(57)【要約】【課題】  フィルターを使用することによって細胞を分離する、特別の熟練なしに容易に実施可能な分離用の器具であって、細胞の回収率を改善できる器具を提供する。【解決手段】    一端に試料導入口を備えた筒状体からなる細胞分離構造体であって、その他端に重力方向に平行な貫通孔を形成したフィルターを備えることを特徴とする細胞分離構造体により課題を解決し、目的細胞等を安定的に、高い回収率で回収可能とする。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
一端に試料導入口を備えた筒状体からなる細胞分離構造体であって、その他端に重力方向に平行な貫通孔を形成したフィルターを備えることを特徴とする細胞分離構造体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、液体試料から目的とする細胞を分離する細胞分離構造体と当該分離構造体を用いた分離方法に関するものであり、特に好適には体液、分散組織標本又は培養液のような細胞を含む試料から細胞を分離し、濃縮するための細胞分離構造体及び分離方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
体液や細胞培養液等の生物学的液体から、又は、組織を懸濁・分散した分散組織標本から細胞のみを分離し、分離した細胞を臨床診断や治療へ応用する研究が進められている。例えば、血液や組織から分離した腫瘍細胞について、形態学的分析や組織型分析を行い、その知見に基づいて治療薬を選定することが挙げられる。
【０００３】
血液等から細胞を分離する（濃縮する）方法として、細胞のサイズや形態（形状）の違いを利用する方法が知られている。例えばＩＳＥＴ法（Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｓｉｚｅ  ｏｆ  Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｔｕｍｏｒ  Ｃｅｌｌ）は、白血球に比較してサイズが大きな上皮性腫瘍細胞をフィルターで分離する方法で、一例を述べれば、孔径８μｍのポリカーボネートメンブレンフィルターによって血液から腫瘍細胞を分離する方法である（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｒｏｓｔａｇｎｏ  Ｐら、Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒａｒｅ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  ａｎｄ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｂｙ  ＤＮＡ  ｃｏｎｔｅｎｔ：ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ａｎ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｍｏｄｅｌ．、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １７（４Ａ）：２８４１−５、１９９７年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ＩＳＥＴ法等では、重イオン照射後にエッチングを行って形成した孔を有するポリカーボネートメンブレンフィルター等を使用することや、真空ポンプに接続した容器を用いて吸引によって細胞を分離することから、特別の熟練がなくとも容易に実施可能で、しかも安価であるという特徴を有する。しかし、例えば上皮性腫瘍細胞の分離については、分離操作後に回収できる細胞数が５０から６０％程度であり、いまだ改善の余地が残されている。
【０００６】
そこで本発明の目的は、フィルターを用いて細胞を効率的に分離（回収）し得る細胞分離構造体を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
前記目的に鑑みて完成された本発明は、一端に試料導入口を備えた筒状体からなる細胞分離構造体であって、その他端に重力方向に平行な貫通孔を形成したフィルターを備えることを特徴とする細胞分離構造体である。また本発明は、かかる細胞分離構造体を使用する細胞分離方法である。以下、図面に基づき本発明を詳細に説明する。
【０００８】
図１は、本発明の一態様を示した図である。本例では、細胞分離構造体は概円筒の筒状体１であり、その一端は、貫通孔４を形成したキャップ２で密閉されている。筒状体の寸法や形状について特に制限はないが、必要に応じて遠心分離操作や吸引操作によって細胞の分離を行う可能性や製造及び保管の容易性等を考慮すると、多角形状や円筒が特に好ましい。
