(57)【要約】【課題】１−オクテン−３−オールの製造法を提供する。【解決手段】１−オクテン−３−オールを生産する能力を有するニューロスポラ・シトフィラ（Neurospora sitophila）を、麦芽エキスおよび乳化剤を含有する培地で培養することにより、１−オクテン−３−オールを製造する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
１−オクテン−３−オールを生産する能力を有するニューロスポラ・シトフィラ（Neurospora sitophila）を、麦芽エキスおよび乳化剤を含有する培地で培養することを特徴とする、１−オクテン−３−オールの製造方法。
【請求項２】
培地中の麦芽エキスの濃度が、２．５％〜２０％である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
培地中の乳化剤の濃度が、０．０００５％〜０．３％である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
麦芽エキス濃度に対する乳化剤濃度の比率（乳化剤濃度／麦芽エキス濃度）が、０．０３％〜２％である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記乳化剤が、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、モノグリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリンポリリシノレート、ソルビタン脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステル、酸素分解レシチンからなる群より選択される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、風味素材の製造法、具体的には１−オクテン−３−オールの製造法、に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
１−オクテン−３−オール（1-octen-3-ol）は、分子式Ｃ8Ｈ16Ｏで表される不飽和ア
ルコールである。１−オクテン−３−オールは、別名マツタケオールとも呼ばれ、マツタケを始めとする多くのキノコ類に見られる。１−オクテン−３−オールは、香料等の風味成分として、飲食品に配合して利用することができる。
【０００３】
１−オクテン−３−オールは、一般的に、キノコの菌糸体中で合成されることが知られている。そのようにして合成された１−オクテン−３−オールを利用するためには、キノコの菌糸体からの抽出および精製が必要となる（非特許文献１〜３）。また、菌糸体から抽出して得られた１−オクテン−３−オールには菌糸体に由来する異風味があり、風味成分として利用するには問題があった。
【０００４】
一方、微生物を用いた発酵法により１−オクテン−３−オールを製造する試みもなされている。例えば、カビの一種であるニューロスポラ・シトフィラ（Neurospora sitophila）を、麦芽エキスを含有する培地で培養することにより、１−オクテン−３−オールを生成できることが知られている（非特許文献４）。Neurospora sitophilaによる１−オクテン−３−オールの生成量は２０ｐｐｍ程度であった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Smadar Assaf et al., Enz. Microb. Technol., 21, 484-490 (1997)
【非特許文献２】Kenji Matsui et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 67(10), 2280-2282 (2003)
【非特許文献３】Roland Tressel et al, J. Agric. Food. Chem., 30, 89-93 (1982)
【非特許文献４】Hiromasa Yamauchi et al, Agric. Biol. Chem., 55(12), 3115-3116 (1991)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、１−オクテン−３−オールの製造法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、麦芽エキスおよび乳化剤を含有する培地でニューロスポラ・シトフィラ（Neurospora sitophila）を培養することにより１−オクテン−３−オールを効率的に製造できることを見出し、本発明を完成させた。
【０００８】
すなわち、本発明は以下のとおり例示できる。
［１］
