(57)【要約】【課題】細胞のホメオスタシス経路および細胞の生存を調節する方法の提供。【解決手段】糖尿病は、活動筋細胞が本来ほど容易にグルコースを取り込むことができないような、身体自身のインスリンに対する代謝応答障害である。糖尿病またはインスリン感受性の低下が存在すると、身体は、膵臓からより多くのインスリンを分泌することにより、この抵抗性を克服しようと試みる。このような生理学的状況では血中インスリンレベルが慢性的に高くなり、これにより、脂肪細胞が貯蔵エネルギーを放出することが抑制され、体重減少がおこる。糖尿病は、肥満、高血圧、異常トリグリセリドおよび耐糖能障害と関連している。本発明は、糖尿病、糖尿病随伴障害、代謝障害および癌の処置および予防に有用な組成物および治療剤、ホメオスタシス経路の調節方法を提供する。【選択図】図４
2014139245.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願明細書に記載された発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連する出願
本願は、２００７年５月２日に出願された米国特許出願第６０／９１５，５９４号の利益を主張する。米国特許出願第６０／９１５，５９４号の内容は、その全体が、本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
連邦により後援された研究の申告
本発明は、ＮＩＨ補助金５Ｒ３７ＣＡ５０２３９；Ｋ０１ＣＡ１０６５９；および５Ｋ０ＨＬ０７４０４９−０２のもと、米国政府の支援でなされた。米国政府は、本発明における一定の権利を有する。
【０００３】
発明の分野
本発明は、β島細胞の機能と生存の調節方法に関し、糖尿病を処置するため、および膵島細胞死を抑制するための方法を提供する。さらに、本発明において、生理活性ＢＨ３ペプチド性化合物のリン酸化模倣（ｐｈｏｓｐｈｏｍｉｍｅｔｉｃ）系修飾による個々のＢＨ３単独タンパク質の個々に異なる活性を制御する方法を記載する。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
糖尿病は、活動筋細胞が本来ほど容易にグルコースを取り込むことができないような、身体自身のインスリンに対する代謝応答障害である。糖尿病またはインスリン感受性の低下が存在すると、身体は、膵臓からより多くのインスリンを分泌することにより、この抵抗性を克服しようと試みる。このような生理学的状況では血中インスリンレベルが慢性的に高くなり、これにより、脂肪細胞が貯蔵エネルギーを放出することが抑制され、体重減少がおこる。糖尿病は、肥満、高血圧、異常トリグリセリドおよび耐糖能障害と関連している。ＢＣＬ−２ファミリータンパク質（ＢＡＤなど）は、プログラムされた細胞死すなわちアポトーシスを調節することにより、生物体のホメオスタシスに重要な役割を果たしていることがよく知られている。近年、新規な非アポトーシス機能が特定の（ｓｅｌｅｃｔ）ＢＣＬ−２ファミリー構成員で確認され、この新たに確認された役割は、生物体ホメオスタシスの維持に不可欠である。ＢＣＬ−２ファミリー構成員のアポトーシス機能の調節異常により、過剰な細胞減少または過剰な細胞の生存がもたらされ、それぞれ神経変性および癌などの疾患が発生し得る。ＢＡＤなどのＢＣＬ−２ファミリー構成員の非アポトーシス機能の調節異常により、細胞死の生理学におけるＢＡＤの役割と無関係な糖尿病誘発性表現型が生じることがあり得る。特定のＢＣＬ−２ファミリータンパク質が相違する機能間でスイッチ切替ができる能力は、その生理活性の重要な側面である。前記タンパク質が二重の役割を果たす分子機構は、その生理活性ＢＨ３ドメインによって、特にそのリン酸化状態によって媒介され得る。したがって、リン酸化ＢＨ３ドメインを模倣する選択的化合物が作製され得ることは、ヒトの疾患の処置において重要な治療可能性を有する。
【０００５】
ＢＣＬ−２ファミリータンパク質：不可欠な細胞内アポトーシスチェックポイント
プログラムされた細胞死は、適正な胚発生と組織ホメオスタシスの維持に必須である遺伝的に保存された経路である（Ｃｏｒｙ，Ｓ．およびＡｄａｍｓ，Ｊ．Ｍ．２００２．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  ２，６４７−５６）。この経路の異常調節は、多くのヒトの疾患、例えば、癌、自己免疫、神経変性障害および糖尿病の発生に関与している。哺乳動物のアポトーシス経路により、小器官、特にミトコンドリアの関与の証拠が示されている（Ｇｒｅｅｎ，Ｄ．Ｒ．およびＫｒｏｅｍｅｒ，Ｇ．２００４．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０５，６２６−９）。ミトコンドリアは、細胞ＡＴＰの大部分を供給していることに加え、シトクロムｃおよび他のアポトーシス誘発性因子を放出することによってアポトーシスにも関与している。シトクロムｃは、放出されると、ＡＰＡＦ−１およびカスパーゼ−９とともに一体化されて「アポトソーム」を形成し、これが下流カスパーゼを活性化し、最終的に細胞死がもたらされる（Ｌｉ，Ｐ．ら，１９９７．Ｃｅｌｌ  ９１  ：４７９−８９）。また、ミトコンドリアは、細胞呼吸を担い、多くの代謝経路を協調させるが、これらの機能とアポトーシスとの相互関係は不明なままである。
【０００６】
ＢＣＬ−２タンパク質ファミリーは、不可逆的な細胞損傷のすぐ上流に存在する重要なアポトーシス制御点を構成しており、この場合、構成員は、ミトコンドリアからのアポトーシス誘発性因子の放出を制御する（Ｄａｎｉａｌ，Ｎ．Ｎ．およびＫｏｒｓｍｅｙｅｒ，Ｓ．Ｊ．２００４．Ｃｅｌｌ  １１６：２０５−１９）。いくつかのＢｃｌ−２タンパク質は、細胞内の膜、例えば、ミトコンドリア外膜、ＥＲおよび核膜に存在している。ファミリーは、デスアゴニストとデスアンタゴニストの両方からなり、これらは、ＢＣＬ−２相同性（ＢＨ）ドメイン（図１）として知られる１つ以上のセグメントにおいて配列相同性を共有している。抗アポトーシス性の構成員（ＢＣＬ−２およびＢＣＬ−ＸＬなど）ならびにアポトーシス促進性ファミリー構成員のサブセット（ＢＡＸとＢＡＫなど）はすべて、３〜４個のＢＨドメイン内に配列相同性を共有する「マルチドメイン」タンパク質である。アポトーシス促進性分子の「ＢＨ３単独」サブセット、例えば、ＢＡＤ、ＢＩＤ、ＢＩＭ、ＮＯＸＡおよびＰＵＭＡは、単一のαへリックスセグメントのＢＨ３ドメイン内のみに配列相同性を示すものであり、前記ドメインは重要なデスドメインとしても知られている（Ｗａｎｇ，Ｋ．ら，１９９６．Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １０：２８５９−６９）。ＢＡＸとＢＡＫは、これらのタンパク質がともに欠損した細胞が、内因性経路によってシグナル伝達されるあらゆるアポトーシス刺激に対して抵抗性であるため、ミトコンドリアのアポトーシス経路への必要不可欠なゲートウェイを構成している（Ｌｉｎｄｓｔｅｎ，Ｔ．ら，２０００．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ６，１３８９−９９；Ｗｅｉ，Ｍ．Ｃ．ら，２００１．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９２，７２７−３０）。ＢＨ３単独分子は、すべてＢＡＸとＢＡＫの上流で作用し、近位のデスシグナルと生存シグナルをコアのアポトーシス経路に連結させる（図２）（Ｃｈｅｎｇ，Ｅ．Ｈ．ら，２００１．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ８，７０５−１１；Ｚｏｎｇ，Ｗ．Ｘ．ら，２００１．Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １５，１４８１−８６）。デスシグナルを受けると、ＢＡＸとＢＡＫはミトコンドリアでアロステリック活性化を受け、外膜の透過処理がもたらされ、シトクロムｃが放出される（Ｗｅｉ，Ｍ．Ｃ．ら，２０００．Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １４，２０６０−７１）（図２）。
【０００７】
ＢＣＬ−２分子の抗アポトーシスサブクラスとアポトーシス促進性サブクラス間の均衡により、細胞死感受性を決定する「加減抵抗器」が設定される（Ｏｌｔｖａｉ，Ｚ．ら，１９９３．Ｃｅｌｌ  ７４，６０９−１９）。ＢＨ３単独アポトーシス促進性分子（ＢＡＤ、ＢＩＤ、ＢＩＭなど）は、この「加減抵抗器」を能動的に調整し、その機能は、相違する機構、例えば、転写制御および翻訳後修飾によって動的に調節される。例えば、細胞質内ＢＩＤは、カスパーゼ−８によって切断されると活性化され、ミトコンドリアへのトランスロケーション、ＢＡＸ／ＢＡＫの活性化、およびシトクロムｃの放出がもたらされる（Ｌｉ，Ｈ．ら，１９９８．Ｃｅｌｌ  ９４，４９１−５０１；Ｌｕｏ，Ｘ．ら，１９９８．Ｃｅｌｌ  ９４，４８１−９０  １９９８）。ＮＯＸＡおよびＰＵＭＡは、遺伝子毒性ストレスによって誘導されるアポトーシスにおいて特定の役割を有するｐ５３の転写標的である（Ｎａｋａｎｏ，Ｋ．ら，２００１．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ７，６８３−９４；＃３２８；Ｙｕ，Ｊ．ら，２００１．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ７，６７３−８２）。さらに、ＢＡＤのアポトーシス促進性活性が、細胞外増殖因子または生存因子に応答したリン酸化によって阻害される（Ｚｈａ，Ｊ．ら，１９９６．Ｃｅｌｌ  ８７，６１９−２８１９９６）。
【０００８】
インビトロ試験により、ＢＨ３単独分子の過剰発現によって、さまざまな細胞株でアポトーシスがもたらされることが示されているが、マウスモデルの機能低下は、個々のＢＨ３単独タンパク質が、限局的な細胞型で選択されたシグナルに応答して細胞死イニシエーターとしての機能を果たすことを示す。ＢＨ３単独分子の細胞型特異的およびシグナル特異的インビボ機能は、これらの分子の機能的重複が組織型特異的であること、またはＢＨ３単独分子が他の経路において相違する役割を有し得ることのいずれかを示唆する。実際、最近の知見により、アポトーシス以外のＢＣＬ−２ファミリータンパク質の生理学的役割が解明された。以下は、アポトーシスと細胞内ホメオスタシス経路との統合のほんの４つの例である。
【０００９】
（ｉ）ＢＣＬ−２ファミリータンパク質と細胞内代謝：本発明者らは、以前に、肝臓ミトコンドリアのプロテオミクス解析を行ない、ＢＣＬ−２ファミリーのタンパク質であるＢＡＤが、グルコース誘導型全細胞呼吸を調節しているグルコキナーゼ（ＧＫ）含有複合体内に存在することを明らかにした（Ｄａｎｉａｌ  Ｎ．Ｎ．ら，２００３．Ｎａｔｕｒｅ  ４２４，９５２−６）（図４）。Ｂａｄヌル遺伝子モデルにより、ＢＡＤは複合体の合成に必要であることが示され、リン酸化不可能型Ｂａｄ  ３ＳＡノックインマウスモデルにより、リン酸化ＢＡＤが、完全なミトコンドリアテザー型ＧＫ活性に必要とされるという証拠が示された。ＧＫ活性の支持におけるＢＡＤの役割と整合して、Ｂａｄ欠損動物およびＢａｄ  ３ＳＡ動物は、ともに、空腹時高血糖および耐糖能障害を特徴とするグルコースホメオスタシスの異常を示す。ＢａｄヌルおよびＢａｄ３ＳＡは、それぞれ、ＢＡＤのアポトーシス促進性活性モデルで機能低下および機能獲得を示すため、これらの動物における共通の代謝異常により、グルコース代謝におけるＢＡＤの役割は、細胞を感作させる能力とアポトーシスとで相違している可能性が示唆された。実際、本出願書類に示した実験は、膵臓と肝臓の両方におけるＢＡＤの特定の役割を示し、各々が有意な生理学的重要性を有することを示す。
【００１０】
（ｉｉ）ＢＣＬ−２ファミリータンパク質ＢＩＤおよびＤＮＡ損傷に対する細胞応答：ＤＮＡ損傷に応答して、細胞は、充分な期間でそのＤＮＡの修復が可能な増殖が停止されるか、またはアポトーシスを受けるかのいずれかとなる。アポトーシス促進性タンパク質ＢＩＤは、細胞内で、アポトーシスとＤＮＡ損傷チェックポイントの両方において機能を果たす（Ｚｉｎｋｅｌ，Ｓ．ら，２００６．Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ  １３，１３５１−９）。ＢＩＤの減損によってゲノム不安定性および骨髄性悪性腫瘍がもたらされる（Ｚｉｎｋｅｌ，Ｓ．ら，２００３．Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １７，２２９−３９）。ＢＩＤは、損傷ＤＮＡを有する細胞内において、核内のＤＮＡ損傷キナーゼＡＴＭの基質であり、Ｓ期内チェックポイントを調節する（Ｚｉｎｋｅｌ，Ｓ．ら，２００５．Ｃｅｌｌ  １２２，５７９−９１；Ｋａｍｅｒ，Ｉ．２００５．Ｃｅｌｌ  １２２，５９３−６０３）。重要なことには、ＢＩＤのＢＨ３ドメインは、ミトコンドリアにおけるそのアポトーシス機能に必要とされるが、核内でのその細胞周期チェックポイント機能には必要でない（Ｚｉｎｋｅｌ，Ｓ．ら，２００５．Ｃｅｌｌ  １２２，５７９−９１）（図６８）。
【００１１】
（ｉｉｉ）  タンパク質の品質管理とアポトーシスとのクロストーク（ｃｒｏｓｓ  ｔａｌｋ）：タンパク質の適正なフォールディングは、細胞の機能の完全性に必須である。したがって、細胞は、適正な「タンパク質  ホメオスタシス」が確保されるように精巧な機構が創出されている（Ｒｕｔｋｏｗｓｋｉ，Ｄ．Ｔ．およびＫａｕｆｍａｎ，Ｒ．Ｊ．２００４．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １４，２０−８）。小胞体（ＥＲ）におけるミスフォールドタンパク質の蓄積（ＥＲストレスとしても知られる）は、ＵＰＲ（Ｕｎｆｏｌｄｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ：アンフォールドタンパク質応答）と称される細胞の順応性応答を活性化させる。ＥＲストレスは、多くの神経変性疾患、例えば、ハンティングトン病およびアルツハイマー病の病態生理に関与している（Ｏａｋｅｓ，Ｓ．Ａ．ら，２００６．Ｃｕｒｒ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  ６，９９−１０９）。ＢＣＬ−２ファミリーのタンパク質であるＢＡＸとＢＡＫは、ＵＰＲに関与しているシグナル伝達経路のいくつかの成分と物理的に会合することにより、この経路の適正な実行に必要であることが最近示された（Ｈｅｔｚ，Ｃ．ら，２００６．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１２：５７２−６）。ＢＡＸ／ＢＡＫは、ミトコンドリアにおいてＥＲのＵＰＲをコアアポトーシス機構とリンクさせる機能を果たし、したがって、順応性応答または細胞死の適正な実行のいずれかによってミスフォールドタンパク質に対する細胞応答を調和させているという提案がなされている。
【００１２】
（ｉｖ）ＢＣＬ−２ファミリータンパク質ならびに生存中および死滅中のミトコンドリアの形態の調節：ミトコンドリアの形状および細網構造は、融合および分裂プロセスによって動的に調節される（Ｇｒｉｐａｒｉｃ，Ｌ．およびＶａｎ  ｄｅｒ  Ｂｌｉｅｋ，Ａ．Ｍ．２００１．Ｔｒａｆｆｉｃ  ２，２３５−４４）。これにより、種々のミトコンドリア間での物質交換および機能に適さない小器官の排除が確保される。ミトコンドリアの形態構造における動的変化は、細胞の代謝適応度に直接影響を及ぼす。アポトーシス中、ミトコンドリアは、カスパーゼ活性化の前に断片化を受ける（Ｆｒａｎｋ，Ｓ．ら，２００１．Ｄｅｖ  Ｃｅｌｌ  １，５１５−２５）。いくつかのＢＣＬ−２ファミリータンパク質は、このようなプロセスに関与している。
抗アポトーシス性分子であるＢＣＬ−２／ＢＣＬ−ＸＬは、融合促進活性を有し、これは、進化の過程で保存されているようである。このことは、ミトコンドリア融合を支配することがわかっているタンパク質であるミトフュージョン（ｍｉｔｏｆｕｓｉｏｎ）−２（Ｍｆｎ−２）に対するその結合能と整合する（Ｄｅｌｉｖａｎｉ，Ｐ．ら，２００５．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ２１，７６１−７３）。アポトーシス促進性ＢＡＸは、Ｍｆｎ−２の活性を直接調節する（Ｋａｒｂｏｗｓｋｉ，Ｍ．ら，２００６．Ｎａｔｕｒｅ  ４４３，６５８−６２）。ミトコンドリアの動力学におけるＢＣＬ−２ファミリー構成員の役割はまた、デス刺激を受けていない健常細胞においても必須であることは注目に値する。ＢＡＸのＢＨ３ドメインはミトコンドリアの動力学の調節に必要であるという提案がなされている（Ｋａｒｂｏｗｓｋｉ，Ｍ．ら，２００６．Ｎａｔｕｒｅ  ４４３，６５８−６２）。したがって、ＢＡＸ内の同じドメインが、２つの相違する機能；アポトーシスおよびミトコンドリアの形状の調節能を有する。
【００１３】
グルコースホメオスタシス、糖尿病およびメタボリックシンドローム
２型真性糖尿病（Ｔ２ＤＭ）は、一般的には耐糖能の障害にて顕現される多くの代謝異常を包含する複遺伝子性疾患である。Ｔ２ＤＭの基本的な生理学的見解としては、インスリンの産生と機能の異常が挙げられる（非特許文献１）。これは、膵臓、筋肉、脂肪および肝臓の機能の変化を伴う。膵β細胞および肝細胞は、体内の主なグルコースセンサーである（Ａｃｃｉｌｉ，Ｄ．２００４．Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５３，１６３３−４２）。血中グルコースの変動に応答して、β細胞は、インスリンを用量応答的に分泌する。さらに、インスリンが、筋肉および脂肪などの末梢組織によるグルコース取込みを刺激し、肝臓内へのグリコゲンとしてのグルコースの適正な貯蔵を促進する。また、膵島は、体内のインスリン分泌需要が満たされるように自身の質量を順応させる傾向にある（Ｂｅｌｌ  Ｇ．Ｉ．およびＰｏｌｏｎｓｋｙ  Ｋ．Ｓ．，２００１．Ｎａｔｕｒｅ  ４１４，７８８−９１；Ｗｅｉｒ  Ｇ．Ｃ．ら，２００１．Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５０  Ｓｕｐｐｌ  １，Ｓ１５４−９；ＤｅＦｒｏｎｚｏ  Ｒ．Ａ．，１９８８．Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ３７，６６７−８７；Ａｃｃｉｌｉ  Ｄ．ら，２００１．Ｃｕｒｒ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  １，９−２３）。島による適正なグルコース感知および／または質量順応の欠如は、Ｔ２ＤＭに寄与する。肝細胞は、血中グルコースの変動を感知し、空腹時のグルコース産生（これは、脳への充分なグルコース供給の維持を補助する）、または血中グルコースレベル正常範囲を超えた場合はグリコゲンとしてのグルコースの貯蔵のいずれかのために、その機能を調整する（Ｃｈｅｒｒｉｎｇｔｏｎ，Ａ．Ｄ．１９９９．Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ４８，１１９８−１２１４）。糖質の代謝の調節に加え、インスリンはまた、脂肪細胞内でのリポリシスを抑制することにより脂肪の代謝にも影響を及ぼす（ＤｅＦｒｏｎｚｏ，Ｒ．Ａ．２００４．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐｒａｃｔ  Ｓｕｐｐｌ  １４３，９−２１）。インスリン抵抗性は、筋肉、脂肪および肝臓がインスリンの作用に非感受性である状態である。メタボリックシンドロームは、インスリン抵抗性、脂質異常症（例えば、異常レベルの血漿トリグリセリド）、肥満および糖尿病が包含される一群の代謝障害と定義される（Ｒｅａｖｅｎ，Ｇ．Ｍ．２００４．Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ  ２７，１０１１−１２）。
【００１４】
グルコース代謝と癌
個々の細胞は、細胞内代謝と細胞生存の両方を特性的に調節する成長／生存因子の利用能に依存している（Ｐｌａｓ，Ｄ．Ｒ．およびＴｈｏｍｐｓｏｎ，Ｃ．Ｂ．２００２．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ  １３，７５−８）。細胞内代謝は、グルコースなどの栄養分が分解されて生命過程のためのエネルギーが生成される、生細胞内または生物体内で起こる一群の化学的反応を示すために使用される用語である。インスリン、インスリン様成長因子（ＩＧＦ−１）および多くのサイトカインは、ＰＩ３Ｋを経由してセリン／トレオニンキナーゼＡＫＴおよび関連キナーゼを介してシグナルを伝達し、グルコースの輸送と代謝を調節する（Ｃｈｅａｔｈａｍ，Ｂ．およびＫａｈｎ，Ｃ．Ｒ．１９９５．Ｅｎｄｏｃｒ  Ｒｅｖ  １６，１１７−４２）。ＡＫＴの下流でのシグナル伝達は、グルコース輸送体（Ｇｌｕｔ  １およびＧｌｕｔ  ４）のレベルが調節されることによりグルコース代謝に影響を与える（図３）。その結果、ＡＫＴ２欠損マウスは、低レベルのＧｌｕｔ４を示し、顕著なインスリン抵抗性を示す（Ｃｈｏ，Ｈ．ら，２００１．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９２，１７２８−３１）。ＡＫＴがグルコース代謝を調節する第２の機構は、ミトコンドリアへのヘキソキナーゼ（ＨＫ）の漸増の刺激によるものである（Ｒｏｂｅｙ，Ｒ．Ｂ．およびＨａｙ，Ｎ．２００６．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２５，４６８３−９６）。ヘキソキナーゼは、グルコースがグルコース−６リン酸に転化されるグルコース代謝（解糖）の第１段階を触媒する酵素である。ＨＫのミトコンドリア局在の下地となる分子機構は充分にわかっていない。ミトコンドリア会合ヘキソキナーゼは、ミトコンドリアＡＴＰへの直接進入可能であり、グルコース６リン酸（Ｇ６Ｐ）による産物阻害を回避するため、このことは、活性化されたＡＫＴがどのようにしてグルコース−６リン酸化活性を増大させるかの説明となり得る（Ｂｕｓｔａｍａｎｔｅ，Ｅ．およびＰｄｅｒｓｅｒｎ，Ｐ．Ｌ．１９７７．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ７４，３７３５−３９；Ａｒｏｒａ，Ｋ．Ｋ．およびＰｅｄｅｒｓｅｎ，Ｐ．Ｌ．１９８８．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６３，１７４２２−２８）。活性化されたＡＫＴは、さらに、いくつかの抗アポトーシス性タンパク質（ＢＣＬ−ＸＬおよびＭＣＬ−１など）の発現を刺激すること、ならびにいくつかの重要な細胞内奏効因子（例えば、フォークヘッド型転写因子ＢＡＤおよびＮＦκＢ）をリン酸化することにより生存を促進させる（Ｄａｔｔａ，Ｓ．Ｒ．ら，１９９９．Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １３，２９０５）。
【００１５】
アポトーシスに対する抵抗性および細胞内代謝の増大は、腫瘍の一般的な特徴である。ＢＣＬ−２は、最初、濾胞性リンパ腫内でのその染色体転座によって見出された。また、ＢＣＬ−２ファミリータンパク質のマウスモデルにより、アポトーシスの欠陥は主な腫瘍形成性事象であり得ることが明白に示されている（ＭｃＤｏｎｎｅｌ，Ｔ．Ｊ．ら，１９８９．Ｃｅｌｌ  ５７，７９−８８；ＭｃＤｏｎｎｅｌ，Ｔ．Ｊ．ら，Ｎａｔｕｒｅ  ３４９，２５４−５６）。ヒトの濾胞性リンパ腫に見られるＢｃｌ−２遺伝子の染色体転座により、Ｂｃｌ−２コード配列が免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子配列の隣に並置される。重要なことには、Ｂｃｌ−２−Ｉｇトランスジェニックマウスを用いてこの染色体転座を反復すると、経時的に、びまん性大細胞型リンパ腫が充分引き起こされた。同様に、いくつかの所見により、アポトーシス促進性ＢＣＬ−２ファミリー構成員は、その機能の低下が悪性腫瘍に寄与するため、腫瘍サプレッサーとしての機能を果たし得ることが示唆されている。切断型ＳＶ４０  Ｔ抗原を発現するＢａｘヌルマウスにおける脈絡叢腫瘍の高発生率、およびＢｉｄ欠損マウスにおける慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）の高発症率は、それぞれ、ニューロン細胞生存および骨髄ホメオスタシスにおける構成員の重要性を反映している（Ｚｉｎｋｅｌ，Ｓ．ら，２００３．Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １７，２２９−３９；Ｙｉｎ，Ｃ．ら，１９９７．Ｎａｔｕｒｅ  ３８５，６３７−４０）。Ｂａｄヌルマウスでは、胚芽中心起源のびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）に進行する（Ｒａｎｇｅｒ，Ａ．Ｍ．ら，２００３．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ
１００，９３２４−２９）。このことは、成熟Ｂ細胞が胚芽中心に遊走するため、細胞の細胞内ホメオスタシスの調節におけるＢＡＤの潜在的役割を反映したものであり得る。
