(57)【要約】【課題】新規なスーパーオキシドディスムターゼ（ＳＯＤ）活性亢進剤を提供すること。【解決手段】スーパーオキシドディスムターゼ（ＳＯＤ）活性亢進剤に、その有効成分として味噌抽出物を含有せしめる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
味噌抽出物を有効成分として含有するスーパーオキシドディスムターゼ（ＳＯＤ）活性亢進剤。
【請求項２】
前記味噌抽出物が、味噌抽出液を分画分子量３ｋＤａ未満の濾過膜で濾過して得られる分子量３ｋＤａ未満の画分である、請求項１に記載のＳＯＤ活性亢進剤。
【請求項３】
脳組織ＳＯＤ活性又は心臓組織ＳＯＤ活性を亢進するための、請求項１又は２に記載のＳＯＤ活性亢進剤。
【請求項４】
脳組織酸化ストレス又は心臓組織酸化ストレスを抑制するための、請求項３に記載のＳＯＤ活性亢進剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、スーパーオキシドディスムターゼ活性亢進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
日本食文化の代表である味噌は、元来、寺院や貴族階級に珍重されるほど贅沢品で貴重な食品であり、味噌汁として調理されることよりも、おかずや薬として利用されていた。鎌倉時代に「一汁一菜」という武士の食事習慣が確立し、味噌汁の形で食することが流行してから、今では日本人の食生活には欠かせない必需品となっている。
【０００３】
味噌の主な原料は大豆で、これに麹や塩を混ぜ合わせ、発酵させることによって栄養が豊富となり、大豆タンパク質が消化しやすく、また、旨みの元であるアミノ酸が多量に遊離している。その他にも、サポニン、イソフラボン、酵素、ビタミン、カリウム、繊維質等の数多くの栄養素が含まれており、健康維持や生活習慣病予防への効果が期待されている。一方、含有される食塩に対する懸念から、味噌の及ぼす健康効果について過少評価されてきたきらいがある。味噌には食塩以外にも多くの栄養素が含まれ、これらによる消化管での食塩吸収の抑制、血管拡張、内皮細胞保護効果等も期待され、食塩による影響以上に血管・臓器への保護効果が高いと考えられる。しかし、味噌の健康への効果については、これまで味噌の構成栄養素から推測することが多く、味噌の長期摂取が実際高血圧でみられる血管障害に保護効果を発揮し、脳・心臓・腎臓機能に有用であるか否かについては必ずしも明らかにはされていない。
【０００４】
味噌には、サポニン、イソフラボン等の抗酸化物質が含まれることが知られている。また、味噌抽出物の作用として、フリーラジカル消去作用が知られている（特許文献１，２）。
【０００５】
活性酸素のうち、フリーラジカルであるヒドロキシルラジカルは、最も反応しやすく、酸化力が強いため、生体組織に酸化ストレスを与え、組織障害を惹起しやすい。例えば、ヒドロキシルラジカルは、タンパク質、ＤＮＡ、脂質、酵素等の生体分子と反応してその構造を変化させ、細胞機能に障害を与える。また、ヒドロキシルラジカルは、コレステロール、中性脂肪等の脂質と反応して過酸化脂質を生成し、組織及び臓器を構成する細胞それ自体を傷付けて破壊する。
【０００６】
ヒドロキシラジカルの上流にはスーパーオキシドアニオンが存在しており、スーパーオキシドアニオンは、スーパーオキシドディスムターゼ（ＳＯＤ）によって酸素と過酸化水素へ無害化される。
【０００７】
したがって、生体組織ＳＯＤ活性が亢進されれば、ヒトロキシルラジカルによる過酸化反応及びそれに伴う生体組織酸化ストレスを抑制することが可能となる。
【０００８】
しかしながら、味噌に含まれるサポニン、イソフラボン等の抗酸化作用も、味噌抽出物のフリーラジカル消去作用（フリーラジカルスカベンジャー作用）も、ＳＯＤ活性とは無関係である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２００６−６９９４９号公報
【特許文献２】特開２００６−７００１５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、新規なスーパーオキシドディスムターゼ（ＳＯＤ）活性亢進剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記課題を解決するために、本発明は、味噌抽出物を有効成分として含有するスーパーオキシドディスムターゼ（ＳＯＤ）活性亢進剤を提供する。
本発明のＳＯＤ活性亢進剤の好ましい態様において、味噌抽出物は、味噌抽出液を分画分子量３ｋＤａ未満の濾過膜で濾過して得られる分子量３ｋＤａ未満の画分である。
