(57)【要約】【課題】ｍｉＲ−３１に関連する組成物および方法の提供。【解決手段】マイクロＲＮＡ−３１（ｍｉＲ−３１）、ｍｉＲ−３１の標的、腫瘍の転移の阻害におけるｍｉＲ−３１の役割、および腫瘍の転移の促進におけるｍｉＲ−３１標的遺伝子の役割が開示される。本発明は、腫瘍におけるｍｉＲ−３１の少なくとも１つの標的の発現または活性を阻害するステップを含む、被験体における腫瘍の転移を阻害する方法を提供する。いくつかの実施形態において、方法は、少なくとも１つのｍｉＲ−３１標的遺伝子の発現を阻害するステップを含む。いくつかの実施形態において、方法は、ｍｉＲ−３１標的遺伝子によりコードされる少なくとも１つのタンパク質の活性を阻害するステップを含む。【選択図】図１
2014221834.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載された発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願は、２００８年１２月５日に出願された米国仮出願第６１／１２０，３２２号への優先権およびその利益を主張する。上記出願の全体の内容は、参考として本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００２】
転移は、ヒトの癌での死亡の９０％を占める（非特許文献１）。これらの成長を導く浸潤−転移カスケードは、原発腫瘍からの腫瘍性細胞の逃避（局所浸潤）、全身循環への血管内異物侵入、移行中の脈管構造を通しての存続、遠位組織の実質への血管外遊走、微小転移の確立および最終的には巨視的な二次腫瘍の増殖（定着）を含む複雑な多段階プロセスである（非特許文献２）。転移散在を支配する分子回路は、まだ完全に理解されないままである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】ＧｕｐｔａおよびＭａｓｓａｇｕｅ、Ｃｅｌｌ（２００６年）１２７、６７９〜６９５
【非特許文献２】Ｆｉｄｌｅｒ、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ（２００３年）３、４５３〜４５８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
転移の出現率を低減させる薬剤を同定するための新しいアプローチが必要とされている。転移散在および／または治療後の転位再発の可能性の評価を補助する新しい方法も必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、少なくとも部分的に、マイクロＲＮＡ−３１（ｍｉＲ−３１）、ｍｉＲ−３１の標的、腫瘍の転移の阻害におけるｍｉＲ−３１の役割および腫瘍の転移の促進におけるｍｉＲ−３１標的遺伝子の役割に関する。
【０００６】
本発明は、腫瘍におけるｍｉＲ−３１の少なくとも１つの標的の発現または活性を阻害するステップを含む、被験体における腫瘍の転移を阻害する方法を提供する。いくつかの実施形態において、方法は、少なくとも１つのｍｉＲ−３１標的遺伝子の発現を阻害するステップを含む。いくつかの実施形態において、方法は、ｍｉＲ−３１標的遺伝子によりコードされる少なくとも１つのタンパク質の活性を阻害するステップを含む。いくつかの実施形態において、方法は、ＲＮＡｉ作用物質を被験体に投与するステップを含む。いくつかの実施形態において、方法は、ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ前駆体、ｍｉＲＮＡを模倣する作用物質またはｓｉＲＮＡを被験体に投与するステップを含む。いくつかの実施形態において、方法は、ｍｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡの前駆体をコードする核酸構築物を被験体に投与するステップを含む。いくつかの実施形態において、方法は、成熟ｍｉＲ−３１、ｍｉＲ−３１を模倣する作用物質、またはｍｉＲ−３１をコードするかもしくはｍｉＲ−３１の前駆体をコードする核酸構築物を被験体に投与するステップを含む。
【０００７】
本発明は、腫瘍細胞におけるｍｉＲ−３１の少なくとも１つの標的の発現または活性を阻害するステップを含む、腫瘍細胞の転移を阻害する方法を提供する。いくつかの実施形態において、腫瘍細胞は、被験体の中にある。いくつかの実施形態において、方法は、少なくとも１つのｍｉＲ−３１標的遺伝子の発現を阻害するステップを含む。いくつかの実施形態において、方法は、ｍｉＲ−３１標的遺伝子によりコードされる少なくとも１つのタンパク質の活性を阻害するステップを含む。いくつかの実施形態において、方法は、ＲＮＡｉ作用物質を細胞または被験体に投与するステップを含む。いくつかの実施形態において、方法は、ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡを模倣する作用物質、ｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡを細胞または被験体に投与するステップを含む。いくつかの実施形態において、方法は、ｍｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを腫瘍細胞において発現させるステップを含む。いくつかの実施形態において、方法は、ｍｉＲ−３１を腫瘍細胞において発現させるステップを含む。
【０００８】
本発明は、細胞におけるｍｉＲ−３１の少なくとも１つの標的の発現または活性を阻害する作用物質を含む、腫瘍の転移を阻害するための組成物をさらに提供する。いくつかの実施形態において、組成物は、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ前駆体またはｍｉＲＮＡを模倣する作用物質（例えばｍｉＲ−３１を模倣する作用物質）を含む。いくつかの実施形態において、作用物質は、ｍｉＲ−３１標的遺伝子の発現を阻害する。いくつかの実施形態において、作用物質は、ｍｉＲ−３１標的遺伝子によりコードされるタンパク質の活性を阻害する。
【０００９】
本発明は、被験体における腫瘍が転移する可能性を評価するための方法であって、（ａ）腫瘍から得られた生物学的試料中のｍｉＲ−３１遺伝子産物のレベルを決定するステップと、（ｂ）該レベルを対照レベルと比較するステップとを含み、（ａ）で決定されたレベルが対照レベルより低い場合に、腫瘍が転移する可能性が増加しているとみなされる方法をさらに提供する。いくつかの実施形態において、生物学的試料は、腫瘍組織を含む。いくつかの実施形態において、腫瘍は、乳癌である。いくつかの実施形態において、ｍｉＲ−３１遺伝子産物は、ｍｉＲ−３１  ＲＮＡまたはｍｉＲ−３１前駆体ＲＮＡ（例えばプレｍｉＲ−３１）である。いくつかの実施形態において、ｍｉＲ−３１遺伝子産物は、成熟ｍｉＲ−３１である。いくつかの実施形態において、生物学的試料中のｍｉＲ−３１遺伝子産物のレベルを決定するステップは、ハイブリッド形成に基づくアッセイ、ポリメラーゼ連鎖反応アッセイまたは配列決定を行うステップを含む。
【００１０】
本発明は、被験体における腫瘍の転移の発生の可能性を評価する方法であって、（ａ）被験体から得られた生物学的試料中のｍｉＲ−３１遺伝子産物のレベルを決定するステップと、（ｂ）（ａ）で決定されたレベルを適切な対照と比較するステップとを含み、（ａ）で決定されたレベルがｍｉＲ−３１遺伝子産物の対照レベルより低い場合に、被験体において転移が発生する可能性が増加している方法をさらに提供する。いくつかの実施形態において、生物学的試料は、腫瘍組織を含む。いくつかの実施形態において、被験体における腫瘍の転移の発生の可能性を評価する方法は、（ａ）生物学的試料を被験体から得るステップと、（ｂ）生物学的試料中のｍｉＲ−３１遺伝子産物のレベルを決定するステップと、（ｃ）（ｂ）で決定されたレベルを適切な対照と比較するステップとを含み、（ｂ）で決定されたレベルが対照試料中のｍｉＲ−３１遺伝子産物のレベルより低い場合に、被験体において転移が発生する可能性が増加している。いくつかの実施形態において、腫瘍は、乳癌である。いくつかの実施形態において、ｍｉＲ−３１遺伝子産物は、ｍｉＲ−３１  ＲＮＡまたはｍｉＲ−３１前駆体ＲＮＡ（例えばプレｍｉＲ−３１）である。いくつかの実施形態において、ｍｉＲ−３１遺伝子産物は、成熟ｍｉＲ−３１  ＲＮＡである。いくつかの実施形態において、生物学的試料および／または対照試料中のｍｉＲ−３１遺伝子産物のレベルを決定するステップは、ハイブリッド形成に基づくアッセイ、ポリメラーゼ連鎖反応アッセイまたは配列決定を行うステップを含む。
【００１１】
本発明は、被験体における腫瘍が転移するかまたは転移した可能性を評価するための方法であって、（ａ）腫瘍から得られた生物学的試料中のｍｉＲ−３１標的遺伝子の発現産物のレベルを決定するステップと、（ｂ）該レベルを対照レベルと比較するステップとを含み、（ａ）で決定されたレベルが対照レベルより高い場合に、腫瘍が転移する可能性が増加しているとみなされる方法をさらに提供する。いくつかの実施形態において、生物学的試料は、腫瘍組織を含む。いくつかの実施形態において、対照試料または対照レベルは、場合によって同じ被験体から得られた非腫瘍組織（例えば腫瘍部位に近接した）である非腫瘍組織から得られる。いくつかの実施形態において、対照または参照レベルは、過去のデータ、例えば以前に回収された非腫瘍組織の複数の試料について行った測定から得られる。いくつかの実施形態において、腫瘍は、乳癌である。いくつかの実施形態において、発現産物は、ｍＲＮＡまたはポリペプチドである。いくつかの実施形態において、発現産物のレベルを決定するステップは、ハイブリッド形成に基づくアッセイ、ポリメラーゼ連鎖反応アッセイ、配列決定、ＥＬＩＳＡアッセイ、ウェスタンブロット、質量分析法または免疫組織化学法を行うステップを含む。いくつかの実施形態において、方法は、生物学的試料中の少なくとも２つのｍｉＲ−３１標的遺伝子の発現産物のレベルを測定するステップを含み、少なくとも２つのｍｉＲ−３１標的遺伝子の産物の発現レベルが対照レベルと比べて増加している場合に、腫瘍が転移するかまたは転移した可能性が増加しているとみなされる。
【００１２】
本発明は、被験体における腫瘍が転移する可能性に関する予後情報を提供するための方法であって、（ａ）腫瘍から得られた生物学的試料中のｍｉＲ−３１遺伝子産物のレベルを決定するステップと、（ｂ）該レベルを対照レベルと比較するステップとを含み、（ｉ）（ａ）で決定されたレベルが対照レベルより低い場合に、腫瘍が予後不良であるとみなされるか、（ｉｉ）（ａ）で決定されたレベルが対照レベルより高い場合に、腫瘍が予後良好であるとみなされる方法をさらに提供する。いくつかの実施形態において、生物学的試料は、腫瘍組織を含む。いくつかの実施形態において、腫瘍は、乳癌である。いくつかの実施形態において、ｍｉＲ−３１遺伝子産物は、ｍｉＲ−３１  ＲＮＡまたはｍｉＲ−３１前駆体ＲＮＡである。いくつかの実施形態において、ｍｉＲ−３１遺伝子産物は、成熟ｍｉＲ−３１  ＲＮＡである。いくつかの実施形態において、生物学的試料中のｍｉＲ−３１遺伝子産物のレベルを決定するステップは、ハイブリッド形成に基づくアッセイ、ポリメラーゼ連鎖反応アッセイまたは配列決定を行うステップを含む。
【００１３】
本発明は、細胞の生存および／または増殖を阻害する化合物の能力を試験するための方法であって、（ａ）１または複数の試験細胞を化合物と接触させるステップであって、１または複数の試験細胞が、対照細胞と比較してｍｉＲ−３１の発現もしくはｍｉＲ−３１の活性が低減しているかまたはそれらを欠くステップと、（ｂ）該化合物による１または複数の試験細胞の生存および／または増殖の阻害のレベルを検出するステップとを含む方法をさらに提供する。いくつかの実施形態において、細胞は、癌細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、乳癌細胞である。いくつかの実施形態において、方法は、（ａ）１または複数の試験細胞および１または複数の対照細胞を化合物と接触させるステップであって、１または複数の試験細胞が、１または複数の対照細胞と比較してｍｉＲ−３１の発現もしくはｍｉＲ−３１の活性が低減しているかまたはそれらを欠くステップと、（ｂ）該化合物による１または複数の試験細胞および対照細胞の生存ならびに／または増殖の阻害のレベルを検出するステップと、（ｃ）該化合物が、試験細胞の生存および／または増殖に対して対照細胞よりも大きい阻害効果を有する場合に、該化合物を、候補抗腫瘍薬剤（例えば腫瘍の転移の阻害に有用な薬剤）として同定するステップとを含む。いくつかの実施形態において、試験細胞および対照細胞は、遺伝子的に一致する。いくつかの実施形態において、試験細胞は、ｍｉＲ−３１遺伝子の変異もしくは欠失を有するか、またはｍｉＲ−３１活性を抑制するｍｉＲＮＡスポンジ（ｍｉＲＮＡ  ｓｐｏｎｇｅ）を発現する。いくつかの実施形態において、方法は、化合物を被験体に投与するステップをさらに含む。いくつかの実施形態において、被験体は、非ヒト動物であり、方法は、１もしくは複数の癌細胞を被験体に導入するかまたは被験体において癌を誘導するステップを場合によってさらに含む。いくつかの実施形態において、被験体は、癌を有する。いくつかの実施形態において、方法は、被験体において転移を阻害する化合物の能力を評価するステップをさらに含む。
