(57)【要約】      （修正有）【課題】チオエステラーゼ改変体を用いた脂質の製造方法を提供する。【解決手段】宿主に下記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子を導入して形質転換体を得る工程と、得られた形質転換体から脂質を採取する工程とを含む、脂質の製造方法。（ａ）特定な配列からなるアミノ酸配列であって、特定箇所のアミノ酸がトリプトファンからトレオニン、グルタミン酸、又はアラニンに置換されたアミノ酸配列を有し、かつチオエステラーゼ活性を有するタンパク質（ｂ）（ａ）のタンパク質のアミノ酸配列において、特定箇所のアミノ酸以外の１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
宿主に下記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子を導入して形質転換体を得る工程と、得られた形質転換体から脂質を採取する工程とを含む、脂質の製造方法。
（ａ）配列番号１の１１２番〜４１４番までのアミノ酸配列であって、配列番号１の２０９番目に相当するアミノ酸がトリプトファンからトレオニン、グルタミン酸、又はアラニンに置換されたアミノ酸配列を有し、かつチオエステラーゼ活性を有するタンパク質
（ｂ）（ａ）のタンパク質のアミノ酸配列において、配列番号１の２０９番目に相当するアミノ酸以外の１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつチオエステラーゼ活性を有するタンパク質
【請求項２】
前記宿主が、植物、藻類及び微生物から選択される、請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
前記宿主が、シロイヌナズナ、シアノバクテリア及び大腸菌から選択される、請求項１又は２記載の製造方法。
【請求項４】
前記脂質がラウリン酸を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項５】
前記脂質中に、ラウリン酸が２７質量％以上含有される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項６】
宿主に下記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子を導入して形質転換体を得る工程を含む、脂質の生産性を向上させる方法。
（ａ）配列番号１の１１２番〜４１４番までのアミノ酸配列であって、配列番号１の２０９番目に相当するアミノ酸がトリプトファンからトレオニン、グルタミン酸、又はアラニンに置換されたアミノ酸配列を有し、かつチオエステラーゼ活性を有するタンパク質
（ｂ）（ａ）のタンパク質のアミノ酸配列において、配列番号１の２０９番目に相当するアミノ酸以外の１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつチオエステラーゼ活性を有するタンパク質
【請求項７】
宿主に下記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子を導入して得られる形質転換体。
（ａ）配列番号１の１１２番〜４１４番までのアミノ酸配列であって、配列番号１の２０９番目に相当するアミノ酸がトリプトファンからトレオニン、グルタミン酸、又はアラニンに置換されたアミノ酸配列を有し、かつチオエステラーゼ活性を有するタンパク質
（ｂ）（ａ）のタンパク質のアミノ酸配列において、配列番号１の２０９番目に相当するアミノ酸以外の１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつチオエステラーゼ活性を有するタンパク質
【請求項８】
前記宿主が、植物、藻類及び微生物から選択される、請求項７記載の形質転換体。
【請求項９】
前記宿主が、シロイヌナズナ、シアノバクテリア及び大腸菌から選択される、請求項７又は８記載の形質転換体。
【請求項１０】
下記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質。
（ａ）配列番号１の１１２番〜４１４番までのアミノ酸配列であって、配列番号１の２０９番目に相当するアミノ酸がトリプトファンからトレオニン、グルタミン酸、又はアラニンに置換されたアミノ酸配列を有し、かつチオエステラーゼ活性を有するタンパク質
（ｂ）（ａ）のタンパク質のアミノ酸配列において、配列番号１の２０９番目に相当するアミノ酸以外の１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつチオエステラーゼ活性を有するタンパク質
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、チオエステラーゼ改変体及びこれを用いた脂質の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
脂肪酸は脂質の主要構成成分の１つであり、生体内においてグリセリンとエステル結合をしてトリアシルグリセロール等の脂質を構成し、多くの動植物においてエネルギー源として貯蔵され利用される物質である。動植物内に蓄えられた脂肪酸や脂質は、食用又は工業用として広く利用されており、例えば、モノアシルグリセロール、ジアシルグリセロール等の食品の中間原料や、その他各種の工業製品の添加剤、中間原料として利用されている。また、炭素数１２〜１８前後の高級脂肪酸を還元して得られる高級アルコールの誘導体は、界面活性剤として用いられている。例えば、アルキル硫酸エステル塩やアルキルベンゼンスルホン酸塩等は陰イオン性界面活性剤として、また、ポリオキシアルキレンアルキルエーテルやアルキルポリグリコシド等は非イオン性界面活性剤として、いずれも洗浄剤又は殺菌剤として利用されている。同じく高級アルコールの誘導体としてアルキルアミン塩やモノ又はジアルキル４級アミン塩は、繊維処理剤や毛髪リンス剤又は殺菌剤として、ベンザルコニウム型４級アンモニウム塩は殺菌剤や防腐剤として日常的に利用されている。さらに、炭素数１８前後の高級アルコールは植物の成長促進剤としても有用である。
