(57)【要約】      （修正有）【課題】微生物のグリセリン資化能を向上させる方法、及びグリセリン資化能が向上した微生物の形質転換体を提供する。【解決手段】下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子を、グリセリン資化能を有する微生物に導入する工程を含む、微生物のグリセリン資化能を向上させる方法、及び下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子を、グリセリン資化能を有する微生物に導入して得られた、グリセリン資化能が向上した形質転換体。（ａ）特定な配列のアミノ酸配列からなるタンパク質（ｂ）特定な配列のアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつグリセリン取り込み活性を有するタンパク質（ｃ）特定な配列のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつグリセリン取り込み活性を有するタンパク質。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子を、グリセリン資化能を有する微生物に導入する工程を含む、微生物のグリセリン資化能を向上させる方法。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつグリセリン取り込み活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつグリセリン取り込み活性を有するタンパク質
【請求項２】
前記微生物がバチルス（Bacillus）属細菌である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記微生物がバチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）である、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
前記遺伝子がリステリア（Listeria）属細菌由来の遺伝子である、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
前記遺伝子がリステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）由来の遺伝子である、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子を、グリセリン資化能を有する微生物に導入して得られた、グリセリン資化能が向上した形質転換体。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつグリセリン取り込み活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつグリセリン取り込み活性を有するタンパク質
【請求項７】
前記微生物がバチルス（Bacillus）属細菌である、請求項６記載の形質転換体。
【請求項８】
前記微生物がバチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）である、請求項６又は７記載の形質転換体。
【請求項９】
前記遺伝子がリステリア（Listeria）属細菌由来の遺伝子である、請求項６〜８のいずれか１項記載の形質転換体。
【請求項１０】
前記遺伝子がリステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）由来の遺伝子である、請求項６〜９のいずれか１項記載の形質転換体。
【請求項１１】
下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子を、グリセリン資化能を有する微生物に導入する工程、及び導入後の微生物をグリセリン含有培地で培養する工程を含む、微生物の生育性を向上させる方法。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつグリセリン取り込み活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつグリセリン取り込み活性を有するタンパク質
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物のグリセリン資化能を向上させる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオ燃料であるバイオディーゼルは、化石燃料の代替エネルギーとして注目され、欧州等において盛んに生産されている。バイオディーゼルは油脂から製造され、その製造過程において副産物としてグリセリンが生成する。また、天然油脂から高級アルコールや脂肪酸を工業生産する際にも、グリセリンが副産物として生成されるため、このグリセリンを有効活用する道が模索されている。
【０００３】
なかでも、微生物を用いてグリセリンを有用物質に変換する技術は、環境にやさしく、注目されている。例えば、放線菌を用いてグリセリンを糖含有化合物へ変換する方法（非特許文献１参照）や、酢酸菌を用いてグリセリンをグリセリン酸へ変換する方法（特許文献１参照）等が報告されている。
また、グリセリンをより効率的に利用できるよう、微生物にグリセリン取込み能を付与する又は強化することも試みられている。例えば、グリセリン資化能の欠損しているコリネ型細菌にグリセリン資化能を付与する方法（特許文献２）、グリセリン取込み能のないアフリカツメガエルの細胞にLactococcus lactisやEscherichia coli由来のグリセリンファシリテーター遺伝子を導入し、グリセリン取込み能を付与する方法（非特許文献２参照）、等が報告されている。また、Ｌ-アミノ酸生産能を有し、グリセロールデヒドロゲナーゼ及びジハイドロキシアセトンキナーゼの活性を増強されるように改変された腸内細菌科に属する微生物を、グリセロールを炭素源として含む培地に培養し、Ｌ−アミノ酸を該培地中又は菌体内に生成、蓄積させ、該培地又は菌体よりＬ−アミノ酸を採取する、Ｌ−アミノ酸の製造方法も報告されている（特許文献３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００９−１５９８２６号公報
【特許文献２】国際公開第２００７/０１３６９５号
【特許文献３】国際公開第２００８/１０２８６１号
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Folia  Microbiologica  （2007），  52，  pp451-456
【非特許文献２】Froger  A  et  al.，  Microbiology  (2001)，  147，  pp1129-1135
