(57)【要約】      （修正有）【課題】二本鎖デオキシリボ核酸の塩基配列中の特定の部位にニックを導入する方法を提供する。【解決手段】ニッキング酵素活性を有するタンパク質を用いて二本鎖デオキシリボ核酸の所定の部位にニックを導入する方法であって、前記二本鎖デオキシリボ核酸の塩基配列中に存するチミン／グアニン（Ｔ／Ｇ）ミスマッチ部位、及び／又は、前記二本鎖デオキシリボ核酸中に存する特定の塩基配列中の部位、に前記ニックを導入することを特徴とする方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ニッキング酵素活性を有するタンパク質を用いて二本鎖デオキシリボ核酸の所定の部位にニックを導入する方法であって、
前記二本鎖デオキシリボ核酸の塩基配列中に存するチミン／グアニン（Ｔ／Ｇ）ミスマッチ部位、及び／又は、
前記二本鎖デオキシリボ核酸中に存する配列番号１に記載の塩基配列中の部位、
に前記ニックを導入することを特徴とする方法。
【請求項２】
前記タンパク質が、ロドコッカス属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ．  ｓｐ）細菌由来である請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記ロドコッカス属細菌が、ロドコッカス  ロドクロウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）、ロドコッカス  エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）、ロドコッカス  ピリジノボランス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｒｉｄｉｎｏｖｏｒａｎｓ）、ロドコッカス  オパカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｐａｃｕｓ）、ロドコッカス  ジョスティ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｊｏｓｔｉｉ）、ロドコッカス  イムテケンシス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｍｔｅｃｈｅｎｓｉｓ）及びロドコッカス  エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ）のいずれかである請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記タンパク質が、以下の（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｃ）のタンパク質である請求項３記載の方法。
（Ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列を含むタンパク質。
（Ｂ）配列番号２記載のアミノ酸配列と同一性が８０％以上のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｃ）配列番号２記載のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を含む、タンパク質。
【請求項５】
塩基配列中にＴ／Ｇミスマッチを有する二本鎖デオキシリボ核酸と、前記タンパク質と、を接触させて、
Ｔ／Ｇミスマッチのチミン（Ｔ）の５´側に前記ニックを導入する請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
塩基配列中にミスマッチを有さないプラスミドと、前記タンパク質と、を接触させて、
前記プラスミド中に存する配列番号１に記載の塩基配列中の部位に前記ニックを導入する請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
二本鎖デオキシリボ核酸の塩基配列中に存するチミン／グアニン（Ｔ／Ｇ）ミスマッチ部位、及び、
二本鎖デオキシリボ核酸中に存する配列番号１に記載の塩基配列中の部位、
にニックを導入するニッキング酵素活性を有するタンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、二本鎖デオキシリボ核酸にニックを導入する方法及びニッキング酵素活性を有するタンパク質に関する。より詳しくは、二本鎖デオキシリボ核酸の塩基配列中の特定の部位にニックを導入する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヌクレアーゼ（Ｎｕｃｌｅａｓｅ）は、核酸の糖とリン酸の間のホスホジエステル結合を加水分解してヌクレオチドとする酵素である。ヌクレアーゼは、分解の形式により、エンドヌクレアーゼとエキソヌクレアーゼに分類できる。
【０００３】
エキソヌクレアーゼ（Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ）は、核酸配列の外側（ｅｘｏ−）から、すなわち核酸の５´末端または３´末端から削るように分解する。一方エンドヌクレアーゼ（Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ）は、核酸配列の内部（ｅｎｄｏ−）で核酸を切断する酵素である。制限酵素は、代表的なエンドヌクレアーゼである。
【０００４】
分子生物学または生化学等の発展により、ＤＮＡが遺伝子を司る本体であることが明らかになって以来、ヌクレアーゼは、遺伝子操作等の遺伝子工学技術において幅広く用いられている。
【０００５】
ニッキング酵素（Ｎｉｃｋｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅあるいはＮｉｃｋｉｎｇ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ）は、二本鎖ＤＮＡのうち一方の鎖だけホスホジエステル結合が切断されたニックを生じさせるエンドヌクレアーゼである。
【０００６】
ニッキング酵素によって生じる通常のニック（３´−ヒドロキシ、５´−リン酸）は、さまざまな酵素反応の基点となるため、ニッキング酵素はＤＮＡの加工に用いられている。
【０００７】
例えば、ニッキング酵素を用いて二本鎖ＤＮＡの片方にニックを形成させ、生じたニックをプライミングサイトとして、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼにより、１５塩基程度の短い核酸を恒温増幅する方法が知られている（非特許文献１参照）。また、この方法の改良技術として、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼとニッキング酵素を用いて、２１塩基以上の核酸を恒温増幅する方法も開発されている（特許文献１参照）。
