(57)【要約】【課題】放射線によって惹起される造血障害及び免疫機能低下に対する造血障害回復剤及び免疫機能賦活剤の提供。【解決手段】霊芝又はその抽出物を有効成分とする放射線による造血障害回復剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
霊芝又はその抽出物を有効成分とする放射線による造血障害回復剤。
【請求項２】
霊芝の抽出物が、霊芝の水抽出物である請求項１記載の放射線による造血障害回復剤。
【請求項３】
霊芝又はその抽出物を有効成分とする放射線による免疫機能低下に対する賦活剤。
【請求項４】
霊芝の抽出物が、霊芝の水抽出物である請求項３記載の放射線による免疫機能低下に対する賦活剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、放射線によって惹起される造血障害及び免疫機能低下に対する造血障害回復剤及び免疫機能賦活剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
放射線は悪性腫瘍の化学療法や放射線治療において有力な武器となっている。しかし、担腫瘍状態においてリンパ球系障害を介して生体の免疫機能を低下させ、宿主に悪影響を及ぼすことが知られている。臨床的には、貧血、リンパ球減少に伴う白血球減少、血小板減少等の造血系細胞の抑制がみられる（非特許文献１）。これらの症状は、治療の本来の目的から望まれるものではない。従って、放射線によって惹起される造血・細網内皮系障害や免疫機能の低下を予防・改善させる有用な方法が求められている。
【０００３】
一方、霊芝は、サルノコシカケ科のマンネンタケの子実体から得られる生薬として知られ、漢方では強壮、補血、精神安定、利水、補肝作用があるとされている。近年、霊芝は人工栽培の成功によって大量供給が可能となり、その有効性に関し様々な研究がされている。例えば、霊芝の活性ステロイドはエンドヌクレアーゼの働きを助ける役割を担い、アポトーシスのプログラムが組み込まれた遺伝子の働きを活性化するアポトーシス誘導作用を示すことや、霊芝が血中尿酸値、尿中尿酸値において用量依存的な抑制作用を示すこと等が報告されている（非特許文献２及び３）。
しかしながら、霊芝と放射線照射に伴う造血障害や免疫機能低下との関連については何ら報告されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  １８（１）：１８−２２、１９９０
【非特許文献２】三重大学社会連携研究センター研究報告  １８：１２９−１３４、２０１０
【非特許文献３】三重大学社会連携研究センター研究報告  １９：７７−８３、２０１１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、放射線によって惹起される造血障害及び免疫機能低下に対する造血障害回復剤及び免疫機能賦活剤を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、造血系前駆細胞の解析や抗体産生免疫応答の面より、放射線防禦作用を有する物質について鋭意研究を重ねた結果、霊芝が、放射線によって惹起される造血・細網内皮系障害に対して軽減効果を示すこと、また、霊芝により、ヒツジ赤血球に対する抗体免疫産生能が促進され、更に組織学的所見において造血巣の回復と脾臓・胸腺障害の軽減が認められることを見出し、本発明を完成した。
【０００７】
すなわち、本発明は、霊芝又はその抽出物を有効成分とする放射線による造血障害回復剤を提供するものである。
また、本発明は、霊芝又はその抽出物を有効成分とする放射線による免疫機能低下に対する賦活剤を提供するものである。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、放射線の照射により障害された造血・細網内皮系機能及び免疫リンパ系細胞の抗体産生能を回復させることができる。霊芝は、食経験が豊富で安全性も高いため、放射線治療等における副作用の予防・改善に極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】Ｘ線照射１０日後の胸腺及び脾臓の組織切片を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明に用いられる霊芝は、サルノコシカケ科マンネンタケ（Ｇａｎｏｄｅｒｍａ  ｌｕｃｉｄｕｍ）の子実体である。霊芝はその色の違いによって赤芝、黒芝、青芝、白芝、黄芝、紫芝等に区別されるが、これらは原植物が異なるわけではなく、系統、生育条件等の相違によるものである。本発明では、五岳霊芝ＧＹ（瑶輪）系に属する霊芝を用いるのが好ましい。五岳霊芝ＧＹ（瑶輪）系に属する霊芝は、直井幸雄により分類固定され、直井霊芝と称されている。
