(57)【要約】【課題】ヒト抗アルファシヌクレイン自己抗体の提供。【解決手段】ヒトαシヌクレイン特異自己抗体、ならびにそのフラグメント、誘導体、およびその変異体、ならびにそれらに関連する方法を提供する。αシヌクレインに対して特異的な抗体に関連するアッセイ、キット、および固形支持体もまた開示する。前記抗体、免疫グロブリン鎖、ならびにその結合フラグメント、誘導体、および変異体は、αシヌクレイン標的免疫療法および診断のために、それぞれ、薬学的組成物および診断用組成物で使用することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載された発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、概して、新規αシヌクレイン特異結合分子、特にヒト抗体、ならびにそれぞれ、αシヌクレインおよびαシヌクレインの凝集型を認識するそのフラグメント、誘導体、および変異体に関する。加えて、本発明は、血漿およびＣＳＦにおけるαシヌクレインの有毒種を特定するための診断用手段として、またパーキンソン病（ＰＤ）、レビー小体を伴う認知症（ＤＬＢ）、およびアルツハイマー病のレビー小体変異型（ＡＤ）、ならびに他のシヌクレイノパチー疾患等のαシヌクレインの凝集体に関連する疾患を治療するための受動的ワクチン接種戦略においての両方で有益である、そのような結合分子、抗体、およびその模倣物を含む薬学的および診断用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
タンパク質ミスフォールディングおよび凝集は、多数の神経変性疾患の病理学的側面である。αシヌクレインの凝集体は、パーキンソン病（ＰＤ）と関連するレビー小体およびレビー神経突起の主要な成分である。天然ではフォールドされていないタンパク質、αシヌクレインは、オリゴマー、前原線維、および原線維を含む異なる凝集形態を採択することができる。小さいオリゴマー凝集体は、特に有毒であると示されている。
【０００３】
αシヌクレインに対する自然発生自己抗体が、健常人において検出されており、患者におけるレベルの変化は、特定の神経変性疾患と関連付けられた。総説として、非特許文献１を参照されたい。したがって、特に健常患者において、自然発症的に、またはワクチン接種時のどちらか一方で、パーキンソン病に罹患する患者の自然発生抗体は、シヌクレイン凝集に対して保護的役割を果たし得る。例えば、非特許文献２および非特許文献３を参照されたい。これまで、自己抗体の治療的有意性を評価するのが困難であった。これは主に、インビトロでのそれらの単離およびその後の特徴付けのための率直な実験的アプローチの欠如による。
【０００４】
近年、αシヌクレインのオリゴマー種は、血漿およびＣＳＦ中の細胞外で報告されており（非特許文献４）、ＰＤのマウスモデルにおける免疫研究は、αシヌクレインに対する細胞外のマウスモノクローナル抗体が、細胞内のαシヌクレイン凝集体の蓄積を減少させることができ（非特許文献５）、モノマーαシヌクレインの有益な機能を妨害することなく、神経毒性凝集体を中和する抗体が有用な治療であり得るという考えを支持する。しかしながら、ヒトにおけるマウスベースの抗体の治療的有用性は、それらの非ヒト起源を考慮して、ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）反応によって妨害される。
【０００５】
非特許文献６は、αシヌクレインに対するヒト配列に基づくファージディスプレイ抗体ライブラリからの単鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）の単離を説明しており、これは、αシヌクレインのオリゴマー型にのみ結合し、インビトロでαシヌクレインの凝集および毒性の両方を阻害するものである。しかしながら、ファージディスプレイからのｓｃＦｖの産生はむしろ簡単であるが、そのように産生される抗体が、自己抗原に対する望まれない交差反応性の危険性を有し、ヒト免疫システムから産生される進化的最適化天然ヒト抗体の特性を欠くので、この手法は深刻な弱点を有する。さらに、そのような抗体は、通常の生理環境および機能を有する背景において、他のタンパク質および／または標的タンパク質との交差反応性のせいで、十分に特異的ではないかもしれない。パーキンソン病が発症した場合、例えば、αシヌクレインの生理学的誘導体とも交差反応する抗体は、生理学的標的構造の正常な機能に関連する副作用を引き起こす潜在性を有する。この点において、望まれない自己免疫疾患が徹底的に誘発され、これは、変異体形態で生理学的に発生もするタンパク質構造を採用する能動免疫実験の概念設計においても、ほぼ計算不可能な危険性である。
【０００６】
より最近になって、非特許文献７は、異なる免疫グロブリン溶液および単一供血者の試料からの親和性クロマトグラフィーを介する抗αシヌクレインポリクローナル自己抗体の単離を報告した。しかしながら、このアプローチが所望の抗体のほんの限られた量を提供するという事実に加えて、ポリクローナル抗体は、例えば、それらの不均一性、および望まれない副作用を有する他のαシヌクレイン関連分子で汚染されている危険性のせいで、治療的適用に対しては、わずかに限定的な有用性しか持たない。同様に、抗体の組成物の可変性が、全体の特異性および反応性に影響を与えるため、ポリクローナル抗体の診断価値は減少する。これら全ては、ミスフォールディングによる凝集および沈着の対象であるタンパク質に対する抗体により当てはまる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｎｅｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ．Ｒｅｖ．７（２００８），５０１−５０７
【非特許文献２】Ｗｏｕｌｆｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ５８（２００２），１４３５−１４３６
【非特許文献３】Ｐａｐａｃｈｒｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．１０１（２００７），７４９−７５６
【非特許文献４】Ｅｌ−Ａｇｎａｆ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＡＳＥＢ  Ｊ．２０（２００６），４１９-４２５
【非特許文献５】Ｍａｓｌｉａｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ，４６（２００５），８５７-８６８
【非特許文献６】Ｅｍａｄｉら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３６８（２００７），１１３２-１１４４
【非特許文献７】Ｓｅｉｔｚら，８１．  Ｋｏｎｇｒｅｓｓ  ｄｅｒ  Ｄｅｕｔｓｃｈｅｎ  Ｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ  ｆuｒ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｅ  ｍｉｔ  Ｆｏｒｔｂｉｌｄｕｎｇｓａｋａｄｅｍｉｅ  Ｈａｍｂｕｒｇ１０．−１３．０９．２００８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
したがって、上述の制限を打開し、αシヌクレインに対する治療的および診断的ヒト抗体を提供する必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明の開示
本発明は、天然αシヌクレイン特異的ヒトモノクローナル抗体の単離のために、高齢の健常対照対象および神経疾患を有する患者のαシヌクレイン特異的免疫反応を利用する。特に、本発明に従って実行された実験は、パーキンソン症の徴候のない高齢対象の集団からの、αシヌクレインに対して特異的なモノクローナル抗体の単離に成功した。
【００１０】
本発明は、したがって、ヒト抗体、抗原結合フラグメント、およびαシヌクレインを特異的に認識することができる同様の抗原結合分子を対象とする。「αシヌクレインを特異的に認識する」、「αシヌクレインに／に対して特異的な抗体」、および「抗αシヌクレイン抗体」とは、具体的に、一般的に、および集合的に、αシヌクレインの天然型に対する、またはミスフォールドもしくはオリゴマーもしくは凝集もしくは翻訳後に修飾されたαシヌクレインに対する抗体を指す。天然モノマー、全長型、切り詰め型、および凝集型に対して選択的なヒト抗体が本明細書にて提供される。
【００１１】
本発明の特に好ましい実施形態では、ヒト抗体またはその抗原結合フラグメントは、図１に説明される、可変領域ＶＨおよび／またはＶＬに特徴付けられる抗体の免疫学的結合特性を実証する。
【００１２】
抗体の抗原結合フラグメントは、単鎖Ｆｖフラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、Ｆ（ａｂ）フラグメント、およびＦ（ａｂ’）２フラグメント、または任意の他の抗原結合フラグメントであり得る。以下の特定の実施形態では、抗体またはそのフラグメントは、ヒトＩｇＧイソタイプ抗体である。あるいは、抗体は、キメラヒトマウスまたはマウス化抗体であり、後者は、動物における診断法および研究に特に有用である。
【００１３】
さらに、本発明は、本発明の抗体もしくはその活性フラグメント、またはアゴニストおよび同種分子、あるいは、同一のアンタゴニストを含む組成物、ならびにシヌクレイノパチー疾患の予防、診断、もしくは治療においてそのような組成物を使用する免疫治療的および免疫診断法に関し、組成物の有効量がそれを必要とする患者に投与される。
【００１４】
当然ながら、本発明は、不死化ヒトＢメモリーリンパ球およびＢ細胞に及び、それぞれ、以下に定義される明確に異なり、独特の特性を有する抗体を産生する。
【００１５】
本発明はまた、本発明の抗体の免疫グロブリン鎖の少なくとも可変領域をコードするポリヌクレオチドにも関する。好ましくは、該可変領域は、図１に示す、可変領域のＶＨおよび／またはＶＬの少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。
【００１６】
したがって、本発明はまた、該ポリヌクレオチドを含むベクターおよびそれで形質転換される宿主細胞、ならびにαシヌクレインに対して特異的な抗体および同等の結合分子の産生のためのそれらの使用を包含する。抗体およびその模倣物の組換え産生のための手段および方法、ならびに抗体であってもなくてもよい競合する結合分子をスクリーニングする方法は、当技術分野で知られている。しかしながら、本明細書に説明されるように、特にヒトでの治療適用に関して、本発明の抗体は、該抗体の適用が、さもなければキメラおよびさらにはヒト化抗体に観察されるＨＡＭＡ反応を実質的に示さないという意味において、ヒト抗体である。
【００１７】
さらに、試料中のαシヌクレインを特定するために使用することができる組成物および方法が、本明細書に開示される。開示される抗αシヌクレイン抗体は、例えば、ＥＬＩＳＡベースまたは表面適応アッセイを使用することによって、試料中のαシヌクレインの存在に関して、ヒト血液、ＣＳＦ、および尿をスクリーニングするために使用することができる。本明細書に開示される方法および組成物は、パーキンソン病診断等のシヌクレイノパチー疾患に役立ち、疾患の進行および治療的有効性を監視するために使用することができる。
【００１８】
実施例４に実証されるように、本発明の抗αシヌクレイン抗体は、パーキンソン病の遺伝子導入マウスモデルにおける運動能力および高架十字迷路行動を改善することができる。これらの結果は、本発明のヒト由来抗αシヌクレイン抗体の予期される治療的価値を確認する。
【００１９】
ゆえに、パーキンソン病（ＰＤ）、パーキンソン病認知症（ＰＤＤ）、レビー小体を伴う認知症（ＤＬＢ）、アルツハイマー病のレビー小体変異型（ＬＢＶＡＤ）、多系統萎縮症（ＭＳＡ）、純粋自律神経不全症（ＰＡＦ）、脳鉄蓄積１型を伴う神経変性（ＮＢＩＡ−Ｉ）、アルツハイマー病、ピック病、若年発症全身性神経軸索ジストロフィー（ハラーフォルデンシュパッツ）、筋萎縮性側索硬化症、外傷性脳損傷、およびダウン症等のシヌクレイノパチー疾患を治療または予防するための方法を提供することが、本発明の特別な目的である。方法は、抗体がαシヌクレインを標的とする対象に、ヒト抗体または抗体誘導体の有効濃度を投与することを含む。
【００２０】
本発明のさらなる実施形態は、以下の記述および実施例から明らかとなる。
本発明の好ましい実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
ヒトモノクローナル抗αシヌクレイン抗体。
（項目２）
天然モノマー型のαシヌクレインに特異的に結合する能力がある、項目１に記載の抗体。
（項目３）
オリゴマー型または凝集型のαシヌクレインに結合する能力がある、項目１または２に記載の抗体。
（項目４）
前記抗体は、βシヌクレインまたはγシヌクレインと比較して、αシヌクレインに特異的に結合する、項目１〜３のいずれか１項に記載の抗体。
（項目５）
αシヌクレインのＮ末端１−６０フラグメントまたはＣ末端９６−１４０フラグメントを認識する、項目１〜４のいずれか１項に記載の抗体。
（項目６）
αシヌクレインの切り詰め型を認識しない、項目１〜４のいずれか１項に記載の抗体。
（項目７）
図１に示される少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を可変領域に含む、項目１〜６のいずれか１項に記載の抗体またはそのαシヌクレイン結合フラグメント。
（項目８）
図１に示されるＶＨおよび／またはＶＬ領域のアミノ酸配列を含む、項目７に記載の抗体または結合フラグメント。
（項目９）
αシヌクレインへの特異結合のために、項目１〜８のいずれか１項に記載の抗体と競合する、抗体または抗原結合分子。
（項目１０）
キメラマウス／ヒト抗体またはマウス化抗体である、項目９に記載の抗体。
（項目１１）
単鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、Ｆ（ａｂ）フラグメント、およびＦ（ａｂ’）２フラグメントから成る群から選択される、項目１〜１０のいずれか１項に記載の抗体。
（項目１２）
少なくとも項目１〜１１のいずれか１項に記載の抗体の免疫グロブリン鎖の結合ドメインまたは可変領域をコードする、ポリヌクレオチド。
（項目１３）
項目１２に記載のポリヌクレオチドを含むベクターであって、前記抗体のもう一方の免疫グロブリン鎖の可変領域をコードする項目１２に記載のポリヌクレオチドと任意で組み合わされる、ベクター。
（項目１４）
項目１０に記載のポリヌクレオチドまたは項目１３に記載のベクターを含む、宿主細胞。
（項目１５）
抗αシヌクレイン抗体またはその免疫グロブリン鎖を調製するための方法であって、前記方法は、
（ａ）項目１４に記載の細胞を培養することと、
（ｂ）前記抗体またはその免疫グロブリン鎖を前記培養物から単離することと、を含む、方法。
（項目１６）
項目１２に記載のポリヌクレオチドによってコードされるか、または項目１５に記載の方法によって入手可能である、抗体またはその免疫グロブリン鎖。
（項目１７）
検出可能に標識化される、項目１〜１１または１６のいずれか１項に記載の抗体。
（項目１８）
前記検出可能な標識は、酵素、放射性同位元素、蛍光色素分子、および重金属から成る群から選択される、項目１７に記載の抗体。
（項目１９）
薬物に付着される、項目１〜１１または１６〜１８のいずれか１項に記載の抗体。
（項目２０）
項目１〜１１または１６〜１９のいずれか１項に記載の抗体、項目１２に記載のポリヌクレオチド、項目１３に記載のベクター、または項目１４に記載の細胞を含む、組成物。
（項目２１）
薬学的組成物であり、薬学的に許容される担体をさらに含む、項目２０に記載の組成物。
（項目２２）
ワクチンである、項目２１に記載の組成物。
（項目２３）
シヌクレイノパチー疾患を治療するのに有用な追加的薬剤をさらに含む、項目２１または２２に記載の薬学的組成物。
（項目２４）
診断用組成物であって、免疫または核酸ベースの診断法で慣習的に使用される試薬を任意で含む、項目２０に記載の組成物。
（項目２５）
対象におけるシヌクレイノパチー疾患の進行またはシヌクレイノパチー疾患治療に対する応答を監視する、シヌクレイノパチー疾患の予防的および治療的治療のための薬学的組成物または診断用組成物の調製のための、項目１〜１１もしくは１６〜１９のいずれか１項に記載の抗体、またはそれらのうちのいずれか１つと実質的に同一の結合特異性を有するαシヌクレイン結合分子、項目１２に記載のポリヌクレオチド、項目１３に記載のベクター、または項目１４に記載の細胞の使用。
（項目２６）
対象において、シヌクレイノパチー疾患を診断する方法であって、前記方法は、
（ａ）項目１〜１１または１６〜１９のいずれか１項に記載の抗体、そのαシヌクレイン結合フラグメント、またはそれらのうちのいずれか１つと実質的に同一の結合特異性を有するαシヌクレイン結合分子を用いて、診断される前記対象からの試料中のαシヌクレインのレベルを評価することと、
（ｂ）１人以上の対照対象における前記αシヌクレインの前記レベルを示す参照基準と、前記αシヌクレインの前記レベルを比較することと、を含み、
前記αシヌクレインの前記レベルと前記参照基準との間の相違点または類似点は、前記対象がパーキンソン病を有することを示す、方法。
（項目２７）
前記シヌクレイノパチー疾患は、パーキンソン病（ＰＤ）、パーキンソン病認知症（ＰＤＤ）、レビー小体を伴う認知症（ＤＬＢ）、アルツハイマー病のレビー小体変異型（ＬＢＶ  ＡＤ）、多系統萎縮症（ＭＳＡ）、純粋自律神経不全症（ＰＡＦ）、脳鉄蓄積１型を伴う神経変性（ＮＢＩＡ−Ｉ）、アルツハイマー病、ピック病、若年発症全身性神経軸索ジストロフィー（ハラーフォルデンシュパッツ病）、筋萎縮性側索硬化症、外傷性脳損傷、およびダウン症から成る群から選択される、項目２５に記載の使用または項目２６に記載の方法。
（項目２８）
シヌクレイノパチー疾患の診断のためのキットであって、前記キットは、試薬および／もしくは使用説明書を任意で伴って、項目１〜１１もしくは１６〜１９のいずれか１項に記載の抗体、またはそれらのうちのいずれか１つと実質的に同一の結合特異性を有するシヌクレイン結合分子、項目１２に記載のポリヌクレオチド、項目１３に記載のベクター、または項目１４に記載の細胞を含む、キット。
（項目２９）
ヒトまたは動物体において、αシヌクレインをインビボで検出するための、または治療薬および／もしくは診断薬をαシヌクレインに標的化するための組成物の調製のための、項目１〜１１または１６〜１９のいずれか１項に記載の抗体の少なくとも１つのＣＤＲを含むαシヌクレイン結合分子の使用。
（項目３０）
前記インビボ画像法は、陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）、単一光子放出断層撮影（ＳＰＥＣＴ）、近赤外（ＮＩＲ）、光学的画像法、または磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）を含む、項目２９に記載の使用。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１−１】可変領域のアミノ酸およびヌクレオチド配列、すなわち、ヒト抗体ＮＩ−２０２．３Ｇ１２（Ａ）、ＮＩ−２０２．１２Ｆ４（Ｂ）、およびＮＩ−２０２．３Ｄ８（Ｃ）の重鎖およびカッパ／ラムダ軽鎖。ヒト抗体ＮＩ−２０２．３Ｄ８に関して、２つの可変軽鎖配列ＶＫａ１（Ｃ）およびＶＫｃ１（Ｄ）はクローン化され、それらの各々は、可変重鎖配列ＶＨＥ１（Ｃ）と対になり得る。フレームワーク（ＦＲ）および相補性決定領域（ＣＤＲ）は、下線が引かれたＣＤＲで示される。重鎖連結領域（ＪＨ）および軽鎖連結領域（ＪＫ）も同様に示される。クローン化戦略により、重鎖および軽鎖のＮ末端におけるアミノ酸配列は、ＦＲ１でプライマー誘発変形を潜在的に含有し得るが、それは抗体の生物活性に実質的に影響を及ぼさない。コンセンサスヒト抗体を提供するために、原クローンのヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、データベースの関連のヒト生殖細胞系可変領域配列と整列し、それに従って調整され、例えば、ＭＲＣ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）によって主催されたＶｂａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｖｂａｓｅ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／）を参照されたい。コンセンサス生殖細胞系配列から潜在的に逸脱すると見なされ、したがって、ＰＣＲプライマーによるものであり得るそれらのアミノ酸は、太字で示される。
【図１−２】可変領域のアミノ酸およびヌクレオチド配列、すなわち、ヒト抗体ＮＩ−２０２．３Ｇ１２（Ａ）、ＮＩ−２０２．１２Ｆ４（Ｂ）、およびＮＩ−２０２．３Ｄ８（Ｃ）の重鎖およびカッパ／ラムダ軽鎖。ヒト抗体ＮＩ−２０２．３Ｄ８に関して、２つの可変軽鎖配列ＶＫａ１（Ｃ）およびＶＫｃ１（Ｄ）はクローン化され、それらの各々は、可変重鎖配列ＶＨＥ１（Ｃ）と対になり得る。フレームワーク（ＦＲ）および相補性決定領域（ＣＤＲ）は、下線が引かれたＣＤＲで示される。重鎖連結領域（ＪＨ）および軽鎖連結領域（ＪＫ）も同様に示される。クローン化戦略により、重鎖および軽鎖のＮ末端におけるアミノ酸配列は、ＦＲ１でプライマー誘発変形を潜在的に含有し得るが、それは抗体の生物活性に実質的に影響を及ぼさない。コンセンサスヒト抗体を提供するために、原クローンのヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、データベースの関連のヒト生殖細胞系可変領域配列と整列し、それに従って調整され、例えば、ＭＲＣ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）によって主催されたＶｂａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｖｂａｓｅ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／）を参照されたい。コンセンサス生殖細胞系配列から潜在的に逸脱すると見なされ、したがって、ＰＣＲプライマーによるものであり得るそれらのアミノ酸は、太字で示される。
【図１−３】可変領域のアミノ酸およびヌクレオチド配列、すなわち、ヒト抗体ＮＩ−２０２．３Ｇ１２（Ａ）、ＮＩ−２０２．１２Ｆ４（Ｂ）、およびＮＩ−２０２．３Ｄ８（Ｃ）の重鎖およびカッパ／ラムダ軽鎖。ヒト抗体ＮＩ−２０２．３Ｄ８に関して、２つの可変軽鎖配列ＶＫａ１（Ｃ）およびＶＫｃ１（Ｄ）はクローン化され、それらの各々は、可変重鎖配列ＶＨＥ１（Ｃ）と対になり得る。フレームワーク（ＦＲ）および相補性決定領域（ＣＤＲ）は、下線が引かれたＣＤＲで示される。重鎖連結領域（ＪＨ）および軽鎖連結領域（ＪＫ）も同様に示される。クローン化戦略により、重鎖および軽鎖のＮ末端におけるアミノ酸配列は、ＦＲ１でプライマー誘発変形を潜在的に含有し得るが、それは抗体の生物活性に実質的に影響を及ぼさない。コンセンサスヒト抗体を提供するために、原クローンのヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、データベースの関連のヒト生殖細胞系可変領域配列と整列し、それに従って調整され、例えば、ＭＲＣ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）によって主催されたＶｂａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｖｂａｓｅ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／）を参照されたい。コンセンサス生殖細胞系配列から潜在的に逸脱すると見なされ、したがって、ＰＣＲプライマーによるものであり得るそれらのアミノ酸は、太字で示される。
【図１−４】可変領域のアミノ酸およびヌクレオチド配列、すなわち、ヒト抗体ＮＩ−２０２．３Ｇ１２（Ａ）、ＮＩ−２０２．１２Ｆ４（Ｂ）、およびＮＩ−２０２．３Ｄ８（Ｃ）の重鎖およびカッパ／ラムダ軽鎖。ヒト抗体ＮＩ−２０２．３Ｄ８に関して、２つの可変軽鎖配列ＶＫａ１（Ｃ）およびＶＫｃ１（Ｄ）はクローン化され、それらの各々は、可変重鎖配列ＶＨＥ１（Ｃ）と対になり得る。フレームワーク（ＦＲ）および相補性決定領域（ＣＤＲ）は、下線が引かれたＣＤＲで示される。重鎖連結領域（ＪＨ）および軽鎖連結領域（ＪＫ）も同様に示される。クローン化戦略により、重鎖および軽鎖のＮ末端におけるアミノ酸配列は、ＦＲ１でプライマー誘発変形を潜在的に含有し得るが、それは抗体の生物活性に実質的に影響を及ぼさない。コンセンサスヒト抗体を提供するために、原クローンのヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、データベースの関連のヒト生殖細胞系可変領域配列と整列し、それに従って調整され、例えば、ＭＲＣ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）によって主催されたＶｂａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｖｂａｓｅ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／）を参照されたい。コンセンサス生殖細胞系配列から潜在的に逸脱すると見なされ、したがって、ＰＣＲプライマーによるものであり得るそれらのアミノ酸は、太字で示される。
【図２】組換えヒトαシヌクレイン抗体は、明確に異なるエピトープを対象とする。組換え全長および切り詰め型αシヌクレインは、同等の被覆濃度（２０μｇ／ｍｌ）で、ＥＬＩＳＡプレート上に被覆された。（Ａ）組換えヒトαシヌクレイン抗体ＮＩ−２０２．３Ｇ１２は、直接ＥＬＩＳＡで全長αシヌクレインに結合するが、αシヌクレイン切り詰め型には結合せず、ＮＩ−２０２．３Ｇ１２の構造認識エピトープを示す。（Ｂ）組換えＮＩ−２０２．１２Ｆ４は、直接ＥＬＩＳＡにおいて、全長αシヌクレインおよびアミノ酸（ａａ）１−６０を含有するαシヌクレイン切り詰め型に結合し、アルファシヌクレインのＮ末端両親媒性反復領域内のＮＩ−２０２．１２Ｆ４のエピトープを指す。（Ｃ）ＬＢ５０９抗体は、すでに決定されたエピトープ（ａａ１１５−１２２）を確認するＣ末端αシヌクレインフラグメントに結合する。値は、平均値±平均標準誤差（ｎ＝２−３）である。
【図３】組換えヒトαシヌクレイン抗体は、直接ＥＬＩＳＡにおいてαシヌクレインに結合するが、βおよびγシヌクレインには結合しない。同等の被覆濃度（２μｇ／ｍｌ）でＥＬＩＳＡプレート上に被覆された組換えα、β、およびγシヌクレインは、組換えヒトαシヌクレイン抗体または汎シヌクレイン抗体とインキュベートされた。（Ａ）後者は、３つ全てのシヌクレインタンパク質を検出し、組換えヒトαシヌクレイン抗体（Ｂ）ＮＩ−２０２．３Ｇ１２および（Ｃ）ＮＩ−２０２．１２Ｆ４（Ｃ）は、αシヌクレインに選択的に結合する。値は、平均値±平均標準誤差（ｎ＝２−３）である。
【図４】組換えヒトαシヌクレイン抗体ＮＩ−２０２．１２Ｆ４は、ウエスタンブロット分析でαシヌクレインに結合するが、βおよびγシヌクレインには結合しない。組換えα、β、およびγシヌクレイン（各７５０ｎｇ）を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、その後、ウエスタンブロット分析に供した。（Ａ）クーマシー染色は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで同等のタンパク質濃度を示す。（Ｂ）ＮＩ−２０２．１２Ｆ４は、αシヌクレインと強く相互作用するが、ベータまたはガンマシヌクレインとは相互作用しない。（Ｃ）一次抗体なしではシグナルは検出されなかった。
【図５】（Ａ）非遺伝子導入およびヒトアルファシヌクレイン遺伝子導入マウスからの脳抽出物のＮＩ−２０２．１２Ｆ４免疫ブロット分析は、ヒトαシヌクレインへの優先結合を示す。野生型およびヒトαシヌクレイン遺伝子導入マウスからの脳抽出物は、ヒト特異的αシヌクレイン抗体ＬＢ５０９、ヒトおよびマウスαシヌクレイン反応性抗体クローン４２、ならびにＮＩ−２０２．１２Ｆ４を用いる免疫ブロット法で分析された。クローン４２がマウスおよびヒトαシヌクレインに対応する顕著なバンドを検出する一方で、ＬＢ５０９およびＮＩ−２０２．１２Ｆ４は、ヒトαシヌクレインへの強い優先度を示す。（Ｂ）脳抽出物のＮＩ−２０２．１２Ｆ４免疫ブロット分析は、ヒトαシヌクレイン凝集体への優先結合を示す。健常対照対象およびレビー小体を伴う認知症（ＤＬＢ）患者からの皮質脳抽出物、ならびに野生型マウスおよびヒトＡ３０Ｐαシヌクレイン遺伝子導入マウスからの脳抽出物は、ウエスタンブロット法で分析された。ＮＩ−２０２．１２Ｆ４は、ＤＬＢならびにＡ３０Ｐαシヌクレイン遺伝子導入脳抽出物におけるαシヌクレイン凝集体のオリゴマーおよび原線維型を高感度で検出する。最小結合が、ヒトまたは野生型マウス組織のαシヌクレインのモノマー型に対して観察され、および中程度の結合が、αシヌクレインを非常に過剰発現するＡ３０Ｐαシヌクレイン遺伝子導入脳抽出物で観察される。対照的に、クローン４２抗体は、高感度でモノマー型およびαシヌクレインフラグメントを検出し、凝集αシヌクレイン種に不十分に結合する。
【図６】組換えＮＩ−２０２．１２Ｆ４は、ヒトαシヌクレインの野生型および疾病を引き起こす変異体への高親和性結合を示す。組換え野生型（●）、Ａ５３Ｔ（■）、Ａ３０Ｐ（＊）、およびＥ６４Ｋ（◇）ヒトαシヌクレインは、ＥＬＩＳＡプレート上へ被覆され（２μｇ／ｍｌ）、様々な濃度のＮＩ２０２．１２Ｆ４で精査された。最大半量の有効濃度（ＥＣ５０）は、野生型αシヌクレインでは３２１ｐＭ、Ａ５３Ｔでは２９３ｐＭ、Ａ３０Ｐでは２２８ｐＭ、およびＥ６４Ｋ変異体ヒトαシヌクレインでは４８３ｐＭであった。
【図７】ＮＩ−２０２．１２Ｆ４の免疫組織化学結合分析。ＮＩ−２０２．１２Ｆ４は、ヒトＡ５３Ｔ（Ａ）またはＡ３０Ｐαシヌクレイン（Ｂ）を発現する遺伝子導入マウスからの浮遊切片、ならびにパーキンソン病（Ｃ）およびレビー小体を伴う認知症（Ｄ）のヒト脳組織において、レビー小体およびレビー神経突起様封入物、ならびに小さい細胞体樹状突起およびシナプス性αシヌクレイン蓄積を含む、αシヌクレイン病態の顕著な染色を示す。抗体Ｓｙｎ２１１は、ヒトＡ３０Ｐαシヌクレイン遺伝子導入マウスにおいて高感度で生理学的シナプス性αシヌクレインを検出する（Ｅ）一方で、ＮＩ−２０２．１２Ｆ４は、病理学的αシヌクレイン凝集体（Ｂ）に優先的に結合する。ＮＩ−２０２．１２Ｆ４の結合は、二次抗体のみの対照染色（Ｇ）と同様に、野生型マウス（Ｆ）の脳切片からは事実上不在である一方で、クローン４２抗体は、マウスαシヌクレインタンパク質（Ｈ）の顕著なシナプス染色を示す。
【図８】組換えＮＩ−２０２．１２Ｆ４は、高密度被覆されたαシヌクレインへの優先結合を示す。組換え全長または切り詰め型αシヌクレインは、指示濃度でＥＬＩＳＡプレート上に被覆され、直接ＥＬＩＳＡによりＮＩ−２０２．１２Ｆ４またはＳｙｎ２１１抗体の様々な濃度で精査された（組換え全長または１−６０αシヌクレインの○２０μｇ／ｍＬ、▲２μｇ／ｍＬ、▼１μｇ／ｍＬ、u２５０ｎｇ／ｍＬ、□１００ｎｇ／ｍＬ被覆濃度）。抗体の力価を示す最大半量の有効濃度（ＥＣ５０）が決定された。（Ａ）αシヌクレインに対する組換えＮＩ−２０２．１２Ｆ４の高親和性結合は、αシヌクレインタンパク質の高い被覆密度を必要とする。１１１ｐＭのＥＣ５０が、２０μｇ／ｍＬ濃度で被覆されたαシヌクレインに対して観察される一方で、ＥＣ５０値は、被覆濃度の減少に従って急激に増加し、αシヌクレインのより低い被覆濃度での親和性の目覚ましい低下を示している。これらの特徴は、αシヌクレインの高い被覆濃度で優先的に形成されるＮＩ−２０２．１２Ｆ４の立体構造エピトープを示している。（Ｂ）Ｓｙｎ２１１の結合は、被覆濃度によって影響を及ぼされない。より低い被覆密度において、市販のＳｙｎ２１１抗体の親和性の減少は観察されず、ＥＣ５０はαシヌクレインの被覆密度２０μｇ／ｍＬに対する３３５ｐｍから１００ｎｇ／ｍＬに対する９９ｐｍまでの範囲であり、線状非立体構造エピトープへの結合を示唆している。（Ｃ）アミノ酸１〜６０個を含むＮ末端αシヌクレインフラグメントへの組換えＮＩ−２０２．１２Ｆ４の高親和性結合は、高い被覆密度を必要とする。ＮＩ−２０２．１２Ｆ４は、全長ならびに切り詰め型αシヌクレインに対して同等かつする被覆濃度依存的な結合を示し、αシヌクレインタンパク質のアミノ酸１〜６０内に含有されるＮＩ−２０２．１２Ｆ４の立体構造エピトープへの結合を示す。（Ｄ）αシヌクレインのＮ末端の６０個のアミノ酸に及ぶ、重複する２０個のアミノ酸フラグメントを含むビオチン化ペプチドを、アビジンプレート上に被覆し、ＮＩ−２０２．１２Ｆ４またはａａ２１〜４０内でエピトープを検出する汎シヌクレイン対照抗体で精査した。したがって、対照抗体は、ペプチド２１〜４０に強力に結合し、ペプチド１１〜３０および３１〜５０により低い程度で結合する。対照的に、試験されたペプチドのいずれに対しても、ＮＩ−２０２．１２Ｆ４の結合は観察されず、Ｎ末端フラグメントはどれも、ＮＩ−２０２．１２Ｆ４エピトープとして十分ではなく、より大きなフラグメントが、構造ＮＩ−２０２．１２Ｆ４エピトープの最適な結合および形成に必要とされ得ることを示唆している。
【図９】ＮＩ−２０２．１２Ｆ４を用いての慢性治療は、αシヌクレインＡ５３Ｔ遺伝子導入マウスにおける運動能力を改善する。１０．５月齢のαシヌクレインＡ５３Ｔ遺伝子導入マウスを、ＮＩ−２０２．１２Ｆ４またはＰＢＳで毎週治療した（５ｍｇ／ｋｇ、腹腔内適用）。ポール試験で、２ヶ月間の治療の後に運動能力を評価した。（Ａ）ＮＩ−２０２．１２Ｆ４で治療された動物は、下向きになるのに有意に少ない時間を必要とした（ｔ−ｔｕｒｎ、１．７±０．３対４．６±０．６秒、ｐ＝０．０００２、両側スチューデントのｔ検定）。（Ｂ）ＮＩ−２０２．１２Ｆ４で治療された動物はまた、ホームケージに下降するのに有意に少ない時間（ｔ−ｔｏｔａｌ）を使用した（７．３±０．９対１０．４±０．７秒、ｐ＝０．０１２、両側スチューデントのｔ検定）。
