(57)【要約】【課題】  本発明の課題は、毒性などの副作用のない新たなサーチュイン１遺伝子の発現増強剤を探すことである。【解決手段】  本発明はグルコサミン塩又はＮ−アセチルグルコサミンを有効成分とするサーチュイン１遺伝子の発現増強剤、例えば、軟骨細胞又は血管内皮細胞におけるサーチュイン１遺伝子の発現増強剤に関する。【選択図】  無し【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルコサミン塩又はＮ−アセチルグルコサミンを有効成分とするサーチュイン１遺伝子の発現増強剤。
【請求項２】
サーチュイン１遺伝子が軟骨細胞におけるサーチュイン１遺伝子である請求項１に記載のサーチュイン１遺伝子の発現増強剤。
【請求項３】
サーチュイン１遺伝子が血管内皮細胞におけるサーチュイン１遺伝子である請求項１に記載のサーチュイン１遺伝子の発現増強剤、
【請求項４】
グルコサミン塩又はＮ−アセチルグルコサミンを有効成分とするサーチュイン１遺伝子の発現増強用医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グルコサミン塩を有効成分とするサーチュイン（ｓｉｒｔｕｉｎ）１（ＳＩＲＴ１）遺伝子の発現増強剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
サーチュイン遺伝子は飢餓やカロリー制限によって活性化され、ほ乳類におけるサーチュイン１（SIRT1）遺伝子は、酵母における老化抑制遺伝子として注目されたＳｉｒ２遺伝子に最も近い遺伝子として知られている。酵母において、ゲノム上から切り出された環状ｒＤＮＡの過剰な蓄積は細胞死につながることが知られており、Ｓｉｒ２はこの環状ｒＤＮＡの蓄積を抑制する。このことなどから、老化抑制遺伝子として注目された。
【０００３】
その後、サーチュイン遺伝子、特にSIRT1遺伝子の研究が種々なされ、SIRT1遺伝子が基本的な代謝応答の制御にも関係していると考えられる研究結果なども出てきており、記憶の調節への関与や、SIRT1遺伝子の活性化がアルツハイマー病や筋萎縮性側索硬化症等の治療に役立つ可能性もあり、研究が進められている。そして、サーチュイン１活性化物質（Sirtuin-activator)はアルツハイマー病等の神経変性疾患、2型糖尿病、肥満、筋肉減少症、廃用性萎縮症への効果が期待されている。
【０００４】
このような事情から、サーチュイン１活性化物質の探索が盛んに行われてきている。特に、レスベラトロールは、サーチュイン１活性化物質として注目され、その後もいくつかの活性化物質が見出されている。
例えば、フラボノイド類（特許文献１）、乳酸菌由来成分（特許文献２）、カッコンエキス（特許文献３）などが知られている。
また、本発明で使用するグルコサミン塩、特に硫酸塩または塩酸塩等は毒性や副作用もなく、関節等における抗炎症作用が知られ、膝関節症等の治療などにも用いられることも知られており(特許文献４）、健康食品等として、使用されている。また、Ｎ−アセチルグルコサミンは、肌や関節における保湿成分であるヒアルロン酸を形成する成分の一つとして知られ、乾燥肌の改善、関節痛の改善などの効果が報告され、やはりサプリメントなどとして、使用されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００７−３２６８７２号公報
【特許文献２】特開２００８−１９５６７３号公報
【特許文献３】特開２０１０−２７００１２号公報
【特許文献４】米国特許第３６８３０７６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記の通り、サーチュイン１活性化剤は、今後の高齢化社会における疾病やその予防、更には、代謝応答の不全から生ずる難病等の治療、予防に役立つ可能性がある。細胞内におけるサーチュイン１の活性は、サーチュイン１遺伝子の発現量自体を増強することによっても、増強され得る。本発明者らは、サーチュイン１遺伝子の発現量自体を増強する、より安全なサーチュイン１遺伝子の発現増強剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記のように安全なグルコサミン塩又はＮ−アセチルグルコサミンの、温血動物細胞、例えばヒト細胞におけるサーチュイン１遺伝子の発現への影響を見るため、ヒト軟骨肉腫培養株（SW１３５３）又はヒト血管内皮細胞株（HMVEC-L細胞）をグルコサミン塩又はＮ−アセチルグルコサミンの存在下に培養したところ、意外にも、それらの細胞におけるサーチュイン１遺伝子の発現を増強させることを見いだし、本発明を完成した。