【０００８】
本発明者らは、ロドコッカス  ロドクロウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）Ｊ−１株からニッキング酵素を単離している（特許文献２参照）。特許文献２には、このニッキング酵素が、二本鎖ＤＮＡの塩基配列中に存するチミン／グアニン（Ｔ／Ｇ）ミスマッチ部位のうち、チミンの５´側及び３´側の塩基が所定の塩基となっている部位のみにニックを導入することが記載されている（当該文献請求項２参照）。
【０００９】
また、本発明者らは、ロドコッカス  ロドクロウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）Ｊ−１株から単離されたニッキング酵素が、プラスミド（ｐＢＲ３２２）のｃｌｏｓｅｄ ｃｉｒｃｕｌａｒをｏｐｅｎ ｃｉｒｃｕｌａｒにするニッキング活性を有していることを明らかにしている（特許文献３参照）。なお、特許文献３では、ニッキング酵素が認識し切断する塩基配列（認識配列）は明らかにされていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開２００８−１３６４５１号公報
【特許文献２】特開２０１３−５７９１号公報
【特許文献３】特開２０１３−５７９２号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｊｅｆｆｒｅｙ  Ｖａｎ  Ｎｅｓｓ，ｅｔ  ａｌ．，（２００３）"Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ"  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ.１００，Ｎｏ.８，４５０４−４５０９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
遺伝子工学技術では、目的の遺伝子操作を効率的に行うため、制限酵素のような、二本鎖ＤＮＡ中の特定の塩基配列を認識して切断するヌクレアーゼが求められている。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記課題解決のため、本発明は、ニッキング酵素活性を有するタンパク質を用いて二本鎖デオキシリボ核酸の所定の部位にニックを導入する方法であって、前記二本鎖デオキシリボ核酸の塩基配列中に存するチミン／グアニン（Ｔ／Ｇ）ミスマッチ部位、及び／又は、前記二本鎖デオキシリボ核酸中に存する配列番号１に記載の塩基配列中の部位、に特異的に前記ニックを導入することを特徴とする方法を提供する。
【００１４】
この方法では、塩基配列中にＴ／Ｇミスマッチを有する二本鎖デオキシリボ核酸と、前記タンパク質と、を接触させて、Ｔ／Ｇミスマッチのチミン（Ｔ）の５´側に前記ニックを導入することが可能である。また、塩基配列中にミスマッチを有さない二本鎖デオキシリボ核酸（特にはプラスミド）と、前記タンパク質と、を接触させて、前記二本鎖デオキシリボ核酸（特にはプラスミド）中に存する配列番号１に記載の塩基配列中の部位に前記ニックを導入することも可能である。
【００１５】
この方法において、前記タンパク質は、ロドコッカス属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ．  ｓｐ）細菌由来とできる。また、前記ロドコッカス属細菌は、ロドコッカス  ロドクロウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）、ロドコッカス  エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）、ロドコッカス  ピリジノボランス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｒｉｄｉｎｏｖｏｒａｎｓ）、ロドコッカス  オパカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｐａｃｕｓ）、ロドコッカス  ジョスティ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｊｏｓｔｉｉ）、ロドコッカス  イムテケンシス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｍｔｅｃｈｅｎｓｉｓ）及びロドコッカス  エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ）のいずれかとできる。
【００１６】
特に、前記タンパク質は、以下の（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｃ）のタンパク質とすることができる。
（Ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列を含むタンパク質。
（Ｂ）配列番号２記載のアミノ酸配列と同一性が８０％以上のアミノ酸配列からなり、かつニッキング酵素活性を有するタンパク質。
（Ｃ）配列番号２記載のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を含み、かつニッキング酵素活性を有するタンパク質。
【００１７】
また、本発明は、二本鎖デオキシリボ核酸の塩基配列中に存するチミン／グアニン（Ｔ／Ｇ）ミスマッチ部位、及び、二本鎖デオキシリボ核酸中に存する配列番号１に記載の塩基配列中の部位、に特異的にニックを導入するニッキング酵素活性を有するタンパク質も提供する。
【００１８】
本発明において、「ニッキング酵素活性」とは、特定の配列を有する二本鎖デオキシリボ核酸の片方の鎖のみを切断するエンドヌクレアーゼ活性を意味する。また、「エンドヌクレアーゼ活性」とは、核酸配列の内部（ｅｎｄｏ−）で核酸を切断する酵素活性を意味する。
【発明の効果】
【００１９】
本発明により、二本鎖デオキシリボ核酸の塩基配列中の特定の部位にニックを導入する方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】無細胞タンパク質合成系により得たＲｒｈＪ１ＩＩヌクレアーゼのニッキング酵素活性を示す図である。
【図２】プラスミドｐＲＲ０１の構造を示す模式図である。
【図３】大腸菌発現系により得たＲｒｈＪ１ＩＩヌクレアーゼのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ａ）及びＨｉｓ−ｔａｇ特異的抗体を用いたウェスタンブロッティング（Ｂ）の結果を示す図である。
【図４】大腸菌発現系により得たＲｒｈＪ１ＩＩヌクレアーゼのニッキング酵素活性を示す図である。
