(57)【要約】【課題】  本発明は、樹脂の分子量及び粒子径を均一に制御することができ、かつ、反応性基が粒子表面に均一に分布する樹脂粒子を製造することが可能な樹脂粒子の製造方法、該樹脂粒子の製造方法を用いた樹脂粒子、アフィニティー微粒子の製造方法及びタンパク質解析方法を提供することを目的とする。【解決手段】  α−ブロモカルボニル基を有するアレンモノマーを用いてリビング重合を行う工程を有する樹脂粒子の製造方法。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）に示すα−ブロモカルボニル基を有するアレンモノマーを用いてリビング重合を行う工程を有することを特徴とする樹脂粒子の製造方法。
【化１】
2014139534.tif 000011
式（１）中、Ｒ１及びＲ２は、水素原子又はアルキル基を示す。
【請求項２】
α−ブロモカルボニル基を有するアレンモノマーは、α−ブロモカルボニル基とアレニル基の間に、ポリオキシアルキレンユニットが介在することを特徴とする請求項１記載の樹脂粒子の製造方法。
【請求項３】
リビング重合を行う工程において、炭化水素系アレンモノマーを用いてリビング重合を行う工程と、α−ブロモカルボニル基を有するアレンモノマーを用いてリビング重合を行う工程とを連続的に行うことを特徴とする請求項１又は２記載の樹脂粒子の製造方法。
【請求項４】
リビング重合を行う工程において、更に架橋性アレンモノマーを添加することを特徴とする請求項１、２又は３記載の樹脂粒子の製造方法。
【請求項５】
貧溶媒中でリビング析出重合を行うことを特徴とする請求項１、２、３又は４記載の樹脂粒子の製造方法。
【請求項６】
架橋性アレンモノマーを含有するアレンモノマーを用いてリビング重合を行うことで架橋性樹脂コア粒子を作製する工程１を行った後、  
得られた架橋性樹脂コア粒子及びα−ブロモカルボニル基を有するアレンモノマーを用いてリビング重合を行い、前記架橋性樹脂コア粒子の表面にα−ブロモカルボニル基を有するポリマー層を形成する工程２を行う  
ことを特徴とする請求項１、２、３、４又は５記載の樹脂粒子の製造方法
【請求項７】
請求項１、２、３、４、５又は６記載の樹脂粒子の製造方法を用いて得られることを特徴とする樹脂粒子。
【請求項８】
重量平均分子量／数平均分子量で示される分子量分布が、１．５以下のポリマーからなることを特徴とする請求項７記載の樹脂粒子。
【請求項９】
請求項７又は８記載の樹脂粒子に、α−ブロモカルボニル基と反応するユニットと、生体活性ユニットとを有するリガンド化合物を担持させる工程を有することを特徴とするアフィニティー微粒子の製造方法。
【請求項１０】
リガンド化合物は、チオール基及び／又はアミノ基を有することを特徴とする請求項９記載のアフィニティー微粒子の製造方法。
【請求項１１】
リガンド化合物は、薬理作用を示す化合物、免疫調整作用を示す化合物、及び、免疫抑制作用を示す化合物からなる群より選択される少なくとも１種であることを特徴とする請求項９又は１０記載のアフィニティー微粒子の製造方法。
【請求項１２】
請求項９、１０又は１１記載のアフィニティー微粒子の製造方法を用いて得られるアフィニティー微粒子を使用して、リガンド化合物に対応する候補タンパク質を選別することを特徴とするタンパク質解析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、樹脂の分子量及び粒子径を均一に制御することができ、かつ、反応性基が粒子表面に均一に分布する樹脂粒子を製造することが可能な樹脂粒子の製造方法、該樹脂粒子の製造方法を用いた樹脂粒子、アフィニティー微粒子の製造方法及びタンパク質解析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリマー微粒子は、生物学、医療若しくは薬品分野におけるスクリーニングやデリバリーシステム、発光ダイオード（ＬＥＤ）、化粧品、装飾材料等の分野で注目されその利用が試みられている。近年は、アフィニティークロマトグラフィーの担体への応用や、医療における診断や薬物送達システム（ドラックデリバリーシステム、ＤＤＳ）などへの応用に対する関心が高まっている。
【０００３】
こうした応用のうち、アフィニティークロマトグラフィーの担体への応用は、ポリマー微粒子を担体とし、この担体にタンパク質などの生体分子と特異的に結合する物質であるリガンドを固定し、このリガンドの活性を利用して特定の生体分子を分離精製するものである。
例えば、特許文献１には、架橋されたグルコマンナン球状粒子に、アフィニティーリガンドを導入したアフィニティークロマトグラフィー用充填剤法が記載されている。
このような架橋グルコマンナン球状粒子を基材粒子として用いる場合は、アフィニティーリガンドを導入する際に活性化剤を用いる必要があるが、基材粒子に対する活性化剤の反応性を定量評価することができないため、リガンドの導入率を精緻に制御することは不可能であった。よって、非特異吸着を抑制し、目的物質のみ効率的に吸着させる方法として、充分なものとはいえなかった。
【０００４】
