(57)【要約】      （修正有）【課題】生物学的試料中のインフルエンザＡウイルスのすべての既知のヒト変異体および少なくとも９０％のインフルエンザＡウイルスのトリおよびブタ変異体の検出のための方法、試薬、およびキットを提供する。【解決手段】インフルエンザＡウイルスのヒト、ブタ、およびトリ変異体の少なくとも９０％を増幅し得るポリヌクレオチドのセットであって、以下を含む少なくとも１つのプライマーペアを含む、セット：特定の塩基配列の少なくとも１０個の連続するヌクレオチドまたはその相補鎖を含む、フォワードプライマー；および特定の配列の少なくとも１０個の連続するヌクレオチドまたはその相補鎖を含む、リバースプライマー。インフルエンザＡウイルス変異体を増幅するためのキットであって、フォワードプライマーおよびリバースプライマーを含む1対のプライマーを含む、キット。インフルエンザＡウイルスの変異体の少なくとも９０％の存在を検出する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
インフルエンザＡウイルスのヒト、ブタ、およびトリ変異体の少なくとも９０％を増幅し得るポリヌクレオチドのセットであって、以下を含む少なくとも１つのプライマーペアを含む、セット：配列表の配列番号２に示す配列の少なくとも１０個の連続するヌクレオチドまたはその相補鎖を含む、フォワードプライマー；および配列表の配列番号３、４、５、または６に示す配列の少なくとも１０個の連続するヌクレオチドまたはその相補鎖を含む、リバースプライマー。
【請求項２】
前記それぞれのプライマーが、１５から３０のヌクレオチドの長さである、請求項１に記載のポリヌクレオチドのセット。
【請求項３】
前記フォワードプライマーが、配列表の配列番号２の核酸分子を含み、前記リバースプライマーが配列表の配列番号３、４、５または６からなる群から選択される核酸分子である、請求項１または２に記載のポリヌクレオチドのセット。
【請求項４】
インフルエンザＡウイルス変異体を増幅するためのキットであって、請求項１記載のフォワードプライマーおよびリバースプライマーを含む1対のプライマーを含む、キット。
【請求項５】
請求項４記載のキットであって、前記少なくとも１対のプライマーが、以下を含む、キット：ａ）配列表の配列番号２および配列表の配列番号３、ｂ）配列表の配列番号２および配列表の配列番号４、ｃ）配列表の配列番号２および配列表の配列番号５、またはｄ）配列表の配列番号２および配列表の配列番号６。
【請求項６】
請求項４記載のキットであって、さらに、配列表の配列番号１に示す配列の一部からなる核酸を含む、キット。
【請求項７】
請求項４記載のキットであって、さらに、少なくとも二つの検出プローブのパネルを含み、ここで、検出プローブの少なくとも一つは、増幅産物中の配列の少なくとも一部に相補的である、キット。
【請求項８】
生物学的試料におけるインフルエンザＡウイルスの変異体の少なくとも９０％の存在を検出する方法であって、生物学的試料由来の少なくとも１つのインフルエンザＡターゲット核酸を、そのウイルスゲノムの保存されている領域に向けられたプライマー対を使って増幅する工程であって、該少なくとも１つのプライマー対が、ａ）配列表の配列番号２および配列表の配列番号３、ｂ）配列表の配列番号２および配列表の配列番号４、ｃ）配列表の配列番号２および配列表の配列番号５、またはｄ）配列表の配列番号２および配列表の配列番号６を含む工程；および増幅されたターゲット核酸を検出する工程、を含む方法。
【請求項９】
生物学的試料におけるインフルエンザＡウイルスの変異体の少なくとも９０％の存在を検出する方法であって、ウイルスゲノムの保存された領域に向けられた少なくとも一つのプライマーを使って、少なくとも一つのインフルエンザＡターゲット核酸を増幅する工程であって、該少なくとも１つのプライマーが、ａ）配列表の配列番号２、ｂ）配列表の配列番号３、ｃ）配列表の配列番号４、ｄ）配列表の配列番号５、またはｅ）配列表の配列番号６を含む工程；および増幅されたターゲット核酸を検出する工程を含む、方法。
【請求項１０】
請求項８または９の方法であって、前記インルエンザＡの前記変異体が、ヒトインフルエンザＡ、トリインフルエンザＡ、およびブタインフルエンザＡからなる群から選択される、方法。
【請求項１１】
請求項８または９の方法であって、前記増幅されたターゲット核酸が、増幅された核酸を、検出プローブの少なくとも一つが増幅された核酸中の配列の少なくとも一部に相補的であるような検出プローブのパネルと接触させ、そして、前記試料における前記ターゲット核酸の存在を示すシグナルが生成したかどうかを決定することによって検出される、方法。
【請求項１２】
前記パネルが、インフルエンザＡの前記変異体の各ウイルスについて、増幅されるべき少なくとも一つのインフルエンザＡターゲットの配列に相補的な少なくとも一つの検出プローブを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記検出プローブの少なくとも一つは、前記保存された領域の配列を持つ核酸または前記保存された領域の相補体の少なくとも一部に相補的である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記検出プローブの少なくとも一つが、増幅されたＤＮＡ中の一つ以上のタグ配列に相補的である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記検出プローブの少なくとも一つが、増幅されたターゲットＤＮＡに相補的な配列と、汎用検出用プローブにハイブリダイズする能力を持つタグ配列の両者を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記検出プローブの少なくとも一つは、配列表の配列番号７および８からなる群から選択される少なくとも１０個の連続ヌクレオチドを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
前記シグナルが、使い果たされずに複数のシグナルを生成することができる触媒的検出試薬によって生成される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
前記保存された領域が配列表の配列番号１に示す配列の一部を含む、請求項８または９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、米国特許法第１１９条に基づき、２００６年５月１１日に出願された米国仮特許出願第６０／７９９，５２３号（これを参照することによりその全てが本明細書に援用される）への優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、１００％配列一致によるインフルエンザＡウイルス変異体の検出に関する。より具体的には、本発明は、生物学的試料中のインフルエンザＡウイルスを検出するための方法および試薬ならびにそれらの方法を実行するためのキットに関する。
【背景技術】
【０００３】
インフルエンザＡウイルスはオルソミクソウイルス属のＲＮＡウイルスであり、インフルエンザ（気道を冒す急性ウイルス感染症）の原因物質である。これは、鼻粘膜、咽頭、および結膜の炎症、ならびに頭痛および重度の（しばしば全身性の）筋肉痛を特徴とする。インフルエンザの流行は歴史を通じて記録されてきたが、なかでも最悪の流行は、世界中で約２０００万例の死亡、米国において約５００，０００例の死亡を引き起こした１９１８年の大流行である（Ｓａｍ Ｂａｒｏｎ「ＭＥＤＩＣＡＬ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ」第４版、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｅｘａｓ−Ｇａｌｖｅｓｔｏｎ（１９９６））。
