(57)【要約】【課題】ペプチドの制御された集合体構造に金属イオンを配置してペプチドを構成し、このペプチドを利用して能力の高い造影剤やドラッグデリバリーシステムを提供する。【解決手段】シート形成ペプチドと金属キレート錯体との間に、炭素数が３〜６０のエーテル結合を含んでもよい直鎖状炭化水素鎖又は側鎖が小さいアミノ酸から成るペプチド鎖から成るリンカーを組み込むことにより、緩和能（r1）を大幅に向上させた。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（１）〜（４）のいずれかで表されるペプチド複合体。
【化１】
2014201566.tif 000008
（式中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、任意のアミノ酸残基又は２〜１３個のアミノ酸残基から成るペプチド鎖を表し、Ｘ１及びＸ２はそれぞれ親水性アミノ酸残基を表し、Ｙ１及びＹ２はそれぞれ疎水性アミノ酸残基を表し、Ｒ３は炭素数が３〜６０のエーテル結合を含んでもよい２価の直鎖状炭化水素鎖又は側鎖が小さいアミノ酸から成るペプチド鎖を表し、Ｚは（ｉ）金属イオンと錯体を形成可能な多座配位子を含む基、（ｉｉ）標的指向性基、又は（ｉｉｉ）蛍光色素を表し、ａ及びｂは、それぞれ独立して、１以上の整数を表し、ｃ〜ｅは、それぞれ独立して、０又は１を表す。）
【請求項２】
前記Ｘ１及びＸ２が、同じであっても異なってもよく、グルタミン酸残基、アスパラギン酸残基、リシン残基、アルギニン残基、オルニチン残基又はヒスチジン残基であり、前記Ｙ１及びＹ２が、同じであっても異なってもよく、イソロイシン残基、フェニルアラニン残基、チロシン残基又はバリン残基である請求項１に記載のペプチド複合体。
【請求項３】
前記Ｘ１及びＸ２のうち少なくとも一つがグルタミン酸残基又はアスパラギン酸残基である陰性アミノ酸残基であり、かつＸ１及びＸ２のうち少なくとも一つがリシン残基、アルギニン残基、オルニチン残基又はヒスチジン残基である陽性アミノ酸残基である請求項１又は２に記載のペプチド複合体。
【請求項４】
前記Ｒ１及びＲ２のうち少なくとも一方は、プロリン残基、ピペコリン酸残基及び下記一般式（５）：
【化２】
2014201566.tif 000009
（式中、Ｒ４はアルキル基を表し、Ｒ５は水素原子又はアルキル基を表し、ｍは１以上の整数を表す。）で表されるアミノ酸残基から選ばれる１種である請求項１〜３のいずれか一項に記載のペプチド複合体。
【請求項５】
前記Ｒ３において、エーテル結合を含んでもよい２価の直鎖状炭化水素鎖がポリアルキレンオキシド鎖である請求項１〜４のいずれか一項に記載のペプチド複合体。
【請求項６】
βシート構造を形成した請求項１〜５のいずれか一項に記載のペプチド複合体。
【請求項７】
前記多座配位子が金属イオンと錯体を形成した請求項１〜６のいずれか一項に記載のペプチド複合体。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のペプチド複合体及び薬剤から成る薬剤組成物であって、前記Ｚが（ｉ）金属イオンと錯体を形成可能な多座配位子を含む基であり、該薬剤が該多座配位子に結合している薬剤組成物。
【請求項９】
下記（ａ）〜（ｃ）から成る群から選択される少なくとも２種から成るペプチド複合体組成物。
（ａ）前記Ｚが、金属イオンと錯体を形成可能な多座配位子を含む基である請求項１〜５のいずれか一項に記載のペプチド複合体
（ｂ）前記Ｚが、標的指向性基である請求項１〜５のいずれか一項に記載のペプチド複合体
（ｃ）前記Ｚが、蛍光色素である請求項１〜５のいずれか一項に記載のペプチド複合体
【請求項１０】
請求項９に記載のペプチド複合体組成物が、集合してβシート構造を形成した集合ペプチド複合体。
【請求項１１】
前記多座配位子が金属イオンと錯体を形成した請求項１０に記載の集合ペプチド複合体。
【請求項１２】
請求項１１に記載の集合ペプチド複合体から成る造影剤。
【請求項１３】
ＭＲＩ用造影剤であり、前記金属がＧｄ又はＭｎである請求項１２に記載の造影剤。
【請求項１４】
請求項１０に記載の集合ペプチド複合体及び薬剤から成る薬剤組成物であって、該薬剤が該集合ペプチド複合体中の多座配位子に結合している薬剤組成物。
【請求項１５】
請求項１０に記載の集合ペプチド複合体から成る薬剤組成物であって、該集合ペプチド複合体が前記（ｃ）を含み、前記蛍光色素として蛍光性の薬剤を用いた薬剤組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、ＭＲＩ、ＰＥＴ、ＳＰＥＣＴ又は放射線等によるイメージングやドラッグデリバリーシステムのために構成されたペプチド複合体に関する。  
【背景技術】
【０００２】
イメージングやドラッグデリバリーシステムにおいて、適切な場所に適切なタイミングで適量の物質を送達するためのキャリアは重要な鍵のひとつである。例えば、がんをターゲットとした場合、ナノサイズの物質は、腫瘍血管から漏れ出しそこに滞留する現象（ＥＰＲ効果）がみられることから、ナノ粒子を利用したキャリア開発が活発に進められている（非特許文献１など）。そのような目的のために、陽イオンキレートを組み込んだペプチド（特許文献１）や、陽イオンキレートを組み込んだ自己集積型のペプチド（非特許文献２〜４）が開示されている。
また本発明者らは、自己集合してβシート構造を有するペプチドを開示している（特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特表２００６−５０６３２５号公報
【特許文献２】特開２００４−１９０２１２号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Peer D., et.al., Nat.Nanotechnol., (2007) vol.2, pp.751-760.
【非特許文献２】Ghosh A., et.al., J.Am.Chem.Soc., (2012) vol.134, pp.3647-3650.
【非特許文献３】Bull SR., et.al., Bioconjug Chem., (2005) vol.16, pp.1343-1348.