１−オクテン−３−オールを生産する能力を有するニューロスポラ・シトフィラ（Neurospora sitophila）を、麦芽エキスおよび乳化剤を含有する培地で培養することを特徴と
する、１−オクテン−３−オールの製造方法。
［２］
培地中の麦芽エキスの濃度が、２．５％〜２０％である、［１］に記載の方法。
［３］
培地中の乳化剤の濃度が、０．０００５％〜０．３％である、［１］または［２］に記載の方法。
［４］
麦芽エキス濃度に対する乳化剤濃度の比率（乳化剤濃度／麦芽エキス濃度）が、０．０３％〜２％である、［１］〜［３］のいずれかに記載の方法。
［５］
前記乳化剤が、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、モノグリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリンポリリシノレート、ソルビタン脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステル、酸素分解レシチンからなる群より選択される、［１］〜［４］のいずれかに記載の方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、１−オクテン−３−オールを効率的に製造することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、本発明を詳細に説明する。なお、本発明において、濃度は、特記しない限り質量を基準とする濃度である。すなわち、例えば、「％」は特記しない限り「質量％」を、「ｐｐｍ」は特記しない限り「質量ｐｐｍ」を、「ｐｐｂ」は特記しない限り「質量ｐｐｂ」を示す。
【００１１】
＜１＞本発明の１−オクテン−３−オールの製造方法
本発明の１−オクテン−３−オールの製造方法は、１−オクテン−３−オールを生産する能力を有するニューロスポラ・シトフィラ（Neurospora sitophila）を、麦芽エキスおよび乳化剤を含有する培地で培養することを特徴とする、１−オクテン−３−オールの製造方法、である。同方法において用いられるNeurospora sitophilaを、「本発明の微生物」ともいう。同方法において用いられる培地を、「本発明の培地」ともいう。
【００１２】
＜１−１＞本発明の微生物
本発明の微生物は、１−オクテン−３−オールを生産する能力を有するNeurospora sitophilaである。「１−オクテン−３−オールを生産する能力」とは、麦芽エキスおよび乳化剤を含有する培地中で本発明の微生物を培養したときに、１−オクテン−３−オールを生成し、培地中に蓄積する能力をいう。１−オクテン−３−オールの培地中での蓄積量は、特に制限されないが、例えば、１ｐｐｍ以上、５ｐｐｍ以上、１０ｐｐｍ以上、または２０ｐｐｍ以上であってよく、１００ｐｐｍ以下、８０ｐｐｍ以下、または５０ｐｐｍ以下であってもよい。本発明の微生物は、麦芽エキスおよび／または乳化剤を含有しない培地で培養した場合には、１−オクテン−３−オールを培地中に蓄積することができてもよく、できなくてもよい。
【００１３】
Neurospora sitophilaとしては、微生物学の専門家に知られている分類によりNeurospora sitophilaに分類される微生物を用いることができる。１−オクテン−３−オールを生産する能力を有するNeurospora sitophilaとして、具体的には、例えば、Neurospora sitophila JCM22453（IFO 4596）株が挙げられるが、それには限定されない。同株は、独立
行政法人  理化学研究所  バイオリソースセンター（郵便番号305-0074  日本国茨城県つくば市高野台3-1-1）から分譲を受けることができる。
【００１４】
＜１−２＞本発明の培地
本発明の培地は、麦芽エキスおよび乳化剤を含有する。
【００１５】
麦芽エキスとは、麦芽から抽出された糖の濃縮物をいい、具体的には、麦芽を糖化して得られる麦汁の濃縮物をいう。麦芽エキスは、経口摂取可能なものであれば特に制限されない。
【００１６】
麦芽エキスとしては、市販品を用いてもよく、適宜製造して取得したものを用いてもよい。
【００１７】
麦芽エキスの製造方法は特に制限されず、例えば公知の方法を利用できる。麦芽エキスは、具体的には、例えば、大麦を発芽させ、乾燥し、粉末にし、水分を加えて加温して糖化させ、糖化液を濃縮することにより製造できる。麦芽エキスは、乾燥させて粉末等の固形状に調製することもできる。
【００１８】
麦芽エキスとしては、１種の麦芽エキスを用いてもよく、２種またはそれ以上の麦芽エキスを組み合わせて用いてもよい。
【００１９】
乳化剤は、経口摂取可能なものであれば特に制限されない。
【００２０】
経口摂取可能な乳化剤としては、例えば、エステルエーテル型乳化剤、エステル型乳化剤、その他各種乳化剤が挙げられる。