【０００４】
インフルエンザＡウイルスは、分節ゲノムを持つ一本鎖ＲＮＡウイルスである。ゲノムＲＮＡは、５’末端および３’末端に非コード配列が隣接する一つ以上のオープンリーディングフレームを含有する（Ｄｅｓｓｅｌｂｅｒｇｅｒら，Ｇｅｎｅ １９８０，８：３１５）。その遺伝子構成は、このウイルスが異なる株から遺伝子分節の再集合によって進化することを可能にし、この再集合は、新たに感染した生物がそれに対する既往免疫応答を持たない新しい変異体を生み出す。いくつかのインフルエンザＡサブタイプは種特異的であるが、トリ類には全てのサブタイプが見出される（Ｗｅｂｓｔｅｒら，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．１９９２，５６：１５２）。
【０００５】
各サブタイプは多くの異なる株を包含し、ＲＮＡゲノムの変異性が高いため、新しい株が頻繁に生じている。水鳥を循環している１５個のヘマグルチニン（ＨＡ）および９個のノイラミニダーゼ（ＮＡ）サブタイプのうち、Ｈ１Ｎ１、Ｈ２Ｎ２およびＨ３Ｎ２サブタイプの三つは、ヒトに汎流行を引き起こしたことが知られている（Ｗｅｂｓｔｅｒら，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．１９９２，５６：１５２）。ヒトにおいて病原性を示す新しい株の生成には、ブタが中間宿主（「混合容器」）として役立ちうるという証拠もある（Ｓｃｈｏｌｔｉｓｓｅｋら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９８５，１４７：２８７）。１９９７年に香港で致命的な「トリインフルエンザ」の大発生を引き起こしたトリウイルスＨ５Ｎ１は、高病原性インフルエンザＡウイルスがトリ種からヒトへも直接的に伝播されうることを明らかにした（Ｃｌａａｓら，Ｌａｎｃｅｔ １９９８，３５１：４７２；Ｓｕａｒｅｚら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１９９８，７２：６６７８；Ｓｕｂｂａｒａｏら，Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９８，２７９：３９３；Ｓｈｏｒｔｒｉｄｇｅ，Ｖａｃｃｉｎｅ １９９９，１７（Ｓｕｐｐｌ．１）：Ｓ２６；ＷｅｂｂｙおよびＷｅｂｓｔｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００３，３０２：１５１９）。
【０００６】
インフルエンザＡに対する処置は、ノイラミニダーゼ阻害剤などの抗ウイルス治療によって受けることができる。これらの抗ウイルス処置は、発病後最初の４８時間以内に投与された場合に、最も有効である。Ｈａｙｄｅｎら，Ｊ．Ａｍ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．１９９９；２８２：１２４０。しかし、インフルエンザＡウイルス株の存在を検出する伝統的な方法は、細胞株または孵化鶏卵における増殖を含む長期間の工程を伴う場合がある。次にウイルス抗原が、インフルエンザウイルスに特異的な蛍光標識または免疫ペルオキシダーゼ標識抗体を使って、細胞培養物中に検出される。これらの伝統的培養方法の主な欠点は、それらがしばしば数日を要し、臨床的に有意義な時間枠では、すなわち発症後最初の４８時間以内には、結果が得られないことである。Ｎｅｗｔｏｎら，Ａｍ．Ｊ．Ｍａｎａｇ．Ｃａｒｅ ２０００，６：Ｓ２６５を参照されたい。
【０００７】
検査室診断の所要時間を短縮するためのさらなる努力として、患者検体中のウイルス核酸を検出するために分子的方法が利用されている。核酸増幅法では、伝統的なウイルス培養および免疫蛍光技法よりも良好な感度が得られる。ＥｌｌｉｓおよびＺｏｍｂｏｎ，Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．，２００２，１２：３７５を参照されたい。増幅に基づく方法は、典型的には、二つの基本ステップ、すなわち１）特異的アンプリコンを生成させるための一組のオリゴヌクレオチドプライマーを使った増幅、および２）ウイルスの存在をシグナルするための、好ましくは配列特異的ハイブリダイゼーションプローブを用いる、アンプリコンの検出を含む。
【０００８】
多くの異なるインフルエンザＡ株がゲノムレベルで多重のヌクレオチド相違を示すので、既存の方法では増幅プライマーおよび検出プローブが最も多く保存された核酸領域に置かれている。Ｆｏｕｃｈｉｅｒら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０００，３８：４０９６；Ｓｐａｃｋｍａｎら，Ａｖｉａｎ Ｄｉｓ．２００３，４７：１０７９。しかし、ヒトに重度の疾患を引き起こしうる数多くのさまざまな他種変異体、特にトリ類（＞６５０トリ変異体）は言うまでもなく、既に存在するヒトインフルエンザＡ変異体（＞４５０配列）に限っても、その全体にわたって１００％配列ホモロジーを持つような領域を同定することは不可能である。異なる変異体では与えられた領域の異なる部分に可変性が出現するので、既存のウイルス変異体に対して１００％配列ホモロジーを達成するために縮重オリゴヌクレオチドを使用すると、オリゴヌクレオチドの複雑度が著しく増加する。Ｓｕａｒｅｚ ａｎｄ Ｐｅｒｄｕｅ，Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ．１９９８，５４：５９；Ｘｕら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９９６，２２４：１７５．これは多数の検出プローブの使用および検出感度の低下につながる。
【０００９】
したがって、ヒトインフルエンザＡ変異体を検出するための現行の増幅に基づく検出方法では、既存の全てのヒト変異体およびトリ変異体のいくつかを、増幅および検出プローブに関して、診断製品開発にとって望ましいプロセスである１００％配列ホモロジーに基づいて検出することができない。むしろ、そうではなくて、既存の方法における検出の程度は、ウイルス変異体に対する増幅および検出オリゴヌクレオチドの配列ホモロジーの度合いの関数である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｓａｍ Ｂａｒｏｎ「ＭＥＤＩＣＡＬ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ」第４版、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｅｘａｓ−Ｇａｌｖｅｓｔｏｎ（１９９６）
【非特許文献２】Ｄｅｓｓｅｌｂｅｒｇｅｒら，Ｇｅｎｅ １９８０，８：３１５
【非特許文献３】Ｗｅｂｓｔｅｒら，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．１９９２，５６：１５２
【非特許文献４】Ｓｃｈｏｌｔｉｓｓｅｋら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９８５，１４７：２８７
【非特許文献５】Ｃｌａａｓら，Ｌａｎｃｅｔ １９９８，３５１：４７２
【非特許文献６】Ｓｕａｒｅｚら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１９９８，７２：６６７８
【非特許文献７】Ｓｕｂｂａｒａｏら，Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９８，２７９：３９３
【非特許文献８】Ｓｈｏｒｔｒｉｄｇｅ，Ｖａｃｃｉｎｅ １９９９，１７（Ｓｕｐｐｌ．１）：Ｓ２６
【非特許文献９】ＷｅｂｂｙおよびＷｅｂｓｔｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００３，３０２：１５１９）
