(57)【要約】【課題】４−ＰＢＡよりも小胞体ストレスを抑制する効果が大きい化合物を用いた、小胞体ストレスを十分に抑制可能な小胞体ストレス関連実験用試薬及び小胞体ストレス関連疾患治療薬を提供する。【解決手段】２−（４−Ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｏｘｙ）ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ、２−（４−Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｘｙ）ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ又は２−（２−Ｎａｐｈｔｈｙｌｏｘｙ）ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ（以下、本発明における各化合物という。）からなる小胞体ストレス関連実験用試薬、本発明における各化合物を有効成分として含有する小胞体ストレス関連実験用試薬及び本発明における各化合物を有効成分として含有する小胞体ストレス関連疾患治療薬。【選択図】図７
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の式（１）で表される化合物である２−（４−Ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｏｘｙ）ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄからなることを特徴とする小胞体ストレス関連実験用試薬。
【化１】
2014162741.tif 000009
【請求項２】
下記の式（２）で表される化合物である２−（４−Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｘｙ）ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄからなることを特徴とする小胞体ストレス関連実験用試薬。
【化２】
2014162741.tif 000010
【請求項３】
下記の式（３）で表される化合物である２−（２−Ｎａｐｈｔｈｙｌｏｘｙ）ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄからなることを特徴とする小胞体ストレス関連実験用試薬。
【化３】
2014162741.tif 000011
【請求項４】
下記の式（１）で表される化合物である２−（４−Ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｏｘｙ）ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄを有効成分として含有することを特徴とする小胞体ストレス関連実験用試薬。
【化４】
2014162741.tif 000012
【請求項５】
下記の式（２）で表される化合物である２−（４−Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｘｙ）ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄを有効成分として含有することを特徴とする小胞体ストレス関連実験用試薬。
【化５】
2014162741.tif 000013
【請求項６】
下記の式（３）で表される化合物である２−（２−Ｎａｐｈｔｈｙｌｏｘｙ）ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄを有効成分として含有することを特徴とする小胞体ストレス関連実験用試薬。
【化６】
2014162741.tif 000014
【請求項７】
下記の式（１）で表される化合物である２−（４−Ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｏｘｙ）ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄを有効成分として含有することを特徴とする小胞体ストレス関連疾患治療薬。
【化７】
2014162741.tif 000015
【請求項８】
下記の式（２）で表される化合物である２−（４−Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｘｙ）ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄを有効成分として含有することを特徴とする小胞体ストレス関連疾患治療薬。
【化８】
2014162741.tif 000016
【請求項９】
下記の式（３）で表される化合物である２−（２−Ｎａｐｈｔｈｙｌｏｘｙ）ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄを有効成分として含有することを特徴とする小胞体ストレス疾患治療薬。
【化９】
2014162741.tif 000017
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、小胞体ストレス関連実験用試薬及び小胞体ストレス関連疾患治療薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
小胞体（ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ  ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ。ＥＲともいう。）は細胞内の小器官であり、細胞での脂質の合成や分泌タンパクの合成又は修飾に重要な役割を担っている。最近、種々の疾患（癌、動脈硬化症、虚血性疾患、アルツハイマー病やパーキンソン病等の神経変性疾患、糖尿病等の代謝性疾患、ウイルス感染症）や老化（以下、小胞体ストレス関連疾患等という）について、小胞体ストレス（あるいは、小胞体ストレスに起因する細胞組織の損傷）がその原因として注目されている、このため、小胞体ストレスを抑制することで小胞体ストレス関連疾患等を治療又は緩和することを目的として、多くの医学・生命科学領域の研究者らが活発な研究を行っている。
【０００３】
ところで、現在、小胞体ストレスを抑制する化合物として、４−ｐｈｅｎｙｌｂｕｔｙｒｉｃ  ａｃｉｄ（以下、明細書において４−ＰＢＡと記載する。）が広く知られている（例えば、特許文献１参照。）。また、上記化合物を含む試薬等、つまり、このため、４−ＰＢＡからなる小胞体ストレス関連実験用試薬、４−ＰＢＡを有効成分として含有する小胞体ストレス関連実験用試薬及び４−ＰＢＡを有効成分として含有する小胞体ストレス関連疾患治療薬が知られている。
【０００４】
４−ＰＢＡはケミカルシャペロンとして機能し、タンパク質の高次構造の形成を補助することで、小胞体ストレスをある程度抑制することができる化合物である。
なお、本明細書においては、「シャペロン」とは、タンパク質の正しい折りたたみを補助する物質のことをいう。
また、「ケミカルシャペロン」とは、シャペロンの中でも低分子化合物からなるものをいう。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表２０１１−５１８１１９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、４−ＰＢＡでは小胞体ストレスを十分に抑制できない（つまり、効果が低い）という問題がある。しかし、不十分であっても小胞体ストレスを抑制可能な化合物は４−ＰＢＡ以外にあまり知られておらず、研究において利用もされていないというのが現状である。このため、小胞体ストレスの研究分野においては、主に代替手段がないという理由で、４−ＰＢＡが使用されてきた。
【０００７】
そこで、本発明は上記の問題を解決するためになされたもので、４−ＰＢＡよりも小胞体ストレスを抑制する効果が大きい化合物を用いた、小胞体ストレスを十分に抑制することが可能な小胞体ストレス関連実験用試薬及び小胞体ストレス関連疾患治療薬を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の発明者らは、小胞体ストレスを抑制することができるケミカルシャペロンとなりそうな化合物に関して膨大な実験を行った結果、以下に記載する３種類の化合物について、４−ＰＢＡよりも小胞体ストレスを抑制する効果が大きいことを確認し、本発明を完成させた。本発明は以下の要素を含む。
【０００９】
本発明は、「下記の式（１）で表される化合物である２−（４−Ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｏｘｙ）ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄからなる小胞体ストレス関連実験用試薬」、「下記の式（１）で表される化合物である２−（４−Ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｏｘｙ）ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄを有効成分として含有する小胞体ストレス関連実験用試薬」及び「下記の式（１）で表される化合物である２−（４−Ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｏｘｙ）ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄを有効成分として含有する小胞体ストレス関連疾患治療薬」に関する