本発明のＳＯＤ活性亢進剤の好ましい態様は、脳組織ＳＯＤ活性又は心臓組織ＳＯＤ活性を亢進するためのＳＯＤ活性亢進剤である。
本発明のＳＯＤ活性亢進剤の好ましい態様は、脳組織酸化ストレス又は心臓組織酸化ストレスを抑制するためのＳＯＤ活性亢進剤である。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、新規なＳＯＤ活性亢進剤として、味噌抽出物を有効成分として含有するＳＯＤ活性亢進剤が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】各実験群におけるラット脳内過酸化脂質（ＬＰＯ）量の測定結果を示す図である。
【図２】各実験群におけるラット脳内ＳＯＤ活性の測定結果を示す図である。
【図３】味噌水溶液の遠心上清又はそのＭＷ＜３ｋＤａ画分を添加したラット脳ホモジネートから生成された過酸化脂質（ＬＰＯ）量の測定結果を示す図である。
【図４】ＤＰＰＨラジカル消去作用の測定結果を示す図である。
【図５】各実験群におけるラット心臓組織過酸化脂質（ＬＰＯ）量及び心筋内膠原線維の面積の測定結果を示す図である。
【図６】各実験群におけるラット心臓組織ＳＯＤ活性の測定結果を示す図である。
【図７】心筋内膠原線維化と心臓組織過酸化脂質（ＬＰＯ）量との関係を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明のＳＯＤ活性亢進剤は、味噌抽出物を有効成分として含有する。ここで、「味噌抽出物」には、味噌抽出液、味噌抽出液の希釈液、濃縮液若しくは乾燥物、又はこれらの精製物のいずれの形態も含まれる。
【００１５】
味噌抽出物を得る際に抽出原料として使用される味噌は、食用の味噌である限り特に限定されない。味噌としては、例えば、米味噌（大豆（脱脂加工大豆を除く。以下同じ）を蒸煮したものに、米を蒸煮して麹菌を培養したもの（以下「米麹」という。）を加えたものに食塩を混合したもの）、麦味噌（大豆を蒸煮したものに、大麦又ははだか麦を蒸煮して麹菌を培養したもの（以下「麦麹」という。）を加えたものに食塩を混合したもの）、豆味噌（大豆を蒸煮して麹菌を培養したもの（以下「豆麹」という。）に食塩を混合したもの）、調合味噌（米味噌、麦味噌又は豆味噌を混合したもの、米麹に麦麹又は豆麹を混合したものを使用したもの等、米味噌、麦味噌及び豆味噌以外のもの）（以上、原料に基づく分類）、甘口味噌、辛口味噌（以上、味に基づく分類）、赤味噌、淡色味噌，白味噌（以上、色に基づく分類）等が挙げられるが、これらのうち、米味噌が好ましく、米味噌のうち辛口味噌がさらに好ましい。味噌は、１種を単独で又は２種以上を組み合わせて抽出原料として使用することができる。
【００１６】
味噌抽出物を得る際に抽出原料として使用される味噌は、常法に従って醸造された自家製の味噌及び市販の味噌のいずれであってもよい。
一般的な味噌の醸造方法は、米、麦等の穀類又は豆類を蒸煮したものに麹菌を添加して培養し、米麹、麦麹、豆麹等の各種麹を得る製麹工程と、大豆を蒸煮したもの（必要に応じて、米、麦等の穀類又は豆類を蒸煮したものを加えてもよい）、製麹工程で得られた各種麹、塩、水、その他の材料を所望の割合で混合して麹混合材料を得る仕込み工程と、麹混合材料を発酵・熟成させて醸造物を得る発酵・熟成工程とを含む。
【００１７】
味噌の醸造に使用される穀類としては、例えば、米、麦（例えば、大麦、裸麦、はと麦、ライ麦、小麦等）、トウモロコシ、ソバ、アワ、ヒエ等が挙げられる。豆類としては、例えば、大豆、緑豆、えんどう豆、黒豆、小豆、そら豆等が挙げられる。穀類及び豆類の品種、産地等は特に限定されない。
【００１８】
各種麹を得るために添加・培養される麹菌は、味噌の醸造に一般的に使用される麹菌である限り特に限定されない。麹菌としては、例えば、アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｏｊａｅ）、アスペルギルス・タマリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔａｍａｒｉ）等が挙げられる。麹菌は、種麹の形態で穀類及び／又は豆類を蒸煮したものに添加してもよい。麹菌を添加して培養する温度は、使用する麹菌の最適生育温度に依存するが、通常２０〜４５℃、好ましくは２５〜４０℃である。
【００１９】
味噌の醸造に使用される塩は、食用の塩である限り特に限定されず、例えば食塩、特級塩、岩塩、並塩、白塩等が挙げられる。
【００２０】
