(57)【要約】【課題】１７−アルキニル−７−ヒドロキシステロイドおよび関連する化合物の調製方法の提供。【解決手段】本発明は、核エストロゲン受容体において結合活性を有するプロセス不純物を本質的に含まない、１７−エチニル−１０Ｒ１３Ｓ−ジメチル２，３，４，７，８Ｒ，９Ｓ，１０，１１，１２，１３，１４Ｓ，１５，１６，１７−ヘキサデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３Ｒ，７Ｒ，１７Ｓ−トリオール（１７α−エチニル−アンドロスタ−５−エン−３β，７β，１７β−トリオールとも称する）などの、１７−アルキニル−７−ヒドロキシ−ステロイドの調製方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載された発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権
本ＰＣＴ国際出願は、２００８年６月６日に出願された米国仮特許出願第６１／０５９，６５８号からの優先権を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明の実施形態は、性ステロイド受容体において望ましくない結合活性を有する反応によるステロイド不純物を本質的に含まない１７−エチニル−１０Ｒ，１３Ｓ−ジメチル２，３，４，７，８Ｒ，９Ｓ，１０，１１，１２，１３，１４Ｓ，１５，１６，１７−ヘキサデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３Ｒ，７Ｒ，１７Ｓ−トリオールおよびこれに関連する他の医薬活性化合物の調製方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
１７−エチニル−１０Ｒ，１３Ｓ−ジメチル２，３，４，７，８Ｒ，９Ｓ，１０，１１，１２，１３，１４Ｓ，１５，１６，１７−ヘキサデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３Ｒ，７Ｒ，１７Ｓ−トリオール（本明細書では、１７α−エチニル−アンドロスタ−５−エン−３β，７β，１７β−トリオールまたは化合物１とも称する）は、慢性の非増殖性炎症に起因する病状の処置に有効である。他の抗炎症ステロイド類とは対照的に、化合物１は、かかる化合物による望ましくない副作用の一因となり得る活性である、性ステロイド核受容体における結合活性が本質的にないことがわかった。ステロイドの合成中間体、副産物、副生成物または性ステロイド受容体活性（１つもしくは複数）が影響あるいはモジュレートされることがあり得るような他の不純物、および化合物１の調製物中に存在し得るような他の不純物は、副作用の一因となり得るため望ましくない。したがって、核の性ステロイド活性（１つまたは複数）に影響またはモジュレートする不純物（合成中間体、ステロイド副生成物または副産物）の生成が回避される化合物１ならびにその類似体および誘導体の調製方法は有用である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
発明の概要
１７α−アルキニル−アンドロスタ−５−エン−３β，７β，１７β−トリオールを得るための反応シーケンスでは、予測に反して、別の場合では提示され得ない性ステロイド受容体活性（１つまたは複数）を付与する望ましくないステロイド不純物（１種類または複数種）を含有する物質が生成されることがわかった。このような不純物は、１７α−アルキニル−アンドロスタ−５−エン−３β，７β，１７β−トリオールの医薬としての許容性に有害な影響を及ぼす。１７α−アルキニル−アンドロスタ−５−エン−３β，７β，１７β−トリオールの調製物中にこのような不純物が存在することは報告されておらず、その存在により、該存在を除去または性ステロイド活性（１つもしくは複数）が存在しないであろうレベルまで低減させるためのさらなるコストが追加される。本明細書に開示する反応シーケンスは、望ましくないステロイド不純物（１種類または複数種）の生成を回避し、したがって、不純物（１種類または複数種）の除去またはレベル低減を行うために、このようにして得られる１７α−アルキニル−アンドロスタ−５−エン−３β，７β，１７β−トリオールの精製の必要性を回避するものである。
【０００５】
本発明の一実施形態は、３位に酸素連結基および１７位にケトンを有するアンドロスタ−５−エンに対して１７位にアルキニル基および７位に酸素官能基を導入し、Ｃ７に酸素置換基がなく、したがって、性ステロイド受容体において望ましくない結合活性を有する副生成物が除外されるようにするための反応シーケンスを提供する。
【０００６】
本発明の別の実施形態は、デヒドロエピアンドロステロン（本明細書では、ＤＨＥＡまたは３β−ヒドロキシ−アンドロスタ−５−エン−１７−オンとも称する）に対して１７位にエチニル基および７位にヒドロキシ基を導入し、性ステロイド受容体における結合活性が本質的にない化合物１の調製物が形成されるようにするための反応シーケンスを提供する。
【０００７】
別の実施形態において、本発明は、ＤＨＥＡを出発物質として使用し、エストロゲン化合物である１７α−エチニル−アンドロスタ−５−エン−３β，１７β−ジオールまたはその潜在的前駆体１７α−エチニル−３β−アセトキシ−アンドロスタ−５−エン−１７β−オールを本質的に含まない化合物１を含む調製物を得る反応シーケンスを提供する。
【０００８】
本発明の一実施形態において、反応シーケンスは、３位および１７位に第１および第２の酸素連結基を有する適切に保護されたアンドロスタ−５−エンを、第３の酸素連結基が７位に導入されるように酸化する事前工程、ならびに１７位の第２の酸素連結基が＝Ｏである中間体をアルキン由来のアニオンと反応させる後続工程を含む。
【０００９】
本発明の別の実施形態では、反応シーケンスは、ＤＨＥＡ（適切に保護）を、第３の酸素連結基が７位に導入されるように酸化する事前工程、ならびに１７位に置換基＝Ｏを有する中間体をアセチレンアニオン（任意選択で保護）と反応させる後続工程を含む。
【００１０】
本発明の別の実施形態では、反応シーケンスは、アンドロスタ−５−エン−１７−オン−３β，７β−ジオール（適切に保護）を、アルキン由来のアニオンと反応させる工程を含む。本発明はまた以下をも含む。
（１）（ａ）好適に保護されたデヒドロエピアンドロステロンを酸化剤と接触させ、７位に＝Ｏ（ケトン）官能基を直接導入する工程；
（ｂ）好適に保護されたアンドロスタ−５−エン−７，１７−ジオン−３β−オールを還元剤と接触させ、７位の該＝Ｏ（ケトン）官能基を主にβ−配置のヒドロキシルに変換する工程；ならびに
（ｃ）任意選択で保護されたアルキニルアニオンを、好適に保護されたアンドロスタ−５−エン−１７−オン−３β，７β−ジオールと接触させ、１７位の該＝Ｏ（ケトン）官能基への該アルキニルアニオンの付加によって１７位に主にα−配置のアルキニル置換基を導入する工程
を含む、７位に酸素置換基がないステロイド副生成物を本質的に含まない１７α−アルキニル−アンドロスタ−５−エン−３β，７β，１７β−トリオールの調製方法。
（２）前記１７α−アルキニル−アンドロスタ−５−エン−３β，７β，１７β−トリオールが、１７α−エチニル−アンドロスタ−５−エン−３β，７β，１７β−トリオールである、項目１に記載の方法。
（３）前記好適に保護されたデヒドロエピアンドロステロンが、
【化７】
2014231526.tif 000002
（式中、Ｒ１は、−Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ３〜６シクロアルキル、任意選択で置換されたアリールまたは任意選択で置換されたヘテロアリールである）
の構造を有する、項目１に記載の方法。
（４）前記好適に保護されたアンドロスタ−５−エン−７，１７−ジオン−３β−オールが、
【化８】
2014231526.tif 000003
の構造を有する、項目１に記載の方法。
（５）前記好適に保護されたアンドロスタ−５−エン−７，１７−ジオン−３β−オールが、
【化９】
2014231526.tif 000004
（式中、Ｒ１は、−Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ３〜６シクロアルキル、任意選択で置換されたアリールまたは任意選択で置換されたヘテロアリールであり、Ｒ２は、−Ｈ、Ｃ１〜６アルキルまたはアリールである）
の構造を有する、項目１に記載の方法。
（６）Ｒ１がＣ１〜６アルキルまたはフェニルである、項目５に記載の方法。
（７）前記好適に保護されたアンドロスタ−５−エン−１７−オン−３β，７β−ジオールが、
【化１０】
2014231526.tif 000005
（各Ｒ３および各Ｒ４は、独立してＣ１〜６アルキルまたはアリールである）
