(57)【要約】【課題】癌を処置するための操作されたヒトアルギナーゼの組成物および方法の提供。【解決手段】癌の処置用の組成物および方法、より好ましくは、血清中のＬ−アルギニンを欠乏させる酵素を用いて、アルギニノコハク酸シンテターゼを発現しない、または他の理由でアルギニノコハク酸シンテターゼが不足している癌の処置が記載されている。一実施形態では、本発明は、少なくとも１つのアミノ酸置換および金属補因子を含む、ヒトアルギナーゼＩタンパク質などのアルギナーゼタンパク質であって、前記タンパク質が、天然ヒトアルギナーゼＩと比較すると高い触媒活性を有する、アルギナーゼタンパク質を企図する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願明細書に記載された発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
この出願は、２００８年１０月３１日に出願された米国仮特許出願第６１／１１０，２１８号（この全体の開示は、参考として本明細書に具体的に援用される）の優先権を主張する。
【０００２】
１．発明の分野
本発明は、全体として、血清中のＬ−アルギニンを欠乏させる酵素を用いた癌の処置用の組成物および方法に関する。一部の実施形態では、この癌は、アルギニンの生合成に必要なアルギニノコハク酸シンテターゼ（ＡＳＳ）、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）、もしくは他の酵素を発現しない、または他の理由で不足している癌である。
【背景技術】
【０００３】
２．関連技術の説明
５０年以上前に、特定の癌細胞が、Ｌ−アルギニンなどのアミノ酸を強く必要とし、Ｌ−アルギニン欠乏の条件下で死滅することが認識されていた（非特許文献１）。ヒト細胞では、Ｌ−アルギニンは、まず、アルギニノコハク酸シンテターゼ（ＡＳＳ）がＬ−シトルリンおよびアスパラギン酸をアルギニノコハク酸塩に変換し、次いで、アルギニノコハク酸がアルギニノコハク酸リアーゼによってＬ−アルギニンおよびフマル酸塩に変換される２つのステップで合成される。Ｌ−シトルリン自体は、酵素オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）によってＬ−オルニチンおよびカルバモイルリン酸から合成される。多数の肝細胞癌、メラノーマ、および最近見出された腎細胞癌（非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４）は、ＡＳＳを発現しないため、Ｌ−アルギニンの欠乏が起こる。ＡＳＳの発現の欠如についての分子機序は、多様であると思われ、異所性遺伝子制御およびスプライシング欠損を含む。Ｌ−アルギニンの欠乏時に非悪性細胞は静止状態（Ｇ０）に入るため、数週間に渡って生存するが、腫瘍細胞は、たとえタンパク質合成が阻害されていてもＤＮＡ合成の再開を引き起こして、大きな不均衡および迅速な細胞死をもたらす細胞周期障害を来たす（Ｓｈｅｎら、２００６；Ｓｃｏｔｔら、２０００）。ＨＣＣ細胞、メラノーマ細胞、および他のＡＳＳ−欠損癌細胞に対するＬ−アルギニン欠乏の選択毒性は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、異種移植動物モデル、および臨床試験で広く実証された（非特許文献２；非特許文献３；Ｓｈｅｎら、２００６；Ｉｚｚｏら、２００４）。近年、Ｃｈｅｎｇら（２００７）は、多くのＨＣＣ細胞も、オルニチントランスカルバミラーゼ発現で不足しているため、これらも、酵素的Ｌ−アルギニン欠乏が起こる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】ＷｈｅａｔｌｅｙおよびＣａｍｐｂｅｌｌ、Ｐａｔｈｏｌ．  Ｏｎｃｏｌ．  Ｒｅｓ．（２００２）８：１８〜２５
【非特許文献２】Ｅｎｓｏｒら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（２００２）６２：５４４３〜５４５０
【非特許文献３】Ｆｅｕｎら、Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｏｎｃｏｌ．（２００７）８２：１７７〜１８１
【非特許文献４】Ｙｏｏｎら、Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ，（２００７）１２０：８９７〜９０５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
癌治療、特に、高罹患率の癌の一般的な形態である肝細胞癌、メラノーマ、および腎細胞癌の処置におけるＬ−アルギニン加水分解酵素の使用に関心がある。２つのＬ−アルギニン分解酵素：細菌アルギニンデイミナーゼおよびヒトアルギナーゼが、癌治療に使用されてきた。残念ながら、これらの酵素は共に、臨床用途で大きな障害をもたらす大きな欠点を示す（それぞれが、免疫原生、低い触媒活性（ｌｏｗ  ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）、および血清中での非常に低い安定性）。したがって、Ｌ−アルギニン欠乏治療の治療上の成功は、これらの欠点の対処次第である。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、全体として、血清中のＬ−アルギニンを欠乏させる酵素を用いた癌の処置用の組成物および方法に関する。一部の実施形態では、この癌は、アルギニンの生合成に必要なアルギニノコハク酸シンテターゼ（ＡＳＳ）、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）、もしくは他の酵素を発現しない、または他の理由でこれらが不足している癌である。
【０００７】
一部の態様では、本発明は、天然金属補因子（Ｍｎ２＋）が別の金属で置換されたアルギナーゼタンパク質を企図する。特定の実施形態では、アルギナーゼタンパク質は、ヒトアルギナーゼＩのアミノ酸配列またはヒトアルギナーゼＩＩのアミノ酸配列と非天然金属補因子を含む。一部の実施形態では、この金属はコバルト（Ｃｏ２＋）である。本発明のヒトアルギナーゼＩおよびＩＩタンパク質は、２つのＭｎ（ＩＩ）部位を有する。一方または両方の部位が、非天然金属補因子を備えた突然変異アルギナーゼＩまたはＩＩタンパク質を作製するために置換することができる。一部の実施形態では、このタンパク質は、ｐＨ７．４で４００ｍＭ−１ｓ−１を超えるｋｃａｔ／Ｋｍを示す。特定の実施形態では、このタンパク質は、ｐＨ７．４で４００ｍＭ−１ｓ−１〜４，０００ｍＭ−１ｓ−１のｋｃａｔ／Ｋｍを示す。別の実施形態では、このタンパク質は、ｐＨ７．４、３７℃で４００ｍＭ−１ｓ−１〜２，５００ｍＭ−１ｓ−１のｋｃａｔ／ＫＭを示す。特定の実施形態では、本発明は、ヒトアルギナーゼＩまたはＩＩのアミノ酸配列と非天然金属補因子を含むタンパク質であって、前記タンパク質が、ｐＨ７．４、３７℃で４００ｍＭ−１ｓ−１を超えるｋｃａｔ／Ｋｍを示す、タンパク質を企図する。
【０００８】
一部の実施形態では、天然アルギナーゼは、金属補因子の置換によってのみ修飾されている。他の実施形態では、アルギナーゼは、置換、欠失、および切断などの他の修飾に加えて、金属補因子の置換によって修飾されている。特定の実施形態では、本発明は、ヒトアルギナーゼＩまたはＩＩの天然アミノ酸配列と非天然金属補因子を含むタンパク質であって、このアミノ酸配列が、天然配列の一部を欠いている、タンパク質を提供する。特定の実施形態では、非天然金属補因子はコバルトである。一部の実施形態では、ヒトアルギナーゼＩのアミノ酸配列は配列番号１を含む。他の実施形態では、ヒトアルギナーゼＩＩのアミノ酸配列は配列番号２を含む。さらに他の実施形態では、アルギナーゼは、野生型配列の一部を欠いている。他の実施形態では、アミノ酸配列は、切断型アルギナーゼＩまたはアルギナーゼＩＩ配列を含む。特定の実施形態では、アルギナーゼは、アルギナーゼＩＩであり、野生型配列の最初の２１アミノ酸を欠いている。別の実施形態では、天然アルギナーゼは、Ｎ末端メチオニンを欠いている。
【０００９】
別の態様では、本発明は、少なくとも１つのアミノ酸置換を含むアルギナーゼタンパク質であって、このタンパク質が、天然ヒトアルギナーゼＩまたはＩＩタンパク質と比較して、生理的条件下で、特にヒト血清のｐＨ（ｐＨ７．４）で高い触媒活性を示す、タンパク質を企図する。一部の実施形態では、アルギナーゼタンパク質は、ヒトアルギナーゼＩタンパク質またはヒトアルギナーゼＩＩタンパク質である。一部の実施形態では、タンパク質は、非天然金属補因子をさらに含む。特定の実施形態では、非天然金属補因子はＣｏ＋２である。Ｍｎ＋２補因子のＣｏ＋２での置換により、触媒活性が著しく上昇し、生理的ｐＨでのＫｍが大幅に低下する。
【００１０】
一実施形態では、本発明は、金属結合部位における少なくとも１つのアミノ酸置換を含むヒトアルギナーゼＩタンパク質であって、このタンパク質が、配列番号１を有する天然ヒトアルギナーゼＩのｋｃａｔ／Ｋｍよりも少なくとも２倍高いｋｃａｔ／Ｋｍをもたらすアルギニンの加水分解の増加を示す、タンパク質を提供する。別の実施形態では、本発明は、金属結合部位における少なくとも１つのアミノ酸置換を含むヒトアルギナーゼＩＩタンパク質であって、このタンパク質が、配列番号２を有する天然ヒトアルギナーゼＩＩのｋｃａｔ／Ｋｍよりも少なくとも２倍高いｋｃａｔ／Ｋｍをもたらすアルギニンの加水分解の増加を示す、タンパク質を提供する。一部の実施形態では、タンパク質は、ｐＨ７．４で４００ｍＭ−１ｓ−１を超えるｋｃａｔ／Ｋｍを示す。特定の実施形態では、タンパク質は、ｐＨ７．４で４００ｍＭ−１ｓ−１〜４，０００ｍＭ−１ｓ−１のｋｃａｔ／Ｋｍを示す。別の実施形態では、タンパク質は、ｐＨ７．４、３７℃で４００ｍＭ−１ｓ−１〜２，５００ｍＭ−１ｓ−１のｋｃａｔ／ＫＭを示す。一部の態様では、本発明は、天然ヒトアルギナーゼの安定性に対して血清中でのヒトアルギナーゼの安定性を増加させる突然変異を提供する。
【００１１】
一部の実施形態では、アミノ酸置換が、Ｈｉｓ１０１、Ａｓｐ１２４、Ｈｉｓ１２６、Ａｓｐ１２８，Ａｓｐ２３２、Ａｓｐ２３４、Ｔｒｐ１２２、Ａｓｐ１８１、Ｓｅｒ２３０、Ｈｉｓ１２０、Ａｓｐ１４３、Ｈｉｓ１４５、Ａｓｐ１４７、Ａｓｐ２５１、Ａｓｐ２５３、Ｔｒｐ１４１、Ａｓｐ２００、Ｓｅｒ２４９、Ｃｙｓ３０３、またはＧｌｕ２５６である。多数の突然変異が、生理的条件下で触媒活性を増大させ、Ｌ−アルギニンのＫｍを大幅に低下させることが分かった。一部の実施形態では、突然変異は、Ａｓｐ１８１Ｓｅｒ、Ｓｅｒ２３０Ｃｙｓ、Ｓｅｒ２３０Ｇｌｙ、Ｃｙｓ３０３Ｐｈｅ、Ｃｙｓ３０３Ｉｌｅ、Ｇｌｕ２５６Ｇｌｎ、Ａｓｐ１８１Ｇｌｕ、およびＳｅｒ２３０Ａｌａからなる群から選択される置換突然変異である。一部の態様では、本発明は、２つ以上の突然変異がヒトアルギナーゼに導入された実施形態を提供する。一部の実施形態では、ヒトアルギナーゼタンパク質は、少なくとも２つのアミノ酸置換を含む。特定の実施形態では、置換は、Ａｓｐ１８１ＧｌｕおよびＳｅｒ２３０Ａｌａである。
【００１２】
一部の態様では、本発明は、野生型または天然タンパク質に対して追加の変更を含むアルギナーゼを提供する。一部の実施形態では、この変更には、置換、欠失（例えば、天然配列の一部の欠失）、切断、またはこれらの組み合わせが含まれる。一部の実施形態では、本発明は、アミノ酸配列の変更が欠失のみである天然アルギナーゼも企図する。特定の実施形態では、本発明は、Ｎ末端メチオニンを欠いているヒトアルギナーゼＩタンパク質を企図する。本明細書に記載される様々な突然変異アルギナーゼの他の欠失およびより大きな欠失も企図される。例えば、１４のＣ末端アミノ酸を欠いている切断型アルギナーゼが報告され、Ａｒｇ−３０８が、配列の最後の残基として残されている（Ｍｏｒａら、２０００）。さらに別の実施形態では、アルギナーゼは、野生型配列の最初の２１アミノ酸を欠いている。
【００１３】
一部の態様では、本発明は、非アルギナーゼアミノ酸配列に連結されたアルギナーゼを含む融合タンパク質も企図する。一実施形態では、非アルギナーゼ配列は、例えば、患者に投与されたときに血清中でのアルギナーゼの半減期を延長するために、免疫グロブリンのＦｃ領域の少なくとも一部を含む。Ｆｃ領域またはその一部は、あらゆる適当なＦｃ領域であり得る。一実施形態では、Ｆｃ領域またはその一部は、ＩｇＧ  Ｆｃ領域である。一部の実施形態では、アルギナーゼ活性を有するアミノ酸配列は、ヒトアルギナーゼＩの天然または突然変異アミノ酸配列およびヒトアルギナーゼＩＩの天然または突然変異アミノ酸配列からなる群から選択される。一実施形態では、二量体Ｆｃ−アルギナーゼ融合タンパク質が企図される。
【００１４】
融合タンパク質中のアルギナーゼは、天然、突然変異、および／または他の方法での修飾、例えば、金属補因子の修飾であり得る。一部の実施形態では、アルギナーゼは、欠失、置換、切断、またはこれらの組み合わせを含み得る。特定の実施形態では、本発明は、Ｆｃ−アルギナーゼを含む融合タンパク質であって、このアルギナーゼがアルギナーゼＩである、融合タンパク質を企図する。一実施形態では、アルギナーゼは、野生型配列の一部を欠いている。別の実施形態では、アルギナーゼは、Ｎ末端メチオニンを欠いたアルギナーゼＩである。さらに別の実施形態では、アルギナーゼは、野生型アルギナーゼＩＩ配列の最初の２１アミノ酸を欠いたアルギナーゼＩＩである。一部の実施形態では、アルギナーゼは、非天然金属補因子をさらに含む。これらの実施形態では、一方または両方の部位を、ヒトアルギナーゼＩまたはＩＩのアミノ酸配列と非天然金属補因子を含む融合タンパク質を作製するために置換することができる。一部の実施形態では、非天然金属補因子はコバルトである。一部の実施形態では、アルギナーゼは、置換を含む。一部の実施形態では、この置換はＧｌｕ２５６Ｇｌｎである。別の実施形態では、この置換は、Ａｓｐ１８１Ｓｅｒである。さらに別の実施形態では、この置換はＳｅｒ２３０Ｃｙｓである。なお別の実施形態では、この置換はＳｅｒ２３０Ｇｌｙである。さらに別の実施形態では、この置換はＣｙｓ３０３Ｐｈｅである。なお別の実施形態では、この置換は、Ｃｙｓ３０３Ｉｌｅである。一部の実施形態では、ヒトアルギナーゼＩは、少なくとも２つのアミノ酸置換を含む。一実施形態では、これらの置換は、Ａｓｐ１８１ＧｌｕおよびＳｅｒ２３０Ａｓｐである。
【００１５】
一部の態様では、本発明は、このようなアルギナーゼをコードする核酸をさらに企図する。一部の実施形態では、この核酸は、細菌での発現用にコドンが最適化されている（ｃｏｄｏｎ  ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ）。特定の実施形態では、この細菌は大腸菌である。他の態様では、本発明は、このような核酸を含むベクターをさらに企図する。特定の実施形態では、突然変異アルギナーゼをコードする核酸は、限定されるものではないが、異種プロモーターを含むプロモーターに機能的に連結されている。なおさらなる態様では、本発明は、このようなベクターを含む宿主細胞をさらに企図する。一部の実施形態では、宿主細胞は、突然変異アルギナーゼを発現するトランスフェクトまたは形質転換宿主細胞である。タンパク質は、任意の適当な方法で発現され得る。一実施形態では、タンパク質は、このタンパク質がグリコシル化されるように宿主細胞で発現される。別の実施形態では、タンパク質は、このタンパク質がグリコシル化されない（ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ）ように宿主細胞で発現される。
【００１６】