味噌の醸造に使用されるその他の材料としては、例えば、耐塩性の酵母、耐塩性の乳酸菌等が挙げられ、これらを仕込み工程においてさらに添加・混合して、麹混合材料を調製してもよい。耐塩性の酵母としては、例えば、チゴサッカロミセス・ルキシー（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｕｘｉｉ）、カンジダ・バーサチルス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｖｅｒｓａｔｉｌｉｓ）、カンジダ・エチェルシー（Ｃａｎｄｉｄａ  ｅｔｃｈｅｌｌｓｉｉ）等が挙げられ、耐塩性の乳酸菌としては、例えば、テトラジェノコッカス・ハロフィラス（Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、ペディオコッカス・アシディラクティシ（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ）等が挙げられる。
【００２１】
味噌の醸造に使用される各種材料（穀類、豆類、塩、その他の材料等）は、醸造すべき味噌の種類に応じて適宜調整した割合で配合することができる。例えば、麹の配合割合は、通常５割麹〜２０割麹であり、好ましくは５割麹である。塩の配合割合は、通常５重量％以上、好ましくは８〜１３重量％である。麹混合材料に含有される水分量は、全ての材料に含有される水分量を考慮して、通常３５〜５５重量％の範囲に調整される。
【００２２】
仕込み工程で得られた麹混合材料を発酵・熟成工程で発酵・熟成させることにより、醸造物、すなわち味噌が醸造される。発酵・熟成工程は、通常１０〜８０℃、好ましくは２５〜３５℃又は４５〜６０℃で行う。発酵・熟成工程の途中で必要に応じて適宜攪拌を行ってもよい。発酵・熟成工程の期間は、熟成温度にもよるが、例えば２５〜３５℃では通常約１ヶ月〜１年、４５〜５５℃では通常約１〜７日である。
【００２３】
味噌抽出物を得る際に抽出溶媒として使用される溶媒は、好ましくは極性溶媒である。極性溶媒としては、例えば、水、極性有機溶媒、又はこれらの混合液が挙げられるが、好ましくは水である。水としては、例えば、水道水、脱イオン水、蒸留水等が挙げられ、極性有機溶媒としては、例えば、一価アルコール、多価アルコール、ケトン等が挙げられる。一価アルコールとしては、例えば、メタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール、ブチルアルコール、イソブチルアルコール、ｓｅｃ−ブチルアルコール、ｔｅｒｔ−ブチルアルコール、ペンチルアルコール、イソペンチルアルコール等の炭素数１〜５の低級脂肪族アルコール等が挙げられ、多価アルコールとしては、例えば、エチレングリコール、プロピレングリコール、１，３ブチレングリコール、グリセリン等の炭素数２〜５の多価アルコールが挙げられ、ケトンとしては、例えば、アセトン、メチルエチルケトン、ジエチルケトン等の低級脂肪族ケトンが挙げられる。これらの溶媒は、通常、室温又は溶媒の沸点以下の温度で抽出溶媒として使用される。２種以上の溶媒の混合液を抽出溶媒として使用する場合、その混合比は適宜調整することができる。
【００２４】
味噌抽出物を得るための抽出法は、極性溶媒に可溶な味噌成分を溶出可能である限り特に限定されず、食品から成分を分離する際に使用される通常の抽出法を使用することができる。例えば、抽出溶媒を満たした処理槽に抽出原料を投入し、必要に応じて時々撹拌しながら、可溶性成分を溶出した後、静置、濾過又は遠心分離により固形物を除去し、抽出液を得ることができる。抽出溶媒量は、抽出原料の通常５〜３０倍量（重量比）、好ましくは１０〜２５倍量（重量比）である。抽出溶媒として水を使用する場合、抽出温度は、通常４〜４０℃、好ましくは１５〜３５℃である。遠心条件は、通常５０００〜１５０００ｇ、好ましくは８０００〜１２０００ｇで、通常５〜１５分間、好ましくは８〜１２分間である。
【００２５】
得られた抽出液から溶媒を留去するとペースト状の濃縮物が得られ、この濃縮物をさらに乾燥すれば、固形の抽出物が得られる。味噌抽出物は、その生理活性の低下を招かない範囲で、活性炭処理、吸着樹脂処理、イオン交換樹脂、液−液向流分配等の方法により精製してもよい。
【００２６】
味噌抽出物は、味噌抽出液を分画分子量３ｋＤａ未満の濾過膜で濾過して得られる分子量３ｋＤａ未満の画分であることが好ましい。濾過膜としては、例えば、分子ふるい膜（限外濾過膜）、逆浸透膜等が挙げられるが、好ましくは分子ふるい膜（限外濾過膜）である。濾過は、４℃下で実施することが好ましい。
【００２７】
味噌抽出物は、ＳＯＤ活性亢進作用を有する。作用成分の詳細は、現在のところ判明してないが、味噌抽出物がＳＯＤ活性亢進作用を有することは後述する実施例から明らかである。