【図１０】ＮＩ−２０２．１２Ｆ４でのαシヌクレインＡ５３Ｔ遺伝子導入マウスの慢性治療は、高架十字迷路行動の回復に導く。１０．５月齢のαシヌクレインＡ５３Ｔ遺伝子導入マウスを、５ｍｇ／ｋｇのＮＩ−２０２．１２Ｆ４またはＰＢＳで毎週腹腔内治療した。２ヶ月間の治療の後、動物を高架十字迷路行動のために試験した。ＮＩ−２０２．１２Ｆ４で治療された動物は、媒体治療された対照動物と比較して、壁のないアームにおいて有意に少ない時間を費やし、著しく低い距離に及び、正常な行動の回復を示した。
【図１１】ＮＩ−２０２．１２Ｆ４でのαシヌクレインＡ５３Ｔ遺伝子導入マウスの慢性治療は、ヒトＡ５３Ｔαシヌクレインの血漿レベルの上昇をもたらす。５ｍｇ／ｋｇのＮＩ−２０２．１２Ｆ４またはＰＢＳで２ヶ月間、毎週腹腔内治療されていた１２．５月齢のαシヌクレインＡ５３Ｔ遺伝子導入マウスから、血漿試料を調製した。最終の適用の２４時間後に血液を採取した。（Ａ）血漿におけるＮＩ−２０２．１２Ｆ４レベルを、直接αシヌクレインＥＬＩＳＡを使用して決定した。（Ｂ）血漿におけるヒトＡ５３Ｔαシヌクレインレベルを、ヒト−特異的αシヌクレインサンドイッチＥＬＩＳＡを使用して決定した。ＮＩ−２０２．１２Ｆ４で治療された動物は、対照動物と比較して、血漿においてヒトαシヌクレインの著しく上昇したレベルを有する（２４．９±４．１対１．９±１．２ｎｇ／ｍＬ、ｐ＝０．０００２）。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
発明の詳細記述
Ｉ．  定義
シヌクレイノパチー疾患またはシヌクレイン病は、神経細胞および膠細胞の選択的に脆弱性の集団での不溶性αシヌクレインタンパク質の凝集体から成る、共通の病変を共有する神経変性疾患の多様な群である。これらの疾患は、パーキンソン病（ＰＤ）、パーキンソン病認知症（ＰＤＤ）、レビー小体を伴う認知症（ＤＬＢ）、若年発症全身性神経軸索ジストロフィー（ハラーフォルデンシュパッツ）、純粋自律神経不全症（ＰＡＦ）、多系統萎縮症（ＭＳＡ）、および脳鉄蓄積１型を伴う神経変性（ＮＢＩＡ−Ｉ）を含む。臨床的に、それらは、運動、認識、行動、ならびに自律機能の慢性および進行性の低下に特徴付けられ、病変の分布に依存する。
【００２３】
パーキンソン病は、未知の病因を伴う年齢依存性神経変性疾患である。散発性パーキンソン病は、遺伝的脆弱性および環境障害の組み合わせに由来すると考えられる。異種機構によって誘発されたものであっても、パーキンソン病（ＰＤ）は共有の病態生理学的経路に従うとさらに考えられる。１つの共有の節点は、αシヌクレインの関与である。パーキンソン病発病とのこのタンパク質の関連は、家族性症例における遺伝子の点突然変異および三倍体化の両方の特定、パーキンソン病の顕著な病理学的特徴の１つであるレビー小体に対するαシヌクレインの局在性、ならびにパーキンソン病の神経毒性モデルにおけるαシヌクレイン発現および疾病病理学の相関関係によって確立されている。さらなる証拠は、αシヌクレインの特定の型（例えば、ミスフォールドした、およびαシヌクレイン結合したドーパミン）が、散発性疾病に関与することを示す。
【００２４】
シヌクレインは、神経組織およびある腫瘍で主に発現される小さい可溶性タンパク質である。ファミリーは、３つの知られているタンパク質：αシヌクレイン、βシヌクレイン、およびγシヌクレインを含む。全てのシヌクレインは、交換可能なアポリポタンパク質のクラスＡ２脂質結合ドメインに対して類似性のある高度に保存されたα螺旋脂質結合モチーフを持つという共通点がある。シヌクレインファミリーメンバーは脊椎動物以外では見出されないが、それらは、植物の「後期胚豊富な」タンパク質とのある程度の保存構造類似性を有する。αおよびβシヌクレインタンパク質は、主として脳組織内で見出され、その中では主にシナプス前末端で見られる。γシヌクレインタンパク質は、主として末梢神経系および網膜で見出されるが、乳房の腫瘍でのその発現は、腫瘍進行のマーカーである。正常な細胞機能は、シヌクレインタンパク質のいずれに対しても決定されていないが、ある資料は、膜安定性および／または代謝回転の調節の役割を示す。αシヌクレインにおける変異は、早発型のパーキンソン病の稀な家族性症例と関連し、タンパク質は、パーキンソン病、アルツハイマー病、およびいくつかの他の神経変性疾患で異常に蓄積する。総説として、例えば、２００１年１２月２０日にオンラインで発行され、その表１が、ＧｅｎＢａｎｋに現在収載されるシヌクレインファミリーの独特のメンバーを列挙し、その開示内容は、参照により本明細書に組み込まれる、Ｇｅｏｒｇｅ，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ．  ３（２００２），ｒｅｖｉｅｗｓ３００２．１-ｒｅｖｉｅｗｓ３００２．６を参照されたい。
【００２５】
αシヌクレインは、アルツハイマー病（ＡＤ）斑の（ＮＡＣ）の非βアミロイド成分の前駆タンパク質として、ヒト脳内に最初に特定され、例えば、Ｕｅｄａ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０（１９９３），１２８２−１２８６を参照されたい。ＡＤアミロイドの非Ａβ成分前駆体（ＮＡＣＰ）とも称されるαシヌクレインは、１４０個のアミノ酸のタンパク質である。αシヌクレインは、ランダムコイルとしてその天然型で存在するが、しかしながら、ｐＨ、分子密集、重金属含有量、およびドーパミンレベルにおける変化は全て、タンパク質構造に影響を及ぼす。オリゴマー、プロト原線維、原線維、および凝集体成分への構造変化は、タンパク質毒性を調節すると考えられる。増加する証拠は、ドーパミン付加されたαシヌクレインは、非付加タンパク質と比較して、原線維形成へのより速い経時変化を有することを示す。さらに、αシヌクレイン過剰発現の背景におけるドーパミンは、有毒である。
【００２６】
本明細書において、「αシヌクレイン」、「アルファシヌクレイン」、「ａ−シヌクレイン」、および「ａＳｙｎ」という用語は、互換的に使用され、特にαシヌクレインの天然モノマー型を指す。「αシヌクレイン」という用語は、αシヌクレイン、例えば、ドーパミンキノン（ＤＡＱ）と結合したαシヌクレインおよびαシヌクレインのオリゴマーまたは凝集体の他の配座異性体を概して特定するためにも使用される。「αシヌクレイン」という用語は、αシヌクレインの全ての種類と型を集合的に指すためにも使用される。ヒトαシヌクレインのタンパク質配列は、ＭＤＶＦＭＫＧＬＳＫＡＫＥＧＶＶＡＡＡＥＫＴＫＱＧＶＡＥＡＡＧＫＴＫＥＧＶＬＹＶＧＳＫＴＫＥＧＶＶＨＧＶＡＴＶＡＥＫＴＫＥＱＶＴＮＶＧＧＡＶＶＴＧＶＴＡＶＡＱＫＴＶＥＧＡＧＳＩＡＡＡＴＧＦＶＫＫＤＱＬＧＫＮＥＥＧＡＰＱＥＧＩＬＥＤＭＰＶＤＰＤＮＥＡＹＥＭＰＳＥＥＧＹＱＤＹＥＰＥＡ（配列番号１）である。αシヌクレインのアミノ酸配列は、文献および関連データベースから検索することができ、例えば、例えば、Ｕｅｄａら（同書）、ＧｅｎＢａｎｋ  ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ：ローカスＳＹＵＡ＿ＨＵＭＡＮ、受託番号Ｐ３７８４０を参照されたい。ＡＤアミロイドの非Ａβ成分（ＮＡＣ）は、αシヌクレインに由来する。αシヌクレイン内の高疎水性ドメイン、ＮＡＣは、少なくとも２８個のアミノ酸残基（残基６０〜８７）および任意で３５個のアミノ酸残基（残基６１〜９５）から成るペプチドである。ＮＡＣは、ベータシート構造を形成する傾向を示す（Ｉｗａｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３４（１９９５）１０１３９−１０１４５）。ＮＡＣのアミノ酸配列は、Ｊｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３１０（１９９５），９１−９４、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｓ５６７４６およびＵｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ９０（１９９３），１２８２−１１２８６に記載される。
【００２７】
非凝集αシヌクレインまたはＮＡＣを含むそのフラグメントは、モノマーペプチドユニットを意味する。非凝集αシヌクレインまたはそのフラグメントは、通常可溶性であり、自己凝集して可溶性オリゴマーを形成する能力がある。αシヌクレインおよびそのフラグメントのオリゴマーは、通常可溶性であり、主にα螺旋体として存在する。モノマーαシヌクレインは、超音波処理を伴う純ＤＭＳＯに凍結乾燥ペプチドを溶解することによって、インビトロで調製され得る。得られた溶液を、任意の不溶性微粒子を除去するために遠心分離する。凝集αシヌクレインまたはＮＡＣを含むそのフラグメントとは、不溶性βシート集合体に会合したαシヌクレインまたはそのフラグメントのオリゴマーを意味する。凝集αシヌクレインまたはＮＡＣを含むそのフラグメントはまた、原線維ポリマーを意味する。原線維は通常不溶性である。ある種の抗体は、可溶性αシヌクレインもしくはそのフラグメント、または凝集αシヌクレインもしくはそのフラグメントのどちらか一方に結合する。ある種の抗体は、モノマー型または原線維型によりも強く、αシヌクレインのオリゴマーに結合する。ある種の抗体は、可溶性および凝集αシヌクレインまたはそのフラグメントの両方に、任意でオリゴマー型にも同様に結合する。
【００２８】
本明細書に開示されるヒト抗αシヌクレイン抗体は、αシヌクレインおよびそのエピトープ、ならびにαシヌクレインおよびそのエピトープの様々な構造に特異的に結合する。例えば、αシヌクレイン、その天然モノマー型のαシヌクレイン、全長および切り詰め型αシヌクレイン、ならびにαシヌクレイン凝集体に特異的に結合する抗体が、本明細書に開示される。本明細書で使用される、αシヌクレインに「特異的に結合する」、「選択的に結合する」、または「優先的に結合する」抗体への言及は、他の非関連タンパク質に結合しない抗体を指す。１つの例では、本明細書に開示されるαシヌクレイン抗体は、αシヌクレインまたはそのエピトープに結合することができ、他のタンパク質に対して、自然界の約１．５倍を超えて結合を示さない。αシヌクレイン配座異性体に「特異的に結合する」または「選択的に結合する」抗体は、αシヌクレインの全ての構造に結合するわけではない、すなわち、少なくとも１つの他のαシヌクレイン配座異性体に結合しない抗体を指す。例えば、αシヌクレイン、ヒトおよびマウスαシヌクレイン、全長のαシヌクレインおよび切り詰め型、ならびにヒトαシヌクレイン対βおよびγシヌクレインのモノマーおよび凝集型の中で区別することができる抗体が、本明細書に開示される。本発明のヒト抗αシヌクレイン抗体は、パーキンソン症の徴候がなく、αシヌクレイン特異的免疫反応を示している高齢対象の集団から単離されているため、本発明の抗αシヌクレイン抗体は、それらの抗体が実際に対象によって発現され、例えば、これまでヒト様の抗体を提供するために試みるための１つの一般的な方法を代表するものであった、ヒト免疫グロブリンを発現するファージライブラリから単離されたものではないことを強調するために、「ヒト自己抗体」とも呼ばれ得る。
【００２９】
「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」実体という用語は、その実体の１つ以上を指すことに注目されたく、「１つの抗体（ａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）」は、１つ以上の抗体を示すと理解されたい。したがって、「１つの（ａ）」（または「１つの（ａｎ）」）、「１つ以上」、および「少なくとも１つ」という用語は、本明細書で互換的に使用され得る。
【００３０】
本明細書で使用される、「ポリペプチド」という用語は、単数形の「ポリペプチド」、ならびに複数形の「ポリペプチド」を包含することが意図され、アミド結合（ペプチド結合としても知られている）によって線状に連結されるモノマー（アミノ酸）から成る分子を指す。「ポリペプチド」という用語は、２つ以上のアミノ酸の任意の鎖または複数の鎖を指し、生成物の特定の長さを指さない。したがって、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」、または２つ以上のアミノ酸の１本の鎖または複数の鎖を指すために使用される任意の他の用語は、「ポリペプチド」の定義内に含まれ、「ポリペプチド」という用語は、これらの用語の任意の代わりに、または互換的に使用され得る。
【００３１】
「ポリペプチド」という用語は、ポリペプチドの発現後修飾の生成物を指すことも意図され、限定なしに、グリコシル化、アセチル化、リン酸化反応、アミド化、周知の保護基／ブロッキング基による誘導体化、タンパク質分解的切断、または非自然発生アミノ酸による修飾を含む。ポリペプチドは、天然生物学的起源に由来し得る、または組換え技術によって産生され得るが、必ずしも指定された核酸配列から翻訳されない。それは、化学合成を含む任意の様式で産生され得る。
【００３２】
本発明のポリペプチドは、約３個以上、５個以上、１０個以上、２０個以上、２５個以上、５０個以上、７５個以上、１００個以上、２００個以上、５００個以上、１，０００個以上、または２，０００個以上のアミノ酸の大きさであり得る。ポリペプチドは、必ずしもそのような構造を有するとは限らないが、確定した三次元構造を有し得る。確定した三次元構造を有するポリペプチドは、フォールドと称され、確定した三次元構造を有さないが、むしろ多数の異なる構造を採用することができるポリペプチドは、アンフォールドと称される。本明細書で使用される、糖タンパク質という用語は、アミノ酸残基、例えば、セリン残基またはアスパラギン残基の酸素含有もしくは窒素含有側鎖を介してタンパク質に結合される少なくとも１つの炭水化物成分に結合するタンパク質を指す。
【００３３】
「単離」ポリペプチドまたはそのフラグメント、変異体、または誘導体は、その自然環境に存在しないポリペプチドを指す。精製の特定のレベルは必要とされない。例えば、単離ポリペプチドは、その天然または自然環境から除去され得る。組換え技術によって産生されるポリペプチドおよび宿主細胞で発現されるタンパク質は、任意の適切な手法で、分離、分画、または部分的もしくは十分に精製された天然または組換えポリペプチドのように、本発明の目的のために単離されたと見なされる。
【００３４】
本発明のポリペプチドには、前述のポリペプチドのフラグメント、誘導体、類似体、または変異体、およびそれらの任意の組み合わせも含まれる。「フラグメント」、「変異体」、「誘導体」、および「類似体」という用語は、本発明の抗体または抗体ポリペプチドを参照するとき、対応する天然結合分子、抗体、またはポリペプチドの抗原結合特性の少なくともいくつかを保持する任意のポリペプチドを含む。本発明のポリペプチドのフラグメントは、本明細書の他の箇所で説明される特異的抗体フラグメントに加えて、タンパク質分解フラグメント、ならびに欠失フラグメントを含む。本発明の抗体および抗体ポリペプチドの変異体は、上で説明されたフラグメント、ならびにアミノ酸置換、欠失、または挿入による変化したアミノ酸配列を有するポリペプチドも含む。変異体は、自然に発生し得るか、または非自然的に生じている場合もある。非自然発生変異体を、当技術分野で知られている突然変異誘発技術を使用して産生し得る。変異体ポリペプチドは、保存もしくは非保存アミノ酸置換、欠失、または添加を含み得る。αシヌクレイン特異結合分子の誘導体、例えば本発明の抗体および抗体ポリペプチドは、天然ポリペプチドで見出されない付加的な特徴を示すように変えられたポリペプチドである。実施例は、融合タンパク質を含む。変異体ポリペプチドはまた、「ポリペプチド類似体」と本明細書にて称される場合もある。本明細書で使用される、結合分子もしくはそのフラグメント、抗体、または抗体ポリペプチドの「誘導体」は、官能側基の反応によって化学的に誘導体化される１つ以上の残基を有する対象のポリペプチドを指す。「誘導体」には、２０個の標準アミノ酸の１つ以上の自然発生アミノ酸誘導体を含有するそれらのペプチドも含まれる。例えば、４−ヒドロキシプロリンはプロリンに対して置換され得、５−ヒドロキシリジンはリジンに対して置換され得、３−メチルヒスチジンはヒスチジンに対して置換され得、ホモセリンはセリンに対して置換され得、およびオルニチンはリジンに対して置換され得る。
【００３５】
「ポリヌクレオチド」という用語は、単数の核酸、ならびに複数の核酸を包含することを意図し、単離核酸分子またはコンストラクト、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）またはプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を指す。ポリヌクレオチドは、従来のリン酸ジエステル結合または非従来的な結合（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）で見出されるもの等のアミド結合）を含み得る。「核酸」という用語は、任意の１つ以上の核酸断片、例えば、ポリヌクレオチドで存在するＤＮＡまたはＲＮフラグメントを指す。「単離」核酸またはポリヌクレオチドは、核酸分子、ＤＮＡ、またはＲＮＡを指し、それは、その天然環境から除去されている。例えば、ベクターに含有される抗体をコードする組換えポリヌクレオチドは、本発明の目的のために単離されたと見なされる。単離ポリヌクレオチドのさらなる例は、異種宿主細胞内で維持される組換えポリヌクレオチド、または溶液で（部分的または十分に）精製されるポリヌクレオチドを含む。単離ＲＮＡ分子は、本発明のポリヌクレオチドのインビボまたはインビトロＲＮＡ転写物を含む。本発明に記載の単離ポリヌクレオチドまたは核酸は、合成的に産生されるそのような分子をさらに含む。加えて、ポリヌクレオチドまたは核酸は、プロモーター、リボソーム結合部位、または転写ターミネータ等の調節要素であり得るか、またはそれらを含み得る。
【００３６】
本明細書で使用される、「コーディング領域」は、アミノ酸に翻訳されるコドンから成る核酸の一部である。「終止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡ、またはＴＡＡ）は、アミノ酸に翻訳されないが、コーディング領域の一部と見なされ得、任意の隣接配列、例えば、プロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネータ、イントロン等は、コーディング領域の一部ではない。本発明の２つ以上のコーディング領域は、単一ポリヌクレオチドコンストラクト、例えば、単一ベクター上、または分離ポリヌクレオチドコンストラクト内、例えば、分離（異なる）ベクター上に存在することができる。さらに、任意のベクターは、単一コーディング領域を含有し得、２つ以上のコーディング領域を含み得、例えば、単一ベクターは、免疫グロブリン重鎖可変領域および免疫グロブリン軽鎖可変領域を別々にコードし得る。加えて、本発明のベクター、ポリヌクレオチド、もしくは核酸は、結合分子、抗体、またはそのフラグメント、変異体、もしくは誘導体をコードする核酸に融合されるか、または融合されなくてもよい、異種コーディング領域をコードし得る。異種コーディング領域は、制限なく、分泌シグナルペプチドまたは異種機能ドメイン等の特殊成分またはモチーフを含む。
【００３７】
ある実施形態では、ポリヌクレオチドまたは核酸はＤＮＡである。ＤＮＡの場合、ポリペプチドをコードする核酸を含むポリヌクレオチドは、通常、１つ以上のコーディング領域に操作可能に付随するプロモーターおよび／または他の転写もしくは翻訳制御要素を含む。操作可能な付随は、遺伝子産物、例えば、ポリペプチド、に対するコーディング領域が、調節配列の影響または制御下に遺伝子産物の発現が置かれるような形で、１つ以上の調節配列に付随される場合である。２つのＤＮＡフラグメント（ポリペプチドコーディング領域およびそれに付随されるプロモーター等）は、プロモーター機能の誘導が、所望の遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの転写をもたらす場合、および２つのＤＮＡフラグメントの間の連鎖の性質が、遺伝子産物の発現を指示するための発現調節配列の能力を妨害しない、またはＤＮＡ鋳型の転写される能力を妨害しない場合、「操作可能に付随される」または「操作可能に連結される」。したがって、プロモーター領域は、プロモーターがその核酸の転写をもたらすことができた場合、ポリペプチドをコードする核酸と操作可能に付随されるであろう。プロモーターは、所定細胞内でのみ、ＤＮＡの実質的な転写を指示する細胞特異的プロモーターであり得る。プロモーターに加えて、他の転写制御要素、例えば、エンハンサー、オペレーター、リプレッサー、および転写終結シグナルを、細胞特異的転写を指示するために、ポリヌクレオチドと操作可能に付随することができる。適切なプロモーターおよび他の転写制御領域は、本明細書に開示される。
【００３８】
多種多様の転写制御領域が当業者に知られている。これらは、制限なく、サイトメガロウイルス（イントロンＡと協同する、前初期プロモーター）、シミアンウイルス４０（初期プロモーター）、ならびにレトロウイルス（ラウス肉腫ウイルス等）からのプロモーターおよびエンハンサー断片等であるが、それらに限定されない脊椎動物細胞内で機能する転写制御領域を含む。他の転写制御領域は、アクチン、熱ショックタンパク質、ウシ成長ホルモン、およびウサギβ−グロビン等の脊椎動物遺伝子、ならびに真核細胞内で遺伝子発現を制御することができる他の配列に由来するものを含む。さらなる適切な転写制御領域は、組織特異的プロモーターおよびエンハンサー、ならびにリンフォカイン誘導性プロモーター（例えば、インターフェロンまたはインターロイキンによって誘導可能なプロモーター）を含む。
【００３９】
同様に、多種多様の翻訳制御要素が当業者に知られている。これらは、リボソーム結合部位、翻訳開始および終結コドン、ならびにピコルナウイルスに由来する成分（特に、ＣＩＴＥ配列としても参照される内部リボソーム侵入部位、またはＩＲＥＳ）を含むが、それらに限定されない。
【００４０】
他の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡ、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の形である。
【００４１】
本発明のポリヌクレオチドおよび核酸コーディング領域は、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの分泌を指示する分泌またはシグナルペプチドをコードする付加的なコーディング領域に付随され得る。シグナル仮説によると、哺乳類細胞によって分泌されるタンパク質は、いったん粗面小胞体を越えて成長タンパク鎖の搬出が開始されると、成熟タンパク質から切断されるシグナルペプチドまたは分泌リーダー配列を有する。当業者は、通常、脊椎動物細胞によって分泌されるポリペプチドは、ポリペプチドのＮ末端に対してシグナルペプチド融合を有し、それはポリペプチドの分泌または「成熟」形態を産生するために、完全なまたは「全長」ポリペプチドから切断されることを承知している。ある実施形態では、天然シグナルペプチド、例えば、免疫グロブリン重鎖もしくは軽鎖シグナルペプチド、またはそれに操作可能に付随されるポリペプチドの分泌を指示する能力を保持するその配列の機能誘導体が使用される。あるいは、異種哺乳類シグナルペプチド、またはその機能誘導体が使用され得る。例えば、野生型リーダー配列は、ヒト組織プラスミノーゲンアクチベーター（ＴＰＡ）またはマウスβ−グルクロニダーゼのリーダー配列で置換され得る。
【００４２】
別途提示されない限り、「疾患」および「疾病」という用語は、本明細書で互換的に使用される。
【００４３】
本発明の文脈で使用される「結合分子」は、主として抗体、およびそのフラグメントに関するが、ホルモン、受容体、リガンド、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）等のシャペロン、ならびにカドヘリン、インテグリン、Ｃ型レクチン、および免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーのメンバー等の細胞間接着分子を含むが、それらに限定されないαシヌクレインに結合する他の非抗体分子を指す場合もある。したがって、明瞭さの目的のみで、本発明の範囲を制限することなく、以下の実施形態の大部分は、治療および診断薬の開発への好ましい結合分子を代表する抗体および抗体様の分子に関して説明される。
【００４４】
「抗体」および「免疫グロブリン」という用語は、本明細書で互換的に使用される。抗体または免疫グロブリンは、少なくとも重鎖の可変ドメインを含み、通常少なくとも重鎖および軽鎖の可変ドメインを含むαシヌクレイン結合分子である。脊椎動物システムの基本的な免疫グロブリン構造は、比較的よく理解されており、例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ２ｎｄ  ｅｄ．  １９８８）を参照されたい。
【００４５】
以下でより詳しく説明される、「免疫グロブリン」という用語は、生化学的に識別することができるポリペプチドの様々な広範のクラスを含む。当業者は、重鎖が、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、またはエプシロン（γ、μ、α、δ、ε）、およびそれらの間のいくつかのサブクラス（例えば、γ１−γ４）に分類されることを理解する。それぞれ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧ、またはＩｇＥとして抗体の「クラス」を決定するのはこの鎖の性質である。免疫グロブリンサブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１等は、よく特徴付けられており、機能分化を与えることで知られている。これらのクラスおよびアイソタイプの各々の修正版は、本開示を考慮すると当業者にとって容易に認識可能であり、したがって、本発明の範囲内である。全ての免疫グロブリンクラスは、明らかに本発明の範囲内であり、以下の説明は、通常免疫グロブリン分子のＩｇＧクラスに向けられる。ＩｇＧに関して、標準免疫グロブリン分子は、分子量約２３，０００ダルトンの２つの同一の軽鎖ポリペプチド、および分子量５３，０００〜７０，０００ダルトンの２つの同一の重鎖ポリペプチドを含む。４つの鎖は、典型的には「Ｙ」配置で、ジスルフィド連結によって連結され、軽鎖が「Ｙ」配置の口で始まり、可変領域を通して続く重鎖を一括する。
【００４６】
軽鎖は、カッパまたはラムダ（κ、λ）のいずれか一方に分類される。各重鎖クラスは、カッパまたはラムダ軽鎖のいずれか一方と結合され得る。通常、軽鎖および重鎖は、相互に共有結合的に結合され、２つの重鎖の「尾」部分は、免疫グロブリンが、ハイブリドーマ、Ｂ細胞、または遺伝子改変宿主細胞のいずれかによって産生されるときに、共有結合ジスルフィド連鎖または非共有結合連鎖によって相互に結合される。重鎖において、アミノ酸配列は、Ｙ配置のフォーク状末端におけるＮ末端から、各鎖の下部におけるＣ末端まで及ぶ。
【００４７】
軽鎖および重鎖の両方ともに、構造的および機能的相同性の領域に分割される。「定常」および「可変」という用語は、機能的に使用される。この点において、軽（ＶＬ）および重（ＶＨ）鎖部分の両方の可変ドメインが、抗原認識および特異性を決定することを理解されたい。逆に、軽鎖（ＣＬ）および重鎖（ＣＨ１、ＣＨ２、またはＣＨ３）の定常ドメインは、分泌、経胎盤移動性、Ｆｃ受容体結合、補体結合等の重要な生物学的特性を与える。慣習によって、定常領域ドメインの番号付けは、抗原結合部位または抗体のアミノ末端から離れるにつれて増加する。Ｎ末端部分は可変領域であり、Ｃ末端部分では定常領域であり、ＣＨ３およびＣＬドメインは、実際にそれぞれ、重鎖および軽鎖のカルボキシ末端を含む。
【００４８】
上に示すように、可変領域は、抗体が抗原上でエピトープを選択的に認識し、特異的に結合することを許す。つまり、抗体のＶＬドメインおよびＶＨドメイン、または相補性決定領域（ＣＤＲ）のサブセットは、三次元抗原結合部位を定義する可変領域を形成するために結合する。この四次抗体構造は、Ｙの各アームの末端で存在する抗原結合部位を形成する。より具体的には、抗原結合部位は、ＶＨ鎖およびＶＬ鎖の各々上の３つのＣＤＲによって定義される。αシヌクレインに特異的に結合するために十分な構造を含有する任意の抗体または免疫グロブリンフラグメントは、「結合フラグメント」または「免疫特異的フラグメント」として互換的に本明細書に示される。
【００４９】
自然発生抗体において、抗体は、各抗原結合ドメインに存在する「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」と時々呼ばれる６つの超可変領域を含み、それらは、抗体が水性環境中でその三次元構造であると想定すると、抗原結合ドメインを形成するために特異的に配置されるアミノ酸の、短い非近接配列である。「ＣＤＲ」は、分子間可変性がより低い４つの相対的に保存される「フレームワーク」領域または「ＦＲ」によって隣接される。フレームワーク領域は、βシート立体構造を主として採択し、ＣＤＲはβシート構造に連結し、場合によってはβシート構造の一部を形成するループを形成する。したがって、フレームワーク領域は、鎖間の非共有結合相互作用により、正しい配向でＣＤＲを配置させる足場を形成する役割を果たす。配置されるＣＤＲによって形成される抗原結合ドメインは、免疫反応性抗原上のエピトープに対して相補的な面を定める。この相補的な面は、その同種エピトープに対して、抗体の非共有結合を促進する。ＣＤＲおよびフレームワーク領域を含むアミノ酸は、それらは正確に定義されているので、それぞれ、いかなる重鎖または軽鎖可変領域に関しても、当業者によって容易に特定されることができ、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」Ｋａｂａｔ，Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，（１９８３）、およびＣｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６（１９８７），  ９０１−９１７を参照されたく、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【００５０】
当技術分野内で使用および／または承認される用語の２つ以上の定義が存在する場合、本明細書で使用される用語の定義は、明確に反論されない限り、全てのそのような意味を含むことを意図する。具体的な例は、重鎖および軽鎖ポリペプチドの両方の可変領域内で見出される非近接抗原結合部位を説明するための「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）という用語の使用である。この特定の領域は、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆＨｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”（１９８３）およびＣｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６（１９８７），９０１−９１７によって説明されており、それらは、参照により本明細書に組み込まれ、これらの定義は、相互に比較される場合、アミノ酸残基の重複またはサブセットを含む。それでもなお、抗体またはその変異体のＣＤＲを指すためのいずれか一方の定義の適用は、本明細書で定義および使用される用語の範囲内にあることを意図する。上で引用された参考文献の各々によって定義される、ＣＤＲを包含する適切なアミノ酸残基は、比較として以下の表１に示される。特定のＣＤＲを包含する正確な残基数は、ＣＤＲの配列および大きさによって変化する。当業者は、抗体の可変領域アミノ酸配列を考えれば、どの残基が、抗体のヒトＩｇＧサブタイプの特定の超可変領域またはＣＤＲを含むかを日常的に決定することができる。
【００５１】
【表１】
2014221835.tif 000002
【００５２】
カバットらは、任意の抗体に適用できる可変ドメイン配列のための番号付けシステムも定義した。当業者は、配列自体を超えるいずれの実験資料にも依存することなく、任意の可変ドメイン配列に対する「カバットの番号付け」のこのシステムを明確に割り当てることができる。本明細書で使用される、「カバットの番号付け」は、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｕ．Ｓ．  Ｄｅｐｔ．  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」（１９８３）によって示される番号付けシステムを指す。別途特定されない限り、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメント、変異体、もしくは誘導体における、特異的アミノ酸残基位置の番号付けへの言及は、カバット番号付けシステムに準じている。
【００５３】
本発明の抗体またはその抗原結合フラグメント、免疫特異的フラグメント、変異体、または誘導体は、ポリクローナル、モノクローナル、多特異的、ヒト、ヒト化、霊長類化、マウス化、またはキメラ抗体、単鎖抗体、エピトープ結合フラグメント、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、およびＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、ジスルフィド連鎖Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）、ＶＬまたはＶＨドメインのいずれか一方を含むフラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリによって産生されるフラグメント、および抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、本明細書に開示される抗体に対する抗Ｉｄ抗体を含む）を含むが、それらに限定されない。ＳｃＦｖ分子は、当技術分野で知られており、例えば、米国特許第５，８９２，０１９号で説明される。本発明の免疫グロブリンまたは抗体分子は、任意の型（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２）、または免疫グロブリン分子のサブクラスであり得る。
