(57)【要約】      （修正有）【課題】検体中の微量のチオール化合物及びスルフィド化合物を、再現性よく、かつ簡便な操作で定量できる方法を提供する。【解決手段】金属原子を担持させた担体と検体とを接触させて、検体からチオール化合物又はスルフィド化合物を分離する。担体から目的成分を回収し、溶媒抽出により精製、さらに濃縮を行い、ガスクロマトグラフ質量分析装置等で定量する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
金属原子を担持させた担体と検体とを接触させて、該検体からチオール化合物又はスルフィド化合物を分離することを含む精製工程を備える、チオール化合物及びスルフィド化合物の定量方法。
【請求項２】
前記金属原子が、周期律表の第４〜１５族に属する金属元素から選ばれる少なくとも１種である、請求項１に記載の定量方法。
【請求項３】
前記金属原子が、銅（Ｃｕ）、パラジウム（Ｐｄ）、銀（Ａｇ）、白金（Ｐｔ）、金（Ａｕ）、水銀（Ｈｇ）、クロム（Ｃｒ）及びビスマス（Ｂｉ）から選ばれる少なくとも１種である、請求項１又は２に記載の定量方法。
【請求項４】
前記金属原子が、パラジウム（Ｐｄ）、銀（Ａｇ）、白金（Ｐｔ）、金（Ａｕ）及び水銀（Ｈｇ）から選ばれる少なくとも１種である、請求項１又は２に記載の定量方法。
【請求項５】
前記精製工程において、前記検体からスルフィド化合物を分離する、請求項４に記載の定量方法。
【請求項６】
前記精製工程の前に、前記検体中のチオール化合物と下記一般式（１）で表されるマレイミド化合物とを反応させてチオール化合物誘導体を得る工程を更に備える、請求項１〜５のいずれか一項に記載の定量方法。
【化１】
2014211433.tif 000014
［一般式（１）中、Ｒは、水素原子、置換基を有していてもよい炭素数１〜１２のアルキル基、置換基を有していてもよい炭素数５〜１２のシクロアルキル基、置換基を有していてもよい炭素数７〜１２のアリールアルキル基又は置換基を有していてもよい炭素数６〜１２のアリール基を示す。］
【請求項７】
前記検体中の前記チオール化合物又は前記スルフィド化合物の濃度が、１０００ｎｇ／Ｌ以下である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の定量方法。
【請求項８】
前記金属原子を担持させた担体が、支持体に支持されている、請求項１〜７のいずれか一項に記載の定量方法。
【請求項９】
前記金属原子を担持させた担体が、カラムに充填されている、請求項１〜８のいずれか一項に記載の定量方法。
【請求項１０】
前記精製工程の後に、ガスクロマトグラフ質量分析によりチオール化合物又はスルフィド化合物を定量する工程を更に備える、請求項１〜９のいずれか一項に記載の定量方法。
【請求項１１】
前記検体が飲食品である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の定量方法。
【請求項１２】
前記検体が飲料である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の定量方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、チオール化合物及びスルフィド化合物の定量方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
チオール化合物及びスルフィド化合物は、飲食品中の香気成分の一種である。飲食品には多種多様な成分が含まれており、香気成分等は極めて微量（例えば、ｎｇ／Ｌレベル）な成分である。このような、多種多様な成分を含む検体中に微量にしか含まれていない成分を定量しようとした場合、検出対象となる成分を特異的に又は選択的に精製又は濃縮する必要がある。
【０００３】
例えば、非特許文献１には、チオール化合物とｐ−ヒドロキシ水銀安息香酸（ｐ−ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｒｃｕｒｉｂｅｎｚｏａｔｅ）との可逆的な結合により形成させた複合体をジクロロメタンで抽出し、ワイン中の揮発性のチオール化合物を精製したこと、及びシステインにより当該チオール化合物を遊離させ、ガスクロマトグラフ質量分析法によりチオール化合物の濃度を測定したことが記載されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｔｏｍｉｎａｇａ  Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．１９９８年，４６巻，ｐｐ．１０４４−１０４８．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
非特許文献１に記載の方法では、毒物であるｐ−ヒドロキシ水銀安息香酸を含む大量の廃液及び廃棄物（樹脂等）が発生するため、その処理が煩雑であるという問題がある。また、そもそもの操作が煩雑なうえ、微量成分を検出するために、例えば、数百ｍＬの検体を数十μＬまで濃縮する必要が生じることが多く、１日に処理できる検体数が限られることから、多点数の分析を行うことができない等の問題もある。このように、これまで、検体中の微量のチオール化合物及びスルフィド化合物を、再現性よく、かつ簡便な操作で定量できる方法はなかった。
【０００６】
そこで、本発明は、検体中の微量のチオール化合物及びスルフィド化合物を、再現性よく、かつ簡便な操作で定量できる方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、金属原子を担持させた担体と検体とを接触させて、該検体からチオール化合物又はスルフィド化合物を分離することを含む精製工程を備える、チオール化合物及びスルフィド化合物の定量方法を提供する。
