(57)【要約】【課題】癌細胞増殖抑制剤並びに健康食品を提供する。【解決手段】鮭白子を酵素処理することにより得られる分子量１０００乃至３０００の水溶性核酸、又は該水溶性核酸及びアミノ酸を含有することを特徴とする癌細胞増殖抑制物質及びこれを含む癌細胞増殖抑制剤並びに健康食品に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
鮭白子を酵素処理することにより得られる分子量１０００乃至３０００の水溶性核酸、又は該水溶性核酸及びアミノ酸を含有することを特徴とする癌細胞増殖抑制物質。
【請求項２】
請求項１記載の癌細胞増殖抑制物質を含む癌細胞増殖抑制剤。
【請求項３】
請求項１記載の癌細胞増殖抑制物質を含む健康食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は癌細胞増殖抑制剤並びに健康食品に関するものであり、詳細には、鮭白子を酵素処理することにより得られる分子量１０００乃至３０００の水溶性核酸、又は該水溶性核酸及びアミノ酸を含有する癌細胞増殖抑制物質を含む、癌細胞増殖抑制剤並びに健康食品に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、健康に対する世間一般の関心の高まりを反映して、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）又は核タンパク質を原料又は有効成分として用いた健康食品が提供されている。
また、鮭白子には、デオキシリボ核酸（DNA）とプロタミンの複合体である核タンパク質が高濃度に含まれており機能性食品として用いられている。核タンパク質は、免疫調節作用（例えば、非特許文献１参照。）、抗酸化作用（例えば、非特許文献２参照。）、血管拡張作用（例えば、非特許文献３参照。）などを有することが知られている。
また、高分子量の核タンパク質を水可溶性及び易消化性とするために、低分子化することも提案されている（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００４−１６１４３号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Sudo, N., Aiba, Y., Takaki, A., Tanaka, K., Yu, X.N., Oyama, N., Koga, Y. and Kubo, C. (2000). Dietary nucleic acids promote a shift in Th1/Th2 balance toward Th1-dominant immunity. Clin Exp Allergy 30, 979-87頁.
【非特許文献２】Ohtaki, H. et al. (2010) Nucleoprotein Diet Ameliorates Arthritis Symptoms in Mice Transgenic for Human T-Cell Leukemia Virus Type I (HTLV-1). J Clin Biochem Nutr 46, 93-104頁.
【非特許文献３】Matsunaga, M. et al. (2003). Nucleoprotamine diet derived from salmon soft roe protects mouse hippocampal neurons from delayed cell death after transient forebrain ischemia. Neurosci Res 47, 269-76頁.