(57)【要約】【課題】  本発明は、新規多糖体及び優れた育毛作用のある新規多糖体を提供する。【解決手段】  多糖の基本構造の糖残基が少なくともガラクトースとマンノースで構成されており、当該ガラクトースにフラノース型が存在する多糖体又はパラクロレラ由来の細胞外多糖体；多糖の基本構造の糖残基が少なくともガラクトースとマンノースで構成されており、当該ガラクトースにフラノース型が存在する多糖体又はパラクロレラ由来の細胞外多糖体を含有する毛母細胞増殖賦活剤、ＦＧＦ−７産生促進剤、ＶＥＧＦ産生促進剤、育毛剤、メラニン産生抑制剤、美白剤、皮膚外用剤；パラクロレラ属単細胞藻類又は改変体を炭素源含有培養培地で好気的な条件下で従属培養し、生産される多糖体を回収する多糖体の製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
多糖の基本構造の糖残基が少なくともガラクトースとマンノースで構成されており、当該ガラクトースにフラノース型が存在する多糖体。
【請求項２】
前記ガラクトースの含有量が、全中性糖中、５０〜７９質量％である請求項１記載の多糖体。
【請求項３】
パラクロレラ由来の細胞外多糖体である請求項１又は２記載の多糖体。
【請求項４】
多糖の基本構造の糖残基が少なくともガラクトースとマンノースで構成されており、当該ガラクトースにフラノース型が存在する多糖体を含有する育毛剤。
【請求項５】
請求項２又は３記載の多糖体を含有する育毛剤。
【請求項６】
請求項１〜３の何れか１項記載の多糖体を含有する毛母細胞増殖賦活剤。
【請求項７】
請求項１〜３の何れか１項記載の多糖体を含有するＦＧＦ−７産生促進剤。
【請求項８】
請求項１〜３の何れか１項記載の多糖体を含有するＶＥＧＦ産生促進剤。
【請求項９】
請求項１〜３の何れか１項記載の多糖体を含有するメラニン産生抑制剤。
【請求項１０】
請求項１〜３の何れか１項記載の多糖体を含有する皮膚外用剤。
【請求項１１】
パラクロレラ属単細胞藻類又は改変体を炭素源含有培養培地で好気的な条件下で従属培養し、生産される多糖体を回収する多糖体の製造方法。
【請求項１２】
前記培養の溶存酸素濃度が、３〜１３ｐｐｍである請求項１１項記載の多糖体の製造方法。
【請求項１３】
前記培養後、遠心分離及びろ過を単独で又は２種組み合わせて藻体を除去した後に凍結乾燥し、さらに水溶液に溶解後、水溶性画分を回収する請求項１２又は１３記載の多糖体の製造方法。
【請求項１４】
前記パラクロレラ属単細胞藻類が、パラクロレラ属ケッセリ（Parachlorella kessreli）である請求項１１〜１３の何れか１項記載の製造方法。
【請求項１５】
前記パラクロレラ属単細胞藻類が、Parachlorella kessleri-PNC1と命名され、FERM BP-11493として寄託された藻体である請求項１１〜１４の何れか１項記載の多糖体の製造方法。
【請求項１６】
Parachlorella kessleri-PNC1と命名され、FERM BP-11493として寄託された藻体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規多糖体及びその製造方法、並びに当該新規多糖体を含有する皮膚外用剤、育毛剤、美白剤等に関する。
【背景技術】
【０００２】
多糖類は、医薬品、食品、工業品等幅広い分野で利用されている。医薬品や食品分野等でよく知られている酸性多糖類として、コンドロイチン硫酸やヒアルロン酸等のグリコサミノグリカン、キサンタンガム等；中性多糖類としてβ１，３グルカン、シクロデキストリン等が挙げられる。サメ軟骨やトリ鶏冠等に含まれているコンドロイチン硫酸や微生物生産が可能となったヒアルロン酸は、膝関節痛改善作用等を有することが知られている。またβ１，３グルカンは免疫賦活作用等を有することが知られている。
また、キサンタンガムは、Xanthomonas campestris細菌が生産する多糖であり、その糖の構成はＤ−グルコース、Ｄ−マンノース、Ｄ−グルクロン酸を構成糖にもつ分岐多糖であり、現在では工業的に大量生産可能であるため、増粘剤等として世界中で利用されている（例えば特許文献１）。
また、クロレラ属単細胞緑藻が細胞外に産生するガラクトース８１．４〜９１．９％含有の多糖体が、マウス肉腫細胞株に対して抗腫瘍作用を有することが記載されている（例えば特許文献２）。
さらに、種々の用途に利用可能な新規多糖体が、産業界において望まれているのが実状である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特公昭６１−１１５９６号公報
【特許文献２】特開平６−２４８００３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
そこで、本発明は、斯かる実状に鑑み、種々の用途に利用可能な新規多糖体を提供しようとするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、種々の用途に利用可能な新規多糖体を鋭意検討した結果、ガラクトース
及びマンノースを主な構成糖とする新規多糖体を見出した。さらに、本発明の新規多糖体は、優れた育毛作用があること及び美白作用があることも見出した。本発明の新規多糖体は、皮膚外用剤、化粧料、食品、医薬品等にも利用可能であることを見出した。しかも、本発明の新規多糖体は、パラクロレラ属（Parachlorella）単細胞緑藻類がその細胞外で生産可能な多糖体であるので、工業的に大量生産可能であり、幅広い分野での利用が期待できる物質である。
【０００６】
ところで、近年、ストレスの増加や食生活の変化など様々な要因によって、薄毛や抜け毛で悩む男女は増加傾向にあり、育毛剤への期待が高まっている。
例えば、特開２０１０−１５０２０３号公報には、ダイジン、ゲスチニン及びフラボステロンＳＥから選ばれる大豆イソフラボン配糖体と、６−ベンジルアミノピリンとを含有する育毛剤組成物が、抜け毛を低減すること及び硬毛化することが開示されている。
特開２０１２−０９７００８号公報には、パイナップル可食部を９０体積％エタノールで８０℃２時間抽出して得られた糖不含有のパイナップル抽出物が、毛乳頭細胞増殖促進作用があることが開示されている。
特開２０１０−１００５３６号公報には、アメリカンアンジェリカ（Angelica atropurpurea）の抽出物に含まれる所定の構造を有するアンギュラー型フロクマリン骨格を有する化合物が、ブタ毛包の毛伸長が認められたことが開示されている。
このように、幅広い化合物による様々な作用機序からの有効な育毛剤の検討が行われているのが実状である。しかしながら、本発明の多糖体は高分子系でありながら優れた育毛作用を有することは全くの意外であり、そして優れた育毛剤を提供することも可能である。
【０００７】
よって、本発明は、上記課題を解決するために、多糖の基本構造の糖残基が少なくともガラクトースとマンノースで構成されており、当該ガラクトースにフラノース型が存在する多糖体を提供するものである。
