(57)【要約】      （修正有）【課題】ポリイミド等の膜表面への微細な凹凸形成の際、粉塵の発生を防止することができる細胞凝集体の形成方法を提供する。【解決手段】（ａ１）下式（１）で表されるポリイミド又はその前駆体が主成分の膜に偏光紫外線を照射する工程、（ａ２）上記偏光紫外線が照射された膜の表面に細胞を播種する工程、及び（ａ３）上記播種された細胞の培養により細胞凝集体を形成する工程を有する細胞凝集体の形成方法。2014030405.tif 000008（式（１）中、Ｒ１は、特定式で表される４価の有機基。Ｒ２は、炭素数１〜２０の２価の有機基である。）【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ１）ポリイミド又はその前駆体が主成分の膜に偏光紫外線を照射する工程、
（ａ２）上記偏光紫外線が照射された膜の表面に細胞を播種する工程、及び
（ａ３）上記播種された細胞の培養により細胞凝集体を形成する工程
を有する細胞凝集体の形成方法。
【請求項２】
上記ポリイミドが、下記式（１）で表される構造単位を有する請求項１に記載の細胞凝集体の形成方法。
【化１】
2014030405.tif 000006
（式（１）中、Ｒ１は、下記式（ｉ−１）〜（ｉ−６）のいずれかで表される４価の有機基である。Ｒ２は、炭素数１〜２０の２価の有機基である。）
【化２】
2014030405.tif 000007
（式（ｉ−１）、式（ｉ−３）及び式（ｉ−４）中、ＲＡ１、ＲＡ３及びＲＡ４は、それぞれ独立して、炭素数１〜４の１価の有機基である。ｎ１は、０〜４の整数である。ｎ３は、０〜４の整数である。ｎ４は、０〜８の整数である。ＲＡ１、ＲＡ３及びＲＡ４がそれぞれ複数の場合、複数のＲＡ１、ＲＡ３及びＲＡ４は、それぞれ同一でも異なっていてもよい。
式（ｉ−２）中、ＲＡ２１は、炭素数１〜４の１価の有機基である。ｎ２は、０〜６の整数である。ＲＡ２２は、単結合、メチレン基又は炭素数２〜４のアルキレン基である。ｎ２が２以上の場合、複数のＲＡ２１は、同一でも異なっていてもよい。
式（ｉ−５）中、ＲＡ５は、フッ素原子又は炭素数１若しくは２の１価の有機基である。ｎ５は、０〜９の整数である。ｎ５が２以上の場合、複数のＲＡ５は、同一でも異なっていてもよい。
式（ｉ−６）中、ＲＡ６１は、フッ素原子又は炭素数１若しくは２の１価の有機基である。ｎ６１は、０〜５の整数である。ＲＡ６２は、フッ素原子又は炭素数１〜４の１価の有機基である。ｎ６２は、０〜４の整数である。ＲＡ６１及びＲＡ６２がそれぞれ複数の場合、複数のＲＡ６１及びＲＡ６２は、それぞれ同一でも異なっていてもよい。
式（ｉ−１）〜（ｉ−６）中、＊は、炭素原子との結合部位を示す。）
【請求項３】
上記ポリイミド又はその前駆体がフッ素原子を含む請求項１又は請求項２に記載の細胞凝集体の形成方法。
【請求項４】
（ｂ１）ポリイミド又はその前駆体が主成分の膜を形成する工程、及び
（ｂ２）上記膜に偏光紫外線を照射する工程
を有する細胞凝集体形成用基材の製造方法。
【請求項５】
基板と、
この基板の表面に形成され、ポリイミド又はその前駆体を主成分とする膜と
を備え、
上記膜が偏光紫外線を照射されたものである細胞凝集体形成用基材。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞凝集体の形成方法、細胞凝集体形成用基材の製造方法及び細胞凝集体形成用基材に関する。
【背景技術】
【０００２】
事故や病気等で身体の組織や器官等を失った場合であっても、残存する細胞を用いて上記組織等を再生し、機能の回復を目指す再生医療の研究が盛んに行われている。再生医療としては、組織の最小単位を再生し、それを大量に移植することで機能を代替させるという考え方が主流である。これを実現する方法として、上記組織の最小単位としての細胞凝集体（スフェロイド）を形成する技術が挙げられる。
【０００３】
このような細胞凝集体の形成方法としては、生体適合性の高いポリイミドやその前駆体を主成分とする膜を用い、例えば、その表面にラビング処理を施して細胞凝集体を形成するラビング法が開示されている（膜（ＭＥＭＢＲＡＮＥ），３２（５），２６６−２７０（２００７）参照）。このラビング法は、ナイロンやコットン等の布を用いてポリイミド等の膜表面をラビングすることにより微細な凹凸形状を形成するもので、このような表面では特定細胞と特異的な相互作用を持たないため、多層形成可能な細胞種であればどのような細胞にも適用できる利点がある。
【０００４】
しかしながら、上述のようなラビング法では、ラビングにより発生した粉塵の膜表面への付着による細胞凝集体の品質への影響が懸念されるため、粉塵の発生を防止可能な膜形成工程を有する新たな細胞凝集体の形成方法が望まれている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】膜（ＭＥＭＢＲＡＮＥ），３２（５），２６６−２７０（２００７）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、以上のような事情に基づいてなされたものであり、その目的は、ポリイミド等の膜表面への微細な凹凸の形成の際、粉塵の発生を防止可能な細胞凝集体の形成方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題を解決するためになされた発明は、
