(57)【要約】【課題】亜硝酸酸化細菌を迅速かつ特異的に検出する方法の提供。【解決手段】微生物を含む試料から抽出されたＤＮＡを鋳型とし、Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌の亜硝酸酸化還元酵素をコードする遺伝子の特定の領域と特異的にハイブリダイズするフォワードプライマーと、Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌の亜硝酸酸化還元酵素をコードする遺伝子の特定の領域と特異的にハイブリダイズするリバースプライマーと、を用いてＰＣＲを行うことを特徴とする、亜硝酸酸化細菌の検出方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物を含む試料中のＤＮＡを鋳型とし、
（Ｆ１−１）配列番号１で表される塩基配列、
（Ｆ１−２）配列番号１で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列、
（Ｆ１−３）配列番号１で表される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列、又は
（Ｆ１−４）配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
を含むフォワードプライマーと、
（Ｒ１−１）配列番号２で表される塩基配列、
（Ｒ１−２）配列番号２で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列、
（Ｒ１−３）配列番号２で表される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列、又は
（Ｒ１−４）配列番号２で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
を含むリバースプライマーと、を用いてＰＣＲを行うことを特徴とする、亜硝酸酸化細菌の検出方法。
【請求項２】
微生物を含む試料中のＤＮＡを鋳型とし、
（Ｆ２−１）配列番号３で表される塩基配列、
（Ｆ２−２）配列番号３で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列、
（Ｆ２−３）配列番号３で表される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列、又は
（Ｆ２−４）配列番号３で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
を含むフォワードプライマーと、
（Ｒ２−１）配列番号４で表される塩基配列、
（Ｒ２−２）配列番号４で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列、
（Ｒ２−３）配列番号４で表される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列、又は
（Ｒ２−４）配列番号４で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
を含むリバースプライマーと、を用いてＰＣＲを行うことを特徴とする、亜硝酸酸化細菌の検出方法。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の亜硝酸酸化細菌の検出方法を用いて金属の腐食を予測することを特徴とする金属の腐食予測方法。
【請求項４】
（Ｆ１−１）配列番号１で表される塩基配列、
（Ｆ１−２）配列番号１で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列、
（Ｆ１−３）配列番号１で表される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列、又は
（Ｆ１−４）配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
を含むフォワードプライマーと、
（Ｒ１−１）配列番号２で表される塩基配列、
（Ｒ１−２）配列番号２で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列、
（Ｒ１−３）配列番号２で表される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列、又は
（Ｒ１−４）配列番号２で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
を含むリバースプライマーと、からなることを特徴とする亜硝酸酸化細菌検出用プライマー。
【請求項５】
（Ｆ２−１）配列番号３で表される塩基配列、
（Ｆ２−２）配列番号３で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列、
（Ｆ２−３）配列番号３で表される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列、又は
（Ｆ２−４）配列番号３で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
を含むフォワードプライマーと、
（Ｒ２−１）配列番号４で表される塩基配列、
（Ｒ２−２）配列番号４で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列、
（Ｒ２−３）配列番号４で表される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列、又は
（Ｒ２−４）配列番号４で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
を含むリバースプライマーと、からなることを特徴とする亜硝酸酸化細菌検出用プライマー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、亜硝酸酸化細菌を特異的に検出し得るプライマー、当該プライマーを用いて亜硝酸酸化細菌を検出する方法、及び当該検出方法を用いた金属の腐食予測方法に関する。  
【背景技術】
【０００２】
亜硝酸酸化細菌は、二酸化炭素を唯一の炭素源とする独立栄養細菌であり、一般的な従属栄養細菌と比べて増殖速度が遅く、一定の菌体量を得るには長時間を要する。そのため、試料中の亜硝酸酸化細菌を確実に検出するためには、先ず、亜硝酸酸化細菌の培養法を検討する必要があった。
【０００３】
