(57)【要約】【課題】レコンビナーゼポリメラーゼ増幅を提供すること。【解決手段】本発明は、新規の、多様な、ハイブリッドおよび作成されたレコンビナーゼ酵素、ならびにＤＮＡ増幅アッセイを行うための、関連組換え因子をともなうそのような蛋白質の使用を、その特色とする。また、本発明は、ＤＮＡ増幅アッセイにおける異なる生化学的活性を有する異なるレコンビナーゼ「系」、ならびに負荷因子、一本鎖ＤＮＡ結合蛋白質（ＳＳＢ）、および使用される密集剤の量についての異なる要求も、その特色とする。さらに詳しくは、本発明は、Ｔ６、Ｒｂ６９、Ａｅｈｌ、およびＫＶＰ４０ハイブリッドおよび作成蛋白質の使用、およびそのような蛋白質のレコンビナーゼポリメラーゼ増幅アッセイにおける使用に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願明細書に記載された発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本願は、２００６年５月４日に出願された、米国仮特許出願第６０／７９８，０６０号の利益を要求し、米国仮特許出願第６０／７９８，０６０号の内容はその全体が参考として本明細書において援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、新規なハイブリッドおよび作成されたレコンビナーゼ酵素、および核酸の増幅のためのそのような酵素の使用に関する。さらに詳しくは、本発明は、Ｔ６、Ｒｂ６９、Ａｅｈｌ、およびＫＶＰ４０ハイブリッドおよび作成蛋白質の使用、およびそのような蛋白質のレコンビナーゼポリメラーゼ増幅アッセイにおける使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
（背景）
レコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）は、オリゴヌクレオチドのＤＮＡ標的へのレコンビナーゼ−媒介標的化がポリメラーゼによるＤＮＡ合成にカップリングされたプロセスである（Ａｒｍｅｓ  ａｎｄ  Ｓｔｅｍｐｌｅ，特許文献１）。ＲＰＡは、細胞ＤＮＡ複製および修復マシーナリーの成分に依存する。イン・ビトロＤＮＡ増幅用のこのマシーナリーのいくつかを使用する概念はしばらくの間存在した（Ｚａｒｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．特許文献２）が、該概念は最近まで実用的技術に変化してきた。というのは、主としてＥ．ｃｏｌｉ  ＲｅｃＡ蛋白質に関連するレコンビナーゼ機能の領域における研究の長い歴史にも関わらず、ＤＮＡの感受性増幅を許容するイン・ビトロ条件は最近決定されたに過ぎないからである（Ｐｉｅｐｅｎｂｕｒｇ  ｅｔ  ａｌ．の特許文献３、また非特許文献１）。ポリメラーゼ活性の存在下において高レベルの組換え活性を１時間に渡って維持するレコンビナーゼ負荷および負荷解除双方の適切な速度を有する「ダイナミック」組合せ環境の発達は、技術的には挑戦的であることが判明し、特異的な密集剤、注目すべきことには、レコンビナーゼ−負荷因子、特異的ストランド−変位ポリメラーゼおよび頑強なエネルギー再生系の使用と組み合わされた、高分子量のＰＥＧ分子（Ｃａｒｂｏｗａｘ
２０Ｍ分子量１５ないし２０，０００、および本明細書中に記載された他のもの、特にＰＥＧ分子量３５，０００）を必要とした。
【０００４】
ＲＰＡ技術は、高分子量のポリエチレングリコール種（特に、＞１０，０００ダルトン以上）が反応挙動にかなり影響したという経験的治験に臨界的に依存するものであった。従前には、サイズが少なくとも分子量１２，０００ないし１００，０００の範囲にあるポリエチレングリコール種は強くＲＰＡ反応を刺激することが見出されていた。どのようにして密集剤が増幅反応内のプロセスに影響するかは明らかでないが、非常に種々の生化学的結果が密集剤に帰されており、恐らくは、ＲＰＡ反応に対するそれらの影響について鍵となるものである。
【０００５】
密集剤は、ポリメラーゼ酵素とＤＮＡとの相互作用（非特許文献２）を増強して、ポリメラーゼの活性を改良して（非特許文献３）、ＳＳＢの存在下においてＤＮＡへのＲｅｃＡ結合のキネティックスに影響すると報告されている（Ｌａｖｅｒｙ  ａｎｄ  Ｋｏｗａｌｃｚｙｋｏｗｓｋｉ，１９９２）。密集剤は、モノマーの協働的結合が、潜在的には数桁の大きさだけ会合定数を増大させることによってロッドおよびフィラメント形成（Ｒｉｖａｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）の間などにて起こることが知られている系に対して顕著な影響を有すると報告されている（Ｍｉｎｔｏｎ，２００１参照）。ＲＰＡ系においては、多数の成分が、ＳＳＢフィラメント、レコンビナーゼフィラメントの形成、および、恐らくは、ＵｖｓＹのような負荷剤の凝縮を含めた、核酸への協働的結合に依拠する。密集剤は核酸のハイブリダイゼーションを増強させることがやはりよく知られており（Ａｍａｓｉｎｏ，１９８６）、これは、ＲＰＡ反応内でやはり必要であるプロセスである。最後に、最終ではないが、ＰＥＧはＤＮＡ分子凝縮を駆動することが知られており、そこでは、それらが細長い構造からコンパクトな球状またはドーナツ型形態に変化し、かくして、多くのイン・ビボとの関係でより共通した構造を模倣し（Ｌｅｒｍａｎ，１９７１参照；またＶａｓｉｌｅｖｓｋａｙａ．ｅｔ．ａｌ．，１９９５参照；またＺｉｎｃｈｅｎｋｏ  ａｎｄ  Ａｎａｔｏｌｙ，２００５参照）、またＤＮＡのスーパーコイリング自由エネルギーに影響することが知られている（Ｎａｉｍｕｓｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。
【０００６】
理論に拘束されるつもりはないが、密集剤は反応内の多数の蛋白質−蛋白質、蛋白質−核酸および核酸−核酸相互作用のキネティックスに影響するようである。最も実質的な反応改良のための高分子量凝集剤（恐らくは、サイズは約１０，０００ダルトンを超える）に対する依存性は、他の物（例えば、ヌクレオチド、ＵｖｓＹのようなより小さなペプチド）の有効な拡散を許容しつつ、あるサイズを超える反応成分（例えば、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド：蛋白質フィラメント、デュプレックス産物、蛋白質成分）に密集効果を制限する必要性を反映するであろう。さらに、高分子量の優先性は、ＰＥＧの分子量は増大するにつれて、ＤＮＡ凝縮を促進するのに必要な金属イオンの濃度は減少するという他での知見を反映するであろう。いずれにせよ、ＲＰＡが高分子量ポリエチレングリコールの使用によって効果的とされるというのは経験的知見である。
【０００７】
前記した特異的タイプの「密集した」反応条件（密集剤の存在下における反応）に対する必要性に加えて、有効なＲＰＡ反応キネティックスは、レコンビナーゼ−ＤＮＡ相互作用に関して反応内の高度な「動的」活性に依存する。換言すれば、（ｉ）ＡＴＰ−γ−Ｓによる反応阻害、またはＲｅｃＡまたはＵｖｓＸの酸性Ｃ末端の除去、および（ｉｉ）過剰なＡＴＰによる阻害（Ｐｉｅｐｅｎｂｕｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）を含む利用可能なデータは、レコンビナーゼフィラメントが迅速に形成できるのは重要であるのみならず、それらは迅速に解離できるのも重要であることを示唆する。このデータは、より早い特許文献４においてなされた予測と合致する。迅速なフィラメント形成は、いずれかの与えられた時期において、高い定常状態レベルの機能的レコンビナーゼ−ＤＮＡフィラメントがあることを保証し、他方、迅速な解離は、完了したストランド交換複合体がポリメラーゼによってアクセス可能であることを保証する。
【０００８】
他のプロセスは、高度に動的なレコンビナーゼ負荷／負荷解除に加えて、反応環境に適切に裏付けられていなければならない。後の考察の利点では、今日、どのようにしてＲＰＡ反応が、成分の活性／特性の変化によって影響され得るかを考慮する場合に注記する因子のより完全なリストに従う。
【０００９】
１．前記したように、侵入およびストランド交換の迅速なキネティックスを保証するためにいずれかの与えられた時期において高い総じてのレベルの活性な正しく負荷されたレコンビナーゼ−ＤＮＡフィラメントがなければならない。これは、標準的な二分子反応キネティックスによって予測されるように反応において初期に低い標的数にて迅速な反応キネティックスを駆動し、ならびに標的が高度に豊富となり、負荷されたフィラメントを容易にアウト−滴定できる場合に、反応において後期に活性なフィラメントの非限定的量を保証するのに必要とされる。
【００１０】
２．フィラメントは動的で、迅速な解体ならびに組み立てが可能であって、ストランド交換プロセスが迅速に働くのを保証し、および（もしそれが生起するならば）非生産的蛋白質−ＤＮＡ立体配座においてフィラメント「ロック−アップ」を回避しなければならない。
【００１１】
３．レコンビナーゼは一本鎖ＤＮＡに対する強い優先性、および二本鎖ＤＮＡに対して比較的より弱い優先性を有すべきである。これは、レコンビナーゼのオリゴヌクレオチドへの正しい分配を保証し、有意な量のデュプレックスＤＮＡが蓄積する場合に、反応の遅い層において非常に重要である。このデュプレックスＤＮＡは、そうでなければ、レコンビナーゼに対して余りにも効果的に競合でき、反応を余りにも迅速に遅らせることができる。デュプレックスＤＮＡに対する解体速度の差もまた、生産的交換の解体の加速が複雑化する限り、因子（ｉｉ）をやはり増強させるであろう。反応の後期における反応速度の減少のような過剰なデュプレックスＤＮＡの「アウト−滴定」活性と合致する観察は、もし過剰な観察は、もし過剰なＤＮＡが反応の初期に存在すれば、なされてきた。
【００１２】
４．一本鎖ＤＮＡの相互へのハイブリダイゼーションは、いずれかの与えられた反応条件下で支持されなければならない。ＲＰＡは、相補的プライミングオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションに続いて新しいデュプレックス標的に変換されて、ＤＮＡ合成を開始できるに過ぎない一本鎖ＤＮＡ産物を生じさせる能力を有する。飽和量の一本鎖ＤＮＡ結合蛋白質（すなわち、負荷蛋白質、一本鎖ＤＮＡ結合蛋白質およびレコンビナーゼ）が反応環境に存在するので、これらのハイブリダイゼーションプロセスはこれらの蛋白質によって支持され／助けられなければならない。ＳＳＢおよびレコンビナーゼはデュプレックス／一本鎖ＤＮＡに対する幾らかの融解／ハイブリダイゼーション活性を有し、恐らくは、異なったレベルの融解／ハイブリダイゼーション活性を示すであろう。かくして、負荷のレコンビナーゼおよびＳＳＢの相対的割合はハイブリダイゼーションのための速度挙動に影響し得、これもまた、ＳＳＢの種および使用されるレコンビナーゼにやはり依存するであろう。もしＳＳＢまたはレコンビナーゼのいずれかが一本鎖ＤＮＡの相互に対するハイブリダイゼーションを支持せず、または貧弱にしか支持しなければ、反応は危うくなるであろう。
【００１３】
５．ｐＨ、アニオン蓄積、ＡＤＰの、ＡＭＰの生成、ピロホスフェート、および他のヌクレオチド種に関する反応組成の一時的変化は、使用するレコンビナーゼによって強く影響され得る。さらに、レコンビナーゼはイオンおよびｐＨ環境に対して異なって応答し得る。ヌクレオチドの加水分解の速度は、前記した種の蓄積に影響し、それらの蓄積は、今度は、レコンビナーゼおよびポリメラーゼの反応における活性に影響し得る。例えば、ホスフェートおよびピロホスフェートの蓄積はレコンビナーゼプロセスに影響でき、他方、ＡＤＰ（および、おそらくは、ＡＭＰ）の蓄積はレコンビナーゼのＤＮＡオン−オフキネティックスに影響し得る。注目すべきは、バクテリオファージＴ４  ＵｖｓＸ蛋白質は、ＡＴＰをＡＤＰおよびＡＭＰ双方に加水分解することが報告されており、これは、今日まで他のレコンビナーゼに帰せられていない特性である。レコンビナーゼは、ｄＡＴＰ、ＵＴＰおよび、潜在的には、他のヌクレオチドも加水分解し得る。異なるヌクレオチドは、ｓｓＤＮＡおよびｄｓＤＮＡに対する複合体のＤＮＡ結合安定性に影響でき、例えば、ｄＡＴＰは、ｓｓＤＮＡに対するＲｅｃＡの安定性を増強させると記載されてきた。理論に拘束されるつもりはないが、そのＤＮＡ結合ドメインおよびヌクレオチド結合／触媒ドメインに関するレコンビナーゼの特定の特性は、反応速度、および反応後期に強いシグナルを生じさせる有効性に対して有意なインパクトを有することができる。
従前に確率されたＲＰＡ条件
有効なＲＰＡ反応は、従来、（危うくされたｇｐ３２蛋白質を含む不均一系において）双方のＥ．ｃｏｌｉ  ＲｅｃＡを用いて、かつ（Ｔ４ファージＵｖｓＹ蛋白質と組合せた場合に）Ｔ４ファージＵｖｓＸ蛋白質に関して示されてきた（Ｐｉｅｐｅｎｂｕｒｇ，２００６）。双方の場合において、ポリエチレングリコールの使用は、増幅が、鋳型が大まかナノモルレベル未満の（または大まかマイクロリットル当たり約１０１０標的分子のオーダー未満の）濃度で存在した場合にいずれかの有用な効率にて起こるのに絶対的に必要であることが判明した。
実験は、直線状鋳型の端部に向けられたオリゴヌクレオチドを用いた場合に、二次的、三次的および、なおさらに、侵入事象を刺激するにおいてＰＥＧの重要性を示し、該オリゴヌクレオチドは、最初、初期標的に対する５’突出を有するが、「バックファイヤー」合成の活性のためより遅い標的に対して平坦である（Ｐｉｅｐｅｎｂｕｒｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．１０／９３１，９１６）。十分に包埋された標的は、ほとんど確実には、外に出るストランドが新たに形成されたデュプレックスの周りで不都合な傷であることによって引き起こされる組換え産物に関連するトポロジー的拘束のため、より頑強であることが判明した。いずれかの理論に拘束されるつもりはないが、ＰＥＧの存在下におけるこれらのより不安定な中間体からの複製を開始する効率の膨大な増加は、複合体に対する密集剤によって付与される安定性に、改変されたＤＮＡ立体配座および（ＤＮＡ凝縮のような）コイリングに対に、中間体へのアクセスを獲得するポリメラーゼのためのかなり高い会合定数、および／または中間体を捕らえるポリメラーゼのより多くの（チャンス）、および伸長に導く組換え事象の頻度の非常に大きな増加に依存するであろう。
バクテリオファージＴ４  ＵｖｓＸ、Ｔ４  ＵｖｓＹ、およびＴ４ｇｐ３２、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＰｏｌＩ大断片、およびＰＥＧ化合物（Ｃａｒｂｏｗａｘ  ２０Ｍ）を利用するＲＰＡ系は、デュプレックスＤＮＡを約１キロベースの長さまで増幅するのに有効である（Ｐｉｅｐｅｎｂｕｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。４０秒以下と短い平均倍化時間が、概略３００ヌクレオチドの断片で獲得されており、標的が１０コピー未満のレベルで最初に存在した場合においてさえ、ＤＮＡは種々の手段によって検出で有用なレベルまで蓄積する。この頑強な挙動にも拘わらず、商業的に有用な産物におけるＲＰＡ系の実施のための非常に迅速なキネティックスおよび強力なシグナルに対する厳格な必要性により、他のレコンビナーゼ、それらの関連する負荷成分および一本鎖ＤＮＡ結合蛋白質の同定に対する要望が存在する。本発明は、これらの必要性および他の必要性を満足する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】米国特許出願第１０／３７１，６４１号明細書
【特許文献２】米国特許第５，２２３，４１４号明細書
【特許文献３】米国特許出願第１０／９３１，９１６号明細書
【特許文献４】米国特許出願第１０／３７１６４１号明細書
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Ｐｉｅｐｅｎｂｕｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＰｌｏｓＢｉｏｌｏｇｙ  ２００６
【非特許文献２】Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ  ａｎｄ  Ｈａｒｒｉｓｏｎ，１９８７
【非特許文献３】Ｃｈａｎ  Ｅ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，１９８０
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本開示は、ＲＰＡ反応を実行するための代替レコンビナーゼ／アクセサリー因子系の使用についてのデータを可能とすることを提供する。本明細書中で証拠が示されるように、バクテリオファージＴ６  ＵｖｓＸ、バクテリオファージＲｂ６９  ＵｖｓＸ、ＵｖｓＹおよびｇｐ３２、およびバクテリオファージＡｅｈ１  ＵｖｓＸ、ＵｖｓＹ、およびｇｐ３２はＲＰＡ反応において成功して使用することができる。問題はこの分析を制限したＫＶＰ４０  ｇｐ３２の生産において遭遇したが、加えて、バクテリオファージＫＶＰ４０
ＵｖｓＸおよびＵｖｓＹはＲＰＡ反応を支持することもできるという証拠が含まれる。一般に、反応体の濃度の変動を行って、各系についての最適な条件を同定しなければならず、総じてのキネティック活性において観察可能な差があることが判明した。本発明は、異なる種から生じた反応成分の間の制限された交差−適合性の証拠を提供する。一般に、同一または同様な種からのＵｖｓＸおよびＵｖｓＹの共使用についての要件が観察され、他方、ｇｐ３２はあまり厳格でなくマッチすることができる。また、本明細書中において、突然変異体およびキメラレコンビナーゼ蛋白質、特に、改変されたＴ６およびＲｂ６９
ＵｖｓＸ蛋白質、およびキメラＴ４およびＲｂ６９  ＵｖｓＹ蛋白質の使用、および、その分析が提供される。この分析は、ＲＰＡ反応における蛋白質のアッセイ可能な挙動に影響する残基の同定に導く。本明細書中において提供されるように、Ｔ４  ＵｖｓＸ蛋白質の特徴の全てではないが、いくつかは、Ｗａｌｋｅｒ  Ａモチーフ内のユニークなセリン残基に由来する。いずれかの理論に拘束されるつもりはないが、該モチーフ内のリシン−セリンジペプチドの得られた再反復は、この蛋白質によるＡＰＰのＡＤＰおよびＡＭＰへの加水分解を支持することができる。この再反復を含有するようなＴ６  ＵｖｓＸ蛋白質の修飾の結果、リアルタイムでモニターした場合に改変された（改善された）ＲＰＡ活性がもたらされる。そのような修飾されたＵｖｓＸは、特に、増幅反応の後期の間により険しい蛍光シグナル−発生曲線を呈する所有権がある蛍光プローブによってアッセイした場合に変化した反応キネティックスを示した。また、本明細書中においては、Ｅ．ｃｏｌｉのＤＮＡ結合ループ２と同等であると予測されるミオウイルスＵｖｓＸ蛋白質の領域は可変であって、ＲＰＡ反応で用いられるＵｖｓＸハイブリッドに区別される活性を付与するという発見が提供される。Ｒｂ６９  ＵｖｓＸは、この配列に関して異常なＵｖｓＸ分子であり、細菌ホモログにかなり密接に似ている。本発明は、拡散およびＡＴＰ双方に結合するレコンビナーゼ酵素の表面領域における構造／構造適合性についてのモデル、およびどのようにしてこの証拠を使用してレコンビナーゼ活性を「調節し」、および改良する（改変する）ことができるかを提供する。驚くべきことに、Ｔ６  ＵｖｓＸは、特に、ＵｖｓＹ蛋白質の完全な非存在で中程度によく機能できることが見出された。この特性は、あまり顕著ではないが、他のＵｖｓＸ種について明らかであろう。最後に、本発明は、ＲＰＡ反応を支持するためのマンガンイオンの使用、シグナル−ノイズ比率を改良するためのヘパリンの使用、ＲＰＡ反応におけるポリメラーゼとしてのＳ．ａｕｒｅｕｓ  ＰｏｌＩ、およびいくつかの場合にプライマー末端を処理し、ブロックを解除して、伸長を可能とするＥ．ｃｏｌｉエンドヌクレアーゼＩＩＩの使用を提供する。
【００１７】
本発明の第一のＲＰＡ具体例は、二本鎖標的拡散分子のレコンビナーゼポリメラーゼ増幅のプロセス（方法）に向けられる。該プロセスの第一の工程において、第一および第二の一本鎖拡散プライマーをレコンビナーゼ（例えば、ＵｖｓＸ）レコンビナーゼ負荷剤（例えば、ＵｖｓＹ）および一本鎖ＤＮＡ結合蛋白質（例えば、ｇｐ３２）と接触させて、第一および第二のヌクレオ蛋白質プライマーを形成する。一本鎖拡散プライマーは、標的核酸分子に対して特異的であって、それに対して相補的である。この場合において、レコンビナーゼ（例えば、ＵｖｓＸ）、レコンビナーゼ負荷剤（例えば、ＵｖｓＹ）および一本鎖ＤＮＡ結合蛋白質（例えば、ｇｐ３２）の各々はミオウイルス科ファージに由来する。さらに、レコンビナーゼ（例えば、ＵｖｓＸ）、レコンビナーゼ負荷剤（例えば、ＵｖｓＹ）および一本鎖ＤＮＡ結合蛋白質（例えば、ｇｐ３２）の内の２以下はＴ４ファージ蛋白質である。
【００１８】
第二の工程において、第一のヌクレオ蛋白質プライマーを二本鎖標的核酸分子に接触させて、二本鎖標的核酸分子の第一の部分において第一のＤループ構造を作り出す（工程２ａ）。さらに、第二のヌクレオ蛋白質プライマーを二本鎖標的核酸分子に接触させて、二本鎖標的核酸分子の第二の部分において第二のＤループ構造を作り出す（工程２ｂ）。Ｄループ構造は、第一の核酸プライマーおよび該第二の核酸プライマーの３’末端が、標的核酸分子を完全に変性することなく同一二本鎖標的核酸分子上で相互に対して向けられるように形成される。工程２ａおよび工程２ｂはいずれかの順序にて、または同時に行うことができるのに注意すべきである。
【００１９】
Ｄループ構造において、プライマーを二本鎖標的拡核酸子の１つのストランドにハイブリダイズさせて、二本鎖構造を形成する。標的核酸分子の第二のストランドはプライマーによって変位される。Ｄの直線部分が構造の二本鎖部分を表し、およびＤの曲がった部分が標的核酸の一本鎖変位第二ストランドを表す場合、構造は大文字Ｄに似ている。
【００２０】
第三の工程において、第一および第二のヌクレオ蛋白質プライマーの３’末端はストランド変位合成が可能な１以上のポリメラーゼおよびｄＤＮＰで延長して、第一および第二の二本鎖標的核酸分子および第一および第二の変位した核酸のストランドを生じさせる。第一および第二の二本鎖標的核酸分子は、引き続いてのラウンドの増幅の間に工程２において標的核酸分子として働くことができる。
【００２１】
工程２および工程３は、所望の程度の標的核酸分子の増幅が達成されるまで反復される。所望の程度の増幅は少なくとも１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、または１０９倍増幅であってよい。
【００２２】
前記した増幅プロセスの間に、核酸の第一および第二の変位したストランドは工程（ｃ）の後に相互にハイブリダイズして、第三の二本鎖標的核酸分子を形成することができる。
【００２３】
本開示のプロセスのいずれにおいても、レコンビナーゼ（例えば、ＵｖｓＸ）、レコンビナーゼ負荷剤（例えば、ＵｖｓＹ）および一本鎖ＤＮＡ結合蛋白質（例えば、ｇｐ３２）はミオウイルス科ファージに由来することができる。ミオウイルス科ファージは、例えば、Ｔ４、Ｔ２、Ｔ６、Ｒｂ６９、Ａｅｈ１、ＫＶＰ４０、アシネトバクターファージ１３３、アエロモナスファージ６５、シアノファージＰ−ＳＳＭ２、シアノファージＰＳＳＭ４、シアノファージＳ−ＰＭ２、Ｒｂ１４、Ｒｂ３２、アエロモナスファージ２５、ビブリオファージｎｔ−１、ｐｈｉ−１、Ｒｂ１６、Ｒｂ４３、ファージ３１、ファージ４４ＲＲ２．８ｔ、Ｒｂ４９、ファージＲｂ３またはファージＬＺ２であってよい。好ましい具体例において、Ｒｂ６９  ＵｖｘＸ、ＲＢ６９  ＵｖｓＹおよびＲｂ６９  ｇｐ３２の組合せを用いることができる。もう１つの好ましい具体例において、Ａｅｈ１  ＵｖｓＸ、Ａｅｈ１  ＵｖｓＹおよびＲｂ６９  ｇｐ３２の組合せを用いてもよい。もう１つの好ましい具体例において、Ｔ４  ＵｖｓＸ、Ｔ４  ＵｖｓＹおよびＲｂ６９  ｇｐ３２の組合せを用いてもよい。もう１つの好ましい具体例において、Ｔ４  ＵｖｓＸ、Ｒｂ６９
ＵｖｓＹおよびＴ４  ｇｐ３２の組合せを用いてもよい。
【００２４】
さらに、本開示のプロセスのいずれにおいても、レコンビナーゼ（例えば、ＵｖｓＸ）、レコンビナーゼ負荷剤（例えば、ＵｖｓＹ）および一本鎖ＤＮＡ結合蛋白質（例えば、ｇｐ３２）は、各々、同一または異なるミオウイルス科ファージ源からの天然、ハイブリッドまたは突然変異体蛋白質であり得る。天然蛋白質は蛋白質の野生型または天然変種であってよい。（遺伝子工学により作成された蛋白質とも呼ばれる）突然変異体蛋白質は、Ｎ末端、Ｃ末端、または内部（Ｎ末端およびＣ末端の間）にある、挿入、欠失、置換、またはその組合せのような天然または人造突然変異を持つ天然蛋白質である。（キメラ蛋白質とも呼ばれる）ハイブリッド蛋白質は、少なくとも２つの異なる生物からの配列を含む。例えば、ハイブリッドＵｖｓＸ蛋白質は１つの種からのアミノ酸（例えば、Ｔ４）を含有してもよいが、もう１つの種からのＤＮＡ結合ループ（例えば、Ｔ６）を含有しない。ハイブリッド蛋白質は、天然蛋白質と比較して、改良された特徴を含んでもよい。改良された特徴は増大したまたはより迅速なＲＰＡ増幅速度、または減少したまたはより制御可能なＲＢＡ増幅速度であってよい。
【００２５】
本開示のいずれのプロセスにおいても、レコンビナーゼ（例えば、ＵｖｓＸ）は突然変異体ＵｖｓＸであってよい。好ましい具体例において、突然変異体ＵｖｓＸは、Ｒｂ６９  ＵｖｓＸアミノ酸配列において少なくとも１つの突然変異を含むＲｂ６９  ＵｖｓＸであり、ここに、該突然変異は、（ａ）位置６４におけるヒスチジンではないアミノ酸、位置６４におけるセリン、Ｃ−末端における１以上のグルタミン酸残基の負荷、Ｃ−末端における１以上のアスパラギン酸残基の負荷、およびその組合せよりなる群から選択される。もう１つの好ましい具体例において、突然変異体ＵｖｓＸはＴ６  ＵｖｓＸアミノ酸配列において少なくとも１つの突然変異を有するＴ６  ＵｖｓＸであり、ここに、該突然変異は（ａ）位置６６ｂにおけるヒスチジンではないアミノ酸；（ｂ）位置６６におけるセリン；（ｃ）Ｃ−末端における１以上のグルタミン酸残基の付加；（ｄ）Ｃ−末端における１以上のアスパラギン酸残基の付加；および（ｅ）その組合せよりなる群から選択される。
【００２６】
ハイブリッド蛋白質が用いられる本開示のいずれのプロセスにおいても、ハイブリッド蛋白質は、異なるＵｖｓＸ種からのアミノ酸配列を含む少なくとも１つの領域を含むＵｖｓＸ蛋白質であってよい。該領域は、例えば、ＵｖｓＸのＤＮＡ−結合ループ−２領域であってよい。
【００２７】
本開示のＲＰＡプロセスのいずれも、密集剤の存在下で行ってもよい。該密集剤はポリエチレングリコール、ポリエチレンオキサイド、ポリビニルアルコール、ポリスチレン、フィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）、デキストラン、ＰＶＰ、アルブミンよりなる群から選択することができる。好ましい具体例において、該密集剤は２００，０００ダルトン未満の分子量を有する。さらに、該密集剤は容量に対して約０．５％ないし約１５重量％（ｗ／ｖ）の量で存在させることができる。
【００２８】
本開示のＲＰＡプロセスのいずれも、大断片ポリメラーゼであるポリメラーゼで行うことができる。該大断片ポリメラーゼはＥ．Ｃｏｌｉ  Ｐｏｌ  Ｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  Ｐｏｌ  Ｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｐｏｌ  Ｉ、およびそのホモログよりなる群から選択することができる。
【００２９】
本開示のＲＰＡプロセスのいずれも、ヘアピンの存在下で行うことができる。ヘアピンは、非−特異的プリマーノイズのレベルを低下させ、およびレコンビナーゼ中間体から３’ブロッキング基または末端残基を迅速に磨くＥ．ｃｏｌｉエキソヌクレアーゼＩＩＩまたはＥ．ＣｏｌｉエキソヌクレアーゼＩＶの能力を増加させる剤として働くことができる。
【００３０】
さらに、本開示のＲＰＡプロセスのいずれも、ブロックされたプライマーで行うことができる。ブロックされたプライマーは、ポリメラーゼでの伸長を可能としないプライマーである。ブロックされたプライマーを用いる場合、ブロック解除剤を用いての、プライマーをブロック解除して、伸長を可能とする。ブロック解除剤は、プライマーからブロッキング基を切断できるエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼであってよい。好ましいブロック解除剤はＥ．ｃｏｌｉエキソヌクレアーゼＩＩＩおよびＥ．ｃｏｌｉエンドヌクレアーゼＩＶを含む。
【００３１】
本開示のＲＰＡプロセスのいずれも、約１ｍＭないし約３ｍＭ二価マンガンイオンの存在下で行うことができる。好ましい具体例において、マンガンイオンはマグネシウムイオンを置き換え、反応はマグネシウムの有りまたは無しにて行うことができる。
【００３２】
さらに、ＵｖｓＹは、所望により、本開示のＲＰＡ反応のいずれかから省略してもよい。すなわち、本開示のＲＰＡ反応のいずれも、ＵｖｓＹの非存在下で行うことができる。
【００３３】
本発明の第二のＲＰＡ具体例は、二本鎖標的核酸分子のレコンビナーゼポリメラーゼ増幅のプロセス（方法）に向けられる。該プロセスの第一の工程において、レコンビナーゼ（例えば、ＵｖｓＸ）、レコンビナーゼ負荷剤（例えば、ＵｖｓＹ）および一本鎖ＤＮＡ結合蛋白質（例えば、ｇｐ３２）を二本鎖標的核酸分子に対して特異的な一本鎖標準核酸プライマーと接触させて第一のヌクレオ蛋白質プライマーの集団を形成し、ここに、該レコンビナーゼ（例えば、ＵｖｓＸ）、レコンビナーゼ負荷剤（例えば、ＵｖｓＹ）および一本鎖ＤＮＡ結合蛋白質（例えば、ｇｐ３２）は、各々、ミオウイルス科ファージに由来し、ここに、レコンビナーゼ（例えば、ＵｖｓＸ）、レコンビナーゼ負荷剤（例えば、ＵｖｓＹ）および一本鎖ＤＮＡ結合蛋白質（例えば、ｇｐ３２）の内の２以下はＴ４ファージ蛋白質である。
【００３４】
第二の工程において、第一のヌクレオ蛋白質プライマーを二本鎖標的核酸分子と接触させて、標的核酸分子を完全に変性させることなく該二本鎖標的核酸分子の第一の部分において第一のＤループ構造を形成する。
【００３５】
第三の工程において、第一のヌクレオ蛋白質プライマーの３’末端を、ストランド変位合成が可能な１以上のポリメラーゼおよびｄＮＰＰで延長して、二本鎖標的核酸分子、および変位した核酸分子のストランドを作成する。
【００３６】
第四の工程において、第二の一本鎖核酸プライマーを核酸分子の変位したストランドにハイブリダイズさせて、ハイブリダイズした第二の一本鎖基核酸プライマーを形成する。
【００３７】
第五の工程において、ハイブリダイズした第二の一本鎖核酸分子を延長して、二本鎖標的核酸分子を生じさせる。
【００３８】
該反応の第二ないし第五の工程は、所望の程度の増幅に到達するまで継続する。
【００３９】
この第二のＲＰＡ具体例の全ての他の態様は、所望の程度の増幅、および蛋白質（レコンビナーゼ、負荷剤、一本鎖ＤＮＡ結合蛋白質）の選択等を含めた第一のＲＰＡ具体例のそれと同様である。これらのパラメーターは第一のＲＰＡ具体例について前記した。我々は、驚くべきことに、核酸プライマーの唯１つがレコンビナーゼ／レコンビナーゼ負荷剤／一本鎖ＤＮＡ結合蛋白質で被覆されたとしても、ＲＰＡは機能するであろうことを見出した。すなわち、ＲＮＡは、被覆されていない１つのプライマー、およびレコンビナーゼ、レコンビナーゼ負化剤、および一本鎖ＤＮＡ結合蛋白質のいずれか１つ、または組合せで被覆された１つのプライマーで行ってもよい。
【００４０】
