(57)【要約】【課題】神経幹細胞の分化につながる可能性の高いＮｇｎ２プロモーター活性剤を新規天然物骨格から提供する。【解決手段】下記（１）及びそれらの誘導体並びにその塩の少なくともいずれかを含むことを特徴とする。2014166974.tif 000006【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（１）で示される化合物及びそれらの誘導体並びにそれらの塩の少なくともいずれかを含むＮｇｎ２プロモーター活性化剤。
【化１】
2014166974.tif 000005
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はＮｇｎ２プロモーター活性化剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
神経幹細胞の分化を促進させ、選択的に特定の神経細胞（ニューロン、アストロサイト、オリゴデンドロサイト）に導く化合物は、認知症などの重篤な神経疾患や、脳溢血後や脊髄損傷後の神経再生医薬のリードとなる。特に、特定のニューロン（例えばドーパミンニューロンなど）に導くことは重要である。
【０００３】
神経幹細胞に作用し、神経再生医薬候補となる有効な化合物は、世界でもほとんど報告例が無い。再生医療の発展がめざましく、幹細胞の活用が非常に期待されている最近の世界状況からも、神経幹細胞に作用する化合物の創製が非常に望まれている。
【０００４】
下記非特許文献１には、神経幹細胞において、転写因子Ｎｇｎ２が継続して発現することにより，ニューロンなどの各神経細胞への分化が開始されると報告されており、Ｎｇｎ２プロモーター活性化の化合物が神経幹細胞の分化を促進することが期待できる。
【０００５】
ところで、下記非特許文献１には、Ｂａｉｃａｌｉｎの神経幹細胞の分化促進作用とＮｇｎ２プロモーター活性化の関連に関する報告がある。また、下記非特許文献２には、発明者らによる他の植物からのＮｇｎ２プロモーター活性化能を有する天然物の単離とそれらの作用として神経幹細胞の分化を促進することが開示されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｍｉｎｇ  Ｌｉ，Ｋａｍ−Ｓｚｅ  Ｔｓａｎｇ，Ｓｚｅ−Ｔｉｎｇ  Ｃｈｏｉ，Ｋａｒｅｎ  Ｌｉ，Ｐａｎｇ−Ｃｈｕｉ  Ｓｈａｗ，Ｋｗｏｋ-Ｆａｉ  Ｌａｕ，ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ，２０１１，１２，４４９−４５６．
【非特許文献２】荒井緑，小柳津和音，小谷野喬，Ｔ．Ｋｏｗｉｔｈａｙａｋｏｒｎ，石橋正己，"Ｂｕｔｅａ  ｓｕｐｅｒｂａからの神経幹細胞の分化活性化剤の探索"，日本薬学会第１３２年会（２０１２）札幌
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、上記非特許文献１は神経幹細胞の分化を活性化させる天然物が結果的にＮｇｎ２プロモーター活性能を持っていたという結果である。また発明者が開示した上記非特許文献２に記載された化合物は、既知天然物であり、新規天然物がＮｇｎ２プロモーター活性能を有している例は報告がない。
【０００８】
そこで、本発明は、神経幹細胞の分化につながる可能性の高いＮｇｎ２プロモーター活性剤を新規天然物骨格から提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、神経幹細胞がニューロンに分化する際の運命決定に大きく関与するｂＨＬＨ転写因子Ｎｇｎ２に着目し、鋭意検討を行ったところ、上記Ｎｇｎ２プロモーター活性を活性化させる化合物を発見し本発明を完成させるに至った。
【００１０】
すなわち、本発明の一の観点に係るＮｇｎ２プロモーター活性化剤は、下記（１）及びそれらの誘導体並びにその塩の少なくともいずれかを含むことを特徴とする。
【化１】
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【発明の効果】
【００１１】
