(57)【要約】【課題】癌に侵された臓器又は組織の切除手術を行った癌患者の予後を、正確且つ簡便に判定することが可能な、データ分析方法を提供すること。【解決手段】癌患者から採取された癌組織試料におけるＲＰＴＯＲ遺伝子のｍＲＮＡ転写産物の発現量を測定する工程と、上記癌組織試料におけるＲＩＣＴＯＲ遺伝子のｍＲＮＡ転写産物の発現量を測定する工程と、上記ＲＩＣＴＯＲ遺伝子のｍＲＮＡ転写産物の発現量を、上記ＲＰＴＯＲ遺伝子のｍＲＮＡ転写産物の発現量で除した発現量比を算出する工程と、所定の基準値より低いと上記癌患者の癌が再発又は転移しにくいという基準と、上記発現量比とを、比較する工程と、を備える、癌の切除手術後の予後を判定するためのデータ分析方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌患者から採取された癌組織試料におけるＲＰＴＯＲ遺伝子のｍＲＮＡ転写産物の発現量を測定する工程と、
前記癌組織試料におけるＲＩＣＴＯＲ遺伝子のｍＲＮＡ転写産物の発現量を測定する工程と、
前記ＲＩＣＴＯＲ遺伝子のｍＲＮＡ転写産物の発現量を、前記ＲＰＴＯＲ遺伝子のｍＲＮＡ転写産物の発現量で除した発現量比を算出する工程と、
所定の基準値より低いと前記癌患者の癌が再発又は転移しにくいという基準と、前記発現量比とを、比較する工程と、
を備える、癌の切除手術後の予後を判定するためのデータ分析方法。
【請求項２】
前記基準値が０．２〜０．８の範囲から選択される数値である、請求項１に記載のデータ分析方法。
【請求項３】
癌患者から採取された癌組織試料におけるＲＩＣＴＯＲ遺伝子のｍＲＮＡ転写産物の発現量を測定する工程と、
所定の基準値より低いと前記癌患者の癌が再発又は転移しにくいという基準と、前記ＲＩＣＴＯＲ遺伝子のｍＲＮＡ転写産物の発現量とを、比較する工程と、
を備える、癌の切除手術後の予後を判定するためのデータ分析方法。
【請求項４】
前記発現量を前記癌組織試料中のβ−アクチンのｍＲＮＡ転写産物の発現量に対する比で表したとき、前記基準値が０．２〜０．８‰の範囲から選択される数値である、請求項３に記載のデータ分析方法。
【請求項５】
前記癌組織試料が、固定化されパラフィンに包埋された癌組織試料である、請求項１〜４のいずれか一項に記載のデータ分析方法。
【請求項６】
前記癌組織試料が、前記癌の切除手術によって切除された癌組織又は癌の生体組織診断によって採取された組織に由来する、請求項１〜５のいずれか一項に記載のデータ分析方法。
【請求項７】
前記発現量の測定が、リアルタイムＰＣＲによって行われる、請求項１〜６のいずれか一項に記載のデータ分析方法。
【請求項８】
前記癌が、肝臓癌である、請求項１〜７のいずれか一項に記載のデータ分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌の切除手術後の予後を判定するためのデータ分析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌の治療法として、外科的手段により癌組織（以下、単に癌という場合がある）を臓器から切除し摘出することが一般に行われている。しかしながら、癌の切除手術が成功した場合であっても、数多くの事例において、その後、癌が再発又は転移を起こすことが知られている。したがって、癌の切除手術による治療後の最大の関心事は、癌の再発又は転移の有無である。このため、治療後においても化学療法、及び、癌の再発又は転移のモニタリングを実施することが必須である。この場合に癌の再発又は転移が起こる可能性等の癌の切除手術後の予後を簡易に予測できれば治療方針を決定する上で極めて有用である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特表２００８−５０４０１８号公報
【特許文献２】特表２００９−５１１９３５号公報
【特許文献３】特表２０１０−５００５７７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
現在、癌の進行とともに血中に出現する腫瘍マーカーを用いて、癌の診断をすることが行われている。具体的には、腫瘍マーカーによって癌の有無の判定、癌が発生した臓器の特定、又は、癌の切除手術後の再発若しくは転移の判別が行われている。しかしながら、多くの腫瘍マーカーは、癌の有無に関係なく発現の数値が高値を示したり、癌であるのに発現の数値が低いままである等不確実なところがあり、確実な検査方法とはなっていない。
