(57)【要約】【課題】正常細胞と癌細胞との共培養系を利用した抗癌剤のスクリーニング方法の提供。【解決手段】正常細胞と、当該正常細胞の起源となる組織と同一組織由来の癌細胞との共培養物に被検物質を接触させ、当該接触後の癌細胞の挙動又は状態を指標として癌を抑制する物質を選択することを特徴とする抗癌剤のスクリーニング方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
正常細胞と、当該正常細胞の起源となる組織と同一組織由来の癌細胞との共培養物に被検物質を接触させ、当該接触後の癌細胞の挙動又は状態を指標として癌を抑制する物質を選択することを特徴とする抗癌剤のスクリーニング方法。
【請求項２】
正常細胞が胃粘膜正常細胞である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
癌細胞の挙動又は状態が、癌細胞に対する細胞毒性、癌細胞の正常細胞への浸潤能、癌細胞の遊走能及び癌細胞の代謝能からなる群から選択される少なくとも１つである請求項１に記載の方法。
【請求項４】
胃粘膜正常細胞がRGM-1細胞である請求項２に記載の方法。
【請求項５】
癌細胞が胃粘膜正常細胞由来の癌様細胞である請求項１に記載の方法。
【請求項６】
胃粘膜正常細胞由来の癌様細胞がRGK-1細胞である請求項５に記載の方法。
【請求項７】
胃粘膜正常細胞であるRGM-1細胞及び当該RGM-1細胞を変異処理させた癌様細胞であるRGK-1細胞を含む、抗癌剤のスクリーニング用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、正常細胞と癌細胞との共培養系を利用した抗癌剤のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
胃粘膜正常細胞及びその癌様変異株は、消化器系抗癌剤のスクリーニングに有用と考えられる。一般に、抗癌剤のスクリーニングを、癌細胞培養系を用いて行うときは、独立した癌細胞培養系にスクリーニングの対象となる候補物質を添加して、癌細胞の動向や状態（増殖、壊死、アポトーシスの有無等）を検査する。
しかしながら、実際の組織では癌細胞と正常細胞とが共生しているため、別個の培養系よりも両者が共存した状態、すなわち、より生理的な状態で評価することが好ましい。
他方、胃粘膜への薬物の作用や胃粘膜障害を引き起こす可能性を評価する方法として、第4528978号特許（特許文献１）、第4280622号特許（特許文献２）、その他非特許文献１〜２などが知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】第4528978号特許
【特許文献２】第4280622号特許
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Potent in vitro and in vivo antitumor effects of MDM2 inhibitor nutlin-3 in gastric cancer cells. Endo S, Yamato K, Hirai S, Moriwaki T, Fukuda K, Suzuki H, Abei M, Nakagawa I, Hyodo I. Cancer Sci. 2011 Mar;102(3):605-13.
【非特許文献２】Apoptosis signal-regulating kinase-1 inhibitor as a potent therapeutic drug for the treatment of gastric cancer. Hayakawa Y, Hirata Y, Sakitani K, Nakagawa H, Nakata W, Kinoshita H, Takahashi R, Takeda K, Ichijo H, Maeda S, Koike K. Cancer Sci. 2012 Oct 30.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、２種類の細胞系を同じ環境で培養し、抗癌剤の効果を検討するより生理的なスクリーニング系を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、胃粘膜正常細胞と癌細胞とを共培養すると、各細胞が集団を形成し、２種類の細胞が混じり合うことなく正常細胞と癌細胞とが境界を形成し、同一環境下でも別個に生存することを見出した。本発明者はこの知見を利用して、共細胞系にスクリーニングの対象となる候補物質を添加して、各細胞の動向の経時変化を観察することにより、より生理的条件下において抗癌剤をスクリーニングし得ることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は、正常細胞と、当該正常細胞の起源となる組織と同一組織由来の癌細胞との共培養物に被検物質を接触させ、当該接触後の癌細胞の挙動又は状態を指標として癌を抑制する物質を選択することを特徴とする抗癌剤のスクリーニング方法である。
