(57)【要約】【課題】蛍光プローブや蛍光インジケーターとして利用できるベンゾ［ａ］フェノキサチンの５位置換イミノ基にピリジニウム構造を含む新規蛍光化合物を提供する。【解決手段】  下記一般式（１）で表わされることを特徴とする近赤外蛍光化合物。【化１】
2014166975.tif 000013
（式中、ｎは２から４の整数を表し、Ｒはメチル基、エチル基又はプロピル基を表し、Ｘ−は陰イオンを表す。）【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（１）で表わされることを特徴とする近赤外蛍光化合物。
【化１】
2014166975.tif 000011
（式中、ｎは２から４の整数を表し、Ｒはメチル基、エチル基又はプロピル基を表し、Ｘ−は陰イオンを表す。）
【請求項２】
請求項１に記載の一般式（１）で表わされる化合物が、下記一般式（２）で表わされることを特徴とする近赤外蛍光化合物。
【化２】
2014166975.tif 000012
（式中、Ｘ−は、陰イオンを表す。）
【請求項３】
上記請求項１又は２に記載のいずれかの化合物を含むことを特徴とする蛍光ｐＨプローブ。
【請求項４】
上記請求項１又は２に記載のいずれかの化合物を含むことを特徴とする蛍光ｐＨインジケーター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は新規な近赤外蛍光化合物に関する。
【背景技術】
【０００２】  遠赤外及び近赤外（ＮＩＲ）蛍光プローブはこの１０年間高い関心を集めている（特許文献１、非特許文献１）。通常、ＮＩＲ発光と呼ばれる６５０ｎｍから６００ｎｍに発光を有するプローブは、ＮＩＲ光が人体の組織に深く浸透し生物学的試料の損傷が少なくすることができ、また試料から生じるバックグラウンド自動発光の影響を減らすことができるので、センサーを設計する上で特に適している。シアニン、ローダミン、ＢＯＤＰＩ（ｂｏｒａｄｉａｚａｉｎｄａｃｅｎｅ）等の誘導体が近赤外蛍光プローブとして利用されている。インドシアニングリーン（ＩＣＧ）は、蛍光イメージング法の臨床応用において有用な蛍光色素となっている（非特許文献２）。【０００３】  細胞内ｐＨは細胞、酵素及びタンパク質等の生体内の構成要素に影響することから非常に重要である。最近の報告によると、多くのｐＨインジケーターが開発されている（非特許文献３）。この中で、いくつかのｐＨ蛍光プローブは長波長発光の特性を有しているものの発光スペクトルの全領域がＮＩＲ領域にあるものは少ない。ＢＯＤＰＩ系ｐＨプローブは有機溶媒中で６８０ｎｍから８５０ｎｍで発光し、スチリルシアニン系ｐＨプローブはエタノール−水（２／１）溶媒中で５７５ｎｍから８２５ｎｍで発光する。マルチメチレン色素は、また、溶液中、及びｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｉｍａｇｉｎｇやｉｎ  ｖｉｖｏ  ｔｕｍｏｒ  ｉｍａｇｉｎｇにおけるｐＨ応答性について注目を集めｐＨプローブとしての利用が検討されている。しかし、マルチメチレンシアニン色素の安定性については改良が必要である（非特許文献４）。また、ｐＨプローブの溶解性についても改良が必要なものが多い。アミノ置換シアニン系プローブ自己吸収はその化合物の発光スペクトルと吸収スペクトルの重なりが生じている。更に、種々のｐＨでの蛍光強度の変化は通常７倍以下で１５倍に達するのはわずか１例しかない（非特許文献５）。このような状況から、新規な蛍光物質に対して、水溶性であり、高感度であり、ｐＨ可逆性を持ち、生体に応用できるＮＩＲ  ｐＨセンサーが渇望されている。【０００４】  ベンゾ［ａ］フェノキサチン誘導体は、最近の研究において高い治療効果を示し安全性の高いマラリア治療薬として有効であることが示されている（特許文献２）。一方、ベンゾ［ａ］フェノキサチン誘導体の近赤外域の蛍光については知られているものの蛍光強度のｐＨ依存性に基づくｐＨプローブへの利用は記載されていない（非特許文献６）。
