(57)【要約】      （修正有）【課題】ハウスダストダニアレルギーであるアレルギーの診断、治療及び予防において用いられ得る、アレルギーを誘発する特性及び過小アレルギー誘発特性を有する新規なポリペプチドの提供。【解決手段】特定のアミノ酸配列と少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列、特定のアミノ酸配列のうちの少なくとも６個の連続するアミノ酸残基の少なくとも１つのアミノ酸断片を含むアミノ酸配列、又は特定のアミノ酸配列若しくはその断片に対する免疫学的交差反応を有するアミノ酸配列、を備えたポリペプチドであって、特定のアミノ酸配列は、特定のアミノ酸配列を有する分子に特異的なＴ細胞レセプターによって認識される、少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含むアレルゲン及びポリペプチドをコードする、ポリペプチド。【選択図】図１
2014221050.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列、又は
配列番号１のアミノ酸配列のうちの少なくとも８個の連続するアミノ酸残基のＴ細胞エピトープからなる少なくとも１つのアミノ酸断片を含むアミノ酸配列、を備えたポリペプチドであって、
上記配列番号１のアミノ酸配列は、アレルゲンをコードしており、
上記ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を有する分子に特異的なＴ細胞レセプターによって認識される、少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含んでおり、
上記少なくとも１つのアミノ酸断片は、NDDDPTTTVのアミノ酸を含むアミノ酸分子、PTTTVHPTTのアミノ酸を含むアミノ酸分子、TTTVHPTTTのアミノ酸を含むアミノ酸分子、TTVHPTTTEのアミノ酸を含むアミノ酸分子、TVHPTTTEQのアミノ酸を含むアミノ酸分子、TTTEQPDDKのアミノ酸を含むアミノ酸分子、TTEQPDDKFのアミノ酸を含むアミノ酸分子、FYICSNWEAのアミノ酸を含むアミノ酸分子、YICSNWEAVのアミノ酸を含むアミノ酸分子、ICSNWEAVHのアミノ酸を含むアミノ酸分子、SNWEAVHKDのアミノ酸を含むアミノ酸分子、AVHKDCPGNのアミノ酸を含むアミノ酸分子およびTRWNEDEETのアミノ酸を含むアミノ酸分子からなる群より選択されることを特徴とする、ポリペプチド。
【請求項２】
低アレルギー誘発性であることを特徴とする請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
上記アミノ酸断片が、配列番号１のアミノ酸配列における上記アミノ酸配列の順番とは異なる順番になるように共に融合されていることを特徴とする請求項１又は２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ分子。
【請求項５】
請求項４に記載のＤＮＡ分子を含むベクター。
【請求項６】
請求項５に記載のベクターを用いて形質転換された細胞。
【請求項７】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチドに結合する抗体。
【請求項８】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチド又は請求項７に記載の抗体を含むワクチン構築物。
【請求項９】
ハウスダストダニアレルギーであるアレルギーの免疫療法のための薬剤の調製のための、請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチド又は請求項７に記載の抗体の使用。
【請求項１０】
ハウスダストダニアレルゲン感作であるアレルゲン感作の予防のための薬剤の調整のための、請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチド又は請求項７に記載の抗体の使用。
【請求項１１】
上記薬剤は、さらに、アジュバント、希釈剤、防腐剤、又はこれらの混合物を含んでいることを特徴とする請求項９又は１０に記載の使用。
【請求項１２】
上記薬剤は、上記ポリペプチドを１０ｎｇ〜１ｇ備えていることを特徴とする請求項９〜１１のいずれか１項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、アレルギーを誘発する特性を有するポリペプチドに関する。
【０００２】
産業化された国における人口の２５％以上が、ＩｇＥ介在アレルギーに苦しめられている。アレルギー患者は、本来無害の抗原（例えばアレルゲン）に対するＩｇＥ抗体の精製の増加によって特徴づけられる。即時に現れる１型アレルギー（アレルギー性鼻結膜炎、喘息、皮膚炎、アナフィラキシーショック）の症状は、アレルゲンが引き起こす肥満細胞結合ＩｇＥ抗体のクロスリンク、及び生物活性媒介物質（例えば、ヒスタミン、ロイコトリエン）によってもたらされる。
【０００３】
ハウスダストダニ（ＨＤＭｓ）は、世界中で最も重要なアレルゲン源の１つに相当する。人口のほぼ１０％及びアレルギー患者の５０％以上が、ダニアレルゲンに感作される。ＨＤＭ  ダーマトファゴイデス  プテロニシナス（Ｄｅｒ  ｐ：Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ  ｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｎｕｓ）は、中央ヨーロッパにおいて流行している。Ｄｅｒ  ｐのアレルゲンは、これまでに同定された２１アレルゲンの３０以上のタンパク質又は糖タンパク質を含んでいる。グループ１及び２のアレルゲン（Ｄｅｒ  ｐ  １及びＤｅｒ  ｐ  ２）は、ＨＤＭ由来の最も重要なアレルゲンに相当し、Ｄｅｒ  ｐアレルギー患者の８０％以上において認識されているが、他のＨＤＭアレルゲン（例えば、Ｄｅｒ
ｐ  ５及びＤｅｒ  ｐ  ７）もまた、かなり低いＩｇＥ結合頻度を除いては、重要なＤｅｒ  ｐアレルゲンに相当することが示されている。
【０００４】
ＷｅｇｈｏｆｅｒらによるＣｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ａｌｌｅｒｇｙ  ３５（２００５）：１３８４−１３９１において、組み換えダストダニアレルゲンがＩｇＥ反応を抑制し得、それゆえにＤｅｒ  ｐアレルギーの診断テスト及び治療に用いられ得ることが示されている。