【非特許文献１０】Ｈａｙｄｅｎら，Ｊ．Ａｍ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．１９９９；２８２：１２４０ ；Ｓｐａｃｋｍａｎら，Ａｖｉａｎ Ｄｉｓ．２００３，４７：１０７９
【非特許文献１１】Ｎｅｗｔｏｎら，Ａｍ．Ｊ．Ｍａｎａｇ．Ｃａｒｅ ２０００，６：Ｓ２６５
【非特許文献１２】ＥｌｌｉｓおよびＺｏｍｂｏｎ，Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．，２００２，１２：３７５
【非特許文献１３】Ｆｏｕｃｈｉｅｒら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０００，３８：４０９６
【非特許文献１４】Ｓｐａｃｋｍａｎら，Ａｖｉａｎ Ｄｉｓ．２００３，４７：１０７９
【非特許文献１５】Ｓｕａｒｅｚ ａｎｄ Ｐｅｒｄｕｅ，Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ．１９９８，５４：５９
【非特許文献１６】Ｘｕら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９９６，２２４：１７５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
したがって、全てのインフルエンザＡ変異体の１００％理論検出を達成する核酸検出方法は、当技術分野では求められていながら、まだ得られていない。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
可変ゲノムの検出方法およびそのための試薬を開示する。本発明では、生物学的試料中のインフルエンザＡウイルスのヒト変異体の少なくとも９０％、好ましくは１００％、ならびにインフルエンザＡウイルスのトリおよびブタ変異体の少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％の存在を、インフルエンザＡマトリックス遺伝子の高度に保存された領域に対して特異的な増幅プライマーに基づいて、低コストで確実に検出することができる。
【００１３】
上記に従って、本明細書には、当該ポリヌクレオチドセットがインフルエンザＡウイルスのヒト、ブタおよびトリ変異体の少なくとも９０％を増幅する能力を持つように、それぞれが、配列番号１に示す配列を持つターゲット核酸の一部と実質的に同じであるか、配列番号１に示す配列を持つターゲット核酸の一部に対して実質的に相補的である、少なくとも一つのフォワードプライマーと、少なくとも一つのリバースプライマーとを含む、一組のポリヌクレオチドを記載する。一定の態様において、インフルエンザＡの変異体は、ヒトインフルエンザＡ、トリインフルエンザＡまたはブタインフルエンザＡを含む群から選択される。さらにもう一つの態様において、インフルエンザＡの変異体は、ヒトインフルエンザＡ、トリインフルエンザＡおよびブタインフルエンザＡの任意の組合せを含む。さらにもう一つの実施形態において、各プライマーは少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、または少なくとも１５ヌクレオチド長である。一定の態様では、各プライマーが１５〜３０ヌクレオチド長である。
【００１４】
一定の実施形態では、フォワードプライマーが配列番号２の核酸分子を含み、リバースプライマーが配列番号３、４、５または６を含む群から選択される核酸分子である。もう一つの実施形態では、フォワードプライマーが配列番号２の少なくとも１０個の連続するヌクレオチドを含み、リバースプライマーが配列番号３、４、５または６を含む群から選択される少なくも１０個の連続するヌクレオチドを含む。
【００１５】
さらに本明細書には、インフルエンザＡウイルス変異体を増幅するためのキットであって、ターゲット核酸からの増幅産物の生成に関与するように適合させたインフルエンザＡウイルス核酸または同核酸の相補体に対して実質的に相補的なヌクレオチド配列を持つ１対のプライマーを含むキットも記載する。好ましい実施形態において、このプライマー対は、インフルエンザＡウイルスのヒト変異体の少なくとも９０％ならびにインフルエンザＡウイルスのトリおよびブタ変異体の少なくとも８０％を増幅する能力を持つ。好ましくは、少なくとも１対のプライマーが、以下に挙げる対のうちの一つを含む：
【００１６】
ｉ）配列番号２および配列番号３、
【００１７】
ｉｉ）配列番号２および配列番号４、
【００１８】
ｉｉｉ）配列番号２および配列番号５、または
【００１９】
ｉｖ）配列番号２および配列番号６。
【００２０】
好ましい実施形態において、本キットはさらに、配列番号１に示す配列の一部からなる核酸を含み、さらに、少なくとも二つの検出プローブのパネルを含み、それら検出プローブの少なくとも一つは、増幅産物中の配列の少なくとも一部に相補的である。
【００２１】
一定の態様において、パネルは、インフルエンザＡの前記変異体の各ウイルスについて、増幅されるべき少なくとも一つのインフルエンザＡターゲットの配列に相補的な少なくとも一つの検出プローブを含む。さらにもう一つの実施形態において、パネルは、インフルエンザＡの前記変異体の各ウイルスについて、増幅されるべき少なくとも一つのインフルエンザＡターゲットの配列に対して実質的に相補的な少なくとも一つの検出プローブを含む。
【００２２】
本発明のもう一つの態様は、生物学的試料におけるインフルエンザＡウイルスの変異体の少なくとも９０％の存在を検出する方法である。好ましい実施形態では、次に、生物学的試料由来のターゲット核酸が、そのウイルスの少なくとも二つを上回る変異体にわたって保存されているウイルスゲノムの領域に向けられたプライマー対（少なくとも一つのフォワードプライマーと少なくとも一つのリバースプライマーとが組み合わされて前記変異体のターゲットゲノムに結合するようになっているもの）を使って増幅される。次に、増幅された核酸を、検出プローブの少なくとも一つが増幅された核酸中の配列の少なくとも一部に相補的であるような検出プローブのパネルと接触させ、次に、前記試料における前記ターゲット核酸の存在を示すシグナルが生成したかどうかを決定することによって、増幅されたターゲット核酸を検出する。
【００２３】
本発明のもう一つの態様は、生物学的試料におけるインフルエンザＡウイルスの変異体の少なくとも９０％の存在を検出する方法であって、ウイルスゲノムの保存された領域（そのウイルスの少なくとも二つを上回る変異体にわたって保存されている領域）に向けられた少なくとも一つのプライマーを使って、少なくとも一つのインフルエンザＡターゲット核酸を増幅すること、および増幅されたターゲット核酸を検出することを含む方法である。好ましい実施形態では、インフルエンザＡの前記変異体が、ヒトインフルエンザＡ、トリインフルエンザＡまたはブタインフルエンザＡを含む群から選択される。好ましくは、前記少なくとも一つのプライマーは、配列番号２；配列番号３；配列番号４；配列番号５；または配列番号６を含む。
【００２４】
上記実施形態の一部の態様では、増幅されたターゲット核酸が、増幅された核酸を、検出プローブの少なくとも一つが、増幅された核酸中の配列の少なくとも一部に相補的であるような検出プローブのパネルと接触させ、前記試料における前記ターゲット核酸の存在を示すシグナルが生成したかどうかを決定することによって検出される。
【００２５】
もう一つの態様において、パネルは、インフルエンザＡの前記変異体の各ウイルスについて、増幅されるべき少なくとも一つのインフルエンザＡターゲットの配列に相補的な少なくとも一つの検出プローブを含む。
【００２６】