本発明は、本発明のアルギナーゼタンパク質の投与による処置の方法、特に癌を有する対象を処置する方法も企図する。一部の実施形態では、癌は、アルギニノコハク酸シンテターゼ（ＡＳＳ）またはオルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）を発現しない、または他の理由で不足している癌である。特定の実施形態では、ヒト癌は、アルギニン栄養要求性癌（ａｒｇｉｎｉｎｅ  ａｕｘｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）である。上述したように、アルギナーゼタンパク質は、天然、突然変異、および／または他の方法での修飾体、例えば、金属補因子の修飾体であり得る。一部の実施形態では、本発明は、アルギナーゼ活性を有するアミノ酸配列およびヒト免疫グロブリンのＦｃ領域の少なくとも一部を含む融合タンパク質を含む製剤をヒト癌患者に投与することを含む、ヒト癌患者を処置する方法を企図する。一部の実施形態では、投与は、癌の癌細胞の少なくとも一部が死滅するような条件下で行う。別の実施形態では、製剤は、生理的条件で標準ヒトアルギナーゼによって示されるヒトアルギナーゼ活性よりも高いヒトアルギナーゼ活性を有するアミノ酸配列を含み、付着ポリエチレングリコール鎖をさらに含む。一部の実施形態では、製剤は、上述のアルギナーゼタンパク質のいずれかおよび薬学的に許容され得る賦形剤を含む医薬製剤である。このような薬学的に許容され得る賦形剤は、当業者には周知である。上述のアルギナーゼ変異体のすべては、ヒトの治療に有用であると企図される。
【００１７】
癌は、あらゆる型の癌または腫瘍型であり得る。一部の実施形態では、癌は、肝細胞癌、腎細胞癌、メラノーマ、前立腺癌、または膵臓癌である。一部の実施形態では、製剤は、局所に、静脈内に、皮内に、動脈内に、腹腔内に、病変内に、頭蓋内に、関節内に、前立腺内に、胸膜内に、気管内に、眼内に、鼻腔内に、硝子体内に、膣内に、直腸内に、筋肉内に、皮下に、結膜下に、胞内に（ｉｎｔｒａｖｅｓｉｃｕｌａｒｌｌｙ）、粘膜に、心膜内に、臍帯内に、経口で、吸入によって、注射によって、注入によって、連続注入によって、直接標的細胞を局所灌流浴（ｌｏｃａｌｉｚｅｄ  ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  ｂａｔｈｉｎｇ）することによって、カテーテルによって、または洗浄液を介して投与される。一実施形態では、血清での半減期を延長するために、本明細書に記載されたアルギナーゼ変異体はＰＥＧ化される。
【００１８】
上述のアルギナーゼおよび変異体などのすべては、精製または単離タンパク質、好ましくは単量体タンパク質として好ましい実施形態で企図される。
【００１９】
実施例のセクションの実施形態は、本発明のすべての態様に適用可能な本発明の実施形態であると理解される。
【００２０】
請求項での語「または」の使用は、本開示は別の可能性のみおよび「および／または」を指す定義を支持するが、別の可能性のみまたは別の可能性が相互に排他的であるという特段の記載がない限り、「および／または」を意味する。
【００２１】
本願全体において、語「約」は、値を決定するために利用される装置または方法における誤差の標準偏差を値が含むことを示すために使用される。
【００２２】
長年の特許法に従って、語「１つの」および「ある」は、請求項または明細書において語「含む」と共に使用される場合、特段の記載がなければ１つ以上を意味する。
【００２３】
本明細書で使用される語「治療効果がある」は、処置される状態の少なくとも１つの症状が少なくとも改善されるような治療効果を達成するために本発明の方法に利用される細胞および／または治療用組成物（治療用ポリヌクレオチドおよび／または治療用ポリペプチドなど）の量、および／またはこれらの細胞と共に使用されるプロセスまたは材料の分析を指す。
【００２４】
本発明の他の目的、特徴、および利点は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。しかし、本発明の趣旨および範囲内での様々な変形および変更が、以下の詳細な説明から当業者には明らかになるため、詳細な説明および特定の例は、本発明の特定の実施形態を示すが、単なる例示として提示されることを理解されたい。
【００２５】
添付の図面は、本明細書の一部を構成し、本発明の特定の態様をさらに実証するために含められている。本発明は、本明細書に開示される特定の実施形態の詳細な説明と共に１つ以上のこれらの図面を参照することによってより良く理解されるであろう。
したがって、本発明は以下の項目を提供する：
（項目１）  ヒトアルギナーゼＩのアミノ酸配列またはヒトアルギナーゼＩＩのアミノ酸配列と非天然金属補因子とを含むタンパク質であって、上記非天然金属補因子がコバルトである、タンパク質。
（項目２）  上記アミノ酸配列が、アルギナーゼＩとしてさらに定義される、項目１に記載のタンパク質。
（項目３）  上記ヒトアルギナーゼＩが、配列番号１を含む、項目２に記載のタンパク質。
（項目４）  上記アミノ酸配列が、アルギナーゼＩＩとしてさらに定義される、項目１に記載のタンパク質。
（項目５）  上記アルギナーゼＩＩが、配列番号２を含む、項目４に記載のタンパク質。
（項目６）  上記アミノ酸配列が、切断型アルギナーゼＩ配列または切断型アルギナーゼＩＩ配列を含む、先行する項目のいずれか一項に記載のタンパク質。
（項目７）  上記アミノ酸配列が、Ｎ末端メチオニンを欠いている、項目６に記載のタンパク質。
（項目８）  上記アミノ酸配列が、野生型配列の最初の２１アミノ酸を欠いている、項目６に記載のタンパク質。
（項目９）  上記タンパク質が、ｐＨ７．４で４００ｍＭ−１ｓ−１〜４，０００ｍＭ−１ｓ−１のｋｃａｔ／Ｋｍを示す、先行する項目のいずれか一項に記載のタンパク質。
（項目１０）  上記タンパク質が、ｐＨ７．４で４００ｍＭ−１ｓ−１〜２，５００ｍＭ−１ｓ−１のｋｃａｔ／Ｋｍを示す、項目９に記載のタンパク質。
（項目１１）  金属結合部位における少なくとも１つのアミノ酸置換をさらに含む、先行する項目のいずれか一項に記載のタンパク質。
（項目１２）  上記少なくとも１つのアミノ酸置換が、Ｈｉｓ１０１、Ａｓｐ１２４、Ｈｉｓ１２６、Ａｓｐ１２８，Ａｓｐ２３２、Ａｓｐ２３４、Ｔｒｐ１２２、Ａｓｐ１８１、Ｓｅｒ２３０、Ｈｉｓ１２０、Ａｓｐ１４３、Ｈｉｓ１４５、Ａｓｐ１４７、Ａｓｐ２
５１、Ａｓｐ２５３、Ｔｒｐ１４１、Ａｓｐ２００、Ｓｅｒ２４９、Ｃｙｓ３０３、またはＧｌｕ２５６におけるものである、項目１１に記載のタンパク質。
（項目１３）  上記少なくとも１つのアミノ酸置換が、Ａｓｐ１８１Ｓｅｒ、Ｓｅｒ２３０Ｃｙｓ、Ｓｅｒ２３０Ｇｌｙ、Ｃｙｓ３０３Ｐｈｅ、Ｃｙｓ３０３Ｉｌｅ、Ｇｌｕ２５６Ｇｌｎ、Ａｓｐ１８１Ｇｌｕ、またはＳｅｒ２３０Ａｌａである、項目１２に記載のタンパク質。
（項目１４）  少なくとも２つのアミノ酸置換をさらに含む、項目１〜１１のいずれか一項に記載のタンパク質。
（項目１５）  金属結合部位を有し、上記金属結合部位における少なくとも１つのアミノ酸置換を含むヒトアルギナーゼＩタンパク質またはヒトアルギナーゼＩＩタンパク質であって、上記タンパク質は、配列番号１を有する天然ヒトアルギナーゼＩまたは配列番号２を有する天然ヒトアルギナーゼＩＩのｋｃａｔ／Ｋｍよりも少なくとも２倍高いｋｃａｔ／Ｋｍをもたらすアルギニンの加水分解の増加を示す、タンパク質。
（項目１６）  上記タンパク質が、ｐＨ７．４で４００ｍＭ−１ｓ−１〜４，０００ｍＭ−１ｓ−１のｋｃａｔ／Ｋｍを示す、項目１５に記載のタンパク質。
（項目１７）  上記タンパク質が、ｐＨ７．４で４００ｍＭ−１ｓ−１〜２，５００ｍＭ−１ｓ−１のｋｃａｔ／Ｋｍを示す、項目１６に記載のタンパク質。
（項目１８）  上記アルギナーゼタンパク質が、１つのポリペプチド鎖を含む、項目１５〜１７のいずれか一項に記載のタンパク質。
（項目１９）  上記少なくとも１つのアミノ酸置換が、Ｈｉｓ１０１、Ａｓｐ１２４、Ｈｉｓ１２６、Ａｓｐ１２８，Ａｓｐ２３２、Ａｓｐ２３４、Ｔｒｐ１２２、Ａｓｐ１８１、Ｓｅｒ２３０、Ｈｉｓ１２０、Ａｓｐ１４３、Ｈｉｓ１４５、Ａｓｐ１４７、Ａｓｐ２５１、Ａｓｐ２５３、Ｔｒｐ１４１、Ａｓｐ２００、Ｓｅｒ２４９、Ｃｙｓ３０３、またはＧｌｕ２５６におけるものである、項目１５〜１８のいずれか一項に記載のタンパク質。
（項目２０）  上記少なくとも１つのアミノ酸置換が、Ａｓｐ１８１Ｓｅｒ、Ｓｅｒ２３０Ｃｙｓ、Ｓｅｒ２３０Ｇｌｙ、Ｃｙｓ３０３Ｐｈｅ、Ｃｙｓ３０３Ｉｌｅ、Ｇｌｕ２５６Ｇｌｎ、Ａｓｐ１８１Ｇｌｕ、またはＳｅｒ２３０Ａｌａである、項目１９に記載のタンパク質。
（項目２１）  上記ヒトアルギナーゼが、少なくとも２つのアミノ酸置換を含む、項目１５〜１９のいずれか一項に記載のタンパク質。
（項目２２）  上記アミノ酸置換が、Ａｓｐ１８１ＧｌｕおよびＳｅｒ２３０Ａｌａである、項目２１に記載のタンパク質。
（項目２３）  非天然金属補因子をさらに含む、項目１５〜２２のいずれか一項に記載のタンパク質。
（項目２４）  上記非天然金属補因子が、コバルトである、項目２３に記載のタンパク質。
（項目２５）  上記アミノ酸配列が、切断型アルギナーゼＩ配列または切断型アルギナーゼＩＩ配列を含む、項目１５〜２４のいずれか一項に記載のタンパク質。
（項目２６）  上記アミノ酸配列が、Ｎ末端メチオニンを欠いている、項目２５に記載のタンパク質。
（項目２７）  上記アミノ酸配列が、野生型配列の最初の２１アミノ酸を欠いている、項目２５に記載のタンパク質。
（項目２８）  上記タンパク質が、ポリエチレングリコールに共有結合している、項目１５〜２７のいずれか一項に記載のタンパク質。
（項目２９）  先行する項目のいずれか一項に記載のタンパク質をコードする核酸。
（項目３０）  上記核酸が、細菌での発現用にコドンが最適化されている、項目２９に記載の核酸。
（項目３１）  項目２９に記載の核酸を含むベクター。
（項目３２）  項目３１に記載のベクターを含む宿主細胞。
（項目３３）  先行する項目のいずれか一項に記載のタンパク質を含む融合タンパク質であって、異種ペプチドセグメントをさらに含む、融合タンパク質。
（項目３４）  上記異種ペプチドセグメントが、免疫グロブリンのＦｃ領域またはその一部を含む、項目３３に記載の融合タンパク質。
（項目３５）  上記アミノ酸配列が、切断型アルギナーゼＩ配列または切断型アルギナーゼＩＩ配列を含む、項目３３または３４に記載の融合タンパク質。
（項目３６）  上記アミノ酸配列が、Ｎ末端メチオニンを欠いている、項目３５に記載の融合タンパク質。
（項目３７）  上記アミノ酸配列が、野生型配列の最初の２１アミノ酸を欠いている、項目３５に記載の融合タンパク質。
（項目３８）  項目３３〜３７のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする核酸。
（項目３９）  上記核酸が、大腸菌での発現用にコドンが最適化されている、項目３８に記載の核酸。
（項目４０）  項目３８に記載の核酸を含むベクター。
（項目４１）  項目４０に記載のベクターを含む宿主細胞。
（項目４２）  アルギニン栄養要求性癌のヒト患者を処置する方法であって、先行する項目のいずれか一項に記載のタンパク質を含む製剤を上記患者に投与することを含む、方法。
（項目４３）  上記患者が、肝細胞癌、腎細胞癌、またはメラノーマと診断されている、項目４２に記載の方法。
（項目４４）  上記製剤が、局所に、静脈内に、皮内に、動脈内に、腹腔内に、病変内に、頭蓋内に、関節内に、前立腺内に、胸膜内に、気管内に、眼内に、鼻腔内に、硝子体内に、膣内に、直腸内に、筋肉内に、皮下に、結膜下に、胞内に、粘膜に、心膜内に、臍帯内に、経口で、吸入によって、注射によって、注入によって、連続注入によって、直接標的細胞を局所灌流浴することによって、カテーテルによって、または洗浄液を介して投与される、項目４２または４３に記載の方法。
（項目４５）  先行する項目のいずれか一項に記載のタンパク質および薬学的に許容され得る賦形剤を含む医薬製剤。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】図１は、アルギナーゼＩ（配列番号１）およびアルギナーゼＩＩ（配列番号２）核酸配列を示している。
【図２】図２は、ヒトアルギナーゼＩの精製ステップを示すＳＤＳ−ＰＡＧＥの写真である。Ｌ＝分子量ラダー；ＷＣ＝全細胞画分、ＳＮ＝上清；ＦＴ＝ＩＭＡＣカラムからの通過物；Ｗ＝カラム洗浄；Ｅ＝アルギナーゼ溶出画分。
【図３】図３は、１００ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ緩衝液、ｐＨ７．４、３７℃におけるＣｏ−ｈＡｒｇＩ（黒塗りの円）およびＭｎ−ｈＡｒｇＩ（白抜きの円）によるＬ−アルギニン加水分解の定常状態動力学の代表的なグラフである。Ｃｏ−ｈＡｒｇＩは、ｋｃａｔが２４０±１４ｓ−１、ＫＭが１９０±４０μＭ、およびｋｃａｔ／ＫＭが１，２７０±３３０ｍＭ−１ｓ−１であった。Ｍｎ−ＡｒｇＩは、ｋｃａｔが３００±１２ｓ−１、ＫＭが２，３３０±２６０μＭ、およびｋｃａｔ／ＫＭが１２９±２０ｍＭ−１ｓ−１であった。
【図４】図４は、上昇縁ｐＫａが７．５のＣｏ−ｈＡｒｇＩ（黒塗りの円）および下降縁ｐＫａが８．５のＭｎ−ｈＡｒｇＩ（黒塗りの四角形）についてのｋｃａｔ／ＫＭのｐＨに対するプロットである。
【図５】図５は、プールされたヒト血清中で、３７℃で長時間、プールされたヒト血清でインキュベートされたＣｏ−ｈＡｒｇＩおよびＭｎ−ｈＡｒｇＩ（１μＭ）の安定性を示すグラフである。アリコートを経時的に取り出し、ｐＨ７．４、３７℃で、１００ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ緩衝液中の１ｍＭ  Ｌ−Ａｒｇに対してアッセイした。Ｍｎ−ｈＡｒｇＩ（白抜きの円）は、Ｔ１／２寿命が４．８±０．８時間である活性の指数関数的喪失を示した。対照的に、Ｃｏ−ｈＡｒｇＩ（黒塗りの円）は、見かけの第１のＴ１／２が６．１±０．６時間で、続く第２のＴ１／２が大幅に長い３７±３時間である活性の二相喪失を示した。
【図６】図６は、Ｃｏ−ｈＡｒｇＩ（上側のパネル）または透析緩衝液（下側のパネル）のいずれかでインキュベートされた２０の基準アミノ酸のＨＰＬＣトレースを示すグラフである。２０の基準アミノ酸と共にインキュベートされたＣｏ−ｈＡｒｇＩでは、Ｌ−アルギニンコントロールと一致して、ＲＴ＝１２．３分で１つのピークが喪失し、Ｌ−オルニチンコントロールと一致して、ＲＴ＝１８．８分で１つの新しいピークが出現した。
【図７Ａ】図７Ａおよび図７Ｂは、様々なアルギナーゼ変異体で（コントロールと共に）処置したときの組織培養物におけるＨＣＣの生存を示すグラフである。図７Ａは、０〜１００ｎＭアルギナーゼで処置したときのＨＣＣ組織培養物（Ｈｅｐ３ｂ）の生存を実証する（５日目）。Ｍｎ−ｈＡｒｇＩ（黒塗りの三角形）は、見かけのＩＣ５０が５±０．３ｎＭ（約０．１８μｇ／ｍｌ）となった。Ｃｏ−ｈＡｒｇＩ（黒塗りの円）とのインキュベーションにより、細胞毒性が１５倍に増加し、見かけのＩＣ５０が０．３３±０．０２ｎＭ（約０．０１２μｇ／ｍｌ）となった。
【図７Ｂ】図７Ａおよび図７Ｂは、様々なアルギナーゼ変異体で（コントロールと共に）処置したときの組織培養物におけるＨＣＣの生存を示すグラフである。図７Ｂは、Ａ３７５メラノーマ細胞の増殖に対するｈＡｒｇＩの影響を示すグラフである（５日目）。Ｍｎ−ｈＡｒｇＩ（黒塗りの三角形）は、見かけのＩＣ５０が４．１±０．１ｎＭ（約０．１５μｇ／ｍｌ）となった。Ｃｏ−ｈＡｒｇＩ（黒塗りの円）とのインキュベーションにより、細胞毒性が１３倍に増加し、見かけのＩＣ５０が０．３２±０．０６ｎＭ（約０．０１２μｇ／ｍｌ）となった。
【図８】図８は、ｈＡｒｇＩ−Ｅ２５６Ｑ変異体が三量体野生型ｈ−ＡｒｇＩとは対照的に単量体であることを示す非変性電気泳動ゲルの写真である。