【００１４】
本発明のあるいくつかの態様を、本明細書に、乳癌細胞および乳癌に主に関連して記載する。しかし、本発明はそのように限定されず、むしろ、本明細書に記載される産物およびプロセスを、その他の癌、例えばｍｉＲ−３１を発現する細胞から生じる任意の癌の関係において用い得る実施形態を包含する。当業者は、本発明の詳細を、特定のタイプの癌または目的の癌細胞のタイプに従って改変し得ることを認識するであろう。
【００１５】
本発明の実行は、そうでないと記載しない限り、当該技術の技能範囲内である分子生物学、細胞培養、組換え核酸（例えばＤＮＡ）技術、免疫学、核酸およびポリペプチドの合成、検出、操作および定量、ならびにＲＮＡ干渉の通常の技術を典型的に用いることになる。例えばＡｕｓｕｂｅｌ，  Ｆ．ら（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ
Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ
ＳｃｉｅｎｃｅおよびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（全てＪｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎ．Ｙ．、２００８年１２月時点での刊本）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ＲｕｓｓｅｌｌおよびＳａｍｂｒｏｏｋ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、２００１年；Ｈａｒｌｏｗ，  Ｅ．およびＬａｎｅ，  Ｄ．、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、１９８８年を参照されたい。癌についてのさらなる情報は、Ｃａｎｃｅｒ：
Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（Ｖ．Ｔ．  Ｄｅ  Ｖｉｔａら編、Ｊ．Ｂ．  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ、第７版、２００４年または第８版、２００８年）およびＷｅｉｎｂｅｒｇ，  ＲＡ、Ｔｈｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ、Ｇａｒｌａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００６年で見出すことができる。本特許出願で引用する全ての特許、特許出願、刊行物、参考文献などは、それらの全体が参照により組み込まれる。明細書との対立または矛盾がある場合には、明細書が支配するものとする。本出願人らは、任意の組み込まれた参考文献に基づいて明細書を補正し、かつ／または明らかな誤りを修正する権利を留保する。組み込まれた参考文献の内容はいずれも本発明を限定しないものとする。
例えば、本願発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
被験体における腫瘍の転移を阻害する方法であって、該腫瘍におけるｍｉＲ−３１の少なくとも１つの標的の発現または活性を阻害するステップを含む、方法。
（項目２）
ＲＮＡｉ作用物質を前記被験体に投与するステップを含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
ｍｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡを前記被験体に投与するステップをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目４）
ｍｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡの前駆体をコードする核酸構築物を前記被験体に投与するステップを含む、項目１に記載の方法。
（項目５）
ｍｉＲ−３１またはｍｉＲ−３１の前駆体をコードする核酸構築物を前記被験体に投与するステップを含む、項目１に記載の方法。
（項目６）
成熟ｍｉＲ−３１またはｍｉＲ−３１の前駆体を前記被験体に投与するステップを含む、項目１に記載の方法。
（項目７）
被験体における腫瘍細胞の転移を阻害する方法であって、該腫瘍細胞におけるｍｉＲ−３１の少なくとも１つの標的の発現または活性を阻害するステップを含む、方法。
（項目８）
ＲＮＡｉ作用物質を前記被験体に投与するステップを含む、項目７に記載の方法。
（項目９）
ｍｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡを前記被験体に投与するステップをさらに含む、項目７に記載の方法。
（項目１０）
ｍｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを前記腫瘍細胞において発現させるステップを含む、項目７に記載の方法。
（項目１１）
ｍｉＲ−３１を前記腫瘍細胞において発現させるステップを含む、項目７に記載の方法。
（項目１２）
細胞におけるｍｉＲ−３１の少なくとも１つの標的の発現または活性を阻害する作用物質を含む、腫瘍の転移を阻害するための組成物。
（項目１３）
ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡを含む、項目１２に記載の組成物。
（項目１４）
被験体における腫瘍が転移する可能性を評価するための方法であって、
（ａ）該腫瘍から得られた生物学的試料中のｍｉＲ−３１遺伝子産物のレベルを決定するステップと、
（ｂ）該レベルを対照レベルと比較するステップと
を含み、
（ａ）で決定された該レベルが該対照レベルより低い場合に、該腫瘍が転移する可能性が増加しているとみなされる、方法。
（項目１５）
前記生物学的試料が腫瘍組織を含む、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記腫瘍が乳癌である、項目１４に記載の方法。
（項目１７）
前記ｍｉＲ−３１遺伝子産物が、成熟ｍｉＲ−３１  ＲＮＡまたはｍｉＲ−３１前駆体ＲＮＡである、項目１４に記載の方法。
（項目１８）
前記生物学的試料中の前記ｍｉＲ−３１遺伝子産物のレベルを決定するステップが、ハイブリッド形成に基づくアッセイ、ポリメラーゼ連鎖反応アッセイまたは配列決定を行うステップを含む、項目１４に記載の方法。
（項目１９）
被験体における腫瘍の転移の発生の可能性を評価する方法であって、
（ａ）被験体から得られた生物学的試料中のｍｉＲ−３１遺伝子産物のレベルを決定するステップと、
（ｂ）（ａ）で決定された該レベルを適切な対照と比較するステップと
を含み、
（ａ）で決定された該レベルが該ｍｉＲ−３１遺伝子産物の対照レベルより低い場合に、該被験体において転移が発生する可能性が増加している、方法。
（項目２０）
前記生物学的試料が腫瘍組織を含む、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
前記腫瘍が乳癌である、項目１９に記載の方法。
（項目２２）
前記ｍｉＲ−３１遺伝子産物が、成熟ｍｉＲ−３１  ＲＮＡまたはｍｉＲ−３１前駆体ＲＮＡである、項目１９に記載の方法。
（項目２３）
前記生物学的試料中の前記ｍｉＲ−３１遺伝子産物のレベルを決定するステップが、ハイブリッド形成に基づくアッセイ、ポリメラーゼ連鎖反応アッセイまたは配列決定を行うステップを含む、項目１９に記載の方法。
（項目２４）
被験体における腫瘍が転移するかまたは転移した可能性を評価するための方法であって、
（ａ）該腫瘍から得られた生物学的試料中のｍｉＲ−３１標的遺伝子の発現産物のレベルを決定するステップと、
（ｂ）該レベルを対照レベルと比較するステップと
を含み、
（ａ）で決定された該レベルが該対照レベルより高い場合に、該腫瘍が転移するかまたは転移した可能性が増加しているとみなされる、方法。
（項目２５）
前記生物学的試料が腫瘍組織を含む、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
前記腫瘍が乳癌である、項目２４に記載の方法。
（項目２７）
前記発現産物が、ｍＲＮＡまたはポリペプチドである、項目２４に記載の方法。
（項目２８）
前記生物学的試料中の前記発現産物のレベルを決定するステップが、ハイブリッド形成に基づくアッセイ、ポリメラーゼ連鎖反応アッセイ、配列決定、ＥＬＩＳＡアッセイ、ウェスタンブロット、質量分析法または免疫組織化学法を行うステップを含む、項目２４に記載の方法。
（項目２９）
前記生物学的試料中の少なくとも２つのｍｉＲ−３１標的遺伝子の発現産物のレベルを測定するステップを含み、少なくとも２つの遺伝子の産物の発現レベルが対照レベルと比べて増加している場合に、前記腫瘍が転移するかまたは転移した可能性が増加しているとみなされる、項目２４に記載の方法。
（項目３０）
被験体における腫瘍が転移する可能性に関する予後情報を提供するための方法であって、
（ａ）該腫瘍から得られた生物学的試料中のｍｉＲ−３１遺伝子産物のレベルを決定するステップと、
（ｂ）該レベルを対照レベルと比較するステップと
を含み、
（ｉ）（ａ）で決定された該レベルが該対照レベルより低い場合に、該腫瘍が予後不良であるとみなされるか、または（ｉｉ）（ａ）で決定された該レベルが該対照レベルより高い場合に、該腫瘍が予後良好であるとみなされる、方法。
（項目３１）
前記生物学的試料が腫瘍組織を含む、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
前記腫瘍が乳癌である、項目３０に記載の方法。
（項目３３）
前記ｍｉＲ−３１遺伝子産物が、ｍｉＲ−３１  ＲＮＡまたはｍｉＲ−３１前駆体ＲＮＡである、項目３０に記載の方法。
（項目３４）
前記生物学的試料中の前記ｍｉＲ−３１遺伝子産物のレベルを決定するステップが、ハイブリッド形成に基づくアッセイ、ポリメラーゼ連鎖反応アッセイまたは配列決定を行うステップを含む、項目３０に記載の方法。
（項目３５）
細胞の生存および／または増殖を阻害する化合物の能力を試験するための方法であって、（ａ）１または複数の試験細胞を化合物と接触させるステップであって、１または複数の該試験細胞が、対照細胞と比較してｍｉＲ−３１の発現もしくはｍｉＲ−３１の活性が低減しているかまたはそれらを欠く、ステップと、（ｂ）該化合物による１または複数の該試験細胞の生存および／または増殖の阻害のレベルを検出するステップとを含む、方法。
（項目３６）
前記細胞が癌細胞である、項目３５に記載の方法。
（項目３７）
前記細胞が乳癌細胞である、項目３５に記載の方法。
（項目３８）
（ａ）１または複数の試験細胞および１または複数の対照細胞を前記化合物と接触させるステップであって、１または複数の該試験細胞が、１または複数の該対照細胞と比較してｍｉＲ−３１の発現もしくはｍｉＲ−３１の活性が低減しているかまたはそれらを欠く、ステップと、（ｂ）該化合物による１または複数の該試験細胞および該対照細胞の生存および／または増殖の阻害のレベルを検出するステップと、（ｃ）該化合物が、該対照細胞よりも該試験細胞の生存および／または増殖に対して大きい阻害効果を有する場合に、該化合物を、候補抗腫瘍薬剤として同定するステップとを含む、項目３５に記載の方法。
（項目３９）
前記試験細胞および前記対照細胞が、遺伝子的に一致する、項目３５に記載の方法。
（項目４０）
前記試験細胞が、ｍｉＲ−３１遺伝子の変異もしくは欠失を有するか、またはｍｉＲ−３１活性を抑制するｍｉＲＮＡスポンジを発現する、項目３５に記載の方法。
（項目４１）
前記化合物を被験体に投与するステップをさらに含む、項目３５に記載の方法。
