチル化配糖体の３種類およびマロニル化配糖体の３種類、あわせて１２種類が存在する。大豆中では、主に配糖体として存在しており、アグリコンは非常に少ない（非特許文献１）。
【０００３】
イソフラボンの機能性として、ガン細胞増殖の抑制、循環器疾患の予防、骨粗鬆症の予防等が報告されている。しかし、大豆中のイソフラボンの主要構成成分である配糖体の腸内吸収は、アグリコンに比べて非常に弱いことが知られており、摂取された食品中のイソフラボン配糖体が体内で吸収されるためには、腸内フローラを構成する微生物によってアグリコンに加水分解される必要がある。
【０００４】
一方、大豆を主成分とする味噌やテンペなどの発酵食品では、微生物の働きによりイソフラボン配糖体のβ-グルコシド結合が加水分解されることが知られている。このようなアグリコンを多く含む発酵食品ではイソフラボンが腸内環境に影響されず、そのままの状態で迅速に腸管から体内吸収される。味噌では、イソフラボン配糖体が麹由来のβ-グルコシダーゼにより加水分解されアグリコン化されることが示されている（非特許文献２〜５）。しかし、乳酸菌の関与については全く知られていない。
【０００５】
特開２００１−３４００５９や特開２００１−３３３６９２には、イソフラボンアグリコンを高めた発酵豆乳に関する技術が開示され、乳酸菌としてラクトバチルス（Lactobacillus）属、ストレプトコッカス（Streptococcus）属、ラクトコッカス（Lactococcus）属等が挙げられることが示されている。しかしながら、この技術が味噌の製造においても有効であるとは容易に想像し得ない。なぜならば、塩分の多い味噌のスターターとして用いられる乳酸菌はテトラゲノコッカス（Tetragenococcus）属等の耐塩性乳酸菌であり、耐塩性を持たない乳酸菌を味噌製造のスターターとした事例は見当たらないからである。
【０００６】
特開２００５−２２４２２４には、新規な乳酸菌株ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）HOKKAIDO（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９６４５）および、それを用いた発酵豆乳に関して開示されているが、この菌株が味噌の製造に有効であるかは明らかにされていない。また、当該株がイソフラボンのアグリコン化活性を有するとの報告がある（非特許文献６）が、上記のように耐塩性をもたないラクトバチルス属に分類されることから、味噌の製造において有効であるとは容易に想像し得ない。したがって、味噌の製造において、イソフラボンアグリコンを高めることを目的とした従来の技術は、味噌の主原料である麹のβ-グルコシダーゼを利用するものであり、乳酸菌をスターターとしてイソフラボンアグリコンを増加させた味噌を提供することはできなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００１−３４００５９号公報
【特許文献２】特開２００１−３３３６９２号公報
【特許文献３】特開２００５−２２４２２４号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】食科工，54，295-303（2007）
【非特許文献２】大豆イソフラボン（幸書房，東京），130-142（1994）
【非特許文献３】食科工，42，322-327（1995）
【非特許文献４】味噌の科学と技術，53，213-218 (2005)
【非特許文献５】味噌の科学と技術，53，416-418 (2005)
【非特許文献６】北海道立食品加工研究センター報告，9，21-25 (2011)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
味噌に含まれるイソフラボンのアグリコン化という課題に対して、通常の味噌製造においては、味噌の主原料である麹によりなし得るが、他の微生物スターターを用いた技術は知られていない。
【００１０】
我々は、これまでの試験研究から、味噌用乳酸菌スターターとして利用されるテトラゲノコッカス  ハロフィラス（Tetragenococcus halophilus）もβ-グルコシダーゼ活性を有するが、イソフラボンに対する特異性が非常に低く、実用性的でないという結果を得ている。
【００１１】
そこで、本発明の目的は、イソフラボン配糖体に対して特異性を示すβ-グルコシダーゼを保有する乳酸菌株をスターターとして発酵させることにより、イソフラボンアグリコンを高含有する味噌を製造し、提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
発明者らは、上記課題について検討を行った結果、乳酸菌の一種であるラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）HOKKAIDO（独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−１９６４５）をセロビオース含有培地で前培養することでβ-グルコシダーゼ活性の高い菌体が得られ、これをスターターとすることで上記課題が解決されることを見出した。
【００１３】