【０００３】
このように脂肪酸類の利用は多岐にわたり、そのため動植物等において生体内での脂肪酸や脂質の生産性を向上させる試みがおこなわれている。例えば、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ（ACCase）の導入により種子中の脂質量を向上させる方法（特許文献１、非特許文献１、特許文献５）、酵母sn-2アシルトランスフェラーゼ（SLC1-1）の導入により種子中の脂質量を向上させる方法（特許文献２、特許文献３及び非特許文献２）、ジアシルグリセロールアシル基転移酵素遺伝子（DGAT）の導入により種子中の脂質量を向上させる方法（特許文献４及び非特許文献３）等が提案されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００２-３３５７８６号公報
【特許文献２】特表平１１-５０６３２３号公報
【特許文献３】国際公開第２００８／０７６３７７号パンフレット
【特許文献４】国際公開第２０００／０３６１１４号パンフレット
【特許文献５】米国特許第５，９２５，８０５号明細書
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Madoka  Y，Tomizawa  K，Mizoi  J，Nishida  I，Nagano  Y，Sasaki  Y.，“Chloroplast  transformation  with  modified  accD  operon  increases  acetyl-CoA  carboxylase  and  causes  extension  of  leaf  longevity  and  increase  in  seed  yield  in  tobacco”，Plant  Cell  Physiol.，2002  Dec，43（12），p.1518-1525
【非特許文献２】Zou  J，Katavic  V，Giblin  EM，Barton  DL，MacKenzie  SL，Keller  WA，Hu  X，Taylor  DC.，“Modification  of  seed  oil  content  and  acyl  composition  in  the  brassicaceae  by  expression  of  a  yeast  sn-2  acyltransferase  gene”，Plant  Cell，1997  Jun，9（6），p.909-923
【非特許文献３】Jako  C，Kumar  A，Wei  Y，Zou  J，Barton  DL，Giblin  EM，Covello  PS，Taylor  DC.，“Seed-specific  over-expression  of  an  Arabidopsis  cDNA  encoding  a  diacylglycerol  acyltransferase  enhances  seed  oil  content  and  seed  weight”，Plant  Physiol.，2001，126（2），p.861-874
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、野生型チオエステラーゼのアミノ酸配列を改変したチオエステラーゼ改変体、及びこれを用いた脂質の製造方法を提供することを課題とする。また、本発明は、チオエステラーゼ改変体を導入し脂質生産能が向上した形質転換体を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、動植物等における脂質生産性を向上させるべく、鋭意検討をおこなった。その結果、ココヤシ（Cocos nucifera）由来のチオエステラーゼのアミノ酸配列を一部改変したところ、このチオエステラーゼ改変体を導入した形質転換体において、野生型のチオエステラーゼを導入した形質転換体と比較して、脂質の生産性が有意に向上することを見出した。本発明はこの知見に基づいて完成するに至ったものである。
【０００８】
すなわち本発明は、宿主に下記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子を導入して形質転換体を得る工程と、得られた形質転換体から脂質を採取する工程とを含む、脂質の製造方法（以下、「本発明の製造方法」ともいう。）に関する。
（ａ）配列番号１の１１２番〜４１４番までのアミノ酸配列であって、配列番号１の２０９番目に相当するアミノ酸がトリプトファンからトレオニン、グルタミン酸、又はアラニンに置換されたアミノ酸配列を有し、かつチオエステラーゼ活性を有するタンパク質
（ｂ）（ａ）のタンパク質のアミノ酸配列において、配列番号１の２０９番目に相当するアミノ酸以外の１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつチオエステラーゼ活性を有するタンパク質
【０００９】
また、本発明は、宿主に前記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子を導入して形質転換体を得る工程を含む、脂質の生産性を向上させる方法に関する。
また、本発明は、宿主に前記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子を導入して得られる形質転換体（以下、「本発明の形質転換体」ともいう。）に関する。
さらに、本発明は、前記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質（以下、「本発明のチオエステラーゼ改変体」ともいう。）に関する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の形質転換体は、野生型チオエステラーゼを導入した形質転換体に比べ、優れた脂質生産能を有する。そのため、当該形質転換体を用いた本発明の製造方法は、脂質の生産性に優れる。本発明のチオエステラーゼ改変体、形質転換体、及び製造方法は、脂肪酸及び脂質の工業的生産に好適に用いることができる。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明のチオエステラーゼ改変体、これを用いた形質転換体及び脂質の製造方法について順に説明する。