【図９】図９は、Ｃｏ−ｈＡｒｇ−ＩＩ（黒塗りの円）およびＭｎ−ｈＡｒｇ−ＩＩ（白抜きの円）によるＬ−アルギニン加水分解の定常状態動力学の代表的なグラフである。ｐＨ７．４、３７℃でのＬ−Ａｒｇのコバルト置換ｈＡｒｇ−ＩＩ（黒塗りの円）加水分解では、ｋｃａｔが１８２±７ｓ−１、ＫＭが１２６±１８μＭ、およびｋｃａｔ／ＫＭが１，４４０±２６０ｍＭ−１ｓ−１である。Ｈ７．４、３７℃でのＬ−Ａｒｇのマンガン置換ｈＡｒｇ−ＩＩ（白抜きの円）加水分解では、ｋｃａｔが４８±２ｓ−１、ＫＭが２，９００±３００μＭ、およびｋｃａｔ／ＫＭが１７±２ｍＭ−１ｓ−１である。
【図１０】図１０は、マウスモデルにおける血清中のＬ−アルギニンの欠乏を示すグラフである。Ｃｏ−ｈＡｒｇＩの単回ＩＰ投与で処置したＢａｌｂ／ｃマウスの血清Ｌ−Ａｒｇ濃度が、３日間に渡って≦３〜４μＭに維持されている。
【図１１】図１１は、コントロールと比較した、Ｃｏ−ｈＡｒｇＩで処置したときのＨＣＣ腫瘍異種移植片の減少を示すグラフである。Ｈｅｐ３ｂ腫瘍異種移植片を有するヌードマウスを、９日目と１２日目にＰＢＳ（白抜きの円）またはＣｏ−ｈＡｒｇＩ（黒塗りの円）でＩＰ注射によって２回処置した。腫瘍の縮小は、Ｃｏ−ｈＡｒｇＩで処置したマウスでは観察されたが、ＰＢＳで処置した腫瘍は抑制されず成長した。
【図１２】図１２は、見かけＭＷが約１５０ｋＤａであるＰＥＧ  ＭＷ５０００に結合したｈＡｒｇＩを示す１４〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥの写真である。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本発明は、血清中のＬ−アルギニンを欠乏させる酵素を用いた癌の処置用の組成物および方法全般に関する。一部の実施形態では、癌は、アルギニンの生合成に必要なアルギニノコハク酸シンテターゼ（ＡＳＳ）、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）、もしくは他の酵素を発現しない、または他の理由でこれらが不足している癌である。天然および突然変異酵素の両方、修飾された金属補因子を備えた酵素、他のポリペプチドに融合した酵素、および血清での持続性を高めるポリマー、例えば、高分子量ポリエチレングリコールに結合した酵素が企図される。
【００２８】
Ｉ．アルギナーゼ
アルギナーゼは、マンガン含有酵素である。アルギナーゼは、尿素サイクルの最終酵素である。アルギナーゼは、尿素サイクル、体が有害アンモニアを処分する際の哺乳動物における一連の生物物理学的反応の第５の最終ステップである。特に、アルギナーゼは、Ｌ−アルギニンをＬ−オルニチンおよび尿素に変換する。
【００２９】
Ｌ−アルギニンは、酸化窒素シンターゼ（ＮＯＳ）の窒素供与基質であり、Ｌ−シトルリンおよびＮＯを生成する。アルギナーゼのＫＭ（２〜５ｍＭ）が、Ｌ−アルギニンのＮＯＳのＫＭ（２〜２０μＭ）よりも大幅に高いことが報告されているが、アルギナーゼは、ＮＯＳ活性の調節にも役割を果たし得る。特定の条件下では、アルギナーゼＩは、Ｃｙｓ−Ｓ−ニトロシル化されて、Ｌ−アルギニンに対して高親和性となり、利用可能なＮＯＳの基質が減少する。
【００３０】
アルギナーゼは、幾つかのへリックスによって取り囲まれた平行な８本鎖βシートのα／βフォールドを備えたホモ三量体酵素である。この酵素は、Ｌ−アルギニンのグアニジン炭素に対する求核攻撃のための水酸化物の生成に不可欠な二核金属クラスターを含む。アルギナーゼの天然金属は、Ｍｎ２＋である。これらのＭｎ２＋イオンは、水と配位結合し、分子を配向および安定化させ、水が求核剤として機能してＬ−アルギニンを攻撃し、Ｌ−アルギニンをオルニチンと尿素に加水分解する。
【００３１】
哺乳動物は、Ｌ−アルギニンの尿素とＬ−オルニチンへの加水分解を触媒する２つのアルギナーゼアイソザイム（ＥＣ３．５．３．１）を有する。アルギナーゼＩ遺伝子は、第６染色体（６ｑ．２３）に位置し、肝細胞のサイトゾルで高度に発現され、尿素サイクルの最終ステップとして窒素除去で機能する。アルギナーゼＩＩ遺伝子は、第１４染色体（１４ｑ．２４．１）で見られる。アルギナーゼＩＩは、腎臓、脳、および骨格筋などの組織のミトコンドリア内に存在し、そこで、プロリンおよびポリアミン生合成のためのＬ−オルニチンを供給すると思われている（Ｌｏｐｅｚら、２００５）。
【００３２】
アルギナーゼは、細胞外Ｌ−アルギニンを分解するための方法としてほぼ５０年に渡って研究されてきた（Ｄｉｌｌｏｎら、２００２）。ある種の有望な臨床結果が、経肝臓的動脈塞栓形成によるアルギナーゼの導入によって達成され、この導入後に、幾人かの患者が、ＨＣＣの部分的な寛解を経験した（Ｃｈｅｎｇら、２００５）。しかし、アルギナーゼは、高いＫＭ（約２〜５ｍＭ）を有し、生理的ｐＨ値で非常に低い活性を示すため、化学療法目的には高用量が必要である（Ｄｉｌｌｏｎら、２００２）。天然アルギナーゼは、数分以内に循環から除去されるが（Ｓａｖｏｃａら、１９８４）、ＰＥＧ−アルギナーゼＭＷ５０００のラットへの単回注射が、約３日間でアルギニンをほぼ完全に欠乏させるのに十分であった（Ｃｈｅｎｇら、２００７）。
【００３３】
Ｃｈｅｎｇらは、多くのヒトＨＣＣ細胞系が、ＯＴＣ（ＡＳＳに加えて）を発現しないため、これらがＰＥＧ−アルギナーゼの影響を受けやすいという驚くべき観察を行った（Ｃｈｅｎｇら、２００７）。Ｈｅｐ３ｂ肝細胞癌細胞が移植されたマウスでは、ＰＥＧ−アルギナーゼの週に一度の投与により、腫瘍の成長が遅延し、この遅延が、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）の同時投与によって倍加した。しかし、ＰＥＧ−アルギナーゼは、ヒトの治療では実施できない非常に高用量で使用され、ＰＥＧ−アルギナーゼの低い生理活性を反映している。
【００３４】
これらの問題に対処するために、細菌アルギニン加水分解酵素、アルギニンデイミナーゼ、または良好な動力学および安定性を示すＡＤＩをｉｎ  ｖｉｔｒｏで試験した。現在は、ＡＤＩのＰＥＧ化形態が、フェーズＩＩ／ＩＩＩ臨床試験中である。残念ながら、ＡＤＩは、細菌酵素であるため、強い免疫応答および副作用をほとんどの患者で引き起こす。しかし、有意な有害反応が生じない患者では、すばらしい割合で疾患の安定または寛解を示す。しかし、ＡＤＩの好ましくない免疫学的プロフィールのために、ＡＤＩによるＬ−アルギニン欠乏が、肝癌の主流の処置になる可能性は低い。
【００３５】
臨床用途では、循環中で長い時間（例えば、数日）持続可能となるようにアルギナーゼを遺伝子操作することが必須である。まったく修飾されていない場合、ヒトアルギナーゼは、主に、そのサイズが腎臓でのろ過を回避するのに十分な大きさでないことから、循環中ではわずか数分の半減期である。非修飾ヒトアルギナーゼは、血清中で非常に非活性化しやすく、わずか４時間の半減期で分解される。したがって、本発明は、臨床研究用の新規かつ改善された形態のアルギナーゼ、および循環持続性が改善された有望な治療での使用を開発した。
【００３６】
ＩＩ．アルギナーゼ変異体
哺乳動物は、Ｌ−アルギニンの尿素とＬ−オルニチンへの加水分解を触媒する２つのアルギナーゼアイソザイム（ＥＣ３．５．３．１）を有する。アルギナーゼＩ遺伝子は、第６染色体（６ｑ．２３）に位置し、肝細胞のサイトゾルで高度に発現され、尿素サイクルの最終ステップとして窒素除去で機能する。アルギナーゼＩＩ遺伝子は、第１４染色体（１４ｑ．２４．１）で見出された。アルギナーゼＩＩは、腎臓、脳、および骨格筋などの組織のミトコンドリア内に存在し、そこで、プロリンおよびポリアミン生合成のためのＬ−オルニチンを供給すると思われている（Ｌｏｐｅｚら、２００５）。
【００３７】
Ｌ−アルギニンは、酸化窒素シンターゼ（ＮＯＳ）の唯一の基質であり、Ｌ−シトルリンおよびＮＯを生成する。アルギナーゼのＫＭ（２〜５ｍＭ）が、Ｌ−アルギニンのＮＯＳのＫＭ（２〜２０μＭ）よりも大幅に高いことが報告されているが、アルギナーゼは、ＮＯＳ活性の調節にも役割を果たし得る（Ｄｕｒａｎｔｅら、２００７）。特定の条件下では、アルギナーゼＩは、Ｃｙｓ−Ｓ−ニトロシル化されて、Ｌ−アルギニンに対して高親和性となり、利用可能なＮＯＳの基質が減少する（Ｓａｎｔｈａｎａｍら、２００７）。アルギナーゼは、幾つかのへリックスによって取り囲まれた平行な８本鎖βシートのα／βフォールドを備えたホモ三量体酵素である。この酵素は、Ｌ−アルギニンのグアニジン炭素に対する求核攻撃のための水酸化物の生成に不可欠な二核金属クラスターを含む（Ｃａｍａら、２００３；Ｄｏｗｌｉｎｇら、２００８）。アルギナーゼの天然金属は、Ｍｎ２＋である。天然金属（すなわち、Ｍｎ２＋）を備えたアルギナーゼは、最適ｐＨ９を示す。生理的ｐＨでは、この酵素は、Ｌアルギニンの加水分解で１０倍以上低いｋｃａｔ／Ｋｍを示す（図４）。天然Ｍｎ２＋を備えた標準ヒトアルギナーゼ酵素によって示される低い触媒活性は、治療に適したＬ−アルギニンの血漿レベルの低下を達成するためには非実用的な用量の酵素を使用しなければならないことを意味するため、ヒトでの治療に問題がある。
【００３８】
一部の態様では、本発明は、天然金属補因子（Ｍｎ２＋）が別の金属によって置換された突然変異アルギナーゼも企図する。ヒトアルギナーゼにおける金属補因子の置換は、天然金属補因子を備えた天然ヒトアルギナーゼと比較すると、生理的条件下でＬ−アルギニンの加水分解の速度および安定性に有利な効果を与えることが見出された。他の二価の陽イオンを備えた天然金属（Ｍｎ２＋）の置換が、酵素の最適ｐＨを低い値にシフトさせて生理的条件下でＬ−アルギニンの加水分解の速度を高めるために利用され得る。本発明のヒトアルギナーゼＩおよびＩＩタンパク質は、２つのＭｎ（ＩＩ）部位を有するため、一方または両方の部位が、非天然金属補因子を備えた突然変異アルギナーゼＩまたはＩＩタンパク質を生成するために置換され得る。
【００３９】
一部の実施形態では、金属はコバルト（Ｃｏ２＋）である。ヒトアルギナーゼＩまたはヒトアルギナーゼＩＩにＭｎ２＋の代わりにＣｏ２＋が組み込まれると、生理的ｐＨで活性が劇的に上昇する。Ｃｏ２＋含有酵素（「Ｃｏ−ｈＡｒｇＩ」）は、ｐＨ７．４、ｉｎ
ｖｉｔｒｏでｋｃａｔ／Ｋｍが１０倍高く、このため、Ｍｎ２＋を含むヒトアルギナーゼＩと比較してＨＣＣ細胞毒性が１５倍高く、メラノーマ細胞毒性が１３倍高くなることが分かった。また、Ｃｏ−ｈＡｒｇＩの薬理学的製剤が、マウスでは、単回注射で血清中のＬ−Ａｒｇが３日間で除去され得ることも分かった。さらに、Ｃｏ−ｈＡｒｇＩの薬理学的製剤は、ヌードマウスのＨＣＣ腫瘍異種移植片を収縮させ得るが、Ｍｎ−ｈＡｒｇＩは、腫瘍の成長を遅延させるだけであることも分かった（Ｅｎｓｏｒ、Ｈｏｌｓｂｅｒｇら、２００２）。
【００４０】
一部の実施形態では、本発明は、金属結合部位における少なくとも１つのアミノ酸置換を含むヒトアルギナーゼタンパク質を提供する。アルギナーゼの構造は、より深く局在化したＭｎＡと呼ぶイオンがＨ１０１、Ｄ１２４、Ｄ１２８、Ｄ２３２と配位結合し、水酸化物を架橋している２つのＭｎ２＋イオンを含む活性部位クレフトを示す。他方の金属は、ＭｎＢと呼ばれ、Ｈ１２６、Ｄ１２４、Ｄ２３２、Ｄ２３４と配位結合し、水酸化物を架橋している（ＣｈｒｉｓｔｉａｎｓｏｎおよびＣｏｘ、１９９９）。アルギナーゼＩの第１のシェルに対する金属結合部位を含む残基は、Ｈ１０１、Ｄ１２４、Ｈ１２６、Ｄ１２８、Ｄ２３２、およびＤ２３４であり、第２のシェルに対する金属結合部位を含む残基は、Ｗ１２２、Ｄ１８１、およびＳ２３０である。同様に、アルギナーゼＩＩの第１のシェルに対する金属結合部位を含む残基は、Ｈ１２０、Ｄ１４３、Ｈ１４５、Ｄ１４７、Ｄ２５１、およびＤ２５３であり、第２のシェルに対する金属結合部位を含む残基は、Ｗ１４１、Ｄ２００、およびＳ２４９である。
【００４１】
アルギナーゼは、完全な活性には両方のＭｎ２＋イオンを必要とするが、ＭｎＡは、可逆的に分離され、結果としてその触媒活性が半分の酵素になり得る（Ｓｃｏｌｎｉｃｋら、１９９７）。ｈＡｒｇＩの金属（Ａ）は、Ｈ１０１のイミダゾールと配位結合し、このイミダゾールはＳ２３０のヒドロキシルと水素結合している。ｈＡｒｇＩの金属（Ｂ）は、Ｈ１２６のイミダゾールと配位結合し、このイミダゾールは、Ｄ１８１のカルボキシルと水素結合した第２のシェルを有する。金属の結合に関与する位置は、飽和突然変異誘発を受けやすく、得られるライブラリーを、マイクロタイター・ウェル・プレート・アッセイを用いてアルギナーゼ活性についてスクリーニングし（実施例で詳細に後述）、高い触媒活性を示すタンパク質を発現するクローンを単離した。新規なクローンは、配列決定によって同定し、大腸菌（ＢＬ２１）を再形質転換し、精製し、下の実施例で記載するように動力学的に特徴付けた。野生型≦見かけの活性を示す変異体を、大量に精製し、それらの安定状態の動力学的パラメーターｋｃａｔおよびＫＭについてアッセイした。変異体：Ｄ１８１Ｓ、Ｄ１８１Ｅ／Ｓ２３０Ａ（２つの置換を含む二重突然変異体）は、Ｃｏ−ｈＡｒｇＩよりも大きいｋｃａｔ／ＫＭ定数を有することが分かった。同様に、アミノ酸置換Ｓ２３０ＣおよびＳ２３０Ｇが、触媒活性に対して、および血清安定性に対しても特に重要な効果を有することが分かった。加えて、金属結合部位から除去されたアミノ酸も、組み合わせ飽和突然変異誘発を受けやすかった。例えば、Ｃｏ−ｈＡｒｇＩにおけるＣ３０３Ｐ置換が、ｐＨ７．４で、天然のＭｎ−ｈＡｒｇＩと比較して１０倍高いｋｃａｔ／ＫＭをもたらすことが分かった。アルギナーゼのこれらの変異体または突然変異体の形態の多くは、例えば、これらが、（半減期を長くするために）免疫グロブリンのＦｃ領域（またはその一部）を備えた融合タンパク質として作製されることを含め、癌の処置での使用が企図される。
【００４２】
Ｃｙｓ３０３変異体も、血清安定性について試験した。Ｃ３０３Ｐ変異体、すなわちアルギナーゼの１つのアミノ酸置換は、血清安定性の約６０％の上昇を示し、これにより、ｐＨ７．４で、Ｍｎ置換酵素と比較して、ＨＣＣ細胞毒性が３０倍に増加した。一実施形態では、本発明は、この新規な酵素またはさらなる突然変異を有するこの新規な酵素を用いた処置も企図する。特定の実施形態では、この新規な酵素は、アルギナーゼ変異体の長い血清持続性を確保するために、ＩｇＧ  ｆｃドメインのエンドソーム再利用から恩恵を受けるアルギナーゼ−Ｆｃタンパク質融合として処置に利用される。長い血清持続性は、治療薬としてのアルギナーゼの使用を改善する。
【００４３】
ＩＩＩ．ＰＥＧ化
本発明の特定の態様では、ＰＥＧ化アルギナーゼに関連した方法および組成物が開示される。特に、遺伝子操作されたシステイン残基におけるアルギナーゼのＰＥＧ化（例えば、Ｎ末端の第３の残基の置換）が、均一ＰＥＧ化アルギナーゼ組成物を作製するために使用され得る。重合の一時的な中断に基づいたＰＥＧ化アルギナーゼの単離の方法も開示される。
【００４４】
ＰＥＧ化は、ポリ（エチレングリコール）ポリマー鎖の別の分子、通常は薬物または治療用タンパク質への共有結合のプロセスである。ＰＥＧ化は、ＰＥＧの反応性誘導体の標的巨大分子とのインキュベーションによってルーチンで達成される。ＰＥＧの薬物または治療用タンパク質への共有結合は、宿主の免疫系から作用物質を「マスク」することができ（免疫原性および抗原性の低下）、腎クリアランスの低下によってその循環時間を長くする作用物質の流体力学的サイズ（溶液中のサイズ）を増大させる。ＰＥＧ化は、疎水性薬物およびタンパク質に水溶性ももたらし得る。
【００４５】
ＰＥＧ化の第１のステップは、一方または両方の末端でのＰＥＧポリマーの適切な官能化である。同じ反応性部分を備えた各末端で活性化されるＰＥＧは、「ホモ二官能性」として知られるが、存在する官能基が異なる場合は、ＰＥＧ誘導体は、「ヘテロ二官能性」または「ヘテロ官能性」と呼ばれる。ＰＥＧポリマーの化学的に活性な誘導体または活性化誘導体は、ＰＥＧを所望の分子に結合させるために準備される。
【００４６】
