(57)【要約】【課題】  植物性材料からフェルラ酸をより効率的かつ安全に遊離させることができる、酵素製剤およびそれを用いたフェルラ酸の製造方法を提供すること。【解決手段】  植物性材料からフェルラ酸を効率的に遊離することができる酵素製剤およびそれを用いたフェルラ酸の製造方法を開示する。本発明の酵素製剤は、植物性材料からフェルラ酸を遊離するための酵素製剤であって、フェルラ酸エステラーゼ活性を有する酵素と、アラビノフラノシダーゼおよびキシラナーゼからなる群から選択される少なくとも１の酵素とを含有する。本発明によれば、所定量の植物性材料から、より効率的かつ多量のフェルラ酸を遊離させることができる。本発明の酵素製剤に含まれる酵素は、医薬品・食品等の分野においてすでに安全に使用されているため、当該得られたフェルラ酸もまた安全であり、医薬品・食品等の機能性素材として有用である。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物性材料からフェルラ酸を遊離するための酵素製剤であって、フェルラ酸エステラーゼ活性を有する酵素と、アラビノフラノシダーゼおよびキシラナーゼからなる群から選択される少なくとも１種の酵素とを含有する、酵素製剤。
【請求項２】
前記フェルラ酸エステラーゼ活性を有する酵素と前記アラビノフラノシダーゼと前記キシラナーゼを含有する、請求項１に記載の酵素製剤。
【請求項３】
前記キシラナーゼがストレプトマイセス属菌由来である、請求項１または２に記載の酵素製剤。
【請求項４】
前記アラビノフラノシダーゼがストレプトマイセス属菌由来である、請求項１から３のいずれかに記載の酵素製剤。
【請求項５】
さらに、セルラーゼおよびアセチルキシランエステラーゼからなる群から選択される少なくとも１種の酵素を含有する、請求項１から４のいずれかに記載の酵素製剤。
【請求項６】
前記フェルラ酸エステラーゼ活性を有する酵素がキシラナーゼ活性を複合的に有する、請求項１から５のいずれかに記載の酵素製剤。
【請求項７】
前記植物性材料が、米ぬか、米粕、小麦フスマ、コーンフスマ、および大豆フスマからなる群より選択される少なくとも１種の材料である、請求項１から６のいずれかに記載の酵素製剤。
【請求項８】
植物性材料をフェルラ酸エステラーゼ活性を有する酵素と、アラビノフラノシダーゼおよびキシラナーゼからなる群から選択される少なくとも１種の酵素とで処理する工程を包含する、フェルラ酸含有組成物を製造する方法。
【請求項９】
フェルラ酸の製造方法であって、
植物性材料をフェルラ酸エステラーゼ活性を有する酵素と、アラビノフラノシダーゼおよびキシラナーゼからなる群から選択される少なくとも１種の酵素とで処理してフェルラ酸含有組成物を得る工程；および
該フェルラ酸含有組成物を精製してフェルラ酸を得る工程；
を包含する、方法。
【請求項１０】
植物性材料からフェルラ酸を遊離させるためのキットであって、フェルラ酸エステラーゼ活性を有する酵素と、アラビノフラノシダーゼおよびキシラナーゼからなる群から選択される少なくとも１の酵素とを含有する、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵素製剤およびそれを用いたフェルラ酸の製造方法に関し、より詳細には、植物性材料から、より効率的にフェルラ酸を遊離させることができる酵素製剤およびそれを用いたフェルラ酸の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
フェルラ酸は、植物の細胞壁等に存在し、細胞壁多糖間に架橋を形成することにより、植物の成長調節や病原微生物の侵入抑制に関わっている。植物の細胞壁中ではフェルラ酸はアラビノースなどの糖とエステル結合して存在しているが、フェルラ酸エステラーゼによりエステル結合が加水分解されて、フェルラ酸を遊離させ得る。
【０００３】
近年、フェルラ酸は機能性素材として種々の飲食物への配合が検討されており、かつフェルラ酸を植物性材料から得るために、フェルラ酸エステラーゼ活性を有する酵素とキシラナーゼ活性を有する酵素との組み合わせや、フェルラ酸エステラーゼ活性を有する酵素とセルラーゼ活性を有する酵素とキシラナーゼ活性を有する酵素の組み合わせのような酵素製剤が提案されている（特許文献１および２）。
【０００４】
所定のキシラナーゼ活性およびフェルラ酸エステラーゼ活性を有する麹菌を用いて、焼酎酵母を仕込んだもろみから、フェルラ酸を含有する穀類蒸留酒を製造するための方法が知られている（特許文献３）。
【０００５】
上記いずれの酵素処理も植物性材料から目的のフェルラ酸を遊離させることができている。しかし、植物性材料をアルカリ処理して得られるフェルラ酸量には遠く及ばず、フェルラ酸の製造法として実用的であるとは言い難い。また、このアルカリ処理では食品等としての安全性の面から得られるフェルラ酸の用途が限られてしまう。フェルラ酸の機能に対する注目と今後の工業的生産量の拡大に対するニーズを考慮すれば、植物性材料から、安全性に優れかつより効率的にフェルラ酸を製造する技術の開発が所望されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００７−２０２５０４号公報
【特許文献２】特開２０１０−１４８４８５号公報
【特許文献３】特開２００４−２３６６３４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は上記問題の解決を課題とするものであり、その目的とするところは、植物性材料から安全性の高いフェルラ酸をより効率的に遊離させることができる、酵素製剤およびそれを用いたフェルラ酸の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、植物性材料からフェルラ酸を遊離するための酵素製剤であって、フェルラ酸エステラーゼ活性を有する酵素と、アラビノフラノシダーゼおよびキシラナーゼからなる群から選択される少なくとも１種の酵素とを含有する、酵素製剤である。