【化１】
2014162741.tif 000003
【００１０】
また、本発明は、「下記の式（２）で表される化合物である２−（４−Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｘｙ）ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄからなる小胞体ストレス関連実験用試薬」、「下記の式（２）で表される化合物である２−（４−Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｘｙ）ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄを有効成分として含有する小胞体ストレス関連実験用試薬」及び「下記の式（２）で表される化合物である２−（４−Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｘｙ）ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄを有効成分として含有する小胞体ストレス関連疾患治療薬」に関する。
【化２】
2014162741.tif 000004
【００１１】
また、本発明は、「下記の式（３）で表される化合物である２−（２−Ｎａｐｈｔｈｙｌｏｘｙ）ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄからなる小胞体ストレス関連実験用試薬」、「下記の式（３）で表される化合物である２−（２−Ｎａｐｈｔｈｙｌｏｘｙ）ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄを有効成分として含有する小胞体ストレス関連実験用試薬」及び「下記の式（３）で表される化合物である２−（２−Ｎａｐｈｔｈｙｌｏｘｙ）ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄを有効成分として含有する小胞体ストレス疾患治療薬」に関する。
【化３】
2014162741.tif 000005
【００１２】
なお、上記した本発明は、別の書き方で表現することもできる。以下、別の書き方での表現を記載する。以下の記載における式（１）、式（２）及び式（３）は、上記した式（１）、式（２）及び式（３）と同様であるため、化学式の記載は省略する。
【００１３】
「下記の式（１）で表される化合物である２−（４−Ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｏｘｙ）ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄからなる小胞体ストレス関連実験用試薬」及び「下記の式（１）で表される化合物である２−（４−Ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｏｘｙ）ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄを有効成分として含有する小胞体ストレス関連実験用試薬」は、「小胞体ストレス関連の実験を行うための試薬を製造するための、下記の式（１）で表される化合物である２−（４−Ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｏｘｙ）ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄの使用」、又は、「下記の式（１）で表される化合物である２−（４−Ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｏｘｙ）ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄを用いることにより、小胞体ストレス関連の実験を行う方法」と表現することもできる。
【００１４】
「下記の式（１）で表される化合物である２−（４−Ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｏｘｙ）ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄを有効成分として含有する小胞体ストレス関連疾患治療薬」は、「小胞体ストレス関連疾患を治療するための医薬を製造するための、下記の式（１）で表される化合物である２−（４−Ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｏｘｙ）ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄの使用」、又は、「下記の式（１）で表される化合物である２−（４−Ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｏｘｙ）ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄを患者に投与することにより、小胞体ストレス関連疾患を治療する方法」と表現することもできる。
【００１５】
「下記の式（２）で表される化合物である２−（４−Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｘｙ）ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄからなる小胞体ストレス関連実験用試薬」及び「下記の式（２）で表される化合物である２−（４−Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｘｙ）ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄを有効成分として含有する小胞体ストレス関連実験用試薬」は、「小胞体ストレス関連の実験を行うための試薬を製造するための、下記の式（２）で表される化合物である２−（４−Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｘｙ）ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄの使用」、又は、「下記の式（２）で表される化合物である２−（４−Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｘｙ）ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄを用いることにより、小胞体ストレス関連の実験を行う方法」と表現することもできる。
【００１６】
「下記の式（２）で表される化合物である２−（４−Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｘｙ）ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄを有効成分として含有する小胞体ストレス関連疾患治療薬」は、「小胞体ストレス関連疾患を治療するための医薬を製造するための、下記の式（２）で表される化合物である２−（４−Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｘｙ）ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄの使用」、又は、「下記の式（２）で表される化合物である２−（４−Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｘｙ）ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄを患者に投与することにより、小胞体ストレス関連疾患を治療する方法」と表現することもできる。
【００１７】
「下記の式（３）で表される化合物である２−（２−Ｎａｐｈｔｈｙｌｏｘｙ）ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄからなる小胞体ストレス関連実験用試薬」及び「下記の式（３）で表される化合物である２−（２−Ｎａｐｈｔｈｙｌｏｘｙ）ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄを有効成分として含有する小胞体ストレス関連実験用試薬」は、「小胞体ストレス関連の実験を行うための試薬を製造するための、下記の式（３）で表される化合物である２−（２−Ｎａｐｈｔｈｙｌｏｘｙ）ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄの使用」、又は、「下記の式（３）で表される化合物である２−（２−Ｎａｐｈｔｈｙｌｏｘｙ）ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄを用いることにより、小胞体ストレス関連の実験を行う方法」と表現することもできる。
【００１８】
「下記の式（３）で表される化合物である２−（２−Ｎａｐｈｔｈｙｌｏｘｙ）ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄを有効成分として含有する小胞体ストレス関連疾患治療薬」は、「小胞体ストレス関連疾患を治療するための医薬を製造するための、下記の式（３）で表される化合物である２−（２−Ｎａｐｈｔｈｙｌｏｘｙ）ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄの使用」、又は、「下記の式（３）で表される化合物である２−（２−Ｎａｐｈｔｈｙｌｏｘｙ）ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄを患者に投与することにより、小胞体ストレス関連疾患を治療する方法」と表現することもできる。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、後述する各実験例に示すように４−ＰＢＡよりも小胞体ストレスを抑制する効果が大きい化合物からなるため、小胞体ストレスを十分に抑制可能な小胞体ストレス関連実験用試薬を提供することが可能となる。