【００２１】
エステルエーテル型乳化剤としては、例えば、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルが挙げられる。
【００２２】
ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルとして、具体的には、例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウリン酸エステル（Tween 20）、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアリン酸エステル（Tween 60）、ポリオキシエチレンソルビタントリステアリン酸エステル（Tween 65）、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレイン酸エステル（Tween 80）が挙げられる。
【００２３】
エステル型乳化剤としては、例えば、グリセリン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステルが挙げられる。エステル型乳化剤を構成する脂肪酸は特に制限されない。エステル型乳化剤を構成する脂肪酸として、具体的には、例えば、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、カプリル酸、カプリン酸、ベヘニン酸、エルカ酸が挙げられる。
【００２４】
グリセリン脂肪酸エステルとしては、例えば、モノグリセリン脂肪酸エステル、有機酸モノグリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリンポリリシノレート、が挙げられる。
【００２５】
モノグリセリン脂肪酸エステルとしては、例えば、モノグリセリン高級脂肪酸エステル、モノグリセリン中鎖脂肪酸エステルが挙げられる。モノグリセリン高級脂肪酸エステルとして、具体的には、例えば、オレイン酸モノグリセリド、オレイン酸ジグリセリド、ステアリン酸モノグリセリド、ステアリン酸ジグリセリド、パーム硬化油モノグリセリド、ナタネ硬化油脂肪酸モノグリセリド、ナタネ硬化油脂肪酸ジグリセリドが挙げられる。モノグリセリン中鎖脂肪酸エステルとして、具体的には、例えば、カプリル酸モノグリセリド、カプリル酸ジグリセリド、ラウリン酸モノグリセリド、カプリン酸モノグリセリドが挙げられる。
【００２６】
有機酸モノグリセリン脂肪酸エステルとは、モノグリセリン脂肪酸エステルのヒドロキシル基にさらに有機酸がエステル結合した誘導体をいう。有機酸モノグリセリン脂肪酸エステルを構成する有機酸として、具体的には、例えば、酢酸、クエン酸、コハク酸、ジアセチル酒石酸、乳酸が挙げられる。有機酸モノグリセリン脂肪酸エステルとして、具体的には、例えば、50％アセチル化モノステアリン酸グリセリン、乳酸モノステアリン酸グリセリン、クエン酸モノステアリン酸グリセリン、クエン酸モノオレイン酸グリセリン、コハク酸モノステアリン酸グリセリン、ジアセチル酒石酸モノステアリン酸グリセリンが挙げられる。
【００２７】
ポリグリセリン脂肪酸エステルとして、具体的には、例えば、モノオレイン酸ジグリセリン、ジオレイン酸ジグリセリン、モノステアリン酸ジグリセリン、ジステアリン酸ジグリセリン、モノステアリン酸ジグリセリン、ペンタオレイン酸デカグリセリン、ペンタステアリン酸デカグリセリン、デカオレイン酸デカグリセリン、デカステアリン酸デカグリセリン、トリオレイン酸ペンタグリセリン、ヘキサステアリン酸ペンタグリセリン、モノラウリン酸デカグリセリン、モノミリスチン酸デカグリセリン、モノオレイン酸デカグリセリン、モノステアリン酸デカグリセリン、ジステアリン酸デカグリセリン、モノラウリン酸ペンタグリセリン、モノミリスチン酸ペンタグリセリン、モノオレイン酸ペンタグリセリン、モノステアリン酸ペンタグリセリンが挙げられる。
【００２８】
ポリグリセリンポリリシノレートとして、具体的には、例えば、縮合リシノレイン酸テトラグリセリン、縮合リシノレイン酸ヘキサグリセリン、縮合リシノレイン酸ペンタグリセリンが挙げられる。
【００２９】
ソルビタン脂肪酸エステルとして、具体的には、例えば、モノステアリン酸ソルビタン、モノオレイン酸ソルビタンが挙げられる。
【００３０】
プロピレングリコール脂肪酸エステルとして、具体的には、例えば、モノステアリン酸プロピレングリコール、モノオレイン酸プロピレングリコールが挙げられる。
【００３１】
ショ糖脂肪酸エステルとして、具体的には、例えば、ショ糖ラウリン酸エステル、ショ糖ミリスチン酸エステル、ショ糖パルミチン酸エステル、ショ糖ステアリン酸エステル、ショ糖オレイン酸エステル、ショ糖ベヘニン酸エステル、ショ糖エルカ酸エステル、ショ糖混合脂肪酸エステル（例えば、オレイン酸、パルミチン酸、ステアリン酸の混合エステル）が挙げられる。
