(57)【要約】【課題】天然物中から従来知られていなかった皮膚構成タンパク質分解酵素の阻害活性を有する物質を見出し、これを有効成分とする酵素活性阻害剤を提供することである。【解決手段】ゲットウ（Alpinia zerumbet）抽出物を有効成分とすることを特徴とする酵素活性阻害剤の提供。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゲットウ抽出物を有効成分として含有するコラゲナーゼ、エラスターゼおよびヒアルロニダーゼから選ばれる酵素の活性阻害剤。
【請求項２】
ゲットウ抽出物が、ゲットウの熱水抽出物である請求項１記載の酵素の活性阻害剤。
【請求項３】
次の式（Ｉ）
【化１】
2014136691.tif 000007
（式中、点線は結合の存在または不存在を示す）
で表されるデヒドロカワイン化合物を有効成分として含有する請求項１または２に記載の酵素の活性阻害剤。
【請求項４】
次の式（Ｉａ）
【化２】
2014136691.tif 000008
で表されるジヒドロ−５,６−デヒドロカワインを有効成分とする請求項３記載の酵素の活性阻害剤。
【請求項５】
次の式（Ｉｂ）
【化３】
2014136691.tif 000009
で表される５,６−デヒドロカワインを有効成分とする請求項３記載の酵素の活性阻害剤。
【請求項６】
次の式（ＩＩ）
【化４】
2014136691.tif 000010
で表される８（１７）,１２−ラブダジエン−１５,１６−ジアールを有効成分とする請求項１または２に記載の酵素の活性阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵素の活性阻害剤に関し、更に詳細には、ゲットウ抽出物を有効成分とするコラゲナーゼ、エラスターゼおよびヒアルロニダーゼから選ばれる酵素に対する酵素活性阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚は、慢性的に内因性および外因性の酸化促進物質にさらされており、有害な活性酸素種（ＲＯＳ）の発生が起こり易い。その結果、歳を重ねるごとに肌にシミやシワ等の老化現象が現れてくる。そして、このような老化現象の防止には、酸化ストレスを誘発するフリーラジカルを防御する抗酸化剤は欠かせない物質である。さらに、肌の老化には、コラーゲン、エラスチン、ヒアルロン酸などのタンパク質が深く関わりあっており、これらを分解する酵素の働きを阻害することは、アンチエイジングに不可欠である。
【０００３】
ところで、コラーゲンは、皮膚の細胞外基質を構成するタンパク質であるが、老化現象や長期にわたる紫外線照射の影響により、コラゲナーゼの作用で分解され、この結果、肌にシワやたるみが形成される。また、エラスチンは、コラーゲン線維を支える役割を持つ弾性線維であり、伸縮性に富み皮膚に適度な柔軟性を与えているが、エラスターゼの働きによりエラスチンが分解されると皮膚の弾力性が失われ易い。さらに、ヒアルロン酸は、皮膚、血管、関節等生体中に広く含まれる高分子多糖であり、皮膚の表皮組織で水を保持し、柔軟性や保湿性に役だっている。しかし、ヒアルロニダーゼの活性によりヒアルロン酸が分解されると皮膚が乾燥されて肌に老化をもたらす。
【０００４】
上記のような皮膚の構成タンパク質に関連する酵素を阻害する物質としては、これまでに、アセロラ種子の抽出物（特許文献１）やツバキ属に属する茶花の抽出物（特許文献２）等から得られるコラゲナーゼ活性阻害剤が知られている。また、エラスターゼ活性阻害剤として、大豆タンパク質（特許文献３）や、ツツジ科の植物の抽出物（特許文献４）等が知られている。さらに、ヒアルロニダーゼ活性阻害剤として、ツバキ科チャ属の花からの抽出物（特許文献５）、キツネノマゴ科植物の抽出物（特許文献６）等が知られている。