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、グリセリン資化能を有する微生物のグリセリン資化能を向上させる方法を提供することを課題とする。また、本発明は、グリセリン資化能が向上した微生物の形質転換体を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者等は上記課題に鑑み、微生物のグリセリン資化能を強化する方法について鋭意検討を行った。その結果、グリセリン資化能を有する微生物に、リステリア（Listeria）属細菌由来のグリセリンファシリテーター遺伝子（以下、「glpF遺伝子」ともいう。）を導入して形質転換することで、形質転換体のグリセリンを含む培地での生育が大きく向上することを見出した。本発明はこの知見に基づき完成されたものである。
【０００８】
すなわち、本発明は、下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子を、グリセリン資化能を有する微生物に導入する工程を含む、微生物のグリセリン資化能を向上させる方法、に関する。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつグリセリン取り込み活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつグリセリン取り込み活性を有するタンパク質
【０００９】
また、本発明は、前記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子を、グリセリン資化能を有する微生物に導入して得られた、グリセリン資化能が向上した形質転換体、に関する。
さらに、本発明は、前記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子を、グリセリン資化能を有する微生物に導入する工程、及び導入後の微生物をグリセリン含有培地で培養する工程を含む、微生物の生育性を向上させる方法、に関する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の方法によれば、微生物のグリセリン資化能を強化することができる。また、本発明の形質転換体は、優れたグリセリン資化能を有する。
本発明の形質転換体、すなわち、本発明の方法により資化能が強化された微生物は、グリセリンを原料として種々の代謝産物を産生できるため、グリセリンを有効に利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】枯草菌由来GlpFタンパク質発現ベクター：ｐＮＫＳ１００１，及びリステリア・モノサイトゲネス由来GlpFタンパク質発現ベクター：ｐＮＫＳ１００３の構成、並びに導入したＳＤ配列（ＲＢＳ）、ヒスチジンタグ付枯草菌GlpFタンパク質コード領域、ヒスチジンタグ付リステリア・モノサイトゲネスGlpFタンパク質コード領域を示した図である。
【図２】ウエスタンブロッティングにより各GlpFタンパク質導入株のGlpFタンパク質検出結果を示す図である。
【図３】グリセリン１０％含有Ｌ培地にて各GlpFタンパク質導入株を２５時間培養した後の、各導入株の生育性を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は、第１の態様として、グリセリン資化能を有する微生物にリステリア（Listeria）属細菌由来のグリセリンファシリテータータンパク質（以下、「GlpFタンパク質」ともいう。）又はそれと機能的に同等のタンパク質をコードする遺伝子を導入して、微生物を形質転換し、該導入遺伝子が発現した形質転換体に関する。得られた形質転換体は、野生型微生物に比べて、グリセリン資化能が向上し、グリセリン含有培地での生育性に優れる。当該形質転換体は培地中のグリセリンを基質として代謝し、種々の有用な発酵生成物または反応生成物を作り出すことができる。
上記の観点から、本発明は第２の態様としては、リステリア（Listeria）属細菌由来のGlpFタンパク質又はそれと機能的に同等のタンパク質をコードする遺伝子を、グリセリン資化能を有する微生物に導入する工程を含む、微生物のグリセリン資化能を向上させる方法に関する。同様に、第３の態様として、リステリア（Listeria）属細菌由来のGlpFタンパク質又はそれと機能的に同等のタンパク質をコードする遺伝子を、グリセリン資化能を有する微生物に導入する工程、及び導入後の微生物をグリセリン含有培地で培養する工程を含む、微生物の生育性を向上させる方法に関する。
【００１３】
１．形質転換体
はじめに、本発明の形質転換体（組換え微生物）について説明する。
（１）宿主
本発明の形質転換体の宿主には、グリセリン資化能を有する微生物を用いる。グリセリン資化能を有する微生物とは、グリセリンを炭素源として利用可能な微生物のことをいう。グリセリン資化能を有する微生物は、グリセリンを唯一の炭素源とした場合でも生育が可能である。グリセリン資化能を有する微生物として具体的には、バチルス（Bacillus）属、エシェリヒア（Escherichia）属、クレブシエラ（Klebisiella）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、ストレプトコッカス（Streptococcus）属、ラクトコッカス（Lactococcus）属、マイコプラズマ（Mycoplasma）属、等に属する微生物が挙げられる。
なかでも、グリセリン資化能を有する微生物としては、グリセリン資化能向上の観点から、バチルス属細菌を用いることが好ましい。バチルス属細菌としては、例えば、Alicyclobacillus acidoterrestris  （Bacillus acidoterrestris）、Alicyclobacillus cycloheptanicus（Bacillus cycloheptanicus）、Aneurinibacillus aneurinilyticus（Bacillus aneurinilyticus）、Aneurinibacillus migulanus（Bacillus migulanus）、Bacillus alcalophilus、Bacillus amyloliquefaciens、Bacillus atrophaeus、Bacillus azotoformans、Bacillus badius、Bacillus bataviensis、Bacillus cereus、Bacillus circulans、Bacillus coagulans、Bacillus cohnii、Bacillus drentensis、Bacillus fastidiosus、Bacillus firmus、Bacillus flexus、Bacillus fumarioli、Bacillus korlensis、Bacillus krulwichiae、Bacillus lentus、Bacillus licheniformis、Bacillus megaterium、Bacillus mojavensis、Bacillus mycoides、Bacillus niacini、Bacillus novalis、Bacillus odysseyi、Bacillus oleronius、Bacillus pseudomycoides、Bacillus