（ａ１）ポリイミド又はその前駆体（以下、ポリイミドの前駆体を、単に「前駆体」ともいう）が主成分の膜（以下、「膜（α）」ともいう）に偏光紫外線を照射する工程、
（ａ２）上記偏光紫外線が照射された膜の表面に細胞を播種する工程、及び
（ａ３）上記播種された細胞の培養により細胞凝集体を形成する工程
を有する細胞凝集体の形成方法である。
【０００８】
また、上記課題を解決するためになされた別の発明は、
（ｂ１）ポリイミド又はその前駆体が主成分の膜を形成する工程、及び
（ｂ２）上記膜に偏光紫外線を照射する工程
を有する細胞凝集体形成用基材の製造方法である。
【０００９】
さらに、上記課題を解決するためになされた別の発明は、
基材と、この基材の表面に形成され、ポリイミド又はその前駆体を主成分とする膜とを備え、上記膜が偏光紫外線を照射されたものである細胞凝集体形成用基材である。
【００１０】
なお、本発明において、主成分とは、含有する成分のうち、質量割合が最も多い成分を指す。上記主成分の質量割合としては、５０質量％以上が好ましく、７０質量％以上がより好ましい。
【発明の効果】
【００１１】
本発明は、ポリイミド等の膜表面への微細な凹凸形成の際、粉塵の発生を防止することができる。そのため、本発明の細胞凝集体の形成方法、細胞凝集体形成用基材の製造方法及び細胞凝集体形成用基材は、粉塵の発生を防止可能であるため、細胞凝集体の形成プロセスにおいて、形成される細胞凝集体の品質の向上、更には粉塵除去の不要化による生産性の向上に寄与することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明の細胞凝集体の形成方法において、膜（α）に偏光紫外線を照射する前の状態の一例を示す模式図である。
【図２】本発明の細胞凝集体の形成方法において、膜（α）に偏光紫外線を照射した後の状態の一例を示す模式図である。この図は、本発明の細胞凝集体形成用基材の一例を示す模式図でもある。
【図３】本発明の細胞凝集体の形成方法において、細胞を播種する際の状態の一例を示す模式図である。
【図４】本発明の細胞凝集体の形成方法において、細胞の培養により細胞凝集体を形成した後の状態の一例を示す模式図である。
【図５】図４の細胞凝集体を膜（α）から剥離した後の状態の一例を示す模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
＜細胞凝集体の形成方法＞
本発明の細胞凝集体の形成方法は、
（ａ１）ポリイミド又はその前駆体（以下、ポリイミド又はその前駆体を「ポリイミド等」ともいう）が主成分の膜（α）に偏光紫外線を照射する工程（以下、「工程（ａ１）」ともいう）、
（ａ２）上記偏光紫外線が照射された膜（α）の表面に細胞を播種する工程（以下、「工程（ａ２）」ともいう）、及び
（ａ３）上記播種された細胞の培養により細胞凝集体を形成する工程（以下、「工程（ａ３）」ともいう）
を有する。
当該細胞凝集体の形成方法がポリイミド等が主成分の膜（α）に偏光紫外線を照射する工程を有するため、当該細胞凝集体の形成方法は、上記膜（α）表面への微細な凹凸形成の際、粉塵の発生を防止することができ、これにより形成される細胞凝集体の品質を高めることができる。なお、膜（α）表面の微細な凹凸形状は、ポリイミド等の重合体分子が偏光紫外線により局所的に切断又は異方的に異性化若しくは二量化されることで形成されるものと推察される。以下、各工程について、図１〜図５を参照しながら詳述する。
【００１４】
［工程（ａ１）］
本工程では、ポリイミド又はその前駆体が主成分の膜（α）に偏光紫外線を照射する。
【００１５】
上記ポリイミド又はその前駆体が主成分の膜（α）としては、ポリイミド成分からなる膜、前駆体成分からなる膜、ポリイミドが主成分でありかつ前駆体成分を含有する膜、前駆体が主成分でありかつポリイミド成分を含有する膜、上記成分と共に、ポリイミド及び前駆体以外の成分を含有する膜が挙げられる。
【００１６】
図１に示すように、上記膜（α）（図１において符号１で表される膜）は、通常、基板１００上に形成されている。上記基板１００としては、例えば、合成樹脂製、ＴＣＰＳ（Ｔｉｓｓｕｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ）製、ガラス製等の基板が挙げられる。上記膜（α）の形成方法としては、例えば、上記ポリイミド等の溶液を上記基板１００上に塗布することで形成する方法等が挙げられる。上記塗布方法としては、例えば、スプレー法、オフセット印刷法、ロールコーター法、インクジェット印刷法、溶媒キャスト法、スピンコート法等が挙げられる。上記ポリイミド等の膜厚としては、特に限定されないが、膜（α）の形成容易性の観点から、１０ｎｍ〜３００ｎｍが好ましい。