また、本発明によれば、後述する各実験例に示すように４−ＰＢＡよりも小胞体ストレスを抑制する効果が大きい化合物を有効成分として含有するため、小胞体ストレスを十分に抑制可能な小胞体ストレス関連実験用試薬を提供することが可能となる。
さらに、本発明によれば、後述する各実験例に示すように４−ＰＢＡよりも小胞体ストレスを抑制する効果が大きい化合物を有効成分として含有するため、小胞体ストレスを十分に抑制可能な小胞体ストレス関連疾患治療薬を提供することが可能となる。
【００２０】
なお、本発明を別の書き方で表現した場合には、効果も以下のように表現することができる。
本発明によれば、後述する各実験例に示すように４−ＰＢＡよりも小胞体ストレスを抑制する効果が大きい化合物を、小胞体ストレス関連の実験を行うための試薬を製造するために使用するため、小胞体ストレスを十分に抑制することが可能となる。
また、本発明によれば、後述する各実験例に示すように４−ＰＢＡよりも小胞体ストレスを抑制する効果が大きい化合物を用いることにより、小胞体ストレス関連の実験を行う方法であるため、小胞体ストレスを十分に抑制することが可能となる。
また、本発明によれば、後述する各実験例に示すように４−ＰＢＡよりも小胞体ストレスを抑制する効果が大きい化合物を、小胞体ストレス関連疾患を治療するための医薬を製造するために使用するため、小胞体ストレスを十分に抑制することが可能となる。
さらに、本発明によれば、後述する各実験例に示すように４−ＰＢＡよりも小胞体ストレスを抑制する効果が大きい化合物を用いることにより、小胞体ストレス関連疾患を治療する方法であるため、小胞体ストレスを十分に抑制することが可能となる。
【００２１】
また、本発明における化合物である２−（４−Ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｏｘｙ）ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ（以下、明細書において２−ＰＯＡＡ−ＯＭｅと記載する。）、２−（４−Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｘｙ）ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ（以下、明細書において２−ＰＯＡＡ−ＮＯ２と記載する。）及び２−（２−Ｎａｐｈｔｈｙｌｏｘｙ）ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ（以下、明細書において２−ＮＯＡＡと記載する。）は、入手容易な化合物から簡単な（１ステップ〜２ステップ程度の）化学合成により得られるものである。このため、本発明によれば、比較的入手容易であり、かつ、比較的低コストである小胞体ストレス関連実験用試薬及び小胞体ストレス関連疾患治療薬とすることが可能となる。
【００２２】
なお、「小胞体ストレスを抑制する」とは、小胞体ストレスそのものを抑制することの他に、小胞体ストレスにより分泌される物質の量を制御することで小胞体ストレスによって引き起こされる結果（細胞異常や細胞組織の損傷等）を抑制することも含む。
後者を指して「小胞体ストレスを抑制する」というのは必ずしも適切ではない可能性があるが、小胞体ストレス関連疾患等を治療又は緩和するという観点からはどちらでも同様の結果が得られ、また、現在行うことができる実験では前者と後者とを明確に区別することは困難であるという事情もあることから、本明細書では両者を基本的に区別せずに用いる。
症状を抑制することも治療の一種と考えられるため、本発明の「小胞体ストレス関連疾患治療薬」は、「小胞体ストレス関連疾患抑制薬」と言い換えることもできる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】ＮＲＫ−５２Ｅをタプシガルギンで処理した場合の、２−ＰＯＡＡ−ＯＭｅがＧＲＰ７８遺伝子とＣＨＯＰ遺伝子の発現に与える影響を示す写真である。
【図２】ＮＲＫ−５２Ｅをツニカマイシンで処理した場合の、２−ＰＯＡＡ−ＯＭｅがＧＲＰ７８遺伝子とＣＨＯＰ遺伝子の発現に与える影響を示す写真である。
【図３】ＮＲＫ−５２Ｅをタプシガルギンで処理した場合の、２−ＰＯＡＡ−ＮＯ２がＧＲＰ７８遺伝子とＣＨＯＰ遺伝子の発現に与える影響を示す写真である。
【図４】ＮＲＫ−５２Ｅをツニカマイシンで処理した場合の、２−ＰＯＡＡ−ＮＯ２がＧＲＰ７８遺伝子とＣＨＯＰ遺伝子の発現に与える影響を示す写真である。
【図５】ＮＲＫ−５２Ｅをタプシガルギンで処理した場合の、２−ＮＯＡＡがＧＲＰ７８遺伝子とＣＨＯＰ遺伝子の発現に与える影響を示す写真である。
【図６】ＮＲＫ−５２Ｅをツニカマイシンで処理した場合の、２−ＮＯＡＡがＧＲＰ７８遺伝子とＣＨＯＰ遺伝子の発現に与える影響を示す写真である。
【図７】ＮＲＫ−５２Ｅをタプシガルギンで処理した場合の、２−ＮＯＡＡがＧＲＰ７８遺伝子とＣＨＯＰ遺伝子の発現に与える影響と、４−ＰＢＡがＧＲＰ７８遺伝子とＣＨＯＰ遺伝子の発現に与える影響とを比較するために示す写真である。
【図８】ＮＲＫ／ＵＰＲＥ−Ｌｕｃをタプシガルギンで処理した場合の、本発明における各化合物がＵＰＲＥ活性に与える影響を示すグラフである。
【図９】ＮＲＫ／ＳＶ４０−Ｌｕｃをタプシガルギンで処理した場合の、本発明における各化合物がＳＶ４０プロモーター活性に与える影響を示すグラフである。
【図１０】ＮＲＫ／ＥＲＳＥ−Ｌｕｃをタプシガルギンで処理した場合の、本発明における各化合物がＥＲＳＥ活性に与える影響を示すグラフである。
【図１１】ＮＲＫ／ＥＲＳＥ−Ｌｕｃをタプシガルギンで処理した場合の、２−ＮＯＡＡがＥＲＳＥ活性に与える影響の濃度依存性を示すグラフである。
【図１２】ＮＲＫ−５２Ｅをタプシガルギンで処理した場合の、本発明における各化合物がＧＲＰ７８遺伝子、ＧＲＰ９４遺伝子及びＯＲＰ１５０遺伝子の発現に与える影響を示す写真である。
【図１３】ＮＲＫ−５２Ｅをツニカマイシンで処理した場合の、本発明における各化合物がＧＲＰ７８遺伝子、ＧＲＰ９４遺伝子及びＯＲＰ１５０遺伝子の発現に与える影響を示す写真である。
【図１４】ＮＲＫ−５２Ｅをタプシガルギンで処理した場合の、２−ＰＯＡＡ−ＯＭｅがＰＥＲＫのリン酸化に与える影響を示す写真である。
【図１５】ＮＲＫ−５２Ｅをタプシガルギンで処理した場合の、２−ＰＯＡＡ−ＮＯ２がＰＥＲＫのリン酸化に与える影響を示す写真である。
【図１６】ＮＲＫ−５２Ｅをタプシガルギンで処理した場合の、２−ＮＯＡＡがＰＥＲＫのリン酸化に与える影響を示す写真である。
【図１７】ＮＲＫ−５２Ｅをタプシガルギンで処理した場合の、２−ＰＯＡＡ−ＯＭｅがｅＩＦ２αのリン酸化に与える影響を示す写真である。
【図１８】ＮＲＫ−５２Ｅをタプシガルギンで処理した場合の、２−ＰＯＡＡ−ＮＯ２がｅＩＦ２αのリン酸化に与える影響を示す写真である。
【図１９】ＮＲＫ−５２Ｅをタプシガルギンで処理した場合の、２−ＮＯＡＡがｅＩＦ２αのリン酸化に与える影響を示す写真である。
【図２０】ＮＲＫ−５２Ｅに対して、本発明における各化合物そのものがＰＥＲＫのリン酸化に与える影響を示すグラフである。
【図２１】ＮＲＫ−５２Ｅに対して、本発明における各化合物そのものがｅＩＦ２αのリン酸化に与える影響を示すグラフである。
【図２２】ＮＲＫ−５２Ｅをタプシガルギンで処理した場合の、４−ＰＢＡがＰＥＲＫ及びｅＩＦ２αのリン酸化に与える影響を示すグラフである。
【図２３】ＮＲＫ−５２Ｅに対して、４−ＰＢＡそのものがＰＥＲＫ及びｅＩＦ２αのリン酸化に与える影響を示すグラフである。
【図２４】ＮＲＫ／ＮＦκＢ−Ｌｕｃをタプシガルギンで処理した場合の、本発明における各化合物がＮＦ−κＢ活性に与える影響を示すグラフである。
【図２５】ＮＲＫ／ＮＦκＢ−Ｌｕｃをタプシガルギンで処理した場合の、本発明における各化合物がＮＦ−κＢ活性に与える影響を示す写真である。
【図２６】ＮＲＫ／ＮＦκＢ−ＬｕｃをＳｕｂＡＢで処理した場合の、本発明における各化合物がＮＦ−κＢ活性に与える影響を示すグラフである。
【図２７】ＮＲＫ／ＮＦκＢ−ＬｕｃをＳｕｂＡＢで処理した場合の、本発明における各化合物がＮＦ−κＢ活性に与える影響を示すグラフである。
【図２８】ＮＲＫ／ＮＦκＢ−Ｌｕｃに対して、本発明における各化合物がＮＦ−κＢ活性に与える影響を示すグラフである。
【図２９】ＮＲＫ−５２Ｅをツニカマイシンで処理した場合の、２−ＰＯＡＡＮＯ２が細胞の傷害を抑制する様子を示す写真である。
【図３０】ＮＲＫ−５２Ｅをツニカマイシンで処理した場合の、２−ＰＯＡＡＮＯ２が細胞の傷害を抑制する様子を示すグラフである。
【図３１】ＮＲＫ−５２Ｅをタプシガルギンで処理した場合の、２−ＰＯＡＡがＧＲＰ７８遺伝子とＣＨＯＰ遺伝子の発現に与える影響を示す写真である。
【図３２】ＮＲＫ−５２Ｅをタプシガルギンで処理した場合の、２−ＰＯＡＡ−ＯＭｅＮａがＧＲＰ７８遺伝子とＣＨＯＰ遺伝子の発現に与える影響を示す写真である。
【図３３】ＮＲＫ−５２Ｅをタプシガルギンで処理した場合の、２−ＰｙＡがＧＲＰ７８遺伝子とＣＨＯＰ遺伝子の発現に与える影響を示す写真である。
【００２４】
［実施形態１］