本発明において、脂質には、中性脂肪、ろう、セラミド等の単純脂質、リン脂質、糖脂質、スルホ脂質等の複合脂質、脂肪酸、アルコール類、炭化水素類等の誘導脂質が含まれる。
【００１２】
１．チオエステラーゼ改変体
本発明のチオエステラーゼ改変体は、配列番号１に示すココヤシ（Cocos nucifera）由来の野生型チオエステラーゼ（以下、単に野生型チオエステラーゼともいい、ＣＴＥとも略記する）のアミノ酸配列を一部改変したアミノ酸配列を有し、チオエステラーゼ活性を有するタンパク質である。
チオエステラーゼは、トリグリセリドの生合成系に関与する酵素であるアシル‐アシルキャリヤープロテイン（Acyl-ACP）チオエステラーゼであって、葉緑体内や色素体内において脂肪酸生合成過程の中間体であるアシル‐アシルキャリヤープロテイン（脂肪酸残基であるアシル基とアシルキャリヤープロテインとからなる複合体）のチオエステル結合を加水分解し、遊離の脂肪酸を生成する酵素である。チオエステラーゼの作用によって、アシルキャリヤープロテイン上での脂肪酸合成が終了し、遊離した脂肪酸は色素体から輸送されトリグリセリド合成に供される。チオエステラーゼは、基質であるアシル‐アシルキャリヤープロテインを構成する脂肪酸残基の種類によって異なる反応特異性を示すものがあることがわかっており、生体内での脂肪酸組成を決める重要なファクターであると考えられている。
【００１３】
本発明のチオエステラーゼ改変体として、具体的には下記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質が挙げられる。
（ａ）配列番号１の１１２番〜４１４番までのアミノ酸配列であって、配列番号１の２０９番目に相当するアミノ酸がトリプトファンからトレオニン、グルタミン酸、又はアラニンに置換されたアミノ酸配列を有し、かつチオエステラーゼ活性を有するタンパク質
（ｂ）（ａ）のタンパク質のアミノ酸配列において、配列番号１の２０９番目に相当するアミノ酸以外の１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつチオエステラーゼ活性を有するタンパク質
【００１４】
前記（ａ）のタンパク質は、配列番号１に示す野生型チオエステラーゼのアミノ酸配列の１１２番〜４１４番までのアミノ酸配列を少なくとも有する。配列番号１に示す野生型チオエステラーゼのアミノ酸配列において、１１２番目から４１５番目までの領域は、チオエステラーゼとして機能するために特に重要で、チオエステラーゼ活性を示すために必要十分な領域である（Voelker，T．A.，A．C．Worrell，L．Anderson，J．Bleibaum，C．Fan,D．H．Hawkins，S．E．Radke，and  H．M．Davies,“Fatty  acid  biosynthesis  redirected  to  medium  chains  in  transgenic  oilseed  plants”，Science，1992，257，p.72-74参照）。前記（ａ）のタンパク質は、このチオエステラーゼ活性にとって必要十分な領域を有し、後述の実施例でも実証されているように、チオエステラーゼとして機能する。
さらに、前記（ａ）のタンパク質のアミノ酸配列では、配列番号１の１１２番〜４１４番までのアミノ酸配列中の、配列番号１の２０９番目に相当するトリプトファン（Ｔｒｐ；Ｗ）が、トレオニン（Ｔｈｒ；Ｔ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ；Ｅ）、及びアラニン（Ａｌａ；Ａ）から選ばれるいずれかのアミノ酸で置換されている。
以下、配列番号１の２０９番目に相当するアミノ酸が、トレオニンに置換されたチオエステラーゼ改変体をＣＴＥ（Ｗ２０９Ｔ）、グルタミン酸に置換されたチオエステラーゼ改変体をＣＴＥ（Ｗ２０９Ｅ）、アラニンに置換されたチオエステラーゼ改変体をＣＴＥ（Ｗ２０９Ａ）、とそれぞれ略記する。
【００１５】
前記（ｂ）のタンパク質は、前記（ａ）のタンパク質のアミノ酸配列の一部に欠失、置換、挿入、又は付加の変異を有するアミノ酸配列を有し、かつチオエステラーゼ活性を有するタンパク質である。ただし、欠失、置換、挿入、又は付加の変異を有するのは、前記（ａ）において置換が施された配列番号１の２０９番目に相当するアミノ酸以外の領域である。すなわち、（ｂ）のタンパク質が有するアミノ酸配列は、配列番号１の１１２番〜４１４番までのアミノ酸配列を基本とし、当該配列中の配列番号１の２０９番目に相当するアミノ酸がトリプトファンから、トレオニン、グルタミン酸、及びアラニンから選ばれるいずれかのアミノ酸で置換され、さらに、当該配列中の該置換が施された２０９番目に相当するアミノ酸以外の１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列である。
一般に、酵素タンパク質をコードしているアミノ酸配列は、必ずしも全領域の配列が保存されていなければ酵素活性を示さないというものではなく、アミノ酸配列が変化しても酵素活性に影響を与えない領域も存在することが知られている。このような酵素活性に必須でない領域においては、アミノ酸の欠失、置換、挿入又は付加といった変異が導入されても酵素本来の活性を維持することができる。本発明においても、このようにチオエステラーゼ活性が保持され、かつアミノ酸配列が一部欠失等により変化した改変体を用いることができる。
なお、改変タンパク質がチオエステラーゼ活性を有することは、基質としてAcyl‐ACPを用いたin  vitro活性測定法、例えば、Robert  M  et  al.  Plant  Cell  Physiol．40(2):  155-163  (1999)に記載の方法により確認することができる。
