(57)【要約】【課題】簡便、かつ失活を抑えた方法で強固に固定化された、反応用固定化酵素を提供する。【解決手段】表面がフルオラス化された固体担体と、フルオラス基を有する修飾基で修飾された酵素との間のフルオラス−フルオラス相互作用を利用して担体に固定化された固定化酵素であって、該固体担体が少なくともメソ領域に空孔を有する多孔質であることを特徴とする固定化酵素である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面がフルオラス化されたメソ領域の空孔を有する多孔質な固体担体に、フルオラス基含有基で修飾された酵素が固定化されたことを特徴とする固定化酵素。
【請求項２】
該酵素を修飾するフルオラス基含有基が、炭素数２０個以上のパーフルオロアルキル基である、請求項１に記載の固定化酵素。
【請求項３】
固体担体が、炭素数５個以上のパーフルオロアルキル基でフルオラス化された、請求項１または２に記載の固定化酵素。
【請求項４】
酵素を修飾するフルオラス基含有基と該酵素とが、非共有結合で結合した、請求項１〜３のいずれかに記載の固定化酵素。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、主として合成等の各種反応に用いられる酵素を、フルオラス−フルオラス相互作用を利用して担体に固定化した、固定化酵素に関する。
【背景技術】
【０００２】
酵素を用いた合成反応は、常温・常圧付近で反応が行えること、選択性・特異性に優れ、時に化学合成では実現困難な反応まで成し遂げられることから、近年ますます盛んになっている。使い捨ての場合を除き、特に高価な酵素を繰り返し使用する場合は、通常、酵素は固体担体に固定化して用いられることが多いが、その固定化の方法としてはアミドやエステル等を形成する縮合反応や、エポキシ基の開環反応によりエーテル結合を生成させる等の反応が利用されてきた。しかし、酵素の活性を維持したままこれらの反応を成し遂げるためには多くの制約があった。
【０００３】
その他、固定化する方法として疎水基を導入する方法がある。酵素への疎水基（長鎖アルキル基等）導入には化学反応を利用する必要はあるが、固体担体への固定化においては、やはり疎水基を導入した固体担体との疎水性相互作用によりソフトに固定化させる方法も知られてはいた。しかしこの場合は疎水基によって酵素の高次構造が変質してしまうという欠点があった。
【０００４】
ところで同じ疎水基でもフルオラス基の場合、アルキル基のような疎水基とは相互作用せず、フルオラス基同士でのみ相互作用することが知られている。したがって、フルオラス基の場合は酵素の疎水性基とは相互作用しないため、高次構造の変質が抑えられると期待される。その効果を期待して、フルオラス−フルオラス相互作用を利用して酵素等のタンパク質を固定化する方法はいくつか知られていた。
【０００５】
特許文献１には、Ｃ８Ｆ１７基からなるフルオラス基を、カルボン酸チオエステル基を有するスペーサーを介し、該カルボン酸チオエステル基とタンパク質のチオール基との縮合反応で結合させ、フッ素樹脂等の基板に固定化する方法が開示されている。
特許文献２には、一般論としてタンパク質や炭水化物に、特有のフルオラスタグであるフルオラスレブリネート（Ｃ６Ｆ１３基を含む）やフルオラスアリル（Ｃ８Ｆ１７基を含む）を、グリコシル化反応で結合させ、Ｃ８Ｆ１７基を表面に導入したガラス基板に固定化させる方法が開示されている。
【０００６】
非特許文献１には、スペーサーを介してＣ８Ｆ１７基を有するカルボン酸を、酵素等のタンパク質表面の１級アミノ基とアミド結合で結合させ、固体フルオロカーボン上に固定化させる方法が開示されている。