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、癌細胞増殖抑制剤並びに健康食品の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者等は、上記課題を解決するために、鮭白子由来の核タンパク質の腫瘍細胞に対する効果を鋭意検討した結果、鮭白子を酵素処理（ヌクレアーゼ処理）により低分子化することにより得られる分子量１０００乃至３０００の水溶性核酸を含む分解生成物（主成分は、核酸及びアミノ酸）が、複数の癌細胞株（Ａ５４９、ＨｅｐＧ２、ＨｅＬａ、ＨＳＣ−３、ＭＣＦ−７、ＬＮＣａｐ、ＨｕＨ−７、ＨＬＥ、ＣＡＣＯ−２等）において細胞増殖抑制効果を示すこと、該効果は細胞周期を止める若しく該周期を遅らせるという機構により、癌細胞の増殖を抑制するであろうこと、上記分解生成物中の細胞増殖抑制効果は、分子量１０００乃至３０００の水溶性核酸を活性本体とするものであること、及び、これにより優れた癌細胞の増殖抑制効果を奏し得る、癌細胞増殖抑制剤並びに健康食品を提供できることを見い出し、本発明を完成させた。
【０００７】
即ち、本発明は、
（１）鮭白子を酵素処理することにより得られる分子量１０００乃至３０００の水溶性核酸、又は該水溶性核酸及びアミノ酸を含有することを特徴とする癌細胞増殖抑制物質、
（２）前記（１）記載の癌細胞増殖抑制物質を含む癌細胞増殖抑制剤、
（３）前記（１）記載の癌細胞増殖抑制物質を含む健康食品、
に関する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、非常に安全性が高く且つ副作用が殆ど存在しない癌細胞増殖抑制剤並びに健康食品が提供される。
また、本発明の分子量１０００乃至３０００の水溶性核酸を含有する癌細胞増殖抑制物質は、癌細胞に特異性があり、特に、ＨＬＥ細胞（ヒト肝癌）、ＨｅＬａ細胞（ヒト子宮頚癌）、ＬＮＣａｐ細胞（ヒト前立腺癌）及びＭＣＦ−７細胞（ヒト乳腺癌）において感受性が高いものであり、従って、本発明の癌細胞増殖抑制物質を含む癌細胞増殖抑制剤は、ある種の、または、特定の種類のヒト肝癌、ヒト子宮頚癌、ヒト前立腺癌及びヒト乳腺癌の治療及び予防において有用であると考えられる。
また、特に、ＭＣＦ−７細胞（ヒト乳腺癌）においては感受性が高かったため、本発明の癌細胞増殖抑制物質を含む癌細胞増殖抑制剤は、特に、ヒト乳腺癌の治療又は予防において有用であると考えられる。
【０００９】
また、本発明の癌細胞増殖抑制物質は、細胞周期を止める若しくは遅らせることにより、癌細胞の増殖を抑制することが示唆されたが、これにより、同時に投与する他の薬剤を選択する際に、作用機序的に不利な組み合わせとなる薬剤の使用を回避することを可能とする。
また、本発明の癌細胞増殖抑制物質が示す癌細胞増殖抑制効果における活性本体は、分子量１０００乃至３０００の水溶性核酸（以下、水溶化核酸とも言及する）であるため、水溶化核酸を含む癌細胞増殖抑制剤並びに健康食品は、癌細胞増殖抑制効果を示すものとして、有利に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】製造例１で製造した低分子化核タンパク質の濃度に対する各細胞の増殖率を示すグラフである。
【図２】製造例１で製造した低分子化核タンパク質（０、１、５ｍｇ／ｍＬ）の添加後、０時間及び９６時間におけるＭＣＦ−７細胞の状態を示す写真である。
【図３】製造例１で製造した低分子化核タンパク質（０、１、５ｍｇ／ｍＬ）の添加後、０ないし９６時間におけるＭＣＦ−７細胞数の変化を示すグラフである。
【図４】細胞周期を説明する概略図である。
【図５】製造例１で製造した低分子化核タンパク質０、１、５ｍｇ／ｍＬの添加３日後に細胞分裂Ｍ期を特異的に認識する抗体で免疫染色した際の写真である。
【図６】Ｉｍａｇｅ  Ｊによる画像処理による画像の変化を示す図である。
【図７】製造例１で製造した低分子化核タンパク質０、１、５ｍｇ／ｍＬの添加３日後のＨｉｓｔｏｎ  Ｈ３陽性細胞数の割合を示すグラフである。
【図８】フローサイトメーターにより得られるチャートと細胞周期の相関を説明する概略図である。
【図９】製造例１で製造した低分子化核タンパク質０ｍｇ／ｍＬの添加０日及び３日後並びに１ｍｇ／ｍＬ添加３日後におけるチャートと、Ｇ０／Ｇ１期、Ｓ期及びＧ２／Ｍ期の割合（％）を示す図である。
