(57)【要約】【課題】  解剖学・組織学分野における臓器などの電子顕微鏡による超微形態学的な画像撮影の目的に用いる凍結標本を作製する装置であって、高圧凍結により標的物の氷晶形成による破壊や変質を抑え、硝子凍結の深度が広い凍結標本が得られる作成装置を提供する。【解決手段】  標的物を収納する収納部１１ａを備える容器１１と、容器１１に圧入される加圧体１３ａとを備える凍結操作部１０が、収納部１１ａと加圧体１３ａとを互いに対向させた配置として加圧機構としての加圧ハンドル３０に装着されている。加圧ハンドル３０により、容器１１と加圧体１３ａとを冷却させた状態で、収納部１１ａに加圧体１３ａを圧入して収納部１１ａに収納された標的物を加圧しながら凍結させる。【選択図】  図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的物を収納する収納部を備える容器と、前記容器に圧入される加圧体とを備える凍結操作部が、前記収納部と前記加圧体とを互いに対向させた配置として加圧機構に装着され、
前記加圧機構は、前記容器と加圧体とを冷却させた状態で、前記収納部に前記加圧体を圧入して前記収納部に収納された標的物を加圧しながら凍結させることを特徴とする凍結標本の作製装置。
【請求項２】
前記収納部と前記加圧体とは、液蜜にシールされて前記収納部に前記加圧体が圧入されることを特徴とする請求項１記載の凍結標本の作製装置。
【請求項３】
前記収納部は、内面形状が、開口端が薄肉の鋭利状となるテーパ面に形成され、
前記加圧体は先端側が縮径するテーパ体状に形成されていることを特徴とする請求項１または２記載の凍結標本の作製装置。
【請求項４】
前記容器は、台座に前記収納部が起立して設けられ、該台座を介して支持ブロックに脱着自在に装着されるとともに、
前記加圧体は加圧ブロックに一体に形成され、
前記凍結操作部は、前記支持ブロック及び前記加圧ブロックを介して前記加圧機構に装着されていることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項記載の凍結標本の作製装置。
【請求項５】
前記加圧機構は、加圧ハンドルとして構成され、
加圧ハンドルの加圧端側の一方のレバーに前記容器が装着され、他方のレバーに前記加圧体が装着されていることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項記載の凍結標本の作製装置。
【請求項６】
標的物を収納する収納部を備える容器と、前記容器に圧入される加圧体とを備える凍結操作部が、前記収納部と前記加圧体とを互いに対向させた配置として加圧機構に装着され、
前記加圧機構は、前記容器と加圧体とを冷却させた状態で、前記収納部に前記加圧体を圧入して前記収納部に収納された標的物を加圧しながら凍結させることを特徴とする凍結標本の作製装置を用いて凍結標本を作製する方法であって、
前記収納部にあらかじめ液体窒素を充填しておき、標的物を収納部に収納するとともに、前記加圧体を前記収納部に圧入して標的物を加圧しながら凍結させることにより凍結標本を作製することを特徴とする凍結標本の作製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、解剖学・組織学分野における臓器等の、超微形態学的な画像撮影に使用するための凍結標本の作製装置及び凍結標本の作製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
解剖学・組織学分野における臓器等の電子顕微鏡による超微形態学的な画像撮影の目的で凍結標本を作製する際に、氷晶形成による標的物（検査対象物）の破壊を避けるために、氷晶形成過程をできる限り抑えて硝子凍結させた標本を得る必要がある。このような標本を得る方法として、従来、（１）切除しながら急速に冷却して凍結する方法（凍結切除）と、（２）高圧をかけて凍結する方法（高圧凍結）が行われている。
凍結切除法（１）は、あらかじめ切除具を液体窒素等により冷却しておき、標的物を切断する際に切断面の近傍の組織を瞬間的に凍結させ、氷晶を形成させないようにして凍結標本を作製する方法である（非特許文献１）。
高圧凍結法（２）は、高圧下（2,100kgf/cm2以上）において凍結させると氷晶形成を抑えて硝子凍結領域を大きくした凍結標本が得られることを利用する方法である（非特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００９−８２７００号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ohno S, Terada N, Ohno N, Saitoh S, Saitoh Y, Fujii Y. Significance of 'invivo cryotechnique' for morphofunctional analyses of living animal organs.Journal of Electron Microscopy. 59(5):395-408, 2010.