（項目４２）
前記被験体が非ヒト動物であり、前記方法が、１または複数の癌細胞を該被験体に導入するかまたは該被験体において癌を誘導するステップを場合によってさらに含む、項目４１に記載の方法。
（項目４３）
前記被験体が、癌を有する、項目４１に記載の方法。
（項目４４）
前記被験体において腫瘍の発生または転移を阻害する前記化合物の能力を評価するステップをさらに含む、項目４１に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、ｍｉＲ−３１レベルが、乳房細胞株における転移能力と逆の相関があることを示す。（Ａ）７種のヒト乳房細胞株におけるｍｉＲ−３１についてのＲＴ−ＰＣＲ。５Ｓ  ｒＲＮＡは、ローディング対照であった。ＮＴＣ：鋳型なし対照。ｎ＝３。（Ｂ）８種のマウス乳腺細胞株におけるｍｉＲ−３１  ＲＴ−ＰＣＲ。５Ｓ  ｒＲＮＡは、ローディング対照であった。ｎ＝３。（Ｃ）動物一致４Ｔ１細胞原発乳腺腫瘍および肺転移におけるｍｉＲ−３１についてのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成（緑色）；ＤＡＰＩ対比染色（青色）。ｎ＝４。（Ｄ）４Ｔ１細胞原発乳腺腫瘍のヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色（上）；箱：浸潤先進部。４Ｔ１細胞におけるｍｉＲ−３１  ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成は、浸潤先進部付近または原発腫瘍の内部に位置した（下）。ｎ＝３。
【図２】図２は、ｍｉＲ−３１発現が転移を阻害することを示す。（Ａ）ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（２３１）細胞に、記載される構築物を形質移入した後の浸潤および運動性のアッセイ。ｎ＝３。（Ｂ）記載されるようにして感染させた２３１細胞を用いるアノイキスアッセイ。ｎ＝３。（Ｃ）記載されるようにして感染させた１．０×１０６のＧＦＰ標識２３１細胞の同所性注射による原発腫瘍成長。実験は、原発腫瘍負荷により１３週後に終結した。群あたり時点あたりｎ＝５。（Ｄ）同所性注射の６２日後の２３１原発腫瘍のＨ＆Ｅ染色。（Ｅ）注射の６２日後の記載される２３１原発乳腺腫瘍に近接した組織のＨ＆Ｅ染色。矢印：正常な脂肪（ａ、ｂ）、筋肉（ｃ、ｄ）および皮下組織（ｅ、ｆ）における散在腫瘍細胞。（Ｆ）同所性移植の６２日後のＧＦＰ標識２３１細胞を視覚化するためのマウス肺の画像（左）。記載される腫瘍を有する動物からの肺のＨ＆Ｅ染色（右）；矢印：転移巣。ｎ＝５。（Ｇ）尾静脈注射の８８日後のＧＦＰ標識２３１細胞を検出するためのマウス肺の画像（左）。肺のＨ＆Ｅ染色（右）；矢印：転移巣。アスタリスク：Ｐ＞０．６６。１０分および２時間（ｎ＝４）以外はｎ＝５。
【図３】図３は、ｍｉＲ−３１の阻害が、転移を促進することを示す。（Ａ）記載される一過性ｍｉＲ−３１阻害因子を形質移入したＭＣＦ７−Ｒａｓ細胞を用いる浸潤および運動性アッセイ。ｎ＝３。（Ｂ）記載されるスポンジを安定的に発現するＭＣＦ７−Ｒａｓ細胞を用いるアノイキスアッセイ。ｎ＝３。（Ｃ）記載されるようにして感染させた５．０×１０５のＧＦＰ標識ＭＣＦ７−Ｒａｓ細胞の同所性注射による原発腫瘍成長。実験は、原発腫瘍負荷により１６週間後に終結した。群あたり時点あたりｎ＝５。（Ｄ）同所性注射の４７日後のＭＣＦ７−Ｒａｓ原発腫瘍のＨ＆Ｅ染色。矢印：被包が乏しい領域。（Ｅ）注射の４７日後の記載されるＭＣＦ７−Ｒａｓ原発腫瘍に近接した組織のＨ＆Ｅ染色。矢印：正常な脂肪（ａ、ｃ）および筋肉（ｂ、ｄ）における散在腫瘍細胞。（Ｆ）同所性注射の１１３日後のＧＦＰ標識ＭＣＦ７−Ｒａｓ細胞を視覚化するためのマウス肺の画像（左）。記載される腫瘍を有する動物からの肺のＨ＆Ｅ染色（中央）；矢印：転移巣。ｎ＝５。（Ｇ）尾静脈注射の１２２日後のＧＦＰ標識ＭＣＦ７−Ｒａｓ細胞を検出するためのマウス肺の画像（左）。肺のＨ＆Ｅ染色（中央）；矢印：転移。１日（ｎ＝３）以外はｎ＝４。
【図４】図４は、ｍｉＲ−３１が、転移促進性遺伝子のコホートを直接調節することを示す。（Ａ）記載される３’ＵＴＲ駆動レポーター構築物の形質移入後にｍｉＲ−３１または対照ベクターに感染させた２３１細胞におけるルシフェラーゼ活性。ｎ＝３。（Ｂ）ｍｉＲ−３１部位変異体３’ＵＴＲ駆動レポーター構築物の形質移入による、記載される２３１細胞におけるルシフェラーゼ活性。ｗｔ：野生型；部位１：ＲｈｏＡ３’ＵＴＲのｎｔ１４５〜１５１でのｍｉＲ−３１モチーフ；部位２：ｎｔ３０３〜３０９にまたがるモチーフ。アスタリスク：変異体−ＵＴＲ＋ベクター対照に対してＰ＞０．８０。ｎ＝３。（Ｃ）記載される２３１細胞における内因性Ｆｚｄ３、ＩＴＧＡ５、ＭＭＰ１６、ＲＤＸおよびＲｈｏＡについてのイムノブロット。β−アクチンは、ローディング対照であった。抑制：ベクター対照に対するｍｉＲ−３１発現細胞におけるタンパク質レベル。（Ｄ）内因性ＣＸＣＬ１２、Ｆｚｄ３、ＩＴＧＡ５、Ｍ−ＲＩＰ、ＭＭＰ１６、ＲＤＸおよびＲｈｏＡについてのＲＴ−ＰＣＲ。ＧＡＰＤＨは、ローディング対照であった。アスタリスク：ベクター対照に対してＰ＜０．０３。ｎ＝３。
【図５】図５は、Ｆｚｄ３、ＩＴＧＡ５、ＲＤＸおよびＲｈｏＡの抑制が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのｍｉＲ−３１依存性表現型の根底にあることを示す。（Ａ）６遺伝子ｍｉＲ−３１標的シグネチャーの発現に基づいて階層分けした転移なし生存を示す２９５のヒト原発乳腺腫瘍についてのカプラン−マイヤー曲線。ログランク検定に基づくＰ値。（Ｂ）これらの原発腫瘍中のｍｉＲ−３１標的シグネチャー発現に基づいて階層分けした２９５名の乳癌患者についてのカプラン−マイヤー５年生存曲線。ログランク検定に基づくＰ値。（Ｃ）記載されるようにして形質移入したｍｉＲ−３１発現２３１細胞または対照２３１細胞を用いる浸潤アッセイ。アスタリスク：ベクター＋ｓｉ対照細胞に対してＰ＞０．１９。ｎ＝３。（Ｄ）記載されるｓｉＲＮＡを形質移入した２３１細胞を用いるアノイキスアッセイ。アスタリスク：ベクター＋ｓｉ対照細胞に対してＰ＞０．８０。ｎ＝３。（Ｅ）ｍｉＲＮＡ耐性発現構築物を形質移入した記載される２３１細胞を用いる浸潤アッセイ。アスタリスク：ｍｉＲ−３１＋モック細胞に対してＰ＞０．６１。ｎ＝３。（Ｆ）記載されるようにして形質移入した記載される２３１細胞を用いるアノイキスアッセイ。アスタリスク：ｍｉＲ−３１＋モック細胞に対してＰ＞０．１１。ｎ＝３。
【図６】図６は、ＲｈｏＡの再発現が、ｉｎ  ｖｉｖｏでのｍｉＲ−３１により強制される転移欠損を部分的に反転することを示す。（Ａ）５．０×１０５のＧＦＰ標識２３１細胞の同所性注射による原発腫瘍成長。実験は、原発腫瘍負荷により１１週後に終結した。アスタリスク：Ｐ＜０．０２。群あたり時点あたりｎ＝５。（Ｂ）同所性注射の６０日後の２３１原発腫瘍のＨ＆Ｅ染色。（Ｃ）注射の６０日後の記載される２３１原発乳腺腫瘍に近接した組織のＨ＆Ｅ染色。矢印：正常な筋肉（ａ、ｃ、ｅ、ｇ）および脂肪（ｂ、ｄ、ｆ、ｈ）における散在腫瘍細胞。（Ｄ）同所性注射の６０日後のＧＦＰ標識２３１細胞を視覚化するためのマウス肺の画像（左）。記載される腫瘍を有する動物からの肺のＨ＆Ｅ染色（右）；矢印：転移巣。ｎ＝５。（Ｅ）尾静脈注射の８６日後のＧＦＰ標識２３１細胞を検出するためのマウス肺の画像（左）；矢印：微小転移病変。アスタリスク：ベクター＋ベクター対照に対してＰ＞０．８７。２週間（ｎ＝３）以外はｎ＝４。
【図７】図７は、ｍｉＲ−３１レベルが、ヒト乳腺腫瘍における転移と逆の相関があることを示す。（Ａ）５４の原発乳腺腫瘍におけるｍｉＲ−３１  ＲＴ−ＰＣＲ。正常：病気でない個体からの組織；転移陽性および転移なし：記載される遠位転移の転帰の腫瘍。５Ｓ  ｒＲＮＡは、ローディング対照であった。ｎ＝４（正常）；ｎ＝１４（転移陽性）；ｎ＝４０（転移なし）。（Ｂ）これらの原発腫瘍におけるｍｉＲ−３１レベルに基づいて階層分けした５４名の乳癌患者についてのカプラン−マイヤー遠位転移なし生存曲線。カイ二乗検定に基づくＰ値。（Ｃ）患者一致原発乳腺腫瘍および遠位転移におけるｍｉＲ−３１のｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成（緑色）（患者１＝肺；２＝胸膜）；ＤＡＰＩ対比染色（青色）。ｎ＝８視野。（Ｄ）患者一致原発乳腺腫瘍および遠位転移におけるＩＴＧＡ５、ＲＤＸおよびＲｈｏＡの免疫組織化学的検出（患者１＝肺；２＝胸膜）。ｎ＝８視野。
【図８】図８は、ｍｉＲ−３１が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の生存性および増殖に影響しないことを示す。（Ａ）ヒトｍｉＲ−３１または対照ベクターに感染させたＭＤＡ−ＭＢ−２３１（２３１）細胞におけるｍｉＲ−３１についてのＲＴ−ＰＣＲ、および正常ヒト乳腺上皮細胞（ＨＭＥＣ）中の内因性ｍｉＲ−３１レベル。５Ｓ  ｒＲＮＡは、ローディング対照であった。ＮＴＣ：鋳型なし対照。ｎ＝３。（Ｂ）ｍｉＲ−３１または対照ベクターを発現する２３１細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ成長曲線。各コホートからの３重のウェルを、記載されるように１４日間計数した。ｎ＝３。（Ｃ）ｍｉＲ−３１またはベクター対照を感染させた２３１細胞を用いる浸潤および運動性アッセイ。ｎ＝３。（Ｄ）記載される発現構築物を２４時間形質移入した２３１細胞を用いるトリパンブルー色素排除アッセイ。ｎ＝３。
【図９】図９は、ｍｉＲ−３１が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＳＵＭ−１５９の浸潤、運動性およびアノイキス耐性を阻害することを示す。（Ａ）ｍｉＲ−３１または対照ベクターに感染させたＳＵＭ−１５９（１５９）細胞におけるｍｉＲ−３１についてのＲＴ−ＰＣＲ、および正常ＨＭＥＣにおける内因性ｍｉＲ−３１。５Ｓ  ｒＲＮＡは、ローディング対照であった。ｎ＝３。（Ｂ）ｍｉＲ−３１またはベクター対照に感染させた１５９細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ成長曲線。各コホートからの３重のウェルを、記載されるように１４日間計数した。ｎ＝３。（Ｃ）ｍｉＲ−３１または対照ベクターを発現する１５９細胞を用いる浸潤および運動性アッセイ。ｎ＝３。（Ｄ）ｍｉＲ−３１またはベクター対照に感染させた１５９細胞を用いるアノイキスアッセイ。細胞を、足場非依存的に２４時間培養し、次いで、細胞生存性をトリパンブルー染色により評価した。ｎ＝３。
【図１０】図１０は、ｍｉＲ−３１が、原発腫瘍成長を促進し、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の単細胞由来集団における局所浸潤と肺転移をともに阻害することを示す。（Ａ）記載されるようにして感染させた２３１細胞の親集団であるｍｉＲ−３１または対照ベクターを過剰発現するＳＣＰ３細胞におけるｍｉＲ−３１についてのＲＴ−ＰＣＲ、および正常ＨＭＥＣにおける内因性ｍｉＲ−３１レベル。５Ｓ  ｒＲＮＡは、ローディング対照であった。ｎ＝３。（Ｂ）記載されるようにして感染させた１．０×１０６のＧＦＰ標識ＳＣＰ３細胞の同所性注射による原発腫瘍成長の動態。群あたり時点あたりｎ＝５。（Ｃ）同所性注射の３２日後の記載されるＳＣＰ３原発腫瘍のヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色。（Ｄ）同所性移植の６１日後の記載されるＧＦＰ標識ＳＣＰ３細胞を視覚化するためのマウス肺の蛍光画像（上のパネル）。コホートあたり時点あたりｎ＝５。
【図１１】図１１は、ｍｉＲ−３１が、ＳＵＭ−１５９細胞における原発腫瘍成長を促進し、局所浸潤を阻害することを示す。（Ａ）記載されるようにして感染させた１．０×１０６のＳＵＭ−１５９細胞の同所性注射の３２日後の原発腫瘍負荷。群あたり時点あたりｎ＝５。（Ｂ）同所性移植の３２日後の記載されるＳＵＭ−１５９原発腫瘍のＨ＆Ｅ染色。
