(57)【要約】【課題】キシロースを原料として１，３−ブタジエンの新規合成方法を提供すること。【解決手段】（Ａ）キシロースを、クロチルアルコールおよび／またはその異性体に変換し得る酵素活性を有する微生物またはその処理物の存在下で、キシロースを水性媒体中でクロチルアルコールおよび／またはその異性体に変換する工程、および、（Ｂ）該クロチルアルコールおよび／またはその異性体を脱水する工程を有することを特徴とする、１，３−ブタジエンの製造方法。【選択図】図１
2014030376.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ）キシロースを、クロチルアルコールおよび／またはその異性体に変換し得る酵素活性を有する微生物またはその処理物の存在下で、キシロースを水性媒体中でクロチルアルコールおよび／またはその異性体に変換する工程、および、
（Ｂ）該クロチルアルコールおよび／またはその異性体を脱水する工程を有する
ことを特徴とする、１，３−ブタジエンの製造方法。
【請求項２】
前記（Ａ）工程において、前記微生物またはその処理物が、
酵素番号が４．２．１．１２０に分類される酵素の活性を有する
ことを特徴とする、請求項１に記載の１，３−ブタジエンの製造方法。
【請求項３】
前記（Ａ）工程において、前記微生物またはその処理物が、
酵素番号が４．１．１．７１もしくは４．１．１．７３に分類される酵素の活性を有することを特徴とする、請求項１に記載の１，３−ブタジエンの製造方法。
【請求項４】
前記微生物またはその処理物が、さらに、酵素番号が
１．１．１．１２１、１．１．１．１７５、または１．１．１．１７９に分類される酵素、
４．２．１．８２に分類される酵素、
４．２．１．３０、または４．２．１．４３に分類される酵素、
６．２．１．２、または６．２．１．３に分類される酵素、
３．１．２．１、または３．１．２．２０に分類される酵素、
および
１．１．１．１に分類される酵素
の活性を有する
ことを特徴とする、請求項２または請求項３に記載の１，３−ブタジエンの製造方法。
【請求項５】
前記微生物またはその処理物が、さらに、酵素番号が
１．１．１．１７２、または１．１．１．２７２に分類される酵素の活性を有することを特徴とする、請求項４に記載の１，３−ブタジエンの製造方法。
【請求項６】
前記微生物またはその処理物が、さらに、酵素番号が
５．３．３．３に分類される酵素の活性を有することを特徴とする、請求項４または請求項５に記載の１，３−ブタジエンの製造方法。
【請求項７】
前記（Ｂ）工程が、
モリブデン酸ビスマス触媒の存在下で行なわれる
ことを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の１，３−ブタジエンの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はブタジエンの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
タイヤに利用される合成ゴムの原料となるブタジエンは、現在は原油などから製造されているが、原油価格の高騰および地球温暖化防止の観点から、再生可能な資源からブタジエンを生産させる技術の開発が望まれている。再生可能なブタジエンの製造方法として、可食糖であるグルコースを含む原料を利用する方法が知られている（特許文献１）。しかしながら、再生可能な資源のうちサトウキビやトウモロコシなどの可食資源を化学品原料として用いることは、食料との競合になり得るという問題が指摘されており、このため、これまで有効利用されていなかった非可食バイオマスを原料としたブタジエンの生産方法が強く求められている。
【０００３】
一方、非可食バイオマスの主成分であるキシロースを原料にして化学品を生産する方法としては、遺伝子組換え酵母にキシロースを資化させてエタノールを生産させる研究（非特許文献１、２）、キシロースを用いて１，４―ブタンジオールを生産する方法（特許文献２）が知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第２０１１／０３００５９７号パンフレット
【特許文献２】国際公開第２０１１／０１３７１９２号パンフレット
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（２０１２）９４：１５８５−１５９２
【非特許文献２】Ｊ.  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２０１２）２８７：１４６０６−１４６１４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
非可食の再生可能資源を有効活用する観点からは、ヘミセルロースの主成分であるキシロースを微生物に資化させてブタジエンを製造することができれば有用である。しかしながら、産業上よく使われる宿主であるコリネ型細菌や酵母の代表的宿主であるSaccharomyces cerevisiaeにはキシロースの資化能がないことが知られている。こうした宿主を用いてブタジエンを生産するためには、キシロースを取り込んでブタジエンを合成する経路を人工的に宿主内に構築することが必要である。また、大腸菌は、本来的にキシロースを資化する能力があり、ペントースリン酸経路から解糖系などの中央代謝経路にて代謝することができるが、中央代謝経路はエネルギーや還元力供給の働きを主に担う経路であり、未だ十分に解明されていない様々な代謝調節機構が働いているため、キシロースを原料として効率よくブタジエンを生成させることは容易ではない。このように、キシロースを原料として微生物によりブタジエンを生産させることには課題が多い。
【０００７】
本発明は、このような課題に鑑みてなされたものであり、キシロースから効率的にクロチルアルコールおよび／またはその異性体、並びにブタジエンを製造することができる新たな合成方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、キシロースを原料として、中央代謝経路を経由せずに直接的に、ブタジエンの前駆体であるクロチルアルコールもしくはその異性体である３−ブテン−１−オールの合成経路の探索を行ったところ、新たな合成経路を見出すことに成功し、本発明を完成させた。
なお、本発明において、新たな合成経路の探索は、京都大学先端技術グローバルリーダー養成ユニット、荒木通啓准教授によって開発された技術を利用している。
【０００９】
本発明は、以下を提供する。
［１］（Ａ）キシロースを、クロチルアルコールおよび／またはその異性体に変換し得る酵素活性を有する微生物またはその処理物の存在下で、キシロースを水性媒体中でクロチルアルコールおよび／またはその異性体に変換する工程、および、
（Ｂ）該クロチルアルコールおよび／またはその異性体を脱水する工程を有することを特徴とする、１，３−ブタジエンの製造方法。
［２］前記（Ａ）工程において、前記微生物またはその処理物が、酵素番号が４．２．１．１２０に分類される酵素の活性を有することを特徴とする、［１］に記載の１，３−ブタジエンの製造方法。
［３］前記（Ａ）工程において、前記微生物またはその処理物が、酵素番号が４．１．１．７１もしくは４．１．１．７３に分類される酵素の活性を有することを特徴とする、［１］に記載の１，３−ブタジエンの製造方法。
［４］前記微生物またはその処理物が、さらに、酵素番号が
１．１．１．１２１、１．１．１．１７５、または１．１．１．１７９に分類される酵素、
４．２．１．８２に分類される酵素、
４．２．１．３０、または４．２．１．４３に分類される酵素、
６．２．１．２、または６．２．１．３に分類される酵素、
３．１．２．１、または３．１．２．２０に分類される酵素、
および
１．１．１．１に分類される酵素の活性を有することを特徴とする、［２］または［３］に記載の１，３−ブタジエンの製造方法。
［５］前記微生物またはその処理物が、さらに、酵素番号が１．１．１．１７２、または１．１．１．２７２に分類される酵素の活性を有することを特徴とする、［４］に記載の１，３−ブタジエンの製造方法。
［６］前記微生物またはその処理物が、さらに、酵素番号が５．３．３．３に分類される酵素の活性を有することを特徴とする、［４］または［５］に記載の１，３−ブタジエンの製造方法。
［７］前記（Ｂ）工程が、モリブデン酸ビスマス触媒の存在下で行なわれることを特徴とする、［１］〜［６］のいずれかに記載の１，３−ブタジエンの製造方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、本発明のブタジエンの製造方法によれば可食資源と競合しない非可食の再生可能資源からクロトニルアルコールやその異性体およびブタジエンを効率よく製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】クロチルアルコールを経由する場合の１，３−ブタジエンの合成経路を示す。反応経路（Ａ−１）および（Ａ−２）に相当する。
【図２】３−ブテン−１−オールを経由する場合の１，３−ブタジエンの合成経路を示す。反応経路（Ａ−３）および（Ａ−４）に相当する。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明について具体的に説明する。
本発明は、１，３−ブタジエンの製造方法であって、（Ａ）キシロースを、クロチルアルコールおよび／またはその異性体に変換し得る酵素活性を有する微生物またはその処理物の存在下で、キシロースを水性媒体中でクロチルアルコールおよび／またはその異性体に変換する工程（以下、「（Ａ）工程」と称する場合がある。）、および、（Ｂ）該クロチルアルコールおよび／またはその異性体を脱水する工程（以下、「（Ｂ）工程」と称する場合がある。）を有することを特徴とするものである。
【００１３】
＜（Ａ）工程＞
（Ａ）工程は、キシロースを、クロチルアルコールおよび／またはその異性体に変換し得る酵素活性を有する微生物またはその処理物の存在下で、キシロースを水性媒体中でクロチルアルコールおよび／またはその異性体に変換する工程である。
ここで、キシロースは、Ｌ体であってもＤ体であってもよいが、天然に存在するバイオマス由来のキシロースはＤ体であることからＤ体が好ましい。
【００１４】
また、クロチルアルコールの異性体とは、具体的には、３−ブテン−１−オールのことであり、（Ａ）工程においてクロチルアルコールを製造しても、その異性体を製造しても後述の（Ｂ）工程に供することができる。
また、（Ａ）工程は、一種類の微生物またはその処理物の存在下で行なってもよいが、異なる酵素の活性を有する微生物またはその処理物を組み合わせ、全体としてキシロースをクロチルアルコールおよび／またはその異性体に変換し得る酵素活性を有するようにして反応を行なってもよい。
【００１５】
＜（Ａ）工程における反応経路＞
（Ａ）工程では、キシロースを、クロチルアルコールおよび／またはその異性体に変換することができれば、その反応経路に特に制限はないが、以下に示す（Ａ−１）〜（Ａ−４）の反応経路であることが好ましい。なお、（Ａ−１）と（Ａ−２）は、クロチルアルコールを製造する反応経路であり、（Ａ−３）と（Ａ−４）は、クロチルアルコールの異性体を製造する反応経路である。
【００１６】