これに対して、特許文献１では、無機性液体培地の組成を改良して、亜硝酸酸化細菌を長期にわたり安定に培養する方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００７−２７４９６８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、特許文献１の培養法を用いても、試料中の亜硝酸酸化細菌の検出に長期間を要するため、依然として亜硝酸酸化細菌を迅速に検出できる方法が求められている。
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、亜硝酸酸化細菌を迅速かつ特異的に検出する方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、亜硝酸酸化酵素をコードするｎｉｔｒｉｔｅ  ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ  ａｌｐｈａ  ｓｕｂｕｎｉｔ（ｎｏｒＡ）遺伝子において、Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌に特異的な塩基配列を見出し、当該塩基配列を特異的に検出可能なプライマーを設計し、当該プライマーを用いて、検査対象である試料中のＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを行うことにより、亜硝酸酸化細菌を迅速かつ特異的に検出し得ることを見出し、本発明を完成させた。
【０００７】
すなわち、本発明は、下記の特徴を有する亜硝酸酸化細菌の検出方法、金属の腐食予測方法、及び亜硝酸酸化細菌検出用プライマーを提供するものである。
（１）微生物を含む試料中のＤＮＡを鋳型とし、
（Ｆ１−１）配列番号１で表される塩基配列、
（Ｆ１−２）配列番号１で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列、
（Ｆ１−３）配列番号１で表される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列、又は
（Ｆ１−４）配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
を含むフォワードプライマーと、
（Ｒ１−１）配列番号２で表される塩基配列、
（Ｒ１−２）配列番号２で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列、
（Ｒ１−３）配列番号２で表される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列、又は
（Ｒ１−４）配列番号２で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
を含むリバースプライマーと、を用いてＰＣＲを行うことを特徴とする、亜硝酸酸化細菌の検出方法。
（２）微生物を含む試料中のＤＮＡを鋳型とし、
（Ｆ２−１）配列番号３で表される塩基配列、
（Ｆ２−２）配列番号３で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列、
（Ｆ２−３）配列番号３で表される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列、又は
（Ｆ２−４）配列番号３で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
を含むフォワードプライマーと、
（Ｒ２−１）配列番号４で表される塩基配列、
（Ｒ２−２）配列番号４で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列、
（Ｒ２−３）配列番号４で表される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列、又は
（Ｒ２−４）配列番号４で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
を含むリバースプライマーと、を用いてＰＣＲを行うことを特徴とする、亜硝酸酸化細菌の検出方法。
（３）前記（１）又は（２）に記載の亜硝酸酸化細菌の検出方法を用いて金属の腐食を予測することを特徴とする金属の腐食予測方法。
（４）（Ｆ１−１）配列番号１で表される塩基配列、
（Ｆ１−２）配列番号１で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列、
（Ｆ１−３）配列番号１で表される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列、又は
（Ｆ１−４）配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
を含むフォワードプライマーと、
（Ｒ１−１）配列番号２で表される塩基配列、
（Ｒ１−２）配列番号２で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列、
（Ｒ１−３）配列番号２で表される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列、又は
（Ｒ１−４）配列番号２で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
を含むリバースプライマーと、からなることを特徴とする亜硝酸酸化細菌検出用プライマー。
（５）（Ｆ２−１）配列番号３で表される塩基配列、
（Ｆ２−２）配列番号３で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列、
（Ｆ２−３）配列番号３で表される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列、又は
（Ｆ２−４）配列番号３で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
を含むフォワードプライマーと、
（Ｒ２−１）配列番号４で表される塩基配列、
（Ｒ２−２）配列番号４で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列、
（Ｒ２−３）配列番号４で表される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列、又は
（Ｒ２−４）配列番号４で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