【非特許文献２】Moor H. Theory and practice of high pressurefreezing. In Cryotechniques; Biological Electron Microscopy. Edited bySteinbrecht RA. p175-191, Splinger-Verlag, Berlin, 1987.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上述した従来の凍結標本の作製方法には、以下のような課題がある。
凍結切除法（１）は、大気圧下において手動などで標的物を切除する際に凍結させて標本とするので、標的物の組織の変性が生じる前に手早く処理できるものの、凍結できる深度が切断面から約５μｍ程度に限られるため、電子顕微鏡で観察するために必要な凍結深度が浅く、観察できる範囲が限定されるという問題がある。
高圧凍結法（２）は、高圧下において標的物を凍結させることにより、氷晶形成の無い硝子凍結できる深度が、大気圧下における凍結と比較して深くなる（凍結表面から300〜500μｍ）という利点がある。しかしながら、高圧凍結法では、専用の高圧凍結装置を用いて凍結標本を作製するため、標的物を切除して高圧凍結装置にセットして凍結させるまでに時間がかかり、標的物の変形や変性などの変化が容易に起こってしまうという問題がある。
【０００６】
本発明は、これらの課題を解決すべくなされたものであり、電子顕微鏡撮影できる十分に深い深度まで氷晶形成の無い硝子凍結をさせた標本を容易に得ることができ、標的物を素早く凍結させることを可能にし、標的物の変性を抑えてより生体状態に近い状態での電子顕微鏡による観察を可能にする凍結標本の作製装置及び凍結標本の作製方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明に係る凍結標本の作製装置は、標的物を収納する収納部を備える容器と、前記容器に圧入される加圧体とを備える凍結操作部が、前記収納部と前記加圧体とを互いに対向させた配置として加圧機構に装着され、前記加圧機構は、前記容器と加圧体とを冷却させた状態で、前記収納部に前記加圧体を圧入して前記収納部に収納された標的物を加圧しながら凍結させることを特徴とする。
【０００８】
また、前記収納部と前記加圧体とは、液蜜にシールされて前記収納部に前記加圧体が圧入されることにより、標的物を確実に加圧して凍結させることができる。
また、前記収納部は、内面形状が、開口端が薄肉の鋭利状となるテーパ面に形成され、前記加圧体は先端側が縮径するテーパ体状に形成されていることにより、前記容器と加圧体とにより標的物をクランプして標的物を部分的に切除しながら収納部に収納して加圧凍結することができる。
また、前記容器は、台座に前記収納部が起立して設けられ、該台座を介して支持ブロックに脱着自在に装着されるとともに、前記加圧体は加圧ブロックに一体に形成され、前記凍結操作部は、前記支持ブロック及び前記加圧ブロックを介して前記加圧機構に装着されていることにより、凍結処理後の標本作製過程や常温での観察・解析のための操作が容易になる。
【０００９】
また、前記加圧機構は、加圧ハンドルとして構成され、加圧ハンドルの加圧端側の一方のレバーに前記容器が装着され、他方のレバーに前記加圧体が装着された構成とすることで手動によって標的物を加圧凍結させることができる。
手動操作により氷晶形成を抑えて加圧凍結する可能性について検討する。氷晶形成を抑えられることができる加圧力は2,100 (kgf/cm2)である。1(cm2)あたり2,100(kg)をかける圧力を、半径1(mm)＝0.1(cm)の容器を仮定して計算すると、面積は0.1(cm)×0.1(cm)×3.14（円周率)=0.03(cm2)であるので、2100(kgf/cm2)×0.03(cm2)=63(kg)の力を加えれば目的の圧力に到達できる。この力は、成人男性の握力が60(kg)近くあること、さらに力を加える部分にてこの原理を応用すれば、手動でも十分に達成可能である。
手動操作によって標的物を加圧凍結する方法であれば、きわめて簡単な操作によって氷晶形成を抑えた凍結標本を得ることができるという利点がある。また、凍結標本を作製するための高価な専用装置を使用する必要がないという利点もある。