【０００９】
筒状体１及びキャップ２は、アクリル、エポキシ、ポリスチレン等の樹脂、酸化ケイ素を主成分とした合成石英（ＳｉＯ２）、セラミックス又は金属系材料等で構成することができるが、加工性や経済性の観点、そして特に血液等の生体試料を使用した後の廃棄性の問題からポリプロピレン、ポリスチレン樹脂の熱可塑性樹脂が好ましい。また、分離構造体の内面（試料が接触し得る面）は、目的とする細胞等の非特異的な吸着を防止する観点から親水性であるか、又は、別途の処理により親水化可能なものであることが好ましい。親水化のための処理は、特に制限されず、樹脂であれば、例えばコロナ放電処理により樹脂表面の表面エネルギーを活性化してカルボニル基等の極性基を生成して親水化する方法や、また例えば酸素プラズマ処理により電子、イオン、ラジカルを表面に照射し、-ＣＯＯＨや-ＣＯを導入して表面の親水性を向上させる方法を例示できる。また例えば、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリ（ヒドロキシアルキル）メタクリレート、ポリアクリルアミド、ＭＰＣポリマーなどの親水性ポリマーを塗布して表面を親水化する方法を例示できる。
【００１０】
キャップ２は、本例では筒状体１に脱着可能に取りつける態様としたが、特に樹脂を材料とする場合には、両者を一体的に成型しても良い。なお脱着可能に取りつける場合、筒状体へ挿入する形式の他、ねじ込み式、シール式などを例示できる。
【００１１】
筒状体１の一端には、試料を導入するための試料導入口４が設けられる。本例のように、キャップ２を使用して筒状体の端を形成する場合、試料導入口４は当該キャップに設ければ良い。また前記したように、端を有する筒状体を一体成型する場合には当該端に、試料導入口を設ければ良い。試料導入口は、例えばピペット等の分注手段によって試料導入を行う場合には単なる貫通孔で良いが、試料の入った採血管や試験管を直接接続できるように、例えばこれら管の管縁を挟持する凹凸を形成し、図２に示したように採血管２１等が接続されると管内の試料が漏洩することなく筒状体に導入される構成としても良い。
【００１２】
筒状体１の他端は、重力方向に平行な貫通孔を形成したフィルター３を備える。フィルターに形成する貫通孔は、開口部が円形となるものが好ましく、その孔径は１から２０μｍ、好ましくは１から１０μｍ、特に好ましくは２から８μｍである。孔径が１μｍより小さいとフィルターに目詰まりが発生し、吸引や遠心操作を併用する場合には細胞が破壊されることがある。一方で１０μｍより大きくなると、例えば血液を試料とする場合に血球、血漿又は血清と目的とする細胞との分離が悪化することがある。貫通孔の数や配置については特に制限はないが、多数の貫通孔を設けることが細胞分離効率を向上する上で好ましい。多数の貫通孔を設ける場合、貫通孔間の距離（ある貫通孔の開口部の中心から、他の貫通孔の開口部の中心点までの距離）を等間隔とすることが好ましい。貫通孔間の距離は貫通孔の孔径を考慮して適宜決定することができるが、２０μｍ以上とすることを例示できる。より具体的には、例えば孔径が８から１０μｍである場合には、貫通孔間の距離を５０μｍ程度とすることが特に好ましい。
【００１３】
上記説明した貫通孔を形成したフィルターは、具体的に例えば、電鋳技術を用いて貫通孔を形成したニッケル基板や、レーザー技術を用いて貫通孔を形成したガラスや石英基板を例示できる。いずれの技術によっても、ニッケル基板等に意図した通りの貫通孔を形成することができる。
【００１４】
フィルターは、親水性であることが好ましい。かかる性質により、試料に含まれる成分の吸着が防止され、目詰まり等が発生し難いからである。この目的のためには、本来親水性である材料でフィルターを製造しても良いし、その表面を任意の処理によって親水化しても良い。表面親水化のための処理に特別の制限はなく、樹脂であれば例えばコロナ放電処理によって表面を活性化しカルボニル基等の極性基が生成する処理が例示できる。またプラズマ処理では、電子、イオン又はラジカルといった活性種のプラズマで表面を親水化する処理が例示できる。またポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリ（ヒドロキシアルキル）メタクリレート、ポリアクリルアミド、ＭＰＣポリマー等の親水性ポリマーを塗布して表面を親水化する方法、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）やＯＶＡ（卵白オボアルブミン）等のタンパク質溶液に浸漬して表面を親水化する方法も例示できる。
【００１５】
