(57)【要約】      （修正有）【課題】皮膚刺激性が低い表皮角化細胞増殖促進剤、及び該表皮角化細胞増殖促進剤を含有する化粧品の提供。【解決手段】式（１）または式（２）で表されるサリチル酸誘導体：2014181210.tif 000012〔式中のＲはグルコースまたはソルビトールいずれかの糖残基である〕またはその塩を含有する表皮角化細胞増殖促進剤、及び該表皮角化細胞増殖促進剤を含有する化粧品。該表皮角化細胞増殖促進剤は、サリチル酸メチルとグルコースまたはソルビトールとのエステル交換反応、サリチロイルクロリドによるグルコピラノシルアミンのアミド化反応、Ｄ−グルカミンとサリチルアミドとのアミド交換反応によって製造することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（１）または式（２）で表されるサリチル酸誘導体：
【化１】
2014181210.tif 000010
【化２】
2014181210.tif 000011
〔式中のＲはグルコースまたはソルビトールいずれかの糖残基である〕またはその塩を含有する表皮角化細胞増殖促進剤。
【請求項２】
サリチル酸メチルとグルコースまたはソルビトールを、水および／または有機溶媒中において、触媒存在下で減圧しながらエステル交換させる工程を含む、請求項１記載の式（１）で表される表皮角化細胞増殖促進剤の製造方法。
【請求項３】
グルコピラノシルアミンとサリチロイルクロリドを、有機溶媒中において、塩基の存在下、窒素雰囲気下でアミド化させる工程を含む、請求項１記載の式（２）で表される、Ｒがグルコースである表皮角化細胞増殖促進剤の製造方法。
【請求項４】
Ｄ−グルカミンとサリチルアミドを、水および／または有機溶媒中または無溶媒において、アミド交換させる工程を含む、請求項１記載の式（２）で表される、Ｒがソルビトールである表皮角化細胞増殖促進剤の製造方法。
【請求項５】
請求項１記載の表皮角化細胞増殖促進剤を含有する化粧品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サリチル酸誘導体を含む表皮角化細胞増殖促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
表皮は、深部から表面に向け、基底層、有棘層、顆粒層、角質層の４層構造から成っている。基底層で生まれた表皮角化細胞は、徐々に分化して上層に移動し、ケラチン繊維で満たされた角質細胞となり角質層を形成し、最終的に、いわゆる垢として剥がれ落ちる。
【０００３】
角質層は皮膚の最外殻であり、表皮角化細胞が基底層で生まれ垢となって剥がれ落ちるサイクル（ターンオーバー）を絶えず繰り返すことで、一定の水分量を保持し、保湿機能とともに外界からの刺激に対する保護バリア機能を有している。
【０００４】
しかしながら、加齢や紫外線による影響を受け、表皮角化細胞の新陳代謝機能が衰えると、ターンオーバーが乱れ、色素沈着、肌荒れ、ニキビ等の肌トラブルが生じる。表皮角化細胞の増殖を促進し、乱れたターンオーバーを回復させることで、色素沈着、肌荒れ、ニキビ等の肌トラブルの予防・改善に繋がると考えられている。
【０００５】
サリチル酸は従来より角質化した表皮を軟化、剥離し、皮膚のターンオーバーを正常にし、皮膚の再生を促すケミカルピーリングに用いられている。
一方で、サリチル酸は表皮角化細胞増殖促進に効果を有する物質としても知られている（非特許文献１）。しかしながらサリチル酸は皮膚刺激性が強いことから、表皮角化細胞増殖促進剤として用いる場合、サリチル酸の配合量によって炎症や刺痛感等の問題を引き起こす可能性があった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Toxicol Appl Pharmacol. 2001 Aug 15;175(1):76-82
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、皮膚刺激性が低い表皮角化細胞増殖促進剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記事情を鑑み、表皮角化細胞増殖促進効果を有する化合物について鋭意検討し、サリチル酸に特定の糖類を結合させることよって、表皮角化細胞増殖促進効果を有し、かつ皮膚刺激性が低い物質が得られることを見出して本発明を完成した。
【０００９】
すなわち、本発明は、式（１）または式（２）で表されるサリチル酸誘導体：
【化１】