【００２８】
味噌抽出物は、そのままでもＳＯＤ活性亢進剤として使用することができるが、製剤学的に許容されるキャリアーその他の助剤を使用して、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤、トローチ剤、ドリンク剤、注射剤、点滴剤、座剤等の所望の剤形に製剤化して使用することもできる。製剤化に使用される助剤としては、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定剤、増量剤、希釈剤、矯味・矯臭剤等が挙げられる。
【００２９】
本発明のＳＯＤ活性亢進剤の投与経路は特に限定されないが、好ましくは経口投与である。本発明のＳＯＤ活性亢進剤の投与量及び投与回数は、投与対象、投与経路等に応じて適宜調整することができる。本発明のＳＯＤ活性亢進剤の有効成分である味噌抽出物は、人体に対して無毒性であるから、その摂取量に特に制限はないが、例えば、成人に経口投与する場合には、味噌抽出物の量に換算して、１日の投与量が８〜２４ｇ／日となるよう、１日１〜３回程度投与することができる。
【００３０】
本発明のＳＯＤ活性亢進剤は、生体内ＳＯＤ活性（特に脳組織ＳＯＤ活性及び心臓組織ＳＯＤ活性）を亢進することができる。ここで、「ＳＯＤ活性の亢進」とは、ＳＯＤ活性が対照と比較して統計的な有意差を持って亢進することを意味する。本発明のＳＯＤ活性亢進剤は、対照を１００％としたとき、ＳＯＤ活性を１１５％以上に亢進することが好ましく、１２０％以上に亢進することがさらに好ましく、１３０％以上に亢進することがさらに一層好ましい。ＳＯＤ活性を比較する際に使用されるＳＯＤ活性の測定方法としては、例えば、吸光光度法（例えば、シトクロムｃ還元法、ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）還元法等）、化学発光法（例えば、化学発光プローブとしてウミホタルルシフェリン類縁体（ＭＣＬＡ）又はルシゲニンを使用する方法）、電子スピン共鳴分光（ＥＳＲ）法等が挙げられる。
【００３１】
本発明のＳＯＤ活性亢進剤は、スーパーオキシドアニオンを酸素と過酸化水素へ無害化するＳＯＤ活性を亢進することにより、スーパーオキシドアニオンの下流に存在するヒトロキシルラジカルを減少させ、ヒドロキシラジカルによる過酸化反応及びそれに伴う生体組織酸化ストレス（特に脳組織酸化ストレス及び心臓組織酸化ストレス）を抑制することができる。
【実施例】
【００３２】
〔実施例１〕
本実施例では、脳内の過酸化脂質量（以下「ＬＰＯ量」という。）及びスーパーオキシトディスムターゼ活性（以下「ＳＯＤ活性」という。）をｅｘ  ｖｉｖｏで測定した。また、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてＤＰＰＨラジカル消去作用を測定した。
【００３３】
１．実験方法
（１）試薬
以下の試薬は、和光純薬工業（株）から購入した。
・２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１,３−プロパンジオール９９９
・トリクロル酢酸
・スクロース
・４,６−ジヒドロキシ−２−メルカプトピリミジン
・１,１,３,３−テトラエトキシプロパン
・ウサギアルブミン（４Ｘ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚｅｄ）
・水酸化ナトリウム
・エチレンジアミン四酢酸
・Ｌ（＋）−アスコルビン酸ナトリウム
・１,１−ジフェニル−２−ピクリルヒドラジル（ＤＰＰＨ）
・エタノール（９９．５％）
以下のキットは、（株）同仁化学研究所から購入した。
・ＳＯＤアッセイキット−ＷＳＴ
タンパク質量の測定には、Ｂｉｏ−Ｒａｄプロテインアッセイ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）を使用した。
【００３４】
（２）機器
過酸化脂質量の測定には、以下の機器を使用した。
・ホモジナイザーＫｉｎｅｍａｔｉｃａ  ＣＨ−６０１０（ＰＯＬＹＴＲＯＮ社製）
・微量高速冷却遠心機ＭＸ−３０１（Ｔｏｍｙ社製）
・Ｇｅｎｉｕｓ  Ｄｒｙ  Ｂａｔｈ  Ｉｎｃｕｂａｔｏｒ  ＭＤ−０１Ｎ（Ｍａｊｏｒ  ｓｃｉｅｎｃｅ社製）
・Ｖ−５２０−ＳＲ型分光光度計（日本分光社製）
・ラコムテスタ−卓上型ＰＨ計ＰＨ５１０型（アズワン（株）社製）
ＳＯＤ活性の測定には、以下の機器を使用した。
・ホモジナイザーＫｉｎｅｍａｔｉｃａ  ＣＨ−６０１０（ＰＯＬＹＴＲＯＮ社製）