の構造を有する、項目１に記載の方法。
（８）前記アルキニルアニオンが、Ｍ−Ｃ≡Ｃ−Ｓｉ（Ｒ５）３（式中、Ｒ５は、独立してＣ１〜６アルキルまたはアリールであり、Ｍは、第Ｉ族、第ＩＩ族または遷移金属である）の構造を有する、項目７に記載の方法。
（９）ＭがＬｉ、ＭｇまたはＺｎである、項目８に記載の方法。
（１０）Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４が−ＣＨ３である、項目１〜９いずれか１項に記載の方法。
（１１）（ａ）
【化１１】
2014231526.tif 000006
の構造を有する好適に保護されたアンドロスタ−５−エン−７，１７−ジオン−３β−オールを、還元剤と接触させ、７位の＝Ｏ（ケトン）官能基を主にβ−配置のヒドロキシに変換する工程；
（ｂ）工程（ａ）の生成物の１７位のケタール官能基を、＝Ｏ（ケトン）官能基に変換する工程；および
（ｃ）３位のアセトキシ基を３β−ヒドロキシに変換する工程、または
（ｂ’）工程（ａ）の生成物の３位のアセトキシ基を３β−ヒドロキシに変換する工程；および
（ｃ’）１７位のケタール基を＝Ｏ（ケトン）官能基に変換する工程；ならびに
（ｄ）
【化１２】
2014231526.tif 000007
の構造を有する工程（ｂ）と（ｃ）または工程（ｂ’）と（ｃ’）の生成物の３β位および７β位のヒドロキシル基をＭｅ３ＳｉＯ−基に変換する工程；ならびに
（ｅ）工程（ｅ）の生成物を、リチウムトリメチルシリル−アセチリドと接触させ、１７位の＝Ｏ（ケトン）官能基へのアセチリドの付加によってエチニル置換基を１７位に、主にα−配置で導入する工程；
（ｆ）
【化１３】
2014231526.tif 000008
の構造を有する工程（ｅ）の反応生成物を水性の酸と接触させ、−ＳｉＭｅ３を−Ｈと交換し、それにより、１７α−エチニル−アンドロスタ−５−エン−３β，１７β−ジオールを本質的に含まない１７α−エチニル−アンドロスタ−５−エン−３β，７β，１７β−トリオールを得る工程
を含む、１７α−エチニル−アンドロスタ−５−エン−３β，１７β−ジオールを本質的に含まない１７α−エチニル−アンドロスタ−５−エン−３β，７β，１７β−トリオールの調製方法。
（１２）（ａ）構造
【化１４】
2014231526.tif 000009
好適に保護されたアンドロスタ−５−エン−７，１７−ジオンを還元剤と接触させ、７位の＝Ｏ（ケトン）官能基を、主にβ−配置のヒドロキシに変換する工程；
（ｂ）工程（ａ）の反応生成物の１７位のオキシムを＝Ｏ（ケトン）官能基に変換する工程；
（ｃ）工程（ｂ）の反応生成物のアシルオキシ基を３β−ヒドロキシに変換する工程；
（ｄ）工程（ｃ）の生成物の３位と７位のヒドロキシ基をＭｅ３ＳｉＯ基に変換する工程；および
（ｅ）工程（ｄ）の反応生成物をリチウムトリメチルシリルアセチリドと接触させ、１７位の＝Ｏ（ケトン）官能基へのアセチリドの付加によってエチニル置換基を１７位に、主にα−配置で導入し、それにより、１７α−エチニル−アンドロスタ−５−エン−３β，１７β−ジオールを本質的に含まない１７α−エチニル−アンドロスタ−５−エン−３β，７β，１７β−トリオールを得る工程
を含む、１７α−エチニル−アンドロスタ−５−エン−３β，１７β−ジオールを本質的に含まない１７α−エチニル−アンドロスタ−５−エン−３β，７β，１７β−トリオールの調製方法。
（１３）１７α−アルキニル−アンドロスタ−５−エン−３β，７β，１７β−トリオール生成物を再結晶によって精製するさらなる工程を含む、項目１、１１または１２に記載の方法。
（１４）前記１７α−アルキニル−アンドロスタ−５−エン−３β，７β，１７β−トリオール生成物を、再結晶によってメタノール−水から精製する、項目１３に記載の方法。（１５）前記１７α−アルキニル−アンドロスタ−５−エン−３β，７β，１７β−トリオールが、１７α−エチニル−アンドロスタ−５−エン−３β，７β，１７β−トリオールである、項目１４に記載の方法。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
詳細説明
定義  本明細書で用いる場合、特に記載のない限り、または文脈によって示唆されない限り、本明細書において定義する用語は、記載の意味を有する。記載の実施形態および実施例の説明は、本発明を例示するものであって、なんら本発明の限定を意図しない。特に矛盾または示唆のない限り（例えば、互いに排他的な要素または選択肢を含むことにより）、該説明において、および本明細書全体を通して、用語「ａ」および「ａｎ」は、１つ以上を意味し、用語「または／もしくは」は、および／またはを意味する。
【００１２】
「アルキル」は、本明細書で用いる場合、連結されたノルマル、第２級、第３級または環状、すなわち、線形、分枝鎖、環状またはその任意の組合せの炭素原子をいう。アルキル基またはアルキル部分は、本明細書で用いる場合、飽和または不飽和であり得る、すなわち、該部分は、独立して選択される二重結合または三重結合を１つ、２つ、３つまたはそれ以上含むものであり得る。不飽和アルキル部分としては、アルケニル、アルキニル、シクロアルキルおよびアリール部分について以下に記載する部分が挙げられる。アルキル部分内の炭素原子の数は１〜２０個、好ましくは１〜８個である。Ｃ１〜８アルキルまたはＣ１〜８アルキルは、１、２、３、４、５、６、７または８個の炭素原子を含むアルキル部分を意味し、Ｃ１〜６アルキルまたはＣ１〜６アルキルは、１、２、３、４、５または６個の炭素原子を含むアルキル部分を意味する。アルキル部分が指定されている場合、種としては、メチル、エチル、１−プロピル（ｎ−プロピル）、２−プロピル（イソ−プロピル、−ＣＨ（ＣＨ３）２）、１−ブチル（ｎ−ブチル）、２−メチル−１−プロピル（イソ−ブチル、−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２）、２−ブチル（ｓｅｃ−ブチル、−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３）、２−メチル−２−プロピル（ｔ−ブチル、−Ｃ（ＣＨ３）３）、１−ペンチル（ｎ−ペンチル）、２−ペンチル（−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）、３−ペンチル（−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ３）２）および２−メチル−２−ブチル（−Ｃ（ＣＨ３）２ＣＨ２ＣＨ３）が挙げられ得る。
【００１３】
「シクロアルキル」は、本明細書で用いる場合、炭素原子のみで構成された単環式、二環式または三環式の環系をいう。シクロアルキル基またはシクロアルキル部分内の炭素原子の数は種々であり得るが、典型的には３〜約２０、例えば好ましくは３〜８個である。Ｃ３〜８アルキルまたはＣ３〜Ｃ８アルキルは、３、４、５、６、７または８個の炭素原子を含むシクロアルキル部分を意味し、Ｃ３〜６アルキルまたはＣ３〜Ｃ６は、３、４、５または６個の炭素原子を含むシクロアルキル部分を意味する。好ましいシクロアルキル置換基は、シクロプロピル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチルおよびアダマンチルである。環式環系内に二重結合を有するシクロアルキル置換基は、シクロアルケニル置換基と称されることもある。
【００１４】
「アルケニル」は、本明細書で用いる場合、１つ以上、例えば、１、２、３、４、５、６つ、またはそれ以上、典型的には１、２または３つの二重結合（−ＣＨ＝ＣＨ−）を含み、アリール部分（ベンゼンなど）を含んでいてもよく、さらに、連結されたノルマル、第２級、第３級または環状、すなわち、線形、分枝鎖、環状またはその任意の組合せの炭素原子を含む（アルケニル部分がビニル（−ＣＨ＝ＣＨ２）である場合を除く）部分または基を意味する。多数の二重結合を有するアルケニル部分では、二重結合は、連続的に配置されていてもよく（すなわち、１，３ブタジエチル部分）、１つ以上の介在飽和炭素原子を伴って非連続的に配置されていてもよく、その組合せであってもよいが、二重結合の環状連続配置において、４ｎ＋２個の電子の環状共役系（すなわち、芳香族）は形成されないものとする。アルケニル部分内の炭素原子の数は２〜２０個、好ましくは２〜８個であり得る（ｃａｎ  ｉｓ）。Ｃ２〜８アルケニルまたはＣ２〜８アルケニルは、２、３、４、５、６、７または８個の炭素原子を含むアルケニル部分を意味し、Ｃ２〜６アルケニルまたはＣ２〜６アルケニルは、２、３、４、５または６個の炭素原子を含むアルケニル部分を意味する。アルケニル部分が指定されている場合、種としては、例えば、１つ以上の二重結合を有する上記の任意のアルキル部分、例えば、メチレン（＝ＣＨ２）、メチルメチレン（＝ＣＨ−ＣＨ３）、エチルメチレン（＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ３）、プロピルメチレン（＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ３）、ビニル（−ＣＨ＝ＣＨ２）、アリル（−ＣＨ＝ＣＨＣＨ３）、１−メチルビニル、ブテニル、イソ−ブテニル、３−メチル−２−ブテニルまたは１−ペンテニルなどが挙げられる。