2014181210.tif 000002
【化２】
2014181210.tif 000003
〔式中のＲはグルコースまたはソルビトールのいずれかの糖残基である〕またはその塩を含有する表皮角化細胞増殖促進剤を提供する。
【００１０】
本発明はまた、かかる表皮角化細胞増殖促進剤として用いられるサリチル酸誘導体の製造方法を提供する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の表皮角化細胞増殖促進剤は、皮膚刺激性が低いため、化粧品等に添加して幅広く利用することが可能である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の表皮角化細胞増殖促進剤である式（１）または式（２）で表されるサリチル酸誘導体は、グルコースまたはソルビトールのいずれかの糖残基を有する、サリチル酸のエステル体またはアミド体である。
【００１３】
本願明細書並びに特許請求の範囲において、エステルまたはアミドを形成するグルコース並びにソルビトールの部位は特に限定されない。式（１）または（２）の化合物としてはそれぞれ単一の化合物である場合、２またはそれ以上の構造異性体の混合物である場合のいずれも包含する。
【００１４】
本発明は、上記の式（１）または式（２）で表されるサリチル酸誘導体に加え、式（１）または式（２）で表されるサリチル酸誘導体の塩を含む表皮角化細胞増殖促進剤を提供する。塩の種類は特に限定されないが、一般的には、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、カルシウム塩、ストロンチウム塩等のアルカリ土類金属塩、ベリリウム塩、マグネシウム塩等の金属塩等が挙げられる。
【００１５】
本発明の表皮角化細胞増殖促進剤に含まれる式（１）で表されるサリチル酸誘導体の製造方法としては、特に限定されず、従来知られているいかなる方法にて製造してもよい。
例えば、サリチル酸メチルと糖を、水および／または有機溶媒中において、触媒存在下で減圧しながらエステル交換させる工程、を含む製造方法が挙げられる。
【００１６】
以下、本発明の表皮角化細胞増殖促進剤に含まれる式（１）で表されるサリチル酸誘導体の例示的な製造方法を説明するが、本発明の表皮角化細胞増殖促進剤に含まれる式（１）で表されるサリチル酸誘導体の製造方法は以下の記載に限定されるものではない。
【００１７】
サリチル酸メチルと糖をエステル交換させる方法としては、サリチル酸メチルと糖を有機溶媒中、触媒の存在下で、１２５〜１５５ｍｍＨｇに減圧し、反応途中に生成するメタノールを除去しながら、９３〜１１０℃で４〜１６時間反応させる方法が挙げられる。
【００１８】
上記反応における有機溶媒としては、サリチル酸メチルと糖が溶解し、沸点１００〜２５０℃程度である脱水溶媒を用いるのが好ましく、例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、Ｎ−メチル−２−ピロリドン等を用いることができる。
溶媒の使用量はサリチル酸メチル１重量部に対して、５〜１００重量部が好ましく、７〜７５重量部がより好ましく、９〜５０重量部がさらに好ましい。
【００１９】
上記反応における触媒としては、アルカリ金属炭酸塩、アルカリ金属水酸化物、アルカリ金属アルコキシド等のアルカリ触媒、塩酸、硫酸、硫酸水素ナトリウム、パラトルエンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、メタンスルホン酸等の酸触媒、ジルコニウム化合物、鉛化合物、鉄化合物、亜鉛化合物、有機スズ化合物、アルミニウム化合物、チタン化合物、バナジウム化合物等を用いることができる。
【００２０】
触媒の使用量はサリチル酸メチル１重量部に対して、０．０５〜４重量部が好ましく、０．０６〜３重量部がより好ましく、０．０７〜２重量部がさらに好ましい。
【００２１】
エステル交換反応後、反応液を、ろ過、シリカゲルカラムクロマトグラフィー、分取操作等の公知の方法によって処理して生成物である式（１）で示されるサリチル酸誘導体を分離し、回収することができる。
【００２２】
本発明の表皮角化細胞増殖促進剤に含まれる、式（２）で表され、Ｒがグルコース残基であるサリチル酸誘導体の製造方法としては、特に限定されないが例えば、グルコピラノシルアミンとサリチロイルクロリドを有機溶媒中において、塩基の存在下、窒素雰囲気下でアミド化させる工程を含む製造方法が挙げられる。
【００２３】