【００５４】
１つの実施形態では、本発明の抗体は、五価構造を有するＩｇＭまたはその誘導体ではない。特に、本発明の特定の適用、特に治療的使用において、ＩｇＭは、ＩｇＧおよび他の二価抗体または対応する結合分子より有用でなく、それらの五価構造および親和性成熟の欠如により、ＩｇＭはしばしば、非特異的交差反応性および非常に低い親和性を示す。
【００５５】
特に好ましい実施形態では、本発明の抗体は、ポリクローナル抗体ではなく、すなわち、それは実質的には、血漿免疫グロブリン試料から得られる混合物ではなくむしろ、１つの特定の抗体種から成る。
【００５６】
単鎖抗体を含む抗体フラグメントは、単独のまたは以下の全てまたは一部と組み合わせた可変領域を含むことができる。ヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメイン。また、可変領域とヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメインとの任意の組み合わせも含むαシヌクレイン結合フラグメントは、本発明に含まれる。本発明の抗体またはその免疫特異的フラグメントは、トリおよび哺乳類を含む任意の動物起源であることができる。好ましくは、抗体は、ヒト、マウス、ロバ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ラマ、ウマ、またはニワトリ抗体である。別の実施形態において、可変領域は、起源が、コンドリクトイド（ｃｏｎｄｒｉｃｔｈｏｉｄ）である可能性がある（例えば、サメから）。
【００５７】
一態様において、本発明の抗体は、ヒトから単離されたヒトモノクローナル抗体である。任意で、ヒト抗体のフレームワーク領域は、データベース中の関連ヒト生殖細胞系可変領域配列に従って整列され、採択される；例えば、ＭＲＣ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）によって主催されたＶｂａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｖｂａｓｅ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／）を参照されたい。例えば、真の生殖細胞系配列から潜在的に逸脱すると見なされるアミノ酸は、クローンプロセス中に、組み込まれたＰＣＲプライマー配列の結果である可能性がある。ファージディスプレイ抗体ライブラリまたは異種マウスからの単鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）等の人工的に産生されたヒト様の抗体と比較して、本発明のヒトモノクローナル抗体は、（ｉ）動物の代理のものよりもヒト免疫反応を使用して得られる、すなわち、抗体が、その人体に関連する立体構造内の天然αシヌクレインに応じて産生されることと、（ｉｉ）個々を保護するまたはαシヌクレインの存在に対して少なくとも重要であることと、（ｉｉｉ）抗体が、ヒト由来であるため、自己抗原に対する交差反応性の危険性は最小限にされることに特徴付けられる。したがって、本発明に従って「ヒトモノクローナル抗体」、「ヒトモノクローナル自己抗体」、「ヒト抗体」等の用語は、すなわち、Ｂ細胞またはそのハイブリドーマ等のヒト細胞またはヒト細胞のｍＲＮＡ、例えば、ヒトメモリーＢ細胞から直接クローン化されたｃＤＮＡから単離された、ヒト由来のものであるαシヌクレイン結合分子を示すために使用される。ヒト抗体は、アミノ酸置換が、例えば、結合特性を改善するために、抗体内で作製されても、それでも「ヒト」である。
【００５８】
ヒト免疫グロブリンライブラリにまたは１つ以上のヒト免疫グロブリンに対する動物遺伝子導入に由来し、内因性免疫グロブリンを発現しない、以下に、および例えば、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉらによる米国特許第５，９３９，５９８号内に説明される抗体は、本発明の真のヒト抗体から識別するために、ヒト様の抗体と示される。
【００５９】
本明細書で使用される、「マウス化抗体」または「マウス化免疫グロブリン」という用語は、本発明のヒト抗体から１つ以上のＣＤＲを含む抗体ならびにアミノ酸置換および／または欠失および／またはマウス抗体配列を基にした挿入を含有するヒトフレームワーク領域を指す。ＣＤＲを提供するヒト免疫グロブリンは、「親」または「受容体」と称され、フレームワーク変更を提供するマウス抗体は、「ドナー」と称される。定常領域は、存在する必要はないが、存在する場合、それらは、マウス抗体の定常領域と、通常実質的に同一である、すなわち、少なくとも約８５〜９０％、好ましくは約９５％以上同一である。ゆえに、いくつかの実施形態において、全長マウス化したヒト重または軽鎖免疫グロブリンは、マウス定常領域、ヒトＣＤＲ、および多くの「マウス化する」アミノ酸置換を有する実質的にヒトフレームワークを含有する。典型的に、「マウス化抗体」は、マウス化した可変軽鎖および／またはマウス化した可変重鎖を含む抗体である。例えば、マウス化抗体は、例えば、キメラ抗体の全可変領域が、非マウスのため、典型的なキメラ抗体を包含しないであろう。「マウス化」のプロセスによって「マウス化した」修飾した抗体は、ＣＤＲを提供する親抗体と同じ抗原に結合し、通常親抗体と比較して、マウス内で低い免疫原性である。
【００６０】
本明細書で使用される、「重鎖部分」という用語は、免疫グロブリン重鎖に由来するアミノ酸配列を含む。重鎖部分を含むポリペプチドは、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ（例えば、上方、中間、および／または下方ヒンジ領域）ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、または変異体またはそのフラグメントのうちの少なくとも１つを含む。例えば、本発明で使用するための結合ポリペプチドは、ＣＨ１ドメインを含むポリペプチド鎖、ＣＨ１ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部、およびＣＨ２ドメインを含むポリペプチド鎖、ＣＨ１ドメインおよびＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖、ＣＨ１ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部、およびＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖、またはＣＨ１ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖を含むことができる。別の実施形態において、本発明のポリペプチドは、ＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖を含む。さらに、本発明において使用するための結合ポリペプチドは、ＣＨ２ドメインの少なくとも一部（例えば、ＣＨ２ドメインの全てまたは一部）が、欠如する可能性がある。上記に示すように、これらのドメイン（例えば、重鎖部分）が、それらが自然発生免疫グロブリン分子からのアミノ酸配列が変化するように修飾され得ることが、当業者によって理解されるであろう。
【００６１】
本明細書に開示される特定の抗体、またはその抗原結合フラグメント、変異体、もしくは誘導体において、多量体の１つのポリペプチド鎖の重鎖部分は、多量体の第２のポリペプチド鎖上のものと同一である。あるいは、重鎖部分を含有する本発明のモノマーは、同一ではない。例えば、それぞれのモノマーは、例えば、二特異的抗体または二重特異性抗体を形成する異なる標的結合部位を含むことができる。
【００６２】
別の実施形態において、本明細書に開示される抗体、またはその抗原結合フラグメント、変異体、もしくは誘導体は、ｓｃＦｖ等の単一ポリペプチド鎖からなり、潜在的インビボ治療的および診断的適用に対して細胞内に（細胞内抗体）発現される。
【００６３】
本明細書に開示される診断的および治療方法で使用する結合ポリペプチドの重鎖部分は、異なる免疫グロブリン分子に由来することができる。例えば、ポリペプチドの重鎖部分は、ＩｇＧ１分子に由来するＣＨ１ドメインおよびＩｇＧ３分子に由来するヒンジ領域を含むことができる。別の例において、重鎖部分は、ＩｇＧ１分子に一部およびＩｇＧ３分子に一部由来するヒンジ領域を含むことができる。別の例において、重鎖部分は、ＩｇＧ１分子に一部、およびＩｇＧ４分子に一部由来するキメラヒンジを含むことができる。
【００６４】
本明細書で使用される、「軽鎖部分」という用語は、免疫グロブリン軽鎖に由来するアミノ酸配列を含む。好ましくは、軽鎖部分は、少なくとも１つのＶＬまたはＣＬドメインを含む。
【００６５】
抗体のペプチドまたはポリペプチドエピトープの最小サイズは、約４〜５つのアミノ酸であると考えられる。ペプチドまたはポリペプチドエピトープは、好ましくは、少なくとも７個、より好ましくは、少なくとも９個、および最も好ましくは、少なくとも約１５〜約３０個のアミノ酸を含有する。ＣＤＲが、その三次形態において、抗原性ペプチドまたはポリペプチドを認識することができるため、エピトープを含むアミノ酸は、近接する必要はなく、場合によっては、同じペプチド鎖上にさえもない可能性がある。本発明において、本発明の抗体によって認識されるペプチドまたはポリペプチドエピトープは、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、より好ましくは少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、または約１５〜約３０個のαシヌクレインの近接するまたは非近接アミノ酸の配列を含有する。
【００６６】
本明細書において互換的に使用される「特異的に結合する」、または「特異的に認識する」とは、通常、結合分子、例えば、抗体が、その抗原結合ドメインを通してエピトープに結合すること、および結合が、抗原結合ドメインとエピトープとの間のいくつかの相補性を伴うことを意味する。この定義によると、抗体は、無作為の、無関係のエピトープに結合するよりもより簡単にその抗原結合ドメインを通してそのエピトープに結合する時に、エピトープに「特異的に結合する」といわれる。「特異性」という用語は、特定の抗体が特定のエピトープに結合する相対的親和性を限定するために、本明細書において使用される。例えば、抗体「Ａ」は、抗体「Ｂ」よりも、あるエピトープに対して、高い特異性を有すると見なされ得る、または抗体「Ａ」は、関係するエピトープ「Ｄ」に対して有する特異性よりも高いものでエピトープ「Ｃ」に結合すると言われる可能性がある。
【００６７】
存在する際、「免疫学的結合特性」という用語または抗原との抗体のその他の結合特性は、その全ての文法の形式で、特異性、親和性、交差反応性、および抗体の他の結合特性を指す。
【００６８】
「優先的に結合する」とは、結合分子、例えば抗体が、関係する、同様の、相同の、または類似のエピトープに結合するよりもより簡単エピトープに特異的に結合することを意味する。したがって、あるエピトープに「優先的に結合する」抗体が関係するエピトープと交差反応することができるにもかかわらず、かかる抗体は、関係するエピトープよりもそのエピトープに結合する可能性が高い。
【００６９】
限定しない例として、結合分子、例えば抗体は、第２のエピトープに対して抗体の解離定数（ＫＤ）よりも低いＫＤで第１のエピトープを結合する場合、優先的に該第１のエピトープに結合すると見なされ得る。別の限定しない例において、第２のエピトープに対する抗体のＫＤよりも少なくとも１オーダー分少ない親和性で第１のエピトープに結合する場合、抗体は、優先的に第１の抗原を結合すると見なされ得る。別の限定しない例において、第２のエピトープに対する抗体のＫＤよりも少なくとも２つのオーダー分少ない親和性で第１のエピトープを結合する場合、抗体は、優先的に第１のエピトープと結合すると見なされ得る。
【００７０】
別の限定しない例において、結合分子、例えば抗体は、第２のエピトープに対する抗体のｋ（ｏｆｆ）よりも低いオフ率（ｋ（ｏｆｆ））で第１のエピトープを結合する場合、優先的に第１のエピトープに結合すると見なされ得る。別の限定されない例において、第２のエピトープに対する抗体のｋ（ｏｆｆ）よりも少なくとも１オーダー分低い親和性で第１のエピトープを結合する場合、抗体は、優先的に第１のエピトープに結合すると見なされ得る。別の限定されない例において、第２のエピトープに対する抗体のｋ（ｏｆｆ）よりも少なくとも２つのオーダー分低い親和性で第１のエピトープを結合する場合、抗体は、優先的に第１のエピトープに結合すると見なされ得る。
【００７１】
本明細書に開示される結合分子、例えば、抗体、または抗原結合フラグメント、変異体、もしくは誘導体は、５Ｘ１０−２秒−１、１０−２秒−１、５Ｘ１０−３秒−１、もしくは１０−３秒−１未満、または同等のオフレート（ｋ（ｏｆｆ））で、αシヌクレインまたはそのフラグメントもしくは変異体に結合すると考え得る。さらに好ましくは、本発明の抗体は、５Ｘ１０−４秒−１、１０−４秒−１、５Ｘ１０−５秒−１、もしくは１０−５秒−１、５Ｘ１０−６秒−１、１０−６秒−１、５Ｘ１０−７秒−１もしくは１０−７秒−１未満、または同等のオフレート（ｋ（ｏｆｆ））で、αシヌクレインまたはそのフラグメントもしくはその変異体に結合すると考え得る。
【００７２】
本明細書に開示される結合分子、例えば抗体、または抗原結合フラグメント、変異体、もしくは誘導体は、１０３Ｍ−１秒−１、５Ｘ１０３Ｍ−１秒−１、１０−４Ｍ−１秒−１、もしくは５Ｘ１０４Ｍ−１秒−１を上回るか、または同等のオンレート（ｋ（ｏｎ））で、αシヌクレインまたはそのフラグメントもしくは変異体に結合すると考えられ得る。さらに好ましくは、本発明の抗体は、１０５Ｍ−１秒−１、５Ｘ１０５Ｍ−１秒−１、１０６Ｍ−１秒−１、もしくは５Ｘ１０６Ｍ−１秒−１、もしくは１０７Ｍ−１秒−１を上回るか、または同等のオンレート（ｋ（ｏｎ））で、αシヌクレインまたはそのフラグメントもしくは変異体に結合すると考えられ得る。
【００７３】
結合分子、例えば、抗体は、抗体が優先的に、エピトープへの参照抗体の結合をある程度に遮断する範囲で、そのエピトープへ結合する場合、所与のエピトープへの参照抗体の結合を競合的に阻害すると考えられる。競合的な阻害は、例えば、競合ＥＬＩＳＡアッセイ等の当技術分野で既知の任意の方法によって決定され得る。抗体は、少なくとも９０％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくなくとも６０％、または少なくとも５０％で、競合的に参照抗体の所与のエピトープヘの結合を阻害すると考えられ得る。
【００７４】
本明細書で使用される、用語「親和性」は、結合分子、例えば、免疫グロブリン分子等のＣＤＲを有する個々のエピトープ結合の強度の程度を指す。Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ  ｅｄ．（１９８８）２７〜２８ページを参照されたい。本明細書で使用される、用語「結合活性」は、免疫グロブリンと抗原の集団間の複合体の総合的な安定性、すなわち、免疫グロブリンと抗原の混合物の機能的な結合強度を指し、例えば、Ｈａｒｌｏｗ２９〜３４ページを参照されたい。結合活性は、特異的エピトープを有する集団中の個々の免疫グロブリン分子の親和性、また免疫グロブリンおよび抗原の結合価の双方に関連する。例えば、二価モノクローナル抗体とポリマー等の高度な反復エピトープ構造を供なう抗原間の相互作用は、高い結合活性の１つである。抗原への抗体の親和性または結合活性は、実験的に任意の適切な方法を使用して決定し得、例えば、Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，“Ａｎｔｉｂｏｄｙ‐Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ”Ｆｕｎｄａｍａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．，Ｅｄ．，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９８４）、Ｋｕｂｙ，Ｊａｎｉｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９９２）、および本明細書で説明される方法を参照されたい。抗体の抗原への親和性を測定する一般的手法は、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、および表面プラズモン共鳴法を含む。特定の抗体抗原の相互作用の測定された親和性は、例えば、塩分濃度、ｐＨ等の異なる条件下で測定された場合、変動し得る。したがって、例えば、親和性およびＫＤ、ＩＣ５０等の他の抗原結合のパラメータの測定は、好ましくは抗体および抗原の標準化された溶液、ならびに標準化された緩衝液で行われることが好ましい。
【００７５】
結合分子、例えば、本発明の抗体、またはその抗原結合フラグメント、変異体、もしくは誘導体も、それらの交差反応性に関して説明され得るか、特定され得る。本明細書で使用される、用語「交差反応性」は、１つの抗原に対して特異的な抗体の第二の抗原と反応する能力、つまり２つの異なる抗原物質間の関連性の尺度を指す。したがって、抗体は、その形成を誘発したもの以外のエピトープへ結合した場合、交差反応性である。交差反応性のエピトープは、誘発しているエピトープと同一の相補的な構造特徴を通常多く含有し、いくつかの事例においては、実際に本来のものよりも適合し得る。
【００７６】
例えば、ある抗体は、それらが、関連するが同一ではないエピトープ、例えば、参照エピトープに対して、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６５％、少なくとも６０％、少なくとも５５％、および少なくとも５０％の同一性（当技術分野で既知であり、本明細書で説明される方法を使用して算出された場合）を有するエピトープに結合するという点において、ある程度の交差反応性を有する。抗体は、参照エピトープに対して、９５％未満、９０％未満、８５％未満、８０％未満、７５％未満、７０％未満、６５％未満、６０％未満、５５％未満、および５０％未満の同一性（当技術分野で既知であり、本明細書で説明される方法を使用して算出された場合）を有するエピトープに結合しない場合、交差反応性をほとんどまたは全く有さないと考えられ得る。抗体は、そのエピトープのいずれの他の類似体、相同分子種、または相同体に結合しない場合、あるエピトープに対して「高い特異性」があると見なされ得る。
【００７７】
結合分子、例えば、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメント、変異体もしくは誘導体はまた、αシヌクレインへのそれらの結合親和性に関しても、説明されるか、または特定され得る。好ましい結合親和性には、５ｘ１０−２Ｍ、１０−２Ｍ、５ｘ１０−３Ｍ、１０−３Ｍ、５ｘ１０−４Ｍ、１０−４Ｍ、５ｘ１０−５Ｍ、１０−５Ｍ、５ｘ１０−６Ｍ、１０−６Ｍ、５ｘ１０−７Ｍ、１０−７Ｍ、５ｘ１０−８Ｍ、１０−８Ｍ、５ｘ１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、５ｘ１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ、５ｘ１０−１１Ｍ、１０−１１Ｍ、５ｘ１０−１２Ｍ、１０−１２Ｍ、５ｘ１０−１３Ｍ、１０−１３Ｍ、５ｘ１０−１４Ｍ、１０−１４Ｍ、５ｘ１０−１５Ｍ、または１０−１５Ｍ未満の解離定数またはＫｄを有するものが含まれる。
【００７８】
前述に示したように、様々な免疫グロブリンクラスの定常領域のサブユニット構造および三次元構造は既知である。本明細書で使用される、用語「ＶＨドメイン」は、免疫グロブリン重鎖のアミノ末端の可変ドメインを含み、用語「ＣＨ１ドメイン」は、免疫グロブリン重鎖の第１（ほとんどのアミノ末端）定常領域ドメインを含む。ＣＨ１ドメインは、ＶＨドメインに隣接し、免疫グロブリン重鎖分子のヒンジ領域へのアミノ末端である。
【００７９】
本明細書で使用される、用語「ＣＨ２ドメイン」は、従来の番号付けスキームを使用して、例えば、抗体の約残基２４４から残基３６０まで延長する（残基２４４から３６０、カバット番号付けシステム、および残基２３１〜３４０、ＥＵ番号付けシステム、カバットＥＡら（前掲書）を参照されたい）重鎖分子の部分を含む。ＣＨ２ドメインは、他のドメインと密接に対ではないという点において、独特である。むしろ、２つのＮ結合型分岐糖鎖は、無処置の天然ＩｇＧ分子の２つのＣＨ２ドメイン間に挿入される。ＣＨ３ドメインが、ＣＨ２ドメインからＩｇＧ分子のＣ末端へ延長し、約１０８個の残基を含むということも、十分に立証されている。
【００８０】
本明細書で使用される、用語「ヒンジ得領域」は、ＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインを連結する重鎖分子の部分を含む。このヒンジ領域は、約２５個の残基を含み、可動性であり、したがって、２つのＮ末端の抗原に結合する領域を独立的に移動することを可能にする。ヒンジ領域は、３つの明確なドメインへ細区画され得る。：上位、中位、および下位のヒンジドメイン、Ｒｏｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１（１９９８），４０８３を参照されたい。
【００８１】
本明細書で使用される用語、「ジスルフィド連結」は、２つの硫黄原子間に形成される共有結合を含む。アミノ酸システインは、ジスルフィド連結または第２のチオール基と共に架橋を形成し得るチオール基を含む。ほとんどの自然発生ＩｇＧ分子において、ＣＨ１およびＣＬ領域は、ジスルフィド連結により結合され、２つの重鎖は、２つのジスルフィド連結により、カバット番号付けシステムを使用して、２３９および２４２に対応する位置で、結合される（位置２２６または２２９、ＥＵ番号付けシステム）。
【００８２】
本明細書で使用される、用語「結合される」「融合される」、または「融合」は、互換的に仕様される。これらの用語は、さらに２つの要素または成分を、化学的結合または組換え手段を含む何らかの方法で、結合することを指す。「インフレームの融合」は、本来のＯＲＦの正確な翻訳の読み取りフレームを維持する方法で、持続的により長いＯＲＦを形成するための２つ以上のポリヌクレオチド翻訳領域（ＯＲＦ）の結合を指す。したがって、組換え融合タンパク質は、本来のＯＲＦでコードされるポリペプチドに対応する２つ以上の断片を含有する、単一タンパク質である（その断片は、通常それほど自然に結合されない）。読み取りフレームは、このように、融合した断片を通して持続的とされるが、断片は、物理的または空間的に、例えば、インフレームのリンカー配列によって分離し得る。例えば、免疫グロブリン可変領域のＣＤＲをコードする、ポリヌクレオチドはインフレームで融合し得るが、「融合」したＣＤＲが、持続性のポリペプチドの一部として、同時翻訳される限り、少なくとも１つの免疫グロブリンフレームワーク領域または付加的なＣＤＲ領域をコードするポリヌクレオチドにより分離し得る。
【００８３】
本明細書で使用される用語「発現」は、遺伝子がそれによって生化学物質、例えばＲＮＡまたはポリペプチドを産生するプロセスを指す。本プロセスは、制限なく、遺伝子ノックダウン、ならびに一過性発現および安定発現を含む細胞内の遺伝子の機能的な存在のいずれの顕在化を含む。それは、制限なく、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）またはいずれの他のＲＮＡ産物への遺伝子の転写、およびｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳等を含む。最終の所望の産物が生化学物質である場合、発現は、その生化学物質およびいずれの前駆物質の創造を含む。遺伝子の発現は、「遺伝子産物」を産生する。本明細書で使用される、遺伝子産物は、核酸、例えば、遺伝子の転写によって産生されるメッセンジャーＲＮＡ、または転写物から翻訳されるポリペプチドのいずれか１つになり得る。本明細書で説明される遺伝子産物は、例えばポリアデニル化等の転写後修飾を伴う核酸、または、例えばメチル化、グリコシル化、脂質の付加、他のタンパク質サブユニットとの関連、タンパク質分解等の翻訳後修飾を伴う、ポリペプチドをさらに含む。
【００８４】
本明細書で使用される、用語「試料」は、対象または患者から取得されるいずれの生物学的材料をも指す。１つの態様では、試料は、血液、脳脊髄液（「ＣＳＦ」）、または尿を含み得る。他の態様では、試料は、全血液、血漿、血液試料から濃縮されるＢ細胞、および培養された細胞を含み得る（例えば、対象からのＢ細胞）。試料は、神経組織を含む生検または組織試料をも含み得る。さらに他の態様では、試料は、全細胞および／または細胞の可溶化液を含み得る。血液試料は、当技術分野で既知の方法によって採取され得る。１つの態様では、ペレットは、４℃で２００μｌの緩衝液（２０ｍＭのトリス、ｐＨ．７．５、０．５％のノニデット（Ｎｏｎｉｄｅｔ）、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＰＭＳＦ、０．１Ｍの塩化ナトリウム、ＩＸ  Ｓｉｇｍａプロテアーゼ阻害剤、およびＩＸ  Ｓｉｇｍａホスファターゼ阻害剤１および２）をボルテックスすることで、再懸濁され得る。懸濁液は、断続的にボルテックスすることで氷上で２０分間保ち得る。約４℃で５分間１５，０００ｘｇで回転させた後、上清の一定分量は約-７０℃で保存され得る。
【００８５】
本明細書で使用される、用語「治療する」または「治療」は、治療的治療および予防的または予防する手段の双方を指し、目的はパーキンソン症の発症等、望まれない生理学的変化または疾患を阻止するか、または遅らせる（和らげる）ためのものである。有益または所望の結果には、検出可能であるか検出不可能であるかにかかわらず、症状の軽減、疾病の程度の縮小、安定化した（すなわち、悪化していない）状態の疾病、疾病の進行の遅延または遅らせること、疾病状態の寛解または緩和、および緩解（部分的であるか総合的であるかにかかわらず）が含まれるが、それらに限定されない。「治療」は、治療を受けない場合に予想される生存と比較して、延長している生存をも意味する。治療の必要としては、疾病または疾患をすでに有するもの、ならびに疾病または疾患を有する傾向があるもの、疾病または疾患が現れることを予防するためのものが含まれる。
【００８６】
「対象」または「個体」または「動物」または「患者」、または「哺乳動物」は、いずれの対象をも意味し、特に、哺乳類の対象、例えば、診断、予後、予防、または治療を所望する、ヒト患者を意味する。
【００８７】
ＩＩ．  抗体
本発明は、概して、ヒト抗αシヌクレイン抗体およびその抗原結合フラグメントに関し、好ましくは、実施例で図示される抗体に関する概略のように、免疫学的結合特性および／または生物学的特性を実証する。本発明に従って、αシヌクレインに対して特異的なヒトモノクローナル抗体は、高齢の対象のプールからクローン化した。
【００８８】
本発明に従って実施された実験の過程で、最初の試みは、αシヌクレイン特異抗体をクローン化することに失敗したが、ほぼ毎回偽陽性クローンをもたらした。これらのクローンのさらなる研究は、クローンが、大腸菌のタンパク質を認識している抗体を産生したということを示す。この問題を回避するため、ヒト記憶Ｂ細胞培養物の条件培地中の抗体は、被覆した全長のアルファシヌクレインモノマーに結合するため、ならびに大腸菌タンパク質およびウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に結合しないため、並行してスクリーニングされた。特に、Ｂ細胞の条件培地は、大腸菌タンパク質で、ヒト抗体に結合するαシヌクレインのスクリーニングのためのＥＬＩＳＡアッセイに晒す前に、事前に再吸収した。
【００８９】
特異抗体を単離するための最初の試みは、αシヌクレイン抗体血漿の循環の上昇したレベルを示す、αシヌクレインへの高い血漿結合活性を有するヒト対象のプールに焦点を絞った。予想外に、これらの試みは、αシヌクレイン特異的ヒト記憶Ｂ細胞を産生することに失敗し、当該の発明で説明される抗体は、αシヌクレインへ低い血漿反応性を持つ対象のプールから単離した。
【００９０】
この手段によって、いくつかの抗体は単離し得た。選択した抗体は、クラスおよび軽鎖サブクラス決定のため、さらに分析した。記憶Ｂ細胞培養物からの選択した関連抗体メッセージは、次に、ＲＴ-ＰＣＲによって転写し、クローン化し、組換え産生のための発現
ベクターへ結合し、添付の実施例を参照されたい。ＨＥＫ２９３またはＣＨＯ細胞でのヒト抗体の組換え発現、ならびにその後のウエスタンブロット（図４）での、全長αシヌクレインおよびその切り詰め型（図２）、ならびにβおよびγシヌクレイン（図３）へのそれらの結合特異性の特徴付けによって、初めて、αシヌクレインに対して高度に特異的であり、αシヌクレインタンパク質中の異なるエピトープを認識するヒト抗体がクローン化されたことが確認された。
【００９１】
したがって、本発明は概して、単離した自然発生ヒトモノクローナル抗αシヌクレイン抗体およびその結合フラグメント、誘導体、ならびにその変異体に関する。実施例で実証され、図３に示されるように、本発明のヒトモノクローナル抗αシヌクレイン抗体は、好ましくは、βシヌクレインおよびγシヌクレインと比較して、αシヌクレインに特異的に結合することに特徴付けられる。有利には、抗体は天然モノマー型および／もしくはオリゴマー型または凝集型のαシヌクレインに特異的に結合する能力がある。加えて、本発明のヒト抗αシヌクレイン抗体は、ウエスタンブロット法で、αシヌクレインを認識するその能力により、さらに特徴付けられ、図４を参照されたい。
【００９２】
１つの実施形態では、本発明は、抗体が、ＮＩ‐２０２．３Ｇ１２、ＮＩ‐２０２．１２Ｆ４またはＮＩ２０２．３Ｄ８からなる群から選択される参照抗体と同一のαシヌクレインのエピトープに特異的に結合する、抗αシヌクレイン抗体、またはその抗原結合フラグメント、その変異体もしくは誘導体を対象とする。実施例で図示されるように、抗体ＮＩ‐２０２．３Ｇ１２は、直接ＥＬＩＳＡアッセイで、ＮＩ‐２０２．３Ｇ１２の構造エピトープを示し、野生型（ｗｔ）αシヌクレインに結合するが、αシヌクレイン切り詰め型に結合しない、図２Ａを参照されたい。対照的に、抗体ＮＩ‐２０２．１２Ｆ４は、直接ＥＬＩＳＡアッセイで、ＮＩ‐２０２．１２Ｆ４のＮ末端エピトープを示し、Ｎ末端両親媒性反復領域（アミノ酸番号１〜６０）を含有するαシヌクレイン切り詰め型に結合し、図２Ｂを参照されたい。加えて、抗体ＮＩ２０２．３Ｄ８で実施した直接ＥＬＩＳＡアッセイの予備結果は、ＮＩ２０２．３Ｄ８は、特異的に、αシヌクレインのＣ末端、好ましくは、アミノ酸番号９６〜１４０を認識することを示した。
【００９３】
さらに、最初の実験的観察に束縛されることを意図するものではないが、さらなる予備実験は、抗体ＮＩ‐２０２．１２Ｆ４およびＮＩ‐２０２．３Ｇ１２が、優先的に、αシヌクレインのモノマー型よりもシヌクレイン凝集体または原線維に結合する一方で、抗体ＮＩ２０２．３Ｄ８は、直接ＥＬＩＳＡ抗体アッセイで、優先的に、原線維よりもαシヌクレインモノマーに結合するという推測をもたらす。ゆえに、本発明は、異なる特異性を有する一連のヒト抗αシヌクレイン抗体を提供し、それらは、したがって、診断および治療目的に特に有用である。
【００９４】
１つの実施形態では、本発明の抗体は、実施例１から５のいずれか１つに説明されるような例示的なＮＩ‐２０２．１２Ｆ４抗体の結合特性を示す。例えば、１つの実施形態、特に実施例３に従って分析した際に、本発明の抗αシヌクレイン抗体は、マウスαシヌクレインよりもヒトαシヌクレインを優先的に認識する。加えて、または代替えとして、特に実施例３に従って分析した際に、本発明の抗αシヌクレイン抗体は、生理学的モノマー型よりも凝集またはミスフォールドした型のαシヌクレインを優先的に認識する。加えて、または代替えとして、本発明の抗αシヌクレイン抗体は、特に実施例３で説明されるように、疾病を引き起こすヒトαシヌクレインの変異体に結合する。この状況で、結合特異性は、図５に示されるような例示的なＮＩ‐２０２．１２Ｆ４抗体の範囲内であり得、すなわち、約１００から１０００ｐＭの最大半量の有効濃度（ＥＣ５０）を有し、野生型αシヌクレインまたは疾病を引き起こすその変異体に対しては約１００から５００ｐＭのＥＣ５０であることが好ましい。
【００９５】
ゆえに、本発明の抗αシヌクレイン抗体は、脳でαシヌクレインの病的型、例えば、実施例３で説明されるウエスタンブロットおよび免疫組織化学染色により例証されるαシヌクレインの病的凝集体等に優先的に結合することが好ましい。したがって、他の付加的なまたは代替えの実施形態で、本発明の抗αシヌクレイン抗体は、ヒトαシヌクレインの立体構造エピトープに優先的に結合し、アミノ酸番号１〜２０、２１〜４０、４１〜６０、１１〜３０、または３１〜５０からなるαシヌクレインのＮ末端に由来するフラグメントにほとんど結合しない。
【００９６】
本発明は、抗体が、ＮＩ‐２０２．３Ｇ１２、ＮＩ２０２．１２Ｆ４、またはＮＩ２０２．３Ｄ８からなる群から選択される抗体のものと同一の抗原結合ドメインを含む、抗体またはその抗原結合フラグメント、その変異体、もしくは誘導体にも関する。
【００９７】