以上、本発明によると、神経幹細胞の分化につながる可能性の高いＮｇｎ２プロモーター活性剤を新規天然物骨格から提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】（追って補充）。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明を実施するための形態について図面を用いて詳細に説明する。ただし、本発明は多くの異なる形態による実施が可能であって、以下に示す実施形態、実施例の記載にのみ限定されるわけではない。
【００１４】
本実施形態に係るＮｇｎ２プロモーター活性化剤は、下記（１）で示される化合物、及びそれらの誘導体並びにそれらの塩の少なくともいずれかを含む。
【化２】
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【００１５】
本実施形態にかかる化合物は、Ｎｇｎ２プロモーター活性が強く、神経幹細胞の分化活性化につながる可能性が高いことから認知症等の神経疾患の治療や予防に有用な薬剤となる可能性がある。
【００１６】
また本実施形態における上記化合物の「誘導体」とは、上記化合物と同等の活性を備え、上記化合物の置換基の一部をアルキル化、アリール化、複素環化、エステル化、エーテル化、ハロゲン化、アミド化、ヒドロキシル化、アミノ化等置換反応によって適切な置換基が修飾された化合物を意味する。
【００１７】
薬剤として用いる場合、上記化合物のほか、薬学的に許容される通常の担体、結合剤、賦形剤、希釈剤（例えば蒸留水）、ｐＨ緩衝材（例えばリン酸緩衝生理食塩水）、崩壊剤、可溶化剤、溶解補助剤、等張剤等の各種調剤用配合剤成分を含有することができる。
【００１８】
また本実施形態に係るＮｇｎ２プロモーター活性化剤は、その使用形態に応じて経口的に又は非経口的に投与することができるが、長期にわたるリハビリ等を考慮すると経口的であることが好ましく、脳溢血や脳梗塞等の発病段階では非経口的であることが好ましい。経口的な投与としては通常用いられる投与形態、例えば粉末、顆粒、錠剤、カプセル剤、液剤、懸濁液、油剤、乳化剤等の投与形態を採用することができる。非経口的な投与としては、通常用いられる投与形態、例えば上記の液剤、懸濁液等にしたものを点滴や注射により投与する形態、直接損傷部位に投与する形態等を採用することができる。
【００１９】
本実施形態に係るＮｇｎ２プロモーター活性化剤の投与量は、患者の体重、性別、神経損傷の程度、投与の方法に応じて適宜選択されうるが、例えば非経口な投与であって、損傷部位に直接投与する場合、例えば成人１日、上記化合物を１ｍｇ以上１００ｍｇ以下の範囲内で含む量であることが好ましく、より好ましくは有効成分を１ｍｇ以上２０ｍｇ以下の範囲内で含む量である。なお、注射による投与の場合、非経口な投与であっても、有効成分が上記有効成分の量の１０倍程度の範囲内にあることが好ましい。
【００２０】
本実施形態に係るＮｇｎ２プロモーター活性化剤は、合成によって作製することができる。上記化合物の合成は、例えば、まず２−フェニルアミノベンズアルデヒド誘導体を出発物質として酸触媒条件下にて容易に種々置換基を有するアクリジン誘導体を合成することができ、この例として“Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９８１，３４，８３９−５３”が挙げられる。
【００２１】
なお本実施形態に係るＮｇｎ２プロモーター活性化剤は、得られる限りにおいて限定されるわけではないが、土壌中に存在する放線菌の産生によって得ることもできる。
【００２２】
以上、本実施形態に係るＮｇｎ２プロモーター活性化剤は、神経幹細胞の分化を活性化させることのできる有効な神経幹細胞分化促進剤となる。
【実施例】
【００２３】
以下、上記実施形態に係る神経肝細胞分化促進剤について実際に作製を行い、その効果を確認した。以下に説明する。
【００２４】
（化合物の特定）