【非特許文献４】Bull SR., et.al., Nano Lett., (2005) vol.5, pp.1-4.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
イメージングにおけるキャリアとして、ナノからマイクロサイズの様々な自己集合構造が近年報告されているが（非特許文献２等）、ペプチドは環境因子で構造を制御したり、機能性分子を組み込んだりすることが分子設計によって可能であり、環境に応答して自律的に変化するキャリアをつくる上で有望な素材であると考えられる。
本発明は、集合ペプチド複合体（特許文献２）をナノキャリアとして利用して、ペプチドの制御された集合体構造に金属イオンを配置してペプチドを構成し、このペプチドを利用して能力の高い造影剤（イメージング・プローブ）を提供することを目的とする。更に、本発明は、このペプチドを利用して能力の高いドラッグデリバリーシステムを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
近年報告されているペプチド自己集合構造のキャリアを有しＧｄイオンを用いた造影剤（非特許文献２）は、例えば、１．５Ｔで６．６〜８．３ｍＭ−１s−１程度の緩和能（r1）を有している。この文献に例示されている化合物（ＰＡ５）は、疎水性アルキル部分、βシート形成ペプチド及び親水性ペプチドから成り、さらにＣ末端に金属キレート錯体を導入したものである。
本発明者は、βシート形成ペプチドと金属キレート錯体との間に、炭素数が３〜６０のエーテル結合を含んでもよい直鎖状炭化水素鎖又は側鎖が小さいアミノ酸から成るペプチド鎖から成るリンカーを組み込むことにより、緩和能（ｒ１）を大幅に向上させることができることを見出し（例えば、実施例の表１参照）、本発明を完成させるに至った。更に、このペプチドを利用すれば、能力の高いドラッグデリバリーシステムを提供することができることを見出した。
【０００７】
すなわち、本発明は、下記の特徴を有するペプチド複合体、薬剤組成物、ペプチド複合体組成物、集合ペプチド複合体、及び造影剤を提供するものである。
【０００８】
［１］下記一般式（１）〜（４）のいずれかで表されるペプチド複合体。
【化１】
2014201566.tif 000002
（式中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、任意のアミノ酸残基又は２〜１３個のアミノ酸残基から成るペプチド鎖を表し、Ｘ１及びＸ２はそれぞれ親水性アミノ酸残基を表し、Ｙ１及びＹ２はそれぞれ疎水性アミノ酸残基を表し、Ｒ３は炭素数が３〜６０のエーテル結合を含んでもよい２価の直鎖状炭化水素鎖又は側鎖が小さいアミノ酸から成るペプチド鎖を表し、Ｚは（ｉ）金属イオンと錯体を形成可能な多座配位子を含む基、（ｉｉ）標的指向性基、又は（ｉｉｉ）蛍光色素を表し、ａ及びｂは、それぞれ独立して、１以上の整数を表し、ｃ〜ｅは、それぞれ独立して、０又は１を表す。）
［２］前記Ｘ１及びＸ２が、同じであっても異なってもよく、グルタミン酸残基、アスパラギン酸残基、リシン残基、アルギニン残基、オルニチン残基又はヒスチジン残基であり、前記Ｙ１及びＹ２が、同じであっても異なってもよく、イソロイシン残基、フェニルアラニン残基、チロシン残基又はバリン残基である前記［１］に記載のペプチド複合体。
［３］前記Ｘ１及びＸ２のうち少なくとも一つがグルタミン酸残基又はアスパラギン酸残基である陰性アミノ酸残基であり、かつＸ１及びＸ２のうち少なくとも一つがリシン残基、アルギニン残基、オルニチン残基又はヒスチジン残基である陽性アミノ酸残基である前記前記［１］又は［２］に記載のペプチド複合体。
［４］前記Ｒ１及びＲ２のうち少なくとも一方は、プロリン残基、ピペコリン酸残基及び下記一般式（５）：
【０００９】
【化２】
2014201566.tif 000003
【００１０】
（式中、Ｒ４はアルキル基を表し、Ｒ５は水素原子又はアルキル基を表し、ｍは１以上の整数を表す。）で表されるアミノ酸残基から選ばれる１種である前記［１］〜［３］のいずれか一つに記載のペプチド複合体。
［５］前記Ｒ３において、エーテル結合を含んでもよい２価の直鎖状炭化水素鎖がポリアルキレンオキシド鎖である前記［１］〜［４］のいずれか一つに記載のペプチド複合体。
［６］βシート構造を形成した前記［１］〜［５］のいずれか一つに記載のペプチド複合体。
［７］前記多座配位子が金属イオンと錯体を形成した前記［１］〜［６］のいずれか一つに記載のペプチド複合体。
［８］前記［１］〜［６］のいずれか一つに記載のペプチド複合体及び薬剤から成る薬剤組成物であって、前記Ｚが（ｉ）金属イオンと錯体を形成可能な多座配位子を含む基であり、該薬剤が該多座配位子に結合している薬剤組成物。
［９］下記（ａ）〜（ｃ）から成る群から選択される少なくとも２種から成るペプチド複合体組成物。
（ａ）前記Ｚが、金属イオンと錯体を形成可能な多座配位子を含む基である前記［１］〜［５］のいずれか一つに記載のペプチド複合体
（ｂ）前記Ｚが、標的指向性基である前記［１］〜［５］のいずれか一つに記載のペプチド複合体
（ｃ）前記Ｚが、蛍光色素である前記［１］〜［５］のいずれか一つに記載のペプチド複合体
［１０］前記［９］に記載のペプチド複合体組成物が、集合してβシート構造を形成した集合ペプチド複合体。
［１１］前記多座配位子が金属イオンと錯体を形成した前記［１０］に記載の集合ペプチド複合体。
［１２］前記［１１］に記載の集合ペプチド複合体から成る造影剤。
［１３］ＭＲＩ用造影剤であり、前記金属がＧｄ又はＭｎである［１２］に記載の造影剤。
［１４］前記［１０］に記載の集合ペプチド複合体及び薬剤から成る薬剤組成物であって、該薬剤が該集合ペプチド複合体中の多座配位子に結合している薬剤組成物。