霊芝は、そのまま用いても乾燥させて用いてもよく、更にそれらを処理して用いてもよい。処理としては、例えば、切断、破砕、磨砕、粉砕等が挙げられる。
【００１１】
霊芝の抽出物は、霊芝をそのままもしくは乾燥させ、又はそれらを処理した後に抽出工程に付すことによって得ることができる。霊芝の抽出物としては、市販されているもの、常法により得られる各種溶媒抽出物であってもよい。
霊芝の抽出物を得る抽出手段は、特に制限されず、例えば、固液抽出、浸漬、煎出、浸出、還流抽出、超音波抽出、マイクロ波抽出、攪拌等の手段を用いることができる。
【００１２】
抽出のための溶媒としては、例えば、水、低級アルコール類、多価アルコール類、ケトン類、エステル類、エーテル類、ポリエーテル類、炭化水素類、芳香族炭化水素類、ハロゲン化炭化水素類、超臨界二酸化炭素、オイル類、これらの混合物等が挙げられる。なかでも、水、低級アルコール類、アルコール−水混合液が好ましく、水がより好ましい。
【００１３】
溶媒の使用量としては、霊芝（乾燥重量換算）１ｇに対して１〜１００ｍＬが好ましく、抽出時間としては、１分間〜１０日間が好ましく、３０分間〜１日間がより好ましい。このときの抽出温度は、０℃〜溶媒沸点、より好ましくは２０〜１００℃である。
【００１４】
斯くして得られる霊芝の抽出物は、抽出液や画分をそのまま用いてもよく、適宜な溶媒で希釈した希釈液として用いてもよく、或いは濃縮エキスや乾燥粉末としたり、ペースト状に調製したものでもよい。また、凍結乾燥し、用時に、抽出に用いられる溶媒、例えば水等で希釈して用いることもできる。
【００１５】
霊芝の抽出物は、食品上・医薬品上許容し得る規格に適合し本発明の効果を発揮するものであれば粗精製物であってもよく、さらに得られた粗精製物を公知の分離精製方法を適宜組み合わせてこれらの純度を高めてもよい。精製手段としては、有機溶媒を用いる沈殿法、遠心分離、限界濾過膜、高速液体クロマトグラフやカラムクロマトグラフ等が挙げられる。
【００１６】
霊芝の抽出物は、本発明の効果が有効に発揮される点から、多糖体を２重量％以上、好ましくは３重量％以上含むのが好ましい。多糖体としては、β−グルカン、グルクロノ−β−グルカン等が挙げられる。霊芝の抽出物の組成の一例は後述する実施例の記載の通りである。
【００１７】
霊芝又はその抽出物は、後述する実施例に示すように、放射線防禦作用を有し、放射線照射により障害された造血・細網内皮系機能及び免疫機能を賦活化させ、回復を促進させる。従って、本発明は、霊芝又はその抽出物を有効成分とする放射線による造血障害回復剤及び放射線による免疫機能低下に対する賦活剤を提供する。
なお、本明細書では、放射線は電離放射線を意味し、電離放射線には粒子線と電磁波が含まれる。
本発明の造血障害回復剤及び免疫機能低下に対する賦活剤は、放射線によって惹起される造血障害や免疫機能の低下を予防・抑制・軽減・回復促進・改善等するための医薬品、食品又は他の組成物の製造のために使用することができる。
これら医薬品、食品及び他の組成物は、本発明の効果を奏する限り、必要に応じて、薬学的に許容される担体、添加剤、他の有効成分、薬理成分等を含有していてもよい。
【００１８】
上記医薬品、食品及び他の組成物における造血障害回復剤及び免疫機能低下に対する賦活剤の含有量は、霊芝の抽出物（乾燥物換算）として、好ましくは０．５重量％以上、より好ましくは１重量％以上、更に好ましくは１０重量％以上であり、他方、好ましくは１００重量％以下、より好ましくは９０重量％以下、更に好ましくは５０重量％以下である。
【００１９】
医薬品は任意の投与形態で投与され得る。投与形態としては、例えば注射剤、坐剤、吸入薬、経皮吸収剤、外用剤等による非経口投与又は錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤等による経口投与が挙げられる。
このような種々の剤型の医薬品を調製するには、薬学的に許容される賦形剤、結合剤、増量剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、嬌味剤、香料、被膜剤、希釈剤等を適宜組み合わせて用いることができる。
【００２０】
