(57)【要約】【課題】皮膚の光老化を抑制し、これを美容、健康食品または医療の分野において活用する手段を提供する。【解決手段】以下の一般式（１）で示される構造の酸性ムコ多糖類またはそれらの生理学的に許容される塩もしくは誘導体を有効成分として含む皮膚の光老化抑制剤。【化１】2014162748.tif 000010(上記の構造式において、GalNAcpはピラノース型Ｎ−アセチルガラクトサミン残基を、GlcUApはピラノース型グルクロン酸残基を、ＤはＤ型を、ＬはＬ型を、Pyrはピルビン酸を、ｎはゲル濾過クロマトグラフィーで測定した平均分子量がプルランを標準として１００万〜１５０万であることを示す繰り返しの数をそれぞれ表す。)【選択図】図１
2014162748.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（１）で示される構造の酸性ムコ多糖類またはそれらの生理学的に許容される塩もしくは誘導体を有効成分として含む、皮膚の光老化抑制剤。
【化１】
2014162748.tif 000008
(上記の構造式において、GalNAcpはピラノース型Ｎ−アセチルガラクトサミン残基を、GlcUApはピラノース型グルクロン酸残基を、ＤはＤ型を、ＬはＬ型を、Pyrはピルビン酸を、ｎはゲル濾過クロマトグラフィーで測定した平均分子量がプルランを標準として１００万〜１５０万であることを示す繰り返しの数をそれぞれ表す。)
【請求項２】
前記光老化抑制剤は、皮膚外用剤である、請求項１に記載の皮膚の光老化抑制剤。
【請求項３】
前記光老化抑制剤は、美容用飲食品である、請求項１に記載の皮膚の光老化抑制剤。
【請求項４】
一般式（１）で示される構造の酸性ムコ多糖類またはそれらの生理学的に許容される塩もしくは誘導体を有効成分として含む、ＨＡＳ３ ｍＲＮＡ発現抑制剤。
【化２】
2014162748.tif 000009
(上記の構造式において、GalNAcpはピラノース型Ｎ−アセチルガラクトサミン残基を、GlcUApはピラノース型グルクロン酸残基を、ＤはＤ型を、ＬはＬ型を、Pyrはピルビン酸を、ｎはゲル濾過クロマトグラフィーで測定した平均分子量がプルランを標準として１００万〜１５０万であることを示す繰り返しの数をそれぞれ表す。)
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光老化抑制または改善用に好適な皮膚作用剤に関する。詳しくはヒアルロン酸合成酵素３（ＨＡＳ３）ｍＲＮＡ発現抑制因子を含む皮膚外用剤および健康食品に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
皮膚の老化は生理的老化と光老化に分かれる。光老化は皮膚に特異的な老化であり、紫外線を浴びることで生じる老化である。太陽光からの紫外線は皮膚のタンパク質、ＤＮＡなどの生体構成成分を変性し、サイトカインや関連する因子の発現を変化させ、皮膚の機能を低下させ、悪性腫瘍を誘発する要因ともなっている(非特許文献１、非特許文献２)。
【０００３】
光老化した皮膚では、ヒアルロン酸の含量が減少しているが、最近、紫外線によるヒアルロン酸の産生およびヒアルロン合成酵素関連遺伝子の発現についての研究が進み、ヒアルロン酸による光老化の制御機構が解明されつつある(非特許文献３、非特許文献４)。
【０００４】
ヒアルロン酸は、グルクロン酸とＮ−アセチルグルコサミンの二糖単位の繰り返し構造からなる直鎖状の高分子多糖類で、分子量は１０4ｋＤａにも達するものもある。細胞外マトリックスの主要な構成成分の一つとして生体内に広く分布している。
【０００５】
ヒアルロン酸は、動物細胞でヒアルロン酸合成酵素(ＨＡＳｌ、ＨＡＳ２、ＨＡＳ３)により生合成される。ＨＡＳｌとＨＡＳ２は比較的高分子のヒアルロン酸(１０3ｋＤａ以上)を合成するのに対し、ＨＡＳ３は比較的低分子のヒアルロン酸(１０3ｋＤａ以下)を合成することが知られている。
【０００６】