を含むリバースプライマーと、からなることを特徴とする亜硝酸酸化細菌検出用プライマー。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の亜硝酸酸化細菌検出用プライマー、及びこれを用いた亜硝酸酸化細菌の検出方法により、試料中の亜硝酸酸化細菌を迅速かつ特異的に検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌の亜硝酸酸化酵素をコードするｎｉｔｒｉｔｅ  ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ  ａｌｐｈａ  ｓｕｂｕｎｉｔ遺伝子の塩基配列のアラインメントの一部の図を示す。
【図２】図２は、実施例１における、Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｌｋａｌｉｃｕｓから抽出された染色体ＤＮＡを鋳型として得られたＰＣＲ産物の電気泳動後のアガロースゲルのエチジウムブロマイド染色像を示す。
【図３】図３は、比較例１における、大腸菌、メタン発酵汚泥から抽出された染色体ＤＮＡを鋳型として得られたＰＣＲ産物の電気泳動後のアガロースゲルのエチジウムブロマイド染色像を示す。
【図４】図４左図は、実施例２における、各菌から抽出されたＤＮＡを鋳型として得られたＰＣＲ産物の電気泳動後のアガロースゲルのエチジウムブロマイド染色像を示す。図４右図は、実施例２における、Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｌｋａｌｉｃｕｓから抽出されたＤＮＡを鋳型として得られたＰＣＲ産物をピペッティングしたピペットチップを示す。
【図５】図５は、実施例３における、大腸菌、メタン発酵汚泥、又はＮｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｌｋａｌｉｃｕｓから抽出された染色体ＤＮＡを鋳型として得られたＰＣＲ産物の電気泳動後のアガロースゲルのエチジウムブロマイド染色像を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
＜亜硝酸酸化細菌の検出方法＞
［第１実施形態］
本実施形態の亜硝酸酸化細菌の検出方法（以下、本実施形態の検出方法ということがある。）は、Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌の亜硝酸酸化酵素をコードするｎｉｔｒｉｔｅ  ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ  ａｌｐｈａ  ｓｕｂｕｎｉｔ（以下、ｎｏｒＡという。）遺伝子に特異的にハイブリダイズするプライマーを用いて、微生物を含む試料中の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行うことを特徴とする。
当該試料中に亜硝酸酸化細菌が存在していた場合には、ＰＣＲによってプライマー設計から期待される大きさのＰＣＲ産物が得られる。
本実施形態においては、Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌の亜硝酸酸化酵素をコードするｎｏｒＡ遺伝子と特異的にハイブリダイズするプライマーを亜硝酸酸化細菌検出用プライマーとして用いることにより、亜硝酸酸化細菌を迅速かつ特異的に、検出することができる。
また、本実施形態の検出方法は、Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌に固有に存在する遺伝子をターゲットとするため、１６ＳｒＤＮＡをターゲットとした分析よりも高い信頼性を有している。
【００１１】
亜硝酸酸化細菌の亜硝酸酸化酵素をコードする遺伝子と特異的にハイブリダイズするプライマーを設計するために、本発明者らは、まず、Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌の亜硝酸酸化酵素をコードするｎｏｒＡ遺伝子の塩基配列を調べた。具体的には、Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｖｕｌｇａｒｉｓ (ＮＣＢＩ（米国立生物工学情報センター）のアクセッション番号：ＡＦ３４４８７５．１（配列番号５）、Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｈａｍｂｕｒｇｅｎｓｉｓ（ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＡＦ３４４８７２．１）（配列番号６）、Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｌｋａｌｉｃｕｓ（ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＡＦ３４４８７３．１）（配列番号７）、Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｗｉｎｏｇｒａｄｓｋｙｉ（ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＡＦ３４４８７４．１）（配列番号８）由来の亜硝酸酸化酵素をコードする遺伝子のアライメントを作成した。
【００１２】
図１（ａ）〜（ｄ）にＮｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌のｎｏｒＡ遺伝子の塩基配列のアラインメントの一部の図を示す。
【００１３】
ＰＣＲ産物の塩基対長が５０〜５００となるようにＰＣＲのフォワードプライマー及びリバースプライマーを設計することによって、ＰＣＲ効率を高め、ＰＣＲ産物の検出を比較的容易に行うことができる。そこで、Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌間で保存されている領域の中から、互いの距離が５０〜５００塩基長程度となる２つの領域を選択し、それらの領域と特異的にハイブリダイズし得るプライマーを、亜硝酸酸化細菌の検出用プライマーとして設計した。
具体的には、図１（ｃ）に示す領域１と図１（ｄ）に示す領域２を選択し、領域１のアンチセンス鎖と特異的にハイブリダイズするプライマーをフォワードプライマーとして設計し、領域２のセンス鎖と特異的にハイブリダイズするプライマーをリバースプライマーとして設計した。当該２領域間の距離（当該領域を含む。）は２９６塩基長であった。
【００１４】
本実施形態においては、多種多様な細菌の中からＮｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌のみを特異的に迅速に検出することが重要である。このため、亜硝酸酸化細菌の検出用プライマー中のＮｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌の染色体ＤＮＡとハイブリダイズする領域は、Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌の染色体ＤＮＡの塩基配列と相同性（塩基配列の同一性）が高い塩基配列であることが好ましい。