被覆されたプライマーおよび被覆されていないプライマーの生産は、多数の方法でなすことができる。１つの方法において、唯１つのプライマーを、ＲＰＡの開始前に、レコンビナーゼ、レコンビナーゼ負荷剤、および一本鎖ＤＮＡ結合蛋白質のいずれか１つ、またはその組合せと接触させる。もう１つの方法において、双方のプライマーを、レコンビナーゼ、レコンビナーゼ負荷剤、および一本鎖ＤＮＡ結合蛋白質のいずれか１つ、または組合せに接触させる。しかしながら、１つのプライマーは、標的二本鎖核酸上にＤループを生じさせることができる十分な蛋白質を付着させることができない。これは、それが組換えのために十分な蛋白質に結合できないように、プライマーがあまりにも短いか、または異常な拡散を含有するからであろう。それにもかかわらず、我々が驚いたことには、唯１つのプライマーがＤループを形成できるとしても、ＲＰＡは可能である。ＲＰＡはこの状況で可能である。なぜならば、Ｄループを形成することができないプライマーは、Ｄループ可能プライマー（レコンビナーゼ被覆プライマー）から生じたいずれかの変位したストランドにハイブリダイズして、ＤＮＡ合成を開始することができるからである。
【００４１】
本発明のもう１つの具体例は、（ａ）位置６４におけるヒスチジンではないアミノ酸；（ｂ）位置６４におけるセリン；（ｃ）Ｃ−末端における１以上のグルタミン酸残基の付加；（ｄ）Ｃ−末端における１以上のアスパラギン酸残基の付加；（ｅ）Ｒｂ６９  ＵｖｓＸではないＵｖｓＸ蛋白質からのＤＮＡ−結合ループ−２領域でのＤＮＡ−結合ループ−２領域の置換；および（ｆ）その組合せよりなる群から選択されるアミノ酸配列を持つ突然変異体またはハイブリッドＲｂ６９  ＵｖｓＸ蛋白質に向けられる。そのような突然変異体またはハイブリッドの例は、例えば、配列番号：１１４、配列番号：１１５、配列番号：１１６、配列番号：１１７、配列番号：１１８、配列番号：１１９、配列番号：１２０、または配列番号：１２１に見出すことができる。
【００４２】
本発明のもう１つの具体例は、アミノ酸配列において少なくとも１つの突然変異を有する突然変異体またはハイブリッドＴ６  ＵｖｓＸ蛋白質に向けられ、ここに、該突然変異は（ａ）位置６６におけるヒスチジンではないアミノ酸；（ｂ）位置６６におけるセリン；（ｃ）Ｃ−末端における１以上のグルタミン酸残基の付加；（ｄ）Ｃ−末端における１以上のアスパラギン酸残基の付加；（ｅ）Ｔ６  ＵｖｓＸではないＵｖｓＸ蛋白質からのＤＮＡ−結合ループ−２領域でのＤＮＡ−結合ループ−２領域の置換；（ｆ）位置１６４におけるバリン；（ｇ）位置１６６におけるセリン、および（ｈ）その組合せよりなる群から選択される。例えば、配列番号：１０５および配列番号：１０６参照。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
（ａ）ＵｖｓＸ、ＵｖｓＹ、およびｇｐ３２蛋白質を、二本鎖標的核酸分子に対して特異的な第一および第二の一本鎖核酸プライマーと接触させて、第一および第二のヌクレオ蛋白質プライマーを形成させ、ここに、該ＵｖｓＸ、ＵｖｓＹ、およびｇｐ３２は、各々、ミオウイルス科ファージに由来し、およびここに、該ＵｖｓＸ、ＵｖｓＹ、およびｇｐ３２蛋白質のうちの２以下はＴ４ファージ蛋白質であり；
（ｂ）該第一のヌクレオ蛋白質プライマーを該二本鎖標的核酸分子に接触させて、該二本鎖標的核酸分子の第一の部分において第一のＤループ構造を作り出し、次いで、該第二のヌクレオ蛋白質プライマーを該二本鎖標的核酸分子に接触させて、該第一の核酸プライマーおよび該第二の核酸プライマーが、標的核酸分子を完全に変性することなく、該第一の核酸プライマーおよび該第二の核酸プライマーの３’末端が同一二本鎖標的核酸分子上で相互に対して向けられるように、該二本鎖標的核酸分子の第二の部分において第二のＤループ構造を作り出し；
（ｃ）ストランド変位合成を可能とする１以上のポリメラーゼおよびｄＮＴＰで該第一および第二のヌクレオ蛋白質プライマーの３’末端を延長して、第一および第二の二本鎖標的核酸分子および第一および第二の変位された核酸のストランドを作り出し；次いで、
（ｄ）所望の程度の増幅に到達するまで、（ｂ）および（ｃ）の反復を通じて反応を継続する；
工程を含む、二本鎖標的核酸分子の増幅のレコンビナーゼポリメラーゼ増幅方法。
（項目２）
前記第一および第二の変位された核酸のストランドが工程（ｃ）の後に相互にハイブリダイズして、第三の二本鎖標的核酸分子を形成する項目１記載の方法。
（項目３）
ＵｖｓＸ、ＵｖｓＹおよびｇｐ３２蛋白質が由来するミオウイルス科ファージが：Ｔ４、Ｔ２、Ｔ６、Ｒｂ６９、Ａｅｈ１、ＫＶＰ４０、アシネトバクターファージ１３３、アエロモナスファージ６５、シアノファージＰ−ＳＳＭ２、シアノファージＰＳＳＭ４、シアノファージＳ−ＰＭ２、Ｒｂ１４、Ｒｂ３２、アエロモナスファージ２５、ビブリオファージｎｔ−１、ｐｈｉ−１，Ｒｂ１６，Ｒｂ４３、ファージ３１、ファージ４４ＲＲ２．８ｔ、Ｒｂ４９、ファージＲｂ３、およびファージＬＺ２から選択される項目１記載の方法。
（項目４）
前記ＵｖｓＸ、ＵｖｓＹおよびｇｐ３２が：
（ａ）Ｒｂ６９  ＵｖｓＸ、Ｒｂ６９  ＵｖｓＹおよびＲｂ６９  ｇｐ３２；（ｂ）Ａｅｈ１  ＵｖｓＸ、Ａｅｈ１  ＵｖｓＹおよびＲｂ６９  ｇｐ３２；
（ｃ）Ｔ４  ＵｖｓＸ、Ｔ４  ＵｖｓＹおよびＲｂ６９  ｇｐ３２；および
（ｄ）Ｔ４  ＵｖｓＸ、Ｒｂ６９  ＵｖｓＹおよびＴ４  ｇｐ３２
よりなる群から選択される項目１記載の方法。
（項目５）
前記ＵｖｓＸ、ＵｖｓＹ、およびｇｐ３２が、同一または異なるミオウイルス科ファージ源からの天然、ハイブリッドまたは突然変異体蛋白質である項目１記載の方法。
（項目６）
前記ハイブリッド蛋白質がミオウイルス科ファージの２つの異なる種からの１以上のアミノ酸残基を含んで、前記方法において改良された性能特徴を持つ蛋白質を生じる項目５記載の方法。
（項目７）
前記ＵｖｓＸが突然変異体ＵｖｓＸである項目５記載の方法。
（項目８）
前記突然変異体ＵｖｓＸがＲｂ６９  ＵｖｓＸアミノ酸配列において少なくとも１つの突然変異を含むＲｂ６９  ＵｖｓＸであり、ここに、該突然変異は：
位置６４におけるヒスチジンではないアミノ酸；
位置６４におけるセリン；
Ｃ−末端における１以上のグルタミン酸残基の付加；
Ｃ−末端における１以上のアスパラギン酸残基の付加；および
その組合せ
よりなる群から選択される項目７記載の方法。
（項目９）
前記突然変異体ＵｖｓＸがＴ６  ＵｖｓＸアミノ酸配列において少なくとも１つの突然変異を有するＴ６  ＵｖｓＸであり、ここに、該突然変異が：
位置６６においてヒスチジンではないアミノ酸；
位置６６におけるセリン；
Ｃ−末端における１以上のグルタミン酸残基の付加；
Ｃ−末端における１以上のアスパラギン酸残基の付加；および
その組合せ
よりなる群から選択される項目７記載の方法。
（項目１０）
前記ハイブリッド蛋白質が、異なるＵｖｓＸ種からのアミノ酸配列を含む少なくとも１つの領域を含むＵｖｓＸ蛋白質である項目６記載の方法。
（項目１１）
前記少なくとも１つの領域がＵｖｓＸのＤＮＡ−結合ループ−２領域である項目１０記載の方法。
（項目１２）
前記方法がポリエチレングリコール、ポリエチレンオキサイド、ポリビニルアルコール、ポリスチレン、フィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）、デキストラン、ＰＶＰ、アルブミンよりなる群から選択される密集剤の存在下で行われる項目１記載の方法。
（項目１３）
前記密集剤が２００，０００未満の分子量を有する項目１２記載の方法。
（項目１４）
前記密集剤が約０．５ｗ／ｖ％ないし約１５ｗ／ｖ％の量で存在する項目１２記載の方法。
（項目１５）
前記ポリメラーゼがＥ．Ｃｏｌｉ  Ｐｏｌ  Ｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ
Ｐｏｌ  Ｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｐｏｌ  Ｉ、およびそのホモログよりなる群から選択される大断片ポリメラーゼである項目１記載の方法。
（項目１６）
前記方法がヘパリンの存在下で行われる項目１記載の方法。
（項目１７）
前記第一または第二の核酸プライマーがブロックされたプライマーであり、および前記方法がＥ．ｃｏｌｉエキソヌクレアーゼＩＩＩおよびＥ．ｃｏｌｉエンドヌクレアーゼＩＶよりなる群から選択されるエンドヌクレアーゼの存在下で行われる項目１記載の方法。（項目１８）
前記方法が約１ｍＭないし約８ｍＭ二価マンガンイオンの存在下で行われる項目１記載の方法。
（項目１９）
前記方法がＵｖｓＹの非存在下で行われる項目１記載の方法。
（項目２０）
該ＵｖｓＸ、ＵｖｓＹまたはｇｐ３２蛋白質の少なくとも１つが配列番号：１０５、配列番号：１０６、配列番号：１１４、配列番号：１１５、配列番号：１１６、配列番号：１１７、配列番号：１１８、配列番号：１１９、配列番号：１２０、配列番号：１２１、配列番号：１２２、配列番号：１２３、および配列番号：１２４よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含む項目１記載の方法。
（項目２１）
（ａ）ＵｖｓＸ、ＵｖｓＹ、およびｇｐ３２蛋白質を、二本鎖標的核酸分子に対して特異的な第一の一本鎖核酸プライマーと接触させて、第一のヌクレオ蛋白質プライマーの集団を形成させ、ここに、該ＵｖｓＸ、ＵｖｓＹ、およびｇｐ３２は、各々、ミオウイルス科ファージに由来し、および該ＵｖｓＸ、ＵｖｓＹおよびｇｐ３２蛋白質の２以下はＴ４ファージ蛋白質であり；
（ｂ）該第一のヌクレオ蛋白質プライマーを該二本鎖標的核酸分子と接触させ、それにより、標的核酸分子を完全に変性することなく、該二本鎖標的核酸分子の第一の部分において第一のＤループ構造を形成させ；
（ｃ）ストランド変位合成が可能である１以上のポリメラーゼ、およびｄＮＴＰで該第一のヌクレオ蛋白質プライマーの３’末端を延長して、二本鎖標的核酸分子および変位した核酸分子のストランドを生じさせ；
（ｄ）第二の一本鎖核酸プライマーを該変位した核酸分子のストランドとハイブリダイズさせて、ハイブリダイズした第二の一本鎖核酸プライマーを形成させ；
（ｅ）該ハイブリダイズした第二の一本鎖核酸プライマーを延長させて、二本鎖標的核酸分子を生じさせ；
（ｆ）所望の程度の増幅に到達するまで、（ｂ）および（ｅ）の反復を通じて反応を継続する；
工程を含む、ＤＮＡの第一および第二のストランドでの二本鎖標的核酸分子の増幅のレコンビナーゼポリメラーゼ増幅方法。
（項目２２）
野生型Ｒｂ６９  ＵｖｓＸアミノ酸配列において改変を含む突然変異体またはハイブリッドＲｂ６９  ＵｖｓＸ蛋白質であって、野生型アミノ酸配列における改変が：
位置６４においてヒスチジンでないアミノ酸；
位置６４におけるセリン；
Ｃ−末端における１以上のグルタミン酸残基の付加；
Ｃ−末端における１以上のアスパラギン酸残基の付加；
Ｒｂ６９  ＵｖｓＸではないＵｖｓＸ蛋白質からのＤＮＡ−結合ループ−２領域でのＤＮＡ−結合ループ−２領域の置換；
ヒスチジンタグの付加；および
その組合せ；
よりなる群から選択される蛋白質。
（項目２３）
前記蛋白質が配列番号：１１４、配列番号：１１５、配列番号：１１６、配列番号：１１７、配列番号：１１８、配列番号：１１９、配列番号：１２１、または配列番号：１２２のアミノ酸配列を含む、項目２２記載の突然変異体またはハイブリッドＲｂ６９  ＵｖｓＸ蛋白質。
（項目２４）
野生型Ｔ６  ＵｖｓＸアミノ酸配列において改変を含む突然変異体またはハイブリッドＴ６  ＵｖｓＸ蛋白質であって、該野生型アミノ酸配列における改変が：
位置６６におけるヒスチジンではないアミノ酸；
位置６６におけるセリン；
位置１６４におけるバリン；
位置１６６におけるセリン；
Ｃ−末端における１以上のグルタミン酸残基の付加；
Ｃ−末端における１以上のアスパラギン酸残基の付加；
Ｔ６  ＵｖｓＸではないＵｖｓＸ蛋白質からのＤＮＡ−結合ループ−２領域でのＤＮＡ−結合ループ−２領域の置換；
ヒスチジンタグの付加および
それらの組合せ；
よりなる群から選択される該蛋白質。
（項目２５）
前記蛋白質が配列番号：１０５または配列番号：１０６のアミノ酸配列を含む項目２４記載の突然変異体またはハイブリッドＴ６  ＵｖｓＸ蛋白質。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】図１は、変種ＵｖｓＸ、ＵｖｓＹおよびｇｐ３２蛋白質を生じさせるために用いられるクローンの模式的図を示す。
【図２】図２は、バクテリオファージＴ４  ＵｖｓＸとＥ．ｃｏｌｉ  ｒｅｃＡとの一次配列整列を示す。Ｔ４  ＵｖｓＸは：
【化２５】
2014233293.tif 000002
である。Ｅ．Ｃｏｌｉ  ｒｅｃＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅは以下の通りである：
【化２６】
2014233293.tif 000003
【化２７】
2014233293.tif 000004
【図３】図３は、一次配列整列に基づく同等なＴ４  ＵｖｓＸ残基の重ね合わせおよび標識を持つ活性なＥ．ｃｏｌｉ  ｒｅｃＡフィラメントのモデルの代表的な３−Ｄ構造を示す。図３Ａは、結合したＤＮＡの近似的ロケーションである中央ホールを持つモデルＲｅｃＡフィラメントの軸を見下ろすスクリーンショットである。Ｗａｌｋｅｒ  Ａモチーフおよび移動ＤＮＡ結合ループの近似的ロケーションは単一サブユニットについて示し、それは核酸に面する表面にある。図３Ｂおよび３Ｃは、３Ａに示される表面にＡＴＰが結合した領域から取られた２つのズームドショットである。
【図４】図４はＴ４およびＴ６  ｇｐ３２およびＵｖｓＹ蛋白質の一次配列整列を示す。Ｔ６  ｇｐ３２配列は以下の通りである；
【化２８】
2014233293.tif 000005
Ｔ４  ｇｐ３２配列は以下の通りである：
【化２９】
2014233293.tif 000006
Ｔ４  ＵｖｓＹ配列は以下の通りである：
【化３０】
2014233293.tif 000007
Ｔ６  ＵｖｓＹ配列は以下の通りである：
【化３１】
2014233293.tif 000008
【図５】図５は、多様なＵｖｓＸ蛋白質の一次配列整列を示す。Ｔ４ＵｖｓＸ配列は以下の通りである：
【化３２】
2014233293.tif 000009
ｔ６ＵｖｓＸ配列は以下の通りである：
【化３３】
2014233293.tif 000010
ファージ１３３ＵｖｓＸ配列は以下の通りである：
【化３４】
2014233293.tif 000011
Ｒｂ６９  ＵｖｓＸ配列は以下の通りである：
【化３５】
2014233293.tif 000012
【化３６】
2014233293.tif 000013
Ａｅｈ１ＵｖｓＸ配列は以下の通りである：
【化３７】
2014233293.tif 000014
Ａｅ６５ＵｖｓＸ配列は以下の通りである：
【化３８】
2014233293.tif 000015
Ｋｖｐ４０ＵｖｓＸ配列は以下の通りである：
【化３９】
2014233293.tif 000016
Ｒｂ４３ＵｖｓＸ配列は以下の通りである：
【化４０】
2014233293.tif 000017
【化４１】
2014233293.tif 000018
ＰＳＳＭ２ＵｖｓＸ配列は以下の通りである：
【化４２】
2014233293.tif 000019
ＰＳＳＭ４ＵｖｓＸ配列は以下の通りである：
【化４３】
2014233293.tif 000020
【図６】図６は、多様なＵｖｓＹ蛋白質の一次配列整列を示す。Ｔ４ＵｖｓＹ配列は以下の通りである：
【化４４】
2014233293.tif 000021
Ｔ６ＵｖｓＹ配列は以下の通りである：
【化４５】
2014233293.tif 000022
Ｒｂ６９ＵｖｓＹ配列は以下の通りである：
【化４６】
2014233293.tif 000023
ファージ１３３ＵｖｓＹ配列は以下の通りである：
【化４７】
2014233293.tif 000024
【化４８】
2014233293.tif 000025
Ａｅｈ１ＵｖｓＹ配列は以下の通りである：
【化４９】
2014233293.tif 000026
Ｒｂ４３ＵｖｓＹ配列は以下の通りである：
【化５０】
2014233293.tif 000027
Ｋｖｐ４０ＵｖｓＹ配列は以下の通りである：
【化５１】
2014233293.tif 000028
ＰＳＳＭ２ＵｖｓＹ配列は以下の通りである：
【化５２】
2014233293.tif 000029
ＰＳＳＭ４ＵｖｓＹ配列は以下の通りである：
【化５３】
2014233293.tif 000030
【図７】図７は、多様なｇｐ３２蛋白質の一次配列整列を示す。Ｔ４ｇｐ３２配列は以下の通りである：
【化５４】
2014233293.tif 000031
Ｔ６ｇｐ３２配列は以下の通りである：
【化５５】
2014233293.tif 000032
【化５６】
2014233293.tif 000033
Ｒｂ６９ｇｐ３２配列は以下の通りである：
【化５７】
2014233293.tif 000034
Ａｅｈ１ｇｐ３２配列は以下の通りである：
【化５８】
2014233293.tif 000035
Ｒｂ４３ｇｐ３２配列は以下の通りである：
【化５９】
2014233293.tif 000036
Ｋｖｐ４０ｇｐ３２配列は以下の通りである：
【化６０】
2014233293.tif 000037
ＰＳＳＭ２ｇｐ３２配列は以下の通りである：
【化６１】
2014233293.tif 000038
【化６２】
2014233293.tif 000039
ＰＳＳＭ４ｇｐ３２配列は以下の通りである：
【化６３】
2014233293.tif 000040
【図８】図８は、増幅のためにＴ６  ＵｖｓＸおよびＴ４  ＵｖｓＸを用いるＲＰＡ産物を示す臭化エチジウム染色アガロースゲルの写真である。Ｒｓ８１７９１４５−２は（配列番号：３４）であって、Ｒｓ８１７９１４５−３は（配列番号：３５）である。
【図９】図９は、ＳＹＢＲ緑色色素を用いるＲＰＡ反応におけるＴ６およびＴ４  ＵｖｓＸのキネティック挙動の比較を示すグラフである。
【図１０】図１０は、蛍光プローブを用いるＲＰＡ反応におけるＴ６およびＴ４  ＵｖｓＸのキネティック挙動の比較を示すグラフである。
【図１１】図１１は、本発明の新規な作成されたＴ６  ＵｖｓＸ蛋白質構築体の模式的レイアウトである。
【図１２】図１２は、蛍光プローブを用いるＴ６  ＵｖｓＸ  Ｈ６６Ｓおよび野生型Ｔ６  ＵｖｓＸのキネティック挙動の比較を示すグラフである。
【図１３】図１３は、蛍光プローブを用いるＲＰＡ反応における種々のＴ６  ＵｖｓＸ突然変異体のキネティック挙動の比較を示すグラフである。
【図１４】図１４は、ＲＰＡ反応におけるＲｂ６９成分によるＤＮＡ増幅の比較を示すグラフである。試料はＳＹＢＲ緑色色素を用いて分析した。
【図１５】図１５は、ＲＰＡ反応におけるＡｅｈ１成分によるＤＮＡ増幅の比較を示すグラフである。試料は蛍光プローブを用いて分析した。
【図１６】図１６は、Ａｅｈ１成分によるＤＮＡ増幅の比較、およびＲＰＡ反応における塩滴定の効果を示すグラフである。
【図１７】図１７は、ＲＰＡ反応におけるＴ４系に対するＡｅｈ１系のキネティック挙動の比較を示すグラフである。試料は蛍光プローブを用いて分析した。
【図１８】図１８は、Ａｅｈ１  ＵｖｓＸおよびＵｖｓＹを示すグラフであり、異種ｇｐ３２はＲＰＡ反応を用いてＤＮＡを増幅することができる。試料はＳＹＢＲ緑色色素を用いて分析した。
【図１９】図１９は、異種反応成分：Ｒｂ６９、ｇｐ３２およびＡｅｈ１  ＵｖｓＸ、およびＡｅｈ１  ＵｖｓＹを用いるＲＰＡ反応におけるＤＮＡ増幅を示す臭化エチジウム染色アガロースゲルの写真である。
【図２０】図２０は、新規なＲｂ６９作成構築体の模式図である。
【図２１】図２１は、さらなる新規なＲｂ６９作成構築体の模式図である。配列は、頂部から底部にかけて、配列番号：３６、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：４１、および配列番号：４２である。
【図２２】図２２は、ＲＰＡ反応におけるＲｂ６９およびＲｂ６９  Ｈ６４Ｓのキネティック挙動の比較を示すグラフである。試料はＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ色素を用いて分析した。
【図２３】図２３は、野生型Ｒｂ６９  ＵｖｓＸまたは突然変異体Ｒｂ６９  ＵｖｓＸ  Ｈ６４Ｓを用いるＲＰＡに対するＲｂ６９  ｇｐ３２滴定の効果の比較を示すグラフである。試料はＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ色素を用いて分析した。
【図２４】図２４は、ＲＰＡ反応における野生型Ｒｂ６９  ＵｖｓＸに対する突然変異体Ｒｂ６９  Ｈ６４Ｓ  ＵｖｓＸ蛋白質のキネティック挙動の比較を示すグラフである。試料は蛍光プローブを用いて分析した。
【図２５】図２５は、一定範囲のＲｂ６９  ｇｐ３２濃度（３００、４００、または５００ｎｇ／μｌのＲｂ６９  ｇｐ３２蛋白質）にわたってＲＰＡにおいて機能的である突然変異体Ｒｂ６９  Ｈ６４Ｓ  ＵｖｓＸを示すグラフである。試料は蛍光プローブを用いて分析した。
【図２６】図２６は、ＲＰＡにおける突然変異体Ｒｂ６９  Ｈ６４Ｓ  ＵｖｓＸの滴定を示すグラフである（００、１５０または２００ｎｇ／μｌのＲｂ６９  Ｈ６４Ｓ  ＵｖｓＸ）。試料は蛍光プローブを用いて分析した。
【図２７】図２７は、ＲＰＡにおける突然変異体Ｒｂ６９  ＵｖｓＸのさらなる滴定を示すグラフである（６０、８０または１００ｎｇ／μｌのＲｂ６９  Ｈ６４Ｓ  ＵｖｓＸ）。試料は蛍光プローブを用いて分析した。
【図２８】図２８は、Ｔ４  ＵｖｓＸおよびＵｖｓＹとのＲＰＡ反応におけるＲｂ６９  ｇｐ３２の有効性を示すグラフである。試料は蛍光プローブを用いて分析した。
【図２９】図２９は、Ｒｂ６９  ｇｐ３２を高濃度で用いた場合の、ＲＰＡにおけるＴ４およびＲｂ６９  ＵｖｓＸ／ＵｖｓＹ系のキネティック挙動の成分を示すグラフである。試料は蛍光プローブを用いて分析した。
【図３０】図３０は、ＲＰＡにおける突然変異体Ｒｂ６９  ＵｖｓＸ  Ｈ６４Ｔのキネティック挙動を示すグラフである。試料は蛍光プローブを用いて分析した。
【図３１】図３１は、ＲＰＡにおいてＲｂ６９  ＵｖｓＸを用いる場合ＡＴＰ滴定を示すグラフである。試料は蛍光プローブを用いて分析した。
【図３２】図３２は、ＲＰＡにおけるＲｂ６９  ＵｖｓＸおよびＵｖｓＹに対するＴ４  ｇｐ３２の効果を示すグラフである。試料は蛍光プローブを用いて分析した。
【図３３】図３３は、ＲＰＡ反応における、Ｃ−末端に対する修飾を有する突然変異体Ｒｂ６９  ＵｖｓＸ構築体のキネティック挙動の比較を示すグラフである。試料は蛍光プローブを用いて分析した。
【図３４】図３４は、ＲＰＡ反応における、Ｃ−末端に対する修飾を有するさらなる突然変異体Ｒｂ６９  ＵｖｓＸ構築体キネティック挙動の比較を示すグラフである。試料は蛍光プローブを用いて分析した。
【図３５】図３５は、ＲＰＡ反応において突然変異体Ｒｂ６９  ＵｖｓＸ  Ｈ６４Ｓ  ２ｘＬＤＥを用いる場合のＰＥＧ３５，０００の滴定を示すグラフである。試料は蛍光プローブを用いて分析した。
【図３６】図３６は、新規な作成されたハイブリッドＵｖｓＹ構築体の模式図である。
【図３７】図３７は、ＲＰＡにおけるＴ４  ＵｖｓＸおよびＴ４  ｇｐ３２での新規なＵｖｓＹハイブリッド構築体のキネティック挙動を示すグラフである。試料は蛍光プローブを用いて分析した。
【図３８】図３８は、ＲＰＡにおけるＲｂ６９  ＵｖｓＸおよびＲｂ６９  ＵｖｓＹでの新規なＵｖｓＹハイブリッド構築体の比較を示すグラフである。
【図３９】図３９は、ＲＰＡにおける突然変異体Ｒｂ６９  ＵｖｓＸ  Ｈ６４Ｓ／Ｔ６−１  ２ｘＬＤＥのキネティック挙動を示すグラフである。試料は蛍光プローブを用いて分析した。
【図４０】図４０は、ＲＰＡにおける突然変異体Ｒｂ６９  ＵｖｓＸ  Ｈ６４Ｓ／２ｘＬＤＥ存在下でのＲｂ６９  ｇｐ３２の滴定を示すグラフである。試料は蛍光プローブを用いて分析した。
【図４１】図４１は、ＲＰＡにおける突然変異体Ｒｂ６９  ＵｖｓＸ  Ｈ６４Ｓ／２×ＬＤＥおよびＲｂ６９  Ｈ６４Ｓ／Ｆ６９Ｍ／Ｇ７０Ｓ／Ｔ６−１／２ｘＬＤＥのキネティック挙動を示すグラフである。試料は蛍光プローブを用いて分析した。
【図４２】図４２は、ＲＰＡにおける突然変異体Ｒｂ６９  Ｈ６４Ｓ  Ｔ６８Ｓ／Ｌ６８Ｎ／Ｔ４／２ｘＬＤＥのキネティック挙動を示すグラフである。試料は蛍光プローブを用いて分析した。
【図４３】図４３は、ＲＰＡにおける突然変異体Ｒｂ６９  ＵｖｓＸ  Ｈ６４Ｓ  Ｔ６７Ｓ／Ｌ６８Ｎ／Ｔ４／２ｘＬＤＥを用いる場合のＲｂ６９  ｇｐ３２の滴定の効果を示すグラフである。試料は蛍光プローブを用いて分析した。
【図４４】図４４は、ＲＰＡにおけるＴ４  ｇｐ３２での突然変異体Ｒｂ６９  ＵｖｓＸ  Ｈ６４Ｓ  Ｔ６７Ｓ／Ｌ６８Ｎ  Ｔ４  ２ｘＬＤＥ蛋白質の活性を示すグラフである。試料は蛍光プローブを用いて分析した。
【図４５】図４５は、ＲＰＡにおけるファージ１３３、シアノファージ、およびＡｅｈ１からのＤＮＡ−結合ループを含有するＲｂ６９  ＵｖｓＸキメラの活性を示すグラフである。試料は蛍光プローブを用いて分析した。
【図４６】図４６は、ＰＲＡにおける突然変異体Ｒｂ６９  ＵｖｓＸ  Ｈ６４Ｓ  Ｔ６  ２ｘＬＤＥの活性を示すグラフである。試料は蛍光プローブを用いて分析した。
【図４７】図４７は、０．１ｍＭ、０．５ｍＭ、１ｍＭ、２ｍＭ、３ｍＭマンガンを用いるＲＰＡ反応からの増幅されたＤＮＡ産物を示す臭化エチジウム染色ゲルの写真である。
【図４８】図４８は、ＲＰＡにおけるＳ．Ａｕｒｅｕｓ  Ｐｏｌ  Ｉを用いるＤＮＡ増幅を示すグラフである。試料はＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ色素を用いて分析した。
【図４９】図４９は、ＲＰＡ反応において対照として水を用いるノイズ検出の開始におけるヘアピンを示すグラフである。試料はＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ色素を用いて分析した。
【図５０】図５０は、ＲＰＡ反応におけるヘアピンの使用による低コピー標的数の改良された分解能を示すグラフである。試料は蛍光プローブを用いて分析した。
【図５１】図５１は、ＲＰＡにおけるブロックされたプライマーを用いるＤＮＡ増幅を示すグラフである。試料は蛍光プローブを用いて分析した。
【図５２】図５２は、ＵｖｓＹ負荷剤の存在下または非存在下においてＴ６  Ｈ６６Ｓ  ＵｖｓＸおよびＲｂ６９  ｇｐ３２を用いるＲＰＡ産物を示す臭化エチジウム染色アガロースゲルの写真である。
【図５３】図５３は、ＵｖｓＹ負荷剤の存在下または非存在下においてＴ６  Ｈ６６Ｓ  ＵｖｓＸおよびＲｂ６９  ｇｐ３２を用いるＲＰＡ産物を示す臭化エチジウム染色アガロースゲルのもう１つの写真である。
【図５４】図５４は、ＵｖｓＹ負荷剤の存在下または非存在下においてＴ６  Ｈ６６Ｓ  ＵｖｓＸおよびＲｂ６９  ｇｐ３２を用いる小ゲノムＤＮＡ標的のＤＮＡ増幅を示す臭化エチジウム染色アガロースゲルの写真である。
【図５５】図５５は、ＵｖｓＹ負荷剤の存在下または非存在下においてＴ６  Ｈ６６Ｓ  ＵｖｓＸおよびＲｂ６９  ｇｐ３２を用いる複合体ゲノムＤＮＡ標的のＤＮＡ増幅を示す臭化エチジウム染色アガロースゲルの写真である。
【図５６】図５６は、ＵｖｓＹ負荷剤の存在下または非存在下における、およびＰＥＧの存在下または非存在下におけるＴ６  Ｈ６６Ｓ  ＵｖｓＸおよびＲｂ６９  ｇｐ３２を用いるＲＰＡ産物を示す臭化エチジウム染色アガロースゲルの写真である。
【図５７】図５７は、ＵｖｓＹ負荷剤の存在下または非存在下におけるＴ４  ｇｐ３２またはＲｂ６９  ｇｐ３２と共にＴ６  Ｈ６６Ｓ  ＵｖｓＸを用いるＲＰＡ産物を示す臭化エチジウム染色アガロースゲルの写真である。
【図５８】図５８は、ＵｖｓＹ負荷剤の存在下または非存在下におけるＲｂ６９  ｇｐ３２またはＡｅｈ１  ｇｐ３２と共にＴ６  Ｈ６６Ｓ  ＵｖｓＸを用いるＲＰＡ産物を示す臭化エチジウム染色アガロースゲルの写真である。
【図５９】図５９は、ＵｖｓＹ負荷剤の存在下または非存在下におけるＲｂ６９  ｇｐ３２と共にＴ６  Ｈ６６Ｓ  ＵｖｓＸまたはＴ４  ＵｖｓＸを用いるＲＰＡ産物を示す臭化エチジウム染色アガロースゲルの写真である。
【図６０】図６０は、ＵｖｓＹ負荷剤の存在下または非存在下におけるＴ４  ｇｐ３２、Ｔ６  Ｈ６６Ｓ  ＵｖｓＸまたはＴ４  ＵｖｓＸと共に用いるＲＰＡ産物を示す染色された臭化エチジウム染色アガロースゲルの写真である。
【図６１】図６１は、ＵｖｓＹ負荷剤の存在下または非存在下におけるＲｂ６９  ｇｐ３２と共にＴ４  ＵｖｓＸまたはＴ６  Ｈ６６Ｓ  ＵｖｓＸを用いるＤＮＡ増幅を用いるグラフである。試料は蛍光プローブを用いて分析した。
【図６２】図６２は、ＵｖｓＹ負荷剤の存在下または非存在下におけるとＲｂ６９  ｇｐ３２と共にＴ６  ＵｖｓＸまたはＴ６  Ｈ６６Ｓ  ＵｖｓＸを用いるＲＰＡ産物を示す臭化エチジウム染色アガロースゲルの写真である。
【図６３】図６３は、ＵｖｓＹ負荷剤の存在下または非存在下におけるＲｂ６９  ｇｐ３２と共にＴ６  Ｈ６６Ｓ  ＵｖｓＸまたはＲｂ６９  ＵｖｓＸを用いるＲＰＡ産物を示す臭化エチジウム染色アガロースゲルの写真である。
【図６４】図６４は、ＵｖｓＹ負荷剤の存在下または非存在下におけるＲｂ６９  ｇｐ３２と共にＲｂ６９  ＵｖｓＸまたはＡｅｈ１  ＵｖｓＸを用いるＲＰＡ産物を示す臭化エチジウム染色アガロースゲルの写真である。
【図６５】図６５は、ＵｖｓＹ負荷剤の存在下または非存在下におけるＲｂ６９  ｇｐ３２と共にＴ６  Ｈ６６Ｓ  ＵｖｓＸまたはＲｂ６９Ｔ６ループ２Ｈ６４Ｓ  ＵｖｓＸを用いるＲＰＡ産物を示す臭化エチジウムン染色アガロースゲルの写真である。
【図６６】図６６は、ｇｐ３２活性を検出するように設計されたアッセイにおけるＲｂ６９  ｇｐ３２を滴定する効果の結果を示すグラフである。試料は蛍光プローブを用いて分析した。
【図６７】図６７Ａないし図６７Ｃは、ｇｐ３２活性を検出するように設計されたアッセイにおいてＴ４、Ａｅｈ１およびＲｂ６９  ｇｐ３２分子の活性を比較するグラフである。試料は蛍光プローブを用いて分析した。
【図６８】図６８Ａないし図６８Ｃは、ｇｐ３２活性を検出するように設計されたアッセイにおいてＴ４、Ａｇｈ１およびＲｂ６９  ｇｐ３２分子の温度上限を比較するグラフである。試料は蛍光プローブを用いて分析した。
【図６９】図６９は、ＵｖｓＹ負荷剤の存在下または非存在下における、Ｒｂ６９  ｇｐ３２と共にＴ４  ＵｖｓＸを用いるＲＰＡ反応でのＤＮＡ増幅の比較を示すグラフである。試料は蛍光プローブを用いて分析した。
【図７０】図７０は、ＵｖｓＹ負荷剤の存在下または非存在下におけるＲｂ６９  ｇｐ３２と共にＴ４  ＵｖｓＸを用いるＲＰＡ反応でのＤＮＡ増幅の比較を示すさらなるグラフである。試料は蛍光プローブを用いて分析した。
【図７１】図７１は、ＵｖｓＹ負荷剤の存在下または非存在下におけるＴ４  ＵｖｓＸおよびＲｂ６９  ｇｐ３２を用いるＲＰＡ産物を示す臭化エチジウム染色アガロースゲルの写真である。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
本発明は、多様なハイブリッドおよび作成されたレコンビナーゼ酵素の使用についての新規な可能化データを構成する。種々のｒｅｃＡ／ＵｖｓＸ−様組換え蛋白質の用途、およびＲＰＡ反応を行うための関連する組換え因子が示される。驚くことに、変種レコンビナーゼ（例えば、新規な作製されたキメラおよび突然変異体レコンビナーゼ）およびそれらの関連成分はキネティックスの差、最適なＰＥＧ濃度、ＳＳＢ濃度の差、およびレコンビナーゼ負荷因子に対する依存性の差を呈することが見出された。さらに、本発明の新規なキメラおよび突然変異体蛋白質は、これらの挙動に対してかなり影響する特異的ペプチド領域の解明を可能とした。