［１５］前記［１０］に記載の集合ペプチド複合体から成る薬剤組成物であって、該集合ペプチド複合体が前記（ｃ）を含み、前記蛍光色素として蛍光性の薬剤を用いた薬剤組成物。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、能力の高い造影剤（イメージング・プローブ）を提供できる。更に、本発明によれば、能力の高いドラッグデリバリーシステムを提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明のペプチドが形成するβシート構造の一例を示す図である。ペプチドとして、ＰＩＫＦＫＩＩＥＦＥＩＰ（配列番号１）を用いた例を示す。矢印の向きはペプチドの方向を示す。（ａ）はペプチドの親水性側鎖と疎水性側鎖が交互に現れている様子を示す。（ｂ）はβシート構造の概略図を示す。
【図２】ペプチドの円二色性（ＣＤ)スペクトルを示す図である。（１)はＭｎ−ＤＯＴＡ−ペプチド(β)の構造を示し、（２)と（３)は円二色性（ＣＤ)スペクトルを示す。（ａ）はＭｎ−ＤＯＴＡ−ペプチド(β)、（ｂ)はＧｄ−ＤＯＴＡ−ペプチド(β)、（ｃ）はＭｎ−ＤＯＴＡ−ペプチド(ｒｃ)のスペクトルを示す。（ａ）と（ｂ）は、いずれも２２０ｎｍ付近に負の極大、２００ｎｍ付近に正の極大を持ち、βシート構造に特徴的なスペクトルを示す。
【図３】大気中で観察した集合ペプチド複合体の原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）像を示す図である。（ａ）はＭｎ−ＤＯＴＡ−ペプチド(β)、（ｂ)はＧｄ−ＤＯＴＡ−ペプチド(β)のＡＦＭ像を示す。高さ４ｎｍ程度、幅１００ｎｍ程度、長さ数百ｎｍ程度のテープ状構造を基本単位とした集合体を形成していることがわかる。
【図４】ペプチド溶液投与前後のマウスの核磁気共鳴画像(ＭＲＩ)を示す。投与前と比較し、投与３０分後に肝臓、腎臓、脾臓が白く造影されている。
【図５】ＦＡＭ−ペプチド(β)、ＮＧＲ−ペプチド(β)及びＧｄ−ＤＯＴＡ−ペプチド(β)から成る集合ペプチド複合体Ａの円二色性（ＣＤ)スペクトルを示す図である。βシート構造に特徴的なスペクトルを示す。
【図６】集合ペプチド複合体ＡのＡＦＭ像を示す図である。
【図７】集合ペプチド複合体Ａを含む培地で培養した細胞の蛍光顕微鏡像を示す。青色（輝度が低いもの）は核を示し、細胞があることを示している。緑色（輝度が高いもの）は集合ペプチド複合体を示す。青と緑が隣り合っており、細胞に集合ペプチド複合体が結合していることを示している。
【図８】ＦＡＭ−ペプチド(β)、Ａｃ−ペプチド(β)及びＧｄ−ＤＯＴＡ−ペプチド(β) から成る集合ペプチド複合体Ｂを含む培地で培養した細胞の蛍光顕微鏡像を示す。
【図９】集合ペプチド複合体Ａを含む培地で培養した細胞の共焦点蛍光顕微鏡像を示す。共焦点蛍光顕微鏡像は細胞の断面像に相当する。青色（輝度が低いもの）は核を示し、緑色（輝度がやや高いもの）は集合ペプチド複合体を示し、赤色（輝度が最も高いもの）は細胞質に存在するライソソームを示す。赤色と緑色が重なって黄色（輝度がやや高く、赤色と緑色の中間の輝度を示す。）になっており、ペプチド複合体が細胞内に取り込まれ、ライソソームに存在していることを示している。
【図１０】抗がん剤ドキソルビシンが結合した集合ペプチド複合体の蛍光顕微鏡像を示す。（ａ）はＤＯＴＡ−ペプチド（β）と配列番号１のペプチドからなる集合体、(b)は配列番号１のペプチドとＦＡＭ−ペプチド(β)からなる集合体のものを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明で用いるペプチド複合体（略して「ペプチド」ともいう。）は、下記一般式（１）〜（４）のいずれかで表される。
【００１４】
【化３】
2014201566.tif 000004
【００１５】
（式中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、任意のアミノ酸残基又は２〜１３個のアミノ酸残基から成るペプチド鎖を表し、Ｘ１及びＸ２はそれぞれ親水性アミノ酸残基を表し、Ｙ１及びＹ２はそれぞれ疎水性アミノ酸残基を表し、Ｒ３は炭素数が３〜６０のエーテル結合を含んでもよい２価の直鎖状炭化水素鎖又は側鎖が小さいアミノ酸から成るペプチド鎖を表し、Ｚは（ｉ）金属イオンと錯体を形成可能な多座配位子を含む基、（ｉｉ）標的指向性基、又は（ｉｉｉ）蛍光色素を表し、ａ及びｂは、それぞれ独立して、１以上の整数を表し、ｃ〜ｅは、それぞれ独立して、０又は１を表す。）
【００１６】
このペプチド複合体は、親水性アミノ酸残基と疎水性アミノ酸残基とが交互に結合した２つのペプチド鎖−（Ｘ１Ｙ１）ａ−及び−（Ｙ２Ｘ２）ｂ−（又は−（Ｙ１Ｘ１）ａ−及び−（Ｘ２Ｙ２）ｂ−）を含んで構成されており、図１に示すように、親水性アミノ酸残基Ｘ１、Ｘ２が配置された側の面が親水面、疎水性アミノ酸残基Ｙ１、Ｙ２が配置された側の面が疎水面となる。また、親水面と疎水面とは−（Ｘ１Ｙ１）ａ−と−（Ｙ２Ｘ２）ｂ−との間（又は−（Ｙ１Ｘ１）ａ−と−（Ｘ２Ｙ２）ｂ−との間）で反転している。このようなペプチド鎖を有することで、βストランド間の静電的結合、疎水的結合、水素結合等の相互作用力は若干弱くなるが、その一方で自己修復力が大きくなり、全体としてはβストランド間の相互作用の制御が容易となる。
【００１７】
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、アミノ酸残基又は２〜１３個、好ましくは２〜６個のアミノ酸残基から成るペプチド鎖、好ましくはアミノ酸残基を表す。
Ｒ１及びＲ２のうち少なくとも一方、好ましくは両方は、プロリン残基、ピペコリン酸残基及び下記一般式（５）：
【００１８】
【化４】
2014201566.tif 000005