【０００５】
最近、ｍＴＯＲ（ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｔａｒｇｅｔ  ｏｆ  Ｒａｐａｍｙｃｉｎ）というセリン・スレオニンリン酸化酵素が、細胞の栄養状態又は増殖因子からのシグナルを介して、細胞の増殖を調節していることが分かってきた（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、２３：３１５１−３１７１，２００４、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６９：５３３８−５３４９，２００２）。ｍＴＯＲは、２つの異なる複合体の状態で働いていることも分かっている（Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．６：１１２２−１１２８，２００４、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．１４：１２９６−１３０２，２００４）。その複合体の一つは、ｍＴＯＲＣ１と呼ばれ、ｍＴＯＲ、ＲＰＴＯＲ（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  ｍＴＯＲ）、ＧβＬ（Ｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  βｓｕｂｕｎｉｔ−ｌｉｋｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）等を構成タンパク質として含んでいる。ｍＴＯＲＣ１は、免疫抑制剤であるラパマイシンによって阻害を受け、ｐ７０  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓ６  ｋｉｎａｓｅ−１（Ｓ６Ｋ１）又はｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ−４Ｅ（ｅＩＦ４Ｅ）  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−１（４ＥＢＰ１）のリン酸化を介してタンパク質合成又は細胞増殖を調節している（Ｃｅｌｌ  １１０：１７７−１８９，２００２、Ｃｅｌｌ  １１０：１６３−１７５，２００２、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  １１：８９５−９０４，２００３）。もう一つの複合体は、ｍＴＯＲＣ２と呼ばれ、ｍＴＯＲ、ＲＩＣＴＯＲ（ｒａｐａｍｙｃｉｎ  ｉｎｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｃｏｍｐａｎｉｏｎ  ｏｆ  ｍＴＯＲ）、ＧβＬ等を構成タンパク質として含んでいる。ｍＴＯＲＣ２は、ＰＫＣ−α又はａｃｔｉｎ  ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎのリン酸化を介して細胞骨格の動きを調節している。（Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．１４：１２９６−１３０２，２００４）。
【０００６】
これらｍＴＯＲを含む複合体が調節しているシグナル伝達の異常は、癌、心血管系疾患及び代謝障害等の多くの病態に関与していることも知られており、ｍＴＯＲ阻害剤が抗癌剤として開発されている（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６４（１），２５２，２００４、Ｌａｎｃｅｔ  ３７２（９６３７），４４９，２００８）。ＲＩＣＴＯＲ遺伝子のＤＮＡコピー数の増大が、肝臓癌の再発と関連していることも、報告されている（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ１３５：１９７２−１９８４，２００８）。
【０００７】
ｍＴＯＲのシグナル伝達系は、細胞増殖及び癌に深く関係していることから、癌を発症する素因の指標として利用可能であることが、特許文献１に開示されている。癌組織中のｍＴＯＲのシグナル伝達系の構成成分のリン酸化状態を抗体アレイ法で測定することで、その癌の予後を予測できる可能性が、特許文献２に開示されている。ｍＴＯＲを含むタンパク質を抗体アレイ法で分析することで、癌の治療法の指標として利用できる可能性が、特許文献３に開示されている。