【先行技術文献】
【特許文献１】国際公開公報ＷＯ２０１０／１２６０７７号パンフレット
【特許文献２】国際公開公報ＷＯ２００９／１１３５６９号パンフレット
【非特許文献１】Ｙｕａｎ，Ｌ．；Ｌｉｎ，Ｗ．；Ｚｈｅｎｇ，Ｋ．；Ｈｕａｎｇ．Ｗ．，Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．４２，６２２（２０１２）
【非特許文献２】Ｋｉｔａｉ，Ｔ．；Ｉｎｏｍｏｔｏ，Ｔ．；Ｍｉｗａ，Ｍ．；Ｓｈｉｋａｙａｍａ，Ｔ．Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ，Ｖｏｌ．１２ＮＯ．３  Ｊｕｌｙ（２００５）
【非特許文献３】Ｈａｎ，Ｊ．；Ｂｕｒｇｅｓｓ，Ｋ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．，１１０，２７０９（２０１０）
【非特許文献４】Ａｌｔｍａｎ，Ｒ．Ｂ．；Ｔｅｒｒｙ，Ｄ．Ｓ．；Ｚｈｏｕ，Ｚ．；Ｚｈｅｎｇ，Ｑ．；Ｇｅｇｇｉｅｒ，Ｐ．；Ｋｏｌｓｔｅｒ，Ｒ．Ａ．；Ｚｈａｏ，Ｙ．；Ｊａｖｉｔｃｈ，Ｊ．Ａ．；Ｗａｒｒｅｎ，Ｊ．Ｄ．；Ｂｌａｎｃｈａｒｄ，Ｓ．Ｃ．，Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，９，６８（２０１２）
【非特許文献５】Ｔａｎｇ，Ｂ．；Ｙｕ，Ｆ．；Ｌｉ，Ｐ．；Ｔｏｎｇ，Ｌ．；Ｄｕａｎ，Ｘ．；Ｘｉｅ，Ｔ．；Ｗａｎｇ，Ｘ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１３１，３０１６（２００９）
【非特許文献６】Ｊｏｓｅ，Ｊ．；Ｂｕｒｇｅｓｓ，Ｋ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ６２，１１０２１（２００６）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】  本発明の目的は、蛍光プローブやインジケーターとして利用できるベンゾ［ａ］フェノキサチン５位置換イミノ基にピリジニウム構造を含む新規蛍光化合物を提供することである。
【問題を解決するための手段】
【０００６】  本発明者らは上記の目的を達成すべく鋭意検討した結果、ベンゾ［ａ］フェノキサチン５位置換イミノ基にピリジニウム構造を含む新規なベンゾ［ａ］フェノキサチン化合物を見出し、またその化合物の近赤外領域における蛍光が親水性の媒体中でｐＨに対し応答することを見出して本発明を完成するに至った。本発明は以下の方法によって達成される。
【０００７】＜１＞下記一般式（１）で表わされることを特徴とする近赤外蛍光化合物。
【化１】
2014166975.tif 000002
（式中、ｎは２から４の整数を表し、Ｒはメチル基、エチル基又はプロピル基を表し、Ｘ−は陰イオンを表す。）
＜２＞請求項１に記載の一般式（１）で表わされる化合物が、下記一般式（２）で表わされることを特徴とする近赤外蛍光化合物。
【化２】
2014166975.tif 000003
（式中、Ｘ−は、陰イオンを表す。）
＜３＞上記＜１＞又は＜２＞に記載のいずれかの化合物を含むことを特徴とする蛍光ｐＨプローブ。
＜４＞上記＜１＞又は＜２＞に記載のいずれかの化合物を含むことを特徴とする蛍光ｐＨインジケーター。
【０００８】
【発明の効果】