【図１０】製造例１で製造した低分子化核タンパク質０ｍｇ／ｍＬの添加０日及び３日後並びに１ｍｇ／ｍＬ添加３日後における、Ｇ０／Ｇ１期、Ｓ期及びＧ２／Ｍ期の割合（％）を示すグラフである。
【図１１】ＭＣＦ−７細胞に製造例１で製造した低分子化核タンパク質を添加し、４日後にＭＴＴアッセイを行った結果と、ＭＣＦ−７細胞に、製造例２で製造した水溶化核酸を添加し、４日後にＭＴＴアッセイを行った結果とを比較するグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
更に詳細に本発明を説明する。
本発明の癌細胞増殖抑制物質は、鮭白子を酵素処理することにより得られる分子量１０００乃至３０００の水溶性核酸、又は該水溶性核酸及びアミノ酸を含有することを特徴とする。
【００１２】
本発明の癌細胞増殖抑制物質に使用可能な分子量１０００乃至３０００の水溶性核酸（水溶化核酸）は、鮭白子を酵素処理ことにより得ることができる。
上記水溶化核酸の態様としては、例えば、二本鎖、一本鎖又は環状のＤＮＡであり得る。
また、上記水溶化核酸の原料となる鮭白子は、とりわけＤＮＡを多く含むものの、従来、資源として有効に利用されず、多くが廃棄されていた。それ故、廃棄物の資源化という観点から、鮭白子由来のＤＮＡを利用することは望ましい。
【００１３】
上記酵素処理としては、ヌクレアーゼを用いる処理が挙げられ、また、ヌクレアーゼとプロテアーゼを用いる処理が挙げられる。
上記ヌクレアーゼとしては、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の３，５'−ホスホジエステル結合を加水分解し、オリゴ体重合の５'−ヌクレオチドを生成するものである。該ヌクレアーゼの性質について特に制限はないが、ある程度の熱安定性を備えることが好ましい。このようなヌクレアーゼは、例えば天野エンザイム株式会社（旧天野製薬株式会社）、シグマ社等から市販品を入手可能である。
【００１４】
前記ヌクレアーゼを用いた加水分解処理において重要なのは、反応を行う温度である。反応温度は６０〜７５℃の範囲内でなければならず、７０℃が最も好ましい。該温度範囲より低い温度で反応を行うと、低分子化が十分に進行せず、分解物が水溶性とならない。一方、該温度範囲より高い温度で行うと、低分子化が過度に進行し、核タンパク質の優れた効果を失う惧れがある。
【００１５】
また、上記のヌクレアーゼ処理に先立って、プロテアーゼを使用して鮭白子に含まれるタンパク質等を加水分解しておくのが好ましい。
前記プロテアーゼはトリプシンを主体とするものである。トリプシンは高い特異性を有するセリンプロテアーゼであり、アルギニン及びリジンのカルボキシル側でペプチド結合を選択的に加水分解するので、アルギニンを多く含むプロタミンの加水分解に適している。また前記プロテアーゼは、トリプシンに加えて、他のプロテアーゼ、例えばキモトリプシン等を含むこともできる。良好なプロテアーゼとしては、ノボザイムズジャパン株式会社（旧ノボノルディスクバイオインダストリー株式会社）製のプロテアーゼを挙げることができる。
【００１６】
上記のようなプロテアーゼ処理及びヌクレアーゼ処理（６０〜７５℃）を鮭白子に対して行うことにより、分子量範囲約１０００乃至３０００の水溶性核酸（通常、ヌクレオチド数（塩基数）３ないし１０の核酸からなる）を２０ないし５０％及びタンパク質（アミノ酸）を３０ないし７０％含有する低分子化核タンパク質を得ることができる。
【００１７】
一方、分子量１０００乃至３０００の水溶性核酸（水溶化核酸）は、鮭白子に対して上記のようなプロテアーゼ処理を行った後、透析処理を行って加水分解したタンパク質（ア
ミノ酸）とイオン類を除去し、その後、上記と同様のヌクレアーゼ処理を行って、核酸を低分子化することにより製造することができる。
上記透析処理としては、例えば、分画分子量が２，０００〜１，０００，０００である中空糸膜を用いる透析処理が挙げられる。