【図１２】図１２は、改変ｍｉＲＮＡスポンジが、ＭＣＦ７−Ｒａｓ細胞におけるｍｉＲ−３１を安定的かつ特異的に阻害することを示す。（Ａ）ＭＣＦ７−Ｒａｓ細胞への改変ｍｉＲ−３１スポンジまたは対照スポンジの安定的感染によるルシフェラーゼアッセイ。細胞に、その３’ＵＴＲにｍｉＲ−３１モチーフを含有するＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼレポーターおよび対照ホタルルシフェラーゼレポーターを同時形質移入した。レポーター遺伝子での形質移入の２４時間後に、細胞可溶化液を採集し、ルシフェラーゼ活性を定量した。ｎ＝３。（Ｂ）ｍｉＲ−３１または対照スポンジを安定的に感染させたＭＣＦ７−Ｒａｓ細胞を用いるルシフェラーゼアッセイ。細胞に、その３’ＵＴＲにｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−２０６またはｍｉＲ−３３５モチーフのいずれかを含有するＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼレポーターおよび対照ホタルルシフェラーゼレポーターを同時形質移入した。レポーターでの形質移入の２４時間後に、可溶化液を採集し、ルシフェラーゼ活性を定量した。ｎ＝３。（Ｃ）ｍｉＲ−３１スポンジまたは対照スポンジを安定的に発現するＭＣＦ７−Ｒａｓ細胞を用いる浸潤および運動性アッセイ。ｎ＝３。（Ｄ）ｍｉＲ−３１スポンジまたは対照スポンジを感染させたＭＣＦ７−Ｒａｓ細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ成長曲線。各コホートからの３重のウェルを、記載されるように１４日間計数した。ｎ＝３。
【図１３】図１３は、ｍｉＲ−３１が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＨＭＥおよびＳＵＭ−１４９の浸潤、運動性ならびにアノイキス耐性を阻害することを示す。（Ａ）ｍｉＲ−３１または対照スポンジでのＨＭＥ細胞の感染によるルシフェラーゼアッセイ。細胞に、その３’ＵＴＲにｍｉＲ−３１モチーフを含有するＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼレポーターおよび対照ホタルルシフェラーゼレポーターを同時形質移入した。レポーターでの形質移入の２４時間後に、細胞可溶化液を採集し、ルシフェラーゼ活性を定量した。ｎ＝３。（Ｂ）ｍｉＲ−３１または対照スポンジを感染させたＨＭＥ細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ成長曲線。各コホートからの３重のウェルを、記載されるように１４日間計数した。ｎ＝３。（Ｃ）記載されるスポンジを感染させたＨＭＥ細胞を用いる浸潤および運動性アッセイ。ｎ＝３。（Ｄ）ｍｉＲ−３１または対照スポンジを感染させたＳＵＭ−１４９細胞を用いる浸潤および運動性アッセイ。ｎ＝３。（Ｅ）記載されるようにして感染させたＨＭＥ細胞を用いるアノイキスアッセイ。細胞を、足場非依存的に２４時間培養し、次いで、細胞生存性をトリパンブルー染色により評価した。ｎ＝３。（Ｆ）記載されるようにして感染させたＳＵＭ−１４９細胞を用いるアノイキスアッセイ。細胞を、足場非依存的に２４時間培養し、次いで、細胞生存性をトリパンブルー染色により評価した。ｎ＝３。
【図１４】図１４は、原発ヒト乳腺腫瘍におけるｍｉＲ−３１レベルが、分子サブタイプと部分的に相関することを示す。ＲＴ−ＰＣＲにより評価した、記載されるグレードＩＩおよびグレードＩＩＩの原発乳腺腫瘍におけるｍｉＲ−３１レベル。５Ｓ  ｒＲＮＡは、ローディング対照であった。ｎ＝１３（ＥＲ＋）；ｎ＝１９（基底膜細胞型）；ｎ＝１６（ＨＥＲ２＋）。
【図１５】図１５は、原発ヒト乳癌におけるｍｉＲ−３１発現が、腫瘍グレードおよびサブタイプとは独立して転移再発と相関することを示す。（Ａ）ＲＴ−ＰＣＲにより評価した、記載されるグレードおよび転移状態の原発乳腺腫瘍におけるｍｉＲ−３１レベル。５Ｓ  ｒＲＮＡは、ローディング対照であった。正常：病気でない個体の組織に由来するＲＮＡ；転移陽性および転移なし：記載される遠位転移の転帰の原発腫瘍からのＲＮＡ。ｎ＝４（正常）；ｎ＝６（グレードＩ、転移なし）；ｎ＝１（グレードＩ、転移陽性）；ｎ＝９（グレードＩＩ、転移なし）；ｎ＝５（グレードＩＩ、転移陽性）；ｎ＝２５（グレードＩＩＩ、転移なし）；ｎ＝９（グレードＩＩＩ、転移陽性）。（Ｂ）記載される分子サブタイプおよび転移状態の原発乳腺腫瘍におけるｍｉＲ−３１についてのＲＴ−ＰＣＲ。５Ｓ  ｒＲＮＡは、ローディング対照であった。正常：病気でない個体の組織に由来するＲＮＡ；転移陽性および転移なし：記載される遠位転移の転帰の原発腫瘍からのＲＮＡ。ｎ＝４（正常）；ｎ＝１６（ＥＲ陽性、転移なし）；ｎ＝４（ＥＲ陽性、転移陽性）；ｎ＝１０（基底膜細胞型、転移なし）；ｎ＝５（基底膜細胞型、転移陽性）；ｎ＝１３（ＨＥＲ２陽性、転移なし）；ｎ＝６（ＨＥＲ２陽性、転移陽性）。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
Ｉ．ｍｉＲ−３１に関する組成物および方法、ならびに転移におけるその役割
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、約２０〜２５ヌクレオチド（ｎｔ）、例えば２１〜２２ｎｔの長さの範囲の小型ＲＮＡの進化的に保存されたクラスを構成し、配列特異的な様式での切断または翻訳抑制のためにｍＲＮＡを標的にすることにより動物および植物において多様で重要な調節性の役割を演じる。哺乳類の細胞において、ｍｉＲＮＡは、翻訳阻害（例えば同族ｍＲＮＡ標的の３’非翻訳領域（ＵＴＲ）との配列特異的相互作用による）および／またはｍＲＮＡ分解による転写後の遺伝子サイレンシングを行う（Ｂａｒｔｅｌ，  Ｄ．、ＭｉｃｒｏＲＮＡｓ：  ｇｅｎｏｍｉｃｓ，  ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ，  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ，  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ．  Ｃｅｌｌ、１１６巻（２号）：２８１〜９７頁、２００４年）。ｍｉＲＮＡの生合成は、プリｍｉＲＮＡと呼ばれる１次ｍｉＲＮＡ転写産物の核切断を含み、これは、ｍｉＲＮＡ前駆体またはプレｍｉＲＮＡとして公知であるおよそ６０〜７０ｎｔのステムループ中間体をもたらし、これが細胞質に輸送されて、ここでこれはダイサーによるさらなるプロセシングを受け、成熟ｍｉＲＮＡとプレｍｉＲＮＡの他方の腕に由来する同様のサイズの断片（ｍｉＲＮＡ＊）とを含むｓｉＲＮＡ様の不完全２重鎖を残す。マイクロＲＮＡは、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と呼ばれるリボヌクレオタンパク質複合体に組み込まれ、ここで、これらは、ｍＲＮＡ切断および／または翻訳抑制により遺伝子発現の下方制御を指図する。一般的に、ｍｉＲＮＡは、ｍＲＮＡがｍｉＲＮＡと十分に相補的である場合に切断を特異的にすることができ、ｍＲＮＡが適切な一群のｍｉＲＮＡ相補的部位（これらはしばしば、３’ＵＴＲにある）を有する場合に、生産的翻訳を抑制できる。
【００１８】
ｍｉＲＮＡは、広い範囲の生物学的プロセスを変調でき、いくつかのヒト疾患と関連する遺伝子を調節することが公知である。ヒト腫瘍の確立および進行におけるｍｉＲＮＡの中心的な役割は、明らかになり始めている。ｍｉＲＮＡをコードする遺伝子座のうち５０％より多くは、腫瘍発生中に変更される染色体領域中にあり（Ｃａｌｉｎら、２００４年）、発現プロファイリングにより、疾患状態および臨床転帰を予測する、乳房腫瘍を含む多くのタイプの腫瘍について特徴的なｍｉＲＮＡシグネチャーが明らかになる（ＣａｌｉｎおよびＣｒｏｃｅ、２００６年）。さらに、伝統的な癌遺伝子または癌抑制遺伝子として機能するｍｉＲＮＡ（ＶｅｎｔｕｒａおよびＪａｃｋｓ、２００９年）とともに、腫瘍進行の後期に作用する限定数のｍｉＲＮＡが同定されている（Ｍａら、２００７年；Ｔａｖａｚｏｉｅら、２００８年；Ｈｕａｎｇら、２００８年；Ａｓａｎｇａｎｉら、２００８年；Ｚｈｕら、２００８年；Ｌｕｊａｍｂｉｏら、２００８年）。転移に影響すると報告された全てのｍｉＲＮＡが、原発腫瘍発生、アポトーシスおよび／または細胞増殖に対しても潜在的な著しい影響を示すので、ｍｉＲＮＡが転移に特異的に影響する程度は不明確なままである（Ｖｏｏｒｈｏｅｖｅら、２００６年；Ｓａｔｈｙａｎら、２００７年；Ｍａら、２００７年；Ｓｉら、２００７年；Ｔａｖａｚｏｉｅら、２００８年；Ｋｏｎｄｏら、２００８年；Ｌｕｊａｍｂｉｏら、２００８年）。さらに、局所浸潤後の浸潤−転移カスケードのステップにおけるｍｉＲＮＡの役割は、記載されていない。
【００１９】
転移促進性（ｍｉＲ−１０ｂ、−２１および−３７３／５２０ｃ）または転移抑制性（ｍｉＲ−３４ｂ／ｃ、−１２６、−１４８ａ、−２０６および−３３５）の機能を有する限定数のｍｉＲＮＡが同定されている。しかし、特異的に転移促進に対するｍｉＲ−１０ｂ、ｍｉＲ−２１およびｍｉＲ−３７３／５２０ｃの寄与は、それらの分裂促進性および／または抗アポトーシス性の役割のために、容易に見分けられない（Ｖｏｏｒｈｏｅｖｅら、２００６年；Ｍａら、２００７年；Ｓｉら、２００７年）。同様に、転移抑制性ｍｉＲＮＡであるｍｉＲ−３４ｂ／ｃ、ｍｉＲ−１２６およびｍｉＲ−１４８ａは、原発腫瘍成長を損なうが（Ｌｕｊａｍｂｉｏら、２００８年；Ｔａｖａｚｏｉｅら、２００８年）、ｍｉＲ−２０６およびｍｉＲ−３３５は、増殖を阻害するかもしくはアポトーシスを促進し（Ｓａｔｈｙａｎら、２００７年；Ｋｏｎｄｏら、２００８年）、ここでもまた転移におけるそれらの厳密な役割を不明瞭にする。
【００２０】
ｍｉＲＮＡが示す遺伝子調節の多指向性の性質に基づいて、本発明者らは、あるいくつかのｍｉＲＮＡが、腫瘍の転移の重要な修飾因子として機能する能力を授かっていると仮定した。実施例にさらに記載するように、本発明者らは、転移促進性標的のコホートの抑制により浸潤−転移カスケードの複数のステップにて作用する転移抑制性ヒトｍｉＲＮＡであるｍｉＲ−３１を同定した。本発明者らは、ヒト乳癌でのｍｉＲ−３１の下方制御またはｍｉＲ−３１ゲノム遺伝子座の欠失が、全ゲノム研究において検出されたことを観察した（Ｃａｌｉｎら、２００４年；Ｚｈａｎｇら、２００６年；Ｙａｎら、２００８年）。臨床的乳腺腫瘍の発現プロファイルの試験により、管腔細胞型Ｂ（管腔細胞型Ａと比べて）、基底膜細胞型およびＨＥＲ２＋腫瘍において低減されたｍｉＲ−３１が明らかになった（これらの研究について、Ｍａｔｔｉｅら、２００６年；Ｂｌｅｎｋｉｒｏｎら、２００７年を参照されたい）（低減のパターンは攻撃性疾患と相関する（Ｓｏｒｌｉｅら、２００１年））。これとは対照的に、別のプロファイリング研究により、ヒト乳腺腫瘍において上昇したｍｉＲ−３１が見出された（Ｖｏｌｉｎｉａら、２００６年）。これらの研究のいずれも、患者を転移状態により階層分けしなかった。さらに、ｍｉＲ−３１は、異なって発現された多数の遺伝子のうちの１つにすぎなかった。
【００２１】
本発明は、ｍｉＲ−３１が、乳癌転移を阻害するために必要かつ十分である多指向活動性ｍｉＲＮＡであることを見出したことに少なくとも部分的に基づく。実施例９に記載するように、原発乳腺腫瘍におけるｍｉＲ−３１発現は、転移再発と逆の相関があった。本発明者らは、ｍｉＲ−３１が、あるいくつかの標的遺伝子、例えばＦｚｄ３、ＩＴＧＡ５、Ｍ−ＲＩＰ、ＭＭＰ１６、ＲＤＸおよびＲｈｏＡの発現を阻害するように通常は作用することを示した。よって、ｍｉＲ−３１の喪失はｍｉＲ−３１標的遺伝子の上方制御をもたらし、このような上方制御は、転移の増加と関連する。これらの研究結果に少なくとも部分的に基づいて、本発明は、例えば腫瘍が転移したかもしくは転移するかという可能性を評価または予測し、かつ／あるいは腫瘍の攻撃性または再発の可能性を評価するための、診断および予後のための組成物ならびに方法を提供する。本発明は、さらに、研究または療法のための組成物および方法を提供する（例えば転移の可能性を低減させ、かつ／または転移の成長を阻害し、かつ／または浸潤性もしくは運動性のような転移表現型の特徴であるとみなされる１または複数の態様を阻害するため）。いくつかの実施形態において、組成物および方法は、ｍｉＲ−３１の効果を模倣し、例えば、これらは、１または複数のｍｉＲ−３１標的遺伝子（複数可）を阻害する。このような作用物質は、例えば１もしくは複数のｍｉＲ−３１標的遺伝子を阻害するｍｉＲ−３１と同一もしくは十分に類似のオリゴヌクレオチド（例えばＲＮＡ）、またはｍｉＲ−３１標的遺伝子を標的にするｓｉＲＮＡであり得る。いくつかの実施形態において、組成物は、医薬組成物である。いくつかの実施形態において、組成物または組成物中に含有される作用物質は、単離されている（例えば天然または人工的に合成された場合に一緒に見出される少なくともいくつかのその他の成分から分離されている）。