psychrosaccharolyticus、Bacillus pumilus、Bacillus safensis、Bacillus simplex、Bacillus smithii、Bacillus soli、Bacillus sonorensis、Bacillus sporothermodurans、Bacillus subtilis、Bacillus thuringiensis、Bacillus trypoxylicola、Bacillus tusciae、Bacillus vallismortis、Bacillus vietnamensis、Bacillus vireti、Bacillus weihenstephanensis、Brevibacillus agri  （Bacillus agri）、Brevibacillus borstelensis（Bacillus borstelensis）、Brevibacillus brevis（Bacillus brevis）、Brevibacillus centrosporus（Bacillus centrosporus）、Brevibacillus choshinensis（Bacillus choshinensis）、Brevibacillus formosus（Bacillus formosus）、Brevibacillus laterosporus（Bacillus laterosporus）、Brevibacillus parabrevis（Bacillus parabrevis）、Brevibacillus reuszeri（Bacillus reuszeri）、Geobacillus stearothermophilus（Bacillus stearothermophilus）、Geobacillus thermoglucosidasius（Bacillus thermoglucosidasius）、Lysinibacillus fusiformis（Bacillus fusiformis）、Lysinibacillus sphaericus（Bacillus sphaericus）、Paenibacillus alginolyticus（Bacillus alginolyticus）、Paenibacillus alvei（Bacillus alvei）、Paenibacillus amylolyticus（Bacillus amylolyticus）、Paenibacillus chitinolyticus（Bacillus chitinolyticus）、Paenibacillus chondroitinus（Bacillus chondroitinus）、Paenibacillus curdlanolyticus（Bacillus curdlanolyticus）、Paenibacillus durus（Bacillus azotofixans）、Paenibacillus ehimensis（Bacillus ehimensis）、Paenibacillus glucanolyticus（Bacillus glucanolyticus）、Paenibacillus kobensis（Bacillus kobensis）、Paenibacillus lautus（Bacillus lautus）、Paenibacillus macerans（Bacillus macerans）、Paenibacillus pabuli（Bacillus pabuli）、Paenibacillus peoriae（Bacillus peoriae）、Paenibacillus polymyxa（Bacillus polymyxa）、Paenibacillus thiaminolyticus（Bacillus thiaminolyticus）、Paenibacillus validus（Bacillus validus）、Salimicrobium halophilum（Bacillus halophilus）、Sporolactobacillus laevolacticus（Bacillus laevolacticus）、Sporosarcina globispora（Bacillus globisporus）、Sporosarcina psychrophila（Bacillus psychrophilus）、Virgibacillus pantothenticus（Bacillus pantothenticus）等が挙げられる。
なかでも、グリセリン資化能向上の観点から、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）、Bacillus amyloliquefaciens、Bacillus licheniformis、Bacillus megaterium、Bacillus thuringiensis、Brevibacillus brevis（Bacillus brevis）、Geobacillus stearothermophilus（Bacillus stearothermophilus）が好ましく、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）、Bacillus amyloliquefaciens、Bacillus megaterium、Brevibacillus brevis（Bacillus brevis）がより好ましく、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）がさらに好ましい。
前記バチルス属細菌は、ATCC（American  Type  Culture  Collection）、NBRC  (Biological  Resource  Center,  NITE)等の生物遺伝資源ストックセンターから、入手することができる。
【００１４】
（２）宿主に導入する遺伝子
宿主として用いられる前記微生物に導入する遺伝子は、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるGlpFタンパク質又はそれと機能的に同等のタンパク質をコードする遺伝子である。
GlpFタンパク質は、細胞膜上でチャネルを形成してグリセリン輸送を担う膜タンパク質で、グリセリン取込みタンパク質とも称される。GlpFタンパク質の働きにより、細胞外から細胞内へグリセリンが取り込まれる。細胞内に取り込まれたグリセリンは、続いてグリセロールキナーゼ（glpK）によってグリセロール−３−リン酸に変換され、解糖系や脂肪酸合成系に供給される。
GlpFタンパク質及び当該タンパク質をコードするglpF遺伝子は、大腸菌等の様々な微生物に存在することが知られている。本発明で宿主として用いる、グリセリン資化能を有する微生物も、自身のGlpFタンパク質及びglpF遺伝子を有している。
【００１５】
本発明では、自身のGlpFタンパク質及びglpF遺伝子を有する微生物を宿主として、これに配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるGlpFタンパク質又はそれと機能的に同等のタンパク質をコードする遺伝子を導入し、発現させる。後述の実施例で示されているように、当該遺伝子を導入することで、グリセリン資化能が大きく向上する。