【０００８】
本発明によれば、検体中の微量のチオール化合物及びスルフィド化合物を、再現性よく、かつ簡便な操作で定量することができる。上記精製工程では、金属原子を担持させた担体の当該金属原子にチオール化合物又はスルフィド化合物を硫黄原子を介して結合させることにより、これらの化合物を検体から分離することができる。金属原子を担持させた担体を用いているため、非特許文献１に記載の方法に比べて、格段に操作が簡便である。また、廃液中に多量の金属原子が含まれることがなく、廃液の処理も容易になる。
【０００９】
上記定量方法において、上記金属原子は、周期律表の第４〜１５族に属する金属元素から選ばれるものであってもよい。また、上記金属原子は、銅（Ｃｕ）、パラジウム（Ｐｄ）、銀（Ａｇ）、白金（Ｐｔ）、金（Ａｕ）、水銀（Ｈｇ）、クロム（Ｃｒ）及びビスマス（Ｂｉ）から選ばれる少なくとも１種であることが好ましい。これにより、検体中のチオール化合物又はスルフィド化合物をより一層効率よく分離することができる。さらに、上記金属原子は、パラジウム（Ｐｄ）、銀（Ａｇ）、白金（Ｐｔ）、金（Ａｕ）及び水銀（Ｈｇ）から選ばれる少なくとも１種であってもよい。この場合、検体中のスルフィド化合物をより一層効率よく分離することができるため、精製工程において、スルフィド化合物を分離する場合に好ましく用いることができる。
【００１０】
上記定量方法では、上記精製工程の前に、検体中のチオール化合物と下記一般式（１）で表されるマレイミド化合物とを反応させてチオール化合物誘導体を得る工程を更に備えることが好ましい。
【００１１】
【化１】
2014211433.tif 000002
一般式（１）中、Ｒは、水素原子、置換基を有していてもよい炭素数１〜１２のアルキル基、置換基を有していてもよい炭素数５〜１２のシクロアルキル基、置換基を有していてもよい炭素数７〜１２のアリールアルキル基又は置換基を有していてもよい炭素数６〜１２のアリール基を示す。
【００１２】
上記マレイミド化合物はチオール化合物との反応性が高いため、定量的にチオール化合物誘導体を得ることができる。また、チオール化合物誘導体にすることにより、反応性の高いチオール基を保護することができ、チオール化合物がプラスチック等に吸着することを抑制することができるため、より一層再現性よく定量することができる。また、吸着が抑制されるため、担体、容器等の材質による影響を低減することができ、例えば、市販されている担体、容器等を使用することができる。さらに、チオール化合物誘導体とすることで、分子量が大きくなり沸点が上昇するため、揮発性の高いチオール化合物もより一層再現性よく定量することができる。
【００１３】
上記チオール化合物誘導体を得る工程を行う場合、チオール化合物をマレイミド化合物と反応させつつチオール化合物誘導体を有機溶媒で抽出することもできるため、検出対象となる成分の濃縮をより効率よく行うことができる。
【００１４】
加えて、上記チオール化合物誘導体を得る工程を行う場合、ガスクロマトグラフ質量分析等により分析する場合の内部標準物質を容易に準備することができるという利点もある。例えば、内部標準物質として測定対象となるチオール化合物の同位体を用いる場合、測定対象となるチオール化合物それぞれについて安定同位体を調製する必要があり、容易ではない。一方、チオール化合物誘導体を得る工程を行う場合は、測定対象となるチオール化合物とマレイミド化合物の安定同位体を反応させることにより、容易に内部標準物質を作製することができる。
【００１５】
上記定量方法は、検体中に微量しか含まれていないチオール化合物及びスルフィド化合物の定量に特に適しているため、検体中のチオール化合物又はスルフィド化合物の濃度が、１０００ｎｇ／Ｌ以下であってもよい。
【００１６】
上記定量方法において、上記金属原子を担持させた担体は、支持体に支持されていることが好ましい。これにより操作が簡便になる。また、上記金属原子を担持させた担体は、カラムに充填されていることがより好ましい。これにより、より一層操作が簡便になる。
【００１７】
上記定量方法は、上記精製工程の後に、ガスクロマトグラフ質量分析によりチオール化合物又はスルフィド化合物を定量する工程を更に備えていてもよい。
【００１８】
また、上記定量方法は、多種多様な成分を含む検体中に微量しか含まれていないチオール化合物及びスルフィド化合物の定量に特に適しているため、上記検体が飲食品であってもよく、また飲料であってもよい。
【発明の効果】
【００１９】
本発明により、検体中の微量のチオール化合物及びスルフィド化合物を、再現性よく、かつ簡便な操作で定量できる方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】実施例１で使用した２次元ガスクロマトグラフ質量分析装置の構成を示す模式図である。
【図２】実施例１において得られた検量線である。
【図３】試験例３における２次元ガスクロマトグラフ質量分析により得られたクロマトグラムである。
【図４】実施例３において得られた検量線である。
【図５】実施例４における２次元ガスクロマトグラフ質量分析により得られたクロマトグラムである。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下、本発明を実施するための形態について説明する。しかし、本発明は、以下の実施形態に何ら限定されるものではない。
【００２２】
本実施形態に係るチオール化合物及びスルフィド化合物の定量方法は、金属原子を担持させた担体と検体とを接触させて、検体からチオール化合物又はスルフィド化合物を分離することを含む精製工程を備える。
【００２３】