（Ａ−１）  キシロースをキシロン酸に，キシロン酸を２−デヒドロ−３−デオキシペンタン酸に，２−デヒドロ−３−デオキシペンタン酸を２，５−ジオキソペンタン酸に，２，５−ジオキソペンタン酸を２−オキソ−５−ヒドロキシペンタン酸に，２−オキソ−５−ヒドロキシペンタン酸を２−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイルＣｏＡに，２−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイルＣｏＡを２−オキソペンタ−４−エノイルＣｏＡに，２−オキソペンタ−４−エノイルＣｏＡを２−オキソペンタ−３−エノイルＣｏＡに，２−オキソペンタ−３−エノイルＣｏＡを２−オキソペンタ−３−エン酸に，２−オキソペンタ−３−エン酸をクロチルアルデヒドに，クロチルアルデヒドをクロチルアルコールに変換する反応経路である（図１）。
【００１７】
（Ａ−２）  キシロースをキシロン酸に，キシロン酸を２−デヒドロ−３−デオキシペンタン酸に，２−デヒドロ−３−デオキシペンタン酸を２，５−ジオキソペンタン酸に，２，５−ジオキソペンタン酸を２−ヒドロキシ−５−オキソペンタン酸に，２−ヒドロキシ−５−オキソペンタン酸を２，  ５−ジヒドロキシペンタン酸に、２，  ５−ジヒドロキシペンタン酸を２，  ５−ジヒドロキシペンタノイルＣｏＡに，２，  ５−ジヒドロキシペンタノイルＣｏＡを２−ヒドロキシペンタ−４−エノイルＣｏＡに，２−ヒドロキシペンタ−４−エノイルＣｏＡを２−ヒドロキシペンタ−３−エノイルＣｏＡに，２−ヒドロキシペンタ−３−エノイルＣｏＡを２−ヒドロキシペンタ−３−エン酸に，２−ヒドロキシペンタ−３−エン酸をクロチルアルコールに変換する反応経路である（図１）。
【００１８】
（Ａ−３）  キシロースをキシロン酸に，キシロン酸を２−デヒドロ−３−デオキシペンタン酸に，２−デヒドロ−３−デオキシペンタン酸を２，５−ジオキソペンタン酸に，２，５−ジオキソペンタン酸を２−オキソ−５−ヒドロキシペンタン酸に，２−オキソ−５−ヒドロキシペンタン酸を２−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイルＣｏＡに，２−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイルＣｏＡを２−オキソペンタ−４−エノイルＣｏＡに，２−オキソペンタ−４−エノイルＣｏＡを２−オキソペンタ−４−エン酸に，２−オキソペンタ−４−エン酸を３−ブテン−１−オンに，３−ブテン−１−オンを３−ブテン−１−オールに変換する反応経路である（図２）。
【００１９】
（Ａ−４）  キシロースをキシロン酸に，キシロン酸を２−デヒドロ−３−デオキシペンタン酸に，２−デヒドロ−３−デオキシペンタン酸を２，５−ジオキソペンタン酸に，２、５−ジヒドロキシペンタン酸を２、５−ジヒドロキシペンタノイルＣｏＡに，２、５−ジヒドロキシペンタノイルＣｏＡを２−ヒドロキシペンタ−４−エノイルＣｏＡに，２−ヒドロキシペンタ−４−エノイルＣｏＡを２−ヒドロキシペンタ−４−エン酸に，２−ヒドロキシペンタ−４−エン酸を３−ブテン−１−オールに変換する反応経路である（図２）。
【００２０】
＜（Ａ）工程における微生物またはその処理物＞
（Ａ）工程における微生物またはその処理物は、後述する酵素番号に分類される酵素の活性を有することが好ましい。以下に、酵素番号ごとに、酵素、および該酵素をコードする遺伝子について説明する。
なお、表１〜１４は、各酵素をコードする遺伝子名、由来微生物およびアミノ酸配列のＧｅｎＢａｎｋアクセス番号を示す。また、以下に示す各酵素は、それぞれの酵素活性を保持した蛋白質である限り、各ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号の塩基配列にコードされるアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０%以上、より好ましくは９５%以上、特に好ましくは９９%以上の同一性を有する蛋白質であってもよい。
【００２１】
（Ａ）工程における微生物またはその処理物は、酵素番号が４．２．１．１２０に分類される酵素の活性を有することが好ましい。
酵素番号が４．２．１．１２０に分類される酵素としては、具体的には、表１に示す通り、Clostridium aminobutyricum 、Clostridium kluyveri、もしくは、Metallosphaera sedula由来の４−ヒドロキシブタノイルＣｏＡデヒドラターゼ等が挙げられる。
【００２２】
【表１】
2014030376.tif 000003
【００２３】
（Ａ）工程における微生物またはその処理物は、酵素番号が４．１．１．７１もしくは４．１．１．７３に分類される酵素の活性を有することが好ましい。
酵素番号が４．１．１．７１に分類される酵素としては、具体的には、表２に示す通り、Mycobacterium tuberculosis 、もしくはHomo sapiens由来の２−オキソグルタル酸デ
カルボキシラーゼ等が挙げられる。
【００２４】
【表２】
2014030376.tif 000004
【００２５】
酵素番号が４．１．１．７３に分類される酵素としては、具体的には、表２に示す通り、Pseudomonas savastanoi、もしくはEscherichia coli由来の酒石酸デカルボキシラーゼ等が挙げられる。
【００２６】
【表３】
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【００２７】
（Ａ）工程における微生物またはその処理物は、酵素番号が４．２．１．１２０に分類される酵素の活性を有し、かつ、酵素番号が４．１．１．７１もしくは４．１．１．７３に分類される酵素の活性を有することがより好ましい。
また、（Ａ）工程における微生物またはその処理物は、さらに、４．２．１．８２に分類される酵素、４．２．１．３０または４．２．１．４３に分類される酵素、１．１．１．１２１、１．１．１．１７５、または１．１．１．１７９に分類される酵素、６．２．１．２または６．２．１．３に分類される酵素、３．１．２．１または３．１．２．２０
に分類される酵素、および、１．１．１．１に分類される酵素の活性を有することが好ましい。
【００２８】
酵素番号が４．２．１．８２に分類される酵素としては、具体的には、表４に示す通り、Haloferax volcaniiもしくはCaulobacter vibrioides由来のキシロン酸デヒドラターゼ等が挙げられる。
【００２９】
【表４】
2014030376.tif 000006
【００３０】
酵素番号が４．２．１．３０に分類される酵素としては、具体的には、表５に示す通り、 Escherichia coli もしくはCitrobacter freundii由来のキシロン酸デヒドラターゼ等が挙げられる。
【００３１】
【表５】
2014030376.tif 000007
【００３２】
酵素番号が４．２．１．４３に分類される酵素としては、具体的には、表６に示す通り、Azospirillum brasilenseもしくはSulfolobus solfataricus由来の２−デヒドロー３−デオシキーアラビノン酸デヒドラターゼ等が挙げられる。
【００３３】
【表６】
2014030376.tif 000008
【００３４】
酵素番号が１．１．１．１２１に分類される酵素としては、具体的には、表７に示す通り、Thermoplasma acidophilum由来のアルドース  １−デヒドロゲナーゼ等が挙げられる。
【００３５】
【表７】
2014030376.tif 000009
【００３６】
酵素番号が１．１．１．１７５に分類される酵素としては、具体的には、表８に示す通り、Haloferax volcanii、もしくはHaloarcula marismortui由来のＮＡＤ＋依存型Ｄ−キシロース  １−ヒドロゲナーゼ等が挙げられる。
【００３７】
【表８】
2014030376.tif 000010
【００３８】
酵素番号が１．１．１．１７９に分類される酵素としては、具体的には、表９に示す通り、Homo sapiens 、Macaca fascicularis、Sus scrofa、Bos taurus、Trichoderma reesei、Oryctolagus cuniculus、もしくはEscherichia coli等に由来するＮＡＤＰ＋依存型
Ｄ−キシロース  １−ヒドロゲナーゼ等が挙げられる。
【００３９】
【表９】
2014030376.tif 000011
【００４０】
酵素番号が６．２．１．２に分類される酵素としては、具体的には、表１０に示す通り、Dictyostelium discoideum、Homo sapiens、もしくはMycobacterium avium由来のブタ
ン酸ＣｏＡリガーゼ等が挙げられる。
【００４１】
【表１０】
2014030376.tif 000012
【００４２】
酵素番号が６．２．１．３に分類される酵素としては、具体的には、表１１に示す通り、Saccharomyces cerevisiae、もしくはEscherichia coli由来の長鎖脂肪酸ＣｏＡリガーゼ等が挙げられる。
【００４３】
【表１１】
2014030376.tif 000013
【００４４】
酵素番号が３．１．２．１に分類される酵素としては、具体的には、表１２に示す通り、Saccharomyces cerevisiae由来のアセチルＣｏＡヒドロラーゼ等が挙げられる。
【００４５】
【表１２】
2014030376.tif 000014
【００４６】
酵素番号が３．１．２．２０に分類される酵素としては、具体的には、表１３に示す通り、Escherichia coli由来のアシルＣｏＡヒドロラーゼ等が挙げられる。
【００４７】
【表１３】
2014030376.tif 000015
【００４８】
酵素番号が１．１．１．１に分類される酵素としては、具体的には、表１５に示す通り、Methanocaldococcus jannaschii <javascript:Org('2190')>、Escherichia coli、Saccharomyces cerevisiae、Corynebacterium glutamicum、もしくはSulfolobus solfataricus由来のアルコールデヒドロゲナーゼ等が挙げられる。
【００４９】
【表１４】
2014030376.tif 000016
【００５０】
（Ａ）工程における微生物またはその処理物は、さらに、酵素番号が１．１．１．１７２または１．１．１．２７２に分類される酵素の活性を有していてもよい。
酵素番号が１．１．１．２７２に分類される酵素としては、具体的には、表１４に示す通り、Methanocaldococcus jannaschii <javascript:Org('2190')>、もしくはMethanothermus fervidus <javascript:Org('2180')>由来の２−ヒドロキシ酸デヒドロゲナーゼ等が挙げられる。
【００５１】
【表１５】
2014030376.tif 000017
【００５２】
（Ａ）工程における微生物またはその処理物は、さらに、酵素番号が５．３．３．３に分類される酵素の活性を有していてもよい。
酵素番号が５．３．３．３に分類される酵素としては、具体的には、表１６に示す通り、Escherichia coli、Clostridium kluyveri、Clostridium aminobutyricum、もしくはBos taurus由来のビニルアセチルＣｏＡデルタイソメラーゼ等が挙げられる。
【００５３】
【表１６】
2014030376.tif 000018
