(57)【要約】【課題】魚類由来のコラーゲンの耐熱性の改善及び再膨潤を高め、同時にコラーゲン自体の保水性を高めたスキャフォールド材料に好適な線維性コラーゲンゲルを提供する。【解決手段】プロテオグリカン及びグリコサミノグリカンの中から少なくとも一つと魚類由来のコラーゲンを架橋して複合体線維性コラーゲンゲルを製造する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
魚類由来のコラーゲンにプロテオグリカン、グリコサミノグリカンの中から少なくとも一つを架橋剤により架橋されたことを特徴とする線維性コラーゲンゲル。
【請求項２】
請求項１記載のプロテオグリカンが、魚類由来のものであることを特徴とする線維性コラーゲンゲル。
【請求項３】
請求項１〜請求項２いずれかに記載のグリコサミノグリカンがヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、コンドロイチン、ヘパラン硫酸であることを特徴とする線維性コラーゲンゲル。
【請求項４】
請求項１〜請求項３のいずれかに記載された架橋剤がカルボジイミドであることを特徴とする線維性コラーゲンゲル。
【請求項５】
コラーゲンの線維化と架橋を同時進行させることを特徴とする請求項１〜請求項４の線維性コラーゲンゲルの製造法。
【請求項６】
コラーゲンの線維化後に架橋することを特徴とする請求項１〜請求項４の線維性コラーゲンゲルの製造法。
【請求項７】
請求項１〜請求項４のいずれかに記載された線維性コラーゲンゲルからなるスキャフォールド材料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は魚類由来プロテオグリカンやグリコサミノグリカンとコラーゲンを架橋してなるスキャフォールド材料に好適な複合体の線維性コラーゲンゲルとその製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】  現在、再生医療を実施するうえでの細胞供給源の一つとして「間葉系幹細胞」が注目されている。間葉系幹細胞は骨髄中に存在すると考えられており、未分化な細胞なので、骨、軟骨、筋、靭帯、脂肪などの間葉系細胞に分化する能力を持っている。【０００３】  また、間葉系幹細胞は未分化なので増殖能力が高く、生体外での細胞培養環境で容易に数を増やす可能性が高く、そのため、患者の骨髄より分離した間葉系幹細胞を培養し増殖させた後、患部へ移植する治療も可能になってきている。その細胞培養機材としてアテロコラーゲン線維を骨格とするバイオスキャフォールドが最近注目されている。【０００４】  生物において、細胞の外に存在する細胞外マトリックス（ＥＣＭ）は、多細胞の場合に様々な役割を担っている。ＥＣＭは空間を充填する物質であると同時に、骨格的役割、細胞接着における足場の役割、細胞増殖因子などの保持提供する役割などを担っており、細胞増殖には欠かせない存在である。【０００５】  ヒトを含めた脊椎動物のＥＣＭの主成分は、コラーゲン、プロテオグリカン、フィブロネクチンやラミニン等の糖タンパクである。間質（結合組織）にはＩ型コラーゲン、プロテオグリカン、フィブロネクチンが主成分であり、軟骨を作る主成分は、ＩＩ型コラーゲン、プロテオグリカン（アグリカン）、ヒアルロン酸、リンクプロテインである。【０００６】  コラーゲンには、その両端にコラーゲンの抗原部位であるテロペプチドが存在するが、この部分を酵素処理で取り外すと抗原性が極端に低くなる。この酵素処理をしたアテロコラーゲンは細胞の接着性、増殖性、生体親和性、生分解性などの長所を持つために再生医療・細胞培養に広く活用されている。（特許文献１、非特許文献１）【０００７】  コラーゲンは、分子が線維状に会合する線維性コラーゲン（Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、Ｖ、ＸＩ型等）と非線維性コラーゲンに分類される。コラーゲンは、生体内で細胞から産出された後、コラーゲン分子が細胞外で会合し線維性コラーゲンとなる。繊維性コラーゲンは加熱するとコラーゲンの三重ラセン構造がほどけて、ポリペプチド鎖のコラーゲン分子がランダムコイル状の変性物となる。このような構造変化を起こす温度を変性温度という。熱変性物はゼラチンと呼ばれる。生体から抽出されたコラーゲンの変性温度は、哺乳類では４０℃前後であり、魚類は３０℃以下である。【０００８】  また、プロテオグリカンは、コアタンパク質にグリコサミノグリカンの多くが糖鎖として共有結合した分子の総称である。グリコサミングルカンは二糖繰返し構造を骨格とする長い糖鎖であって、その骨格構造の違いによりコンドロイチン、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ケラタン硫酸、ヒアルロン酸等に分類される。上記グルコサミノグリカンのうち唯一例外はヒアルロン酸で、プロテオグリカンのコアタンパク質に糖鎖として結合していない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２００５−３３４６２５