ヒアルロン酸は、高分子と低分子で働きが相反することが数多く報告されている。一般に、高分子ヒアルロン酸は正常組織に存在し、低分子ヒアルロン酸は炎症部位やがん組織での働きが示されている。低分子ヒアルロン酸には、炎症性サイトカインやケモカインの誘導や、血管新生作用など高分子ヒアルロン酸にはない生理活性を持つことが知られている(非特許文献５、非特許文献６)。逆に高分子ヒアルロン酸は、血管新生や炎症性サイトカインの産生を抑制する。また、ヒアルロン酸は細胞分化の過程でも重要な役割を果たすが、その効果も糖鎖サイズによって変化する。このようにヒアルロン酸は、分子量依存的に異なる機能を持つが、どのようなメカニズムでサイズ依存的な活性を発揮するのかは分かっていない(非特許文献７)。
【０００７】
皮膚におけるヒアルロン酸合成酵素としてはＨＡＳ３が主に発現しており、ついでＨＡＳ２も検出されるが、ＨＡＳｌは検出されていない(非特許文献８)。
【０００８】
一方、後述の式（１）の化学構造式で表される本酸性ムコ多糖類は、以前より美白剤としての化粧品用途、軟骨細胞増殖促進作用および免疫賦活作用としての医薬品用途が知られている(特許文献１、特許文献２、特許文献３)。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特許第４４６１２８６号公報
【特許文献２】特許第３８０２０１１号公報
【特許文献３】特許第４８８９２０６号公報
【特許文献４】特開２００８−１９４０２６号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Arch Dermatol.138(11),1462-1470(2002).
【非特許文献２】ＪDermatol Sci.50(3),169-176(2008).
【非特許文献３】ＪInvest Dermatol.127(3),687-697(2006).
【非特許文献４】Photochemistry and Photobiology,82(5),1342-1347(2006).
【非特許文献５】EurＪCell Biol.85,699-715(2006).
【非特許文献６】Matrix Biology.21、25-29(2002).
【非特許文献７】FASEB J.20,9-22(2006).
【非特許文献８】日本香粧品学会誌.31(4),308-311(2007).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
以上、様々な研究報告がされてはいるものの、皮膚化粧料に広く使用可能な抗老化剤は未だ提供されておらず、その速やかな提供が強く求められていた。
【００１２】
本発明は、紫外線による皮膚の光老化を抑制する技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明の第一の態様は、以下の一般式（１）で示される構造の酸性ムコ多糖類またはそれらの生理学的に許容される塩もしくは誘導体を有効成分として含む皮膚の光老化抑制剤を要旨とする。
【化１】
2014162748.tif 000003
(上記の構造式において、GalNAcpはピラノース型Ｎ−アセチルガラクトサミン残基を、GlcUApはピラノース型グルクロン酸残基を、ＤはＤ型を、ＬはＬ型を、Pyrはピルビン酸を、ｎはゲル濾過クロマトグラフィーで測定した平均分子量がプルランを標準として１００万〜１５０万であることを示す繰り返しの数をそれぞれ表す。)
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、紫外線による皮膚の光老化を抑制する技術が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、マウスの皮膚におけるＨＡＳ３ ｍＲＮＡ発現抑制効果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下に実施形態を挙げて本発明を説明するが、本発明は以下の実施形態に限定されない。
【００１７】
(皮膚の光老化抑制剤)
【００１８】
本発明者らは、ヒト表皮細胞に紫外線照射するとＨＡＳ３の発現量の亢進が認められると共に、細胞内の各種サイトカインや活性酸素量が亢進されることに着目した。そしてそれらの因子を介したシグナリングについての詳細な研究から紫外線で働くこれら各種サイトカインによりＨＡＳの発現が調節されている可能性について検討した。
【００１９】
具体的には酸性ムコ多糖類の薬理作用の解明の観点から検討を加えたところ、酸性ムコ多糖類が紫外線照射による皮膚組織の炎症性ＨＡＳ３ ｍＲＮＡの発現を抑制し皮膚の光老化抑制剤として有用であることを知見した。このことは、本発明者らによる新たな知見である。