金属原子としては、チオール化合物及びスルフィド化合物と、これらの分子中の硫黄原子を介して結合（例えば、配位結合、水素結合、イオン結合、共有結合、吸着）可能なものであればよく、周期律表の第４〜１５族に属する金属元素から選ばれるものであってよい。
【００２４】
金属原子としては、より具体的には、銅（Ｃｕ）、パラジウム（Ｐｄ）、銀（Ａｇ）、白金（Ｐｔ）、金（Ａｕ）、水銀（Ｈｇ）、クロム（Ｃｒ）及びビスマス（Ｂｉ）が好ましい。これらの金属原子は、チオール化合物及びスルフィド化合物の吸着能が高いため、より効率よくチオール化合物及びスルフィド化合物を分離することが可能となる。また、スルフィド化合物の分離効率を向上させる観点から、金属原子としてパラジウム（Ｐｄ）、銀（Ａｇ）、白金（Ｐｔ）、金（Ａｕ）及び水銀（Ｈｇ）を用いてもよい。担体に担持される金属原子は１種のみであってもよく、２種以上であってもよい。
【００２５】
担体としては、金属原子を担持させることができるものであればよく、例えば、シリカ、カーボン、アルミナ、フロリジル、合成樹脂、デキストラン及びアガロース等の親水性ポリマー、並びにセルロース等のカラムクロマトグラフィー用担体として通常用いられるものが挙げられる。これらは１種のみであってもよく、２種以上を組み合わせてもよい。また、金属原子を担持させるために、表面を改質したものであってもよい。
【００２６】
金属原子を担持させた担体は、検体と接触した際の金属原子の溶出が抑制されるように、上記金属原子を上記担体に担持させたものであればよい。具体的には、例えば、金属原子が直接担体となるイオン交換樹脂に結合（例えば、配位結合、イオン結合、水素結合等）したもの、キレート化合物が結合した担体上の当該キレート化合物に金属原子が結合したもの等が挙げられる。
【００２７】
上記金属原子を担持させた担体は、例えば、陽イオン交換樹脂に金属イオンを含む溶液を接触させ、金属原子を直接陽イオン交換樹脂に結合させる方法、担体の表面にキレート化合物を結合（例えば、共有結合、イオン結合、水素結合、吸着）させた後、これに金属イオンを含む溶液を接触させキレート化合物に金属原子をキレート結合させる方法等により得ることができる。なお、これらの方法においては、金属原子を担持させる前の担体が、後述する支持体に支持された状態であってもよい。
【００２８】
検出対象となるチオール化合物は−ＳＨ基を含有する化合物であれば特に制限されないが、上記定量方法は微量のチオール化合物を定量するのに特に適しているため、検体中に低濃度で含まれるチオール化合物であることが好ましい。検出対象となるチオール化合物としては、これに制限されるものではないが、例えば、４−メルカプト−４−メチル−２−ペンタノン、２−フルフリルメルカプタン（フルフリルチオール）、３−メルカプトヘキシルアセテート、３−メルカプト−１−ヘキサノールなどを挙げることができる。
【００２９】
検出対象となるスルフィド化合物は、二価の硫黄が２個の有機基で置換された化合物であれば特に制限されないが、上記定量方法は微量のスルフィド化合物を定量するのに特に適しているため、検体中に低濃度で含まれるスルフィド化合物であることが好ましい。検出対象となるスルフィド化合物としては、これに制限されるものではないが、例えば、チオール化合物誘導体（チオール化合物と上記一般式（１）で表されるマレイミド化合物との反応物）、メチオナール、ジメチルスルフィド等を挙げることができる。
【００３０】
上記定量方法によれば、低濃度のチオール化合物又はスルフィド化合物を再現性よく定量することができるため、検体中のチオール化合物又はスルフィド化合物の濃度は、１０００ｎｇ／Ｌ以下であってもよい。また、これらの濃度は、例えば、３００ｎｇ／Ｌ以下、１００ｎｇ／Ｌ以下又は５０ｎｇ／Ｌ以下であってもよい。検体中のチオール化合物又はスルフィド化合物の濃度の下限には特に制限はなく、０ｎｇ／Ｌであってもよい。
【００３１】
検体としては特に制限されることなく、任意の検体を用いてもよい。また、上記定量方法によれば、多種多様な成分が含まれる検体であっても低濃度のチオール化合物又はスルフィド化合物を再現性よく定量することができるため、検体として飲食品を用いてもよい。飲食品には多種多様な成分が含まれており、飲食品に含まれるチオール化合物及びスルフィド化合物は極微量（例えば、ｎｇ／Ｌレベル）であることが多い。上記定量方法によれば、検体として飲食品を用いてもチオール化合物又はスルフィド化合物を再現性よく定量することができる。
【００３２】
検体とする飲食品としては、例えば、ビール、ビールテイスト飲料、ワイン等の果実酒、甘味果実酒、焼酎、チューハイ、カクテル、コーヒー、牛乳及び果汁飲料等の飲料、果物及びその加工品等が挙げられる。飲食品が固形物である場合には、例えば水等の液体中ですりつぶし、液体の形状にしたうえで上記定量方法を適用するとよい。飲食品が飲料である場合には、基本的にそのまま上記定量方法を適用することができる。
【００３３】
上記精製工程は、金属原子を担持させた担体と検体とを接触させて、チオール化合物又はスルフィド化合物に含まれる硫黄原子と金属原子との結合を利用して、検体からチオール化合物又はスルフィド化合物を分離することにより行われる。
【００３４】
金属原子を担持させた担体と検体とを接触させる前に、例えば、ジクロロメタン、エーテル、ペンタン、酢酸エチル及びクロロホルム等の有機溶媒で検体を抽出し、検体中のチオール化合物又はスルフィド化合物を有機溶媒相に抽出する工程を備えていてもよい。これにより、検体中のチオール化合物又はスルフィド化合物を選択的に濃縮することができる。この場合、上記有機溶媒相を検体として、上記精製工程を行えばよい。
【００３５】