【０００５】
Ｐｉｔｔｎｅｒ  ＧらによるＣｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ａｌｌｅｒｇｙ  ３４（２００４）：５９７−６０３において、Ｄｅｒ  ｐ抽出物を用いて免疫療法のための患者を選択するために用いられる、主要なアレルゲンＤｅｒ  ｐ  １及びＤｅｒ  ｐ  ２、並びにクロス反応性の高いダストダニアレルゲンに関する診断テスト方法が記載されている。
【０００６】
Ｖｒｔａｌａ  Ｓ．らによるＭｅｔｈｏｄｓ  ３２（２００４）：３１３−３２０において、低減したアレルギー活性を示し、ワクチンに適したアレルゲン運搬体（例えば、過小エネルギー分子）の生成及び評価が記載されている。
【０００７】
ＥＰ  １  ６１２  ２１９  Ａ１は、ハウスダストダニ由来のアレルゲン（Ｄｅｒ  ｐ）を扱っている。
【０００８】
現在ＨＤＭアレルギー患者の診断及び治療に用いられている粗ＨＤＭ抽出物は、Ｄｅｒ
ｐ  １及びＤｅｒ  ｐ  ２のためのみ標準化されている一方で、他の重要なアレルゲンは、ＨＤＭ抽出物において少量存在しているのみである。
【０００９】
本発明の目的は、特にハウスダストダニアレルギーであるアレルギーの診断、治療及び予防において用いられ得る、アレルギーを誘発する特性及び過小アレルギー誘発特性を有する新規なポリペプチドを提供することである。
【００１０】
それゆえに、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列、配列番号１のアミノ酸配列のうちの少なくとも６個の連続するアミノ酸残基の少なくとも１つのアミノ酸断片を含むアミノ酸配列、又は配列番号１のアミノ酸配列若しくはその断片に対する免疫学的交差反応を有するアミノ酸配列、を備えたポリペプチドであって、配列番号１のアミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸配列を有する分子に特異的なＴ細胞レセプターによって認識される、少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含むアレルゲン及びポリペプチドをコードする、ポリペプチドに関する。
【００１１】
配列番号１に示すアミノ酸配列を有するポリペプチド（MKFNIIIVFI SLAILVHSSY AANDNDDDPT TTVHPTTTEQ PDDKFECPSR FGYFADPKDP HKFYICSNWE AVHKDCPGNT RWNEDEETCT）は、新規の主要なＤｅｒ  ｐアレルゲンであり、例えば、Ｄｅｒ  ｐアレルギー患者の診断及び治療に有用であり得る。この新規のＤｅｒ  ｐアレルゲンは、分子量が約８ｋＤａであり、５０％以上のダニアレルゲン患者からのＩｇＥに結合する。
【００１２】
配列番号１に示すアミノ酸配列を有するアレルゲンのＩｇＥ結合高頻度及び当該アレルゲンの生物活性の観察は、当該アレルゲンが、個体においてハウスダストダニアレルギーの診断のための重要な分子にする。
【００１３】
さらに、この新規のダニアレルゲンはまた、ハウスダストダニアレルギーの治療又は予防に有用である。本発明によるポリペプチドは、動物において、高い力価の特異的ＩｇＧ抗体を誘導する。
【００１４】
これらの特異的ＩｇＧ抗体が個体に導入されたとき、すなわち、上記個体のＩｇＥ分子を含み、好ましくは血清であるサンプルに加えられた提示されているハウスダストダニアレルゲンを個体に導入したとき、ＩｇＥのこの新規アレルゲンへの結合は抑制される。これは、この新規のダニアレルゲンを用いたアレルギー特異的免疫療法が、ヒトにおいてブロッキングＩｇＧ抗体を誘導するだろう。首尾よい免疫療法のためのブロッキングＩｇＧ抗体誘導の重要性は、定義されたアレルゲン及びアレルゲン誘導体を用いた免疫療法試験において近年示されている（Ｇａｆｖｅｌｉｎ，Ｇ．ら、（２００５）Ｉｎｔ  Ａｒｃｈ
Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １３８：５９；Ｊｕｔｅｌ，Ｍ．ら、（２００５）Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １１６：６０８）。高レベルのアレルゲン特異的ＩｇＧ抗体は、アレルゲン誘導好塩基球脱顆粒の抑制を誘導された（Ｎｉｅｄｅｒｂｅｒｇｅｒ，Ｖ．ら、（２００４）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  １０１  Ｓｕｐｐｌ  ２：１４６７７）。高アレルギー誘発性誘導体に導かれるアレルギー誘発性を示す本発明によるポリペプチドを、アレルギー誘発活性を低減し、かつ免疫原性を保つように改良することによって、アナフィラキシー副作用の低減により免疫療法がさらに向上し得る（Ｖａｌｅｎｔａ，Ｒ．ら、（２００４）Ａｄｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ８２：１０５）。低アレルギー誘発性の誘導体は、分子生物学的技術又はアレルゲンのＴ細胞若しくはＢ細胞エピトープ由来のペプチド合成によって生成され得る（Ｋｙｔｅ，Ｊ．及びＲ．Ｆ．Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ．（１９８２）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １５７：１０５）。
【００１５】
ここで使用する場合、「ポリペプチド」は、少なくとも６個のアミノ酸残基、好ましくは８個のアミノ酸残基を含む分子に関する。
【００１６】