本発明は、さらにいくつかのそのような結合分子、例えば、抗体およびその結合フラグメント等を例証し、例えば、図１で示されるアミノ酸配列の任意の１つを含む、ＶＨおよび／またはＶＬ可変領域の少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を、それらの可変領域、例えば、結合ドメインに含むことにより特徴付けられ得る。上記の特定した可変領域をコードする対応するヌクレオチド配列は、添付の配列リストで示す。図１に示されるＶＨおよび／またはＶＬ領域の上記のアミノ酸配列の例示的な一連のＣＤＲも、添付の配列リストで示す。しかしながら、以下で説明されるように、当業者は、加えて、または代替えとして、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の場合、１つ、２つ、３つまたはそれ以上のアミノ酸で、それらのアミノ酸配列が図１で示されるものと異なるＣＤＲを使用し得るという事実を熟知している。
【００９８】
１つの実施形態では、本発明の抗体は、図１に示されるＶＨおよび／またはＶＬ領域のアミノ酸配列を含む任意の１つの抗体である。あるいは、本発明の抗体は、図１に示されるようなＶＨおよび／またはＶＬ領域を有する少なくとも１つの抗体とαシヌクレインへの結合について競合する、抗体またはその抗原結合フラグメント、誘導体、もしくは変異体である。それらの抗体は、特に治療的適用のためには、ヒト抗体でもあり得る。あるいは、抗体は、マウス、マウス化した抗体、およびキメラマウス／ヒト抗体であり、診断法および動物での研究に特に有用である。
【００９９】
上記に述べられるように、ヒト免疫反応におけるその産生によって、本発明のヒトモノクローナル抗体は、特定の生理学的関連があり、例えば、マウスモノクローナル抗体の産生のための免疫処理の場合、およびファージディスプレイライブラリのインビトロのスクリーニングの場合、それぞれ到達不可能であるか、より少ない免疫原性である、エピトープを認識するであろう。したがって、本発明のヒト抗αシヌクレイン抗体のエピトープは独特であり、本発明のヒトモノクローナル抗体で認識されるエピトープに結合する能力がある他の抗体は存在しないことを明記することは賢明である。故に、本発明はまた、概して、αシヌクレインへの特異結合のため本発明のヒトモノクローナル抗体と競合する抗αシヌクレイン抗体およびαシヌクレイン結合分子にも及ぶ。本発明は、より明確には、抗体が、ＮＩ‐２０２．３Ｇ１２、ＮＩ‐２０２．１２Ｆ４またはＮＩ２０２．３Ｄ８からなる群から選択される参照抗体と同一のαシヌクレインのエピトープに特異的に結合する、抗体またはその抗原結合フラグメント、変異体、もしくは誘導体を対象とする。
【０１００】
抗体間の競合は、試験下の免疫グロブリンが、参照抗体がαシヌクレイン等の一般的な抗原へ特異結合することを阻害するアッセイで決定する。多種の競合的な結合アッセイは、既知であり、例えば、：固相直接型または非直接型放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）もしくは、固相直接型または非直接型酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）、サンドイッチ競合アッセイ：Ｓｔａｈｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ９（１９８３）を参照されたい、固相直接型ビオチンアビジンＥＩＡ、Ｋｉｒｋｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７（１９８６），３６１４‐３６１９およびＣｈｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１７６（１９９０），５４６‐５５２を参照されたい、固相直接型標識アッセイ、固相直接型標識サンドイッチアッセイ、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｒｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９８８）を参照されたい、Ｉ１２５標識を使用する固相直接型標識ＲＩＡ、Ｍｏｒｅｌ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌｅｃ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５（１９８８），７‐１５およびＭｏｌｄｅｎｈａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２（１９９０），７７‐８２を参照されたい。典型的に、そのようなアッセイには、固体表面に結合した精製したαシヌクレインもしくはその凝集体、またはそのいずれか一方を有する細胞、非標識の試験用免疫グロブリン、および標識化した参照免疫グロブリン、すなわち、本発明のヒトモノクローナル抗体、の使用が含まれる。競合的な阻害は、試験用の免疫グロブリンの存在下で固体表面または細胞に結合する標識の量を決定することで、測定される。通常、試験用免疫グロブリンは、過度に存在する。競合的結合アッセイは、好ましくは、ＥＬＩＳＡアッセイに関する添付の実施例で説明されるような条件下で実施される。競合アッセイ（競合抗体）により特定された抗体は、参照抗体と同一のエピトープに結合する抗体、および立体障害を発生させるために、参照抗体によって結合されるエピトープの十分に近位にある、隣接するエピトープに結合する抗体を含む。通常、競合抗体が、過度に存在する場合、参照抗体の一般的な抗原への特異結合を、少なくとも５０％または７５％阻害するであろう。ゆえに、本発明は、さらに、抗体が競合して、ＮＩ‐２０２．３Ｇ１２、ＮＩ‐２０２．１２Ｆ４またはＮＩ２０２．３Ｄ８からなる群から選択される参照抗体のαシヌクレインへの結合を阻害する、抗体またはその抗原結合フラグメント、変異体、もしくは誘導体に関する。
【０１０１】
他の実施形態では、本発明は、重鎖可変領域の少なくなくとも１つのＶＨ−ＣＤＲまたは重鎖可変領域の少なくとも２つのＶＨ−ＣＤＲの少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％が、本明細書に開示される抗体からの参照重鎖ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、またはＶＨ−ＣＤＲ３アミノ酸配列と同一である、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる単離されたポリペプチドを提供する。あるいは、ＶＨのＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、またはＶＨ−ＣＤＲ３の領域の少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％が、本明細書に開示される抗体からの、参照重鎖ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、またはＶＨ−ＣＤＲ３アミノ酸配列と同一である。故に、この実施形態にしたがって、本発明の重鎖可変領域は、図１に示される群に関連するＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、およびＶＨ−ＣＤＲ３ポリペプチド配列を有する。図１は、カバットシステムで定義されるＶＨ−ＣＤＲを示す一方、他のＣＤＲ定義、例えば、Ｃｈｏｔｈｉａシステム等で定義される、ＶＨ−ＣＤＲもまた本発明に含まれ、図１に提示される資料を使用して、当業者により簡単に定義され得る。
【０１０２】
他の実施形態では、本発明は、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり、ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、およびＶＨ−ＣＤＲ３領域は、図１で示されるＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、およびＶＨ−ＣＤＲ３群と同一であるポリペプチド配列を有する、単離されたポリペプチドを提供する。
【０１０３】
他の実施形態では、本発明は、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり、ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、およびＶＨ−ＣＤＲ３領域は、いずれかの１つのＶＨ−ＣＤＲでの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのアミノ酸置換を除いては、図１で示されるＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、およびＶＨ−ＣＤＲ３群と同一であるポリペプチド配列を有する、単離したポリペプチドを提供する。ある実施形態では、アミノ酸置換は保存される。
【０１０４】
他の実施形態では、本発明は、軽鎖可変領域の少なくなくとも１つのＶＬ−ＣＤＲまたは軽鎖可変領域の少なくとも２つのＶＬ−ＣＤＲの少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％が、本明細書に開示される抗体からの参照軽鎖ＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、またはＶＬ−ＣＤＲ３アミノ酸配列と同一である、免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる単離したポリペプチドを提供する。あるいは、ＶＬのＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、またはＶＬ−ＣＤＲ３の領域の少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％が、本明細書に開示される抗体からの参照軽鎖ＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、またはＶＬ−ＣＤＲ３アミノ酸配列と同一である。故に、この実施形態にしたがって、本発明の軽鎖可変領域は、図１に示される群に関連するＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、およびＶＬ−ＣＤＲ３ポリペプチド配列を有する。図１は、カバットシステムで定義されるＶＬ−ＣＤＲを示す一方で、他のＣＤＲ定義、例えば、Ｃｈｏｔｈｉａシステム等で定義される、ＶＬ−ＣＤＲもまた本発明に含まれる。
【０１０５】
他の実施形態では、本発明は、ＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、およびＶＬ−ＣＤＲ３領域は、図１で示されるＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、およびＶＬ−ＣＤＲ３群と同一であるポリペプチド配列を有する、免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる単離されたポリペプチドを提供する。
【０１０６】
他の実施形態では、本発明は、ＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、およびＶＬ−ＣＤＲ３領域は、いずれかの１つのＶＬ−ＣＤＲでの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのアミノ酸置換を除いては、図１で示されるＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、およびＶＬ−ＣＤＲ３群と同一であるポリペプチド配列を有する、免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる単離されたポリペプチドを提供する。ある実施形態では、アミノ酸置換は保存される。
【０１０７】
免疫グロブリンまたはそのコードするｃＤＮＡは、さらに修飾し得る。したがって、さらなる実施形態では、本発明の方法は、キメラ抗体、マウス化抗体、単鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、二重特異的抗体、融合抗体、標識された抗体、またはこれらのうち任意の１つの類似体を産生する任意の１つのステップを含む。対応する方法は、当業者に既知であり、例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，“Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｒｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，ＣＨＳ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ（１９８８）に説明される。該抗体の誘導体が、ファージディスプレイ手法で取得される際、ＢＩＡｃｏｒｅシステムで用いられるような表面プラズモン共鳴法は、本明細書で説明されるいずれか１つの抗体のものと同一のエピトープに結合する、ファージ抗体の効率を上げるために使用し得る（Ｓｃｈｉｅｒ，ヒト抗体ハイブリドーマ７（１９９６），９７‐１０５、Ｍａｌｍｂｏｒｇ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ１８３（１９９５），７‐１３）。キメラ抗体の産生は、例えば、国際出願第ＷＯ８９／０９６２２号に説明される。ヒト化抗体の産生のための方法は、欧州出願第ＥＰ‐Ａ１  ０  ２３９  ４００号および国際出願第ＷＯ９０／０７８６１号に説明される。さらなる本発明に従って利用される抗体の源は、いわゆる異種抗体である。マウスでのヒト様の抗体等の異種抗体の産生のための一般的な原理は、例えば、国際出願第ＷＯ９１／１０７４１号、第ＷＯ９４／０２６０２号、第ＷＯ９６／３４０９６号、および第ＷＯ９６／３３７３５号に説明される。上記に説明されたように、本発明の抗体は、完全抗体に加え、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、およびＦ（ａｂ）２、ならびに単一鎖を含む、多種多様の型で存在し得、例えば、国際出願第ＷＯ８８／０９３４４号を参照されたい。
【０１０８】
本発明の抗体またはそれらの対応する免疫グロブリン鎖は、当技術分野で既知の従来の手法を使用して、例えば、アミノ酸欠失、挿入、置換、付加、および／もしくは組換え、ならびに／または当技術分野で既知のいずれかの他の修飾を、それ単独または組み合わせて使用することでさらに修飾し得る。免疫グロブリン鎖のアミノ酸配列の基礎をなすＤＮＡ配列でそのような修飾を導入するための方法は、当業者に周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）Ｎ．Ｙ．およびＡｕｓｕｂｅｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｉｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉｔａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．（１９９４）を参照されたい。本発明の抗体の修飾は、１つ以上の構成アミノ酸での、アセチル化、ヒドロキシル化、メチル化、アミド化、および糖鎖または脂鎖の付着、ならびに補助因子等を含む、側鎖修飾、主鎖修飾、ＮおよびＣ末端の修飾を含む、化学および／または酵素誘導体化を含む。同様に、本発明は、カルボキシ末端の免疫賦活性リガンド等の、異種分子に融合されるアミノ末端にある説明された抗体またはそのいくつかのフラグメントを含む、キメラタンパク質の産生を包含し、例えば、対応する手法の詳細に関して、国際出願第ＷＯ００／３０６８０号を参照されたい。
【０１０９】
加えて、本発明は、上記の説明されたように結合分子を含有するもの、例えば、上記の抗体の任意の１つの可変領域のＣＤＲ３領域を含有するもの、重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）が抗原抗体相互作用においてより大きな度合いの可変性および主な関与を有する領域であることが頻繁に観察されているため、特に重鎖のＣＤＲ３を含有するものを含む、ペプチドを包含する。そのようなペプチドは、本発明に記載の有用な結合剤を産生するため、組換え手段で簡単に合成または産生し得る。そのような方法は、当業者には既知である。ペプチドは、例えば、商業的に入手可能な自動ペプチド合成機を使用して、合成し得る。ペプチドは、ペプチドを産生するため、ペプチドを発現するＤＮＡを発現ベクターに取り入れること、および発現ベクターで細胞を形質転換することによる組換え手法で産生し得る。
【０１１０】
ゆえに、本発明は、本発明のヒト抗αシヌクレイン抗体に対して方向付けられる例えば抗体またはその結合フラグメント等の任意の結合分子に関し、上記の特性、すなわち、αシヌクレインを特異的に認識する特性を表示する。そのような抗体および結合分子は、それらの結合特異性および親和性を、ＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロットならびに本明細書で説明される免疫組織化学的検査で試験し得る。例えば、実施例を参照されたい。さらに、本発明に従って実施されたその後の実験予備結果は、本発明のヒトアリαシヌクレイン抗体は、特に、抗体ＮＩ‐２０２．１２Ｆ４は、レビー小体を伴う認知症（ＤＬＢ）またはパーキンソン病（ＰＤ）を罹患する患者のヒト脳切片で存在する、αシヌクレイン封入物体を認識することを示す。したがって、本発明の特定の好ましい実施形態では、ヒト抗体またはその結合フラグメント、誘導体、もしくは変異体は、ヒトＤＬＢまたはＰＤの脳切片でαシヌクレインを認識する。
【０１１１】
不死化Ｂ細胞またはＢ記憶細胞の培養物から直接的に免疫グロブリンを取得するための代替えとして、不死化細胞は、その後の発現および／または遺伝子操作のために再編成された重鎖および軽鎖座位の供給源として使用し得る。再編成された抗体遺伝子は、ｃＤＮＡを産生するため、適切なｍＲＮＡから逆転写し得る。所望する場合、重鎖定常領域は、異なるアイソタイプのものに交換するか、または全て除去し得る。可変領域は、単鎖Ｆｖ領域をコードするため、連結し得る。複数のＦｖ領域は、採用し得る１つ以上の標的またはキメラ重鎖および軽鎖の組み合わせに結合能力を与えるため、連結し得る。遺伝子材料が取得可能になった時点で、所望の標的に結合するそれらの能力の双方を保持する上記に説明された類似体の設計は容易である。抗体可変領域および組換え抗体の産生クローン化のための方法は、当業者に既知であり、例えば、Ｇｉｌｌｉｌａｎｄ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ  ４７（１９９６），１‐２０、Ｄｏｅｎｅｃｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌｅｕｋｅｍｉａ１１（１９９７），１７８７‐１７９２、に説明される。
【０１１２】
適切な遺伝子材料を取得し、所望の場合、類似体をコードするために修飾する時点で、重鎖および軽鎖の可変領域を最小でもコードするものを含むコード配列は、標準の組換え宿主細胞へトランスフェクトされ得るベクターで含有される、発現システムへ挿入し得る。そのような多種の宿主細胞を、効率的な処理のため使用し得るが、哺乳類細胞は好ましい。この目的のために有用な典型的な哺乳類細胞株はＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、またはＮＳＯ細胞を含むが、それらに限定されない。
【０１１３】
抗体または類似体の産生は、次に、宿主細胞の成長およびコード配列の発現に適切な培養条件下で、修飾した組換え宿主を培養することで実行する。抗体を、次に、培養物からそれらを単離することで回収する。発現システムは、好ましくはシグナルペプチドを含むように設計し、そのため結果の抗体は、培地内に分泌されるが、細胞内の産生もまた可能である。
【０１１４】
上記に従って、本発明は、本発明の抗体または相当する結合分子をコードし、抗体の場合は、好ましくは少なくとも上記に説明される抗体の免疫グロブリン鎖の可変領域をコードする、ポリヌクレオチドにも関する。典型的に、ポリヌクレオチドでコードされた該可変領域は、該抗体の可変領域のＶＨおよび／またはＶＬの少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。
【０１１５】
当業者は、上述の可変ドメインを有する抗体の可変ドメインは、所望の特異性および生物学的機能を持つ他のポリペプチドまたは抗体のコンストラクトに使用し得るということを容易に理解するだろう。したがって、本発明は上述の可変ドメインの少なくとも１つのＣＤＲを含み、有利にも添付した実施例に説明される抗体と、同一または同様の結合特性を実質的に有するポリペプチドおよび抗体も含有する。結合親和性を、ＣＤＲ内、またはカバットによって定義されたＣＤＲと部分的に重複する超可変ループ内（Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６（１９８７），９０１‐９１７）でアミノ酸置換を作ることで増強することができることは、当業者に既知である。例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２（１９８８），３２３‐３２７を参照されたい。したがって、本発明は、１つ以上の上述のＣＤＲが、１つ以上、好ましくは２つ以下のアミノ酸置換を含む、抗体にも関する。好ましくは、本発明の抗体は、図１に示されるように、１つまたは双方のその免疫グロブリン鎖で、可変領域の２つまたは３つ全てのＣＤＲを含む。
【０１１６】
当業者に既知であるように、結合分子、例えば、本発明の抗体、またはその抗原結合フラグメント、変異体、もしくは誘導体は、１つ以上のエフェクター機能を媒介する定常領域を含み得る。例えば、抗体定常領域への補体のＣ１成分の結合は、補体システムを活性化し得る。補体の活性化は、細胞病原体のオプソニン作用および溶解で重要である。補体の活性化は、炎症反応をも刺激し、自己免疫性過敏症にも関与し得る。さらに、抗体は、細胞でＦｃ受容体（ＦｃＲ）に結合する抗体Ｆｃ領域のＦｃ受容体結合部位を伴って、Ｆｃ領域を通じて、様々な細胞で受容体に結合する。ＩｇＧ（ガンマ受容体）、ＩｇＥ（エプシロン受容体）、ＩｇＡ（アルファ受容体）、およびＩｇＭ（ミュー受容体）を含む、抗体の異なるクラスに対して特異的な多数のＦｃ受容体がある。細胞表面上での抗体のＦｃ受容体への結合は、抗体で被覆した粒子の貪食および破壊、免疫複合体のクリアランス、キラー細胞による抗体で被覆した標的細胞の溶解（抗体依存性細胞傷害、またはＡＤＣＣ）、炎症性メディエーターの遊離、胎盤通過、免疫グロブリン産生の制御を含む、多数の重要で多様な生物学的反応を誘発する。
【０１１７】
したがって、本発明のある実施形態は、抗体、またはその抗原結合フラグメント、変異体、もしくは誘導体を含み、１つ以上の定常領域ドメインの分画は、ほぼ同一の免疫原性の変化させていない全抗体と比較した場合、低下したエフェクター機能、非共有結合的二量体化への能力、αシヌクレイン凝集および沈着の部位で局在化するための能力の増加、減少した血清半減期、または血清半減期の増加等の所望の生化学的特性を提供するように、除去されるかまたは、さもないと、変質される。例えば、本明細書に説明される診断方法および治療方法のため使用される、ある抗体は、免疫グロブリン重鎖と同様のポリペプチド鎖を含むが、少なくとも１つ以上の重鎖ドメインの部分を不足する、ドメイン欠失抗体である。例として、ある抗体では、修飾した抗体の定常領域の１つの全ドメインが除去される。例えば、ＣＨ２ドメインの全てまたは一部分が除去される。他の実施形態では、本明細書に説明される診断方法および治療方法のために使用されるある抗体は、例えば、グリコシル化を排除するように変質される、本明細書の他の箇所でアグリコシル化または「アグリ」抗体と称される、ＩｇＧ重鎖定常領域等の定常領域を有する。そのような「アグリ」抗体は、酵素的ならびに定常領域で、コンセンサスグリコシレーション部位を操作することによって調製し得る。理論に束縛されるものではないが、「アグリ」抗体は、インビボで改善された安全性および安定性を有し得ると考えられる。所望のエフェクター機能を有する非グリコシル化抗体を産生する方法は、例えば、国際出願第ＷＯ２００５／０１８５７２号で見られ、参照によりその全体が組み込まれる。
【０１１８】
本明細書で説明される、ある抗体、またはその抗原結合フラグメント、変異体、もしくは誘導体では、当技術分野で既知の手法を使用して、Ｆｃ部分を、エフェクター機能を減少させるために変異し得る。例えば、定常領域ドメインの欠失または不活性化（点突然変異または他の方法を通して）は、循環する修飾した抗体のＦｃ受容体結合を減少し、よって、αシヌクレイン局在性を増加し得る。他の事例では、本発明と一致する定常領域の修飾は、補体結合を緩和し、したがって抱合型細胞毒の血清半減期および非特異的対合を減少させる。しかし、定常領域の他の修飾は、増加した抗原特異性または抗体可動性によって、増強した局在性を可能にするジスルフィド連鎖またはオリゴ糖部分を修飾するために使用し得る。得られる生理学的特性、生物学的利用率、ならびにαシヌクレイン局在性、体内分布、および血清半減期等の他のこの修飾による生理学的効果は、過度な実験を行うことなく、既知の免疫学的手法を使用することで、簡単に測定し、定量化し得る。
【０１１９】
本明細書で説明される、ある抗体、またはその抗原結合フラグメント、変異体、もしくは誘導体において、Ｆｃ部分は、抗体の細胞の取り込みを増加させるため、例として、抗体の受容体で媒介したエンドサイトーシスを、Ｆｃγ受容体、ＬＲＰ、またはＴｈｙ１受容体を通して増強させるか、もしくは抗体を損傷することなく生細胞内へ送り込むことを可能にするとされる「Ｓｕｐｅｒ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」によって、変異するか、または代替えのタンパク質配列に交換し得る（Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．（２００５），２３７−２４１）。例えば、抗体結合領域の融合タンパク質および細胞面受容体の同種タンパク質リガンド、もしくはαシヌクレインに結合する特異的配列を伴う二重または多特異抗体、ならびに細胞面受容体の産生は、当技術分野で既知の手法を使用して操作し得る。
【０１２０】
本明細書で説明される、ある抗体、またはその抗原結合フラグメント、変異体、もしくは誘導体では、Ｆｃ部分は、変異するか、または代替えのタンパク質配列に交換し得、もしくは、抗体はその血液脳障壁透過を増加させるため化学的に修飾し得る。
【０１２１】
本発明の抗体、またはその抗原結合フラグメント、変異体、もしくは誘導体の修飾型は、当技術分野で既知の手法を使用して、全前駆体または親抗体から作り得る。例示的な手法は、本明細書で詳細に説明される。本発明の抗体、またはその抗原結合フラグメント、変異体、もしくは誘導体は、当技術分野で既知の手法を使用して、作り得るか、または製造し得る。ある実施形態では、抗体分子またはそのフラグメントは、「組換え技術」によって産生する。すなわち、組換えＤＮＡ技術を使用して産生する。抗体分子またはそのフラグメントを作るための例示的な手法は、本明細書の他の箇所で詳細に説明される。
【０１２２】
本発明の抗体、またはその抗原結合フラグメント、変異体、もしくは誘導体には、例えば、共有結合の付着が、抗体がその同種エピトープへ特異的に結合することを阻止しないような、いずれの分子型の抗体への共有結合の付着で修飾された誘導体をも含む。例えば、限定するものではないが、抗体誘導体は、既知の保護／ブロッキング基による、グリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、誘導体化、タンパク質分解の切断、細胞リガンドまたは他のタンパク質への連鎖等により、修飾されていた抗体を含む。多数の化学的修飾のいずれも、特定の化学分解、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成等を含むが限定されない既知の手法によって実行し得る。加えて、誘導体は、１つ以上の非古典的アミノ酸を含有し得る。
【０１２３】
特に好ましい実施形態では、本発明の抗体、またはその抗原結合フラグメント、変異体、もしくは誘導体は、治療する動物、例えばヒトで、有害な免疫反応を誘発しないだろう。ある実施形態では、結合分子、例えば、本発明の抗体、またはその抗原結合フラグメントは、患者、例えば、ヒト患者に由来し、その後それらを、それらが由来する同一の種、例えばヒトに使用して、有害な免疫反応の発生を軽減または最小化する。
【０１２４】
脱免疫化もまた、抗体の免疫原性を減少させるために使用することができる。本明細書で使用される、用語「脱免疫化」は、Ｔ細胞エピトープを修飾するための抗体の変質を含み、例えば、国際出願第ＷＯ９８／５２９７６号および第ＷＯ００／３４３１７号を参照されたい。例えば、出発抗体からのＶＨおよびＶＬ配列を分析し、各Ｖ領域からのヒトＴ細胞エピトープ「マップ」は、配列内の相補性決定領域（ＣＤＲ）および他の鍵となる残基との関連で、エピトープの位置を示す。Ｔ細胞エピトープマップからの個々のＴ細胞エピトープは、最終の抗体の活性を変化する低い危険性で、代替えのアミノ酸の置換を特定するために分析する。代替えのＶＨおよびＶＬ配列の範囲は、アミノ酸置換の組み合わせを含んで設計され、これらの配列は、その後、結合するポリペプチド、例えば、本明細書に開示される診断方法および治療方法での使用のためのαシヌクレイン特異抗体またはその免疫特異的フラグメントの範囲へ取り込まれ、次に機能を試験される。典型的に、１２から２４の変異体抗体を、産生し、試験する。修飾したＶおよびヒトＣ領域を含む、完全重鎖および軽鎖遺伝子を次に、発現ベクターにクローン化し、その後、プラスミドを、全抗体の産生のため細胞株へ導入する。抗体を次に適切な生化学的および生物学的アッセイで比較し、最適な変異体を特定する。
【０１２５】
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、組換え型、およびファージディスプレイ技術、またはその組み合わせの使用を含む、当技術分野で既知の多種の手法を使用して調製し得る。例えば、モノクローナル抗体は、当技術分野で既知のもの、および、例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｒｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｒｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ  ｅｄ．（１９８８）、Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，５６３‐６８１（１９８１）で教示されるものを含む、ハイブリドーマ手法を使用して産生することができ、該参考文献は、参照によりそれらの全体が組み込まれる。本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」は、ハイブリドーマ技術を通して産生される抗体に限定されない。用語「モノクローナル抗体」は、いずれの真核、原核、またはファージクローンをも含む単一クローンに由来する抗体を指し、それを産生する方法を指さない。したがって、用語「モノクローナル抗体」は、ハイブリドーマ技術を通して産生される抗体に限定されない。ある実施形態では、本発明の抗体は、本明細書に説明されるように、エプスタインバーウイルスでの形質転換を通して不死化されたヒトＢ細胞に由来する。
【０１２６】
周知のハイブリドーマ処理（Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ２５６（１９７５），４９５）において、哺乳類からの相対的に短命な、または致死のリンパ球、例えば、本明細書に説明されるようなヒト対象に由来するＢ細胞は、不死化腫瘍細胞株に融合し（例えば、骨髄腫細胞株）、したがって、双方とも不死化され、遺伝的にコードされるＢ細胞の抗体を産生する能力があるハイブリッド細胞または「ハイブリドーマ」を産生する。結果のハイブリッドは、単一抗体の形成のために、特異的遺伝子を含む、各個々の株での選定、希釈、および再成長により、単一の遺伝子株に分離する。それらは、所望の抗原に対して均一である抗体を産生し、それらの純粋な遺伝子の近縁に関連して、抗体は「モノクローナル」と称される。
【０１２７】
このように調製されたハイブリドーマ細胞は、好ましくは未融合の親骨髄腫細胞の成長または生存を阻害する１つ以上の物質を含有する、適切な培養培地で、播種され、成長する。当業者は、ハイブリドーマの形成、選定、および成長のための試薬、細胞株、および培地が、多数の供給源から商業的に入手可能であり、標準化したプロトコルは十分に確立しているということを理解するだろう。通常、所望の抗原に対するモノクローナル抗体の生産のため、ハイブリドーマ細胞が成長する培地培養は、アッセイされる。ハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、本明細書に説明されるように、免疫沈降、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）または酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）等のインビトロのアッセイで決定する。ハイブリドーマ細胞が、所望の特異性、親和性および／または活性を有する抗体を産生することが特定された後、クローンは、希釈の手順を限定することでサブクローン化し、標準の方法により成長させ、例えば，Ｇｏｌｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ５９‐１０３（１９８６）を参照されたい。サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体は、通常の精製手順、例えば、タンパク質Ａ、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、または親和性クロマトグラフィーによって、培養培地、腹水液、または、血清から分離する。
