(57)【要約】【課題】非特異吸着が生じている状態においても、特異吸着による信号を分離し、Ｓ／Ｎ比を向上させることが可能な表面プラズモン増強蛍光測定装置の測定方法を提供する。【解決手段】アナライトが特異的に反応する１次抗体が固定化された反応場に捕捉された抗体に、振動付与手段により振動を与える。金属薄膜の一方の面に励起光を照射し、他方の面側の電場を増強させることにより前記抗体に付された蛍光物質を励起させる。前記蛍光物質からの蛍光を測定し、出力信号を周波数解析することにより検体の分析を行う。振動付与手段により振動を与えるステップでは、金属薄膜とＩＴＯ基板との間に電圧を印加することにより、前記反応場に捕捉された抗体に振動を与える。【選択図】図３
2014025951.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
金属薄膜が設けられた反応場に所定の周波数で振動を与える振動付与手段を有する表面プラズモン増強蛍光測定装置を用いた測定方法であって、
アナライトが特異的に反応する１次抗体が固定化された前記反応場に捕捉された抗体に、前記振動付与手段により振動を与えるステップと、
前記金属薄膜の一方の面に励起光を照射し、他方の面側の電場を増強させることにより前記抗体に付された蛍光物質を励起させるステップと、
前記蛍光物質からの蛍光を測定し、出力信号を周波数解析することにより検体の分析を行うステップと、を有し、
前記振動付与手段は、前記反応場に対向する位置に配置されたＩＴＯ基板を含み、
前記振動付与手段により振動を与えるステップでは、前記金属薄膜と前記ＩＴＯ基板との間に電圧を印加することにより、前記反応場に捕捉された抗体に振動を与えることを特徴とする測定方法。
【請求項２】
前記振動付与手段により与える振動の周波数は前記反応場に捕捉されている前記抗体が共振する周波数よりも低く、振動により前記抗体を強制振動させることを特徴とする請求項１に記載の測定方法。
【請求項３】
前記振動付与手段により与える振動の周波数は、前記反応場に捕捉されている前記抗体が共振する周波数であることを特徴とする請求項１に記載の測定方法。
【請求項４】
前記増強された電場は、前記金属薄膜からの距離により異なっており、
前記振動付与手段により与える振動により、前記蛍光物質の前記金属薄膜からの距離を周期的に変化させ、前記蛍光物質の前記金属薄膜からの距離の変化により蛍光の強度を変化させることを特徴とする請求項１から３の何れか一項に記載の測定方法。
【請求項５】
金属薄膜が設けられ、アナライトが特異的に反応する１次抗体が固定化された反応場と、
前記反応場に対向する位置に配置されたＩＴＯ基板を含み、前記反応場に所定の周波数で振動を与える振動付与手段と、
前記金属薄膜の一方の面に励起光を照射し、他方の面側の電場を増強させ前記反応場に捕捉された抗体に付与された蛍光物質を励起させる発光部と、
前記蛍光物質からの励起光を検出する光検出部と、
前記反応場に捕捉された抗体に前記振動付与手段により振動を与えた状態で、抗体に付された蛍光物質からの蛍光を前記光検出部で測定し、出力信号を周波数解析し、得られた信号強度から検体の分析を行う解析手段と、を有し、
前記振動付与手段は、前記金属薄膜と前記ＩＴＯ基板との間に電圧を印加することにより、前記反応場に捕捉された抗体に振動を与えることを特徴とする表面プラズモン増強蛍光測定装置。
【請求項６】
前記振動付与手段により与える振動の周波数は前記反応場に捕捉されている前記抗体が共振する周波数よりも低く、振動により前記抗体を強制振動させることを特徴とする請求項５に記載の表面プラズモン増強蛍光測定装置。
【請求項７】
前記振動付与手段により与える振動の周波数は、前記反応場に捕捉されている前記抗体が共振する周波数であることを特徴とする請求項５に記載の表面プラズモン増強蛍光測定装置。
【請求項８】
前記振動付与手段は、前記金属薄膜と前記ＩＴＯ基板との間に交番電界を印加することを特徴とする請求項５から７の何れか一項に記載の表面プラズモン増強蛍光測定装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、表面プラズモン励起増強蛍光分光法（ＳＰＦＳ；Surface Plasmon-field enhanced Fluorescence Spectroscopy）の原理に基づいた表面プラズモン増強蛍光測定装置を用いた測定方法、及び表面プラズモン増強蛍光測定装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来より、表面プラズモン励起増強蛍光分光法（ＳＰＦＳ）の原理に基づき、例えば生体内の極微少なアナライトの検出が行われている。表面プラズモン励起増強蛍光分光法（ＳＰＦＳ）は、光源より照射したレーザ光（励起光）が金属薄膜表面で全反射減衰（ＡＴＲ；attenuated total reflectance）する条件において、金属薄膜表面に粗密波（表面プラズモン）を発生させることによって、光源より照射したレーザ光（励起光）が有するフォトン量を数十倍〜数百倍に増やし（表面プラズモンの電場増強効果）、これにより金属薄膜近傍の蛍光物質を効率良く励起させることによって、極微量および／または極低濃度のアナライトを検出する方法である。