【０００５】
しかしながら、上記植物抽出物等での酵素活性は、十分に満足がゆくというものではなく、更に皮膚構成タンパク質に対する酵素阻害活性を有する新しい物質の提供が望まれていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００７−３１４５５２
【特許文献２】特開２０１１−１１９９１
【特許文献３】特開２００４−１８２６８７
【特許文献４】特開２００９−１９１０４３
【特許文献５】特開２００８−２８０３１９
【特許文献６】特開２０１１−８４４７２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従って、本発明の課題は、天然物中から従来知られていなかった皮膚構成タンパク質分解酵素の阻害活性を有する物質を見出し、これを有効成分とする酵素の活性阻害剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、従来から、沖縄に自生する植物であるゲットウ（月桃）に着目し、この植物中に含まれる成分の薬理活性について研究を行っていたが、今回新たにゲットウ抽出物中に皮膚構成タンパク質を分解する、コラゲナーゼ、エラスターゼおよびヒアルロニダーゼの酵素活性を阻害する物質が存在することを見出した。
【０００９】
そして更に、本発明者らは、その抽出物の活性本体について解析を進めた結果、次の式（Ｉ）で表されるデヒドロカワイン化合物および次の式（II）で表される８（１７），１２−ラブダジエン−１５,１６−ジアールがコラゲナーゼ、エラスターゼおよびヒアルロニダーゼの高い酵素活性阻害作用を有することを見出した。
【００１０】
【化１】
2014136691.tif 000002
（式中、点線は結合の存在または不存在を示す）
【００１１】
【化２】
2014136691.tif 000003
【００１２】
本発明は、これら知見に基づくものであり、その第一の発明は、ゲットウ抽出物を有効成分として含有するコラゲナーゼ、エラスターゼおよびヒアルロニダーゼから選ばれる酵素の活性阻害剤である。
【００１３】
また、本発明の第二の発明は、上記式（Ｉ）で表されるデヒドロカワイン化合物を有効成分として含有するコラゲナーゼ、エラスターゼおよびヒアルロニダーゼから選ばれる酵素の活性阻害剤である。
【００１４】
更に、本発明の第三の発明は、上記式（ＩＩ）で表わされる８（１７）,１２−ラブダジエン−１５,１６−ジアールを有効成分として含有するコラゲナーゼ、エラスターゼおよびヒアルロニダーゼから選ばれる酵素の活性阻害剤である。
【発明の効果】
【００１５】
本発明のゲットウ抽出物あるいはこれら抽出物に含まれる式（Ｉ）および（ＩＩ）の化合物は、コラゲナーゼ、エラスターゼおよびヒアルロニダーゼから選ばれる酵素の活性に対し優れた阻害作用を有するものである。
【００１６】
従って、本発明のコラゲナーゼ、エラスターゼおよびヒアルロニダーゼから選ばれる酵素の活性阻害剤（以下、「皮膚関連酵素阻害剤」ということがある）は、皮膚外用剤や化粧料等に配合することで、若々しく、みずみずしい肌を維持することができると共に、しわ、たるみ等の防止に有効である。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】ゲットウの各組織からの、水抽出物およびエタノール抽出物の有するコラゲナーゼ活性阻害作用を示す図面である。
【図２】ゲットウ抽出物に含まれるＤＫ、ＤＤＫおよびラブダジエンの有するコラゲナーゼ活性阻害作用を示す図面である。