上記のようにして得られた水溶化核酸は、核酸の含有量が高く（通常、ＤＮＡ−Ｎａとして８６％以上）、また、タンパク質（アミノ酸）の含有量は極めて低い（通常１％以下）ものとなる。
【００１８】
本発明の癌細胞増殖抑制物質は、上記水溶化核酸で有り得るが、上記水溶化核酸及びアミノ酸を含む組成物でも有り得る。
上記組成物としては、例えば、上記水溶化核酸２０ないし５０質量％及びアミノ酸３０ないし７０質量％を含む組成物等が挙げられる。
また、上記低分子化核タンパク質を癌細胞増殖抑制物質として使用することもできる。
【００１９】
本発明はまた、癌細胞増殖抑制物質を含む癌細胞増殖抑制剤にも関する。
本発明の癌細胞増殖抑制剤における有効成分は、癌細胞増殖抑制物質、即ち、鮭白子をヌクレアーゼ処理により低分子化することにより得られる分子量１０００乃至３０００の水溶性核酸であるか、又は該水溶性核酸及びアミノ酸を含有する組成物である。
本発明の癌細胞増殖抑制剤の投与形態としては、注射剤（皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内注射）、軟膏剤、坐剤、エアゾール剤等による非経口投与又は錠剤、カプセル剤、顆粒剤、丸剤、シロップ剤、液剤、乳剤、懸濁液剤等による経口投与をあげることができる。
本発明の癌細胞増殖抑制剤は、全組成物の質量に対して、有効成分である癌細胞増殖抑制物質を約0.01〜99.5質量％、好ましくは、約0.1〜30質量％を含有する。
【００２０】
本発明の癌細胞増殖抑制剤は、有効成分である癌細胞増殖抑制物質に加えて、他の医薬的に又は獣医薬的に活性な化合物を含ませることもできる。
本発明の癌細胞増殖抑制剤に含まれる癌細胞増殖抑制物質の臨床的投与量は、年令、体重、患者の感受性、症状の程度等により異なるが、通常効果的な投与量は、成人一日0.001〜5.0ｇ、好ましくは、0.5〜2.5ｇ程度である。しかし必要により上記の範囲外の量を用いることもできる。
本発明の癌細胞増殖抑制剤は、製薬の慣用手段によって投与用に製剤化される。
【００２１】
即ち、経口投与用の錠剤、カプセル剤、顆粒剤、丸剤は、賦形剤、例えば白糖、乳糖、ブドウ糖、でんぷん、マンニット；結合剤、例えばヒドロキシプロピルセルロース、シロップ、アラビアゴム、ゼラチン、ソルビット、トラガント、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン；崩壊剤、例えばでんぷん、カルボキシメチルセルロース又はそのカルシウム塩、微結晶セルロース、ポリエチレングリコール；滑沢剤、例えばタルク、ステアリン酸マグネシウム又はカルシウム、シリカ；潤滑剤、例えばラウリル酸ナトリウム、グリセロール等を使用して調製される。
注射剤、液剤、乳剤、懸濁剤、シロップ剤及びエアゾール剤は、活性成分の溶剤、例えば水、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、プロピレングリコール、1,3−ブチレングリコール、ポリエチレングリコール；界面活性剤、例えばソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、水素添加ヒマシ油のポリオキシエチレンエーテル、レシチン；懸濁剤、例えばカルボキシメチルナトリウム塩、メチルセルロース等のセルロース誘導体、トラガント、アラビアゴム等の天然ゴム類；保存剤、例えばパラオキシ安息香酸のエステル、塩化ベンザルコニウム、ソルビン酸塩等を使用して調製される。
経皮吸収型製剤である軟膏には、例えば白色ワセリン、流動パラフィン、高級アルコール、マクロゴール軟膏、親水軟膏、水性ゲル基剤等が用いられる。
坐剤は、例えばカカオ脂、ポリエチレングリコール、ラノリン、脂肪酸トリグリセライ
ド、ココナット油、ポリソルベート等を使用して調製される。
【００２２】
本発明の癌細胞増殖抑制剤の製剤例を以下に示す。
製剤例１
錠剤
癌細胞増殖抑制物質              ２０ｇ
乳    糖                      ２６０ｇ