前記（ｂ）のタンパク質において、「１又は数個のアミノ酸」は、脂質生産能向上の観点から、１〜１０個であることが好ましく、１〜５個であることがより好ましく、１〜２個であること特に好ましい。
【００１６】
前記（ａ）及び（ｂ）のタンパク質は、配列番号１の１１２番〜４１４番までのアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列の他に、他のアミノ酸配列を有していてもよい。他のアミノ酸配列としては、脂質生産能向上の観点から、配列番号１の１番〜１１１番までのアミノ酸配列若しくはその一部の配列が好ましい。
脂質生産能向上の観点から、前記（ａ）及び（ｂ）のタンパク質として好ましくは、下記（ｃ）及び（ｄ）のタンパク質である。
（ｃ）配列番号１に示すアミノ酸配列において２０９番目のアミノ酸がトリプトファンからトレオニン、グルタミン酸、又はアラニンに置換されたアミノ酸配列からなり、かつチオエステラーゼ活性を有するタンパク質
（ｄ）（ｃ）のアミノ酸配列において、２０９番目以外の１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつチオエステラーゼ活性を有するタンパク質
【００１７】
前記（ｃ）のタンパク質は、配列番号１に示す野生型チオエステラーゼのアミノ酸配列において２０９番目に相当するトリプトファンが、トレオニン、グルタミン酸、及びアラニンから選ばれるいずれかのアミノ酸で置換されたアミノ酸配列を有する。２０９番目のアミノ酸が、トレオニンに置換されたチオエステラーゼ改変体のアミノ酸配列を配列番号３に、グルタミン酸に置換されたチオエステラーゼ改変体のアミノ酸配列を配列番号５に、アラニンに置換されたチオエステラーゼ改変体のアミノ酸配列を配列番号７に、それぞれ示す。
【００１８】
前記（ｄ）のタンパク質は、配列番号１に示す野生型チオエステラーゼのアミノ酸配列において２０９番目に相当するトリプトファンが、トレオニン、グルタミン酸、及びアラニンから選ばれるいずれかのアミノ酸で置換され、さらに２０９番目以外の１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつチオエステラーゼ活性を有するタンパク質である。
前記（ｄ）のタンパク質において、「１又は数個のアミノ酸」は、脂質生産能向上の観点から、１〜１０個であることが好ましく、１〜５個であることがより好ましく、１〜２個であることがさらに好ましい。
【００１９】
２．チオエステラーゼ改変体をコードする遺伝子
前記（ａ）〜（ｄ）のタンパク質をコードする遺伝子として、下記（ｅ）〜（ｈ）の遺伝子が例示できるが、本発明はこれに限定されるものではない。
（ｅ）配列番号２の３３４番〜１２４５番までの塩基配列であって、配列番号２の６２５番〜６２７番に相当する塩基がトリプトファンをコードする塩基からトレオニン、グルタミン酸、又はアラニンをコードする塩基に置換された塩基配列を有し、かつチオエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
（ｆ）（ｅ）の遺伝子の塩基配列において、配列番号２の６２５番〜６２７番に相当する塩基以外の１又は数個の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加された塩基配列を有し、かつチオエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
（ｇ）配列番号２に示す塩基配列において、６２５番〜６２７番のトリプトファンをコードする塩基がトレオニン、グルタミン酸、又はアラニンをコードする塩基に置換された塩基配列からなり、かつチオエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
（ｈ）（ｇ）の遺伝子の塩基配列において、６２５番〜６２７番以外の１又は数個の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加された塩基配列からなり、かつチオエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
【００２０】
配列番号２に示す塩基配列は、ココヤシ由来の野生型チオエステラーゼをコードする遺伝子の塩基配列の一例である。
前記（ｆ）又は（ｈ）の遺伝子の塩基配列において、「１又は数個の塩基」は、脂質生産能向上の観点から、１〜１０個であることが好ましく、１〜５個であることがより好ましく、１〜２個であること特に好ましい。
前記（ｇ）の遺伝子の塩基配列として、トリプトファンをコードする塩基がトレオニンに置換された塩基配列の一例を配列番号４に、グルタミン酸に置換された塩基配列の一例を配列番号６に、アラニンに置換された塩基配列の一例を配列番号８に、それぞれ示す。
【００２１】
チオエステラーゼ改変体及びこれをコードする遺伝子は、通常の遺伝子工学的手法により得ることができる。例えば、野生型チオエステラーゼのアミノ酸配列情報又は塩基配列情報を取得し、これに基づいて部位特定変異導入法等の手法により所望の位置のアミノ酸配列又は塩基配列に置換（変異）を施すことができる。
野生型チオエステラーゼのアミノ酸配列（配列番号１）及びそれをコードする塩基配列（例えば、配列番号２）は、GenBank等のデータベースから得ることができる（例えばGenBankでは、タンパク質配列；AEM72521.1，ｍＲＮＡ配列：JF338905.1）。得られた配列をもとに、野生型チオエステラーゼをコードする遺伝子を人工合成により取得することができる。遺伝子の人工合成はインビトロジェン社等のサービスを利用することができる。また、ココヤシから野生型チオエステラーゼをコードする遺伝子をクローニングによって取得することもでき、例えば、Molecular  Cloning−A  LABORATORY  MANUAL  THIRD  EDITION［Joseph  Sambrook，David  W.  Russell，Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press（2001）］記載の方法等により行うことができる。