【０００８】
また、本発明は、多糖の基本構造の糖残基が少なくともガラクトースとマンノースで構成されており、当該ガラクトースにフラノース型が存在する多糖体及び／又はパラクロレラ由来の細胞外多糖体を含有する、毛母細胞増殖賦活剤、ＦＧＦ−７産生促進剤、ＶＥＧＦ産生促進剤、育毛剤、メラニン産生抑制剤、美白剤又は皮膚外用剤を提供するものである。
【０００９】
また、本発明は、パラクロレラ属単細胞藻類又は改変体を炭素源含有培養培地で好気的な条件下で従属培養し、生産される多糖体を回収する多糖体の製造方法を提供するものである。
また、本発明は、Parachlorella kessleri-PNC1と命名され、FERM BP-11493として寄託された藻体を提供するものである。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、種々の用途に利用可能な新規な多糖体を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】墨汁染色による細胞（藻体）外の多糖体の可視化を行った図である。
【図２】藻体PNC1株の１８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列に基づく分子系統樹である。
【図３】本開示の多糖体のＧＰＣ分析の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
１．本開示の多糖体
２．本開示の多糖体の製造方法
３．本開示の多糖体の用途
【００１３】
１．本開示の多糖体
本開示の多糖体は、多糖の基本構造の糖残基が少なくともガラクトース（以下「Ｇａｌ」ともいう）とマンノース（以下「Ｍａｎ」ともいう）で構成される。当該ガラクトースには、少なくともフラノース型が存在するのが好適である。
前記マンノースとガラクトースとの糖残基の比率が、マンノースを１としたときに、好ましくはＭａｎ  １：Ｇａｌ  ２〜４、より好ましくはＭａｎ  １：Ｇａｌ  ２．５〜３．５であるのが好適である。
【００１４】
前記ガラクトースの含有量は、多糖体の中性単糖組成の全量を１００質量％としたとき（以下、「全中性糖中」とする）に、好ましくは５０〜７９質量％であり、より好ましくは６０〜７９質量％である。
本開示の多糖体の中性単糖組成は、マンノース及びガラクトースの他に、アラビノース（以下、「Ａｒａ」ともいう）、ラムノース（以下、「Ｒｈａ」ともいう）及びキシロール（以下、「Ｘｙｌ」ともいう）が含まれてもよい。
これらの含有量は、多糖体の中性単糖組成の全量を１００質量％としたとき（以下、「全中性糖中」とする）に、好ましくは０〜１６質量％、より好ましくは５〜１６質量％である。さらに、アラビノース、ラムノース及びキシロースの含有量は、全中性糖中、それぞれ、アラビノース  ３〜７質量％、ラムノース  ２〜６質量％、キシロース  ０〜３質量％であるのが好適である。
このときマンノース及びガラクトースのこれら含有量は、全中性糖中、好ましくは８４〜１００質量％である。このマンノースの含有量は、全中性糖中、好ましくは１９〜２５質量％であり、またガラクトースの含有量は、全中性糖中、好ましくは６５〜７５質量％である。
【００１５】
本開示の多糖体の分子量は、ＧＰＣ測定において、好ましくは３〜９×１０４、より好ましくは５〜８×１０４である。
また、本開示の多糖体は水溶性のものが、様々な分野の用途で利用しやすいので、好適である。
【００１６】
２．本開示の多糖体の製造方法
本開示の多糖体の製造方法は、本開示の多糖体を産生することが可能であれば、その手段は特に限定されず、例えば、細菌や藻類等の微生物及びこの改変体を用いることが挙げられる。当該改変体とは、本開示の多糖体を産生することが可能な機能をする微生物の遺伝子組み換え体、突然変異体等であり、必要に応じて生産性や耐久性等を向上させている微生物である。
【００１７】
好適な本開示の多糖体の製造方法として、本開示の多糖体は、パラクロレラ属（Parachlorella）単細胞緑藻類又は改変体を独立的培養法又は従属的培養法等の任意の培養方法により培養することで製造することが可能である。
当該緑藻類を用いることで、本開示の多糖体は、藻類の細胞外に生産させて回収することが可能である。細胞外に産出させることで、遠心分離等の物理的手段等により藻体と多糖体とを分離させることが容易となる。これによって、培養培地交換等による連続培養による多糖体の生産も容易である。よって、本開示のパラクロレラ属単細胞緑藻類又は改変体を用いることは、多糖体の生産性を非常に向上させることができ、工業的生産に適しており、本開示の多糖体の安定的供給を可能とする。安定的供給性が可能となるため、本開示の多糖体は幅広い分野での利用も可能となる。
【００１８】
前記パラクロレラ属単細胞緑藻類のうち、好ましくはパラクロレラ属ケッセリ（Parachlorella kessreli）であり、より好ましくはParachlorella kessleri-PNC1株(FERM BP-11493)が好適である。
独立行政法人  国立環境研究所  微生物系統保存施設（NIESコレクション）から、NIES-2152〜NIES-2162、2177、2178、2179の14株を、パナック株式会社新規事業開発第二部が入手した。この入手した株を継代培養しながら、これらの中から、細胞外多糖体の生産性が高く、かつ従属培養に適した株を探索した。
具体的には、NIES-2152株を複数に分けて、後記実施例に示す従属培養条件下にて、継代培養を繰り返した。他の株についても同様に継代培養を繰り返し行った。継代培養を繰り返しながら、これらの中から、細胞外多糖体の生産性が高く、かつ従属培養に適した株を見出し、これをPNC1株とした。
当該PNC1株に関する形態観察及びrRNA遺伝子配列に基づく分子系統樹により、パラクロレラ属ケッセリ（Parachlorella kessreli）単細胞緑藻類と判断し、Parachlorella kessleri-PNC1株と命名した。この株は、新規な藻類として、2012年7月19日、〒305-8566 茨城県つくば市東1-1-1  つくばセンター中央第6、独立行政法人  製品評価技術基盤機構  特許生物寄託センター（NITE-IPOD）に、Parachlorella kessleri-PNC1株(FERM BP-11493)として寄託した。
【００１９】
本開示のパラクロレラ属単細胞緑藻類を培養して多糖体を製造させる際に用いる培地として、一般的な単細胞緑藻類が培養可能な基礎培地に、グルコース等の炭素源を含有させた炭素源含有の培養培地が好適である。単細胞緑藻類が培養可能な基礎培地とは、例えば、〔Appl Microbiol Biotechnol. 2011 Jul;91(1):31-46. Best practices in heterotrophic high-cell-density microalgal processes: achievements, potential and possible limitations.Bumbak F, Cook S, Zachleder V, Hauser S, Kovar K〕に記載されている培地が挙げられる。
