(57)【要約】【課題】脳腫瘍、白血病、大腸がん、胃がん、甲状腺がん、悪性黒色腫などの癌におけるＩＤＨ変異を検出するための新規なマーカおよび方法を提供する。【解決手段】トランス−グルタコン酸、シトラコン酸、５−オキソ−テトラヒドロフラン−２−カルボン酸、トリゴネリン、ジヒドロタキステロール、４−アミノ−３−ヒドロキシ酪酸、５−アミノ吉草酸、ホモセリン、イソバレリルカルニチン、Ｎ８−アセチルスペルミジン、オクタノイルカルニチン、ケノデオキシコール酸、およびウルソデオキシコール酸からなる群より選ばれる少なくとも一つを測定することを含む方法によって、イソクエン酸脱水素酵素変異を検出する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
トランス−グルタコン酸、シトラコン酸、５−オキソ−テトラヒドロフラン−２−カルボン酸、トリゴネリン、ジヒドロタキステロール、４−アミノ−３−ヒドロキシ酪酸、５−アミノ吉草酸、ホモセリン、イソバレリルカルニチン、Ｎ８−アセチルスペルミジン、オクタノイルカルニチン、ケノデオキシコール酸、およびウルソデオキシコール酸からなる群より選ばれる少なくとも一つを含む
イソクエン酸脱水素酵素変異検出用マーカ。
【請求項２】
イソクエン酸脱水素酵素変異が検出される疾患が、脳腫瘍、白血病、大腸がん、胃がん、甲状腺がんおよび悪性黒色腫からなる群より選ばれる少なくとも一つである、請求項１に記載の検出用マーカ。
【請求項３】
トランス−グルタコン酸、シトラコン酸、５−オキソ−テトラヒドロフラン−２−カルボン酸、トリゴネリン、ジヒドロタキステロール、４−アミノ−３−ヒドロキシ酪酸、５−アミノ吉草酸、ホモセリン、イソバレリルカルニチン、Ｎ８−アセチルスペルミジン、オクタノイルカルニチン、ケノデオキシコール酸、およびウルソデオキシコール酸からなる群より選ばれる少なくとも一つを測定することを含む、イソクエン酸脱水素酵素変異の検出方法。
【請求項４】
イソクエン酸脱水素酵素変異が検出される疾患が、脳腫瘍、白血病、大腸がん、胃がん、甲状腺がんおよび悪性黒色腫からなる群より選ばれる少なくとも一つである、請求項３に記載の検出方法。
【請求項５】
測定を磁気共鳴法にて行う請求項３に記載の検出方法。
【請求項６】
測定を採取した血液の検査で行う請求項３に記載の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イソクエン酸脱水素酵素（以下、ＩＤＨということがある。）変異検出用マーカおよびＩＤＨ変異の検出方法に関する。より詳細に、本発明は、脳腫瘍、白血病、大腸がん、胃がん、甲状腺がん、悪性黒色腫などの癌におけるＩＤＨ変異を検出するためのマーカおよび方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
原発性脳腫瘍の中で最も頻度の高い腫瘍をグリオーマ（神経膠腫）という。グリオーマの中で最も悪性度の高いグリオブラストーマの生存期間中央値は、約21.4か月と他の癌腫と比較して極端に悪い。脳腫瘍の網羅的遺伝子解析の結果、ＩＤＨ１に変異がみられないグリオーマでは、ＩＤＨ２のアミノ酸類似体（Ｒ１７２）に影響を及ぼす変異が高頻度に認められたが、ＩＤＨ１，ＩＤＨ２のいずれかが変異したグリオーマは特徴的な遺伝的特性と臨床的特性をもっており、このような変異型のＩＤＨを有する患者は、正常型のＩＤＨを有する患者よりも転帰（変異型31か月、正常型15か月）が優れていたと非特許文献２は報告している。
【０００３】
脳腫瘍、白血病、大腸がん、胃がん、甲状腺がん、悪性黒色腫などの癌において、イソクエン酸脱水素酵素をコードする遺伝子ＩＤＨ１およびＩＤＨ２の変異が見つかっている。変異型ＩＤＨ群のゲノムＤＮＡにおいてＣｐＧサイトの過剰メチル化（hypermethylation）が報告されている（非特許文献５）。ＭＧＭＴ（methyl guanine methyl transferase）プロモータ領域の過剰メチル化によって化学療法感受性増大により予後良好の機序になるとの報告がなされている（非特許文献４）。ＭＧＭＴは抗がん剤により生じるＤＮＡ障害を修復する働きがある。過剰メチル化によってＭＧＭＴの働きが弱まり、抗がん剤が有効になり、予後良好となる。