微結晶セルロース              ６００ｇ
コーンスターチ                ３５０ｇ
ヒドロキシプロピルセルロース  １００ｇ
ＣＭＣ−Ｃａ                  １４０ｇ
ステアリン酸マグネシウム        ３０ｇ
全    量                １，５００ｇ
上記成分を常法により混合したのち１錠中に１ｍｇの活性成分を含有する糖衣錠１０，０００錠を製造する。
製剤例２
カプセル剤
癌細胞増殖抑制物質            ２０ｇ
乳    糖                    ４３０ｇ
微結晶セルロース        １，０００ｇ
ステアリン酸マグネシウム      ５０ｇ
全    量                １，５００ｇ
上記成分を常法により混合したのちゼラチンカプセルに充填し、１カプセル中に１ｍｇの活性成分を含有するカプセル剤１０，０００カプセルを製造する。
製剤例３
軟カプセル剤
癌細胞増殖抑制物質                ２５ｇ
ＰＥＧ４００                    ４６４ｇ
飽和脂肪酸トリグリセライド  １，５００ｇ
ハッカ油                            １ｇ
ポリソルベート(Polysorbate)80     １０ｇ
全    量                    ２，０００ｇ
上記成分を混合したのち常法により３号軟ゼラチンカプセルに充填し、１カプセル中に１ｍｇの活性成分を含有する軟カプセル剤１０，０００カプセルを製造する。
製剤例４
軟膏
癌細胞増殖抑制物質            １．０ｇ
流動パラフィン              １０．０ｇ
セタノール                  ２０．０ｇ
白色ワセリン                ６８．４ｇ
エチルパラベン                ０．１ｇ
ｌ−メントール                ０．５ｇ
全    量                  １００．０ｇ
上記成分を常法により混合し、１％軟膏とする。
製剤例５
坐剤
癌細胞増殖抑制物質                １ｇ
ウィッテップゾールＨ１５＊    ４７８ｇ
ウィッテップゾールＷ３５＊    ５２０ｇ
ボリソルベート(Polysorbate)80    １ｇ
全    量                 １，０００ｇ
「＊  トリグリセライド系化合物の商標名
ウィッテップゾール＝Ｗｉｔｅｐｓｏｌ」
上記成分を常法により溶融混合し、坐剤コンテナーに注ぎ冷却固化して１ｍｇの活性成分を含有する１ｇ坐剤１，０００個を製造する。
製剤例６
注射剤
癌細胞増殖抑制物質            １ｍｇ
注射用蒸留水                  ５ｍＬ
用時、溶解して用いる。
【００２３】
本発明はまた、癌細胞増殖抑制物質を含む健康食品にも関する。
本発明の健康食品における有効成分は、癌細胞増殖抑制物質、即ち、鮭白子をヌクレアーゼ処理により低分子化することにより得られる分子量１０００乃至３０００の水溶性核酸であるか、又は該水溶性核酸及びアミノ酸を含有する組成物である。
本発明の健康食品としては、例えば、癌細胞増殖抑制作用を有する健康食品として実施することが好適である。また、公知の甘味料、酸味料、ビタミン等の各種成分と混合してユーザーの嗜好に合う製品とすればよい。例えば、錠剤、カプセル剤、ドリンク剤、ヨーグルト等の乳製品、調味料、加工食品、デザート類、菓子等の形態で提供することが可能である。
【実施例】
【００２４】
製造例１：低分子化核タンパク質の製造
冷凍した鮭白子２５００ｇを解凍し、皮、筋、血管等を除去した後、血抜き及び水洗を行った。その後、該鮭白子を水１０００ｍｌと共に粉砕して、プロテアーゼ（ＮＯＶＯ社製）２．５ｇを添加し、攪拌しながら４４〜４７℃、ｐＨ６．０〜６．３で４時間酵素処理を行った。続いて、処理後の液を７０℃に昇温し、ヌクレアーゼ（アマノ社製）２．５ｇを添加し、攪拌しながら、ｐＨ５．０〜５．５で４時間酵素分解処理を行った。その後、処理後の液を８５℃に昇温して、残存するプロテアーゼ及びヌクレアーゼを失活させた。得られた生成液を４０〜５０℃に冷却し、これを連続的にデカンターに送液して清澄液を分離し、噴霧乾燥して粉体の形態で、低分子化核タンパク質を得た。
