(57)【要約】【課題】エタノールを効率よく生成できる酵母ならびにこれを用いたエタノールの製造方法を提供する。【解決手段】本発明のエタノール生成酵母は、キシロース代謝酵素遺伝子を有し、かつ、下記（Ｘ）または（Ｙ）の少なくとも一方の条件を満たす形質転換体である。（Ｘ）ＨＳＴ１タンパク質が不活性化された酵母形質転換体（Ｙ）ＱＮＳ１遺伝子の発現ベクターが導入された酵母形質転換体本発明のエタノール生成酵母を、キシロース存在下で培養することにより、効率よくエタノールを生成できるため、キシロース等を含むバイオマスを原料として有効利用できる。【選択図】図７
2014060978.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
キシロース代謝酵素遺伝子を有し、かつ、下記（Ｘ）または（Ｙ）の少なくとも一方の条件を満たす形質転換体であることを特徴とする、エタノール生成酵母。
（Ｘ）Ｈｓｔ１タンパク質が不活性化された酵母形質転換体
（Ｙ）ＱＮＳ１遺伝子の発現ベクターが導入された酵母形質転換体
【請求項２】
前記形質転換体が、前記（Ｘ）および（Ｙ）の両方の条件を満たす形質転換体である、請求項１記載のエタノール生成酵母。
【請求項３】
前記（Ｘ）において、前記Ｈｓｔ１タンパク質が、ＨＳＴ１遺伝子の破壊によって不活性化されている、請求項１または２記載のエタノール生成酵母。
【請求項４】
前記（Ｘ）において、前記ＨＳＴ１遺伝子の破壊が、前記ＨＳＴ１遺伝子の全領域の欠失、置換、付加および挿入からなる群から選択された少なくとも一つである、請求項３記載のエタノール生成酵母。
【請求項５】
前記（Ｘ）において、前記ＨＳＴ１遺伝子の破壊が、前記ＨＳＴ１遺伝子の部分領域の欠失、置換、付加および挿入からなる群から選択された少なくとも一つである、請求項３記載のエタノール生成酵母。
【請求項６】
前記（Ｘ）において、前記Ｈｓｔ１タンパク質が、ＨＳＴ１遺伝子の発現阻害によって不活性化されている、請求項１または２記載のエタノール生成酵母。
【請求項７】
前記（Ｘ）において、前記ＨＳＴ１遺伝子の発現阻害が、前記ＨＳＴ１遺伝子の転写および翻訳の少なくとも一方の阻害である、請求項６記載のエタノール生成酵母。
【請求項８】
前記酵母が、サッカロミセス  セレビシエである、請求項１から７のいずれか一項に記載のエタノール生成酵母。
【請求項９】
前記キシロース代謝酵素遺伝子が、キシロース還元酵素遺伝子、キシリトール脱水素酵素遺伝子およびキシルロースリン酸化酵素遺伝子からなる群より選択される少なくとも1つである、請求項１から８に記載のエタノール生成酵母。
【請求項１０】
前記形質転換体が、キシロース還元酵素遺伝子およびキシリトール脱水素酵素遺伝子の発現ベクターが導入された形質転換体である、請求項１から９のいずれか一項に記載のエタノール生成酵母。
【請求項１１】
前記キシロース還元酵素遺伝子および前記キシリトール脱水素酵素遺伝子が、ピキア  スティピティス由来である、請求項１０記載のエタノール生成酵母。
【請求項１２】
前記発現ベクターが、さらに、キシルロースリン酸化酵素遺伝子を有する、請求項１０または１１記載のエタノール生成酵母。
【請求項１３】
請求項１から１２のいずれか一項に記載のエタノール生成酵母を用いてエタノール発酵を行う発酵工程を含むことを特徴とする、エタノールの製造方法。
【請求項１４】
前記発酵工程において、キシロースを含有する培地を使用する、請求項１３記載のエタノールの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エタノールを生成する酵母およびこれを用いたエタノールの製造方法に関し、具体的には、キシロースを効率よくエタノールに変換する酵母およびこれを用いたエタノールの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、化石燃料の枯渇、ＣＯ２ガス削減等の観点から、廃棄物であるバイオマスを原料とし、燃料となるエタノールを生成する研究が進められている。前記バイオマスとしては、例えば、コーンコブ、稲ワラ、スイッチグラス、エリアンサスおよび廃材等があげられる。これらの廃棄物は、多糖としてヘミセルロースを含んでおり、前記ヘミセルロースには、キシロース、アラビノース等の五炭糖が含まれる。このため、これらの五炭糖を基質として利用できることが望ましい。
【０００３】
一方、酵母を用いた一般的なエタノールの製造方法として、サッカロミセス  セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）の醗酵による、デンプンからのエタノール生成が広く知られている。デンプンは、グルコースがα−１，４結合した多糖であり、加水分解酵素によって容易に分解できる。そして、分解により得られるグルコースは、サッカロミセス  セレビシエの最も好ましい炭素源であり、１分子のグルコースから２分子のエタノールを、発酵により生成できる。しかしながら、前記バイオマスを原料とする場合、サッカロミセス  セレビシエは、前記ヘミセルロース中の五炭糖、特にキシロースを醗酵できない。そこで、前記バイオマスを原料とするエタノール生成には、キシロース発酵能を有する酵母ピキア  スティピティス（Pichia stipitis）のキシロース還元酵素遺伝子およびキシリトール脱水素酵素遺伝子等のキシロース代謝酵素遺伝子を、サッカロミセス  セレビシエに導入して、キシロース醗酵能を付与した形質転換体を使用する方法が広く利用されている。
【０００４】
そこで、前記収率を改善する方法として、例えば、キシロース代謝酵素の改変等が、報告されている（非特許文献１〜４）。しかしながら、これらの方法によっても、十分な収率の向上は実現されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Petschacher B,Nidetzky B. Microb Cell Fact. 2008 Mar 17; 7: 9
【非特許文献２】Watanabe S,Saleh AA, Pack SP, Annaluru N, Kodaki T, Makino K.  J Biotechnol. 2007 Jun 30;130(3): 316-9. Epub 2007 Apr 29
【非特許文献３】Verho R, Londesborough J, Penttile M, Richard P. Appl Environ Microbiol.2003 Oct; 69(10): 5892-7
【非特許文献４】Mikael Anderlund et.al. Appl Environ Microbiol. 1999 June 65(6):2333-2340
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
そこで、本発明は、エタノールを効率よく生成できる酵母ならびにこれを用いたエタノールの製造方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
前記目的を達成するために、本発明のエタノール生成酵母は、キシロース代謝酵素遺伝子を有し、かつ、下記（Ｘ）または（Ｙ）の少なくとも一方の条件を満たす形質転換体であることを特徴とする。
（Ｘ）Ｈｓｔ１タンパク質が不活性化された酵母形質転換体
（Ｙ）ＱＮＳ１遺伝子の発現ベクターが導入された酵母形質転換体
【０００８】
本発明のエタノールの製造方法は、前記本発明のエタノール生成酵母を用いてエタノール発酵を行う発酵工程を含むことを特徴とする。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のエタノール生成酵母によれば、キシロースを基質として、効率よくエタノールを生成できる。このため、本発明は、例えば、前述の廃棄物等のバイオマスを原料として、エタノールをバイオプロセスによって製造できるため、極めて有用といえる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】実施例で用いたプラスミドｐＵＣｐＨＳＴ１の概略図である。
【図２】実施例で用いたプラスミドｐＵＧＲＦＲＴの概略図である。
【図３】実施例で用いたプラスミドｐＵＣｐＨＳＴ１Ｇの概略図である。
【図４】実施例で用いたプラスミドｐＥＮＴＲ−Ｄ−ＱＮＳ１の概略図である。
【図５】実施例で用いたプラスミドｐＹＣＨＴＰＩ−ＲｆＡの概略図である。
【図６】実施例で用いたプラスミドｐＹＣＨＱＮＳ１の概略図である。
【図７】実施例１において、ＨＨ４７２株を親株としたＨＳＴ１遺伝子破壊株に関するキシロース発酵試験の結果を示すグラフである。
【図８】実施例１において、ＨＨ５９４株を親株としたＨＳＴ１遺伝子破壊株に関するキシロース発酵試験の結果を示すグラフである。