【００１０】
また、前記凍結標本の作製装置を用いて凍結標本を作製する方法として、前記収納部にあらかじめ液体窒素などの低温の液性寒剤を充填しておき、標的物を収納部に収納するとともに、前記加圧体を前記収納部に圧入して標的物を加圧しながら凍結させることにより凍結標本を作製する方法は、標的物に確実に圧力を作用させて凍結させる方法として有効である。
【発明の効果】
【００１１】
本発明に係る凍結標本の作製装置及び作成方法によれば、凍結と高圧を加える操作が一連の操作としてできることから、標的物を凍結と同時に加圧して、氷晶形成の少ない硝子凍結の深度を大きくした凍結標本を得ることができ、標本の観察・解析範囲を広げることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】凍結操作部の組み立て斜視図である。
【図２】支持ブロックに容器を装着した状態の斜視図である。
【図３】支持ブロックに容器を装着した状態の断面図である。
【図４】加圧凍結操作を行っている状態の凍結操作部の断面図である。
【図５】凍結操作部を加圧器具に装着した状態を示す斜視図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
（凍結操作部）
図１は、標的物（標本対象物）を冷却しながら加圧凍結させる凍結操作部１０の組み立て斜視図である。凍結操作部１０は、標的物を収納する容器１１と、容器１１を支持する支持ブロック１２と、容器１１と組み合わせて用いられる加圧体１３ａを有する加圧ブロック１３とを備える。
【００１４】
容器１１は、標的物を収納する収納部１１ａと、収納部１１ａを支持する台座１１ｂとからなる。収納部１１ａは上部が開口する円筒状に形成され、台座１１ｂと一体に台座１１ｂ上に起立して設けられている。
収納部１１ａと加圧ブロック１３の加圧体１３ａは、収納部１１ａに収納された標的物を加圧しながら凍結させる作用をなす。このため、加圧体１３ａは、その先端部側から収納部１１ａ内に摺入されるように外形及び外形寸法が設定される。
加圧体１３ａと収納部１１ａは、収納部１１ａに標的物を収納した状態で加圧体１３ａを収納部１１ａに圧入することにより、標的物に加圧力が作用するように相互の形状を設定する。
【００１５】
標的物を収納部１１ａに収納した状態で標的物を加圧凍結させる操作としては、収納部１１ａと加圧体１３ａとをあらかじめ液体窒素等で冷却しておき、収納部１１ａに標的物を収納すると同時に加圧体１３ａで標的物を加圧しながら冷却・凍結する方法と、収納部１１ａにあらかじめ液体窒素を充填して冷却状態にしておき、収納部１１ａに標的物を収納しながら加圧体１３ａにより標的物を加圧して冷却・凍結する方法がある。
収納部１１ａにあらかじめ液体窒素を充填しておく場合は、液体圧を利用して標的物を加圧しながら冷却するから、加圧体１３ａと収納部１１ａとは完全にシールされた（液蜜なシール性）状態で加圧される必要がある。
【００１６】
本実施形態においては、加圧体１３ａを先端側が縮径するテーパ状（円錐台状）とし、収納部１１ａの内面をテーパ体状として、加圧体１３ａを収納部１１ａに圧入した際に、シール性を確保しながら標的物が加圧されるようにしている。加圧体１３ａと収納部１１ａとのシール性を確保して加圧する方法としては、加圧体１３ａと収納部１１ａとの摺り合わせ部分の形状を適宜設計する方法、加圧体１３ａが圧入される収納部１１ａの部位に可撓性を持たせておき圧入時のシールと加圧を確保する方法、摺り合わせ部分にシール材を装着してシールと加圧を確保する方法等が可能である。
【００１７】
図１では、収納部１１ａの内面を開口部側の肉厚が薄くなるテーパ面とし、収納部１１ａの開口端側を鋭利な形態としている。これは、加圧体１３ａと収納部１１ａとで標的物を挟みようにして加圧した際に、標的物を切除しながら収納部１１ａに標的物を取り込むようにするためである。標的物は、収納部１１ａに収納できる程度の大きさにして収納部１１ａに収納するが、収納部１１ａは内径が１(mm)〜数(mm)程度の細径のものであり、標的物が収納部１１ａから、はみ出すことがある。この場合に、標的物を切除しながら収納部１１ａに収納することにより、確実に加圧凍結させることができる。なお加圧の目的のためには、収納部１１ａの先端部分を鋭利状とすることは必須の要件ではない。