【０００４】
変異型ＩＤＨは２−ヒドロキシグルタル酸（２ＨＧ）を産生することが知られている（非特許文献１）。産生する２ＨＧの量を測定することによってＩＤＨ変異の有無を検出することができる。２ＨＧの測定法として磁気共鳴分光法を用いた方法が知られている（非特許文献３）。ところが、２ＨＧに由来する化学シフトの位置は他の物質（グルタル酸やグルタミンなど）の化学シフトの位置と重なるので、２ＨＧは明確なピークとして表れず、ＩＤＨ変異検出の信頼性が然程高くないと言われている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特許第４４４１６２２号公報
【特許文献２】特許第４８６５３７７号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Reitman et al. "Profiling the effects of isocitrate dehydrogenase 1 and 2 mutations on the cellular metabolome" 3270-3275, Proc. Natl. Acad. Sci., Feb. 22, 2011, Vol. 108, No. 8
【非特許文献２】Yan et al. "IDH1 and IDH2 Mutations in Glimas" N. Engl, J. Med. 360; 8 NEJM. Org. Feb. 19, 2009, p765-773
【非特許文献３】Pope et al. "Non-invasive detection of 2-hydroxyglutarate and other metabolites in IDH1 mutant glioma patients using magnetic resonance spectroscopy" J. Neurooncol (2012) 107 : 197-205
【非特許文献４】Sanson et al., J. Clin. Oncol. 2009
【非特許文献５】Christensen et al., J. Natl. Cancer Inst. 2011
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、脳腫瘍、白血病、大腸がん、胃がん、甲状腺がん、悪性黒色腫などの疾患における、ＩＤＨ変異を検出するための新規なマーカおよび方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、下記の形態を包含する本発明を完成するに至った。
【０００９】
〔１〕  トランス−グルタコン酸、シトラコン酸、５−オキソ−テトラヒドロフラン−２−カルボン酸、トリゴネリン、ジヒドロタキステロール、４−アミノ−３−ヒドロキシ酪酸、５−アミノ吉草酸、ホモセリン、イソバレリルカルニチン、Ｎ８−アセチルスペルミジン、オクタノイルカルニチン、ケノデオキシコール酸、およびウルソデオキシコール酸からなる群より選ばれる少なくとも一つを含む
イソクエン酸脱水素酵素変異検出用マーカ。
〔２〕  イソクエン酸脱水素酵素変異が検出される疾患が、脳腫瘍、白血病、大腸がん、胃がん、甲状腺がんおよび悪性黒色腫からなる群より選ばれる少なくとも一つである、〔１〕に記載の検出用マーカ。
【００１０】
〔３〕  トランス−グルタコン酸、シトラコン酸、５−オキソ−テトラヒドロフラン−２−カルボン酸、トリゴネリン、ジヒドロタキステロール、４−アミノ−３−ヒドロキシ酪酸、５−アミノ吉草酸、ホモセリン、イソバレリルカルニチン、Ｎ８−アセチルスペルミジン、オクタノイルカルニチン、ケノデオキシコール酸、およびウルソデオキシコール酸からなる群より選ばれる少なくとも一つを測定することを含む、イソクエン酸脱水素酵素変異の検出方法。
【００１１】
〔４〕  イソクエン酸脱水素酵素変異が検出される疾患が、脳腫瘍、白血病、大腸がん、胃がん、甲状腺がんおよび悪性黒色腫からなる群より選ばれる少なくとも一つである、〔３〕に記載の検出方法。
〔５〕  測定を磁気共鳴法にて行う〔３〕に記載の検出方法。