【００１９】
（式中、Ｒ４はアルキル基を表し、Ｒ５は水素原子又はアルキル基を表し、ｍは１以上の整数を表す。）で表されるアミノ酸残基から選ばれる１種であることが好ましい。Ｒ１及び／又はＲ２として、上記特定残基を配することで、βストランド端部における水素結合が十分に抑制されるため、βストランド間の端部が不揃いとなる現象をより確実に抑制することができる。
Ｒ４及びＲ５のアルキル基は、それぞれ独立して、好ましくは炭素数が１〜３のアルキル基、例えば、メチル基、エチル基、イソプロピル基である。
一般式（５）で表されるアミノ酸としては、例えば、サルコシン（Ｎ−メチルグリシン、一般式（５）中、Ｒ４がメチル基、Ｒ５が水素原子、ｍが１であるアミノ酸）が挙げられる。
【００２０】
Ｘ１及びＸ２は、それぞれ独立して、親水性アミノ酸残基を表し、好ましくは、グルタミン酸残基（Ｅ）若しくはアスパラギン酸残基（Ｄ）である陰性アミノ酸残基、又はリシン残基（Ｋ）、アルギニン残基（Ｒ）、オルニチン残基（Ｏｒｎ）若しくはヒスチジン残基（Ｈｉｓ）である陽性アミノ酸残基である。同一ペプチド内に親水性アミノ酸残基（即ち、Ｘ１及びＸ２）が複数存在するとき、それらのアミノ酸残基は同じであっても異なってもよいが（例えば、各Ｘ１は同じであっても異なってもよく、各Ｘ２は同じであっても異なってもよい。）、Ｘ１及びＸ２のうち少なくとも一つが陰性アミノ酸残基であり、かつＸ１及びＸ２のうち少なくとも一つが陽性アミノ酸残基であることが好ましい。Ｘ１及びＸ２が、全て陰性アミノ酸残基又は陽性アミノ酸残基であると、そのペプチドはβシートを形成しにくい。
Ｙ１及びＹ２は、それぞれ独立して、疎水性アミノ酸残基を表し、好ましくは、イソロイシン残基（Ｉ）、フェニルアラニン残基（Ｆ）、チロシン残基（Ｙ）又はバリン残基（Ｖ）である。同一ペプチド内に疎水性アミノ酸残基（即ち、Ｙ１及びＹ２）が複数存在するとき、それらのアミノ酸残基は同じであっても異なってもよい（例えば、各Ｙ１は同じであっても異なってもよく、各Ｙ２は同じであっても異なってもよい。）。
【００２１】
Ｒ３は炭素数が３〜６０、好ましくは６〜３０のエーテル結合を含んでもよい２価の直鎖状炭化水素鎖又は１個以上、好ましくは３個以上の側鎖が小さいアミノ酸から成るペプチド鎖を表す（「リンカー」ともいう。）。
エーテル結合を含んでもよい２価の直鎖状炭化水素鎖としては、ポリアルキレンオキシド鎖又はアルキレン基が挙げられる。ポリアルキレンオキシド鎖としては、ポリエチレンオキシド鎖（ＰＥＧ）が好ましい。
側鎖が小さいアミノ酸としては、グリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）、アスパラギン（Ｎ）、プロリン（Ｐ）等が挙げられ、これらは１又は複数種を組み合わせて使用してもよく、そのアミノ酸数は好ましくは１０個程以下である。
また、Ｒ３として、上記エーテル結合を含んでもよい２価の直鎖状炭化水素鎖と側鎖が小さいアミノ酸から成るペプチド鎖とを組み合わせて用いてもよい。
【００２２】
Ｚは金属イオンと錯体を形成可能な多座配位子を含む基を表す。
この金属としては、特に限定はなく、金属イオン、例えば、１〜４価の金属イオンになりうる金属であれば使用することができ、例えば、Ｆｅ、Ｃｕ、Ｃｒ、Ｅｕ、Ｄｙ、Ｌａ、Ｙｂ、Ｍｎ、Ｇｄ、Ｔｌ、Ｔｃ、Ｓｒ、Ｇａ、Ｔｂ、Ｌａ、Ｃｅ、Ｔｍ、Ｌｕ、Ｈｏ、Ｙ等が挙げられる。Ｍｎ及びＧｄなどの常磁性金属はＭＲＩ（核磁気共鳴画像法）用検出、６８Ｇａ、１７７Ｌｕ、６４Ｃｕ、８９ＺｒなどはＰＥＴ（陽電子放射断層撮影法）用検出、１１１Ｉｎ、２０１Ｔｌ、９９ｍＴｃなどはＳＰＥＣＴ（単光子放射線コンピュータ断層撮影法）用検出、８５Ｓｒ、８７ｍＳｒなどは放射線検出に使用できる。常磁性金属イオンとしては、Ｆｅ２＋、Ｆｅ３＋、Ｃｕ２＋、Ｃｒ３＋、Ｅｕ３＋、Ｄｙ３＋、Ｌａ３＋、Ｙｂ３＋、Ｍｎ２＋、Ｍｎ３＋及びＧｄ３＋などが好ましい。
【００２３】
この多座配位子を含む基に使用できる化合物としては、大環状化合物で、環の構成原子として窒素を３〜５個含み、窒素原子上の水素のうち、少なくとも２つがカルボキシル基あるいはカルボン酸アミド基を含む置換基で置換され、さらにリンカー分子との結合に寄与できる官能基を少なくとも一つ持つ誘導体が挙げられる。例えば、シクロサイクレン（１，４，７，１０−ｔｅｔｒａａｚａｃｙｃｌｏｄｏｄｅｃａｎｅ）誘導体で、４つの窒素原子上の水素のうち、少なくとも２つがカルボキシル基あるいはカルボン酸アミド基を含む置換基で置換され、さらにリンカー分子との結合に寄与できる官能基を少なくとも一つ持つ誘導体が挙げられる。例えば、シクロサイクレン誘導体のＤＯＴＡ （１，４，７，１０−ｔｅｔｒａａｚａｃｙｃｌｏｄｏｄｅｃａｎｅ−１，４，７，１０−ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）を使用する場合は、４つの窒素原子上の水素のうちの３つが酢酸に置換され、１つがアセチルアミドを介してリンカー分子と結合する形になっている。シクロサイクレン誘導体としては、ＤＯＴＡ，ＤＯ３Ａ（１，４，７，１０−ｔｅｔｒａａｚａｃｙｃｌｏｄｏｄｅｃａｎｅ−１，４，７−ｔｒｉａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）,１，７−ＤＯ２Ａ （１，４，７，１０−ｔｅｔｒａａｚａｃｙｃｌｏｄｏｄｅｃａｎｅ−１，７−ｄｉａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ），  １，４−ＤＯ２Ａ  （１，４，７，１０−ｔｅｔｒａａｚａｃｙｃｌｏｄｏｄｅｃａｎｅ−１，４−ｄｉａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ), ＤＯＴＡＭ （１，４，７，１０−ｔｅｔｒａａｚａｃｙｃｌｏｄｏｄｅｃａｎｅ−１，４，７，１０−ｔｅｔｒａａｃｅｔａｍｉｄｅ), ＤＯ３ＡＭ （１，４，７，１０−ｔｅｔｒａａｚａｃｙｃｌｏｄｏｄｅｃａｎｅ−１，４，７−ｔｒｉａｃｅｔａｍｉｄｅ), ＤＯ３ＡＭ−ＣｙＯＨ （１，４，７，１０−ｔｅｔｒａａｚａｃｙｃｌｏｄｏｄｅｃａｎｅ−１−（２−ｈｙｄｒｏｘｙｌｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ）−４，７，１０−ｔｒｉａｃｅｔａｍｉｄｅ)などが挙げられる。