【００１６】
細胞内代謝と悪性腫瘍との関連性は、腫瘍が多くの場合で高い解糖速度を示すことに注目したＷａｒｂｕｒｇによって最初に認識された。解糖は、腫瘍細胞内のＡＴＰの約６０％を占め、ＤＮＡ合成に必要な核酸などの巨大分子の合成およびその迅速な増殖のための代謝中間体を提供する。実際、ヒトの癌において、いくつかの充分に特性評価された癌遺伝子（例えば、Ｒａｓ、Ｍｙｃ、Ａｋｔ）は、解糖経路を標的化することがわかっている（Ｓｅｍｅｎｚａ，Ｇ．Ｌ．２００１．Ｎｏｖａｒｔｉｓ  Ｆｏｕｎｄ  Ｓｙｍｐ  ２４０，２５１−６０）。Ｗａｒｂｕｒｇの仮説では、さらに、高い解糖速度は、ミトコンドリアの呼吸障害によるものであり得ると示唆された。しかしながら、この所見は、諸腫瘍においていくぶん変動性であることが示された。最近の試験で、ミトコンドリアによる充分機能性の酸化的リン酸化（ＯＸＰＨＯＳ）能が存在する場合であっても、腫瘍細胞は、解糖によるその生体エネルギー生成需要を優先的に支持することが示された（Ｆａｎｔｉｎ，Ｖ．Ｒ．ら，２００６．Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ９，４２５−３４）。
【００１７】
このスイッチングは腫瘍の維持に必要である。それは、解糖による干渉が、腫瘍細胞の増殖能の低下に付随するＯＸＰＨＯＳの代償的増大と関連しているためである。腫瘍におけるこの「解糖スイッチング」の考えられ得る理論的解釈は、ＡＴＰがより速い速度で供給されることに加え、解糖生成物（主にピルビン酸）が脂肪酸合成の中間体として使用される（図３）ということであり得る。これにより、腫瘍細胞が、速い速度の細胞増殖を維持するために新たな膜合成を行なうための充分な脂肪酸供給を有することが確実となる。さらに、ＯＸＰＨＯＳではなく解糖への依存により、腫瘍が酸素の非存在下（低酸素）で増殖した後、血管新生できることが確実となる（Ｇａｔｅｎｂｙ．Ｒ．Ａ．およびＧｉｌｌｉｅｓ，Ｒ．Ｊ．２００４．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  ４，８９１−９９）。いくつかのヒト腫瘍では、グルコース代謝に関与している多くの重要な酵素が、正常組織と比べて活性増大を示す。前記酵素としては、ヘキソキナーゼ（ＨＫ）、ホスホフルクトキナーゼ（ＰＦＫ）、ピルビン酸キナーゼ（ＰＫ）および乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）が挙げられる。活性増大の下地となる機構は、ＨＫ酵素の場合で最もよく試験されており、発現の増大（遺伝子増幅および／またはプロモーター活性化に副次的）、ミトコンドリアに対する結合の増大、および／または高ｋｍアイソフォーム（ヘキソキナーゼＩＶ）から低ｋｍアイソフォーム（ヘキソキナーゼＩ〜ＩＩＩ）への遺伝子発現におけるスイッチングが挙げられる（Ｒｅｍｐｅｌ，Ａ，ら，１９９４．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ３０３，２６９−７４；Ｋｌｉｍｅｋ，Ｆ．ら，１９９３．Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  １４，１８５７−６１；Ｍａｚｕｒｅｋ，Ｓ．ら，１９９９．Ｊ  ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｉｓｏｌ  １８１，１３６−４６）。このような観察結果は、有望な治療ストラテジーとしての解糖の標的化または腫瘍の特定経路における解糖中間体の使用の重要性を強調する。
【００１８】
また、最近の証拠により、肥満およびメタボリックシンドロームが、癌、例えば、結腸直腸癌（Ｇｕｎｔｅｒ，Ｍ．Ｊ．およびＬｅｉｚｍａｎｎ，Ｍ．Ｆ．２００６．Ｊ  Ｎｕｔｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １７，１４５−５６）、乳癌（Ｌｏｒｉｎｃｚ，Ａ．Ｍ．２００６．Ｅｎｄｏｃｒ  Ｒｅｌａｔ  Ｃａｎｃｅｒ  １３，２７９−９２）ならびに前立腺癌（Ｏ’Ｍａｌｌｅｙ，Ｒ．Ｌ．およびＴａｎｅｊａ，Ｓ．Ｓ．２００６．Ｃａｎ  Ｊ  Ｕｒｏｌ  Ｓｕｐｐｌ  ２，１１−７）の高リスクと関連していることが示唆されている。とはいえ、このような代謝異常と癌との分子レベルでの関連性は充分に理解されておらず、いくつかの試験により、インスリン抵抗性状態で見られるような血漿インスリンレベルの上昇によって、上皮細胞における細胞増殖が活性化されることが示唆されている。さらに、インスリンは、有意な増殖活性と抗アポトーシス活性を有する成長ホルモンであるインスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）のレベルを増大させ得る（Ｃｏｗｅｙ，Ｓ．およびＨａｒｄｙ，Ｒ．Ｗ．２００６．Ａｍｅｒ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  １６９，１５０５−２２）。また、インスリンおよびＩＧＦ−Ｉは性ステロイドを調節し、これにより、エストロゲンおよびアンドロゲンの活性が調節され、その結果、性ホルモン依存性の癌（例えば、乳癌および前立腺癌）が発生する（Ｃａｌｌｅ，Ｅ．Ｅ．およびＫａａｋｓ，Ｒ．２００４．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  ４，５７９−９１）。さらに、脂肪細胞によって産生されるホルモンであるアディポカインは、増殖性、脈管形成性および炎症促進性の効果を有する。アディポカインは癌細胞に対し、これらの効果によって直接、またはインスリン抵抗性（したがって高インスリン血症）を引き起こすことによって間接的のいずれかによって影響を及ぼす（Ｃｏｗｅｙ，Ｓ．およびＨａｒｄｙ，Ｒ．Ｗ．２００６．Ａｍｅｒ
Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  １６９，１５０５−２２）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１９】
【非特許文献１】Ｓａｌｔｉｅｌ，Ａ．Ｒ．およびＫａｈｎ，Ｃ．Ｒ．２００１．Ｎａｔｕｒｅ  ４１４，７９９−８０６
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２０】
相違する機能間の切替えを行なう特定のＢＣＬ−２ファミリータンパク質の能力は、その生理活性の重要な側面である。本発明は、アポトーシス促進性のＢＣＬ−２ファミリー構成員であるＢＡＤが、ミトコンドリアが該ミトコンドリア自身のアポトーシス機構の活性化能とは示差的に標的化および模倣され得る機構によって、グルコースを燃料として利用する効率を調節しているという知見に基づく。肝臓および膵臓ではともに、２つの主要組織が血糖の調節に関与しており、ＢＡＤは、哺乳動物における重要なグルコースセンサーであるグルコキナーゼ（ヘキソキナーゼＩＶ）の活性を調節している。ＢＡＤが二重の役割を果たす分子機構は、その生理活性ＢＨ３ドメインによって媒介される。具体的には、重要な残基のリン酸化状態（これは、遺伝的および化学的に模倣させること、および操作することができる）によって、ＢＡＤは、代謝機能またはアポトーシス機能のいずれかを担うように指令されることがわかっている。リン酸化型ＢＡＤまたはその模倣物は、膵臓のβ細胞においてグルコキナーゼ活性、グルコース誘導性ミトコンドリア呼吸およびインスリン分泌を調節すると同時に、前記細胞に、インスリン抵抗性状態において好都合な順応性応答を賦与する（図４）。これは、アポトーシスと他の細胞内生理学的経路における二重の役割を有することがわかっているＢＣＬ−２ファミリー調節因子による細胞内ホメオスタシス経路と細胞生存の遺伝的および化学的操作の重要性と有益性に関して本明細書に示した多くの例のうちの１つである。重要なことには、この調節は、リン酸化模倣部分を含み、かつヒトの疾患の処置において有意な潜在能力を有するペプチド性化合物によって操作され得る。
【００２１】
本発明は、異常な（例えば、不充分もしくは過剰な）グルコース代謝または外因性もしくは内因性のアポトーシス経路異常と関連する障害のリスクがある（もしくは易罹患性である）か、または前記障害を有する対象を処置する予防方法と治療方法の両方を提供する。
【００２２】
糖尿病（例えば、Ｉ型またはＩＩ型）は、ＢＡＤ  ＢＨ３ドメインペプチドまたはその模倣物を含有する組成物を、それを必要とする対象に投与することによって処置されるか、またはその発症が遅延される。対象は、例えば、高血糖、肥満またはインスリン抵抗性である。
【００２３】
β細胞の生存は、β細胞を、ＢＡＤ  ＢＨ３ドメインペプチドまたはその模倣物を含有する組成物と接触させることにより増大される。種々の態様において、前記細胞は、対象への移植の前または後に接触させる。
【００２４】
インスリン分泌の誘導またはグルコキナーゼ活性の増大は、組織（例えば、膵臓組織）または細胞（例えば、β細胞）をＢＡＤ  ＢＨ３ペプチドまたは模倣物に曝露すること、例えば、接触させることによりなされる。
【００２５】
腫瘍増殖のモジュレーションまたは治療用薬剤（例えば、化学療法剤もしくは放射線）への腫瘍細胞の感作は、腫瘍細胞をＢＨ３ドメインペプチドまたはその模倣物と接触させることによりなされる。
【００２６】
細胞周期またはホメオスタシス経路のモジュレーションは、細胞をＢＨ３ドメインペプチドまたはその模倣物と接触させることによりなされる。細胞は、肝臓細胞またはニューロン細胞である。
【００２７】
ＢＨ３ドメインペプチド、ＢＡＤ  ＢＨ３ドメインペプチドまたはその模倣物は、リン酸化する。好ましくは、ＢＨ３ドメインペプチドまたはＢＡＤ  ＢＨ３ドメインペプチドのαヘリックス構造を安定化させる。例えば、ペプチドは、炭化水素ホチキス留め（ｓｔａｐｌｉｎｇ）または化学的架橋によって安定化させる。ＢＡＤ  ＢＨ３ドメインペプチドは、配列番号：１〜３および５〜１７またはその断片のアミノ酸配列を含むものである。
【００２８】
また、本発明には、Ｘ３がリン酸化されている配列番号１、２または３のアミノ酸配列を有するペプチド、またはＸ１がリン酸化されている配列番号４〜１７のアミノ酸配列を有するペプチドが包含される。
【００２９】
特に規定のない限り、本明細書で用いるすべての科学技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書に記載する方法および材料の類似または等価物を、本発明の実施または検証において用いることができるが、好適な方法および材料を以下に記載する。本明細書において言及するすべての刊行物、特許出願、特許およびその他の参照文献は、参照によりその全体を援用する。矛盾する場合は、その定義を記載する本出願書類が優先される。また、材料、方法および実施例は例示にすぎず、限定を意図しない。
【００３０】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細説明および特許請求の範囲から明らかとなろう。
本発明はまた、以下の項目を提供する。
（項目１）
糖尿病の発症を処置または遅滞させる方法であって、それを必要とする対象に、ＢＡＤ  ＢＨ３ドメインペプチドまたはその模倣物を含む組成物を投与することを含む方法。
（項目２）
上記糖尿病がＩ型またはＩＩ型糖尿病である、項目１に記載の方法。
（項目３）
上記対象が高血糖である、項目１に記載の方法。
（項目４）
上記対象が肥満である、項目１に記載の方法。
（項目５）
上記がインスリン抵抗性である、項目１に記載の方法。
（項目６）
β細胞を、ＢＡＤ  ＢＨ３ドメインペプチドまたはその模倣物を含む組成物と接触させることを含む、β細胞の生存を増大させる方法。
（項目７）
上記細胞を対象への移植前に接触させる、項目６に記載の方法。
（項目８）
上記細胞を対象への移植後に接触させる、項目６に記載の方法。
（項目９）
β島細胞をＢＡＤ  ＢＨ３ドメインペプチドまたはその模倣物を含む組成物と接触させることを含む、インスリン分泌を誘導する方法。
（項目１０）
細胞をＢＡＤ  ＢＨ３ドメインペプチドまたはその模倣物を含む組成物と接触させること
を含む、グルコキナーゼ活性を増大させる方法。
（項目１１）
上記ＢＡＤ  ＢＨ３ドメインペプチドがリン酸化される、項目１〜１０いずれか１項に記載の方法。
（項目１２）
上記ＢＡＤ  ＢＨ３ドメインペプチドのαヘリックス構造を安定化させる、項目１〜１１いずれか１項に記載の方法。
（項目１３）
上記αヘリックス構造を炭化水素ホチキス留めまたは化学的架橋によって安定化させる、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
上記ＢＡＤ  ＢＨ３ドメインペプチドが、配列番号：１〜３および５〜１７のアミノ酸配列またはその断片を含む、項目１〜１２いずれか１項に記載の方法。
（項目１５）
腫瘍細胞をＢＨ３ドメインペプチドまたはその模倣物と接触させることを含む、腫瘍増殖を調節するか、または腫瘍細胞を治療用薬剤に感作させる方法。
（項目１６）
上記治療用薬剤が化学療法剤または放射線である、項目１６に記載の方法。
（項目１７）
細胞をＢＨ３ドメインペプチドまたはその模倣物と接触させることを含む、細胞周期の調節方法。
（項目１８）
細胞をＢＨ３ドメインペプチドまたはその模倣物と接触させることを含む、ホメオスタシス経路の調節方法。
（項目１９）
上記細胞が肝臓細胞またはニューロン細胞である、項目１７または１８に記載の方法。
（項目２０）
上記ＢＨ３ドメインペプチドまたはその模倣物がリン酸化される、項目１６〜１９いずれか１項に記載の方法。
（項目２１）
上記ＢＨ３ドメインペプチドまたはその模倣物が誘導体化される、項目１６〜２０いずれか１項に記載の方法。
（項目２２）
配列番号１、２または３のアミノ酸配列を含むペプチドであって、Ｘ３がリン酸化されているペプチド。
（項目２３）
配列番号４〜１７いずれか１つのアミノ酸配列を含むペプチドであって、Ｘ１がリン酸化されているペプチド。
（項目２４）
項目２１または２２に記載のペプチドを含む組成物。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】図１は、１つ以上の保存されたＢＣＬ−２相同性（ＢＨ）ドメインを有するＢＣＬ−２ファミリー構成員を示す図表である。
【図２】図２は、ミトコンドリアおよび小胞体（ＥＲ）などの小器官が重要な役割を果たす内因性アポトーシス経路の略図である。ＢＨ３単独分子は、特異的デスシグナルに選択的に応答し、最終的にＢＡＸとＢＡＫの活性化を直接または間接的に調節する上流歩哨（ｓｅｎｔｉｎｅｌ）としての機能を果たす。このプロセスが、さらに、抗アポトーシス性ＢＣＬ−２ファミリー構成員によって阻害される。ＢＡＸとＢＡＫは、アポトーシスへのゲートウェイとしての機能を果たし、ミトコンドリアからのシトクロムｃ放出とＥＲからのＣａ２＋放出の両方を調節する。
【図３】図３は、解糖スイッチングを受けて解糖を構成的様式で活性化する癌細胞の相違する代謝を強調表示する図である。詳細については試験を参照のこと。
【図４】図４は、ＢＡＤのＢＨ３ドメインが、インスリン分泌対アポトーシスに関してβ細胞の運命を決定する分子パートナーの相違する組を関与させるための細胞内代謝の合図を組み込む機能を果たしている可能性があることを示す概略図である。ＢＡＤ  ＢＨ３ドメイン内のセリン１５５のリン酸化により、そのＧＫ、グルコース誘導性呼吸およびインスリン分泌に対する効果によって、タンパク質が代謝上の役割を果たすよう指示される。
【図５】図５は、高血糖クランプ解析中の血漿グルコースレベルを示す折れ線グラフである。グルコースレベルは上昇し、Ｂａｄ  ＋／＋（ｎ＝１０）およびＢａｄ  −／−（ｎ＝１２）マウスの解析全体を通して３００ｍｇ／ｄｌで維持された。
【図６】図６は、Ｂａｄ  ＋／＋（ｎ＝１０）およびＢａｄ  −／−（ｎ＝１２）マウスにおける血漿インスリンレベルを示す折れ線グラフである。アスタリスク：ｐ＜０．０５；ダブルアスタリスク、ｐ＜０．０１、対応なし両側ｔ−検定。
【図７】図７は、実験全体を通して（０〜１２０分）、または分泌急性期（０〜３０分）および分泌後期（３０〜１２０分）のインスリン分泌の曲線下面積（ＡＵＣ）を定量する棒グラフである。アスタリスク：ｐ＜０．０５；ダブルアスタリスク、ｐ＜０．０１、対応なし両側ｔ−検定。
【図８】図８は、Ｂａｄ  ＋／＋およびＢａｄ  −／−マウスから精製した浴液洗浄済みの（ｐｅｒｉｆｕｓｅ）島からのインスリン分泌を示す折れ線グラフである。３ｍＭのグルコースでの２５分間の予備浴液洗浄期間後、各遺伝子型の１２０例の島を、表示したとおりに３ｍＭおよび２５ｍＭのグルコースで浴液洗浄した。４０分後、浴液洗浄溶液を３０ｍＭのＫＣｌにスイッチして原形質膜を脱分極させ、全インスリン顆粒プールを放出させた。島１つあたりのＤＮＡ含有量は、Ｂａｄ  ＋／＋およびＢａｄ  −／−マウスで、それぞれ１２．４ｎｇおよび１４．６ｎｇであった。Ｂａｄ  ＋／＋およびＢａｄ  −／−は、それぞれ、放出第１期（８〜１５分）のＡＵＣが１２．５０対５．９８であり、放出第２期（１５〜４０分）では１５．０５対８．４４であった。３つの独立した実験の代表例を示す。
【図９】図９は、グルコースを５．５ｍＭから２５ｍＭに増加したときのＢａｄ  ＋／＋とＢａｄ  −／−の島におけるＡＴＰ／ＡＤＰ比を示す棒グラフである。
【図１０】図１０は、分泌促進薬に応答したＢａｄ  ＋／＋とＢａｄ  −／−の島におけるインスリン放出を示す棒グラフである。Ｂａｄ  ＋／＋とＢａｄ  −／−の島は、１０ｍＭの２−ケトイソカプロン酸（ＫＩＣ）、０．２５ｍＭのトルブタミドまたは０．２５ｍＭのカルバコールの存在下または非存在下、表示した量のグルコースを含有する培地中で培養した。インスリン分泌は、静的インキュベーション法を用いて測定した。ｎ＝８〜１１／群。島１つあたりのインスリン含有量は、Ｂａｄ  ＋／＋およびＢａｄ  −／−で、それぞれ、１１５．１±４．６４および１１８．４９±４．０９ｎｇであった。アスタリスク、ｐ＜０．０５、Ｂａｄ  ＋／＋対Ｂａｄ  −／−、対応なし両側ｔ−検定。ｎ＝８〜１１／群。ｐ＜０．０５、Ｂａｄ  ＋／＋対Ｂａｄ  −／−、対応なし両側ｔ−検定。
【図１１】図１１は、グルコース濃度を３から８ｍＭに増加したときの、個々のＢａｄ  ＋／＋およびＢａｄ  −／−のβ細胞からのＴＭＲＥ蛍光強度における変化を示す図である。蛍光強度に関して画像を色分けしている；青（低）および赤（高）。
【図１２】図１２は、３ｍＭのグルコースの存在下、１０ｍＭのＫＩＣの添加後の個々のＢａｄ  ＋／＋およびＢａｄ  −／−のβ細胞のΔΨにおける変化を示す棒グラフである。
【図１３】図１３は、Ｂａｄ  ＋／＋およびＢａｄ  −／−マウスから単離された一次島のホモジネートにおけるグルコキナーゼ活性の表示としてのＮＡＤＨ蛍光を示す棒グラフである。
【図１４】図１４は、グルコースの漸増用量で浴液洗浄済みのＢａｄ  ＋／＋とＢａｄ  −／−の島におけるインスリン分泌を示す棒グラフである。ダブルアスタリスク、ｐ＜０．０１、対応なし両側ｔ−検定、表示したグルコース濃度でＢａｄ  ＋／＋対Ｂａｄ  −／−島。
【図１５】図１５は、ＧＦＰ単独、ＧＦＰ−ＢＡＤまたはＧＦＰ−ＢＡＤ  Ｌ→Ａを発現するアデノウイルスに感染させたＢａｄ  ＋／＋とＢａｄ  −／−の島におけるグルコース刺激型インスリン分泌（ＧＳＩＳ）を示す棒グラフである。ｎ＝１０〜１５／群。３つの独立した実験の代表例を２つの独立したウイルスストック調製物とともに示す。
【図１６】図１６は、Ｂａｄ  ＋／＋マウスまたはＢＡＤのリン酸化不可能変異型（Ｂａｄ  ３ＳＡおよびＢａｄ  Ｓ１５５Ａ）を発現する動物におけるＧＳＩＳを示す棒グラフである。ｎ／群：Ｂａｄ  ＋／＋（ｎ＝１０）、Ｂａｄ  ３ＳＡ（ｎ＝８）、Ｂａｄ  Ｓ１５５Ａ（ｎ＝１２）。
【図１７】図１７は、図１８に示した３μＭの表示したＢＣＬ−２ドメインの安定化α−へリックス（ＳＡＨＢ）またはビヒクル対照（ＤＭＳＯ）で処理したＢａｄ  ＋／＋とＢａｄ  −／−の島におけるＧＳＩＳを示す棒グラフである。ｎ＝８／群。
【図１８−１】図１８は、（ｃ）で用いたＳＡＨＢ化合物を示したチャートである。ＢＡＤおよびＢＩＤ  ＢＨ３ドメイン内の保存されたＬ１５１およびＤ１５６残基を黄色で強調表示し、Ｓ１５５を灰色でマーキングしている。種々のＳＡＨＢ化合物で改変されている残基を緑でマーキングしている。ＢＩＤ  ＳＡＨＢＡ内のＮＬ：ノルロイシン、＊：Ｓ５非天然アミノ酸（図３３参照）。ＢＡＤ  ＢＨ３化合物の切断型ライブラリーおよびそのＢＣＬ−ＸＬに対する結合能を示す。リン酸化模倣化合物および標的捕捉およびＳＡＨＢ系免疫沈降または架橋のための化合物を含む、これまでに作製されたＢＡＤ  ＳＡＨＢ誘導体の完全なリストを示す。
【図１８−２】図１８は、（ｃ）で用いたＳＡＨＢ化合物を示したチャートである。ＢＡＤおよびＢＩＤ  ＢＨ３ドメイン内の保存されたＬ１５１およびＤ１５６残基を黄色で強調表示し、Ｓ１５５を灰色でマーキングしている。種々のＳＡＨＢ化合物で改変されている残基を緑でマーキングしている。ＢＩＤ  ＳＡＨＢＡ内のＮＬ：ノルロイシン、＊：Ｓ５非天然アミノ酸（図３３参照）。ＢＡＤ  ＢＨ３化合物の切断型ライブラリーおよびそのＢＣＬ−ＸＬに対する結合能を示す。リン酸化模倣化合物および標的捕捉およびＳＡＨＢ系免疫沈降または架橋のための化合物を含む、これまでに作製されたＢＡＤ  ＳＡＨＢ誘導体の完全なリストを示す。
【図１８−３】図１８は、（ｃ）で用いたＳＡＨＢ化合物を示したチャートである。ＢＡＤおよびＢＩＤ  ＢＨ３ドメイン内の保存されたＬ１５１およびＤ１５６残基を黄色で強調表示し、Ｓ１５５を灰色でマーキングしている。種々のＳＡＨＢ化合物で改変されている残基を緑でマーキングしている。ＢＩＤ  ＳＡＨＢＡ内のＮＬ：ノルロイシン、＊：Ｓ５非天然アミノ酸（図３３参照）。ＢＡＤ  ＢＨ３化合物の切断型ライブラリーおよびそのＢＣＬ−ＸＬに対する結合能を示す。リン酸化模倣化合物および標的捕捉およびＳＡＨＢ系免疫沈降または架橋のための化合物を含む、これまでに作製されたＢＡＤ  ＳＡＨＢ誘導体の完全なリストを示す。
【図１８−４】図１８は、（ｃ）で用いたＳＡＨＢ化合物を示したチャートである。ＢＡＤおよびＢＩＤ  ＢＨ３ドメイン内の保存されたＬ１５１およびＤ１５６残基を黄色で強調表示し、Ｓ１５５を灰色でマーキングしている。種々のＳＡＨＢ化合物で改変されている残基を緑でマーキングしている。ＢＩＤ  ＳＡＨＢＡ内のＮＬ：ノルロイシン、＊：Ｓ５非天然アミノ酸（図３３参照）。ＢＡＤ  ＢＨ３化合物の切断型ライブラリーおよびそのＢＣＬ−ＸＬに対する結合能を示す。リン酸化模倣化合物および標的捕捉およびＳＡＨＢ系免疫沈降または架橋のための化合物を含む、これまでに作製されたＢＡＤ  ＳＡＨＢ誘導体の完全なリストを示す。
【図１９】図１９は、ミトコンドリア膜電位におけるグルコース誘導性変化（ΔΨ）に対するＳＡＨＢ化合物の効果を示す棒グラフである。
【図２０】図２０は、３μＭの表示した化合物で４時間処理したＭＩＮ６  β細胞から調製したホモジネートにおけるグルコキナーゼ活性の表示としてのＮＡＤＨ蛍光を示す棒グラフである。アスタリスク：ｐ＜０．０５  ＢＡＤ  ＳＡＨＢＡ対ＤＭＳＯ、二重短剣符：ｐ＜０．０１  ＢＡＤ  ＳＡＨＢＡ（Ｓ→ＰＳ）またはＢＡＤ  ＳＡＨＢＡ（Ｓ→Ｄ）対ＢＡＤ  ＳＡＨＢＡ
【図２１】図２１は、高脂肪食餌（ＨＦＤ）を１６週間または対照食餌での野生型マウスにおける島のＢＡＤ  ｍＲＮＡレベルを示す棒グラフである。
【図２２】図２２は、ＨＦＤ下に１６週間置いたＢａｄ  ＋／＋およびＢａｄ  −／−のコホート（ｎ＝２０）の毎週の血中グルコースレベルを示す折れ線グラフである。
【図２３】図２３は、ＨＦＤ下に１６週間置いたＢａｄ  ＋／＋およびＢａｄ  −／−のコホート（ｎ＝２０）の毎週の体重を示すドットプロットである。
【図２４】図２４は、対照またはＨＦＤのコホートから調製した膵臓切片中の島面積の割合示す棒グラフである。アスタリスク：ＨＦＤにおいてＢａｄ  ＋／＋に対してＢａｄ  −／−でｐ＜０．０５
【図２５】図２５は、抗インスリン抗体で発色させた上記のコホートから調製した代表的な膵臓切片の免疫組織化学的解析を示す図である。
【図２６】図２６は、８週間の対照またはＨＦＤにおけるＢａｄ  ＋／＋およびＢａｄ  −／−の非空腹時血中インスリンレベルを示す棒グラフである。
【図２７】図２７は、ＨＦＤ下に１６週間置いたＢａｄ  ＋／＋およびＢａｄ  ３ＳＡコホート（ｎ＝８）の毎週の血中グルコースレベルを示す折れ線グラフである。
【図２８】図２８は、ＨＦＤ下に１６週間置いたＢａｄ  ＋／＋およびＢａｄ  ３ＳＡのコホート（ｎ＝８）の体重を示すドットプロットである。
【図２９】図２９は、上記（２７〜２８）に示したコホートから調製した膵臓切片中の島面積の割合を示す棒グラフおよび写真である。
【図３０】図３０は、８週間の対照またはＨＦＤにおけるＢａｄ  ＋／＋およびＢａｄ３ＳＡの非空腹時血中インスリンレベルを示す棒グラフである。アスタリスク：ＨＦＤにおいてＢａｄ  ＋／＋に対してＢａｄ  ３ＳＡでｐ＜０．０５。
【図３１】図３１は、抗グルコキナーゼ抗体（レーン１〜３）または対照ウサギＩｇＧ（レーン４〜６）を、ＭＩＮ６  β細胞から調製されたＣＨＡＰＳ可溶化型ミトコンドリア富化重膜（ＨＭ）画分とともにインキュベートした結果を示すウエスタンブロットの写真である。