非特許文献２には、３個のＣ８Ｆ１７基を有するフルオラスタグを、アミド結合によりタンパク質に結合させ、Ｃ８Ｆ１７基を表面に導入したガラス基板に固定化させる方法が開示されている。
【０００７】
しかしながらこれらの方法は主として分析を目的とした固定化法で、合成反応に求められるような、強い激しい撹拌や洗浄操作に耐え得る程の強い結合力を有するものではなかった。
そもそもフルオラス−フルオラス相互作用は極めて弱い結合力しか示さず、強固な固定を達成することは従来困難であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００７−１８７６４７
【特許文献２】特表２００８−５３２０４５
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １９８９，  ７, １０１
【非特許文献２】ＣｈｅｍＰｌｕｓＣｈｅｍ  ２０１２，  ７７，  １０６６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、固定化における酵素へのダメージを極力抑えつつ、担体に強固に固定化された固定化酵素を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、フルオラス−フルオラス相互作用という極めて弱い作用を利用しつつも、特定の構造の多孔質担体に固体化することで強固に固定化された固定化酵素が得られることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
すなわち本発明は、以下の通りである。
（１）表面がフルオラス化されたメソ領域の空孔を有する多孔質な固体担体に、フルオラス基含有基で修飾された酵素が固定化されたことを特徴とする固定化酵素。
（２）該酵素を修飾するフルオラス基含有基が、炭素数２０個以上のパーフルオロアルキル基である、（１）に記載の固定化酵素。
（３）固体担体が、炭素数５個以上のパーフルオロアルキル基でフルオラス化された、（１）または（２）に記載の固定化酵素。
（４）酵素を修飾するフルオラス基含有基と該酵素とが、非共有結合で結合した、（１）〜（３）のいずれかに記載の固定化酵素。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の固定化酵素は、フルオラス−フルオラス相互作用というソフトな相互作用で担体に固定化させているため、固定化過程における酵素の活性低下を抑制しているにも関わらず、担体には強固に固定化されているため、合成反応等で激しい撹拌操作にさらされたり、回収再利用のための洗浄工程においても脱落することなく活性を維持し続けられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、表面がフルオラス化された固体担体と、フルオラス基含有基で修飾された酵素との間のフルオラス−フルオラス相互作用を利用して担体に固定化された固定化酵素であるが、本来、フルオラス−フルオラス相互作用は極めて弱い相互作用であるため、強固な固定化は不可能であった。しかしながら、本発明者らは、該固体担体が少なくともメソ領域に空孔を有する多孔質であれば強固に固定できることを見出した。空孔のサイズ、すなわち細孔径はメソ領域である２ｎｍ以上、５０ｎｍ以下の範囲であればよい。最適なサイズは酵素のサイズにもよるので一概には決められないが、一般的には３ｎｍ以上が好ましく、４ｎｍ以上がより好ましく、５ｎｍ以上がさらに好ましい。一方、細孔径が大きすぎると保持の効果が弱まるので３０ｎｍ以下が好ましく、２０ｎｍ以下がさらに好ましい。