実施形態１においては、「２−ＰＯＡＡ−ＯＭｅ、２−ＰＯＡＡ−ＮＯ２又は２−ＮＯＡＡからなる小胞体ストレス関連実験用試薬」について説明する。
【００２５】
実施形態１に係る、２−ＰＯＡＡ−ＯＭｅ、２−ＰＯＡＡ−ＮＯ２又は２−ＮＯＡＡからなる小胞体ストレス関連実験用試薬は、文字通り上記の化合物のいずれかからなる試薬であって、小胞体ストレス関連実験に用いるものである。実施形態１に係る小胞体ストレス関連実験用試薬を小胞体ストレス関連実験に用いるときには、そのまま用いたり、溶媒（例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ））に溶解させて用いたり、補助剤（例えば、安定剤やｐＨ調整剤）や他の薬理成分とともに用いたりすることができる。
【００２６】
なお、本発明における化合物である２−ＰＯＡＡ−ＯＭｅ、２−ＰＯＡＡ−ＮＯ２又は２−ＮＯＡＡは、通常、白色〜淡黄色の結晶又は粉末の形態をとる。発明者らの実験環境においては、常温・常圧において、２−ＰＯＡＡ−ＯＭｅは白色の菱形結晶であり、２−ＰＯＡＡ−ＮＯ２は淡黄色の粉末であり、２−ＮＯＡＡは白色の板状結晶であった。
２−ＰＯＡＡ−ＯＭｅ、２−ＰＯＡＡ−ＮＯ２及び２−ＮＯＡＡは、合成して得たものを用いてもよいし、購入して得たものを用いてもよい。これは後述する実施形態２及び実施形態３においても同様である。
【００２７】
実施形態１に係る小胞体ストレス関連実験用試薬によれば、後述する各実験例に示すように、４−ＰＢＡよりも小胞体ストレスを抑制する効果が大きい化合物である２−ＰＯＡＡ−ＯＭｅ、２−ＰＯＡＡ−ＮＯ２又は２−ＮＯＡＡからなるため、小胞体ストレスを十分に抑制することが可能な小胞体ストレス関連実験用試薬となる。
【００２８】
また、実施形態１における化合物である２−ＰＯＡＡ−ＯＭｅ、２−ＰＯＡＡ−ＮＯ２及び２−ＮＯＡＡは、入手容易な化合物から簡単な（１ステップ〜２ステップ程度の）化学合成により得られるものである。このため、実施形態１に係る小胞体ストレス関連実験用試薬によれば、比較的入手容易であり、かつ、比較的低コストである小胞体ストレス関連実験用試薬とすることが可能となる。
【００２９】
［実施形態２］
実施形態２においては、「２−ＰＯＡＡ−ＯＭｅ、２−ＰＯＡＡ−ＮＯ２又は２−ＮＯＡＡを有効成分として含有する小胞体ストレス関連実験用試薬」について説明する。
【００３０】
実施形態２に係る、２−ＰＯＡＡ−ＯＭｅ、２−ＰＯＡＡ−ＮＯ２又は２−ＮＯＡＡを有効成分として含有する小胞体ストレス関連実験用試薬は、２−ＰＯＡＡ−ＯＭｅ、２−ＰＯＡＡ−ＮＯ２又は２−ＮＯＡＡを有効成分として含有する試薬であって、小胞体ストレス関連実験に用いるものである。当該小胞体ストレス関連実験用試薬は、有効成分としての２−ＰＯＡＡ−ＯＭｅ、２−ＰＯＡＡ−ＮＯ２又は２−ＮＯＡＡの他に、溶媒、他の有効成分、補助成分等を含む。
【００３１】
実施形態２に係る小胞体ストレス関連実験用試薬は、小胞体ストレス関連実験にそのまま使用することができるものであってもよいし、希釈して使用するものであってもよいし、他の試薬と併せて使用するものであってもよい。
【００３２】
なお、本発明に係る小胞体ストレス関連実験用試薬については、使用時（実験時）において２−ＰＯＡＡ−ＯＭｅ、２−ＰＯＡＡ−ＮＯ２又は２−ＮＯＡＡが有効成分となるものであればよい。つまり、非使用時（保存時）においては、２−ＰＯＡＡ−ＯＭｅ、２−ＰＯＡＡ−ＮＯ２又は２−ＮＯＡＡそのものは少量しか含まない、あるいはまったく含まない小胞体ストレス関連実験用試薬であっても、使用時において２−ＰＯＡＡ−ＯＭｅ、２−ＰＯＡＡ−ＮＯ２又は２−ＮＯＡＡが有効成分となる小胞体ストレス関連実験用試薬（例えば、非使用時において主に２−ＰＯＡＡ−ＯＭｅ、２−ＰＯＡＡ−ＮＯ２又は２−ＮＯＡＡの塩を含有するもの）は、本発明の範囲に含まれうる。
【００３３】
実施形態２に係る小胞体ストレス関連実験用試薬によれば、後述する各実験例に示すように、４−ＰＢＡよりも小胞体ストレスを抑制する効果が大きい化合物である２−ＰＯＡＡ−ＯＭｅ、２−ＰＯＡＡ−ＮＯ２又は２−ＮＯＡＡを有効成分として含有するため、小胞体ストレスを十分に抑制することが可能な小胞体ストレス関連実験用試薬となる。
【００３４】
また、実施形態２における化合物である２−ＰＯＡＡ−ＯＭｅ、２−ＰＯＡＡ−ＮＯ２及び２−ＮＯＡＡは、入手容易な化合物から簡単な（１ステップ〜２ステップ程度の）化学合成により得られるものである。このため、実施形態２の小胞体ストレス関連実験用試薬によれば、比較的入手容易であり、かつ、比較的低コストである小胞体ストレス関連実験用試薬とすることが可能となる。
【００３５】
［実施形態３］
実施形態３においては、「２−ＰＯＡＡ−ＯＭｅ、２−ＰＯＡＡ−ＮＯ２又は２−ＮＯＡＡを有効成分として含有する小胞体ストレス疾患治療薬」について説明する。
【００３６】
実施形態３に係る、２−ＰＯＡＡ−ＯＭｅ、２−ＰＯＡＡ−ＮＯ２又は２−ＮＯＡＡを有効成分として含有する小胞体ストレス疾患治療薬は、２−ＰＯＡＡ−ＯＭｅ、２−ＰＯＡＡ−ＮＯ２又は２−ＮＯＡＡを有効成分として含む治療薬であって、小胞体ストレス関連疾患等を治療又は緩和する目的に用いるものである。
【００３７】
実施形態３に係る小胞体ストレス疾患治療薬は、小胞体ストレス疾患治療にそのまま使用するものであってもよいし、希釈して使用するものであってもよいし、他の医薬品等と併せて使用するものであってもよい。
【００３８】
実施形態３に係る小胞体ストレス疾患治療薬の形態としては、内用薬（例えば、液剤、粉末剤、錠剤、フィルム剤、カプセル剤）でも外用薬（例えば、軟膏剤、テープ剤、液剤）でもよく、利用方法も目的に応じて各種の方法（例えば、経口投与、腹腔投与、注射、塗布）を用いることができる。
小胞体ストレス疾患治療薬の投与量も目的に応じて適切な量とすることができる。本発明における化合物である２−ＰＯＡＡ−ＯＭｅ、２−ＰＯＡＡ−ＮＯ２又は２−ＮＯＡＡの量で考えたとき、例えば、投与対象の体重１ｋｇあたり１ｍｇ〜１０００ｍｇとなる量であることが好ましく、投与対象の体重１ｋｇあたり１０ｍｇ〜５００ｍｇとなる量であることが一層好ましい。
【００３９】
実施形態３に係る小胞体ストレス疾患治療薬によれば、後述する実験例に示すように、４−ＰＢＡよりも小胞体ストレスを抑制する効果が大きい化合物である２−ＰＯＡＡ−ＯＭｅ、２−ＰＯＡＡ−ＮＯ２又は２−ＮＯＡＡを有効成分として含有するため、小胞体ストレスを十分に抑制することが可能な小胞体ストレス疾患治療薬となる。
【００４０】
また、実施形態３における化合物である２−ＰＯＡＡ−ＯＭｅ、２−ＰＯＡＡ−ＮＯ２及び２−ＮＯＡＡは、入手容易な化合物から簡単な（１ステップ〜２ステップ程度の）化学合成により得られるものである。このため、実施形態３に係る小胞体ストレス疾患治療薬によれば、比較的入手容易であり、かつ、比較的低コストである小胞体ストレス疾患治療薬とすることが可能となる。
【００４１】
［実験例及び比較例］
本発明における化合物である２−ＰＯＡＡ−ＯＭｅ、２−ＰＯＡＡ−ＮＯ２及び２−ＮＯＡＡと、従来の化合物である４−ＰＢＡとについて、小胞体ストレス抑制効果の有無や度合いを調べるために各種実験を行った。以下に記載する実験例及び比較例は、行った実験とその結果について、図面を用いて説明するものである。
【００４２】
［実験例１］
図１は、ＮＲＫ−５２Ｅをタプシガルギンで処理した場合の、２−ＰＯＡＡ−ＯＭｅがＧＲＰ７８遺伝子及びＣＨＯＰ遺伝子の発現に与える影響を示す写真である。
図２は、ＮＲＫ−５２Ｅをツニカマイシンで処理した場合の、２−ＰＯＡＡ−ＯＭｅがＧＲＰ７８遺伝子及びＣＨＯＰ遺伝子の発現に与える影響を示す写真である。
図３は、ＮＲＫ−５２Ｅをタプシガルギンで処理した場合の、２−ＰＯＡＡ−ＮＯ２がＧＲＰ７８遺伝子及びＣＨＯＰ遺伝子の発現に与える影響を示す写真である。
図４は、ＮＲＫ−５２Ｅをツニカマイシンで処理した場合の、２−ＰＯＡＡ−ＮＯ２がＧＲＰ７８遺伝子及びＣＨＯＰ遺伝子の発現に与える影響を示す写真である。
図５は、ＮＲＫ−５２Ｅをタプシガルギンで処理した場合の、２−ＮＯＡＡがＧＲＰ７８遺伝子及びＣＨＯＰ遺伝子の発現に与える影響を示す写真である。
図６は、ＮＲＫ−５２Ｅをツニカマイシンで処理した場合の、２−ＮＯＡＡがＧＲＰ７８遺伝子及びＣＨＯＰ遺伝子の発現に与える影響を示す写真である。
【００４３】
なお、図面においては、２−（４−Ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｏｘｙ）ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄは２−ＰＯＡＡ−ＯＭｅと記載し、２−（４−Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｘｙ）ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄは２−ＰＯＡＡ−ＮＯ２と記載し、２−（２−Ｎａｐｈｔｈｙｌｏｘｙ）ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄは２−ＮＯＡＡと記載する。また、タプシガルギンはＴｇと記載し、ツニカマイシンはＴｍと記載する。
【００４４】
実験例１は、本発明における化合物である２−ＰＯＡＡ−ＯＭｅ、２−ＰＯＡＡ−ＮＯ２及び２−ＮＯＡＡ（以下、単に「本発明における各化合物」ということもある。）が小胞体ストレスを抑制する効果を、ＧＲＰ７８遺伝子及びＣＨＯＰ遺伝子の発現を指標として調べたものである。
【００４５】
実験例１について、もう少し詳しく説明する。