【図９】実施例２において、ＨＨ４７２株を親株としたＨＳＴ１遺伝子破壊株およびＱＮＳ１遺伝子高発現株に関するキシロース発酵試験の結果を示すグラフである。
【図１０】実施例２において、ＨＨ５９４株を親株としたＨＳＴ１遺伝子破壊株およびＨＳＴ１遺伝子破壊／ＱＮＳ１遺伝子高発現株に関するキシロース発酵試験の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
（１）エタノール生成酵母
本発明のエタノール生成酵母は、前述のように、キシロース代謝酵素遺伝子を有し、かつ、下記（Ｘ）または（Ｙ）の少なくとも一方の条件を満たす形質転換体であることを特徴とする。
（Ｘ）Ｈｓｔ１タンパク質が不活性化された酵母形質転換体
（Ｙ）ＱＮＳ１遺伝子の発現ベクターが導入された酵母形質転換体
【００１２】
本発明のエタノール生成酵母が、エタノールを効率よく生成できる理由、すなわち、キシロースからエタノールへの変換を効率よく行える理由は、以下のように推測される。なお、この推測は、本発明を限定するものではない。
【００１３】
グルコースを原料とする醗酵の場合、ＮＡＤＰ／ＮＡＤＰＨまたはＮＡＤ／ＮＡＤＨのバランスは変化しない。他方、キシロース還元酵素は、キシロースをキシリトールに変換する際、同時に、補酵素であるＮＡＤＰＨをＮＡＤＰ＋に変換し、また、キシリトール脱水素酵素は、キシリトールをキシルロースに変換する際、同時に、補酵素であるＮＡＤ＋をＮＡＤＨに変換する。このため、キシロースを原料とする発酵の場合、酵母による発酵が進むにしたがって、ＮＡＤＰＨまたはＮＡＤ＋が減少し、ＮＡＤＰまたはＮＡＤＨが増加する方向に傾き、両者のバランスの変化が原因となって、キシロースからのエタノール収率が低下すると考えられる。そこで、本発明者らは、鋭意研究の結果、まず、ＮＡＤまたはＮＡＤＰＨの増加が重要であるとの知見を得て、ＮＡＤのｄｅ  ｎｏｖｏ合成系を促進すべく、Ｈｓｔ１タンパク質を不活性化した酵母形質転換体、ならびに、Ｑｎｓ１タンパク質を高発現する酵母形質転換体の製造を試みた。その結果、Ｈｓｔ１タンパク質の不活性化およびＱｎｓ１タンパク質の高発現の少なくとも一方を実現することによって、前記形質転換体は、野生型である同一株と比較して、エタノール収率が向上するとの結果を得て、本発明を確立するに至った。
【００１４】
本発明において、前記酵母は、特に制限されない。前記酵母は、例えば、出芽酵母および分裂酵母があげられる。前記出芽酵母は、例えば、サッカロミセス  セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)があげられ、ＮＢＲＣ１９５１、ＮＢＲＣ１９５２、ＮＢＲＣ１９５３、ＮＢＲＣ１９５４、Ｘ２１８０−１Ａ（ＡＴＣＣ２６７８６）、ＣＢ１１（Ｂｅｒｋｌｅｙ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒ）、Ｗ３０３−１Ａ（ＢＹ４８４８）等があげられる。前記分裂酵母は、例えば、シゾサッカロミセス  ジャポニクス（Schizosaccharomyces japonicus、Hasegawaea japonicus）、シゾサッカロミセス  オクトスポルス（Schizosaccharomyces octosporus、Octosporomyces octosporus）およびシゾサッカロミセス  ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）等があげられる。この他に、例えば、ピキア  スティピティス（Pichia stipitis）、キャンディダ  マグノリアエ（Candida magnoliae）等も使用できる。
【００１５】
本発明において、前記（Ｘ）の形質転換体は、Ｈｓｔ１タンパク質が不活性化された酵母形質転換体である。本発明において、Ｈｓｔ１タンパク質が不活性化される前の酵母を、親株酵母または宿主酵母ともいう。
【００１６】
ＨＳＴ１（NAD-dependent  protein  deacetylase  HST1）タンパク質は、ＮＡＤ＋依存型ヒストン脱アセチル化酵素の一種であり、ＯＲＣ（複製開始点認識複合体）−依存型サイレンシングまたは減数分裂抑制に必要なＳｕｍ１ｐ／Ｒｆｍ１ｐ／Ｈｓｔ１ｐ複合体の必須因子である。
【００１７】
本発明において、前記Ｈｓｔ１タンパク質は、前述のように、不活性化されていればよく、具体的には、本来の前記Ｈｓｔ１タンパク質の機能が不活性化されていればよい。前記Ｈｓｔ１タンパク質の不活性化は、特に制限されず、例えば、前記Ｈｓｔ１タンパク質そのものを発現しない形態でもよいし、前記Ｈｓｔ１タンパク質の前記本来の機能が変異により不活性化された形態でもよいし、前記Ｈｓｔ１タンパク質が前記本来の機能を有し且つ前記機能が中和によって不活性化された形態でもよい。前記Ｈｓｔ１タンパク質の不活性化の具体例は、例えば、前記Ｈｓｔ１タンパク質をコードするＨＳＴ１遺伝子の破壊もしくは前記ＨＳＴ１遺伝子の発現阻害、または、前記Ｈｓｔ１タンパク質の中和によって不活性化されてもよい。
【００１８】
本発明において、前記ＨＳＴ１遺伝子の破壊は、例えば、前記破壊されたＨＳＴ１遺伝子から発現するタンパク質が、本来の前記Ｈｓｔ１タンパク質の機能を奏さないように、破壊されていることを意味し、例えば、本来のＨＳＴ１遺伝子の機能を奏さないということもできる。このように、本来の前記Ｈｓｔ１タンパク質の機能を奏さないタンパク質は、以下、「変異Ｈｓｔ１タンパク質」ともいう。前記本来のＨＳＴ１遺伝子とは、例えば、前記破壊が行われていないＨＳＴ１遺伝子を意味する。本発明において、遺伝子とは、特に示さない限り、例えば、ＤＮＡおよびｍＲＮＡ等のＲＮＡのいずれの意味でもよい。
【００１９】
前記ＨＳＴ１遺伝子の破壊は、特に制限されず、例えば、前記ＨＳＴ１遺伝子の変異があげられる。前記変異は、例えば、前記ＨＳＴ１遺伝子における、塩基の欠失、置換、付加および／または挿入があげられ、いずれか一種類の変異でもよいし、二種類以上の変異の組合せでもよい。前記ＨＳＴ１遺伝子の配列は、例えば、全領域が変異してもよいし、部分領域が変異してもよい。具体例として、前記変異が欠失の場合、例えば、全領域が欠失してもよいし、部分領域が欠失してもよい。この場合、例えば、前記全領域の欠失によって、前記ＨＳＴ１タンパク質自体が発現しない状態でもよいし、前記部分領域の欠失によって、前記ＨＳＴ１タンパク質が部分的に欠失した前記変異Ｈｓｔ１タンパク質として発現してもよい。前記変異が置換の場合、例えば、全領域が置換してもよいし、部分領域が置換してもよい。この場合、例えば、前記置換によって、前記本来のＨＳＴ１遺伝子とは異なるアミノ酸をコードするコドンに設計し、これによって、前記変異Ｈｓｔ１タンパク質として発現してもよい。前記変異が挿入の場合、例えば、全領域にわたって塩基が挿入されてもよいし、部分領域において塩基が挿入されてもよい。この場合、例えば、塩基の挿入によって、前記ＨＳＴ１遺伝子の読み枠を変化させ、前記本来のＨＳＴ１遺伝子とは異なるアミノ酸配列をコードするように設計し、これによって、前記変異Ｈｓｔ１タンパク質として発現してもよい。
【００２０】
本発明において、前記ＨＳＴ１遺伝子の発現阻害は、特に制限されず、例えば、前記ＨＳＴ１遺伝子の転写および翻訳の少なくとも一方の阻害があげられる。具体的に、例えば、前記ＨＳＴ１遺伝子のｍＲＮＡへの転写自体が阻害されてもよいし、前記ＨＳＴ１遺伝子から転写されたｍＲＮＡが切断されてもよいし、前記ＨＳＴ１遺伝子から転写されたｍＲＮＡに基づく翻訳が阻害されてもよい。前記ＨＳＴ１遺伝子の転写および翻訳の阻害には、例えば、前記ＨＳＴ１遺伝子またはそのｍＲＮＡを標的とした、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスおよびリボザイム等の核酸分子が利用できる。前記核酸分子を利用する遺伝子の発現阻害の技術は、例えば、遺伝子からのｍＲＮＡ転写を阻害する手段、または、遺伝子から転写されたｍＲＮＡの分解による、タンパク質への翻訳を阻害する手段等として確立されている。このため、前記ＨＳＴ１遺伝子の発現阻害のために、例えば、前記核酸分子を設計することは、当業者であれば技術常識に基づいて行うことができる。また、前記核酸分子の構成材料は、特に制限されず、例えば、天然由来の核酸でもよいし、ＰＮＡ等の人工核酸等でもよく、何ら制限されない。
【００２１】
前記酵母として、例えば、サッカロミセス  セレビシエを使用する場合、サッカロミセス属由来のＨＳＴ１遺伝子およびＨｓｔ１タンパク質は、例えば、Saccharomyces  Genome  Databaseにおいて、登録番号ＹＯＬ０６８Ｃで登録されている。サッカロミセス  セレビシエのＨＳＴ１遺伝子の全長塩基配列を、配列番号１に示し、Ｈｓｔ１タンパク質の全長アミノ酸配列を、配列番号２に示す。
【００２２】