得られた低分子化核タンパク質は、核酸を３６．６質量％（分子量範囲約１０００乃至３０００の水溶性核酸）及びアミノ酸４６．１％（アルギニン１５％を含む）を含有していた。
【００２５】
製造例２：水溶化核酸の製造
冷凍した鮭白子２５００ｇを解凍し、皮、筋、血管等を除去した後、血抜き及び水洗を行った。その後、該鮭白子を水１０００ｍｌと共に粉砕して、プロテアーゼ（ＮＯＶＯ社製）２．５ｇを添加し、攪拌しながら４４〜４７℃、ｐＨ６．０〜６．３で４時間酵素処理を行った。処理後の液を濾過した後、分画分子量が２，０００〜１，０００，０００である中空糸膜を用いて透析処理を行い、分解したタンパク質およびイオン類を除去すると共に二本鎖ＤＮＡを濃縮した。得られた溶液を７０℃に昇温し、ヌクレアーゼ（アマノ社製）２．５ｇを添加し、攪拌しながら、ｐＨ５．０〜５．５で４時間酵素分解処理を行った。その後、処理後の液を８５℃に昇温して、残存するヌクレアーゼを失活させた。得られた生成液を４０〜５０℃に冷却し、これを連続的にデカンターに送液して清澄液を分離し、噴霧乾燥して粉体の形態で、水溶化核酸（分子量範囲約１０００乃至３０００の水溶性核酸）を単離した（製造例１で製造した低分子化核タンパク質に含まれる核酸成分に相当する。）。
尚、得られた水溶化核酸の規格は以下の通りであった。
【表１】
2014152144.tif 000002
【００２６】
試験例１：癌細胞増殖抑制試験
９６ウェルプレートに２×１０3ないし２×１０4個の癌細胞を播種し、接着後に製造例１で製造した低分子化核タンパク質を添加した。
ここで、使用した癌細胞株は、Ａ５４９細胞（ヒト肺癌）、ＨｅｐＧ２細胞（ヒト肝癌）、ＨＳＣ−３細胞（ヒト舌扁平上皮癌）、ＨｅＬａ細胞（ヒト子宮頚癌）、ＭＣＦ−７細胞（ヒト乳腺癌）、ＬＮＣａｐ細胞（ヒト前立腺癌）、ＣＡＣＯ−２細胞（ヒト大腸癌）、ＨＬＥ細胞（ヒト肝癌）及びＨｕＨ−７細胞（ヒト肝癌）であり、製造例１で製造した低分子化核タンパク質の濃度は、０ないし１．４ｍｇ／ｍＬの範囲（０、０．０１、０．０２、０．０５、０．０７、０．０８、０．１、０．１４、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．８、１及び１．４ｍｇ／ｍＬ）とした。
４日後にＭＴＴアッセイを行って細胞数を判定した。
細胞増殖率は、製造例１で製造した低分子化核タンパク質の濃度０ｍｇ／ｍＬであるウェルの吸光度を１００％とした場合の比率とした。
この実験を３回繰り返し、平均値を算出し、これを細胞増殖率として
図１に、製造例１で製造した低分子化核タンパク質の濃度に対する各細胞の増殖率を示すグラフを示した。
図１から判るように、各癌細胞において、感受性が異なり、ＨＬＥ細胞（ヒト肝癌）、ＨｅＬａ細胞（ヒト子宮頚癌）、ＬＮＣａｐ細胞（ヒト前立腺癌）及びＭＣＦ−７細胞（ヒト乳腺癌）においては感受性が高かったものの、ＨｅｐＧ２細胞（ヒト肝癌）、ＣＡＣＯ−２細胞（ヒト大腸癌）、Ａ５４９細胞（ヒト肺癌）及びＨＳＣ−３細胞（ヒト舌扁平上皮癌）では、感受性が低かった。
また、ＨｅｐＧ２細胞（ヒト肝癌）とＨＬＥ細胞（ヒト肝癌）は、どちらも肝細胞由来であるにもかかわらず、感受性が異なった。
特に、ＭＣＦ−７細胞（ヒト乳腺癌）において高い感受性が確認された。
以上より、低分子化核タンパク質の癌細胞増殖抑制作用は、細胞特異性を有するものと考えられた。
【００２７】
試験例２：ＭＣＦ−７細胞の生細胞数の経時的変化
ＭＣＦ−７細胞株を６ウェルプレートに６×１０4個づつを播種し、接着後に製造例１で製造した低分子化核タンパク質（０、１、５ｍｇ／ｍＬ）を添加した。
Ｂｉｏｓｔａｔｉｏｎ（使用機器：ニコン  Ｂｉｏｓｔａｔｉｏｎ  ＣＴ  Ｖｅｒ．３．４、解析ソフト：ＣＬ−ＱＵＡＮＴ  ２．２２）にて６時間おきに４日間（９６時間）写