正常細胞としては、例えば胃粘膜正常細胞が挙げられ、胃粘膜正常細胞は、具体的にはRGM-1細胞であることが好ましい。
【０００８】
本発明において、癌細胞の挙動又は状態は、癌細胞に対する細胞毒性、癌細胞の正常細胞への浸潤能、癌細胞の遊走能及び癌細胞の代謝能からなる群から選択される少なくとも１つである。
癌細胞としては、胃粘膜正常細胞由来の癌様細胞が挙げられる。胃粘膜正常細胞由来の癌様細胞は、RGK-1細胞であることが好ましい。
さらに、本発明は、胃粘膜正常細胞であるRGM-1細胞及び当該RGM-1細胞を変異処理させた癌様細胞であるRGK-1細胞を含む、抗癌剤のスクリーニング用キットである。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、正常細胞と癌細胞との共培養系が提供される。本発明によれば、培養細胞系による抗癌剤のスクリーニングを、より生理的に比較検討することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】EGFPを発現させるためのpCAGFPベクターを示す図である。
【図２】RGM-1細胞とRGK-1細胞との共培養系に紫外線を照射した後のフローサイトメトリー解析結果を示す図である。
【図３】RGM-1とRGK-1との共培養後の各細胞集団の形成を示す図である。
【図４】KusabiraOrangeで蛍光標識したRGK-1の動きを示す図である。
【図５】RGK-1の１時間ごとの移動距離を示す図である。
【図６】RGKの９時間後の累積移動距離（μｍ）を表す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明を詳細に説明する。
１．概要
本発明は、正常細胞と、当該正常細胞の起源となる組織と同一組織由来の癌細胞との共培養系に関するものであり、培養細胞系による抗癌剤のスクリーニングを、生理的に近い条件で比較検討することができる方法に関する。
本発明は、正常細胞と、当該正常細胞の起源となる組織と同一組織由来の癌細胞とを、同じ培養容器内、すなわち同一環境下で培養し、この培養系に抗癌剤の候補となり得る各種被検物質を接種した後の癌細胞に対する細胞毒性、浸潤能及び遊走能等に与える影響を、正常細胞と同時に比較検討するというものである。
【００１２】
正常膜細胞と、当該正常細胞の起源となる組織と同一組織由来の癌細胞とを同一培養容器内で培養すると、意外にも両者は混在せずに正常細胞同士及び癌細胞同士で細胞集団となり、正常細胞集団と癌細胞集団との間に境界が形成されて、それぞれの細胞集団が個別に生存することが判明した。従って、この共培養系にスクリーニングの候補となる被検物質を添加することにより、正常細胞と癌細胞とを別個独立して評価することができる。
例えば、正常培養細胞に蛍光色素１（例えば緑色蛍光タンパク質）、癌細胞培養系に蛍光色素１とは別の蛍光色素２（例えば赤色蛍光タンパク質）を安定発現する共培養系を作製し、この共培養系に抗癌剤の候補となる被検物質を添加して、これらの色素の蛍光強度などを測定することにより、当該被検物質が正常細胞及び癌細胞にどのような影響を及ぼすかを判定することができる。その結果、癌細胞は死滅し又はアポトーシス等を起こすが正常細胞は死滅等は起こさずに生存した場合は、候補物質は抗癌剤として選択することができる。
【００１３】
２．正常細胞
本発明において使用される正常細胞は、特に限定されるものではなく、任意に選択することができる。例えば、線維芽細胞、胃粘膜細胞、血管内皮細胞、正常上皮細胞、正常骨芽細胞、正常星状膠細胞、正常脂肪細胞、正常軟骨細胞、正常血液細胞、正常筋細胞、正常角化細胞、正常色素細胞などが挙げられる。
胃粘膜細胞を例に説明する。
胃壁は、内側から粘膜層、粘膜下層、筋層からなっており、このうち、本発明において使用される正常細胞は、粘膜層における胃粘膜細胞である。本発明においては、胃粘膜から採取された上皮細胞でもよく、樹立された上皮細胞株でもよい。胃粘膜細胞は、形態的に被蓋上皮細胞として培養系では単層に培養されコンタクトインヒビションによって増殖が制限されるという性質を有する上皮細胞であり、ムチンを産生性があってもなくてもよい。
【００１４】
樹立された細胞株としては、ラット由来の胃粘膜上皮細胞であるRGM-1細胞（本明細書において、単に「RGM-1」ともいう）、ヒト由来の胃粘膜細胞上皮細胞である細胞などが挙げられるが、RGM-1細胞が好ましい。