【００２２】
本発明の種々の実施形態において有用な作用物質（本明細書において「化合物」ともいう）は、例えばペプチド、ポリペプチド、核酸、オリゴヌクレオチド、小分子（例えば１．５ｋＤ以下、例えば１ｋＤ未満の分子量と通常は複数の炭素−炭素結合を有する有機分子）、抗体、糖類、脂質などであり得る。作用物質は、共有結合していてよい２つ以上の上記のタイプの物質を含み得ると理解される。いくつかの実施形態において、「小分子」とは、複数の炭素−炭素結合と、２０００ダルトン未満、例えば５０〜１，５００ダルトンの分子量を有する有機化合物のことをいう。典型的には、このような化合物は、タンパク質との構造的相互作用、例えば水素結合を媒介する１または複数の官能基を含み、典型的には少なくともアミン、カルボニル、ヒドロキシまたはカルボキシ基、いくつかの実施形態においては少なくとも２つの化学官能基を含む。小分子は、１もしくは複数の化学官能基および／または複素原子で置換された環状炭素もしくは複素環構造および／または芳香族もしくは多環芳香族構造を含んでよい。核酸、例えばオリゴヌクレオチド（これは、典型的には、短い、例えば５０ヌクレオチド以下の長さの核酸のことをいう）について、１本鎖、２本鎖（ｄｓ）、平滑末端、突出を有する２本鎖を本発明の種々の実施形態において用いることが意図される。研究もしくは治療の目的のためのｓｉＲＮＡまたはアンチセンスに基づく分子の関係において有用であると当該技術において公知の改変（例えばヌクレオシドおよび／または主鎖の改変）、非標準的ヌクレオチド、送達媒体およびシステムなどの全範囲を、本発明の種々の実施形態において用いることが意図される。本明細書において有用なポリペプチドは、タンパク質において天然に見出されるもの（例えば２０の「標準」アミノ酸）、タンパク質中に天然に見出されないアミノ酸および／またはアミノ酸でないアミノ酸類似体のようなアミノ酸を含有してよい。ポリペプチド中のアミノ酸の１または複数を、例えば、炭化水素基、ホスフェート基、脂肪酸基などのような化学部分の付加により改変してよい。核酸およびポリペプチドは、当該技術において公知の任意の適切な方法を用いて生成できる。いくつかの実施形態において、核酸またはポリペプチドは、化学合成される。いくつかの実施形態において、核酸は、例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写またはＰＣＲのような増幅反応による酵素合成を用いて生成される。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳による酵素合成を用いて生成される。いくつかの実施形態において、核酸またはポリペプチドは、細胞または多細胞生物により合成され、それから単離される。細胞または生物は、核酸を発現するように遺伝子改変されていてよい。用語「抗体」は、免疫グロブリンおよび抗原と結合できる免疫グロブリンドメインを含有するその誘導体を包含する。抗体は、任意の哺乳類または鳥類の種、例えばヒト、げっ歯類（例えばマウス、ウサギ）、ヤギ、ニワトリなどを起源とし得るか、例えばファージディスプレイを用いて作製できる。抗体は、任意の免疫グロブリンクラス、例えばＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥまたはＩｇＧ１、ＩｇＧ２などのようなそ��サブクラスのメンバーであってよい。本発明の種々の実施形態において、「抗体」とは、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ（単鎖可変）もしくは抗原結合部位を保持するその他の断片、または組換え生成された断片を含む組換え生成されたｓｃＦｖ断片のような抗体断片のことをいう。抗体は、種々の実施形態において１価、２価または多価であり得る。抗体は、キメラまたは「ヒト化」抗体であってよく、これらは、当該技術において公知の方法を用いて作製できる。抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルであってよいが、本発明の目的のために、モノクローナル抗体が一般的に好ましい。実質的にいずれの目的分子にも特異的に結合する抗体を生成する方法は、当該技術において公知である。例えば、モノクローナルまたはポリクローナル抗体は、（例えば分子もしくはその抗原性断片への自然な曝露またはそれを用いる免疫化の後に）抗体を生成する動物の血液または腹水から精製できるか、細胞培養またはトランスジェニック生物における組換え技術を用いて生成できるか、または化学合成により少なくとも部分的に作製できる。本発明において有用な化合物または作用物質（例えば研究、試験、予後および／または療法のため）は、組成物の部分として用いてよく、これは、１または１より多い分子体で構成されてよい。組成物は、例えばイオン、塩、水性もしくは非水性の希釈剤または担体、緩衝剤、酵素阻害剤、防腐剤などを含有してよいが、含有する必要はない。
【００２３】
いくつかの態様において、本発明は、遺伝子改変細胞、例えばｍｉＲ−３１の発現もしくはｍｉＲ−３１の活性が低減するように遺伝子改変された細胞に関するか、またはそれを利用する。「遺伝子改変」または「工学的改変」細胞とは、人間の手を含むプロセスにより核酸が導入された細胞（または核酸の少なくとも一部分を受け継いだこのような細胞の子孫）のことをいう。核酸は、例えば、細胞において天然に見出されない配列を含んでよく、これは、天然配列（すなわち細胞において天然に見出される配列）を天然に生じない配置（例えば異なる遺伝子からのプロモーターと連結されたコード領域）で含んでよい、または天然配列の変更されたバージョンなどを含んでよい。核酸を細胞に移動するプロセスは、任意の適切な技術により達成でき、ベクターの使用をしばしば伴う。適切な技術は、リン酸カルシウムもしくは脂質媒介形質移入、エレクトロポレーション、およびウイルスベクターを用いる形質導入もしくは感染を含む。いくつかの実施形態において、核酸またはその一部分は、細胞のゲノムに組み込まれ、かつ／またはそうでなければ安定的に受け継がれることができる。核酸は、その後、ゲノムから除去または切り出してよい（但し、このような除去または切り出しが未改変であるがその他の点では等価な細胞に対して細胞の検出可能な変更をもたらすことを条件とする）。いくつかの態様において、本発明は、遺伝子改変多細胞生物に関するか、またはそれを利用する。細胞の少なくともいくつかが工学的遺伝子改変されている生物またはそのような細胞に由来する生物は、工学的遺伝子改変生物とみなす。本明細書で用いる場合、「ベクター」は、例えば制限消化とその後のライゲーションにより所望の核酸をその中に挿入し得る任意の多様な核酸分子を含んでよい。ベクターは、例えば核酸を目的の細胞に導入し、場合によってそのような細胞における発現を指図するために、異なる環境間でこのような核酸を輸送するために用い得る。ベクターは、しばしば、ＤＮＡで構成されるが、ＲＮＡベクターも公知である。ベクターは、それらに限定されないが、プラスミドおよびウイルスゲノムまたはそれらの部分を含む。ベクターは、ベクターで形質転換もしくは形質移入されたかまたはされていない細胞を同定および／または選択するために用いるのに適切なマーカーをコードする１または複数の核酸を含有してよい。マーカーは、例えば、抗生物質もしくはその他の化合物に対する耐性または感受性を増加または減少させるタンパク質、当該技術において公知の標準的なアッセイにより活性を検出できる酵素（例えばβ−ガラクトシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）および形質転換もしくは形質移入された細胞の表現型に検出可能に影響するタンパク質またはＲＮＡ（例えば蛍光タンパク質）を含む。発現ベクターは、調節要素（「調節配列」、「発現制御要素」または「発現制御配列」ともいう）と機能的に連結され、かつＲＮＡ転写産物（例えばタンパク質に翻訳され得るｍＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡもしくはｍｉＲＮＡ前駆体のような非コードＲＮＡ）として発現され得るようにその中に所望の核酸を挿入できるものである。調節要素は、ベクターに含有されてよいか、または挿入核酸の���分であってよいか、もしくはその発現が所望される核酸の挿入の前もしくは後に挿入されてよい。本明細書で用いる場合、核酸および調節要素（複数可）は、調節要素（複数可）の影響もしくは制御下に核酸の発現または転写が行われるようにこれらが共有結合する場合に、「機能的に連結される」と言われる。例えば、プロモーター領域が核酸の転写を行うことができた場合に、プロモーター領域は、その核酸と機能的に連結される。当業者は、遺伝子発現に必要とされる調節配列の厳密な性質が、種または細胞のタイプ間で変動し得るが、一般的に、必要に応じて、ＴＡＴＡボックス、キャップ配列、ＣＡＡＴ配列などのようなそれぞれ転写および翻訳の開始に関与し得る５’非転写および／または５’非翻訳配列を含むことができることを認識するであろう。その他の調節要素は、ＩＲＥＳ配列を含む。このような５’非転写調節配列は、機能的に連結された遺伝子の転写制御のためのプロモーター配列を含むプロモーター領域を含むことになる。調節配列は、エンハンサー配列または上流活性化配列も含んでよい。ベクターは、場合によって、５’リーダーまたはシグナル配列を含んでよい。ベクターは、場合によって、切断および／もしくはポリアデニル化シグナルならびに／または３’非翻訳領域を含んでよい。適切なベクターおよび調節要素（複数可）の選択ならびに設計は、当業者の能力および判断の範囲内に含まれる。例えば、当業者は、所望の種（例えば哺乳類の種）または細胞タイプでの発現のために適切なプロモーター（またはその他の発現制御配列）を選択することになる。当業者は、Ｔｅｔ系および小分子などにより調節され得るその他のもののような調節可能（例えば誘導可能または抑制可能）発現系、ならびに組織特異的および細胞タイプ特異的調節要素を認識する。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ワクシニアウイルスおよび弱毒化ポックスウイルスを含むポックスウイルス、レトロウイルス（例えばレンチウイルス）、セムリキ森林ウイルス、シンドビスウイルスなどからなる群より選択される。場合によって、ウイルスは、複製欠損性である。いくつかの実施形態において、複製欠損レトロウイルス（すなわち１または複数の所望の転写産物の合成を指図できるが、感染性粒子を製造できないウイルス）が用いられる。核酸分子を細胞に導入するために種々の技術を用いてよい。このような技術は、核酸分子−リン酸カルシウム沈殿物の形質移入、ＤＥＡＥと会合した核酸分子の形質移入、目的の核酸分子を含有するウイルスでの形質移入または感染、リポソーム媒介形質移入、ナノ粒子媒介形質移入などを含む。
【００２４】
いくつかの態様において、本発明の方法は、被験体を含む。「被験体」は、ヒトまたは非ヒト動物であってよい。被験体は、医療的および／もしくは外科的な手当が正当化される疾患（例えば癌）に罹患しているかまたは予後情報を必要としていてよいか、あるいは集団の平均的なメンバーと比べて疾患を発生する危険性が増加していてよい。いくつかの実施形態において、被験体は、女性である。非ヒト被験体は、非ヒト哺乳動物、例えばマウス、ラット、ハムスター、ウサギもしくはモルモットのようなげっ歯類、イヌ、ネコ、ウシもしくはヒツジ、非ヒト霊長類などであってよい。いくつかの実施形態において、被験体は、癌、例えば乳癌についての動物モデルとして働くことがある。例えば、被験体は、腫瘍を発生する素因を有する工学的遺伝子改変非ヒト哺乳動物、例えばマウスであってよい。哺乳動物は、癌遺伝子（例えば導入遺伝子として）を過剰発現するか、または癌抑制遺伝子を過小発現してよい（例えば動物は、癌抑制遺伝子に変異または欠失を有してよい）。
【００２５】