【００１５】
すなわち、本実施形態の検出方法は、微生物を含む試料中のＤＮＡを鋳型とし、領域１のアンチセンス鎖と特異的にハイブリダイズするフォワードプライマーと、領域２のセンス鎖と特異的にハイブリダイズするリバースプライマーとを用いてＰＣＲを行うことを特徴とする。
【００１６】
フォワードプライマーとして用いられるプライマーは、具体的には、下記の（Ｆ１−１）〜（Ｆ１−４）のいずれかの塩基配列を含む。
（Ｆ１−１）配列番号１で表される塩基配列、
（Ｆ１−２）配列番号１で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列、
（Ｆ１−３）配列番号１で表される塩基配列と相同性（塩基配列の同一性）が８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上である塩基配列、又は
（Ｆ１−４）配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列。
【００１７】
リバースプライマーとして用いられるプライマーは、具体的には、下記の（Ｒ１−１）〜（Ｒ１−４）のいずれかの塩基配列を含む。
（Ｒ１−１）配列番号２で表される塩基配列、
（Ｒ１−２配列番号２で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列、
（Ｒ１−３）配列番号２で表される塩基配列と相同性が８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上である塩基配列、又は
（Ｒ１−４）配列番号２で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列。
【００１８】
尚、本発明及び本願明細書において、「ストリンジェントな条件下」とは、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＣｌｏｎｉｎｇーＡ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ  ＴＨＩＲＤ  ＥＤＩＴＩＯＮ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）に記載の方法が挙げられる。例えば、５×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣの組成：３Ｍ塩化ナトリウム、０．３Ｍクエン酸溶液、ｐＨ７．０）、０．１重量％Ｎ−ラウロイルサルコシン、０．０２重量％のＳＤＳ、２重量％の核酸ハイブルダイゼーション用ブロッキング試薬、及び５０％フォルムアミドから成るハイブリダイゼーションバッファー中で、５５〜７０℃で数時間から一晩インキュベーションを行うことによりハイブリダイズさせる条件を挙げることができる。
尚、インキュベーション後の洗浄の際に用いる洗浄バッファーとしては、好ましくは０．１重量％ＳＤＳ含有１×ＳＳＣ溶液、より好ましくは０．１重量％ＳＤＳ含有０．１×ＳＳＣ溶液である。
【００１９】
より特異性に優れているため、フォワードプライマーとして用いられるプライマーは、前記（Ｆ１−１）〜（Ｆ１−４）の塩基配列を３’末端に有していることが好ましく、配列番号１で表される塩基配列を３’末端に有していることがより好ましく、Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌の染色体ＤＮＡとハイブリダイズする領域が配列番号１で表される塩基配列のみであることがさらに好ましい。
同様に、リバースプライマーとして用いられるプライマーは、前記（Ｒ１−１）〜（Ｒ１−４）の塩基配列を３’末端に有していることが好ましく、配列番号２で表される塩基配列を３’末端に有していることがより好ましく、Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌の染色体ＤＮＡとハイブリダイズする領域が配列番号２で表される塩基配列のみであることがさらに好ましい。
配列番号１で表される塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２で表される塩基配列からなるリバースプライマーとを用いて、Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った場合、２９６塩基対長のＰＣＲ産物が得られる。
【００２０】
フォワードプライマーとして用いられるプライマー及びリバースプライマーとして用いられるプライマーは、いずれも、Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌の染色体ＤＮＡとハイブリダイズする領域の５’端側に、Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌の染色体ＤＮＡとはハイブリダイズしないその他の塩基配列からなる領域を有していてもよい。当該その他の塩基配列としては、例えば、制限酵素認識配列等、ＰＣＲプライマーに一般的に付加される塩基配列が挙げられる。
【００２１】
本実施形態の検出方法に供される微生物を含む試料は、特に限定されるものではないが、亜硝酸酸化細菌が含まれていることが期待される、又はそのおそれのある試料であることが好ましく、Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌が含まれていることが期待される又はそのおそれのある試料であることがより好ましい。
【００２２】
亜硝酸酸化細菌は、亜硝酸イオンを硝酸イオンに酸化する際にエネルギーを得て増殖する細菌であり、亜硝酸酸化細菌によって生成される硝酸が、金属の腐食を促進する。
従って、検査対象となる試料としては、特に限定されるものではないが、本実施形態においては、金属に付着した試料を検査対象とすることが好ましい。
尚、検査対象である試料からのＤＮＡの抽出及び精製は、分子生物学の分野で公知の手法の中から適宜選択して用いることができる。
また、本実施形態において、発明者は、亜硝酸酸化細菌の培養液を超音波破砕し、その上清を用いることで、試料からＤＮＡを抽出せずとも、所定のＰＣＲ産物が得られることを見出した。この超音波処理と実施例において後述するＰＣＲ増幅判定ツール（ピペットチップ型ＰＣＲ増幅判定ツールＤ−ＱＵＩＣＫ；カネカ社製）を本実施形態の検出方法に組み合わせることにより、検出時間を大幅に短縮できる。