【０００９】  本発明により、親水性媒体中で蛍光が６２５ｎｍから８５０ｎｍの領域にありその蛍光強度がｐＨにより８．２倍から４０．２倍に変化するベンゾ［ａ］フェノキサチン５位置換イミノ基にピリジニウム構造を含む親水性の化合物を得ることができ、これらの化合物を利用することによりｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏで使用する蛍光ｐＨプローブや蛍光ｐＨインジケーターを提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】０．１％ＤＭＳＯを含む各種ｐＨ値の緩衝液中で測定した本発明化合物（１Ｂ、１０μＭ）の（ａ）吸収スペクトル、（ｂ）蛍光スペクトル（励起波長６００ｎｍ）及び（ｃ）波長６９７ｎｍにおける蛍光強度のｐＨ依存性を示す図である。
【図２】本発明の蛍光プローブ（化合物１Ｂ、１０μＭ）によるＨｅＬａ細胞の共焦点顕微鏡画像。（ａ）：明視野画像、（ｂ）：蛍光プルーブで２０分間インキュベートしたＨｅＬａ細胞の蛍光画像、（ｃ）：緩衝液（ｐＨ＝５．０）とナイジェリシン（２μｇ・ｍＬ−１）とで２０分間インキュベートしたＨｅＬａ細胞の蛍光画像、（ｄ）：（ｃ）からその液を除去した後、緩衝液（ｐＨ＝８．０）とナイジェリシン（２μｇ・ｍＬ−１）とで２０分間インキュベートしたＨｅＬａ細胞の蛍光画像
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】  以下、本発明について詳細に説明する。本発明の蛍光化合物は、下記一般式（１）のいずれかで表わされるベンゾ［ａ］フェノキサチン５位置換イミノ基にピリジニウム構造を含む化合物である。
【化１】
2014166975.tif 000004
（式中、ｎは２から４の整数を表し、Ｒはメチル基、エチル基又はプロピル基を表し、Ｘ−は陰イオンを表す。）
Ｘ−で表される陰イオンの好ましい例は、塩素原子、臭素原子、硝酸イオン、硫酸イオン、ｐ−トルエンスルホン酸イオン、シュウ酸イオンが挙げられる。【００１２】  本発明の化合物の具体的な構造式例を以下に示す。【００１３】
【化３】
2014166975.tif 000005
【００１４】  本発明の化合物は６２５ｎｍから８５０ｎｍの領域で蛍光を出し、ｐＨに依存して吸収スペクトル及び蛍光スペクトルが変化する。この変化は、例えば化合物１Ｂの場合で示すと、下記の平衡が存在しプロトン化した分子種と脱プロトン化した分子種の比率がｐＨ値によって変化することに基づくと考えられる。【００１５】
【化４】
2014166975.tif 000006
【００１６】  本発明の化合物は、ベンゾ［ａ］フェノキサチン５位置換イミノ基にピリジニウム構造を含む化合物である。５置換イミノ基にピリジンを含む化合物の場合は水への親和性が低く中性ｐＨ付近の領域では溶媒の有機溶媒比率が非常に高くないと溶解出来ないのに対し、本発明の化合物は、極めて低い有機溶媒比率（例えばＤＭＳＯ：Ｈ２Ｏ＝１：１０００）、でのｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏ実験が可能となる。本発明により、親水性媒体中で蛍光が６２５ｎｍから８５０ｎｍの領域にありその蛍光強度がｐＨにより８．２倍から４０．２倍に変化するベンゾ［ａ］フェノキサチンの５位置換イミノ基にピリジニウム構造を含む親水性の化合物を得ることができ、これらの化合物を利用することによりｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏで使用する蛍光ｐＨプローブや蛍光ｐＨインジケーターを提供できる。【００１７】  本発明の化合物を蛍光プローブとして使用する方法は特に限定されないが、従来公知の方法を用いることができる。例えば、生理食塩水や緩衝液などの水性媒体、またはエタノール、エチレングリコール、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシドなどの水混和性の有機溶媒と水性媒体との混合物などに本発明の化合物のいずれかを溶解し、細胞や組織を含む適切な緩衝液中にこの溶液を添加して蛍光スペクトルを測定すればよい。