(57)【要約】【課題】ＡＳとＦＬの各ＭＮ／ＣＡ９発現を識別することを目的として、前新生物疾患／新生物疾患の診断／予後診断方法、ならびにこれらの方法に有用なプローブ、プライマー、および抗体を提供する。【解決手段】  ヒト患者における選択的にスプライスされた切断［ＡＳ］ＭＮ／ＣＡ９ ｍＲＮＡの発現と完全長［ＦＬ］ＭＮ／ＣＡ９ ｍＲＮＡの発現とを識別するために使用されるプローブまたはプライマーであって、ＦＬ  ＭＮ／ＣＡ９ ｍＲＮＡを検出しないでＡＳ  ＭＮ／ＣＡ９ ｍＲＮＡを検出するのに使用され、ＭＮ／ＣＡ９遺伝子のエクソン７および１０のスプライスジャンクションに結合する核酸を含むことを特徴とするプローブまたはプライマー。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト患者における選択的にスプライスされた切断［ＡＳ］ＭＮ／ＣＡ９ ｍＲＮＡの発現と完全長［ＦＬ］ＭＮ／ＣＡ９ ｍＲＮＡの発現とを識別するために使用される少なくとも２１塩基長を有するプローブまたはプライマーであって、ＦＬ  ＭＮ／ＣＡ９ ｍＲＮＡを検出しないでＡＳ  ＭＮ／ＣＡ９ ｍＲＮＡを検出するのに使用され、ＭＮ／ＣＡ９遺伝子のエクソン７および１０のスプライスジャンクションに結合する核酸を含むことを特徴とするプローブまたはプライマー。
【請求項２】
請求項１記載のプローブまたはプライマーのヌクレオチド配列を含むベクター。
【請求項３】
請求項２記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項４】
ヒト患者における選択的にスプライスされた切断［ＡＳ］ＭＮ／ＣＡ９ ｍＲＮＡの発現と完全長［ＦＬ］ＭＮ／ＣＡ９ ｍＲＮＡの発現とを識別するために使用される少なくとも２１塩基長を有するプローブまたはプライマーであって、ＡＳ  ＭＮ／ＣＡ９ ｍＲＮＡは検出しないでＦＬ  ＭＮ／ＣＡ９ ｍＲＮＡを検出するのに使用され、ヒトＭＮ／ＣＡ９遺伝子のエクソン８またはエクソン９に結合するか、またはヒトＭＮ／ＣＡ９遺伝子のエクソン７および８のスプライスジャンクション、エクソン８および９のスプライスジャンクション、またはエクソン９および１０のスプライスジャンクションに結合する核酸を含むことを特徴とするプローブまたはプライマー。
【請求項５】
請求項１記載のプローブを１以上含むマイクロアレイチップ。
【請求項６】
ヒト患者における選択的にスプライスされた切断［ＡＳ］ＭＮ／ＣＡ９ ｍＲＮＡの発現と完全長［ＦＬ］ＭＮ／ＣＡ９ ｍＲＮＡの発現とを識別するために使用される一対の少なくとも２１塩基長を有するプローブおよび／またはプライマーであって、ＦＬ  ＭＮ／ＣＡ９ ｍＲＮＡを検出しないでＡＳ  ＭＮ／ＣＡ９ ｍＲＮＡを検出するのに使用され、ＭＮ／ＣＡ９遺伝子のエクソン７および１０のスプライスジャンクションに結合する核酸を含むことを特徴とする一対のプローブおよび／またはプライマー。
【請求項７】
ヒトにおける選択的にスプライスされた切断［ＡＳ］ＭＮ／ＣＡ ＩＸをコードする単離核酸であって、該ＡＳ  ＭＮ／ＣＡ ＩＸが、４３〜４８ｋＤａの分子量を有し、
（ａ）ＭＮ／ＣＡ９遺伝子においてエクソン８および９に相当するヌクレオチドが欠失された核酸、および
（ｂ）配列番号１０８の配列を有する核酸、または配列番号１０８と少なくとも９０％同一である核酸、
から選択され、前記ＡＳ  ＭＮ／ＣＡ ＩＸが、２％以下のｐＯ２の低酸素状態下におけるＦＬ  ＭＮ／ＣＡ ＩＸ発現細胞による細胞外酸性化を阻害し得ることを特徴とする単離核酸。
【請求項８】
配列番号１０８の配列を有することを特徴とする、請求項７記載の単離核酸。
【請求項９】
請求項７記載の単離核酸を発現するベクター。
【請求項１０】
請求項９記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１１】
配列番号１０８の配列または請求項７記載の単離核酸によりコードされ、ＡＴＣＣ番号ＨＢ１１１２８としてアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託されたハイブリドーマＶＵ−Ｍ７５から分泌されるＭ７５モノクローナル抗体により特異的に結合されるが、登録番号ＬＭＢＰ６００９ＣＢとしてベルギー国ヘント所在の「ＢＣＣＭ」／ＬＭＢＰに寄託されたハイブリドーマＶＵ−Ｖ／１０により産生されるＶ／１０モノクローナル抗体によっては結合されないことを特徴とする、ＡＳ型のＭＮ／ＣＡ ＩＸ。
【請求項１２】
配列番号１０８の配列によりコードされることを特徴とする、請求項１１記載のＡＳ型のＭＮ／ＣＡ ＩＸ。
【請求項１３】
請求項７記載の単離核酸によりコードされるＡＳ  ＭＮ／ＣＡ ＩＸに特異的に結合するがＦＬ  ＭＮ／ＣＡ ＩＸには特異的に結合しない抗体または抗原結合性抗体断片、あるいは請求項７記載の単離核酸によりコードされるＡＳ  ＭＮ／ＣＡ ＩＸに特異的に結合するが可溶性のＭＮ／ＣＡ ＩＸ（ｓ−ＣＡ ＩＸ）には特異的に結合しない抗体または抗原結合性抗体断片。
【請求項１４】
配列番号１０８の配列によりコードされるＡＳ  ＭＮ／ＣＡ ＩＸに特異的に結合するがＦＬ  ＭＮ／ＣＡ ＩＸには特異的に結合しない抗体または抗原結合性抗体断片。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝医学の一般領域におけるものであり、生化学的工学、免疫化学および腫瘍学の分野におけるものである。さらに詳細には、本発明は、ＭＮ遺伝子すなわち、ＭＮ／ＣＡ９、ＣＡ９、または炭酸脱水酵素９としても知られる発癌遺伝子と考えられている細胞遺伝子に関するものであり、その遺伝子は、現在、ＭＮタンパク質、ＭＮ／ＣＡ ＩＸイソ酵素、ＭＮ／ＣＡ ＩＸ、炭酸脱水酵素ＩＸ、ＣＡ ＩＸまたはＭＮ／Ｇ２５０タンパク質としても知られている腫瘍性タンパク質をコードしている。
【０００２】
さらに詳細には、本発明は、選択的にスプライスされた［ＡＳ］型のＭＮ／ＣＡ９ ｍＲＮＡ、およびそれを検出するためのプローブ／プライマーに関する。ＡＳのＭＮ／ＣＡ９ ｍＲＮＡは、主として正常細胞および酸素正常状態下で発現し、完全長［ＦＬ］のＭＮ／ＣＡ９ ｍＲＮＡの発現を測定するアッセイ、特にＲＴ−ＰＣＲアッセイを阻害する可能性がある。本発明はまた、ＡＳ型のＭＮ／ＣＡ ＩＸ、および、それを単独で、またはＦＬ型のＭＮ／ＣＡ９ ｍＲＮＡと組み合わせて、検出、あるいは検出および定量化するためのアッセイを用いる診断／予後診断法に関する。さらに本発明は、ＦＬのＭＮ／ＣＡ ＩＸタンパク質を標的とする手段として、ＭＮ／ＣＡ９の選択的スプライシングを活用する治療方法に関する。本発明の焦点であるＡＳ型のＭＮ／ＣＡ９／ＣＡ ＩＸの種類は、脊椎動物であって差し支えなく、哺乳動物であることが好ましく、ヒトであることがさらに好ましい。
【背景技術】
【０００３】
上述の通り、ＭＮ遺伝子およびタンパク質は、多くの別名が知られており、それらの名称は、本明細書において同義的に使用される。ＭＮタンパク質は、亜鉛に結合することが判明しており、炭酸脱水酵素（ＣＡ）活性を有し、現在、９番目の炭酸脱水酵素イソ酵素−ＭＮ／ＣＡ ＩＸまたはＣＡ ＩＸであると考えられている［非特許文献１］。炭酸脱水酵素の命名法に従って、ヒトＣＡイソ酵素は、大文字のローマ字と数字で記され、一方、それらの遺伝子は、イタリック文字とアラビア数字で記される。あるいは、本明細書では、「ＭＮ」は、文脈に示されるように、炭酸脱水酵素イソ酵素ＩＸ（ＣＡ ＩＸ）タンパク質／ポリペプチド、または炭酸脱水酵素イソ酵素９（ＣＡ９）の遺伝子、核酸、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡなどを称するのに使用される。
【０００４】
ＭＮタンパク質はまた、Ｇ２５０抗原であることが確認されている。非特許文献２には、「配列分析およびデータベース検索により、Ｇ２５０抗原は、ＭＮ、すなわち、子宮頚部癌に確認されたヒト腫瘍関連抗原と同一であることが明らかとなった（パストレク（Ｐａｓｔｏｒｅｋ）ら、１９９４年）」ことが記載されている。
【０００５】
ＣＡ ＩＸは、非特許文献３により最初に記載されたＭ７５モノクローナル抗体を用いてザバダ，Ｊ（Ｚａｖａｄａ，Ｊ．）、パストレコバ，Ｓ．（Ｐａｓｔｏｒｅｋｏｖａ，Ｓ．）およびパストレク，Ｊ．（Ｐａｓｔｏｒｅｋ，Ｊ．）［「ザバダ（Ｚａｖａｄａ）ら」、例えば、特許文献１を参照］により同定された癌関連炭酸脱水酵素である。その抗体は、ＣＡ ＩＸをコードするｃＤＮＡのクローニング［非特許文献４］、腫瘍および正常組織におけるＣＡ ＩＸ発現の評価［非特許文献５、および他の多くの引用文献］、細胞密度によるＣＡ ＩＸ調節試験［非特許文献６、非特許文献７］、ならびに低酸素症によるＣＡ ＩＸ誘導の実証［非特許文献８、および他の多くの引用文献］に使用された。このような試験の全ては、ＭＮ／ＣＡ ＩＸ／ＣＡ９が、前新生物／新生物腫瘍マーカーとして診断および／または予後診断に、および標的として治療に使用できるというザバダ（Ｚａｖａｄａ）らの独創的な着想および研究［例えば、ザバダ（Ｚａｖａｄａ）ら、特許文献１］を裏付けるものであり、Ｍ７５モノクローナル抗体は、種々の免疫検出法および免疫標的アプローチに有用な、価値のあるＣＡ ＩＸ特異的試薬であることを示している。
【０００６】
ザバダ（Ｚａｖａｄａ）らの特許文献２（１９９３年９月１６日公開）および特許文献１（１９９５年２月７日発行）は、ＭＮ遺伝子およびＭＮタンパク質の発見および生物学的性質ならびに分子的性質について記載している。ＭＮ遺伝子は、全ての被験脊椎動物の染色体ＤＮＡに存在し、その発現は、腫瘍形成能と強く関連することが判明した。
【０００７】
ＭＮタンパク質は、ヒト子宮頚部癌に由来するＨｅＬａ細胞において最初に確認された。ＭＮタンパク質は、多くのタイプのヒト癌（中でもとりわけ子宮頚部、卵巣、子宮内膜、腎臓、膀胱、乳房、大腸、肺、食道、および前立腺）において見られる。ＭＮタンパク質を有意に発現する正常組織は極めて少ないことが判明している。これらのＭＮ発現正常組織としては、ヒト胃粘膜および胆嚢上皮、ならびに消化管の他の幾つかの正常組織が挙げられる。逆説的に言えば、通常ＭＮを発現する幾つかの組織、例えば胃粘膜における癌および他の前新生物疾患／新生物疾患においては、ＭＮ遺伝子発現が消滅するか、または減少することが判明している。
【０００８】
一般に、発癌は、ＭＮタンパク質の異常発現が前兆となり得る。例えば、発癌は：（１）通常ＭＮタンパク質を有意に発現しない組織において、ＭＮタンパク質が存在する場合；（２）通常ＭＮタンパク質を発現する組織にＭＮタンパク質が存在しない場合；（３）組織において通常に発現されるレベルからＭＮ遺伝子発現が、有意に増加レベルまたは有意に減少レベルにある場合；または（４）ＭＮタンパク質が、細胞内の異常位置に発現する場合、が前兆となり得る。
【０００９】
ザバダ（Ｚａｖａｄａ）らの特許文献２および特許文献３（１９９５年１２月２１日公開）には、ＭＮ遺伝子およびＭＮタンパク質の発見、ならびにＭＮ遺伝子発現と腫瘍形成能との強い関連付けが、いかにして癌および前癌病態の診断／予後診断法および治療方法を生み出したかについて開示している。その明細書には、脊椎動物における異常ＭＮ遺伝子発現を検出、または検出および定量化することによって、新生物疾患の発症および存在を確認するための方法および組成物が提供されている。例えば、ＭＮ抗原を検出、または検出および定量化するためにＭＮ特異的抗体を用いる免疫アッセイ、ハイブリダイゼーションアッセイ、あるいは、ＭＮ ｍＲＮＡなどのＭＮ核酸を検出、または検出および定量化するために、ＭＮ ｃＤＮＡなどのＭＮ核酸を用いてＲＴ−ＰＣＲなどのＰＣＲアッセイなど、脊椎動物のサンプルの種々の従来のアッセイにより、異常ＭＮ遺伝子発現を検出、または検出および定量化することができる。
【００１０】
ＭＮ／ＣＡ ＩＸは、ウェスタンブロッティングによる推定で５８および５４ｋＤａの見かけの分子量を有する原形質膜および核タンパク質として、ＨｅＬａ細胞において最初に確認された。ＭＮ／ＣＡ ＩＸは、３ｋＤａの単一炭水化物鎖によりＮ−グリコシル化され、非還元条件下でＳ−Ｓ結合オリゴマーを形成する［非特許文献３；非特許文献４］。ＭＮ／ＣＡ ＩＸは、細胞表面に位置する膜間タンパク質であるが、一部の事例では、ＭＮ／ＣＡ ＩＸは、核内に検出されている［非特許文献５；非特許文献３］。
【００１１】
ＭＮは、双子タンパク質（twin protein）であるｐ５４／５８ＮによりＨｅＬａ細胞中に見られる。ｐ５４／５８Ｎ（ＭＡｂ Ｍ７５）と反応するモノクローナル抗体を用いた免疫ブロット法により、５４ｋｄと５８ｋｄに２本のバンドが現われた。これらの２本のバンドは、恐らくは翻訳後プロセシングにより異なるであろうタンパク質の１種に相当すると考えられる。
【００１２】
ザバダ（Ｚａｖａｄａ）らの特許文献２および特許文献３には、本明細書の図８Ａ〜８Ｃに示されているＭＮ ｃＤＮＡ配列（配列番号１）、図８Ａ〜８Ｃにも示されているＭＮアミノ酸配列（配列番号２）、および本明細書の図９Ａ〜９Ｆに示されているＭＮゲノム配列（配列番号３）が開示されている。ＭＮ遺伝子は、１１のエクソンおよび１０のイントロンで構成される。配列番号１のヒトＭＮ ｃＤＮＡ配列は、１５２２の塩基対（ｂｐ）を含む。配列番号７０のＭＮ ｃＤＮＡ配列は、１５５２のｂｐを含む（ＥＭＢＬ登録番号Ｘ６６８３９；パストレク（Ｐａｓｔｏｒｅｋ）ら（１９９４年））。
【００１３】
図８Ａ〜８Ｃに示されているＭＮタンパク質の最初の３７のアミノ酸（配列番号２）は、推定上のＭＮシグナルペプチド［配列番号４］を構成する。ＭＮタンパク質は、細胞外（ＥＣ）ドメイン［図８Ａ〜８Ｃのアミノ酸（ａａ）の３８〜４１４（配列番号５）］、膜貫通（ＴＭ）ドメイン［ａａの４１５〜４３４（配列番号６）］、および細胞内（ＩＣ）ドメイン［ａａ４３５〜４５９（配列番号７）］を有する。細胞外ドメインは、アミノ酸（ａａ）の約５３〜１１１（配列番号８）または好ましくはａａの約５２〜１２５（配列番号８１）にプロテオグリカン様（ＰＧ）ドメイン、およびａａの約１３５〜３９１（配列番号９）または好ましくはａａの約１２１〜３９７（配列番号８２）に炭酸脱水酵素（ＣＡ）ドメインを含む。
【００１４】
ザバダ（Ｚａｖａｄａ）らの特許文献２および特許文献３には、ＭＮ特異的抗体の製造について記載されている。代表的で好ましいＭＮ特異的な抗体であるモノクローナル抗体Ｍ７５（ＭＡｂ Ｍ７５）、そのハイブリドーマ（ＶＵ−Ｍ７５）は、ＡＴＣＣ指定番号ＨＢ１１１２８として、米国バージニア州マナサス所在のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託された。Ｍ７５抗体は、ＭＮタンパク質を発見し、同定するために用いられ、例えば、新鮮、凍結、またはホルマリン−、アルコール−、アセトン−あるいは他の様式で固定、および／または、パラフィン埋め込みおよび脱パラフィン化された組織サンプルにおいて、ラジオイムノアッセイおよび免疫組織化学的にウェスタンブロットでＭＮ抗原を容易に同定するためにＭ７５抗体を使用することができる。別の代表的で好ましいＭＮ特異的抗体であるＭａｂ ＭＮ１２は、指定ＨＢ１１６４７としてＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマＭＮ１２．２．２により分泌される。ザバダ（Ｚａｖａｄａ）らの特許文献３の実施例１では、ＭＡｂ Ｍ７５を用いて組織の免疫組織化学的染色からＭＮ遺伝子の発癌性を立証する代表的な結果を提供している。
【００１５】
免疫優性エピトープは事実上、Ｍ７５ ｍａｂ、特にＮ末端ＰＧ領域において４回等しく反復されるアミノ酸配列ＰＧＥＥＤＬＰ（配列番号１１）に関する反復性エピトープなど、ＭＮ／ＣＡ ＩＸのＰＧドメイン内にあるものと考えられている［非特許文献９］。
【００１６】
Ｍ７５ ｍａｂは、非特許文献２で最初に報告され、例えば、ザバダ（Ｚａｖａｄａ）らの特許文献４および特許文献５など多くの米国特許および外国特許において、全てのＭＮ／ＣＡ ＩＸ特異的抗体、ポリクローナルおよびモノクローナルならびにそれらの断片を用いて、具体的ならびに包括的に主張されている。［ザバダらの特許文献１；特許文献６〜２０も参照のこと］。これらザバダらの米国特許および外国特許は、参照することにより本明細書に援用される。
【００１７】
ＣＡ ＩＸは、二酸化炭素と重炭酸イオンとの間での可逆的変換を触媒する亜鉛金属酵素のうちのα炭酸脱水酵素群の高活性な種である［非特許文献４；非特許文献１；非特許文献１０〜１２］。ＣＡ ＩＸは、哺乳動物に存在する１４のイソ体のうちの１つであり、細胞質（ＣＡ Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＶＩＩ）、ミトコンドリア（ＣＡ ＶＡ、ＶＢ）、分泌胞（ＣＡ ＶＩ）および細胞膜（ＣＡ ＩＶ、ＩＸ、ＸＩＩ、ＸＩＶ）など、種々の細胞成分の位置を占めている。イソ酵素の幾つかは、広範囲の組織にわたって分布しており（ＣＡ Ｉ、ＩＩ、ＣＡ ＩＶ）、他のイソ酵素は、特定の器官に限定されており（唾液腺のＣＡ ＶＩ）、２つのイソ体は、癌組織に関連している（ＣＡ ＩＸ、ＸＩＩ）［非特許文献１０；非特許文献１３］。酵素活性および動態学的性質、ならびにスルホンアミド阻害剤に対する感受性は、高感受性（ＣＡ ＩＩ、ＣＡ ＩＸ、ＣＡ  ＸＩＩ、ＣＡ ＩＶ）から低感受性（ＣＡ ＩＩＩ）まで異なっている［非特許文献１４］。ＣＡ関連タンパク質と称される幾つかのイソ体（ＣＡ−ＲＰ ＶＩＩＩ、Ｘ、ＸＩ）は、活性部位の保存が不完全なため触媒活性はない。同じ群のタンパク質の遺伝的に関連する種内で非常に変動があることが、多様な生理学的かつ病理学的過程におけるそれらの使用根拠をなしている。この触媒活性は、代謝活性組織における酸−塩基バランスの維持およびイオン類と水との交換に関して基本的に関連性がある。この活性を介して、ＣＡ類は、事実上、呼吸、体液の産生（硝子体液、胃液、脳脊髄液）、骨吸収、腎酸性化などに寄与する（非特許文献１０）。
【００１８】
ＣＡ ＩＸイソ酵素は、基礎研究ならびに臨床研究の重要な対象となる幾つかの性質を含んでいる。第一に、ＣＡ ＩＸの発現は、多種多様のヒト腫瘍と極めて密に関連するが、一方、その発現は一般に、対応する正常組織には存在しない［非特許文献５；非特許文献１５〜２１］。これは、−１０／−３位における転写開始部位に近位の最小ＣＡ９プロモーターに局在化した低酸素状態応答因子（ＨＲＥ）に結合する低酸素状態誘導因子（ＨＩＦ）を介してＣＡ９遺伝子の転写を強力に活性化する腫瘍低酸素状態に主に関連している［非特許文献８］。ＨＩＦ転写因子は、腫瘍細胞の生存および低酸素ストレスへの適応または腫瘍細胞死に導く遺伝子の活性化により、弱く酸素化された腫瘍細胞の発現プロフィールを有意に変化させる。その結果、低酸素状態は、浸潤および転移する能力が増大したより攻撃的な腫瘍細胞を選択し、したがって、予後不良および抗癌治療に対する応答不良に本質的に関連する［非特許文献２２］。
【００１９】
腫瘍低酸素状態は、癌発生および癌治療に関して大いに関連を有する重要な現象であるので［非特許文献２３］、ＭＮは、診断／予測値を有する固有の低酸素マーカーとして、ならびに有望な治療標的として重要な可能性を有している［非特許文献８；非特許文献２４〜２８］。提案された臨床適用の有利な点として、ＣＡ ＩＸは、癌細胞の表面に露出した大きな細胞外部分を有する不可欠な細胞膜タンパク質であり、したがって特異的モノクローナル抗体などの標的手段によりアクセス可能である。さらに、ＣＡ ＩＸは、細胞外ＣＡドメインのＮ末端伸長を形成する独特なプロテオグリカン関連領域（ＰＧ）の存在により他のＣＡイソ酵素とは異なり、他のイソ酵素との交差認識の排除が可能になる［非特許文献１］。ＣＡ ＩＸは、細胞接着の調整およびｐＨの調節の双方を介して腫瘍生物学において積極的な役割を果たしていると思われる（非特許文献２９〜３１）。ＣＡ ＩＸは、重炭酸イオン輸送メタボロン（metabolon）に関与しており、低酸素状態に応答して細胞外微小環境の酸性化に寄与している（非特許文献３２、非特許文献３０）。さらに、ＣＡ ＩＸの細胞内ドメイン（ＩＣ）は、少なくとも腎細胞癌において腫瘍形成的な第三の役割を果たしている可能性がある：チロシンリン酸化ＣＡ ＩＸ（ＥＧＦＲを介して媒介）は、ＰＩ−３Ｋの調節サブユニット（ｐ８５）と相互作用し、Ａｋｔの活性化をもたらす［非特許文献３３］。発癌に寄与するその多くの潜在的活性のため、その機能の抑止のためにＣＡ ＩＸタンパク質を標的にすることは、治療効果を有することが期待されている。しかしながら、ＣＡ ＩＸの基礎的な分子的および機能的態様の多くは知られていない；そのうちの１つは、ＣＡ ＩＸの選択的スプライシングの可能性であった。
【００２０】
選択的スプライシングは、タンパク質の構造的および機能的多様化に寄与する重要な分子機構である。選択的スプライシングは、エクソン封入(exon inclusion)の差異から生じることが多く、ドメイン組成、細胞内局在性、相互作用の可能性、およびシグナル伝達能力における変化、ならびにタンパク質レベルにおける他の変化をもたらす。最近のゲノムテクノロジーにより得られたデータでは、ヒト遺伝子の６０％以上が選択的にスプライスされることが示されている。また、選択的スプライシングの変異体発現の不均衡は、細胞表現型に著しく影響を及ぼし、種々の病状に役割を果たし得る証拠が増加しつつある（非特許文献３４）。
【００２１】