【０００９】
１つの実施態様では、上記フェルラ酸エステラーゼ活性を有する酵素と上記アラビノフラノシダーゼと前記キシラナーゼを含有する。
【００１０】
１つの実施態様では、上記キシラナーゼはストレプトマイセス属菌由来である。
【００１１】
１つの実施態様では、上記アラビノフラノシダーゼはストレプトマイセス属菌由来である。
【００１２】
１つの実施態様では、本発明の酵素製剤は、さらに、セルラーゼおよびアセチルキシランエステラーゼからなる群から選択される少なくとも１種の酵素を含有する。
【００１３】
１つの実施態様では、上記フェルラ酸エステラーゼ活性を有する酵素はキシラナーゼ活性を複合的に有する。
【００１４】
１つの実施態様では、上記植物性材料は、米ぬか、米粕、小麦フスマ、コーンフスマ、および大豆フスマからなる群より選択される少なくとも１種の材料である。
【００１５】
本発明はまた、植物性材料をフェルラ酸エステラーゼ活性を有する酵素と、アラビノフラノシダーゼおよびキシラナーゼからなる群から選択される少なくとも１種の酵素とで処理する工程を包含する、フェルラ酸含有組成物を製造する方法である。
【００１６】
本発明はまた、フェルラ酸の製造方法であって、
植物性材料をフェルラ酸エステラーゼ活性を有する酵素と、アラビノフラノシダーゼおよびキシラナーゼからなる群から選択される少なくとも１種の酵素とで処理してフェルラ酸含有組成物を得る工程；および
該フェルラ酸含有組成物を精製してフェルラ酸を得る工程；
を包含する、方法である。
【００１７】
本発明はまた、植物性材料からフェルラ酸を遊離させるためのキットであって、フェルラ酸エステラーゼ活性を有する酵素と、アラビノフラノシダーゼおよびキシラナーゼからなる群から選択される少なくとも１の酵素とを含有する、キットである。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、所定量の植物性材料から、より効率的かつ多量のフェルラ酸を遊離させることができる。本発明の酵素製剤に含まれる酵素として、医薬品・食品等の分野においてすでに安全に使用されているものを使用すると、当該遊離したフェルラ酸もまた、安全性が高いので、後の精製工程の一部または全部を省略又は簡易化でき、得られたフェルラ酸を種々の分野における機能性素材として使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】種々の酵素組合せを脱脂米ぬかに添加した場合のフェルラ酸生成量を示すグラフである。
【図２】脱脂米ぬか、生米ぬか、またはトウモロコシに種々の酵素組合せを添加した場合のフェルラ酸生成量を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、本発明について詳述する。
【００２１】
本発明の酵素製剤は、植物性材料からフェルラ酸を遊離するように機能し得る。
【００２２】
ここで、フェルラ酸は、植物の細胞壁中に存在する植物性化学物質（リグニン誘導体）であり、例えば、抗酸化剤として作用し、アレルギーやアルツハイマー疾患に起因すると考えられている酸化ストレスを緩和すると考えられている物質である。
【００２３】
本発明の酵素製剤は、フェルラ酸エステラーゼ活性を有する酵素を含有する。
【００２４】
フェルラ酸エステラーゼ活性を有する酵素は、細胞壁を構成する多糖構造のうち、アラビノフラノースとフェルラ酸との間の結合に作用して当該結合を切断するエステラーゼであれば特に限定されない。
【００２５】
本発明における「フェルラ酸エステラーゼ活性を有する酵素」は、フェルラ酸エステラーゼそれ自体、従来より他の酵素活性を有するものとして公知な酵素のうち、当該他の酵素活性以外にフェルラ酸エステラーゼ活性を有する酵素、ならびにこれらの組合せのいずれをも包含する。本発明において、後者の「従来より他の酵素活性を有するものとして公知な酵素のうち、当該他の酵素活性以外にフェルラ酸エステラーゼ活性を有する酵素」における、当該フェルラ酸エステラーゼ活性の程度は必ずしも限定されないが、例えば、１．０ｍＭフェルラ酸エチルエステルを含む５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ４．８）中で５０℃、３０分間作用させたのち、生成物のフェルラ酸を高速液体クロマトグラフィーにて定量する（酵素活性１ユニット（Ｕ）は１分間に１μｍｏｌのフェルラ酸を生成する酵素量と定義する）という方法により測定した場合のフェルラ酸エステラーゼ活性が、例えば、製品重量（ｍｇ）当たり０．００１ユニット（Ｕ）以上、好ましくは０．００３ユニット（Ｕ）以上、より好ましくは０．００４ユニット（Ｕ）以上を示す酵素が、当該「フェルラ酸エステラーゼ活性を有する酵素」の一例として挙げられる。
【００２６】
本発明において、植物性材料に対するフェルラ酸エステラーゼ活性を有する酵素の使用量は、例えば、植物性材料１ｇに対し、当該酵素の活性を基準として０．１ユニット（Ｕ）〜１００ユニット（Ｕ）に相当する量に設定され得る。
【００２７】
フェルラ酸エステラーゼ活性を有する酵素としては、市販のものであってもよいし、微生物、動物または植物から調製したものであってもよい。フェルラ酸エステラーゼ活性を有する酵素の具体的な例としては、セルロシンＨＣ１００（エイチビィアイ株式会社製）、ウマミザイムＧ（天野エンザイム株式会社製）、セルラーゼＸＬ５３１（ナガセケムテックス株式会社製）、およびスミチームＡＣＨ（新日本化学工業株式会社製）、ならびにこれらの組み合わせが挙げられる。