・Ｍｏｄｅｌ  ６８０  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅｒ  Ｒｅａｄｅｒ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）
ＤＰＰＨラジカル消去作用の測定には、以下の機器を使用した。
・Ｖ−５２０−ＳＲ型分光光度計（日本分光社製）
【００３５】
（３）実験群
２０匹の６週齢雌食塩感受性Ｄａｈｌラット（三協ラボサービス株式会社から購入）を、
（Ａ）水道水投与群（以下「対照群」という。）、
（Ｂ）０．５％食塩水投与群（以下「０．５％ＤＳ群」という。）、及び
（Ｃ）４％味噌水溶液（０．５％食塩水相当）投与群（以下「ＭＩＳＯ群」という。）
に分け、恒温恒湿（２３±２℃）、自動照明（午前８：００〜午後８：００）下にて、１２週間飼育した。
いずれの実験群のラットにも、長期飼育用固型飼料ＣＥ−７（日本クレア（株））を自由摂食させた。
０．５％食塩水は、塩化ナトリウム（和光純薬工業（株））を水に溶解して調製し、０．５％ＤＳ群に自由摂取させた。
４％味噌水溶液は、味噌４０ｇを約２５℃の水道水１０００ｍＬで溶解後、ホモジナイザーで粉砕し、オートクレーブにかけることにより調製し、ＭＩＳＯ群に自由摂取させた。味噌としては、市販の辛口の米味噌（麹歩合：５歩，塩分：１２．５％，原料：米（国産）・塩（国産）・大豆（北米産））を使用した。
対照群における水及び０．５％ＤＳ群における食塩水は、２日に１回交換し、ＭＩＳＯ群における味噌水溶液は毎日交換した。
１２週間飼育した後、ペントバルビタール麻酔下にＤａｈｌラットから脳を摘出し、ただちに液体窒素につけ、過酸化脂質（ＬＰＯ）量及びＳＯＤ活性の測定まで−８０℃で保存した。
【００３６】
（４）脳内ＬＰＯ量の測定方法
（４−１）脳内ＬＰＯ量の測定方法
各実験群のラットから摘出した脳組織に、Ｄ−ＰＢＳ（ｐＨ７．４）２ｍＬを加えてホモジナイズし、３，０００ｇで１０分間遠心した後、上清を回収し、そのうちの１ｍＬを測定に使用した。回収した脳ホモジネート上清を３７℃でインキュベートし、３０分間に生成された過酸化脂質を酸性条件下でマロンジアルデヒドに変換後、チオバルビツール酸にて発色させ、５３２ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００３７】
（４−２）味噌水溶液の遠心上清及びそのＭＷ＜３ｋＤａ画分の過酸化脂質生成に対する影響
ラット脳ホモジネート上清に、味噌水溶液の遠心上清（０．１ｇ／ｍＬ）又はそのＭＷ＜３ｋＤａ画分（０．１ｇ／ｍＬ）を等量に加え、３７℃でインキュベートし、３０分間に産生された過酸化脂質をマロンジアルデヒドに変換後、チオバルビツール酸にて発色させ、５３２ｎｍにおける吸光度を測定した。なお、味噌水溶液の遠心上清は、味噌１０ｇに約４℃の水１００ｍＬを加えて十分に撹拌した後、１０，０００ｇで１０分間遠心して得られた上清である。ＭＷ＜３ｋＤａ画分は、味噌水溶液の遠心上清を分画分子量３ｋＤａ未満の分子ふるい膜（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  ｍｅｍｂｒａｎｅｓ  ＮＭＷＬ３，０００）で濾過して得られた分子量３ｋＤａ未満（ＭＷ＜３ｋＤａ）の画分である。
【００３８】
（４−３）タンパク質量の測定方法
Ｂｉｏ−Ｒａｄプロテインアッセイ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を使用して、測定試料中のタンパク質量を測定した。標準液、５０倍希釈した測定試料、蒸留水（ブランク）をそれぞれ１００μＬとり、５ｍＬ反応試薬を加え、直ちによく混ぜた。１５分間インキュベートした後、分光光度計を使用して５９５ｎｍにおける吸光度を測定した。検量線により、測定試料中のタンパク質の濃度及び量を算出した。
【００３９】
（５）脳内ＳＯＤ活性の測定方法
各実験群のラットから摘出した脳組織に５ｍＬショ糖緩衝液（０．２５ｍｏｌ／Ｌ  ショ糖，１０ｍｍｏｌ／Ｌ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４），１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ）を加え、よくホモジナイズし、４℃、１６，０００ｇで３０分間遠心し、得られた上清を測定試料とした。ＳＯＤアッセイキット−ＷＳＴを使用し、３７℃で２０分間インキュベートした後、Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅｒ  Ｒｅａｄｅｒ（４１６ｎｍ）にて吸光度を測定した。