【図３２】図３２は、ＭＩＮ６  β細胞から単離されたＣＨＡＰＳ可溶化型ミトコンドリア富化重膜（ＨＭ）画分を、ミクロシスチン（ＭＣ）カップリング型アガロースビーズとともにインキュベートした結果を示すウエスタンブロットの写真である。結合されたタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、表示した抗体を用いてイムノブロットを行なった。非カップリング型ビーズは対照（ｃｔｒｌ）として供される。
【図３３】図３３は、炭化水素ホチキス留め合成ストラテジーの概略図である。Ｓ−Ｎ−（９−フルオレニルメチルカルバメート）−２−（４’−ペンテニル）アラニン（「Ｓ５」）の不斉合成は既報のとおりにして行なった。ＳＡＨＢ化合物は、ＢＨ３配列内の３つの天然アミノ酸にフランキングしている異なる位置（ｉ位、ｉ＋４位）の２つのアミノ酸を非天然アミノ酸で置き換えることにより作製した。ペプチド合成、オレフィンメタセシス、ＦＩＴＣ−誘導体化、逆相ＨＰＬＣ精製、および微量分析は、ＢＩＤ  ＳＡＨＢについて既報のとおりにして行なった。ＢＩＤ  ＢＨ３の天然メチオニンは、イオウとルテニウム触媒型メタセシス反応との不適合性のため、ＢＩＤ  ＳＡＨＢ内のノルロイシン（ＮＬ）で置き換えた。
【図３４】図３４は、円二色性スペクトルが、対応する非修飾ペプチドと比べてＳＡＨＢα−らせん度の向上示すことを示すドットプロットである。
【図３５】図３５は、精製ＢＣＬ−ＸＬ  ΔＣまたは対照ＧＳＴタンパク質に対するＳＡＨＢ化合物の結合親和性を示す折れ線グラフとドットプロットである。
【図３６】図３６は、ノックイン標的化ストラテジーを示す概略図である。ＢＡＤ遺伝子座の地図に、制限部位Ｘ、Ｘｂａｌ；Ｂ、ＢａｍＨｌ；ＥＶ、ＥｃｏＲＶ；Ｓ、ＳｍａＩ；Ｅ、ＥｃｏＲｌを記号で示し、四角はエキソンを表す。セリン１５５のアラニンへの変異をＲＦＬＰ（ＥｃｏＲｌ）に連鎖させ、フランキングＦＲＴ部位（青三角）を有するＰＧＫ−ＮＥＯカセットを３’ＵＴＲの下流に挿入した。ＦｌｐＥトランスジェニックマウスとの交配によりＢａｄ  Ｓ１５５Ａ（ｎｅｏ）／＋の作出後、ＮＥＯカセットを切除した。
【図３７】図３７は、適切な標的化を確認するサザンブロットの写真である。図３６に示したプローブを用いて、ＦＲＴ−Ｎｅｏ−ＦＲＴカセットの挿入（左パネル）、ＢＡＤ内へのＥｃｏＲＩ  ＲＦＬＰの組込み（右パネル）を示した。（＊）の記号を示したクローンは、挿入とＲＦＬＰの両方について陽性であった。
【図３８】図３８は、ＦｌｐＥマウスと交配したＢａｄ  Ｓ１５５Ａ（ｎｅｏ）／＋のＳ１５５Ａ子孫の遺伝子型判定に用いたＥｃｏＲｌで消化後の、Ｓ１５５ＡのＲＦＬＰ変異マーカーＰＣＲ断片を示す写真である。
【図３９】図３９は、腹腔内耐糖能試験（ｉｐＧＴＴ）後の血中グルコースレベルを示す折れ線グラフである。この試験では、一晩絶食後、マウスに１ｇ／ｋｇのグルコースをｉ．ｐ．注射した（時間０）。血中グルコースおよびインスリンレベルは、ｉｐＧＴＴの前、試験に入って５分、１５分および３０分の時点に測定した。ｎ／群：ＷＴ＝１０およびＢａｄ  Ｓ１５５Ａ＝１０。アスタリスク：ｐ＜０．０５。
【図４０】図４０は、図３９のような腹腔内耐糖能試験後の血中インスリンレベルを示す折れ線グラフである。アスタリスク：ｐ＜０．０５；（ｅ）のダブルアスタリスク，ｐ＜０．０１、対応なし両側ｔ−検定、Ｂａｄ  Ｓ１５５Ａに対するＢａｄ  ＋／＋。
【図４１】図４１は、Ｂａｄ  −／−島での高グルコースまたはＳＴＺに対する慢性的曝露の効果を示す棒グラフである。Ｂａｄ  ＋／＋  Ｂａｄ  ＋／＋を、それぞれ、ＧＦＰ単独またはＧＦＰとＢＡＤを発現するアデノウイルスに感染させた。次いで、各群のＧＦＰ発現島をピッキングし、５．５ｍＭ（正常グルコース）、１６．７ｍＭ（高グルコース）または５．５ｍＭおよび１．２ｍＭのＳＴＺを含有する培地中で４８時間培養した。穏やかなトリプシン処理によって島を分散させ、バイアビリティをトリパンブルー排除によって評価した。
【図４２】図４２は、高グルコースまたはＳＴＺに対する慢性的曝露の効果を示す棒グラフである。Ｂａｄ  ＋／＋およびＢａｄ  ３ＳＡ島を慢性高グルコースまたはＳＴＺに曝露し、バイアビリティを上記のようにして評価した。少なくとも３つの独立した実験の３連での読み値の結果を示す。アスタリスクは、Ｂａｄ  −／−対Ｂａｄ  ＋／＋、またはＢａｄ  ３ＳＡ対Ｂａｄ  ＋／＋の比較である。
【図４３】図４３は、インスリン（赤）およびグルカゴン（緑）に対する抗体で二重染色した、ＳＴＺ処理後、第０日目または第７日目のＢａｄ  −／−およびＢａｄ  ＋／＋マウスから調製した膵臓切片の蛍光顕微鏡検査を示す写真である。
【図４４】図４４は、インスリンまたは活性カスパーゼ−３に対する抗体で染色した後、ヘマトキシリンとエオシンで対比染色したときの、図４３の実験の膵臓切片の免疫組織化学検査を示す写真である。
【図４５】図４５は、（図４３〜４４）で使用したものと同じコホートのＢａｄ  ＋／＋（ｎ＝７）およびＢａｄ  −／−（ｎ＝８）マウスでの、第０日目および第７日目の血清インスリンレベルを示す棒グラフである。アスタリスク、ｐ＜０．０５；ダブルアスタリスク、ｐ＜０．０１、対応なし両側ｔ−検定。
【図４６】図４６は、（図４３〜４４）で使用したものと同じコホートのＢａｄ  ＋／＋（ｎ＝７）およびＢａｄ  −／−（ｎ＝８）マウスでの、第０日目および第７日目のグルコースレベルを示す棒グラフである。アスタリスク、ｐ＜０．０５。
【図４７】図４７は、ＨＦＤで１６週間後のＢａｄ  ＋／＋マウスから調製した代表的な膵臓切片中の島の数およびそのサイズ分布を示すヒストグラムである。ヒストグラムは、ＨＦＤで１６週間後のＢａｄ  ＋／＋マウスから調製した代表的な膵臓切片中の島の数およびそのサイズ分布を示す。各ひし形は、抗インスリン抗体で免疫染色された島を表す。縦軸は、ＭｅｔａＭｏｒｐｈソフトウェアプログラムによってトレースされた島に割り当てられたピクセル面積を表す。横軸は、島を表す。表示した各代表的な遺伝子型ペア（Ｂａｄ  ＋／＋対Ｂａｄ  −／−およびＢａｄ  ＋／＋対Ｂａｄ  ３ＳＡ）について、総切片面積は同程度であった。Ｂａｄ  −／−切片は、同じ総組織面積に対して有意に多くの島を含むが、Ｂａｄ  ３ＳＡマウスは有意に少ない島を有する。少なくとも３匹の動物／群の多くの切片を同様にして解析した。
【図４８】図４８は、ＨＦＤで１６週間後のＢａｄ  −／−マウスから調製した代表的な膵臓切片中の島の数およびそのサイズ分布を示すヒストグラムである。
【図４９】図４９は、ＨＦＤで１６週間後のＢａｄ  ＋／＋マウスから調製した代表的な膵臓切片中の島の数およびそのサイズ分布を示すヒストグラムである。
【図５０】図５０は、ＨＦＤで１６週間後のＢａｄ  ３ＳＡマウスから調製した代表的な膵臓切片中の島の数およびそのサイズ分布を示すヒストグラムである。
【図５１】図５１は、正常血糖高インスリン血症クランプ法および種々の代謝パラメータを計算するのに用いた式を簡単に示したものである。
【図５２】図５２は、Ｂａｄ  ＋／＋（ｎ＝７）およびＢａｄ  −／−（ｎ＝９）マウスにおいて、クランプ期間中、正常血糖に達し、維持されたことを示す折れ線グラフである。
【図５３】図５３は、正常血糖高インスリン血症クランプ解析に供されたＢａｄ  ＋／＋（ｎ＝７）およびＢａｄ  −／−（ｎ＝９）マウスにおけるグルコース注入速度（ＧＩＮＦ）を示す折れ線グラフである。
【図５４】図５４は、図５１の式を用いて計算された肝グルコース生成を示す棒グラフである（ＨＧＯ）。
【図５５】図５５は、末梢インスリン感受性指数を示す棒グラフであり、グルコース取込み、解糖およびグリコゲン合成（すべて、図５１に示した式を用いて測定）を含む。
【図５６】図５６は、正常血糖高インスリン血症クランプ解析に供されたＢａｄ  ＋／＋およびＢａｄ  −／−動物から採取した骨格筋におけるグルコース取込みを示す棒グラフである。
【図５７】図５７は、正常血糖高インスリン血症クランプ解析に供されたＢａｄ  ＋／＋およびＢａｄ  −／−動物から単離された白色脂肪組織におけるグルコース取込みを示す棒グラフである。
【図５８】図５８は、正常血糖高インスリン血症クランプ解析に供されたＢａｄ  ＋／＋およびＢａｄ  −／−動物における、血漿遊離脂肪酸（ＦＦＡ）に対するインスリンの効果を示す棒グラフである。
【図５９】図５９は、正常血糖高インスリン血症クランプ解析に供されたＢａｄ  ＋／＋およびＢａｄ  −／−動物における血漿脂質に対するインスリンの効果を示す棒グラフである。
【図６０】図６０は、対照食餌を１６週間与えたＢａｄ  −／−マウスから切除した肝臓から調製した組織切片の免疫組織化学的解析を示す写真である。
【図６１】図６１は、高脂肪食餌を１６週間与えたＢａｄ  ３ＳＡマウスから切除した肝臓から調製した組織切片の免疫組織化学的解析を示す写真である。
【図６２】図６２は、対照食餌を１６週間与えたＢａｄ  ＋／＋マウスから切除した肝臓から調製した組織切片の免疫組織化学的解析を示す写真である。
【図６３】図６３は、高脂肪食餌を１６週間与えたＢａｄ  −／−マウスから切除した肝臓から調製した組織切片の免疫組織化学的解析を示す写真である。
【図６４】図６４は、高脂肪食餌を１６週間与えたＢａｄ  ＋／＋マウスから切除した肝臓から調製した組織切片の免疫組織化学的解析を示す写真である。
【図６５】図６５は、高脂肪食餌を１６週間与えたＢａｄ  ＋／＋マウスから切除した肝臓から調製した組織切片の免疫組織化学的解析を示す写真である。
【図６６】図６６は、アポトーシスとＤＮＡ損傷チェックポイントにおけるＢＩＤの二重機能のモデルを示す。両方の役割がＢＩＤの相違する残基の翻訳後修飾によって調節される。デスレセプターのシグナル伝達の下流では、ＢＩＤがカスパーゼ−８によって切断される。次いで、切断されたＢＩＤは、脂質部分（ミリストイル基）の付加によって修飾され、ミトコンドリアに移行し、アポトーシスを活性化する。他方、ＤＮＡ損傷の下流では、ＢＩＤは核に移行し、そこで、細胞周期チェックポイントキナーゼであるＡＴＭ／ＡＴＲによるリン酸化によって、ＢＨ３ドメイン近傍の特定の残基において修飾される。この修飾により、ＢＩＤが細胞周期停止（Ｓ期内チェックポイント）において機能を果たすことが可能となり、最終的に、細胞が、増殖前にその損傷ＤＮＡを修復することが妨げられる。
【図６７】図６７は、バイオインフォマティクスによって規定され、続いて試験された多数のＢＣＬ−２ファミリータンパク質のＢＨ３配列内のリン酸化部位の一覧である。ＢＨ３模倣化合物内のこれらの部位の誘導体化により、アポトーシスと他のホメオスタシス機能との間でスイッチ切替するＢＣＬ−２ファミリータンパク質の操作が可能となる。
【図６８】図６８は、クーマシーで染色されたタンパク質ゲルの写真であり、ＢＡＤ  ＢＨ３配列を用いる標的捕捉アッセイのための架橋方法論を示す。架橋方法論および光活性化可能なＢＡＤ  ＢＨ３配列を用いた標的捕捉アッセイ。４−ベンゾイルフェニルアラニンを含有するＢＡＤ  ＢＨ３ペプチドのＦＩＴＣ誘導体（図１８の標的捕捉パネル参照）２０μＭを、５μＭの精製ＧＳＴタグ化ＢＣＬ−ＸＬとともに、ＴＬＣトランスイルミネーターから３５０ｎｍの光路長において１３５分間インキュベートした。ビヒクル対照（ＤＭＳＯ）で処理したＢＣＬ−ＸＬを対照に供した。タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に負荷し、クーマシーで染色した。表示のように、光活性化によってＢＣＬ−ＸＬとＢＨ３ペプチドの共有結合性架橋がもたらされ、ＢＣＬ−ＸＬタンパク質の移動度シフトがもたらされる。
【図６９】図６９は、蛍光ゲルスキャンに供されたタンパク質ゲルの写真であり、ＢＡＤ  ＢＨ３配列を用いる標的捕捉アッセイのための架橋方法論を示す。ＦＩＴＣ  ＢＡＤ  ＢＨ３ペプチドに架橋されたＢＣＬ−ＸＬを含むタンパク質複合体が検出される。
【図７０】図７０は、直接ＢＡＤ  ＢＨ３標的としてのグルコキナーゼを示すイムノブロットの写真である。光活性化可能なベンゾフェノン部分を含むＢＡＤ  ＳＡＨＢ化合物２０μＭを、ＩＮＳ−１細胞から調製した抽出物とともに２３℃で３０分間プレインキュベートした後、３５０ｎｍの光に４℃で２時間曝露した。ＧＫに対するＳＡＨＢの共有結合をＧＫ免疫沈降（ＩＰ）によって検出した。結合物質を溶出し、ゲル分画し、抗ＧＫまたは抗ＦＩＴＣ  抗体を用いてブロット（ＷＢ）した。
【図７１】図７１は、組換えグルコキナーゼに対する結合に関するＢＡＤ  ＳＡＨＢ化合物と完全長組換えＢＡＤの競合を示すイムノブロットの写真である。ＢＡＤとＧＫを、ウサギ網状赤血球ライセート系において、インビトロ転写−翻訳（ＩＶＴＴ）を用いて共翻訳させた。ＧＫとＢＡＤを、３０μＭのＳＡＨＢ化合物またはＤＭＳＯの存在下、ＲＩＰＡバッファー中で、図３１に示したＧＫアフィニティーカラムを用いて共免疫沈降させた。免疫複合体をＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離し、抗ＢＡＤ抗体を用いてプローブ結合（ＷＢ）させた。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
発明の詳細な説明
本発明は、一部において、アポトーシス促進性ＢＣＬ−２ファミリー構成員ＢＡＤが、グルコース誘導性呼吸を調節するグルコキナーゼ含有複合体内に存在しているという知見に基づく。より詳しくは、本発明は、β細胞グルコキナーゼのモジュレーションを介した膵β細胞によるグルコース刺激型ミトコンドリア呼吸、グルコース感知およびグルコース刺激型インスリン分泌におけるＢＡＤの生理学的役割の知見に基づく。ＢＡＤの新規な機能は、以前に必須デスドメインと規定されたそのＢＨ３配列のリン酸化に特異的に依存性である。リン酸化ＢＡＤ  ＢＨ３ドメインペプチドの化学的に安定化させた型を使用すると、グルコキナーゼ活性グルコース誘導性ミトコンドリア呼吸が回復し、ＢＡＤ欠損島におけるインスリン分泌が修正された。したがって、ＢＡＤのＢＨ３ドメインは、２つの別々の機能：アポトーシスと代謝を調節する。重要なことには、ＢＨ３配列内の規定のセリン残基のリン酸化は、ＢＡＤに代謝上の役割を担うよう指示する分子内スイッチングを構成している。増殖因子および生存因子によるシグナル伝達は、細胞内代謝とコアアポトーシス機構の両方に影響を及ぼす。最近の多くの研究により、正常なホメオスタシス経路、例えば、グルコース代謝、ＥＲ  Ｃａ２＋ホメオスタシスおよびＤＮＡ損傷応答において、新規な役割がＢＣＬ−２ファミリータンパク質のものであるとされた。このような新規な役割が、あるいは細胞死の調節因子として知られているタンパク質の別々の機能を表しているのかどうかの調査は、さかんに行なわれている。アポトーシス促進性タンパク質ＢＡＤは、保存された両親媒性のα−ヘリックスＢＨ３モチーフを共有するＢＣＬ−２ファミリー構成員のサブセットに属する。ＢＡＤのアポトーシス促進性活性は、ミトコンドリア膜に局在するキナーゼによって媒介されるリン酸化によって調節される。ミトコンドリアにおけるＢＡＤの役割を解明するため、肝臓ミトコンドリアのプロテオミクス解析を行ない、これにより、ＢＡＤが、グルコース誘導性呼吸を調節するグルコキナーゼ（ＧＫ）含有複合体内に存在していることが明らかになった。Ｂａｄヌル遺伝子モデルにより、ＢＡＤは複合体の合成に必要であることが示され、リン酸化不可能型Ｂａｄ  ３ＳＡノックインマウスにより、リン酸化型のＢＡＤが、ミトコンドリアテザー型ＧＫの充分な活性化に必要であるという証拠が示された（Ｄａｎｉａｌ  Ｎ．Ｎ．ら，２００３．Ｎａｔｕｒｅ  ４２４，９５２−６）。ＧＫ活性のモジュレーションにおけるＢＡＤの役割と整合して、Ｂａｄ欠損動物とＢａｄ  ３ＳＡ動物は、ともに異常なグルコースホメオスタシスを示した。ＢａｄヌルおよびＢａｄ  ３ＳＡが、それぞれ、この分子のアポトーシス促進性活性の機能モデルの喪失および獲得を示すため、これらの動物の共通の代謝異常により、グルコース代謝におけるＢＡＤの役割は、細胞をアポトーシスに感作させるその能力と相違し得ることが示唆された。ＧＫは、主に肝細胞と膵β細胞で発現され、哺乳動物のグルコース感知機構の重要な成分を構成する。ＧＫは、肝臓ではグリコゲン合成とグルコース産出を制御するが、膵臓ではβ細胞によるインスリン分泌を調節する。したがって、Ｂａｄマウスモデルで観察されたグルコースホメオスタシスの欠陥は、前記組織の両方またはいずれかにおける欠乏に由来するものであり得る。遺伝的アプローチおよび新規な化学的ツールにより、β細胞によるグルコース刺激型インスリン分泌（ＧＳＩＳ）調節におけるＢＡＤの必須の役割が解明された。
【００３３】
したがって、本発明は、対象に、誘導体化ＢＡＤ  ＢＨ３ドメインペプチドまたはその模倣物を投与することにより、糖尿病および肥満の症状を処置、軽減する方法、またはその発症を遅延させる方法を提供する。さらに、本発明は、β細胞質量の減損に苦しむ対象において島移植片の生存と機能を改善する方法を提供する。
【００３４】
ＢＨ３ペプチドおよび模倣物
ＢＨ３ペプチドは、Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質由来の両親媒性のα−ヘリックスＢＨ３ドメインを含有する。ＢＨ３ペプチドは、ＢＩＤ、ＮＯＸＡ、ＢＡＤ、ＢＮＩＰ３、ＨＲＫ、ＮＩＸ、ＳＰＩＫＥ、ＢＡＫ、ＢＡＸ、ＢＯＫ、ＢＣＬ−２、ＢＣＬ−ＸＬ、ＢＣＬ−Ｗ、ＭＣＬ−１、ＰＵＭＡ、ＢＩＫ、ＢＩＭおよび他のＢＨ３−ドメイン含有相同タンパク質由来のＢＨ３ドメインを含むものである。用語「ペプチド」は、特定の長さを暗示するものではない。用語「ペプチド」は、共有結合（例えば、アミド結合）によって連結された２つ以上の天然または合成アミノ酸を意味する。
【００３５】
ＢＨ３ドメインペプチドは、１９５アミノ酸長未満、例えば、１５０以下、１００、７５、５０、３５、２５、１５または１０アミノ酸長である。好ましくは、ＢＨ３ドメインペプチドは、２５アミノ酸未満である。用語「ペプチド」は、さらに、共有結合（例えば、アミド結合）によって連結された２つ以上の天然または合成アミノ酸を包含する。用語「アミノ酸」は、アミノ基とカルボキシル基の両方を含む分子をいう。好適なアミノ酸としては、限定されないが、ペプチドに見られる２０種類の一般的な天然に存在するアミノ酸（例えば、Ａ、Ｒ、Ｎ、Ｃ、Ｄ、Ｑ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、Ｖ（一文字記号として知られているもの））のＤ−異性体およびＬ−異性体の両方、ならびに有機合成または他の代謝経路によって調製される天然に存在するアミノ酸および天然に存在していないアミノ酸が挙げられる。
【００３６】
ＢＨ３ペプチドは、１つ以上のセリン、トレオニンまたはチロシン残基がリン酸化されたものである。あるいはまた、ＢＨ３ペプチドは、ホスホペプチド模倣物である。ホスホペプチド模倣物により、ホスホペプチド模倣物が天然のリン酸化残基の官能性に非常に近いことを意図する。例えば、リン酸化可能なアミノ酸を、リン原子の負電荷を模倣するアミノ酸（グルタミン酸またはアスパラギン酸など）で置き換える。好ましくは、ホスホペプチド模倣物は化学的に安定である（例えば、ホスファターゼによる脱リン酸化に抵抗性である。例えば、ホスホペプチド模倣物は、炭素骨格とリン原子の間に非加水分解性結合を含む。これは、天然に存在する酸素架橋の代わりにリン酸基部分に対する非加水分解性結合を有するアミノ酸原子構造を含む合成分子により達成される。例えば、ＣＦ２基によってアミノ酸をリン酸基に連結する。天然でリン酸化されているいくつかのアミノ酸の模倣物が、このアプローチによって作製され得る。ホスホセリン、ホスホトレオニン、およびホスホチロシンの模倣物は、適切な炭素からリン酸基部分にＣＦ２結合を配置することにより作製される。任意に、模倣分子Ｌ−２−アミノ−４−（ジエチルホスホノ）−４，−４−ジフルオロブタン酸がホスホセリンの代用とされ（Ｏｔａｋａら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ３６：９２７−９３０（１９９５））、Ｌ−２−アミノ−４−ホスホノ−４，−４−ジフルオロ−３−メチルブタン酸がホスホトレオニンの代用とされ、Ｌ−２−アミノ−４−ホスホノ（ジフルオロメチル）フェニルアラニンがホスホチロシンの代用とされる。非加水分解性結合あるいは安定なリン酸化模倣物の他の作製方法は、当業者ならわかるであろう。
【００３７】
セリン、トレオニンおよびチロシンのリン酸化模倣物には、リン酸基の電子の特性を模倣するとともに、内在する細胞内ホスファターゼによるリン酸基の加水分解を抑制し、したがってホスホペプチドの生物学的特性および活性が維持される種が使用される。上記の特性を有するもので、生物医学研究機関で現在主流となっている慣用法には２つのアプローチがある。
【００３８】
アスパラギン酸およびグルタミン酸は、ともに、ホスホセリン、ホスホトレオニン、およびホスホチロシンの側鎖と正味の負電荷を擬態し、組込み容易性および単純性に関して有用性が見出された（Ｈａｏ，Ｌｏｗｙら  １９９６；Ｆｕ，Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎら
２０００；Ｍｏｄｒｏｆ，Ｍｏｒｉｔｚら  ２００１）。非加水分解性ホスホセリン／ホスホトレオニン／ホスホチロシン模倣物のより厳密な模倣物としては、ホスホノメチレンアラニン（Ｐｍａ）（Ｓｈａｐｉｒｏ，Ｂｕｅｃｈｌｅｒら  １９９３）、ホスホノジフルオロメチレンアラニン（Ｐｆａ）（Ｂｅｒｋｏｗｉｔｚ，Ｅｇｇｅｎら  １９９６）、ホスホノメチレンフェニルアラニン（Ｐｍｐ）（Ｂｕｒｋｅ、Ｒｕｓｓら  １９９１）、ホスホノジフルオロメチレンフェニルアラニン（Ｆ２Ｐｍｐ）（Ｂｕｒｋｅ，Ｓｍｙｔｈら  １９９４）（どちらもリン酸基の不安定性酸素が非不安定性炭素で置換されている）が挙げられる。このようなより厳密なリン酸化模倣物は、アスパラギン酸およびグルタミン酸のリン酸化模倣物で考えられ得るものよりも多くの天然水素結合可能性が維持されているため、より有用である。
【００３９】
ＢＡＤ  ＢＨ３ドメインペプチドは、ＢＡＤ由来のα−ヘリックスＢＨ３ドメインを含むものである。例示的なＢＡＤ  ＢＨ３ドメインペプチドは、配列：
【００４０】
【化１】
2014139245.tif 000003
（式中；Ｘ１およびＸ２は、任意の天然または非天然のアミノであり、Ｘ３は、Ｇ、Ｄ、Ｅ、Ｓ、Ｔ、Ｙまたはそのリン酸化模倣物である）
を含むものである。例えば、Ｘ２はノルロイシンである。
【００４１】
ＸａａおよびＸｂｂは、独立してアミノ酸であり、Ｎは０〜１０の整数である。
【００４２】
ＢＡＤ様ＢＨ３の他の例は、
【００４３】
【化２】
2014139245.tif 000004
【００４４】
【化３】
2014139245.tif 000005
または図１８に示した配列番号：１８−ＸＸの少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５個またはそれ以上のアミノ酸である。
【００４５】
好ましい実施形態において、Ｘ１は、Ｓ５またはアミノ酪酸のいずれかであり、Ｘ２は、好ましくはノルロイシンである。Ｘ１ｓがＳ５の場合、Ｓ５アミノ酸が反応して全炭化水素架橋体が形成され得る。好ましくは、Ｘ３アミノ酸は、リン酸基部分が模倣される正味負電荷を含むように修飾されるか、または正味負電荷がマスクされて細胞内に進入するように修飾される。例えば、Ｘ３アミノ酸は、リン酸化、スルホン化、酸素化、硝酸化もしくはフッ素化されたもの、またはその機能的等価物である。任意に、Ｘ３アミノ酸は、エステル化またはステル化（ｓｔｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を受けたものである。
【００４６】
種々の実施形態において、［Ｘａａ］ｎは、Ｒ、ＱＲ、ＡＱＲ、ＡＡＱＲ、ＷＡＡＱＲ、ＬＷＡＡＱＲまたはＮＬＷＡＡＱＲであり、［Ｘｂｂ］ｎは、Ｖ、ＶＤ、ＶＤＳ、ＶＤＳＦ、ＶＤＳＦＫ、またはＶＤＳＦＫＫである。
【００４７】
ＢＩＤ  ＢＨ３ドメインペプチドは、ＢＩＤ由来のα−ヘリックスＢＨ３ドメインを含むものである。例示的なＢＩＤ  ＢＨ３ドメインペプチドとしては、配列：
【００４８】
【化４】
2014139245.tif 000006
（式中、Ｘ１および／またはＸ４は、Ｇ、Ｄ、Ｅ、Ｓ、Ｔ、Ｙまたはそのリン酸化模倣物であり、Ｘ２またはＸ３は、任意の天然または非天然アミノ酸である）
を含むものである。好ましい実施形態において、Ｘ２とＸ３はともにＳ５である。Ｘ２とＸ３がともにＳ５である場合、Ｓ５アミノ酸が反応して全炭化水素架橋体が形成され得る。好ましくは、Ｘ１アミノ酸は、リン酸基部分が模倣される正味負電荷を含むように修飾されるか、または正味負電荷がマスクされて細胞内に進入するように修飾される。例えば、Ｘ１および／またはＸ４アミノ酸は、リン酸化、スルホン化、酸素化、硝酸化もしくはフッ素化されたものである。例えば、Ｘ１は、Ｄ、Ｅ、Ｓ、Ｔ、Ｙまたはそのリン酸化模倣物である。一部のある実施形態において、Ｘ２はＱであり、およびまたはＸ３は、Ｓ、ＴまたはＹである。任意に、Ｘ３がＳ、ＴまたはＹである場合、そのアミノ酸は、リン酸化、スルホン化、酸素化、硝酸化またはフッ素化されたものである。
【００４９】