ここで使用する場合、用語「同一性」は、いずれか２個（またはそれ以上）のペプチド配列、ポリペプチド配列又はタンパク質配列が、互いに特定の割合（％同一）で同一であるアミノ酸配列を有するかどうかを示している。この割合は、“ＦＡＳＴ  Ａ”プログラムのような、公知のコンピュータアルゴリズムを用いて、例えばＰｅａｒｓｏｎらによる初期設定パラメータを用いて決定することができる（（１９８８）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８５：２４４４（ｏｔｈｅｒ  ｐｒｏｇｒａｍｓ  ｉｎｃｌｕｄｅ  ｔｈｅ  ＧＣＧ  ｐｒｏｇｒａｍ  ｐａｃｋａｇｅ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１２，３８７−３９５）、ＢＬＡＳＴＰ，  ＢＬＡＳＴＮ，  ＦＡＳＴＡ  （Ａｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、Ｊ  Ｍｏｌｅｃ  Ｂｉｏｌ  ２１５：４０３（１９９０）；Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｈｕｇｅ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ，Ｍａｒｔｉｎ  Ｊ．Ｂｉｓｈｏｐ，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，１９９４，ａｎｄ  Ｃａｒｉｌｌｏｅｔ  ａｌ，（１９８８）ＳＩＡＭ  Ｊ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ  ４８：１０７３））。例えば、ＮＣＢＩデータベースのＢＬＡＳＴツールは、同一性決定のために用いられ得る。他の市販の又は公共の使用可能なプログラムには、ＤＮＡＳｔａｒ“ＭｅｇＡｌｉｇｎ”プログラム（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）及びｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＵＷＧ）  “Ｇａｐ”プログラム（Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ））が含まれる。タンパク質分子の同一性比率を、例えば、ＧＡＰコンピュータプログラムを用いた配列情報の比較によって、さらに決定することができる（例えば、Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ａｄｖ．  Ａｐｐｌ．  Ｍａｔｈ．２：４８２によって修正された、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら，（１９７０）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．４８：４４３）。簡単に説明すると、ＧＡＰプログラムは、同一の配列した記号（例えば、核酸又はアミノ酸）の数を２つの配列のうちのより短いほうの配列における全記号数で割って同一性を定義する。ＧＡＰプログラムのための初期設定パラメータは、（１）一元比較マトリックス（同一又は非同一のための値１を含む）及びＧｒｉｂｓｋｏｖら、１４：６７４５の加重比較マトリックス（Ｓｃｈｗａｒｔｚ  ａｎｄ  Ｄａｙｈｏｆｆ，ｅｄｓ．，  ＡＴＬＡＳ  ＯＦ  ＰＲＯＴＥＩＮ  ＳＥＱＵＥＮＣＥ  ＡＮＤ  ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ，  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，  ｐｐ．３５３−３５８（１９７９））、（２）各ギャップにおける３．０のペナルティ及び各ギャップにおける記号毎の０．１０の追加ペナルティ、並びに（３）末端ギャップにはペナルティなし、を含む。
【００１７】
本発明の好ましい実施形態によれば、アミノ酸配列は、配列番号１に示すアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、特に１００％同一である。
【００１８】
ここで使用する場合、「交叉反応」は、抗原（例えば、ペプチド、タンパク質、ポリペプチド）の次に結合する抗体の能力に関し、ｉｎ  ｖｉｖｏシステムにおいて他の抗原によってその生成が刺激される。これは、配列番号１に示すアミノ酸配列又はその断片を有するポリペプチドに特異的に結合するように生成された抗体が、配列番号１に示すアミノ酸配列のホモログではないポリペプチドに対する結合親和性もまた示し得ることを意味している。ポリペプチドに対する抗体の結合特異性は、例えば、Ｖａｌｅｎｔａら（Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ（１９９２）１７５：３７７−３８５）の記載された、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、イムノブロット等の当該技術分野における公知の方法によって決定することができる。
【００１９】
本発明に係るポリペプチドは、当該技術分野における公知の方法によって、組み換え的に生成されていることが好ましい。上記ポリペプチドを生成するのに用いられ得る宿主は、いずれかの対応するベクター及びプラスミドを用いることで得ることができる（例えば、好ましくは酵母、哺乳動物細胞、植物細胞及び昆虫細胞である、真核細胞、並びに、好ましくは大腸菌及びバチルスサブティリスである、原核細胞）。もちろん、本発明に係るポリペプチドを、当該技術分野において公知の方法によって化学的に生成することも可能である。
【００２０】
本発明の他の好ましい実施形態によれば、上記ポリペプチドは低アレルギー誘発性である。
【００２１】
ここで使用するとき、用語「低アレルギー誘発性」は、アレルゲンに特異的に結合しする抗体の生成を誘導し、かつ個体に導入されたときに、低減したアレルギー反応を示す、又はアレルギー反応を示さない、アレルギー特性を有するアレルゲン由来のペプチド、ポリペプチド又はタンパク質の可能性に関する。個体においてアレルギー反応を引き起こす配列番号１のようなアレルゲンの、「低アレルギー誘発性」誘導体のアレルギー低減又はアレルギー欠失可能性は、当該アレルゲンからＩｇＥ結合エピトープを除去又は破壊するが、当該アレルゲン上に存在するＴ細胞エピトープを保存することによって得られる。これは、例えば、アレルゲンを、ＩｇＥ結合能が減少又は欠失した断片に分割し、野生型アレルゲンの断片の並びに対応しない順になるように、いくつか又は全ての上記断片を融合することによって達成される（例えばＥＰ１  ４４０  ９７９参照のこと）。アレルゲンからの「低アレルギー誘発性」分子の他の生成方法は、野生型アレルゲンのＣ末端及び／又はＮ末端の欠失を含む（例えば、ＥＰ  １  ２２４  ２１５参照のこと）。
【００２２】
本発明の他の好ましい実施形態によれば、上記アミノ酸断片は、配列番号１に示す上記断片の順とは異なる順に共に融合されている。
【００２３】