【０００３】
近年、このような表面プラズモン励起増強蛍光分光法（ＳＰＦＳ）の原理に基づいた表面プラズモン増強蛍光測定装置の開発が進められており、例えば特許文献１や特許文献２などにその技術開示がなされている。
【０００４】
このような表面プラズモン増強蛍光測定装置１０は、図９に示したように基本的な構造において、誘電体部材１０６の表面に金属薄膜１０２、更にその表面に反応場１０４が設けられたチップ構造体１０８を備えている。
【０００５】
そして、チップ構造体１０８の誘電体部材１０６側には、誘電体部材１０６内に入射され、金属薄膜１０２に向かって励起光ｂ１を照射する光源１１２を備え、さらに光源１１２から照射され金属薄膜１０２で反射した金属薄膜反射光ｂ２を受光する受光手段１１６が備えられている。
【０００６】
一方、チップ構造体１０８の反応場１０４側には、反応場１０４で捕捉されたアナライトを標識した蛍光物質が発する蛍光ｂ３を受光する光検出部１２０が設けられている。
【０００７】
なお、反応場１０４と光検出部１２０との間には、蛍光ｂ３を効率よく集光するための集光部材１２２と、蛍光ｂ３以外に含まれる光を除去し、必要な蛍光のみを選択するフィルタ１２４が設けられている。
【０００８】
そして、表面プラズモン増強蛍光測定装置１０の使用においては、あらかじめ金属薄膜１０２の表面上には検出対象のＤＮＡ等のアナライトに含まれる抗原に特異的に結合する１次抗体があらかじめ固定されている。金属薄膜１０２に接する反応場１０４に、アナライト及び当該アナライトに特異的に結合する２次抗体を順に送液して、２次抗体を反応場１０４で捕捉させる。アナライトとともに捕捉される２次抗体は蛍光物質で標識されている。
【０００９】
捕捉された反応場１０４に光源１１２より誘電体部材１０６内に励起光ｂ１を照射し、この励起光ｂ１が特定の角度（共鳴角）θ１で金属薄膜１０２に入射することで、金属薄膜１０２上に粗密波（表面プラズモン）を生ずるようになっている。なお、金属薄膜１０２上に粗密波（表面プラズモン）が生ずる際には、励起光ｂ１と金属薄膜１０２中の電子振動とがカップリングし、金属薄膜反射光ｂ２の光量減少という現象が生ずる。
【００１０】
受光手段１１６及び光源１１２とは対となって金属薄膜１０２の照射領域を中心として回動し、金属薄膜１０２への入射角度を変更することができる。入射角度を変化させ、その際の受光手段１１６で受光される金属薄膜反射光ｂ２のシグナルが変化（光量が減少）する地点を見つければ、粗密波（表面プラズモン）が生ずる共鳴角θ１を得ることができる。
【００１１】
そして、この粗密波（表面プラズモン）を生ずる現象により、金属薄膜１０２上の反応場１０４の蛍光物質が効率良く励起され、これにより蛍光物質が発する蛍光ｂ３の光量が増大することとなる。
【００１２】
この増大した蛍光ｂ３を、集光部材１２２およびフィルタ１２４を介して光検出部１２０で受光することで、極微量および／または極低濃度のアナライトを検出することができるようになっている。
【００１３】
このように、表面プラズモン増強蛍光測定装置１０は、特に生体分子間などの微細な分子活動を観察可能とする高感度計測センサである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】特許第３２９４６０５号公報
【特許文献２】特開２００８−１０２１１７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
アナライトは必ずしも均一な成分ではなく不均一の場合が多い。このような場合には反応場での吸着は特異吸着だけではなく、これ以外の非特異吸着も少なからず発生する。微量の検体で分析するために分析感度を上げるが、その場合に特異吸着による信号のみならず非特異吸着による信号も増加してしまうためにＳ／Ｎ比の向上には結びつかない。
【００１６】
本願発明はこのような問題に鑑み非特異吸着が生じている状態においても、特異吸着による信号を分離し、Ｓ／Ｎ比を向上させることが可能な表面プラズモン増強蛍光測定装置を用いた測定方法、及び表面プラズモン増強蛍光測定装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
上記の目的は、下記に記載する発明により達成される。
【００１８】
１．金属薄膜が設けられた反応場に所定の周波数で振動を与える振動付与手段を有する表面プラズモン増強蛍光測定装置を用いた測定方法であって、
アナライトが特異的に反応する１次抗体が固定化された前記反応場に捕捉された抗体に、前記振動付与手段により振動を与えるステップと、