本発明の蛍光プローブを適切な添加剤と組み合わせて組成物の形態で用いてもよい。例えば、緩衝剤、溶解補助剤、細胞膜浸透促進剤などの添加物と組み合わせることができる。【００１８】  本発明の化合物を細胞内ｐＨ測定用のインジケーターとして使用する方法は特に限定されないが、従来公知の方法を用いることができる。例えば、Ｈａｎ，Ｊ．；Ｂｕｒｇｅｓｓ，Ｋ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．，１１０  （５），ｐｐ２７０９−２７２８（２０１０）に記載された方法を用いることができる。
【実施例】
【００１９】  以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。比較例として用いた化合物ａ、ｂ、ｃ、ＩＣＧ及びＮｉｌｅ  Ｂｌｕｅ  Ａの構造を以下に示す。【００２０】
【化５】
2014166975.tif 000007
【実施例１】
【００２１】＜Ｎ，Ｎ−ジエチル−５−（（１−（２−Ｈ−ヒドロキシエチル）ピリジン−１−イウム−２−イル）イミノ）−５Ｈ−ベンゾ［ａ］フェノキサチン−９−アミン  ナイトレート（化合物１Ａ）の合成＞
ＷＯ２００９−１１３５６９記載の方法で合成した９−Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ−５−（ピリジン−２−イルイミノ）−５Ｈ−ベンゾ［ａ］フェノキサチン（化合物ａ、３９４．２ｍｇ、１．０ｍＭ）とヨードエタノール（０．８０ｍＬ、  １０．０ｍＭ）の混合物をアセトニトリル中で一晩還流した。溶媒を留去して残渣を得た。この残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、溶離液メタノール：クロロホルム＝１：１）により精製して粗生成物を得た。この粗生成物をクロロホルムで再結晶して２−（（９−（ジエチルアミノ）−５Ｈ−ベンゾ［ａ］フェノキサチン−５−イリデン）アミノ）−１−（２−ヒドロキシエチル）ピリジン−１−イウム  イオダイドを得た。このアイオダイドのメタノール溶液をアニオン交換樹脂（ナイトレート型）に通した。溶媒を留去して化合物１Ａを得た。ダークブルーの粉末。収量５７％。融点２３６−２３８℃。分析データ：
ＩＲ  ν（ＫＢｒ，ｃｍ−１）：３４２０，２０３０，１６３０，１５９０，１３８０，１１１０．１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−Ｄ６）δ  ８．６９（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，１Ｈ，Ａｒ−Ｈ），８．６５（ｄ，Ｊ＝６．１Ｈｚ，１Ｈ，Ａｒ−Ｈ），８．５３（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，１Ｈ，Ａｒ−Ｈ），８．３１（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ，Ａｒ−Ｈ），７．９１（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，１Ｈ，Ａｒ−Ｈ），７．８１（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，１Ｈ，Ａｒ−Ｈ），７．７４（ｄ，Ｊ＝９．１Ｈｚ，１Ｈ，Ａｒ−Ｈ），７．６３（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ，Ａｒ−Ｈ），７．５３（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，１Ｈ，Ａｒ−Ｈ），７．０２（ｄ，Ｊ＝９．１Ｈｚ，１Ｈ，Ａｒ−Ｈ），６．７０（ｓ，１Ｈ，Ａｒ−Ｈ），６．６６（ｓ，１Ｈ），５．１４（ｓ，１Ｈ，ＯＨ），４．５６（ｂｒ，２Ｈ，ＣＨ２），３．