【００１６】
本発明で前記微生物に導入するGlpFタンパク質をコードする遺伝子として、まず、下記（ａ）のタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
配列番号１で表されるアミノ酸配列は、リステリア属細菌の１種であるリステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）由来のGlpFタンパク質のアミノ酸配列である。当該タンパク質をコードする遺伝子としては、例えば、配列番号２で表される塩基配列からなる遺伝子が挙げられる。
【００１７】
さらに本発明では、前記微生物に導入する遺伝子として、前記（ａ）のタンパク質と機能的に同等のタンパク質をコードする遺伝子を用いることができる。
一般にタンパク質のアミノ酸配列は、必ずしも全領域の配列が保存されていなければタンパク質としての活性を示さないというものではなく、アミノ酸配列が多少変化しても同等の活性を保持しうることが知られている。本発明においても、配列番号１のアミノ酸配列が一部変化したアミノ酸配列を有し、かつグリセリン取り込み活性が保持されたタンパク質コードする遺伝子も、導入遺伝子として用いることができる。
【００１８】
ここで、「前記（ａ）のタンパク質と機能的に同等のタンパク質をコードする遺伝子」とは、配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の生物学的機能、生化学的機能を有するタンパク質をコードしている遺伝子をいう。
配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の生物学的機能、生化学的機能を有するタンパク質としては、下記（ｂ）又は（ｃ）のタンパク質が挙げられる。本発明では、下記（ｂ）又は（ｃ）のタンパク質をコードする遺伝子も、導入遺伝子として用いることができる。
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつグリセリン取り込み活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつグリセリン取り込み活性を有するタンパク質
【００１９】
前記（ｂ）において、アミノ酸配列の同一性は、グリセリン資化能向上の観点から、８０％以上であることが好ましく、９０％以上であることがより好ましく、９５％以上であることがさらに好ましく、９９％以上であることが特に好ましい。
本発明においてアミノ酸配列の同一性とは、比較する２つのアミノ酸配列を必要に応じて間隙を導入して整列（アラインメント）させ、得られる最大のアミノ酸配列の同一性（％）をいう。アミノ酸配列の同一性は通常の方法により解析することができ、例えば、ＢＬＡＳＴアルゴリズムを実装したＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴ（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/）のｂｌａｓｔｐや、Ｇｅｎｅｔｙｘ  Ｗｉｎ実装のＨｏｍｏｌｏｇｙ  ｓｅａｒｃｈ、などにより算出することができる。
また、前記（ｃ）において、「１又は数個のアミノ酸」は、グリセリン資化能向上の観点から、１〜１０個のアミノ酸であることが好ましく、１〜５個のアミノ酸であることがより好ましく、１〜３個のアミノ酸であることが特に好ましい。
【００２０】
さらに、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等のタンパク質をコードする遺伝子として、下記（ｄ）〜（ｆ）のＤＮＡからなる遺伝子が挙げられ、本発明ではこれらの遺伝子も導入遺伝子として用いることができる。
（ｄ）配列番号２で表される塩基配列と７０％以上の同一性を有し、かつグリセリン取り込み活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｅ）配列番号２で表される塩基配列において、１又は数個の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加された塩基配列からなるＤＮＡであって、かつグリセリン取り込み活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｆ）配列番号２で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、かつグリセリン取り込み活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【００２１】
前記（ｄ）において、塩基配列の同一性は、グリセリン資化能向上の観点から、８０％以上であることが好ましく、９０％以上であることがより好ましく、９５％以上であることがさらに好ましく、９９％以上であることが特に好ましい。
本発明において塩基配列の同一性とは、比較する２つの塩基配列を必要に応じて間隙を導入して整列（アラインメント）させ、得られる最大の塩基配列の同一性（％）をいう。塩基配列の同一性は通常の方法により解析することができ、例えば、ＢＬＡＳＴアルゴリズムを実装したＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴ（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/）のｂｌａｓｔｐや、Ｇｅｎｅｔｙｘ  Ｗｉｎ実装のＨｏｍｏｌｏｇｙ  ｓｅａｒｃｈ、などにより算出することができる。
前記（ｅ）において、「１又は数個の塩基」は、グリセリン資化能向上の観点から、１〜１０個の塩基であることが好ましく、１〜５個の塩基であることがより好ましく、１〜３個の塩基であることが特に好ましい。
また、前記（ｆ）において、「ストリンジェントな条件」としては、Molecular  Cloning−A  LABORATORY  MANUAL  THIRD  EDITION［Joseph  Sambrook，David  W．Russell.，Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press］記載のサザンハイブリダイゼーション法等が挙げられ、例えば、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０.１５Ｍ塩化ナトリウム、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、pH７．０）、０．５％ＳＤＳ、５×デンハート及び１００ｍｇ／ｍＬニシン精子ＤＮＡを含む溶液にプローブとともに４２℃で８〜１６時間恒温し、ハイブリダイズさせる条件が挙げられる。
【００２２】