他の環状化合物の誘導体としては、ＮＯＴＡ （１，４，７−ｔｒｉａｚａｃｙｃｌｏｎｏｎａｎ−１，４，７−ｔｒｉａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ)、ＥＮＯＴＡ （２つのＮＯＴＡがエチレンを介して結合したもの)などが挙げられる。キレート錯体を形成する化合物は、環状でない化合物でもよく、例えば、ＥＤＴＡ  （ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ)、ＤＴＰＡ （Ｄｉｅｔｈｙｌｅｎｅｔｒｉａｍｉｎｅ−Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ”，Ｎ”−ｐｅｎｔａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）などの、２個以上のカルボキシル基と２個以上のＮ原子をもつアミノポリカルボン酸類の化合物またこれらの誘導体が挙げられる。これら化合物は、リンカー分子との結合に寄与できる官能基を少なくとも１つ持つため、この官能基を介してこの多座配位子を含む基とリンカー分子とを結合できる。
【００２４】
この多座配位子を利用して、ペプチド複合体に薬剤を結合させることができる。この薬剤としては、静電的相互作用で結合させる場合にはプラス電荷を持つ化合物、例えば、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ピラルビシン等が好ましい。又は配位結合を利用する場合にはシスプラチン、オキサリプラチン、カルボプラチン、ネダプラチンなどのプラチナ製剤が挙げられる。
このような薬剤は多座配位子と結合し、結果として、ペプチド複合体又は集合ペプチド複合体に薬剤を結合させることが可能になる。標的指向性基と薬剤を結合させた多座配位子を含む基を有する集合ペプチド複合体は、標的まで薬剤を運ぶことが可能になる。
【００２５】
標的指向性基としては、ＮＧＲペプチド（ＮＧＲ)、ＲＧＤペプチド（ＲＧＤ)、ＬｙＰ−１ペプチド（ＣＧＮＫＲＴＲＧＣ（配列番号２））、ＣＬＴ−１ペプチド（ＣＧＬＩＩＱＫＮＥＣ（配列番号３））、ＣＲＥＫＡペプチド（ＣＲＥＫＡ（配列番号４））、Ｐｌｅｃｔｉｎ−１結合ペプチド（ＫＴＬＬＰＴＰ（配列番号５））、ＧＥ１１ペプチド（ＹＨＷＹＧＹＴＰＱＮＶＩ（配列番号６））葉酸、マンノースなどが挙げられる。
【００２６】
蛍光色素としては、可視又は近赤外領域に蛍光を発する色素が好ましく、例えばアジン系色素、アクリシン系色素、トリフェニルメタン系色素、キサンテン系色素、ポルフィリン系色素、シアニン系色素、スチリル系色素、ピリリウム系色素、アゾ色素、キノン系色素、テトラサイクリン系色素、フラボン系色素、ポリエン系色素等が挙げられる。
また、この蛍光色素として、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ピラルビシン等の蛍光性の薬剤を用いてもよい。
【００２７】
ａ及びｂはそれぞれＸ１Ｙ１若しくはＸ２Ｙ２又はＹ１Ｘ１若しくはＹ２Ｘ２の繰り返し数を表し、それぞれ独立して、１以上の整数である。ここで、ａとｂとは同一でも異なっていてもよく、また、ａとｂが異なる場合にはａ、ｂの大小関係は特に制限されない。しかし形状制御の点からは、ａとｂとの差は２以下であることが好ましく、ａとｂとが同数であることが特に好ましい。ａとｂは５以下であることが好ましい。
ｃ〜ｅは、それぞれ独立して、０又は１を表す。
【００２８】
リンカーとペプチド鎖、多座配位子部分、標的指向性基又は蛍光色素との連結は、カルボキシル基とアミノ基によるアミド形成反応、チオール基とチオール基によるジスルフィド結合、チオール基とマレイミド基によるチオエーテル形成反応、チオール基とハロゲン化アルキル基によるチオエーテル形成反応、アルキン基とアジド基によるクリック反応などの公知の反応を利用して行うことができる。
【００２９】
標的指向性基や蛍光色素を使用したペプチド複合体としては、下記（ａ）〜（ｃ）から成る群から選択される少なくとも２種から成るペプチド複合体組成物が挙げられる。
（ａ）前記Ｚが、金属イオンと錯体を形成可能な多座配位子を含む基である、上記一般式（１）〜（４）のいずれかで表されるペプチド複合体
（ｂ）前記Ｚが、標的指向性基である、上記一般式（１）〜（４）のいずれかで表されるペプチド複合体
（ｃ）前記Ｚが、蛍光色素である、上記一般式（１）〜（４）のいずれかで表されるペプチド複合体
【００３０】
このペプチド複合体組成物の多座配位子に、上記と同様にして、金属イオンと錯体を形成させたり、薬剤を結合させたり、蛍光色素として蛍光性の薬剤を用いてもよい。
このような組み合わせとして、（ａ）と（ｂ）と（ｃ）、（ａ）と（ｂ）、（ｂ）と（ｃ）等が有用である。
【００３１】
このペプチド複合体又は組成物には、更に下記一般式（ｄ）〜（ｉ）のペプチドを加えてもよい。
【００３２】
【化５】
2014201566.tif 000006
【００３３】
（式中、Ｒ１〜Ｒ３、Ｘ１、Ｘ２、Ｙ１、Ｙ２、ａ〜eは上記と同様に定義される。リンカー（Ｒ３）の末端に、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、エステル基、アルコキシ基、アミノ基、アミド基、カルボキシル基、アシル基、チオール基、チオエステル基、チオアルコキシ基等を付してもよい。）