【００４０】
（６）ＤＰＰＨラジカル消去作用の測定方法
０．４ｍＭ  １，１−ジフェニル−２−ピクリルヒドラジル（ＤＰＰＨ）エタノール溶液に２０％エタノールを加えて溶解した。調製したＤＰＰＨ溶液を６本の測定用試験管に１ｍＬを加え、それぞれに８０％エタノール３００，２７０，２４０，２１０，１８０及び１５０μＬずつ加え、１０％味噌水溶液を０，３０，６０，９０，１２０及び１５０μＬずつを添加し、５２０ｎｍの吸光度を２０分間追跡測定した。標準液として、０．２ｍＭ  Ｌ（＋）−アスコルビン酸ナトリウムを使用した。
【００４１】
（７）統計解析
データは平均値±標準偏差（ＳＤ）で表した。ＳＴＡＴＩＳＴＩＣＡを用いて分散分析、Ｐｏｓｔ−ｈｏｃ（ＬＳＤ）により検定した。両側検定でｐ＜０．０５を有意とした。
【００４２】
２．結果
（１）脳内ＬＰＯ量の測定結果（図１）
図１に示すように、脳組織ホモジネートにおけるＬＰＯ生成量は、対照群に比較して０．５％ＤＳ群では変化がなかったが、０．５％ＤＳ群に比較してＭＩＳＯ群では有意に低下した（０．３２３±０．０８５  vs  ０．１７７±０．１１１  ｎｇ／ｍｇタンパク質／３０分，ｐ＜０．０５）。
【００４３】
（２）脳内ＳＯＤ活性の測定結果（図２）
図２に示すように、脳組織ホモジネートにおけるＳＯＤ活性は、対照群に比較して０．５％ＤＳ群では変化がなかったが、０．５％ＤＳ群に比較してＭＩＳＯ群では有意に高値を示した（４．３３６±０．１８７  vs  １１．１７３±６．３９６  Ｕ／ｍｇタンパク質，ｐ＜０．０５）。
【００４４】
（３）味噌水溶液の遠心上清及びそのＭＷ＜３ｋＤａ画分の過酸化脂質生成に対する影響（図３）
味噌水溶液の遠心上清（０．１ｇ／ｍＬ）又はそのＭＷ＜３ｋＤａ画分（０．１ｇ／ｍＬ）を加えた脳組織ホモジネートから産生されるＬＰＯ量を調べたところ、図３に示すように、緩衝液を加えた対照に比較して、いずれも有意に低値を示した（０．１１０±０．０１５  vs  ０．０３２±０．００８  ｎｇ／ｍｇタンパク質／３０分，ｐ＜０．０５；０．１０２±０．００７  vs  ０．０３４±０．００３  ｎｇ／ｍｇタンパク質／３０分，ｐ＜０．０５））。
また、図３に示すように、ＭＷ＜３ｋＤａ画分は、味噌水溶液の遠心上清と同程度の過酸化脂質産生抑制効果を示した。
【００４５】
（４）ＤＰＰＨラジカル消去作用の測定結果（図４）
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、味噌成分の活性酸素消去作用の有無を検討したところ、図４に示すように、ビタミンＣ添加（図中「VitaminC」）は、緩衝液添加（図中「water」）と比較してＤＰＰＨラジカル消去効果を示したが、ＭＩＳＯのＤＰＰＨラジカル消去作用（図中「MISO with DPPH」）はビタミンＣに比較して１４％強いことが示された。
【００４６】
３．考察
脳内神経細胞膜の膜脂質は過酸化脂質を生じやすい不飽和酸が豊富である。また、ミトコンドリアで産生し、ＳＯＤ等の抗酸化酵素によって消去されなかった活性酸素は、ヒドロキシルラジカルを生成し、生成したヒドロキシルラジカルは、膜脂質と反応し、過酸化脂質を生成する（Eguchi H, Fujiwara N, Ookawara T, Suzuki K, Taniguchi N. Oxidative stress and health. 生物試料分析 2009;32:247-256., Ji L L, Dillon D, Wu E. Alteration of antioxidant enzymes weith aging in rat skeletal muscle and liver.Am J Physiol 1990;2:918-923.）。過酸化脂質が大量に蓄積すると、脳血管及び脳神経細胞に損傷を与え、記憶障害、運動障害等の脳機能障害を引き起こすと考えられる。
本実施例の結果により、味噌の経口投与は、食塩感受性Ｄａｈｌラットの脳組織から産生される過酸化脂質を、同濃度の食塩摂取群に比較して有意に低下させることが示された。また、脳組織ＳＯＤ活性は味噌摂取群で食塩水群より有意に高値を示した。
これらの結果から、味噌成分は、脳組織ＳＯＤ活性を亢進し、脳内活性酸素の抑制を通じて脳組織酸化ストレス低下作用を発揮することが示された。また、分子量３ｋＤａ未満の画分が味噌水溶液の遠心上清と同じ程度の過酸化脂質の抑制効果を示したことから、酸化ストレス抑制因子（特に脳組織ＳＯＤ活性亢進成分）は、３ｋＤａ未満の画分に存在すると推測される。
【００４７】
実施例１の結果及び考察を以下に要約する。
・味噌の経口摂取は脳内酸化ストレスを抑制する作用がある。