一定の態様において、パネルは、インフルエンザＡの前記変異体の少なくとも一つのウイルスについて、増幅されるべき少なくとも一つのインフルエンザＡターゲットの配列に対して実質的に相補的な少なくとも一つの検出プローブを含む。
【００２７】
一定の態様において、前記検出プローブの少なくとも一つは、前記保存された領域の配列を持つ核酸または前記保存された領域の相補体の少なくとも一部に相補的である。
【００２８】
ある実施形態において、これら検出プローブの少なくとも一つは、インフルエンザＡウイルスマトリックスタンパク質の保存された領域に相補的である。もう一つの実施形態において、これら検出プローブの少なくとも一つは、増幅されたＤＮＡ中の一つ以上のタグ配列に相補的である。もう一つの実施形態では、検出プローブ自体が、増幅されたターゲットＤＮＡに相補的な配列と、汎用検出用プローブにハイブリダイズする能力を持つタグ配列の両者を含む。
【００２９】
さらにもう一つの実施形態において、前記検出プローブの少なくとも一つは、配列番号７または８を含む群から選択される少なくとも１０個の連続ヌクレオチドを含む。
【００３０】
一部の実施形態において、ターゲット核酸の存在を示すシグナルは、使い果たされずに複数のシグナルを生成することができる触媒的検出試薬によって生成される。好ましい実施形態では、ターゲット核酸の保存された領域が配列番号１に示す配列の一部を含む。好ましくは、少なくとも一つのプライマー対が、以下に挙げる対の一つを含む：
【００３１】
ｉ）配列番号２および配列番号３、
【００３２】
ｉｉ）配列番号２および配列番号４、
【００３３】
ｉｉｉ）配列番号２および配列番号５、または
【００３４】
ｉｖ）配列番号２および配列番号６。もう一つの態様は、インフルエンザＡウイルスを検出するためのキットであって、増幅産物の作製に関与する能力を持つ少なくとも一つのプライマー、および増幅産物の形成を検出する能力を持つ検出試薬を含むキットである。
【００３５】
もう一つの態様は、インフルエンザＡウイルスを検出するためのキットであって、増幅産物の作製に関与する能力を持つ一組のプライマー、および増幅産物の形成を検出する能力を持つ検出試薬を含むキットである。
【発明の効果】
【００３６】
本開示は概して生物学的試料中のインフルエンザＡ変異体を検出するための方法に関する。先行技術に対する利点には、全ての既知ヒトインフルエンザＡ変異体が検出されると共に、新しい変異体も高い確率で検出されることが含まれる。さらにまた、全てのトリＨ５Ｎ１変異体を含めて、全てのトリおよびブタ変異体のうち９０％を超える変異体が検出されることも有利である。
【００３７】
本開示には、インフルエンザＡウイルス変異体の検出感度が高いという利点もある。先行技術では、全ての既知変異体を増幅し検出するために複雑な縮重プライマーと多数の検出プローブを利用し、その結果として、ノイズの増加と感度の低下が起こる。しかし本開示では、増幅オリゴヌクレオチドと検出プローブのどちらについても、複雑性がより低いものを使って、より高い検出感度を達成する。
【００３８】
最後に、本開示の汎用性は、検出範囲および感度検証研究の観点から、関連検出技術の開発により良く適している。先行技術には、コンセンサス配列との相違を持つ全ての既知変異体を試験することが要求されるという欠点がある。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】インフルエンザＡウイルスの１０００を超える変異体の比較配列解析の結果を図示し、インフルエンザＡウイルスのマトリックスタンパク質の１００％保存された領域を示している。図１Ａは、配列表に配列番号９として示すフォワードプライマー領域に関する解析を示す。図１Ｂは、配列番号１０に示すリバースプライマー領域に関する解析を示す。第１列は宿主種（ブタ、トリ）またはヒトサブタイプ（例えばＨ５Ｎ１）を表し、第２列は、解析されたそのカテゴリー内の変異体の数を示す。最下行はコンセンサス配列を示し、プライマー設計の位置を網掛け表示している。
【図２】本発明の一形態を図示している。フォワードプライマー、リバースプライマー、および検出オリゴヌクレオチドが示されている。
【図３】本発明による一実験の結果を図示している。一連の異なる検出プローブのそれぞれについて相対的単位で表した電気化学的検出シグナルのグラフが示されている。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
[定義および略号]
【００４１】
「増幅試薬」は、選択されたＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲ増幅手順を行うために使用されるさまざまな緩衝液、酵素、プライマー、デオキシヌクレオシド三リン酸、およびオリゴヌクレオチドを一括して示す。
【００４２】
「増幅する」または「増幅」は、特異的なポリヌクレオチドプローブまたはプライマーを使用する、任意の適切な核酸増幅法を意味する。当技術分野で知られている適切な技法には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ＴＭＡ法（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：転写媒介増幅）、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（ＯＬＡ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、ローリングサークル増幅法（ＲＣＡ）などがある。しかしこれらの用語は、好ましくは、特異的ターゲット配列を増幅するために設計されたＰＣＲの結果として起こる、ターゲット配列の基本的に量的な、そして好ましくは対数的な、任意の増加を指す。「アンプリコン」は増幅産物を意味する。
【００４３】
「アニール」は、オリゴヌクレオチドとターゲット配列の間の相補的ハイブリダイゼーションを指し、逆転写酵素もしくはＤＮＡポリメラーゼのための望ましいプライミングを達成するために、またはハイブリダイゼーションシグナルを検出するために、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを下げることによって対応することができる軽微なミスマッチを包含する。
【００４４】
「生物学的試料」は、ターゲット配列を含有するのではないかと疑われるあらゆるものを示す。生物学的試料は制限なく任意の生物学的由来源に由来することができる。生物学的試料は（ｉ）由来源から得られたものをそのまま使用するか、または（ｉｉ）試験試料の特徴を修飾するための前処理を行った後に使用することができる。したがって生物学的試料は、使用する前に、例えば細胞および／またはビリオンを破壊すること、固形の生物学的試料から液体を調製すること、粘稠な液体を希釈すること、液体を濾過すること、液体を蒸留すること、液体を濃縮すること、妨害化合物を不活化すること、試薬を加えること、核酸を精製することなどによって、前処理することができる。
【００４５】
「ｃＤＮＡ」は、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）の作用によってＲＮＡテンプレートから作製される相補的ＤＮＡまたはコピーＤＮＡを指す。
【００４６】
「相補的」は、Ｃ−ＧおよびＡ−ＴまたはＡ−Ｕ結合を可能にする整列されたヌクレオチドの相補性ゆえにハイブリダイズする能力を持つポリヌクレオチド、例えばＤＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖またはＲＮＡの自己相補鎖を指す。
【００４７】
「コンセンサス配列」は、関連する配列を互いに比較して、類似する機能的配列モチーフを見つけ出す、多重配列アラインメントの結果を表示する方法を指す。コンセンサス配列は、どの残基が保存されているか（常に同じであるか）、そしてどの残基が可変であるかを示す。
【００４８】