部位特異的変異の導入方法としては、例えば、後述する実施例で用いたSplicing  overlap  extension（SOE）PCR反応（Horton  et  al.，Gene  77，61−68，1989）を利用した方法、ＯＤＡ法（Hashimoto-Gotoh  et  al.，Gene，152，271-276，1995））、又はKunkel法（Kunkel，T.  A.，Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA，1985，82，488）等が挙げられる。また、Site-Directed  Mutagenesis  System  Mutan-SuperExpress  Kmキット（タカラバイオ社）、Transformer  TM  Site-Directed  Mutagenesisキット（Clonetech社）、又はKOD-Plus-Mutagenesis  Kit（東洋紡社）等の市販のキットを利用することもできる。なかでも、本発明においては、部位特異的変異導入が高効率である観点から、Kunkel法によって行うことが好ましい。
【００２２】
本発明で用いるチオエステラーゼ改変体をコードする遺伝子を調製する具体的な手法としては、まず、ココヤシよりクローニングした野生型チオエステラーゼ遺伝子の塩基配列（例えば、配列番号２で示される塩基配列）を、In-Fusion（登録商標）  HD  Cloning  Kit（Clonthech,  Mountain  View,  California）を用いてベクターに組み込む。次いで、得られたベクターＤＮＡを鋳型にして、配列番号１で示されるアミノ酸配列における２０９番目のアミノ酸がトリプトファンからトレオニン、グルタミン酸、又はアラニンに置換されたアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むオリゴヌクレオチド（例えば、配列番号１３又は１４で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド）をプライマーとして用い、ＰＣＲ法によってＤＮＡ断片を増幅する。ここで、ＰＣＲの反応条件の好ましい一例としては、２本鎖ＤＮＡを１本鎖にする熱変性反応を９４℃で３０秒間行い、プライマー対を１本鎖ＤＮＡにハイブリダイズさせるアニーリング反応を５５℃で約３０秒間行い、ＤＮＡポリメラーゼを作用させる伸長反応を７２℃で約７０秒間行い、これらを１サイクルとしたものを３０サイクル行うことが挙げられる。
ＰＣＲ反応で増幅したＤＮＡを、メチル化ＤＮＡを特異的に切断するDpnＩ酵素で処理し、これを用いて大腸菌を形質転換し、抗生物質含有プレート培地で選択する。形質転換された大腸菌よりプラスミド抽出することで、目的のアミノ酸変異が導入されたチオエステラーゼ改変体をコードする遺伝子を取得することができる。
【００２３】
３．形質転換体（組換え体）
本発明の形質転換体は、宿主に前記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子を導入して得られる。当該形質転換体では、野生型チオエステラーゼ遺伝子を導入した形質転換体に比べ、脂質の生産能が有意に向上する。なお、野生型チオエステラーゼ及びチオエステラーゼ改変体の脂肪酸及び脂質の生産能については、実施例で用いた方法により測定することができる。
【００２４】
本発明の形質転換体は、チオエステラーゼ改変体をコードする遺伝子を、通常の遺伝子工学的方法によって宿主に導入することで得られる。具体的には、チオエステラーゼ改変体をコードする遺伝子を宿主細胞中で発現させることのできる発現ベクターを調製し、これを宿主細胞に導入して宿主細胞を形質転換させることにより作製できる。
【００２５】
形質転換体の宿主としては特に限定されず、微生物、藻類、植物体、又は動物体を用いることができる。製造効率及び得られた脂質の利用性の点から、宿主としては、微生物、藻類、又は植物が好ましく、微生物又は藻類がより好ましく、微生物がさらに好ましい。
宿主として用いる微生物は原核生物、真核生物のいずれであってもよい。原核生物としては、エシェリキア（Escherichia）属に属する微生物やバシラス（Bacillus）属に属する微生物が挙げられる。真核生物としては、酵母や糸状菌等が挙げられる。なかでも、有用物質の生産性の観点から、大腸菌（Escherichia coli）、枯草菌（Bacillus subtilis）、赤色酵母（Rhodosporidium toruloides）、又はモルチエレラ  エスピー（Mortierella  sp．）が好ましく、大腸菌又は枯草菌がより好ましく、大腸菌がさらに好ましい。
植物としては、種子に脂質を高含有する観点から、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）、ナタネ、ココヤシ、パーム、クフェア、又はヤトロファが好ましく、シロイヌナズナがより好ましい。
藻類としては、遺伝子組換え手法が確立している観点から、シアノバクテリア（Synechocystis  sp.）、クラミドモナス、又はフェオダクチラムが好ましく、シアノバクテリアがより好ましい。
【００２６】
発現ベクターの母体となるベクターとしては、チオエステラーゼ改変体をコードする遺伝子を宿主に導入することができ、宿主細胞内で当該遺伝子を発現可能なベクターであればよい。例えば、導入する宿主の種類に応じたプロモーターやターミネーター等の発現調節領域を有するベクターであって、複製開始点や選択マーカー等を有するベクターを用いることができる。また、プラスミド等の染色体外で自立増殖・複製するベクターであってもよいし、染色体内に組み込まれるベクターであってもよい。