【０００８】
ｍＴＯＲのシグナル伝達系は、ＲＰＴＯＲ、ＲＩＣＴＯＲという二つの異なるタンパク質のうちのいずれかがｍＴＯＲに結合して複合体を形成することによって、細胞増殖に異なる影響を与えているものと考えられている。その結果、ｍＴＯＲのシグナル伝達系は、癌の予後にも異なる影響を及ぼすものと思われる。しかし、ＲＰＴＯＲ及びＲＩＣＴＯＲそれぞれの発現量又は両者の関係が、癌の増殖又は癌の切除手術後の予後にどのような影響を与えているかといった知見はなかった。
【０００９】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、癌に侵された臓器又は組織の切除手術を行った癌患者の予後を、正確且つ簡便に判定することが可能な、データ分析方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、癌組織中のＲＩＣＴＯＲ遺伝子のｍＲＮＡ転写産物の発現量、又は、ＲＩＣＴＯＲ遺伝子のｍＲＮＡ転写産物の発現量とＲＡＰＴＯＲ遺伝子のｍＲＮＡ転写産物の発現量との比が、癌の再発又は転移と有意に相関し、これを用いて癌に侵された臓器又は組織の切除手術を行った癌患者の予後の判定が可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は、癌患者から採取された癌組織試料におけるＲＰＴＯＲ遺伝子のｍＲＮＡ転写産物の発現量を測定する工程と、
上記癌組織試料におけるＲＩＣＴＯＲ遺伝子のｍＲＮＡ転写産物の発現量を測定する工程と、
上記ＲＩＣＴＯＲ遺伝子のｍＲＮＡ転写産物の発現量を、上記ＲＰＴＯＲ遺伝子のｍＲＮＡ転写産物の発現量で除した発現量比を算出する工程と、
所定の基準値より低いと上記癌患者の癌が再発又は転移しにくいという基準と、上記発現量比とを、比較する工程と、
を備える、癌の切除手術後の予後を判定するためのデータ分析方法を提供する。
【００１２】
本発明は、このような構成を備えることによって、癌に侵された臓器又は組織の切除手術を行った癌患者の予後を、正確且つ簡便に判定することが可能になる。
【００１３】
上記データ分析方法において、上記基準値は０．２〜０．８の範囲から選択される数値であることが好ましい。癌に侵された臓器又は組織の切除手術を行った癌患者の予後を、更に正確に判定することが可能になる。
【００１４】
本発明は、癌患者から採取された癌組織試料におけるＲＩＣＴＯＲ遺伝子のｍＲＮＡ転写産物の発現量を測定する工程と、
所定の基準値より低いと上記癌患者の癌が再発又は転移しにくいという基準と、上記ＲＩＣＴＯＲ遺伝子のｍＲＮＡ転写産物の発現量とを、比較する工程と、
を備える、癌の切除手術後の予後を判定するためのデータ分析方法を提供する。
【００１５】
本発明は、このような構成を備えることによって、癌に侵された臓器又は組織の切除手術を行った癌患者の予後を、正確且つ簡便に判定することが可能になる。
【００１６】
上記データ分析方法において、上記発現量を上記癌組織試料中のβ−アクチンのｍＲＮＡ転写産物の発現量に対する比で表したとき、上記基準値が０．２〜０．８‰の範囲から選択される数値であることが好ましい。癌に侵された臓器又は組織の切除手術を行った癌患者の予後を、更に正確に判定することが可能になる。
【００１７】
上記癌組織試料は、固定化されパラフィンに包埋された癌組織試料であることが好ましい。
【００１８】
上記癌組織試料は、上記癌の切除手術によって切除された癌組織又は癌の生体組織診断によって採取された組織に由来することが好ましい。
【００１９】
上記発現量の測定は、リアルタイムＰＣＲによって行われることが好ましい。
【００２０】
本発明は、上記癌が、肝臓癌であるときに好ましく適用される。
【発明の効果】
【００２１】
本発明によれば、癌に侵された臓器又は組織の切除手術を行った癌患者の予後を、正確且つ簡便に判定することが可能な、データ分析方法を提供することが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】本実施形態に係る第１のデータ分析方法を説明するフローチャートである。
【図２】本実施形態に係る第２のデータ分析方法を説明するフローチャートである。
【図３】短期再発群及び長期無再発群における、ＲＰＴＯＲ遺伝子のｍＲＮＡ転写産物の発現量を示すグラフである。