【図３】ゲットウの各組織からの、水抽出物およびエタノール抽出物の有するエラスターゼ活性阻害作用を示す図面である。
【図４】ゲットウ抽出物に含まれるＤＫ、ＤＤＫおよびラブダジエンの有するエラスターゼ活性阻害作用を示す図面である。
【図５】ゲットウの各組織からの、水抽出物およびエタノール抽出物の有するヒアルロニダーゼ活性阻害作用を示す図面である。
【図６】ゲットウ抽出物に含まれるＤＫ、ＤＤＫおよびラブダジエンの有するヒアルロニダーゼ活性阻害作用を示す図面である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明の第一発明において使用されるゲットウ抽出物は、ゲットウ（月桃）（学名：Alpinia zerumbet）を水、低級アルコールなどの溶媒で抽出したものである。
【００１９】
このゲットウは、ショウガ科ハナミョウガ属（アルピニア属）の多年草で、熱帯から亜熱帯アジアに分布し、日本では沖縄県から九州南部に分布する。ゲットウの葉から取った精油が甘い香を放つので、アロマオイルや香料として使用されており、また、虫よけの効果も知られているものである。沖縄県ではこの葉でムーチー（餅）を包んで蒸すほか、香り付けを兼ねて饅頭の包装に使用したり、肉や魚を包んで蒸し焼きにするなど幅広く利用されている。
【００２０】
ゲットウ抽出物の原料となるゲットウとしては、その６つの組織（根茎、茎、葉、花、果皮、種子）のいずれの組織を使用しても良いが、比活性の点から根茎を抽出原料とすることが好ましい。この抽出原料は、好ましくは、風乾した後、適切な大きさに細断ないし粉砕し、次の抽出行程において使用する。
【００２１】
次いで、上記のように準備した抽出原料に対し、その１０ないし１００重量倍の抽出溶媒を加えた後、２０分ないし２４時間程度抽出を行う。抽出に用いる抽出溶媒としては、水や、エタノール等の低級アルコール、アセトン、酢酸エチル等の溶媒、あるいはこれらの混液等の溶媒（以下、「水性溶媒」という）が好ましい。上記水性溶媒のうち、混液としては、例えば、１０ないし９６％程度の、任意の割合のエタノール−水混液のような混合溶媒であっても良い。
【００２２】
上記の抽出に当たっての抽出温度は、５０ないし１００℃程度が好ましく、抽出中、必要により連続あるいは間欠的に攪拌すればよい。
【００２３】
こうして得られるゲットウの抽出物は、そのままでも使用可能であるが、必要に応じて濾過、遠心分離等により固液分離した後、更に任意で精製し、液状のゲットウ抽出物とし、これを皮膚関連酵素阻害剤として使用することができる。また、更に必要により液状のゲットウ抽出物を凍結乾燥などの手段で乾燥させることで粉末状のゲットウ抽出物とし、これを皮膚関連酵素阻害剤とすることができる。
【００２４】
一方、本発明の第二発明において使用されるデヒドロカワイン化合物（I）は、下式（Iａ）で表されるジヒドロ−５,６−デヒドロカワイン（以下、「ＤＤＫ」と略称する）と、下式（Ｉｂ）で表される５,６−デヒドロカワイン（以下、「ＤＫ」と略称する）より構成される。
【００２５】
【化３】
2014136691.tif 000004
【００２６】
このＤＫ、ＤＤＫは、例えばゲットウ根茎の熱水抽出物から単離精製することができる。
【００２７】
すなわち、例えば、前記したゲットウ抽出物からカラムクロマトグラフィーを用い、例えば、勾配溶離を行うことにより、ＤＫおよびＤＤＫを単離精製することができる。
【００２８】