【００２３】
本実施形態の検出方法は、特定の亜硝酸酸化細菌の検出用プライマーを用いる以外は、常法により実施することができる。すなわち、ＰＣＲに用いるポリメラーゼ、反応用バッファー、ｄＮＴＰ等の各種試薬は、当該技術分野で使用されている公知の試薬等を通常の態様で使用することができる。また、ＰＣＲの温度サイクル条件は、使用するポリメラーゼの特性及び用いるプライマーのＴｍ値等を考慮して適宜決定される。
【００２４】
また、ＰＣＲ産物の検出も、分子生物学の分野で公知の手法の中から適宜選択して用いることができる。本実施形態の検出方法では、亜硝酸酸化細菌の検出用プライマーを用いてＰＣＲを行うため、検査対象である金属に亜硝酸酸化細菌が付着していた場合には、これらの試料中のＤＮＡを鋳型とした場合に、２００〜３００塩基長程度という検出が容易な大きさのＰＣＲ産物を得ることができる。このため、例えば、電気泳動法等の汎用されている簡便な手法により、ＰＣＲ産物を検出することができる。
【００２５】
本実施形態の検出方法により、亜硝酸酸化細菌を迅速かつ特異的に検出することができる。このため、当該方法を用いることにより、金属の腐食を予測することができる。例えば、検査対象である金属片中のＤＮＡを鋳型とし、亜硝酸酸化細菌の検出用プライマーを用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物が得られた場合には、当該金属が腐食する可能性ありと、予測することができる。
【００２６】
［第２実施形態］
本実施形態の検出方法は、第１実施形態の検出方法に用いた亜硝酸酸化細菌検出用プライマーとは、別のプライマーを用いて、微生物を含む試料中の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行うことを特徴とする。プライマーの設定以外は、第１実施形態の検出方法と同様であるため、その説明を省略する。
本発明者は、図１に示すアライメントを用いて、図１（ａ）に示す領域３と図１（ｂ）に示す領域４を選択し、領域３のアンチセンス鎖と特異的にハイブリダイズするプライマーをフォワードプライマーとして設計し、領域４のセンス鎖と特異的にハイブリダイズするプライマーをリバースプライマーとして設計した。当該２領域間の距離（当該領域を含む。）は２３６塩基長であった。
【００２７】
すなわち、本実施形態の検出方法は、微生物を含む試料から抽出されたＤＮＡを鋳型とし、領域３のアンチセンス鎖と特異的にハイブリダイズするフォワードプライマーと、領域４のセンス鎖と特異的にハイブリダイズするリバースプライマーとを用いてＰＣＲを行うことを特徴とする。
領域３及び領域４の塩基配列は、Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌間で、完全には保存されていない。Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌を特異的に検出すべく、本発明者は、これらの塩基配列に基づいて縮重プライマーを設計した。
【００２８】
即ち、フォワードプライマーとして用いられるプライマーは、具体的には、下記の（Ｆ２−１）〜（Ｆ２−４）のいずれかの塩基配列を含む。
（Ｆ２−１）配列番号３で表される塩基配列、
（Ｆ２−２）配列番号３で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列、
（Ｆ２−３）配列番号３で表される塩基配列と相同性が８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上である塩基配列、又は
（Ｆ２−４）配列番号３で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列。
【００２９】
また、リバースプライマーとして用いられるプライマーは、具体的には、下記の（Ｒ２−１）〜（Ｒ２−４）のいずれかの塩基配列を含む。
（Ｒ２−１）配列番号４で表される塩基配列、
（Ｒ２−２）配列番号４で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列、
（Ｒ２−３）配列番号４で表される塩基配列と相同性が８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上である塩基配列、又は
（Ｒ２−４）配列番号４で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列。
【００３０】
より特異性に優れているため、フォワードプライマーとして用いられるプライマーは、前記（Ｆ２−１）〜（Ｆ２−４）の塩基配列を３’末端に有していることが好ましく、配列番号３で表される塩基配列を３’末端に有していることがより好ましく、Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌の染色体ＤＮＡとハイブリダイズする領域が配列番号３で表される塩基配列のみであることがさらに好ましい。
同様に、リバースプライマーとして用いられるプライマーは、前記（Ｒ２−１）〜（Ｒ２−４）の塩基配列を３’末端に有していることが好ましく、配列番号４で表される塩基配列を３’末端に有していることがより好ましく、Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌の染色体ＤＮＡとハイブリダイズする領域が配列番号４で表される塩基配列のみであることがさらに好ましい。
配列番号３で表される塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４で表される塩基配列からなるリバースプライマーとを用いて、Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った場合、２３６塩基対長のＰＣＲ産物が得られる。
【００３１】
また、試料からＮｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌を、種ごとに検出したい場合には、各種における領域３及び領域４の塩基配列に基づいて設計したプライマーを用いてもよい。
即ち、Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｗｉｎｏｇｒａｄｓｋｙｉ検出用プライマーとして、配列番号９で表される塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１０で表される塩基配列からなるリバースプライマーのプライマーセットが挙げられる。
Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｈａｍｂｕｒｇｅｎｓｉｓ検出用プライマーとして、配列番号１１で表される塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１２で表される塩基配列からなるリバースプライマーのプライマーセットが挙げられる。
Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｖｕｌｇａｒｉｓ検出用プライマーとして、配列番号１３で表される塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１４で表される塩基配列からなるリバースプライマーのプライマーセットが挙げられる。
Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｌｋａｌｉｃｕｓ検出用プライマーとして、配列番号１５で表される塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１６で表される塩基配列からなるリバースプライマーのプライマーセットが挙げられる。
【００３２】
また、試料中のＮｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌を、種ごとに検出したい場合に用いられるプライマーセットとして、以下のものも挙げられる。
Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｗｉｎｏｇｒａｄｓｋｙｉ検出用プライマーとして、配列番号１７で表される塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１８で表される塩基配列からなるリバースプライマーのプライマーセットが挙げられる。
Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｈａｍｂｕｒｇｅｎｓｉｓ検出用プライマーとして、配列番号１９で表される塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２０で表される塩基配列からなるリバースプライマーのプライマーセットが挙げられる。
Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｖｕｌｇａｒｉｓ検出用プライマーとして、配列番号２１で表される塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２２で表される塩基配列からなるリバースプライマーのプライマーセットが挙げられる。
Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｌｋａｌｉｃｕｓ検出用プライマーとして、配列番号２３で表される塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２４で表される塩基配列からなるリバースプライマーのプライマーセットが挙げられる。
【００３３】
第１の実施形態と同様、本実施形態の検出方法により、亜硝酸酸化細菌を迅速かつ特異的に検出することができる。このため、当該方法を用いることにより、金属の腐食を予測することができる。
【実施例】
【００３４】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００３５】
［実施例１］
Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｌｋａｌｉｃｕｓから抽出された染色体ＤＮＡを鋳型として、本発明の検出方法を行った。
具体的には、鋳型ＤＮＡに、２μＬのバッファー（アプライドバイオシステム社製）、２μＬのｄＮＴＰ（２．５ｍＭ  ｅａｃｈ；アプライドバイオシステム社製）、最終濃度２００ｐＭのフォワードプライマー、最終濃度２００ｐＭのリバースプライマー、及び０．５ＵのＡｍｐｌｉＴａｑＧｏｌｄ（登録商標）ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（アプライドバイオシステム社製）を添加し、さらに適量の水を添加して２０μＬの反応溶液を調製した。当該反応溶液をＰＣＲ装置（アスペック社製）にセットし、９５℃で１０分間の変性工程後、１サイクルが９５℃で６０秒間、６０℃で６０秒間、７２℃で６０秒間を３０サイクル行い、その後７２℃で６０秒間の伸長工程を行い、４℃で保存する温度条件で、ＰＣＲを行った。
【００３６】
ＰＣＲ後の各反応液を、４％のＮｕＳｉｅｖｅ ３：１（タカラバイオ社製）アガロースゲルにアプライし、電気泳動を行った後、当該アガロースゲルをエチジウムブロマイドで染色した。図２に、電気泳動後のアガロースゲルのエチジウムブロマイド染色像を示す。
図２中、レーン２はフォワードプライマーとして配列番号１で表される塩基配列からなるプライマーと、リバースプライマーとして配列番号２で表される塩基配列からなるプライマーを用いた反応溶液；レーン３はフォワードプライマーとして配列番号１１で表される塩基配列からなるプライマーと、リバースプライマーとして配列番号１２で表される塩基配列からなるプライマーを用いた反応溶液；レーン４はフォワードプライマーとして配列番号１９で表される塩基配列からなるプライマーと、リバースプライマーとして配列番号２０で表される塩基配列からなるプライマーを用いた反応溶液；レーン５はフォワードプライマーとして配列番号１３で表される塩基配列からなるプライマーと、リバースプライマーとして配列番号１４で表される塩基配列からなるプライマーを用いた反応溶液；レーン６はフォワードプライマーとして配列番号２１で表される塩基配列からなるプライマーと、リバースプライマーとして配列番号２２で表される塩基配列からなるプライマーを用いた反応溶液；レーン７はフォワードプライマーとして配列番号１５で表される塩基配列からなるプライマーと、リバースプライマーとして配列番号１６で表される塩基配列からなるプライマーを用いた反応溶液；レーン８はフォワードプライマーとして配列番号２３で表される塩基配列からなるプライマーと、リバースプライマーとして配列番号２４で表される塩基配列からなるプライマーを用いた反応溶液；レーン９はフォワードプライマーとして配列番号２５で表される塩基配列からなるＮｉｔｒｏｐｉｒａ属細菌検出用プライマーと、リバースプライマーとして配列番号２６で表される塩基配列からなるプライマーＮｉｔｒｏｐｉｒａ属細菌検出用を用いた反応溶液；レーン１０はフォワードプライマーとして配列番号２７で表される塩基配列からなるＮｉｔｒｏｐｉｎａ属細菌検出用プライマーと、リバースプライマーとして配列番号２８で表される塩基配列からなるＮｉｔｒｏｐｉｎａ属細菌検出用プライマーを用いた反応溶液；レーン１１はフォワードプライマーとして配列番号２９で表される塩基配列からなるＮｉｔｒｏｐｉｎａ属細菌検出用プライマーと、リバースプライマーとして配列番号３０で表される塩基配列からなるＮｉｔｒｏｐｉｎａ属細菌検出用プライマーを用いた反応溶液；レーン１２はフォワードプライマーとして配列番号３１で表される塩基配列からなるＮｉｔｒｏｃｏｃｃｕｓ属細菌検出用プライマーと、リバースプライマーとして配列番号３２で表される塩基配列からなるＮｉｔｒｏｃｏｃｃｕｓ属細菌検出用プライマーを用いた反応溶液；レーン１３はプライマー無しの反応溶液を、それぞれアプライしたレーンである。
