(57)【要約】      （修正有）【課題】水素細菌の代謝を制御する。【解決手段】培地４中の水素細菌２に対し、酸化体と還元体の両形態をとり得る電子媒体物質５を介して電子の引き抜きを行いながら、水素と二酸化炭素と水素細菌の最終電子受容体として機能する物質とを与えて培養を行うようにした。水素細菌がハイドロジェノバクターサーモフィラスであり、該細菌を利用したアミノ酸及び脂肪酸からなる群から選択される１種以上の有用物質の生産方法。【選択図】図１Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
培地中の水素細菌に対し、酸化体と還元体の両形態をとり得る電子媒体物質を介して電子の引き抜きを行いながら、水素と二酸化炭素と前記水素細菌の最終電子受容体として機能する物質とを与えて培養を行うことを特徴とする水素細菌の代謝制御方法。
【請求項２】
前記電子の引き抜きを、以下の（１）及び／又は（２）の方法で実施する、請求項１に記載の代謝制御方法。
（１）前記水素細菌の細胞表面に前記電子媒体物質を吸着させると共に前記培地に電極を接触させて、前記電極に酸化電位を印加する
（２）前記培地に前記電子媒体物質を添加すると共に前記培地に電極を接触させて、前記電極に酸化電位を印加する
【請求項３】
前記水素細菌を、ハイドロジェノバクター  サーモフィラス（Hydrogenobacter themophilus）とする、請求項１又は２に記載の代謝制御方法。
【請求項４】
請求項１又は２に記載の代謝制御方法を行う工程を含む、有用物質の生産方法。
【請求項５】
請求項３に記載の代謝制御方法を行う工程を含む、アミノ酸及び脂肪酸からなる群から選択される１種以上の有用物質の生産方法。
【請求項６】
請求項１又は２に記載の代謝制御方法により得られる、通常よりも有用物質が蓄積されている水素細菌。
【請求項７】
請求項３に記載の代謝制御方法により得られる、通常よりもアミノ酸及び脂肪酸が蓄積されているハイドロジェノバクター  サーモフィラス（Hydrogenobacter themophilus）。
【請求項８】
請求項６又は７に記載の水素細菌を含む微生物含有組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、水素細菌の代謝制御方法に関する。さらに詳述すると、本発明は、特にハイドロジェノバクター  サーモフィラス（Hydrogenobacter themophilus）に適用して好適な代謝制御方法と、この方法を利用した有用物質の生産方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
大気中の二酸化炭素等の温室効果ガスの増加は、地球温暖化や気候変動等を引き起こす要因となり得ることから、地球規模の環境問題として重要視されている。例えば、電気事業においては、火力発電所から多量の二酸化炭素が排出される。このような排出二酸化炭素の回収処分方法として、水素細菌を利用した二酸化炭素固定法が知られている（例えば、非特許文献１を参照）。
【０００３】
水素細菌とは、水素（遊離水素）をエネルギー源とし、二酸化炭素を唯一炭素源として増殖可能な独立栄養生物である。水素細菌は増殖速度（炭酸同化速度）が速いことから、大量の二酸化炭素を固定・資源化する上で非常に有用であると考えられている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】電力中央研究所報告Ｕ９２０５８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ところで、水素細菌の有用性をより向上させる上では、水素細菌の代謝を制御して、二酸化炭素固定産物として水素細菌により産生される代謝産物中の有用物質量を増大させることが有効であると考えられる。しかしながら、水素細菌の代謝を制御する方法は未だ確立されていない。
【０００６】
そこで、本発明は、水素細菌の代謝を制御する方法を提供することを目的とする。
【０００７】
また、本発明は、水素細菌の代謝を制御することによって、有用物質を生産する方法を提供することを目的とする。
【０００８】
さらに、本発明は、水素細菌の代謝を制御することによって、通常よりも有用物質が蓄積されている水素細菌、さらにはこの水素細菌を含む微生物含有組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
かかる課題を解決するため、本願発明者が鋭意研究を行った結果、ハイドロジェノバクター  サーモフィラス（Hydrogenobacter themophilus）ＴＫ−６の細胞内から、酸化体と還元体の両形態をとり得る電子媒体物質を介して電子を引き抜きながら培養を行うことによって、通常の培養を行う場合よりもアミノ酸及び脂肪酸の産生を増大させる方向に代謝を制御できることを知見するに至った。
【００１０】
本願発明者は、上記知見から、ハイドロジェノバクター  サーモフィラス（Hydrogenobacter themophilus）ＴＫ−６だけでなく、ハイドロジェノバクター  サーモフィラス（Hydrogenobacter themophilus）全般、さらには水素細菌全般について、酸化体と還元体の両形態をとり得る電子媒体物質を介して電子を引き抜くことによって、代謝を制御できる可能性が導かれることを知見するに至り、さらに種々検討を重ねて本発明を完成するに至った。
【００１１】
即ち、本発明の水素細菌の代謝制御方法は、培地中の水素細菌に対し、酸化体と還元体の両形態をとり得る電子媒体物質を介して電子の引き抜きを行いながら、水素と二酸化炭素と水素細菌の最終電子受容体として機能する物質とを与えて培養を行うようにしている。
【００１２】
ここで、本発明の水素細菌の代謝制御方法において、電子の引き抜きを、以下の（１）及び／又は（２）の方法で実施することが好ましい。
（１）水素細菌の細胞表面に電子媒体物質を吸着させると共に培地に電極を接触させて、電極に酸化電位を印加する
（２）培地に電子媒体物質を添加すると共に培地に電極を接触させて、電極に酸化電位を印加する
【００１３】
また、本発明の水素細菌の代謝制御方法において、水素細菌を、ハイドロジェノバクター  サーモフィラス（Hydrogenobacter themophilus）とすることが好ましい。
【００１４】
次に、本発明の有用物質の生産方法は、本発明の水素細菌の代謝制御方法を行う工程を含むものとしている。
【００１５】
また、本発明の有用物質の生産方法は、本発明の水素細菌の代謝制御方法を、ハイドロジェノバクター  サーモフィラス（Hydrogenobacter themophilus）を用いて行う工程を含むようにしており、これにより、アミノ酸及び脂肪酸からなる群から選択される１種以上の有用物質を生産することができる。