ＰＥＧ誘導体の適切な官能基の選択は、ＰＥＧに結合する分子に利用可能な反応基の種類に基づいている。タンパク質の場合、典型的な反応性アミノ酸には、リシン、システイン、ヒスチジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、トレオニン、チロシンが含まれる。Ｎ末端アミノ基およびＣ末端カルボン酸が用いられ得る。
【００４７】
第１世代ＰＥＧ誘導体を形成するために使用される技術は、一般に、ＰＥＧポリマーを、ヒドロキシル基、典型的には無水物、酸塩化物、クロロギ酸エステル、および炭酸塩と反応する基と反応させる。第２世代ＰＥＧ化化学では、アルデヒド、エステル、アミドなどのより効率的な官能基を結合に利用できるようにする。
【００４８】
ＰＥＧ化の適用がますます進展し、高度になってきたため、結合用のヘテロ二官能性ＰＥＧの要望が増加した。これらのヘテロ二官能性ＰＥＧは、親水性、可撓性、かつ生体適合性のスペーサーが必要な場合、２つの実体を連結するのに非常に有用である。ヘテロ二官能性ＰＥＧの好ましい末端基は、マレイミド、ビニルスルホン、ピリジルジスルフィド、アミン、カルボン酸、およびＮＨＳエステルである。
【００４９】
最も一般的な修飾剤またはリンカーは、メトキシＰＥＧ（ｍＰＥＧ）分子に基づいている。これらの活性は、タンパク質修飾基のアルコール末端への付加に依存する。場合によっては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧジオール）が、前駆体分子として使用される。その後、このジオールは、ヘテロ二量体またはホモ二量体ＰＥＧ結合分子を作製するために両方の末端で修飾される（ＰＥＧビス−ビニルスルホンを用いた例で示されている）。
【００５０】
タンパク質は、一般に、非プロトン化チオール（システイニル残基）またはアミノ基などの求核部位でＰＥＧ化される。システイニル特異的修飾試薬の例として、ＰＥＧマレイミド、ＰＥＧヨード酢酸、ＰＥＧチオール、およびＰＥＧビニルスルホンが挙げられる。４つすべてが、温和な条件および中性からややアルカリ性ｐＨで強力にシステイニル特異的であるが、それぞれに欠点もある。マレイミドで形成されたアミドは、アルカリ性条件下でやや不安定であり得るため、このリンカーを用いた形成時の選択である程度の制限が存在し得る。ヨードＰＥＧで形成されたアミド結合は、より安定であるが、遊離ヨウ素が、ある条件化でチロシン残基を修飾し得る。ＰＥＧチオールは、タンパク質チオールとジスルフィド結合を形成するが、この結合も、アルカリ性条件下では不安定であり得る。ＰＥＧ−ビニルスルホン反応性は、マレイミドＰＥＧおよびヨードＰＥＧと比べて比較的遅いが、形成されるチオエーテル結合はかなり安定している。また、ＰＥＧ−ビニルスルホンの遅い反応速度は、ＰＥＧ−ビニルスルホン反応の制御を容易にし得る。
【００５１】
天然システイニル残基での部位特異的ＰＥＧ化は、これらの残基が、通常はジスルフィド結合の形態であるか、または生物活性を必要とするため、稀にしか起こらない。他方、部位指定突然変異誘発が、チオール特異的リンカーに対するシステイニルＰＥＧ化部位を組み入れるために使用され得る。システイン突然変異は、ＰＥＧ化試薬を使用しやすく、かつＰＥＧ化後も生物学的に活性であるようにデザインされなければならない。
【００５２】
アミン特異的修飾剤として、ＰＥＧ  ＮＨＳエステル、ＰＥＧトレシレート、ＰＥＧアルデヒド、ＰＥＧイソチオシアネート、およびいくつかの他のものが挙げられる。これらすべてが、温和な条件下で反応し、アミノ基に対して非常に特異的である。ＰＥＧ  ＮＨＳエステルは、恐らく反応性の高い作用物質の１つであるが、この高い反応性は、大量でのＰＥＧ化反応を制御するのを困難にし得る。ＰＥＧアルデヒドは、アミノ基とイミンを形成し、このイミンは、シアノ水素化ホウ素ナトリウムを用いて第二級アミンに還元される。水素化ホウ素ナトリウムとは異なり、シアノ水素化ホウ素ナトリウムは、ジスルフィド結合を還元しない。しかし、この化学種は、毒性が高く、特に揮発性になる低いｐＨでは慎重に取り扱わなければならない。
【００５３】
ほとんどのタンパク質に多数のリシン残基があるため、部位特異的ＰＥＧ化は、困難であり得る。幸いにも、これらの試薬が非プロトン化アミノ基と反応するため、低いｐＨで反応させることによってＰＥＧ化を低いｐＫアミノ基に向けることが可能である。一般に、α−アミノ基のｐＫは、リシン残基のε−アミノ基よりも１〜２ｐＨ単位低い。ｐＨ７またはそれ以下での分子のＰＥＧ化により、Ｎ末端の高い選択性を、高頻度で達成することができる。しかし、これは、タンパク質のＮ末端部分が生物活性に必要でない場合のみ達成可能である。さらに、ＰＥＧ化による薬物動態的恩恵は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの生物活性の有意な喪失に勝る場合が多く、ＰＥＧ化化学にかかわらずｉｎ  ｖｉｖｏでの生物活性が格段に高い産物がもたらされる。
【００５４】
いつＰＥＧ化処理を行うかを判断するいくつかのパラメーターが存在する。幸いにも、通常は４つまたは５つの重要なパラメーターしか存在しない。ＰＥＧ化条件の最適化に対する「実験のデザイン」手法は、非常に有用であり得る。チオール特異的ＰＥＧ化反応の場合、考慮すべきパラメーターには、タンパク質濃度、ＰＥＧとタンパク質の比（モルベース）、温度、ｐＨ、反応時間、および場合によっては酸素の排除が含まれる（酸素は、タンパク質による分子間ジスルフィド結合に寄与することができ、これがＰＥＧ化産物の収量を低下させる）。特にＮ末端アミノ基を標的にする場合はｐＨがさらに重要である点を除き、アミン特異的修飾についても同じ因子（酸素を除いて）を考慮すべきである。
【００５５】
アミン特異的修飾およびチオール特異的修飾の両方の場合、反応条件は、タンパク質の安定性に影響を与え得る。これは、温度、タンパク質濃度、およびｐＨを制限し得る。加えて、ＰＥＧリンカーの反応性は、ＰＥＧ化反応を開始する前に知っておくべきである。例えば、ＰＥＧ化剤が７０％しか活性でない場合は、使用されるＰＥＧ剤の量は、活性なＰＥＧ分子のみが、タンパク質からＰＥＧへの反応の化学量論で確実に考慮されるようにすべきである。ＰＥＧの反応性および質の判定方法については後述する。
【００５６】
ＩＶ．タンパク質およびペプチド
特定の実施形態では、本発明は、安定化アルギナーゼ多量体などの少なくとも１つのタンパク質またはペプチドを含む新規な組成物に関する。これらのペプチドは、融合タンパク質に含めても良いし、上述の作用物質に結合させても良い。
【００５７】
Ａ．タンパク質およびペプチド
本明細書で使用されるタンパク質またはペプチドは、一般に、限定されるものではないが、約２００を超えるアミノ酸から、ある遺伝子から翻訳された完全長の配列までのタンパク質；約１００のアミノ酸を超えるポリペプチド；および／または約３〜約１００のアミノ酸のペプチドを指す。便宜上、語「タンパク質」、「ポリペプチド」、および「ペプチド」は、本明細書では同義的に使用される。
【００５８】
特定の実施形態では、少なくとも１つのタンパク質またはペプチドのサイズは、限定されるものではないが、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、約１１０、約１２０、約１３０、約１４０、約１５０、約１６０、約１７０、約１８０、約１９０、約２００、約２１０、約２２０、約２３０、約２４０、約２５０、約２７５、約３００、約３２５、約３５０、約３７５、約４００、約４２５、約４５０、約４７５、約５００、約５２５、約５５０、約５７５、約６００、約６２５、約６５０、約６７５、約７００、約７２５、約７５０、約７７５、約８００、約８２５、約８５０、約８７５、約９００、約９２５、約９５０、約９７５、約１０００、約１１００、約１２００、約１３００、約１４００、約１５００、約１７５０、約２０００、約２２５０、約２５００、またはそれ以上のアミノ酸残基を含み得る。
【００５９】
本明細書で使用される「アミノ酸残基」は、自然に発生するあらゆるアミノ酸、あらゆるアミノ酸誘導体、または当技術分野で周知のあらゆるアミノ酸模倣体を指す。特定の実施形態では、タンパク質またはペプチドの残基は、アミノ酸残基の配列を中断する非アミノ酸を一切含まず連続している。別の実施形態では、配列は、１つ以上の非アミノ酸部分を含み得る。特定の実施形態では、タンパク質またはペプチドの残基の配列は、１つ以上の非アミノ酸残基によって中断され得る。
【００６０】
したがって、語「タンパク質またはペプチド」は、自然に発生するタンパク質に見られる２０の通常のアミノ酸の少なくとも１つ、または限定されるものではないが、以下の表１に示されるものを含む少なくとも１つの修飾もしくは非通常アミノ酸を含むアミノ酸配列を包含する。
【００６１】
【表１】
2014036676.tif 000002
タンパク質またはペプチドは、標準的な分子生物学技術によるタンパク質、ポリペプチド、もしくはペプチドの発現、天然源からのタンパク質もしくはペプチドの単離、またはタンパク質もしくはペプチドの化学合成を含む、当業者に知られた任意の技術によって作製され得る。様々な遺伝子に一致するヌクレオチド、タンパク質、ポリペプチド、およびペプチド配列が、既に開示されており、当業者に知られた電子化されたデータベースで見ることができる。１つのこのようなデータベースは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ’ｓ  ＧｅｎｂａｎｋおよびＧｅｎＰｅｐｔデータベース（ウェブサイト：ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／で閲覧可能）である。既知の遺伝子のコード領域は、本明細書に開示された技術または当業者がわかるであろう技術を用いて増幅および／または発現され得る。あるいは、タンパク質、ポリペプチド、およびペプチドの様々な市販の調製物が当業者に知られている。
【００６２】
Ｂ．核酸およびベクター
本発明の特定の態様では、安定化多量体アルギナーゼとしての融合タンパク質をコードする核酸配列が開示され得る。どの発現系が使用されるかによって、核酸配列が、従来の方法に基づいて選択され得る。例えば、ヒトアルギナーゼＩおよびＩＩは、発現を妨げ得る大腸菌で稀にしか使用されない多数のコドンを含むため、それらの各遺伝子または変異体は、大腸菌発現にコドンが最適化され得る。様々なベクターも、融合多量体アルギナーゼまたはシステイン置換アルギナーゼなどの目的のタンパク質を発現させるために使用され得る。例示的なベクターとして、限定されるものではないが、プラスミドベクター、ウイルスベクター、トランスポゾンまたはリポソームをベースとするベクターが挙げられる。
【００６３】
Ｃ．宿主細胞
本発明に有用な宿主細胞、好ましくは真核細胞は、アルギナーゼおよびその融合多量体の発現および分泌を可能にするために形質転換され得るあらゆるものである。宿主細胞は、細菌、哺乳動物細胞、酵母、または糸状菌であり得る。様々な細菌には、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａおよびＢａｃｉｌｌｕｓが含まれる。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｋｉｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ属、またはＰｉｃｈｉａ属に属する酵母は、適切な宿主細胞としての使用が見つかるであろう。糸状菌の様々な種は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ属、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属、Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ属、Ａｃｈｌｙａ属、Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ属、Ｅｎｄｏｔｈｉａ属、Ｍｕｃｏｒ属、Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ属、およびＰｙｒｉｃｕｌａｒｉａ属を含め、発現宿主として使用され得る。
【００６４】
使用可能な生物の例として、細菌、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＭＣ１０６１、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＢＲＢ１の誘導体（Ｓｉｂａｋｏｖら、１９８４）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ＳＡＩ１２３（Ｌｏｒｄａｎｅｓｃｕ、１９７５）、またはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ（Ｈｏｐｗｏｏｄら、１９８５）；酵母、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＡＨ２２（Ｍｅｌｌｏｒら、１９８３）、およびＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ；糸状菌、例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ（Ｗａｒｄ、１９８９）、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ（Ｐｅｎｔｔｉｌａら、１９８７；Ｈａｒｋｋｉら、１９８９）が挙げられる。
【００６５】
哺乳動物宿主細胞の例として、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ−Ｋ１；ＡＴＣＣ  ＣＣＬ６１）、ラット下垂体細胞（ＧＨ１；ＡＴＣＣ  ＣＣＬ８２）、ＨｅＬａ  Ｓ３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ２．２）、ラット肝細胞癌細胞（Ｈ−４−ＩＩ−Ｅ；ＡＴＣＣＣＲＬ  １５４８）、ＳＶ４０−形質転換サル腎細胞（ＣＯＳ−１；ＡＴＣＣ  ＣＲＬ
１６５０）、およびマウス胚細胞（ＮＩＨ−３Ｔ３；ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５８）が挙げられる。上記は、例示目的であり、当技術分野で知られた多くの可能な宿主生物が限定されるものではない。原則として、原核生物または真核生物にかかわらず、分泌可能なすべての宿主が使用され得る。
【００６６】
アルギナーゼおよび／またはそれらの融合多量体を発現する哺乳動物宿主細胞が、親細胞系の培養に典型的に利用される条件下で培養される。一般に、細胞は、生理的塩類および栄養分、例えば、標準的なＲＰＭＩ、ＭＥＭ、ＩＭＥＭ、またはＤＭＥＭを含み、典型的には、５〜１０％血清、例えば、ウシ胎児血清などが添加された標準培地で培養される。培養条件も標準であり、例えば、培養物が、所望のレベルのタンパク質に達するまで静置培養またはローラー培養で、３７℃でインキュベートされる。
【００６７】
Ｄ．タンパク質精製
タンパク質精製技術は、当業者に周知である。このような技術では、あるレベルで、細胞、組織または器官を均質化および粗分画し、ポリペプチド画分および非ポリペプチド画分にする。目的のタンパク質またはポリペプチドは、特段の記載がなければ、部分精製または完全精製（または均一精製）に達するまでクロマトグラフ法および電気泳動法でさらに精製され得る。純粋なペプチドの調製に特に適した分析法は、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル排除クロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、アフィニティークロマトグラフィー、免疫親和性クロマトグラフィー、および等電点電気泳動である。ペプチドを精製する特に有効な方法は、高速液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）またはさらに高速の液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）である。
