(57)【要約】【課題】  ＡＤＣＣ活性が増強された抗体及びその製造方法を提供すること。【解決手段】  本発明者らは、ヒトＨ鎖定常領域における２４４位、２４６位又は２５９位のアミノ酸をシステインに置換することによって、置換前の抗体と比較するに１０倍以上もＡＤＣＣ活性が向上されることを見出した。また、リンパ腫モデルマウスに、２４４位又は２４６位のアミノ酸をシステインに置換したＡｎｔｉ−ＣＤ２０キメラ抗体抗体を投与することにより、当該モデルマウスの生存日数が、置換前の抗体等を投与した際と比較して、顕著に改善されることも明らかにした。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｈ鎖定常領域において、２４４位、２４６位及び２５９位からなる群より選択される少なくとも１つの位置のアミノ酸残基がシステインに置換された抗体。
【請求項２】
Ｈ鎖定常領域がヒトＣγ１、Ｃγ２、Ｃγ３及びＣγ４からなる群より選択されるいずれか１の定常領域である、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
Ｈ鎖定常領域において、２４４位、２４６位及び２５９位からなる群より選択される少なくとも１つの位置のアミノ酸残基をシステインに置換する工程を含む、ＡＤＣＣ活性が増強された抗体の製造方法。
【請求項４】
以下の（ａ）及び（ｂ）の工程を含む、ＡＤＣＣ活性が増強された抗体の製造方法；
（ａ）Ｈ鎖定常領域において、２４４位、２４６位及び２５９位からなる群より選択される少なくとも１つの位置のアミノ酸残基がシステインに置換されたＨ鎖をコードするＤＮＡ、及びＬ鎖をコードするＤＮＡを発現させる工程、
（ｂ）工程（ａ）の発現産物を回収する工程。
【請求項５】
Ｈ鎖定常領域がヒトＣγ１、Ｃγ２、Ｃγ３及びＣγ４からなる群より選択されるいずれか１の定常領域である、請求項３又は４に記載の方法。
【請求項６】
請求項１又は２に記載の抗体及び医薬的に許容し得る担体を含む、医薬組成物。
【請求項７】
請求項１又は２に記載の抗体を対象に投与する工程を含む、前記対象を治療するための方法。
【請求項８】
請求項１又は２に記載の抗体をコードする核酸。
【請求項９】
請求項８に記載の核酸を含むベクター。
【請求項１０】
請求項９に記載のベクターを有する宿主細胞。
【請求項１１】
請求項９に記載のベクターを有する宿主生物。
【請求項１２】
Ｈ鎖定常領域において、２４４位、２４６位及び２５９位からなる群より選択される少なくとも１つの位置のアミノ酸残基をシステインに置換する工程を含む、抗体のＡＤＣＣ活性を増強する方法。
【請求項１３】
Ｈ鎖定常領域がヒトＣγ１、Ｃγ２、Ｃγ３及びＣγ４からなる群より選択されるいずれか１の定常領域である、請求項１２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗体のＡＤＣＣ活性を増強する方法及びＡＤＣＣ活性を増強させた抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗体の可変領域をマウス型に定常領域をヒト型にしたキメラ抗体や、ＣＤＲ（相補性決定領域）と定常領域との両方をヒト型にしたヒト化抗体は、癌や慢性関節リウマチの治療薬として期待されている。癌の治療において従来より用いられているシスプラチン等の化学合成された治療薬は、癌細胞と正常細胞の識別能力が低く、毒性が高い。そのために癌の化学療法は、癌患者への体力的な負担が大きいのが現状である。一方、キメラ化あるいはヒト化された抗体は、癌細胞表面上に特異的の分子を認識して作用するためにその毒性は低く、治療を受ける患者にとっても体力的負担は軽い。慢性関節リウマチの治療に対しても、従来のステロイド薬を中心とした治療では、リウマチ症状の進行を遅くするにとどまるものであるが、インターロイキン６受容体に対するヒト化抗体は、骨破壊や炎症の原因因子を抑制することができるために著しい治療効果を発揮している。
【０００３】
これらの治療用抗体（キメラ抗体、ヒト化抗体）の作製方法には、大きく分けて３通りある。一つ目は、遺伝子組み換え技術によってマウス抗体からキメラ抗体、ヒト化抗体へと抗体の抗原結合部位を残してヒト型の蛋白に置き換えてゆくことでヒト化していく方法である。二つ目は、ファージディスプレイを用いる方法である。この方法では、多種類のヒト由来の抗体可変領域をファージ表面に発現させたものから、目的蛋白を認識できる完全ヒト型可変領域を選び出すことができるので、選び出された完全ヒト型可変領域を材料に、遺伝子組み換え技術を利用して、ヒト型定常領域をさらに加えた完全ヒト化抗体を作製することが出来る。最後に、ヒトの抗体産生遺伝子を持つように遺伝子操作されたＴＣマウスを利用した方法がある（非特許文献１）。このＴＣマウスは、目的蛋白である抗原が免疫されると、マウスにより産生されてくる抗体はすべてヒト型となるように遺伝子操作されているので、ＴＣマウスに抗原を免疫してから取り出したリンパ球細胞とマウスミエローマ細胞を融合させて得られるハイブリドーマ細胞からは、免疫した抗原を認識する完全ヒト化抗体が産生される。
【０００４】
上記の３つの方法によりキメラ抗体、ヒト化抗体を作製できるが、いずれの方法を用いても、治療抗体の製造コストは低分子化合物の治療薬に比べて非常に高いことが問題である。その高い製造コストのために、治療抗体の価格も非常に高く、癌やリウマチ患者にとっても大きな治療費負担となるのが現状である。
【０００５】
この問題を解決する一つの解決策として、単位質量あたりの治療抗体の癌細胞等への治療効果を上昇させることが考えられた。つまり、少ない治療抗体量においても、従来の投与量と同様の治療効果が得られれば、患者への１回あたりの投薬量を低減させることができ、また、１回あたりの投薬費も低減させることができる。この治療抗体の治療効果を示す一つの指標として、Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ−Ｃｅｌｌｕｌａｒ−Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ（ＡＤＣＣ）活性がある。このＡＤＣＣ活性は、治療抗体のＦｃ部分が、癌細胞を殺傷できるキラー細胞上のＦｃレセプターに結合し、さらに治療抗体の可変領域の認識作用で、癌細胞へキラー細胞を導くことにより、結果的に治療抗体を介してキラー細胞が癌細胞を殺傷する機構である。
【０００６】
ＡＤＣＣ活性を上昇させるために要求される治療抗体の性能としては、１）治療抗体の可変領域が癌細胞表面に特異的にある蛋白を強く認識できるということ、２）キラー細胞上のＦｃレセプターに治療抗体のＦｃ部分が強く結合できること、が挙げられるが、この２）の項目を解決することでＡＤＣＣ活性を上昇させる研究が特に多くなされてきた。
【０００７】
Ｓｈｉｎｋａｗａ  Ｔらは、治療抗体ＩｇＧ１のＦｃ領域である２９７位のアミノ酸であるアスパラギン（Ａｓｎ）に結合している二つの糖鎖（Ｎ−Ｌｉｎｋｅｄ  ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）構造に着目し、その糖鎖構造のフコースが欠損した糖鎖構造にすれば２０倍〜１００倍のＡＤＣＣ活性上昇になることを見出した（非特許文献２）。このフコース欠損構造によるＡＤＣＣ活性の報告は、Ｓｈｉｅｌｄｓ  Ｒ  Ｌらによっても行われた（非特許文献３）。また、Ｐａｂｌｏ  Ｕらも同様の糖鎖構造に着目して、その糖鎖構造中のｂｉｓｅｃｔｉｎｇＮ−ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅの結合量を制御することで数倍のＡＤＣＣ活性の上昇を行えることを発見した（非特許文献４）。さらに、フコース欠損糖鎖を用いた例では、マウス個体において、腫瘍増殖抑制活性が上昇していることも知られている（非特許文献５）。
【０００８】
このような、ＩｇＧ１のＦｃ領域に結合している糖鎖構造を改変することでその治療抗体のＡＤＣＣ活性を上昇させる方法以外に、米国Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．らの研究者らは、治療抗体のＦｃ構造そのもののアミノ酸に変異を加えることでＦｃレセプターとの結合を増強させる技術をコンピューター検索により検索し、Ｓ２９８Ａ，Ｅ３３３Ａ，Ｋ３３４Ａのトリプル変異によりＡＤＣＣ活性を数十倍増強することに成功している（非特許文献６）。また、このように、Ｆｃ領域のアミノ酸を他のアミノ酸に置換することにより抗体のＡＤＣＣ活性を増強できることが、特許文献１〜１０に記載されている。
【０００９】
さらに、カニクイザルに、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ変異抗体を投与することによって、Ｂ細胞が減少したこと（非特許文献７）、Ｆｃ領域中Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００Ｌ、Ｖ３０５Ｉ及びＰ３９６Ｌを置換した抗体をマウスモデルに投与し生存日数、抗腫瘍活性が上昇していること（非特許文献８）も明らかになっている。
【００１０】
しかしながら、Ｆｃ領域（Ｈ鎖定常領域）中２４４位、２４６位又は２５９位を置換した抗体は、Ｆｃレセプターに対する結合性やＡＤＣＣ活性の上昇が示唆されたことは過去になく、むしろ、２４４位又は２４６位のアミノ酸を置換した抗体では、低下することが示されていた（特許文献５〜１０）。具体的には、特許文献５及び６において、２４４位のアミノ酸を置換したＦｃの変異体によるＦｃレセプターに対する結合性は、親抗体（アミノ酸置換前の抗体）のそれを１とした場合に、０．８３に低下することが示されている（同文献の表７９参照）。さらに、Ｆｃ領域中２４４位に関しては、特許文献７において、この部位のアミノ酸を置換した抗体のＡＤＣＣ活性は、野生型（アミノ酸置換前の抗体）のそれを１００とした場合に、７７に低下することが示されている（同文献の表９−２参照）。また、Ｆｃ領域中２４６位に関しては、特許文献８において、この部位のアミノ酸を置換した抗体のＦｃレセプター：Ｖ１５８及びＦ１５８に対する結合性は、野生型のそれらを１とした場合に、各々０．７５及び０，７１に低下することが示されている（同文献の図５ａ参照）。さらに、Ｆｃ領域中２４６位に関しては、特許文献９及び１０において、この部位のアミノ酸をリシンからアラニンに置換した抗体のＦｃレセプターに対する結合性は、親抗体のそれらを１とした場合に、０．９２〜１．１４であり、殆ど改善されないことが示されている（同文献の［０１０８］参照）。また、同文献において、Ｆｃ領域中２４６位のアミノ酸をリシンからメチオニンに置換した抗体のＦｃレセプターに対する結合性は、親抗体のそれらを１とした場合に、０．６９〜０．９５であり、殆ど改善されない、むしろ低下することが示されている（同文献の［０１０８］参照）。
【００１１】
なお、本明細書において、特に断りがない限りは、Ｅｌｖｉｎ  Ａ．ＫａｂａｔらがＳｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２，１９９１）において示したヒトＨ鎖定常領域のＥＵ  ｉｎｄｅｘの番号（ｋａｂａｔのＥＵ  ｉｎｄｅｘ）に従って、アミノ酸の位置は示される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】国際公開２００４／０６３３５１号
【特許文献２】国際公開２００４／０９９２４９号
【特許文献３】国際公開２００６／０１９４４７号
【特許文献４】特表２００３−５１２０１９号公報
【特許文献５】特表２００６−５１２４０７号公報
【特許文献６】国際公開２００４／０２９２０７号
【特許文献７】特表２００８−５１１２９２号公報
【特許文献８】特表２００８−５３７９４１号公報
【特許文献９】特開２０１０−２２７１１６号公報
【特許文献１０】国際公開２０００／０４２０７２号
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１９９７年、１６巻、１１３〜１１４ページ
【非特許文献２】Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２００３年、２７８巻、３４６６〜３４７３ページ
【非特許文献３】Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００２年、２７７巻、２６７３３〜２６７４０ページ
【非特許文献４】Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１９９９年、１７巻、１７６〜１８０ページ
【非特許文献５】ＣＡＮＣＥＲ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ、２００４年３月１５日、６４巻、２１２７〜２１３３ページ
【非特許文献６】Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２００１年、２７６巻、６５９１〜６６０４ページ
【非特許文献７】ＰＮＡＳ、２００６年３月１４日、１０３巻、１１号、４００５〜４０１０ページ
【非特許文献８】Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、２００７年９月１５日、６７巻、１８号、８８８２〜８８９０ページ
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は、ＡＤＣＣ活性が増強された抗体及びその製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは、前記目的を達成すべく、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ  Ｉｎｃらの研究者らが行ったＦｃ領域のアミノ酸変異をさらに発展させ、ヒトＣγ１（配列番号：５４に記載のアミノ酸配列）における様々なアミノ酸のシステインへの置換を行った。
【００１６】
その結果、Ｈ鎖定常領域における２５９位のアミノ酸をシステインに置換することによって、抗体のＡＤＣＣ活性は増強されることが明らかになった。さらに驚くべきことに、アミノ酸を置換してもＡＤＣＣ活性等が改善することなく、むしろ低下することが従前示されていた２４４位及び２４６位に関しても、システインに置換することによって、抗体のＡＤＣＣ活性が増強されることが見出された。しかも、Ｈ鎖定常領域における２４４位、２４６位又は２５９位のアミノ酸をシステインに置換した抗体のＡＤＣＣ活性は、置換前の抗体と比較するに１０倍以上も向上されていた。さらに、かかるインビトロにおけるＡＤＣＣ活性の向上のみならず、２４４位又は２４６位のアミノ酸をシステインに置換したＡｎｔｉ−ＣＤ２０キメラ抗体を、リンパ腫モデルマウスに投与することにより、当該モデルマウスの生存日数が、置換前の抗体等を投与した際と比較して、顕著に改善されることも見出し、本発明を完成するに至った。即ち本発明は、以下＜１＞〜＜１３＞を提供するものである。
＜１＞  Ｈ鎖定常領域において、２４４位、２４６位及び２５９位からなる群より選択される少なくとも１つの位置のアミノ酸残基がシステインに置換された抗体。
＜２＞  Ｈ鎖定常領域がヒトＣγ１、Ｃγ２、Ｃγ３及びＣγ４からなる群より選択されるいずれか１の定常領域である、＜１＞に記載の抗体。
＜３＞  Ｈ鎖定常領域において、２４４位、２４６位及び２５９位からなる群より選択される少なくとも１つの位置のアミノ酸残基をシステインに置換する工程を含む、ＡＤＣＣ活性が増強された抗体の製造方法。
＜４＞  以下の（ａ）及び（ｂ）の工程を含む、ＡＤＣＣ活性が増強された抗体の製造方法；
（ａ）Ｈ鎖定常領域において、２４４位、２４６位及び２５９位からなる群より選択される少なくとも１つの位置のアミノ酸残基がシステインに置換されたＨ鎖をコードするＤＮＡ、及びＬ鎖をコードするＤＮＡを発現させる工程、
（ｂ）工程（ａ）の発現産物を回収する工程。
＜５＞  Ｈ鎖定常領域がヒトＣγ１、Ｃγ２、Ｃγ３及びＣγ４からなる群より選択されるいずれか１の定常領域である、＜３＞又は＜４＞に記載の方法。
＜６＞  ＜１＞又は＜２＞に記載の抗体及び医薬的に許容し得る担体を含む、医薬組成物。
＜７＞  ＜１＞又は＜２＞に記載の抗体を対象に投与する工程を含む、前記対象を治療するための方法。
＜８＞  ＜１＞又は＜２＞に記載の抗体をコードする核酸。
＜９＞  ＜８＞に記載の核酸を含むベクター。
＜１０＞  ＜９＞に記載のベクターを有する宿主細胞。
＜１１＞  ＜９＞に記載のベクターを有する宿主生物。
＜１２＞  Ｈ鎖定常領域において、２４４位、２４６位及び２５９位からなる群より選択される少なくとも１つの位置のアミノ酸残基をシステインに置換する工程を含む、抗体のＡＤＣＣ活性を増強する方法。
＜１３＞  Ｈ鎖定常領域がヒトＣγ１、Ｃγ２、Ｃγ３及びＣγ４からなる群より選択されるいずれか１の定常領域である、＜１２＞に記載の方法。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、ＡＤＣＣ活性が増強された抗体及びその製造方法を提供することが可能となる。ひいては、本発明のＡＤＣＣ活性が増強された抗体を用いることによって、本発明の方法によりアミノ酸を置換する前の抗体と比較して、より多くの細胞障害を引き起こすことが出来る。
【００１８】
また本発明の抗体は、特に低濃度の投与例において、前記アミノ酸置換前の抗体と比較して、ＡＤＣＣ活性が１０倍以上上昇する。従って、本発明の抗体を治療抗体として用いることによって、単位質量あたりの癌細胞等への治療効果を上昇させることが可能である。また本発明の抗体を用いれば、患者への１回あたりの投薬量を低減させることができるため、投薬費を低減することも可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】野生型、２４４Ｃｙｓ型、２４６Ｃｙｓ型、２５９Ｃｙｓ型のＡｎｔｉ−ＣＤ２０キメラ抗体のＡＤＣＣ活性結果を示すグラフである。野生型キメラ抗体のＡＤＣＣ活性と比較して、３種類のＣｙｓ型キメラ抗体は、０．０１〜１０μｇ／ｍＬの濃度範囲で非常に高いＡＤＣＣ活性を示した。なお、本明細書において「Ｃｙｓ型」とは、抗体のＨ鎖定常領域において、所定の位置のアミノ酸残基がシステインに置換されていることを示し、例えば、「２４４Ｃｙｓ型のＡｎｔｉ−ＣＤ２０キメラ抗体」とは、２４４位のアミノ酸残基がシステインに置換されているＡｎｔｉ−ＣＤ２０キメラ抗体を意味する。
【図２】野生型、２８６Ｃｙｓ型のＡｎｔｉ−ＣＤ２０キメラ抗体のＡＤＣＣ活性結果を示すグラフである。野生型キメラ抗体のＡＤＣＣ活性と比較して、２８６Ｃｙｓ型キメラ抗体は、０．０１〜１０μｇ／ｍＬの濃度範囲で非常に高いＡＤＣＣ活性を示した。
【図３】野生型、２４４Ｃｙｓ型、２４６Ｃｙｓ型、２５９Ｃｙｓ型のＡｎｔｉ−ＥＧＦＲヒト抗体のＡＤＣＣ活性結果を示すグラフである。野生型キメラ抗体のＡＤＣＣ活性と比較して、３種類のＣｙｓ型ヒト抗体は、０．０１〜１０μｇ／ｍＬの濃度範囲で非常に高いＡＤＣＣ活性を示した。
【図４】コントロール、野生型、２８６Ｃｙｓ型のＡｎｔｉ−ＣＤ２０キメラ抗体のマウスの生存日数を示すグラフである。コントロール抗体に対して、野生型抗体は、５日間、２８６Ｃｙｓ抗体は９日間の生存日数が延長された。
【図５】２４４Ｃｙｓ、２８６Ｃｙｓ型のＡｎｔｉ−ＣＤ２０キメラ抗体のマウスの生存日数を示すグラフである。２８６Ｃｙｓ抗体に対して、２４４Ｃｙｓ抗体は、生存日数が４日間、延長された。
【図６】２４６Ｃｙｓ、２８６Ｃｙｓ型のＡｎｔｉ−ＣＤ２０キメラ抗体のマウスの生存日数を示すグラフである。２８６Ｃｙｓ抗体に対して、２４６Ｃｙｓ抗体は、生存日数が４日間、延長された。
【図７】２５９Ｃｙｓ、２８６Ｃｙｓ型のＡｎｔｉ−ＣＤ２０キメラ抗体のマウスの生存日数を示すグラフである。２８６Ｃｙｓ抗体に対して、２５９Ｃｙｓ抗体は、生存日数が４日間、短くなった。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
＜本発明の抗体＞
本発明は、Ｈ鎖定常領域において、２４４位、２４６位及び２５９位からなる群より選択される少なくとも１つの位置のアミノ酸残基がシステインに置換された抗体を提供する。
【００２１】
前述の通り、本発明にかかるアミノ酸の位置は、Ｅｌｖｉｎ  Ａ．ＫａｂａｔらがＳｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２，１９９１）において示したヒトＨ鎖定常領域のＥＵ  ｉｎｄｅｘの番号を意味する。
【００２２】
本発明におけるシステインには、その誘導体も含まれる。本発明におけるシステイン誘導体としては、システイン分子にヒドロキシル基、メチル基、エチル基、カルボキシル基、アミノ基等が付加された化合物、システイン分子を構成する原子や官能基の一部が欠失した化合物、システイン分子を構成する原子や官能基の一部が別のそれに置換された化合物等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２３】
ヒトの免疫グロブリンとして、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭの９種類のクラス（アイソタイプ（ｉｓｏｔｙｐｅ））が知られている。本発明の抗体には、これらのｉｓｏｔｙｐｅのうちＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４が含まれる。
【００２４】
また本発明の抗体には、抗体のＦｃ領域以外の部分が、抗原結合能を有する別のペプチドに置換されたものも含まれる。抗体のＦｃ領域以外の部分としては、例えば可変領域、ＣＨ１領域、ヒンジ領域等が挙げられるが、これらに限定されない。抗体のｉｓｏｔｙｐｅは、定常領域の構造によって決定される。ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４の各ｉｓｏｔｙｐｅの定常領域は、それぞれ、Ｃγ１、Ｃγ２、Ｃγ３、Ｃγ４と呼ばれている。本発明の抗体には、ヒトＣγ１、Ｃγ２、Ｃγ３又はＣγ４において、２４４位、２４６位及び２５９位からなる群より選択される少なくとも１つの位置のアミノ酸がＣｙｓに置換された抗体も含まれる。ヒトＣγ１、Ｃγ２、Ｃγ３、Ｃγ４の塩基配列を、配列番号：５４、５６、５８、６０に例示する。また、ヒトＣγ１、Ｃγ２、Ｃγ３、Ｃγ４のアミノ酸配列を、配列番号：５５、５７、５９、６１に例示する。
【００２５】
なお、本明細書における定常領域の配列は全て、［Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）］を基に作製した。
【００２６】
本発明の抗体としては、特に低濃度において、約２倍以上、好ましくは約５倍以上、より好ましくは約１０倍以上、約１００倍以上、さらに好ましくは約５００倍以上、特に好ましくは約１０００倍以上、置換前と比較しＡＤＣＣ活性が上昇している抗体である。
【００２７】
なお、本発明において「ＡＤＣＣ活性の上昇」は、例えば後述の実施例において示すように、乳酸脱水素酵素放出アッセイ（ｌａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｒｅｌｅａｓｅ  ａｓｓａｙ）を用いることによって、当業者であれば評価することができる。すなわち、先ず、標的細胞及びエフェクター細胞の共培養系に、所定のアミノ酸をシステインに置換した抗体（以下「変異型抗体」とも称する）を添加し、その後該標的細胞から放出される乳酸脱水素酵素の活性を通して、該抗体の細胞障害性を評価する。次に、得られた細胞障害性と、システインに置換する前の抗体（以下「野生型抗体」とも称する）を添加した際の細胞障害性とが同一の値となる、各々の抗体の前記共培養系への添加濃度を求める。次に、当該変異型抗体の添加濃度を１とした際の当該野生型抗体の添加濃度の相対値を算出する。そして、得られた相対値が１を越えていれば、当該変異型抗体は、置換前と比較して、ＡＤＣＣ活性が上昇していると判断することができ、さらに、その相対値をもってその上昇の比率を表わすこともできる。