また、特許文献２には、共有結合によってポリマーリガンドがポリマー担体に結合されたクロマトグラフィーのための吸着剤材料が開示されている。
しかしながら、特許文献２の方法を用いた場合でも、ポリマーリガンドとポリマー担体との結合点を定量的に成業することは難しく、使用時の耐久性を向上できたとしても、非特異吸着を抑制し吸着効率を向上させることは困難であるという問題点があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特公平０７−０５８２８７号公報
【特許文献２】特開２０１２−０３２３９１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、樹脂の分子量及び粒子径を均一に制御することができ、かつ、反応性基が粒子表面に均一に分布する樹脂粒子を製造することが可能な樹脂粒子の製造方法、該樹脂粒子の製造方法を用いた樹脂粒子、アフィニティー微粒子の製造方法及びタンパク質解析方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、下記式（１）に示すα−ブロモカルボニル基を有するアレンモノマーを用いてリビング重合を行う工程を有する樹脂粒子の製造方法である。
【化１】
2014139534.tif 000002
式（１）中、Ｒ１及びＲ２は、水素原子又はアルキル基を示す。
以下に本発明を詳述する。
【０００８】
本発明者らは、鋭意検討の結果、α−ブロモカルボニル基を有するアレンモノマーを用いてリビング重合を行うことで樹脂粒子を作製することにより、樹脂の分子量及び粒子径を均一に制御することができ、かつ、反応性官能基（α−ブロモカルボニル基）が粒子表面に均一に分布する樹脂粒子が作製できることを見出した。
また、このような樹脂粒子を、アフィニティークロマトグラフィー（アフィニティー微粒子）の担体として使用した場合、得られるアフィニティー微粒子は、非特異吸着が少なく選択性の高いものとなることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００９】
本発明の樹脂粒子の製造方法は、α−ブロモカルボニル基を有するアレンモノマーを用いてリビング重合を行う工程を有する。
【００１０】
上記リビング重合とは、開始剤を起点とする重合反応が停止反応や連鎖移動反応などの副反応で妨げられることなく分子鎖が生長していく重合のことをいう。
特に、本発明では、上記リビング重合を析出重合で行う方法が好ましい。
本発明では、このようなリビング重合を用いることで、重合反応が同時に開始すれば分子量が均一な重合体を得ることができ、例えば析出重合を用いた場合、粒子核が発生するタイミングを揃えることができるので、分子量や樹脂組成が均一に規制された高分子鎖からなり粒子径が揃った樹脂粒子を得ることができる。
【００１１】
上記リビング重合としては、特に限定されず、例えば、リビングアニオン重合、リビングラジカル重合、リビングカチオン重合、リビング配位重合等を採用することができる。
なかでも、リビング配位重合が好ましい。
上記リビング配位重合を用いることで、水系媒体中での重合反応が可能となり、種々の反応性官能基を有するポリマーを得ることが可能となる。
【００１２】
上記リビング配位重合において使用する開始剤としては、例えば、π−アリルニッケル触媒をはじめとする各種遷移金属触媒が使用できる。
上記π−アリルニッケル触媒は、ハロゲン化アリル、アリルアセテート等のアリル化合物に、ビス（１，５−シクロオクタジエン）ニッケル（以下Ｎｉ（ＣＯＤ）２とする）等の有機ニッケル、トリフェニルフォスフィン、トリブチルフォスフィン、トリフェノキシフォスフィン、トリエトキシフォスフィン等のフォスフィンを添加して得られる。
【００１３】
上記リビング重合において使用する重合溶媒としては特に限定されず、例えば、ヘキサン、シクロヘキサン、オクタン、トルエン、キシレン等の非極性溶媒のほか、水、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、アセトン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、テトラヒドロフラン、ジオキサン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド等の高極性溶媒を用いることができる。これらの溶媒は、１種類又は２種類以上用いてもよい。これらの中では、水およびメタノール、エタノールを適宜混合して使用するのが好ましい。
また、重合温度は、反応速度の観点から０〜９０℃が好ましい。
【００１４】
更に、上記リビング重合においては、貧溶媒中でリビング析出重合を行うこと好ましい。このような方法を用いることで、粒子を構成する樹脂の分子量が揃っている特徴を生かしつつ、極めて粒子径分布の狭い樹脂粒子を得ることができる。
上記貧溶媒としては、使用するα−ブロモカルボニル基を有するアレンモノマーの種類よって異なるが、例えば、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、トルエン、キシレン等の比較的ＳＰ値の小さい溶媒が挙げられる。