【０００８】
即ち本発明は、
（１）  グルコサミン塩又はＮ−アセチルグルコサミンを有効成分とするサーチュイン１遺伝子の発現増強剤、
（２）  サーチュイン１遺伝子が軟骨細胞におけるサーチュイン１遺伝子である上記(１)に記載のサーチュイン１遺伝子の発現増強剤、
（３）  サーチュイン１遺伝子が血管内皮細胞におけるサーチュイン１遺伝子である上記(１)に記載のサーチュイン１遺伝子の発現増強剤、
（４）  グルコサミン塩又はＮ−アセチルグルコサミンを有効成分とするサーチュイン１遺伝子の発現増強用医薬組成物、
に関するものである。
【発明の効果】
【０００９】
グルコサミン塩又はＮ−アセチルグルコサミンは、毒性及び副作用がほとんどなく、サーチュイン１遺伝子の発現を増強することができることから、温血動物、特にヒト若しくはペット等の代謝異常等に伴って生じる前記の種々の疾患の治療や、又は、予防に有用であると考えられる。特に、本発明においては、軟骨細胞や血管内皮細胞のサーチュイン１遺伝子の発現を増強することから、それらの細胞の代謝を正常に維持し、代謝異常に伴う疾病を防ぎ、又は治療に役立つ可能性がある。従来、グルコサミン塩又はＮ−アセチルグルコサミンは、変形性関節症等における抗炎症作用等が知られているが、グルコサミン塩又はＮ−アセチルグルコサミンのサーチュイン１遺伝子の発現増強作用が解明された結果、変形性関節症の抗炎症作用というのでなく、より根本的な、代謝異常による疾患を予防及び治療出来る可能性がある。例えば、軟骨の代謝異常の疾患としては、骨軟骨異形成症などの骨系統疾患と総称される骨格の形成の異常を特徴とする一群の疾患や、Kashin Beck病と呼ばれる病気等もあり、それらの予防、治療又は病状の改善などに役立つ可能性がある。また、血管内皮細胞におけるサーチュイン１遺伝子の発現も増強することができることから、血管内皮細胞の代謝を正常に維持し、血管内皮を健全に保持することが出来る。また、血管内皮の代謝異常に基づく種々の疾病の予防治療に役立つ可能性がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明を以下により詳しく説明する。
本発明におけるグルコサミン塩としては薬理学的に許容されるものであれば特に制限はなく、無機酸塩、有機酸塩いずれも使用できるが一般的には硫酸塩もしくは塩酸塩等の無機塩が使用され、本発明においては塩酸塩が好ましい。有機酸塩としては例えば酢酸塩、クエン酸塩、リンゴ酸塩等が挙げられる。Ｎ−アセチルグルコサミンは、医薬用途に使用し得るものであれば何れも使用しうる。
【００１１】
本発明におけるサーチュイン１遺伝子の発現増強剤は、グルコサミン塩又はＮ−アセチルグルコサミン単独でもよく、また、グルコサミン塩と、担体、賦形剤、助剤（矯味剤、香料、甘味料、結合剤）等の医薬用に使用される添加剤とを含む組成物となっていてもよい。
本発明におけるサーチュイン１遺伝子の発現増強剤は、必要に応じて、医薬製剤に使用される添加剤と共に、常法に従って、液剤又は固形剤、例えば錠剤、顆粒剤、粉剤、カプセル剤等に製剤化して、経口投与することが出来る。グルコサミン塩又はＮ−アセチルグルコサミンに添加される坦体又は賦形剤等の添加剤としては、水および／または糖類等を挙げることが出来る。該発現増強剤におけるグルコサミン塩の含量は、特に限定はなく、通常０．０５％（質量％：以下同じ）以上、好ましくは０．２％以上、より好ましくは１％以上で、最大１００％までよい。
従って、本発明におけるサーチュイン１遺伝子の発現増強剤は、サーチュイン１遺伝子の発現増強作用を発揮する限り、グルコサミン塩又はＮ−アセチルグルコサミン単独又は両者を含むもの、又は、賦形剤などを混合して製剤化したもの等何れをも含むものである。