本発明は、ＣＡ９遺伝子発現が選択的スプライシングを含むことの発見に基づくものである。本明細書では、ＭＮ ｍＲＮＡの選択的にスプライスされた（ＡＳ）マウスおよびヒト変異体について記載する。ヒトＡＳ変異体は、腫瘍において、完全長（ＦＬ）のＣＡ９ ｍＲＮＡよりも量が少ないが、正常組織および酸素正常状態下で検出することができることを、本発明者は実証している。ヒトＡＳ ＣＡ９ ｍＲＮＡは、エクソン８および９を含まず、切断されたＣＡ ＩＸタンパク質をコードしている。その結果、ＡＳ ＣＡ ＩＸは、細胞膜にとどめられず、触媒活性の減少を示す。ＨｅＬａ細胞における過剰発現の際、ＡＳ ＣＡ ＩＸは、低酸素状態に誘導された細胞外酸性化を減少させ、ＨｅＬａスフェロイドの増殖を損なう。ＡＳ変異体は、正常表現型を有する酸素正常状態の細胞内に存在し得ることから、ＡＳ変異体は、ＣＡ９遺伝子の低酸素関連発現および腫瘍関連発現を評価するために設計された診断および／または予後診断試験において偽陽性結果を生じさせる可能性がある。さらに、ＡＳ型のＣＡ ＩＸタンパク質は、特に、ＦＬレベルが比較的低い場合の中等度の低酸素状態でＦＬ型のＣＡ ＩＸを機能的に阻害し得る。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２２】
【特許文献１】米国特許第５，３８７，６７６号明細書
【特許文献２】国際公開第９３／１８１５２号パンフレット
【特許文献３】国際公開第９５／３４６５０号パンフレット
【特許文献４】米国特許第５，９８１，７１１号明細書
【特許文献５】欧州特許出願公開第０  ６３７  ３３６Ｂ１号明細書
【特許文献６】米国特許第５，９５５，０７５号明細書
【特許文献７】米国特許第５，９７２，３５３号明細書
【特許文献８】米国特許第５，９８９，８３８号明細書
【特許文献９】米国特許第６，００４，５３５号明細書
【特許文献１０】米国特許第６，０５１，２２６号明細書
【特許文献１１】米国特許第６，０６９，２４２号明細書
【特許文献１２】米国特許第６，０９３，５４８号明細書
【特許文献１３】米国特許第６，２０４，３７０号明細書
【特許文献１４】米国特許第６，２０４，８８７号明細書
【特許文献１５】米国特許第６，２９７，０４１号明細書
【特許文献１６】米国特許第６，２９７，０５１号明細書
【特許文献１７】オーストラリア国特許第６６９６９４号明細書
【特許文献１８】カナダ国特許第２，１３１，８２６号明細書
【特許文献１９】独国特許第６９３２５５７７．３号明細書
【特許文献２０】韓国特許第２８２２８４号明細書
【非特許文献】
【００２３】
【非特許文献１】オパブスキー（Ｏｐａｖｓｋｙ）ら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ３３（３）：４８０−４８７頁（１９９６年）
【非特許文献２】ウエムラ（Ｕｅｍｕｒａ）ら「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｕｍｏｒ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ａｎｔｉｇｅｎ  ＭＮ／Ｇ２５０  ｉｎ  Ｕｒｏｌｏｇｉｃ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ：Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｔａｒｇｅｔ」、Ｊ．Ｕｒｏｌ．、１５４（補遺４）：３７７頁（Ａｂｓｔｒａｃｔ  １４７５；１９９７年）
【非特許文献３】パストレコバ（Ｐａｓｔｏｒｅｋｏｖａ）ら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１８７：６２０−６２６頁（１９９２年）
【非特許文献４】パストレク（Ｐａｓｔｒｅｋ）ら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ９：２７８８−２８８８頁（１９９４年）
【非特許文献５】ザバダ（Ｚａｖａｄａ）ら、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ、５４：２６８−２７４頁（１９９３年）
【非特許文献６】リースコブスカ（Ｌｉｅｓｋｏｖｓｋａ）ら、Ｎｅｏｐｌａｓｍａ、４６：１７−２４頁（１９９９年）
【非特許文献７】カルツ（Ｋａｌｕｚ）ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、６２：４４６９−４４７７頁（２００２年）
【非特許文献８】ウィコッフ（Ｗｙｋｏｆｆ）ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、６０：７０７５−７０８３頁（２０００年）
【非特許文献９】ザバダ（Ｚａｖａｄａ）ら、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ８２（１１）：１８０８−１８１３頁（２０００年）
【非特許文献１０】チェグウィッデン（Ｃｈｅｇｗｉｄｄｅｎ）ら、ＥＸＳ９０：３４３−３６３頁（２０００年）
【非特許文献１１】ウィンゴ（Ｗｉｎｇｏ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ２８８：６６６−６６９頁（２００１年）
【非特許文献１２】パストレコバ（Ｐａｓｔｏｒｅｋｏｖａ）ら、Ｊ  Ｅｎｚ  Ｉｎｈｉｂ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ１９：１９９−２２９頁（２００４年）
【非特許文献１３】パストレコバ（Ｐａｓｔｏｒｅｋｏｖａ）およびパストレク（Ｐａｓｔｏｒｅｋ）、第９章、Ｃａｒｂｏｎｉｃ  Ａｎｈｙｄｒａｓｅ：Ｉｔｓ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ（スプラン（Ｓｕｐｕｒａｎ）ら編；ＣＲＣプレス（ロンドンなど）２００４年）
【非特許文献１４】スプラン（Ｓｕｐｕｒａｎ）およびスコッザファバ（Ｓｃｏｚｚａｆａｖａ）、Ｊ．Ｅｎｚｙｍ  Ｉｎｈｉｂ．１５（６）：５９７−６１０頁（２０００年）
【非特許文献１５】リアオ（Ｌｉａｏ）ら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１４５（３）：５９８−６０９頁（１９９４年）
【非特許文献１６】ターナー（Ｔｕｒｎｅｒ）ら、Ｈｕｍａｎ  Ｐａｔｈｏｌ．２８（６）：７４０−７４４頁（１９９７年）
【非特許文献１７】リアオ（Ｌｉａｏ）ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７：２８２７−２８３１頁（１９９７年）
【非特許文献１８】サーニオ（Ｓａａｒｎｉｏ）ら、Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  １５３：２７９−２８５頁（１９９８年）
【非特許文献１９】ベルミレン（Ｖｅｒｍｙｌｅｎ）ら、Ｅｕｒ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｊ．１４：８０６−８１１頁（１９９９年）
【非特許文献２０】イワノフ（Ｉｖａｎｏｖ）ら、Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５８（３）：９０５−９１９頁（２００１年）
【非特許文献２１】バートソバ（Ｂａｒｔｏｓｏｖａ）ら、Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１９７：３１４−３２１頁（２００２年）
【非特許文献２２】ハリス  ＡＬ．（Ｈａｒｒｉｓ  ＡＬ．）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ２：３８−４７頁（２００２年）
【非特許文献２３】ホッケル（Ｈｏｃｋｅｌ）およびバウペル（Ｖａｕｐｅｌ）、Ｓｅｍｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２８（２  補遺ｌ８）：３６−４１頁（２００１年）
【非特許文献２４】ウィコッフ（Ｗｙｋｏｆｆ）ら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５８（３）：１０１１−１０１９頁（２００１年）
【非特許文献２５】ビースレイ（Ｂｅａｓｌｅｙ）ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６１（１３）：５２６２−５２６７頁（２００１年）
【非特許文献２６】ギアトロマノラキ（Ｇｉａｔｒｏｍａｎｏｌａｋｉ）ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６１（２１）：７９９２−７９９８頁（２００１年）
【非特許文献２７】コーコーラキス（Ｋｏｕｋｏｕｒａｋｉｓ）ら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．７（１１）：３３９９−３４０３頁（２００１年）
【非特許文献２８】ポッター（Ｐｏｔｔｅｒ）およびハリス（Ｈａｒｒｉｓ）、Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ８９：２−７頁（２００３年）
【非特許文献２９】スバストバ（Ｓｖａｓｔｏｖａ）ら、Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  ＲＥｓ２９０：３３２−３４５頁（２００３年）
【非特許文献３０】スバストバ（Ｓｖａｓｔｏｖａ）ら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ５７７：４３９−４４５頁（２００４年）
【非特許文献３１】スウィータッチ（Ｓｗｉｅｔａｃｈ）ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  Ｒｅｖ、ＤＯＩ  １０，１００７／ｓ１０５５５−００７−９０６４−０（２００７年）
【非特許文献３２】モーガン（Ｍｏｒｇａｎ）ら、Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ−Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ２９３（２）：Ｃ７３８−Ｃ７４８頁（２００７年）
【非特許文献３３】ドライ（Ｄｏｒａｉ）ら、Ｅｕｒ．Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ４１：２９３５−２９４７頁（２００５年）
【非特許文献３４】マトリン（Ｍａｔｌｉｎ）ら、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ６：３８６−３９８頁（２００５年）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２４】
本発明は、低酸素状態で誘導された膜結合腫瘍関連ＭＮタンパク質をコードする完全長（ＦＬ）ＣＡ９ ｍＲＮＡ転写体に加えて、細胞膜にとどめられないＡＳのＭＮタンパク質（ＡＳのＭＮ／ＣＡ ＩＸまたはＡＳ ＣＡ ＩＸ）をコードする、構成的に産生された、選択的にスプライスされた（ＡＳ）ＣＡ９ ｍＲＮＡ転写体もまた存在するという発見に基づいている。本発明の治療的態様の基礎となるさらなる発見は、ＡＳ型のＣＡ ＩＸがＦＬ型のＣＡ ＩＸの機能を阻害することである。ＣＡ ＩＸのＡＳ変異体の低酸素状態および腫瘍に無関係な産生は、ＣＡ ＩＸの診断、予後診断および治療態様に多くの密接な関係を有する。
【課題を解決するための手段】
【００２５】
本発明の一態様は、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトにおける、異常なＭＮ／ＣＡ ＩＸ発現に関連する前新生物疾患／新生物疾患に対する診断法および／または予後診断法に関するものであり、これらの方法は、完全長［ＦＬ］および選択的にスプライスされた［ＡＳ］ＭＮ／ＣＡ９ ｍＲＮＡ発現、あるいは、ＡＳ型およびＦＬ型のＭＮ／ＣＡ ＩＸ発現を識別する工程を有してなる。
【００２６】
前記方法は、ＦＬのＭＮ／ＣＡ９ ｍＲＮＡの発現および／またはＡＳのＭＮ／ＣＡ９ ｍＲＮＡの発現を検出、または検出および定量化するために１種類以上のプローブおよび／またはプライマーの使用を含んで差し支えなく；好ましくは、前記方法は：（ａ）選択的にスプライスされた［ＡＳ］ＭＮ／ＣＡ９ ｍＲＮＡは検出せず、完全長［ＦＬ］ＭＮ／ＣＡ９ ｍＲＮＡを検出するためのプローブおよび／またはプライマー；（ｂ）ＦＬのＭＮ／ＣＡ９ ｍＲＮＡは検出せず、ＡＳのＭＮ／ＣＡ９ ｍＲＮＡを検出するためのプローブおよび／またはプライマー；および／または（ｃ）ＦＬのＭＮ／ＣＡ９ ｍＲＮＡとＡＳのＭＮ／ＣＡ９ ｍＲＮＡの双方を検出するためのプローブおよび／またはプライマーの使用を含んでなる。本発明の一態様において、診断法および／または予後診断法は、例えば、ＦＬのＭＮ／ＣＡ９ ｍＲＮＡには存在しないが、ＡＳのＭＮ／ＣＡ９ ｍＲＮＡには存在するスプライスジャンクション、またはＡＳのＭＮ／ＣＡ９ ｍＲＮＡに存在しないがＦＬのＭＮ／ＣＡ９ ｍＲＮＡに存在する核酸配列を、プローブの標的にすることにより、選択的にスプライスされたＭＮ／ＣＡ９核酸と完全長ＭＮ／ＣＡ９核酸との間の差異を利用する。同様に、例えば、ＦＬのＭＮ／ＣＡ９ ｍＲＮＡには見られず、ＡＳのＭＮ／ＣＡ９ ｍＲＮＡにのみ見られる領域を増幅するために一対のプライマーを設計することができ、または逆の設計もできる。本開示に鑑みて当業者は、本発明の診断法／予後診断法に有用であると思われる任意の数のプローブおよび／またはプライマー／プライマー対を設計することができるであろう。
【００２７】
ヒトにおける前新生物疾患／新生物疾患に対する好ましい診断法／予後診断法において、本発明の１種類以上の特に好ましいプローブおよび／またはプライマーは、配列番号９７〜１０１および配列番号９７〜１０１と少なくとも８０％相同、好ましくは配列番号９７〜１０１と少なくとも９０％相同である核酸配列からなる群から選択される。ＦＬおよび／またはＡＳのＭＮ／ＣＡ９ ｍＲＮＡ発現を検出、または検出および定量化するために１種類以上のプローブおよび／またはプライマーの使用を含んでなる前記の方法は、ＦＬのＭＮ／ＣＡ９ ｍＲＮＡ：ＡＳのＭＮ／ＣＡ９ ｍＲＮＡの比、または経時的にＦＬのＭＮ／ＣＡ９ ｍＲＮＡ：ＡＳのＭＮ／ＣＡ９ ｍＲＮＡの比の変化を測定することをさらに含むことができる。
【００２８】
さらに、前記ＡＳのＭＮ／ＣＡ９ ｍＲＮＡの発現を、正常なＭＮ／ＣＡ９遺伝子発現を示すために使用することができ、かつ、前記ＦＬのＭＮ／ＣＡ９ ｍＲＮＡ発現を、異常なＭＮ／ＣＡ９遺伝子発現を示すために使用することができ、特にＡＳおよび／またはＦＬのＭＮ／ＣＡ９ ｍＲＮＡ発現のレベルを使用できる。あるいは、または加えて、前記ＡＳのＭＮ／ＣＡ９ ｍＲＮＡの発現を、酸素正常状態のＭＮ／ＣＡ９遺伝子発現を示すために使用することができ、また、前記ＦＬのＭＮ／ＣＡ９ ｍＲＮＡの発現を、低酸素状態のＭＮ／ＣＡ９遺伝子発現を示すために使用することができる。また、前記ＭＮのＡＳおよび／またはＦＬ ｍＲＮＡ発現のレベルは、特定の指示的値となるであろう。
【００２９】
ＦＬおよび／またはＡＳのＭＮ／ＣＡ９ ｍＲＮＡの発現を検出、または検出および定量化するために、１種類以上のプローブおよび／またはプライマーの使用を含んでなる前記方法は、核酸増幅方法、好ましくは、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲまたは定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲから選択される増幅方法、および当業者に知られている同等の核酸増幅方法の使用をさらに含むことができる。あるいは、ＦＬおよび／またはＡＳのＭＮ／ＣＡ９ ｍＲＮＡの発現を検出、または検出および定量化するための前記方法は、マイクロアレイチップの使用を含むことができる。例えば、前記マイクロアレイチップは、選択的にスプライスされた［ＡＳ］ＭＮ／ＣＡ９ ｍＲＮＡには結合しないが、完全長［ＦＬ］ＭＮ／ＣＡ９ ｍＲＮＡに結合するプローブ、および／またはＦＬのＭＮ／ＣＡ９ ｍＲＮＡには結合しないが、ＡＳのＭＮ／ＣＡ９ ｍＲＮＡに結合するプローブを含むことができ、このようなチップ上の前記プローブの戦略的配置は、当該技術分野の範囲内にある。
【００３０】
別の態様において、本発明は、ＦＬのＭＮ／ＣＡ ＩＸ発現とＡＳのＭＮ／ＣＡ ＩＸ発現とを識別する工程を有してなり、哺乳動物における異常なＭＮ／ＣＡ ＩＸ発現に関連する前新生物疾患／新生物疾患に係わる診断方法および／または予後診断方法に関する。前記方法は、前新生物組織／新生物組織においてＦＬのＭＮ／ＣＡ ＩＸ発現とＡＳのＭＮ／ＣＡ ＩＸ発現とを識別するために１種類以上の抗体の使用を含んでなることが好ましい。前記方法は、前記組織においてＡＳのＭＮ／ＣＡ ＩＸを検出、または検出および定量化することを含むことができ；前記組織においてＦＬのＭＮ／ＣＡ ＩＸレベル対ＡＳのＭＮ／ＣＡ ＩＸレベルの比を測定することをさらに含むことができる。さらに前記ＦＬのＭＮ／ＣＡ ＩＸ：ＡＳのＭＮ／ＣＡ ＩＸの比は、前記組織における低酸素状態の存在または程度を示すために使用することができる。
【００３１】
本発明の好ましい一実施形態において、診断方法／予後診断方法は、脊椎動物の組織におけるＦＬのＭＮ／ＣＡ ＩＸおよびＡＳのＭＮ／ＣＡ ＩＸを検出、または検出および定量化する工程を有してなり、該工程は：
（ａ）前記サンプルを、少なくとも２種の抗体、少なくとも２種の抗原結合性抗体断片、または抗体と抗原結合性抗体断片の混合物とを同時にまたは連続的に接触させて、少なくとも１種の抗体／抗体断片をＡＳのＭＮ／ＣＡ ＩＸタンパク質には結合しないが、ＦＬのＭＮ／ＣＡ ＩＸタンパク質に特異的に結合させ、少なくとも他の１種の抗体／抗体断片をＦＬのＭＮ／ＣＡ ＩＸとＡＳのＭＮ／ＣＡ ＩＸの双方に特異的に結合させる工程と；
（ｂ）前記サンプルにおいて前記抗体／抗体断片の結合を検出および定量化する工程と；
（ｃ）前記差異的に結合する抗体／抗体断片の結合を比較してＦＬのＭＮ／ＣＡ ＩＸとＡＳのＭＮ／ＣＡ ＩＸの相対的レベルを特定する工程と、
を有してなる。
【００３２】
ＡＳのＭＮ／ＣＡ ＩＸには結合しないが、ＦＬのＭＮ／ＣＡ ＩＸに特異的に結合する前記１種類以上の抗体／抗体断片が、ＭＮ／ＣＡ ＩＸの炭酸脱水酵素（ＣＡ）ドメインに特異的であり；ＦＬのＭＮ／ＣＡ ＩＸおよびＡＳのＭＮ／ＣＡ ＩＸの双方に特異的に結合する前記１種類以上の抗体／抗体断片が、ＭＮ／ＣＡ ＩＸのプロテオグリカン様（ＰＧ）ドメインに特異的であることが好ましい。さらにより好ましくは、ＭＮ／ＣＡ ＩＸのＣＡドメインに特異的な前記抗体が、登録番号ＬＭＢＰ６００９ＣＢとしてベルギー国ヘント所在のＢＣＣＭ（商標）／ＬＭＢＰに寄託されたハイブリドーマＶＵ−Ｖ／１０により産生されるＶ／１０モノクローナル抗体であり；ＭＮ／ＣＡ ＩＸのＰＧドメインに特異的な前記抗体が、ＡＴＣＣ指定番号ＨＢ１１１２８としてアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託されたハイブリドーマＶＵ−Ｍ７５により産生されるＭ７５モノクローナル抗体である。
【００３３】
さらに本発明は、脊椎動物における異常なＭＮ／ＣＡ ＩＸ発現に関連する前新生物疾患／新生物疾患の診断および／または予後診断方法に関するものであり、適切な脊椎動物の組織サンプルにおける選択的にスプライスされた［ＡＳ］ＭＮ／ＣＡ ＩＸタンパク質は検出せず、完全長［ＦＬ］ＭＮ／ＣＡ ＩＸタンパク質を検出、または検出および定量化する工程を有してなり、該工程は：
（ａ）前記サンプルを抗体または抗体断片に接触させるステップであって、前記抗体または抗体断片が、ＡＳのＭＮ／ＣＡ ＩＸには結合しないが、ＦＬのＭＮ／ＣＡ ＩＸに特異的に結合する工程と；
（ｂ）前記サンプルにおける前記抗体／抗体断片の結合を検出および定量化する工程と、
を有してなる。前記脊椎動物は、哺乳動物であることが好ましく、前記哺乳動物はヒトであることがさらに好ましい。
【００３４】
ＡＳのＭＮ／ＣＡ ＩＸには結合しないが、ＦＬのＭＮ／ＣＡ ＩＸに特異的に結合する代表的な好ましい抗体または抗体断片は、ＭＮ／ＣＡ ＩＸの炭酸脱水酵素（ＣＡ）ドメインに特異的であるものである。より好ましくは、ＭＮ／ＣＡ ＩＸのＣＡドメインに特異的な前記抗体は、登録番号ＬＭＢＰ６００９ＣＢとしてベルギー国ヘント所在の「ＢＣＣＭ」／ＬＭＢＰに寄託されたハイブリドーマＶＵ−Ｖ／１０により産生されるＶ／１０モノクローナル抗体である。
【００３５】
本発明の特に好ましい態様は、脊椎動物、好ましくは哺乳動物における異常なＭＮ／ＣＡ ＩＸ発現に関連する前新生物疾患／新生物疾患の診断および／または予後診断方法に関するものであり、それらの方法は、脊椎動物、好ましくは哺乳動物の前新生物疾患／新生物サンプルにおいて選択的にスプライスされた［ＡＳ］ＭＮ／ＣＡ９ ｍＲＮＡは検出せず、完全長［ＦＬ］ＭＮ／ＣＡ９ ｍＲＮＡを検出、または検出および定量化する工程を有してなり、前記サンプルからのｍＲＮＡを、ＡＳのＭＮ／ＣＡ９ ｍＲＮＡには結合しないが、ＦＬのＭＮ／ＣＡ９ ｍＲＮＡに特異的に結合するプライマーまたはプローブに接触させる工程を有してなる。
【００３６】