前記金属薄膜の一方の面に励起光を照射し、他方の面側の電場を増強させることにより前記抗体に付された蛍光物質を励起させるステップと、
前記蛍光物質からの蛍光を測定し、出力信号を周波数解析することにより検体の分析を行うステップと、を有し、
前記振動付与手段は、前記反応場に対向する位置に配置されたＩＴＯ基板を含み、
前記振動付与手段により振動を与えるステップでは、前記金属薄膜と前記ＩＴＯ基板との間に電圧を印加することにより、前記反応場に捕捉された抗体に振動を与えることを特徴とする測定方法。
【００１９】
２．前記振動付与手段により与える振動の周波数は前記反応場に捕捉されている前記抗体が共振する周波数よりも低く、振動により前記抗体を強制振動させることを特徴とする前記１に記載の測定方法。
【００２０】
３．前記振動付与手段により与える振動の周波数は、前記反応場に捕捉されている前記抗体が共振する周波数であることを特徴とする前記１に記載の測定方法。
【００２１】
４．前記増強された電場は、前記金属薄膜からの距離により異なっており、
前記振動付与手段により与える振動により、前記蛍光物質の前記金属薄膜からの距離を周期的に変化させ、前記蛍光物質の前記金属薄膜からの距離の変化により蛍光の強度を変化させることを特徴とする前記１から３の何れか一項に記載の測定方法。
【００２２】
５．金属薄膜が設けられ、アナライトが特異的に反応する１次抗体が固定化された反応場と、
前記反応場に対向する位置に配置されたＩＴＯ基板を含み、前記反応場に所定の周波数で振動を与える振動付与手段と、
前記金属薄膜の一方の面に励起光を照射し、他方の面側の電場を増強させ前記反応場に捕捉された抗体に付与された蛍光物質を励起させる発光部と、
前記蛍光物質からの励起光を検出する光検出部と、
前記反応場に捕捉された抗体に前記振動付与手段により振動を与えた状態で、抗体に付された蛍光物質からの蛍光を前記光検出部で測定し、出力信号を周波数解析し、得られた信号強度から検体の分析を行う解析手段と、を有し、
前記振動付与手段は、前記金属薄膜と前記ＩＴＯ基板との間に電圧を印加することにより、前記反応場に捕捉された抗体に振動を与えることを特徴とする表面プラズモン増強蛍光測定装置。
【００２３】
６．前記振動付与手段により与える振動の周波数は前記反応場に捕捉されている前記抗体が共振する周波数よりも低く、振動により前記抗体を強制振動させることを特徴とする前記５に記載の表面プラズモン増強蛍光測定装置。
【００２４】
７．前記振動付与手段により与える振動の周波数は、該反応場に捕捉されている前記抗体が共振する周波数であることを特徴とする前記５に記載の表面プラズモン増強蛍光測定装置。
【００２５】
８．前記振動付与手段は、前記金属薄膜と前記ＩＴＯ基板との間に交番電界を印加することを特徴とする前記５から７の何れか一項に記載の表面プラズモン増強蛍光測定装置。
【発明の効果】
【００２６】
本願発明によれば、反応場の特異吸着ｓｐを所定の周期で振動させ、特異吸着ｓｐの蛍光物質からの蛍光からの信号を周波数解析し、得られた信号強度から検体の分析を行うことにより、特異吸着のみならず非特異吸着が生じている状態においても、特異吸着による信号を分離し、Ｓ／Ｎ比を向上させることが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】マイクロチップ送液システムを用いた表面プラズモン増強蛍光測定装置の概略図である。
【図２】図２（ａ）は、マイクロチップ１４周辺の断面図であり、図２（ｂ）はその一部の上面図である。
【図３】反応場１０４の検体の振動状態を説明する模式図である。
【図４】金属薄膜１０２からの距離と電場強度との関係を示す図である。
【図５】倒立振り子モデルを説明する図である。
【図６】制御部１８が実行する制御フローである。
【図７】光検出部１２０の出力信号に対して周波数解析を行った例である。
【図８】振動付与手段の第１の変形例として、微細流路１４３の壁面を機械的に往復運動させて反応場に振動を与えるものである。
【図９】従来の表面プラズモン増強蛍光測定装置の概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本発明を実施の形態に基づいて説明するが、本発明は該実施の形態に限られない。
【００２９】
図１、図２は、実施形態に係るマイクロチップ送液システムを用いた表面プラズモン増強蛍光測定装置の概略図である。
【００３０】
表面プラズモン増強蛍光測定装置は、励起光を金属薄膜に照射して粗密波（表面プラズモン）を生じさせて励起された蛍光物質が生ずる蛍光を正確に検出し、検出感度を上げても超高精度に蛍光検出を行うことを可能とするものである。
【００３１】
［表面プラズモン増強蛍光測定装置１０］