【００６８】
精製タンパク質または精製ペプチドは、他の成分から単離可能な組成物を指すものであり、精製タンパク質または精製ペプチドは、その自然で得られる状態に対して任意の程度まで精製されたものである。したがって、単離もしくは精製タンパク質または単離もしくは精製ペプチドは、タンパク質またはペプチドが自然に発生し得る環境から分離されたタンパク質またはペプチドも指す。一般に、「精製された」は、分画されて様々な他の成分が除去されたタンパク質またはペプチド組成物を指し、このような組成物は、発現された生物活性を実質的に維持している。語「実質的に精製された」が本明細書で使用される場合、この語は、タンパク質またはペプチドが、組成物の主成分を形成する、例えば、タンパク質が組成物の約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、またはこれ以上を構成する組成物を指す。
【００６９】
タンパク質精製の使用に適した様々な技術は、当業者には周知である。このような技術として、例えば、硫酸アンモニウム、ＰＥＧ、および抗体などを用いた沈殿、または熱変性、これに続く遠心分離；クロマトグラフィーステップ、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、およびアフィニティークロマトグラフィー；等電点電気泳動；ゲル電気泳動；ならびにこれらおよび他の技術の組み合わせが挙げられる。当技術分野で一般に知られているように、様々な精製ステップを行う順序を変更することができ、または特定のステップが省略されても、実質的に精製されたタンパク質またはペプチドの調製に適した方法となり得ると考えられている。
【００７０】
タンパク質またはペプチドの精製の程度を定量するための様々な方法は、本開示に照らして、当業者には知られている。このような方法には、例えば、活性画分の特定の活性を決定すること、またはＳＤＳ／ＰＡＧＥ分析によって画分内のポリペプチドの量を評価することが含まれる。画分の純度を評価する好ましい方法では、画分の特定の活性を計算し、それを初期抽出物の特定の活性と比較し、これにより画分中の純度の程度を計算し、「整数倍の精製」によって評価する。活性の量を表すために使用される実際の単位は、もちろん、発現されたタンパク質またはペプチドが検出可能な活性を示すか否かにかかわらず、精製の後に選択される特定のアッセイ技術によって決まる。
【００７１】
タンパク質またはペプチドが常に最も精製された状態で提供されるべきであるという一般要件は存在しない。実際、実質的にあまり精製されていない産物が特定の実施形態で有用であり得ることも企図される。部分精製は、少ない精製ステップの組み合わせを使用することよって、または同じ一般的な精製スキームの異なる形態を利用することによって達成され得る。例えば、ＨＰＬＣ装置を利用して行われる陽イオン交換カラムクロマトグラフィーは、一般に、低圧クロマトグラフィー系を利用する同じ技術よりも「整数倍」高い精製をもたらす。低度の相対精製を示す方法は、タンパク質産物の完全な回復または発現されたタンパク質の活性の維持に有利であり得る。
【００７２】
特定の実施形態では、タンパク質またはペプチドは、単離または精製された、例えば、安定化アルギナーゼ多量体融合タンパク質、またはＰＥＧ化の前もしくは後のアルギナーゼであり得る。例えば、Ｈｉｓタグまたは親和性エピトープは、精製を容易にするためにこのようなアルギナーゼ変異体に含まれ得る。アフィニティークロマトグラフィーは、単離される物質とこの物質が特異的に結合し得る分子との間の特異的親和性に依存するクロマトグラフィー処理である。これは、レセプター−リガンド型の相互作用である。カラム材料は、１つの結合パートナーと不溶性マトリックスの共有結合によって合成される。次いで、カラム材料は、溶液から物質を特異的に吸収することができる。結合が生じない条件に条件を変更することによって溶出が起こる（例えば、ｐＨ、イオン強度、温度などの変更）。マトリックスは、それ自体が有意な程度までは分子を吸収せず、かつ広範囲の化学安定性、物理的安定性、および熱安定性を有する物質とすべきである。リガンドは、その結合特性に影響を与えないように結合されるべきである。リガンドはまた、比較的強い結合を提供すべきである。そして、リガンドは、試料またはリガンドを破壊せずに物質の溶出を可能とすべきである。
【００７３】
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）は、溶液中の分子が、そのサイズ、技術的用語では、その流体力学的容積に基づいて分離されるクロマトグラフィー法である。サイズ排除クロマトグラフィーは、通常は、タンパク質および産業用ポリマーなどの大きい分子または巨大分子複合体に適用される。典型的には、カラムに試料を通すために水溶液が使用される場合、この技術は、有機溶媒が移動相として使用される場合に使用されるゲル透過クロマトグラフィーという名称に対して、ゲルろ過クロマトグラフィーとして知られている。
【００７４】
ＳＥＣの基本原理は、異なるサイズの粒子が、異なる速度で固定相から溶出（ろ過）されることである。これにより、サイズに基づいて溶液の粒子が分離される。すべての粒子が、同時またはほぼ同時に添加されるのであれば、同じサイズの粒子は、一緒に溶出するはずである。各サイズ排除カラムは、広範囲の分子量を分離できる。排除限界は、この範囲の上限の分子量を規定し、分子が固定相に捕捉されるには大きすぎる場合である。透過限界は、分離の範囲の下限の分子量を規定し、十分に小さいサイズの分子が固定相の孔の中に完全に浸透することができ、かつこの分子量未満のすべての分子が１つのバンドとして溶出するほど小さい場合である。
【００７５】
高速液体クロマトグラフィー（または高圧液体クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ）は、化合物を分離、同定、および定量するために生化学および分析化学で頻繁に使用されるカラムクロマトグラフィーの形態である。ＨＰＬＣは、クロマトグラフィー充填材量（固定相）を保持するカラム、移動相（複数可）をカラムに通すポンプ、および分子の保持時間を示す検出器を利用する。保持時間は、固定相と分析される分子と使用される溶媒（複数可）との間の相互作用によって変化する。
【００７６】
Ｖ．医薬組成物
本発明の新規なアルギナーゼが、腫瘍の細胞増殖を抑制するため、最も好ましくは局所的に進行した癌または転移癌の患者の癌細胞を死滅させるために、全身投与または局所投与され得ることも企図される。本発明の新規なアルギナーゼは、静脈内投与、くも膜下腔内投与、および／または腹腔内投与され得る。本発明の新規なアルギナーゼは、単独投与または抗増殖剤と併用投与され得る。一実施形態では、本発明の新規なアルギナーゼは、外科手術または他の処理の前に患者の癌負荷を軽減するために投与される。あるいは、本発明の新規なアルギナーゼは、あらゆる残った癌（例えば、外科手術で排除できなかった癌）が生き延びないように外科手術後に投与され得る。
【００７７】
本発明が、治療製剤の特定の性質によって限定されることを意図するものではない。例えば、このような組成物は、生理的に認容され得る液体担体、ゲル担体、または固体担体、希釈剤、および賦形剤と共に製剤に含められ得る。このような治療製剤は、家畜動物などに獣医学的に使用するため、および他の治療薬と同様の方法でヒトに臨床上使用するために哺乳動物に投与され得る。一般に、治療効果に必要な用量は、使用の種類および投与方法、ならびに個々の対象の個別要件によって様々である。
【００７８】
このような組成物は、典型的には、注射可能となるように溶液または懸濁液として調製される。適切な希釈剤および賦形剤として、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、またはグリセロールなど、およびこれらの組み合わせが挙げられる。加えて、所望に応じて、組成物は、湿潤剤または乳化剤、安定化剤またはｐＨ緩衝剤などの補助物質を少量含み得る。
【００７９】
臨床適用が企図される場合、医薬組成物を、発現ベクター、ウイルスストック、タンパク質、抗体、および薬物などの目的の適用に適切な形態で調製する必要があり得る。一般に、本発明の医薬組成物は、薬学的に許容され得る担体中に溶解または分散された有効量の１つ以上のアルギナーゼ変異体または追加の作用物質を含む。句「薬学的または薬理学的に許容され得る」は、必要に応じて、例えば、ヒトなどの動物に投与されたときに、有害反応、アレルギー反応、または他の不所望の反応を引き起こさない分子実体および組成物を指す。少なくとも１つのアルギナーゼ変異体、例えば、本明細書に開示される方法によって単離される安定化多量体アルギナーゼもしくはＰＥＧ化アルギナーゼなどの少なくとも１つのアルギナーゼ変異体または追加の活性成分を含む医薬組成物の調製は、参照により本明細書に組み入れられるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ
Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版、１９９０年によって実証されているように、本開示に照らして当業者には明らかであろう。さらに、動物（例えば、ヒト）への投与の場合、製剤は、ＦＤＡ事務局の生物学的基準によって要求される無菌性、発熱性、全体的な安全性、および純度の基準を満たすべきであることを理解されたい。
【００８０】
本明細書で使用される「薬学的に許容され得る担体」として、当業者はわかるであろう、あらゆる溶媒、分散媒、コーティング、界面活性剤、抗酸化剤、防腐剤（例えば、抗菌剤、抗真菌剤）、等張剤、吸収遅延剤、塩、防腐剤、薬物、薬物安定剤、ゲル、結合剤、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、甘味剤、芳香剤、染料、このような同様の材料、およびこれらの組み合わせが挙げられる（例えば、参照により本明細書に組み入れられるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版、１９９０年を参照されたい）。どの従来の担体も活性成分と適合しない場合を除き、医薬組成物での従来の担体の使用が企図される。
【００８１】
本発明は、固体、液体、またはエアロゾルの形態で投与されるか否か、および注射の投与経路が無菌である必要があるか否かによって異なる種類の担体を含み得る。本発明は、当業者はわかるであろう、静脈内投与、皮内投与、経皮投与、くも膜下腔内投与、動脈内投与、腹腔内投与、鼻腔内投与、膣内投与、直腸内投与、局所投与、筋肉内投与、皮下投与、粘膜投与、経口投与、局所投与、局在投与、吸入（例えば、エアロゾル吸入）投与、注射投与、注入投与、連続注入投与、直接投与、カテーテルを介した投与、洗浄液を介した投与、脂質組成物（例えば、リポソーム）に含める投与、もしくは他の方法による標的細胞の局所灌流浴投与、または上記の任意の組み合わせ投与によって投与され得る（例えば、参照により本明細書に組み入れられるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版、１９９０年を参照されたい）。
【００８２】
アルギナーゼ変異体は、遊離塩基、中性、または塩の形態で組成物に調製され得る。薬学的に許容され得る塩として、酸付加塩、例えば、タンパク様組成物の遊離アミノ基で形成された酸付加塩、あるいは、例えば、塩酸もしくはリン酸などの無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、もしくはマンデル酸などの有機酸で形成された酸付加塩が挙げられる。遊離カルボキシル基で形成された塩は、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、もしくは水酸化第二鉄などの無機塩基；またはイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、もしくはプロカインなどの有機塩基にも由来し得る。処方時に、溶液は、投与製剤に適合する方法で、治療効果のある量で投与される。製剤は、注射用溶液または肺送達用のエアロゾルなどの非経口投与用に処方された、または薬物放出カプセルなどの栄養投与用に処方された様々な剤形で容易に投与される。
【００８３】
さらに、本発明によると、投与に適した本発明の組成物は、不活性希釈剤を用いるまたは用いずに薬学的に許容され得る担体で提供される。この担体は、吸収可能とすべきであり、この担体には、液体担体、半固体担体、すなわちペースト、または固体担体が含まれる。どの従来の媒体、作用物質、希釈剤、または担体も、レシピエントに対して、またはその内部に含められる組成物の治療効果に対して有害である場合を除き、本発明の方法の実施に使用される投与可能な組成物でのその使用は適切である。担体または希釈剤の例として、脂肪、油、水、食塩水、脂質、リポソーム、樹脂、結合剤、および充填剤など、またはこれらの組み合わせが挙げられる。組成物は、１つ以上の成分の酸化を遅延させる様々な抗酸化剤も含み得る。加えて、微生物の作用の防止が、限定されるものではないが、パラベン（例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン）、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール、またはこれらの組み合わせを含む様々な抗菌剤および抗真菌剤などの防腐剤によってもたらされ得る。
【００８４】
本発明によると、組成物は、任意の便利かつ実施可能な方法で、すなわち溶液、懸濁液、乳化、混合、被包、および吸収などによって担体と組み合わせられる。このような処理は、当業者にとってルーチンである。
【００８５】
本発明の特定の実施形態では、組成物は、半固体担体または固体担体と完全に組み合わせまたは混合される。混合は、粉砕などの任意の従来の方法で行われ得る。安定化剤も、組成物の治療活性の喪失、すなわち胃での変性から組成物を保護するために混合プロセスで添加され得る。組成物中に使用される安定化剤の例として、緩衝液、グリシンおよびリシンなどのアミノ酸、デキストロース、マンノース、ガラクトース、フルクトース、ラクトース、スクロース、マルトース、ソルビトール、マンニトールなどの炭水化物が挙げられる。
【００８６】
さらなる実施形態では、本発明は、アルギナーゼ変異体、１つ以上の脂質、および水性溶媒を含む医薬脂質ビヒクル組成物の使用に関し得る。本明細書で使用される語「脂質」は、水中で特徴的に不溶性であり、かつ有機溶媒で抽出可能である広範囲の物質のいずれも含むと定義される。化合物のこの広い分類は、当業者に周知であり、本明細書で使用される語「脂質」は、特定の構造に限定されるものではない。例として、長鎖脂肪族炭化水素およびその誘導体を含む化合物が挙げられる。脂質は、自然発生または合成（すなわち、人間によってデザインまたは生産される）であり得る。しかし、脂質は、通常は生物学的物質である。生物学的脂質は、当技術分野で周知であり、生物学的脂質には、例えば、中性脂肪、リン脂質、ホスホグリセリド、ステロイド、テルペン、リゾ脂質、スフィンゴ糖脂質、糖脂質、スルファチド、エーテルおよびエステル結合脂肪酸を備えた脂質、重合可能な脂質、およびこれらの組み合わせが含まれる。もちろん、当業者によって脂質として理解されている本明細書に具体的に記載される化合物以外の化合物も、本発明の組成物および方法に包含される。
【００８７】