【００２０】
本発明は、本海洋細菌の産生する酸性ムコ多糖類が紫外線照射により惹起する皮膚のＨＡＳ３ ｍＲＮＡ発現の亢進を指標とする炎症作用を抑制する機能性物質であるという上記の知見に基づいてなされたものである。
【００２１】
本発明の光老化抑制剤は、下記式（１）により示される本酸性ムコ多糖類またはその生理学的に許容される塩もしくは誘導体(以下「本酸性ムコ多糖類」と記す)を有効成分として含有することを特徴とする。
【化２】
2014162748.tif 000004
(上記の構造式において、GalNAcpはピラノース型Ｎ−アセチルガラクトサミン残基を、GlcUApはピラノース型グルクロン酸残基を、ＤはＤ型を、ＬはＬ型を、Pyrはピルビン酸を、ｎはゲル濾過クロマトグラフィーで測定した平均分子量がプルランを標準として１００万〜１５０万であることを示す繰り返しの数をそれぞれ表す。)
【００２２】
本酸性ムコ多糖類は、紫外線照射した皮膚のＨＡＳ３ ｍＲＮＡ発現抑制作用を指標とする皮膚の光老化抑制作用を有することから、皮膚の光老化抑制効果が期待される化粧品分野、医薬品分野および健康食品分野に有用な素材を提供することができる。
【００２３】
なお、上記酸性ムコ多糖類は、メラニン生成抑制作用、マクロファージ賦活作用、軟骨培養細胞増殖促進効果を有することが知られているが、これを皮膚の光老化抑制剤として使用したという報告は、現在までに全く知られていないものである。
【００２４】
(光老化抑制組成物)
上記本酸性ムコ多糖類を光老化抑制剤として用いる場合、有効成分である本酸性ムコ多糖類と医薬品または食品に一般に用いられている各種成分、例えば、油分、保湿剤、防腐剤、殺菌剤、色剤、香料、増粘剤、緩衝剤などを、その剤形にあわせ、本発明の効果を損なわない範囲で適宜配合することにより調製される。また、上記光老化抑制組成物に、本酸性ムコ多糖類を配合するに当たっては、これら化合物の光老化抑制活性を考慮することが好ましく、一般にはこれら化合物を有効成分として、光老化抑制組成物の全質量基準で、少なくとも０．００１質量％以上、好ましくは０．０１〜２０．０質量％程度添加すればよい。必ずしも有効成分を単離して使用する必要はなく、必要に応じて本発明の効果を損なわない範囲で、本発明の化合物を含む粗精製物を使用することができる。
【００２５】
本発明の光老化抑制組成物の剤型は任意であり、例えばカプセル剤、錠剤、丸剤、顆粒剤、ドリンク剤等の可溶化系、乳液またはクリーム等の乳化系、あるいは軟膏または分散液などの剤型をとることができる。上記皮膚の光老化抑制剤は、優れた皮膚の光老化抑制効果を示すと共に、安定性および高い安全性を併せ持つため、例えばがん、ウイルス病、アトピー性皮膚炎等の発生を防ぐことができる。また既に発症しているがん、ウイルス病、アトピー性皮膚炎等の治療に使用できることが期待される。
【００２６】
(有効成分)
本発明で使用される本酸性ムコ多糖類は、医薬品として使用できる程度に精製されたものであれば、種々の方法で調製されたものを用いることができる。本酸性ムコ多糖類の調製方法としては、各種の方法が知られている。例えば、海洋微生物を炭素源として蔗糖、窒素源としてペプトン、酵母エキスを含有する海水で調製した培地で培養して産生した多糖類を採取、精製して得ることができる。
【００２７】
本酸性ムコ多糖類を産生する微生物を培養する基本培地としては、多糖類を産生しうる微生物が生育できるものであって、少なくとも炭素源と、窒素源と各種無機塩とおよび微量元素とを適量含有するものが用いられる。さらに好ましくは、上記基本培地として、コベチア属(Cobetia)に属する微生物が生育できるものが用いられる。炭素源としては、グルコース、フラクトース、ガラクトース、シュクロース等の糖、あるいは糖蜜や廃糖蜜が挙げられる。炭素源として１種または２種以上を単独で又は組み合わせて用いることができる。窒素源としては、硝酸塩、アンモニウム塩等の化合物やペプトン、酵母エキス、アミノ酸などの天然物が挙げられる。窒素源として１種または２種以上を単独で又は組み合わせて用いることができる。無機塩としては、例えば、リン酸塩、マグネシウム塩、カリウム塩等が挙げられる。無機塩として１種または２種以上を単独でまたは組み合わせて用いることができる。固体培地の場合には寒天をもちいる。
