(57)【要約】      （修正有）【課題】自己免疫疾患、アレルギー応答、癌、炎症性疾患の治療、臓器又は組織の創傷治癒の促進、上皮傷害の修復、および血管の形成を促進する方法の提供。【解決手段】有効量の間葉系幹細胞を投与し、インターロイキン-4（IL-4）及びインターロイキン-10（IL-10）等の抗炎症性サイトカインの分泌を上昇する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物の腸陰窩を修復するための、有効な量の間葉系幹細胞を含む医薬組成物であって、該動物に投与され、該間葉系幹細胞は抗炎症性サイトカイン分泌の上昇を促進する、医薬組成物。
【請求項２】
前記動物が哺乳動物である、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記哺乳動物がヒトである、請求項２記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記腸陰窩が、移植片対宿主病の結果として傷害されている、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記傷害されている腸陰窩が、潰瘍腸上皮組織を含む、請求項４記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記動物が、移植片対宿主病に罹患している、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記移植片対宿主病が、グレードIVの消化管移植片対宿主病である、請求項６記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記間葉系幹細胞の投与が、該動物に１回のみ提供される、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記抗炎症性サイトカインが、インターロイキン-4（IL-4）及びインターロイキン-10（IL-10）である、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記間葉系幹細胞の投与が、該動物に単回投与として提供される、請求項７記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記単回投与が、新しい機能的腸組織の再生をもたらす、請求項１０記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記単回投与が、腸組織における炎症部位及び潰瘍形成を消失させる、請求項１０記載の医薬組成物。
【請求項１３】
腸組織における炎症部位及び潰瘍形成が、注入後十分な時間のうちに消失する、請求項１２記載の医薬組成物。
【請求項１４】
注入後十分な時間が、少なくとも約２週間である、請求項１３記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記単回投与が、該動物の体重１ｋｇ当り３×１０６個の間葉系幹細胞を含む、請求項１０記載の医薬組成物。
【請求項１６】
投与後に腸の傷害が再発しない、請求項１５記載の医薬組成物。
【請求項１７】
動物の腸陰窩を修復するための、有効な量の間葉系幹細胞を含む医薬組成物の使用であって、該組成物は該動物に投与され、該間葉系幹細胞は抗炎症性サイトカイン分泌の上昇を促進する、使用。
【請求項１８】
前記動物が哺乳動物である、請求項１７記載の使用。
【請求項１９】
前記哺乳動物がヒトである、請求項１７記載の使用。
【請求項２０】
前記腸陰窩が、移植片対宿主病の結果として傷害されている、請求項１７記載の使用。
【請求項２１】
前記傷害されている腸陰窩が、潰瘍腸上皮組織を含む、請求項２０記載の使用。
【請求項２２】
前記動物が、移植片対宿主病に罹患している、請求項１７記載の使用。
【請求項２３】
前記移植片対宿主病が、グレードIVの消化管移植片対宿主病である、請求項２２記載の使用。
【請求項２４】
前記抗炎症性サイトカインが、インターロイキン-4（IL-4）及びインターロイキン-10（IL-10）である、請求項１７記載の使用。
【請求項２５】
前記間葉系幹細胞の投与が、該動物に１回のみ提供される、請求項１７記載の使用。
【請求項２６】
前記間葉系幹細胞の投与が、該動物に単回投与として提供される、請求項２３記載の使用。
【請求項２７】
前記単回投与が、消化管移植片対宿主病の炎症性成分の低下をもたらす、請求項２６記載の使用。
【請求項２８】
前記単回投与が、新しい機能的腸組織の再生をもたらす、請求項２３記載の使用。
【請求項２９】
前記単回投与が、腸組織における炎症部位及び潰瘍形成を消失させる、請求項２３記載の使用。
【請求項３０】
腸組織における炎症部位及び潰瘍形成が、注入後十分な時間のうちに消失する、請求項２９記載の使用。
【請求項３１】
注入後十分な時間が、少なくとも約２週間である、請求項３０記載の使用。
【請求項３２】
前記単回投与が、該動物の体重１ｋｇ当り３×１０６個の間葉系幹細胞を含む、請求項２３記載の使用。
【請求項３３】
投与後に上皮傷害が再発しない、請求項３２記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は間葉系幹細胞に関する。さらに詳しくは、本発明は、種々の組織や臓器における血管形成の促進、自己免疫疾患の治療、アレルギー応答の治療、癌の治療、炎症性疾患と障害の治療、創傷治癒の促進、炎症の治療、及び上皮傷害の修復を含む間葉系幹細胞の新規用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明は、海軍省により契約第Ｎ６６００１−０２−Ｃ−８０６８号で政府の援助で行われた。政府は本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
本出願は、２００４年３月２２日に出願された仮特許出願第６０／５５５，１１８号（その内容は参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）に基づく優先権を請求する２００５年３月１５日出願の特許出願第１１／０８０，２９８号の一部継続出願である。
【０００４】
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、骨芽細胞、筋細胞、軟骨細胞、及び脂肪細胞を含む系統に容易に分化できる多能性幹細胞である（Pittenger, et al., Science, Vol. 284, pg. 143 (1999); Haynesworth, et al., Bone, Vol. 13, pg. 69 (1992); Prockop, Science, Vol. 276, pg. 71 (1997)）。インビトロの試験により、ＭＳＣが筋肉（Wakitani, et al., Muscle Nerve, Vol. 18,, pg. 1417 (1995)）、神経様前駆体（Woodbury, et al., J. Neurosci. Res., Vol. 69, pg. 908 (2002); Sanchez-Ramos, et al., Exp. Neurol., Vol. 171 , pg. 109 (2001)）、心筋細胞（Toma, et al., Circulation, Vol. 105, pg. 93 (2002); Fakuda, Artif. Organs, Vol. 25, pg. 187 (2001)）、及びおそらくは他のタイプの細胞に分化する能力が証明されている。さらにＭＳＣは、造血幹細胞や胚幹細胞の拡張のための有効なフィーダー層となることが証明されている（Eaves, et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., Vol. 938, pg. 63 (2001); Wagers, et al., Gene Therapy, Vol. 9, pg. 606 (2002)）。種々の動物モデルを用いた最近の研究は、ＭＳＣが、傷害された骨、軟骨、半月板、又は心筋組織の修復又は再生において有用であることを証明している（DeKok, et al., Clin. Oral Implants Res., Vol. 14, pg. 481 (2003)); Wu, et al., Transplantation, Vol. 75, pg. 679 (2003); Noel, et al., Curr. Opin. Investig. Drugs, Vol. 3, pg. 1000 (2002); Ballas, et al., J. Cell. Biochem. Suppl., Vol. 38, pg. 20 (2002); Mackenzie, et al., Blood Cells Mol. Dis., Vol. 27 (2002)）。何人かの研究者は、骨形成不全症（Pereira, et al., Proc. Nat. Acad. Sci., Vol. 95, pg. 1142 (1998)）、パーキンソン病（Schwartz, et al., Hum. Gene Ther., Vol. 10, pg. 2539 (1999)）、脊髄損傷（Chopp, et al., Neuroreport, Vol. 11 , pg. 3001 (2000); Wu, et al., J. Neurosci. Res., Vol. 72, pg. 393 (2003)）、及び心臓疾患（Tomita, et al., Circulation, Vol. 100, pg. 247 (1999). Shake, et al., Ann. Thorac. Surg., Vol. 73, pg. 1919 (2002)）を含む動物疾患モデルにおける移植について、ＭＳＣを使用して有望な結果を得ている。重要なことに、有望な結果はまた、骨形成不全症（Horwitz, et al., Blood, Vol. 97, pg. 1227 (2001); Horowitz, et al. Proc. Nat. Acad. Sci., Vol. 99, pg. 8932 (2002)）と異種骨髄移植（Frassoni, et al., Int. Society for Cell Therapy, SA006 (要約) (2002); Koc, et al., J. Clin. Oncol., Vol. 18, pg. 307 (2000)）の移植の向上の臨床治験でも報告されている。