【００３２】
その他各種乳化剤としては、例えば、レシチン、酵素分解レシチン、サポニン、カゼインナトリウムが挙げられる。
【００３３】
レシチンとして、具体的には、例えば、大豆レシチン、卵黄レシチンが挙げられる。酸素分解レシチンとして、具体的には、例えば、酵素分解大豆レシチン、酵素分解卵黄レシチンが挙げられる。サポニンとして、具体的には、例えば、キラヤ、大豆、茶種子、エンジュのサポニンが挙げられる。
【００３４】
乳化剤は、例えば、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、モノグリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリンポリリシノレート、ソルビタン脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステル、酸素分解レシチンからなる群より選択されてもよい。
【００３５】
乳化剤としては、市販品を用いてもよく、適宜製造して取得したものを用いてもよい。
【００３６】
乳化剤の製造方法は特に制限されず、例えば公知の方法を利用できる。例えば、グリセリンの脂肪酸エステルは、グリセリンと脂肪酸のエステル化反応またはグリセリンと油脂のエステル交換反応により製造することができる。
【００３７】
乳化剤としては、１種の乳化剤を用いてもよく、２種またはそれ以上の乳化剤を組み合わせて用いてもよい。
【００３８】
培地中の麦芽エキスの濃度は、１−オクテン−３−オールを製造することができる限り特に制限されない。麦芽エキスの濃度は、例えば、２．５％以上、３％以上、４％以上、または５％以上であってよい。麦芽エキスの濃度は、例えば、２０％以下、１７％以下、または１５％以下であってよい。麦芽エキスの濃度は、具体的には、例えば、２．５％〜２０％、または５％〜１５％であってよい。なお、麦芽エキスが液状等の水分を含有する形態である場合は、培地中の麦芽エキスの濃度は、麦芽エキスの乾燥重量に基づいて算出される。
【００３９】
培地中の乳化剤の濃度は、乳化剤を含有しない場合と比較して、１−オクテン−３−オールの生産が向上する限り特に制限されない。「乳化剤を含有しない場合と比較して、１−オクテン−３−オールの生産が向上する」とは、乳化剤を含有しない場合と比較して１−オクテン−３−オールの培地への蓄積量が増大する限り特に制限されない。「乳化剤を含有しない場合と比較して、１−オクテン−３−オールの生産が向上する」とは、例えば、乳化剤を含有しない場合と比較して、１−オクテン−３−オールの培地への蓄積量が１ｐｐｍ以上、５ｐｐｍ以上、１０ｐｐｍ以上、または２０ｐｐｍ以上増大することであってよく、５００ｐｐｍ以下、３００ｐｐｍ以下、または１００ｐｐｍ以下増大することであってもよい。「乳化剤を含有しない場合と比較して、１−オクテン−３−オールの生産が向上する」とは、例えば、乳化剤を含有しない場合と比較して、１−オクテン−３−オールの培地への蓄積量が１．２倍以上、１．５倍以上、２倍以上、または３倍以上に増大することであってよく、５０倍以下、３０倍以下、または１０倍以下に増大することであってもよい。
【００４０】
乳化剤の濃度は、例えば、０．０００１％以上、０．０００３％以上、または０．０００５％以上であってよい。乳化剤の濃度は、例えば、０．５％以下、０．３％以下、０．２％以下、０．１％以下、０．０７５％以下、または０．０５％以下であってよい。乳化剤の濃度は、具体的には、例えば、０．０００５％〜０．３％、０．０００５％〜０．1
％、または０．０００５％〜０．０５％であってよい。
【００４１】
培地中の麦芽エキスと乳化剤の濃度比は、１−オクテン−３−オールを製造することができ、且つ、乳化剤を含有しない場合と比較して１−オクテン−３−オールの生産が向上する限り特に制限されない。麦芽エキス濃度に対する乳化剤濃度の比率（乳化剤濃度／麦芽エキス濃度）は、例えば、０．００７％以上、０．０２％以上、または０．０３％以上であってよい。麦芽エキス濃度に対する乳化剤濃度の比率（乳化剤濃度／麦芽エキス濃度）は、例えば、３．３３％以下、２％以下、１．３３％以下、０．６７％以下、０．５％以下、または０．３３％以下であってよい。麦芽エキス濃度に対する乳化剤濃度の比率（乳化剤濃度／麦芽エキス濃度）は、具体的には、例えば、０．０３〜２％、または０．０３〜０．３３％であってよい。
【００４２】
培地は、その他の成分を含有していてもよい。その他の成分としては、経口摂取可能なものであれば特に制限されない。その他の成分としては、例えば、カビ等の微生物の培養に用いられる成分を用いることができる。
【００４３】