【００２８】
フェルラ酸エステラーゼ活性を有する酵素の産生微生物としては、特に限定されないが、例えば、放線菌、糸状菌、および細菌が挙げられる。上記放線菌としては、例えば、アミコラトプシス（Amycolatopsis）属菌およびストレプトマイセス（Streptomyces）属菌が挙げられる。上記アミコラトプシス属菌としては、例えば、アミコラトプシス・オリエンタリス（A. olientalis）が挙げられる。上記ストレプトマイセス属菌としては、例えば、ストレプトマイセス・バイオラセオルバー（S. violaceoruber）、ストレプトマイセス・アベルミティリス（S. avermitilis）、ストレプトマイセス・コエリコラ（S. coelicolor）、ストレプトマイセス・サーモビオラセウス（S. thermoviolaceus）、ストレプトマイセス・リビダンス（S. lividans）、およびストレプトマイセス・グリセウス（S. griseus）が挙げられる。上記糸状菌としては、例えば、トリコデルマ（Trichoderma）属菌、アスペルギルス（Aspergillus）属菌、ペニシリウム（Penicillium）属菌が挙げられる。上記トリコデルマ属菌としては、例えば、トリコデルマ・ハルジアナム（T. harzianum）およびトリコデルマ・リーゼイ（T. reesei）が、アスペルギルス属菌としては、例えば、アスペルギルス・ニガー（A. niger）が、ペニシリウム属菌としては、例えば、ペニシリウム・フニクロスム（Penicillium funiculsom）が挙げられる。上記細菌としては、例えば、バチラス（Bacillus）属菌、ラクトバチラス（Lactobacillus）属菌が挙げられる。上記バチラス属菌としては、バチラス・サブチリス（Bacillus subtilis）が、ラクトバチラス属菌としては、ラクトバチラス・フェルメンタス（Lactobacillus fermentum）が挙げられる。好ましくは、ストレプトマイセス属菌、アスペルギルス属菌、より好ましくはアスペルギルス・ニガーである。上記産生微生物からフェルラ酸エステラーゼ活性を有する酵素を調製する方法としては、特に限定されないが、一般的な菌体培養法、遺伝子工学的手法など、当業者が通常用いる方法が挙げられる。
【００２９】
なお、本発明においては、上記フェルラ酸エステラーゼ活性を有する酵素がキシラナーゼ活性をも複合的に有することが好ましい。このようなフェルラ酸エステラーゼ活性とキシラナーゼ活性の両方を備える酵素を用いることにより、植物性材料からより効果的にフェルラ酸を遊離させることが可能となる。当該フェルラ酸エステラーゼ活性とキシラナーゼ活性の両方を備える酵素の例としては、セルロシンＨＣ１００（エイチビィアイ株式会社製）が挙げられる。
【００３０】
本発明の酵素製剤は、上記フェルラ酸エステラーゼ活性を有する酵素に加えて、アラビノフラノシダーゼおよび／またはキシラナーゼを含有する。
【００３１】
アラビノフラノシダーゼは、細胞壁を構成する多糖構造のうち、β−１，４−キシランとアラビノフラノースとの間の結合に作用して当該結合を切断するものであれば特に限定されない。アラビノフラノシダーゼとしては、市販のものであってもよいし、微生物、動物または植物から調製したものであってもよい。アラビノフラノシダーゼの具体的な例としては、α-L-Arabinofuranosidase from A. nigerおよびα-L-ARABINOFURANOSIDASE from Bifidobacterium sp.（メガザイム社製）、ならびにこれらの組み合わせが挙げられる。
【００３２】
アラビノフラノシダーゼの産生微生物としては、特に限定されないが、例えば、放線菌、糸状菌、および細菌が挙げられる。上記放線菌としては、例えば、アミコラトプシス属菌およびストレプトマイセス属菌が挙げられる。上記アミコラトプシス属菌としては、例えば、アミコラトプシス・オリエンタリスが挙げられる。上記ストレプトマイセス属菌としては、例えば、ストレプトマイセス・バイオラセオルバー、ストレプトマイセス・アベルミティリス、ストレプトマイセス・コエリコラ、ストレプトマイセス・サーモビオラセウス、ストレプトマイセス・リビダンス、およびストレプトマイセス・グリセウスが挙げられる。上記糸状菌としては、例えば、トリコデルマ属菌、アスペルギルス属菌が挙げられる。上記トリコデルマ属菌としては、例えば、トリコデルマ・ハルジアナム、トリコデルマ・リーゼイ、およびトリコデルマ・ロンギブラキアタム（T. longibrachiatum）が、アスペルギルス属菌としては、例えば、アスペルギルス・ニガーが挙げられる。上記細菌としては、例えば、バチラス属菌、ラクトバチラス属菌、およびビフィドバクテリウム属菌が挙げられる。好ましくは、ストレプトマイセス属菌、アスペルギルス属菌、ビフィドバクテリウム属菌、より好ましくはストレプトマイセス・コエリコラ、ストレプトマイセス・アベルミティリス、ストレプトマイセス・バイオラセオルバー、アスペルギルス・ニガー、ビフィドバクテリウム属菌、より一層好ましくはストレプトマイセス・コエリコラ、ストレプトマイセス・サーモビオラセウス、ストレプトマイセス・アベルミティリス、ストレプトマイセス・バイオラセオルバーである。上記産生微生物からアラビノフラノシダーゼを調製する方法としては、特に限定されないが、一般的な菌体培養法、遺伝子工学的手法など、当業者が通常用いる方法が挙げられる。
【００３３】