次に、上記説明した細胞分離構造体を使用して細胞を分離する分離方法について説明する。本発明は、尿、血液、血漿、血清、唾液、精液、糞便、痰、髄液、羊水等の生体試料、細胞の凝集物、腫瘍、リンパ節又は動脈といった器官や組織に由来する試料、細胞培養液等の試料に含まれる細胞を分離するために使用することができる。器官や組織については、通常の処理に従って細胞懸濁液を調製後、分離を行えば良い。なお本明細書において、目的とする細胞の分離は当該細胞の濃縮と同義である。すなわち、細胞以外の成分から分離した細胞等を回収することは目的とする細胞の濃縮にほかならない。
【００１６】
前記した細胞分離構造体を用いて細胞を分離する前に、必要に応じて試料を前処理することが好ましい。前処理としては、不要な細胞を除去するためのもの、例えば不安定な（一定の形状をとらない）細胞の形状を固定するためのもの、例えば試料調整時又は長時間の試料保管中に変形等した細胞の修復のためのもの、目的の細胞を修飾することによって他の成分との相違をより明確にするためのもの等、種々のものが例示できる。不要な細胞を除去するための前処理について具体的に例示すれば、例えば血液を試料とし、赤血球以外の細胞を分離する場合、試薬として溶血剤を使用して赤血球を溶血することが例示できる。不安定な細胞の形状を固定するための前処理について具体的に例示すれば、例えばパラホルムアルデヒド、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、アクロレイン、メタノール、エタノール、プロパノール、ポリエチレングリコール、タンニン酸等を使用してその固定を行うことが例示できる。目的の細胞を修飾することによって他の成分との相違をより明確にするための前処理について具体的に例示すれば、例えば目的とする細胞を修飾してその大きさを変化させ、他の成分との相違をより明確にすることが例示できるが、この目的のためには、例えば、目的とする細胞に特異的に結合する物質と任意の物質（サイズを変化させるためのものや、立体的な形状を変化させるものの両者又はいずれかをいう）の結合物等を使用することが例示できる。このような前処理は、予め試料に前処理用の試薬を混合して実施することもできるが、筒状体に予め前処理用の試薬を投入しておき、試料を筒状体に導入した段階で反応が生じるようにしても良い。後者の場合には、前処理の最中にフィルターを通過して試料が筒状体外に漏洩しないよう、フィルターを密閉する等すると良い。
【００１７】
前処理については、例えば図３に示すように、目的とする細胞３１に特異的に結合する結合する結合物質を担持した任意の物質（サイズの大きな担体３２）を使用して、これを試料と混合することにより、目的とする細胞と任意の物質との複合体を形成させ、サイズや形状が似通った他の細胞との相違を明確にするのである。これにより、目的とする細胞を他の細胞からより確実に分離し回収することが可能である。なお、特異的な結合物質や任意の物質を使用した場合、目的とする細胞を分離、回収した後にそれらを除去するには、例えばｐＨの調整、特異的な結合物質の酵素的切断等、従来の手法に従うことが例示できる。
【００１８】
上記任意の物質３２としては、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリビニルクロリド、ポリアクリロニトリル、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリカルボネートなどのポリビニル化合物に代表される有機ポリマーおよびポリスチレンラテックス、ナイロン、ポリテレフタレートなどの共重合体、あるいはガラス、シリカ、ジルコニアなどの無機材料、セルロース、デキストラン、アガロース、セルロース、セファロースやそれらの組合せが例示できる。また目的とする細胞に特異的に結合する物質としては、例えば抗体、抗原、ペプチド、ポリペプチド、成長因子、サイトカイン、レクチン等を例示できる。
【００１９】
必要により前処理を実施した後、試料を導入した筒状体に対し、ポンプ等の通常の手段によって加圧又は負圧を与える。これにより、目的とする細胞はフィルターを通過せずにその上部に捕捉され、その他の成分はフィルターを通過し、両者は分離される。場合によってはポンプ等の手段を使用せずとも、重力によって両者は分離される。分離された細胞は、例えばフィルター下部を密閉した上で緩衝液等を筒状体に投入し、再懸濁液として回収すれば良い。
【発明の効果】
【００２０】
本発明の細胞分離構造体は、筒状体１の端が重力方向に平行な貫通孔を形成したフィルターを備えるものである。そしてこの特徴的なフィルターにより、細胞の分離操作時に細胞が受けるダメージが低減され、結果として分離操作によって回収できる細胞数が従来技術と比較して大きく改善する。
【００２１】