【０００５】
ＭＳＣは、その表面に主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩ抗原を発現するが、ＭＨＣクラスII（Le Blanc, et al., Exp. Hematol., Vol. 31 , pg. 890 (2003); Potian, et al., J. Immunol., Vol. 171 , pg. 3426 (2003)）やＢ７もＣＤ４０同時刺激分子（Majumdar, et al., J. Biomed. Sci., Vol. 10, pg. 228 (2003)）も発現せず、これらの細胞が免疫原性表現型（Tse, et al., Transplantation, Vol. 75, pg. 389 (2003)）を有することを示唆している。ＭＳＣはまたＭＨＣ非依存性にＴ細胞増殖応答を阻害する（Bartholomew, et al., Exp. Hematol., Vol. 30, pg. 42 (2002); Devine, et al., Cancer J., Vol. 7, pg. 576 (2001); DiNicola, et al., Blood, Vol. 99, pg. 3838 (2002)）。ＭＳＣのこれらの免疫学的性質は移植を向上させ、移植後の同種異系細胞を認識し拒絶する受容者の免疫系の能力を制限しているかも知れない。局所的刺激下で適切なタイプの細胞に分化する能力とともに、免疫応答を調節し造血を支持する因子のＭＳＣによる産生は、これらを細胞移植研究のための好ましい幹細胞にしている（Majumdar, et al., Hematother. Stem Cell Res., Vol. 9, pg. 841 (2000); Haynesworth, et al., J. Cell. Physiol., Vol. 166, pg. 585 (1996)）。
【発明の開示】
【０００６】
本出願人は、樹状細胞（ＤＣ１とＤＣ２）、エフェクターＴ細胞（Ｔｈ１とＴｈ２）、及びＮＫ細胞を含む、間葉系幹細胞と単離された免疫細胞集団との相互作用を調べた。かかる相互作用に基づいて本出願人は、間葉系幹細胞が、免疫応答プロセスのいくつかの工程を制御する種々の因子の産生を制御することを発見した。すなわち間葉系幹細胞は、免疫系が関与する症状や障害、炎症が関与する疾患、症状、及び障害、上皮傷害、又はアレルギー応答の治療に使用できるかも知れない。かかる疾患、症状、及び障害には、特に限定されないが、自己免疫疾患、アレルギー、関節炎、炎症を起こした創傷、円形脱毛症（禿）、歯周病（歯肉炎と歯周炎を含む）、及び免疫応答が関与する他の疾患、症状、又は障害がある。
【０００７】
さらに間葉系幹細胞は、血管内皮増殖因子、又はＶＥＧＦ（これは新しい血管の形成を刺激することにより血管形成を促進する）を発現し分泌する。間葉系幹細胞はまた末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を刺激してＶＥＧＦを産生させる。
【０００８】
さらに間葉系幹細胞は樹状細胞がインターフェロン−ベータ（ＩＦＮ−β）を産生するのを刺激して、これが腫瘍抑制とウイルス感染に対する免疫を促進する。
【０００９】
本発明のある態様において、動物の自己免疫疾患と移植片対宿主病よりなる群から選択される疾患を治療する方法が提供される。この方法は、動物の疾患を治療するために有効な量の間葉系幹細胞を動物に投与することを含む。
【００１０】
本発明のこの態様の範囲はいかなる理論にも限定されないが、間葉系幹細胞が自己免疫疾患と移植片対宿主病を抑制する少なくとも１つの機構は、制御Ｔ細胞（Ｔreg細胞）及び／又は樹状細胞（ＤＣ）からのインターロイキン−１０（ＩＬ−１０）の放出を引き起こすことによると考えられる。
【００１１】
本発明で治療される自己免疫疾患には、特に限定されないが、多発性硬化症、１型糖尿病、慢性関節リウマチ、ブドウ膜炎、自己免疫甲状腺疾患、炎症性腸疾患、強皮症、グレーブス病、ループス、クローン病、自己免疫リンパ増殖性疾患（ＡＬＰＳ）、脱髄疾患、自己免疫脳脊髄炎、自己免疫胃炎（ＡＩＧ）、及び自己免疫糸球体疾患がある。また上記したように、移植片対宿主病も治療される。しかし本発明の範囲は、本明細書に記載の特定の疾患の治療に限定されないことを理解されたい。
【００１２】
ある実施態様において、間葉系幹細胞が投与される動物は哺乳動物である。哺乳動物は、ヒト及び非ヒト霊長類を含む霊長類である。
【００１３】
一般に間葉系幹細胞（ＭＳＣ）療法は、以下の順序に基づく：ＭＳＣ含有組織の採取、ＭＳＣの単離と拡張、動物へのＭＳＣの投与（生化学的又は遺伝的操作有り又は無し）。
【００１４】
投与される間葉系幹細胞は均一組成物であるか、又はＭＳＣで濃縮された混合細胞集団でもよい。均一間葉系幹細胞組成物は接着性骨髄細胞又は骨膜細胞を培養することにより得られ、間葉系幹細胞組成物は接着性骨髄細胞又は骨膜細胞を培養することにより得られ、間葉系幹細胞は、ユニークなモノクローナル抗体を用いて同定される特異的細胞表面マーカーにより同定される。間葉系幹細胞で濃縮された細胞集団を得る方法は、例えば米国特許第５，４８６，３５９号明細書に記載されている。間葉系幹細胞の別の供給源には、特に限定されないが、血液、皮膚、臍帯血、筋肉、脂肪、骨、及び軟骨膜がある。
【００１５】
間葉系幹細胞は種々の方法で投与される。間葉系幹細胞は、例えば静脈内、動脈内、又は腹腔内投与により全身的に投与してもよい。
【００１６】
間葉系幹細胞は、自己、同種異系、又は異種を含む範囲の供給源由来でもよい。
【００１７】
間葉系幹細胞は、動物の自己免疫疾患又は移植片対宿主病を治療するために有効な量で投与される。間葉系幹細胞は約１×１０5細胞／ｋｇ〜約１×１０7細胞／ｋｇの量で投与される。別の実施態様において間葉系幹細胞は、約１×１０6細胞／ｋｇ〜約５×１０6細胞／ｋｇの量で投与される。投与される間葉系幹細胞の量は、患者の年齢、体重、性、治療される自己免疫疾患、及びその程度と重症度を含む種々の要因に依存する。
【００１８】
間葉系幹細胞は薬学的に許容される担体とともに投与してもよい。例えば間葉系幹細胞は、注射又は局所的投与のための薬学的に許容される液体媒体又はゲル中で細胞懸濁液として投与してもよい。
【００１９】
本発明の別の態様において、動物の炎症応答を治療する方法が提供される。この方法は、動物の炎症応答を治療するために有効な量の間葉系幹細胞を動物に投与することを含む。
【００２０】
本発明のこの態様の範囲はいかなる理論にも限定されないが、間葉系幹細胞が、制御Ｔ細胞（Ｔreg細胞）へのＴ細胞成熟を促進し、こうして炎症応答が抑制されると考えられる。また、間葉系幹細胞がＴヘルパー１細胞（Ｔｈ１細胞）を阻害し、それによって、乾癬に関連するもののようなある炎症反応のインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）の発現を低下させると考えられる。
【００２１】
ある実施態様において治療される炎症応答は、乾癬に関連するものである。
【００２２】
別の実施態様において間葉系幹細胞は、脳中の小神経膠細胞及び／又は星状細胞に接触して炎症を低下させるように動物に投与され、こうして間葉系幹細胞は、アルツハイマー病、パーキンソン病、卒中、又は脳細胞損傷のような疾患もしくは障害において活性化グリア細胞により引き起こされる神経変性を制限する。
【００２３】
さらに別の実施態様において間葉系幹細胞は、皮膚の表皮中のケラチン細胞及びランゲルハンス細胞に間葉系幹細胞が接触して、乾癬、慢性皮膚炎、及び接触皮膚炎で起きるような炎症を低下させるように動物に投与される。本発明はいかなる理論にも限定されないが、間葉系幹細胞が表皮中のケラチン細胞及びランゲルハンス細胞に接触して、表皮中のＴ細胞受容体やランゲルハンス細胞の発現を変化させ、こうして腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦ−α）の発現を低下させ、制御Ｔ細胞（Ｔreg細胞）集団を上昇させると考えられる。
【００２４】
さらなる実施態様において間葉系幹細胞は、特に限定されないが骨関節炎や慢性関節リウマチ、及びウェブサイトwww.arthritis.org/conditions/diseasesに記載されている他の関節炎疾患を含む関節炎や関節炎様症状で起こるような、骨の炎症を低下させるのに使用される。本発明のこの実施態様の範囲はいかなる理論にも限定されないが、間葉系幹細胞が、滑液中の記憶Ｔ細胞によるインターロイキン−１７分泌を阻害すると考えられる。
【００２５】
