(57)【要約】【課題】セリアック病の病態解析に有用なツールや、セリアック病に対する医薬品を提供すること。【解決手段】グリアジンペプチドにより、セリアック病を誘導したＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスではセリアック病の症状が増悪していたことから、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスは、セリアック病の病態解析を行うための、またはその治療薬もしくは予防薬の有効成分となりうる候補物質をスクリーニングするためのモデルマウスとして使用することができる。また、Ｄ３００ａとホスファチジルセリンの結合を亢進する物質を含有する、ＣＤ３００ａを発現するミエロイド系細胞の抑制性シグナル伝達を亢進するための活性調節剤を有効成分として含有する医薬品は、セリアック病を治療または予防するために使用することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
セリアック病について、病態解析を行うための、またはその治療薬もしくは予防薬の有効成分となりうる候補物質をスクリーニングするための、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスの使用。
【請求項２】
前記ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスを、セリアック病を誘導する物質を投与したときにセリアック病を発症するモデルマウスとして使用する、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
セリアック病を発症した前記ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスに、セリアック病の治療薬の候補物質を投与して治療効果の有無を確認する工程、またはセリアック病を発症する前の前記ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスに、前記セリアック病を誘導する物質と共にセリアック病の予防薬の候補物質を投与して予防効果の有無を確認する工程を含む、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
ＣＤ３００ａとホスファチジルセリンの結合を亢進する物質を含有する、ＣＤ３００ａを発現するミエロイド系細胞の抑制性シグナル伝達を亢進するための活性調節剤を有効成分として含有することを特徴とする、セリアック病を治療または予防するための医薬品。
【請求項５】
前記ＣＤ３００ａとホスファチジルセリンの結合を亢進する物質がホスファチジルセリンである、請求項４に記載の医薬品。
【請求項６】
前記ミエロイド系細胞が大腸粘膜固有層中のマクロファージである、請求項４または５に記載の医薬品。
【請求項７】
セリアック病について、病態解析を行う際、またはその治療薬もしくは予防薬の有効成分となりうる候補物質をスクリーニングする際の、比較解析用のツールとしての、
ＣＤ３００ａとホスファチジルセリンの結合を阻害する物質を含有する、ＣＤ３００ａを発現するミエロイド系細胞の抑制性シグナル伝達を抑制するための活性調節剤の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、セリアック病に関連する、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスおよびＣＤ３００ａ発現細胞の活性調節剤の使用、ならびにＣＤ３００ａ発現細胞の活性調節剤を含有する医薬品に関する。
【背景技術】
【０００２】
宿主（人体または動物体内）に病原体（細菌、ウイルス、寄生虫等）が侵入したり、内因性の起炎物質が発生したりすると、病原体の侵入部位または起炎物質の発生部位にて細動脈が一時的に収縮した後、拡張・充血に至って、病原体の侵入部位または起炎物質の発生部位の血流が局所的に緩慢になるといった炎症反応が発生する。
【０００３】
すると、白血球が血管壁に膠着し、さらに各種免疫系細胞から放出されるケミカルメディエーターの作用により、アメーバ様運動により血管壁を通過して遊走する。ケミカルメディエーターとしては、ヒスタミン、セロトニン、リンホカイン等が知られている。ヒスタミンやセロトニンを産生・放出するマスト細胞は、炎症反応において中心的な役割を果たしているリンパ球の一つである。また、マクロファージもマスト細胞と同様にＴＮＦ等のケミカルメディエーターを産生・放出する。
【０００４】
炎症反応によって、遊走させられた白血球が病原体等に誘引されると、病原体に抗原抗体反応を伴う体液性免疫や細胞障害性Ｔ細胞等が関与する細胞性免疫によって、病原体が体内から除去され（クリアランス）、感染拡大が防止される。このように、炎症反応およびそれに基づく免疫反応は、生体の恒常性を維持するためには極めて重要である。
【０００５】
一方で、炎症反応は、上述のような生体防御とともに、発赤、発熱、腫張、疼痛、機能障害といった不具合な徴候・症状を示してしまう。このような症状として、具体的には、アレルギー疾患、各種急性または慢性炎症が挙げられる。また、免疫学的寛容が適用されず、自己に対して免疫応等が生じてしまう自己免疫疾患が発生した場合も、炎症反応によって組織傷害が発生してしまう。
【０００６】
すなわち、炎症反応を伴う疾患を予防するには、炎症反応を惹起させる病原体を各種抗生物質（抗菌剤）によって死滅させることや、生体内の免疫機能を向上させる薬剤（免疫賦活剤）を投与して、炎症反応が過剰に亢進する前に、病原体を除去することが重要である。
【０００７】
一方、炎症反応を伴う疾患を改善・治療するには、たとえば、ケミカルメディエーターの放出を抑制するような、過剰に活性化した免疫機能を低下させる薬剤（抗炎症剤（免疫抑制剤））を投与して、炎症の鎮静化を図ることが知られている。
【０００８】
たとえば、特許文献１には、免疫活性剤として、抗原提示細胞として各種免疫系細胞の活性化を担う樹状細胞の機能賦活化剤が開示され、具体的には、イソロイシン、ロイシンおよびバリンから選ばれる少なくとも１種の分岐鎖アミノ酸を有効成分とすることを特徴とするものである。
【０００９】
特許文献２には、抗炎症剤（免疫抑制剤）として、ＳＰＡＲＣ（Ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｐｒоｔｅｉｎ  ｗｈｉｃｈ  ｉｓ  ａｃｉｄｉｃ  ａｎｄ  ｒｉｃｈ  ｉｎ  ｃｙｓｔｅｉｎ）ペプチドおよび薬理学的担体を含む薬剤が開示されている。
【００１０】
ところで、自然免疫系を担当するミエロイド系（骨髄系）細胞の細胞膜上には、ＭＡＩＲ（Myeloid Associated Ig like Receptors）と称されるレセプター分子群が発現していることが知られている（非特許文献１）。このうち、ＣＤ３００ａとしても知られている（その他「ＬＭＩＲ１」、「ＣＬＭ−８」と称されることもある）ＭＡＩＲ−Ｉは、マクロファージ、肥満細胞、顆粒球（好中球）、樹状細胞に発現しており、細胞内領域のＩＴＩＭ（Immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif）配列を介して脱リン酸化酵素と会合し、抑制性シグナルを伝達する抑制性レセプターであることが知られている（非特許文献２）。しかしながら、当該受容体のリガンドは不明であり、いわゆるオーファンレセプターとなっていた。
【００１１】
セリアック病またはシリアック病（Ｃｏｅｌｉａｃ  ｄｉｓｅａｓｅ、Ｃｅｌｉａｃ  ｄｉｓｅａｓｅとも綴る）とは、小麦や大麦、ライ麦などに含まれるタンパク質の一種であるグルテンに対する免疫反応が引き金になって起こる自己免疫疾患であり、進行性の腸炎である。この病気は、英国、ヨーロッパ、米国において３００人に一人以上に罹患する。
【００１２】
２個のタンパク質、グリアジン及びグルテニンの混合物であるグルテンは、小麦、大麦、及びライ麦において見られる。グルテンは小腸と反応して、栄養及びビタミンを吸収するために必要である繊細な小腸上皮を攻撃する免疫システムを活性化することにより、損傷を引き起こす。
【００１３】
セリアック病の患者がグルテンを含有する食物などを摂取すると、ヒトの消化酵素では分解できない小麦に含まれる植物性タンパクのグルテンの一分画であるグリアジン由来ペプチドが、十二指腸粘膜下組織内でＴＧ２により脱アミノ化され、抗原となり、自己抗体が産生されることが原因となっている。
【００１４】
セリアック病は、ＨＬＡ−ＤＱＡ１およびＨＬＡ−ＤＱＢ１によりコードされるＨＬＡ−ＤＱ２（個体の約９０％を占める）、ＨＬＡ−ＤＱ２の変異体、またはＨＬＡ−ＤＱ８のいずれかを保有する遺伝的に感受性な個体において発症する。
【００１５】
かかる個体は、小麦粉の非水溶性タンパク質、グルテン、ならびにライムギおよびオオムギ中の関連タンパク質から誘導されるペプチドに対して、不適切なＨＬＡ−ＤＱ２および／またはＤＱ８に限定されたＣＤ４＋Ｔ細胞に媒介される免疫応答を惹起する。
【００１６】
この際の免疫反応がきっかけとなり、自己の免疫系が小腸の上皮組織を攻撃して炎症を起こすことで絨毛などを損傷し、また上皮細胞そのものの破壊にまで至る。この結果、小腸から栄養を吸収出来なくなり、食事の量などに関らず栄養失調の状態に陥る。
【００１７】
特許文献３の発明では、上記免疫応答を調節することが可能な、ペプチドに基づく免疫治療における使用のための最小混合物に関する発明が記載されている。
しかしながら、現状、病因の根底にある自然免疫応答は完全には解明されておらず、セリアック病の病態解明に有用なツールや、セリアック病を治療等するための医薬品が望まれていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１８】
【特許文献１】特開２００７−２９７３７９号公報
【特許文献２】特開２０１１−５１６６０９号公報
【特許文献３】特表２０１２−５１０４３１号公報
【非特許文献】
【００１９】
【非特許文献１】Yotsumoto et al.. J Exp Med 198 (2), 223-233, 2003
【非特許文献２】Okoshi Y et al, Int Immunol., 17, 65-72, 2005.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
本発明は、セリアック病の病態解明に有用なツールや、セリアック病に対する医薬品を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本発明者は、ＣＤ３００ａのリガンドおよびＣＤ３００ａの機能を解明すべく鋭意研究を重ねた結果、以下に示されるような知見を得た。
（ｉ）ＣＤ３００ａのリガンドは、ホスファチジルセリン（フォスファチジルセリン、ホスホファチジルセリン）（ＰＳ）である。
（ｉｉ）ＰＳがマスト細胞等のＣＤ３００ａへ結合すると、ＣＤ３００ａの抑制性シグナル伝達が亢進し、マスト細胞等の活性化も抑制される。
（ｉｉｉ）ホスファチジルセリン結合性物質またはＣＤ３００ａ結合性物質が共存することにより、マスト細胞等のＣＤ３００ａとＰＳとの結合が阻害されると、ＣＤ３００ａの抑制性シグナル伝達が抑制され、マスト細胞等の活性化も維持される。
【００２２】
（ｉｖ）グリアジンで誘導したCD３００ａ遺伝子欠損マウスにおけるセリアック症状が野生型のマウスよりも増悪していた。
（ｖ）上記の活性化の抑制または維持を通じて、セリアック病の病態解明や治療に資することができる。
【００２３】
（ｖｉ）ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスは、セリアック病の病態解析や医薬品の有効成分のスクリーニングなどを行うためのツールとなり得る。
これらの知見に基づいてなされた本発明により、たとえば、下記［１］〜［７］に示される活性調節剤、医薬品、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスの使用、抗ＣＤ３００ａ抗体などが提供される。
【００２４】
[１]  セリアック病について、病態解析を行うための、またはその治療薬もしくは予防薬の有効成分となりうる候補物質をスクリーニングするための、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスの使用。
【００２５】
[２]  前記ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスを、セリアック病を誘導する物質を投与したときにセリアック病を発症するモデルマウスとして使用する、[１]に記載の使用。
［３］  セリアック病を発症した前記ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスに、セリアック病の治療薬の候補物質を投与して治療効果の有無を確認する工程、またはセリアック病を発症する前の前記ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスに、前記セリアック病を誘導する物質と共にセリアック病の予防薬の候補物質を投与して予防効果の有無を確認する工程を含む、［２］に記載の使用。
【００２６】
［４］  ＣＤ３００ａとホスファチジルセリンの結合を亢進する物質を含有する、ＣＤ３００ａを発現するミエロイド系細胞の抑制性シグナル伝達を亢進するための活性調節剤を有効成分として含有することを特徴とする、セリアック病を治療または予防するための医薬品。
【００２７】
［５］  前記ＣＤ３００ａとホスファチジルセリンの結合を亢進する物質がホスファチジルセリンである、［４］に記載の医薬品。
［６］  前記ミエロイド系細胞が大腸粘膜固有層中のマクロファージである、［４］または［５］に記載の医薬品。
【００２８】
［７］  セリアック病について、病態解析を行う際、またはその治療薬もしくは予防薬の有効成分となりうる候補物質をスクリーニングする際の、比較解析用のツールとしての、
ＣＤ３００ａとホスファチジルセリンの結合を阻害する物質を含有する、ＣＤ３００ａを発現するミエロイド系細胞の抑制性シグナル伝達を抑制するための活性調節剤の使用。
【００２９】
また、上記発明の別の側面として、次の発明が提供される。
上記［４］に係る発明の別の側面として、ＣＤ３００ａとホスファチジルセリンの結合を亢進し、ＣＤ３００ａを発現するミエロイド系細胞の抑制性シグナル伝達を亢進することを特徴とする、セリアック病を治療または予防する方法が提供される。当該方法は、生体内（in vivo）、生体外（ex vivo, in vitro）を問わずに適用可能であり、また生体内で適用される場合、その生物種は、ヒトであるか、ヒト以外であるか（たとえばマウス等の哺乳類）であるかを問わない。
【００３０】
上記［１］に係る発明のさらなる側面として、セリアック病を治療または予防するための医薬品の製造における、ＣＤ３００ａとホスファチジルセリンの結合を亢進し、ＣＤ３００ａを発現するミエロイド系細胞の抑制性シグナル伝達を亢進する活性調節剤の使用が提供される。
【発明の効果】
【００３１】
本発明により、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスを、セリアック病の病態解明や治療等に有用なモデルマウス等として使用することができるようになる。また、本発明により、ＣＤ３００ａ発現細胞の抑制性シグナル伝達を亢進する活性調節剤を有効成分として含有する、セリアック病を治療または予防するための医薬品の製造も可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】図１は、参考例１Ａで得られたフローサイトメトリー分析の結果を示す。
【図２Ａ】図２Ａは、参考例１Ｂで得られたフローサイトメトリー分析の結果を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、参考例１Ｂで得られたフローサイトメトリー分析の結果を示す。
【図２Ｃ】図２Ｃは、参考例１Ｃで得られたフローサイトメトリー分析の結果を示す。
【図２Ｄ】図２Ｄは、参考例１Ｄで得られたフローサイトメトリー分析の結果を示す。
【図２Ｅ】図２Ｅは、参考例１Ｄで得られたフローサイトメトリー分析の結果を示す。
【図２Ｆ】図２Ｆは、参考例１Ｅで得られたイムノブロット分析の結果を示す。
【図３Ａ】図３Ａは、野生型アレル中のＣＤ３００a遺伝子の構造、ＣＤ３００a欠損マウスを作成するために使用したターゲティングベクター、および標的化アレルを示すための模式図である。
【図３Ｂ】図３Ｂは、野生型アレルおよび変異型アレルのＰＣＲ産物を示す電気泳動写真である。
【図３Ｃ】図３Ｃは、野生型マウスおよびＣＤ３００a欠損マウスを用いたウェスタンブロット分析の結果を示す。
【図３Ｄ】図３Ｄは、ＷＴマウスとＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスのフローサイトメトリ−分析結果を示す。
【図４Ａ】図４Ａは、参考例２Ａで得られたフローサイトメトリー分析の結果を示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、参考例２Ｃで得られた光学顕微鏡の分析結果を示す。
【図４Ｃ】図４Ｃは、参考例２Ｃで得られたレーザー走査型共焦点顕微鏡の分析結果を示す。
【図４Ｄ】図４Ｄは、参考例２Ｃで得られた、胸腺細胞を細胞質内に取り込んだＮＩＨ３Ｔ３または各形質転換体における細胞数の比率を示す結果を示す。
【図５Ａ】図５Ａは、参考例２Ｂで得られたフローサイトメトリー分析の結果を示す。
【図５Ｂ】図５Ｂは、参考例２Ｂで得られたＲＴ−ＰＣＲの分析の結果を示す。
【図６Ａ】図６Ａは、参考例３Ａで得られたフローサイトメトリー分析の結果を示す。
【図６Ｂ】図６Ｂは、参考例２Ａで得られたβ―ヘキサミニダーゼアッセイの分析結果を示す。
【図７Ａ】図７Ａは、参考例３Ｂで得られたフローサイトメトリー分析の結果を示す。
【図７Ｂ】図７Ｂは、参考例３Ｃで得られた、各種サイトカインおよびケモカインの放出量の増加率の結果を示す。
【図７Ｃ】図７Ｃは、参考例３Ｅで得られた、各種サイトカインおよびケモカインの放出量の増加率の結果を示す図である。
【図７Ｄ】図７Ｄは、参考例３Ｆで得られた、イムノブロッティング分析の結果を示す。
【図７Ｅ】図７Ｅは、参考例３Ｇで得られた、イムノブロッティング分析の結果を示す図である。
【図７Ｆ】図７Ｆは、参考例３Ｇで得られた、ＴＮＦ−αの増加率を示す図である。
【図８】図８は、参考例３Ｄで得られたフローサイトメトリー分析の結果を示す。
【図９Ａ】図９Ａは、参考例４Ｂで得られたデンシトメトリー分析の結果を示す。
【図９Ｂ】図９Ｂは、参考例４Ｂで得られたデンシトメトリー分析の結果を示す。
【図１０Ａ】図１０Ａは、参考例４Ｃで得られた抗気性細菌のＣＦＵの算出結果を示す図である。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、ＣＤ３００ａ好中球の誘導後、参考例４Ｃで得られた好中球およびマクロファージの細胞数を示す図である。
【図１１】図１１は、参考例４Ｃで得られた、大腸菌を貪食した各マクロファージの細胞数の比率を示す図である。