【００１５】
「アルキニル」は、本明細書で用いる場合、１つ以上、典型的には１、２または３つ、通常１つの三重結合（−Ｃ≡Ｃ−）が存在し、任意選択で１、２、３、４、５、６つ、またはそれ以上の二重結合を含み、残りの結合（存在する場合）が単結合であり、連結されたノルマル、第２級、第３級または環状、すなわち、線形、分枝鎖、環状またはその任意の組合せの炭素原子を含む（アルキニル部分がエチニルである場合を除く）連結されたノルマル、第２級、第３級または環状の炭素原子をいう。アルキニル基またはアルキニル部分内の炭素原子の数は２〜２０個、好ましくは２〜８個である。Ｃ２〜８アルキニルまたはＣ２〜８アルキニルは、２、３、４、５、６、７または８個の炭素原子を含むアルキニル部分を意味する。アルキニル置換基が指定されている場合、好ましい種としては、−Ｃ＝ＣＨ、−Ｃ≡ＣＣＨ３、−Ｃ≡ＣＣＨ２ＣＨ３、−Ｃ≡ＣＣ３Ｈ７および−Ｃ＝ＣＣＨ２Ｃ３Ｈ７が挙げられる。特に好ましい種は、エチニル、プロピニルおよび１−ブチニルであり、エチニルが特に好ましい。
【００１６】
「アリール」は、本明細書で用いる場合、環内ヘテロ原子がなく、１、２、３または４〜６個の環、典型的には１〜３個の環を含み（ここで、環は、炭素原子のみで構成された芳香族環系または縮合環系である）をいい、４ｎ＋２個の電子（ヒュッケル則）、典型的には６、１０または１４個の電子（その一部は、さらに環外共役（交差共役）に関与したものであり得る）の環状共役系をいう。アリール基が指定されている場合、種としては、フェニル、ビフェニル、ナフチル、フェナントリルおよびキノンが挙げられ得る。
【００１７】
「ヘテロアリール」は、本明細書で用いる場合、アリール環系を構成する炭素原子の１つ以上、典型的には１、２または３つであるが全部ではない炭素原子が、炭素以外の原子であるヘテロ原子（例えば、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、Ｂ、Ｓｉ、Ｐ、典型的には、酸素（−Ｏ−）、窒素（−ＮＸ−）またはイオウ（−Ｓ−）（式中、Ｘは、−Ｈ、保護基またはＣ１〜６の任意選択で置換されたアルキルである）、該ヘテロ原子は共役系に、環系内の隣接原子とのπ結合またはヘテロ原子の孤立電子対いずれかによって参与している）で置き換えられており、１つ以上の炭素またはヘテロ原子または両方の組合せにおいて任意選択で置換されていてもよく、環状共役系が保持される様式で複素環を構成しているアリール環系をいい、意味する。
【００１８】
「保護基」は、本明細書で用いる場合、結合対象の原子または官能基が、不要な反応に参与することを抑制または低減させる部分を意味する。例えば、−ＯＲＰＲの場合、ＲＰＲは、ヒドロキシルに見られる酸素原子の保護基であり、一方、＝Ｏでは、保護基はケタールもしくはチオケタール（この場合、二価酸素は、例えば、−Ｘ−（ＣＨ２）ｎ−Ｙ−（式中、ＸおよびＹは、独立して、ＳおよびＯであり、ｎは２〜３である）で置き換えられ、スピロ環系が形成される）、またはオキシム（この場合、二価酸素は、＝Ｎ−ＯＲ（式中、Ｒは、−Ｈ、アルキルもしくはアリールである）で置き換えられる）である。−Ｃ（Ｏ）−ＯＲＰＲでは、ＲＰＲはカルボニルオキシ保護基であり、−ＳＲＰＲでは、ＲＰＲはチオールのイオウの保護基であり、例えば、−ＮＨＲＰＲまたは−Ｎ（ＲＰＲ）２−では、ＲＰＲは、第１級または第２級アミンの窒素原子保護基である。イオウまたは窒素または一価酸素原子の保護基は、通常、求電子性化合物との不要な反応を抑制するために使用される。二価酸素原子（すなわち、＝Ｏ）の保護基は、通常、求核性化合物との不要な反応を抑制するために使用される。
【００１９】
「任意選択で置換されたアルキル」、「任意選択で置換されたアルケニル」、「任意選択で置換されたアルキニル」、「任意選択で置換された複素環」、「任意選択で置換されたアリール」、「任意選択で置換されたヘテロアリール」などは、任意選択で水素原子（１つまたは複数）と置換される置換基（１つまたは複数）を有する本明細書において定義または開示したアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリールまたは他の基もしくは部分を意味する。かかる置換基は、上記のものである。フェニル部分（−Ｐｈ）では、芳香族環上に存在する任意の２つの置換基の配置が、互いに対してオルト（ｏ）、メタ（ｍ）またはパラ（ｐ）であり得る。好ましい任意選択で置換された部分は、−ＣＦ３、−ＣＨ２ＯＨ、−Ｃ≡Ｃ−Ｃｌおよび−Ｐｈ−Ｆである。
【００２０】
「Ｏ連結基」、Ｏ連結置換基などの用語は、本明細書で用いる場合、自身が有する酸素原子を介してある部分に直接結合される基または置換基をいう。Ｏ連結基は、一価であってもよく（例えば、−ＯＨ、アセトキシ、すなわち、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ３）、アシルオキシ、すなわち、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｒ（式中、Ｒは、−Ｈ、任意選択で置換されたアルキル、任意選択で置換されたシクロアルキル、任意選択で置換されたアルケニル、任意選択で置換されたアルキニル、任意選択で置換されたアリール、任意選択で置換されたヘテロアリールもしくは任意選択で置換された複素環である）、アリールオキシ（アリール−Ｏ−）、フェノキシ（Ｐｈ−Ｏ−）、ヘテロアリールオキシ（ヘテロアリール−Ｏ−）、シリルオキシ、すなわち、Ｒ３ＳｉＯ−（式中、Ｒは、独立して、アルキルもしくはアリールである）、または任意選択で置換された−ＯＲＰＲ（式中、ＲＰＲは、先に定義した保護基である）などの基）、二価（すなわち、＝Ｏ）であってもよい。
【００２１】
用語「化合物１の調製物」は、具体的または一般的に記載した合成スキームのいずれか１つに従って調製される物質をいい、質量基準で主要成分としてみられる化合物１と、固形物として最初に単離したとき、あるいは固形物の再結晶およびまたは精製後のいずれかで化合物中に存在するプロセス不純物を含むものである。
【００２２】
用語「結合活性」は、特定の化合物、化合物１を含む調製物、または化合物１の調製物中の不純物（１種類もしくは複数種）が、受容体、典型的には性ステロイド受容体（アンドロゲン受容体またはエストロゲン受容体など）と結合または会合して、該受容体の生物学的活性に奏功またはモジュレートする能力をいう。結合は、通常、アッセイにおいて、化合物（通常、化合物１を含む調製物中の不純物）が、競合アッセイにおいて受容体（すなわち、参照リガンド）に結合された該受容体の生理学的に関連するリガンドと置き換わる能力として測定される。参照リガンドは、典型的には、受容体の天然リガンドまたは放射性プローブもしくは分光分析用プローブで標識された受容体アゴニスト（その存在は、シンチレーション計数もしくは分光分析法（蛍光放射あるいは蛍光偏光など）によって確認（ｑｕｅｒｙ）され得る）である。
【００２３】
放射性プローブは、典型的には３Ｈおよび／または１４Ｃであり、この場合、アッセイ条件下で、アッセイ結果の解釈を複雑にしたり、または混乱させ得る程度まで放射性標識の減少が起こり得ない位置で、リガンドの１個以上の原子が放射性原子（１つまたは複数）で置き換えられている。分光分析用プローブは、典型的にはフルオロフォアであり、これは、参照リガンドに、０．１〜１００ｎＭの範囲のＫｄを有する標識参照リガンドをもたらす位置であって、アッセイ条件下で、アッセイ結果の解釈を複雑にしたり、または混乱させ得る程度まで蛍光標識が減少しない位置で結合される。具体的な化合物または化合物１の調製物の結合活性は、典型的にはＫｉで表示され、Ｋｉは、具体的な化合物または調製物が受容体に対する標識参照リガンドと５０％置き換わる濃度と、標識参照リガンドのＫｄから求められる。
【００２４】
「性ステロイド受容体」は、生殖器官の成長または機能ならびに第二次性徴の発達
への影響と通常関連している核受容体をいい、アンドロゲン受容体、エストロゲン受容体−α（ＥＲα）、エストロゲン受容体−β（ＥＲβ）およびプロゲステロン受容体が挙げられる。
【００２５】