別の実施態様において間葉系幹細胞は、炎症性腸疾患や慢性肝炎におけるそれぞれ消化管及び肝臓中の炎症を抑えるために使用される。本発明のこの実施態様の範囲はいかなる理論にも限定されないが、間葉系幹細胞が、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）の分泌増加と制御Ｔ細胞（Ｔreg細胞）の生成を促進すると考えられる。
【００２６】
別の実施態様において間葉系幹細胞は、敗血症及び火傷、手術、及び移植を含む外傷のような病理症状において好中球とマクロファージの過度の活性化を阻害するために使用される。本発明のこの実施態様の範囲はいかなる理論にも限定されないが、間葉系幹細胞が、ＩＬ−１０のような抑制性サイトカインの分泌を促進し、マクロファージ遊走阻止因子を阻害すると考えられる。
【００２７】
別の実施態様において間葉系幹細胞は、角膜、水晶体、色素上皮細胞、及び網膜を含む眼、脳、脊髄、妊娠子宮と胎盤、卵巣、睾丸、副腎皮質、肝臓、及び毛包のような免疫学的特権部位の炎症を制御するために使用される。この実施態様の範囲はいかなる理論にも限定されないが、間葉系幹細胞が、ＩＬ−１０のような抑制性サイトカインの分泌とＴreg細胞の生成を促進すると考えられる。
【００２８】
別の実施態様において間葉系幹細胞は、透析及び／又は糸球体腎炎の最終段階腎疾患（ＥＳＲＤ）に関連する組織傷害を治療するために使用される。本発明のこの実施態様の範囲はいかなる理論にも限定されないが、間葉系幹細胞が腎修復を促進すると考えられる。間葉系幹細胞はまた、血管内皮増殖因子（すなわちＶＥＧＦ）を発現し分泌し、これが新しい血管形成を刺激し、傷害された腎組織の修復を助けると考えられる。
【００２９】
さらなる実施態様において間葉系幹細胞は、インフルエンザ、Ｃ型肝炎、単純ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス感染症、エプスタインバーウイルスのようなウイルス感染症を抑制するために使用される。この実施態様の範囲はいかなる理論にも限定されないが、間葉系幹細胞がインターフェロン−ベータ（ＩＦＮ−β）の分泌を促進すると考えられる。
【００３０】
さらに別の実施態様において間葉系幹細胞は、リーシュマニア （Leishmania）感染症やヘリコバクター（Helicobacter）感染症のような寄生虫感染症を制御するために使用される。この実施態様の範囲はいかなる理論にも限定されないが、間葉系幹細胞がＴヘルパー２（Ｔｈ２）細胞による応答を仲介し、こうしてβ細胞による免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）の産生増加を促進すると考えられる。
【００３１】
しかし、本発明のこの態様は、特定の炎症応答の治療に限定されないことを理解されたい。
【００３２】
間葉系幹細胞は、上記したようにヒト及び非ヒト霊長類を含む哺乳動物に投与される。
【００３３】
間葉系幹細胞はまた、上記したように全身的に投与される。あるいは骨関節炎又は慢性関節リウマチの場合、間葉系幹細胞は関節炎関節に直接投与される。
【００３４】
間葉系幹細胞は、動物の炎症応答を治療するために有効な量で投与される。間葉系幹細胞は、約１×１０5細胞／ｋｇ〜約１×１０7細胞／ｋｇの量で投与される。別の実施態様において間葉系幹細胞は、約１×１０6細胞／ｋｇ〜約５×１０6細胞／ｋｇの量で投与される。投与される間葉系幹細胞の正確な用量は、患者の年齢、体重、性、治療される炎症応答、及びその程度と重症度を含む種々の要因に依存する。
【００３５】
上記したように、間葉系幹細胞は薬学的に許容される担体とともに投与される。
【００３６】
本発明の別の態様において、動物の炎症を治療し、及び／又は上皮傷害を修復する方法が提供される。この方法は、動物の炎症及び／又は上皮傷害を治療するために有効な量の間葉系幹細胞を動物に投与することを含む。
【００３７】
本発明のこの態様の範囲はいかなる理論にも限定されないが、間葉系幹細胞が、Ｔ細胞による炎症促進性サイトカインであるＴＮＦ−αとインターフェロン−γの分泌の低下と、Ｔ細胞による抗炎症性サイトカインであるインターロイキン−１０（ＩＬ−１０）とインターロイキン−４（ＩＬ−４）の分泌の上昇とを引き起こすと考えられている。また間葉系幹細胞は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞によるインターフェロン−γ分泌の低下を引き起こすと考えられる。
【００３８】
本発明のこの態様で治療される炎症及び／又は上皮傷害は、自己免疫疾患、移植臓器の拒絶、火傷、切傷、裂傷、皮膚潰瘍形成と糖尿病性潰瘍形成を含む潰瘍形成を含むがこれらに限定されない、種々の疾患と障害により引き起こされる炎症及び／又は上皮傷害がある。
【００３９】
ある実施態様において間葉系幹細胞は、慢性関節リウマチ、クローン病、１型糖尿病、多発性硬化症、強皮症、グレーブス病、ループス、炎症性腸疾患、自己免疫胃炎（ＡＩＧ）、及び自己免疫糸球体疾患を含むがこれらに限定されない、自己免疫疾患により生じる上皮傷害を修復するために、動物に投与される。間葉系幹細胞はまた、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）により生じる上皮傷害を修復する。
【００４０】
本発明のこの態様は、移植片対宿主病により生じる上皮傷害の修復、及びさらに詳しくは、皮膚及び／又は消化管系に影響を与えるグレードIIIとIVの移植片対宿主病を含む重症の移植片対宿主病により生じる上皮傷害の修復に適用される。本出願人は特に、重症の移植片対宿主病、特にグレードIIIとIVの消化管移植片対宿主病に罹った患者に間葉系幹細胞が投与されると、間葉系幹細胞の投与により患者の皮膚及び／又は潰瘍形成した小腸上皮組織を修復させることを発見した。
【００４１】
別の実施態様において間葉系幹細胞は、移植臓器又は組織の拒絶により引き起こされる、腎臓、心臓、及び肺を含むがこれらに限定されない移植臓器又は組織に対する上皮傷害を修復するために動物に投与される。
【００４２】
さらに別の実施態様において間葉系幹細胞は、火傷、切傷、裂傷、皮膚潰瘍形成と糖尿病性潰瘍形成を含む潰瘍形成により引き起こされる上皮傷害を修復するために動物に投与される。
【００４３】
間葉系幹細胞は、上記したようにヒト及び非ヒト霊長類を含む哺乳動物に投与される。
【００４４】
間葉系幹細胞はまた、上記したように全身的に投与される。
【００４５】
間葉系幹細胞は、動物の上皮傷害を修復するために有効な量で投与される。間葉系幹細胞は、約１×１０5細胞／ｋｇ〜約１×１０7細胞／ｋｇの量で投与される。別の実施態様において間葉系幹細胞は、約１×１０6細胞／ｋｇ〜約５×１０6細胞／ｋｇの量で投与される。投与される間葉系幹細胞の正確な用量は、患者の年齢、体重、性、修復される上皮傷害のタイプ、及びその程度と重症度を含む種々の要因に依存する。
【００４６】
本発明の別の態様において、動物の癌を治療する方法が提供される。この方法は、動物の癌を治療するために有効な量の間葉系幹細胞を動物に投与することを含む。
【００４７】
本発明のこの態様の範囲はいかなる理論にも限定されないが、間葉系幹細胞が樹状細胞と相互作用してＩＦＮ−βを分泌させ、これが次に腫瘍サプレッサーとして作用すると考えられる。治療される癌には、特に限定されないが、肝細胞癌、子宮頚癌、膵臓癌、前立腺癌、線維肉腫、髄芽細胞腫、及び星状細胞腫がある。しかし本発明の範囲は特定の種類の癌に限定されないことを理解されたい。
【００４８】
動物は上記したようにヒト及び非ヒト霊長類を含む哺乳動物である。
【００４９】
間葉系幹細胞は、動物の癌を治療するために有効な量で投与される。一般に間葉系幹細胞は、約１×１０5細胞／ｋｇ〜約１×１０7細胞／ｋｇの量で投与される。別の実施態様において間葉系幹細胞は、約１×１０6細胞／ｋｇ〜約５×１０6細胞／ｋｇの量で投与される。投与される間葉系幹細胞の正確な用量は、患者の年齢、体重、性、治療される癌のタイプ、及びその程度と重症度を含む種々の要因に依存する。
【００５０】
上記したように、間葉系幹細胞は薬学的に許容される担体とともに投与され、全身的に投与される。あるいは間葉系幹細胞は、治療される癌に直接投与される。
【００５１】
本発明の別の態様において、動物のアレルギー疾患又は障害を治療する方法が提供される。この方法は、動物のアレルギー疾患又は障害を治療するために有効な量の間葉系幹細胞を動物に投与することを含む。
【００５２】
本発明のこの態様の範囲はいかなる理論にも限定されないが、間葉系幹細胞が急性アレルギー応答後に投与されると、肥満細胞活性化と脱顆粒の阻害を提供すると考えられる。また間葉系幹細胞は好塩基球活性化をダウンレギュレートし、サイトカイン、例えばＴＮＦ−α、ケモカイン、例えばインターロイキン−８、単球化学誘引性タンパク質（すなわちＭＣＰ−１）、脂質メディエーター、例えばロイコトリエンを阻害し、主要なメディエーター、例えばヒスタミン、ヘパリン、コンドロイチン硫酸、及びカテプシンを阻害すると考えられる。
【００５３】
治療されるアレルギー疾患又は障害には、特に限定されないが、喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、及び接触皮膚炎がある。しかし、本発明の範囲は、特定のアレルギー疾患又は障害に限定されないことを理解されたい。
【００５４】
間葉系幹細胞は、動物のアレルギー疾患又は障害を治療するために有効な量で投与される。動物は哺乳動物でもよい。哺乳動物は、ヒト及び非ヒト霊長類を含む霊長類でもよい。一般に間葉系幹細胞は、約１×１０5細胞／ｋｇ〜約１×１０7細胞／ｋｇの量で投与される。別の実施態様において間葉系幹細胞は、約１×１０6細胞／ｋｇ〜約５×１０6細胞／ｋｇの量で投与される。投与される間葉系幹細胞の正確な用量は、患者の年齢、体重、性、治療されるアレルギー疾患又は障害、及びその程度と重症度を含む種々の要因に依存する。