【図１２Ａ】図１２Ａは、参考例４Ｄで得られたフローサイトメトリー分析を示す図である。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、参考例４Ｄで得られた各マウスの生存率を示す図である。
【図１２Ｃ】図１２Ｃは、参考例４Ｄで各マウスの腸内の細菌クリアランスを細菌のＣＦＵで示した図である。
【図１２Ｄ】図１２Ｄは、参考例４Ｅで得られたフローサイトメトリー分析の結果等を示す図である。
【図１２Ｅ】図１２Ｅは、参考例４ＦでＴＸ４１を投与した後の各マウスの生存率を示す図である。
【図１２Ｆ】図１２Ｆは、参考例４Ｇで、ＴＸ４１を投与した後の腸内のクリアランスを示す図である。
【図１２Ｇ】図１２Ｇは、参考例４Ｇで、ＴＸ４１を投与した後の好中球の細胞数の変化を分析した結果を示す図である。
【図１３】図１３は、正常食または高グルテン食の給餌開始からモニターした体重（ＢＷ）の経時変化を示す図である。
【図１４】図１４は、正常食または高グルテン食を摂食開始後、２０週目の各マウスの腸の病理組織学的解析の結果を示す写真である。
【図１５】図１５は、正常食または高グルテン食を摂食開始後、20週の各マウスについての臨床スコアを示す図である。
【図１６】図１６は、正常食または高グルテン食を摂食開始後、20週の各マウスについて、腸上皮細胞１００個あたりの上皮内リンパ球数を示す図である。
【図１７】図１７は、正常食または高グルテン食を摂食開始後、20週間の各マウスの空腸の懸濁液中のトランスグルタミナーゼ2の量（TG2）を示す図である。
【図１８】図１８は、ＣＤ４５＋ＰＩ−細胞集団でゲートされた粘膜固有層の細胞のＣＤ１１ｂおよびＣＤ１１ｃの発現をフローサイトメトリー分析の結果を示す図である。
【図１９】図１９は、正常食と高グルテン食で飼育したＷＴマウスとＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスの空腸の粘膜固有層における各免疫細胞の頻度を示す図である。
【図２０】図２０は、各マウスの粘膜固有層（ＬＰ）マクロファージにおける各種サイトカインやケモカインの遺伝子発現量を示す図である。
【図２１】図２１は、各免疫細胞におけるＣＤ３００ａ（ＭＡＩＲ−Ｉ）の発現について、フローサイトメトリーで解析した結果を示す図である。
【図２２】図２２は、各マウスの粘膜固有層（ＬＰ）のＣＤ１１ｂ＋樹状細胞におけるサイトカインやケモカインの相対的な遺伝子発現量を示す図である。
【図２３】図２３は、組換えマウスＭＦＧ−Ｅ８タンパク質の添加によるグリアジン誘発性のサイトカイン発現量の変化を示す図である。
【図２４】図２４は、正常食または高グルテン食を与えているＢａｌｂ／ｃのＷＴマウスまたはＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスにおける大腸の病理組織学的解析の結果を示す図である。
【図２５】図２５は、Ｂａｌｂ／ｃのＷＴまたはＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス由来の血清について、抗グリアジンＩｇＧおよびＩｇＡ抗体力価を示す図である。
【図２６】図２６は、無グルテン食を与えられたＷＴマウスおよびＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスにおける体重変化率の経時変化（週別）を示す図である。
【図２７】図２７は、ＷＴマウスまたはＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスの粘膜固有層（ＬＰ）における通常の状態でのＣＤ１１ｂ＋樹状細胞およびマクロファージのサイトカイン発現量を示す図である。
【図２８】図２８は、グリアジンペプチドＰ３１−４３で刺激した後のチオグリコール酸誘発性腹腔滲出細胞のマクロファージにおけるサイトカイン発現量を示す図である。
【図２９】図２９は、粘膜固有層のＣＤ１１ｂ＋樹状細胞におけるＩＬ−６, ＩＬ−１５, ＴＮＦ−α，ＩＦＮ−β，ＭＣＰ１および ＭＣＰ５の遺伝子発現量を示す図である。
【図３０】図３０は、グリアジン刺激後のＢ６のＷＴマウスまたはＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスの粘膜固有層（ＬＰ）マクロファージにおけるＩＬ−６，ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−βの発現量を示す図である。
【図３１】図３１は、微生物叢を枯渇させたＷＴマウスまたはＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス由来の粘膜固有層（ＬＰ）マクロファージ（グリアジンで刺激したもの）におけるサイトカインやケモカイン発現を示す図である。
【図３２】図３２は、単離された粘膜固有層（ＬＰ）マクロファージのホスファチジルセリン発現細胞の頻度を示す図である。
【図３３】図３３は、ＷＴマウスとＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスの粘膜固有層（ＬＰ）マクロファージにおけるαｖとβ３の各インテグリンサブユニットとの遺伝子発現量を示す図である。
【図３４】図３４は、ホスファチジルセリン受容体（ＴＩＭ−１、ＴＩＭ−４、Ｓｔａｂｉｌｎ−２、ＳＲ−ＰＳＯＸ、ＢＡＩ１とＭｅｒ）の遺伝子発現量を示す図である。
【図３５】図３５は、ＴＸ４１とＴＸ４９のＨ鎖とＬ鎖とをそれぞれ相同性解析を行った結果である。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
本発明に係る活性調節剤、これを含有する医薬品、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスの使用、抗ＣＤ３００ａ抗体について、以下詳細に説明する。免疫機構およびＣＤ３００ａ等に関する従来の知見や公知の試験方法に言及する際に用いる文献を、実施例の末尾に列挙した。
【００３４】
［活性調節剤］
本発明における活性調節剤は、ＣＤ３００ａを発現するミエロイド系細胞の抑制性シグナル伝達を、抑制するためのものと、亢進するためのものを包含する。
【００３５】
ここで、「ＣＤ３００ａを発現するミエロイド系細胞」には、マスト細胞（肥満細胞）、マクロファージ、好中球、樹状細胞などが含まれる。ＣＤ３００ａは、ヒト、マウス、その他の哺乳類に発現しているものを総称しており、生物種は特に限定されるものではない。
【００３６】
また、「抑制性シグナル伝達」とは、抑制性レセプターであるＣＤ３００ａが、細胞内領域のＩＴＩＭ（Ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ−ｂａｓｅｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｍｏｔｉｆ）配列を介して脱リン酸化酵素と会合することにより生じるシグナル伝達である。
【００３７】
以下の説明において、ＣＤ３００ａを発現するミエロイド系細胞の抑制性シグナル伝達を亢進するための活性調節剤は、結果的に免疫機能を抑制する作用を有する場合があるので、本発明において「免疫抑制剤」と称することがある（たとえば、セリアック病に対する医薬品の有効成分として用いる場合）。
【００３８】
＜第１の活性調節剤＞
本発明における第１の活性調節剤は、ＣＤ３００ａを介した抑制性シグナル伝達を抑制する作用を有する成分を含有する。本発明ではそのような成分として、ホスファチジルセリンとＣＤ３００ａとの結合を阻害する物質、すなわちホスファチジルセリン結合性物質およびＣＤ３００ａ結合性物質を用いることができる。第１の活性調節剤は、これらの何れか一方を含んでいてもよいし、これら両方を含んでいてもよい。
【００３９】
本発明では、第１の活性調節剤を、セリアック病について、病態解析を行う際、またはその治療薬もしくは予防薬の有効成分となりうる候補物質をスクリーニングする際の、比較解析用のツールとして使用することができる。
【００４０】
（ホスファチジルセリン結合性物質）
第１の活性調節剤の一つであるホスファチジルセリン結合性物質は、ＣＤ３００ａのリガンドであるホスファチジルセリン（ＰＳ）に結合して、ホスファチジルセリンとミエロイド系細胞に発現したＣＤ３００ａとの相互作用（結合）を阻害するものである限り特に限定されない。
【００４１】
ホスファチジルセリン結合性物質の具体例としては、ＭＦＧ−Ｅ８（Ｍｉｌｋ  Ｆａｔ  Ｇｌｏｂｕｌａｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＥＧＦ−８）、Ｔ細胞免疫グロブリンや、可溶型ＴＩＭ−１、可溶型ＴＩＭ−４、可溶型スタビリンおよび可溶型インテグリンαｖβ３などの可溶型蛋白質が挙げられ、中でもＭＦＧ−Ｅ８が好ましい。
【００４２】
また、ホスファチジルセリン結合性蛋白質としては、ＭＦＧ−Ｅ８などのようなネイティブの蛋白質に限定されず、ホスファチジルセリンへの結合性を喪失しない限り、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有するもの（変異体）であってもよい（たとえば、実施例における「Ｄ８９Ｅ  ＭＦＧ−Ｅ８」等）。
【００４３】
これらの変異体は、部位特異的突然変異誘発（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）やランダム突然変異法などの公知の方法によって作製される。
また、上記「可溶型蛋白質」とは、膜蛋白質など、後述するような希釈剤や体液に対して不溶性である、ネイティブの蛋白質において、公知の遺伝子組み換えの技術によって、疎水性ドメインを削除したり、親水性のペプチドを付加したりして、希釈剤や体液に対して可溶性になるように改変した蛋白質を指す。
【００４４】
（ＣＤ３００ａ結合性物質）
第１の活性調節剤の一つであるＣＤ３００ａ結合性物質は、ＣＤ３００ａに結合して、ミエロイド系細胞に発現したＣＤ３００ａとホスファチジルセリンとの相互作用（結合）を阻害するものである限り特に限定されない。
【００４５】
ＣＤ３００ａ結合性物質の具体例としては、ＣＤ３００ａに対する中和抗体が挙げられる。中和抗体は、特定の一種類のモノクローナル抗体であってもよいし、二種類以上のモノクローナル抗体の組み合わせ（ないしポリクローナル抗体）であってもよい。また、中和抗体は、完全長の抗体であってもよいし、断片化された抗体（Ｆａｂ断片もしくはＦ（ａｂ'）2等）であってもよい。
【００４６】
中和抗体は、公知の手法によって作製することができる。モノクローナル抗体であれば、一般的には、ＣＤ３００ａを用いた免疫、ハイブリドーマの作製、スクリーニング、培養、回収といった手順で、抗ＣＤ３００ａモノクローナル抗体を作製することができる。それらの中から、好ましいＣＤ３００ａとホスファチジルセリンとの結合阻害能（中和作用）を有し、本発明の作用効果を奏する適切なモノクローナル抗体を選択すればよい。
【００４７】
（ＴＸ４１、ＴＸ４９およびこれらに類する抗体）
ＴＸ４１は抗マウスＣＤ３００ａモノクローナル抗体（ラットＩｇＧ２ａ）であり、ＴＸ４９は抗ヒトＣＤ３００ａモノクローナル抗体（マウスＩｇＧ１）である。どちらも後記実施例において作成、使用されたモノクローナル抗体であり、ＣＤ３００ａとホスファチジルセリンとの結合を阻害してシグナル伝達を抑制する機能に優れているため、本発明におけるＣＤ３００ａ結合性物質として好ましい。ただし、本発明に用いることのできる抗ＣＤ３００ａ抗体は、ＴＸ４１、ＴＸ４９およびこれらに類する（同等のアミノ酸配列からなる可変領域を有する）抗体に限定されるものではない。
【００４８】
ＴＸ４１のＨ鎖の可変領域は配列番号１で示されるアミノ酸配列を有し、ＴＸ４１のＬ鎖の可変領域は配列番号２で示されるアミノ酸配列を有し、ＴＸ４９のＨ鎖の可変領域は配列番号３で示されるアミノ酸配列を有し、ＴＸ４９のＬ鎖の可変領域は配列番号４で示されるアミノ酸配列を有する。なお、これらの可変領域には、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）および４つのフレームワーク領域が含まれる。ＴＸ４１およびＴＸ４９の可変領域（Ｈ鎖およびＬ鎖それぞれ）のアミノ酸配列同士の相同性を解析した結果を図３５に示す。
【００４９】
マウスのＣＤ３００ａに対する結合性物質としては、ＴＸ４１に基づいて、Ｈ鎖の可変領域が配列番号１で表されるアミノ酸配列からなり、Ｌ鎖の可変領域が配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる抗体を用いることが好ましい。
【００５０】
ヒトのＣＤ３００ａに対する結合性物質としては、ＴＸ４９に基づいて、Ｈ鎖の可変領域が配列番号３で表されるアミノ酸配列からなり、Ｌ鎖の可変領域として配列番号４で表されるアミノ酸配列からなる抗体を用いることが好ましい。
【００５１】
また、マウスのＣＤ３００ａに対する結合性物質としては、Ｈ鎖の可変領域が配列番号１で表されるアミノ酸配列に対し１，２，３，４または５個のアミノ酸の置換、付加、挿入または欠失を有するアミノ酸配列からなる抗体、またはＬ鎖の可変領域が配列番号２で表されるアミノ酸配列に対し１，２，３，４または５個のアミノ酸の置換、付加、挿入または欠失を含むアミノ酸配列からなる抗体を用いることもできる（Ｈ鎖およびＬ鎖の一方が上記の変異を有するものであってもよいし、それらの両方が上記の変異を有するものであってもよい）。
【００５２】
ヒトのＣＤ３００ａに対する結合性物質としては、Ｈ鎖の可変領域が配列番号３で表されるアミノ酸配列に対し１，２，３，４または５個のアミノ酸の置換、付加、挿入または欠失を含むアミノ酸配列からなる抗体、またはＬ鎖の可変領域が配列番号４で表されるアミノ酸配列に対し１，２，３，４または５個のアミノ酸の置換、付加、挿入または欠失を有するアミノ酸配列からなる抗体を用いることもできる（Ｈ鎖およびＬ鎖の一方が上記の変異を有するものであってもよいし、それらの両方が上記の変異を有するものであってもよい）。
【００５３】
このような変異を生じさせる部位は、可変領域のうちＣＤＲまたはその近傍の部位を避けることが好ましい。また、アミノ酸を置換する場合は、側鎖の構造および／または化学的な性質が類似するアミノ酸同士の間で行われる、保存的アミノ酸置換が好ましい。
【００５４】
抗ＣＤ３００ａ抗体の定常領域、すなわちＦａｂ領域のうちの上記のような可変領域以外の領域およびＦｃ領域の形態（アミノ酸配列、アミノ酸長）は、ＣＤ３００ａへの結合性、すなわち中和作用にほとんど影響しないため、本発明の作用効果を阻害しない範囲で適宜設計することができる。
【００５５】
すなわち、上記所定の可変領域のアミノ酸配列と、公知の各種の定常領域のアミノ酸配列からなる融合タンパク質として抗ＣＤ３００ａ抗体を作製することができる。
たとえば、ヒトの定常領域を利用することにより、ヒトキメラ抗体として抗ヒトＣＤ３００ａ抗体を作製することは、好ましい実施形態の一つである。このような抗ＣＤ３００ａ抗体は、公知の手法により作製することが可能である。
【００５６】
たとえば、上記所定の可変領域のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを合成し、定常領域のアミノ酸配列をコードするＤＮＡおよびその他の必要なＤＮＡ（転写因子等）と連結することにより、抗ＣＤ３００ａ抗体遺伝子の発現ベクターを構築することができる。このベクターを宿主細胞に導入して発現させるようにすれば、目的とする抗ＣＤ３００ａ抗体を産生することができる。
【００５７】
なお、上述したようなＴＸ４１、ＴＸ４９およびこれらに類する抗体は、本発明の作用効果に係る、ホスファチジルセリンとＣＤ３００ａとの結合により生じる抑制性シグナル伝達を阻害する目的以外にも使用できる可能性がある。
（ＣＤ３００ａ  ｓｉRNA）
また、ＣＤ３００ａの遺伝子配列（ＤＤＢＪ/ＥＭＢＬ/ＧｅｎＢａｎｋ＝ＩＮＳＤ等のＤＮＡデータベースから入手可能）を元に設計されたｓｉＲＮＡにより、罹患部位におけるミエロイド系細胞におけるＣＤ３００ａの発現を抑制し、ＣＤ３００ａ遺伝子を欠損させた状態またはＣＤ３００ａとホスファチジルセリンの結合を阻害した状態と同様に、上記の各種疾患に対する治療効果を得ることができる。換言すれば、ＣＤ３００ａ遺伝子に対するｓｉＲＮＡも、本発明におけるＣＤ３００ａとホスファチジルセリンの結合を阻害する物質の一種といえる。
【００５８】
（第１の活性調節剤の用途）
本発明に係る第１の活性調節剤は、ＣＤ３００ａを発現するミエロイド系細胞の抑制性シグナル伝達を抑制するために使用することができる。この際、ミエロイド系細胞は、生体内にあるものであっても、生体外に分離されたものまたは生体外で培養されたものであってもよい。
【００５９】
上記の作用により、ミエロイド系細胞のＣＤ３００ａの活性シグナリングを維持または向上させることで、当該ミエロイド系細胞から放出されるケミカルメディエーターを介する細胞間の情報伝達も維持または向上され、それに連なるさらなる細胞間の情報伝達によって引き起こされるセリアック病の免疫応答等に影響を及ぼすことができる。
【００６０】
したがって、ＣＤ３００ａ結合性物質（ＴＸ４１、ＴＸ４９等の中和抗体）や、ホスファチジルセリン結合性物質（ＭＦＧ−Ｅ８等）がセリアック病を解明するためのツールとなりうることは、当業者にとって十分に推認可能である。
【００６１】
実施例に示したセリアック病のように、ＣＤ３００ａ遺伝子を欠損させる（すなわちＣＤ３００ａとホスファチジルセリンとの結合を完全に生じさせない）ことで発症ないし症状が悪化することが確認された疾患に対しては、ホスファチジルセリンが治療薬となりうることも、当業者にとって十分に推認可能である。また、例えば、実験動物のセリアック病の病態を増悪させて比較解析するための比較解析ツールとしての薬剤の有効成分としても使用することができる。
【００６２】
＜第２の活性調節剤＞
第２の活性調節剤は、ＣＤ３００ａを介した抑制性シグナル伝達を亢進する（つまり、ＣＤ３００ａの活性シグナリングを抑制する）作用を有する成分を含有する。本発明ではそのような成分として、ホスファチジルセリンとＣＤ３００ａとの結合を亢進する物質、特にＣＤ３００ａのリガンドであるホスファチジルセリンを用いることができる。
【００６３】
また、本発明の別の側面により提供されるＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスを用いたスクリーニングにより、ホスファチジルセリンと同様の作用を有する、ＣＤ３００ａに対するアゴニスト（低分子化合物、抗体等）を発見できる可能性があり、それらもホスファチジルセリンとＣＤ３００ａとの結合を亢進する物質として用いることができる。
【００６４】
（ホスファチジルセリン）
ホスファチジルセリン（ＰＳ）は、ミエロイド系細胞に発現しているＣＤ３００ａのリガンドであり、ＰＳとＣＤ３００ａとの相互作用（結合）によって、ＣＤ３００ａ発現細胞の抑制性シグナリングが亢進する。たとえば、マスト細胞においては、この抑制性シグナリングを介して、ヒスタミンや、サイトカイン、ケモカインなどのケミカルメディエーターを放出するという、炎症反応に関連するマスト細胞の活性が抑制される。ＰＳは工業的に生産されており、容易に入手することができる。
【００６５】