観察された変動のいくつかの起源、およびＲＰＡアッセイにおける活性に影響するいくつかの鍵となるアミノ酸残基のロケーションをここに記載する。特に重要なのは、モバイルＤＮＡ−結合ループ、ならびにＡＴＰａｓｅで見出されたＷａｌｋｅｒ  Ａモチーフにおける残基である。注目すべきは、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＲｅｃＡにおけるＤＮＡ結合ループ２に対応するペプチドは非常に重要であって、このペプチドは、一般には、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＲｅｃＡ、およびミオウイルスからのＲｅｃＡ／ＵｖｓＸ−様蛋白質内のかなりの変種には無関係である。驚くべきことには、Ｔ６  ＵｖｓＸ蛋白質、およびその誘導体は、ＲＰＡ反応における非常に重要なＵｖｓＹ−非依存性活性を呈することが見いだされた。このＵｖｓＹ−非依存性活性は、特にＵｖｓＸ−負荷に好都合であるが、Ｔ６およびその誘導体にとっては最も自明である条件下で他のＵｖｓＸ種まで拡大することもできる。この分析は、ＲＰＡで用いられる改変されたＴ６およびＲｂ６９  ＵｖｓＸのエンジニアリングを可能とし、ＲＰＡ系についての作成されたスーパー−レコンビナーゼのさらなる最適化および開発のための段階を設定した。驚くべきことには、Ｔ６−由来レコンビナーゼは、負荷蛋白質が反応の性能および頑強性を改良するにもかかわらず、負荷蛋白質について唯一の部分的要件を示す。ＲＰＡプロセスにおいて改変された活性を呈するハイブリッド蛋白質を利用することができる。組換え成分の異種組合せを含む系も効果的に用いることもできる。
【００４５】
ＲＰＡ反応を改良するためのさらなる成分および条件もまたここに提供される。例えば、本発明は、ＲＰＡ反応に、同様な、またはＣａｒｂｏｗａｘ  ２０Ｍ（ＰＥＧ化合物）よりも大きいさえの効果を付与する他の密集剤を提供する。密集剤、特に、少なくとも１０，０００であって１００，０００未満である分子量を有するものを含めると、ＲＰＡ反応においてかなり刺激性であることが判明した。そのような密集剤は、限定されるものではないが、ポリエチレングリコール、ポリエチレンオキサイド、ポリビニルアルコール、ポリスチレン、Ｆｉｃｏｌｌ、デキストラン、ＰＶＰおよびアルブミンを含む。特に、ＰＥＧ分子量３５，０００はＲＰＡ反応において非常に有効であることが判明した。本発明は、非−特異的プライマーノズルのレベルを低下させる剤としてのＲＰＡ反応におけるヘアピンの使用、および組換え中間体から３’ブロッキング基または末端残基を迅速に磨くＥ．ｃｏｌｉエキソヌクレアーゼＩＩＩまたはＥ．ｃｏｌｉエキソヌクレアーゼＩＶの能力も提供する。加えて、マンガンイオンはマグネシウムを置き換えることができることが示されているが、かなり低い濃度におけるものである。
【００４６】
さらに、本発明は、修復クラスポリメラーゼ、およびプルーフ−リーディング活性を欠如するポリメラーゼを含めた、ＲＰＡ反応で用いるストランド変位合成が可能な代替ポリメラーゼの使用を提供する。驚くことには、Ｅ．ｃｏｌｉ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ，ａｎｄ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓのＰｏｌ  Ｉクラスに対する相同性を担う細菌ポリメラーゼＩ修復酵素の全長蛋白質ではないが大きな断片は、ＲＰＡ反応において有効であり、かくして、効果的であることが示されたポリメラーゼのレパートリーを拡大し、原核生物（および恐らくはファージ）からの修復クラスのストランド−変位ポリメラーゼが一般的に有効であるという考えを支持することが判明した。
ＲＰＡの簡単な記載
ＲＰＡはＤＮＡ断片を増幅するための方法（プロセス）である：ＲＰＡは、オリゴヌクレオチドプライマーをデュプレックスＤＮＡにおける相同配列と対合することができるレコンビナーゼとして知られた酵素を使用する。このように、ＤＮＡ合成は試料ＤＮＡにおける規定された点に向けられる。２つの遺伝子−特異的プライマーを用い、もし標的配列が存在すれば、指数関数的な増幅反応が開始される。反応は迅速に進行し、その結果、丁度少数の標的コピーから、２０ないし４０分のような短い時間内に検出可能なレベルまでの特異的な増幅がもたらされる。
【００４７】
ＲＰＡ反応は、系の組換えエレメントの双方の活性を支持するのに必要な蛋白質および他の因子、ならびに相補的に基質に対合したオリゴヌクレオチドの３’末端からのＤＮＡ合成を支持するもののブレンドを含有する。組換え系の鍵となる蛋白質成分は、原核生物、ウイルスまたは真核生物起源に由来し得るレコンビナーゼそれ自体である。しかしながら、加えて、一本鎖ＤＮＡ結合蛋白質にとっては、反応において継続的な種々の交換トランス作用の間に核酸を安定化させるという要件がある。ストランド−変位特徴を持つポリメラーゼは、具体的に必要とされる。というのは、多くの基質が特徴が依然として部分的にデュプレックスであるからである。実施化が確実とされており、それは、核酸の痕跡量レベルから増幅することができる反応を正確とするには、密集剤および負荷蛋白質の使用を含むイン・ビトロ条件が必要とされる。バクテリオファージＴ４  ＵｖｓＸレコンビナーゼ、バクテリオファージＴ４  ＵｖｓＹ負荷剤、バクテリオファージＴ４  ｇｐ３２およびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓポリメラーゼＩ大断片を含む効果的な系は従前に報告されている。
鍵となる残基の分析、および新規なレコンビナーゼ蛋白質の作成
ＲＰＡ反応を行うための最適な条件および蛋白質についてより多くを学ぶ努力において、Ｔ４バクテリオファージの類縁であるミオウイルス家バクテリオファージからＲｅｃＡ／ＵｖｓＸ−様蛋白質をクローン化し、生産するための努力がなされた。加えて、他の鍵となる蛋白質成分が同定され、これは各ファージからのＲＰＡ反応で必要であろう。例えば、ｇｐ３２蛋白質およびＵｖｓＹ蛋白質の同等体である。図１は、変種ＵｖｓＸ、ＵｖｓＹ、およびｇｐ３２蛋白質を作り出すのに用いたクローンの模式図を示す。オリゴヌクレオチド中の過剰な塩基の、それらのクローニングで用いるＰＣＲ増幅プライマーへの取込みを介して、ヘキサヒスチジンタグをＮまたはＣ末端において作成した。鋳型はゲノムファージＤＮＡであった。Ｔ６はドイツ国のＤＳＭＺストックセンターから得られ、他方、Ｒｂ６９、Ａｅｈ１およびＫＶＰ４０ファージはカナダ国におけるＩｎｓｔｉｔｕｔｅ
Ｆｅｌｉｘ  Ｄ’ｈｅｒｅｌｌｅから得た。
【００４８】
これらの蛋白質の生物学的活性の比較、およびこれらの蛋白質のアミノ酸配列における変動に対するいずれかの生化学的差の関係の分析が行われた。バクテリオファージＵｖｓＸまたはＵｖｓＹ蛋白質のいずれも結晶化されなかった（あるいは公のデータベースで入手できない）が、ＵｖｓＸ蛋白質は、構造が知られた細菌ＲｅｃＡ蛋白質の密接な類縁物である。ＲｅｃＡおよびＵｖｓＸは共通の先祖に由来すると仮定されている（Ｓｔｏｒｙ
ｅｔ  ａｌ．，１９９３）。ＲｅｃＡおよびＵｖｓＸ蛋白質は一次配列レベルにおいて弱い相同性を共に有するに過ぎないが、それらは、ＤＮＡに組立てられた場合に非常に同様な幾何学およびピッチを示し、潜在的サブユニット界面を含む相同性のブロックを共に有する。また、それらは、デュプレックスおよび一本鎖ＤＮＡに対するＤＮＡ親和性に変調に関与するようである酸性Ｃ−末端残基のような細菌ＲｅｃＡ蛋白質に関連する他の特徴を共に有する（Ｂｅｎｅｄｉｃｔ  ａｎｄ  Ｋｏｗａｌｃｚｙｋｏｗｓｋｉ，１９８８）。本明細書中に記載されるように、ＵｖｓＸ蛋白質は、鋳型として標準一次蛋白質を配列整列を用いて公知のＲｅｃＡ蛋白質配列にモデル化された。これは、構造位置に対する一次ペプチド配列変動の効果、および観察すべき、ＤＮＡ結合、ＡＴＰ結合および加水分解、サブユニット界面等に関与する領域の公知の生物学的機能を可能とした。
ＲｅｃＡおよびＴ４  ＵｖｓＸ
図２および３は、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＲｅｃＡを含むバクテリオファージＴ４  ＵｖｓＸ、および活性なＥ．ｃｏｌｉ  ＲｅｃＡフィラメントのモデルの代表的な３−Ｄ構造の一次配列整列を示す。これらの２つの蛋白質は２３％同一性を有し、一次配列レベルにおいて４３％同様である。生物学的活性に関連し、かつ本明細書中における考察に関連するＲｅｃＡ分子の種々の鍵となる領域は整列および構造に示される。ヌクレオチドを結合し、それを加水分解するのに関与する領域は、ＤＮＡ骨格に接触するのに関与する蛋白質の面に密接に関連することが見出される。（全てのＡＴＰ−加水分解酵素において見出される）いわゆるＷａｌｋｅｒ  Ａモチーフを規定する鍵となる残基は双方の蛋白質において見出されていることを注記する。Ｗａｌｋｅｒ  Ａコンセンサスは、しばしば、Ａ／Ｇ  ＸＸＸＸＧＫ  Ｓ／Ｔ（配列番号：４３）として記載されており、ここに、Ｘはいずれかのアミノ酸である（Ｗａｌｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８２）。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＲｅｃＡ蛋白質Ｗａｌｋｅｒ  Ａモチーフはこのコンセンサスに完全にマッチし、他方、Ｔ４  ＵｖｓＸは、リシンの直前に第二のグリシンを欠如している。Ｔ４以外のほとんどのファージＵｖｓＸ蛋白質は、その代わりにフェニルアラニンを有する第二のグリシンを欠如している（図５参照）が、これはシアノファージＳＳＭ２およびＳＳＭ４の幾分より多様なレコンビナーゼには当てはまらない。これらの後者の蛋白質は第二のグリシンを保有し、全体として、Ｗａｌｋｅｒ  Ａ配列に関してＲｅｃＡに有利により密接に似ている。
【００４９】
後の考察のための注目する他のペプチド配列は、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＲｅｃＡにおけるＤＮＡ結合ループ１および２として記載された領域を含む。これらのループは高度に移動性であると記載されており、ＤＮＡへの直接的接触に関連し（Ｍａｌｋｏｖ  ａｎｄ  Ｃａｍｅｒｉｎｉ−Ｏｔｅｒｏ，１９９５）、また、ヌクレオチド加水分解プロセスに参画する（Ｖｏｌｏｓｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．２０００）。かくして、（いくつかの結晶構造においては秩序が乱れた）双方のＤＮＡ結合ループ、およびＷａｌｋｅｒ  Ａモチーフは、全て、蛋白質の共通の面で相互に密接に近接して位置することに注意するのは有意義である。ＤＮＡ結合についてのＡＴＰ相互作用の依存性、およびＤＮＡ結合によって引き起こされたＡＴＰ加水分解の汚染された刺激は、これらの種々のペプチド、ＡＴＰおよびＤＮＡの間の直接的相互作用に関連する密接に相互依存性のプロセスであることは容易に想像できる。
【００５０】
注目する最後の領域は、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＲｅｃＡおよびＴ４  ＵｖｓＸ蛋白質の非常にＣ側末端である。双方の場合において、酸性ペプチド配列がある。これは、従前に、特に、二本鎖ＤＮＡに対するより強い結合の促進、およびマグネシウムイオンおよび種々の塩ならびにｐＨ条件における依存性の低下を除去した場合に、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＲｅｃＡのＤＮＡ結合特性に影響することが示されている（Ｅｇｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２００３；Ｌｕｓｅｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．２００３）。注目すべことにはこの酸性配列の除去は、レコンビナーゼフィラメントの解体が起こる頻度を減少させることができる。従前の研究において、ＲｅｃＡまたはＴ４  ＵｖｓＸいずれかからのこの酸性の配列の除去は、デュプレックス基質に対する望ましくなく高いＤＮＡ親和性に由来し得る一般に有害な効果を有するＲＰＡ反応における蛋白質の活性を改変したと報告されている（Ｐｉｅｐｅｎｂｕｒｇ
ｅｔ  ａｌ．Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．１０／９３１，９１６）。
Ｔ４  ｖｓ  Ｔ６  ＵｖｓＸ蛋白質
予測されない数のアミノ酸置換
多数のＵｖｓＸ−様蛋白質分子は図５において整列されている。Ｔ６  ＵｖｓＸ蛋白質がクローン化され、配列決定され、Ｃ末端においてヒスチジンタグ配列を伴ってＥ．ｃｏｌｉで発現された。Ｔ６  ＵｖｓＸ蛋白質の同様なドラフト配列が、Ｔｕｌａｎｅ大学で供されたデータベースで見出された。驚くべき発見は、かなり多数のアミノ酸残基が、Ｔ４およびＴ６  ＵｖｓＸ蛋白質の間で変種であることであった。２つの蛋白質の間の３８の置換、およびＮ−末端における２アミノ酸挿入があった。異種性のこのかなりのレベルが驚くべきことであったという理由は、Ｔ２、Ｔ４、およびＴ６（いわゆるＴ−偶数ファージ）が相互のかなり近縁の類縁物と見なされることである。奇妙なことには、全ての置換されたアミノ酸残基は蛋白質の多かれ少なかれＮ−末端側半分に制限され、他方、Ｃ−末端側半分は完全に保存されていた。これは特に奇妙なように見えた。なぜならば、より発散したミオウイルス化メンバーからのＵｖｓＸ類縁を研究した場合に、最後のＣ−末端の３０ないし４０残基の他の領域が最も保存されていなかったことが記載されていたからである。また、一次ＤＮＡ配列は、ゆらぎ位置においてさえ少数の塩基変化を伴う蛋白質のＣ−末端側半分についてのコーディング配列においてかなりよく保存されており、他方、Ｎ−末端側半分が塩基変化の濃縮されたクラスターを示したことも記載されていた。事実、置換されたアミノ酸の多くは、観察されたアミノ酸置換を達成するのに２塩基変化を必要とした。後に記載するように、これらの置換のいくつかはレコンビナーゼの機能で重要な領域で起こり、主としてサイレント位置で起こる突然変位のモデルを支持するよりはむしろ、この場合、ポリペプチドに測定可能な生化学的変動を付与することにより、多くの置換が選択することができると提唱されている。
Ｔ４およびＴ６  ＵｖｓＸ蛋白質の相対的活性
ＤＮＡ増幅アッセイにおいてＴ６  ＵｖｓＸ蛋白質の活性をテストし、蛍光プローブまたは小−溝結合色素、ならびに端部における産物はアガロースゲルでモニターしたいくつかの実験にてリアルタイムでモニターした。これらの実験において、Ｔ４からのｇｐ３２およびＵｖｓＹ蛋白質を使用した。このアプローチは、Ｔ４およびＴ６からのｇｐ３２およびＵｖｓＹは非常に同様に見えたので採用した。Ｔ６  ＵｖｓＹを配列決定し、唯２つの高度に保存的な置換が見出された（図４参照）。Ｔ６  ｇｐ３２は唯４つの置換、および単一アミノ酸挿入を有した。Ｔ６  ＵｖｓＸ蛋白質は、事実、活性であって、効果的に働いて、この異種系において標的を増幅したと判断された。アガロースゲルでアッセイすると、Ｔ４およびＴ６  ＵｖｓＸ蛋白質で行った反応（９０分の反応）の間で有意な合致する差はなかった（最終産物蓄積の小さな差はここで観察されたが、合致するものではなく、ピペッティングの不正確さを通じて起きたのであろう）（図８参照）。しかしながら、ＳＹＢＲ−緑色を用い、またはプローブ−ベースのアプローチにてリアルタイムでアッセイすると、反応キネティックスの測定可能な差が観察された。Ｔ６  ＵｖｓＸで行った反応は、Ｔ４  ＵｖｓＸで行ったものよりもシグナル蓄積の曲線が終始一貫してより浅かったが、一般には、シグナル閾値が交差した時は同様であった（ＳＹＢＲ−Ｇｒｅｅｎまたはプローブを用いるＴ４およびＴ６  ＵｖｓＸ増幅キネティックスの比較を示す図９および１０参照）。いずれかの理論に拘束されるつもりはないが、この効果の再現性は、これらの２つの蛋白質の間の現実の生化学的差によって支持されてきたように見える。しかしながら、ここでは、１つの関心はプローブ−ベースの系で行われた実験の解釈について生じるはずであることを注記する。プローブ−ベースの実験において強いシグナルを生じさせるためには、増幅プライマーの非対称比率を使用して、反応後期におけるプローブに相補的な過剰な一本鎖ＤＮＡを誘導した。変種レコンビナーゼが、プローブと相互作用するこの一本鎖ＤＮＡの能力に影響すると仮定すれば、それはこの系で発生するシグナルをマスクすることができ、より低い総じての蛍光を導くであろう。この効果は、より貧弱な全増幅によって引き起こされる同様な応答に対してメカニズム的に異なる起源を有し得る。しかしながら、いずれの場合においても、それは増幅成分の生化学的差を反映するであろう。
Ｔ４およびＴ６  ＵｖｓＸの間の変動の源
Ｗａｌｋｅｒ  Ａモチーフ
Ｔ４およびＴ６  ＵｖｓＸの異なる一次アミノ酸配列の間の可能な関係、および観察された生化学的差を理解する努力において、ＲｅｃＡについて入手可能な既知の構造的および機能的情報を検討し、該情報をファージ蛋白質に移行させた。特に興味深いのは、ＤＮＡ結合およびヌクレオチド加水分解に潜在的に関与する領域であった。先に議論したように、ｓｓＤＮＡおよびｄｓＤＮＡについてのレコンビナーゼの親和性、およびＡＴＰ加水分解速度に関連する加水速度は、ＲＰＡ反応の挙動に臨界的に影響するようにみえる因子である。かくして、最も知られた（非−シアノファージ）ＵｖｓＸ−様蛋白質の間で高度に保存されているが、それがカノニカルＷａｌｋｅｒ  Ａモチーフ（図５参照、ほとんどの蛋白質における配列ＧＰＳＫＨＦＫＳ（配列番号：４４）およびＲｂ６９におけるＡＰＳＫＨＦＫＴ（配列番号：４５））の第二のグリシンを欠如し、かつＴ４  ＵｖｓＸ（ＧＰＳＫＳＨＦＫＳ（配列番号：４６）においてわずかに異なる点でわずかに奇妙であるいわゆるＷａｌｋｅｒ  Ａモチーフ（または「Ｐ−ループ」）（通常はＡ／Ｇ  ＸＸＸＸＧＫ  Ｓ／Ｔ（配列番号：４３）として記載されるコンセンサス）の配列、およびその周囲は特に興味深かった。このモチーフは、ＡＴＰの結合および加水分解、トリホスフェート骨格の配位に関与する残基の保有、および加水分解の刺激に関連する極性残基に関連付けられている。Ｔ４  ＵｖｓＸは、（ＲｅｃＡ蛋白質をより連想させるＰ−ループを有する。離れたシアノファージホモログを除いて全ての他のＵｖｓＸ蛋白質においてはヒスチジンである位置６４においてセリン残基を保有する。この新規な配置の結果、Ｗａｌｋｅｒ
Ａモチーフの中央において新しいリシン−セリンジペプチドが生じ、これは、モチーフのＣ−末端においてのみ通常見出される特徴、よって、再反復であると記載されていた。非常に重要なことには、Ｗａｌｋｅｒ  Ａモチーフのリシンおよびセリン（またはスレオニン）残基は、ガンマホスフェートの配位（リシン）およびホスフェート−ホスフェート結合の加水分解（セリン／スレオニン）にとって鍵となるものである。以前の研究から、Ｔ４  ＵｖｓＸは、該蛋白質がＡＴＰをＡＭＰおよびピロホスフェートへ加水分解し、ならびにＡＤＰおよびホスフェートへ加水分解するという異常な特性、より伝統的な反応を示したことが知られていた（Ｆｏｒｍｏｓａ  ａｎｄ  Ａｌｂｅｒｔｓ，１９８６）。これは、この触媒可塑性が、おそらくは、ベータ−ホスフェートを配位し、より伝統的な反応と同等な方法でアルファ−ベータホスフェート−ホスフェート結合の加水分解を触媒することができるこの中枢的なリシン−セリンジペプチドによって付与されたか否かという疑問を生じた（ＲｅｃＡ蛋白質構造の分析は、これらの中枢的残基が適切に位置しているであろうことを示唆した、図３参照）。もし真実であれば、非−Ｔ４  ＵｖｓＸ蛋白質はＡＭＰおよびピロホスフェートを生じさせず、これはＲＰＡ反応におけるそれらの相対的挙動に対して有意な関連を有し得ると予測された。例えば、Ｔ４  ＵｖｓＸにおいては、この活性は、該反応におけるレコンビナーゼのダイナミシティの程度に対する関連を持つ総じての全ＡＴＰ加水分解活性を増加させるであろう。また、ＡＴＰおよびＡＤＰは異なるヌクレオ蛋白質ラセンピッチに関連すると報告されている（Ｅｌｌｏｕｚｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）ので、ＡＭＰは、重要であり得る第三のピッチを促進するであろう。かくして、この変種残基は、Ｔ４およびＴ６  ＵｖｓＸの間で観察された変動のいくつかまたは全てを裏付けるであろう。
【００５１】
ヒスチジン残基が、Ｔ４で見出された同等な中枢的Ｗａｌｋｅｒ  Ａモチーフ位置においてセリンで置き換えられた突然変異体Ｔ６蛋白質が作成された。この結果、元のＴ６蛋白質の配列に対して改良されたように見える蛋白質がもたらされた。リアルタイムで産物の蓄積を検知することに関連する種々の実験において、傾きはより急峻であって、総じた最大シグナルは突然変異体Ｔ６蛋白質についてより高かった（図１２）。この突然変異は、特に、反応の後期においてＲＰＡ反応の挙動に直接的に利益を与えると結論された。これは、いくつかの源のうち１以上に由来し得る；（ｉ）レコンビナーゼは効率低くデュプレックスＤＮＡに結合し、かくして、産物によるレコンビナーゼのアウト−滴定を余り蒙らない、（ｉｉ）レコンビナーゼはデュプレックスＤＮＡについてより効率的にＡＴＰを加水分解でき、かくして、デュプレックスＤＮＡからより効率的にリサイクルし、（ｉｉｉ）ＡＴＰからＡＭＰおよびＰＰｉを生じる加水分解は、反応の後期に高い動的活性を維持するのに有用な新しいヌクレオ蛋白質ピッチと関連付けることができる。他の説明は、勿論、可能である。
Ｗａｌｋｅｒ  Ａモチーフに対してＣ末端側の残基
Ｔ６  ＵｖｓＸの活性の有意な改良にもかかわらず、一旦ヒスチジン６６がセリンに突然変異したならば、当該蛋白質は、依然として、Ｔ４  ＵｖｓＸに対する挙動がわずかに異なったままのように見えた。かくして、他のアミノ酸を調べた。先に述べたように、Ｔ６およびＴ４の間の３８アミノ酸置換は蛋白質のＮ−末端側半分においてクラスターをなしている。置換は、影響力があるであろういくつかの箇所、すなわち、Ｗａｌｋｅｒ  Ａモチーフに対して直接Ｃ−末端側にある残基、ならびに推定モバイルＤＮＡ−結合ループにおけるものに見出された（後記をより参照されたし）。図５は、Ｔ６がＷａｌｋｅｒ  Ａモチーフの直接的後に２つのアミノ酸、すなわち、メチオニン７１およびセリン７２を有し、これは、これらの残基がフェニルアラニンおよびグリシンであるＴ４とは異なることを示す。図３、パネルＢにおいて、Ｔ４残基フェニルアラニン（Ｆ６９）およびグリシン（Ｇ７０）の推定位置が示される（Ｅ．ｃｏｌｉ  ＲｅｃＡにおけるようにＴ４  ＵｖｓＸにおいて同様なポジショニングを採る）。それらはＷａｌｋｅｒ  Ａモチーフ（または「Ｐ」ループの他の重要な残基に非常に近く、また、その開始および終わりが示された推定モバイルＤＮＡ結合ループ２に対しても非常に近いことに注意されたし。
【００５２】
これらの変種残基はＴ６  ＵｖｓＸにおいて突然変異されて、蛋白質が作成されたクローンＴ６  ＵｖｓＸ  Ｍ７１Ｆ／Ｓ７２Ｇが生じた。この蛋白質をリアルタイムアッセイでテストし、全体として不活性であることが判明した（図１３）。これらの残基の一方または双方は単離において非−置換可能であり、それらは、Ｔ６  ＵｖｓＸにおいてやはり改変されて、正しい知検および／または活性を保証し、それを可能とする他の置換された残基との生化学的相互作用を有するに違いないと結論された。これらの残基の一方または双方がいくつかの他のペプチド領域との測定可能な相互作用を付与するというさらなる証拠は、Ｒｂ６９キメラを分析する後に示されるデータによって示唆される。まとめると、少なくとも単離におけるこれらの２つの残基（Ｍ７１およびＳ７２）はＴ４およびＴ６の間のサイレントの置換ではなく、それらは、単離においてＴ４およびＴ６  ＵｖｓＸの間のわずかな差を付与するのを担っているようには見えない。
ＤＮＡ結合ループ１
Ｔ４およびＴ６ペプチド配列の比較は、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＲｅｃＡのＤＮＡ結合ループ１の同等体を含むようである配列は、一般には、Ｔ４およびＴ６  ＵｖｓＸの間で非常に高度に保存されていることを示唆する（図５）。それにもかかわらず、推定領域の端部における２つの残基は変種、すなわち、Ｔ４においてはバリンであるＴ６のセリン１６４、およびＴ４においてはセリンであるＴ６のアラニン１６６であった。これらの残基は、Ｔ６においては一緒に共に突然変異して、クローンＴ６  ＵｖｓＸ  Ｓ１６４Ｖ／Ａ１６６Ｓを生じた。この蛋白質を発現させ、精製し、リアルタイムアッセイにおいてそれをテストした。この蛋白質で行った最初の実験を図１３に示し、そこでは、それはよく実行され、野生型Ｔ６よりもわずかに良好であった。後の実験において、その挙動は野生型Ｔ６からほとんど区別できないように見えたことが記載されている。その結果、実験の誤差の境界内で、これらの置換はＴ４およびＴ６ポリペプチドの間でサイレントであり、これらの実験で取り込まれたアッセイ可能な特徴に有意には寄与していないと示唆される。
ＤＮＡ結合ループ２
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＲｅｃＡにおける最も興味深いペプチド配列の１つは、いわゆるモバイルＤＮＡ結合ループ２である。このペプチドは、全蛋白質からの完全な単離においてさえ、ＤＮＡ結合活性を保有することが示されている（Ｖｏｌｏｓｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）。また、ループは、レコンビナーゼがＤＮＡに結合した場合のＡＴＰ加水分解を刺激するのに種々の関連付けられており、ＡＴＰ加水分解において触媒的役割を有するようにさえ関連付けられている（Ｖｏｌｏｓｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。同等な配列はＵｖｓＸ機能に対してかなり重要であろうと予測された。しかしながら、このペプチドはＲｅｃＡペプチドに関連しないことに注意されたし。
【００５３】
図５に示すように、Ｔ６およびＴ４は推定ＤＮＡ結合ループ２領域において３つの置換を有する。この領域における全ての公知のＵｖｓＸ−様蛋白質のさらなる整列を以下に示す。配列が同様性によって粗くグループ化されている。ＲｅｃＡループの整列もまたこの領域において示されている。
ＤＮＡ結合ループ２配列
【００５４】
【化１】
2014233293.tif 000041
残基イソロイシン１９９およびイソロイシン２０２は（Ｔ４  ＵｖｓＸにおいては、各々、チロシンおよびグルタミンである）Ｔ６において異なるのみならず、他のＵｖｓＸ類縁からのループの多くにおいてＴ４−様であったと記載されている。この後者の観察は、それらは自明に置換されていないであろうことを示唆した。さらに、ＲｅｃＡループ、イソロイシン１９９で生じた最良な可能な整列は、活性で必要であることが示されたＲｅｃＡ残基に対応した。Ｉ１９９またはＩ２０２いずれかをＴ４同等体に改変する結果を調べた。突然変異体クローンを作製し、蛋白質を発現させた。それらの同等体に対するＩ１９９またはＩ２０２いずれかの置換は蛋白質を完全に不活化させた。この結果は驚くべきことのようなものであったが、これらの置換はサイレントではなく、有意な生物学的結果を有することを再度強調する。Ｔ６  ＵｖｓＸにおけるこれらの置換の各々は、他の箇所の少なくとも１つの他の補償する置換によってマッチされると推定された。さらに、Ｔ４およびＴ６と同様なループ長さを持つ全てのＵｖｓＸ分子（後記参照）は、Ｔ６群およびファージ１３３におけるものとは離れたこれらの位置においてＴ４のようにチロシンおよびグルタミンを保有し、これらの場合において、双方の残基はイソロイシン（Ｔ６群）またはロイシン（１３３）いずれかに改変される。これらの特定の残基は相互に対する鍵となる相互作用を有し、ユニセンにおいて置換されていなければならないと仮定された。この仮定を検定するために、これらの残基の双方はＴ４同等体に変化された二重突然変異体Ｔ６  ＵｖｓＸ分子が作製された。該二重突然変異体蛋白質もまた増幅アッセイにおける活性を示さず、これは、Ｔ４およびＴ６の間で置換された他の変種残基は置換適合性の問題を裏付けることを示唆する。これは、Ｔ４およびＴ６  ＵｖｓＸ蛋白質の間の多数の置換が非−サイレント位置において起こり、蛋白質の生化学に対して現実の影響を有するという事実を強調する。
Ｒｂ６９、Ａｅｈ１およびＫＶＰ４０蛋白質を使用する増幅系
バクテリオファージＲｂ６９、Ａｅｈ１およびＫＶＰ４０のＵｖｓＸ、ＵｖｓＹおよびＧｐ３２蛋白質をコードするクローンを、図１に示すように生じさせた。これらの３つの蛋白質の整列を図５、６および７に示し、他の公知のホモログを含む。ＮＣＢＩ  Ｇｅｎｂａｎｋデータベースにおける可能な誤差は、Ｒｂ６９  ＵｖｓＹ配列に関して記載されている。該データベースに従うと、Ｒｂ６９  ＵｖｓＹは本明細書中で示された配列に対してＮ−末端延長を有するであろうが、しかしながら、このより長いポリペプチドを発現させる試みは不成功であって、該配列の再調査に導いた。全ての他の同定可能なＵｖｓＹ蛋白質はほとんど同一の地点において始まり、および該データベースのエントリーは他のものの第一のメチオニンに対して同等な位置におけるメチオニンを含んだ。自動注釈ソフトウエアを誤っていたと推定された。注釈におけるありそうな誤差もまた、本明細書中における整列で示された配列ト比較してＮ末端において人工的に切形されたＵｖｓＹおよびＧｐ３２に対するシアノファージエントリーのいくつかについて同定されている。
【００５５】
図１に示された蛋白質の全てはＫＶＰ４０  ｇｐ３２を例外として発現され、かつ頑強に精製された。この蛋白質の比較的限定された量のみが、クローンの存在における明白な誤りに関わらず回復された。生化学的な異常性の可能な源を憶測した。図７で示されたｇｐ３２分子の整列の実験は、ＫＶＰ４０が、Ｔ４、Ｔ６、Ｒｂ６９、およびＡｅｈ１  ｇｐ３２において亜鉛原子を配位するに関連付けられた残基に対応する一次配列の部分におけるＴ４  ｇｐ３２分子に対して奇妙であることを明らかにする。より具体的には、４つの残基はＴ４  ｇｐ３２における亜鉛の結合に関与すると示されており、これらは、従前に報告されている（Ｇｉｅｄｒｏｃ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７）ヒスチジン６４、システイン７７、システイン８７、およびシステイン９０（Ｑｉｕ  ａｎｄ  Ｇｉｅｄｒｏｃ  Ｄ．Ｐ．，１９９４）あるいはヒスチジン８１、システイン７７、システイン８７、およびシステイン９０のいずれかである。Ｔ４、Ｔ６、Ｒｂ６９、およびＡｅｈ１においては、ｇｐ３２のこれらの４つの残基は、一般にはヒスチジン６４およびシステイン９０の間の同一の間隔および残基の非常に高い保存でもって高度に保存されている。
【００５６】