前記ＨＳＴ１遺伝子の塩基配列が配列番号１であり、前記ＨＳＴ１タンパク質のアミノ酸配列が配列番号２の場合、例えば、前記ＨＳＴ１タンパク質の不活性化は、以下のような態様が例示できる。なお、本発明は、これらの例示には制限されない。前記ＨＳＴ１遺伝子は、例えば、前述のように、全領域を変異させてもよいし、部分領域を変異させてもよく、前記変異は、欠失が好ましい。前記ＨＳＴ１遺伝子において前記変異させる領域は、例えば、配列番号１における３４６〜１２３９番目を含むことが好ましく、具体例として、配列番号１における３４６〜１２３９番目を含む領域が欠失していることが好ましい。また、これに対応して、前記ＨＳＴ１タンパク質において前記変異させる領域は、例えば、配列番号２における１１６〜４１３番目を含むことが好ましく、具体例として、配列番号２における１１６〜４１３を含む領域が欠失していることが好ましい。
【００２３】
つぎに、本発明において、前記（Ｙ）の形質転換体は、ＱＮＳ１遺伝子の発現ベクターが導入された酵母形質転換体である。本発明において、ＱＮＳ１遺伝子の発現ベクターが導入される前の酵母を、親株酵母または宿主酵母ともいう。
【００２４】
本発明において、Ｑｎｓ１（Glutamine-dependent  NAD(+)  synthetase）タンパク質は、ＮＡＤ生成経路の最終ステップにおいて、脱アミドＮＡＤ＋からＮＡＤ＋を合成する反応を触媒する酵素であり、ＱＮＳ１遺伝子は、前記Ｑｎｓ１タンパク質をコードする遺伝子である。
【００２５】
前記（Ｙ）の酵母形質転換体は、前記ＱＮＳ１遺伝子の発現ベクターが、前記ＱＮＳ１遺伝子を発現可能なように導入されていればよい。
【００２６】
前記ＱＮＳ１遺伝子の由来は、特に制限されない。前記ＱＮＳ１遺伝子は、例えば、酵母由来があげられ、好ましくは、サッカロミセス属由来、より好ましくは、サッカロミセス  セレビシエ由来があげられる。サッカロミセス属由来のＱＮＳ１遺伝子は、例えば、Saccharomyces  Genome  Databaseにおいて、登録番号ＹＨＲ０７４Ｗで登録されている。サッカロミセス  セレビシエのＱＮＳ１遺伝子の全長塩基配列を、配列番号３に示し、Ｑｎｓ１タンパク質の全長アミノ酸配列を、配列番号４に示す。
【００２７】
前記ＱＮＳ１遺伝子は、例えば、下記（ａ）〜（ｇ）からなる群から選択されるポリヌクレオチドがあげられる。
（ａ）配列番号３の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）配列番号３の塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、ＮＡＤ＋合成活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｃ）配列番号３の塩基配列に対して、９０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、ＮＡＤ＋合成活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｄ）配列番号３の塩基配列からなるポリヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに相補的な塩基配列からなり、ＮＡＤ＋合成活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｅ）配列番号４のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｆ）配列番号４のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、ＮＡＤ＋合成活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｇ）配列番号４のアミノ酸配列に対して、９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、ＮＡＤ＋合成活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
【００２８】
前記（ｂ）において、「１もしくは数個」は、例えば、前記（ｂ）のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質が、前記活性を有する範囲であればよい。前記置換等の塩基の数は、例えば、１〜２０個、好ましくは、１〜１０個、より好ましくは、１〜９個、さらに好ましくは、１〜５個、特に好ましくは、１〜３個、最も好ましくは、１または２個である。
【００２９】
前記（ｃ）において、「同一性」は、例えば、前記（ｃ）のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質が、前記活性を有する範囲であればよい。前記同一性は、好ましくは、９５％以上、より好ましくは、９６％以上、９７％以上、９８％以上、さらに好ましくは、９９％以上である。前記同一性は、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴ等の解析ソフトウェアを用いて、デフォルトのパラメータにより算出できる（以下、同様）。
【００３０】
前記（ｄ）において、「ハイブリダイズするポリヌクレオチド」は、例えば、前記（ａ）のポリヌクレオチドに対して、完全または部分的に相補的なポリヌクレオチドである。前記ハイブリダイズは、例えば、各種ハイブリダイゼーションアッセイにより検出できる。前記ハイブリダイゼーションアッセイは、特に制限されず、例えば、サザンハイブリダイゼーションアッセイ、コロニーハイブリダイゼーションアッセイ、プラークハイブリダイゼーションアッセイ等の公知の方法があげられる。ハイブリダイゼーションアッセイは、例えば、ザンブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編「モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリーマニュアル第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  Ｅｄ．）」〔（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  （１９８９）〕等に記載されている方法を採用することもできる。
【００３１】
前記（ｄ）において、「ストリンジェントな条件」は、例えば、低ストリンジェントな条件、中ストリンジェントな条件、高ストリンジェントな条件のいずれでもよい。「低ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、３２℃の条件である。「中ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、４２℃の条件である。「高ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、５０℃の条件である。ストリンジェンシーの程度は、当業者であれば、例えば、温度、塩濃度、プローブの濃度および長さ、イオン強度、時間等の条件を適宜選択することで、設定可能である。「ストリンジェントな条件」は、例えば、前述したザンブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編「モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリーマニュアル第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  Ｅｄ．）」〔（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  （１９８９）〕等に記載の条件を採用することもできる。洗浄の条件は、例えば、次のような条件があげられる、低ストリンジェントな洗浄条件としては、例えば、４０℃で、２ｘ  ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ中で洗浄する。中ストリンジェントな条件としては、例えば、５５℃で、２ｘ  ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ中で洗浄する。高ストリンジェントな条件としては、例えば、５５℃の条件下で、０．１ｘ  ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ中で洗浄する。洗浄のストリンジェンシーの程度も、当業者であれば、例えば、温度、塩濃度、イオン強度、時間等の条件を適宜選択することで、設定可能である。
【００３２】