配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等のタンパク質をコードする遺伝子としてより好ましくは、リステリア属細菌由来のglpF遺伝子であり、具体的には、配列番号７に示すListeria innocua（配列番号２との同一性９１％）、配列番号８に示すListeria ivanovii（配列番号２との同一性８５％）、配列番号９に示すListeria welshimeri（配列番号２との同一性８６％）、配列番号１０に示すListeria grayi（配列番号２との同一性７５％）、Listeria denitrificans、Listeria murrayi、Listeria seeligeri由来のglpF遺伝子が挙げられる。
【００２３】
上述の遺伝子の中でも、グリセリン資化能向上の観点から、前記微生物に導入する遺伝子として特に好ましくは、配列番号２に示すリステリア・モノサイトゲネス由来のglpF遺伝子である。
【００２４】
前記微生物に導入する遺伝子の取得方法は特に限定されない。配列番号１のGlpFタンパク質のアミノ酸配列や配列番号２のglpF遺伝子の塩基配列情報に基づき、クローニング、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、ハイブリダイゼイション法など通常の方法により行うことができる。例えば、配列番号２の塩基配列情報を基にして作製したプライマー対を用いて、リステリア属細菌や他の微生物のｃＤＮＡ又はゲノミックＤＮＡを鋳型として通常の方法でＰＣＲを行うことにより得ることができる。また、これらの配列情報に基づき、通常の方法により化学合成して得ることもできる。
また、リステリア属細菌や他の微生物のglpF遺伝子やはGlpFタンパク質の配列情報は、例えば、ＮＣＢＩ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）やＥＭＢＬ（http://www.ebi.ac.uk/embl/）といった公共のデータベースから入手することができる。
さらに、上記のようにして得られたＤＮＡに部位特異的変異（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）を導入することで、該ＤＮＡの特定のバリアント、すなわち、該ＤＮＡと特定の塩基配列同一性を有するＤＮＡ、該ＤＮＡに特定の変異（欠失、置換等）が導入されたＤＮＡ、該ＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを得ることができる。
【００２５】
（３）発現ベクター
前記微生物に遺伝子を導入する方法は特に限定されず、導入遺伝子が微生物内で発現しうる方法であればよい。例えば、目的遺伝子を適当なベクターに連結して発現ベクターを構築し、これを微生物に導入する方法、相同組換えによって宿主ゲノム上に目的遺伝子を挿入する方法、などが挙げられる。好ましくは、目的遺伝子を挿入した発現ベクターで微生物を形質転換する方法である。
発現ベクターの母体となるベクターとしては、目的遺伝子を前記微生物に導入することができ、前記微生物の細胞内で当該遺伝子を発現可能なベクターであればよい。また、染色体外で自立増殖・複製するベクターであってもよいし、染色体内に組み込まれるベクターであってもよい。具体的には、プラスミド、ファージ及びコスミド等が挙げられる。なかでも、発現ベクター調製時に使用される大腸菌等の微生物と形質転換の宿主となる前記微生物との間で移動可能なシャトルベクターが好ましい。
具体的なベクターとしては、ｐＭＭ１５２２（MoBiTec社）、ｐＷＨ１５２０（MoBiTec社）、ｐＨＹ３００ＰＬＫ(タカラバイオ)、及びこれらから誘導されるハイブリッドプラスミドが挙げられる。
【００２６】
また、上記ベクターは、挿入した遺伝子が確実に発現できるよう、目的遺伝子の挿入領域の上流に適当な発現プロモーターを有していることが好ましい。プロモーターは、グリセリンにより抑制されず下流に存在する遺伝子を発現できるものであれば特に制限はなく、宿主等に応じて適宜選択できる。具体的には、ｔａｃプロモーター、ｘｙｌｏｓｅプロモーター等を用いることができる。
【００２７】
発現ベクターは、上記プロモーターや挿入遺伝子に加え、リボソーム結合部位（ＳＤ配列）等を含む翻訳開始領域、ターミネーター等の発現調節領域や、複製開始点、選択マーカー等を適宜有していることが好ましい。
選択マーカーとしては、抗生物質耐性遺伝子（例えば、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、ネオマイシン、カナマイシン、アンピシリン、テトラサイクリン、スペクチノマイシン）等の薬剤耐性遺伝子が挙げられる。形質転換処理後の微生物を上記抗生物質を含む培地中に培養し、生育してきた微生物を選抜することによって、形質転換体を容易に選抜することができる。
【００２８】
発現ベクターの構築方法は特に限定されるものではなく、適宜選択された母体となるベクターの所定の箇所に、目的遺伝子をコードするＤＮＡを挿入すればよい。例えば、ベクターとして上記のｐＭＭ１５２２プラスミドを用いる場合、目的遺伝子を当該プラスミドが有するキシロースプロモーターの下流に連結すればよい。遺伝子の挿入は、制限酵素処理やライゲーション等の通常の手法により行うことができる。
作製した遺伝子挿入後の発現ベクターを大腸菌等のホスト細胞に導入し、ホスト細胞を増殖させることで発現ベクターを複製し、増殖したホスト細胞から公知の方法で発現ベクターを回収することができる。
【００２９】
（４）形質転換
次に、上記で構築した発現ベクターで前記微生物を形質転換し、細胞内に目的遺伝子を導入する。
宿主への発現ベクターの導入方法としては特に制限はなく、通常の方法を用いることができる。例えば、カルシウムイオンを用いる方法、一般的なコンピテントセル形質転換方法（J．Bacterial．93，1925（1967））、プロトプラスト形質転換法（Mol．Gen．Genet．168，111（1979））、エレクトロポレーション法（FEMS  Microbiol．Lett．55，135（1990））又はLP形質転換方法（T．Akamatsu及びJ．Sekiguchi，Archives  of  Microbiology，1987，146，p.353-357；T．Akamatsu及びH．Taguchi，Bioscience，Biotechnology，and  Biochemistry，2001，65，4，p.823-829）等を用いることができる。
【００３０】
形質転換体の選抜方法に特に制限はなく、例えば、選択マーカーとして薬剤耐性遺伝子が形質転換体に導入されている場合には、当該薬剤に対する耐性を指標として選抜することができる。形質転換体に目的遺伝子が組み込まれていることの確認は、例えば、形質転換体から常法に従ってＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ法もしくはサザンハイブリダイゼーション法等の通常の方法により行うことができる。
【００３１】
（５）形質転換体のグリセリン資化能
得られた形質転換体は、形質転換されていない微生物に比べ、グリセリン資化能が向上し、グリセリン含有培地での生育性に優れる。