基礎培地中の無機塩としてＫＨ２ＰＯ４、ＭｇＳＯ４等の微量無機成分が挙げられ、窒素源としては硫酸アンモニウム、尿素等が挙げられる。この基礎培地として、本開示のパラクロレラ属単細胞緑藻類を培養する際に好適なものとしては表１に示す培地の組成が挙げられ、各成分の含有量は±１０％の範囲であることが好ましい。
前記炭素源として、グルコース、果糖等の単糖類；ショ糖等のオリゴ糖等が挙げられる。これらから１種又は２種以上選択して基礎培地に添加してもよい。
前記炭素源の濃度は、特に限定されないが、培養培地中、好ましくは０．１〜３０質量％、より好ましくは１〜１０質量％とするのが好適である。
【００２０】
本開示の多糖体を製造するための培養に際し、好気的な条件下で培養することが、上記多糖体を安定的に生産させることができるので好適である。通気培養することが、多糖体の生産性を向上させる点で、好ましい。通気手段として、例えば、撹拌、振盪、通気及びバブリング等が挙げられる。これらを単独で又は２種以上組み合わせて行うことが可能である。これにより、培養培地中に適度な気体が混合されるようになる。
培養培地中の溶存酸素（ＤＯ）は、好気的な条件になるように調整すればよく、好ましくは３ｐｐｍ以上、より好ましくは５〜１３ｐｐｍとするのが好適である。
培養温度は、特に限定されないが、５〜４０℃の常温程度であればよい。
また、培養培地中のｐＨ（２０℃）は、好ましくは４〜９、より好ましくは５〜８とするのが好適である。
培養期間は、特に限定されないが、４日〜２週間程度を１サイクルとするのが、多糖体を産出させるのが好適である。また、前培養及び本培養を行う際には、本培養の期間は、４日〜１週間程度であればよい。この際、光照射を行なってもよいが、光照射を行わなくとも、多糖体を生産することが可能である。
また、独立栄養培養条件下にて藻体数を多くする場合、太陽光；植物栽培用ランプ、ＬＥＤ等の人工光源等の光を用いることが可能であり、炭酸ガスの補給と撹拌をすることが好ましい。
【００２１】
また、本開示の多糖の生産方法は、バッチ式、連続式の何れでもよいが、連続式が生産性向上のため好ましい。また、開放系培養及び閉鎖系培養の何れでもよく、例えば、培養タンク内の密閉培養及び開放系の露天培養等が挙げられる。培養条件管理の点で、閉鎖系培養が好ましい。
【００２２】
本開示の多糖体を前記単細胞緑藻類又は改変体に産生させた後に、水溶液洗浄、超音波、遠心分離、ろ過等の物理的手段及び化学的手段にて、藻体から多糖体を分離し、本開示の多糖体が含まれる上清液を得るのが好適である。このとき、培養後の藻体表面から多糖体を分離することがその藻体を用いて連続的に多糖体を生産することも可能であるので好ましい。例えば、遠心分離の際には、５０００〜９０００ｒｐｍ、５分間程度でよい。さらに濾過助剤及びろ過フィルター等を単独で又は組み合わせて用いてろ過を行うことが不純物をより除去できるので好ましい。
得られた本開示の多糖体は、希釈液、濃縮液又は乾燥物等の状態に適宜調整してもよい。乾燥手段として凍結乾燥が好ましい。
【００２３】
本開示の多糖体は、適宜公知の分離・精製技術、例えば液々分液、固液分液、濾過膜、活性炭、吸着樹脂、イオン交換樹脂等の方法によって不活性な不純物を除去し、更に精製してもよい。
本開示の多糖体を水溶液に溶解後、不溶性画分を除去し、水溶性画分を回収することが好適である。水に溶解の際に混合することが好ましく、この水温は、５〜４０℃であるのが好ましい。溶解後、低温（例えば１〜１０℃）に放置（例えば５〜１５時間）することが好ましい。
不溶性画分の除去は、遠心分離及び限界ろ過膜等の物理的手段にて行うことが好ましい。これにより、より水溶性の高い多糖体を得ることができるので、種々の用途に利用可能である。さらに得られた水溶性多糖体を、凍結乾燥することが好ましい。
【００２４】
３．本開示の多糖体の用途
本開示の多糖体は、後記実施例に示すように、線維芽細胞増殖因子のファミリーの一つである線維芽細胞増殖因子−７（ＦＧＦ−７）の量が増加することが認められている。よって、本開示の多糖体は、ＦＧＦ−７産生促進作用、線維芽細胞増殖賦活作用、皮膚の抗老化防止作用、シワ改善作用、毛母細胞増殖作用及び育毛作用等を有する。
【００２５】
ここで、線維芽細胞増殖因子は、血管新生作用、コラーゲンやフィブロネクチンの合成抑制作用等を有することや、ヘパリンに対して強い親和性を有していることが知られている。
また、線維芽細胞は、真皮に含まれており、線維芽細胞の増殖機能が維持されることによって、皮膚の水分量、柔軟性、弾力性等が良好な状態に保たれ、美しく健康的な皮膚（肌）の状態が維持される。また、線維芽細胞の増殖機能が低下することによって、皮膚の線維成分及び基質の産生量が減少する。これは、皮膚の表面形状及び物理的性状に変化を及ぼす要因となり、皮膚のガサつき、肌荒れ、しわ、たるみ等の原因となる。よって、線維芽細胞増殖賦活作用を有すると、皮膚の抗老化防止作用、シワ改善作用等に寄与すると考えられる。
また、ＦＧＦ−７は毛乳頭細胞から分泌される因子であり、このＦＧＦ−７が毛母細胞に作用し、毛母細胞の増殖を促進し、毛髪成長が促進すると考えられている。よって、ＦＧＦ−７産生促進作用を有すると、毛母細胞増殖作用、育毛作用等に寄与すると考えられる。
【００２６】
さらに、本開示の多糖体は、上述のように、ＦＧＦ−７産生促進作用及び線維芽細胞増殖賦活作用等を有することで、ＦＧＦ−７産生量減少、線維芽細胞増殖能の低減、毛母細胞増殖能の低減、線維芽細胞増殖能の低減等に起因する疾患や症状の予防、改善又は治療が可能と考えられる。
本開示のＦＧＦ−７産生量減少、線維芽細胞増殖能の低減、毛母細胞増殖能の低減等に起因する各種疾患や症状として、例えば、皮膚の老化、シワ形成、脱毛症等が挙げられる。この脱毛症としては、男性型脱毛症、女性のびまん性脱毛症、円形脱毛症等が挙げられる。
【００２７】
また、本開示の多糖体は、後記実施例に示すように血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の量が増加することが認められている。よって、本開示の多糖体は、ＶＥＧＦ産生促進作用、血管内皮増殖賦活作用、血管新生促進作用、毛母細胞活性化作用、発毛促進作用等を有する。
【００２８】
ここで、血管内皮増殖因子は、血管内皮細胞に働き、細胞の増殖、遊走を促進させたり、血管新生を促進させたり、また血管透過性を亢進させたりすることが知られている。このように、血管内皮増殖賦活作用を有すると、血管内皮細胞増殖促進作用、血管新生促進作用等に寄与すると考えられる。