【図５】ＲｒｈＪ１ＩＩヌクレアーゼの閉環状ｐＢＲ３２２に対するニッキング酵素活性を示す図である。
【図６】ＲｒｈＪ１ＩＩヌクレアーゼの認識配列の解析結果を示す図である。
【図７】ＲｒｈＪ１ＩＩヌクレアーゼのミスマッチ塩基対に対する認識特異性の解析結果を示す図である。
【図８】さまざまなロドコッカス属細菌の産生するヌクレアーゼのホモロジー解析結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下、本発明を実施するための好適な形態について説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本発明の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。
【００２２】
発明者らは、ロドコッカス  ロドクロウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）Ｊ−１株から単離されたニッキング酵素ＲｒｈＪ１ＩＩ（配列番号２）の二本酸ＤＮＡ切断活性を詳細に検討した結果、ニッキング酵素ＲｒｈＪ１ＩＩ（ＲｒｈＪ１ＩＩヌクレアーゼ）が、二本鎖ＤＮＡの塩基配列中に存する全てのチミン／グアニン（Ｔ／Ｇ）ミスマッチ部位、及び／又は、二本鎖ＤＮＡ中に存する配列番号１に記載の塩基配列中の部位、に特異的にニックを導入することを見い出した（後述する実施例参照）。
【００２３】
ニッキング酵素ＲｒｈＪ１ＩＩは、二本鎖ＤＮＡの塩基配列中のＴ／Ｇミスマッチを、Ｔ／Ｇミスマッチの５´側及び３´側の塩基がアデニン（Ａ），グアニン、チミン及びシトシン（Ｃ）のいずれであるかを問わず、切断した。従って、ＲｒｈＪ１ＩＩを用いたニック導入方法によれば、二本鎖ＤＮＡの塩基配列中に存する全てのチミン／グアニン（Ｔ／Ｇ）ミスマッチ部位に特異的にニックを導入できる。
【００２４】
また、ニッキング酵素ＲｒｈＪ１ＩＩは、ミスマッチを有さないプラスミド（ｐＢＲ３２２）中に存する配列番号１に記載の塩基配列を認識して切断し、該プラスミドのｃｌｏｓｅｄ ｃｉｒｃｕｌａｒをｏｐｅｎ ｃｉｒｃｕｌａｒにした。従って、ＲｒｈＪ１ＩＩを用いたニック導入方法によれば、ミスマッチを有さない二本鎖ＤＮＡについても、その塩基配列中に存する配列番号１に記載の塩基配列中に特異的にニックを導入できる。
【００２５】
二本鎖ＤＮＡの切断は、ニッキング酵素と二本鎖ＤＮＡとを適当な溶液中で接触させ反応させることにより行うことができる。ＤＮＡ量、酵素量、反応温度、反応溶液の組成及び反応時間などの条件は、公知技術に基づいて適宜設定できる。
【００２６】
ニッキング酵素と接触させる二本鎖ＤＮＡは、ミスマッチを有するものであっても有しないものであってもよく、配列番号１に記載の塩基配列を含むものであっても含まないものであってもよいが、二本鎖ＤＮＡの塩基配列中にＴ／Ｇミスマッチが存在する場合には、全てのＴ／ＧミスマッチのＴの５´側にニックが導入される。同時に、二本鎖ＤＮＡの塩基配列中にミスマッチを有さない配列番号１に記載の塩基配列が存在する場合には、該塩基配列中にニックが導入される。
【００２７】
本発明に係るニック導入方法で用いるニッキング酵素は、ＲｒｈＪ１ＩＩ（配列番号２）に限定されず、ＲｒｈＪ１ＩＩと同様に、二本鎖ＤＮＡの塩基配列中に存する全てのＴ／Ｇミスマッチ部位、及び／又は、二本鎖ＤＮＡ中に存する配列番号１に記載の塩基配列中の部位、に特異的にニックを導入する活性（以下「ＲｒｈＪ１ＩＩニッキング酵素活性」という）を有するタンパク質であればよい。
【００２８】
ＲｒｈＪ１ＩＩニッキング活性を有するタンパク質は、候補タンパク質を二本鎖ＤＮＡと接触させ、反応後のＤＮＡの分子量またはＤＮＡ断片数を測定することにより得ることができる。当業者であれば、二本鎖ＤＮＡ量、候補タンパク質量、反応温度、反応溶液の組成及び反応時間などの条件を適宜設定することができる。反応後のＤＮＡの分子量は、例えばアガロース電気泳動によって測定できる。反応前のＤＮＡの分子量と反応後のＤＮＡの分子量、または反応前のＤＮＡの断片数と反応後のＤＮＡ断片数とを比較することで、候補タンパク質についてＲｒｈＪ１ＩＩニッキング酵素活性の有無を評価できる。
【００２９】
本発明に係るニック導入方法で用いられ得るニッキング酵素としては、以下の（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｃ）のタンパク質が挙げられる。
【００３０】
（Ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列を含むタンパク質。
【００３１】
（Ｂ）配列番号２記載のアミノ酸配列と同一性（相同性）が８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上のアミノ酸配列からなり、かつＲｒｈＪ１ＩＩニッキング酵素活性を有するタンパク質。
【００３２】
（Ｃ）配列番号２記載のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつＲｒｈＪ１ＩＩニッキング酵素活性を有するタンパク質。
【００３３】
具体的には、以下の（ｉ）〜（ｖ）のアミノ酸配列を含むタンパク質が挙げられる。
（ｉ）配列番号２記載のアミノ酸配列において、１〜２０個（好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜２個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列。
（ｉｉ）配列番号２記載のアミノ酸配列の１〜２０個（好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜２個）のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列。
（ｉｉｉ）配列番号２記載のアミノ酸配列に１〜２０個（好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜２個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列。
（ｉｖ）配列番号２記載のアミノ酸配列に１〜２０個（好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜２個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列。
（ｖ）上記（ｉ）〜（ｉｖ）を組み合わせたアミノ酸配列。
【００３４】