【図４】短期再発群及び長期無再発群における、ＲＩＣＴＯＲ遺伝子のｍＲＮＡ転写産物の発現量を示すグラフである。
【図５】短期再発群及び長期無再発群における、ＲＩＣＴＯＲ遺伝子とＲＰＴＯＲ遺伝子とのｍＲＮＡ転写産物の発現量比を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
以下、本発明の実施形態を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２４】
図１は、本実施形態に係る第１のデータ分析方法を説明するフローチャートである。本実施形態に係る第１の癌の切除手術後の予後を判定するためのデータ分析方法は、癌患者から採取された癌組織試料におけるＲＰＴＯＲ遺伝子のｍＲＮＡ転写産物の発現量を測定する工程と、
上記癌組織試料におけるＲＩＣＴＯＲ遺伝子のｍＲＮＡ転写産物の発現量を測定する工程と、
上記ＲＩＣＴＯＲ遺伝子のｍＲＮＡ転写産物の発現量を、上記ＲＰＴＯＲ遺伝子のｍＲＮＡ転写産物の発現量で除した発現量比を算出する工程と、
所定の基準値より低いと上記癌患者の癌が再発又は転移しにくいという基準と、上記発現量比とを、比較する工程と、を備える。
【００２５】
図２は、本実施形態に係る第２のデータ分析方法を説明するフローチャートである。本実施形態に係る第２の癌の切除手術後の予後を判定するためのデータ分析方法は、癌患者から採取された癌組織試料におけるＲＩＣＴＯＲ遺伝子のｍＲＮＡ転写産物の発現量を測定する工程と、
所定の基準値より低いと上記癌患者の癌が再発又は転移しにくいという基準と、上記ＲＩＣＴＯＲ遺伝子のｍＲＮＡ転写産物の発現量とを、比較する工程と、を備える。
【００２６】
本実施形態に係る癌は、悪性腫瘍を意味する。上記癌が発生した臓器に限定はなく、固形癌であればどのような癌でもよい。そのような癌としては、例えば、胃癌、大腸癌、食道癌、肺癌、肝臓癌、膵臓癌、腎臓癌、乳癌、皮膚癌、胆嚢癌、前立腺癌、頭頸部癌、咽頭癌、口腔癌、唾液腺癌、甲状腺癌、腎盂尿管癌、膀胱癌、卵巣癌、精巣癌、陰茎癌及び子宮癌が挙げられる。これらのうち、膵臓癌、乳癌、食道癌、肝臓癌等は、再発を起こしやすい癌であるので、本実施形態に係るデータ分析方法を適用するのに好適であり、特に肝臓癌に好適である。
【００２７】
本実施形態において、癌組織試料とは、癌患者に由来する癌細胞を含む試料であって、癌の切除手術によって切除された癌組織に由来する試料、生体組織診断（バイオプシー）によって採取された組織に由来する試料等が挙げられる。また、血液中に流れ出て循環している癌細胞を、癌組織試料として用いることもできる。上記癌組織試料は、採取直後の生の試料、凍結保存した試料、ホルマリン等によって固定化を施した試料、さらに、上記固定化を施した試料を、パラフィンで包埋した試料等を含む。
【００２８】
本実施形態に係るデータ分析方法によって癌の切除手術後の予後を正確に判定するためには、癌組織試料に含まれる癌細胞の割合は、癌組織試料中に含まれる全細胞数又は細胞容積を基準として、５０％以上であることが好ましく、８０％以上であることがより好ましい。但し、壊死している癌細胞は、上記癌細胞の割合には含まれない。
【００２９】
上記癌細胞の割合を所定の範囲内にするために、癌組織試料から、正常組織と思われる部位を取り除いてもよい。例えば以下のような方法が挙げられる。まず、ホルマリン固定しパラフィン包埋した癌組織試料を、厚さ５〜１５μｍの薄切片にした後、スライドに貼り付け、癌細胞と正常細胞との区別が容易となるような染色を施す。その後、顕微鏡観察下で上記薄切片の癌組織試料を観察して、癌細胞のみを切り出して後工程に用いる。癌細胞と正常細胞との区別が容易となるような染色方法としては、例えば、ヌクレアファストレッド染色法が挙げられるが、後工程で行われるＲＮＡ抽出又はＰＣＲ反応に影響を及ぼさない染色法であれば、どのような染色方法であってもよい。
【００３０】
本実施形態に係る癌組織試料の量としては、特に制限はないが、厚さ１０μｍの薄切片にしてスライドに貼り付けたパラフィン包埋癌組織試料の場合、０．５ｍｍ２以上であることが好ましく、５ｍｍ２以上であることがより好ましく、５０ｍｍ２以上であることが更に好ましい。このような範囲とすることで、癌に侵された臓器又は組織の切除手術を行った癌患者の予後を、更に正確且つ簡便に判定することが可能になる。
【００３１】