【００２８】
また本発明の抗体は、前記置換前と比較して改善された、安定性、溶解性、Ｆｃリガンドへの結合親和性又は補体依存性細胞障害（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ；ＣＤＣ）活性を有する。本発明の抗体は、野生型抗体と比較してその安定性、溶解性、Ｆｃリガンドへの結合親和性又はＣＤＣ活性が変化していないか上昇していることが好ましい。しかしながら本発明の抗体は、少なくともＡＤＣＣ活性が上昇していればよく、その安定性、溶解性、Ｆｃリガンドへの結合親和性又はＣＤＣ活性が減少している抗体も、本発明の抗体に含まれる。なお、Ｆｃリガンドとしては、Ｃ１ｑ、ＦｃＲｎ、プロテインＡ及びプロテインＧ等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２９】
本発明の抗体には、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体の両方が含まれる。モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体の調製及び精製方法は、当分野で知られており、例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８８）に記載されている。
【００３０】
本発明の抗体の一形態はヒト化抗体である。「ヒト化抗体」とは、ヒトの抗体に構造を類似させた抗体のことをいい、ヒト型キメラ抗体（例えば抗体の一部がヒト化された抗体、ＣＨ２領域がヒト化された抗体、Ｆｃ領域がヒト化された抗体、定常領域がヒト化された抗体）、並びに定常領域及び可変領域に存在するＣＤＲ（相補性決定領域）以外の部分がヒト化されたヒト型ＣＤＲ移植（ＣＤＲ−ｇｒａｆｔｅｄ）抗体（Ｐ．Ｔ．Ｊｏｈｏｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１，５２２（１９８６））、完全ヒト化抗体等が含まれる。ヒト型ＣＤＲ移植抗体の抗原結合活性を高めるため、マウス抗体と相同性の高いヒト抗体ＦＲを選択する方法、相同性の高いヒト化抗体を作製する方法、ヒト抗体にマウスＣＤＲを移植した後さらにＦＲのアミノ酸を置換する方法の改良技術もすでに開発され（米国特許第５５８５０８９号、米国特許第５６９３７６１号、米国特許第５６９３７６２号、米国特許第６１８０３７０号、欧州特許第４５１２１６号、欧州特許第６８２０４０号、特許第２８２８３４０号等を参照）、本発明のヒト型ＣＤＲ移植抗体の作製に利用することもできる。
【００３１】
ヒト型キメラ抗体は例えば、上記のＨ鎖可変領域の構造及び／又はＬ鎖可変領域の構造を有する抗体の定常領域をヒト抗体の定常領域に置換することにより作製することができる。ヒト抗体の定常領域としては公知のものを採用することができる。以下に、ヒト型キメラ抗体の作製方法の一例を示す。
【００３２】
まず、特定の対象抗原に対するマウス抗体を産生するハイブリドーマよりｍＲＮＡを抽出し、常法に従ってｃＤＮＡを合成する。合成したｃＤＮＡをベクターに組み込みｃＤＮＡライブラリーを構築する。このｃＤＮＡライブラリーから、Ｈ鎖遺伝子フラグメント及びＬ鎖遺伝子フラグメントをプローブとして用いることにより、Ｈ鎖遺伝子及びＬ鎖遺伝子を含有するベクターを選択する。選択されたベクターの挿入配列のシークエンシングを行うことにより、Ｈ鎖可変領域及びＬ鎖可変領域の遺伝子の配列が決定される。このようにして得られた配列データを基にＨ鎖可変領域をコードするＤＮＡを化学合成、生化学的切断／再結合等により作製する。得られたＨ鎖可変領域をコードするＤＮＡを、ヒトＨ鎖定常領域をコードするＤＮＡとライゲーションして発現用ベクターに組込むことによりＨ鎖発現ベクターを作製する。発現ベクターとしては例えばＳＶ４０  ｖｉｒｕｓ  ｂａｓｅｄベクター、ＥＢ  ｖｉｒｕｓ  ｂａｓｅｄベクター、ＢＰＶ（パピローマウイルス）ｂａｓｅｄベクター等を用いることができるが、これらに限定されるものではない。一方、同様の方法によりＬ鎖発現ベクターを作製する。これらＨ鎖発現ベクター及びＬ鎖発現ベクターにより宿主細胞を共形質転換する。宿主細胞としてはＣＨＯ細胞（チャイニーズハムスター卵巣）（Ａ．Ｗｒｉｇｈｔ＆Ｓ．Ｌ．Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０，３３９３−３４０２（１９９８））、ＳＰ２／０細胞（マウスミエローマ）（Ｋ．Ｍｏｔｍａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｐｒｅｖ．５，５１２−５１９（１９９６），Ｒ．Ｐ．Ｊｕｎｇｈａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５０，１４９５−１５０２（１９９０））等が好適に用いられる。また、形質転換にはリポフェクチン法（Ｒ．Ｗ．Ｍａｌｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６，６０７７（１９８９），Ｐ．Ｌ．Ｆｅｌｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４，７４１３（１９８７）、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法（Ｆ．Ｌ．Ｇｒａｈａｍ＆Ａ．Ｊ．ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｅｂ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５２，４５６−４６７（１９７３））、ＤＥＡＥ−Ｄｅｘｔｒａｎ法等が好適に用いられる。
【００３３】
形質転換体を培養した後、形質転換体の細胞内又は培養液よりヒト型キメラ抗体を分離する。抗体の分離、精製には、遠心分離、硫安分画、塩析、限外濾過、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー等の方法を適宜組み合わせて利用することができる。
【００３４】
一方、ヒト型ＣＤＲ移植抗体は例えば以下の方法により作製することができる。まず、上記キメラ抗体の製造方法の欄で述べた方法により、特定の抗原に対する抗体のＨ鎖可変領域及びＬ鎖可変領域のアミノ酸配列及びそれをコードする塩基配列を決定する。併せて各ＣＤＲ領域のアミノ酸配列及び塩基配列を決定する。
【００３５】
次に、ＣＤＲ領域を挟んで存在するＦＲ（フレームワーク領域）を選択する。ＦＲの選択には、およそ三つの方法が採用できる。１つめの方法は、ＮＥＷＭ、ＲＥＩ等、既に三次元構造の明らかとなったヒト抗体フレームを用いる方法である（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２，３２３−３Ｚ７（１９８８）；Ｔｅｍｐｓｔ，ＰＲ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ７，１５０１−１５０７（１９９４）；Ｅｌｌｉｓ  ＪＨ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５５，９２５−９３７（１９９５））。２つめの方法は、目的のマウス抗体可変領域と最も高いホモロジーを持つヒト抗体可変領域をデータベースより選択し、そのＦＲを用いる方法である（Ｑｕｅｅｎ  Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  ＳｃｉＵＳＡ  ８６，１００２９−１００３３（１９８９）；Ｒｏｚａｋ  ＭＪ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７１，２２６１１−２２６１８（１９９６）；Ｓｈｅａｒｍａｎ  ＣＷ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  １４７，４３６６−４３７３（１９９１））。３つめの方法は、ヒト抗体のＦＲで最も共通に用いられるアミノ酸を選択する方法である（Ｓａｔｏ  Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３１，３７１−３８１（１９９４）；Ｋｏｂｉｎｇｅｒ  Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ６，９７１−９８０（１９９３）；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ  ＣＡ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ４，７７３−７８３（１９９１））。本発明ではこれらいずれの方法を用いることもできる。
【００３６】
なお、選択されたヒトＦＲのアミノ酸配列を改変したアミノ酸配列であっても、最終的に得られるヒト型ＣＤＲ移植抗体が対象抗原に対する特異的結合性を有する限り、ＦＲのアミノ酸配列として利用することができる。特に、選択されたヒトＦＲのアミノ酸の一部をＣＤＲの由来となった抗体のＦＲのアミノ酸に変更した場合、抗体の特性が維持される可能性が高い。改変されるアミノ酸の数は好ましくはＦＲ全体の３０％以下であり、更に好ましくはＦＲ全体の２０％以下であり、更に好ましくはＦＲ全体の１０％以下である。
【００３７】
次に、これらいずれかの方法により選択したＦＲと上記ＣＤＲとを組み合わせることによりＨ鎖可変領域及びＬ鎖可変領域をコードするＤＮＡを設計する。この設計を基にＨ鎖可変領域をコードするＤＮＡとＬ鎖可変領域をコードするＤＮＡを化学合成、生化学的切断／再結合等によりそれぞれ作製する。そしてＨ鎖可変領域をコードするＤＮＡを、ヒト免疫グロブリンＨ鎖定常領域をコードするＤＮＡとともに発現ベクターに組み込みＨ鎖発現ベクターを構築する。同様に、Ｌ鎖可変領域をコードするＤＮＡを、ヒト免疫グロブリンＬ鎖定常領域をコードするＤＮＡとともに発現ベクターに組み込みＬ鎖発現ベクターを構築する。発現ベクターとしては例えばＳＶ４０  ｖｉｒｕｓ  ｂａｓｅｄベクター、ＥＢ  ｖｉｒｕｓ  ｂａｓｅｄベクター、ＢＰＶ（パピローマウイルス）ｂａｓｅｄベクター等を用いることができるが、これらに限定されるものではない。
【００３８】
以上の方法で作製されたＨ鎖発現ベクター及びＬ鎖発現ベクターにより宿主細胞を共形質転換する。宿主細胞としてはＣＨＯ細胞（チャイニーズハムスター卵巣）（Ａ．Ｗｒｉｇｈｔ＆Ｓ．Ｌ．Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０，３３９３−３４０２（１９９８））、ＳＰ２／０細胞（マウスミエローマ）（Ｋ．Ｍｏｔｍａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｐｒｅｖ．５，５１２−５１９（１９９６），Ｒ．Ｐ．Ｊｕｎｇｈａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５０，１４９５−１５０２（１９９０））等が好適に用いられる。また、形質転換にはリポフェクチン法（Ｒ．Ｗ．Ｍａｌｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６，６０７７（１９８９），Ｐ．Ｌ．Ｆｅｌｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４，７４１３（１９８７）、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法（Ｆ．Ｌ．Ｇｒａｈａｍ＆Ａ．Ｊ．ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｅｂ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５２，４５６−４６７（１９７３））、ＤＥＡＥ−Ｄｅｘｔｒａｎ法等が好適に用いられる。
【００３９】
形質転換体を培養した後、形質転換体の細胞内又は培養液よりヒト型ＣＤＲ移植抗体を分離する。抗体の分離、精製は、遠心分離、硫安分画、塩析、限外濾過、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー等の方法を適宜組み合わせて行うことができる。
【００４０】
また、ヒト抗体の取得方法も知られている。例えば、ヒトリンパ球をｉｎ  ｖｉｔｒｏで所望の抗原又は所望の抗原を発現する細胞で感作し、感作リンパ球をヒトミエローマ細胞、例えばＵ２６６と融合させ、抗原への結合活性を有する所望のヒト抗体を得ることもできる（特公平１−５９８７８参照）。また、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物を所望の抗原で免疫することで所望のヒト抗体を取得することができる（国際特許出願公開番号ＷＯ９３／１２２２７，ＷＯ９２／０３９１８，ＷＯ９４／０２６０２，ＷＯ９４／２５５８５，ＷＯ９６／３４０９６，ＷＯ９６／３３７３５参照）。
【００４１】
更なる実施態様では、抗体又は抗体断片は、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ等（Ｎａｔｕｒｅ，  ３４８：５５２−５５４（１９９０））に記載された技術を使用して産生される抗体ファージライブラリーから分離することができる。Ｃｌａｃｋｓｏｎ等（Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１））及びＭａｒｋｓ等（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７（１９９１））は、ファージライブラリーを使用したマウス及びヒト抗体の分離を記述している。続く刊行物は、鎖シャフリングによる高親和性（ｎＭ範囲）のヒト抗体の生成（Ｍａｒｋｓ等，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：７７９−７８３［１９９２］）、並びに非常に大きなファージライブラリーを構築するための方策としてコンビナトリアル感染とインビボ組換え（Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ等，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，２１：２２６５−２２６６［１９９３］）を記述している。従って、これらの技術はモノクローナル抗体の分離に対する伝統的なモノクローナル抗体ハイブリドーマ法に対する実行可能な別法である。
【００４２】
この点において、バクテリオファージ（ファージ）ディスプレイは、大きなオリゴペプチドライブラリーを検索して、ポリペプチド標的に特異的に結合する能力のあるこれらライブラリーのメンバーを同定することを可能にするよく知られた技術の一つである。ファージディスプレイは、様々なポリペプチドがバクテリオファージ粒子の表面上のコートタンパク質に融合タンパク質として提示されることによる技術である（Ｓｃｏｔｔ，Ｊ．Ｋ．及びＳｍｉｔｈ  Ｇ．Ｐ．（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３８６）。ファージディスプレイの有用性は、選択的にランダム化されたタンパク質変異体（又はランダムクローンｃＤＮＡ）の大きなライブラリーを標的分子に高い親和性で結合するこれらの配列について素早く効果的に分類することができる点にある。ファージでのペプチド（Ｃｗｉｒｌａ，Ｓ．Ｅ．等（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：６３７８）又はタンパク質（Ｌｏｗｍａｎ，Ｈ．Ｂ．ら（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３０：１０８３２；Ｃｌａｃｋｓｏｎ，Ｔ．ら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４；Ｍａｒｋｓ，Ｊ．Ｄ．等（１９９１），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１；Ｋａｎｇ，Ａ．Ｓ．等（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：８３６３）ライブラリーのディスプレイは、特異的に結合する特性を有するものについて無数のポリペプチド又はオリゴペプチドをスクリーニングするために使用されている（Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｐ．（１９９１）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２：６６８）。ランダム突然変異体のファージライブラリーの分類は、多数の変異体を構築して増殖させる方法、標的レセプターを用いた親和性精製の方法、及び結合増強の結果を評価する手段を必要とする（米国特許第５２２３４０９号、同第５４０３４８４号、同第５５７１６８９号、及び同第５６６３１４３号を参照）。
【００４３】
ほとんどのファージディスプレイ法は繊維状ファージを使用していたが、λファージディスプレイシステム（ＷＯ９５／３４６８３；米国特許第５６２７０２４号）、Ｔ４ファージディスプレイシステム（ＲｅｎＪ．らＧｅｎｅ  ２１５：４３９（１９９８）；Ｚｈｕら  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃ，５８（１５）：３２０９−３２１４（１９９８）；Ｊｉａｎｇ等  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ＆Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，６５（１１）：４７７０−４７７７（１９９７）；Ｒｅｎ等，Ｇｅｎｅ，１９５（２）：３０３−３１１（１９９７）；Ｒｅｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．５：１８３３（１９９６）；Ｅｆｉｍｏｖ等  ＶｉｒｕｓＧｅｎｅｓ  １０：１７３（１９９５）及びＴ７ファージディスプレイシステム（Ｓｍｉｔｈ及びＳｃｏｔｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２１７，２２８−２５７（１９９３）；米国特許第５７６６９０５号）も知られている。
【００４４】
現在、基礎的なファージディスプレイ法は多くの改良及び変形が開発されている。これらの改良により、選択された標的分子との結合性等、ペプチドライブラリーやタンパク質ライブラリーから特性、能力等に基づいてスクリーニングする方法が改善された。ファージディスプレイ法のための組み換え反応手段については、ＷＯ９８／１４２７７に記載がある。ファージディスプレイライブラリーは、二分子相互作用（ＷＯ９８／２０１６９；ＷＯ９８／２０１５９）及び拘束性へリックスペプチドの特性（ＷＯ９８／２００３６）を分析及び制御するために使用されている。ＷＯ９７／３５１９６には、リガンドが標的分子に結合しうる第一の溶液、及び親和性リガンドが標的分子に結合しない第二の溶液とファージディスプレイライブラリーを接触させて結合リガンドを選択的に単離する、親和性リガンドの単離方法が記載されている。ＷＯ９７／４６２５１は、親和性精製抗体でランダムファージディスプレイライブラリーをバイオパニングし、次いで結合ファージを単離し、続いてマイクロプレートのウェルでマイクロパニングして高親和性結合ファージを単離する方法を記載する。黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｌｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）タンパク質Ａの親和性タグとしての使用も報告されている（Ｌｉ等，（１９９８）  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，９：１８７）。ＷＯ９７／４７３１４は、ファージディスプレイライブラリーでもよいコンビナトリアルライブラリーを用いて酵素特異性を識別するための基質サブトラクションライブラリーの使用を記載している。ファージディスプレイに用いる洗浄剤における使用に適した酵素を選択する方法はＷＯ９７／０９４４６に記載される。特異的に結合するタンパク質を選択する更なる方法は、米国特許第５４９８５３８号、同第５４３２０１８号、及びＷＯ９８／１５８３３に記載されている。ペプチドライブラリーの作製及びこれらのライブラリーのスクリーニングの方法は、米国特許第５７２３２８６号、同第５４３２０１８号、同第５５８０７１７号、同第５４２７９０８号、同第５４９８５３０号、同第５７７０４３４号、同第５７３４０１８号、同第５６９８４２６号、同第５７６３１９２号、及び同第５７２３３２３号に記載される。
【００４５】
さらに、ヒト抗体ライブラリーを用いて、パニングによりヒト抗体を取得する技術も知られている。例えば、ヒト抗体の可変領域を一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）としてファージディスプレイ法によりファージの表面に発現させ、抗原に結合するファージを選択することができる。選択されたファージの遺伝子を解析すれば、抗原に結合するヒト抗体の可変領域をコードするＤＮＡ配列を決定することができる。抗原に結合するｓｃＦｖのＤＮＡ配列が明らかになれば、当該配列を有する適当な発現ベクターを作製し、適当な宿主に導入して発現させることによりヒト抗体を取得することができる。これらの方法は既に衆知であり、ＷＯ９２／０１０４７、ＷＯ９２／２０７９１、ＷＯ９３／０６２１３、ＷＯ９３／１１２３６、ＷＯ９３／１９１７２、ＷＯ９５／０１４３８、ＷＯ９５／１５３８８を参考に実施することができる。
【００４６】
別法として、ファージディスプレイ技術（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ等，Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５３［１９９０］）を使用して、非免疫化ドナーの免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリーから、インビトロでヒト抗体及び抗体断片を産出させることができる。この技術によれば、抗体Ｖドメイン遺伝子を、フレーム単位で、繊維状バクテリオファージ、例えばＭ１３ファージ又はｆｄのコートタンパク質遺伝子のどちらかでクローニングし、ファージ粒子の表面で機能的抗体断片として提示させる。繊維状粒子がファージゲノムの一本鎖ＤＮＡコピーを含むので、抗体の機能特性に基づいた選択に基づいても、結果としてこれらの特性を示す抗体をコードする遺伝子の選択が成される。よって、このファージはＢ細胞のいくつかの特性を模倣している。ファージディスプレイは多様な形式で行うことができる；例えばＪｏｈｎｓｏｎ，Ｋｅｖｉｎ  Ｓ．及びＣｈｉｓｗｅｌｌ，ＤａｖｉｄＪ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３：５６４−５７１（１９９３）を参照。Ｖ−遺伝子セグメントのいくつかの供給源を、ファージディスプレイのために使用できる。Ｃｌａｃｋｓｏｎ等，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）は、免疫化したマウス脾臓由来のＶ遺伝子の小さいランダムなコンビナトリアルライブラリーから、多様で多くの抗−オキサゾロン抗体を単離した。非免疫化ヒトドナーのＶ遺伝子のレパートリーが構成可能であり、多様で多くの抗原（自己抗原を含む）に対する抗体は、Ｍａｒｋｓ等，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９１）、又はＧｒｉｆｆｉｔｈ等，ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：７２５−７３４（１９９３）に記載の技術にそのまま従うことで単離することができる。また、米国特許第５５６５３３２号及び同５５７３９０５号を参照のこと。