形質転換体のグリセリン資化能の向上は、グリセリン含有培地で形質転換体及び比較対象として宿主として用いた微生物をそれぞれ培養し、グリセリンの取込み速度をおよび細菌細胞量の変化（生育性）を追跡、比較することにより確認することができる。グリセリンの取込み速度の測定は、培地中に残存するグリセリンの濃度をＨＰＬＣやグリセリン測定キット等を用いて測定できる。また細菌細胞量の変化の測定は、分光光度計による吸光度の変化を測定することにより実施することができる。
【００３２】
２．形質転換体を用いた有用物質の生産
得られた形質転換体をグリセリン含有培地で培養し、培地又は形質転換体内に発酵生成物又は反応生成物を生成、蓄積させた後、培地または形質転換体細胞からこれらの生成物を採取することにより、グリセリンを原料として有用な発酵生成物又は反応生成物を製造することができる。
【００３３】
（１）形質転換体の培養
形質転換体の培養に用いる培地は、グリセリンを含有していればよく、使用した宿主微生物に応じて適宜選択できる。
培地に用いるグリセリンは、市販品であってもよく、バイオ燃料等の製造時に副産物として生じるグリセリンを用いることもできる。副産物として生じるグリセリンを用いることで、余剰物質処理にかかるエネルギー低減、廃棄による環境汚染の低減といった副次的な効果が得られ、環境負荷の低減にもつながる。更に、副産物として生じるグリセリンは安価に購入できるので、コスト面でもメリットがある。
培地中のグリセリン濃度は、使用した宿主微生物に応じて適宜選択することができる。グリセリン資化能向上の観点、発酵生成物又は反応生成物を効率よく製造する観点からは、好ましくは０．１質量％以上、より好ましくは０．５質量％以上、さらに好ましくは１．０質量％以上、よりさらに好ましくは２．０質量％以上である。取り扱い性等の点から、含有量の上限値としては、好ましくは５０質量％以下、より好ましくは２５質量％以下、さらに好ましくは２０質量％以下、よりさらに好ましくは１５質量％以下、よりさらに好ましくは１０質量％以下である。
【００３４】
培地には、上記グリセリン以外にも、通常の培地に添加される炭素源、窒素源、無機塩類、金属塩、各種の有機物、無機物、界面活性剤、消泡剤などを、適宜選択して添加することができる。これらの培地成分は、必要に応じて培地中に追添してもよい。
グリセリン以外の炭素源として具体的には、グルコース、マルトース、シュークロース、フルクトース、キシロース、セルビトース、可溶性デンプンなどが挙げられ、グルコース、マルトース、シュークロースを用いることが好ましい。
培地中のグリセリン以外の炭素源の濃度は、生育および実生産の観点から、好ましくは０．０１〜１０質量％、より好ましくは０．０２５〜５質量％、さらに好ましくは０．５〜３質量％である。
窒素源として具体的には、イーストエクストラクト、ペプトン、牛肉エキス、魚肉エキス、硫安化合物、アンモニア化合物を用いることが好ましい。
無機塩類として具体的には、鉄、マグネシウム、マンガン、亜鉛、コバルト、ニッケルなどが挙げられ、マグネシウム、マンガン、亜鉛を用いることが好ましい。
グリセリン含有培地の好ましい１実施態様として、例えば、グリセリン１０％Ｌ培地（バクトトリプトン（Difco社製）２％、イーストエクスラクト（Difco社製）１％、NaCl（和光社製）１％、グリセリン１０％（Ｗ／Ｖ））が例示できる。
【００３５】
形質転換体の培養条件は、宿主として用いた微生物に応じて適する条件を選択すればよい。
培養温度は、生育性向上の観点、グリセリン資化能向上の観点から、１０〜４５℃程度とすることが好ましく、２５〜３７℃程度とすることがより好ましい。
培地のｐＨは、生育性向上の観点、グリセリン資化能向上の観点から、５〜９程度とすることが好ましく、６〜８程度とすることがより好ましい。
培養時間は、生育性向上の観点、グリセリン資化能向上の観点から、２４時間〜１４日間程度とすることが好ましい。
宿主としてバチルス・サブチリスを用いる場合、３０℃〜３７℃、ｐＨ６．５〜７．５で、２４時間〜１５０時間程度培養することが、生育性向上の観点、グリセリン資化能向上の観点からより好ましい。
【００３６】
形質転換体によって生産される発酵生成物又は反応生成物としては、宿主微生物がグリセリン代謝によって生成する物質、グリセリン代謝によって生成するエネルギーを利用して産生される物質が挙げられる。例えば、宿主としてバチルス属細菌を用いた場合には、アミノ酸（フェニルアラニン、チロシンなど）、ペプチド類（ポリグルタミン酸（PGA）、プリパスタチン、サーファクチン、イツリンA、アグラスタチンなど）、糖類（レバンなど）、有機酸（イノシン酸など）、ビタミン類とその誘導体（メナキノン（ビタミンＫ２）など）、テルペン類（C35テルペン（セスクアテルペン）など）、等が挙げられる。
これらの発酵生成物や反応生成物は、化学品素材、酵素等の生合成の原料として用いることができる。
【００３７】
培養物からの発酵生成物又は反応生成物の採取方法は特に限定されず、微生物により生産された物質を単離、回収する際に通常用いられる方法で行うことができる。例えば、培養物や形質転換体から、ろ過、遠心分離、細胞の破砕、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、クロロホルム／メタノール抽出法、ヘキサン抽出法、エタノール抽出法等により目的の発酵生成物又は反応生成物を単離、回収することができる。
【００３８】
上述した実施形態に関し、本発明はさらに以下の方法及び形質転換体を開示する。
【００３９】
＜１＞  下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子を、グリセリン資化能を有する微生物に導入する工程を含む、微生物のグリセリン資化能を向上させる方法。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と７０％以上（好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９９％以上）の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつグリセリン取り込み活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１又は数個（好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜３個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつグリセリン取り込み活性を有するタンパク質
＜２＞  前記微生物がバチルス（Bacillus）属細菌である、＜１＞項記載の方法。
＜３＞  前記微生物がバチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）である、＜１＞又は＜２＞項記載の方法。
＜４＞  前記遺伝子がリステリア（Listeria）属細菌由来の遺伝子である、＜１＞〜＜３＞のいずれか１項記載の方法。
＜５＞  前記遺伝子がリステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）由来の遺伝子である、＜１＞〜＜４＞のいずれか１項記載の方法。