尚、レーン１はＤＮＡラダーマーカー（ＢＣ−ＤＭＯ１２−Ｒ５００；バイオメディカルサイエンス社製）ある。
【００３７】
図２に示すように、Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌に共通する配列由来のプライマーを用いたレーン２；Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｖｕｌｇａｒｉｓ検出用プライマーを用いたレーン７〜８に２９６塩基対長付近に１本のバンドが検出され、所定の塩基対長のＰＣＲ産物が得られたことが確認された。
一方で、鋳型ＤＮＡと対応するプライマーを用いていないレーン３〜６、９〜１３では全くバンドは検出されなかったことから、これらのレーンではＰＣＲ産物が得られないことが確認された。
この結果、本発明の検出方法によれば、種まで特定できる精度で亜硝酸酸化細菌を検出できることが確認された。
【００３８】
［比較例１］
大腸菌、メタン発酵汚泥から抽出された染色体ＤＮＡを鋳型として用いた以外は、実施例１と同様の方法で、菌の検出を行った。図３に、電気泳動後のアガロースゲルのエチジウムブロマイド染色像を示す。
図３中、レーン２はフォワードプライマーとして配列番号１で表される塩基配列からなるプライマーと、リバースプライマーとして配列番号２で表される塩基配列からなるプライマーを用いた反応溶液；レーン３はフォワードプライマーとして配列番号９で表される塩基配列からなるプライマーと、リバースプライマーとして配列番号１０で表される塩基配列からなるプライマーを用いた反応溶液；レーン４はフォワードプライマーとして配列番号１７で表される塩基配列からなるプライマーと、リバースプライマーとして配列番号１８で表される塩基配列からなるプライマーを用いた反応溶液；レーン５はフォワードプライマーとして配列番号１１で表される塩基配列からなるプライマーと、リバースプライマーとして配列番号１２で表される塩基配列からなるプライマーを用いた反応溶液；レーン６はフォワードプライマーとして配列番号１９で表される塩基配列からなるプライマーと、リバースプライマーとして配列番号２０で表される塩基配列からなるプライマーを用いた反応溶液；レーン７はフォワードプライマーとして配列番号１３で表される塩基配列からなるプライマーと、リバースプライマーとして配列番号１４で表される塩基配列からなるプライマーを用いた反応溶液；レーン８はフォワードプライマーとして配列番号２１で表される塩基配列からなるプライマーと、リバースプライマーとして配列番号２２で表される塩基配列からなるプライマーを用いた反応溶液；レーン９はフォワードプライマーとして配列番号１５で表される塩基配列からなるプライマーと、リバースプライマーとして配列番号１６で表される塩基配列からなるプライマーを用いた反応溶液；レーン１０はフォワードプライマーとして配列番号２３で表される塩基配列からなるプライマーと、リバースプライマーとして配列番号２４で表される塩基配列からなるプライマーを用いた反応溶液；レーン１０はフォワードプライマーとして配列番号２３で表される塩基配列からなるプライマーと、リバースプライマーとして配列番号２４で表される塩基配列からなるプライマーを用いた反応溶液；レーン１１はフォワードプライマーとして配列番号２５で表される塩基配列からなるＮｉｔｒｏｐｉｒａ属細菌検出用プライマーと、リバースプライマーとして配列番号２６で表される塩基配列からなるプライマーＮｉｔｒｏｐｉｒａ属細菌検出用を用いた反応溶液；レーン１２はフォワードプライマーとして配列番号２７で表される塩基配列からなるＮｉｔｒｏｐｉｎａ属細菌検出用プライマーと、リバースプライマーとして配列番号２８で表される塩基配列からなるＮｉｔｒｏｐｉｎａ属細菌検出用プライマーを用いた反応溶液；レーン１３はフォワードプライマーとして配列番号２９で表される塩基配列からなるＮｉｔｒｏｐｉｎａ属細菌検出用プライマーと、リバースプライマーとして配列番号３０で表される塩基配列からなるＮｉｔｒｏｐｉｎａ属細菌検出用プライマーを用いた反応溶液；レーン１４はフォワードプライマーとして配列番号３１で表される塩基配列からなるＮｉｔｒｏｃｏｃｃｕｓ属細菌検出用プライマーと、リバースプライマーとして配列番号３２で表される塩基配列からなるＮｉｔｒｏｃｏｃｃｕｓ属細菌検出用プライマーを用いた反応溶液；レーン１６はフォワードプライマーとして配列番号１で表される塩基配列からなるプライマーと、リバースプライマーとして配列番号２で表される塩基配列からなるプライマーを用いた反応溶液を、それぞれアプライしたレーンである。
レーン２〜１４は、大腸菌から抽出された染色体ＤＮＡを鋳型とした反応液をアプライしたレーンであり、レーン１６は、メタン発酵菌を含有するメタン発酵汚泥から抽出された染色体ＤＮＡを鋳型とした反応液をアプライしたレーンである。
尚、レーン１、１５はＤＮＡラダーマーカー（ＢＣ−ＤＭＯ１２−Ｒ５００；バイオメディカルサイエンス社製）ある。
【００３９】
図３に示すように、大腸菌やメタン発酵汚泥から抽出された染色体ＤＮＡを鋳型とし、本発明の亜硝酸酸化細菌検出用プライマーを用いてＰＣＲを行った場合、ＰＣＲ産物が得られないことが確認された。
この結果、本発明の検出方法によれば、Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌を特異的に検出できることが確認された。
【００４０】
［実施例２］
フォワードプライマーとして配列番号１で表される塩基配列からなるプライマーと、リバースプライマーとして配列番号２で表される塩基配列からなるプライマーを用い、実施例１と同様の方法で、菌の検出を行った。図４左図に、電気泳動後のアガロースゲルのエチジウムブロマイド染色像を示す。