【００４７】
本発明の抗体には、一部のアミノ酸がアセチル化、ＰＥＧ化、リン酸化、アミド化等の化学修飾を受けた抗体も含まれる。このような化学修飾は当業者に公知の方法によって行うことが可能である。
【００４８】
また本発明の抗体には、本発明の抗体と他のペプチド又はタンパク質とが融合した融合タンパク質も含まれる。融合タンパク質を作製する方法は、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドと他のペプチド又はポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをフレームが一致するように連結してこれを発現ベクターに導入し、宿主で発現させればよく、当業者に公知の手法を用いることができる。本発明の抗体との融合に付される他のペプチド又はポリペプチドとしては、例えば、ＦＬＡＧ（Ｈｏｐｐ，Ｔ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９８８）６，１２０４−１２１０）、６個のＨｉｓ（ヒスチジン）残基からなる６×Ｈｉｓ、１０×Ｈｉｓ、インフルエンザ凝集素（ＨＡ）、ヒトｃ−ｍｙｃの断片、ＶＳＶ−ＧＰの断片、ｐ１８ＨＩＶの断片、Ｔ７−ｔａｇ、ＨＳＶ−ｔａｇ、Ｅ−ｔａｇ、ＳＶ４０Ｔ抗原の断片、ｌｃｋ  ｔａｇ、α−ｔｕｂｕｌｉｎの断片、Ｂ−ｔａｇ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃの断片等の公知のペプチドを使用することができる。また、本発明の抗体との融合に付される他のポリペプチドとしては、例えば、ＧＳＴ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）、ＨＡ（インフルエンザ凝集素）、β−ガラクトシダーゼ、ＭＢＰ（マルトース結合タンパク質）等が挙げられる。
【００４９】
また本発明の抗体においては、ＡＤＣＣ活性等のエフェクター機能を向上させるという観点から、糖鎖が付与されていることが好ましい。かかる糖鎖としては、一以上の単糖からなる糖鎖であれば特に制限されず、Ｏ-グリコシド結合型糖鎖であってもよく、Ｎ-グリコシド結合型糖鎖であってもよい、さらに適宜修飾が施されている糖鎖であってもよい。また、ＡＤＣＣ活性をより向上させるという観点から、還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合してないＮ-グリコシド結合型糖鎖が、本発明において好適に用いられる。
【００５０】
本発明の抗体において、かかる糖鎖が付与される部位及び個数としては特に限定されず、また糖鎖の抗体への付与は、抗体のアスパラギン中のアミド基のＮ-グリコシド化や抗体のセリン又はスレオニン中のアルコールのＯ-グリコシド化のみならず、例えば、本発明において置換されたシステイン中のＳＨ基と糖鎖に導入したブロモアセチル基を結合させて抗体に糖鎖を導入することによって行うことが可能である。
【００５１】
このように、糖鎖、ペプチド又はポリペプチドの付与によって、抗体のエフェクター機能を向上させることが出来る。従って、本発明は、糖鎖等が付与されることによって、エフェクター機能が改善される抗体も提供することができる。エフェクター機能としては、これらに限定されるものではないが、ＡＤＣＣ活性、ＣＤＣ活性が挙げられる。
【００５２】
また、エフェクター機能は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲII、ＦｃγＲIII、ＦｃＲｎ等のＦｃ受容体（ＦｃＲ）と抗体のＦｃ領域との相互作用によっても媒介される。従って、本発明の抗体は、エフェクター細胞表面のＦｃγＲＩ、ＦｃγＲII、ＦｃγＲIII又はＦｃＲｎと結合することが好ましい。
【００５３】
Ｆｃ受容体は、造血細胞上に存在する分化した細胞表面受容体として知られている。Ｆｃ受容体のうち、ＩｇＧ抗体に対するＦｃ受容体はＦｃγＲ、ＩｇＥに対するＦｃ受容体はＦｃεＲ、ＩｇＡに対するＦｃ受容体はＦｃαＲと呼ばれており、ＦｃＲは、免疫グロブリンアイソタイプによって定義される。Ｆｃγ受容体に関しては、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲII（ＣＤ３２）及びＦｃγＲIII（ＣＤ１６）の３つのサブクラスが確認されている。各ＦｃγＲサブクラスは２つ又は３つの遺伝子によってコードされ、かつ選択的ＲＮＡスプライシングが複数の転写物をもたらすため、ＦｃγＲアイソフォームにおいて広い多様性が存在する。ＦｃγＲＩサブクラス（ＦｃγＲＩＡ、ＦｃγＲＩＢ及びＦｃγＲＩＣ）をコードしている３つの遺伝子は、第１染色体長腕の領域１ｑ２１．１においてクラスター形成され、ＦｃγＲIIアイソフォーム（ＦｃγＲIIＡ、ＦｃγＲIIＢ及びＦｃγＲIIＣ）をコードしている遺伝子ならびにＦｃγＲIll（ＦｃγＲIIIＡ及びＦｃγＲIIIＢ）をコードしている２つの遺伝子の全ては領域１ｑ２２においてクラスター形成される。ＦｃＲは、Ｒａｖｅｔｃｈ  ａｎｄ  Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９：４５７−９２（１９９１）；Ｃａｐｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ  ４：２５−３４（１９９４）；ａｎｄ  ｄｅ  Ｈａａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１２６：３３０−４１（１９９５）において概説されている。
【００５４】
ＦｃγＲＩが高い親和性で単量体のＩｇＧに結合する一方、ＦｃγＲII及びＦｃγＲIIIは低親和性の受容体であり、複合型又は塊状のＩｇＧと相互作用する。これらの低親和性受容体を検出するための古典的な方法として、ＩｇＧによって感作された抗体に覆われた赤血球（ＥＡ）を使用する「ロゼット形成」が知られている（Ｂｒｅｄｉｕｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ８３：６２４−６３０（１９９４）。また、ロゼットアッセイに関して、Ｔａｘ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３３（３）：１１８５−１１８９（１９８４）；Ｎａｇａｒａｊａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０（４３）：２５７６２−２５７７０（１９９５）；及びＷａｒｍｅｒｄａｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７（４）：１３３８−１３４３（１９９１）も参照されたい）。
【００５５】
本発明において、エフェクター細胞としては、特に制限はないが、例えば末梢血単核球（ＰＢＭＣ）が挙げられる。
【００５６】
本発明の抗体は、細胞障害を与えたいターゲット細胞の表面に存在する分子を認識する抗体であることが好ましい。細胞障害を与えたいターゲット細胞の由来としては、ヒトであることが好ましいが、これに限定されるものではない。また、細胞障害を与えたいターゲット細胞としては、特に制限はなく、例えば、癌細胞、Ｒａｊｉ、ＫＧ−１ａ、ＴＬ−１、ＨＵＴ７８、Ｊｕｒｋａｔ、ＢＡＬＬ−１、ＨＥＰＧ２、ＭＫＮ−７、ＫＢ、又はＨｅｌａが挙げられるが、これらに限定されるものではない。細胞障害を与えたいターゲット細胞の表面に存在する分子（抗原）としては、例えば、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ５２、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＥＧＦＲ、ＥｐＣＡＭ、ＭＵＣ１、ＧＤ３、ＣＥＡ、ＣＡ１２５、ＨＬＡ−ＤＲ、ＴＮＦアルファ及びＶＥＧＦからなる群から選択される標的抗原が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００５７】
２４４Ｃｙｓ型抗ＣＤ２０抗体としては、下記（１）〜（８）の抗体が好適な例として挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００５８】
なお、以下に示す、Ｈ鎖定常領域において所定の位置のアミノ酸残基がシステインに置換されている抗ＣＤ２０抗体に関し、下記（１）及び（５）に記載の抗体は、マウスＨ鎖のＣＤＲ１〜３と、所定の位置のアミノ酸がシステインに置換されているヒトＨ鎖定常領域とを有するＨ鎖を含むキメラ抗体を示し、
下記（２）及び（６）に記載の抗体は、マウスＨ鎖の可変領域と、所定の位置のアミノ酸がシステインに置換されているヒトＨ鎖定常領域とを有するＨ鎖を含むキメラ抗体を示し、
下記（３）及び（７）に記載の抗体は、マウスＨ鎖のＣＤＲ１〜３と、所定の位置のアミノ酸がシステインに置換されているヒトＨ鎖Ｆｃ領域とを有するＨ鎖を含むキメラ抗体を示し、
下記（４）及び（８）に記載の抗体は、前記（１）、（２）又は（３）に記載のＨ鎖と、（ｉ）マウスＬ鎖のＣＤＲ１〜３及びヒトＬ鎖定常領域を有するＬ鎖又は（ii）マウスＬ鎖の可変領域及びヒトＬ鎖定常領域を有するＬ鎖とを含むキメラ抗体を示すものである。２４４Ｃｙｓ型抗ＣＤ２０抗体として、より具体的には以下の通りである。
（１）ＣＤＲ１として配列番号：４７に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：４９に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ３として配列番号：５１に記載のアミノ酸配列及びＣＨとして配列番号：７５に記載のアミノ酸配列を有するＨ鎖を含む抗体。
（２）配列番号：７３に記載のアミノ酸配列を有するＨ鎖を含む抗体。
（３）ＣＤＲ１として配列番号：４７に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：４９に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ３として配列番号：５１に記載のアミノ酸配列及びＦｃ領域として配列番号：７７に記載のアミノ酸配列を有するＨ鎖を含む抗体。
（４）前記（１）、（２）又は（３）に記載のＨ鎖、及び、下記（ｉ）又は（ii）に記載のＬ鎖の対を有する抗体。
（ｉ）ＣＤＲ１として配列番号：６３に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：６５に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ３として配列番号：６７に記載のアミノ酸配列、及びＣＬとして配列番号：７１に記載のアミノ酸配列を有するＬ鎖、
（ii）配列番号：６９に記載のアミノ酸配列を有するＬ鎖。
（５）配列番号：４６に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ１、配列番号：４８に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ２、配列番号：５０に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ３及び配列番号：７４に記載の塩基配列からコードされるＣＨを有するＨ鎖を含む抗体。
（６）配列番号：７２に記載の塩基配列からコードされるＨ鎖を含む抗体。
（７）配列番号：４６に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ１、配列番号：４８に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ２、配列番号：５０に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ３及び配列番号：７６に記載の塩基配列からコードされるＦｃ領域を有するＨ鎖を含む抗体。
（８）前記（５）、（６）又は（７）に記載のＨ鎖、及び、下記（ｉ）又は（ii）に記載のＬ鎖の対を有する抗体、
（ｉ）配列番号：６２に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ１、配列番号：６４に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ２、配列番号：６６に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ３及び配列番号：７０に記載の塩基配列からコードされるＣＬを有するＬ鎖、
（ii）配列番号：６８に記載の塩基配列からコードされるＬ鎖。
【００５９】
２４６Ｃｙｓ型抗ＣＤ２０抗体としては、下記（１）〜（８）の抗体が好適な例として挙げられるが、これらに限定されるものではない。
（１）ＣＤＲ１として配列番号：４７に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：４９に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ３として配列番号：５１に記載のアミノ酸配列及びＣＨとして配列番号：８１に記載のアミノ酸配列を有するＨ鎖を含む抗体。
（２）配列番号：７９に記載のアミノ酸配列を有するＨ鎖を含む抗体。
（３）ＣＤＲ１として配列番号：４７に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：４９に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ３として配列番号：５１に記載のアミノ酸配列及びＦｃ領域として配列番号：８３に記載のアミノ酸配列を有するＨ鎖を含む抗体。
（４）前記（１）、（２）又は（３）に記載のＨ鎖、及び、下記（ｉ）又は（ii）に記載のＬ鎖の対を有する抗体、
（ｉ）ＣＤＲ１として配列番号：６３に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：６５に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ３として配列番号：６７に記載のアミノ酸配列及びＣＬとして配列番号：７１に記載のアミノ酸配列を有するＬ鎖、
（ii）配列番号：６９に記載のアミノ酸配列を有するＬ鎖。
（５）配列番号：４６に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ１、配列番号：４８に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ２、配列番号：５０に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ３及び配列番号：８０に記載の塩基配列からコードされるＣＨを有するＨ鎖を含む抗体。
（６）配列番号：７８に記載の塩基配列からコードされるＨ鎖を含む抗体。
（７）配列番号：４６に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ１、配列番号：４８に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ２、配列番号：５０に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ３、及び配列番号：８２に記載の塩基配列からコードされるＦｃ領域を有するＨ鎖を含む抗体。
（８）前記（５）、（６）又は（７）に記載のＨ鎖、及び、下記（ｉ）又は（ii）に記載のＬ鎖の対を有する抗体、
（ｉ）配列番号：６２に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ１、配列番号：６４に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ２、配列番号：６６に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ３、及び配列番号：７０に記載の塩基配列からコードされるＣＬを有するＬ鎖、
（ii）配列番号：６８に記載の塩基配列からコードされるＬ鎖。
【００６０】
２５９Ｃｙｓ型抗ＣＤ２０抗体としては、下記（１）〜（８）の抗体が好適な例として挙げられるが、これらに限定されるものではない。
（１）ＣＤＲ１として配列番号：４７に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：４９に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ３として配列番号：５１に記載のアミノ酸配列及びＣＨとして配列番号：８７に記載のアミノ酸配列を有するＨ鎖を含む抗体。
（２）配列番号：８５に記載のアミノ酸配列を有するＨ鎖を含む抗体。
（３）ＣＤＲ１として配列番号：４７に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：４９に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ３として配列番号：５１に記載のアミノ酸配列及びＦｃ領域として配列番号：８９に記載のアミノ酸配列を有するＨ鎖を含む抗体。
（４）前記（１）、（２）又は（３）に記載のＨ鎖、及び、下記（ｉ）又は（ii）に記載のＬ鎖の対を有する抗体、
（ｉ）ＣＤＲ１として配列番号：６３に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：６５に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ３として配列番号：６７に記載のアミノ酸配列及びＣＬとして配列番号：７１に記載のアミノ酸配列を有するＬ鎖、
（ii）配列番号：６９に記載のアミノ酸配列を有するＬ鎖。
（５）配列番号：４６に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ１、配列番号：４８に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ２、配列番号：５０に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ３及び配列番号：８６に記載の塩基配列からコードされるＣＨを有するＨ鎖を含む抗体。
（６）配列番号：８４に記載の塩基配列からコードされるＨ鎖を含む抗体。
（７）配列番号：４６に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ１、配列番号：４８に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ２、配列番号：５０に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ３及び配列番号：８８に記載の塩基配列からコードされるＦｃ領域を有するＨ鎖を含む抗体。
（８）前記（５）、（６）又は（７）に記載のＨ鎖、及び、下記（ｉ）又は（ii）に記載のＬ鎖の対を有する抗体、
（ｉ）配列番号：６２に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ１、配列番号：６４に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ２、配列番号：６６に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ３及び配列番号：７０に記載の塩基配列からコードされるＣＬを有するＬ鎖、
（ii）配列番号：６８に記載の塩基配列からコードされるＬ鎖。
【００６１】
また、２４４Ｃｙｓ型抗ＥＧＦＲ抗体としては、下記（１）〜（８）の抗体が好適な例として挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００６２】
なお、以下に示す、Ｈ鎖定常領域において所定の位置のアミノ酸残基がシステインに置換されている抗ＥＧＦＲ抗体に関し、下記（１）及び（５）に記載の抗体は、ヒトＨ鎖のＣＤＲ１〜３と、所定の位置のアミノ酸がシステインに置換されているヒトＨ鎖定常領域とを有するＨ鎖を含む抗体を示し、
下記（２）及び（６）に記載の抗体は、ヒトＨ鎖の可変領域と、所定の位置のアミノ酸がシステインに置換されているヒトＨ鎖定常領域とを有するＨ鎖を含む抗体を示し、
下記（３）及び（７）に記載の抗体は、ヒトＨ鎖のＣＤＲ１〜３と、所定の位置のアミノ酸がシステインに置換されているヒトＨ鎖Ｆｃ領域とを有するＨ鎖を含む抗体を示し、
下記（４）及び（８）に記載の抗体は、前記（１）、（２）又は（３）に記載のＨ鎖と、（ｉ）ヒトＬ鎖のＣＤＲ１〜３及びヒトＬ鎖定常領域を有するＬ鎖又は（ii）ヒトＬ鎖とを含む抗体を示すものである。２４４Ｃｙｓ型抗ＥＧＦＲ抗体として、より具体的には以下の通りである。
（１）ＣＤＲ１として配列番号：１０１に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：１０３に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ３として配列番号：１０５に記載のアミノ酸配列及びＣＨとして配列番号：７５に記載のアミノ酸配列を有するＨ鎖を含む抗体。
（２）配列番号：１１７に記載のアミノ酸配列を有するＨ鎖を含む抗体。
（３）ＣＤＲ１として配列番号：１０１に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：１０３に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ３として配列番号：１０５に記載のアミノ酸配列、及びＦｃ領域として配列番号：７７に記載のアミノ酸配列を有するＨ鎖を含む抗体、
（４）前記（１）、（２）又は（３）に記載のＨ鎖、及び、下記（ｉ）又は（ii）に記載のＬ鎖の対を有する抗体。
（ｉ）ＣＤＲ１として配列番号：１０７に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：１０９に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ３として配列番号：１１１に記載のアミノ酸配列、及びＣＬとして配列番号：１１３に記載のアミノ酸配列を有するＬ鎖、
（ii）配列番号：１１５に記載のアミノ酸配列を有するＬ鎖。
（５）配列番号：１００に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ１、配列番号：１０２に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ２、配列番号：１０４に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ３及び配列番号：７４に記載の塩基配列からコードされるＣＨを有するＨ鎖を含む抗体。
（６）配列番号：１１６に記載の塩基配列からコードされるＨ鎖を含む抗体。
（７）配列番号：１００に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ１、配列番号：１０２に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ２、配列番号：１０４に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ３及び配列番号：７６に記載の塩基配列からコードされるＦｃ領域を有するＨ鎖を含む抗体。