【００１６】
次に、本発明の水素細菌は、本発明の代謝制御方法により得られる、通常よりも有用物質が蓄積されている水素細菌である。ハイドロジェノバクター  サーモフィラス（Hydrogenobacter themophilus）に対して本発明の代謝制御方法を適用した場合には、通常よりもアミノ酸及び脂肪酸が蓄積されているハイドロジェノバクター  サーモフィラス（Hydrogenobacter themophilus）が得られる。そして、本発明の微生物含有組成物は、これらの水素細菌を含むものである。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の代謝制御方法によれば、水素細菌の代謝を制御して、二酸化炭素固定産物として水素細菌により産生される代謝産物中の有用物質量を増大させることが可能となる。したがって、本発明の代謝制御方法を利用することで、有用物質をより効率よく生産することが可能となる。また、有用物質を従来よりも多く蓄積させた水素細菌を提供することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１Ａ】本発明の水素細菌の代謝制御方法の実施形態の一例を示す図である。
【図１Ｂ】本発明の水素細菌の代謝制御方法の実施形態の他の例を示す図である。
【図２】電子媒体物質がＴＫ−６の生育に与える影響を検討した結果を示す図である（実施例１）。
【図３】ＴＫ−６が電子媒体物質を最終電子受容体（呼吸基質）として利用しているか否かを検討した図である（実施例２）。
【図４】実施例にて使用した電気培養装置の構成概略図である。
【図５】培養試験における電流値の経時変化を示す図である（実施例４）。
【図６】ＮＡＤ＋とＮＡＤＨの測定結果を示す図である（実施例４）。
【図７】図６の通電無しの結果についてＮＡＤ＋／ＮＡＤＨを１とした場合の、通電有りのＮＡＤ＋／ＮＡＤＨの換算結果を示す図である（実施例４）。
【図８】培養終了後の菌体密度を示す図である（実施例６）。
【図９】培養終了後の硝酸濃度を示す図である（実施例６）。
【図１０】培養試験における電流値の経時変化を示す図である（実施例６）。
【図１１】通電により増加した各種脂肪酸の化学構造式である（実施例７）。
【図１２】本実施例の結果から推定される電子引き抜きによる水素細菌の推定代謝機構である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、本発明を実施するための形態について、図面に基づいて詳細に説明する。
【００２０】
図１Ａに、本発明の水素細菌の代謝制御方法の実施形態の一例を概念的に示す。本発明の水素細菌の代謝制御方法は、培地４中の水素細菌２に対し、酸化体と還元体の両形態をとり得る電子媒体物質５を介して電子の引き抜きを行いながら、水素（Ｈ２）と二酸化炭素（ＣＯ２）と水素細菌の最終電子受容体として機能する物質（例えば、Ｏ２またはＮＯ３−）とを与えて培養を行うようにしている。
【００２１】
図１Ａに示す実施形態において、水素細菌２からの電子の引き抜きは、培地（培養液）４に電極９を接触（浸漬）させて、電極９に酸化電位を印加することにより行うようにしている。電極９に酸化電位を印加することで、水素細菌２に還元された電子媒体物質５が酸化されて、水素細菌２からの電気化学的な電子の引き抜きを持続的に行うことができる。
【００２２】
ここで、図１Ｂに示すように、電子媒体物質５は、水素細菌２の細胞表面に吸着させてもよい。この場合、電子媒体物質５を介した水素細菌２からの電子の引き抜きをより効率よく行い得る。
【００２３】
本発明の代謝制御方法を適用する対象となる水素細菌２は、水素（遊離水素）をエネルギー源とし、二酸化炭素を唯一炭素源として増殖可能な独立栄養生物であれば特に限定されるものではない。例示すると、Alcaligenes  eutrophus (Cupriavidus necator), Alcaligenes  hydrogenophilus,  Alcaligenes ruhlandii, Alcaligenes latus, Alcaligenes paradoxus, Aquaspirillum autotrophicum, Azospirillum lipoferum, Calderobacterium hydrogenophilum, Derxia gummosa, Flavobacterium autothermophilum, Hydrogenobacter thermophilus, Microcyclus aquaticus, Microcyclus ebruneus, Paracoccus denitrificans, Pseudomonas facilis, Pseudomonas flava, Pseudomonas pseudoflava, Pseudomonas hydrogenovora, Pseudomonas hydrogenothermophila, Pseudomonas palleronii, Pseudomonas thermophila, Pseudomonas saccharophila, Renobacter vacuolatum, Rhizobium ja ponicuni, Xanthobacter autotrophicus, Xanthobacter flavus, Arthrobacter spp., Bacillus schlegelii, Bacillus tusciae, Mycobacterium gordonae, Nocardia autotrophica, Nocardia opaca, Hydrogenovibrio marinus等が挙げられ、特にHydrogenobacter themophilusが好適である。また、Hydrogenobacter themophilusの中でも、特にHydrogenobacter themophilus TK-6株が好適である。Hydrogenobacter themophilus TK-6株は、増殖速度が速く（１．５時間で２倍に増殖）、二酸化炭素の固定能を有する微生物の中でも最高レベルの増殖速度を有している。また、水素細菌２は、遺伝子組み替えにより新たな物質生産能等が組み込まれたものとしてもよい。
【００２４】
尚、水素細菌は自然界の至る所から簡単に単離することのできる微生物であり、入手が容易であるという利点もある。
【００２５】
水素細菌２の培養のための培地４は、水素細菌２の培地として一般的なものを、水素細菌２の種類に応じて適宜選択すればよい。また、水素と二酸化炭素の供給量及び培養温度についても、使用する水素細菌２の種類に応じて適宜選択すればよい。