以下、本発明の表皮角化細胞増殖促進剤に含まれる、式（２）で表され、Ｒがグルコース残基であるサリチル酸誘導体の例示的な製造方法を説明するが、本発明の表皮角化細胞増殖促進剤に含まれる、式（２）で表され、Ｒがグルコース残基であるサリチル酸誘導体の製造方法は以下の記載に限定されるものではない。
【００２４】
グルコピラノシルアミンとサリチロイルクロリドのアミド化は、グルコピラノシルアミンを有機溶媒に溶解させ、塩基の存在下、０〜５０℃で、１〜２０時間サリチロイルクロリドと反応させる方法が挙げられる。グルコピラノシルアミンとサリチロイルクロリドはフェノール性水酸基が保護基によって保護されたものを用いても良い。グルコピラノシルアミンとサリチロイルクロリドとのアミド化反応を行った後、この保護基を当事者に周知の方法によって脱保護することによって、本発明の表皮角化細胞増殖促進剤に含まれる、式（２）で表され、Ｒがグルコース残基であるサリチル酸誘導体が得られる。
【００２５】
上記反応における溶媒としては、脱水溶媒を用いるのが好ましい。脱水溶媒としては、サリチロイルクロリドが反応する溶媒を除けば特に限定されないが、ピリジン、ジメチルスルホキシド、Ｎ−メチル−２−ピロリドン、ジメチルケトン等が使用できる。溶媒の使用量は、グルコピラノシルアミン１重量部に対し、１〜１０重量部が好ましく、２〜８重量部がより好ましく、３〜６重量部がさらに好ましい。
【００２６】
上記反応における塩基としては、炭酸ナトリウム等の無機塩基、ピリジン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−４−アミノピリジン、トリエチルアミン等の有機塩基を用いることができる。塩基の使用量は、グルコピラノシルアミン１重量部に対し、０．３〜１．６重量部が好ましく、０．４〜１．４重量部がより好ましく、０．６〜１．２重量部がさらに好ましい。
【００２７】
かかるアミド化反応により得られた反応液を、分液、シリカゲルカラムクロマトグラフィー、再結晶等の公知の方法によって分離し、回収することにより、本発明の表皮角化細胞増殖促進剤に含まれる、式（２）で表され、Ｒがグルコース残基であるサリチル酸誘導体が得られる。
【００２８】
上記反応に用いるグルコピラノシルアミンは、市販のものを用いてもよく、公知の方法により製造しても良い。製造方法としては、例えば、ＷＯ９５／１８９７１に記載の方法を用いることができる。具体的には、グルコースのアミノ化反応であり、グルコースと炭酸アンモニウムを水および／または有機溶媒に溶解させ、室温で４〜１２０時間反応させる方法が挙げられる。
【００２９】
上記アミノ化反応における溶媒としては、水、有機溶媒およびそれらの混合溶媒のいずれでもよいが、グルコースが溶解し易いものが好ましい。溶媒の例としては、メタノール、エタノール等のアルコール類、ジメチルスルホキシド等の有機溶媒、および水とそれら有機溶媒の混合溶媒が挙げられる。溶媒の使用量はグルコース１重量部に対して、１０〜１６０重量部が好ましく、１４〜１４０重量部がより好ましく、１８〜１２０重量部がさらに好ましい。
【００３０】
上記アミノ化反応において、炭酸アンモニウムは、使用する溶媒が飽和状態になるように随時追加すればよい。
【００３１】
かかるアミノ化反応により得られた反応液から、ろ過等により不純物を取り除き、回収することによりグルコピラノシルアミンが得られる。
【００３２】
上記反応に用いるサリチロイルクロリドは市販のものを用いてもよく、公知の方法により製造しても良い。製造方法としては、サリチル酸の酸塩化物合成反応であり、サリチル酸を有機溶媒中または無溶媒において、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドを触媒として用い、窒素雰囲気下、５０℃で、１５分〜１時間、塩素化剤と反応させる方法が挙げられる。
【００３３】
上記酸塩化物合成反応における溶媒としては、塩素化剤やサリチロイルクロリドが反応する溶媒を除けば特に限定されないが、テトラヒドロフラン、クロロホルム、トルエン、キシレン、ベンゼン等を用いることができ、無溶媒でも反応は進行する。
【００３４】
上記酸塩化物合成反応における塩素化剤としては、塩化チオニル、塩化オキサリル、塩化ホスホリル、塩化スルフリル、三塩化リン、五塩化リン等を用いることができる。
塩素化剤の使用量は、サリチル酸１重量部に対して、１〜４重量部が好ましく、１．５〜３．５重量部がより好ましく、２〜３重量部がさらに好ましい。
【００３５】