〔６〕  測定を採取した血液の検査で行う〔３〕に記載の検出方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明のＩＤＨ変異検出用マーカおよびＩＤＨ変異検出方法によれば、磁気共鳴法（ＭＲＩ、ＭＲＳなど）や血液検査などの比較的に侵襲の少ない方法を採用することができ、また、従来の２ＨＧによる検出法に代えてまたは併用することによってＩＤＨ変異検出の信頼性を高めることができる。ＩＤＨ変異を有する癌患者は予後が良好であるので、そのような患者には侵襲の大きい外科的療法の代わりに、放射線療法、免疫療法、化学療法などを行って、患者の精神的または肉体的負担を軽減することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】細胞解析実験に基づくメタボローム解析の一例を示す図である。
【図２】臨床組織解析実験に基づくメタボローム解析の一例を示す図である。
【図３】細胞解析実験で解析された空（ＧＦＰ）、変異型および正常型におけるマーカの産生量の一例を示す図である。
【図４】臨床組織解析実験で解析された変異型（ＭＴ）および正常型（ＮＴ）におけるマーカの産生量の一例を示す図である。
【図５】臨床組織解析実験で解析された変異型（ＭＴ）および正常型（ＮＴ）におけるマーカの産生量の一例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の一実施形態に係るＩＤＨ変異検出用マーカは、トランス−グルタコン酸（Trans-Glutaconic acid）、シトラコン酸（Citraconic acid）、５−オキソ−テトラヒドロフラン−２−カルボン酸（5-Oxo-2-tetrahydrofurancarboxylic acid）、トリゴネリン（Trigonelline）、ジヒドロタキステロール（Dihydrotachysterol）、４−アミノ−３−ヒドロキシ酪酸（4-Amino-3-hydroxybutyric acid）、５−アミノ吉草酸（5-Aminovaleric acid）、ホモセリン（Homoserine）、イソバレリルカルニチン（Isovalerylcarnitine）、Ｎ８−アセチルスペルミジン（N8-Acetylspermidine）、オクタノイルカルニチン（Octanoylcarnitine）、ケノデオキシコール酸（Chenodeoxycholic acid）、およびウルソデオキシコール酸（Ursodeoxycholic acid）からなる群より選ばれる少なくとも一つを含むものである。
【００１５】
これらの物質のうち、トランス−グルタコン酸（Trans-Glutaconic acid）、シトラコン酸（Citraconic acid）、５−オキソ−テトラヒドロフラン−２−カルボン酸（5-Oxo-2-tetrahydrofurancarboxylic acid）、トリゴネリン（Trigonelline）、およびジヒドロタキステロール（Dihydrotachysterol）は、ＩＤＨ変異によって産生量が有意に増える物質（図４）であり、
４−アミノ−３−ヒドロキシ酪酸（4-Amino-3-hydroxybutyric acid）、５−アミノ吉草酸（5-Aminovaleric acid）、ホモセリン（Homoserine）、イソバレリルカルニチン（Isovalerylcarnitine）、Ｎ８−アセチルスペルミジン（N8-Acetylspermidine）、オクタノイルカルニチン（Octanoylcarnitine）、ケノデオキシコール酸（Chenodeoxycholic acid）、およびウルソデオキシコール酸（Ursodeoxycholic acid）は、ＩＤＨ変異によって産生量が有意に減る物質（図５）である。
【００１６】
これらの物質からなるマーカは、磁気共鳴法（ＭＲＳ、ＭＲＩなど）によって非侵襲にて測定することができる。また、採取した血液をＣＥ／ＭＳ（キャピラリー電気泳動−質量分析）法、およびＬＣ／ＭＳ（液体クロマトグラフ質量分析）法にて分析することによってもマーカの量を測定することができる。
【００１７】