また、食品又は他の組成物の形態は、固形、半固形又は液状であり得る。食品としては、例えば、パン類、ケーキ類、麺類、菓子類、ゼリー類、冷凍食品、アイスクリーム類、乳製品、飲料等の各種食品の他、上述した経口投与製剤と同様の形態（錠剤、カプセル剤、シロップ等）が挙げられる。
種々の形態の食品又は他の組成物を調製するには、他の食品材料や、溶剤、軟化剤、油、乳化剤、防腐剤、香科、安定剤、着色剤、酸化防止剤、保湿剤、増粘剤等を適宜組み合わせて用いることができる。
【００２１】
本発明の造血障害回復剤及び免疫機能低下に対する賦活剤の投与量又は摂取量は、対象者の状態、体重、性別、年齢又はその他の要因に従って変動し得るが、経口投与又は摂取の場合成人１人当たり、霊芝の抽出物（乾燥物換算）として、１日あたり１ｍｇ〜１００ｍｇ／ｋｇとすることが好ましい。
本発明の造血障害回復剤及び免疫機能低下に対する賦活剤を投与又は摂取する時期は、いずれの時期であってもよいが、放射線を照射する前又は後、或いは放射線を照射するのと同時が好ましい。
【実施例】
【００２２】
以下、本発明について実施例をあげて具体的に説明するが、本発明はこれらによって何等限定されるものではない。
【００２３】
１．霊芝抽出物
霊芝として直井霊芝（Ｌｏｔ  Ｎｏ．０００８）を用いた。粉砕した直井霊芝２００ｇに精製水２０００ｍＬを加え、１００℃で２時間撹拌抽出し、１２，０００ｒ／ｍｉｎ、１０分間遠心分離して熱水抽出液を得た。次いで、得られた熱水抽出液を真空凍結乾燥し、霊芝抽出物とした。収率は１９．６％であった。
霊芝抽出物の化学的組成を一般分析法により測定したところ、粗灰分４．５％（重量％、以下同じ）、粗蛋白１２．４％、粗脂質４．２％、粗繊維３０．２％、可溶性炭水化物２０．１％、水溶性全糖２６．８％、エルゴステロール１．８％であった。
また、霊芝抽出物の多糖体含有量は１４．２％であり、その組成は次のとおりであった。
【００２４】
【表１】
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【００２５】
次の試験には、霊芝抽出物の一定量を生理食塩水に溶解し、１２０℃、２０分間滅菌したものを使用した。
【００２６】
２．実験動物及び飼育条件
６週齢のＩＣＲ／Ｓｌｃ雄マウス（日本エスエルシー（株））を７日間予備飼育した後、一般症状観察および尿検査で異常が認められなかったマウスを試験に供した。マウスは、温度２３±２℃、相対湿度５５±５％のバリアシステムの環境下の飼育条件下で１群１０匹とし、プラスチックケージに５匹ずつ同居させ、固型飼料（クレアＣＥ−７）と水道水を自由に摂取させた。
【００２７】
３．Ｘ線照射条件
Ｘ線照射装置ＰＨＩＬＩＰＳ  ＭＧ２２６／４．５（フィリップス高精度Ｘ線発生装置）を用い、管電圧２００ＫＶ、管電流９ｍＡ、線量率０．３６５Ｇｙ／ｍｉｎの照射条件でマウスを１匹ずつアクリル板製の照射用カプセルに入れ、水平回転しながら線量７．０Ｇｙ、５．０ＧｙのＸ線全身照射を行った。
【００２８】
４．試験例１  成熟血球レベルと造血前駆細胞数の測定
測定では、５．０Ｇｙ照射・霊芝投与群、非照射群、５．０Ｇｙ照射群の３群を設定した。５．０Ｇｙ照射・霊芝投与群と５．０Ｇｙ照射群は、初日に線量５．０ＧｙのＸ線全身照射を行った。
５．０Ｇｙ照射・霊芝投与群では、Ｘ線全身照射の次の日から１０日間、霊芝抽出物の投与量を５００ｍｇ／ｋｇ×２／日としてマウスに０．２ｍＬ／マウス体重１０ｇの割合で、１日２回（朝・夕）連日経口投与した。１１日目にエーテル麻酔下、後大動脈よりそれぞれの個体につきヘパリン添加末梢血を採取した。
非照射群と５．０Ｇｙ照射群には霊芝抽出物の代わりに生理食塩液を同量投与し、５．０Ｇｙ照射・霊芝投与群と同様の処置を行った。
【００２９】
成熟血球レベルの検討では、赤血球数、白血球数、血小板数を全自動多項目分析装置（日本電子）で測定した。また、血液塗末標本を作製し、ギムザ染色を行い顕微鏡下で単球数、リンパ球数、顆粒球数を測定した。
【００３０】
マウスの脾臓細胞浮遊液及び骨髄細胞浮遊液の調製は仁保の方法に準じて行った（仁保喜之、マウス脾臓細胞における  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  コロニー形成法、日本免疫学会編  免疫実験操作法Ｂ  日本免疫学会  金沢：１３０１−１３０４、１９７８；仁保喜之、マウス骨髄細胞における  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  コロニー形成法、日本免疫学会編  免疫実験操作法Ｂ  日本免疫学会  金沢：１３０５−１３１０、１９７８）。