金属原子を担持させた担体と検体とを接触させる際、担体が支持体に支持されていると操作が簡便であるため好ましい。支持体としては、担体と検体との接触の際、担体を保持できるものであればよく、例えば、カラム及びカートリッジ等の容器、並びにディスク等が挙げられる。中でも、担体がカラムに充填されているとより一層操作が簡便であるため好ましい。すなわち、カラムに検体を通す操作により、チオール化合物又はスルフィド化合物に含まれる硫黄原子と金属原子とを結合させることができる。また、カラムを通して排出される廃液の取り扱いも容易である。
【００３６】
金属原子に結合した検出対象であるチオール化合物又はスルフィド化合物は、例えば、チオール化合物又はスルフィド化合物よりも金属原子への親和性が高い化合物を含む溶出液と接触させることで、担体から溶出させることもできる。溶出液としては、検出対象であるチオール化合物又はスルフィド化合物の種類、金属原子の種類等に応じて適宜選択すればよいが、例えば、システイン溶液、メルカプトコハク酸及びチオグリセロール等が挙げられる。
【００３７】
溶出に先だち、適切な洗浄液で洗浄してチオール化合物及びスルフィド化合物を担体に結合させたまま不純物を除去してもよい。洗浄液としては、検出対象であるチオール化合物又はスルフィド化合物の種類、金属原子の種類等に応じて適宜選択すればよいが、例えば、ジクロロメタン、メタノール、超純水、システイン等のチオール化合物溶液等が挙げられる。洗浄方法の一例として、ジクロロメタン、メタノール及び超純水を洗浄液として、この順で洗浄する方法を挙げることができる。
【００３８】
上記定量方法は、検体中のチオール化合物と下記一般式（１）で表されるマレイミド化合物とを反応させてチオール化合物誘導体を得る工程を更に備えることが好ましい。
【００３９】
【化２】
2014211433.tif 000003
【００４０】
一般式（１）中、Ｒは、水素原子、置換基を有していてもよい炭素数１〜１２のアルキル基、置換基を有していてもよい炭素数５〜１２のシクロアルキル基、置換基を有していてもよい炭素数７〜１２のアリールアルキル基又は置換基を有していてもよい炭素数６〜１２のアリール基である。
【００４１】
本明細書中、アルキル基は直鎖状であっても分岐状であってもよい。また、アリールアルキル基中のアルキル基は、直鎖状であっても分岐状であってもよい。
【００４２】
Ｒにおける炭素数１〜１２のアルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｔ−ブチル基、２−エチルヘキシル基、ノニル基、デカニル基、ラウリル基が挙げられる。また、Ｒにおける炭素数１〜１２のアルキル基は、置換基を有していてもよい。
【００４３】
Ｒにおける炭素数５〜１２のシクロアルキル基としては、例えば、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロヘプチル基、シクロオクチル基、トリシクロデシル基、ビシクロオクチル基、トリシクロドデシル基、イソボルニル基、アダマンチル基、テトラシクロドデシル基が挙げられる。また、Ｒにおける炭素数５〜１２のシクロアルキル基は、置換基を有していてもよい。
【００４４】
Ｒにおける炭素数７〜１２のアリールアルキル基としては、例えば、ベンジル基、１−フェニルエチル基、２−フェニルエチル基、３−フェニルプロピル基、６−フェニルヘキシル基、が挙げられる。また、Ｒにおける炭素数７〜１２のアリールアルキル基は、置換基を有していてもよい。
【００４５】
Ｒにおける炭素数６〜１２のアリール基としては、例えば、フェニル基、ナフチル基、が挙げられる。また、Ｒにおける炭素数６〜１２のアリール基は、置換基を有していてもよい。
【００４６】
上述の置換基としては、例えば、ハロゲン原子（フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子）、ヒドロキシル基、カルボキシル基、アミノ基、ホルミル基、アセチル基、プロピオニル基、メチルオキシ基、エチルオキシ基等が挙げられる。
【００４７】
上記マレイミド化合物は、測定対象とするチオール化合物の種類に応じて適切なものを選択すればよい。例えば、測定対象とするチオール化合物の分子量に応じてマレイミド化合物の分子量を適切に設定することにより、チオール化合物誘導体の沸点を制御することができる。これにより、例えば、ガスクロマトグラフ質量分析を再現性よくかつ容易に行うこともでき、また測定対象とするチオール化合物が揮発性のものである場合は、揮発を抑制して再現性のよい定量が可能となる。また、例えば、測定対象とするチオール化合物の疎水性度に応じてマレイミド化合物の疎水性度を適切に設定することにより、チオール化合物誘導体の疎水度を制御することもできる。これにより、例えば、有機溶媒を用いて検体からチオール化合物誘導体を抽出する場合、その抽出効率を向上させることができる。検出対象となるチオール化合物が、２−フルフリルメルカプタン（フルフリルチオール）、３−メルカプト−１−ヘキサノール、３−メルカプトヘキシルアセテート等である場合には、チオール化合物誘導体を得る工程を備えることによる効果が顕著である。
【００４８】
上記一般式（１）で表されるマレイミド化合物の具体例としては、例えば、Ｎ−エチルマレイミド（下記式（３））、Ｎ−フェニルマレイミド（下記式（５））、Ｎ−トリクロロフェニルマレイミド（下記式（６））が挙げられる。
【化３】
2014211433.tif 000004
【００４９】
例えば、Ｎ−エチルマレイミドは構造が単純であり、取り扱いがより容易になる。また、Ｎ−フェニルマレイミドは分子量が高いため、検出対象のチオール化合物が低分子量の場合、誘導体化により揮発を抑制し易くなることに加え、誘導体化により疎水性の度合いが高くなり、有機溶媒による抽出効率がより高くなる。さらに、Ｎ−トリクロロフェニルマレイミドは、負イオン化学イオン化法（ＮＣＩ）で検出することができるため、検出感度がより高くなる。