また、本開示の多糖体は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を有するが、このＶＥＧＦは、毛乳頭細胞から分泌され、このＶＥＧＦが血管新生を促進し、それにより毛母細胞が活性化することで発毛が促進されると考えられている。このように、ＶＥＧＦ産生促進作用を有すると、毛母細胞活性化作用、発毛促進作用等に寄与すると考えられる。
さらに、本開示の多糖体は、上述のように、ＶＥＧＦ産生促進作用及び血管内皮増殖賦活作用を有することで、ＶＥＧＦ産生量減少、血管内皮増殖抑制、毛母細胞活性低下等に起因する各種疾患や症状の予防、改善又は治療が可能と考える。
本開示のＶＥＧＦ産生抑制、血管内皮増殖抑制、毛母細胞活性低下等に起因する各種疾患や症状として、脈管形成不全、血管系の発達異常、脱毛症等が挙げられる。
【００２９】
本開示の多糖体は、後記実施例に示すように、毛乳頭の細胞を賦活することが認められている。よって、本開示の多糖体は、上述のように、ＦＧＦ−７産生促進作用及びＶＥＧＦ産生促進作用も有していることから、非常に良好に毛母細胞増殖賦活作用、育毛作用等に寄与すると考えられる。
一般的に、育毛作用物質の探索は、アデノシンのような低分子化合物又は植物等由来の有機溶媒抽出物等から行われているが、これとは本開示の多糖体は分子量や性質も異なる高分子かつ多糖体であり、さらに新規である本開示の多糖体に優れた育毛作用があることは全くの意外である。
【００３０】
よって、本開示の多糖体は、上述のような、ＦＧＦ−７産生促進作用、線維芽細胞増殖賦活作用、細胞賦活作用、毛乳頭細胞賦活作用、育毛作用、皮膚の抗老化防止作用、シワ改善作用、ＶＥＧＦ産生促進作用、血管内皮増殖賦活作用等のために使用してもよく、また、ＦＧＦ−７産生促進剤、線維芽細胞増殖賦活剤、細胞増殖賦活剤、毛乳頭細胞増殖賦活剤、育毛剤、皮膚の抗老化防止剤、シワ改善剤、ＶＥＧＦ産生促進剤、血管内皮増殖賦活剤等の上述のような使用を目的とした各種製剤に使用することができ、これら各種製剤を製造するために使用することができる。
なお、本開示における「育毛剤」とは、毛を発育させること、毛の発育を促進させること、毛の健康状態を保つこと、脱毛を予防すること、及び脱毛を低減させること等の効果を発揮することを意味し、「養毛剤」をも包含する。
【００３１】
通常、皮膚においてメラニンは紫外線から生体を保護する役目も果たしているが、過剰生成や不均一な蓄積は、皮膚の黒化やシミの原因となる。一般的に、メラニンは色素細胞中で生成されるチロシナーゼの酵素の働きによって、チロシンからドーパ、ドーパからトーパキノンに変化し、次いで、５，６―ジヒドロキシインドフェノール等の中間体を経て形成される。従って、皮膚の色黒（皮膚色素沈着症）を予防又は改善するため、すなわち、美白のためには、メラニン産生過程を阻害すること、又は既に産生したメラニンを淡色化漂白することが有効と考えられている。
このようなチロキシナーゼ活性阻害作用を有する物質として、例えば、特開２００２−３７０９６２号公報には、藤茶枝葉部からのエタノール抽出物に優れたチロシナーゼ活性があることが開示されている。
また、特開２００１−０２６５３０号公報には、スフィンゴ脂質という脂質に、メラノーマＢ１６細胞のメラニン生成抑制作用があることが開示されている。
このように、従来植物抽出物やスフィンゴ脂質等の低分子系について美白作用が多く報告されているため、高分子で中性の多糖体に美白作用があるとの知見はほとんど見出されていない。
【００３２】
本開示の多糖体は、後記実施例に示すように、Ｂ１６メラノーマ細胞におけるメラニンの蓄積抑制作用が認められている。よって、本開示の多糖体は、メラニン産生抑制作用及び美白作用を有する。
さらに、本開示の多糖体は、メラニン産生抑制作用を有することで、メラニン蓄積やメラニン産生量増加等に起因する疾患や症状の予防、改善又は治療が可能と考えられる。
本開示のメラニン産生量増加等に起因する各種疾患や症状として、例えば、皮膚がん、皮膚の色黒化（皮膚色素沈着症、悪性黒色腫）等が挙げられる。
よって、本開示の多糖体は、上述のような、メラニン産生抑制作用及び美白作用等のために使用してもよく、また、メラニン産生抑制剤、美白剤等の上述のような使用を目的とした各種製剤に使用することができ、これら各種製剤を製造するために使用することができる。
【００３３】
また、本開示の多糖体は、ヒトを含む動物に摂取、投与又は接触させて、上述のような、線維芽細胞増殖賦活作用、ＦＧＦ−７産生促進作用、皮膚の抗老化防止作用、シワ改善作用、血管内皮増殖賦活作用、ＶＥＧＦ産生促進作用、育毛作用、メラニン産生抑制作用及び美白作用等を図るために、使用することができる物質である。
従って、本開示の多糖体は、上述のような、線維芽細胞増殖賦活、ＦＧＦ−７産生促進、皮膚の抗老化防止、シワ改善、血管内皮増殖賦活、ＶＥＧＦ産生促進、育毛、メラニン産生抑制及び美白等のために、皮膚外用剤、化粧品、医薬品、医薬部外品、食品や機能性食品（例えば特定保健用食品等）等に配合することが可能であり、本開示の育毛剤、美白剤等は、これら皮膚外用剤、化粧品等として有用である。
【００３４】
本開示の多糖体は、特に皮膚外用剤、化粧品、医薬部外品に用いるのが好ましく、皮膚に塗布などに接触させる製剤が好適である。
前記育毛剤、美白剤等の製剤中における多糖体の含有量は、好ましくは０．００１〜０．０１質量％、より好ましくは０．０１〜０．１質量％であり、さらに好ましくは０．１〜１質量％である。
【００３５】
なお、前記育毛剤及び美白剤等には、本開示の多糖体に、必要に応じて、任意の成分を組み合わせて使用してもよい。好ましい他の成分としては、薬学的に又は食品的に許容される成分であればよく、例えば、細胞賦活剤、抗酸化剤、保湿剤、紫外線防止剤、溶剤（水、アルコール類等）、油剤、界面活性剤、増粘剤、粉体、キレート剤、ｐＨ調整剤、乳化剤、安定化剤、着色剤、光沢剤、矯味剤、矯臭剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、希釈剤、浸透圧調整剤、香料等が挙げられ、これらを目的とする製剤に応じて配合すればよい。
また、前記育毛剤及び美白剤等の形態は、特に限定されず、液状、ペースト状、ゲル状、固形状、粉末状等の何れの形態でもよい。
【００３６】
本技術は、以下の構成を採用することが可能である。
〔１〕  多糖の基本構造の糖残基が少なくともガラクトースとマンノースで構成されており、当該ガラクトースにフラノース型が存在する多糖体。
〔２〕前記ガラクトースの含有量が、全中性糖中、５０〜７９質量％である前記〔１〕記載の多糖体。
〔３〕前記多糖体の分子量が、ＧＰＣ測定において３〜９×１０４である前記〔１〕又は〔２〕記載の多糖体。
〔４〕  前記ガラクトースとマンノースの糖残基の比率が２．５〜３．５：１である前記〔１〕〜〔３〕の何れか１項記載の多糖体。
〔５〕  パラクロレラ由来の細胞外多糖体である前記〔１〕〜〔４〕の何れか１項記載の多糖体。好適にはパラクロレラ属ケッセリ（Parachlorella kessreli）由来の多糖体である。また、前記多糖体は水溶性であるのが好適である。