【００１０】
【非特許文献１】生物工学会誌  第８５巻  ｐ．１２６−１３１（２００７）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】  近年、再生医療や創薬の研究のため、生体を反映した簡便な細胞培養用スキャフォールドの構築が求められている。その生体を反映した細胞培養用スキャフォールドとして牛、ブタ、鳥等の脊椎動物のコラーゲン等のＥＣＭを抽出した材料を機能化する試みがなされているが、牛、ブタの場合、ＢＳＥや口蹄疫の問題、鳥は鳥インフルエンザの問題があり、これらの問題をすべて解決するのは難しい現状である。【００１２】  一方、魚類コラーゲンのＥＣＭを抽出した材料は、上記のような人獣共通の感染症の例がほとんど見られず細胞培養用スキャフォ−ルドとして好適な材料であるが、魚類コラーゲンの場合、欠点として加熱したとき三重ラセン構造がほどけて、哺乳類のコラーゲンより低温で変性するという耐熱性の問題があった。魚類コラーゲンを原料として、コラーゲンの線維化と架橋を同時に行うことにより耐熱性の改善の試みもなされているが、コラーゲン線維間で架橋されるために培地を加えても膨潤性が低く、コラーゲン自体の保水性も高くないという問題があった。【００１３】  本発明は、前記の問題を解決して、魚類コラーゲンの耐熱性の改善及び膨潤性を高め、同時にコラーゲン自体の保水性を高めた線維性コラーゲンゲルを作ることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】  本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、魚類由来のコラーゲンにプロテオグリカン及び特定のグリコサミノグリカンの中から少なくとも一つを架橋剤により架橋することにより、魚類由来のコラーゲンの欠点である変性温度を高め、合わせてコラーゲン自体の膨潤性、保水性を高めることを見出し、本発明を完成した。【００１５】  故に第１の発明は、魚類由来のコラーゲンにプロテオグリカン、グリコサミノグリカンの中から少なくとも一つを架橋剤により架橋されたことを特徴とする線維性コラーゲンゲルである。【００１６】  また、第２の発明は、請求項１記載のプロテオグリカンが、魚類由来のものであることを特徴とする線維性コラーゲンゲルである。【００１７】  また、第３の発明は、請求項１〜請求項２いずれかに記載のグリコサミノグリカンがヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、コンドロイチン、ヘパラン硫酸であることを特徴とする線維性コラーゲンゲルである。【００１８】  また、第４の発明は、請求項１〜請求項３のいずれかに記載された架橋剤がカルボジイミドであることを特徴とする線維性コラーゲンゲルである。【００１９】  また、第５の発明は、コラーゲンの線維化と架橋を同時進行させることを特徴とする請求項１〜請求項４の線維性コラーゲンゲルの製造法である。【００２０】  また、第６の発明は、コラーゲンの線維化後に架橋すること特徴とする請求項１〜請求項４の線維性コラーゲンゲルの製造法である。【００２１】  また、第７の発明は、請求項１〜請求項４のいずれかに記載された線維性コラーゲンゲルからなるスキャフォールド材料である。【００２２】  本発明におけるコラーゲンは非変性の線維性コラーゲンであれば何でも可能であるが、人獣共通の感染症を防止することから魚類由来のコラーゲンがより好ましい。また、非変性のコラーゲンを酵素処理して抗原性を低めたアテロコラーゲンの方が細胞培養スキャフォールド材料としてより好ましい。魚類由来のコラーゲンは、具体例として例えば、鮭、鱈、鮫などのコラーゲンが挙げられる。【００２３】  本発明の原料の非変性コラーゲンは生体内から抽出される。生体内では、非変性コラーゲンが三重ラセンのコラーゲン構造を保持したまま線維を形成し不溶化している。三重ラセンのコラーゲン構造を保ったまま可溶化し、抽出するためには、酸や、アルカリによる可溶化、あるいはタンパク質分解酵素処理によりコラーゲンの架橋を切断し可溶化する方法がある。