【００１５】
このような多孔質の固体担体の素材としてはとしては、一般的なシリカ、アルミナ、ポリマー系など、クロマトなどの担体として使われるものが使用可能である。さらにはメソ領域に空孔を有する材料として、メソポーラスシリカ等の各種メソポーラス材料が使用可能である。そのような固体担体の表面フルオラス化については、例えばシリカ等の材料であれば
Ｒ１Ｒ２２Ｓｉ（ＣＨ２）ｎＲｆ
（式中、Ｒ１はＣｌ、ＭｅＯ、ＥｔＯのいずれか、Ｒ２はＭｅまたはＣｌ、ＭｅＯ、ＥｔＯのいずれか、ｎは２または３、Ｒｆはパーフルオロアルキル基）
で表される一般的なシラン処理剤で処理して製造されたものが例示され、また下記のようなフルオラスシリカとして市販されている市販品が使用可能である。
【００１６】
１）ＦｌｕｏｒｏＦｌａｓｈ（登録商標、フルオラステクノロジー社製）（細孔径６ｎｍ）
フルオラス基として−ＣＦ２ＣＦ２ＣＦ２ＣＦ２ＣＦ２ＣＦ２ＣＦ２ＣＦ３基を有する
２）ＦｌｕｏｆｉｘII１２０Ｅ（登録商標、残存シラノール基がエンドキャップされたもの、和光純薬社製）（細孔径１２ｎｍ）
フルオラス基として−Ｃ（ＣＦ３）２ＣＦ２ＣＦ２ＣＦ３基を有する
【００１７】
尚、このようなシリカ由来の材料の場合、残存シラノール基が酸性基として酵素の活性を阻害する場合があるが、そのような場合はＦｌｕｏｆｉｘII１２０Ｅ(登録商標)のようにシラノール基をエンドキャップ処理により不活性化したり、あるいは塩基性化合物による中和処理を施した後に用いることができる。
【００１８】
固体担体をフルオラス化するフルオラス基はパーフルオロアルキル基であればよく、分岐やエーテル基を挟んでいてもよい。また一部がヘテロ原子で置換されていてもよい。しかしながら、より強固な保持性を得るためには該フルオラス基は炭素数５個以上のパーフルオロアルキル基が好ましく、炭素数６個以上がより好ましく、炭素数８個以上がさらに  好ましい。一方、フルオラス基が大きすぎると空孔を塞いでしまうので、好ましい上限は概ね炭素数２０個程度である。
【００１９】
また、固体担体をフルオラス化するフルオラス基の量をフッ素含量で表すと、好ましいフッ素含量は３ｗｔ％以上であり、より好ましくは５ｗｔ％以上、さらに好ましくは８ｗｔ％以上である。
【００２０】
一方、酵素を修飾するフルオラス基含有基中のフルオラス基は、公知技術で使用されているようなＣ８Ｆ１７基等を含むフルオラスタグでもよいが、一般に酵素表面にはフルオラスタグで修飾できる部位の数に限りがあり、強固な固定に十分な量のフルオラス基を導入するためにはなるべく長鎖のフルオラス基が望ましい。すなわち、該酵素を修飾するフルオラス基含有基が、炭素数２０個以上のパーフルオロアルキル基を有することが好ましい。さらに好ましくは炭素数３０個以上のパーフルオロアルキル基を有することが好ましい。またパーフルオロアルキル基の鎖長が長すぎると、酵素に比べ、フルオラス基の比率が高すぎるので、概ね炭素数２００個以下が好ましい。該パーフルオロアルキル基には分岐があっても差支えない。また、エーテル基等のヘテロ原子を挟んでいてもよい。また、フルオラス基と酵素を修飾するための官能基との間にスペーサーがあっても構わない。
【００２１】
通常、酵素を修飾する方法としては、従来技術にみられるように、例えば修飾基を有するカルボン酸と酵素表面の１級アミノ基とのアミド結合等の共有結合で結合させる方法が取られる。本発明においてもこのような従来法を用いてもよいが、共有結合生成過程においては一般に縮合剤等の試薬を必要とし、また酵素活性を損なわない反応条件を設定する必要があるため、適用できる修飾基の種類や反応条件に多くの制約があった。