本実施形態に係るＲＰＴＯＲ遺伝子は、配列番号１に記載の塩基配列を有するヒト由来のＲＰＴＯＲ遺伝子（ＮＣＢＩのアクセス番号：ＮＭ＿０２０７６１．２）及びこれの遺伝子多型を含むが、これらに限られず、公知となっている他の動物由来のホモログ及びそれらの遺伝子多型も含まれる。
【００３２】
本実施形態に係るＲＩＣＴＯＲ遺伝子は、配列番号２に記載の塩基配列を有するヒト由来のＲＩＣＴＯＲ遺伝子（ＮＣＢＩのアクセス番号：ＮＭ＿１５２７５６．３）及びこれの遺伝子多型を含むが、これらに限られず、公知となっている他の動物由来のホモログ及びそれらの遺伝子多型も含まれる。
【００３３】
本実施形態に係る癌組織試料中のＲＰＴＯＲ遺伝子又はＲＩＣＴＯＲ遺伝子のｍＲＮＡ転写産物の発現量を測定する工程において、癌組織試料からのＲＮＡ抽出を行わずにｉｎ  ｓｉｔｕで目的遺伝子のｍＲＮＡ転写産物の発現量を測定することも可能であるが、上記癌組織試料からＲＮＡを抽出した後に目的遺伝子のｍＲＮＡ転写産物の発現量を測定することが好ましい。ｍＲＮＡの抽出方法としては、例えば、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１６２：１５６−１５９（１９８７）に開示されている方法、ＲＮｅａｓｙ（商品名、ＱＩＡＧＥＮ社制）等の市販されているＲＮＡ抽出キットを用いた方法が挙げられる。ホルマリン固定した試料からのｍＲＮＡの抽出は、特表２００３−５２５０３３号公報に開示されている方法で行うことができる。また、ホルマリン固定した試料からのＲＮＡ抽出に向けたキットも市販されており、これを用いてもよい。抽出したＲＮＡ中に混入しているＤＮＡを除くため、ＲＮＡ分解酵素活性をもたないＤＮＡ分解酵素で処理してもよい。
【００３４】
抽出したＲＮＡ中の、目的遺伝子のｍＲＮＡ転写産物の発現量を測定する方法としては、例えば、ノーザンブロット法、目的遺伝子のｍＲＮＡの特異的な増幅反応による方法が挙げられ、目的遺伝子のｍＲＮＡの特異的な増幅反応による方法が好ましく用いられる。目的遺伝子のｍＲＮＡの特異的な増幅反応による方法としては、ＮＡＳＢＡ法及びＴＲＣ法等のＲＮＡを鋳型として用いる方法、並びに、ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法、ＩＣＡＮ法及びＳＭＡＰ法等のＤＮＡを鋳型として用いる方法が挙げられる。ＤＮＡを鋳型として用いる方法においては、逆転写反応によって、ＲＮＡからｃＤＮＡを作製した後に、ｃＤＮＡを鋳型として特異的に目的遺伝子を増幅し、ｍＲＮＡを測定してもよい。これらの方法の中で、測定の正確性、測定範囲の広さ等の観点から、リアルタイムＰＣＲ法で目的遺伝子のｍＲＮＡ転写産物の発現量を測定するのが好ましい。
【００３５】
リアルタイムＰＣＲを行う場合、目的遺伝子の増幅領域の５’側と３’側に特異的にアニールするプライマーを合成し、用いる必要がある。本実施形態で測定するＲＰＴＯＲ遺伝子（配列番号１）及びＲＩＣＴＯＲ遺伝子（配列番号２）は、ともにその遺伝子配列が公知であるので、当業者であれば、この配列情報を基に、プライマーの設計を行うことが可能である。また、これらの遺伝子のリアルタイムＰＣＲ用のプライマーは、市販もされているので、それを用いることもできる。市販されているプライマーとしては、例えば、ＲＰＴＯＲ遺伝子の測定用プライマーとしてＡＢＩ  Ａｓｓａｙ  ＩＤ    Ｈｓ００３７５３３２＿ｍ１（商品名、Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、ＲＩＣＴＯＲ遺伝子の測定用プライマーとして、ＡＢＩ  Ａｓｓａｙ  ＩＤ    Ｈｓ００３８０９０３＿ｍ１（商品名、Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）が挙げられる。
【００３６】
リアルタイムＰＣＲを行う場合、反応サイクルごとに増幅されたヌクレオチドの量をモニタリングする必要がある。モニタリングする方法としては、インターカレータ法、モレキュラビーコン法、タックマンプローブ法等が挙げられる。反応の特異性の観点から、タックマンプローブ法を用いることが好ましい。上述の市販品には、タックマンプローブも含まれている。
【００３７】