【００２８】
使用する培地、培地のｐＨ、培地への添加物、培養温度などの培養条件は通常微生物の培養の際に用いられている条件に従って設定することができる。
【００２９】
本酸性ムコ多糖類の産生に用いられる微生物としては、多糖類を産生しうるものであれば特に制限なく使用することができる。好ましくは海洋微生物、さらに好ましくは本酸性ムコ多糖類を産生する能力のある海洋微生物が用いられる。具体的にはコベチア属(Cobetia)細菌が挙げられ、より具体的にはコベチア(Cobetia)属に属し寄託番号がＦＥＲＭ Ｐ−２１１０１として寄託されている菌株またはその変異株が挙げられる。本菌株は本発明者らが瀬戸内海においてワカメの表面より分離した海洋性細菌であり、その分類学的特性は、上記特許文献４に記載されている。
【００３０】
本発明における培養条件は、培養時のｐＨは微生物が生育し、かつ多糖類を産生する範囲であれば制限されないが、通常は６から７．５の範囲のｐＨが好ましい。培養温度については微生物が生育し、かつ多糖類を産生する範囲であれば制限されないが、２５℃から３０℃の範囲が多糖類の産生には良好である。培養期間は培養のｐＨや温度により変化するが、通常２日から５日が適切である。
【００３１】
上述した培地と微生物を用いて従来法を用いて微生物を培養することにより、有効成分である本酸性ムコ多糖類が効率的に産生されることとなる。
【００３２】
本発明に用いられる本酸性ムコ多糖類は、構成糖のモル比がＮ−アセチル−Ｄ− ガラクトサミン:Ｄ−グルクロン酸:Ｎ−アセチル−Ｌ−ガラクトサミン:ピルビン酸が２:１:１:１(モル濃度比)で、ゲル濾過クロマトグラフィーで測定した平均分子量がプルランを標準として１００万〜１５０万であることが好ましい。構成成分の分析には、セルロースアセテート膜電気泳動、または高速液体クロマトグラフィーを用いることができる。この構成成分の分析には、多糖類を２Ｍのトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、または４Ｎ−ＨＣｌで１００℃、１２時間加水分解し、ロータリーエバポレイターでＴＦＡまたはＨＣｌを除いたものを検体とし、中性糖、ウロン酸、有機酸およびアミノ糖の分析を行う。特にウロン酸の分析は、多糖のカルボキシル基還元後に加水分解して中性糖を分析することにより行う。有機酸の分析にはこの他に酵素法を用いることができる。
【００３３】
本酸性ムコ多糖類の分子量の測定は、ゲル濾過クロマトグラフィー法を用いることができる。具体的には、Asahipak GFA 7M(昭和電工(株)製)をカラムとする高速液体クロマトグラフィー(島津製)を使用し、０．ｌＮＮａＣｌを移動相とし、分子量既知のプルラン(Shodex STANDARD KIT  P-82、昭和電工(株)製)を標準サンプルとして作成した分子量保持時間標準曲線を使用して測定することができる。
【００３４】
(有効成分の製造方法)
次に、本発明の光老化抑制剤の有効成分である本酸性ムコ多糖類の製造方法について、好ましい一実施形態を挙げて説明する。尚、本酸性ムコ多糖類の生産方法は以下の製法に限定されない。好ましい一実施形態としての本酸性ムコ多糖類の製造方法は、(ａ)培地において微生物を培養し多糖類を産生する工程と、(ｂ)産生された本酸性ムコ多糖類を抽出・回収する工程とを有する。
【００３５】
続いて、上述の実施形態を各工程毎に詳細に説明していく。
(ａ)培地において微生物を培養し多糖類を生産する工程
上述のようにして調製した培地を用いて微生物を培養して目的の多糖類を生産するわけであるが、本酸性ムコ多糖類を得るためには微生物としてコベチア(Cobetia)属の細菌を用いることが好ましい。さらに好ましくはコベチア(Cobetia)属に属し寄託番号がＦＥＲＭ Ｐ−２１１０１として寄託されている菌株またはその変異株を用いることが望ましい。微生物として該菌株またはその変異株を用いることで、本酸性ムコ多糖類を効率的に産生することができる。そして、以下に説明する抽出・回収工程を経ることにより高純度の本酸性ムコ多糖類を高収率で得ることが可能となる。
【００３６】
(ｂ)産生された酸性ムコ多糖類を袖出・回収する工程