真撮影を行った。
また、１ウェルにつき、５箇所（１箇所のエリア１６．０８６ｍｍ2）の細胞数を測定し、その合計から１ｍｍ2当りの細胞数を算出した。
製造例１で製造した低分子化核タンパク質（０、１、５ｍｇ／ｍＬ）の添加後、０時間及び９６時間における細胞の状態を示す写真を図２に示し、低分子化核タンパク質（０、１、５ｍｇ／ｍＬ）の添加後、０ないし９６時間における細胞数の変化を示すグラフを図３に示した。
図２から、低分子化核タンパク質の添加量が多くなる程、ＭＣＦ−７細胞の増殖が抑制されていることが目視的に観察された。尚、細胞が浮いたり死滅したりしている様子は観察されなかったため、毒性やアポトーシスの兆候はみられなかった。
また、図３から、用量依存的にＭＣＦ−７細胞の増殖が抑制されることが明確に示された。
【００２８】
試験例３：免疫染色による癌細胞増殖抑制機構の解明
図４に示されるように、細胞周期には、ＤＮＡ合成準備期（Ｇ１期）、ＤＮＡ合成期（Ｓ期）、分裂準備期（Ｇ２期）及び分裂期（Ｍ期）の４つの過程が存在する。
試験例２で示されるような癌細胞抑制機構が、上記細胞周期のどの過程に影響することによるものであるかを調査するためにＭ期のマーカーの抗体で免疫染色を行った。
ＭＣＦ−７細胞株を６ｃｍのディッシュに２．１×１０5個づつを播種し、接着後に製造例１で製造した低分子化核タンパク質（０、１、５ｍｇ／ｍＬ）を添加した。
３日後に４％ＰＦＡにて固定し、Ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｈｉｓｔｏｎｅ  Ｈ３［ｐＳｅｒ10］（シグマ社製：細胞分裂Ｍ期を特異的に認識する抗体）を用い免疫染色した。
各群で任意の６箇所を写真撮影した。
製造例１で製造した低分子化核タンパク質０、１、５ｍｇ／ｍＬの添加３日後に免疫染色した際の写真を図５に示した。
また、Ｉｍａｇｅ  Ｊにて画像処理し、全体の細胞数を測定し、Ｈｉｓｔｏｎ  Ｈ３陽性細胞数の割合を算出した。
Ｉｍａｇｅ  Ｊによる画像処理による画像の変化を図６に示し、また、図７に上記で算出されたＨｉｓｔｏｎ  Ｈ３陽性細胞数の割合を示すグラフを示した。
図５から、低分子化核タンパク質の添加量が多くなる程、免疫染色された細胞数が少なくなることが、目視的に観察された。
また、図７から、用量依存的にＨｉｓｔｏｎ  Ｈ３陽性細胞数の割合が減少することが明確に示された。
上記の試験から、低分子化核タンパク質の添加により細胞分裂Ｍ期の細胞の割合が減少することが明確に示された。
このことから、低分子化核タンパク質は細胞周期を止める若しくは遅らせることにより、癌細胞の増殖を抑制することが示唆された。
【００２９】
試験例４：フローサイトメーターを用いた細胞周期の検討
試験例３で示唆された低分子化核タンパク質の癌細胞増殖抑制機構（細胞周期を止める若しくは遅らせる）の詳細を、フローサイトメーターを用いて検討した。
使用機器：ＢＥＣＫＭＡＮ  ＣＯＵＬＴＥＲ社製  Ｇａｌｌｉｏｓ
解析ソフト：ＦｌｏｗＪｏ７．６．５
核染色試薬：ＰＩ（Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  Ｉｏｄｉｄｅ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ：ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）
試験方法
１．ＭＣＦ−７細胞を５×１０5個づつ１０ｃｍディッシュに播種
２．細胞接着後、製造例１で製造した低分子化核タンパク質添加（最終濃度：０．１ｍｇ／ｍＬ）
３．３日後に０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡにて細胞を剥がし、チューブに回収
４．７０％エタノールにて固定し、４℃で１晩以上放置
５．細胞をＰＢＳで洗浄し、Ｒｎａｓｅ溶液を加え、３７℃で１時間放置