本発明に係るポリペプチドは、配列番号１に示されるアミノ酸配列由来のアミノ酸断片を含んでいてもよく、好ましくは配列番号１に示されるアミノ酸配列とは異なる順に共に融合されていてもよい。この「入れ替え」によって、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する野生型アレルゲンに対して異なる特徴を有するポリペプチドを得ることができる。例えば、この入れ替えによって、損傷のないＴ細胞エピトープ及び破壊されたＢ細胞エピトープを含むポリペプチドが得られるだろう。このような分子は、低アレルギー誘導性特性を有し得る。
【００２４】
事実上Ｔ細胞エピトープからなる、上記少なくとも１つのアミノ断片は、配列番号１に示されるアミノ酸配列の、第５〜１３位、第９〜１７位、第１０〜１８位、第１１〜１９位、第１２〜２０位、第１６〜２４位、第１７〜２５位、第４３〜５１位、第４４〜５２位、第４５〜５３位、第４７〜５５位、第５１〜５９位、及び第６０〜６８位のアミノ酸を含む、アミノ酸分子からなる群より選択されることが好ましい。
【００２５】
本発明に係るポリペプチドを導入したときに、個体にＴ細胞免疫反応を誘発させるために、上記ポリペプチドはＴ細胞エピトープを備えている必要がある。Ｔ細胞エピトープは、配列番号１に示されるアミノ酸配列の、少なくとも６個、好ましくは少なくとも７個、より好ましくは少なくとも８個の連続したアミノ酸残基を備えている。上記Ｔ細胞エピトープは、また、リンカーを介して又はリンカーを用いずに運搬体に結合されていてもよい。上記運搬体は、マイクロアレイ技術で用いられる固体支持体であってもよい。ポリペプチドにおけるＴ細胞エピトープの存在は、当該技術において公知の方法によって決定することができる（例えば、“Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ：Ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ”Ｅｄ．Ｏ．Ｗｅｓｔｗｏｏｄ  ａｎｄ  Ｆ．Ｈａｙ，２００１，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓを参照のこと）。特に好ましい方法は、ＥＬＩＳｐｏｔ（Ｔｏｂｅｙ  ＴＷ  ａｎｄ  Ｃａｕｌｆｉｅｌｄ  ＭＪ（２００４），Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．９４：１２１−１３２）。
【００２６】
特定されたＴ細胞エピトープは、タンパク質、又は配列番号１に示すアミノ酸配列から断片化によって得られた大断片の一部のような分子が、Ｎ末端又はＣ末端に融合されてもよい。
【００２７】
本発明の他の局面は、本発明に係るポリペプチドをコードするＤＮＡ分子に関する。
【００２８】
本発明のさらに他の局面は、本発明に係るＤＮＡ分子を備えたベクターに関する。
【００２９】
本発明において用いられるに好ましいベクター（例えばプラスミド）は、プロモーター、複製起点、調節要素、選択マーカー及び／又は他のベクター要素を備えた、発現ベクターのみならずクローニングベクターである。ベクターが、宿主細胞のゲノムに組み込まれえる組み込みベクターであるとき、上記ベクターに対応する手法が提供されてもよい（例えば、挿入配列要素）。用いられるベクターの型及び当該ベクター上の調節要素は、どの宿主細胞に当該ベクターが組み込まれるかにも依存する。発現ベクターを用いたとき、本発明に係るＤＮＡ分子及び上述したポリペプチドをコードするＤＮＡ分子は、プロモーター領域に操作可能に連結される。
【００３０】
本発明の他の局面は、本発明に係るベクターで形質転換された細胞に関する。
【００３１】
ここで用いられる細胞は、原核細胞だけでなく真核細胞であってもよい。好ましい真核細胞は、特にサッカロマイセス  セレビジアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ピチア  パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）及びハンセヌラ  ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）である酵母細胞、尾\特にタバコ植物細胞である植物細胞、昆虫細胞、並びに特にチャイニーズハムスター卵巣細胞であるヒト及び動物細胞のような哺乳動物細胞である。好ましい原核細胞は、例えば、バチルス  サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）及び大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）である。本発明に係るベクター又はＤＮＡ分子を備えた細胞は、本発明に係るポリペプチドを生成するために用いられ得る。
【００３２】
本発明の他の局面は、本発明に係るポリペプチドに結合する抗体に関する。
【００３３】
本発明に係る抗体は、多クローン抗体、単クローン抗体、多特異的抗体、ヒト化又はキメラ抗体、単鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）断片及び上記いずれかのエピトープ結合断片を含むが、これに限定されない。さらに、抗体は、例えば、免疫特異的に抗原に結合する抗原結合部位を含む分子のような、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫活性部位としてみなされる。本発明に係る免疫グロブリン分子は、好ましくは、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＹクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）又は免疫グロブリン分子のサブクラスである。
【００３４】