本発明はさらに、哺乳動物における選択的にスプライスされた［ＡＳ］ＭＮ／ＣＡ９ ｍＲＮＡ発現と完全長［ＦＬ］ＭＮ／ＣＡ９ ｍＲＮＡ発現とを識別するために使用される核酸プローブおよび／またはプライマーに関する。上記のとおり、本開示に基づくようなプローブ／プライマーの設計は、当該技術分野の範囲内にある。好ましくは、前記哺乳動物はヒトであり、前記プローブおよび／またはプライマーは、ＦＬのＭＮ／ＣＡ９ ｍＲＮＡは検出せず、ＡＳのＭＮ／ＣＡ９ ｍＲＮＡを検出するために使用され、前記プローブまたはプライマーは、ＭＮ／ＣＡ９遺伝子のエクソン７および１０のスプライスジャンクションに結合する核酸を含んでなる。より好ましくは、前記プローブまたはプライマーは、配列番号１０１の配列または配列番号１０１と少なくとも８０％相同、より好ましくは、配列番号１０１と少なくとも９０％相同である配列を有する。あるいは、前記哺乳動物はヒトであり、前記プローブおよび／またはプライマーは、ＡＳのＭＮ／ＣＡ９ ｍＲＮＡは検出せずＦＬのＭＮ／ＣＡ９ ｍＲＮＡを検出するために使用され、前記プローブまたはプライマーは、ヒトＭＮ／ＣＡ９遺伝子のエクソン８またはエクソン９に結合するか、またはヒトＭＮ／ＣＡ９遺伝子のエクソン７と８のスプライスジャンクション、エクソン８と９のスプライスジャンクション、もしくはエクソン９と１０のスプライスジャンクションに結合する核酸を含んでなる。より好ましくは、ＡＳのＭＮ／ＣＡ９ ｍＲＮＡは検出せずヒトＦＬのＭＮ／ＣＡ９ ｍＲＮＡを検出するために使用される前記プローブまたはプライマーは、配列番号１００の配列または配列番号１００と少なくとも８０％相同、より好ましくは、配列番号１００と少なくとも９０％相同である配列を有する。本発明はさらに、このようなプローブまたはプライマーを発現するベクター、および／またはこのようなベクターを含んでなる宿主細胞、および１種類以上のこのようなプローブを含んでなるマイクロアレイチップに関する。
【００３７】
本発明はさらに、哺乳動物における選択的にスプライスされた［ＡＳ］ＭＮ／ＣＡ９ ｍＲＮＡ発現と完全長［ＦＬ］ＭＮ／ＣＡ９ ｍＲＮＡ発現とを識別するために使用される一対のプローブおよび／またはプライマーに関する。前記一対のプローブおよび／またはプライマーは、完全長［ＦＬ］ヒトＭＮ／ＣＡ９ ｍＲＮＡは検出せず、選択的にスプライスされた［ＡＳ］ヒトＭＮ／ＣＡ９ ｍＲＮＡを検出するために使用することができる。完全長［ＦＬ］ヒトＭＮ／ＣＡ９ ｍＲＮＡは検出せず、選択的にスプライスされた［ＡＳ］ヒトＭＮ／ＣＡ９ ｍＲＮＡを検出するために使用される代表的な好ましい一対のプローブまたはプライマーは、配列番号９９および１０１、または配列番号９９および１０１と少なくとも８０％相同、より好ましくは少なくとも９０％相同である核酸配列からなる。
【００３８】
あるいは、前記一対のプローブおよび／またはプライマーは、選択的にスプライスされた［ＡＳ］ヒトＭＮ／ＣＡ９ ｍＲＮＡは検出せず、完全長［ＦＬ］ヒトＭＮ／ＣＡ９ ｍＲＮＡを検出するために使用される。ＦＬ ｍＲＮＡのみを検出するために使用される代表的な好ましい一対のプローブまたはプライマーは、配列番号９９および１００、または配列番号９９および１００と少なくとも８０％相同、より好ましくは少なくとも９０％相同である核酸配列からなる。本発明のさらなる実施形態において、一対のプローブまたはプライマーは、ＡＳヒトＭＮ／ＣＡ９ ｍＲＮＡおよびＦＬヒトＭＮ／ＣＡ９ ｍＲＮＡの双方を検出するために使用され、前記ＡＳ  ｍＲＮＡと前記ＦＬ ｍＲＮＡは長さにより識別される。ＡＳとＦＬの双方のヒトＭＮ／ＣＡ９ ｍＲＮＡを検出するために使用される前記一対のプローブおよび／またはプライマーは、配列番号９７および９８、または配列番号９７および９８と少なくとも８０％相同、より好ましくは少なくとも９０％相同である核酸配列からなることが好ましい。
【００３９】
本発明はさらに、哺乳動物における選択的にスプライスされた［ＡＳ］ＭＮ／ＣＡ ＩＸをコードする単離された核酸に関する。前記ＡＳのＭＮ／ＣＡ ＩＸは、約４３〜約４８ｋＤａの分子量を有することが好ましい。本発明はさらに、このような核酸またはその断片を発現するベクター、このようなベクターを含んでなる宿主細胞および／または組換え、合成または他の生物学的手段によるＡＳのＭＮ／ＣＡ ＩＸタンパク質およびポリペプチドの産生に関する。
【００４０】
前記単離された核酸によりコードされた、代表的な好ましいＡＳ型のＭＮ／ＣＡ ＩＸのは、ＭＮ／ＣＡ ＩＸのＰＧドメインに特異的な抗体により特異的に結合されるが、ＭＮ／ＣＡ ＩＸのＣＡドメインに特異的な抗体により結合されないことをさらに特徴とする。本発明のさらにより好ましい実施形態において、前記ＡＳ型のＭＮ／ＣＡ ＩＸは、ＡＴＣＣ番号ＨＢ１１１２８としてアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託されたハイブリドーマＶＵ−Ｍ７５から分泌されるＭ７５モノクローナル抗体により特異的に結合されるが、登録番号ＬＭＢＰ６００９ＣＢとしてベルギー国ヘント所在の「ＢＣＣＭ」／ＬＭＢＰに寄託されたハイブリドーマＶＵ−Ｖ／１０により産生されるＶ／１０モノクローナル抗体には結合されない。
【００４１】
より好ましくは、前記哺乳動物がヒトであり、前記単離された核酸が、ＭＮ／ＣＡ９のエクソン８およびエクソン９に相当するヌクレオチドを欠失させることを特徴とする。さらにより好ましくは、前記単離ヒト核酸が、配列番号１０８、または配列番号１０８と少なくとも８０％相同、より好ましくは配列番号１０８と少なくとも９０％相同の核酸配列を有する。好ましくは、配列番号１０８または密接に関連する配列によりコードされたＡＳ型の代表的なヒトＭＮ／ＣＡ ＩＸは、ＡＴＣＣ番号ＨＢ１１１２８としてアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託されたハイブリドーマＶＵ−Ｍ７５から分泌されるＭ７５モノクローナル抗体により特異的に結合されるが、登録番号ＬＭＢＰ６００９ＣＢとしてベルギー国ヘント所在の「ＢＣＣＭ」／ＬＭＢＰに寄託されたハイブリドーマＶＵ−Ｖ／１０により産生されるＶ／１０モノクローナル抗体により結合されない。
【００４２】
さらに本発明は、他の型のＭＮ／ＣＡ ＩＸには結合しないが、ＡＳ型のＭＮ／ＣＡ ＩＸに特異的に結合する抗体または抗原結合抗体に関する。例えば、このようなＡＳ特異的抗体は、ＡＳ型のＭＮ／ＣＡ ＩＸに特異的に結合するが、ＦＬ型のＭＮ／ＣＡ ＩＸに特異的に結合しない抗体または抗原結合抗体であり得るか；またはＡＳのＭＮ／ＣＡ ＩＸに特異的に結合するが、可溶性ＭＮ／ＣＡ ＩＸ（ｓ−ＣＡ ＩＸ）に特異的に結合しない抗体または抗原結合抗体であり得る。
【００４３】
哺乳動物における前新生物疾患／新生物疾患を治療するための治療方法が、さらに本明細書に開示されており、前記疾患は、ＭＮ／ＣＡ ＩＸの異常発現に関連し、本方法は、完全長［ＦＬ］ＭＮ／ＣＡ ＩＸのレベルと比較して選択的にスプライスされた［ＡＳ］ＭＮ／ＣＡ ＩＸのレベルを増加させる薬剤を含む組成物を治療に有効な量で前記哺乳動物に投与する工程を有してなる。前記ＡＳのＭＮ／ＣＡ ＩＸはまた、ＦＬのＭＮ／ＣＡ ＩＸの活性を阻害するＡＳのＭＮ／ＣＡ ＩＸの任意のタンパク質またはポリペプチド断片を含むことも考えられる。前記ＡＳのＭＮ／ＣＡ ＩＸの相対的レベルの増加により、前記ＦＬのＭＮ／ＣＡ ＩＸの炭酸脱水酵素の活性が阻害されることが好ましい。前記薬剤は、生理学的に許容できる担体中のＡＳのＭＮ／ＣＡ ＩＸ自体、ＡＳのＭＮ／ＣＡ９ ｍＲＮＡを発現するベクター、ＡＳのＭＮ／ＣＡ ＩＸの発現は遮断しないがＦＬのＭＮ／ＣＡ ＩＸの発現を遮断するアンチセンスオリゴヌクレオチド、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドを発現するベクター、ＦＬのＭＮ／ＣＡ９のイソ型に特異的なｓｉＲＮＡ、または前記ＦＬのＭＮ／ＣＡ９のイソ型に特異的なｓｉＲＮＡを発現するベクターであり得る。
【００４４】
例えば、前記薬剤は、エクソン７と８、エクソン８と９、またはエクソン９と１０のスプライスジャンクションに標的化されるＦＬのＭＮ／ＣＡ９のイソ型に特異的なｓｉＲＮＡであり得る。あるいは、前記薬剤は、ＡＳおよび／またはＦＬのＭＮ／ＣＡ９の前ｍＲＮＡスプライシングを調節するアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【００４５】
別の態様において、本発明は、完全長［ＦＬ］ＭＮ／ＣＡ ＩＸのレベルに比して選択的にスプライスされた［ＡＳ］ＭＮ／ＣＡ ＩＸのレベルを増加させるオリゴヌクレオチドに関するものであって、前記オリゴヌクレオチドは、異常なＭＮ／ＣＡ ＩＸ発現に関連する前新生物疾患／新生物疾患の治療に使用される。例えば、前記オリゴヌクレオチドは、ＡＳのＭＮ／ＣＡ９の前ｍＲＮＡには相補的ではないが、ＦＬのＭＮ／ＣＡ９の前ｍＲＮＡに相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドである可能性があり；好ましくは、前記オリゴヌクレオチドは、ＦＬのＭＮ／ＣＡ９ ｍＲＮＡのエクソン７と８、エクソン８と９、またはエクソン９と１０のスプライスジャンクションに相補的である。あるいは、ＦＬのＭＮ／ＣＡ ＩＸのレベルに比してＡＳ  ＦＬのＭＮ／ＣＡのレベルを増加させる前記オリゴヌクレオチドは、ＡＳのＭＮ／ＣＡ９ ｍＲＮＡには相補的ではないが、ＦＬのＭＮ／ＣＡ９ ｍＲＮＡに相補的であるｓｉＲＮＡであり得る。
【００４６】
本発明はまた、ＡＳのＭＮ／ＣＡ ＩＸを発現する細胞を、この細胞において前記ＡＳのＭＮ／ＣＡ ＩＸのレベルを調節すると思われる薬剤に接触させ、前記ＡＳのＭＮ／ＣＡ ＩＸのレベルの変化を検出および定量化する工程を有してなる、選択的にスプライスされた［ＡＳ］ＭＮ／ＣＡ ＩＸのレベルを調節することができる薬剤を同定するインビトロ方法に関する。
【００４７】
引用文献
以下の引用文献は、ＭＮ／ＣＡ９遺伝子およびＭＮ／ＣＡ ＩＸタンパク質、または選択的にスプライスされたｍＲＮＡに関する最新情報を本明細書に引用するか、または提供する。本明細書に引用されるリストに挙げられた引用文献ならびに他の引用文献の全ては、参照することにより具体的に援用される。
【００４８】
・アンダーソン（Ａｎｄｅｒｓｏｎ）ら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２５：６１−６９頁（２００６年）
・アルバレツ−ペレツ（Ａｌｖａｒｅｚ−Ｐｅｒｅｚ）ら、ＭＡＧＭＡ  １８：２９３−３０１頁（２００５年）
・バートソバ（Ｂａｒｔｏｓｏｖａ）ら、Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１９７：３１４−３２１頁（２００２年）
・ビースレイ（Ｂｅａｓｌｅｙ）ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６１（１３）：５２６２−５２６７頁（２００１年）
・セッチ（Ｃｅｃｃｈｉ）ら、Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ４８：４８３４−４１頁（２００５年）
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・シンＹ（Ｘｉｎｇ  Ｙ．）Ｆｒｏｎｔ  Ｂｉｏｓｃｉ．、１２：４０３４−４１頁（２００７年）
・ザトビコバ（Ｚａｔｏｖｉｃｏｖａ）ら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２８２：１１７−１３４頁（２００３年）
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略語
以下の略語が本明細書中に使用される：
2014057596.tif 000002
2014057596.tif 000003
2014057596.tif 000004
細胞株
2014057596.tif 000005
ヌクレオチドおよびアミノ酸の記号
以下の記号は、本明細書においてヌクレオチドを表すために使用される：
2014057596.tif 000006
２０の主要アミノ酸があり、それらの各々は、３つの隣接ヌクレオチド（トリプレットコードまたはコドン）の異なる配列により特定され、特定の順序で一緒に結合して特徴的なタンパク質を形成する。例えば、以下の図１に示される前記アミノ酸を同定するために、３文字または１文字の通則が、本明細書に使用される：
2014057596.tif 000007
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１Ａ】マウスＣＡ ＩＸのスプライシング変異体の同定および推定構造：マウスＣａｒ９遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ番号ＡＹ０４９０７７）のゲノム構造。
【図１Ｂ】マウスＣＡ ＩＸのスプライシング変異体の同定および推定構造：マウス胃腸管系組織におけるＣａｒ９スプライシング変異体のＲＴ−ＰＣＲ［実施例に用いられるプライマーの配列に関しては下記表２を参照］。
【図１Ｃ】マウスＣＡ ＩＸのスプライシング変異体の同定および推定構造：ＦＬ転写体およびＡＳ転写体の別々の増幅。
【図１Ｄ】マウスＣＡ ＩＸのスプライシング変異体の同定および推定構造：ＦＬアミノ酸配列［配列番号７３］とＡＳアミノ酸配列［配列番号１０７］の比較。
【図１Ｅ】マウスＣＡ ＩＸのスプライシング変異体の同定および推定構造：マウスＡＳ ＣＡ ＩＸタンパク質の推定された構造。
【図２Ａ】マウスＡＳ ＣＡ ＩＸの免疫ブロット分析および局在化。マウスＡＳ ｃＤＮＡを含むｐＳＧ５Ｃ−ＡＳプラスミドは、ＮＩＨ３Ｔ３細胞およびＭＤＣＫ細胞にそれぞれ形質移入された：マウスＣＡ ＩＸに対してポリクローナル血清を用いるＡＳ形質移入細胞の免疫ブロットが、単一のＡＳ関連バンドを示す。
【図２Ｂ】マウスＡＳ ＣＡ ＩＸの免疫ブロット分析および局在化。マウスＡＳ ｃＤＮＡを含むｐＳＧ５Ｃ−ＡＳプラスミドは、ＮＩＨ３Ｔ３細胞およびＭＤＣＫ細胞にそれぞれ形質移入された：形質移入体の免疫蛍光分析が、マウスＡＳタンパク質の細胞内局在を示す。
【図３Ａ】ヒトＣＡ ＩＸのスプライシング変異体の同定および推定された構造：ヒトＣＡ９遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ番号Ｚ５４３４９）のゲノム構造の略図。プライマー位置は、矢印により示される[実施例に用いられるプライマーの配列に関しては表２を参照]。選択的スプライシングにより排除されたエクソンは、暗灰色にある。
【図３Ｂ】ヒトＣＡ ＩＸのスプライシング変異体の同定および推定された構造：スプライシング変異体間を識別しないｈ１Ｓ−ｈ６Ａプライマー［配列番号９５および９６］を用いたヒト胃腸におけるＣＡ９のＲＴ−ＰＣＲ分析。
【図３Ｃ】ヒトＣＡ ＩＸのスプライシング変異体の同定および推定された構造：ｈ６Ｓ−ｈ１１Ａプライマー［配列番号９７および９８］を用いたヒト組織におけるＦＬとＡＳ双方の転写体の増幅。
【図３Ｄ】ヒトＣＡ ＩＸのスプライシング変異体の同定および推定された構造：ヒトＦＬおよびＡＳ ＣＡ９  ｃＤＮＡから推測されたアミノ酸配列［配列番号２および１０９］の比較。シグナルペプチド（ＳＰ）はイタリックで書かれ、プロテオグリカン様ドメイン（ＰＧ）は太字であり、炭酸脱水酵素ドメイン（ＣＡ）は実線で囲み、アミノ酸（ａａ）４１５で開始する膜貫通領域（ＴＭ）は破線で囲ってある。点線はＡＳで欠失したアミノ酸残基を表す。触媒亜鉛に結合するヒスチジンおよびＳ−Ｓ結合の形成に関与するシステインは、単独に破線で囲ってある。
【図３Ｅ】ヒトＣＡ ＩＸのスプライシング変異体の同定および推定された構造：ヒトＦＬおよびＡＳ ＣＡ ＩＸタンパク質の推定された構造。
【図４Ａ】スプライシング変異体、すなわちＦＬに関してはｈ７Ｓ−ｈ８Ａ［配列番号９９および１００］およびＡＳに関してはｈ７Ｓ−ｈ１０／７Ａ［配列番号９９および１０１］の個々の増幅のために設計されたプライマーを用いた（図３を参照）ヒトＡＳ ＣＡ９のＲＴ−ＰＣＲ分析による、ヒト腫瘍細胞株およびヒト組織におけるＡＳ ＣＡ ＩＸ変異体の発現。ベータ−アクチンを標品として用いた（図４Ｂおよび４Ｃにおいて同じ）：酸素正常状態（Ｎ）および低酸素状態（Ｈ）に４８時間露出させた細胞からｃＤＮＡを単離した。この結果は、ＡＳ発現が安定しており、低酸素状態に依存しないことを示している。
【図４Ｂ】低密度および高密度で７２時間インキュベートした細胞からｃＤＮＡを単離した。この結果は、ＡＳ発現が安定しており、密度に依存しないことを示している。
【図４Ｃ】正常および腫瘍ヒト組織からｃＤＮＡを単離した。この結果は、ＡＳ発現が安定しており、腫瘍表現型に依存しないことを示している。
【図５Ａ】ヒトＡＳ ＣＡ ＩＸの局在化およびオリゴマー化を示す図。ＣＡ ＩＸ陰性ＭＤＣＫ細胞およびＦＬ ＣＡ ＩＸの天然の低酸素状態により誘導された発現を有するＨｅＬａ細胞に、ｐＳＧ５Ｃプラスミド内のＡＳＣＡ９ ｃＤＮＡを持続的に形質移入した：ＡＳ形質移入（ＡＳ）、ＦＬ形質移入（ＦＬ）および対照細胞（モック）の免疫蛍光分析を、ＡＳおよびＦＬタンパク質の双方を認識するＭ７５ ｍａｂを用いて実施した。
【図５Ｂ】ヒトＡＳ ＣＡ ＩＸの局在化およびオリゴマー化を示す図。ＣＡ ＩＸ陰性ＭＤＣＫ細胞およびＦＬ ＣＡ ＩＸの天然の低酸素状態により誘導された発現を有するＨｅＬａ細胞に、ｐＳＧ５Ｃプラスミド内のＡＳＣＡ９ ｃＤＮＡを持続的に形質移入した：ＨｅＬａ−ＡＳ細胞および対照ＨｅＬａ細胞からのタンパク質抽出物および培地の免疫ブロット分析。ＡＳ ＣＡ ＩＸ変異体は、ＡＳ形質細胞の抽出物ならびに培地中のＭ７５ ｍａｂにより検出された。
【図６Ａ】オリゴマーを形成するＦＬおよびＡＳスプライシング変異体の能力：非還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＭ７５による免疫ブロットにより、ＡＳがオリゴマーを形成できないことを示した。
【図６Ｂ】オリゴマーを形成するＦＬおよびＡＳスプライシング変異体の能力：ＭＡｂＶ／１０（ＡＳは認識しないが、ＦＬを認識する）またはＭ７５（双方の変異体を認識する）で抽出されたＨｅＬａ−ＡＳ抽出物からの免疫沈降によるオリゴマー中のスプライシング変異体の検出。沈降されたオリゴマーの成分は、ペルオキシダーゼ標識Ｍ７５を用いて可視化した。
【図７Ａ】酸性化、阻害剤結合およびスフェロイド形成に対する過剰発現ＡＳ変異体の効果：ＡＳ形質移入ＨｅＬａ細胞および関連するモック形質移入対照を、それぞれ酸素正常状態および低酸素状態で４８時間インキュベートし、細胞外ｐＨを、実験の終了直後に培地中で測定した。データは、低酸素状態の細胞対酸素正常状態の細胞で測定されたｐＨ値間の差異（ΔｐＨ）として表され、標準偏差を含む。結果は、ＡＳの発現が、低酸素状態でＦＬ ＣＡ ＩＸタンパク質により媒介される酸性化を減少させることを示す。
【図７Ｂ】酸性化、阻害剤結合およびスフェロイド形成に対する過剰発現ＡＳ変異体の効果：ヒトＦＬ ＣＡ ＩＸタンパク質を構成的に発現するＭＤＣＫ−ＣＡ ＩＸ形質移入細胞を、ＭＤＣＫ−ＡＳ形質移入体からの調整培地を添加した分泌ＡＳ変異体の不在下（対照）または存在下、蛍光ＣＡ阻害剤（ＦＩＴＣ−ＣＡ Ｉ）により４８時間処理した図である。調整培地を、新鮮な培地と混合した。ＦＩＴＣ−ＣＡ Ｉは低酸素状態の細胞にのみ結合し、ＡＳタンパク質の存在下でかなり減少した。
【図７Ｃ】酸性化、阻害剤結合およびスフェロイド形成に対する過剰発現ＡＳ変異体の効果：同じ実験を、ＭＤＣＫ−ＡＳ細胞からの調整培地の半分（１／２ＡＳ）または三分の一（１／３ＡＳ）のいずれかで繰り返し実施した。ＦＩＴＣ−ＣＡ Ｉと対応する蛍光との結合は、シオン（Ｓｃｉｏｎ）画像ソフトウェアを用いて獲得された画像から評価した。データは、ＡＳの不在下、ＦＩＴＣ−ＣＡ Ｉと共にインキュベートされた低酸素状態のＭＤＣＫ−ＣＡ ＩＸ細胞により示された陽性対照のパーセンテージとして表示された。その結果、ＡＳがＣＡ ＩＸに対するＦＩＴＣ−ＣＡ Ｉの結合を減少させることが確認された。
【図７Ｄ】酸性化、阻害剤結合およびスフェロイド形成に対する過剰発現ＡＳ変異体の効果：対照のモック形質移入ＨｅＬａ細胞およびＡＳ形質移入ＨｅＬａ細胞それぞれから増殖させたスフェロイドの顕微鏡画像。対照のＨｅＬａ細胞は、低酸素状態誘導の機能性ＦＬ ＣＡ ＩＸタンパク質を発現し、コンパクトコア(compact core)を形成するスフェロイドを生じる。低酸素誘導のＦＬ ＣＡ ＩＸおよび構成的に発現したＡＳ双方を含むＨｅＬａ−ＡＳ細胞は、ルースコア(loose core)を含むが、これは恐らくＦＬの機能がＡＳにより損なわれるため、低酸素コア細胞の生存減少に至ったためと思われる。
【図８Ａ】図８Ａ〜Ｃは、本明細書に記載される、単離されたＭＮ ｃＤＮＡ［配列番号１］クローンのヌクレオチド配列である。また、ｃＤＮＡによりコードされた推定アミノ酸配列［配列番号２］も示している。
【図８Ｂ】図８Ａ〜Ｃは、本明細書に記載される、単離されたＭＮ ｃＤＮＡ［配列番号１］クローンのヌクレオチド配列である。また、ｃＤＮＡによりコードされた推定アミノ酸配列［配列番号２］も示している。
【図８Ｃ】図８Ａ〜Ｃは、本明細書に記載される、単離されたＭＮ ｃＤＮＡ［配列番号１］クローンのヌクレオチド配列である。また、ｃＤＮＡによりコードされた推定アミノ酸配列［配列番号２］も示している。
【図９Ａ】図９Ａ〜Ｆは、ＭＮ［配列番号３］の１０，８９８ｂｐの完全ゲノム配列。塩基数は以下のとおりである：２６５４のＡ；２７３９のＣ；２６４５のＧ；および２８５９のＴ。１１のエクソンは、一般に大文字で示されるが、エクソン１は、ＲＮアーゼ保護アッセイにより測定されたように３５０７位で開始されると考えられている。
【図９Ｂ】図９Ａ〜Ｆは、ＭＮ［配列番号３］の１０，８９８ｂｐの完全ゲノム配列。塩基数は以下のとおりである：２６５４のＡ；２７３９のＣ；２６４５のＧ；および２８５９のＴ。１１のエクソンは、一般に大文字で示されるが、エクソン１は、ＲＮアーゼ保護アッセイにより測定されたように３５０７位で開始されると考えられている。
【図９Ｃ】図９Ａ〜Ｆは、ＭＮ［配列番号３］の１０，８９８ｂｐの完全ゲノム配列。塩基数は以下のとおりである：２６５４のＡ；２７３９のＣ；２６４５のＧ；および２８５９のＴ。１１のエクソンは、一般に大文字で示されるが、エクソン１は、ＲＮアーゼ保護アッセイにより測定されたように３５０７位で開始されると考えられている。
【図９Ｄ】図９Ａ〜Ｆは、ＭＮ［配列番号３］の１０，８９８ｂｐの完全ゲノム配列。塩基数は以下のとおりである：２６５４のＡ；２７３９のＣ；２６４５のＧ；および２８５９のＴ。１１のエクソンは、一般に大文字で示されるが、エクソン１は、ＲＮアーゼ保護アッセイにより測定されたように３５０７位で開始されると考えられている。