【００１５】
上記リビング析出重合において使用する分散安定剤としては、例えば、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、メチルセルロース、エチルセルロース、ポリ（メタ）アクリル酸、ポリ（メタ）アクリル酸エステル、ポリエチレングリコール等が挙げられる。
【００１６】
上記リビング重合の具体的方法としては、例えば、窒素置換した重合容器に予め調製したπ−アリルニッケル触媒に溶媒、α−ブロモカルボニル基を有するアレンモノマーを添加し、室温で数時間攪拌する方法が挙げられる。
【００１７】
本発明では、リビング重合を行う工程において、α−ブロモカルボニル基を有するアレンモノマーを用いる。
本発明者らは、基材粒子上にリガンドを固定化する反応点を導入するための材料として、上記α−ブロモカルボニル基を有するアレンモノマーが非常に好適であることを見出した。すなわち、リガンドに用いられる生体活性物質は、概して熱や強酸・強アルカリ等の刺激により容易に構造変化を起こしてしまうため、リガンドを固定化する反応は温和な条件で進むことが要求され、その点でα−ブロモカルボニル基は好適な反応点となる。
【００１８】
上記式（１）に示すα−ブロモカルボニル基を有するアレンモノマーとしては、例えば、α−ブロモメチルカルボニルアレン、α−ブロモエチルカルボニルアレン、α−ブロモイソプロピルカルボニルアレン、Ｎ−アレニルα−ブロモメチルアミド等が挙げられる。
【００１９】
式（１）中のＲ１及びＲ２は、水素原子又はアルキル基を示す。なかでも、Ｒ１及びＲ２は、水素原子であることが好ましい。また、Ｒ１及びＲ２がアルキル基である場合、ブロモ基の反応性を損なわないためにも炭素数は３以下であることが好ましい。
【００２０】
上記α−ブロモカルボニル基を有するアレンモノマーは、１分子あたり２個以上のα−ブロモカルボニル基を有することが好ましい。このようにα−ブロモカルボニル基を複数有することで、少ないα−ブロモカルボニル基を有するアレンモノマーの導入量で粒子表面の反応性官能基の密度を上げることができる。
【００２１】
上記α−ブロモカルボニル基を有するアレンモノマーは、α−ブロモカルボニル基とアレニル基の間に、直鎖状に伸びる繰り返し分子ユニットが介在することが好ましい。このような直鎖状に伸びる繰り返し分子ユニットが介在することで、樹脂粒子の母体となる幹ポリマーと反応性官能基との間にスペースが生じることにより、アフィニティー微粒子の担体として使用した場合に、嵩高いリガンドとの結合反応を効率よく行うことができる。上記直鎖状に伸びる繰り返し分子ユニットとしては、例えば、直鎖状アルキル基やポリオキシアルキレンユニットが挙げられるが、分子鎖の回転自由度の高いポリオキシアルキレンユニットが好ましい。上記α−ブロモカルボニル基とアレニル基の間に介在するポリオキシアルキレンユニットとしては、長すぎては樹脂粒子上の反応基密度が減少してしまうため、ポリオキシエチレンユニット、ポリオキシプロピレンユニット、ポリオキシブチレンユニットが好ましく、ユニット数としては、１〜５が好ましい。
【００２２】
また、上記α−ブロモカルボニル基を有するアレンモノマーとしては、α−ブロモカルボニル基とアレニル基の間に、芳香環が介在するものや、アミド結合やエーテル結合を介在するものを用いることが好ましい。
【００２３】
上記α−ブロモカルボニル基を有するアレンモノマーを用いてリビング重合を行う工程では、上記α−ブロモカルボニル基を有するアレンモノマー以外に、炭化水素系アレンモノマーを加えてもよい。これにより、リビング析出重合において副反応が抑制され、安定して粒子径の揃った基材粒子を得ることができる。
【００２４】
上記炭化水素系アレンモノマーとしては、例えば、フェノキシアレン、メトキシアレン、エトキシアレン、プロピオキシアレン、ブトキシアレン、アレン（１，２−プロパジエン）、メチルアレン、エチルアレン、プロピルアレン、ブチルアレン、イソプロピルアレン、ヘキシルアレン、フェニルアレン、ベンジルアレン、ジメチルアレン、ジエチルアレン、ジヘキシルアレン、ジフェニルアレン、置換アルキルブタジニエルエーテル、アレン酸エステル、ポリオキシエチレンアレニルアルキルエーテル等が挙げられる。
上記フェノキシアレンとしては、例えば、フェノキシアレン、（４−ｔｅｒｔ−ブチルフェノキシ）アレン、（４−アセチルフェノキシ）アレン等が挙げられる。
【００２５】
上記α−ブロモカルボニル基を有するアレンモノマーを用いてリビング重合を行う工程では、上記α−ブロモカルボニル基を有するアレンモノマー以外に、更に架橋性アレンモノマーを添加してもよい。これにより、得られる樹脂粒子の機械的強度ならびに耐薬品性を向上させることができる。その結果、アフィニティー微粒子の担体として使用した場合に、プルダウンアッセイ時における樹脂粒子の崩壊を防止することができる。
【００２６】