なお、生体外にある（試験的な環境における）ＣＤ３００ａ発現細胞に対しては、ＰＳを提示した状態にあるアポトーシス細胞（ＰＳは、通常の細胞においては細胞の内側（脂質二重層のうち細胞質側の層）に存在するが、アポトーシスが起こると細胞の外側に提示されることが知られている）も第２の活性調節剤となり得る。また、外側にＰＳを含む脂質膜が形成されているリポソーム等も、第２の活性調節剤として用いることができる可能性がある。
【００６６】
（カルシウム塩）
ＰＳとマスト細胞におけるＣＤ３００ａとの相互作用は、カルシウムイオンを必要とすることから、本発明に係る第２の活性調節剤は、電離によってカルシウムイオンを発生するカルシウム塩（たとえば、塩化カルシウム等）を含有することが好ましい。
【００６７】
第２の活性調節剤中のカルシウム塩の含有量は、投与部位におけるカルシウムイオンの濃度や本発明に係る第２の活性調節剤に含まれるＰＳの量等を考慮して、適宜決定することができる。
【００６８】
（第２の活性調節剤の用途）
本発明に係る第２の活性調節剤は、ＣＤ３００ａを発現するミエロイド系細胞の抑制性シグナル伝達を亢進するために使用することができる。この際、ミエロイド系細胞は、生体内にあるものであっても、生体外に分離されたものまたは生体外で培養により生産したものであってもよい。
【００６９】
上記の作用により、ミエロイド系細胞のＣＤ３００ａの活性シグナリングを抑制することで、当該ミエロイド系細胞から放出されるケミカルメディエーターを介する細胞間の情報伝達も抑制され、それに連なるさらなる細胞間の情報伝達によって引き起こされるＣＤ４＋Ｔ細胞の免疫応答等に影響を及ぼすことができる。したがって、本発明の第２の活性調節剤は、後述する所定の医薬品の有効成分（たとえば免疫抑制剤）として使用することができる。また、例えば、実験動物のセリアック病の病態を改善させて比較解析するための比較解析ツールとしての薬剤の有効成分としても使用することができる。
【００７０】
［医薬品］
本発明に係る医薬品（医薬組成物）は、上述したような活性調節剤を有効成分（免疫抑制剤など）として含有し、必要に応じて薬学的に許容される各種の添加剤（たとえば担体）をさらに含有していてもよい。
【００７１】
このような医薬品は、ＣＤ３００ａを発現するミエロイド系細胞の抑制性シグナル伝達が関与する疾病または症状を、治療（緩和も含む）または予防するためのものとして製剤化することができる。
【００７２】
より具体的には、前記第２の活性調節剤を有効成分（免疫抑制剤）として配合することにより、セリアック病を治療または予防するための医薬品などを調製することができる。
医薬品の投与部位は、適用対象とする疾病または病状に応じて、過剰な免疫機能（炎症反応）が生じている部位とすることができ、特に限定されるものではない。たとえば、腹腔内、気管内、皮下、皮内、泌尿生殖器内などの部位が挙げられる。
【００７３】
ＣＤ３００ａを発現するミエロイド系細胞は、通常、哺乳類の粘膜下組織や結合組織に存在するため、医薬品は、上記の部位の粘膜下組織や結合組織またはその付近に直接的に投与されることが好ましい。そのような投与は、静脈内注射、動脈内注射、皮下注射、皮内注射、筋肉内注射、腹腔内注射等の注射投与によって行うことができる。たとえば、炎症性感染症（細菌性腹膜炎など）を治療または予防する場合は、腹腔内注射が好ましい。
【００７４】
医薬品（ないしそこに含まれる有効成分）の１回あたりの投与量および投与回数は、患者の年齢、性別、体重及び症状、必要とされる治療効果の程度、投与方法、処理時間、有効成分の種類などにより異なり、適宜調整されてもよい。投与回数は、たとえば、１日あたり１回〜数回である。
【００７５】
医薬品が第２の活性調節剤を有効成分（免疫抑制剤）として含有する場合、免疫抑制効果を一層向上させるという観点から、当該医薬品は、投与されるヒトまたは動物１ｋｇあたり、ホスファチジルセリンの１回あたりの投与量が通常３〜１５０ｍｇ、好ましくは５〜１００ｍｇになるように製剤化してもよい。
【００７６】
（薬学的に許容され得る担体）
本発明に係る医薬品は、必要に応じて、薬学的に許容され得る担体を含んでいてもよい。
【００７７】
薬学的に許容され得る担体とは、医薬品の目的に反しないものである限り特に限定されず、たとえば、水性希釈剤や非水性希釈剤等の希釈剤、抗酸化剤（亜硫酸塩など）等の安定剤・保存剤、リン酸塩類等の緩衝剤、界面活性剤等の乳化剤、着色剤、粘稠剤、リドカインなどの局所麻酔剤、グリコール類などの溶解補助剤、塩化ナトリウムやグリセリン等の等張化剤あるいはその他の添加剤等が挙げられる。
【００７８】
たとえば、本発明に係る医薬品の剤形が注射剤である場合、所望の粘度や含有成分の濃度になるように希釈剤を配合することにより、有効成分を希釈剤に溶解または分散させることが好ましい。
【００７９】
このような希釈剤としては、生理食塩水または市販の注射用蒸留水等の水性希釈剤、ポリエチレングリコール、エタノール等のアルコール類等の非水性希釈剤が挙げられる。
剤形が注射剤である医薬品は、常法に従って、フィルターによる濾過滅菌されてもよいし、殺菌剤の配合等により無菌化されてもよい。
【００８０】
また、本発明に係る医薬品を注射剤として投与する場合、用時調製の形態としてもよい。たとえば、凍結乾燥法などによって第２の活性調節剤を含む固体剤を調製し、使用前に希釈剤に溶解または分散させて注射剤を調製してから投与することができる。
【００８１】
ＣＤ３００ａ発現細胞（大腸粘膜固有層中のマクロファージ）に対するホスファチジルセリンの結合が維持されると、ＭｙＤ８８およびＴＲＩＦを介した抑制性のグリアジンシグナル伝達経路によって、セリアック病の進行に保護的な役割が果たされる。したがって、第２の活性調節剤を有効成分として使用することにより、セリアック病に対する医薬品が得られる。
【００８２】
[ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスのセリアック病に関する使用]
本発明で得られた知見により、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスに対して、セリアック病を誘導する物質として知られているグルテン由来のグリアジンペプチドを投与することでセリアック病を誘導した場合、セリアック病の病徴が野生マウスよりも悪化する。
【００８３】
すなわち、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスは、セリアック病を誘導する物質を投与したときにセリアック病を発症するモデルマウスとして使用することができる。
本発明に係るセリアック病のモデルマウスはＣＤ３００ａ遺伝子が不活化し且つ、マスト細胞やマクロファージから抗炎性サイトカインの放出が抑制解除されたマウスである。
【００８４】
当該マウスは、早期に（壮年期から）セリアック病を誘導する物質を与えると、セリアック病の症状（小腸の炎症）を示す。そのため、このマウスはセリアック病の原因解明に役立つとともに、セリアック病治療薬の開発に貴重な役割を果たす。
【００８５】
セリアック病の症状は、炎症誘導物質投与した後に、マウスの小腸上皮の切片を顕微鏡下で観察する公知の方法等により確認することができる。
また、本発明に係るセリアック病モデルマウスは、セリアック病治療薬をスクリーニングする際にも用いることができる。特に、確実にセリアック病の症状を示すため、セリアック病の症状発症後の治療薬だけではなく、セリアック病の予防薬の開発にも有用である。
【００８６】
さらに、既に治療効果が実証されているセリアック病の治療薬の評価にも有用である。
例えば、一定の範囲の濃度では治療効果を有するが、当該範囲の濃度以下では効果を有さず、当該範囲の濃度以上では毒性を示す様な治療薬の最適な濃度の検討にも有用である。
【００８７】
具体的には、セリアック病モデルマウスを被験マウス群及び対照マウス群に分け、被験マウス群にのみ試験する治療薬を投与し、小腸上皮の切片により各群を比較し、治療薬の効果を評価することができる。
【００８８】
さらに、被検マウス群に濃度の異なる治療薬を与えることにより、治療効果のある最適な治療薬の濃度の検討を行うこともできる。
すなわち、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスは、セリアック病を発症した前記ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスに、セリアック病の治療薬の候補物質を投与して治療効果の有無を確認する用途、または、セリアック病を発症する前の前記ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスに、前記セリアック病を誘導する物質と共にセリアック病の予防薬の候補物質を投与して予防効果の有無を確認する用途、さらにはセリアック病の病態解析用途に用いることができる。
【００８９】
また、ＣＤ３００ａ（ＭＡＩＲ−Ｉ）受容体は、抗炎症性サイトカインの産生を抑制するシグナル伝達の上流を担っている。よって、抗炎症性サイトカインの産生を抑制するシグナルの伝達を維持または促進させるＣＤ３００ａ（ＭＡＩＲ−Ｉ）の作動薬（アゴニスト）やシグナル伝達物質を投与することで、セリアック病の症状は改善することが期待される。
【００９０】
このことから、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスは、作動薬（アゴニスト）の探索、ＭＡＩＲ−Ｉ受容体より下流のシグナル伝達を相補するようなシグナル伝達物質やこれを誘導する物質の探索、さらには当該シグナル伝達物質等の産生に関与する遺伝子の探索の用のスクリーニングにも好適に用いることができる。
このスクリーニングは、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスとＷＴマウス間で、ＤＮＡマイクロアレイ解析や２次元蛋白質電気泳動等による差分解析により行うことができる。
【００９１】
（ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスの作製方法）
本発明のＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスは、染色体上のＣＤ３００ａ遺伝子が不活性型ＣＤ３００ａ遺伝子に置換されたことにより、ＣＤ３００ａタンパク質の機能が欠損したマウスである。
【００９２】
「不活性型ＣＤ３００ａ遺伝子」とは、ＣＤ３００ａ遺伝子の一部の欠損、ＣＤ３００ａ遺伝子のコード領域への他の塩基配列の挿入、ＣＤ３００ａ遺伝子内の点突然変異、ＣＤ３００ａ遺伝子の発現調節領域内の変異などにより、正常なＣＤ３００ａタンパク質を発現できない遺伝子をいう。欠損型ＣＤ３００ａ遺伝子としては、たとえば、ＣＤ３００ａ遺伝子に含まれるエクソン1〜6の少なくとも一つが欠損した遺伝子などが挙げられるが、これには限定されない。
【００９３】
「ＣＤ３００ａタンパク質の機能が欠損した」とは、本発明が関与する抑制性シグナル伝達に係るＣＤ３００ａタンパク質の機能の少なくとも一部が失われたことをいい（たとえば、ヘテロノックアウトマウスのように片方のアレルのみ不活性型に置換されて、ＣＤ３００ａタンパク質の機能が一部失われたような場合が含まれる。）、好ましくは当該機能が完全に失われたことを意味する。
【００９４】
遺伝子カセットを用いてＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスを得るための一般的な方法は次の通りである。ただし、本発明のＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスはこの方法により得られるものに限定されない。
【００９５】
野生型アレル中のＣｄ３００ａ遺伝子のエクソンを抗生物質耐性遺伝子（マーカー遺伝子）カセットで置き換えた標的化アレル（変異型アレル）を有するターゲティングベクターを調製する。常法に従い、当該ターゲティングベクターとＥＳ細胞を用いてキメラマウスを得る。当該キメラマウスと野生型マウスとを交配させて、子マウス（ヘテロ接合体（＋／−））を得、さらに子マウス同士を交配させて、孫マウスを得る。
【００９６】
孫マウスからゲノムＤＮＡを抽出し、該ゲノムＤＮＡをＰＣＲ法によって、ゲノムＤＮＡ中の野生型アレルおよび変異型アレルの存在の有無を確認し、変異型アレルのみを有する孫マウス（ホモ接合体（−／−））を得る。さらにＣＤ３００ａが発現していないことを確認するために、当該マウス由来の細胞を抗ＣＤ３００ａ抗体を用いたウエスタンブロット分析で確認し、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスとする。
【実施例】
【００９７】
以下、実施例に則して、本発明をより具体的に説明するが、下記の実施例は、本発明を限定するものではない。
１．調製例
（１）ＣＤ３００ａ−Ｆｃ融合タンパク質、ＭＦＧ−Ｅ８およびＤ８９Ｅ  ＭＦＧ−Ｅ８の調製
（１−１）  ヒトＩｇＧのＦｃ部位を有するＣＤ３００ａの融合タンパク質（ＣＤ３００ａ−Ｆｃ）を、下記文献２５に記載されているように、マウスまたはヒトＣＤ３００ａの細胞外ドメイン全体をコードする遺伝子のｃＤＮＡとヒトＩｇＧ１Ｆｃをコードする遺伝子のｃＤＮＡとを含むキメラｃＤＮＡから調製した。なお、上記融合タンパク質において、ＣＤ３００ａの細胞外ドメインが、マウス由来のものおよびヒト由来のものを、それぞれ「マウスＣＤ３００ａ−Ｆｃ」および「ヒトＣＤ３００ａ−Ｆｃ」と称する。
【００９８】
（１−２）  ＭＦＧ−Ｅ８は、Ｍａｓａｔｏ  Ｔａｎａｋａ氏（ＲＣＡＩ、日本国横浜市）から提供されたものである。
（１−３）  Ｄ８９Ｅ  ＭＦＧ−Ｅ８は、下記文献４に記載されているように、ＭＦＧ−Ｅ８のＲＧＤモチーフに部位特異的突然変異を導入して得られたＭＦＧ−Ｅ８の変異体である。
【００９９】
得られたＤ８９Ｅ  ＭＦＧ−Ｅ８は、Ｎ末端から８９番目のアミノ酸がアスパラギン酸からグルタミン酸に置換されている。また、ＭＦＧ−Ｅ８（ネイティブ）は、フォスファチジルセリン（ＰＳ）とαｖβ３インテグリンとの両方に結合して、アポトーシス細胞とαｖβ３インテグリンを発現する貪食細胞とを架橋する（下記文献４）のに対して、Ｄ８９Ｅ  ＭＦＧ−Ｅ８は、フォスファチジルセリン（ＰＳ）に結合するものの、αｖβ３インテグリンに結合しない。
【０１００】
（２）マウスおよび盲腸結紮穿刺（ＣＬＰ）
本参考例および実施例で使用されたノックアウトマウスは、以下のように作製あるいは提供されたものである。
【０１０１】
（ｉ）ＣＤ３００ａ遺伝子欠損（Ｃｄ３００ａ-/-）マウス
野生型アレル中のＣｄ３００ａ遺伝子のエクソン１〜６を、細菌人工染色体（ＢＡＣ）システムを用いて、ネオマイシン耐性遺伝子カセット（ＰＧＫ−ＧＢ２−ｎｅｏ）で置き換え、標的化アレル（変異型アレル）を調製した（図３Ａ）。次いで、常法に従い、キメラマウスを得、さらに該キメラマウスと野生型マウスとを交配させて、子マウス（ヘテロ接合体（＋／−））を得、さらに子マウス同士を交配させて、孫マウスを得た。
【０１０２】
孫マウスの中から、ＣＤ３００ａ欠損（Ｃｄ３００ａ-/-）マウスを選別するために、各孫マウスの尾部からゲノムＤＮＡを抽出し、該ゲノムＤＮＡをＰＣＲ法によって、ゲノムＤＮＡ中の、ＷＴアレルおよび変異型アレルの存在の有無を確認した。
【０１０３】
なお、図３Ｂに示されるように、ＷＴアレルを示すＰＣＲ産物、変異型アレルを示すＰＣＲ産物は、それぞれ、約５４０ｂｐ、約７００ｂｐのバンドとして検出される。
さらにＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスに、ＣＤ３００ａが発現していないことを確認するために、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス由来の細胞を抗ＣＤ３００ａ抗体を用いたウエスタンブロット分析に供した。図３Ｃに示されるように、野生型マウスでは、約５０ｋＤａにＣＤ３００ａに由来するバンドが示される一方で、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスでは、このバンドは検出されなかった。
【０１０４】
（ｉｉ）Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ−ｋｉｔW-sh/W-shマウス
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ−ｋｉｔW-sh/W-shマウス（以下、「ｋｉｔW-sh/W-shマウス」または「マスト細胞欠損マウス」）は、理研バイオリソースセンター（日本国つくば市）から提供されたものである。なお、該マウスは、マスト細胞を欠損したマウスであること（下記文献２１）および、アポトーシス性のＤＮＡ断片化を経ずに、貪食細胞によってＤＮＡが取り込まれた後に、貪食細胞内でＤＮＡの分解が生じることが知られている（下記文献１２）。
【０１０５】
（ｉｉｉ）ＣＡＤ欠損マウス
ＣＡＤ（カスパーゼ活性型ＤＮＡ分解酵素（Ｃａｓｐａｓｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＤＮａｓｅ））欠損マウスは、下記文献１２に記載されたものである。
【０１０６】
（ｖ）マクロファージおよび好中球のｉｎ  ｖｉｖｏ除去
下記文献３０の記載に基づき、クロドン酸リポソームおよびコントロール用ＰＢＳリポソーム（Ｅｎｃａｐｓｕｌａ  ＮａｎｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）を調製した。次いで、ＣＬＰ後２４時間目に、これらのリポソーム０．５ｍＬをマウス腹腔内に注入して、マクロファージを除去した。
【０１０７】
また、ＣＬＰ後２４時間目に、抗Ｇｒ−１抗体を、マウス腹腔内に注入して、好中球を除去した。
なお、本実施例におけるマウスを用いた調製および評価試験の実施は何れも、筑波大学生命科学動物資源センター動物倫理員会作製のガイドラインを遵守したものである。
【０１０８】
（３）各種抗体
各種抗体の購入先および調製方法を下記表１に示す。
【０１０９】
【表１】
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【０１１０】
（４）各種細胞の調製
各種細胞は、以下のように調製されたものである。
（ｉ）骨髄由来マスト細胞（ＢＭＭＣ）
マウス骨髄細胞２×１０8個を、１０ｃｍｍディッシュにて、細胞増殖因子（ＳＣＦ）（１０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ−３（４ｎｇ／ｍＬ）および仔牛血清（ＦＢＳ）（１０％）を含むコンプリートＲＰＭＩ１６４９メディウム中で５週間以上培養して骨髄由来マスト細胞（ＢＭＭＣ）を調製した。ＢＭＭＣは、毎週新しいメディウムで継代した。調製されたＢＭＭＣのうち、９５％超は、フローサイトメトリー分析によって、ｃ−Ｋｉｔ+ＦｃεＲＩ+細胞であることが示された。
【０１１１】
（ｉｉ）骨髄由来マクロファージ（ＢＭＭφ）
マウス骨髄細胞２×１０6細胞を、１０ｃｍｍディッシュにて、Ｍ−ＣＳＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）および仔牛血清（ＦＢＳ）（１０％）を含むコンプリートＲＰＭＩ１６４９メディウム中で１週間培養して骨髄由来マクロファージ（ＢＭＭφ）を調製した。
【０１１２】