【図９Ｅ】図９Ａ〜Ｆは、ＭＮ［配列番号３］の１０，８９８ｂｐの完全ゲノム配列。塩基数は以下のとおりである：２６５４のＡ；２７３９のＣ；２６４５のＧ；および２８５９のＴ。１１のエクソンは、一般に大文字で示されるが、エクソン１は、ＲＮアーゼ保護アッセイにより測定されたように３５０７位で開始されると考えられている。
【図９Ｆ】図９Ａ〜Ｆは、ＭＮ［配列番号３］の１０，８９８ｂｐの完全ゲノム配列。塩基数は以下のとおりである：２６５４のＡ；２７３９のＣ；２６４５のＧ；および２８５９のＴ。１１のエクソンは、一般に大文字で示されるが、エクソン１は、ＲＮアーゼ保護アッセイにより測定されたように３５０７位で開始されると考えられている。
【図１０】ヒトＭＮ遺伝子［配列番号２４］の提案されたプロモーターに関するヌクレオチド配列。このヌクレオチドは、ＲＮアーゼ保護アッセイにしたがって転写開始部位から番号が付けられる。調節要素として可能性のあるものを上線で示している。転写開始部位は、星印（ＲＮアーゼ保護）および対応するヌクレオチド上に点（ＲＡＣＥ）で示される。第一のエクソンの配列は、星印のもとで開始する。ＭＮ４プロモーター断片のＦＴＰ分析により、コード鎖および非コード鎖双方で保護された５つの領域（Ｉ〜Ｖ）、および非コード鎖は保護されないが、コード鎖において保護された２つの領域（ＶＩおよびＶＩＩ）が明らかとなった。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
ｐＨおよび細胞接着を調節する調節機構の一部として、ＭＮ／ＣＡ ＩＸタンパク質は腫瘍形成において機能的に関係がある。ＭＮ／ＣＡ ＩＸは、ＨＩＦ−１経路を経て主として低酸素状態で誘導される；ＨＩＦ−１はまた、ＭＮ／ＣＡ ＩＸ発現の増加を生じ得るＰＩ３Ｋ経路を経て伝達された高細胞密度など、種々の細胞外シグナルおよび発癌性変化により酸素正常状態でも発現する可能性がある。ＨＩＦ−１とＰＩ３Ｋ双方の経路が、ＨＩＦ−１タンパク質レベルを増加させ、その増加が、ＭＮ／ＣＡ ＩＸレベルの増加に移し変えられる可能性がある。
【００５１】
下記の実施例に示されるように、本発明者は、高酵素活性およびｐＨを調節する能力により低酸素誘導されるＣＡ ＩＸタンパク質をコードする完全長（ＦＬ）ＣＡ９転写体に加えて、量の少ない構成的に産生された選択的にスプライスされた（ＡＳ）ＣＡ９転写体もあることを見出した。下記の実施例２に示されるように、ヒトＣＡ９ ｍＲＮＡの選択的スプライシング変異体は、エクソン８および９を含まず、低酸素状態とは無関係に腫瘍細胞に発現する。また、この変異体は、完全長転写体の不在下で正常組織において検出可能であり、したがって、低酸素状態関連および癌関連ＣＡ９発現の検出に基づく予後診断において偽陽性データが生じ得る。スプライシング変異体は、触媒ドメインのＣ末端部分を欠く切断ＣＡ ＩＸタンパク質をコードし、触媒活性の減少を示し、細胞内に局在するか、または分泌する。過剰発現される場合、変異体は、完全長ＣＡ ＩＸタンパク質が低酸素状態の細胞内ｐＨを酸性化する能力、および炭酸脱水酵素阻害剤に結合する能力を減少させる。実施例４および５において、ヒトＡＳ ＣＡ ＩＸ変異体が、細胞膜に限らず、過剰発現の際にＦＬタンパク質の機能を阻害することを示す実験を記載している。実施例５において、スプライシング変異体ｃＤＮＡを形質移入したＨｅＬａ細胞は、コンパクトなコアを形成しないスフェロイドを生じることから、ＨｅＬａ細胞は、低酸素ストレスに適合できないことを示唆している。このＡＳ能力は、細胞が、苛酷なアシドーシスを受けず、過度のｐＨ調節を必要としない場合、特に軽度の低酸素条件下で関連があり得る。
【００５２】
ＣＡ ＩＸのＡＳ変異体の低酸素および腫瘍に無関係な産生は、ＣＡ ＩＸの診断態様、予後診断態様および治療態様に関して多くの関係がある。完全長ＣＡ９ ｍＲＮＡ（機能的ＣＡ ＩＸタンパク質をコードする）の将来の診断／予後診断試験において、選択的にスプライスされた変異体の同時検出を回避するために設計されたプローブ／プライマーを設計することができ、癌治療は、例えば、他の治療法の中でもアンチセンスおよびＲＮＡ干渉療法に用いられるオリゴヌクレオチドの設計により、ＣＡ９選択的スプライシングに基づくことができる。
【００５３】
前新生物／新生物疾患
本発明の診断方法／予後診断方法および治療方法の対象である前新生物疾患／新生物疾患（および患部組織）は、ＭＮ／ＣＡ ＩＸの異常発現に関連するものである。本明細書に用いられる「前新生物組織／新生物組織」はまた、体液中の前新生物細胞／新生物細胞を含むことができる。前記前新生物疾患／新生物疾患は、乳房、尿路、膀胱、腎臓、卵巣、子宮、子宮頚部、子宮内膜、扁平上皮細胞、腺扁平上皮細胞、膣、外陰部、前立腺、肝臓、肺、皮膚、甲状腺、膵臓、精巣、脳、頭頚部、中胚葉、肉腫、胃、脾臓、胃腸管、食道、および大腸の前新生物疾患／新生物疾患からなる群から選択されるのが好ましい。
【００５４】
酸素正常状態および低酸素状態
本明細書に用いられる「酸素正常状態」とは、哺乳動物の特定組織に関して生理的酸素張力レベルの正常範囲内にある特定の哺乳動物組織中の酸素張力レベルとして定義される。本明細書に用いられる「低酸素状態」とは、特定の組織または細胞中のＨＩＦ−１αを安定化させるために必要な酸素張力レベルとして定義される。実験的に誘導された低酸素状態は、一般的に２％以下であって、酸欠状態（酸欠状態は致死的となり得る０％のｐＯ２）以上のｐＯ２の範囲内にある。低酸素状態に関係する本明細書に記載された実施例では、代表的な低酸素状態である２％ｐＯ２で実施された。しかしながら、当業者は、「低酸素状態」として理解され、同様の実験結果を生じる他の酸素張力レベルを考えることもあろう。例えば、ウィコッフ（Ｗｙｋｏｆｆ）ら［Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、６０：７０７５−７０８３頁（２０００年）］は、代表的な低酸素状態として０．１％ｐＯ２の条件を用いてＣＡ９のＨＩＦ−１α−従属発現を誘導した。トームズ（Ｔｏｍｅｓ）らは、０．３％、０．５％および２．５％ｐＯ２の代表的なインビトロ低酸素状態下、ＨｅＬａ細胞またはヒト乳房線維芽細胞におけるＨＩＦ−１αの安定化およびＣＡ９発現の程度が変わることを立証している［トームズ（Ｔｏｍｅｓ）ら、Ｂｒ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．Ｔｒｅａｔ．８１（１）：６１−６９頁（２００３年）］。あるいは、カルツ（Ｋａｌｕｚ）らは、ＣＡ９の実験的誘導に関して０．５％ｐＯ２の代表的な低酸素状態を用いており［カルツ（Ｋａｌｕｚ）ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、６３：９１７−９２２頁（２００３年）］、０．１〜１％ｐＯ２を低酸素状態の「実験的に誘導された範囲」として言及している［Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、６２：４４６９−４４７７頁（２００２年）］。
【００５５】
上記文献のトームズ（Ｔｏｍｅｓ）らにより示されるように、２％以上のｐＯ２の酸素張力レベルもまた低酸素状態であり得る。当業者は、ＨＩＦ−１α安定化の特定に基づいて、ある状態が本明細書に定義された低酸素状態であるかどうかを特定することができるであろう。特定の組織または細胞における低酸素状態の代表的な範囲は、例えば、約３％から約０．０５％ｐＯ２の間、約２％から約０．１％ｐＯ２の間、約１％から約０．１％ｐＯ２の間、および約０．５％から約０．１％ｐＯ２の間であり得る。
【００５６】
ＭＮ遺伝子およびタンパク質
本明細書における用語「ＣＡ ＩＸ」および「ＭＮ／ＣＡ９」は、ＭＮに関する同義語と考えられている。Ｇ２５０抗原は、ＭＮタンパク質／ポリペプチドを称するものと考える。
【００５７】
ザバダ（Ｚａｖａｄａ）らの国際公開第９３／１８１５２号パンフレットおよび／または国際公開第９５／３４６５０号パンフレットは、本明細書の図８に示されるＭＮ ｃＤＮＡ配列［配列番号１］、また図８に示されるＭＮアミノ酸配列［配列番号２］、および本明細書の図９に示されるＭＮゲノム配列［配列番号３］について開示している。ＭＮ遺伝子は、１１のエクソンおよび１０のイントロンで構成される。
【００５８】
図８に示されたＭＮ ｃＤＮＡのＯＲＦは、計算値４９．７ｋｄの分子量を有する４５９のアミノ酸タンパク質に関するコード化能力を有する。ＭＮタンパク質の総アミノ酸組成物はかなり酸性であり、４．３のｐＩを有することが推定される。二次元電気泳動後の免疫ブロット法によるＣＧＬ３からの天然ＭＮタンパク質の分析は、コンピュータ推定と一致して、ＭＮは、４．７から６．３のｐＩ範囲を有する幾つかの等電点形態で存在する酸性タンパク質であることを示している。
【００５９】
図８に示されるＭＮタンパク質の最初の３７のアミノ酸は、推定上のＭＮシグナルペプチド［配列番号４］である。ＭＮタンパク質は、細胞外ドメイン［図８のアミノ酸（ａａ）３８〜４１４；配列番号５］、膜貫通ドメイン［ａａ４１５〜４３４；配列番号６］および細胞内ドメイン［ａａ４３５〜４５９；配列番号７］を有する。細胞外ドメインは、プロテオグリカン様ドメイン［ａａ５３〜１１１；配列番号８］および炭酸脱水酵素（ＣＡ）ドメイン［ａａ１３５〜３９１；配列番号９］を含む。
【００６０】
ＣＡドメインは、アンカーに依存しない誘導に必須であるが、一方、ＴＭアンカーおよびＩＣテールは、その生物学的効果にとって不必要である。ＭＮタンパク質はまた、形質移入された細胞内で細胞膜ラッフリングさせることができ、固体支持体への結合に関与すると思われる。このデータは、細胞増殖の調節、接着および細胞間伝達におけるＭＮの関与を示している。
【００６１】
ＭＮ遺伝子−クローニングおよび配列決定
図８Ａ〜Ｃに、完全長ＭＮ ｃＤＮＡクローンに関するヌクレオチド配列［配列番号１］を提供する。図９Ａ〜Ｆに、完全ＭＮゲノム配列［配列番号３］を提供する。提案されたＭＮプロモーターに関するヌクレオチド配列［配列番号２４］は、図９Ａ〜Ｆのｎｔｓ３００１から３５４０、および図１０に示される。
【００６２】
当然のことながら、遺伝子コードの縮退のため、すなわち、１つ以上のコドンが１つのアミノ酸をコードし［例えば、コドンＴＴＡ、ＴＴＧ、ＣＴＴ、ＣＴＣ、ＣＴＡおよびＣＴＧの各々が、アミノ酸のロイシン（ｌｅｕ）をコードする］、例えば、１つのコドンが別のコドンで置換される配列番号１および３におけるヌクレオチド配列の変更は、本発明による実質的に等しいタンパク質またはポリペプチドを生じるであろう。ＭＮ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列および相補的核酸配列におけるこのような変更は全て、本発明の範囲内に含まれる。
【００６３】
さらに、当然のことながら、本明細書に記載され、図８、９および１０に示されるヌクレオチド配列は、本明細書で単離され、記載されたｃＤＮＡ、ゲノムおよびプロモーターヌクレオチド配列の正確な構造のみを表している。実質的に同様のまたは相同的ＭＮタンパク質およびポリペプチド、例えば、同様のエピトープを有するものをコードするために、僅かに修飾されたヌクレオチド配列が見出されるか、または当業界に知られた技法により修飾できることが予想され、このようなヌクレオチド配列およびタンパク質／ポリペプチドは、本発明の目的にとって等価物であると考えられる。
【００６４】
ＭＮタンパク質／ポリペプチドに相同的または実質的に相同的なタンパク質／ポリペプチドをコードする合成核酸配列、ならびにストリンジェント条件下、前記代表的配列［配列番号１、３および２４］にハイブリダイズする核酸配列、または遺伝子コードの縮退がなかったら、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下、前記ｃＤＮＡヌクレオチド配列にハイブリダイズする核酸配列などの、等価コドンを有するＤＮＡまたはＲＮＡは、本発明の範囲内であると考えられる。本明細書に示された核酸配列の修飾および変更は、代表的なＭＮ配列およびその断片と実質的に同じである配列を生じると考えられる。
【００６５】
少なくとも８０〜９０％、好ましくは少なくとも９０％の相同性を有する極めて密接に関連するｎｔ配列だけが、ストリンジェント条件下、互いにハイブリダイズすると考えられる。図８に示されたＭＮ ｃＤＮＡ配列とヒト炭酸脱水酵素ＩＩ（ＣＡ ＩＩ）の対応するｃＤＮＡの配列比較により、２５以上のヌクレオチドを有するＣＡ ＩＩ ｃＤＮＡ配列のセグメントが、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下、ＭＮ ｃＤＮＡにハイブリダイズすることまたは逆を可能にする上で十分に長いと考えられる２つの配列間で同一の延伸部分がないことが示された。
【００６６】
本明細書におけるストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、ストリンジェントであるとして当該技術分野で理解される標準的なハイブリダイゼーション条件に合致すると考えられる。例えば、当然のことながら一般に、ストリンジェント条件は、５０℃から７０℃の温度で０．０２Ｍから０．１５ＭのＮａＣｌにより提供されるような、比較的低塩条件および／または高温条件を包む。２０℃〜５５℃の温度で０．１５Ｍ〜０．９Ｍ塩のような低ストリンジェント条件は、温度上昇とともにハイブリッド二重鎖を不安定にさせるのに役立つホルムアミド量を増加させて加えることによって、よりストリンジェントにさせることができる。
【００６７】
代表的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）らのＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、１．９１頁および９．４７−９．５１頁（第二版、コールドスプリングハーバー・ラボラトリープレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）；コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州；１９８９年）；マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、３８７−３８９頁（コールドスプリングハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州；１９８２年）；ツチヤ（Ｔｓｕｃｈｉｙａ）ら、Ｏｒａｌ  Ｓｕｒｇｅｒｙ，Ｏｒａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｏｒａｌ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、７１（６）：７２１−７２５頁（１９９１年６月）；および米国特許第５，９８９，８３８号明細書、米国特許第５，９７２，３５３号明細書、米国特許第５，９８１，７１１号明細書、ならびに米国特許第６，０５１，２２６号明細書に記載されている。
【００６８】
ＭＮゲノム配列（配列番号３）を含むプラスミド−Ａ４ａクローンならびにＸＥ１およびＸＥ３サブクローンは、１９９５年６月６日、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に、それぞれＡＴＣＣ寄託番号９７１９９、９７２００、および９７１９８として寄託された。
【００６９】
完全ＭＮゲノム領域のエクソン−イントロン構造
オーバーラップクローンの完全配列は、１０，８９８ｂｐ（配列番号３）を含む。ヒトＭＮ遺伝子は、１１のエクソンならびに２つの上流反復要素および６つのイントロンＡｌｕ反復要素を含んでなる。エクソンは全て、４４５ｂｐである第１エクソンを除いて２７ｂｐから１９１ｂｐの範囲と小型である。イントロンのサイズは、８９ｂｐから１４００ｂｐの範囲である。ＣＡドメインは、エクソン２〜８によりコードされ、一方、エクソン１、１０および１１は、それぞれＭＮ／ＣＡ ＩＸタンパク質のプロテオグリカン様ドメイン、膜貫通アンカーおよび細胞質テールに相当する。下表１は、ＡＧ−ＧＴモチーフを含むコンセンサススプライス配列に合致するスプライスドナーおよびアクセプター配列を掲げている［マウント（Ｍｏｕｎｔ）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１０：４５９−４７２頁（１９８２年）］。
【表１】
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【００７０】
ＭＮ遺伝子転写開始部位および終結部位のマッピング
ザバダ（Ｚａｖａｄａ）らの国際公開第９５／３４６５０号パンフレットには、ＭＮ遺伝子転写開始部位および終結部位をマッピングする方法が記載されている。ＲＮアーゼ保護アッセイを、ＭＮ遺伝子の５'末端の精密マッピングに使用した。プローブは、均一に標識された４７０ヌクレオチドコピーＲＮＡ（ｎｔ−２０５から＋２６５）［配列番号６６］であり、そのプローブをＭＮを発現するＨｅＬａ細胞およびＣＧＬ３細胞からの全ＲＮＡにハイブリダイズさせ、配列決定ゲル上で分析した。その分析は、ＭＮ遺伝子転写が複数部位で開始し、最も長いＭＮ転写物の５'末端は、ＲＡＣＥにより以前特徴づけられたものよりも３０ｎｔ長いことを示した。
【００７１】
マウスＣａｒ９ｃＤＮＡ
マウスＣＡ ＩＸをコードするｃＤＮＡおよび遺伝子のクローニングおよび特徴づけは、以前に記載されている［オルトバ−ガット（Ｏｒｔｏｖａ−Ｇｕｔ）ら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ、１２３：１８８９−１９０３頁（２００２年）］。マウスＣａｒ９ｃＤＮＡ断片を、ヒトｃＤＮＡ由来のプライマーおよびＣ５７ ＢＬ／６Ｊマウスの胃から単離されたテンプレートＲＮＡを用いてＲＴ  ＰＣＲにより単離した。完全長ｃＤＮＡは、５'／３'双方の方向においてｃＤＮＡ末端の高速増幅により得られた。完全長ｃＤＮＡは、４９ｂｐの５'非翻訳領域、１３１１ｂｐのオープンリーディングフレームおよび６２２ｐの３'非翻訳配列からなる１９８２ｂｐを包含する（登録番号ＡＪ２４５８５７；配列番号７１のもとでＥＭＢＬデータベースに寄託された）。
【００７２】
Ｃａｒ９ ｃＤＮＡは、４７．３ｋＤａの理論的分子量を有する４３７のアミノ酸タンパク質（登録番号ＣＡＣ８０９７５（Ｑ８ＶＤＥ４）；配列番号７３としてＥＭＢＬデータベースに寄託された）のコード能を有する。マウスタンパク質は、そのヒト相同体と６９．５％の配列同一性を示し、同様の推定されたドメイン配列を有する［オパブスキー（Ｏｐａｖｓｋｙ）ら、（１９９６年）］。アミノ酸（ａａ）１〜３１（配列番号７４）は、シグナルペプチドに相当する。成熟タンパク質（ａａ３２〜３８９）（配列番号７５）のＮ末端細胞外領域は、プロテオグリカン様領域（ａａ４８〜１０７）（配列番号７６）、および炭酸脱水酵素ドメイン（ａａ１１２〜３６９）（配列番号７７）からなる。Ｃ末端領域（ａａ３９０〜４３７）（配列番号７８）は、膜貫通アンカー（ａａ３９０〜４１１）（配列番号７９）および短細胞質テール（ａａ４１２〜４３７）（配列番号８０）からなる。マウスＣＡ ＩＸとヒトＣＡ ＩＸとの間の配列相違の大部分は、プロテオグリカン様（ＰＧ）領域内に見られたが、一方、ＣＡドメインは最も高度に保存されていることが明らかとなった。しかしながら、酵素活性部位に関与する５つの重要なアミノ酸（Ｈｉｓ９４、Ｈｉｓ９６、Ｇｌｕ１０６、Ｈｉｓ１１９、Ｔｈｒ１９９）のうち、ヒトＣＡ ＩＸでは全てが保存されるが、マウスのイソ酵素では１つが変化する（Ｔｈｒ１９９→Ｓｅｒ）。その置換にもかかわらず、スルホンアミドアガロースに結合されたマウスＣＡ ＩＸは、酵素活性を有し得ることが示唆される。
【００７３】
Ｃａｒ９ ｃＤＮＡの利用により、マウス組織におけるＣａｒ９ ｍＲＮＡの発現パターンの分析を可能にした。ＣＡドメインをコードする領域の３'部分を検出するために設計された１７０ｂｐのリボプローブによりリボヌクレアーゼ保護アッセイ（ＲＮＰ）を実施した。ヒトおよびラットの組織における分布に基づいて予想されたとおり、最高レベルのＣａｒ９ ｍＲＮＡが、マウスの胃に検出された。中等度レベルのＣａｒ９ ｍＲＮＡは、小腸および大腸に見られたが、一方、腎臓および脳では、極めて弱い発現を示した。肝臓および脾臓は陰性であった。注目すべきことに、ＲＮＰシグナルはまた、胎仔日齢Ｅ１８．５におけるマウス胎仔に存在したが、Ｅ１０．５における胎仔幹細胞には存在しなかった。これは、マウス胃腸管の発育におけるＣＡ ＩＸに関する役割を示唆し得る。
【００７４】
マウスＣａｒ９遺伝子の編成
Ｃａｒ９遺伝子を単離し、その編成を特定するために、完全長Ｃａｒ９ ｃＤＮＡを、ｐＢＡＣ１０８Ｌにおけるマウス胎仔幹細胞１２９／Ｏｌａゲノムライブラリーのスクリーニングに用いた。マウス野生型ゲノムＤＮＡの制限マッピングおよびサザンブロット解析により確認されたように、完全Ｃａｒ９ゲノム配列を含む１つのＢＡＣＭ−３５５（Ｇ１３）クローンが得られた。このクローンから誘導された３つのオーバーラップゲノム断片を、ｐブルースクリプトＩＩ ＫＳにサブクローン化した。
【００７５】
ゲノム配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＹ０４９０７７；配列番号７２）の分析により、Ｃａｒ９遺伝子は、６．７ｋｂのマウスゲノムを含み、１１のエクソンおよび１０のイントロンからなることが明らかとなった。イントロンの分布およびエクソン対タンパク質ドメインの関係は、ヒトのものと同様である［オパブスキー（Ｏｐａｖｓｋｙ）ら、（１９９６年）］。サザンハイブリダイゼーションパターンにより、Ｃａｒ９が単一コピー遺伝子であることが示された。５．９ｋｂを包含し、プロモーター領域およびエクソン１〜６にわたる大腸菌（ＥｃｏＲｉ）−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を、標的ベクターの構築に用いた。