（８）前記（５）、（６）又は（７）に記載のＨ鎖、及び、下記（ｉ）又は（ii）に記載のＬ鎖の対を有する抗体、
（ｉ）配列番号：１０６に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ１、配列番号：１０８に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ２、配列番号：１１０に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ３及び配列番号：１１２に記載の塩基配列からコードされるＣＬを有するＬ鎖、
（ii）配列番号：１１４に記載の塩基配列からコードされるＬ鎖。
【００６３】
２４６Ｃｙｓ型抗ＥＧＦＲ抗体としては、下記（１）〜（８）の抗体が好適な例として挙げられるが、これらに限定されるものではない。
（１）ＣＤＲ１として配列番号：１０１に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：１０３に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ３として配列番号：１０５に記載のアミノ酸配列及びＣＨとして配列番号：８１に記載のアミノ酸配列を有するＨ鎖を含む抗体。
（２）配列番号：１１９に記載のアミノ酸配列を有するＨ鎖を含む抗体。
（３）ＣＤＲ１として配列番号：１０１に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：１０３に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ３として配列番号：１０５に記載のアミノ酸配列及びＦｃ領域として配列番号：８３に記載のアミノ酸配列を有するＨ鎖を含む抗体。
（４）前記（１）、（２）又は（３）に記載のＨ鎖、及び、下記（ｉ）又は（ii）に記載のＬ鎖の対を有する抗体。
（ｉ）ＣＤＲ１として配列番号：１０７に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：１０９に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ３として配列番号：１１１に記載のアミノ酸配列及びＣＬとして配列番号：１１３に記載のアミノ酸配列を有するＬ鎖。
（ii）配列番号：１１５に記載のアミノ酸配列を有するＬ鎖。
（５）配列番号：１００に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ１、配列番号：１０２に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ２、配列番号：１０４に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ３及び配列番号：８０に記載の塩基配列からコードされるＣＨを有するＨ鎖を含む抗体。
（６）配列番号：１１８に記載の塩基配列からコードされるＨ鎖を含む抗体。
（７）配列番号：１００に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ１、配列番号：１０２に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ２、配列番号：１０４に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ３、及び配列番号：８２に記載の塩基配列からコードされるＦｃ領域を有するＨ鎖を含む抗体。
（８）上記（５）、（６）又は（７）に記載のＨ鎖、及び、下記（ｉ）又は（ii）に記載のＬ鎖の対を有する抗体、
（ｉ）配列番号：１０６に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ１、配列番号：１０８に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ２、配列番号：１１０に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ３、及び配列番号：１１２に記載の塩基配列からコードされるＣＬを有するＬ鎖、
（ii）配列番号：１１４に記載の塩基配列からコードされるＬ鎖。
【００６４】
２５９Ｃｙｓ型抗ＥＧＦＲ抗体としては、下記（１）〜（８）の抗体が好適な例として挙げられるが、これらに限定されるものではない。
（１）ＣＤＲ１として配列番号：１０１に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：１０３に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ３として配列番号：１０５に記載のアミノ酸配列及びＣＨとして配列番号：８７に記載のアミノ酸配列を有するＨ鎖を含む抗体。
（２）配列番号：１２１に記載のアミノ酸配列を有するＨ鎖を含む抗体。
（３）ＣＤＲ１として配列番号：１０１に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：１０３に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ３として配列番号：１０５に記載のアミノ酸配列及びＦｃ領域として配列番号：８９に記載のアミノ酸配列を有するＨ鎖を含む抗体、
（４）上記（１）、（２）又は（３）に記載のＨ鎖、及び、下記（ｉ）又は（ii）に記載のＬ鎖の対を有する抗体、
（ｉ）ＣＤＲ１として配列番号：１０７に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：１０９に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ３として配列番号：１１１に記載のアミノ酸配列、及びＣＬとして配列番号：１１３に記載のアミノ酸配列を有するＬ鎖、
（ii）配列番号：１１５に記載のアミノ酸配列を有するＬ鎖。
（５）配列番号：１００に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ１、配列番号：１０２に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ２、配列番号：１０４に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ３及び配列番号：８６に記載の塩基配列からコードされるＣＨを有するＨ鎖を含む抗体。
（６）配列番号：１２０に記載の塩基配列からコードされるＨ鎖を含む抗体。
（７）配列番号：１００に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ１、配列番号：１０２に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ２、配列番号：１０４に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ３及び配列番号：８８に記載の塩基配列からコードされるＦｃ領域を有するＨ鎖を含む抗体。
（８）上記（５）、（６）又は（７）に記載のＨ鎖、及び、下記（ｉ）又は（ii）に記載のＬ鎖の対を有する抗体。
（ｉ）配列番号：１０６に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ１、配列番号：１０８に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ２、配列番号：１１０に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ３及び配列番号：１１２に記載の塩基配列からコードされるＣＬを有するＬ鎖、
（ii）配列番号：１１４に記載の塩基配列からコードされるＬ鎖。
【００６５】
上述したように、本発明の抗体には、ヒト化（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）抗体等の組換え抗体も含まれる。ヒト化（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）抗体には、キメラ（ｃｈｉｍｅｒｉｃ）抗体（特にヒト型キメラ抗体）、ＣＤＲ移植抗体（特にヒト型ＣＤＲ移植抗体）が含まれる。これらの抗体の具体的な説明は上述の通りである。
【００６６】
＜本発明の抗体をコードする核酸、ベクター、宿主細胞、宿主生物＞
【００６７】
本発明は、本発明の抗体をコードする核酸、該核酸を含むベクター、及び該ベクターを有する宿主細胞を提供する。ベクターの例としては、Ｍ１３系ベクター、ｐＵＣ系ベクター、ｐＢＲ３２２、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ等が挙げられる。また、ｃＤＮＡのサブクローニング、切り出しを目的とした場合、上記ベクターの他に、例えば、ｐＧＥＭ−Ｔ、ｐＤＩＲＥＣＴ、ｐＴ７等が挙げられる。
【００６８】
発現ベクターとしては、例えば、大腸菌での発現を目的とした場合は、ベクターが大腸菌で増幅されるような上記特徴を持つほかに、宿主をＪＭ１０９、ＤＨ５α、ＨＢ１０１、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ等の大腸菌とした場合においては、大腸菌で効率よく発現できるようなプロモーター、例えば、ｌａｃＺプロモーター（Ｗａｒｄら，Ｎａｔｕｒｅ（１９８９）３４１，５４４−５４６；ＦＡＳＥＢ  Ｊ．（１９９２）６，２４２２−２４２７）、ａｒａＢプロモーター（Ｂｅｔｔｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２４０，１０４１−１０４３）又はＴ７プロモーター等を持っていることが不可欠である。このようなベクターとしては、上記ベクターの他にｐＧＥＸ−５Ｘ−１（ファルマシア社製）、「ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓ  ｓｙｓｔｅｍ」（キアゲン社製）、ｐＥＧＦＰ又はｐＥＴ（この場合、宿主はＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを発現しているＢＬ２１が好ましい）等が挙げられる。
【００６９】
また、ベクターには、ポリペプチド分泌のためのシグナル配列が含まれていてもよい。蛋白質分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリプラズムに産生させる場合、ｐｅｌＢシグナル配列（Ｌｅｉ，Ｓ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ  Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９８７）１６９，４３７９）を使用すればよい。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法を用いて行うことができる。
【００７０】
大腸菌以外にも、例えば、哺乳動物由来の発現ベクター（例えば、ｐｃＤＮＡ３（インビトロゲン社製）や、ｐＥＧＦ−ＢＯＳ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１９９０，１８（１７），ｐ５３２２）、ｐＥＦ、ｐＣＤＭ８）、昆虫細胞由来の発現ベクター（例えば「Ｂａｃ−ｔｏ−ＢＡＣ  ｂａｃｕｌｏｖａｉｒｕｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ」（ギブコＢＲＬ社製）、ｐＢａｃＰＡＫ８）、植物由来の発現ベクター（例えばｐＭＨ１、ｐＭＨ２）、動物ウィルス由来の発現ベクター（例えば、ｐＨＳＶ、ｐＭＶ、ｐＡｄｅｘＬｃｗ）、レトロウィルス由来の発現ベクター（例えば、ｐＺＩＰｎｅｏ）、酵母由来の発現ベクター（例えば、「Ｐｉｃｈｉａ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｋｉｔ」（インビトロゲン社製）、ｐＮＶ１１、ＳＰ−Ｑ０１）、枯草菌由来の発現ベクター（例えば、ｐＰＬ６０８、ｐＫＴＨ５０）が挙げられる。
【００７１】
ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞等の動物細胞での発現を目的とした場合には、細胞内で発現させるために必要なプロモーター、例えばＳＶ４０プロモーター（Ｍｕｌｌｉｇａｎら，Ｎａｔｕｒｅ（１９７９）２７７，１０８）、ＭＭＴＶ−ＬＴＲプロモーター、ＥＦ１αプロモーター（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９９０）１８，５３２２）、ＣＭＶプロモーター等を持っていることが不可欠であり、細胞への形質転換を選抜するための遺伝子（例えば、薬剤（ネオマイシン、Ｇ４１８等）により判別できるような薬剤耐性遺伝子）を有すればさらに好ましい。このような特性を有するベクターとしては、例えば、ｐＭＡＭ、ｐＤＲ２、ｐＢＫ−ＲＳＶ、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐＯＰＲＳＶ、ｐＯＰ１３等が挙げられる。
【００７２】
さらに、遺伝子を安定的に発現させ、かつ、細胞内での遺伝子のコピー数の増幅を目的とする場合には、核酸合成経路を欠損したＣＨＯ細胞にそれを相補するＤＨＦＲ遺伝子を有するベクター（例えば、ｐＣＨＯＩ等）を導入し、メトトレキセート（ＭＴＸ）により増幅させる方法が挙げられ、また、遺伝子の一過性の発現を目的とする場合には、ＳＶ４０  Ｔ抗原を発現する遺伝子を染色体上に持つＣＯＳ細胞を用いてＳＶ４０の複製起点を持つベクター（ｐｃＤ等）で形質転換する方法が挙げられる。複製開始点としては、また、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、ウシパピローマウィルス（ＢＰＶ）等の由来のものを用いることもできる。さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発現ベクターは選択マーカーとして、アミノグリコシドトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）遺伝子、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｅｃｏｇｐｔ）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）遺伝子等を含むことができる。
【００７３】
ベクターが導入される宿主細胞としては特に制限はなく、例えば、大腸菌や種々の動物細胞等を用いることが可能である。宿主細胞は、例えば、本発明の抗体の製造や発現のための産生系として使用することができる。ポリペプチド製造のための産生系は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏの産生系がある。ｉｎ  ｖｉｔｒｏの産生系としては、真核細胞を使用する産生系や原核細胞を使用する産生系が挙げられる。
【００７４】
真核細胞を使用する場合、例えば、動物細胞、植物細胞、真菌細胞を宿主に用いることができる。動物細胞としては、哺乳類細胞、例えば、ＣＨＯ（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９５）１０８，９４５）、ＣＯＳ、３Ｔ３、ミエローマ、ＢＨＫ（ｂａｂｙ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｋｉｄｎｅｙ）、ＨｅＬａ、Ｖｅｒｏ、両生類細胞、例えばアフリカツメガエル卵母細胞（Ｖａｌｌｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８１）２９１，３５８−３４０）、あるいは昆虫細胞、例えば、Ｓｆ９、Ｓｆ２１、Ｔｎ５が知られている。本発明においては、ＣＨＯ−ＤＧ４４、ＣＨＯ−ＤＸＢ１１、ＣＯＳ７細胞、ＢＨＫ細胞が好適に用いられる。動物細胞において、大量発現を目的とする場合には特にＣＨＯ細胞が好ましい。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥデキストラン法、カチオニックリボソームＤＯＴＡＰ（ベーリンガーマンハイム社製）を用いた方法、エレクトロポーレーション法、リポフェクション等の方法で行うことが可能である。
【００７５】
植物細胞としては、例えば、ニコチアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）由来の細胞が蛋白質生産系として知られており、これをカルス培養すればよい。真菌細胞としては、酵母、例えば、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセス・ポンベ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、糸状菌、例えば、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、例えば、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）が知られている。
【００７６】
原核細胞を使用する場合、細菌細胞を用いる産生系がある。細菌細胞としては、大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）、例えば、ＪＭ１０９、ＤＨ５α、ＨＢ１０１等が挙げられ、その他、枯草菌が知られている。本発明のＤＮＡにより形質転換された細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養し、当業者が通常行う方法によって精製することによって、本発明の抗体を得ることが可能である。
【００７７】
また本発明は、本発明の抗体をコードする核酸を含むベクターを有する宿主生物を提供する。本発明の宿主生物は、組換え型抗体の産生に有用である。本発明における宿主生物としては、ヤギ等が挙げられる。例えば、本発明のトランスジェニックヤギの作製は次のようにして行うことが可能である。即ち、抗体遺伝子が乳汁中に固有に産生されるタンパク質（ヤギβカゼイン等）をコードする遺伝子の内部にインフレームで挿入された融合遺伝子を構築する。抗体遺伝子が挿入された融合遺伝子を含むＤＮＡ断片をヤギの胚へ注入すれば、該注入胚が雌のヤギへ導入される。胚を受容したヤギから生まれるトランスジェニックヤギ又はその子孫が産生する乳汁から、本発明の抗体を取得することができる。トランスジェニックヤギから産生される本発明の抗体を含む乳汁量を増加させるために、ホルモンをトランスジェニックヤギに適宜使用することも可能である（Ｅｂｅｒｔ，Ｋ．Ｍ．  ｅｔａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９４）１２，６９９−７０２）。
【００７８】
＜本発明の抗体の製造方法＞
【００７９】
本発明は、２４４位、２４６位及び２５９位からなる群より選択される少なくとも１つの位置のアミノ酸がＣｙｓに置換されたＣγ１、Ｃγ２、Ｃγ３及びＣγ４を提供することもできる。このようなＣγ１、Ｃγ２、Ｃγ３及びＣγ４は、ＡＤＣＣ活性が増強された抗体の製造において有用である。
【００８０】
当業者であれば、例えば、前記２４４位、２４６位及び２５９位からなる群より選択される少なくとも１つの位置のアミノ酸がＣｙｓに置換されたＣγ１、Ｃγ２、Ｃγ３又はＣγ４と任意の抗体可変領域を組み合わせることによって、ＡＤＣＣ活性が増強された任意の抗原を認識する抗体を製造することが可能である。また当業者であれば、例えば、前記２４４位、２４６位及び２５９位からなる群より選択される少なくとも１つの位置のアミノ酸がＣｙｓに置換されたＣγ１、Ｃγ２、Ｃγ３又はＣγ４のＦｃ領域と任意の抗体Ｆａｂ領域とを組み合わせることによって、ＡＤＣＣ活性が増強された任意の抗原を認識する抗体を製造することが可能である。上述したように、本発明の抗体は、細胞障害を与えたいターゲット細胞の表面に存在する分子を認識する抗体であることが好ましい。また、細胞障害を与えたいターゲット細胞の由来としては、ヒトであることが好ましいが、これに限定されるものではない。細胞障害を与えたいターゲット細胞の表面に存在する分子（抗原）としては、例えばＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ５２、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＥＧＦＲ、ＥｐＣＡＭ、ＭＵＣ１、ＧＤ３、ＣＥＡ、ＣＡ１２５、ＨＬＡ−ＤＲ、ＴＮＦアルファ及びＶＥＧＦからなる群から選択される標的抗原が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００８１】
本発明はまた、Ｈ鎖定常領域において、２４４位、２４６位及び２５９位からなる群より選択される少なくとも１つの位置のアミノ酸残基をシステインに置換する工程を含む、ＡＤＣＣ活性が増強された抗体の製造方法を提供する。
【００８２】
該製造方法の一つの態様としては、当業者に公知のＡＤＣＣ活性を有する抗体のＨ鎖定常領域において、２４４位、２４６位及び２５９位からなる群より選択される少なくとも１つの位置のアミノ酸残基をシステインに置換する。当業者に公知のＡＤＣＣ活性を有する抗体の取得方法に制限はない。例えば、本発明の製造方法を実施する者が自ら製造することもできるし、他者より購入することもできる。アミノ酸残基をシステインに置換する方法としては、例えば、部位特異的変異誘発法（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ−Ｇｏｔｏｈ，Ｔ，  Ｍｉｚｕｎｏ，Ｔ，Ｏｇａｓａｈａｒａ，Ｙ，ａｎｄ  Ｎａｋａｇａｗａ，Ｍ．（１９９５）Ａｎ  ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｄｕａｌ  ａｍｂｅｒ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ．Ｇｅｎｅ  １５２，２７１−２７５、Ｚｏｌｌｅｒ，ＭＪ，ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．（１９８３）Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｃｌｏｎｅｄ  ｉｎｔｏ  Ｍ１３  ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００，４６８−５００、Ｋｒａｍｅｒ，Ｗ，Ｄｒｕｔｓａ，Ｖ，Ｊａｎｓｅｎ，ＨＷ，Ｋｒａｍｅｒ，Ｂ，Ｐｆｌｕｇｆｅｌｄｅｒ，Ｍ，ａｎｄ  Ｆｒｉｔｚ，ＨＪ（１９８４）Ｔｈｅ  ｇａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ  ＤＮＡ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２，９４４１−９４５６、Ｋｒａｍｅｒ  Ｗ，ａｎｄ  Ｆｒｉｔｚ  ＨＪ（１９８７）Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｖｉａ  ｇａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ  ＤＮＡ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４，３５０−３６７、Ｋｕｎｋｅｌ，ＴＡ（１９８５）Ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．８２，４８８−４９２）が挙げられる。該方法を用いて、抗体の所望のアミノ酸をシステインに置換することができる。