（ｉｉｉ）ＮＩＨ３Ｔ３細胞形質転換体
常法に基づいて、Ｆｌａｇタグ付きＣＤ３００ａのｃＤＮＡまたはＦｌａｇタグ付きＣＤ３００ｄのｃＤＮＡを含むｐＭＸ−ｎｅｏレトロウイルスベクタープラスミドを調製した。
【０１１３】
調製されたプラスミドをＮＩＨ３Ｔ３細胞を形質導入（トランスフェクト）して、ＣＤ３００ａまたはＣＤ３００ｄを安定発現する形質転換体を得た。得られた、ＣＤ３００ａを安定発現する形質転換体およびＣＤ３００ｄを安定発現する形質転換体をそれぞれ、「ＮＩＨ３Ｔ３形質転換体（ＣＤ３００ａ）」および「ＮＩＨ３Ｔ３形質転換体（ＣＤ３００ｄ）」と称する。
【０１１４】
また、ＴＩＭ−４を安定発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞形質転換体は、Ｔ．Ｋｉｔａｍｕｒａ氏（東京大学）から提供されたものである。なお、この形質転換体を、「ＮＩＨ３Ｔ３形質転換体（ＴＩＭ−４）」と称する。
【０１１５】
［評価方法］
以下に、評価方法の条件を記載する。なお、生存試験においては、カプラン・マイヤーログランク検定（Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ  ｌｏｇ−ｒａｎｋ  ｔｅｓｔ）を用い、その他の評価試験においては、アンペアード・スチューデントｔ検定（ｕｎｐａｉｒｅｄ  Ｓｔｕｄｅｎｔ'ｓ  ｔ  ｔｅｓｔ）を用いて統計学分析を行った。Ｐ＜０．０５を統計学的有意差とみなした。
【０１１６】
（５）結合アッセイ等
（ｉ）結合アッセイ
細胞を、２％ＦＢＳを含むリン酸緩衝液中、１ｍＭＣａＣｌ2の存在下または非存在下でＣＤ３００ａまたはコントロール用ヒトＩｇＧを用いて３０分間染色し、同一の緩衝液で２回洗浄して、ＦＩＴＣ結合型のヤギ抗ヒトＩｇＧのＦ（ａｂ'）2フラグメントとともにインキュベートした。次いで、アネキシンＶで染色するために、細胞を、１４０ｍＭ  ＮａＣｌおよび２．５ｍＭＣａＣｌ2を含む１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液中で、アネキシンＶとともに１５分室温でインキュベートした。
【０１１７】
（ｉｉ）結合阻止アッセイ
細胞を、マウスＣＤ３００ａに対するモノクローナル抗体（ＴＸ４１）、コントロール用アイソタイプの抗体またはＭＦＧ−Ｅ８とともに、３０分間プレインキュベートした後、上記結合アッセイのように、ＣＤ３００ａ−Ｆｃで染色した。また、ＣＤ３００ａ−Ｆｃがリン脂質へ結合したか否かを分析するために、ＰＩＰストリップアッセイ（Ｅｃｈｅｌｏｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を製造元の取扱説明書に準拠して実施した。
【０１１８】
（６）好気性細菌のＣＦＵ（コロニー形成単位）の測定
マウスの腹膜灌流液の段階希釈液をプレーティングして、該希釈液をブレインハートインフュージョン（ＢＨＩ）寒天を含むプレート上で、３７℃、４８時間培養した。次いで、好気性細菌のＣＦＵを、下記文献２７に記載されているように、腹膜灌流液１ｍＬ中のコロニー数を計測して算出した。
【０１１９】
［参考例１：ＣＤ３００ａのリガンドの同定］
［参考例１Ａ］
各種造血幹細胞系列細胞株または腫瘍細胞系列細胞株におけるマウスＣＤ３００ａリガンドの発現を確認するために、以下のような試験を行った。
【０１２０】
「１．調製例」において得られた、骨髄由来マクロファージ（ＢＭＭφ）、骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）またはＩＬ−３依存性造血細胞株（ＢａＦ／３細胞）（各細胞数２Ｘ１０5個）を、ＣＤ３００ａ−Ｆｃ（１μｇ）、および塩化カルシウム（１ｍＭ）を含むＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）中で２０℃、３０分間インキュベートし、次いでＦＩＴＣ結合型抗ヒトＩｇＧ抗体（０．１μｇ）およびヨウ化プロピジウム（ＰＩ）（１μｇ）を含む緩衝液を用いて染色した。
【０１２１】
染色された各細胞を、フローサイトメトリー（ベクトン・ディッキンソン社製、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ、型番「Ｅ６１３３」）を用いた分析に供した。
また、マウスＣＤ３００ａ−Ｆｃの代わりにコントロール用ヒトＩｇＧ（１μｇ）を用いたこと以外は上記試験方法と同様にして、対照試験も実施した。
【０１２２】
ＢＭＭφ、ＢＭＤＣおよびＢａＦ／３細胞を用いた場合のフローサイトメトリーの分析結果を、それぞれ図１Ａ、図１Ｂおよび図１Ｃに示す（なお、対照試験は、「Ｃｔｒｌ  Ｉｇ」に示す。）。
【０１２３】
図１Ａ〜図１Ｃに示されるように、マウスＣＤ３００ａ−Ｆｃは、塩化カルシウムを含む場合、ＰＩ-細胞（生細胞）に結合する一方、ＰＩ+細胞（死細胞）には結合しないことが分かった。つまり、マウスＣＤ３００ａリガンドは、死細胞において発現していることが示唆される。
【０１２４】
［参考例１Ｂ］
マウスＣＤ３００ａ−Ｆｃが、死細胞の一種であるアポトーシス細胞に結合するか否かを検証するために、以下のような試験を行った。
【０１２５】
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（野生型マウス）由来の胸腺細胞に、ＲＰＭＩメディウム中でデキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ社製）（１０μＭ）とともにインキュベートして、胸腺細胞のアポトーシス細胞を調製した。
【０１２６】
得られたアポトーシス細胞（細胞数２Ｘ１０5）を、ＣＤ３００ａ−Ｆｃ（１μｇ）、ＡＰＣ結合型アネキシンＶ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）（１μｌ）および塩化カルシウム（１ｍＭ）を含むメディウム（ＰＢＳ）中で２０℃、３０分間インキュベートし、次いで、ＦＩＴＣ結合型抗ヒトＩｇＧ抗体（０．１μｇ）およびヨウ化プロピジウム（ＰＩ）（１μｇ）を含む緩衝液を用いて染色した。
【０１２７】
染色された各細胞を、フローサイトメトリー（ベクトン・ディッキンソン社製、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ、型番「Ｅ６１３３」）を用いて分析した（結果：図２Ａ）。
また、塩化カルシウムを含むメディウムの代わりに塩化カルシウムを含まないメディウムを用いたこと以外は、上記試験条件と同様にして、フローサイトメトリーを用いた分析に供した（結果：図２Ｂ）。
【０１２８】
図２Ａによると、塩化カルシウムの存在下では、マウスＣＤ３００ａ−Ｆｃは、アネキシンＶで染色されない（アネキシンＶ-）胸腺細胞に結合しないのに対して、アネキシンＶで染色される胸腺細胞に結合することが分かる。すなわち、マウスＣＤ３００ａ−Ｆｃは、アポトーシスした胸腺細胞に結合することが示される。
【０１２９】
一方で、図２Ｂに示されるように、塩化カルシウムの非存在下では、マウスＣＤ３００ａ−Ｆｃは、アポトーシスした胸腺細胞へ結合しないことが分かる。
本試験結果から、マウスＣＤ３００ａは、カルシウムイオン依存的に、アポトーシス細胞に結合することが理解できる。
【０１３０】
［参考例１Ｃ］
参考例１Ｂで得られたアポトーシス細胞（細胞数２Ｘ１０5）を、マウスＣＤ３００ａ−Ｆｃ（１μｇ）、ＡＰＣ結合型アネキシンＶ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）（１μｌ）、コントロール用ヒトＩｇＧ１（１μｇ）および塩化カルシウム（１ｍＭ）を含むメディウム（ＰＢＳ）中で２０℃、３０分間インキュベートし、次いで、ＦＩＴＣ結合型抗ヒトＩｇＧ抗体（０．１μｇ）およびヨウ化プロピジウム（ＰＩ）（１μｇ）を含む緩衝液を用いて染色した。
【０１３１】
染色された各細胞を、フローサイトメトリー（ベクトン・ディッキンソン社製、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ、型番「Ｅ６１３３」）を用いた分析に供した（結果：図２Ｃ「ＨｕＩｇＧ１」）。
【０１３２】
また、コントロール用ヒトＩｇＧ１の代わりに、モノクローナル抗体である「ＴＸ４１」またはマクロファージに発現する蛋白質「ＭＦＧ−Ｅ８」を用いたこと以外は、上記試験条件と同様にして、上記試験条件と同様にして、フローサイトメトリーを用いて分析した（結果：図２Ｃ「ＴＸ４１」および「ＭＦＧ−Ｅ８」）。
【０１３３】
ここで使用された「ＴＸ４１」は、上述したように、抗マウスＣＤ３００ａモノクローナル抗体であり、マウスＣＤ３００ａとリガンドとの結合を阻止するものである。
また、「ＭＦＧ−Ｅ８」は、フォスファチジルセリン（ＰＳ）とαｖβ３インテグリンとの両方に結合し、アポトーシス細胞とαｖβ３インテグリンを発現する貪食細胞（ｐｈａｇｏｃｙｔｅ）とを架橋することが知られている（下記文献４）。
【０１３４】
図２Ｃの各フローサイトメトリーの結果を対比すると分かるように、ＴＸ４１またはＭＦＧ−Ｅ８の存在下では、マウスＣＤ３００ａは、アポトーシス細胞へ結合しないことが理解できる。
【０１３５】
この点を鑑みると、マウスＣＤ３００ａ−Ｆｃは、ＰＳに対する結合性を有すること（ＣＤ３００ａのリガンドはＰＳであること）が示唆される。
［参考例１Ｄ］
ヒトＣＤ３００ａも、マウスＣＤ３００ａと同様に、アポトーシス細胞に結合するのか否かを検証すべく、以下の試験を行った。
【０１３６】
まず、Ｊｕｒｋａｔ細胞（ヒトＴ細胞系列）を、ＲＰＭＩ１６４０メディウムに懸濁させ、該メディウムに紫外線を６０分間照射して、Ｊｕｒｋａｔ細胞のアポトーシス細胞を調製した。
【０１３７】
アポトーシス細胞として、野生型マウス胸腺細胞由来のアポトーシス細胞の代わりに、上記「Ｊｕｒｋａｔ細胞由来のアポトーシス細胞」を用い、「マウスＣＤ３００ａ−Ｆｃ」の代わりに「ヒトＣＤ３００ａ−Ｆｃ」を用いたこと以外は、参考例１Ａの試験条件と同様にして、フローサイトメトリーを用いて分析した（結果：図２Ｄ）。
【０１３８】
また、アポトーシス細胞として、野生型マウス胸腺細胞由来のアポトーシス細胞の代わりに、上記「Ｊｕｒｋａｔ細胞由来のアポトーシス細胞」を用い、「マウスＣＤ３００ａ−Ｆｃ」の代わりに「ヒトＣＤ３００ａ−Ｆｃ」を用い、さらに、「ＴＸ４１」の代わりに「ＴＸ４９」または「コントロール用ヒトＩｇＧ１」を用いたこと以外は、参考例１Ｂの試験条件と同様にして、フローサイトメトリーを用いて分析した（結果：図２Ｅ「ＴＸ４９」または「ＨｕＩｇＧ１」）。なお、「ＴＸ４９」とは、抗ヒトＣＤ３００ａ抗体（モノクローナル抗体）であり、ＣＤ３００ａとリガンドとの結合を阻止するものである。
【０１３９】
図２Ｄ〜図２Ｅに示されるように、ヒトＣＤ３００ａ−Ｆｃも、アネキシンＶ+細胞に結合する一方で、抗ヒトＣＤ３００ａ抗体の存在下では結合しないことが分かる。
すなわち、マウスＣＤ３００ａ−Ｆｃと同様に、ヒトＣＤ３００ａもアポトーシス細胞に結合することが示唆される。
【０１４０】
［参考例１Ｅ］
メンブレン（ＰＩＰ−ｓｔｒｉｐ（Ｅｃｈｅｌｏｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製））に、各種リン脂質（ＰＳ、ＰＣ、ＰＥ）（１００  ｐｍｏｌ）を含む液（試料液）をスポットして、該メンブレン上に各種リン脂質を吸着させた。
【０１４１】
次いで、該メンブレンを、マウスＣＤ３００ａ−Ｆｃ（１．５μｇ／ｍＬ）を含む塩化カルシウム（１ｍＭ）及びＢＳＡを加えたＴＢＳＴ緩衝液（ｐＨ  ８．０）中に２０℃で２時間浸漬した。
【０１４２】
浸漬後、マウスＣＤ３００ａ−Ｆｃを含まないＴＢＳＴ緩衝液（ｐＨ８．０）で、３回洗浄して、メンブレン上の各リン脂質に未結合のＣＤ３００ａ−Ｆｃを除去した後、ＨＲＰ結合型抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎ社製）を含むＢＳＡを加えたＴＢＳＴ緩衝液（ｐＨ８．０）を用いて検出した（結果：図２Ｆ）
【０１４３】
図２Ｆ中、「ＰＥ」、「ＰＣ」および「ＰＳ」は、それぞれホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、およびホスファチジルセリンがメンブレン上にスポットされた部分を指し、「Ｂｌａｎｋ」は、何れのリン脂質もメンブレン上にスポットされていない部分を指す。
【０１４４】
図２Ｆによれば、ＣＤ３００ａは、ＰＥおよびＰＣの何れにも結合しない一方、ＰＳに特異的に結合したことを示している。
参考例１Ａ〜１Ｅの結果から、ＣＤ３００ａは、カルシウムイオン依存的にホスファチジルセリン（ＰＳ）に結合すること（ＣＤ３００ａのリガンドはＰＳであること）が理解できる。
【０１４５】
［参考例２：ＣＤ３００ａの機能解析（２）］
一部のＰＳ結合性受容体は、貪食細胞において発現し、生理学的および病理的状況下で、アポトーシス細胞の除去に関与することが知られている（下記文献４〜９）。
【０１４６】
また、ＰＳは、ＣＤ３００ａを発現する細胞である貪食細胞（マクロファージ等）において、いわゆる「ｅａｔ  ｍｅ」シグナルを介在することが知られている（下記文献１０〜１１）。この点を鑑みて、下記参考例２Ａ〜Ｃに記載の試験を行って、ＣＤ３００ａが、アポトーシス細胞の貪食作用に関与するか否かを検証した。
【０１４７】
［参考例２Ａ］
ＣＡＤ欠損マウスに由来する胸腺細胞を、参考例１Ｂと同様にして、アポトーシス胸腺細胞を調製した。
【０１４８】
次いで、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス由来のマクロファージ（チオグリコレート誘発性腹腔マクロファージ）（２×１０5細胞）を、８穴Ｌａｂ−ＴｅＫＩＩチャンバースライド（Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ社製）内で、ＣＡＤ欠損マウスに由来するアポトーシス胸腺細胞とともに、１：５（マクロファージ：アポトーシス胸腺細胞（細胞数））の比率で、３７℃、１時間共培養した。
【０１４９】
次いで、下記文献５または２６に記載されているように、共培養したマクロファージを冷ＰＢＳで洗浄し、パラホルムアルデヒド（１％）を含む固定液で固定した後、ＦＩＴＣ標識化ｄＵＴＰ（Ｒｏｃｈｅ社製）を含む緩衝液を用いたＴＵＮＥＬ染色に供した。
【０１５０】
染色された５０細胞数以上のマクロファージをランダムにレーザー走査型共焦点顕微鏡（オリンパス社製、「ＦＶ１０ｉ」、型番：１Ｂ２２３５８）で分析し、マクロファージ１細胞に含まれるＴＵＮＥＬポジティブ細胞（アポトーシス細胞）の数を計測した。全マクロファージの個数を１００％として、０〜８個の各アポトーシス細胞を含むマクロファージの比率（貪食率）を算出した（結果：図４Ａ「Ｃｄ３００ａ-/-」）。
【０１５１】
また、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス由来のマクロファージの代わりに、野生型マウス由来のマクロファージを用いたこと以外は、上記試験条件と同様にして、貪食率を計測した（結果：図４Ａ「ＷＴ」）。
【０１５２】
図４Ａに示されるように、マクロファージがＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスに由来する場合であっても、野生型マウスに由来する場合であっても、貪食率には明確な差異は見られなかった。
【０１５３】
［参考例２Ｂ］
マスト細胞は、公知のＰＳ受容体（ＴＩＭ−１、ＴＩＭ−４、スタビリン２、インテグリンαｖβ３）を発現するか否かを検証するために、以下の試験を行った。
【０１５４】
骨髄由来マスト細胞（ＢＭＭＣ）（細胞数２Ｘ１０5個）と、ＰＥ（Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）結合型抗ＴＩＭ−１モノクローナル抗体（０．１μｇ）、ＡＰＣ結合型抗ＴＩＭ−４モノクローナル抗体（０．１μｇ）およびＡｌｅｘａ結合型抗マウスＣＤ３００ａモノクローナル抗体（ＴＸ４１）（０．５μｇ）を含むメディウム（ＰＢＳ）中で２０℃、３０分間インキュベートした。
【０１５５】
次いで、ＰＢＳを用いて、２回洗浄した後、染色された各細胞を、フローサイトメトリー（ベクトン・ディッキンソン社製、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ、型番「Ｅ６１３３」）を用いた分析に供した（結果：図５Ａ「ＢＭＭＣｓ」）。
【０１５６】
また、ＢＭＭＣのかわりに、腹腔マクロファージおよびＢＭ由来マクロファージを用いたこと以外は上記試験方法と同様にして、フローサイトメトリー分析も実施した（結果：図５Ａ「Ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ」および「ＢＭ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ」）。
【０１５７】
さらに、Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ａｐｐｌｉｅｄ  ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて、腹腔マクロファージおよびＢＭＭＣからｃＤＮＡを調製し、調製された各ｃＤＮＡを用いて、スタビリン２、ＢＡｌ−１、αｖインテグリン、Ｃｄ３００ａおよびβアクチン（ローディングコントロール））の発現量を、ＲＴ−ＰＣＲによって分析した（結果：図５Ｂ）。
【０１５８】
図５Ａおよび図５Ｂを参照すると、マクロファージの場合とは異なって、マスト細胞は、ＣＤ３００ａおよびαｖβ３インテグリンを発現するものの、貪食作用に関与するＰＳ受容体であるＴＩＭ−１、ＴＩＭ−４およびスタビリン２を低いレベルでしか発現していないことが分かる。
【０１５９】
［参考例２Ｃ］
ＮＩＨ３Ｔ３形質転換体（ＣＤ３００ａ）（細胞数６Ｘ１０4）を、ＦＩＴＣで標識化した細胞（アポトーシス胸腺細胞または胸腺細胞（生細胞））とともに、２時間共培養し、ＰＢＳで洗浄した後、光学顕微鏡（Ｋｅｙｅｎｃｅ社製、ＢＺ−９０００）で分析した（結果：図４Ｂ）。
【０１６０】
また、共培養および洗浄後の細胞を、パラフォルムアルデヒドを含む固定液Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）で固定して、レーザー走査型共焦点顕微鏡によって分析した（結果：図４Ｃ）。なお、図４Ｃにおいて、緑色部分（矢印で示す。）は、包摂された細胞（アポトーシス胸腺細胞または胸腺細胞（生細胞））を示す。
【０１６１】
また、ＮＩＨ３Ｔ３形質転換体（ＣＤ３００ａ）の代わりに、ＮＩＨ３Ｔ３未形質転換細胞（ネガティブコントロール）または「ＮＩＨ３Ｔ３形質転換体（ＴＩＭ−４）」（ポジティブコントロール）を用いたこと以外は、上記試験条件と同様にして、光学顕微鏡およびレーザー走査型共焦点顕微鏡を用いて分析した。
【０１６２】
図４Ｂおよび図４Ｃにおける「ＮＩＨ−３Ｔ３」および「ＮＩＨ−３Ｔ３／Ｔｉｍ４」は、それぞれ、「ＮＩＨ３Ｔ３」（未形質転換細胞）および「ＮＩＨ３Ｔ３形質転換体（ＴＩＭ−４）」を用いた光学顕微鏡およびレーザー走査型共焦点顕微鏡のイメージを示す。
【０１６３】