【００５５】
上記したように、間葉系幹細胞は薬学的に許容される担体とともに投与される。間葉系幹細胞は、例えば静脈内又は動脈内投与のように全身的に投与される。
【００５６】
本発明のさらなる態様において、動物の創傷治癒を促進する方法が提供される。この方法は、動物の創傷治癒を促進するために有効な量の間葉系幹細胞を動物に投与することを含む。
【００５７】
本発明の範囲はいかなる理論にも限定されないが、上記したように間葉系幹細胞は、Ｔreg細胞と樹状細胞にインターロイキン−１−１０（ＩＬ−１０）を放出させる。ＩＬ−１０は、創傷の炎症を制限又は抑制し、こうして創傷治癒を促進する。
【００５８】
さらに間葉系幹細胞は、他のタイプの細胞により分泌因子を誘導することにより、創傷治癒と骨折治癒とを促進する。例えば間葉系幹細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）による血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）のプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ2）介在放出、ならびに成長ホルモン、インスリン、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）インスリン様増殖因子結合タンパク質−３（ＩＧＦＢＰ−３）、及びエンドテリン−１のＰＧＥ2介在放出を誘導する。
【００５９】
治癒される創傷には、特に限定されないが、切傷、裂傷、火傷、及び皮膚潰瘍形成から生じるものがある。
【００６０】
間葉系幹細胞は、動物の創傷治癒を促進するために有効な量で動物に投与される。動物は哺乳動物でもよく、哺乳動物はヒト及び非ヒト霊長類を含む霊長類でもよい。一般に間葉系幹細胞は、約１×１０5細胞／ｋｇ〜約１×１０7細胞／ｋｇの量で投与される。別の実施態様において間葉系幹細胞は、約１×１０6細胞／ｋｇ〜約５×１０6細胞／ｋｇの量で投与される。投与される間葉系幹細胞の正確な用量は、患者の年齢、体重、性、治療される創傷、及びその程度と重症度を含む種々の要因に依存する。
【００６１】
上記したように、間葉系幹細胞は薬学的に許容される担体とともに投与される。間葉系幹細胞は、上記したように全身的に投与される。あるいは間葉系幹細胞は、間葉系幹細胞を含有する包帯又はリザーバー上の液体で、創傷に直接投与される。
【００６２】
本発明のさらに別の態様において、動物の繊維症を治療または予防する方法が提供される。この方法は、動物の繊維症を治療または予防するために有効な量の間葉系幹細胞を動物に投与することを含む。
【００６３】
間葉系幹細胞は、肝硬変、最終段階腎疾患に関連する腎臓の繊維症、および肺の繊維症を含むがこれらに限定されない動物の任意の種類の繊維症、成人型呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）および慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）を含むがこれらに限定されない肺の繊維症を治療または予防するために動物に投与される。本発明の範囲は特定の種類の繊維症に限定されないことを理解されたい。
【００６４】
間葉系幹細胞は、動物の繊維症を治療または予防するために有効な量で動物に投与される。動物は哺乳動物でもよく、哺乳動物はヒト及び非ヒト霊長類を含む霊長類でもよい。一般に間葉系幹細胞は、約１×１０5細胞／ｋｇ〜約１×１０7細胞／ｋｇの量で投与される。別の実施態様において間葉系幹細胞は、約１×１０6細胞／ｋｇ〜約５×１０6細胞／ｋｇの量で投与される。投与される間葉系幹細胞の正確な用量は、患者の年齢、体重、性、治療または予防される繊維症の程度と重症度を含む種々の要因に依存する。
【００６５】
間葉系幹細胞は、上記したように薬学的に許容される担体とともに投与される。間葉系幹細胞は上記したように全身的に投与される。
【００６６】
本発明の別の目的は、動物の組織又は臓器の血管形成であって、該組織又は臓器は血管形成が必要である、血管形成を促進することである。
【００６７】
本発明のさらなる態様において、動物の臓器又は組織の血管形成を促進する方法が提供される。この方法は、動物の臓器又は組織の血管形成を促進するために有効な量の間葉系幹細胞を動物に投与することを含む。
【００６８】
血管形成は、既存の微小血管床からの新しい血管の形成である。
【００６９】
血管形成の誘導は、冠動脈及び末梢動脈不全症を治療するために使用され、冠動脈疾患、虚血性心疾患、及び末梢血動脈疾患の治療のための非侵襲的及び治療的アプローチでもよい。血管形成は心臓以外の組織や臓器の疾患と障害の治療、ならびに心臓以外の臓器の成長及び／又は維持において役割を果たす。血管形成は、内部及び外部創傷ならびに皮膚潰瘍の治療において役割を果たす。血管形成はまた、胚の着床、胎盤成長、ならびに胚血管の成長において役割を果たす。血管形成はまた、軟骨再吸収と骨形成との連結に必須であり、正しい成長板の形態形成に必須である。
【００７０】
さらに血管形成は、充分な栄養物質と気体輸送を提供するために必要な高密度の血管ネットワークが必要な高代謝臓器、例えば肝臓の構築と維持の成功に必要である。
【００７１】
間葉系幹細胞は、種々の方法により血管形成の必要な組織又は臓器に投与することができる。間葉系幹細胞は、例えば静脈内、動脈内、又は腹腔内投与により全身的に投与されるか、又は間葉系幹細胞は、例えば血管形成の必要な組織又は臓器への直接投与により、血管形成の必要な組織又は臓器に直接投与される。
【００７２】
間葉系幹細胞は、自己、同種異系、又は異種を含む範囲の供給源由来でもよい。
【００７３】
本発明の範囲はいかなる理論にも限定されないが、間葉系幹細胞は動物に投与されると、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を刺激して血管内皮増殖因子（すなわちＶＥＧＦ）を産生させ、これが新しい血管の形成を刺激すると考えられる。
【００７４】
ある実施態様において動物は哺乳動物である。哺乳動物は、ヒト及び非ヒト霊長類を含む霊長類でもよい。
【００７５】
本発明の間葉系幹細胞は、血管形成を介して緩和、治療、又は予防できる疾患もしくは障害の治療、緩和、又は予防に使用される。例えば間葉系幹細胞は、四肢（すなわち腕、脚、手、及び足）、ならびに首又は種々の臓器中の閉塞動脈を治療するために動物に投与される。例えば間葉系幹細胞は、脳の需要を満たす閉塞動脈を治療、従って卒中を治療又は予防するために使用される。また間葉系幹細胞は、胚及び生後角膜の血管を治療するために使用され、かつ糸球体構造形成を提供するために使用される。別の実施態様において間葉系幹細胞は、内部及び外部の創傷の治療、ならびに糖尿病や鎌状赤血球貧血のような疾患により引き起こされる皮膚潰瘍を含むがこれらに限定されない足、手、脚、又は腕の皮膚潰瘍の治療に使用される。
【００７６】
さらに血管形成は胚の着床と胎盤形成に関与するため、間葉系幹細胞は胚の着床を促進し流産を防ぐために使用される。
【００７７】
さらに間葉系幹細胞は、胎内の動物の血管の成長を促進するために、ヒトを含む胎内の動物に投与される。
【００７８】
別の実施態様において間葉系幹細胞は、軟骨再吸収と骨形成を促進し、正しい成長板の形態形成を促進するために、生後又は生前の動物に投与される。
【００７９】
間葉系幹細胞は、動物の血管形成を促進するために有効な量で投与される。間葉系幹細胞は、約１×１０5細胞／ｋｇ〜約１×１０7細胞／ｋｇの量で投与される。別の実施態様において間葉系幹細胞は、約１×１０6細胞／ｋｇ〜約５×１０6細胞／ｋｇの量で投与される。投与される間葉系幹細胞の量は、患者の年齢、体重、性、治療、緩和、又は予防される疾患もしくは障害、及びその程度と重症度を含む種々の要因に依存する。
【００８０】
間葉系幹細胞は薬学的に許容される担体とともに投与してもよい。例えば間葉系幹細胞は、注射用のための薬学的に許容される液体媒体中で細胞懸濁液として投与してもよい。注射は、局所的、すなわち血管形成の必要な組織又は臓器に直接、又は全身性でもよい。
【００８１】
間葉系幹細胞は、治療薬をコードする１つ又はそれ以上のポリヌクレオチドを用いて遺伝子操作してもよい。ポリヌクレオチドは、適切な発現ビヒクルを介して間葉系幹細胞に提供される。間葉系幹細胞を遺伝子操作するために使用される発現ビヒクルには、特に限定されないが、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、及びアデノ関連ウイルスベクターがある。
【００８２】
治療薬をコードする適切なポリヌクレオチドの選択は、治療される疾患もしくは障害、及びその程度と重症度を含む種々の要因に依存する。治療薬をコードするポリヌクレオチド及び適切な発現ビヒクルは、さらに米国特許第６，３５５，２３９号明細書に記載されている。
【００８３】
間葉系幹細胞は上記治療で使用される時には、増殖因子、サイトカイン、抗炎症剤のような薬剤を含むがこれらに限定されない当業者に公知の他の治療薬、と間葉系幹細胞以外の細胞、例えば樹状細胞とを組合せて使用されるか、あるいは細胞のための可溶性担体、例えばヒアルロン酸、又は適宜固体マトリックス、例えば、コラーゲン、ゼラチン、又は他の生体適合性ポリマーと組合せて投与される。
【００８４】