前記（ｅ）のポリヌクレオチドは、配列番号４のタンパク質をコードするポリヌクレオチドであり、例えば、配列番号４のアミノ酸配列に基づいて、対応するコドンに置き換えることで設計可能である。
【００３３】
前記（ｆ）において、「１もしくは数個」は、例えば、前記（ｆ）のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質が、前記活性を有する範囲であればよい。前記置換等のアミノ酸の数は、例えば、１〜２０個、好ましくは、１〜１０個、より好ましくは、１〜９個、さらに好ましくは、１〜５個、特に好ましくは、１〜３個、最も好ましくは、１または２個である。
【００３４】
前記（ｇ）において、「同一性」は、例えば、前記（ｇ）のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質が、前記活性を有する範囲であればよい。前記同一性は、好ましくは、９５％以上、より好ましくは、９６％以上、９７％以上、９８％以上、さらに好ましくは、９９％以上である。
【００３５】
前記ＱＮＳ１遺伝子は、これらの例示には限定されず、例えば、下記表１に示す種由来のＱＮＳ１遺伝子が同様に利用できる。
【００３６】
【表１】
2014060978.tif 000003
【００３７】
前記改変ＱＮＳ１遺伝子は、例えば、公知の遺伝子工学的手法または合成手法によって製造できる。
【００３８】
前記ＱＮＳ１遺伝子の発現ベクターは、例えば、親株酵母（宿主酵母）において、前記ＱＮＳ１遺伝子がコードするタンパク質を発現可能なように、機能的に前記遺伝子を含んでいればよく、その他の構成は何ら制限されない。前記親株酵母に対する前記発現ベクターの導入方法は、特に制限されず、後述する本発明のエタノール生成酵母の製造方法において説明する。
【００３９】
前記発現ベクターは、例えば、骨格となるベクター（以下、「基本ベクター」ともいう）に、前記ＱＮＳ１遺伝子を挿入することで作製できる。前記基本ベクターの種類は、特に制限されず、例えば、多コピー型（ＹＥｐ型）、単コピー型（ＹＣｐ型）、染色体組み込み型（ＹＩｐ型）等があげられる。前記ＹＥｐ型ベクターは、例えば、ＹＥｐ２４(J.  R.  Broach  et  al.,  Experimental  Manipulation  of  Gene  Expression,  Academic  Press,  New  York,  83,  1983)、前記ＹＣｐ型ベクターは、例えば、ＹＣｐ５０(M.  D.  Rose  et  al.,  Gene,  60,  237,  1987)、前記ＹＩｐ型ベクターは、例えば、ＹＩｐ５(K.  Struhl  et  al.,  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA,  76,  1035,  1979)、等が報告されている。この他にも、例えば、ｐＹＥ２２ｍ（Biosci.  Biotech.  Biochem.,  59,  1221-1228,  1995）、ＹＩｐ１(X70480）等があげられる。これらは、容易に入手可能である。中でも、前記基本ベクターは、過剰発現系ベクターが好ましい。
【００４０】
前記発現ベクターは、例えば、前記挿入した遺伝子の発現を調節する調節配列を有することが好ましい。前記調節配列は、親株酵母内で機能すればよく、例えば、プロモーター、ターミネーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル配列、複製起点配列（ｏｒｉ）等があげられる。前記調節配列は、例えば、前記基本ベクターが予め備える配列を利用してもよいし、前記基本ベクターに、さらに、前記調節配列を挿入してもよいし、前記基本ベクターが備える調節配列を、他の調節配列に置き換えてもよい。前記発現ベクターにおいて、前記調節配列の配置は、特に制限されず、前記遺伝子の発現を機能的に調節できるように配置されていればよく、公知の方法に基づいて行うことができる。前記遺伝子は、例えば、発現を促進できることから、前記プロモーターに対してセンス方向に導入することが好ましい。
【００４１】
前記発現ベクターの具体例としては、例えば、下記（ｉ）〜（iii）の構成要素を含む発現カセットを有する形態があげられる。（ｉ）親株酵母内で転写可能なプロモーター（ii）前記プロモーターに結合した目的遺伝子（iii）ＲＮＡ分子の転写終結およびポリアデニル化に関し、親株酵母内で機能するシグナル
【００４２】
前記プロモーターおよびターミネーターは、例えば、親株酵母内で機能すればよく、その組合せは特に制限されない。前記プロモーターは、例えば、ＴＤＨ３ｐ、ＰＹＫ１ｐ、ＰＧＫ１ｐ、ＴＰＩ１ｐ、ＧＡＬ１ｐ、ＧＡＬ１０ｐ、ＡＤＨ２ｐ、ＰＨＯ５ｐ、ＣＵＰ１ｐ、ＭＦα１ｐ等があげられる。また、高発現プロモーターは、ＴＤＨ３ｐ、ＴＰＩ１ｐ、ＰＧＫ１ｐ、ＰＧＩ１ｐ、ＰＹＫ１ｐ、ＡＤＨ１ｐ等があげられる。
【００４３】
前記発現ベクターは、例えば、さらに、選択マーカーのコード配列を有してもよい。前記選択マーカーは、例えば、栄養要求性マーカー、薬剤耐性等の耐性マーカー、蛍光タンパク質マーカー、酵素マーカー、細胞表面レセプターマーカー等があげられる。前記栄養要求性マーカーは、例えば、ＵＲＡ３遺伝子、ＬＥＵ２遺伝子等があげられる。前記薬剤耐性マーカーは、例えば、ハイグロマイシン耐性、ゼオシン耐性、ジェネティシン耐性等のマーカーがあげられる。この他にも、例えば、銅耐性遺伝子（ＣＵＰ１）（Marin  et  al.,  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA,  81,  337  1984）、セルレニン耐性遺伝子として、ｆａｓ２ｍ遺伝子（猪腰淳嗣ら,  生化学,  64,  660,  1992）、ＰＤＲ４遺伝子（Hussain  et  al.,  gene,  101,  149,  1991）等が利用可能である。
【００４４】
また、本発明のエタノール生成酵母は、例えば、前述のように、前記（Ｘ）の酵母形質転換体でもよいし、前記（Ｙ）の酵母形質転換体でもよいし、前記（Ｘ）の条件と前記（Ｙ）の両方の条件を満たす酵母形質転換体でもよい。中でも、エタノール生成能に優れることから、前記（Ｘ）および（Ｙ）の両方の条件を満たす酵母形質転換体が好ましい。
【００４５】
本発明のエタノール生成酵母において、前記キシロース代謝酵素遺伝子は、例えば、キシロース還元酵素遺伝子、キシリトール脱水素酵素遺伝子およびキシルロースリン酸化酵素遺伝子からなる群より選択される少なくとも1つである。
【００４６】
本発明のエタノール生成酵母は、例えば、キシロース還元酵素の触媒能を有し、さらに、キシリトール脱水素酵素およびキシルロースリン酸酵素の触媒能を有することが好ましい。本発明のエタノール生成酵母において、前記酵素の触媒能は、例えば、酵母が本来有する触媒能でもよいし、前記酵素のコード遺伝子を酵母に導入して、前記酵素を発現させることによって付与された触媒能でもよい。前記コード遺伝子の導入は、例えば、前記コード遺伝子を有する発現ベクターの導入により行うことができる。これらの３種類の遺伝子は、例えば、それぞれ別個の発現ベクターに挿入されてもよいし、そのうち２種類の遺伝子を１つの発現ベクターに挿入し、残り１種類の遺伝子を１つの発現ベクターに挿入してもよいし、３種類の前記遺伝子を１つの発現ベクターに挿入してもよい。中でも、キシロース還元酵素遺伝子、キシリトール脱水素酵素遺伝子およびキシルロースリン酸酵素遺伝子を、同じ発現ユニットで制御できることから、前記３種類の遺伝子を１つの発現ベクターに挿入して使用することが好ましい。なお、前記発現ベクターの構築等に関しては、例えば、前述した前記ＱＮＳ１遺伝子の発現ベクターの説明を援用できる。
【００４７】
前記キシロース還元酵素の触媒能は、キシロースを還元してキシリトールに変換する機能であり、例えば、前述のように、ＮＡＤＰＨを補酵素として、キシリトールを生成する。本発明のエタノール生成酵母において、前記キシロース還元酵素の触媒能は、例えば、酵母が本来有するキシロース還元酵素の還元能でもよいし、キシロース還元酵素のコード遺伝子（以下、キシロース還元酵素遺伝子）を導入し、キシロース還元酵素を発現することによって付与された還元能でもよい。
【００４８】
前者の場合、酵母は、例えば、ピキア  スティピティス（Pichia stipitis）、キャンディダ  マグノリアエ（Candida magnoliae）等があげられる。後者の場合、本発明のエタノール生成酵母は、例えば、キシロース還元酵素遺伝子が導入された酵母が好ましい。
【００４９】