上記製造方法で得られた培養液から本酸性ムコ多糖類を抽出する方法としては、当該技術分野において知られている方法を用いることができる。例えば、培養液をそのまま、あるいは高温で殺菌した後で、遠心分離により菌体を除去し、これをそのまま、あるいは濃縮してから、２〜３倍量のエタノール、イソプロパノール、あるいはアセトン等を加え、沈殿を生じさせる。この沈殿物を再度、水あるいは１〜１５質量％塩化ナトリウム溶液に溶解させた後で、アルコール等による沈殿を２〜３回繰り返し、水で透析を行い、噴霧乾燥機や凍結乾燥機等を用いて乾燥させることにより、本酸性ムコ多糖類を得る。これ以外にも電気透析法や限外濾過法も利用することができる。さらに精製するためには、イオン交換、ゲル濾過等の各種クロマトグラフィーや第４級アンモニウム塩による沈殿や塩析などを用いることができる。
【００３７】
以上のようにして、本酸性ムコ多糖類が産生および回収されることになる。本発明により得られる本酸性ムコ多糖類は特に制限なく種々の用途に使用されうるものであるが、好ましくは上述の光老化抑制剤として好適に用いられる。
【００３８】
ここで、本酸性ムコ多糖類は、下記構造単位を有するものである。
【化３】
2014162748.tif 000005
(上記の構造式において、GalNAcpはピラノース型Ｎ−アセチルガラクトサミン残基を、GlcUApはピラノース型グルクロン酸残基を、ＤはＤ型を、ＬはＬ型を、Pyrはピルビン酸を、ｎはゲル濾過クロマトグラフィーで測定した平均分子量がプルランを標準として１００万〜１５０万であることを示す繰り返しの数をそれぞれ表す。)
【００３９】
本発明では、有効成分として、光老化抑制剤の全質量基準で、少なくとも０．００１質量％以上、好ましくは、０．０１〜２０質量％の本酸性ムコ多糖類を光老化抑制剤に配合する。この本酸性ムコ多糖類を有効成分として含有する光老化抑制剤は、通常使用されている医薬品、皮膚外用剤や食品基材を使用することにより、粉末、乳剤、カプセル剤、錠剤、丸剤、顆粒剤、ドリンク剤等の適当な形態とすることができる。さらに、その他の薬効成分、増粘剤、可塑剤、着色料、香料等、任意の添加物を含有させることができる。なお、本発明の光老化抑制剤の有効成分である本酸性ムコ多糖類については、皮膚に対する毒性も刺激も無く、経口投与による副作用も無い。
【００４０】
本発明の光老化抑制剤は、ＨＡＳ３ ｍＲＮＡ発現抑制作用に基づいて、低分子ヒアルロン酸の産生を抑制することで、抗炎症効果を持つことから、皮膚の老化抑制に有用である。即ち、本発明の光老化抑制剤は、ヒアルロン酸の過剰産生に起因する各種の線維化疾患、例えば、慢性肝炎をはじめとする、肝、肺、腎などの各種臓器における慢性炎症性疾患に伴う線維化、胸膜中皮腫、がんなどの予防・治療にも有用である。
【００４１】
本酸性ムコ多糖類またはその薬学的に許容される塩もしくはその誘導体は、経口投与または非経口投与(例えば、皮膚塗布、静脈注射、皮下投与、直腸投与など)することができる。投与に際してはそれぞれの投与方法に適した剤型に製剤化すればよい。製剤形態としては、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、細粒剤、丸剤、トローチ剤、舌下錠、坐剤、軟膏、注射剤、乳剤、懸濁剤、シロップなどが挙げられ、これら製剤の調製は、無毒性の賦形剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、防腐剤、等張化剤、安定化剤、分散剤、酸化防止剤、着色剤、矯味剤、緩衝剤などの添加剤を使用して自体公知の方法にて行うことができる。無毒性の添加剤としては、例えば、でんぶん、ゼラチン、ブドウ糖、乳糖、果糖、マルトース、炭酸マグネシウム、タルク、ステアリン酸マグネシウム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、アラビアゴム、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、ペトロラタム、グリセリン、エタノール、シロップ、塩化ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、クエン酸、ポリビニルピロリドン、水などが挙げられる。なお、製剤中には、本発明の有用性を補強したり増強したりするために、他の薬剤を含有させてもよい。