【００５４】
なお、酵素番号とは、ＥＣ番号（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ）とも呼ばれ、酵素を整理すべく反応形式に従って４組の数字で表したものであり、国際生化学連合により定められたものである。
【００５５】
〈反応経路（Ａ−１）の酵素活性を有する微生物〉
反応経路（Ａ−１）の酵素活性を有する微生物は、上述の酵素番号１．１．１．１２１、１．１．１．１７５もしくは１．１．１．１７９に分類される酵素、
４．２．１．８２に分類される酵素、
４．２．１．３０、または４．２．１．４３に分類される酵素、
６．２．１．２、または６．２．１．３に分類される酵素、
４．２．１．１２０に分類される酵素、
５．３．３．３に分類される酵素、
３．１．２．１、または３．１．２．２０に分類される酵素、
４．１．１．７１もしくは４．１．１．７３に分類される酵素、
および１．１．１．１に分類される酵素の活性を有する。
【００５６】
反応経路（Ａ−１）の酵素活性を有する微生物は、以下のようにしてクロチルアルコールへ変換することができる。キシロースを酵素番号１．１．１．１２１、１．１．１．１
７５もしくは１．１．１．１７９に分類される酵素により、キシロースをキシロン酸へ変換することができる。次に、酵素番号４．２．１．８２に分類される酵素により、キシロン酸を２−デヒドロ−３−デオキシペンタン酸へ変換することができる。次に、酵素番号４．２．１．３０、または４．２．１．４３に分類される酵素により、２−デヒドロ−３−デオキシペンタン酸を２，５−ジオキソペンタン酸へ変換することができる。次に、酵素番号１．１．１．１に分類される酵素により、２，５−ジオキソペンタン酸を２−オキソ−５−ヒドロキシペンタン酸へ変換することができる。次に、酵素番号６．２．１．２または６．２．１．３に分類される酵素により、２−オキソ−５−ヒドロキシペンタン酸を２−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイルＣｏＡへ変換することができる。次に、酵素番号４．２．１．１２０に分類される酵素により、２−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイルＣｏＡを２−オキソペンタ−４−エノイルＣｏＡへ変換することができる。次に、酵素番号５．３．３．３に分類される酵素により、２−オキソペンタ−４−エノイルＣｏＡを２−オキソペンタ−３−エノイルＣｏＡへ変換することができる。次に、酵素番号３．１．２．１または３．１．２．２０に分類される酵素により、２−オキソペンタ−３−エノイルＣｏＡを２−オキソペンタ−３−エン酸へ変換することができる。次に、酵素番号４．１．１．７１もしくは４．１．１．７３に分類される酵素により、２−オキソペンタ−３−エン酸をクロチルアルデヒドへ変換することができる。次に、酵素番号１．１．１．１に分類される酵素により、クロチルアルデヒドをクロチルアルコールへ変換することができる。
なお、上述したような反応経路（Ａ−１）の酵素活性を有する微生物は、後述する〈微生物またはその処理物の作製方法〉や実施例に記載の方法で作製することができる。
【００５７】
〈反応経路（Ａ−２）の酵素活性を有する微生物〉
反応経路（Ａ−２）の酵素活性を有する微生物は、上述の酵素番号１．１．１．１２１、１．１．１．１７５もしくは１．１．１．１７９に分類される酵素、
４．２．１．８２に分類される酵素、
４．２．１．３０または４．２．１．４３に分類される酵素、
１．１．１．１７２または１．１．１．２７２に分類される酵素、
１．１．１．１に分類される酵素、
６．２．１．２または６．２．１．３に分類される酵素、
４．２．１．１２０に分類される酵素、
５．３．３．３に分類される酵素、
３．１．２．１および３．１．２．２０に分類される酵素、および、
４．１．１．７１もしくは４．１．１．７３に分類される酵素の活性を有する。
【００５８】
すなわち、〈反応経路（Ａ−２）の酵素活性を有する微生物〉とは、１．１．１．１７２または１．１．１．２７２に分類される酵素を有する点で、前記〈反応経路（Ａ−１）の酵素活性を有する微生物〉と異なる。
反応経路（Ａ−２）の酵素活性を有する微生物は、以下のようにしてクロチルアルコールへ変換することができる。酵素番号１．１．１．１２１、１．１．１．１７５もしくは１．１．１．１７９に分類される酵素により、キシロースをキシロン酸へ変換することができる。次に、酵素番号４．２．１．８２に分類される酵素により、キシロン酸を２−デヒドロ−３−デオキシペンタン酸へ変換することができる。次に、酵素番号４．２．１．３０または４．２．１．４３に分類される酵素により、２−デヒドロ−３−デオキシペンタン酸を２，５−ジオキソペンタン酸へ変換することができる。次に、酵素番号１．１．１．１７２または１．１．１．２７２に分類される酵素により、２，５−ジオキソペンタン酸を２−ヒドロキシ−５−オキソペンタン酸へ変換することができる。次に、酵素番号１．１．１．１に分類される酵素により、２−ヒドロキシ−５−オキソペンタン酸を２，５−ジヒドロキシペンタン酸へ変換することができる。次に、酵素番号６．２．１．２または６．２．１．３に分類される酵素により、２，５−ジヒドロキシペンタン酸を２，５
−ジヒドロキシペンタノイルＣｏＡへ変換することができる。次に、酵素番号５．３．３．３に分類される酵素により、２，５−ジヒドロキシペンタノイルＣｏＡを２−ヒドロキシペンタ−３−エノイルＣｏＡへ変換することができる。次に、酵素番号３．１．２．１または３．１．２．２０に分類される酵素により、２−ヒドロキシペンタ−３−エノイルＣｏＡを２−ヒドロキシペンタ−３−エン酸へ変換することができる。次に、酵素番号４．１．１．７１または４．１．１．７３に分類される酵素により、２−ヒドロキシペンタ−３−エン酸をクロチルアルコールへ変換することができる。
なお、上述したような反応経路（Ａ−２）の酵素活性を有する微生物は、後述する〈微生物またはその処理物の作製方法〉や実施例に記載の方法で作製することができる。
【００５９】
〈反応経路（Ａ−３）の酵素活性を有する微生物〉
反応経路（Ａ−３）の酵素活性を有する微生物は、上述の酵素番号１．１．１．１２１、１．１．１．１７５もしくは１．１．１．１７９に分類される酵素、
４．２．１．８２に分類される酵素、
４．２．１．３０、または４．２．１．４３に分類される酵素、
６．２．１．２、または６．２．１．３に分類される酵素、
４．２．１．１２０に分類される酵素、
３．１．２．１、または３．１．２．２０に分類される酵素、
４．１．１．７１もしくは４．１．１．７３に分類される酵素、
および１．１．１．１に分類される酵素の活性を有する。
【００６０】
すなわち、〈反応経路（Ａ−３）の酵素活性を有する微生物〉とは、５．３．３．３に分類される酵素を有しない点で、〈反応経路（Ａ−１）の酵素活性を有する微生物〉と異なる。
反応経路（Ａ−３）の酵素活性を有する微生物は、以下のようにして３−ブテン−１−オールへ変換することができる。酵素番号１．１．１．１２１、１．１．１．１７５もしくは１．１．１．１７９に分類される酵素により、キシロースをキシロン酸へ変換することができる。次に、酵素番号４．２．１．８２に分類される酵素により、キシロン酸を２−デヒドロ−３−デオキシペンタン酸へ変換することができる。次に、酵素番号４．２．１．３０、または４．２．１．４３に分類される酵素により、２−デヒドロ−３−デオキシペンタン酸を２，５−ジオキソペンタン酸へ変換することができる。次に、酵素番号１．１．１．１に分類される酵素により、２，５−ジオキソペンタン酸を２−オキソ−５−ヒドロキシペンタン酸へ変換することができる。次に、酵素番号６．２．１．２または６．２．１．３に分類される酵素により、２−オキソ−５−ヒドロキシペンタン酸を２−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイルＣｏＡへ変換することができる。次に、酵素番号４．２．１．１２０に分類される酵素により、２−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイルＣｏＡを２−オキソペンタ−４−エノイルＣｏＡへ変換することができる。次に、酵素番号３．１．２．１または３．１．２．２０に分類される酵素により、２−オキソペンタ−４−エノイルＣｏＡを２−オキソペンタ−４−エン酸へ変換することができる。次に、酵素番号４．１．１．７１もしくは４．１．１．７３に分類される酵素により、２−オキソペンタ−４−エン酸を３−ブテン−１―オンへ変換することができる。次に、酵素番号１．１．１．１に分類される酵素により、３−ブテン−１−オンを３−ブテン−１−オールへ変換することができる。
なお、上述したような反応経路（Ａ−３）の酵素活性を有する微生物は、後述する〈微生物またはその処理物の作製方法〉や実施例に記載の方法で作製することができる。
【００６１】
〈反応経路（Ａ−４）の酵素活性を有する微生物〉
反応経路（Ａ−４）の酵素活性を有する微生物は、上述の酵素番号１．１．１．１２１、１．１．１．１７５もしくは１．１．１．１７９に分類される酵素、
４．２．１．８２に分類される酵素、
４．２．１．３０または４．２．１．４３に分類される酵素、
１．１．１．１７２または１．１．１．２７２に分類される酵素、
１．１．１．１に分類される酵素、
６．２．１．２または６．２．１．３に分類される酵素、
４．２．１．１２０に分類される酵素、
３．１．２．１および３．１．２．２０に分類される酵素、および、
４．１．１．７１もしくは４．１．１．７３に分類される酵素の活性を有する。
【００６２】
すなわち、〈反応経路（Ａ−４）の酵素活性を有する微生物〉とは、５．３．３．３に分類される酵素を有しない点で、〈反応経路（Ａ−２）の酵素活性を有する微生物〉と異なる。
反応経路（Ａ−４）の酵素活性を有する微生物は、以下のようにして３−ブテン−１−オールへ変換することができる。酵素番号１．１．１．１２１、１．１．１．１７５もしくは１．１．１．１７９に分類される酵素により、キシロースをキシロン酸へ変換することができる。次に、酵素番号４．２．１．８２に分類される酵素により、キシロン酸を２−デヒドロ−３−デオキシペンタン酸へ変換することができる。次に、酵素番号４．２．１．３０または４．２．１．４３に分類される酵素により、２−デヒドロ−３−デオキシペンタン酸を２，５−ジオキソペンタン酸へ変換することができる。次に、酵素番号１．１．１．１７２または１．１．１．２７２に分類される酵素により、２，５−ジオキソペンタン酸を２−ヒドロキシ−５−オキソペンタン酸へ変換することができる。次に、酵素番号１．１．１．１に分類される酵素により、２−ヒドロキシ−５−オキソペンタン酸を２，５−ジヒドロキシペンタン酸へ変換することができる。次に、酵素番号６．２．１．２または６．２．１．３に分類される酵素により、２，５−ジヒドロキシペンタン酸を２，５−ジヒドロキシペンタノイルＣｏＡへ変換することができる。次に、酵素番号３．１．２．１または３．１．２．２０に分類される酵素により、２，５−ジヒドロキシペンタノイルＣｏＡを２−ヒドロキシペンタ−４−エン酸へ変換することができる。次に、酵素番号４．１．１．７１または４．１．１．７３に分類される酵素により、２−ヒドロキシペンタ−４−エン酸を３−ブテン−１−オールへ変換することができる。
なお、上述したような反応経路（Ａ−４）の酵素活性を有する微生物は、後述する〈微生物またはその処理物の作製方法〉や実施例に記載の方法で作製することができる。