RGM-1細胞株は、独立行政法人理化学研究所細胞バンクに細胞番号RCB0876として寄託されている公知の細胞株である（In Vitro Cell.Dev.Biol.-Animal 32:259-261,May 1996）。
【００１５】
３．癌細胞又は癌様細胞
本発明において使用される癌細胞は、前記正常細胞の起源となる組織と同一組織由来の癌細胞又は癌様細胞を使用する。その種類は限定されるものではないが、起源となる正常細胞に応じて、消化器系癌細胞、中でも胃癌細胞、大腸癌細胞、膵癌細胞、胆管癌細胞、肝細胞癌細胞などを選択することができる。正常細胞の起源となる組織と同一組織由来の癌細胞又は癌様細胞を当該正常細胞とともに培養しても、正常細胞集団と癌細胞集団との間に境界が形成されて、それぞれの細胞集団が個別に生存できる理由は、細胞表面の接着タンパク質の種類や性質、そこから細胞内に導入されるシグナル伝達機構が、正常細胞と、その起源となる組織と同一組織由来の癌細胞又は癌様細胞(正常細胞)との間で類似であるか又は一部違いを有することによるものである。従って、そのような性質を有する限り、正常細胞と癌細胞との組み合わせに限定されるものではない。
【００１６】
本発明においては、上記胃粘膜上皮細胞に変異を誘発して癌化させた細胞（癌様細胞、癌様変異株ともいう）を使用することもできる。例えば、癌化細胞株は、RGM-1細胞株を発癌性物質の存在下で培養して形質転換させて得られる細胞株が挙げられる。本明細書においては、癌様細胞及び癌様変異株も「癌細胞」に含まれる概念とする。
【００１７】
癌様変異株は、例えば、正常胃粘膜細胞の培養のために通常用いられる培養液に、N-メチル-N’-ニトロ-N-ニトログアニジン（MNNG）などの発癌性物質をその含量が0.1%〜10%程度になるように添加し、ここに正常胃粘膜細胞を103個/mL〜107個/mLの割合で播いて通常の培養条件のもとに継代培養を10日〜3ヶ月行うことで取得することができる。なお、正常胃粘膜細胞の培養のために通常用いられる培養液としては、例えば、（DMEM:HamF12=1:1）+5%〜20%FBSなどが挙げられる。また、正常胃粘膜細胞の通常の培養条件としては、例えば、36℃〜38℃、4%〜6%CO2といった条件が挙げられる。正常胃粘膜上皮細胞が癌様変異株に形質転換されたかどうかは、例えば、増殖因子依存性の低下（形質転換されることで増殖因子に対する依存性が低下する）、増殖速度の向上（形質転換されることで増殖速度が速くなる）、形態変化（形質転換されることで形や大きさが不揃いになる）、接触阻止の喪失とパイルアップ（形質転換されることでシャーレ一杯にまで増殖しても増殖が止らず、細胞の上に細胞が盛り上がるようにして増殖する）、フォーカス形成（形質転換されることで細胞がパイルアップしたコロニー（フォーカス）を形成する）、クリスクロス（形質転換されることで細胞同士がクロスして増殖する）、運動性（形質転換されることで運動性が低下する）、足場依存性の喪失（形質転換されることで軟寒天やアガロースゲルに混ぜて播き込んでも細胞が球状のまま増殖してコロニーを形成する）、分化機能の変化（形質転換されることで分化機能の発現が変化する）、造腫瘍性の獲得（形質転換されることでラットやマウスに移植すると腫瘍を形成する）などから選ばれる1以上の判定項目に基づいて判断することができる。
このようにして樹立された癌様変異株の一つとしてRGK-1細胞株が挙げられ、RGK-1細胞株（識別のための表示：「RGK-1」）は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号FERM BP-10619として寄託されている（寄託日：平成１７年４月５日）。
【００１８】
４．共培養
本発明において、「共培養」とは、同一環境下において2種類の細胞を培養することを意味し、同一の培養容器又はシャーレ内に正常細胞と癌細胞又は癌様細胞とを所定細胞数入れて培養する。
培養液は動物細胞の培養に使用されるものであれば特に限定されるものではなく、DMEM、RPMI-1640、Ham’s F12などを使用することができる。
【００１９】
培養液中には、通常用いられる抗生物質、ウシ胎児血清、遺伝子導入細胞選択用抗生剤などを0.1〜10％の濃度で添加してもよい。
培養温度は３６〜３８℃、好ましくは37℃である。また、４〜６％CO2、好ましくは５％CO2雰囲気下で培養すればよい。
培養期間は特に限定されるものではなく、１〜１０日である。
正常細胞として胃粘膜正常細胞を使用する場合、胃粘膜正常細胞と癌細胞との濃度比は、癌細胞１に対して0.1〜100、好ましくは0.5〜2である。
【００２０】
具体的には、10,000個/mlの胃粘膜正常細胞の培養液と10,000個/mlの癌細胞の培養液とを混合してしばらく培養する。培養後、胃粘膜正常細胞と癌細胞とは、お互いに細胞同士が集まって細胞集団を形成し、胃粘膜正常細胞と癌細胞との間に境界が形成される。