脾臓細胞浮遊液はマウスより脾臓を取り出し、あらかじめ４℃に冷却しておいたＥａｇｌｅｓ’  ＭＥＭ培地（Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，Ｎ．Ｙ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．）に移し、その後、２枚のスライドガラスを用いて脾臓を圧砕し、脾細胞浮遊液を得た。さらにステンレス製メッシュで濾過して単細胞浮遊液とし、培養あるいは抗体産生細胞検出に用いた。
大腿骨骨髄は一本を２０％牛胎児血清（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．）を含むＤＭＥＭ培地（Ｎｉｓｓｕｉ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏ．東京，日本）に浮遊し、大腿骨一本あたりの骨髄（有核）細胞数の算定を行った。
造血前駆細胞のＢＦＵ−Ｅ（Ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ  ｂｕｒｓｔ−ｆｏｒｍｉｎｇ  ｃｅｌｌ，前期赤芽球系前駆細胞）の測定では、マウス脾細胞又は骨髄細胞を２×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍｌ、ＣＦＵ−Ｅ（Ｃｏｌｏｎｙ−ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔ−ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｅｔｉｎ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ，後期赤芽球系前駆細胞）の測定では、マウス脾細胞又は骨髄細胞を２×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍＬ濃度で直径３５ｍｍのプラスチック製ペトリ皿（Ｆａｌｃｏｎ，Ｎｏ．１００８，Ｕ．Ｓ．Ａ．）を用いて２Ｕ／ｍＬ  ＥＰＯ（ヒト遺伝子組換リコンビナントエリスロポエチン  Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．）存在下で、メチルセルロース法にて培養した。
ＣＦＵ−ＧＭ（Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅｓ−ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｃｏｌｏｎｙ−ｆｏｒｍｉｎｇ  ｃｅｌｌ，顆粒球マクロファージコロニー形成細胞）の測定では、細胞を２×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍＬ濃度で１％  Ｐｏｋｅｗｅｅｄ  ｍｉｔｏｇｅｎ（ＧＩＢＣＯ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，Ｎ．Ｙ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．）、１０％牛胎児血清を含むＲＰＭＩ  １６４０培地（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．）に浮遊し、３７℃、５％ＣＯ2下で一週間培養した。
結果を表２に示す。
【００３１】
【表２】
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【００３２】
表２より、５．０Ｇｙ照射群では、非照射群と比較して末梢赤血球数、血小板数、末梢白血球数、顆粒球数、リンパ球数、単球数、前期赤芽球系前駆細胞数、後期赤芽球系前駆細胞数、顆粒球マクロファージコロニー形成細胞数、いずれも有意に減少した。これによって、放射線照射に伴って造血系細胞が障害を受けることが確認された。
他方、５．０Ｇｙ照射・霊芝投与群では、５．０Ｇｙ照射群と比較して、赤血球数と顆粒球を中心とした白血球数の有意な増加が認められた。また、骨髄、脾臓での前駆細胞であるＣＦＵ−ＧＭ数の有意な増加が認められ、霊芝の投与は、造血系細胞の増殖を刺激することが明らかとなった。さらに、未分化な赤血球系造血前駆細胞であるＢＦＵ−Ｅ数を骨髄、脾臓において顕著に増加させた。
【００３３】
５．試験例２  脾・胸腺指数と抗体産生細胞の測定