「〜が本質的にない」は、本明細書で用いる場合、化合物１の調製物中に不純物または不純物の性質が存在しないか、または化合物１の所望の薬理学的活性に有害な影響を及ぼし得る、もしくは消失させ得る量で測定可能でないことをいう。例えば、用語「本質的に性ステロイド受容体結合活性がない」は、化合物１の調製物について、性ステロイド核受容体に対して、該受容体への結合に関するＫｉ＞１０μＭの値（標準的な受容体結合アッセイ条件を用いて測定）によって規定される受容体結合活性がないことをいい、該調製物中に存在し得る性受容体結合活性をもたらし得る不純物の実体とは無関係である。同様に、本質的にエストロゲン受容体結合活性がないエストロゲン受容体は、化合物１の調製物について、核エストロゲン受容体ＥＲαとＥＲβに対して、該受容体への結合に関するＫｉ＞１０μＭの値（標準的な受容体結合アッセイ条件を用いて測定）によって規定される受容体結合活性がないことをいい、該調製物中に存在し得るエストロゲン受容体結合活性をもたらし得る不純物の実体とは無関係である。用語「〜を本質的に含まない」が、化合物１の調製物中に存在する不純物の量を示すために使用されている場合、該用語は、通常、核エストロゲン受容体の活性化に起因し、かつこの受容体における不純物の結合活性による副作用に対する一因となることにより、化合物１のその意図された用途に対する薬理学的活性に有害な影響を及ぼし得る量で不純物が存在しないことを意味する。不純物（例えば、１７α−エチニル−アンドロスタ−５−エン−３β，１７β−ジオール）は、エストロゲン受容体に対する結合もしくはモジュレーションによって化合物１の薬理学的活性に直接影響を及ぼすことがあり得、または化合物１の調製物を含む組成物での処置対象の被検体内において、加水分解（自発的もしくは酵素的のいずれか）によって、エストロゲン受容体に影響を及ぼす、もしくはモジュレートする化合物に変換される（例えば、１７α−エチニル−３β−アセトキシ−アンドロスタ−５−エン−１７β−オールが１７α−エチニル−アンドロスタ−５−エン−３β，１７β−オールに変換される）ことにより、化合物１の薬理学的活性に間接的に影響を及ぼすこともあり得る。
【００２６】
用語「不純物」または「プロセス不純物」は、本明細書で用いる場合、化合物１の合成中に形成されるステロイド副産物、副生成物または分解生成物であって、調製物全体の質量に対する寄与が小さい（典型的には約２％未満である）化合物１の調製物中の成分をいう。
【００２７】
「製剤」または「薬学的に許容され得る製剤」は、本明細書で用いる場合、化合物１の調製物と、１種類以上の薬学的に許容され得る賦形剤とを含む組成物をいう。
【００２８】
本明細書に記載の発明は、３位、７位および１７位に酸素置換基を有し、性ステロイド受容体において望ましくない結合活性を有する不純物を本質的に含まない１７−アルキニルステロイドの調製方法を提供する。このようにして調製されるかかる１７−アルキニルステロイドは、１種類以上の不純物を本質的に含まず、望ましくない結合活性の原因であるＣ７の酸素置換基がないと特性評価されるものである。
【００２９】
本方法は、化合物１に見られた予想外のエストロゲン性効果に対応して開発された。化合物１は、プロセスＡと称する以下の工程：
（１）好適に保護されたアセチレンアニオンを、好適に保護されたデヒドロエピアンドロステロンと接触させ、１７位の＝Ｏ官能基へのアセチレンアニオンの付加によって１７位αにエチニル基を導入する工程；
（２）好適に保護された１７α−エチニル−アンドロスタ−５−エン−３β，１７α−ジオールを酸化剤と接触させ、＝Ｏ官能基を７位に導入する工程；および
（３）好適に保護された１７α−エチニル−アンドロスタ−５−エン−７−オン−３β，１７α−ジオールを還元剤と接触させ、７位の＝Ｏ官能基をβ−ヒドロキシルに直接変換する工程を含む経路によって調製した。
【００３０】
プロセスＡの実施形態をスキームＩ（本明細書では、プロセスＡ，経路１と称する）に示す。このようにして調製された化合物１は、予測に反して、エストロゲン性効果を有することがわかった。この経路によって調製した化合物１の不純物プロファイリングでは、７位のβ−ヒドロキシ基が存在しないこと以外は化合物１と同じ構造を有する１７α−エチニル−アンドロスタ−５−エン−３β，１７β−ジオールの存在が示された。受容体結合試験では、１７α−エチニル−アンドロスタ−５−エン−３β，１７β−ジオールは、エストロゲン受容体ＥＲαとＥｒβにおいて有意な結合活性を有するが、この不純物を本質的に含まない化合物１は、１０μＭまで試験した場合、これらの受容体において活性をもたないことが示された。この望ましくない性ステロイド活性に基づき、エストロゲン副生成物である１７α−エチニル−アンドロスタ−５−エン−３β，１７β−ジオールの生成が回避されるプロセスＢと称する新たなプロセスを開発した。
【００３１】
プロセスＢは、以下の工程
（ａ）好適に保護されたデヒドロエピアンドロステロンを酸化剤と接触させ、
７位に＝Ｏ官能基を直接導入する工程；
（ｂ）好適に保護されたアンドロスタ−５−エン−７，１７−ジオン−３β−オールを還元剤と接触させ、７位の＝Ｏ官能基をβ−ヒドロキシルに変換する工程；
（ｃ）好適に保護されたアセチレンアニオンを、好適に保護されたアンドロスタ−５−エン−１７−オン−３β，７β−ジオールと接触させ、１７位の＝Ｏ官能基へのアセチレンアニオンの付加によって１７α位にエチニル基を導入する工程
を含む。
【００３２】
工程（ａ）を行うための手順は、Ｗｕｔｓ，Ｐ．Ｇ．Ｍ．“Ａ  ｃｈｅｍｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｅｐｌｅｒｅｎｏｎｅ”Ｓｙｎｌｅｔｔ（３）：４１８−４２２（２００８）に記載の微生物による酸化；オキソクロム系試薬での酸化［例えば、Ｋｏｕｔｓｏｕｒｅａら，“Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ａ  ｃｙｔｏｓｔａｔｉｃ  ｓｔｅｒｏｉｄａｌ  Ｂ−Ｄ  ｂｉｌａｃｔａｍ”Ｓｔｅｒｏｉｄｓ  ６８：５６９−６６６（２００３）およびＣｏｎｄｏｍら，“Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｔｅｒｏｉｄ−ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｔｅｒｏｉｄ  ｎｏｔ  ｂｅａｒｉｎｇ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｇｒｏｕｐ”Ｓｔｅｒｏｉｄｓ  ２３：４８３−４９８（１９７４）参照］、ペルオキシド補助型アリル酸化［例えば、Ｍａｒｗａｈ，Ｐ．ら“Ａｎ  ｅｃｏｎｏｍｉｃａｌ  ａｎｄ  ｇｒｅｅｎ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｏｘｉｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｌｅｆｉｎｓ  ｔｏ  ｅｎｅｏｎｅｓ”Ｇｒｅｅｎ  Ｃｈｅｍ．６：５７０−５７７（２００４）およびＭａｒｗａｈ，Ｐ．ら，“Ｅｒｇｏｓｔｅｒｏｉｄｓ  ＩＶ：ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｓｔｅｒｏｉｄ  ｇｌｕｃｕｒｏｎｏｓｉｄｅｓ，ｅｔｈｅｒｓ  ａｎｄ  ａｌｋｙｌｃａｒｂｏｎａｔｅｓ”Ｓｔｅｒｏｉｄｓ  ６６：５８１−５９５（２００１）参照］、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド／ＡＩＢＮでの酸化［例えば、Ｌａｒｄｙら“Ｅｒｇｏｓｔｅｒｏｉｄｓ  ＩＩ：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ  ａｎｄ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ｏｆ  ｄｅｈｙｄｒｏｅｐｉａｎｄｒｏｓｔｅｒｏｎｅ”Ｓｔｅｒｏｉｄｓ  ６３：１５８−１６５（１９９８）参照］を含む