【００１７】
上記偏光紫外線は、所定の波長の紫外線を偏光板を介することで得ることができ、得られた偏光紫外線を膜（α）表面に対して所定の方向から照射する。偏光紫外線の照射条件としては、光開裂反応が起こる限り特に限定されないが、上記波長としては、通常２００ｎｍ以上３００ｎｍ以下であり、２２０ｎｍ以上２８０ｎｍ以下が好ましく、２５４ｎｍがより好ましい。照射量としては、通常２，０００Ｊ／ｍ２以上であり、４，０００Ｊ／ｍ２以上が好ましく、６，０００Ｊ／ｍ２以上がより好ましく、８，０００Ｊ／ｍ２以上がさらに好ましい。上記偏光紫外線を照射する方向としては、一定方向でもよく、複数の方向でもよく、膜（α）表面の領域毎に異なった方向であってもよい。
【００１８】
上記偏光紫外線は、膜（α）表面の全体に亘って照射してもよく、フォトマスクを介して膜（α）表面の一部の領域にパターン状に照射してもよい。上記パターン状に照射する場合、所望の形状及びサイズを有する細胞凝集体を簡便かつ確実に形成することができる。これは、偏光紫外線の照射領域とそれ以外の領域とで膜（α）表面の形状が異なり、これにより播種された細胞と膜（α）との接着力に差異が生ずるためであると推察される。このパターン状の照射により、移植に際して生体に合致できる所望形状の細胞凝集体を精度良く得ることができる。
【００１９】
上記偏光紫外線を照射した後の状態を図２に示す。この図２に示すように、偏光紫外線の照射により膜（α）の表面に微細な凹凸を形成することができる。
【００２０】
上記ポリイミドは、後述のようにポリアミック酸の有するアミック酸構造を脱水閉環してイミド化することにより製造できる。上記ポリイミドは、その前駆体であるポリアミック酸が有しているアミック酸構造の全てを脱水閉環した完全イミド化物であってもよく、アミック酸構造の一部のみを脱水閉環し、アミック酸構造とイミド環構造とが併存している部分イミド化物であってもよい。
【００２１】
膜（α）の主成分がポリイミドである場合、このポリイミドのイミド化率は、４０％以上が好ましく、５０％以上がより好ましく、６０％以上がさらに好ましい。
【００２２】
上記ポリイミドの前駆体としては、ポリアミック酸が挙げられる。
【００２３】
上記ポリイミド及びポリアミック酸としては、偏光紫外線により光開裂反応を生ずるもの、光配向性基を有するものが好ましく、偏光紫外線により光開裂反応を生ずるものがより好ましい。上記ポリイミド及びポリアミック酸が上記性質又は基を有することで、膜（α）表面において微細な凹凸を容易かつ確実に形成することができる。
【００２４】
上記偏光紫外線により光開裂反応を生ずるポリイミドとしては、下記式（１）で表される構造単位を有することが好ましい。上記ポリイミドが下記構造を有することで、光開裂反応によりポリマー主鎖又は側鎖が有する一部の構造が開裂し、膜（α）表面において分子レベルの微細な凹凸をより容易かつ確実に形成することができる。
【００２５】
【化１】
2014030405.tif 000002
【００２６】
上記式（１）中、Ｒ１は、下記式（ｉ−１）〜（ｉ−６）のいずれかで表される４価の有機基である。Ｒ２は、炭素数１〜２０の２価の有機基である。
【００２７】
【化２】
2014030405.tif 000003
【００２８】
上記式（ｉ−１）、式（ｉ−３）及び式（ｉ−４）中、ＲＡ１、ＲＡ３及びＲＡ４は、それぞれ独立して、炭素数１〜４の１価の有機基である。ｎ１は、０〜４の整数である。ｎ３は、０〜４の整数である。ｎ４は、０〜８の整数である。ＲＡ１、ＲＡ３及びＲＡ４がそれぞれ複数の場合、複数のＲＡ１、ＲＡ３及びＲＡ４は、それぞれ同一でも異なっていてもよい。
上記式（ｉ−２）中、ＲＡ２１は、炭素数１〜４の１価の有機基である。ｎ２は、０〜６の整数である。ＲＡ２２は、単結合、メチレン基又は炭素数２〜４のアルキレン基である。ｎ２が２以上の場合、複数のＲＡ２１は、同一でも異なっていてもよい。
上記式（ｉ−５）中、ＲＡ５は、フッ素原子又は炭素数１若しくは２の１価の有機基である。ｎ５は、０〜９の整数である。ｎ５が２以上の場合、複数のＲＡ５は、同一でも異なっていてもよい。
上記式（ｉ−６）中、ＲＡ６１は、フッ素原子又は炭素数１若しくは２の１価の有機基である。ｎ６１は、０〜５の整数である。ＲＡ６２は、フッ素原子又は炭素数１〜４の１価の有機基である。ｎ６２は、０〜４の整数である。ＲＡ６１及びＲＡ６２がそれぞれ複数の場合、複数のＲＡ６１及びＲＡ６２は、それぞれ同一でも異なっていてもよい。
式（ｉ−１）〜（ｉ−６）中、＊は、炭素原子との結合部位を示す。
【００２９】
上記ＲＡ１、ＲＡ２１、ＲＡ３、ＲＡ４及びＲＡ６２で表される炭素数１〜４の１価の有機基としては、例えば、炭素数１〜４の鎖状炭化水素基、炭素数３〜４の脂環式炭化水素基、これらの炭化水素基の炭素−炭素間に酸素原子、窒素原子等のヘテロ原子を有する基を含む基等が挙げられる。