プライマー及びタックマンプローブを設計するに当たっては、ゲノムＤＮＡからの増幅が起こらないこと、特異性が高いこと、多型に依存しないこと等の注意が必要であるが、当業者であれば係る注意点に留意して、当然に設計が可能である。また、増幅効率の点などから、増幅産物の鎖長は、５００ｂｐ以下であることが好ましく、２００ｂｐ以下であることがより好ましく、１００ｂｐ以下であることが更に好ましく、そのようにプライマーを設計することも、当業者であれば当然に実施可能である。
【００３８】
リアルタイムＰＣＲ法によって得られる目的遺伝子のｍＲＮＡ転写産物の発現量の測定値を、どのような細胞にも一定量発現していると考えられている遺伝子（ハウスキーピング遺伝子）のｍＲＮＡ転写産物の発現量の測定値で標準化して用いてもよい。標準化は、例えば、以下の式によって行われる。ここで、Ｃｔ値とは、増幅産物の量が一定となるサイクル数を意味する。
目的遺伝子のｍＲＮＡ転写産物の発現量（ハウスキーピング遺伝子‰）＝１０００×２＾｛（ハウスキーピング遺伝子のＣｔ値）−（目的遺伝子のＣｔ値）｝
【００３９】
ハウスキーピング遺伝子としては、β−アクチン、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、β２−ミクログロブリン、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ１（ＨＰＲＴ１）等が挙げられる。
【００４０】
本実施形態に係る第１のデータ分析方法においては、上述の測定によって得られたＲＩＣＴＯＲ遺伝子のｍＲＮＡ転写産物の発現量を、上述の測定によって得られたＲＰＴＯＲ遺伝子のｍＲＮＡ転写産物の発現量で除することで発現量比を算出する。得られた発現量比を、所定の基準値より低いと癌患者の癌が再発又は転移しにくいという基準と比較することによって、癌の切除手術後の予後を判定するためのデータ分析を行う。
【００４１】
上記発現量比と比較するための基準値は、０．２〜０．８の範囲から選択される数値であることが好ましく、０．３〜０．７の範囲から選択される数値であることがより好ましく、０．４〜０．６の範囲から選択される数値であることが更に好ましい。このような数値とすることによって、癌の切除手術後の予後をより正確に判定することが可能になる。
【００４２】
本実施形態に係る第２のデータ分析方法においては、上述の測定によって得られたＲＩＣＴＯＲ遺伝子のｍＲＮＡ転写産物の発現量を、所定の基準値より低いと癌患者の癌が再発又は転移しにくいという基準と比較することによって、癌の切除手術後の予後を判定するためのデータ分析を行う。
【００４３】
上記ＲＩＣＴＯＲ遺伝子のｍＲＮＡ転写産物の発現量を癌組織試料中のβ−アクチンのｍＲＮＡ転写産物の発現量に対する比で表したとき、上記基準値は０．２〜０．８‰の範囲から選択される数値であることが好ましく、０．３〜０．７‰の範囲から選択される数値であることがより好ましく、０．４〜０．６‰の範囲から選択される数値であることが更に好ましい。このような数値とすることによって、癌の切除手術後の予後をより正確に判定することが可能になる。
【実施例】
【００４４】
以下に、実施例を示し、本発明の実施様態の詳細を記載する。
【００４５】
実施例において用いた検体は、２９例の肝臓癌患者由来の癌であった。そのうち１３例は、癌切除手術後１年以内に再発を起こした例（短期再発群；ｎ＝１３）であり、残りの１６例は、癌切除手術後長期（５年間）に無再発で生存した例（長期無再発群；ｎ＝１６）である。
【００４６】
癌組織試料として、癌切除手術によって切除された肝臓癌組織に由来する薄切片を用いた。上記薄切片は、ホルマリンで固定化され、パラフィンに包埋された後、スライドに貼付することで薄切片試料とした。厚さ５μｍの上記薄切片試料は、ヘマトキシリン・エオジンで染色し、封入剤（商品名：オイキット液、Ｏ．Ｋｉｎｄｌｅｒ社製）を滴下した後、カバーガラスを上において封入した。その後、顕微鏡で、ヘマトキシリン・エオジンで染色した上記薄切片試料を観察し、癌部位を特定してマーキングした。上記マーキングした部分に基づいて、癌部位の面積を概算した。癌部位の面積から、合計で１００平方ミリメートル以上の面積とするのに必要な、薄切片試料の枚数を計算した。
【００４７】
厚さ１０μｍの薄切片試料は、上述した計算で求めた枚数を用意し、ヌクレアファストレッドで染色した。実体顕微鏡観察下、薄切片試料の癌細胞に相当する部分（ヌクレアファストレッドで染色した部分）を、メス刃を用いて削りとった。
【００４８】