当業者であれば、脂質ビヒクル中に組成物を分散させるために利用され得る様々な技術を熟知しているであろう。例えば、安定化多量体アルギナーゼまたはＰＥＧ化アルギナーゼが、脂質を含む溶液中に分散され得る、脂質で溶解され得る、脂質で乳化され得る、脂質と混合され得る、脂質と組み合わせられ得る、脂質と共有結合され得る、脂質中に懸濁物として含められ得る、ミセルまたはリポソームに含められるか複合体化され得る、または当業者に周知の任意の手段によって脂質もしくは脂質構造に他の方法で結合され得る。分散は、リポソームの形成をもたらしても、もたらさなくても良い。
【００８８】
動物患者に投与される本発明の組成物の実際の用量は、体重、状態の重症度、処置される疾患の種類、過去または現在の治療介入、患者の突発性疾患、および投与経路などの身体的および生理的要因によって決定され得る。用量および投与経路によって、好ましい用量および／または有効量の投与回数は、対象の応答によって異なり得る。投与に責任がある実施者が、いずれの場合も、組成物中の活性成分（複数可）の濃度および個々の対象の適切な用量（複数可）を決定する。
【００８９】
特定の実施形態では、医薬組成物は、例えば、少なくとも約０．１％の活性化合物を含み得る。他の実施形態では、活性化合物は、単位重量の約２％〜約７５％、例えば、約２５％〜約６０％を含み得、この中の任意の範囲であり得る。当然、治療に有用な各組成物中の活性化合物（複数可）の量は、適当な用量が化合物のどの単位用量でも得られるように調製され得る。溶解度、生物学的利用能、生物学的半減期、投与経路、製品の保存可能期間、および他の薬学的考慮事項などの因子が、このような医薬製剤の調製分野の技術者によって検討されるため、様々な投薬量および処置計画が望ましいであろう。
【００９０】
他の制限目的ではない例では、用量は、１回の投与で、体重１ｋｇ当たり約１μｇ、約５μｇ、約１０μｇ、約５０μｇ、約１００μｇ、約２００μｇ、約３５０μｇ、約５００μｇ、約１ｍｇ、約５ｍｇ、約１０ｍｇ、約５０ｍｇ、約１００ｍｇ、約２００ｍｇ、約３５０ｍｇ、約５００ｍｇ〜約１０００ｍｇまたはこれ以上を含み得、この中の任意の範囲であり得る。本明細書に列記される数値から導き出される範囲の限定目的ではない例では、体重１ｋｇ当たり約５ｍｇ〜約１００ｍｇ、約５μｇ〜約５００ｍｇなどが、上述の数値に基づいて投与され得る。
【００９１】
ＶＩＩ．定義
語「ａａ」は、アミノ酸（複数可）を指す。アミノ酸置換は、文字コード（数字の前の文字が置換されたアミノ酸を指し、その数字の後の文字が導入されたアミノ酸を指す）を用いて分子におけるアミノ酸位置、例えば、３０３によって示される。
【００９２】
タンパク質について述べられる場合、本明細書で使用される語「部分」（「所定のタンパク質の部分」のように）は、そのタンパク質の断片を指す。断片は、４つのアミノ酸残基から、全アミノ酸残基から１つのアミノ酸を減じたアミノ酸残基数までの範囲のサイズであり得る。
【００９３】
本明細書で使用される語「タンパク質」および「ポリペプチド」は、ペプチド結合によって結合されたアミノ酸を含む化合物を指し、同義的に使用される。
【００９４】
本明細書で使用される語「融合タンパク質」は、外来性タンパク質断片（非アルギナーゼタンパク質からなる融合パートナー）に結合された（または機能的に連結された）目的のタンパク質（すなわち、ヒトアルギナーゼまたはその変異体）を含むキメラタンパク質を指す。融合パートナーは、血清半減期、溶解度、またはこれらの両方を向上させ得る。融合パートナーは、宿主細胞、培養上清、またはこれらの両方からの組み換え融合タンパク質の精製を可能にする親和性タグ（例えば、ｈｉｓタグ）も提供し得る。
【００９５】
語「機能的組み合わせで」、「機能的順序で」、および「機能的に連結された」は、所定の遺伝子の転写および／または望ましいタンパク質分子の合成を導くことができる核酸分子が産生されるような核酸配列の連結を指す。この語はまた、機能的タンパク質が産生されるようなアミノ酸配列の連結も指す。
【００９６】
本明細書で使用される語「Ｋｍ」は、酵素のミカエリス−メンテン（Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｏｎ）定数を指し、所定の酵素が酵素触媒反応でその最大速度を半分にする特定の基質の濃度として定義される。
【００９７】
本明細書で使用される語、ｋｃａｔは、ターンオーバー数、または各酵素部位が単位時間当たりに産物に変換し、酵素が最大の効率で機能する基質分子の数を指す。
【００９８】
本明細書で使用される語、Ｋｃａｔ／Ｋｍは、酵素が基質を産物に変換する効率の指標である特異性定数である。
【００９９】
語「Ｍｎ−ｈＡｒｇＩ」は、Ｍｎ（ＩＩ）補因子を備えたヒトアルギナーゼＩを指す。語「Ｃｏ−ｈＡｒｇＩ」は、Ｃｏ（ＩＩ）補因子を備えたヒトアルギナーゼＩ（突然変異体または天然型）を指す。
【０１００】
語「ＩＣ５０」は、最大の半分（５０％）の阻害濃度（ＩＣ）であり、このため有効性の指標である。
【０１０１】
語「ＰＥＧ化」は、薬物担体として広く使用されて高い生体適合性および修飾の易化をもたらすポリエチレングリコール（ＰＥＧ）との結合を指す（Ｈａｒｒｉｓら、２００１）。様々な薬物、タンパク質、およびリポソームへの付加は、滞留時間を改善し、毒性を低下させることが示されている（Ｇｒｅｅｎｗａｌｄら、２０００；Ｚａｌｉｐｓｋｙら、１９９７）。ＰＥＧは、鎖の末端のヒドロキシル基を介して、および他の化学法によって活性剤に結合（例えば、共有結合）され得るが、ＰＥＧ自体は、１分子当たり最大でも２つの活性剤に制限されている。異なる手法では、ＰＥＧとアミノ酸のコポリマーが、ＰＥＧの生体適合性特性を維持し得、しかも１分子当たり多数の付加点（優れた薬物負荷を提供する）というさらなる利点を有する新規な生体材料として開発され、この新規な生体材料は、様々な用途に適するように合成的にデザインされ得る（Ｎａｔｈａｎら、１９９２；Ｎａｔｈａｎら、１９９３）。
【０１０２】
語「遺伝子」は、ポリペプチドまたはその前駆体の産生に必要な制御配列およびコード配列を含むＤＮＡ配列を指す。ポリペプチドは、完全長コード配列によって、または望ましい酵素活性が維持される範囲のコード配列のあらゆる部分によってコードされ得る。
【０１０３】
語「対象」は、ヒトを含む動物を指す。
【０１０４】
語「野生型」は、自然発生源から単離されたときにその遺伝子または遺伝子産物の特徴を有する遺伝子または遺伝子産物を指す。野生型遺伝子は、ある集団で最も頻繁に観察される遺伝子であり、このため遺伝子の「標準」または「野生型」と自由裁量で命名される。対照的に、語「修飾された」、「変異体」、または「突然変異体」は、野生型遺伝子または遺伝子産物と比較した場合の配列中の修飾および／または機能的特性（すなわち、変更された特徴）を示す遺伝子または遺伝子産物を指す。自然発生する突然変異体が単離され得ることに留意されたい。これらは、野生型遺伝子または遺伝子産物と比較した場合に変更された特徴を有するという事実によって同定される。
【０１０５】
ＶＩＩＩ．キット
本発明は、治療キットなどのキットを提供する。例えば、キットは、本明細書に開示される１つ以上の医薬組成物および任意選択のその使用説明書を含み得る。キットは、このような組成物の投与を行うための１つ以上の装置も含み得る。例えば、対象用キットは、医薬組成物、およびこの医薬組成物の癌性腫瘍内への直接的な静脈注射を行うカテーテルを含み得る。他の実施形態では、対象用キットは、送達装置に使用するために任意選択で薬剤として製剤されるかまたは凍結乾燥された、安定化多量体アルギナーゼまたは単離されたＰＥＧ化アルギナーゼが予め充填されたアンプルを含み得る。
【０１０６】
キットは、ラベルが貼られた容器を含み得る。適当な容器として、例えば、ビン、バイアル、および試験管が挙げられる。容器は、ガラスやプラスチックなどの様々な材料から形成され得る。容器は、上記したような治療用途または非治療用途に有効な抗体を含む組成物を保持できる。容器のラベルは、組成物が特定の治療用途または非治療用途に使用されることを示し得、上記したようにｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏのいずれかでの使用の指示も示し得る。本発明のキットは、典型的には、上記した容器と、緩衝液、希釈剤、充填剤、針、シリンジ、および使用上の指示が書かれた添付文書を含め、商業的および使用者の観点から望ましい材料を含む１つ以上の他の容器を含む。
【実施例】
【０１０７】
ＩＸ．実施例
以下の実施例は、本発明の特定の好ましい実施形態および態様を例示する役割を果たし、本発明の範囲を限定すると解釈されるべきものではない。以下の実験の開示では、以下の略語の意味はカッコ内に示す通りである：ｅｑ（同等）；Ｍ（モル）；μＭ（マイクロモル）；ｍＭ（ミリモル）；Ｎ（正常）；ｍｏｌ（モル）；ｍｍｏｌ（ミリモル）；μｍｏｌ（マイクロモル）；ｎｍｏｌ（ナノモル）；ｇ（グラム）；ｍｇ（ミリグラム）；μｇ（マイクログラム）；Ｌ（リットル）；ｍｌ（ミリリットル）；μｌ（マイクロリットル）；ｃｍ（センチメートル）；ｍｍ（ミリメートル）；μｍ（マイクロメートル）；ｎｍ（ナノメートル）；ＥＣ（セ氏度）；ＭＷ（分子量）；ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）；ｍｉｎ（分）。
【０１０８】
実施例１
ヒトアルギナーゼＩおよびＩＩの遺伝子の合成および発現
ヒトアルギナーゼＩおよびＩＩ遺伝子の両方は、発現を妨げ得る、大腸菌で稀にしか利用されない複数のコドンを含む。したがって、大腸菌でのタンパク質の発現を最適化するために、各遺伝子は、ＤＮＡ−Ｗｏｒｋｓソフトウエアでデザインされたコドン最適化オリゴヌクレオチドで構築された（Ｈｏｏｖｅｒら、２００２）。各構築物は、Ｎ末端ＮｃｏＩ制限部位、インフレームＮ末端Ｈｉｓ６タグの後に続くＴａｂａｃｃｏ  Ｅｔｃｈ  Ｖｉｒｕｓ（ＴＥＶ）プロテアーゼ部位、およびクローニングを単純化するＣ末端ＢａｍＨＩ部位を含む。ＴＥＶプロテアーゼによる切断により、アルギナーゼのＮ末端ＭｅｔおよびＨｉｓ６ペプチドが除去される。アルギナーゼＩＩ遺伝子は、ＴＥＶプロテアーゼ切断部位を備え、最初の天然の２１のａａを備えないようにデザインされた。最初の２１のａａは、推定ミトコンドリア標的配列であり、その除去によりタンパク質の収量および安定性が増大する（Ｃｏｌｌｅｌｕｏｒｉら、２００１）。ｐＥＴ２８ａベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）へのクローニング後、適切なアルギナーゼ発現ベクターを含む大腸菌（ＢＬ２１）を、ＯＤ６００が０．５〜０．６に達するまで、２５０ｒｐｍで、振蘯フラスコ内で、５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＴｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ（ＴＢ）培地を用いて３７℃で増殖させた。その時点で、培養物を２５℃にし、０．５ｍＭ  ＩＰＴＧで誘導してさらに１２時間に渡ってタンパク質を発現させた。次いで、細胞ペレットを遠心分離によって収集し、ＩＭＡＣ緩衝液（１０ｍＭ  ＮａＰＯ４／１０ｍＭイミダゾール／３００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８）中に再懸濁した。フレンチプレス細胞破砕機（Ｆｒｅｎｃｈ
ｐｒｅｓｓｕｒｅ  ｃｅｌｌ）による溶解後、溶解物を４℃で２０分間、２０，０００×ｇで遠心分離し、得られた上清をコバルトまたはニッケルＩＭＡＣカラムに添加し、１０〜２０カラム容量のＩＭＡＣ緩衝液で洗浄し、次いでＩＭＡＣ溶出緩衝液（５０ｍＭ  ＮａＰＯ４／２５０ｍＭイミダゾール／３００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８）で溶出させた。望ましい二価金属陽イオンを、５０℃〜５５℃で１５分間、１０ｍＭ金属（ＣｏＣｌ２またはＭｎＳＯ４）とのインキュベーションによって組み入れ、次いで０．４５μｍシリンジフィルターによってろ過する。次いで、１０，０００ＭＷＣＯ遠心分離フィルター装置（Ａｍｉｃｏｎ）を用いて、タンパク質を、１００ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１０％グリセロール、ｐＨ７．４の溶液に数回、緩衝液交換した。次いで、アルギナーゼ酵素のアリコートを液体窒素で瞬間凍結させ、−８０℃で保存した。このように精製されたアルギナーゼは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクーマシー染色による評価で、＞９５％の均一性である（図２）。収量は、６Ｍグアニジン塩酸塩、２０ｍＭリン酸緩衝液の最終緩衝液濃度、ｐＨ６．５において計算された吸光係数、ε２８０＝２４，１８０Ｍ−１ｃｍ−１に基づいて１Ｌの培地当たり約２００ｍｇと計算される（Ｇｉｌｌおよびｖｏｎ  Ｈｉｐｐｅｌ、１９８９）。
【０１０９】
実施例２
アルギナーゼＩへの金属の組み入れおよび金属含量の決定
実施例１で述べたように、Ｍｎ２＋およびＣｏ２＋の組み入れは、アルギナーゼの精製、続く５０℃で１０分間の１０ｍＭ金属とのインキュベーションステップによって達成され得る。アルギナーゼ調製物の最終金属含量および同一性を決定するために、Ｍｎ−ｈＡｒｇＩ（１４５μＭ）、Ｃｏ−ｈＡｒｇＩ（１８２μＭ）、および関連する透析緩衝液（１００μＭ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．４）のタンパク質試料を２％硝酸で希釈し、誘導結合プラズマ質量分析（ＩＣＰ−ＭＳ、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｇｅｏｌｏｇｉｃａｌ
Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｅｘａｓ  ａｔ  Ａｕｓｔｉｎ）によって分析し、最終タンパク質試料の金属濃度から、透析緩衝液中に見られる金属の濃度を減じ、この値をタンパク質濃度で除して、タンパク質のコバルト、鉄、マンガン、および亜鉛の含量を定量した。タンパク質濃度を決定するために、アミノ酸配列に基づいてｈＡｒｇＩについて吸光係数を計算した（Ｇｉｌｌおよびｖｏｎ  Ｈｉｐｐｅｌ、１９８９）。アルギナーゼＩの全タンパク質濃度を、６Ｍグアニジン塩酸塩、２０ｍＭリン酸緩衝液の最終緩衝液濃度、ｐＨ６．５において計算されたε２８０＝２４，１８０Ｍ−１ｃｍ−１に基づいて計算した。比較のために、アルギナーゼ濃度も、基準としてＢＳＡの希釈液を用いるＢＣＡアッセイによって計算した。この方法を用いて、Ｃｏ２＋と共にインキュベートしたアルギナーゼ試料が、２．１±０．５等量Ｃｏおよび０．４±０．１等量Ｆｅを含み、検出可能な量のＺｎまたはＭｎを含まないことを見出した。Ｍｎ２＋と共にインキュベートした試料は、１．５±０．２等量Ｍｎおよび０．４±０．１等量Ｆｅを含み、検出可能な量のＺｎまたはＣｏを含まない。したがって、加熱インキュベーションは、コバルトの組み入れの効率的な方法である。
【０１１０】
実施例３
アルギナーゼＩＩへの金属の組み入れおよび金属含量の決定