上記架橋性アレンモノマーとしては、例えば、１，４−ジアレノキシベンゼン、１，４−ジアレニルベンゼン、ビスフェノールＡジアレニルエーテル（各種ビスフェノール系の化合物のジアレニルエーテルを含む）、その他にもジオール類および多官能アルコール（例えばポリウレタンやポリカーボナートの合成用の原料など）のアレニルエーテル類等が挙げられる。
【００２７】
上記α−ブロモカルボニル基を有するアレンモノマーの添加量は、使用モノマーの全量に対して好ましい下限は２ｍｏｌ％である。上記α−ブロモカルボニル基を有するアレンモノマーの添加量が２ｍｏｌ％未満であると樹脂粒子が生成しにくくなることがある。
上記α−ブロモカルボニル基を有するアレンモノマーの添加量のより好ましい下限は５ｍｏｌ％である。
【００２８】
上記α−ブロモカルボニル基を有するアレンモノマーを用いてリビング重合を行う工程の具体的な方法としては特に限定されないが、リビング重合を行う工程において、炭化水素系アレンモノマーを用いてリビング重合を行う工程と、α−ブロモカルボニル基を有するアレンモノマーを用いてリビング重合を行う工程とを連続的に行うことが好ましい。
これにより、例えば、アフィニティー微粒子の担体として使用した場合に、炭化水素の部分が非特異吸着を抑制し、選択性の高いものとすることができる。
【００２９】
本発明の樹脂粒子の製造方法としては、上記α−ブロモカルボニル基を有するアレンモノマーを用いてリビング重合を行う工程を有するものであれば、特に限定されないが、架橋性アレンモノマーを含有するアレンモノマーを用いてリビング重合を行うことで架橋性樹脂コア粒子を作製する工程１を行った後、得られた架橋性樹脂コア粒子及びα−ブロモカルボニル基を有するアレンモノマーを用いてリビング重合を行い、前記架橋性樹脂コア粒子の表面にα−ブロモカルボニル基を有するポリマー層を形成する工程２を行う方法を用いてもよい。
このような方法を用いることで、粒径制御を容易にできるという利点がある。また、反応性官能基を効率的に粒子表面に局在化させることが可能となる。
【００３０】
上記工程１では、架橋性アレンモノマーを含有するアレンモノマーを用いてリビング重合を行うことで架橋性樹脂コア粒子を作製する工程１を行う。これにより、特に重合後期に起こりやすい粒子間の架橋による凝集を抑制し、粒子径分布を狭くすることができるという利点がある。
なお、上記架橋性アレンモノマーとしては、上述したものを用いることができる。また、上記架橋性アレンモノマーに加えて、炭化水素系アレンモノマーを添加してもよい。
【００３１】
上記工程１では、必要に応じて官能基含有アレンモノマーを共重合させても良い。官能基含有アレンモノマーとしては、例えば、カルボキシメチルアレン、２−カルボキシエチルアレン、ジカルボキシルメチルアレン、２，２−ジカルボキシエチルアレン、アミノメチルアレン、２−アミノエチルアレン、シアノメチルアレン、２−シアノエチルアレン等が挙げられる。
【００３２】
上記架橋性樹脂コア粒子は、平均粒子径の好ましい下限が０．００１μｍ、好ましい上限が１０００μｍである。平均粒子径が０．００１μｍ未満であると、コア粒子表面上に水α−ブロモカルボニル基を有するポリマー層を均質に形成できないことがある。平均粒子径が１０００μｍを超えると、重合中に粒子が凝集することがある。上記平均粒子径のより好ましい下限は０．０１μｍ、より好ましい上限は１００μｍである。
なお、上記架橋性樹脂コア粒子の平均粒子径は、光学顕微鏡、又は、電子顕微鏡を用いて無作為に選んだ５０個の架橋性樹脂コア粒子を観察して得られた直径の平均値を意味する。
【００３３】
また、上記架橋性樹脂コア粒子の平均粒子径は、ＣＶ値の好ましい上限が３０％である。ＣＶ値が３０％を超えると、疎水性樹脂コア粒子が粒子径分布の広いものとなる。ＣＶ値のより好ましい上限は２０％である。なお、ＣＶ値は、標準偏差を平均粒子径で割った値の百分率（％）で示される数値である。
【００３４】
上記工程１における上記架橋性アレンモノマーの添加量は、コア形成用モノマーの全量に対して好ましい下限は２ｍｏｌ％、好ましい上限は９０ｍｏｌ％である。上記架橋性アレンモノマーの添加量が２ｍｏｌ％未満であると架橋性樹脂コア粒子が生成しにくくなることがあり、９０ｍｏｌ％を超えると、架橋性樹脂コア粒子同士の凝集を招くことがある。
上記架橋性アレンモノマーの添加量のより好ましい下限は５ｍｏｌ％、より好ましい上限は５０ｍｏｌ％である。
【００３５】
上記工程２は、工程１を行った後、得られた架橋性樹脂コア粒子及びα−ブロモカルボニル基を有するアレンモノマーを用いてリビング重合を行い、前記架橋性樹脂コア粒子の表面にα−ブロモカルボニル基を有するポリマー層を形成する工程である。
【００３６】
上記工程２では、リビング重合を用いることで、架橋性樹脂コア粒子を構成するポリマーにα−ブロモカルボニル基を有するアレンモノマーを共重合させることができ、その結果、均一な厚みを有するα−ブロモカルボニル基を有するポリマー層を形成することができる。また、上記ポリマー層の厚みを所望の厚みに制御することが可能となる。
【００３７】
上記工程２において使用するα−ブロモカルボニル基を有するアレンモノマー、開始剤、重合溶媒、重合条件については、上記と同様とすることが好ましい。