亜鉛配位はＴ４  ｇｐ３２の協調的挙動に対して臨界的であることが示されており（Ｎａｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０）、当該アポプロテインは効果的なＲＰＡ反応を支持しない（Ｐｉｅｐｅｎｂｕｒｇ  ｅｔ  ａｌ．参照）。しかしながら、ＫＶＰ４０  ｇｐ３２は、この領域のＣ−末端側半分における推定配位残基の間隔に対する有意な破壊を有し、この領域でのＴ４、Ｔ６、ＲＢ６９、およびＡｅｈ１における他の残基に対してほとんどまたは全く相同性を有しない。この破壊はＴ４、Ｔ６、Ｒｂ６９等に対するＫＶＰ４０  ｇｐ３２の金属−結合特性を改変したことが提唱されている。いずれかの理論に拘束されるつもりはないが、ＫＶＰ４０はもはや亜鉛に結合せず、あるいはその代わり、コバルトのようなもう１つの金属原子を用いる可能性がある。ＫＶＰ４０、広いスペクトルのビブリオファージは、痕跡量金属条件がコリファージが棲むものに異なり得る海洋環境から単離された。いずれかの理論に拘束されるつもりはないが、おそらく、改変された金属依存性および折畳み特徴はＥ．ｃｏｌｉにおける発現の効率に影響してきた。さらに、シアノファージＳＳＭ２およびＳＳＭ４推定蛋白質配列は保存された配位システイン残基のいずれかの非存在下で目立つことが記載されている。これらのｇｐ３２分子は亜鉛、または同様な金属イオンを含有しないと推定された。これはかなりの興味があるものであり、というのは、アポプロテインの共精製によって、あるいは貧弱な貯蔵条件下での蛋白質からの亜鉛の喪失によって引き起こされたようである、ｇｐ３２の活性における場合によっての問題に遭遇したのでかなり興味深いものである。さらに、ｇｐ３２が熱変性した場合に亜鉛原子を失うので、それは、結果的には、ＰＣＲまたは熱変性工程を必要とする他の技術において限定的使用のものであった。もしＳＳＭ２およびＳＳＭ４  ｇｐ３２で蛋白質が亜鉛原子なくして同様な配位挙動を有する道を切り開き、および依然としてＲＰＡに必要とされる全ての他の特性を有するならば、それらはＲＰＡまたは他の技術のための非常に有用な剤であり得る。
Ｒｂ６９蛋白質でのＲＰＡ
ＲＰＡ反応はＲｂ６９  ＵｖｓＸ、Ｒｂ６９  ＵｖｓＹ、およびＲｂ６９  ｇｐ３２で構成された。最適成分濃度に対する限定された調査は、反応挙動は顕著にはＴ４またはＴ６  ＵｖｓＸ−ベースの系から区別されることを確立した。より多量のＵｖｓＹが最適な活性に必要であることが見出された。図１４は、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎで行われた増幅を示し、図２４は蛍光プローブ系でモニターされた反応を示す。反応はよく働いたが、Ｔ４またはＴ６ベースの反応よりもわずかに遅いキネティックスを有する。Ｒｂ６９増幅系の挙動における異常が記載されている。例えば、増幅系は奇妙にも双方のＲｂ６９  ｇｐ３２の過剰滴定に対して非常に感受性であり（図２３参照）、Ｒｂ６９  ＵｖｓＸの過剰滴定に対して感受性であった（図２６および２７参照）。双方のこれらの感受性は区別され、Ｔ４（およびＴ６）増幅系でなされた観察とは異なる。後に記載されるこれらの差の基礎となる源に取り込むためにかなりの努力がなされた。しかしながら、これらの変動にもかかわらず、高度に有効なＲＰＡ反応はＲｂ６９成分で構成することができ、再度、ＲＰＡ系の一般性、および広い範囲のレコンビナーゼ剤および関連因子を用いて可能性が再度確認される。
Ａｅｈ１蛋白質でのＲＰＡ
ＲＰＡ反応はＡｅｈ１  ＵｖｓＸ、Ａｅｈ１  ＵｖｓＹ、およびＡｅｈ１  ｇｐ３２で構成された（図１５、１６、および１７参照）。Ｒｂ６９系に関しては、Ａｅｈ１系は明らかに機能的であったが、Ｔ４およびＴ６ベースの系に対する差を示した。かなりの量のポリエチレングリコールに対する依存性があるように見え、再度、キネティックスはＴ４およびＴ６で観察されたよりも幾分遅い傾向があった。
【００５７】
双方のゲル−ベースのアッセイ（図１９）およびリアルタイムアッセイ（図１８）を用いてなされた１つの観察は、恐らくは、Ａｅｈ１成分を用いる場合ほどは頑強でないにもかかわらず、増幅系が、Ａｅｈ１  ＵｖｓＸおよびＡｅｈ１  ＵｖｓＹと組合せてＲｂ６９  ｇｐ３２を用いる増幅系を構成できたことである。この興味の結果は、用いたｇｐ３２種はＵｖｓＸおよびＵｖｓＹ種にマッチさせる絶対的必要性はないであろう事を示唆する。
ＫＶＰ４０蛋白質でのＲＰＡ
ＫＶＰ４０  ｇｐ３２は成長の条件下でＥ．ｃｏｌｉにおいて頑強に発現されず、誘導を用いた。その結果、ＫＶＰ４０成分を用いる増幅系が確立できなかった。それにもかかわらず、ＫＶＰ４０  ＵｖｓＸおよびＵｖｓＹがＲＰＡ反応を確立するのに必要な基本的生化学活性を保有することができることがいくつかの理由で考えられる。１つの実験において、ＫＶＰ４０  ＵｖｓＸおよびＵｖｓＹをＲｂ６９からのｇｐ３２、またはＡｅｈ１からのｇｐ３２のいずれかと組み合わせた。これらの条件下で、ＤＮＡ合成の証拠があり、他方、予測されたサイズの産物は生じず、見かけ上増幅されたプライマー人工物の存在は、組換え−媒介ポリメラーゼプライミングが遅れつつあったという考えに対する裏付けに役立つ。これはこの異種系の部分的機能性を示唆し、ＫＶＰ４０もまた、原理的には、有用なＲＰＡ系に適合するであろうと提案される。
Ｒｂ６９キメラ
Ｔ４およびＴ６のものよりはむしろＲｂ６９成分を用いるＲＰＡ反応における最も顕著な差のいくつかの源を個々で取り込む。図１４はＲｂ６９系の最初の異常の１つを明らかとし、すなわち、そのＲｂ６９はＴ４またはＴ６系よりもかなりのＵｖｓＹを必要とするように見える。第二の異常は、Ｒｂ６９系が、図２３において明らかにされるように、使用されるｇｐ３２の濃度に対して非常に感受性であるということである。そのような高度の感受性はＴ４系については記載されていなかった。第三の異常は、図２６および２７において明らかにされるように、Ｒｂ６９  ＲＰＡ系が使用されるＵｖｓＸの濃度に対して非常に感受性であることであり、特に、もし過剰の蛋白質が使用されるならば悩むところである。異種混合物における蛋白質を他の蛋白質と比較すると、他の特異性がこれらに加えて発見された。例えば、Ｒｂ６９  ＵｖｓＸはＴ４  ｇｐ３２を全く許容できず、他方、Ｒｂ６９  ｇｐ３２はＴ４  ＵｖｓＸおよびＴ４  ＵｖｓＹで非常に効率的に働いたことが見出された（図２８、２９、および３２）。同様に、Ｒｂ６９  ＵｖｓＹは異種Ｔ４成分での増幅を容易に裏付ける（図３７）が、Ｒｂ６９  ＵｖｓＸを使用した場合、用いたＵｖｓＹのタイプは実験の結果に対して有意なインパクトを有したことが判明した（図３８）。Ｒｂ６９  ＵｖｓＹは最高の刺激を与え、他方、Ｔ４  ＵｖｓＹまたはＴ４およびＲｂ６  ＵｖｓＹの間のハイブリッドは顕著に効果が低かったことが判明した。
【００５８】
前記データを合理化する可能な説明をここに提示する。いずれかの理論に拘束されるつもりはないが、Ｒｂ６９  ＵｖｓＸが、主として、Ｒｂ６９増幅系の変種挙動を担うことが示唆される。おそらくは、Ｒｂ６９  ＵｖｓＸは、少なくとも我々が収容する塩、ｐＨおよび他の条件下で、Ｔ４  ＵｖｓＸと比較して相対的に貧弱なＤＮＡ結合挙動を有する。結果として、おそらくは、Ｒｂ６９  ＵｖｓＸが系に存在するｇｐ３２の過剰量に対してコピーにおける相対的困難性を有し、貧弱なＤＮＡ−結合競合体であり、それ自体、それは高度に効果的なＵｖｓＹ挙動により依存しており、過剰なｇｐ３２によって阻害され、かつ恐らくはＲｂ６９およびＴ４で蛋白質の間でかすかに異なる使用されるｇｐ３２およびＵｖｓＹ種の豊富性に対して感受性である（かくして、Ｒｂ６９  ＵｖｓＸが影響されつつ使用されるｇｐ３２またはＵｖｓＹ種によってＴ４  ＵｖｓＸがなぜ大いに影響されないかを説明する）。
【００５９】
この理論は、Ｒｂ６９成分を用いるＲＰＡ反応についてなされた観察のほとんどを説明できよう。しかしながら、これによって回答されないまま残った１つの態様は、それを一見したところでは、反応キネティクスを妨げるよりはむしろ助けると予測される、Ｒｂ６９  ＵｖｓＸの過剰滴定に対してなぜ反応が感受性であるべきかの疑問である。いずれかの理論に拘束されるつもりはないが、恐らくは、影響を及ぼすであろう第二の因子は、Ｒｂ６９  ＵｖｓＸは相互に対する相補的オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを裏付けることができないことである。ＲｅｃＡおよびＵｖｓＸは相補的オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを裏付け、ストランド変位ＤＮＡ合成としての効果的なＲＰＡ反応に必須の特性は、侵入ベースのプライミングではなく、ハイブリダイゼーションを介するデュプレックスＤＮＡへの変換を必要とする量のｓｓＤＮＡを生じさせるに違いないと報告されている。もし真実であれば、状況は以下のように説明されるであろう：Ｒｂ６９  ＵｖｓＸはＴ４／Ｔ６  ＵｖｓＸと比較してｓｓＤＮＡに対して、またはｓｓＤＮＡについての滞留時間に対する低い親和性を有し、これは、それは過剰なｇｐ３２と貧弱に競合（よって、ｇｐ３２過剰滴定に対する感受性）が、それはオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションを裏付けず、かくして、非常に高いオリゴヌクレオチド−レコンビナーゼ負荷の刺激もまた、損なわれた増幅反応に導く。なぜならば、少数のプライマーしかハイブリダイゼーションで利用可能でないからである。結果的に、中心的理由は除去されなければならず、そこでは、大まか半分のプライマーがＵｖｓＸで被覆され、半分はｇｐ３２で被覆される。最大最適Ｒｂ６９  ＵｖｓＸ濃度は〜１００ｎｇ／μｌであることが判明し、これは反応において全てのプライマーを飽和するのに必要な大まか半分であるということは、一致がなくてもよい。
【００６０】
前記「理論」にかかわらず、他の合理的な説明が存在し、このモデルに幾分合致しない他のデータが存在する。例えば、Ｒｂ６９成分−媒介増幅の分析（ここでは示さず）は、典型的には、Ｔ４−ベースの系で見出され、典型的には生じるよりは大きな量の産物ＤＮＡを明らかとする。総じてのそのような反応は、Ｒｂ６９  ＵｖｓＸが弱いＤＮＡ−結合挙動を有するという解釈とは幾分合致せずに極端に高いレコンビナーゼ活性の印象を与えた。これは、Ｒｂ６９  ＵｖｓＸがＴ４またはＴ６  ＵｖｓＸに対して改変されたｓｓＤＮＡ／ｄｓＤＮＡ分配を示すことを示唆し、恐らくは、これはデュプレックスＤＮＡ形成によるより少ない阻害を示す。
【００６１】
この時点においては憶測である、ＲＢ６９およびＴ４／Ｔ６  ＵｖｓＸ分子の挙動の差についての根本原理がいずれであるにせよ、この全てにおいて主たる疑いである１つのペプチド領域は推定移動性ＤＮＡ結合ループ２である。ＵｖｓＸ蛋白質の整列を示す図５は、どのようにして非常に異常なＲｂ６９ループ２配列をその最も近い類似の隣接体と比較するかを明らかにする。Ｔ４、Ｔ６、Ａｅｈ１、ＫＶＰ４０、ファージ１３３（および密接なＲｂ６９類縁であるＪＳ９８は別として全てのＵｖｓＸ分子）、およびシクロファージ蛋白質とは異なり、Ｒｂ６９ループ２は異なる数のアミノ酸を有し、他のものと比較して完全に解読されたように見える。これは最も予期せぬことであり、ＲｅｃＡの研究におけるこのループに払われた注意、およびＴ４およびＴ６ループで見出されたかすかな改変に関して前記した結果を仮定すると、この変種ループ配列は測定可能な差の多くを裏付けるであろうと予測された。
【００６２】
他の推定ＵｖｓＸ−様ループ２配列およびＷａｌｋｅｒ  Ａアミノ酸を使用し、これを用いて、Ｒｂ６９バージョンを置換えた。加えて、蛋白質の酸性Ｃ−末端に対する変化を調べた。図２０および２１は、突然変異体蛋白質を発現させるために生じさせたクローンの模式図を示す。これらの実験は、調査の時間的プローブに従い、これは、ほとんどのデータが、Ｒｂ６９蛋白質骨格で生じたクローンの改変の順次の肯定によって生じたことを意味する。
【００６３】
最初に、Ｔ６についてなされたように、Ｗａｌｋｅｒ  Ａモチーフ中のヒスチジンはセリンに代えて置換された。図２２および２４は、Ｒｂ６９  ＵｖｓＸ野生型をＲｂ６９  Ｈ６４Ｓと比較するためになされた実験を示す。図２２および２４は、Ｒｂ６９  Ｈ６４Ｓは野生型同等体よりも良好に実行されることを示す。いずれかのＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎを用い、またはプローブ−ベースのアプローチを用いて試料を分析した。この知見Ｔ６でなされた知見をよく反映しており、ヒスチジン残基の改変はＲＰＡで用いられるＵｖｓＸ蛋白質に対して普遍的に有益であり得ることを示唆する。第二に、蛋白質の非常にＣ側末端の性質を改変する用途を調べた。Ｒｂ６９はＴ６およびＴ４  ＵｖｓＸに対して非常にＣ側末端において非常にわずかにより短かったと記載された（図５参照）。これらの蛋白質の調査は、Ｃ末端で見出された酸性残基が、規則（疎水性／構造／−酸性）−（酸性）に従って非常な蛋白質末端において密に緩く配置されたという結論に導く。このモデルにしたがって、Ｒｂ６９がＴ４およびＴ６に対するこの反復の１つの単位を欠如していた。この酸性溶液の長さはＲＰＡ効率に影響するであろうと仮定された。この仮定を検定するために、アミノ酸「ＬＳＤ」のトリプレットを挿入する１つの場合において、およびトリプレット「ＬＤＥ」のタンデム反復および、かくして、６つの新しい残基を挿入する２つの場合において（図２０参照）、わずかに延長されたＣ−末端Ｒｂ６９配列を持つ２つの新規なクローンを生じさせた。これらの改変を含む蛋白質を、プローブ−ベースの検出アプローチをアッセイにおいてテストした。（恐らくは、部分的には、異なる開始コピー数を用いる故に）あらゆる実験が完全に合致する結果を与えないが、一般に、明瞭な傾向が認められた。それは、通常、累積曲線の傾きが野生型Ｒｂ６９、「ＬＳＤ」突然変異体、および「２ｘＬＤＥ」突然変異体との間でわずかに異なる場合であった。該突然変異体は、一般には、検出の非常にわずかにより遅い開始を示したが、次いで、わずかにより鋭いシグナル蓄積傾き、およびわずかにより高い最終合計蛍光を有した（図３３および３４）。この効果の程度はわずかに変動させた条件下で行った異なる実験の間で幾分変動したが、それにもかかわらず、これらの改変が有意な生物学的効果を有すると結論するのは十分に明らかであった。いずれかの理論に拘束されるつもりはないが、これらの改変はある種の基質、特に恐らくはデュプレックスＤＮＡについてのレコンビナーゼの親和性／安定性をわずかに低下させ得、それ自体、産物の蓄積によって沈殿する後期反応遅延を低下させるという特別な強調を伴って反応キネティクスを改変する。
【００６４】
次の工程は、かなりの変動の根拠を与えることが疑われるＤＮＡ結合ループ２配列を調査することであった。Ｒｂ６９ループ２配列ＮＨＴ  ＡＭＥＩＧＧＬＹＰＫＥ  ＩＭＧ  ＧＧ（配列番号：６８）を、Ｒｂ６９で見出された天然グリシンとして残る最後の変種スレオニン（ここでは太文字とし、かつ下線を施した）を除いて、Ｔ６ループＮＨＴ  ＩＥＴＩＥＭＦＳＫＴ  ＶＭＴ  ＧＧ（配列番号：６９）に代えて置換えた。これを行ったのは、Ｔ４ループがＲｂ６９配列に対して同様なグリシンを有したからであり、この残基は重要でないまたはフレキシブルなループ領域においては厳格でない）と推定して、より複雑な突然変異誘発プロトコルを回避するためにそれを残した。機能的Ｒｂ６９  Ｈ６４Ｓ／２ｘＬＤＥ蛋白質の骨格で生じていたこの新しい蛋白質をテストした。この蛋白質はＲｂ６９  Ｈ６４Ｓ／Ｔ６−１／２ｘＬＤＥと命名され、そこでは、Ｔ６−１とは、Ｃ−末端グリシンの対に先行する最後の天然スレオニンを欠如するＴ６  ＤＮＡ−結合ループ２という（図２０および脚注参照）。この蛋白質はＲＰＡアッセイにおいて活性を有しないことが判明した（図３９）。活性のこの欠如はＤＮＡ−結合ループおよび近くのＷａｌｋｅｒモチーフ中の残基の間の不適合性に由来するであろうと想定された。Ｒｂ６９はいくつかの点で異常なＷａｌｋｅｒモチーフを有する。まず、他の非−シアノファージ蛋白質とは対称的に、該モチーフの主な推定触媒残基としてそれはセリンを有さないが、むしろスレオニンを有する。このスレオニンに続いてもう１つの非典型的な残基ロイシンがあり、これもまた他のＵｖｓＸ蛋白質では見出されない。これに加えて、Ｗａｌｋｅｒ  Ａコンセンサスの始まりにおいて見出されたグリシンは、（近いないし同一のＪＳ９８蛋白質とは別にいずれの他のＵｖｓＸ分子またはＥ．ｃｏｌｉ  ＲｅｃＡさえとも異なり、Ｒｂ６９  ＵｖｓＸにおけるアラニンである。
【００６５】
Ｒｂ６９  ＵｖｓＸおよび他のＵｖｓＸ分子の間の奇妙な差に加えて、Ｔ６  ＵｖｓＸはこの領域においてやはり奇妙な残基を有する。特に、メチオニン７１は、Ｔ６、またはファージ１３３に近いないし同一であるものを除いてほとんどの他のＵｖｓＸ蛋白質において見出されていない（図５参照）。ファージ１３３もまた、おそらくは、これらの種々の残基の間の直接的接触の証拠を表した（Ｔ６におけるイソロイシンに対して置換された位置においてロイシンを有する）ＤＮＡ−結合ループ２領域で変化を有したと認められた。全てにおいて、そのＣ−末端領域におけるＲｂ６９  Ｗａｌｋｅｒモチーフは２残基だけＴ４から異なり（Ｒｂ６９  ＫＴＬＦＧＬ（配列番号：７０）をＴ４  ＫＳＮＦＧＬ（配列番号：７１）と比較せよ）、および４残基だけＴ６から異なる（Ｒｂ６９  ＫＴＬＦＧＬ（配列番号：７２）をＫＳＮＭＳＬ（配列番号：７３）と比較せよ）。クローンＲｂ６９  Ｈ６４Ｓ／２ｘＬＤＥ／Ｔ６−１の骨格との関係におけるＷａｌｋｅｒ領域の変化が生じており、それをＴ４（ＫＳＮＦＧＬ（配列番号：７４））のように、Ｔ６（ＫＳＮＭＳＬ（配列番号：７５））のようにし、あるいはユニークにはＴ６（ＫＴＬＭＳＬ（配列番号：７６））に特徴的な変化がなされている。これらのクローンのいくつかを発現する試みは、明らかにエラーを含まない多数の配列決定されたクローンの使用にもかかわらず失敗した。事実、Ｔ４またはＴ６配列（ＫＳＮＦＧＬ（配列番号：７７）またはＫＳＮＭＳＬ（配列番号：７８））と同等なようにされたクローンは適切には発現され、精製されないように見えた。「ＳＮ」モチーフは、Ｔ６−１  ＤＮＡループが挿入されて、Ｒｂ６９  ＤＮＡ−結合ループ２を置き換える場合に許容されないと結論された。これは最も困惑するものであった。なぜならば、後に記載するように、もしＴ４  ＤＮＡ−結合ループ２を用いてＲｂ６９を置換えたならば、この変化はよく許容されるからである。１つの発現されたクローン（ＫＴＬＭＳＬ）は、テストした場合にアッセイにおいて活性を有しないように見えた。
完全なＴ６  ＤＮＡ−結合ループ２配列は活性を示す。
【００６６】
キメラＲｂ６９−Ｔ６構築体におけるＴ６  ＤＮＡ−結合ループ２（ＮＨＴ  ＩＥＴＩＥＭＦＳＫＴ  ＶＭＴ  ＧＧ（配列番号：７９））の最後の変種残基が回復されたクローンを生じさせた。Ｒｂ６９  Ｈ６４Ｓ／２ｘＬＤＥ／Ｔ６−１／ＫＳＮＭＳＬ（配列番号：８０）およびＲｂ６９  Ｈ６４Ｓ／２ｘＬＤＥ／Ｔ６−１／ｗｔＲｂ６９  Ｗａｌｋｅｒに対応するクローンを生じさせたが、修復されたスレオニンを伴うものであり、かくして、Ｒｂ６９  Ｈ６４Ｓ／２ｘＬＤＥ／Ｔ６／ＫＳＮＭＳＬ（配列番号：８１）およびＲｂ６９  Ｈ６４Ｓ／２ｘＬＤＥ／Ｔ６／ｗｔＲｂ６９  Ｗａｌｋｅｒと命名された。再度、改変されたＷａｌｋｅｒモチーフを持つクローンは発現され、精製されないであろう。いずれかの理論に拘束されるつもりはないが、これは、これらのＷａｌｋｅｒ  Ａ残基およびＴ６  ＤＮＡ−結合ループ２に存在する変種イソロイシンの間の密接な生化学的関係を暗に示す。しかしながら、驚くべき発見は、修復されたＴ６  ＤＮＡ−結合ループのみを保有し、天然Ｒｂ６９  Ｗａｌｋｅｒ  Ａモチーフに対する改変を保有しない最後のクローンは発現され、機能的に活性であることが判明したということであった（図４６）。かくして、この最後の変種スレオニン残基は、少なくともＲｂ６９骨格に移動した場合に、Ｔ６  ＤＮＡ−結合ループの機能にとって絶対的に臨界的であるように見える。機能的キメラ蛋白質を生じさせることができ、Ｔ４およびＴ６  ＤＮＡ−結合ループ２の配列の間の３つの全ては測定可能な機能的関連を有すると結論された。
Ｔ４  ＤＮＡ−結合ループ２配列を含有するＲｂキメラは活性である。
【００６７】
Ｔ４  ＵｖｓＸのＤＮＡ−結合ループ２配列を含有するさらなるキメラ分子を生じさせた。Ｒｂ６９／Ｔ６キメラとは対照的に、これらの蛋白質は、Ｗａｌｋｅｒモチーフが天然状態で改変されないままであるか、あるいはＴ４−様（ＫＳＮＦＧＬ（配列番号：８２））に変化されたか否かとはかかわらず活性であったが、そのようなＷａｌｋｅｒ  Ａモチーフは、Ｔ６  ＤＮＡ−結合ループを使用した場合に許容された。再度、これは「ＳＮ」モチーフ、およびＤＮＡ−結合ループ２の第一の少数の残基の間の直接的接触を反映できないことを強調する。濃縮されたストックからより容易に沈殿する天然Ｒｂ６９  Ｗａｌｋｅｒモチーフで作成された蛋白質のいくらかの傾向が観察され、これは異種配列の間のわずかな非適合性を示すことができるが、これはほんのわずかな効果であった。
Ｒｂ６９キメラについての改良されたレコンビナーゼ挙動
前記からＤＮＡ−結合ループ２配列は、異なる起源からのＵｖｓＸ分子の間で交換して、いくつかの場合に機動的な蛋白質を作り出すことができると結論することができる。生じたＲｂ６９キメラ分子をテストして、それらは天然Ｒｂ６９によって呈される特徴に対して異なる特徴を呈するか否かを決定した。まず、蛋白質をアッセイして、ｇｐ３２蛋白質の過剰滴定に対してより抵抗性であるか否かを決定した。図４３は、Ｔ４  ＤＮＡ−結合ループを含有する突然変異体を用いる場合に測定されるシグナル開始の遅延が、天然Ｒｂ６９の場合よりも多い量のｇｐ３２を用いた場合に減少することを示す。作成された設計は、Ｔ４およびＴ６  ＵｖｓＸ蛋白質で見出されたより許容される活性のいくらかをＲｂ６９キメラに対して寄与させたと結論された。次に、蛋白質をアッセイして、Ｔ４  ｇｐ３２を使用して、Ｒｂ６９  ｇｐ３２を置き換えることができるか否かを決定し、これは、天然Ｒｂ６９蛋白質では可能でなかったものである。事実、増幅反応が、今日、Ｔ４
ＤＮＡ−結合ループを含有するＲｂ６９蛋白質を用いて行うことができるのが判明した（図４４参照）。
【００６８】
かくして、鍵となる残基を置換することによって新規な生化学活性を持つＵｖｓＸ蛋白質を作成するのが可能であり、これらのいくつかは、ＲＰＡアッセイにおいてそれらの天然親と比較して相対的に改良される。
他のＤＮＡ−結合ループ２配列
この分析をさらにその論理的結論まで拡大するために、利用できたＤＮＡ−結合ループ２配列の全ての種々のクラスを含有するＲｂ６９蛋白質を生じさせた。このプロセスを容易とするために、一方側にユニークなＢａｌ  Ｉ制限酵素部位、および他方側にＫｐｎＩ制限部位を有する、Ｒｂ６９クローンに対する「カセット」構造を作成した。合成オリゴヌクレオチドを、これらの酵素で切断したＲｂ６９  ＵｖｓＸクローンにクローン化した。該クローンは図２１に模式的に示されるように作成した。これらの蛋白質のいくつかを発現させようと試みる場合に、問題に遭遇した。ＲｅｃＡ−置換ループについての精製された蛋白質は回収することができず、分析の間にＫＶＰ４０−置換ループは凝集し、その後に効果的に再度可溶化させることはできなかった。残りの蛋白質のうち、Ａｅｈ１、Ｒｂ１６／Ａｅｈ１およびシアノファージ−置換ループをよく発現させたが、アッセイにおいて活性を有しなかった。ファージ１３３−置換ループは、弱いが、アッセイにおいて活性を保有した。
【００６９】
いずれかの理論に拘束されるつもりはないが、これらのクローンは、恐らくは、Ｔ４およびＴ６  ＤＮＡ−結合ループになされた実験に対してわずかに不利であった。なぜならば、この場合には、それらは、Ｈ６４Ｓ、およびより酸性のＣ−末端よりはむしろ野生型Ｒｂ６９骨格に作られたからである。Ｗａｌｋｅｒ  Ａモチーフの他の部分の作成はなされなかった。それにもかかわらず、結果は、この領域において改変された配列のありそうな許容性に対して有用な診断剤を提供する。まず、Ｔ４およびＴ６のように、ファージ１３３  ＤＮＡ−結合ループはいくらかの活性をハイブリッド蛋白質に付与することができたことを注記する。ある程度、ほとんどの配列決定されたファージＵｖｓＸ分子で見出された短い「標準」ループ長さに対して一般的な許容性があると結論することができる。第二に、Ａｅｈ１は失敗したが、この蛋白質は、ループを開始し、そうでなければ、非常に高度に保存されているアスパラギンの非常に予測されない突然変異を有すると認められた。他の置換は、この変化を許容するために必要であろうと予測される。最後に、シアノファージまたはＲｅｃＡループは許容されるように見えなかった。ＲｅｃＡループの場合には、これは予測されない。というのは、このループはＲｅｃＡにおいてより長いループ長さを保存さえしないからである。いずれかの理論に拘束されるつもりはないが、この蛋白質が正しく折畳まれるに対して問題があるようであり、あるいはそれは凝集する傾向があろう。シアノファージループは親Ｒｂ６９ループと同一の長さであるが、該配列はほとんど完全に異なる。シアノファージ蛋白質はＲｂ６９から非常にそれており、かつかなり異なるＷａｌｋｅｒ  Ａモチーフを有するので、単離においてこのループを変化させることが、機能的分子を生じさせるのに十分ではないであろう。
Ｔ６  ＵｖｓＸおよび誘導体はＵｖｓＹ−非依存性活性を呈する。
【００７０】
実験を行って、ＲＰＡで用いるオリゴヌクレオチドにおける修飾されたＤＮＡ骨格の効果を調べて、特に、それらが、ＵｖｓＹに対する必要性に影響するか否かを評価した。この仕事のコースにおいて、ヒスチジン６６からセリンへの突然変異に関してＴ６  ＵｖｓＸで行った実験において、ＵｖｓＹはＤＮＡの増幅で必須でなかったことが観察された（Ｔ６  Ｈ６６Ｓ）。この予測されない現象をさらに調べ、以下に記載されたデータはこの特性が、恐らくは完全ではないが、反応におけるレコンビナーゼ種のＴ６起源に対して帰属できることを確認した。
【００７１】
図５２は、種々のプライマーを用いて、（ＰＣＲによって生じた）鋳型からのＤＮＡ断片の増幅にＵｖｓＹが必要か否かを評価するために行った実験を示す。実験は、本実験で用いた４つのプライマー組の３つについて（全ての組合せは鋳型において可変距離離れた対向するプライマーと対合した１つの共通プライマーを共に有した）、産物は、予測される分子量のＵｖｓＹの非存在下で生じたことを明瞭に示した。追跡実験を図５３に示し、そこでは、同一の鋳型が使用されたが、いくつかの可変プライマー組合せを用いた（脚注参照）。この場合において、５つの組合せのうち４つはＵｖｓＹの存在または非存在にかかわらず成功した。産物強度の差が観察され、ある場合には、産物はＵｖｓＹの非存在下でより豊富であった。結果は、ＵｖｓＹが、このレコンビナーゼ（Ｔ６  Ｈ６６Ｓ）、ＳＳＢ（Ｒｂ６９  ｇｐ３２）、ＰＥＧ  ３５，０００およびポリメラーゼ（Ｓａｕ  Ｐｏｌ）で行った少なくともいくつかの増幅反応において部分的に必要不可欠であることを示す。
【００７２】
複雑なゲノムＤＮＡとして供された鋳型まで調査を拡大した。特に関心があるのが、ＭＳ２鋳型で観察された異常な効果が生起するかもしれないことであった。なぜならば、この鋳型は最初ＰＣＲによって生じ、変性したまたは一本鎖鋳型を含有するだろうからである。これらの状況は、増幅の初期サイクルの間にトコロジー的歪んだ構造を形成するそれらの傾向のため潜在的に困難である真に埋め込まれた配列上の開始ＲＰＡに置かれたいくつかの「制限」を除去することができた。図５４に示された実験は、徐々により長くなる断片を生じるプライマー（１つの共通プライマー）の対を用いるヒトゲノムＤＮＡからのＤＮＡの増幅を示す。この場合、結果は、ＭＳ２鋳型で観察されたよりはむしろより変動した。しかしながら、ＵｖｓＹを省略した場合でさえ（全ての反応はＵｖｓＹの存在下で機能的であった）、組合せの少なくとも２つは予測される長さであると考えられた断片を生じた。この仕事は、図５５に示された実験において延長された。再度、いくつかの場合において、予測されるサイズのＤＮＡ産物は、ＵｖｓＹが省略された場合にさえ対合した反応において生じ、再度、プライマー対および／または予測された産物のサイズに依存して、結果に対する有意な変動があった。反応２および４は双方の場合において成功したと考えられた。
【００７３】
実験のもう１つの組を行って、Ｔ６誘導体レコンビナーゼ（および恐らくは本明細書中で用いる関連因子）に帰属できると考えられる、この顕著かつ従前に認識されていなかった活性は、ポリエチレングリコールについての要件の差まで拡大された。図５６は、ＵｖｓＹについての必要性に対する部分的抵抗性にも拘わらず、ＰＥＧの省略の結果、有意なＤＮＡ合成の非存在がもたらされたことを示す。ＰＥＧは、低い標的濃度の試料からの有用なＤＮＡ増幅を達成するのに依然として必要とされたと結論された。
【００７４】
次に評価したのは、使用されるｇｐ３２のタイプがこれらの増幅反応のＵｖｓＹ−非依存的性質に影響したか否かであった。図５７は、Ｔ４  ｇｐ３２をＲｂ６９  ｇｐ３２の代わりに使用した実験の結果を示す。図５７に示すように、産物のわずかに異なる比率に拘わらず、ＤＮＡはＴ４  ｇｐ３２の存在下で依然として増幅された。図５８はこの仕事を拡大し、ＤＮＡは、Ａｅｈ１  ｇｐ３２を使用する異種系において依然として合成されるが、予測されるサイズの産物はＵｖｓＹの非存在下で生じなかったことを示す。しかしながら、いくつかの記載のＤＮＡは、これらの反応、および全てのＴ４試薬を用いる以前の反応の間の有意な生化学的差と合致するＵｖｓＹの非存在下で行われたことに注意されたし。本明細書中に記載されたモデルにおいて、終点においてゲル上で見えるいずれかのＤＮＡを合成し／増幅するためには、最小数の負荷されたレコンビナーゼフィラメントが必要であり、これは、再負荷／安定化剤として作用するＵｖｓＹの非存在下において余りにも少ないと考えられた。かくして、ｇｐ３２種の交換はこれらの条件下で反応の効率に影響するが、全ての場合において、ＤＮＡ合成は、Ｔ４試薬で達成された以前の結果とは対照的に、ＵｖｓＹの非存在下においてさえ起こると結論された。Ｔ６−誘導体ＵｖｓＸは、Ｔ４  ＵｖｓＸでの状況とは対照的にレコンビナーゼフィラメントの高−負荷を可能とすることを主として担っていると結論された。これは、恐らくは、ＤＮＡ−結合ドメインの差、ならびに協働フィラメント構造の安定化に関与するサブユニット間表面を反映し得るであろう。
【００７５】
ＵｖｓＸ挙動のこの差は、さらに、Ｔ４  ＵｖｓＸがＴ６  Ｈ６６Ｓ  ＵｖｓＸに代えて置き換え、次いで、ＵｖｓＹが省かれた場合のＤＮＡ合成の完全な非存在を示す図５９に示された実験で確認された。同様な結果が、同様な実験が全体を通じてＴ４  ｇｐ３２を用いる以外は行われる図６０で示される実験で得られており−Ｔ４  ＵｖｓＸは絶対的にＵｖｓＹを必要とし、他方、Ｔ６  Ｈ６６Ｓはこれらの実験ではそうではない。キネティック実験を図６１に示す。図６１に示すように、検出キネティックスはＴ４およびＴ６
Ｈ６６Ｓ実験の間で中程度に同様である。しかしながら、ＵｖｓＹを省いた場合、Ｔ６  Ｈ６６Ｓ増幅キネティックスに対する結果はほとんどなく、他方、Ｔ４レコンビナーゼは活性を示さない。他の鋳型での他の実験においては、Ｔ６  Ｈ６６Ｓを用いた場合でさえＵｖｓＹに対する強制的必要性が認められた。かくして、ＵｖｓＹはこのレコンビナーゼを用いる場合には部分的に不可欠であるに過ぎず、それは依然として反応挙動を改善することができ、標的の間の頑強かつ合致したＲＰＡ挙動において役割を演じると結論された。
【００７６】
次に、この異常な特性が修飾されていないＴ６  ＵｖｓＸで観察されたか否か、およびそれが（Ｒｂ６９  ＵｖｓＸおよびＡｅｈ１  ＵｖｓＸのような）他のレコンビナーゼまで拡大されたか否かの調査を行った。図６２は、Ｔ６レコンビナーゼをＵｖｓＹの非存在下で使用する場合にＤＮＡは少なくとも１つのオリゴヌクレオチド組合せで効果的に合成されることを非常に明瞭に示す。Ｔ４  ＵｖｓＸで観察されなかったＵｖｓＹ−非依存性の異常な特性は、それらの生化学的区別を確認する、Ｔ６  ＵｖｓＸおよびＴ６  Ｈ６６Ｓ  ＵｖｓＸの間の産物蓄積レベルの差があったにも拘わらず、修飾されていないＴ６  ＵｖｓＸまで拡大されると結論された。
【００７７】