すなわち、本発明の第一は、乳酸菌をスターターとしたイソフラボンアグリコンを増加させる味噌の製造方法に関する。本発明の第二は、乳酸菌スターターとして、セロオリゴ糖などのβ―グルコシル基をもつ糖類を含む培地で前培養した乳酸菌を用いる本発明の第一に関する。本発明の第三は、乳酸菌スターターとして、ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）HOKKAIDO（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９６４５）を用いる本発明の第一および第二に関する。本発明の第四は、本発明の第一から第三により得られる味噌に関する。
【発明の効果】
【００１４】
スターターとして添加した乳酸菌により、イソフラボンアグリコンを高含有する味噌が製造できるとともに、イソフラボンのアグリコン割合を増加させた味噌を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１はグルコース糖源ＭＲＳ培地で前培養した乳酸菌体のβ-グルコシダーゼ活性および食塩の影響について示した説明図である。（実施例）
【図２】図２はセロビオース糖源ＭＲＳ培地で前培養した乳酸菌体のβ-グルコシダーゼ活性および食塩の影響について示した説明図である。（実施例）
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の実施の形態について、具体的且つ詳細に説明する。本発明の第一にある乳酸菌スターターには、β―グルコシダーゼを有する菌株が該当する。例えば、ラクトバチルス（Lactobacillus）属、ラクトコッカス（Lactococcus）属、ペディオコッカス（Pediococcus）属、ストレプトコッカス（Streptococcus）属、ロウコノストック（Leuconostoc）属などが挙げられる。これらの菌体を前培養する場合、培地には、一般的なＭＲＳ培地、ＧＹＰ培地、ＢＬＢ培地などの乳酸菌用培地、果汁、野菜などの搾汁等の乳酸菌が効果的に増殖でき、安全な素材であれば基本的に使用できるが、β―グルコシダーゼ活性を高めるために、糖源として、セロオリゴ糖（セロビオース等）などのβ―グルコシル基をもつ糖類を含むものを用いることが望ましい。
【００１７】
β―グルコシダーゼはイソフラボンのアグリコン化活性を有する必要がある。そこで、イソフラボン配糖体を基質に酵素反応を行い、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）などの分析機器を用いて反応生成物を調べ、イソフラボンのアグリコン化活性を確認し、イソフラボン配糖体に基質特異性を示すβ―グルコシダーゼを有する乳酸菌株を用いることが重要である。
【００１８】
β―グルコシダーゼは、味噌中の食塩濃度である５％〜１５％でも高い活性をもつことが必要である。そこで、乳酸菌スターターはセロオリゴ糖（セロビオース等）などのβ―グルコシル基をもつ糖類を含有する培地で培養し、食塩中でも高い酵素活性を維持している菌体を用いることが望ましい。
【００１９】
前培養した菌体は、培養液や個体培養物などの本体、培養物本体を濃縮又は希釈した菌体、あるいは培養物本体や菌体の乾燥物などの形態で使用できる。濃縮、洗浄、乾燥などの方法は特に限定されず、濃縮はろ過法や遠心分離法などで、洗浄は滅菌した生理食塩水などを用いて、乾燥は熱風乾燥、噴霧乾燥、流動層乾燥、真空凍結乾燥など、一般的な方法で実施できる。
【００２０】
得られる味噌は品質基準をクリアしていれば、種類等は特に限定されない。
【００２１】
分離操作の煩雑さなどから有効な方法とは言い難いが、上記に該当する乳酸菌株のβ―グルコシダーゼを含む粗酵素を分離し、これをスターターとして用いることも可能である。
【００２２】
通常、乳酸菌スターターは発酵前の味噌原料に対して、菌体量として10の6、 7、 8乗/g程度を添加するが、作業効率等から添加量は少ない方が良く、10の6乗/g程度で効果を発揮する乳酸菌株を用いるのが望ましい。
【００２３】
好ましくは、乳酸菌株として上記の各条件をクリアすることが明らかであるラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus
plantarum）HOKKAIDO（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９６４５）を用い、前培養にはセロビオースを糖源とするMRS培地を用いるのが良い。
【実施例】
【００２４】
乳酸菌をスターターとしたイソフラボンアグリコンを増加させる味噌の製造方法および得られる味噌に関して、以下に実施例を示す。
【００２５】
ＭＲＳ液体培地（Lactobacilli MRS broth、Difco）に、ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus
plantarum）HOKKAIDO（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９６４５、以下ではHOKKAIDO株と略す）の凍結保存した種菌0.1%を接種し、30℃で約24時間の培養により菌体培養液を得た。また、上記培地のグルコースの代わりにセロビオースとした培地（セロビオース糖源ＭＲＳ液体培地）を使って同様に培養し、菌体培養液を得た。対照として、テトラゲノコッカス
ハロフィラス（T. halophilus）の２株を用い、これらは５％食塩含有のＭＲＳ液体培地またはセロビオース糖源ＭＲＳ液体培地を使い、30℃で約48時間培養した。得られた菌体懸濁液を高速冷却遠心機で遠心分離(8,000×g，15分間)した後、菌体を回収し、さらに、生理食塩水で3度の遠心洗浄した。以下の実験に用いるため、各菌体懸濁液は生理食塩水を用いて濁度（600 nm吸光度、A600）をそれぞれ7.4に調整した。