また、本発明には、他のＢＨ３ドメイン含有ペプチド由来のＢＨ３ペプチドが包含される。このようなペプチドおよびそのリン酸化模倣物は、酵素活性（例えば、キナーゼおよびホスファターゼ）ならびにタンパク質−タンパク質相互作用（例えば、ＭＣＬ−１／ＢＡＫ相互作用）を調節するのに有用であり、したがって、多くの細胞内ホメオスタシス経路の操作に関与する（図６７参照）。例示的なＢＨ３ペプチドは、以下に示す配列番号：５〜１７を含むものであった。
【００５０】
【化５】
2014139245.tif 000007
【００５１】
【化６】
2014139245.tif 000008
式中、Ｘ１は、任意の天然または非天然アミノ酸である。好ましくは、Ｘ１は、Ｅ、Ｄ  Ｓ、ＴもしくはＹまたはそのリン酸化模倣物である。
【００５２】
これらおよび他の実施形態において、ＢＨ３ペプチドにおける非天然アミノ酸（例えば、Ｓ５）は、炭化水素ホチキス留めが可能なようにＸ１の上流または下流のいずれかに存在する。非天然アミノ酸は、互いに離れた２、３、４、５、６、７、８、９または１０アミノ酸残基である。例えば、２つの非天然アミノ酸は、１つまたは互いに離れた２つのヘリックスターン（すなわち、約３．４または約７アミノ酸）である。したがって、ｉとｉ＋３；ｉとｉ＋４；またはｉとｉ＋７に存在するアミノ酸が、化学的修飾と架橋に理想的な候補である。したがって、例えば、ペプチドが配列Ｘａａ１、Ｘａａ２、Ｘａａ３、Ｘａａ４、Ｘａａ５、Ｘａａ６、Ｘａａ７、Ｘａａ８、Ｘａａ９、・・・を有する場合、Ｘａａ１とＸａａ４間、またはＸａａ１とＸａａ５間、またはＸａａ１とＸａａ８間架橋体は、Ｘａａ２とＸａａ５間、またはＸａａ２とＸａａ６間、またはＸａａ２とＸａａ９間の架橋体と同様に有用であるなどである。
【００５３】
ＢＨ３ペプチドは、Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、または両者の組合せのポリマーである。例えば、種々の実施形態において、前記ペプチドは、Ｄレトロ−インベルソ（ｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏ）ペプチドである。用語「レトロ−インベルソ異性体」は、配列の向きが逆であり、各アミノ酸残基のキラリティーが反転している線状ペプチドの異性体をいう。例えば、Ｊａｍｅｓｏｎら，Ｎａｔｕｒｅ，３６８，７４４−７４６（１９９４）；Ｂｒａｄｙら，Ｎａｔｕｒｅ，３６８，６９２−６９３（１９９４）を参照のこと。Ｄ−エナンチオマーと逆合成を組み合わせた最終結果は、各アミド結合内のカルボニル基とアミノ基の位置が交換されるが、各α炭素の側鎖基の位置は保存されるというものである。特に記載のない限り、本発明の任意の所与のＬ−アミノ酸配列は、対応する天然Ｌ−アミノ酸配列の逆配列を合成することにより、Ｄレトロ−インベルソペプチドが作製され得るものであると仮定する。
【００５４】
任意に、ＢＨ３ペプチドは、化学修飾されたアミノ酸、例えば、アミノ酸類縁体（ペニシラミン、３−メルカプト−Ｄ−バリンなど）、天然に存在する非タンパク質新生アミノ酸（例えば、ノルロイシン、β−アラニン、オルニチン、タウリンヒドロキシプロリンまたはヒドロキシリシン）、および当該技術分野で知られたアミノ酸に特徴的な性質を有する化学合成された化合物を含むものである。用語「タンパク質新生」は、アミノ酸が細胞内のタンパク質に、よく知られた代謝経路によって組み込まれ得ることを示す。さらに、ＢＨ３ペプチドは、５−炭素オレフィン性アミノ酸のＲおよびＳエナンチオマー、および８−炭素オレフィン性アミノ酸のＳエナンチオマーなどの非天然アミノ酸を含むものである。
【００５５】
また、本発明には、本明細書に記載のペプチドと生物学的または機能的に等価なペプチドが包含される。用語「生物学的に等価な」または「機能的に等価な」は、本発明の組成物が、同じグルコース刺激型インスリン分泌モジュレーション効果またはホメオスタシス経路調節の一部または全部を示す能力を有するが、必ずしもヒト、ラットまたはマウス起源のｃＤＮＡライブラリーから同定された配列から推定されるＢＨ３ドメインポリペプチド、または組換え発現症状から産生されるＢＨ３ドメインポリペプチドと同じ程度ではないことを意味するものとする。
【００５６】
また、ＢＨ３ペプチドには、ＢＨ３ペプチドの誘導体が包含され得、該誘導体は、ＢＨ３ペプチドのハイブリッド形態および修飾形態、例えば、融合タンパク質およびＢＨ３ペプチド断片、ならびにある種のアミノ酸が欠失または置換されたハイブリッド形態および修飾形態、ならびに１つ以上のアミノ酸が修飾アミノ酸または非通常アミノ酸に変更された場合などの修飾体、ならびにグリコシル化などの修飾体を包含するものとするが、前記ハイブリッドまたは修飾形態は、ＢＨ３ペプチドの生物学的活性を保持しているものとする。誘導型および刺激型という用語は、本明細書全体を通して互換的に用いる。ＢＨ３ペプチドの生物学的活性としては、生理学的ＢＡＤ活性の刺激ならびにグルコース刺激型インスリンホメオスタシスおよびＢＡＤ欠陥の他の結果の回復が挙げられる。また、生物学的活性は、その天然のリガンドに対する結合を包含する。
【００５７】
好ましいバリアントは、１つ以上の推定非必須アミノ酸残基になされた保存アミノ酸置換を有するものである。「保存アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似した側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられたものである。類似した側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野において特定されている。このようなファミリーとしては、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、無電荷極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β−分枝側鎖を有するアミノ酸（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が挙げられる。また、非天然アミノ酸が組み込まれることがあり得る。したがって、ＢＨ３ドメインポリペプチド内の推定非必須アミノ酸残基が、同じ側鎖ファミリーの別のアミノ酸残基で置き換えられる。あるいはまた、別の実施形態において、変異は、ＢＨ３コード配列の全部または一部（したがって、非必須部位および必須部位に変異を含む）とともに、飽和変異誘発などによって無作為に導入され得、得られた変異型をスクリーニングして活性を保持した変異型が同定され得る。また、実質的に相同の意味には、本明細書に記載のＢＨ３ペプチドに対する抗体との交差反応性によって単離され得るか、またはヌクレオチドコード配列（例えば、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡもしくはｃＤＮＡ）が、ゲノムヌクレオチド配列もしくはゲノムヌクレオチド部分配列の相補配列あるいは本明細書におけるＢＨ３ペプチドもしくはその断片のｃＤＮＡとのハイブリダイゼーションによって単離され得る任意のＢＨ３ペプチドが包含される。
【００５８】
誘導体、バリアントおよび類縁体は完全長、または誘導体または類縁体が修飾された核酸またはアミノ酸を含む場合は完全長以外であり得る。ＢＨ３ペプチドの誘導体または類縁体としては、例えば、前記ペプチドに実質的に相同な領域を含む分子、種々の実施形態において、同一サイズのアミノ酸配列と比較したとき、または当該技術分野で知られたコンピュータ相同性プログラムによってアラインメントを行なった場合のアラインメント配列と比較したとき少なくとも約３０％、５０％、７０％、８０％もしくは９５％、９８％またはさらに９９％同一性領域を含む分子が挙げられる。例えば、配列同一性は、配列解析ソフトウェア（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｅｎｔｅｒ，１７１０  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ａｖｅｎｕｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．５３７０５）を、そのデフォルトパラメータとともに用いて測定され得る。
【００５９】
種々の実施形態において、ＢＨ３ペプチドは、その二次構造、例えばα−ヘリックス構造を維持したものである。ヘリックスの安定化方法は当該技術分野で知られている。
【００６０】
好ましくは、ＢＨ３ペプチドは安定なペプチドである。「安定な」により、ペプチドが、製造を可能にするのに充分な安定性を有し、本明細書に詳述した目的に有用であるのに充分な期間、化合物の完全性を維持していることを意図する。例えば、ペプチドは、極性およびまたは不安定性架橋体を用いて共有結合により安定化させる（Ｐｈｅｌａｎら  １９９７  Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１９：４５５；Ｌｅｕｃら  ２００３  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １００：１１２７３；Ｂｒａｃｋｅｎら，１９９４  Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１６：６４３２；Ｙａｎら  ２００４  Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１４：１４０３）。あるいはまた、ペプチドは、メタセシス系アプローチを用いて安定化させる。前記アプローチは、アルキルテザーを含むα，α−二置換非天然アミノ酸を使用するものである（Ｓｃｈａｆｍｅｉｓｔｅｒら，２０００
Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２２：５８９１；Ｂｌａｃｋｗｅｌｌら  １９９４  Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．３７：３２８１）。好ましくは、ペプチドは、炭化水素ホチキス留めを用いて安定化させる。ホチキス留めペプチドは、その形状、したがって活性が回復されおよび／または維持されるように化学的に固定または「ホチキス留め」されたペプチドである。少なくとも２つの修飾アミノ酸を有するポリペプチドの安定な架橋（「炭化水素ホチキス留め」と称されるプロセス）により、そのポリペプチドの天然二次構造のコンホメーションの付与が補助され得る。例えば、α−ヘリックス二次構造を有する傾向にあるポリペプチド架橋により、該ポリペプチドを、その天然α−ヘリックスコンホメーションに拘束することができる。この拘束された二次構造により、タンパク質分解性切断に対するポリペプチドの抵抗性が増大され得、また疎水性が増大し得る。ホチキス留めＢＨ３ペプチドは、例えば、ＷＯ０５０４４８３９Ａ２（引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載のようにして作製される。あるいはまた、ＢＨ３ペプチドは環状ペプチドである。環状ペプチドは、当該技術分野で知られた方法によって作製される。例えば、大環状化は、多くの場合、ペプチドのＮ末端とＣ末端間、側鎖とＮ末端またはＣ末端間［例えば、Ｋ３Ｆｅ（ＣＮ）６によりｐＨ８．５で］（Ｓａｍｓｏｎら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１３７：５１８２−５１８５（１９９６））、または２つのアミノ酸側鎖間にアミド結合を形成することにより行なわれる。例えば、ＤｅＧｒａｄｏ，Ａｄｖ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍ，３９：５１−１２４（１９８８）を参照のこと。
【００６１】
あるいはまた、ＢＨ３ドメインは非天然リガンド、例えば模倣物である。例示的なＢＨ３模倣物としては、Ｇｏｓｓｙｐｏｌ、ＡＢＴ２６３およびＡＢＴ７３７が挙げられる。他のＢＨ３模倣物としては、Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  ａｎｄ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ（２００６）１３：１３３９−１３５０（その内容は、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載のものが挙げられる。ＢＨ３ドメイン模倣物は、Ｂｃｌ−２ファミリー構成員に結合し、１つ以上のＢＨ３活性誘導する能力を有する薬剤である。模倣物としては、例えば、抗体などのポリペプチド、幽霊細胞（ｃｅｌｌ  ｇｈｏｓｔ）または小分子が挙げられる。小分子としては、限定されないが、ペプチド、ペプチド模倣物（例えば、ペプトイド）、アミノ酸、アミノ酸類縁体、ペプチド核酸、ペプチド−核酸コンジュゲート、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド類縁体、ヌクレオチド、ヌクレオチド類縁体、約５，０００グラム／モル未満の分子量を有する有機および無機化合物（ヘテロ有機（ｈｅｔｅｒｏｒｇａｎｉｃ）および有機金属化合物など）、約２，０００グラム／モル未満の分子量を有する有機または無機化合物、約１，０００グラム／モル未満の分子量を有する有機または無機化合物、約５００グラム／モル未満の分子量を有する有機または無機化合物、ならびにかかる化合物の塩、エステルおよび他の薬学的に許容され得る形態が挙げられる。
【００６２】
ＢＨ３ペプチドまたはその模倣物は、キメラ種が形成されるように、非ＢＨ３ペプチドに作動可能に（例えば、共有結合により）連結される。非ＢＨ３ペプチドは、ＢＨ３ペプチドに実質的に相同でないタンパク質に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドをいう。非ＢＨ３ペプチドにより、ＢＨ３ペプチドへの官能基の付加が可能となる。例えば、非ＢＨ３ペプチドは、トランスロケーション配列、ＧＳＴタンパク質または免疫グロブリン分子の一部分（例えば、Ｆｃ領域）、または核酸誘導体である。
【００６３】
本明細書に記載のＢＨ３ペプチドも同様に、検出可能な基、例えば、ビオチン、放射性標識（例えば、３５Ｓ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎ）、酵素標識（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ）、および蛍光標識（例えば、フルオレセイン）に、既知の手法に従ってコンジュゲートさせ得る。
【００６４】
ＢＨ３ペプチドは現行のクローニング手法を用いて容易に調製されるか、または固相方法もしくは部位特異的変異誘発によって合成され得る。ドメインＢＨ３ペプチドは、ポリペプチドのドミナントネガティブ形態を包含し得る。一実施形態において、天然ＢＨ３ペプチドは細胞または組織供給源から、標準的なタンパク質精製手法を用いて適切な精製スキームによって単離され得る。別の実施形態において、ＢＨ３ドメインポリペプチドは、組換えＤＮＡ手法によって作製される。
【００６５】
組換え発現の代替手段として、ＢＨ３ペプチドは、標準的なペプチド合成手法を用いて化学合成される。本明細書に記載の化合物の合成に有用な合成化学変換および保護基の方法論（保護および脱保護）は、当該技術分野で知られており、例えば、Ｒ．Ｌａｒｏｃｋ，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ，ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９８９）；Ｔ．Ｗ．ＧｒｅｅｎｅおよびＰ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，第２版，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（１９９１）；Ｌ．ＦｉｅｓｅｒおよびＭ．Ｆｉｅｓｅｒ，Ｆｉｅｓｅｒ  ａｎｄ  Ｆｉｅｓｅｒ’ｓ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（１９９４）；ならびにＬ．Ｐａｑｕｅｔｔｅ編，Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（１９９５）およびその後続版などに記載のものが挙げられる。本発明のペプチドは、当業者にはよく知られている化学合成法によって作製され得る。例えば、Ｆｉｅｌｄｓら，Ｃｈａｐｔｅｒ  ３  ｉｎ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａ  Ｕｓｅｒ’ｓ  Ｇｕｉｄｅ，編集Ｇｒａｎｔ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆
Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．，１９９２、ｐ．７７参照。したがって、ペプチドは、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ  Ｍｏｄｅｌ  ４３０Ａ  ｏｒ  ４３１の側鎖保護アミノ酸を使用し、ｔ−ＢｏｃまたはＦ−ｍｏｃのいずれかの化学反応によって保護されたα−ＮＨ２を用いた固相合成の自動メリフィールド手法を用いて合成され得る。
【００６６】
本明細書に記載のペプチドの作製様式の一例は、固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）の使用である。Ｃ末端アミノ酸を架橋ポリスチレン樹脂に、リンカー分子との酸不安定性結合によって結合させる。この樹脂は、合成に使用される溶媒に不溶性であり、過剰な試薬および副生成物を比較的簡単かつ高速で洗い流すことができる。Ｎ末端は、酸に安定であるが塩基によって除去可能なＦｍｏｃ基で保護する。任意の側鎖官能基が、塩基安定性で酸不安定性の基で保護される。長鎖ペプチドは、個々の合成ペプチドを共連結することにより天然の化学的ライゲーションにより作製され得る。あるいはまた、長鎖の合成ペプチドは、よく知られた組換えＤＮＡ手法によって合成され得る。かかる手法は、よく知られた標準的なマニュアルに詳細なプロトコルとともに示されている。本発明のペプチドをコードする遺伝子を構築するため、アミノ酸配列を逆翻訳させて、該アミノ酸配列をコードし、好ましくは遺伝子を発現させる生物体に最適なコドンを有する核酸配列を得る。次に、典型的には、ペプチドおよび必要であれば任意の調節エレメントをコードするオリゴヌクレオチドを合成することにより合成遺伝子を作製する。この合成遺伝子を適当なクローニングベクター内に挿入し、宿主細胞内にトランスフェクトする。次いで、選択した発現系および宿主に適切な適当な条件下でペプチドを発現させる。このペプチドを、標準的な方法によって精製およびキャラクタライズする。
【００６７】
ペプチドは、例えば、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｈｅｍｔｅｃｈから入手可能なハイスループット多チャネルコンビナトリアル合成装置を使用し、ハイスループットコンビナトリアル様式でも作製することもできる。
【００６８】
「単離された」または「精製された」タンパク質またはその生物学的に活性な部分は、細胞性物質またはＢＨ３ペプチドが由来する細胞もしくは組織供給源由来の他の混入タンパク質を実質的に含まないもの、あるいは、化学合成した場合は化学的前駆物質または他の化学物質を実質的に含まないものである。文言「細胞性物質を実質的に含まないもの」は、タンパク質が、単離された細胞または組換え産生された細胞の細胞成分から分離されたＢＨ３ペプチド調製物を包含する。一実施形態において、文言「細胞性物質を実質的に含まないもの」は、約３０％（乾燥重量）未満の非ＢＨ３ペプチド（本明細書において、「混入タンパク質」とも称する）、より好ましくは約２０％未満の非ＢＨ３ペプチドおよび／または非形質導入ドメインペプチド、さらにより好ましくは約１０％未満の非ＢＨ３ペプチド、最も好ましくは約５％未満の非ＢＨ３ペプチドおよび／または非形質導入ドメインペプチドを有するＢＨ３ペプチド調製物を包含する。ＢＨ３ペプチドまたはその生物学的に活性な部分は、組換え産生されたものであり、また、好ましくは培養培地を実質的に含まないもの、すなわち、培養培地がタンパク質調製物の容積の約２０％未満、より好ましくは約１０％未満、最も好ましくは約５％未満のものである。
【００６９】
文言「化学的前駆物質または他の化学物質を実質的に含まないもの」は、タンパク質が、その合成に関与した化学的前駆物質または他の化学物質から分離されたＢＨ３ペプチド調製物を包含する。一実施形態において、文言「化学的前駆物質または他の化学物質を実質的に含まないもの」は、約３０％（乾燥重量）未満の化学的前駆物質または非ＢＨ３ペプチドおよび／または非形質導入ドメインペプチド化学物質、より好ましくは約２０％未満の化学的前駆物質または非ＢＨ３ペプチドおよび／または非形質導入ドメインペプチド化学物質、さらにより好ましくは約１０％未満の化学的前駆物質または非ＢＨ３ペプチド化学物質、最も好ましくは約５％未満の化学的前駆物質または非ＢＨ３ペプチドおよび／または非形質導入ドメインペプチド化合物を有するＢＨ３ペプチド調製物を包含する。
【００７０】
治療方法
本発明は、異常な（例えば、不充分もしくは過剰な）グルコース代謝または外因性もしくは内因性アポトーシス経路異常と関連している障害のリスクがある（もしくは易罹患性である）か、または障害を有する対象を処置する予防方法と治療方法の両方を提供する。本明細書で用いる場合、用語「処置」は、疾患、疾患の症状または疾患に対する素因の治療、治癒、軽減、緩和、改変、救済、改善、向上または影響を目的とした、疾患、疾患の症状または疾患に対する素因を有する患者への治療用薬剤の適用もしくは投与、または患者から単離された組織もしくは細胞株への治療用薬剤の適用もしくは投与と定義する。
【００７１】
インスリン分泌は、組織（例えば、膵臓組織）または細胞（例えば、β細胞）をＢＡＤ
ＢＨ３ペプチドまたは模倣物に曝露（例えば、接触）させることにより誘導される。誘導するとは、ＢＡＤ  ＢＨ３ペプチドまたは模倣物と接触させていない組織または細胞と比較したときのインスリン産生の増大を意味する。組織または細胞は、ＢＡＤ  ＢＨ３ペプチドまたは模倣物と直接接触させる。あるいはまた、ＢＡＤ  ＢＨ３ペプチドまたは模倣物は、全身投与される。ＢＡＤ  ＢＨ３ペプチドまたは模倣物は、グルコキナーゼ活性の増大（例えば、活性化）、細胞内Ｃａ２＋濃度の増大、または血中グルコースレベルの低下に充分な量で投与される。インスリン分泌は、当該技術分野で知られた、例えば、インスリン特異的ＥＬＩＳＡアッセイなどによって測定される。あるいはまた、インスリン分泌は、血中グルコースレベルを測定することにより評価される。ベースライン（例えば、正常）グルコースレベルに戻ることもまた、インスリン分泌の増大を示す。
【００７２】
β細胞の生存は、β島細胞をＢＡＤ  ＢＨ３ペプチドまたは模倣物に曝露することにより増大される。生存の増大は、ＢＡＤ  ＢＨ３ペプチドまたは模倣物と接触させていない細胞と比較したときの細胞死の減少を意味する。細胞死は、トリパンブルー排除などの当該技術分野で知られた方法によって測定される。細胞は、ＢＡＤ  ＢＨ３ペプチドまたは模倣物と直接接触させる。あるいはまた、ＢＡＤ  ＢＨ３ペプチドまたは模倣物は、全身投与される。細胞はＢＡＤ  ＢＨ３ペプチドまたは模倣物と、対象への細胞移植前、移植中または移植後に接触させる。
【００７３】
前記方法は、糖尿病またはインスリン抵抗性の処置、その症状の軽減またはその発症の遅延に有用である。糖尿病は、Ｉ型糖尿病またはＩＩ型糖尿病を含む。Ｉ型糖尿病あるいはインスリン依存性糖尿病は、膵臓のβ細胞の緩徐な崩壊により、膵臓がインスリンを生成できなくなることによって引き起こされる。ＩＩ型糖尿病あるいはインスリン非依存性糖尿病は、インスリン分泌欠陥とインスリンに対する応答欠陥（多くの場合、インスリン感受性の低下と称される）の組合せによるものである。若年発症成人型糖尿病（ＭＯＤＹ）は、ＩＩ型糖尿病の遺伝型形態である。
【００７４】
インスリン抵抗性（例えば、糖尿病予備軍）は、通常の量のインスリンが、脂肪細胞、筋肉細胞および肝臓細胞からの正常なインスリン応答をもたらすのに不充分な状態である。脂肪細胞におけるインスリン抵抗性は、貯蔵トリグリセリドの加水分解をもたらし、これにより血漿中の遊離脂肪酸が上昇する。筋肉におけるインスリン抵抗性はグルコース取込みを低下させ、一方、肝臓におけるインスリン抵抗性はグルコース貯蔵を低下させ、ともに、血中グルコースの上昇という影響を及ぼす。インスリン抵抗性による高血漿インスリンおよびグルコースレベルは、多くの場合、メタボリックシンドロームおよび２型糖尿病をもたらす。
【００７５】