また、レーザー走査型共焦点顕微鏡のイメージから、アポトーシス胸腺細胞を細胞質内に取り込んだ、未形質転換細胞または各形質転換体の細胞数の比率（共培養された未形質転換細胞または各形質転換体の細胞数を１００％とする。）を計測した（結果：図４Ｄ「ａｐｏｐｔｏｔｉｃ」）。
【０１６４】
また、同様にして、胸腺細胞（生細胞）を細胞質内に取り込んだＮＩＨ３Ｔ３または各形質転換体の細胞数の比率（共培養された未形質転換細胞または各形質転換体の細胞数を１００％とする。）を計測した（結果：図４Ｄ「Ｌｉｖｅ」）。
【０１６５】
図４Ｂに示されるように、ＮＩＨ３Ｔ３とは異なって、上記の形質変換体は、両方ともアポトーシス胸腺細胞に付着した。しかしながら、図４Ｃおよび図４Ｄから判断すると、ＮＩＨ３Ｔ３形質転換体（ＴＩＭ−４）のみがアポトーシス胸腺細胞を取り込み、貪食作用を発揮したことがわかる。
【０１６６】
また、データを示さないが、ＮＩＨ３Ｔ３と同様に、ＮＩＨ３Ｔ３形質転換体（ＣＤ３００ａ）は、生細胞（胸腺細胞）を貪食しないことが観察された。
参考例２Ａ〜Ｃの結果から、ＣＤ３００ａは、マクロファージによるアポトーシス細胞の貪食作用に関与しないことが理解できる。
【０１６７】
［参考例３：ＣＤ３００ａの機能解析（２）］
図５に示すように、マスト細胞は、ＣＤ３００ａを発現するものの、マクロファージとは異なって、ＰＳ受容体であるＴＩＭ−１、ＴＩＭ−４、スタビリンを発現しない。
【０１６８】
これらのＰＳ受容体には、ＰＳが直接的にまたは間接的に結合することが知られており、アポトーシス細胞の取り込みに寄与することが知られている（下記文献１３）。そこで、ＣＤ３００ａもこのような機能を有しているのか否か（アポトーシス細胞を取り込む機能的重複があるのか否か）を検証すべく、下記参考例３Ａ〜Ｃに示す試験を行った。
【０１６９】
［参考例３Ａ］
ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスの骨髄細胞（ＢＭ細胞）２×１０8個を１０ｃｍｍディッシュにて、細胞増殖因子（ＳＣＦ）（１０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ−３（４ｎｇ／ｍＬ）および仔牛血清（ＦＢＳ）（１０％）を含むコンプリートＲＰＭＩ１６４９メディウム中で４週間培養して、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスの骨髄由来のマスト細胞（ＢＭＭＣ）を調製した。なお、ＢＭＭＣは、毎週新しいメディウムで継代した。
【０１７０】
次いで、得られたＢＭＭＣを、ＦＩＴＣ結合型抗ＦｃεＲＩα抗体（０．１μｇ）およびＰＥ結合型抗ｃ−Ｋｉｔ抗体（０．１μｇ／ｍＬ）を含むＲＰＭＩ１６４９メディウム中で、４℃、３０分インキュベートし、フローサイトメトリーで分析した（結果：図６Ａ「ＣＤ３００-/-」）。
【０１７１】
また、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス由来の骨髄細胞の代わりに野生型マウス由来の骨髄細胞を用いて、ＢＭＭＣを調製したこと以外は、上記試験条件と同様にして、フローサイトメトリーで分析した（結果：図６Ａ「ＷＴ」）なお、図６Ａの数字は、ボックス中の細胞の比率を指し、各試験は独立して３回行った。
【０１７２】
また、各ＢＭＭＣを用いてβ−ヘキソサミニダーゼ放出アッセイ（脱顆粒アッセイ）を以下のように実施した（詳細な条件は下記文献２９に記載されている）。
まず、対数増殖期における各ＢＭＭＣ１×１０5細胞〜２×１０5細胞を、ゼラチン（Ｓｉｇｍａ社製）でコートされた２４穴プレート中で３７℃、一昼夜培養し、ビオチン結合型マウス抗トリニトロフェノールＩｇＥ（０．５ｍｇ／ｍＬ）を含み、サプリメントを含まないメディウム中において、３７℃、１時間インキュベートした。
【０１７３】
次いで、上記メディウム中にストレプトアビジンを添加して、ビオチン結合型マウス抗トリニトロフェノールＩｇＥ同士をクロスリンクさせて、３７℃、４５分間培養した後、上清を採取した。
【０１７４】
採取された上清に、ｐ−ニトロフェニルーＮ−アセチルーβーＤ−グルコサミド（Ｓｉｇｍａ社製）およびクエン酸（０．４Ｍ）およびリン酸ナトリウム（０．２Ｍ）を含む緩衝液（ｐＨ４．５）を加え、３７℃、３時間インキュベートして、放出されたβ−ヘキソサミニダーゼによってｐ−ニトロフェニルーＮ−アセチルーβーＤ−グルコサミドを加水分解反応させ、該反応を、０．２Ｍグリシン−ＮａＯＨ（ｐＨ１０．７）を添加して、停止した後、ｐ−ニトロフェニルーＮ−アセチルーβーＤ−グルコサミドの加水分解によって生じる波長４１５ｎｍの吸光度を測定し、β−ヘキソサミニダーゼの放出量を定量した。さらに、上記処理をしていない各ＢＭＭＣに対する、β−ヘキソサミニダーゼの放出量の増加率（％）を図６Ｂに示した。
【０１７５】
図６Ｂは、β−ヘキソサミニダーゼを放出したＢＭＭＣの比率を示す。図６Ａおよび図６Ｂに示されるように、ＢＭＭＣがＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス由来の場合と野生型マウス由来との場合とで、ＦｃεＲＩαやｃ−Ｋｉｔの発現（マスト細胞のマーカー蛋白質）や、β−ヘキソサミニダーゼの放出量の増加率には、有意な差異は見られなかった。
すなわち、骨髄細胞からの分化やＦｃｅＲＩ介在性の脱顆粒化には、ＣＤ３００ａは影響を与えるものではないことが分かる。
【０１７６】
［参考例３Ｂ］
ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス由来のＢＭＭＣおよび、参考例１Ｂで得られたアポトーシス細胞（ＢＭＭＣ：アポトーシス細胞＝１０：１（細胞数比））を、塩化カルシウム（１ｍＭ）、ＡＰＣ結合型アネキシンＶ（１μｌ）、ＣＤ３００ａ−Ｆｃ（１μｇ／ｍＬ）およびＭＦＧ−Ｅ８（５μｇ）を含むＰＢＳ中で２０℃、３０分間インキュベートし、次いで、ＦＩＴＣ結合型抗ヒトＩｇＧ抗体（０．１μｇ／ｍＬ）およびヨウ化プロピジウム（ＰＩ）（１μｇ）を含む緩衝液を用いて染色した。
【０１７７】
染色された細胞を、フローサイトメトリー（ベクトン・ディッキンソン社製、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ、型番「Ｅ６１３３」）を用いた分析に供した（結果：図７Ａ「ＭＦＧ−Ｅ８」）。
【０１７８】
また、ＭＦＧ−Ｅ８の代わりにコントロール用ＩｇＧを用いたこと以外は、上記試験条件と同様にして、フローサイトメトリー分析を行った（結果：図７Ａ「Ｃｔｒｌ  Ｉｇ」）。
【０１７９】
図７Ａに示される結果から、コントロール用ＩｇＧの存在下では、ＣＤ３００ａ−Ｆｃはアポトーシス細胞（アネキシンＶ+）に結合するのに対して、ＭＦＧ−Ｅ８（ＰＳ結合性物質）の存在下では、この結合が特異的に阻害されていることが分かる。
【０１８０】
なお、この混合試料の上清において、サイトカインおよびケモカインの濃度は、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製（ＴＮＦ−αおよびＩＬ−６）およびＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製（ＭＩＰ−２、ＭＣＰ−１，ＩＬ−１３およびＭＩＰ−１α）のＥＬＩＳＡキットを用いてサイトカインやケモカインの定量を試みたところ、サイトカインやケモカインは検出されなかった。
【０１８１】
［参考例３Ｃ］
ＢＭＭＣおよびアポトーシス細胞が共存する場合、ＬＰＳ（リポポリサッカリド）の刺激によって、各種サイトカインの放出量が変化するか否かを検証すべく、以下のような試験を行った。
【０１８２】
ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス由来のＢＭＭＣおよびアポトーシス細胞（ＢＭＭＣ：アポトーシス細胞＝１０：１（細胞数比））を、ＬＰＳ（１μｇ／ｍＬ）を含むＲＰＭＩ中で４時間インキュベートした後、メディウムの上清を採取した。
【０１８３】
次いで、サイトカインおよびケモカインの濃度を、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製（ＴＮＦ−αおよびＩＬ−６）およびＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製（ＭＩＰ−２、ＭＣＰ−１，ＩＬ−１３およびＭＩＰ−１α）のＥＬＩＳＡキットを用いて３回測定し、上記のＬＰＳ処理が実施されていないＢＭＭＣの各サイトカインおよびケモカインの放出量の増加率を算出した（結果：図７Ｂ「Ｃｄ３００ａ-/-」）。
【０１８４】
また、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス由来のＢＭＭＣの代わりに、野生型マウス由来のＢＭＭＣを用いたこと以外は上記試験条件と同様にして、サイトカインおよびケモカインの増加率を算出した（結果：図７Ｂ「ＷＴ」）。
【０１８５】
図７Ｂに示されるように、何れのＢＭＭＣにおいても、ＬＰＳによって、各種サイトカインの放出量が増加した。しかしながら、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス由来のＢＭＭＣにおいては、野生型マウス由来のＢＭＭＣに比べてＴＮＦ−α、ＩＬ−１３、およびＭＣＰ−１が有意に増加した。
【０１８６】
［参考例３Ｄ］
さらに、各ＢＭＭＣの細胞内中の各種サイトカインおよびケモカインの増加率を検証すべく、以下の試験を行った。
【０１８７】
ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス由来のＢＭＭＣおよび、参考例１Ｂで得られたアポトーシス細胞（ＢＭＭＣ：アポトーシス細胞＝１０：１（細胞数比））を、ＬＰＳ（リポポリサッカリド）（１μｇ／ｍＬ）を含むメディウム（ＲＰＭＩ）中で４時間インキュベートした後、上記インキュベート後のＢＭＭＣおよびアポトーシス細胞を、各種サイトカインおよびケモカインに対する各種蛍光標識化抗体と、ホルムアルデヒドを含むメディウム（ＦＩＸ  ＆  ＰＥＲＭ，ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）中で４℃、２０分インキュベートし、染色された細胞を、フローサイトメトリー（ベクトン・ディッキンソン社製、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ、型番「Ｅ６１３３」）を用いた分析に供した（結果：図８矢印（１））。また、各種サイトカインおよびケモカインに対する各種蛍光標識化抗体の代わりに、コントロール用抗体を用いたことは上記試験条件と同様にして、フローサイトメトリー分析を行った（コントロール試験（結果：図８矢印（２）））。
【０１８８】
また、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス由来のＢＭＭＣの代わりに、野生型マウス由来のＢＭＭＣを用いたこと以外は上記試験条件と同様にして、フローサイトメトリー分析を行った（結果：図８矢印（３））。さらに、各種サイトカインおよびケモカインに対する各種蛍光標識化抗体の代わりに、コントロール用抗体を用いたことは上記試験条件と同様にして、フローサイトメトリー分析を行った（コントロール試験（結果：図８矢印（４）））。
【０１８９】
また、図８のグラフは、各ＢＭＭＣにおける各サイトカイニンおよびケモカインに関するＭＦＩ値（ｍｅａｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）を測定し、ＬＰＳ未処理のＢＭＭＣに対するＭＦＩの増加量を示す。
【０１９０】
図８によれば、何れのＢＭＭＣの細胞質中においても、ＬＰＳ未処理の場合に比べてサイトカイニンおよびケモカインの量が増加したことを示しているが、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス由来のＢＭＭＣの細胞質中では、野生型マウス由来のＢＭＭＣの細胞質中と比べても、ＴＮＦ−α等が有意に増加したことが分かる。
【０１９１】
［参考例３Ｅ］
Ｄ８９Ｅ  ＭＦＧ−Ｅ８は、ＲＧＤモチーフにおいて点変異（Ｄ８９Ｅ）を含むＭＦＧ−Ｅ８のバリアント（変異体）であり、ＰＳに結合するが、αｖβ３インテグリンに結合しないという結合特性を有する。
【０１９２】
そこで、Ｄ８９Ｅ  ＭＦＧ−Ｅ８の存在下において、各ＢＭＭＣのサイトカインおよびケモカインの放出量が変化するか否かを検証すべく、以下のような試験を行った。
ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス由来のＢＭＭＣおよびアポトーシス細胞を含むメディウム中に、ＬＰＳとともにＤ８９Ｅ  ＭＦＧ−Ｅ８（５μｇ／ｍＬ）を添加したこと以外は、参考例３Ｃと同様にして、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１３、ＭＣＰ−１およびＩＬ−６を定量した（結果：図７Ｃ「ＣＤ３００ａ-/-」）。
【０１９３】
また、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス由来のＢＭＭＣの代わりに、野生型マウス由来のＢＭＭＣを用いたこと以外は上記試験条件と同様にして、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１３、ＭＣＰ−１およびＩＬ−６を定量した（結果：図７Ｃ「ＷＴ」）。
【０１９４】
図７Ｃに示されるように、Ｄ８９Ｅ  ＭＦＧ−Ｅ８の存在下では、ＢＭＭＣがＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス由来の場合と野生型マウス由来との場合とで、各種サイトカインの濃度には、有意な差異が見られなかった。
【０１９５】
［参考例３Ｆ］
ＣＤ３００ａは、細胞内部位において免疫受容抑制性チロシンモチーフ（ＩＴＩＭ）を有し、抗ＣＤ３００ａ抗体で架橋されると、ＳＨＰ−１が誘導されることが知られている（下記文献１４）。
【０１９６】
そこで、ＣＤ３００ａとＳＨＰ−１とが相互作用するのか否かを検証すべく、以下のような試験を実施した。試験例３Ｃのように、ＬＰＳの存在下でアポトーシス細胞と４時間共培養したＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスまたは野生型マウス由来のＢＭＭＣの細胞破砕物を、抗ＣＤ３００ａ抗体（ＴＸ４１）で免疫沈降させた。
【０１９７】
得られた免疫沈降物を用いて、下記文献１４に記載されているように、抗ＳＨＰ−１抗体または抗ＣＤ３００ａ抗体によるイムノブロットを行った（結果：図７Ｄ）。
この結果からも分かるように、ＢＭＭＣがアポトーシス細胞と共培養された場合、ＬＰＳ刺激に応答して、ＳＨＰ−１を誘導（リクルート）することが分かる。しかしながら、Ｄ８９Ｅ  ＭＦＧ−Ｅ８の存在下においては、ＣＤ３００ａはＳＨＰ−１をリクルートしなかった。
すなわち、ＬＰＳ刺激の応答に対するＣＤ３００ａによるＳＨＰ−１の誘導（リクルート）には、ＰＳがＣＤ３００ａへ結合することが必要であると考えられる。
【０１９８】
［参考例３Ｇ］
ＳＨＰ−１が、ＣＤ３００ａ介在性のシグナリングに関与しているかどうかを調べるために、まず、野生型マウス由来のＢＭＭＣにおいて、ｓｉＲＮＡでＰｔｐｎ６（ＳＨＰ−１遺伝子）をノックアウトして、ＳＨＰ−１欠損（Ｐｔｐｎ６−ＫＤ）野生型マウス由来のＢＭＭＣを以下の条件で作製した。また、同様にして、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス由来ＢＭＭＣからＳＨＰ−１欠損（Ｐｔｐｎ６−ＫＤ）ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス由来のＢＭＭＣを作製した。
【０１９９】
ＢＭＭＣ中のＳＨＰ−１遺伝子（Ｐｔｐｎ６遺伝子）をターゲットとしたｓｉＲＮＡ（ＳＨＰ−１  ｓｉＲＮＡ）（ｓｉＧＥＮＯＭＥ  ＳＭＡＲＴｐｏｏｌ；ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｄｈａｒｍａｃｏｍ）０．５ｍＭを、Ｘ−ｔｒｅｍｅ  Ｇｅｎｅ  ｓｉＲＮＡ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ社製）１ｍＬと混合し、下記文献２８に記載されているように、５×１０5細胞のＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス由来のＢＭＭＣに形質導入（トランスフェクト）して、ＳＨＰ−１がノックダウンされたＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス由来のＢＭＭＣ（ＢＭＭＣ（ＣＤ３００ａ-/-・Ｐｔｐｎ６−ＫＤ））を作製した。
【０２００】
また、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス由来のＢＭＭＣの代わりに、野生型マウス由来のＢＭＭＣを用いたこと以外は、上記試験条件と同様にして、ＳＨＰ−１がノックダウンされた野生型マウス由来のＢＭＭＣ（ＢＭＭＣ（ＷＴ・Ｐｔｐｎ６−ＫＤ））を作製した。
【０２０１】
ここで、ＳＨＰ−１  ｓｉＲＮＡが各ＢＭＭＣに形質導入され、ＳＨＰ−１の発現量が低減していることを確認するために、ＢＭＭＣ（ＣＤ３００ａ-/-・Ｐｔｐｎ６−ＫＤ）またはＢＭＭＣ（ＷＴ・Ｐｔｐｎ６−ＫＤ）のライセートを用いて、抗ＳＨＰ−１抗体、抗ＳＨＰ−２抗体および抗βアクチン抗体によるイムノブロッティング分析を行った（結果：図７Ｅ）。
【０２０２】
図７Ｅに示されるように、ＳＨＰ−１  ｓｉＲＮＡを形質導入したＢＭＭＣでは、ＳＨＰ−１の発現量が低減されていることが確認できる。なお、「Ｃｔｒｌ」は、ＳＨＰ−１  ｓｉＲＮＡの代わりに、コントロール用ｓｉＲＮＡを形質導入したＢＭＭＣを用いたイムノブロッティング分析の結果を示す。
【０２０３】
次に、ＢＭＭＣ（ＣＤ３００ａ-/-・Ｐｔｐｎ６−ＫＤ）またはＢＭＭＣ（ＷＴ・Ｐｔｐｎ６−ＫＤ）および参考例１Ｂで得られたアポトーシス細胞（ＢＭＭＣ：アポトーシス細胞＝１０：１（細胞数比））を、塩化カルシウム（１ｍＭ）およびＬＰＳ（リポポリサッカリド）（１μｇ／ｍＬ）含むＲＰＭＩ中で４時間インキュベートした後、参考例３Ｂと同様にして、ＴＮＦ−αの放出量を測定した（結果：図７Ｆ）。
【０２０４】
図７Ｆ（左グラフ）に示されるように、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス由来のＢＭＭＣは野生型マウス由来のＢＭＭＣよりも有意にＴＮＦ−αを産生した。一方で、図７Ｆ（右グラフ）に示されるように、野生マウスまたはＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス由来のＢＭＭＣは、ＳＨＰ−１  ｓｉＲＮＡが形質導入された場合、野生由来ＢＭＭＣもＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス由来ＢＭＭＣも、ＴＮＦ−αの放出量は同程度であり、両者に有意な差異は見られなかった。
【０２０５】
これらの結果は、ＰＳがＣＤ３００ａに結合すると、ＣＤ３００ａはＳＨＰ−１を誘導して、ＢＭＭＣの活性化抑制シグナルを介在し、結果として、ＴＮＦ−αの分泌の抑制をすることを示唆している。
【０２０６】