【００３７】
〔７〕  多糖の基本構造の糖残基が少なくともガラクトースとマンノースで構成されており、当該ガラクトースにフラノース型が存在する多糖体を含有するＦＧＦ−７産生促進剤、ＶＥＧＦ産生促進剤、線維芽細胞増殖賦活剤、血管内皮増殖賦活剤、細胞増殖賦活剤、育毛剤、メラニン産生抑制剤、美白剤、シワ改善剤、皮膚の抗老化剤、血管新生促進剤。
〔８〕  前記〔２〕〜〔５〕の何れか１項記載のパラクロレラ細胞外多糖体を含有するＦＧＦ−７産生促進剤、ＶＥＧＦ産生促進剤、線維芽細胞増殖賦活剤、血管内皮増殖賦活剤、細胞増殖賦活剤、育毛剤、メラニン産生抑制剤、美白剤、シワ改善剤、皮膚の抗老化剤、又は血管新生促進剤。
〔９〕  前記細胞増殖賦活が、毛乳頭細胞増殖賦活である前記〔７〕又は〔８〕記載の細胞増殖賦活剤。
〔１０〕  多糖の基本構造の糖残基が少なくともガラクトースとマンノースで構成されており、当該ガラクトースにフラノース型が存在する多糖体を含有する皮膚外用剤。
〔１１〕好適には、前記〔７〕〜〔１３〕に記載の各種製剤の多糖体は、前記〔２〕〜〔５〕の何れか１項記載の多糖体である。
【００３８】
〔１２〕  ＦＧＦ−７産生促進剤、ＶＥＧＦ産生促進剤、線維芽細胞増殖賦活剤、血管内皮増殖賦活剤、細胞増殖賦活剤、育毛剤、メラニン産生抑制剤、美白剤、シワ改善剤、皮膚の抗老化剤又は血管新生促進剤の製造のための、多糖の基本構造の糖残基が少なくともガラクトースとマンノースで構成されており、当該ガラクトースにフラノース型が存在する多糖体の使用。
好適には、前記〔２〕〜〔５〕の何れか１項記載の多糖体である。
〔１３〕  多糖の基本構造の糖残基が少なくともガラクトースとマンノースで構成されており、当該ガラクトースにフラノース型が存在する多糖体の、ＦＧＦ−７産生促進剤、ＶＥＧＦ産生促進剤、線維芽細胞増殖賦活剤、血管内皮増殖賦活剤、細胞増殖賦活剤、育毛剤、メラニン産生抑制剤、美白剤、シワ改善剤、皮膚の抗老化剤又は血管新生促進剤への使用。
好適には、前記〔２〕〜〔５〕の何れか１項記載の多糖体である。
〔１４〕  ＦＧＦ−７産生量減少、線維芽細胞増殖能の低減、毛母細胞増殖能の低減、線維芽細胞増殖能の低減、ＶＥＧＦ産生量減少、血管内皮増殖抑制、毛母細胞活性低下、及びメラニン産生量増加等に起因する疾患の、予防、改善又は治療のための、〕多糖の基本構造の糖残基が少なくともガラクトースとマンノースで構成されており、当該ガラクトースにフラノース型が存在する多糖体。
好適には、前記〔２〕〜〔５〕の何れか１項記載の多糖体である。
【００３９】
また、本技術は、以下の構成を採用することが可能である。
（１）  パラクロレラ属単細胞藻類又は改変体を炭素源含有培養培地で好気的な条件下で従属培養し、生産される多糖体を回収する多糖体の製造方法。
（２）  前記多糖体が、前記〔１〕多糖の基本構造の糖残基が少なくともガラクトースとマンノースで構成されており、当該ガラクトースにフラノース型が存在する多糖体である、前記（１）〜（１０）の何れか１項記載の多糖体の製造方法。好適には前記〔２〕〜〔５〕の多糖体である。
（３）パラクロレラ属単細胞藻類が、パラクロレラ属ケッセリ（Parachlorella kessreli）である前記（１）又は（２）記載の多糖体の製造方法。
（４）前記炭素源の培地中の濃度が、０．１〜１０質量％である前記（１）〜（３）の何れか１項記載の多糖体の製造方法。
（５）  前記炭素原が、グルコース、果糖及びショ糖から選ばれる１種又は２種以上のものである前記（１）〜（４）記載の多糖体の製造方法。
（６）  前記培養が、通気条件下の従属的培養である前記（１）〜（５）の何れか１項記載の多糖体の製造方法。
（７）  前記培養の溶存酸素濃度が、３〜１３ｐｐｍである前記（１）〜（６）の何れか１項記載の多糖体の製造方法。
（８）  前記培養の温度が、５〜４０℃である前記（１）〜（７）の何れか１項記載の多糖体の製造方法。
（９）  前記培養のｐＨが、４〜９である前記（１）〜（８）の何れか１項記載の多糖体の製造方法。
（１０）  前記培養後、遠心分離及びろ過を単独で又は２種組み合わせて藻体を除去する前記（１）〜（９）の何れか１項記載の多糖体の製造方法。
（１１）  前記藻体を除去した後に凍結乾燥し、さらに水溶液に溶解後、水溶性画分を回収する前記（１）〜（１０）の何れか１項記載の多糖体の製造方法。
（１２）  前記（１）〜（１１）の何れか１項記載の多糖体の製造方法にて得られた多糖体。
（１３）Parachlorella kessleri-PNC1と命名され、FERM BP-11493として寄託された藻体である前記（１）〜（１２）の何れか１項記載の多糖体の製造方法。
（１４）  Parachlorella kessleri-PNC1と命名され、FERM BP-11493として寄託された藻体。
【実施例】
【００４０】
以下、本発明（本技術）を具体的に説明するために実施例及び比較例等を挙げるが、本
発明（本技術）は実施例等に限定されるものではない。
【００４１】
独立行政法人  国立環境研究所  微生物系統保存施設（NIESコレクション）から、NIES-2152〜NIES-2162、2177、2178、2179の14株を、パナック株式会社新規事業開発第二部が入手した。各１株を複数に分けて、表１に示す培地にて継代培養しながら、これらの中から、光学顕微鏡において、細胞体の細胞外に墨汁に染まらない部分が非常に多く認められるものを、細胞外多糖体の生産性が高い株として探索した。
ここで、多糖体が細胞外に多く生産されること；藻体と多糖体との分離が容易であると、多糖体の回収が容易であること；藻体が多糖体生産に再利用可能なものであること；従属培養に適していると、大型タンクでの培養も可能であることが、工業的生産に適している藻体と考える。
継代培養を繰り返しながら、これらの中から、細胞外多糖体の生産性が高く、かつ従属培養に適した株を見出し、これをPNC1株とした。
【００４２】
藻体PNC1株を、表１に示す培地にて従属培養を行い、光学顕微鏡において、墨汁染色を行った。細胞体の細胞外に墨汁に染まらない部分が認められた。その墨汁に染まらない部分について、以下の製造例１〜３に示す方法にて多糖体を分離し、分析を行った結果、藻体の細胞外に多糖体が生産されていることを見出した（図１）。
さらに、前記PNC1株に関する形態観察及びrRNA遺伝子配列に基づく分子系統樹により（図２）、パラクロレラ属ケッセリ（Parachlorella kessreli）単細胞緑藻類と判断し、Parachlorella kessleri-PNC1株と命名した。独立行政法人  製品評価技術基盤機構  特許生物寄託センター（NITE-IPOD）に、Parachlorella kessleri-PNC1株(FERM BP-11493)として寄託した。
【００４３】
【表１】
2014025035.tif 000002