対象は、糖尿病、心臓血管疾患、高血圧、肥満、糖尿病性網膜症または糖尿病性ニューロパシーに罹患しているか、またはその発症リスクがある対象である。糖尿病、糖尿病性網膜症、糖尿病性ニューロパシー、心臓血管疾患、高血圧または肥満に罹患しているか、またはその発症リスクがある対象は、当該技術分野で知られた方法によって特定される。例えば、糖尿病は、例えば、空腹時の血中グルコースレベルもしくはインスリンを測定することによって、または耐糖能試験によって診断される。成人の正常グルコースレベルは６０〜１２６ｍｇ／ｄｌである。正常インスリンレベルは７ｍＵ／ｍＬ±３ｍＵである。高血圧は、１４０／９０以上の一貫した血圧によって診断される。心臓血管疾患は、コレステロールレベルを測定することにより診断される。例えば、１３７より高いＬＤＬコレステロールまたは２００より高い総コレステロールは、心臓血管疾患の指標となる。肥満は、例えばボディマス指数によって診断される。ボディマス指数（ＢＭＩ）は、（ｋｇ／ｍ２（またはｌｂ／ｉｎ２×７０４．５））で測定される。あるいはまた、腹囲（脂肪分布の推定）、ウエスト・ヒップ比（脂肪分布の推定）、皮下脂肪厚（いくつかの部位で測定する場合、脂肪分布の推定）、またはバイオインピーダンス（低脂肪塊は体脂肪塊よりも電流をよく通すという原理に基づく（すなわち、体脂肪塊が電流を妨げる）、脂肪％の推定）が測定される。正常、太りすぎ、または肥満の個体のパラメータは、以下のとおりである。低体重：ＢＭＩ＜１８．５；正常：ＢＭＩが１８．５〜２４．９；太りすぎ：ＢＭＩ＝２５〜２９．９。太りすぎの個体は、腹囲が男性で＞９４ｃｍまたは女性で＞８０ｃｍおよびウエスト・ヒップ比が男性で≧０．９５および女性で≧０．８０を有する個体と特性評価する。肥満の個体は、ＢＭＩが３０〜３４．９であり、身長に対する「正常」体重の２０％超であり、体脂肪率が女性で＞３０％および男性で２５％を有し、腹囲が男性で＞１０２ｃｍ（４０インチ）または女性で８８ｃｍ（３５インチ）を有する個体と特性評価する。重症または病的な肥満の個体は、≧３５のＢＭＩを有する個体と特性評価する。
【００７６】
本明細書に記載の方法により、糖尿病、インスリン抵抗性、糖尿病と関連する障害または異常なグルコース代謝と関連する障害の１つ以上の症状の重症度の低下または軽減がもたらされる。糖尿病の症状としては、例えば、空腹時血中グルコースレベルの上昇、１４０／９０ｍｍ／Ｈｇ以上の血圧；異常な血中脂肪レベル、例えば、３５ｍｇ／ｄＬ以下の高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）または２５０ｍｇ／ｄＬ以上の高いトリグリセリド（ｍｇ／ｄＬ＝グルコースミリグラム／血液デシリットル）などが挙げられる。処置の有効性は、糖尿病、インスリン抵抗性または糖尿病と関連する障害の診断または処置のための任意の既知の方法と関連させて判定される。糖尿病、インスリン抵抗性または糖尿病と関連する障害の１つ以上の症状の軽減とは、前記化合物が臨床的有益性を賦与することを示す。糖尿病と関連する障害としては、例えば、腎不全、失明、ニューロパシー、および冠動脈疾患が挙げられる。糖尿病、インスリン抵抗性または糖尿病と関連する障害は、典型的には、医師が標準的な方法論を用いて診断およびモニターする。例えば、糖尿病は、空腹時血漿グルコース試験または経口グルコース試験によって診断される。９９ｍｇ／ｄＬより低い空腹時グルコースレベルは正常である。１００〜１２５ｍｇ／ｄＬの空腹時グルコースレベルは糖尿病予備軍を示す。１２６ｍｇ／ｄＬ以上のグルコースレベルは糖尿病を示す。
【００７７】
ＢＡＤ  ＢＨ３ペプチドまたは模倣物は、抗糖尿病性化合物とともに投与される。抗糖尿病性化合物の例としては、限定されないが、インスリン、スルホニル尿素薬、メグリチニド、ビグアナイド、α−グルコシダーゼ阻害薬、チアゾリジンジオンまたはＧＫ活性化因子化合物（ＧＫＡ）が挙げられる。例示的なＧＫＡ化合物としては、Ｒｏｃｈｅ社の化合物ＲＯ−２８−１６７５、Ｌｉｌｌｙ社の化合物ＬＹ２１２１２６０ならびにａｓｔｒａＺｅｎｅｃａ社の化合物ＧＫＡ１および２（Ｇｒｉｍｓｂｙら  Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００３）３０１：３７０−３７３．ＭｃＫｅｒｒｅｃｈｅｒら  Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ａｎ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｌｅｔｔｅｒｓ（２００５）２１０３−２１０６；およびＢｒｏｃｋｌｅｈｕｒｓｔら  Ｄｉａｂｅｔｅｓ（２００４）５３：５３５−５４１（これらは各々、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照のこと）が挙げられる。
【００７８】
腫瘍増殖または細胞増殖は、腫瘍細胞をＢＨ３ペプチドまたは模倣物と接触させることにより、調節、増大または低減される。例えば、腫瘍細胞内でのグルコース利用を阻害することにより、細胞増殖が低減される。あるいはまた、腫瘍内でのグルコース利用を増大させることにより、細胞増殖が増大する。腫瘍増殖の増大および低減はともに、治療上の有益性を有する。腫瘍増殖の低減により腫瘍の進行が遅滞され、一方、腫瘍増殖の増大により、腫瘍を化学療法剤または放射線などの治療用薬剤に対してより感受性とし得る。あるいはまた、腫瘍増殖のモジュレーションは、ホメオスタシス経路とアポトーシス促進性経路間でのＢＨ３機能の切り替えによって行なわれ得、それにより癌の細胞死が再活性化される。
【００７９】
細胞内ホメオスタシス経路は、細胞をＢＨ３ペプチドまたはその模倣物と接触させることにより調節される。例えば、細胞の細胞周期の進行が、ＢＩＤ  ＮＨ３ペプチド、その模倣物またはリン酸化模倣物の投与によって調節され得る。
【００８０】
細胞は、肝臓細胞または脳細胞などの任意の細胞である。
【００８１】
対象は、例えば、任意の哺乳動物、例えば、ヒト、霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタであり得る。
【００８２】
治療的投与
本発明の化合物、例えば、ＢＨ３ペプチドまたは模倣物（本明細書では、「活性化合物」とも称する）ならびにその誘導体、断片、類縁体およびホモログは、投与に適した医薬組成物に組み込まれ得る。かかる組成物は、典型的には、ペプチドまたは模倣物と、薬学的に許容され得る担体とを含む。本明細書で用いる場合、「薬学的に許容され得る担体」は、医薬の投与に適合性のある任意のあらゆる溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤ならびに吸収遅延剤などを包含するものとする。好適な担体は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓの最新版、当該技術分野の標準的な参考教科書（引用により本明細書に組み込まれる）に記載されている。かかる担体または希釈剤の好ましい例としては、限定されないが、水、生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、および５％ヒト血清アルブミンが挙げられる。リポソームおよび非水性ビヒクル（固定油など）もまた使用され得る。医薬として活性な物質のためのかかる媒体および薬剤の使用は、当該技術分野でよく知られている。活性化合物と非適合性である場合を除き、組成物において任意の慣用的な媒体または薬剤の使用が想定される。補助活性化合物もまた、組成物に組み込まれることがあり得る。
【００８３】
本発明の医薬組成物は、その意図される投与経路と適合性となるように製剤化される。投与経路の例としては、非経口、例えば、静脈内、皮内、皮下、経口（例えば、吸入）、経皮（局所）、経粘膜、および直腸投与が挙げられる。非経口、皮内または皮下適用に使用される液剤または懸濁剤としては、以下の成分：滅菌希釈剤、例えば、注射用水、生理食塩水溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒；抗菌性の薬剤、例えば、ベンジルアルコールまたはメチルパラベン；抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウム；キレート化剤、例えば、エチレンジアミン四酢酸；緩衝剤、例えば、酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩、および張度調整用の薬剤、例えば、塩化ナトリウムまたはデキストロースが挙げられ得る。ｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基で調整され得る。非経口調製物は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジまたは反復用量バイアル内に封入され得る。
【００８４】
注射用用途に適した医薬組成物としては、滅菌された水性液剤（水溶性の場合）または分散剤、および滅菌された注射用液剤または分散剤の即時調製用の滅菌された粉末剤が挙げられる。静脈内投与では、好適な担体として、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬＴＭ（ＢＡＳＦ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，Ｎ．Ｊ．）またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。すべての場合において、前記組成物は、滅菌されたものでなければならず、易注射針通過性（ｓｙｒｉｎｇｅａｂｉｌｉｔｙ）が存在する程度に流動性であるのがよい。前記組成物は、製造および保存の条件下で安定なものでなければならず、細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して保護されたものでなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液状ポリエチレングリコールなど）、ならびにその適当な混合物を含有する溶媒または分散媒体であり得る。適正な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散剤の場合は必要とされる粒径の維持によって、および界面活性剤の使用によって維持され得る。微生物の作用の抑制は、種々の抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって得られ得る。多くの場合、等張剤、例えば、糖類、多価アルコール（マンニトール、ソルビトールなど）、塩化ナトリウムを組成物中に含めることが好ましい。注射用組成物の持続性吸収は、組成物中に、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含めることによりもたらされ得る。
【００８５】
滅菌された注射用液剤は、活性化合物（例えば、ＢＨ３ペプチドまたは模倣物）を必要量で適切な溶媒中に、必要に応じて上記の成分の１種類または組合せとともに組み込んだ後、濾過滅菌することにより調製され得る。一般的に、分散剤は、活性化合物を、基礎分散媒体と上記のものからの必要な他の成分とを含有する滅菌ビヒクル中に組み込むことにより調製される。滅菌注射用液剤の調製用の滅菌粉末剤の場合、調製方法は、事前に滅菌濾過した液剤から活性成分＋任意のさらなる所望の成分の粉末剤が得られる真空乾燥および凍結乾燥である。
【００８６】
経口用組成物には、一般的に、不活性希釈剤または可食担体が含まれる。前記組成物は、ゼラチンカプセル剤内に封入してもよく、圧縮して錠剤にしてもよい。治療的経口投与の目的には、活性化合物は、賦形剤とともに組み込まれ得、錠剤、トローチ剤、またはカプセル剤の形態で使用され得る。また、経口用組成物は、マウスウォッシュとしての使用のための流動性担体を用いて調製してもよく、この場合、流動性担体中の化合物は、経口適用され、口腔内で濯いで吐き出される（ｓｗｉｓｈ／ｅｘｐｅｃｔｏｒａｔｅ）か、または嚥下される。医薬適合性のある結合剤および／または補助物質を、組成物の一部として含めてもよい。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤などには、任意の以下の成分、または類似した性質の化合物：結合剤（微晶質セルロース、トラガカントゴムもしくはゼラチンなど）；賦形剤（デンプンもしくはラクトースなど）、崩壊剤（アルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌもしくはコーンスターチなど）；滑沢剤（ステアリン酸マグネシウムもしくはＳｔｅｒｏｔｅｓなど）；流動促進剤（コロイド状二酸化ケイ素など）；甘味剤（スクロースもしくはサッカリンなど）；またはフレーバー剤（ペパーミント、サリチル酸メチル、もしくはオレンジフレーバーなど）が含有され得る。
【００８７】
吸入による投与では、化合物は、適当な噴霧推進剤（例えば、二酸化炭素などのガス）が内包された加圧容器もしくはディスペンサー、またはネブライザーからのエーロゾルスプレー剤の形態で送達される。
【００８８】
また、全身投与は経粘膜または経皮手段によるものであり得る。経粘膜または経皮投与では、バリア層内に浸透するために適切な浸透剤が製剤中に使用される。かかる浸透剤は、当該技術分野で一般的に知られており、例えば、経粘膜投与のためには、デタージェント、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体が挙げられる。経粘膜投与は、鼻腔内スプレー剤または坐剤の使用によってなされ得る。経皮投与には、活性化合物は、当該技術分野で一般的に知られた軟膏、膏薬、ゲル剤、またはクリーム剤に製剤化される。
【００８９】
また、化合物は、坐剤（例えば、ココアバターおよび他のグリセリドなどの慣用的な坐剤基剤を使用）または直腸送達用の持続性かん腸剤の形態に調製され得る。
【００９０】
一実施形態において、活性化合物は、化合物を体内からの急速な排出から保護する担体を用いて調製される（制御放出製剤、例えば、埋入およびマイクロカプセル封入送達系など）。生分解性で生体適合性のポリマー、例えば、エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などが使用され得る。かかる製剤の調製方法は当業者には自明である。また、これらの物質は、Ａｌｚａ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＮｏｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から市販品で入手可能である。リポソーム懸濁剤（例えば、ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を有する感染細胞に標的化されるリポソーム）もまた、薬学的に許容され得る担体として使用され得る。これらは、当業者にはわかる方法、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号（引用により完全に本明細書に組み込まれる）に記載の方法に従って調製することができる。
【００９１】
経口用または非経口用組成物を、容易な投与および投薬量の均一性のために単位投薬形態に製剤化することが特に好都合である。単位投薬形態は、本明細書で用いる場合、処置対象の被検体に対する単回投薬量に適応させた物理的に独立した単位であって、各単位が、所望の治療効果がもたらされるように計算された所定量の活性化合物を、必要な医薬用担体とともに含むものをいう。本発明の単位投薬形態の仕様は、活性化合物の独自の特性および達成されるべき具体的な治療効果によって決定され、かつ直接的に依存性である。
【００９２】
医薬組成物は、容器、パック、またはディスペンサー内に含められ、投与の使用説明書を同封してもよい。
【００９３】
スクリーニングアッセイ
本発明は、グルコキナーゼの活性を調節する薬剤、または細胞周期を調節する薬剤を同定するための方法（本明細書では、「スクリーニングアッセイ」とも称する）を提供する。
【００９４】
標識された、例えば蛍光標識されたＢＨ３ペプチドまたはその断片（例えば、ＢＩＤ、ＢＡＤ、ＢＡＫ、ＢＡＸなど）を、その標的タンパク質（例えば、グルコキナーゼ）の存在下、種々の濃度の候補化合物（例えば、１ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭ、１μＭ、１０μＭ、１００μＭ、１ｍＭ、および１０ｍＭ）に曝露すると、この相互作用の分子インヒビターが同定され得る。任意に、ＢＨ３ペプチドをリン酸化する。次いで、各濃度の候補化合物の効果を解析し、グルコキナーゼ活性、細胞周期、またはインビトロＢＨ３−標的タンパク質結合活性に対する候補化合物の効果を調べる。候補化合物は、グルコースキナーゼ活性または細胞周期を、競合的または非競合的様式で調節するものであり得る。また、ＢＣＬ−２ファミリータンパク質と蛍光標識した候補化合物との直接結合アッセイを行ない、結合相互作用のＫｄを測定してもよい。また、候補化合物は、生物学的活性についてインビトロで、例えば、精製ミトコンドリアからのシトクロムｃ放出の誘発における用量応答的有効性、ミトコンドリア膜電位、またはグルコキナーゼ活性（ＮＡＤＨのグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ媒介型生成によって評価）を測定することによりスクリーニングされ得る。
【００９５】
本明細書に記載のアッセイは、個々の候補化合物で行なってもよく、複数の候補化合物で行なってもよい。アッセイが複数の候補化合物で行なわれる場合、アッセイは、候補化合物の混合物を用いて行なわれ得るか、または各反応が単一の候補化合物を有するパラレル反応にて実行され得る。試験化合物または薬剤は、当該技術分野で知られたコンビナトリアルライブラリー法における、数多くのアプローチの任意のものを用いて得られ得る。
【００９６】
一実施形態において、アッセイは生化学的アッセイであり、この場合、ホメオスタシス経路（例えば、グルコキナーゼ経路または細胞周期）内の新たな、または既知の相互作用性パートナーを精製または同定するため、炭化水素ホチキス留めポリペプチドがアフィニティ樹脂に連結され得る。別の実施形態において、炭化水素ホチキス留めタンパク質は、ホメオスタシス経路（例えば、グルコキナーゼ経路または細胞周期）内の新たな、または既知の相互作用性パートナーとの共有結合性架橋の形成を可能にする光活性化可能な部分を含むものである。
【００９７】
本発明を、以下の実施例においてさらに説明する。本実施例は、特許請求の範囲に示される本発明の範囲を制限するものではない。
【実施例】
【００９８】
実施例１．β細胞の機能におけるＢＡＤの役割
β細胞におけるＢＡＤの役割を調べるため、インスリン分泌をＢａｄ  ＋／＋およびＢａｄ  −／−マウスのコホートにおいて、高血糖クランプ解析を用いて評価した。２時間のクランプは、Ｂａｄ  ＋／＋（ｎ＝１０）およびＢａｄ  −／−（ｎ＝１２）マウスにおいて、２０％グルコースの初回刺激と可変注入によって血漿グルコース濃度を３００ｍｇ／ｄｌまで上昇させて維持して行なった（図５）。クランプ期間中の多数の時間点での血漿インスリンレベルの解析により、Ｂａｄ欠損マウスにおいて有意なインスリン分泌障害が示された（図６）。実験全体を通して（０〜１２０分）のインスリン応答の曲線下面積（ＡＵＣ）により、Ｂａｄ  −／−マウスにおいて３２％低下が示された（ｐ＜０．０５、図７）。分泌急性期（０〜３０分）および分泌後期（３０〜１２０分）は、それぞれ、３７％（ｐ＜０．０１）および３０％（ｐ＜０．０５）の低下がみとめられた（図７）。
【００９９】
このインスリン分泌欠陥が同様にインビトロでも示されるかどうかを調べるため、Ｂａｄ  −／−マウスからから精製した島を、浴液洗浄アッセイ（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  Ｂ．Ａ．ら，１９９６．Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２７１，Ｅ７０２−１０）に供した（図８）。３ｍＭのグルコースでの２５分間の予備浴液洗浄期間後、各遺伝子型の１２０例の島を、表示したとおりに３ｍＭおよび２５ｍＭのグルコースで浴液洗浄した。４０分後、浴液洗浄溶液を３０ｍＭのＫＣｌにスイッチして原形質膜を脱分極させ、全インスリン顆粒プールを放出させた。島１つあたりのＤＮＡ含有量は、Ｂａｄ  ＋／＋およびＢａｄ
−／−マウスで、それぞれ１２．４ｎｇおよび１４．６ｎｇであった。Ｂａｄ  ＋／＋およびＢａｄ  −／−は、それぞれ、放出第１期（８〜１５分）のＡＵＣが１２．５０対５．９８であり、放出第２期（１５〜４０分）では１５．０５対８．４４であった。２５ｍＭのグルコースで浴液洗浄したＢａｄ  −／−島は、分泌応答の第１期および第２期の両方において、有意に低いレベルのインスリンを分泌した。しかしながら、ＫＣｌによって放出させたインスリンの全プールは変化がなかった（図８）。インスリン放出の規模は小さいが、Ｂａｄ  −／−島における分泌の振動パターンは対照島と同等であった（データ示さず）。この結果は、Ｂａｄ欠損により、β細胞がグルコースに応答してインスリンを分泌する能力が損なわれることを示し、これが、少なくとも一部において、以前にＢａｄ  −／−マウス報告された異常な耐糖能（Ｄａｎｉａｌ  Ｎ．Ｎ．ら，２００３．Ｎａｔｕｒｅ  ４２４，９５２−６）に寄与しているかもしれない。
【０１００】
実施例２．Ｂａｄ  −／−β細胞のインスリン分泌欠陥におけるインスリン分泌経路の諸成分の役割
β細胞におけるグルコース誘導性インスリン分泌経路は、ミトコンドリアの近位事象と遠位事象の両方からなる（Ｗｉｅｄｅｒｋｅｈｒ  Ａ．およびＷｏｌｌｈｅｉｍ  Ｃ．Ｂ．，２００６．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １４７，２６４３−９）。ミトコンドリアは、グルコースおよび他の栄養分によるインスリン放出の誘導に必要とされる代謝カップリング因子をもたらす。細胞内ＡＴＰ／ＡＤＰ比の増大は、このプロセスにおける重要な代謝カップリング因子であり、原形質膜でのＡＴＰ感受性Ｋ（ＫＡＴＰ）チャネルの閉鎖をもたらし、続いて膜脱分極が起こり、電位感受性Ｃａ２＋チャネルが開放される（Ａｓｈｃｒｏｆｔ  Ｆ．Ｍ．およびＧｒｉｂｂｌｅ  Ｆ．Ｍ．，１９９９．Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ  ４２，９０３−１９；Ｒｏｒｓｍａｎ  Ｐ，１９９７．Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ  ４０，４８７−９５）。細胞内Ｃａ２＋濃度［Ｃａ２＋］ｉの上昇が、さらに、インスリン放出を刺激する。グルコースに応答した分泌欠陥と整合して、Ｂａｄ  −／−島では、ＡＴＰ／ＡＤＰ比のロバストな増大が示されず（図９）、これは、充分な代謝カップリングの欠如を示す。
【０１０１】
インスリン放出に関与しているミトコンドリアの遠位段階および近位段階がＢａｄ  −／−島においてインタクトであるかどうかを調べるため、いくつかの充分特性評価された分泌促進薬を試験した。ＫＩＣ（α−ケトイソカプロン酸）は、ＧＫによるグルコースリン酸化に非依存性のミトコンドリアのＴＣＡ回路を刺激する栄養分分泌促進薬である（Ｇａｏ  Ｚ，ら，２００３．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １４４，１９４９−５７）。Ｂａｄ  ＋／＋とＢａｄ  −／−の島を、１０ｍＭの２−ケトイソカプロン酸（ＫＩＣ）、０．２５ｍＭのトルブタミドまたは０．２５ｍＭのカルバコールの存在下または非存在下、表示した量のグルコースを含有する培地中で培養した。インスリン分泌は、静的インキュベーション法を用いて測定した。島１つあたりのインスリン含有量は、Ｂａｄ  ＋／＋およびＢａｄ  −／−で、それぞれ、１１５．１±４．６４および１１８．４９±４．０９ｎｇであった。Ｂａｄ欠損島によるＫＩＣ誘導性インスリン分泌はロバストであり、対照で見られるものと同等であった（図１０）。ミトコンドリアの遠位段階（例えば、［Ｃａ２＋］ｉ増大および分泌機構の活性化に至るもの）を、スルホニル尿素系のトルブタミドおよびムスカリン性受容体アゴニストであるカルバコールを用いて試験した。トルブタミドは、ＡＴＰ／ＡＤＰ比の変化とは無関係にＫＡＴＰチャネルに結合して閉鎖することから（Ｐｒｏｋｓ  Ｐ．ら，２００２．Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５１  Ｓｕｐｐｌ  ３，Ｓ３６８−７６）、このチャネル下流のシグナル伝達を調べることが可能である。カルバコールは、細胞内Ｃａ２＋貯蔵分のＩＰ３媒介性放出が適正に起こったかどうかを評価するために使用した。トルブタミドとカルバコールの両方に対するＢａｄ  −／−島の応答は、野生型の島と同等であった（図１０）。このインスリン分泌の薬理学的解析は、Ｂａｄ  −／−島が、その分泌応答において完全には損なわれていないことを示す。
【０１０２】