【００８３】
該製造方法の別の態様としては、まず、当業者に周知な方法によって、所望の抗原に結合する抗体を得る。取得された抗体が非ヒト動物抗体であれば、ヒト化することもできる。次いで、取得された抗体がＡＤＣＣ活性を有するか否かを当業者に周知な方法によって判定する。抗体のＡＤＣＣ活性は、例えば実施例に記載の乳酸脱水素酵素放出アッセイ系で測定することができるが、この方法に限定されず、例えば、Ｃｒ５１放出アッセイ（Ｃｒ５１−ｒｅｌｅａｓｅ  ａｓｓａｙ）によっても測定可能である。次いで、ＡＤＣＣ活性を有すると判定された抗体のＨ鎖定常領域において、２４４位、２４６位及び２５９位位からなる群より選択される少なくとも１つの位置のアミノ酸残基をシステインに置換する。
【００８４】
より具体的には、以下の（ａ）及び（ｂ）の工程を含む、ＡＤＣＣ活性が増強された抗体の製造方法を提供する。
（ａ）Ｈ鎖定常領域において、２４４位、２４６位及び２５９位からなる群より選択される少なくとも１つの位置のアミノ酸残基がシステインに置換されたＨ鎖をコードするＤＮＡ、及びＬ鎖をコードするＤＮＡを発現させる工程
（ｂ）工程（ａ）の発現産物を回収する工程。
【００８５】
本発明の製造方法においては、まず、ＡＤＣＣ活性を有する抗体の変異体のＨ鎖をコードするＤＮＡであって、２４４位、２４６位及び２５９位からなる群より選択される少なくとも１つの位置のアミノ酸残基がシステインに置換されたＨ鎖をコードするＤＮＡ及びＡＤＣＣ活性を有する抗体のＬ鎖をコードするＤＮＡを発現させる。Ｈ鎖定常領域において、２４４位、２４６位及び２５９位からなる群より選択される少なくとも１つの位置のアミノ酸残基がシステインに置換されたＨ鎖をコードするＤＮＡは、例えば、野生型のＨ鎖をコードするＤＮＡのＨ鎖定常領域部分を取得し、該Ｈ鎖定常領域中の特定のアミノ酸をコードするコドンがシステインをコードするよう、適宜置換を導入することによって得ることが出来る。なお、システインをコードするコドンは、ＴＧＴ又はＴＧＣである。
【００８６】
また、あらかじめ、野生型Ｈ鎖の定常領域部分のアミノ酸がシステイン置換されたタンパク質をコードするＤＮＡを設計し、該ＤＮＡを化学的に合成することによって、Ｈ鎖定常領域において、２４４位、２４６位及び２５９位からなる群より選択される少なくとも１つの位置のアミノ酸残基がシステインに置換されたＨ鎖をコードするＤＮＡを得ることも可能である。
【００８７】
また、Ｆｃ領域のＨ鎖定常領域において、２４４位、２４６位及び２５９位からなる群より選択される少なくとも１つの位置のアミノ酸残基がシステインに置換されたＨ鎖をコードするＤＮＡは、部分ＤＮＡに分けて製造することができる。部分ＤＮＡの組み合わせとしては、例えば、可変領域をコードするＤＮＡと定常領域をコードするＤＮＡ、あるいはＦａｂ領域をコードするＤＮＡとＦｃ領域をコードするＤＮＡが挙げられるが、これら組み合わせに限定されるものではない。Ｌ鎖をコードするＤＮＡもまた、同様に部分ＤＮＡに分けて製造することができる。
【００８８】
例えば、２４４位、２４６位及び２５９位からなる群より選択される少なくとも１つの位置のアミノ酸残基がシステインに置換されたＨ鎖定常領域をコードするＤＮＡ、Ｈ鎖可変領域をコードするＤＮＡ、Ｌ鎖定常領域をコードするＤＮＡ、Ｈ鎖定常領域をコードするＤＮＡを発現させる方法としては、以下の方法が挙げられる。即ち、Ｈ鎖可変領域をコードするＤＮＡを、Ｈ鎖定常領域をコードするＤＮＡとともに発現ベクターに組み込みＨ鎖発現ベクターを構築する。同様に、Ｌ鎖可変領域をコードするＤＮＡを、Ｌ鎖定常領域をコードするＤＮＡとともに発現ベクターに組み込みＬ鎖発現ベクターを構築する。発現ベクターとしては例えばＳＶ４０  ｖｉｒｕｓ  ｂａｓｅｄベクター、ＥＢ  ｖｉｒｕｓ  ｂａｓｅｄベクター、ＢＰＶ（パピローマウイルス）ｂａｓｅｄベクター等を用いることができるが、これらに限定されるものではない。
【００８９】
上記４つのＤＮＡをベクターに導入する方法としては、４つのＤＮＡを１つのベクターへ導入する方法、４つのＤＮＡを２つのベクターに分けて導入する方法、４つのＤＮＡを３つのベクターに分けて導入する方法（１つのベクターに１つのＤＮＡを導入し、もう１つのベクターに１つのＤＮＡを導入し、残りのベクターに２つのＤＮＡを導入する方法）、４つのＤＮＡを４つのベクターに導入する方法（４つのＤＮＡを各々別々のベクターに導入する方法）が含まれる。ここで、４つのＤＮＡを２つのベクターに分けて導入する場合、及び、３つのベクターに分けて導入する場合において、４つのＤＮＡのグループ分けはなんら制限されるものではない。
【００９０】
以上の方法で作製された抗体発現ベクターにより宿主細胞を共形質転換する。宿主細胞としてはＣＨＯ細胞（チャイニーズハムスター卵巣）等上述の細胞が好適に用いられる。また、形質転換にはリポフェクチン法（Ｒ．Ｗ．Ｍａｌｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６，６０７７（１９８９），Ｐ．Ｌ．Ｆｅｌｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４，７４１３（１９８７）、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法（Ｆ．Ｌ．Ｇｒａｈａｍ＆Ａ．Ｊ．ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｅｂ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５２，４５６−４６７（１９７３））、ＤＥＡＥ−Ｄｅｘｔｒａｎ法等が好適に用いられる。
【００９１】
本発明の抗体の製造方法においては、次に、工程（ａ）で得られた発現産物を回収する。発現産物の回収は、例えば、形質転換体を培養した後、形質転換体の細胞内又は培養液より分離することによって行うことが出来る。抗体の分離、精製には、遠心分離、硫安分画、塩析、限外濾過、Ｃ１ｑ、ＦｃＲｎ、プロテインＡ、プロテインＧカラム、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー等の方法を適宜組み合わせて行うことができる。
【００９２】
上記の方法によって、抗体のＡＤＣＣ活性を増強することができる。すなわち、本発明は、Ｈ鎖定常領域において、２４４位、２４６位及び２５９位からなる群より選択される少なくとも１つの位置のアミノ酸残基をシステインに置換する工程を含む、抗体のＡＤＣＣ活性を増強する方法もまた提供するものである。
【００９３】
＜本発明の医薬組成物及び治療方法＞
本発明は、本発明の抗体及び医薬的に許容し得る担体を含む、医薬組成物を提供する。また本発明は、本発明の抗体を対象に投与することを含む、前記対象を治療するための方法を提供する。前記対象としては、ヒト、非ヒト哺乳動物（例えばマウス、ラット、サル等）が挙げられる。本発明の医薬組成物は、抗体がＣＤ２０を認識する抗体である場合、Ｂ細胞性悪性リンパ腫等の治療において有用である。また、抗体がＥＧＦＲを認識する抗体である場合、肺癌等の治療において有用である。また、抗体がＨｅｒ２を認識する抗体である場合、乳癌等の治療において有用である。
【００９４】
本発明の医薬組成物は、抗体に加えて医薬的に許容し得る担体を導入し、公知の方法で製剤化することが可能である。例えば、水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、又は懸濁液剤の注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、薬理学上許容される担体もしくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤等と適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することが考えられる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。
【００９５】
注射のための無菌組成物は注射用蒸留水のようなベヒクルを用いて通常の製剤実施に従って処方することができる。
【００９６】
注射用の水溶液としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えばＤ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、具体的にはエタノール、ポリアルコール、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート８０（ＴＭ）、ＨＣＯ−５０と併用してもよい。
【００９７】
油性液としてはゴマ油、大豆油があげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールと併用してもよい。また、緩衝剤、例えばリン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、無痛化剤、例えば、塩酸プロカイン、安定剤、例えばベンジルアルコール、フェノール、酸化防止剤と配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填させる。
【００９８】
投与は好ましくは非経口投与であり、具体的には、注射剤型、経鼻投与剤型、経肺投与剤型、経皮投与型等が挙げられる。注射剤型の例としては、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射等により全身又は局部的に投与することができる。
【００９９】
また、患者の年齢、症状により適宜投与方法を選択することができる。抗体又は抗体をコードするポリヌクレオチドを含有する医薬組成物の投与量としては、例えば、一回につき体重１ｋｇあたり０．０００１ｍｇから１０００ｍｇの範囲で選ぶことが可能である。あるいは、例えば、患者あたり０．００１から１０００００ｍｇ／ｂｏｄｙの範囲で投与量を選ぶことができるが、これらの数値に必ずしも制限されるものではない。投与量、投与方法は、患者の体重や年齢、症状等により変動するが、当業者であれば適宜選択することが可能である。
【０１００】
なお、本明細書で開示した抗体の塩基配列及びアミノ酸配列は、以下の配列番号に従って配列表に記載されている。
＜２４４Ｃｙｓ型抗ＣＤ２０抗体＞
配列番号４６：マウスＨ鎖ＣＤＲ１の塩基配列
配列番号４７：マウスＨ鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号４８：マウスＨ鎖ＣＤＲ２の塩基配列
配列番号４９：マウスＨ鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号５０：マウスＨ鎖ＣＤＲ３の塩基配列
配列番号５１：マウスＨ鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号６８：キメラＬ鎖全長の塩基配列
配列番号６９：キメラＬ鎖全長のアミノ酸配列
配列番号６２：マウスＬ鎖ＣＤＲ１の塩基配列
配列番号６３：マウスＬ鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号６４：マウスＬ鎖ＣＤＲ２の塩基配列
配列番号６５：マウスＬ鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号６６：マウスＬ鎖ＣＤＲ３の塩基配列
配列番号６７：マウスＬ鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号７０：ヒトＬ鎖定常領域の塩基配列
配列番号７１：ヒトＬ鎖定常領域のアミノ酸配列
配列番号７２：キメラＨ鎖全長の塩基配列（２４４Ｃｙｓ型）
配列番号７３：キメラＨ鎖全長のアミノ酸配列（２４４Ｃｙｓ型）
配列番号７４：ヒトＨ鎖定常領域の塩基配列（２４４Ｃｙｓ型）
配列番号７５：ヒトＨ鎖定常領域のアミノ酸配列（２４４Ｃｙｓ型）
配列番号７６：ヒトＨ鎖Ｆｃ領域の塩基配列（２４４Ｃｙｓ型）
配列番号７７：ヒトＨ鎖Ｆｃ領域のアミノ酸配列（２４４Ｃｙｓ型）
【０１０１】
＜２４６Ｃｙｓ型抗ＣＤ２０抗体＞
配列番号４６：マウスＨ鎖ＣＤＲ１の塩基配列
配列番号４７：マウスＨ鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号４８：マウスＨ鎖ＣＤＲ２の塩基配列
配列番号４９：マウスＨ鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号５０：マウスＨ鎖ＣＤＲ３の塩基配列
配列番号５１：マウスＨ鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号６８：キメラＬ鎖全長の塩基配列
配列番号６９：キメラＬ鎖全長のアミノ酸配列
配列番号６２：マウスＬ鎖ＣＤＲ１の塩基配列
配列番号６３：マウスＬ鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号６４：マウスＬ鎖ＣＤＲ２の塩基配列
配列番号６５：マウスＬ鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号６６：マウスＬ鎖ＣＤＲ３の塩基配列
配列番号６７：マウスＬ鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号７０：ヒトＬ鎖定常領域の塩基配列
配列番号７１：ヒトＬ鎖定常領域のアミノ酸配列
配列番号７８：キメラＨ鎖全長の塩基配列（２４６Ｃｙｓ型）
配列番号７９：キメラＨ鎖全長のアミノ酸配列（２４６Ｃｙｓ型）
配列番号８０：ヒトＨ鎖定常領域の塩基配列（２４６Ｃｙｓ型）
配列番号８１：ヒトＨ鎖定常領域のアミノ酸配列（２４６Ｃｙｓ型）
配列番号８２：ヒトＨ鎖Ｆｃ領域の塩基配列（２４６Ｃｙｓ型）
配列番号８３：ヒトＨ鎖Ｆｃ領域のアミノ酸配列（２４６Ｃｙｓ型）
【０１０２】
＜２５９Ｃｙｓ型抗ＣＤ２０抗体＞
配列番号４６：マウスＨ鎖ＣＤＲ１の塩基配列
配列番号４７：マウスＨ鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号４８：マウスＨ鎖ＣＤＲ２の塩基配列
配列番号４９：マウスＨ鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号５０：マウスＨ鎖ＣＤＲ３の塩基配列
配列番号５１：マウスＨ鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号６８：キメラＬ鎖全長の塩基配列
配列番号６９：キメラＬ鎖全長のアミノ酸配列
配列番号６２：マウスＬ鎖ＣＤＲ１の塩基配列
配列番号６３：マウスＬ鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号６４：マウスＬ鎖ＣＤＲ２の塩基配列
配列番号６５：マウスＬ鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号６６：マウスＬ鎖ＣＤＲ３の塩基配列
配列番号６７：マウスＬ鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号７０：ヒトＬ鎖定常領域の塩基配列
配列番号７１：ヒトＬ鎖定常領域のアミノ酸配列
配列番号８４：キメラＨ鎖全長の塩基配列（２５９Ｃｙｓ型）
配列番号８５：キメラＨ鎖全長のアミノ酸配列（２５９Ｃｙｓ型）
配列番号８６：ヒトＨ鎖定常領域の塩基配列（２５９Ｃｙｓ型）
配列番号８７：ヒトＨ鎖定常領域のアミノ酸配列（２５９Ｃｙｓ型）
配列番号８８：ヒトＨ鎖Ｆｃ領域の塩基配列（２５９Ｃｙｓ型）
配列番号８９：ヒトＨ鎖Ｆｃ領域のアミノ酸配列（２５９Ｃｙｓ型）
【０１０３】
＜２８６Ｃｙｓ型抗ＣＤ２０抗体＞
配列番号４６：マウスＨ鎖ＣＤＲ１の塩基配列
配列番号４７：マウスＨ鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号４８：マウスＨ鎖ＣＤＲ２の塩基配列
配列番号４９：マウスＨ鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号５０：マウスＨ鎖ＣＤＲ３の塩基配列
配列番号５１：マウスＨ鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号６８：キメラＬ鎖全長の塩基配列
配列番号６９：キメラＬ鎖全長のアミノ酸配列
配列番号６２：マウスＬ鎖ＣＤＲ１の塩基配列
配列番号６３：マウスＬ鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号６４：マウスＬ鎖ＣＤＲ２の塩基配列
配列番号６５：マウスＬ鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号６６：マウスＬ鎖ＣＤＲ３の塩基配列
配列番号６７：マウスＬ鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号７０：ヒトＬ鎖定常領域の塩基配列
配列番号７１：ヒトＬ鎖定常領域のアミノ酸配列
配列番号９０：キメラＨ鎖全長の塩基配列（２８６Ｃｙｓ型）
配列番号９１：キメラＨ鎖全長のアミノ酸配列（２８６Ｃｙｓ型）
配列番号９２：ヒトＨ鎖定常領域の塩基配列（２８６Ｃｙｓ型）
配列番号９３：ヒトＨ鎖定常領域のアミノ酸配列（２８６Ｃｙｓ型）
配列番号９４：ヒトＨ鎖Ｆｃ領域の塩基配列（２８６Ｃｙｓ型）
配列番号９５：ヒトＨ鎖Ｆｃ領域のアミノ酸配列（２８６Ｃｙｓ型）
【０１０４】
＜２４４Ｃｙｓ型抗ＥＧＦＲ抗体＞
配列番号１００：ヒトＨ鎖ＣＤＲ１の塩基配列
配列番号１０１：ヒトＨ鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号１０２：ヒトＨ鎖ＣＤＲ２の塩基配列
配列番号１０３：ヒトＨ鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号１０４：ヒトＨ鎖ＣＤＲ３の塩基配列
配列番号１０５：ヒトＨ鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号１１４：ヒトＬ鎖全長の塩基配列
配列番号１１５：ヒトＬ鎖全長のアミノ酸配列
配列番号１０６：ヒトＬ鎖ＣＤＲ１の塩基配列
配列番号１０７：ヒトＬ鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号１０８：ヒトＬ鎖ＣＤＲ２の塩基配列
配列番号１０９：ヒトＬ鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号１１０：ヒトＬ鎖ＣＤＲ３の塩基配列
配列番号１１１：ヒトＬ鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号１１２：ヒトＬ鎖定常領域の塩基配列
配列番号１１３：ヒトＬ鎖定常領域のアミノ酸配列
配列番号１１６：ヒトＨ鎖全長の塩基配列（２４４Ｃｙｓ型）
配列番号１１７：ヒトＨ鎖全長のアミノ酸配列（２４４Ｃｙｓ型）
配列番号７４：ヒトＨ鎖定常領域の塩基配列（２４４Ｃｙｓ型）
配列番号７５：ヒトＨ鎖定常領域のアミノ酸配列（２４４Ｃｙｓ型）
配列番号７６：ヒトＨ鎖Ｆｃ領域の塩基配列（２４４Ｃｙｓ型）
配列番号７７：ヒトＨ鎖Ｆｃ領域のアミノ酸配列（２４４Ｃｙｓ型）
【０１０５】
＜２４６Ｃｙｓ型抗ＥＧＦＲ抗体＞
配列番号１００：ヒトＨ鎖ＣＤＲ１の塩基配列
配列番号１０１：ヒトＨ鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号１０２：ヒトＨ鎖ＣＤＲ２の塩基配列
配列番号１０３：ヒトＨ鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号１０４：ヒトＨ鎖ＣＤＲ３の塩基配列
配列番号１０５：ヒトＨ鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号１１４：ヒトＬ鎖全長の塩基配列
配列番号１１５：ヒトＬ鎖全長のアミノ酸配列
配列番号１０６：ヒトＬ鎖ＣＤＲ１の塩基配列
配列番号１０７：ヒトＬ鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号１０８：ヒトＬ鎖ＣＤＲ２の塩基配列
配列番号１０９：ヒトＬ鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号１１０：ヒトＬ鎖ＣＤＲ３の塩基配列
配列番号１１１：ヒトＬ鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号１１２：ヒトＬ鎖定常領域の塩基配列
配列番号１１３：ヒトＬ鎖定常領域のアミノ酸配列
配列番号１１８：ヒトＨ鎖全長の塩基配列（２４６Ｃｙｓ型）
配列番号１１９：ヒトＨ鎖全長のアミノ酸配列（２４６Ｃｙｓ型）
配列番号８０：ヒトＨ鎖定常領域の塩基配列（２４６Ｃｙｓ型）
配列番号８１：ヒトＨ鎖定常領域のアミノ酸配列（２４６Ｃｙｓ型）
配列番号８２：ヒトＨ鎖Ｆｃ領域の塩基配列（２４６Ｃｙｓ型）
配列番号８３：ヒトＨ鎖Ｆｃ領域のアミノ酸配列（２４６Ｃｙｓ型）
【０１０６】
＜２５９Ｃｙｓ型抗ＥＧＦＲ抗体＞
配列番号１００：ヒトＨ鎖ＣＤＲ１の塩基配列
配列番号１０１：ヒトＨ鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号１０２：ヒトＨ鎖ＣＤＲ２の塩基配列
配列番号１０３：ヒトＨ鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号１０４：ヒトＨ鎖ＣＤＲ３の塩基配列
配列番号１０５：ヒトＨ鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号１１４：ヒトＬ鎖全長の塩基配列
配列番号１１５：ヒトＬ鎖全長のアミノ酸配列
配列番号１０６：ヒトＬ鎖ＣＤＲ１の塩基配列
配列番号１０７：ヒトＬ鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号１０８：ヒトＬ鎖ＣＤＲ２の塩基配列
配列番号１０９：ヒトＬ鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号１１０：ヒトＬ鎖ＣＤＲ３の塩基配列
配列番号１１１：ヒトＬ鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号１１２：ヒトＬ鎖定常領域の塩基配列
配列番号１１３：ヒトＬ鎖定常領域のアミノ酸配列
配列番号１２０：ヒトＨ鎖全長の塩基配列（２５９Ｃｙｓ型）
配列番号１２１：ヒトＨ鎖全長のアミノ酸配列（２５９Ｃｙｓ型）
配列番号８６：ヒトＨ鎖定常領域の塩基配列（２５９Ｃｙｓ型）
配列番号８７：ヒトＨ鎖定常領域のアミノ酸配列（２５９Ｃｙｓ型））
配列番号８８：ヒトＨ鎖Ｆｃ領域の塩基配列（２５９Ｃｙｓ型）
配列番号８９：ヒトＨ鎖Ｆｃ領域のアミノ酸配列（２５９Ｃｙｓ型）
【実施例】
【０１０７】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【０１０８】
（実施例１）
２４４、２４６、２５９又は２８６Ｃｙｓ型のＡｎｔｉ−ＣＤ２０キメラ抗体を作製し、これら各種Ｃｙｓ型のＡｎｔｉ−ＣＤ２０キメラ抗体のＡＤＣＣ活性を評価した。その結果、野生型のＡｎｔｉ−ＣＤ２０キメラ抗体のＡＤＣＣ活性と比較して、２４４、２４６、２５９又は２８６Ｃｙｓ型のＡｎｔｉ−ＣＤ２０キメラ抗体はいずれも非常に高いＡＤＣＣ活性を示した。
【０１０９】
以下にその詳細について、すなわちＡｎｔｉ−ＣＤ２０キメラ抗体の野生型と４種類の変異型（２４４Ｃｙｓ、２４６Ｃｙｓ、２５９Ｃｙｓ、２８６Ｃｙｓ）の作製方法ならびにそのＡＤＣＣ活性測定とＣＤ２０分子に対する反応性とを記載する。
【０１１０】
１）Ａｎｔｉ−ＣＤ２０キメラ抗体の作製
キメラ抗体は、以下のＡ）〜Ｆ）の工程を経て、精製キメラ抗体として得られる。