＜６＞  前記遺伝子を有する発現ベクターを微生物に導入する、＜１＞〜＜５＞のいずれか１項記載の方法。
【００４０】
＜７＞  下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子を、グリセリン資化能を有する微生物に導入して得られた、グリセリン資化能が向上した形質転換体。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と７０％以上（好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９９％以上）の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつグリセリン取り込み活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１又は数個（好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜３個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつグリセリン取り込み活性を有するタンパク質
＜８＞  前記微生物がバチルス（Bacillus）属細菌である、＜７＞項記載の形質転換体。
＜９＞  前記微生物がバチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）である、＜７＞又は＜８＞項記載の形質転換体。
＜１０＞  前記遺伝子がリステリア（Listeria）属細菌由来の遺伝子である、＜７＞〜＜９＞のいずれか１項記載の形質転換体。
＜１１＞  前記遺伝子がリステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）由来の遺伝子である、＜７＞〜＜１０＞のいずれか１項記載の形質転換体。
＜１２＞  前記遺伝子を有する発現ベクターを微生物に導入する、＜７＞〜＜１１＞のいずれか１項記載の形質転換体。
【００４１】
＜１３＞  下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子を、グリセリン資化能を有する微生物に導入する工程、及び導入後の微生物をグリセリン含有培地で培養する工程を含む、微生物の生育性を向上させる方法。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と７０％以上（好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９９％以上）の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつグリセリン取り込み活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１又は数個（好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜３個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつグリセリン取り込み活性を有するタンパク質
＜１４＞  前記微生物がバチルス（Bacillus）属細菌である、＜１３＞項記載の方法。
＜１５＞  前記微生物がバチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）である、＜１３＞又は＜１４＞項記載の方法。
＜１６＞  前記遺伝子がリステリア（Listeria）属細菌由来の遺伝子である、＜１３＞〜＜１５＞のいずれか１項記載の方法。
＜１７＞  前記遺伝子がリステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）由来の遺伝子である、＜１３＞〜＜１６＞のいずれか１項記載の方法。
＜１８＞  前記遺伝子を有する発現ベクターを微生物に導入する、＜１３＞〜＜１７＞のいずれか１項記載の方法。
【００４２】
＜１９＞  ＜７＞〜＜１２＞のいずれか１項に記載の形質転換体をグリセリン含有培地で培養する工程、及び培養物から発酵生成物または反応生成物を取得する工程を含む、発酵生成物または反応生成物の製造方法。
【実施例】
【００４３】
以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００４４】
実施例
１．GlpFタンパク質発現用ベクターの構築
（１）枯草菌由来GlpFタンパク質発現用ベクター
枯草菌GlpFタンパク質（配列番号３、配列番号１のアミノ酸配列との同一性６０％）をコードするglpF遺伝子（配列番号４、配列番号２の塩基配列との同一性６０％）を組み込んだベクターｐＮＫＳ１００１を構築した（図１）。
枯草菌glpF遺伝子は、枯草菌１６８株の染色体を鋳型に、プライマーBSglpFF-1（GCTTTTTACTAGTGACTTTAGG（配列番号５）、下線がＳｐｅＩ）及びプライマーBSglpFR-2(AATGTACGTAGATCTTTAATGGTGATGGTGATGGTGAATATATTT（配列番号６）、下線AGATCTがＢｇｌＩＩを、下線ATGGTGATGGTGATGGTGがヒスチジンタグ（Ｈｉｓ６）をコードするＤＮＡ配列）を用いてＰＣＲ法で増幅した。なお、増幅したglpF遺伝子のＤＮＡ配列の後ろには、後述のウエスタンブロッティング法に用いるためのヒスチジンタグ（Ｈｉｓ６）を付加した。
増幅したglpF遺伝子のＤＮＡを制限酵素処理し、ライゲーション反応によりベクターｐＭＭ１５２２（MoBiTec社製、耐性マーカー（アンピシリン、テトラサイクリン）、キシロースプロモーターを持つベクター）のＳｐｅＩ−ＢａｍＨＩサイトに挿入して、ベクターｐＮＫＳ１００１を構築した（図１）。
【００４５】
（２）リステリア・モノサイトゲネス由来GlpFタンパク質発現用ベクター
リステリア・モノサイトゲネスのGlpFタンパク質（配列番号１）をコードするglpF遺伝子（配列番号２）を組み込んだベクターｐＮＫＳ１００３を構築した（図１）。
リステリア・モノサイトゲネスのglpF遺伝子は、５’上流にＳｐｅＩおよび自身のＳＤ配列を、３’下流にＢｇｌＩＩを付加したＤＮＡ配列として人工合成し、ベクターｐＣＲ２．１（インビトロジェン社製）にサブクローニングした。サブクローニングしたＤＮＡ配列は、シークエンスにより確認した。なお、ＤＮＡ配列の人工合成、サブクローニング、及びシークエンスによる確認方法は、オペロン社に依頼し、定法に基づき行った。
サブクローニングしたベクターから、ＳｐｅＩ−ＢｇｌＩＩの各制限酵素サイトでリステリア・モノサイトゲネス  glpF遺伝子を切り出し、ライゲーション反応によりベクターｐＭＭ１５２２のＳｐｅＩ−ＢａｍＨＩサイトに挿入して、ベクターｐＮＫＳ１００３を構築した。なお、サブクローニングベクターから切り出されたglpF遺伝子のＤＮＡ配列の後ろには、後述のウエスタンブロッティング法に用いるためのヒスチジンタグ（Ｈｉｓ６）を付加されている。
【００４６】