本明細書に記載の方法は、多くの方法でかつ当該分野で公知の種々の修飾及び置換を用いて行われる。細胞タイプ間の作用又は相互作用のモードについて提唱されている理論は、決して本発明を限定するものではなく、本発明の方法をよりよく理解できるように提供されていることを理解されたい。
【００８５】
本発明を図面により説明する。
【００８６】
図１。ＭＳＣは樹状細胞機能を調節する。（Ａ）ＨＬＡ−ＤＲとＣＤ１１ｃに対する抗体を使用する成熟単球ＤＣ１細胞のフローサイトメトリー解析と、ＨＬＡ−ＤＲとＣＤ１２３（ＩＬ−３受容体）に対する抗体を使用する形質球様ＤＣ２細胞のフローサイトメトリー解析。（破線）：アイソタイプ対照；（実線）：ＦＩＴＣ／ＰＥ結合抗体。（Ｂ）ＭＳＣは、活性化ＤＣ１とＤＣ２からの、それぞれＴＮＦ−α分泌（第１ｙ軸）を阻害し、ＩＬ−１０分泌（第２ｙ軸）を上昇させる。（Ｃ）成熟ＤＣ１細胞で培養したＭＳＣは、ＭＳＣもしくはＤＣ単独と比較して、Ｔ細胞によるＩＦＮ−γ分泌（第１ｙ軸）を阻害しＩＬ−４レベル（第２ｙ軸）を上昇させる。ＭＳＣの存在下での炎症促進性ＩＦＮ−γの産生低下と抗炎症性ＩＬ−４の産生増加は、Ｔ細胞集団の抗炎症性表現型への移動を示した。
【００８７】
図２。ＭＳＣは炎症促進性エフェクターＴ細胞機能を阻害する。（Ａ）ＦＩＴＣ結合ＣＤ４（ｘ軸）抗体とＰＥ結合ＣＤ２５（ｙ軸）抗体を用いる、ＭＳＣ＋ＰＢＭＣ培養物（ＭＳＣ＋ＰＢＭＣ）中のＰＢＭＣ又は非接着性画分を染色することによるＴReg細胞数（％）のフローサイトメトリー解析。ゲートはバックグランドとしてのアイソタイプ対照抗体に基づく。グラフは５つの独立した実験の典型である。（Ｂ）細胞培養上清中で、ＭＳＣの存在下で生成したＴH１細胞は低レベルのＩＦＮ−γ（第１ｙ軸）を分泌し、ＭＳＣの存在下で生成したＴH２細胞は増加量のＩＬ−４（第２ｙ軸）を分泌した。（Ｃ）ＭＳＣは、２４ウェルプレート中で０、２４、又は４８時間培養した精製ＮＫ細胞からのＩＦＮ−γ分泌を阻害する。示したデータは１つの実験の平均±ＳＤサイトカイン分泌であり、３つの独立した実験の典型である。
【００８８】
図３。ＭＳＣはＴreg細胞集団の数とＧＩＴＲ発現を上昇させる。（Ａ）ＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔreg細胞集団を、ＰＢＭＣ又はＭＳＣ＋ＰＢＭＣ（ＭＳＣ対ＰＢＭＣ比は１：１０）培養物（さらなる刺激無しで３日間培養した）から２工程磁性単離法を使用して単離した。これらの細胞に放射線照射し（さらなる増殖を阻止するため）、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）において刺激細胞として使用し、ここで応答細胞は植物性血球凝集素（ＰＨＡ）（２．５ｍｇ／ｍｌ）の存在下の同種異系ＰＢＭＣ（刺激細胞対応答細胞比は１：１００）であった。細胞を４８時間培養し、次に3Ｈチミジンを加え、２４時間後、取り込まれた放射活性を計測した。結果は、ＭＳＣの存在下で生成したＴreg集団（レーン３）は、ＭＳＣの非存在下で生成したＴreg細胞（レーン２）と機能的に同等であることを示した。（Ｂ）ＰＢＭＣをＭＳＣの非存在下（上のプロット）又は存在下（下のプロット）で３日間培養（ＭＳＣ対ＰＢＭＣ比は１：１０）し、次に非接着画分を採取し、ＦＩＴＣ標識ＧＩＴＲとＰＥ標識ＣＤ４で免疫染色した。結果は、ＭＳＣの存在下で培養した細胞でＧＩＴＲ発現の２倍以上の上昇を示す。
【００８９】
図４。ＭＳＣはＰＧＥ2を産生し、ＰＧＥ2を阻止するとＭＳＣ性免疫調節作用が逆転する。（Ａ）種々の濃度のＰＧＥ2ブロッカーであるＮＳ−３９８又はインドメタシン（Ｉｎｄｏｍｅｔｈ．）の存在下又は非存在下で培養したＭＳＣから得られた培養上清中のＰＧＥ2分泌（平均±ＳＤ）。インヒビター濃度はμＭであり、示したデータは２４時間培養後に得られた値である。（Ｂ）リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを使用したＭＳＣとＰＢＭＣ中のＣＯＸ−１とＣＯＸ−２発現。ＭＳＣはＰＢＭＣと比較して有意に高レベルのＣＯＸ−２を発現し、ＭＳＣをＰＢＭＣの存在下で培養すると、ＭＳＣ中のＣＯＸ−２発現の３倍を超える上昇があった。１〜３つの独立した実験からの典型的データを示す。ＭＳＣ＋ＰＢＭＣ培養物をトランスウェルチャンバープレート中で準備し、ここでＭＳＣは下のチャンバーに蒔き、ＰＢＭＣは上のチャンバーに蒔いた。（Ｃ）ＰＧＥ2ブロッカーであるインドメタシン（Ｉｎｄ．）又はＮＳ−３９８の存在は、対照と比較して、活性化ＤＣ（白バー）からのＴＮＦ−α分泌と、ＴH１細胞（斜線バー）からのＩＦＮ−γ分泌を上昇させる。データは、ＭＳＣとＰＧＥ2インヒビターの非存在下で生成した培養物からの％変化として計算した。（Ｄ）ＭＳＣ−ＰＢＭＣ同時培養物（１：１０）中のＰＧＥ2ブロッカーであるインドメタシン（Ｉｎｄｏ）又はＮＳ−３９８の存在は、ＰＨＡ処理ＰＢＭＣに対するＭＳＣ性抗増殖作用を逆転させる。示したデータは１つの実験からであり、３つの独立した実験の典型である。
【００９０】
図５。構成性ＭＳＣサイトカイン分泌は同種異系ＰＢＭＣの存在下で上昇する。すでに性状解析したヒトＭＳＣを使用して、ＰＢＭＣの存在下（斜線）又は非存在下（白い棒）（ＭＳＣ対ＰＢＭＣ比は１：１０）で２４時間培養したＭＳＣの培養上清中のサイトカインＩＬ−６とＶＥＧＦ、脂質メディエーターＰＧＥ2、及びマトリックス金属プロテアーゼ１（ｐｒｏ−ＭＭＰ−１）のレベルを分析した。ＭＳＣはＩＬ−６、ＶＥＧＦ、及びＰＧＥ2を構成性に産生し、これらの因子のレベルはＰＢＭＣとの同時培養で上昇し、従ってＭＳＣが炎症性状況で免疫機能の調節において役割を果たすことを示唆する。
【００９１】
図６。ＭＳＣは分裂促進剤誘導性のＴ細胞増殖を用量依存的に阻害する。増加する数の同種異系ＰＢＭＣを、ＰＨＡ（２．５ｍｇ／ｍｌ）の存在下又は非存在下で９６ウェルプレートに蒔いた一定数のＭＳＣ（２，０００細胞／ウェル）とインキュベートし、3Ｈチミジン取り込みを測定した（１分当たりのカウント、ｃｐｍ）。ＭＳＣの存在下でＰＨＡ処理ＰＢＭＣの増殖の用量依存性阻害があった。３つの独立した実験の１つからの典型的結果を示す。同様の結果が、LeBlanc, et al., Scand J. Immunol., Vol. 57, pg. 11 (2003)により報告された。
【００９２】
図７。提唱されているＭＳＣ作用機構の模式図
ＭＳＣは、先天的（ＤＣ経路２〜４；及びＮＫ経路６）免疫系と適応（Ｔ経路１と５、及びＢ経路７）免疫系の両方からの細胞に影響を与えることにより免疫調節作用を仲介する。浸入病原体に応答して未成熟ＤＣは、侵入可能部位に移動し、成熟し、未処理のＴ細胞を刺激して（抗原特異的及び同時刺激シグナルにより）、防御性エフェクターＴ細胞（細胞性ＴH１又は体液性ＴH２免疫）になる能力を獲得する。ＭＳＣ−ＤＣ相互作用中に、ＭＳＣは直接の細胞−細胞接触により又は分泌された因子により、細胞性応答（経路２）を開始するＤＣの能力を制限することにより、又は体液性応答（経路４）を開始する能力を促進することにより、免疫応答の結果を変化させる。また成熟エフェクターＴ細胞が存在する時、ＭＳＣはこれらと相互作用してＴH１（経路１）応答のバランスをＴＨ2応答（経路５）に向けて、おそらくＩｇＥ産生Ｂ細胞活性（経路７）の上昇（これは、ＧｖＨＤと自己免疫疾患症状の抑制に好ましい結果である）に向ける。ＭＳＣはＴReg集団（経路３）の生成を増加させる能力により、寛容表現型となり、局所的微小環境におけるバイスタンダー（bystander）炎症を緩和することにより受容体宿主を助ける。点線（----）は提唱された機構である。
【００９３】
本発明を以下の実施例で説明する；しかし本発明の範囲は決してこれらにより限定されるものではない。
【００９４】
実施例１
【００９５】
材料と方法
【００９６】
ヒトＭＳＣの培養
ヒトＭＳＣを、Pittenger et al., Science, Vol. 284, pg. 143 (1999)に記載されたように培養した。すなわち、Poietics Technologies, Div of Cambrex Biosciencesによるインフォームドコンセントの後、匿名のドナーの腸骨稜から骨髄試料を採取した。１％抗生物質−抗真菌剤溶液（Invitrogen, Carlsbad, California）と１０％牛胎児血清（FBS, JRH BioSciences, Lenexa, Kansas）を含有する完全ダルベッコー改変イーグル培地−低グルコース（Life Technologies, Carlsbad, California）中でＭＳＣを培養した。ＭＳＣは接着性単層として増殖し、トリプシン／ＥＤＴＡを用いて剥がした（０．０５％トリプシンで３７℃で３分）。使用したすべてのＭＳＣは多分化性についてすでに性状解析され、間葉性系統（軟骨細胞性、脂肪細胞生成性、及び骨形成性）に分化する能力を保持した（Pittenger, et al., Science, Vol. 284, pg. 143 (1999)）。
【００９７】
樹状細胞の単離
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、Poietics Technologies, Div of Cambrex Biosciences (Walkersville, MD)から得た。単球系統（ＣＤ１ｃ+）の樹状細胞（ＤＣ）の前駆体を、Dzionek, et. al., J. Immunol., Vol. 165, pg. 6037 (2000)に従う２工程磁性分離法を使用して、ＰＢＭＣから陽性選択した。すなわち、ＣＤ１ｃ発現Ｂ細胞を磁性ビーズを使用してＣＤ１９+細胞を磁性的に枯渇させ、次にＢ細胞枯渇画分をビオチン標識ＣＤ１ｃ（ＢＤＣＡ１+）と抗ビオチン抗体とで標識し、製造業者（Miltenyi Biotech, Auburn, California）の説明書に従って磁性カラムを使用して、非標識細胞画分からこれらを分離した。陽性標識した抗体コーティング細胞（ＢＤＣＡ２+）（Miltenyi Biotech, Auburn, California）の免疫−磁性分類により、ＰＢＭＣから形質細胞様系統のＤＣの前駆体を単離した。