【００３０】
上記炭素数１〜４の鎖状炭化水素基としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｉ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｉ−ブチル基、ｔ−ブチル基等が挙げられる。
【００３１】
上記炭素数３〜４の脂環式炭化水素基としては、例えば、シクロプロピル基、シクロブチル基等が挙げられる。
【００３２】
これらの炭化水素基の炭素−炭素間に酸素原子、窒素原子等のヘテロ原子を有する基を含む基としては、上記炭化水素基の炭素−炭素間に、−Ｏ−、−ＣＯ−、−ＣＯＯ−、−ＯＣＯ−、−ＮＯ−、−ＮＨ２−等の少なくともひとつのヘテロ原子を有する結合基を含む基等が挙げられる。
【００３３】
上記ＲＡ２２で表される炭素数２〜４のアルキレン基としては、例えば、エチレン基、プロピレン基、ブチレン基等が挙げられる。
【００３４】
上記ＲＡ５及びＲＡ６１で表される炭素数１若しくは２の１価の有機基としては、例えば、上記ＲＡ１等として例示した炭素数１〜４の１価の有機基のうち、炭素数１若しくは２のもの等が挙げられる。
【００３５】
これらの中で、上記Ｒ１としては、上記式（ｉ−１）、（ｉ−２）で表される有機基が好ましく、式（ｉ−１）で表される有機基がより好ましい。上記（ｉ−１）及び（ｉ−２）において、上記ｎ１及びｎ２は、それぞれ０がさらに好ましい。
【００３６】
上記Ｒ２で表される炭素数１〜２０の２価の有機基としては、例えば、炭素数１〜２０の脂肪族ジアミン化合物、炭素数１〜２０の脂環式ジアミン化合物、炭素数１〜２０の芳香族ジアミン化合物及び下記式（２）で表されるジアミノシロキサン化合物等のジアミン化合物に由来する２価の有機基等が挙げられる。
【００３７】
【化３】
2014030405.tif 000004
【００３８】
上記式（２）中、ｍは、１〜１０の整数である。
【００３９】
上記炭素数１〜２０の脂肪族ジアミン化合物としては、例えば、テトラメチレンジアミン、ヘキサメチレンジアミン等が挙げられる。
【００４０】
上記炭素数１〜２０の脂環式ジアミン化合物としては、例えば、ビス（４−アミノシクロヘキシル）メタン、ビス（４−アミノ−３−メチルシクロヘキシル）メタン等が挙げられる。
【００４１】
上記炭素数１〜２０の芳香族ジアミン化合物としては、例えば、ｐ−フェニレンジアミン、ｍ−フェニレンジアミン、２，５−ジアミノトルエン、２，６−ジアミノトルエン、４，４’−ジアミノビフェニル、３，３’−ジメチル−４，４’−ジアミノビフェニル、３，３’−ジメトキシ−４，４’−ジアミノビフェニル、ジアミノジフェニルメタン、ジアミノジフェニルエ−テル、２，２’−ジアミノジフェニルプロパン、ビス（３，５−ジエチル４−アミノフェニル）メタン、ジアミノジフェニルスルホン、ジアミノベンゾフェノン、ジアミノナフタレン、１，４−ビス（４−アミノフェノキシ）ベンゼン、１，４−ビス（４−アミノフェニル）ベンゼン、９，１０−ビス（４−アミノフェニル）アントラセン、１，３−ビス（４−アミノフェノキシ）ベンゼン、４，４’−ビス（４−アミノフェノキシ）ジフェニルスルホン、２，２−ビス［４−（４−アミノフェノキシ）フェニル］プロパン、２，２−ビス（４−アミノフェニル）ヘキサフルオロプロパン、２，２−ビス［４−（４−アミノフェノキシ）フェニル］ヘキサフルオロプロパン等が挙げられる。
【００４２】
これらの中で、上記Ｒ２で表される炭素数１〜２０の２価の有機基としては、生体適合性の観点から、含フッ素ジアミン化合物由来の基が好ましく、含フッ素芳香族ジアミン化合物由来の基がより好ましく、２，２−ビス（４−アミノフェニル）ヘキサフルオロプロパン、２，２−ビス［４−（４−アミノフェノキシ）フェニル］ヘキサフルオロプロパン由来の基がさらに好ましく、２，２−ビス（４−アミノフェニル）ヘキサフルオロプロパン由来の基が特に好ましい。なお、上記ポリイミドは、上記ジアミン化合物由来の基を１種又は２種以上含んでいてもよい。
【００４３】
上記偏光紫外線により光開裂反応を生ずるポリアミック酸としては、例えば、下記式（３）で表される構造単位を有するポリアミック酸等が挙げられる。
【００４４】
【化４】
2014030405.tif 000005
【００４５】
上記式（３）中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ上記式（１）と同義である。
【００４６】
（ポリアミック酸の合成方法）
上記ポリアミック酸は、例えば、上記式（ｉ−１）〜（ｉ−６）で表される４価の有機基が有する脂環式構造を含むテトラカルボン酸二無水物（以下、「特定テトラカルボン酸二無水物」ともいう）とジアミン化合物とを反応させることで合成することができる。
【００４７】
上記特定テトラカルボン酸二無水物としては、例えば、
上記式（ｉ−１）で表される有機基を与えるものとして、例えば、１，２，３，４−シクロブタンテトラカルボン酸二無水物等；