【００７６】
ＭＮタンパク質および／またはポリペプチド
語句「ＭＮタンパク質および／またはポリペプチド」（ＭＮタンパク質／ポリペプチド）とは、ＭＮ遺伝子またはその断片によりコードされるタンパク質および／またはポリペプチドを意味するとして本明細書に定義される。本発明による代表的な好ましいＭＮタンパク質は、図８に示される推定アミノ酸配列を有する。好ましいＭＮタンパク質／ポリペプチドは、図８に示されたＭＮタンパク質と実質的に相同性を有するタンパク質および／またはポリペプチドである。例えば、そのような実質的に相同なＭＮタンパク質／ポリペプチドは、本発明のＭＮ特異的抗体、好ましくはＭＡｂ Ｍ７５、Ｖ／１０、ＭＮ１２、ＭＮ９およびＭＮ７またはそれらの等価体と反応性であるものである。Ｍ７５ ｍａｂを分泌するＶＵ−Ｍ７５ハイブリドーマは、１９９２年９月１７日、ＨＢ１１１２８としてＡＴＣＣに寄託された。
【００７７】
「ポリペプチド」または「ペプチド」は、ペプチド結合により共有結合したアミノ酸の鎖であり、本明細書において５０以下のアミノ酸からなると考えられている。「タンパク質」は、本明細書において５０以上のアミノ酸からなるポリペプチドであると定義される。用語のポリペプチドは、用語のペプチドおよびオリゴペプチドを包含する。本明細書に用いられる「ＡＳのＭＮ／ＣＡ ＩＸ」、「ＡＳのＣＡ ＩＸ」または「ＡＳのＭＮ」とは、ＡＳ型のＭＮ／ＣＡ９ ｍＲＮＡによりコードされたタンパク質および／またはポリペプチドのことである。
【００７８】
ＭＮタンパク質は、幾つかの興味深い特徴：細胞膜局在性、ＨｅＬａ細胞における細胞密度依存的な発現、ＨｅＬａ×線維芽細胞体細胞ハイブリッドの腫瘍形成表現型との関連性、および数ある組織の中で、多くのヒト癌における発現を示す。ＭＮタンパク質は、一般に対応する正常な組織には認められないが、腫瘍組織切片では直接見ることができる（正常な胃粘膜および胆嚢組織のような上記の例外）。ＭＮはまた、形成異常および／または悪性疾患を示す組織検体の形態学的には正常に見える領域に時に発現する。まとめると、これらの特徴は、細胞増殖、分化および／または悪性転換の調節におけるＭＮの関与を示している。
【００７９】
インビボで新生物細胞により産生されるタンパク質またはポリペプチドは、細胞培養における腫瘍細胞により、または形質転換細胞により産生されるタンパク質またはポリペプチドとは、配列が変化し得ることを認識できる。したがって、限定はしないが、アミノ酸置換、伸長、欠失、切断およびそれらの組合せなど、アミノ酸配列を変化させたＭＮタンパク質および／またはポリペプチドは、本発明の範囲内に入る。体液中に存在するタンパク質は、タンパク質分解プロセスなどの分解プロセスに供されることもまた認識することができ；したがって、著しく切断されているＭＮタンパク質およびＭＮポリペプチドが、血清などの体液中に認められる。語句「ＭＮ抗原」は、本明細書では、ＭＮタンパク質および／またはポリペプチドを包含するものとして使用される。
【００８０】
ＭＮタンパク質およびポリペプチドのアミノ酸配列は、遺伝子操作により修飾され得ることがさらに認識されるであろう。１つ以上のアミノ酸を欠失させまたは置換することができる。そのようなアミノ酸の変化は、タンパク質またはポリペプチドの生物学的活性における測定可能な変化は生じさせず、本発明の範囲内にあるタンパク質またはポリペプチド、ならびにＭＮ突然変異タンパク質を生じ得る。
【００８１】
本発明のＭＮタンパク質およびポリペプチドは、本発明による種々の方法、例えば、組換え的、合成的、あるいは生物学的に、すなわちより長いタンパク質およびポリペプチドを酵素的および／または化学的に開裂させることにより、調製することができる。ＭＮタンパク質を調製するための好ましい方法は、組換え手法によるものである。
【００８２】
ＭＮタンパク質およびポリペプチドの組換え製造
ＭＮタンパク質、例えば、図８に示されたようなＭＮタンパク質またはその断片を調製するための代表的な方法は、ＭＮ ｃＤＮＡの完全長または適切な断片を、適切な発現ベクター内に挿入することであると考えられる。ザバダ（Ｚａｖａｄａ）らの国際公開第９３／１８１５２号パンフレットには、ベクターｐＧＥＸ−３Ｘ（ファルマシア（Pharmacia）社）の部分的ｃＤＮＡを用いて融合タンパク質ＧＥＸ−３Ｘ−ＭＮ（現在はＧＳＴ−ＭＮと称される）の製造について記載されている。ＸＬ１−ブルー細胞に由来する非グリコシル化ＧＳＴ−ＭＮ（ＭＮ融合タンパク質ＭＮグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）。
【００８３】
ザバダ（Ｚａｖａｄａ）らの国際公開第９５／３４６５０号パンフレットには、昆虫細胞から発現されたグリコシル化ＭＮタンパク質および発現プラスミドｐＥｔ−２２ｂ［ノバジェン（Novagen）社（米国ウィスコンシン州マジソン所在）］を用いて大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から発現された非グリコシル化ＭＮタンパク質双方の組換え製造が記載されている。組換えバキュロウィルス発現ベクターは、昆虫細胞を感染させるために使用された。グリコシル化ＭＮ２０−１９タンパク質は、バキュロウィルス感染ｓｆ９細胞［クロンテック（Clontech）社（米国カリフォルニア州パロアルト所在）］において組換え的に製造された。
【００８４】
ＭＮ特異的抗体の調製
用語の「抗体」は、抗体全体のみならず抗体の生物学的活性断片、好ましくは抗原結合性領域を含む断片を含むように本明細書に定義されている。ＭＮタンパク質および別の組織特異抗原に特異的である二重特異性抗体が、抗体の定義にさらに含まれる。
【００８５】
本発明の方法に従った有用な抗体は、従来の方法論および／または遺伝子工学により調製することができる。抗体断片は、好ましくは、超可変領域等の、軽鎖および／または重鎖（ＶＨおよびＶＬ）の可変領域、さらにより好ましくは、ＶＨおよびＶＬ双方の領域から遺伝子操作することができる。例えば、本明細書に用いられる用語の「抗体」は、他の可能性の中でも「一価抗体」；共有結合であろうと非共有結合であろうともＦａｂ'およびＦ（ａｂ）２断片を含むＦａｂタンパク質；軽鎖または重鎖単独、好ましくは、可変重鎖領域および可変軽鎖領域（ＶＨおよびＶＬ領域）、より好ましくは、超可変領域［あるいは、ＶＨおよびＶＬ領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）として知られている］を含み；１つ以上の抗原に結合できる「ハイブリッド」抗体；定常領域−可変領域のキメラ、異なる起源の重鎖および軽鎖を有する「複合」免疫グロブリン；特異性の改善および標準的な組換え技法、またオリゴヌクレオチド特異的変異誘発技法により調製された他の特徴を有する「改変」抗体などのポリクローナル抗体ならびにモノクローナル抗体および生物学的に活性なそれらの断片を含む［ダルバディー−マクファリアンド（Ｄａｌｂａｄｉｅ−ＭａｃＦａｒｌａｎｄ））ら、「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ａｓ  ａ  ｇｅｎｅｒａｌ  ａｎｄ  ｐｏｗｅｒｆｕｌ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ」、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ７９：６４０９頁（１９８２年）］。
【００８６】
多数の使用に関して、特に医薬品用、またはインビボ追跡用の使用に関して、部分的またはより好ましくは、完全なヒト化抗体および／または生物学的に活性な抗体断片が、特に最も適切であることが見出され得る。このようなヒト化抗体／抗体断片は、当業界に周知の方法により調製することができる。
【００８７】
ＭＮタンパク質／ポリペプチドを同定するために本発明に従った有用な抗体は、従来の様式、例えば、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）などの酵素、蛍光化合物、または多くの他の標識があるが、中でも１２５Ｉなどの放射性同位元素により標識化することができる。本発明による好ましい標識は１２５Ｉであり、抗体を標識する好ましい方法は、クロラミン−Ｔの使用によるものである［ハンター，Ｗ．Ｍ．（Ｈｕｎｔｅｒ，Ｗ．Ｍ．）、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ１４．１−１４．４０頁における「Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ」（Ｄ．Ｗ．ウェア（Ｄ．Ｗ．Ｗｅｉｒ）編集；ブラックウェル（Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ）、オックスフォード／ロンドン／エジンバラ／メルボルン；１９７８年）］。他の代表的な標識としては、例えば、多くの他の可能性があるが、中でもアロフィコシアニンおよびフィコエリトリンを挙げることができる。
【００８８】
ザバダ（Ｚａｂａｄａ）らの国際公開第９３／１８１５２号パンフレットおよび国際公開第９５／３４６５０号パンフレットには、ＭＮ特異的抗体を製造するための詳細な方法、およびＭ７５、ＭＮ７、ＭＮ９、ならびにＭＮ１２モノクローナル抗体として代表的なＭＮ特異的抗体を調製するための詳細なステップが記載されている。
【００８９】
エピトープ
エピトープを含むペプチドに対するＭＡｂの親和性は、文脈において、例えば、そのペプチドが、短い配列（４〜６のａａ）であるかどうか、またはこのような短ペプチドが、片側または両側に、より長いａａ配列によってフランクされているかどうか、またはエピトープに関する試験において、そのペプチドが溶液中にあるか、または表面に固定されているかどうかによって決まる。したがって、ＭＮ特異的ＭＡｂに関して本明細書に記載された代表的なエピトープは、これらＭＡｂの使用の文脈において変わり得ることが当業者によって予想されるであろう。
【００９０】
用語の「ＭＮタンパク質／ポリペプチドのエピトープに相当する」は、ある場合において、天然タンパク質またはポリペプチドのアミノ酸配列の変更が、抗原性であり、新生物疾患に対する防御免疫および／または抗腫瘍形成効果を付与し得る実用的な可能性を含むことが理解されるであろう。可能な配列変更としては、限定はしないが、アミノ酸置換、伸長、欠失、切断、内挿およびそれらの組合せが挙げられる。このような変更を含むタンパク質またはポリペプチドが免疫原性であり、このようなポリペプチドまたはタンパク質によって誘発された抗体が、ワクチンとして投与された場合に防御免疫および／または抗腫瘍形成活性を提供するのに十分な程度に、天然ＭＮタンパク質およびポリペプチドと交差反応するという条件で、このような変更は本発明の考慮された範囲内に入る。
【００９１】
ＰＧドメインおよび隣接領域における免疫優性エピトープ
上記のとおり、完全長ＣＡ ＩＸの細胞外ドメインは、ＰＧおよびＣＡドメインならびに幾つかのスペーサーあるいはヒンジ領域を含んでなる。ＣＡ ＩＸの免疫優性エピトープは、主として約ａａ５３〜１１１（配列番号８）または約ａａ５２〜１２５（配列番号８１）におけるＰＧ領域にあり、好ましくはここでは約ａａ５２〜１２５（配列番号８１）にあると考えられる。ＣＡ ＩＸの免疫優性エピトープは、ＰＧ領域に隣接する領域に位置し得る。例えば、ａａ３６〜５１（配列番号２１）に関するエピトープは、免疫優性エピトープであると考えられるであろう。
【００９２】
主要なＣＡ ＩＸの免疫優性エピトープは、Ｍ７５ ｍａｂに対するものである。Ｍ７５モノクローナル抗体は、ＣＡ ＩＸのＮ末端プロテオグリカン様（ＰＧ）領域における免疫優性エピトープに特異的であると考えられる。アミノ酸配列の整列により、ＭＮ／ＣＡ ＩＸタンパク質ＰＧ領域（ａａ５３〜１１１）［配列番号８］とヒトアグリカン（ａａ７８１〜８３９）［配列番号１０］との間でかなりの相同性が示される。Ｍ７５のエピトープは、ＣＡ ＩＸのＮ末端ＰＧ領域において４回等しく反復されているアミノ酸配列ＰＧＥＥＤＬＰ（配列番号１１）として同定されている［Ｚａｖａｄａ（ザバダ）ら（２０００年）］。代表的な免疫優性エピトープでもあり、Ｍ７５ ｍａｂも結合し得る密接に関連するエピトープとして、例えば、推定ＣＡ ＩＸアミノ酸配列を示す図８Ａ〜８Ｃのアミノ酸（ａａ）６１〜９６（配列番号１２）に見ることができる免疫優性の６回タンデム反復が挙げられる。ＰＧドメイン内の免疫優性のタンデム反復エピトープの変異としては、ＧＥＥＤＬＰ（配列番号１３）（ａａ６１〜６６、ａａ７９〜８４、ａａ８５〜９０およびａａ９１〜９６）、ＥＥＤＬ（配列番号１４）（ａａ６２〜６５、ａａ８０〜８３、ａａ８６〜８９、ａａ９２〜９５）、ＥＥＤＬＰ（配列番号１５）（ａａ６２〜６６、ａａ８０〜８４、ａａ８６〜９０、ａａ９２〜９６）、ＥＤＬＰＳＥ（配列番号１６）（ａａ６３〜６８）、ＥＥＤＬＰＳＥ（配列番号１７）（ａａ６２〜６８）、ＤＬＰＧＥＥ（配列番号１８）（ａａ８２〜８７、ａａ８８〜９８）、ＥＥＤＬＰＳ（配列番号１９）（ａａ６２〜６７）およびＧＥＤＤＰＬ（配列番号２０）（ａａ５５〜６０）が挙げられる。他の免疫優性エピトープとしては、例えば、ａａ６８〜９１（配列番号２２）が挙げられるであろう。
【００９３】
モノクローナル抗体ＭＮ９およびＭＮ１２は、それぞれＮ末端ＰＧ領域の配列番号１９〜２０内の免疫優性エピトープに特異的であると考えられる。ＭＮ７モノクローナル抗体は、図８Ａ〜８Ｃのａａ１２７〜１４７（配列番号２３）においてＰＧ領域に隣接する免疫優性エピトープに特異的であり得る。
【００９４】
ＣＡドメイン（配列番号９）内で好ましいと考えられるエピトープは、約ａａ２７９〜２９１（配列番号６７）に由来する。細胞内ドメイン（ＩＣドメイン）（配列番号７）内で好ましいと考えられるエピトープは、約ａａ４３５〜４５０（配列番号６８）に由来する。
【００９５】
配列番号６９（図８Ａ〜８Ｃのａａ１６６〜３９７）は、ＣＡドメインの重要な抗原性成分であると考えられる。ＣＡドメイン内には幾つかの抗原性部位がある。ＣＡドメインに特異的になるように、ＣＡ ＩＸ欠失マウスにおいて調製された４つの群のＣＡ ＩＸ特異的モノクローナル抗体があり；これらの群のうちの３つの群は配列番号６９に対するものである。抗原性部位は、アミノ酸１３５〜１６６（配列番号８４）にもまた部分的に位置し得る。ＭＮタンパク質の炭酸脱水酵素ドメインに特異的に結合する代表的な好ましいＭＮ特異的抗体は、登録番号ＬＭＢＰ６００９ＣＢとしてベルギー国ヘント所在の「ＢＣＣＭ」／ＬＭＢＰに寄託されたハイブリドーマＶＵ−Ｖ／１０により産生されるＶ／１０ Ｍａｂである。
【００９６】
アッセイ
組織中のＡＳおよびＦＬのＭＮ／ＣＡ ＩＸ発現に関するスクリーンのためのアッセイ
この方法は、もしあれば、前新生物疾患／新生物疾患と診断された患者から採取したサンプルに存在するＡＳおよび／またはＦＬのＭＮ／ＣＡ９遺伝子発現産物に関するスクリーニングを含むことができ；ＭＮ／ＣＡ９遺伝子発現産物は、ＭＮタンパク質、ＭＮポリペプチド、ＭＮタンパク質またはＭＮポリペプチドをコードするｍＲＮＡ、ＭＮタンパク質またはＭＮポリペプチドをコードするｍＲＮＡに相当するＡＳまたはＦＬ型のｃＤＮＡであり得る。
【００９７】
多数のフォーマットを、本発明の方法による使用に適応させることができる。ＡＳおよび／またはＦＬのＭＮ ｍＲＮＡの検出および定量化は、例えば、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲまたは定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲなどの核酸増幅法により実施することができるか、またはマイクロアレイチップの使用により実施することができる。ＡＳおよび／またはＦＬのＭＮタンパク質またはＭＮポリペプチドの検出および定量化は、当該技術分野で一般に公知のアッセイは他にもあるが、中でもウェスタンブロット、酵素結合免疫吸着アッセイ、放射免疫アッセイ、競合免疫アッセイ、デュアル抗体サンドイッチアッセイ、免疫組織化学染色アッセイ、凝集アッセイ、蛍光免疫アッセイ、免疫電子顕微鏡および免疫金を用いる走査型顕微鏡により実施することができる。このようなアッセイにおけるＭＮ ＡＳおよび／またはＦＬ遺伝子発現産物の検出は、当該技術分野で公知の従来法により適応させることができる。
【００９８】
核酸プローブおよび／またはプライマー
本発明の核酸プローブおよび／またはプライマーは、図８に示されたＭＮ ｃＤＮＡ配列［配列番号１］または図９Ａ〜Ｆの完全ゲノム配列［配列番号３］等の他のＭＮ遺伝子配列に、相補的または実質的に相補的である配列を含むものである。語句の「実質的に相補的」は、当該技術分野で十分に理解され、したがって標準的なハイブリダイゼーション条件の文脈において用いられる意味を有するように本明細書に定義される。ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーは、相補性の精度を制御するために調整することができる。２つの核酸は、例えば、それらがストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で互いにハイブリダイズする場合、互いに実質的に相補的である。上記に示したように、少なくとも８０〜９０％、好ましくは少なくとも９０％の相同性を有する極めて密接に関連するｎｔ配列だけが、ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズすると考えられる。
【００９９】
本発明に使用される特に好ましいプローブおよび／またはプライマーは、完全長［ＦＬ］ＭＮ／ＣＡ９ ｍＲＮＡ発現と、選択的にスプライスされた［ＡＳ］ＭＮ／ＣＡ９ ｍＲＮＡ発現とを識別するプローブおよび／またはプライマーである。最近の多数の論文は、癌における選択的スプライシングに関する一般情報、および癌関連遺伝子により発現されたｍＲＮＡ変異体を検出するために使用された特定のプローブおよび／またはプライマーの設計に関する特定の情報を提供しており、そこからプローブおよび／またはプライマーが、ＡＳおよび／またはＦＬ ＣＡ９ ｍＲＮＡ変異体を検出するために設計され得る［例えば、マトリン（Ｍａｔｌｉｎ）ら、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．６：３８６−３９８頁（２００５年）；ベナブルスＪＰ（Ｖｅｎａｂｌｅｓ  ＪＰ）、ＢｉｏＥｓｓａｙｓ、２８：３７８−３８６頁（２００６年）；スコセイム（Ｓｃｏｔｈｅｉｍ）およびネス（Ｎｅｅｓ）、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、３９（７−８）：１４３２−１４４９頁（２００７年）；スレブロウ（Ｓｒｅｂｒｏｗ）およびコーンブリット（Ｋｏｒｎｂｌｉｈｔｔ）、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．、１１９（第１３部）：２６３５−２６４１頁（２００６年）；ゴーシー（Ｇｏｔｈｉｅ）ら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２７５：６９２２−６９２７頁（２０００年）；ロビンソン（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ）ら、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．、１１４：８５３−８６５頁（２００１年）；フー（Ｈｅ）ら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、２５：２１９２−２２０２頁（２００６年）；ロイ（Ｒｏｙ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、３３（１６）：５０２６−５０３３頁（２００５年）；タコーネリ（Ｔａｃｏｎｅｌｌｉ）ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ６：３４７−３６０頁（２００４年）を参照］。１つの方法において、ＦＬ ＣＡ９ ｍＲＮＡだけを検出するために使用される少なくとも１種のプローブまたはプライマーが、ＡＳ ＣＡ９ ｍＲＮＡにおいて欠失された領域内から全体的にまたは部分的に誘導され、一方、ＡＳ ＣＡ９ ｍＲＮＡだけを検出するために使用される少なくとも１種のプローブまたはプライマーは、選択的スプライシングで生じたジャンクションから誘導されるであろう。例えば、ヒトＦＬのＭＮ／ＣＡ９特異的プローブ／プライマーは、ヒトＭＮ／ＣＡ９遺伝子のエクソン８またはエクソン９に対して十分な特異性を有し、特異的に結合することが好ましく、またはヒトＭＮ／ＣＡ９遺伝子のエクソン７と８のスプライスジャンクション、エクソン８と９のスプライスジャンクション、エクソン９と１０のスプライスジャンクションに対して十分な特異性を有し、好ましくは特異的に結合する核酸を含みうる；あるいは、任意のこれらの配列に対して十分な特異性を有し、好ましくは特異的に結合するのに十分に相同的な核酸を含みうる。同様にヒトＡＳのＭＮ／ＣＡ９特異的プローブ／プライマーは、ヒトＭＮ／ＣＡ９遺伝子のエクソン７および１０のスプライスジャンクションに対して十分な特異性を有し、好ましくは特異的に結合する核酸を含みうる；あるいは、そのスプライスジャンクション位に対して十分な特異性を有し、好ましくは特異的に結合するための十分に相同的な核酸を含みうる。あるいは、プローブおよび／またはプライマーは、ＦＬおよびＡＳ双方のＣＡ９ ｍＲＮＡ、ならびに例えば、ゲル上で長さにより識別されたＦＬおよびＡＳ型のｍＲＮＡ産物を検出するために使用できるであろう。