グルコースおよび他の燃料分泌促進薬がインスリン分泌を刺激する効率は、ミトコンドリア膜電位（ΔΨｍ）を過分極する能力と密接に相関している（Ａｎｔｉｎｏｚｚｉ  Ｐ．Ａ．ら，２００２．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２７７，１１７４６−５５）。β細胞では、グルコース誘導性呼吸の特徴的な特質が、ＧＫによるグルコースリン酸化のものと相関している（Ｌｉａｎｇ  Ｙ，ら，１９９６．Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２７０，Ｅ８４６−５７）。グルコース誘導性ミトコンドリア膜過分極を、Ｂａｄ  ＋／＋およびＢａｄ  −／−のβ細胞において評価した。ΔΨを計算するため、グルコースを３ｍＭから８ｍＭに増加したとき、または３ｍＭのグルコースの存在下で１０ｍＭ  ＫＩＣの添加後に、テトラメチルローダミンエチルエステル（ＴＭＲＥ）の蛍光強度の変化を多数の個々の細胞において解析した（Ｈｅａｒｔ  Ｅ．ら，２００６．Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ  ２９０，Ｅ１４３−Ｅ１４８）。分散させた島を、ミトトラッカー（ｍｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ）および電位差測定用色素ＴＭＲＥとともに共負荷した。ΔΨｍの変化を、個々のＢａｄ  ＋／＋およびＢａｄ  −／−のβ細胞から記録した（図１１）。ＴＭＲＥ蛍光強度の増大は、ミトコンドリア膜電位の過分極を反映し、呼吸の指標として使用される。ΔΨｍのグルコース誘導性変化は、Ｂａｄ  −／−β細胞において有意に低かった（図１２、Ｂａｄ  ＋／＋で６．８８±１．７１に対して、Ｂａｄ  −／−では１．８４±１．５８、ｎ＝１０）が、ＫＩＣ誘導では、ΔΨｍの変化は両方の遺伝子型で同等であった（図１２）。これらのデータは、Ｂａｄ  −／−β細胞におけるインスリン分泌欠陥に、グルコース選択的なミトコンドリア近位成分が関与していることを示す。
【０１０３】
実施例３．ＧＫ活性およびβ細胞によるグルコース感知に対するＢＡＤの効果
Ｂａｄ  −／−β細胞における欠陥のグルコース選択的側面によって、この細胞内のＧＫの精密な検査が促された。本発明者らは、以前に、ＢＡＤが、ミトコンドリアの肝細胞ＧＫアイソフォームと会合していること、およびＢａｄヌル肝細胞が、ミトコンドリアテザー型ＧＫ活性とグルコース誘導性呼吸の鈍化を示すことを報告した（Ｄａｎｉａｌ  Ｎ．Ｎ．ら，２００３．Ｎａｔｕｒｅ  ４２４，９５２−６）。肝細胞ＧＫアイソフォームとβ細胞ＧＫアイソフォームは相違して調節されるため、酵素のβ細胞アイソフォームに対するＢＡＤの潜在的調節効果を評価することが正当であった。グルコキナーゼがβ細胞内のＢＡＤと会合する能力を調べるため、抗ＧＫ抗体（レーン１〜３）または対照ウサギＩｇＧ（レーン４〜６）を、ＡｍｉｎｏＬｉｎｋ  Ｐｌｕｓ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇゲル（Ｐｉｅｒｃｅ）に製造業者の使用説明書のとおりに共有結合させ、ＭＩＮ６  β細胞から調製したＣＨＡＰＳ可溶化型ミトコンドリア富化重膜（ＨＭ）画分とともにインキュベートした（図３１）。結合物質を逐次溶出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離し、抗グルコキナーゼまたは抗ＢＡＤ  抗体を用いてイムノブロット（ＷＢ）を行なった。同様に、図３２は、ＭＩＮ６  β細胞から単離したミトコンドリア内のＰＰ１相互作用性タンパク質のミクロシスチンアフィニティ精製の結果を示す。ミトコンドリア富化ＨＭ画分を、１５ｍＭのＣＨＡＰＳ中で可溶化し、ミクロシスチン（ＭＣ）カップリング型アガロースビーズとともにインキュベートした（Ｄａｎｉａｌ  Ｎ．Ｎ．ら，２００３．Ｎａｔｕｒｅ  ４２４，９５２−６）。結合タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、表示した抗体を用いてイムノブロット（ＷＢ）を行なった。β細胞ＧＫアイソフォームはＢＡＤとミトコンドリアで、肝細胞に見られるものと同様の複合体にて会合している（Ｄａｎｉａｌ  Ｎ．Ｎ．ら，２００３．Ｎａｔｕｒｅ  ４２４，９５２−６）。
【０１０４】
図１３は、Ｂａｄ  ＋／＋およびＢａｄ  −／−マウスから単離された一次島のホモジネートにおけるグルコキナーゼ活性を示す。グルコキナーゼ活性は、１００ｍＭのグルコースと０．５ｍＭのグルコースでのグルコースリン酸化活性の差として測定した。グルコースリン酸化活性は、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ誘導型反応におけるＮＡＤＨ蛍光の増大として測定した（Ｔｒｕｓ  Ｍ．Ｄ．ら，１９８１．Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ３０，９１１−２２）。一次Ｂａｄ  −／−島から調製したホモジネートに関するＧＫアッセイでは、対照島と比べて酵素活性の低下が示された（図１３）。ＧＫ活性の鈍化と関連しているβ細胞の機能不全の特徴的な形跡は、グルコース感知の低下であり、これは、インスリン分泌のグルコース用量応答の右方向へのシフトからわかる（Ｂｙｒｎｅ  Ｍ．Ｍ．ら，１９９４．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ９３，１１２０−３０）。Ｂａｄヌルβ細胞の分泌欠陥におけるＧＫ活性の鈍化有意性をさらに示すため、膵島を、漸増濃度のグルコースで浴液洗浄した（図１４）。各遺伝子型の１２０例の島を図８の場合のようにして浴液洗浄し、インスリン放出の最初のピークに相当する画分を収集してインスリンを測定した後、次のグルコース用量に切り替えた。Ｂａｄヌル島は、対照島によるインスリン分泌と同じ規模を放出するのに、より多くのグルコースを必要とした。例えば、２５および３５ｍＭのグルコースでＢａｄ  −／−島によって放出されたインスリンの量は、それぞれ、１５および２０ｍＭのグルコースでＢａｄ  ＋／＋島によって放出された量と同等であった（図１４）。対照島は、１０から１５ｍＭで最大誘導倍数のインスリン放出を示した後、さらにグルコースを２５ｍＭグルコースまで増大させると、小さいが有意な増大が示された。これらの同じグルコース濃度でのインスリン放出の増大は、Ｂａｄ  −／−島では有意に鈍化していた（図１４）。この結果は、Ｂａｄヌル島におけるＧＫおよびグルコース感知の異常と整合する。
【０１０５】
実施例４．インスリン分泌におけるＢＡＤ  ＢＨ３ドメインの役割
Ｂａｄ  −／−島の分泌欠陥が、β細胞内でのＢＡＤの機能と直接関係しているのか、またはＢａｄ  −／−マウスにおける他の変化に副次的であるのかどうかを調べるための厳密な試験として、ＢＡＤ発現を、精製Ｂａｄ  −／−島においてアデノウイルスを用いて回復させた。インスリン放出は、図１０の場合のようにしてアッセイした。遺伝子修正の前に、Ｂａｄ  −／−島は、グルコース濃度の漸増に伴うインスリン放出の段階的増大を示さなかった（図１５、Ｂａｄ  −／−と対照ＧＦＰウイルスに感染させたＢａｄ  ＋／＋）。これらの島にＢＡＤを再導入すると、欠陥が充分補正され、グルコース濃度の漸増に伴ってロバストな用量応答的分泌挙動が得られた（ｐ＜０．００１、図１５、Ｂａｄ
−／−：ＧＦＰ−ＢＡＤ、１２．５ｍＭ対５．５ｍＭで放出、ならびに２５ｍＭ対１２．５ｍＭのグルコースでｐ＜０．０１）。島１つあたりのインスリン含有量は、Ｂａｄ  ＋／＋およびＢａｄ  −／−で、それぞれ、１２２．７５±１２．３４および１２７．１３±５．０９ｎｇであった。これらのデータは、β細胞内のＢＡＤ減損によってインスリン分泌欠陥がもたらされるという結論と整合する。
【０１０６】
ＢＡＤ変異型では、ＢＡＤの新規な機能の分子的要件のさらに詳細な分析が可能であった。最も充分に確立されたＢＡＤの生化学的性質は、抗アポトーシス性パートナーに対する高い親和性結合であるため、インスリン分泌に対するＢＡＤの効果がＢＣＬ−２／ＸＬに対する結合によって媒介されているのかどうかを詳細に調べることが正当であった。ＢＡＤのＢＨ３ドメインは、ＢＣＬ−２／ＸＬの疎水性ポケットに結合し、それによりその抗アポトーシス活性を中和する両親媒性のα−ヘリックスである（Ｚｈａ  Ｊ．ら，１９９７．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７２，２４１０１−４；Ｋｅｌｅｋａｒ  Ａ．ら，１９９７．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １７，７０４０−６；Ｐｅｔｒｏｓ  Ａ．Ｍ．ら，２０００．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ  ９，２５２８−３４）。ＢＨ３ドメインのロイシン１５１（マウスＢＡＤＬ計数）は、重要なＢＣＬ−２／ＸＬ結合部であり、そのため、Ｌ→Ａ変異によってＢＡＤのアポトーシス促進性活性が無効となる（Ｚｈａ  Ｊ．ら，１９９７．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７２，２４１０１−４）。野生型ＢＡＤとは異なり、Ｌ→Ａ変異型ＢＡＤを伴う遺伝子修正では、Ｂａｄ  −／−島におけるＧＳＩＳ欠陥は修正され得ず（図１５、全グルコース濃度でｐ＞０．０５、Ｂａｄ  −／−：ＧＦＰ対Ｂａｄ  −／−：ＧＦＰ−ＢＡＤ  Ｌ→Ａ）、したがって、観察された野生型ＢＡＤの効果の特異性が確認された。
【０１０７】
実施例５．ＢＡＤのリン酸化：ＢＡＤのアポトーシス機能対代謝機能の分子決定因子
ＧＳＩＳにおいてインタクトなＢＡＤ  ＢＨ３ドメインが必要とされることから、この活性がＢＣＬ−２／ＸＬ結合によって媒介されている可能性が大きくなった。この機構をさらに調べるため、３つのセリンリン酸化部位（Ｓ１１２、Ｓ１３６およびＳ１５５）がアラニンに変換されたＢＡＤ変異型（ＢＡＤ  ３ＳＡ）を使用した（Ｄａｔｔａ  Ｓ．Ｒ．ら，２００２．Ｄｅｖ  Ｃｅｌｌ  ３，６３１−４３）。ＢＡＤとＢＣＬ−２／ＸＬ間の相互作用がリン酸化によって阻害されるため（Ｚｈａ  Ｊ．ら，１９９６．Ｃｅｌｌ  ８７，６１９−２８）、ＢＡＤ  ３ＳＡは、アポトーシスの閾値を低下させる非抑制性の変異型を構成する（Ｄａｔｔａ  Ｓ．Ｒ．ら，２００２．Ｄｅｖ  Ｃｅｌｌ  ３，６３１−４３）。この変異型を担持するアデノウイルスは、遺伝子再構成アッセイで島に対して毒性であったため、リン酸化不可能型Ｂａｄ  ３ＳＡノックインマウスから単離した島を試験した。注目すべきことに、Ｂａｄ  ３ＳＡマウスは、島（データ示さず）および肝臓（Ｄａｎｉａｌ  Ｎ．Ｎ．ら，２００３．Ｎａｔｕｒｅ  ４２４，９５２−６）においてＧＫ活性の鈍化を示す。Ｂａｄ  −／−島と同様、Ｂａｄ  ３ＳＡ島は、ＧＳＩＳ障害を示した（図１６）。インスリン分泌は、上記の静的インキュベーション法を用いて評価した。島１つあたりのインスリン含有量は、Ｂａｄ  ＋／＋、Ｂａｄ  ３ＳＡおよびＢａｄ
Ｓ１５５Ａで、それぞれ、１１８．７４±３．８６、９６．４６±３．４２および１０６．５±６．２４ｎｇであった。３ＳＡ変異とＬ→Ａ変異は、インスリン分泌において類似した欠陥を共有しているが、これらは、ＢＣＬ−ＸＬとの結合に対して反対の能力を示す。この所見は、ＢＡＤのインスリン分泌を調節する能力と、生存促進性パートナーに反対作用する能力が同時分離しないことを示し、アポトーシスの調節における役割とは別のＢＡＤ  ＢＨ３ドメインの新規な機能を強調する。
【０１０８】
実施例６．インスリン放出におけるＢＡＤ模倣化合物の役割
Ｂａｄヌル島で観察されたＧＳＩＳ欠陥を修正するために、ＢＡＤ  ＢＨ３ドメイン自体が充分であるかどうかを調べるため、この領域に相当する一群の「ホチキス留め」されたペプチドで膵島を処理した。ＢＨ３生理活性を再現するＢＣＬ−２ドメイン（ＳＡＨＢ）の安定化α−へリックスの作製に最近使用された炭化水素ホチキス留めとして知られる化学的方法によって、ＢＨ３配列を修飾した（図１７〜１８および図３３）（Ｗａｌｅｎｓｋｙ  Ｌ．Ｄ．ら，２００４．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０５，１４６６−７０）。
【０１０９】
図３３は、炭化水素ホチキス留め合成ストラテジーの概略図を示す。Ｓ−Ｎ−（９−フルオレニルメチルカルバメート）−２−（４’−ペンテニル）アラニン（「Ｓ５」）の不斉合成は既報のとおりにして行なった（Ｓｃｈａｆｍｅｉｓｔｅｒ  Ｃ．ら，２０００．Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  １２２，５８９１−５８９２；Ｗｉｌｌｉａｍｓ  Ｒ．Ｍ．およびＩｍ  Ｍ．Ｎ．，１９９１．Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  １１３，９２７６−９２８６）。ＳＡＨＢ化合物は、ＢＨ３配列内の３つの天然アミノ酸にフランキングしている異なる位置（ｉ位、ｉ＋４位）の２つのアミノ酸を非天然アミノ酸で置き換えることにより作製した。ペプチド合成、オレフィンメタセシス、ＦＩＴＣ−誘導体化、逆相ＨＰＬＣ精製、および微量分析は、ＢＩＤ  ＳＡＨＢについて既報のとおりにして行なった（Ｗａｌｅｎｓｋｙ  Ｌ．Ｄ．ら，２００４．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０５，１４６６−７０）。ＢＩＤ  ＢＨ３の天然メチオニンは、イオウとルテニウム触媒型メタセシス反応との不適合性のため、ＢＩＤ  ＳＡＨＢ内のノルロイシン（ＮＬ）で置き換えた。ホチキス留め化合物の特性評価により、同等のらせん度（図３４）および細胞透過性（データ示さず）が示された。また、ＢＡＤ  ＢＨ３生理活性ペプチドの短縮化に関する耐性を評価するため（高親和性ＢＣＬ−ＸＬ結合活性の保持によって評価）、切断型ライブラリーを評価した（図１８の切断型図配列と結合等温線参照）。注目すべきことには、ＢＡＤ  ＳＡＨＢＡにより、島に対して毒性でない濃度である３μＭで、Ｂａｄ  −／−島において分泌欠陥が回復した（ＢＡＤ  ＳＡＨＢＡ処理Ｂａｄ  −／−において、ｐ＜０．００１、図１７、１２．５対５．５ｍＭでの分泌、および２５対１２．５ｍＭのグルコースでの分泌ではｐ＜０．０５）。インスリン放出の回復に対するＢＡＤ  ＳＡＨＢＡの効果は、遺伝子再構成に使用した完全長置換タンパク質で観察された規模には達しなかったが、統計学的に有意な修正が観察された。ＢＡＤ  ＳＡＨＢＡとは対照的に、ＢＩＤ  ＢＨ３の後にモデル設計された異なるＳＡＨＢでは、Ｂａｄ  −／−島における分泌欠陥は修正されず（ｐ＞０．０５、図１７、Ｂａｄ  −／−、ＤＭＳＯ対ＢＩＤ  ＳＡＨＢＡ処理Ｂａｄ  −／−）、したがって、観察されたＢＡＤ  ＳＡＨＢの効果の配列特異性が示された。ＢＡＤ  ＳＡＨＢの保存されたＬ１５１およびＤ１５６残基の変異（ＢＡＤ  ＳＡＨＢＡ（Ｌ，Ｄ→Ａ））により、インスリン放出に対する効果が無効になった（図１７、ｐ＞０．０５、Ｂａｄ  −／−ＤＭＳＯ対ＢＡＤ  ＳＡＨＢＡ（Ｌ，Ｄ→Ａ）処理Ｂａｄ  −／−）。この結果は、Ｌ→Ａ変異型を用いた遺伝子再構成試験（図１５）と整合する。重要なことには、ＧＳＩＳの回復におけるＢＡＤ  ＳＡＨＢＡの効率は、ミトコンドリア膜電位に対する効果を伴うものであった（図１９）。分散させた島を１μＭの化合物で４時間処理し、ΔΨの変化を図１２の場合のようにして測定した。１μＭの濃度において、グルコース処理を行なうと、ＢＡＤによってミトコンドリア膜電位（ΔΨｍ）の有意な過分極がもたらされたが、ＢＩＤ  ＳＡＨＢではもたらされず、一方、ΔΨｍに対するＢＩＤ  ＳＡＨＢの効果は、ＤＭＳＯ処理β細胞と統計学的��識別不可能であった。
【０１１０】
この所見は、ＢＡＤ  ＢＨ３ドメインが、Ｂａｄ  −／−β細胞においてインスリン分泌欠陥を回復させるのに充分であることを示し、さらに、ＢＡＤ  ＳＡＨＢ化合物の投与によってＢａｄ  −／−マウスにおける耐糖能が改善されることが予測される。実際、パイロット実験では、腹腔内グルコース刺激の６０分後、ＢＡＤ  ＳＡＨＢＡを注射したＢａｄ  −／−マウスの血中グルコースレベルは、ビヒクル注射したＢａｄ  −／−マウスの６６％となったことが示された。
【０１１１】
実施例７．インスリン放出におけるＢＡＤリン酸化模倣化合物の役割
インスリン放出の調節におけるＢＩＤ  ＢＨ３配列と比べたＢＡＤ  ＢＨ３ドメインの特異性により、全ＢＣＬ−２ファミリー構成員のＢＨ３ドメインにおいて保存されているＬ１５１およびＤ１５６以外の残基もまた必要とされる可能性が大きくなった。興味深いことに、セリン１５５は、ＢＡＤ  ＢＨ３配列の識別的特徴である。構造的モデル設計により、ＢＡＤのＳｅｒ１５５は、ＢＣＬ−ＸＬの疎水性裂溝（これは、ＰＫＡによってリン酸化されると、ＢＡＤ／ＢＣＬ−ＸＬ会合体に対して相当な立体障害をもたらす）に向かうことが明らかになった（Ｄａｔｔａ  Ｓ．Ｒ．ら，２０００．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ６，４１−５１）。インスリン分泌におけるＳ１５５の役割を試験するため、このセリン残基のみがアラニンで置き換えられたノックイン遺伝子モデルを作出した（図３６〜３８）。Ｂａｄ  Ｓ１５５Ａ  β細胞は、精製された島を調べた場合のインビトロで（図１６）、および腹腔内耐糖能試験（ｉｐ−ＧＴＴ）でインスリンレベルを評価した場合のインビボで（図３９−４０）の両方において、インスリン分泌の異常を示す。
【０１１２】
この所見は、ＢＡＤ  ＢＨ３ドメイン内のリン酸化によって、インスリン放出に対するＢＡＤの調節効果が指令され得ることを示す。この仮説を試験するために、リン酸化模倣ＢＡＤ  ＳＡＨＢ化合物を作製した（ＳＡＨＢＡ（Ｓ→ＰＳ）およびＳＡＨＢＡ（Ｓ→Ｄ）、図１７〜１８および図３４）。ＳＡＨＢＡ（Ｓ→ＰＳ）は、ＢＡＤ  ＢＨ３配列の１５５位にリン酸化セリン残基を含み、一方、ＳＡＨＢＡ（Ｓ→Ｄ）は、リン酸基の負電荷を模倣することにより構成的リン酸化残基を擬態することが以前に示されたアスパラギン酸置換を含む（Ｄａｔｔａ  Ｓ．Ｒ．ら，２０００．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ６，４１−５１）。前記化合物ではともに、Ｂａｄ  −／−島におけるＧＳＩＳ欠陥が修正された（図１７）。重要なことには、これらのリン酸化模倣化合物はＢＣＬ−ＸＬに結合できないにもかかわらず、インスリン分泌が回復された（図３５）。ＦＩＴＣ−ｌａｂｅｌｅｄペプチド（５０ｎＭ）および表示した濃度（図３５）のＢＣＬ−ＸＬ  ΔＣを用いて蛍光分極結合アッセイを行なった。結合のＥＣ５０値を、Ｐｒｉｓｍ  ４．０ソフトウェア（Ｇｒａｐｈｐａｄ）を用いた用量応答曲線の非線形回帰解析によって求めた。これらの観察結果は、Ｂａｄ  ３ＳＡおよびＳ１５５Ａノックインマウスでのデータと整合し、インスリン放出に対するＢＡＤ  ＢＨ３ドメインの効果がＢＣＬ−ＸＬ結合と同時分離しないという薬理学的確認を示す。
【０１１３】
実施例８．ＢＡＤ模倣化合物：新規なＧＫ活性因子
ＢＡＤ  ＳＡＨＢ化合物がＧＳＩＳを回復させる機構を調べるため、前記化合物のＧＫ活性化に対する効果を調べた。ＢＡＤ  ＳＡＨＢＡおよびそのリン酸化模倣類縁体は、ＭＩＮ６  β細胞株において内在ＧＫ活性を刺激するが、ＢＡＤ  ＳＡＨＢＡ（Ｌ，Ｄ→Ａ）は刺激しない（図２０）。集合的に、図１９〜２０に示されたデータは、ＢＡＤ  ＢＨ３ドメインがインスリン放出を活性化する能力が、ＧＫ活性化およびミトコンドリア膜電位のグルコース誘導性過分極に対する効果と並行していることを示す。
【０１１４】
重要なことには、ＧＫ活性化とＧＳＩＳに対するＢＡＤ  ＳＡＨＢ化合物の効果は、ＧＫに直接結合する能力と並行している（図７０〜７１）。
【０１１５】
実施例９．β細胞生存におけるＢＡＤの役割
β細胞の機能不全および高血糖に対する分泌需要への代償不能は、２型糖尿病の病態生理に有意に寄与する。アポトーシスがβ細胞の複製速度を上回ると、結果としてβ細胞塊が崩壊する。本発明者らの試験では、インスリン放出におけるＢＡＤのＢＨ３ドメインおよび分子のリン酸化状態の役割が確認された。ＢＡＤのアポトーシス機能を調節することがわかっている分子的特徴が同じであるため、本発明者らは、このＢＨ３単独タンパク質がβ細胞の生存に影響を及ぼすかどうかを調べた。
【０１１６】
グルコースに対するβ細胞の短期間曝露ではインスリン分泌が刺激されるが、高グルコース濃度下での慢性インキュベーションによってアポトーシス経路が活性化される。注目すべきことに、このような「グルコース中毒性」条件下では、Ｂａｄなどのいくつかのアポトーシス促進性遺伝子の発現が上方調節される（Ｆｅｄｅｒｉｃｉ  Ｍ．ら，２００１．Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５０，１２９０−３０１）。Ｂａｄ欠損島は、このような条件下で有意に保護された（ｐ＜０．０１  、図４１、高グルコースにおけるバイアビリティ％、Ｂａｄ  ＋／＋対Ｂａｄ  −／−）。Ｂａｄ  アデノウイルスを用いた遺伝子修正により、アポトーシスに対する感受性が回復した（図４１）。さらに、ＢＡＤリン酸化の干渉によって、グルコース中毒誘導性アポトーシスに対するＢａｄ  ３ＳＡ島の感受性の向上から明白なように、アポトーシスの閾値が低下した（図４２）。集合的に、これらのデータは、ＢＡＤがグルコース中毒誘導性細胞死に役割を果たしているという遺伝学的証拠を示す。
【０１１７】
β細胞毒であるストレプトゾトシン（ＳＴＺ）は、β細胞を特異的に枯渇させ、実験的に誘導した糖尿病の動物モデルに一般に使用されている。ＢＡＤ欠損島はＳＴＺ誘導性細胞死に抵抗性であるが、ＢＡＤ  ３ＳＡ動物から単離したものは、ＳＴＺに対する感受性の向上を示した（図４１〜４２）。ＳＴＺ誘導性β細胞崩壊におけるＢＡＤの必要性を、この化合物を単回腹腔内注射した後のＢａｄ  −／−およびＢａｄ  ＋／＋マウスのコホートを調べることにより試験した。ＳＴＺに対するＢａｄ欠損マウスの抵抗性は、島を膵臓切片で調べた場合、明白であった（図４３）。ＳＴＺはＢａｄ  ＋／＋マウスにおいて島構造の崩壊を引き起こし、これは、島内部のグルカゴン染色に伴うインスリンシグナルの有意な減少によって示された（図４３）。顕著に対照的に、Ｂａｄヌル膵臓切片では、ほぼ完全な島の保存が示された（図４３）。この結果は、第７日目でのＢａｄ  ＋／＋対Ｂａｄ  −／−β細胞におけるカスパーゼ−３活性の差と整合する（図４４）。また、アポトーシスに対するＢａｄ  −／−β細胞の抵抗性は、ＳＴＺ処理後に検出されたインスリンおよびグルコースのレベルでも明白であった。第０日目において、血中インスリンレベルは、Ｂａｄ  ＋／＋対照と比べてＢａｄ  −／−マウスにおいてほぼ１．５倍高かった。（ｐ＜０．０１、図４５）。第７日目までに、島はアポトーシスを受けたため、Ｂａｄ  ＋／＋動物におけるインスリンレベルは８６％急落したが、Ｂａｄ欠損マウスは、ホルモン中４４％減少を維持した。第７日目の血清インスリンの絶対値は、Ｂａｄ  ＋／＋マウスに対してＢａｄ  −／−において約６倍高かった（図４５、ｐ＜０．０１）。さらに、ＢＡＤ欠損マウスは、ＳＴＺの高血糖効果から保護される（図４６、第７日目、グルコースはＢａｄ  −／−で２３９．８３±５０．８６ｍｇ／ｄｌに対してＢａｄ  ＋／＋では４３４．２９±５３．３４ｍｇ／ｄｌ、ｐ＜０．０５）。したがって、Ｂａｄ欠損は、ＳＴＺ誘導性β細胞崩壊およびその結果の糖尿病表現型に対する保護をもたらす。
【０１１８】
実施例１０．ＢＡＤ：高脂肪食餌誘導型糖尿病の決定因子
β細胞は、通常、インスリン抵抗性状態下での分泌需要を満たすために代償的変化を受ける。このような順応性機構としては、β細胞の過形成と肥大をもたらすβ細胞シグナル伝達経路および遺伝子発現プログラムの変化が挙げられる。そのため、適正な順応の欠如によって糖尿病が発生する（Ｂｅｌｌ  Ｇ．Ｉ．およびＰｏｌｏｎｓｋｙ  Ｋ．Ｓ．，２００１．Ｎａｔｕｒｅ  ４１４，７８８−９１；Ｗｅｉｒ  Ｇ．Ｃ．ら，２００１．Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５０  Ｓｕｐｐｌ  １，Ｓ１５４−９；ＤｅＦｒｏｎｚｏ  Ｒ．Ａ．，１９８８．Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ３７，６６７−８７；Ａｃｃｉｌｉ  Ｄ．ら，２００１．Ｃｕｒｒ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  １，９−２３）。さらに、高グルコースおよび脂質への慢性的曝露は、最終的には、インスリン分泌障害（糖脂毒性）およびβ細胞アポトーシスに至ることがあり得る（Ｐｒｅｎｔｋｉ  Ｍ．ら，２００２．Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５１  Ｓｕｐｐｌ  ３，Ｓ４０５−１３）。
【０１１９】
上記の試験により、インスリン放出の調節におけるＢＡＤ  ＢＨ３ドメインおよびそのリン酸化誘導体の役割が確認された。興味深いことに、同じペプチド性のモチーフは、ＢＡＤのアポトーシス機能を調節することがわかっており、証拠により、ＢＡＤは、慢性高グルコース曝露またはストレプトゾトシン処理下でのβ細胞の生存における（図４１〜４６）、および新生児β細胞死における重要な歩哨であることが示されている（Ｈｅｔｔｉａｒａｃｈｃｈｉ  Ｋ．Ｄ．ら，２００６．提出済）。
【０１２０】