上記式（ｉ−２）で表される有機基を与えるものとして、例えば、１，２，３，４−シクロペンタンテトラカルボン酸、２，３，５−トリカルボキシシクロペンチル酢酸二無水物等；
上記式（ｉ−３）で表される有機基を与えるものとして、例えば、２，３，４，５−テトラヒドロフランテトラカルボン酸二無水物等；
上記式（ｉ−４）で表される有機基を与えるものとして、例えば、１，２，４，５−シクロヘキサンテトラカルボン酸二無水物等；
上記式（ｉ−５）で表される有機基を与えるものとして、例えば、３，４−ジカルボキシ−１−シクロヘキシルコハク酸二無水物等；
上記式（ｉ−６）で表される有機基を与えるものとして、例えば、３，４−ジカルボキシ−１，２，３，４−テトラヒドロ−１−ナフタレンコハク酸等の脂環式テトラカルボン酸二無水物が挙げられる。これらの中で、１，２，３，４−シクロブタンテトラカルボン酸二無水物及び２，３，５−トリカルボキシシクロペンチル酢酸二無水物が好ましく、１，２，３，４−シクロブタンテトラカルボン酸二無水物がより好ましい。なお、この特定テトラカルボン酸二無水物は、単独で又は２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００４８】
また、本発明の効果を損なわない範囲で、上記特定テトラカルボン酸二無水物以外の他のテトラカルボン酸二無水物を併用してもよい。
【００４９】
上記他のテトラカルボン酸二無水物としては、例えば、
脂肪族テトラカルボン酸二無水物として、１，２，３，４−ブタンテトラカルボン酸二無水物等；
芳香族テトラカルボン酸二無水物として、ピロメリット酸、２，３，６，７−ナフタレンテトラカルボン酸、１，２，５，６−ナフタレンテトラカルボン酸、１，４，５，８−ナフタレンテトラカルボン酸、２，３，６，７−アントラセンテトラカルボン酸、１，２，５，６−アントラセンテトラカルボン酸、３，３’，４，４’−ビフェニルテトラカルボン酸、２，３，３’，４−ビフェニルテトラカルボン酸、ビス（３，４−ジカルボキシフェニル）エ−テル、３，３’，４，４’−ベンゾフェノンテトラカルボン酸、ビス（３，４−ジカルボキシフェニル）スルホン、ビス（３，４−ジカルボキシフェニル）メタン、２，２−ビス（３，４−ジカルボキシフェニル）プロパン、１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２，２−ビス（３，４−ジカルボキシフェニル）プロパン、ビス（３，４−ジカルボキシフェニル）ジメチルシラン、ビス（３，４−ジカルボキシフェニル）ジフェニルシラン、２，３，４，５，−ピリジンテトラカルボン酸、２，６−ビス（３，４−ジカルボキシフェニル）ピリジン等の二無水物等が挙げられる。；
なお、他のテトラカルボン酸二無水物は、単独で又は２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００５０】
上記ポリアミック酸を合成するために用いられるジアミン化合物としては、例えば、脂肪族ジアミン化合物、脂環式ジアミン化合物、芳香族ジアミン化合物及びジアミノシロキサン化合物等が挙げられる。
【００５１】
上記脂肪族ジアミン化合物、脂環式ジアミン化合物及び芳香族ジアミン化合物としては、例えば、Ｒ２で表される２価の有機基を与えるジアミン化合物として例示したそれぞれの化合物と同様の化合物等が挙げられる。
【００５２】
ポリアミック酸の合成に用いられるテトラカルボン酸二無水物とジアミン化合物との使用割合は、ジアミン化合物に含まれるアミノ基１当量に対して、テトラカルボン酸二無水物の酸無水物基が０．２当量〜２当量となる割合が好ましく、０．３当量〜１．２当量となる割合がより好ましい。
【００５３】
ポリアミック酸の合成反応は、有機溶媒中において行われることが好ましい。反応温度としては、−２０℃〜１５０℃が好ましく、０℃〜１００℃がより好ましく、０℃〜５０℃がさらに好ましい。反応時間としては、０．５時間〜２４時間が好ましく、２時間〜１５時間がより好ましく、５時間〜１２時間がさらに好ましい。
【００５４】
上記有機溶媒としては、合成されるポリアミック酸を溶解できるものであれば特に制限はなく、例えば、
非プロトン系極性溶媒として、Ｎ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルイミダゾリジノン、ジメチルスルホキシド、γ−ブチロラクトン、テトラメチル尿素、ヘキサメチルホスホルトリアミド等；
フェノール系溶媒として、ｍ−クレゾール、キシレノール、フェノール、ハロゲン化フェノール等が挙げられる。
【００５５】
これらの中で、上記有機溶媒としては、非プロトン系極性溶媒が好ましく、Ｎ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）がより好ましい。
【００５６】
なお、上記有機溶媒は、単独で又は２種以上を組み合わせて用いてもよい。また、ポリアミック酸を溶解しない溶媒又は溶解しにくい溶媒であっても、ポリアミック酸の均一な溶解性が失われない範囲で、この溶媒を上記有機溶媒に加えてもよい。