【００２６】
水素細菌２の最終電子受容対として機能する物質は、水素細菌２に対する好ましい培養環境の条件（好気であるか嫌気であるか）に応じて適宜選択される。即ち、培養環境を好気条件とする場合には、培地４にバブリング等により供給される酸素とすればよい。培養環境を嫌気条件とする場合には、例えば硝酸イオン等として水素細菌２に硝酸呼吸を行わせればよい。尚、Hydrogenobacter themophilusは、培養環境を好気条件と嫌気条件のいずれとしても、生育・増殖させることが可能である。
【００２７】
電子媒体物質５としては、酸化体と還元体の両形態をとり得る物質であり、水素細菌２を失活させることがなく、水素細菌２により還元され得る物質を適宜選択すればよい。例示すると、アントラキノン誘導体（アントラキノン−１−スルホン酸ナトリウム、アントラキノン−１，５−ジスルホン酸ジナトリウム、アントラキノン−１，８−ジスルホン酸ジカリウム、アントラキノン−２−スルホン酸ナトリウム、１−アミノ−４−ブロモアントラキノン−２−スルホン酸ナトリウム及びアントラキノン−２，６−ジスルホン酸ジナトリウム等）及び２−メチル−１，４−ナフトキノン等のキノン化合物、メチルビオロゲン等の農薬系物質、インジゴカルミン、ニュートラルレッド、レマゾールブリリアントブルー、クリスタルバイオレット、２，６−ジクロロフェノール−インドフェノール、アルシアンブルー、サフラニン及びチオニン等の色素系物質、又はヘキサシアノ鉄酸カリウム、鉄イオン錯体（鉄（ＩＩＩ）−ＥＤＴＡ等）、Ｍｎ（ＩＩ）Ｃｌ２、ヨウ化カリウム及びセレン酸等の金属系物質等が挙げられる。
【００２８】
ここで、水素細菌２の細胞表面に電子媒体物質５を吸着させる場合には、電子媒体物質５として、色素系物質の使用が好適である。例えば、水素細菌２をHydrogenobacter themophilusとする場合には、ニュートラルレッドの使用が好適である。但し、水素細菌２の細胞表面に電子媒体物質５を吸着させずとも本発明の効果は得られる。例えば、水素細菌２をHydrogenobacter themophilusとする場合には、アントラキノン誘導体等のキノン化合物も好適に使用し得る。
【００２９】
電子媒体物質５の添加量は、電子媒体物質５の種類、使用する水素細菌２の種類、菌体密度等に応じてその最適量が適宜変化するが、概ね０．５〜１０ｍＭ、好適には０．５〜５ｍＭ、より好適には０．５〜３ｍＭ、さらに好適には２ｍＭ程度とすればよい。電子媒体物質５の添加量が少なすぎると水素細菌２からの電子の引き抜きが十分に起こらず、代謝制御効果が得られにくくなる。また、電子媒体物質５の添加量が多すぎると、電子媒体物質５の種類によっては水素細菌２の活性が阻害されることもあり得る。
【００３０】
電極９としては、例えば炭素板やグラッシーカーボン等の炭素電極、白金電極等を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
【００３１】
水素細菌２は、酸化型の電子媒体物質５を還元して還元型の電子媒体物質５に変換する（換言すると、酸化型の電子媒体物質５に電子を供給して還元型の電子媒体物質５に変換する）機能を有している。したがって、電極９に酸化電位を印加することで、還元型の電子媒体物質５から電子が引き抜かれて酸化型の電子媒体物質５に変換される。これら一連の流れにより、水素細菌２から電気化学的に電子が持続的に引き抜かれ、水素細菌２の代謝が制御される。
【００３２】
ここで、電極９に印加する酸化電位の値は、電子媒体物質５のサイクリックボルタモグラムに基づいて求めることができる。例えば、電子媒体物質５としてニュートラルレッドを用いる場合には、電極９に＋０．４Ｖ程度の電位を印加すればよい。電子媒体物質５としてアントラキノン−２，６−ジスルホン酸ジナトリウムを用いる場合には、電極９に＋０．６Ｖ程度の電位を印加すればよい。
【００３３】
本発明の代謝制御方法により水素細菌２の代謝を制御することで、水素細菌２の代謝産物中に含まれる有用物質の割合を増大させることができる。具体的には、水素細菌２をHydrogenobacter themophilusとする場合には、アミノ酸と脂肪酸の生産量を増大させることができる。
【００３４】
ここで、水素細菌２をHydrogenobacter themophilusとする場合、アミノ酸として特にリシンとアルギニンの量を増大させたい場合には、増殖の定常期又は対数増殖期後期にあるHydrogenobacter themophilusに対して本発明の代謝制御方法を適用するのが好適である。また、電子の引き抜きを行いながら培養する期間については、長すぎると菌数が低下したり、所望の代謝産物量の増大効果が小さくなることもあるので、例えば８５０分よりも短く、好適には５００分以下、より好適には３００分以下、さらに好適には１５０分程度である。
【００３５】
また、水素細菌２をHydrogenobacter themophilusとする場合、脂肪酸として特に炭素数３〜１２の直鎖飽和脂肪酸であるプロピオン酸、酪酸、ヘキサン酸、ヘプタン酸、オクチル酸、ペラルゴン酸、デカン酸、ウンデカン酸及びラウリン酸（この中でも特に炭素数１１と１２のウンデカン酸及びラウリン酸）の量を増大させたい場合には、増殖期（対数増殖期前、対数増殖期初期あるいは中期、好適には対数増殖期前）にあるHydrogenobacter themophilusに対して本発明の代謝制御方法を適用するのが好適である。電子を引き抜きながら、対数増殖期を得て増殖の定常期に至るまで培養を行うことで、上記直鎖飽和脂肪酸を増大する効果が得られやすくなる。
【００３６】
本発明の代謝制御方法により、水素細菌２の有用物質の生産量を増大させることができる。水素細菌２をHydrogenobacter themophilusとする場合には、アミノ酸と脂肪酸の量を増大させることができる。したがって、本発明の代謝制御方法を利用することで、水素細菌を利用して有用物質を効率よく生産することが可能になる。
【００３７】
また、本発明の代謝制御方法により、水素細菌２に蓄積される有用物質の量を通常（つまり、水素細菌から電子を引き抜くこと無く通常の培養を行う場合）よりも増大させることができる。即ち、有用物質の蓄積量を通常よりも増大させた水素細菌２が得られる。したがって、この水素細菌２を微生物タンパク資源（ＳＣＰ）として利用することができる。
【００３８】