【０１００】
ＭＮ選択的スプライシング変異体に基づく癌治療
多くの論文において、癌関連遺伝子の選択的スプライシング変異体に基づく癌治療が検討されており、他にも治療法があるが、中でもアンチセンスおよびＲＮＡ干渉療法に使用されるオリゴヌクレオチドの設計に関する戦略が提供されている［例えば、ガルシア−ブランコ（Ｇａｒｃｉａ−Ｂｌａｎｃｏ）、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．、７（５）：４７６−４８２頁（２００５年）；ウィルトン（Ｗｉｌｔｏｎ）およびフレッチャー（Ｆｌｅｔｃｈｅｒ）、Ｃｕｒｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、５（５）：４６７−４８３頁（２００５年）；パジャレス（Ｐａｊａｒｅｓ）ら、Ｌａｎｃｅｌ  Ｏｎｃｏｌ．、８（４）：３４９−３５７頁（２００７年）；シンＹ．（Ｘｉｎｇ  Ｙ．）、Ｆｒｏｎｔ  Ｂｉｏｓｃｉ．、１２：４０３４−４０４１頁（２００７年）］。例えば、当業者は、それぞれ配列番号１および１０８の核酸配列からヒトＡＳ ＣＡ９ ｍＲＮＡには特異的ではないが、ヒトＦＬ ＣＡ９ ｍＲＮＡに特異的な適切なアンチセンス核酸配列、好ましくはアンチセンスオリゴヌクレオチドを特定することができるであろう。
【０１０１】
ＡＳ型のＣＡ９ ｍＲＮＡにより発現されたＡＳのＭＮ／ＣＡ ＩＸ全体に加えて、単離されたＡＳのＭＮ／ＣＡ ＩＸタンパク質またはポリペプチド断片が、ＦＬのＭＮ／ＣＡ ＩＸ活性を阻害する能力を有し得ることを当業者は予想するであろう。したがって、ＦＬのＭＮ／ＣＡ ＩＸの活性を阻害するＡＳのＭＮ／ＣＡ ＩＸ由来の任意のタンパク質またはポリペプチドは、本発明の治療法の範囲内で考慮されている。
【０１０２】
ＭＮ  ＲＮＡ干渉（ＭＮ  ＲＮＡｉ）
ＭＮ遺伝子の発現阻害は、例えば、ＭＮ遺伝子の発現に対するＲＮＡ干渉効果を適用することによって実施することができる。ＲＮＡ干渉は、近年報告されたようにＲＮＡを用いることによって遺伝子発現を阻害するための方法である［エルバシア（Ｅｌｂａｓｈｉｒ）ら、Ｎａｔｕｒｅ、４１１：４９４−４９８頁（２００１年）］。さらに詳細には、ＭＮ遺伝子の発現は、ＭＮ遺伝子の特定のｍＲＮＡスプライス変異体（ＦＬスプライス変異体など）の発現に対してＲＮＡ干渉効果を示す１種類以上のオリゴヌクレオチドを用いることによって阻害することができる。
【０１０３】
ＭＮ遺伝子のｍＲＮＡスプライス変異体の発現阻害は、細胞にｃＤＮＡの断片を含むベクターまたはその相補的ＲＮＡを形質移入することにより実施することができる。したがって、前記オリゴヌクレオチドを含んでなるＭＮスプライス変異体を阻害する薬剤もまた、本発明の範囲内に含まれる。ＭＮ ｍＲＮＡスプライス変異体を阻害する薬剤は、１種のオリゴヌクレオチドを含むことができるか、または２種以上のオリゴヌクレオチドを含むことができる。ＲＮＡ干渉効果を示す前記オリゴヌクレオチドは、ＭＮ遺伝子発現系を用いてＦＬ ｍＲＮＡ変異体の発現を特異的にサイレンシングするオリゴヌクレオチドを選択することによって、ＭＮ遺伝子のＡＳおよび／またはＦＬ ｍＲＮＡ変異体のヌクレオチド配列に基づいて設計されるオリゴヌクレオチドから得ることができる。
【０１０４】
ＭＮ遺伝子治療ベクター
オリゴヌクレオチドを用いてＦＬ ＭＮ／ＣＡ ＩＸの発現を阻害するために、遺伝子治療の使用により標的細胞にオリゴヌクレオチドを導入することが可能である。遺伝子治療は、既知の方法を用いることによって実施することができる。例えば、注入により直接オリゴヌクレオチドを投与する工程を有してなる非ウィルス性形質移入、またはウィルスベクターを用いる形質移入のいずれかを用いることができる。非ウィルス性形質移入に関する好ましい方法は、オリゴヌクレオチドを含むリポソームなどのリン脂質小胞を投与することを含む方法、ならびに注入により直接オリゴヌクレオチドを投与することを含む方法がある。形質移入に使用される好ましいベクターは、ウィルスベクター、より好ましくは、レトロウィルスベクター、アデノウィルスベクター、アデノ関連ウィルスベクターおよびワクシニアウィルスベクターなどのＤＮＡウィルスベクター、またはＲＮＡウィルスベクターである。
【０１０５】
材料および方法
細胞培養、組織および抗体
マウスＮＩＨ  ３Ｔ３線維芽細胞、イヌＭＤＣＫ上皮細胞、腎癌由来のヒト腫瘍細胞株ＣＡＫＩ−１およびＡＣＨＮ、ならびに子宮頚部癌由来のＣａｓｋｉ、ＳｉＨａ、ＨｅＬａ、およびＣ３３ａ系を、３７℃、５％ＣＯ２で加湿下、１０％ＦＣＳ（バイオウィタカー（BioWhittaker）社（ベルギー国ベルビエ所在））および４０μｇ／ｍｌのゲンタマイシン（レック社（スロベニア国所在）で補足されたＤＭＥＭ中で培養した。低酸素処理は、３７℃、２％Ｏ２、５％ＣＯ２、１０％Ｈ２および８３％Ｎ２中、嫌気性ワークステーション（ラスキンテクノロジーズ（Ruskin Technologies）社（英国ブリジェンド所在））内で実施した。
【０１０６】
ＨｅＬａ細胞のスフェロイドを、３７℃で３日間、組織培養皿のふたに懸滴させた培地２０μｌ当り４００の細胞から予め形成した。生じた細胞凝集体を、非接着表面のペトリ皿に移し、３日目ごとに培地を交換しながらさらに１１日間懸濁液中で培養した。このスフェロイドを、ニコンＥ４００顕微鏡で調べて、ニコンクールピクス９９０カメラで撮影した。
【０１０７】
ヒト組織は、以前に記載された（キベラ（Ｋｉｖｅｌａ）ら、２００５年）採取物から選択された。マウス組織は、子宮頚部転移により殺処理されたＢＡＬＢ／ｃマウスから切開された。この組織を、ＲＮＡ単離および／またはタンパク質抽出に使用するまで−８０℃で保存した。
【０１０８】
ヒトＭＮ／ＣＡ ＩＸタンパク質に特異的なＭ７５およびＶ／１０マウスＭＡｂは、以前に同定されている（パストレコバ（Ｐａｓｔｏｒｅｋｏｖａ）ら、１９９３年、ザトビコバ（Ｚａｔｏｖｉｃｏｖａ）ら、２００３年）。二次抗マウスペルオキシダーゼ複合化抗体および西洋わさびペルオキシダーゼと複合化した抗ウサギ抗体は、セバファーマ（Sevapharma）社（チェコ共和国プラハ所在）から入手した。抗マウスＦＩＴＣ複合化抗体は、ベクターラボラトリーズ（Vector Laboratories）社（米国カリフォルニア州バーリンガム所在）から入手した。Ａｌｅｘａ４８８複合化抗ウサギ二次抗体は、アドバンスト・ターゲッティング・システムズ（Advanced Targeting Systems）社（米国カリフォルニア州サンディエゴ所在）から入手した。
【０１０９】
免疫蛍光法
免疫蛍光法を、以前に記載されたとおりに実施した（スバストバ（Ｓｖａｓｔｏｖａ）ら、２００４年）。カバーガラス上で増殖させた細胞を氷冷ＰＢＳで２回すすぎ、冷メタノールにより−２０℃で５分間固定した。このカバーグラスを、１％ＢＳＡを含むＰＢＳにより３７℃で３０分間インキュベートし、次いで１：１０００に希釈されたｍＣＡ ＩＸに対しＭ７５ ｍａｂまたはウサギポリクローナル血清を含む非希釈ハイブリドーマ培地と共にインキュベートした。マウスＣＡ ＩＸタンパク質に対する抗体は、他でも記載されている（ガット（Ｇｕｔ）ら、２００２年）。一次抗体とのインキュベーションを、３７℃での加湿チャンバ内で１時間実施した。このカバーグラスを、０．０２％のツイーン２０を含むＰＢＳで１０分間３回洗浄し、次にＰＢＳ中０．５％ＢＳＡ中、１：３００に希釈されたフルオレセイン複合化抗マウス二次抗体で処理するか、またはＰＢＳ中０．５％ＢＳＡ中、１：１０００に希釈された抗ウサギＡｌｅｘａ４８８複合化二次抗体で処理した。ＰＢＳで１０分間、３回すすいだ後、このカバーグラスを装着媒体（カルビオケム（Calbiochem）社（米国マサチューセッツ州ケンブリッジ所在））と共に顕微鏡スライド上に乗せ、次にニコン社のＥ４００顕微鏡で調べてニコンクールピクス９９０カメラで撮影した。
【０１１０】
発現プラスミド
マウススプライシング変異体をコードする真核生物発現プラスミドｐＳＧ５Ｃ−ｍＡＳを、マウスＣＡ９ ｃＤＮＡを含むｐＳＧ５Ｃ−Ｃａｒ９プラスミドから逆ＰＣＲにより作出した。順方向プライマーは、エクソン９（ｍ９Ｓ、５'−ＴＣＣＡＴＧＴＧＡＡＴＴＣＣＴＧＣＴＴＣＡＣＴＧ−３'）［配列番号１０２］の開始点に対して設計され、逆方向プライマーは、エクソン６（ｍ６Ａ、５'−ＣＴＴＣＣＴＣＣＧＡＧＡＴＴＴＣＴＴＣＣＡＡＡＴ−３'）［配列番号１０３］の終止点に特異的であった。同様に、ヒトスプライシング変異体をコードする真核生物発現プラスミドｐＳＧ５Ｃ−ＡＳを、エクソン１０および７に対するプライマーを用いて完全長ヒトＣＡ９ ｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ番号Ｘ６６８３９）を含むｐＳＧ５Ｃ−ＭＮ／ＣＡ９発現プラスミド（パストレク（Ｐａｓｔｏｒｅｋ）ら、１９９４年）から逆ＰＣＲにより作出した。順方向プライマー（ｈ１０Ｓ、５'−ＧＴＧＡＣＡＴＣＣＴＡＧＣＣＣＴＧＧＴＴＴＴＴ−３'）［配列番号１０４］は、エクソン１０の開始点に特異的であり、逆方向プライマー（ｈ７Ａ、５'−ＣＴＧＣＴＴＡＧＣＡＣＴＣＡＧＣＡＴＣＡＣＴＧ−３'）［配列番号１０５］は、エクソン７の終止点に特異的であった。同じｈ７Ａおよびｈ１０Ｓプライマーを、シグナルペプチドなしの完全長ＣＡ ＩＸタンパク質をコードする一次プラスミド構成物ｐＧＥＸ−３Ｘ−ＣＡ９から、ヒトＣＡ ＩＸタンパク質のＧＳＴ融合スプライス変異体をコードする細菌発現ベクターｐＧＥＸ−３Ｘ−ＡＳの調製に使用した。ＰＣＲ増幅は、Ｐｈｕｓｉｏｎポリメラーゼ（フィンザイムス（Finnzymes）社（フィンランド国エスポー所在））を用いて実施した。ＰＣＲ反応は、９８℃で３０秒間の最初の変性、９８℃で１０秒間３２サイクルの変性、６４℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で１分４０秒間の伸長、最後に７２℃で５分間の伸長で構成された。ＰＣＲ産物をゲル精製し、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼで処理し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（インビトロジェン社（米国カリフォルニア州カールスバッド所在））とライゲーションさせた。全ての構成物を塩基配列決定法により検証した。ヒトＣＡ ＩＸの細胞外部分を含むＧＳＴ−ＰＧＣＡ融合タンパク質をコードする構成物は、以前に記載されている（ザトビコバ（Ｚａｔｏｖｉｃｏｖａ）ら、２００３年）。下表２に、実施例に使用されたプライマーの配列を提供する。
【表２】
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【０１１１】
形質移入
細胞を６０ｍｍのペトリ皿にプレーティングし、翌日およそ７０％の密度に達した。形質移入は、ヒトおよびマウスのＣＡ ＩＸのスプライシング変異体をコードするそれぞれ２μｇのｐＳＧ５Ｃ−ｈＡＳプラスミドおよびｐＳＧ５Ｃ−ｍＡＳプラスミド、２００ｎｇのｐＳＶ２ｎｅｏプラスミドと共に実施した。形質移入は、ヒトおよびマウスのＣＡ ＩＸのスプライシング変異体をコードするそれぞれ２μｇのｐＳＧ５Ｃ−ｈＡＳプラスミドおよびｐＳＧ５Ｃ−ｍＡＳプラスミド、２００ｎｇのｐＳＶ２ｎｅｏプラスミドと共に、Ｇｅｎｅ  Ｐｏｒｔｅｒ  ＩＩ形質移入剤（ゲンランティス（Genlantis）社（米国カリフォルニア州サンディエゴ所在））を用いて実施した。ＨｅＬａ細胞に関しては９００μｇ／ｍｌの濃度で、ＭＤＣＫ細胞に関しては５００μｇ／ｍｌの濃度でＧ４１８（インビトロジェン社製）を用いて、形質移入細胞を選別に供した。耐性コロニーをクローン化し、免疫ブロット法によりスプライシング変異体の発現を試験し、増殖させた。
【０１１２】
蛍光ＣＡ阻害剤の結合
蛍光ＣＡ阻害剤（ＦＩＴＣ−ＣＡ Ｉ）は、ホモスルファニルアミドとフルオレセインイソチオシアネートとの反応により得られ、ＣＡ ＩＸに対して２４ｎＭのＫｉ値を示した（スバストバ（Ｓｖａｓｔｏｖａ）ら、２００４年、セッチ（Ｃｅｃｃｈｉ）ら、２００５年）。この阻害剤を１００ｍＭの濃度で２０％のＤＭＳＯを有するＰＢＳ中に溶解し、細胞への添加直前に培地中で最終的に１ｍＭ濃度に希釈した。ＭＤＣＫ−ＣＡ ＩＸ細胞（スバストバ（Ｓｖａｓｔｏｖａ）ら、２００４年）を、ヒトＡＳ変異体を分泌するＭＤＣＫ−ＡＳ形質移入体から馴化培地を含めた培地に、３．５ｃｍの皿当り４×１０５細胞の密度でプレーティングした。対照細胞を、分泌ＡＳの不在下でインキュベートした。２４時間のインキュベーション後、同じ新鮮な培地を補充し、ＦＩＴＣ−ＣＡ Ｉを細胞に添加し、細胞を低酸素ワークステーションに移し、さらに４８時間結合させた。平行して酸素正常状態中でサンプルをインキュベートした。最後に細胞をＰＢＳで５回洗浄し、ニコンＥ４００エピ蛍光顕微鏡により検視した。蛍光強度は、Ｓｃｉｏｎ  Ｉｍａｇｅ  Ｂｅｔａ４．０２ソフトウェア（シオン社（Scion Corporation）（米国メリーランド州フレデリック所在））を用いて獲得した画像から評価し、相対的ＦＩＴＣ−ＣＡ Ｉ結合をパーセントで表した。
【０１１３】
タンパク質の抽出
タンパク質は、以前記載されたとおり（スバストバ（Ｓｖａｓｔｏｖａ）ら、２００４年）、ＲＩＰＡ緩衝液により、細胞単層または組織ホモジネートから抽出した。タンパク質は、プロテアーゼ阻害剤のＣｏｍｐｌｅｔｅ  ｍｉｎｉ（ロッシュ・アプライドサイエンス（Roche Applied Science）社（ドイツ国マンハイム所在））を含むＲＩＰＡ緩衝液（ＰＢＳ中、１％トリトンＸ−１００、０．１％デオキシコール酸ナトリウム、１ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオリド）により、細胞単層または組織ホモジネートから、氷上で３０分間、抽出した。抽出物は、１３０００ｒｐｍで１５分間、遠心分離し、総タンパク質濃度を、製造元の指示に従って、ＢＣＡアッセイ（ピアス（Pierce）社（米国イリノイ州ロックフォード所在））によって特定した。総タンパク質の抽出物（３０〜５０μｇを含むアリコート）を、２−メルカプトエタノール有り（還元条件）、または２−メルカプトエタノールなし（非還元条件）で、ラムリ（Laemmli）のサンプル緩衝液中、１０％および８％のＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて分離した。
【０１１４】
免疫沈降および免疫ブロット法
低酸素状態下および正常酸素状態下で２４時間、ＦＣＳなしでインキュベートしたＡＳ−形質移入細胞の培地から、細胞外ヒトＡＳの検出用サンプルを調製した。培地の１／４（５００μｌ）を１０倍に濃縮し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。免疫沈降用に、１ｍｌのハイブリドーマ培地中のＣＡ ＩＸ特異的ＭＡｂｓを、タンパク質−Ａセファロースの５０％懸濁液（ファルマシア（Pharmacia）社（スウェーデン国ウプサラ所在））２５μｌに、室温で２時間結合させた。細胞抽出物（２００μｌ）を、タンパク質−Ａセファロースの５０％懸濁液２０μｌで予備クリアしてから、結合したＭＡｂに加えた。タンパク質−Ａセファロース上に採取した免疫複合体を洗浄し、沸騰させ、以前記載されたとおり（ザトビコバ（Ｚａｔｏｖｉｃｏｖａ）ら、２００３年）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび免疫ブロット法に供した。タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて分離し、ポリビニリデンフルオリド（ＰＶＤＦ）膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ（商標）−Ｐ、ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）社（米国マサチューセッツ州ビレリカ所在））上にブロットした。この膜を、０．２％Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０を含むＰＢＳ中、５％無脂肪乳を含むブロック緩衝液で１時間処理し、次いで、ブロック緩衝液（１：２に希釈したハイブリドーマ培地中のＭ７５モノクローナル抗体または１：１０００に希釈したウサギ抗マウスＣＡ ＩＸポリクローナル抗体）中に希釈した一次抗体と共に１時間インキュベートした。処理後、膜を、０．２％のＮｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０を有するＰＢＳ中、４５分間完全に洗浄し、ブロック緩衝液中で１：７５００および１：５０００に希釈した、西洋わさびペルオキシダーゼに結合させたブタ抗マウスまたは抗ウサギ二次抗体（セバファーマ（Sevapharma）社製）と共に１時間インキュベートした。膜を、０．２％のＮｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０（シグマ（Ｓｉｇｍａ）社（米国ミズーリ州セントルイス所在））を含むＰＢＳ中で洗浄し、ＥＣＬ検出系により展開した。
【０１１５】
膜タンパク質および膜直下タンパク質の単離およびオリゴマーの分析のため、細胞をＰＢＳで洗浄し、ＲＩＰＡ抽出緩衝液と共に３０秒間、氷上でインキュベートした。タンパク質を有するＲＩＰＡ緩衝液を吸引し、細胞に新鮮なＲＩＰＡ緩衝液を加えた。次いで、残りのタンパク質を氷上で１５分間抽出した。ＣＡ ＩＸ特異的なＭＡｂ  Ｖ／１０（ＦＬを認識するが、ＡＳは認識しない）またはＭ７５（双方の変異体を認識する）を用いて先ずオリゴマーをＨｅＬａ−ＡＳ抽出物から免疫沈降させた。沈降させたオリゴマーの成分を、還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥ中に溶解し、ブロットし、ペルオキシダーゼ標識したＭ７５を用いて可視化した。
【０１１６】
逆転写ＰＣＲ
ＩｎｓｔａＰｕｒｅ試薬（ユーロジェンテック（Eurogentec）社（ベルギー国セライング所在）を用いて、総ＲＮＡを、細胞または組織から単離した。ランダムヘプタマープライマー（４００ｎｇ／μｌ）を用い、Ｍ−ＭｕＬＶ逆転写酵素（フィンザイムス（Finnzymes）社（フィンランド国オイ所在））により、逆転写を実施した。５μｇの総ＲＮＡとランダムプライマー（４００ｎｇ／μｌ）の混合物を７０℃で１０分間加熱し、氷上で速やかに冷却し、６ｍＭのＭｇＣｌ２、４０ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＤＴＴ、０．１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡおよび５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．３を含む逆転写酵素緩衝液を添加した。最終容量２４μｌの混合物に、さらに２００ＵのＭ−ＭｕＬＶ逆転写酵素を添加し、４２℃で１時間インキュベートし、７０℃で１５分間加熱し、使用するまで−８０℃で保存した。
【０１１７】
表２（上記）に掲載したプライマーと共に、Ｄｙｎａｚｙｍｅ  ＥＸＴポリメラーゼ（フィンザイムス（Finnzymes）社製）によってＰＣＲを実施した。得られたＰＣＲ断片を、１．５％アガロースゲル上で処理した。ＰＣＲのプロトコルは、以下のように構成された：９４℃で３分間の後、以下を３０サイクル：９４℃で３０秒間の変性、４０秒間のアニーリング（温度はプライマーセットに依る）、７２℃で４０秒間の伸長、引き続き、７２℃で５分間の最終伸長。このＰＣＲ産物を精製し、アプライドバイオシステムズ（Applied Biosystems）社（米国フォスターシティー所在）のＡＢＩ ３１００による自動シークエンサーを用いて配列決定した。
【実施例】
【０１１８】
以下の実施例は例示のみを目的としており、本発明を限定することは決して意図していない。
【０１１９】
実施例１
ＣＡ ＩＸのマウススプライス変異体の同定、構造および発現
マウス組織におけるＣａｒ９  ｍＲＮＡの発現に関する以前の逆転写（ＲＴ）ＰＣＲデータは、エクソン１〜６の増幅に基づいていた。しかし、エクソン６〜１１にわたる領域を増幅するために、プライマーｍ６Ｓおよびｍ１１Ａを用いたＣａｒ９ ｍＲＮＡのＲＴ ＰＣＲ分析により、２つの増幅産物、すなわち、１つは予想された大きさのＰＣＲ産物、もう１つはそれよりも小さい産物の存在が判明した（図１Ａ、１Ｂ）。この小さいＰＣＲ産物の配列決定により、そのＣａｒ９特異性が証明され、それが、エクソン７および８を欠く、マウスＣａｒ９ ｍＲＮＡの選択的スプライシング（ＡＳ）変異体（配列番号１０６）であることが示された。このマウスＡＳ変異体は、分析した３つの組織、胃、小腸および結腸全てに見られた（図１Ｂ）。対応する一対のプライマー（野性型に対してはｍ８Ｓ〜ｍ１０ＡおよびＡＳに対してはｍ６／９Ｓ〜ｍ１０Ａ）を用いたＣａｒ９の野生型およびＡＳ変異体の個々のＲＴ ＰＣＲ増幅により、分析した組織において、双方の産物が同時に存在することが確認された（図１Ｃ）。
【０１２０】
ＡＳ変異体配列のコンピュータ解析により、推定タンパク質（配列番号１０７）は、完全長マウスＣＡ ＩＸより約６ｋＤａだけ小さく、その推定分子量は４８ｋＤａであることが示された。スプライシング変異体は、触媒（ＣＡ）ドメインのＣ末端部分および膜貫通アンカーの上流の領域を欠く一方、膜貫通ドメインおよび細胞質内ドメインは完全のままである、アミノ酸３３５〜３７９を欠失したタンパク質をコードする能力を有する（図１Ｄ、１Ｅ）。
【０１２１】