前記キシリトール脱水素酵素の触媒能は、キシリトールを還元してキシルロースに変換する機能であり、例えば、前述のように、ＮＡＤを補酵素として、キシルロースを生成する。本発明のエタノール生成酵母において、前記キシリトール脱水素酵素の触媒能は、例えば、酵母が本来有するキシリトール脱水素酵素の還元能でもよいし、キシリトール脱水素酵素のコード遺伝子（以下、キシリトール脱水素酵素遺伝子）を導入し、キシリトール脱水素酵素を発現することによって付与された還元能でもよい。
【００５０】
前記キシルロースリン酸化酵素の触媒能は、キシルロースをリン酸化する機能であり、キシルロース５−リン酸（Ｘ５Ｐ）を生成する。本発明のエタノール生成酵母において、前記キシルロースリン酸化酵素の触媒能は、例えば、酵母が本来有するキシルロースリン酸化酵素のリン酸化能でもよいし、キシルロースリン酸化酵素のコード遺伝子（以下、キシルロースリン酸化酵素遺伝子）を導入し、キシルロースリン酸化酵素を発現することによって付与されたリン酸化能でもよい。
【００５１】
本発明のエタノール生成酵母は、例えば、前記キシロース還元酵素遺伝子、前記キシリトール脱水素酵素遺伝子および前記キシルロースリン酸酵素遺伝子が導入された酵母形質転換体が好ましい。このような形質転換体は、例えば、キシロースを単独の炭素源とする培地を使用する場合も、キシロースを炭素源として効果的にエネルギーを確保できる。他方、これら３種類の遺伝子のうち、キシロース還元酵素遺伝子のみを導入した酵母の場合、例えば、炭素源として、キシロースの他に、炭素源としてグルコース等を含有する培地を使用することが好ましい。
【００５２】
前記キシロース還元酵素遺伝子および前記キシロース還元酵素の由来は、特に制限されない。前記キシロース還元酵素遺伝子および前記キシロース還元酵素は、例えば、サッカロミセス属、ピキア属、シゾサッカロミセス属、アスペルギルス属等の酵母由来、ラクトバチルス属由来等があげられる。以下の表に、具体例として、前記キシロース還元酵素遺伝子の由来、遺伝子名およびデータベースの登録番号を示す。なお、これらは例示であって、本発明を制限するものではない。
【００５３】
【表２】
2014060978.tif 000004
【００５４】
前記キシリトール脱水素酵素遺伝子および前記キシリトール脱水素酵素の由来は、特に制限されない。前記キシリトール脱水素酵素遺伝子および前記キシリトール脱水素酵素は、例えば、サッカロミセス属、アスペルギルス属、スタフィロコッカス属、ピキア属等の酵母由来等があげられる。以下の表に、具体例として、前記キシリトール脱水素酵素遺伝子の由来、遺伝子名およびデータベースの登録番号を示す。なお、これらは例示であって、本発明を制限するものではない。
【００５５】
【表３】
2014060978.tif 000005
【００５６】
前記キシルロースリン酸化酵素遺伝子および前記キシルロースリン酸化酵素の由来は、特に制限されない。前記キシルロースリン酸化酵素遺伝子および前記キシルロースリン酸化酵素は、例えば、サッカロミセス属、スタフィロコッカス属、ピキア属等の酵母由来、エッセリシア属由来等があげられる。以下の表に、具体例として、前記キシルロースリン酸化酵素遺伝子の由来、遺伝子名およびデータベースの登録番号を示す。なお、これらは例示であって、本発明を制限するものではない。
【００５７】
【表４】
2014060978.tif 000006
【００５８】
前記キシロース還元酵素遺伝子が導入された酵母は、例えば、下記表に示す酵母株等が使用できる。
【００５９】
【表５】
2014060978.tif 000007
【００６０】
本発明のエタノール生成酵母において、前記親株酵母と、ＱＮＳ１遺伝子、キシロース還元酵素遺伝子、キシリトール脱水素酵素遺伝子およびキシルロースリン酸酵素遺伝子の由来は、それぞれ、特に制限されず、例えば、前述した親株酵母および各遺伝子の由来を、適宜組合せてもよい。具体例としては、前記親株酵母がサッカロミセス  セレビシエであり、これに対して、ＱＮＳ１遺伝子がサッカロミセス  セレビシエ由来であることが好ましく、さらに、ピキア  スティピティス由来キシロース還元酵素遺伝子、ピキア  スティピティス由来キシリトール脱水素酵素遺伝子および／またはサッカロミセス  セレビシエ由来キシルロースリン酸酵素遺伝子の組合せが例示できる。
【００６１】
（エタノール生成酵母の製造方法）
つぎに、本発明のエタノール生成酵母の製造方法について説明する。なお、以下の方法は、例示であって、本発明は、これらの方法に制限されない。
【００６２】
本発明において、前記（Ｘ）のＨｓｔ１タンパク質が不活性化された酵母形質転換体は、例えば、前述のように、親株酵母に対する、前記ＨＳＴ１遺伝子の破壊、前記ＨＳＴ１遺伝子の発現阻害等を行うことで製造できる。前記ＨＳＴ１遺伝子の破壊は、例えば、前記親株酵母に対して、リコンビナーゼを使用した相同組換えにより行うことができ、市販のキット等が使用できる。また、前記ＨＳＴ１遺伝子の発現阻害は、例えば、前述のように、親株酵母に対して、ｓｉＲＮＡ等の核酸分子を導入することにより行うことができる。
【００６３】
本発明において、前記（Ｙ）のＱＮＳ１遺伝子の発現ベクターが導入された酵母形質転換体は、例えば、前述のように、親株酵母に対して、前述のＱＮＳ１遺伝子の発現ベクターを導入することにより製造できる。
【００６４】
本発明において、前記（Ｘ）と（Ｙ）の両方の条件を満たす酵母形質転換体は、例えば、前述のように、親株酵母に対して、前記ＨＳＴ１遺伝子の破壊等と、前記ＱＮＳ１遺伝子の発現ベクターの導入とを行うことで製造できる。前記ＨＳＴ１遺伝子の破壊等と前記発現ベクターの導入とは、例えば、いずれが先でもよく、前記ＨＳＴ１遺伝子の破壊等を行った後に、前記発現ベクターを導入してもよいし、前記発現ベクターを導入した後に、前記ＨＳＴ１遺伝子の破壊等を行ってもよい。
【００６５】
前記親株酵母に前記発現ベクターを導入する形質転換方法は、特に制限されず、公知の方法が利用できる。前記方法は、例えば、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法（Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA,  75  p1929（1978））、酢酸リチウム法（J.  Bacteriology,  153,  p163（1983））等があげられ、この他にも、例えば、“Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA,  75  p1929  （1978）”、“Methods  in  yeast  genetics,  2000  Edition:  A  Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Course  Manual”等に記載の方法が採用できる。
【００６６】
その他、一般的なクローニング技術に関しては、例えば、“Sambrook  ＆  Russell,  Molecular  Cloning:  A  Laboratory  Manual  Vol.  3,  Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press  2001”、“Methods  in  Yeast  Genetics、A  laboratory  manual  （Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press、Cold  Spring  Harbor,  NY）”等を参照できる。
【００６７】
前記発現ベクターが前記親株酵母に導入されたか否かする方法は、特に制限されず、公知の方法が利用できる。例えば、前記発現ベクターが有する前記各選択マーカーを利用して確認できる。あるいは、ＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法等によって行うことができる。例えば、形質転換された前記親株酵母からＤＮＡを調製し、ＤＮＡ特異的プライマーを設計してＰＣＲを行う。その後は、増幅産物についてアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動またはキャピラリー電気泳動等を行い、臭化エチジウム、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ液等によって染色し、そして増幅産物を１本のバンドとして検出することによって、形質転換されたことを確認できる。また、予め蛍光色素等によって標識したプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅産物を検出できる。さらに、マイクロプレート等の固相に増幅産物を結合させ、蛍光または酵素反応等によって増幅産物を確認する方法も利用できる。これらの方法を使用して、前記発現ベクターが導入された前記親株酵母を、本発明における前記（Ｙ）の酵母形質転換体として選択できる。