本発明の酵素製剤において、上記フェルラ酸エステラーゼ活性を有する酵素に対する、当該アラビノフラノシダーゼの割合としては、特に限定されないが、例えば、フェルラ酸エステラーゼ活性を有する酵素１ユニット（Ｕ）に対し、当該アラビノフラノシダーゼは、例えば、０．１ユニット（Ｕ）〜１０ユニット（Ｕ）、好ましくは０．５ユニット（Ｕ）〜２ユニット（Ｕ）、より好ましくは０．８ユニット（Ｕ）〜１．２ユニット（Ｕ）である。当該アラビノフラノシダーゼが、本発明の酵素製剤においてこのような範囲で含まれていることにより、本発明の酵素製剤は、酵素を過剰に使用することなく、フェルラ酸を効率的に優れた収率で得ることができる。
【００３４】
キシラナーゼは、細胞壁を構成する多糖構造のうち、β−１，４−キシラン中のβ−１，４結合に作用して当該結合を切断するものであれば特に限定されない。キシラナーゼとしては、市販のものであってもよいし、微生物、動物または植物から調製したものであってもよい。キシラナーゼの具体的な例としては、スクラーゼＸ（三菱化学フーズ株式会社製）、スミチームＸ（新日本化学工業株式会社製）、ペントパン（ノボザイムズジャパン社製）、バリダーゼＸ（ＤＳＭジャパン株式会社製）、およびヘミセルラーゼ「アマノ」９０（天野エンザイム株式会社製）ならびにこれらの組み合わせが挙げられる。
【００３５】
キシラナーゼの産生微生物としては、特に限定されないが、例えば、放線菌、糸状菌、および細菌が挙げられる。上記放線菌としては、例えば、アミコラトプシス属菌およびストレプトマイセス属菌が挙げられる。上記アミコラトプシス属菌としては、例えば、アミコラトプシス・オリエンタリスが挙げられる。上記ストレプトマイセス属菌としては、例えば、ストレプトマイセス・バイオラセオルバー、ストレプトマイセス・アベルミティリス、ストレプトマイセス・コエリコラ、ストレプトマイセス・サーモビオラセウス、ストレプトマイセス・リビダンス、およびストレプトマイセス・グリセウスが挙げられる。上記糸状菌としては、例えば、トリコデルマ属菌、アスペルギルス属菌、ヒュミコラ（Humicola）属菌が挙げられる。上記トリコデルマ属菌としては、例えば、トリコデルマ・ハルジアナム、トリコデルマ・ロンギブラキアタムおよびトリコデルマ・リーゼイが、アスペルギルス属菌としては、例えば、アスペルギルス・ニガーが、ヒュミコラ属菌としてはヒュミコラ・インソレンス（H. insolens）が挙げられる。上記細菌としては、例えば、アエロモナス（Aeromonas）属菌、バチルス属菌が挙げられる。好ましくは、ストレプトマイセス属菌、トリコデルマ属菌、アスペルギルス属菌、より好ましくはストレプトマイセス・コエリコラ、ストレプトマイセス・アベルミティリス、ストレプトマイセス・バイオラセオルバー、トリコデルマ・ロンギブラキアタム、トリコデルマ属菌、アスペルギルス属菌、ヒュミコラ・インソレンス、より一層好ましくはストレプトマイセス・コエリコラ、ストレプトマイセス・アベルミティリス、ストレプトマイセス・サーモビオラセウス、ストレプトマイセス・バイオラセオルバーである。上記産生微生物からキシラナーゼを調製する方法としては、特に限定されないが、一般的な菌体培養法、遺伝子工学的手法など、当業者が通常用いる方法が挙げられる。
【００３６】
本発明の酵素製剤において、上記フェルラ酸エステラーゼ活性を有する酵素に対する、当該キシラナーゼの割合としては、特に限定されないが、例えば、フェルラ酸エステラーゼ活性を有する酵素１ユニット（Ｕ）に対し、当該キシラナーゼは、１０ユニット（Ｕ）〜２０００ユニット（Ｕ）、好ましくは２０ユニット（Ｕ）〜１０００ユニット（Ｕ）、より好ましくは３０ユニット（Ｕ）〜５００ユニット（Ｕ）である。当該キシラナーゼが、本発明の酵素製剤においてこのような範囲で含まれていることにより、本発明の酵素製剤は、酵素を過剰に使用することなく、フェルラ酸を効率的に優れた収率で得ることができる。
【００３７】
本発明においては、上記フェルラ酸エステラーゼ活性を有する酵素と、アラビノフラノシダーゼとキシラナーゼとの組合せを用いるとフェルラ酸の生産量が飛躍的に増大するので好ましい。
【００３８】
さらに、本発明の酵素製剤は、上記フェルラ酸エステラーゼ活性を有する酵素と、アラビノフラノシダーゼおよび／またはキシラナーゼとの組合せ以外に、第四の酵素を含有していてもよい。
【００３９】
このような第四の酵素の例としては、セルラーゼおよびアセチルキシランエステラーゼ、ならびにこれらの組み合わせが挙げられる。このような第四の酵素は、上記フェルラ酸エステラーゼ活性を有する酵素と、アラビノフラノシダーゼおよび／またはキシラナーゼとを併用した酵素製剤とすることにより、植物性材料に対し当該第四の酵素が作用して当該植物性材料から遊離されるフェルラ酸の量をさらに増大させることができる。
【００４０】
このようなセルラーゼは、β−１，４−グルカンに作用してβ−１，４結合を切断するものであれば特に限定されない。セルラーゼは、市販のものであってもよいし、微生物、動物または植物から調製したものであってもよい。セルラーゼの具体的な例としては、セルラーゼＴ「アマノ」４（天野エンザイム株式会社製）、セルクラスト（ダニスコジャパン株式会社製、ＧＯＤＯ−ＴＣＦ（合同酒精株式会社製）、セルロシンＡＬ（エイチビィアイ株式会社製）、スミチームＡＣ（新日本化学株式会社製）、およびシトラーゼＣＬ（ＤＳＭジャパン株式会社製）ならびにこれらの組み合わせが挙げられる。
【００４１】