【００９８】
ＭＳＣ−ＤＣ培養
ほとんどの実験でヒトＭＳＣとＤＣを同じ数で種々の時間培養し、細胞培養物上清を採取し、さらに評価するまで−８０℃で保存した。選択された実験で、ＭＳＣを成熟ＤＣ１もしくはＤＣ２細胞（１：１  ＭＳＣ：ＤＣ比）と３日間培養し、次に一緒にした培養物（ＭＳＣとＤＣ）に放射線照射してさらなる増殖を止めた。次に抗体で精製した未処理の同種異系Ｔ細胞（ＣＤ４+、ＣＤ４５ＲＡ+）を放射線照射ＭＳＣ／ＤＣに加え、さらに６日間培養した。次に培養物から非接着性細胞画分（精製Ｔ細胞）を採取し、２回洗浄し、ＰＨＡでさらに２４時間再刺激し、次に細胞培養上清を採取し、分離されたＩＦＮ−γとＩＬ−４についてＥＬＩＳＡにより分析した。
【００９９】
ＮＫ細胞の単離
ビオチン結合モノクローナル抗体のカクテル（抗−ＣＤ３、−ＣＤ１４、−ＣＤ１９、−ＣＤ３６、及び抗ＩｇＥ抗体）を１次試薬とし、マイクロビーズに結合した抗ビオチンモノクローナル抗体を２次標識試薬として、磁性標識した非ＮＫ細胞を枯渇させることにより、ＮＫ細胞の精製集団が得られた。磁性標識した非ＮＫ細胞は、磁界中でＭＡＣＳ（Miltenyi Biotech, Auburn, California）カラム中に保持され、ＮＫ細胞は通過し、採取された。
【０１００】
ＴReg細胞集団の単離
２工程単離法を使用してＴReg細胞集団を単離した。まずビオチン標識抗体のカクテルと抗ビオチンマイクロビーズを用いて、非ＣＤ４+ Ｔ細胞を間接に磁性標識した。次に標識した細胞をＭＡＣＳカラム（Miltenyi Biotech, Auburn, California）で分離して枯渇させた。次にＣＤ４+ＣＤ２５+細胞をＣＤ２５マイクロビーズで直接標識し、あらかじめ濃縮したＣＤ４+ Ｔ細胞画分から陽性選択により単離した。磁性標識したＣＤ４+ＣＤ２５+細胞はカラムに保持され、磁界からカラムを取り出した後溶出した。
【０１０１】
ＭＳＣの存在下で生成されたＣＤ４+ＣＤ２５+集団の増加が自然界で抑制性であるかどうかを調べるために、ＣＤ４+ＣＤ２５+ Ｔreg細胞集団を、２工程磁性単離法を使用してＰＢＭＣ又はＭＳＣ＋ＰＢＭＣ（ＭＳＣ対ＰＢＭＣ比は１：１０）培養物（さらなる刺激無しで３日間培養した）から単離した。これらの細胞に放射線照射してさらなる増殖を阻止し、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）で刺激細胞として使用し、ここで応答細胞はＰＨＡ（２．５μｇ／ｍｌ）の存在下で同種異系ＰＢＭＣ（刺激細胞対応答細胞の比は１：１００）であった。４８時間培養を行い。次に3Ｈチミジンを加えた。２４時間後に取り込まれた放射活性を計測した。
【０１０２】
ＭＳＣの非存在下又は存在下でＰＢＭＣを培養（ＭＳＣ対ＰＢＭＣ比は１：１０）し、次に非接着性画分を採取し、ＦＩＴＣ標識グルココルチコイド誘導性ＴＮＦ受容体（すなわちＧＩＴＲ）、及びＰＥ標識ＣＤ４で免疫染色した。
【０１０３】
ＴH１／ＴH２細胞の作製
２×１０6細胞／ｍｌで３７℃で４５分、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をプレートに蒔き、単球を除去した。非接着性画分をプレート結合抗ＣＤ３（５μｇ／ｍｌ）と抗ＣＤ２８（１μｇ／ｍｌ）抗体の存在下で、ＴH１（ＩＬ−２（４ｎｇ／ｍｌ）＋ＩＬ−１２（５ｎｇ／ｍｌ）＋抗ＩＬ−４（１μｇ／ｍｌ））条件又はＴH２（ＩＬ−２（４ｎｇ／ｍｌ）＋ＩＬ−４（４ｎｇ／ｍｌ）＋抗ＩＦＮ−γ（１μｇ／ｍｌ））条件で３日間、ＭＳＣの存在下又は非存在下でインキュベートした。細胞を洗浄し、次にＰＨＡ（２．５μｇ／ｍｌ）でさらに２４もしくは４８時間再刺激し、次に培養上清中のＩＦＮ−γとＩＬ−４のレベルをＥＬＩＳＡ（R&D Systems, Minneapolis, Minnesota）により測定した。
【０１０４】
ＭＳＣの培養上清中のＶＥＧＦ、ＰＧＥ2、及びｐｒｏ−ＭＭＰ−１のレベルの分析
すでに性状解析されたヒトＭＳＣを使用して、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、ＶＥＧＦ、脂質メディエータープロスタグランジンＥ2（ＰＧＥ2）、及びマトリックス金属プロテアーゼ１（ｐｒｏ−ＭＭＰ−１）のレベルを、ＰＢＭＣの存在下又は非存在下（ＭＳＣ対ＰＢＭＣ比は１：１０）で２４時間培養したＭＳＣの培養上清で分析した。
【０１０５】
ＰＢＭＣの増殖
フィコール−ハイパーク（Lymphoprep, Oslo, Norway）上でleukopack（Cambrex, Walkersville, Maryland）を遠心分離して、精製ＰＢＭＣを調製した。分離した細胞をＭＳＣ（ＰＢＭＣ添加の３〜４時間前にプレートに蒔いて沈降させた）の存在下又は非存在下で、分裂促進剤ＰＨＡ（Sigma Chemicals, St. Louis, Missouri）の存在下で４８時間培養した（三重測定）。選択された実験で、ＰＢＭＣをＰＧＥ2インヒビターであるインドメタシン（Sigma Chemicals, St. Louis, Missouri）又はＮＳ−９３８（Cayman Chemicals, Ann Arbor, Michigan）を含有する培地に再懸濁した。（3Ｈ）チミジンを加え（２００μｌの培養物に２０μｌ）、さらに２４時間培養後自動ハーベスターを使用して細胞を採取した。ＭＳＣ又はＰＧＥ2ブロッカーの作用を、ＰＨＡの存在下での対照応答（１００％）のパーセントとして計算した。
【０１０６】
定量的ＲＴ−ＰＣＲ
市販のキット（Qiagen, Valencia, California）を使用して製造業者の説明書に従って、細胞ペレットから総ＲＮＡを調製した。混入しているゲノムＤＮＡをＤＮＡフリーキット（Ambion, Austin, Texas）を使用して除去した。QuantiTect SYBR Green RT-PCR キット（Qiagen, Valencia, California）を使用して、０．５μＭ濃度のプライマーを用いて、MJ Research Opticon検出系（South San Francisco, California）で定量的ＲＴ−ＰＣＲを行った。異なる条件で培養した細胞中の発現レベルの相対的変化を、β−アクチンを内部対照として使用してＣｔ値（交差点）の差により計算した。ＣＯＸ−１及びＣＯＸ−２特異的プライマーの配列は以下の通りであった：ＣＯＸ−１：5'-CCG GAT GCC AGT CAG GAT GAT G-3' （フォワード）、5'-CTA GAC AGC CAG ATG CTG ACA G-3' （リバース)；COX-2：5'-ATC TAC CCT CCT CAA GTC CC-3'（フォワード）、 5'-TAC CAG AAG GGC AGG ATA CAG-3' （リバース）。
【０１０７】
増加する数の同種異系ＰＢＭＣを、９６ウェルプレート上に蒔いた一定数のＭＳＣ（２，０００細胞／ウェル）と、ＰＨＡ（２．５μｇ／ｍｌ）の存在下で７２時間インキュベートし、3Ｈチミジンの取り込み（１分当たりのカウント、ｃｐｍ）を測定した。ＰＢＭＣとＭＳＣは、ＭＳＣ：ＰＢＭＣが１：１、１：３、１：１０、１：３０、及び１：８１の比で培養した。
【０１０８】
結果  本試験では、ヒトＭＳＣと、樹状細胞（ＤＣ１とＤＣ２）、エフェクターＴ細胞（ＴH１とＴH２）及びＮＫ細胞を含む単離した免疫細胞集団との相互作用を調べた。ＭＳＣと各免疫細胞タイプとの相互作用は特定の結果を有し、ＭＳＣが免疫応答プロセスのいくつかの工程を調節することを示唆した。ＭＳＣ免疫調節作用を調節し、これの原因かも知れない分泌因子の産生を評価し、プロスタグランジン合成が示唆された。
【０１０９】
それぞれＢＤＣＡ１+とＢＤＣＡ２+細胞の免疫磁性分類により、骨髄性（ＤＣ１）と形質細胞性（ＤＣ２）前駆樹状細胞を単離し、ＤＣ１細胞についてはＧＭ−ＣＳＦとＩＬ−４（それぞれ１×１０3ＩＵ／ｍｌと１×１０3ＩＵ／ｍｌ）と、ＤＣ２細胞についてはＩＬ−３（１０ｎｇ／ｍｌ）とインキュベートして成熟させた。フローサイトメトリーを使用すると、ＤＣ１細胞はＨＬＡ−ＤＲ+であり、一方ＤＣ２細胞はＨＬＡ−ＤＲ+とＣＤ１２３+であった（図１Ａ）。炎症性物質である細菌リポ多糖（ＬＰＳ、１ｎｇ／ｍｌ）の存在下で、ＤＣ１細胞は中レベルのＴＮＦ−αを産生したが、ＭＳＣが存在する時（調べた比率１：１と１：１０）は、ＴＮＦ−α分泌の＞５０％低下があった（図１Ｂ）。一方ＤＣ２細胞はＬＰＳの存在下でＩＬ−１０を産生し、そのレベルは、ＭＳＣ：ＤＣ２同時培養（１：１）で２倍以上上昇した（図１Ｂ）。従ってＭＳＣは培養物中の活性化ＤＣのサイトカインプロフィールをより寛容原性表現型に修飾した。さらに活性化ＤＣはＭＳＣと培養するとＩＦＮ−γを低下させ、かつ未処理のＣＤ４+Ｔ細胞により分泌されるＩＬ−４レベルを上昇（図１Ｃ）させることができ、炎症促進性から抗炎症性Ｔ細胞表現型へのＭＳＣ性シフトを示唆した。
【０１１０】