また、本発明の第三発明において使用される８（１７）,１２−ラブダジエン−１５,１６−ジアール（以下、「ラブダジエン」と略称する）も、例えばゲットウ根茎を抽出原料とする前記の熱水抽出物から、カラムクロマトグラフィーを用い、例えば、勾配溶離等を行うことにより、単離精製することができる。
【００２９】
このようにして得られた、ＤＫ、ＤＤＫおよびラブダジエンも、コラゲナーゼ、エラスターゼおよびヒアルロニダーゼから選ばれる酵素の活性阻害作用を有するので、皮膚関連酵素阻害剤の有効成分として使用することができる。
【００３０】
以上のようにして得られる本発明の皮膚関連酵素阻害剤は、医薬品、医薬部外品の皮膚外用剤や、化粧料、食品、飼料等の有効成分として利用可能である。特に、若々しく、みずみずしい肌を維持するための皮膚外用剤や化粧料として、あるいは皮膚のシワ、たるみ等を有効に抑制する皮膚外用剤や化粧料として用いることができる。
【００３１】
本発明の皮膚関連酵素阻害剤を皮膚外用剤の形態で使用する場合は、これを薬学的に許容される担体や添加剤と組み合わせ、軟膏剤、クリーム剤、乳剤、ゲル剤、ローション剤、貼付剤等の形態に調製すればよい。また、これを化粧料として使用する場合は、公知の化粧料用担体、配合剤、添加剤と適宜組み合わせ、クリーム、乳液、化粧水、ローション、ジェル、美容液、パックなどの基礎化粧品；日焼け止めクリーム、日焼け止めローション、日焼け止めリップクリームなどの日焼け止め化粧料；メイクアップベースクリーム、パウダーファンデーション、リキッドファンデーション、口紅などのメイクアップ化粧料；ハンドクリーム、レッグクリーム、ボディローション、入浴剤などのボディ用化粧料等に調製すればよい。
【００３２】
上記皮膚外用剤や化粧料において任意成分として使用される担体、配合剤、添加剤としては、例えば、界面活性剤、水、油分、アルコール類、保湿剤、増粘剤、安定剤、防腐剤、酸化防止剤、キレート剤、各種アミノ酸類、ｐＨ調整剤、香料、色素、紫外線吸収剤、紫外線散乱剤、顔料等が挙げられ、これらを組みあわせて使用することもできる。
【００３３】
皮膚外用剤や化粧料の調製における皮膚関連酵素阻害剤の添加量は、特に限定されるものではなく、また、皮膚外用剤や化粧料の種類、使用目的によっても異なるが、その有効成分がゲットウ抽出物の場合、その乾燥固形分として約１０〜５００ｍｇであり、好ましくは、約１０〜５０ｍｇである。
【００３４】
また、皮膚関連酵素阻害剤の有効成分が、ＤＫ、ＤＤＫまたはラブダジエンである場合、皮膚外用剤や化粧料の調製におけるその添加量は、ＤＫ、ＤＤＫまたはラブダジエンとして約１０〜５００ｍｇであり、好ましくは、約１０〜５０ｍｇである。
【００３５】
更に、本発明の皮膚関連酵素阻害剤は、上記以外の医薬品、医薬部外品の形態で使用することもできる。この場合の投与形態は、経口であっても非経口であっても良い。経口投与による場合は、通常の経口投与製剤、例えば、錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤等の固形剤；水剤；油性懸濁剤；又はシロップ剤もしくはエリキシル剤等の液剤のいずれかの剤形としても用いることができる。非経口投与による場合には、水性又は油性懸濁注射剤として用いることができる。
【実施例】
【００３６】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００３７】
実  施  例  １
ゲットウ抽出物の取得：
琉球大学（沖縄県中頭群西原町千原１）のキャンパスからゲットウ（Alpinia zerumbet）を採取し、ゲットウの根茎、茎、葉、花、果皮および種子の６つの組織をそれぞれ抽出試料とした。