かかる酸塩化物合成反応により得られた反応液を濃縮することにより、サリチロイルクロリドが得られる。
【００３６】
尚、このサリチロイルクロリドを得るための酸塩化物合成反応は、目的物の収率を上げるためにサリチル酸のフェノール性水酸基を、アセチル基、メチル基、エチル基、ピバロイル基、ベンゾイル基等の保護基によって保護して行っても良い。
【００３７】
保護基を用いる場合は、まず、当事者に周知の方法によって、サリチル酸のフェノール性水酸基を所望の保護基により保護した後、上記と同様にサリチル酸を有機溶媒中または無溶媒において、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドを触媒として用い、窒素雰囲気下で５０℃で１５分〜１時間、塩素化剤と反応させる方法を行うと良い。その結果、フェノール性水酸基が保護されたサリチロイルクロリドが得られる。
【００３８】
本発明の表皮角化細胞増殖促進剤に含まれる、式（２）で表され、Ｒがソルビトール残基であるサリチル酸誘導体の製造方法としては、特に限定されないが、例えば、Ｄ−グルカミンとサリチルアミドを、水および／または有機溶媒中または無溶媒においてアミド交換させる工程、を含む製造方法が挙げられる。
【００３９】
以下、本発明の表皮角化細胞増殖促進剤に含まれる、式（２）で表され、Ｒがソルビトール残基であるサリチル酸誘導体の、上記の例示的な製造方法を説明するが、本発明の表皮角化細胞増殖促進剤に含まれる、式（２）で表され、Ｒがソルビトール残基であるサリチル酸誘導体の製造方法は以下の記載に限定されるものではない。
【００４０】
Ｄ−グルカミンとサリチルアミドをアミド交換させる方法としては、Ｄ−グルカミンとサリチルアミドを、水および／または有機溶媒に溶解させ、９０〜１５０℃で８〜２０時間反応させる方法が挙げられる。
【００４１】
上記反応における溶媒としては、Ｄ−グルカミンとサリチルアミドが溶解すれば特に限定されないが、例えば、Ｎ−Ｎジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、Ｎ−メチル−２−ピロリドン等の有機溶媒、水溶媒等を用いることができ、Ｄ−グルカミンとサリチルアミドを融解させると無溶媒でも反応は進行する。
【００４２】
かかるアミド交換反応により得られた反応液を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー、再結晶等の公知の方法によって分離し、回収することにより、本発明の表皮角化細胞増殖促進剤に含まれる、式（２）で表され、Ｒがソルビトール残基であるサリチル酸誘導体が得られる。
【００４３】
上記反応で用いるＤ−グルカミンは、市販のものを用いてもよく、公知の方法により製造しても良い。製造方法としては、例えば、米国特許２８３０９８３に記載の方法を用いることができる。具体的には、グルコースの還元的アミノ化反応であり、グルコースを水に溶解させ、ニッケル触媒を用い、水素雰囲気下、１０００〜２０００ｐ．ｓ．ｉ．の圧力で、９０〜１２０℃で２〜６時間ヒドラジンと反応させる方法である。かかる還元的アミノ化反応により得られた反応液から、ろ過等により不純物を取り除き、回収することによりＤ−グルカミンが得られる。
また、上記反応で用いるサリチルアミドは、市販のものを用いてもよく、公知の方法で製造しても良い。
【００４４】
本発明の表皮角化細胞増殖促進剤に含まれる、式（１）または式（２）で表されるサリチル酸誘導体は、製造の容易さから、式（１）または式（２）中のＲがソルビトール残基であることが好ましい。本発明の表皮角化細胞増殖促進剤は、これらのサリチル酸誘導体を単独で含むものでもよく、２種以上を混合して含むものでもよい。
【００４５】
本発明の表皮角化細胞増殖促進剤は、式（１）または式（２）で表されるサリチル酸誘導体またはその塩のみからなるもの、あるいは式（１）または式（２）で表されるサリチル酸誘導体またはその塩を含むものであればよく、表皮角化細胞増殖促進効果を妨げない限り、化粧品、医薬品、医薬部外品等に一般に用いられる賦型剤等を適宜用いて顆粒状、粉末状とする他、適当な溶剤等を用いて液状、エマルション、クリーム、ペースト等としてもよい。これらの賦型剤の種類や配合量は、当業者に周知のものから適宜選択することができる。
【００４６】