好ましくはアジュバントを用いて、本発明に係るポリペプチドを、非ヒト動物に導入し、結果として得られる抗血清を回収することによって、多クローン抗体は、準備することが可能である。期間にわたって繰り返し注入することによって、向上した力価が得られる。抗体を導出するために用いられ得る動物種は特に限定されず、一般に、ウサギ又はモルモットを用いることが好ましいが、ウマ、ネコ、イヌ、ヤギ、ブタ、ラット、ウシ、ヒツジ、ラクダ等を用いることもできる。抗体の生成において、本発明の免疫原の明確な量を、例えば、生理食塩水によって適した濃度に希釈し、得られた希釈溶液を、例えば完全フロインドアジュバントと混合して懸濁液を準備する、又は無機物ゲルと混合する。このような無機物ゲルは、アルミニウム水酸化物、リゾレシチンのような表面活性剤、多価アルコール、ポリアニオン、ペプチド、油乳濁液、キーホールリンペットヘモシニアン、ジニトロフェノール、及びＢＣＧ（Ｂａｃｉｌｌｅ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）及びコリネバクテリウム  パルヴムのような潜在的に有用なヒトアジュバントのようなものがある。懸濁液及び混合液を、本発明のポリペプチドを投与当たり約５０μｇから約２５００μｇ用いて、例えばウサギの例えば腹腔内のように、動物に投与する。懸濁液は、免疫反応性付与をもたらすために、好ましくは約２週間毎に、約２〜３ヶ月、好ましくは約１ヶ月にわたって投与されることが好ましい。抗体は、最終投与に続く１〜２週間経過後に免疫した動物から血液を回収し、当該血液を遠心分離して当該血液から血清を分離することによって、回収する。
【００３５】
単クローン抗体は、例えば、ヒト又はネズミ系であってもよい。ネズミ単クローン抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎの方法（Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６（１９７５）４９５）によって、例えば適切なマウス骨髄腫細胞株との超免疫化マウスの脾臓細胞の融合によって、準備することができる。
【００３６】
キメラ抗体は、ネズミ単クローン抗体及びヒト免疫グロブリン定常領域由来の可変領域を有する抗体のような、異なる動物種由来の抗体の異なる部分における分子である。キメラ抗体の生成方法は、当該分野において公知である。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２（１９８５）；Ｏｉら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：２１４（１９８６）；Ｇｉｌｌｉｅｓら、（１９８９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １２５：１９１−２０２；ＵＳ５，８０７，７１５；ＵＳ４，８１６，５６７及びＵＳ４，８１６，３９７参照のこと。
【００３７】
ヒト化抗体は、非ヒト種由来の１以上の相補性決定領域（ＣＤＲｓ）及びヒト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域を有する、所望の抗原に結合する、非ヒト種由来の抗体分子である。ヒトフレームワーク領域におけるフレームワーク残基は、抗原結合を変化、好ましくは向上させるために、ＣＤＲドナー抗体から対応する残基に置換されることが多い。これらのフレームワーク置換は、当該技術分野において公知の方法によって決定する。この方法は、例えば、抗原結合に重要なフレームワーク残基を同定するための、ＣＤＲとフレームワーク残基との相互作用をモデリング、及び特定の位置における異常なフレームワーク残基を同定するための配列比較である（例えば、Ｑｕｅｅｎら、ＵＳ  ５，５８５，０８９；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３３３（１９８８））。抗体は、当該分野において公知の様々な技術を用いてヒト化することができる。この技術には、例えば、ＣＤＲ−グラフト重合（ＥＰ  ２３９，４００；ＷＯ  ９１／０９９６７；ＵＳ  ５，２２５，５３９；ＵＳ  ５，５３０，１０１；及びＵＳ  ５，５８５，０８９）、張り合わせ又は再舗装（ＥＰ  ５９２，１０６；ＥＰ５１９，５９６；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２８（４／５）：４８９−４９８（１９９１）；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ７（６）：８０５−８１４（１９９４）；Ｒｏｇｕｓｋａら、ＰＮＡＳ  ９１：９６９−９１３（１９９４））、及び鎖入れ替え（ＵＳ  ５，５６５，３３２）が含まれる。
【００３８】
本発明に係る抗体は、特にハウスダストダニアレルギーであるアレルギーに苦しむ個体の受動免疫付与に用いるのに有利である。受動免疫付与のために、抗体は、好ましくはＩｇＧ又はその誘導体である（例えば、キメラ又はヒト化抗体）。さらにこの抗体は、また、個体の脱感作のためにもまた用いられ得る。
【００３９】
本発明の他の局面は、本発明に係るポリペプチド又は抗体を備えたワクチン構築物に関する。
【００４０】
ポリペプチド又は抗体の次に、本発明に係る上記構築物はまた、安定剤、アジュバント、薬学的に許容される基剤等のような他の物質を備えていてもよい。ワクチン構築物生成の適したプロトコルは当業者に知られており、例えば“Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ”（Ａ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｍ．Ｐ．Ｃｒａｎａｇｅ，Ｍ．Ｈｕｄｓｏｎ；Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．，Ｕ．Ｓ．；２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ  ２００３）において見つけることができる。
【００４１】
本発明のさらに他の局面は、個体における、特にハウスダストダニアレルギーであるアレルギーの診断のための本発明に係るポリペプチドの使用に関する。
【００４２】
上述したポリペプチドは、例えば、ヒスタミン放出細胞を含む個体サンプルに上述したポリペプチドをさらすことによって、特にハウスダストダニアレルギーであるアレルギーの診断のために用いられ得る（例えば、Ｐｕｒｏｈｉｔら、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ａｌｌｅｒｇｙ  ３５（２００５）：１８６−１９２参照のこと）。さらに、本発明に係るポリペプチドは、ポリペプチドアレイチップを形成するために、表面に固定されていてもよい。このようなアレイは、例えば複数の個体から得た複数のサンプルにおいて、アレルギーを診断するための高生産性スクリーニングにおいて用いられ得る。
【００４３】