【００３８】
上記工程２における上記α−ブロモカルボニル基を有するアレンモノマーの添加量としては、形成する水酸基含有アレンポリマー層の厚みに応じて決定されるが、上記架橋性樹脂コア粒子１００重量部に対して１〜５０重量部であることが好ましい。上記範囲内とすることで、適度な厚みを有するポリマー層を形成することが可能となる。より好ましくは、架橋性樹脂コア粒子１００重量部に対して２〜３０重量部である。
【００３９】
上記工程２において形成されるα−ブロモカルボニル基を有するポリマー層の厚みの好ましい下限は５ｎｍ、好ましい上限５０００ｎｍである。厚みが５ｎｍ未満であると、α−ブロモカルボニル基の効果が十分得られないことがある。厚みが５０００ｎｍを超えると、コア粒子の架橋による利点が失われることがある。上記厚みのより好ましい下限は１０ｎｍ、より好ましい上限は２０００ｎｍである。
【００４０】
本発明の樹脂粒子の製造方法で得られる樹脂粒子もまた本発明の１つである。
本発明の樹脂粒子を構成するポリマーの分子量分布（＝重量平均分子量／数平均分子量）の好ましい上限は１．５である。
上記分子量分布が１．５より大きくなると、粒子径分布が広くなるほか、２種類以上のモノマーを用いてブロックポリマーを合成する際、各ブロックの組成比のばらつきが大きくなる。
なお、架橋性モノマーを用いた場合、得られる架橋体について分子量分布を定義又は測定することは困難であるが、リビング重合の特性上、架橋体においても上記粒子径分布の均一性、あるいは構成モノマーユニットの配列の均一性は維持されると考えられる。
上記ポリマーの分子量分布のより好ましい範囲は、１．０〜１．４である。
【００４１】
上記樹脂粒子は、平均粒子径の好ましい下限が０．００１μｍ、好ましい上限が１０００μｍである。平均粒子径が０．００１μｍ未満であると、重合系の粘度が上昇して粒子を溶媒と分離できないことがある。平均粒子径が１０００μｍを超えると、重合中に粒子が凝集することがある。上記平均粒子径のより好ましい下限は０．０１μｍ、より好ましい上限は１００μｍである。
なお、上記樹脂粒子の平均粒子径は、光学顕微鏡、又は、電子顕微鏡を用いて無作為に選んだ５０個の樹脂粒子を観察して得られた直径の平均値を意味する。
【００４２】
また、上記樹脂粒子の平均粒子径は、ＣＶ値の好ましい上限が１０％である。ＣＶ値が１０％を超えると、粒子径分布が広くなり過ぎる。ＣＶ値のより好ましい上限は７％である。なお、ＣＶ値は、標準偏差を平均粒子径で割った値の百分率（％）で示される数値である。
【００４３】
本発明で得られる樹脂粒子は、スペーサー、表面改質剤、艶消し剤、顔料、化粧品、光拡散剤等のほか、ＨＰＬＣ用充填剤、イオンクロマト用充填剤、金属精製用キレート樹脂、蛋白質精製用樹脂等として好適に用いることができる。
【００４４】
本発明の樹脂粒子の製造方法を用いて得られた樹脂粒子に、α−ブロモカルボニル基と反応するユニットと、生体活性ユニットとを有するリガンド化合物を担持させる工程を行うことで、アフィニティー微粒子を製造することができる。
【００４５】
上記リガンド化合物としては、上記α−ブロモカルボニル基と反応するユニットを有するものを用いることが好ましい。
上記α−ブロモカルボニル基と反応するユニットとしては、臭素と求核置換反応する官能基であれば特に限定されず、例えば、チオール基、チオウレア基、アミノ基、グアニジン基、カルボン酸基等が挙げられ、好ましくはチオール基、アミノ基である。
【００４６】
また、上記リガンド化合物は、生体活性ユニットを有すれば特に限定されないが、薬理作用を示す化合物、免疫調整作用を示す化合物、及び、免疫抑制作用を示す化合物からなる群より選択される少なくとも１種であることがより好ましい。
【００４７】
本発明のアフィニティー微粒子の製造方法を用いて得られるアフィニティー微粒子は、プルダウンアッセイ法を利用した、リガンド化合物に対応する候補タンパク質を選別するタンパク質解析方法に使用することができる。
【００４８】
上記プルダウンアッセイ法によるタンパク質解析の手法としては、まず、機能を知りたい目的タンパク質を遺伝子操作により人工的にフラッグタグ融合タンパク質として細胞内に発現させる。次に細胞を酵素等により可溶化後、タグの抗体を融合したアフィニティー微粒子で目的タンパク質および目的タンパク質と相互作用するタンパク質の複合体をプルダウン（分離精製する）。これら全てのタンパク質を質量分析システムで同定することにより、目的タンパク質のネットワークを明らかにすることができる。
本発明のアフィニティー微粒子の製造方法により得られるアフィニティー微粒子は、リガンド化合物を効率的に粒子表面に導入できるため、プルダウンアッセイにおいてタンパク質の非特異吸着を抑制することができ、Ｓ／Ｎ比のよいタンパク質解析を行うことができる。
【発明の効果】
【００４９】
本発明によれば、樹脂の分子量及び粒子径を均一に制御することができ、かつ、反応性基が粒子表面に均一に分布する樹脂粒子を製造することが可能な樹脂粒子の製造方法、該樹脂粒子の製造方法を用いた樹脂粒子、アフィニティー微粒子の製造方法及びタンパク質解析方法を提供できる。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。