アルギナーゼＩＩへの効率的な金属の組み入れは、ＯＤ６００が１に達するまで、最少培地でＡｒｇＩＩ遺伝子を含む大腸菌を培養することによって達成され、この時点で、タンパク質がさらに１２時間に渡って１ｍＭ  ＩＰＴＧおよび１００μＭ  ＣｏＣｌ２で発現された。アルギナーゼ調製物の最終金属含量および同一性を決定するために、Ｃｏ−ｈＡｒｇＩ（２９０μＭ）および関連する透析緩衝液（１００ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．４）のタンパク質試料を１％硝酸で希釈し、誘導結合プラズマ質量分析（ＩＣＰ−ＭＳ、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｇｅｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｅｘａｓ  ａｔ  Ａｕｓｔｉｎ）によって分析し、最終タンパク質試料の金属濃度から、透析緩衝液中に見られる金属の濃度を減じ、この値をタンパク質濃度で除して、タンパク質のコバルト、鉄、マンガン、および亜鉛の含量を定量した。タンパク質濃度を決定するために、アミノ酸配列に基づいてｈＡｒｇＩについて吸光係数を計算した（Ｇｉｌｌおよびｖｏｎ  Ｈｉｐｐｅｌ、１９８９）。アルギナーゼＩＩの全タンパク質濃度を、６Ｍグアニジン塩酸塩、２０ｍＭリン酸緩衝液の最終緩衝液濃度、ｐＨ６．５において計算されたε２８０＝２２，９００Ｍ−１ｃｍ−１に基づいて計算した。比較のために、アルギナーゼ濃度も、基準としてＢＳＡの希釈液を用いるＢＣＡアッセイによって計算した。この方法を用いて、Ｃｏ２＋と共に発現したアルギナーゼ試料が、１．３５±０．１等量Ｃｏおよび０．６３±０．１等量Ｆｅを含み、検出可能な量のＺｎまたはＭｎを含まないことを見出した。
【０１１１】
実施例４
生理的ｐＨにおけるコバルトアルギナーゼＩの定常状態動力学
λｍａｘが約５３０ｎｍの発色団を生成するために加熱された強酸、チオセミカルバジドおよびＦｅ３＋の存在下での尿素産物のジアセチルモノキシン（ｄｉａｃｅｔｙｌｍｏｎｏｘｉｎｅ：ＤＡＭＯ）誘導体を用いて、アルギナーゼによるＬ−アルギニンの加水分解の後の尿素産生をモニタリングした。色素構造は、明確には知られてはいないが、その反応は、Ｆｅ３＋イオンによって安定する可能性がある尿素／ウレイド（ｕｒｉｅｄｏ）およびＤＡＭＯの濃縮であると推論される（ＢｅａｌｅおよびＣｒｏｆｔ、１９６１）。０〜３００μＭ尿素で線形であり、検出下限が１〜２μＭである尿素のＡ５３０に対する標準曲線を作成した。Ｃｏ−ｈＡｒｇＩおよびＭｎ−ｈＡｒｇＩの定常状態動力学を、１００ｍＭ  Ｈｅｒｐｅｓ緩衝液、ｐＨ７．４、３７℃において、一定範囲のＬ−アルギニン濃度（０〜４０ｍＭ）に対して試験した。典型的には、反応は、加熱ブロックにおいて、３７℃で、１．５ｍｌエッペンドルフ管内で２００μＬを平衡化することによって行い、この反応は、３０秒間、酵素５μＬを添加して開始し、１２Ｎ  ＨＣｌ  １５μＬでクエンチした。次いで、反応液とブランク液を、発色剤（ＣＯＬＤＥＲ）（ＫｎｉｐｐおよびＶａｓａｋ、２０００）８００μＬと混合し、１５分間煮沸した。１０分間の冷却後、試料をキュベットに移し、分光光度計で、５３０ｎｍで読み取った。Ｌ−アルギニンは、補正が必要となるバックグラウンド吸光度を有するため、Ｌ−アルギニンブランク液を、使用するすべての濃度に含めた。次いで、得られたデータを、標準曲線から計算した、生成された産物のバックグラウンドおよび濃度について補正した。次いで、この結果を、使用した酵素の濃度および時間で除し、ν０／［Ｅ］を、基質濃度に対してプロットし、ミカエリス−メンテンの式に直接フィットさせた（図３）。ν０／［Ｅ］＝ｋｃａｔ＊［Ｓ］／（［Ｓ］＋ＫＭ）である。この方法では、Ｃｏ−ｈＡｒｇＩは、ｋｃａｔが３００±１２ｓ−１、ＫＭが２，３３０±２６０μＭ、ｋｃａｔ／ＫＭが１２９±２０ｍＭ−１ｓ−１のＭｎ−ｈＡｒｇＩと比較して、ｋｃａｔが２４０±１４ｓ−１、ＫＭが１９０±４０μＭ、ｋｃａｔ／ＫＭが１，２７０±３３０ｍＭ−１ｓ−１であった。生理的ｐＨでのコバルトの補因子としての使用により、特異性定数が１０倍に増加した。
【０１１２】
実施例５
生理的ｐＨにおけるコバルトアルギナーゼＩＩの定常状態動力学
実施例３に記載されているように精製され、実施例４に記載されているように特徴付けられたアルギナーゼＩＩは、ｋｃａｔが４８±２ｓ−１、ＫＭが２，９００±３００μＭ、ｋｃａｔ／ＫＭが１７±２ｍＭ−１ｓ−１であることが分かったＭｎ−ｈＡｒｇＩＩと比較して、ｋｃａｔが１８２±７ｓ−１、ＫＭが１２６±１８μＭ、ｋｃａｔ／ＫＭが１，４４０±２６０ｍＭ−１ｓ−１であることが分かった。生理的ｐＨでのコバルトの補因子としての使用により、アルギナーゼＩＩの特異性定数が８０倍に増加した。
【０１１３】
実施例６
アルギナーゼ活性およびクローンの順位付けについての９６ウェルプレートのスクリーニング
Ｌ−アルギニンのアルギナーゼ加水分解により、Ｌ−オルニチンおよび尿素を生成する。実施例３のＬ−アルギニン加水分解アッセイを、タンパク質突然変異体のライブラリーのスクリーニングおよび最も高いアルギナーゼ活性を筆頭とするクローンの順位付けに使用される、尿素の検出用の９６ウェルプレート形式に適合させた。活性の２倍を超える増加を示すクローンをさらなる特徴付けのために選択した。アッセイは、ウレイド産物検出に対して約５〜２００μＭのダイナミックレンジを有することを示した。手動スクリーニングによって１日に５００を超えるクローンを容易にスクリーニングすることができる。シグナル出力、すなわち色強度は、３つの主なパラメーター、すなわち特異性定数（ｋｃａｔ／ＫＭ）、酵素濃度［Ｅｎｚ］、および時間（ｔ）を反映する。必要に応じて、個々のクローンにおける酵素レベルをＥＬＩＳＡによって検出することができるが、一般に、アルギナーゼの酵素発現は、２倍未満で変化するため、発現の差は、重要な問題とはならない。
【０１１４】
５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含む１ウェルに付きＴＢ培地７５μＬを含む９６ウェル培養プレートに単一コロニーを入れた。次いで、これらの培養物をプレートシェーカーで、ＯＤ６００が０．８〜１に達するまで３７℃で増殖させ、２５℃まで冷却し、５０μｇ／ｍｌカナマイシンおよび０．５ｍＭ  ＩＰＴＧを含む培地７５μＬを追加した。約２時間、振蘯しながら２５℃で発現させ、次いで１ウェルに付き培地１００μＬを９６ウェル・アッセイ・プレートに移した。次いで、アッセイプレートを遠心分離して細胞をペレットにし、培地を除去し、１ウェルに付きＢ−ＰＥＲタンパク質抽出試薬（Ｐｉｅｒｃｅ）５０μＬを添加して細胞を溶解した。次いで、２００μＭ  Ｌ−アルギニン、１ｍＭ  ＣｏＣｌ２が溶解したｐＨ７．４の１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液を、１ウェルに付き５０μＬを添加し、３７℃で反応させた。約１〜２分反応させた後、１ウェルに付き発色剤１００μＬを添加し、プレートを処理した（ＫｎｉｐｐおよびＶａｓａｋ、２０００）。尿素産生能を有するコロニーは、λｍａｘが５３０ｎｍの明赤色色素を形成した。
【０１１５】
実施例７
コバルトアルギナーゼおよびマンガンアルギナーゼのｐＨ率依存
コバルトおよびマンガン置換アルギナーゼのｋｃａｔ／ＫＭのｐＨ依存を検査するために、定常状態動力学定数を広範囲のｐＨ値に対して決定した。濃度がそれぞれ１００ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ５〜５．５）、ＭＥＳ（ｐＨ６〜６．５）、ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７〜７．８）、Ｔｒｉｓ（ｐＨ８〜９）、Ｃａｐｓｏ（ｐＨ９〜１０．５）の緩衝液を使用した。すべての動力学を、３７℃で少なくとも３連で決定した。動力学データをミカエリス−メンテンの式にフィットさせた後、ｋｃａｔ／ＫＭ値を計算し、この値をヘンダーソン−ハッセルバルヒ（Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ−Ｈａｓｓｅｌｂａｃｈ）の式にフィットさせてｐＫａ値を決定した。３．５単位よりも近い２つのｐＫａ値に対するフィットがｙｍａｘを過小評価する傾向にあるため、シーゲル法（Ｓｅｇｅｌ’ｓ  ｍｅｔｈｏｄ）を用いてｋｃａｔ／ＫＭプロフィールの各縁についての補正ｐＫａ値を計算した（Ｓｅｇｅｌ、１９７５）。ｋｃａｔ／ＫＭのｐＨに対する調整フィットが、Ｃｏ−ｈＡｒｇＩが７．５±０．１の上昇縁ｐＫａおよび９．８±０．１の下降縁ｐＫａを有するベル型曲線になった。Ｍｎ−ｈＡｒｇＩもベル型曲線を有し、上昇縁ｐＫａ値が８．５±０．１であり、下降縁が１０．１±０．１の見かけｐＫａ値を示していた（図４）。Ｍｎ−ｈＡｒｇＩおよびＣｏ−ＡｒｇＩ酵素は、１ｐＨ単位のΔｐＫａ値を示した。Ｃｏ置換時のｐＫａのこのシフトは、特異性定数で観察された改善の多くを付与する可能性が高い。生理的ｐＨでは、Ｍｎ−ｈＡｒｇＩの７％とは対照的に、Ｃｏ−ｈＡｒｇＩの約４４％が、水酸化結合（ｈｙｄｒｏｘｉｄｅ  ｂｏｕｎｄ）を有するであろう。
【０１１６】
実施例８
位置３０３における突然変異の効果
変異誘発プライマー：順方向‘５−ｃｇａｔｃａｃｇｔｔａｇｃａＮＮＳｔｔｃｇｇｔｔｔａｇｃｃｃｇ（配列番号３）および逆方向‘５−ＣＧＧＧＣＴＡＡＡＣＣＧＡＡｓｎｎＴＧＣＴＡＡＣＧＴＧＡＴＣＧ（配列番号４）を用い、鋳型ＤＮＡとしてのｈＡｒｇＩ遺伝子および特異的末端プライマー：順方向‘５−ＧＡＴＡＴＡＣＣＡＴＧＧＧＴＴＣＴＴＣＴＣＡＣＣＡＴＣＡＴＣＡＣＣＡＣＣＡＣＡＧＣＴＣＴＧＧＣＧ（配列番号５）および逆方向‘５−ＣＧＡＡＴＴＣＧＧＡＴＣＣＴＣＡＣＴＴＣＧＧＴＧＧＡＴＴＣＡＧＡＴＡＡＴＣＡＡＴＴ（配列番号６）を用いて位置３０３におけるＮＮＳコドン飽和ライブラリーを構築し、スクリーニングした。ＰＣＲ産物をＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩで消化し、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用いてｐＥＴ２８ａベクターにライゲートした。得られたライゲーションで大腸菌（ＢＬ２１）を直接形質転換し、実施例４に記載されているように後のスクリーニングのためにＬＢ−カナマイシンプレートに蒔いた。最も高い活性を示すクローンを単離し、このＤＮＡを配列決定した。各酵素変異体を、実施例１に記載されているように精製し、実施例２に記載されているようにコバルトと共に加熱インキュベートした。すべてのタンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる評価で、＞９５％均一性まで精製した。アルギニン加水分解動力学を、１００ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ緩衝液、ｐＨ７．４において、３７℃の一定範囲のＬ−アルギニン濃度（０〜２ｍＭ）で決定し、得られたデータを、カレイダグラフでミカエリス−メンテンの式にフィットさせた。ＰｈｅまたはＩｌｅで置換されたＣｙｓ３０３がそれぞれ、野生型Ｃｏ−ｈＡｒｇＩと比較して、ｋｃａｔ／ＫＭの２倍および１．６倍の増加をもたらした。Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、およびＡｒｇ置換は、野生型の活性の約９０％を有していた。
【０１１７】
Ｃｙｓ３０３変異体は、以下のように３７℃で血清安定性についても試験した。精製された酵素を、１μＭの濃度でプールされたヒト血清（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ）に添加し、３７℃でインキュベートした。約２４時間ごとに、アリコートを取り出し、ｐＨ７．４の１００ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ緩衝液の１ｍＭ  Ｌ−アルギニンを加水分解する能力について３連で試験した。約４日後、得られたデータを、指数関数モデルまたはロジスティック減衰モデル（ｌｏｓｇｉｓｔｉｃ  ｄｅｃａｙ  ｍｏｄｅｌ）のいずれかにフィットさせて、Ｔ１／２値を計算した。野生型酵素の安定性を基準として用いて計算した結果、Ｔ１／２が３３±３時間であった。Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、およびＨｉｓで置換された酵素は、野生型の約半分しか安定でなかった。Ｍｎ−ｈＡｒｇＩ（白抜きの円）は、Ｔ１／２寿命が４．８±０．８時間である活性の指数関数的喪失を示した。対照的に、Ｃｏ−ｈＡｒｇＩ（黒塗りの円）は、見かけの第１のＴ１／２が６．１±０．６時間で、続く第２のＴ１／２が大幅に長い３７±３時間である活性の二相喪失を示した。
【０１１８】
実施例９
基質特異性
アルギニンの加水分解についての遺伝子操作されたヒトアルギナーゼの選択性を評価した。Ｃｏ−ｈＡｒｇＩ（１μＭ）または透析緩衝液を、２２０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．４において、３７℃で１２時間、すべての２０ａａ（各５ｍＭ）と共にインキュベートした。基準、コントロール、および実験用を、優れたピーク分離が得られるように流速を１／２に低下させて取得時間を２倍にした分離プロトコルのわずかな変更を除き、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（公開番号：５９８０−３０８８）に本質的に記載されているように、ＯＰＡおよびＦＭＯＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ）で誘導体化し、Ｃ１８逆相ＨＰＬＣカラム（Ａｇｉｌｅｎｔ）（５μｍ、４．６×１５０ｍｍ）で分離した。透析緩衝液と共にインキュベートした２０の基準アミノ酸は、高解像度の２０のピークを示し、Ｃｏ−ｈＡｒｇＩと共にインキュベートした２０の基準アミノ酸は、Ｌ−アルギニンピーク（ＲＴ＝１２．３分）が消失し、保持時間がＬ−オルニチンの保持時間（ＲＴ＝１８．８分）に一致する１つの新しいピークが出現した２０のピーク（図６）を示した。他のアミノ酸はいずれも、Ｃｏ−ｈＡｒｇＩによって影響を受けることが観察されなかった。
【０１１９】
実施例１０
変異体の高スループット精製および動力学的スクリーニング
一度に１ダースのタンパク質を迅速に精製し、高スループット酵素動力学的分析を行う少量精製スキームを開発した。ｈＡｒｇＩの培養物５０ｍｌを、実施例１に記載されているように１２５ｍｌ振蘯フラスコで発現させた。得られた培養物５ｍｌを遠心分離によって収集した。次いで、細胞ペレットをＢ−ＰＥＲタンパク質抽出試薬（Ｐｉｅｒｃｅ）４００μＬで溶解した。可溶性画分を、１．５ｍｌエッペンドルフ管内でＩＭＡＣ溶解緩衝液５００μＬおよびＩＭＡＣビーズ１００μＬと混合し、２分間インキュベートし、卓上型遠心分離機で、３０００ｒｐｍで２０秒遠心分離した。上清を廃棄し、ビーズを混合／遠心分離によるＩＭＡＣ溶解緩衝液１ｍｌで２回洗浄し、上清を廃棄した。次いで、ｈＡｒｇＩを、ＩＭＡＣ溶出緩衝液３００μＬの添加および別の遠心分離ステップによってビーズから溶出した。得られたｈＡｒｇＩを含む上清を、１０，０００ＭＷＣＯ遠心分離濃縮装置（ＹＭ−１０  Ａｍｉｃｏｎ）を用いて、１００ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．４の緩衝液で緩衝液交換を２回行った。次いで、タンパク質をＡ２８０によって定量し、上記したようにコバルトの存在下で加熱し、得られたＣｏ−ｈＡｒｇＩを、実施例１に記載されているようにＳＤＳ−ＰＡＧＥによって評価した。この方法では、約２時間で１２〜１６のタンパク質の精製が可能であり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる評価で９０〜９５％純度のタンパク質２００〜３００μｇの収量である。
【０１２０】
次いで、酵素変異体を、マイクロタイター・プレート・ウェルでの２４ｎＭ酵素の２００μＭ  Ｌ−アルギニンとのインキュベーションによりＬ−アルギニンを加水分解する能力について試験した。アリコートを様々な時点で収集し、酸性発色試薬（ＣＯＬＤＥＲ）に直接クエンチした。色素を生成し、吸光度を読み取った後、プログレス曲線データを指数関数の式にフィットさせて見かけのｋｃａｔ／ＫＭ値を推定した。
【０１２１】
実施例１１
最適な活性化のためのアルギナーゼの第２のシェル金属リガンドの遺伝子操作