【００２２】
その点、非共有結合であるイオン結合や配位結合を利用すれば官能基同士を混合・接触させるだけで結合を形成させることができ、非常に簡便な方法を採用できる。具体的には、フルオラス基を含有するカルボン酸やスルホン酸やリン酸等の酸性基と酵素表面の塩基性基とのイオン結合生成、フルオラス基を含有するアミノ基等の塩基性基と酵素表面のカルボン酸等の酸性基とのイオン結合生成、フルオラス基を含有するカルボン酸やスルホン酸等と酵素表面のエーテル基、水酸基、チオール基等との配位結合生成等が挙げられ、それらが組み合わされたものでもよい。
【００２３】
したがって本発明において好適なフルオラス基含有基化合物としては、酸性基であればＲｆＣＯＯＨ（Ｒｆはパーフルオロアルキル基、以下同様）、ＲｆＳＯ３Ｈ等が例示され、塩基性基であればＲｆＣＯＮＨＲＮＨ２（Ｒはアルキレン基、以下同様）、ＲｆＳＯ２ＮＨＲＮＨ２等が例示される。さらに具体的には、市販品であるＫｒｙｔｏｘ１５７ＦＳ（Ｌ）（登録商標、デュポン社製）、
Ｆ［ＣＦ（ＣＦ３）ＣＦ２Ｏ］≒１５ＣＦ（ＣＦ３）ＣＯＯＨ
１５７ＦＳ（Ｍ）、
Ｆ［ＣＦ（ＣＦ３）ＣＦ２Ｏ］≒３０ＣＦ（ＣＦ３）ＣＯＯＨ
１５７ＦＳ（Ｈ）、
Ｆ［ＣＦ（ＣＦ３）ＣＦ２Ｏ］≒４５ＣＦ（ＣＦ３）ＣＯＯＨ
ＫＤＰ４６０６（デュポン社製）、
Ｆ［ＣＦ（ＣＦ３）ＣＦ２Ｏ］≒８ＣＦ（ＣＦ３）ＣＯＯ−ＮＨ４＋
及びそれらにアミド結合を介して末端アミノ基を導入した化合物等が挙げられる。
【００２４】
次にイオン結合を形成して酵素をフルオラス基含有基で修飾する方法を例示する。酵素はまず、その活性を損なわないようなバッファー溶液に溶解させておく。一方、上記のようなフルオラス基含有基化合物はパーフルオロカーボン（３Ｍ社製のＦＣ７２等）やパーフルオロポリエーテル（ソルベイソレクシス社製のＧａｌｄｅｎ（登録商標）等）のようなフルオラス溶媒に溶解させておく。一般に後者の濃度は、酵素上のイオン結合生成基の量より過剰に設定される。両者を混合し、必要により激しく撹拌し、静置または遠心分離等の方法で液々分離を行う。この段階で下層であるフルオラス溶液には、酵素がイオン結合によりフルオラス基含有基で修飾された状態で溶解している。
【００２５】
尚、酵素が十分にフルオラス基含有基で修飾されているかどうかはフルオラス溶媒への溶解性が一つの目安となる場合がある。すなわち、修飾するフルオラス基の数や鎖長が不十分な場合、上記操作ではフルオラス溶媒に溶解しない場合もある。
【００２６】
次に、フルオラス基含有基で修飾された酵素を、表面がフルオラス化された固体担体に固定化する方法を例示するが、極めて単純で、上記溶液を該固体担体と混合し、フルオラス溶媒を蒸発乾固させるだけである。この際、該酵素は固体担体の外表面等、空孔以外の部分にも弱い結合力で固定化されるが、その部分は一般有機溶媒等で洗浄して洗い落とすことで活性が安定に保たれた固定化酵素とすることができる。しかしながら、この洗浄工程を省略し、そのまま反応に供すれば、初期の１，２回の反応及び反応後の洗浄過程で弱く結合した酵素は脱落し、その後の反応では初期より活性は低下するものの、強固に固定化された酵素のみが反応にかかわるようになるので、そのような使用法も可能である。
【００２７】
本発明の固定化酵素を形成する酵素の種類には特に制限はないが、リパーゼ等の加水分解酵素、ラッカーゼやペルオキシダーゼ等の酸化酵素、α−キモトリプシン等のプロテアーゼ、セルラーゼ、糖転移酵素等が例示される。