参考例３の結果から、ＰＳとＣＤ３００ａとの相互作用は、ＢＭＭＣから炎症誘発性の（ＬＰＳ誘導性の）サイトカインおよびケモカインの産生を阻害すること、およびこの相互作用はＳＨＰ−１をリクルートして、ＴＮＦ−αの分泌の抑制をすることが理解される。
【０２０７】
［参考例４：ＣＤ３００ａの機能解析（３）］
マスト細胞が産生するＴＮＦ−α、ＩＬ−３およびＭＣＰ−１は、好中球の化学誘引物質であり、ＣＬＰ腹膜炎マウスにおいて、細菌クリアランスに重要な役割を果たすことが知られている（下記文献１５〜１９）。
そこで、ＣＤ３００ａが細菌クリアランス機能を有するか否かを検討するために、下記参考例４Ａ〜４Ｈを行った。
【０２０８】
［参考例４Ａ］
野生型マウスの盲腸（腹側域）上において、１〜２ｃｍの正中線切開を実施し、その末端部を結紮した。次いで、結紮部位において、２７ゲージ針を用いて２回穿刺した後、該盲腸を腹部に戻し、無菌食塩水１ｍＬを皮下注射して補水した後、切開部を縫合して切開部分を閉じた。なお、上記のＣＬＰの詳細内容・条件は、下記文献１６に記載されている。
【０２０９】
ＣＬＰの実施前またはＣＬＰの実施後４時間目において、腹膜灌流液を採取した。次いで、該腹膜灌流液にＡＰＣ結合型アネキシンＶ（１μｇ）およびＣＤ３００−Ｆｃ（１μｇ）を添加した後、ＦＩＴＣ結合型抗ヒトＩｇＧおよびＰＩ（ヨウ化プロピジウム）で染色し、フローサイトメトリーで分析した（結果：図１２Ａ）。
【０２１０】
図１２Ａは、下記文献２０に記載されているように、腹膜炎部位は、多数の細胞がアポトーシスに至る部位であることを確認できる結果となっている。
すなわち、ＣＤ３００ａは、膜炎部位のマスト細胞の免疫制御に影響を与えることが示唆される。
【０２１１】
［参考例４Ｂ］
ＣＤ３００ａとマスト細胞の免疫制御との関係を検証すべく、以下のようにプロテオーム解析を行った。
【０２１２】
まず、野生型マウスおよびマスト細胞欠損マウス（ｋｉｔW-sh/W-shマウス）に、参考例４Ａと同様にしてＣＬＰを実施した。
ＣＬＰ実施から４時間経過後、各マウスの腹膜灌流液を採取して、採取された腹膜灌流液を、製造元の説明書に準拠して、Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｐｒｏｆｉｌｅｒ  Ａｒｒａｙ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いてサイトカインおよびケモカインのプロテオーム解析に供した。
【０２１３】
図９Ａは、野生型マウスおよびマスト細胞欠損マウス（ｋｉｔW-sh/W-shマウス）の腹膜灌流液を用いたデンシトメトリー分析（プロテオーム分析）の結果を示す（図９Ａ中「ＰＣ」はポジティブコントロールを示す。）。
【０２１４】
また、図９Ｂは、図９Ａで示される各シグナルをデンシトメトリー像から得られた、各ケモカインやサイトカインのシグナルのピクセル密度を示す。
図９Ｂに示されるように、ＣＬＰ後４時間目において、腹腔内のケモカインの濃度は、野生型マウスよりもｋｉｔW-sh/W-shマウスにおいて高いことが分かる。なお、本試験は、２回実施しても同様の結果が得られた。
【０２１５】
［参考例４Ｃ］
参考例４Ｂと同様にして、野生型マウスおよびマスト細胞欠損マウス（ｋｉｔW-sh/W-shマウス）から腹膜灌流液を採取した（各ｎ＝３）。
【０２１６】
次いで、各腹膜灌流液から段階希釈液系列を調製し、調製された腹膜灌流液の各段階希釈液をプレーティングし、ブレインハートインフュージョン（ＢＨＩ）寒天を含むプレート上で、３７℃、４８時間培養した。次いで、好気性細菌のＣＦＵを、下記文献２７に記載されているように、腹膜灌流液１ｍＬ中のコロニー数を計測して好気性細菌のＣＦＵを算出した（結果：図１０Ａ）。
【０２１７】
また、各腹膜灌流液中の好中球およびマクロファージの細胞数も計測し、結果をそれぞれ図１０Ｂの「ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ」および「ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ」に示す。
さらに、野生型マウスまたはマスト細胞欠損マウス（ｋｉｔW-sh/W-shマウス）からＢＭ由来マクロファージを調製した。これらのマクロファージ（細胞数：１Ｘ１０6）を、フルオレセイン標識化大腸菌を含むメディウム中で、２４穴プレートで１時間共培養し、フローサイトメトリーで大腸菌を貪食した各マクロファージの細胞数を測定し、貪食しているマクロファージの比率を算出した（結果：図１１「ＢＭ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ」）。
【０２１８】
野生型マウスまたはマスト細胞欠損マウス（ｋｉｔW-sh/W-shマウス）由来のＢＭ由来マクロファージの代わりに、野生型マウスまたはマスト細胞欠損マウス（ｋｉｔW-sh/W-shマウス）由来のＰＥＣマクロファージを用いたこと以外は、上記試験条件と同様にして、貪食しているマクロファージの比率を算出した（結果：図１１「ＰＥＣ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ」）。
【０２１９】
図１０Ａに示されるように、ＣＬＰ後４時間目のマスト細胞欠損マウス（ｋｉｔW-sh/W-shマウス）では、野生型マウスに比べて、腹腔内における細菌ＣＦＵが少なく、好中球の細胞数が多いことが分かる。対して、図１０Ｂおよび図１１に示されるように、マクロファージの細胞数および貪食作用は、両遺伝子型間で有意差が無いものであった。
【０２２０】
［参考例４Ｄ］
ＣＤ３００ａが好中球の誘導（リクルート）に関与するか否かを検証するために、以下の実施例を行った。
【０２２１】
マスト細胞欠損マウス（ＫｉｔW-sh/W-shマウス）に、野生型マウス由来のＢＭＭＣ（細胞数１Ｘ１０6）を含むＰＢＳ緩衝液を腹腔内注射で投与した（ｎ＝２０）。次いで、投与してから２８日間経過後、参考例４Ａと同様にしてＣＬＰを実施し、マウスの生存率を測定した（結果：図１２Ｂ「ＷＴ  ＢＭＭＣｓ→ＫｉｔW-sh/ＫｉｔW-sh」）。
【０２２２】
また、野生型マウス由来のＢＭＭＣの代わりに、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス由来のＢＭＭＣを用いたこと以外は、上記試験条件と同様にして、マウスの生存率を測定した（結果：図１２Ｂ「ＣＤ３００ａ-/-  ＢＭＭＣｓ→ＫｉｔW-sh/ＫｉｔW-sh」）。なお、図１２Ｂにおける「ＫｉｔW-sh/ＫｉｔW-sh」は、ＢＭＭＣを投与しないで、ＣＬＰを実施したマスト細胞欠損マウス（ＫｉｔW-sh/W-shマウス）の生存率を示す。
【０２２３】
図１２Ｂによれば、ＣＬＰ後であっても、野生型マウス由来のＢＭＭＣが供されたマスト細胞欠損マウス（ＫｉｔW-sh/W-shマウス）では、ＢＭＭＣを投与されなかった場合と比べて、高い生存率が示された。
【０２２４】
しかしながら、ＣＬＰの後において、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス由来のＢＭＭＣが供されたマスト細胞欠損マウス（ＫｉｔW-sh/W-shマウス）では、野生型マウス由来のＢＭＭＣやＢＭＭＣが投与されなかったマウスと比べて、ＣＬＰ後であっても生存率が有意に高かったことが分かる（図１２Ｂ）。
【０２２５】
さらに、ＣＬＰ後４時間目の上記各マウスの腹膜灌流液を用いて、参考例４Ｃと同様にして細菌のＣＦＵを測定したところ、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス由来のＢＭＭＣが供されたマスト細胞欠損マウス（ＫｉｔW-sh/W-shマウス）では、他のマウスに比べて、細菌クリアランスも大きいことが示された（結果：図１２Ｃ）。
【０２２６】
［参考例４Ｅ］
ＢＭＭＣをマスト細胞欠損マウス（ＫｉｔW-sh/W-shマウス）の腹腔内に投与することで、ＴＮＦ−αの放出量が増加するか否かを検証するために、以下の実施例を行った。
【０２２７】
ＣＬＰの２４時間前において、マスト細胞欠損マウス（ＫｉｔW-sh/W-shマウス）の腹腔内に、ＣＦＳＥ標識化した混合ＢＭＭＣ（ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス由来のＢＭＭＣ：野生マウス由来のＢＭＭＣ＝１：１（細胞数比））を腹腔内注射で投与した。
【０２２８】
該混合ＢＭＭＣが注射されたマウスに参考例４Ａと同様にしてＣＬＰを実施し、ＣＬＰ後４時間目に、腹膜灌流液を採取した。該腹膜灌流液中に含まれる各ＢＭＭＣをフローサイトメトリー（ベクトン・ディッキンソン社製、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ、型番「Ｅ６１３３」）を用いた分析に供した（結果：図１２Ｄ）。
【０２２９】
図１２Ｄに示されるように、ＣＬＰから４時間後において、ＣＤ３００Ｄ遺伝子欠損マウス由来のＢＭＭＣ（ＣＤ３００ａ-ＣＦＳＥ+細胞）は、野生型マウス由来のＢＭＭＣ（ＣＤ３００ａ+ＣＦＳＥ+細胞）よりも有意に大量のＴＮＦ−αを産生していることが分かる。
【０２３０】
［参考例４Ｆ］
抗ＣＤ３００ａモノクローナル抗体（ＴＸ４１）を投与した場合、ＣＤ３００ａにおいてどのような影響があるのかを検証するために、以下のような実施例を行った。
【０２３１】
まず、ＣＬＰの１時間前または１８時間前において、野生型マウスに、５００μｇの抗ＣＤ３００ａモノクローナル抗体（ＴＸ４１）（ｎ＝１３）を腹腔内注射したこと以外は、参考例４Ａと同様にしてＣＬＰを実施して、参考例４Ｄと同様にして、マウスの生存率を測定した（結果：図１２Ｅ「Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｏ  ＣＤ３００ａ」）。
【０２３２】
また、コントロールとして、ＴＸ４１（ｎ＝１３）の代わりに、アイソタイプコントロール用抗体（ｎ＝１１）を用いたこと以外は上記試験条件と同様にして、マウスの生存率を測定した（結果：図１２Ｅ「Ｃｏｎｔｒｏｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ」）。
【０２３３】
図１２Ｅに示されるように、ＣＬＰ実施の１時間または１８時間前において野生型マウスに腹腔内注射によってＴＸ４１を投与した後にＣＬＰを実施した場合、コントロール用抗体を投与した場合と比べて、生存期間が長くなることが分かった。
【０２３４】
［参考例４Ｇ］
参考例４Ｆにおける、ＣＬＰ後４時間目の各マウスから腹膜灌流液を採取した。得られた腹膜灌流液を用いて、参考例４Ｃと同様にして、細菌ＣＦＵおよび好中球の細胞数を測定した（コントロール用抗体：ｎ＝５および、抗ＣＤ３００ａモノクローナル抗体：ｎ＝５）（それぞれ図１２Ｆおよび図１２Ｇ）。
【０２３５】
なお、ＴＸ４１が腹腔内注射で投与されても、各マウスのマスト細胞を含めたミエロイド系細胞が欠損することはなかった。
図１２Ｆおよび図１２Ｇに示されるように、ＣＬＰ実施の１時間または１８時間前において野生型マウスに腹腔内注射によってＴＸ４１を投与した場合、腹腔内において、有意に好中球の細胞数は増加し、細菌クリアランスも向上した。
【０２３６】
参考例４の結果から、ＰＳとＣＤ３００ａとの相互作用を、たとえばＴＸ４１などで阻止することで、腹膜炎誘発性の敗血症を予防できることが理解される。
なお、生理的状況下においては、多くの細胞がアポトーシスに至っている。ここで、アポトーシス細胞の取り込みには、ＰＳ受容体は中心的な役割を果たし、自己免疫疾患の進展を防ぐのに必須なものである（下記文献２２）。
【０２３７】
一方で、微生物感染のような病理的状況では、顕著にアポトーシスによる細胞死が増加し、病原関連分子パターン（ＰＡＭＰｓ）に対する受容体（たとえばＴｏｌｌ様受容体）を介し、マスト細胞による炎症反応を引き起こすことが知られている（下記文献１５，２３および２４）。また、マスト細胞は、病原体に対する免疫反応において重要な役割を果たすことも知られている。
【０２３８】
以上から、上記実施例における結果は、ＰＳが、数種類のＰＳ受容体を介して貪食細胞へ取り込みシグナルを提供することのみならず、今回新たな知見として得られたように、ＣＤ３００ａを介したマスト細胞による炎症反応を有効に抑制する効果を有することが理解できる。
【０２３９】
したがって、ホスファチジルセリン結合性物質（ＭＦＧ−Ｅ８等）やＣＤ３００ａ結合性物質（ＣＤ３００ａに対する中和抗体等）が、ＰＳとマスト細胞におけるＣＤ３００ａとの相互作用を阻止して、マスト細胞を活性化させるまたは該活性を維持させることが理解される。
【０２４０】
すなわち、これらの物質は、たとえばＬＰＳ誘発性の各種炎症性感染症（さらにはそれによる敗血症）の予防に用いられる医薬品の有効成分（免疫賦活化剤）として有用であることが理解できる。
【０２４１】
また、ＰＳは、ＣＤ３００ａの活性シグナリングを抑制させてマスト細胞の活性化を抑制することから、たとえば、アレルギー疾患や自己免疫疾患における炎症反応を抑制して（たとえば、ヒスタミン等のケミカルメディエーターの放出を抑制して）、アレルギー疾患や自己免疫疾患の症状を緩和または治療する（過剰な免疫機能を抑制する）ために用いられる免疫抑制剤の有効成分として有用であることが理解できる。
【０２４２】
＜セリアック病＞
セリアック病（ＣＤ）は、食餌グルテンタンパク質に対する免疫応答によって引き起こされ、進行性の腸炎である。グルテン由来のグリアジンペプチドに特異的な適応免疫応答は、セリアック病の進行に関与している。病因の根底にある自然免疫応答は完全には解明されていない。
【０２４３】
ここでは、我々は、粘膜固有層のマクロファージ（粘膜固有層のマクロファージ）に発現している、骨髄関連免疫グロブリン様受容体ファミリーのメンバーであるＣＤ３００ａ（ＭＡＩＲ−Ｉ）が、食餌グルテン誘発腸疾患の進行に調節的役割を果たしていることを実証する。
【０２４４】
高グルテン食を与えているＣＤ３００ａ（ＭＡＩＲ−Ｉ）が欠損したＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスは、セリアック病様の病徴変化を示した。高グルテン食を与えている野生型（ＷＴ）マウスと比較して、軽度の体重増加、高い臨床スコア、多量のトランスグルタミナーゼ２、空腸の粘膜固有層のマクロファージの蓄積を示した。
【０２４５】
高グルテン食を与えられたＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスにおける粘膜固有層のマクロファージは、高グルテン食を与えられたＷＴマウスと比較して、ＩＬ−６、ＩＬ−１５、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−β、ＭＣＰ１およびＭＣＰ５を高発現した。
【０２４６】
中毒性グリアジンペプチド（Ｐ３１−４３）の試験管内での刺激後に、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスの粘膜固有層のマクロファージは、上記サイトカインをより強く発現した。
【０２４７】
ＩＬ−６、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−βの増強された発現は、ＭｙＤ８８欠損およびＴＲＩＦ欠損の各遺伝的背景を有するＣＤ３００ａ（ＭＡＩＲ−Ｉ）のないＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスの粘膜固有層のマクロファージで引き起こされた。
【０２４８】
さらに、アポトーシス細胞上のＣＤ３００ａ（ＭＡＩＲ−Ｉ）のリガンドであるホスファチジルセリンとＣＤ３００ａ（ＭＡＩＲ−Ｉ）との結合の遮断は、ＷＴマウスの粘膜固有層のマクロファージでのサイトカイン産生を促進した。
【０２４９】
総括すれば、これらの結果は、腸内の粘膜固有層のマクロファージとアポトーシス細胞上のＣＤ３００ａ（ＭＡＩＲ−Ｉ）の相互作用が、ＭｙＤ８８およびＴＲＩＦを介した抑制性のグリアジンシグナル伝達経路によってセリアック病の進行に保護的な役割を果たしていることを示している。
【０２５０】
（材料と方法）
（マウス）
９〜１４週齢の雄であるＢａｌｂ／ｃ野生型（ＷＴ）マウスと、ＣＤ３００ａ（ＭＡＩＲ−Ｉ）を有しないＢａｌｂ／ｃのＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスの同腹子を用意し、正常食（ＮＤ）、高グルテン食（ＨＧＤ）、または無グルテン食（ＧＦＤ）を与える実験等に使用した。
【０２５１】
試験管内での実験のために、Ｂａｌｂ／ｃＷＴマウスと、ＣＤ３００ａ（ＭＡＩＲ−Ｉ）を有しないＢａｌｂ／ｃ又はＣ５７ＢＬ／６Ｂ６のＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスとを、性別と年齢を一致させて用いた。ＭｙＤ８８遺伝子欠損Ｂ６マウスとＴＲＩＦ遺伝子欠損Ｂ６マウスは、オリエンタルバイオサイエンス（京都、日本）から購入した。すべてのマウスは、特定病原体フリーの条件下で飼育した。
【０２５２】
（給餌試験）
ＷＴマウスとＣＤ３００ａ（ＭＡＩＲ−Ｉ）マウスは、２％未満のグルテンを含む正常食の粉末（ＭＦ、オリエンタル酵母、東京、日本）（ＮＤ）で飼育した。また、ＷＴマウスとＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスは、ＭＦ中にグルテンの３０％（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、セントルイス、ミズーリ州）を含む高グルテン食（ＨＧＤ）で飼育した。いくつかの実験では、マウスはＮＤのペレット（ＭＦ）および無グルテン食（ＧＦＤ；ＡＩＮ−７６Ａ、リサーチダイエット、ニューブランズウィック、ニュージャージー州）を給餌した。
【０２５３】
（微生物叢の枯渇）
抗生物質による微生物叢の枯渇は、[下記文献３７]のように行った。微生物叢の枯渇は、ブレインハートインフュージョン培地のアガロースプレートを使用して個々のマウスから糞便中にプラーク形成単位の観察によって確認した。
【０２５４】
（病理組織学的解析）
マウスの病理組織学的変化は後述する特定の週で、ＮＤ，ＨＧＤまたはＧＦＤを給餌した後に観察した。空腸および結腸の標本を単離してホルマリンで固定し、ヘマトキシリン-エオシンで染色した。
【０２５５】
空腸における臨床スコアの基準は、[下記文献３８]に記載したように定義した。簡単に言えば、陰窩と絨毛の比のスコアを、陰窩と絨毛（０〜３点）の平均深さによって算出した。また、単核細胞浸潤のスコア（０〜３点）を絨毛固有層と陰窩の直径平均によって算出した。そして、最終的な臨床スコアを合計０〜６点として表した。
【０２５６】
空腸の腸管上皮細胞（ＩＥＬ）における上皮内リンパ球数が計測され、腸管上皮細胞１００個当たりのＩＥＬ数として表した（[下記文献３９]）。空腸におけるトランスグルタミナーゼ2（ＴＧ２）の定量は、空腸の組織懸濁液を使用した。ＴＧ２−ＣｏｖＴｅｓｔ（Ｚｅｄｉｒａ、ダルムシュタット、ドイツ）をそのメーカーの手順書に従って行った。
【０２５７】
（グリアジンに対するＩｇＧおよびＩｇＡ抗体力価測定）
マウスの血清中のグリアジンに対するＩｇＧおよびＩｇＡの抗体力価を酵素免疫測定法により決定した。これは、[下記文献４０]に記載されているものを、少し改変して行った。