【００４２】
製剤中における有効成分の含有量は、その剤型に応じて異なるが、一般に０．０１〜２０質量％の濃度であることが望ましい。製剤の投与量は、投与対象者の性別や年齢や体重の他、症状の軽重、医師の診断などにより広範囲に調整することができるが、一般に１日当り０．０１〜３００mg/kgとすることができる。上述の投与量は、１日１回または数回に分けて投与すればよい。
【００４３】
以上説明した本発明の光老化抑制剤は、ヒトに対して好適に適用されるものであるが、それぞれの作用効果が奏される限り、ヒト以外の動物に対しても適用することもできる。
【実施例】
【００４４】
次に実施例を挙げ、本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれら実施例になんら制約されるものではない。尚、特記しない限り、百分率(％)は質量基準である。
【００４５】
(実施例１)
ペプトン０．５％、酵母エキス０．１％、薦糖３％の組成を有し海水で調製した培地を温度１２１℃としたオートクレーブ中で１５分間滅菌し、本菌株(ＦＥＲＭ Ｐ-２１１０１)の斜面培養から、１白金耳を試験管中の上記滅菌培地(１０ｍｌ)に接種し、２５℃の温度で２４時間静置培養を行った。次いでこの前培養液を５００ｍｌ容の三角フラスコ中に上記組成の培地１００ｍｌ(１２１℃、１５分間滅菌)に接種し、２５℃の温度で３日間の静置培養を行った。培養後培養液を遠心分離し、次いで濾過助剤(ラヂオライト#５００)を用いてＧＦ-７５濾紙(Advantec)で濾過し、菌体を除いた上澄液から分子量５万カットの中空糸ＵＦ膜モジュール(Spectrum社)を備えた膜濾過装置により得られる高分子画分を濃縮、脱塩回収し、活性炭処理し、凍結乾燥により粉末化した。膜濾過装置は東洋紡エンジニアリング社製SYLS SB04型を用いた。このようにして得られた酸性ムコ多糖類については、セルロースアセテート膜電気泳動法を用いて均一性を確認すると共に、化学分析、核磁気共鳴分析により、本酸性ムコ多糖類であることを確認した。
【００４６】
(実施例２)
前培養までは実施例１と同様に処理し、次いでこの前培養液を５００ｍｌ容の三角フラスコ中に上記組成の培地１００ｍｌ(１２１℃、１５分間滅菌)に接種し、２５℃の温度で3日間の振とう培養を行った。培養後培養液を遠心分離、次いで濾過助剤(ラヂオライト#５００)を用いてＧＦ−７５濾紙(Advantec社製)で濾過し、菌体を除いた上澄液から分子量５万カットの中空糸ＵＦ膜モジュール(Spectrum社製)を備えた膜濾過装置により得られる高分子画分を濃縮、脱塩回収し、活性炭処理し、凍結乾燥により粉末化した。膜濾過装置は東洋紡エンジエアリング社製SYLS SB04型を用いた。このようにして得られた酸性ムコ多糖類については、セルロースアセテート膜電気泳動法を用いて均一性を確認すると共に、化学分析、核磁気共鳴分析により、本酸性ムコ多糖類であることを確認した。
【００４７】
(実施例３)
動物試験
(実験方法)
ヘアレスマウス(Ｈｏｓ:ＨＲ−１)、５週齢、♀、１２匹を１週間予備飼育後、１群３匹とし４群に分け、そのうち３群について紫外線を１日１回、連続背部に照射した。残りの１群は紫外線非照射対照群とした。群設定は以下のとおりである。
１.紫外線照射経口投与群  Ｎ＝３
２.紫外線照射皮膚塗布群  Ｎ＝３
３.紫外線照射対照群      Ｎ＝３
４.紫外線非照射対照群    Ｎ＝３
紫外線照射条件:ＡＴＴＯ社のＨＰ−１５Ｍ型、３１２ｎｍ、１２０ｍｊ／ｃｍ2(約０．２５ｍｗ/ｃｍ2を８分)、マウス背部に照射した。
本酸性ムコ多糖類の経口投与は、朝紫外線照射後に１回と夕方に１回の２回を８日間とした。皮膚塗布投与は、紫外線照射後に１日１回を８日間とした。経口投与は１回１００ｍｇ/ｋｇ、塗布投与は１回２０ｍｇ/ｋｇとした。最終投与日より１日後に安楽死後、背部皮膚を直径８ｍｍの生検トレパンを用いて摘出し摘出後1分以内に−８０℃のＬｉＮ2液に入れて凍結し、遺伝子解析に供した。
(実験結果)
体重の変化
【表１】
2014162748.tif 000006
（Ｎ＝３、平均値±ＳＥ）
表１  本酸性ムコ多糖類投与マウスの体重に及ばす作用
表１に示すように本酸性ムコ多糖類の投与により明らかな体重の変化は認められなかった。
【００４８】