【０１２８】
他の実施形態では、リンパ球は、顕微操作および単離された可変遺伝子で選択し得る。例えば、末梢血液単核細胞は、免疫化または自然免疫性の動物の、例えば、ヒトから、単離し、インビトロで７日間培養し得る。培養物を、スクリーニング判断基準を満たす特異的ＩｇＧのため、スクリーニングし得る。陽性のウェルからの細胞は、単離し得る。個々のＩｇを産生するＢ細胞は、ＦＡＣＳによって単離するか、または補体媒介溶血斑アッセイでそれらを特定することによって単離し得る。Ｉｇを産生するＢ細胞は、管内で顕微操作し得、ＶＨおよびＶＬ遺伝子は、例えば、ＰＴ‐ＰＣＲを用いて、増幅し得る。ＶＨおよびＶＬ遺伝子は、発現のため、抗体発現ベクターにクローン化し、細胞へトランスフェクトし得る（例えば、真核または原核細胞）。
【０１２９】
あるいは、抗体を産生する細胞株は、当業者に周知の手法を使用して、選択し、培養し得る。そのような手法は、多種の実験手引き書および主要な出版物に説明される。この点において、下記に説明される本発明に適切な手法は、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ．，Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ‐Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９１）に説明され、本明細書の参照によりその全体が組み込まれる。
【０１３０】
特異的エピトープを認識する抗体フラグメントは、既知の手法で産生し得る。例えば、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントは、パパイヤ等の酵素（Ｆａｂフラグメントを産生するため）、またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを産生するため）を使用して、組換えで産生するか、または免疫グロブリン分子のタンパク質分解の切断で産生し得る。Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、可変領域、軽鎖定常領域、および重鎖のＣＨ１ドメインを含有する。そのようなフラグメントは、例えば、免疫グロブリンの免疫特異的部分と放射性同位元素等の検出試薬を結合することを含む、免疫診断手順での使用に十分である。
【０１３１】
本明細書で説明されるような完全なヒト抗体は、特に、ヒト患者の治療的治療への使用が望ましい。本発明のヒト抗体は、例えば、彼らの年齢により、例えば、パーキンソン病等の疾患を進行させる危険性が疑われる高齢対象、または疾患を有するが異常に安定した疾患経過である患者から単離する。しかしながら、高齢健常および症状のない対象は、それぞれ、若い対象と比べてより一様に、発達した保護的な抗αシヌクレイン抗体を有するということを想定することは賢明であるが、後者も本発明のヒト抗体の入手源として用いてよい。これは特に、それらの免疫システムおよび反応機能が、高齢者のものよりも効率性が高いため、家族型のシヌクレイノパチー疾患を進行させる可能性があるが症状のないままである若い患者に関して正確である。
【０１３２】
１つの実施形態では、本発明の抗体は、抗体分子の少なくとも１つの重または軽鎖ＣＤＲを含む。他の実施形態では、本発明の抗体は、１つ以上の抗体分子からの少なくとも２つのＣＤＲを含む。他の実施形態では、本発明の抗体は、１つ以上の抗体分子からの少なくとも３つのＣＤＲを含む。他の実施形態では、本発明の抗体は、１つ以上の抗体分子からの少なくとも４つのＣＤＲを含む。他の実施形態では、本発明の抗体は、１つ以上の抗体分子からの少なくとも５つのＣＤＲを含む。他の実施形態では、本発明の抗体は、１つ以上の抗体分子から少なくとも６つのＣＤＲを含む。対象の抗体に含まれ得る少なくとも１つのＣＤＲを含む、例示的な抗体分子は、本明細書に説明される。
【０１３３】
本発明の抗体は、抗体を合成するための当技術分野で既知のいずれの手法、特に、本明細書に説明される化学合成、または、好ましくは組換え発現手法で産生し得る。
【０１３４】
１つの実施形態では、本発明の抗体、またはその抗原結合フラグメント、変異体、もしくは誘導体は、１つ以上のドメインを、部分的にまたは全体的に、削除した（「ドメインを削除した抗体」）合成定常領域を含む。ある実施形態では、適応性のある修飾した抗体は、全ＣＨ２ドメインを除去した、ドメインを削除したコンストラクトまたは変異体を含む（ΔＣＨ２コンストラクト）。他の実施形態において、短い結合のペプチドは、可変領域の可動性および移動の自由を提供するため、除去したドメインを置換し得る。当業者は、そのようなコンストラクトは、抗体の異化率に対するＣＨ２ドメインの調節性のため特に好ましいということを理解するだろう。ドメインを削除したコンストラクトは、ＩｇＧ１ヒト定常ドメインをコードするベクターを使用して、派生し得る。例えば、国際出願第ＷＯ０２／０６０９５５号および第ＷＯ０２／０９６９４８Ａ２号を参照されたい。このベクターを、ＣＨ２ドメインを削除し、ドメインを削除したＩｇＧ１定常領域を発現する合成ベクターを提供するように操作する。
【０１３５】
ある実施形態では、本発明の抗体、またはその抗原結合フラグメント、変異体、もしくは誘導体は、ミニボディである。ミニボディは、当技術分野で説明される方法を使用して作り得る。例えば、米国特許第５，８３７，８２１号または国際出願第ＷＯ９４／０９８１７号を参照されたい。
【０１３６】
１つの実施形態では、本発明の抗体、またはその抗原結合フラグメント、変異体、もしくは誘導体は、モノマーサブユニットの間の対合が可能な限り、数個または単一のアミノ酸の欠失または置換を伴う免疫グロブリン重鎖を含む。例えば、ＣＨ２ドメインの選択した領域での単一アミノ酸の変異は、Ｆｃ結合を実質的に減少するために十分であり得、それによってαシヌクレイン局在性を増加する。同様に、エフェクター機能（例えば、補体結合）を制御する１つ以上の定常領域ドメイン部分を単純に削除することが望ましい場合がある。定常領域のそのような部分的欠失は、対象の定常領域ドメインに付随する他の望ましい機能を損なわずに、選択した抗体の特性（血清半減期）を改善し得る。さらに、上記に示したように、本開示される抗体の定常領域は、結果のコンストラクトの特性を増強する１つ以上のアミノ酸の変異または置換を通して、合成であり得る。この観点において、修飾した抗体の配置および免疫特性を実質的に維持する一方で、保存結合部位（例えば、Ｆｃ結合）により提供された活性を崩壊する可能性がある。さらに他の実施形態には、エフェクター機能等の望ましい特性を増強するため、または細胞毒または炭水化物のより多くの付着を提供するため、定常領域への１つ以上のアミノ酸の付加を含む。そのような実施形態では、選択した定常領域ドメインに由来する特異的配列を、挿入するか、または複写することが望ましい。
【０１３７】
本発明は、本明細書に説明される抗体分子（例えば、ＶＨ領域および／またはＶＬ領域）の変異体（誘導体を含む）を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる抗体を提供し、この抗体またはそのフラグメントは、αシヌクレインに免疫特異的に結合する。当技術分野で既知の標準手法は、抗体をコードするヌクレオチド配列で、変異を導入するために使用し得、アミノ酸置換をもたらす部位特異的変異誘発およびＰＣＲで媒介した変異誘発を含むが、それらに限定されない。好ましくは、、参照ＶＨ領域のＶＨ‐ＣＤＲ１、ＶＨ‐ＣＤＲ２、ＶＨ‐ＣＤＲ３、ＶＬ領域のＶＬ‐ＣＤＲ１、ＶＬ‐ＣＤＲ２、またはＶＬ‐ＣＤＲ３と比較して、変異体（誘導体を含む）は、５０個未満のアミノ酸置換、４０個未満のアミノ酸置換、３０個未満のアミノ酸置換、２５個未満のアミノ酸置換、２０個未満のアミノ酸置換、１５個未満のアミノ酸置換、１０個未満のアミノ酸置換、５個未満のアミノ酸置換、４個未満のアミノ酸置換、３個未満のアミノ酸置換、または２個未満のアミノ酸置換をコードする。「保存アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、同様の荷電で側鎖を有するアミノ酸残基と交換される置換である。同様の荷電で側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野で定義されている。これらのファミリーは、塩基性の側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性の側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸グルタミン酸）、無荷電の極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分岐の側鎖を有するアミノ酸（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む。あるいは、変異は、飽和変異誘発等によって、コード配列の全てまたは一部に沿って無作為に導入し得、結果としての変異体は、活性（例えば、αシヌクレインに結合する能力）を保持する変異体を特定するため、生物活性を、スクリーニングし得る。
【０１３８】
例えば、変異をフレームワーク領域のみ、または抗体分子のＣＤＲ領域のみに導入することが可能である。導入した変異は、サイレントまたは中性ミスセンス変異であり得、例えば、抗原に結合する抗体の能力に全く作用しないか、わずかに作用し、実際に、いくつかのそのような変異は、いかなるアミノ酸配列であれ変化しない。これらの変異の種類は、コドンの使用を最適化するか、またはハイブリドーマの抗体産生を改善するために有用であり得る。本発明の抗体をコードするコドンで最適化したコーディング領域は、本明細書の他部分で開示される。あるいは、非中性ミスセンス変異は、抗原に結合する抗体の能力を変化し得る。ほとんどの非中性ミスセンス変異があると予想される位置は、ＣＤＲ内である一方で、ほとんどのサイレントおよび中性ミスセンス変異があると予想される位置は、フレームワーク領域内である。しかしながら、これは絶対条件ではない。当業者は、抗原結合活性での無変化または結合活性での変化（例えば、抗原結合活性における改善または抗体特異性における変化）等の所望の特性を有する変異体分子を設計し、試験し得る。変異誘発に続いて、コードしたタンパク質は、定期的に発現し得、コードしたタンパク質の機能および／または生物活性（例えば、αシヌクレインの少なくとも１つのエピトープに免疫に特異的に結合する能力）は、本明細書で説明される手法を使用するか、当技術分野で既知の手法を定期的に修正することで決定し得る。
【０１３９】
ＩＩＩ．  抗体をコードするポリヌクレオチド
抗体、またはその抗原結合フラグメント、変異体、もしくは誘導体をコードするポリヌクレオチドは、未修飾のＲＮＡまたはＤＮＡもしくは修飾したＲＮＡまたはＤＮＡであり得る、いずれのポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドでも構成し得る。例えば、抗体、またはその抗原結合フラグメント、変異体、もしくは誘導体をコードするポリヌクレオチドは、単鎖および二重鎖ＤＮＡ、単鎖および二重鎖領域の混合であるＤＮＡ、単鎖および二重鎖ＲＮＡ、ならびに単鎖および二重鎖領域の混合であるＲＮＡ、単鎖または、より典型的には、二重鎖、もしくは単鎖および二重鎖領域の混合であり得る、ＤＮＡおよびＲＮＡ含むハイブリッド分子、で構成し得る。加えて、抗体、またはその抗原結合フラグメント、変異体、もしくは誘導体をコードするポリヌクレオチドは、ＲＮＡまたはＤＮＡまたはＲＮＡおよびＤＮＡを含む三重鎖領域で構成し得る。抗体、またはその抗原結合フラグメント、変異体、もしくは誘導体をコードするポリヌクレオチドは、安定化、または他の理由のため修飾した、１つ以上の修飾した塩基、またはＤＮＡもしくはＲＮＡ主鎖も含み得る。「修飾した」塩基は、例えば、トリチル化した塩基およびイノシン等の珍しい塩基を含む。ＤＮＡおよびＲＮＡに多種の修飾を成し得る。したがって、「ポリヌクレオチド」は、化学的に、酵素的に、または代謝的に修飾した型を包含する。
【０１４０】
免疫グロブリンに由来するポリペプチドの非天然変異体をコードする単離ポリヌクレオチド（例えば、免疫グロブリン重鎖部分または軽鎖部分）は、１つ以上のアミノ酸置換、付加、または欠失を、コードしたタンパク質へ導入するように、１つ以上のヌクレオチド置換、付加、または欠失を、免疫グロブリンのヌクレオチド配列へ導入することにより作られる。変異は、部位特異的変異誘発およびＰＣＲで媒介した変異誘発等の標準手法によって導入し得る。好ましくは、保存アミノ酸置換は、１つ以上の非必須アミノ酸残基で作られる。
【０１４１】
周知のように、ＲＮＡは、グアニジウムイソチオシアン酸抽出および沈殿の後、遠心分離またはクロマトグラフィーを行うような標準手法で、本来のＢ細胞、ハイブリドーマ細胞、または他の形質転換される細胞から単離し得る。所望する場合、ｍＲＮＡは、オリゴｄＴセルロース上でのクロマトグラフィー等の標準手法によって総ＲＮＡから単離し得る。適切な手法は、当技術分野で良く知られている。１つの実施形態では、抗体の軽および重鎖をコードするｃＤＮＡは、周知の方法に従い、同時にかまたは別々のいずれか一方で、逆転写酵素およびＤＮＡポリメラーゼを使用して作り得る。ＰＣＲは、コンセンサス定常領域プライマーまたはより特異的なプライマーで、公開された重鎖および軽鎖ＤＮＡならびにアミノ酸配列に基づいて、開始し得る。上記に説明されるように、ＰＣＲは、抗体軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡクローンを単離するために使用し得る。この事例では、ライブラリは、コンセンサスプライマーまたはヒト定常領域等の大きめの同族のプローブでスクリーニングし得る。
【０１４２】
ＤＮＡ、典型的には、プラスミドＤＮＡは、当技術分野で既知の手法を使用して細胞から単離し、例えば、組換えＤＮＡの手法に関する前述の参考文献で詳細に示される標準の周知の手法に従って制限酵素マッピング、および配列決定を行い得る。当然、ＤＮＡは、単離過程またはその後の分析の間のいずれかの時点で、本発明に従い合成であり得る。
【０１４３】
１つの実施形態では、本発明は、少なくとも１つの重鎖可変領域のＣＤＲまたは少なくとも２つの重鎖可変領域のＶＨ‐ＣＤＲの少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％が、本明細書に開示される抗体からの参照重鎖ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、またはＶＨ−ＣＤＲ３アミノ酸配列と同一である免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）をコードする核酸を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる単離ポリヌクレオチドを提供する。あるいは、ＶＨのＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、またはＶＨ−ＣＤＲ３の領域の少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％が、本明細書に開示される抗体からの、参照重鎖ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、およびＶＨ−ＣＤＲ３アミノ酸配列と同一である。故に、この実施形態にしたがって、本発明の重鎖可変領域は、図１に示されるポリペプチド配列に関連するＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、またはＶＨ−ＣＤＲ３ポリペプチド配列を有する。
【０１４４】
他の実施形態では、本発明は、少なくとも１つのＶＬ−ＣＤＲの軽鎖可変領域または少なくとも２つのＶＬ−ＣＤＲの軽鎖可変領域の少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％が、本明細書に開示される抗体からの参照軽鎖ＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、またはＶＬ−ＣＤＲ３アミノ酸配列と同一である免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードする核酸を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる単離ポリヌクレオチドを提供する。あるいは、ＶＬのＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、またはＶＬ−ＣＤＲ３の領域の少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％が、本明細書に開示される抗体からの、参照軽鎖ＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、またはＶＬ−ＣＤＲ３アミノ酸配列と同一である。故に、この実施形態にしたがって、本発明の軽鎖可変領域は、図１に示される群に関連するＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、およびＶＬ−ＣＤＲ３ポリペプチド配列を有する。
【０１４５】
他の実施形態では、本発明は、ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、およびＶＨ−ＣＤＲ３領域は、図１および添付ので配列リスト示されるＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、およびＶＨ−ＣＤＲ３群と同一であるポリペプチド配列を有する免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）をコードする核酸を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる、単離ポリヌクレオチドを提供する。
【０１４６】
当技術分野で既知のように、２つのポリペプチドまたは２つのポリヌクレオチド間の「配列同一性」は、第二のポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列に対して１つのポリペプチドまたはポリヌクレオチドのアミノ酸または核酸配列を比較して、決定する。本明細書で説明される場合、任意の特定のポリペプチドが、別のポリペプチドと少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％同一であるかどうかは、当技術分野で既知の方法およびコンピュータプログラム／ソフトウェア、限定されないが、ＢＥＳＴＦＩＴプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｉｓｉｏｎ  ８  ｆｏｒ  Ｕｎｉｘ（登録商標），Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｋ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ５３７１１）等を使用して決定することができる。ＢＥＳＴＦＩＴは、２つの配列間の最高の相同性のセグメントを発見するため、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，ＡｄｖａｎｃｅＳ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ２（１９８１），４８２‐４８９のローカル相同性アルゴリズムを使用する。ＢＥＳＴＦＩＴまたは他のいずれの配列整列プログラムを使用して、特定の配列が、例えば、９５％で本発明に記載の参照配列と同一かどうかを決定する場合、パラメータを当然、同一性の割合は、参照ポリペプチド配列の全長にわたって算出されるように、相同性におけるずれは参照配列でのアミノ酸の総数の５％まで許可するように設定する。
【０１４７】
本発明の好ましい実施形態では、ポリヌクレオチドは、基本的に配列番号２、５、８、１１、１４、１７、または２０で示す、抗αシヌクレイン抗体のＶＨまたはＶＬ領域のポリヌクレオチド配列を有する核酸を含むか、本質的にそれらからなるか、それらからなる。この点において、当業者は、少なくとも軽および／または重鎖の可変ドメインをコードするポリヌクレオチドは、双方の免疫グロブリン鎖または１つのみの可変ドメインをコードし得るということを容易に理解するだろう。
【０１４８】
本発明は、他の箇所で説明されるように、本発明のポリヌクレオチドフラグメントも含む。加えて、本明細書に説明される融合ポリヌクレオチド、Ｆａｂフラグメント、および他の誘導体をコードするポリヌクレオチドもまた本発明で意図される。
【０１４９】
ポリヌクレオチドは、当技術分野で既知の任意の方法で産生するか、または製造し得る。例えば、抗体のヌクレオチド配列が既知のものである場合、抗体をコードするポリヌクレオチドは、化学的に合成したオリゴヌクレオチドから構築し得、例えば、Ｋｕｔｍｅｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １７（１９９４），２４２、であり、簡潔に説明すると、抗体をコードする配列部分を含有する重複オリゴヌクレオチドの合成、それらのオリゴヌクレオチドのアニールおよび連結、ならびに、次にＰＣＲによる連結したオリゴヌクレオチドの増幅を含む。
【０１５０】
あるいは、抗体、またはその抗原結合フラグメント、変異体、もしくは誘導体をコードするポリヌクレオチドは、適切な供給源からの核酸から産生し得る。特定の抗体をコードする核酸を含有するクローンは使用不可能だが、抗体分子の配列が既知のものである場合、抗体をコードする核酸は、配列３’および５’末端にハイブリッドが可能な合成プライマーを使用するＰＣＲ増幅によってか、または、例えば、抗体をコードするｃＤＮＡライブラリからのｃＤＮＡクローンを特定するため特定の遺伝子配列に対して特異的なオリゴヌクレオチドプローブを使用するクローン化によって、適切な供給源（例えば、抗体ｃＤＮＡライブラリ、または抗体を発現するために選択したハイブリドーマ細胞等のαシヌクレイン特異的抗体を発現する任意の組織または細胞から作り出されたｃＤＮＡライブラリ、またはそれから単離された核酸、好ましくはｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡ）から化学的に合成するか取得し得る。ＰＣＲで産生した増幅した核酸を、次に当技術分野で周知の任意の方法を使用して、複写可能なクローンベクターへクローン化する。
【０１５１】
抗体のヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメント、変異体、もしくは誘導体を決定した時点で、異なるアミノ酸配列を有する抗体を産生するため、例えば、アミノ酸置換、欠失および／または挿入を作りだすため、そのヌクレオチド配列を、ヌクレオチド配列の操作のための当技術分野で既知の方法、例えば、組換えＤＮＡ手法、部位特異的変異誘発、ＰＣＲ等を使用して、操作し得る（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９９０）、およびＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  ＮＹ（１９９８）に説明される手法を参照されたい、双方とも参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）。
【０１５２】
ＩＶ．  抗体ポリペプチドの発現
本発明の抗体、またはその抗原結合フラグメント、変異体、もしくは誘導体を提供するための単離した遺伝子材料の操作に続いて、抗体をコードするポリヌクレオチドは、典型的に、所望の量の抗体を産生するために使用し得る宿主細胞への導入のため、発現ベクターに挿入する。抗体、またはそのフラグメント、誘導体もしくは類似体、例えば、標的分子に結合する抗体の重または軽鎖の組換え発現は、本明細書に説明される。本発明の抗体分子、または抗体の重もしくは軽鎖、またはその部分（好ましくは、重または軽鎖可変ドメインを含有する）をコードするポリヌクレオチドが取得された時点で、抗体分子の産生のためのベクターは、当技術分野で周知の手法を使用して、組換えＤＮＡ技術を使用して、産生し得る。したがって、抗体をコードするヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチドを発現することでタンパク質を調製する方法が本明細書に説明される。当業者に周知の方法は、抗体コード配列、ならびに適切な転写および翻訳の制御シグナルを含有する発現ベクターをコンストラクトするために使用し得る。これらの方法には、例えば、インビトロの組換えＤＮＡ手法、合成手法、およびインビボの遺伝子組換えが含まれる。本発明はしたがって、プロモーターに操作可能に連結する、本発明の抗体分子、またはその重もしくは軽鎖、または重もしくは軽鎖可変ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む複写可能なベクターを提供する。そのようなベクターは、抗体分子の定常領域をコードするヌクレオチド配列を含み得、（例えば、国際出願第ＷＯ８６／０５８０７号および第ＷＯ８９／０１０３６号ならびに米国特許第５，１２２，４６４号を参照されたい）抗体の可変ドメインは、全重または軽鎖の発現のためのそのようなベクターへクローン化し得る。
【０１５３】
本明細書で使用される用語「ベクター」または「発現ベクター」は、宿主細胞へ導入し、宿主細胞で所望の遺伝子を発現するための媒体として、本発明に従って使用するベクターを意味する。当業者には既知のように、そのようなベクターは、容易にプラスミド、ファージ、ウイルスおよびレトロウイルスからなる群から選択し得る。一般的に、本発明に適応するベクターは、選択マーカー、所望の遺伝子のクローン化を促進する適切な制限部位、および真核または原核細胞で侵入および／または複写する能力を含むだろう。この発明の目的のため、多数の発現ベクターシステムを採用し得る。例えば、ベクターの１つのクラスは、ウシパピローマウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス、レトロウイルス（ＲＳＶ、ＳＶ、ＭＭＴＶ、またはＭＯＭＬＶ）、またはＳＶ４０ウイルス等の動物ウイルスに由来するＤＮＡ要素を利用する。他は、内部リボソーム結合部位を有するポリシストロニックシステムの使用を含む。加えて、それらの染色体へＤＮＡを組み込んだ細胞は、移入した宿主細胞の選択を可能にする１つ以上のマーカーを導入することにより選択し得る。マーカーは、栄養要求宿主に対する原栄養性、殺生物抵抗性（例えば、抗生物質）、または銅等の重金属への抵抗性を提供し得る。選択可能なマーカー遺伝子を、発現するためにＤＮＡ配列に直接連結するか、または同時形質転換によって同細胞へ導入するかのどちらかが可能である。ｍＲＮＡの最適な合成のために付加的な要素も必要であり得る。これらの要素には、シグナル配列、スプライスシグナル、ならびに転写プロモーター、エンハンサー、および終結シグナルを含み得る。
【０１５４】
特に好ましい実施形態では、上記で説明されたように、クローン化した可変領域遺伝子は、重鎖および軽鎖定常領域遺伝子（好ましくはヒト）とともに、発現ベクターへ挿入する。１つの実施形態では、これは米国特許第６，１５９，７３０号で開示されるＮＥＯＳＰＬＡと称される、Ｂｉｏｇｅｎ  ＩＤＥＣ，Ｉｎｃ．，専売の発現ベクターを使用して行われる。このベクターは、サイトメガロウイルスプロモーター／エンハンサー、マウスベータグロビン主要プロモーター、複写のＳＶ４０起源、ウシ成長ホルモンポリアデニル配列、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼエクソン１およびエクソン２、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、およびリーダー配列を含有する。このベクターは、可変および定常領域遺伝子の取り込み、ＣＨＯ細胞でのトランスフェクション、その後のＧ４１８含有培地での選択、およびメトトレキサート増幅を行うことで、抗体の高いレベルの発現をもたらすことが分かった。当然、真核細胞で発現を誘発する能力があるいずれの発現ベクターも本発明で使用し得る。適切なベクターの例は、プラスミドｐｃＤＮＡ３、ｐＨＣＭＶ／Ｚｅｏ、ｐＣＲ３．１、ｐＥＦ１／Ｈｉｓ、ｐＩＮＤ／ＧＳ、ｐＲｃ／ＨＣＭＶ２、ｐＳＶ４０／Ｚｅｏ２、ｐＴＲＡＣＥＲ‐ＨＣＭＶ、ｐＵＢ６／Ｖ５‐Ｈｉｓ、ｐＶＡＸ１、およびｐＺｅｏＳＶ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡから入手可能）、およびプラスミドｐＣＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩから入手可能）を含むが、それらに限定されない。一般的に、適宜に高いレベルの免疫グロブリン重鎖および軽鎖を発現するための多数の形質転換した細胞をスクリーニングすることは、例えば、ロボットシステムによって実行し得る定期的な実験である。ベクターシステムは、米国特許番号第５，７３６，１３７号、および第５，６５８，５７０号でも教示され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。このシステムは、例えば、３０ｐｇ／細胞／日を上回る、高い発現レベルを提供する。他の例示的なベクターシステムは、例えば、米国特許第６，４１３，７７７号に開示される。
【０１５５】
他の好ましい実施形態では、本発明の抗体、またはその抗原結合フラグメント、変異体、もしくは誘導体は、米国特許出願第２００３‐０１５７６４１  Ａ１号で開示され、その全体が本明細書に組み込まれるポリシストロニックコンストラクト等を使用して、発現し得る。これらの発現システムでは、抗体の重鎖および軽鎖等の複数の対象の遺伝子産物は、単一ポリシストロニックコンストラクトから産生し得る。これらのシステムは、相対的に高いレベルの抗体を提供するため、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を有利に使用する。適応するＩＲＥＳ配列は、米国特許第６，１９３，９８０号に開示され、これも本明細書に組み込まれる。当業者は、そのような発現システムは、本出願で開示される、あらゆる種類の抗体を効果的に産生するために使用し得るということを理解するであろう。
【０１５６】
より一般的には、抗体のモノマーサブユニットをコードするベクターまたはＤＮＡ配列を調製した時点で、発現ベクターは、適切な宿主細胞へ導入し得る。宿主細胞へのプラスミドの導入は、当技術分野で既知の様々な手法で達成し得る。これらは、例えば、Ｆｕｇｅｎｅまたはリポフェクタミンを使用するリポトランスフェクション（ｌｉｐｏｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）、原形質融合、リン酸カルシウム沈降、エンベロープＤＮＡとの細胞融合、微量注入、および無処置のウイルスへの感染を含むトランスフェクションを含むが、それらに限定されない。典型的に、宿主へのプラスミド導入は、標準のリン酸カルシウム共沈法を用いる。発現コンストラクトを宿す宿主細胞は、重および／または軽鎖タンパク質の産生に適切な条件の下、成長させ、重および／または軽鎖タンパク質合成のためアッセイした。例示的なアッセイ手法は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、または蛍光励起セルソーターアッセイ（ＦＡＣＳ）、免疫組織化学的検査等を含む。
【０１５７】
発現ベクターは、従来の手法で宿主細胞へ移入し、トランスフェクトされた細胞は、次に、本明細書に説明される方法で用いる抗体を、産生するため従来の手法で培養する。したがって、本発明は、異種プロモーターに操作可能に連結する、本発明の抗体またはその重もしくは軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含有する宿主細胞を含む。二重鎖の抗体の発現のための好ましい実施形態では、重鎖および軽鎖の双方をコードするベクターは、下記に説明されるように、全免疫グロブリン分子の発現のため宿主細胞で同時発現し得る。
【０１５８】
宿主細胞は本発明の２つの発現ベクターで同時トランスフェクトし得、第１のベクターは重鎖に由来するポリペプチドをコードし、第２のベクターは軽鎖に由来するポリペプチドコードをコードする。２つのベクターは、重鎖および軽鎖ポリペプチドの同等の発現を可能にする同一の選択可能なマーカーを含有し得る。あるいは、重鎖および軽鎖ポリペプチドの双方をコードする単一ベクターを使用し得る。そのような状態で、軽鎖は、有利に有毒でない重鎖の過多を避けるため、重鎖の前に置かれ、Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ，Ｎａｔｕｒｅ  ３２２（１９８６），５２、Ｋｏｈｌｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．ＵＳＡ７７（１９８０），２９１７を参照されたい。重鎖および軽鎖のコード配列は、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを含み得る。
【０１５９】
本明細書で使用される「宿主細胞」は、組換えＤＮＡ手法を使用してコンストラクトされるベクターを宿し、少なくとも１つの異種遺伝子をコードする細胞を指す。組換え宿主からの抗体の単離の過程の記述において、用語「細胞」および「細胞培養」は、抗体の源を示すため、明瞭に特定しない限りは、互換的に使用する。言い換えると、「細胞」からのポリペプチドの回収は、全細胞の沈降から、または培地および懸濁した細胞の双方を含有する細胞培養物からの回収を意味し得る。
【０１６０】