マウスＡＳ ＣＡ ＩＸ変異体の細胞内局在性を調べるために、本発明者らは、ＡＳ ＣＡｒ９のｃＤＮＡをｐＳＧ５Ｃ発現プラスミド内にクローン化し、それを、永久的な形質移入細胞株の作出に用いた。ＡＳ変異体は、内因性のＣＡ ＩＸタンパク質を含まないマウスＮＩＨ３Ｔ３線維芽細胞およびイヌＭＤＣＫ上皮細胞に過剰発現した。ポリクローナル抗マウスＣＡ ＩＸ抗体を用い（ガット（Ｇｕｔ）ら、２００２年）、免疫ブロットおよび免疫蛍光により、双方の形質移入した細胞株を調べた。形質移入体の細胞抽出物中におよそ４８ｋＤａの単一バンドが検出され、コンピュータで推定されたマウスＡＳ ＣＡ ＩＸタンパク質の分子量とよく対応していた（図２Ａ）。形質移入された細胞は、明瞭な細胞質染色を示し、マウスＡＳ変異体が細胞質ゾル内に局在していることを示唆していた（図２Ｂ）。
【０１２２】
実施例２
ＣＡ ＩＸのヒトスプライス変異体の同定および構造
ヒトの組織および細胞株におけるＡＳ ＣＡ９ ｍＲＮＡを探索するために、本発明者らは、ヒトＣＡ９ ｍＲＮＡの全体をカバーするプライマーセットを設計した（図３Ａ）。これらを、ヒトの胃および小腸から単離したｍＲＮＡから逆転写したｃＤＮＡテンプレート上でＲＴ−ＰＣＲにおいて用いた。エクソン１および６に対して設計されたプライマーを用いて、本発明者らは、予想されたＰＣＲ産物のみを検出した（図３Ｂ）。しかしながら、エクソン６および１１に対するプライマーにより、２つのＰＣＲアンプリコン、すなわち、大量の長い産物と、非常に少量の短い産物が生じた（図３Ｃ）。この短い方の産物の配列解析によって、これが、ヒトＣＡ９ ｍＲＮＡのＡＳ変異体に相当することが確認された。スプライシングにより、エクソン８および９の検出に至った。
【０１２３】
コンピュータで推定されたヒトＡＳ ＣＡ ＩＸタンパク質は、アミノ酸３５６〜４１２を欠いており、完全長（ＦＬ）ＣＡ ＩＸに関する４９ｋＤａの推定サイズに比較して、その推定分子量は約４３ｋＤａである。欠失により、触媒ＣＡドメインのＣ末端部分から３５のアミノ酸およびＣＡドメインと膜貫通領域との間に局在する２１のアミノ酸が除去されたが、これらには、分子間Ｓ−Ｓ結合の形成に関与すると考えられるＣｙｓ４０９が含まれる（図３Ｄ）。ＡＳ  ｍＲＮＡにおける１１１９ｂｐ位（ＦＬ ＣＡ９ ｍＲＮＡでは、停止コドンは、１１４２ｂｐ位にある）におけるフレームシフトで作出された停止コドンにより、ＡＳタンパク質は切断され、膜貫通ドメインも細胞質内ドメインも含んでいない（図３Ｅ）。
【０１２４】
実施例３
腫瘍細胞株および腫瘍組織におけるヒトＡＳ ＣＡ ＩＸの発現
ＣＡ９ ｍＲＮＡのＦＬ変異体およびＡＳ変異体の別々の検出を促進するために、本発明者らは、それら個々の増幅を可能にするプライマーを利用した。その設計は、１つのＦＬ特異的プライマーを欠失領域内に配置し、もう１つのＡＳ特異的プライマーを選択的スプライシングで生じたジャンクションに配置することに基づいていた（図３Ａ）。
【０１２５】
先ず、本発明者らは、低酸素状態（２％）および酸素正常状態（２１％）に曝露したヒト癌細胞株におけるＡＳ変異体の存在を解析した。ＡＳ変異体は、試験した全ての細胞株で検出され、低酸素状態と酸素正常状態とで同様のレベルを示した（図４Ａ）。これは、ＦＬ ＣＡ９ ｍＲＮＡと対照的であり、ＦＬＣＡ９ ｍＲＮＡは、明らかに低酸素状態誘導的であり、いわゆる腎癌由来のＡＣＨＮ細胞および子宮頚部癌由来のＣａｓｋｉ細胞およびＳｉＨａ細胞においてかなりのレベル増加を示し、一方、ＣＡＫＩ−１細胞は、きわめて低レベルのＦＬＣＡ９を発現した（図４Ａ）。ＣＡ９遺伝子を欠くＣ３３ａ子宮頚部癌細胞においては、ＦＬＣＡ９特異的なシグナルは見られなかった（リースコブスカ（Ｌｉｅｓｋｏｖｓｋａ）ら、１９９９年）。
【０１２６】
以前の研究により、細胞周囲の低酸素状態に関連したＦＬ ＣＡ ＩＸの密度誘導発現が示されている（カルツ（Ｋａｌｕｚ）ら、２００２年）。ＡＳ変異体の発現が密度依存的であるかどうかを調べるために、本発明者らは、低密度培養（１ｃｍ２当たり１×１０４細胞でプレーティング）ならびに高密度培養（１ｃｍ２当たり８×１０４細胞でプレーティング）それぞれにおいて２４時間培養したＨｅＬａ細胞およびＳｉＨａ細胞を用いた。高密度細胞は、明らかにＦＬＣＡ９ ｍＲＮＡの酸素正常状態発現を示したが、そのレベルは、低酸素状態細胞におけるレベルよりも低かった。ＡＳ変異体のレベルに関しては、低密度単層で培養した細胞と高密度単層で培養した細胞との間に顕著な違いは見られなかった（図４Ｂ）。
【０１２７】
最後に、本発明者らは、ヒトの胃、結腸、直腸および肝臓などの正常な組織と悪性組織におけるＡＳ発現を解析した。ＲＴ−ＰＣＲにより、試験した全ての組織においてＡＳ変異体の存在が判明した（図４Ｃ）。先行の研究と一致して、ＦＬ転写体は、正常な胃、ならびに結腸および直腸に由来する腫瘍において見られた（サーミオ（Ｓａａｒｎｉｏ）ら、１９９８年、キベラ（Ｋｉｖｅｌａ）ら、２００５年）。
【０１２８】
実施例４
ＣＡ ＩＸのヒトＡＳ変異体の局在性および基本的な特徴
ＣＡ ＩＸのＡＳ変異体の基本的な特徴付けを実施するために、本発明者らは、ヒトＡＳタンパク質の異所性発現を有する形質移入体を作出した。ＣＡ ＩＸ陰性のＭＤＣＫ細胞、ならびに高密度および低酸素状態に応じてＦＬ ＣＡ ＩＸを天然に発現するヒトＨｅＬａ子宮頚部癌細胞に、ヒトＡＳ  ｃＤＮＡを形質移入した。ＴＭ領域およびＩＣ領域のスプライシングおよびフレームシフト媒介の除去を推定したコンピュータ解析と一致して、ＡＳ ＣＡ ＩＸタンパク質は、細胞膜にとどめられず、ＭＤＣＫ細胞と酸素正常状態のＨｅＬａ細胞の双方において、細胞内局在を示した（図５Ａ）。これは、形質移入ＭＤＣＫ細胞および低酸素状態（２％のＯ２）に曝露した偽形質移入ＨｅＬａ細胞におけるＦＬ ＣＡ ＩＸの細胞表面局在とは明らかに対照的であった。
【０１２９】
形質移入ＨｅＬａ−ＡＳ細胞は、免疫ブロットにおいて、ＡＳ ＣＡ ＩＸに対応するおよそ４３／４７ｋＤａの２つのバンドおよび低酸素状態により誘導されたＦＬ ＣＡ ＩＸに対応する５４／５８Ｋのさらに２つのバンドを示した（図５Ｂ）。ＡＳタンパク質から膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインが完全に欠如しているため、本発明者らはまた、ＡＳ ＣＡ ＩＸ分子の少なくとも一部は、培地に放出されるはずであると推測した。この可能性を調べるため、細胞を、無血清培地中、酸素正常状態下および低酸素状態下で培養した。２４時間のインキュベーション後、培地の１／４を濃縮し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。免疫ブロットにより、酸素正常状態下と低酸素状態下の双方で、培地中にＡＳ ＣＡ ＩＸの存在が示された（図５Ｂ）。これらを考え合わせると、これらのデータは、ほとんど細胞膜に限定されているＦＬ ＣＡ ＩＸとは対照的に、ＡＳは、細胞内ならびに細胞外空間に存在していることを示した。
【０１３０】
しかしながら、一部のＡＳ分子は、ＦＬ ＣＡ ＩＸと共にヘテロオリゴマー内に組み込まれる可能性が残っている。ＣＡ ＩＸの完全ドメインに正常に結合するが、ＡＳ変異体を認識できないモノクローナル抗体であるＶ／１０を用いて、この仮定を試験した（データは示していない）。ＦＬ分子との相互作用を介したＣＡ ＩＸオリゴマーの免疫沈降に、このＶ／１０  Ｍａｂを利用した。次いで、オリゴマーの成分（組み込まれた可能性のあるＡＳ分子を含め）を還元性ＰＡＧＥに溶解させ、ＦＬ型とＡＳ型の双方と反応するペルオキシダーゼ標識Ｍ７５抗体を用いる免疫ブロットにより視覚化した。非還元条件下、ＦＬタンパク質は、約１５３Ｋのオリゴマーを形成し、一方、ＡＳ ＣＡ ＩＸ変異体は、それができず、また、ＦＬ ＣＡ ＩＸタンパク質によって構築されたオリゴマー内に進入することもできなかった（図６；詳細は、材料と方法を参照）。
【０１３１】
実施例５
ヒトＡＳ ＣＡ ＩＸの機能的特性
腫瘍細胞におけるＦＬ ＣＡ ＩＸの発現は、低酸素状態によって誘導される。低酸素状態はまた、ＣＡ ＩＸの触媒性能も活性化し、その結果、細胞外ｐＨの酸性化が増強される（スバストバ（Ｓｖａｓｔｏｖａ）ら、２００４年）。この酸性化能力は、ＣＡ ＩＸの触媒ＣＡドメインを欠くドミナントネガティブな変異体の過剰発現によって消滅する（スバストバ（Ｓｖａｓｔｏｖａ）ら、２００４年）。ＡＳタンパク質は、不完全なＣＡドメインしか含んでいないので、それが触媒的に活性であるかどうか、およびＦＬ ＣＡ ＩＸタンパク質によって媒介される酸性化を阻害する能力があるかどうかを分析することは特に重要であった。酵素活性の測定は、完全ＣＡドメイン［例えば、配列番号９］を含み、それによってＰＧドメインとＣＡドメインの双方［ａａ５２〜３９７（配列番号８３）］を含むＧＳＴ−ＰＧＣＡを形成するＦＬ ＣＡ ＩＸのＧＳＴ融合細胞外部分と比較して、切断ＣＡドメインを含む組換え細菌ＧＳＴ−ＡＳ融合タンパク質を用いて、ストップドフロー分光法により達成した。その結果、野生型ＣＡ ＩＸの触媒活性、Ｋｃａｔ（ＷＴ）＝３．８×１０５／秒は、スプライシング変異体において半分、Ｋｃａｔ（ＡＳ）＝１．９×１０５／秒に低下することが判明した。また、ＧＳＴ−ＡＳタンパク質は、炭酸脱水酵素のスルホンアミド阻害剤であるアセタゾールアミンに対して、かなり低い親和性：Ｋｉ  ＷＴ＝１４ｎＭ対ＫｉＡＳ＝１１０ｎＭを示した。それらのデータにより、このスプライシングは、ＣＡ ＩＸの酵素活性と阻害剤に対するその親和性との双方を損なったことが示唆される。
【０１３２】
また、本発明者らは、ＡＳ ＣＡ ＩＸが、低酸素条件下で、細胞外ｐＨを酸性化するＦＬ ＣＡ ＩＸの能力を調節できるかどうかを知ることを望んだ。その目的のために、本発明者らは、２％のＯ２（低酸素状態）および２１％のＯ２（酸素正常状態）において、４８時間インキュベートした形質移入ＨｅＬａ−ＡＳ細胞と偽形質移入対照とを分析した。低酸素インキュベーションは、酸素正常状態対応物に比較して、対照ならびにＡＳ形質移入ＨｅＬａ細胞において、予想された細胞外酸性化をもたらした（図７Ａ）。しかし、培地は、ＡＳ過剰発現細胞において、酸性化がおよそ０．２ｐＨ単位少なく、ＡＳが野生型のＣＡ ＩＸタンパク質の活性を阻害したことを示唆した。
【０１３３】
ＣＡ ＩＸの触媒部位は細胞外空間に曝露されるため、本発明者らは、ＡＳの細胞外画分の可能性のある役割を試験した。先に述べたように、ＣＡ ＩＸの活性は、その触媒部位が阻害剤によってアクセス可能である低酸素状態−活性化ＣＡ ＩＸにのみ結合するフルオレセイン標識ＣＡ阻害剤（ＦＩＴＣ−ＣＡ Ｉ）阻害剤を用いて間接的に示すことができる（スバストバ（Ｓｖａｓｔｏｖａ）ら、２００４年）。したがって、本発明者らは、低酸素処理した場合にＣＡ ＩＸ媒介の細胞外酸性化を示し、低酸素状態でＦＩＴＣ−ＣＡを蓄積するが、酸素正常状態においては蓄積しないＣＡ ＩＸ−形質移入ＭＤＣＫ細胞の確立されたモデルを用いた。ここで本発明者らは、ＡＳ分泌ＭＤＣＫ−ＣＡ ＩＸ細胞形質移入体からの培地の存在下および不在下で、ＭＤＣＫ−ＣＡ ＩＸ細胞におけるＦＩＴＣ−ＣＡ Ｉの蓄積を分析した。図７Ｂに示されるように、ＡＳ含有調整培地を混合した新鮮培地中でのＭＤＣＫ−ＣＡ ＩＸ細胞のインキュベーションにより、ＦＩＴＣ−ＣＡ ＩＸの蓄積が明らかに減少し、細胞外ＡＳが阻害剤の結合を減少させたという考えを裏付けていた。この実験を、１／２ならびに１／３のＡＳ含有調整培地によって繰り返した。獲得した画像を分析して、蛍光強度の差を特定した。その結果、ＡＳの細胞外画分は、ＦＩＴＣ−ＣＡ Ｉの蓄積をおよそ半分に減少させることが実証された（図７Ｃ）。
【０１３４】
ＦＬ ＣＡ ＩＸの機能性に及ぼすＡＳ変異体の効果が、生物学的帰結を有し得るかどうかを調べるために、本発明者らは、偽形質移入対照と比較して、ＨｅＬａ−ＡＳ形質移入体の増殖パラメーターを分析した。酸素正常状態または低酸素状態に関係なく、接着培養における短期（７２時間）増殖に際して、これら２つの細胞型の間に有意な差は見られなかった（データは示していない）。したがって、本発明者らは、１４日間増殖させたＨｅＬａ細胞スフェロイドも作製し、ＨｅＬａ−ＡＳ細胞および対照ＨｅＬａ細胞それぞれから作出したスフェロイドの質量および形状を比較した。ＨｅＬａ−ＡＳスフェロイドはそれほどコンパクトでなく(less compact)、低酸素および酸性ｐＨを被る細胞を通常含む中央領域を欠いた（図７Ｄ）。これらＨｅＬａ−ＡＳスフェロイドの外見は、ｐＨを調節するＦＬ ＣＡ ＩＸの能力の低下を引き起こすＡＳの効果が、これらの微小環境ストレスを生き延びる細胞の能力に影響を及ぼし得ることを示唆した。
【０１３５】
これらをまとめると、我々の結果によって、ＡＳ ＣＡ ＩＸは、ＦＬ ＣＡ ＩＸと比較したときに、調節のされ方が異なっており、局在化が異常であり、機能が不能化されていることが示された。
【０１３６】
考察
選択的スプライシングの脱制御は、特に癌においてよく認識された現象である（ベナブルス（Ｖｅｎａｂｌｅｓ）ら、２００６年）。ＣＤ４４、ＨＩＦ−α、ＶＥＧＦ、オステオポンチンなど、また他にも多くの、その産物が腫瘍の進行に因果的に関与している、選択的にスプライスされた遺伝子の例は多数ある（ワン（Ｗｏｎｇ）ら、２００３年、ゴチー（Ｇｏｔｈｉｅ）ら、２０００年、ロビンソン（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ）ら、２００１年、フー（Ｈｅ）ら、２００６年）。ある場合、正常な組織では稀であるスプライス型が腫瘍においては一般的になり得、一方で、正常組織に存在する選択的スプライス型は、不変のままであり得る（ロイ（Ｒｏｙ）ら、２００５年）。
【０１３７】
本研究において同定されたヒトＣＡ ＩＸの選択的スプライシング変異体は、この範疇に分類できるが、完全長ＣＡ ＩＸの発現パターンはかなり特殊であるため、明快に結論づけることは難しい。ＦＬ ＣＡ ＩＸは、胃や小腸などのきわめてわずかな正常組織中に多量に存在するが、同時に、その選択的スプライシング変異体の発現は低レベルである。胃癌においては、ＦＬ ＣＡ ＩＸの発現は減少するが、ＡＳのレベルは正常な胃と同様である。他方、完全長ＣＡ ＩＸの発現は、正常な結腸および直腸において存在しないか、またはきわめて少なく（本研究において分析されていない他の正常組織においても）、対応する腫瘍においては有意に増加する（サーミオ（Ｓａａｒｎｉｏ）ら、１９８８年）。しかしながら、ＡＳ変異体は、正常な組織と結腸直腸癌の双方において、安定した発現レベルを示す。これらのデータにより、その発現は腫瘍の表現型に関連していないことが強く示唆される。さらには、そのレベルが密集培養で増殖させ低酸素状態に曝露された細胞において誘導されるＦＬ ＣＡ ＩＸとは対照的に、ＡＳ変異体は、基本的に低酸素状態および細胞密度には依存しない。
【０１３８】
ＡＳの比較的低いが構成的な発現は、可能性のある予後診断または予測の目的のために低酸素状態腫瘍のマーカーとしてＣＡ９転写を用いる臨床的研究にとってかなり重要である。正常および／または非低酸素状態組織におけるＦＬ ＣＡ９の不在下でＡＳが存在するために、スプライシングによって影響を受けない領域の検出を目的に設計されたプライマーまたはプローブは、ＣＡ９ ｍＲＮＡの２つの型を識別することができず、したがって、偽陽性の結果を与える可能性があり、低酸素状態に誘導されたＦＬ ＣＡ９の真の臨床値に影響を及ぼし得る。
【０１３９】
注目すべきことに、ＦＬ転写体と比較したＡＳ ｍＲＮＡの５'ＰＡＣＥ分析により、同じ長さの産物が作出され、双方の変異体が同一のプロモーターから生じるという結論を裏付けている（データは示していない）。この事実は、転写装置(transcriptional apparatus)の、生理学的環境に依存するＣＡ９転写体のプロセシングにおけるスプライシング機構(splicing machinery)の成分との差動協力(differential cooperation)を示唆し得る。実際、ｈＴＥＲＴ、ＴｒｋＡおよびＸＢＰ１に関連するものなど、低酸素状態によって調節されるスプライシング事象がいくつかある（アンダーソン（Ａｎｄｅｒｓｏｎ）ら、２００６年、タコーネリ（Ｔａｃｏｎｅｌｌｉ）ら、２００４年、ロメロ−ラミレツ（Ｒｏｍｅｒｏ−Ｒａｍｉｒｅｚ）ら、２００４年）。ｈＴＥＲＴの場合、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ、ＴＦＩＩＢ、ＨＩＦおよびコアクチベーターを含む転写複合体が、低酸素状態下でプロモーターに動員され、転写が進行する限り遺伝子に結合したままでいることが実証されている。これによって、酵素の活性形態に有利なスプライスパターンにおけるスイッチが誘起される（アンダーソン（Ａｎｄｅｒｓｏｎ）ら、２００６年）。ＣＡ９遺伝子の転写の間も同様な機序がはたらく可能性はかなり考え得ることである。
【０１４０】
ヒトＣＡ９ ｍＲＮＡのＡＳ変異体は、エクソン８プラス９の欠失から生じ、膜貫通領域、細胞内テール、および触媒ドメインのＣ末端部分を含まない切断タンパク質に翻訳される。ＴＭおよびＩＣ領域の除去は明らかに、細胞内空間に優勢的に存在し、細胞外媒体にも放出されるこのＡＳ変異体の局在性の変更の原因となる。これは、内在性膜タンパク質(integral plasma membrane protein)であるＦＬ ＣＡ ＩＸタンパク質とは対照的である。触媒ドメインの部分的欠失に関連するそのような不適切な局在性は、タンパク質の機能性を危うくすると予想することができる。実際、ＧＳＴ−ＡＳは、完全な触媒ドメインを含む対応するＧＳＴ−ＰＧ＋ＣＡタンパク質の酵素活性の半分しか示さない。しかしながら、この知見を、ＣＡ ＩＸが低酸素状態下で重炭酸イオントランスポーターと相互作用し、細胞膜を横断するｐＨ調節に寄与する局所細胞の文脈（モーガン（Ｍｏｒｇａｎ）ら、２００７年、スバストバ（Ｓｖａｓｔｏｖａ）ら、２００４年、スウィータッチ（Ｓｗｉｅｔａｃｈ）ら、２００７年）に直接移し変えることはきわめて難しい。第１に、活性測定は、細胞下構造(subcellular structure)、タンパク質−タンパク質相互作用、イオン流、およびＣＡ ＩＸの触媒性能の調節に確かにある役割を果たしている微小環境の影響が無い設定下で、細菌において産生されたタンパク質を用いて実施した。第２に、種々の炭酸脱水酵素イソ酵素の触媒活性は、おおよそ２桁の大きさの範囲内で変動し、より高い活性イソ型は、中程度と考えられるイソ酵素よりも２０倍からほんの３倍までの活性の高さを示す（パストレコバ（Ｐａｓｔｏｒｅｋｏｖａ）ら、２００４年）。したがって、半分に減少した活性が、ＣＡ ＩＸの生理学的機能にとって十分であるかどうかを除外することはできない。いずれにせよ、ＡＳ変異体は細胞膜に適切に局在しておらず、ＣＡ ＩＸタンパク質の機能にとってきわめて重要な条件であるオリゴマーを形成することができないため、この疑問は恐らく重要ではない。
【０１４１】
しかしながら、ＡＳ型のＣＡ ＩＸを構成的に過剰発現する低酸素状態のＨｅＬａ−ＡＳ細胞の培養において見られる細胞外酸性化の減少により、ＡＳ型のＣＡ ＩＸは、内因性の低酸素状態誘導ＦＬタンパク質の機能を阻害することが明らかに示唆される。その機序は現在のところ明らかではないが、ＡＳ変異体で処理した低酸素状態のＭＤＣＫ−ＣＡ ＩＸ細胞におけるＣＡ阻害剤の蓄積減少に基づき、重炭酸イオン輸送メタボロン（metabolon）の細胞表面成分との相互作用に関して、ＡＳがＦＬ ＣＡ ＩＸと競合することを提案することができる。さらに、ＡＳの過剰発現が、対応する腫瘍内微小環境を有する腫瘍塊を模倣する３Ｄモデルとしてたびたび用いられるコンパクトなスフェロイド(compact spheroids)を形成するＨｅＬａ細胞の能力にかなりの影響を及ぼす。コア領域が、より酸性の微小環境により特徴づけられる固形腫瘍の低酸素領域と明らかな類似性を示すスフェロイドを横断する酸素分圧、ｐＨ、栄養物および代謝物の勾配が、多くの研究により十分に文書化されている（アルバレツ−ペレツ（Ａｌｖａｒｅｚ−Ｐｅｒｅｚ）ら、２００５年）。他に、ＦＬ ＣＡ ＩＸの細胞膜染色が、ＳｉＨａおよびＨｅＬａの子宮頚部癌細胞から生成した多細胞スフェロイドの最内部の細胞で有意に増加することが示されている（オリーブ（Ｏｌｉｖｅ）ら、２００１年、クラスチナ（Ｃｈｒａｓｔｉｎａ）ら、２００３年）。細胞が生き延びるために、低酸素ストレスおよび酸性微小環境の有害な影響に対する保護および／または適応の増大を必要としているまさにその領域にＦＬ ＣＡ ＩＸが存在することを、これらのデータは示している。ここでＦＬ ＣＡ ＩＸは、細胞内ｐＨの重炭酸媒介緩衝作用を介して作用する（スウィータッチ（Ｓｗｉｅｔａｃｈ）ら、２００７年）。このｐＨ調節を部分的に動揺させるＡＳ変異体は明らかに、スフェロイド内の酸性ｐＨに対する適応を許さず、スフェロイドのコアから最もストレスを受けた中心の細胞の除去をもたらす。この考えは、ＣＡ ＩＸの触媒活性が低酸素状態により調節されるという知見と一致し、ｐＨを調節するＣＡ ＩＸの能力は、低酸素腫瘍細胞の生き残りにとって重要であることを示唆している。後者の示唆はまた、ロバートソン（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ）ら（２００４年）によるＲＮＡｉ実験によっても間接的に裏付けられている。
【０１４２】