・これには、味噌成分によるＳＯＤ活性維持とヒドロキシルラジカル消去作用が
関与していると考えられる。
・味噌の酸化ストレス抑制因子は分子量３ｋＤａ未満分画に存在すると考えられる。
【００４８】
〔実施例２〕
心臓は高血圧の重要な標的臓器の一つであり、圧負荷は心筋壊死、膠原線維化をもたらし心不全の原因となる。収縮期及び拡張期の血圧負荷の増大により、心筋リモデリングが生じる。心筋の線維化は、酸化ストレスを介して進展することが報告されている（Barnes PJ, Karin M.Nuclear factor-kappaB: a pivotal transcription factor in chronic inflammatory diseases.N Engl J Med 1997;336:1066-1071.）。実施例１において、味噌成分にはヒドロキシルラジカルの直接的なスカベンジャー作用（捕捉作用）とＳＯＤ活性亢進作用とにより酸化ストレスを抑制することが見出された。これが正しければ、味噌摂取時には心筋障害の抑制と膠原線維増殖抑制効果が観察されることが期待される。食塩感受性Ｄａｈｌラットは、食塩依存性の高血圧とともに心筋障害が生じやすいという特性がある。そこで、本実施例は、食塩感受性Ｄａｈｌラットを使用して、味噌摂取による心臓組織における酸化ストレスへの影響と心筋膠原線維化との関連性を明らかにすることを目的とする。
【００４９】
１．実験方法
（１）試薬
以下の試薬は、和光純薬工業（株）から購入した。
・２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１,３−プロパンジオール９９９
・トリクロル酢酸
・スクロース
・４,６−ジヒドロキシ−２−メルカプトピリミジン
・１,１,３,３−テトラエトキシプロパン
・ウサギアルブミン（４Ｘ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚｅｄ）
・水酸化ナトリウム
・エチレンジアミン四酢酸
以下のキットは、（株）同仁化学研究所から購入した。
・ＳＯＤアッセイキット−ＷＳＴ
タンパク質量の測定には、Ｂｉｏ−Ｒａｄプロテインアッセイ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を使用した。
【００５０】
（２）機器
過酸化脂質量の測定には、以下の機器を使用した。
・ホモジナイザーＫｉｎｅｍａｔｉｃａ  ＣＨ−６０１０（ＰＯＬＹＴＲＯＮ社製）
・微量高速冷却遠心機ＭＸ−３０１（Ｔｏｍｙ社製）
・Ｇｅｎｉｕｓ  Ｄｒｙ  Ｂａｔｈ  Ｉｎｃｕｂａｔｏｒ  ＭＤ−０１Ｎ（Ｍａｊｏｒ  ｓｃｉｅｎｃｅ社製）
・Ｖ−５２０−ＳＲ型分光光度計（日本分光社製）
・ラコムテスタ−卓上型ＰＨ計ＰＨ５１０型（アズワン（株）社製）
・ＳＯＤ活性の測定には、以下の機器を使用した。
・ホモジナイザーＫｉｎｅｍａｔｉｃａ  ＣＨ−６０１０（ＰＯＬＹＴＲＯＮ社製）
・Ｍｏｄｅｌ  ６８０  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅｒ  Ｒｅａｄｅｒ  （ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）
心筋内膠原線維の面積の測定には、以下の機器を使用した。
・Ｍｏｄｅｌ  ＢＸ５１ＴＥ顕微鏡  （ＯＬＹＭＰＵＳ社製）
・Ｗｉｎ  ＲＯＯＦ  Ｖ３．０，Ｖｉｅｗｆｉｎｄｅｒ  Ｌｉｔｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ１．０
【００５１】
（３）実験群
３０匹の４週齢雄食塩感受性Ｄａｈｌラットを、
（Ａ）水道水投与群（以下「対照群」という）、
（Ｂ）０．９％食塩水投与群（以下「ＤＳ−Ｌｏｗ群」という）、
（Ｃ）１．３％食塩水投与群（以下「ＤＳ−Ｈｉｇｈ群」という）、及び
（Ｄ）１０％味噌水溶液（１．３％ＮａＣｌに相当）投与群（以下「ＭＩＳＯ群」という）
の４群に分け、恒温恒湿（２３±２℃）、自動照明（午前８：００〜午後８：００）下にて、８週間飼育した。
いずれの実験群のラットにも、長期飼育用固型飼料ＣＥ−７（日本クレア（株））を自由摂食させた。
０．９％及び１．３％食塩水は、塩化ナトリウム（和光純薬工業（株））を水に溶解して調製し、それぞれＤＳ−Ｌｏｗ群及びＤＳ−Ｈｉｇｈ群に自由摂取させた。
１０％味噌水溶液は、味噌１０ｇを約２５℃の水１００ｍＬに溶解したものをホモジナイザーで粉砕し、オートクレーブにかけて調製し、ＭＩＳＯ群に自由摂取させた。味噌としては、市販の辛口の米味噌（麹歩合：５歩，塩分：１２．５％，原料：米（国産）・塩（国産）・大豆（北米産））を使用した。