β細胞におけるＢＡＤの代謝機能とアポトーシス機能が、どのように糖尿病の病態生理と関連し得るのかを調べるため、インスリン抵抗性の高脂肪食餌（ＨＦＤ）関連モデルに関連するβ細胞の順応における役割を調べた。相対ＢＡＤ  ｍＲＮＡレベルは、ＨＦＤに供された野生型マウスから単離された島において有意に増大する（図２１）。この観察結果の有意性を調べるため、Ｂａｄ  ＋／＋およびＢａｄ  −／−マウスのコホートを１６週間、ＨＦＤに供した。並行コホートを対照食餌にて維持した。対照食餌では、Ｂａｄ  ＋／＋およびＢａｄ  −／−マウスの体重および非空腹時グルコースレベルは、試験全体を通して同等であった（データ示さず）。しかしながら、ＨＦ食餌では、Ｂａｄ  −／−マウスは、対照動物と同様の速度で体重が増加しているにもかかわらず（図２３）、高血糖の発生に抵抗性であった（図２２）。この抵抗性は、島面積割合の増加と関連しており、前記面積は、対照と比べてＢａｄ  −／−マウスにおいて有意に高かった（図２４〜２５）。
【０１２１】
次に、ＨＦＤ下の全β細胞面積の増加がＢＡＤおよびそのリン酸化状態に依存性であるかどうかを調べた。図４７〜５０において、各ひし形は、抗インスリン抗体で免疫染色された島を表す。縦軸は、ＭｅｔａＭｏｒｐｈソフトウェアプログラムによってトレースされた島に割り当てられたピクセル面積を表す。横軸は、島を表す。表示した各代表的な遺伝子型ペア（Ｂａｄ  ＋／＋対Ｂａｄ  −／−およびＢａｄ  ＋／＋）について、総切片面積は同程度であった。Ｂａｄ  −／−切片は、同じ総組織面積に対して有意に多くの島を含む。少なくとも３匹の動物／群の多くの切片を同様にして解析した。Ｂａｄ  −／−膵臓切片の解析により、増大は、Ｂａｄ  ＋／＋  ＨＦＤ切片と比べて島の数が多いことに由来することが明らかとなった（図４７〜４８）。これらの観察結果と並行して、血中インスリンレベルは、Ｂａｄ  ＋／＋対照と比べ、Ｂａｄ  −／−マウスにおいて高かった（ｐ＜０．０５、図２６）。したがって、Ｂａｄ  −／−β細胞は、そのＧＳＩＳの欠陥とは無関係に、好都合な順応性応答を有するようである。
【０１２２】
ＢＡＤは、β細胞の生存に影響を及ぼすことがわかっているＡＫＴおよびＳ６Ｐ７０ネットワークなどの生存シグナル伝達経路の標的である（Ｔｕｔｔｌｅ  Ｒ．Ｌ．ら  ２００１．Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ７，１１３３−７；Ｐｅｎｄｅ  Ｍ．ら，２０００．Ｎａｔｕｒｅ  ４０８，９９４−７）。ＡＫＴおよびＳ６Ｐ７０は、ともにＢＡＤをリン酸化し、そのアポトーシス促進性機能を不活化する。ＨＦＤモデルにおいてβ細胞順応におけるＢＡＤの効果がアポトーシス機能と同時分離するかどうかを評価するため、Ｂａｄ  ３ＳＡマウスとその対応する同腹子対照のパラレルコホートを、上記のようにして調べた。Ｂａｄ
−／−マウスとは異なり、Ｂａｄ  ３ＳＡ動物は、ＨＦＤ刺激に対してより感受性であり、平均して、より高い血中グルコースレベルを示した（図２７）。Ｂａｄ  ３ＳＡマウスの体重は、最初は対照コホートよりも少なかった（ｐ＜０．０５、第０週目および第１週目、図２８）が、試験中のその後の週において、なんら有意差は示されなかった。膵臓切片中の島面積の割合は、同腹子対照と比べてＢａｄ  ３ＳＡマウスにおいて有意に低く、これは、β細胞の質量順応が無効であった可能性を示す（図２９）。Ｂａｄ  ３ＳＡ切片は、有意に少ない島を含む（図４９〜５０）。これらのデータは、ＨＦＤでのＢａｄ  ３ＳＡマウスにおいて有意に低かった血中インスリンレベルの測定（図３０）と整合した。集合的に、この所見は、ＨＦＤに対して付随するβ細胞の代償と感受性が、ＢＡＤリン酸化状態によって影響されることを示す。さらに、この遺伝子モデルの共通の代謝異常にもかかわらず、ＨＦＤ刺激に対するＢａｄ  −／−とＢａｄ  ３ＳＡの応答が反対であることは、ＨＦＤに対する感受性の決定におけるＢＡＤの役割が、ＧＫに対する効果ではなくアポトーシス機能と並行することを示し、各々が重要な生理学的重要性を有するＢＡＤの二重の役割をさらに強調する。
【０１２３】
島機能の治療的操作におけるＢＣＬ−２タンパク質の役割の利用には、代謝とβ細胞の生存の両方に対する相違するファミリー構成員の影響の注意深い評価が必要である。これは、ミトコンドリア（Ｇｒｅｅｎ  Ｄ．Ｒ．およびＫｒｏｅｍｅｒ  Ｇ．，２００４．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０５，６２６−９）およびＥＲ（Ｔｈｏｍｅｎｉｕｓ  Ｍ．Ｊ．およびＤｉｓｔｅｌｈｏｒｓｔ  Ｃ．Ｗ．，２００３．Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ  １１６，４４９３−９）におけるＢＣＬ−２ファミリータンパク質の新たな役割を考慮すると、特に重要である。β細胞によるグルコース刺激型インスリン放出におけるＢＡＤの役割は、ＧＫに影響を及ぼしてグルコース誘導性呼吸を調節するその能力と整合する。ＢＡＤ  ＢＨ３ドメインは、分子のアポトーシス促進性機能に必要とされるが、インスリン分泌にも必要とされる。実際、ＢＡＤ  ＢＨ３ドメイン由来のＳＡＨＢ化合物により、インスリン分泌のＢＡＤ調節の理想的な分子プローブが示された。ＢＡＤ変異型ならびにＢＣＬ−ＸＬへの結合に欠陥がある（ＳＡＨＢＡ（Ｌ，Ｄ→Ａ，Ａ）、ＢＡＤ  ＳＡＨＢＡ（Ｓ→ＰＳ）およびＢＡＤ  ＳＡＨＢＡ（Ｓ→Ｄ））か、またはその結合が抑制され得ない（ＢＡＤ  ３ＳＡおよび１５５Ａ）かのいずれかであるペプチドを使用し、ＢＡＤ  ＢＨ３が、インスリン分泌の調節とＢＣＬ−ＸＬ結合において相違する機能性を有することが示された。この所見は、ＢＡＤの減損によってＢＣＬ−ＸＬ過剰発現が完全には表現型模写されないという観察結果と整合する。β細胞特異的ＢＣＬ−ＸＬトランスジェニックモデルでは、島生存の向上に、ミトコンドリア機能、Ｃａ２＋処理およびインスリン分泌の混乱が付随した（Ｚｈｏｕ  Ｙ．Ｐ．ら，２０００．Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ  ２７８，Ｅ３４０−５１）。Ｂｃｌ−ＸＬトランスジェニック島は、Ｃａ２＋固定化分泌促進薬（ＫＣｌおよびトルブタミド）ならびにミトコンドリア燃料（ＫＩＣなど）に応答して有意な分泌欠陥を示した（Ｚｈｏｕ  Ｙ．Ｐ．ら，２０００．Ａｍ
Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ  ２７８，Ｅ３４０−５１）。他方、Ｂａｄ  −／−島は、これらの同じ分泌促進薬すべてに対してロバストな応答を有する。したがって、β細胞生存の向上は両方の遺伝子モデルに共通しているが、島の分泌欠陥の性質は共通していない。これも、やはり、ＢＡＤとの相互作用に依存性でない細胞内生体エネルギー生成に対するＢＣＬ−ＸＬの効果によるものであり得る。
【０１２４】
ＢＡＤは、ＢＨ３単独分子が、相違するシグナル伝達経路の統合成分としての機能を果たし、アポトーシスの制御以外の生理学的プロセスを調節するという可能性の前例である。ＢＨ３ドメインを獲得することにより、これらのタンパク質は、アポトーシスを他のホメオスタシス経路に組み込むように進化したのかもしれない。グルコース誘導性ミトコンドリア呼吸を調節する能力のため、ＢＡＤは、グルコース代謝およびグルコース利用後の任意の細胞内生体エネルギー生成という結果をもたらすような特殊な位置にある。ＢＡＤ
ＢＨ３ドメインは、グルコース代謝／インスリン分泌を調節する個々のタンパク質相互作用に選択的に関与する能力を有する（図４）。この二重の能力は、ＢＨ３ドメインのリン酸化状態によって決定される。ＢＣＬ−ＸＬは、ＢＡＤがアポトーシス機構に関与する際のＢＨ３標的であるが、ＧＫの活性化を可能にするＢＨ３標的の性質には、さらなる調査が待たれる。今後の試験では、ＢＡＤ  ＳＡＨＢが、複合体内の負の調節因子を置き換えること、または活性化因子をＧＫに利用可能にすることによって機能を果たすのかどうかが評価され、これらの事象がＢＡＤ  ＢＨ３のリン酸化状態によって、どのようにして調和されるのかが調べられよう。相違する条件下で機能を果たすＢＡＤ  ＢＨ３標的の特定の特徴、およびその選択に関与する明確な代謝シグナルが特性評価されることにより、代謝とアポトーシス間のＢＡＤ依存性バイナリー決定の下地となる機構に対する重要な洞察が得られる。また、この所見は、ＢＡＤの２つの機能が、治療目的のために別々に標的化され得ることを示す。ＢＡＤリン酸化は、ＢＣＬ−ＸＬ結合とＧＳＩＳに対して反対の効果を有するため、ＧＳＩＳを助長するが、ＢＣＬ−ＸＬに結合してアポトーシスを促進することができないリン酸化ＢＡＤ  ＢＨ３模倣物は、糖尿病および島移植におけるプロトタイプ治療剤として供され得る。
【０１２５】
実施例１１：末梢インスリン抵抗性
２型糖尿病は、インスリン作用と膵β細胞機能の両方の不足から生じる。３つの組織、すなわち骨格筋、脂肪細胞および肝臓が、それぞれ、グルコース取込み、リポリシスおよび肝グルコース生成において重要な役割を有するインスリン抵抗性部位を構成している。しかしながら、インスリン抵抗性の原発部位は、活発な研究の対象となっている（Ａｃｃｉｌｉ  Ｄ．２００３．Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５３，１６３３−４２）。遺伝学的証拠により、肝臓がインスリンに応答してグルコース代謝を適正に調節できないことが、２型糖尿病におけるインスリン抵抗性の原発部位を構成することが示されている（Ｌａｕｒｏ  Ｄ．ら，１９９８．Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ２０：２９４−８；Ｂｒｕｎｉｎｇ  Ｊ．Ｃ．ら，１９９８．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ２：５５９−６９）。肝グルコース生成とグルコースの取込みおよび貯蔵とのバランスが維持できないことは、血中グルコースレベルに対して劇的な効果を有する。そのため、糖尿病の治療的制御における主な取り組みは、肝グルコース産生（ＨＧＰ）の抑制を中心としたものであった。例えば、２型糖尿病の処置に一般に使用されている抗糖尿病薬メトホルミンの顕著な特徴は、ＨＧＰに対する効果である（Ｋｉｒｐｉｃｈｎｉｋｏｖ  Ｄ．，２００２．Ａｎｎ  Ｉｎｔｅｒｎ  Ｍｅｄ  １３７：２５−３３）。
【０１２６】
肝グルコース生成とグルコースの処理／貯蔵とのバランスは、それぞれ重要な２つの酵素、すなわち、グルコースリン酸化を制御するグルコキナーゼと、グルコース−６−リン酸をグルコースに変換し戻すグルコース−６−ホスファターゼの反対の機能に大きく依存する。さらに、グルコースを利用することにより、グルコキナーゼは、ＨＧＰに関与している肝臓内の糖新生遺伝子（発現にグルコースの存在を必要とする）の転写に直接影響を及ぼす（Ｖａｕｌｏｎｔ  Ｄ．，２００１．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９８：９１１６−２１；Ｓｃｏｔｔ  Ｄ．Ｋ．，１９９８．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７３：２４１４５−５１）。遺伝子発現に対するＧＫのこの効果は、肝臓内でのグルコースセンサーとしての役割と整合する。そのため、ＧＫの小分子活性化因子は、種々のマウス糖尿病モデルにおいて、ＨＧＰの抑制に効力を有する（Ｇｒｉｍｓｂｙ  Ｊ．ら，２００３．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０１  ：３７０−３）。
【０１２７】
末梢インスリン抵抗性におけるＢＡＤの役割を示すため、インスリンに対する肝臓、筋肉および脂肪の感受性を、ＢＡＤ欠損マウスにおいて正常血糖高インスリン血症クランプ解析を用いて評価した（図５１〜５２）。この条件下で必要とされるグルコース注入速度は、筋肉、肝臓および脂肪組織におけるインスリン応答によって決定される。本発明者らは、Ｂａｄ  −／−対Ｂａｄ  ＋／＋動物において、グルコース注入速度の小さい（ただし統計学的に有意な）減少（約１７％）をみとめた（図５３）。この差は、完全に、肝グルコース生成の抑制の欠如によるものであり得る（図５４）。本発明者らは、グリコゲン合成（グルコース流出試験によって表示）（図５５）または筋肉とＷＡＴにおけるグルコース取込み（図５６および５７）に差をみとめなかった。これらのデータは、ＢＡＤが、肝臓内でのインスリンの作用の媒介に重要な役割を果たしていることを示し、これは、ＧＫ活性に対する効果と整合する。したがって、ＢＡＤ模倣化合物によるＧＫの活性化（図１８）が、肝グルコース生成の抑制および血中グルコースレベルの正常化に有効であることを示すものであり得る。
【０１２８】
さらに、血漿脂肪酸のインスリン媒介型抑制が低減され（図５８）、インスリンクランプ中、Ｂａｄ  −／−マウスにおいて高レベルの脂質が検出された（図５９）。これらのデータは、ＢＡＤ欠損マウスにおける異常な脂質プロフィールを示し、脂肪組織内でのインスリンの効果の媒介におけるＢＡＤの役割を示す。
【０１２９】
実施例１２：グルコキナーゼ関連低血糖
ＭＯＤＹ２（若年発症成人型２型糖尿病）患者から単離されたもののようなグルコキナーゼの変異の不活化は、グルコース感知の低下および肝グルコース生成の抑制に対するインスリン効果の低下を特徴とする代謝障害と関連しているが、グルコキナーゼの変異の活性化は、先天性高インスリン血症  と関連しており（Ｂｙｒｎｅ  Ｍ．Ｍ．ら，１９９４．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ９３，１１２０−３０；Ｃｌｅｍｅｎｔ  Ｋ．，１９９６．Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉｃａ  ３９：８２−９０）、これは、新生児高インスリン血性低血糖症の臨床障害の亜型である（Ｇｌａｓｅｒ  Ｂ．，１９９８．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ
Ｍｅｄ  ３３８：２２６−３０；Ｃｈｒｉｓｔｅｓｅｎ  Ｈ．Ｂ．Ｔ．，２０００．Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５１：１２４０−６）。
【０１３０】
ＢＡＤリン酸化の抑制により、グルコキナーゼ活性が減衰される（Ｄａｎｉａｌ  Ｎ．Ｎ．ら，２００３．Ｎａｔｕｒｅ  ４２４，９５２−６）。セリン１５５からアラニンへの変異を模倣するＢＡＤ  ＳＡＨＢ化合物の誘導体（図１８）（前記変異によって、このアミノ酸残基がリン酸化不可能となっている）は、この疾患状況におけるグルコキナーゼ抑制の重要な治療ツールであることが示されるかもしれない。この修飾とＢＡＤ  ＢＨ３ドメイン内のＬ１５１とＤ１５６の変異との組合せにより、アポトーシスとインスリン分泌を活性化する能力がブロックされ、この疾患状況の標的細胞においてアポトーシスを誘導することなくＧＫ活性化を抑制し得るＢＡＤ模倣化合物の基礎部分として供され得る。
【０１３１】
実施例１３：脳内におけるグルコース感知
グルコース感知ニューロンは、主に視床下部と髄質に見られる特別なニューロンであり（Ｙａｎｇ  Ｘ．，１９９９．Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ４８：１７６３−７２；Ｄｕｎｎ−Ｍａｙｎｅｌｌ  Ａ．Ａ．，２００２．Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５１  ：２０５６−６５）、他のニューロンとは異なり、自身の活性を調節するためのシグナル伝達分子としてグルコースを利用する。グルコース感知ニューロンは、ＧＫを伴う膵β細胞と非常に類似した様式で機能し、グルコース誘導型ニューロン活性のゲートキーパーとしての機能を果たす。さらに、刺激カップリング型分泌のβ細胞経路と同様、ＡＴＰ生成は、ＫＡＴＰチャネルを不活化させ、その結果Ｃａ２＋流入、続いて活動電位の伝播を促進することによりグルコース代謝をニューロン活性に連結させる主な代謝因子である（Ｌｅｖｉｎ  Ｂ．，２００６．Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｂｅｈａｖ近刊）。このニューロン活性が、さらに、エネルギー取込み、消費および貯蔵を制御する統合ニューロン経路を調節する。
【０１３２】
グルコース感知ニューロンにおけるＧＫ活性は、その生理学的機能に必須であるため（Ｋａｎｇ  Ｌ．，２００６．Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５５：４１２−２０）、ＢＡＤ  ＳＡＨＢ化合物（図１８）などのＧＫの活性化因子は、エネルギーホメオスタシス（これは、糖尿病および肥満と関連する代謝障害と重要な関連性を有することが示されている）の神経内分泌調節に影響を及ぼすことが予測される（Ｓｃｈｗａｒｔｚ  Ｍ．Ｗ．，２００５．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０７：３７５）。
【０１３３】
実施例１５：慢性肝疾患
肝臓は、全身のグルコース／脂質利用において制御中心的な役割を果たしている。グリコゲン合成と糖新生により、肝臓は、体内でのグルコースの生成と貯蔵を決定する（Ｄｅｎｔｉｎ，Ｒ．，２００５．Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ  ８７：８１）。他方、β−酸化（エネルギー生成のための脂肪分解を担うミトコンドリア経路）と脂肪酸合成により、肝臓は脂質代謝に影響を及ぼす。肝臓でのグルコースと脂質の代謝異常は、インスリン抵抗性（ＩＲ）状態を構成し、慢性肝疾患、例えば、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）およびそのより重症な形態である非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）に寄与すると考えられている（Ｂｕｇｉａｎｅｓｉ，Ｅ．，２００５．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ４２：９８７）。
【０１３４】
ＮＡＦＬＤは、ＩＲ、肥満、ＩＩ型糖尿病、高血圧、高脂血症を含む一群の代謝障害であるメタボリックシンドロームの肝臓症状である（Ｆａｌｃｋ−Ｙｔｔｅｒ、Ｙ．２００１．Ｓｅｍｉｎ  Ｌｉｖｅｒ  Ｄｉｓ  ２１；１７）。前記疾患のより重症な形態であるＮＡＳＨでは、細胞の損傷による肝臓の適正な構造の喪失（肝硬変）が観察される（Ｂｒｕｎｔ，Ｅ．Ｍ．２００５．Ｈｅｐａｔｈｏｌ  Ｒｅｓ  ３３：６８）。脂肪肝は、脂肪症または脂肪性肝炎としても知られており、肝細胞内の高レベルのトリグリセリド蓄積を特徴とするＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨの組織学的特徴である。ＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨの現行の処置ストラテジーとしては、脂質を低下させる薬剤または肝細胞をインスリン作用に感作させる薬剤が挙げられる。
【０１３５】
この所見により、マウスにおけるＢａｄ除去は、ＩＲとＩＩ型糖尿病のＨＦＤモデルにおいて誘導した高血糖に対する抵抗性と関連するという証拠が示される（図２２）。また、この処置に対するＢａｄ  ＋／＋およびＢａｄ  −／−マウスの示差的応答が脂肪肝の発生の顕著な差で示される（図６０〜６３）。ＢＡＤヌル動物は脂肪肝にならない。重要なことには、この抵抗性はＢＡＤのリン酸化状態と関連している（図６４〜６５）。決してリン酸化され得ないＢＡＤの変異型形態を示すマウス（Ｂａｄ  ３ＳＡ）は、野生型同腹子対照と比べ、ＨＦＤによって誘導される高血糖に対して感受性が高く（図２７）、より脂肪肝となる傾向にある（図６４〜６５）。
【０１３６】
この所見を考慮すると、ＢＡＤのアポトーシス機能の抑制は、肝臓の損傷と機能が抑制されることにより、ＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨの有効な治療ストラテジーであることが示され得る。重要なことには、このストラテジーは、ＮＡＳＨの現行の薬理学的処置と組み合わせて考慮され得る（Ｐｏｒｔｉｎｃａｓａ，Ｐ．２００６．Ｃｕｒｒ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ
１３：２８８９）。
【０１３７】
実施例１６：腫瘍における解糖スイッチ
腫瘍は解糖作用が高いことがわかっている（Ｇａｔｅｎｂｙ．Ｒ．Ａ．およびＧｉｌｌｉｅｓ，Ｒ．Ｊ．２００４．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  ４，８９１−９９）。これは、ミトコンドリアによる欠陥性酸化的リン酸化（ＯＸＰＨＯＳ）、または解糖およびその中間体を主なＡＴＰ源として利用し、対応物への還元と巨大分子合成により高い生体エネルギー生成需要を補助する腫瘍内の代謝経路の「リワイヤリング（ｒｅ−ｗｉｒｉｎｇ）」のいずれかに起因している（Ｍａｚｕｒｅｋ  Ｓ．およびＥｉｇｅｎｂｒｏｄｔ  Ｅ．２００３．Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２３，１１４９−５４）。かかる代謝シフト、すなわち「リワイヤリング」の例としては、切断型ＴＣＡ（トリカルボン酸）回路が挙げられ、これは、ミトコンドリアによるピルビン酸の利用によって生成したＴＣＡ中間体のクエン酸が、脂肪酸合成のための細胞質内アセチル−ＣｏＡを提供するものである（図３）（Ｈａｔｚｉｖａｓｓｉｌｉｏｕ  Ｇ．ら  ２００５．Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ８，３１１−２１）。腫瘍細胞の代謝シフトの別の例は、乳酸デヒドロゲナーゼによって触媒される反応により乳酸が生成するピルビン酸の利用である（図３）（Ｆａｎｔｉｎ，Ｖ．Ｒ．ら，２００６．Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ９，４２５−３４）。
【０１３８】
ミトコンドリアがグルコースを呼吸の炭素源として利用する効率を調節する能力によって、ＢＡＤは、上記の代謝経路で利用されるピルビン酸の利用可能性を決定している可能性がある。Ｂａｄ欠損マウスは、解糖作用が高いことがわかっている腫瘍であるびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）に進行する（Ｒａｎｇｅｒ，Ａ．Ｍ．ら，２００３．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １００，９３２４−２９）。これは、Ｂａｄ欠損ＤＬＢＣＬにおける適正なアポトーシス制御の低下と、ＯＸＰＨＯＳから解糖への代謝スイッチングの増強の両方を示すものであり得る。
【０１３９】
実施例１７．一般的な方法
動物モデル．Ｂａｄ  −／−およびＢａｄ  ３ＳＡノックイン遺伝子モデルは既報のものとした（Ｄａｔｔａ  Ｓ．Ｒ．ら，２００２．Ｄｅｖ  Ｃｅｌｌ  ３，６３１−４３；Ｒａｎｇｅｒ  Ａ．Ｍら，２００３．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １００，９３２４−９）。Ｂａｄ  Ｓ１５５Ａノックインモデルは、図７に記載のようにして作出した。
【０１４０】
高血糖クランプ試験．高血糖クランプ試験は、１０週齢の雄マウスで、Ｙａｌｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｍｏｕｓｅ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  Ｃｅｎｔｅｒで確立された標準化された手順に従って行なった。クランプ解析の少なくとも５日前、マウスに麻酔し、グルコースの静脈内注入のため、右内頚静脈内に留置カテーテルを挿入した。マウスを一晩絶食させ、覚醒および最低限のストレス負荷状態でクランプ解析を行なった。３方向コネクタを静脈内注入用の頚静脈カテーテルに取り付け、血液試料を採取した。２時間の高血糖クランプは、２０％グルコースの初回刺激と可変注入によって血漿グルコース濃度を約３００ｍｇ／ｄｌまで上昇させて維持して行なった。血液試料（２０μｌ）を１０〜２０分間隔で採取し、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｇｌｕｃｏｓｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ＩＩ（Ｂｅｃｋｍａｎ，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ）を用いて、速やかに血漿グルコース濃度の測定を行なった。血漿インスリンは、Ｌｉｎｃｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｓｔ．Ｃｈａｒｌｅｓ，ＭＯ）製のキットを使用し、ラジオイムノアッセイによって測定した。
【０１４１】