また、有用物質の蓄積量を通常よりも増大させた水素細菌２を含む微生物含有組成物を提供することも可能となる。微生物含有組成物としては、例えば家畜飼料が挙げられる。アミノ酸と脂肪酸の蓄積量が通常よりも増大したHydrogenobacter themophilusを含む微生物含有組成物を家畜飼料とすることで、栄養価の高い家畜飼料を提供し得る。その他にも、アミノ酸等の摂取を目的としたサプリメントや食糧等として提供し得る。
【００３９】
上述の形態は本発明の好適な形態の一例ではあるがこれに限定されるものではなく本発明の要旨を逸脱しない範囲において種々変形実施可能である。例えば、上述の実施形態では、電極９を用いて電気化学的に電子媒体物質５を酸化するようにしていたが、電子媒体物質５の酸化は、電気化学的な手法には限定されない。例えば、電気化学的に酸化可能な化合物の大半は酸素によっても酸化可能であることから、培地４中にバブリング等を行って効率的に酸素を供給することによって、電子媒体物質５の酸化することもできる。つまり、培地４中に酸素を持続的に供給することによって、水素細菌２から電子媒体物質５を介して電子を引き抜きながら培養を行い、本発明の代謝制御方法を実施することも可能である。
【実施例】
【００４０】
以下に本発明の実施例を説明するが、本発明はこれら実施例に限られるものではない。
【００４１】
（使用菌体）
東京大学大学院農学生命科学研究科応用生命工学専攻応用微生物研究室より分譲を受けたハイドロジェノバクター  サーモフィラス（Hydrogenobacter themophilus）ＴＫ−６を水素細菌として用いた。以降の説明では、この水素細菌を単にＴＫ−６と呼ぶこともある。
尚、ＴＫ−６は、理化学研究所バイオリソースセンター微生物材料開発室からも入手可能である。
【００４２】
ＴＫ−６の培養に使用した培地の組成を以下に示す。尚、後述する培養試験においても、以下の組成を有する培地を使用した。
【００４３】
［培地組成（脱イオン水１Ｌ中）］
（ＮＨ４）２ＳＯ４         ３ｇ
ＫＨ２ＰＯ４                １ｇ
Ｋ２ＨＰＯ４              ２ｇ
ＮａＣｌ              ０．２５ｇ
ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ      ０．０１４ｇ
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ      ０．５ｇ
ＣａＣｌ２                ０．０３ｇ
微量元素溶液                ５００μＬ
【００４４】
［微量元素溶液（脱イオン水１Ｌ中）］
ＭｏＯ３              ４ｍｇ
ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ        ２８ｍｇ
ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ        ２ｍｇ
Ｈ３ＢＯ３              ４ｍｇ
ＭｎＳＯ４・５Ｈ２Ｏ        ４ｍｇ
ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ        ４ｍｇ
【００４５】
ＴＫ−６は、前培養してから後述する培養試験に供した。即ち、上記培地を使用し、嫌気条件下（培養容器であるガラスバイアル瓶内の気相部分のガス組成をＨ２：Ｎ２：ＣＯ２＝７５：１０：１５（１．５ｋＰａ）に制御）にて、７０℃で振とう培養してから、後述する培養試験に供した。
【００４６】
（実施例１）
電子媒体物質がＴＫ−６の生育に与える影響を検討した。
【００４７】
１００ｍＬ容ガラスバイアル瓶（Ｄｕｒａｎ）に収容した１０ｍＬの上記培地に、菌体密度が１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるようにＴＫ−６を添加した。さらに、上記培地には、ＮａＮＯ３を６０ｍＭとなるように添加すると共に、以下の電子媒体物質（酸化体）を２ｍＭとなるように添加した。そして、当該バイアル瓶の気相のガス組成をＨ２：Ｎ２：ＣＯ２＝７５：１０：１５（１．５ｋＰａ）としてバイアル瓶の蓋を閉め、７０℃で振とう培養し、バッチ試験を実施した。また、電子媒体物質を添加しない培養試験を対照試験として実施した。
【００４８】
［電子媒体物質］
アントラキノン−２，６−ジスルホン酸ジナトリウム
アントラキノン−１，５−ジスルホン酸ジナトリウム
Ｆｅ（ＩＩＩ）−ＥＤＴＡ
レマゾールブリリアントブルー
【００４９】
培養６０時間後の菌体密度を図２に示す。図２に示される結果から、電子媒体物質の添加によって、ＴＫ−６の生育が阻害されることはないことが確認された。
【００５０】
また、電子媒体物質としてアントラキノン−２，６−ジスルホン酸ジカリウムとアントラキノン−１，５−ジスルホン酸ジナトリウムを使用した場合には、ＴＫ−６によるこれらの電子媒体物質の還元によって、培地色が無色（透明）から還元色（赤色）に変化することも確認された。
【００５１】
（実施例２）
ＴＫ−６が電子媒体物質を最終電子受容体（呼吸基質）として利用しているか否かを検討した。
【００５２】
検討条件は、以下の通りとした。
（ａ）酸素呼吸条件
（ｂ）硝酸呼吸条件
（ｃ）電子媒体物質条件１：アントラキノン−２，６−ジスルホン酸ジナトリウム
（ｄ）電子媒体物質条件２：アントラキノン−１，５−ジスルホン酸ジナトリウム
（ｅ）電子媒体物質条件３：Ｆｅ（ＩＩＩ）−ＥＤＴＡ
【００５３】
（ａ）酸素呼吸条件
１００ｍＬ容ガラスバイアル瓶（Ｄｕｒａｎ）に収容した１０ｍＬの培地に、ＯＤ５４０＝０．１となるようにＴＫ−６を添加し、当該バイアル瓶の気相のガス組成をＨ２：ＣＯ２：Ｏ２＝７５：１５：１０（１．５ｋＰａ）として、７０℃で振とう培養し、バッチ試験を実施した。つまり、この条件においては、最終電子受容体は酸素である。
【００５４】
（ｂ）硝酸呼吸条件
１００ｍＬ容ガラスバイアル瓶（Ｄｕｒａｎ）に収容した１０ｍＬの培地に、ＯＤ５４０＝０．１となるようにＴＫ−６を添加した。さらに、培地には、ＮａＮＯ３を６０ｍＭとなるように添加した。そして、当該バイアル瓶の気相のガス組成をＨ２：ＣＯ２：Ｎ２＝７５：１５：１０（１．５ｋＰａ）としてバイアル瓶の蓋を閉め、７０℃で振とう培養し、バッチ試験を実施した。また、電子媒体物質を添加しない培養試験を対照試験として実施した。つまり、この条件においては、最終電子受容体は硝酸である。
【００５５】
（ｃ）〜（ｅ）電子媒体物質条件
１００ｍＬ容ガラスバイアル瓶（Ｄｕｒａｎ）に収容した１０ｍＬの培地に、ＯＤ５４０＝０．１となるようにＴＫ−６を添加した。さらに、培地には、電子媒体物質を２ｍＭとなるように添加した。そして、当該バイアル瓶の気相のガス組成をＨ２：ＣＯ２：Ｎ２＝７５：１５：１０（１．５ｋＰａ）としてバイアル瓶の蓋を閉め、７０℃で振とう培養し、バッチ試験を実施した。