本発明の表皮角化細胞増殖促進剤は、例えば、化粧品、医薬品、医薬部外品等に配合することができる。本発明の表皮角化細胞増殖促進剤の、化粧品、医薬品、医薬部外品等への配合量は使用する系により異なり、配合する対象全重量に対して、式（１）または式（２）で表されるサリチル酸誘導体が０．０１〜２０重量％であることが好ましく、０．０５〜５重量％であることがより好ましく、０．１〜１重量％であることがさらに好ましい。配合量が０．０１重量％未満の場合、十分な表皮角化細胞の増殖効果が発揮されない傾向があり、配合量が２０重量％を超えると表皮角化細胞増殖の効果が低下する傾向がある。
【００４７】
以下、実施例により本発明をさらに説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例】
【００４８】
合成例１
加熱乾燥した２００ｍｌ４つ口フラスコにグルコース１０．７ｇを入れ窒素置換し、脱水ＤＭＦ（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド）６０ｍｌを加え９０℃に昇温した。この溶液に、サリチル酸メチル３．０ｇ、炭酸カリウム（減圧中ヒートガンであぶって乾燥させたもの）０．３ｇを加えて９５℃で減圧下（１５０ｍｍＨｇ）、１１．５時間反応させた。反応終了後、反応液を減圧濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム／メタノール／水＝６／１／０．１）とクロマト分取装置（装置：Ｋｐｒｅｐ（ＹＭＣ社製）、展開溶媒：メタノール／超純水＝５０／５０、流速：１０ｍｌ/ｍｉｎ）にて未反応の原料を除去した。構造異性体をまとめて回収し、淡桃色固体を０．６ｇ得た。
【００４９】
得られた生成物のＬＣ／ＭＳ分析によりｍ/ｚ２９９（Ｍ−１）のピークを確認し、得られた生成物が以下の式および／またはその構造異性体の混合物であるサリチル酸グルコースエステルであることを確認した。
【００５０】
【化３】
2014181210.tif 000004
【００５１】
合成例２
加熱乾燥した２００ｍｌ４つ口フラスコにソルビトール２７．３ｇを入れ窒素置換し、脱水ＤＭＦ１００ｍｌを加え９０℃に昇温した。この溶液に、サリチル酸メチル６．７ｇ、炭酸カリウム（減圧中ヒートガンであぶって乾燥させたもの）０．７ｇを加えて９０〜９６℃で減圧下（１４６〜１５２ｍｍＨｇ）、１２時間反応させた。反応終了後、反応液を減圧濃縮し、残渣にメタノール１００ｍｌを加えて１．５時間還流させた。室温まで冷却した後、ろ過で析出物を取り除き、減圧濃縮することで薄茶色の粘稠なオイルを３０．４ｇ得た。得られた生成物をクロマト分取装置（装置：Ｋｐｒｅｐ（ＹＭＣ社製）、展開溶媒：メタノール／超純水＝５０／５０、流速：１０ｍｌ/ｍｉｎ）を用いて単離し、薄黄色固体を７．３ｇ得た。この生成物をさらにメタノールで再結晶し、綿状白色固体を１．３ｇ得た。
【００５２】
得られた生成物の１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ‐ｄ６）分析により、３．３９−３．６３（ｍ，４Ｈ），３．７８−３．８１（ｍ，１Ｈ），３．９６（ｓ，１Ｈ），４．３０−４．５５（ｍ，６Ｈ），５．１３（ｓ，１Ｈ），６．９８（ｍ，２Ｈ），７．５４（ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ），７．８７（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，１Ｈ），１０．５７（ｓ，１Ｈ）のシグナルを確認し、以下の式のサリチル酸ソルビトールエステルであることを確認した。 
【００５３】
【化４】
2014181210.tif 000005
【００５４】
合成例３
５０ｍｌ２つ口フラスコに、Ｄ−グルカミン４．８ｇ、２−ヒドロキシベンズアミド３．５ｇ、水１５ｍｌを加え、窒素気流下２０時間還流させた。反応終了後、反応液を酢酸エチル約８０ｍＬで３回抽出し、水層を減圧濃縮し、オレンジ色の粘稠なオイルを６．７ｇ得た。得られた生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム／メタノール／水＝４／１／０．１→２／１／０．１）にて単離し、白色固体を１．５ｇ得た。この生成物をさらに再結晶（メタノール／水＝２／１）にて精製し、白色固体を１．０ｇ得た。
【００５５】