なお、共培養を行う前の各細胞の単独培養においては、培養液は異なるものであってもよい。
具体的には、細胞数は正常細胞、がん細胞の濃度比1:1であることが好ましく、例えば50μLずつ96Wellディッシュに入れて培養する。細胞数は10,000 - 75,000 cells/cm2であるが、共培養状態で31,250 cells/cm2であることが好ましい。
この段階で、候補物質を共培養系に添加して後述のスクリーニングを行う。
【００２１】
５．スクリーニング方法
本発明のスクリーニング方法は、具体的には、前記共培養系に抗癌剤の候補となる被検物質を接触させる工程、並びに正常細胞及び癌細胞の挙動又は状態を比較評価する工程を含む。 
これら各工程について以下に説明する。
(i) 接触工程
共培養系に接触させる被検物質としては、例えば、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物（高分子又は低分子化合物）、発酵生産物、細胞抽出液、細胞培養上清、植物抽出液、哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ブタ、ウシ、ヒツジ、サル、ヒトなど）の組織抽出液又は血液成分などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよく、また天然であっても人為的に合成されたものでもよい。候補物質は単一の被検物質を独立に試験しても、いくつかの候補となる被検物質の混合物（ライブラリーなどを含む）について試験をしてもよい。複数の被験物質を含むライブラリーとしては、合成化合物ライブラリー（コンビナトリアルライブラリーなど）、ペプチドライブラリー（コンビナトリアルライブラリーなど）などが挙げられる。
【００２２】
さらに、これら候補物質は塩を形成していてもよく、被検物質の塩としては、生理学的に許容される酸（例えば、無機酸や有機酸など）や塩基（例えば金属酸など）等との塩が用いられる。
被検物質の接触方法としては、正常細胞と癌細胞との共培養物中に被検物質を添加する方法が挙げられる。
(ii) 評価工程
本工程において評価の対象としては、癌細胞の挙動ないし状態、例えば、癌細胞に対する細胞毒性、癌細胞の正常細胞への浸潤能、癌細胞の遊走能、癌細胞の代謝能等が挙げられる。
【００２３】
これらの評価は、正常細胞と癌細胞を別個の蛍光標識で標識し、被検物質を添加した後の蛍光強度などを測定することにより行なうことができる。
例えば、正常細胞及び癌細胞にそれぞれ別個の蛍光物質を導入するか、あるいは、それぞれ別個の蛍光色素をコードする遺伝子を導入し、遺伝子の発現量（蛍光色素の蛍光強度等）などを指標として行うことができる。
【００２４】
蛍光色素としては、緑色蛍光タンパク質（GFP）、赤色蛍光タンパク質（RFP）、
Cell Tracker Green Fluorescent Probe、Cell Tracker Orange Fluorescent Probe、Alexa Fluor（登録商標）の各シリーズ、Hoechst 33342、Hoechst 33258などが挙げられる。
細胞毒性試験方法は、蛍光顕微鏡画像解析およびフローサイトメトリー等の細胞が有する蛍光タンパク量を指標とした測定、あるいは蛍光色素をコードする遺伝子量をPCR等の技術を用いて測定する解析法により行う。
【００２５】
癌細胞の正常細胞への浸潤能試験方法は、平面培養もしくはゲル（浸潤アッセイ）、又はフィルター（トランスポアアッセイ）を用いた蛍光による顕微鏡撮像と画像解析を行う。
癌細胞の遊走能試験方法は、基本的に共焦点（蛍光）顕微鏡による観察にて行うことができる。これはWound healing assay様に細胞培養シャーレに細胞欠損部を人工的に作成し、欠損部の消失を経時的に計測する方法、あるいは正常細胞―癌細胞共培養中に播種した蛍光ラベル癌細胞の軌跡を経時的に計測する方法などを含む。
癌細胞の代謝能試験方法は、アルブミン産生、サイトカイン産生など癌細胞が産生するタンパクの化学的もしくは免疫学的な測定あるいはグルコースなど外因性物質の代謝試験などを行う。
【００２６】
評価の判定基準を以下に示す。
癌細胞に対する細胞毒性を指標とした場合、候補物質曝露後に正常細胞が癌細胞に比べて生存率が高いのであれば、候補物質はがん細胞選択性を有すると判定する。
癌細胞の正常細胞への浸潤を指標とした場合、癌細胞と正常細胞の重なりが候補物質非曝露のコントロールに比べ少ないのであれば、候補物質はがん浸潤を抑制すると判定する。
癌細胞の遊走能を指標とした場合、癌細胞の動きが候補物質曝露時に比べて低下しているのであれば、候補物質はがん遊走を抑制する物質であると判定する。