【実施例】
【００２８】
以下に実施例を挙げて、本発明を具体的に説明する。
［実施例１］
（酵素のフルオラス化）
リパーゼＡＫアマノ（ワコーケミカル社製）６０ｍｇを５ｍｌの５０ｍＭ炭酸塩ｐＨ緩衝液に溶解し、Ｋｒｙｔｏｘ１５７ＦＳ（Ｌ）（登録商標、デュポン社製）の３ｍＭＧａｌｄｅｎＳＶ１１０（登録商標、ソルベイソレクシス社製）溶液１０ｍｌと混合し、２分間激しく撹拌した。遠心分離（８０００ｒｐｍ，５分）の後、下相を分離した。該操作を１０回繰り返し、得られた溶液はまとめて、無灰パルプと０．４５μｍのメンブレンフィルターで濾過した。
得られたＧａｌｄｅｎＳＶ１１０（登録商標）溶液には、ＵＶ測定の結果、２．２ｍｇ／ｍｌの濃度でフルオラス基含有基で修飾されたリパーゼＡＫアマノが溶解していた。
【００２９】
（酵素の固定化）
フルオラス基として−ＣＦ２ＣＦ２ＣＦ２ＣＦ２ＣＦ２ＣＦ２ＣＦ２ＣＦ３基を有するフルオラスシリカＦｌｕｏｒｏＦｌａｓｈ（登録商標、フルオラステクノロジー社製）（残存酸性基中和のため、事前にＥｔ３Ｎで処理したもの）（細孔径６ｎｍ、フッ素含量１２ｗｔ％）０．６ｇに前記溶液４ｍｌを加え、３０℃を保ったまま減圧で溶媒留去した。リパーゼＡＫアマノを１４ｍｇ／ｇ含む０．６２ｇの固定化酵素を得た。
【００３０】
（固定化酵素を用いた反応）
デカンを内標とし、０．５ｍｍｏｌイソブチルアルコールを１．５ｍｌの酢酸ビニルに溶解した溶液に、上記固定化酵素０．２５ｇを加え、３７℃で２４時間撹拌した。反応をＧＣで分析したところ、９５％の収率で酢酸イソブチルが生成していた。反応液を濾過後、固定化酵素を洗浄、乾燥して同条件で再使用した。以下、２回目以降の収率は、７２％（２回目）、６７％（３回目）、６２％（４回目）、６３％（５回目）であり、２回目以降はほぼ一定の活性を保っていた。
【００３１】
［実施例２］
酵素を固定化する際、リパーゼＡＫアマノのＧａｌｄｅｎＳＶ１１０（登録商標）溶液を８ｍｌとした以外は実施例１と同様に固定化操作を行い、リパーゼＡＫアマノを２７ｍｇ／ｇ含む０．６４ｇの固定化酵素を得た。
得られた固定化酵素を用い、実施例１と同様に反応を繰り返し行った結果、収率はそれぞれ９５％（１回目）、９２％（２回目）、８９％（３回目）、８９％（４回目）、８４％（５回目）であった。
【００３２】
［実施例３］
Ｅｔ３Ｎの代わりにアンモニアを用いて残存酸性基中和処理したＦｌｕｏｒｏＦｌａｓｈ（登録商標）を用いた以外、実施例１と同様に固定化操作を行い、リパーゼＡＫアマノを１４ｍｇ／ｇ含む０．６３ｇの固定化酵素を得た。
得られた固定化酵素を用い、実施例１と同様に反応を繰り返し行った結果、収率はそれぞれ６６％（１回目）、３０％（２回目）、２６％（３回目）、３９％（４回目）、３２％（５回目）であり、２回目以降はほぼ一定の活性を保っていた。
【００３３】
［実施例４］
Ｅｔ３Ｎの代わりに４−ジメチルアミノピリジンを用いて残存酸性基中和処理したＦｌｕｏｒｏＦｌａｓｈ（登録商標）を用いた以外、実施例１と同様に固定化操作を行い、リパーゼＡＫアマノを１４ｍｇ／ｇ含む０．６２ｇの固定化酵素を得た。
得られた固定化酵素を用い、実施例１と同様に反応を繰り返し行った結果、収率はそれぞれ１００％（１回目）、１００％（２回目）、１００％（３回目）、９７％（４回目）、９０％（５回目）であった。
【００３４】
［実施例５］
Ｅｔ３Ｎの代わりにＫＦを用いて残存酸性基中和処理したＦｌｕｏｒｏＦｌａｓｈ（登録商標）（フッ素含量２１ｗｔ％）を用いた以外、実施例１と同様に固定化操作を行い、リパーゼＡＫアマノを１３ｍｇ／ｇ含む０．６２ｇの固定化酵素を得た。