千葉県銚子市犬吠埼で採取された土壌サンプルより単離されたＣＫＫ８４６株について活性成分の探索を活性成分の探索を行った。具体的には、本菌株のグリセロールストックをＩＳＰ−２寒天培地で３日間培養し、得られたコロニーを坂口フラスコ中ＩＳＰ−２液体培地（１００ｍＬ）に植菌後３日間震盪培養し、さらに、培養液をカブ型フラスコ中ＩＳＰ−２液体培地（計２４Ｌ）に植菌し、７日間震盪培養した。
【００２５】
上記の結果得られた培養液上清を各種クロマトグラフィー（ダイヤイオンＨＰ２０、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０、ＯＤＳ、ＯＤＳ−ＨＰＬＣ）で活性を指標に分画し、３種類の新規アクリジン誘導体の構造を以下の（１）〜（３）として特定した。
【００２６】
（アッセイの準備）
本実施例において、Ｎｇｎ２プロモーター活性は、ルシフェラーゼ遺伝子の上流にＮｇｎ２プロモーター領域を有するプラスミドを作成し、マウス繊維芽細胞（Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２）に安定発現させることで、ルシフェラーゼ活性でＮｇｎ２プロモーター活性を評価するアッセイ系を構築した。具体的には、Ｎｇｎ２プロモーター部を有するルシフェラーゼレポータージーンを安定発現する細胞（Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２を用いて発明者が作成）を５０μＬ／ｗｅｌｌ（２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）ずつ９６−ｗｅｌｌ  ｗｈｉｔｅ  ｐｌａｔｅに播種し、２４時間培養（３７℃、５％ＣＯ２）した。培地を取り除き、それぞれの濃度に希釈した化合物溶液を作成し、５０μＬずつ加えた。２４時間インキュベーションし、ルシフェラーゼ活性の測定を行った。ルシフェラーゼ活性の測定は、以下のように行った。培地を取り除き、２０μＬの１×Ｇｌｏ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を加え、室温にて３０分間振とうした。細胞が溶解した後、２０μＬのＢｒｉｇｈｔ−ＧｌｏＴＭ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）のｌｕｃｉｆｅｒｉｎを添加し、Ｌｕｍｉｎｏｓｋａｎ  Ａｓｃｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ）を用いて化学発光量を測定し、Ｎｇｎ２プロモーター活性を評価した。
【００２７】
なお、この活性評価は、サンプルを添加していないコントロールの値を１００％とし、テストサンプル群の値の変化を割合で計算し、ルシフェラーゼ活性におけるＮｇｎ２プロモーター活性を算出した。
【００２８】
上記（１）について、上記アッセイ系を用いて効果を確認した。この結果を図１に示す。本図によると、上記化合物（１）については２．５μＭでコントロールの１．５倍，２０μＭでコントロールの２．３倍程度のＮｇｎ２プロモーター活性化作用を濃度依存的に示した．本結果は非特許文献１で報告されている天然物ｂａｉｃａｌｉｎと比較しても非常に強い活性であった（ｂａｉｃａｌｉｎは１００μＭの高い濃度でコントロールの１．５倍）．また非特許文献２で報告され，神経幹細胞の分化を示したＮｇｎ２プロモーター活性化剤である既知天然物３’-ｍｅｔｈｏｘｙｄａｉｄｚｅｉｎと同等の活性であった．以上より，本結果は新規天然物がＮｇｎ２プロモーター活性化作用を示した初めての例であり，Ｎｇｎ２プロモーター活性化が報告されている化合物の中でもａｃｒｉｄｉｎｅ（あるいはアクリジン）骨格を持つ初めての例である。
【００２９】
以上、本実施例により、本実施例に係る化合物が神経幹細胞の分化を活性化させることのできる有効なＮｇｎ２プロモーター活性化剤となることを確認した。
【産業上の利用可能性】
【００３０】
本発明は、Ｎｇｎ２プロモーター活性化剤、神経幹細胞分化促進剤のリード化合物として産業上の利用可能性がある。
【図１】
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