【００５７】
上記有機溶媒の使用量（ａ）としては、テトラカルボン酸二無水物及びジアミン化合物の総量（ｂ）が、反応溶液の全量（ａ＋ｂ）に対して０．１質量％〜５０質量％となる量が好ましく、５質量％〜３０質量％となる量がより好ましい。
【００５８】
以上のようにして得られたポリアミック酸溶液は、そのまま膜（α）の形成に用いてもよく、上記溶液に含まれるポリアミック酸を単離して膜（α）の形成に用いてもよく、単離したポリアミック酸をさらに精製して膜（α）の形成に用いてもよい。
【００５９】
ポリアミック酸の単離方法としては、例えば、上記反応溶液を大量の貧溶媒中に注いで析出物を得た後、この析出物を減圧下乾燥する方法、反応溶液中の有機溶媒をエバポレーターで減圧留去する方法等が挙げられる。また、ポリアミック酸の精製方法としては、例えば、単離したポリアミック酸を再び有機溶媒に溶解し、次いで貧溶媒で析出させる方法、エバポレーターで減圧留去する工程を１回又は複数回行う方法等が挙げられる。
【００６０】
なお、得られたポリアミック酸は、これを脱水閉環して後述のポリイミドの合成に用いることができる。この場合、上記ポリアミック酸の反応溶液をそのまま脱水閉環反応に供してもよく、反応溶液中に含まれるポリアミック酸を上述のように単離して脱水閉環反応に供してもよく、単離したポリアミック酸を上述のように精製して脱水閉環反応に供してもよい。
【００６１】
（ポリイミドの合成方法）
上記ポリイミドは、上述の如くして得られたポリアミック酸の有するアミック酸構造を脱水閉環して合成することができる。このとき、アミック酸構造の全部をイミド化して完全イミド化物としてもよく、アミック酸構造の一部をイミド化して部分イミド化物としてもよい。ポリアミック酸を脱水閉環する方法としては、例えば、（ｉ）ポリアミック酸を加熱する方法、（ｉｉ）ポリアミック酸を有機溶媒に溶解し、この溶液中に脱水剤及び脱水閉環触媒を添加し必要に応じて加熱する方法等が挙げられる。
【００６２】
上記（ｉ）のポリアミック酸を加熱する方法において、反応温度は、１５０℃〜４５０℃が好ましく、１７０℃〜３５０℃がより好ましい。反応温度が１５０℃未満では脱水閉環反応が十分に進行せず、反応温度が４５０℃を超えると得られるポリイミドの分子量が低下する場合がある。反応時間は、３０秒〜１０時間が好ましく、５分〜５時間がより好ましい。
【００６３】
上記（ｉｉ）のポリアミック酸の溶液中に脱水剤及び脱水閉環触媒を添加する方法において、脱水剤としては、例えば、無水酢酸、無水プロピオン酸、無水トリフルオロ酢酸等の酸無水物を用いることができる。脱水剤の使用量としては、ポリアミック酸構造単位の１モルに対して０．０１モル〜２０モルが好ましい。脱水閉環触媒としては、例えば、ピリジン、コリジン、ルチジン、トリエチルアミン等の３級アミンを用いることができる。しかし、これらに限定されるものではない。脱水閉環触媒の使用量としては、使用する脱水剤１モルに対して０．０１モル〜１０モルが好ましい。脱水閉環反応に用いられる有機溶媒としては、例えば、ポリアミック酸の合成に用いられる有機溶媒として例示したものと同様の有機溶媒等が挙げられる。脱水閉環反応の反応温度としては、０℃〜１８０℃が好ましく、１０℃〜１５０℃がより好ましい。反応時間としては、０．５時間〜２０時間が好ましく、１時間〜８時間がより好ましい。
【００６４】
上記方法（ｉ）において得られるポリイミドは、これをそのまま膜（α）の形成に用いてもよく、このポリイミドを精製して膜（α）の形成に用いてもよい。一方、上記方法（ｉｉ）においてはポリイミドを含有する反応溶液が得られる。この反応溶液は、これをそのまま膜（α）の形成に用いてもよく、反応溶液から脱水剤及び脱水閉環触媒を除いて膜（α）の形成に用いてもよく、ポリイミドを単離して膜（α）の形成に用いてもよく、単離したポリイミドを精製して膜（α）の形成に用いてもよい。反応溶液から脱水剤及び脱水閉環触媒を除く方法としては、例えば、溶媒置換等の方法を適用することができる。ポリイミドの単離及び精製方法としては、例えば、ポリアミック酸の単離及び精製方法として例示したそれぞれの方法と同様の方法等が挙げられる。
【００６５】
上記光配向性基を有するポリイミド及びその前駆体としては、側鎖に光配向性基を有するポリイミド、側鎖に光配向性基を有するポリアミック酸が挙げられる。ここで、光配向性基とは、光照射により膜に異方性を付与することができる官能基である。この異方性は、光異性化反応又は光二量化反応により付与される。上記ポリイミド及びその前駆体が光配向性基を有することで、偏光紫外線が照射された膜（α）上において、播種された細胞の成長を促進することができる。これは、光配向性基を有する場合も、光開裂反応を生ずるポリイミド等と同様に、膜（α）表面に微細な凹凸が形成されるためであると推察される。
【００６６】