本発明の他の局面は、特にハウスダストダニアレルギーであるアレルギーの免疫療法のための薬剤の調整のための、本発明に係るポリペプチド又は抗体の使用に関する。本発明のポリペプチド及び抗体は、活性ワクチン及び受動ワクチンのそれぞれとして使用され得る。本発明に係るポリペプチドが個体に導入されたとき、防御ＩｇＧの形成が引き起こされるので、これらの両方として使用され得る。そして、上述したポリペプチドに導かれた免疫グロブリンの導入は、アレルギーの症状を順に軽減する、ＩｇＥと導入された防御抗体との間の競合を引き起こすだろう。
【００４４】
本発明の他の局面は、特にハウスダストダニアレルギーであるアレルギー感作の予防のための薬剤の調整のための、請求項１〜４のいずれか１つに記載のポリペプチド又は請求項７に記載の抗体の使用に関する。
【００４５】
個体のワクチン接種のためのポリペプチドの使用は、好ましくは低アレルギー誘発性である。このようなポリペプチドの使用は、上述したポリペプチドのＩｇＥ結合を予防し、それゆえに、アレルギー反応を予防する。
【００４６】
本発明の好ましい実施形態によれば、上述した薬剤はさらに、アジュバント、基剤、希釈剤、防腐剤又はその混合物を含む。
【００４７】
薬剤は、好ましくは１０ｎｇから１ｇ、より好ましくは１００ｎｇから１０ｍｇ、特に０．５μｇから２００μｇの上述したポリペプチドを備えている。
【００４８】
本発明を以下の図面及び例によってさらに説明するが、本発明はこれに限定されない。
【００４９】
図１は、クローン３０由来アレルゲンのｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。開始コドン及び終止コドンに下線を付した。シグナル配列は、アミノ酸残基１〜２１を備え、太字で示すアミノ酸残基２１（Ａ）と２２（Ａ）との間に予想される分裂部位を有する。配列の左側の数字は核酸の位置を示し、配列の右側の数字はアミノ酸の位置を示す。
【００５０】
図２は、クローン３０由来アレルゲンのクマシーブルー染色及び質量分析（ＭＳ）を示す。Ａのクマシーブルーで染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルは、分子量マーカー（Ｍ）及び３μｇの精製したクローン３０由来アレルゲン（３０）を示している。Ｂの精製したクローン３０由来アレルゲンのＭＳ解析は、Ｘ軸に質量／電荷比率を示し、Ｙ軸にシグナル強度を、調査した質量範囲において得られたシグナルの最大強度の比率として示した。７９７９．２０におけるピークは、クローン３０由来アレルゲンの推論アミノ酸配列の測定された質量に対応する。
【００５１】
図３は、クローン３０由来アレルゲンの免疫ブロットを示す。精製したクローン３０由来アレルゲンのサンプルを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離して、ニトロセルロース上にブロットし、２人のダニアレルギー患者からの血清（１、２）及び１人の非アレルギー患者からの血清（３）と共にインキュベートした。クローン３０由来アレルゲンのＩｇＥ抗体特異的結合は、１２５Ｉ標識抗ヒトＩｇＥ抗体を用いて検出した。
【００５２】
図４は、ウサギ抗クローン３０由来アレルゲン抗血清のＩｇＧ反応を示す。クローン３０由来アレルゲン及び主要なダニアレルゲンＤｅｒ  ｐ  ２を、ニトロセルロース片に点在させ、１：１０００〜１：１００００００に希釈したウサギプレ免疫血清（Ａ）又はウサギ抗クローン３０由来アレルゲン抗血清（Ｂ）とともにインキュベートした。ＩｇＧ抗体結合を、１２５Ｉ標識ロバ由来抗ウサギ完全抗体を用いて検出した。
【００５３】
図５は、クローン３０由来アレルゲンの生物学活性を示す。ダニアレルギー患者からの血液サンプルを、クローン３０由来アレルゲン１０μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ及び０．１μｇ／ｍｌ、抗ＩｇＥ抗体１μｇ／ｍｌ、又はコントロールバッファ（Ｃｏ）としてＰＢＳ（Ｘ軸）にさらした。ＣＤ２０３ｃ発現をＦＡＣＳ分析によって決定し、平均蛍光強度（ＭＦＩ）として示した（Ｙ軸）。
【００５４】
図６は、プロットスケールを用いた、成熟したクローン３０由来アレルゲンの疎水性分析（Ｋｙｔｅ＆Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ）を示す。Ｎ末端メチオニンを含む成熟タンパク質のアミノ酸位置をＸ軸に示した。Ｂは、ウェブベースの計算システムであるＭＵＬＴＩＰＲＥＤを用いた、クローン３０由来アレルゲンの考えられるＴ細胞エピトープ予測である。配列の両側の数字は、成熟クローン３０由来アレルゲンのアミノ酸位置を示す。
【００５５】
〔実施例〕
本実施例は、例えば、Ｄｅｒ  ｐアレルギー患者の診断及び治療に有用な、新規の主要なＤｅｒ  ｐアレルゲンの同定について記載する。
【００５６】
この新規のダニアレルゲンをコードするｃＤＮＡを、Ｄｅｒ  ｐ発現ｃＤＮＡライブラリから単離し、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において、組み換えアレルゲンとして発現させた。新規のアレルゲンは、分子量約８ｋＤａで、ダニアレルギー患者からのＩｇＥの５０％以上に結合し、それゆえに主要なアレルゲンに相当する。
【００５７】
（実施例１：クローン３０由来アレルゲンの発現及び精製）
予測される成熟クローン３０由来アレルゲンをコードする、クローン３０（図１）のｃＤＮＡ配列（Ｎ末に追加のＡＴＧを有する核酸８９〜２９５）を、発現ベクターｐＥＴ−１７ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎｅ，ＷＩ）にサブクローンし、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＣＡ）において発現させた。細菌細胞を、１００ｍｇ／Ｌアンピシリンを含むＬＢ培地において、２７℃で一晩成長させ、イソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加して終濃度０．５ｍＭすることによって、組み換えタンパク質の発現を誘導した。２７℃で６時間の追加培養の後、１ＬのＥ．ｃｏｌｉ培養培地からの細胞を、遠心分離（１５分、３０００回転、４℃、Ｓｏｒｖａｌｌ  ＲＣ５Ｃ）によって回収し、ペレットを３０ｍｌ  ２５ｍＭ  イミダゾール  ｐＨ７．４／０．１％（ｖ／ｖ）ＴｒｉｔｏｎＸ１００中に再懸濁した。その後、３００μｇリゾチームを用いて、室温で２０分間細菌細胞を処理した。細菌細胞の溶解物を液体窒素中での凍結及び５０℃のウォーターバス中での解凍を３回行った。ＤＮａｓｅ  ３μｇを添加して室温で１０分間の経過した後、５Ｍ  ＮａＣｌ  ６００μｌ添加して、ゲノムＤＮＡを分解した。