【００５６】
培養試験結果を図３に示す。（ａ）の酸素呼吸条件と（ｂ）の硝酸呼吸条件においては、ＴＫ−６の良好な生育が確認された。しかし、（ｃ）〜（ｅ）の電子媒体物質条件では、ＴＫ−６が生育しなかった。このことから、ＴＫ−６は、上記のような電子媒体物質を最終電子受容体として呼吸することで生育することはできないことが明らかとなった。
【００５７】
ここで、実施例１では、電子媒体物質としてアントラキノン−２，６−ジスルホン酸ジナトリウムとアントラキノン−１，５−ジスルホン酸ジナトリウムを使用した場合に、ＴＫ−６によるこれらの電子媒体物質の還元によって、培地色が無色（透明）から還元色（赤色）に変化することが確認された。また、本実施例においてはこれらの電子媒体物質がＴＫ−６の最終電子受容体としては機能していないことが確認された。これらの結果から総合的に判断すると、電子媒体物質を使用することで、ＴＫ−６細胞内の代謝過程の電子を、細胞外に引き抜くことができる可能性が示唆された。
【００５８】
（実施例３）
ＴＫ−６細胞内から細胞外への電子授受を効率的に行う上では、培養液溶解型の電子媒体物質を使用するよりも、細胞吸着型の電子媒体物質の使用が好適であると考えられた。そこで、細胞吸着型の電子媒体物質について検討した。
【００５９】
以下の９種類の電子媒体物質の溶液にＴＫ−６細胞懸濁液を添加し、６時間後に電子媒体物質のＴＫ−６の吸着を評価した。
・フェリシアン化カリウム
・ＰＭＳ（フェナジンメトサルフェート）
・メチルビオロゲン
・ニュートラルレッド
・Ｆｅ（ＩＩＩ）−ＥＤＴＡ
・インジゴカルミン
・メチレンブルー
・ＤＣＰＩＰ（２，６−ジクロロフェノール−インドフェノール）
・レマゾールブリリアントブルー
【００６０】
その結果、ニュートラルレッドについて、溶液のニュートラルレッド濃度が低下する傾向が見られた。このことから、ニュートラルレッドがＴＫ−６に吸着し、ＴＫ−６とともに沈降したものと推定された。
【００６１】
（実施例４）
ニュートラルレッドを吸着させたＴＫ−６から、ニュートラルレッドを介して電気化学的に電子を引き抜くことによる影響について検討した。換言すると、ＴＫ−６細胞内の電子の流れ（酸化還元バランス）を、電気化学的に変化させることによる影響について検討した。
【００６２】
本実施例においては、ニュートラルレッドを吸着させたＴＫ−６から、ニュートラルレッドを介した電気化学的な電子の引き抜きを行うために（具体的には、水素→ＴＫ−６細胞内→ニュートラルレッド→電極の流れで電子を回収）、図４に示す電気培養装置１を使用した。この電気培養装置１は、１００ｍＬ用ねじ口瓶（Ｄｕｒａｎ）（以下、容器２０と呼ぶ）を培養槽とした。容器２０には蓋３０を取り付けた。蓋３０の上面３０ａにはシリコーンゴム栓を設けて、配線や電極、管を通した際の容器２０の密閉性を確保した。
【００６３】
対極槽としての小容器２１は、イオン交換膜６を成型して袋状（以下、袋２１と呼ぶこともある）とした。具体的には、陽イオン交換膜（デュポン製、ナフィオンＫ）をヒートシーラーで熱圧着により加工し上部はシリコン系接着剤で埋めて密閉した。陰イオン交換膜６の片側面積は１０．５ｃｍ２に相当する。袋２１の内部には電解液４ａを収容すると共に対電極１０を収容して電解液４ａに浸した。電解液４aは、使用菌体の欄で説明した上記培地とした。
【００６４】
容器２０に培養液４（使用菌体の欄で説明した上記培地）を１００ｍＬ収容し、培養液４に小容器２１と作用電極９を浸した。作用電極９と対電極１０の配線は、蓋３０に設けたシリコーンゴム栓を介して容器２０の外側に引き出した。銀・塩化銀参照電極１１（ＲＥ−１Ｂ、ＢＡＳ株式会社）は蓋３０から容器２０内に向けて突き刺して培養液４と接触させた。
【００６５】
培養期間中に容器２０内にて発生したガスは、容器２０の上部に設置したアルミニウム製サンプリングバッグ４０（ジーエルサイエンス製、商品名：アルミニウムバッグ、１Ｌ）に回収した。
【００６６】
作用電極９と対電極１０は共に炭素板とした。作用電極９のサイズは６ｃｍ×２．３ｃｍとした。対電極１０のサイズは５ｃｍ×１ｃｍとした。
【００６７】
ニュートラルレッドを吸着させたＴＫ−６は、使用菌体の欄で説明した前培養（硝酸呼吸条件下）を行って回収した菌体（対数増殖期後期）を、ニュートラルレッドを２ｍＭ含有する溶液に懸濁し、細胞表面にニュートラルレッドを吸着させた後、菌体を培地で洗浄して余剰のニュートラルレッドを洗い流してから培養試験に供した。
【００６８】
上記手順によりニュートラルレッドを吸着させたＴＫ−６を、電気培養装置１の容器２０内に収容した培養液４に添加し（ＯＤ５４０＝２．３）、電流値の経時変化を測定した。尚、本実施例におけるＴＫ−６の添加量は、菌体が増殖しない高菌体密度条件（静止菌条件）である。
【００６９】
試験条件は以下の３条件とした。また、容器２０の気相部分のガス組成はＨ２：Ｎ２：ＣＯ２＝７５：１０：１５（１．５ｋＰａ）に制御し、培養温度は７０℃とした。
（１）ニュートラルレッドを吸着させたＴＫ−６を添加、ＮａＮＯ３添加有り（６０ｍＭ）
（２）ニュートラルレッドを吸着させたＴＫ−６を添加、ＮａＮＯ３添加無し
（３）菌体添加無し、ニュートラルレッド添加有り（２ｍＭ）、ＮａＮＯ３添加無し
【００７０】
作用電極９への印加電位は＋０．４Ｖとした。
【００７１】
尚、本実施例、さらには以降の実施例では、電気化学的な酸化の効果を正確に評価するために、電子媒体物質が電極上以外で酸化されたり、酸素が電極上で反応したりすることのない嫌気条件（硝酸呼吸条件）にて試験を実施した。
【００７２】
電流値の経時変化を図５に示す。条件（１）と条件（２）ともに、菌体由来の電流値が２００分付近において検出された。また、電流値は、条件（１）＜条件（２）であったことから、条件（２）では本来呼吸鎖を介して硝酸に流れるべき電子が、ニュートラルレッドを介して電極に流れたものと推定された。尚、条件（１）において、実験終了後（６００分後）には硝酸濃度が３７．１ｍＭまで減少していた。
【００７３】
次に、条件（１）の実験終了後、細胞内代謝において電子授受反応に使用される重要な物質であるＮＡＤ＋（酸化体）とＮＡＤＨ（還元体）の測定を行った。具体的には、実験終了後の培養液を１ｍＬ採取した後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ、４℃、１０分）により菌体を回収し、回収した菌体をＮＡＤ＋抽出バッファー（0.5M 過塩素酸）もしくはＮＡＤＨ抽出バッファー（５０ｍＭ 水酸化ナトリウム、１ｍＭ  ＥＤＴＡ)に浸漬して、３０秒間超音波処理を５回繰り返し行い、代謝産物抽出液を得た。この抽出液について、ＣｙｃＬｅｘ  ＮＡＤ＋／ＮＡＤＨ  Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔを用いて、ＮＡＤ＋とＮＡＤＨの測定を行った。また、対照試験として、条件（１）を非通電で実施した場合についても同様に試験し、ＮＡＤ＋とＮＡＤＨの測定を行った。