上記（ｉｉ）におけるアミノ酸置換は、類似するアミノ酸残基間の保存的置換が好ましい。例えばアミノ酸は、その側鎖の性質に基づいて、疎水性アミノ酸（Ａ，Ｉ，Ｌ，Ｍ，Ｆ，Ｐ，Ｗ，Ｙ，Ｖ）、親水性アミノ酸（Ｒ，Ｄ，Ｎ，Ｃ，Ｅ，Ｑ，Ｇ，Ｈ，Ｋ，Ｓ，Ｔ）、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（Ｇ，Ａ，Ｖ，Ｌ，Ｉ，Ｐ）、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（Ｓ，Ｔ，Ｙ）、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（Ｃ，Ｍ）、カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸（Ｄ，Ｎ，Ｅ，Ｑ）、塩基含有側鎖を有するアミノ酸（Ｒ，Ｋ，Ｈ）、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（Ｈ，Ｆ，Ｙ，Ｗ）に分類される。各群に分類されたアミノ酸は、相互に置換したときに、当該ポリペプチドの活性が維持される可能性が高いことが知られており、そのようなアミノ酸相互の置換が好ましい。例えば、グリシンとプロリン、グリシンとアラニンまたはバリン、ロイシンとイソロイシン、グルタミン酸とグルタミン、アスパラギン酸とアスパラギン、システインとスレオニン、スレオニンとセリン又はアラニン、リジンとアルギニン間での置換を挙げることができる。
【００３５】
さらに、本発明に係るニック導入方法で用いられ得るニッキング酵素として、ロドコッカス  ロドクロウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）、ロドコッカス  エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）、ロドコッカス  ピリジノボランス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｒｉｄｉｎｏｖｏｒａｎｓ）、ロドコッカス  オパカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｐａｃｕｓ）、ロドコッカス  ジョスティ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｊｏｓｔｉｉ）、ロドコッカス  イムテケンシス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｍｔｅｃｈｅｎｓｉｓ）及びロドコッカス  エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ）などのロドコッカス属細菌由来のタンパク質も挙げられる。
【００３６】
より具体的には、ロドコッカス  ロドクロウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）Ｊ１，ロドコッカス  エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）ＰＲ４（ＮＢＲＣ  １００８８７），ＳＫ１２１，ロドコッカス  ピリジノボランス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｒｉｄｉｎｏｖｏｒａｎｓ）ＡＫ３７，ロドコッカス  オパカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｐａｃｕｓ）Ｂ４，ロドコッカス  ジョスティ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｊｏｓｔｉｉ）ＲＨＡ１，ロドコッカス  イムテケンシス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｍｔｅｃｈｅｎｓｉｓ），ロドコッカス  エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ）１０３Ｓ，ＡＴＣＣ３３７０７，ロドコッカス  スピーシーズ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）ＤＫ１７，ＪＶＨ１，Ｐ１４等由来のタンパク質が挙げられる。
【実施例】
【００３７】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明する。以下は本発明の例示であって本発明を限定する趣旨ではない。本明細書において「％」は、「ｗ／ｖ」を意味するものとする。
【００３８】
［実施例１：無細胞タンパク質合成系によるＲｒｈＪ１ＩＩヌクレアーゼの生産］
（１）無細胞タンパク質合成系の鋳型ＤＮＡの作製
参考例１〜３で調製したプラスミドｐＢＲｒｈＪ１ＩＩのＯＲＦ１をターゲットとして、Ｎ末端にＨｉｓ−ｔａｇ、Ｃ末端にＳｔｒｅｐｔ−ｔａｇが付加するよう、配列番号３、４に示すプライマーを設計して一次ＰＣＲを行った。
【００３９】
反応液組成                                                      
鋳型ＤＮＡ（ｐＢＲｒｈＪ１ＩＩ）                  １μｌ
１０×ＥｘＴａｑ  Ｂｕｆｆｅｒ（タカラバイオ社）１０μｌ
３０μＭ  プライマーＨＩＳ（配列番号３）          １μｌ
３０μＭ  プライマーＳＴＲＥＰ（配列番号４）      １μｌ
２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ                              ８μｌ
ＤＭＳＯ                                        １０μｌ
滅菌水                                          ６８μｌ
ＥｘＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社）  １μｌ      
総量                                          １００μｌ
【００４０】
温度サイクル
９４℃：６０秒、５０℃：６０秒および７２℃：６０秒の反応を３０サイクル。
【００４１】
その後、転写開始シグナルを付加するために配列番号５、６に示すプライマーを設計し、一次ＰＣＲ産物を鋳型として二次ＰＣＲを行った。
【００４２】
反応液組成                                              
鋳型ＤＮＡ（一次ＰＣＲ産物）                      １μｌ
１０×ＥｘＴａｑ  Ｂｕｆｆｅｒ（タカラバイオ社）１０μｌ
３０μＭ  プライマーＮＨ（配列番号５）            １μｌ
３０μＭ  プライマーＣＳ（配列番号６）            １μｌ
２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ                              ８μｌ