癌細胞の代謝能を指標とした場合、標的タンパクの代謝が単一種細胞培養に比べて増加あるいは減少するのであれば、候補物質は共培養環境に対して代謝促進もしくは代謝抑制物質であると判定する。
【００２７】
６．キット
本発明において、スクリーニング用キットの形態は特に限定されるものではないが、RGM-1細胞及びRGK-1細胞を含めることができ、これらの細胞培養用容器、培養液、緩衝駅、蛍光色素検出試薬、使用説明書などをさらに含めることができる。
上記細胞は、培養液中に懸濁後に凍結させた状態で提供することが好ましい。
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２８】
（１）蛍光色素遺伝子を導入した細胞の構築
RGM-1細胞にはpCAG-EGFPを、RGK細胞にはpCAG-huKOを導入し、G418 0.2 mg/ml にて選択して細胞株を樹立した。EGFPを発現させるためのpCAGFPベクターを図１に示す。このベクターのうち、pCAG-EGFPは、文献Tanaka J et al. Construction of Epstein-Barr Virus-based expression vector containing mini-oriP. Biochem. Biophys. Res. Commun. 264: 938-943, 1999年、に記載の通りである。 
他方、pCAG-KOは、GFP部分を開始コドンからストップコドンまで、オレンジ色の蛍光タンパク質huKusabira-Orange（huKO）と置き換えたものである。
【００２９】
（２）共培養
EGFP発現RGM-1細胞と、KO発現RGK-1細胞をトリプシン処理して浮遊させた後、等量ずつ混合しRGM-１用培地（DMEM/F12、カタログ番号11330（Gibco））、またはRGK-１用培地（DMEM nutrient mixture F-12 HAM、カタログ番号D6421（SIGMA、））を入れた35 mmシャーレに播種して培養を開始した。すなわち、RGM-1の培養用培地（Gibco DMEM/F12）に所定濃度のRGM-1細胞を入れた細胞懸濁液、及びRGK-1の培養用培地（DMEM nutrient mixture F-12 HAM）に所定濃度となるようにRGK-1細胞を入れた細胞懸濁液を作製し、両者を混合したときに、細胞数は同数であるが培地の量が異なるように共培養する系を作製した。
培養２日後、抗癌剤の候補物質のモデルとして、紫外線（254 nm UVC）を30秒照射した。
１２時間後に死細胞を洗浄して除き、フローサイトメトリーにて解析した。
その結果、RGM-１細胞のほうが選択的に効率よくアポトーシスによって死亡するため、RGK-１細胞の割合が増加し、RGM細胞の割合が減少した（図２）。
【００３０】
（３）RGM-1とRGK-1との共培養における細胞集団形成
RGM-1細胞およびRGK-1細胞を15,000 cells/cm2ずつシャーレに播種し、培養インキュベータ中で培養を7日間おこなった後に共焦点レーザー顕微鏡で撮影を行った。
結果を図３に示す。
図３において、１、0.8、0.6、0.4、0.2及び0は、RGK-1用培地に対するRGM-1用培地の濃度比（v/v）を表す。
図３より、培養培地の混合比により細胞の増殖に対して多大な影響はないことが示され、グルタミンの容量が減少することにより癌細胞集団の正常細胞集団への浸潤傾向が大きくなることが示された。
【００３１】
（４）遊走能の評価
遊走能の試験結果を図４〜６に示す。図４は、KusabiraOrangeで蛍光標識したRGK-1の動きを示す図である。
また、図５及び６は、RGKの移動距離を示す図である。図５は１時間ごとの移動距離（μｍ）を表し、図６は９時間後の累積移動距離（μｍ）を表す。図６において、左側のバーはRGM-1、右側のバーはRGK-1を示す。
【受託番号】
【００３２】
RGK-1は、平成17年4月5日付（原寄託日）で、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒305-8566  茨城県つくば市東1-1-1 中央第6）にブダペスト条約に基づき国際寄託した。その受託番号は「FERM BP-10619」である。
なお、上記寄託は、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター（〒 292-0818 千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 NITEバイオテクノロジー本部  特許微生物寄託センター）に、2012年4月1日付で承継された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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