【００１２】
本発明のサーチュイン１遺伝子の発現増強剤でのグルコサミン塩又はＮ−アセチルグルコサミンの投与量は該薬効を発揮する量であれば特に制限はない。通常成人(一人）当たり１日０．３g以上、より好ましくは０．５g以上、更に好ましくは１g以上で、上限は毒性もほとんどないので特に制限はないが、通常２０g以下、好ましくは１０g以下、更に好ましくは５g以下程度である。
【００１３】
本発明においては、温血動物の細胞、例えば、軟骨細胞又は血管内皮細胞をグルコサミン又はＮ−アセチルグルコサミンの存在下に培養することにより、該細胞におけるサーチュイン１遺伝子の発現を増強することから、温血動物における細胞、例えば軟骨細胞又は血管内皮細胞とグルコサミン又はＮ−アセチルグルコサミンを共存させることが好ましい。グルコサミン塩又はＮ−アセチルグルコサミンを経口投与するとき、それらはそのまま又はグルコサミンとして体内に吸収されることから、経口摂取でも、また、場合によっては、注射剤などとして、投与することも出来る。
【００１４】
本発明におけるサーチュイン１遺伝子(以下SIRT1遺伝子ともいう）の発現の増強は、常法例えばＲＴ−ＰＣＲ（Reverse Transcription−Polymerase Chain Reaction）法等により、確認することが出来る。例えば、温血動物における細胞を、ヒト細胞などの細胞培養培地で、グルコサミン塩又はＮ−アセチルグルコサミンの共存下及びグルコサミン又はＮ−アセチルグルコサミンの不存在下に培養した後、それぞれ、細胞を回収し、細胞内の全ＲＮＡを抽出した後、その全ＲＮＡの一定量を用いて、市販の逆転写反応用キットなどを用いて、ｃＤＮＡを合成し、公知のSIRT1遺伝子特有のプライマー配列を用いて、市販のＰＣＲ(Polymerase Chain Reaction)キットで、ＰＣＲ反応を行い、ＰＣＲ反応生成物を、アガロースゲルなどを用いて、電気泳動する。該電気泳動したゲルから、グルコサミン又はＮ−アセチルグルコサミンの不存在下に培養した場合と、グルコサミン塩又はＮ−アセチルグルコサミンの共存下に培養した場合のサーチュイン１遺伝子の発現量を比較することにより、相対的な発現量の増強を確認することが出来る。 
また、サーチュイン１タンパク質発現量での増強の確認は、常法のウエスタンブロット法により行うことが出来る。
次に、本発明を実施例により、具体的に説明する。
【実施例】
【００１５】
実施例１
本実施例では、グルコサミン塩のSIRT1遺伝子発現について試験した。
（１）試験に用いた細胞、培地および試薬
ヒト軟骨由来培養細胞株であるSW1353細胞は、１０％ウシ胎児血清と抗生剤を含むLeibovitz's L-15培地(G i b c o社）を用い、培養及び維持を行った。また本実施例に用いたグルコサミンは、グルコサミン塩酸塩（和光純薬株式会社製）(以下GlcNという）を用いた。
（２）RT-PCR法によるSIRT1遺伝子発現量の測定
T-75フラスコに2x106個のSW1353細胞を播種し、一晩培養した。その後、GlcNの存在下、非存在下で２４時間培養した。その後、細胞を氷冷したリン酸緩衝生理食塩水で洗浄した後、細胞を回収した。回収した細胞より、RNeasy Plus Mini Kit（株式会社キアゲン製）を用いて、total RNAを抽出した。その後、５００ｎｇのtotal RNAを用い、ReverTra -Plus- High Fidelity RT-PCR kit（東洋紡株式会社製）により逆転写反応を行い、cDNAを合成した。合成したcDNAを用いて、GoTaq（プロメガ株式会社製）により、PCR反応を行った。なお、SIRT1遺伝子に特異的なプライマー配列は、 Zahid H. et al., Mol. Cell. Biol. 32, 704 (2012)と同様のものを用いた。PCR反応生成物をエチジウムブロミドを含む1%アガロースゲルを用いて、電気泳動した。電気泳動したゲルを、BioDoc-It System（UVP社製）により、SIRT1遺伝子の発現量を測定した。
（３）試験結果