ＤＭＳＯ                                        １０μｌ
滅菌水                                          ６８μｌ
ＥｘＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社）  １μｌ
総量                                          １００μｌ
【００４３】
温度サイクル：９４℃：６０秒、５０℃：６０秒および７２℃：６０秒の反応を３０サイクル。
【００４４】
二次ＰＣＲにて得られたＤＮＡ断片を鋳型ＤＮＡとして、ＥａｓｙＸｐｒｅｓｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用い、添付のマニュアルにしたがってタンパク質の翻訳を行い、クルードライセートを得た。
【００４５】
得られたクルードライセート中に発現したタンパク質を、Ｎｉ−ＮＴＡ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ａｇａｒｏｓｅ  Ｂｅａｄｓ（ＱＩＡＧＥＮ社製）とＳｔｒｅｐ−ｔａｃｔｉｎ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｂｅａｄｓ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製した。
【００４６】
精製したサンプルをウェスタンブロッティングに供した後、Ｐｅｎｔａ−Ｈｉｓ  ＨＲＰ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）またはＳｔｒｅｐ−ｔａｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いた化学発光法にてタンパク質を検出した。
【００４７】
（２）ニッキング酵素活性の確認
（１）で調製した無細胞タンパク質合成系精製サンプルを用いて、ニッキング酵素活性を調べた。
【００４８】
基質としてｐＢＲ３２２プラスミド０．２５μｇを使用し、無細胞タンパク質合成系精製サンプルをＮＥＢ４緩衝液（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂ社）とともに加え、３７℃で２時間インキュベートした。サンプリングした反応液はフェノール処理を行い、電気泳動に供した。用いた基質ＤＮＡは、ＲｒｈＪ１ＩＩヌクレアーゼによりニックが入ると約９ｋｂの位置にバンドが出現する。
【００４９】
結果を図１に示す。図中、「Ｍ」は分子量マーカーを示す。「１」は無細胞タンパク質合成系精製サンプルを添加して行った実験結果を、「ＮＣ」は添加しないで行った実験結果を示す。「１」では、約９ｋｂの位置に、ニックが入った基質ＤＮＡのバンドが出現し、ＲｒｈＪ１ＩＩヌクレアーゼがニッキング酵素活性を有することが確認された。
【００５０】
［実施例２：大腸菌組換体によるＲｒｈＪ１ＩＩヌクレアーゼの生産］
（１）ＲｒｈＪ１ＩＩヌクレアーゼ発現ベクターの構築
ＲｒｈＪ１ＩＩヌクレアーゼを得るために、参考例１で得られたＪ１菌染色体ＤＮＡを鋳型として使用し、以下に示す反応液組成およびプライマーを用いてＰＣＲを行った。この際、ＲｒｈＪ１ＩＩヌクレアーゼをＨｉｓ−ｔａｇ融合タンパクとして発現させるため、ＲｒｈＪ１ＩＩヌクレアーゼ遺伝子上流にＳＤ配列とＨｉｓ−ｔａｇ配列を付加した。
【００５１】
反応液組成                                                  
鋳型ＤＮＡ（Ｊ１菌染色体ＤＮＡ）                    １μｌ
２×ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ  ＫＯＤ  ＦＸ（東洋紡）  ２５μｌ
１０μＭプライマーＮ（配列番号７）              １．５μｌ
１０μＭプライマーＣ（配列番号８）              １．５μｌ
２ｍＭ  ｄＮＴＰ                                  １０μｌ
ＫＯＤ  ＦＸ  ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡）          １μｌ
総量                                              ５０μｌ
【００５２】
温度サイクル：９４℃：１２０秒、９８℃：１０秒および６８℃：１分の反応を３０サイクル。
【００５３】
反応終了後、反応液５μｌを１％アガロースゲルにおける電気泳動に供し、約０．５ｋｂのＰＣＲ産物の検出を行った。ＰＣＲ産物を確認した後、反応液からＰＣＲ産物をＤＮＡ／ＲＮＡ  ｅｘｔａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＶＩＯＧＥＮＥ社）で精製した。
【００５４】
得られたＰＣＲ産物を、制限酵素ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断した。制限酵素処理を行ったＰＣＲ産物を１％アガロースゲルにおける電気泳動に供し、約０．５ｋｂ付近のバンドを回収した。
【００５５】
回収したＰＣＲ産物をベクターｐＵＣ１８のＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ部位に連結し、プラスミドを作製した。得られたプラスミドをｐＲＲ０１と名づけた。図２は、プラスミドｐＲＲ０１の構造を示す模式図である。
【００５６】
プラスミドｐＲＲ０１で大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、１００μｇ／ｍｌアンピシリン、１ｍＭ  ＩＰＴＧ，５０μｇ／ｍｌ  Ｘ−ｇａｌを含むＬＢ寒天培地上でコロニーを形成させた。得られた白色のコロニーを１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ液体培地に植菌し、３７℃で一晩培養した後Ｍｉｎｉ  Ｐｌｕｓ  Ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ＶＩＯＧＥＮＥ社）を使用してプラスミドを回収し、ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩによる切断とシークエンス解析を行って目的のＤＮＡ断片が挿入されていることを確認した。
【００５７】
（２）精製酵素の調製
（１）で作製したＲｒｈＪ１ＩＩヌクレアーゼ発現ベクターを含む大腸菌組換体（ＪＭ１０９／ｐＲＲ０１）を、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ液体培地１０ｍｌで３７℃，５時間培養した後、１ｍｌを１００μｇ／ｍｌアンピシリン、１ｍＭ  ＩＰＴＧを含むＬＢ液体培地１００ｍｌ、１本に植菌し、３７℃，１８時間培養した。