【０２５８】
西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）で標識した抗マウスＩｇＧ抗体（ＧＥヘルスケア、リトルチャルフォント、イギリス）とＨＲＰで標識した抗マウスＩｇＡ抗体（サザンバイオテック、バーミンガム、アラバマ州）は、抗グリアジンＩｇＧおよびＩｇＡの検出抗体としてそれぞれ使用した。また、ＯＰＤ試薬（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を比色分析のＨＲＰの基質として使用した。
【０２５９】
（粘膜固有層のマクロファージや樹状細胞の単離）
粘膜固有層のマクロファージ（ＬＰ  Ｍφ）と樹状細胞（ＤＣ）の単離は、いくつかの変更を加えて、[下記文献４１]に沿って行った。
【０２６０】
空腸は、腸間膜およびパイエル板を除去した後、小片に切り出し、２ｍＭＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）と２０％ＦＣＳを含むＰＢＳ緩衝液で振とうしながら３７℃で１５分間、合計３回洗浄した。
【０２６１】
残りの組織をホモジナイズし、タイプＶＩＩＩのコラゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を１．５ ｍｇ/ｍＬ、ＦＣＳを２０％で含むＰＢＳ緩衝液で、振とうしながら３７℃で２０分間消化した。
【０２６２】
組織懸濁液中のＣＤ４５を発現している粘膜固有層のマクロファージと粘膜固有層の樹状細胞とを、ビオチン化抗マウスＣＤ４５（３０−Ｆ１１、ＢＤバイオサイエンス、フランクリンレイクス、ニュージャージー州）とストレプトアビジン粒子プラスＩＭＡＧ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を使用して濃縮した。
【０２６３】
粘膜固有層のＣＤ４５発現細胞を、フルオレセインイソチオシアネート結合抗マウスのＣＤ１１ｂ（Ｍ１/７０）、フィコエリトリン結合のＣＤ１１ｃ（ＨＬ３）、プロピジウムヨウ素、Ａｌｅｘａ６４７標識ＴＸ４１（抗マウスＣＤ３００ａ（抗マウスＭＡＩＲ−Ｉ）、ラットＩｇＧ２ａ）またはＡｌｅｘａ６４７標識ＴＸ７４（抗−ＦＬＡＧ、ＴＸ４１のアイソタイプコントロール）、ビオチン化抗マウスＣＤ４５およびストレプトアビジンアロフィコエリトリンＣｙ７（ａｌｌｏｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ−Ｃｙ７）で染色した。
【０２６４】
なお、すべての蛍光標識抗体とストレプトアビジンアロフィコエリトリン−Ｃｙ７はＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社から購入した。
ＣＤ４５＋ＰＩ−細胞の数でゲートされたＣＤ１１ｂ+ＣＤ１１ｃlow 細胞とＣＤ１１ｃ+細胞は、それぞれ、粘膜固有層のマクロファージおよび粘膜固有層の樹状細胞として、ＦＡＣＳＡｒｉａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して単離された。
【０２６５】
フローサイトメトリーデータ解析の重要な原理は、不必要な粒子（死細胞および残渣など）を除きながら、目的の粒子を選択的に可視化することであり、この操作を、ゲーティング（ゲート）と呼ぶ。
【０２６６】
（フローサイトメトリー解析）
ＣＤ４５+ＰＩ-である粘膜固有層の細胞におけるマクロファージ、ＣＤ１１ｂ+樹状細胞、およびＣＤ１１ｂ-樹状細胞がＣＤ１１ｂ+ＣＤ１１ｃlow, ＣＤ１１ｂ+ＣＤ１１ｃ+, およびＣＤ１１ｂ-ＣＤ１１ｃ+の細胞数によりそれぞれゲートされた。
【０２６７】
上皮内リンパ球と腸管上皮細胞を2 ｍＭでＥＤＴＡ、２０％でＦＣＳを含むＰＢＳ緩衝液で空腸の小片を洗浄することにより得た。この懸濁液中の上皮内リンパ球と腸管上皮細胞は、ＣＤ４５+ＰＩ-細胞数と、ｃｄ４５-ＰＩ-細胞数によってそれぞれゲートした。
【０２６８】
粘膜固有層のマクロファージ、ＣＤ１１ｂ+樹状細胞、ＣＤ１１ｂ-樹状細胞、上皮内リンパ球および腸上皮細胞におけるＣＤ３００ａ（ＭＡＩＲ−Ｉ）の発現を、Ａｌｅｘａ６４７で標識したＴＸ４１（抗マウスＭＡＩＲ−Ｉ、ラットＩｇＧ２ａ）またはＡｌｅｘａ６４７で標識したＴＸ７４（ＴＸ４１の抗ＦＬＡＧ、アイソタイプコントロール）で解析した。
【０２６９】
ホスファチジルセリン（ＰＳ）を表示するアポトーシス細胞について、アロフィコシアニン共役アネキシンVを用いて分析した。フローサイトメトリー解析をＦＡＣＳＡｒｉａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて行った。
【０２７０】
（定量的ＲＴ−ＰＣＴ法）
１００００〜２００００個の粘膜固有層のマクロファージと粘膜固有層の樹状細胞を中毒性グリアジンペプチドＰ３１−４３ペプチドで刺激したものと、刺激しないものを、ＩｓｏｇｅｎＬＳ（ニッポンジーン、東京、日本）に再懸濁し、手順書に従って全ＲＮＡを単離した。
【０２７１】
一本鎖ＤＮＡは、ｃＤＮＡの逆転写キット（アプライドバイオシステムズ社、フォスターシティ、カリフォルニア州）を用いて全ＲＮＡから合成した。使用した定量的逆転写酵素媒介ポリメラーゼ連鎖反応（Ｑ-ＲＴ−ＰＣＲ）用のプライマーセットはＰｒｉｍｅｒＢａｎｋによって設計した（ｈｔｔｐ：//ｐｇａ.ｍｇｈ.ｈａｒｖａｒｄ.ｅｄｕ/ｐｒｉｍｅｒｂａｎｋ/）[下記文献４２]。
【０２７２】
Ｑ−ＲＴ−ＰＣＲは、プラチナＳＹＢＲグリーンスーパーミックスＵＤＧ（インビトロジェン、カールスバッド、カリフォルニア州）、ＡＢＩ７５００ファスト（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行った。そのデータをＤＤＣＴ（ｄｅｌｔａ  ｄｅｌｔａ  ＣＴ）法により分析した。
【０２７３】
この研究で試験された全遺伝子を発現するコントロールのサンプルは、リポ多糖刺激した脾臓細胞（１０００ｎｇ/ ｍＬで、６時間）から調製し、一本鎖ＤＮＡであった。各サンプルの遺伝子発現を示した試料と比較定量することにより表した。
【０２７４】
（グリアジン刺激）
グルテンに由来する中毒性α-グリアジンペプチドＰ３１−４３ [下記文献４３]と、コントロールとしてのオボアルブミンペプチドＰ３２３−３３９とを、オペロンバイオテクノロジー（ハンツヴィル、アラバマ州）に依頼して合成した。
【０２７５】
これらのペプチドの純度は９５％以上であり、０．００１未満のエンドトキシン単位／ｍＬで含まれている。このことは、カブトガニ色ＫＹテストワコー（和光純薬、大阪）を用いて確認した。
【０２７６】
Ｂ６マウスから調製したチオグリコール酸誘発性腹腔滲出細胞（ＰＥＣ）のマクロファージを、１００μｇ / ｍＬのグリアジンペプチドＰ３１−４３、または、オボアルブミンＰ３２３−３３９を用いて、[下記文献４４]に記載されているように刺激した。
【０２７７】
ＷＴマウスまたはＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス由来の粘膜固有層のマクロファージやＣＤ１１ｂ＋樹状細胞の１００００〜２００００個を、９６ウェル平底プレートのウェル内で、１０％ＦＣＳ、グルタミン／ストレプトマイシン/ペニシリン、ＨＥＰＥＳ、非必須アミノ酸を添加したＲＰＭＩ１６４０培地で培養した。
【０２７８】
Ｂａｌｂ / ｃマウスまたはＢ６マウスの粘膜固有層のマクロファージを、それぞれ、１０時間または３時間、１００μｇ／ｍＬのグリアジンペプチドＰ３１−４３で刺激した。いくつかの実験において、粘膜固有層のマクロファージは、組換えマウスのＭＦＧ−Ｅ８（終濃度５μｇ／ｍＬ）を用いて４℃、３０分間処理し、または処理しないようにし、さらにグリアジンペプチドＰ３１−４３で、３７℃で３時間、刺激した。
【０２７９】
（統計分析）
全ての統計分析は、Ｍａｎｎ−ＷｈｉｔｎｅｙのＵ検定を用いて行った。 Ｐ＜０．０５を統計学的に有意であると考えた。
【０２８０】
［実施例１Ａ］体重（ＢＷ）の変化（図１３）
ＣＤ３００ａ（ＭＡＩＲ−Ｉ）がセリアック病（ＣＤ）の進行に関与しているか否かを調べるために、Ｂａｌｂ／ｃのＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスまたは野生型（ＷＴ）マウスを2％未満のグルテン（ＮＤ）を含む正常食または３０％のグルテン（ＨＧＤ）を含む高グルテン食で飼育した。正常食または高グルテン食の給餌開始から、体重（ＢＷ）の変化をモニターした。
【０２８１】
なお、「○」は、「ＷＴマウス正常食、ｎ＝７」、「●」は「ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス、正常食、ｎ＝９」、「□」は、「ＷＴマウス、高グルテン食、ｎ＝１０」そして、「■」は「ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス、高グルテン食、ｎ＝１４）」を示す。
【０２８２】
高グルテン食（ＨＧＤ）で飼育したＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスは、高グルテン食（ＨＧＤ）で飼育したＷＴマウス（図１３）よりも有意に少ない体重（ＢＷ）増加を示した。ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスでは、高グルテン食を摂食した後にセリアック病様腸症が進行することが確認された。これらの結果は、ＣＤ３００ａ（ＭＡＩＲ−Ｉ）は高グルテン食を摂食した後の空腸における腸疾患の進行に防御的な役割を果たしていることを示唆している。
【０２８３】
［実施例１Ｂ］Ｈ＆Ｅ染色（図１４）
正常食または高グルテン食（ＨＧＤ）を摂食した後の、２０週目のマウスの腸の病理組織学的解析を行った。各マウスの空腸をホルマリンで固定し、ヘマトキシリン−エオシンで染色した。図１４に、各グループのマウスの代表的なデータを示す。
【０２８４】
高グルテン食（ＨＧＤ）で飼育したＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスでは、高グルテン食（ＨＧＤ）で飼育したＷＴマウスと比較して、空腸における腸疾患の進行していた（図１４参照）。
【０２８５】
［実施例１Ｃ］上皮内リンパ球数（図１５、図１６）
上述した方法に従い、臨床スコアとマウスの空腸の腸上皮細胞（ＩＥＣ）１００個当たりの上皮内リンパ球（ＩＥＬ）の数について、正常食または高グルテン食を摂食した後、２０週の時点でカウントされた。なお、「*, **」は、それぞれ ｐ＜０．０５,０．０１を示す。
【０２８６】
上述したように、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスは、空腸内の絨毛萎縮を示し（図１４）、また、有意に高い臨床スコアを示した（図１５参照）。また、ＦＤで飼育したＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスと同様にＨＧＤで飼育したＷＴマウスと比較して、小腸の腸上皮細胞（ＩＥＣ）における上皮内リンパ球（ＩＥＬ）の増加を示した（図１６参照）。
【０２８７】
［実施例１Ｄ］ＴＧ２−ＣｏｖＴｅｓｔ（特定ＴＧ２架橋活性の定量測定ための比色分析）（図１７）
トランスグルタミナーゼ２（ＴＧ２）の量は、腸の炎症の徴候であることが知られている。ＴＧ２は、セリアック病の進行の鍵となる酵素である。ＷＴマウスおよびＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスについて、少なくとも２０週間、正常食または高グルテン食を摂食した後の、各マウスの空腸の懸濁液中のトランスグルタミナーゼ２の量（ＴＧ２）をＴＧ２−ＣｏｖＴｅｓｔによって定量化した。
その結果、高グルテン食（ＨＧＤ）で飼育したＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスの腸内では、ＴＧ２の量が各マウスのグループの中で、最大であった（図１７参照）。
【０２８８】
［実施例１Ｅ］フローサイトメトリー（図１８）
ＣＤ４５＋ＰＩ−細胞集団でゲートされた粘膜固有層の細胞のＣＤ１１ｂおよびＣＤ１１ｃの発現を、フローサイトメトリーによって分析した。正常食または高グルテン食を供給されたＢａｌｂ／ｃ種のＷＴマウスまたはＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスの粘膜固有層（ＬＰ）細胞をフローサイトメトリーによって分析した。ＣＤ４５発現ＬＰ細胞は、Ｉ−Ｍａｇのテクノロジ（磁気ビーズを利用した細胞分離システム）を使用して濃縮した。
【０２８９】
ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１ｃlow細胞は粘膜固有層のマクロファージであり、ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１ｃ＋およびＣＤ１１ｂ−ＣＤ１１ｃ＋は粘膜固有層（ＬＰ）の樹状細胞(ＤＣ)である。
【０２９０】
［実施例１Ｆ］免疫細胞の量的、質的な変化（図１９）
ＷＴマウスとＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスの各マウスにおいて、粘膜固有層（ＬＰ）のマクロファージ（白抜）の頻度、粘膜固有層（ＬＰ）のＣＤ１１ｂ＋樹状細胞（黒塗）の頻度、粘膜固有層（ＬＰ）のＣＤ１１ｂ−樹状細胞（網掛）の頻度を計測した。
【０２９１】
すなわち、正常食（ＮＤ）と高グルテン食（ＨＧＤ）で飼育したＷＴマウスとＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスの空腸の粘膜固有層における免疫細胞の量的、質的な変化を調べた。
【０２９２】
高グルテン食（ＨＧＤ）で飼育したＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスにおけるＣＤ１１ｂ＋ ＣＤ１１ｃlowを発現する粘膜固有層のマクロファージ（ｌｐ Ｍf）の頻度は、高グルテン食（ＨＧＤ）で飼育したＷＴマウスと正常食（ＮＤ）で飼育したＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスの両方のそれよりも有意に大きかった（それぞれ、図１８の右下パネルの５．８、左下パネルの２．３、右上パネルの２．２の細胞集団を対比して参照、図１９参照）。
【０２９３】
腸内の粘膜固有層のマクロファージは、末梢血中でＣＣＲ２を発現する炎症性単球から分化したものである[下記文献４５]。
ＣＣＲ２がＭＣＰ１とＭＣＰ５の受容体であることを考慮すると、グリアジン刺激後に、粘膜固有層のマクロファージでの、これらのケモカインの発現上昇は、高グルテン食（ＨＧＤ）で飼育したＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスにおける粘膜固有層のマクロファージの高い頻度と一致している（図１９参照）。
【０２９４】
［実施例１Ｈ］サイトカインおよびケモカインの遺伝子発現量（図２０）
各マウスから単離された粘膜固有層（ＬＰ）マクロファージにおける、サイトカインおよびケモカインの遺伝子発現を定量的ＲＴ−ＰＣＲ法により解析した。なお、図２０において、各遺伝子発現量は、正常食のＷＴマウスのものを標準の「１」として、相対量で表されている。
【０２９５】
高グルテン食（ＨＧＤ）で飼育したＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスの粘膜固有層のマクロファージは、炎症性サイトカイン（ＩＬ−６, ＩＬ−１５, ＴＮＦ−a，ＩＦＮ−bおよびＭＣＰ１）およびＭＣＰ５といったいくつかのケモカインについて、高グルテン食（ＨＧＤ）で飼育したＷＴマウスのものと比較して、有意に高い量を示した（図２０参照）。
【０２９６】
高グルテン食（ＨＧＤ）で飼育したＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスの粘膜固有層のマクロファージからの炎症性サイトカインおよびケモカインの発現増強は、各マウスで観察された腸疾患に起因していると考えられる。
【０２９７】
また、興味深いことに、正常食（ＮＤ）で飼育したＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスの粘膜固有層のマクロファージは、ＮＤで飼育したＷＴマウスと比較して、ＩＬ−１５およびｐ１９を高発現した（図２７）。
【０２９８】
［実施例１Ｉ］（図２１）
粘膜固有層細胞のマクロファージ、ＣＤ１１ｂ＋の樹状細胞、ＣＤ１１ｂ−の樹状細胞、腸上皮細胞および上皮内リンパ球におけるにおけるＣＤ３００ａ（ＭＡＩＲ−Ｉ）の発現をフローサイトメトリーにより解析した。
【０２９９】
ＣＤ３００ａ（ＭＡＩＲ−Ｉ）は、ＴＸ４１（抗ＭＡＩＲ−Ｉマウスモノクローナル抗体）を用いて検出した。なお、粘膜固有層細胞のマクロファージ（Ｍφ）、ＣＤ１１ｂ＋樹状細胞およびＣＤ１１ｂ−樹状細胞は、ＣＤ４５＋ＰＩ−の粘膜固有層の細胞数でゲートした。
【０３００】
上皮内リンパ球（ＩＥＬ）および腸上皮細胞（ＩＥＣ）は、ＣＤ３＋ＣＤ４５＋ＰＩ−およびＣＤ４５−ＰＩ−の分画（ｆｒａｃｔｉｏｎｓ)にそれぞれゲートした。
ＣＤ３００ａ（ＭＡＩＲ−Ｉ）は、マクロファージ、顆粒球、マスト細胞と樹状細胞を含む骨髄細胞の大部分に発現する（[下記文献４６]）。
【０３０１】
上述のように、発明者らは、粘膜固有層上のマクロファージ、粘膜固有層のＣＤ１１ｂ＋炎症性樹状細胞、ＣＤ１１ｂ−寛容原性の樹状細胞、腸管上皮細胞（ＩＥＬ）および腸上皮細胞（ＩＥＣ）、粘膜固有層のマクロファージについて、ＣＤ３００ａ（ＭＡＩＲ−Ｉ）の発現を解析し、さらに、ＣＤ３００ａ（ＭＡＩＲ−Ｉ）を発現した粘膜固有層のＣＤ１１ｂ＋樹状細胞および粘膜固有層のＣＤ１１ｂ−樹状細胞の亜集団を調べた。その結果、腸管上皮細胞（ＩＥＬ）および腸上皮細胞（ＩＥＣ）では、ＣＤ３００ａ（ＭＡＩＲ−Ｉ）を発現していなかった（図２１）。
【０３０２】
［実施例１Ｊ］（図２２）
グリアジンペプチドの受容体が同定されていないが、以前の研究では、グリアジンＰ３１−４３ペプチドは初期エンドソームに蓄積し、それらの成熟を阻害することを報告している[下記文献４７、４８]。
【０３０３】
粘膜固有層（ＬＰ）のＣＤ１１ｂ＋樹状細胞をＢａｌｂ／ｃのＷＴマウスまたはＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスから単離し、ｉｎ ｖｉｔｒｏで１０時間１００ｍｇ／ｍＬの中毒性グリアジンペプチドＰ３１−４３で刺激した。
【０３０４】
グリアジン刺激後のＷＴマウスまたはＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスの粘膜固有層（ＬＰ）のＣＤ１１ｂ＋樹状細胞のサイトカインやケモカイン（ＩＬ−６、ＩＬ−１５、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−β、ＭＣＰ１およびＭＣＰ５）の遺伝子発現量を定量的ＲＴ-ＰＣＲ法に解析した。なお、それら遺伝子の発現レベルは、相対的な量で表されており、非処理のＷＴマウスの遺伝子発現量を基準の「１」としている。
【０３０５】