得られた生成物の１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ‐ｄ６）分析により、３．３６（ｑ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，１Ｈ），３．５２−３．６１（ｍ，２Ｈ），３．５９−３．６３（ｍ，１Ｈ），３．６５−３．７３（ｍ，３Ｈ），３．８８−３．９２（ｍ，１Ｈ）６．８８（ｍ，２Ｈ），７．３４（ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ），７．６１（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ）のシグナルを確認し、以下の式のサリチル酸ソルビトールアミドであることを確認した。
【００５６】
【化５】
2014181210.tif 000006
【００５７】
実施例１（表皮角化細胞増殖促進効果試験）
ヒト表皮角化細胞（ＨａＣａＴ細胞）を８０ｃｍ２のフラスコで１０％のＦＢＳ（ウシ胎児血清）（バイオウエスト社製）を含むＤＭＥＭ培地（ダルベッコ・フォークト変法イーグル最小必須培地）（ライフテクノロジーズ社製）を用いて３７℃、５％炭酸ガス濃度のインキュベーター内で培養し、常法に従いヒト表皮角化細胞を回収した。得られたヒト表皮角化細胞を２％のＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地にて３×１０４個／ｍｌとなるように調整した。１００μｌずつ９６ウエルプレートに播種し、３７℃、５％炭酸ガス濃度のインキュベーター内で１日培養した。培養後、ＤＭＳＯに合成例１〜３のサリチル酸誘導体を含む表皮角化細胞増殖促進剤を溶解させたサンプル液を１μｌずつ添加し、３７℃、５％炭酸ガス濃度のインキュベーター内で３日培養した。培養後、Ｃｅｌｌ−Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８（同仁化学社製）を用い細胞数を測定することで、促進作用を評価した。細胞数は各濃度において４回ずつ測定し、その平均値±SDを結果として示した。ｔ−検定により有意差検定（対０ppm）を行い、有意水準０．０５未満の場合に有意差ありと評価した。結果を表１に示す。
【００５８】
【表１】
2014181210.tif 000007
＊：ｐ＜０．０５
【００５９】
本発明の表皮角化細胞増殖促進剤は、ヒト表皮角化細胞数を有意に増加させることが分かった。
【００６０】
実施例２（刺激性確認試験）
トランスウエル内で培養された培養皮膚であるヒト三次元培養皮膚モデル（Ｌａｂｃｙｔｅ ＥＰＩ−ＭＯＤＥＬ ジャパン・ティッシュ・エンジニアリング社製）を用いて実施した。まず、Ｌａｂｃｙｔｅを２４ウエルアッセイプレートに入れた。続いて、この２４ウエルアッセイプレートの各ウエルにアッセイ培地（ジャパン・ティッシュ・エンジニアリング社製）を１ｍｌ加え、３７℃、５％炭酸ガス濃度のインキュベーター内で２０時間前培養を行った。
次に、Ｌａｂｃｙｔｅの表面に５％に調製した滅菌した合成例１〜３のサリチル酸誘導体を含む表皮角化細胞増殖促進剤を５０μｌ添加した。比較例として、滅菌した超純水５０μｌを添加し、その上からサリチル酸を５０ｍｇ添加した。陰性対照として、滅菌した超純水５０μｌのみを添加した。１５分間放置後、滅菌したＰＢＳ水溶液（タカラバイオ社製）で、Ｌａｂｃｙｔｅを十分に洗浄した。Ｌａｂｃｙｔｅを３７℃、５％炭酸ガス濃度のインキュベーター内で４２時間培養を行った後、０．５ｍｇ／ｍｌのＭＴＴ（３−（４,５−ジメチル−２−チアゾリル）−２,５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）試薬を含むアッセイ培地に交換し、更に３７℃、５％炭酸ガス濃度のインキュベーター内で３時間培養を行った。
その後、Ｌａｂｃｙｔｅを０．３ｍｌのイソプロパノール液に浸し、生成した青紫色のホルマザンの抽出を２日間行った。抽出終了後、９６ウエルマイクロプレートリーダーを用いて抽出液の５７０ｎｍと６５０ｎｍの吸光度を測定した。細胞生存率は下記計算式により算出した。結果を表２に示す。
【００６１】
測定値  ＝［サンプルの吸光度（５７０ｎｍ）−ブランクの吸光度（５７０ｎｍ）］−［サンプルの吸光度（６５０ｎｍ）−ブランクの吸光度（６５０ｎｍ）］
細胞生存率（％）＝サンプルの測定値／陰性対照の測定値×１００
【００６２】
【表２】
2014181210.tif 000008
【００６３】
本発明の表皮角化細胞増殖促進剤は、サリチル酸と比較して、細胞生存率が高く刺激性が低いことが分かった。
【００６４】
実施例３
本発明の化粧品用途として表３に化粧水の処方例を示す。
【００６５】
【表３】
2014181210.tif 000009