多種の宿主発現ベクターシステムは、本明細書に説明される方法での使用で用いる抗体分子を発現するため利用し得る。そのような宿主発現システムは、対象のコード配列を産生し、その後精製し得る媒体を示すだけでなく、適切なヌクレオチドコード配列で形質転換するか、またはトランスフェクトする際、インサイチュで本発明の抗体分子を発現し得る細胞を示す。これらは、抗体コード配列を含有する組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、またはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換される微生物等（例えば、大腸菌、枯草菌）、抗体コード配列を含有する組換え酵母発現ベクターで形質転換される酵母（例えば、サッカロミセス、、ピチア）、抗体コード配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染する昆虫細胞システム、組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ））に感染するか、または抗体コード配列を含有する組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換する植物細胞システム、または哺乳類細胞のゲノム（例えば、メタロチオネインプロモーター）または哺乳類ウイルス（例えば、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）に由来するプロモーターを含有する組換え発現コンストラクトを宿す哺乳類細胞システム（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＮＳＯ、ＢＬＫ、２９８、３Ｔ３細胞）を含むが、それらに限定されない。特に全組換え抗体分子の発現のため、好ましくは、大腸菌等の細菌性細胞、より好ましくは真核細胞を、組換え抗体分子の発現に使用し得る。例えば、ヒトサイトメガロウイルスからの主要な中間初期遺伝子プロモーター要素等のベクターと併用するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞等の哺乳類細胞は、抗体の有効な発現システムであり、例えば、Ｆｏｅｃｋｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ４５（１９８６），１０１、Ｃｏｃｋｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ８（１９９０），２、を参照されたい。
【０１６１】
タンパク質発現のため使用される宿主細胞株は、しばしば哺乳類起源のものであり、当業者は、本明細書で発現される所望の遺伝子産物に最適である特定の宿主細胞株を優先的に決定するための能力を有すると考えられる。例示的な宿主細胞株は、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）、ＤＧ４４およびＤＵＸＢ１１（チャイニーズハムスター卵巣、ＤＨＦＲマイナス）、ＨＥＬＡ（ヒト子宮頸癌）、ＣＶＩ（サル腎臓線）、ＣＯＳ（ＳＶ４０Ｔ抗原を有するＣＶＩの誘導体）、ＶＥＲＹ、ＢＨＫ（ベビーハムスター腎臓）、ＭＤＣＫ、ＷＩ３８、Ｒ１６１０（チャイニーズハムスター線維芽細胞）ＢＡＬＢＣ／３Ｔ３（マウス線維芽細胞）、ＨＡＫ（ハムスター腎臓線）、ＳＰ２／Ｏ（マウス骨髄腫）、Ｐ３ｘ６３‐Ａｇ３．６５３（マウス骨髄腫）、ＢＦＡ‐１ｃ１ＢＰＴ（ウシ内皮細胞）、ＲＡＪＩ（ヒトリンパ球）、および２９３（ヒト腎臓）を含むが、それらに限定されない。ＣＨＯ細胞および２９３細胞が特に好ましい。宿主細胞株は、典型的に商業サービス、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、または出版された文献から入手可能である。
【０１６２】
加えて、宿主細胞株は、挿入した配列の発現を調節するか、または所望の特異様式で、遺伝子産物を修飾およびプロセシングするものが選択される。そのようなタンパク質産物の修飾（例えば、グリコシル化）およびプロセシング（例えば、切断）は、タンパク質の機能において重要である可能性がある。異なる宿主細胞は、タンパク質および遺伝子産物の翻訳後プロセシングおよび修飾に特徴的および特異的機構を有する。適切な細胞株または宿主システムは、発現する外来タンパク質の正しい修飾およびプロセシングを確実にするように選択し得る。この目的を達成するため、遺伝子産物の一次転写物、グリコシル化、およびリン酸化の適切なプロセシングのための細胞機構を有する真核宿主細胞を使用し得る。
【０１６３】
長期間においては、組換えタンパク質の高収量産生が好ましい。例えば、抗体分子を安定的に発現する細胞株を操作し得る。複写のウイルス起源を含有する発現ベクターを使用するよりはむしろ、宿主細胞は、適切な発現制御要素（例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネータ、ポリアデニル化部位等）、および選択可能なマーカーによって制御されるＤＮＡで形質転換し得る。外来ＤＮＡの導入に続いて、操作した細胞は、濃縮した培地で１〜２日間成長させ得、次に選択の培地へ切り替え得る。組換えプラスミドでの選択可能なマーカーは、選択物へ抵抗を与え、細胞が、安定的にそれらの染色体へプラスミドが組み込まれること、および次々に株細胞株へクローン化し伸長し得る病巣を形成するように成長させることを可能にする。この方法は、抗体分子を安定的に発現する細胞株を操作するため、有利に使用し得る。
【０１６４】
多数の選択システムは、それぞれ、チミジンキナーゼ、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、またはアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ細胞で採用し得る単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ１１（１９７７），２２３）、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ＆Ｓｚｙｂａｌｓｋａ＆Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ４８（１９９２），２０２）、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ２２（１９８０），８１７）遺伝子の使用を含むが、それらに限定されない。また、抗代謝物抵抗は次の遺伝子の選択の基準として使用し得る。メトトレキサートに抵抗を与えるｄｈｆｒ（Ｗｉｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７７（１９８０），  ３５７、Ｏ’Ｈａｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７８（１９８１），  １５２７）、ミコフェノール酸に抵抗を与えるｇｐｔ（Ｍｕｌｌｉｇａｎ  ＆  Ｂｅｒｇ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７８（１９８１），  ２０７２）、Ｇ‐４１８  Ｇｏｌｄｓｐｉｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  １２（１９９３），  ４８８−５０５に抵抗を与えるｎｅｏ、Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｕ，  Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ３（１９９１），  ８７−９５、Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ，  Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｏｘｉｃｏｌ．３２（１９９３），５７３‐５９６、Ｍｕｌｌｉｇａｎ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０（１９９３），  ９２６−９３２、およびＭｏｒｇａｎ  ａｎｄ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ，  Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ６２（１９９３），１９１−２１７、ＴＩＢ  ＴＥＣＨ  １１（１９９３），１５５−２１５、およびハイグロマイシン（Ｓａｎｔｅｒｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ３０（１９８４），１４７、に抵抗を与えるｈｙｇｒｏ。使用し得る当技術分野で一般的に知られる組換えＤＮＡ技術の方法は、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ（ｅｄｓ．），  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９３）、Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９９０）、およびＣｈａｐｔｅｒｓ  １２  ａｎｄ  １３，Ｄｒａｃｏｐｏｌｉ  ｅｔ  ａｌ（ｅｄｓ），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  ＮＹ  （１９９４）、Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １５０：１  （１９８１）に説明され、参照によってそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【０１６５】
抗体分子の発現レベルは、ベクター増幅で増加し得る。再考察のため、Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎ  ａｎｄ  Ｈｅｎｔｓｃｈｅｌ，Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｇｅｎｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｌｏｎｅｄ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ＤＮＥ  ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｖｏｌ．３．（１９８７）、を参照されたい。抗体を発現するベクターシステムでのマーカーが、増幅可能な場合、宿主細胞の培養に存在する阻害物質のレベルの増加は、マーカー遺伝子の複写物の数を増加させるだろう。増幅した領域が抗体遺伝子に付随するため、抗体の産生もまた増加するだろう。Ｃｒｏｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  ３（１９８３），２５７を参照されたい。
インビトロの産生は、大量の所望のポリペプチドを与えるようにスケールアップすることを可能にする。組織培養条件下の哺乳類細胞培養の手法は当技術分野で既知であり、例えば、気泡ポンプリアクタまたは持続型かくはん器等の均一懸濁液培養、もしくは、例えば、中空繊維内、マイクロカプセル内、アガロースミクロビーズまたはセラミックカートリッジ上等での固定化または捕捉化細胞培養を含む。必要および／または所望であれば、ポリペプチドの溶液は、通例のクロマトグラフィー法、例えば、本明細書に説明される合成ヒンジ領域ポリペプチドの優先的生合成後またはＨＩＣクロマトグラフィーステップの前後に、例えば、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、ＤＥＡＥセルロースでのクロマトグラフィー、または（免疫）親和性クロマトグラフィーによって精製し得る。
【０１６６】
本発明の抗体、またはその抗原結合フラグメント変異体、もしくは誘導体をコードする遺伝子は、細菌もしくは昆虫もしくは酵母もしくは植物細胞等の非哺乳類細胞でも発現し得る。核酸を容易に吸収する細菌は、大腸菌またはサルモネラ株、枯草菌、肺炎球菌、連鎖球菌、およびインフルエンザ菌等の腸内細菌科のメンバーを含む。細菌中で発現した場合、異種ポリペプチドは、典型的に封入体の一部になるということが理解されるだろう。異種ポリペプチドは、必ず単離し、精製し、次に機能分子へ構築する必要がある。抗体の四価型を所望する場合、サブユニットは次に四価抗体へ自己構築し、例えば、国際出願第ＷＯ０２／０９６９４８号を参照されたい。
【０１６７】
細菌システムにおいて、多数の発現ベクターは、発現された抗体分子を目的とした使用次第で、有利に選択し得る。例えば、抗体分子の薬学的組成物の産生のため、大量のタンパク質等を産生する場合、容易に精製し得る高いレベルの融合タンパク質産物の発現を指示するベクターが望ましい。そのようなベクターは、抗体コード配列がｌａｃＺコーディング領域での枠内で個々にベクターに連結し得、それによって融合タンパク質が産生される大腸菌発現ベクターｐＵＲ２７８（Ｒｕｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ＥＭＢＯ  Ｊ．  ２（１９８３），１７９１）；ｐＩＮベクター（Ｉｎｏｕｙｅ  ＆  Ｉｎｏｕｙｅ，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１３（１９８５），  ３１０１−３１０９、Ｖａｎ  Ｈｅｅｋｅ  ＆  Ｓｃｈｕｓｔｅｒ，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．２４（１９８９），  ５５０３−５５０９）等を含むが限定されない。ｐＧＥＸベクターもまた、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）を有する融合タンパク質として外来ポリペプチドを発現するために使用し得る。一般的に、そのような融合タンパク質は、可溶性であり、遊離型グルタチオンの存在下での吸着およびグルタチオンアガロースビーズのマトリクスへの結合、次に続く溶出により容易に、溶解した細胞から精製し得る。ｐＧＥＸベクターは、トロンビンまたは活性化第Ｘａ因子プロテアーゼ切断部位を含むように設計され、そのため、クローン化した標的遺伝子産物は、ＧＳＴ成分から遊離し得る。
【０１６８】
原核生物に加えて、真核微生物も使用し得る。例えば、ピキア・パストリス等、他の多数の株も一般的に入手可能であるが、出芽酵母または一般のパン酵母は、真核微生物の中で最も一般的に使用される。サッカロミセスでの発現において、プラスミドＹＲｐ７、例えば、（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ２８２（１９７９），３９、Ｋｉｎｇｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ７（１９７９），１４１、Ｔｓｃｈｅｍｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １０（１９８０），１５７）が一般的に使用される。このプラスミドは、トリプトファンで成長する能力に欠ける酵母の変異株のための選択マーカーを提供するＴＲＰ１遺伝子をすでに含有している。例えば、ＡＴＣＣ  Ｎｏ．４４０７６またはＰＥＰ４‐１（Ｊｏｎｅｓ，  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ８５（１９７７），１２）。酵母宿主細胞ゲノムの特性としてのｔｒｐｌ病変の存在は、次に、トリプトファンの非存在で、成長による形質転換を検出するための有効な環境を提供する。
【０１６９】
昆虫システムでは、キンウワバ科核多角体病ウイルス（ＡｃＮＶＰ）が外来遺伝子を発現するためのベクターとして、典型的に使用される。ウイルスは、ヨトウガ細胞で成長させる。抗体コード配列を、それぞれ、ウイルスの非必須領域（例えば、ポリヘドリン遺伝子）へクローン化し、ＡｃＮＰＶプロモーター（例えば、ポリヘドリンプロモーター）の制御下に配置し得る。
【０１７０】
本発明の抗体分子が、組換え技術によって発現した時点で、全抗体、それらの二量体、個々の軽鎖、および重鎖、または本発明の他の免疫グロブリン型は、当技術分野の、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、親和性、特にタンパク質Ａの後の特異的抗原に対する親和性、およびふるいカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、硫安塩析等の吸収率較差溶解度、またはタンパク質の精製のための他の任意の標準手法によるものを含む、当技術分野の標準手順に従って精製し得、例えば、Ｓｃｏｐｅｓ，  ”Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ”，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，  Ｎ．Ｙ．（１９８２）を参照されたい。あるいは、本発明の抗体の親和性を増加させるために好ましい方法は、米国特許出願第２００２‐０１２３０５７Ａ１号に開示される。
【０１７１】
Ｖ．  融合タンパク質および抱合体
ある実施形態では、抗体ポリペプチドは、通常抗体に付随しないアミノ酸配列または１つ以上の部分を含む。例示的な修飾は以下でより詳しく説明される。例えば、本発明の単鎖ｆｖ抗体フラグメントは、可動性のリンカー配列を含むか、機能成分（例えば、ＰＥＧ、薬物、毒素、または蛍光性、放射性、酵素、核磁気、および重金属等の標識）を付加するために修飾し得る。
【０１７２】
本発明の抗体ポリペプチドは、融合タンパク質を含むか、本質的にそれからなるか、それからなることを特徴とする。融合タンパク質は、例えば、少なくとも１つの標的結合部位、および少なくとも１つの異種部分、すなわち、自然に連結しない部分を有する免疫グロブリンαシヌクレイン結合ドメインを含む、キメラ分子である。アミノ酸配列は通常、融合ポリペプチドに集まる別々のタンパク質に存在し得るか、または融合ポリペプチドの新しい配列に配置されるが、通常同一のタンパク質に存在し得る。例えば、化学合成、またはペプチド領域が所望の関係でコードされるポリヌクレオチドの作製および翻訳により、融合タンパク質を作り得る。
【０１７３】
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに適用される用語「異種」は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、比較される他の実体の残りの部分とは異なる実体に由来するということを意味する。例えば、本明細書で使用される、抗体、またはその抗原結合フラグメント、変異体、もしくは類似体に融合させるための「異種ポリペプチド」は同種の非免疫グロブリンポリペプチド、もしくは異なる種の免疫グロブリンまたは非免疫グロブリンポリペプチドに由来する。
【０１７４】
本明細書の他の部分で詳細に説明されるように、本発明の抗体、またはその抗原結合フラグメント、変異体、もしくは誘導体は、さらなる組換え技術によって、ＮまたはＣ末端で異種ポリペプチドに融合するか、または化学的にポリペプチドまたは他の組成物に抱合し得る（共有結合および非共有結合抱合体を含む）。例えば、抗体は、組換え技術によって、検出するアッセイの標識で有用な分子、および異種ポリペプチド、薬物、放射性、または毒素等のエフェクター分子に融合または抱合し得、例えば、国際出願第ＷＯ９２／０８４９５号、第ＷＯ９１／１４４３８号、第ＷＯ８９／１２６２４号、米国特許番号５，３１４，９９５、および欧州特許出願公開第０  ３９６３８７号を参照されたい。
【０１７５】
本発明の抗体、またはその抗原結合フラグメント、変異体、もしくは誘導体は、ペプチド結合または修飾したペプチド結合、すなわちペプチドアイソスターにより相互に連結するアミノ酸からなり得、２０個の遺伝子でコードしたアミノ酸以外にも、アミノ酸を含有する。抗体は、当技術分野で周知の翻訳後プロセシング等の自然なプロセシング、または化学的修飾手法によって修飾し得る。そのような修飾は、本文および詳細な論文、ならびに膨大な数の研究文献により詳細に説明される。修飾は、ペプチド主鎖、アミノ酸側鎖、およびアミノまたはカルボキシル終端、もしくは炭水化物等の部分を含む、抗体のいかなる場所でも生じ得る。同一の修飾型は、所与の抗体のいくつかの部位で、同一または異なる程度に、存在し得るということが理解されるだろう。また、所与の抗体は、多くの修飾型を含有し得る。抗体は、例えば、ユビキチン化の結果として分岐し得、それらは分岐または非分岐で環状であり得る。環状の、分岐した、および分岐した環状の抗体は、翻訳後自然プロセシングからもたらされるか、合成方法により作り得る。修飾には、アセチル化、アシル化、ＡＤＰリボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム成分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋結合、環化、ジスルフィド連結の形成、脱メチル化、共有結合架橋結合の形成、システインの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、ガンマカルボキシ化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、水酸化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、ペグ化、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化等のアミノ酸の転移ＲＮＡで媒介したタンパク質への付加、およびユビキチン化を含み、例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ２ｎｄ  Ｅｄ．，（１９９３）、Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｖａｌｅｎｔ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ｐｇｓ  １‐１２（１９８３）、Ｓｅｉｆｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８２（１９９０），６２６−６４６、Ｒａｔｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．  ＮＹ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６６３（１９９２），４８−６２）を参照されたい。
【０１７６】
本発明は抗体、またはその抗原結合フラグメント、変異体、もしくは誘導体、および異種ポリペプチドを含む融合タンパク質も提供する。１つの実施形態では、本発明の融合タンパク質は、本発明の抗体、またはそのフラグメントもしくは変異体のＶＨ領域のうちの任意の１つ以上のアミノ酸配列、あるいは本発明の抗体、またはそのフラグメントもしくは変異体のＶＬ領域のうちの任意１つ以上のアミノ酸配列を有するポリペプチド、ならびに異種ポリペプチド配列を含むか、それらから本質的になるか、それらからなる。他の実施形態では、本明細書に開示される診断および治療方法での使用のための融合タンパク質は、抗体、またはそのフラグメント、変異体、もしくは誘導体のＶＨ‐ＣＤＲのうちのいずれか１つ、２つ、３つのアミノ酸配列、あるいは抗体、またはそのフラグメント、変異体、もしくは誘導体のＶＬ‐ＣＤＲのうちのいずれか１つ、２つ、３つのアミノ酸配列を有するポリペプチド、ならびに異種ポリペプチド配列を含むか、それらから本質的になるか、それらからなる。１つの実施形態では、融合タンパク質は、本発明の抗体、またはそのフラグメント、誘導体、もしくは変異体のＶＨ‐ＣＤＲ３のアミノ酸配列、および異種ポリペプチド配列を有するポリペチドを含み、この融合タンパク質は、αシヌクレインに特異的に結合する。他の実施形態では、融合タンパク質は、本発明の抗体またはそのフラグメント、誘導体、もしくは変異体の少なくとも１つのＶＨ領域のアミノ酸配列、および本発明の抗体またはそのフラグメント、誘導体、もしくは変異体の少なくとも１つのＶＬ領域のアミノ酸配列、および異種ポリペプチド配列を有するポリペプチドを含む。好ましくは、融合タンパク質のＶＨおよびＶＬ領域は、αシヌクレインに特異的に結合する単一源抗体（またはｓｃＦｖまたはＦａｂフラグメント）に対応する。さらに他の実施形態では、本明細書に開示される診断および治療方法での使用のための融合タンパク質は、抗体、またはそのフラグメント、もしくは変異体の任意の数量の、１つ、２つ、３つまたはそれ以上のＶＨＣＤＲのアミノ酸配列、抗体、またはそのフラグメント、もしくは変異体の任意の数量の、１つ、２つ、３つまたはそれ以上のＶＬＣＤＲのアミノ酸配列、および異種ポリペプチド配列を有するポリペプチドを含む。好ましくは、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、またはそれ以上のＶＨ‐ＣＤＲまたはＶＬ‐ＣＤＲは本発明の単一源抗体（またはｓｃＦｖまたはＦａｂフラグメント）に対応する。これらの融合タンパク質をコードする核酸も、また本発明に包含する。
【０１７７】
文献に報告される例示的な融合タンパク質は、Ｔ細胞受容体（Ｇａｓｃｏｉｇｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４（１９８７），２９３６−２９４０、ＣＤ４（Ｃａｐｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３７（１９８９），５２５−５３１、Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３９（１９８９），  ６８−７０、Ｚｅｔｔｍｅｉｓｓｌ  ｅｔ  ａｌ．，ＤＮＥ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ＵＳＡ  ９（１９９０），  ３４７−３５３およびＢｙｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４４（１９９０），６６７−６７０）、Ｌセレクチン（ホーミング受容体）（Ｗａｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．１１０（１９９０），２２２１−２２２９およびＷａｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３４９（１９９１），１６４−１６７）、ＣＤ４４（Ａｒｕｆｆｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ６１（１９９０），１３０３−１３１３）、ＣＤ２８およびＢ７（Ｌｉｎｓｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １７３（１９９１），７２１−７３０）、ＣＴＬＡ−４（Ｌｉｓｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １７４（１９９１），５６１−５６９）、ＣＤ２２（Ｓｔａｍｅｎｋｏｖｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ６６（１９９１），１１３３−１１４４）、ＴＮＦ受容体（Ａｓｈｋｅｎａｚｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８８（１９９１），  １０５３５−１０５３９、Ｌｅｓｓｌａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７（１９９１），  ２８８３−２８８６および  Ｐｅｐｐｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １７４（１９９１），１４８３−１４８９（１９９１）、およびＩｇＥ受容体（Ｒｉｄｇｗａｙ  ａｎｄ  Ｇｏｒｍａｎ，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１５（１９９１），Ａｂｓｔｒａｃｔ  Ｎｏ．  １４４８）、の融合を含む。
【０１７８】
本明細書の他の箇所で説明されるように、本発明の抗体、またはその抗原結合フラグメント、変異体、もしくは誘導体は、ポリペプチドのインビボの半減期を増加するため、または当技術分野で既知の方法を使用して免疫アッセイでの使用のために、異種ポリペプチドに融合し得、例えば、Ｌｅｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  １６（２００１），１０６−１１９、Ａｄｖ．ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．  Ｒｅｖ．５４（２００２），５３１、またはＷｅｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  ３０（２００２），５１２を参照されたい。
【０１７９】
さらに、本発明の抗体、またはその抗原結合フラグメント、変異体、または誘導体は、それらの精製または検出を促進するため、ペプチド等のマーカー配列に融合し得る。好ましい実施形態では、マーカーアミノ酸配列は、ｐＱＥベクター（ＱＩＡＧＥＮ，  Ｉｎｃ．，  ９２５９  Ｅｔｏｎ  Ａｖｅｎｕｅ，  Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，  Ｃａｌｉｆ．，  ９１３１１）で提供されるタグ等のヘキサヒスチジンペプチド（ＨＩＳ）であり、とりわけ、それらの多くは商業的に入手可能である。Ｇｅｎｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６（１９８９），８２１−８２４で説明されるように、例えば、ヘキサヒスチジンは、融合タンパク質の簡便な精製を提供する。精製に有用な他のペプチドタグは、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質（Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ３７（１９８４），７６７）および「ｆｌａｇ」タグに由来するエピトープに相当する、「ＨＡ」タグを含むが、それらに限定されない。
【０１８０】
融合タンパク質は、当技術分野で周知の方法を使用して調製し得、例えば、米国特許番号第５，１１６，９６４号および第５，２２５，５３８号を参照されたい。融合がなされる正確な部位は、融合タンパク質の分泌または結合特性を最適化するため経験的に選択し得る。融合タンパク質をコードするＤＮＡは、発現のため次に宿主細胞へトランスフェクトする。
【０１８１】
本発明の抗体は、例えば、分子の治療的特性を改善するため、標的検出を促進するため、または患者のイメージングまたは治療のため、非抱合の型で使用し得るか、または少なくとも１つの様々な分子に抱合し得る。本発明の抗体、またはその抗原結合フラグメント、変異体、もしくは誘導体は、精製を実施した場合、精製の前または後のいずれかに標識化し得るか、抱合し得る。特に、本発明の抗体、またはその抗原結合フラグメント、変異体、もしくは誘導体は、治療的薬剤、プロドラッグ、ペプチド、タンパク質、酵素、ウイルス、脂質、生物学的反応修飾因子、薬学的薬剤、またはＰＥＧに抱合し得る。
【０１８２】
従来の抗体を含む免疫毒素である抱合は、当技術分野で広く説明される。毒素は従来の結合手法によって抗体に結合し得るか、またはタンパク質毒素部分を含有する免疫毒素は、融合タンパク質として産生し得る。本発明の抗体は、免疫毒素等を取得するため、対応する方法で、使用し得る。そのような免疫毒素の図解は、Ｂｙｅｒｓ，Ｓｅｍｉｎａｒｓ  Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２（１９９１），５９‐７０およびＦａｎｇｅｒ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ１２（１９９１）５１‐５４に説明される。
【０１８３】
当業者は、抱合は、抱合するため選択した薬剤次第で、多種の手法を使用しても構築し得るということを理解するだろう。例えば、ビオチンでの抱合は、例えば、シヌクレイン結合ポリペプチドをビオチンＮ‐ヒドロキシサクシニミドエステル等のビオチンの活性化したエステルで反応させることによって調製する。同様に、蛍光マーカーでの抱合は、例えば、本明細書に挙げられるもの等の結合薬剤の存在下で調製するか、イソチオシアン酸、好ましくはフルオレセインイソチオシアン酸での反応によって調製し得る。本発明の抗体、または抗原その結合フラグメント、変異体、もしくは誘導体の抱合は、類似の方法で調製し得る。
【０１８４】
本発明は、診断または治療的薬剤と抱合される、本発明の抗体、またはその抗原結合フラグメント、変異体、もしくは誘導体をさらに包含する。抗体は、例えば、神経疾患の存在を実証するため、神経疾患を患う危険性を示すため、例えば所与の治療および／または予防療法の有効性を決定するための臨床試験手順の一部として、神経疾患、すなわち、シヌクレイノパチー疾患の発症または進行を監視するため、診断で使用し得る。検出は、抗体、またはその抗原結合フラグメント、変異体、もしくは誘導体の結合を検出可能な物質へ結合することによって、促進し得る。検出可能な物質の例は、様々な酵素、補欠分子族、蛍光材料、発光材料、生物発光材料、放射性材料、様々なポジトロン放射組織分布を用いるポジトロン放射金属、および非放射性常磁性金属イオンを含み、例えば、本発明に記載の診断のような使用のため、抗体に抱合し得る金属イオンに関して、米国特許第４，７４１，９００号を参照されたい。適切な酵素の例には、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼまたはアセチルコリンエステラーゼを含み、適切な補欠分子族複合体の例には、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンを含み、適切な蛍光材料の例には、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアン酸、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシルまたはフィコエリトリンを含み、発光材料の例には、ルミノールを含み、生物発光材料の例には、ルシフェラーゼルシフェリンおよびエクオリンを含み、適切な放射性材料の例には、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎまたは９９Ｔｃを含む。