図６３は、Ｒｂ６９  ＵｖｓＸがＵｖｓＹの非存在下で働くことができるか否かを決定するための実験の結果を示す。アンプリコンの１つはＵｖｓＹでさえ増幅しなかったゆえに結果の解釈には注意を払うが、主な観察はＵｖｓＹが省かれた場合に生じたＤＮＡの欠如であった。いずれかの理論に拘束されるつもりはないが、これは、Ｔ４  ＵｖｓＸのように、Ｒｂ６９  ＵｖｓＸはＵｖｓＹの存在なくして効果的な増幅を容易に支持することができることを示唆する。図６４は、この分析をファージＡｅｈ１成分の使用まで拡大する。図６４に示したように、増幅は、Ａｅｈ１  ＵｖｓＸ、Ａｅｈ１  ＵｖｓＹおよびＲｂ６９  ｇｐ３２を含む異種系において効果的であるが、もしＡｅｈ１  ＵｖｓＹが省かれれば、増幅は見られない。次に、とりわけ、Ｔ６のＤＮＡ結合ループ２配列を含む修飾されたＲｂ６９  ＵｖｓＸの活性を評価した。この実験を行って、Ｔ６誘導体の活性が区別されるＴ６  ＤＮＡ結合ループ２配列から生起するか否かを評価した。この場合、ＵｖｓＹの存在下でむしろ弱く見えた増幅として注意を払うが、ＵｖｓＹの非存在下において増幅は観察されなかった。しかしながら、額面通りにとると、この結果は、Ｔ６  ＤＮＡ結合ループ２がＴ６  ＵｖｓＸおよびその誘導体の異常な挙動に対して全面的に責任があり、あるいはこの特性は単離において自明に移すことができないことを支持しない。
【００７８】
これらの結果は、集合的に、種々のタイプのＧＰ３２種（Ｔ４、Ｒｂ６９およびＡｅｈ１）の存在下において共インキュベートした場合に、それがＵｖｓＹの必要性なくして有意な組換え活性を支持できる限り、Ｔ６  ＵｖｓＸおよびその誘導体は異常であることを示す。いずれかの理論に拘束されるつもりはないが、現存のモデルは、レコンビナーゼ−駆動増幅系の限定的成分はレコンビナーゼ−負荷フィラメントの濃度であることを示唆する。これらは、Ｔ４  ＵｖｓＸをＴ４  ｇｐ３２の存在下で、およびＵｖｓＹおよび密集剤の非存在下で共インキュベートする場合に豊富であると考えられない。しかしながら、証拠は、Ｔ６  ＵｖｓＸについては、この競合環境は、ＵｖｓＹがいくつかの場合になしで済ませることができるようにレコンビナーゼに好都合に遅くはシフトされることを示唆する。これが起こるためには、Ｔ６  ＵｖｓＸがＴ４  ＵｖｓＸよりも一本鎖ＤＮＡに対するより高い親和性を有することができ、および／またはそれは活性なＡＴＰ加水分解の結果としてフィラメントからあまり解体されないようであると推測することができよう。今度は、これらの特性は、核酸に対するレコンビナーゼのＤＮＡ結合エレメントのより高い親和性のため、および／または解体の低下に導くフィラメント中の蛋白質サブユニットの間により高い親和性を介して生起し得る。しかしながら、反応は、ＵｖｓＹが含まれる場合に全体としてより頑強なように見えたことは注目すべきである。場合によっては、その非存在下で、ＤＮＡが合成されたが、予測されるサイズの産物は蓄積しなかった。この結果は、ＲＰＡ反応サイクルにおけるいくつかの他の基本的な欠陥を除いて活性なフィラメントの豊富さを反映できよう。
【００７９】
いずれかの理論に拘束されるつもりはないが、ＵｖｓＹが、それがいくらかの増幅活性で厳格には必要とされない場合でさえＲＰＡ機能性をなぜ増強させるのかを説明するための２つの可能なメカニズムがここに提案される。まず、ＵｖｓＹはオリゴヌクレオチドにフィラメントの十分かつ均一な負荷を付与することができ、それらがそれらの５’末端に被覆され、それらの長さに沿って十分な組換えを受けることを確実とする。ＵｖｓＹの非存在下においては、この合理的原理に従うと、フィラメントは部分的にしか負荷できず、これは、組換えが拘束された中間体に導かれる状況に導くことができ（基質５’末端において可能な自由な解け無し）、大体の場合、それが、標的に沿っての完全な合成が起こってしまう前に不安定であって、レコンビナーゼ合成／中間体の解体に導く。これは、ほとんど前進的ＤＮＡ合成を必要としないプライマーダイマーのような非常に短い産物に好都合であり得る。第二の代替は、それが継続する間は、ＵｖｓＹがＤＮＡ合成プロセスにおいて活性な役割を演じることである。例えば、ＵｖｓＹは外へ向かうストランドのレコンビナーゼ−負荷および再侵入を促進して、「バブル移動」活性を引き起こすことができる。そのようなバブル移動合成は、合成複合体に対するトポロジー的歪みを減少させるように作用できよう。同様に、伸長複合体の進行性は、依然としてＵｖｓＸで部分的に被覆されるＤＮＡの３’末端の評価に依拠し、これはＵｖｓＹの存在を必要とするであろう。いずれの場合においても、データは、反応環境における組換え的に活性なフィラメントの定常状態数を単純に増加させるよりも精巧であるＲＰＡプロセスにおいてＵｖｓＹは役割を演じることができるという考えを支持する。
【００８０】
さらに、異なるｇｐ３２種の使用はＲＰＡ反応のＵｖｓＹ−依存性に影響し得る。以下に示される競合オリゴヌクレオチドの競合データおよび熱的安定性のデータを含めた、本明細書中で提供される実験データは、Ｒｂ６９  ｇｐ３２およびＡｅｈ１  ｇｐ３２と比較した場合にＴ４  ｇｐ３２はＤＮＡに対する特に高い親和性を有することができることを示唆する。かくして、ＵｖｓＸおよびｇｐ３２が先に記載したように共通の基質に対して競合するモデルによると、もしより低いＤＮＡ親和性を持つｇｐ３２が使用されれば、それはレコンビナーゼについて有益であろう。かくして、Ｒｂ６９  ｇｐ３２は、そのような競合環境においてレコンビナーゼ−負荷に好都合なようである。
マンガンはＲＰＡ反応を支持することができる。
【００８１】
マンガンはマグネシウムイオンを置換えて、ＲＰＡ系によるＤＮＡ増幅を支持することができる。特に、頑強な増幅を支持するためのマンガンイオンの有用な範囲は、マグネシウムで見出されるものよりも有意に低い。マンガンが大まか１ないし３ｍＭで存在する場合、最も効果的な増幅が起こる（図４７）。より高い濃度は、有意な産物蓄積に対して進行的に阻害性である。これらの低いレベルの支持イオンは、驚きである。というのは、いくつかの場合において、これは反応において豊富なＡＴＰおよびｄＮＴＰ種を飽和するのに不十分な量だからである（ＡＴＰは３ｍＭで用いられる）。
ヘパリンはノイズ−抑制性試薬として作用することができる。
【００８２】
ＲＰＡ反応に対するヘパリンの効果を調べた。これは、部分的には、臨床および環境試料で共通して見出される剤に対するＲＰＡ反応の抵抗性を確立する努力におけるものであった。増幅反応においてＲＰＡはヘパリンを含めることに対してむしろ抵抗性であることを見出したのは驚きであった。事実、見掛け上、プライマー人工物がＲＰＡ反応において蓄積する速度を低下させることによって、ヘパリンはＲＰＡ反応の結果を改良することができるようにさえ見えた。図４９は、２０ｎｇ／μｌでヘパリンを含めるのは、どのようにして、プライマー人工物の蓄積の遅延をもたらすのかを明らかとし、これは、ＲＰＡが反応に存在する標的なくして働くことを可能とするように見える。プローブ−ベースの検知アプローチを用い、ＲＰＡにヘパリンを含めることをテストして、それがＲＰＡ反応の挙動を改良するか否かを決定した。図５０は、増幅反応にヘパリンを含める効果を探索する。以下の現象が観察される：シグナル検出の開始の時点はヘパリンの存在に拘わらず同様であるが、ヘパリンを存在させた場合、低コピー数での検出の開始のより合致した時間に導く。ヘパリンは、反応において発生する全シグナルをわずかに減少させる。恐らくは、ヘパリンはＵｖｓＸまたは他のＤＮＡ結合蛋白質について「シンク」として作用し、ある状況下ではシグナルよりはむしろノイズが利点となり得る過剰な活性からそれを緩衝するのを助けることができると結論された。
Ｅ．ｃｏｌｉエキソヌクレアーゼＩＩＩはＲＰＡにおいてプライマー研磨剤として機能することができる。
【００８３】
Ｅ．ｃｏｌｉエンドヌクレアーゼＩＶ（Ｎｆｏ）またはＥ．ｃｏｌｉエキソヌクレアーゼＩＩＩを、脱塩基部位含有プローブを処理するための剤としての所有権がある蛍光プローブ検知システム（Ｐｉｅｐｅｎｂｕｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）を含むＲＰＡ反応に含めた。しかしながら、新規なプローブ構造の調査の間に、いくつかの驚くべきかつ予期せぬ観察がなされ、すなわち、恐らくは、３’−ブロックプライマーが、恐らくは、もしエンドヌクレアーゼＩＶ（Ｎｆｏ）を含有するよりも程度は低いが、エキソヌクレアーゼＩＩＩを含有する反応で用いると、効果的な増幅プライマーであり得るという観察である（図５１）。これらの場合に使用したブロックされたポリマーは、酵素の活性によってブロックが解かれつつあった。これらの酵素の双方は、３’−エキソヌクレアーゼ活性を含む、ならびに３’−ジエステラーゼまたはホスファターゼ活性を有する活性が報告されている。いずれかの理論に拘束されるつもりはないが、それらは最終塩基からブロッキング基を「磨き」、またはその上のブロッキング基で最終塩基を除去するようである。これらの実験から２つの可能性の間を区別するのは可能でない。しかしながら、配列−依存的にプライマーの「ブロックを解除する」潜在的能力は、ある潜在的に有用な適用を有する。
Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  Ｐｏｌ  Ｉ大断片はＲＰＡ反応において機能的である。
【００８４】
ＲＰＡは従前に示されているようにＢｓｕポリメラーゼで効果的に働く（Ｐｉｅｐｅｎｂｕｒｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．１０／９３１，９１６参照）。また、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｐｏｌ  Ｉのクレノウ断片で、およびＢｓｔポリメラーゼで機能することも示されている。ＲＰＡ反応で用いることができるポリメラーゼの幅を拡大する試みにおいて、他のポリメラーゼを調べた。調べたポリメラーゼは、修復クラスのポリメラーゼ、およびプルーフ−リーディング活性を欠如するポリメラーゼを含んだ。そのようなポリメラーゼの大断片は、全長蛋白質とは反対に、やはり調べた。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  Ｐｏｌ  Ｉに対応する配列は、メチシリン−感受性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ株ＭＳＳＡ４７６のゲノム配列であるＧｅｎｂａｎｋエントリー座ＢＸ５７１８５７において同定された。完全なポリメラーゼコーディング配列は、ゲノム配列の位置１７４０７６９ないし１７４３３９９に対する相補体に対応し、推定のコードされたポリペプチドはＴｒＥＭＢＬアクセション番号Ｑ６Ｇ８Ｎ６を有する。このコーディング領域の断片を、コーディング領域の８６５ないし２６３１に対応するＭＳＳＡ４７６ゲノムＤＮＡから増幅され、かくして、主として５’−３’エキソヌクレアーゼドメインに対応する最初の２８８アミノ酸残基を省く。この断片をｐＥＴ２１＋にクローン化され、５’末端においてＰＣＲプライマーに取り込まれたヒスチジン−コーディングタグを含んだ。この蛋白質は効果的に発現され、Ｎｉ−ＮＴＡアガロースで容易に精製された。図４８に示すように、この蛋白質はＲＰＡ反応でテストされた。（Ｓａｕポリメラーゼといわれる）Ｓ．ａｕｒｅｕｓ酵素は非常によく働きＢｓｕポリメラーゼと少なくとも同程度に見えることが観察された。
ｇｐ３２活性
以下に示されるように、ｇｐ３２蛋白質についての新規な活性アッセイは、それらの区別される生化学的活性を示す。ｇｐ３２蛋白質はいくつかの異なるバクテリオファージから由来した。１つの実験において、ｇｐ３２活性は、反応に含まれるｇｐ３２の質量が、ヌクレアーゼ−保護アッセイによって評価して、それがちょうど活性において限定的となるまで滴定された反応環境を確立することによって評価した。図６６はそのようなアッセイを示し、これを行って、Ｅ．ｃｏｌｉのエンドヌクレアーゼＩＶ（Ｎｆｏ）によるレポータープローブオリゴヌクレオチドの切断を阻害するのに必要なＲｂ６９  ｇｐ３２の量（質量）を決定ひた。このアッセイにおいて、プローブにおけるフルオロファオおよび暗いクエンチャーの間に位置するテトラヒドロフィラン（脱塩基ミメティック）に対する核酸分解攻撃の結果として起こる蛍光を上昇させることによって切断をモニターした。ｇｐ３２の非存在下において、プローブは余りにも迅速に切断されたので、チューブが測定のためにフルオロメーターまで移動される時点まで、それは既にほとんど完全に分解されていた（高蛍光）。逆に、２５０ｎｇ／μＬのＲｂ６９  ｇｐ３２を反応に含めると、切断は完全になくなり、平坦な線がアッセイ時間を通じてもたらされた（１００秒）。中間量のｇｐ３２蛋白質の結果、蛋白質の質量および保護能力の間の厳格な関係に合致する種々の傾きの蛍光増大曲線がもたらされた。結果は、ｇｐ３２調製の「活性」を確立するにおけるこのアッセイの利用性を示す。
【００８５】
図６６に示されるように、８３および１００ｎｇ／μＬの間のように、完全な保護の境界にあるプローブオリゴヌクレオチドおよびｇｐ３２蛋白質の比率を確率するのは可能である。ゆっくりに過ぎないが起こったｇｐ３２切断のこの濃度において、ｇｐ３２活性のいずれかの変化は切断速度の差によって容易に観察されるようであった。そのような濃度において、反応はさらに加えた試薬で挑戦され、あるいは温度、およびプローブ保護におけるｇｐ３２の効率のような環境条件の変化を評価した。図６７は、さらなる一本鎖または二本鎖ＤＮＡとの反応に挑戦する結果が評価された実験の結果を示す。本実験において、Ｒｂ６９  ｇｐ３２、Ｔ４  ｇｐ３２およびＡｅｈｌ  ｇｐ３２に対するこれらの変化の効果を比較した。全ての場合において、規定された時刻における競合体ｓｓＤＮＡでの挑戦の結果、プローブ攻撃の鋭い増加がもたらされた。
【００８６】
結果は、ｇｐ３２の分布は高度に動的であるに違いないことを示し、これは、会合および解離事象がＲＰＡ反応で頻繁に起こるが（密集剤および他のＲＰＡ試薬の存在下で、キネティックスは改変させることができる）という考えを支持する。ｓｓＤＮＡのこの競合効果は強く異なるｇｐ３２種の間で同様であったが、系が二本鎖ＤＮＡで挑戦された場合に有意な差が認められた。（プローブと比較して）ｄｓＤＮＡの１０倍の質量で挑戦された場合、Ａｅｈ１およびＲＢ６９  ｇｐ３２は切断活性の非常にわずかな増加を示したに過ぎなかった。対照的に、Ｔ４  ｇｐ３２は切断活性の非常に有意な増加を示した。いずれかの理論に拘束されるつもりはないが、結果は、二本鎖ＤＮＡに対するｇｐ３２種の相対的親和性はかなり変動したことを示唆する。これらの結果は、さらに、ｇｐ３２の種に依存して後期ＲＰＡ反応挙動の有意な差があり得ることを示唆する。Ｒｂ６９またはｇｐ３２は一本鎖および二本鎖ＤＮＡの間でより強く分配されるようであり、他方、Ｔ４  ｇｐ３２はディプレックス産物へ滴定されるようである。これは、いくつかのＲＰＡ反応における、Ｒｂ６９  ｇｐ３２で認められた改良された活性のいくらかを説明することができる。Ｔ４  ｇｐ３２は、単に、より高い総じてのより高いＤＮＡ親和性を有する可能性があり、これは、後に詳細に記載される次の実験の結果と合致するであろう。
【００８７】
プローブ保護アッセイのもう１つの変形において、プローブを保護するにおけるｇｐ３２の活性に対する温度の効果を調べた。図６８は、経時的な反応環境の温度を徐々に増加させる効果を示し、ある時点において、ｇｐ３２の保護特性が突然減少することを明らかにする。これは、恐らくは、蛋白質が効果的に機能する上方温度を表す。プロフィールが本明細書中でテストされた３つの種の間で顕著に異なることが認められた。Ａｅｈ１  ｇｐ３２は約４０℃を超えては効果が少なく、この温度を超えては保護能力を非常に迅速に失う。４２度までには、それはその活性のほとんど全てを失う。対照的には、Ｒｂ６９  ｇｐ３２は、約４２度まで十分な活性を保持し、次いで、ゆっくりと活性を失い始める。妥協しつつ、それは、このアッセイにおいて４７度までいくらかの保護能力を供する。しかしながら、最も強力な保護能力は、本実験でアッセイした最高温度である４９度において効果のわずかな減少を示し始めたに過ぎないＴ４  ｇｐ３２で観察された。かくして、これらの３つの蛋白質についての操作温度範囲は明瞭にかつ測定可能に区別されると推定された。これは、いずれのｇｐ３２種が与えられた適用で最も適当であるかを決定する場合にかなりの重要性を有し、蛋白質それ自体の熱的安定性ならびに蛋白質の相対的ＤＮＡ結合親和性の双方を反映し得る。
【００８８】
「酸Ｃ−末端」、酸性Ｃ末端、酸Ｎ−末端、および酸性Ｎ末端とは、ｎが１ないし４である（ＬＤＥ）ｎまたは（ＬＳＤ）ｎのような１以上の酸のアミノ酸、または１０以下の酸性アミノ酸の、蛋白質のＣまたはＮ末端の任意の負荷をいう。加えて、レコンビナーゼ（例えば、ＵｖｓＸ）、レコンビナーゼ負荷剤（例えば、ＵｖｓＹ）、および一本鎖結合蛋白質（例えば、ｇｐ３２）を含めた本明細書中のいずれかの箇所に記載された蛋白質のいずれも、所望により、（酸性ＣまたはＮ末端のような）いずれかの他の修飾に加えて、蛋白質のＮ末端において、Ｃ末端において、またはＮ末端およびＣ末端の間にＨｉｓタグを含んでもよい。Ｈｉｓタグは、直列のヒスチジン、または直列のヒスチジンまたはグルタミン（ＨＱ、またはＱＨ）を含む１０以下のアミノ酸を意味すると理解され−好ましい具体例においては、数は６である。さらに、Ｈｉｓタグは、ＨＱＨＱＨＱ（配列番号：８４）のような長さが１０アミノ酸未満であるＨＱＨＱＨＱＨＱＨＱ（配列番号：８３）のようなアミノ酸もいうことができる。例えば、もし蛋白質が酸性Ｃ末端およびＣ−末端ヒスチジンタグ双方を有するならば、該蛋白質は［蛋白質］−［酸性残基］−［ヒスチジンタグ］のような、あるいは［蛋白質］−［ヒスチジンタグ］−［酸性残基］のような立体配置を有してもよい。別法として、酸性Ｎ末端およびＮ末端ヒスチジンタグ双方を持つ蛋白質は、［酸性残基］−［ヒスチジンタグ］−［蛋白質］の、または［ヒスチジンタグ］−［酸性残基］−［蛋白質］のような立体配置を有してもよい。
【実施例】
【００８９】
一般的に記載してきた本発明は、本発明のある態様および具体例の単に説明の目的で含め、断じて本発明を限定される意図ではない以下の実施例を参照してより容易に理解することができる。他の態様、利点および修飾は特許請求の範囲内のものである。
【００９０】
（実施例１）クローニングおよび蛋白質発現
全てのＤＮＡ操作は標準的な技術、特にＰＣＲを用いるクローニング、ＰＣＲ−ベースの突然変異誘発手法、および標準的な制限消化および連結を用いて行った。配列決定がＬａｒｋ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｌｔｄ，Ｓａｆｆｒｏｎ  Ｗａｌｄｅｎ，ＵＫによって行った。全ての蛋白質はＥ．ｃｏｌｉにおいて発現させ、１ｍｇ／ｍｌのリソソームを用いる溶解および２ないし３の凍結解凍サイクルに続いてＩＭ  ＮａＣｌ中で精製した。Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂はＱｉａｇｅｎから購入した。
増幅反応
個々の増幅反応についての条件は以下に供する詳細な記載で記載する。一般に、反応は、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ色素を含めることによって、なおよりしばしばは、我々が開発したプローブ−ベースのアプローチの使用によって、リアルタイムでモニターした（Ｐｉｅｐｅｎｂｕｒｇ  ｅｔ  ａｌ．２００６参照）。この場合、プローブは、フルオロフォアおよびクエンチャーによって近接挟まれた内部テトラヒドロフラン残基（脱塩基部位ミメティック）を含有する第三のＤＮＡプライマーである。増幅されたＤＮＡに対するハイブリダイゼーションに対してこのプローブは、反応に含めた酵素であるエンドヌクレアーゼＩＶ（Ｎｆｏ）またはエキソヌクレアーゼＩＩＩのエンド核酸分解活性に対する基質となる。
【００９１】
本明細書中に記載された蛍光プローブの配列は以下の通りである：
【００９２】
【化２】
2014233293.tif 000042
ここに、（Ｔ）はｄＴ−ＴＡＭＲＡであり、（Ｆ）はｄｔ−フルオレセインであり、（Ｈ）はＴＨＦであり、（ｑ１）はｄＴ−ＢＨＱ１であり、（ｑ２）はｄＴ−ＢＨＱ２であり、（ｑ３）はｄＴ−ＤＤＱ１である。Ｎｆｏ酵素は２００ｎｇ／μｌで用いたが、ほとんどの全てのプローブ−ベースの実験は６５ｎｇ／μｌのエンドヌクレアーゼＩＩＩを使用した。励起／検出は４８５／５２５ｎｍ（ＳＹＢＲ  ＧｒｅｅｎまたはプローブＢｓＦｌｃ）または５３０／５７５ｎｍにおけるものであった（ＳＡＴａｍｒａ１／２）。測定は３０ないし４５秒毎に行った。蛍光プローブデータを水対照で正規化し、プレ−増幅ベースラインを調整した。一般に、正規化された蛍光の読みの対数をプローブ−ベースの実験についての時間に対してプロットした。
増幅プライマー：
【００９３】
【化３】
2014233293.tif 000043
【００９４】
【化４】
2014233293.tif 000044
クローンは、Ｔ６ファージ、Ｒｂ６９ファージ、Ａｅｈ１ファージ、またはファージＫＶＰ４０を用いるＰＣＲによって構築した。図１は、ミオウイルスからの多様な組換えマシーナリーをコードする新規なクローンの模式的レイアウトを示す。修飾されたｐＥＴ２１＋プラスミド（Ｎｏｖａｇｅｎ）を用い、ヘキサヒスチジンタグをＰＣＲプライマーに作製して、Ｎ末端（ＵｖｓＹ蛋白質）において、またはＣ末端（ＵｖｓＸおよびｇｐ３２蛋白質）においてタグをイン−フレームでコードさせた。整列および後の考察において、アミノ酸残基の数とは、関連データベースに記載されている天然蛋白質における位置をいう。ＵｖｓＹの場合には、６つのヒスチジン、および用いたクローンにおけるこれに先行するメチオニンがある。
【００９５】
（実施例２）多様なレコンビナーゼ蛋白質の一次配列整列
Ｔ４  ＵｖｓおよびＥ．ｃｏｌｉ  ＲｅｃＡの一次配列整列
（Ｅｘｐａｓｙプロテオミックスサーバーを介してアクセスした）ウェブ−ベースのツールＮＡＦＦＴを用いて、図２に示したように、Ｔ４  ＵｖｓおよびＥ．ｃｏｌｉ  ＲｅｃＡの位置維持ポリペプチド配列を整列させた。この整列は生成させ、かつ他の箇所で議論したものと合致した。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＲｅｃＡの既知の結晶構造に基づき、注目する３つの領域、すなわち、ＡＴＰ結合および加水分解に関与するＷａｌｋｅｒ  Ａモチーフ、モバイルＤＮＡ結合ループ１、およびモバイルＤＮＡ結合ループ２配列の位置をボックスに入れる。整列下で、記号は全てのホモログの間のアミノ酸同一性（＊）、保存された置換（：）、または半−保存置換（．）を示す。
同等Ｔ４  ＵｖｓＸ残基の重ね合わせおよび標識を備えたＲｅｃＡ構造のモデル
ＲｅｃＡヌクレオ蛋白質フィラメントのモデルは、ＣＮ３ＤおよびＮＣＢＩデータベース、ＰＤＢエントリー１Ｎ０３（関連引用Ｖａｎｌｏｏｃｋ  ＭＳ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２００３  Ｆｅｂ；１（２）１８７−９６）からダウンロードされたデータセットを用いて作成した。図２中の整列を用い、Ｔ４  ＵｖｓＸ残基の推定位置を、注目するＵｖｓＸアミノ酸の可能な位置および相互に対するそれらの近接性についての洞察を供するにおけるエクササイズとしてＲｅｃＡ構造にマッピングした。図３は、一次配列整列に基づく同等Ｔ４  ＵｖｓＸ残基の重ね合わせおよび標識を備えたＲｅｃＡ構造のモデルを示す。図３Ａは、結合したＤＮＡの近似的ロケーションである中央穴を備えたモデルＲｅｃＡフィラメントの軸を見下ろすスクリーンショットを示す。Ｗａｌｋｅｒ  ＡモチーフおよびモバイルＤＮＡ結合ループの近似的ロケーションは単一サブユニットについて示され、それは核酸に面する表面にある。図３Ｂおよび３Ｃは、２つのズームドショットが、ＡＴＰが（Ａ）に示された表面に結合した領域から取った。Ｔ４  ＵｖｓＸ残基Ｇ６０、Ｓ６４、Ｓ６７、Ｆ６９、Ｇ７０、Ｈ１９５、およびＭ２０８の推定位置を図３に示す。また、モバイルＤＮＡ−結合ループ２の始まりおよび終わりの近似的ロケーションも示される。これらのアミノ酸はこのモデルで示されるように正確に位置させることは、ＲｅｃＡ  および  ＵｖｓＸの間のかなりの多様性を仮定するとありそうにないが、しかしながら、これらの近似は、おそらくは、本明細書中における研究についての意義ある有用性のものである。
Ｔ４  および  Ｔ６  ｇ３２および  ＵｖｓＹ蛋白質の一次配列整列
（Ｅｘｐａｓｙプロテオミックスサーバーを介してアクセスされた）ウェブ−アクセスツールＭＡＦＦＴを用いて、図４に示すように、Ｔ４およびＴ６、ｇｐ３２およびＵｖｓＹ蛋白質の一次ポリペプチドの配列を整列させた。この整列により、これらの蛋白質の間の唯一の小さな差が明らかとなった。ＵｖｓＹ蛋白質は唯２つの高度に保存的置換を有した。整列の下では、記号は全てのホモログの間のアミノ酸同一性（＊）、保存された置換（：）、または半−保存置換（．）を示す。
多様なＵｖｓＸ蛋白質の一次配列整列
（Ｅｘｐａｓｙプロテオミックスサーバーを介してアクセスされた）ウェブ−ベースのツールＭＡＦＦＴを用いて、図５に示したように、Ｔ４、Ｔ６、ファージ１３３、Ｒｂ６９、Ａｅｈｌ、Ａｅ６５、ＫＶＰ４０、Ｒｂ４３、ＰＳＳＭ２、およびＰＳＳＭ４  ＵｖｓＸ蛋白質の一次ポリペプチド配列を整列させた。注目するいくつかの配列の領域、すなわち、ＤＮＡ結合および加水分解に関与するＷａｌｋｅｒ  Ａモチーフ（または、「Ｐ−ループ」）、モバイルＤＮＡ結合ループ１、およびモバイルＤＮＡ結合ループ２をボックスに入れた。議論するある残基は、強調した。Ｔ４およびＴ６  ＵｖｓＸの間の全てのアミノ酸の差を太文字で示す。整列下で、記号は全てのホモログの間のアミノ酸同一性（＊）、保存された置換（：）、または半−保存置換（．）を示す。
多様なＵｖｓＹ蛋白質の一次配列整列
（Ｅｘｐａｓｙプロテオミックスサーバーを介してアクセスされた）ウェブ−ベースのツールＭＡＦＦＴを用いて、図６に示すように、Ｔ４、Ｔ６、ファージ１３３、Ｒｂ６９、Ａｅｈｌ、ＫＶＰ４０、Ｒｂ４３、ＰＳＳＭ２、およびＰＳＳＭ４  ＵｖｓＸ蛋白質の一次ポリペプチド配列を整列させた。この整列において、ＰＳＳＭ４配列はゲノムＤＮＡの自分自身の翻訳、ポリペプチド配列からの最初の４３残基を誤って見掛け上省略するＮＣＢＩエントリーに由来した。整列下で、記号は全てのホモログの間のアミノ酸同一性（＊）、保存された置換（：）、または半−保存置換（．）を表す。
多様なｇｐ３２蛋白質の一次配列整列
（Ｅｘｐａｓｙプロテオミックスサーバーを介してアクセスされた）ウェブ−ベースのツールＭＡＦＦＴを用いて、図７で示すように、Ｔ４、Ｔ６、Ｒｂ６９、Ａｅｈｌ、ＫＶＰ４０、Ｒｂ４３、ＰＳＳＭ２、およびＰＳＳＭ４  ｇｐ３２蛋白質の一次ポリペプチド配列を整列させた。この整列において、ＰＳＳＭ２配列は、ゲノムＤＮＡの自分自身の翻訳、ポリペプチド配列から最初の２５残基を見掛け上誤って省略するＮＣＢＩエントリーに由来した。整列下で、記号は、全てのホモログの間のアミノ酸同一性（＊）、保存された置換（：）または半−保存置換（．）を表す。また、矢印によって、Ｔ４  ｇｐ３２における亜鉛の配位に関連する残基の位置も示される。また、配列の上方の線によって、シアノファージｇｐ３２蛋白質には存在せず、かつＴ４  ｇｐ３２の亜鉛原子におけるように協働結合に関連する共通の配列ＦＫＲＫ（またはＲｂ４３におけるＦＫＲＱ）が示される。シアノファージｇｐ３２蛋白質における配位残基の欠如は、これらの蛋白質は活性のために亜鉛、コバルト、ニッケル等のような金属を必要としないであろうことを示唆する。ＫＶＰ４０金属−結合領域の再組織化状態は、この蛋白質が亜鉛には結合できないが、むしろ異なる金属に結合できないが、むしろ異なる金属原子に結合できることを示唆し、あるいは成長の間における亜鉛についての改変された要件、あるいは競合体金属原子による置換攻撃に対する改変された感受性を示すことができる。
【００９６】
（実施例３）異種成分を用いるＲＰＡ反応におけるＴ４  ＵｖｓＸに代えて置換されたＴ６  ＵｖｓＸ
ＲＰＡ反応は、その配列が示されたプライマーＲｓ８１７９１４５−２およびＲｓ８１７９１４５−３を用いて構成した。標的ＤＮＡはヒトゲノムＤＮＡであって、反応条件は以下の通りであった：１００ｍＭ酢酸カリウム、５０ｎＭトリスアセテートｐＨ８．３、５０ｍＭホスホクレアチン、３ｍＭＰ  ＡＴＰ、２００μＭ  ｄＮＴＰ、３００ｎＭ  Ｒｓ８１７９１４５−２プライマー、３００ｎＭ  Ｒｓ８１７９１４５−３プライマー、１５０ｎｇ／μＬ  Ｔ４またＴ６  ＵｖｓＸ、１０００ｎｇ／ｎｇ／μＬ  Ｔ４  ｇｐ３２、４０ｎｇ／μＬ  Ｔ４ＵｖｓＹ、４２コピーのヒトゲノムＤＮＡ、５％  Ｃａｒｂｏｗａｘ  ２０Ｍ、および３２ｎｇ／μＬ  Ｂｓｕポリメラーゼ。９０分後に、Ｑｉａｇｅｎ
ＰＣＲ産物クリーンアップカラムを通す遠心を介して試料を精製した。精製された試料は臭化エチジウム染色アガロースゲルで分析した。ヒト遺伝子座Ｒｓ８１７９４５からの予測されたアンプリコンサイズは２０５ｂｐであった。図８に示されるゲル上のアスタリスクは、予測されるバンドの位置、２０５ｂｐを示し、マーカーバンドの位置は左側に示す。図８に示すように、Ｔ６  ＵｖｓＸは異種成分を用いるＲＰＡ反応においてＴ４  ＵｖｓＸに代えて効果的に置換することができる。
【００９７】
ＲＰＡ反応を確立して、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ色素を用い、プライマーＪ１およびＫ２を用い、以下の条件下でＴ６およびＴ４  ＵｖｓＸのキネティクスを比較した：５０ｍＭ
トリスアセテートｐＨ７．９、１００ｍＭ酢酸カリウム、１４ｍＭ酢酸マグネシウム、５０ｍＭリン酸クレアチン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、３ｍＭ  ＡＴＰ（Ｒｏｃｈｅ）、２００マイクロモラーｄＮＴＰ、５０ｎｇ／μｌクレアチンキナーゼ（Ｒｏｃｈｅ）、Ｔ４またはＴ６の１２０ｎｇ／μｌ  ＵｖｓＸ、３０ｎｇ／μｌ  ＵｖｓＹ、９００ｎｇ／μｌ  ｇｐ３２、３０ｎｇ／μｌ  Ｂｓｕポリメラーゼ、５％  Ｃａｒｂｏｗａｘ  ２０Ｍ、３００ｎＭ増幅プライマー、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎのストックからの１：５０，０００希釈（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。反応を９６−ウェルプレート中の氷上で確立し、次いで、３８℃に設定されたステージを備えたＢＩＯＴＥＫ  Ｆｌｘ−８００蛍光マイクロプレートリーダーに移し、その時点で、周期的に頂部−読み取りプローブから測定を行った。試料は標的（水）を含有しないか、または標的配列を含有するＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓゲノムＤＮＡの５０または５０００コピーを含有した。試料はＴ４またはＴ６  ＵｖｓＸいずれか、およびレコンビナーゼを含有し、標的の存在は脚注に示す。各試料は二連で実行した。
【００９８】
陽性シグナルは６０分間のインキュベーションの間に全ての試料で発生し、シグナルの時間の増加は予測される非−標的試料におけるよりも標的−含有試料において早かった。図９に示すように、シグナル増加が最初に検出された時刻はＴ４およびＴ６試料の間で同様であった。しかしながら、曲線は異なる傾きおよび最終最大でもって作成された。Ｔ６はより鋭くないシグナルの蓄積およびより高くない最終シグナルを与えた。
【００９９】