あるいくつかの態様において、本発明は、例えば腫瘍の転移の可能性を評価または予測するための診断および予後のための組成物ならびに方法を提供する。いくつかの実施形態において、方法は、ｍｉＲ−３１遺伝子産物の発現を評価するステップを含む（例えば、ｍｉＲ−３１遺伝子、例えばプリｍｉＲＮＡもしくはプレｍｉＲＮＡから転写される成熟ｍｉＲ−３１  ＲＮＡまたはｍｉＲ−３１前駆体ＲＮＡのレベルを評価するステップ）。いくつかの実施形態において、方法は、ｍｉＲ−３１による調節の標的である遺伝子の発現産物のレベルまたは活性を評価するステップを含む。「発現産物」は、遺伝子から転写されたＲＮＡおよび／または遺伝子から転写されたｍＲＮＡの翻訳により得られるポリペプチド（その翻訳後プロセシングされた形態を含む）のことであり得る。上記の方法は、腫瘍から得られた生物学的試料中のレベルまたは活性を評価するステップを含んでよい。試料は、例えば組織生検、細針生検、手術標本、ブラッシングなどから得られる細胞を含んでよい。いくつかの実施形態において、細胞は、腫瘍から得られた後に培養で増殖させてよい。いくつかの実施形態において、生物学的試料は、さらに加工して（例えば適切に処理する、染色するなど）、後続のアッセイ手順で用いるためにそれが適切になるようにしてよい。このような加工材料も、用語「生物学的試料」または「試料」の範囲内である。いくつかの実施形態において、方法は、１または複数の他のマイクロＲＮＡ（例えば転移促進もしくは転移抑制の特性を有する１または複数のｍｉＲＮＡ）の発現を測定すること、またはその他の診断／予後のアプローチ、例えばエストロゲンもしくはプロゲステロン受容体の状態、癌遺伝子もしくは癌抑制遺伝子における変異の存在などを評価することとともに用いられる。方法は、例えば、腫瘍を治療もしくは再発を妨げるために治療上の結論を勧めるかまたは決定して、例えば特定のアプローチ（例えば手術、化学療法、放射線照射など）を選択するために用いてよい。いくつかの実施形態において、本発明は、適切な対照との比較を含む。適切な対照レベルは、例えば、非転移性腫瘍におけるレベル、正常組織または細胞（例えば腫瘍が由来するのと同じタイプもしくは同じ器官からの細胞または組織）におけるレベルなどであってよい。対照または参照レベルは、目的の生物学的試料を評価するステップと同時に決定してよいか、または過去の対照もしくは参照レベルであってよい（例えば方法を行うより以前に回収された複数の試料から得られる平均的な測定）。本発明は、本発明の診断、予後および治療方法において使用が適切な作用物質および試薬を含み、場合によって使用説明書を含むキットにも関する。いずれのキットも、本発明の方法を行うためにキットの内容物を用いるための使用説明書と、場合によって、方法を行うために有用な試薬（例えば酵素、緩衝剤）または適切な対照とを含み得る。
【００２６】
いくつかの実施形態において、本発明の方法は、ｍｉＲ−３１標的シグネチャーに関する。このようなシグネチャーは、本発明の診断および予後の方法において用いてよい。いくつかの実施形態において、本発明の方法は、１または複数のｍｉＲ−３１標的遺伝子、例えばＦｚｄ３、ＩＴＧＡ５、Ｍ−ＲＩＰ、ＭＭＰ１６、ＲＤＸおよび／またはＲｈｏＡに関する。本発明の実施形態は、培養している細胞における１もしくは複数のこのような遺伝子の発現または活性を評価することに関する。本発明の実施形態は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの細胞における１もしくは複数のこのような遺伝子の発現または活性を評価することに関する。本発明の実施形態は、培養している細胞における１もしくは複数のこのような遺伝子の発現または活性を変調（例えば増加または阻害）することに関する。本発明の実施形態は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの細胞における１もしくは複数のこのような遺伝子の発現または活性を変調（例えば増加または阻害）することに関する。いくつかの実施形態において、細胞は、動物被験体、例えばげっ歯類、非ヒト霊長類またはヒトにある。いくつかの実施形態において、げっ歯類もしくは非ヒト霊長類またはその他の非ヒト動物は、腫瘍の形成、発達および／または治療薬剤の効力を評価するために有用な動物モデルである。いくつかの実施形態において、動物は、易感染性である。いくつかの実施形態において、細胞は、腫瘍原性細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、非腫瘍原性細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、不死化されている。いくつかの実施形態において、細胞は、遺伝子改変されている。例えば、細胞は、１または複数の癌遺伝子、癌抑制遺伝子などを発現してよい。本発明の実施形態は、任意の上記の遺伝子または任意のその部分集合に関する。
【００２７】
本発明の種々の実施形態において、腫瘍は、癌腫、例えば乳癌である。いくつかの実施形態において、腫瘍は、腺癌である。いくつかの実施形態において、腫瘍は、肉腫である。いくつかの実施形態において、腫瘍は、乳房、リンパ節、前立腺、腎臓、膀胱、肺、肝臓、消化管、結腸、精巣、胃、膵臓、甲状腺、皮膚、卵巣、子宮、子宮頚部、皮膚、神経、骨および神経系（例えば脳）から選択される器官または器官系に影響する。多様な種々の腫瘍タイプが、これらの器官のいくらかを起源とすることがあり、用語「腫瘍」は、全てのこのような腫瘍タイプを包含することを意図する。「癌」は、本明細書で用いる場合、転移する可能性がある任意の腫瘍タイプ、例えば任意の悪性腫瘍（例えば種々の実施形態の癌腫または肉腫）を包含すると理解されよう。いくつかの実施形態において、腫瘍は、上皮細胞、例えば乳房上皮細胞を起源とする。
【００２８】
本出願は、米国特許出願第１０／９９０，９９３号（米国特許出願公開第２００５０１９３４３２号）、２００８年８月１１日にファイルされたＰＣＴ／ＵＳ２００８／００９６３９および／または２００８年１１月２６日にファイルされたＰＣＴ／ＵＳ０８／８５０４０に記載される発明、技術、方法および材料を、本発明の関係において用いることを意図する。例えば、このような発明、技術、方法および／または材料は、腫瘍の転移におけるｍｉＲ−３１および／もしくはｍｉＲ−３１標的遺伝子の役割に関するさらなる分析において、かつ／またはｍｉＲ−３１および／もしくはｍｉＲ−３１標的遺伝子などに関する治療薬剤および薬物候補をスクリーニングおよび評価するために有用であり得る。例えば、ｍｉＲ−３１標的遺伝子を阻害する作用物質の能力および／または腫瘍の成長もしくは転移の可能性または重度を低減する作用物質の能力を評価できる。
【００２９】
ｍｉＲ−３１、例えばヒトｍｉＲ−３１の配列および遺伝子配置は、当該技術において公知であり、ｍｉＲＢａｓｅ（ｗｗｗ．ｍｉｒｂａｓｅ．ｏｒｇ）ｍｉＲＢａｓｅ：マイクロＲＮＡゲノム学のためのツール（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓ  Ｓら、ＮＡＲ  ２００８年３６巻（データベース版）：Ｄ１５４〜Ｄ１５８頁；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓ  Ｓら、ＮＡＲ  ２００６年３４巻（データベース版）：Ｄ１４０〜Ｄ１４４頁；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓ  Ｓ．  ＮＡＲ  ２００４年３２巻（データベース版）：Ｄ１０９〜Ｄ１１１頁）およびＧｅｎＢａｎｋのような公共データベースにおいて入手可能である。クローニング研究において最も一般的に観察される成熟ヒトｍｉＲ−３１は、以下の配列を有すると報告され：ＡＧＧＣＡＡＧＡＵＧＣＵＧＧＣＡＵＡＧＣＵ（配列番号１；ｍｉＲＢａｓｅ受託番号ＭＩＭＡＴ０００００８９）、以下の配列を有すると予測されるステム−ループ内にある：ＧＧＡＧＡＧＧＡＧＧＣＡＡＧＡＵＧＣＵＧＧＣＡＵＡＧＣＵＧＵＵＧＡＡＣＵＧＧＧＡＡＣＣＵＧＣＵＡＵＧＣＣＡＡＣＡＵＡＵＵＧＣＣＡＵＣＵＵＵＣＣ（配列番号２；ｍｉＲＢａｓｅ受託番号ＭＩＭＡＴ０００４５０４；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＲ＿０２９５０５）。
【００３０】
５’および３’末端のいくつかの配列は、ドローシャ切断により生成される中間前駆体ｍｉＲＮＡに含まれないことがある。異なる個体の間に配列の違い（多型）が存在し得ることが認識されよう。例えば、配列は、配列番号２と比較して１〜５つの位置間で異なってよい。さらに、成熟ｍｉＲ−３１は、さらなるヌクレオチド（複数可）、例えば１または２ｎｔを５’および／または３’末端に有するかまたは欠いていてよい。本発明は、あるいくつかの実施形態において非ヒト動物からのｍｉＲ−３１またはｍｉＲ−３１前駆体の使用を包含する。例えば、マウスｍｉＲ−３１を、例えば腫瘍の転移および薬物発見のためのモデルに関する実施形態において用いることができる。成熟マウスｍｉＲ−３１は、以下の配列を有し：ＡＧＧＣＡＡＧＡＵＧＣＵＧＧＣＡＵＡＧＣＵＧ（配列番号３；ｍｉＲＢａｓｅ受託番号ＭＩＭＡＴ００００５３８）、以下の配列のステム−ループにある：ＵＧＣＵＣＣＵＧＵＡＡＣＵＣＧＧＡＡＣＵＧＧＡＧＡＧＧＡＧＧＣＡＡＧＡＵＧＣＵＧＧＣＡＵＡＧＣＵＧＵＵＧＡＡＣＵＧＡＧＡＡＣＣＵＧＣＵＡＵＧＣＣＡＡＣＡＵＡＵＵＧＣＣＡＵＣＵＵＵＣＣＵＧＵＣＵＧＡＣＡＧＣＡＧＣＵ（配列番号４；ｍｉＲＢａｓｅ受託番号ＭＩ００００５７９）。当業者は、ｍｉＲ−３１もしくはそのステム−ループ前駆体またはそれらの一部分を検出および／または増幅するためのプローブを容易に設計できる。当業者は、ｍｉＲ−３１またはそのステム−ループ前駆体をコードするＤＮＡ配列を、場合によってフランキング配列（複数可）、例えば約１００〜１５０ｎｔまでのフランキング配列と一緒に容易にクローニングまたは合成することもできる。このようなＤＮＡは、適切なベクターに挿入して、目的の細胞において発現させることができる。
【００３１】
ＩＩ．予後方法
本発明は、情報、例えば腫瘍、例えば乳腺腫瘍に関する予後情報を提供する多様な方法を提供する。方法は、いくつかの実施形態において、ｍｉＲ−３１もしくはｍｉＲ−３１前駆体の発現レベルまたは活性を評価する（例えば検出する、定量するなど）こと（またはいくつかの実施形態において、１または複数のｍｉＲ−３１標的遺伝子の発現レベルまたは活性を評価すること）に少なくとも部分的に基づく。このような方法は、本明細書において、「ｍｉＲ−３１に基づく方法またはアッセイ」という。いくつかの実施形態において、ｍｉＲ−３１のレベルを用いて、転移の危険性が高い腫瘍と危険性が低い腫瘍とを識別する。例えば、いくつかの実施形態において、腫瘍が、参照レベルと比べて著しく低減したレベルのｍｉＲ−３１を有する場合、腫瘍は、転移の危険性が高いと分類されるが、腫瘍が、参照レベルと比べて著しく低減したレベルのｍｉＲ−３１を有さない場合、腫瘍は、危険性が低いと分類される。参照レベルは、多様な方法で決定してよい。いくつかの実施形態において、参照レベルは絶対レベルであり、その他の実施形態において、参照レベルは相対レベルである。いくつかの実施形態において、腫瘍は、腫瘍コホートとの比較に基づいてｍｉＲ−３１陽性または陰性と分類される。例えば、実施例９に記載するように、腫瘍は、ｍｉＲ−３１の正規化された発現がコホート内の腫瘍のそれぞれ上位または下位３０％内にある場合に、ｍｉＲ−３１陽性または陰性とみなしてよい。ｍｉＲ−３１陽性である腫瘍は、転移の危険性が低く、ｍｉＲ−３１陰性である腫瘍は、転移の危険性が高い。その他の実施形態において、腫瘍は、ｍｉＲ−３１の正規化された発現がコホート内の腫瘍のそれぞれ上位または下位２５％内にある場合に、ｍｉＲ−３１陽性または陰性とみなしてよい。その他の実施形態において、腫瘍は、ｍｉＲ−３１の正規化された発現がコホート内の腫瘍のそれぞれ上位または下位３５％内にある場合に、ｍｉＲ−３１陽性または陰性とみなしてよい。その他の値を用いて、ｍｉＲ−３１陽性または陰性の腫瘍を規定してよいことが理解されよう。いくつかの実施形態において、１または複数の試料は、腫瘍から得られ、１または複数の試料は、同様の細胞タイプで構成される近傍の患者一致正常（非腫瘍）組織から得られる。患者一致非腫瘍試料対腫瘍試料中のｍｉＲ−３１の相対レベルを決定する。いくつかの実施形態において、非腫瘍試料対腫瘍試料中のｍｉＲ−３１の相対レベル（比）が、予め決定された値より高い場合（腫瘍の細胞が有するｍｉＲ−３１が低減しているかまたはそれらを欠くことを示す）、腫瘍は、危険性が高いと分類される。いくつかの実施形態において、予め決定された値は、例えば少なくとも１．５、２．０、２．５、３．０などである。いくつかの実施形態において、予め決定された値は、約１．５〜約１０である。種々の危険性カテゴリーを規定してよい。例えば、腫瘍は、転移の危険性が低い、中間または高いと分類してよい。多様な統計学的方法を用いて、転移の危険性を、ｍｉＲ−３１発現もしくは発現の喪失の相対または絶対レベルと相関させてよい。