得られた固定化酵素を用い、実施例１と同様に反応を繰り返し行った結果、収率はそれぞれ９９％（１回目）、９０％（２回目）、８７％（３回目）、７９％（４回目）、７５％（５回目）であった。
【００３５】
［実施例６］
フルオラス基として−Ｃ（ＣＦ３）２ＣＦ２ＣＦ２ＣＦ３基を有するフルオラスシリカＦｌｕｏｆｉｘII１２０Ｅ（登録商標、残存シラノール基がエンドキャップされたもの、和光純薬社製）（細孔径１２ｎｍ、フッ素含量１４．５ｗｔ％）０．５ｇに、実施例１のリパーゼＡＫアマノのＧａｌｄｅｎＳＶ１１０（登録商標）溶液を４ｍｌ加え、３０℃を保ったまま減圧で溶媒留去した。リパーゼＡＫアマノを１７ｍｇ／ｇ含む０．５２ｇの固定化酵素を得た。
得られた固定化酵素を用い、実施例１と同様に反応を繰り返し行った結果、収率はそれぞれ９８％（１回目）、６７％（２回目）、４２％（３回目）、４１％（４回目）、３９％（５回目）であり、３回目以降はほぼ一定の活性を保っていた。
【００３６】
［比較例１］
実施例１で用いた固定化酵素の代わりに、実施例１で担体として用いたＦｌｕｏｒＦｌａｓｈ（登録商標、Ｅｔ３Ｎで処理したもの）を０．５ｇに増やして用い、実施例１と同様の反応を行った。その結果、２４時間後の収率は２．８％であった。
【００３７】
［比較例２］
実施例４で用いた固定化酵素の代わりに、実施例４で担体として用いたＦｌｕｏｒＦｌａｓｈ（登録商標、４−ジメチルアミノピリジンで処理したもの）を０．５ｇに増やして用い、実施例１と同様の反応を行った。その結果、２４時間後の収率は２．５％であった。
【００３８】
［比較例３］
表面がフルオラス化されていないクロマト用のシリカゲル６０（メルク社製、細孔径６ｎｍ）を用いた以外、実施例１と同様に固定化操作を行い、リパーゼＡＫアマノを１４ｍｇ／ｇ含む０．６４ｇの固定化酵素を得た。
得られた固定化酵素を用い、実施例１と同様に反応を繰り返し行った結果、収率はそれぞれ８４％（１回目）、５４％（２回目）、３６％（３回目）、２６％（４回目）、１６％（５回目）であった。
【００３９】
［比較例４］
（表面フルオラス化）
無孔質シリカＮＰ−２００（ＡＧＣエスアイテック社製）５ｇにトルエン３０ｍｌ、（ＥｔＯ）３ＳｉＣＨ２ＣＨ２Ｃ８Ｆ１７を５ｇ加え、２４時間加熱還流した。反応後濾過し、トルエン、アセトンで洗浄後、１００℃で真空乾燥した。フルオラス基として−ＣＦ２ＣＦ２ＣＦ２ＣＦ２ＣＦ２ＣＦ２ＣＦ２ＣＦ３基を有する無孔質シリカ（フッ素含量２．８ｗｔ％）を５．３２ｇ得た。
【００４０】
（酵素の固定化と該固定化酵素を用いた反応）
上記担体を用いた以外、実施例１と同様に固定化操作を行い、リパーゼＡＫアマノを１４ｍｇ／ｇ含む０．６３ｇの固定化酵素を得た。
得られた固定化酵素を用い、実施例１と同様に反応を繰り返し行った結果、収率はそれぞれ７２％（１回目）、４９％（２回目）、１１％（３回目）、２．６％（４回目）、１．６％（５回目）であった。
【００４１】
［参考例］
Ｋｒｙｔｏｘ１５７ＦＳ（Ｌ）（登録商標）の代わりにＦ［ＣＦ（ＣＦ３）ＣＦ２Ｏ］３ＣＦ（ＣＦ３）ＣＯＯＨを用いた以外、実施例１と同様に酵素のフルオラス化を行ったが、得られたＧａｌｄｅｎＳＶ１１０（登録商標）溶液にはリパーゼＡＫアマノは溶解していなかった。
【産業上の利用可能性】
【００４２】
本発明の固定化酵素は、失活を抑制したソフトな方法で固定化されているにもかかわらず、強固に固定化されており、激しい撹拌や洗浄に耐え、繰り返し使用可能なため、産業上有用である。