小胞体ストレスに対する細胞の反応を小胞体ストレス応答（ｕｎｆｏｌｄｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ。ＵＰＲともいう。）という。小胞体ストレス応答が誘導される主な経路として、ＡＴＦ６（ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ６）が誘導される経路、ＩＲＥ１（ｉｎｏｓｉｔｏｌ−ｒｅｑｕｉｒｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ  １）が誘導される経路及びＰＥＲＫ（ＰＫＲ−ｌｉｋｅ  ＥＲ  ｋｉｎａｓｅ）が誘導される経路の３つがある。
【００４６】
このうち、ＡＴＦ６の経路とＩＲＥ１の経路においては、ＡＴＦ６及びＸＢＰ１（Ｘ−ｂｏｘ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １。ＩＲＥ１が触媒することにより誘導されるタンパク質。）がＥＲＳＥ（ＥＲ  ｓｔｒｅｓｓ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ）及びＵＰＲＥ（ＵＰＲ  ｅｌｅｍｅｎｔ）に結合し、ＧＲＰ７８（７８ｋＤａ  ｇｌｕｃｏｓｅ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子を含む遺伝子を発現させる。
【００４７】
また、ＰＥＲＫの経路においては、ｅＩＦ２α（ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ２α）のリン酸化と、それに起因するＣＨＯＰ（ＣＣＡＡＴ／ｅｎｈａｎｃｅｒ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ）の誘導が発生する。
【００４８】
つまり、ＧＲＰ７８遺伝子及びＣＨＯＰ遺伝子の発現を、小胞体ストレスのマーカーとして用いることができるということである。実験例１においては、小胞体ストレスを誘導した細胞において、本発明における各化合物を添加した場合のＧＲＰ７８遺伝子及びＣＨＯＰ遺伝子の発現の様子を見ることにより、本発明における各化合物の効果を調べた。
【００４９】
最初に、使用した試薬等について説明する。
本発明における各化合物は、全て合成により得たものを用いた。
まず、本発明の各化合物に対応するフェノール類、つまり、２−ＰＯＡＡ−ＯＭｅに対応する４−メトキシフェノール、２−ＰＯＡＡ−ＮＯ２に対応する４−ニトロフェノール（ｐ−ニトロフェノールとも）及び２−ＮＯＡＡに対応する２−ナフトールと、ブロモ酢酸エチルとを準備した。なお、上記したフェノール類及びブロモ酢酸エチルは、ナカライテスク製のものを用いた。
次に、上記フェノール類とブロモ酢酸エチルとを無水炭酸カリウム（関東化学製）の存在下で反応させ（ウィリアムソン反応。アセトン中で２時間加熱還流を行った。）、反応により合成されたエステルを加水分解することで（水酸化ナトリウムを加えたテトラヒドロフラン中で１時間室温撹拌を行った。）本発明における各化合物を得た。各化合物の構造は、１Ｈ  ＮＭＲにより確認した。
以降の実験例で用いた２−ＰＯＡＡ−ＯＭｅ、２−ＰＯＡＡ−ＮＯ２及び２−ＮＯＡＡも、上記と同様の方法により合成したものであるので、都度の記載は省略する。
【００５０】
小胞体ストレス誘導剤であるタプシガルギン（ｔｈａｐｓｉｇａｒｇｉｎ）及びツニカマイシン（ｔｕｎｉｃａｍｙｃｉｎ）は、日本のシグマアルドリッチジャパン合同会社から購入したものを用いた。以降の実験例で用いたタプシガルギン及びツニカマイシンも上記と同様のものであるので、都度の記載は省略する。
【００５１】
次に、実験例１で行った実験について説明する。
まず、細胞としてＮＲＫ−５２Ｅ（培養腎尿細管細胞の一種）を準備した。ＮＲＫ−５２Ｅは、アメリカのＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ社から購入したものを用いた。当該細胞は、アメリカのＧｉｂｃｏ−ＢＲＬ社から購入したダルベッコ改変イーグル培地／栄養混合物Ｆ−１２ハムである培養液に５％ウシ胎児血清を添加したものを用いて保存した。
【００５２】
次に、前処理として、ＮＲＫ−５２Ｅの培養液を上記培養液に１％ウシ胎児血清を添加したものに置換し、規定の濃度（２．５ｍＭ又は５．０ｍＭ）の２−ＰＯＡＡ−ＯＭｅ、２−ＰＯＡＡ−ＮＯ２又は２−ＮＯＡＡを添加して３０分間前培養を行った。
さらに、前処理を行ったＮＲＫ−５２Ｅと前処理を行っていないＮＲＫ−５２Ｅについて、小胞体ストレス誘導剤であることが知られているタプシガルギン又はツニカマイシンを添加し、２時間、処理を行った。濃度については、タプシガルギンの濃度は５００ｎＭとし、ツニカマイシンの濃度は２．５μｇ／ｍｌとした。
【００５３】
最後に、前処理も処理も行っていないＮＲＫ−５２Ｅ、前処理を行わずにタプシガルギン又はツニカマイシンで処理を行ったＮＲＫ−５２Ｅ、前処理を行った上でタプシガルギン又はツニカマイシンで処理を行ったＮＲＫ−５２Ｅについて、ＲＮＡ検出法であるノーザンブロット法により、ＧＲＰ７８遺伝子及びＣＨＯＰ遺伝子の発現を検出した。なお、コントロールとしてＧＡＰＤＨ（ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）遺伝子の発現の検出も行った。
【００５４】
ノーザンブロット法については、広く知られている方法であるため詳細な説明は省略するが、細胞よりＲＮＡを抽出し、アガロースゲルで展開し、ナイロン膜に転写し、放射性同位元素でラベルしたｃＤＮＡを用いてハイブリダイゼーションを行い、放射性活性を検出することにより行った。
【００５５】
まず、図１及び図２に示すように、２−ＰＯＡＡ−ＯＭｅについて、タプシガルギンで処理した場合（図１参照。）及びツニカマイシンで処理した場合（図２参照。）の両方において、ＧＲＰ７８遺伝子及びＣＨＯＰ遺伝子に係る反応が減少することが確認できた。また、２−ＰＯＡＡ−ＯＭｅの濃度を５．０ｍＭとしたときの方が２．５ｍＭとしたときよりも上記反応が減少する度合いが大きい、つまり小胞体ストレスを抑制する効果が大きいことから、２−ＰＯＡＡ−ＯＭｅにおける小胞体ストレス抑制効果の濃度依存性が確認できた。
【００５６】
次に、図３及び図４に示すように、２−ＰＯＡＡ−ＮＯ２についても、タプシガルギンで処理した場合（図３参照。）及びツニカマイシンで処理した場合（図４参照。）の両方において、ＧＲＰ７８遺伝子及びＣＨＯＰ遺伝子に係る反応が減少することが確認できた。また、２−ＰＯＡＡ−ＮＯ２の濃度を５．０ｍＭとしたときの方が２．５ｍＭとしたときよりも上記反応が減少する度合いが大きい、つまり小胞体ストレスを抑制する効果が大きいことから、２−ＰＯＡＡ−ＮＯ２における小胞体ストレス抑制効果の濃度依存性が確認できた。
【００５７】
さらに、図５及び図６に示すように、２−ＮＯＡＡについても、タプシガルギンで処理した場合（図５参照。）及びツニカマイシンで処理した場合（図６参照。）の両方において、ＧＲＰ７８遺伝子及びＣＨＯＰ遺伝子に係る反応が減少することが確認できた。また、２−ＮＯＡＡの濃度を５．０ｍＭとしたときの方が２．５ｍＭとしたときよりも上記反応が減少する度合いが大きい、つまり小胞体ストレスを抑制する効果が大きいことから、２−ＮＯＡＡにおける小胞体ストレス抑制効果の濃度依存性を確認することができた。
【００５８】
実験例１の条件においては、図１〜図６に示すように、本発明における各化合物の中でも２−ＮＯＡＡが最も高い小胞体ストレス抑制効果を有することが確認できた。
【００５９】
［実験例２］
図７は、ＮＲＫ−５２Ｅをタプシガルギンで処理した場合の、２−ＮＯＡＡがＧＲＰ７８遺伝子及びＣＨＯＰ遺伝子の発現に与える影響と、４−ＰＢＡがＧＲＰ７８遺伝子とＣＨＯＰ遺伝子の発現に与える影響とを比較するために示す写真である。
【００６０】
実験例２は、本発明における化合物である２−ＮＯＡＡが小胞体ストレスを抑制する効果と、従来用いられている化合物である４−ＰＢＡが小胞体ストレスを抑制する効果とを、ＧＲＰ７８遺伝子とＣＨＯＰ遺伝子との発現を指標として調べて比較したものである。
【００６１】
最初に、使用した試薬等について説明する。
４−ＰＢＡは、アメリカのＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ社から購入したものを用いた。以降の実験例で用いた４−ＰＢＡも上記と同様のものであるので、都度の記載は省略する。
【００６２】
以下、実験例２で行った実験について説明する。
まず、実験例２においては、実験例１と同様のＮＲＫ−５２Ｅを用意した。
次に、ＮＲＫ−５２Ｅについて、規定の濃度（０．１ｍＭ、０．５ｍＭ、１．０ｍＭ、２．５ｍＭ又は５．０ｍＭ）の２−ＮＯＡＡ又は４−ＰＢＡを添加し、３０分間、前処理を行った。
さらに、前処理を行ったＮＲＫ−５２Ｅと前処理を行っていないＮＲＫ−５２Ｅについて、タプシガルギンを添加し、２時間、処理を行った。濃度については、５００ｎＭとした。
【００６３】
最後に、前処理も処理も行っていないＮＲＫ−５２Ｅ、前処理を行わずにタプシガルギンで処理を行ったＮＲＫ−５２Ｅ、前処理を行った上でタプシガルギンで処理を行ったＮＲＫ−５２Ｅについて、ノーザンブロット法により、ＧＲＰ７８遺伝子及びＣＨＯＰ遺伝子の発現を検出した。なお、コントロールとしてＧＡＰＤＨ遺伝子の発現の検出も行った。
【００６４】
その結果、図７に示すように、４−ＰＢＡを用いた場合よりも、２−ＮＯＡＡを用いた場合の方がＧＲＰ７８遺伝子及びＣＨＯＰ遺伝子に係る反応が減少する度合いが大きいことを確認できた。
また、２−ＮＯＡＡについては、２−ＮＯＡＡの濃度を１．０ｍＭとしたときから小胞体ストレスを抑制する効果を確認することができた。
【００６５】