乾燥重量１０ｇの各組織試料を、ミキサーを用いて粉末にした後、これに水１００ｍＬを加え、約２０分間煮沸して熱水抽出物を作成した。また、乾燥重量１０ｇの試料を同様に裁断した後、９６％エタノール１００ｍＬを加え、７８℃で２４時間浸漬してエタノール抽出物を作成した。
【００３８】
熱水抽出物およびエタノール抽出物をそれぞれ濾過して不溶物を除去し、真空乾燥させた後、固形物を定量し、それぞれを再度水および９６％エタノールに溶解して、抽出物（固形分量）が１０ｍｇ／ｍＬ濃度であるゲットウ抽出物の各サンプルを得た。
【００３９】
実  施  例  ２
ＤＫおよびＤＤＫの単離と定量：
下記方法により、ＤＫおよびＤＤＫをゲットウの根茎から単離した。
【００４０】
すなわち、‘J Agric Food Chem 2011,59:2857-2862頁’に記載された方法により得たゲットウ抽出物を、ＴＳＫゲルＯＤＳ−１００Ｚカラム（１５×０．４６ｃｍ ｉ.ｄ；５μｍ粒子径、東ソー株式会社）を用い、２８０ｎｍで連続的に吸光度を測定しながらＤＫおよびＤＤＫの精製を行った。この精製において、移動相には、０．１％酢酸水溶液（溶媒Ａ）と０．１％酢酸メタノール溶液（溶媒Ｂ）を使用する勾配溶出を採用し、その流速を０．８ｍｌ／ｍｉｎとした。勾配溶出の条件は、１〜１０分の間は、溶媒Ａと溶媒Ｂの１：１混液を用いる定組成溶離、１０〜２０分の間は、溶媒Ｂが８０〜１００％に変化する直線勾配、２０〜３０分の間は、溶媒Ｂが１００％の定組成溶離とした。
【００４１】
ＤＫおよびＤＤＫの定量測定は、ゲットウの６つの組織（根茎、茎、葉、花、果皮および種子）での熱水抽出物およびエタノール抽出物を、上記カラムを用いた時のピーク面積の大きさを測定することで行った。
【００４２】
この結果、ＤＫとＤＤＫは全ての組織に存在することが分かった。特に、根茎の水抽出物には、ＤＫが平均１．２３ｍｇ／ｇと多く含まれていた。果皮の水抽出物には平均１．１５ｍｇ／ｇ、また、根茎のエタノール抽出物には平均１．１４ｍｇ／ｇのＤＫが含まれている事が分かった。
【００４３】
一方、ＤＤＫは、果皮の水抽出物に多く含まれ、平均０．８５ｍｇ／ｇであった。また、根茎の水抽出物には、平均０．６２ｍｇ／ｇのＤＤＫが含まれていた。ゲットウ抽出物から単離したＤＫおよびＤＤＫの定量結果を表１に示す。
【００４４】
【表１】
2014136691.tif 000005
【００４５】
実  施  例  ３
ラブダジエンの単離と定量：
ラブダジエンはFood Chem 2011, 129:709-715頁に記載された方法により、２３５ｎｍの吸光度を測定しながらＴＳＫゲルＯＤＳ−１００Ｚカラムを用いて単離した。
具体的には、移動相に、０．１％酢酸水溶液（溶媒Ａ）と０．１％酢酸メタノール溶液（溶媒Ｂ）を使用し、流速を０．８ｍｌ／ｍｉｎとする勾配溶出により分離を行った。
この勾配溶出の条件は、０〜１０分の間は、溶媒Ａと溶媒Ｂの１：４混液を使用する定組成溶離、１０〜２０分の間は、Ｂ溶媒が８０〜１００％に変化する直線勾配、２０〜４０分の間は、溶媒Ｂが１００％である定組成溶離とした。
【００４６】
ラブダジエンの定量測定は、ゲットウの６つの組織（根茎、茎、葉、花、果皮および種子）での水抽出物およびエタノール抽出物を用いて、上記カラムを用いた時のピーク面積の大きさを測定することで行った。
【００４７】
この結果、種子のエタノール抽出物および水抽出物には、ラブダジエンがそれぞれ平均１．００ｍｇ／ｇおよび０．９６ｍｇ／ｇ含まれていた。また、根茎の水抽出物には、平均０．８１ｍｇ／ｇ、果皮の水抽出物には平均０．７５ｍｇ／ｇのラブダジエンが含まれていた。
一方、茎、葉、花の抽出物にはラブダジエンは含まれていなかった。