「検出プローブ」は、広く、ターゲット配列またはタグに結合する能力を持つ分子を指し、この場合、「検出プローブ」は、支持体上に固定化されたプローブ分子および支持体に固定化されていないプローブ分子を包含しうる。より具体的には、本明細書において使用する用語「プローブ配列」は、オリゴヌクレオチドプローブのヌクレオチド配列を指し、この場合、「プローブ配列」は、配列を構成するヌクレオチドの物理的ひも（列）を示すか、ヌクレオチドのひも（列）の性質を表現する情報文字列を示すことができ、その場合、そのような情報文字列は、望ましい性質を持つ一組のプローブを設計または選択するために、プログラムの一部として操作することができる。用語「検出プローブ」は、本明細書では、検出プローブに対するタグのハイブリダイゼーションを測定するための検出手段と結合されたタグ相補的プローブを指すために、広く使用される。
【００４９】
「ハイブリダイゼーション」は、相補的塩基対形成によって、二つの一本鎖核酸が二本鎖構造を形成することを指す。ハイブリダイゼーションは厳密に相補的な核酸鎖間または軽微なミスマッチ領域を含有する核酸鎖間で起こりうる。本明細書において使用する用語「実質的に相補的」は、軽微なミスマッチ領域を除けば相補的であるような配列を指し、この場合、ミスマッチしたヌクレオチドの総数は、約１５〜約３５ヌクレオチド長の配列の場合で、約３を超えない。厳密に相補的な核酸鎖だけがハイブリダイズするような条件を「ストリンジェントな」または「配列特異的な」ハイブリダイゼーション条件という。実質的に相補的な核酸の安定な二本鎖は、それよりストリンジェンシーが低いハイブリダイゼーション条件下で達成することができる。核酸技術の当業者であれば、例えばオリゴヌクレオチドの長さおよび塩基対濃度、イオン強度、およびミスマッチした塩基対の出現率を含むいくつかの変量を考慮して、二本鎖の安定性を経験的に決定することができる。二本鎖安定性を計算するためのコンピューターソフトウェアは、さまざまなベンダーから市販されている。
【００５０】
「核酸」は、一本鎖型または二本鎖型のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーを指し、別段の限定がない限り、天然ヌクレオチドと同じまたは類似する様式で機能することができる天然ヌクレオチドの既知の類似体を包含する。
【００５１】
「オリゴヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド」は、二つ以上のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドから構成される分子、例えばプライマー、プローブ、検出されるべき核酸フラグメント、および核酸コントロールなどを指す。ポリヌクレオチドの厳密なサイズは、多くの因子およびそのポリヌクレオチドの最終的な機能または用途に依存する。ポリヌクレオチドは、当技術分野において現在知られているか、将来開発される任意の適切な方法により、例えば従来の周知のヌクレオチドホスホルアミダイト化学と、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（カリフォルニア州フォスターシティー）；Ｄｕｐｏｎｔ（デラウェア州ウィルミントン）；またはＭｉｌｌｉｇｅｎ（マサチューセッツ州ベッドフォード）から入手することができる装置とを使って製造することができる。
【００５２】
「ＰＣＲ」はポリメラーゼ連鎖反応を示す。
【００５３】
「ＲＴ−ＰＣＲ」は逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応を示す。
【００５４】
「逆転写酵素」は、デオキシリボヌクレオシド三リン酸の重合を触媒してリボ核酸テンプレートに相補的なプライマー伸長産物を形成させる酵素を指す。この酵素は、ＲＮＡテンプレートにアニールされるプライマーの３’末端で合成を開始し、ＲＮＡテンプレートの５’末端に向かって合成が終結するまで進行する。
【００５５】
「プライマー」は、核酸鎖に相補的なプライマー伸長産物の合成が誘導される条件下で、すなわち適当な緩衝液中の四つの異なるヌクレオシド三リン酸および重合用の薬剤（すなわちＤＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素）の存在下、適切な温度で、ＤＮＡ合成の開始点として作用する能力を持つオリゴヌクレオチド（天然物であるか合成物であるかを問わない）を指す。プライマーは好ましくは一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドである。プライマーの適当な長さは、そのプライマーの使用目的に依存するが、典型的には１５〜３０ヌクレオチドの範囲であり、８ヌクレオチド程度の短いものであってもよいし、５０または１００ヌクレオチド程度の長いものであってもよい。短いプライマー分子は、一般に、テンプレートと十分に安定なハイブリッド複合体を形成するのに、より低い温度を要求する。プライマーはテンプレートの厳密な配列を反映する必要はないが、テンプレートとハイブリダイズするように十分に相補的でなければならない。プライマーは「フォワード」または「リバース」であることができる。フォワードプライマーは、そのプライマーが組み込まれる鎖の合成を開始させるために使用されるプライマーを指す。リバースプライマーは、フォワードプライマーによって合成が開始された鎖に相補的な鎖の合成を開始させるために使用されるプライマーを指す。
【００５６】
「株」および「サブタイプ」は、インフルエンザＡ型ウイルスの分類を指す。現在、Ａ型インフルエンザには、ヘマグルチニン（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）表面糖タンパク質によって分類される１５のサブタイプがある。各サブタイプ内に、ヌクレオチドレベルで変異を持つ株または変異体が数多く存在する。
【００５７】
「タグ」は、広く、プローブに結合する能力を持つ分子を指し、この場合、「タグ」はターゲット分子に取り付けられたタグ分子、ターゲット分子に取り付けられていないタグ分子、コンピューター可読型の発現されたタグ、および本明細書に開示するタグの概念を包含しうる。本明細書において使用する用語「タグ配列」は、オリゴヌクレオチドタグのヌクレオチド配列を指し、この場合、「タグ配列」または「識別用タグ配列」は、ヌクレオチドのひもを示すか、そのヌクレオチドのひもの性質を表現する情報文字列を示すことができ、その場合、そのような情報文字列は、望ましい性質を持つ一組のタグを設計または選択するために、プログラムの一部として操作することができる。本発明において「識別用タグ」は、特定ターゲットの独特な識別子として役立つように選択されるタグである。本明細書において使用する用語「識別用タグ」は、相補的検出プローブに結合するオリゴヌクレオチドと、識別用タグのヌクレオチド配列との両方を指すために使用される。用語「識別用タグの相補体」は、識別用タグのヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を持つオリゴヌクレオチドを構成するヌクレオチドのひもを指すことができ、その相補体のヌクレオチド配列（情報文字列）を指すこともできる。
【００５８】
「ターゲット配列」または「ターゲット領域」は同義語であり、検出されかつ／または増幅されるか、さもなければ、本明細書に記載するプライマーまたはプローブの一つにストリンジェントな条件下でアニールするであろう核酸配列（一本鎖または二本鎖）を示す。
【００５９】