Ａ）キメラ抗体を作製する上で必要となる遺伝子のクローニング、
Ｂ）クローニングされた遺伝子の変異導入、
Ｃ）クローニングされた遺伝子及びその変異導入した遺伝子を組み合わせたキメラ抗体発現ベクターの構築、
Ｄ）キメラ抗体発現ベクターのＣＨＯ細胞への遺伝子導入とキメラ抗体を高発現するＣＨＯ細胞のスクリーニング、
Ｅ）キメラ抗体高発現ＣＨＯ細胞の培養、
Ｆ）キメラ抗体高発現細胞の培養上清からのカラム精製。
以下にＡ）〜Ｆ）の工程を順に記載する。
【０１１１】
Ａ）  キメラ抗体を作製する上で必要となる遺伝子のクローニング
１種のＡｎｔｉ−ＣＤ２０キメラ抗体を作製するためには、４種の遺伝子が必要になる。この４種の遺伝子は、Ａｎｔｉ−ＣＤ２０マウスＬ鎖可変領域遺伝子、Ａｎｔｉ−ＣＤ２０マウスＨ鎖可変領域遺伝子、Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ１  Ｌ鎖定常領域遺伝子、Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ１  Ｈ鎖定常領域遺伝子である。この遺伝子のクローニング実施例について、以下に記述する。
【０１１２】
（Ａｎｔｉ−ＣＤ２０マウスＬ鎖可変領域遺伝子）
本出願人が保有するＡｎｔｉ−ＣＤ２０マウスモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞からＱｕｉｃｋＰｒｅｐ  ｍｉｃｒｏ  ｍＲＮＡ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ｃｏｄｅ  ２７−９２５５−０１）を用いてｍＲＮＡを得た。そのｍＲＮＡをＦｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ｃｏｄｅ  ２７−９２６１−０１）を用いてｃＤＮＡとした。このｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法で遺伝子を増幅させるのであるが、以下に示す１１パターンのＰｒｉｍｅｒの組み合わせによりＰＣＲ反応を行った。
【０１１３】
ＰＣＲ反応条件は、
マウスハイブリドーマからのｃＤＮＡ      ４μＬ
２．５ｍＭ  ｄＮＴＰｓ      ４μＬ
ＭＫＶ１〜ＭＫＶ１１  ｐｒｉｍｅｒ（２０μＭ）の１１種類中の１つ      ２．５μＬ
ＭＫＣ  ｐｒｉｍｅｒ（２０μＭ）      ２．５μＬ
ＤＭＳＯ      ２．５μＬ
×１０  ｐｆｕ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｂｕｆｆｅｒ      ５μＬ
ｐｆｕ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ      １μＬ
滅菌水      ２８．５μＬ                                                        
計      ５０μＬ
９４℃  ２  ｍｉｎ
９４℃  １  ｍｉｎ  ５５℃  ２ｍｉｎ  ７２℃  ２ｍｉｎ  （３０サイクル）
７２℃  ４ｍｉｎ
４℃    無制限時間
ＰｒｉｍｅｒのＤＮＡ配列は以下を参照。
ＭＫＶ１  ｐｒｉｍｅｒ：ＡＴＧＡＡＧＴＴＧＣＣＴＧＴＴＡＧＧＣＴＧＴＴＧＧＴＧＣＴＧ（配列番号：１）
ＭＫＶ２  ｐｒｉｍｅｒ：ＡＴＧＧＡＧＷＣＡＧＡＣＡＣＡＣＴＣＣＴＧＹＴＡＴＧＧＧＴＧ（配列番号：２）
ＭＫＶ３  ｐｒｉｍｅｒ：ＡＴＧＡＧＴＧＴＧＣＴＣＡＣＴＣＡＧＧＴＣＣＴＧＧＳＧＴＴＧ（配列番号：３）
ＭＫＶ４  ｐｒｉｍｅｒ：ＡＴＧＡＧＧＲＣＣＣＣＴＧＣＴＣＡＧＷＴＴＹＴＴＧＧＭＷＴＣＴＴＧ（配列番号：４）
ＭＫＶ５  ｐｒｉｍｅｒ：ＡＴＧＧＡＴＴＴＷＣＡＧＧＴＧＣＡＧＡＴＴＷＴＣＡＧＣＴＴＣ（配列番号：５）
ＭＫＶ６  ｐｒｉｍｅｒ：ＡＴＧＡＧＧＴＫＣＹＹＴＧＹＴＳＡＧＹＴＹＣＴＧＲＧＧ（配列番号：６）
ＭＫＶ７  ｐｒｉｍｅｒ：ＡＴＧＧＧＣＷＴＣＡＡＧＡＴＧＧＡＧＴＣＡＣＡＫＷＹＹＣＷＧＧ（配列番号：７）
ＭＫＶ８  ｐｒｉｍｅｒ：ＡＴＧＴＧＧＧＧＡＹＣＴＫＴＴＴＹＣＭＭＴＴＴＴＴＣＡＡＴＴＧ（配列番号：８）
ＭＫＶ９  ｐｒｉｍｅｒ：ＡＴＧＧＴＲＴＣＣＷＣＡＳＣＴＣＡＧＴＴＣＣＴＴＧ（配列番号：９）
ＭＫＶ１０  ｐｒｉｍｅｒ：ＡＴＧＴＡＴＡＴＡＴＧＴＴＴＧＴＴＧＴＣＴＡＴＴＴＣＴ（配列番号：１０）
ＭＫＶ１１  ｐｒｉｍｅｒ：ＡＴＧＧＡＡＧＣＣＣＣＡＧＣＴＣＡＧＣＴＴＣＴＣＴＴＣＣ（配列番号：１１）
ＭＫＣ  ｐｒｉｍｅｒ：ＡＣＴＧＧＡＴＧＧＴＧＧＧＡＡＧＡＴＧＧ（配列番号：１２）
（Ｍ＝ＡｏｒＣ，Ｒ＝ＡｏｒＧ，Ｗ＝ＡｏｒＴ，Ｓ＝ＣｏｒＧ，Ｙ＝ＣｏｒＴ，Ｋ＝ＧｏｒＴ）。
【０１１４】
ＰＣＲ反応では、ＭＫＶ５とＭＫＣ  ｐｒｉｍｅｒの組み合わせにより、Ａｎｔｉ−ＣＤ２０マウスＬ鎖可変領域遺伝子が増幅され、この遺伝子はｐＣＲ２．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｏｇｅｎ）に一時的に挿入され保管された。また、この遺伝子は挿入されたベクターをｐＣＲ２．１−ＭＬＶと名前を付けた。
【０１１５】
また、Ａｎｔｉ−ＣＤ２０マウスＬ鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３の塩基配列をそれぞれ、配列番号：６２、６４、６６に示す。また、Ａｎｔｉ−ＣＤ２０マウスＬ鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ、配列番号：６３、６５、６７に示す。
【０１１６】
（Ａｎｔｉ−ＣＤ２０マウスＨ鎖可変領域遺伝子）
Ａｎｔｉ−ＣＤ２０マウスＬ鎖可変領域遺伝子のクローニングと同様に、Ａｎｔｉ−ＣＤ２０マウスモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞から調製されたｃＤＮＡを鋳型として、以下に示す１２パターンのＰＣＲ増幅を行った。
マウスハイブリドーマからのｃＤＮＡ      ４μＬ
２．５ｍＭ  ｄＮＴＰｓ      ４μＬ
ＭＨＶ１〜ＭＨＶ１２  ｐｒｉｍｅｒ（２０μＭ）の１２種類中の１つ      ２．５μＬ
ＭＨＣＧ２ｂ  ｐｒｉｍｅｒ（２０μＭ）      ２．５μＬ
ＤＭＳＯ      ２．５μＬ
×１０  ｐｆｕ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｂｕｆｆｅｒ      ５μＬ
ｐｆｕ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ      １μＬ
滅菌水      ２８．５μＬ                                                        
計      ５０μＬ
９４℃  ２  ｍｉｎ
９４℃  １  ｍｉｎ  ５５℃  ２ｍｉｎ  ７２℃  ２ｍｉｎ  （３０サイクル）
７２℃  ４ｍｉｎ
４℃    無制限時間
ＰｒｉｍｅｒのＤＮＡ配列は以下を参照。
ＭＨＶ１  ｐｒｉｍｅｒ：ＡＴＧＡＡＡＴＧＣＡＧＣＴＧＧＧＧＣＡＴＳＴＴＣＴＴＣ（配列番号：１３）
ＭＨＶ２  ｐｒｉｍｅｒ：ＡＴＧＧＧＡＴＧＧＡＧＣＴＲＴＡＴＣＡＴＳＹＴＣＴＴ（配列番号：１４）
ＭＨＶ３  ｐｒｉｍｅｒ：ＡＴＧＡＡＧＷＴＧＴＧＧＴＴＡＡＡＣＴＧＧＧＴＴＴＴＴ（配列番号：１５）
ＭＨＶ４  ｐｒｉｍｅｒ：ＡＴＧＲＡＣＴＴＴＧＧＧＹＴＣＡＧＣＴＴＧＲＴＴＴ（配列番号：１６）
ＭＨＶ５  ｐｒｉｍｅｒ：ＡＴＧＧＡＣＴＣＣＡＧＧＣＴＣＡＡＴＴＴＡＧＴＴＴＴＣＣＴＴ（配列番号：１７）
ＭＨＶ６  ｐｒｉｍｅｒ：ＡＴＧＧＣＴＧＴＣＹＴＲＧＳＧＣＴＲＣＴＣＴＴＣＴＧＣ（配列番号：１８）
ＭＨＶ７  ｐｒｉｍｅｒ：ＡＴＧＧＲＡＴＧＧＡＧＣＫＧＧＲＴＣＴＴＴＭＴＣＴＴ（配列番号：１９）
ＭＨＶ８  ｐｒｉｍｅｒ：ＡＴＧＡＧＡＧＴＧＣＴＧＡＴＴＣＴＴＴＴＧＴＧ（配列番号：２０）
ＭＨＶ９  ｐｒｉｍｅｒ：ＡＴＧＧＭＴＴＧＧＧＴＧＴＧＧＡＭＣＴＴＧＣＴＡＴＴＣＣＴＧ（配列番号：２１）
ＭＨＶ１０  ｐｒｉｍｅｒ：ＡＴＧＧＧＣＡＧＡＣＴＴＡＣＡＴＴＣＴＣＡＴＴＣＣＴＧ（配列番号：２２）
ＭＨＶ１１  ｐｒｉｍｅｒ：ＡＴＧＧＡＴＴＴＴＧＧＧＣＴＧＡＴＴＴＴＴＴＴＴＡＴＴＧ（配列番号：２３）
ＭＨＶ１２  ｐｒｉｍｅｒ：ＡＴＧＡＴＧＧＴＧＴＴＡＡＧＴＣＴＴＣＴＧＴＡＣＣＴＧ（配列番号：２４）
ＭＨＣＧ２ｂ  ｐｒｉｍｅｒ：ＣＡＧＴＧＧＡＴＡＧＡＣＴＧＡＴＧＧＧＧＧ（配列番号：２５）
（Ｍ＝ＡｏｒＣ，Ｒ＝ＡｏｒＧ，Ｗ＝ＡｏｒＴ，Ｓ＝ＣｏｒＧ，Ｙ＝ＣｏｒＴ，Ｋ＝ＧｏｒＴ）。
【０１１７】
ＰＣＲ反応では、ＭＨＶ７とＭＨＣＧ２ｂ  ｐｒｉｍｅｒの組み合わせにより、Ａｎｔｉ−ＣＤ２０マウスＨ鎖可変領域遺伝子が増幅され、この遺伝子はｐＣＲ２．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｏｇｅｎ）に一時的に挿入され保管された。また、この遺伝子が挿入されたベクターをｐＣＲ２．１−ＭＨＶと名前を付けた。
【０１１８】
また、Ａｎｔｉ−ＣＤ２０マウスＨ鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の塩基配列をそれぞれ、配列番号：４６、４８及び５０に示す。また、Ａｎｔｉ−ＣＤ２０マウスＨ鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ、配列番号：４７、４９及び５１に示す。
【０１１９】
（Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ１  Ｌ鎖定常領域遺伝子）
ヒトの血液からＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（Ａｘｉｓ  Ｓｈｉｅｌｄ）を用いてリンパ球を取り出した。このリンパ球からＱｕｉｃｋＰｒｅｐ  ｍｉｃｒｏ  ｍＲＮＡ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ｃｏｄｅ  ２７−９２５５−０１）を用いてｍＲＮＡを得た。そのｍＲＮＡをＦｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ｃｏｄｅ  ２７−９２６１−０１）を用いてｃＤＮＡとした。このヒトリンパ球からのｃＤＮＡを鋳型にして、以下のＰＣＲ反応を行いＨｕｍａｎ  ＩｇＧ１  Ｌ鎖定常領域遺伝子を得た。この遺伝子もｐＣＲ２．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｏｇｅｎ）に一時的に挿入され保管された。また、この遺伝子が挿入されたベクターをｐＣＲ２．１−ＬＣと名前を付けた。
ＰＣＲの反応条件は以下の通りである。
ヒトリンパ球ｃＤＮＡ      ４μＬ
２．５  ｍＭ  ｄＮＴＰｓ      ４μＬ
ｈＩｇＧ１  ＬＣＦ  ｐｒｉｍｅｒ（２０μＭ）      ２．５μＬ
ｈＩｇＧ１  ＬＣＲ  ｐｒｉｍｅｒ（２０μＭ）      ２．５μＬ
ＤＭＳＯ      ２．５μＬ
×１０  ｐｆｕ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｂｕｆｆｅｒ      ５μＬ
ｐｆｕ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ      １μＬ
滅菌水      ２８．５μＬ                                                        
計      ５０μＬ
９４℃  ２  ｍｉｎ
９４℃  １ｍｉｎ  ５５℃  ２ｍｉｎ  ７２℃  ２ｍｉｎ  （３０サイクル）
７２℃  ４ｍｉｎ
４℃    無制限時間
ＰｒｉｍｅｒのＤＮＡ配列は以下を参照。
ｈＩｇＧ１  ＬＣＦ  ｐｒｉｍｅｒ：ＡＣＴＧＴＧＧＣＴＧＣＡＣＣＡＴＣＴＧＴＣＴＴＣ（配列番号：２６）
ｈＩｇＧ１  ＬＣＲ  ｐｒｉｍｅｒ：ＴＴＡＡＣＡＣＴＣＴＣＣＣＣＴＧＴＴＧＡＡＧＣＴＣＴＴ（配列番号：２７）。
【０１２０】
（Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ１  Ｈ鎖定常領域遺伝子）
Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ１  Ｌ鎖定常領域遺伝子のクローニングと同様にして、ヒトリンパ球からのｃＤＮＡを鋳型にして、以下のＰＣＲ反応を行いＨｕｍａｎ  ＩｇＧ１  Ｈ鎖定常領域遺伝子を得た。この遺伝子もｐＣＲ２．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に一時的に挿入され保管された。このベクターは、ｐＣＲ２．１−ＨＣ（野生型）と名前を付けた。
ＰＣＲの反応条件は以下の通りである。
ヒトリンパ球ｃＤＮＡ      ４μＬ
２．５ｍＭ  ｄＮＴＰｓ      ４μＬ
ｈＩｇＧ１  ＨＣＦ  ｐｒｉｍｅｒ（２０μＭ）      ２．５μＬ
ｈＩｇＧ１  ＨＣＲ  ｐｒｉｍｅｒ（２０μＭ）      ２．５μＬ
ＤＭＳＯ      ２．５μＬ
×１０  ｐｆｕ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｂｕｆｆｅｒ      ５μＬ
ｐｆｕ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ      １μＬ
滅菌水      ２８．５μＬ
計      ５０μＬ
９４℃  ２ｍｉｎ
９４℃  １ｍｉｎ  ５５℃  ２ｍｉｎ  ７２℃  ２ｍｉｎ  （３０サイクル）
７２℃  ４ｍｉｎ
４℃    無制限時間
ＰｒｉｍｅｒのＤＮＡ配列は以下を参照。
ｈＩｇＧ１  ＨＣＦ  ｐｒｉｍｅｒ：ＧＣＣＴＣＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＡＴＣＧＧＴＣ（配列番号：２８）
ｈＩｇＧ１  ＨＣＲ  ｐｒｉｍｅｒ：ＴＴＡＴＴＴＡＣＣＣＧＧＡＧＡＣＡＧＧＧＡＧＡＧＧＣＴ（配列番号：２９）。
【０１２１】
Ｂ）クローニングされた遺伝子の変異導入
２４４Ｃｙｓキメラ抗体、２４６Ｃｙｓキメラ抗体、２５９Ｃｙｓキメラ抗体、２８６Ｃｙｓキメラ抗体を得るためには、クローニングされたＨｕｍａｎ  ＩｇＧ１  Ｈ鎖定常領域の特定箇所に変異を導入しなければならない。Ｅｌｖｉｎ  Ａ．ＫａｂａｔらがＳｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２，１９９１）において示したＨｕｍａｎ  ＩｇＧ１  Ｈ鎖定常領域の番号に従い、２４４位のＰｒｏをＣｙｓに、２４６位のＬｙｓをＣｙｓに、２５９位のＶａｌをＣｙｓに、２８６位のＡｓｎをＣｙｓに変更するために、クローニングされたＨｕｎａｎ  ＩｇＧ１  Ｈ鎖定常領域が挿入されたｐＣＲ２．１ベクター：ｐＣＲ２．１−ＨＣ（野生型）を鋳型として、ＰＣＲ法により変異導入した。この変異導入法の詳細を以下に記述する。
【０１２２】
（１）２４４（Ｐｒｏ→Ｃｙｓ）への変異導入
ｐＣＲ２．１−ＨＣ（野生型）  （２５ｎｇ／μＬ）      ２μＬ
２．５ｍＭ  ｄＮＴＰｓ      ４μＬ
２９４Ｃｙｓ１  ｐｒｉｍｅｒ（２０μＭ）      １．２５μＬ
２９４Ｃｙｓ２  ｐｒｉｍｅｒ（２０μＭ）      １．２５μＬ
×１０  ｐｆｕ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｂｕｆｆｅｒ      ５μＬ
ｐｆｕ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ      １μＬ
滅菌水      ３５．５μＬ                                                        
計      ５０μＬ
９５℃  ３０ｓｅｃ
９５℃  ３０ｓｅｃ  ５５℃  １ｍｉｎ  ６８℃  １３ｍｉｎ（１２サイクル）
６８℃  ４ｍｉｎ
４℃    無制限時間
ＰｒｉｍｅｒのＤＮＡ配列は以下を参照。
２４４Ｃｙｓ１  ｐｒｉｍｅｒ：ＧＴＣＴＴＣＣＴＣＴＴＣＴＧＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧ（配列番号：３０）
２４４Ｃｙｓ２  ｐｒｉｍｅｒ：ＣＴＴＧＧＧＴＴＴＴＧＧＧＣＡＧＡＡＧＡＧＧＡＡＧＡＣ（配列番号：３１）
上記のＰＣＲ反応終了後、ＤｐｎＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）を１μＬ添加して、２時間３７℃でインキュベーションした。インキュベーションが終了した液を用いて、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、形質転換された大腸菌からプラスミドを精製した。精製プラスミドのＤＮＡシークエンスを確認することで、変異２４４（Ｐｒｏ→Ｃｙｓ）導入されたＨｕｍａｎ  ＩｇＧ１  Ｈ鎖定常領域を挿入したｐＣＲ２．１ベクターを得た。この変異導入されたベクターをｐＣＲ２．１−ＨＣ（２４４Ｃｙｓ）と名前を付けた。
【０１２３】
（２）２４６（Ｌｙｓ→Ｃｙｓ）への変異導入
この変異導入も上記の２４４（Ｐｒｏ→Ｃｙｓ）の変異導入と同様にして行われた。違っている箇所は、使用された２４４Ｃｙｓ１  ｐｒｉｍｅｒと２４４Ｃｙｓ２  ｐｒｉｍｅｒの代わりに２４６Ｃｙｓ１  ｐｒｉｍｅｒと２４６Ｃｙｓ２  ｐｒｉｍｅｒを使用している点のみである。以下に、２４６Ｃｙｓ１  ｐｒｉｍｅｒと２４６Ｃｙｓ２  ｐｒｉｍｅｒの配列を示す。これらの操作により得られた変異２４６（Ｌｙｓ→Ｃｙｓ）導入されたＨｕｍａｎ  ＩｇＧ１  Ｈ鎖定常領域を挿入したｐＣＲ２．１ベクターをｐＣＲ２．１−ＨＣ（２４６Ｃｙｓ）と名前を付けた。
２４６Ｃｙｓ１  ｐｒｉｍｅｒ：ＣＴＣＴＴＣＣＣＣＣＣＡＴＧＴＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣ（配列番号：３２）
２４６Ｃｙｓ２  ｐｒｉｍｅｒ：ＧＧＴＧＴＣＣＴＴＧＧＧＡＣＡＴＧＧＧＧＧＧＡＡＧＡＧ（配列番号：３３）。
【０１２４】
（３）２５９（Ｖａｌ→Ｃｙｓ）への変異導入
この変異導入も上記の２４４（Ｐｒｏ→Ｃｙｓ）の変異導入と同様にして行われた。違っている箇所は、使用された２４４Ｃｙｓ１  ｐｒｉｍｅｒと２９４Ｃｙｓ２  ｐｒｉｍｅｒの代わりに２５９Ｃｙｓ１  ｐｒｉｍｅｒと２５９Ｃｙｓ２  ｐｒｉｍｅｒを使用している点のみである。以下に、２５９Ｃｙｓ１  ｐｒｉｍｅｒと２５９Ｃｙｓ２  ｐｒｉｍｅｒの配列を示す。これらの操作により得られた変異２５９（Ｖａｌ→Ｃｙｓ）導入されたＨｕｍａｎ  ＩｇＧ１  Ｈ鎖定常領域を挿入したｐＣＲ２．１ベクターをｐＣＲ２．１−ＨＣ（２５９Ｃｙｓ）と名前を付けた。
２５９Ｃｙｓ１  ｐｒｉｍｅｒ：ＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＴＧＣＡＣＡＴＧＣＧＴＧＧＴＧ（配列番号：３４）
２５９Ｃｙｓ２  ｐｒｉｍｅｒ：ＣＡＣＣＡＣＧＣＡＴＧＴＧＣＡＣＴＣＡＧＧＧＧＴＣＣＧ（配列番号：３５）。
【０１２５】
（４）２８６（Ａｓｎ→Ｃｙｓ）への変異導入
この変異導入も上記の２４４（Ｐｒｏ→Ｃｙｓ）の変異導入と同様にして行われた。違っている箇所は、使用された２４４Ｃｙｓ１  ｐｒｉｍｅｒと２９４Ｃｙｓ２  ｐｒｉｍｅｒの代わりに２８６Ｃｙｓ１  ｐｒｉｍｅｒと２８６Ｃｙｓ２  ｐｒｉｍｅｒを使用している点のみである。以下に、２８６Ｃｙｓ１  ｐｒｉｍｅｒと２８６Ｃｙｓ２  ｐｒｉｍｅｒの配列を示す。これらの操作により得られた変異２８６（Ａｓｎ→Ｃｙｓ）導入されたＨｕｍａｎ  ＩｇＧ１  Ｈ鎖定常領域を挿入したｐＣＲ２．１ベクターをｐＣＲ２．１−ＨＣ（２８６Ｃｙｓ）と名前を付けた。
２８６Ｃｙｓ１  ｐｒｉｍｅｒ：ＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＴＧＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧ（配列番号：３６）
２８６Ｃｙｓ２  ｐｒｉｍｅｒ：ＣＴＴＴＧＴＣＴＴＧＧＣＡＣＡＡＴＧＣＡＣＣＴＣＣＡＣ（配列番号：３７）。
【０１２６】
Ｃ）クローニングされた遺伝子及びその変異導入した遺伝子を組み合わせたキメラ抗体発現ベクターの構築
１種類のＡｎｔｉ−ＣＤ２０キメラ抗体を発現させるために、Ａｎｔｉ−ＣＤ２０キメラ抗体のＬ鎖とＨ鎖の２種類の発現ベクターをＣＨＯ細胞にＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎさせることで達成される。ここで、Ａｎｔｉ−ＣＤ２０キメラ抗体のＬ鎖の発現ベクターとは、Ａｎｔｉ−ＣＤ２０マウスＬ鎖可変領域遺伝子＋Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ１  Ｌ鎖定常領域遺伝子を結合させたものを発現ベクターに組み込んだものであり、Ａｎｔｉ−ＣＤ２０キメラ抗体のＨ鎖の発現ベクターとは、Ａｎｔｉ−ＣＤ２０マウスＨ鎖可変領域遺伝子＋Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ１  Ｈ鎖定常領域遺伝子を結合させたものを発現ベクターに組み込んだものである。野生型、２４４Ｃｙｓ型、２４６Ｃｙｓ型、２５９Ｃｙｓ型あるいは２８６Ｃｙｓ型のＡｎｔｉ−ＣＤ２０キメラ抗体を作製するにあたり、Ａｎｔｉ−ＣＤ２０キメラ抗体のＬ鎖の発現ベクターは、これら５種のキメラ抗体を発現させるために共通に使用するものであるが、Ａｎｔｉ−ＣＤ２０キメラ抗体のＨ鎖の発現ベクターは、野生型、２４４Ｃｙｓ型、２４６Ｃｙｓ型、２５９Ｃｙｓ型あるいは２８６Ｃｙｓ型キメラ抗体の各々に対して専用のＨ鎖発現ベクターを必要とする。ここでは、はじめに各キメラ抗体の発現に共通に使用できるＡｎｔｉ−ＣＤ２０キメラ抗体Ｌ鎖の発現ベクターの構築について詳細を記述し、その後に野生型、２４４Ｃｙｓ型、２４６Ｃｙｓ型、２５９Ｃｙｓ型あるいは２８６Ｃｙｓ型キメラ抗体の発現に必要な専用のＡｎｔｉ−ＣＤ２０キメラ抗体Ｈ鎖発現ベクターの構築について記述する。
【０１２７】
Ａｎｔｉ−ＣＤ２０キメラ抗体Ｌ鎖の発現ベクターの構築
発現ベクターとしては、ＢＣＭＧｎｅｏベクターを使用し、このベクターのＸｈｏＩとＮｏｔＩサイトにＡｎｔｉ−ＣＤ２０マウスＬ鎖可変領域遺伝子＋Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ１  Ｌ鎖定常領域遺伝子を挿入させる。Ａｎｔｉ−ＣＤ２０マウスＬ鎖可変領域遺伝子は、先に作製されたｐＣＲ２．１−ＭＬＶを鋳型に以下のＰＣＲ反応を行うことで断片を得た。また、Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ１  Ｌ鎖定常領域遺伝子は、先に作製されたｐＣＲ２．１−ＬＣを鋳型として以下のＰＣＲ反応により断片を得た。
【０１２８】
（Ａｎｔｉ−ＣＤ２０マウスＬ鎖可変領域遺伝子の増幅反応）
ｐＣＲ２．１−ＭＬＶ（２０  ｎｇ／μＬ）      ２μＬ
２．５ｍＭ  ｄＮＴＰｓ      ４μＬ
Ｌ１  ｐｒｉｍｅｒ（２０μＭ）      ２．５μＬ
Ｌ２  ｐｒｉｍｅｒ（２０μＭ）      ２．５μＬ
ＤＭＳＯ      ２．５μＬ
×１０  ｐｆｕ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｂｕｆｆｅｒ      ５μＬ
ｐｆｕ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ      １μＬ
滅菌水      ３０．５μＬ                                                        
計      ５０μＬ
９４℃  ２ｍｉｎ
９４℃  １ｍｉｎ  ５５℃  ２ｍｉｎ  ７２℃  ２ｍｉｎ（２０サイクル）