本発明の表面プラズモン増強蛍光測定装置１０は、図１に示したように、まず金属薄膜１０２と、金属薄膜１０２の一方側面に形成された反応場１０４と、他方側面に形成された誘電体部材１０６と、を有するチップ構造体１０８を備えている。
【００３２】
そして、チップ構造体１０８の誘電体部材１０６側には、誘電体部材１０６内に入射され、金属薄膜１０２に向かって励起光ｂ１を照射する「発光部」として機能する光源１１２を備え、さらに光源１１２から照射され金属薄膜１０２に反射した金属薄膜反射光ｂ２を受光する受光手段１１６を備えている。
【００３３】
ここで光源１１２から照射される励起光ｂ１としてはレーザ光が好ましく、波長２００〜１０００ｎｍのガスレーザまたは固体レーザ、波長３８５〜８００ｎｍの半導体レーザが好適である。
【００３４】
一方、チップ構造体１０８の反応場１０４側には、反応場１０４で生じた蛍光ｂ３を受光する光検出部１２０が設けられている。
【００３５】
光検出部１２０としては、超高感度の光電子増倍管、または多点計測が可能なＣＣＤイメージセンサを用いることが好ましい。
【００３６】
なお、チップ構造体１０８の反応場１０４と光検出部１２０との間には、光を効率よく集光するための集光部材１２２と、光の内で蛍光ｂ３とは異なる波長の光の透過を低減して蛍光ｂ３を選択的に透過するように形成されたフィルタ１２４が設けられている。
【００３７】
集光部材１２２としては、光検出部１２０に蛍光シグナルを効率よく集光することを目的とするものであれば、任意の集光系で良い。簡易な集光系としては、顕微鏡などで使用されている市販の対物レンズを転用してもよい。対物レンズの倍率としては、１０〜１００倍が好ましい。
【００３８】
一方、フィルタ１２４としては、光学フィルタ、カットフィルタなどを用いることができる。光学フィルタとしては、減光（ＮＤ）フィルタ、ダイアフラムレンズなどが挙げられる。さらにカットフィルタとしては、外光（装置外の照明光）、励起光（励起光の透過成分）、迷光（各所での励起光の散乱成分）、プラズモンの散乱光（励起光を起源とし、プラズモン励起センサ表面上の構造体または付着物などの影響で発生する散乱光）、酵素蛍光基質の自家蛍光などの各種ノイズ光を除去するフィルタであって、例えば干渉フィルタ、色フィルタなどが挙げられる。
【００３９】
制御部１８は、ＣＰＵやメモリを備えており、メモリに記憶されているプログラムを実行することにより、光源１１２、光検出部１２０、後述のポンプ１３０等を制御する。また制御部１８の周波数解析部１８１は「解析手段」として機能し、光検出部１２０からの信号に対して、ＦＦＴや特定の周波数を除去等の周波数解析を行うことができる。
【００４０】
そして、このような表面プラズモン増強蛍光測定装置１０を用いたアナライト検出方法では、反応場１０４に接する側の金属薄膜１０２表面上には１次抗体を結合させたＳＡＭ膜（Self-Assembled Monolayer：「自己組織化単分子膜」ともいう）や高分子材料が設けられている。１次抗体はＳＡＭ膜や高分子材料の一方の端部に結合されており、ＳＡＭ膜や高分子材料の他方の端部は、直接若しくは間接に金属薄膜１０２表面に固定されている。高分子材料は複数種類が介在していてもよい。ＳＡＭ膜としては例えばＨＯＯＣ−（ＣＨ２）１１−ＳＨなどの置換脂肪族チオールで形成された膜、高分子材料としては例えばポリエチレングリコール（polyethylene glycol、以下「ＰＥＧ」と記す。）やＭＰＣポリマー等が挙げられる。これは使用時に調製しても、予めこれらを結合させた基板を用いてもよい。また、１次抗体に対する反応性基（または反応性基に変換可能な官能基）を備えたポリマーを直接金基板上に固定化し、その上に１次抗体を固定化してもよい。各種反応性基を利用して抗体やポリマーを結合させる際には、スクシンイミジル化を経たアミド化縮合反応や、マレイミド化を経た付加反応等が一般的である。
【００４１】
このようにして構成した反応場１０４に標的物質としてのアナライト（検体ともいう）の抗原を含む溶液（以下、検体液ともいう）と、２次抗体を含む試薬液の送液を行う。固定化した１次抗体によって抗原を捕捉することが可能である。これに対しさらに蛍光物質で標識した２次抗体を含む試薬液を作用させることで捕捉された抗原を標識している。なお予め抗原と２次抗体とを反応させておいてから１次抗体を作用させてもよい。
【００４２】
蛍光物質で標識されたアナライトの検出は、アナライトが捕捉された反応場１０４に光源１１２より誘電体部材１０６に励起光ｂ１を照射し、この励起光ｂ１が金属薄膜１０２に対して特定の入射角度（共鳴角θ１）で金属薄膜１０２に入射することで、金属薄膜１０２上に粗密波（表面プラズモン）を生ずるようになる。
【００４３】
なお、金属薄膜１０２上に粗密波（表面プラズモン）が生ずる際には、励起光ｂ１と金属薄膜１０２中の電子振動とがカップリングし、金属薄膜反射光ｂ２のシグナルが変化（光量が減少）することとなるため、受光手段１１６で受光される金属薄膜反射光ｂ２のシグナルが変化（光量が減少）する地点を見つければ良い。