工程（ａ）では、好適に保護されたデヒドロエピアンドロステロンは、３β−ヒドロキシルと、ヒドロキシルおよびケトンに対して典型的に使用される保護基（Ｇｒｅｅｎｅ，Ｔ．Ｗ．“Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  ｏｒｇａｎｉｃ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８１に示されている）で保護された＝Ｏ官能基を有する。ヒドロキシ保護基は、（１）１７位の＝Ｏ官能基を保護するため（既に存在しない場合）（または（１’）１７位に事前に導入されたケトン保護基に有害な影響を及ぼすものを導入するための条件が必要とされない）、および（２）７位に＝Ｏ官能基を直接導入するために必要とされる条件に適したものであるのがよい。また、好ましいヒドロキシ保護基は、（３）７位に導入される＝Ｏ官能基を充分な選択性を伴って還元し、７β−ヒドロキシを主要異性体として得るために必要とされる条件に適したもの、および（４）＝Ｏ官能基の還元によって形成されるアリルアルコールが充分な安定性を有する条件下で除去されるものである。（１）〜（４）の条件を満たすヒドロキシ保護基としては、エステル、通常、アリールエステルまたはＣ１〜６アルキルエステル、（１７位の＝Ｏ官能基の保護基がケタールであり、使用される還元剤がボロヒドリド系還元剤である場合）が挙げられる。より強力なヒドリド還元剤の使用では、ヒドロキシ保護基の早期の減少を抑制するためのヒドロキシ保護基として、ヒンダードエステルまたは置換メチルエーテルが必要とされ得る。好ましい＝Ｏ保護基は、ジメチルケタール、ジエチルケタールまたはエチレングリコールから調製されるスピロケタールなどのケタールである。好ましい好適に保護されたデヒドロエピアンドロステロンは、３β−アセトキシ−アンドロスタ−５−エン−１７−オンのエチレンケタールである。
【００３３】
工程（ｂ）を行うための手順は、金属ヒドリド系試薬、例えば、ボロヒドリド系試薬など（Ｚｎ（ＢＨ４）２、ＮａＢＨ４が挙げられる）での還元、任意選択で、遷移金属塩（ＣｅＣｌ３、ＮｉＣｌ２、ＣｏＣｌ２またはＣｕＣｌ２など）、Ｌ−Ｓｅｌｅｃｔｒｉｄｅ（リチウムトリ−ｓｅｃ−ブチルボロヒドリド）またはＮ−Ｓｅｌｅｃｔｒｉｄｅ（ナトリウムトリ−ｓｅｃ−ブチルボロヒドリド）での還元を含む。また、水素化アルミニウムリチウム系または水素化アルミニウムナトリウム試薬も使用され得るが、かかる試薬の還元強度のため、選択性に欠点を有することがあり得る。これは、反応性を低下させるためのアルミニウムに対するアルコキシ配位子を有する水素化アルミニウムリチウム系試薬を使用することにより改善され得る。かかる試薬は、一般式ＬｉＡｌ−Ｈｎ（ＯＲ）４−ｎ（式中、ｎ＝１、２、３，Ｒは、Ｃ１〜６アルキルである）を有し、ＬＴＭＡ（水素化トリエトキシアルミニウムリチウムＬＴＥＡＨ（水素化トリエトキシアルミニウムリチウム）、ＲＥＤ−ＡＬ（水素化ビス（２−メトキシエトキシ）アルミニウムナトリウム）が挙げられる。ボロヒドリド系試薬が使用される還元はアルコール溶媒中で行われ得るが、水素化アルミニウム系試薬が使用される還元は、ＴＨＦなどのエーテル溶媒が必要とされる。選択性は、特に、水素化アルミニウム試薬では、反応を０℃〜−７８℃の温度で行うことにより改善され得、低温の方が水素化アルミニウム試薬には、より適している。
【００３４】
工程（ｃ）を行うための手順は、インサイチュでのアセチレンアニオンの調製後、このようにして形成されるアセチリドを好適に保護されたアンドロスタ−５−エン−１７−オン−３β，７β，１７β−トリオールと接触させることを含む。アセチリドは、アセチレンを、アミドアニオン（例えば、ＮａＮＨ２）と炭化水素溶媒（例えば、ベンゼン、トルエンまたはキシレン）中で、例えばＵＳ２，２５１，９３９の場合のようにして接触させることにより、金属ナトリウムまたはカリウムと液体アンモニア中で、例えばＵＳ２，２６７，２５７の場合のようにして接触させることにより、あるいは、モノシリル保護アセチレン（トリメチルシリルアセチレンなど）をオルガノリチウム試薬と接触させることにより調製してもよい。好適なオルガノリチウム試薬としては、市販のｎ−ブチルリチウム、ｓｅｃ−ブチルリチウム、メチルリチウム、ｔ−ブチルリチウムまたはフェニルリチウムが挙げられ、あるいはアルキルまたはアリールブロミドと金属リチウムとの不活性溶媒（例えば、ジエチルエーテルまたはテトラヒドロフラン）中での反応によって調製したものであってもよい。このようにして調製されるアセチリドを、次いで、好適に保護されたアンドロスタ−５−エン−１７−オン−３β，１７β−ジオールと接触させる。
【００３５】
工程（ｃ）では、好適に保護されたアンドロスタ−５−エン−１７−オン−３β，７β−ジオールはヒドロキシル保護基を有し、該保護基は、カルバニオン化学反応において典型的に使用され、末端アルキンおよびアリルアルコールの存在と適合性である条件下で除去され得るものであり、中性条件または弱酸性条件下、典型的にはｐＨ３〜７で除去され、アリルアルコールと適合性である条件下で導入され得る保護基が挙げられる。好ましい保護基は、式（Ｒ１）３ＳｉＯ−（式中、Ｒ１は、独立して、アリールまたはＣ１〜６アルキルであり、トリメチルシリル、トリエチルシリル、ｔ−ブチルジメチルシリル、イソプロピルジメチルシリル、ｔ−ブチルジフェニルシリル、メチルジイソプロピルシリル、メチル−ｔ−ブチルシリル、トリベンジルシリルおよびトリフェニルシリルエーテルが挙げられる）のシリルエーテルである。好ましいシリルエーテルは、トリメチルシリルエーテルおよびｔ−ブチルジメチルシリルエーテルである。一部の置換メチルエーテルが使用され得、２−（トリメチルシリル）−エトキシメチルエーテル（ＳＥＭエーテル）、テトラヒドロピラニルエーテル（ＴＨＰエーテル）、テトラヒドロチオピラニルエーテル、４−メトキシ−テトラヒドロピラニルエーテル、４−メトキシテトラヒドロチオピラニルエーテル、テトラヒドロフラニルエーテルおよびテトラヒドロチオフラニルエーテルが挙げられる。一部の置換エチルエーテルがヒドロキシ保護基として使用され得、１−エトキシエチルエーテルおよびｔ−ブチルエーテルが挙げられる。好ましいヒドロキシ保護基は、立体要件が少なく（トリメチルシリルエーテルなど）、３βと７βのヒドロキシ基の同時保護が可能なものである。
【００３６】
工程（ｃ）を行うための他の手順は、好適に保護されたアンドロスタ−５−エン−１７−オン−３β，７β−ジオールを、ナトリウムアセチリド、リチウムアセチリド（そのエチレンジアミン複合体として）、エチニルマグネシウムハライド（例えば、塩化物もしくは臭化物）またはエチニル亜鉛ハライドと、例えば、ＵＳ２，２４３，８８７の場合のようにして、ジエチルエーテルまたは他のエーテル溶媒中（例えば、テトラヒドロフラン、１，２−ジメトキシエタン、２−メトキシエチルエーテルなど）で接触させることを含むものである。
【００３７】
プロセスＢの一実施形態では、３β−アセトキシ−アンドロスタ−５−エン−７−オン−１７，１７−エチレンジオキシが好適に保護されたアンドロスタ−５−エン−７，１７−ジオン−３β−オールとして使用される（スキームＩＩ参照；本明細書では、プロセスＢ，経路１と称する）。
【００３８】
プロセスＢの別の実施形態では、３β−アセトキシ−アンドロスタ−５−エン−７−オン−１７−オキシムが好適に保護されたアンドロスタ−５−エン−７，１７−ジオン−３β−オールとして使用される（スキームＩＩＩ参照；本明細書では、プロセスＢ，経路２と称する）。
【００３９】
以下の実施例およびスキームにより、本発明をさらに説明する。これらは、なんら本発明を限定することを意図しない。
【００４０】
スキームＩ．プロセスＡ，経路１
【００４１】
【化１】
2014231526.tif 000010
【００４２】
【化２】
2014231526.tif 000011
【実施例】
【００４３】
実施例
実施例１．  ３β−トリメチルシリルオキシ−アンドロスタ−５−エン−１７−オン（ＴＭＳ−ＤＨＥＡ）の合成：ＤＨＥＡを、１，１，１，３，３，３−ヘキサメチルジシラザン（ＨＭＤＳ）およびサッカリン（触媒として）と、アセトニトリル中で合わせる。反応混合物を数時間、窒素雰囲気下で攪拌しながら還流加熱した。遊離アンモニアを微真空下でパージした。次いで、容量を蒸留によって減少させた後、混合物を冷却し、析出した生成物を濾過によって収集した。ＴＭＳ−ＤＨＥＡ生成物の濾過ケークを冷アセトニトリルで洗浄し、０．５％以下の乾燥減量（ＬＯＤ）まで温窒素で乾燥させ、単離収率ほぼ９０％の標題化合物を得た。
【００４４】
実施例２．  １７α−エチニル−アンドロスタ−５−エン−３β，１７β−ジオールの合成：ｎ−ブチルリチウムをＴＨＦ中のＭｅ３Ｓｉ−Ｃ≡ＣＨに、窒素雰囲気下、ほぼ０℃でゆっくりと添加し、リチウムアセチリドＭｅ３Ｓｉ−Ｃ≡Ｃ−Ｌｉを得る。温度を約２０℃まで上げ、ＴＭＳ−ＤＨＥＡ  ＴＨＦ中の溶液として添加し、約３時間攪拌した。温度を約４０℃まで上げることにより反応をクエンチした後、メタノールをゆっくりと添加した。遊離アセチレンを微真空下でパージする。次いで濃ＫＯＨをゆっくりと、ガスの発生がおさまるまで添加し、ほぼ４５℃での真空蒸留によって容量をほぼ５０％減少させた。温度をほぼ４０℃に維持しながら、過剰の６Ｎ  ＨＣｌをゆっくりと添加した。反応混合物を水で希釈し、ほぼ５℃まで冷却した後、生成物を濾過によって収集し、濾過ケークを冷５０／５０メタノール水で洗浄した。生成物を０．５％（ｎｏｔ  ｍｏｒｅ  ｔｈａｎ  ｔｏ）のＬＯＤまで温窒素で乾燥させ、単離収率ほぼ８７％の標題化合物を得た。
【００４５】