遺伝子発現量を調べた結果、グリアジンペプチドＰ３１−４３による刺激後、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスの粘膜固有層のマクロファージは、ＷＴマウスの粘膜固有層のマクロファージと比較して、ＩＬ−６、ＩＬ−１５、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−β、ＭＣＰ１、及びＭＣＰ５をより有意に高発現した（図２２）。
【０３０６】
正常食（ＮＤ）で飼育したＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスの粘膜固有層の炎症性のＣＤ１１ｂ＋樹状細胞は、正常食（ＮＤ）で飼育したＷＴマウスと比較して、ＩＬ−１５を高発現した。
【０３０７】
［実施例１Ｋ］グリアジン誘発性のサイトカイン発現の抑制（図２３）
発明者らは、組換えマウスＭＦＧ−Ｅ８タンパク質を添加することにより、粘膜固有層のマクロファージ上のＣＤ３００ａ（ＭＡＩＲ−Ｉ）と、アポトーシス細胞に呈示されているホスファチジルセリン（ＰＳ）との間の相互作用を遮断できるか否かを検討した。
【０３０８】
Ｂ６のＷＴマウスまたはＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス由来の粘膜固有層細胞のマクロファージが、５ｍｇ／ｍＬのマウスＭＦＧ−Ｅ８を用いて、または用いないで前処理され、その後、中毒性グリアジンペプチドＰ３１−４３により試験管内で１０時間、刺激された。
【０３０９】
その後、刺激したマクロファージのＩＬ−６, ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−βの遺伝子発現を定量的ＲＴ−ＰＣＲ法により解析した。遺伝子発現量は、非処理のＷＴマウスの遺伝子発現量を「１」として比較定量した。
【０３１０】
その結果、非処理ＷＴマウスの粘膜固有層のマクロファージと比較して、ＭＦＧ−Ｅ８で処理したＷＴマウスの粘膜固有層のマクロファージは、ＩＬ−６、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−βの発現を有意に増強させた（図２３）。
【０３１１】
これらの結果は、粘膜固有層のマクロファージ上のＣＤ３００ａ（ＭＡＩR−Ｉ）と、アポトーシス細胞上のホスファチジルセリンとの間の相互作用が， ＭｙＤ８８媒介およびＴＲＩＦ媒介のグリアジンシグナル伝達経路を抑制することで、栄養グルテンに対する過剰な炎症反応を調節することを示している。
【０３１２】
これらの結果は、粘膜固有層のマクロファージ上のＣＤ３００ａ（ＭＡＩＲ−Ｉ）とアポトーシス細胞上のホスファチジルセリンとの間の相互作用により、ＭｙＤ８８およびＴＲＩＦを介したグリアジンシグナル伝達経路を抑制して、食餌グルテンに対する過剰な炎症反応を調節することを示唆している。
【０３１３】
［実施例１Ｌ］（図２４）
正常食または高グルテン食を与えているＢａｌｂ／ｃのＷＴマウスまたはＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスについて大腸の病理組織学的解析を行った。
【０３１４】
その結果、高グルテン食（ＨＧＤ）で飼育したＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスにおける萎縮性変化は、腸では観察されなかった（図２４）。
［実施例１Ｍ］（図２５）
正常食または高グルテン食を与えているＢａｌｂ／ｃのＷＴまたはＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス由来の血清について、抗グリアジンＩｇＧおよびＩｇＡ抗体力価を上記方法に従って調べた。
【０３１５】
図２５において、上段のパネルは各マウスのデータを表している。そして、下段のパネルは、その平均値を表している。その結果、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスは、高グルテン食を摂食した後に腸症を示したが、グリアジンに対するＩｇＧおよびＩｇＡの力価の増加は認められなかった。
【０３１６】
［実施例１Ｎ］病理学的分析（図２６）
無グルテン食を与えられたＷＴマウスおよびＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスにおける病理学的分析を行った。
【０３１７】
Ｂａｌｂ／ｃのＷＴマウスまたはＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスに無グルテン食を与えた。無グルテン食の給餌開始から、各マウスの体重（ＢＷ）の変化を経時的にモニターした。その結果、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスはＷＴマウスに対して有意に低い体重増加率を示した。
【０３１８】
［実施例１Ｏ］サイトカイン発現量（図２７）
ＷＴマウスまたはＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスの粘膜固有層（ＬＰ）における通常の状態でのＣＤ１１ｂ＋樹状細胞とマクロファージのサイトカイン発現量について調べた。
【０３１９】
粘膜固有層（ＬＰ）マクロファージをＢａｌｂ／ｃのＷＴマウスまたはＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスから単離し、ｐ１９の発現を定量的ＲＴ−ＰＣＲ法により解析した。遺伝子発現量はＷＴマウスを「１」として相対定量で表した。
【０３２０】
また、同様に、粘膜固有層（ＬＰ）のＣＤ１１ｂ＋樹状細胞をＢａｌｂ／ｃマウスから単離し、ＩＬ−１５の発現を定量的ＲＴ−ＰＣＲ法により解析した。発現レベルはＷＴマウスのものを「１」として相対定量で表された。
図２７に示すように、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスは、ＷＴマウスと比較して、ｐ１９およびＩＬ−１５の遺伝子発現量が有意に多かった。
【０３２１】
［実施例１Ｐ］（図２８）
中毒性グリアジンペプチドＰ３１−４３で刺激した後のチオグリコール酸誘発性腹腔滲出細胞のマクロファージにおけるサイトカイン発現を調べた。
【０３２２】
ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスにおける粘膜固有層のマクロファージだけ高グルテン食（ＨＧＤ）の授乳後に炎症性サイトカインを大量に生産することを考え、発明者らは、グルテン由来中毒性グリアジンペプチドＰ３１−４３がマクロファージの炎症性サイトカインの発現を刺激するか否かを調べた。
【０３２３】
チオグリコール酸誘発性腹腔滲出細胞（ＰＥＣ）のマクロファージは、Ｂ６のＷＴマウスから調製した。そして、１００ｍｇ／ｍＬの中毒性グリアジンペプチドＰ３１−４３またはネガティブコントロール刺激としてのＯＶＡペプチドＰ３２３−３３９でｉｎ ｖｉｔｒｏで３時間刺激した。
【０３２４】
刺激を受けた腹腔滲出細胞マクロファージにおけるＩＬ−６、ＩＬ−１５、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−βの遺伝子発現を定量的ＲＴ−ＰＣＲ法により解析した。遺伝子の発現レベルはＯＶＡペプチドで感作をしたマクロファージを「１」として相対定量で表された。
【０３２５】
グリアジンペプチドＰ３１−４３の刺激後、チオグリコール酸誘発性腹腔滲出細胞（ＰＥＣ）のマクロファージは、コントロールのオボアルブミンペプチドＰ３２３−３３９で感作・刺激したマクロファージと比較して、ＩＬ−６、ＩＬ−１５、ＴＮＦ−β、およびＩＦＮ−αを有意に高発現した（図２８）
【０３２６】
［実施例１Ｑ］（図２９）
ＣＤ１１ｂ＋樹状細胞をＢａｌｂ／ｃのＷＴマウスおよびＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスから単離し、１００ｍｇ／ｍＬ中毒性のグリアジンペプチドＰ３１−４３で１０時間、試験管内で刺激した。
刺激した粘膜固有層のＣＤ１１ｂ＋樹状細胞におけるＩＬ−６, ＩＬ−１５, ＴＮＦ−α, ＩＦＮ−β, ＭＣＰ１およびＭＣＰ５の遺伝子発現量を定量的ＲＴ−ＰＣＲ法により解析した。なお。遺伝子の発現レベルはＷＴマウスを「１」として相対定量で表した。
【０３２７】
ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスの粘膜固有層のＣＤ１１ｂ＋樹状細胞は、ＷＴマウスの粘膜固有層のＣＤ１１ｂ＋樹状細胞より、これらサイトカインＩＬ−６, ＩＬ−１５, ＴＮＦ−α, ＩＦＮ−βとＭＣＰ１をより多く発現した（図２９）。
【０３２８】
［実施例１Ｒ］（図３０）
グリアジン刺激後のｂ６のＷＴマウスまたはＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスの粘膜固有層（ＬＰ）マクロファージにおけるサイトカインやケモカイン発現について調べた。
【０３２９】
ｂ６のＷＴマウスまたはＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス由来の粘膜固有層（ＬＰ）マクロファージを１００ｍｇ／ｍＬの中毒性グリアジンペプチドＰ３１−４３によりｉｎ ｖｉｔｒｏで３時間、刺激した。
【０３３０】
刺激した粘膜固有層（ＬＰ）マクロファージのＩＬ−６、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−βの遺伝子発現を定量的ＲＴ−ＰＣＲ法により解析した。遺伝子の発現量をＷＴマウスのものを「１」として相対定量で表した。
【０３３１】
その結果、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスの粘膜固有層のマクロファージは、ＷＴマウスのものより、ＩＬ−６，ＴＮＦ−α, ＩＦＮ−βを有意に高発現した（図３０）。
粘膜固有層のマクロファージのＣＤ３００ａ（ＭＡＩＲ−Ｉ）とアポトーシス細胞上のホスファチジルセリンの間の相互作用は、ＭｙＤ８８を媒介およびＴＲＩＦ媒介としたグリアジンシグナル伝達経路を抑制した。
【０３３２】
ｉｎ ｖｉｔｒｏでグリアジンペプチドＰ３１−４３で刺激した後、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスの粘膜固有層のマクロファージは、炎症性サイトカインやＩ型ＩＦＮの両方を高度に発現した（図２２と図３０）
これらの結果は、空腸内の粘膜固有層のマクロファージ上のＣＤ３００ａ（ＭＡＩＲ−Ｉ）が、食餌グルテン由来の中毒性グリアジンペプチドに対する応答により増強された炎症性サイトカインおよびケモカインの発現を抑制することを実証している。
【０３３３】
［実施例１Ｓ］（図３１）
微生物叢を枯渇させたＷＴマウスまたはＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス由来の粘膜固有層（ＬＰ）マクロファージ（グリアジンに刺激したもの）におけるサイトカインやケモカイン発現を調べた。
【０３３４】
抗生物質処理した、Ｂａｌｂ／ｃのＷＴマウスまたはＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスから粘膜固有層（ＬＰ）マクロファージを単離し、１００ｍｇ／ｍＬの中毒性グリアジンペプチドＰ３１−４３によりｉｎ ｖｉｔｒｏで１０時間で刺激した。
【０３３５】
刺激した粘膜固有層（ＬＰ）マクロファージのＩＬ−６、ＩＬ−１５、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−β、ＭＣＰ１およびＭＣＰ５の遺伝子発現を定量的ＲＴ−ＰＣＲ法により解析した。遺伝子発現量はＷＴマウスのものを「１」として相対定量で表された。
【０３３６】
グリアジンにＰ３１−４３で刺激したＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスの固有層のマクロファージにおけるＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−βの高発現は、ｂ６のＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスだけでなく（図３０）、微生物叢を枯渇させたＢａｌｂ／ｃのＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスでも観察された（図３１）。
【０３３７】
［実施例１Ｔ］（図３２）
単離された粘膜固有層（ＬＰ）マクロファージのホスファチジルセリン発現細胞の頻度を調べた。
【０３３８】
ＷＴマウスまたはＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスの粘膜固有層（ＬＰ）マクロファージをアネキシンＶで染色または染色せずに、ホスファチジルセリン発現している粘膜固有層（ＬＰ）マクロファージを、ｃｄ４５＋ＰＩ−ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１ｃlowでゲートした集団集団について検出した。なお、アネキシンＶにより、アポトーシスによる細胞膜内のホスファチジルセリンの分布の変化を検出することができる。
【０３３９】
発明者らは，ＣＤ３００ａ（ＭＡＩＲ−Ｉ）は新しいホスファチジルセリン（ＰＳ）の受容体であり、細菌に対する炎症反応を調節していることを実証した。単離した粘膜固有層のマクロファージは、アネキシンＶ＋細胞を１０％未満、含んでいた（図３２）。
【０３４０】
［実施例１Ｕ］（図３３）
チオグリコール酸誘発性腹腔滲出細胞（ＰＥＣ）のマクロファージをＷＴマウスから調製し、粘膜固有層（ＬＰ）マクロファージは、ＷＴマウスまたはＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスから単離した。
【０３４１】
ＷＴマウスとＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスの粘膜固有層（ＬＰ）マクロファージにおけるαｖとβ３の各インテグリンサブユニットとホスファチジルセリン受容体の発現を調べた。
【０３４２】
［実施例１Ｖ］（図３４）
これらのマクロファージ中のαｖβ３インテグリンとホスファチジルセリン受容体（ＴＩＭ−１、ＴＩＭ−４、Ｓｔａｂｉｌｎ−２、ＳＲ−ＰＳＯＸ、ＢＡＩ１とＭＥＲ）の遺伝子発現量を定量的ＲＴ−ＰＣＲ法により解析した。遺伝子の発現量は、ＷＴマウスのチオグリコール酸誘発性腹腔滲出細胞のマクロファージを「１」として相対定量で表された。
【０３４３】
粘膜固有層のマクロファージ及びチオグリコール酸誘発性腹腔滲出細胞（ＰＥＣ）のマクロファージでは、Ｔｉｍ−１を発現しなかった（図３３）。
ＰＳ受容体として知られているＴｉｍ−４, ｓｔａｂｉｌｉｎ−２, ＳＲ−ＰＳＯＸ, ＢＡＩ１およびＭａｒについても、ＷＴマウスの粘膜固有層のマクロファージとＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスの粘膜固有層のマクロファージ間でそれほど有意な差がなかった（図３３、図３４）。
【０３４４】
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【図１】
2014095570.tif 000003
【図２Ａ】
2014095570.tif 000004
【図２Ｂ】
2014095570.tif 000005
【図２Ｃ】
2014095570.tif 000006
【図２Ｄ】
2014095570.tif 000007
【図２Ｅ】
2014095570.tif 000008
【図２Ｆ】
2014095570.tif 000009
【図３Ａ】
2014095570.tif 000010
【図３Ｂ】
2014095570.tif 000011
【図３Ｃ】
2014095570.tif 000012
【図３Ｄ】
2014095570.tif 000013
【図４Ａ】
2014095570.tif 000014
【図４Ｂ】
2014095570.tif 000015
【図４Ｃ】
2014095570.tif 000016
【図４Ｄ】
2014095570.tif 000017
【図５Ａ】
2014095570.tif 000018
【図５Ｂ】
2014095570.tif 000019
【図６Ａ】
2014095570.tif 000020
【図６Ｂ】
2014095570.tif 000021
【図７Ａ】
2014095570.tif 000022
【図７Ｂ】
2014095570.tif 000023
【図７Ｃ】
2014095570.tif 000024
【図７Ｄ】
2014095570.tif 000025
【図７Ｅ】
2014095570.tif 000026
【図７Ｆ】
2014095570.tif 000027
【図８】
2014095570.tif 000028
【図９Ａ】
2014095570.tif 000029
【図９Ｂ】
2014095570.tif 000030
【図１０Ａ】
2014095570.tif 000031
【図１０Ｂ】
2014095570.tif 000032
【図１１】
2014095570.tif 000033
【図１２Ａ】
2014095570.tif 000034
【図１２Ｂ】
2014095570.tif 000035
【図１２Ｃ】
2014095570.tif 000036
【図１２Ｄ】
2014095570.tif 000037
【図１２Ｅ】
2014095570.tif 000038
【図１２Ｆ】
2014095570.tif 000039
【図１２Ｇ】
2014095570.tif 000040
【図１３】
2014095570.tif 000041
【図１４】
2014095570.tif 000042
【図１５】
2014095570.tif 000043
【図１６】
2014095570.tif 000044
【図１７】
2014095570.tif 000045
【図１８】
2014095570.tif 000046
【図１９】
2014095570.tif 000047
【図２０】
2014095570.tif 000048
【図２１】
2014095570.tif 000049
【図２２】
2014095570.tif 000050
【図２３】
2014095570.tif 000051
【図２４】
2014095570.tif 000052
【図２５】
2014095570.tif 000053
【図２６】
2014095570.tif 000054
【図２７】
2014095570.tif 000055
【図２８】
2014095570.tif 000056
【図２９】
2014095570.tif 000057
【図３０】
2014095570.tif 000058
【図３１】
2014095570.tif 000059
【図３２】
2014095570.tif 000060
【図３３】
2014095570.tif 000061
【図３４】
2014095570.tif 000062
【図３５】
2014095570.tif 000063
【配列表】
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