【００４４】
そして、この粗密波（表面プラズモン）により、金属薄膜１０２上の反応場１０４で生じた蛍光物質が効率良く励起され、これにより蛍光物質が発する蛍光ｂ３の光量が増大し、この蛍光ｂ３を集光部材１２２およびフィルタ１２４を介して光検出部１２０で受光することで、極微量および／または極低濃度のアナライトを検出することができる。
【００４５】
なお、チップ構造体１０８の金属薄膜１０２の材質としては、好ましくは金、銀、アルミニウム、銅、および白金からなる群から選ばれる少なくとも１種の金属からなり、より好ましくは金からなり、さらにこれら金属の合金から成ることである。
【００４６】
このような金属は、酸化に対して安定であり、かつ粗密波（表面プラズモン）による電場増強が大きくなることから金属薄膜１０２に好適である。
【００４７】
また、金属薄膜１０２の形成方法としては、例えばスパッタリング法、蒸着法（抵抗加熱蒸着法、電子線蒸着法など）、電解メッキ、無電解メッキ法などが挙げられる。中でもスパッタリング法、蒸着法は、薄膜形成条件の調整が容易であるため好ましい。
【００４８】
さらに金属薄膜１０２の厚さとしては、金：５〜５００ｎｍ、銀：５〜５００ｎｍ、アルミニウム：５〜５００ｎｍ、銅：５〜５００ｎｍ、白金：５〜５００ｎｍ、およびそれらの合金：５〜５００ｎｍの範囲内であることが好ましい。
【００４９】
電場増強効果の観点からは、金：２０〜７０ｎｍ、銀：２０〜７０ｎｍ、アルミニウム：１０〜５０ｎｍ、銅：２０〜７０ｎｍ、白金：２０〜７０ｎｍ、およびそれらの合金：１０〜７０ｎｍの範囲内であることがより好ましい。
【００５０】
金属薄膜１０２の厚さが上記範囲内であれば、粗密波（表面プラズモン）が発生し易く好適である。また、このような厚さを有する金属薄膜１０２であれば、大きさ（縦×横）は特に限定されないものである。
【００５１】
電場強度は、金属薄膜１０２に近い程強く離れるにつれて弱くなる。但し、金属薄膜の表面近傍（表面〜数十ｎｍ）では電場増強が生じても、金属薄膜へエネルギーの移動が発生しても励起状態が消光してしまう消光現象が発生する。そのため、電場強度のピークは、消光現象が生じない範囲で最も近い距離にそのピークを持つ（後述の図４参照）。
【００５２】
また、誘電体部材１０６としては、高屈折率の６０度プリズムを用いることができる。材料としては光学的に透明な各種の無機物、天然ポリマー、合成ポリマーを用いることができ、化学的安定性、製造安定性および光学的透明性の観点から、二酸化ケイ素（ＳｉＯ２）または二酸化チタン（ＴｉＯ２）を含むことが好ましい。
【００５３】
さらに、このような表面プラズモン増強蛍光測定装置１０は、光源１１２から金属薄膜１０２に照射される励起光ｂ１による表面プラズモン共鳴の最適角（共鳴角θ１）を調整するため、角度可変部（図示せず）を有している。
【００５４】
ここで、角度可変部（図示せず）は制御部１８により制御され、「共鳴角スキャン工程」においては角度可変部のサーボモータで全反射減衰（ＡＴＲ）条件を求めるために受光手段１１６と光源１１２とを同期して、照射領域を中心として回動し、４５〜８５°の範囲で角度変更を可能としている。また分解能は０．０１°以上であることが好ましい。
【００５５】
図２（ａ）は、マイクロチップ１４周辺の断面図であり、図２（ｂ）はその一部の上面図である。図２（ａ）では図１に示した誘電体部材１０６にマイクロチップ１４を取り付けている。マイクロチップ１４は少なくとも反応場１０４の周辺は蛍光ｂ３を透過する基材を用いる必要があり、本実施形態としては基材として石英を用いている。そして石英基板１４２には微細流路１４３が設けられており、図２（ａ）に示す状態では微細流路１４３の底面はその表面に金属薄膜１０２が形成された誘電体部材１０６で構成されている。周囲を固定具１６１により支持された石英基板１４２は、誘電体部材１０６と隙間なく固定されている。
【００５６】
微細流路１４３の経路中には、前述の反応場１０４が設けられている。微細流路１４３の一方の端部には開口１４４ａが、他方の端部には開口１４４ｂがそれぞれ設けられている。また開口１４４ａ側には接続部１４５が設けられている。反応場１０４の金属薄膜１０２と相対する側には蛍光ｂ３の測定に支障がないように透明なＩＴＯ基板１４６Ａ（ＩＴＯ:Indium-Tin Oxide）が設けられている。ＩＴＯ基板１４６Ａについては図３の説明で後述する。
【００５７】
接続部１４５は、ピペット１５０が接続可能である。接続部１４５は弾性体材料で構成されており、ピペット１５０を装填する際にはシール部材として機能する。他方の開口１４４ｂの先には不要な液体を廃棄する貯留部１４８が設けられている。なお貯留部１４８の上部には不図示の微細な空気孔が設けられている。
【００５８】