【００４４】
製造例１：本開示の多糖体の製造方法
Parachlorella kessleri-PNC1株(FERM BP-11493)を含むスラント状培地（５０ｍｌ）を、グルコース含有培養培地２５０ｍｌを含む３Ｌ容バッフル付き三角フラスコに添加し、照度８０００〜１００００ｌｕｘ、２８℃で、１６０ｒｐｍにて４日間前培養した。なお、前培養前に、予備的に藻体数を増やしてもよい。
なお、グルコース含有培養培地は、表１の基礎培地１Ｌ当たりにグルコース１０ｇを含有させたものである。
前培養物２４０ｍｌを３０Ｌ容のジャーファメンターに移して１２日間本培養を行い、これを本培養物とした。このときの培養条件は、３０℃、２３０ｒｐｍ、通気０．５６ｖｖｍ、内圧０．３ｋｇｆ／ｃｍ２、ｐＨ７．２の好気的な条件下であり、光照射は行わなかった。
本培養物を、遠心分離（７０００ｒｐｍ（６５００Ｇ）、２５℃）し、目的とする多糖体を含有する上清液と藻体とに分離した。さらに分画分子量６０００のＵＦ膜（ＳＩＰ１０１３）を用いて、原液を２Ｌまで濃縮した。濃縮物（２Ｌ）に、陰イオン交換樹脂２００ｍＬを添加し、ブリックス０．１まで回収し、ＵＦ膜ろ過にて、５００ｍＬ濃縮し、凍結乾燥して、パラクロレラ由来の多糖体を得た。収率は、培養液１Ｌ当たり、０．２〜０．４ｇであった。
【００４５】
製造例２：多糖体の精製
パラクロレラ由来の多糖体１ｇに蒸留水４０ｍＬを添加して混合撹拌し、懸濁液を得た。この懸濁液を４℃にて一晩放置し、この懸濁液を遠心分離（７０００ｒｐｍ、６５００ｇ、５分間）し、上清と沈殿部とに分けた。上清について凍結乾燥し、水溶性のパラクロレラ由来の多糖体（以下、「水溶性パラクロレラ多糖」という）を得た（０．４〜０．５ｇ）。
【００４６】
実施例１：水溶性パラクロレラ多糖体の構造解析
〔多糖体の分子量〕
水溶性パラクロレラ多糖体の分子量（Ｍｗ）を、ＧＰＣ分析にて測定した結果、６．２×１０４、Ｍｗ（重量平均分子量）／Ｍｎ（数平均分子量）＝１．５あった（図３のＰ１参照）。また、上述の製造例１及び２と同様にして得られた水溶性パラクロレラ多糖体の分子量（Ｍｗ）を、ＧＰＣ分析にて測定した結果、６．７×１０４、Ｍｗ（重量平均分子量）／Ｍｎ（数平均分子量）＝１．５あった（図３のＰ２参照）。
＜ＧＰＣ分析＞
測定カラム：TSKgel GMPWXL(7.6mmID x 300 mm：東ソー株式会社)の2本直列
測定温度：40℃
移動相：0.1 M NaNO3
HPLCシステム：島津  LC-20システム
検出器：示差屈折計  LaboSystem RI-2000
標準物質：プルラン（昭和電工  P-52）
使用ソフト（GPC計算）：LC Solutions, GPC software（島津）
【００４７】
〔多糖体の組成〕
水溶性パラクロレラ多糖体を、２Ｍ−ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）、１２０℃、２時間で加水分解した。この加水分解物を、室温、ＮａＢＨ４にて還元し、さらに（無水酢酸：１−メチルイミダゾール  ９：１）にてアセテート化し、アルジトールアセテート誘導体を得た。アルジトールアセテート誘導体は、ＧＣで分析を行った。
ＧＣ測定は、GL Science GC-353ガスクロマトグラフ（カラム  SP-2330 (Spelco)；検出器  FID；220 ℃の恒温分析）にて、行った。
アラビノース（４．７％）、ラムノース（４．０％）、キシロース（１．７％）、マンノース（２２．５％）、ガラクトース（６７．１％）であった。
【００４８】
また、水溶性パラクロレラ多糖体について、メチル化分析を行った。
多糖試料をＤＭＳＯに溶解後、粉末ＮａＯＨを加え撹拌した後、ＣＨ３Ｉを加え多糖をメチル化した。メチル化多糖を回収後、２Ｍ−ＴＦＡ中１２０℃で２時間加水分解し、ＮａＢＤ４で還元後、無水酢酸と１−メチルイミダゾールでアセチル化した。得られた誘導体はＧＣ−ＭＳで分析した。
GC-MSは、Shimadzu QP-5000 GC-MS ガスクロマトグラフ質量分析装置〔カラム：SPB-50 (0.32 x 30 m)〕を行った。
本多糖体のマンノース残基として、非還元末端、１，２−結合、１，３−結合した残基が認められた。また、本多糖体のガラクトース残基の大部分はフラノースである、また本多糖体のガラクトース残基として、非還元末端、１，２−結合フラノース、１，５−結合フラノース、１，６−結合フラノース，  １，２，６−結合フラノース、そして１，３−結合ピラノースが認められた。
【００４９】
また、１Ｈ-ＮＭＲ分析（Varian Unity plus 500、１Ｈ：５００ＭＨｚ，１３Ｃ：１２５ＭＨｚ、〔溶媒：重水（Ｄ２Ｏ）、測定温度は３０℃、内部標準：ＤＳＳ〕）により、水溶性パラクロレラ多糖体のガラクトース残基の多くは、フラノース型で存在することが認められた。
水溶性パラクロレラ多糖体のタンパク質含量（ローリー法）及びウロン酸含量（カルバゾール−硫酸法）にて測定を行った結果、タンパク質及びウロン酸の存在は、多量ではないが、認められた。
【００５０】
水溶性パラクロレラ多糖体に存在するガラクトース及びマンノースのＤＬを調べた。
水溶性パラクロレラ多糖体の試料を２Ｍ  ＴＦＡ中、１２０℃で２時間加水分解した後、酸を窒素気流下で除去した。
加水分解物に（Ｓ）−（＋）−２−ｂｕｔａｎｏｌ（１００μＬ）と塩化アセチル（７．５μＬ）を加え、６０℃で一晩加熱し、ブチルグリコシドとした。試薬を窒素気流下で除去後、トリメチルシリル化し得られた誘導体をＧＣで分析した。このとき、既知のＤ−Ｇａｌ，Ｌ−Ｇａｌ，Ｄ−Ｍａｎ及びＬ−Ｍａｎも同様に誘導体を調製し、それぞれの保持時間との比較により、構成糖の絶対配置を確認した。Ｄ−ガラクトース及びＤ−マンノースが認められた。
＜ＧＣ条件＞
Ｃｏｌｕｍｎ：  ＳＰＢ−１  （Spelco, 0.32 mm x 30 m）
ＧＣ：  ＧＬ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＧＣ−３５３ガスクロマトグラフ（検出器  ＦＩＤ）
キャリアガス：窒素
オーブン温度：  １３５−２００℃（１℃／ｍｉｎ）
【００５１】
このことから、本開示の多糖の基本構造の糖残基は、少なくともガラクトースとマンノースを主体として構成されており、当該ガラクトースのほとんどがフラノース型で存在するものと推定した。
【００５２】
実施例２：毛乳頭細胞賦活試験
〔ヒト正常毛乳頭細胞〕
凍結保存ヒト正常毛乳頭細胞（TOYOBO, Code No.CA60205a）の起眠時、継代培養、必要細胞数までの増殖には、毛乳頭細胞専用培地を使用した。培養はインキュベーター（５％ＣＯ２、３７℃）内で行った。
【００５３】
なお、実施例２及び後述の実施例３で使用する試薬等について、以下に示す。
＜試薬＞
DMEM 培地 （Nacalai tesque, 14242-65）
FBS （Invitrogen, Cat. No. 10091-148）