その他の成分としては、例えば、炭素源、窒素源、リン酸源、硫黄源、その他の各種有機成分や無機成分が挙げられる。
【００４４】
炭素源として、具体的には、例えば、グルコース、フルクトース、スクロース、ラクトース、ガラクトース、廃糖蜜、澱粉加水分解物、バイオマスの加水分解物等の糖類、酢酸、フマル酸、クエン酸、コハク酸等の有機酸類、エタノール等のアルコール類、脂肪酸類が挙げられる。
【００４５】
窒素源として、具体的には、例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩、ペプトン、酵母エキス、肉エキス等の有機窒素源、アンモニアが挙げられる。
【００４６】
リン酸源として、具体的には、例えば、リン酸２水素カリウム、リン酸水素２カリウム等のリン酸塩が挙げられる。
【００４７】
硫黄源として、具体的には、例えば、硫酸塩、チオ硫酸塩、亜硫酸塩等の無機硫黄化合物、システイン、シスチン、グルタチオン等の含硫アミノ酸が挙げられる。
【００４８】
その他の各種有機成分や無機成分として、具体的には、例えば、鉄、マンガン、マグネシウム、カルシウム等の微量金属類、アミノ酸類、ビタミン類、核酸類、これらを含有するペプトン等の有機成分が挙げられる。
【００４９】
その他の成分としては、１種の成分を用いてもよく、２種またはそれ以上の成分を組み合わせて用いてもよい。
【００５０】
培地中のその他の成分の濃度は、１−オクテン−３−オールを製造することができる限り特に制限されない。例えば、その他の成分として炭素源を含有する場合、麦芽エキス由来の炭素源が主要な炭素源であるのが好ましい。「麦芽エキス由来の炭素源が主要な炭素源である」とは、例えば、麦芽エキス由来の炭素源の量が、炭素源の総量に対して、５０％以上、７０％以上、または９０％以上であることを意味してよい。
【００５１】
＜１−３＞培養条件
培養は、麦芽エキスおよび乳化剤を含有する培地を用いること以外は、カビの培養に用いられる通常の条件で行うことができる。
【００５２】
培養は、液体培地を用いて好気的に行うことができる。培養は、具体的には、通気培養または振盪培養で行うことができる。培養温度は、例えば、１５〜４０℃、好ましくは２５〜３５℃であってよい。培地のｐＨは、例えば、５〜９であってよい。ｐＨ調整には、無機あるいは有機の酸性あるいはアルカリ性物質を使用することができる。培養期間は、例えば、１日〜３０日、または２日〜２１日であってよい。このような条件下で培養することにより、培地中に１−オクテン−３−オールが蓄積する。
【００５３】
培養は、回分培養（batch culture）、流加培養（Fed-batch culture）、連続培養（continuous culture）、またはそれらの組み合わせにより実施することができる。なお、培養開始時の培地を、「初発培地」ともいう。また、流加培養または連続培養において培養系（発酵槽）に供給する培地を、「流加培地」ともいう。また、流加培養または連続培養において培養系に流加培地を供給することを、「流加」ともいう。
【００５４】
本発明において、培養は、種培養と本培養とに分けて行われてもよい。その場合、種培養と本培養の培養条件は、同一であってもよく、そうでなくてもよい。例えば、種培養と
本培養を、共に回分培養で行ってもよい。また、例えば、種培養を回分培養で行い、本培養を流加培養または連続培養で行ってもよい。麦芽エキスおよび乳化剤は、少なくとも本培養の際に培地に含有される。
【００５５】
本発明において、各培地成分、すなわち麦芽エキス、乳化剤、およびその他の成分は、初発培地、流加培地、またはその両方に含有されていてよい。初発培地に含有される成分の種類は、流加培地に含有される成分の種類と、同一であってもよく、そうでなくてもよい。また、初発培地に含有される各成分の濃度は、流加培地に含有される各成分の濃度と、同一であってもよく、そうでなくてもよい。また、含有する成分の種類および／または濃度の異なる２種またはそれ以上の流加培地を用いてもよい。例えば、複数回の流加が間欠的に行われる場合、各流加培地に含有される成分の種類および／または濃度は、同一であってもよく、そうでなくてもよい。
【００５６】
麦芽エキスおよび乳化剤は、それぞれ、初発培地、流加培地、またはその両方に、上記例示した濃度範囲で含有されていてよい。
【００５７】
また、麦芽エキスが流加培地に含有される場合、麦芽エキスは、流加後の培地中の麦芽エキス濃度が上記例示した濃度範囲となるように、流加培地に含有されていてよい。また、乳化剤が流加培地に含有される場合、乳化剤は、流加後の培地中の乳化剤濃度が上記例示した濃度範囲となるように、流加培地に含有されていてよい。
【００５８】