「耐熱性ポリメラーゼ」は、熱に対して比較的安定であり、ヌクレオシド三リン酸の重合を触媒して、ターゲット配列の核酸鎖の一つに相補的なプライマー伸長産物を形成させる酵素を指す。この酵素は、テンプレートにアニールされるプライマーの３’末端で合成を開始し、テンプレートの５’末端に向かって合成が終結するまで進行する。精製耐熱性ポリメラーゼ酵素は、米国特許第４，８８９，８１８号および同第５，０７９，３５２号に、さらに詳しく記載されている。この用語は、逆転写酵素活性を持つポリメラーゼを包含する。Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓおよびＰｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（ウィスコンシン州マディソン）など多数の供給業者から数多くの耐熱性ポリメラーゼを入手することができる。
【００６０】
「転写物」は、ＲＮＡポリメラーゼ（典型的にはＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ）の産物を指す。
【００６１】
[説明]
ある態様では、インフルエンザＡウイルスのヒト変異体の少なくとも９０％、好ましくは１００％、ならびにインフルエンザＡウイルスのトリおよびブタ変異体の少なくとも８０％、ただし好ましくは９０％を検出する能力を持つポリヌクレオチドが提供される。したがって、本ポリヌクレオチドは、インフルエンザＡウイルスマトリックスタンパク質遺伝子の高度に保存された領域に向けられる（図１）。ヒトおよび他の動物から同定された１０００を超えるインフルエンザＡ変異体からのマトリックスタンパク質遺伝子の核酸配列解析を注意深く行ったところ、変異体間の相違はマトリックスタンパク質遺伝子内では限られていることが明らかになった。したがって、その境界内において、さまざまな変異体ゆえの相違を異なる位置に持つが、それらの間で少なくとも全てのヒト変異体に１００％配列ホモロジーを達成するような、保存された領域を同定することが可能である。したがって、任意の与えられたウイルス変異体について、他の変異体と１００％ホモロジーを共有する領域が常に少なくとも一つは存在する。増幅および検出プローブを１００％ホモロジー領域に配置することにより、全ての変異体の１００％理論検出が保証される。
【００６２】
[プライマー配列および検出プローブ配列の同定]
図１に、１０００を超えるインフルエンザＡウイルス変異体の比較配列解析の結果を図示する。図１Ａと図１Ｂのどちらにおいても、各行は、コンセンサス配列（最下行）と比較してウイルスのブタ、トリ、およびヒト変異体中に同定されるヌクレオチドの相違を表す。例えば、４Ｇ（図１Ａ、最上行）は、１４２個のブタ変異体のうち４個が、この位置にグアノシン（Ｇ）ヌクレオチドを、アデノシン（Ａ）ヌクレオチドの代りに含有することを示している。一部の変異体は二つ以上の塩基置換を持ち、それらを「＊」記号および「＃」記号で表す（図１Ｂ）。
【００６３】
好ましい実施形態では、フォワードプライマーが、全てのヒト変異体間で既知のヌクレオチド相違を含有しないインフルエンザＡマトリックスタンパク質の領域に相補的である（図１Ａ、網掛けした配列）。一部のトリおよびブタ変異体のこの領域にあるヌクレオチド相違が少数であることからわかるように、このフォワードプライマーは、９０％を超えるトリおよびブタ変異体を検出する能力も持つ（図１Ａ）。
【００６４】
本発明の一態様では、全ての既知ヒト変異体ならびに９０％を超えるトリおよびブタ変異体を検出する能力を持つリバースプライマーを利用する（図１Ｂ）。好ましい実施形態では、５’末端近くに三つの塩基にウォブル（ゆらぎ）を持つ一つのリバースプライマーが、全ての既知ヒト、トリおよびブタ変異体のうち９０％を超える変異体を検出する能力を持つ（配列番号３〜５）。配列番号３の配列において、Ｎはイノシンを意味する。２番目のリバースプライマー（配列番号６）は、単独で、全ての既知ヒト、トリおよびブタ変異体のうち９０％を超える変異体を検出する能力を持つ。
【００６５】
好ましい実施形態（図２）では、全てのヒト変異体の１００％理論増幅を達成するために、一つのフォワードプライマーを、少なくとも二つの異なる領域に結合するように設計されたリバースプライマーと組み合わせて使用する。さらにまた、図２に示すように、全てのヒト変異体の１００％理論検出が達成されるように、検出プローブ用に少なくとも二つの領域が同定された（配列番号７および８）。この実施形態では、９０％を超えるトリ変異体および９０％を超えるブタ変異体が増幅され、検出される。
【００６６】
一部の実施形態では、フォワードプライマーおよびリバースプライマー用の少なくとも二つの領域と、検出プローブ用の少なくとも二つの領域とを使用することによって、少なくとも二つの別個のアンプリコンを生成させ、少なくとも一つの検出プローブが各アンプリコンを検出する能力を持つ。
【００６７】
別の実施形態では、リバースプライマー用の少なくとも一つの領域を、フォワードプライマー用の少なくとも二つの領域および検出プローブ用の少なくとも二つの領域と組み合わせて使用する。
【００６８】
別の実施形態では、検出プローブ用の少なくとも一つの領域を、フォワードプライマー用の少なくとも二つの領域およびリバースプライマー用の少なくとも二つの領域と組み合わせて使用する。
【００６９】
別の実施形態では、フォワードプライマー用およびリバースプライマー用の少なくとも一つの領域を、検出プローブ用の少なくとも二つの領域と組み合わせて使用する。
【００７０】
別の実施形態では、フォワードプライマー用および検出プローブ用の少なくとも一つの領域を、リバースプライマー用の少なくとも二つの領域と組み合わせて使用する。
【００７１】
別の実施形態では、検出プローブ用およびリバースプライマー用の少なくとも一つの領域をフォワードプライマー用の少なくとも二つの領域と組み合わせて使用する。
【００７２】
[ターゲット配列]
一部の実施形態では、ターゲット核酸が、プライマー結合用のテンプレートとして役立つ合成オリゴヌクレオチドである。合成オリゴヌクレオチドテンプレートは増幅のコントロールとして役立つことができ、増幅条件の初期開発または最適化のために外部ウイルスＲＮＡ供給源を獲得する必要性を軽減する。さらにまた、そのような合成オリゴヌクレオチドテンプレートは、ウイルスＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲでテンプレートを生成させる必要なく、候補検出プローブのスキャンを容易にする。
【００７３】
一部の実施形態において、合成オリゴヌクレオチドは、ターゲット領域全体にまたがる一本鎖オリゴヌクレオチドである。別の実施形態では、合成テンプレートが、当業者には知られているとおり、ＤＮＡポリメラーゼを使って末端充填反応で末端が二本鎖にされる、オーバーラップした２本の相補鎖から生成する二本鎖である。好ましい実施形態では、ＲＴ−ＰＣＲ用のＲＮＡテンプレートのインビトロ生成が容易になるように、合成ターゲット核酸が３’末端にＴ７プロモーターを含有する。
【００７４】
一部の実施形態では、ターゲット核酸が、インフルエンザＡウイルスの特定変異体と実質的に同じである配列を含有する。別の実施形態では、ターゲット核酸が、特定変異体から得られるインフルエンザＡ ＲＮＡゲノム全体からなる。さらに別の実施形態では、ターゲット核酸が、一組のインフルエンザＡ変異体、一群の株、または全ての既知株の間で保存された領域から得られるコンセンサス配列を含有する合成オリゴヌクレオチドである。好ましい実施形態では、ターゲット核酸が配列番号１と同じまたは実質的に同じ配列を含有する。
【００７５】