具体的なベクターとしては、微生物を宿主とする場合には、例えば、pBluescript  II  SK(-)（Stratagene社製）、pUC系ベクター（宝酒造社製）、pET系ベクター（タカラバイオ社製）、pGEX系ベクター（GEヘルスケア社製）、pCold系ベクター（タカラバイオ社製）、pHY300PLK（タカラバイオ社製）、pUB110（Mckenzie，T.  et  al.,（1986）,Plasmid  15（2）；p.93-103）、pBR322（タカラバイオ社製）、pRS403（ストラタジーン社製）、又はpMW218/219（ニッポンジーン社製）等を挙げることができる。植物細胞を宿主とする場合には、例えば、pRI系ベクター（タカラバイオ社製）、pBI系ベクター（クロンテック社製）、又はIN3系ベクター（インプランタイノベーションズ社製）等を挙げることができる。藻類を宿主とする場合には、例えば、pUC系ベクター（宝酒造社製）、pET系ベクター（タカラバイオ社製）、又はpBluescript  II  SK(-)（Stratagene社製）等を挙げることができる。
特に、大腸菌を宿主とする場合には、pBluescript  II  SK(-)、又はpMW218/219が好ましく用いられ、シロイヌナズナを宿主とする場合には、pRI系ベクター、又はpBI系ベクターが好ましく用いられ、シアノバクテリアを宿主とする場合には、pUC系ベクターが好ましく用いられる。
【００２７】
プロモーターやターミネーター等の発現調節領域や選択マーカーの種類も特に限定されず、通常使用されるプロモーターやマーカー等を導入する宿主の種類に応じて適宜選択して用いることができる。
具体的なプロモーターとしては、lacプロモーター、trpプロモーター、tacプロモーター、trcプロモーター、T7プロモーター、SpoVGプロモーター、カリフラワーモザイルウイルス35SRNAプロモーター、アクチンやユビキチン等ハウスキーピング遺伝子のプロモーター、ナタネ由来Napin遺伝子プロモーター、又は植物由来Rubiscoプロモーター等が挙げられる。
また、選択マーカーとしては、抗生物質耐性遺伝子（アンピシリン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、エリスロマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ブラストサイジンＳ耐性遺伝子、ビアラホス耐性遺伝子、及びハイグロマイシン耐性遺伝子）等の薬剤耐性遺伝子が挙げられる。さらに、栄養要求性に関連する遺伝子の欠損等を選択マーカー遺伝子として使用することも可能である。
上記ベクターにチオエステラーゼ改変体をコードする遺伝子を、制限酵素処理やライゲーション等の通常の手法によって組み込むことにより形質転換に用いる発現ベクターを構築することができる。なお、チオエステラーゼ改変体をコードする遺伝子の取得方法については上述した。
【００２８】
形質転換方法としては、宿主に目的遺伝子を導入しうる方法であれば特に限定されるものではない。例えば、カルシウムイオンを用いる方法、一般的なコンピテントセル形質転換方法（J．Bacterial．93，1925（1967））、プロトプラスト形質転換法（Mol．Gen．Genet．168，111（1979））、エレクトロポレーション法（FEMS  Microbiol．Lett．55，135（1990））又はLP形質転換方法（T．Akamatsu及びJ．Sekiguchi，Archives  of  Microbiology，1987，146，p.353-357；T．Akamatsu及びH．Taguchi，Bioscience，Biotechnology，and  Biochemistry，2001，65，4，p.823-829）等を用いることができる。
また、目的遺伝子断片が導入された形質転換体の選択は、選択マーカー等を利用することで行うことができる。例えば、ベクター由来の薬剤耐性遺伝子が、形質転換時に目的ＤＮＡ断片とともに宿主細胞中に導入された結果、形質転換体が獲得する薬剤耐性を指標に行うことができる。また、ゲノムを鋳型としたＰＣＲ法等によって、目的ＤＮＡ断片の導入を確認することもできる。
【００２９】
４．脂質の製造方法
次いで、上記で得られた形質転換体を用いて脂質を生産する。
本発明の製造方法は、チオエステラーゼ改変体をコードする遺伝子を導入した形質転換体から脂質を採取する工程を含む。当該工程は、脂質の生産性向上の観点から、チオエステラーゼ改変体をコードする遺伝子を導入した形質転換体を適切な条件にて培養又は生育して培養物又は生育物を得る工程、及び得られた培養物又は生育物から脂質を採取する工程を含むことが好ましい。ここで、培養物とは、培養した後の培養液及び形質転換体をいい、生育物とは、生育した後の形質転換体をいう。
【００３０】
形質転換体の培養又は生育条件は、遺伝子が導入された宿主の種類に応じて選択することができ、適宜好ましい条件を採用することができる。例えば、大腸菌を宿主として用いた形質転換体の場合、ＬＢ培地で３０〜３７℃、０．５〜１日間培養することが好ましい。シロイヌナズナを宿主として用いた形質転換体の場合、温度条件２０〜２５℃、白色光を連続照射又は明期１６時間・暗期８時間等の光条件下で１〜２か月間育成することが好ましい。シアノバクテリアを宿主として用いた形質転換体の場合、温度条件２５〜３２℃、白色光を連続照射又は明期１２時間・暗期１２時間等の光条件下で１週間〜１か月間培養することが好ましい。
また、脂肪酸及び脂質の生産効率の点から、培地中に、例えばチオエステラーゼの基質或いは脂肪酸生合成系に関与する前駆物質としてグリセロール、酢酸、又はマロン酸等を添加してもよい。
【００３１】
形質転換体において産生された脂質を採取する方法としては、通常生体内の脂質成分等を単離する際に用いられる方法、例えば、前述の培養物、生育物又は形質転換体から、ろ過、遠心分離、細胞の破砕、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、クロロホルム／メタノール抽出法、ヘキサン抽出法、又はエタノール抽出法等により脂質成分を単離、回収する方法が挙げられる。より大規模な場合は、培養物、生育物又は形質転換体より油分を圧搾又は抽出により回収後、脱ガム、脱酸、脱色、脱蝋、脱臭等の一般的な精製を行い、脂質を得ることができる。このように脂質成分を単離した後、単離した脂質を加水分解することで脂肪酸を得ることができる。脂質成分から脂肪酸を単離する方法としては、例えば、アルカリ溶液中で７０℃程度の高温で処理をする方法、リパーゼ処理をする方法、又は高圧熱水を用いて分解する方法等が挙げられる。