麦芽エキスおよび乳化剤は、培養の全期間において一定の濃度範囲で培地に含有されていてもよく、そうでなくてもよい。例えば、一定期間、麦芽エキスおよび／または乳化剤が不足していてもよい。「不足する」とは、必要量を満たさないことをいい、例えば、培地中の濃度がゼロであることであってよい。「一定期間」とは、例えば、培養の全期間の内の、１０％以下の期間、２０％以下の期間、または３０％以下の期間であってよい。なお、培養が種培養と本培養とに分けて行われる場合、「一定期間」とは、例えば、本培養の全期間の内の、１０％以下の期間、２０％以下の期間、または３０％以下の期間であってよい。麦芽エキスが不足する期間には、他の炭素源が充足されているのが好ましい。例えば、麦芽エキスおよび乳化剤を含有せず、且つ、麦芽エキス以外の炭素源等を含有する培地で培養を開始し、所定の期間経過後に麦芽エキスおよび乳化剤を培地に添加し、培養を継続してもよい。このように、一定期間、麦芽エキスおよび／または乳化剤が不足していても、麦芽エキスおよび乳化剤を含有する培地での培養期間が存在する限り、「麦芽エキスおよび乳化剤を含有する培地でNeurospora sitophilaを培養する」ことに含まれる。
【００５９】
流加培養または連続培養においては、流加は、培養の全期間を通じて継続されてもよく、培養の一部の期間においてのみ継続されてもよい。また、流加培養または連続培養においては、複数回の流加が間欠的に行われてもよい。
【００６０】
複数回の流加が間欠的に行われる場合、１回当たりの流加の継続時間が、例えば、複数回の流加の合計時間の３０％以下、２０％以下、または１０％以下となるように、流加の開始と停止を繰り返してもよい。
【００６１】
連続培養においては、培養液の引き抜きは、培養の全期間を通じて継続されてもよく、培養の一部の期間においてのみ継続されてもよい。また、連続培養においては、複数回の培養液の引き抜きが間欠的に行われてもよい。培養液の引き抜きと流加は、同時に行われてもよく、そうでなくてもよい。例えば、培養液の引き抜きを行った後で流加を行ってもよく、流加を行った後で培養液の引き抜きを行ってもよい。引き抜く培養液量は、流加させる培地量と同量であるのが好ましい。ここで、「同量」とは、例えば、流加させる培地量に対して９３〜１０７％の量であってよい。
【００６２】
培養液を連続的に引き抜く場合には、例えば、流加の開始前に、流加と同時に、または流加の開始後に、引き抜きを開始してよい。具体的には、例えば、流加の開始後５時間以内、３時間以内、または１時間以内に、引き抜きを開始してよい。
【００６３】
培養液を間欠的に引き抜く場合には、例えば、所望の１−オクテン−３−オール濃度に到達したときに、培養液を一部引き抜き、新たに培地を流加して培養を継続してよい。
【００６４】
また、引き抜いた培養液を培養上清と菌体に分離し、菌体を発酵槽に戻して再利用してもよい。
【００６５】
培地中に１−オクテン−３−オールが蓄積したことは、化合物の検出または同定に用いられる公知の手法により確認することができる。そのような手法としては、例えば、ＨＰＬＣ、ＬＣ／ＭＳ、ＧＣ／ＭＳ、ＮＭＲが挙げられる。
【００６６】
このようにして製造された１−オクテン−３−オールは、菌糸体から抽出して得られた１−オクテン−３−オールとは異なり、菌糸体に由来する異風味がない。よって、このようにして製造された１−オクテン−３−オールは、風味素材として、飲食品に配合して好適に利用できる。１−オクテン−３−オールは、そのまま風味素材として利用してもよく、所望の程度に精製して風味素材として利用してもよい。
【００６７】
例えば、１−オクテン−３−オールを含有する培養物、または同培養物から得られた培養上清を風味素材として利用することができる。培養上清は、培養物を遠心分離や濾過等の固形分を除去する処理に供することにより得られる。培養物や培養上清は、滅菌処理に供してから風味素材として利用してもよい。滅菌処理は、例えば、６０℃で１０分以上の加熱、または０．４５μｍのフィルター濾過により行うことができる。
【００６８】
精製は、化合物の精製に用いられる公知の手法により行うことができる。そのような手法としては、例えば、イオン交換樹脂法、膜処理法、晶析法が挙げられる。これらの手法は適宜組み合わせて用いることができる。
【００６９】
＜２＞本発明の飲食品の製造方法
本発明の飲食品の製造方法は、本発明の１−オクテン−３−オールの製造方法により得られる１−オクテン−３−オールを飲食品またはその原料に添加することを含む、１−オクテン−３−オールを含有する飲食品の製造方法、である。このようにして製造される１−オクテン−３−オールを含有する飲食品を、「本発明の飲食品」ともいう。
【００７０】
「１−オクテン−３−オールを添加する」とは、所望の程度に精製された１−オクテン−３−オールを添加することであってもよく、上述した培養物や培養上清等の１−オクテン−３−オールを含有する素材を添加することであってもよい。
【００７１】