結果を表１に示す。表１から明らかなとおり、軟骨細胞においてGlcN添加によりSIRT1遺伝子の発現量がグルコサミン無添加時に比して、有意に増加した。
【００１６】
表１
SIRT1遺伝子発現
GlcN添加量              相対SIRT1発現量
無添加                  １±０
0.1 mM GlcN            ２．６６±０．８６＊
1 mM GlcN              ３．８１±１．０６＊＊
10 mM GlcN             ２．６７±０．８７＊
＊：P<0.05、＊＊：P<0.01（無添加群との比較）
【００１７】
実施例２
本実施例では、グルコサミン塩のSIRT1タンパク質発現について試験した。
（１）試験に用いた細胞、培地および試薬
実施例１において記載したものを使用した。
（２）ウェスタンブロット法によるSIRT1タンパク質発現量の測定
T-75フラスコに2x106個のSW1353細胞を播種し、一晩培養した。その後、GlcNの存在下、非存在下で２４時間培養した。その後、細胞を氷冷したリン酸緩衝生理食塩水で洗浄した後、細胞を回収した。そして、その細胞を細胞溶解液（50 mM Tris-塩酸 pH 7.6、150 mM 塩化ナトリウム、1 mM 塩化マグネシウム、1% NP-40（octylphenoxypolyethoxyethanol）、10% グリセリン、1 mM ジチオトレイトール、タンパク質分解酵素阻害剤）で溶解し、Bio-Rad Protein Assay Kit（BioRad社製）を用いてタンパク定量した。さらに、１０μｇの細胞溶解物を10%SDS-ポリアクリルアミドゲルで電気泳動したのち、タンパク質をメンブレンフィルターに転写した。そして該メンブレンフィルターをウサギ抗ヒトSIRT1抗体（Santa Cruz Biotechnology社、商品コードsc-15404）と２時間反応させた後、西洋わさびペルオキシダーゼ（HRP）と結合した抗ウサギ抗体と１時間反応させた。その後、HRPの反応基質（Pierce社、SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate）と反応させ、ルミノメーター（富士フイルム株式会社製、商品コードLAS-3000）を用いて、SIRT1タンパク質量の定量を行った。
（３）試験結果
結果を表２に示す。表２から明らかなとおり、軟骨細胞においてGlcN添加によりSIRT1タンパク質の発現量がグルコサミン無添加時に比して、有意に増加した。
【００１８】
表２
SIRT1タンパク質発現
GlcN添加量              相対SIRT1発現量
無添加                  １±０
0.1 mM GlcN            １．４３±０．３９
1 mM GlcN              ６．３２±１．９４＊＊
10 mM GlcN             ５．５１±５．４６
＊＊：P<0.01（無添加群との比較）
【００１９】
実施例３
本実施例では、グルコサミンの血管内皮細胞でのSIRT1遺伝子発現について試験した。
（１）試験に用いた細胞、培地および試薬
正常ヒト肺微小血管内皮細胞であるHMVEC-L細胞は、Lonza社より購入し、同社の指示に従い、ブレットキットEGM-2MV培地を用いて培養・維持した。また本実施例に用いたグルコサミンは、グルコサミン塩酸塩（和光純薬株式会社、GlcN）を用いた。
（２）RT-PCR法によるSIRT1遺伝子発現量の測定
10cm ディッシュに3 x 105個のHMVEC-L細胞を播種し、一晩培養した。その後、GlcNの存在下、非存在下で２４時間培養した。その後、実施例１と同様にして、SIRT1遺伝子の発現量を測定した。
（３）試験結果
結果を表３に示す。表３から明らかなとおり、血管内皮細胞においてGlcN添加によりSIRT1遺伝子の発現量がGlcN無添加時に比して、増加した。
【００２０】
表３
SIRT1遺伝子発現
GlcN添加量              相対SIRT1発現量
無添加                  １
0.1 mM GlcN            ６．４３