上昇したＩＬ−１０分泌は制御細胞の生成において役割を果たす（Kingsley, et al., J. Immunol., Vol. 168, pg. 1080 (2002)）ため、Ｔ制御細胞（ＴReg）は、ＰＢＭＣとＭＳＣの同時培養でフローサイトメトリーにより定量した。ＰＢＭＣとＭＳＣを３〜５日間培養すると、抗ＣＤ４と抗ＣＤ２５抗体を用いてＰＢＭＣを染色して測定したＴReg細胞数が増加し（図２Ａ）、これはＭＳＣ誘導性の寛容原性応答をさらに支持した。ＭＳＣの存在下で生成するＣＤ４+ＣＤ２５+ ＴReg細胞集団は、グルココルチコイド誘導性のＴＮＦ受容体（ＧＩＴＲ）（ＴReg細胞集団上で発現される細胞表面受容体）のレベル上昇を示し、自然界では同種異系Ｔ細胞増殖を抑制したため抑制性であった（図３Ａ、３  Ｂ）。次にＴ細胞分化に影響を与えるその直接能力についてＭＳＣを調べた。抗体で選択した精製Ｔ細胞（ＣＤ４+ Ｔｈ細胞）を使用して、ＩＦＮ−γ産生ＴH１細胞とＩＬ−４産生ＴH２細胞を、ＭＳＣの存在下又は非存在下で作製した。分化中にＭＳＣが存在する時に、ＴH１細胞によるＩＦＮ−γ分泌が低下し、ＴH２細胞によるＩＬ−４分泌が上昇した（図２Ｂ）。Ｔ細胞がエフェクターＴH１又はＴH２型（データは示していない）に分化（３日目）した後にＭＳＣを培養物に加えると、ＩＦＮ−γとＩＬ−４レベルに有意な変化はなかった。これらの実験は、ＭＳＣがエフェクターＴ細胞分化に直接影響を与え、Ｔ細胞サイトカイン分泌を体液性表現型に変化させることを示唆する。
【０１１１】
同様に、ＭＳＣを精製ＮＫ細胞（ＣＤ３−、ＣＤ１４−、ＣＤ１９−、ＣＤ３６−）と１：１の比率で異なる時間（０〜４８時間）培養すると、培養上清中でＩＦＮ−γ分泌が低下（図２Ｃ）し、従ってＭＳＣがＮＫ細胞機能も調節できることを示唆する。
【０１１２】
以前の研究は、ＭＳＣが可溶性因子によりＴ細胞機能を修飾することを示している（LeBlanc, et al., Exp. Hematol., Vol. 31 , pg. 890 (2003); Tse, et al., Transplantation, Vol. 75, pg. 389 (2003)）。ＭＳＣは、ＩＬ−６、プロスタグランジンＥ2、ＶＥＧＦ、及びｐｒｏ−ＭＭＰ−１を含むいくつかの因子を構成的に分泌し、それぞれのレベルがＰＢＭＣとの培養により上昇することが観察された（図５）。ＤＣによるＴＮＦ−αの阻害とＩＬ−１０産生の上昇を引き起こすＭＳＣ由来因子を調べるために、プロスタグランジンＥ2の役割の可能性を調べた（これは活性化ＤＣによるＴＮＦ−α産生を阻害することが証明されているため）（Vassiliou, et al., Cell. Immunol., Vol. 223, pg. 120 (2003)）。ＭＳＣ培養物（０．５×１０6細胞／ｍｌの２４時間培養物）からの調整培地は約１０００ｐｇ／ｍｌのＰＧＥ2を含有した（図４Ａ）。培養上清中にＰＧＥ2分泌の公知のインデューサー、例えば、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、又はＩＬ−１βの検出可能な存在は無く（データは示していない）、ＭＳＣによるＰＧＥ2の構成性分泌を示している。ｈＭＳＣによるＰＧＥ2分泌は、ＰＧＥ2産生の公知のインヒビター［ＮＳ−３９８（５μＭ）及びインドメタシン（４μＭ）］の存在下で６０〜９０％阻害された（図４Ａ）。構成的活性なシクロオキシゲナーゼ酵素１（ＣＯＸ−１）と誘導性シクロオキシゲナーゼ酵素２（ＣＯＸ−２）の酵素活性の結果としてＰＧＥ2分泌の放出が起きるため（Harris, et al., Trends Immunol., Vol. 23, pg. 144 (2002)）、トランスウェル培養系を使用してＭＳＣとＰＢＭＣ中のＣＯＸ−１とＣＯＸ−２のｍＲＮＡ発現を分析した。ＭＳＣは、ＰＢＭＣと比較して有意に高レベルのＣＯＸ−２を発現し、その発現レベル上昇は、ＭＳＣとＰＢＭＣ（ＭＳＣとＰＢＭＣの比は１：１０）と２４時間同時培養すると＞３倍であった（図４Ｂ）。ＣＯＸ−１レベルにわずかな変化が見られ、ＭＳＣ−ＰＢＭＣ同時培養でのＰＧＥ2分泌の上昇（図５）はＣＯＸ−２のアップレギュレーションにより仲介されることを示唆している。ＤＣとＴ細胞に対するＭＳＣの免疫調節作用がＰＧＥ2により仲介されるかどうかを調べるために、ＰＧＥ2インヒビターであるＮＳ−３９８又はインドメタシンの存在下でＭＳＣを活性化樹状細胞（ＤＣ１）又はＴH１細胞と培養した。ＮＳ−３９８又はインドメタシンの存在は、それぞれＤＣ１によるＴＮＦ−α分泌と、ＴH１細胞によるＩＦＮ−γ分泌を上昇させ（図４Ｃ）、免疫細胞タイプへのＭＳＣの作用は分泌されたＰＧＥ2により仲介されることを示唆した。最近の研究は、種々の刺激により誘導されるＴ細胞増殖をＭＳＣが阻害することを証明している（DeNicola, et al., Blood, Vol. 99, pg. 3838 (2002); LeBlanc, et al., Scand. J. Immunol., Vol. 57, pg. 11 (2003)）。ＭＳＣは分裂促進剤誘導性のＴ細胞増殖を用量依存性に阻害（図６）し、ＰＧＥ2インヒビターであるＮＳ−３９８（５μＭ）又はインドメタシン（４μＭ）が存在すると、インヒビターの無い対照と比較して、培養物を含有するＭＳＣ中のＰＨＡ処理ＰＢＭＣにより（3Ｈ）チミジン取り込みが＞７０％上昇することが観察された（図４Ｄ）。
【０１１３】
要約すると、ＭＳＣと他の免疫細胞種との相互作用のモデル（図７）が提唱される。成熟Ｔ細胞が存在すると、ＭＳＣが直接これらと相互作用し、炎症促進ＩＦＮ−γ産生（経路１）を阻害し、制御性Ｔ細胞表現型（経路３）を増加させ、抗炎症性ＴH２細胞（経路５）を増加する。さらにＭＳＣは、ＰＧＥ2を分泌することにより、炎症促進ＤＣ１細胞を阻害（経路２）することにより、及び抗炎症性ＤＣ２細胞（経路４）又は制御性ＤＣ（経路３）を増加させることにより、ＤＣを介するＴ細胞免疫応答の結果を変化させることができる。ＴH２免疫へのシフトは、ＩｇＥ／ＩｇＧ１サブタイプ抗体の生成上昇（経路７）へのＢ細胞活性の変化を示唆する。ＭＳＣはＮＫ細胞からのＩＦＮ−γ分泌を阻害する能力により、ＮＫ細胞機能を修飾するようである（経路６）。このＭＳＣ：免疫細胞相互作用のモデルは、いくつかの他の実験室で行われた実験と一致する（LeBlanc, et al., Exp. Hematol., Vol. 31 , pg. 890 (2003); Tse, et al., Transplantation, Vol. 75, pg. 389 (2003); DiNicola, et al., Blood, Vol. 99, pg. 3838 (2002)）。提唱された機構のさらなる研究が進行中であり、ＭＳＣ投与のインビボ作用を調べるために動物試験が必要である。
【０１１４】
実施例２
【０１１５】
重症の段階IVの消化管移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）に罹っている３３才の女性患者に間葉系幹細胞を投与した。この患者は他のすべてのＧＶＨＤ治療に抵抗性であった。患者の結腸の内視鏡観察は、治療前に潰瘍形成と炎症の部位を示した。患者の結腸の組織検査は、治療前にＧＶＨＤが患者の腸陰窩の大部分を破壊していることを証明した。
【０１１６】
患者は、体重１ｋｇ当たり３×１０6細胞の量でPlasma Lyte Aの５０ｍｌ中で同種異系間葉系幹細胞の静脈内注入を受けた。
【０１１７】
注入の２週間後患者を評価した。注入後２週間で、患者の結腸の内視鏡観察は、治療前に見えていた炎症部位と潰瘍形成が消失したことを示した。さらに患者の結腸の生検は、腸陰窩の有意な再生を示した。すなわち患者への間葉系幹細胞の投与により、消化管移植片対宿主病の炎症性成分の有意な低下と、新しい機能的小腸組織の再生が起きた。
【０１１８】
すべての特許、刊行物（公開された特許出願、寄託受け入れ番号、及びデータベース受け入れ番号を含む）は、すべての特許、刊行物（公開された特許出願、寄託受け入れ番号、及びデータベース受け入れ番号を含む）が具体的かつ個々に取り込まれているのと同じ程度に、参照することにより本明細書に組み込まれる。
【０１１９】
しかし本発明の範囲は本明細書に記載の具体例に限定されるものではないことを理解されたい。本発明は、本明細書の具体的な記載とは別に実施することができ、それでも添付の特許請求の範囲内にある。
発明の態様
［１］  心臓以外の動物の臓器又は組織中の血管形成を促進する方法であって、
該動物の心臓以外の臓器又は組織中の血管形成を促進するために有効な量の間葉系幹細胞を該動物に投与することを含む、前記方法。
［２］  前記動物が哺乳動物である、［１］記載の方法。
［３］  前記動物が霊長類である、［２］記載の方法。
［４］  前記霊長類がヒトである、［３］記載の方法。
［５］  前記間葉系幹細胞が、約１×１０5細胞／ｋｇ〜約１×１０7細胞／ｋｇの量で投与される、［１］記載の方法。
［６］  前記間葉系幹細胞が、約１×１０6細胞／ｋｇ〜約５×１０6細胞／ｋｇの量で投与される、［５］記載の方法。
［７］  前記間葉系幹細胞が全身的に投与される、［１］記載の方法。
［８］  前記間葉系幹細胞が静脈内に投与される、［１］記載の方法。
［９］  前記間葉系幹細胞が、前記動物の心臓以外の臓器又は組織への直接注入により投与される、［１］記載の方法。
［１０］  動物の自己免疫疾患及び移植片対宿主反応からなる群より選ばれる疾患を治療する方法であって、以下のステップ：
該動物の疾患を治療するために有効な量の間葉系幹細胞を該動物に投与すること、
を含む、前記方法。
［１１］  前記動物が哺乳動物である、［１０］記載の方法。
［１２］  前記哺乳動物がヒトである、［１１］記載の方法。
［１３］  前記疾患が多発性硬化症である、［１０］記載の方法。
［１４］  動物の炎症応答を治療するために有効な量の間葉系幹細胞を該動物に投与することを含む、動物の炎症応答の治療方法。