ターゲット核酸は、生物学的試料から収集されるウイルスＲＮＡから作製されたｃＤＮＡであることができる。生物学的試料からＲＮＡを単離し、ウイルスＲＮＡをｃＤＮＡに変換するための方法、技法および試薬類は、当業者にはよく知られている（例えばＳａｍｂｒｏｏｋら「ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ」第３版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（２００１）またはＡｕｓｕｂｅｌら「ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ」Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、ニューヨーク州ニューヨーク（１９９２）を参照されたい）。
【００７６】
[ターゲット配列の増幅]
本発明の一態様は、周知の方法を使ったターゲット配列の増幅によるターゲット配列だけを含む増幅産物の作製を伴う。場合により、増幅産物は、増幅ステップそのものには有意な影響を持たない増幅産物の増幅後操作に関与するタグ配列などといった追加の外来ヌクレオチド配列を含有する。線形的または指数的（非線形的）な増幅様式を任意の適切な増幅方法で使用することができ、増幅様式の選択はその実施形態の状況に応じて当業者によってなされる。増幅の方法には、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）およびローリングサークル（ＲＣ）増幅を使ったポリヌクレオチドテンプレートの増幅が含まれるが、これらに限るわけではない。
【００７７】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるテンプレート増幅では、ＤＮＡ分子の所定の領域の相補鎖が耐熱性ＤＮＡポリメラーゼによって同時に合成される複数ラウンドのプライマー伸長反応を使用する。プライマー伸長反応の反復ラウンド中に、新たに合成されるＤＮＡ鎖の数は指数的に増加するので、２０〜３０反応サイクル後には、初期テンプレートが数千倍〜数百万倍に複製されうる。さまざまなタイプおよび様式のＰＣＲを実行するための方法が、例えば「ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」（ＤｉｅｆｆｅｎｂａｃｈおよびＤｖｅｋｓｌｅｒ編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９９５）などの文献に詳しく記載されている他、Ｍｕｌｌｉｓらにより、特許（例えば米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，６８３，２０２号および同第４，８００，１５９号）および科学刊行物（例えばＭｕｌｌｉｓら，１９８７，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５５：３３５−３５０）に記載され、米国特許第６，８１５，１６７号にも記載されている。
【００７８】
簡単に述べると、ＰＣＲは以下に述べる一連のステップで進行する。手順の初期ステップでは、二本鎖テンプレートが単離され、熱（好ましくは約９０℃〜約９５℃）を使ってその二本鎖ＤＮＡが一本鎖に分離される（変性ステップ）。一本鎖テンプレートの場合、初期変性ステップは省略される。約５５℃への冷却により、プライマーがテンプレートのターゲット領域に付着することが可能になり、この際、プライマーはターゲット核酸配列に隣接する領域に結合するように設計される（アニーリングステップ）。耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（例えばＴａｑポリメラーゼ）および遊離ヌクレオチドを加えて、プライマー伸長によりテンプレートのターゲット領域に相補的な新しいＤＮＡフラグメントを生成させることで（伸長ステップ）、ＰＣＲの１サイクルが完了する。この変性、アニーリングおよび伸長のプロセスを何回も、好ましくはサーマルサイクラーで繰り返す。各サイクルが終了した時点で、新たに合成された各ＤＮＡ分子は次のサイクルにとってのテンプレートとして働き、結果として、各テンプレート分子から何百または何千、さらには何百万という二本鎖増幅産物の蓄積が起こる。
【００７９】
マルチプレックスＰＣＲでは、複数の相異なるターゲットヌクレオチド配列の同時増幅と、所望の核酸配列および長さを持つ複数の相異なる一本鎖ＤＮＡ分子の生成を可能にするために、同じテンプレートの相異なるターゲットヌクレオチド配列に特異的な複数のプライマー対を含むように、アッセイが改変される。例えばマルチプレックスＰＣＲは、ある生物または個体のゲノムＤＮＡをテンプレートとして使って行うことができ、その場合、マルチプレックスＰＣＲは複数の相異なる一本鎖ＤＮＡ分子を生成させる。
【００８０】
ＰＣＲでは増幅後プロセシングに適した二本鎖増幅産物が生じる。ＰＣＲ増幅産物は、ターゲットヌクレオチド配列中に見出されない追加ヌクレオチド配列などの特徴を含有しうる。テンプレートを増幅するために使用されるプライマーは、ターゲットヌクレオチド配列には見出されない外来ヌクレオチド配列を導入することによって増幅産物中に特徴が導入されるように設計することができる。そのような特徴には、識別用タグ、制限消化部位、修飾ヌクレオチド、プロモーター配列、逆方向反復、化学修飾、アドレス可能なリガンド、および増幅そのものには有意な影響を持たずに増幅産物の増幅後操作を可能にする他の非テンプレート５’伸長部などがあるが、これらに限るわけではない。好ましくは、外来配列は、ターゲットヌクレオチド配列への結合に関与するプライマー配列の５’側（「上流」）にある。好ましい一実施形態では、プライマーが識別用タグを導入する。もう一つの実施形態では、プライマーが、増幅産物の制限酵素による認識、結合および切断（「トリミング」）に関与する部位を導入する。
【００８１】
もう一つの態様では、ターゲット配列を増幅するのにＰＣＲ以外の増幅方法が使用される。代替的増幅方法には、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）およびローリングサークル増幅法（ＲＣＡ）などがあるが、これらに限るわけではない。これらの増幅方法および他の増幅方法を実行するためのプロトコールは、とりわけＸｕおよびＫｏｏｌ（１９９９，Ｎｕｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２７：８７５−８８１）、Ｋｏｏｌら（米国特許第５，７１４，３２０号、同第６，３６８，８０２号および同第６，０９６，８８０号）、Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら（米国特許第５，８７１，９２１号）、Ｚｈａｎｇら（米国特許第５，８７６，９２４号および同第５，９４２，３９１号）ならびにＬｉｚａｒｄｉら（Ｌｉｚａｒｄｉら，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ １９：２２５−２３２、ならびに米国特許第５，８５４，０３３号、同第６，１２４，１２０号、同第６，１４３，４９５号、同第６，１８３，９６０号、同第６，２１０，８８４号、同第６，２８０，９４９号、同第６，２８７，８２４号、および同第６，３４４，３２９号）によって記述されているように、当技術分野ではよく知られている。
【００８２】
もう一つの態様において、代替的増幅方法は、シングルプライマー増幅法（ｓｉｎｇｌｅ ｐｒｉｍｅｒ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ＳＰＡ）の使用またはスコーピオンプライマー増幅および検出の使用を含みうる。参照によりその全てが本明細書に組み入れられる米国特許第６，３２６，１４５号には、テンプレート核酸を、テンプレート結合領域とリンカーおよびターゲット結合領域を含むテールとを持つテール付き核酸プライマーに接触させることを含む、ターゲット核酸の検出方法が記載されている。増幅中に、プライマーのテンプレート結合領域は、テンプレート核酸中の相補的配列にハイブリダイズし、伸長されてプライマー伸長産物を形成し、そのような産物をテンプレートから分離すると、プライマーのテール中のターゲット結合領域がターゲット核酸に相当するプライマー伸長産物中の配列にハイブリダイズする。試料中のターゲット核酸は、シグナル伝達系（例えば取り付けられたフルオロフォアおよび近接消光分子）のシグナルの変化によって検出される。