【００６３】
〈微生物またはその処理物の作製方法〉
本発明で用いることのできる微生物またはその処理物（以下、単に「微生物」と称する場合がある。）としては、キシロースをクロチルアルコールおよび／またはその異性体に変換し得る酵素の活性を有していればよく、天然に該酵素の活性を有する微生物でもよいし、遺伝子改変等により該酵素の活性を付与された微生物であってもよい。
【００６４】
本発明における微生物とは生きている微生物に限らず、生体としては死んでいるが酵素活性を有するものも含む。
また、本発明における微生物の処理物としては、アセトン、トルエン等で処理した菌体、凍結乾燥菌体、菌体破砕物、菌体を破砕した無細胞抽出物、精製酵素（部分的に精製した酵素を含む。）等が挙げられる。また、これらの微生物の処理物を、常法により担体に固定化した固定化物も処理物に含まれる。
【００６５】
微生物の種類は特に限定されないが、大腸菌、コリネ型細菌、シュードモナス属細菌、バチルス属細菌、リゾビウム属細菌、ラクトバチルス属細菌、サクシノバチルス属細菌、アナエロビオスピリラム属細菌、アクチノバチルス属細菌、糸状菌、酵母等が例示され、これらの中でも、大腸菌、酵母、コリネ型細菌が好ましい。
該酵素および／または該酵素反応系の活性が付与された微生物としては、公知の配列をもとに該酵素および／または該酵素反応系をコードするＤＮＡを取得し、これを上記微生
物に、プラスミドベクターや相同組換えなどを利用した形質転換法等により導入することで得ることができる。即ち、プラスミドベクター上に該遺伝子を導入しても、染色体（ゲノム）上に該遺伝子を導入してもよい。宿主微生物が染色体上に該酵素をコードする遺伝子を有する場合は、該遺伝子のプロモーターを強力なプロモーターに置換することによっても本発明で用いる微生物を得ることもできる。宿主微生物の染色体上に該酵素遺伝子がない場合は、該酵素遺伝子を染色体上へ相同組換え法により導入したり、プラスミドベクターにより該酵素遺伝子を導入したりすることもできる。
【００６６】
例えば、宿主微生物に酵素番号４．２．１．１２０に分類される２−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイルＣｏＡデヒドラターゼ遺伝子を導入する際には、適当なプロモーターを該遺伝子の５'-側上流に組み込むことが好ましく、加えてターミネーターを３'-側下流にそれぞれ組み込むことがより好ましい。このプロモーター及びターミネーターとしては、宿主として利用する微生物において機能することが知られているプロモーター及びターミネーターであれば特に限定されず、該酵素遺伝子自身のプロモーター及びターミネーターであってもよいし、他のプロモーター及びターミネーターに置換してもよい。これら各微生物において利用可能なベクター、プロモーター及びターミネーターなどに関しては、例えば「微生物学基礎講座８遺伝子工学・共立出版」などに詳細に記述されている。
【００６７】
該酵素遺伝子は、必要に応じて宿主微生物のコドン使用頻度にあわせて遺伝子配列を最適化することができる。コドン最適化は、例えば、Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１２），２２（３），３１６-３２５に記載の方法や、ＧｅｎＳｃｒ
ｉｐｔ社のＯｐｔｉｍｕｍＧｅｎｅTMサービスを利用する方法がある。  
なお、ＤＮＡの切断、連結、その他、染色体ＤＮＡの調製、ＰＣＲ、プラスミドＤＮＡの調製、形質転換、プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドの設定等の方法は、当業者によく知られている通常の方法を採用することができる。これらの方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ”，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｐｒｅｓｓ，（１９８９）等に記載されている。
以下、微生物の種類ごとに、該酵素および／または該酵素反応系の活性が付与された微生物を得る方法について説明する。
【００６８】
（大腸菌）
宿主微生物として大腸菌を用いる場合、大腸菌の親株としては、例えば、Ｋ１２株またはＢ株、加えてこれらの誘導体を用いることが好ましい。例として、ＨＢ１０１、ＤＨ５α、ＪＭ１０９、ＪＭ１１０，ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＴＨ２、ＴＯＰ１０の株、及びこれらの改良株が挙げられ、これらは市販されている。加えて、例えば一遺伝子破壊株であるＫＥＩＯコレクションで使用されているＢＷ２５１１３株なども利用可能であり、これらはナショナルバイオリソースプロジェクトより分与が可能である。
【００６９】
大腸菌の組換え方法としては、目的とする遺伝子または配列を含むＤＮＡ断片をプラスミドベクターに導入することにより、大腸菌内で前記酵素遺伝子の発現増強が可能な組換えプラスミドベクターを得て、このプラスミドベクターを菌体内へ導入する方法等が挙げられる。
大腸菌に目的とする遺伝子または配列を導入することができるプラスミドベクターとしては、大腸菌内での複製増殖機能を司る遺伝子を少なくとも含むものであれば特に制限されない。プラスミドベクターとしては、例えば、Ｐ１５Ａ、ＣｏｌＥ１（ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ）、ＲＳＦ１０３０、ｐＳＣ１０１、ＣｌｏＤＦ１３などの複製開始点をもつものを好適に用いることができる。
【００７０】
また、プロモーターとしては、大腸菌において機能するものであればいかなるプロモーターであってもよく、導入される遺伝子自身のプロモーターであってもよい。例えば、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ＰＬプロモーター、Ｔ５プロモーター、Ｔ７プロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔａｃプロモーター及びλＰＬプロモーター等を用いることができる。
【００７１】
本発明で用いることができるプラスミドベクターは、例えば、ｐＥＴシリーズ（ノバジェン）、ｐＤＵＡＬシリーズ（スロラタジェン）、ｐＭＡＬシリーズ（ＮＥＢ）、ｐＧＥＸシリーズ（ＧＥヘルスケア）、ｐＫＫ２２３（ＧＥヘルスケア）ｐＴｒｃシリーズ（ライフテクノロジーズ）、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９（タカラバイオ）等が挙がられる。
【００７２】
また、前記＜（Ａ）工程における微生物またはその処理物＞に具体的に挙げた酵素をコードする遺伝子のうち、大腸菌は、酵素番号１．１．１．１に分類されるアルデヒドレダクターゼをコードする遺伝子（ａｄｈＥ）、酵素番号６．２．１．３に分類されるアシルＣｏＡリガーゼをコードする遺伝子（ｆａｄＤ）、および、酵素番号３．２．１．２０に分類されるアシルＣｏＡヒドロラーゼをコードする遺伝子（ｙｃｉＡ）を内在している。そのため、公知の相同組換え法によって、これらの酵素をコードする遺伝子のプロモーターを上述のプロモーター（中でも遺伝子増幅能の高いプロモーターが好ましい。）に置換することもできる。
【００７３】
また、上記の組換え方法に代えて、あるいは、上記の組換え方法に加えて、ａｄｈＥ遺伝子、ｙｃｉＡ遺伝子およびｆａｄＤ遺伝子の一部または全部を上述したものと同様のプラスミドベクターにより導入し、発現させることができる。
また、上記の組換え方法に代えて、あるいは、上記の組換え方法に加えて、公知の相同組換え法によって、前述した外来および内在の遺伝子の一部または全部を導入したり、置換したり、増幅したり、加えて、染色体上へ導入された当該遺伝子のプロモーターへの変異導入、より強力なプロモーターへの置換などによっても高発現株を得ることができる。
【００７４】
（コリネ型細菌）
宿主微生物として、コリネ型細菌（coryneform bacterium）を用いる場合、コリネ型細菌としては、コリネバクテリウム属に属する細菌、ブレビバクテリウム属に属する細菌又はアースロバクター属に属する細菌等が挙げられ、これらのうち、コリネバクテリウム属又はブレビバクテリウム属に属するものが好ましく、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、ブレビバクテリウム・フ
ラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ）、ブレビバクテリウム・アンモ
ニアゲネス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）又はブレビバ
クテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒ
ｍｅｎｔｕｍ）に属する細菌がより好ましい。
【００７５】
本発明において、用いることのできる親株としては、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７）、同ＭＪ−２３３ ＡＢ−４１（ＦＥＲＭ ＢＰ
−１４９８）、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス ＡＴＣＣ６８７２、コリネバク
テリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ３１８３１、及びブレビバクテリウム・ラクトファー
メンタムＡＴＣＣ１３８６９等が挙げられる。
【００７６】
なお、ブレビバクテリウム・フラバムは、現在、コリネバクテリウム・グルタミカムに分類される場合もあることから（Ｌｉｅｌｂｌ，Ｗ．ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，  １９９１，ｖｏｌ．４１，ｐ２５５−２６０）、本発明においては、ブレビバクテリウム
・フラバムＭＪ−２３３株、及びその変異株ＭＪ−２３３  ＡＢ−４１株はそれぞれ、コリネバクテリウム・グルタミカムＭＪ−２３３株及びＭＪ−２３３  ＡＢ−４１株と同一の株であるものとする。なお、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３は、１９７５年４月２８日に通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所（現独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター）（〒３０５−８５６６  日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に受託番号ＦＥＲＭＰ−３０６８として寄託され、１９８１年５月１日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１４９７の受託番号で寄託されている。
【００７７】
本発明の方法において親株として用いられる上記細菌は、野生株だけでなく、ＵＶ照射やＮＴＧ処理等の通常の変異処理により得られる変異株、細胞融合もしくは遺伝子組換え法などの遺伝学的手法により誘導される組換え株などのいずれの株であってもよい。
目的とする遺伝子または配列は、以下に示す方法によりコリネ型細菌に導入することができる。
【００７８】