セルラーゼの産生微生物としては、特に限定されないが、例えば、放線菌、糸状菌、および細菌が挙げられる。上記放線菌としては、例えば、アミコラトプシス属菌およびストレプトマイセス属菌が挙げられる。上記アミコラトプシス属菌としては、例えば、アミコラトプシス・オリエンタリスが挙げられる。上記ストレプトマイセス属菌としては、例えば、ストレプトマイセス・バイオラセオルバー、ストレプトマイセス・アベルミティリス、ストレプトマイセス・コエリコラ、ストレプトマイセス・サーモビオラセウス、ストレプトマイセス・リビダンス、およびストレプトマイセス・グリセウスが挙げられる。上記糸状菌としては、例えば、トリコデルマ属菌、アスペルギルス属菌、ヒュミコラ属菌が挙げられる。上記トリコデルマ属菌としては、例えば、トリコデルマ・ハルジアナム、トリコデルマ・ロンギブラキアタムおよびトリコデルマ・リーゼイが、アスペルギルス属菌としては、例えば、アスペルギルス・ニガーが、ヒュミコラ属菌としてはヒュミコラ・インソレンスが挙げられる。上記細菌としては、例えば、アエロモナス属菌、バチルス属菌が挙げられる。好ましくは、ストレプトマイセス属菌、トリコデルマ属菌、アスペルギルス属菌、より好ましくはストレプトマイセス・コエリコラ、ストレプトマイセス・アベルミティリス、ストレプトマイセス・バイオラセオルバー、トリコデルマ・ロンギブラキアタム、トリコデルマ属菌、アスペルギルス属菌、ヒュミコラ・インソレンス、より一層好ましくはストレプトマイセス・コエリコラ、ストレプトマイセス・アベルミティリス、ストレプトマイセス・サーモビオラセウス、ストレプトマイセス・バイオラセオルバーである。上記産生微生物からセルラーゼを調製する方法としては、特に限定されないが、一般的な菌体培養法、遺伝子工学的手法など、当業者が通常用いる方法が挙げられる。
【００４２】
アセチルキシランエステラーゼは、細胞壁を構成する多糖構造のうち、アセチルアラビノキシラン中のアセチル基に作用してエステル結合を切断するものであれば特に限定されない。アセチルキシランエステラーゼは、市販のものであってもよいし、微生物、動物または植物から調製したものであってもよい。アセチルキシランエステラーゼの具体的な例としては、Acetyl xylan esterase from Clostridium thermocellum (PROZOMIX社製)が挙げられる。
【００４３】
アセチルキシランエステラーゼの産生微生物としては、特に限定されないが、例えば、放線菌、糸状菌、および細菌が挙げられる。上記放線菌としては、例えば、アミコラトプシス属菌およびストレプトマイセス属菌が挙げられる。上記アミコラトプシス属菌としては、例えば、アミコラトプシス・オリエンタリスが挙げられる。上記ストレプトマイセス属菌としては、例えば、ストレプトマイセス・バイオラセオルバー、ストレプトマイセス・アベルミティリス、ストレプトマイセス・コエリコラ、ストレプトマイセス・サーモビオラセウス、ストレプトマイセス・リビダンス、およびストレプトマイセス・グリセウスが挙げられる。上記糸状菌としては、例えば、トリコデルマ属菌、アスペルギルス属菌、ヒュミコラ属菌が挙げられる。上記トリコデルマ属菌としては、例えば、トリコデルマ・ハルジアナム、トリコデルマ・ロンギブラキアタムおよびトリコデルマ・リーゼイが、アスペルギルス属菌としては、例えば、アスペルギルス・ニガーが、ヒュミコラ属菌としてはヒュミコラ・インソレンスが挙げられる。上記細菌としては、例えば、アエロモナス属菌、バチルス属菌が挙げられる。好ましくは、ストレプトマイセス属菌、トリコデルマ属菌、アスペルギルス属菌、より好ましくはストレプトマイセス・コエリコラ、ストレプトマイセス・アベルミティリス、ストレプトマイセス・バイオラセオルバー、トリコデルマ・ロンギブラキアタム、トリコデルマ属菌、アスペルギルス属菌、ヒュミコラ・インソレンス、より一層好ましくはストレプトマイセス・コエリコラ、ストレプトマイセス・アベルミティリス、ストレプトマイセス・サーモビオラセウス、ストレプトマイセス・バイオラセオルバーである。上記産生微生物からアセチルキシランエステラーゼを調製する方法としては、特に限定されないが、一般的な菌体培養法、遺伝子工学的手法など、当業者が通常用いる方法が挙げられる。
【００４４】
本発明の酵素製剤において、上記フェルラ酸エステラーゼ活性を有する酵素に対する、当該第四の酵素の割合としては、特に限定されないが、例えば、フェルラ酸エステラーゼ活性を有する酵素１ユニット（Ｕ）に対し、セルラーゼは、１００ユニット（Ｕ）〜１００００ユニット（Ｕ）、好ましくは５００ユニット（Ｕ）〜５０００ユニット（Ｕ）、より好ましくは１０００ユニット（Ｕ）〜５０００ユニット（Ｕ）であり、アセチルキシランエステラーゼは、０．１ユニット（Ｕ）〜５０ユニット（Ｕ）、好ましくは０．１ユニット（Ｕ）〜５ユニット（Ｕ）、より好ましくは０．１ユニット（Ｕ）〜３ユニット（Ｕ）である。
【００４５】
本発明の酵素製剤において、上記フェルラ酸エステラーゼ活性を有する酵素と、アラビノフラノシダーゼおよび／またはキシラナーゼと、必要に応じて添加され得る第四の酵素とはそれぞれが所定量にて予め混合されていてもよく、あるいは別々に小分けされたキット製剤として提供され、上記キット製剤を使用の際に、各酵素が混合されるものであってもよい。混合方法の際の方法および手段は特に限定されず、当業者によって任意の方法および手段が採用され得る。
【００４６】
本発明の酵素製剤はまた、本発明の効果を阻害しない限りにおいて、賦形剤など酵素製剤一般に用いられる任意量の他の成分を含有していてもよい。さらに本発明の酵素製剤の形態としては、特に限定されないが、例えば、粉末および液体が挙げられる。液体の場合、溶媒または分散媒は、酵素が機能する限り、特に限定されないが、好ましくは水である。溶媒または分散媒が水の場合、ｐＨは酵素の働きが維持される限り限定されないが、公知のｐＨ調整剤を用いて、例えば、ｐＨ４〜ｐＨ８、好ましくはｐＨ４〜ｐＨ７、より好ましくはｐＨ５〜ｐＨ６に調整される。
【００４７】