高インスリン正常血糖クランプ試験．高インスリンクランプ正常血糖試験の４日前、マウスの体組成を１Ｈ磁気共鳴スペクトロスコピー（Ｂｒｕｋｅｒ  ＢｉｏＳｐｉｎ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）によって評価した。頚静脈カテーテルを埋め込み、マウスを４日間回復させた。一晩絶食後、［３−３Ｈ］グルコース（ＨＰＬＣ精製済；Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）を、０．０５μＣｉ／分の速度で２時間注入し、基底グルコース代謝回転を評価した。基底期間後、ヒトインスリンの初回刺激／連続注入（３００−ｐｍｏｌ／ｋｇ初回刺激、１５−ｐｍｏｌ・ｋｇ−１・分−１注入）（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ＮＪ）および正常血糖（約１００〜１２０ｍｇ／ｄｌ）を維持する２０％デキストロースの可変注入により、高インスリン正常血糖クランプを１２０分間行なった。血漿試料は尾部から、２０、４０、５５、７０、７５、８０、９５および１２０分の時点で採取し、［３−３Ｈ］グルコースはクランプ全体を通して０．１μＣｉ／分の速度で注入し、２−デオキシ−Ｄ−［ｌ−１４Ｃ］グルコース（ＤＯＧ；Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）は、クランプ７５分の時点でボーラスとして注射し、既報のインスリン刺激性組織グルコース取込み速度を推定した（Ｙｏｕｎ  Ｊ．Ｈ．，１９９３．Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ４２：７５７−６３）。クランプの終了時、マウスをペントバルビタールナトリウム注射（１５０ｍｇ／ｋｇ）で麻酔し、全組織を４分以内に採取し、液体Ｎ２冷却アルミニウム製トングを用いて即座に凍結し、後の解析のために−８０℃で保存した。
【０１４２】
島調製．マウスの膵臓を、既報のようにしてコラゲナーゼで灌流して島を単離した（Ｌａｒｓｓｏｎ  Ｏ．ら，１９９６．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７１，１０６２３−６）。島を常套的に１〜２日間培養した後、インスリン分泌（浴液洗浄または静的インキュベーション）アッセイを行なった。
【０１４３】
島浴液洗浄アッセイ．浴液洗浄アッセイは、既報のようにして行なった（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  Ｂ．Ａ．ら，１９９６．Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２７１，Ｅ７０２−１０）。簡単には、１２０個の島をカラム内で、Ｃｙｔｏｄｅｘ−３マイクロ担体ビーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の２つの層間にサンドイッチし、表示した濃度のグルコースまたはＫＣｌを含有するクレブスバッファー（１１９ｍＭのＮａＣｌ、４．６ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＭｇＳＯ４、０．１５ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、０．４ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、２５ｍＭのＮａＨＣＯ３、２ｍＭのＣａＣｌ２、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、０．０５％ウシ血清アルブミン）で浴液洗浄した。浴液洗浄溶液は、高精密マルチチャネルポンプ（ＩＰ  Ｉｓｔａｍｅｃ型番７８０２３−０２，Ｃｏｌｅ−Ｐａｒｍｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｃｏ．）を、浴液洗浄過程中に島が過剰な圧力に曝露されないことが確保される０．３ｍｌ／分の流速で用いてポンプ輸送した。画分収集前、島を３ｍＭのグルコースで２５分間、予備浴液洗浄した。溶出画分は、ＢｉｏＲａｄ画分収集装置（型番２１２８）を用いて１５秒ごとに収集した。系全体をチャンバ内で３７℃に維持した。浴液洗浄溶液中のグルコース濃度は、表示した時間点で変更した（図１ｄ）。インスリン分泌のグルコース用量応答評価のため（図２ｆ）、インスリン放出の最初のピークに相当する画分をインスリン測定用に収集した後、グルコース濃度を漸次増大させた。インスリンは、ラジオイムノアッセイによって測定した。
【０１４４】
ＡＴＰ／ＡＤＰ比の測定．５０個のサイズが適合した島のバッチを洗浄し、３ｍＭのグルコースを含有するクレブスバッファー中で３０分間プレインキュベートした。次いで、バッファーを５．５ｍＭまたは２５ｍＭのグルコースを含有するクレブス溶液に切り替えた後、クレブスバッファー中、３７℃で１時間インキュベーションした。ＡＴＰとＡＤＰの含有量を、生物発光系アプローチを用いて既報のようにして測定した（Ｓｃｈｕｌｔｚ
Ｖ．ら，１９９３．Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２１５，３０２−０４）。
【０１４５】
ＳＡＨＢ合成．ＢＩＤおよびＢＡＤ  ＳＡＨＢ誘導体を作製するため、Ｆｍｏｃ系ペプチド合成、オレフィンメタセシス、ＦＩＴＣ−誘導体化、逆相ＨＰＬＣ精製、および微量分析を、既報のようにして行なった（Ｗａｌｅｎｓｋｙ  Ｌ．Ｄ．ら，２００４．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０５，１４６６−７０；Ｗａｌｅｎｓｋｙ  Ｌ．Ｄ．ら，２００６．Ｍｏｌ
Ｃｅｌｌ近刊）。最初の一群のＢＩＤおよびＢＡＤ  ＳＡＨＢホスホリル誘導体は記載のようにして合成した（図１８）。
【０１４６】
ＳＡＨＢ系免疫沈降または架橋による標的の同定．免疫沈降用の「ハンドル」（例えば、ＦＩＴＣ、ビオチン）を用いて合成したＳＡＨＢを用いて、ＢＨ３系結合の細胞内標的（１つまたは複数）および生物学的活性を既報のようにして同定した（Ｗａｌｅｎｓｋｙ
Ｌ．Ｗ．ら，２００６．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ２４，１９９−２１０）。また、ＳＡＨＢ化合物を誘導体化し、光刺激または他の誘発因子によって細胞内標的に直接架橋させる代替的なインサイチュ架橋方法論も使用されている（Ｓｅｇｈａｔｅｌｉａｎ、Ａ．ら，２００４．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０１，１００００−５）（図６８〜６９）。
【０１４７】
単離された一次β島におけるインスリン放出の静的インキュベーション（バッチ放出）法．島を３回洗浄し、３ｍＭのグルコースを含有するクレブスバッファーを入れたチューブ１つあたり５つの島をピッキングした。チューブを３７℃で３０分間インキュベートした。次いで、島をペレット化し、バッファーを表示した濃度のグルコースまたは分泌促進薬を含有するクレブス溶液と置き換えた。３７℃で１時間のインキュベーション後、島をペレット化し、インスリン測定のために上清みを収集した。ペレットを可溶化して細胞内インスリン含有量を評価した。インスリンは、マウスインスリンを標準として使用し（インスリンＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ、カタログ番号ＩＮＳＫＲ０２０，Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｃｈｅｍ．Ｉｎｃ．，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）、ＥＬＩＳＡによって測定した。遺伝子再構成アッセイのため、１５０個の新鮮単離島のバッチを、１１ｍＭのグルコース、１０％血清を含有するＲＰＭＩ培地中、１０８プラーク形成単位のアデノウイルスの存在下、３７℃で９０分インキュベートした（Ｚｈｏｕ  Ｙ．Ｐ．ら，２００３．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７８，５１３１６−２３）。このｐｆｕでは、感染による有意な島アポトーシスは引き起こされなかった。次いで、培地を新鮮ＲＰＭＩと置き換え、島を２４〜４８時間培養した後、インスリン放出アッセイを行なった。各群のＧＦＰ発現島を、バッチ放出アッセイ用に上記のようにしてハンドピッキングした。ＳＡＨＢ化合物での処理のため、１５０個の新鮮単離島を、１１ｍＭのグルコース、１０％血清および３μＭの表示した化合物またはＤＭＳＯビヒクル対照を含有するＲＰＭＩ培地中で、一晩インキュベートした。島を洗浄し、インスリン放出アッセイを上記のクレブスバッファー中で行なった。
【０１４８】
ミトコンドリア膜電位の測定．島を分散させ、カバースリップ上にプレーティングし、３７℃で一晩インキュベートした。実験当日、β細胞を３ｍＭのグルコース中で３時間プレインキュベートした。画像化の前に、細胞に７ｎＭのテトラメチルローダミンエチルエステル（ＴＭＲＥ）と１００ｎＭのＭｉｔｏ  Ｔｒａｃｋｅｒ  Ｇｒｅｅｎ（ＭＴＧ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を、それぞれ、４５分間および３０分間負荷した。ＭＴＧを培地から除去し、倒立型Ｌｅｉｃａ  ＴＣＳ  ＳＰ２共焦点顕微鏡（Ｗｅｔｚｌａｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて細胞を画像化した。４枚のスタック画像を多数の個々の細胞から、細胞外グルコース濃度を３ｍＭから８ｍＭに上昇させる前と後、または１０ｍＭのＫＩＣの添加前に撮影した。ＴＭＲＥ蛍光強度を既報のようにして解析した（Ｈｅａｒｔ  Ｅ．ら，２００６．Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ  ２９０，Ｅ１４３−Ｅ１４８）。ΔΨに対するＳＡＨＢ化合物の効果を評価する試験では、分散させたβ細胞を、ＤＭＳＯビヒクル対照または１μＭの表示したＳＡＨＢ化合物とともに４時間インキュベートした後、画像化を行なった。４枚のスタック画像を多数の個々の細胞から、細胞外グルコース濃度を３ｍＭから８ｍＭに上昇させる前と後に撮影した。
【０１４９】
一次島およびＭＩＮ６  β細胞株におけるグルコキナーゼアッセイ．Ｔｒｕｓら（Ｔｒｕｓ  Ｍ．Ｄ．ら，１９８１．Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ３０，９１１−２２）に記載の手順に従った。アッセイは、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ５（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）プレートリーダーを用いた９６ウェル形式に適合させた。簡単には、９００〜１０００個のマウス島（図２ｅ）または５〜６×１０６ＭＩＮ６  β細胞（図３ｆ）を、３０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．２）、４ｍＭのＥＤＴＡ、１５０ｍＭのＫＣｌ、４ｍＭのＭｇＣｌ２、２．５ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭの５’ＡＭＰ、３ｍＭのリン酸カルシウム（ｐＨ７．４）、１ｍＭのＫ２ＳＯ４、１５ｍＭのβ−メルカプトエタノールおよび０．２％ＢＳＡを含有するバッファー中で、テフロン（登録商標）製乳棒および回転式ホモジナイザーを用いてホモジナイズした。ホモジネートの少量のアリコートを、ＤＮＡまたはタンパク質の含有量の測定用に確保した。グルコースリン酸化活性を、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤＨ）誘導型ＮＡＤＨ生成反応において検出した。グルコキナーゼ活性は、グルコースに加えて５０ｍＭのＨＥＰＥＳ
ＨＣｌ（ｐＨ７．７）、１００ｍＭのＫＣｌ、７．４ｍＭのＭｇＣｌ２、１５ｍＭのβ−メルカプトエタノール、０．５ｍＭのＮＡＤ＋、０．０５％ＢＳＡ、２．５μｇ／ｍｌ（０．７Ｕ／ｍｌ）のＧ６ＰＤＨ（ｓｉｇｍａ）および５ｍＭのＡＴＰを含む反応バッファー中で、１００ｍＭ（グルコキナーゼ活性）と０．５ｍＭ（ヘキソキナーゼ活性）のグルコース濃度で生成されたＮＡＤＨの差として計算した。反応液を、１００μｌの総容量で、３１℃にて９０分間インキュベートした（Ｔｒｕｓ  Ｍ．Ｄ．ら，１９８１．Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ３０，９１１−２２）。これらのアッセイで常套的に得られた値は、一次島内（Ｔｒｕｓ  Ｍ．Ｄ．ら，１９８１．Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ３０、９１１−２２）およびＭＩＮ６  β細胞株内（Ｉｉｚｕｋａ  Ｋ．ら，２０００．Ｊ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  １６４，３０７−１４）のＧＫについて以前に報告された範囲内である。図３ｆに示した試験では、ＭＩＮ６細胞を３μＭのＳＡＨＢ化合物で４時間処理した後、ホモジネートを調製した。
【０１５０】
アデノウイルスのストックの調製．ＧＦＰ単独またはＧＦＰと野生型もしくは変異型ＢＡＤを発現する組換えアデノウイルスを、ｐＡｄＥａｓｙ系を用いて既報のようにして作製した（Ｈｅ  Ｔ．Ｃ．ら，１９９８．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９５，２５０９−１４）。ウイルスの増幅、精製、滴定および確認は、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｃｏｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｈａｒｖａｒｄ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅ，Ｈａｒｖａｒｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡにおいて行なった。
【０１５１】
リアルタイムＰＣＲアッセイ．全ＲＮＡを島から、Ｒｎｅａｓｙ  Ｐｌｕｓ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて調製した。少なくとも３匹の別々の動物をＲＮＡ調製に使用し、ＲＮＡ試料は２連または３連で調製し、各試料について、逆転写酵素を含まない対照ｃＤＮＡ合成反応を行なった。ＰＣＲ反応は３連で実行した。１μｇの全ＲＮＡを、標準的な手法を用いて２０μｌのｃＤＮＡ合成反応液に使用した。ｃＤＮＡを２０倍に希釈し、２μｌを、ＢＡＤ用プライマーを用いた２５μｌのＰＣＲ反応液に使用した。別の組の対照反応には、ＲＮＡ品質の内部対照として供されるリボソームタンパク質（ＲＰＬ４）用のプライマーを含めた。反応混合物には、３００ｎＭの各プライマーと１×ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を含めた。ＰＣＲ産物をＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で検出し、蛍光強度の統計学的に有意な増大が最初に検出されるサイクル数の指標として閾値（ＣＴ）を求めた。増幅された遺伝子のアバンダンスをＣＴ値を用いて計算し、ＲＰＬ４の平均値に標準化して相対アバンダンスを得た。次いで、相対アバンダンスを対照群（Ｂａｄ  ＋／＋試料）のものに標準化し、比をプロットした。プライマーの配列は請求に応じて入手可能である。
【０１５２】
高脂肪食餌試験および血液化学検査．雄Ｂａｄ  −／−およびＢａｄ  ３ＳＡマウスおよびその対応する同腹子対照を、高脂肪（５８％脂肪エネルギー，Ｄ１２３３１，Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ，ＮＪ）で構成した食餌下に１６週間置いた（Ｗｉｎｚｅｌｌ  Ｍ．Ｓ．およびＡｈｒｅｎ  Ｂ．，２００４．Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５３  Ｓｕｐｐｌ  ３，Ｓ２１５−９）。パラレルコホートを正常食餌下に維持した。体重および非空腹時血中グルコースレベルを毎週モニターした。血中グルコースレベルを、グルコメーター（Ｏｎｅ  Ｔｏｕｃｈ，Ｌｉｆｅｓｃａｎ，Ｍｉｌｐｉｔａｓ，ＣＡ）を用いて測定した。血清インスリン濃度を、マウスインスリンを標準として用いて評価した（インスリンＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ，カタログ番号ＩＮＳＫＲ０２０，Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｃｈｅｍ．Ｉｎｃ．，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）。
【０１５３】
免疫染色および島面積測定．膵臓を１０％ホルマリン中に固定し、パラフィン中に包埋した。膵臓の連続５μｍ切片を下記のようにして染色した。モルモット抗ヒトインスリン血清＃４０１１−０１（Ｌｉｎｃｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｃｈａｒｌｅｓ，ＭＯ）を用いて免疫組織学検査を行なった後、ペルオキシダーゼコンジュゲートＡｆｆｉＰｕｒｅ二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）とともにインキュベーションした。３，３−ジアミノベンジジン四塩酸塩を用いて切片を発色させ、次いで、ヘマトキシリンとエオシンで対比染色した。島面積の測定のため、切片を上記の抗インスリン抗体で、続いてビオチン化二次抗体で染色した後、テキサスレッドコンジュゲートストレプトアビジン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）で標識した。各切片について、平均１４個の低倍率視野を顕微鏡下で調べ、デジタル画像に取り込み、次いで、これをＭｅｔａＭｏｒｐｈソフトウェアを用いて解析した。簡単には、各切片由来の島をトレースし、ＭｅｔａＭｏｒｐｈソフトウェアを用いて閾値を決定し、インスリン陽性面積を計算した。インスリン陽性面積の合計（全島面積）を各スライド上の総組織面積で除算し、得られた数値を島面積割合として表示した。少なくとも３匹のマウス／群の多数の切片を解析した。
【０１５４】
Ｓ１５５Ａ  Ｂａｄノックインマウスの作出．ノックインストラテジーは、３ＳＡ対立遺伝子の作製に使用されたものと同様にした（Ｄａｔｔａ  Ｓ．Ｒ．ら，２００２．Ｄｅｖ  Ｃｅｌｌ  ３，６３１−４３）。簡単には、サイレントＲＦＬＰコードＥｃｏＲ１部位を有するＢＡＤ  ＢＨ３ドメイン内のＳ１５５のセリンからアラニンへの変異を、ｐＢＲ３２２ＢＡＤを鋳型として用いたＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅによってＢＡＤエキソン３に導入した。この変異を含む９００ｂｐのＳｅｘＡ１／ＲｓｒＩＩ断片を、新たなｐＢＲ３２２ＢＡＤ構築物内にスワッピングさせた。ＦＲＴ−ＰＧＫ−ＮＥＯ−ＦＲＴカセットをＢＡＤ  ３’ＵＴＲの１．４ｋＢ遠位のＮｓｉＩ部位内にクローニングし、ジフテリア毒素陰性選択カセットを、ＢＡＤ遺伝子座の５’末端のゲノムＢＡＤ／ｐＢＲ３２２ジャンクション部内に導入した。このベクターを１２９  Ｊ１  ＥＳ細胞内にエレクトロポレーションし、Ｃ５７Ｂ６胚盤胞内に注射した。標準的な手順によって相同組換体を同定した。ＳｅｘＡ１／ＲｓｒＩＩ断片をＲＦＬＰマーカーについて陽性のマウスから再度単離し、配列決定してマウスが正しい変異を有することを確認した。
【０１５５】
蛍光分極結合アッセイ．Ｃ末端膜貫通ドメインが欠損した（ＧＳＴ−ＢＣＬ−ＸＬ  ΔＣ）ＢＣＬ−ＸＬ（残基１〜２１２）のグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ融合タンパク質を、ｐＧＥＸ２Ｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて大腸菌ＢＬ２１内で発現させ、アフィニティクロマトグラフィー（グルタチオン−アガロースビーズ（Ｓｉｇｍａ）を使用）および高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）によって精製した。Ｂｒａｄｆｏｒｄ  Ａｓｓａｙを用いてタンパク質濃度を測定した。フルオレシン結合ＳＡＨＢ（５０ｎＭ）をＧＳＴ−ＢＣＬ−ＸＬ  ΔＣ（０．２５〜１０００ｎＭ）とともに、結合バッファー（１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ７．４］）中で室温にてインキュベートした。結合活性を蛍光分極によって、ＰＯＬＡＲｓｔａｒ  ＯＰＴＩＭＡマイクロプレートリーダー（ＢＭＧ  ｌａｂｔｅｃｈ）を用いて測定した。Ｐｒｉｓｍソフトウェア（Ｇｒａｐｈｐａｄ）を用いた非線形回帰解析によってＥＣ５０値を求めた。
【０１５６】
円偏光二色性．ＳＡＨＢペプチドを、中性ｐＨ水に２５〜５０μＭの濃度まで溶解させた。Ｊａｓｃｏ  Ｊ−７１０分光偏光計においてＣＤスペクトルを得た（２０℃）。以下の標準的な測定パラメータ：波長１９０〜２６０ｎｍ；ステップ分解能０．５ｎｍ；速度２０ｎｍ／秒；累積１０；応答１秒；バンド幅１ｎｍ；光路長０．１ｃｍを使用した。各ペプチドのα−ヘリックス含有量を、２２２ｎｍにおける平均残基モル楕円率値（［θ］２２２）から算出した（Ｃｈｅｎ  Ｙ．Ｈ．ら、１９７４．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １３，３３５０−９；Ｙａｎｇ  Ｊ．Ｔ．ら，１９８６．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １３０，２０８−２６９）。
【０１５７】
他の実施形態
本発明を詳細な説明とともに説明したが、前述の記載は、本発明の例示であって、添付の特許請求の範囲によって規定される本発明の範囲を限定しないものとする。他の態様、利点および変形例は、以下の特許請求の範囲に含まれる。
【図５】
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【図６】
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【図８】
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【図１１】
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【図１８−１】
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【図１８−３】
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【図１８−４】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６】
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【図６７】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図７】
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【図９】
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【図１０】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８−２】
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【図３３】
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【図３７】
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【図３８】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図５４】
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【図５５】
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【図６８】
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【図６９】
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【図７０】
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【図７１】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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