【００５１】
（実施例１）
（樹脂粒子の作製）
三方コックをつけたすり付き試験管中に、分散安定剤としてポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）０．０７０ｇを加え、窒素置換を行った。これにアリルトリフルオロアセテートのトルエン溶液（１．０Ｍ、１２０μＬ）、Ｎｉ（ＣＯＤ）２のトルエン溶液（０．１Ｍ、１．０ｍＬ）、トリフェニルホスフィンのトルエン溶液（１．０Ｍ、１５０μＬ）を順次加え、減圧下にてトルエンを留去した。ここに重合媒体として乾燥エタノール（１０．０ｍＬ）を加え、π−アリルニッケル触媒溶液（０．１０ｍｍｏｌ）を得た。
得られたπ−アリルニッケル触媒溶液に対して、フェノキシアレン（１．３２ｇ、１０．０ｍｍｏｌ）を加え室温にて２４時間、３５０ｒｐｍで攪拌しつつ重合を行うことにより、ポリマーの懸濁液を得た。この懸濁液に下記式（２）に示すα−ブロモカルボニル基を有するアレンモノマー（０．２２ｇ、０．５ｍｍｏｌ）をさらに加え、室温にて２４時間、３５０ｒｐｍで攪拌しつつ重合を行うことにより、樹脂粒子を得た。
【００５２】
【化２】
2014139534.tif 000003
【００５３】
（実施例２）
（樹脂粒子の作製）
合成に用いたフェノキシアレンモノマーの量を１．０６ｇ（８．０ｍｍｏｌ）、上記式（２）に示すα−ブロモカルボニル基を有するアレンモノマーの量を０．８７ｇ（２．０ｍｍｏｌ）とした以外は、実施例１と同様にして樹脂粒子を得た。
【００５４】
（実施例３）
（架橋樹脂粒子の作製）
三方コックをつけたすり付き試験管中に、分散安定剤としてポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）０．０７０ｇを加え、窒素置換を行った。これにアリルトリフルオロアセテートのトルエン溶液（１．０Ｍ、１２０μＬ）、Ｎｉ（ＣＯＤ）２のトルエン溶液（０．１Ｍ、１．０ｍＬ）、トリフェニルホスフィンのトルエン溶液（１．０Ｍ、１５０μＬ）を順次加え、減圧下にてトルエンを留去した。ここに重合媒体として乾燥エタノール（１０．０ｍＬ）を加え、π−アリルニッケル触媒溶液（０．１０ｍｍｏｌ）を得た。
得られたπ−アリルニッケル触媒溶液に対して、フェノキシアレン（１．３２ｇ、１０．０ｍｍｏｌ）を加え室温にて２４時間、３５０ｒｐｍで攪拌しつつ重合を行うことにより、ポリマーの懸濁液を得た。この懸濁液に上記式（２）に示すα−ブロモカルボニル基を有するアレンモノマー（０．２２ｇ、０．５ｍｍｏｌ）をさらに加え、室温にて２４時間、３５０ｒｐｍで攪拌しつつ重合を行うことにより、樹脂粒子を得た。この樹脂粒子懸濁液に下記式（４）に示すジアレンモノマー（０．９３ｇ、０．５ｍｍｏｌ）をさらに加え、室温にて２４時間、３５０ｒｐｍで攪拌しつつ重合を行うことにより、架橋樹脂粒子を得た。
【００５５】
【化３】
2014139534.tif 000004
【００５６】
（実施例４）
（コアシェル型樹脂粒子の作製）
三方コックをつけたすり付き試験管中に、分散安定剤としてポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）０．０７０ｇを加え、窒素置換を行った。これにアリルトリフルオロアセテートのトルエン溶液（１．０Ｍ、１２０μＬ）、Ｎｉ（ＣＯＤ）２のトルエン溶液（０．１Ｍ、１．０ｍＬ）、トリフェニルホスフィンのトルエン溶液（１．０Ｍ、１５０μＬ）を順次加え、減圧下にてトルエンを留去した。ここに重合媒体として乾燥エタノール（１０．０ｍＬ）を加え、π−アリルニッケル触媒溶液（０．１０ｍｍｏｌ）を得た。
得られたπ−アリルニッケル触媒溶液に対して、フェノキシアレン（１．３２ｇ、１０．０ｍｍｏｌ）を加え室温にて２４時間、３５０ｒｐｍで攪拌しつつ重合を行うことにより、ポリマーの懸濁液を得た。この懸濁液に上記式（４）に示すジアレンモノマー（０．９３ｇ、０．５ｍｍｏｌ）をさらに加え、室温にて２４時間、３５０ｒｐｍで攪拌しつつ重合を行うことにより、架橋樹脂粒子を得た。この樹脂粒子懸濁液に上記式（２）に示すα−ブロモカルボニル基を有するアレンモノマー（０．２２ｇ、０．５ｍｍｏｌ）をさらに加え、室温にて２４時間、３５０ｒｐｍで攪拌しつつ重合を行うことにより、樹脂粒子を得た。
【００５７】
（実施例５）
（コアシェル型樹脂粒子の作製）
三方コックをつけたすり付き試験管中に、分散安定剤としてポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）０．０７０ｇを加え、窒素置換を行った。これにアリルトリフルオロアセテートのトルエン溶液（１．０Ｍ、１２０μＬ）、Ｎｉ（ＣＯＤ）２のトルエン溶液（０．１Ｍ、１．０ｍＬ）、トリフェニルホスフィンのトルエン溶液（１．０Ｍ、１５０μＬ）を順次加え、減圧下にてトルエンを留去した。ここに重合媒体として乾燥エタノール（１０．０ｍＬ）を加え、π−アリルニッケル触媒溶液（０．１０ｍｍｏｌ）を得た。