また、ＲＰＡ反応を確立して、蛍光プローブを用い、プライマーｏｒｆｘ４５ａ（１２０ｎＭ）およびｓｃｃｉｉ３５ＩＶ（４８０ｎＭ）を用い、以下の条件下でＴ６およびＴ４  ＵｖｓＸのキネティクスを比較した：５０ｍＭトリスアセテートｐＨ７．９、１００ｍＭ酢酸カリウム、１４ｍＭ酢酸マグネシウム、５０ｍＭリン酸クレアチン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、３ｍＭ  ＡＴＰ（Ｒｏｃｈｅ）、２００マイクロモラーｄＮＴＰ、５０ｎｇ／μｌのクレアチンキナーゼ（Ｒｏｃｈｅ）、Ｔ４またはＴ６の１２０ｎｇ／μｌ  ＵｖｓＸ、３０ｎｇ／μｌ  ＵｖｓＹ、９００ｎｇ／μｌ  Ｂｓｕポリメラーゼ、５％  Ｃａｒｂｏｗａｘ  ２０Ｍ、１２０ｎＭ蛍光プローブＳＡＴａｍｒａ２。エキソヌクレアーゼＩＩＩは６５ｎｇ／μｌで含めた。反応を３８４−ウェルプレート中で氷上で確立し、次いで、３８℃に設定されたステージに備えたＢＩＯＴＥＫ  Ｆｌｘ−８００蛍光マイクロプレートリーダーに移し、その時点で、底−読み取りプローブから周期的に測定を行った。試料は標的（水）を含有せず、標的配列を含有するＭＲＳＡ３（ｍｅｃｌ）ゲノムＤＮＡの１００または１０００コピーいずれかを含有した。試料はＴ４またはＴ６  ＵｖｓＸ、およびレコンビナーゼのいずれかを含有し、標的の存在は脚注に示す。各試料は二連で実行した。
【０１００】
陽性シグナルは９０分のインキュベーションの間に鋳型陽性試料で発生し、シグナル増加の時刻は最高標的−含有試料で最も早かった。図１０に示すように、シグナル増加が最初に検出された時刻は、特に、１０００コピー資料についてＴ４およびＴ６試料の間で同様であったが、曲線は異なる傾きおよび最終最大を伴って発生した。Ｔ６はより鋭くないシグナルの蓄積、およびより高くない最終シグナルを与えた。
【０１０１】
（実施例４）作成されたＴ６  ＵｖｓＸ蛋白質構築体
修飾されたｐＥＴ２１＋ベクター中にＴ６  ＵｖｓＸを含有する親プラスミドクローンは、標準的なＰＣＲ突然変異誘発プロトコルを用いて改変した。推定構造エレメントに対するコーディング領域／一次ポリペプチド配列の関連の模式的レイアウトを図１１の頂部に示す。模式図でボックスとして示される３つの領域、Ｗａｌｋｅｒ  Ａモチーフ、ＤＮＡ結合ループ１およびＤＮＡ結合ループ２に対して修飾を行った。いくつかの領域およびアミノ酸は標的であって、これらはクローンに与えられた名称の次の下側模式図に示される。数字は野生型Ｔ６  ＵｖｓＸ蛋白質中のアミノ酸の位置をいい、よって、Ｈ６６Ｓは、野生型Ｔ６中のアミノ酸６６として存在するヒスチジンがセリンに改変されたことを意味する。図１１の左側には、ＲＰＡアッセイでテストした場合にこのクローンから生じた蛋白質の一般的活性の単純な図を示す。
Ｔ６  ＵｖｓＸ  Ｈ６６Ｓおよび野生型Ｔ６  ＵｖｓＸの比較
ＲＰＡ反応を確立して、プライマーＪ１（１２０ｎＭ）およびＫ２（４８０ｎＭ）を用い、以下の条件下でＴ６  ＵｖｓＸ  Ｈ６６Ｓおよび野生型Ｔ６  ＵｖｓＸを比較した：５０ｍＭトリスアセテートｐＨ７．９、１００ｍＭ酢酸カリウム、１４ｍＭ酢酸マグネシウム、５０ｍＭリン酸クレアチン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、３ｍＭ  ＡＴＰ（Ｒｏｃｈｅ）、２００マイクロモラーｄＮＴＰ、５０ｍｇ／μｌクレアチンキナーゼ（Ｒｏｃｈｅ）、１２０ｎｇ／μｌ  ＵｖｓＸのＴ４またはＴ６  ＵｖｓＸ  Ｈ６６Ｓ、４５ｎｇ／μｌ  Ｔ４  ＵｖｓＹ、９００ｎｇ／μｌ  Ｔ４  ｇｐ３２、３０ｎｇ／μｌ  Ｂｓｕポリメラーゼ、５％  Ｃａｒｂｏｗａｘ  ２０Ｍ、１２０ｎＭ蛍光プローブＢｓＦｌｃ。エキソヌクレアーゼＩＩＩは６５ｎｇ／μｌで含めた。反応を３８４−ウェルプレート中の氷上で確立し、次いで、３８℃に設定されたステージを備えたＢＩＯＴＥＫ  Ｆｌｘ−８００蛍光マイクロプレートリーダーに移し、その時点で、底−読み取りプローブから周期的に測定を行った。試料は標的配列を含有するＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓゲノムＤＮＡの１００または１０００コピーいずれかを含有した。試料はＴ４またはＴ６  ＵｖｓＸ  Ｈ６６Ｓ、およびレコンビナーゼのいずれかを含有し、標的の存在は図１２において脚注に示す。各試料は二連で実行した。
【０１０２】
Ｔ６  ＵｖｓＸ  Ｈ６６Ｓの配列は以下の通りである：
【０１０３】
【化５】
2014233293.tif 000045
【０１０４】
図１２に示すように、９０分のインキュべーションの間に陽性シグナルが試料中で発生し、シグナル増加の時刻は最高標的−含有試料において最も早かった。シグナルは、特に、１０００コピー試料について、Ｔ６  ＵｖｓＸ  Ｈ６６Ｓ−含有試料においてより早く、曲線は最終最大を生じた。この実験に基づくと、Ｔ６  ＵｖｓＸ  Ｈ６６Ｓは野生型Ｔ６  ＵｖｓＸよりもこれらのアッセイにおいて良好に実行されたと結論された。しかしながら、この系を用いるシグナル蓄積の傾きは２つの蛋白質の間で同様であり、従って、Ｔ６  ＵｖｓＸ  Ｈ６６ＳはこのアッセイにおいてはＴ４  ＵｖｓＸの活性を正確に再現するようではない。
Ｔ６  ＵｖｓＸの他の突然変異体のキネティック挙動
ＲＰＡ反応は、突然変異体Ｔ６  ＵｖｓＸ成分を用い、プライマーＪ１（１２０ｎＭ）およびＫ２（４８０ｎＭ）を用い、以下の条件下で確立した：５０ｍＭトリスアセテートｐＨ７．９、１００ｍＭ酢酸カリウム、１４ｍＭ酢酸マグネシウム、５０ｍＭリン酸クレアチン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、３ｍＭ  ＡＴＰ（Ｒｏｃｈｅ）、２００マイクロモラーｄＮＴＰ、５０ｎｇ／μｌクレアチンキナーゼ（Ｒｏｃｈｅ）、Ｔ６またはＴ６  ＵｖｓＸ  Ｈ６６Ｔの１２０ｎｇ／μｌまたはＴ６  ＵｖｓＸ  Ｍ７１Ｆ／Ｓ７２ＧまたはＴ６  ＵｖｓＸ  Ｓ１６４Ｖ／Ａ１６６Ｓ、４５ｎｇ／μｌ  Ｔ４  ＵｖｓＹ、１０００ｎｇ／μｌ  Ｔ４ｇｐ３２、３０ｎｇ／μｌ  Ｂｓｕポリメラーゼ、６％  Ｃａｒｂｏｗａｘ  ２０Ｍ、１２０ｎＭ蛍光プローブＢｓＦｌｃ。エンドヌクレアーゼＩＩＩは６５ｎｇ／μｌで含めた。反応を３８４−ウェルプレート中の氷上で確立し、次いで、３８℃に設定されたステージを備えたＢＩＯＴＥＫ  Ｆｌｘ−８００蛍光マイクロプレートリーダーに移し、その時点で、底−読み取りプローブから周期的に測定を行った。試料は水、または脚注に示したように標的配列を含有するＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓゲノムＤＮＡの２００コピーを含有した。
図１３に示すように、９０分のインキュベーションの間にいくつかの試料において陽性シグナルが発生した。シグナルはＴ６  ＵｖｓＸ  Ｓ１６４Ｖ／Ａ  １６６Ｓ、次いで、野生型試料において最も早く発生した。シグナルがＴ６  Ｕｖｓ  Ｈ６６Ｔ試料においてかなり遅く蓄積し、Ｔ６  ＵｖｓＸ  Ｍ７１Ｆ／Ｓ７２Ｇ試料においてシグナルは蓄積しなかった。Ｔ６  ＵｖｓＸ  Ｓ１６４Ｖ／Ａ１６６Ｓはこれらのアッセイにおいてよく実行されたが、いくつかのより遅い実験では、野生型Ｔ６  ＵｖｓＸに対してほとんどまたは全く差は見出されなかったと結論された。さらに、Ｔ６  ＵｖｓＸ  Ｈ６６Ｔは貧弱な活性を有し、Ｔ６  ＵｖｓＸ  Ｍ７１Ｆ／Ｓ７２Ｇは不活性であると結論された。
【０１０５】
Ｔ６  ＵｖｓＸ  Ｓ１６４Ｖ／Ａ１６６Ｓの配列は以下の通りである：
【０１０６】
【化６】
2014233293.tif 000046
【０１０７】
（実施例５）Ｒｂ６９成分を用いるＲＰＡ
ＲＰＡ反応はＲｂ６９成分を用い、プライマーＪ１およびＫ２を用い、以下の条件下で確立した：５０ｍＭトリスアセテートｐＨ７．９、１００ｍＭ酢酸カリウム、１４ｍＭ酢酸マグネシウム、５０ｍＭリン酸クレアチン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、３ｍＭ  ＡＴＰ（Ｒｏｃｈｅ）、２００マイクロモラーｄＮＴＰ、５０ｎｇ／μｌクレアチンキナーゼ（Ｒｏｃｈｅ）、１００ｎｇ／μｌ  ＵｖｓＸのＲｂ６９、２０ないし１００ｎｇ／μｌ  Ｒｂ６９  ＵｖｓＹ、４００ｎｇ／μｌ  Ｒｂ６９  ｇｐ３２、３０ｎｇ／μｌ  Ｂｓｕポリメラーゼ、７％  Ｃａｒｂｏｗａｘ  ２０Ｍ、３００ｎＭ増幅プライマー、ＳＹＢＲ
Ｇｒｅｅｎのストックからの１：５０，０００希釈（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。反応は３８４−ウェルプレート中の氷上で確立され、次いで、３８℃に設定されたステージを備えたＢＩＯＴＥＫ  Ｆｌｘ−８００蛍光マイクロプレートリーダーに移し、その時点で、底−読み取りプローブから周期的に実験を行った。試料は標的（対照−水）を含有せず、または標的配列を含有するＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓゲノムＤＮＡの２５００コピーを含有した。試料は変化させる濃度のＲｂ６９  ＵｖｓＹを含有し、用いる量は脚注に示す。
【０１０８】
図１４に示すように、９０分のインキュベーションの間に全ての試料において陽性シグナルが発生し、シグナル増加の時点は、６０ｎｇ／μｌ異常のＲｂ６９  ＵｖｓＹの濃度についての理想的な要件の基礎となるより高い量のＵｖｓＹを含有する試料においてより早かった。対照試料は６０ｎｇ／μｌのＵｖｓＹを含有するが、標的ＤＮＡを欠如する陽性試料と同一の条件下で行った。この実験は、Ｒｂ６９成分を使用して、感受性活特異的増幅系を構成することができる。
【０１０９】
（実施例６）Ａｅｈ１成分を用いるＲＰＡ
ＲＰＡ反応はＡｅｈ１成分を用い、プライマーＪ１（１２０ｎＭ）およびＫ２（４８０ｎＭ）を用い、以下の条件下で確立した：５０ｍＭトリスアセテートｐＨ７．９、１００ｍＭ酢酸カリウム、１４ｍＭ酢酸マグネシウム、５０ｍＭリン酸クレアチン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、３ｍＭ  ＡＴＰ（Ｒｏｃｈｅ）、２００マイクロモラーｄＮＴＰ、５０ｎｇ／μｌクレアチンキナーゼ（Ｒｏｃｈｅ）、２００ｎｇ／μｌ  Ａｅｈｌ  ＵｖｓＸ、８０ｎｇ／μｌ  Ａｅｈｌ  ＵｖｓＹ、５００ｎｇ／μｌ  Ａｅｈｌ  ｇｐ３２、３０ｎｇ／μｌ  Ｂｓｕポリメラーゼ、７％ＰＥＧ化合物、１２０ｎＭ蛍光プローブＢｓＦｌｃ。エキソヌクレアーゼＩＩＩは６５ｎｇ／μｌで含めた。反応は３８４−ウェルプレート中で氷上で確立し、次いで、３８℃に設定されたステージを備えたＢＩＯＴＥＫ  Ｆｌｘ−８００蛍光マイクロプレートリーダーに移し、その時点で、底−読み取りプローブから周期的に測定を行った。試料は、図１５に示された脚注に示されたように、水、標的配列を含有するＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓゲノムＤＮＡの１０、１００または１０００コピーいずれかを含有した。塩滴定
また、ＲＰＡ反応はＡｅｈ１成分テスト塩滴定を用い、プライマーＪ１およびＫ２を用い、以下の条件下で確立した：５０ｍＭトリスアセテートｐＨＸＸ、６０または８０または１００または１２０または１４０または１６０ｍＭの酢酸カリウム、１４ｍＭ酢酸マグネシウム、５０ｍＭのリン酸クレアチン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、３ｍＭ  ＡＴＰ（Ｒｏｃｈｅ）、２００マイクロモラーｄＮＴＰ、５０ｎｇ／μｌのクレアチンキナーゼ（Ｒｏｃｈｅ）、１５０ｎｇ／μｌ  ＵｖｓＸのＡｅｈ１、５０ｎｇ／μｌ  Ａｅｈｌ  ＵｖｓＹ、５００ｎｇ／μｌ  Ａｅｈｌ  ｇｐ３２、３０ｎｇ／μｌ  Ｂｓｕポリメラーゼ、７％  Ｃａｒｂｏｗａｘ  ２０Ｍ、３００ｎＭ増幅プライマー、ＳＹＢＹ  Ｇｒｅｅｎのストックからの１：５０，０００  希釈（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。反応を３８４−ウェルプレート中の氷上で確立し、次いで、３８℃に設定されたステージを備えたＢＩＯＴＥＫ  Ｆｌｘ−８００蛍光マイクロプレートリーダーに移し、その時点で、底−読み取りプローブから周期的に測定を行った。試料は標的配列を含有するＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓゲノムＤＮＡの２０００コピーを含有した。
【０１１０】
図１６に示すように、９０分のインキュベーションの間に全ての試料において陽性シグナルが発生した。この実験は、Ａｅｈ１成分を首尾よく使用して、広い範囲の塩濃度にわたってＤＮＡを増幅することができることを示唆する。
Ｔ４と比較したＡｅｈ１
ＲＰＡ反応を確立して、プライマーｏｒｆｘ４５ａ（１００ｎｇ／μｌ）およびｓｃｃｉｉ３５ＩＶ（５００ｎｇ／μｌ）を用い、以下の条件下でＡｅｈ１増幅をＴ４増幅系と比較した：５０ｍＭトリスアセテートｐＨ７．９、１００ｍＭ酢酸カリウム、１４ｍＭ酢酸マグネシウム、５０ｍＭリン酸クレアチン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、３ｍＭ  ＡＴＰ（Ｒｏｃｈｅ）、２００マイクロモラーｄＮＴＰ、５０ｎｇ／μｌクレアチンキナーゼ（Ｒｏｃｈｅ）、２００ｎｇ／μｌ  Ａｅｈｌ  ＵｖｓＸ、８０ｎｇ／μｌ  Ａｅｈｌ、ＵｖｓＹ、５００ｎｇ／μｌ  Ａｅｈｌ  ｇｐ３２、７０ｎｇ／μｌ、Ｂｓｕポリメラーゼ、７％ＰＥＧ化合物（Ｓｉｇｍａ）、１２０ｎＭ蛍光プローブＳＡＴａｍｕｒａ２。あるいは以下の組換え成分以外は同様な条件下で比較した：１２０ｎｇ／μｌ  Ｔ４  ＵｖｓＸ、３０ｎｇ／μｌ  Ｔ４  ＵｖｓＹおよび９００ｎｇ／μｌ  Ｔ４  ｇｐ３２。エキソヌクレアーゼＩＩＩは６５ｎｇ／μｌで含めた。反応は３８４−ウェルプレート中の氷上で確立し、次いで、３８℃に設定されたステージを備えたＢＩＯＴＥＫ  Ｆｌｘ−８００蛍光マイクロプレートリーダーに移し、その時点で、底−読み取りプローブから周期的に測定を行った。試料は、脚注に示すように、水、標的配列を含有するＭＲＳＡゲノムＤＮＡの１０または１０００コピーを含有した。図１７に示すように、見積られた１０コピーが供された場合に、シグナルはいずれの組換え系でも検出されなかった。より後の実験に基づくと、本実験で用いたＤＮＡ希釈は妥協したものであって、よって、現実のコピー数は予測されたものよりも有意に低いと考えられた。図１７に示すように、Ａｅｈ１組換え系はＴ４よりも遅く検出閾値に到達し、本実験においてはより低い全シグナル強度を達成する。
Ａｅｈｌ  ＵｖｓＸおよびＵｖｓＹは異種ｇｐ３２を用いて増幅することができる。
【０１１１】
ＲＰＡ反応はプライマーＪ１およびＫ２を用い、以下の条件下で確立した：５０ｍＭトリスアセテートｐＨ７．９、１００ｍＭ酢酸カリウム、１４ｍＭ酢酸マグネシウム、５０ｍＭリン酸クレアチン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、３ｍＭ  ＡＴＰ（Ｒｏｃｈｅ）、２００マイクロモラーｄＮＴＰ、５０ｎｇ／μｌのクレアチンキナーゼ（Ｒｏｃｈｅ）、２００ｎｇ／μｌ  ＵｖｓＸのＡｅｈ１、１００ｎｇ／μｌ  Ａｅｈｌ  ＵｖｓＹ、３００ｎｇ／μｌ  Ａｅｈｌ  ｇｐ３２または５００ｎｇ／μｌ  Ｒｂ６９  ｇｐ３２または７００ｎｇ／μｌ  Ｔ４  ｇｐ３２、３０ｎｇ／μｌ  Ｂｓｕポリメラーゼ、７％Ｃａｒｂｏｗａｘ  ２０Ｍ、３００ｎＭ増幅プライマー、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎのストックからの１：５０，０００希釈（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。反応は３８４−ウェルプレート中の氷上で確立し、次いで、３８℃に設定されたＢＩＯＴＥＫ  Ｆｌｘ−８００蛍光マイクロプレートリーダーに移し、その時点で、底−読み取りプローブから周期的に測定を行った。試料は標的配列を含有するＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓゲノムＤＮＡの２０００コピーを含有した。
【０１１２】
図１８で示すように、シグナルは全ての試料で発生し、これは、ＤＮＡ増幅が全ての場合に起こったことを示す。最速かつ最強のシグナルはＡｅｈｌ  ｇｐ３２を使用した場合に発生し、次いで、Ｒｂ６９  ｇｐ３２、次いで、Ｔ４  ｇｐ３２であった。ｇｐ３２分子の相対的有効性は注意深く解釈すべきである。というのは、それらは同一濃度で使用したのではなかったからである。
【０１１３】
（実施例７）異種反応成分を用いるＲＰＡ
ＲＰＡ反応は、ヒトゲノムＤＮＡからの大まか３００塩基対デュプレックス産物を増幅するプライマーＡｐｏ３００およびＡｐｏＢ４を用いて確立した。以下の条件を使用した：５０ｍＭトリスアセテートｐＨ８．３、１００ｍＭ酢酸カリウム、１４ｍＭ酢酸マグネシウム、５０ｍＭリン酸クレアチン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、３ｍＭ  ＡＴＰ（Ｒｏｃｈｅ）、２００マイクロモラーｄＮＴＰ、５０ｎｇ／μｌクレアチンキナーゼ（Ｒｏｃｈｅ）、２００ｎｇ／μｌ  ＵｖｓＸのＫＶＰ４０、ＡｅｈｌまたはＲｂ６９、示された３２ｎｇ／μｌ  ＵｖｓＹのＫＶＰ４０、ＡｅｈｌまたはＴ４、６００ｎｇ／μｌ  Ｒｂ６９  ｇｐ３２またはＴ４  ｇｐ３２、３０ｎｇ／μｌ  Ｂｓｕポリメラーゼ、５％Ｃａｒｂｏｗａｘ  ２０Ｍ、３００ｎＭ増幅プライマー。反応を確立し、３７℃に９０分間放置した。全ての試料は、標的配列を含有するキットゲノムＤＮＡの１０００コピーを含有した。ｇｐ３２、ＵｖｓＸおよびＵｖｓＹの種に関する各反応の正確な組成を示す。試料は、Ｑｉａｇｅｎ  ＰＣＲクリーンアップカラムの通過によって精製し、臭化エチジウムを含有する２％アガロースゲル上の電気詠動に付した。図１９に示すように、増幅は、Ｒｂ６９  ｇｐ３２とＡｅｈｌ  ＵｖｓＸおよびＵｖｓＹとの不均一な混合物を含有する試料で起こった。
【０１１４】
（実施例８）作成されたＲｂ６９構築体
修飾されたｐＥＰ２１＋ベクター中のＲｂ６９  ＵｖｓＹの我々の親クローンの変形物を作成した。興味のある領域に注目するＲｂ６９のコーディング一次アミノ酸配列の総じてのレイアウトを図２０の頂部に示す。コーディング配列の変化を作り出して、具体的には、Ｗａｌｋｅｒ  Ａモチーフ中およびその周りの、ＤＮＡ−結合ループ２中およびその周りの、および蛋白質の非常にＣ側末端のコードされたアミノ酸を改変した。Ｗａｌｋｅｒモチーフ中およびその周りの改変は、特殊なレタリング、およびＲｂ６９野生型蛋白質中のアミノ酸の位置に言及する数値、どんなアミノ酸か、および何にそれが突然変異したかによって示される。例えば、Ｈ６４Ｓとは、天然蛋白質のヒスチジン６４のセリンへの改変をいう。ＤＮＡ−結合ループ２の領域における改変された配列は、異なるスキームに従って示される。この場合、ＤＮＡ結合ループ配列のほとんどまたは全ては、Ｔ６またはＴ４  ＵｖｓＸからループによって置換えられた。Ｔ６−１が示される場合、これは配列ＮＨＴ  ＡＭＥＩＧＧＬＹＰＫＥ  ＩＭＧ  ＧＧ（配列番号：１０７）の、配列ＮＨＴ  ＩＥＴＩＥＭＦＳＫＴ  ＶＭＧ  ＧＧ  （配列番号：１０８）での置き換えをいい、そこでは、下線を施したグリシンはＴ６天然配列ではなく、Ｒｂ６９配列と同様である。Ｔ６が示される場合、これは、Ｒｂ６９配列のＮＨＴ  ＩＥＴＩＥＭＦＳＫＴ  ＶＨＴ  ＧＧ
（配列番号：１０９）での置き換えをいい、そこでは、下線を施したスレオニンはこの位置における天然Ｔ６配列である。Ｔ４が示される場合、これは、Ｒｂ６９配列の、ＮＨＴ  ＹＥＴＱＥＭＦＳＫＴ  ＶＭＧ  ＧＧ（配列番号：１１０）であるＴ４配列での置き換えをいう。Ｃ末端に対する修飾の場合には、記号「ＬＳＤ」は、コードされたアミノ酸配列ＥＮＤ  ＬＥＤ  ＭＥＤＦＤＥ（配列番号：１１１）からの非常にＣ側末端におけるＲｂ６９の天然配列の、配列ＥＮＤ  ＬＥＤ  ＬＳＤ  ＭＥＤＦＤＥ（配列番号：１１２）への改変を示す。記号「ＬＤＥ  ＬＤＥ」または時々は脚注においては「２×ＬＤＥ」とは、Ｒｂ６９  Ｃ−末端配列のＥＮＤ  ＬＤＥ  ＭＥＤＦＤＥ  ＬＤＥ  ＬＤＥ（配列番号：１１３）への変化をいう。すべての場合において、非常にＣ−末端側配列に続いて、蛋白質精製で用いられる６ヒスチジン残基をコードする１８塩基が続く。
【０１１５】
簡単に述べれば、先に議論した選択された配列は以下にリストされる。
【０１１６】
Ｒｂ６９  ＵｖｓＸ  Ｈ６４Ｓ配列は以下の通りである：
【０１１７】
【化７】
2014233293.tif 000047
端部における６つの「Ｈ」は任意である。
【０１１８】
Ｒｂ６９  ＵｖｓＸ  Ｈ６４Ｓ  ＬＳＤ配列は以下の通りである：
【０１１９】
【化８】
2014233293.tif 000048
【０１２０】
【化９】
2014233293.tif 000049
端部の６つの「Ｈ」は任意である。
【０１２１】
Ｒｂ６９  ＵｖｓＸ  Ｈ６４Ｓ  ２×ＬＤＥ配列は以下の通りである：
【０１２２】
【化１０】
2014233293.tif 000050
端部の６つの「Ｈ」は任意である。
【０１２３】
Ｒｂ６９  ＵｖｓＸ  Ｈ６４Ｓ  Ｔ６／２×ＬＤＥ配列は以下の通りである：
【０１２４】
【化１１】
2014233293.tif 000051
端部の６つの「Ｈ」は任意である。
【０１２５】
Ｒｂ６９  ＵｖｓＸ  Ｈ６４Ｓ  Ｔ４／２×ＬＤＥ配列は以下の通りである：
【０１２６】
【化１２】
2014233293.tif 000052
【０１２７】
【化１３】
2014233293.tif 000053
端部の６つの「Ｈ」は任意である。
【０１２８】
Ｒｂ６９  ＵｖｓＸ  Ｈ６４Ｓ  Ｔ６７Ｓ  Ｌ６８Ｎ  Ｔ４／２×ＬＤＥ配列は以下の通りである：
【０１２９】
【化１４】
2014233293.tif 000054
端部の６つの「Ｈ」は任意である。
【０１３０】
修飾されたｐＥＴ２１＋ベクター中のＲｂ６９  ＵｖｓＸの親クローンに対するさらなる改変物を作製した。興味があるさらなる領域に注目するＲｂ６９のコーディング／一次アミノ酸配列の全体的レイアウトを図２１の頂部に示す。コーディング配列における変化を、具体的には、ＤＮＡ−結合ループ２中およびその周りに生じさせた。完全なＤＮＡ−結合ループ２配列を、ファージ１３３、ファージＡｅｈ１、ファージＫＶＰ４０、代表的な（ハイブリッド）シアノファージ配列からの同等な配列、またはＥ．ｃｏｌｉ  ＲｅｃＡからのループで置換えた。Ａｃｈ１部分およびＲｂ１６部分であるループもテストした。正確なアミノ酸置換を図２１に示す。ＲＰＡにおける発現／精製の間にこれらのクローンから生じた蛋白質の挙動／活性に関するまとめ注釈を図２０および２１の左側に掲げる。
【０１３１】
Ｒｂ６９  ＵｖｓＸ配列は以下の通りである：
【０１３２】
【化１５】
2014233293.tif 000055
Ｒｂ６９  ループ１３３  ＵｖｓＸ配列は以下の通りである：
【０１３３】
【化１６】
2014233293.tif 000056
Ｒｂ６９  ループＫＶＰ４０  ＵｖｓＸ配列は以下の通りである：
【０１３４】
【化１７】
2014233293.tif 000057
Ｒｂ６９  Ｈ６４Ｓの活性
野生型Ｒｂ６９、またはＴ４  ＵｖｓＸと比較した突然変異体Ｒｂ６９  Ｈ６４Ｓ蛋白質の活性のキネティック実験を行った。蛍光プローブベースのモニタリングアプローチを採用した。一般的な条件は、組換え成分のタイプおよび濃度、およびＰＥＧ化合物を７％ｗ／ｖで使用した以外は図１３に示した実験に関するのと同じであった。他の変更は以下の通りである：１２０ｎｇ／μｌ  Ｔ４  ＵｖｓＸ、９００ｎｇ／μｌ  Ｔ４  ｇｐ３２、５０ｎｇ／μｌ  Ｔ４  ＵｖｓＹ、あるいは１００ｎｇ／μｌ  Ｒｂ６９またはＲｂ６９  Ｈ６４Ｓ  ＵｖｓＸ、４００ｎｇ／μｌ  Ｒｂ６９  ｇｂ３２、８０ｎｇ／μｌ  Ｒｂ６９  ＵｖｓＹ。標的ＤＮＡは合計１００コピーで存在させる。図２２に示したように、Ｒｂ６９  Ｈ６４Ｓ蛋白質は（この実験は増幅の間に生じたＤＮＡの性質に取り込むものではないが）このアッセイによるとよく作動し、野生型蛋白質のキネティックスよりも性能が優れているようである。行った次の実験において、見掛け上同一の条件（４００ｎｇ／μｌ  Ｒｂ６９  ｇｐ３２）下での速度、結果はわずかに異なるものであった。これは、最もありそうには、後者の実験におけるわずかなピペッティング誤差によるものであろう。
Ｒｂ６９  Ｈ６４Ｓ−ｇｐ３２アップ−滴定に対する相対的抵抗性
野生型Ｒｂ６９と比較した突然変異体Ｒｂ６９  Ｈ６４Ｓ蛋白質の活性のキネティック実験を行い、そこでは、Ｒｂ６９  ｇｐ３２の量を幾分変化させた。蛍光プローブベースのモニタリングアプローチを採用した。一般的な条件は、ｐｇ３２蛋白質の可変濃度を除いて図２２で示した実験に関するものであり、そのＰＥＧ化合物は６％ｗ／ｖで使用した。条件は：示された１００ｎｇ／μｌ  Ｒｂ６９あるいはＲｂ６９  Ｈ６４Ｓ  ＵｖｓＸ、Ｒｂ６９  ｇｐ３２濃度、８０ｎｇ／μｌ  Ｒｂ６９  ＵｖｓＹであった。標的ＤＮＡは合計１００コピーで存在させた。図２３に示すように、ｇｐ３２のアップ滴定はＲｂ６９蛋白質と比較してＲｂ６９  Ｈ６４Ｓのキネティックスに対してより低いインパクトを有した。ＲｂＨ６４Ｓはｇｐ３２による競合に対して幾分より抵抗性であると結論された。
野生型Ｒｂ６９と比較したＲｂ６９  Ｈ６４Ｓの活性
野生型Ｒｂ６９と比較した突然変異体Ｒｂ６９  Ｈ６４Ｓ蛋白質の活性のキネティック実験を行った。蛍光プローブベースのモニタリングアプローチを採用した。一般的な条件は、組換え成分のタイプおよび濃度およびＰＥＧ化合物を６％ｗ／ｖで用いた以外は図２２に示した実験についてのものであった。他の条件は以下の通りである：１００ｎｇ／μｌ  Ｒｂ６９またはＲｂ６９  Ｈ６４Ｓ  ＵｖｓＸ、４００ｎｇ／μｌ  Ｒｂ６９  ｇｐ３２、８０ｎｇ／μｌ  Ｒｂ６９  ＵｖｓＹ。標的ＤＮＡは示された合計０コピー、１００コピー、または１０００コピーで存在させた。図２４に示すように、Ｒｂ６９  Ｈ６４Ｓ蛋白質はこのアッセイに従ってよく作動し、野生型蛋白質の挙動よりも性能がよい。
３００ないし５００ｎｇ／μｌ  ｇｐ３２におけるＲｂ６９  ＵｖｓＸ  Ｈ６４Ｓの活性
突然変異体Ｒｂ６９  Ｈ６４Ｓ蛋白質の活性のキネティック実験は、３００、４００、または５００ｎｇ／μｌのＲｂ６９  ｇｐ３２蛋白質の条件下で行った。蛍光プローブベースのモニタリングアプローチを採用した。一般的な条件は図２２に示した実験に関する通りであったが、ｇｐ３２濃度を変化させ、ＰＥＧ化合物は６％ｗ／ｖで用いた。かくして、蛋白質濃度は以下の通りであった：１００ｎｇ／μｌ  Ｒｂ６９  Ｈ６４Ｓ  ＵｖｓＸ、３００ないし５００ｎｇ／μｌ  Ｒｂ６９  ｇｐ３２、８０ｎｇ／μｌ  Ｒｂ６９  ＵｖｓＹ。標的ＤＮＡは、示されたように、０（水対照）または合計１００コピーで存在させた。図２５に示すように、Ｒｂ６９  Ｈ６４Ｓは、Ｒｂ６９  ｇｐ３２蛋白質のテストされた範囲に渡って、Ｒｂ６９  Ｈ６４Ｓ蛋白質はキネティック挙動においてほとんど差なしにこのアッセイに従ってよく作動した。
Ｒｂ６９  Ｈ６４Ｓ  ＵｖｓＸの滴定
突然変異体Ｒｂ６９  Ｈ６４Ｓ  ＵｖｓＸ蛋白質の活性のキネティック実験は、変化させる濃度のＵｖｓＸ蛋白質下で行った。蛍光プローブベースのモニタリングアプローチを採用した。一般的条件は図２２に示された実験についての通りであったが、Ｒｂ６９  Ｈ６４Ｓ  ＵｖｓＸの濃度を変化させ、ＰＥＧ化合物は６％  ｗ／ｖで用いた。かくして、蛋白質濃度は以下の通りであった：１００、１５０または２００ｎｇ／μｌ  Ｒｂ６９  Ｈ６４Ｓ  ＵｖｓＸ、５００ｎｇ／μｌ  Ｒｂ６９  ｇｐ３２、８０ｎｇ／μｌ  Ｒｂ６９  ＵｖｓＹ。標的ＤＮＡは示したように合計０（水対照）または１００コピーで存在させた。図２６に示すように、Ｒｂ６９  Ｈ６４Ｓ蛋白質はこのアッセイに従ってよく作動し、ＵｖｓＸ濃度は有意に１００ｎｇ／μｌを超えないことを供する。
【０１３５】
突然変異体Ｒｂ６９  Ｈ６４Ｓ蛋白質の活性のもう１つのキネティック実験は、蛍光プローブベースのモニタリングアプローチを用いて変化させる濃度のＵｖｓＸ蛋白質下で行った。一般的条件は図２２に示した実験に関する通りであったが、Ｒｂ６９  Ｈ６４Ｓ  ＵｖｓＸの濃度は変化させ、ＰＥＧ化合物は６％ｗ／ｖで使用した。かくして、蛋白質濃度は以下の通りであった：６０、８０または１００ｎｇ／μｌ  Ｒｂ６９  Ｈ６４Ｓ  ＵｖｓＸ、５００ｎｇ／μｌ  Ｒｂ６９  ｇｐ３２、８０ｎｇ／μｌ  Ｒｂ６９  ＵｖｓＹ。標的ＤＮＡは示された合計０（水対照）または１００コピーで存在させた。図２７に示すように、Ｒｂ６９  Ｈ６４Ｓ蛋白質は、蛋白質が６０ないし１００ｎｇ／μｌの範囲内にあるか否かに拘わらず、このアッセイに従ってよく作動する。
Ｔ４  ＵｖｓＸおよびＵｖｓＹとの反応におけるＲｂ６９  ｇｐ３２の有効性
Ｔ４  ＵｖｓＸおよびＵｖｓＹと組合せた場合のＲｂ６９  ｇｐ３２の利用性を調べるキネティック実験を行った。ＲＰＡ反応はＪ１（１２０ｎｇ／μｌ）およびＫ２（４８０ｎｇ／μｌ）を用い、以下の条件下で確立した：５０ｍＭトリスアセテートｐＨ７．９、１００ｍＭ酢酸カリウム、１４ｍＭ酢酸マグネシウム、５０ｍＭリン酸クレアチン、（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、３ｍＭ  ＡＴＰ（Ｒｏｃｈｅ）、２００マクロモラーｄＮＴＰ、５０ｎｇ／μｌクレアチニンキナーゼ（Ｒｏｃｈｅ）、１２０ｎｇ／μｌ  Ｔ４  ＵｖｓＸ、３０ｎｇ／μｌ  Ｔ４  ＵｖｓＹ、９００ｎｇ／μｌ  Ｔ４  ｇ３２あるいは５００ｎｇ／μｌ  Ｒｂ６９  ｇｐ３２あるいは１０００ｎｇ／μｌ、３０ｎｇ／μｌ  Ｂｓｕポリメラーゼ、６％  ＰＥＧ  ３５，０００、１２０ｎＭ蛍光プローブＢｓＦｌｃ。エキソヌクレアーゼＩＩＩは６５ｎｇ／μｌで含めた。反応は３８４−ウェルプレート中で氷上で確立し、次いで、３８℃に設定したステージを備えたＢＩＯＴＥＫ  Ｆｌｘ−８００蛍光マイクロプレートリーダーに移し、その時点で、底−読み取りプローブから実験を周期的に行った。試料は、水、または脚注に示したように標的配列を含有するＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓゲノムＤＮＡの１００コピーを含有した。図２８に示したように、全ての鋳型陽性試料は効果的に働き、Ｔ４およびＲｂ６９  ｇｐ３２蛋白質の使用の間でほとんど差はないように見えた。
Ｒｂ６９  ｇｐ３２を双方の場合で用いる場合、Ｔ４はＲｂ６９  ＵｖｓＸ／ＵｖｓＹよりも性能がよい。
【０１３６】
Ｔ４  ＵｖｓＸおよびＵｖｓＹと組み合わせた場合、あるいはＲｂ６９  ＵｖｓＸおよびＵｖｓＹと組み合わせた場合、Ｒｂ６９  ｇｐ３２の利用性を調べるキネティック実験。ＲＰＡ反応はプライマーＪ１（１２０ｎＭ）およびＫ２（４８０ｎＭ）を用い、以下の条件下で確立した：５０ｍＭトリスアセテートｐＨ７．９、１００ｍＭ酢酸カリウム、１４ｍＭ酢酸マグネシウム、５０ｍＭリン酸クレアチン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、３ｍＭ  ＡＴＰ（Ｒｏｃｈｅ）、２００マイクロモラーｄＮＴＰ、５０ｎｇ／μｌクレアチンキナーゼ（Ｒｏｃｈｅ）、１２０ｎｇ／μｌ  Ｔ４  ＵｖｓＸ、３０ｎｇ／μｌ  Ｔ４  ＵｖｓＹ、１０００ｎｇ／μｌ  Ｒｂ６９  ｇｐ３２、３０ｎｇ／μｌ  Ｂｓｕポリメラーゼ、６％  ＰＥＧ  ３５，０００、３００ｎＭ増幅プライマー、１２０ｎＭ蛍光プローブＢｓＦｌｃ。エキソヌクレアーゼＩＩＩは、６５ｎｇ／μｌで含めた。別法として、同様の条件を使用したが、レコンビナーゼは１００ｎｇ／μｌ  Ｒｂ６９  ＵｖｓＸであって、負荷蛋白質は８０ｎｇ／μｌ  Ｒｂ６９  ＵｖｓＹ蛋白質であった。反応は３８４−ウェルプレート中で氷上で確立され、次いで、３８℃に設定されたステージを備えたＢＩＯＴＥＫ  Ｆｌｘ−８００蛍光マイクロプレートリーダーに移し、その時点で、底−読み取りプローブから周期的に測定を行った。試料は水、あるいは脚注に示したように標的配列を含有するＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓゲノムＤＮＡの１００コピーを含有した。図２９に示すように、全ての鋳型陽性試料は陽性シグナルを発生したが、Ｔ４  ＵｖｓＸおよびＵｖｓＹで確立された系はかなり初期および強いシグナルを発生した。Ｒｂ６９  ｇｐ３２濃度が１０００ｎｇ／μｌ  Ｒｂ６９まで上昇させた場合に、Ｔ４成分を用いる場合に増幅の阻害はほとんど起こらないが、Ｒｂ６９  ＵｖｓＸおよびＵｖｓＹを用いる場合、有意な阻害がある（図２３におけるＲｂ６９  ＵｖｓＸおよびＵｖｓＹでのＲｂ６９  ｇｐ３２過剰滴定の効果参照）。