【００５０】
検体中のチオール化合物と上記マレイミド化合物との反応は、例えば、チオール化合物が２−フルフリルメルカプタン（フルフリルチオール）（下記式（２））であり、マレイミド化合物がＮ−エチルマレイミド（下記式（３））である場合を例にとると、下記式のように進むと考えられる。この場合、得られる反応生成物（下記式（４））は、スルフィド化合物となる。
【００５１】
【化４】
2014211433.tif 000005
【００５２】
チオール化合物とマレイミド化合物との反応は容易に進むため、任意の条件で反応を行ってもよい。一方、反応効率をより高める観点から、例えば、５％（ｗ／ｖ）のマレイミド化合物溶液を検体に対して、０．５％（ｖ／ｖ）〜５％（ｖ／ｖ）となるように添加することが好ましく、０．５％（ｖ／ｖ）〜２％（ｖ／ｖ）となるように添加することがより好ましい。反応時間は、例えば、０．５時間〜５時間とすることができ、０．５時間〜２時間とすることが好ましく、０．５時間〜１時間とすることがより好ましい。反応温度は特に制限されず、例えば、室温であってもよい。
【００５３】
検体中のチオール化合物とマレイミド化合物との反応は、上述した、検体中のチオール化合物又はスルフィド化合物を有機溶媒相に抽出する工程と同時に行うことができる。すなわち、検体中のチオール化合物とマレイミド化合物とを反応させながら有機溶媒で抽出することにより、マレイミド化合物により誘導体化されたチオール化合物（チオール化合物誘導体）を有機溶媒相に抽出しながら反応を行うこともできる。
【００５４】
チオール化合物をマレイミド化合物により誘導体化することにより、チオール基を保護してチオール化合物の挙動の安定性を向上させることができる。また、沸点を上昇させることにより、ガスクロマトグラフへの大容量注入が可能となる。これにより、上記の精製工程における最終液量を１００μＬとしても、そのうち５０μＬを注入できるため、１００００倍濃縮する場合でも、試料量を２０ｍＬまで減らすことが可能となる。これにより、更に作業効率を高めることができる。
【００５５】
精製工程で得られたチオール化合物又はスルフィド化合物は、例えば、ガスクロマトグラフ質量分析装置、ガスクロマトグラフ化学発光硫黄検出器、ガスクロマトグラフ炎光光度検出器等を使用して定量することができる。これらの中でも、特異的に検出できるという利点があることから、ガスクロマトグラフ質量分析により定量することが好ましい。
【実施例】
【００５６】
以下、実施例等に基づいて本発明をより詳細に説明する。
【００５７】
〔試験例１：チオール化合物及びスルフィド化合物吸着能の評価（１）〕
各種金属原子のチオール化合物及びスルフィド化合物吸着能を評価した。
【００５８】
（処理方法）
２０ｍＬのヘッドスペースバイアルに８ｍＬの超純水又は５０ｐｐｍの金属溶液を加え、これにフルフリルチオール（チオール化合物）及びメチオノール（スルフィド化合物）をそれぞれ１ｐｐｍになるように添加し、密栓した。密栓したバイアルを４０℃で１５分間振とうした後、ＳＰＭＥ用ファイバー（Ｐｏｌｙｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｏｘａｎｅ／Ｄｉｖｙｎｙｌｂｅｎｚｅｎｅ  ６５μｍ：スペルコ社製）をバイアル中のヘッドスペースに露出させた。４０℃で１５分間揮発性成分をファイバーに吸着させた後、注入口で３分間脱着させＧＣ／ＭＳにより分析した。なお、金属溶液は市販（和光純薬）の１０００ｐｐｍ溶液を超純水で希釈したものを使用した。
【００５９】
（ＧＣ／ＭＳ分析）
ＧＣ／ＭＳ分析の測定条件は以下のとおりである。
・分析機器
６８９０Ｎ  ＧＣ、５９７３Ｎ  ＭＳＤ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）
・カラム
ＨＰ−１ＭＳ、３０ｍ（長さ）×０．２５ｍｍ（内径）、１．０μｍ（膜厚）（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）
・注入モード
スプリットレス注入
・流量
１ｍＬ／分（定流量）
・注入口温度
２７０℃
・オーブン温度
４０℃（３分）→５℃／分→２００℃（０分：達温）→１０℃／分→３２０℃（３分）
・ＭＳ検出器
ＳＩＭ  ｍ／ｚ  １１４（フルフリルチオール）、１０６（メチオノール）
【００６０】
（結果）
各種金属原子を含む金属溶液でのフルフリルチオール又はメチオノールの定量結果（面積値）を、超純水（金属原子は含まない）でのフルフリルチオール又はメチオノールの定量結果（面積値）を１００とした相対値で求めた。結果を表１に示す。
【表１】
2014211433.tif 000006
【００６１】
金属原子にフルフリルチオール（チオール化合物）又はメチオノール（スルフィド化合物）が吸着すると、ヘッドスペースに移行するフルフリルチオール又はメチオノール量が減少する。したがって、定量結果（相対値）が小さいほど吸着能が高いことを示す。フルフリルチオール（チオール化合物）に対しては、Ｃｕ、Ｃｒ、Ａｇ、Ａｕ、Ｐｔ、Ｐｄ、Ｈｇ及びＢｉの吸着能が高かった（表１）。メチオノール（スルフィド化合物）に対しては、Ａｕ、Ｐｄ、Ａｇ、Ｐｔ及びＨｇの吸着能が高かった（表１）。
【００６２】
〔試験例２：チオール化合物及びスルフィド化合物吸着能の評価（２）〕
金属原子を固定化したカラムを用い、チオール化合物及びスルフィド化合物吸着能を評価した。
【００６３】
（金属原子を固定化したカラムの調製）
金属原子を固定化したカラム（金属固定化カラム）を以下のように調製した。
・Ａｇ固定化カラム
市販品（ＭｅｔＳＥＰ  ＩＣ−Ａｇ：ジーエルサイエンス社）を使用した。
・Ｃｕ固定化カラム