微細流路１４３の幅（Ｙ方向長さ）は１ｍｍ〜３ｍｍ、高さ（Ｚ方向）は５０μｍ〜５００μｍ、反応場１０４の幅は微細流路１４３の幅と同等であり、長さは１ｍｍ〜３ｍｍとするが、必ずしも限定されるものではない。また微細流路１４３の両端の開口１４４ａ、１４４ｂの大きさは微細流路１４３の幅と同等のφ１ｍｍ〜φ３ｍｍである。ピペット１５０の先端は開口１４４ａとほぼ同等の形状であり、根元部分はこれよりも太い軸径の円柱形状である。貯留部１４８は流路方向で開口１４４ｂよりも大きな断面形状であり、例えば２〜４ｍｍ角の形状としている。なお図２（ｂ）においては略正方形の断面形状としているが、円形の断面形状としてもよい。
【００５９】
図２（ａ）においては、ピペット１５０を装填した状態を示している。なお、貯留部１４８はマイクロチップ１４に固定した例を示しているが、ピペット１５０と同様に取り外し可能な構成としてもよい。なおピペット１５０は材料としてはポリプロピレンを用いており、接続部１４５を介して容易に脱着が可能であり、供給した検体液とともにピペット１５０の廃棄を容易に行うことができる。またポンプ１３０は例えばシリンジポンプであり、所定量の液体を吐出あるいは吸引することが可能である。なお本願においては、「吐出」とはポンプ１３０から液体あるいは空気を送りだすことにより、ピペット１５０の内部の液体を順方向（図２（ａ）の微細流路１４３において右方向）に搬送することであり、「吸引」とはその逆である。
【００６０】
制御部１８がポンプ１３０を制御することにより、ピペット１５０の内部に貯留した検体液等の液体をマイクロチップ１４の内部に吐出したり、吸引したりすることが可能である。このようにして微細流路１４３には蛍光物質が標識された２次抗体等が含まれる試薬液や、アナライトが含まれる検体液がポンプ１３０により送液される。
【００６１】
検体としては、血液、血清、血漿、尿、鼻孔液、唾液、便、体腔液（髄液、腹水、胸水等）などが挙げられる。検体中に含有されるアナライトは、例えば、核酸（一本鎖であっても二本鎖であってもよいＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ＰＮＡ（ペプチド核酸）等、またはヌクレオシド、ヌクレオチドおよびそれらの修飾分子）、タンパク質（ポリペプチド、オリゴペプチド等）、アミノ酸（修飾アミノ酸も含む。）、糖質（オリゴ糖、多糖類、糖鎖等）、脂質、またはこれらの修飾分子、複合体などが挙げられ、具体的には、ＡＦＰ（αフェトプロテイン）等のがん胎児性抗原や腫瘍マーカー、シグナル伝達物質、ホルモンなどであってもよく、特に限定されない。
【００６２】
さらに蛍光物質としては、所定の励起光ｂ１を照射するか、または電界効果を利用することで励起し、蛍光ｂ３を発する物質であれば特に限定されないものである。なお本明細書でいう蛍光ｂ３とは、燐光など各種の発光も含まれるものである。
【００６３】
［振動付与手段］
図３は、反応場１０４の検体の振動状態を説明する模式図である。同図に示すように、金属薄膜１０２とＩＴＯ基板１４６Ａは高圧電源ＰＳにより接続されている。高圧電源ＰＳは交流電圧あるいは極性を交互に入れ替えたパルス状の電圧を出力することが可能であり、反応場１０４に対して極性を所定の周波数で変化する交番電界を与えることができる。電圧としては例えば数百Ｖ、好ましくは数十Ｖ以下である。である。高圧電源ＰＳ及びＩＴＯ基板１４６Ａが振動付与手段として機能する。所定の周波数は、反応場１０４において特異吸着している検体が共振する周波数あるいはこれよりも低い周波数に設定している。当該周波数としては概ね数Ｈｚから数十Ｈｚである。振動を与えることにより特異吸着ｓｐは共振あるいは強制振動させられる。
【００６４】
同図において、１次抗体ａ１は反応場１０４に固定されており、当該１次抗体ａ１に特異的に反応する検体ａｙと検体ａｙに特異的に反応する２次抗体ａ２とは、この順で繋がっている。また２次抗体ａ２は蛍光標識Ｆが修飾されている。なお、微細流路１４３の内部は液体が充填されているが図示は省略している。
【００６５】
同図に示すように特異吸着ｓｐ（１次抗体ａ１、検体ａｙ、２次抗体ａ２の連結）に混じって、特異吸着以外の非特異吸着ｕｓ（同図の例では、検体ａｙ、２次抗体ａ２の組み合わせ）が混在している。同図に示す例では、特異吸着ｓｐ及び非特異吸着ｕｓは負の電荷を帯びており、反応場１０４及び反応場１０４周辺の微細流路１４３に高圧電源ＰＳにより所定の周波数で交番電界を印加することにより、これらの物質は上下方向に力を受けることになる。
【００６６】
図３（ａ）のように特異吸着ｓｐが上方に力を受ける状態では、特異吸着ｓｐは伸びた状態となるので、蛍光標識Ｆの金属薄膜１０２からの距離ｈ１は長くなる。一方で、図３（ｂ）のように下方に力を受ける状態では、特異吸着ｓｐは縮んだ状態となるので蛍光標識Ｆの金属薄膜１０２からの距離ｈ２は短くなる。
【００６７】