【００１８】
容器１１は、標的物を収納して加圧凍結させた後、電子顕微鏡により観察するために凍結標本を凍結保持する容器（アタッチメント）としての作用も有する。このため、容器１１を支持ブロック１２に脱着自在に装着する構成とする。本実施形態では支持ブロック１２の上面に、容器１１の台座１１ｂと脱着可能に係合する係合部１２ａを設けた。係合部１２ａは、支持ブロック１２の上面に容器１１の台座１１ｂの底面を添わせて、側方へスライド移動させることにより、台座１１ｂが挿入されるように設けている。容器１１を取り外す際には、係合部１２ａから台座１１ｂを側方へ引き出せばよい。
【００１９】
図２は、支持ブロック１２に容器１１をセットした状態を示す。容器１１の台座１１ｂの略半周部が係合部１２ａに挿入されて支持ブロック１２に容器１１が支持されている。
係合部１２ａを弾性片により形成して、容器１１の台座１１ｂを弾性的に支持ブロック１２に支持することも可能である。容器１１を支持ブロック１２に脱着自在に支持する方法には、支持ブロック１２にあり溝を設け、台座１１ｂとあり溝とを係合させるといった種々の方法が可能である。
【００２０】
図３は、支持ブロック１２に容器１１をセットした状態を示す断面図である。容器１１の台座１１ｂが支持ブロック１２の係合部１２ａに挿入されて支持されている。図示例は係合部１２ａを支持ブロック１２と一体に形成した例であるが、係合部１２ａを支持ブロック１２とは別体に形成してもよい。
容器１１は、収納部１１ａの内面がテーパ面となり、開口部側が薄肉となって鋭利形状となっている。容器１１の収納部１１ａに対向して加圧ブロック１３の加圧体１３ａが位置する。
【００２１】
前述したように、容器１１は凍結物を凍結保存する容器としても用いられる。台座１１ｂ上に収納部１１ａを設けた構成としたことで、凍結物を搬送したり、パレット等にのせたりして一時的に保管するような場合に、凍結物を安定して保持する容器として利用できる。
また、標的物を加圧凍結させる際には、容器１１の冷却を維持する必要がある。その場合は、容器１１とともに支持ブロック１２を液体窒素で冷却した状態で支持ブロック１２に容器１１をセットすることにより、台座１１ｂを介して収納部１１ａが冷却され、収納部１１ａの昇温を抑えて、標的物を確実に凍結させることができる。
なお、標的物の加圧凍結操作が数秒程度で完了するような場合は、支持ブロック１２を断熱材によって形成し、支持ブロック１２と容器１１との熱伝導を遮断して、冷却状態にある容器１１ができるだけ昇温しないようにして処理することも可能である。
【００２２】
（加圧凍結操作）
図４は、凍結操作部１０により標的物２０を加圧凍結している状態を示す。
容器１１の収納部１１ａに標的物２０が収納され、加圧体１３ａが収納部１１ａに圧入され、標的物２０が加圧されながら冷却されることによって加圧凍結される。
収納部１１ａに液体窒素を充填した状態で収納部１１ａに標的物を収納して加圧凍結する場合は、液体窒素の液圧の作用により標的物が等方的に加圧され、標的物の組織を破壊せずに加圧凍結することができる。
標的物を加圧しながら凍結する方法によれば、標的物に氷晶を生じさせないようにして凍結させることができ、凍結深度の深い位置まで短時間で凍結させることができることから、良好な状態の凍結標本を得ることができる。
【００２３】
（加圧機構）
図５は、上述した凍結操作部１０を、加圧ハンドル３０を用いた加圧機構に装着した例を示す。凍結操作部１０は加圧機構に装着し、加圧機構による加圧力を利用して、容器１１に収納した標的物を加圧凍結することができる。加圧機構は、容器１１を支持する支持ブロック１２と加圧体１３ａとを備える加圧ブロック１３とを互いに接離させて加圧する機構を備え、支持ブロック１２と加圧ブロック１３とを相互に加圧操作することにより標的物を加圧凍結する。
【００２４】