本発明の細胞分離構造体は、その製造においては大量生産が可能で、低価格で提供し得るものである。またその使用にも特別の熟練を必要としない。この結果、例えば血液試料中に存在する特定細胞の分離、回収といった作業を、安価かつ簡便に実施可能とするものである。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】本発明の細胞分離構造体を説明するための図である。
【図２】本発明の細胞分離構造体を用いる細胞分離方法を説明するための図である。
【図３】本発明の細胞分離構造体を用いる細胞分離方法を説明するための図である。
【図４】本発明の実施例で実施した細胞の測定方法を説明するための図である。
【図５】本発明の細胞分離構造体を用いて実施した細胞分離の結果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
以下、本発明を実施例に基づいて更に詳細に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００２４】
実施例１
図１に示した態様の分離構造体を使用して、上皮系のがん細胞（平均直径約１５μｍ）の分離を行った。分離構造体は、詳細には、筒状体１は内径Φ２７ｍｍ、縦７０ｍｍ、容量３５ｍＬの円筒状のポリプロピレン製部材である。部材の内面にはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）をコーティングし、親水化することで細胞等の非特異吸着を防止してある。またキャップ２はポリプロピレン製で、筒状体１に挿入するタイプであり、試料導入口は内径Φ８ｍｍ、導入口の外周には採血管、試験管が直接接続できるよう、管の接続部の外径Φ２２ｍｍ、管縁を挟持する深さ９ｍｍ、幅７ｍｍの溝を設けている。また管を導入口の奥まで接続した際に管内の試料が漏洩しないよう管縁を固定するための横溝（１ｍｍ）を設けてある。
【００２５】
筒状体１の一端に装着したフィルターは、直径１３ｍｍ、厚さ１５μｍのニッケル基板に電鋳技術を用いて直径８μｍの垂直孔を、基板全面に渡って５０μｍ間隔で設けてある（フィルターに設けた孔の総数は、合計で約５．２万個である）。この孔径は、目的とする上皮系がん細胞の平均直径と、当該細胞が毛細血管を巡り体内を循環する、変形能の高い細胞であることを考慮して決定したものである。
【００２６】
血液試料は、インフォームドコンセントを得て取得した健常者血液に約３０個のヒト乳がん細胞（ＳＫＢＲ３）を懸濁した懸濁液（５ｍＬ）である。当該がん細胞は、細胞密度が約２×１０５個/ｃｍ２になるように静置培養後、０．２５％トリプシン／１ｍＭ ＥＤＴＡにより細胞をディッシュから剥離し、限界希釈により調整した。
【００２７】
血液試料をキャップに設けた試料導入口に直接接続し、予め塩化アンモニウムを主成分とする溶血剤を投入した筒状体に導入した。筒状体の端に設けたフィルターを密閉した状態で筒状体を振動させて血液試料の前処理（溶血処理）を行った後、フィルター下部に吸引ポンプを接続し、筒状体の下方から種々の速度で血液試料を吸引してがん細胞をフィルター上に捕捉した。続いて、ＥＤＴＡを含む３００ｍＭのマンニトール水溶液を３ｍＬずつ２回、試料導入口から筒状体に投入し、フィルター上に捕捉した細胞を洗浄後、１．２ｍＬのＥＤＴＡを含む３００ｍＭのマンニトール水溶液を添加して細胞を懸濁し、筒状体の試料導入口から吸引、回収した。なお、以上の操作は２０分で完了し、目的とする細胞がダメージを受けないように配慮した。
【００２８】
図４に示した装置を使用して、分離された細胞が目的とするヒト乳がん細胞であることを確認した。図４の装置は、電源４１、電極基板４２及び４３を有し、基板間に電圧を印加することにより細胞４４に誘電泳動力４５を作用させ、保持孔４６内に導入し捕捉するものである（特許第４９１０７１６号公報参照）。前記のようにして分離した細胞の懸濁液に、がん細胞を特異的に蛍光染色する試薬（株式会社同仁化学研究所製、商品名ＣａｌｃｅｉｎＡＭ）を添加し、この装置に供して保持孔に捕捉した細胞を蛍光顕微鏡４７で観察した。
【００２９】
吸引速度（ｍＬ／ｍｉｎ）と目的とするがん細胞の回収率の関係を図５に示す。流速を１、３、４、５、６又は８ｍＬ／ｍｉｎとした結果、４から６ｍＬ/ｍｉｎの条件では８２．５％と高い回収率が達成でき、従来の５０から６０％という回収率を大きく改善することができた。
【符号の説明】
【００３０】
１：筒状体
２：キャップ
３：フィルター
４：細胞導入口
２１：採血管
３１：目的とする細胞
３２：担体
４１：交流電源
４２：上部電極基板
４３：下部電極基板
４４：細胞
４５：誘電泳動力
４６：保持孔
４７：蛍光顕微鏡
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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