１０００ｐｐｍの硫酸銅水溶液をキレート樹脂を充填した固相（ＭｅｔａＳＥＰ  ＩＣ−ＭＥ：ジーエルサイエンス社）に５０ｍＬ通液して調製した。
・Ｂｉ固定化カラム及びＦｅ固定化カラム
市販（和光純薬）の１０００ｐｐｍ溶液を超純水で１０倍希釈したものをキレート樹脂を充填した固相ＭｅｔａＳＥＰ  ＩＣ−ＭＥ：ジーエルサイエンス社）に５０ｍＬ通液して調製した。
【００６４】
（処理方法）
超純水１０ｍＬ、メタノール５ｍＬ及びジクロロメタン５ｍＬでコンディショニングした金属固定化カラムに、フルフリルチオール、メチオノールをそれぞれ１ｐｐｍ含むジクロロメタン溶液を１０ｍＬ負荷した。負荷したものをそのまま回収し、ＧＣ／ＭＳにより分析した。
【００６５】
（ＧＣ／ＭＳ分析）
ＧＣ／ＭＳ分析の測定条件は以下のとおりである。・分析機器
６８９０Ｎ  ＧＣ、５９７３Ｎ  ＭＳＤ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）
・カラム
ＨＰ−５ＭＳ、３０ｍ（長さ）×０．２５ｍｍ（内径）、０．２５μｍ（膜厚）（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）
・注入モード
スプリットレス注入
・流量
１ｍＬ／分（定流量）
・注入口温度
２５０℃・オーブン温度
５０℃（１分）→２５℃／分→３２５℃（０分：達温）
・ＭＳ検出器
ＳＩＭ  ｍ／ｚ  １１４（フルフリルチオール）、１０６（メチオノール）
【００６６】
（結果）
定量結果（面積値）をカラム負荷前の定量結果（面積値）を１００とした相対値で求めた。結果を表２に示す。
【００６７】
【表２】
2014211433.tif 000007
【００６８】
表１及び表２から明らかなように、金属原子のチオール化合物及びスルフィド化合物吸着能は、金属原子を固定化しても変化はなかった。また、Ｃｕ及びＡｇは試薬（それぞれ硫酸銅及び硝酸銀）の水への溶解性が高いため、固定化操作が容易に行える点でより好ましい。
【００６９】
〔実施例１：チオール化合物の定量〕
標準液中の４−メルカプト−４−メチル−２−ペンタノン（４ＭＭＰ）を簡易標準添加法により定量して検量線を作成し、定量法の妥当性を評価した。
【００７０】
（試薬類）
チオール化合物として４−メルカプト−４−メチル−２−ペンタノン（１％プロピレングリコール溶液、ＩＮＴＥＲＣＨＩＭ）を用いた。
【００７１】
システインは東京化成のものを使用した。ジクロロメタン、メタノールは和光純薬の残留農薬用を、それ以外の試薬は特級グレードのものを用いた。内部標準物質としては、１−ペンタデカノール（１００μｇ／Ｌ、東京化成社）を用いた。チオール化合物の精製には、銀を担持した担体として、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ａｇ−ＩＯＮ（ＳＵＰＥＬＣＯ社）を用いた。
【００７２】
（試料の調製）
ビール飲料（以下、「試験醸造品Ｘ１」という。）２０ｍＬを６ｇの塩化ナトリウムを入れた５０ｍＬガラス製遠沈管に採り、ジクロロメタン２０ｍＬ加えた。これを１試料に付き３本用意し、１５分間振とうして抽出後、３０００ｒｐｍで１５分間遠心した。３本分の抽出液を２００ｍＬの分液ロートに界面を壊さないようにゆっくりと移し、下層を１００ｍＬの三角フラスコに採取した。さらにエマルジョンからも分液ろ紙を使用してジクロロメタン層を回収した。ジクロロメタン層を硫酸ナトリウムで脱水した後、５０ｍＬをターボバップを使用して、窒素気流下５ｍＬまで濃縮した。これをジクロロメタン５ｍＬでコンディショニングしたＤｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ａｇ−ＩＯＮ（商品名、ＳＵＰＥＬＣＯ社）に全量負荷し、ジクロロメタン１０ｍＬ、メタノール１０ｍＬ、超純水５０ｍＬで洗浄し、１％システイン溶液２０ｍＬで溶出した。溶出液を５０ｍＬガラス製遠沈管に移し、ジクロロメタン２５ｍＬを加えて１５分間振とうして抽出後、３０００ｒｐｍで１５分間遠心した。下層を５０ｍＬ三角フラスコに採り、硫酸ナトリウムで脱水後、２０ｍＬを濃縮容器に採り、１ｍＬの内部標準物質（１００μｇ／Ｌ、１−ペンタデカノール）を添加後、ターボバップで窒素気流下２００μＬまで濃縮し測定に供した。
【００７３】
（検量線の作成）
検量線は、試験醸造品Ｘ１に２５ｎｇ／Ｌ、５０ｎｇ／Ｌ、１００ｎｇ／Ｌになるよう４ＭＭＰを添加したものを、上記試料の調製と同様に処理したものを測定して作成した。
【００７４】
（２次元ガスクロマトグラフ質量分析）
調製した測定用検体を２次元ガスクロマトグラフ質量分析（以下、「２Ｄ−ＧＣ−ＭＳ」という場合がある。）により分析した。また、調製した標準液についても同様に分析し、検量線を作成した。２次元ガスクロマトグラフ質量分析装置は図１に示すようにセットアップし、下記の測定条件で分析を行った。
・分析機器
７８９０Ｎ  ＧＣ、  ５９７５Ｃ  ＭＳＤ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）
・カラム
１次元目（１Ｄ）ＤＢ−ＷＡＸ、３０ｍ（長さ）×０．２５ｍｍ（内径）、０．２５μｍ（膜厚）（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ)：
２次元目（２Ｄ）ＤＢ−５、１０ｍ（長さ）×０．１８ｍｍ（内径）、０．４μｍ（膜厚）（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）
・注入口
ＰＴＶ注入口、シングルバッフル  ガラスウール入り：
ソルベントベント、０ｋＰａ（０．３５分）、パージ流量５０ｍＬ／分：
スプリットベント流量  ５０ｍＬ／分（２分）：
１０℃（０．６５分）→６００℃／分→３００℃（３分）