図５に示した加圧機構は、加圧ハンドル３０の第１のレバー３１の加圧端に支持ブロック１２を装着し、第２のレバー３２の加圧端に加圧ブロック１３を装着して、第１のレバー３１の操作端と第２のレバー３２の操作端を開閉操作することにより、凍結操作部１０の加圧凍結操作を行うものである。この例では、加圧ハンドル３０による加圧機構と凍結操作部１０とが凍結標本の作製装置を構成する。
【００２５】
第１のレバー３１と第２のレバー３２には、支持ブロック１２と加圧ブロック１３との相互位置を位置合わせする調節部３３、３４が設けられている。この調節部３３、３４は、容器１１の収納部１１ａと加圧ブロック１３の加圧体１３ａとを対向位置に位置合わせし、標的物を加圧凍結する操作が的確になされるようにするためのものである。支持ブロック１２と加圧ブロック１３の取り付け位置が可動となるように調節部３３、３４を設け、第１のレバー３１と第２のレバー３２を開閉して容器１１と加圧体１３ａとを嵌合させることにより、支持ブロック１２と加圧ブロック１３とが自動的に位置調節できるようにしてもよい。
【００２６】
図５に示す加圧機構では、容器１１の収納部１１ａを冷却して液体窒素を充填した状態で、第１のレバー３１と第２のレバー３２とを開いておき、凍結対象とする標的物を収納部１１ａに収納し、直ちに、第１のレバー３１と第２のレバー３２を閉じて、標的物を加圧凍結させる。第１のレバー３１と第２のレバー３２による加圧操作は、加圧ハンドル３０の操作端を閉める操作によってなされる。加圧ハンドル３０による加圧力は軸３５を支点とする、“てこ”の作用による。
【００２７】
標的物に作用する加圧力は、凍結操作部１０の収納部１１ａと加圧体１３ａとの間で作用する加圧力である。加圧ハンドル３０による加圧力は、容器１１の収納部１１ａと加圧体１３ａとの間に集中して作用するから、収納部１１ａと加圧体１３ａを十分に細径にしておけば、氷晶が生じさせずに標的物を凍結させるに必要な加圧力を得ることができる。
前述したように、氷晶形成が抑えるためには2,100 (kgf/cm2)程度の圧力を標的物に作用させる必要があるが、加圧ハンドル３０を利用した手動操作により、この程度の加圧力を得ることは容易に可能である。
【００２８】
加圧ハンドル３０を利用して凍結標本を作製する方法は、凍結操作部１０をあらかじめ冷却しておくといった準備をしておけば、標的物を採取した後、凍結操作部１０で標的物を挟み込むようにするだけで直ちに凍結物を加圧凍結することができるから、凍結標本を作製する操作が容易であるという利点に加えて、標的物を採取後の短時間のうちに凍結標本を得ることができ、より生体に近い状態で検査できるという利点がある。
【００２９】
加圧機構としては、本実施形態の加圧ハンドル３０を利用する方法の他に、凍結操作部１０の容器１１と加圧体１３ａとを互いに対向させて接離させる機構と、相互に加圧する機構とを備えるものであれば、適宜構成とすることが可能である。加圧操作も、“てこ”の作用を利用して加圧する方法の他に、ねじで加圧する方法や、モータ等の電動力を利用する方法も可能である。
加圧機構の構成にもよるが、加圧凍結作用に必要な十分な加圧力が得られる場合には、複数個の凍結操作部１０を並設して、一度に複数の凍結操作部１０で加圧凍結操作を行うようにすることもできる。一回の操作で、複数個の標的物をまとめて加圧凍結することができれば、凍結標本の作製がきわめて効率的になり、標的物の検査効率を向上させることができる。
【００３０】
この装置によって加圧凍結した標的物は、その後、従来から行われている電子顕微鏡で観察するための標本処理を行う。具体的には、標的物の形態を保持しながら低温下の有機溶剤中で含まれる氷を有機溶剤に置換する「凍結置換固定法」によって室温に移し、プラスチック基剤に包埋した後、超薄切片を作製して電子顕微鏡で観察することができる。
【符号の説明】
【００３１】
１０  凍結操作部
１１  容器
１１ａ  収納部
１１ｂ  台座
１２  支持ブロック
１２ａ  係合部
１３  加圧ブロック
１３ａ  加圧体
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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