【０１８５】
抗体、またはその抗原結合フラグメント、変異体、もしくは誘導体は、化学発光の化合物に結合させることによっても検出可能に標識化し得る。化学発光でタグをつけた抗体は次に、化学反応の経過中に生じる発光の存在を検出することで決定する。特に有用な、化学発光標識化合物の例は、ルミノール、イソルミノール、セロマティックアクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩、およびシュウ酸エステルである。
【０１８６】
抗体またはその抗原結合フラグメント、変異体、もしくは誘導体が、検出可能に標識化し得る１つの方法は、同一のものを酵素に連結すること、および酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）（Ｖｏｌｌｅｒ，  Ａ．，  ”Ｔｈｅ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）”Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ，  Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．，Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｈｏｒｉｚｏｎｓ  ２（１９７８），１−７）、Ｖｏｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．３１（１９７８），５０７−５２０、Ｂｕｔｌｅｒ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．７３（１９８１），４８２−５２３、Ｍａｇｇｉｏ，Ｅ．（ｅｄ．），Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓａｙ，  ＣＲＣ
Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．，（１９８０）、Ｉｓｈｉｋａｗａ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，（ｅｄｓ．），Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓａｙ，Ｋｇａｋｕ  Ｓｈｏｉｎ，  Ｔｏｋｙｏ（１９８１）で連結した産物を使用することである。抗体に結合する酵素は、適切な基質と、好ましくは発色基質と、例えば分光光度法、蛍光定量法、または視覚的手段によって、検出可能な化学成分を産生するような方法で、反応するだろう。抗体を検出可能に標識化するために使用し得る酵素は、リンゴ酸脱水素酵素、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、デルタ−５−ステロイド異性化酵素、酵母アルコール脱水素酵素、アルファグリセロリン酸、脱水素酵素、トリオースリン酸イソメラーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコース酸化酵素、ベータガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、グルコアミラーゼおよびアセチルコリンエステラーゼを含むが、それらに限定されない。加えて、検出は、酵素に比色物質を採用する比色法によって達成し得る。検出は、同様に調製した基準と比較して、物質の酵素反応の程度の視覚的比較によっても達成し得る。
【０１８７】
検出は、任意の多種多様の他の免疫アッセイを使用しても達成し得る。例えば、抗体、またはその抗原結合フラグメント、変異体、もしくは誘導体を放射性に標識化することによって、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）（例えば、本明細書で参照によって組み込まれるＷｅｉｎｔｒａｕｂ，Ｂ．，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，Ｓｅｖｅｎｔｈ  Ｔｒａｉｎｉｎｇ  Ｃｏｕｒｓｅ  ｏｎ  Ｒａｄｉｏｌｉｇａｎｄ  Ａｓｓａｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｔｈｅ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，（Ｍａｒｃｈ，  １９８６））を参照されたい。）の使用で抗体を検出することが可能である。放射性同位元素は、ガンマカウンター、シンチレーションカウンター、またはオートラジオグラフィーを含む、手段によって検出し得るが、限定されない。
【０１８８】
抗体、またはその抗原結合フラグメント、変異体、もしくは誘導体は、１５２Ｅｕ、または他のランタニド系等の蛍光放射金属を使用しても検出可能に標識化し得る。これらの金属は、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）またはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）のような金属キレート群を使用して抗体に付着し得る。
【０１８９】
抗体、またはその抗原結合フラグメント、変異体、もしくは誘導体への様々な成分を抱合するための手段は、既知であり、例えば、Ａｒｎｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，”Ｍｏｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｏｆ  Ｄｒｕｇｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ”，ｉｎ  Ｍｏｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｒｅｉｓｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．  （ｅｄｓ．），ｐｐ．  ２４３−５６（Ａｌａｎ  Ｒ．  Ｌｉｓｓ，  Ｉｎｃ．（１９８５）、  Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，”Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ”，ｉｎ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（２ｎｄ  Ｅｄ．），  Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  （ｅｄｓ．），Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｉｎｃ．，ｐｐ．  ６２３−５３（１９８７）、Ｔｈｏｒｐｅ，”Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  Ｏｆ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、  Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ”，  ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ’８４：  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  Ｐｉｎｃｈｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．  （ｅｄｓ．），ｐｐ．  ４７５−５０６（１９８５）、”Ａｎａｌｙｓｉｓ，  Ｒｅｓｕｌｔｓ，  Ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｕｓｅ  Ｏｆ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ”，ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｅｔｅｃｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｂａｌｄｗｉｎ  ｅｔ  ａｌ．  （ｅｄｓ．），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  ｐｐ．  ３０３−１６（１９８５），  ａｎｄ  Ｔｈｏｒｐｅ  ｅｔ  ａｌ．，”Ｔｈｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  Ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｔｏｘｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ”，Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｒｅｖ．  ６２（１９８２），１１９−１５８を参照されたい。
【０１９０】
上述したように、ある実施形態では、例えば結合ポリペプチド、例えば、抗体またはその免疫特異的フラグメント等の結合分子の安定性または有効性を増強する成分を抱合し得る。例えば、１つの実施形態では、本発明のＰＥＧは、それらのインビボでの半減期を増加させるため結合分子に抱合し得る。Ｌｅｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  １６（２００１），  １０６、Ａｄｖ．  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．  Ｒｅｖ．  ５４（２００２），  ５３１、またはＷｅｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  ３０（２００２），５１２．
【０１９１】
ＶＩ．  使用の組成物および方法
本発明は、例えば、本発明の抗体、またはその抗原結合フラグメント、もしくはその誘導体または変異体等の上述のαシヌクレイン結合分子、または本発明のポリヌクレオチド、ベクター、もしくは細胞を含む組成物に関する。本発明の組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含み得る。さらに、本発明の薬学的組成物は、インターロイキンまたはインターフェロン等のさらなる薬剤を、目的とする薬学的組成物の使用次第で、含み得る。例えば、パーキンソン病の治療のための使用において、付加的な薬剤は、小さい有機体分子、抗αシヌクレイン抗体、およびその組み合わせからなる群から選択し得る。ゆえに、特定の好ましい実施形態では、本発明は、シヌクレイノパチー疾患の予防的および治療的治療のための薬学的または診断用組成物の調製のため、対象のシヌクレイノパチー疾患の進行またはシヌクレイノパチー疾患の治療への応答を観察するため、またはシヌクレイノパチー疾患を発症する対象の危険性を決定するための、αシヌクレイン結合分子、例えば、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメント、もしくはそのうちの任意の１つと同一の結合特異性を実質的に有する結合分子、本発明のポリヌクレオチド、ベクター、または細胞の使用に関する。
【０１９２】
ゆえに、１つの実施形態では、本発明は、脳および中枢神経系のそれぞれでの、αシヌクレインの異常な蓄積および／または堆積に特徴付けられる神経性疾患を治療する方法に関し、その方法は、上述の本発明のαシヌクレイン結合分子、抗体、ポリヌクレオチド、ベクターまたは細胞の任意の１つの治療的有効量をその必要性に応じて、対象に投与することを含む。用語「神経性疾患」は、パーキンソン（ＰＤ）、パーキンソン病認知症（ＰＤＤ）、レビー小体を伴う認知症（ＤＬＢ）、アルツハイマー病のレビー小体変異型（ＬＢＶＡＤ）、多系統萎縮症（ＭＳＡ）、純粋自律神経不全症（ＰＡＦ）を伴う神経変性脳鉄蓄積１型（ＮＢＩＡ‐Ｉ）、アルツハイマー病、ピック病、若年発症全身性神経軸索ジストロフィー（ハラーフォルデンシュパッツ）、筋萎縮性側索硬化症、外傷性脳損傷等のシヌクレイノパチー疾患、およびダウン症、ならびに他の運動障害、および中枢神経システム（ＣＮＳ）の疾病全般を含むがこれらに限定されない。別途提示されない限り、神経変性、神経性、または精神神経性の用語は、本明細書で、互換的に使用される。
【０１９３】
本発明の治療的アプローチの特定の利点は、本発明の抗体が、パーキンソン症の兆候のない高齢対象からのＢ細胞またはＢ記憶細胞に由来し、したがって、いくらかの確率で、臨床的に顕性のシヌクレイノパチー疾患を予防するか、または臨床的に顕性の疾病を発生させる危険性を減少させるか、または臨床的に顕性の疾病の発症または進行を遅らせる能力があるということにある。典型的に、本発明の抗体は、すでに、体細胞成熟、すなわち、抗体の可変領域の体細胞の変動手段による標的のαシヌクレイン分子への高親和性結合における、選択性および有効性に対する最適化に成功している。
【０１９４】
インビボでのそのような細胞、例えば、ヒトの細胞は、関連のまたは他の生理学的タンパク質、または自己免疫性またはアレルギー性反応の細胞構造の手段によって活性化されないという知識も、これが、臨終試験を通して成功的に生存の可能性を大幅に増加することを示すため、医学的に非常に重要である。いわば、有効性、許容性、および耐容性は、少なくとも１つのヒト対象で予防的または治療的抗体の前臨床および臨床開発の以前に実証されている。したがって、本発明のヒト抗αシヌクレイン抗体は、その臨床的成功の可能性を著しく増加させる治療的薬剤としての標的構造のその特異的有効性およびその副作用を減少する可能性の双方を想定し得る。
【０１９５】
本発明は、１つ以上の上述の成分、例えば本発明の抗αシヌクレイン抗体、その結合フラグメント、誘導体もしくは変異体、ポリヌクレオチド、ベクター、または細胞で満たされる１つ以上の容器をそれぞれ含む医薬用および診断用のパックまたはキットも提供する。そのような容器には、薬学的または生物学的産物の使用または販売を監督する行政機関が規定する形態の通知を付随させることができ、その通知はヒトへの投与のための製造、使用または販売のその機関による許可を反映する。加えて、または代替えとして、キットには、適切な診断アッセイでの使用のため試薬および／または説明書を含む。組成物、例えば、本発明のキットは、当然、αシヌクレインの存在を伴う疾患の危険性評価、診断、予防および治療のため特に適しており、パーキンソン病（ＰＤ）、パーキンソン病認知症（ＰＤＤ）、レビー小体を伴う認知症（ＤＬＢ）、およびアルツハイマー病のレビー小体変異型（ＬＢＶＡＤ）に特に適用できる。
【０１９６】
本発明の薬学的組成物は、当技術分野で周知の方法によって形成し得、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（２０００）ｂｙ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＩＳＢＮ  ０−６８３−３０６４７２．を参照されたい。適切な薬学的担体の例は、当技術分野で周知であり、リン酸緩衝食塩水、水、油／水乳濁液等の乳濁液、様々な種類の湿潤剤、無菌溶液等を含む。そのような担体を含む組成物は、従来の周知の方法によって形成し得る。これらの薬学的組成物は、適切な用量で対象へ投与し得る。適切な組成物の投与は、異なる方法、例えば、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、鼻腔内、局所的、もしくは皮内投与、または脊髄もしくは脳送達によって行い得る。点鼻剤等のエアロゾル剤は、保存剤および等張剤を有する活性剤の精製した水溶液または他の溶液を含む。そのような薬剤は、好ましくは鼻粘膜に相当するｐＨおよび等張状態に調整し得る。直腸または腟への投与のための薬剤は、適切な担体を有する坐薬で提供し得る。
【０１９７】
さらに、本発明が、本発明の薬物を投与するために頭蓋骨に小さな穴を開けるｎｏｗ  ｓｔａｎｄａｒｄ（幸いにもまれであるが）手順を含むのに対して、好ましい態様では、結合分子、特に本発明の抗体または抗体ベースの薬物は、血液脳障害を越えることができ、静脈内または経口内投与を可能にする。
【０１９８】
用量計画は、担当の医師および臨床学的因子により決定されるだろう。医学分野で周知のように、任意の一人の患者への用量は、患者の体格、体表面積、年齢、投与される特定の化合物、性別、時間、投与の経路、一般的な健康状態、および同時に投与する他の薬物を含む多くの因子次第である。典型的な用量は、例えば、０．００１から１０００μｇ（またはこの範囲で、発現させるかまたは発現を阻害するための核酸の量）であるが、この例示的な範囲を下回るか、または上回る用量は、特に上述の因子を考慮して想定する。通常、用量は、例えば、ホストの体重に対して０．０００１から１００ｍｇ／ｋｇであり、より一般的には０．０１から５ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．０２ｍｇ／ｋｇ、０．２５ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．７５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ等）である。例えば、用量は、１ｍｇ／ｋｇ体重または１０ｍｇ／ｋｇ体重、または１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲内であり得、好ましくは、少なくとも１ｍｇ／ｋｇであり得る。上記の中間の用量もまた本発明の範囲内にあることを意図する。対象は、毎日のように投与するか、または隔週もしくは実証的分析により決定される他のスケジュールに従う。例示的な治療は長期にわたる、例えば、少なくとも６ヶ月の複数回投与を伴う。付加的な例示的治療法は、２週間に一度または１ヶ月に一度、または３から６ヶ月に一度の投与を伴う。例示的な用量スケジュールは、連日の１〜１０ｍｇ／ｋｇまたは１５ｍｇ／ｋｇ、隔日の３０ｍｇ／ｋｇ、または隔週の６０ｍｇ／ｋｇを含む。いくつかの方法では、投与した各抗体の用量が示した範囲内に収まる場合、異なる結合特異性を有する２つ以上のモノクローナル抗体は、同時に投与する。経過は、定期的評価により監視され得る。非経口投与のための調製は、水または非水溶液、懸濁液および乳濁液を含む。非水溶液溶剤の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイル等の植物性油、およびエチルオレイン酸等の注射可能な有機エステルである。水溶液担体は、水、アルコール／水溶液、生理食塩水および緩衝媒体を含む、乳濁液および懸濁液を含む。非経口媒体は、塩化ナトリウム溶液、リンゲルブドウ糖、ブドウ糖および塩化ナトリウム溶液、乳酸リンゲル、または固定化した油を含む。静脈内媒体は、液体および栄養補充薬、電解質補充薬等（リンゲルブドウ糖を基礎とするもの等）を含む。例えば、抗菌薬、抗酸化剤、キレート化剤、および不活性ガス等の保存料および他の添加物も存在し得る。さらに、本発明の薬学的組成物は、ドーパミンまたは精神薬理学的薬物等のさらなる薬剤を、その薬学的組成物の意図する使用次第で含み得る。
【０１９９】
さらに、本発明の好ましい実施形態では、薬学的組成物は、受動免疫のため、抗αシヌクレイン抗体またはその結合フラグメント、誘導体もしくは変異体を含む場合、ワクチンとして、例えば、本発明の薬学的組成物を処方し得る。背景技術部分で述べられたように、αシヌクレインのオリゴマー種は、血漿およびＣＳＦ（Ｅｌ−Ａｇｎａｆ  ｅｔ  ａｌ．，  ＦＡＳＥＢ  Ｊ．２０（２００６），４１９-４２５）の細胞外に報告され、パーキンソン病のマウスモデルでの受動免疫の研究は、αシヌクレインに対する細胞外のマウスモノクローナル抗体は、細胞内のαシヌクレイン凝集体の蓄積を減少し得るということを示す（Ｍａｓｌｉａｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｅｕｒｏｎ，４６（２００５），８５７-８６８）。従って、本発明のヒト抗αシヌクレイン抗体および相当するαシヌクレイン結合分子は、ＰＤ、ＤＬＢおとびＬＢＶＡＤ等のシヌクレイノパチー疾患の阻止または回復のためのワクチンとして特に有用であるということを想定することは賢明である。
【０２００】
１つの実施形態では、本発明の抗体の組換えＦａｂ（ｒＦａｂ）および単鎖フラグメント（ｓｃＦｖ）を使用することは有益であり、これらは容易に細胞膜を浸透する可能性がある。例えば、先にインターネット上で公開されたＲｏｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．（２００８）Ｏｃｔ  １６、Ｓ１７４１−０１３４は、ＡβのＮ末端領域でエピトープを認識する、モノクローナル抗体ＷＯ‐２のキメラ組換えＦａｂ（ｒＦａｂ）および単鎖フラグメント（ｓｃＦＶ）の使用に関して説明する。操作したフラグメントは、全ＩｇＧ分子と同じ有効性で、（ｉ）アミロイド原線維化を阻止、（ｉｉ）予め形成されたＡβ１〜４２原線維の脱凝集、および（ｉｉｉ）インビトロでのＡβ１〜４２オリゴマーで媒介した神経毒性の阻害、を行うことが可能であった。エフェクター機能に欠ける抗体型を操作される小さいＦａｂおよびｓｃＦｖを使用することにおける認知された利点には、より血液脳障害を越える効果的な経路および、炎症性の副反応を引き起こす可能性を最小化することを含む。さらに、ｓｃＦＶおよび単一ドメイン抗体が、全長の抗体の結合特異性を保持することに加えて、それらは、それらの標的の折り畳み、相互作用、修飾、細胞内の局在性の変化の可能性を伴なって、単一遺伝子として、および哺乳類細胞の細胞内で細胞内抗体として発現し得、例えば、再考察のため、Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｅｓｓｅｒ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １２（２００５），３９４-４０１を参照されたい。
【０２０１】
異なるアプローチでは、 Ｍｕｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．（２００５），２３７−２４１は、「Ｓｕｐｅｒ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」と称される技術プラットフォームを説明し、これは、抗体を損傷することなく生細胞へ送り込むことを可能にするとされる。そのような細胞浸透性抗体は、新しい診断的および治療的機会を開く。用語「ＴｒａｎｓＭａｂｓ」は、これらの抗体のために作られた。
【０２０２】
さらなる実施形態において、シヌクレイノパチー疾患を治療するため有用な他の神経保護剤の同時投与または連続投与が望ましい。１つの実施形態では、本発明の薬学的組成物に付加的な薬剤を含む。対象を治療するために使用し得る神経保護剤の実施例は、グルタミン酸作動性の受容体アンタゴニスト、キナーゼ阻害剤、ＨＤＡＣ阻害剤、抗炎症剤、ジバルプロエクスナトリウム、またはその任意の組み合わせを含むが、それらに限定されない。本発明の薬学的組成物との併用で使用し得る他の神経保護剤の実施例は、例えば、国際出願第ＷＯ２００７／０１１９０７号を参照されたい。１つの実施形態では、付加的な薬剤は、ドーパミンまたはドーパミン受容体アゴニストである。
【０２０３】
本発明のさらなる実施形態では、αシヌクレイン結合分子、特に本発明の抗体は、同時投与か、シヌクレイノパチー疾患を治療するために有用な神経移植または幹細胞治療を伴う移植治療の前後に投与し得る。胚中脳神経細胞の移植を伴うそのようなアプローチは、疾病で失われた神経細胞を交換すること、および線条体でのドーパミン系神経伝達を元通りにすることを目的としてパーキンソン病を有する患者で実施されてきた。移植後１１から１６年後、移植された神経細胞は、レビー小体およびレビー神経突起を含有するように発見された。このホストからの移植した組織へのαシヌクレイン病体の広がりは、αシヌクレイン結合分子、特に本発明の抗体の同時投与によって阻止し得る。
【０２０４】
治療的に有効用量または量は、症状または疾病を回復させるために十分な活性成分の量を指す。そのような組成物の治療的有効性および毒性は、細胞培養物または実験的動物で標準薬学的手順、例えば、ＥＤ５０（集団の５０％で治療的に有効な用量）およびＬＤ５０（集団の５０％へ致死的な量）によって決定し得る。治療的と有毒的な効果の間の用量割合は、治療的指標であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０の割合として表すことができる。好ましくは、組成物での治療的薬剤は、ＰＤ、ＤＬＢまたは他のシヌクレイノパチー疾患の場合、正常な行動および／または認識を回復するか保存するため十分な量で存在する。
【０２０５】
前述から、本発明は、上記に説明される特にシヌクレイノパチー疾患の診断および／または治療、特にパーキンソン病で、上記に説明された抗体の少なくとも１つのＣＤＲを含むαシヌクレイン結合分子の任意の使用を含有する。好ましくは、該結合分子は、本発明の抗体またはその免疫グロブリン鎖である。加えて、本発明は、本明細書で前記に説明される任意の１つの上述の抗体の抗イディオタイプ抗体に関する。これらは、抗原結合部位付近の抗体の可変領域上に位置する独特の抗原性ペプチド配列に結合する抗体または他の結合分子であり、例えば、対象の試料で抗αシヌクレイン抗体を検出するために有用である。
【０２０６】
他の実施形態では、本発明は、上記に説明した本発明のαシヌクレイン結合分子、抗体、抗原結合フラグメント、ポリヌクレオチド、ベクターまたは細胞の任意の１つを含み、任意で免疫または核酸ベースの診断法で従来使用される試薬のような検出のため任意の適切な手段を含む、診断用組成物に関する。本発明の抗体は、例えば、液相で利用されるか、または固相担体に結合し得る免疫アッセイでの使用に適している。本発明の抗体を利用し得る免疫アッセイの例は、直接型または非直接型のどちらか一方での、競合的および非競合的免疫アッセイである。そのような免疫アッセイの例は、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、サンドイッチ（免疫アッセイ）、フローサイトメトリーおよびウエスタンブロットアッセイである。本発明の抗原および抗体は、多くの異なる担体に結合し、それらに特異的に結合する細胞を単離するために使用し得る。周知の担体の例は、ガラス、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリカーボネート、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然および修飾したセルロース、ポリアクリルアミド、アガロース、およびマグネタイトを含む。担体の性質は、本発明の目的のため、可溶性または不溶性のどちらか一方であり得る。当業者に知られている多くの異なる標識および標識化の方法がある。本発明で使用され得る標識の種類の例は、酵素、放射性同位元素、コロイド金属、蛍光性化合物、化学発光性化合物、および生物発光性化合物を含み、本明細書上部で説明された実施形態も参照されたい。
【０２０７】
さらなる実施形態で、αシヌクレイン結合分子、特に本発明の抗体は、血液試料、リンパ試料または他の任意の体液試料になり得る試験された個体から体液試料を取得し、抗体抗原複合体の形成を可能にする条件下で本発明の抗体とその体液試料とを接触させることにより、個体での疾患の診断方法でも使用し得る。そのような複合体のレベルは、次に当技術分野で既知の方法により決定され、対象試料で形成されたものよりも著しく高いレベルは、試験した個体に疾病があることを示す。同様の方法で、本発明の抗体により結合した特異的抗原も使用し得る。したがって、本発明は、結合分子、例えば、本発明の抗体、またはその抗原結合フラグメントを含む、インビトロの免疫アッセイに関する。
【０２０８】
この前後関係において、本発明は、この目的のため特異的に設計される手段にも関する。例えば、αシヌクレインを特異的に認識する本発明の抗体または相当する抗原結合分子が添加された抗体ベースのアレイを使用し得る。マイクロアレイ免疫アッセイの設計は、Ｋｕｓｎｅｚｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ５（２００６），１６８１−１６９６で要約される。したがって、本発明は、本発明に従って特定されるαシヌクレイン結合分子が添加されたマイクロアレイにも関する。
【０２０９】
１つの実施形態では、本発明は、対象のシヌクレイノパチー疾患を診断する方法に関し、方法は、
（ａ）本発明の抗体、そのαシヌクレイン結合フラグメント、またはそのいずれとも実質的に同じ特異性を有するαシヌクレイン結合分子を用いて、診断する対象からの試料中のαシヌクレインレベルを評価すること、
（ｂ）１つ以上の対照対象でαシヌクレインのレベルを示す参照基準に対するαシヌクレインのレベルを比較することを含み、
αシヌクレインと参照基準のレベルの違いまたは類似性は、対象がパーキンソン病を有することを示す。
【０２１０】
診断される対象は、疾病に対して無症状か前臨床であり得る。好ましくは、対照対象は、例えばＰＤ、ＤＬＢまたはＬＢＶＡＤ等のシヌクレイノパチー疾患を有し、αシヌクレインのレベルと参考基準のレベルの類似性は、診断される対象はシヌクレイノパチー疾患を有することを示す。あるいは、または追加的に第２対照として、対照対象が、シヌクレイノパチー疾患を有さない場合、αシヌクレインのレベルと参考基準のレベルの相違性は、診断する対象はシヌクレイノパチー疾患を有することを示す。好ましくは、診断される対象および対照対象は、年齢が一致している。分析される試料は、αシヌクレインを含有する疑いのある任意の体液、例えば、血液、ＣＳＦ、または尿試料であり得る。
【０２１１】
αシヌクレインのレベルは、例えば、ウエスタンブロット、免疫沈殿、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）、二次元ゲル電気泳動、質量分析（ＭＳ）、マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析／飛行時間型ＭＳのイオン化（ＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ）、表面増強レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析（ＳＥＬＤＩ‐ＴＯＦ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）、多次元的液体クロマトグラフィー（ＬＣ）、次に続く続タンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）、およびレーザデンシトメトリーから選択される１つ以上の手法によってαシヌクレインを分析することを含む、当技術分野で既知の任意の適切な方法により評価され得る。好ましくは、αシヌクレインの該インビボ画像は、陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）、単一光子放出断層撮影（ＳＰＥＣＴ）、近赤外（ＮＩＲ）光学的画像、または磁気共鳴画像（ＭＲＩ）を含む。
【０２１２】
本発明に従って適応し得る抗体および関連する手段を用いて、パーキンソン病またはレビー小体疾病等のシヌクレイノパチー疾患を診断する方法、シヌクレイノパチー疾患の進行を監視する方法、ならびにシヌクレイノパチー疾患の治療を監視する方法は、国際出願第２００７／０１１９０７号にも説明される。同様に、αシヌクレインのための抗体ベースの検出方法は、国際出願第ＷＯ９９／５０３００号、ＷＯ２００５／０４７８６０号、ＷＯ２００７／０２１２５５号、およびＷＯ２００８／１０３４７２号に説明され、本開示の全ての内容は参照により本明細書に組み込まれる。それらの方法は、説明されたように適用されるが、本発明のαシヌクレイン特異的抗体、結合フラグメント、誘導体、または変異体を用いる。
【０２１３】
これらおよび他の実施形態は、本発明の記述および実施例によって開示され、包含される。本発明に従って、採用される任意の１つの材料、使用、化合物に関するさらなる文献は、公開ライブラリ、および例えば、電子機器を使用してデータベースから回収し得る。例えば、公開データベース「Ｍｅｄｌｉｎｅ」は、利用され得、それは国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）および／または国立保健研究機構（Ｎａｔｉｏｎａｌ
Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）の国立医学図書館（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）により主催される。欧州分子生物学研究所（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）（ＥＭＢＬ）の一部である欧州バイオインフォマティクス研究所（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）（ＥＢＩ）等のもののようなさらなるデータベースおよびウェブアドレスは、当業者に既知であり、またインターネットの検索エンジンを使用して取得可能である。遡及的な探究および現状の認識のため有用な生物工学での特許情報の概要および関連する特許情報の供給源に関する調査は、Ｂｅｒｋｓ，ＴＩＢＴＥＣＨ  １２（１９９４），３５２−３６４に与えられる。
【０２１４】