Penicillin-streptmycin solution （Nacalai tesque, Cat.No.26253-84）
0.25% trypsin-EDTA solution （Nacalai tesque、32777-44）
PBS （日水製薬株式会社, Code No. 05913）
Melanin （Sigma, Cat. No. M8631-100MG）
Phenyl-１-thiourea (PTU)  （Wako, Cat. No. 166-13702）
Dimethyl sulfoxide （Nacalai tesque Cat. No. 13445-74）
Theophyline  （Wako, Cat. No. 209-09932）
毛乳頭細胞増殖培地（TOYOBO, Code No.TMTPGM-250）添加剤含
毛乳頭細胞専用サブカルチャーセット（TOYOBO, Code No.CA090K）
生細胞数測定試薬ＳＦ（nacalai tesque, Cat.No. 07553）
Adenosine (Wako, Cat. No. 016-10493)
＜その他＞
Minisart 0.2 μm （Sartorius, Code No. 16534）
96 well culture plate （SUMILON, Cat. No. MS-8096F）
24 well cell culture cluster （TPP, Code No. 92424）
15 ml centrifuge tube （Corning, Code No. 430766）
Precision microplate reader （Molecular Devices）
Thermo Alumi Bath (IWAKI, ALB-121)
＜標品等＞
［１］メラニン生成を促進させるためテオフィリンを使用した。テオフィリンはＤＭＳＯに溶解・濾過滅菌し、３６ｍｇ／ｍｌ溶液を調製した。使用時は培地にて希釈し、９０μｇ／ｍＬに調整した。
［２］  Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ
毛乳頭細胞賦活試験の陽性コントロールとしてアデノシンを使用した。アデノシンはＤＭＳＯに溶解・濾過滅菌し、１００ｍＭ溶液を調製した。使用時は培地にて希釈し、１００μＭに調整した。
【００５４】
〔毛乳頭毒性試験〕
毛乳頭細胞を１．４ｘ１０４個／１００μＬ／ｗｅｌｌの濃度で９６ウェルプレートに播種し、翌日（８０％コンフルエント）、各濃度（０．０１、０．１、１質量％）の水溶性パラクロレラ多糖体を含む試験培地に交換し、２４時間培養した。
細胞の増殖性を、生細胞数測定試薬ＳＦにて、測定した。生細胞数測定試薬を１０％含む増殖培地を１００μＬ／ｗｅｌｌで添加し、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。３０、９０分後にマイクロプレートリーダーを用いて反応培地の吸光度を測定した（測定波長：４５０ｎｍ、対照波長：５９５ｎｍ）。試験数３にて行った。
水溶性パラクロレラ多糖体の０．０１、０．１及び１質量％の何れの濃度でも、毛乳頭細胞に対して細胞毒性がほとんど認められなかった。
【００５５】
〔毛乳頭細胞・細胞賦活試験〕
毛乳頭細胞を５ｘ１０３個／１００μＬ／ｗｅｌｌの濃度で９６ウェルプレートに播種し、翌日（５０％コンフルエント）、各濃度（０．００００１、０．００１、０．１質量％）の被験物質を含む試験培地に交換し、２４時間、７２時間培養した。細胞増殖性を、生細胞数測定試薬ＳＦを用いて測定した。生細胞数測定試薬を１０％含む増殖培地を１００μＬ／ｗｅｌｌで添加し、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。３０、９０分後にマイクロプレートリーダーを用いて反応培地の吸光度を測定した（測定波長：４５０ｎｍ、対照波長：５９５ｎｍ）。試験数５にて行った。
表２に示すように、水溶性パラクロレラ多糖体の０．００００１質量％以上の濃度で、優れた毛乳頭細胞増殖賦活作用が認められた。
＜有意差検定＞
比較試験区間では有意差検定を行った。検定はＳｔｕｄｅｎｔ  Ｔ−ｔｅｓｔとして行いＰ＜０．０５（帰無仮説が５％未満）のものを有意差ありと判断した。
【００５６】
【表２】
2014025035.tif 000003
【００５７】
【表３】
2014025035.tif 000004
【００５８】
一般に細胞増殖過程では分裂が盛んな指数増殖期と分裂を停止し安定的に細胞を維持する維持期に大別できる。本試験において各時期における水溶性パラクロレラ多糖の効果を検証するため細胞密度（コンフルエント）が４０〜６０％の状態で水溶性パラクロレラ多糖を添加し、２４時間培養後の生細胞数を測定した。また、さらに４８時間培養（合計３日間）により維持期における細胞へ与える影響を検証した。
指数増殖期（培養１日）、維持期（培養３日）において水溶性クロレラ多糖体の最低濃度区において無添加区と比較して約１．１〜１．４倍の増殖促進を示した。これは被験物質に細胞分裂促進効果と維持促進効果があることが考えられる。
一方、陽性対照であるアデノシンは指数増殖期において増殖促進作用を示したものの、維持期では無添加区と同程度の生細胞数であった。これはアデノシンが細胞分裂を促進するものの細胞密度が１００％となった後では細胞維持には作用しないことが考えられる。
よって、本開示の多糖体は、優れた細胞増殖賦活作用及び優れた毛乳頭細胞増殖賦活作用を有することが認められた。
【００５９】
実施例３：美白作用（メラニン産生抑制）試験
〔細胞培養〕
Ｂ１６  ｍｅｌａｎｏｍａ細胞を３ｘ１０４個／ｍｌ／ｗｅｌｌで２４ウェルプレートに播種し、翌日、各濃度（０．０１、０．１質量％）の水溶性パラクロレラ多糖体を含む試験培地１ｍｌに交換し、４８時間培養した。その後、全細胞の細胞内メラニン量を測定した。試験数５にて行った。
〔細胞内メラニンの測定〕
培地上清を除去後、ウェルに接着している細胞をＰＢＳ、１ｍｌで洗浄する。細胞に０．２５％  ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ  ｓｏｌｕｔｉｏｎを１００μｌを加え３７℃、５％ＣＯ２条件下で１分間静置する。トリプシン処理によって剥離した細胞をＰＢＳ１ｍｌにて回収し、１．５ｍｌチューブに移した。その後、１，０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心し、上清を除去後、ＰＢＳにて細胞ペレットを２回洗浄した。細胞懸濁液を３，０００ｒｐｍで５分間遠心した後、ＰＢＳを除去し、１Ｎ水酸化ナトリウム溶液１１０μｌに細胞を懸濁した。剥離した細胞を含むすべてのメラニン量を測定するため、培地上清、洗浄後のＰＢＳを回収し３，０００ｒｐｍで５分間遠心した後、得られた沈殿と細胞懸濁液を混ぜ、１００℃で３０分インキュベートして細胞を溶解し、この溶解液８０μｌを９６ウェルプレートに移し、４０５ｎｍにおける吸光度をマイクロプレートリーダーにて測定し、細胞内のメラニン量を算出した。メラニンの標準品として、市販合成メラニンを用いた。１Ｎ水酸化ナトリウム溶液にて２．５〜１６０μｇ／ｍｌ溶液を調製し、それぞれの吸光度から検量線を作成した。この標準検量線をもとに、各検体におけるメラニン量を算出した。