Ｒｂ６９  ＵｖｓＸ  Ｈ６４Ｔ蛋白質の貧弱な活性
Ｒｂ６９  ＵｖｓＸ−コーディングクローンを作製し、そこでは、ヒスチジン６４をスレオニンに改変した。この突然変異は先に評価したＲｂ６９  ＵｖｓＸ  Ｈ６４Ｓ蛋白質と類似しており、スレオニン残基がＲＰＡ挙動を改良するにおいてセリン残基と同程度に効果的であるか否かをテストするために設計した。一般的な反応条件は以下の例外を除いては図２９中の実験について記載したのと同一であった。：ＵｖｓＸは１００ｎｇ／μｌのＲｂ６９野生型ＵｖｓＸ、または１００ｎｇ／μｌのＲｂ６９  ＵｖｓＸ  Ｈ６４Ｔ、８０ｎｇ／μｌのＲｂ６９  ＵｖｘＹ、および５００ｎｇ／μｌ  Ｒｂ６９  ｇｐ３２いずれかであった。ＤＮＡ標的は０または１００コピーいずれかで存在させた。図３０に示すように、Ｒｂ６９  ＵｖｓＸ  Ｈ６４Ｔを用いて行った反応はほとんどシグナルを発生せず、このアミノ酸置換はセリンをこの位置において置換した場合とは対照的に効果的でないと推定された。
Ｒｂ６９  ＵｖｓＸを用いるＡＴＰ滴定
Ｒｂ６９  ＵｖｓＸを用いる場合の増幅キネティクスに対する異なるＡＴＰ濃度の効果を調べた。反応条件は、図３０における通りであるが、野生型Ｒｂ６９  ｇｐ３２、ＵｖｓＸ、およびＵｖｓＹのみを用いた。ＡＴＰの最終濃度は１ｍＭ、２ｍＭ、または３ｍＭいずれかに調整した。標的は示したように０または１００コピーでいずれかで存在させた。図３１に示したように、増幅は、標的ＤＮＡを存在させたすべての場合に起こったが、最強のシグナルは３ｍＭ  ＡＴＰを用いた場合に発生する。
Ｒｂ６９  ＵｖｓＸおよびＵｖｓＹに対するＴ４  ｇｐ３２の抑制効果
Ｒｂ６９  ＵｖｓＸおよびＵｖｓＹ蛋白質と共にＴ４  ｇｐ３２蛋白質を用いる効果を調べた。条件は、以下の修飾を施して図２９に記載されたものと同一であった。Ｒｂ６９
ＵｖｓＸは１００ｎｇ／μｌで用いた。Ｒｂ６９  ＵｖｓＹは８０ｎｇ／μｌで用い、ｇｐ３２は５００ｎｇ／μｌのＲｂ６９  ｇｐ３２、あるいは５００ｎｇ  μｌのＴ４  ｇｐ３２、あるいは１０００ｎｇ／μｌのＴ４  ｇｐ３２いずれかであった。図３２に示したように、Ｒｂ６９  ｇｐ３２を用いた場合にシグナルが発生したに過ぎず、Ｔ４  ｇｐ３２を使用した場合には発生せず、Ｔ４異種成分を用いた場合のＲｂ６９  ｇｐ３２の十分な適合性とは対照的である。
Ｒｂ６９  ＵｖｓＸのＣ末端に対する修飾の結果
Ｒｂ６９  ＵｖｓＸ  Ｈ６４Ｓで、Ｒｂ６９  ＵｖｓＸ  Ｈ６４Ｓ  ＬＳＤで、およびＲｂ６９  ＵｖｓＸ  Ｈ６４Ｓ  ２×ＬＤＥで構成された増幅反応のキネティック実験を行った。一般的な反応条件は、異なるＵｖｓＸ蛋白質を１００ｎｇ／μｌにて全ての場合に用いたのを除いて図２９に記載した通りであった。Ｒｂ６９  ＵｖｓＹは８０ｎｇ／μｌで用いた。Ｒｂ６９  ｇｐ３２は５００ｎｇ／μｌで用いた。ＤＮＡ標的は０または１０００コピーいずれかで存在させた。図３３に示したように、強いシグナルが全ての標的含有試料において発生し、同様なキネティックスを示す。シグナルを非常にわずかに遅く開始し、合計してわずかにより強いシグナルを生じさせるより酸性のＣ−末端を持つ蛋白質（ＬＳＤおよび２×ＬＤＥクローン）についての非常にわずかな傾向が見られる。
【０１３７】
図３３に記載されたのと同様な実験を行った。しかしながら、この場合には、ＤＮＡ標的を０または１００コピーいずれかで存在させた。図３４に示すように、強いシグナルはすべての標的−含有試料で発生し、再度、かなり同様なキネティックスを示す。この場合において、わずかに遅くシグナルを開始させ、より強いシグナルを生じさせるより酸性のＣ−末端を持つ蛋白質（ＬＳＤおよび２×ＬＤＥクローン）についてのわずかにより強い傾向が観察された。
Ｒｂ６９  ＵｖｓＸ  Ｈ６４Ｓ／２×ＬＤＥを用いる場合のＰＥＧの滴定
同様な条件を図３３に記載された実験におけるように使用した。しかしながら、この場合、Ｒｂ６９  ＵｖｓＸ  Ｈ６４Ｓ  ２×ＬＤＥのみを用い、１００ｎｇ／μｌの濃度において、Ｒｂ６９  ＵｖｓＹは８０ｎｇ／μｌで用い、およびＲｂ６９  ｇｐ３２は５００ｎｇ／μｌで用いた。ＤＮＡ標的は示された反応当たり０または２００コピーいずれかで存在させた。ポリエチレングリコール（Ｍ．Ｗ．３５，０００  Ｆｌｕｋａ）の濃度は５％、６％、および７％でテストした。図３５に示すように、裁量のシグナルは、ポリエチレングリコールＮ．Ｗ．３５，０００を５％ｗ／ｖで用いた場合に得られた。
【０１３８】
（実施例９）作製されたＵｖｓＹ構築体
Ｔ４  ＵｖｓＹによってコードされると予測されるペプチドは配列の模式図が示され、Ｒｂ６９  ＵｖｓＹ遺伝子は図３６示される。これらの２つの蛋白質の間で置換される反応が示され、全ての他の残基は同一である。キメラ蛋白質を発現するのに用いた２つのキメラクローンを作り出した。各キメラは他方のＣ−末端半分に融合した１つのＵｖｓＹ分子のＮ−末端半分よりなるものであった。これらをＵｖｓＹハイブリッド１およびＵｖｓＹハイブリッド２という。
Ｔ４  ＵｖｓＹおよびＴ４  ｇｐ３２とのＵｖｓＹハイブリッドの活性
実験は、図３６に記載されたＴ４、Ｒｂ６９、およびハイブリッドＵｖｓＹ蛋白質はどれほどよく、Ｔ４  ＵｖｓＸおよびＴ４  ｇｐ３２と組み合わせた場合に機能するかに取組むために行った。図２９中の実験について記載された標準条件を用いたが、以下の修飾を行った。Ｔ４  ＵｖｓＸは１２０ｎｇ／μｌの濃度で使用し、Ｔ４  ｇｐ３２は９００ｎｇ／μｌで使用し、およびテストしたＵｖｓＹ蛋白質は８０ｎｇ／μｌで用いた。ＤＮＡ標的は各反応において０または１０００コピーいずれかで存在させた。ＰＥＧ  ３５，０００（Ｆｌｕｋａ）は５％ｗ／ｖで使用した。図３７に示すように、ＵｖｓＹの異なる形態のすべてはこのアッセイにおいて優れて挙動し、これは、Ｔ４  ＵｖｓＸおよびＴ４  ｇｐ３２を使用した場合に、Ｔ４  ｖｓ  Ｒｂ６９  ＵｖｓＹについて目に見える優先性はほとんどまたは全くなく、またはハイブリッド分子からのいずれの有意な区別にもなかったことを示す。
Ｒｂ６９  ＵｖｓＸおよびＲ６９  ｇｐ３２とのＵｖｓＹハイブリッドの活性
実験は、図３６に記載されたＴ４、Ｒｂ６９、およびハイブリッドＵｖｓＹ蛋白質が、Ｒｂ６９  ＵｖｓＸおよびＲｂ６９  ｇｐ３２と組み合わせた場合にどれほどよく機能するかに取組むために行った。図３７中の実験について記載された標準条件を用いたが、以下の修飾を行った。Ｒｂ６９  ＵｖｓＸ  Ｈ６４Ｓ  ２×ＬＤＥは１００ｎｇ／μｌの濃度で使用し、Ｒｂ６９  ｇｐ３２は５００ｎｇ／μｌで使用し、およびテストしたＵｖｓＹ蛋白質は８０ｎｇ／μｌで用いた。ＤＮＡ標的は各反応において０または１０００コピーいずれかで存在した。図３８に示すように、ＵｖｓＹのすべての形態はこのアッセイで機能したが、応答時間およびシグナル強度において強い差があった。これは、Ｒｂ６９  ＵｖｓＸおよびＲＢ６９  ｇｐ３２を使用した場合に、Ｒｂ６９  ＵｖｓＹについて明瞭な優先性があることを示す。
【０１３９】
ＵｖｓＹハイブリッド１の配列は以下の通りである：
【０１４０】
【化１８】
2014233293.tif 000058
【０１４１】
【化１９】
2014233293.tif 000059
Ｎ末端の６つのヒスチジンは任意である。
【０１４２】
ＵｖｓＹハイブリッド２の配列は以下の通りである：
【０１４３】
【化２０】
2014233293.tif 000060
Ｎ末端の６つのヒスチジンは任意である。
【０１４４】
（実施例１０）Ｒｂ６９作成構築体およびキメラのさらなる分析
Ｒｂ６９  ＵｖｓＸ  Ｈ６４Ｓ／Ｔ６−１／２×ＬＤＥについての活性無し
Ｒｂ６９  ＵｖｓＸ  Ｈ６４Ｓ／２×ＬＤＥの頑強な活性と比較したＲｂ６９  ＵｖｓＸ  Ｈ６４Ｓ／Ｔ６−１  ２×ＬＤＥの活性を調べた。反応は、以下の修飾を施して図２９に記載した標準条件に従って確立した。Ｒｂ６９  ＵｖｓＸ  Ｈ６４Ｓ／２×ＬＤＥ蛋白質およびＲｂ６９  ＵｖｓＸ  Ｈ６４Ｓ／Ｔ６−１／２×ＬＤＥ蛋白質は１００ｎｇ／μｌで用い、Ｒｂ６９  ｇｐ３２は６００ｎｇ／μｌで用い、およびＲｂ６９  ＵｖｓＹは８０ｎｇ／μｌで使用した。ＤＮＡ標的は反応あたり０または１０００コピーいずれかで存在させた。図３９に示したように、頑強な活性がＲｂ６９  ＵｖｓＸ  Ｈ６４Ｓ／２×ＬＤＥ蛋白質によって呈されたが、Ｒｂ６９  ＵｖｓＸ  Ｈ６４Ｓ／Ｔ６−１／２×ＬＤＥ蛋白質で活性が検出されなかった。明らかに、この場合におけるＤＮＡ−結合ループ２配列の再コーディングの結果、非−機能的蛋白質がもたらされた。
Ｒｂ６９  ＵｖｓＸ  Ｈ６４Ｓ／２×ＬＤＥの存在下におけるＲｂ６９  ｇｐ３２の滴定
Ｒｂ６９  ＵｖｓＸ  Ｈ６４Ｓ／２×ＬＤＥ蛋白質を使用する場合の増幅キネティックスに対する滴定Ｒｂ６９  ｇｐ３２蛋白質の効果を調べた。反応は、以下の修飾を施して、図２９に記載された標準条件に従って確立した。ＰＥＧ  ３５，０００（Ｆｌｕｋａ）は５％ｗ／ｖで用いた。Ｒｂ６９  ＵｖｓＸ  Ｈ６４Ｓ／２ｘＬＤＥ蛋白質は１００ｎｇ／μｌで用い、Ｒｂ６９  ｇｐ３２は４００、７００、または１０００ｎｇ／μｌで用い、およびＲｂ６９  ＵｖｓＹは８０ｎｇ／μｌで使用した。ＤＮＡ標的は反応当たり０または１００コピーいずれかで存在させた。図４０に示したように、増大させる量のＲｂ６９  ｇｐ３２はシグナル検出の開始の遅延を導く。
Ｒｂ６９  ＵｖｓＸ  Ｈ６４Ｓ／Ｆ６９Ｍ／Ｇ７０Ｓ／Ｔ６−１／２×ＬＤＥについての活性なし
増幅反応におけるＲｂ６９  ＵｖｓＸ  Ｈ６４Ｓ／Ｆ６９Ｍ／Ｇ７０Ｓ／Ｔ６−１／２×ＬＤＥ蛋白質を用いる効果を調べた。このクローンはＴ６  ＵｖｓＸ  ＤＮＡ−結合ループ２のほとんどを含有する先にテストしたものと同様であるが、Ｗａｌｋｅｒ  Ａモチーフ近くに２つのさらなるＴ６−様残基を含有した。反応は、以下の修飾を施して、図４０に記載された標準条件に従って確立した。Ｒｂ６９  ＵｖｓＸ  Ｈ６４Ｓ／２×ＬＤＥ蛋白質またはＲｂ６９  ＵｖｓＸ  Ｈ６４Ｓ  Ｆ６９Ｍ／Ｇ７０Ｓ／Ｔ６−１／２×ＬＤＥは１００ｎｇ／μｌで用い、Ｒｂ６９  ｐｇ３２は５００ｎｇ／μｌで用い、およびＲｂ６９  ＵｖｓＹは８０ｎｇ／μｌで使用した。ＤＮＡ標的は反応当たり０または１０００コピーいずれかで存在させた。図４１に示すように、Ｒｂ６９  ＵｖｓＸ  Ｈ６４Ｓ  Ｆ６９Ｍ／Ｇ７０Ｓ／Ｔ６−１／２×ＬＤＥ蛋白質について活性は検出されない。
Ｒｂ６９  Ｈ６４Ｓ  Ｔ６７Ｓ／Ｌ６８Ｎ／Ｔ４／２×ＬＤＥおよびＲｂ６９  Ｈ６４Ｓ／Ｔ４／２×ＬＤＥの強力な活性
Ｒｂ６９  Ｈ６４Ｓ  Ｔ６７Ｓ／Ｌ６８Ｎ／Ｔ４／２×ＬＤＥおよびＲｂ６９  Ｈ６４Ｓ／Ｔ４／２×ＬＤＥ蛋白質を増幅反応で用いる効果を調べた。これらの蛋白質は、この場合には、ＤＮＡ−結合ループ２配列およびＷａｌｋｅｒ  Ａ配列がＴ４  ＵｖｓＸに由来した以外は、Ｔ６  ＵｖｓＸ  ＤＮＡ−結合ループ２を含有し、および／またはＷａｌｋｅｒ  Ａモチーフ近くのＴ６−様残基をさらに含有する先にテストされたものと同様であった（クローンの模式的チャート参照）。反応は、以下の修飾を施して、図４０に記載された標準的な条件に従って確立した。Ｒｂ６９  ＵｖｓＸ蛋白質またはＲｂ６９  ＵｖｓＸ  Ｈ６４Ｓ／２ｘＬＤＥまたはＲｂ６９  ＵｖｓＸ  Ｈ６４Ｓ／Ｔ６７Ｓ／Ｌ６８Ｎ／Ｔ４／２ｘＬＤＥは１００ｎｇ／μｌで用い、Ｒｂ６９  ｇｐ３２は５００ｎｇ／μｌで用い、Ｒｂ６９  ＵｖｓＹは８０ｎｇ／μｌで使用した。ＤＮＡ標的は反応当たり０または１００コピーいずれかで存在させた。図４２に示すように、テストした全てのＵｖｓＸ蛋白質について優れた活性が検出され、これは、Ｔ４  ＤＮＡ−結合ループおよび関連Ｗａｌｋｅｒ  Ａ残基がＲｂ６９  ＵｖｓＸ蛋白質に成功して置換することができることを示す。
Ｒｂ６９  ＵｖｓＸ  Ｈ６４Ｓ／Ｔ６７Ｓ／Ｌ６８Ｎ／Ｔ４／２ｘＬＤＥ蛋白質はＲｂ６９  ｇｐ３２のアップ−滴定に対して比較的抵抗性である。
【０１４５】
野生型Ｒｂ６９  ＵｖｓＸおよびＲｂ６９  ＵｖｓＸ  Ｈ６４Ｓ／Ｔ６７Ｓ／Ｌ６８／Ｔ４／２ｘＬＤＥを比較する反応キネティクスに対するＲｂ６９  ｇｐ３２の濃度の阻害効果を調べた。反応は、以下の修飾を施して、図４０に記載された標準条件に従って確立した。Ｒｂ６９  ＵｖｓＸ蛋白質またはＲｂ６９  ＵｖｓＸ  Ｈ６４Ｓ／Ｔ６７Ｓ／Ｌ６８／Ｔ４／２ｘＬＤＥは１００ｎｇ／μｌで用い、Ｒｂ６９  ｇｐ３２は４００または８００ｎｇ／μｌいずれかで用い、およびＲｂ６９  ＵｖｓＹは８０ｎｇ／μｌで使用した。ＤＮＡ標的は反応当たり０または１００コピーいずれかで存在させた。図４３に示すように、ｇｐ３２濃度を増大させる場合、野生型Ｒｂ６９  ＵｖｓＸと比較したＲｂ６９  ＵｖｓＸ  Ｈ６４Ｓ／Ｔ６７Ｓ／Ｌ６８／Ｔ４／２ｘＬＤＥについて経験した検出に対して適時に示すことはせいぜい約半分に過ぎなかった。置換された蛋白質はｇｐ３２濃度に対して感受性が低いと結論された。
Ｒｂ６９  ＵｖｓＸ  Ｈ６４Ｓ／Ｔ６７Ｓ／Ｌ６８／Ｔ４／２ｘＬＤＥ蛋白質はＴ４  ｇｐ３２とで機能できる。
【０１４６】
Ｒｂ６９  ＵｖｓＸおよびＵｖｓＹで構成された反応に対するＴ４  ｇｐ３２の阻害効果がＲｂ６９  ＵｖｓＸ  Ｈ６４Ｓ／Ｔ６７Ｓ／Ｌ６８／Ｔ４／２ｘＬＤＥの使用によって克服できるか否かを調べた。反応は、以下の修飾を施して、図４０に記載された標準条件に従って確立した。Ｔ４  ＵｖｓＸ蛋白質またはＲｂ６９  ＵｖｓＸまたはＲｂ６９  ＵｖｓＸ  Ｈ６４Ｓ／Ｔ６７Ｓ／Ｌ６８／Ｔ４／２ｘＬＤＥは、各々、１２０ｎｇ／μｌまたは１００ｎｇ／μｌまたは１００ｎｇ／μｌで用い、Ｔ４  ｇｐ３２は７００ｎｇ／μｌで用い、およびＴ４またはＲｂ６９  ＵｖｓＹは、各々、３０ｎｇ／μｌまたは８０ｎｇ／μｌで使用した。Ｔ４  ＵｖｓＸをＴ４  ＵｖｓＹと組み合せ、Ｒｂ６９  ＵｖｓＸ蛋白質をＲｂ６９  ＵｖｓＹと組み合わせた。ＤＮＡ標的は反応当たり０または１００コピーいずれかで存在させた。図４４に示すように、Ｒｓ６９  ＵｖｓＸ  Ｈ６４Ｓ／Ｔ６７Ｓ／Ｌ６８Ｎ／Ｔ４／２ｘＬＤＥはＴ４成分とほとんど同程度によく機能し、他方、Ｔ４  ｇｐ３２を用いた場合は野生型Ｒｂ６９  ＵｖｓＸは不活性であった。置換されたＲｂ６９蛋白質はＴ４  ｇｐ３２に対して非常に良好な許容性を発生した。
ファージ１３３からのＤＮＡ−結合ループを含有するＲｂ６９  ＵｖｓＸキメラは弱く作動し、他方、シアノファージおよびＡｅｈ１ループは非−機能的である。
【０１４７】
他の多様なＵｖｓＸ−様分子において見出された配列でＤＮＡ−結合ループ２が置換されているＲｂ６９  ＵｖｓＸ蛋白質の活性を調べた。反応は、以下の修飾を施し、図４０に記載した標準条件に従って確立した。Ｒｂ６９  ＵｖｓＸ蛋白質またはＲｂ６９  ＵｖｓＸ  ｌｏｏｐ  １３３またはＲｂ６９  ｌｏｏｐ  Ｃｙａｎｏ  またはＲｂ６９  ｌｏｏｐ  Ａｅｈｌは１００ｎｇ／μｌで用い、Ｒｂ６９  ｇｐ３２は５００ｎｇ／μｌで用い、およびＲｂ６９  ＵｖｓＹは８０ｎｇ／μｌで使用した。図４５に示すように、シアノファージまたはＡｅｈ１ループを含有する蛋白質で活性は検出されず、他方、ファージ１３３ループを含有する蛋白質は非常に弱い活性を示した。
Ｒｂ６９  ＵｖｓＸ  Ｈ６４Ｓ／Ｔ６／２ｘＬＤＥは、ＤＮＡ−結合ループ２の最終的なＧからＴへの置換を欠如する同等体とは異なって活性である。
【０１４８】
Ｔ４およびＴ６の間が異なる最終残基が、Ｒｂ６９  ＵｖｓＸ  Ｈ６４Ｓ  Ｔ６−１  ２ｘＬＤＥの場合とは異なってＴ６同等体に改変された蛋白質である、Ｒｂ６９  ＵｖｓＸ  Ｈ６４Ｓ／Ｔ６／２ｘＬＤＥの活性をテストした。また、ＤＮＡ−結合ループ２がＡｅｈ１ループおよびＲｂ１６ループのハイブリッドで置き換えられた蛋白質もテストした（Ｒｂ１６で見出されたシステインの代わりにＡｅｈ１ループの始まりにおいて異常なアラニンを補充）反応は、以下の修飾を施して、図４０に記載された標準条件に従って確立した。Ｒｂ６９  ＵｖｓＸ蛋白質またはＲｂ６９  ＵｖｓＸ  Ｈ６４Ｓ／Ｔ６／２ｘＬＤＥまたはＲｂ６９ループ（ハイブリッドＡｅｈｌ／Ｒｂ１６）は１００ｎｇ／μｌで用い、Ｒｂ６９  ｇｐ３２は５００ｎｇ／μｌで用い、およびＲｂ６９  ＵｖｓＹは８０ｎｇ／μｌで使用した。図４６に示すように、Ａｅｈｌ／Ｒｂ１６ハイブリッドループを含有する蛋白質では活性は検出されなかったが、修復されたＴ６ループを含有する蛋白質は優れた活性を示した。Ｔ６−様ＤＮＡ−結合ループ２の完全な置換えの結果活性がもたらされたが、同様なＴ４およびＴ６ループのハイブリッドは活性ではなく、これは、Ｔ４およびＴ６の間の置換がサイレントではなく、基が交換されていなければならないと結論されたことを示す。
【０１４９】
（実施例１１）マンガンイオンはＲＰＡ反応を支持することができる。
【０１５０】
ＲＰＡ反応は以下の条件下で確立された：５０ｍＭトリスアセテートｐＨ８．３、１００ｍＭ酢酸カリウム、２００μＭ  ｄＮＴＰ、３ｍＭ  ＡＴＰ、５０ｍＭホスホクレアチン、１２０ｎｇ／μｌ  Ｔ４  ＵｖｓＸ、３０ｎｇ／μｌ  Ｔ４  ＵｖｓＹ、９００ｎｇ／μｌ  Ｔ４  ｇｐ３２、５％  ＰＥＧ  ３５，０００、３０ｎｇ／μｌ  Ｂｓｕポリメラーゼ、１０００コピーのＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓゲノムＤＮＡ。二価マンガンカチオンを、個々に、０．１ｍＭ、０．５ｍＭ、１ｍＭ、２ｍＭ、３ｍＭの最終濃度を与えるまで各反応に供給した。別法として、対照として、１６ｍＭマグネシウムを使用した。反応を３７℃にて９０分間インキュベートし、ＰＣＲクリンアップカラム（ＳＩＧＭＡ）で精製し、次いで、臭化エチジウムでの可視化前に２％アガロースゲルで分離した。図４７に示すように、マンガンイオンは０．５ないし３ｍＭマンガンの濃度範囲においてＲＰＡを効果的に支持した。（約４ないし５ｍＭマンガンからの−ここでは示さず）有意により高い濃度は反応挙動を阻害することを開始し、それは、１０ｍＭマンガンにおいて、９０分後に産物がこれらのプライマーで検出されないようになるまで徐々により少ない産物に導く。緩衝液からのマンガンイオンのいくらかのキャリーオーバーが予測され、恐らくは、反応当たり合計して大まか０．５ｍＭマンガンイオンを占める。
【０１５１】
（実施例１２）Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｃｓポリメラーゼＩ大断片はＲＰＡ反応においてよく機能する。
【０１５２】
ＲＰＡ反応は、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓのＰｏｌ  Ｉクラスに対して相同性を担う細菌ポリメラーゼＩ修復酵素を含めた、ストランド変位合成が可能な代替ポリメラーゼを用いて構築した。この実験において、どこかおよび本明細書中に記載された、あるいはイン−ハウスで生じた、Ｓ．ａｕｒｅｕｓからの同等な大断片を持つＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＰｏｌＩ大断片いずれかをＲＰＡ反応で用いた。反応は標準条件下で構成された。すなわち：３００ｎＭプライマーＪ１、３００ｎＭプライマーＫ２、５０ｍＭトリスアセテートｐＨ７．９、１００ｍＭ酢酸カリウム、２００μＭ  ｄＮＴＰ、３ｍＭ  ＡＴＰ、５０ｍＭホスホクレアチン、１２０ｎｇ／μｌ  Ｔ４  ＵｖｓＸ、３０ｎｇ／μｌ  Ｔ４  ＵｖｓＹ、９００ｎｇ／μｌ  Ｔ４  ｇｐ３２、５％ＰＥＧ化合物（ＳＩＧＭＡ）、７０ｎｇ／μｌ  Ｂｓｕポリマー、あるいは７０ｎｇ／μｌ  Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（Ｓａｕ）ポリメラーゼ、および０、１００、１０００、または１０，０００コピーのＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓゲノムＤＮＡ。反応は、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の１：５０，０００希釈を含めることによってモニターした。図４８に示すように、双方の場合において、頑強な増幅が起こった。もし何かがあるとすれば、水および標的−含有試料の間の一時的な分離は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓポリメラーゼを使用した場合にはより高かった。これは、このポリメラーゼが感受性があるＲＰＡ反応についてのわずかに改良された特徴を呈することを示すことができよう。
【０１５３】
（実施例１３）ＲＰＡ反応におけるヘパリンの使用
ヘパリンは、０−標的対照におけるシグナルの発生を遅延させる。
【０１５４】
ＲＰＡ反応は、慎重に標的ＤＮＡを省いた以外は、本開示において他の箇所で用いたＪ１およびＫ２プライマーを用いて構成した。反応は、標準条件下で構成した。すなわち：３００ｎＭプライマーＪ１、３００ｎＭプライマーＫ２、５０ｍＭトリスアセテートｐＨ７．９、１００ｍＭ酢酸カリウム、２００μＭ  ｄＮＴＰ、３ｍＭ  ＡＴＰ、５０ｍＭホスホクレアチン、１２０ｎｇ／μｌ  Ｔ４  ＵｖｓＸ  ３０ｎｇ／μｌ  Ｔ４  ＵｖｓＹ、９００ｎｇ／μｌ  Ｔ４  ｇｐ３２、５％ＰＥＧ化合物（ＳＩＧＭＡ）、３０ｎｇ／μｌ  Ｂｓｕポリメラーゼ。反応は、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の１：５０，０００希釈を含めることによってモニターした。ヘパリンは反応に含めず、あるいは２０ｎｇ／μｌで存在させた。図４９に示すように、しばらく後、バックグラウンドシグナルが全ての反応で発生し、しかしながら、これはヘパリンを含有する試料で後に起こり、それがノイズ発生を遅らせることを示唆する。
ＲＰＡ反応におけるシグナル：ノイズ比率をヘパリンは改良する。
【０１５５】
キネティック実験を行って、プローブ−ベースのアプローチを介してモニターされた増幅反応の感度およびキネティクスに対するヘパリンの効果を示した。ＲＰＡ反応はプライマーＪ１（１２０ｎｇ／μｌ）およびＫ２（４８０ｎｇ／μｌ）を用い、以下の条件下で確立した：５０ｍＭトリスアセテートｐＨ７．９、１００ｍＭ酢酸カリウム、１４ｍＭ酢酸マグネシウム、５０ｍＭクレアチンホスフェート（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、３ｍＭ  ＡＴＰ（Ｒｏｃｈｅ）、２００マイクロモラーｄＮＴＰ、５０ｎｇ／μｌクレアチンキナーゼ（Ｒｏｃｈｅ）、１２０ｎｇ／μｌ  Ｔ４  ＵｖｓＸ、３０ｎｇ／μｌ  Ｔ４  ＵｖｓＹ、１０００ｎｇ／μｌ  Ｒｂ６９  ｇｐ３２、３０ｎｇ／μｌ  Ｂｓｕポリメラーゼ、５％ＰＥＧ化合物、１２０ｎＭ蛍光プローブＢｓＦｌｃ。エキソヌクレアーゼＩＩＩは６５ｎｇ／μｌで含めた。ヘパリンは存在させないか、または示したように２０ｎｇ／μｌで存在させた。反応は３８４−ウェルプレート中で氷上で確立され、次いで、３８℃に設定されたステージを備えたＢＩＯＴＥＫ  Ｆｌｘ−８００蛍光マイクロプレートリーダーに移し、その時点に、底−読み取りプローブから周期的に測定を行った。試料は水、脚注に示したように標的配列を含有するＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓゲノムＤＮＡの１０、１００、１０００または１０，０００コピーいずれかを含有した。図５０に示すように、全ての鋳型陽性試料は陰性シグナルを発生し、しかしながら、ヘパリンで確立された系は、１０コピーにおいてシグナル発生の合致性の改良を示した。ヘパリンを含めると、ノイズの発生を遅らせ、これは、低コピー数におけるシグナル検出の同時性のより少ない破壊に導く。
【０１５６】
（実施例１４）ＲＰＡ反応における３’−ブロックプライマーおよびＥ．ｃｏｌｉエキソヌクレアーゼＩＩＩ
少なくとも炭素−酸素−炭素結合を介してビオチンのような基で３’−ブロックされたプライマーが、もしＥ．ｃｏｌｉエキソヌクレアーゼＩＩＩが反応に含まれれば、増幅プライマーとして成功して使用することができることを示唆する強力な証拠が発見された。本実験はこの現象の例を提供する。本実験において、ＲＰＡ反応は、本明細書中で広く用いられるプライマーＪ１およびＫ２を用いてＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓゲノムからの断片を増幅することによって行った。他の目的で設計されてきたＫ２−イプシロンと命名されたプライマーの使用。このプライマーはＫ２プライマーと同一の配列を有するが、リンカーを介して攻撃され、かつビオチン−ＴＥＧと記載される３’−ブロッキングビオチン基のその保有が異なる（供給者のウェブサイトｈｔｔｐ：／／ｕｋ．ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ．ｃｏｍ参照）。これは、酸素原子を介して３’糖に連結されたリンカーを介して結合されたビオチンを構成する。Ｋ２−イプシロンプライマーは、配列の本体内のデオキシチミジン残基を置き換えるデオキシウラシル残基も含有するが、これはこの実験には関係がないと考えられる。反応は、Ｋ２プライマーと追号したＪ１プライマー、あるいはＫ２−イプシロン「ブロック」プライマー、およびエキソヌクレアーゼＩＩＩまたはＥ．ｃｏｌｉ  Ｎｆｏ蛋白質を含有した。ＲＰＡ反応はプライマーＪ１（１２０ｎｇ／μｌ）およびＫ２またはＫ２イプシロン（４８０ｎｇ／μｌ）を用い、以下の条件下で確立された：５０ｍＭトリスアセテートｐＨ７．９、１００ｍＭ酢酸カリウム、１４ｍＭ酢酸マグネシウム、５０ｍＭリン酸クレアチン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、３ｍＭ  ＡＴＰ（Ｒｏｃｈｅ）、２００マイクロモラーｄＮＴＰ、５０ｍｇ／μｌクレアチンキナーゼ（Ｒｏｃｈｅ）、１２０ｎｇ／μｌ  Ｔ４  ＵｖｓＸ、３０ｎｇ／μｌ  Ｔ４  ＵｖｓＹ、１０００ｎｇ／μｌ  Ｔ４  ｇｐ３２、３０ｎｇ／μｌ  Ｂｓｕポリメラーゼ、５％ＰＥＧ化合物、１２０ｎＭ蛍光プローブＢｓＦｌｃ。エキソヌクレアーゼＩＩＩは６５ｎｇ／μｌで含め、あるいはエンドヌクレアーゼＩＶ（Ｎｆｏ）は２００ｍｇ／μｌで含めた。Ｋ２イプシロンプライマーのブロックされた性質にかかわらず、エキソヌクレアーゼＩＩＩを蛍光を発するためのプローブを処理する剤として用いる場合、図５１に示すように、Ｋ２を使用する試料およびＫ２−イプシロンを使用するものの間に増幅キネティクスの差はない。これは、エキソヌクレアーゼＩＩＩが、恐らくは、エキソヌクレアーゼ活性によって、あるいはこの酵素および（エンドヌクレアーゼＩＶとしても知られた）Ｎｆｏに帰属されてきた活性の３’−ジエステラーゼまたはホスファターゼタイプを介して、Ｋ２−イプシロンに結合した鋳型の延長できないハイブリッドを延長可能な形態に迅速に処理することを示唆する。対照的に、ＮｆｏをＥｘｏ  ＩＩＩの代わりに使用した場合、増幅に一般的な遅延はないが、これはＫ２−イプシロン反応と対合したＪ１についてかなりより顕著であった「活性化」プロセスは、Ｎｆｏを使用する場合には貧弱にしか働かないが，ｅｘｏＩＩＩを使用した場合には非常に迅速に働くと結論された。
【０１５７】
（実施例１５）ＵｖｓＹ−フリーＤＮＡ増幅
一連の実験を行って、ＲＰＡ反応からＵｖｓＹを除去することによるＤＮＡ増幅に対する効果を調べた。
Ｔ６  Ｈ６６Ｓを用いるＵｖｓＹ−フリーＤＮＡ増幅
本実験においては、ＲＰＡは以下の条件下で行った：適切には、１００ｍＭ酢酸カリウム、５０ｍＭトリスアセテートｐＨ８．３、１４ｍＭ酢酸マグネシウム、５ｍＭ  ｄＴＴ、２００ｍＭ  ｄＮＴＰ、５０ｍＭリン酸クレアチン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、２．５ｍＭ  ＡＴＰ（Ｒｏｃｈｅ）、５０ｍｇ／μｌクレアチンキナーゼ（Ｒｏｃｈｅ）、３００ｎＭ増幅プライマー、５％ＰＥＧ  ３５，０００、４３ｎｇ／μｌ  Ｓ．ａｕポリメラーゼ、６００ｎｇ／μｌ  Ｒｂ６９  ｇｂ３２、１２０ｎｇ／μｌ  Ｔ６  Ｈ６６Ｓ  ＵｖｓＸ  および７９ｎｇ／μｌ  Ｒｂ６９  ＵｖｓＹ。反応は、プライマーＭＳ２  ｄｏｗｎＲｔ２およびプライマーＭＳ２  ｕｐ４、ｕｐ５、ｕｐ６、またはｕｐ７と共に１０００コピーのＭＳ２  ＤＮＡ鋳型を用い、かつＲｂ６９  ＵｖｓＹの存在下または非存在下で行った。反応を氷上で確立し、次いで、１時間で３７℃まで移した。増幅に続いて、ＧｅｎＥｌｕｔｅ  ＰＣＲクリーンアップキッド（Ｓｉｇｍａ）を用いて産物を精製し、ゲル電気泳動を用いて可視化した。Ｔ６  Ｈ６６Ｓレコンビナーゼは、ＵｖｓＹ非存在下において、ＲＰＡ反応でＤＮＡを効果的に増幅することができるのが予期せぬことに見出された。図５２に示すように、正しいサイズの産物はＵｖｓＹの存在下で増幅された。ＵｖｓＹの非存在下において、ＭＳ２  ｄｏｗｎＲＴ２＋ＭＳ２  ｕｐ５反応産物を例外として、ほとんどの豊富な産物は、ＵｖｓＹが存在した場合に合成されたのと同一のサイズのものであるように見えた。用いた鋳型およびプライマー対では、ＲＰＡ  ＤＮＡ増幅はＵｖｓＹの非存在下で可能であって、そのような反応は、しばしば、正しいサイズの産物を生じさせると結論された。
【０１５８】
さらなる実験を行って、従前に観察されたＵｖｓＹ−非依存性増幅が、異なるサイズの産物を合成する異なるプライマー対を用いて起こるか否かを調べた。このさらなる実験についての結果は、（キネティクスは知られていないが）ＵｖｓＹの非存在下においてＴ６
Ｈ６６Ｓレコンビナーゼを用いて丁度どれくらい効果的な増幅であり得るかを巧く示す。一般的な反応条件は以下の例外を除いて、図５２に示された実験について記載したのと同一であった：反応はプライマーＭＳ２  ｕｐ５、ｕｐ６、ｕｐ７、またはｕｐ２と共にプライマーＭＳ２  ｄｏｗｎ５を用いて行った。また、反応はプライマーＭＳ２  ｄｏｗｎ２およびＭＳ２  ｕｐ４を用いても行った。プライマー組合せのいずれかを用いた場合、かつＵｖｓＹの存在下および非存在下の双方において、増幅産物が作られた。図５３に示すように、全ての反応はＭＳ２  ｄｏｗｎ５／ｕｐ５プライマー対を例外としてよく作動したが、これは、依然として、少量の正しい産物を生じた。各反応からの主な産物は、ＵｖｓＹが反応に存在するか否かにかかわらず正しいサイズのものであった。ＵｖｓＹの非存在下においては、正しくない産物のより大きな豊富性があるように見えたが、これらは正しい産物よりも少量で存在した。種々のプライマー対を用いて異なるサイズのＲＰＡ産物を増幅することができ、かつＵｖｓＹの非存在下で進行する反応の能力は用いるプライマーまたは得られた産物のサイズに依存するようではないと結論された。
小さなゲノムＤＮＡ標的のＵｖｓＹ−フリー増幅
実験を行って、ＵｖｓＹの非存在下において、ＤＮＡ標的のサイズがＤＮＡを増幅するＲＰＡの能力において役割を演じるか否かを調べた。この目的で、ヒトゲノムＤＮＡから増幅された小さな３０５ｂｐ  ＲＰＡ産物をＲＰＡ反応においてＤＮＡ標的として用いた。反応条件が各々、３０５ｂｐ、２１０ｂｐ、１４３ｂｐおよび１４１ｂｐの産物を生じる、プライマーＡｐｏＢ４、およびＡｐｏＢ３００、ＡｐｏＢ３、ＡｐｏＢ７またはＡｐｏＢ１０いずれかと共にＤＮＡ標的の１０００コピーを用いて反応を行った以外は、図５２に示した実験について述べたのと同一であった。図５４に示したように、ＵｖｓＹの非存在下で、反応の全てはＤＮＡアンプリコンを生じたが、ＵｖｓＹの非存在下においてＤＮＡ産物を合成する見掛け上頑強な能力にかかわらず、ＵｖｓＹなくしてＴ６  Ｈ６６Ｓ