対照群における水並びにＤＳ−Ｌｏｗ群及びＤＳ−Ｈｉｇｈ群における食塩水は、２日に１回交換し、ＭＩＳＯ群における味噌水溶液は毎日交換した。
８週間飼育した後、ペントバルビタール麻酔下にＤａｈｌラットから心臓を摘出し、ただちに液体窒素につけ、過酸化脂質量及びＳＯＤの活性の測定まで−８０℃で保存した。
【００５２】
（４）心臓組織ＬＰＯ量の測定方法
各実験群のラットから摘出した心臓組織を使用して、実施例１と同様にして過酸化脂質量を測定した。
【００５３】
（５）心臓組織ＳＯＤ活性の測定方法
各実験群のラットから摘出した心臓組織を使用して、実施例１と同様にして、ＳＯＤ活性を測定した。
【００５４】
（６）心筋内膠原線維の面積の測定方法（Yoshinaga M等, Japanese Traditional Miso Soup Attenuates Salt-induced Hypertension and its Organ Damage in Dahl Salt-sensitive Rats. Nutrition 2012; 28: 924-931.）
アザン・マロリー染色で染色された心筋内膠原線維について、濃い青色の波長を解析し、それと同一波長部位の面積を測定し、心筋内膠原線維量とした（Ｍｏｄｅｌ  ＢＸ５１ＴＥ顕微鏡、Ｗｉｎ  ＲＯＯＦ  Ｖ３．０、Ｖｉｅｗｆｉｎｄｅｒ  Ｌｉｔｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ１．０）。左心室から心室中隔にかけ１０か所の測定域面積を測り、その部位での膠原線維全面積を計測し、検査面積当りの比で表した。
【００５５】
（６）統計解析
有意差検定はＳＴＡＴＩＳＴＩＣＡを用いてＡＮＯＶＡ及びＰｏｓｔ−ｈｏｃ  （ＬＳＤ）で統計的有意差検定を行った。
【００５６】
２．結果
（１）心臓組織ＬＰＯ量の測定結果（図５）
図５に示すように、心臓組織ホモジネートにおけるＬＰＯ生成量は、対照群に比較してＤＳ−Ｈｉｇｈ群では有意に高値を示し（０．１５８±０．１００  vs  ０．５４２±０．０８６  ｎｇ／ｍｇタンパク質／３０分，ｐ＜０．０５）、ＤＳ−Ｈｉｇｈ群に比較してＭＩＳＯ群では有意に低値を示した（０．５４２±０．０８６  vs  ０．２８１±０．１１９  ｎｇ／ｍｇタンパク質／３０分，ｐ＜０．０５）。
【００５７】
（２）心臓組織ＳＯＤ活性の測定結果（図６）
図６に示すように、心臓組織ホモジネートにおけるＳＯＤ活性は、対照群に比較してＤＳ−Ｈｉｇｈ群では有意に低値を示し（１０．５７２±７．４２２  vs  ６．０４５±１．０７４  Ｕ／ｍｇタンパク質，ｐ＜０．０５）、ＤＳ−Ｈｉｇｈ群に比較してＭＩＳＯ群では有意に高値を示した（６．０４５±１．０７４  vs  １８．３２１±１２．６５１  Ｕ／ｍｇタンパク質，ｐ＜０．０５）。
【００５８】
（３）心筋内膠原線維の面積の測定結果（図５）
光学的に測定した心筋内膠原線維量は、対照群に比較してＤＳ−Ｈｉｇｈ群では有意に高値を示し（０．０３３±０．０２１  vs  ０．１５３±０．０４３  ｍｍ２／１．２３４ｍｍ２，  ｐ＜０．０５）、ＤＳ−Ｈｉｇｈ群の膠原線維量の増加は味噌摂取（ＭＩＳＯ群）により完全に消失した（０．０７４±０．０６１  ｍｍ２／１．２３４ｍｍ２，ｐ＜０．０５）。
【００５９】
３．考察
味噌摂取群ではラットの心臓組織における抗酸化酵素ＳＯＤの活性が維持され、産生された過酸化脂質の量も低値であった。この結果から、脳内酸化ストレスと同様、味噌は心筋内酸化ストレスを抑制することが示された。酸化ストレスの低下は心筋障害に抑制的に働くと考えられ、実際、光学的に測定した心臓内膠原線維量は、味噌摂取により食塩水摂取群より有意に低値を示した。
心臓組織ホモジネートから産生された過酸化脂質と心筋内膠原線維量との関連を調べると、両者の間には有意な正の相関関係がみられた（ｒ＝０．６７６，  ｐ＜０．０５）（図７）。活性酸素が少ないほど、膠原線維量が少ないことを示している。味噌は心臓の組織から産生された活性酸素を抑制し、心筋内膠原線維量を低下させる可能性が強く示唆された。
味噌摂取は、心臓組織における抗酸化酵素ＳＯＤ活性を高め、活性酸素を低下し、酸化ストレスを抑制する。酸化ストレスの減少は心臓内膠原線維量を低下し、心筋線維化を抑制することで心機能を保護することが考えられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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