天然に産生されたＡＳ変異体は低レベルで発現するが、ＦＬ ＣＡ ＩＸをほんの弱く誘導する生理学的環境および細胞型がある。例えば、機能的血液供給性血管から短距離に局在化した腫瘍細胞は、軽微な低酸素状態に曝露され、同等レベルのＦＬおよびＡＳを発現させて、ＣＡ ＩＸ活性のドミナントネガティブなダウンレギュレーションを可能にし得る。このような弱い低酸素状態の細胞は、おそらく苛酷なアシドーシスに曝露されず、したがって、このｐＨ制御機序の完全な実施から利益を得ない可能性がある。軽微な虚血を被っている正常組織にも同様な説明を適用することができる。この考えは、いくつかの腫瘍細胞株、高密度の酸素正常状態の細胞（細胞周辺の弱い低酸素状態に影響を受けた）およびいくつかの早期の低酸素状態の程度が低い腫瘍は、ただ低レベルのＦＬ ＣＡ ＩＸを発現するということを示す最近ならびに以前のデータによって裏付けられている。結論として本発明者らは、ＡＳ変異体が、双方のタンパク質が同時発現される環境下で、ＦＬ ＣＡ ＩＸのモジュレーターとして働くことを提案する。可能な予後診断または予測を目的とした、低酸素腫瘍のマーカーとしてのＣＡ９転写に基づいた臨床的研究のために、選択的スプライシング変異体の低いが構成的な発現はかなり重要である。正常および／または非低酸素状態組織におけるＦＬ ＣＡ９の不在下でＡＳが存在するために、スプライシングによって影響を受けない領域の検出を目的に設計されたプライマーまたはプローブは、ＣＡ９ ｍＲＮＡの２つの型を識別することができず、したがって、偽陽性の結果を与える可能性があり、低酸素状態に誘導されたＦＬ ＣＡ９の真の臨床値に影響を及ぼし得る。実際これは、今までに公開されたいくつかの研究［例えば、マッキーナン（ＭｃＫｉｅｒｎａｎ）ら、Ｃａｎｃｅｒ．８６（３）：４９２〜４９７頁（１９９９年）；スパン（Ｓｐａｎ）ら、Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．８９（２）：２７１〜２７６頁（２００３年）；シミ（Ｓｉｍｉ）ら、Ｌｕｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ．５２（１）：５９〜６６頁（２００６年）；グライナー（Ｇｒｅｉｎｅｒ）ら、Ｂｌｏｏｄ．１０８（１３）：４１０９〜４１１７頁（２００６年）］において、生じ得る。この理由から、マイクロアレイチップおよびＲＴ−ＰＣＲのための正しいプライマーおよびプローブの設計は注意して行なう必要があり、ＡＳ型のＭＮ／ＣＡ ＩＸを考慮に入れる必要がある。
【０１４３】
ブダペスト条約の寄託
下記に掲げた物質は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）（米国２０１１０−２２０９バージニア州マナッサスUniversity Blvd.，10810所在）に寄託された。この寄託は、the Budapest Treaty on the International Recognition of Deposited Microorganisms for the Purpose of Patent Procedure and Regulations（ブダペスト条約）にしたがって行なわれた。生存可能な培養物の維持は、寄託日から３０年間保証される。ハイブリドーマおよびプラスミドは、ブダペスト条約の下、ＡＴＣＣにより入手でき、当該出願から特許が付与された際に、寄託されたハイブリドーマおよびプラスミドの公的に非制限的利用を保証する出願者とＡＴＣＣ間の同意に従う。寄託された株が利用可能であることは、任意の政府当局のもとでその特許法に従って付与された権利に違反して、本発明を実施することの許可として解釈すべきではない。
【０１４４】
2014057596.tif 000010
2014057596.tif 000011
同様に、Ｖ／１０モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株Ｖ／１０−ＶＵは、ブダペスト条約の下、ヘント大学（Universiteit Gent）（ベルギー国ヘントＢ−９０００，K. L. Ledeganckstraat 35所在）のthe Laboratorium voor Moleculaire Biologie-Plasmidencollectie（ＬＭＢＰ）にある、ベルギーの微生物保存機関（the Belgian Coordinated Collections of Microorganisms）（ＢＣＣＭ）［ＢＣＣＭ／ＬＭＢＰ］の国際寄託当局（the International Depository Authority）（ＩＤＡ）に、２００３年２月１９日に登録番号６００９ＣＢとして寄託された。
【０１４５】
本発明の前述の実施形態の記載は、例示および説明目的のために提供された。それらは、逐一的ではなく、または開示された正確な形態に本発明を限定する意図はなく、多くの修飾および変更が、上記の教示に鑑みて可能であることは明らかである。本発明の原理およびその実際の適用を説明し、それによって当業者が考慮される特定の使用に適するように種々の実施形態で、および種々の変更によって本発明を利用することができるように、これらの実施形態が選択され記載されている。
【０１４６】
本明細書に引用された全ての参考文献は、参照として本明細書に援用されている。
【０１４７】
他の実施態様
１．完全長［ＦＬ］および選択的にスプライスされた［ＡＳ］ＭＮ／ＣＡ９ ｍＲＮＡの発現、あるいは、ＡＳおよびＦＬのＭＮ／ＣＡ ＩＸの発現の差異を識別する工程を有してなる、哺乳動物における異常なＭＮ／ＣＡ ＩＸの発現に関連する前新生物疾患／新生物疾患の診断および／または予後診断方法。
【０１４８】
２．１種類以上のプローブおよび／またはプライマーを使用して、ＦＬおよび／またはＡＳのＭＮ／ＣＡ９ ｍＲＮＡ発現を検出、または検出および定量化する実施態様１に記載の方法。
【０１４９】
３．（ａ）選択的にスプライスされた［ＡＳ］ＭＮ／ＣＡ９ ｍＲＮＡは検出せず、完全長［ＦＬ］のＭＮ／ＣＡ９ ｍＲＮＡを検出するためのプローブおよび／またはプライマー；
（ｂ）ＦＬのＭＮ／ＣＡ９ ｍＲＮＡは検出せず、ＡＳのＭＮ／ＣＡ９ ｍＲＮＡを検出するためのプローブおよび／またはプライマー；および／または
（ｃ）ＦＬおよびＡＳのＭＮ／ＣＡ９ ｍＲＮＡの双方を検出するためのプローブおよび／またはプライマー
の使用を含んでなる実施態様２に記載の方法。
【０１５０】
４．前記哺乳動物がヒトであり、前記１種類以上のプローブおよび／またはプライマーが、配列番号９７〜１０１および、配列番号９７〜１０１と少なくとも８０％相同である核酸配列からなる群から選択される実施態様２に記載の方法。
【０１５１】
５．核酸増幅方法の使用を含んでなる実施態様２に記載の方法。
【０１５２】
６．前記核酸増幅方法が、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲまたは定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲの使用を含んでなる実施態様５に記載の方法。
【０１５３】
７．選択的にスプライスされた［ＡＳ］ＭＮ／ＣＡ９ ｍＲＮＡには結合しないが、完全長［ＦＬ］ＭＮ／ＣＡ９ ｍＲＮＡに結合するプローブ、および／またはＦＬのＭＮ／ＣＡ９ ｍＲＮＡには結合しないが、ＡＳのＭＮ／ＣＡ９ ｍＲＮＡに結合するプローブを含む、マイクロアレイチップの使用を含んでなる実施態様２に記載の方法。
【０１５４】
８．ＦＬ：ＡＳのＭＮ／ＣＡ９ ｍＲＮＡの比を決定する工程をさらに有してなる実施態様２に記載の方法。
【０１５５】
９．前記ＡＳのＭＮ／ＣＡ９ ｍＲＮＡ発現が、正常なＭＮ／ＣＡ９遺伝子発現を示し、前記ＦＬのＭＮ／ＣＡ９ ｍＲＮＡ発現が、異常なＭＮ／ＣＡ９遺伝子発現を示す実施態様２に記載の方法。
【０１５６】
１０．前記ＡＳのＭＮ／ＣＡ９ ｍＲＮＡ発現が、酸素正常状態のＭＮ／ＣＡ９遺伝子発現を示し、前記ＦＬのＭＮ／ＣＡ９ ｍＲＮＡ発現が、低酸素状態のＭＮ／ＣＡ９遺伝子発現を示す実施態様２に記載の方法。
【０１５７】
１１．１種類以上の抗体を使用して、前新生物／新生物組織におけるＦＬおよびＡＳのＭＮ／ＣＡ９ ｍＲＮＡ発現の差異を識別する工程を有してなる実施態様１に記載の方法。
【０１５８】
１２．前記組織においてＡＳのＭＮ／ＣＡ ＩＸを検出、または検出および定量化する工程を有してなる実施態様１１に記載の方法。
【０１５９】
１３．前記組織においてＦＬのＭＮ／ＣＡ ＩＸレベルのＡＳのＭＮ／ＣＡ ＩＸレベルに対する比を決定する工程をさらに有してなる実施態様１２に記載の方法。
【０１６０】
１４．前記比が、前記組織における低酸素状態の存在または程度を示す実施態様１３に記載の方法。
【０１６１】
１５．脊椎動物の組織においてＦＬのＭＮ／ＣＡ ＩＸおよびＡＳのＭＮ／ＣＡ ＩＸを検出、または検出および定量化する工程であって、
（ａ）前記脊椎動物の組織サンプルを、少なくとも２種の抗体、少なくとも２種の抗原結合性抗体断片、または抗体および抗原結合性抗体断片の混合物に同時にまたは連続的に接触させる工程であって、
ここで、少なくとも１種の抗体／抗体断片は、ＦＬのＭＮ／ＣＡ ＩＸタンパク質には特異的に結合するが、ＡＳのＭＮ／ＣＡ ＩＸタンパク質には結合せず、
少なくとも１種の他の抗体／抗体断片は、ＦＬのＭＮ／ＣＡ ＩＸとＡＳのＭＮ／ＣＡ ＩＸの双方に特異的に結合する、
ことを特徴とする工程と、
（ｂ）前記サンプルにおいて前記抗体／抗体断片の結合を検出および定量化する工程と、
（ｃ）前記特異的に結合する抗体／抗体断片の結合を比較して、ＦＬのＭＮ／ＣＡ ＩＸとＡＳのＭＮ／ＣＡ ＩＸの相対的レベルを決定する工程と、
を有してなる実施態様１１に記載の方法。
【０１６２】
１６．前記抗体／抗体断片、または、ＦＬのＭＮ／ＣＡ ＩＸに特異的に結合するが、ＡＳのＭＮ／ＣＡ ＩＸには結合しない抗体／抗体断片が、ＭＮ／ＣＡ ＩＸの炭酸脱水酵素（ＣＡ）ドメインに特異的であり、
前記抗体／抗体断片、または、ＦＬのＭＮ／ＣＡ ＩＸとＡＳのＭＮ／ＣＡ ＩＸの双方に特異的に結合する抗体／抗体断片が、ＭＮ／ＣＡ ＩＸのプロテオグリカン様（ＰＧ）ドメインに特異的である、
実施態様１５に記載の方法。
【０１６３】
１７．前記ＭＮ／ＣＡ ＩＸのＣＡドメインに特異的な前記抗体が、登録番号ＬＭＢＰ６００９ＣＢとして、ベルギー国ヘント所在のＢＣＣＭ（商標）／ＬＭＢＰに寄託されたハイブリドーマＶＵ−Ｖ／１０により産生されるＶ／１０モノクローナル抗体であり、
前記ＭＮ／ＣＡ ＩＸのＰＧドメインに特異的な前記抗体が、ＡＴＣＣ指定番号ＨＢ１１１２８として、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託されたハイブリドーマＶＵ−Ｍ７５により産生されるＭ７５モノクローナル抗体である、
実施態様１６に記載の方法。
【０１６４】
１８．脊椎動物における異常なＭＮ／ＣＡ ＩＸ発現に関連する前新生物疾患／新生物疾患の診断および／または予後診断方法であって、
脊椎動物の組織において選択的にスプライスされた［ＡＳ］ＭＮ／ＣＡ ＩＸタンパク質は検出せず、完全長［ＦＬ］ＭＮ／ＣＡ ＩＸタンパク質を検出、または検出および定量化する工程であって、
（ａ）前記脊椎動物の組織サンプルを、抗体または抗体断片と接触させる工程であって、前記抗体または抗体断片が、ＡＳのＭＮ／ＣＡ ＩＸには結合しないが、ＦＬのＭＮ／ＣＡ ＩＸには特異的に結合することを特徴とする工程と、
（ｂ）前記サンプルにおける前記抗体／抗体断片の結合を検出および定量化する工程と、
を有してなる方法。
【０１６５】
１９．前記抗体または抗体断片が、ＭＮ／ＣＡ ＩＸの炭酸脱水酵素（ＣＡ）ドメインに特異的である実施態様１８に記載の方法。
【０１６６】
２０．前記ＭＮ／ＣＡ ＩＸのＣＡドメインに特異的な前記抗体が、登録番号ＬＭＢＰ６００９ＣＢとして、ベルギー国ヘント所在の「ＢＣＣＭ」／ＬＭＢＰに寄託されたハイブリドーマＶＵ−Ｖ／１０により産生されるＶ／１０モノクローナル抗体である実施態様１９に記載の方法。
【０１６７】
２１．哺乳動物における異常なＭＮ／ＣＡ ＩＸ発現に関連する前新生物／新生物疾患の診断および／または予後診断方法であって、
哺乳動物の前新生物／新生物サンプルにおける選択的にスプライスされた［ＡＳ］ＭＮ／ＣＡ９ ｍＲＮＡは検出せず、完全長［ＦＬ］ＭＮ／ＣＡ９ ｍＲＮＡを検出、または検出および定量化する工程を有してなり、前記サンプルからのｍＲＮＡを、ＡＳのＭＮ／ＣＡ９ ｍＲＮＡには結合しないが、ＦＬのＭＮ／ＣＡ９ ｍＲＮＡに特異的に結合するプライマーまたはプローブに接触させる工程を有してなることを特徴とする方法。
【０１６８】
２２．哺乳動物における選択的にスプライスされた［ＡＳ］ＭＮ／ＣＡ９ ｍＲＮＡ発現と完全長［ＦＬ］ＭＮ／ＣＡ９ ｍＲＮＡ発現とを識別するために使用されるプローブまたはプライマー。
【０１６９】
２３．前記哺乳動物がヒトであり、
前記プローブまたはプライマーが、ＦＬのＭＮ／ＣＡ９ ｍＲＮＡは検出せず、ＡＳのＭＮ／ＣＡ９ ｍＲＮＡを検出するために使用され、
前記プローブまたはプライマーが、ＭＮ／ＣＡ９遺伝子のエクソン７および１０のスプライスジャンクションに結合する核酸を含む、
実施態様２２に記載のプローブまたはプライマー。
【０１７０】
２４．前記プローブまたはプライマーが、配列番号１０１の配列、または配列番号１０１と少なくとも８０％相同な配列を有する実施態様２３に記載のプローブまたはプライマー。
【０１７１】
２５．実施態様２２に記載のプローブまたはプライマーを発現するベクター。
【０１７２】
２６．実施態様２５に記載のベクターを含む宿主細胞。
【０１７３】
２７．前記哺乳動物がヒトであり、
前記プローブまたはプライマーが、ＡＳのＭＮ／ＣＡ９ ｍＲＮＡは検出せず、ＦＬのＭＮ／ＣＡ９ ｍＲＮＡを検出するために使用され、
前記プローブまたはプライマーが、ヒトＭＮ／ＣＡ９遺伝子のエクソン８またはエクソン９に結合するか、またはヒトＭＮ／ＣＡ９遺伝子のエクソン７および８のスプライスジャンクション、エクソン８および９のスプライスジャンクション、またはエクソン９および１０のスプライスジャンクションに結合する核酸を含む、
実施態様２２に記載のプローブまたはプライマー。
【０１７４】
２８．前記プローブまたはプライマーが、配列番号１００の配列、または配列番号１００と少なくとも８０％相同な配列を有する実施態様２７に記載のプローブまたはプライマー。
【０１７５】
２９．実施態様２２に記載のプローブを１種類以上含むマイクロアレイチップ。
【０１７６】
３０．哺乳動物における選択的にスプライスされた［ＡＳ］ＭＮ／ＣＡ９ ｍＲＮＡと完全長［ＦＬ］ＭＮ／ＣＡ９ ｍＲＮＡとの発現を識別するために使用される一対のプローブおよび／またはプライマー。
【０１７７】
３１．完全長［ＦＬ］のヒトＭＮ／ＣＡ９ ｍＲＮＡは検出せず、選択的にスプライスされた［ＡＳ］ヒトＭＮ／ＣＡ９ ｍＲＮＡを検出するために使用される実施態様３０に記載の一対のプローブおよび／またはプライマー。
【０１７８】
３２．配列番号９９および１０１、または配列番号９９および１０１と少なくとも８０％相同な核酸配列からなる実施態様３１に記載の一対のプローブまたはプライマー。
【０１７９】
３３．選択的にスプライスされた［ＡＳ］ヒトＭＮ／ＣＡ９ ｍＲＮＡは検出せず、完全長［ＦＬ］ヒトＭＮ／ＣＡ９ ｍＲＮＡを検出するために使用される実施態様３０に記載の一対のプローブおよび／またはプライマー。
【０１８０】
３４．配列番号９９および１００、または配列番号９９および１００と少なくとも８０％相同な核酸配列からなる実施態様３３に記載の一対のプローブまたはプライマー。
【０１８１】
３５．配列番号９７および９８、または配列番号９７および９８と少なくとも８０％相同な核酸配列からなるＡＳのヒトＭＮ／ＣＡ９ ｍＲＮＡおよびＦＬのヒトＭＮ／ＣＡ９ ｍＲＮＡの双方を検出するために使用され、
前記ＡＳのｍＲＮＡおよび前記ＦＬのｍＲＮＡが、その長さにより識別される、
実施態様３０に記載の一対のプローブおよび／またはプライマー。
【０１８２】
３６．哺乳動物の選択的にスプライスされた［ＡＳ］ＭＮ／ＣＡ ＩＸをコードする単離された核酸であって、前記ＡＳのＭＮ／ＣＡ ＩＸが、約４３〜約４８０００の分子量を有することを特徴とする単離された核酸。
【０１８３】
３７．実施態様３６に記載の単離された核酸配列を発現するベクター。
【０１８４】
３８．実施態様３７に記載のベクターを含む宿主細胞。
【０１８５】
３９．ＭＮ／ＣＡ９のエクソン８およびエクソン９に相当するヌクレオチドを欠失させることを特徴とし、ここで前記ＡＳのＭＮ／ＣＡ ＩＸがヒトである実施態様３６に記載の単離された核酸。
【０１８６】
４０．配列番号１０８、または配列番号１０８と少なくとも８０％相同である単離された核酸を有し、ここで前記ＡＳのＭＮ／ＣＡ ＩＸがヒトである実施態様３６に記載の単離された核酸。
【０１８７】
４１．配列番号１０８、または実施態様４０に記載の単離された核酸によりコードされたＡＳ型のＭＮ／ＣＡ ＩＸであって、前記ＡＳ型のＭＮ／ＣＡ ＩＸが、ＡＴＣＣ番号ＨＢ１１１２８としてアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託されたハイブリドーマＶＵ−Ｍ７５から分泌されるＭ７５モノクローナル抗体により特異的に結合されるが、登録番号ＬＭＢＰ６００９ＣＢとしてベルギー国ヘント所在の「ＢＣＣＭ」／ＬＭＢＰに寄託されたハイブリドーマＶＵ−Ｖ／１０により産生されるＶ／１０モノクローナル抗体によっては結合されないことを特徴とするＡＳ型のＭＮ／ＣＡ ＩＸ。
【０１８８】
４２．ＭＮ／ＣＡ ＩＸのＰＧドメインに特異的な抗体により特異的に結合されるが、ＭＮ／ＣＡ ＩＸのＣＡドメインに特異的な抗体によっては結合されないことをさらに特徴とする実施態様３６に記載の単離された核酸によりコードされたＡＳ型のＭＮ／ＣＡ ＩＸ。
【０１８９】
４３．実施態様４２に記載されたＡＳ型のＭＮ／ＣＡ ＩＸであって、ＡＴＣＣ番号ＨＢ１１１２８としてアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託されたハイブリドーマＶＵ−Ｍ７５から分泌されるＭ７５モノクローナル抗体により特異的に結合されるが、登録番号ＬＭＢＰ６００９ＣＢとしてベルギー国ヘント所在の「ＢＣＣＭ」／ＬＭＢＰに寄託されたハイブリドーマＶＵ−Ｖ／１０により産生されるＶ／１０モノクローナル抗体によっては結合されないことをさらに特徴とするＡＳ型のＭＮ／ＣＡ ＩＸ。
【０１９０】
４４．実施態様３６に記載のＡＳのＭＮ／ＣＡ ＩＸに特異的に結合するが、ＦＬのＭＮ／ＣＡ ＩＸには特異的に結合しないことを特徴とする抗体または抗原結合性抗体断片。
【０１９１】
４５．実施態様３６に記載のＡＳのＭＮ／ＣＡ ＩＸに特異的に結合するが、可溶性のＭＮ／ＣＡ ＩＸ（ｓ−ＣＡ ＩＸ）には特異的に結合しないことを特徴とする抗体または抗原結合性抗体断片。
【０１９２】
４６．哺乳動物における前新生物疾患／新生物疾患を治療する方法であって、前記疾患が、ＭＮ／ＣＡ ＩＸの異常発現に関連し、完全長［ＦＬ］ＭＮ／ＣＡ ＩＸのレベルと比較して選択的にスプライスされた［ＡＳ］ＭＮ／ＣＡ ＩＸのレベルを増加させる薬剤を含む組成物を治療に有効な量で前記哺乳動物に投与する工程を有してなる方法。
【０１９３】
４７．前記ＡＳのＭＮ／ＣＡ ＩＸの相対的レベルの増加により、前記ＦＬのＭＮ／ＣＡ ＩＸの炭酸脱水酵素の活性が阻害される実施態様４６に記載の方法。
【０１９４】
４８．前記薬剤が、生理学的に許容できる担体中のＡＳのＭＮ／ＣＡ ＩＸ自体、ＡＳのＭＮ／ＣＡ９ ｍＲＮＡ発現ベクター、ＦＬのＭＮ／ＣＡ ＩＸの発現を遮断するがＡＳのＭＮ／ＣＡ ＩＸの発現は遮断しないアンチセンスオリゴヌクレオチド、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドを発現するベクター、ＦＬのＭＮ／ＣＡ９のイソ型に特異的なｓｉＲＮＡ、または前記ＦＬのＭＮ／ＣＡ９のイソ型に特異的なｓｉＲＮＡを発現するベクターである実施態様４６に記載の方法。
【０１９５】
４９．前記ＦＬのＭＮ／ＣＡ９のイソ型に特異的なｓｉＲＮＡが、ＭＮ／ＣＡ９ ｍＲＮＡのエクソン７と８、エクソン８と９、またはエクソン９と１０のスプライスジャンクションを標的とする実施態様４８に記載の方法。
【０１９６】
５０．前記薬剤が、ＡＳおよび／またはＦＬのＭＮ／ＣＡ９の前ｍＲＮＡスプライシングを調節するアンチセンスオリゴヌクレオチドである実施態様４６に記載の方法。
【０１９７】
５１．完全長［ＦＬ］ＭＮ／ＣＡ ＩＸのレベルと比較して選択的にスプライスされた［ＡＳ］ＭＮ／ＣＡ ＩＸのレベルを増加させるオリゴヌクレオチドであって、異常なＭＮ／ＣＡ ＩＸ発現に関連する前新生物疾患／新生物疾患の治療に使用されることを特徴とするオリゴヌクレオチド。
【０１９８】
５２．ＡＳのＭＮ／ＣＡ９の前ｍＲＮＡには相補的ではないが、ＦＬのＭＮ／ＣＡ９の前ｍＲＮＡに相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドである実施態様５１に記載のオリゴヌクレオチド。
【０１９９】
５３．ＡＳのＭＮ／ＣＡ９ ｍＲＮＡには相補的ではないが、ＦＬのＭＮ／ＣＡ９ ｍＲＮＡには相補的な、ｓｉＲＮＡである実施態様５１に記載のオリゴヌクレオチド。
【０２００】
５４．ＦＬのＭＮ／ＣＡ９ ｍＲＮＡのエクソン７と８、エクソン８と９、またはエクソン９と１０のスプライスジャンクションに相補的である実施態様５３に記載のオリゴヌクレオチド。
【０２０１】
５５．ＡＳのＭＮ／ＣＡ ＩＸを発現する細胞を、前記細胞における前記ＡＳのＭＮ／ＣＡ ＩＸのレベルを調節すると思われる薬剤に接触させる工程と、
前記ＡＳのＭＮ／ＣＡ ＩＸのレベルの変化を検出および定量化する工程と、
を有してなる、選択的にスプライスされた［ＡＳ］ＭＮ／ＣＡ ＩＸのレベルを調節する能力のある薬剤をインビトロにおいて同定する方法。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図９Ｆ】
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【図１０】
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【配列表】
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