飲食品としては、特に制限されず、あらゆる飲食品が包含される。飲食品としては、例えば、果汁、牛乳、茶、アルコール飲料、スープ、インスタント味噌汁、インスタント吸い物などの飲料；ハム、ソーセージなどの食肉加工食品；かまぼこ、ちくわなどの水産加工食品；バター、発酵乳、粉乳などの乳製品；米飯加工品；パン；麺類；菓子；だし、風味調味料などの粉体調味料；たれ、ソース、ドレッシングなどの液体調味料等が挙げられる。
【００７２】
本発明の飲食品は、１−オクテン−３−オールを添加すること以外は、通常の飲食品と同様の原料を用い、同様の方法によって製造することができる。１−オクテン−３−オー
ルは、飲食品の原料に添加されてもよく、製造途中の飲食品に添加されてもよく、完成した飲食品に添加されてもよい。１−オクテン−３−オールは、１回のみ添加されてもよく、２またはそれ以上の回数に分けて添加されてもよい。
【００７３】
１−オクテン−３−オールの添加量は特に制限されず、飲食品の種類や飲食品の摂取態様等の諸条件に応じて適宜設定することができる。１−オクテン−３−オールは、例えば、１−オクテン−３−オールの喫食濃度が１ｐｐｂ〜１０００ｐｐｍ、１ｐｐｂ〜１００ｐｐｍ、５ｐｐｂ〜１０ｐｐｍ、または１０ｐｐｂ〜１ｐｐｍとなるように、飲食品またはその原料に対して添加されてよい。ここでいう「１−オクテン−３−オールの喫食濃度」とは、１−オクテン−３−オールを添加して製造した飲食品を喫食する際の、当該飲食品における１−オクテン−３−オールの濃度をいう。
【実施例】
【００７４】
本発明は、以下の実施例によって更に具体的に説明されるが、これらはいかなる意味でも本発明を限定する意図と解してはならない。
【００７５】
実施例１：麦芽エキスと乳化剤の併用による1-octen-3-olの生成
【００７６】
本実施例では、乳化剤の添加が1-octen-3-ol生成へ与える影響について評価した。乳化剤としては、Tween20を用いた。
【００７７】
Neurospora sitophila JCM22453（IFO 4596）株を、下記の培養条件で培養し、培地中
に生成した1-octen-3-ol量をＧＣ−ＭＳにより測定した。結果を表１に示す。
【００７８】
＜培養条件＞
容器      500 mL 坂口フラスコ
培地容量  150 mL
温度      30℃
培養      160 rpm 振とう培養
培養時間  144 hr
培地      表１のとおり
【００７９】
＜ＧＣ−ＭＳ分析条件＞
使用機器：GCMS5973Network（Agilent）、LTMsystem（Agilent）
カラム：DB-WAX(10m×0.18mm×0.3μm)
吸着：50℃、45min
脱着：220℃、2min
オーブン：50℃、0.6min hold→25℃/min to 230℃→230℃、4.2min hold
ファイバー:Sperco light-blue(CAR/PDMS)
【００８０】
【表１】
2014166152.tif 000002
【００８１】
麦芽エキスを単独で用いた場合と比較して、麦芽エキスとTween20を併用した場合には
、1-octen-3-olの生成量が増大した。以上より、乳化剤の添加により1-octen-3-olの生産が向上することが明らかとなった。
【００８２】
実施例２：麦芽エキス濃度による1-octen-3-ol生成量の違い
【００８３】
本実施例では、麦芽エキスを種々の濃度で乳化剤と併用し、麦芽エキス濃度が1-octen-3-ol生成に与える影響について評価した。乳化剤としては、Tween20を用いた。
【００８４】
Neurospora sitophila JCM22453（IFO 4596）株を、下記の培養条件で培養し、培地中
に生成した1-octen-3-ol量をＧＣ−ＭＳにより測定した。ＧＣ−ＭＳ分析条件は実施例１のものと同一である。結果を表２に示す。
【００８５】
＜培養条件＞
容器      500 mL 坂口フラスコ
培地容量  150 mL
温度      30℃
培養      160 rpm 振とう培養
培養時間  168 hr
培地      表２のとおり
【００８６】
【表２】
2014166152.tif 000003
【００８７】
麦芽エキスを単独で用いた場合と比較して、麦芽エキスを２．５％〜２０％の濃度でTween20と併用した場合に、1-octen-3-olの生成量が増大した。特に、麦芽エキス濃度が５
％〜１５％の場合に、1-octen-3-olの生成量が顕著に増大した。
【００８８】
実施例３：乳化剤濃度による1-octen-3-ol生成量の違い
【００８９】
本実施例では、乳化剤を種々の濃度で麦芽エキスと併用し、乳化剤添加濃度が1-octen-3-ol生成に与える影響について評価した。乳化剤としては、Tween20を用いた。
【００９０】