上記の開示は、一般的に本発明を説明する。示されない限り、本明細書で使用される用語は、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９７，ｒｅｖｉｓｅｄ  ２０００  ａｎｄ  ｒｅｐｒｉｎｔｅｄ  ２００３，ＩＳＢＮ  ０  １９  ８５０６７３  ２．で提供されるように定義する。全ての書誌の引用は、請求項の直前の明細書の終わりで見られる。全ての参考文献に示される内容（公開された特許、本出願を通して示された公表された特許出願、および製造者の仕様書、説明書を含む）は、参照により、明確に組み込まれるが、示されるいかなる文書は、真に本発明に関する従来技術であるということは認められない。
【０２１５】
より完全な理解は、図示するためのみに本明細書で提供され、本発明の範囲を制限することがない以下の特定の実施例への参照により得られる。
【実施例】
【０２１６】
以下の実施例は、本発明をさらに解説するが、いずれにおいても本発明の範囲を制限するためではない。実施例１および２の以下の実験は、クローン化した際のＮＩ‐２０２．３Ｇ１２、ＮＩ‐２０２．１２Ｆ４、およびＮＩ２０２．３Ｄ８に関して図示し、説明し、すなわち、まさにフレームワーク１Ｉｇ可変領域のＮ末端でプライマー誘発変異を有し、ヒト可変重鎖および軽鎖の生殖系列（ＧＬ）に対する適合はされておらず、図１を参照されたい。しかしながら、ＮＩ‐２０２の他の抗体系は、特に、適応されたＧＬ配列を有する抗体系は、構造的に同様であり、したがって比較可能な結果を提供することを想定し得る。これらの抗体は、ヒトＩｇＧ分子として発現した。実施例３および４の実験は、ヒト可変重鎖および軽鎖の生殖系列（ＧＬ）に適応されたＩｇ可変領域のＮ末端でプライマー誘発変異を有する抗体ＮＩ２０２．１２Ｆ４に関して、図示し、説明する、図１を参照されたい。本抗体は、マウス抗ヒト免疫反応をマウス誘発することなく、遺伝子導入マウスモデルでの長期間の研究を可能にするため、適応したヒト可変ドメインがＩｇＧ２ａ定常領域に融合された、キメラ分子として発現した。
【０２１７】
材料および方法
本明細書で採用されたもの等の従来の方法の詳細な記述は、示された文献で見られ得る。下記に示されない限り、それらの組換え発現および機能的特徴付けならびに関心の特異性を表示するαシヌクレイン特異的Ｂ細胞およびαシヌクレイン抗体の分子クローニングの特定は、第ＷＯ２００８／０８１００８号として公開されたＥｘａｍｐｌｅ  ａｎｄ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｓｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ＰＣＴ／ＥＰ２００８／００００５３に説明され、それらの開示の内容は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。
【０２１８】
抗原の精製
組換えＨｉｓ‐αシヌクレインは、大腸菌内での組換え発現、およびその後の、熱誘発沈殿、ニッケル親和性クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、および分子ふるいクロマトグラフィーを使用しての精製によって取得した。
【０２１９】
例えば、Ｔ７プロモーターの制御下でαシヌクレインをコードするｃＤＮＡを含むＤＮＡコンストラクトは、ＢＬ２１（ＤＥ３）等の適切な大腸菌株を形質転換するために使用し、２００ｍｌ細胞培養の発現は、イソプロピルβ‐Ｄ‐チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の付加によって誘発した。細胞は、３７℃で誘導し４時間後に採集し、次に２０ｍｌ、５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８の１５０ｍＭのＮａＣｌ、で再懸濁し、その後超音波処理を行った。１５分間煮沸した後、耐熱性の１７０００ｇの上清を収集した。同様に、偽の大腸菌からの耐熱性の１７０００ｇの上清を収集した。Ｈｉｓでタグをつけたαシヌクレインを発現する大腸菌からの耐熱性の１７０００ｇの上清を５０ｍＭのＴｒｉｓ、３００ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのイミダゾール、ｐＨ８に調整した後、ＨｉｓＴｒａｐ  ＨＰ  １ｍｌ（ＧＥ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）カラムに添加し、ＨＩＳ‐αシヌクレインは、３０〜５００ｍＭのイミダゾール勾配で溶出した。ＨＩＳ‐αシヌクレインを含有する分画は、プールし、次にｐＨ８の５０ｍＭのＴｒｉｓで１：１０に希釈した。希釈し、プールした分画を、ＨｉＴｒａｐ  Ｑ  ＨＰ  １ｍｌ（ＧＥ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）カラムに加え、結合したタンパク質は、３０〜１０００ｍＭのＮａｃｌ勾配で溶出した。最後に、ＨＩＳ‐αシヌクレインを含有する溶出物を、高性能のゲル濾過（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  １０／３００ＧＬ）を使用してさらに精製した。この精製手順は、ＳＤＳ‐ＰＡＧＥおよびクーマシー染色により推定されたように約９９％の純度でＨＩＳ‐αシヌクレインを産生した。精製したタンパク質の濃度は、ＢＣＡアッセイを使用して決定した（Ｐｉｅｒｃｅ）。
【０２２０】
αシヌクレイン抗体スクリーニング
９６  ｗｅｌｌ  ｈａｌｆ  ａｒｅａ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅｓ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）は、４℃で一晩、被覆する緩衝液（ｐＨ９．６のＰＢＳ）中で２μｇ／ｍｌの標準濃度で、精製ＨＩＳ‐αシヌクレインまたはαシヌクレイン（ｒペプチド）で被覆した。プレートは、ｐＨ７．６のＰＢＳ‐Ｔで洗浄し、非特異結合は、１時間、２％のＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ，  Ｂｕｃｈｓ，  Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を含有するＰＢＳ‐Ｔを用いて、室温で遮断した。Ｂ細胞条件培地を、１時間、室温で１％のＢＳＡ中で１０％の耐熱性大腸菌タンパク質を用いて事前吸収した。この事前吸収ステップは、いくつかの以前のＥＬＩＳＡスクリーニングの試みがヒトαシヌクレイン特異抗体を特定することに失敗した後で開発された。したがって、幸いにも、耐熱性大腸菌タンパク質を用いるＥＬＩＳＡプレートの事前吸収は、精製された組換えαシヌクレイン試料に存在する可能性のある粘着性の抗体および大腸菌タンパク質に向けられる抗体の混入等の偽陽性の的中のスクリーニングを除外することが判明した。事前吸収した培地は、次に記憶Ｂ細胞培養プレートからＥＬＩＳＡプレートに移され、２時間室温でインキュベートした。ＥＬＩＳＡプレートは、ＰＢＳ‐Ｔで洗浄し、次に西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）で抱合したロバ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃγフラグメント特異性）ポリクローナル抗体でインキュベートした。ＰＢＳ‐Ｔで洗浄した後、ヒト抗体の結合は、標準の比色アッセイによるＨＲＰの測定により決定した。
【０２２１】
αシヌクレイン抗体の分子クローン化
記憶Ｂ細胞を含有する試料は、６０歳を上回る志願者から取得した。全ての志願者には、共通してパーキンソン症のいずれの兆候も見られなかった。選択した記憶Ｂ細胞の生Ｂ細胞を採集し、ｍＲＮＡを調製した。免疫グロブリンの重鎖および軽鎖配列は、次に５’プライマーのような全てのヒト可変重鎖および軽鎖ファミリーに対するＩｇ‐フレームワーク１特異的プライマーと、３’プライマーのような全てのヒトＪセグメント（重およびカッパ軽鎖）およびＣセグメント（ラムダ軽鎖）に対して特異的なプライマーとの組み合わせを使用して取得した（Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２（１９９１），５８１−５９７、ｄｅ  Ｈａａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６（１９９９），１８２１８−１８２３０）。
【０２２２】
所望の特異性を有する抗体クローンの特定は、完全抗体の組換え発現においてＥＬＩＳＡを再スクリーニングすることで実施する。完全ヒトＩｇＧ１抗体またはキメラＩｇＧ２ａ抗体の組換え発現は、「正しい読み枠内」の可変重鎖および軽鎖配列を、適切な定常ドメインをコードする配列を伴って、５’末端および３’末端で、リーダーペプチドをコードする配列を有する可変領域配列を補完する発現ベクターへ挿入することで達成する。そのために、プライマーには、可変重鎖および軽鎖配列の抗体発現ベクターへのクローン化が促進されるように設計された制限部位を含有させた。重鎖免疫グロブリンは、免疫グロブリン重鎖ＲＴ‐ＰＣＲ産物を、シグナルペプチドおよびヒト免疫グロブリンガンマ１またはマウス免疫グロブリンガンマ２ａの定常ドメインを有する重鎖発現ベクターへ枠内で挿入することによって発現させる。カッパ軽鎖免疫グロブリンは、ＮＩ‐２０２．３Ｄ８のカッパ軽鎖ＲＴ‐ＰＣＲ産物を、シグナルペプチドおよびヒトカッパ軽鎖免疫グロブリンの定常ドメインを提供する軽鎖発現ベクターへ枠内で挿入することによって発現させる。ＮＩ‐２０２．１２Ｆ４およびＮＩ‐２０２．３Ｇ１２のラムダ軽鎖免疫グロブリンは、ラムダ軽鎖ＲＴ‐ＰＣＲ産物を、シグナルペプチドおよびヒトまたはマウスラムダ軽鎖免疫グロブリンの定常ドメインを提供するラムダ軽鎖発現ベクターに枠内で挿入することによって発現させる。
【０２２３】
機能的組換えモノクローナル抗体は、Ｉｇ重鎖発現ベクターおよびカッパまたはラムダＩｇ軽鎖発現ベクターのＨＥＫ２９３またはＣＨＯ細胞（またはヒトまたはマウス起源の任意の他の適切なレシピエント細胞株）への同時トランスフェクションによって得る。組換えヒトモノクローナル抗体は、その後標準タンパク質Ａカラム精製を使用して条件培地から精製する。組換えヒトモノクローナル抗体は、一過性または安定性のいずれか一方のトランスフェクトした細胞を使用して制限のない数量で産生し得る。細胞株化した産生組換えヒトモノクローナル抗体は、Ｉｇ発現ベクターを直接的に使用するか、またはＩｇ可変領域を異なる発現ベクターに再クローン化のいずれかによって確立することができる。Ｆ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ）２、およびｓｃＦＶ等の誘導体もこれらのＩｇ可変領域から産生し得る。
【０２２４】
抗体
ウサギポリクローナル汎シヌクレイン抗体（Ａｂｃａｍ）、マウスモノクローナルＬＢ５０９αシヌクレイン特異的抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、抗体Ｓｙｎ２１１（Ｓｉｇｍａ）およびＣｌｏｎｅ４２（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）は、製造者のプロトコルに従って使用した。組換えヒトαシヌクレイン抗体ＮＩ２０２．３Ｇ１２、ＮＩ２０２．１２Ｆ４、およびＮＩ‐２０２．３Ｄ８はこの発明の抗体である。それらは、ＨＥＫ２９３またはＣＨＯ細胞で発現し、次に調整した培地は示されない限り、その後の処理に直接使用した。実施例３から５では、本発明の精製した組換え抗体を使用した。
【０２２５】
直接ＥＬＩＳＡ
抗原は、指示濃度で、ｐＨ９．６のＰＢＳ中で、９６  ｗｅｌｌ  ｈａｌｆ  ａｒｅａ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅｓ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）上で４℃で一晩被覆した。プレートは、ｐＨ７．６のＰＢＳ‐Ｔで洗浄し、非特異結合部位は、２％のＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）を含有するＰＢＳ‐Ｔを用いて、室温で１時間遮断した。プローブ（一次抗体）を次にウェルへ移し、室温で２時間インキュベートした。ｐＨ７．６のＰＢＳ‐Ｔで洗浄した後、ウェルは、次に西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）で抱合したポリクローナル抗ヒト（組換えヒト抗体のため）、抗ウサギ（汎シヌクレイン抗体のため）または抗マウス（ＬＢ５０９またはＳｙｎ２１１）二次抗体で、室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳ‐Ｔで厳密に洗浄した後、プローブの結合を、３，３’，５，５‐テトラメチルビフェニル‐４，４’‐ジアミン（Ｓｉｇｍａ）を発色基質として使用して、標準の比色アッセイでのＨＲＰの活性の測定によって判定した。
【０２２６】
ウエスタンブロット法およびクーマシータンパク質染色
ヒトおよびマウスαシヌクレインへの結合を評価するため、凍結した野生型またはαシヌクレイン遺伝子導入マウスの脳をＰＢＳ中（１０ｍｌ／ｇ湿重量）で、加圧型細胞破砕装置を使用して均質化した。抽出物は、１００’０００ｇでスピンし、上清は可溶性分画とした。可溶性分画または組換えタンパク質（７５０ｎｇ）は、添加する色素と混合し、６５℃で１０分間熱し、０．７５μｇをレーンごとに添加し、４〜２０％のＴｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離した。ゲルは、０．０２５％のクーマシーブリリアントブルーＲ２５０（Ｆｌｕｋａ）溶液で染色するか、またはニトロセルロース転写膜へエレクトロブロットした。ブロットは次に一次抗体で２時間インキュベートした。一次抗体の結合を、ＨＲＰに抱合した二次抗ヒト抗体を使用して示した。ブロットをＥＣＬプラスウエスタンブロット検出試薬（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して発色させた。
【０２２７】
αシヌクレインモノマーおよび凝集体への結合を評価するため、脳抽出物を、０．５％のトリトンＸ１００を含有するＰＢＳ中で調製し、次に５分間、１０００ｇで遠心分離した。上清は４〜１２％のＢｉｓ−Ｔｒｉｓ  ＮｕＰＡＧＥゲル電気泳動によって分離し、ＷＢで分析した。
【０２２８】
ポール試験
マウスを、それらが最も活発な暗期の始まりに試験する。ポールは、登ることを促進するため布で被服し、長さ５０ｃｍで幅１ｃｍの木で作る。マウスの檻にポールの基礎を設置する。マウスは、ポールの頂点に配置し、下へ向かうための時間、檻へ下るための時間は、３０分間隔で５回を上回る回数の試行を記録する。最高成績の試行を分析する。
【０２２９】
高架式十字迷路試験
マウスは、それらが最も活発な暗記の始まりに試験する。試験は、薄暗い明かり（４０ｌｕｘ）で実施する。高架式十字迷路試験は、２つの壁のないアームおよび２つの壁の付いたアームからなる。（アームの長さ：３０ｃｍ、幅：５ｃｍ）。壁のないアームは小さい１ｃｍの端を有し、壁の付いたアームは、１５ｃｍの壁によって仕切られている。任務の始めに、マウスを壁のないアームに対面する高架式十字迷路の中心に配置する。マウスは、迷路を探索している間、５分間ビデオで追跡する。壁のないアームおよび壁の付いたアームで過ごした時間、ならびに動いた距離は測定し、分析する。
【０２３０】
遺伝子導入マウス
Ｂ６；Ｃ３−Ｔｇ（Ｐｒｎｐ−ＳＮＣＡ＊Ａ５３Ｔ）８３Ｖｌｅ／Ｊ（Ｇｉａｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ．  ３４（２００２），５２１‐５３３）遺伝子導入αシヌクレインマウスおよび対応する野生型マウスは、１２時間ずつ明／暗の周期を反転し、餌および水の場所へ自由に行けるように、標準の小屋の条件下で維持した。治療群の年齢および性別はバランスよく調整した。
【０２３１】
マウス血漿中のＮＩ‐２０２．１２Ｆ４およびαシヌクレインレベルの決定
ＮＩ‐２０２．１２Ｆ４の血漿レベルを、基準として既知の濃度の組換えＮＩ‐２０２．１２Ｆ４を使用する直接型αシヌクレインＥＬＩＳＡを用いて決定した。血漿中のヒトαシヌクレインレベルの決定のため、サンドイッチＥＬＩＳＡを適用した（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）。
【０２３２】
実施例１：異なるエピトープ特異性を有するヒトαシヌクレイン特異抗体の特定
αシヌクレインは、３つのドメインからなる１４０アミノ酸（ａａ）長の天然変性タンパク質である。これらは、Ｎ末端両親媒性反復領域（１〜６０ａａ）、中心領域は（６１〜９５ａａ）、および酸性のＣ末端領域（９６〜１４０）である。組換えヒトαシヌクレイン抗体のさらなる特異性を理解するため、認識配列を含有するαシヌクレインのドメインを決定した。αシヌクレイン切り詰め型である１〜６０ａａ、１〜９５ａａ、６１〜１４０ａａ、および９６〜１４０ａａを、ＥＬＩＳＡプレート上で同等の濃度で被覆し、組換えヒトαシヌクレイン自己抗体ＮＩ‐２０２．３Ｇ１２およびＮＩ２０２．１２Ｆ４は、次にこれらの切り詰め方に結合するためにプローブした。
【０２３３】
興味深いことに、ＮＩ‐２０２．３Ｇ１２は、被覆した全長のαシヌクレインのみ結合し、４つの試験した切り詰め型（図２Ａ）のいずれにも結合しない。これは、ＮＩ‐２０２．３Ｇ１２の認識エピトープは、線状一次認識配列というよりむしろ構造モチーフであるということを示す。
【０２３４】
一方で、ＮＩ‐２０２．１２Ｆ４は、ａａ１〜６０を含む（図２Ｂ）αシヌクレインフラグメントに結合するが、アミノ酸番号６１〜１４０または番号９６〜１４０を含むＮ末端を切り詰めたフラグメントに結合しない。これはエピトープがＮ末端内に局在するということを示す。特に、選択的に病的封入物でαシヌクレインに結合するマウスモノクローナル抗体の特徴付けは、まさにＮ末端部分内にそれらのエピトープがあることを示した（Ｗａｘｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．１１６（２００８），３７−４６）。
【０２３５】
加えて、抗体ＮＩ‐２０２．３Ｄ８を用いて実施した直接ＥＬＩＳＡアッセイの予備結果は、ＮＩ‐２０２．３Ｄ８がαシヌクレインのＣ末端、特にアミノ酸９６〜１４０を特異的に認識することを示した。Ｃ末端ドメイン内の鍵となるアミノ酸１２５〜１４０の欠失は、αシヌクレイン凝集を大きく変化させ、レビー小体疾病（ＬＢＤ）を伴う認知症を有する患者の脳、ならびに遺伝子導入動物モデルにおいて、Ｃ末端αシヌクレインフラグメントの蓄積が大量に存在する。これらの研究は、Ｃ末端領域を認識する能力がある抗体は、潜在的な治療的効果を有することを示し、Ｍａｓｌｉａｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｅｕｒｏｎ，  ４６（２００５），８５７-８６８を参照されたい。
【０２３６】
ＥＬＩＳＡプレート上で効率的に被覆しない切り詰め型を含むＣ末端αシヌクレインを除外するため、マウスモノクローナルアルファシヌクレイン抗体ＬＢ５０９のエピトープマッッピング（Ｂａｂａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５２（１９９８），８７９-８８４）を実施した。ＬＢ５０９は、Ｃ末端エピトープに結合する（Ｊａｋｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２６９（１９９９），  １３−１６）。図２Ｃで示すように、この研究は、ＬＢ５０９のＣ末端エピトープを確認し、したがって、Ｃ末端αシヌクレインフラグメントの効率的な被覆を確認する。結果として、本発明に従って実施した実験における組換えヒトαシヌクレイン抗体のエピトープマッピングは、これらの抗体は、Ｎ末端およびＣ末端で、立体構造エピトープおよび潜在的な病的構造を含む異なるエピトープに対して方向付けられる、ということを示す。
【０２３７】
実施例２：ヒト抗体は、αシヌクレインに対して特異的である
αシヌクレイン、βシヌクレイン、およびγシヌクレインは、神経系、骨格筋、および心臓で主に発現する高度な相同体のタンパク質である。しかしながら、βシヌクレインがαシヌクレイン凝集の阻害剤であることを示す一方で異常なαシヌクレインのみがＣＮＳ疾病の広域スペクトルに連結し、αシヌクレインの神経毒性効果から中枢神経系を保護し得る。したがって病的αシヌクレイン変異体に対する（治療）抗体は、βおよびγシヌクレインに優先的に交差反応しない。特異性および組換えヒト抗αシヌクレイン抗体の潜在的な治療的使用を支持するため、候補抗体は、直接ＥＬＩＳＡアッセイで、ウエスタンブロット法（ＷＢ）によりαシヌクレイン、βシヌクレイン、およびγシヌクレイン結合に対してプローブした。始めに、組換えα、βおよびγシヌクレインは、同等の被覆濃度（２μｇ／ｍｌ）で、ＥＬＩＳＡプレート上で被覆し、次に、汎シヌクレイン対照抗体または組換えヒトαシヌクレイン抗体のどちらか一方でインキュベートした。汎シヌクレイン抗体は、ＥＬＩＳＡプレート上で被覆した全ての３つのシヌクレインタンパク質に反応した（図３Ａ）。次に、組換えヒトαシヌクレイン抗体は特異的αシヌクレイン結合に対して、プローブした。ＮＩ‐２０２．３ｇ１２およびＮＩ‐２０２．１２Ｆ４の双方は、被覆したαシヌクレインに反応するが、βおよびγシヌクレインに反応しない（図３Ａおよび３Ｂ）。
【０２３８】
同様に、組換え抗体の特異性もＷＢ分析を使用して調査した。クーマシータンパク質染色は、同等の濃度の３つの全てのシヌクレインタンパク質が、ＳＤＳＰＡＧＥ分析（図４Ａ）に加えられたことを確認する。一次抗体なしで、シグナルが検出されなかったのに対し（図４Ｃ）、ＷＢ分析は、次にＮＩ２０２．１２Ｆ４が、選択的にαシヌクレインに結合する（図４Ｂ）ということを示した。ＷＢ上でのαシヌクレインへのＮＩ２０２．３Ｇ１２結合は、検出されなかった。これは、ＮＩ２０２．３Ｇ１２の線状認識配列というよりむしろ構造的エピトープに一致する。これらの調査結果は、本発明で説明される組換えヒトアルファシヌクレイン抗体が、高い特異性であり得ることを実証する。
【０２３９】
その後の実験の全ては、ＮＩ２０２．１２Ｆ４マウスキメラ抗体で実施した。
【０２４０】
実施例３：抗体ＮＩ２０２．１２Ｆ４の結合特異性
凝集αシヌクレイン種への優先度を有するヒトαシヌクレインへの特異結合
ヒトおよびマウスαシヌクレインへのＮＩ２０２．１２Ｆ４の結合を評価するため、脳抽出物を野生型およびαシヌクレインＡ５３Ｔ遺伝子導入マウスから調製し、抗体結合は、ウエスタンブロット法で分析した。ＮＩ２０２．１２Ｆ４は、そのようなバンドが、実質的に野生型マウスからの脳抽出物に存在しないの（図５Ａ）に対して、ヒトＡ５３Ｔαシヌクレイン遺伝子導入マウスからの脳抽出物でαシヌクレインに対応する顕著なバンドを検出し、このことは、マウスではなくヒトαシヌクレインへの特異結合を示している。同様の結果は、商業的に入手可能なヒトαシヌクレインに対して特異的なエピトープに対して方向付けられるＬＢ５０９抗体（Ｊａｋｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２６９（１９９９），  １３−１６）で得られた。対照的に、商業的に入手可能な、双方の種のαシヌクレインに結合すると報告された抗体クローン４２（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｐｕｔｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０（２０００），６０２１−６０２９）を、ヒトならびにマウスαシヌクレインタンパク質で検出した。これらの資料はＮＩ‐２０２‐１２Ｆ４が優先的にヒトαシヌクレインに結合するということを示す。
【０２４１】
ヒトαシヌクレインの生理型ならびに病的凝集体へのＮＩ２０２．１２Ｆ４の結合を評価するため、健常対照対象およびレビー小体を伴う認知症（ＤＬＢ）患者からの皮質脳抽出物、ならびに野生型マウスおよびヒトＡ３０Ｐαシヌクレイン遺伝子導入マウスの脳からの抽出物（Ｋａｈｌｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０（２０００），６３６５−７３）を調製し、ＳＤＳゲル電気泳動で分離し、ウエスタンブロット法で分析した。ＮＩ２０２．１２Ｆ４は、高感度で、ＤＬＢおよびＡ３０Ｐαシヌクレイン遺伝子導入脳抽出物で、顕著なスメアを反映するオリゴマーおよびαシヌクレイン凝集体原線維型を検出したが、健常対照および野生型対照の抽出物では検出しなかった（図５Ｂ）。対照的に、最小の結合が、ヒトまたは野生型マウス組織でαシヌクレインのモノマー型に対して観察され、αシヌクレインタンパク質を過剰発現するＡ３０Ｐαシヌクレイン遺伝子導入脳抽出物での中度の結合が観察された。対照的に、クローン４２抗体は、ウエスタンブロット分析で、モノマー型およびαシヌクレインフラグメントを高感度で検出し、凝集したαシヌクレイン種に不十分に結合しながら、対照的な結合様式を示した。これらの結果はＮ２０２．１２Ｆ４が生理学的αシヌクレインモノマーよりも優先的にオリゴマーおよび原線維等のαシヌクレインの病的凝集体に結合することを示す。
【０２４２】
ＮＩ‐２０２．１２Ｆ４は、ヒトアルファシヌクレインの野生型および疾病を引き起こす変異体に高親和性で結合する。
【０２４３】
野生型、ならびに疾病を引き起こすヒトαシヌクレイン変異体の最大半量の有効濃度（ＥＣ５０）を、直接αシヌクレインＥＬＩＳＡを使用して決定した。高親和性結合は、野生型ならびにヒトαシヌクレインのＡ３０Ｐ、Ｅ４６Ｋ、およびＡ５３Ｔの変異体型において観察された（図６）。
【０２４４】
組換えＮＩ‐２０２．１２Ｆ４は、脳で優先的に、αシヌクレインの病的型に結合する。
【０２４５】
αシヌクレインへのＮＩ‐２０２．１２Ｆ４の結合はシヌクレイン遺伝子導入マウスおよび神経病理学的にパーキンソン病またはレビー小体を伴う認知症が確認された患者からの脳切片の免疫組織化学染色にさらに特徴付けられた。ＮＩ‐２０２．１２Ｆ４は、ヒトＡ５３Ｔ（図７Ａ）またはＡ３０Ｐαシヌクレイン（図７Ｂ）のどちらか一方を発現する遺伝子導入マウスからの浮遊切片、ならびにパーキンソン病およびレビー小体を伴う認知症のヒト脳組織（図７Ｃ、Ｄ）での、レビー小体およびレビー神経突起様封入物、ならびに小さい細胞体樹状突起およびシナプス性αシヌクレイン蓄積を含む、αシヌクレイン病態の顕著な染色を示す。高感度で生理学的シナプス性αシヌクレインも検出する商業的に入手可能なＳｙｎ２１１抗体（Ｇｉａｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．５９（２０００），５２８−３３）（図７Ｅ）と対照的に、ＮＩ‐２０２．１２Ｆ４は、ヒトＡ３０Ｐαシヌクレイン遺伝子導入マウス免疫組織化学染色（図７Ｂ）によって例証されるように、αシヌクレインの病的凝集体に優先的に結合する。ＮＩ‐２０２．１２Ｆ４の結合は、野生型マウス（図７Ｆ）の脳切片に実質的に存在せず、これは二次抗体のみの対照染色（図７Ｇ）と同等であり、このことから、ウエスタンブロット分析で観察された（図５）ように、ヒト対マウスαシヌクレインへの優先的な結合が確認される。対照的に、ヒト、ならびにマウス起源のαシヌクレインの結合を報告した商業的に入手可能なクローン４２抗体（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｐｕｔｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０（２０００），６０２１−６０２９）は、野生型マウスの脳切片でマウスαシヌクレインタンパク質の顕著なシナプス染色を示した（図７Ｈ）。
【０２４６】
ＮＩ‐２０２．１２Ｆ４は、立体構造エピトープを示す、高い被覆濃度でのヒトαシヌクレインへの優先的な結合を示す。
【０２４７】
抗体の力価を示している最大半量の有効濃度（ＥＣ５０）は、直接αシヌクレインＥＬＩＳＡを使用して、組換えαシヌクレインの低いおよび高い被覆濃度のために決定した。約１００ｐＭのＥＣ５０を用いた組換えＮＩ‐２０２．１２Ｆ４の高親和性結合を、αシヌクレインタンパク質（２０μｇ／ｍｌ）の高い被覆密度のため観察した。αシヌクレインの低めの被覆濃度で、１００倍に近いＥＣ５０の増加に対応する、親和性の急落を観察した（図８Ａ）。対照的に、シヌクレインＣ末端内の線状エピトープに対して方向付けられる商業的に入手可能なＳｙｎ２１１抗体（Ｇｉａｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．５９（２０００），５２８−３３）は、アルファシヌクレインの低い被覆密度で、結合親和性に減少を示さなかった（図８Ｂ）。これらの結果は、ＮＩ‐２０２．１２Ｆ４は、優先的に高い濃度のαシヌクレインで形成されるαシヌクレインの構造的なエピトープを狙いとすることを示唆している。結果は、αシヌクレイン原線維またはオリゴマー等のαシヌクレイン凝集体の病的構造に対する優先度を示すＮＩ‐２０２．１２Ｆ４の免疫組織化学の結合特性と一致している。全長αシヌクレインにおいて観察されたように、切り詰め型αシヌクレイン番号１〜６０に結合するＮＩ‐２０２．１２Ｆ４は、同等の被覆濃度への依存を示し、このことは、αシヌクレインタンパク質のアミノ酸番号１〜６０に含有される立体構造エピトープを指し示す（図８Ｃ）。しかしながら、αシヌクレインの６０〜１４０のアミノ酸は、Ｎ末端エピトープの形成に影響を与え得るということを排除してはならない。特に、Ａ５３Ｔ変異体を含有する番号１〜６０のヒトαシヌクレインは、マウスαシヌクレインのＮ末端と１００％同一である。したがって、マウスオルソログに対するヒトαシヌクレインの観察された優先度は、Ｎ末端で好ましいＮＩ‐２０２．１２Ｆ４のエピトープの到達性または形成におけるシヌクレインのＣ末端の影響によるものであり得る。小さめのαシヌクレインのＮ末端に由来するフラグメント（アミノ酸番号１〜２０、番号２１〜４０、番号４１〜６０、番号１１〜３０、番号３１〜５０）を用いたエピトープマッピッング研究は、いずれのペプチドへのＮＩ‐２０２．１２Ｆ４抗体の結合もなかったことを明らかにしており、このことは、これらの領域はＮＩ‐２０２．１２Ｆ４の結合に十分ではないことを示唆している（図８Ｄ）。
【０２４８】
実施例４：アルファシヌクレインに対する組換えヒト由来抗体は、パーキンソン病の遺伝子導入マウスモデルの運動能力および高架十字迷路行動を改善する。
【０２４９】
ＮＩ‐２０２．１２Ｆ４治療の薬理学的有効性を評価するため、年齢１０．５ヶ月のヒトＡ５３Ｔαシヌクレイン導入遺伝子（Ｇｉａｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｅｕｒｏｎ
３４（２００２），  ５２１−５３３）を過剰発現する遺伝子導入マウスを、５ｍｇ／ｋｇの組換えキメラＮＩ‐２０２．１２Ｆ４抗体または媒体の隔週の腹腔内投与で、合計４ヶ月間治療した。治療の２ヶ月後、ポール試験で、運動能力を評価した。ＮＩ‐２０２．１２Ｆ４で治療したマウスは、図９で示されるように、ポール上で下向きになる時間（Ｔｔｕｒｎ、ｐ＜０．００１、ｎ＝１７〜１９動物／群）ならびに檻へ降りるまでの合計時間（Ｔｔｏｔａｌ、ｐ＜０．０５、ｎ＝１７〜１９動物／群）が著しく減少し、媒体で治療した群と比較して著しい運動能力の改善を示した。二次の行動試験では、高架十字迷路動作に有効である治療を分析した。αシヌクレインＡ５３Ｔ遺伝子導入マウスは、野生型対照と比較して壁のないアームでより時間を過ごし、低下した高架十字迷路行動を示すと過去に報告された（Ｇｅｏｒｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．，２１０（２００８），７８８−９２）。図１０で示されるように、ＮＩ‐２０２．１２Ｆ４による慢性治療は、αシヌクレインＡ５３Ｔ遺伝子導入動物における高架十字迷路行動で、著しい改善へ導いた。抗体で治療したマウスは、双方の群の活動レベルは一致していたが、媒体で治療した動物（ｐ＜０．０５、ｎ＝１７〜１９動物／群）と比較して、壁のないアームで著しく少ない時間を過ごし、著しく短い距離を動いた。これらの結果は、ＮＩ‐２０２．１２Ｆ４を用いた慢性治療が、運動能力の著しい改善を導き、パーキンソン病のαシヌクレイン遺伝子導入マウスモデルの異常な高架十字迷路行動を更正するということを実証した。
【０２５０】
実施例５：ＮＩ‐２０２．１２Ｆ４抗体は、パーキンソン病のシヌクレイン遺伝子導入マウスモデルで血漿シヌクレインレベルを増加させる。
【０２５１】
年齢１０．５ヶ月の遺伝子導入Ａ５３Ｔのαシヌクレイン遺伝子導入マウスを、を、５ｍｇ／ｋｇの組換えキメラＮＩ‐２０２．１２Ｆ４抗体またはＰＢＳの隔週の腹腔内投与で、合計２ヶ月間治療した。注射の２４時間後、血漿試料を調製し、治療抗体およびヒトαシヌクレイン血漿濃度を、ＥＬＩＳＡで決定した（図１１）。ヒトαシヌクレインの血漿レベルは媒体で治療した動物と比較して１０倍を超えて著しく増加し、ＮＩ‐２０２．１２Ｆ４での治療におけるαシヌクレインの薬理学的調節を実証した（２５±４．１ｎｇ／ｍｌのＮＩ‐２０２．１２Ｆ４治療群対１．９±１．２ｎｇ／ｍｌのＰＢＳ群、ｐ＝０．０００２）。同様の有効性が、Ａ３０Ｐのαシヌクレイン遺伝子導入マウスの急性抗体治療において観察された。Ａ５３ＴおよびＡ３０Ｐのαシヌクレイン遺伝子導入モデルのヒトαシヌクレインは主に脳で発現するため、ヒトαシヌクレインの循環における増加は、脳から末梢へのαシヌクレインのＮＩ‐２０２．１２Ｆ４で媒介した正味流束によるものであり得る。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図２】
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【図３】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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