【００６８】
前記親株酵母は、特に制限されず、例えば、前述のような各種酵母が使用できる。また、前記親株酵母は、例えば、キシロース還元能を有する酵母、キシロース還元能を有さない酵母のいずれであってもよい。後者の場合は、前述のように、例えば、前記親株酵母に、前記キシロース還元酵素遺伝子を導入すればよい。
【００６９】
（エタノールの製造方法）
つぎに、本発明のエタノールの製造方法は、前述のように、前記本発明のエタノール生成酵母を用いてエタノール発酵を行う発酵工程を含むことを特徴とする。本発明は、前記本発明のエタノール生成酵母を使用することが特徴であって、その他の工程および条件は、特に制限されない。本発明のエタノールの製造方法は、例えば、さらに、前記本発明のエタノール生成酵母を培養する培養工程を有してもよく、前記培養工程により培養菌体を取得した後、前記発酵工程を行ってもよい。
【００７０】
前記培養工程および前記発酵工程において、前記培地の種類は、特に制限されず、例えば、酵母の培養に使用できる公知の培地があげられ、前記培地にキシロースを含有させることが好ましい。前記培地は、例えば、ＹＰＤ培地（イーストエキストラクト、ポリペプトン、グルコース）、ＳＤ培地（Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ  ｗ／ｏ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ６．７ｇ／ｌ、グルコース２０ｇ／ｌ）等があげられる。前記培養工程に使用する場合、前記培地において、キシロースは、例えば、含まれても、含まれなくてもよい。前記発酵工程に使用する場合、前記培地のキシロースの含有量は、特に制限されず、例えば、１０〜１００ｇ／Ｌ、好ましくは２０〜８０ｇ／Ｌであり、より好ましくは５０〜８０ｇ／Ｌである。具体例として、例えば、前記ＹＰＤ培地にキシロースが含まれていてもよいし、キシロースのみが炭素源であるＹＰＸ培地（イーストエキストラクト、ポリペプトン、キシロース）等でもよい。
【００７１】
前記培地へのキシロースの添加は、例えば、単品のキシロースの添加でもよいし、キシロース含有原料の添加でもよい。前記原料は、キシロースを含んでいればよく、特に制限されず、例えば、キシロースを含む生物由来の原料、すなわち、キシロース含有バイオマスが好ましい。前記バイオマスは、日本国農林水産省が発行した「バイオマス・ニッポン総合戦略」において、「再生可能な、生物由来の有機性資源で化石資源を除いたもの」と定義されている。この定義から、「キシロース含有バイオマス」は、例えば、「再生可能な、生物由来の有機性資源で化石資源を除いたものであって、キシロースを含むもの」と定義できる。前記キシロース含有バイオマスは、特に制限されず、例えば、サトウキビ、トウモロコシ、テンサイ、ジャガイモ、サツマイモ、麦、モロコシ（こうりゃん）、ソルガム等の否可食部、廃木材、パルプ廃液、バガス、もみ殻、コーンコブ、稲ワラ、スイッチグラス、エリアンサス、ネピアグラス等があげられる。
【００７２】
前記培養工程における培養条件は、特に制限されず、酵母培養時の公知の条件が採用できる。培養温度は、例えば、２８〜３５℃であり、好ましくは、３０〜３２℃である。培養時間は、特に制限されず、例えば、１〜９６時間であり、好ましくは、１〜４８時間である。酵母の培養は、例えば、好気条件下が好ましく、例えば、振とう培養が好ましい。また、前記発酵工程における発酵条件についても、特に制限されず、例えば、酵母によるアルコール発酵時の公知の条件が採用できる。発酵温度は、例えば、２８〜３５℃であり、好ましくは、３０〜３２℃である。発酵時間は、特に制限されず、例えば、１〜９６時間であり、好ましくは、１〜４８時間である。また、前記発酵条件は、例えば、嫌気条件から微好気条件下であり、好ましくは、通気なしで、６０ｒｐｍでゆっくり攪拌する等である。
【００７３】
本発明のエタノール生成酵母は、生成したエタノールを細胞外に放出するため、本発明の製造方法は、さらに、前記発酵工程により得られた培養物から、菌体を含む固体画分と液体画分とを分離する工程を含んでもよい。前記分離は、例えば、遠心分離、ろ過等により行える。
【００７４】
また、本発明の製造方法は、さらに、前記固体画分または前記液体画分から、エタノールを精製する精製工程を含んでもよい。前記固体画分は、酵母を含むため、例えば、酵母を破壊して、細胞内からエタノールを放出させ、エタノールを精製できる。前記液体画分は、細胞内から放出されたエタノールを含むため、前記液体画分から直接エタノールを精製できる。前記精製方法は、特に制限されず、例えば、各種クロマトグラフィーが使用できる。
【実施例】
【００７５】
以下、実施例を用いて本発明を詳細に説明するが、本発明は実施例に記載された態様に限定されるものではない。
【００７６】
以下に、実施例で使用した材料および方法を示す。なお、特に示さない限り、使用した試薬等のマニュアルに準じて処理を行った。
【００７７】
１．酵母株
実施例において、以下に示す酵母株を使用した。株名とあわせて、分譲の登録番号および遺伝子型を示す。
【００７８】
【表６】
2014060978.tif 000008
【００７９】
実施例において、ＨＳＴ１遺伝子とＱＮＳ１遺伝子の取得には、S.cerevisiae  Ｘ２１８０−１Ａ株を、ＨＳＴ１遺伝子破壊株とＱＮＳ１遺伝子高発現株の育種には、ＨＨ４７２株およびＨＨ５９４株を用いた。ＨＨ４７２株およびＨＨ５９４株は、Ｘ２１８０−１Ａ株に、P.stipitisのキシロース還元酵素遺伝子（ＸＹＬ１）とキシリトール脱水素酵素遺伝子（ＸＹＬ２）とS.cerevisiaeのキシルロースリン酸化酵素遺伝子（ＸＫＳ１）の発現ユニットが、遺伝子型に示したようなプロモーター制御下で、ＶＩ染色体のＧＡＴ１とＰＡＵ５との間のノンコーディング領域に組み込まれている。なお、本発明は、これらの株に限定されない。
【００８０】
２．培地
培地は、後述する目的に応じて、以下の培地を使用した。下記培地において、「＊」は、個別にろ過滅菌した後に、培地に添加したことを示す。
（１）ＹＰＤ培地
イーストエキストラクト  １０ｇ／Ｌ、ポリペプトン  ２０ｇ／Ｌ、グルコース＊  ２０ｇ／Ｌ
（２）ＹＰＧｌｙ培地
イーストエキストラクト  １０ｇ／Ｌ、ポリペプトン  ２０ｇ／Ｌ、グリセロール  ２０ｇ／Ｌ
（３）ＹＰＸ培地
イーストエキストラクト  １０ｇ／Ｌ、ポリペプトン  ２０ｇ／Ｌ、キシロース＊  ５０〜６０ｇ／Ｌ
【００８１】
３．ＰＣＲ用の鋳型ＤＮＡの調製
酵母細胞を、５０μｌのＬｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒに懸濁した。前記ｂｕｆｆｅｒの組成は、０．１２５ｍｇ／ｍｌ  ザイモリアーゼ１００Ｔ、１ｍｏｌ／Ｌ  ソルビトール、４０ｍｍｏｌ／Ｌ  リン酸カリウムバッファー  ｐＨ６．８、１ｍｍｏｌ／Ｌ  ジチオスレイトールとした。前記懸濁液を、３０℃で１時間インキュベートした後、プロテアーゼＥ  １ｍｇ／ｍｌを５μｌ加え、さらに、５５℃で２０分、９９℃で１０分インキュベートした。インキュベート後の懸濁液を１５，０００ｒｐｍで１０分遠心し、染色体ＤＮＡを含む上清を回収した。これを鋳型ＤＮＡとした。
【００８２】
４．ＨＳＴ１遺伝子破壊のためのユニットの作製
サッカロミセス  セレビシエのＨＳＴ１遺伝子は、Saccharomyces  Genome  Databaseにおいて登録されており、登録番号は、ＹＯＬ０６８Ｃである。この塩基配列情報に基づいて、サッカロミセス  セレビシエの染色体ＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲによって、ＨＳＴ１遺伝子の部分配列の増幅産物を得た。具体的には、以下の通りに行った。
【００８３】
サッカロミセス  セレビシエは、サッカロミセス  セレビシエＸ２１８０−１Ａ株を使用した。この酵母株の染色体ＤＮＡを鋳型として、下記プライマーｐｄＨＳＴ１＿Ｆ１およびｐｄＨＳＴ１＿Ｒ１を用いて、ＨＳＴ１遺伝子のＮ末端側をコードする部分配列を、ＰＣＲによって増幅した。また、下記プライマーｐｄＨＳＴ１＿Ｆ２およびｐｄＨＳＴ１＿Ｒ２を用いて、ＨＳＴ１遺伝子のＣ末端側をコードする部分配列を、ＰＣＲによって増幅した。
ｐｄＨＳＴ１＿Ｆ１（配列番号５）
5’-TACCCGTTTAAACGCGGGCGATACTTTCATGTTGG-3’
ｐｄＨＳＴ１＿Ｒ１（配列番号６）
5’-CCCGGCGCGCCGATATCGAATCCCAGCAATTTTATCA-3’
ｐｄＨＳＴ１＿Ｆ２（配列番号７）
5’-CCCGGCGCGCCGATATCAAGTTTGAAAGTGGCTCCTG-3’
ｐｄＨＳＴ１＿Ｒ２（配列番号８）