実施例３．  １７α−エチニル−３β−アセトキシ−アンドロスタ−５−エン−１７β−オールの合成：１７α−エチニル−アンドロスタ−５−エン−３β，１７β−ジオールを、無水酢酸、トリエチルアミンおよび触媒量のＤＭＡＰ（ＴＨＦ中）と、還流温度で少なくとも４時間混合した。反応の進行をＨＰＬＣによってモニターし、残留する出発物質が１％以下になるまで進行させた。次いで混合物を３０〜５０℃まで冷却し、水を添加した後、ほぼ０℃まで１時間冷却した。粗製生成物を濾過によって回収し、冷アセトニトリルで洗浄し、５％以下のＬＯＤまで温窒素で乾燥させた。粗製生成物をＨＰＬＣによって特性評価し、標題化合物が、ＨＰＬＣによるピーク面積純度９５％未満で存在する場合は、アセトニトリルから再結晶させた。再結晶させた生成物を濾過によって回収し、乾燥させ、単離全収率８３％の標題化合物を得た。
【００４６】
実施例４：  １７α−エチニル−３β−アセトキシ−１７β−オール−アンドロスタ−５−エン−７−オンの合成：１７α−エチニル−３β−アセトキシ−アンドロスタ−５−エン−１７β−オールを、ｔ−ブチルヒドロペルオキシドとヨウ化銅（Ｉ）を含むアセトニトリルと合わせ、２時間還流した。次いで約５０℃まで冷却した後、大過剰のチオ硫酸ナトリウム水溶液を、攪拌しながら少なくとも３０分間添加することにより、反応をクエンチした。この条件下では、有機相と水相は混和性ではない。攪拌を停止して相分離させ、水相（下側）を廃棄する。有機相を亜硫酸ナトリウム水溶液とブラインで、約４５℃で少なくとも３０分間混合した後、相分離させることによって２回抽出し、水相を除去した。得られた有機相を、４５℃未満での真空蒸留によって元の容量のほぼ２５％まで濃縮し、次いで約５℃まで冷却した。粗製生成物１７α−エチニル−３β−アセトキシル−アンドロスタ−５−エン−７−オン−１７β−オールを濾過によって回収した。濾過ケークを冷アセトニトリル／水で洗浄し、１．０％以下のＬＯＤまで温窒素で乾燥させた。粗製生成物を、Ｎ−メチル−ピロリジノン（ＮＭＰ）にほぼ９０℃で溶解させた後、０℃でほぼ１時間冷却することによって２回再結晶させた。標題化合物を濾過によって、単離全収率ほぼ３０％で回収した。
【００４７】
実施例５：  １７α−エチニル−アンドロスタ−５−エン−３β，７β，１７β−トリオールの合成：１７α−エチニル−３β−アセトキシ−アンドロスタ−５−エン−７−オン−１７β−オールをＮａＢＨ４含有ＴＨＦ／メタノールで、ＣｅＣｌ３の存在下、ほぼ０℃で約２時間還元した。反応の進行をＨＰＬＣによってモニターした。希ＨＣｌをゆっくりと添加するとともに、遊離水素を微真空除去しながら、反応をクエンチした。メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）を添加し、反応混合物をブラインで２回洗浄し、水相を廃棄した。メタノール性ＫＯＨを有機相に、ほぼ０℃で約２時間添加することによって、粗製生成物から３β−アセトキシ基を除去し、反応の進行をＨＰＬＣによってモニターした。終了後、反応混合物を酢酸で中和し、反応容量のほぼ２分の１を、４５℃未満での真空蒸留によって除去した。元の反応混合物の容量のほぼ３分の２を、イソプロパノール（ＩＰＡ）として添加し、続いて、４５℃未満での真空蒸留によって、容量を元の容量のほぼ４分の１まで減少させた。残渣混合物を０℃まで冷却し、粗製１７α−エチニル−アンドロスタ−５−エン−３β，７β，１７β−トリオールを濾過によって回収し、冷ＩＰＡで洗浄し、温窒素で乾燥させた。
【００４８】
実施例６．  プロセスＡによる１７α−エチニル−アンドロスタ−５−エン−３β，７β，１７β−トリオールの再結晶：実施例５の粗製１７α−エチニル−アンドロスタ−５−エン−３β，７β，１７β−トリオールを、還流メタノール／水（約１０／１）に溶解させた。メタノールを、攪拌しながら真空蒸留によって除去し、充分な水と交換して、結晶化生成物の懸濁液を維持した。この懸濁液を、攪拌しながらほぼ５℃まで冷却し、生成物を濾過によって回収した。濾過ケークを水で洗浄し、真空下で水分０．５％未満まで乾燥させ、標題化合物をほぼ６９％の単離収率で得た。
【００４９】
スキームＩＩ：プロセスＢ，経路１
【００５０】
【化３】
2014231526.tif 000012
【００５１】
【化４】
2014231526.tif 000013
【００５２】
【化５】
2014231526.tif 000014
実施例７．  ３β−アセトキシ−アンドロスタ−５−エン−１７，１７−エチレンジオキシの合成：３００Ｌ容反応器に、３６ｋｇのオルトギ酸トリエチル、２０ｋｇの３β−アセトキシ−５−アンドロステン−１７−オン、１２．６ｋｇのエチレングリコールおよび４００ｇのｐ−トルエンスルホン酸を仕込んだ。混合物を、窒素下、反応が終了するまで（約２〜３時間）還流加熱した。次いで混合物を６０℃まで冷却し、１６ｋｇの無水エタノールおよび４００ｍｌのピリジンを添加した。得られた溶液を容器に移し、一晩冷蔵した。形成された固形物を濾過し、８０ｋｇの５０％エタノールで洗浄し、４０〜５０℃で乾燥させ、１８．５〜２１．０ｋｇ（８１．５〜９２．５％）の標題化合物を得た。
【００５３】
実施例８．  ３β−アセトキシ−アンドロスタ−５−エン−７−オン−１７，１７−エチレンジオキシの合成：５００Ｌ容反応器に、２００ｋｇの酢酸エチルおよび２５ｋｇの３β−アセトキシ−アンドロスタ−５−エン−１７，１７−エチレンジオキシを仕込んだ。混合物を３０分間攪拌し、この時点で、５５ｋｇの７０％ｔ−ブチルペルオキシドおよび９ｋｇの重炭酸ナトリウムを添加した。次いで反応混合物を０℃まで冷却し、１１６ｋｇの１３％過塩素酸ナトリウム（水溶液）を１０時間かけて、反応温度が５℃未満であり、かつｐＨ７．５〜８．５が維持されるように添加した。反応終了後、有機層を分離し、水相を酢酸エチル（３５ｋｇ×２）で抽出した。合わせた有機相を、３３ｋｇの亜硫酸ナトリウムを含む１６７ｋｇの水の溶液と合わせ、得られた混合物を４０℃で３時間攪拌した。有機相を５０ｋｇのブラインで洗浄し、５５〜６０ｋｇまで濃縮し、この時点で、５０ｋｇのメタノールを添加した。一晩冷蔵後、白色固形物が形成され、これを濾過し、１０ｋｇのメタノールで洗浄し、４０〜５０℃で乾燥させ、７．１〜７．８ｋｇ（２７．４〜３０．１％）の標題化合物を得た。
【００５４】
実施例９．  ３β−アセトキシ−アンドロスタ−５−エン−１７，１７−エチレンジオキシ−７β−オールの合成。５００Ｌ容反応器に、４８ｋｇのＴＨＦ、１０ｋｇの３β−アセトキシ−アンドロスタ−５−エン−７−オン−１７，１７−エチレンジオキシおよび９．６ｋｇのＣｅＣｌ３・７Ｈ２Ｏを含む９５ｋｇメタノールの溶液を仕込んだ。この混合物を０℃までを冷却し、この時点で、２．０ｋｇのＮａＢＨ４を、温度が５℃未満に維持されるようにバッチ式で３時間かけて添加した。３０分間以上攪拌後、２８ｋｇのアセトンを、温度が５℃未満に維持されるようにゆっくりと添加し、攪拌をさらに３０分間継続した。この混合物に、２４０ｋｇの水を添加し、攪拌を１時間継続した。有機溶媒を真空除去し、残渣を酢酸エチル（１００ｋｇ＋５０ｋｇ）で抽出した。合わせた有機相をブラインで洗浄した。次いで溶媒を除去し、８．６〜８．９ｋｇ（８５．１〜８８．１％）の標題化合物を得た。
【００５５】
実施例１０．  ３β−アセトキシ−アンドロスタ−５−エン−１７−オン−７β−オールの合成：５００Ｌ容反応器に、３１５ｋｇのアセトンおよび１８ｋｇの３β−アセトキシ−アンドロスタ−５−エン−１７，１７−エチレンジオキシ−７β−オールを仕込んだ。混合物を５℃まで冷却し、２．３４ｋｇのｐ−トルエンスルホン酸を、温度が１０℃未満に維持されるようにゆっくりと添加した。混合物を８〜１５℃で３６〜４８時間攪拌後、３．０ｋｇの重炭酸ナトリウムを添加し、攪拌を１時間継続した。アセトンを真空除去し、残渣に１００ｋｇの水を添加した。混合物をを冷蔵庫に一晩入れ、白色沈殿物を得、これを濾過し、３３ｋｇ（湿潤）の標題化合物を得た。
【００５６】
実施例１１．  アンドロスタ−５−エン−１７−オン−３β，７β−ジオールの合成：５００Ｌ容反応器に、２３０ｋｇメタノール、３３ｋｇ（湿潤）の３β−アセトキシ−７β−ヒドロキシ−５−アンドロステン−１７−オン、１０８ｋｇの水および１５ｋｇのＮａ２ＣＯ３を仕込んだ。混合物を３時間還流加熱した。メタノールを真空除去し、この時点で、残渣に２５０ｋｇの水を添加した。混合物をを冷蔵庫に一晩入れ、析出物を得た。固形物を濾過によって回収し、次いで水で洗浄し、４０〜５０℃で乾燥させ、９．５〜１０．５ｋｇ（６７．９〜７５．０％）の標題化合物を白色固形物として得た。
【００５７】