７７（ｂｒ，２Ｈ，ＣＨ２），３．５５（ｑ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，４Ｈ，２×ＣＨ２），１．１８（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，６Ｈ，２×ＣＨ３）．１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−Ｄ６）δ  １６１．３３，１５７．２４，１５１．７７，１５０．９６，１４６．９０，１４４．８６，１４４．２７，１３７．１５，１３１．６５，１３１．５３，１３１．３４，１３０．０４，１２９．８９，１２６．５２，１２５．５８，１２３．４１，１１９．２１，１１８．７７，１１２．３２，９７．１６，９５．７０，５８．７８，５６．９３，４４．８４，１２．４８．ＨＲＭＳ−ＥＳＩ＋：ｍ／ｚ＝４３９．２１３５（ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  ［Ｍ−Ｃｌ−］＋，４３９．２１３４）．
【実施例２】
【００２２】＜Ｎ，Ｎ−ジエチル−５−（（１−（２−Ｈ−ヒドロキシエチル）ピリジン−１−イウム−３−イル）イミノ）−５Ｈ−ベンゾ［ａ］フェノキサチン−９−アミン  ナイトレート（化合物１Ｂ）の合成＞
ＷＯ２００９−１１３５６９記載の方法で合成した９−Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ−５−（ピリジン−３−イルイミノ）−５Ｈ−ベンゾ［ａ］フェノキサチン（化合物ｂ）とヨードエタノールを実施例１に記載したのと同様の方法により化合物１Ｂを合成した。フレーク状の緑色粉末。収量６５％。融点２３２−２３４℃。分析データ：
ＩＲ  ν（ＫＢｒ，ｃｍ−１）：３４４０，２０３０，１６４０，１５９０，１３８０，１１１０．１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−Ｄ６）δ  ８．７４−８．７３（ｍ，２Ｈ，２×Ａｒ−Ｈ），８．５９（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ，Ａｒ−Ｈ），８．４９（ｄ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，１Ｈ，Ａｒ−Ｈ），８．２０−８．１１（ｍ，２Ｈ，２×Ａｒ−Ｈ），７．８３（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，１Ｈ，Ａｒ−Ｈ），７．７６（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，１Ｈ，Ａｒ−Ｈ），７．６０（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，１Ｈ，Ａｒ−Ｈ），６．８２（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ，Ａｒ−Ｈ），６．４８（ｓ，１Ｈ，Ａｒ−Ｈ），６．３４（ｓ，１Ｈ，Ａｒ−Ｈ），５．３１（ｓ，１Ｈ，ＯＨ），４．６５（ｂｒ，２Ｈ，ＣＨ２），３．９２（ｂｒ，２Ｈ，ＣＨ２），３．４８（ｑ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，４Ｈ，２×ＣＨ２），１．１５（ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，６Ｈ，２×ＣＨ３）．１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−Ｄ６）δ  １５９．１９，１５１．０８，１５０．４７，１４９．５１，１４６．２６，１３９．１３，１３９．０３，１３７．４０，１３７．０９，１３１．１１，１３１．０４，１３０．８５，１３０．６９，１３０．０２，１２８．０４，１２４．８９，１２４．４２，１２３．４６，１１０．１１，９６．７１，９５．７１，６３．２４，６０．１４，４４．４５，１２．４１．ＨＲＭＳ−ＥＳＩ＋：ｍ／ｚ＝４３９．２１４２（ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ［Ｍ−Ｃｌ−］＋，４３９．２１３４）．