得られたπ−アリルニッケル触媒溶液に対して、フェノキシアレン（１．３２ｇ、１０．０ｍｍｏｌ）を加え室温にて２４時間、３５０ｒｐｍで攪拌しつつ重合を行うことにより、ポリマーの懸濁液を得た。この懸濁液に上記式（４）に示すジアレンモノマー（０．９３ｇ、０．５ｍｍｏｌ）をさらに加え、室温にて２４時間、３５０ｒｐｍで攪拌しつつ重合を行うことにより、架橋樹脂粒子を得た。この樹脂粒子懸濁液に下記式（３）に示すα−ブロモカルボニル基を有するアレンモノマー（０．１５ｇ、０．５ｍｍｏｌ）をさらに加え、室温にて２４時間、３５０ｒｐｍで攪拌しつつ重合を行うことにより、樹脂粒子を得た。
【００５８】
【化４】
2014139534.tif 000005
【００５９】
（比較例１）
（樹脂粒子の作製）
三方コックをつけたすり付き試験管中に、分散安定剤としてポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）０．３０ｇ、重合触媒としてブチルリチウム（６．４ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）を加え、窒素置換を行った。ここに重合媒体として乾燥トルエン（２．０ｍＬ）および乾燥エタノール（８．０ｍＬ）を加え、ブチルリチウム触媒溶液を得た。
得られたブチルリチウム触媒溶液に対して、フェノキシアレン（１．３２ｇ、１０．０ｍｍｏｌ）および上記式（２）に示すα−ブロモカルボニル基を有するアレンモノマー（０．２２ｇ、０．５ｍｍｏｌ）を加え２３℃にて１時間、３５０ｒｐｍで攪拌しつつ重合を行うことにより、樹脂粒子を得た。
【００６０】
（比較例２）
（樹脂粒子の作製）
三方コックをつけたすり付き試験管中に、分散安定剤としてポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）０．０７０ｇを加え、窒素置換を行った。これにアリルトリフルオロアセテートのトルエン溶液（１．０Ｍ、１２０μＬ）、Ｎｉ（ＣＯＤ）２のトルエン溶液（０．１Ｍ、１．０ｍＬ）、トリフェニルホスフィンのトルエン溶液（１．０Ｍ、１５０μＬ）を順次加え、減圧下にてトルエンを留去した。ここに重合媒体として乾燥エタノール（１０．０ｍＬ）を加え、π−アリルニッケル触媒溶液（０．１０ｍｍｏｌ）を得た。
得られたπ−アリルニッケル触媒溶液に対して、フェノキシアレン（１．３２ｇ、１０．０ｍｍｏｌ）を加え室温にて２４時間、３５０ｒｐｍで攪拌しつつ重合を行うことにより、樹脂粒子を得た。
【００６１】
（実施例６）
（アフィニティー微粒子の作製）
実施例１で得られた樹脂粒子に、下記の方法にて、予め標的タンパク質の分かっている生体機能性分子（下記式（５）に示す免疫抑制剤、ＦＫ５０６、アステラス製薬社製）を固定化し、アフィニティー微粒子を合成した。
具体的には、−７８℃の塩化メチレン溶媒中において、ＦＫ５０６に対してＮ，Ｎ−ジメチル−４−アミノピリジン５．０Ｅｑとクロロ蟻酸パラニトロフェニル１．４Ｅｑとを添加した。その後反応温度を−４０℃に昇温し、１時間熟成した。一旦系の温度を−７８℃にした後、下記式（６）に示すアミン化合物を添加した。反応温度を徐々に０℃まで昇温し、０℃にて３時間熟成した。得られた中間体を、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）を用いて還元することにより、下記式（７）に示すＦＫ５０６のチオール体を得た。次いで、トリエチルアミン存在下、メタノール溶媒中に、実施例１で得られた樹脂粒子１．５４重量部に対して、得られたＦＫ５０６のチオール体０．５１２重量部を添加し、４８時間熟成することによって、粒子表面にＦＫ５０６が固定化されたアフィニティー微粒子が得られた。なお、実施例１で得られた樹脂粒子及びＫ５０６のチオール体は、実施例１で得られた樹脂粒子のブロモ基と、ＦＫ５０６のチオール体のチオール基が等モルとなるように添加した。
【００６２】
【化５】
2014139534.tif 000006
【化６】
2014139534.tif 000007
【化７】
2014139534.tif 000008
【００６３】
（実施例７）
（アフィニティー微粒子の作製）
リガンドを担持させるためのベース粒子として、実施例１で得られた樹脂粒子に代えて、実施例３で得られた樹脂粒子を用いたこと以外は、実施例６と同様にしてアフィニティー微粒子を作製した。なお、実施例３で得られた樹脂粒子２．４７重量部に対して、得られたＦＫ５０６のチオール体０．５１２重量部を添加した。実施例３で得られた樹脂粒子及びＫ５０６のチオール体は、実施例３で得られた樹脂粒子のブロモ基と、ＦＫ５０６のチオール体のチオール基が等モルとなるように添加した。
【００６４】
（比較例３）
（アフィニティー微粒子の作製）
リガンドを担持させるためのベース粒子として、実施例１で得られた樹脂粒子に代えて、比較例１で得られた樹脂粒子を用いたこと以外は、実施例６と同様にしてアフィニティー微粒子を作製した。なお、比較例１で得られた樹脂粒子１．５４重量部に対して、得られたＦＫ５０６のチオール体０．５１２重量部を添加した。比較例１で得られた樹脂粒子及びＫ５０６のチオール体は、比較例１で得られた樹脂粒子のブロモ基と、ＦＫ５０６のチオール体のチオール基が等モルとなるように添加した。