5’-TCCCCGTTTAAACGCTTGTTTCTTTCGTGGCTGTTT-3’
【００８４】
取得した各ＤＮＡ断片を、クローニングキット（Invitrogen社、商品名GENEART（登録商標）Seamless  Cloning  and  Assembly  Kit）を用いて、ベクターｐＵＣ１９ＰＮのＮｏｔＩサイトに挿入し、プラスミドｐＵＣｐＨＳＴ１（図１）を得た。この際、ＨＳＴ１遺伝子のＮ末端側をコードする部分配列とＨＳＴ１遺伝子のＣ末端側をコードする部分配列とが並ぶように挿入した。これらの部分配列の間には、ＥｃｏＲＶサイトがある。なお、ｐＵＣ１９ＰＮは、市販のベクターｐＵＣ１９のＳｍａＩサイトに、ＰｍｅＩ−ＮｏｔＩ−ＰｍｅＩリンカーを挿入したベクターである。そして、挿入したこれらの部分配列は、ＤＮＡシークエンスにより確認した。これらの部分配列を取得するために用いる染色体ＤＮＡは、前述の株に限定するものではなく、サッカロミセス  セレビシエに属する酵母であれば、何れの酵母から調製されたものであってもよい。染色体ＤＮＡを用いたＰＣＲによる目的遺伝子の増幅およびその後の単離は、ＰＣＲプライマーの調製を含め、当業者に周知な方法で行うことができる。
【００８５】
つぎに、プラスミドｐＵＧＲＦＲＴ（図２）をＥｃｏＲＶで切断し、両端にＦＲＴ配列を持つジェネティシン耐性遺伝子（ＦＲＴ−ＰＧＫ１ｐ：：ＫａｎＭＸ−ＦＲＴ）を切り出した。このジェネティシン耐性遺伝子をｐＵＣｐＨＳＴ１のＥｃｏＲＶサイトに挿入し、プラスミドｐＵＣｐＨＳＴ１Ｇ（図３）を得た。このｐＵＣｐＨＳＴ１ＧをＰｍｅＩで切断し、アガロースゲル電気泳動を行った。そして、約２．０ｋｂｐのＤＮＡ断片を、アガロースゲルから切り出した。前記断片は、ＨＳＴ１遺伝子のＮ末端側をコードする部分配列およびＣ末端側をコードする部分配列を持ち、これらの部分配列の間に、Ｇ４１８耐性マーカー遺伝子（ＰＧＫ１ｐ：：ＫａｎＭＸ）を含む。このＤＮＡ断片を前記ゲルから精製および抽出した。精製および抽出は、illustraTM  GFXTM  PCR  DNA  and  Gel  Band  Purification  kitを用いて、マニュアルに従って行った。ＦＲＴは、酵母２μプラスミド上に存在し、リコンビナーゼによって組換えが起こる、組換え部位である。ＦＲＴ配列はGAAGTTCCTATTCTCTAGAAAGTATAGGAACTTC（配列番号９）である。
【００８６】
５．ＱＮＳ１遺伝子の取得
サッカロミセス  セレビシエのＱＮＳ１遺伝子は、Saccharomyces  Genome  Databaseにおいて登録されており、登録番号は、ＹＨＲ０７４Ｗである。この塩基配列情報に基づいて、サッカロミセス  セレビシエの染色体ＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲによって、ＱＮＳ１遺伝子の部分配列の増幅産物を得た。具体的には、以下の通りに行った。
【００８７】
サッカロミセス  セレビシエは、サッカロミセス  セレビシエＸ２１８０−１Ａ株を使用した。この酵母株の染色体ＤＮＡを鋳型として、下記プライマーｐｅｎｔｒＳｔｕＱＮＳ１＿ＦおよびｐｅｎｔｒＳｔｕＱＮＳ１＿Ｒを用いて、ＱＮＳ１遺伝子のＯＲＦ配列を、ＰＣＲによって増幅した。
ｐｅｎｔｒＳｔｕＱＮＳ１＿Ｆ（配列番号１０）
5’-AAAAGCAGGCTCCGCAGGCCTATGTCACATCTTATCACTTTAGC-3’
ｐｅｎｔｒＳｔｕＱＮＳ１＿Ｒ（配列番号１１）
5’-AGAAAGCTGGGTCGGAGGCCTAATCAATAGACATAATGTC-3’
【００８８】
取得したＤＮＡ断片を、クローニングキット（Invitrogen社、商品名GENEART（登録商標）Seamless  Cloning  and  Assembly  Kit）を用いて、ＮｏｔＩ−ＡｓｃＩで切断したベクターｐＥＮＴＲ−Ｄ−ＴＯＰＯに挿入し、ｐＥＮＴＲ−Ｄ−ＱＮＳ１（図４）を得た。挿入したＱＮＳ１遺伝子のＯＲＦの塩基配列は、シークエンスによって確認した。
【００８９】
６．ＱＮＳ１遺伝子高発現ベクターの構築
Ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒとして、ｐＹＣＨＴＰＩ−ＲｆＡプラスミド（図５）を使用した。そして、Invitrogen社のマニュアルに従って、前記ｐＥＮＴＲ−Ｄ−ＱＮＳ１と前記プラスミドｐＹＣＨＴＰＩ−ＲｆＡとのＬＲ反応を行った。これにより、プラスミドｐＹＣＨ＿ＲｆＡのＲｆＡ配列とｐＥＮＴＲ−Ｄ−ＱＮＳ１のＱＮＳ１遺伝子を交換し、ＱＮＳ１遺伝子高発現ベクターであるｐＹＣＨＱＮＳ１（図６）を作製した。ｐＹＣＨＱＮＳ１において、ＱＮＳ１遺伝子は、ＴＰＩ１プロモーターにより制御される。
【００９０】
７．ＨＳＴ１遺伝子破壊株の取得
前記「４．」において、ｐＵＣｐＨＳＴ１ＧからＰｍｅＩで切り出した約２．０ｋｂｐの精製ＤＮＡ断片、すなわち、ＨＳＴ１遺伝子のＮ末端側をコードする部分配列およびＣ末端側をコードする部分配列を持ち、これらの部分配列の間にＧ４１８耐性マーカー遺伝子（ＰＧＫ１ｐ：：ＫａｎＭＸ）を含む断片を用いて、ＨＨ４７２株を形質転換した。得られた形質転換体を、ジェネティシン３００μｇ／ｍｌを含むＹＰＤ培地に塗布した。生育した株において、ＦＲＴ−ＰＧＫ１ｐ：：ＫａｎＭＸ−ＦＲＴ断片が、ＨＳＴ１遺伝子のＯＲＦと置き換わったことを確認するために、数個のコロニーからゲノミックＤＮＡを調製した。これを鋳型として、下記プライマーＨＳＴ１Ｕ＿Ｆ（ＲＴＧ１Ｃ＿Ｆ）およびｐＰＧＫ６５７−ｒ１、または、下記プライマーＨＳＴ１Ｄ＿Ｒ（ＮＵＦ２Ｃ＿Ｆ）およびＧ４１８＿Ｆ１のプライマーを用いて、ＰＣＲを行った。ＨＳＴ１Ｕ＿Ｆ（ＲＴＧ１Ｃ＿Ｆ）は、ＨＳＴ１遺伝子のＯＲＦの５’上流の配列であり、ＨＳＴ１Ｄ＿Ｒ（ＮＵＦ２Ｃ＿Ｆ）は、Ｇ４１８耐性遺伝子の配列である。
ＨＳＴ１Ｕ＿Ｆ（ＲＴＧ１Ｃ＿Ｆ）（配列番号１２）
5’-AAGCAGACAGGCACCATTG-3’
ｐＰＧＫ６５７−ｒ１（配列番号１３）
5’-GCAATCAATAGGAAGACAGG-3’
ＨＳＴ１Ｄ＿Ｒ（ＮＵＦ２Ｃ＿Ｆ）（配列番号１４）
5’-CGGACATTTTCATTCAAGAGG-3’
Ｇ４１８＿Ｆ１（配列番号１５）
5’-TGGTTGTAACACTGGCAGAG-3’
【００９１】
プラスミドｐＹＲＮＦＬＰ（図３）を用いて、ＰＣＲで適切な長さのＤＮＡが増幅された株をさらに形質転換した。得られた形質転換体を、Ｎｏｕｒｓｅｏｔｈｒｉｃｉｎ  ｄｉｈｙｄｒｏｇｅｎ  ｓｕｌｆａｔｅ  ５０μｇ／ｍｌを含むＹＰＤ培地に塗布した。ｐＹＲＮＦＬＰプラスミドは、酵母２μプラスミド上にあるリコンビナーゼを、ＴＤＨ３ｐ制御下で発現する、ＹＲｐタイプのプラスミドである。リコンビナーゼを発現すると、ＦＲＴ配列間で組換えが生じるため、ＰＧＫ１ｐ：：ＫａｎＭＸは、ゲノムからループアウトされる。ＰＧＫ１ｐ：：ＫａｎＭＸがループアウトしたことは、前記プライマーＨＳＴ１Ｕ＿Ｆ（ＲＴＧ１Ｃ＿Ｆ）およびＨＳＴ１Ｄ＿Ｒ（ＮＵＦ２Ｃ＿Ｆ）を用いてＰＣＲを行うこと、および、前記形質転換体のＧ４１８耐性がなくなることにより確認した。前記形質転換体は、Ｈｓｔ１タンパク質のアミノ酸配列（配列番号２）において、１１６〜４１３番目が欠失している。さらに、前記形質転換体は、前記ＹＰＧｌｙ培地で生育を確認し、呼吸欠損株ではないことを確認した。また、ＹＲｐタイプのプラスミドは、安定性が悪く、選択圧をかけない状態では、細胞からすぐに脱落する。このため、Ｎｏｕｒｓｅｏｔｈｒｉｃｉｎ  ｄｉｈｙｄｒｏｇｅｎ  ｓｕｌｆａｔｅを含まない培地で生育させることにより、プラスミドｐＹＲＮＦＬＰを脱落させることができる。従って、本方法によりＨＳＴ１遺伝子を破壊した株は、薬剤耐性を持たないため、同じ方法で、複数の遺伝子をさらに破壊できる。
【００９２】
８．ＱＮＳ１遺伝子高発現株の取得
前記「６．」で得たプラスミドｐＹＣＨＱＮＳ１を用いて、ＨＨ４７２株を形質転換し、ハイグロマイシン耐性株を取得することにより、ＱＮＳ１遺伝子高発現株を得た。形質転換体は、前記ＹＰＧｌｙ培地で生育を確認し、呼吸欠損株ではないことを確認した。
【００９３】
９．ＨＳＴ１遺伝子破壊／ＱＮＳ１遺伝子高発現株の取得
ＨＳＴ１遺伝子を破壊したＨＨ４７２株を使用した以外は、前記「８．」と同様にして、プラスミドｐＹＣＨＱＮＳ１を用いて形質転換を行い、ＨＳＴ１遺伝子が破壊され、且つ、ＱＮＳ１遺伝子を高発現するＨＳＴ１遺伝子破壊／ＱＮＳ１遺伝子高発現株を得た。
【００９４】
１０．キシロース発酵試験（スモールスケール）