ここで、前述のとおり、消光現象により金属薄膜１０２と近接する領域では電場強度は小さく、離れる程大きくなる。図４は、金属薄膜１０２からの距離と電場強度との関係を示す図である。同図に示すように金属薄膜１０２に接する距離ゼロにおいては、消光現象により電場強度はゼロに近く、距離が離れるほどその影響は小さくなるので電場強度は大きくなる。一方で、近傍以外では金属薄膜１０２から離れるほど電場強度は小さくなるので、距離ｈｐをピークとして離れるほど電場強度は徐々に小さくなってゆく。距離ｈｘ（一般的には２００〜５００ｎｍ）以上ではほぼゼロとなる。
【００６８】
また距離ｈｐは例えば３０〜５０ｎｍであり、特異吸着ｓｐの長さは２０〜３０ｎｍであるので、距離ｈｐ≧ｈ１＞ｈ２の関係となっている。このようなことから、蛍光標識Ｆに対する電場強度は、図３（ａ）の状態での距離ｈ１の方が、図３（ｂ）状態での距離ｈ２のときよりも強い。つまり、蛍光標識Ｆの金属薄膜１０２表面からの距離が、距離ｈｐ以下の範囲内で変化する場合には、蛍光の強度も距離に応じて変化することになる。
【００６９】
このような特性から、特異吸着ｓｐに振動を与えることにより金属薄膜１０２からの距離が周期的に変化し、当該振動により蛍光標識Ｆから発する蛍光の強度も振動することになる。一方で、非特異吸着ｕｓは、特異吸着ｓｐとは長さ及び重さが異なる。特に非特異吸着としては主に（１）蛍光標識された２次抗体ａ２だけが、ＳＡＭ膜上に横たわっている状態（２）２次抗体ａ２が検体ａｙに直接付着している状態、がある。非特異吸着ｕｓが上記（１）であれば振動を付与させても振動せずに蛍光の強度は一定（ＤＣ成分）となり、上記（２）であれば特異吸着ｓｐよりも長さが短く、質量も小さいので、共振周波数は特異吸着ｓｐと比較して大きなものとなる。よって後述の周波数解析により特異吸着ｓｐの振動成分を取り出すことにより、Ｓ／Ｎ比を向上させた分析を行うことが可能となる。
【００７０】
［共振周波数］
ここで特異吸着ｓｐの共振周波数について説明する。特異吸着ｓｐの共振周波数を算出するために、まずは図５に示す様な倒立振り子モデルを用いてタンパクの運動方程式について検討する。
【００７１】
ｍはタンパクの質量、ｌはタンパクの長さ、ｋはバネ定数、ｈはバネの作用点までの長さ、Ｃは溶媒により粘性減衰係数としたとき、以下のようになる。
慣性モーメント：Ｊ＝ｍｌ２
転倒モーメント：ｍｇ・ｌ・ｓｉｎθ≒ｍｇｌ・θ
バネの復元力：−ｋ・ｈθ
復元モーメント：−ｋ・ｈθ・ｈ＝−ｋｈ２・θ
上記の元で、運動方程式は以下の数式１で表される。
【００７２】
【数１】
2014025951.tif 000003
【００７３】
数式１は、数式２となり、重力とバネ復元力による共振角周波数をＷｎとすると、数式３、数式４のようになり、数式２は数式５で表される。
【００７４】
【数２】
2014025951.tif 000004
【００７５】
溶媒の粘性減衰を含めたトータルでの共振周期Ｔは、以下の数式６のとおりとなる。
【００７６】
【数３】
2014025951.tif 000005
【００７７】
ｈ＝ｌ＝１．８×１０−９（ｍ）、Ｍ＝６．１７×１０−２２（ｋｇ）、ｇ＝９．８（ｍ／ｔ２）、またｋ＝２．５（Ｎ／ｍ）＝２．５（ｋｇ／ｔ２）として、
ｋｔ＝ｋｈ２−ｍｇｌ≒０．８１×１０−１５（ｋｇｍ２／ｔ２）
Ｊ＝Ｍ×ｌ２＝６．１７×１０−２２×（１８×１０−９）２＝１．９９９０８×１０−３７（ｋｇｍ２）
ｗｎ＝√（ｋｔ／Ｊ）≒０．６３６×１０１１（Ｈｚ）
溶媒が水であれば粘度η＝０．８９（ｃＰ）＝０．８９×１０−３（ｋｇ／（ｍｔ））、
タンパクの大きさを半径ｒ＝５ｎｍとすると
体積Ｖ＝４／３πｒ３＝５．２３６×１０−２５（ｍ３）
粘性減衰係数：Ｃ＝η×Ｖ＝５．２３６×１０−２５×０．８９×１０−３≒４．６６００４×１０−２８（ｋｇｍ２／ｔ）
減衰比：ζ＝Ｃ／（２Ｗｎ×Ｊ）＝４．６６００４×１０−２８／（２×０．６３６×１０１１×１．９９９０８×１０−３７）≒０．０１８３
共振周期Ｔ＝２π／（Ｗｎ×√（１−ζ２））≒９．８８×１０−１１（ｔ）
共振周波数ｆ＝１／Ｔ≒１０（Ｇｈｚ）となる。
【００７８】
溶媒の種類を選択して、より粘度の高いものにすることにより特異吸着ｓｐが共振する共振周波数ｆ１を任意の値に設定することができる。共振周波数ｆ１としては数Ｈｚ程度に抑えることが望ましい。
【００７９】
［制御フロー］
図６は、表面プラズモン増強蛍光測定装置の制御部１８が実行する制御フローである。ステップＳ１１では、ポンプ１３０を作動させることにより、ピペット１５０内のアナライトが含まれる検体液を、微細流路１４３を通じて貯留部１４８に送液する。当該行為により反応場１０４の固定されている１次抗体にアナライトが捕捉される。続いて、ピペット１５０の交換を行う。交換されたピペット１５０には、蛍光標識が修飾された２次抗体が含まれる２次抗体液が充填されており、２次抗体液を、微細流路１４３を通じて貯留部１４８まで送液する。２次抗体はアナライトに特異的に反応するので、反応場１０４には、１次抗体、アナライト、２次抗体の順で連結した状態（特異吸着ｓｐ）で捕捉されることになる。