ゲットウ抽出物から単離したラブダジエンの定量結果を表２に示す。
【００４８】
【表２】
2014136691.tif 000006
【００４９】
実  施  例  ４
コラゲナーゼ活性阻害試験：
ゲットウ抽出物および同抽出物から単離したＤＫ、ＤＤＫ、ラブダジエンについて、コラゲナーゼ活性阻害試験を行った。
コラゲナーゼ活性阻害試験は、Analyt Biochem 1981, 113:356-365頁に記載された方法、すなわちコラゲナーゼがＮ−［３−（２−フリル）アクリロイル］−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ（ＦＡＬＧＰＡ）を加水分解し、ＦＡ−ＬｅｕとＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａを生成する方法を用いて行った。
この試験では、緩衝液として５０ｍＭトリシン緩衝液（４００ｍＭＮａＣｌおよび１０ｍＭ ＣａＣｌ２、ｐＨ７．５）を用いた。
【００５０】
ヒストリチクム菌（Clostridium histolyticum;ＣｈＣ）由来のコラゲナーゼを緩衝液で溶解し、その濃度が０．８ｕｎｉｔｓ／ｍｌの酵素溶液を調整した。
ＦＡＬＧＰＡ合成基質をトリシン緩衝液中に加え、これを２ｍＭに調整して合成基質液とした。試料抽出物を種々の濃度で酵素溶液中に加えて１５分間インキュベートした後、ＦＡＬＧＰＡ合成基質液を加えて反応を開始させた。なお、最終的な反応混合溶液は、トリシン緩衝液、０．８ｍＭＦＡＬＧＰＡ、０．１ユニットＣｈＣおよび２５μｇ試料が含まれ、１５０μｌであった。基質を入れてから２０分後にコラゲナーゼ活性を３４０ｎｍの吸光度で測定した。
陽性コントロールとしては、オレアノール酸を使用した。
上記した試験の結果から、酵素活性阻害率（％）を以下の式で計算し、ＩＣ５０値を求めた。
【００５１】
[数１]
酵素活性阻害率（％）＝（１−Ｂ／Ａ）×１００
Ａ：試料を含まないときの酵素活性
Ｂ：試料を添加したときの酵素活性
【００５２】
この結果、ゲットウ果皮の水抽出物のＩＣ５０値は、平均４５．６７μｇ／ｍｌであった。ゲットウ抽出物におけるコラゲナーゼ活性阻害試験の結果を図１に示す。
【００５３】
また、ゲットウ抽出物から単離したＤＫ、ＤＤＫおよびラブダジエンのコラゲナーゼ活性阻害試験の結果を図２に示す。ＤＫが高いコラゲナーゼ活性阻害作用を有することが分かった。
【００５４】
実  施  例  ５
エラスターゼ活性阻害試験：
ゲットウ抽出物および同抽出物から単離したＤＫ、ＤＤＫ、ラブダジエンについて、エラスターゼ活性阻害試験を行った。
エラスターゼ活性阻害試験は、Biochemistry 1996, 35:9090-9096頁に記載された方法を少し改良して行った。
エラスターゼ活性の基質には、Ｎ−ｓｕｃｃ−（Ａｌａ）３−ニトロアニリド（ＳＡＮＡ）を使用し、阻害活性は、エラスターゼがＳＡＮＡを切断することよって遊離するｐ−ニトロアニリンの色の強度により測定した。
【００５５】
０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）を用いて、１ｍＭ ＳＡＮＡを調整しこれを基質液とした。試料溶液はＩＣ５０を求めるために各濃度になる様に調製した。
まず、試料溶液２０μｌに１ｍＭ ＳＡＮＡ（基質液）２００μｌを加え、ボルテックスで混合し、１０分間２５℃でプレインキュベートした。その後、豚の膵臓に由来するエラスターゼ２０μｌ（０．０３ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）を上記混合溶液に加え、よく混合した後、１０分間２５℃の恒温槽に入れ反応させた。その後、吸光度を４１０ｎｍで測定した。なお、陽性コントロールとしてはオレアノール酸を使用した。