このようにして測定されたマーカの量を、正常型ＩＤＨによる代謝で産生するマーカの量（基準値）と比較し、有意に増加または減少している場合にはＩＤＨが変異していると判定することができる。
【実施例】
【００１８】
まず、細胞解析実験を行い、その結果を網羅的代謝解析した。
（細胞解析実験−メタボローム解析）
正常型IDH1発現プラスミド（IDH1WT-myc-IRES-EGFP）を導入したU87膠芽腫細胞、変異型IDH1発現プラスミド（IDH1R132H-myc-IRES-EGFP）を導入したU87膠芽腫細胞、およびIDH1が空（ＧＦＰ）のプラスミド（myc-IRES-EGFP）を導入したU87膠芽腫細胞を、それぞれ４８時間培養して、ＲＮＡおよび細胞ライセートを調製した。これらから代謝産物を抽出して、ＣＥ／ＭＳ（キャピラリー電気泳動−質量分析）法およびＬＣ／ＭＳ（液体クロマトグラフ質量分析）法を用いて分析を行った。
その結果をメタボローム解析した。その結果の一例を図１に示す。図３にマーカの産生量を示す棒グラフの一例を示す。左から右に、ＧＦＰ、変異型、正常型である。
【００１９】
次に臨床組織解析実験を行い、その結果を網羅的代謝解析した。
（臨床組織解析実験−メタボローム解析）
ＷＨＯグレードII〜IVの患者から腫瘍組織を摘出し、それらを、それぞれ４８時間培養して、ＲＮＡおよび細胞ライセートを調製した。これらから代謝産物を抽出して、ＣＥ／ＭＳ（キャピラリー電気泳動−質量分析）法およびＬＣ／ＭＳ（液体クロマトグラフ質量分析）法を用いて分析を行った。
その結果をメタボローム解析した。その結果の一例を図２に示す。図４および図５にマーカの代謝産生量を示す棒グラフの一例を示す。左から右に、変異型、正常型である。
【００２０】
細胞解析実験からの解析結果と臨床組織解析実験からの解析結果との間で矛盾のないものを抽出した。その結果、正常型ＩＤＨに比べて変異型ＩＤＨは、トランス−グルタコン酸、シトラコン酸、５−オキソ−テトラヒドロフラン−２−カルボン酸、トリゴネリン、およびジヒドロタキステロールの産生量が有意に多くなっていた（図４）。特に、トランス−グルタコン酸およびシトラコン酸の産生量の増加は顕著であった。
【００２１】
正常型ＩＤＨに比べて変異型ＩＤＨは、４−アミノ−３−ヒドロキシ酪酸、５−アミノ吉草酸、ホモセリン、イソバレリルカルニチン、Ｎ８−アセチルスペルミジン、オクタノイルカルニチン、ケノデオキシコール酸、およびウルソデオキシコール酸の産生量が有意に少なくなっていた（図５）。特に、５−アミノ吉草酸、ホモセリン、およびＮ８−アセチルスペルミジンの産生量の減少が顕著であった。
なお、この解析から、従来から知られている２−ヒドロキシグルタル酸（２ＨＧ）の算出量も、正常型ＩＤＨに比べて変異型ＩＤＨは、増加していることが確かめられた。
【００２２】
網羅的代謝解析によって、さらに、次のようなことが明らかになった。１）解糖系の亢進、TCA回路が抑制され、lactateの上昇傾向が認められた。２）細胞増殖、分裂に必要な材料（アミノ酸、核酸、エネルギー）の低下が認められた。３）脂質代謝は亢進していた。４）酸化ストレスの傾向にあった。
【００２３】
また、臨床組織解析実験に協力して頂いた患者のうち、変異型ＩＤＨを有する患者は、正常型ＩＤＨを有する患者に比べて、無増悪生存期間（PFS: Progression-Free Survival）および全生存期間（OS: Overall Survival)がいずれも長かった。結果の一部を表１に示す。
【００２４】
【表１】
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【００２５】
これらの結果から、本発明の一実施形態に係るマーカを測定することによって、その患者の予後が予測できる。マーカの量によって予後が良好であると考えられる患者には、外科的療法を避け、侵襲の少ない化学療法、免疫療法、放射線療法などを行うという治療方針を立てることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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