【００５８】
培養液を遠心分離によって回収し、回収した菌体を破砕用緩衝液（組成  ２０ｍＭ  Ｓｏｄｉｕｍ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，０．５Ｍ  ＮａＣｌ，２０ｍＭ  イミダゾール、１０％  グリセロール、ｐＨ７．４）に懸濁した後４℃で１０分間超音波による破砕を行った。破砕液を遠心分離し、得られた上清を無細胞抽出液とした。
【００５９】
無細胞抽出液をＨｉｓ−ｔａｇ精製カラム（Ｈｉｓ  Ｔｒａｐ  ＨＰ：ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて精製した。精製タンパク質はＥｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（０．５Ｍ  ＮａＣｌ，０．５Ｍ  イミダゾール、２０ｍＭ  Ｓｏｄｉｕｍ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，１０％グリセロール、ｐＨ７．４）にて溶出し、２つのフラクションに分画してフラクション１、フラクション２とした。
【００６０】
得られた精製サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＨｉｓ−ｔａｇ特異的抗体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いたウェスタンブロッティングに供し、目的タンパク質が精製されていることを確認した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を図３Ａに、ウェスタンブロッティングの結果を図３Ｂに示す。図中、Ａ，Ｂの「１」は分子量マーカー（ＢｉｏＲａｄ  Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｂｒｏａｄ）、「４」はポジティヴコントロール（Ｈｉｓ×６融合タンパク質、１２ｋＤａ）である。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果、フラクション１（Ａ「２」）とフラクション２（Ａ「３」）で約２５ｋＤａ付近にバンドが出現し、Ｈｉｓ−ｔａｇ特異的抗体を用いたウェスタンブロッティングにより、目的タンパク質であることを確認した（Ｂ「２」「３」）。
【００６１】
［実施例３：酵素活性の解析］
（１）ニッキング酵素活性の確認
実施例２で調製した精製酵素を用いて、ＲｒｈＪ１ＩＩヌクレアーゼの活性を調べた。
【００６２】
基質としてｐＢＲ３２２プラスミド４３．８ｎｇを使用し、精製酵素を緩衝液Ｌ、Ｍ、Ｈ、Ａ、ＢまたはＳ（すべてニッポンジーン社）とともに加え、３７℃で１時間インキュベートした。サンプリングした反応液はフェノール処理を行い、電気泳動に供した。用いた基質ＤＮＡは、ＲｒｈＪ１ＩＩヌクレアーゼによりニックが入ると約９ｋｂの位置にバンドが出現する。
【００６３】
結果を図４に示す。図中、「Ｍ」は分子量マーカーを示し、「−」は酵素を添加しないで行った実験結果を示す。電気泳動の結果、酵素を添加したサンプル（「Ｌ」、「Ｍ」、「Ｈ」、「Ａ」、「Ｂ」、「Ｓ」）はいずれも約９ｋｂの位置にバンドが出現した。この結果より、ＲｒｈＪ１ＩＩヌクレアーゼが、ニッキング酵素活性を有していることが確認された。
【００６４】
（２）ミスマッチを有さない二本鎖ＤＮＡに対するニッキング酵素活性と認識配列の解析
閉環状ｐＢＲ３２２を基質として、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ７．５）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡを含む２０μｌの反応液で、３７℃で９０分間酵素反応を行った。反応後のサンプルを、アガロースゲルを用いて分離した。
【００６５】
結果を図５に示す。図中「Ｍ」は分子量マーカー、「‐」は酵素無添加、「＋」は酵素添加のサンプルを示す。閉環状のｐＢＲ３２２は開環状へと変換し、ＲｒｈＪ１ＩＩヌクレアーゼはミスマッチをもたない二本鎖ＤＮＡに対してニッキング酵素活性を示した。
【００６６】
さらに、ニッキング酵素活性の塩基配列特異性を明らかにするため、ｐＢＲ３２２の塩基配列上の異なる部分配列（５０ｂｐ）を有するオリゴＤＮＡを合成し、オリゴＤＮＡを基質として酵素反応を行った。オリゴＤＮＡのうちの片方の鎖の５´末端をビオチンで標識し、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、５ｍＭ ＭｎＣｌ2、０．１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡを含む１０μｌの反応液で、３７℃で１８時間酵素反応を行った。反応後のサンプルを、変性ポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動した後、化学発光法を用いて検出した。
【００６７】
結果を図６に示す。図Ｂ中「Ｍ」は分子量マーカー（２０ｍｅｒ）、「‐」は酵素無添加、「＋」は酵素添加のサンプルを示す。Ａに示すオリゴＤＮＡ１は、Ｂに示すように切断されて２０ｍｅｒ以上のＤＮＡ断片が生成した。また、Ａに示すオリゴＤＮＡ２は、Ｂに示すように切断されて２０ｍｅｒＤＮＡ断片が生成した。この結果から、ＲｒｈＪ１ＩＩヌクレアーゼは、オリゴＤＮＡ１及びオリゴＤＮＡ２の共通配列である配列番号１の塩基配列を認識して切断すると考えられた。さらに、生成したＤＮＡ断片のサイズから、ＲｒｈＪ１ＩＩヌクレアーゼは、配列番号１の塩基配列中の「ＣＡＧ」で示す３塩基を含む配列を認識してその近傍を切断している可能性が示唆された。
【００６８】
（３）ミスマッチ塩基対の認識特異性の解析
４０ｍｅｒと２９ｍｅｒの一本鎖ＤＮＡをアニーリングさせて、Ｔ／Ｇミスマッチを１ヶ所持つ一本鎖突出の基質を調製した。基質は、Ｔ／Ｇミスマッチの５´側の塩基をＡ、Ｇ、Ｔ、Ｃの４種類としたもの、３´側の塩基をＡ、Ｇ、Ｔ、Ｃの４種類としたものの合計１６種類を作成した。
【００６９】
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ７．５）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、５ｍＭ ＭｎＣｌ2、０．１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡを含む２０μｌの反応液で、３７℃で一晩酵素反応を行った。反応生成物をＤＮＡ／ＲＮＡ分析用マイクロチップ電気泳動装置ＭｕｌｔｉＮＡ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＭＣＥ−２０２）を用いて解析した。