【００３２】
本発明は、被験体における腫瘍の転移の発生の可能性を評価する方法であって、（ａ）対照から得られた生物学的試料中のｍｉＲ−３１遺伝子産物のレベルを決定するステップと、（ｂ）（ａ）で決定されたレベルを適切な対照レベルと比較するステップとを含み、（ａ）で決定されたレベルがｍｉＲ−３１遺伝子産物の対照レベルより低い場合に、被験体において転移が発生する可能性が増加している（例えば、（ａ）で決定されたレベルが対照レベルより低くない場合の可能性と比較して）方法を提供する。ｍｉＲ−３１遺伝子産物は、ｍｉＲ−３１遺伝子から転写された任意の転写産物またはそのプロセシングされた形態であり得る。例えば、ｍｉＲ−３１遺伝子産物は、成熟ｍｉＲ−３１  ＲＮＡまたはｍｉＲ−３１前駆体ＲＮＡであり得る。いくつかの実施形態において、生物学的試料は、腫瘍から得られる。いくつかの実施形態において、対照レベルは、被験体から得られた非腫瘍組織の試料を用いて決定される。本発明は、被験体における腫瘍が転移するかまたは転移した可能性を評価するための方法であって、（ａ）腫瘍から得られた生物学的試料中の１または複数のｍｉＲ−３１標的遺伝子（複数可）の発現産物のレベルを決定するステップと、（ｂ）該レベルを対照レベルと比較するステップとを含み、（ａ）で決定されたレベルが対照レベルより高い場合に、腫瘍が転移するかまたは転移した可能性が増加しているとみなされる（例えば、（ａ）で決定されたレベルが対照レベルより大きくない場合の可能性と比較して）方法をさらに提供する。いくつかの実施形態において、少なくとも２つのｍｉＲ−３１標的遺伝子の発現レベルが評価される。本明細書で用いる場合、「ｍｉＲ−３１標的遺伝子」は、その発現がｍｉＲ−３１により直接調節される遺伝子であり、すなわち、ｍｉＲ−３１が、ｍｉＲ−３１が存在するよりもｍｉＲ−３１が存在しない場合に該遺伝子の発現レベルが高くなるように、該遺伝子のｍＲＮＡの切断および／または翻訳抑制を指図する。いくつかの実施形態において、ｍｉＲ−３１標的遺伝子は、ＲｈｏＡ、ＲＤＸおよびＩＴＧＡ５から選択される。予後方法が、転移するかまたは転移した危険性が低下している腫瘍を同定する観点で表現できることが認識されよう。例えば、ｍｉＲ−３１遺伝子産物のレベルが対照と比較して低減していないかまたは不在でない腫瘍は、腫瘍のｍｉＲ−３１遺伝子産物のレベルが低減しているかまたはそれらを欠く場合に存在する可能性と比較して、転移する可能性が低下していた。ｍｉＲ−３１標的遺伝子（複数可）の発現のレベルが対照と比較して増加していない腫瘍は、腫瘍のｍｉＲ−３１標的遺伝子（複数可）の発現レベルが増加している場合に存在する可能性と比較して、転移する可能性が低下していた。
【００３３】
本発明は、被験体における腫瘍が転移する可能性に関する予後情報を提供するための方法であって、（ａ）腫瘍から得られた生物学的試料中のｍｉＲ−３１遺伝子産物のレベルを決定するステップと、（ｂ）該レベルを対照レベルと比較するステップとを含み、（ｉ）（ａ）で決定されたレベルが対照レベルより低い場合に、腫瘍が予後不良であるとみなされるか、（ｉｉ）（ａ）で決定されたレベルが対照レベルより高い場合に、腫瘍が予後良好であるとみなされる方法をさらに提供する。「腫瘍の予後」についての、例えば腫瘍が予後良好または予後不良である、および類似の表現への言及は、そのような腫瘍を有する被験体が、それぞれ予後良好または予後不良であることを意味することに留意されたい。いくつかの実施形態において、本発明の予後方法は、癌、例えば乳癌についての治療を必要とする被験体を準備するステップを含む。いくつかの実施形態において、本発明の予後方法は、癌、例えば乳癌についての治療を必要とする被験体を診断するステップを含む。
【００３４】
ｍｉＲ−３１に基づく予後方法において用いられる生物学的試料は、典型的には、被験体から単離された細胞を含むか、またはそれに由来することになる。細胞は、典型的には、腫瘍細胞、例えば乳腺腫瘍細胞を含むであろう。試料は、例えば手術試料、組織生検試料、細針生検試料、針生検試料であり得る。試料は、当該技術において公知の方法を用いて得てよい。試料は、１または複数の加工ステップに供することができる。いくつかの実施形態において、試料は、凍結および／または固定される。いくつかの実施形態において、試料は、切片化され、かつ／または例えばパラフィンに包埋される。いくつかの実施形態において、腫瘍細胞、例えば上皮腫瘍細胞は、少なくともいくらかの周囲間質組織（例えば間質細胞および／または細胞外基質）から分離されている。目的の細胞は、例えば組織マイクロダイセクション、例えばレーザキャプチャマイクロダイセクションを用いて単離できる。
【００３５】
いくつかの実施形態において、試料の細胞は、可溶化されている。核酸またはポリペプチドは、単離してよい。いくつかの実施形態において、場合によって試料から単離されたＲＮＡは、逆転写および／または増幅される。いくつかの実施形態において、短いＲＮＡ（例えば約２００ヌクレオチド未満）を、より長い核酸から分離する。ＲＮＡ、例えばｍｉＲ−３１のようなｍｉＲＮＡの検出のために、広範囲の溶液相または固相方法が利用可能である。適切な方法は、例えばハイブリッド形成法に基づくアプローチ（例えばヌクレアーゼプロテクションアッセイ、ノザンブロット、マイクロアレイ、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成法）、増幅に基づくアプローチ（例えば逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（リアルタイムＰＣＲ反応であり得る）または配列決定（例えばＲＮＡ転写産物を定量するためにハイスループット配列決定技術を用いるＲＮＡ−Ｓｅｑ（例えばＷａｎｇ，  Ｚ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １０巻、５７〜６３頁、２００９年を参照されたい））を含む。興味のあるいくつかの実施形態において、定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）アッセイを用いる。その他の方法は、電気化学的検出、生物発光に基づく方法、蛍光相関分光法などを含む。少なくとも部分的にロックド核酸（ＬＮＡ）で構成されるプローブは、有用である。いくつかの実施形態において、ｍｉＲ−３１は、ホルマリン固定試料中でｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成法を用いて検出される。プローブとのインキュベーションの前に、組織を、ＲＮＡの５’ホスフェートをタンパク質側鎖と不可逆的に連結する水溶性固定液であるＥＤＣで処理する。例えばＰｅｎａ，  Ｊら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ６巻、１３９〜１４１頁、２００９年を参照されたい。ｍｉＲＮＡを単離、検出および／または定量するためのキットは、Ａｍｂｉｏｎ／Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓからのｍｉＲｖａｎａ（商標）キット；副木−ライゲーション技術によるトータルＲＮＡからの成熟ｍｉＲＮＡおよび小型ＲＮＡの標識および検出のための方法であるＵＳＢ  Ｃｏｒｐ．（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）からのｍｉＲｔｅｃｔ−ＩＴ（商標）ｍｉＲＮＡ標識および検出キットのように商業的に入手可能である。副木−ライゲーション技術は、ｍｉＲＮＡと検出オリゴヌクレオチドとの塩基対を形成するためにｍｉＲＮＡ特異的ブリッジオリゴヌクレオチドを用いる核酸ハイブリッド形成アッセイである。捕捉されたｍｉＲＮＡは、その後、検出オリゴヌクレオチドとライゲーションされる。例えばＭａｒｏｎｅｙ，  ＰＡら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、１３巻（１号）２７９〜２８７頁、２００８年を参照されたい。適切な対照および正規化手順を用いて、ｍｉＲ−３１発現を正確に定量できることが理解されよう。例えば、値は、その発現が癌および／または転移と相関しない５Ｓ  ＲＮＡまたはマイクロＲＮＡのような小型ＲＮＡの発現に基づいて正規化できる。値は、異なる試料が含有する目的の細胞タイプ、例えば癌細胞対非癌細胞の割合が異なり得るという事実を根拠として正規化することもできる。例えば、間質細胞、例えば線維芽細胞のパーセンテージは、間質細胞特異的マーカーの発現を測定することにより評価��、全体的な結果を、腫瘍細胞中に特異的なｍｉＲ−３１発現を正確に反映するように調整してよい。本発明のあるいくつかの実施形態において、ｍｉＲ−３１発現のレベルは、少なくとも１０の異なる遺伝子（例えば少なくとも２０、３０、５０または１００遺伝子）の発現が測定される（例えばマイクロアレイを用いて）遺伝子発現プロファイルの部分として測定されない。本発明のあるいくつかの実施形態において、例えばｍｉＲ−３１発現が、少なくとも１０の異なる遺伝子の発現が測定される（例えばマイクロアレイを用いて）遺伝子発現プロファイルの部分として測定される場合、ｍｉＲ−３１発現のレベルは、全体的な遺伝子発現プロファイルに対するその寄与とは別個の転移の可能性の指標または予後指標として用いられる。あるいくつかの実施形態において、本発明の方法は、ｍｉＲ−３１発現レベルを、遺伝子発現プロファイルに対するｍｉＲ−３１の寄与に少なくとも部分的に依存しない様式で、腫瘍の攻撃性、転移の可能性または予後の指標として用いるステップを含む。一実施形態において、ｍｉＲ−３１レベルは、遺伝子発現プロファイルの部分として評価されるが、ｍｉＲ−３１について得られた結果は、全体的な遺伝子発現プロファイルに基づく分類への寄与因子としてのその使用とは異なる様式で分析されるかまたは用いられる。発現レベルｍｉＲ−３１標的遺伝子は、任意の適切な方法を用いて評価してよい。ｍＲＮＡまたはタンパク質のいずれのレベルを測定してもよい。ｍＲＮＡを測定するための例示的な方法は、ハイブリッド形成に基づくアッセイ、ポリメラーゼ連鎖反応アッセイ、配列決定、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成法などを含む。タンパク質レベルを測定するための例示的な方法は、ＥＬＩＳＡアッセイ、ウェスタンブロット、質量分析法または免疫組織化学法を含む。
【００３６】
ｍｉＲ−３１に基づく予後アッセイの結果は、被験体についての治療計画を選択するために有用であり得る。例えば、このような結果は、被験体が、１または複数の化学療法剤（化学療法）、ホルモン療法またはトラスツズマブのような抗ＨＥＲ２抗体の施与を受けるべきかどうか、例えばそれが有益である可能性があるかどうかを決定するために有用であり得る。いくつかの実施形態において、「化学療法剤」とは、細胞傷害性または細胞増殖抑制性の特性を有し、特定の細胞タイプ（複数可）に特異的または比較的特異的であるホルモン経路と相互作用する（例えば干渉する）ことにより主に作用しない抗腫瘍薬（抗悪性腫瘍薬とも呼ばれる）のことをいう。例示的な化学療法剤は、代謝拮抗剤、アルキル化剤、微小管安定化剤または阻害剤（例えばタキサン）、トポイソメラーゼ阻害剤およびＤＮＡ挿入剤（例えばアントラサイクリン抗生物質）を含む。このような薬剤は、通常、全身投与される。しばしば、複数の薬剤が投与される。乳癌のための例示的な計画は、ＣＭＦ（シクロホスファミド、メトトレキセートおよび５−ＦＵ）、ＡＣ（ドキソルビシンおよびシクロホスファミド）、およびアントラサイクリンに基づく計画を含む。「ホルモン療法」とは、特定の細胞タイプ（複数可）に特異的または比較的特異的であるホルモン経路と相互作用する（例えば干渉する）ことにより主に作用する抗腫瘍薬の投与のことをいう。「アジュバント療法」とは、１または複数の抗腫瘍薬を、手術および／または放射線照射のような局所療法と結び付けて、例えば局所療法の後に投与することをいう。アジュバント療法は、癌が大部分または完全に根絶されたように見受けられるが、再発の危険性がある場合に用いてよい。このような療法は、原発腫瘍部位での残存細胞を排除し、かつ／または散在したいずれの細胞も排除することを補助し得る。「ネオアジュバント療法」とは、例えば原発腫瘍を収縮させるために局所療法の前に施与されるアジュバント療法のことをいう。
【００３７】