削り取った癌細胞からのＲＮＡ抽出は、ＱＩＡＧＥＮ社のＲＮｅａｓｙを用いて行った。抽出ＲＮＡ溶液として、各検体に由来する癌組織試料からそれぞれ１００μＬを得た。
【００４９】
抽出したＲＮＡ溶液（５０μＬ）、５×１ｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  Ｂｕｆｆｅｒ（２５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、３７５ｍＭ  ＫＣｌ、１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２０μＬ）、０．１Ｍ  ＤＴＴ水溶液（１０μＬ）、１０ｍＭ  ｄＮＴＰ水溶液（１０μＬ）、３μｇ／μＬ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ水溶液（２．５μＬ）、０．１０Ｕ／μＬ  ｐｄ（Ｎ）６  ｒａｎｄｏｍ  ｈｅｘａｍｅｒｓ水溶液（１．０μＬ）、４０Ｕ／μＬ  ＲＮＡ  Ｇｕａｒｄ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、８ｍＭ  ＤＴＴ、５０％（ｖ／ｖ）グリセロール、２．５μＬ）、２００Ｕ／μＬ  Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素溶液（５．０μＬ）を混合した。得られた混合液を２６℃で８分間に続いて、４２℃で４５分間インキュベートしてｃＤＮＡ合成を行った。その後、上記混合液を９５℃で５分間加熱し、逆転写酵素を失活させ、ｃＤＮＡ溶液とした。
【００５０】
２４０容のリアルタイムＰＣＲ試薬Ａ（１００ｍＭ  ＫＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．０２ｍＭ  ＥＤＴＡ、１．６５ｍＭ  ｄＮＴＰ、７．２３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．０４Ｕ／μＬ  ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）、３容の２００μＭ  ５’側プライマー、３容の２００μＭ  ３’側プライマー、１容の１００μＭ  プローブを混合して、２倍濃度のリアルタイムＰＣＲ試薬とした。試験に用いたプライマー、プローブは、以下のとおりである。
ＲＰＴＯＲ測定用プライマー：ＡＢＩ  Ａｓｓａｙ  ＩＤ    Ｈｓ００３７５３３２＿ｍ１（商品名、Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）
ＲＩＣＴＯＲ測定用プライマー：ＡＢＩ  Ａｓｓａｙ  ＩＤ    Ｈｓ００３８０９０３＿ｍ１（商品名、Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）
βＡｃｔｉｎ測定用プライマー：５’側プライマー：５’−ＧＡＧＣＧＣＧＧＣＴＡＣＡＧＣＴＴ−３’（配列番号３）
３’側プライマー：５’−ＴＣＣＴＴＡＡＴＧＴＣＡＣＧＣＡＣＧＡＴＴＴ−３’（配列番号４）
プローブ：５’−ＡＣＣＡＣＣＡＣＧＧＣＣＧＡＧＣＧＧ−３’（配列番号５）
プローブの５’末端には、蛍光物質のカルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）を、３’末端には、消蛍光物質のカルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）又は非蛍光クエンチャー‐マイナーグルーブ結合剤（Ｎｏｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｑｕｅｎｃｈｅｒ−Ｍｉｎｏｒ  Ｇｒｏｏｖｅ  Ｂｉｎｄｅｒ、ＮＦＱ‐ＭＧＢ）を結合させた。
【００５１】
３８４ウエルＰＣＲプレートのウエルに、２倍濃度のリアルタイムＰＣＲ試薬（１０μＬ）と、β−アクチンのＣｔ値が２２〜３０になるように５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝液で希釈したｃＤＮＡ溶液（１０μＬ）とを加えて混合した。その後、上記ＰＣＲプレートをプレートシールでシールした後、リアルタイムＰＣＲ装置（商品名、ＡＢＩ  ７９００型、Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）でＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応は、ｎ＝３で行った。ＰＣＲ反応の温度サイクルプロファイルは、次のとおりである。