実験例１及び実験例２の結果により、本発明における各化合物が小胞体ストレスを抑制する効果は、４−ＰＢＡが小胞体ストレスを抑制する効果よりも大きいことを確認できた。
つまり、本発明における各化合物を用いることにより、４−ＰＢＡよりも小胞体ストレスを抑制する効果が大きい化合物を用いた、小胞体ストレスを十分に抑制することが可能な小胞体ストレス関連実験用試薬及び小胞体ストレス関連疾患治療薬を実現することが可能となる。
【００６６】
［実験例３］
図８は、ＮＲＫ／ＵＰＲＥ−Ｌｕｃをタプシガルギンで処理した場合の、本発明における各化合物がＵＰＲＥ活性に与える影響を示すグラフである。
図９は、ＮＲＫ／ＳＶ４０−Ｌｕｃをタプシガルギンで処理した場合の、本発明における各化合物がＳＶ４０プロモーター活性に与える影響を示すグラフである。
【００６７】
実験例３は、本発明における各化合物が小胞体ストレスを抑制する効果を、ＵＰＲＥ活性を指標として調べたものである。
【００６８】
実験例３について、もう少し詳しく説明する。
ＩＲＥ１の経路においては、ＸＢＰ１がＵＰＲＥに結合することは上記した通りである。さらに詳しく説明すると、まず、ＩＲＥ１の経路において、ＩＲＥ１のエンドヌクレアーゼ活性を有するドメインがＸＢＰ１ｍＲＮＡのイントロンを除去する。次に、これによって生産されるＸＢＰ１がＵＰＲＥを活性化する。
実験例３においては、小胞体ストレス誘導剤で処理した細胞において、本発明における各化合物を用いた場合のＵＰＲＥの活性を見ることにより、本発明における各化合物が小胞体ストレスを抑制する効果を調べた。
【００６９】
以下、実験例３の実験条件について説明する。
まず、細胞としてＮＲＫ／ＵＰＲＥ−Ｌｕｃ及びＮＲＫ／ＳＶ４０−Ｌｕｃを準備した。
ＮＲＫ／ＵＰＲＥ−Ｌｕｃは、ＮＲＫ−５２ＥのＵＰＲＥサイトにルシフェラーゼ遺伝子を導入したものである。導入の方法については、広く知られているものであるため、説明を省略する。
【００７０】
ＮＲＫ／ＳＶ４０−Ｌｕｃは、ＮＲＫ−５２ＥのＳＶ４０プロモーター／エンハンサーにルシフェラーゼ遺伝子を導入したものである。導入の方法については、広く知られているものであるため、説明を省略する。
なお、ＳＶ４０プロモーターは、小胞体ストレスに直接関連する要素ではない。ＮＲＫ／ＳＶ４０−Ｌｕｃは、実験例３に係る実験において、本発明における各化合物が非特異的に遺伝子の発現を抑制するものではないことを確認するために準備した。
【００７１】
次に、準備したＮＲＫ／ＵＰＲＥ−Ｌｕｃ及びＮＲＫ／ＳＶ４０−Ｌｕｃについて、規定の濃度（２．５ｍＭ又は５．０ｍＭ）の２−ＰＯＡＡ−ＯＭｅ、２−ＰＯＡＡ−ＮＯ２又は２−ＮＯＡＡと、５００ｎＭのタプシガルギンとを含む溶液中で、９時間、処理を行った。また、別のＮＲＫ／ＵＰＲＥ−Ｌｕｃ及びＮＲＫ／ＳＶ４０−Ｌｕｃについて、５００ｎＭのタプシガルギンを含む溶液中で、９時間、処理を行った。
【００７２】
最後に、処理を行っていないＮＲＫ／ＵＰＲＥ−Ｌｕｃ及びＮＲＫ／ＳＶ４０−Ｌｕｃ、タプシガルギンを含む溶液中で処理を行ったＮＲＫ／ＵＰＲＥ−Ｌｕｃ及びＮＲＫ／ＳＶ４０−Ｌｕｃ、本発明にかかる各化合物及びタプシガルギンを含む溶液中で処理を行ったＮＲＫ／ＵＰＲＥ−Ｌｕｃ及びＮＲＫ／ＳＶ４０−Ｌｕｃのそれぞれについて、ＵＰＲＥの活性をみるために、ルシフェラーゼアッセイを行った。活性は相対発光強度（ＲＬＵ：ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｌｉｇｈｔ  ｕｎｉｔ）単位で測定した。
ルシフェラーゼアッセイは、アメリカのプロメガ社製のルシフェラーゼアッセイシステムを用いて、製造者による手順どおりに行った。
【００７３】
その結果、図８に示すように、本発明における各化合物がＵＰＲＥの活性を抑制すること、つまり、小胞体ストレスを抑制する効果があることが確認できた。
２−ＰＯＡＡ−ＯＭｅについては、濃度が５．０ｍＭのときに顕著な効果が確認できた。
２−ＰＯＡＡ−ＮＯ２については、濃度が２．５ｍＭのときにも効果が確認でき、５．０ｍＭのときに顕著な効果が確認できた。
２−ＮＯＡＡについては、濃度が２．５ｍＭのときにも５．０ｍＭのときにも顕著な効果が確認できた。
【００７４】
また、図９に示すように、本発明における各化合物は、ＳＶ４０プロモーターの活性化については有意な影響を与えないことが確認できた。つまり、本発明における各化合物は、遺伝子の活性化を非特異的に抑制するものではなく、小胞体ストレスに関連する経路に作用するものであることが確認できた。
【００７５】
［実験例４］
図１０は、ＮＲＫ／ＥＲＳＥ−Ｌｕｃをタプシガルギンで処理した場合の、本発明における各化合物がＥＲＳＥ活性に与える影響を示すグラフである。
【００７６】
実験例４は、本発明における各化合物が小胞体ストレスを抑制する効果を、ＥＲＳＥ活性を指標として調べたものである。
【００７７】
以下、実験例４の実験条件について説明する。
まず、細胞としてＮＲＫ／ＥＲＳＥ−Ｌｕｃを準備した。
ＮＲＫ／ＥＲＳＥ−Ｌｕｃは、ＮＲＫ−５２ＥのＥＲＳＥサイトにルシフェラーゼ遺伝子を導入したものである。導入の方法については、広く知られているものであるため、説明を省略する。
【００７８】
次に、準備したＮＲＫ／ＥＲＳＥ−Ｌｕｃについて、規定の濃度（２．５ｍＭ又は５．０ｍＭ）の２−ＰＯＡＡ−ＯＭｅ、２−ＰＯＡＡ−ＮＯ２又は２−ＮＯＡＡと、５００ｎＭのタプシガルギンとを含む溶液中で、９時間、処理を行った。また、別のＮＲＫ／ＥＲＳＥ−Ｌｕｃについて、５００ｎＭのタプシガルギンを含む溶液中で、９時間、処理を行った。
【００７９】
最後に、処理を行っていないＮＲＫ／ＥＲＳＥ−Ｌｕｃ及び、タプシガルギンを含む溶液中で処理を行ったＮＲＫ／ＥＲＳＥ−Ｌｕｃ、本発明における各化合物及びタプシガルギンを含む溶液中で処理を行ったＮＲＫ／ＥＲＳＥ−Ｌｕｃのそれぞれについて、ＥＲＳＥの活性をみるために、ルシフェラーゼアッセイを行った。活性は相対発光強度（ＲＬＵ）単位で測定した。
ルシフェラーゼアッセイは、アメリカのプロメガ社製のルシフェラーゼアッセイシステムを用いて、製造者による手順どおりに行った。
【００８０】
その結果、図１０に示すように、本発明における各化合物は、ＥＲＳＥの活性を抑制すること、つまり、小胞体ストレスを抑制する効果があることが確認できた。
また、本発明における各化合物は、いずれも２．５ｍＭからＥＲＳＥの活性を抑制する顕著な効果を有することが確認できた。
【００８１】
［実験例５］
図１１は、ＮＲＫ／ＥＲＳＥ−Ｌｕｃをタプシガルギンで処理した場合の、２−ＮＯＡＡがＥＲＳＥ活性に与える影響の濃度依存性を示すグラフである。
【００８２】
実験例５は、本発明における化合物である２−ＮＯＡＡが小胞体ストレスを抑制する効果の濃度依存性を、ＥＲＳＥ活性を指標として調べたものである。
【００８３】
以下、実験例５の実験条件について説明する。
まず、細胞として実験例４と同様のＮＲＫ／ＥＲＳＥ−Ｌｕｃを準備した。
次に、準備したＮＲＫ／ＥＲＳＥ−Ｌｕｃについて、規定の濃度（０．１ｍＭ、０．５ｍＭ、１．０ｍＭ、２．５ｍＭ又は５．０ｍＭ）の２−ＮＯＡＡと、５００ｎＭのタプシガルギンとを含む溶液中で、９時間、処理を行った。
【００８４】
最後に、処理を行っていないＮＲＫ／ＥＲＳＥ−Ｌｕｃ、タプシガルギンを含む溶液中で処理を行ったＮＲＫ／ＥＲＳＥ−Ｌｕｃ、本発明にかかる各化合物及びタプシガルギンを含む溶液中で処理を行ったＮＲＫ／ＥＲＳＥ−Ｌｕｃのそれぞれについて、ＥＲＳＥの活性をみるために、ルシフェラーゼアッセイを行った。活性は相対発光強度（ＲＬＵ）単位で測定した。
ルシフェラーゼアッセイについては、広く知られた測定方法であるため、説明を省略する。
【００８５】
その結果、図１１に示すように、２−ＮＯＡＡは、０．５ｍＭという低濃度からＥＲＳＥの活性を抑制する効果を有することが確認できた。
【００８６】
実験例１〜実験例５の結果により、本発明における各化合物は、ＡＴＦ６の経路を優先的に抑制するものであることが考えられる。
【００８７】
［実験例６］
図１２は、ＮＲＫ−５２Ｅをタプシガルギンで処理した場合の、本発明における各化合物がＧＲＰ７８遺伝子、ＧＲＰ９４遺伝子及びＯＲＰ１５０遺伝子の発現に与える影響を示す写真である。
図１３は、ＮＲＫ−５２Ｅをツニカマイシンで処理した場合の、本発明における各化合物がＧＲＰ７８遺伝子、ＧＲＰ９４遺伝子及びＯＲＰ１５０遺伝子の発現に与える影響を示す写真である。
【００８８】
実験例６は、本発明における各化合物が小胞体ストレスを抑制する効果を、ＧＲＰ７８遺伝子、ＧＲＰ９４遺伝子及びＯＲＰ１５０遺伝子の発現を指標として調べたものである。
実験例６について、もう少し詳しく説明する。
ＡＴＦ６の経路においては、ＡＴＦ６がＥＲＳＥに結合しＧＲＰ７８遺伝子を含む遺伝子を発現させることは前述したが、ＡＴＦ６はＧＲＰ７８遺伝子の他にもＧＲＰ９４遺伝子及びＯＲＰ１５０（１５０ｋＤａ  ｏｘｙｇｅｎ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子を発現させることが知られている。
このため、ＡＴＦ６の経路に対する本発明における各化合物の効果を検証するために、小胞体ストレスを誘導した細胞において、本発明における各化合物を添加した場合のＧＲＰ７８遺伝子、ＧＲＰ９４遺伝子及びＯＲＰ１５０遺伝子の発現の様子を見ることにより、本発明における各化合物の効果を調べた。
【００８９】
実験例６で行った実験については、ＧＲＰ９４遺伝子及びＯＲＰ１５０遺伝子の発現の様子を見ること以外は、実験例１で行った方法と同様の方法により行ったため、記載を省略する。なお、本発明における各化合物の濃度は５．０ｍＭとした。
【００９０】
その結果、図１２及び図１３に示すように、本発明における各化合物を用いた場合、ＧＲＰ７８遺伝子に係る反応だけではなく、ＧＲＰ９４遺伝子及びＯＲＰ１５０遺伝子に係る反応も減少することが確認できた。