測定では、５．０Ｇｙ照射・霊芝投与群、非照射群、５．０Ｇｙ照射群の３群を設定した。マウスの脾臓・胸腺重量、脾細胞数、抗体産生細胞免疫応答試験はＳｉｍｐｓｏｎらの方法を改良した方法に準じて行った（Ｓｉｍｐｓｏｎ  ＭＡ，Ｇｏｚｚｏ  ＪＪ：Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｓｈｅｅｐ  ｒｅｄ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌ  ｈｅｍｏｌｙｓｉｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈ  ２１（１−２）：１５９−１６５、１９７８）。
５．０Ｇｙ照射・霊芝投与群と５．０Ｇｙ照射群は、初日に線量５．０ＧｙのＸ線全身照射を行った。５．０Ｇｙ照射・霊芝投与群では、Ｘ線全身照射の次の日から１０日間、霊芝抽出物の投与量を５００ｍｇ／ｋｇ×２／日としてマウスに０．２ｍＬ／マウス体重１０ｇの割合で、１日２回（朝・夕）連日経口投与した。１１日目にエーテル麻酔下、全採血を行い安楽殺した後、脾臓及び胸腺を摘出し、重量を測定した。
また、脾細胞１×１０7ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、ヒツジ赤血球１×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、１０％モルモット血清（補体血清）１ｍＬを混合し３７℃で１時間培養し、２，０００ｒ／ｍｉｎ、１０分間遠心分離を行った。得られた上清の４１３ｎｍにおける吸光度を測定して、抗体産生細胞を調べた。
結果を表３に示す。
【００３４】
【表３】
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【００３５】
表３より、５．０Ｇｙ照射群では、非照射群と比較して脾臓・胸腺重量、脾細胞数、ヒツジ赤血球に対する抗体産生細胞数（ＱＨＳ）は各々３０．１％、２５．９％、２２．６％、３０．３％減少した。
他方、５．０Ｇｙ照射・霊芝投与群では、脾臓・胸腺重量、脾細胞数及びＱＨＳは非照射群マウスのレベルに近く、いずれの数値も５．０Ｇｙ照射群と比較して有意な増加が認められた。これらより、霊芝は、放射線照射により障害された細網内皮系機能及び免疫リンパ系細胞の抗体産生能の賦活化、回復促進に有効であることが確認された。
【００３６】
６．試験例３  組織学的検査
測定では、７．０Ｇｙ照射・霊芝投与群、７．０Ｇｙ照射群の２群を設定し、初日に線量７．０ＧｙのＸ線全身照射を行った。
７．０Ｇｙ照射・霊芝投与群では、Ｘ線全身照射の次の日から１０日間、霊芝抽出物の投与量を５００ｍｇ／ｋｇ×２／日としてマウスに０．２ｍＬ／マウス体重１０ｇの割合で、１日２回（朝・夕）連日経口投与した。７．０Ｇｙ照射群には霊芝抽出物の代わりに生理食塩液を同量経口投与した。
Ｘ線全身照射から１１日目に、各群３例の脾臓及び胸腺を切除し、４℃で１０％ホルマリン液で固定した後、通常の方法により４μパラフィン切片を作製し、ヘマトキシリン・エオジン染色をして観察した。
なお、統計処理についてはＳｔｕｄｅｎｔ’ｓのｔ−ｔｅｓｔにより検定を行った。結果を図１に示す。
【００３７】
図１の（ａ）より、７．０Ｇｙ照射群の胸腺においては、リンパ球の破壊が強く、核破片、核濃縮を示す細胞が散在し、それに代わって大型の細網細胞が増殖していた。リンパ球は減少し、皮質・髄質境界が不明瞭となり、細網細胞に置き換えられた像が散見された。
図１の（ｂ）より、７．０Ｇｙ照射・霊芝投与群の胸腺においては、照射後の胸腺重量が著明に増加し、組織学的には放射線照射によりリンパ球が減少した７．０Ｇｙ照射群に比較して、強いリンパ球数の回復傾向が示された。
また、図１の（ｃ）より７．０Ｇｙ照射群の脾臓においては、白脾髄のリンパ球減少がみられ、リンパ濾胞は縮小した。赤脾髄には赤血球が破壊したものとみられる著明なヘモジデリン色素沈着が認められた。
図１の（ｄ）より、７．０Ｇｙ照射・霊芝投与群の脾臓においては照射後の脾臓重量が著明に増加し、組織学的にも放射線照射による赤血球の破壊、ヘモジデリン色素沈着はほとんど認められず、造血巣の回復が認められた。また、脾臓障害が軽減されることが確認された。
【００３８】
これらの結果より、霊芝の抽出物は、放射線で惹起される造血障害の回復促進に有用であり、また抗体産生免疫応答低下を賦活化させることが確認された。
【図１】
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