これらにより本発明の非変性コラーゲンを生体より抽出することができる。【００２４】  可溶化されたコラーゲンは、条件によりイン・ビトロでコラーゲン線維を再形成し再線維化をする。再線維化環境としてリン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、Ｔｒｉｓ、ＰＢＳ、ＨＥＰＳ等の中から１種以上の緩衝能を有する塩水溶液が使用される。コラーゲンの変性を防止するために変性温度以下で再線維化を行う必要がある。【００２５】  本発明におけるプロテオグリカンは、コラーゲン同様に人獣共通の感染症を防止するために魚類由来がより好ましい。魚類由来のものの具体例として、鮭のコンドロイチン硫酸型プロテオグリカン、イカのヘパラン硫酸型プロテオグリカン、鮫のコンドロイチン硫酸型プロテオグリカン等が挙げられる。哺乳類由来のものは、牛、豚のプロテオグリカンが挙げられる。【００２６】  また、コラーゲンと架橋する各種グリコサミノグリカンのうち、多量に入手が容易なヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、コンドロイチン、ヘパラン硫酸がより好ましい。【００２７】  本発明における架橋剤の導入によりプロテオグリカン及びその糖鎖類との結合体からなるコラーゲンゲルを作る方法は２種類あり、
１．コラーゲンの線維化後に架橋する方法
２．コラーゲンの線維化と架橋を同時進行させる方法
上記１及び２の方法により作られたコラーゲンゲルは両方とも網目状の線維は形成される。上記１の方法では上記２より太い径の線維になる。【００２８】  本発明の架橋剤については、アルデヒド系、カルボジイミド系、エポキシド系、イミダゾール系、トリアジン系が安全性から好ましい。代表例としてグルタルアルデヒド、ホルムアルデヒドや、ＤＭＴ−ＭＭ〔４−（４，６‐ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウムクロライドｎ−ハイドレード〕、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）、及び１−エチル−３−（３−トリメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＴＣ）、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリノエチル）カルボジイミド（ＣＭＣ）などの水溶性カルボジイミド及びその塩及び混合物がある。この中で、反応後に容易に洗條でき、経済性から水溶性カルボジイミドが好ましい。この中でＥＤＣがより好ましい。【００２９】  本発明の架橋反応溶媒は、水と混合できてプロテオグリカンやグリコサミノグリカンが不溶な有機溶剤と水の混合溶媒が使用される。有機溶剤の代表例としては、メタノール、エタノール、イソプロパノールなどのアルコール類、ＴＨＦ、ＤＭＳＯ、ＤＭＦが挙げられる。その中で、本発明ゲルの作製過程で生体に適応できる材料として滅菌ができるエタノールが最も好ましい。例えばプロテオグリカンの場合は、水との混合比率はエタノール：水＝９：１〜６：４が好ましい。エタノールの比率がこの範囲以上または以下の場合では、線維構造に架橋が出来ない。また、エタノール水の混合溶媒の好ましい範囲では、エタノールの比率が高いとゲルの透明性は増し、エタノールの比率が低ければ、ゲルの強靭性が増す。エタノールと水の比率を変えることにより、透明なゲル、丈夫なゲルを自在に作製できる。【００３０】  更に本発明のゲルは、同じ素材を用いて線維化環境や凍結乾燥等の作製方法を変えて水和ゲルとキセロゲルの両方を作製できる。水和ゲルは、生体埋没型のスキャフォールドとして使用できるし、キセロゲルは生体外での培養基材として使用できる。従来の無架橋タイプのコラーゲンは、水和ゲルとして取り出せる程の機械的強度はなく、また架橋タイプのコラーゲン（特許文献１及び非特許文献１参照）は、単なる保水性のないゴム弾性コラーゲンであり、いずれも本発明のゲルのように、同じ素材を用いて再膨潤性、保水性及び機械的強度を兼ね揃えた水和ゲル及びキセロゲルを作製することは出来ない。
【発明の効果】
【００３１】  本発明の魚類由来の線維性コラーゲンゲンとプロテオグリカン及びグリコサミノグリカンの中から少なくとも一つを架橋した結合体により、未処理の魚類由来のコラーゲンゲルより変性温度を高め、哺乳類由来のコラーゲンゲルと同等以上の耐熱性を示す。【００３２】  また、本発明の線維性コラーゲンとプロテオグリカン及びグリコサミノグリカンの中から少なくとも一つを架橋した結合体により、細胞培養において培地を加えても再膨潤性が高く、また保水性も高い網目構造の細胞培養スキャフォールド材料を作ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】実施例１の架橋されたコラーゲンープロテオグリカン複合体のコラーゲン線維のＳＥＭ写真である。