７２℃  ４ｍｉｎ
４℃    無制限時間
Ｌ１  ｐｒｉｍｅｒ：ＡＣＣＧＣＴＣＧＡＧＡＴＧＧＡＴＴＴＴＣＡＧＧＴＧＣＡＧＡＴＴＡＴＣＡＧＣ（配列番号：３８）
Ｌ２  ｐｒｉｍｅｒ：ＴＴＴＣＡＧＣＴＣＣＡＧＣＴＴＧＧＴＣＣＣＡＧＣＡＣＣ  （５’−リン酸化されている）（配列番号：３９）。
【０１２９】
（Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ１  Ｌ鎖定常領域遺伝子の増幅反応）
ｐＣＲ２．１−ＬＣ  （２０ｎｇ／μＬ）      ２μＬ
２．５ｍＭ  ｄＮＴＰｓ      ４μＬ
Ｌ３  ｐｒｉｍｅｒ（２０μＭ）      ２．５μＬ
Ｌ４  ｐｒｉｍｅｒ（２０μＭ）      ２．５μＬ
ＤＭＳＯ      ２．５μＬ
×１０  ｐｆｕ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｂｕｆｆｅｒ      ５μＬ
ｐｆｕ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ      １μＬ
滅菌水      ３０．５μＬ
計      ５０μＬ
９４℃  ２ｍｉｎ
９４℃  １ｍｉｎ  ５５℃  ２ｍｉｎ  ７２℃  ２ｍｉｎ  （２０サイクル）
７２℃  ４ｍｉｎ
４℃    無制限時間
Ｌ３  ｐｒｉｍｅｒ：ＡＣＴＧＴＧＧＣＴＧＣＡＣＣＡＴＣＴＧＴＣＴＴＣＡＴＣ  （５’−リン酸化されている）（配列番号：４０）
Ｌ４  ｐｒｉｍｅｒ：ＡＴＡＧＴＴＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＡＣＡＣＴＣＴＣＣＣＣＴＧＴＴＧＡＡＧＣＴＣＴＴＴＧＴ（配列番号：４１）。
【０１３０】
上記のＰＣＲ反応で得られたＡｎｔｉ−ＣＤ２０マウスＬ鎖可変領域遺伝子断片は、制限酵素ＸｈｏＩ（Ｔａｋａｒａ）で切断されてから精製した。また、ＰＣＲ反応で得られたＨｕｍａｎ  ＩｇＧ１  Ｌ鎖定常領域遺伝子断片は、制限酵素ＮｏｔＩ（Ｔａｋａｒａ）で切断されてから精製した。ＢＣＭＧｎｅｏベクターをＸｈｏＩとＮｏｔＩで切断して精製した断片に、先の精製Ａｎｔｉ−ＣＤ２０マウスＬ鎖可変領域遺伝子断片と精製Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ１  Ｌ鎖定常領域遺伝子断片を混同してＬｉｇａｔｉｏｎした。このＬｉｇａｔｉｏｎで得られたベクターは、シークエンスにより目的の断片が挿入されていることを確認された。このＡｎｔｉ−ＣＤ２０キメラ抗体Ｌ鎖の発現ベクターは、ｐキメラＬＣと名前が付けられた。
【０１３１】
Ａｎｔｉ−ＣＤ２０キメラ抗体Ｈ鎖発現ベクターの構築
発現ベクターとしては、ＢＣＭＧｎｅｏベクターを使用し、このベクターのＸｈｏＩとＮｏｔＩサイトにＡｎｔｉ−ＣＤ２０マウスＨ鎖可変領域遺伝子＋Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ１  Ｈ鎖定常領域遺伝子を挿入させる。Ａｎｔｉ−ＣＤ２０マウスＨ鎖可変領域遺伝子は、先に作製されたｐＣＲ２．１−ＭＨＶを鋳型に以下のＰＣＲ反応を行うことで断片を得た。野生型、２４４Ｃｙｓ型、２４６Ｃｙｓ型、２５９Ｃｙｓ型あるいは２８６Ｃｙｓ型キメラ抗体の各々に対して専用のＨ鎖発現ベクターは、Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ１  Ｈ鎖定常領域遺伝子をＰＣＲ増幅させる際の鋳型となるプラスミドは異なるが、操作自体は全く同様に行われて各種Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ１  Ｈ鎖遺伝子断片を得た。以下にＰＣＲ反応を含む詳細を記述する。
【０１３２】
（Ａｎｔｉ−ＣＤ２０マウスＨ鎖可変領域遺伝子の増幅反応）
ｐＣＲ２．１−ＭＨＶ  （２０ｎｇ／μＬ）      ２μＬ
２．５  ｍＭ  ｄＮＴＰｓ      ４μＬ
Ｈ１  ｐｒｉｍｅｒ（２０μＭ）      ２．５μＬ
Ｈ２  ｐｒｉｍｅｒ（２０μＭ）      ２．５μＬ
ＤＭＳＯ      ２．５μＬ
×１０  ｐｆｕ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｂｕｆｆｅｒ      ５μＬ
ｐｆｕ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ      １μＬ
滅菌水      ３０．５μＬ
計      ５０μＬ
９４℃  ２ｍｉｎ
９４℃  １ｍｉｎ  ５５℃  ２ｍｉｎ  ７２℃  ２ｍｉｎ  （２０サイクル）
７２℃  ４ｍｉｎ
４℃    無制限時間
Ｈ１  ｐｒｉｍｅｒ：ＡＣＣＧＣＴＣＧＡＧＡＴＧＧＧＡＴＧＧＡＧＣＴＧＧＧＴＣＴＴＴＣＴＣＴＴＣ（配列番号：４２）
Ｈ２  ｐｒｉｍｅｒ：ＴＧＡＧＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＧＴＣＣＣ  （５’−リン酸化されている）（配列番号：４３）。
【０１３３】
（Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ１  Ｈ鎖定常領域遺伝子の増幅反応）
＃各種鋳型プラスミド  （２０ｎｇ／μＬ）      ２μＬ
２．５  ｍＭ  ｄＮＴＰｓ      ４μＬ
Ｈ３  ｐｒｉｍｅｒ（２０μＭ）      ２．５μＬ
Ｈ４  ｐｒｉｍｅｒ（２０μＭ）      ２．５μＬ
ＤＭＳＯ      ２．５μＬ
×１０  ｐｆｕ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｂｕｆｆｅｒ      ５μＬ
ｐｆｕ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ      １μＬ
滅菌水      ３０．５μＬ
ｔｏｔａｌ      ５０μＬ
９４℃  ２ｍｉｎ
９４℃  １ｍｉｎ  ５５℃  ２ｍｉｎ  ７２℃  ２ｍｉｎ  （２０サイクル）
７２℃  ４ｍｉｎ
４℃    無制限時間
Ｈ３  ｐｒｉｍｅｒ：ＧＣＣＴＣＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＡＴＣＧＧＴＣ（５’−リン酸化されている）（配列番号：４４）
Ｈ４  ｐｒｉｍｅｒ：ＡＴＡＧＴＴＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＴＴＴＡＣＣＣＧＧＡＧＡＣＡＧＧＧＡＧＡＧＧＣＴＣＴＴ（配列番号：４５）。
【０１３４】
野生型のＡｎｔｉ−ＣＤ２０キメラ抗体用の遺伝子断片を調製するためには、ｐＣＲ２．１−ＨＣ（野生型）を鋳型として用いた。２４４Ｃｙｓ型のＡｎｔｉ−ＣＤ２０キメラ抗体用の遺伝子断片を調製するためにはｐＣＲ２．１−ＨＣ（２４４Ｃｙｓ）を鋳型として用いた。２４６Ｃｙｓ型のＡｎｔｉ−ＣＤ２０キメラ抗体用の遺伝子断片を調製するためにはｐＣＲ２．１−ＨＣ（２４６Ｃｙｓ）を鋳型として用いた。２５９Ｃｙｓ型のＡｎｔｉ−ＣＤ２０キメラ抗体用の遺伝子断片を調製するためにはｐＣＲ２．１−ＨＣ（２５９Ｃｙｓ）を鋳型として用いた。２８６Ｃｙｓ型のＡｎｔｉ−ＣＤ２０キメラ抗体用の遺伝子断片を調製するためにはｐＣＲ２．１−ＨＣ（２８６Ｃｙｓ）を鋳型として用いた。
【０１３５】
上記のＰＣＲ反応で得られたＡｎｔｉ−ＣＤ２０マウスＨ鎖可変領域遺伝子断片は、制限酵素ＸｈｏＩ（Ｔａｋａｒａ）で切断されてから精製した。また、鋳型の異なる各種ＰＣＲ反応で得られたＨｕｍａｎ  ＩｇＧ１  Ｈ鎖定常領域遺伝子断片は、制限酵素ＮｏｔＩ（Ｔａｋａｒａ）で切断されてから精製した。ＢＣＭＧｎｅｏベクターをＸｈｏＩとＮｏｔＩで切断して精製した断片に、先の精製Ａｎｔｉ−ＣＤ２０マウスＨ鎖可変領域遺伝子断片と精製Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ１  Ｈ鎖定常領域遺伝子断片を混合してＬｉｇａｔｉｏｎした。このＬｉｇａｔｉｏｎで得られたベクターは、シークエンスにより目的の断片が挿入されていることを確認された。このＡｎｔｉ−ＣＤ２０キメラ抗体Ｈ鎖の発現ベクターは、ｐキメラＨＣ（野生型）、ｐキメラＨＣ（２４４Ｃｙｓ）、ｐキメラＨＣ（２４６Ｃｙｓ）、ｐキメラＨＣ（２５９Ｃｙｓ）あるいはｐキメラＨＣ（２８６Ｃｙｓ）とそれぞれ名前が付けられた。なお、Ａｎｔｉ−ＣＤ２０マウスＨ鎖可変領域遺伝子断片とＨｕｍａｎ  ＩｇＧ１  Ｈ鎖定常領域（野生型）との塩基配列を配列番号：５２に示し、そのアミノ酸配列を配列番号：５３に示す。
【０１３６】
Ｄ）キメラ抗体発現ベクターのＣＨＯ細胞への遺伝子導入とキメラ抗体を高発現するＣＨＯ細胞のスクリーニング
構築された各種発現ベクターは、以下の組み合わせでＴｒａｎｓＩＴ−ＣＨＯ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｍｉｒｕｓ，  ＭＩＲ２１７０）を使用してＣＨＯ細胞へ遺伝子導入された。
野生型キメラ抗体：ｐキメラＬＣ＋ｐキメラＨＣ（野生型）
２４４Ｃｙｓキメラ抗体：ｐキメラＬＣ＋ｐキメラＨＣ（２４４Ｃｙｓ）
２４６Ｃｙｓキメラ抗体：ｐキメラＬＣ＋ｐキメラＨＣ（２４６Ｃｙｓ）
２５９Ｃｙｓキメラ抗体：ｐキメラＬＣ＋ｐキメラＨＣ（２５９Ｃｙｓ）
２８６Ｃｙｓキメラ抗体：ｐキメラＬＣ＋ｐキメラＨＣ（２８６Ｃｙｓ）。
【０１３７】
遺伝子導入されたＣＨＯ細胞は、１０％Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ（ＥＱＩＴＥＣ−ＢＩＯ）と１ｍｇ／ｍＬのＧｅｎｅｔｉｃｉｎ（ＧＩＢＣＯ，１０１３１−０３５）を補足したＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｓｉｇｍａ，Ｄ５７９６）で３７℃５％二酸化炭素の条件下で培養することで増殖した。この増殖してコロニーを形成したＣＨＯ細胞の中からキメラ抗体を高発現しているＣＨＯ細胞を選択するのであるが、はじめに各コロニーの一部を９６  ｗｅｌｌプレートに移植して、さらに１０日間培養した。その培養上清の一部を取り出し、以下に示すＥＬＩＳＡ測定をすることで高発現ＣＨＯ細胞クローンを決定した。
【０１３８】
（ＥＬＩＳＡ測定）
１）Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ（γ−ｃｈａｉｎ）（ＭＢＬ，１０３ＡＧ）をコートした９６Ｗｅｌｌプレートに、ＴａｎｓｆｅｃｔｉｏｎされたＣＨＯ細胞の培養上清を１００μＬ／ｗｅｌｌで添加し、室温で１時間放置した。
２）培養上清液を９６ｗｅｌｌプレートから捨てて、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）でｗｅｌｌを十分洗浄した。
３）Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ（γ−ｃｈａｉｎ）Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ（ＭＢＬ，２０８）をＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で２０００倍希釈した溶液を１００μＬ／ｗｅｌｌ添加して、室温で１時間放置した。
４）溶液を９６ｗｅｌｌプレートから捨てて、ＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０でｗｅｌｌを十分洗浄した。
５）ＴＭＢ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｍｏｓｓ，ＴＭＢＥ−１０００ｓ）を１００μＬ／ｗｅｌｌ添加して、発色反応させた。
６）１０〜１５分の発色反応後、１Ｎ硫酸を１００μＬ／ｗｅｌｌ添加して、発色反応を停止させた。
７）４５０ｎｍ吸光度を測定した。
【０１３９】
このＥＬＩＳＡ測定で、高い発色値を示すコロニーが、キメラ抗体を高発現するクローンである。
【０１４０】
Ｅ）キメラ抗体高発現ＣＨＯ細胞の培養
ＥＬＩＳＡ測定により選択されたキメラ抗体高発現ＣＨＯ細胞は、１０％Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍと０．１ｍｇ／ｍＬのＧｅｎｅｔｉｃｉｎを補足したＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍで３７℃５％二酸化炭素の条件下で培養することで増殖させた。十分に増殖したキメラ抗体の高発現ＣＨＯ細胞は、０．１ｍｇ／ｍＬのＧｅｎｅｔｉｃｉｎを補足した無血清培地であるＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩＢＣＯ，１２０５２−０９８）での培養に置き換えられ、継続して１０００ｍＬ程度培養された。
【０１４１】
Ｆ）キメラ抗体高発現細胞の培養上清からのカラム精製
無血清培地であるＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩで培養されたキメラ抗体高発現ＣＨＯ細胞の培養上清は、回収された。野生型キメラ抗体の精製は、そのＦｃ領域構造に変化を加えていないため、抗体精製に通常用いられるＰｒｏｔｅｉｎ  Ａカラム精製により実施された。しかしながら、２４４Ｃｙｓ型キメラ抗体、２４６Ｃｙｓ型キメラ抗体、２５９Ｃｙｓ型キメラ抗体、２８６Ｃｙｓ型キメラ抗体は、そのＦｃ領域構造に変異を加えているために、Ｆｃ領域の構造変化を伴い、通常のＰｒｏｔｅｉｎ  Ａカラムへは、ほとんど吸着されない。この理由から、これらＣｙｓ型キメラ抗体では、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌカラムを使用して精製を実施した。今回作製されたＡｎｔｉ−ＣＤ２０キメラ抗体は、その可変領域がκ鎖である。このＰｒｏｔｅｉｎ  Ｌは、この可変領域κ鎖を認識して結合できるタンパク質である。以下に、野生型キメラ抗体のＰｒｏｔｅｉｎ  Ａカラム精製とＣｙｓ型キメラ抗体のＰｒｏｔｅｉｎ  Ｌカラム精製の詳細を記述する。
【０１４２】
野生型キメラ抗体のＰｒｏｔｅｉｎ  Ａカラム精製
１）１０００ｍＬのＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩで野生型キメラ抗体高発現ＣＨＯ細胞を培養して得られた培養上清は、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｃｏｄｅ  ＹＭ１０）を取り付けたＡｍｉｃｏｎ  Ｓｔｉｒｒｅｄ  Ｕｉｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  Ｃｅｌｌ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｍｏｄｅｌ８４００）を用いて、１０００ｍＬから１００ｍＬまで濃縮された。
２）培養上清濃縮液に、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅであるｒＰｒｏｔｅｉｎＡ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，１７−１２７９−０３）８ｍＬを添加し、２日間４℃で攪拌させてＰｒｏｔｅｉｎＡに野生型キメラ抗体を吸着させた。
３）野生型キメラ抗体を吸着したＰｒｏｔｅｉｎＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅは、直径１．５ｃｍ、長さ８ｃｍのカラムに充填させた。
４）ＰｒｏｔｅｉｎＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅが充填されたカラムは、ＰＢＳ  １００ｍＬで洗浄された後、Ｅｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（０．１７Ｍ  Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ，ｐＨ２．３）でカラムから野生型キメラ抗体を溶出した。
５）溶出された野生型キメラ抗体溶液は、すぐに１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．５を適量加えてｐＨを中性にした。
６）野生型キメラ抗体溶出液は、透析チューブであるＣｅｌｌ  Ｓｅｐ  Ｔ２（Ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｉｎｃ，８０３０−２３）に入れて４℃でＰＢＳ  ５Ｌに透析された。透析後に回収した野生型キメラ抗体を、精製品とした。
【０１４３】
Ｃｙｓ型キメラ抗体のＰｒｏｔｅｉｎ  Ｌカラム精製
１）１０００ｍＬ  のＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩでＣｙｓ型キメラ抗体高発現ＣＨＯ細胞を培養して得られた培養上清は、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｃｏｄｅ  ＹＭ１０）を取り付けたＡｍｉｃｏｎ  Ｓｔｉｒｒｅｄ  Ｕｉｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  Ｃｅｌｌ  （Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，  Ｍｏｄｅｌ  ８４００）を用いて、１０００ｍＬから１００ｍＬまで濃縮された。
２）培養上清濃縮液１００ｍＬは、ＰｒｏｔｅｉｎＬ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（０．１Ｍ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，０．１５Ｍ  ＮａＣｌ，ｐＨ７．２）１００ｍＬを加えて混合された。
３）直径１．５ｃｍ、長さ８ｃｍのカラムにＰｒｏｔｅｉｎ  Ｌ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅであるＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ  Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌ  Ｐｌｕｓ（ＰＩＥＲＣＥ，２０２５０）２ｍＬを充填させた。
４）２）で調製した液をカラム上端から加えて、カラム下端からゆっくり流し出した。この操作でＰｒｏｔｅｉｎ  Ｌ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅへＣｙｓ型キメラ抗体を吸着させた。その後、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ  ５０ｍＬでカラムを洗浄し、カラムに吸着した余分な蛋白を除去した。
５）Ｅｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（０．１７Ｍ  Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ，ｐＨ２．３）でカラムからＣｙｓ型キメラ抗体を溶出した。溶出されたＣｙｓ型キメラ抗体溶液は、すぐに１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．５を適量加えてｐＨを中性にした。
６）Ｃｙｓ型キメラ抗体溶出液は、透析チューブであるＣｅｌｌ  Ｓｅｐ  Ｔ２  （Ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｉｎｃ，８０３０−２３）に入れて４℃でＰＢＳ  ５Ｌに透析された。透析後に回収したＣｙｓ型キメラ抗体を、精製品とした。
【０１４４】
＜各種キメラ抗体のＡＤＣＣ活性評価＞
各種キメラ抗体のＡｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ（ＡＤＣＣ）活性評価は、乳酸脱水素酵素放出アッセイ（ｌａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｒｅｌｅａｓｅ  ａｓｓａｙ）により行った。このＡｓｓａｙでは、Ｔａｒｇｅｔ細胞としてＣＤ２０分子を細胞膜表面に持つＤａｕｄｉ細胞を用い、Ｅｆｆｅｃｔｏｒ細胞として、Ｈｕｍａｎ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌｓ（ＰＢＭＣ）を用いた。このＨｕｍａｎ  ＰＢＭＣは、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（Ａｘｉｓ  Ｓｈｉｅｌｄ）を使って、ヒトの血液から調製された。
【０１４５】
Ｒａｊｉ細胞（１×１０４個／５０μＬ）は、９６−ｗｅｌｌ  Ｕ−ｂｏｔｔｏｍｅｄプレートの各ｗｅｌｌに入れ、Ｅｆｆｅｃｔｏｒ細胞であるＨｕｍａｎ  ＰＢＭＣが、Ｅ／Ｔ  ｒａｔｉｏが２０／１となるように２×１０５個加えられた。この細胞液にさらに、各種Ａｎｔｉ−ＣＤ２０キメラ抗体を連続的な希釈系列となるように添加して、３７℃で１７時間保温された。保温後に、９６−ｗｅｌｌ  Ｕ−ｂｏｔｔｏｍｅｄプレートは、遠心分離され、その上清中のｌａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙをＣｙｔｏＴｏｘ  ９６  Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｇ１７８０）を用いて測定された。抗体依存的かつ特異的な細胞障害（Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）％は、以下の式を用いて算出された。
％  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ＝１００×（Ｅ−ＳＥ−ＳＴ）／（Ｍ−ＳＴ）
【０１４６】
ここで、ＥとはＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｒｅｌｅａｓｅを表し、抗体とＥｆｆｃｔｏｒ細胞が、Ｔａｒｇｅｔ細胞と共に保温された時のＴａｒｇｅｔ細胞からｒｅｌａｅｓｅされたｌａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ活性である。ＳＥとは、Ｅｆｆｅｃｔｏｒ細胞からの自然発生的に放出されたｌａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ活性である。ＳＴとは、Ｔａｒｇｅｔ細胞からも自然発生的に放出されたｌａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ活性である。Ｍとは、Ｔａｒｇｅｔ細胞の最大に放出されるｌａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ活性を表し、これはＬｙｓｉｓ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（９％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）の添加により、Ｔａｒｇｅｔ細胞から放出されたｌａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ活性である。
【０１４７】
以上のような評価方法により得られた、野生型、２４４Ｃｙｓ型、２４６Ｃｙｓ型、２５９Ｃｙｓ型のＡｎｔｉ−ＣＤ２０キメラ抗体のＡＤＣＣ活性結果を、図１及び表１に示す。
【０１４８】
図１に示した結果から明らかなように、野生型キメラ抗体のＡＤＣＣ活性と比較して、３種類のＣｙｓ型キメラ抗体は、野生型と比べて０．０１から１０μｇ／ｍＬの範囲で測定された全域に対して高いＡＤＣＣ活性を示した。
【０１４９】
【表１】
2014057542.tif 000002