【００３２】
本発明の製造方法は、本発明のチオエステラーゼ改変体を用いることで、野生型チオエステラーゼを用いた場合と比べ、脂質の生産性を有意に向上させることができる。
本発明の製造方法において製造される脂質は、その利用性の点から、単純脂質及び誘導脂質から選ばれる１種以上を含んでいることが好ましく、誘導脂質を含んでいることがより好ましく、脂肪酸又はそのエステルを含んでいることがさらに好ましい。脂質中に含まれる脂肪酸又はそのエステルは、界面活性剤等への利用性から、炭素原子数１２〜１６の脂肪酸又はそのエステルが好ましく、炭素原子数１２〜１４の脂肪酸又はそのエステルがより好ましく、ラウリン酸又はそのエステルがさらに好ましい。これらの高級脂肪酸を還元して得られる高級アルコールの誘導体は、界面活性剤として利用できる。
採取された総脂質成分中の炭素原子数１２〜１６の脂肪酸の含有量は、界面活性剤として利用する観点から、好ましくは６５質量％以上、より好ましくは７５質量％以上、さらに好ましくは８５質量％以上である。また、採取された総脂質成分中の炭素原子数１２〜１４の脂肪酸の含有量は、界面活性剤として利用する観点から、好ましくは５０質量％以上、より好ましくは５５質量％以上、さらに好ましくは６０質量％以上である。さらに、採取された総脂質成分中に含まれるラウリン酸の含有量は、界面活性剤として利用する観点から、好ましくは２７質量％以上、より好ましくは２８質量％以上、さらに好ましくは３０質量％以上である。ここで、「採取された総脂質成分」とは、実施例で用いられた方法により算出された総脂質成分をいう。
【００３３】
本発明の製造方法、形質転換体により得られる脂肪酸や脂質は、食用として用いる他、乳化剤として化粧品等に配合したり、石鹸や洗剤等の洗浄剤、繊維処理剤、毛髪リンス剤、又は殺菌剤や防腐剤として利用することができる。
【００３４】
上述した実施形態に関し、本発明はさらに以下の方法、形質転換体、タンパク質を開示する。
【００３５】
＜１＞  宿主に下記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子を導入して形質転換体を得る工程と、得られた形質転換体から脂質を採取する工程とを含む、脂質の製造方法。
（ａ）配列番号１の１１２番〜４１４番までのアミノ酸配列であって、配列番号１の２０９番目に相当するアミノ酸がトリプトファンからトレオニン、グルタミン酸、又はアラニンに置換されたアミノ酸配列を有し、かつチオエステラーゼ活性を有するタンパク質
（ｂ）（ａ）のタンパク質のアミノ酸配列において、配列番号１の２０９番目に相当するアミノ酸以外の１又は数個（好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜２個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつチオエステラーゼ活性を有するタンパク質
＜２＞  前記宿主が、植物、藻類及び微生物から選択される、＜１＞項記載の製造方法。
＜３＞  前記宿主が、シロイヌナズナ、シアノバクテリア及び大腸菌から選択される、＜１＞又は＜２＞項記載の製造方法。
＜４＞  前記脂質がラウリン酸を含む、＜１＞〜＜３＞のいずれか１項に記載の製造方法。
＜５＞  前記脂質中に、ラウリン酸が２７質量％以上（好ましくは２８質量％以上、より好ましくは３０質量％以上）含有される、＜１＞〜＜４＞のいずれか１項に記載の製造方法。
＜６＞  前記宿主が微生物である、＜１＞〜＜５＞のいずれか１項に記載の製造方法。
＜７＞  前記宿主が大腸菌である、＜１＞〜＜６＞のいずれか１項に記載の製造方法。
【００３６】
＜８＞  宿主に前記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子を導入して形質転換体を得る工程を含む、脂質の生産性を向上させる方法。
【００３７】
＜９＞  宿主に前記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子を導入して得られる形質転換体。
＜１０＞  前記宿主が、植物、藻類及び微生物から選択される、＜９＞項記載の形質転換体。
＜１１＞  前記宿主が、シロイヌナズナ、シアノバクテリア及び大腸菌から選択される、＜９＞又は＜１０＞項記載の形質転換体。
＜１２＞  前記宿主が微生物である、＜９＞〜＜１１＞のいずれか１項に記載の質転換体。
＜１３＞  前記宿主が大腸菌である、＜９＞〜＜１２＞のいずれか１項に記載の質転換体。
【００３８】
＜１４＞  前記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質。
【実施例】
【００３９】
以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００４０】
実施例
１．野生型チオエステラーゼ（CTE）遺伝子発現プラスミドの構築
配列番号２に示す塩基配列からなる野生型チオエステラーゼをコードする遺伝子を鋳型として、下記表１に示すCTE  FW（配列番号９）及びCTE  RV（配列番号１０）のプライマー対を用いたＰＣＲ反応により、野生型チオエステラーゼ遺伝子のＤＮＡ断片を取得した。また、プラスミドベクターpMW219（ニッポンジーン社製）を鋳型とし、pMW219  FW（配列番号１１）及びpMW219  RV（配列番号１２）のプライマー対を用いたＰＣＲ反応により、直鎖状にしたpMW219を取得した後、これをDpnＩ処理した。これら２つのＤＮＡ断片をIn-Fusion（登録商標）  HD  Cloning  Kit（Clonthech,  Mountain  View,  California）を用いて連結し、ベクター由来のLacZタンパク質のＮ末端２７アミノ酸と野生型チオエステラーゼ遺伝子断片（配列番号２に示す塩基配列において、３３４番目から１２４５番目の塩基配列）が融合する形で野生型チオエステラーゼ遺伝子が発現するプラスミドを構築した。得られたプラスミドは、ＤＮＡシークエンス法によって、野生型チオエステラーゼをコードする遺伝子が挿入されていることを確認した。