【００７４】
結果を図６に示す。また、通電無しの結果についてＮＡＤ＋／ＮＡＤＨを１とした場合の、通電有りのＮＡＤ＋／ＮＡＤＨの換算結果を図７に示す。図６及び図７に示される結果から、通電を行うことで、酸化体であるＮＡＤ＋の割合が増加することが明らかとなった。したがって、細胞から電極への電子の引き抜きを行うことで、代謝における電子授受に関わる重要なＮＡＤ＋（酸化体）／ＮＡＤＨ（還元体）の増加が起こることが明らかとなった。また、このことから、ＴＫ−６について、電気化学的に代謝を制御できる可能性が示唆された。
【００７５】
（実施例５）
電気培養試験（静止菌試験）を行った後の試料について、メタボローム解析を実施した。
【００７６】
実施例４の条件（１）と同様の条件、及び実施例４の条件（１）を非通電とした条件で培養を行い、培養開始から１５０分後、８５０分後にそれぞれ培養液を採取した。採取した培養液に含まれる菌体を吸引ろ過装置を用いて、フィルター(Millipore Isopore Membrane Filter HTTP 0.4 μm pore 47 mm diameter, Millipore）上に回収した。フィルター上に回収した菌体を10 mLのMilliQ水で2回洗浄し、内部標準 (H3304-1002, HMT) を含有するメタノール (LC/MS用, Wako) 2 mLを入れた密閉シャーレにフィルターの菌体付着面を下にしてフィルターをメタノールに浸漬させた。メタノールに浸漬させたフィルターを30秒、超音波処理を行い、代謝産物抽出液を得た。回収した菌数は以下の通りであった。
（ａ）１５０分通電  ：  ６．７×１０９ｃｅｌｌｓ
（ｂ）１５０分非通電：  ６．７×１０９ｃｅｌｌｓ
（ｃ）８５０分通電  ：  ３．４×１０９ｃｅｌｌｓ
（ｄ）８５０分非通電：  ５．８×１０９ｃｅｌｌｓ
【００７７】
回収した菌体は、１６００μＬのクロロホルム及び６４０μＬのＭｉｌｌｉＱ水を加えて撹拌し、遠心分離（２３００×ｇ、４℃、５分）を行った。遠心分離後、水層を限外ろ過チューブ（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ、ウルトラフリーＭＣ  ＰＬＨＣＣ  ＨＭＴ  遠心式フィルターユニット  ５ｋＤａ）に３２５μＬ×４本移し取った。これを遠心（９１００×ｇ、４℃、１２０分）し、限外ろ過処理を行った。ろ液を乾固させ、再び５０μＬのＭｉｌｌｉ−Ｑ水に溶解し、代謝産物の測定（菌体試料）に供した。
【００７８】
また、培養開始から８５０分後に培養液を４０μＬ回収し、この４０μＬの試料に対し、内部標準物質の濃度が１０００μＭとなるように調製した１０μＬの水溶液を加えて撹拌し、限外ろ過チューブ（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ、ウルトラフリーＭＣ  ＰＬＨＣＣ  ＨＭＴ  遠心式フィルターユニット  ５ｋＤａ）に３２５μＬ×４本移し取った。これを遠心（９１００×ｇ、４℃、１２０分）し、限外ろ過処理を行った。ろ液を乾固させ、再び５０μＬのＭｉｌｌｉ−Ｑ水に溶解し、代謝産物の測定（上清試料）に供した。
【００７９】
代謝産物の分析はＣＥ−ＴＯＦ  ＭＳ  ｓｙｓｔｅｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用し、陽イオン性物質および陰イオン性物質をカチオンモード、アニオンモードでそれぞれ測定した。カチオンモードとアニオンモードの測定条件を以下に示す。
【００８０】
［カチオンモードの測定条件］
Run buffer : Cation Buffer Solution (p/n : H3301-1001)
Rinse buffer : Cation Buffer Solution (p/n : H3301-1001)
Sample injection : Pressure injection 50 mbar, 10 sec
CE voltage : Positive, 27 kV
MS ionization : ESI Positive
MS capillary voltage : 4,000 V
MS scan range : m/z 50-1,000
Sheath liquid : HMT Sheath Liquid (p/n : H3301-1020)
【００８１】
［アニオンモードの測定条件］
Run buffer : Anion Buffer Solution (p/n : H3302-1021)
Rinse buffer : Anion Buffer Solution (p/n : H3302-1022)
Sample injection : Pressure injection 50 mbar, 25 sec
CE voltage : Positive, 30 kV
MS ionization : ESI Negative
MS capillary voltage : 3,500 V
MS scan range : m/z 50-1,000
Sheath liquid : HMT Sheath Liquid (p/n : H3301-1020)
【００８２】
ＣＥ−ＴＯＦ  ＭＳで検出されたピークは自動積分ソフトウェアのＭａｓｔｅｒＨａｎｄｓ  ｖｅｒ．２．９．０．９（慶應義塾大学開発）を用いて自動抽出し、ピーク情報として質量電荷比（ｍ／ｚ）、泳動時間（Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ｔｉｍｅ：ＭＴ）とピーク面積値を得た。得られたピーク面積値は下記の［式１］を用いて相対面積値に変換した（菌体試料については、採取細胞数による補正を行った。つまり、下記の式［１］中の試料数を採取細胞数として計算した。）。また、これらのデータにはＮａ＋やＫ＋などのアダクトイオン及び、脱水、脱アンモニウムなどのフラグメントイオンが含まれているので、これらの分子量関連イオンを削除した。しかし、物質特異的なアダクトやフラグメントも存在するため、すべてを精査することはできなかった。精査したピークについて、ｍ／ｚとＭＴの値をもとに、各試料間のピークの照合・整列化を行った。
相対面積値＝目的ピークの面積値／（内部標準物質の面積値×試料量）・・・［式１］
【００８３】