【０１５０】
また表１より、野生型抗体と２４４Ｃｙｓ型、２４６Ｃｙｓ型、２５９Ｃｙｓ型キメラ抗体との間で細胞障害の割合が同程度である２点を選択し、ＡＤＣＣ活性の比較を試みた。例えば、２４４Ｃｙｓ型キメラ抗体は０．１μｇ／ｍＬで約３０％、野生型抗体は１μｇ／ｍＬで約３０％の細胞障害を示している。この２点を用いて比較した場合、同じＡＤＣＣ活性を得るために必要な抗体濃度が１０分の１に減少した。このことから、ＡＤＣＣ活性が約１０倍上昇した（野生型抗体と変異型抗体が同一の細胞障害の割合を示す２点間における、野生型抗体に対する変異型抗体の濃度の比が１０倍になった）と判断した。
【０１５１】
さらに、２８６Ｃｙｓ型キメラ抗体と野生型抗体の細胞障害の割合を、ｌａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｒｅｌｅａｓｅ  ａｓｓａｙによって比較した。野生型、２８６Ｃｙｓ型のＡｎｔｉ−ＣＤ２０キメラ抗体のＡＤＣＣ活性結果を図２及び表２に示す。
【０１５２】
図２に示した結果から明らかなように、野生型キメラ抗体のＡＤＣＣ活性と比較して、２８６Ｃｙｓ型キメラ抗体は、野生型と比べて０．００１から１０μｇ／ｍＬの範囲で測定された全域に対して高いＡＤＣＣ活性を示した。
【０１５３】
【表２】
2014057542.tif 000003
【０１５４】
また表２より、野生型抗体と２８６Ｃｙｓ型キメラ抗体との間で細胞障害の割合が同程度である２点を選択し、ＡＤＣＣ活性の比較を試みた。２８６Ｃｙｓ型キメラ抗体は０．０１μｇ／ｍＬで約２５％、野生型抗体は０．１μｇ／ｍＬで約２５％の細胞障害を示している。この２点を用いて比較した場合、同じＡＤＣＣ活性を得るために必要な抗体濃度が１０分の１に減少した。このことから、ＡＤＣＣ活性が約１０倍上昇した（野生型抗体と変異型抗体が同一の細胞障害の割合を示す２点間における、野生型抗体に対する変異型抗体の濃度の比が１０倍になった）と判断した。
【０１５５】
（実施例２）
Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲヒト抗体の作製
野生型と２４４Ｃｙｓ型、２４６Ｃｙｓ型、２５９Ｃｙｓ型のＡｎｔｉ−ＥＧＦＲヒト抗体をＣＨＯ細胞で発現させるために、発現ベクターとして５種類の発現ベクター（Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲヒト抗体Ｌ鎖発現ベクター、野生型Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲヒト抗体Ｈ鎖発現ベクター、２４４Ｃｙｓ型Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲヒト抗体Ｈ鎖発現ベクター、２４６Ｃｙｓ型Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲヒト抗体Ｈ鎖発現ベクター、２５９Ｃｙｓ型Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲヒト抗体Ｈ鎖発現ベクター）を構築した。各発現ベクターの構築の詳細を以下に記述する。
【０１５６】
１）Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲヒト抗体Ｌ鎖発現ベクターの構築
抗体研究所より提供されたヒトＡｎｔｉ−ＥＧＦＲ抗体Ｌ鎖の可変領域と定常領域を含む遺伝子を鋳型として、以下に示すｐｒｉｍｅｒを用いてＰＣＲ反応によりＤＮＡ断片を得た。
ＥＧＦＲ−Ｌ１  ｐｒｉｍｅｒ：ＡＣＣＧＣＴＣＧＡＧＡＴＧＧＡＣＡＴＧＡＧＧＧＴＣＣＣＣＧＣＴＣＡＧＣＴＣ（配列番号：９６）
ＥＧＦＲ−Ｌ２  ｐｒｉｍｅｒ：ＡＴＡＧＴＴＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＣＧＡＡＣＡＴＴＣＴＧＴＡＧＧＧＧＣＣＡＣＴＧＴＣＴＴ（配列番号：９７）
【０１５７】
ＰＣＲ反応で得られたＤＮＡ断片は、エタノール沈殿をして精製した後に、制限酵素ＸｈｏＩ（タカラバイオ、１０９４Ａ）とＮｏｔＩ（タカラバイオ、Ｃｏｄｅ  １１６６Ａ）により処理された。ＢＣＭＧ−ｎｅｏベクターも同様に制限酵素ＸｈｏＩとＮｏｔＩで処理された。次に、制限酵素処理されたＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片とＢＣＭＧ−ｎｅｏベクターは、エチジウムブロミドを含む１％アガロースゲルで電気泳動された。電気泳動後、ＵＶ照射することで可視化されたＤＮＡ断片の中から目的サイズのＤＮＡ断片をゲルから切り出し、ＳＵＰＲＥＣ−０１（タカラバイオ、ｃｏｄｅ  ９０４０）を用いてゲルからＤＮＡ断片を抽出して精製した。ゲルからの切り出し精製されたＰＣＲ増幅断片とＢＣＭＧ−ｎｅｏベクターは、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２．１（タカラバイオ、ｃｏｄｅ  ６０２２）を用いてＬｉｇａｔｉｏｎ反応させた。Ｌｉｇａｔｉｏｎ反応終了後のＤＮＡ溶液は、大腸菌ＪＭ１０９へＴｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎするのに使用され、得られた形質転換体からプラスミドＤＮＡをアルカリＳＤＳ法にて精製した。精製されたプラスミドは、シークエンス解析が行われ、Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲヒト抗体のＬ鎖（可変領域と定常領域）遺伝子を含んでいることを確認し、これをＡｎｔｉ−ＥＧＦＲヒト抗体Ｌ鎖発現ベクターとした。
【０１５８】
なお、Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲヒト抗体Ｌ鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の塩基配列をそれぞれ、配列番号：１０６、１０８及び１１０に示す。また、Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲヒト抗体Ｌ鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ、配列番号：１０７、１０９及び１１１に示す。
【０１５９】
２）野生型Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲヒト抗体Ｈ鎖発現ベクターと２４４Ｃｙｓ型、２４６Ｃｙｓ型、２８６Ｃｙｓ型Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲヒト抗体Ｈ鎖発現ベクターとの構築
抗体研究所より提供されたヒトＡｎｔｉ−ＥＧＦＲ抗体Ｈ鎖の可変領域を含む遺伝子を鋳型として、以下に示すｐｒｉｍｅｒを用いてＰＣＲ反応によりＤＮＡ断片を得た。なお、このヒトＡｎｔｉ−ＥＧＦＲ抗体は、ファージディスプレイ法により調製されたヒト抗体である。
ＥＧＦＲ−Ｈ１  ｐｒｉｍｅｒ：ＡＣＣＧＣＴＣＧＡＧＡＴＧＡＡＡＣＡＣＣＴＧＴＧＧＴＴＣＴＴＣＣＴＣ（配列番号：９８）
ＥＧＦＲ−Ｈ２  ｐｒｉｍｅｒ：ＣＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＣＡＴＴＧＴＣＣＣＴＴＧ（５’−リン酸化されている）（配列番号：９９）。
【０１６０】
ＰＣＲ反応で得られたＤＮＡ断片は、エタノール沈殿をして精製した後に、制限酵素ＸｈｏＩ（タカラバイオ、１０９４Ａ）により処理された。次に、制限酵素処理されたＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片は、エチジウムブロミドを含む１％アガロースゲルで電気泳動した。電気泳動後、ＵＶ照射することで可視化されたＤＮＡ断片の中から目的サイズのＤＮＡ断片をゲルから切り出し、ＳＵＰＲＥＣ−０１（タカラバイオ、ｃｏｄｅ  ９０４０）を用いてゲルからＤＮＡ断片を抽出して精製した。この精製ＤＮＡ断片が、Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲヒト抗体Ｈ鎖可変領域遺伝子である。
【０１６１】
なお、Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲヒト抗体Ｈ鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３の塩基配列をそれぞれ、配列番号：１００、１０２、１０４に示す。また、Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲヒト抗体Ｈ鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ、配列番号：１０１、１０３、１０３に示す。
【０１６２】
Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲヒト抗体の作製に必要なＨｕｍａｎ  ＩｇＧ１  Ｈ鎖定常領域遺伝子は、Ａｎｔｉ−ＣＤ２０キメラ抗体を作製する際に使用したＤＮＡ断片と同様のものを使用した。プラスミドｐＣＲ２．１−ＨＣ（ｗｉｌｄ）を鋳型として、Ｈ３  ｐｒｉｍｅｒとＨ４  ｐｒｉｍｅｒを用いてＰＣＲ増幅させてＤＮＡ断片を得た。そのＤＮＡ断片は、制限酵素ＮｏｔＩで処理してから精製された。このＤＮＡ断片が、野生型Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲヒト抗体Ｈ鎖定常領域遺伝子である。プラスミドｐＣＲ２．１−ＨＣ（２４４Ｃｙｓ）を鋳型にして、野生型と同様にＨ３  ｐｒｉｍｅｒとＨ４  ｐｒｉｍｅｒを用いてＰＣＲ増幅させて得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＮｏｔＩで処理してから精製したものが、２４４Ｃｙｓ型Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲヒト抗体Ｈ鎖定常領域遺伝子である。プラスミドｐＣＲ２．１−ＨＣ（２４６Ｃｙｓ）を鋳型にして、野生型と同様にＨ３  ｐｒｉｍｅｒとＨ４  ｐｒｉｍｅｒを用いてＰＣＲ増幅させて得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＮｏｔＩで処理してから精製したものが、２４６Ｃｙｓ型Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲヒト抗体Ｈ鎖定常領域遺伝子である。プラスミドｐＣＲ２．１−ＨＣ（２５９Ｃｙｓ）を鋳型にして、野生型と同様にＨ３  ｐｒｉｍｅｒとＨ４  ｐｒｉｍｅｒを用いてＰＣＲ増幅させて得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＮｏｔＩで処理してから精製したものが、２５９Ｃｙｓ型Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲヒト抗体Ｈ鎖定常領域遺伝子である。
【０１６３】
上記のように調製されたＡｎｔｉ−ＥＧＦＲヒト抗体Ｈ鎖可変領域遺伝子断片と野生型Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲヒト抗体Ｈ鎖定常領域遺伝子断片とＢＣＭＧ−ｎｅｏベクターをＸｈｏＩとＮｏｔＩで切断して精製したＤＮＡ断片を混合して、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２．１（タカラバイオ、ｃｏｄｅ  ６０２２）を用いてＬｉｇａｔｉｏｎ反応させた。Ｌｉｇａｔｉｏｎ反応終了後のＤＮＡ溶液は、大腸菌ＪＭ１０９へＴｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎするのに使用され、得られた形質転換体からプラスミドＤＮＡをアルカリＳＤＳ法にて精製した。精製されたプラスミドは、シークエンス解析が行われ、Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲヒト抗体の野生型Ｈ鎖（可変領域と定常領域）遺伝子を含んでいることを確認し、これを野生型Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲヒト抗体Ｈ鎖発現ベクターとした。同様に、Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲヒト抗体Ｈ鎖可変領域遺伝子断片と２４４Ｃｙｓ型Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲヒト抗体Ｈ鎖定常領域遺伝子断片とＢＣＭＧ−ｎｅｏベクターをＸｈｏＩとＮｏｔＩで切断して精製したＤＮＡ断片を混合して、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２．１（タカラバイオ、ｃｏｄｅ  ６０２２）を用いてＬｉｇａｔｉｏｎ反応させた。Ｌｉｇａｔｉｏｎ反応終了後のＤＮＡ溶液は、大腸菌ＪＭ１０９へＴｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎするのに使用され、得られた形質転換体からプラスミドＤＮＡをアルカリＳＤＳ法にて精製した。精製されたプラスミドは、シークエンス解析が行われ、Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲヒト抗体の２４４Ｃｙｓ型Ｈ鎖（可変領域と定常領域）遺伝子を含んでいることを確認し、これを２４４Ｃｙｓ型Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲヒト抗体Ｈ鎖発現ベクターとした。同様に、Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲヒト抗体Ｈ鎖可変領域遺伝子断片と２４６Ｃｙｓ型Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲヒト抗体Ｈ鎖定常領域遺伝子断片とＢＣＭＧ−ｎｅｏベクターをＸｈｏＩとＮｏｔＩで切断して精製したＤＮＡ断片を混合して、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２．１（タカラバイオ、ｃｏｄｅ  ６０２２）を用いてＬｉｇａｔｉｏｎ反応させた。Ｌｉｇａｔｉｏｎ反応終了後のＤＮＡ溶液は、大腸菌ＪＭ１０９へＴｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎするのに使用され、得られた形質転換体からプラスミドＤＮＡをアルカリＳＤＳ法にて精製した。精製されたプラスミドは、シークエンス解析が行われ、Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲヒト抗体の２４６Ｃｙｓ型Ｈ鎖（可変領域と定常領域）遺伝子を含んでいることを確認し、これを２４６Ｃｙｓ型Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲヒト抗体Ｈ鎖発現ベクターとした。同様に、Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲヒト抗体Ｈ鎖可変領域遺伝子断片と２５９Ｃｙｓ型Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲヒト抗体Ｈ鎖定常領域遺伝子断片とＢＣＭＧ−ｎｅｏベクターをＸｈｏＩとＮｏｔＩで切断して精製したＤＮＡ断片を混合して、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２．１（タカラバイオ、ｃｏｄｅ  ６０２２）を用いてＬｉｇａｔｉｏｎ反応させた。Ｌｉｇａｔｉｏｎ反応終了後のＤＮＡ溶液は、大腸菌ＪＭ１０９へＴｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎするのに使用され、得られた形質転換体からプラスミドＤＮＡをアルカリＳＤＳ法にて精製した。精製されたプラスミドは、シークエンス解析が行われ、Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲヒト抗体の２５���Ｃｙｓ型Ｈ鎖（可変領域と定常領域）遺伝子を含んでいることを確認し、これを２５９Ｃｙｓ型Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲヒト抗体Ｈ鎖発現ベクターとした。
【０１６４】
３）野生型Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲヒト抗体と２４４Ｃｙｓ型、２４６Ｃｙｓ型、２５９Ｃｙｓ型Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲヒト抗体のＣＨＯ細胞での発現と精製
Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲヒト抗体Ｌ鎖発現ベクターと野生型Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲヒト抗体Ｈ鎖発現ベクターをＣＨＯ細胞にＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎさせて野生型Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲヒト抗体をＣＨＯ細胞に産生させた。同様に、Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲヒト抗体Ｌ鎖発現ベクターと２４４Ｃｙｓ型、２４６Ｃｙｓ型あるいは２５９Ｃｙｓ型Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲヒト抗体Ｈ鎖発現ベクターをＣＨＯ細胞にＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎさせて２４４Ｃｙｓ型、２４６Ｃｙｓ型あるいは２５９Ｃｙｓ型Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲヒト抗体をＣＨＯ細胞に産生させた。野生型、２４４Ｃｙｓ型、２４６Ｃｙｓ型あるいは２５９Ｃｙｓ型Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲヒト抗体を高発現するＣＨＯ細胞を選択した。選択された高発現ＣＨＯ細胞は、無血清培地ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ培地で培養された。培養終了後、培養液上清をＰｒｏｔｅｉｎＡカラムあるいはＰｒｏｔｅｉｎＬカラムで精製することで高純度のＡｎｔｉ−ＥＧＦＲヒト抗体を得た。
【０１６５】
２４４Ｃｙｓ型、２４６Ｃｙｓ型、２５９Ｃｙｓ型のＡｎｔｉ−ＥＧＦＲヒト抗体と野生型抗体の細胞障害の割合を、ｌａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｒｅｌｅａｓｅ  ａｓｓａｙによって比較した。得られた、野生型、２４４Ｃｙｓ型、２４６Ｃｙｓ型、２５９Ｃｙｓ型のＡｎｔｉ−ＥＧＦＲヒト抗体のＡＤＣＣ活性結果を、図３及び表３に示す。
【０１６６】
図３に示した結果から明らかなように、野生型抗体のＡＤＣＣ活性と比較して、３種類のヒト抗体は、野生型と比べて０．０１から１０μｇ／ｍＬの範囲で測定された全域に対して高いＡＤＣＣ活性を示した。
【０１６７】
【表３】
2014057542.tif 000004
【０１６８】
また表３より、野生型抗体と２４４Ｃｙｓ型、２４６Ｃｙｓ型、２５９Ｃｙｓ型ヒト抗体との間で細胞障害の割合が同程度である２点を選択し、ＡＤＣＣ活性の比較を試みた。例えば、２４４Ｃｙｓ型ヒト抗体は０．０１μｇ／ｍＬで約２０％、野生型抗体は０．１μｇ／ｍＬで約２０％の細胞障害を示している。この２点を用いて比較した場合、同じＡＤＣＣ活性を得るために必要な抗体濃度が１０分の１に減少した。このことから、ＡＤＣＣ活性が約１０倍上昇した（野生型抗体と変異型抗体が同一の細胞障害の割合を示す２点間における、野生型抗体に対する変異型抗体の濃度の比が１０倍になった）と判断した。
【０１６９】
（実施例３）
実施例１で作製した野生型、２４４Ｃｙｓ型、２４６Ｃｙｓ型、２５９Ｃｙｓ型あるいは２８６Ｃｙｓ型のＡｎｔｉ−ＣＤ２０キメラ抗体を使用して、治療効果を評価した。
【０１７０】
３匹のＮＯＧ  ｍｏｕｓｅ（ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｓｕｇ／Ｊｉｃ）に３ｘ１０６個のＤａｕｄｉ（バーキットリンパ腫）を静脈注射した。５日後に２ｘ１０６個のＮＫ細胞とコントロール抗体、野生型あるいは２８６Ｃｙｓ型のＡｎｔｉ−ＣＤ２０キメラ抗体のうち一種類の抗体を４０ｕｇ、静脈注射した。その後、マウスの生存期間を評価した。なお、コントロール抗体としては、Ａｎｔｉ−ＫＬＨキメラ抗体を用いた。
【０１７１】
コントロール抗体、野生型抗体、２８６Ｃｙｓ型キメラ抗体の結果を図４に示した。コントロール抗体に比べると野生型抗体は５日間、２８６Ｃｙｓ型キメラ抗体は、野生型抗体よりも９日間の生存日数が延長された。この結果、２８６Ｃｙｓ型キメラ抗体は、野生型よりも高い治療効果を示した。
【０１７２】
次に、２８６Ｃｙｓ型と２４４Ｃｙｓ型、２４６Ｃｙｓ型、２５９Ｃｙｓ型のＡｎｔｉ−ＣＤ２０キメラ抗体について、マウスの生存期間を比較した。得られた結果を図５〜７に示す。
【０１７３】
図５及び６に示した結果から明らかなように、２４４Ｃｙｓ型の抗体と２４６Ｃｙｓ型の抗体は、前述の野生型の抗体よりも高い治療効果を示した２８６Ｃｙｓ型よりも、さらに生存日数が４日間延長された。また、図７に示した結果から明らかなように、２５９Ｃｙｓ型の抗体は、２８６Ｃｙｓ型の抗体よりも生存日数が４日間短くなった。しかしながら、前述の図４に示した結果も併せ考慮するに、２５９Ｃｙｓ型の抗体も野生型の抗体よりも高い治療効果を有していることが示唆される。
【産業上の利用可能性】
【０１７４】
以上説明したように、本発明によれば、ＡＤＣＣ活性が増強された抗体及びその製造方法を提供することが可能となる。
【０１７５】
したがって、本発明のＡＤＣＣ活性が増強された抗体を用いることによって、本発明の方法によりアミノ酸を置換する前の抗体と比較して、より多くの細胞障害を引き起こすことが出来る。また本発明の抗体は、特に低濃度の投与例において、前記アミノ酸置換前の抗体と比較して、ＡＤＣＣ活性が１０倍以上上昇する。従って、本発明の抗体を治療抗体として用いることによって、単位質量あたりの癌細胞等への治療効果を上昇させることが可能である。また本発明の抗体を用いれば、患者への１回あたりの投薬量を低減させることができるため、投薬費を低減することも可能である。そのため、本発明の抗体及びその製造方法は、医療分野において極めて有用である。
【配列表フリーテキスト】
【０１７６】
配列番号：１〜４５、５２、６８、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６〜９９、１１６、１１８、１２０
＜２２３＞  人工的に合成されたヌクレオチドの配列
配列番号：５３、６９、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、１１７、１１９、１２１
＜２２３＞  人工的に合成されたペプチドの配列
【図１】
2014057542.tif 000005
【図２】
2014057542.tif 000006
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2014057542.tif 000010
【図７】
2014057542.tif 000011
【配列表】
2014057542000001.app