本発明の酵素製剤は、例えば、植物性材料における細胞壁を構成する多糖構造から、フェルラ酸をより効率的に遊離することができる。このようなフェルラ酸の遊離にあたり使用可能な植物性材料の例としては、特に限定されないが、イネ科、マメ科の植物が挙げられる。使用され得る植物の部位も特に限定されないが、例えば、全草、茎、葉、根、籾殻、果肉、種子が挙げられる。さらに、当該植物は予め乾燥させたものであっても、生のものであってもいずれでもよい。本発明の酵素製剤を使用することができる植物性材料は、例えば、農業分野、林業分野、海洋分野、または食品加工分野などで生じる各種バイオマスが使用され得、さらに具体的な例としては、必ずしもこれらに限定されないが、米ぬか、脱脂米ぬか、米粕、小麦フスマ、コーンフスマ、および大豆フスマが挙げられる。
【００４８】
次に、本発明の酵素製剤を用いて植物性材料からフェルラ酸を製造するための方法の一例について説明する。
【００４９】
本発明のフェルラ酸の製造方法においては、上記植物性材料が酵素製剤で処理される。
【００５０】
より具体的な例としては、必要に応じ、所定の大きさまで粉砕または破砕した植物性材料が、上記酵素製剤を含有する水溶液に含浸またはスプレーされるか、当該植物性材料および水を含む容器内に、上記酵素製剤を仕込むことにより、酵素製剤が植物性材料と作用する。
【００５１】
なお、上記植物性材料の酵素製剤の処理においては、当該植物性材料と上記本発明の酵素製剤とを一度に合わせて行ってもよく（すなわち、上記各構成成分でなる各種酵素を合わせた本発明の酵素製剤を一旦調製し、このような酵素製剤で植物性材料を処理してもよく）、あるいは、本発明の酵素製剤を構成する上記酵素を個別に当該植物性材料と合わせて行ってもよい。
【００５２】
このような処理は、例えば、所定の温度に調整された条件で所定時間をかけて行われる。
【００５３】
この処理において採用され得る温度としては、必ずしも限定されるものではないが、例えば、２０℃〜７０℃、好ましくは３０℃〜６０℃、より好ましくは４０℃〜６０℃である。処理時間もまた適宜変更され得るが、例えば、１２０分〜１４４０分、好ましくは３６０分〜１３２０分である。
【００５４】
上記処理により、植物材料から遊離したフェルラ酸を含有する混合物（フェルラ酸含有組成物）を得ることができる。ここで、植物性材料の残渣は、ろ過または遠心分離等の当業者に周知の手段によって取り除かれ得る。その後、有機溶剤による抽出、イオン交換カラムを用いた分離、再結晶などの手法により精製が行われてもよい。例えば、フェルラ酸含有組成物を酸性条件としてフェルラ酸を析出し、ろ取した粗フェルラ酸を高温（約９０℃〜１００℃）の水に溶解させた後冷却してフェルラ酸を析出させることにより精製することができる。
【００５５】
このようにして、植物性材料から安全性の高いフェルラ酸を収率良く効率的に得ることができる。得られたフェルラ酸は、食品、医薬品等における安全な機能性材料として利用され得る。
【実施例】
【００５６】
以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【００５７】
なお、以下の例におけるフェルラ酸エステラーゼ活性の測定方法は上記のとおりであり、その他の酵素活性の測定方法はそれぞれ以下のとおりである。
（１）キシラナーゼ活性の測定
２％Ａｚｏ−ｘｙｌａｎ（メガザイム社製）０．１ｍＬと０．１Ｍのクエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ５．３）０．０８ｍＬ、酵素液０．０２ｍＬを混合し、５０℃、３０分間反応させたのち、エタノールを０．５ｍＬ加えよく混合した後、遠心分離（１５００  ｇ、１０分間）した上清の吸光度５９０ｎｍを測定した。生成物と同等の吸収スペクトルを持つ色素であるリマゾールブリリアントブルーＲ（シグマ社製）を用いて検量線を作成し、１分間に１μｍｏｌの青色色素（リマゾールブリリアントブルーＲ）を生成させる酵素量を１ユニットとした。
（２）アラビノフラノシダーゼ活性の測定
２５ｍＭのｐ−ニトロフェニルアラビノフラノシド（ナカライテスク株式会社製）０．０１ｍＬ、０．１Ｍのクエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ６．２）０．０５ｍＬ、蒸留水０．０３ｍＬ、酵素液０．０１ｍＬを混合し、５０℃、３０分間反応した。１０％炭酸ナトリウム水溶液０．１ｍＬを加え反応を停止し、吸光度４０５ｎｍを測定した。生成物の標品としてｐ−ニトロフェノール（ナカライ社製）を用いて、検量線を作成し、１分間に１μｍｏＬのｐ−ニトロフェノールを生成させる酵素量を酵素活性１ユニットとした。
（３）セルラーゼ活性の測定
２％Ａｚｏ−ＣＭＣ０．１ｍＬと０．０５Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で希釈した酵素液０．１ｍＬを混合し、４０℃、３０分間反応させた後、０．５ｍＬのエタノールを加えてよく混合した後、遠心分離（１５００ｇ、１０分間）した上清の吸光度５９０ｎｍを測定した。生成物と同等の吸収スペクトルを持つ色素であるリマゾールブリリアントブルーＲ（シグマ社製）を用いて検量線を作成し、１分間に１μｍｏＬの青色色素（リマゾールブリリアントブルーＲ）を生成させる酵素量を１ユニットとした。
（４）アセチルキシランエステラーゼ活性の測定
５０ｍＭｐ−ニトロフェニル酢酸（アセトニトリルに溶解）０．０２ｍＬと０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）０．１ｍＬ、酵素液０．１ｍＬを混合し、３７℃、１０分間反応させ、１分毎に吸光度４０５ｎｍを測定した。１分間に１μｍｏＬのｐ−ニトロフェノールを生成させる酵素量を１ユニットとした。
【００５８】
（調製例１：酵素の調製）