実験例６の結果は、本発明における各化合物がＡＴＦ６の経路を優先的に抑制することを裏付けるものとなった。
【００９１】
［実験例７］
図１４は、ＮＲＫ−５２Ｅをタプシガルギンで処理した場合の、２−ＰＯＡＡ−ＯＭｅがＰＥＲＫのリン酸化に与える影響を示す写真である。
図１５は、ＮＲＫ−５２Ｅをタプシガルギンで処理した場合の、２−ＰＯＡＡ−ＮＯ２がＰＥＲＫのリン酸化に与える影響を示す写真である。
図１６は、ＮＲＫ−５２Ｅをタプシガルギンで処理した場合の、２−ＮＯＡＡがＰＥＲＫのリン酸化に与える影響を示す写真である。
図１７は、ＮＲＫ−５２Ｅをタプシガルギンで処理した場合の、２−ＰＯＡＡ−ＯＭｅがｅＩＦ２αのリン酸化に与える影響を示す写真である。
図１８は、ＮＲＫ−５２Ｅをタプシガルギンで処理した場合の、２−ＰＯＡＡ−ＮＯ２がｅＩＦ２αのリン酸化に与える影響を示す写真である。
図１９は、ＮＲＫ−５２Ｅをタプシガルギンで処理した場合の、２−ＮＯＡＡがｅＩＦ２αのリン酸化に与える影響を示す写真である。
【００９２】
実験例７は、本発明における各化合物によるＰＥＲＫの経路への影響を、ＰＥＲＫ及びｅＩＦ２αのリン酸化を指標として調べたものである。
実験例７について、もう少し詳しく説明する。
ＰＥＲＫの経路においては、ｅＩＦ２αのリン酸化が起こることは前述したが、当該経路ではＰＥＲＫのリン酸化も起こる。このため、本発明における各化合物がＰＥＲＫの経路を抑制する効果があるならば、ＰＥＲＫ及びｅＩＦ２αのリン酸化を抑制することができるはずである。実験例７は、上記のことを検証するために行った。
【００９３】
以下、実験例７で行った実験について説明する。
実験例７で行った実験は、実験対称である各細胞を準備・処理するところまでは実験例１で行った方法と同様の方法により行ったため、記載を省略する。
【００９４】
前処理も処理も行っていないＮＲＫ−５２Ｅ、前処理を行わずにタプシガルギンで処理を行ったＮＲＫ−５２Ｅ、前処理を行った上でタプシガルギンにより処理を行ったＮＲＫ−５２Ｅについて、タンパク質検出法であるウェスタンブロット法により、ＰＥＲＫ、ｐ−ＰＥＲＫ（ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ  ＰＥＲＫ）、ｅＩＦ２α及びｐ−ｅＩＦ２α（ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ  ｅＩＦ２α）の量を検出した。
【００９５】
ウェスタンブロット法については、広く知られている方法であるため詳細な説明は省略する。ＰＥＲＫ、ｐ−ＰＥＲＫ及びｅＩＦ２αに対する抗体はアメリカのＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社から購入したものを用い、ｐ−ｅＩＦ２αに対する抗体はアメリカのＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社から購入したものを用いた。また、コントロールとしてβ−アクチンとラミンＢ１について検出を行った。β−アクチンに対する抗体はシグマアルドリッチジャパンから購入したものを用い、ラミンＢ１に対する抗体はアメリカのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から購入したものを用いた。核酸タンパク質の抽出にはドイツのＭｅｒｃｋ  ＫｇａＡ社から購入したＰｒｏｔｅｏＥｘｔｒａｃｔ  Ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｐｒｏｔｅｏｓｏｍｅ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いた。
【００９６】
その結果、図１４〜図１６に示すように、タプシガルギンの存在下でＰＥＲＫのリン酸化が促進されることと、本発明における各化合物によってはタプシガルギンによって促進されたＰＥＲＫのリン酸化の度合いは変わらないこととを確認できた。
【００９７】
また、上記図１７〜図１９に示すように、タプシガルギンの存在下でｅＩＦ２αのリン酸化が促進されることと、本発明における各化合物によってはタプシガルギンによって促進されたｅＩＦ２αのリン酸化の度合いは変わらないこととを確認できた。
【００９８】
つまり、本発明における各化合物は、小胞体ストレス誘導剤を用いたときにおいては、ＰＥＲＫの経路におけるＰＥＲＫ及びｅＩＦ２αのリン酸化を抑制する効果を有しないと考えられる。
【００９９】
なお、実験例７で調べた範囲は、小胞体ストレス応答のうちＰＥＲＫの経路のみに関連するものであるため、本発明における各化合物がＰＥＲＫの経路に作用しないことは、本発明における各化合物が小胞体ストレスを抑制する効果がないことを示すものではない。
実験例１〜６に示したとおり、本発明における各化合物は、主にＡＴＦ６の経路に作用することにより、全体として小胞体ストレスを抑制するものであると考えられる。
【０１００】
［実験例８］
図２０は、ＮＲＫ−５２Ｅに対して、本発明における各化合物そのものがＰＥＲＫのリン酸化に与える影響を示すグラフである。
図２１は、ＮＲＫ−５２Ｅに対して、本発明における各化合物そのものがｅＩＦ２αのリン酸化に与える影響を示すグラフである。
【０１０１】
実験例８は、実験例７の結果を受けて、本発明における各化合物そのものによるＰＥＲＫの経路への影響を、ＰＥＲＫ及びｅＩＦ２αのリン酸化を指標として調べたものである。
実験例８について、もう少し詳しく説明する。
実験例８は、本発明における各化合物そのものによるＰＥＲＫの経路への影響を調べ、上記実験例７の結果と併せて、本発明における各化合物の効果を調べるための実験である。
【０１０２】
実験例８で行った実験は、タプシガルギンを用いないこと以外は実験例７で行った方法と同様の方法により行ったため、記載を省略する。
【０１０３】
その結果、図２０及び図２１に示すように、本発明における各化合物は、小胞体ストレスがない場合には、ＰＥＲＫ及びｅＩＦ２αのリン酸化を促進することが確認できた。
【０１０４】
ここで、実験例７においては、小胞体ストレスを誘導するタプシガルギンのみで細胞を処理した場合と、本発明における各化合物を加えて細胞を処理した場合とで、ＰＥＲＫのリン酸化及びｅＩＦ２αのリン酸化の度合いに有意な差は確認できなかった。つまり、小胞体ストレスによるリン酸化の促進と、本発明における各化合物によるリン酸化の促進とが足しあわされた結果にはならなかった。
つまり、実験例７及び実験例８の結果から、本発明における各化合物は、ＰＥＲＫの経路におけるリン酸化を促進するものの、小胞体ストレスの存在下ではＰＥＲＫの経路が過度に活性化するのを抑制する効果があると考えられる。
【０１０５】
［比較例１］
図２２は、ＮＲＫ−５２Ｅをタプシガルギンで処理した場合の、４−ＰＢＡがＰＥＲＫ及びｅＩＦ−２αのリン酸化に与える影響を示すグラフである。
図２３は、ＮＲＫ−５２Ｅに対して、４−ＰＢＡそのものがＰＥＲＫ及びｅＩＦ２αのリン酸化に与える影響を示すグラフである。
【０１０６】
比較例１は、４−ＰＢＡについて上記実験例７及び上記実験例８に準じる実験を行い、４−ＰＢＡによるＰＥＲＫの経路への影響と、４−ＰＢＡそのものによるＰＥＲＫの経路への影響とを、ＰＥＲＫ及びｅＩＦ２αのリン酸化を指標として調べたものである。
【０１０７】
比較例１における実験は、本発明における各化合物ではなく４−ＰＢＡを用いること以外は、４−ＰＢＡによるＰＥＲＫの経路への影響については実験例７で行った方法と、４−ＰＢＡそのものがＰＥＲＫの経路に及ぼす影響については実験例８で行った方法と、それぞれ同様の方法により行ったため、記載を省略する。
【０１０８】
その結果、図２２に示すように、本発明における各化合物を用いた場合と同様に、４−ＰＢＡによってはタプシガルギンによって促進されたＰＥＲＫ及びｅＩＦ２αのリン酸化の度合いは変わらないことを確認できた。
【０１０９】
また、図２３に示すように、本発明における各化合物を用いた場合と同様に、４−ＰＢＡは、小胞体ストレスがない場合には、ＰＥＲＫ及びｅＩＦ２αのリン酸化を促進することが確認できた。
【０１１０】
上記の比較例１より、本発明における各化合物がＰＡＲＫの経路に及ぼす影響は、構造が似ている４−ＰＢＡがＰＡＲＫの経路及ぼす影響と同様の傾向を有することが確認できた。
【０１１１】
［実験例９］
図２４は、ＮＲＫ／ＮＦκＢ−Ｌｕｃをタプシガルギンで処理した場合の、本発明における各化合物がＮＦ−κＢ活性に与える影響を示すグラフである。
図２５は、ＮＲＫ／ＮＦκＢ−Ｌｕｃをタプシガルギンで処理した場合の、本発明における各化合物がＮＦ−κＢ活性に与える影響を示す写真である。
図２６は、ＮＲＫ／ＮＦκＢ−ＬｕｃをＳｕｂＡＢで処理した場合の、本発明における各化合物がＮＦ−κＢ活性に与える影響を示すグラフである。
図２７は、ＮＲＫ／ＮＦκＢ−ＬｕｃをＳｕｂＡＢで処理した場合の、本発明における各化合物がＮＦ−κＢ活性に与える影響を示すグラフである。
【０１１２】
実験例９は、本発明における各化合物が小胞体ストレスを抑制する効果を、ＮＦ−κＢ活性を指標として調べたものである。
実験例９について、もう少し詳しく説明する。
小胞体ストレス応答が誘導される経路としては、上記した３つの主な経路の以外にも他の経路が存在する。このうち重要なものと目される経路が、ＮＦ−κＢ（ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ−κＢ）が活性化される経路（以下、ＮＦ−κＢの経路という。）である。
実験例９は、本発明における各化合物がＮＦ−κＢの経路に与える影響を調べるために行ったものである。