・注入口圧力
２５２．２８ｋＰａ
・注入量
１０μＬ（注入速度３０００μＬ／分）
・オーブン温度
４０℃（１分）−１０℃／分−１８０℃−２５℃／分−２５０℃（１３分）
・ＬＴＭ温度
４０℃（１５分）−２５℃／分−１４０℃（６分）−２５℃／分−３００℃（２分）
・ＡＵＸ温度
２５０℃
・Ｄｅａｎｓ圧力
１００ｋＰａ（０．３５分）−２０８．３７ｋＰａ
・Ｄｅａｎｓバルブ
バルブ１  ＯＮ（１３分）−ＯＦＦ（１３．７分）−ＯＮ（２３分）−ＯＦＦ（２４分）
・ＦＩＤ検出器
２５０℃、Ｈ２４０ｍＬ／分、Ａｉｒ  ４５０ｍＬ／分、Ｍａｋｅ  ｕｐ  Ｈｅ  ４５ｍＬ／ｍｉｎ
・ＭＳ検出器
ゲイン係数２、ＳＩＭ  ｍ／ｚ  １３２（４ＭＭＰ）、１８２（内部標準物質）、ｄｗｅｌｌ  １００
【００７５】
（結果）
２次元ガスクロマトグラフ質量分析により標準液の測定を実施した。得られたｍ／ｚ１３２の面積値とｍ／ｚ１８２の面積値との比｛内部標準比：（ｍ／ｚ１３２面積値）／（ｍ／ｚ１８２面積値）｝に対する４ＭＭＰ濃度をプロットし検量線を作成した（図２）。その結果、検量線の直線性は非常に良好であった（Ｒ２値  ０．９９）。
【００７６】
〔試験例３：定量法の評価〕
（回収率の評価）
４ＭＭＰを含まない市販飲料品Ｘ１に５０ｎｇ／Ｌ、１００ｎｇ／Ｌになるよう４ＭＭＰを添加したものを、上記試料の調製と同様の操作を行い、精製濃縮した検体を測定用検体とした。得られた測定用検体について測定を行い、図２の検量線の傾きを使用して定量を行い、回収率を求めた。結果を表３に示す。表３に示したように検体中の４ＭＭＰを６０％近くの回収率で抽出することができた。
【００７７】
【表３】
2014211433.tif 000008
【００７８】
（併行精度の評価）
試験醸造品Ｘ１に対して、上記試料の調製と同様の操作を行い、精製濃縮した検体を測定用検体とした。得られた測定用検体について、独立に４回定量を行い（ｎ＝４）、併行精度を求めた。表４に結果を示す。表４に示すように、併行精度（変動係数、ＣＶ）は４．０％と非常に良好であった。なお、図３は、２Ｄ−ＧＣ−ＭＳにより得られたクロマトグラムであるが、この結果から選択性が良好であることが確認された。
【００７９】
【表４】
2014211433.tif 000009
【００８０】
〔実施例２：試験醸造品及び市販飲料品の分析〕
試験醸造品及び市販飲料品中の４ＭＭＰを定量した。試験醸造品としては、互いに異なるビール飲料（以下、それぞれ「試験醸造品Ｘ１」〜「試験醸造品Ｘ５」という。）を用いた。
【００８１】
試料の調整、検量線の作成は、実施例１と同様にして調製した。２Ｄ−ＧＣ−ＭＳの測定条件も実施例１と同様である。結果を表５に示す。
【００８２】
【表５】
2014211433.tif 000010
【００８３】
〔実施例３：チオール化合物の誘導体化による定量〕
標準液及び検体中のフルフリルチオールを定量して検量線を作成し、定量法の妥当性を評価した。
【００８４】
（試薬類）
チオール化合物として２−フルフリルメルカプタン（フルフリルチオール）（東京化成）を用い、マレイミド化合物として、Ｎ−エチルマレイミド（東京化成、下記式（３））を用いた。
【００８５】
【化５】
2014211433.tif 000011
【００８６】
システインは東京化成から、Ｎ−エチルマレイミド−ｄ５（ＥＴＨＹＬ−Ｄ５、９８％）はＣａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｉｓｏｔｏｐｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃから購入したものを用いた。ジクロロメタン、メタノールは和光純薬の残留農薬用を、それ以外の試薬は特級グレードのものを用いた。チオール化合物誘導体の精製には、銀を担持した担体として、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ａｇ−ＩＯＮ（ＳＵＰＥＬＣＯ社）を用いた。
【００８７】
（内部標準の調製）
１０ｍＬのガラス製遠沈管に、超純水２ｍＬ、塩化ナトリウム０．６ｇ、１％  Ｎ−エチルマレイミド−ｄ５  エタノール溶液０．２ｍＬ、１０００ｍｇ／Ｌフルフリルチオール  エタノール溶液２０μＬを加えて軽く攪拌した。ジクロロメタン２ｍＬを加えて３０分間振とうして抽出後、３０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して、下層を採取した。採取した下層をジクロロメタンで５０倍希釈したものを内部標準原液、さらにジクロロメタンで１００倍に希釈したものを内部標準液として使用した。
【００８８】
（検体の誘導体化処理）
市販のビール（以下、「市販品Ａ」という。）及び市販品Ａに５０ｎｇ／Ｌ、１００ｎｇ／Ｌのフルフリルチオールを添加したものそれぞれ２０ｍＬを６ｇの塩化ナトリウムを入れた５０ｍＬガラス製遠沈管にとり検体とした。検体に４００μＬの誘導体化試薬（５％（ｗ／ｖ）Ｎ−エチルマレイミド  エタノール溶液）を加えて軽く攪拌した。ジクロロメタン２０ｍＬを加え３０分間振とうして抽出後、３０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。下層１８ｍＬを予め２ｍＬの内部標準液を入れた２０ｍＬメスフラスコに回収した。ジクロロメタン５ｍＬでコンディショニングしたＤｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ａｇ−ＩＯＮ（商品名、ＳＵＰＥＬＣＯ社）に、回収した検体１８ｍＬを負荷し、ジクロロメタン１０ｍＬ、メタノール１０ｍＬ、超純水５０ｍＬで洗浄し、１％システイン溶液４０ｍＬで溶出した。溶出液を２０ｍＬずつ２本の５０ｍＬガラス製遠沈管に移し、６ｇ塩化ナトリウム、ジクロロメタン２０ｍＬを加えて１５分間振とうして抽出後、３０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。遠心管２本分の下層を５０ｍＬ三角フラスコにとり、硫酸ナトリウムで脱水し、窒素気流下１００μＬまで濃縮した。このようにして得られた誘導体化処理を施した検体を測定用検体とした。