光配向性基としては、光配向性を示す種々の化合物由来の基を採用することができ、例えば、アゾベンゼン又はその誘導体を基本骨格として含有するアゾベンゼン構造を含む基、桂皮酸又はその誘導体を基本骨格として含有する桂皮酸構造を含む基、カルコン又はその誘導体を基本骨格として含有するカルコン構造を含む基、ベンゾフェノン又はその誘導体を基本骨格として含有するベンゾフェノン構造を含む基、クマリン又はその誘導体を基本骨格として含有するクマリン構造を含む基、ポリイミド又はその誘導体を基本骨格として含有するポリイミド構造を含む基等が挙げられる。これらの中で、優れた光配向性と上記基の導入容易性の観点から、桂皮酸又はその誘導体を基本骨格として含有する桂皮酸構造を含む基であることが好ましい。
【００６７】
上記光配向性基を有するポリイミドにおけるポリイミドとしては、主鎖を構成する構造単位中にイミド構造を有する限り特に限定されない。また、上記光配向性基を有するポリアミック酸におけるポリアミック酸としては、主鎖を構成する構造単位中にアミック酸構造を有する限り特に限定されない。但し、このポリアミック酸は、上記イミド構造を含むものを除くものである。
【００６８】
上記光配向性基を有するポリアミック酸の合成方法としては、例えば、テトラカルボン酸二無水物とエポキシ基を有するジアミン化合物とを適当な溶媒中で重合させた後、得られた重合体に光配向性基を有するカルボン酸化合物を反応させる方法等が挙げられる。
【００６９】
また、上記光配向性基を有するポリイミドの合成方法としては、例えば、上記光配向性基を有するポリアミック酸の合成方法において得られたポリアミック酸を、加熱等により脱水閉環する方法等が挙げられる。
【００７０】
上記ポリイミド等は、フッ素原子を含むことが好ましい。ポリイミド及びその前駆体がフッ素原子を含むことで、膜（α）は、優れた生体適合性を有し、播種された細胞からの細胞凝集体の形成を促進することができる。
【００７１】
［工程（ａ２）］
本工程では、図３に示すように、上記偏光紫外線が照射された膜（α）（図３において符号２で表される膜）の表面に細胞Ｃを播種する。播種可能な細胞としては、例えば、肝臓、腎臓など各種臓器の細胞、皮膚細胞等が挙げられるが、これらに限らず、細胞凝集体を形成可能な全ての細胞が挙げられる。播種する細胞Ｃとしては、治療の対象となる生物種と同一の生物種由来の細胞が好ましい。例えば、ヒトの治療に用いる場合はヒト由来の細胞が好ましく、同一のヒト由来の細胞がより好ましい。
【００７２】
播種する細胞Ｃは、予め各種の培養方法で予備培養し、細胞数を十分に増やしておくことが好ましい。予備培養法としては、例えば、単層培養、コートディッシュ培養、ゲル培養、懸濁培養等の公知の培養法が挙げられる。予備培養した細胞を培地から採取し、偏光紫外線が照射された膜（α）の表面に播種する。
【００７３】
膜（α）の表面における播種する細胞Ｃの濃度としては、予備培養の有無にかかわらず、１×１０４〜1×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌが好ましく、１×１０５〜1×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌがより好ましい。
【００７４】
［工程（ａ３）］
本工程では、図４に示すように、上記播種された細胞Ｃの培養により細胞凝集体ＣＭを形成する。細胞Ｃの培養は、通常、培地中で行われる。この培地は、播種する細胞Ｃの種類に応じて従来公知の培地を適宜選択することができる。上記培地としては、例えば、ＭＥＭ培地、ＢＭＥ培地、ＤＭＥ培地、αＭＥＭ培地、ＩＭＥＭ培地、ＥＳ培地、ＤＭ−１６０培地、Ｆｉｓｈｅｒ培地、Ｆ１２培地、ＷＥ培地、ＲＰＭＩ培地、これらの混合培地等が挙げられる。また、血管形成性細胞の培地としては、上記培地にウシ胎児血清等の血清成分を添加したものを用いることもできる。培地の種類は、継代ごとに変えてもよく、同一の培地を用いてもよい。
【００７５】
培養温度としては、３５℃〜３８℃が好ましく、３６℃〜３７℃がより好ましい。培養時間としては、２日間〜７日間が好ましく、２日間〜４日間がより好ましい。形成される細胞凝集体の大きさとしては、細胞活動性の観点から、直径３００μｍ以下が好ましく、直径１００μｍ〜２００μｍがより好ましい。
【００７６】
得られた細胞凝集体ＣＭは、キレート（ＥＤＴＡ）処理又はピペッティング等により膜（α）から剥がすことができ（図５参照）、これを遠心分離して回収することができる。
【００７７】
＜細胞凝集体形成用基材の製造方法＞
本発明の細胞凝集体形成用基材の製造方法は、
（ｂ１）ポリイミド又はその前駆体が主成分の膜を形成する工程（以下、「工程（ｂ１）」ともいう）、及び
（ｂ２）上記膜に偏光紫外線を照射する工程（以下、「工程（ｂ２）」ともいう）
を有する。
当該細胞凝集体用基材の製造方法は、ポリイミド等が主成分の膜に偏光紫外線を照射する工程を有しているため、従来のようなラビングによらず膜（α）表面への微細な凹凸形状を形成することができ、その結果、粉塵の発生を防止することができる。