【図２】実施例２の架橋されたコラーゲンープロテオグリカン複合体のコラーゲン線維のＳＥＭ写真である。
【図３】実施例１の架橋されたコラーゲンープロテオグリカン複合体の再膨潤性を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００３４】  以下、この発明の実施形態を具体的に説明する。尚、本発明はこれらの実施形態によって何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００３５】  マイクロチューブに塩酸（ＰＨ３．０）を入れ、鮭軟骨ＩＩ型アテロコラーゲン（ｔｙｐｅ−ＩＩＡＣ）を加えて、２．２ｍｇ／ｍｌｔｙｐｅ−ＩＩＡＣ溶液を調整した。これにＨＥＰＥＳバッファー（ＰＨ７．４）を入れ２ｍｇ／ｍＬのコラーゲン溶液（Ａ液）を調整し、４℃で３時間放置した。新たにマイクロチューブに鮭軟骨プロテオグリカン（ＣＳＰＧｓ）を秤量し、リン酸緩衝液（ＰＨ６．０）を加えて攪拌して２０ｍｇ／ｍｌ−ＣＳＰＧｓ溶液を調整した。そのＣＳＰＧｓ溶液にＥＤＣを秤量して加え、溶解させて４００ｍＭ−ＥＤＣ／２０ｍｇ／ｍＣＳＰＧｓ溶液（Ｂ液）を調整した。上記４℃で３時間放置したＡ液とＢ液を混合後、混合サンプルを４℃雰囲気下で２４時間静置した。その結果、白色のゲルが観測された。ゲルのＳＥＭ写真を図１に、変性温度、水分保持率を表−１に示す。また、凍結乾燥後のゲルを水中で再膨潤した結果を図３に示す。
【実施例２】
【００３６】  マイクロチューブに塩酸（ＰＨ３．０）を入れ、鮭軟骨ＩＩ型アテロコラーゲン（ｔｙｐｅ−ＩＩＡＣ）を加えて、１．１ｍｇ／ｍｌコラーゲン溶液を調整した。これに２００ｍＭのＨＥＰＳバッファー（ＰＨ７．４）を入れ、１．０ｍｇ／ｍＬｔｙｐｅ−ＩＩＡＣ溶液を調整し、４℃で２４時間静置した。その後、凍結乾燥を行ってサンプル（Ｃ）を得た。また、別のマイクロチューブに２００ｍＭのＨＥＰＳバッファー（ＰＨ７．４）を入れ、ＣＳＰＧｓを所定量秤量し、溶解させて１０ｍｇ／ｍＬのＣＳＰＧｓ溶液（Ｄ液）を調整した。上記Ｄ液にＣを溶解し、４℃で２４時間静置した後、凍結乾燥を行ってサンプル（Ｅ）を得た。更に、また別のマイクロチューブにリン酸緩衝液（ＰＨ６．０）にエタノールを加え１００ｍＭ−ＥＤＣ／エタノール水溶液〔水：エタノール＝１：９〕（Ｆ液）を調整した。上記Ｆ液にＥを溶解し、４℃で２４時間静置した。その結果白色のゲルが観測された。ゲルのＳＥＭ写真を図２に、変性温度、水分保持率を表−１に示す。
【比較例１】
【００３７】  マイクロチューブに塩酸（ＰＨ３．０）を入れ、鮭軟骨ＩＩ型アテロコラーゲン（ｔｙｐｅ−ＩＩＡＣ）を加えて、１．１ｍｇ／ｍｌコラーゲン溶液を調整した。これに２００  ｍＭのＨＥＰＳバッファー（ＰＨ７．４）を入れ、１．０ｍｇ／ｍＬｔｙｐｅ−ＩＩＡＣ溶液を調整し、４℃で２４時間静置した。その結果白色のゲルが観測された。変性温度、水分保持率を表−１に示す。
【００３８】  実施例１及び２、及び比較例１の耐熱性と水分保持率の結果（表−１）で明らかに、本発明のコラーゲンは、耐熱性と水分保持率が高いことがわかる。
【００３９】  表−１の水分保持率は、得られたゲルがどの程度水分を吸収するかの値である。
水分保持率（％）＝〔膨潤ゲルの重量（ｇ）−乾燥ゲル重量（ｇ）〕／乾燥ゲル重量（ｇ）×１００
【００４０】  実施例１で得られたゲルを洗浄後、凍結乾燥し、その後水に浸漬して乾燥ゲルがどの程度水を吸収し再膨潤した結果を図３に示す。
【００４１】  耐熱性は示差走差熱分析（ＤＳＣ）で吸熱ピークより測定した。
【００４２】
【表１】
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【産業上の利用可能性】
【００４３】  本発明の方法により線維性コラーゲンゲルは、熱安定性の向上及び再膨潤性、水分保持率が高く、従来のコラーゲンゲルより優れている。そのために変性温度の低い魚類由来コラーゲンを新たな医療用材料や細胞培養用スキャフォールド材料へ応用が可能となった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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