【００４１】
２．チオエステラーゼ改変体発現プラスミドの構築
前記１．で構築した野生型チオエステラーゼ発現プラスミドを鋳型として、下記表１に示すCTE_W209T  FW（配列番号１３）及びCTE_W209T  RV（配列番号１４）のプライマー対、CTE_W209E  FW（配列番号１５）及びCTE_W209E  RV（配列番号１６）のプライマー対、CTE_W209A  FW（配列番号１７）及びCTE_W209A  RV（配列番号１８）、又はCTE_W209D  FW（配列番号１９）及びCTE_W209D  RV（配列番号２０）のプライマー対を用いたＰＣＲ反応により、配列番号２に示した野生型チオエステラーゼ遺伝子の塩基配列の６２５〜６２７番目の塩基ＴＧＧ（トリプトファン；Ｗ）が、ＡＣＣ（トレオニン；Ｔ）、ＧＡＧ（グルタミン酸；Ｅ）、ＧＣＣ（アラニン；Ａ）、又はＧＡＣ（アスパラギン酸；Ｄ）へとそれぞれ置換されたチオエステラーゼ改変体ＣＴＥ（Ｗ２０９Ｔ）、ＣＴＥ（Ｗ２０９Ｅ）、ＣＴＥ（Ｗ２０９Ａ）、ＣＴＥ（Ｗ２０９Ｄ）をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した。得られたＰＣＲ反応溶液をDpnＩで処理し、鋳型ＤＮＡを消化した後、大腸菌を形質転換して、チオエステラーゼ改変体が発現するプラスミドを構築した。得られたプラスミドは、ＤＮＡシークエンス法によって、チオエステラーゼ改変体をコードする遺伝子が挿入されていることを確認した。
【００４２】
【表１】
2014060943.tif 000002
【００４３】
３．形質転換体の構築
前記で構築した野生型チオエステラーゼ発現プラスミド、チオエステラーゼ改変体発現プラスミドを用いて、大腸菌突然変異株であるＫ２７株（ｆａｄＤ８８）（Overath  et  al，  Eur．J．Biochem．7，559-574，1969）をコンピテントセル形質転換法により形質転換した。形質転換処理をしたＫ２７株を３０℃で一晩静置して得られたコロニーをＬＢＫｍ液体培地（Bacto  Trypton  １％，Yeast  Extract  ０．５％，ＮａＣｌ  １％，カナマイシン５０μｇ／ｍＬ）１ｍＬに接種し、３０℃で１２時間振とう培養した。１２時間後の培養液を別のＬＢＫｍ液体培地２．０ｍＬに２０μＬ添加し、３０℃で振とう培養し、培養開始から３６時間経過した培養液中に含まれている脂質成分を後述の方法にて解析した。また３６時間後の培養液の６００ｎｍにおける吸光度（ＯＤ６００）を計測し、培養液に含まれる大腸菌の量を測定した。なお、陰性対照として、プラスミドベクターpMW219にて形質転換した大腸菌Ｋ２７株についても同様に実験を行った。
【００４４】
４．大腸菌培養液中の脂質の抽出および脂肪酸分析
培養開始後３６時間経過した培養液１ｍＬに、２Ｎ塩酸１０μＬ、および内部標準としてメタノールに溶解した７−ペンタデカノン（５ｍｇ／ｍＬ）を３０μＬ添加した。この液に対してクロロホルム０．５ｍＬとメタノール１ｍＬを添加し、十分に攪拌した後に１５分間静置した。さらに、１．５％塩化カリウム水溶液０．５ｍＬとクロロホルム０．５ｍＬを添加し、十分に攪拌した後に１５分間静置した。室温、１５００ｒｐｍで５分間遠心分離を行った後、下層部分を採取し、窒素ガスで乾燥した。乾燥したサンプルに３−フッ化ホウ素メタノール錯体溶液を１ｍＬ添加し、８０℃で１０分間恒温することにより脂肪酸のメチルエステル化処理を行った。その後、飽和食塩水１ｍＬとヘキサン１ｍＬを添加し、十分に攪拌した後に３０分間静置した。上層部分を採取し、ガスクロマトグラフィー（Agilent  6890）解析に供した。使用したガスクロマトグラフィーは［キャピラリーカラム：ＤＢ−１  ＭＳ  ３０ｍ×２００μｍ×０．２５μｍ（J＆W  Scientific）、移動相：高純度ヘリウム、カラム内流量：１．０ｍＬ／分、昇温プログラム：１００℃（１分間）→１０℃／分→３００℃（５分間）、平衡化時間：１分間、注入口：スプリット注入（スプリット比：１００：１），圧力１４．４９ｐｓｉ，１０４ｍＬ／分，注入量１μＬ、洗浄バイアル：メタノール・クロロホルム、検出器温度：３００℃］の条件で行った。
【００４５】
５．大腸菌培養液中の脂質及び脂肪酸量の解析
ガスクロマトグラフィー解析により得られた波形データのピーク面積より、各脂肪酸のメチルエステル量を定量した。なお、各ピーク面積を内部標準である７−ペンタデカノンのピーク面積と比較することで試料間の補正を行い、培養液１リットルあたりの各脂肪酸量を算出した。さらに、算出した各脂肪酸量を、事前に計測した培養液中に含まれる大腸菌量（ＯＤ６００）で標準化した。また、上記で算出された各脂肪酸生産量を合計して得総脂肪酸生産量（脂質量）算出した。結果を表２に示す。さらに、総脂肪酸生産量に占める各脂肪酸生産量の割合を表３に示した。なお、表２において、各脂肪酸生産量及び総脂肪酸生産量（脂質量）は、野生型チオエステラーゼ遺伝子を導入した形質転換体での生産量を１とした相対値で示した。
【００４６】
【表２】
2014060943.tif 000003
【００４７】
【表３】
2014060943.tif 000004
【００４８】
表２から明らかなように、チオエステラーゼ改変体ＣＴＥ（Ｗ２０９Ｔ）、ＣＴＥ（Ｗ２０９Ｅ）、ＣＴＥ（Ｗ２０９Ａ）を導入した形質転換体では、野生型チオエステラーゼ遺伝子を導入した形質転換体と比較して、各脂肪酸の生産量及び総脂肪酸量が大きく増加していた。
これに対し、チオエステラーゼ改変体ＣＴＥ（Ｗ２０９Ｄ）を導入した形質転換体では、野生型チオエステラーゼ遺伝子を導入した形質転換体と同程度の脂肪酸生産量に留まった。
【配列表】
2014060943000001.app