上記の結果から、酵素活性阻害率（％）を以下の式で計算し、ＩＣ５０値を求めた。
【００５６】
[数２]
酵素活性阻害率（％）＝（１−Ｂ／Ａ）×１００
Ａ：試料を含まないときの酵素活性
Ｂ：試料を添加したときの酵素活性
【００５７】
この結果、ゲットウ根茎の水抽出物のＩＣ５０値は、平均５７．４３μｇ／ｍｌであった。ゲットウ抽出物におけるエラスターゼ活性阻害試験の結果を図３に示す。
【００５８】
また、ゲットウ抽出物から単離したＤＫ、ＤＤＫおよびラブダジエンのエラスターゼ活性阻害試験の結果を図４に示す。ＤＫおよびＤＤＫは、高いエラスターゼ活性阻害作用を有することが分かった。
【００５９】
実  施  例  ６
ヒアルロニダーゼ活性阻害試験：
ゲットウ抽出物および同抽出物から単離したＤＫ、ＤＤＫ、ラブダジエンについて、ヒアルロニダーゼ活性阻害試験を行った。
ヒアルロニダーゼ活性阻害試験は、酸性溶液中のタンパク質を沈殿させる、J Med Plant Res 2009, 3:914-920頁に記載された方法により行った。
【００６０】
具体的には、各試料１０μｌにウシ由来のヒアルロニダーゼ（１．５０ｕｎｉｔｓ／１００μｌ）１００μｌ、７７ｍＭ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）１００μｌ、および０．０１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）１ｍｌ加え、１０分間３７℃でプレインキュベートした。
この混合溶液に、鶏冠由来の０．０３％ヒアルロン酸ナトリウム塩１００μｌ（３００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５．３５）を加え、４５分間、３７℃でインキュベートした。
ヒアルロニダーゼ未消化のヒアルロン酸が、２４ｍＭ酢酸ナトリウム及び７９ｍＭ 酢酸の溶液（ｐＨ３．７５）に０．１％ＢＳＡを加えて調製される酸アルブミン溶液中で沈殿する反応を利用し、１ｍｌ酸アルブミン溶液中の沈殿ヒアルロン酸量からヒアルロニダーゼ活性阻害を調べた。
１０分間室温で放置して吸光度を６００ｎｍで測定した。オレアノール酸を陽性コントロールに使用した。
上記結果から、酵素活性阻害率（％）を以下の式で計算し、ＩＣ５０値を求めた。
【００６１】
[数３]
酵素活性阻害率（％）＝（１−Ｂ／Ａ）×１００
Ａ：試料を含まないときの酵素活性
Ｂ：試料を添加したときの酵素活性
【００６２】
この結果、ゲットウ根茎の水抽出物のＩＣ５０値は、平均３５．０２μｇ／ｍｌであった。ゲットウ抽出物におけるヒアルロニダーゼ活性阻害試験の結果を図５に示す。
【００６３】
また、ゲットウ抽出物から単離したＤＫ、ＤＤＫおよびラブダジエンのヒアルロニダーゼ活性阻害試験の結果を図６に示す。ＤＫが高いヒアルロニダーゼ活性阻害作用を有することが分かった。
【産業上の利用可能性】
【００６４】
本発明の酵素活性阻害剤は、皮膚のシワやたるみ等のアンチエイジングに関わる化粧品や医薬品の分野において利用することができる。
従って、新たな化粧品、医薬品等の開発に極めて有効なものである。
以    上
【図１】
2014136691.tif 000011
【図２】
2014136691.tif 000012
【図３】
2014136691.tif 000013
【図４】
2014136691.tif 000014
【図５】
2014136691.tif 000015
【図６】
2014136691.tif 000016