これらの溶解した細菌細胞を、４℃、１８０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、クローン３０由来アレルゲンを含む可溶分画のタンパク質を６０％硫酸アンモニウムを用いて、４℃で１．５時間処理した。凝結したタンパク質を遠心分離によって分離し（１８０００ｒｐｍ、２０分間、４℃）、クローン３０由来アレルゲンを含む可溶分画を、２Ｍ  硫酸アンモニウム／５０ｍＭ  リン酸ナトリウム  ｐＨ７．０／１０ｍｇ／Ｌ  フェニルメチルスルフォニルフルオリド（ＰＭＳＦ）に対して透析し、ＨｉＴｒａｐフェニルＦＦ（ｈｉｇｈ  ｓｕｂ）カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＢ，Ｓｗｅｄｗｎ）に供した。クローン３０由来アレルゲンを、５００〜０ｍＭの硫酸アンモニウム勾配で抽出し、クローン３０由来アレルゲンを含む分画を溜めた。２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ８．０に対して透析した後、サンプルをＨｉＴｒａｐ  ＤＥＡＥセファロースＦＦカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に供した。０〜５００ｍＭのＮａＣｌ勾配によってクローン３０由来アレルゲンを抽出し、９０％以上の純粋なクローン３０由来アレルゲンを含む分画を溜めた。クローン３０由来アレルゲンを、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ８．０に対して透析し、−２０℃で保存した。純度のために、タンパク質サンプルを１４％  ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）及びクマシーブリラントブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  ｂｒｉｌｌａｎｔ  ｂｌｕｅ）タンパク質染色によって分析した（図２Ａ）。成熟タンパク質の分子量分析は、７．９８ｋＤａ（図２Ｂ）で、クローン３０由来アレルゲンの推定アミノ酸配列を計算した分子量に対応していたが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいては、約１４ｋＤａに広がった（図２Ａ）。
【００５８】
（実施例２：クローン３０由来アレルゲンのＩｇＥ反応）
デルマトファゴイダス  プテロニスナス（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ  ｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｎｕｓ）に感作する２人の患者の血清を用いた、免疫ブロット分析によって、クローン３０由来アレルゲンのＩｇＥ結合能を証明した（図３）。クローン３０由来アレルゲンのサンプルを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ニトロセルロース上にブロットした。ニトロセルロース片を１：１０に希釈したヒト血清（１〜３）と共にインキュベートし、１：１０に希釈した１２５Ｉ標識抗ヒトＩｇＥ抗体を用いて、ＩｇＥ抗体結合を検出した。ダニアレルギー患者（１、２）の血清は、クローン３０由来アレルゲンと特異的に反応した。非アレルギー個体（３）からのコントロール血清は、クローン３０由来アレルゲンと反応しなかった。
【００５９】
ＩｇＥ結合頻度を、ダニアレルギーに対して継続した症状が見られ、ＳＰＴ及びヤケヒョウダニ（Ｄ．ｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｎｕｓ）特異的ＩｇＥ−ＲＡＳＴが陽性の５３人のダニアレルギー個体からの結成を用いて、ＥＬＩＳＡ分析によって決定した。ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を、クローン３０由来アレルゲン  ５μｇ／ｍｌでコートし、１：１０に希釈したダニアレルギー患者からの血清と共にインキュベートした。ヒトＩｇＥ結合を、１：１０００に希釈したＡＫＰ−結合抗ヒトＩｇＥ抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ−Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，ＮＪ）を用いて検出した。
【００６０】
ダニアレルギー患者からの５３個の血清のうち２９個（５５％）が、クローン３０由来アレルゲンに対してＩｇＥ反応性を示した（表１）
【００６１】
【表１】
2014221050.tif 000003
【００６２】
（実施例３：ウサギにおいてＩｇＧ抗体を誘導する、クローン３０由来アレルゲンによる免疫）
クローン３０由来アレルゲンが免疫するか否かを試験するために、ウサギを新規アレルゲンと共にフロインドのアジュバントを用いて免疫した。ウサギを、完全フロインドアジュバントを１回及び不完全アジュバント（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を２回注入して、２００μｇのタンパク質で３回免疫した。
【００６３】
ＩｇＧ抗体の誘導を、ドットブロット実験によって調査した。組み換えＤｅｒ  ｐ  ２及びクローン３０由来アレルゲンをニトロセルロース片上に点在させ（０．５μｇ／点）、この片を１：１０００、１：１００００、１：１０００００及び１：１００００００で希釈したウサギプレ免疫血清及び抗クローン３０由来アレルゲン抗血清と共にインキュベートした。１２５Ｉ標識ロバ由来抗ウサギ完全抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて、結合ＩｇＧ抗体を検出した。
【００６４】
特異的ＩｇＧ抗体の高力価が、クローン３０由来アレルゲンによって誘導された（図４）。抗クローン３０由来アレルゲン抗血清は、１：１０００００の希釈までクローン３０由来アレルゲンに特異的に反応し、Ｄｅｒ  ｐ  ２に反応しないことが観察された（図４Ｂ）。プレ免疫血清は、クローン３０由来アレルゲン及びＤｅｒ  ｐ  ２に反応しなかった（図４Ａ）。
【００６５】
（実施例４：ウサギにおいてクローン３０由来アレルゲンに誘導されたＩｇＧ抗体の、ダニアレルギー患者ＩｇＥにおけるクローン３０由来アレルゲンのＩｇＥ結合阻害）