【００８３】
[増幅産物の検出]
本発明の一態様は、検出オリゴヌクレオチドまたは「プローブ」を使った増幅産物の検出を伴う。本明細書で論じるように、インフルエンザＡの全てのヒト由来株ならびにトリおよびブタ株の少なくとも９０％の、１００％理論増幅および検出を可能にするターゲット配列の領域が同定された。検出プローブは、ターゲット配列と同一であるか実質的に同じ配列を含有しうる。あるいは、検出プローブは、ターゲット配列と相補的であるか実質的に相補的である配列を含有しうる。一部の実施形態では、増幅されたターゲット配列の１００％理論検出が得られるように、検出プローブの設計に二つ以上の領域を使用する（図２参照）。
【００８４】
一部の実施形態では、増幅されたターゲット配列が検出プローブにハイブリダイズすることが可能な条件下で、検出プローブを、増幅されたターゲット配列を含有する試料と接触させる。次に、検出プローブへのターゲット配列のハイブリダイゼーションを測定する。例えば、検出プローブは、ハイブリダイゼーションが起こった時にシグナリングする能力を持つ電極表面を含有するアッセイチップ上に直接固定化することができる。あるいは、検出プローブはタグ配列を含み、それがさらにＲＣＡによって増幅され、それが次に汎用アッセイチップ上の固定化プローブにハイブリダイズしてもよい。これらの例では、固定化プローブ鎖へのハイブリダイゼーションを、いくつかの異なる技法を使って検出することができる。
【００８５】
核酸検出に役立つさまざまな技法および電子伝達種は、ＷＯ２００４／０４４５４９、２００３年４月２４日に出願された「ＵＮＩＶＥＲＳＡＬ ＴＡＧ ＡＳＳＡＹ」と題する米国特許出願第１０／４２４，５４２号に開示されている。具体的には、これらの出願で議論されている一態様は、少なくとも一つの酸化可能な塩基を酸化還元反応で酸化する能力を持つ遷移金属錯体を使った、タグと固定化プローブのハイブリダイゼーションの検出である。
【００８６】
さらなる実施形態は、２００３年５月２日に出願された「ＥＬＥＣＴＲＯＣＨＥＭＩＣＡＬ ＭＥＴＨＯＤ ＴＯ ＭＥＡＳＵＲＥ ＤＮＡ ＡＴＴＡＣＨＭＥＮＴ ＴＯ ＡＮ ＥＬＥＣＴＲＯＤＥ ＳＵＲＦＡＣＥ ＩＮ ＴＨＥ ＰＲＥＳＥＮＣＥ ＯＦ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＯＸＹＧＥＮ」と題する米国特許出願第１０／４２９，２９１号；２００３年５月２日に出願された「ＭＥＴＨＯＤ ＯＦ ＥＬＥＣＲＯＣＨＥＭＩＣＡＬ ＤＥＴＥＣＴＩＯＮ ＯＦ ＳＯＭＡＴＩＣ ＣＥＬＬ ＭＵＴＡＴＩＯＮＳ」と題する米国特許出願第１０／４２９，２９３号；および２００４年８月２３日に出願された同時係属中のＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０２７４１２において議論されている。
【００８７】
具体的に述べると、米国特許出願第１０／４２９，２９３号では、ターゲット鎖がプローブ鎖にハイブリダイズした後に、そのターゲット鎖を伸長することによってシグナルを強化する方法（「オンチップ増幅」と呼ばれることもある技法）が議論されている。
【００８８】
汎用タグ検出を利用するアッセイの一例は、「ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤ ＤＥＴＥＣＴＩＯＮ ＭＥＴＨＯＤ ＨＡＶＩＮＧ ＩＮＣＲＥＡＳＥＤ ＳＥＮＳＩＴＩＶＩＴＹ」と題する米国特許出願第１０／９８５，２５６号に開示されている。この出願では、合成的に延長された核酸と電極表面の間の触媒サイクルの電気化学的検出を利用することによって感度が増大した核酸検出方法が議論されている。具体的に述べると、この出願では、対イオンではなく電極表面で自身が電子移動を起こす触媒的検出部分（例えばルテニウム錯体）の使用を含む実施形態が論じられている。
【実施例】
【００８９】
以下の実施例は例示を目的として記載するに過ぎず、本発明の範囲を限定しようとするものではない。
【実施例１】
【００９０】
関心対象であるインフルエンザＡマトリックス遺伝子の一部に相当する約２００ｂｐの合成ＲＮＡ（配列番号１）を、オーバーラップしたオリゴを設計し、その末端を３７℃で２時間のＴａｑポリメラーゼ伸長で埋めることによって作製した。得られた二本鎖テンプレートは、標準的な転写反応後に合成ＲＮＡの作製を可能にするＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを一端に持った。ＲＮＡテンプレートをＡｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒで定量することにより、ＲＮＡコピー数を見積った。
【００９１】
ＲＮＡｓｅフリーＤＮＡｓｅＩで消化することによってｄｓＤＮＡテンプレートの除去を確実にした３００〜５００個のＲＮＡコピーで、Ｑｉａｇｅｎ Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲキットを製造者の説明書に従って使用することにより、逆転写ＰＣＲを行った。ゲル結果により転写を確認した。ｒｔ−ＰＣＲミックスは、最終体積５０μｌ中の０．２〜０．４μＭ ５’リン酸化フォワードプライマー（配列番号２）および５’ＦＡＭ標識リバースプライマー（配列番号５および６）、２μＭ ＭｇＣｌ２、１×ｒｔ−ＰＣＲミックス、０．１ｍＭ ｄＮＴＰ、１０単位のＲＮａｓｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ）および５単位のＱｉａｇｅｎ酵素ミックスからなった。増幅条件は以下のとおりとした：５０℃で３０分、９５℃で１５分、［９５℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分］を４０サイクル、および７２℃で１０分間の最終インキュベーション、４℃で保存。
【００９２】
次に、ＰＣＲ産物をλｅｘｏで消化することにより、一本鎖テンプレートを作製した。次に、そのテンプレートを、インフルエンザＡ検出プローブ（配列番号７および８）を使用し、ｅＰｌｅｘ（商標）電気化学検出プラットフォーム（ＧｅｎｅＯｈｍ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、カリフォルニア州サンディエゴ）を使って検出した。結果を図３に示す。陰性コントロールと比較して、増幅は、インフルエンザＡ検出プローブによって特異的に検出される産物を生成した。
【００９３】
ここに開示した実施形態の上記の説明は、当業者が本発明をなし、または使用することができるように記載するものである。これらの実施形態に対するさまざまな改変は、当業者には明白であるだろうし、本明細書で明確にした一般原理は、本発明の精神または範囲から逸脱することなく、他の実施形態にも応用することができる。したがって本発明は本明細書に示す実施形態に限定されるのではなく、本明細書に開示した原理および新規な特徴と合致する最も広い範囲が、本発明に与えられるものとする。
【００９４】
本明細書において言及した全ての参考文献（特許、特許出願、論文、教科書などを含む）とそこで引用されている参考文献は、本願に援用することが既に述べられていない限り、この記載をもって参照することによりその全てが本明細書に援用される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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