【実施例３】
【００２３】  ＜Ｎ，Ｎ−ジエチル−５−（（１−（２−Ｈ−ヒドロキシエチル）ピリジン−１−イウム−４−イル）イミノ）−５Ｈ−ベンゾ［ａ］フェノキサチン−９−アミン  ナイトレート（化合物１Ｃ）の合成＞の合成
ＷＯ２００９−１１３５６９記載の方法で合成した９−Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ−５−（ピリジン−４−イルイミノ）−５Ｈ−ベンゾ［ａ］フェノキサチン（化合物ｃ）とヨードエタノールを実施例１に記載したのと同様の方法により化合物１Ｃを合成した。フレーク状の緑色粉末。収量７０％。融点１９８−２００℃。分析データ：
Ｇｒｅｅｎ  ｆｌａｋｙ  ｃｒｙｓｔａｌｓ，ｙｉｅｌｄ  ７０％，ｍｐ  １９８−２００℃．ＩＲ  ν（ＫＢｒ，ｃｍ−１）：３４１０，２０３０，１６３０，１５８０，１３８０，１１３０．１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−Ｄ６）δ  ８．７２（ｂｒ，２Ｈ，２×Ａｒ−Ｈ），８．６２（ｂｒ，１Ｈ，Ａｒ−Ｈ），８．４１（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ，Ａｒ−Ｈ），７．８６（ｂｒ，１Ｈ，Ａｒ−Ｈ），７．７８（ｂｒ，１Ｈ，Ａｒ−Ｈ），７．６４（ｂｒ，１Ｈ，Ａｒ−Ｈ），７．５６（ｄ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，２Ｈ，２×Ａｒ−Ｈ），６．８７（ｂｒ，１Ｈ，Ａｒ−Ｈ），６．５６（ｓ，１Ｈ，Ａｒ−Ｈ），６．２４（ｓ，１Ｈ，Ａｒ−Ｈ），５．２５（ｓ，１Ｈ，ＯＨ），４．５０（ｂｒ，２Ｈ，ＣＨ２），３．８６（ｂｒ，２Ｈ，ＣＨ２），３．５１（ｂｒ，４Ｈ，２×ＣＨ２），１．１７（ｂｒ，６Ｈ，２×ＣＨ３）．１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−Ｄ６）δ  １６５．２７，１５７．７６，１５０．８７，１４９．９１，１４６．４５，１４５．２１，１３８．３２，１３１．２４，１３１．２０，１３０．９３，１３０．２４，１２９．９６，１２５．２４，１２５．０４，１２３．４４，１１８．８１，１１０．７９，９６．５４，９５．７３，６１．２９，６０．１７，４４．５５，１２．４２．ＨＲＭＳ−ＥＳＩ＋：ｍ／ｚ＝  ４３９．２１４０（ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ［Ｍ−Ｃｌ−］＋，４３９．２１３４）．
【実施例４】
【００２４】    本発明の化合物（１Ａ、１Ｂ及び１Ｃ）各々の保存溶液（１００μＭ）をＤＭＳＯ（１．０ｍＬ）と蒸留水とで１００ｍＬ用量フラスコを用いて調製した。次いで各測定溶液（１０μＭ）を保存溶液（１．０ｍＬ）と緩衝液とで１０ｍＬ用量フラスコを用いて調製し、各化合物を含むこれらの溶液の吸収スペクトルと蛍光スペクトルを測定した。蛍光スペクトルの測定では、６００ｎｍの波長で励起した。  緩衝液は、塩酸−クエン酸緩衝液（ｐＨ＝０．９）、リン酸水素２ナトリウム−クエン酸緩衝液（ｐＨ＝１．６，１．９，２．２，２．５，３．１，３．６，４．０，４．５，４．９，５．４，５．８，６．３，６．７，７．１，７．６，８．０，８．４，９．９）及び炭酸ナトリウム−炭酸水素ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝９．