コリネ型細菌に前記遺伝子をプラスミドベクターにより導入する際、利用できるプラスミドベクターの具体例は、例えば、特開平３−２１０１８４号公報に記載のプラスミドｐＣＲＹ３０；特開平２−７２８７６号公報及び米国特許５，１８５，２６２号明細書公報に記載のプラスミドｐＣＲＹ２１、ｐＣＲＹ２ＫＥ、ｐＣＲＹ２ＫＸ、ｐＣＲＹ３１、ｐＣＲＹ３ＫＥ及びｐＣＲＹ３ＫＸ；特開平１−１９１６８６号公報に記載のプラスミドｐＣＲＹ２およびｐＣＲＹ３；特開昭５８−６７６７９号公報に記載のｐＡＭ３３０；特開昭５８−７７８９５号公報に記載のｐＨＭ１５１９；特開昭５８−１９２９００号公報に記載のｐＡＪ６５５、ｐＡＪ６１１及びｐＡＪ１８４４；特開昭５７−１３４５００号公報に記載のｐＣＧ１；特開昭５８−３５１９７号公報に記載のｐＣＧ２；特開昭５７−１８３７９９号公報に記載のｐＣＧ４およびｐＣＧ１１；Ｐｌａｓｍｉｄ  ｖｏｌ．３６（１）ｐ６２−６６（１９９６）に記載のｐＣ２又はその改変プラスミド等を挙げることができる。
【００７９】
また、前記＜（Ａ）工程における微生物またはその処理物＞に具体的に挙げた酵素をコードする遺伝子のうち、コリネ型細菌は、酵素番号１．１．１．１に分類されるアルデヒドレダクターゼをコードする遺伝子（Ｃｇｌ０２２２）、酵素番号６．２．１．３に分類されるアシルＣｏＡリガーゼをコードする遺伝子（Ｃｇｌ０２８４）を内在しているため、公知の相同組換え法によって、これらの酵素をコードする遺伝子のプロモーターを上述のプロモーター（中でも遺伝子増幅能の高いプロモーターが好ましい。）に置換することも好ましい。
【００８０】
また、上記の組換え方法に代えて、あるいは、上記の組換え方法に加えて、Ｃｇｌ０２２２遺伝子およびＣｇｌ０２８４遺伝子の一部または全部を上述したものと同様のプラスミドベクターにより導入し、発現させることができる。
また、上記の組換え方法に代えて、あるいは、上記の組換え方法に加えて、公知の相同組換え法によって、前述した外来遺伝子の一部または全部を導入したり、置換したり、増幅したり、加えて、染色体上へ導入された当該遺伝子のプロモーターへの変異導入、より強力なプロモーターへの置換などによっても高発現株を得ることができる。
【００８１】
（酵母）
宿主微生物として、酵母を用いる場合、親株として用いる酵母の種類は特に限定されないが、サッカロミセス属、デバリオマイセス属、シゾサッカロマイセス属、キャンディダ属、ヤロウィア属、ロドトルラ属、リポマイセス属、クルイベロマイセス属、ロドスポリジウム属、トリコデルマ属または、トルロプシス属、ピキア属等に属する酵母を親株として用いることが好ましい。例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevi
siae）、サッカロミセス・バヤヌス（Saccharomyces bayanus）、デバリオマイセス・ニ
ルソニ（Debaryomyces nilssonii）、デバリオマイセス・ハンセニ（Debaryomyces hansenii）、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、キャンディダ・グラブラータ（Candida glabrata）、キャンディダ・トロピカリス（Candida tropicalis）、キャンディダ・ユティリス（Candida utilis）、キャンディダ・ボイディニィ（Candida boidinii）、ヤロウィア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）、ロドトルラ・グ
ルティニス（Rhodotorula glutinis）、リポマイセス・リポフェラス（Lipomyces lipoferus）、クルイベロマイセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）、ロドスポリジウム
・トルロイディス（Rhodosporidium toruloides）、トリコデルマ・リセイ（Trichoderma
reesei）、トルロプシス・コリキュロサ（Torulopsis colliculosa）、ピキア・ファリ
ノサ（Pichia farinosa）等が挙げられる。これらの中で、代謝工学的手法が用いやすい
ことからサッカロミセス属が最も好ましい。
【００８２】
さらに、サッカロミセス属は、ｈｉｓ３、ｌｅｕ２、ｔｒｐ１、ｕｒａ３などの栄養要求性の遺伝型であることが望ましく、例えば、サッカロミセス・セレビジエＹＰＨ４９９株（ＭＡＴａ  ｕｒａ３  ｌｙｓ２  ａｄｅ２  ｔｒｐ１  ｈｉｓ３  ｌｅｕ２）（ＡＴＣＣ２０４６７９：Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ又はＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社より入手できる）、サッカロミセス・セレビジエＦＹ１６７９−０６ｃ株（ＭＡＴα  ｕｒａ３  ｌｅｕ２  ｔｒｐ１  ｈｉｓ３）（Ｅｕｒｏｓｃａｒｆ社から入手できる）、サッカロミセス・セレビジエＢＹ４７４１株（ＭＡＴａ，ｈｉｓ３Δ１，ｌｅｕ２Δ０，ｍｅｔ１５Δ０，ｕｒａ３Δ０）（Ｙｅａｓｔ  １４：１１５−１３２（１９９８）、ＡＴＣＣ２０１３８８）なども用いることができる。
【００８３】
目的とする遺伝子または配列は、以下に示す方法により酵母に導入することができる。酵母において外来遺伝子を導入する方法としては、公知の手法を用いることができ、形質転換体において形質転換の目的とした酵素が発現していればよく、遺伝子の導入の方法は限定されない。用いるプラスミドベクターとしては、例えば、後述する３つのプラスミドベクターが挙げられる。（ｉ）酵母に常在する２μｍプラスミドの複製配列を利用した多コピーのＹＥｐ型ベクターを用いることができる。本発明において酵母に遺伝子を導入するために使用できるプラスミドの具体例としては、２μｍプラスミド由来のｐＡＵＲ１１２ベクター（タカラバイオ社製）やｐＥＳＣベクター（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）、ｐＹＥＳベクター（ライフテクノロジーズ）などが挙げられる。これらのベクターは市販されている。（ｉｉ）自立複製配列（ＡＲＳ）とセントロメア配列（ＣＥＮ）を利用した低コピー安定型のＹＣｐ型ベクターを用いることができる。本発明において用いることのできるプラスミドベクターとしては、例えば、ｐＡＵＲ１２３（タカラバイオ）等が挙げられる。（ｉｉｉ）染色体組込みを目的とした酵母内では自律複製をしないＹＩｐ型のプラスミドを用いることができる。これは、酵母の高い相同組換え能を利用するものであり、染色体ゲノムと相同な配列を両端に置き、選択可能なマーカー遺伝子、プロモーター及びターミネーターに挟まれた形で希望の遺伝子をＹＩｐ型のプラスミドに組み込み、これを酵母内に導入することで、外来遺伝子は染色体内に組み込まれ、安定的に外来遺伝子を発現することが期待できる。これは一般的な大腸菌用のプラスミドを用いて構築することが可能であるほか、ＰＣＲや合成ＤＮＡを用いて作製することが可能である。
【００８４】
用いることのできるプロモーターとしては、宿主酵母で機能しうるものであれば特に制限されないが、例えば、ＰＧＫ遺伝子のプロモーター（３−ホスホグリセラートキナーゼ
１９８３、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２１９、６２０−６２５）、ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒドホスフェートデヒドロゲナーゼ１９７９、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５４、９８３９−９８４５）をコードするＴＤＨ遺伝子のプロモーター、ＴＥＦ１遺伝子（伸長因子１、１９８５、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６０、３０９０−３０９６）のプロモーター、アルコールデヒドロゲナーゼをコードするＡＤＨ遺伝子のプロモーター、グルコース
の存在下に抑制される調節可能なＣＹＣ１遺伝子のプロモーター（１９８１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、ＵＳＡ、７８、２１９９−２２０３）、チアミンにより調節され得るＰＨＯ５遺伝子のプロモーター（１９８２、ＥＭＢＯ  Ｊ．、１、６７５−６８０）、グルコース非存在下でガラクトースにより誘導されるＧＡＬ１またはＧＡＬ１０遺伝子のプロモーターなどが挙げられる。
【００８５】
また、前記＜（Ａ）工程における微生物またはその処理物＞に具体的に挙げた酵素をコードする遺伝子のうち、酵母には、酵素番号１．１．１．１に分類されるアルデヒドレダクターゼをコードする遺伝子  （ＡＤＨ１、ＡＤＨ２、ＡＤＨ３、ＡＤＨ４、ＡＤＨ５）、および酵素番号６．２．１．３に分類されるアシルＣｏＡリガーゼをコードする遺伝子（ＦＡＡ２、ＦＡＡ３、ＦＡＡ４）を内在しているため、公知の相同組換え法によって、これらの酵素をコードする遺伝子のプロモーターを上記のプロモーターに置換することが好ましい。
【００８６】
また、上記の組換え方法に代えて、あるいは、上記の組換え方法に加えて、ＡＤＨ１、ＡＤＨ２、ＡＤＨ３、ＡＤＨ４、ＡＤＨ５遺伝子およびＦＡＡ２、ＦＡＡ３、ＦＡＡ４遺伝子の一部または全部を上述したものと同様のプラスミドベクターにより導入し、発現させることができる。
また、上記の組換え方法に代えて、あるいは、上記の組換え方法に加えて、公知の相同組換え法によって、外来および内在遺伝子の一部または全部を導入したり、置換したり、増幅したり、加えて、染色体上へ導入された当該遺伝子のプロモーターへの変異導入、より強力なプロモーターへの置換などによっても高発現株を得ることができる。
【００８７】
なお、酵母の形質転換は、例えば、エレクトロポレーション法（Ｆｒｏｍｍ  ＭＥ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  １９８６，３１９（６０５６）：７９１−７９３）、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法（Ｉｔｏ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ，（１９８３）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５３（１），１６３−１６８）等によって行うことができ、二種以上のプラスミドを導入することもできる。また、酵母における遺伝子の発現増強は、公知の相同組換え法によって宿主のゲノム上で該遺伝子を多コピー化させることによって行うこともできる。例えば、ゲノム組込型プラスミドのうち多コピーがゲノムに組み込まれるベクターを用いる方法（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．１９９１，９，１３８２−１３８５）が挙げられる。ゲノム上の各遺伝子を含む発現単位の挿入箇所は、クロチルアルコールもしくはその異性体の合成関連遺伝子や生育関連遺伝子の発現が阻害されない箇所であれば何れのものでもよい。
【００８８】
＜（Ａ）工程における反応条件＞
上述のようにして得られたキシロースをクロチルアルコールおよび／またはその異性体（以下、クロチルアルコールは異性体を含むものとする）に変換し得る酵素活性を有する微生物または処理物を用いてキシロースからクロチルアルコールを製造することができる。