メタロヒドロラーゼ（ｍｅｔａｌｌｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ）の触媒能力は、水の正常ｐＫａ値（約１６）を大幅に低い値に下げ、基質を攻撃する高反応性水酸化物イオンを配位結合する顕著な能力に部分的に起因する。金属の種類ならびに第１および第２のシェルリガンドを含むその局所環境の両方が、求核水／水酸化物分子のｐＫａ値に影響を及ぼす（ＣｈｒｉｓｔｉａｎｓｏｎおよびＣｏｘ、１９９９）。ｈＡｒｇＩの金属（Ａ）は、Ｈ１０１のイミダゾールに配位結合され、Ｈ１０１は、Ｓ２３０のヒドロキシルに水素結合されている。ｈＡｒｇＩの金属（Ｂ）は、Ｈ１２６のイミダゾールに配位結合され、Ｈ１２６は、Ｄ１８１のカルボキシルに水素結合した第２のシェルを有する。位置１８１および２３０におけるＮＮＳコドン飽和ライブラリーを、変異誘発プライマー：（Ｄ１８１）順方向‘５−ｃａｔｔｇｇｃｔｔａｃｇｔＮＮＳｇｔｃｇａｃｃｃａｇｇ（配列番号７）、逆方向‘５−ＣＣＴＧＧＧＴＣＧＡＣＳＮＮＡＣＧＴＡＡＧＣＣＡＡＴＧ（配列番号８）；（Ｓ２３０）順方向‘５−ｃｇｔｃｃａａｔｃｃａｔｃｔｇＮＮＳｔｔｃｇａｔｇｔｔｇａｃｇ（配列番号９）、逆方向‘５−ＣＧＴＣＡＡＣＡＴＣＧＡＡＳＮＮＣＡＧＡＴＧＧＡＴＴＧＧＡＣＧ（配列番号１０）、ならびにｈＡｒｇＩ遺伝子および特異的末端プライマーを用いてオーバーラップ伸長ＰＣＲによって構築した。クローニング後、このライブラリーで大腸菌（ＢＬ２１）を形質転換し、実施例４に記載されているようにスクリーニングした。新規なクローンを配列決定によって同定し、大腸菌（ＢＬ２１）を再び形質転換し、実施例８に記載されているように精製し、動力学的に特徴付けた。見かけの活性≧野生型を示す変異体を、大量に精製し、これらの定常状態の動力学的パラメーター、ｋｃａｔおよびＫＭについてアッセイした。変異体：ｈＡｒｇＩ  Ｄ１８１Ｓ：１４２０±２００ｓ−１ｍＭ−１：ｈＡｒｇＩ  Ｄ１８１Ｅ／Ｓ２３０Ａ：１，４５０±２００ｓ−１ｍＭ−１、ｈＡｒｇＩ  Ｓ２３０Ｃ：２，２９０±２００ｓ−１ｍＭ−１、およびｈＡｒｇＩ  Ｓ２３０Ｇ：２，３４０±７０ｓ−１ｍＭ−１は、Ｃｏ−ｈＡｒｇＩよりも高いｋｃａｔ／ＫＭ定数を有することが分かった。
【０１２２】
実施例１２
肝細胞癌細胞および転移性メラノーマに対するＣｏ−Ａｒｇおよびその変異体の細胞毒性
遺伝子操作アルギナーゼのｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞毒性を試験するために、様々な濃度（０〜１００ｎＭ）のＭｎ−ＡｒｇＩ、Ｃｏ−ＡｒｇＩ、またはＣｏ−ｈＡｒｇＩ変異体を、ウシ胎児血清添加ＤＭＥＭ培地で、５００細胞／ウェルの播種密度で、９６ウェルプレート内でＨＣＣ（Ｈｅｐ３ｂ）またはメラノーマ（Ａ３７５）細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）と共にインキュベートした。３７℃で２４時間インキュベートした後、細胞を様々な濃度で、３連でアルギナーゼ含有培地で処置した。コントロール溶液は、培地中の平衡塩類溶液であった。処置した細胞を、３７℃、５％ＣＯ２で維持した。細胞を、１ウェルに付きＭＴＴ（５ｍｇ／ｍＬ）  １００μＬを添加することによって１日目、３日目、５日目、および７日目に標準ＭＴＴアッセイ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）によって試験し、１時間に１、２回軽く撹拌して４時間インキュベートした。この後、溶液を吸引し、ＤＭＳＯ  ２００μＬを各ウェルに添加した。５７０ｎｍでの吸光度を、自動プレートリーダーを用いて各ウェルについて読み取り、コントロールに対する生存細胞の相対数を決定した。得られたデータを、指数関数の式にフィットさせて、アルギナーゼ細胞毒性の見かけＩＣ５０値を決定した。図７Ａは、ＨＣＣ細胞のＭＴＴ吸光度（％）に対するＭｎ−ＡｒｇＩまたはＣｏ−ＡｒｇＩ添加の影響を示す。５日目のＩＣ５０値を計算し、Ｍｎ−ｈＡｒｇＩのＩＣ５０値が５±０．３ｎＭ（約０．１８μｇ／ｍｌ）、Ｃｏ−ｈＡｒｇＩの値が０．３３±０．０２ｎＭ（約０．０１２μｇ／ｍｌ）であった。したがって、Ｃｏ−ＡｒｇＩ酵素は、ＨＣＣに対してＭｎ置換酵素よりも１５倍高い細胞毒性であると思われる。転移性メラノーマ細胞系（Ａ３７５）に対して、Ｍｎ−ｈＡｒｇＩ（図７Ｂ）は、見かけＩＣ５０が４．１±０．１ｎＭ（約０．１５μｇ／ｍｌ）となった。Ｃｏ−ｈＡｒｇＩとのインキュベーションにより、細胞毒性の１３倍の増加がもたらされ、見かけＩＣ５０が０．３２±０．０６ｎＭ（約０．０１２μｇ／ｍｌ）となった。
【０１２３】
実施例１３
ｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期の延長のためのＦｃ−アルギナーゼ融合タンパク質の遺伝子操作
ＩｇＧ  Ｆｃドメインへの融合が、ＴＮＦ−α阻害剤エタネルセプト（Ｅｎｂｒｉｌ（登録商標））などの治療用ポリペプチドのｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期を延長するために広く利用されている。Ｆｃドメインは、ＦｃγＲｎ受容体に結合し、ＦｃγＲｎ受容体は、血管内皮および多くの他の組織で発現される（ＲｏｏｐｅｎｉａｎおよびＡｋｉｌｅｓｈ、２００７）。ＩｇＧ  Ｆｃドメインに対するＦｃγＲｎの親和性は、強くｐＨに依存する。酸性ｐＨのエンドソーム区画で結合が起こり、タンパク質の細胞表面での再利用を可能にし、このためタンパク質分解が回避される。生理的ｐＨで結合親和性が非常に低いため、細胞表面で、ＦｃドメインがＦｃγＲＮから放出される。ＦｃγＲＮによるエンドソーム再利用は、免疫グロブリンの血清半減期を少なくとも４〜７倍、ヒトでは約７〜１４日に延長すると推定される。Ｆｃ融合は、この特性を利用して短命の分子の半減期を延長する。しかし、ヒトアルギナーゼは、ホモ三量体であるため、それ自体が二量体であるＩｇＧ  Ｆｃに融合すると、得られるＦｃ−アルギナーゼポリペプチドは、高分子量凝集体を形成する可能性が高い。
【０１２４】
この問題は、三量体形成を阻害し、かつ単量体型で安定であるアルギナーゼの突然変異型を利用することによって回避した。アルギナーゼＩの三量体形成およびサブユニット界面は、かなり詳しく研究された（Ｌａｖｕｌｏら、２００１）。Ｇｌｕ２５６Ｇｌｎにおける１つのａａ置換は、三量体形成を阻害して、単量体アルギナーゼＩ酵素の形成をもたらすことが示された（Ｓａｂｉｏら、２００１）。この突然変異は、オーバーラップ伸長ＰＣＲによって、２つの変異誘発プライマー：順方向‘５−ｇｇｔｔｔａａｃｇｔａｔｃｇｃＣＡＧｇｇｃｃｔｇｔａｔａｔｃａｃｇｇ（配列番号１１）および逆方向‘５−ＣＣＧＴＧＡＴＡＴＡＣＡＧＧＣＣＣＴＧＧＣＧＡＴＡＣＧＴＴＡＡＡＣＣ（配列番号１２）、ならびに２つの特異的末端プライマー（実施例１）の使用によってｈＡｒｇＩに導入し、ｐＥＴ２８ａベクターにクローニングした。この変異体の発現および精製の後、定常状態動力学分析により、ｋｃａｔ／ＫＭが１，３２０ｓ−１ｍＭ−１のＣｏ−ｈＡｒｇＩと比較してほぼ同一の活性が明らかになった。図８は、予想通り、Ｃｏ−ｈＡｒｇＩ−Ｅ２５６Ｑが単量体であることを示す非変性ＰＡＧＥゲルを示す。
【０１２５】
次いで、この構築物を、利用可能なＦｃ発現ベクターにクローニングした。Ｆｃ発現ベクターは、ＤｓｂＡリーダー配列、続くＩｇＧ  Ｆｃコード領域、ＥｃｏＲＩ制限部位、および停止コドンを含むｐＴＲＣ９９ａプラスミド（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に基づく構築物である。単量体アルギナーゼ遺伝子を、ベクターおよび遺伝子の両方をＥｃｏＲＩで消化することによってＦｃコード領域の後のフレーム内に入れ、続いてライゲートし、配列決定および発現のために大腸菌（ＢＬ２１）を形質転換した。ＩｇＧ  Ｆｃが、通常はグリコシル化タンパク質であるため、組み換えＩｇＧまたはＦｃ融合物の発現を、細菌とは異なりＮ連結グリコシル化できる組み換え哺乳動物細胞でこれまで行ってきた。しかし、Ａｓｎ２９７でのグリコシル化は、活性化および阻害Ｆｃγ受容体（ヒトにおけるＦｃγＲＩ−ＩＩＩ）への結合にきわめて重要であるが、ＦｃγＲｎに対する親和性またはｐＨ依存性の結合に対する顕著な影響を有していない（ＴａｏおよびＭｏｒｒｉｓｏｎ、１９８９；Ｓｉｍｍｏｎｓら、２００２）。したがって、細菌で発現されるグリコシル化されていないＩｇＧ抗体は、霊長類において、哺乳動物細胞で発現される完全にグリコシル化された抗体の血清持続性とほとんど区別が付かない血清持続性を示す（Ｓｉｍｍｏｎｓら、２００２）。従来の通説とは対照的に、ＩｇＧ抗体およびＦｃタンパク質は、発酵槽でｇ／Ｌレベルまで大腸菌で効率的に発現され得る。大腸菌の発現は、技術的に格段に単純かつ迅速である。加えて、得られるタンパク質は、グリコシル化されていないため、治療用糖タンパク質の発現で重要な問題であるグリカン不均一性を示さない（Ｊｅｆｆｅｒｉｓ、２００７）。融合タンパク質は、プロテインＡクロマトグラフィーによって精製され、二量体形成しなかったポリペプチドに対する適切に折り畳まれた二量体Ｆｃ−アルギナーゼ融合物の収量は、ＦＰＬＣゲルろ過クロマトグラフィーによって定量する。この方式は、ｉｎ  ｖｉｖｏ試験に適した、ヒトアルギナーゼの活性が高い非常に安定した形態をもたらす。
【０１２６】
実施例１４
アルギナーゼのＰＥＧ化
アルギナーゼを、実施例１０に記載されているように精製したが、１つの例外：ＩＭＡＣカラムに結合した後、タンパク質を、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ１１４を含むＩＭＡＣ緩衝液で広範囲（８０〜９０カラム容量）に洗浄し（このステップは、ほとんどのエンドトキシンを除去する）、１０〜２０カラム容量のＩＭＡＣ緩衝液、次いでＩＭＡＣ溶出緩衝液（５０ｍＭ  ＮａＰＯ４／２５０ｍＭ  イミダゾール／３００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８）で溶出したことを含む。アルギナーゼを、１０，０００ＭＷＣＯろ過装置（Ａｍｉｃｏｎ）を用いて、ｐＨ８．３で１００ｍＭ  ＮａＰＯ４と緩衝液交換した。小型の反応ジャーを用い、Ｍｅｔｈｏｘｙ  ＰＥＧ  Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  Ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌ  Ｅｓｔｅｒ  ５０００ＭＷ（ＪｅｎＫｅｍ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を、４０：１のモル比でアルギナーゼに添加し、常に撹拌しながら２５℃で１時間反応させた。次いで、得られた混合物をＣｏＣｌ２で１０ｍＭにし、５０℃で１０分間加熱した。遠心分離してあらゆる沈殿物を除去した後、ＰＥＧ−５０００アルギナーゼを、１００，０００ＭＷＣＯろ過装置（Ａｍｉｃｏｎ）を用いて、広範に緩衝液交換し（１０％グリセロールを含むＰＢＳ）、０．２ミクロンシリンジフィルター（ＶＷＲ）で滅菌した。すべてのＰＥＧ化酵素を、Ｌｉｍｕｌｕｓ  Ａｍｅｂｏｃｙｔｅ  Ｌｙｓａｔｅ（ＬＡＬ）キット（Ｃａｐｅ  Ｃｏｄ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）を用いてリポ多糖（ＬＰＳ）含量について分析した。
【０１２７】
ＰＥＧ化Ｃｏ−ｈＡｒｇＩは、野生型酵素とほぼ同一の血清安定性を有することが分かり、１６９０±２９０ｓ−１ｍＭ−１のｋｃａｔ／ＫＭ値を示した。図１２は、見かけのＭＷが約１５０ｋＤａの最終産物の変性ゲルを示す。
【０１２８】
実施例１５
マウスモデルにおける血清中のＬ−Ａｒｇの欠乏
Ｂａｌｂ／ｃマウスを、単回ＩＰ注射により、薬理学的に調製されたＰＥＧ化Ｃｏ−ｈＡｒｇＩ  ５００μｇまたは等量のＰＢＳで処置した。マウスを、０時間、４８時間、７２時間、および９６時間の時点で、血液収集のために心静脈穿刺によって屠殺した。血液試料を、ｐＨ４の４００ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液と５０：５０（ｖ／ｖ）で迅速に混合し、３０分間凝固させ、血清の分離のために遠心分離した。次いで、得られた血清を、巨大タンパク質の除去のために１０，０００ＭＷＣＯ装置（Ａｍｉｃｏｎ）でろ過し、沈殿させ、分析のために通過物を収集した。Ｌ−アルギニン基準、コントロールマウス血清、および実験用を、優れたピーク分離が得られるように流速を１／２に低下させて取得時間を２倍にした分離プロトコルのわずかな変更を除き、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（公開番号：５９８０−３０８８）に本質的に記載されているように、ＯＰＡ（Ａｇｉｌｅｎｔ）で誘導体化し、Ｃ１８逆相ＨＰＬＣカラム（Ａｇｉｌｅｎｔ）（５μｍ、４．６×１５０ｍｍ）で分離した。Ｌ−アルギニン基準曲線を、血清Ｌ−Ａｒｇレベルを定量するためにＬ−Ａｒｇピーク領域を濃度に対してプロットすることによって作成した。１回量の薬学的に調製されたＣｏ−ｈＡｒｇＩは、Ｌ−Ａｒｇを３日間に渡って検出限界またはそれ以下に維持するのに十分であった（図１０）。
【０１２９】
実施例１６
Ｃｏ−ｈＡｒｇＩを用いたＨＣＣ腫瘍異種移植片の処置
ヌードマウスに、７５％コンフルエントの組織培養物から収集した約１０６ＨＣＣ細胞を側腹部に皮下注射した。ＨＣＣ異種移植腫瘍が、直径が約０．５ｃｍ３に成長したら（９日目）、マウスを２つの群に分けた。実験群には、９日目および１２日目に、薬理学的に最適化されたＣｏ−ｈＡｒｇＩ  ５００μｇをＩＰ注射した。コントロール群には、９日目および１２日目に、ＰＢＳをＩＰ内注射した。図１１から分かるように、ＰＢＳ処置腫瘍は、１５日目までに３倍のサイズに増大した。まったく対照的に、Ｃｏ−ｈＡｒｇＩ処置腫瘍は、１５日目までにサイズが縮小した。Ｍｎ−ｈＡｒｇＩ処置腫瘍は、成長速度の低下のみが見られた（Ｃｈｅｎｇら、２００７）。Ｃｏ−ｈＡｒｇＩは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの両方において、ＨＣＣに対して非常に有効な化学療法剤であると思われる。
【０１３０】
本明細書に開示および請求されたすべての組成物および方法は、本開示を踏まえると、過度の実験を行うことなく作製および実施され得る。本発明の組成物および方法は、好ましい実施形態の観点から記載されたが、当業者には、変更形態が、本発明の概念、趣旨、および範囲から逸脱することなく、本発明の組成物および方法、ならびに本明細書に記載された方法のステップまたは一連のステップに適用され得ることが明らかであろう。より具体的には、化学的にも生理的にも関連した特定の作用物質が、本明細書に開示された作用物質に置換され得、しかも同じまたは同様の結果が得られるであろうことは明らかであろう。当業者に明らかなすべてのこのような同様の置換および修飾は、添付の特許請求の範囲によって規定される本発明の趣旨、範囲および概念内であると見なされる。
【０１３１】
参考文献
以下の参考文献は、本明細書の記載を補足する例示的な手順または他の詳細を提供する範囲で、参照により本明細書に明確に組み入れられる。
【０１３２】
【化１】
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【０１３３】
【化２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図６】
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【図８】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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