６．各試料にＰＩを５μＬ加え、４℃で３０分放置
７．ナイロンメッシュに通した後、フローサイトメーターにて測定
フローサイトメーターにより得られるチャートと細胞周期の相関を説明する概略図を図８に示した。
フローサイトメーターにより得られるチャートにおいて、左側の最も大きなピークがＧ０／Ｇ１期に対応し、右側のピークがＧ２／Ｍ期に対応し、その間がＳ期に対応する。
図９に、製造例１で製造した低分子化核タンパク質０ｍｇ／ｍＬの添加０日及び３日後並びに１ｍｇ／ｍＬ添加３日後におけるチャートと、Ｇ０／Ｇ１期、Ｓ期及びＧ２／Ｍ期の割合（％）を示した。
また、図１０に上記の割合（％）をグラフとして示した。
図９，１０から明らかなように、製造例１で製造した低分子化核タンパク質０ｍｇ／ｍＬの添加０日と３日後においては、Ｇ０／Ｇ１期、Ｓ期及びＧ２／Ｍ期の割合において、特に変化はなかったものの、製造例１で製造した低分子化核タンパク質１ｍｇ／ｍＬ添加３日後においては、Ｓ期の割合が増加し、Ｇ２／Ｍ期の割合が減少することが明らかになった。
この結果は、試験例３で示唆された癌細胞増殖抑制機構、即ち、細胞周期を止める若しくは遅らせることにより、癌細胞の増殖を抑制することを支持するものである。
【００３０】
試験例５：有効成分の検討
製造例１で製造した低分子化核タンパク質、即ち、核酸を３６．６質量％（分子量範囲約１０００乃至３０００の水溶性核酸）及びアミノ酸４６．１％（アルギニン１５％）を含む分解生成物に含まれる核酸成分、即ち、製造例２で製造した水溶化核酸（分子量範囲約１０００乃至３０００の水溶性核酸）が癌細胞増殖抑制効果における活性本体であるか否かを調べた。
ＭＣＦ−７細胞に製造例１で製造した低分子化核タンパク質０．００ないし８．００ｍｇ／ｍＬ（０．００、０．０１、０．０２、０．０５、０．０７、０．０８、０．１０、０．１４、０．２０、０．３０、０．４０、０．５０、０．６０、０．８０、１．００、１．４０、２．００、４．００、６．００及び８．００ｍｇ／ｍＬ）を添加し、４日後にＭＴＴアッセイを行った結果と、ＭＣＦ−７細胞に、製造例２で製造した水溶化核酸を、製造例１で製造した低分子化核タンパク質に含まれる核酸成分の量と同量、即ち、３６％の量である０．００ないし２．８８ｍｇ／ｍＬ（０．００、０．００３６、０．００７２、０．０１８０、０．０２５２、０．０２８８、０．０３６０、０．０５０４、０．０７２０、０．１０８０、０．１４４０、０．１８００、０．２１６０、０．２８８０、０．３６、０．５０、０．７２、１．４４、２．１６及び２．８８ｍｇ／ｍＬ）を添加し、４日後にＭＴＴアッセイを行った結果とを比較した。
上記の結果を示すグラフを図１１に示した。
尚、該グラフにおいて、製造例２で製造した水溶化核酸の濃度は、製造例１で製造した低分子化核タンパク質の濃度に換算したもの（即ち、実際に使用した濃度を０．３６で割ったもの）として表示した。
図１１から、製造例１で製造した低分子化核タンパク質が示す癌細胞増殖抑制効果は、これに含まれる核酸成分、即ち、製造例２で製造した水溶化核酸の癌細胞増殖抑制効果と同等のものであることが示された。
これにより、製造例１で製造した低分子化核タンパク質に含まれる核酸成分である製造例２で製造した水溶化核酸が、製造例１で製造した低分子化核タンパク質が示す癌細胞増殖抑制効果における活性本体であることが明らかとなった。
【図１】
2014152144.tif 000003
【図３】
2014152144.tif 000004
【図４】
2014152144.tif 000005
【図７】
2014152144.tif 000006
【図８】
2014152144.tif 000007
【図９】
2014152144.tif 000008
【図１１】
2014152144.tif 000009
【図２】
2014152144.tif 000010
【図５】
2014152144.tif 000011
【図６】
2014152144.tif 000012
【図１０】
2014152144.tif 000013