検出されたピークに対してｍ／ｚとＭＴの値をもとにＨＭＴ代謝物質データベースに登録された全物質との照合、検索を行った。検索のための許容誤差はＭＴで±０．５ｍｉｎ、ｍ／ｚでは±１０ｐｐｍとした。
質量誤差（ｐｐｍ）＝（実測値−理論値×１０６）／実測値
【００８４】
主要代謝産物としてアミノ酸、有機酸、糖リン酸及び核酸を含む１０８物質について解析を行った。検量線は内部標準物質により補正したピーク面積を用い、各物質について１００μＭの一点検量（内部標準物質２００μＭ）として濃度を算出した。
【００８５】
メタボローム解析を行った結果、菌体試料については１３０ピーク（カチオン４２、アニオン８８）を検出し、このうち６２物質（カチオン２８、アニオン３４）を定量可能であった。また、上清試料については４３ピーク（カチオン２５、アニオン１８）を検出し、このうち３３物質（カチオン２４、アニオン９）を定量可能であった。
【００８６】
菌体試料（１５０分）について、非通電時よりも通電時の方が増加した代謝産物を表１に示す。
【００８７】
【表１】
2014060976.tif 000003
【００８８】
ピリミジングループでは、ＣＴＰ（シチジン三リン酸）、ＣＤＰ（シチジン二リン酸）、ＣＭＰ（シチジン一リン酸）が増加した。
【００８９】
プリングループでは、Ｇｕａｎｉｎｅ（グアニン）、ＧＭＰ（グアノシン一リン酸）、ＧＤＰ（グアノシン二リン酸）、ＧＴＰ（グアノシン三リン酸）が増加した。
【００９０】
アミノ酸グループでは、Ｔｒｐ（トリプトファン）、Ｈｉｓ（ヒスチジン）、Ｇｌｕ（グルタミン酸）、Ａｒｇ（アルギニン）、Ｌｙｓ（リシン）、Ａｓｐ（アスパラギン酸）が増加した。
【００９１】
その他、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｃ  ａｃｉｄ（プロピオン酸）、２−ａｍｉｎｏａｄｉｐｉｃ  ａｃｉｄ（２−アミノアジピン酸）、ＣｏＡ（補酵素Ａ）が増加した。
【００９２】
次に、菌体試料（８５０分）について、非通電時よりも通電時の方が増加した代謝産物を表２に示す。
【００９３】
【表２】
2014060976.tif 000004
【００９４】
ピリミジングループでは、ＣＭＰ（シチジン一リン酸）、ＣＤＰ（シチジン二リン酸）、ＣＴＰ（シチジン三リン酸）、ｄＣＭＰ（デオキシシチジン一リン酸）、ｄＣＤＰ（デオキシシチジン二リン酸）、ｄＣＴＰ（デオキシシチジン三リン酸）、ｄＴＭＰ（チミジン一リン酸）、ｄＴＤＰ（チミジン二リン酸）、ｄＴＴＰ（チミジン三リン酸）、ＵＤＰ（ウリジン二リン酸）が増加した。
【００９５】
プリングループでは、ＧＭＰ（グアノシン一リン酸）、ＧＤＰ（グアノシン二リン酸）、ＧＴＰ（グアノシン三リン酸）、ＩＭＰ（イノシン一リン酸）、ａｄｅｎｉｎｅ（アデニン）、ＡＤＰ（アデノシン二リン酸）、ｄＡＤＰ（デオキシアデノシン二リン酸）、ｄＡＴＰ（デオキシアデノシン三リン酸）が増加した。
【００９６】
アミノ酸グループでは、Ｌｙｓ（リシン）、Ａｒｇ（アルギニン）、Ａｌａ（アラニン）、Ｔｒｐ（トリプトファン）、Ｔｙｒ（チロシン）、Ｐｈｅ（フェニルアラニン）、Ｓｅｒ（セリン）、Ｔｈｒ（トレオニン）、Ｇｌｙ（グリシン）、Ｈｉｓ（ヒスチジン）、Ｐｒｏ（プロリン）、Ｕｒｉｃ  ａｃｉｄ（尿酸）、Ｏｘｏｐｒｏｌｉｎｅ（オキソプロリン）が増加した。
【００９７】
ＴＣＡサイクルグループでは、Ｃｉｔｒｉｃ  ａｃｉｄ（クエン酸）、ｃｉｓ−Ａｃｏｎｉｔｉｃ  ａｃｉｄ（シス−アコニット酸）、Ｓｕｃｃｉｎｉｃ  ａｃｉｄ（コハク酸）が増加した。
【００９８】
糖新生グループでは、ＡｃＣｏＡ（アセチル補酵素Ａ）、Ｌａｃｔｉｃ  ａｃｉｄ（乳酸）、Ｇｌｙｃｅｒｉｃ  ａｃｉｄ（グリセリン酸）、Ｆ６Ｐ（フルクトース−６−リン酸）が増加した。
【００９９】
その他、Ｃｈｏｌｉｎｅ（コリン）、Ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ（エタノールアミン）、Ｕｒｅａ（尿素）が増加した。
【０１００】
表１及び表２に示される結果から、菌体試料については、通電により、特に、ＣＴＰ（シチジン三リン酸）、ＣＤＰ（シチジン二リン酸）、ＣＭＰ（シチジン一リン酸）、Ｇｕａｎｉｎｅ（グアニン）、ＧＭＰ（グアノシン一リン酸）、ＧＤＰ（グアノシン二リン酸）、ＧＴＰ（グアノシン三リン酸）、Ｔｒｐ（トリプトファン）、Ｈｉｓ（ヒスチジン）、Ａｒｇ（アルギニン）、Ｌｙｓ（リシン）の増加量が多くなり、この中でも特に、Ａｒｇ（アルギニン）、Ｌｙｓ（リシン）の増加量が顕著に多くなることが明らかとなった。
【０１０１】
表３に、通電による増加量が顕著に多かったＡｒｇ（アルギニン）、Ｌｙｓ（リシン）について、通電（Ｅｌｅｃｔｒｏｌｙｓｉｓ）と非通電（Ｃｏｎｔｒｏｌ）における濃度の比較データを示す。
【０１０２】
【表３】
2014060976.tif 000005
【０１０３】
表３に示される結果から判断すると、通電を８５０分行って菌体を回収するよりも、通電を１５０分行って菌体を回収した方が、Ａｒｇ（アルギニン）、Ｌｙｓ（リシン）をより多く回収できると考えられた。
【０１０４】
次に、上清試料について、非通電時よりも通電時の方が増加した代謝産物を表４に示す。
【０１０５】
【表４】
2014060976.tif 000006
【０１０６】
ピリミジングループでは、ＵＤＰ（ウリジン二リン酸）、ＣＭＰ（シチジン一リン酸）、ＵＭＰ（ウリジン一リン酸）が増加した。
【０１０７】
プリングループでは、ＧＭＰ（グアノシン一リン酸）、ＡＭＰ（アデノシン一リン酸）が増加した。
【０１０８】
アミノ酸グループでは、Ｇｌｙ（グリシン）、Ｖａｌ（バリン）、Ｌｅｕ（ロイシン）、ｌｌｅ（イソロイシン）、Ａｓｎ（アスパラギン）、Ｇｌｎ（グルタミン）、Ｈｉｓ（ヒスチジン）、Ｔｙｒ（チロシン）、Ｐｒｏ（プロリン）、Ｐｈｅ（フェニルアラニン）、Ｓｅｒ（セリン）、Ａｒｇ（アルギニン）、Ｌｙｓ（リシン）、５−Ｏｘｏｐｒｏｌｉｎｅ（５−オキソプロリン）が増加した。
【０１０９】
ＴＣＡサイクルグループでは、Ｓｕｃｃｉｎｉｃ  ａｃｉｄ（コハク酸）、Ｍａｌｉｃ  ａｃｉｄ（リンゴ酸）が増加した。
【０１１０】
脂肪酸グループでは、Ｂｕｔｙｒｉｃ  ａｃｉｄ（酪酸）、Ｉｓｏｖａｌｅｒｉｃ  ａｃｉｄ（イソ吉草酸）、Ａｄｉｐｉｃ  ａｃｉｄ（アジピン酸）、ｔｒａｎｓ−Ｆｅｒｕｌｉｃ  ａｃｉｄ（トランス−フェルラ酸）、Ｓｅｂａｃｉｃ  ａｃｉｄ（セバシン酸）が増加した。
【０１１１】
（実施例６）
実施例４では高菌体密度条件（静止菌条件）にて培養試験を実施したが、本実施例では増殖条件で実施例４と類似の培養試験を実施し、代謝の制御性について検討した。
【０１１２】