【００７８】
［工程（ｂ１）］
本工程では、ポリイミド又はその前駆体が主成分の膜（α）を形成する。この膜（α）は、通常、基板上に形成される。上記ポリイミド等及び基板としては、例えば、上述の＜細胞凝集体の形成方法＞におけるそれぞれの説明を適用することができる。
【００７９】
上記膜（α）の形成方法としては、例えば、ポリイミド又はポリアミック酸が溶解した溶液を上記基板上に塗布することで形成する方法等が挙げられる。また、膜（α）の主成分がポリイミドである場合、基板上にポリアミック酸溶液を塗布した後、これを加熱することにより脱水閉環してポリイミドの膜（α）を形成する方法等も挙げられる。この場合の加熱条件としては、上述の（ポリイミドの合成方法）の項で説明したものと同様の条件を適用することができる。
【００８０】
［工程（ｂ２）］
本工程では、上記膜（α）に偏光紫外線を照射する。偏光紫外線及びその照射方法としては、細胞凝集体の形成方法における（ａ１）工程で説明したものと同様のものを適用することができる。
【００８１】
＜細胞凝集体形成用基材＞
図２に示すように、本発明の細胞凝集体形成用基材Ａは、基板１００と、この基板１００の表面に形成され、ポリイミド又はその前駆体を主成分とする膜（α）（図２において符号２で表される膜）とを備え、上記膜（α）が偏光紫外線を照射されたものである。当該細胞凝集体形成用基材Ａは、細胞凝集体の形成に用いられる。具体的には、当該細胞凝集体形成用基材Ａの偏光紫外線が照射された膜（α）の表面に細胞を播種し、この細胞を培養することで細胞凝集体を形成することができる。
当該細胞凝集体形成用基材Ａは、偏光紫外線が照射されたポリイミド等が主成分の膜（α）を備えているため、粉塵の付着が抑制された基材により、品質の高い細胞凝集体を形成することができる。
【００８２】
上記基板１００、ポリイミド等及び当該細胞凝集体形成用基材Ａの製造方法としては、上述の＜細胞凝集体の形成方法＞及び＜細胞凝集体形成用基材の製造方法＞の項におけるそれぞれの説明を適用することができる。
【実施例】
【００８３】
以下、本発明を実施例に基づいて具体的に説明するが、本発明は、これらの実施例に限定されるものではない。各物性値の測定方法を以下に示す。
【００８４】
＜ポリイミドの合成＞
［合成例１］
特定テトラカルボン酸二無水物としての１，２，３，４−シクロブタンテトラカルボン酸二無水物１９．２ｇ（０．９８モル）及びジアミン化合物としての２，２−ビス（４−アミノフェニル）ヘキサフルオロプロパン４１．０ｇ（０．１モル）を、ＮＭＰ３４３．５ｇ中に投入し、室温で１０時間反応させてポリイミドの前駆体（ポリアミック酸）溶液を得た。
【００８５】
＜ポリイミドの膜形成＞
合成例１で合成したポリアミック酸の溶液をガラス基板上にスピンコートし、次いで、８０℃のホットプレート上で１分間プレベークして溶媒を蒸発させた。その後、２３０℃のホットプレート上で１０分間ポストベークして脱水閉環させ、膜厚１００ｎｍのポリイミドの膜（α）を形成した。
【００８６】
＜細胞凝集体形成用基材及び細胞凝集体の形成＞
［実施例１］
上述のようにして作製したポリイミド膜の全面に、波長２５４ｎｍの偏光紫外線を１０，０００Ｊ／ｍ２照射して細胞凝集体形成用基材を作製した後、この偏光紫外線を照射したポリイミド膜の表面に２．７×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度でラット皮膚由来繊維芽細胞（ＦＲ細胞）を播種し、培地を用いて上記細胞を３７℃で４日間培養した。
【００８７】
［比較例１］
偏光紫外線を照射しないこと以外は、実施例１と同様に操作し、ＦＲ細胞を培養した。
【００８８】
上記培養の結果、実施例では播種したＦＲ細胞が増殖して細胞凝集体を形成することができたのに対し、比較例では細胞の増殖が見られず細胞凝集体を形成することができなかった。なお、実施例において偏光紫外線照射後のポリイミド膜の表面に粉塵の付着は見られなかった。
【産業上の利用可能性】
【００８９】
本発明は、ポリイミド等の膜表面への微細な凹凸形成の際、粉塵の発生を防止することができる。そのため、本発明は、粉塵の発生を防止可能な細胞凝集体の形成方法、細胞凝集体形成用基材の製造方法及び細胞凝集体形成用基材を提供することができる。従って、当該細胞凝集体の形成方法、細胞凝集体形成用基材及びその製造方法は、形成される細胞凝集体の品質を向上、更には粉塵除去の不要化による生産性の向上が可能な細胞凝集体の形成プロセスに好適に適用することができる。
【符号の説明】
【００９０】
Ａ  細胞凝集体形成用基材
Ｃ  細胞
ＣＭ  細胞凝集体
１  偏光紫外線照射前の膜（α）
２  偏光紫外線照射後の膜（α）
１００  基板
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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