メラニン産生抑制試験の結果を表４に示す。水溶性パラクロレラ多糖体にてメラニン産生抑制を有意に示した。
よって、本開示の多糖体は、優れたメラニン産生抑制作用及び優れた美白作用を有することが認められた。
【００６０】
【表４】
2014025035.tif 000005
【００６１】
実施例４：線維芽細胞増殖賦活試験
〔培養上清〕
毛乳頭細胞の培養条件及び被験物質処理条件などは、上述の実施例１及び２と同様に行った。培養上清は測定まで冷凍保存した。
〔試薬〕
FGF7 Human ELISA kit（abcam、Code No．ablOO519）
〔分析装置〕
Precision   microplate reader（Molecular Devices）
〔試薬等の調製〕
ＦＧＦ−７測定において必要量１００μＬ、ＶＥＧＦ測定において必要量２００μＬである。
実施例２で得られた培養上清量が約９０μＬを、１×ＰＢＳを用いて約４倍に希釈しＦＧＦ−７測定に使用した。
〔培養上清中のＦＧＦ−７量の測定〕
［１］ＦＧＦ−７の測定はキットのプロトコールに順じて行った。以下にその詳細を述べる。
［２］ＦＧＦ−７標準原液（５０ｎｇ／ｍｌ）をもとに、反応緩衝液を用いて４００、１３３．３、４４．４４、１４．８１、４．９４、１．６５、０．５５ｐｇ／ｍｌのＦＧＦ−７標準溶液を調製する。
［３］ＦＧＦ−７標準溶液および検体（培養上清）１００μｌをＦＧＦ−７固相化マイクロプレートの各ウェルに添加し、室温にて２時間３０分反応した（一次反応）。
ウェル内の溶液を除去し、洗浄液で４回洗浄する。
［４］ビオチン標識抗ＦＧＦ−７抗体溶液を各ウェルに１００μｌずつ添加し、室温で６０分間反応させる（二次反応）。
［５］ウェル内の溶液を除去し、洗浄液で４回洗浄する。
［６］ストレプトアピジン溶液１００μｌを各ウェルに添加し、室温で４５分反応する。
［７］酵素基質溶液１００μｌを各ウェルに添加し、遮光・室温下で３０分間静置する（発色反応）。
［８］反応停止溶液を各ウェルに５０μｌずつ添加し、プレートミキサーで１分間混和後、プレートリーダーで各ウェルの吸光度を測定する（測定波長４５０ｎｍ）。
［９］標準曲線から、検体中のＦＧＦ−７濃度を算出する。
【００６２】
実施例２で回収した毛乳頭細胞培養上清中のＦＧＦ−７産生量を測定した。
表５及び６に示すように、毛乳頭細胞培養１日間では、陽性対照であるアデノシンにおいてＦＧＦ−７が未検出であった。しかし、水溶性パラクロレラ多糖体において、ＦＧＦ−７産生促進効果が認められた。さらに、３日間では、水溶性パラクロレラ多糖体の０．０１〜１質量％の濃度において、アデノシンと比較しても高いＦＧＦ−７産生促進効果が認められた。
よって、本開示の多糖体に非常に優れたＦＧＦ−７の産生促進作用、線維芽細胞増殖賦活作用を有することが認められた。
【００６３】
【表５】
2014025035.tif 000006
【００６４】
【表６】
2014025035.tif 000007
【００６５】
実施例５：血管内皮増殖賦活試験
〔培養上清〕
毛乳頭細胞の培養条件及び被験物質処理条件などは、上述の実施例１及び２と同様に行った。培養上清は測定まで冷凍保存した。
〔試薬〕
Human VEGF Quantikine ELISA（R＆D Systems，Cat．No．DVEOO）
〔分析装置〕
Precision microplate reader（Molecular Devices）
〔培養上清中のVEGF量の測定〕
ＶＥＧＦの測定はキットのプロトコールに順じて行った。以下にその詳細を述べる。
［１］ＶＥＧＦ標準原液（２０００ｐｇ／ｍｌ）をもとに、反応緩衝液を用いて１０００、５００、２５０、１２５、６２．５、３１．２、１５．６ｐｇ／ｍｌのＶＥＧＦ標準溶液を調製する。
［２］ＶＥＧＦ標準溶液および検体（培養上清）２００μｌを５０μｌの希釈溶液を各ウェルに添加したＶＥＧＦ固相化マイクロプレートに添加し、室温にて２時間反応した（一次反応）。
［３］ウェル内の溶液を除去し、洗浄液で３回洗浄する。
［４］西洋ワサビベルオキシダーゼ結合ＶＥＧＦ抗体溶液を各ウェルに２００μｌずつ添加し、室温で２時間反応させる（二次反応）。
［５］ウェル内の溶液を除去し、洗浄液で３回洗浄する。
［６］基質溶液２００μＬを各ウェルに添加し、室温で２０分反応する。
［７］反応停止溶液を各ウェルに５０μｌずつ添加し、プレートミキサーで１分間混和後、プレートリーダーで各ウェルの吸光度を測定する（測定波長４５０ｎｍ）。
［８］標準曲線から、検体中のＶＥＧＦ濃度を算出する。
〔有意差検定〕
比較試験区間では有意差検定を行った。検定はＳｔｕｄｅｎｔＴ−ｔｅｓｔとして行いＰく０．０５（帰無仮説が５％未満）のものを有意差ありと判断した。
【００６６】
実施例２で回収した毛乳頭細胞培養上清中のＶＥＧＦ産生量を測定した。
表７及び８に示すように、陽性対照であるアデノシンのＶＥＧＦ産生促進効果はあまりなかった。しかし、水溶性パラクロレラ多糖体いずれも高濃度試験区でＶＥＧＦ産生促進効果が認められた。
よって、本開示の多糖体に非常に優れたＶＥＧＦの産生促進作用及び血管内皮増殖賦活作用を有することが認められた。
【００６７】
【表７】
2014025035.tif 000008
【００６８】
【表８】
2014025035.tif 000009
【００６９】
実際の毛髪組織では毛乳頭細胞は３次元的に増殖していることから、産生促進されたＦＧＦ−７及びＶＥＧＦが十分に機能すると考えられ、さらに毛乳頭細胞増殖賦活作用も認められているので、本開示の多糖体は、非常に優れた育毛作用を発揮すると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００７０】
本開示の多糖体は、種々の効能が認められ、また大量生産も可能であるため、幅広い分野での応用が可能である。また、本開示の多糖体の製造方法にて、高付加価値の多糖体を効率良く生産することが可能であるため、製造コストの点や安定供給の点からも、産業上の利用可能性が非常に高い。
【受託番号】
【００７１】
（１）Parachlorella kessleri-PNC1株(FERM BP-11493)（受託日：2012年 7月19日）
寄託先：〒305-8566 茨城県つくば市東1-1-1  つくばセンター中央第6、独立行政法人  製品評価技術基盤機構  特許生物寄託センター（NITE-IPOD）。
【図２】
2014025035.tif 000010
【図３】
2014025035.tif 000011
【図１】
2014025035.tif 000012