具体的には、ＴＫ−６にニュートラルレッドを吸着させることなく、電子媒体物質としてアントラキノン−２，６−ジスルホン酸ジナトリウムを培養液４に溶解させ（２ｍＭ）、作用電極９の印加電位を＋０．６Ｖとし、初期菌体密度を１．０×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬとした以外は、実施例４の条件（１）と同様の条件で培養試験を実施した。また、同様の培養試験を非通電で実施した。
【０１１３】
培養試験終了後の菌体密度を図８に示し、培養液の硝酸濃度を図９に示す。通電を行うことで、培養終了後の菌体密度が増加し、それに対応して硝酸濃度が減少していることが明らかとなった。
【０１１４】
次に、通電条件において、菌体の有無による電流値の経時変化について検討した結果を図１０に示す。菌体有りの場合には、菌体の増殖に伴った電流値の増加が見られた。したがって、菌体の増殖に伴って、アントラキノン−２，６−ジスルホン酸ジナトリウムを介した電流が検出されることが明らかとなった。
【０１１５】
（実施例７）
電気培養試験（増殖条件）を行った後の試料について、メタボローム解析を実施した。
【０１１６】
実施例６と同様の条件で培養試験を行い、電流値の増加が観察される培養開始から３０００分経過後に菌体を回収した。回収した菌数は以下の通りであった。
（ａ）通電  ：  ５．０×１０９ｃｅｌｌｓ
（ｂ）非通電：  ２．８×１０９ｃｅｌｌｓ
【０１１７】
尚、菌体回収方法、メタボローム解析条件は、実施例５と同様とした。
【０１１８】
メタボローム解析を行った結果、９６ピークを検出し、通電により増加した代謝物質は３０物質であった。通電により増加したアミノ酸グループ及びアミノ酸生合成グループの代謝産物を表５に示し、通電により増加した直鎖飽和脂肪酸グループ等の代謝産物を表６に示す。また、図１１に、通電により増加した各種脂肪酸の化学構造式を示す。
【０１１９】
【表５】
2014060976.tif 000007
【０１２０】
【表６】
2014060976.tif 000008
【０１２１】
アミノ酸グループでは、Ｇｌｎ（グルタミン）、Ｖａｌ（バリン）、Ｇｌｕ（グルタミン酸）、Ｐｒｏ（プロリン）、ｌｌｅ（イソロイシン）、Ａｓｐ（アスパラギン酸）、Ａｌａ（アラニン）、Ｔｙｒ（チロシン）、Ｌｅｕ（ロイシン）が増加した。
【０１２２】
アミノ酸生合成グループでは、Ｂｅｔａｉｎｅ（ベタイン）、２，６−ｄｉａｍｉｎｏｐｉｍｅｌｉｃ  ａｃｉｄ（２，６−ジアミノピメリン酸）、２−Ａｍｉｎｏａｄｉｐｉｃ  ａｃｉｄ（２−アミノアジピン酸）、２−Ｈｙｄｒｏｘｙｉｓｏｂｕｔｙｒｉｃ  ａｃｉｄ（２−ヒドロキシイソ酪酸）、Ｇｌｙｃｅｒｏｌ  ３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（グリセロール  ３−リン酸）が増加した。
【０１２３】
直鎖飽和脂肪酸グループでは、Ｕｎｄｅｃａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ（ウンデカン酸）、Ｌａｕｒｉｃ  ａｃｉｄ（ラウリン酸）、Ｄｅｃａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ（デカン酸）、Ｂｕｔｙｒｉｃ  ａｃｉｄ（酪酸）、Ｏｃｔａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ（オクチル酸）、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｃ  ａｃｉｄ（プロピオン酸）、Ｐｅｌａｒｇｏｎｉｃ  ａｃｉｄ（ペラルゴン酸）、Ｈｅｐｔａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ（ヘプタン酸）、Ｈｅｘａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ（ヘキサン酸）が増加した。
【０１２４】
その他、Ｉｓｏｖａｌｅｒｉｃ  ａｃｉｄ（イソ吉草酸）、Ｔｉｇｌｉｃ  ａｃｉｄ（チグリン酸）が増加した。
【０１２５】
以上の結果から、増殖条件においても、静止菌条件と同様に、通電によってアミノ酸の量が増加することが明らかとなった。また、増殖条件においては、炭素数３〜１２の直鎖飽和脂肪酸量が増加していることが特徴的であった。特に、鎖長が長い炭素数１１、１２の直鎖飽和脂肪酸（ウンデカン酸、ラウリン酸）の増加効果が大きいことが明らかとなった。
【０１２６】
（まとめ）
本実施例の結果から推定される水素細菌の代謝機構を図１２に示す。電気化学的に電子を引き抜くことで、電子媒体物質の還元体（ＮＲｒｅｄ（ニュートラルレッドの還元体）又は２，６−ＡＱＤＳｒｅｄ（アントラキノン−２，６−ジスルホン酸ジナトリウムの還元体））が、電子媒体物質の酸化体（ＮＲｏｘ（ニュートラルレッドの酸化体）又は２，６−ＡＱＤＳｏｘ（アントラキノン−２，６−ジスルホン酸ジカリウムの酸化体））に酸化される。水素細菌細胞内では、水素由来の電子によってＮＡＤ＋がＮＡＤＨに還元されるが、電極による電子媒体物質を介した電子の引き抜きによって、ＮＡＤＨがＮＡＤ＋に酸化される反応が支配的となり、ＮＡＤＨに対するＮＡＤ＋の量が増加する。つまり、水素細菌細胞内の酸化還元バランスが酸化にシフトし、アミノ酸及び脂肪酸の生産性が向上するものと推定される。水素細菌は非常に増殖速度の速い生物であり、固定した二酸化炭素は効率的に自らの細胞を構築することに利用される。そのため、通常の培養条件では細胞内に有用物質の有意な蓄積はほとんどないと考えられる。これに対し、本発明によれば、代謝を制御することで、アミノ酸、脂肪酸を有意に蓄積することができる。有用物質を細胞内に有意に蓄積できる点で、通常の培養方法と比較して極めて優れた手法であると言える。
【符号の説明】
【０１２７】
２    水素細菌
４    培地
５    電子媒体物質
９    電極
【図８】
2014060976.tif 000009
【図９】
2014060976.tif 000010
【図１１】
2014060976.tif 000011
【図１Ａ】
2014060976.tif 000012
【図１Ｂ】
2014060976.tif 000013
【図２】
2014060976.tif 000014
【図３】
2014060976.tif 000015
【図４】
2014060976.tif 000016
【図５】
2014060976.tif 000017
【図６】
2014060976.tif 000018
【図７】
2014060976.tif 000019
【図１０】
2014060976.tif 000020
【図１２】
2014060976.tif 000021