これらペプチド複合体組成物に含まれる複数のペプチド複合体及びペプチドの、ａ及びｂはそれぞれ同一であっても異なってもよいが、各ペプチド複合体のａの差及びｂの差は３以下であることが好ましい。
【００３４】
上記ペプチド複合体及び上記ペプチド複合体組成物は、集積してβシート構造を取ることができる。
このペプチドを水溶液中に溶解することにより、このペプチドは自発的に集合化しβシート構造を形成し、集合体を形成する。水溶液としては、例えば、ｐＨ７．４のＨＥＰＥＳ緩衝液で、少量の有機溶媒を含んでもよいし含まなくてもよい。ｐＨは４〜９で中性付近が望ましい。形成されたペプチド複合体及び集合ペプチド複合体は、細胞培養用の培地中、例えば、ＲＰＭＩ１６４０＋１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ社製）でも集合体構造を維持することができる。
【実施例】
【００３５】
以下、実施例にて本発明を例証するが本発明を限定することを意図するものではない。
[実施例１]
本実施例では、βシートを形成するペプチド（Ｇｄ−ＤＯＴＡ−ペプチド(β)）を調製した。
まず、ＤＯＴＡ−ペプチド(β)（ＤＯＴＡ−ｄＰＥＧ４−ＭｅＧ−Ｉ−Ｋ−Ｆ−Ｋ−Ｉ−Ｉ−Ｅ−Ｆ−Ｅ−Ｉ−Ｐ）（配列番号７）（ＭｅＧは、Ｎ−メチルグリシン（又はサルコシン）を表し、ｄＰＥＧ４は−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）４−ＣＨ２ＣＨ２−を表す。）を、Ｈ−Ｐｒｏ−２−ＣｌＴｒｔ樹脂（メルク社製）を用いて９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ)固相合成法で合成した（Ｆｍｏｃ  Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ,Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ., Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ,  ２０００を参照)。
アミノ酸の縮合では、Ｆｍｏｃ−アミノ酸誘導体３当量、（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル)−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロフフォスフェート  （ＨＡＴＵ)３当量及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン(ＤＩＰＥＡ)  ６当量を用いて、Ｎ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）中で６０分間反応させた。Ｆｍｏｃ基の除去では、ピペリジン（ＰＰＤ、ＮＭＰ中２５容量％)で５分間の反応を２回行った。アミノ酸の縮合とＦｍｏｃ基の除去を、目的のアミノ酸配列に従って繰り返し、側鎖保護基を有する配列番号１に示すペプチド鎖を上記樹脂上に延長した。リンカー分子としてＦｍｏｃ−Ｎ−ａｍｉｄｏ−ｄＰＥＧ４−ａｃｉｄ（Ｑｕａｎｔａ  Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ社製）を導入後、ＮＭＰに溶解したトリ−ｔｅｒｔ−ブチル１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−テトラアセタート（ＤＯＴＡ−ｔｒｉｓ  （ｔｅｒｔ−Ｂｕ) ｅｓｔｅｒ)（ＣｈｅＭａｔｅｃｈ社製）２当量、ＨＡＴＵ ２当量、ＤＩＰＥＡ ４当量を添加し、マイクロウェーブ合成装置（バイオタージ社製、Ｉｎｉｔｉａｔｏｒ＋）を用いて５０℃で４０分間反応させた。樹脂を９５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ)／２．５％テトライソプロピルシラン／２．５％水溶液で処理し樹脂からの切り出しと保護基の除去を行った。逆相ＨＰＬＣ（島津社製、ＬＣ−２０１０）により分取精製し、凍結乾燥した。
得られたペプチドについて、液体クロマトグラフ質量分析（ＬＣ−ＭＳ、島津社製、ＬＣＭＳ−２０２０）で分子量を測定した。ＤＯＴＡ−ペプチドの［Ｍ＋２Ｈ]２＋／２の計算値１０４１．７に対して実測値１０４１．６、［Ｍ＋３Ｈ］３＋／３の計算値６９４．８に対して実測値６９５．０であった。
【００３６】
得られたＤＯＴＡ−ペプチドを１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノール（ＨＦＩＰ）に１〜２ｍＭの濃度で溶解し、１〜２ｍＭの塩化ガドリニウム（ＧｄＣｌ３）水溶液を１．１当量添加した。１時間後、透析チューブ（スペクトラム社製、Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ ７, ＭＷＣＯ: １０００）に入れ、３〜４日間、水で透析し、結合していない金属イオンを除去し、凍結乾燥した。得られたペプチドのＬＣ−ＭＳを行った。Ｇｄ−ＤＯＴＡ−ペプチドの［Ｍ＋３Ｈ]３＋／３の計算値７４６．２に対して実測値７４６．２であったことから、ＤＯＴＡ−ペプチドにガドリニウムが結合したことが確認された（Ｇｄ−ＤＯＴＡ−ペプチド(β)）。
ペプチド溶液中のＧｄイオンの定量を、誘導結合プラズマ質量分析（ＩＣＰ−ＭＳ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  ＳＣＩＥＸ社製、ＥＬＡＮ  ＤＲＣ  ＩＩ）により行い、この濃度をもとに緩和能ｒ１を算出した。
ペプチドをＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）に加え、１０〜２００μＭの濃度に調製し、ペプチドの自発的な集合により集合体を形成させた。その二次構造を円二色性（ＣＤ)スペクトル（日本分光社製、Ｊ−８２０）により調べたところ、βシート構造を形成していることが確認された（図２（ｂ））。
ペプチド溶液をマイカ基板に滴下し、水洗、乾燥後、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ、アサイラムテクノロジー社製、ＭＦＰ−３Ｄ）で観察した。高さ約４ｎｍのテープ状集合体が観察された（図３）。
【００３７】
[実施例２]
本実施例では、塩化ガドリニウム（ＧｄＣｌ３）水溶液に代えて塩化マンガン（ＭｎＣｌ２）水溶液を用いて、実施例１と同様にして、βシートを形成するペプチド（Ｍｎ−ＤＯＴＡ−ペプチド(β)）を調製した。
得られたペプチドのＬＣ−ＭＳを測定した結果、Ｍｎ−ＤＯＴＡ−ペプチドの［Ｍ＋３Ｈ］３＋／３の計算値７１２．５に対して実測値７１２．６であった。
得られたペプチドは、実施例１のペプチドと同様にβシート構造を形成していることが確認された（図２（ａ））。
【００３８】
[比較例１，２]
実施例１、２のＤＯＴＡ−ペプチド(β)と同様に、ＤＯＴＡ−ペプチド（ｒｃ）（ＤＯＴＡ−ｄＰＥＧ４−ＭｅＧ−Ｉ−Ｒ−Ｆ−Ｒ−Ｉ−Ｉ−Ｒ−Ｆ−Ｒ−Ｉ−Ｐ）（配列番号８）を合成し、実施例１、２と同様に、Ｇｄ又はＭｎを結合させた。ＬＣ−ＭＳを行ったところ、Ｍｎ−ＤＯＴＡ−ペプチド（ｒｃ)の［Ｍ＋３Ｈ］３＋／３の計算値７４９．２に対して実測値７４９．２、Ｇｄ−ＤＯＴＡ−ペプチド（ｒｃ)の［Ｍ＋３Ｈ］３＋／３の計算値７８３．０に対して実測値７８３．０であった。ＣＤスペクトルを測定すると、βシート構造を形成せずにランダムコイル（ｒｃ)であることが確認された（図２（ｃ））。
【００３９】
[比較例３，４]
１０ ｍＭの塩化ガドリニウム（ＧｄＣｌ３）又は塩化マンガン（ＭｎＣｌ２）と、過剰量のＤＯＴＡ（約１．１当量）を水溶液中で混合し、９０℃で１時間反応させて錯体を形成させた（Ｇｄ−ＤＯＴＡ及びＭｎ−ＤＯＴＡ）。
【００４０】
（測定例１）
実施例１，２及び比較例１〜４で作製したＭｎ−ＤＯＴＡ−ペプチド(β)、Ｇｄ−ＤＯＴＡ−ペプチド(β)、Ｍｎ−ＤＯＴＡ−ペプチド（ｒｃ)、Ｇｄ−ＤＯＴＡ−ペプチド（ｒｃ)、Ｇｄ−ＤＯＴＡ及びＭｎ−ＤＯＴＡの緩和能を評価するために、ＭＲＩ実験を行った。
ＭＲＩ装置（１Ｔ又は７Ｔ）を用いてペプチド溶液の縦緩和時間（Ｔ１）を測定した。７テスラ（Ｔ）のＭＲＩ装置として、７テスラ水平型高磁場MRI装置（磁石：４０ｃｍ口径超電導磁石、コベルコ及びＪＡＳＴＥＣ社製、コンソール：ブルカーバイオスピン社製、ＡＶＡＮＣＥ−Ｉシステム）に内径３８ｍｍのバードケージ送受信コイルを使用した。１テスラ（Ｔ）のＭＲＩ装置として、１テスラ水平型永久磁石ＭＲＩ装置（アスペクトイメージング社製、Ｍ２システム）に内径３５ｍｍの送受信ソレノイドコイルを使用した。
縦緩和時間（Ｔ１）の逆数（１／Ｔ１）を縦軸に、金属イオン濃度を横軸にしてプロットして得られた回帰直線の傾きから縦緩和能（ｒ１）を求めた。結果を表１に示す。縦緩和能（ｒ１）が高いことは、金属キレート化合物を含むペプチドの集積度が高く、ＭＲＩにおける陽性造影能力が高いことを示す。
【００４１】
【表１】
2014201566.tif 000007
【００４２】
ペプチド部分を持たない小分子キレート化合物、Ｇｄ−ＤＯＴＡやＭｎ−ＤＯＴＡの縦緩和能（ｒ１）と比べて、Ｇｄ−ＤＯＴＡ−ペプチド及びＭｎ−ＤＯＴＡ−ペプチドの縦緩和能（ｒ１）は大きく、ＭＲＩにおける陽性造影能力は高い。
一方、βシート構造を形成するＧｄ−ＤＯＴＡ−ペプチド(β)及びＭｎ−ＤＯＴＡ−ペプチド(β)と比べて、βシート構造を形成しないＧｄ−ＤＯＴＡ−ペプチド（ｒｃ)及びＭｎ−ＤＯＴＡ−ペプチド（ｒｃ)の縦緩和能（ｒ１）は小さい。
また、本願のリンカーを持たない造影剤（非特許文献２、Ｇｄイオン使用、緩和能（ｒ１）は１．５Ｔで６．６〜８．３ｍＭ−１）に比べて、Ｇｄ−ＤＯＴＡ−ペプチドの縦緩和能（ｒ１）は大きく、より集積していると考えられる。
【００４３】
（測定例２）
また、１Ｔ  ＭＲＩ装置にマウスを麻酔下で固定し、試料の投与前と投与後に繰り返し撮像した。Ｍｎ−ＤＯＴＡ−ペプチド水溶液（２ｍＭ,ｐＨ７．４,０．５ ｍＬ)をマウスの尾静脈に投与し、核磁気共鳴画像法（ＭＲＩ)により、７分ごとに１８０分まで撮影した（図４）。ペプチド投与後、肝臓、脾臓、腎臓が、造影剤の効果により、投与前と比べて白く造影される。また膀胱も徐々に白く造影させるようになったことから、造影剤が尿として排出され膀胱に溜まったと考えられる。
【００４４】
[実施例３]
ＤＯＴＡ−ｔｒｉｓ（ｔｅｒｔ−Ｂｕ) ｅｓｔｅｒに代わりに、５(６)−カルボキシフルオレセインＮ−ヒドロキシスクシミドエステル（シグマ社製）を用いて、実施例１と同様にして、蛍光色素カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）を導入したペプチド（ＦＡＭ−ペプチド(β)：ＦＡＭ−ｄＰＥＧ４−ＭｅＧ−Ｉ−Ｋ−Ｆ−Ｋ−Ｉ−Ｉ−Ｅ−Ｆ−Ｅ−Ｉ−Ｐ）を合成した。
ＬＣ−ＭＳの結果、［Ｍ＋２Ｈ］２＋／２の計算値１０２７．７に対して実測値１０２７．９、［Ｍ＋３Ｈ］３＋／３の計算値６８５．５に対して実測値６８５．８であった。