Neurospora sitophila JCM22453（IFO 4596）株を、下記の培養条件で培養し、培地中
に生成した1-octen-3-ol量をＧＣ−ＭＳにより測定した。ＧＣ−ＭＳ分析条件は実施例１のものと同一である。結果を表３に示す。
【００９１】
＜培養条件＞
容器      500 mL 坂口フラスコ
培地容量  150 mL
温度      30℃
培養      160 rpm 振とう培養
培養時間  168 hr
培地      表３のとおり
【００９２】
【表３】
2014166152.tif 000004
【００９３】
麦芽エキスを単独で用いた場合と比較して、Tween20を０．００５％〜０．５％の濃度
（麦芽エキス濃度に対して０．０３％〜３．３３％）で麦芽エキスと併用した場合に、1-octen-3-olの生成量が増大した。特に、Tween20濃度が０．００５％〜０．３％（麦芽エ
キス濃度に対して０．０３％〜２％）である場合に、1-octen-3-olの生成量が顕著に増大した。
【００９４】
実施例４：乳化剤の種類による1-octen-3-ol生成量の違い
【００９５】
本実施例では、種々の乳化剤を麦芽エキスと併用し、乳化剤の種類が1-octen-3-ol生成に与える影響について評価した。
【００９６】
Neurospora sitophila JCM22453（IFO 4596）株を、下記の培養条件で培養し、培地中
に生成した1-octen-3-ol量をＧＣ−ＭＳにより測定した。ＧＣ−ＭＳ分析条件は実施例１のものと同一である。
【００９７】
＜培養条件＞
容器      500 mL 坂口フラスコ
培地容量  150 mL
温度      30℃
培養      160 rpm 振とう培養
培養時間  168 hr
培地      ５％麦芽エキス濃度に表４に示す乳化剤（いずれも太陽化学製）を０．０１％で添加した。
【００９８】
【表４】
2014166152.tif 000005
【００９９】
【表５】
2014166152.tif 000006
【０１００】
結果を表５に示す。麦芽エキスを単独で用いた場合と比較して、いずれの乳化剤を麦芽エキスと併用した場合にも、1-octen-3-olの生成量が増大した。特に、以下の乳化剤を麦芽エキスと併用した場合には、1-octen-3-olの生成量がコントロールの２倍以上に増大した：モノグリセリン高級脂肪酸エステル系（オレイン酸モノ・ジグリセリド）、モノグリセリン中鎖脂肪酸エステル系（カプリル酸モノグリセリド、カプリル酸ジグリセリド）、ポリグリセリン脂肪酸エステル系（モノ・ジオレイン酸ジグリセリン、ペンタオレイン酸デカグリセリン、デカオレイン酸デカグリセリン、モノミリスチン酸デカグリセリン、モノオレイン酸デカグリセリン）、プロピレングリコール脂肪酸エステル系（モノオレイン酸プロピレングリコール）、酵素分解レシチン系（酵素分解大豆レシチン製剤（レシチン含量33%））。以上より、種々の乳化剤の添加により1-octen-3-olの生産が向上すること
が明らかとなった。
【０１０１】
実施例５：Neurospora sitophila発酵液の飲食品への添加効果
【０１０２】
本実施例では、Neurospora sitophila発酵液の飲食品への添加効果について評価した。
【０１０３】
市販の風味調味料（KSKビーフコンソメ2.5g/dl）をコントロールとして用いた。コントロールに、1-octen-3-ol標品（香料）を、1-octen-3-olとして終濃度３２ｐｐｂとなるよ
うに添加し、ポジティブコントロールとした。また、実施例２の試験区２（5% 麦芽エキ
ス + 0.01% Tween20）で得られた発酵液を０．４５μｍのフィルターで除菌した後、1-octen-3-olとして終濃度３２ｐｐｂとなるようにコントロールに添加し、評価サンプルとした。
【０１０４】
各サンプルについて、専門パネル３名により、「中後味の肉風味およびうま味」を評価した。評価は、「１．０：コントロールと比較して弱い」、「２．０：コントロールと比較してやや弱い」、「３．０：コントロールと同等」、「４．０：コントロールと比較してやや強い」、「５．０：コントロールと比較して強い」の５．０点法により実施した。
【０１０５】
結果を表６に示す。Neurospora sitophila発酵液は、1-octen-3-ol標品と同様に、飲食品の「中後味の肉風味およびうま味」を増強する性質を有していた。また、その力価も、Neurospora sitophila発酵液と1-octen-3-ol標品でほぼ同等であった。すなわち、1-octen-3-olを含有するNeurospora sitophila発酵液は、特段の精製工程なしに、風味素材として飲食品に配合して利用できることが明らかとなった。
【０１０６】
【表６】
2014166152.tif 000007