実施例で使用するセルロシンＨＣ１００（エイチビィアイ株式会社製）を除く酵素は特開２００９−０６５８３７号公報の実施例１〜３に準じて調製した。すなわち、所望のＰＣＲ断片を接合型放線菌プラスミドｐＴＯＮＡ５に導入し、ストレプトミセス・リビダンス１３２６株（ＮＢＲＣ番号：１５６７５）で培養液中に酵素を発現させ、培養液から菌体を遠心分離した後、硫酸アンモニウムを添加して生成した沈殿物を回収し、水で沈殿物を溶解し、凍結乾燥して酵素粉末を調製した。なお、この調製において培養培地としては、当該公報の実施例３の基本培地に炭酸カルシウムを０．２％添加したカルシウム強化培地を使用した。
【００５９】
なお、この調製では、以下の配列に基づいたＰＣＲ断片およびプライマー対を用いた：
ＸＧＰ４２０（キシラナーゼ）
GenBank accession number CAD55241（ＰＣＲ断片の基礎となる配列；ストレプトマイセス・コエリコラ由来），ATGGGCTCCTACGCCCTTCCCAGATCAGGT（フォワードプライマー：配列番号１），TCAGGTGCGGGTCCAGCGTTGGTTGCTGCC（リバースプライマー：配列番号２）；
ＸＧＰ４２２（キシラナーゼ）
GenBank accession number BAC72696（ＰＣＲ断片の基礎となる配列；ストレプトマイセス・アベルミティリス由来），ATGAGATCTCTGAAAAGATCAGGCTTATCC（フォワードプライマー：配列番号３），TTACCCCAGCGTCACTGTCGGCAGCGGGTT（リバースプライマー：配列番号４）；
ＸＧＰ４２７（キシラナーゼ）
GenBank accession number BAD02382（ＰＣＲ断片の基礎となる配列；ストレプトマイセス・バイオラセオルバー由来），ATGGGCTCTCACGCCCTTCCCAGACCGGCT（フォワードプライマー：配列番号５），TCAGGAGACGGTCCAGCGCTGGTTGTCGGC（リバースプライマー：配列番号６）；
ＸＧＰ４３８（アラビノフラノシダーゼ）
GenBank accession number BAD02381（ＰＣＲ断片の基礎となる配列；ストレプトマイセス・バイオラセオルバー由来），ATGTCGTTCCACCGCTCGCTGCCGTTCCGT（フォワードプライマー：配列番号７），TCAGCGCTGCAGCGTCAGCAGGCCCGGACG（リバースプライマー：配列番号８）；
ＸＧＰ４４０（セルラーゼ）
GenBank accession number CAB61599（ＰＣＲ断片の基礎となる配列；ストレプトマイセス・コエリコラ由来），ATGCGAACGTTACGGCCCCAGGCCCGCGCC（フォワードプライマー：配列番号９），TTACACCGTGGTGCAGGCGGTGCCGTTCAG（リバースプライマー：配列番号１０）；および
ＸＧＰ４５０（アセチルキシランエステラーゼ）
GenBank accession number CAA20497（ＰＣＲ断片の基礎となる配列；ストレプトマイセス・コエリコラ由来），ATGTTCGCGAACGTGCCCACCGTCCTCACC（フォワードプライマー：配列番号１１），TCAGTCGCCGACCCTCAGCGCGCCCAGCAG（リバースプライマー：配列番号１２）。
【００６０】
（調製例２：酵素の調製）
セルロシンＨＣ１００および調製例１で得た酵素の活性を測定したところ以下のとおりであった：
セルロシンＨＣ１００（エイチビィアイ株式会社製、アスペルギルス・ニガー由来のキシラナーゼ、キシラナーゼ活性０．３２１Ｕ／ｍｇおよびフェルラ酸エステラーゼ活性０．０１Ｕ／ｍｇ保有）；
ＸＧＰ４２０（キシラナーゼ活性１．４Ｕ／ｍｇ）；
ＸＧＰ４２２（キシラナーゼ活性１．４Ｕ／ｍｇ）；
ＸＧＰ４２７（キシラナーゼ活性１．６Ｕ／ｍｇ）；
ＸＧＰ４３８（アラビノフラノシダーゼ活性０．０１１Ｕ／ｍｇ）；
ＸＧＰ４４０（セルラーゼ活性２３．５Ｕ／ｍｇ）；
ＸＧＰ４５０（アセチルキシランエステラーゼ活性０．００２４Ｕ／ｍｇ）。
【００６１】
（実施例１：脱脂米ぬか（ＤＲＢ）からのフェルラ酸生成）
脱脂米ぬか１０ｍｇを、スクリューキャップ付き１．５ｍＬ容量マイクロチューブに測り取り、５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．７）で懸濁し、エッペンドルフ社製サーモミキサーコンフォートを用いて、９９℃にて５分間静置した。
【００６２】
次いで、室温まで、サンプルチューブを冷却後、以下の表１に示す各酵素粉末（各５ｍｇ）を混合して混合粉末を得た。混合粉末を０．２ｍＬの５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．７）に添加し混合した液の全量を当該脱脂米ぬか入りのチューブに加え、ここにさらに緩衝液を添加し、総量０．５ｍＬとした。これを、エッペンドルフ社製サーモミキサーコンフォートを用いて、１分間あたり１４００回転の条件で撹拌しながら、４５℃にて１７時間酵素反応を行った。
【００６３】
反応終了後、サンプルのスクリューキャップ付き１．５ｍＬ量マイクロチューブを、遠心（１分間あたり１５０００回転、５分間）し、その上清を、０．１％ギ酸を含む蒸留水で１０倍希釈し、定量用のサンプルとした。このうち１０μＬを高速液体クロマトグラフ装置（株式会社島津製作所製）に注入し、分析した。カラムは、日本ウォーターズ株式会社製のSymmetry C18 (粒子径3.5μm, カラム径2.1mm，カラム長50mm)を４０℃で使用した。分析は、Ａ液：０．１％ギ酸を含む蒸留水、Ｂ液：０．１％ギ酸を含むアセトニトリルの、２液からなるＡからＢへのグラジエントにより行った。分析開始時は、１０％Ｂ液で行い、０〜５分、１０％Ｂ液から６０％Ｂ液へのリニア・グラジエント分析を、１分間あたり流速０．３ｍLで行い、３２２ｎｍの吸光度でフェルラ酸を検出した。上記の条件で、フェルラ酸は、約２．３分付近に溶出した。別途、市販のフェルラ酸を適宜希釈することで、検量線を作成し、サンプルに含まれるフェルラ酸を定量した。得られた結果を表１に併せて示す。