実施例１２．  アンドロスタ−５−エン−１７−オン−３β，７β−ジオールの精製：５００Ｌ容反応器に、２０ｋｇの粗製３β，７β−ジヒドロキシアンドロスタ−５−エン−１７−オンおよび２００ｋｇメタノールを仕込み、すべての固形物が溶解するまで加熱した。この溶液を高温の間に濾過し、濾液を冷却すると、白色の結晶性固形物が形成された。固形物を濾過によって回収し、少量のメタノールで洗浄し、４０〜５０℃で乾燥させた。次いで、固形物を５０ｋｇの酢酸エチル中で２０分間還流した。冷却後、固形物を濾過し、４０〜５０℃で真空乾燥させ、１５．２ｋｇ（７６％）の精製標題化合物を得た。
【００５８】
実施例１３．  ３β，７β−ビス−（トリメチルシリルオキシ（ｓｉｌｏｘｙ））−５−アンドロステン−１７−オンの合成：１４．８７Ｋｇのアンドロスタ−５−エン−１７−オン−３β，７β−ジオール、２３．８ＫｇのＨＭＤＳおよび０．７Ｋｇのサッカリン触媒と１００Ｌのアセトニトリルの混合物を、窒素雰囲気下で攪拌しながら、８時間還流加熱した。遊離アンモニアを微真空下でパージした。次いで、反応容量を蒸留によって減少させ、３０Ｌの蒸留液を収集した（約２時間を要する）。反応容量を、減圧下（７００ｍｍＨｇ）での蒸留によって元の反応容量の半分までさらに減少させた（これは、５０℃での約２時間の加熱を要する）。得られた均一な粘稠性のスラリーを５℃まで冷却し、（約３時間を要する）、さらなるアセトニトリルを、混合容量が最小限に維持されるように添加し、該温度に１保持した。析出した生成物を濾過によって回収し、真空下（２９ｍｍＨｇ）、４５〜５０℃で１％以下の乾燥減量（ＬＯＤ）まで乾燥させ（２０時間を要する）、１６Ｋｇ（８１％収率）の標題化合物（９５％純度）を得た。
【００５９】
実施例１４．  １７α−エチニル−５−アンドロステン−３β，７β，１７β−トリオールの合成：１１．０２ＫｇのＴＭＳ−アセチレンを含む５６．５Ｌのテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）に、窒素雰囲気下、−２７℃で、８．５１Ｌの１０Ｍ  ｎ−ＢｕＬｉを添加した。このｎ−ブチルリチウムは、温度が−７〜−２７℃が維持されるように非常にゆっくりと添加し（約２時間を要する）、得られた反応液をほぼ０℃で１０分間攪拌し、ＴＭＳ−リチウム−アセチリドを得た。このＴＭＳ−リチウム−アセチリド溶液に、２５．４１Ｋｇの３β，７β−ビス−（トリメチルシロキシ）−５−アンドロステン−１７−オンを含む９５．３ＬのＴＨＦの溶液を添加し、反応温度を２０〜２５℃に上げながら、２５μｍフィルターに通して濾過した。添加が終了した後、反応温度を４０〜４５℃に上昇させた。反応器の内容物をクエンチするため、３１．８Ｌのメタノールを約１時間にわたって添加した後、３．８１ＫｇのＫＯＨを含む１８．４Ｌの水を添加し、最終反応器温度を５０℃にした。遊離アセチレンを微真空下でパージする。次いで、反応器の内容物を８０℃で１時間、次いで、真空下（１７５ｍｍＨｇ）、約７０℃（バンピング（ｂｕｍｐｉｎｇ）を回避するため、初期温度は２５℃）の蒸留によって、元のポット容量（ｐｏｔ  ｖｏｌｕｍｅ）の半分まで濃縮した。残渣を約１０℃まで冷却し、３５．０Ｋｇの脱イオン水を添加した後、約１０℃のポット温度を維持しながら１６．４Ｋｇの１２Ｎ  ＨＣｌを添加し、最終ｐＨを１にした。さらに２６．０ｋｇの脱イオン水を添加し、得られた混合物を約５℃で１時間攪拌した。得られたスラリーを濾過し、メタノール／水の７５／２５混合物（１６．９Ｌのメタノール、５．６Ｌの水）で洗浄した。回収した固形物を真空下（２８水銀柱インチ）、４５℃で１２時間、０．５％以下の乾燥減量に乾燥させ、９．６Ｋｇの標題化合物（８３％収率）を得た。
【００６０】
実施例１５．  １７α−エチニル−５−アンドロステン−３β，７β，１７β−トリオールの再結晶：実施例１４で調製した粗製９．６Ｋｇの１７α−エチニル−５−アンドロステン−３β，７β，１７β−トリオールを、還流５０／５０メタノール／水（４．２Ｋｇのメタノールおよび５．４Ｋｇの水）に溶解させた。この溶液に、３３．４Ｋｇのメタノール、続いて３７．６ＫｇのＴＨＦを添加した。混合物を還流加熱し、すべての固形物が溶解するまで攪拌を継続し、この時点で、反応器の温度を６０〜７５℃に維持しながら、９９．８Ｋｇの脱イオン水を添加した。混合物を２時間かけて０〜５℃まで冷却し、攪拌を継続しながら、該温度で１時間維持した。固形物を濾過によって回収し、９．６Ｋｇの冷５０／５０メタノール水で洗浄し、真空下（２８水銀柱インチ）、５０℃で８時間乾燥させ、８．２Ｋｇの１７α−エチニル−５−アンドロステン−３β，７β，１７β−トリオールを得た。この最初の再結晶は、微量の着色不純物を最初の生成物から除去するために用いる。最初の再結晶による固形物を約１０：１メタノール：水（１４５．８Ｋｇのメタノールおよび１８．２Ｋｇの水）中で８０℃まで、すべての固形物が溶解するまで加熱することにより、２度目の再結晶を行った。この溶液（５５〜６０℃）を２５μｍフィルターに通して濾過し、微粒状不純物を除去し、この時点で、５５〜６０℃の２．５Ｋｇのメタノール（反応器のすすぎ洗いのために使用）を添加した。１２５ｍｍＨｇで７０℃での真空蒸留を、反応器に添加したメタノールの容量の０．９〜１．２倍の容量が蒸留液として回収されるまで、攪拌が可能であるように必要に応じて水を添加しながら（約１２０〜１６０Ｋｇの水を添加）行った。最終反応容量を２００〜２２５Ｌとした。反応器の混合物を０〜５℃まで冷却し、該温度で１時間維持した。得られたスラリーを濾過し、濾過ケークを１０Ｋｇの脱イオン水ですすぎ洗いし、真空下（２８水銀柱インチ）、５０℃で１２時間、残留水分含量０．５％未満まで乾燥させた。この単離手順を用いて、最終生成物中のＴＨＦ含量を減少させた。収量は、再結晶標題化合物８．０Ｋｇであった（８３％収率）。
【００６１】
スキームＩＩ：プロセスＢ，経路２
【００６２】
【化６】
2014231526.tif 000015
実施例１６．  ３β−アセトキシ−アンドロスタ−５−エン−７−オン−１７−オキシムの合成：３β−アセトキシ−アンドロスタ−５−エン−７，１７−ジオン（４５ｇ，１３０ｍｍｏｌ）を、８００ｍＬのメタノール、２００ｍＬのジクロロメタンおよび１４．５ｇのＥｔ３Ｎ（１４４ｍｍｏｌ）に溶解させた。この溶液に、室温で、１０ｇの塩酸ヒドロキシルアミンを２００ｍＬのメタノールに溶解させた溶液を添加した。一晩攪拌後、２００ｍＬの水を添加した後、揮発性有機物質を減圧下でのエバポレーションによって除去した。得られた残渣に、さらに１Ｌの水を添加して白色固形物を得、これを濾過し、水で充分に洗浄した。４５ｇの粗製標題オキシムが（１Ｈ−ＮＭＲによる純度９５％で）得られ、これを、さらに精製せずに次の工程で使用した。
【００６３】
実施例１７．  ３β−アセトキシ−アンドロスタ−５−エン−１７−オキシム−７β−オールの合成：４４ｇの３β−アセトキシ−アンドロスタ−５−エン−７−オン−１７−オキシム（１００ｍｏｌ％）を含む８００ｍＬのメタノールと２００ｍＬのテトラヒドロフランの溶液に、５０ｇの塩化セリウム七水和物（１１０ｍｏｌ％）を含む２０ｍＬのメタノールを添加した。得られた混合物を、固形物が完全に溶解するまで攪拌した。約−５℃まで冷却したこの溶液に、７ｇの水素化ホウ素ナトリウムを３０分間かけて添加した。さらに１．５時間−５℃で攪拌後、反応混合物をアセトン（１００ｍＬ）でクエンチし、次いで、室温まで３０分間かけて昇温させた。クエンチした反応混合物を真空濃縮し、揮発性有機物質を除去した。残渣に、８００ｍＬの水を添加した後、酢酸エチル（３×５００ｍＬ）で抽出した。合わせた有機抽出物をブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、次いで濃縮し、４２ｇの標題化合物を白色泡状物として得、これを、さらに精製せずに次の工程で使用した。
【００６４】
実施例１８．  ３β−アセトキシ−アンドロスタ−５−エン−１７−オン−７β−オール：４２ｇの３β−アセトキシ−アンドロスタ−５−エン−１７−オキシム−７β−オール（１００ｍｏｌ％）を含む２００ｍＬのエタノールの溶液に、１００ｍＬの水を添加した後、８０ｇ（４００ｍｏｌ％）の亜ジチオン酸ナトリウムを添加した。反応液を５５℃で加熱し、１６時間攪拌した。冷却後、反応液を減圧濃縮した。残渣を１００ｍＬの水で希釈し、得られた固形物を濾過によって回収し、１Ｌのジクロロメタンに再溶解させた。このＤＣＭ溶液に１ｇの活性炭を添加した。一晩攪拌後、混合物を濾過し、得られた濾液を水で洗浄し、乾燥させ、濃縮し、２５ｇの粗製生成物を得た。酢酸エチルからの再結晶により２２ｇの標題化合物を得た。
【００６５】