【００８０】
ステップＳ１２では反応場１０４の洗浄工程として、同様にピペット１５０を交換し、内部の水等の洗浄液を、微細流路１４３を通じて貯留部１４８まで送液する。
【００８１】
ステップＳ１１、Ｓ１２により反応場１０４は、図３のように特異吸着ｓｐが形成される。またこの際に、ステップＳ１２の洗浄工程でも除去できなかった非特異吸着ｕｓが少なからず反応場１０４に存在している。
【００８２】
ステップＳ１３では、制御部１８は、振動付与手段としての高圧電源ＰＳを作動させて、反応場１０４に所定の周波数の交番電界を印加することにより所定の周波数で特異吸着ｓｐに振動を与える。
【００８３】
ステップＳ１４では、光源１１２からの励起光ｂ１により生じる電場増強により、反応場の蛍光標識Ｆからの蛍光を光検出部１２０で測定する。
【００８４】
ステップＳ１５では、周波数解析部１８１により、ステップＳ１４で得られて出力信号を周波数解析することにより、特異吸着ｓｐにより信号を分離する。周波数解析としては例えば（１）特異吸着ｓｐが強制振動により振動した周波数あるいは共振周波数ｆ１（以下、これらを総称して振動周波数ｆｓｐという）以外の信号成分を除去するようにバンドパスフィルタあるいはローパスフィルタをかけ、得られた信号からアナライトの定量等を行う、あるいは（２）ＦＦＴ（高速フーリエ変換）の様な周波数変換処理を行い、振動周波数ｆｓｐの信号強度からアナライトの定量等を行う、がある。また更に（３）ＦＦＴの後に、振動周波数ｆｓｐを通すフィルタをかけ、その後にＩＦＦＴ（高速フーリエ逆変換）の様な周波数逆変換処理を行うことにより上記（１）の様に定量等を行ってもよい。
【００８５】
図７は、光検出部１２０の出力信号に対して周波数解析を行った例である。図７（ａ）は、バンドパスフィルタにより出力信号から振動周波数ｆｓｐ以外の信号成分を除去した例である。図７（ｂ）は、出力信号にＦＦＴ処理をかけた例である。
【００８６】
このように、反応場の特異吸着ｓｐを所定の周期で振動させ、特異吸着ｓｐの蛍光物質からの蛍光からの信号を周波数解析し、得られた信号強度から検体の分析を行うことにより、特異吸着のみならず非特異吸着が生じ、両者が混在している状態においても、特異吸着による信号を分離し、Ｓ／Ｎ比を向上させることが可能となる。
【００８７】
［振動付与手段の他の実施形態］
以下に、振動付与手段の変形例について説明する。以下においては振動付与手段以外の構成は図１から図７で説明した構成と同一であり、説明は省略する。
【００８８】
図８は、振動付与手段の第１の変形例として、微細流路１４３の壁面を機械的に往復運動させて反応場に振動を与えるものである。同図に示す例では、微細流路１４３のうち、反応場１０４とは反対側の壁面が可動壁１４６Ｂとなっており、圧電素子１７を駆動させることにより可動壁１４６Ｂは微細流路１４３の高さ方向（図示矢印方向）に可動する。
【００８９】
圧電素子１７を所定周期で駆動させることにより反応場１０４の特異吸着ｓｐを振動させることが可能となる。
【００９０】
また、第２の変形例としては、ポンプ１３０を制御することにより、ピペット１５０の内部の液体を吐出させたり吸引させたりすることにより微細流路１４３の内部の液体を所定の周期で往復運動させる。そして液体の往復運動により特異吸着ｓｐを倒立振り子のように振動させることができる。
【００９１】
第３の変形例としては、励起光ｂ１及び蛍光ｂ３（図１参照）とは波長が重複しない、例えば赤外波長の光を、別の光源により反応場１０４周辺に照射させるものである。当該照射をパルス状で所定周期で行うことにより、反応場１０４周辺を加熱することにより、特異吸着ｓｐを振動させることが可能となる。
【符号の説明】
【００９２】
１０  増強蛍光測定装置
１４  マイクロチップ
１８  制御部
１８１  周波数解析部
ＰＳ  高圧電源
１４６Ａ  ＩＴＯ基板
１４６Ｂ  可動壁
１７  圧電素子
１４２  石英基板
１４３  微細流路
１４８  貯留部
１５０  ピペット
１６１  固定具
１０２  金属薄膜
１０４  反応場
１１２  光源
１１６  受光手段
１２０  光検出部
ｂ１  励起光
ｂ２  金属薄膜反射光
ｂ３  蛍光
【図１】
2014025951.tif 000006
【図２】
2014025951.tif 000007
【図３】
2014025951.tif 000008
【図４】
2014025951.tif 000009
【図５】
2014025951.tif 000010
【図６】
2014025951.tif 000011
【図７】
2014025951.tif 000012
【図８】
2014025951.tif 000013
【図９】
2014025951.tif 000014