患者ＩｇＥに対するアレルゲンの結合を阻害するための、クローン３０由来アレルゲンに特異的なウサギ抗体の可能性を、ＥＬＩＳＡ−抑制分析によって試験した。クローン３０由来アレルゲン（５μｇ／ｍｌ）を結合させたＥＬＩＳＡプレートを、ＰＢＳＴ／０．５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ  １：１００で希釈したウサギ抗クローン３０由来アレルゲン抗体又はウサギプレ免疫血清と共にプレインキュベートし、４℃で一晩インキュベートした。続いてプレートを、４℃で一晩、ＰＢＳＴ／０．５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ  １：５で希釈した１４人のダニアレルギー患者からの血清にさらした。ＩｇＥ抗体結合を、ＰＢＳＴ／０．５％ＢＳＡ  １：２５００で希釈したＨＲＰ連結ヤギ抗ヒトＩｇＥ抗体（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ＆Ｐｅｒｒｙ  Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｙ，ＭＤ）で検出した。抑制度を、以下の通り算出した：ＩｇＥ結合抑制比率（％）＝１００−ＯＤ抗クローン３０由来血清Ｘ１００／ＯＤプレ免疫血清。
【００６６】
患者の大多数においてＩｇＥ結合が強く抑制され、２５〜９７％の範囲（平均：８２％）の抑制が観察できた（表２）。血清の半分において、クローン３０由来アレルゲンに対するＩｇＥ結合が９０％以上抑制された。
【００６７】
表２：抗ウサギクローン３０由来ＩｇＧ抗体によるダニアレルギー患者血清からクローン３０由来アレルゲンまでのＩｇＥ結合抑制。
【００６８】
【表２】
2014221050.tif 000004
【００６９】
（実施例５：クローン３０由来アレルゲンの生物学的活性）
好塩基球におけるＣＤ２０３ｃのアップレギュレーションを、誘導された活性と引き続く好塩基球の脱顆粒の指標として用いることができる。それゆえに、アレルゲンのアレルギー活性を決定することができる。ダニアレルギー患者からのヘパリン添加血液サンプル（１００μｌ）を、様々な濃度のクローン３０由来アレルゲン、単クローン抗ＩｇＥ抗体（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ，Ｆｒａｎｃｅ）、又はＰＢＳと共に、３７℃で１５分間インキュベートした。ＣＤ２０３ｃ発現を、ＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，ＣＡ）における２色フローサイトメトリーによって決定した。
【００７０】
クローン３０由来アレルゲンは、濃度１０μｇ／ｍｌで、ダニアレルギー患者の好塩基球におけるＣＤ２０３ｃ発現のアップレギュレーションを誘導した（図５）。抗ヒトＩｇＥ抗体（ポジティブコントロール）は、１μｇ／ｍｌにおいてＣＤ２０３ｃ発現のアップレギュレーションを誘導した。一方で、ネガティブコントロール（ＰＢＳ単独）においては、アップレギュレーションが見られなかった。
【００７１】
（実施例６：クローン３０由来アレルゲンの表面提示領域及び予測Ｔ細胞エピトープ）
タンパク質の疎水性領域は、分子の表面に提示されやすく、潜在的に抗原性であり得る。それゆえに、クローン３０由来アレルゲンの表面における疎水性領域は、潜在的Ｂ細胞エピトープに相当し得る。プロットスケール（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｔｏｏｌｓ／ｐｒｏｔｓｃａｌｅ．ｈｔｍｌ）によって、タンパク質３０由来アレルゲンのいずれかのアミノ酸の大きさによって作られる疎水性プロフィールの算出と提示が可能である（Ｋｙｔｅ＆Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ）。ウインドウサイズ７を構造調査のために選択した。成熟クローン３０由来アレルゲンのプロットスケールの出力は、疎水性部分に相当するたくさんのネガティブピークを有するタンパク質を示す（図６Ａ）。クローン３０由来アレルゲンのＢ細胞エピトープは、成熟タンパク質のアミノ酸３〜１２、１５〜２８、３４〜４３、及び４９〜６８の間に位置する。
【００７２】
ヒト免疫システムのＴ細胞は、アレルゲンの変質により得られた短いペプチド断片（Ｔ細胞エピトープ）としてアレルゲンを認識する。ＭＵＬＴＩＰＲＥＤ（ｈｔｔｐ：／／ａｎｔｉｇｅｎ．ｉ２ｒ．ａｓｔａｒ．ｅｄｕ．ｓｇ／ｍｕｌｔｉｐｒｅｄ／）は、ヒト白血球抗原（ＨＬＡｓ；ヒトＭＨＣ、主要組織適合複合体）対立遺伝子に属する複数の分子に結合するペプチドの予測のための、ウェブベースの算出システムである。４０以上の和（個体におけるペプチドのＭＨＣ分子に対する結合スコアの和）を用いて、個体における９個のペプチドの予測された結果を図６Ｂに示す。Ｔ細胞エピトープは、成熟クローン３０由来アレルゲンのＮ末及びＣ末近傍に位置する。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】クローン３０由来アレルゲンのｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す図である。
【図２】クローン３０由来アレルゲンのクマシーブルー染色及び質量分析（ＭＳ）を示す図である。
【図３】クローン３０由来アレルゲンの免疫ブロットを示す図である。
【図４】ウサギ抗クローン３０由来アレルゲン抗血清のＩｇＧ反応を示す図である。
【図５】クローン３０由来アレルゲンの生物学活性を示す図である。
【図６】プロットスケールを用いた、成熟したクローン３０由来アレルゲンの疎水性分析（Ｋｙｔｅ＆Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ）を示す図である。
【図１】
2014221050.tif 000005
【図２】
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【図３】
2014221050.tif 000007
【図４】
2014221050.tif 000008
【図５】
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【図６】
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【配列表】
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