実施例１９．  エストロゲン受容体結合アッセイ：好適な系の一例は、ＥＲβ用のＰａｎＶｅｒａ製のエストロゲン受容体キットであり、これは、組換えエストロゲン受容体βリガンド、蛍光標識エストロゲンリガンドであるＦＬＵＯＲＭＯＮＥＴＭ  ＥＳ２（ＥＳ２）、および適切なバッファーを含む。この系を蛍光偏光競合アッセイにおいて使用した。該アッセイでは、化合物１の調製物などの試験物品または陽性対照がＥＳ２をその結合部位から移動させる。ＥＲβに結合すると、ＥＳ２はゆっくりと転動し、高い蛍光偏光値を有する。未結合ＥＳ２は、急速に転動し低い蛍光偏光値を示す。次いで、試験化合物の存在下での偏光値の変化により、該試験化合物のＥＲβに対する相対結合親和性（これは、偏光の最大半量シフトがもたらされる試験化合物の濃度であるＩＣ５０で示される）を測定する。ＩＣ５０から、Ｋｉを、チェン−プルソフの方程式［Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２２：３０９９−３１０８，（１９７３）］：Ｋｉ＝ＩＣ５０／（１＋Ｄ／Ｋｄ）（式中、Ｄは、ＥＳ２の濃度であり、Ｋｄは、ＥＲβに対するＥＳ２の結合の解離定数（Ｋｄ＝４±２ｎＭ）である）を用いて計算した。
【００６６】
競合アッセイは、製造業者のプロトコル（Ｌｉｔ．Ｎｏ．Ｌ０７１２，Ｒｅｖ．１０／０３）に従って行った。使用したアッセイ試薬は、バキュロウイルスで発現させた完全長ヒトＥＲβ  ４．５ｐｍｏｌ／μＬを含む５０ｍＭ  ビス−Ｔｒｉｓプロパン（ｐＨ＝９）、４００ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０％グリセロール、ＥＳ２  ４００ｎＭを含むメタノール、および１００ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ＝７．４）、１００μｇ／ｍＬ  ＢＧＧ、０．０２％ＮａＮ３からなるＥ２スクリーニングバッファーであった。ＥＳ２−ＥＲβ複合体は、２０μＬの２０ｎＭ  ＥＲβ（０．０２０ｐｍｏｌ／μＬ）と２０μＬの２ｎＭ  ＥＳ２（０．００２ｐｍｏｌ／μＬ）を用いて形成した。陽性対照（エストロゲン）溶液は、２０μＬの１．０ｍＭストック溶液含有ＤＭＳＯおよび８０μＬのＤＭＳＯを用いて調製した。１回目の希釈では、５０μＬのこの溶液を５０μＬのＤＭＳＯに添加し、続いて、これを２倍増ずつ希釈し、１４点希釈曲線を得る。２回目の希釈では、１回目の希釈の４μＬの各ＤＭＳＯ溶液に、４００μＬのＥＳ２スクリーニングバッファーを添加する。２０μＬの試験化合物（３８４ウェル黒色平底マイクロタイタープレート内で、直前に記載のようにして連続希釈したもの）に、２０μＬのＥＳ２−ＥＲβ複合体（０．５％最終ＤＭＳＯ濃度）を添加した後、暗所で２０〜３０℃にて１〜４時間インキュベーションした。試験化合物を、開始濃度を１０ｍＭにしたこと以外は同様にして処理した。蛍光偏光値は、４８５ｎｍ励起および５３０ｎｍ発光干渉フィルターを用いて取得する。ＥＲαの結合アッセイは、バキュロウイルスで発現させた完全長ヒトＥＲα  ２．８ｐｍｏｌ／μＬを試薬として使用し、ＥＲα−ＥＳ２複合体を、２０μＬの３０ｎＭ（０．０３０ｐｍｏｌ／μＬ）と２０μＬの２ｎＭ  ＥＳ２（０．００２ｐｍｏｌ／μＬ）から形成したこと以外は、Ｅｒβの場合のようにして行った。
【００６７】
実施例２０．  ＡＲ、ＧＲおよびＰＲ受容体結合アッセイ。ＡＲ競合アッセイは、製造業者のプロトコル（Ｌｉｔ．Ｎｏ．Ｌ０８４４，Ｒｅｖ．０５／０２）に従って、以下のこと以外はＥＲβで記載のようにして行った。使用した試薬は、組換えラットアンドロゲン受容体リガンド結合ドメイン（Ｈｉｓでタグ化）とＧＳＴ［ＡＲ−ＬＢＤ（Ｈｉｓ−ＧＳＴ）］を０．３８ｐｍｏｌ／μＬで含むバッファー（タンパク質安定化剤およびグリセロールを含有）（ｐＨ＝７．５）、２００ｎＭのＦＬＵＯＲＭＯＮＥＴＭ  ＡＬ  Ｇｒｅｅｎ（蛍光標識アンドロゲンリガンド）を含む２０ｍＭのＴｒｉｓ、９０％メタノール、ならびにＡＲスクリーニングバッファー（安定化剤およびグリセロールを含有，ｐＨ＝７．５，スクリーニングバッファー１ｍＬあたり２μＬの１ｍＭのＤＴＴを添加（添加ＤＴＴ中、ＡＲスクリーニングバッファーは２ｍＭ））とし、試薬として使用した。ＡＬ  Ｇｒｅｅｎ−ＡＲ複合体は、２０μＬの５０ｎＭ  ＡＲ（０．０５０ｐｍｏｌ／μＬ）と２０μＬの２ｎＭ  ＡＬ  Ｇｒｅｅｎ（０．００２ｐｍｏｌ／μＬ）を用いて形成した。Ｋｉは、受容体に対するフルオロフォアの結合の解離定数であるＫｄ＝２０±１０ｎＭを用いて計算した。
【００６８】
ＰＲ競合アッセイは、製造業者のプロトコル（Ｌｉｔ．Ｎｏ．Ｌ０５０３，Ｒｅｖ．０６／０３）に従って、以下のこと以外はＥＲβで記載のようにして行った。使用した試薬は、組換えヒトプロゲステロン受容体リガンド結合ドメイン（ＧＳＴでタグ化）［ＰＲ−ＬＢＤ（ＧＳＴ）を３．６ｐｍｏｌ／μＬで含む５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ＝８．０）、５００ｍＭ  ＫＣｌ、１Ｍ尿素、５ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＥＤＴＡおよび５０％グリセロール、４００ｎＭのＦＬＵＯＲＭＯＮＥＴＭ  ＰＬ  Ｇｒｅｅｎ（蛍光標識プロゲステロンリガンド）を含む２０ｍＭのＴｒｉｓ９０％メタノール（ｐＨ＝６．８）、ならびにＰＲスクリーニングバッファー（タンパク質安定化剤およびグリセロールを含有（ｐＨ＝７．４）、スクリーニングバッファー１ｍＬあたり４μＬの１ｍＭ  ＤＴＴを添加（添加ＤＴＴ中、ＰＲスクリーニングバッファーは４ｍＭ））とした。ＰＬ  Ｇｒｅｅｎ−ＰＲ複合体は、２０μＬの８０ｎＭ  ＰＲ（０．０８０ｐｍｏｌ／μＬ）と２０μＬの４ｎＭ  ＰＬ  Ｇｒｅｅｎ（０．００４ｐｍｏｌ／μＬ）を用いて形成した。Ｋｉは、受容体に対するフルオロフォアの結合の解離定数であるＫｄ＝４０ｎＭを用いて計算した。
【００６９】
ＧＲ競合アッセイは、製造業者のプロトコル（Ｌｉｔ．Ｎｏ．Ｌ０３０４，Ｒｅｖ．１２／０１）に従って、以下のこと以外はＥＲβで記載のようにして行った。使用した試薬は、組換え完全長ヒトグルココルチコイド受容体を０．２４０ｐｍｏｌ／μＬで含む１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ＝７．４）、２００ｍＭ  Ｎａ２ＭｏＯ４、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５ｍＭ  ＤＴＴおよび１０％グリセロール、２００ｎＭのＦＬＵＯＲＭＯＮＥＴＭ  ＧＳ１（蛍光標識グルココルチコイドリガンド）を含む７５％メタノール、ならびにＧＲスクリーニングバッファー（１００ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ＝７．４）、２００ｍＭ  Ｎａ２ＭｏＯ４、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、２０％ＤＭＳＯを含有、スクリーニングバッファー１ｍＬあたり５μＬの１ｍＭ  ＤＴＴを添加（添加ＤＴＴ中、ＧＲスクリーニングバッファーは５ｍＭ））、１ｍＭ  ＧＲ安定化ペプチド（これは、コアクチベーター関連ペプチドである［Ｃｈａｎｇ，ＣＹ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１９：８２２６−３６（１９９９）参照］）を含む１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ＝７．４）および１Ｍ  ＤＴＴ含有水とし、試薬として使用した。２．５ｍＬのＧＲスクリーニングバッファーに、２．５ｍＬのＧＲ安定化ペプチド溶液および１２５μＬの１Ｍ  ＤＴＴを添加し、ＧＲ安定化ペプチド−グルココルチコイド受容体複合体を形成させる。マイクロタイタープレートへの添加順は、２０μＬの試験化合物含有１％ＤＭＳＯ、１０μＬの１６ｎＭ  ＧＲ（０．０１６ｐｍｏｌ／μＬ）および最後に１０μＬの４ｎＭ  ＧＳ１とし、続いて、暗所にて２０〜３０℃で４時間インキュベーションを行った（全実験時間は７時間を超えてはならない）。Ｋｉは、受容体に対するフルオロフォアの結合の解離定数であるＫｄ＝０．３±０．１ｎＭを用いて計算した。
【００７０】
実施例２１．  １７α−エチニル−５−アンドロステン−３β，７β，１７β−トリオール（化合物１）の調製物の不純物プロファイリング
プロセスＡ：プロセスＢによる化合物１の調製物の不純物プロファイリングのためのＨＰＬＣ条件を表１に示す。
【００７１】
【表１】
2014231526.tif 000016
【００７２】
【表２】
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【００７３】
【表３】
2014231526.tif 000018
プロセスＢ：プロセスＢによる化合物１の調製物の不純物プロファイリングのためのＨＰＬＣ条件は、表１のものと同一である。
【００７４】
【表４】
2014231526.tif 000019
【外国語明細書】
2014231526000001.pdf