５０℃  １０秒
９５℃  １０分
（９５℃  １５秒→６０℃  １分）×４６回
【００５２】
ＲＰＴＯＲ遺伝子又はＲＩＣＴＯＲ遺伝子のｍＲＮＡ転写産物の発現量は、β−アクチンのｍＲＮＡ転写産物の発現量で標準化した。その計算方法は、以下のとおりである。
ＲＰＴＯＲ遺伝子のｍＲＮＡ転写産物の発現量（β−アクチン‰）＝１０００×２＾｛（β−アクチンのＣｔ値）−（ＲＰＴＯＲのＣｔ値）｝
ＲＩＣＴＯＲ遺伝子のｍＲＮＡ転写産物の発現量（β−アクチン‰）＝１０００×２＾｛（β−アクチンのＣｔ値）−（ＲＩＣＴＯＲのＣｔ値）｝
【００５３】
短期再発群と長期無再発群とでＲＰＴＯＲ遺伝子のｍＲＮＡ転写産物の発現量に差があるかどうか、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙの検定を行った。しかしながら、短期再発群と長期無再発群とで有意な差は無かった（図３）。一方、ＲＩＣＴＯＲ遺伝子のｍＲＮＡ転写産物の発現量は、長期無再発群よりも短期再発群で有意に高かった（図４）。ＲＩＣＴＯＲ遺伝子とＲＰＴＯＲ遺伝子とのｍＲＮＡ転写産物の発現量比（ＲＩＣＴＯＲ／ＲＰＴＯＲ発現量比）は、長期無再発群よりも短期再発群で有意に高かった（図５）。
【００５４】
図４において、ＲＩＣＴＯＲ遺伝子のｍＲＮＡ転写産物の発現量を、０．５（β−アクチン‰）以上と、０．５（β−アクチン‰）未満とに分類した結果を表１に示す。
【００５５】
【表１】
2014036637.tif 000002
【００５６】
短期再発群における、ＲＩＣＴＯＲ遺伝子のｍＲＮＡ転写産物の発現量が０．５（β−アクチン‰）以上である割合は、６９％であった（９例／１３例）。長期無再発群における、ＲＩＣＴＯＲ遺伝子のｍＲＮＡ転写産物の発現量が０．５（β−アクチン‰）未満である割合は、８８％であった（１４例／１６例）。この結果は、「ＲＩＣＴＯＲ遺伝子のｍＲＮＡ転写産物の発現量が０．５（β−アクチン‰）より低いと癌患者の癌が再発又は転移しにくい」という基準によって、癌の切除手術後の予後を有意に判定できることを示唆している。上記基準による判定の一致率（全体一致率）は、７９％（２３例／２９例）であった。
【００５７】
図５において、ＲＩＣＴＯＲ／ＲＰＴＯＲ発現量比を、０．５以上と、０．５未満とに分類した結果を表２に示す。ＲＰＴＯＲ及びＲＩＣＴＯＲ遺伝子のｍＲＮＡ転写産物の発現量が０（検出感度以下）であるときは、不定としてデータを除外した。ＲＰＴＯＲ遺伝子のｍＲＮＡ転写産物の発現量が０であり、ＲＩＣＴＯＲ遺伝子のｍＲＮＡ転写産物の発現量が０超であるときは、ＲＩＣＴＯＲ／ＲＰＴＯＲ発現量比が２．０とみなして分析した（１例）。ＲＰＴＯＲ遺伝子のｍＲＮＡ転写産物の発現量が０超であり、ＲＩＣＴＯＲ遺伝子のｍＲＮＡ転写産物の発現量が０であるときは、ＲＩＣＴＯＲ／ＲＰＴＯＲ発現量比が０．０であるとみなして分析した。（７例）。
【００５８】
【表２】
2014036637.tif 000003
【００５９】
短期再発群における、ＲＩＣＴＯＲ／ＲＰＴＯＲ発現量比が０．５以上である割合は、７３％であった（８例／１１例）。長期無再発群における、ＲＩＣＴＯＲ／ＲＰＴＯＲ発現量比が０．５未満である割合は、９０％であった（９例／１０例）。この結果は、「ＲＩＣＴＯＲ／ＲＰＴＯＲ発現量比が０．５より低いと癌患者の癌が再発又は転移しにくい」という基準によって、癌の切除手術後の予後を有意に判定できることを示唆している。上記基準による判定の一致率（全体一致率）は、８１％（１７例／２１例）であった。ＲＩＣＴＯＲ／ＲＰＴＯＲ発現量比を用いて判定した方が、ＲＩＣＴＯＲ遺伝子のｍＲＮＡ転写産物の発現量を用いて判定するよりも正確であることがわかった。
【００６０】
以上説明した本発明の癌の切除手術後の予後を判定するためのデータ分析方法により、癌切除手術後の癌の再発の予後の判定が可能となる。この結果は、癌の切除手術を行った患者の、その後の抗癌剤による治療の方針決定及び癌の再発を監視するための方針の決定等に有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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