まず、前記ＹＰＤ培地１０ｍｌに、一白金耳の酵母を植菌し、３０℃のインキュベーターで、２０時間、振とう培養した。得られた培養液から酵母を集菌し、新たなＹＰＤ培地２０ｍｌに懸濁し、３０℃で３時間、振とう培養した。培養後、酵母を集菌し、発酵試験用培地である前記ＹＰＸ培地で２回洗浄した後、新たなＹＰＸ培地２ｍｌに、ＯＤ６００が２０または２５となるように植菌し、その懸濁液を、容量３ｍｌのマイクロチューブに入れて蓋をし、３０℃でインキュベートした。そして、この培養液から、所定時間後にサンプリングして、遠心、ろ過後、回収した上清について、高速液体クロマトグラフィーによって成分の分析を行った。
【００９５】
１１．キシロース発酵試験（ラージケール）
容量１００ｍｌのメディウム瓶を用いて、発酵試験を行った。前記メディウム瓶の蓋から内部に、内径シリコンチューブを通した。前記メディウム瓶の内部において、前記チューブの一方の先端は、前記内部の培地に接触しない長さに調節した。前記メディウム瓶の外部において、前記チューブの他方の先端には、逆止弁を取り付け、前記瓶内の内圧が高くなった場合は、前記弁を通じて、前記瓶の内部から外部に気体が抜けて、前記内圧が外圧と同じになるようにした。
【００９６】
まず、前記ＹＰＤ培地１０ｍｌに、一白金耳の酵母を植菌し、３０℃のインキュベーターで、２０時間振とう培養した。得られた培養液全量を、容量３００ｍｌの三角フラスコ中の前記ＹＰＤ培地１００ｍｌに植菌し、３０℃のインキュベーターで、２０時間振とう培養した。培養後、遠心により酵母全量を回収し、再び、容量５００ｍｌの三角フラスコ中の前記ＹＰＤ培地２００ｍｌに懸濁し、３０℃で６時間振とう培養した。培養後、酵母を集菌し、発酵試験用培地である前記ＹＰＸ培地で２回洗浄した後、前記メディウム瓶中の新たなＹＰＸ培地４５ｍｌに、ＯＤ６００が２０になるように植菌した。前記メディウム瓶は、内部における前記ＹＰＸ培地が入っている量の深さまで、水浴につけ、３０℃に温度を保ち、滅菌したスターラーバーを入れて、６０ｒｐｍの速度で攪拌しながら培養した。そして、この培養液から、所定時間後に、１ｍｌサンプリングして、遠心、ろ過後、回収した上清について、高速液体クロマトグラフィーによって成分の分析を行った。
【００９７】
１２．エタノール、キシロースの測定
前記上清サンプルについて、高速液体クロマトグラフィーにより、各成分の定量を行った。前記上清サンプルにおける各成分の濃度は、既知濃度の純品サンプルのピーク面積から算出した。
（１）分離カラムおよび条件
カラム：Ｓｈｏｄｅｘ  ＳＵＧＡＲ  ＳＨ−Ｇ（６．０×５０ｍｍ）＋ＳＨ１０１１（８．０×３００ｍｍ）
溶離液：５ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｈ２ＳＯ４
流速：０．６ｍｌ／ｍｉｎ
カラムオーブン：６０℃
検出器：ダイオードアレイ検出器（ＤＡＤ）２８０ｎｍ（フルフラール類）
示差屈折率検出器（ＲＩ）（他の糖類）
（２）装置構成
ＨＰＬＣ本体：日立Ｌ−２０００シリーズ
ポンプ：Ｌ−２１３０
オートサンプラ：Ｌ−２２００
ＤＡＤ検出器：Ｌ−２４５０
ＲＩ検出器：Ｌ−２４９０
カラムオーブン：島津  ＣＴＯ−１０Ａ
【００９８】
［実施例１］
ＨＳＴ１遺伝子破壊株について、エタノール生成を確認した。
【００９９】
親株として、ＨＨ４７２株とＨＨ５９４株を使用し、前記「８．ＨＳＴ１遺伝子破壊株の取得」に従って、ＨＳＴ１遺伝子破壊株を育種した。そして、親株（ｎ＝３）と、ＨＳＴ１遺伝子破壊株（ｎ＝８）について、前記「１０．キシロース発酵試験（スモールスケール）」に従って、発酵試験を行い、高速液体クロマトグラフィーにてエタノールとキシロースを定量した。この際、前記「１０．」における条件を、ＯＤ６００＝２０とし、前記所定時間を４８時間とした。
【０１００】
これらの結果を、図７および図８に示す。図７および図８は、消費したキシロースの濃度、生成したエタノールの濃度を示すグラフであり、図７が、親株ＨＨ４７２とＨＳＴ１遺伝子破壊株ＨＨ４７２Δｈｓｔ１の結果であり、図８が、親株ＨＨ５９４とＨＳＴ１遺伝子破壊株ＨＨ５９４Δｈｓｔ１の結果である。図７および図８において、白いバーが、消費したキシロース濃度（ΔＸＹＬ，ｇ／Ｌ）、黒いバーが、生成したエタノール濃度（ＥｔＯＨ，ｇ／Ｌ）、白い菱形が、エタノール収率（ＥＹ，％）を示す。そして、エタノール収率は、「キシロース資化量×０．５１」で表わされる量のエタノールが生成した場合を、収率１００％として計算した。その結果、ＨＳＴ１遺伝子破壊株は、ＨＨ４７２株とＨＨ５９４株のどちらを親株にした場合でも、前記親株よりもキシロースからのエタノール収率が増加した。具体的に、ＨＨ４７２株の場合、エタノールの収率は、親株が５２．４％であるのに対し、ＨＳＴ１遺伝子破壊株は、５９．２％であった。ＨＨ５９４株の場合は、エタノールの収率は、親株が７３．８％であるのに対し、ＨＳＴ１遺伝子破壊株は、７７．４％であった。キシロース資化量は、親株およびＨＳＴ１遺伝子破壊株の間でほとんど同じであった。
【０１０１】
［実施例２］
ＨＳＴ１遺伝子破壊株、ＱＮＳ１遺伝子高発現株およびＨＳＴ１遺伝子破壊／ＱＮＳ１遺伝子高発現株について、エタノール生成を確認した。
【０１０２】
ＨＨ４７２株とＨＨ５９４株を親株として、前記「７．」、「８．」および「９．」に従って、ＨＳＴ１遺伝子破壊株、ＱＮＳ１遺伝子高発現株、ＨＳＴ１遺伝子破壊／ＱＮＳ１遺伝子高発現株を育種した。そして、それぞれ、一株について、前記「１１．キシロース発酵試験（ラージスケール）」に従って、発酵試験を行い、高速液体クロマトグラフィーにてエタノール、キシロースを定量した。この際、前記「１１．」における条件をＯＤ６００＝２０とし、前記所定時間を、０．５、２、８、２４、４８時間とした。
【０１０３】
これらの結果を、図９および図１０に示す。図９および図１０は、消費したキシロースの濃度、生成したエタノールの濃度を示すグラフであり、図９が、親株ＨＨ４７２、ＨＳＴ１遺伝子破壊株ＨＨ４７２Δｈｓｔ１およびＱＮＳ１遺伝子高発現株ＨＨ４７２ＱＮＳ１の結果であり、図１０が、親株ＨＨ５９４、ＨＳＴ１遺伝子破壊株ＨＨ５９４Δｈｓｔ１およびＨＳＴ１遺伝子破壊／ＱＮＳ１遺伝子高発現株ＨＨ５９４Δｈｓｔ１＋ＱＮＳ１の結果である。図９と図１０の左図は、消費したキシロース濃度（ΔＸＹＬ，ｇ／Ｌ）を示し、図９と図１０の右図は、生成したエタノール濃度（ＥｔＯＨ，ｇ／Ｌ）を示す。そして、エタノール収率は、「キシロース資化量×０．５１」で表わされる量のエタノールが生成した場合を、収率１００％として計算した。
【０１０４】
図９に示すように、ＨＨ４７２株を親株とした場合、ＨＳＴ１遺伝子破壊株およびＱＮＳ１遺伝子高発現株は、親株よりもエタノールの生成量が増加した。具体的に、エタノールの収率は、親株が５１．５％であるのに対し、ＨＳＴ１遺伝子破壊株およびＱＮＳ１遺伝子高発現株は、それぞれ６０．５％および６１．５％であった。
【０１０５】
また、図１０に示すように、ＨＨ５９４株を親株とした場合、ＨＳＴ１遺伝子破壊株およびＨＳＴ１遺伝子破壊／ＱＮＳ１遺伝子高発現株は、親株よりもエタノールの生成量が増加した。特に、ＨＳＴ１遺伝子破壊／ＱＮＳ１遺伝子高発現株は、ＨＳＴ１遺伝子を破壊し、且つ、ＱＮＳ１遺伝子を高発現させることによって、ＨＳＴ１遺伝子破壊株よりも、さらにエタノール生成量が増加した。具体的に、エタノールの収率は、親株が６１．４％であるのに対し、前記ＨＳＴ１遺伝子破壊株および前記ＨＳＴ１遺伝子破壊／ＱＮＳ１遺伝子高発現株は、それぞれ７１．８％および７９．３％であった。なお、キシロース資化速度は、親株、ＨＳＴ１遺伝子破壊株、ＱＮＳ１遺伝子高発現株およびＨＳＴ１遺伝子破壊／ＱＮＳ１遺伝子高発現株の間で同じであった。
【０１０６】
このように、酵母のＨＳＴ１遺伝子の破壊、酵母におけるＱＮＳ１遺伝子の高発現、または、酵母のＨＳＴ１遺伝子の破壊および酵母におけるＱＮＳ１遺伝子の高発現によって、キシロースからエタノールへの変換効率を向上できた。以上の結果から、本発明によれば、キシロースを含むバイオマスを原料として、バイオプロセスによるエタノールの効率よい生成が可能となる。
【産業上の利用可能性】
【０１０７】
以上のように、本発明のエタノール生成酵母によれば、キシロースを基質として、効率よくエタノールを生成できる。このため、本発明は、例えば、前述の廃棄物等のバイオマスを原料として、エタノールをバイオプロセスによって製造できるため、極めて有用といえる。
【図７】
2014060978.tif 000009
【図８】
2014060978.tif 000010
【図９】
2014060978.tif 000011
【図１０】
2014060978.tif 000012
【図１】
2014060978.tif 000013
【図２】
2014060978.tif 000014
【図３】
2014060978.tif 000015
【図４】
2014060978.tif 000016
【図５】
2014060978.tif 000017
【図６】
2014060978.tif 000018
【配列表】
2014060978000001.app