０）を使用した。本発明化合物１Ｂについてｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏ実験で特に重要なｐＨ領域であるｐＨ３．６からｐＨ８．４の範囲における各ｐＨ値に対する吸収スペクトルと蛍光スペクトル、及び蛍光強度（λｍａｘ＝６９７ｎｍ）のｐＨ依存性を図１に示す。図１より、本発明の化合物がｐＨの異なる０．１％ＤＭＳＯを含む緩衝液中でｐＨ変化に対応して吸収スペクトル及び蛍光スペクトルが変化していることが分かる。本発明の化合物１Ａ、１Ｂ及び１Ｃの蛍光のｐＨに対する相対強度を表１に示す。ｐＨ値の変化に対して化合物１Ａの場合はｐＨ６．３から０．９の範囲で、化合物１Ｂの場合はｐＨ８．４から３．Ｉの範囲で、また化合物１Ｃの場合はｐＨ９．５から４．５の範囲でシグモイド状に明確な変化があり、相対強度変化はそれぞれ約１７倍、４０倍、８倍であることが分かる。【００２５】
【表１】
2014166975.tif 000008
一方、比較例として比較化合物ＩＣＧ及びＮｉｌｅ  Ｂｌｕｅ  Ａの近赤外域における蛍光を調べた。ＩＣＧについてはｐＨ値による蛍光強度の変化はあるもののｐＨの領域で蛍光強度が不規則に上下し、Ｎｉｌｅ  Ｂｌｕｅ  Ａについては実質的に変化が無かった。従って、本発明の化合物はｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏ試験において有用なｐＨプローブとして使用できる。
【実施例５】
【００２６】  本発明の化合物（１Ａ、１Ｂ及び１Ｃ）、及び比較化合物としてＷＯ２００９−１１３５６９に記載の化合物ａ、ｂ、及びｃについて、水への親和性の度合いを調べるためＤＭＳＯ−Ｈ２Ｏの比率を変えた３種の溶媒（ＤＭＳＯ：Ｈ２Ｏの溶媒比率、４：１、１：１及び１：１０００）に対する調液可能性の可否を検討した。この結果を表３に示す。表２からわかるように本発明の化合物は溶媒比率が１：１から１：１０００まで非常にＨ２Ｏが多い溶媒比率でも調液可能であることが分かる。【００２７】
【表２】
2014166975.tif 000009
○は、該当する溶媒比率において調液可能であることを示す。
×は、該当する溶媒比率において調液できないことを示す。
【実施例６】
【００２８】  本発明の化合物１Ｂについて、実施例４と同様にしてｐＨ９．０の溶液，ｐＨ９．０の溶液を酸の添加によりｐＨ３．０にした時の溶液、及び再度このｐＨ３．０の溶液をアルカリでｐＨ９．０にした時の溶液それぞれの蛍光スペクトルの波長６９７ｎｍにおける蛍光吸収強度、及び吸収強度のｐＨ変化に対する可逆性を表３に示す。【００２９】
【表３】
2014166975.tif 000010
表３が示すように、本発明の化合物１ＢのｐＨ変化に対する可逆性が非常に優れていることが分かる。本発明の化合物１ＡについてｐＨ７．５とｐＨ１．５の間で、また化合物１ＣについてｐＨ９．５とｐＨ３．０の間で上記と同様に蛍光強度のｐＨ変化に対する可逆性を測定しいずれも１００％であった。したがって、本発明の化合物はｐＨ値の変化に対し安定なｐＨプローブであることが分かる。
【実施例７】
【００３０】  本発明の化合物によるＨｅＬａ細胞中の蛍光に関して共焦点蛍光顕微鏡像（照射：６３３ｎｍレーザー光、蛍光：６５０−７９５ｎｍ）を評価した。ＨｅＬａ細胞を本発明の化合物１Ｂと共に培養した後、ｐＨ５．０の酸性緩衝液に次いでｐＨ９．０の塩基性緩衝液に入れ培養した。この時、ナイジェリシン（２μｇ・ｍＬ−１）をＨｅＬａ細胞と媒体間の酸・塩基平衡を促進するために使用した。本発明の化合物を含むＨｅＬａ細胞の共焦点蛍光顕微鏡像を図２に示す。図２は、本発明の化合物による蛍光が細胞中でｐＨにより変わることを示している。
【図１】
2014166975.tif 000014
【図２】
2014166975.tif 000015