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法によるＨＡＳ３ ｍＲＮＡ発現の解析
マウス背部皮膚組織よりＲＮＡを抽出し、逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを合成した後、以下に示すリアルタイムＰＣＲ法によりＨＡＳ３ ｍＲＮＡ発現を解析した。
検体の品質検定及び前処理:摘出したマウス背部組織からRNAiso Plus(タカラバイオ株式会社製)を用いてＲＮＡを抽出精製し、次いでRNeasy MinElute Cleanup (QIAGEN社製)を用いてカラム精製を実施した後DNaseI処理を行い、再度同様の方法で品質を確認し検体とした。
プライマーの設計と合成: Perfect Real Timeサポートシステム(タカラバイオ株式会社製)により目的遺伝子、標準遺伝子に対するリアルタイムＰＣＲ用のプライマーを設計した。本解析に用いたプライマーは表２に示す。
ｃＤＮＡの合成:前処理後の各検体についてPrimeScript RT reagent Kit(タカラバイオ株式会社製)を用いてｃＤＮＡを合成した。２００ｎｇ当量のトータルＲＮＡを鋳型として、ランダムプライマーを用いてReverse Transcription Reagent(タカラバイオ株式会社製)により４２℃、１時間反応して逆転写反応を行った。
検量線の作成:合成したｃＤＮＡを鋳型として、SYBR Premix Ex Taq II(Perfect Real Time、タカラバイオ株式会社製)を用いてインターカレーター法によるリアルタイムＰＣＲ反応を目的遺伝子および標準遺伝子に対して行った。反応にはThermal Cycler Dice Real Time System(タカラバイオ株式会社製)を使用し、Ｃｔ値は、ＳＤＭ法により算出した。検量線用サンプルを８段階に段階希釈してリアルタイムＰＣＲ反応を行い、得られたＣｔ値と希釈系列から各解析対象遺伝子の検量線を作成した。
各サンプルのＣｔ値の測定:各サンプルともｔｏｔａｌ ＲＮＡ量に換算して４０ｎｇ相当を１反応に用い、Ｎ＝２で反応を行った。得られたＣｔ値と検量線から、各遺伝子の定量値を算出した。各サンプルの相対的なｍＲＮＡ量はアクチンで補正した。
各サンプルについて、標準遺伝子の平均値を指標に目的遺伝子の平均値を標準化することにより、各サンプル中の目的遺伝子の相対定量値を算出した。相対定量値の算出にはソフトウエアMultiplate RQ(タカラバイオ株式会社製)を用いた。本解析に用いたプライマーを表２に示す。
【表２】
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【００４９】
(実験結果)
本酸性ムコ多糖類によるＨＡＳ３ ｍＲＮＡ発現量への影響
紫外線照射した皮膚組織から総ＲＮＡを調製し、ＨＡＳ３ ｍＲＮＡについてリアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより分析した結果を図１に示す。図１から明らかなように、ＨＡＳ３ ｍＲＮＡ発現量は、非照射に比べ照射することにより顕著に亢進した。また光照射したにも関わらず、本酸性ムコ多糖類を経口または皮膚塗布投与した場合は、その発現量が顕著に抑制された。即ち、本酸性ムコ多糖類の非存在下における紫外線照射において発現量が亢進するＨＡＳ３ ｍＲＮＡは、本酸性ムコ多糖類の存在によりその発現量が顕著に抑制され、それにより皮膚の光老化が抑制されていると考えられる。
【受託番号】
【００５０】
なお、本実施例において用いられた上記ＦＥＲＭ Ｐ−２１１０１菌株は、日本国独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター〒３０５−８５６６  日本国茨城県つくば市東1丁目1番地１中央第６に寄託し、平成１８年１１月２０日受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１１０１として受託されたものである。
【産業上の利用可能性】
【００５１】
本発明は、皮膚光老化抑制または改善用などに好適な皮膚外用剤および健康飲食品に応用できる。
【図１】
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