［１５］  前記動物が哺乳動物である、［１４］記載の方法。
［１６］  前記哺乳動物がヒトである、［１５］記載の方法。
［１７］  前記炎症応答が乾癬と関連している、［１４］記載の方法。
［１８］  動物の癌を治療するために有効な量の間葉系幹細胞を該動物に投与することを含む、動物の癌の治療方法。
［１９］  前記動物が哺乳動物である、［１８］記載の方法。
［２０］  前記哺乳動物がヒトである、［１９］記載の方法。
［２１］  動物のアレルギー疾患又は障害を治療するために有効な量の間葉系幹細胞を該動物に投与することを含む、動物のアレルギー疾患又は障害の治療方法。
［２２］  前記動物が哺乳動物である、［２１］記載の方法。
［２３］  前記哺乳動物がヒトである、［２２］記載の方法。
［２４］  前記のアレルギー疾患又は障害が関節炎である、［１４］記載の方法。
［２５］  動物の創傷治癒を促進するために有効な量の間葉系幹細胞を該動物に投与することを含む、動物の創傷治癒の促進方法。
［２６］  前記動物が哺乳動物である、［２５］記載の方法。
［２７］  前記哺乳動物がヒトである、［２６］記載の方法。
［２８］  動物の繊維症を予防するために有効な量の間葉系幹細胞を該動物に投与することを含む、動物の繊維症の予防方法。
［２９］  動物の上皮傷害を修復するために有効な量の間葉系幹細胞を該動物に投与することを含む、動物の上皮傷害の修復方法。
［３０］  前記動物が哺乳動物である、［２９］記載の方法。
［３１］  前記哺乳動物がヒトである、［３０］記載の方法。
［３２］  前記上皮傷害が、移植片対宿主病の結果である、［２９］記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【０１２０】
【図１Ａ】図１Ａは、ＭＳＣは樹状細胞機能を調節することを示す。ＨＬＡ−ＤＲとＣＤ１１ｃに対する抗体を使用する成熟単球ＤＣ１細胞のフローサイトメトリー解析と、ＨＬＡ−ＤＲとＣＤ１２３（ＩＬ−３受容体）に対する抗体を使用する形質球様ＤＣ２細胞のフローサイトメトリー解析。（破線）：アイソタイプ対照；（実線）：ＦＩＴＣ／ＰＥ結合抗体。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ＭＳＣが、活性化ＤＣ１とＤＣ２からの、それぞれＴＮＦ−α分泌（第１ｙ軸）を阻害し、ＩＬ−１０分泌（第２ｙ軸）を上昇させる、ことを示す。
【図１Ｃ】図１Ｃは、成熟ＤＣ１細胞で培養したＭＳＣが、ＭＳＣもしくはＤＣ単独と比較して、Ｔ細胞によるＩＦＮ−γ分泌（第１ｙ軸）を阻害しＩＬ−４レベル（第２ｙ軸）を上昇させる、ことを示す。ＭＳＣの存在下での炎症促進性ＩＦＮ−γの産生低下と抗炎症性ＩＬ−４の産生増加は、Ｔ細胞集団の抗炎症性表現型への移動を示した。
【図２Ａ】図２Ａは、ＭＳＣは炎症促進性エフェクターＴ細胞機能を阻害することを示す。ＦＩＴＣ結合ＣＤ４（ｘ軸）抗体とＰＥ結合ＣＤ２５（ｙ軸）抗体を用いる、ＭＳＣ＋ＰＢＭＣ培養物（ＭＳＣ＋ＰＢＭＣ）中のＰＢＭＣ又は非接着性画分を染色することによるＴReg細胞数（％）のフローサイトメトリー解析。ゲートはバックグランドとしてのアイソタイプ対照抗体に基づく。グラフは５つの独立した実験の典型である。
【図２Ｂ】図２Ｂは、細胞培養上清中で、ＭＳＣの存在下で生成したＴH１細胞は低レベルのＩＦＮ−γ（第１ｙ軸）を分泌し、ＭＳＣの存在下で生成したＴH２細胞は増加量のＩＬ−４（第２ｙ軸）を分泌した、ことを示す。
【図２Ｃ】図２Ｃは、ＭＳＣが、２４ウェルプレート中で０、２４、又は４８時間培養した精製ＮＫ細胞からのＩＦＮ−γ分泌を阻害する、ことを示す。示したデータは１つの実験の平均±ＳＤサイトカイン分泌であり、３つの独立した実験の典型である。
【図３Ａ】図３Ａは、ＭＳＣはＴreg細胞集団の数とＧＩＴＲ発現を上昇させることを示す。ＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔreg細胞集団を、ＰＢＭＣ又はＭＳＣ＋ＰＢＭＣ（ＭＳＣ対ＰＢＭＣ比は１：１０）培養物（さらなる刺激無しで３日間培養した）から２工程磁性単離法を使用して単離した。これらの細胞に放射線照射し（さらなる増殖を阻止するため）、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）において刺激細胞として使用し、ここで応答細胞は植物性血球凝集素（ＰＨＡ）（２．５ｍｇ／ｍｌ）の存在下の同種異系ＰＢＭＣ（刺激細胞対応答細胞比は１：１００）であった。細胞を４８時間培養し、次に3Ｈチミジンを加え、２４時間後、取り込まれた放射活性を計測した。結果は、ＭＳＣの存在下で生成したＴreg集団（レーン３）は、ＭＳＣの非存在下で生成したＴreg細胞（レーン２）と機能的に同等であることを示した。
【図３Ｂ】図３Ｂは、ＰＢＭＣをＭＳＣの非存在下（上のプロット）又は存在下（下のプロット）で３日間培養（ＭＳＣ対ＰＢＭＣ比は１：１０）し、次に非接着画分を採取し、ＦＩＴＣ標識ＧＩＴＲとＰＥ標識ＣＤ４で免疫染色した結果を示す。結果は、ＭＳＣの存在下で培養した細胞でＧＩＴＲ発現の２倍以上の上昇を示す。
【図４Ａ】図４Ａは、ＭＳＣはＰＧＥ2を産生し、ＰＧＥ2を阻止するとＭＳＣ性免疫調節作用が逆転することを示す。種々の濃度のＰＧＥ2ブロッカーであるＮＳ−３９８又はインドメタシン（Ｉｎｄｏｍｅｔｈ．）の存在下又は非存在下で培養したＭＳＣから得られた培養上清中のＰＧＥ2分泌（平均±ＳＤ）。インヒビター濃度はμＭであり、示したデータは２４時間培養後に得られた値である。
【図４Ｂ】図４Ｂは、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを使用したＭＳＣとＰＢＭＣ中のＣＯＸ−１とＣＯＸ−２発現を示す。ＭＳＣはＰＢＭＣと比較して有意に高レベルのＣＯＸ−２を発現し、ＭＳＣをＰＢＭＣの存在下で培養すると、ＭＳＣ中のＣＯＸ−２発現の３倍を超える上昇があった。１〜３つの独立した実験からの典型的データを示す。ＭＳＣ＋ＰＢＭＣ培養物をトランスウェルチャンバープレート中で準備し、ここでＭＳＣは下のチャンバーに蒔き、ＰＢＭＣは上のチャンバーに蒔いた。
【図４Ｃ】図４Ｃは、（Ｃ）ＰＧＥ2ブロッカーであるインドメタシン（Ｉｎｄ．）又はＮＳ−３９８の存在は、対照と比較して、活性化ＤＣ（白バー）からのＴＮＦ−α分泌と、ＴH１細胞（斜線バー）からのＩＦＮ−γ分泌を上昇させることを示す。データは、ＭＳＣとＰＧＥ2インヒビターの非存在下で生成した培養物からの％変化として計算した。
【図４Ｄ】図４Ｄは、ＭＳＣ−ＰＢＭＣ同時培養物（１：１０）中のＰＧＥ2ブロッカーであるインドメタシン（Ｉｎｄｏ）又はＮＳ−３９８の存在は、ＰＨＡ処理ＰＢＭＣに対するＭＳＣ性抗増殖作用を逆転させることを示す。示したデータは１つの実験からであり、３つの独立した実験の典型である。
【図５】図５は、構成性ＭＳＣサイトカイン分泌は同種異系ＰＢＭＣの存在下で上昇することを示す。すでに性状解析したヒトＭＳＣを使用して、ＰＢＭＣの存在下（斜線バー）又は非存在下（白バー）（ＭＳＣ対ＰＢＭＣ比は１：１０）で２４時間培養したＭＳＣの培養上清中のサイトカインＩＬ−６とＶＥＧＦ、脂質メディエーターＰＧＥ2、及びマトリックス金属プロテアーゼ１（ｐｒｏ−ＭＭＰ−１）のレベルを分析した。ＭＳＣはＩＬ−６、ＶＥＧＦ、及びＰＧＥ2を構成性に産生し、これらの因子のレベルはＰＢＭＣとの同時培養で上昇し、従ってＭＳＣが炎症性状況で免疫機能の調節において役割を果たすことを示唆する。
【図６】図６は、ＭＳＣは分裂促進剤誘導性のＴ細胞増殖を用量依存的に阻害することを示す。増加する数の同種異系ＰＢＭＣを、ＰＨＡ（２．５ｍｇ／ｍｌ）の存在下又は非存在下で９６ウェルプレートに蒔いた一定数のＭＳＣ（２，０００細胞／ウェル）とインキュベートし、3Ｈチミジン取り込みを測定した（１分当たりのカウント、ｃｐｍ）。ＭＳＣの存在下でＰＨＡ処理ＰＢＭＣの増殖の用量依存性阻害があった。３つの独立した実験の１つからの典型的結果を示す。同様の結果が、LeBlanc, et al., Scand J. Immunol., Vol. 57, pg. 11 (2003)により報告された。
【図７】図７は、提唱されているＭＳＣ作用機構の模式図を示す。ＭＳＣは、先天的（ＤＣ経路２〜４；及びＮＫ経路６）免疫系と適応（Ｔ経路１と５、及びＢ経路７）免疫系の両方からの細胞に影響を与えることにより免疫調節作用を仲介する。浸入病原体に応答して未成熟ＤＣは、侵入可能部位に移動し、成熟し、未処理のＴ細胞を刺激して（抗原特異的及び同時刺激シグナルにより）、防御性エフェクターＴ細胞（細胞性ＴH１又は体液性ＴH２免疫）になる能力を獲得する。ＭＳＣ−ＤＣ相互作用中に、ＭＳＣは直接の細胞−細胞接触により又は分泌された因子により、細胞性応答（経路２）を開始するＤＣの能力を制限することにより、又は体液性応答（経路４）を開始する能力を促進することにより、免疫応答の結果を変化させる。また成熟エフェクターＴ細胞が存在する時、ＭＳＣはこれらと相互作用してＴH１（経路１）応答のバランスをＴＨ2応答（経路５）に向けて、おそらくＩｇＥ産生Ｂ細胞活性（経路７）の上昇（これは、ＧｖＨＤと自己免疫疾患症状の抑制に好ましい結果である）に向ける。ＭＳＣはＴReg集団（経路３）の生成を増加させる能力により、寛容表現型となり、局所的微小環境におけるバイスタンダー（bystander）炎症を緩和することにより受容体宿主を助ける。点線は提唱された機構である。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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