【０１１３】
以下、実験例９の実験条件について説明する。
まず、まず、細胞としてＮＲＫ／ＮＦκＢ−Ｌｕｃを準備した。
ＮＲＫ／ＮＦκＢ−Ｌｕｃは、ＮＲＫ−５２ＥのＮＦ−κＢサイトにルシフェラーゼ遺伝子を導入したものである。導入の方法については、広く知られているものであるため、説明を省略する。
【０１１４】
次に、ＮＲＫ／ＮＦκＢ−Ｌｕｃについて、規定の濃度（１．０ｍＭ、２．５ｍＭ又は５．０ｍＭ）の２−ＰＯＡＡ−ＯＭｅ、２−ＰＯＡＡ−ＮＯ２又は２−ＮＯＡＡと、５００ｎＭのタプシガルギン又は２０ｎｇ／ｍｌのＳｕｂＡＢとを含む溶液中で、８時間、処理を行った。また、別のＮＲＫ／ＮＦκＢ−Ｌｕｃについて、本発明における各化合物を用いないこと以外は上記と同様の条件で処理を行った。
【０１１５】
最後に、処理を行っていないＮＲＫ／ＮＦκＢ−Ｌｕｃ及び、タプシガルギンを含む溶液中で処理を行ったＮＲＫ／ＮＦκＢ−Ｌｕｃ、本発明にかかる各化合物及びタプシガルギンを含む溶液中で処理を行ったＮＲＫ／ＮＦκＢ−Ｌｕｃのそれぞれについて、ＮＦ−κＢの活性をみるために、ルシフェラーゼアッセイ及びノーザンブロット法による分析を行った。
【０１１６】
ルシフェラーゼアッセイ及びノーザンブロット法は、基本的に上記した方法と同様の方法で行ったため、説明を省略する。ルシフェラーゼアッセイにおける活性は、ホルマザンアッセイによる生存細胞数の見積もりに対する相対値（タプシガルギンのみで処理した場合を１００％とした。）で評価した。図２４においては、当該相対値を単に「ＮＦ−κＢ活性」と表記している。図２６においても同様である。
ホルマザンアッセイは、株式会社  同仁化学研究所のＣｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８を用いて生存細胞数を評価した。
【０１１７】
その結果、図２４に示すように、本発明における各化合物は、タプシガルギンにより促進されるＮＦ−κＢ活性を高い効果で抑制することが可能であることが確認できた。また、本発明における各化合物の効果の濃度依存性も確認できた。
なお、本発明における各化合物の中では、２−ＮＯＡＡが顕著な効果を有し、１．０ｍＭで高い効果が見られ、２．５ｍＭで５．０ｍＭとほぼ同じ程度の効果が見られた。
図２５に示すように、本発明における各化合物の効果は、ノーザンブロット法による分析によっても確認することができた。
【０１１８】
さらに、図２６に示すように、本発明における各化合物は、ＳｕｂＡＢを小胞体ストレス誘導剤として用いた場合においても、ＳｕｂＡＢにより促進されるＮＦ−κＢ活性を高い効果で抑制することが可能であることが確認できた。また、本発明における各化合物の効果の濃度依存性も確認できた。さらにまた、この場合においても２−ＮＯＡＡが顕著な効果を有することが確認できた。
図２７に示すように、ＳｕｂＡＢを小胞体ストレス源として用いた場合においても、本発明における各化合物の効果は、ノーザンブロット法による分析によっても確認することができた。
【０１１９】
［実験例１０］
図２８は、ＮＲＫ／ＮＦκＢ−Ｌｕｃに対して、本発明における各化合物がＮＦ−κＢ活性に与える影響を示すグラフである。
【０１２０】
実験例１０は、本発明における各化合物そのものによるＮＦ−κＢの経路への影響を、ＮＦ−κＢ活性を指標として調べたものである。
【０１２１】
実験例１０について、もう少し詳しく説明する。
実験例１０においては、本発明における各化合物が、ＮＦ−κＢの経路自体を抑制しているのか、それとも小胞体ストレスによるＮＦ−κＢの経路の活性化を抑制しているのか調べるために、小胞体ストレス誘導剤を使用せずに実験を行った。
【０１２２】
実験例１０で行った実験は、タプシガルギンやＳｕｂＡＢといった小胞体ストレス誘導剤を使用しない他は、実験例９で行った実験と同様の方法により行ったため、説明を省略する。
【０１２３】
その結果、図２８に示すように、小胞体ストレス剤を使用しない場合には、本発明における各化合物はＮＦ−κＢの経路に影響を与えないことが確認できた。
つまり、本発明における各化合物自体は、ＮＦ−κＢの経路そのものを常に抑制するものではないことが確認できた。
【０１２４】
［実験例１１］
図２９は、ＮＲＫ−５２Ｅをツニカマイシンで処理した場合の、２−ＰＯＡＡＮＯ２が細胞の傷害を抑制する様子を示す写真である。
図３０は、ＮＲＫ−５２Ｅをツニカマイシンで処理した場合の、２−ＰＯＡＡＮＯ２が細胞の傷害を抑制する様子を示すグラフである。
【０１２５】
実験例１１は、本発明における化合物である２−ＰＯＡＡ−ＮＯ２が小胞体ストレスを抑制する効果を、細胞の様子を直接観察することで調べたものである。
まず、細胞としてＮＲＫ−５２Ｅを準備し、当該ＮＲＫ−５２Ｅについて、規定の濃度（１．０ｍＭ又は２．０ｍＭ）の２−ＰＯＡＡ−ＮＯ２を添加し、３０分間、前処理を行った。
さらに、前処理を行ったＮＲＫ−５２Ｅと前処理を行っていないＮＲＫ−５２Ｅについてツニカマイシンを添加し、４８時間、処理を行った。ツニカマイシンの濃度は２．５μｇ／ｍｌとした。
【０１２６】
最後に、前処理も処理も行っていないＮＲＫ−５２Ｅ、前処理を行わずにタプシガルギン又はツニカマイシンで処理を行ったＮＲＫ−５２Ｅ、前処理を行った上でタプシガルギン又はツニカマイシンで処理を行ったＮＲＫ−５２Ｅについて、位相差顕微鏡による観察（図２９参照。）と、空胞化した細胞の定量的評価（図３０参照。）を行った。
【０１２７】
その結果、図２９及び図３０に示すように、２−ＰＯＡＡ−ＮＯ２の効果により、ツニカマイシンによる小胞体ストレスで損傷した細胞の空胞化が抑制され、正常な状態に近くなっていくことが確認できた。
【０１２８】
［比較例２］
図３１は、ＮＲＫ−５２Ｅをタプシガルギンで処理した場合の、２−ＰＯＡＡがＧＲＰ７８遺伝子とＣＨＯＰ遺伝子の発現に与える影響を示す写真である。
図３１は、ＮＲＫ−５２Ｅをタプシガルギンで処理した場合の、２−ＰＯＡＡ−ＯＭｅＮａがＧＲＰ７８遺伝子とＣＨＯＰ遺伝子の発現に与える影響を示す写真である。
図３３は、ＮＲＫ−５２Ｅをタプシガルギンで処理した場合の、２−ＰｙＡがＧＲＰ７８遺伝子とＣＨＯＰ遺伝子の発現に与える影響を示す写真である。
【０１２９】
なお、図面においては、２−Ｐｈｅｎｏｘｙａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄは２−ＰＯＡＡと記載し、Ｓｏｄｉｕｍ  ２−(４−ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｏｘｙ)ａｃｅｔａｔｅは２−ＰＯＡＡ−ＯＭｅＮａと記載し、２−（Ｐｙｒｉｄｉｎｉｕｍ−１−ｙｌ）ａｃｅｔａｔｅは２−ＰｙＡと記載する。
【０１３０】
比較例２は、２−Ｐｈｅｎｏｘｙａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ（以下、明細書において２−ＰＯＡＡと記載する。以下の式（４）参照。）、Ｓｏｄｉｕｍ  ２−(４−ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｏｘｙ)ａｃｅｔａｔｅ（以下、明細書において２−ＰＯＡＡ−ＯＭｅＮａと記載する。以下の式（５）参照。）及び２−（Ｐｙｒｉｄｉｎｉｕｍ−１−ｙｌ）ａｃｅｔａｔｅ（以下、明細書において２−ＰｙＡと記載する。以下の式（６）参照。）が小胞体ストレスを抑制する効果を、ＧＲＰ７８遺伝子及びＣＨＯＰ遺伝子の発現を指標として調べたものである。
【化４】
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【化５】
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【化６】
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【０１３１】
比較例２について、もう少し詳しく説明する。
本発明の発明者らは、小胞体ストレスを抑制することができるケミカルシャペロンとなりそうな化合物に関して膨大な実験を行ったことは上記した。実験を行った化合物のうち、上記した２−ＰＯＡＡ、２−ＰＯＡＡ−ＯＭｅＮａ及び２−ＰｙＡの構造は、本発明における各化合物の構造と比較的似ていると考えられる。化合物の構造が４−ＰＢＡの構造と似ているだけで目的のケミカルシャペロンとなるのならば、上記した化合物も本発明における各化合物と同じような効果を有する可能性が高い。
比較例２は、上記の観点から実験を行ったものである。
【０１３２】
比較例２で行った実験については、本発明における各化合物の代わりに２−ＰＯＡＡ、２−ＰＯＡＡ−ＯＭｅＮａ及び２−ＰｙＡを用いたこと以外は、実験例１で行った方法と同様の方法により行ったため、記載を省略する。
【０１３３】
その結果、図３１〜図３３に示すように、２−ＰＯＡＡ、２−ＰＯＡＡ−ＯＭｅＮａ及び２−ＰｙＡには小胞体ストレスを抑制する効果が見られないことが確認できた。
このため、化合物の構造が４−ＰＢＡの構造と似ているだけでは目的のケミカルシャペロンにはならないと考えられる。
【０１３４】
上記の各実験例及び比較例より、本発明における各化合物が、４−ＰＢＡよりも小胞体ストレスを抑制する効果が大きい化合物であることを確認できた。このため、本発明における各化合物を用いることで、小胞体ストレスを十分に抑制することが可能な小胞体ストレス関連実験用試薬及び小胞体ストレス関連疾患治療薬を提供することが可能となる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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