【００８９】
この場合、微生物を生育させつつ、キシロースをクロチルアルコールに変換させることが好ましく、用いる水性媒体（培地）及び培養条件は、使用する微生物の種類に応じて適宜設定することができるが、炭素源、窒素源、無機塩及び必要に応じその他の有機微量栄養素を含有する通常の培地を用いることができる。培養およびキシロースをクロチルアルコールへの変換は、用いる微生物の生育が可能な条件で行われる。通常、培養温度１０℃〜４５℃で１２時間〜９６時間実施する。
【００９０】
水性媒体としては、後述の炭素源等を含む培地や、水、リン酸塩、炭酸塩、酢酸塩、ほう酸塩、クエン酸塩、トリスなどの緩衝液、メタノール、エタノールなどのアルコール類
、酢酸エチルなどのエステル類、アセトンなどのケトン類、アセトアミドなどのアミド類等が挙げられる。
また、水性媒体に含まれるキシロースの濃度は、通常１ｍｇ／Ｌ以上、好ましくは１０ｍｇ／Ｌ以上であり、また、通常２００ｇ／Ｌ以下、好ましくは１００ｇ／Ｌ以下である。
【００９１】
炭素源は、上記微生物が資化しうる炭素源であれば特に限定されないが、例えば、ガラクトース、ラクトース、グルコース、フルクトース、グリセロール、シュークロース、サッカロース、デンプン、セルロース等の炭水化物；グリセリン、マンニトール、キシリトール、リビトール等のポリアルコール類等の発酵性糖質が用いられる。
窒素源としては、例えば、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩の他、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカー等が用いられる。
【００９２】
無機塩としては、例えば、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム等が用いられる。
また、ビオチン、パントテン酸、イノシトール、ニコチン酸等のビタミン類、ヌクレオチド、アミノ酸などの生育を促進する因子を必要に応じて添加してもよい。
クロチルアルコールおよび／またはその異性体は当該技術分野において周知の方法、例えば、有機溶媒を用いる抽出、蒸留、カラムクロマトグラフィーなどにより、水性媒体または菌体内から回収および精製することができる。
【００９３】
＜（Ｂ）工程＞
（Ｂ）工程は、（Ａ）工程で得られたクロチルアルコールおよび／またはその異性体を脱水する工程である。
（Ｂ）工程では、通常、化学的な反応によりクロチルアルコールおよび／またはその異性体の脱水が行なわれるため、（Ａ）工程と（Ｂ）工程との間に、必要に応じて、（Ａ）工程で使用した微生物またはその処理物を分離、除去したり、（Ａ）工程の水性媒体からクロチルアルコールおよび／またはその異性体を回収したり、さらには、回収されたクロチルアルコールおよび／またはその異性体を濃縮したりする工程を設けることができる。（Ｂ）工程では、公知の手法により、（Ａ）工程で得られたクロチルアルコールおよび／またはその異性体を脱水すればよく、その反応条件に特に制限はないが、例えば、２００〜５００℃、毎分１〜４０ｃｃの酸素通気下、ガス化したクロチルアルコールおよびその異性体を触媒の存在下、１〜２０時間反応させることにより、脱水することができる。
また、用いる触媒には特に制限はないが、モリブデン、ビスマス、及び鉄を含む酸化物触媒が好ましく、中でも、モリブデン酸ビスマス触媒が好ましい。
【００９４】
＜１，３−ブタジエンの用途＞
本発明の方法により製造された１，３−ブタジエンは、合成ゴムの生産などの用途に好適に用いることができる。
なお、本発明によれば、以下の２つの製造方法も提供される。
本発明によれば、２，５−ジオキソペンタン酸を２−オキソ−５−ヒドロキシペンタン酸に変換し得る酵素活性，２−オキソ−５−ヒドロキシペンタン酸を２−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイルＣｏＡに変換し得る酵素活性，２−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイルＣｏＡを２−オキソペンタ−４−エノイルＣｏＡに変換し得る酵素活性，２−オキソペンタ−４−エノイルＣｏＡを２−オキソペンタ−４−エン酸を有する微生物またはその処理物の存在下で２，５−ジオキソペンタン酸から２−オキソペンタ−４−エン酸を生成させることを特徴とする、２−オキソペンタ−４−エン酸の製造方法も提供される。
【００９５】
また、本発明によれば、２，５−ジオキソペンタン酸を２−ヒドロキシ−５−ヒドロキ
シペンタン酸に変換し得る酵素活性，２−ヒドロキシ−５−ヒドロキシペンタン酸を２，５−ジヒドロキシペンタン酸に変換し得る酵素活性，２，５−ジヒドロキシペンタン酸を２，５−ジヒドロキシペンタノイルＣｏＡに変換し得る酵素活性，２，５−ジヒドロキシペンタノイルＣｏＡを２−ヒドロキシペンタ−４−エノイルＣｏＡに変換し得る酵素活性，２−ヒドロキシペンタ−４−エノイルＣｏＡを２−ヒドロキシペンタ−４−エン酸に変換し得る酵素活性、および２−ヒドロキシペンタ−４−エン酸に変換する酵素活性を有する微生物またはその処理物の存在下で２，５−ジオキソペンタン酸から２−ヒドロキシペンタ−４−エン酸を生成させることを特徴とする、２−ヒドロキシペンタ−４−エン酸の製造方法も提供される。
【００９６】
上記の２，５−ジオキソペンタン酸から２−オキソペンタ−４−エン酸または２−ヒドロキシペンタ−４−エン酸を生成させる反応経路については、各反応を触媒する全ての酵素の活性を本来的または外来的に有する微生物を用い、同一反応系で、出発物質である２，５−ジオキソペンタン酸から２−オキソペンタ−４−エン酸または２−ヒドロキシペンタ−４−エン酸への変換反応を行うことが好ましい。
【００９７】
すなわち、２，５−ジオキソペンタン酸から２−オキソペンタ−４−エン酸または２−ヒドロキシペンタ−４−エン酸に至る上記各反応を触媒する酵素活性を有する微生物の菌体もしくはその処理物を、２，５−ジオキソペンタン酸を含む反応液中に加え、通常２０〜４０℃で反応させることにより２−オキソペンタ−４−エン酸または２−ヒドロキシペンタ−４−エン酸を生成させることができる。必要に応じて、補酵素等を加えることが好ましい。
【００９８】
また、２−オキソペンタ−４−エン酸または２−ヒドロキシペンタ−４−エン酸生産能を有し２，５−ジオキソペンタン酸から２−オキソペンタ−４−エン酸または２−ヒドロキシペンタ−４−エン酸に至る上記各反応を触媒する酵素活性を有する微生物を用い、グルコースやキシロースなどの炭素源から発酵法により２−オキソペンタ−４−エン酸または２−ヒドロキシペンタ−４−エン酸を製造することもできる。この場合、微生物の培養に用いる培地及び培養条件は、使用する微生物の種類に応じて適宜設定することができるが、炭素源、窒素源、無機塩及び必要に応じその他の有機微量栄養素を含有する通常の培地を用いることができる。培養は、用いる微生物の生育に好適な条件で行われる。通常、培養温度１０℃〜４５℃で１２〜９６時間実施する。
【実施例】
【００９９】
以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明する。ただし、本発明は以下の態様には限定されない。
実施例１  （キシロースから２，５−ジオキソペンタン酸を合成する組換え大腸菌）
キシロースから２，５−ジオキソペンタン酸を合成する組換え大腸菌は、一般的な分子生物学的手法（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ｉｎ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（２００３）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ，
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（２００１）など）を用いることにより、次の手順で作成することができる。
【０１００】
Trichoderma ressei由来のｘｙｌ１遺伝子、Gluconobactor oxydans由来のｘｙｌＤ遺
伝子およびAzospirillum brasilence由来のＡｒａＤ遺伝子を連結し、大腸菌プラスミド
ベクターｐＥＴ２１ａ（ノバジェン）のＴ７プロモーター下流側に組み込んだプラスミドｐＸＹＬ１を構築する。得られたプラスミドｐＸＹＬ１を用いて、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換することによりｘｙｌ１、ｘｙｌＤおよびＡｒａＤ遺伝子のコピー数を増加させた組換え大腸菌株を作製し、この大腸菌株をＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＸＹＬ１と
命名する。
【０１０１】
なお、必要に応じて、一般的な分子生物学的手法により、菌株を改良することができる。２，５−ジオキソペンタン酸の生産性を向上させるための改良方法として、例えば、ＭＭＡ生産経路の律速反応となっている酵素に関して、遺伝子コピー数を増やしたり、コドンを最適化したり、酵素活性部位近辺のアミノ酸置換により酵素活性を増加させたりする方法、また、副生成物を生産する反応を触媒する酵素の遺伝子を破壊する方法、また、ＮＴＧや紫外線による変異処理を行い２，５−ジオキソペンタン酸生産性が向上した菌体を選抜することを繰り返し行う方法等を利用することができる。
【０１０２】
また、必要に応じて、分子進化工学的手法を用いて、酵素活性を改良して生産性を向上させることができる。このような方法として、具体的には、エラープローンＰＣＲ法により、ｘｙｌ１、ｘｙｌＤおよび／またはＡｒａＤ遺伝子自体に変異を導入する方法が挙げられる。この方法では、変異遺伝子ライブラリー作成を行うために、ｘｙｌ１、ｘｙｌＤおよび／またはＡｒａＤがコードする酵素の分子内に数箇所の変異導入が得られる条件（エラー率０．５％前後）となるように、マグネシウム濃度を変更する、マンガンを添加する等して、ポリメラーゼの塩基取り込み間違いを促進させる。例えば、ｘｙｌ１、ｘｙｌＤおよび／またはＡｒａＤ遺伝子を含むプラスミドＤＮＡ、２．５ユニットのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、各０．５μＭの遺伝子末端のプライマーセット１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）緩衝液、５０ｍＭ  ＫＣｌ、５．０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．５ｍＭ
ＭｎＣｌ２のそれぞれを混合して滅菌水で５０μＬにあわせて反応液を調製し、エラープローンＰＣＲ反応を実施する。次に、エラープローンＰＣＲによりランダムに変異を導入した遺伝子断片を、公知の一般的な手法により、前記プラスミドｐＸＹＬ１へ再導入する。得られた組換え菌を上記と同様の手法により培養することで２，５−ジオキソペンタン酸の蓄積を解析し、生産性の高い組み換え菌を選択する。
【０１０３】
ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＸＹＬ１は、周知の方法（日本生物工学会編，生物工学実験書（２００２）；  Ｖｏｇｅｌ  Ｈ．  ｅｔ  ａｌ，  Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，  ２ｎｄ  Ｅｄ．（２００７）  など）により培養することができる。５０μｇ／ｍｌアンピシリン、０．２ｍＭ  ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）を添加したＬＢ培地１００ｍｌに、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＴａｍを播種し、フラスコを用いて、３７℃で２４時間以上培養する。ジャーファーメンターを使用して培養を実施する場合は、基質の供給速度、攪拌回転数、通気量、ｐＨなどを適正な範囲で制御することができる。必要に応じて、嫌気条件、微好気条件、好気条件を選択することができる。また、回分培養、半回分培養、連続培養などの形態も自由に選択することができる。
【０１０４】
培養液を遠心分離することで分離した菌体は、中性付近に緩衝能が高いリン酸の緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌまたはＨＥＰＥＳ緩衝液）に縣濁し、そこにキシロースを添加することで反応を開始することができる。反応開始から経時的にサンプリングを行い、２，５−ジオキソペンタン酸の生成を確認する。
また、５０μｇ／ｍｌアンピシリン、０．２ｍＭ  ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）および２０ｇ／ｌのキシロースを添加した最小培地で培養を行うことで２，５−ジオキソペンタン酸の生成を確認することもできる。
【０１０５】
または、上述の培養に代えて、遠心分離した菌体を超音波処理による物理的破砕、またはＢｕｇｂａｓｔｅｒ（ノバジェン）にて処理し、同様に緩衝液に懸濁し、反応を実施することもできる。
なお、培養液中のキシロースおよび２，５−ジオキソペンタン酸の濃度は、高速液体クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー質量分析装置（Ｇ
Ｃ−ＭＳ）、液体クロマトグラフィー質量分析装置（ＬＣ−ＭＳ）などにより測定することができる。
【０１０６】
また、ｘｙｌ１、ｘｙｌＤおよび／またはＡｒａＤ遺伝子が発現していることの確認は、ノーザンブロット法、リアルタイムＰＣＲ法、免疫ブロット法などの周知の方法により調べることができる。
実施例１の反応液（培養液）中に蓄積した２，５−ジオキソペンタン酸は、常法に従って、反応液より回収することができる。具体的には、遠心分離、ろ過等により菌体等の固形物を除去した後、その溶液から蒸留、晶析、抽出、あるいはカラムクロマトグラフィー等の操作により２，５−ジオキソペンタン酸を分離・精製することができる。
【０１０７】
実施例２（２，５−ジオキソペンタン酸から２−オキソペンタ−４−エン酸を合成する組換え大腸菌）
２，５−ジオキソペンタン酸から２−オキソペンタ−４−エン酸を合成する組換え大腸菌は、一般的な分子生物学的手法を用いることにより、次の手順で作成することができる。
【０１０８】
Clostridium Kluyveri由来のＡｂｆＤ遺伝子、Dictyostelium discoideum由来のｅｌｏＡ遺伝子およびSaccharomyces cerevisiae由来のＡＣＨ１ｐ遺伝子を連結し、大腸菌プラスミドベクターｐＥＴ２１ａ（ノバジェン）のＴ７プロモーター下流側に組み込んだプラスミドｐＸＹＬ２を構築する。得られたプラスミドｐＸＹＬ２を用いて、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換することによりＡｂｆＤ、ｅｌｏＡおよびＡＣＨ１ｐ遺伝子のコピー数を増加させた組換え大腸菌株を作製し、この大腸菌株をＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＸＹＬ２と命名する。
【０１０９】
なお、必要に応じて、一般的な分子生物学的手法により、実施例１と同様、菌株および酵素活性の改良をすることができる。得られた組換え菌を実施例１と同様の手法により培養することで２−オキソペンタ−４−エン酸の蓄積を解析し、生産性の高い組み換え菌を選択する。
ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＸＹＬ２は、周知の方法（日本生物工学会編，生物工学実験書（２００２）；Ｖｏｇｅｌ  Ｈ．  ｅｔ  ａｌ，Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，２ｎｄ  Ｅｄ．（２００７）など）により培養することができる。このとき、実施例１の場合と同様に、ジャーファーメンターを使用して培養することもできる。
【０１１０】
培養液を遠心分離することで分離した菌体は、中性付近に緩衝能が高いリン酸の緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌまたはＨＥＰＥＳ緩衝液）に縣濁し、そこに２，５−ジオキソペンタン酸を添加することで反応を開始することができる。反応開始から経時的にサンプリングを行い、２−オキソペンタ−４−エン酸の生成を確認する。
また、５０μｇ／ｍｌアンピシリン、０．２ｍＭ  ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）および２０ｇ／ｌの２，５−ジオキソペンタン酸を添加した最小培地で培養を行うことで２−オキソペンタ−４−エン酸の生成を確認することもできる。
【０１１１】
または、上述の培養に代えて、遠心分離した菌体を超音波処理による物理的破砕、またはＢｕｇｂａｓｔｅｒ（ノバジェン）にて処理し、同様に緩衝液に懸濁し、反応を実施することもできる。
なお、培養液中の２，５−ジオキソペンタン酸および２−オキソペンタ−４−エン酸の濃度、ＡｂｆＤ、ｅｌｏＡおよび／またはＡＣＨ１ｐ遺伝子が発現していることの確認は、実施例１に記載の方法で行なうことができる。
【０１１２】
実施例３（２−オキソペンタ−４−エン酸から３−ブテン−１−オールを合成する組換え大腸菌）
２−オキソペンタ−４−エン酸から３−ブテン−１−オールを合成する組換え大腸菌は、一般的な分子生物学的手法を用いることにより、次の手順で作成することができる。
Homo sapiens由来のＡＬＫＢＨ４を大腸菌プラスミドベクターｐＥＴ２１ａ（ノバジェン）のＴ７プロモーター下流側に組み込んだプラスミドｐＸＹＬ３を構築する。得られたプラスミドｐＸＹＬ３を用いて、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換することによりＡＬＫＢＨ４遺伝子のコピー数を増加させた組換え大腸菌株を作製し、この大腸菌株をＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＸＹＬ３と命名する。
【０１１３】
なお、必要に応じて、一般的な分子生物学的手法により、実施例１と同様、菌株および酵素活性の改良をすることができる。得られた組換え菌を実施例１と同様の手法により培養することで３−ブテン−１−オールの蓄積を解析し、生産性の高い組み換え菌を選択する。
ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＸＹＬ３は、周知の方法により培養することができる。このとき、実施例１の場合と同様に、ジャーファーメンターを使用して培養することもできる。
【０１１４】
培養液を遠心分離することで分離した菌体は、中性付近に緩衝能が高いリン酸の緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌまたはＨＥＰＥＳ緩衝液）に縣濁し、そこに２−オキソペンタ−４−エン酸を添加することで反応を開始することができる。反応開始から経時的にサンプリングを行い、３−ブテン−１−オールの生成を確認する。
また、５０μｇ／ｍｌアンピシリン、０．２ｍＭ  ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）および２０ｇ／ｌの２−オキソペンタ−４−エン酸を添加した最小培地で培養を行うことで３−ブテン−１−オールの生成を確認することもできる。
【０１１５】
または、上述の培養に代えて、遠心分離した菌体を超音波処理による物理的破砕、またはＢｕｇｂａｓｔｅｒ（ノバジェン）にて処理し、同様に緩衝液に懸濁し、反応を実施することもできる。
なお、培養液中の３−ブテン−１−オールおよび２−オキソペンタ−４−エン酸の濃度、ＡＬＫＢＨ４遺伝子が発現していることの確認は、実施例１に記載の方法で行なうことができる。
【０１１６】
実施例４（キシロースから3−ブテン−1−オールの合成）
実施例１〜３で作成した組換え大腸菌株を用いてキシロースから３−ブテン−１−オールは、次の手順で作成することができる。なお、本実施例の反応経路は、前記（Ａ−３）に相当する。
実施例１〜３で作製した組換え大腸菌をそれぞれ実施例１〜３に記載の方法により培養し、培養液を遠心分離することで菌体を分離、回収する。中性付近に緩衝能が高いリン酸の緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌまたはＨＥＰＥＳ緩衝液）に、回収した菌体（実施例１〜３で作製した菌体）を混合して縣濁し、そこにキシロースを添加することで反応を開始することができる。反応開始から経時的にサンプリングを行い、３−ブテン−１−オールの生成を確認する。
【０１１７】
培養に用いる培地は、実施例１に記載の培地の他、５０μｇ／ｍｌアンピシリン、０．２ｍＭ  ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）および２０ｇ／ｌの２−オキソペンタ−４−エン酸を添加した最小培地を用いることもできる。培養中のサンプルを適時抜き出し、分析に供することで３−ブテン−１−オールの生成を確認することもできる。
【０１１８】
または、上述の培養に代えて、遠心分離した菌体を超音波処理による物理的破砕、またはＢｕｇｂａｓｔｅｒ（ノバジェン）にて処理し、同様に緩衝液に懸濁し、反応を実施することもできる。
なお、培養液中のキシロース、２，５−ジオキソペンタン酸、２−オキソペンタ−４−エン酸、および３−ブテン−１−オールの濃度、実施例１〜３に記載の方法で行なうことができる。
【０１１９】
実施例５（３−ブテン−１−オールから１，３−ブタジエンの合成）
次の手順により、実施例４で作成した３−ブテン−１−オールを用いて１，３−ブタジエンを作成することができる。
４５０℃の高温下でガス化させた３−ブテン−１−オール、酸素ガス、およびヘリウムガスを、それぞれ毎分２０ｍｌ、毎分２０ｍｌ、および毎分２２０ｍｌでモリブデン酸ビスマス触媒を充填した反応器に供する。反応開始３０分から６０分の間に反応器から流出した出口ガスを冷却液化して捕集し、本流出物をガスクロマトグラフィーで分析することにより、３−ブテン−１−オールの生成を確認する。
【０１２０】
実施例６（（２，５−ジオキソペンタン酸から２−オキソペンタ−４−エン酸を合成する組換え酵母）
２，５−ジオキソペンタン酸から２−オキソペンタ−４−エン酸を合成する組換え酵母は、一般的な分子生物学的手法を用いることにより、次の手順で作成することができる。