【００７０】
結果を図７に示す。図中「Ｍ」は分子量マーカー（２０ｍｅｒ）、「‐」は酵素無添加、「＋」は酵素添加のサンプル、「Ｐ」は２０ｍｅｒの一本鎖ＤＮＡを示す。Ｔ／Ｇミスマッチの５´側及び３´側に位置する塩基を変化させた１６種類の基質すべてから、Ｔ／Ｇミスマッチ部位で切断された２０ｍｅｒのＤＮＡ断片が生成した。この結果から、ＲｒｈＪ１ＩＩヌクレアーゼは、Ｔ／Ｇミスマッチを含む３塩基対に対して認識特異性を示さず、全てのＴ／Ｇミスマッチを切断することが明らかとなった。
【００７１】
［参考例１：Ｊ１菌染色体ＤＮＡの調製］
ロドコッカス  ロドクロウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）Ｊ−１株を１００ｍｌのＭＹＫＧ培地中、３０℃にて７２時間振盪培養した。
【００７２】
培養後、集菌し、集菌された菌体をＳａｌｉｎｅ−ＥＤＴＡ溶液（０．１Ｍ  ＥＤＴＡ，０．１５Ｍ  ＮａＣｌ（ｐＨ８．０））４ｍｌに懸濁した。懸濁液にリゾチーム４０ｍｇを加えて３７℃で１〜２時間振盪した後、−２０℃で凍結した。
【００７３】
次に、１０ｍｌのＴｒｉｓ−ＳＤＳ液（１％ＳＤＳ，０．１Ｍ  ＮａＣｌ，０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０））を穏やかに振盪しながら加え、さらにプロテイナーゼＫ（１０ｍｇ／ｍｌ）を１０μｌ加えて３７℃で１時間振盪した。
【００７４】
次に、等量のＴＥ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０））飽和フェノールを加え、攪拌後、遠心した。上層を採取し、２倍量のエタノールを加えた後、ガラス棒でＤＮＡを巻き取り、９０％，８０％，７０％のエタノールで順次フェノールを取り除いた。
【００７５】
次に、ＤＮＡを３ｍｌのＴＥ緩衝液に溶解させ、リボヌクレアーゼＡ溶液（１００℃，１５分間の加熱処理済）を１０μｇ／ｍｌになるように加え、３７℃で３０分間振盪した。さらに、プロテイナーゼＫを加え３７℃で３０分間振盪した後、等量のＴＥ飽和フェノールを加えて遠心し、上層と下層に分離させた。
【００７６】
上層についてこの操作を２回繰り返した後、同量のクロロホルム（４％イソアミルアルコール含有）を加え、同様の抽出操作を繰り返した。その後、上層に２倍量のエタノールを加え、ガラス棒でＤＮＡを巻き取り回収し、染色体ＤＮＡ標品を得た。
【００７７】
［参考例２：ＲｒｈＪ１ＩＩヌクレアーゼ遺伝子のＰＣＲ］
ＲｒｈＪ１ＩＩヌクレアーゼ遺伝子をＰＣＲで増幅するためのプライマーを以下の方法で設計した。図８はロドコッカス属細菌の産生するヌクレアーゼのアミノ酸ホモロジー解析結果を示す。図中でホモロジー解析を行ったヌクレアーゼとその由来は以下のとおりである。
【００７８】
Ａ：ＤＮＡ  ｍｉｓｍａｔｃｈ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｖｓｒ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ  ＡＴＣＣ３３７０７）
Ｂ：ＮａｅＩ  ｖｅｒｙ  ｓｈｏｒｔ  ｐａｔｃｈ  ｒｅｐａｉｒ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ  ＳＫ１２１）
Ｃ：Ｖｅｒｙ  ｓｈｏｒｔ  ｐａｔｃｈ  ｒｅｐａｉｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｊｏｓｔｉｉ  ＲＨＡ１）
Ｄ：ＤＮＡ  ｍｉｓｍａｔｃｈ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ  （Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ  ＰＲ４）
Ｅ：ＤＮＡ  ｍｉｓｍａｔｃｈ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｐａｃｕｓ  Ｂ４）
【００７９】
特に保存されている２つの領域を選んで配列番号９、１０のデジェネレイトプライマーを設計し、参考例１で調製したＪ１菌ゲノムＤＮＡを鋳型としてデジェネレイトＰＣＲを以下の条件で実施した。その結果、約３５０ｂのバンドの増幅が確認された。
【００８０】
反応液組成                                                
鋳型ＤＮＡ（Ｊ１菌染色体ＤＮＡ，参考例１）        １μｌ
１０×Ｅｘ  Ｂｕｆｆｅｒ（タカラバイオ社）      １０μｌ
１５０μＭプライマーＤＧ−０１（配列番号９）      １μｌ
１５０μＭプライマーＤＧ−０２（配列番号１０）    １μｌ
２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ                              ８μｌ
ＤＭＳＯ                                        １０μｌ
滅菌水                                          １８μｌ
ＥｘＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社）  １μｌ
総量                                            ５０μｌ
【００８１】
温度サイクル：９４℃：３０秒、６５℃：３０秒および７２℃：１分の反応を３０サイクル。
【００８２】
次に、増幅された配列のダイレクトシークエンシングをＰＣＲで使用したプライマーを用いて実施した。その結果、配列番号１１に示す配列が得られ、ホモロジー検索の結果、前述のエンドヌクレアーゼとの相同性が認められた。
【００８３】
［参考例３：ＲｒｈＪ１ＩＩヌクレアーゼ遺伝子のクローニング］
（１）ゲノミックサザンハイブリダイゼーション
ＡｐａＬＩ，ＢａｍＨＩ，ＣｌａＩ，Ｅｃｏ５２Ｉ，ＥｃｏＴ１４Ｉ，ＫｐｎＩ，ＭｌｕＩ，ＮｃｏＩ，ＮｏｔＩ，ＰｖｕＩ，ＳａｃＩ，ＸｂａＩ，ＸｈｏＩそれぞれで消化したＪ１菌ゲノムＤＮＡに対し、後述の方法で調製したＲｒｈＪ１ＩＩのプローブを用いてサザンハイブリダイゼーションを行ったところ、Ｅｃｏ５２Ｉで消化した断片から、約１．２ｋｂの単一シグナルが得られた。
【００８４】