【００６５】
（比較例４）
（アフィニティー微粒子の作製）
リガンドを担持させるためのベース粒子として、実施例１で得られた樹脂粒子に代えて、比較例２で得られた樹脂粒子を用いたこと以外は、実施例６と同様にしてアフィニティー微粒子を作製した。なお、比較例２で得られた樹脂粒子１．３２重量部に対して、得られたＦＫ５０６のチオール体０．５１２重量部を添加した。
【００６６】
（比較例５）
（アフィニティー微粒子の作製）
炭酸水素ナトリウム存在下ＴＨＦ溶媒中、市販のアフィニティー用樹脂粒子（Ｍｉｃｒｏｍｅｒ、平均粒子径約１μｍのポリスチレン粒子、コアフロント社製）にα−ブロモ活性化エステルを添加し、ブロモ基を導入したＭｉｃｒｏｍｅｒ誘導体粒子を作製した。
このブロモ基を導入したＭｉｃｒｏｍｅｒ誘導体粒子に対し、トリエチルアミン存在下メタノール溶媒中、実施例６と同様にして合成したＦＫ５０６のチオール体を添加し、４８時間熟成することによって、粒子表面にＦＫ５０６が固定化されたアフィニティー微粒子が得られた。
【００６７】
（比較例６）
（アフィニティー微粒子の作製）
炭酸水素ナトリウム存在下ＴＨＦ溶媒中、市販のアフィニティー用樹脂粒子（Ｓｉｃａｓｔａｒ、平均粒子径約１μｍのシリカ粒子、コアフロント社製）にα−ブロモ活性化エステルを添加し、ブロモ基を導入したＳｉｃａｓｔａｒ誘導体粒子を作製した。このブロモ基を導入したＳｉｃａｓｔａｒ誘導体粒子に対し、トリエチルアミン存在下メタノール溶媒中、実施例６と同様にして合成したＦＫ５０６のチオール体を添加し、４８時間熟成することによって、粒子表面にＦＫ５０６が固定化されたアフィニティー微粒子が得られた。
【００６８】
（評価）
（１）樹脂粒子の評価
結果を表１に示す。
【００６９】
（１−１）平均粒子径の測定
レーザー回折式粒度分布計（堀場製作所社製、「ＬＡ−９５０」）を用いて、各実施例及び比較例で得られた樹脂粒子の体積平均粒子径及び粒子径のＣＶ値を測定した。
【００７０】
（１−２）数平均分子量及び分子量分布の測定
粒子を構成する樹脂の重量平均分子量及び分子量分布は下記の方法により測定した。水酸基をもつ樹脂粒子に関しては、無水酢酸とピリジンにより３５℃で５時間反応させ、アセチル化した後に評価を行った。カラムとしてＴＯＳＯＨ社製カラムＧＭＨ−ＨＲを用い、ゲルパーミエーションクロマトグラフィーによる分析を行い、ポリスチレン換算による数平均分子量（Ｍｎ）及び分子量分布（重量平均分子量（Ｍｗ）と数平均分子量（Ｍｎ）との比（Ｍｗ／Ｍｎ））を測定した。
【００７１】
（１−３）粒子表面の官能基の密度と均一性の評価
走査型電子顕微鏡ＥＤＳ（エネルギー分散型Ｘ線分光器、Ｓ−３４００Ｎ、日立製作所社製）を用いて評価した。
具体的には、樹脂粒子の主な構成元素のうち、検出可能な炭素元素・酸素元素・臭素元素における臭素元素の存在重量分率を、官能基密度として評価した。
また、樹脂粒子表面を撮影したＳＥＭ−ＥＤＳ画像において、臭素原子のマッピングを行い、以下の基準で均一性の評価を行った。
粒子表面の臭素原子検出濃度にムラが見られないもの：○
粒子表面の臭素原子検出濃度にムラが見られるもの：×
臭素元素が検出されないもの：−
【００７２】
（２）アフィニティー微粒子の評価
結果を表２に示す。
（２−１）プルダウンアッセイ
得られたアフィニティー微粒子を細胞溶解液に添加し、４℃で１時間インキュベートした。その後、遠心分離により微粒子を回収し、バッファー液で洗浄後、溶出ペプチド（１００ｍＭのＧｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ、ｐＨ＝３）により微粒子に結合したタンパク質を回収した。回収したタンパク質をペプチターゼ処理により断片化し、ナノフローＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析を行い、ペプチド断片のアミノ酸配列を決定した。得られたアミノ酸配列をデータベースと照らし合わすことによって結合タンパク質を同定した。
プルダウンされたタンパク質のうち、それぞれの基材粒子に対してＦＫ５０６の代わりにアルコールを導入したコントロール粒子にも結合したタンパク質を除いたものを「候補タンパク質」とし、その数を調べた。次に候補タンパク質のうち、ＦＫ５０６の標的タンパク質の数を調べた。「プルダウンのＳ／Ｎ比＝標的タンパク質の数／候補タンパク質」を求めることにより、アフィニティー微粒子の非特異吸着性を評価した。
【００７３】
【表１】
2014139534.tif 000009
【００７４】
【表２】
2014139534.tif 000010
【産業上の利用可能性】
【００７５】
本発明によれば、樹脂の分子量及び粒子径を均一に制御することができ、かつ、反応性基が粒子表面に均一に分布する樹脂粒子を製造することが可能な樹脂粒子の製造方法、該樹脂粒子の製造方法を用いた樹脂粒子、アフィニティー微粒子の製造方法及びタンパク質解析方法を提供できる。