上記で示したGlpFタンパク質発現用ベクターは、大腸菌ＤＨ５α株（タカラバイオ社製）もしくはＪＭ１０９株（タカラバイオ社製）に導入し、作成および複製した。大腸菌の培養には、Ｌ培地（バクトトリプトン（Difco社製）１％、イーストエクスラクト（Difco社製）０．５％、NaCl（和光社製）０．５％）を用いた。
【００４７】
２．発現ベクター導入株の作製
上記で得られた各発現ベクターを、枯草菌（バチルス・サブチリス）１６８株に導入して形質転換し、GlpFタンパク質発現ベクター導入株を得た。形質転換は、ＳＰＩ培地（0.20％  硫酸アンモニウム（和光社製）、1.40％  リン酸水素二カリウム（和光社製）、0.60％  リン酸二水素カリウム（和光社製）、0.10％  クエン酸三ナトリウム二水和物（和光社製）、0.50％  グルコース（和光社製）、0.02％  カザミノ酸（Difco社製））、及びＳＰＩＩ培地（0.20％  硫酸アンモニウム（和光社製）、1.40%  リン酸水素二カリウム（和光社製）、0.60％  リン酸二水素カリウム（和光社製）、0.10％  クエン酸三ナトリウム二水和物（和光社製）、0.50％  グルコース（和光社製）、0.01％  カザミノ酸（Difco社製）、5mM  硫酸マグネシウム（和光社製）、0.40μM  塩化マンガン（和光社製）、5μg/ml  トリプトファン（和光社製））を用いてコンピテント法により行い、１５μｇ／ｍＬテトラサイクリンを含むＬＢ寒天培地に生育した菌株をGlpFタンパク質発現ベクター導入株として選択した。
【００４８】
３．ウエスタンブロッティングによるGlpFタンパク質の発現確認
各GlpFタンパク質発現ベクター導入株でGlpFタンパク質が発現していることを、ウエスタンブロッティング法により確認した。
前記各導入株の培養には、Ｌ培地（バクトトリプトン（Difco社製）１％、イーストエクスラクト（Difco社製）０．５％、NaCl（和光社製）０．５％）を用いた。抗生物質は、テトラサイクリン１５μｇ／ｍＬの濃度で適時使用した。
培養は、Ｌ培地にて１６時間、３７℃で前培養し、前培養液をＬ培地に２％植菌し、３７℃にて細胞増殖期中期まで培養した。培養開始から６時間後に、ｐＭＭ１５２２の持つキシロースプロモーター誘導のため、キシロースを終濃度０．５％で添加した。培養開始２５時間後の培養液を遠心分離して、培養上清と沈殿した培養菌体とを得た。この培養菌体をリゾチーム処理後、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファーに懸濁し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルバッファーを加えて加熱処理した。その後、遠心して得られた上清をライゼートサンプルとした。
ウエスタンブロッティングは、セミドライシステム（バイオラッド社製）を用いて行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるタンパク質分離後、タンパク質をＰＶＤＦ膜（ミリポア社、イモビロン-Ｐ）に転写した。タンパク質の検出は、イムノスターＬＤ検出システム（和光純薬工業株式会社製）を用いた。抗Ｈｉｓ６抗体（和光純薬工業株式会社製）およびマウス用ＨＲＰ標識二次抗体（ＧＥヘルスケア社製）を使用してＨｉｓ６タグ付タンパク質を検出した。
結果を図２示す。図２の各レーンは、レーン１：１６８（枯草菌１６８株、キシロース誘導なし）、レーン２：１６８（枯草菌１６８株、キシロース誘導あり）、レーン３：１６８＋ｐＮＫＳ１００１（枯草菌由来GlpFタンパク質導入株、キシロース誘導なし）、レーン４：１６８＋ｐＮＫＳ１００１（枯草菌由来GlpFタンパク質導入株、キシロース誘導あり）、レーン５：１６８＋ｐＮＫＳ１００３（リステリア・モノサイトゲネス由来GlpFタンパク質導入株、キシロース誘導なし）、レーン６：１６８＋ｐＮＫＳ１００３（リステリア・モノサイトゲネス由来GlpFタンパク質導入株、キシロース誘導あり）、をそれぞれ示す。
【００４９】
図２に示すように、キシロース誘導後の枯草菌GlpFタンパク質導入株（１６８＋ｐＮＫＳ１００１）及びリステリア・モノサイトゲネス  GlpFタンパク質導入株（１６８＋ｐＮＫＳ１００３）から、GlpFタンパク質のバンドが検出され、発現が確認された。
【００５０】
４．グリセリン含有培地での生育性評価
導入したGlpFタンパク質の発現が確認できた各GlpFタンパク質導入株を、グリセリン含有培地で培養して、その生育性を評価した。
GlpFタンパク質導入株の培養には、グリセリン１０％Ｌ培地（バクトトリプトン（Difco社製）２％、イーストエクスラクト（Difco社製）１％、NaCl（和光社製）１％、グリセリン１０％（Ｗ／Ｖ））を用いた。抗生物質は、テトラサイクリン１５μｇ／ｍＬの濃度で適時使用した。
培養は、Ｌ培地にて１６時間、３７℃培養した前培養液を、グリセリン１０％Ｌ培地に２％植菌し、３７℃にて細胞増殖期中期まで培養した。培養開始から６時間後に、ｐＭＭ１５２２のもつキシロースプロモーターの誘導のためキシロースを終濃度０．５％で添加した。培養開始後２５時間後に、吸光度計にて培養液の吸光度（Ａ６００）を測定した。
【００５１】
測定した培養液の濁度を生育の指標として、各GlpFタンパク質導入株のグリセリン含有培地での生育性を評価した。陰性対象として、枯草菌１６８株を用い、同様に培養して生育性を評価した。結果を図３に示す。なお、生育性は、培養液の濁度（Ａ６００）を指標に、各導入株のキシロース誘導なしのものをコントロール（１００％）として、キシロース誘導後のものを相対値（％）にて示した。
【００５２】
図３に示すように、枯草菌GlpFタンパク質導入株（１６８＋ｐＮＫＳ１００１）は、野生型の枯草菌１６８株（１６８）とほぼ同程度の生育性しか示さず、キシロースによる誘導後も生育性に大きな変化はなかった。
これに対し、リステリア・モノサイトゲネスのGlpFタンパク質導入株（１６８＋ｐＮＫＳ１００３）では、キシロース誘導により１８％も生育性が向上した。
【００５３】
以上の結果から明らかなように、枯草菌GlpFタンパク質導入株とリステリア・モノサイトゲネスGlpFタンパク質導入株は、ともに導入したGlpFタンパク質を発現させているにも関わらず、リステリア・モノサイトゲネスGlpFタンパク質導入株のみで、グリセリン含有培地での生育性が向上した。グリセリン含有培地上での生育性の向上は、培養液量あたりの細胞数の増加を意味し、グリセリン取込み能を示す一つの指標である。すなわち、リステリア・モノサイトゲネス由来のGlpFタンパク質の導入が、枯草菌のグリセリン資化能向上に非常に有用であることが確認できた。
【図１】
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【図３】
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【図２】
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【配列表】
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