また、ＮＧＲ配列を導入したペプチドＮＧＲ−ペプチド(β)（Ｐ−Ｉ−Ｋ−Ｆ−Ｋ−Ｉ−Ｉ−Ｅ−Ｆ−Ｅ−Ｉ−ＭｅＧ−ｄＰＥＧ８−ＮＧＲＧ）（配列番号９）を合成した。ＮＧＲ配列はがん細胞や腫瘍血管内皮細胞に発現するＣＤ１３に結合能力を持つ。ＮＧＲ配列の次には、リンカー分子としてＦｍｏｃ−Ｎ−ａｍｉｄｏ−ｄＰＥＧ８−ａｃｉｄ（Ｑｕａｎｔａ Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ社、ｄＰＥＧ８は−(ＣＨ２ＣＨ２Ｏ)８-ＣＨ２ＣＨ２−を表す。）を導入した。このＮＧＲ導入ペプチドは、樹脂としてＮｏｖａＳｙｎ  ＴＧＲ樹脂（メルク社製）を使用した以外は実施例１と同様の方法で、アミノ酸配列に従ってＦｍｏｃ固相合成法で合成した。
ＬＣ−ＭＳの結果、［Ｍ＋３Ｈ]３＋／３の計算値７５２．６に対して実測値７５２．８、［Ｍ＋３Ｈ］４＋／４の計算値５６４．７に対して実測値５６４．８であった。
ＦＡＭ、ＮＧＲ、ＤＯＴＡを持たないペプチドＡｃ−ペプチド(β)（ａｃｅｔｙｌ−ｄＰＥＧ４−ＭｅＧ−Ｉ−Ｋ−Ｆ−Ｋ−Ｉ−Ｉ−Ｅ−Ｆ−Ｅ−Ｉ−Ｐ）を同様に合成した。ＬＣ−ＭＳの結果、［Ｍ＋２Ｈ］２＋／２の計算値８６９．６に対して実測値８６９．９であった。
ＦＡＭ−ペプチド(β)、ＮＧＲ−ペプチド(β)、及び実施例１で得たＧｄ−ＤＯＴＡ−ペプチド(β)を１／４０／７のモル比で混合し、ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）に加えて集合体（以下「集合ペプチド複合体Ａ」という。）を形成させた。この集合ペプチド複合体Ａは、実施例１のペプチドと同様に、βシート構造を形成していることが確認され（図５）、高さが４ｎｍ程度、幅、長さが数百ｎｍ程度のテープ状集合体が形成していることが観察された（図６）。
【００４５】
（測定例３）
ＣＤ１３を発現しているがん細胞株としてＨＴ１０８０を、発現していないがん細胞株としてＨＴ２９を用いた。細胞株をＮｕｎｃ ラブテックＩＩカバーグラスチェンバー（サーモサイエンティフィック社製）中で、細胞培養用の培地（ＲＰＭＩ１６４０＋１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、Ｇｉｂｃｏ社製）を用いてインキュベータ内（３７℃、５％  ＣＯ２）であらかじめ培養し、観察に十分な数の細胞をカバーグラスに接着させた。
別途、上記ペプチド複合体を、終濃度が２４μＭ又は１２μＭになるように、この細胞培養用の培地に添加した培地を用意した。
次に培地を取り除き、集合ペプチド複合体Ａを含む培地を用いて、インキュベータ内で培養した。３時間後、この集合ペプチド複合体Ａを含む培地を取り除き、新たな培地（ＲＰＭＩ１６４０＋１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、Ｇｉｂｃｏ社製）を細胞に添加して洗浄した。これを５回繰り返した。
これらの細胞について、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２（インビトロジェン社製）を用いて、プロトコールに記載の方法で細胞核を蛍光染色し、蛍光顕微鏡（ＤＭ ＩＲＥ２、ライカ社製）を用いて観察した（図７）。集合ペプチド複合体Ａに由来するＦＡＭの蛍光を観察すると、ＣＤ１３を発現しているＨＴ１０８０細胞株に集合ペプチド複合体Ａが結合しており、ＣＤ１３を発現していないＨＴ２９細胞株にはほとんど結合していないことが確認された。
【００４６】
一方、ＦＡＭ−ペプチド(β)、Ａｃ−ペプチド(β)、Ｇｄ−ＤＯＴＡ−ペプチド(β)を用いて、同様にして、ＮＧＲ配列を持たない集合体（以下「集合ペプチド複合体Ｂ」という。）を作製し、細胞に添加して蛍光顕微鏡観察を行った（図８）。ＮＧＲ配列を持たない集合ペプチド複合体Ｂは、ＨＴ１０８０細胞株、ＨＴ２９細胞株ともに、ほとんど結合しないことが確認された。
【００４７】
（測定例４）
集合ペプチド複合体Ａを細胞に添加して１時間後に同様の操作で細胞を培地で洗浄した。その後、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２による核染色と、Ｌｙｓｏ Ｔｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄ （インビトロジェン社製）によるライソソームの染色を、プロトコールに従って行い、共焦点蛍光顕微鏡（ＦＶ１０００、オリンパス社製）で観察した（図９）。その結果、ＨＴ１０８０細胞株では、集合ペプチド複合体Ａとライソソームの共局在が確認されたが、ＨＴ２９では確認できなかった。集合ペプチド複合体ＡがＣＤ１３に依存して細胞内に取り込まれたことが確認された。
【００４８】
［実施例４］
実施例１で合成したＤＯＴＡ−ペプチド（β）と別途合成したペプチド（ＰＩＫＦＫＩＩＥＦＥＩＰ（配列番号１））を１／１のモル比で混合し、水溶液（濃度１００μＭ）中で集合体を作製した。比較として、配列番号１のペプチド １００μＭとＦＡＭ−ペプチド(β) ２．５μＭを混合して同様に集合体を作製した。これらの集合ペプチド複合体（２０又は５０μＭ）と抗がん剤のドキソルビシン（和光純薬社製）（２０μＭ）を混合して蛍光顕微鏡（ＤＭＬ、ライカ社製）で観察した。蛍光顕微鏡像を図１０に示す。ドキソルビシンは蛍光を発するため、（ａ）では、ペプチド集合体に結合し集積したものが背景よりも明るくイメージされており、ドキソルビシンが集合ペプチド複合体に結合していることを示している。（ｂ)では、ドキソルビシンがペプチド集合体に結合しないため、溶液中のドキソルビシンが発光し全体が均一になっている。
【図１】
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【図２】
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【図５】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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