【００２６】
上記菌体懸濁液のβ―グルコシダーゼ活性を調べた。酵素反応液はリン酸緩衝生理食塩水 pH7.0(80μl)、2mM p-ニトロフェニルβ-D-グルコピラノシドをリン酸緩衝生理食塩水に溶解したもの (80μl)、乳酸菌体懸濁液 (40μl)とした。この酵素反応液を35℃で、60分間または120分間インキュベイションした後、反応液に0.2M 炭酸ナトリウムの1.0 mlを添加することで酵素反応を停止した。遊離のp-ニトロフェノール量は分光光度計(UV-1200、島津製作所)を用い、400 nm吸光度（A400）によって測定した。検量線はp-ニトロフェノール（Sigma）を標準品として作製した。酵素活性の1Uは1分間で1μmol のp-ニトロフェノールが生成する酵素量と定義した。
【００２７】
結果を表１に示す。HOKKAIDO株では、セロビオース糖源ＭＲＳ培地で培養した菌体懸濁液がグルコース糖源である通常のＭＲＳ培地のものよりも比活性で約14倍高くなった。また、対照としたT. halophilusの２株では、それぞれ約7.5倍、7.1倍高くなった。
【００２８】
【表１】
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【００２９】
次に、イソフラボンの加水分解活性を調べた。反応液は上記のセロビオース糖源液体培地で前培養した菌体懸濁液を2倍希釈した懸濁液（濁度： 3.71〜3.73、菌数：2.5×109/ml）または10倍に希釈した懸濁液（濁度： 0.74〜0.75、菌数：5×108/ml）2.1mL、70 %エタノールに溶解したイソフラボン配糖体（200μg/mL濃度のゲニスチン、ダイジンまたはグリシチン、和光純薬）0.15 mLを混和し調製した。また、HOKKAIDO株については、それらに加えて100倍希釈（濁度： 0.073、菌数：5×107/ml）、1000倍希釈（濁度： 0.0073、菌数：5×106/ml）および1万倍希釈（濁度： 0.00073、菌数：5×105/ml）を調製し、試験サンプルとした。これらを35℃で24時間インキュベイションした後、反応液を遠心分離(8,000×g，15分間)により固液分離し，上清をシリンジフィルター(ポアサイズ0.20μm,
Millipore)で濾過後，HPLCに供した。
【００３０】
イソフラボンのHPLC分析はODS-100Vカラム(150mm×4.6 mmI.D.、 TOSOH)を装備したHPLC（島津製作所）にて実施した。溶離液には0.1％酢酸を含む10％アセトニトリル（A液）と0.1 ％酢酸を含む35％アセトニトリル（B液）の混合液を用い、B液の0％→100％直線濃度勾配（50分間）で溶出し、その後、これを保持（10分間）させた。注入量は10μl、流速は1 ml/分とし、イソフラボンを260 nmの吸光度で検出した。各イソフラボン濃度は、各標準品（和光純薬）のピーク面積と比較して算出した。
【００３１】
結果を表２に示す。対照としたT. halophilusの菌体懸濁液は、イソフラボン基質に対する分解活性が非常に低かった。一方、HOKKAIDO株は非常に高い分解活性を示し、100倍希釈懸濁液ではアグリコン割合１００％、1000倍希釈懸濁液でも約５０％であった。
【００３２】
【表２】
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【００３３】
次に、HOKKAIDO株の味噌中での有効性を検証するため、食塩存在下での活性を調べた。酵素反応液は、基本的に上記と同様であるが、リン酸緩衝生理食塩水pH7.0(80μl)の他、5%、10%または15%の塩化ナトリウムを追加したリン酸緩衝生理食塩水pH7.0(80μl)を用いた。その結果を図１と図２に示す。セロビオース糖源ＭＲＳ培地による菌体懸濁液は、対照であるＭＲＳ培地（グルコース糖源）による菌体懸濁液よりもA400で10倍程度（同食塩濃度での比較）高く、食塩１５％においてもβ―グルコシダーゼの高い活性を維持していたことから、味噌での有効性が期待される結果であった。
【００３４】
次に、発酵前の味噌原料（米麹歩合8割、食塩濃度12%）に、菌数として10の6、 7、 8乗/g 添加し、30℃で発酵させた。これを1週間毎に（5週間まで）サンプリングし、イソフラボンのアグリコン化率を評価した。
【００３５】
イソフラボンの抽出：サンプルリングした味噌1gに70％エタノール10mlを加え、室温で24時間振とう抽出した。これを遠心分離(10,000×g、15分間)した後、上清を回収した。シリンジフィルター(ポアサイズ0.20μm、 Millipore)で濾過後、HPLCに供した。
【００３６】
その結果を表３に示す。スターターとした乳酸菌の添加量は、アグリコン割合に影響を与えなかった。したがって、10の6乗で十分に効果があった。また、発酵日数の経過とともにアグリコン割合が増加し、その効果はグルコース糖源培地で前培養したスターター添加のものよりもセロビオース糖源培地で前培養したスターター添加のもので顕著であった。
【００３７】
【表３】
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【図１】
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【図２】
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