【００８９】
（標準液の調製）
５０ｍＬの遠沈管に１ｍｇ／Ｌフルフリルチオール水溶液２０ｍＬに４００μＬの誘導体化試薬（５％Ｎ−エチルマレイミド  エタノール溶液）を加えて軽く攪拌した。ジクロロメタン２０ｍＬを加え３０分間振とうして抽出後、３０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。下層を回収し、ジクロロメタンで希釈して、１μｇ／Ｌ、２．５μｇ／Ｌ、５μｇ／Ｌ、１０μｇ／Ｌ溶液を作製し、これら９ｍＬと内部標準原液１ｍＬを混和したものを標準液とした。
【００９０】
（２次元ガスクロマトグラフ質量分析）
調製した測定用検体を２Ｄ−ＧＣ−ＭＳにより分析した。また、調製した標準液についても同様に分析し、検量線を作成した。２Ｄ−ＧＣ−ＭＳの測定条件は以下のとおりである。
・分析機器
６８９０Ｎ  ＧＣ、５９７３Ｎ  ＭＳＤ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）
・カラム
１次元目（１Ｄ）ＤＢ−５ＭＳ、１５ｍ（長さ）×０．２５ｍｍ（内径）、０．２５μｍ（膜厚）（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）：
２次元目（２Ｄ）ＨＰ−ＩＮＮＯＷＡＸ、３０ｍ（長さ）×０．２５ｍｍ（内径）、０．２５μｍ（膜厚）（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）
・注入口
ＰＴＶ注入口、マルチバッフルライナー：
ソルベントベント、０ｐｓｉ（０．６分）、パージ流量１５０ｍＬ：
スプリットベント流量５０ｍＬ／分（２分）：
４０℃（０．６分）→６００℃／分→３２０℃（３分）
・注入口圧力
４４．１ｐｓｉ・注入量
５０μＬ（注入速度１００μＬ／分）
・オーブン温度
５０℃→６℃／分→１８２℃（１分）→１５℃／分→２５０℃（１３分）
・ＡＵＸ温度
２５０℃
・ＦＩＤ検出器
２５０℃、Ｈ２  ４０ｍＬ／分、Ａｉｒ  ４５０ｍＬ／分、Ｍａｋｅ  ｕｐ  Ｈｅ  ４５ｍＬ／分
・ＭＳ検出器
ＳＩＭ  ｍ／ｚ  ２３９（フルフリルチオール誘導体）、２４４（内部標準物質）、ｄｗｅｌｌ  ５０：
ＭＳ  ＯＦＦ（３６分）
【００９１】
（結果）
２次元ガスクロマトグラフ質量分析により標準液の測定を実施した。得られたｍ／ｚ２３９の面積値とｍ／ｚ２４４の面積値との比｛（ｍ／ｚ２３９面積値）／（ｍ／ｚ２４４面積値）｝に対するフルフリルチオール濃度をプロットし、検量線を作成した（図４）。その結果、検量線の直線性は非常に良好であった。さらに測定用検体についても同様に測定を実施し、内部標準法によりフルフリルチオールの定量値を求めた。その結果、表６に示したように検体にＮ−エチルマレイミドを用いて誘導体化処理を施すことにより、検体中のフルフリルチオールをほぼ１００％の回収率で抽出することができた。
【００９２】
【表６】
2014211433.tif 000012
【００９３】
〔試験例４：定量法の評価〕
市販の黒ビールテイスト飲料に２０ｎｇ／Ｌのフルフリルチオールを添加したものを検体とし、独立に５回定量を行い（ｎ＝５）、併行精度及び回収率を求めた。
【００９４】
（併行精度及び回収率の評価）
表７に結果を示す。表７に示すように、併行精度（変動係数、ＣＶ）は２．９％と非常に良好であった。
【００９５】
【表７】
2014211433.tif 000013
【００９６】
〔実施例４：市販飲料の分析〕
市販飲料（黒ビール又は黒ビールテイスト飲料）中のフルフリルチオールを定量した。市販飲料としては、市販の黒ビールテイスト飲料（以下、「市販品Ｂ」という。）、市販の黒ビール（以下、「市販品Ｃ」という。）、及び市販品Ｃとは異なる市販の黒ビール（以下、「市販品Ｄ」という。）を用いた。また、標準液（１０ｎｇ／Ｌ）についても同様に定量した。
【００９７】
フルフリルチオールの定量は、以下のようにして行った。検体に対する５％（ｗ／ｖ）Ｎ−エチルマレイミド  エタノール溶液の添加量を１％（ｖ／ｖ）とし、反応時間を０．５時間という条件で検体の誘導体化処理を行ったこと以外は、実施例３と同様の方法により、検体の誘導体化処理を行い、測定用検体を調製した。測定用検体を、実施例３と同様の方法により、２Ｄ−ＧＣ−ＭＳにより分析し、各条件におけるフルフリルチオール誘導体に由来するピーク面積値を比較した。
【００９８】
図５に２Ｄ−ＧＣ−ＭＳの結果を示す。図５（ａ）は、標準液の２Ｄ−ＧＣ−ＭＳのクロマトグラムである。図５（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）は、それぞれ、市販品Ｂ、市販品Ｃ及び市販品Ｄの２Ｄ−ＧＣ−ＭＳのクロマトグラムである。図５に示したとおり、市販の飲料は、夾雑ピークが認められるものの、フルフリルチオールの定量値への影響は大きくないと考えられた。市販品Ｂ、市販品Ｃ及び市販品Ｄに含まれるフルフリルチオールは、それぞれ６ｎｇ／Ｌ、７ｎｇ／Ｌ及び１３ｎｇ／Ｌであった。
【図１】
2014211433.tif 000015
【図２】
2014211433.tif 000016
【図４】
2014211433.tif 000017
【図５】
2014211433.tif 000018
【図３】
2014211433.tif 000019