必要に応じてコドン配列を最適化したClostridium Kluyveri由来のＡｂｆＤ遺伝子を、３−フォスフォグリセレートキナーゼ１遺伝子のプロモーター下流に連結し、連結した配列を、酵母プラスミドベクターｐＥＳＣ−ＬＥＵ（ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）に組み込み、プラスミドｐＸＹＬ４を構築する。得られたプラスミドｐＸＹＬ４を用いて、サッカロミセス・セレビジエＹＰＨ４９９株（ＭＡＴａ  ｕｒａ３  ｌｙｓ２  ａｄｅ２  ｔｒｐ１  ｈｉｓ３  ｌｅｕ２）（ＡＴＣＣ２０４６７９：Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ又はＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社より入手できる）を形質転換することによりＡｂｆＤ遺伝子のコピー数を増加させた組換え酵母株を作製し、この酵母株をＹＰＨ４９９／ｐＸＹＬ４と命名する。
【０１２１】
なお、菌株は、実施例１と同様の方法で、改良することができる。
また、前記Clostridium Kluyveri由来のＡｂｆＤ遺伝子は酵母発現用に配列を最適化することが好ましい。最適化する方法としては、実施例１の記載のエラープローンＰＣＲ法により、ＡｂｆＤ遺伝子自体に変異を導入する方法が挙げられる。
ＹＰＨ４９９／ｐＸＹＬ４は、周知の方法（日本生物工学会編，生物工学実験書（２００２）；Ｖｏｇｅｌ  Ｈ．ｅｔ  ａｌ，Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，２ｎｄ  Ｅｄ．（２００７）など）により培養することができる。ウラシルのみを含まず、アデニン、ロイシン、トリプトファン、リジン、ヒスチジンを含むＳＤ（２％グルコース）培地にＹＰＨ４９９／ｐＸＹＬ４を播種し、３０℃で６−１０時間培養する。菌体を遠心回収し、２度、菌体を滅菌水で洗浄した後、再度炭素源として２％ガラクトースを含み、アデニン、ロイシン、トリプトファン、リジン、ヒスチジンを含むＳＧ培地に播種し、一晩、３０℃にて培養する。このとき、実施例１の場合と同様に、ジャーファーメンターを使用して培養することもできる。
【０１２２】
培養液を遠心分離することにより分離した酵母菌体は、中性付近に緩衝能が高いリン酸の緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌまたはＨＥＰＥＳ緩衝液）に縣濁し、そこに、２，５−ジオキソペンタン酸を添加することで反応を開始することができる。反応開始から経時的にサンプリングを行い、２−オキソペンタ−４−エン酸の生成を確認する。
なお、培養液中の２，５−ジオキソペンタン酸および２−オキソペンタ−４−エン酸の
濃度、およびｐＸＹＬ４遺伝子が発現していることの確認は、実施例１に記載の方法で行なうことができる。
【０１２３】
実施例７（（２−オキソペンタ−４−エン酸から３−ブテン−１−オールを合成する組換え酵母）
２−オキソペンタ−４−エン酸から３−ブテン−１−オールを合成する組換え酵母は、一般的な分子生物学的手法を用いることにより、次の手順で作成することができる。
必要に応じてコドン配列を最適化したHomo sapiens由来のＡＬＫＢＨ４遺伝子を、３−フォスフォグリセレートキナーゼ１遺伝子のプロモーター下流に連結し、連結した配列を、酵母プラスミドベクターｐＥＳＣ−ＬＥＵ（ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）に組み込み、プラスミドｐＸＹＬ５を構築する。得られたプラスミドｐＸＹＬ５を用いて、サッカロミセス・セレビジエＹＰＨ４９９株（ＭＡＴａ  ｕｒａ３  ｌｙｓ２  ａｄｅ２  ｔｒｐ１
ｈｉｓ３  ｌｅｕ２）（ＡＴＣＣ２０４６７９：Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ又はＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社より入手できる）を形質転換することによりＡｂｆＤ遺伝子のコピー数を増加させた組換え酵母株を作製し、この酵母株をＹＰＨ４９９／ｐＸＹＬ５と命名する。
【０１２４】
なお、菌株は、実施例１と同様の方法で、改良することができる。
また、前記Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ由来のＡＬＫＢＨ４遺伝子は酵母発現用に配列を最適化することが好ましい。最適化する方法としては、実施例１の記載のエラープローンＰＣＲ法により、ＡＬＫＢＨ４遺伝子自体に変異を導入する方法が挙げられる。
ＹＰＨ４９９／ｐＸＹＬ５は、周知の方法により培養することができる。ウラシルのみを含まず、アデニン、ロイシン、トリプトファン、リジン、ヒスチジンを含むＳＤ（２％グルコース）培地にＹＰＨ４９９／ｐＸＹＬ５を播種し、３０℃で６−１０時間培養する。菌体を遠心回収し、２度、菌体を滅菌水で洗浄した後、再度炭素源として２％ガラクトースを含み、アデニン、ロイシン、トリプトファン、リジン、ヒスチジンを含むＳＧ培地に播種し、一晩、３０℃にて培養する。このとき、実施例１の場合と同様に、ジャーファーメンターを使用して培養することもできる。
【０１２５】
培養液を遠心分離することにより分離した酵母菌体は、中性付近に緩衝能が高いリン酸の緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌまたはＨＥＰＥＳ緩衝液）に縣濁し、そこに、２−オキソペンタ−４−エン酸を添加することで反応を開始することができる。反応開始から経時的にサンプリングを行い、３−ブテン−１−オールの生成を確認する。
なお、培養液中の２−オキソペンタ−４−エン酸および３−ブテン−１−オールの濃度、およびｐＸＹＬ５遺伝子が発現していることの確認は、実施例１に記載の方法で行なうことができる。
【０１２６】
実施例８（２，５−ジオキソペンタン酸から２−オキソペンタ−４−エン酸を合成する組換えコリネ型細菌）
２，５−ジオキソペンタン酸から２−オキソペンタ−４−エン酸を合成する組換えコリネ型細菌株は、一般的な分子生物学的手法を用いることにより、次の手順で作成することができる。
【０１２７】
必要に応じてコドン最適化処理がなされたClostridium Kluyveri由来のＡｂｆＤ遺伝子、Dictyostelium discoideum由来のeloA遺伝子およびSaccharomyces cerevisiae由来のACH1p遺伝子を連結し、プラスミドベクターｐＴＺ４（特開２００６−３２０２０８）のＴ
Ｚ４プロモーター下流側に組み込んだプラスミドｐＸＹＬ６を構築する。得られたプラスミドｐＸＹＬ６を用いて、コリネ型細菌ＭＪ２３３株を形質転換することによりＡｂｆＤ、ｅｌｏＡおよびＡＣＨ１ｐ遺伝子のコピー数が増加した組換えコリネ株を作成し、ＭＪ２３３／ｐＸＹＬ６と命名する。
【０１２８】
なお、菌株は、実施例１と同様の方法で、改良することができる。
また、前記ＡｂｆＤ、ｅｌｏＡおよびＡＣＨ１ｐ遺伝子はコリネ株の発現用に配列を最適化することが好ましい。最適化する方法としては、実施例１の記載のエラープローンＰＣＲ法により、ＡｂｆＤ、ｅｌｏＡおよび／またはＡＣＨ１ｐ遺伝子自体に変異を導入する方法が挙げられる。
【０１２９】
ＭＪ２３３／ｐＸＹＬ６は、周知の方法により培養することができる。グルコース２％、２５μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＡ培地（尿素  ２ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４  ７ｇ、ＫＨ２ＰＯ４  ０．５ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４  ０．５ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．５ｇ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ６ｍｇ、ＭｎＳＯ４・４−５Ｈ２Ｏ６ｍｇ、ビオチン  ２００μｇ、チアミン  １００μｇ、イーストエキストラクト  １ｇ、カザミノ酸  １ｇ、グルコース  ２０ｇを、蒸留水１Ｌに溶解させた培地）１００ｍｌに、ＭＪ２３３／ｐＸＹＬ６を播種し、フラスコを用いて、３７℃で２４時間以上培養する。このとき、実施例１（大腸菌）の場合と同様に、ジャーファーメンターを使用して培養することもできる。
【０１３０】
培養液を遠心分離することにより回収される菌体は、中性付近に緩衝能が高いリン酸の緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌまたはＨＥＰＥＳ緩衝液）に縣濁し、そこに、２，５−ジオキソペンタン酸を添加することにより、２，５−ジオキソペンタン酸から２−オキソペンタ−４−エン酸へ変換する反応が開始する。反応開始から経時的にサンプリングを行い２−オキソペンタ−４−エン酸の生成を確認することができる。
なお、培養液中の２，５−ジオキソペンタン酸および２−オキソペンタ−４−エン酸の濃度、およびＡｂｆＤ、ｅｌｏＡおよび／またはＡＣＨ１ｐ遺伝子が発現していることの確認は、実施例１に記載の方法で行なうことができる。
【０１３１】
実施例９（２−オキソペンタ−４−エン酸から３−ブテン−１−オールを合成する組換えコリネ型細菌）
２−オキソペンタ−４−エン酸から３−ブテン−１−オールを合成する組換えコリネ型細菌株は、一般的な分子生物学的手法を用いることにより、次の手順で作成することができる。
【０１３２】
必要に応じてコドン最適化処理がなされた  Homo sapiens由来のＡＬＫＢＨ４遺伝子を、プラスミドベクターｐＴＺ４（特開２００６−３２０２０８）のＴＺ４プロモーター下流側に組み込んだプラスミドｐＸＹＬ７を構築する。得られたプラスミドｐＸＹＬ５を用いて、コリネ型細菌ＭＪ２３３株を形質転換することによりＡＬＫＢＨ４遺伝子のコピー数が増加した組換えコリネ株を作成し、ＭＪ２３３／ｐＸＹＬ７と命名する。
【０１３３】
なお、菌株は、実施例１と同様の方法で、改良することができる。
また、前記ＡＬＫＢＨ４遺伝子はコリネ株の発現用に配列を最適化することが好ましい。最適化する方法としては、実施例１の記載のエラープローンＰＣＲ法により、ＡＬＫＢＨ４遺伝子自体に変異を導入する方法が挙げられる。
ＭＪ２３３／ｐＸＹＬ７は、実施例１に記載の方法と同様に培養することもできる。
【０１３４】
培養液を遠心分離することにより回収される菌体は、中性付近に緩衝能が高いリン酸の緩衝液（Tris-HClまたはHEPES緩衝液）に縣濁し、そこに、２−オキソペンタ−４−エン
酸を添加することにより、２−オキソペンタ−４−エン酸から３−ブテン−１−オールへ変換する反応が開始する。反応開始から経時的にサンプリングを行い３−ブテン−1−オ
ールの生成を確認することができる。
【０１３５】
なお、培養液中の２−オキソペンタ−４−エン酸および３−ブテン−１−オールの濃度
、およびＡＬＫＢＨ４遺伝子遺伝子が発現していることの確認は、実施例１に記載の方法で行なうことができる。
実施例１〜９の反応液（培養液）中に蓄積した２，５−ジオキソペンタン酸、２−オキソペンタ−４−エン酸および３−ブテン−１−オールは、常法に従って、反応液（水性媒体）より回収することができる。具体的には、遠心分離、ろ過等により菌体等の固形物を除去した後、その溶液から蒸留、晶析、抽出、あるいはカラムクロマトグラフィー等の操作により２，５−ジオキソペンタン酸、２−オキソペンタ−４−エン酸、または３−ブテン−１−オールを分離、精製することができる。
【図１】
2014030376.tif 000019
【図２】
2014030376.tif 000020