なお、ＲｒｈＪ１ＩＩのプローブは以下のようにして調製した。参考例２で調製したＰＣＲ産物をＧＦＸ  ＰＣＲ  ＤＮＡ  ｂａｎｄ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  Ｂａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ＧＥヘルスケア  バイオサイエンス社）を用いて精製した。精製したＰＣＲ産物に対してＡｌｋＰｈｏｓ    Ｄｉｒｅｃｔ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｋｉｔ（ＧＥヘルスケア  バイオサイエンス社）を用い、添付のマニュアルにしたがってラベリングを行い、ＲｒｈＪ１ＩＩのプローブとした。
【００８５】
（２）コロニーハイブリダイゼーション
Ｊ１菌ゲノムＤＮＡを制限酵素Ｅｃｏ５２Ｉで分解して０．７％アガロースゲル電気泳動で分離し、ゲルからＧＦＸ  ＰＣＲ  ＤＮＡ  ｂａｎｄ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  Ｂａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ＧＥヘルスケア  バイオサイエンス社）を使用して約１．２ｋｂの断片を回収した。得られた断片は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（＋）ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）にＤＮＡ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ＜Ｍｉｇｈｔｙ  ｍｉｘ＞（タカラバイオ社製）を用いて連結した。反応条件は以下の通りである。
【００８６】
反応液組成：                                                          
ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｍｉｇｈｔｙ  ｍｉｘ（タカラバイオ社製）    ５μｌ
Ｊ１菌ゲノムＤＮＡ／Ｅｃｏ５２Ｉ切断断片                      ４μｌ
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（＋）／Ｅｃｏ５２Ｉ切断断片  １μｌ
総量                                                        １０μｌ
【００８７】
反応：１６℃，１時間
【００８８】
上記ライゲーション産物の全量を、後述の方法で調製した大腸菌ＪＭ１０９株コンピテントセル２００μｌに加え、０℃で３０分放置した。続いて、前述コンピテントセルに４２℃で４５秒間ヒートショックを与え、０℃で２分間冷却した。
【００８９】
その後、ＳＯＣ培地（２０ｍＭグルコース、２％バクトトリプトン、０．５％バクトイーストエキス、１０ｍＭ  ＮａＣｌ，２．５ｍＭ  ＫＣｌ，１ｍＭ  ＭｇＳＯ４，１ｍＭ  ＭｇＣｌ2）を１ｍｌ添加し、３７℃にて１時間振盪培養した。培養後の培養液を２００μｌずつ、ＬＢ  ＡＩＸプレート（１００μｇ／ｌアンピシリン、１００μＭ  ＩＰＴＧ，５０μｇ／ｌ  Ｘ−ｇａｌを含むＬＢ寒天培地）に塗布し、３７℃で一晩放置した。
【００９０】
プレート上に生育した白色の組換コロニーを新しいＬＢ  ＡＩＸプレートに、プレート１枚に付き９４個、プレート１０枚分単離した。各プレートにはインサートを含まないｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（＋）で形質転換したＪＭ１０９株を２コロニー／プレート植菌した。コロニー単離したプレートを３７℃で一晩放置した後、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ+（ＧＥヘルスケア  バイオサイエンス社）膜にコロニーを写し取り、上記（１）で調製したＲｒｈＪ１ＩＩのプローブを用いてコロニーハイブリダイゼーションを行った。
【００９１】
検出されたコロニーを培養して得られた培養液を集菌後、ＱＩＡｐｒｅｐ  ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて組換えプラスミドを回収した。キャピラリーＤＮＡシーケンサーＣＥＱ２０００（ベックマン・コールター社製）を用いて、添付のマニュアルに従って、プラスミド中にクローニングされているゲノムＤＮＡ断片の塩基配列を解析した。
【００９２】
その結果、配列番号１２に示される塩基配列が得られた。配列番号１２に示される塩基配列中に、配列番号２のアミノ酸配列をコードする４５０ｂｐのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ１）を見出した。このＯＲＦ１がコードするアミノ酸配列は、図８中に示したＡ〜Ｅのロドコッカス属細菌由来エンドヌクレアーゼに対して８７％〜８９％の相同性を持っていることから、ＯＲＦ１はエンドヌクレアーゼをコードしていることが推定されたため、ＯＲＦ１のコードするエンドヌクレアーゼをＲｒｈＪ１ＩＩヌクレアーゼと命名した。また、ＯＲＦ１を含むプラスミドをｐＢＲｒｈＪ１ＩＩと命名した。
【００９３】
なお、大腸菌ＪＭ１０９株のコンピテントセルは以下の方法で調製した。大腸菌ＪＭ１０９株をＬＢ培地１ｍｌに接種し、３７℃で５時間好気的に前培養した。次に、前培養液０．４ｍｌをＳＯＢ培地４０ｍｌ（２％バクトトリプトン、０．５％バクトイーストエキス、１０ｍＭ  ＮａＣｌ，２．５ｍＭ  ＫＣｌ，１ｍＭ  ＭｇＳＯ４，１ｍＭ  ＭｇＣｌ2）に加え、１８℃で２０時間培養した。
【００９４】
得られた培養物を遠心分離（３，７００×ｇ，１０分間、４℃）により集菌した後、冷ＴＦ溶液（２０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ６．０），２００ｍＭ  ＫＣｌ，１０ｍＭ  ＣａＣｌ2，４０ｍＭ  ＭｎＣｌ2）を１３ｍｌ加え、０℃で１０分間放置し、再度遠心分離（３，７００×ｇ，１０分間、４℃）して上清を除いた。得られた大腸菌菌体を冷ＴＦ溶液３．２ｍｌに懸濁し、０．２２ｍｌのジメチルスルホキシドを加え、０℃で１０分間放置した後、液体窒素を用いて凍結したものをコンピテントセルとした。
【産業上の利用可能性】
【００９５】
本発明に係るニック導入方法によれば、二本鎖ＤＮＡの塩基配列中の特定の部位にニックを導入できる。従って、本発明に係るニック導入方法は、遺伝子工学の分野で有用であり、鎖置換型恒温核酸増幅や、染色体ＤＮＡの蛍光標識による可視化、生体内遺伝子ターゲティングのための相同組換えを誘発するための一本鎖ＤＮＡ切断反応などに利用できる。
【図２】
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【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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