図４左図中、レーン２はＮｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｌｋａｌｉｃｕｓから抽出された染色体ＤＮＡを鋳型として用いた反応溶液；レーン３は大腸菌から抽出された染色体ＤＮＡを鋳型として用いた反応溶液；レーン４はメタン発酵汚泥から抽出された染色体ＤＮＡを鋳型として用いた反応溶液；レーン５はＮｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｌｋａｌｉｃｕｓから抽出された染色体ＤＮＡと大腸菌から抽出された染色体ＤＮＡの混合物を鋳型として用いた反応溶液；レーン６はＮｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｌｋａｌｉｃｕｓから抽出された染色体ＤＮＡとメタン発酵汚泥から抽出された染色体ＤＮＡの混合物を鋳型として用いた反応溶液；レーン７はＮｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｌｋａｌｉｃｕｓ菌体の懸濁液を１分間超音波破砕して得られた上清を鋳型として用いた反応溶液を、それぞれアプライしたレーンである。
尚、レーン１、１５はＤＮＡラダーマーカー（ＢＣ−ＤＭＯ１２−Ｒ５００；バイオメディカルサイエンス社製）ある。
【００４１】
図４左図に示すように、Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｌｋａｌｉｃｕｓから抽出された染色体ＤＮＡに、大腸菌やメタン発酵汚泥から抽出された染色体ＤＮＡを混入させたものを鋳型とし、本発明の亜硝酸酸化細菌検出用プライマーを用いてＰＣＲを行った場合でも、ＰＣＲ産物が得られることが確認された。
この結果、本発明の検出方法によれば、Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌を高精度に検出できることが確認された。
【００４２】
また、図４左図に示すように、Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｌｋａｌｉｃｕｓから染色体ＤＮＡを抽出しなくとも、その菌体の懸濁液を超音波処理した上清を鋳型として用いてＰＣＲ産物が得られることが確認された。通常、細菌からのＤＮＡ抽出に２時間程度の時間を要することころ、超音波処理によれば１分程度で鋳型を調製することができることが分かった。
【００４３】
更に、レーン７にアプライした反応溶液における遺伝子増幅の有無を、ＰＣＲ増幅判定ツール（ピペットチップ型ＰＣＲ増幅判定ツールＤ−ＱＵＩＣＫ；カネカ社製）を用いて確認した。結果を図４右図に示す。図４右図中、左側のピペットチップは、遺伝子増幅の確認されない反応溶液をピペッティングしたものを示し、右側のピペットチップは、レーン７にアプライした反応溶液をピペッティングしたものを示す。
図４右図に示すように、遺伝子増幅の確認されたレーン７にアプライした反応溶液をピペッティングしたピペットチップのみに反応溶液の着色が確認された。通常、電気泳動に１時間程度の時間を要することころ、ＰＣＲ増幅判定ツールによれば１０秒程度でＰＣＲ産物の有無を確認できることができることが分かった。
【００４４】
通常、検出に要する時間は、ＤＮＡ抽出に要する２時間と、遺伝子増幅に要する１．５時間と、電気泳動に要する１時間の、約４．５時間であるところ、上述した超音波処理とＰＣＲ増幅判定ツールを組み合わせることにより、約１．５時間に短縮できることが確認された。
【００４５】
［実施例３］
大腸菌、メタン発酵汚泥、又はＮｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｌｋａｌｉｃｕｓから抽出された染色体ＤＮＡを鋳型と、配列番号３で表される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号４で表される塩基配列からなるリバースプライマーと、を用いて、本発明の検出方法を行った。
９５℃で１０分間の変性工程後、１サイクルが９５℃で６０秒間、５５℃で６０秒間、７２℃で６０秒間を３０サイクル行い、その後７２℃で６０秒間の伸長工程を行い、４℃で保存する温度条件で、ＰＣＲを行った以外は、実施例１と同様の方法で、菌の検出を行った。図５に、電気泳動後のアガロースゲルのエチジウムブロマイド染色像を示す。
図５中、レーン２〜４は大腸菌１６ＳｒＤＮＡをターゲットとする大腸菌専用プライマーを用いた反応溶液；レーン５〜７はフォワードプライマーとして配列番号３で表される塩基配列からなるプライマーと、リバースプライマーとして配列番号４で表される塩基配列からなるプライマーを用いた反応溶液を、それぞれアプライしたレーンである。
また、レーン２及び５は、大腸菌から抽出した染色体ＤＮＡを鋳型として用いた反応溶液；レーン３及び６は、メタン発酵汚泥から抽出した染色体ＤＮＡを鋳型として用いた反応溶液；レーン４及び７は、Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｌｋａｌｉｃｕｓから抽出した染色体ＤＮＡを鋳型として用いた反応溶液を、それぞれアプライしたレーンである。
尚、レーン１はＤＮＡラダーマーカー（ＢＣ−ＤＭＯ１２−Ｒ５００；バイオメディカルサイエンス社製）をアプライしたレーンである。
【００４６】
図５に示すように、Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌に共通する配列由来のプライマーと、鋳型としてＮｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｌｋａｌｉｃｕｓから抽出した染色体ＤＮＡを用いた反応溶液をアプライしたレーン７において、２３９塩基対長付近に１本のバンドが検出され、所定の塩基対長のＰＣＲ産物が得られたことが確認された。
また、大腸菌専用プライマーと、鋳型として大腸菌から抽出した染色体ＤＮＡを用いた反応溶液をアプライしたレーン２において、１５００塩基対長付近に１本のバンドが検出され、ポジティブコントロールとして、所定の塩基対長のＰＣＲ産物が得られたことが確認された。
一方で、プライマーと対応する鋳型ＤＮＡを用いていないレーン３〜６では全くバンドは検出されなかったことから、これらのレーンではＰＣＲ産物が得られないことが確認された。
この結果、本発明の検出方法によれば、Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌を特異的に検出できることが確認された。
【００４７】
これらの結果から、亜硝酸酸化細菌検出用プライマーを用いた本発明の検出方法により、亜硝酸酸化細菌を迅速かつ特異的に検出できることが確認された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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