1 mM GlcN              ７．６６
10 mM GlcN             ３．５４
【００２１】
実施例４
本実施例では、血管内皮細胞におけるグルコサミンのSIRT1タンパク質発現量の増加について試験した。
（１）試験に用いた細胞、培地および試薬
実施例３において記載したものを使用した。
（２）ウェスタンブロット法によるSIRT1タンパク質発現量の測定
10cm ディッシュに3 x 105個のHMVEC-L細胞を播種し、一晩培養した。その後、GlcNの存在下、非存在下で２４時間培養した。その後、実施例２と同様にして、SIRT1タンパク質の発現量を測定した。
（３）試験結果
結果を表４に示す。表４から明らかなとおり、血管内皮細胞においてGlcN添加によりSIRT1タンパク質の発現量がGlcN無添加時に比して、増加した。
【００２２】
表４
SIRT1タンパク質発現
GlcN添加量              相対SIRT1発現量
無添加                  １
0.1 mM GlcN            １．４６
1 mM GlcN              ２．２０
10 mM GlcN             ５．２３
【００２３】
実施例５
本実施例では、Ｎ-アセチルグルコサミンのSIRTl遺伝子発現について試験した。
（１）試験に用いた細胞、培地および試薬
ヒト軟骨由来培養細胞株であるSW1353細胞は、１０％ウシ胎児血清と抗生剤を含むLeibovitz's L-15培地(G i b c o社）を用い、培養及び維持を行った。また本実施例に用いたＮ−アセチルグルコサミン(GlcNAc)は、SIGMA社製のものを用いた。
(2) RT-PCR法によるSTRTl遺伝子発現量の測定
T-75フラスコに２×１０６個のSW1353細胞を播種し、一晩培養した。その後、GlcNAcの存在下、非存在下でそれぞれを２４時間培養した。その後、細胞を氷冷したリン酸緩衝生理食塩水で洗浄した後、細胞を回収した。回収した細胞より、RNeasy Plus Mini Kit （株式会社キアゲン製）を用いて、total RNAを抽出した。その後、5 0 0 n gのtotal RNA を用い、ReverTra -Plus- High Fidelity RT-PCR kit （東洋紡株式会社製）により逆転写反応を行い、cDNAを合成した。合成したcDNAを用いて、GoTaq (プロメガ株式会社製）により、ＰＣＲ反応を行った。なお、SIRT1遺伝子特異的なプライマー配列は、Zahid H. et al., Mol. Cell. Biol. 32, 704 (2012）と同様のものを用いた。PCR反応生成物をエチジウムブロミドを含む1％アガロースゲルを用いて、電気泳動した。電気泳動したゲルを、BioDoc-It System （ＵＶＰ社製）により、SIRTl遺伝子の発現量を測定した。
（３）試験結果
結果を表５に示す。表５から明らかなとおり、軟骨細胞においてGlcNAc添加によりSIRT1遺伝子の発現量が無添加のものに比して、有意に増加した。
【００２４】
表５
SlRTl遺伝子発現                          −
GlcNAc添加量          相対SIRTl発現量
無添加                  １±０
０．１ mM GlcNAc      ２．９８±０．１３＊＊＊
ｌ mM GlcNAc          ２．９７±０．３６＊＊＊
＊＊＊：Ｐ＜０．０１（無添加齢との比較）
【産業上の利用可能性】
【００２５】
本発明で使用するグルコサミン塩又はＮ−アセチルグルコサミンは、温血動物細胞におけるサーチュイン１遺伝子の発現の増強をすることから、細胞の代謝不全を改善し、該細胞を健全に保つ役割を果たす可能性があり、細胞の代謝不全等による疾患治療や予防等に役立つ可能性がある。例えば、軟骨細胞又は血管内皮細胞のサーチュイン１遺伝子の発現の増強をすることから、軟骨細胞又は血管内皮細胞の代謝不全を改善し、該細胞を健全に保つ役割を果たす可能性がある。従って、軟骨細胞又は血管内皮細胞の代謝不全で生ずる疾患の治療、予防、病状の改善などに役立つ可能性がある。