ＵｖｓＸを用いて生じた産物は、常には、予測されたサイズの、およびＵｖｓＹの存在下で生じたものと同一サイズのものではなかった。恐らくは、プライマー−関連人工物は、時々、理由は明瞭ではないが、真実の産物の形成が支配的である。ＵｖｓＹの非存在下において、ＤＮＡ増幅は、小さなＤＮＡ標的を用いて合理的に巧く起こるが、ＵｖｓＹが存在する場合とは異なり、産物は常に正しいサイズのものである。
完全なゲノム標的のＵｖｓＹ−フリー増幅
本実験は、低いコピー数の複雑なゲノム標的がＵｖｓＹの非存在下で増幅できるか否かに取組んだ。反応条件は、各々、３０５ｂｐ、２１０ｂｐ、１４３ｂｐおよび１４１ｂｐの産物を生じる、プライマーＡｐｏＢ４、およびプライマーＡｐｏＢ３００、ＡｐｏＢ３、ＡｐｏＢ７またはＡｐｏＢ１０いずれかと共にヒトゲノムＤＮＡの１０００コピーを用いて反応を行った以外は、図５２に示された実験について記載したのと同一であった。図５５に示すように、ＵｖｓＹの非存在下においては、ＤＮＡ増幅は全ての反応で起こったが、ＵｖｓＹなしでＴ６  Ｈ６６Ｓ  ＵｖｓＸを用いて生じた産物は、常には、予測されたサイズ、およびＵｖｓＹの存在下で生じたのと同一のサイズのものではなかった。ＵｖｓＹの非存在下においては、複雑なゲノムＤＮＡ標的を用いてＤＮＡ増幅は効果的に起きるか、ＵｖｓＹの存在下で行った反応とは異なり、正しい産物が通常合成される場合には、産物は常に正しいサイズのものであると結論された。
ＵｖｓＹフリーＤＮＡ増幅はＰＥＧを必要とする。
【０１５９】
実験を行って、Ｔ６  Ｈ６６Ｓレコンビナーゼによって呈されたＵｖｓＹ−非依存性挙動がＰＥＧについての要件の欠如までさらに拡大されたか否かに取組んだ。これらの反応は、以下の例外として、図５２に示された実験について記載されているように行った：反応は、ＰＥＧの存在の有りおよび無しの双方にて、プライマーＡｐｏＢ３００またはＡｐｏＢ３いずれかと共にヒトゲノムＤＮＡの１０００個ポーおよびプライマーＡｐｏＢ４を用いて行った。図５６に示すように、結果は、ＰＥＧが存在するまたは非存在の間で反応生産性の激しい差を示した。この実験は、効果的な増幅を行うためのＲＰＡ反応にポリエチレングリコールを含めての使用の臨界性を示した。ＰＥＧの非存在下においては、真実の産物の増幅は一般的には起こらないが、使用にわずかな人工物が１つのレーンに存在し、おそらくは、Ｔ６  Ｈ６６Ｓレコンビナーゼを用いた場合に低いレベルの負荷フィラメントを示すが（これはＵｖｓＹの存在下では起こらない）。標的ＤＮＡの正しいかつ効果的な増幅のためには、ＵｖｓＹの存在または非存在にかかわらず、ＰＥＧは反応において必要である。
Ｔ６  Ｈ６６Ｓレコンビナーゼと共にＴ４  ｇｐ３２を用いるＵｖｓＹ−フリーＤＮＡ増幅
本実験を行って、Ｔ４  ｇｐ３２をＴ６  Ｈ６６Ｓ  ＵｖｓＸと共に用いた場合に、ＵｖｓＹ−非依存性増幅が起こるか否かを調べた。一般的な反応条件は、ここでは、Ｒｂ６９  ｇｐ３２または３３７．５ｎｇ／μｌ  Ｔ４  ｇｐ３２いずれかを用いて反応を行った以外は、図５２に示された実験について記載された通りであった。Ｔ４  ｇｐ３２をＵｖｓＹの存在下で用いた場合、３０ｎｇ／μｌ  Ｔ４  ＵｖｓＹを用いた。ヒトゲノムＤＮＡの１０００コピーを、プライマーＡｐｏＢ４、およびプライマーＡｐｏＢ３００またはＡｐｏＢ３いずれかと組合せて反応当たりに用いた。図５７に示したように、この実験は、Ｔ６  Ｈ６６ＳレコンビナーゼのＵｖｓＹ−非依存性の活性が、Ｔ４  ｇｐ３２を、Ｒｂ６９  ｇｐ３２よりはむしろ利用した場合に依然として見出されることを示す。明瞭な予測された産物の生産はＲｂ６９  ｇｐ３２を用いた場合よりも効果的でなかったが、多数の組換えにより活性なフィラメントが存在することは疑いがない。反応でＴ４  ｇｐ３２を用いる場合に、ＤＮＡ増幅が完結に起こるが、正しい産物の点についてはＲｂ６９
ｇｐ３２を用いるよりもこのプロセスは効果的でないと結論された。
Ｔ６  Ｈ６６ＳおよびＡｅｈｌ  ｇｐ３２を用いるＵｖｓＹ−フリーＤＮＡ増幅
本実験を行って、Ａｅｈｌ  ｇｐ３２をＴ６  Ｈ６６Ｓ  ＵｖｓＸと共に用いた場合にＵｖｓＹ−非依存性増幅が起こるか否かを調べた。反応条件は、プライマーＡｐｏＢ４、およびプライマーＡｐｏＢ３００またはＡｐｏＢ３いずれかと共に、４００ｎｇ／μｌ  Ｒｂ６９  ｇｐ３２または３６０ｎｇ／μｌ  Ａｅｈｌ  ｇｐ３２、および１０００コピーのヒトゲノムＤＮＡを用いて反応を行った以外は、図５２に示された実験について記載したのと同一であった。図５８に示すように、結果は、ＵｖｓＹを省き、かつＴ６  Ｈ６６Ｓを用いた場合、Ａｅｈ１  ｇｐ３２は正しい産物を生産するに置いてＲＰＡを支持できないことを示す。しかしながら、ある程度少量の増幅が起こった。Ｔ６  Ｈ６６Ｓと組み合わせた場合、Ａｅｈ１は限定されたＤＮＡ増幅を促進したに過ぎない。このデータは、従前に記載されたデータと組み合わせた場合、Ｔ６  Ｈ６６Ｓ  ＲＰＡ反応のＵｖｓＹ−非依存性挙動の効率が、ある程度、ｇｐ３２タイプに依存することを示唆する。
Ｔ４  ＵｖｓＸを用いるＵｖｓＹ−フリーＤＮＡ増幅
実験を行って、Ｒｂ６９ｇｐ３２と共にＴ４  ＵｖｓＸを用いた場合に、ＵｖｓＹの存在はＤＮＡ増幅が起こるのに必要か否かを調べた。これらの反応は、以下の例外の下に、図５２に示された実験に記載した通りに行った：反応は、プライマーＡｐｏＢ４およびプライマーＡｐｏＢ３００またはＡｐｏＢ３いずれかと共に、Ｔ６  Ｈ６６Ｓ  ＵｖｓＸまたは１２３．５ｎｇ／μｌ  Ｔ４  ＵｖｓＸいずれか、およびヒトゲノムＤＮＡの１０００コピーを用いて行った。Ｔ４  ＵｖｓＸをＵｖｓＹと共に用いた場合、３０ｎｇ／μｌ
Ｔ４  ＵｖｓＹを利用した。図５９に示すように、結果は、ＵｖｓＹの存在下では、Ｔ６  Ｈ６６Ｓ  ＵｖｓＸを用いた場合のように、Ｔ４  ＵｖｓＸ反応は予測されたサイズの産物を生じることを示す。しかしながら、Ｔ６  Ｈ６６Ｓ反応とは異なり、ＵｖｓＹを省くと、増幅産物は決して生じない。この実験は、標準条件下では、使用したＴ４  ＵｖｓＸは、Ｔ６  Ｈ６６Ｓ  ＵｖｓＸとは異なり、ＵｖｓＹ蛋白質の存在に完全に依存することを示す。このデータは、ＵｖｓＹおよびＰＥＧは共にＴ４試薬で構成されたＲＰＡ系の必要な成分であることを示す多量の以前の証拠を確認する。
【０１６０】
さらなる実験を行って、Ｒｂ６９  ｇｐ３２の代わりにＴ４  ｇｐ３２を用いることによって、ＵｖｓＹ−欠乏Ｔ４  ＵｖｓＸ反応が継続的に増幅産物を生産しないか否かを調べた。一般的な反応条件は、Ｔ６  Ｈ６６Ｓ  ＵｖｓＸと共にＲｂ６９  ｇｐ３２あるいは１２３ｎｇ／μｌ  Ｔ４  ＵｖｓＸと共に３３７ｎｇ／μｌ  Ｔ４  ｇｐ３２のいずれかを用いて反応を行った以外は、図５２に示された実験について記載した通りであった。プライマーＡｐｏＢ４、およびプライマーＡｐｏＢ３００またはＡｐｏＢ３いずれかと組合せて、ヒトゲノムＤＮＡの１０００コピーを反応当たりに用いた。Ｔ４  ｇｐ３２および  ＵｖｓＸをＵｖｓＹと共に用いた場合、３０ｎｇ／μｌ  Ｔ４  ＵｖｓＹを利用した。図６０に示すように、結果は、従前に示したのと同様に、ＵｖｓＹの存在下においては、Ｔ４成分を利用する反応は正しいサイズの産物を生じ、およびＵｖｓＹの非存在はこれを否定することを示す。このデータは、標準条件下では、Ｔ４  ＵｖｓＸは、Ｔ６  Ｈ６６Ｓ  ＵｖｓＸとは異なり、ＵｖｓＹ蛋白質の存在に完全に依存することを確認する。この場合、Ｔ４  ｇｐ３２を一本鎖ＤＮＡ結合蛋白質として使用した。
【０１６１】
なおもう１つの実験を行って、蛍光プローブ系を利用するＲＰＡ増幅／検出反応においてＴ４  ＵｖｓＸを用いてＤＮＡ蓄積を検知する場合、ＵｖｓＹについての要件を調べた。本実験においては、ＲＰＡは以下の条件下で行った：適切には、１００ｍＭ酢酸カリウム、５０ｍＭトリスアセテートｐＨ８．３、１４ｍＭ酢酸マグネシウム、５ｍＭ  ｄＴＴ、２００ｍＭ  ｄＮＴｐ、５０ｍＭリン酸クレアチン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、２．５ｍＭ  ＡＴＰ（Ｒｏｃｈｅ）、５０ｎｇ／μｌクレアチンキナーゼ（Ｒｏｃｈｅ）、増幅プライマーＪ１（１２０ｎＭ）およびＫ２（４８０ｎＭ）、１２０ｎＭ蛍光プローブＢｓＦｌｃ、５％ＰＥＧ  ３５，０００、４３．３３ｎｇ／μｌ  Ｓａｕポリメラーゼ、６００ｎｇ／μｌ  Ｒｂ６９  ｇｐ３２、１２０ｎｇ／μｌ  Ｔ６  Ｈ６６Ｓ  ＵｖｓＸおよび７９ｎｇ／μｌ  Ｒｂ６９  ＵｖｓＹ。Ｎｆｏは１００ｎｇ／μｌで含めた。試料は水、またはＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓゲノムＤＮＡの２００コピーいずれかを含有し、Ｒｂ６９  ＵｖｓＹの存在または非存在下のいずれかであった。反応は３８４−ウェルプレート中で氷上で確立し、次いで、３８℃に設定されたステージを備えたＢＩＯＴＥＫ  Ｆｌｘ−８００蛍光マイクロプレートリーダーに移し、その時点で、底−読み取りプレートから実験を周期的に行った。
【０１６２】
図６１に示すように、シグナルはＵｖｓＹの有りまたは無しにてＴ６  Ｈ６６Ｓレコンビナーゼで、およびＵｖｓＹの存在下でＴ４  ＵｖｓＸを含有する反応で構成された反応において鋳型−依存的に蓄積した。しかしながら、ＵｖｓＹの非存在下において、Ｔ４  ＵｖｓＸ反応がＤＮＡ増幅能力を呈しなかった。これらの標準条件下では、ＤＮＡ増幅が起こるためには、Ｔ６  Ｈ６６Ｓ  ＵｖｓＸとは異なり、Ｔ４  ＵｖｓＸ  はＵｖｓＹについて厳格な要件を有すると結論された。
【０１６３】
さらなる実験を行って、ＵｖｓＹについてのＴ４  ＵｖｓＸの要件に対する滴定Ｒｂ６９  ｇｐ３２濃度の効果を調べた。これらの反応は、適切には、反応を増幅プライマーＳｃｃｉｉ３５ＩＶ（４８０ｎＭ）およびＯｒｆｘ４５ａ（１２０ｎＭ）、１２０ｎＭ蛍光プローブＳＡ  Ｔａｍｒａ２、１２５ｎｇ／μｌ、Ｔ４  ＵｖｓＸおよび３０ｎｇ／μｌ  Ｔ４  ＵｖｓＹを用いて行った以外は、図６１に示した実験について記載されたように行った。Ｒｂ６９  ｇｐ３２は４００ｎｇ／μｌ、６００ｎｇ／μｌまたは８００ｎｇ／μｌで用いた。試料は水、またはＭＲＳＡ  ＩゲノムＤＮＡの２００コピーのいずれかを含有し、Ｒｂ６９  ＵｖｓＹの存在下または非存在下のいずれかであった。図６９に示すように、ＤＮＡ増幅は、用いたＲｂ６９の濃度には無関係に、ＵｖｓＹを含有する全ての鋳型試料で起こった。ＵｖｓＹが失われた場合、ＤＮＡ増幅を示した鋳型試料はなかった。使用した標準条件下では、ＤＮＡ増幅が起こるためには、Ｔ４  ＵｖｓＸ蛋白質はＵｖｓＹに依存性であり、およびこの依存性はｇｐ３２濃度の変動によって変化しないと結論された。
【０１６４】
なおもう１つの実験を行って、ＵｖｓＹについてのＴ４  ＵｖｓＸ蛋白質の要件をさらに調べた。用いた反応条件は、以下を除いて、図６１に示した実験について記載したのと同一であった：反応は増幅プライマーＳｃｃｉｉｉ（４８０ｎＭ）およびＯｒｆＸ４５ａ（１２０ｎＭ）、１２０ｎＭ蛍光プローブＢｓＦｌｃベータ、１２３．５ｎｇ／μｌ  Ｔ４  ＵｖｓＸ、５００ｎｇ／μｌ  Ｒｂ６９  ｇｐ３２および１８ｎｇ／μｌ  Ｓａｕポリメラーゼを用いて行った。試料は水、または５０６ｂｐ  ＰＣＲ  ＤＮＡ断片の１００００コピーいずれかを含有し、Ｒｂ６９  ＵｖｓＹの存在下または非存在下のいずれかであった。図７０に示すように、これらの条件下では、Ｔ４  ＵｖｓＸ反応は、ＵｖｓＹの存在下および非存在下双方においてＤＮＡを効果的に増幅する。しかしながら、ＵｖｓＹを含有する試料中でのＤＮＡ増幅は、ＵｖｓＹが失われた場合に先行し、実験の終了においては、ＵｖｓＹの非存在下におけるよりもＵｖｓＹの存在下においてより多くのＤＮＡが増幅された。使用した条件に依存して、Ｔ４  ＵｖｓＸは起こるにはＤＮＡ増幅についてのＵｖｓＹの存在を必要とし、または必要としないであろう。しかしながら、条件がＵｖｓＹの非存在下で増幅が起こるのを可能とする場合でさえ、ＵｖｓＹの添加は反応速度を改良し、増幅されたＤＮＡ出力を増大させる。
【０１６５】
ＵｖｓＹについてのＴ４  ＵｖｓＸ蛋白質の要件をさらに解明するために、さらなる実験を行った。反応条件および試料は図７０に記載されたものであった。反応の完了に続いて、試料の各々をＧｅｎＥｌｕｔｅ  ＰＣＲクリーンアップキット（Ｓｉｇｍａ）を用いて精製し、ゲル電気泳動を用いて可視化した。図７１に示すように、ゲル電気泳動は、図７０に記載された実験のように、ＲＰＡを用いるＤＮＡ増幅で収集されたデータを可視化するさらなる方法（プロセス）として用いることができる。図７１に示された結果は、さらに、これらの条件下で、Ｔ４  ＵｖｓＸがＵｖｓＹの存在および非存在双方においてＤＮＡ増幅が起こるのを可能とすることを示す。しかしながら、図７０に示す実験で記載したように、ＵｖｓＹの非存在下におけるよりもＵｖｓＹの存在下においてより多くのＤＮＡが増幅された。これらの結果は、ある条件下では、Ｔ４  ＵｖｓＸはＵｖｓＹの非存在下においてＤＮＡ増幅を支持できるが、ＤＮＡ増幅の量はＵｖｓＹの存在下において改良されることを確認する。
Ｔ６  ＵｖｓＸを用いるＵｖｓＹ−フリーＤＮＡ増幅
本実験を用いて、修飾されていないＴ６  ＵｖｓＸ蛋白質が、ＵｖｓＹの非存在下においてＤＮＡを増幅する能力を呈するか否かを決定した。用いた反応条件は、プライマーＡｐｏＢ４、およびプライマーＡｐｏＢ３００またはＡｐｏＢ３いずれかと共にＴ６  Ｈ６６Ｓ  ＵｖｓＸまたは１２０ｎｇ／μｌ  Ｔ６  ＵｖｓＸ、およびヒトゲノムＤＮＡの１０００コピーを用いて反応を行った以外は、図５２に示された実験について記載されたとおりであった。図６２に示すように、調べた２つのアンプリコンのうちの１つはＵｖｓＹの非存在下において効果的に増幅されたが、１つはされなかった。さらに、ＵｖｓＹの有りまたは無しにてＴ６およびＴ６  Ｈ６６Ｓレコンビナーゼの間の断片の増幅の相対的効果は可変であった。レコンビナーゼ蛋白質の間の調製−依存性変動を排除できないが、このデータは、修飾されていないおよび修飾されたレコンビナーゼが従前に示されたように可変活性を示すという示唆に合致する。ＵｖｓＹの非存在下においては、ＤＮＡ増幅はＴ６  ＵｖｓＸで起こり得るが、これを行う効率はＴ６  Ｈ６６Ｓ  ＵｖｓＸとは異なる。
Ｒｂ６９  ＵｖｓＸを用いるＵｖｓＹ−フリーＤＮＡ増幅
本実験は、Ｒｂ６９  ＵｖｓＸが効果的な増幅のためにＵｖｓＹを必要とするか否かを調べた。反応は、プライマーＡｐｏＢ４およびプライマーＡｐｏＢ３００またはＡｐｏＢ３いずれかと共にＴ６  Ｈ６６Ｓ  ＵｖｓＸまたは１２０ｎｇ／μｌ  Ｒｂ６９  ＵｖｓＸ、４００ｎｇ／μｌ  Ｒｂ６９  ｇｐ３２、およびヒトゲノムＤＮＡの１０００コピーを用いて反応を行った以外は、図５２に示した実験について記載されたように行った。図６３に示すように、使用した条件下ではＵｖｓＹの存在に対する厳格な依存性と合致して、ＵｖｓＹの非存在下において増幅は見られなかった。存在するＵｖｓＹに関するものでさえ、増幅は貧弱であり、いくつかの注意を解釈にはらうべきである。いずれかの理論に拘束されるつもりはないが、最も単純な説明はＴ４  ＵｖｓＸに関するように、効果的かつ感受性の増幅で必要なフィラメント−負荷レベルを達成するのにＵｖｓＹが必要であるというものである。使用した標準条件下では、Ｒｂ６９  ＵｖｓＸは効果的なＤＮＡ増幅が達成されるためにはＵｖｓＹを必要とするようである。
Ａｅｈ１  ＵｖｓＸを用いるＵｖｓＹ−フリーＤＮＡ増幅
本実験を行って、効果的な増幅のためにはＡｅｈ１  ＵｖｓＸがＵｖｓＹを必要とするか否かに取組んだ。反応条件は、ＵｖｓＹを含めた場合、Ｔ６  Ｈ６６Ｓ  ＵｖｓＸとの反応では、およびＡｅｈ１：５００ｎｇ／μｌ  Ｒｂ６９  ｇｐ３２  ＵｖｓＸ、２００ｎｇ／μｌ  Ａｅｈ１  ＵｖｓＸおよび８０ｎｇ／μｌ  Ａｅｈ１  ＵｖｓＹとの反応では４００ｎｇ／μｌ  Ｒｂ６９  ｇｐ３２を用いて反応を行った以外は、図５２に示された実験について記載した通りである。プライマーＡｐｏＢ４、およびプライマーＡｐｏＢ３００またはＡｐｏＢ３いずれかと組合せて、ヒトゲノムＤＮＡの１０００コピーを反応当たり用いた。図６４に示すように、Ａｅｈ１蛋白質を用いた場合、ＵｖｓＹの非存在下においては増幅は見られず、他方、ＵｖｓＹの存在下では、正しいサイズの産物は明らかであった。使用した条件下では、ＵｖｓＹの存在に対する厳格な依存性と合致して、Ａｅｈ１蛋白質はＵｖｓＹの非存在下においてＤＮＡ増幅を受けることができないと結論された。
修飾されたＲｂ６９  ＵｖｓＸ（Ｔ６  ＤＮＡ結合ループ２、ヒツチジン６４からセリンへの修飾、および修飾されたＣ末端（ＬＤＥｘ２））を用いるＵｖｓＹ−フリーＤＮＡ増幅
本実験を行って、Ｔ６ＵｖｓＸのＤＮＡ結合ループ２を含有する修飾されたＲｂ６９  ＵｖｓＸが効果的な増幅のためにＵｖｓＹを必要とするか否かを調べ、かつＴ６レコンビナーゼの変種ＤＮＡ結合ループ２がＴ６レコンビナーゼのＵｖｓＹ−非依存性活性を説明するか否かを決定した。使用した反応条件は、以下を例外として、図５２に示された実験について記載された通りであった：４００ｎｇ／μｌ  Ｒｂ６９  ｇｐ３２、およびＴ６
Ｈ６６Ｓ  ＵｖｓＸまたは１２０ｎｇ／μｌ  Ｔ６  Ｈ６４Ｓ  ２ｘＬＤＥ  ＵｖｓＸいずれかを用いて反応を行った。プライマーＡｐｏＢ４、およびプライマーＡｐｏＢ３００またはＡｐｏＢ３いずれかと組合せて、ヒトゲノムＤＮＡの１００コピーを反応当たりに用いた。図６５に示すように、使用した条件下では、ＵｖｓＹの存在に対する依存性と合致して、ＵｖｓＹの非存在下で増幅は観察されなかった。
いずれかの理論に拘束されるつもりはないが、本実験の１つの解釈は、ＤＮＡ結合ループ２は、単離において、ハイブリッドレコンビナーゼに対してＵｖｓＹ―非依存性活性を付与するのには不十分であろうということである。しかしながら、注意を払うべきである。というのは、ＵｖｓＹの存在下においてさえこの蛋白質では貧弱な増幅が観察されたからである。使用した標準条件下では、Ｔ６  Ｈ６４Ｓ  ２ｘＬＤＥ  ＵｖｓＸは、効果的なＤＮＡ増幅が達成されるのにＵｖｓＹを必要とするようであると結論された。
【０１６６】
（実施例１６）ｇｐ３２活性
切断速度を調節するにおけるｇｐ３２の有効性を測定する能力は、ｇｐ３２活性を評価するための非常に正確なアプローチであることが判明し、歴史的には評価するのが困難だとされてきたものである。実験を行って、ｇｐ３２調製の活性のために有用なアッセイを示した。実験条件は以下の通りであった：反応は５０μｌ容量で行った；プローブ（ＳＡ−Ｔａｍｅｒａ２；
【０１６７】
【化２１】
2014233293.tif 000061
（配列番号：１２５、ここにｙ＝ｔｈｆ，ｂ＝ＢＨＱ２−ｄＴ，ｒ＝ＴＡＭＲＡ−ｄＴ，３’＝Ｂｉｏ−ＴＥＧ）は１００ｎＭであり；Ｒｂ６９  ｐｇ３２は０、４０、５０、６３、８３、１００、１２５、１６７、または２５０ｎｇ／μｌの最終濃度で用い；Ｎｆｏは３３ｎｇ／μｌで存在させ；緩衝液の条件は２０ｍＭトリスアセテート、５０ｍＭ酢酸カリウム（ｐＨ７．９）、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、１ｍＭジチオスレイトールであった。
【０１６８】
図６６に示すように、本実験の結果は、テトラヒドロフラン残基（ＴＨＦ）によって分離されたフルオロフォアおよびクエンチャーを含有する一本鎖プローブは、緩衝化水溶液中に、およびｇｐ３２蛋白質の非存在下で存在した場合、過剰のＮｆｏヌクレアーゼによって迅速に切断することができることを示す。この活性は、ＮｆｏはデュプレックスＤＮＡ基質のみを標的とするという文献中の主張に拘わらず、この活性はこれらの条件下で頑強であった。いずれかの理論に拘束されるつもりはないが、活性は、本明細書中で用いた条件下では、一過性デュプレックス構造、ヘアピン等の形成によって生起し得る。この活性は、反応混合物に含めた場合、過剰のｇｐ３２蛋白質によって完全に抑制された。ｇｐ３２の質量が徐々に減少した場合、切断活性は、再度、（経時的に蛍光を増加させることによってモニターして）測定され、切断の速度は、これらの限定的最終濃度において加えたｇｐ３２の質量によって調節された。さらに、実験において限定的レベルのｇｐ３２の濃度を設定することによって、ｇｐ３２の挙動および回転に対する競合体核酸または温度の効果のような種々の操作の結果を評価するのが可能であった。
ｇｐ３２分子の異なる種内での生化学的区別
実験を行って、異なる起源の種からのｇｐ３２分子が相互に生化学的に区別されるか否かを評価した。実験条件は以下の通りであった：反応は５０μｌ容量で行い；プローブ（ＳＡ−Ｔａｍｒａ２
【０１６９】
【化２２】
2014233293.tif 000062
（配列番号：１２６）、ここにｙ＝ｔｈｆ，ｂ＝ＢＨＱ２−ｄＴ，ｒ＝ＴＡＭＲＡ−ｄＴ，３’＝Ｂｉｏ−ＴＥＧ）は１００ｎＭであり；Ｒｂ６９  ｇｐ３２は８０ｎｇ／μｌの最終濃度で用い、Ｎｆｏは３３ｎｇ／μｌで存在し；３５０秒後、水、ｄｓＤＮＡ（５５０ｎｇヒトゲノムＤＮＡ；すなわち、ほぼ１０×質量のオリゴヌクレオチドプローブ）またはｓｓＤＮＡ（２８ピコモルの配列：
【０１７０】
【化２３】
2014233293.tif 000063
（配列番号：１２７）のオリゴヌクレオチド）のいずれかを加え；緩衝液条件は２０ｍＭトリスアセテート、５０ｍＭ酢酸カリウム（ｐＨ７．９）、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、１ｍＭジチオスレイトールであった。測定は、５２０ｎＭのＬＥＤ励起および５８５ｎＭにおける発光を用いるＥｍｂｅｄｄｅｄ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（ＥＳＥ，ＧｍｂＨ）によって製造されたフルオロメーターで行った。
【０１７１】
最初に、フルオロフォア／クエンチャープローブでのＮｆｏヌクレアーゼによる非常に低い切断活性のみを許容するｇｐ３２の濃度を確立した。この濃度において、ｇｐ３２の利用性は実質的プローブ保護のための最小量に制限され、これらの条件下では、ｇｐ３２が競合実験においてプローブからｇｐ３２が分配されるか否かを非常に感度よく評価することが可能であった。しばらくの間ゆっくりとしたプローブ切断をモニターした後、過剰な二本鎖ＤＮＡまたは一本鎖オリゴヌクレオチドを加えて、プローブに対するｇｐ３２の分布にこれが影響したか否かを評価した。全ての場合において、一本鎖オリゴヌクレオチドで過剰な付加は、蛍光および、よって、プローブ切断の突然かつ顕著な増加に導く。しかしながら、むしろ興味深いことには、切断が非常に顕著となり、プローブＤＮＡからのｇｐ３２の喪失を示すにつれ、Ｔ４  ｇｐ３２はデュプレックスＤＮＡの添加によって強く影響され、他方、Ｒｂ６９およびＡｅｈ１  ｇｐ３２種は切断においてわずかな増加のみを示したことが発見された。明らかに、Ｒｂ６９およびＡｅｈ１  ｇｐ３２分子は、Ｔ４  ｇｐ３２よりは一本鎖ＤＮＡに好都合にかなり効果的に分けられ、分配された。結果は図６７に示し、これは、Ｔ４およびＲｂ６９  ｇｐ３２分子は、一本鎖およびデュプレックスＤＮＡの間の分配に関して生物学的に区別されることを示す。
異なるｇｐ３２種についての温度制限
プローブ保護アッセイを用いて実験を行って、いずれの高い側温度において、ｇｐ３２の種々の種が正しく機能しないかを評価した。実験条件は以下の通りであった：反応は５０μｌ容量で行い；プローブ（ＳＡ−Ｔａｍａｒａ２；
【０１７２】
【化２４】
2014233293.tif 000064
（配列番号：１２８）、ここに、ｙ＝ｔｈｆ，ｂ＝ＢＨＱ２−ｄＴ，ｒ＝ＴＡＭＲＡ−ｄＴ，３’＝Ｂｉｏ−ＴＥＧ）の最終濃度は１００ｎＭであり；Ｒｂ６９  ｇｐ３２は８０ｎｇ／μｌの最終濃度で用い、Ｎｆｏは３３ｎｇ／μｌで存在させ；３５０秒後に、温度を徐々に上昇させ（グラフ参照）；緩衝液条件は２０ｍＭトリスアセテート、５０ｍＭ酢酸カリウム（ｐＨ７．９）、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、１ｍＭジチオスレイトールであった。測定は、５２０ｎＭのＬＥＤ励起および５８５ｎＭにおける発光にてＥｍｂｅｄｄｅｄ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（ＥＳＥ，ＧｍｂＨ）によって製造されたフルオロメーターで行った。
【０１７３】
ｇｐ３２がプローブ保護に関して丁度制限的である状況に導くｇｐ３２の濃度を用いた。次いで、温度が反応環境中で徐々に上昇するように熱源を適用した後、反応を注意深くモニターした。示された温度は、反応を含むチューブ近くの利用した蛍光プローブデバイスにおける熱電対および、かくして、反応温度の良好なインジケーターからの読みをいうものであった。図６８に示すように、異なるｇｐ３２種についての高い側温度の活性の限界に差があった。温度が上昇するにつれ、蛍光曲線の傾きは最初は一定のままであったが、ある地点において、増大し始めた。いずれかの理論に拘束されるつもりはないが、この証拠は、ｇｐ３２はその有効性を失っていることを示した。なぜならば、蛋白質は構造的に不安定となりつつあったからである。Ｎｆｏ活性は徐々に増大する解釈よりはむしろこの解釈に対する裏付けは、比較的高い温度までＴ４  ｇｐ３２はいずれの速度変化も示さず、他方、他のｇｐ３２分子を用いた場合、変化はかなり早く開始するという事実によって供される。特に、Ａｅｈ１  ｇｐ３２は約４０℃においてかなり非効率的となり、この地点を超えてはアッセイにおいて活性の顕著な喪失を呈したことが認められた。Ｒｂ６９
ｇｐ３２もまた、Ｔ４  ｇｐ３２よりも高い温度は許容性が低いように見え、約４２℃によって部分的に影響されるようになった。Ｔ４  ｇｐ３２はかなり抵抗性であって、少なくとも４７℃の温度において依然として機能的であった。
【０１７４】
データは、本明細書中において、新規で、多様なハイブリッドおよび作成レコンビナーゼ酵素の発見、およびＲＰＡ反応を行うためのそのような酵素の利用性を裏付ける。データは、さらに、本明細書中に記載された新規な、多様なハイブリッドおよび作成レコンビナーゼ剤および関連する組換え因子を用いてＲＰＡ反応を行うための最適条件の同定を裏付ける。主題の発明の特別な具体例を考察してきたが、前記明細書は例示的なものであって、制限的なものではない。本発明の多くの変形は、本明細書をレビューするに際して当業者に明らかとなるであろう。添付の請求の範囲は全てのそのような具体例および変形を主張する意図ではなく、本発明の十分な範囲は、同等物のその十分な範囲と共に請求の範囲、およびそのような変形と共に明細書を参照することによって決定されるべきである。
【０１７５】
以下にリストされる項目を含めた本明細書中で言及した全ての刊行物、特許出願、および特許は、あたかも各個々の刊行物または特許が引用により具体的かつ個々に取り込まれるように示されるかのごとく、引用してその全体をここに援用する。コンフリクトする場合、本明細書中のいずれの定義も含む本出願が支配する。
【０１７６】
【化６４】
2014233293.tif 000065
【０１７７】
【化６５】
2014233293.tif 000066
【図６０】
2014233293.tif 000067
【図１】
2014233293.tif 000068
【図２】
2014233293.tif 000069
【図３】
2014233293.tif 000070
【図４】
2014233293.tif 000071
【図５】
2014233293.tif 000072
【図６】
2014233293.tif 000073
【図７】
2014233293.tif 000074
【図８】
2014233293.tif 000075
【図９】
2014233293.tif 000076
【図１０】
2014233293.tif 000077
【図１１】
2014233293.tif 000078
【図１２】
2014233293.tif 000079
【図１３】
2014233293.tif 000080
【図１４】
2014233293.tif 000081
【図１５】
2014233293.tif 000082
【図１６】
2014233293.tif 000083
【図１７】
2014233293.tif 000084
【図１８】
2014233293.tif 000085
【図１９】
2014233293.tif 000086
【図２０】
2014233293.tif 000087
【図２１】
2014233293.tif 000088
【図２２】
2014233293.tif 000089
【図２３】
2014233293.tif 000090
【図２４】
2014233293.tif 000091
【図２５】
2014233293.tif 000092
【図２６】
2014233293.tif 000093
【図２７】
2014233293.tif 000094
【図２８】
2014233293.tif 000095
【図２９】
2014233293.tif 000096
【図３０】
2014233293.tif 000097
【図３１】
2014233293.tif 000098
【図３２】
2014233293.tif 000099
【図３３】
2014233293.tif 000100
【図３４】
2014233293.tif 000101
【図３５】
2014233293.tif 000102
【図３６】
2014233293.tif 000103
【図３７】
2014233293.tif 000104
【図３８】
2014233293.tif 000105
【図３９】
2014233293.tif 000106
【図４０】
2014233293.tif 000107
【図４１】
2014233293.tif 000108
【図４２】
2014233293.tif 000109
【図４３】
2014233293.tif 000110
【図４４】
2014233293.tif 000111
【図４５】
2014233293.tif 000112
【図４６】
2014233293.tif 000113
【図４７】
2014233293.tif 000114
【図４８】
2014233293.tif 000115
【図４９】
2014233293.tif 000116
【図５０】
2014233293.tif 000117
【図５１】
2014233293.tif 000118
【図５２】
2014233293.tif 000119
【図５３】
2014233293.tif 000120
【図５４】
2014233293.tif 000121
【図５５】
2014233293.tif 000122
【図５６】
2014233293.tif 000123
【図５７】
2014233293.tif 000124
【図５８】
2014233293.tif 000125
【図５９】
2014233293.tif 000126
【図６１】
2014233293.tif 000127
【図６２】
2014233293.tif 000128
【図６３】
2014233293.tif 000129
【図６４】
2014233293.tif 000130
【図６５】
2014233293.tif 000131
【図６６】
2014233293.tif 000132
【図６７】
2014233293.tif 000133
【図６８】
2014233293.tif 000134
【図６９】
2014233293.tif 000135
【図７０】
2014233293.tif 000136
【図７１】
2014233293.tif 000137
【配列表】
2014233293000001.app
【外国語明細書】
2014233293000001.pdf