【００６４】
【表１】
2014057529.tif 000002
【００６５】
表１から明らかなように、フェルラ酸エステラーゼ活性を保有するセルロシンＨＣ１００単独と比較して、セルロシンＨＣ１００をＸＧＰ４２７（キシラナーゼ）またはＸＧＰ４３８（アラビノフラノシダーゼ）と併用した場合、フェルラ酸生成量に増大が見られた。さらに、セルロシンＨＣ１００、ＸＧＰ４２７、およびＸＧＰ４３８の三者を組み合わせた場合、フェルラ酸生成量に顕著な増大が見られた。
【００６６】
（実施例２：生米ぬかからのフェルラ酸生成）
原料として脱脂米ぬか（ＤＲＢ）に代えて生米ぬかを用いたこと以外は、実施例１と同様に酵素処理し、フェルラ酸生成量を測定した。結果を表２に示す。
【００６７】
【表２】
2014057529.tif 000003
【００６８】
表２から明らかなように、原料として生米ぬかを用いた場合もまた、セルロシンＨＣ１００単独と比較して、セルロシンＨＣ１００をＸＧＰ４２７（キシラナーゼ）またはＸＧＰ４３８（アラビノフラノシダーゼ）と併用した場合、フェルラ酸生成量に増大が見られ、さらに、セルロシンＨＣ１００、ＸＧＰ４２７、およびＸＧＰ４３８の三者を組み合わせた場合、フェルラ酸生成量に顕著な増大が見られた。
【００６９】
（実施例３：種々の酵素組み合わせによる脱脂米ぬか（ＤＲＢ）からのフェルラ酸生成）
実施例１と同様にして脱脂米ぬかを用いて調製したサンプルチューブを室温まで冷却後、以下の（１）〜（６）の組合わせによる各酵素粉末（各５ｍｇ）を５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．７）に溶解し、総量０．８ｍＬになるように、当該脱脂米ぬか入りのチューブに加えた。これを、エッペンドルフ社製サーモミキサーコンフォートを用いて、１分間あたり１４００回転の条件で撹拌しながら、５０℃、７時間後、４５℃で１５時間酵素反応を行った：
（１）セルロシンＨＣ１００＋ＸＧＰ４２０＋ＸＧＰ４３８；
（２）セルロシンＨＣ１００＋ＸＧＰ４２２＋ＸＧＰ４３８；
（３）セルロシンＨＣ１００＋ＸＧＰ４２７＋ＸＧＰ４３８（実施例１と同様の組合せ）；
（４）セルロシンＨＣ１００＋ＸＧＰ４２０＋ＸＧＰ４２２＋ＸＧＰ４２７＋ＸＧＰ４３８；
（５）セルロシンＨＣ１００＋ＸＧＰ４２０＋ＸＧＰ４２２＋ＸＧＰ４２７＋ＸＧＰ４３８＋ＸＧＰ４５０；および
（６）セルロシンＨＣ１００＋ＸＧＰ４２０＋ＸＧＰ４２２＋ＸＧＰ４２７＋ＸＧＰ４３８＋ＸＧＰ４４０。
【００７０】
上記反応終了後、実施例１と同様の高速液体クロマトグラフ装置および当該クロマトグラフィー条件を用い、各サンプルに含まれるフェルラ酸を定量した。結果を図１に示す。
【００７１】
図１は、種々の酵素組合せを脱脂米ぬかに添加した場合のフェルラ酸生成量を示すグラフである。縦軸はフェルラ酸生成量（μｇ／ｍｇ脱脂米ぬか）を表し、横軸に、処理に用いた酵素組合せを示す。
【００７２】
図１に見られるように、実施例１の組合せに該当する（３）セルロシンＨＣ１００＋ＸＧＰ４２７＋ＸＧＰ４３８と比較して、ＸＧＰ４２７の代わりに別のキシラナーゼ活性保有酵素ＸＧＰ４２０またはＸＧＰ４２２を用いた場合（（１）、（２））も、ほぼ同等のフェルラ酸生成量を示した。３種のキシラナーゼ活性保有酵素とセルロシンＨＣ１００とＸＧＰ４３８（アラビノフラノシダーゼ）との組合せ（（４））は、１種のキシラナーゼ活性保有酵素とセルロシンＨＣ１００とＸＧＰ４３８との組合せと比較して、増大したフェルラ酸生成量を示した。（４）の組合せにさらにＸＧＰ４５０（アセチルキシランエステラーゼ）またはＸＧＰ４４０（セルラーゼ）を併用した場合（（５）、（６））、（４）に比較して、フェルラ酸生成量のさらなる増大がみられた。
【００７３】
（実施例４：種々の原料からのフェルラ酸生成）
原料として脱脂米ぬか、生米ぬか、またはトウモロコシ穂軸を用い、処理酵素として、
（ｉ）セルロシンＨＣ１００単独；
（ii）セルロシンＨＣ１００＋ＸＧＰ４２０＋ＸＧＰ４２２＋ＸＧＰ４２７＋ＸＧＰ４３８＋ＸＧＰ４５０；または
（iii）セルロシンＨＣ１００＋ＸＧＰ４２０＋ＸＧＰ４２２＋ＸＧＰ４２７＋ＸＧＰ４３８＋ＸＧＰ４４０
を用いたこと以外は、実施例１と同様に酵素処理し、フェルラ酸生成量を測定した。結果を図２に示す。
【００７４】
図２は、脱脂米ぬか、生米ぬか、またはトウモロコシに種々の酵素組合せを添加した場合のフェルラ酸生成量を示すグラフである。縦軸はフェルラ酸生成量（μｇ／ｍｇ原料）を表し、横軸に、処理した原料を示す。各原料におけるフェルラ酸生成量の結果を示す棒は、左から順に上記（ｉ）、（ii）および（iii）の酵素処理である。
【００７５】
図２に見られるように、いずれの原料の場合も、セルロシンＨＣ１００にキシラナーゼおよびアラビノフラノシダーゼと、アセチルキシランエステラーゼまたはセルラーゼとを含む酵素を併用することにより（（ii）、（iii））、セルロシンＨＣ１００単独の（ｉ）と比較して顕著に高い量のフェルラ酸が生成されていた。
【産業上の利用可能性】
【００７６】
本発明によれば、所定量の植物性材料から、より効率的かつ多量のフェルラ酸を遊離させることができる。本発明の酵素製剤に含まれる酵素は、医薬品・食品等の分野においてすでに安全に使用されているため、当該得られたフェルラ酸もまた安全であり、医薬品・食品等の機能性素材として有用である。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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