いくつかの実施形態において、本発明の予後方法は、アジュバント療法、例えばアジュバントホルモン療法および／またはアジュバント化学療法を必要としない癌患者（例えば、このような治療を行わずに臨床的に明確な転移を経験しない可能性が非常に高い患者）を同定するために用いてよい。このような治療は、著しい副作用を引き起こし得るので、それが有益でないと考えられる個体にそのような治療を施与することを回避することが有益である。いくつかの実施形態において、本発明の予後方法は、再発および／または転移の危険性が高く、よってアジュバント療法が有益である癌患者を同定するために用いてよい。いくつかの実施形態において、本発明の予後方法は、その他の予後指標に基づいて危険性が高いと考えられない（よってアジュバント療法を受けないことがある）が、実際には再発および／または転移の危険性が高い癌患者を同定するために用いてよい。本発明の予後アッセイの結果は、特定のタイプの化学療法計画を選択するため、ならびに／または治療後の転移再発について被験体を監視するために用いる手順のタイプおよび／もしくはそのような手順を行う頻度を選択するために有用であり得る。例えば、転移の危険性が高いと分類された被験体は、危険性が低いと分類された被験体よりもより高い頻度で評価され得る。よって、予後方法のいずれも、アッセイにより得られた情報を用いて、癌に罹患しているかもしくは癌の危険性がある被験体の治療または監視の計画を選択するか、あるいはアジュバント療法を行うことなく悪い転帰（例えば癌に関連する死亡または再発）の危険性を推定することを補助するステップをさらに含み得る。いくつかの実施形態において、上記の方法のいずれも、アッセイの結果に少なくとも部分的に基づいて、例えばｍｉＲ−３１遺伝子産物のレベルに部分的に基づいて治療を勧めるかまたは治療を施与するステップを含むことができる。いくつかの実施形態において、上記の方法のいずれも、（ｉ）腫瘍が予後良好であるとみなされる場合に、化学療法（例えばアジュバント化学療法）を被験体が受けないことを勧めるステップ、または（ｉｉ）腫瘍が予後不良であるとみなされる場合に、化学療法（例えばアジュバント化学療法）を被験体が受けることを勧めるか、もしくはそのような化学療法を施与するステップを含むことができる。
【００３８】
ｍｉＲ−３１に基づく方法は、１もしくは複数の認識された臨床病理学的特徴を有するか、かつ／または遺伝子発現プロファイルに基づいて特定のクラスに含まれる腫瘍を有する被験体についての予後情報を提供するために用いてよい。当該技術において公知であるように、乳癌は、組織学的サブタイプ（例えば乳管；小葉；混合）、組織学的グレード（グレード１、２、３）；エストロゲン受容体（ＥＲ）および／またはプロゲステロン受容体（ＰＲ）の状態（陽性（＋）または陰性（−））、ＨＥＲ２（ＥＲＢＢ２）発現の状態、ならびにリンパ節の関与のようないくつかの異なる臨床病理学的特徴に基づいて分類できる。例えば、以下の乳癌サブタイプは、エストロゲン受容体（ＥＲ）またはプロゲステロン受容体（ＰＲ）の発現と、ヒト上皮成長因子受容体２（Ｈｅｒ２）とに基づいて、例えば免疫組織化学法（ＩＨＣ）により評価して規定できる：ＥＲ＋、Ｈｅｒ２＋；ＥＲ＋、Ｈｅｒ２−；ＥＲ−、Ｈｅｒ２＋；およびＥＲ−、Ｈｅｒ２−。発現のレベルは、これらのサブタイプをさらに分割するために用いることができる。ＨＥＲ２遺伝子座の増幅は、例えば蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成法（ＦＩＳＨ）を用いて評価できる。乳癌は、遺伝子発現プロファイルに基づいて分子サブタイプ、例えば管腔細胞型Ａ、管腔細胞型Ｂ、ＥＲＢＢ２関連型、基底膜細胞型および正常型に分類することもできる（例えばＳｏｒｌｉｅ，  Ｔ．ら、２００１年およびＤｅｓｍｅｄｔ，  Ｃ．ら、２００８年を参照されたい）。
【００３９】
全ての乳癌の約半数が、組織学的グレード１または３状態（それぞれ再発の危険性が低い、または高い）に割り当てられるが、腫瘍の実質的なパーセンテージ（３０％〜６０％）は、組織学的グレード２として分類され、このことは、再発の危険性が中間であるので、臨床上の決定を行うためにあまり有益でないことが報告されている（Ｓｏｔｉｒｉｏｕ
Ｃら、Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．、９８巻（４号）：２６２〜７２頁、２００６年）。この背景において、改良された予後方法は、著しく有用であり得る。いくつかの実施形態において、本発明の方法を、組織学的グレード２として分類された腫瘍に用いて、例えば組織学的グレード２腫瘍を高再発危険性群と低再発危険性群とに分類する。いくつかの実施形態において、本発明の方法を、組織学的グレード２として分類された腫瘍に用いて、例えば組織学的グレード２腫瘍を高再発危険性群と低再発危険性群とに分類する。いくつかの実施形態において、本発明の方法をＥＲ＋である腫瘍に用い、他の実施形態において、本発明の方法をＥＲ−である腫瘍に用いる。いくつかの実施形態において、本発明の方法をＨＥＲ２陽性である腫瘍に用い、他の実施形態において、本発明の方法をＨＥＲ２陰性である腫瘍に用いる。特に興味があるいくつかの実施形態において、本発明の方法をＥＲ−／ＨＥＲ２−である腫瘍に用いる。特に興味がある他の実施形態において、本発明の方法を、エストロゲンおよびプロゲステロン受容体ならびにＨＥＲ２の発現について陰性である（「トリプルネガティブ」）腫瘍に用いる。いくつかの実施形態において、被験体は、リンパ節の関与を有さず、すなわち被験体は「リンパ節転移陰性」（ＬＮＮ）である。いくつかの実施形態において、被験体は、ステージＩまたはステージＩＩ乳癌である。いくつかの実施形態において、被験体は、タモキシフェンまたは別の抗エストロゲン薬、例えばラロキシフェンもしくはトレミフェンのような別の選択的エストロゲン受容体調節薬で治療されている。いくつかの実施形態において、被験体は、予め規定された年齢の群または範囲、例えば５０歳以下、６０歳以下、４０〜６０歳などにあてはまる。本明細書で特に言及していなくても、任意の年齢の群または範囲を選択してよい。
【００４０】
いくつかの実施形態において、ｍｉＲ−３１に基づく予後アッセイは、２番目のアッセイ（または複数のアッセイ）の結果のようなさらなる情報および／または臨床病理学的情報と一緒に用いられる。いくつかの実施形態において、このような情報は、例えば、被験体の年齢、腫瘍のサイズ、リンパ節の関与、腫瘍の組織学的グレード、ＥＲ／ＰＲ状態、および／またはＨＥＲ２状態などを含む。いくつかの実施形態において、ｍｉＲ−３１に基づくアッセイからの情報は、コンピュータプログラムＡｄｊｕｖａｎｔ！Ｏｎｌｉｎｅ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ａｄｊｕｖａｎｔｏｎｌｉｎｅ．ｃｏｍ／ｉｎｄｅｘ．ｊｓｐ）のような意思決定または危険性評価ツールと一緒に用いる。Ａｄｊｕｖａｎｔ！の初期のバージョンの基本的なフォーマットは、Ｒａｖｄｉｎ、Ｓｉｍｉｎｏｆｆ、ＤａｖｉｓらＪＣＯ  １９巻（４号）９８０〜９９１頁、２００１年の文献に記載された。いくつかの実施形態において、２番目のアッセイは、ＭａｍｍａＰｒｉｎｔ（登録商標）（Ａｇｅｎｄｉａ  ＢＶ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）、Ｏｎｃｏｔｙｐｅ  ＤＸ（商標）（Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｒｅｄｗｏｏｄ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）、Ｃｅｌｅｒａ  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  Ｓｃｏｒｅ（商標）（Ｃｅｌｅｒａ，Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）、Ｂｒｅａｓｔ  ＢｉｏＣｌａｓｓｉｆｉｅｒ（ＡＲＵＰ、Ｓａｌｔ  Ｌａｋｅ  Ｃｉｔｙ、ＵＴ）、ロッテルダムシグネチャー７６遺伝子パネル（Ｅｒａｓｍｕｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ、Ｒｏｔｔｅｒｄａｍ、Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）または浸潤性遺伝子シグネチャー（ＯｎｃｏＭｅｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｒｅｄｗｏｏｄ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）または腫瘍を（例えば高危険性群または低危険性群に）、複数の遺伝子の発現レベルに基づいて、例えばマイクロアレイもしくは多重ＲＴ−ＰＣＲアッセイを用いて分類するＮｕｖｏＳｅｌｅｃｔ（商標）アッセイ（Ｎｕｖｅｒａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｗｏｂｕｒｎ、ＭＡ）のような遺伝子発現プロファイリングアッセイである。２つ以上のアッセイに関して「一緒に用いる」の句は、２つ以上のアッセイを特定の腫瘍に対して用いることを意味する。例えば、ｍｉＲ−３１に基づくアッセイを、少なくとも１０の異なる遺伝子（「分類指標遺伝子」）の発現レベルを用いて腫瘍が分類される遺伝子発現プロファイリングアッセイと一緒に用いてよい。このようなアッセイは、対照遺伝子および分類指標遺伝子の発現を典型的に測定することが理解されよう。いくつかの実施形態において、ｍｉＲ−３１に基づくアッセイは、ＨＯＸＢ１３およびＩＬ−１７Ｂ遺伝子の発現比を用いて腫瘍が分類されるＨ：Ｉ（商標）試験（ＡｖａｒｉａＤＸ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）と一緒に用いられる。いくつかの実施形態において、ｍｉＲ−３１に基づく予後アッセイは、抗体に基づくアッセイ、例えばＰｒｏＥｘ（商標）Ｂｒ（ＴｒｉＰａｔｈ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、Ｄｕｒｈａｍ、ＮＣ）、Ｍａｍｍｏｓｔｒａｔ（登録商標）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｉｎｃ．、Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、ＡＬ）、またはｅＸａａｇｅｎＢＣ（商標）（ｅＸａｇｅｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．、Ａｌｂｕｑｕｅｒｑｕｅ、ＮＭ）のようなＦＩＳＨに基づく試験と一緒に用いられる。ｍｉＲ−３１に基づくアッセイは、いくつかの方式で２番目のアッセイと一緒に用いてよい。例えば、２つの試験の結果が一致しない場合（すなわち、一方の試験は、被験体の危険性が高いことを予測し、他方は、被験体の危険性が低いことを予測する）、被験体を治療してよい。いくつかの実施形態において、結果が一致する場合に、確信が増大し得る。例えば、両方の試験が、被験体の危険性が低いことを示す場合、アジュバント化学療法を施与しない決定の確信が増大し得る。
【００４１】
本発明は、本発明のｍｉＲ−３１に基づく予後アッセイを行うために適する試薬を含むキットを提供する。このようなキットは、例えば（ｉ）ｍｉＲ−３１もしくはｍｉＲ−３１前駆体を検出し、逆転写し、かつ／または増幅するためのプローブまたはプライマー（場合によって標識され、かつ／または支持体と結合している）、（ｉｉ）ｍｉＲ−３１標的遺伝子から転写されたｍＲＮＡを検出し、逆転写し、かつ／または増幅するためのプローブまたはプライマー、（ｉｉｉ）ｍｉＲ−３１標的遺伝子によりコードされるタンパク質を検出するための抗体、（ｉｖ）１または複数の対照（例えば、ｍｉＲ−３１を検出もしくは増幅しないプローブまたはプライマー）を含有してよい。場合によって、キットは、例えば紙または電子フォーマット（例えばコンピュータ読み取り可能媒体）での成文資料、例えば使用説明書を含む。使用説明書は、アッセイを行うための指図ならびに／または例えば腫瘍の分類、転移の可能性および／もしくは予後に関する結果の解釈についての指図を含んでよい。このような資料は、オンラインで提供することもできる。いくつかの実施形態において、本発明は、ｍｉＲ−３１に基づくアッセイを行うように適合またはプログラムされたシステムを提供する。システムは、１または複数の装置（例えばＰＣＲ装置）および／またはコンピュータ処理機を含んでよい。システムには、例えば腫瘍試料中のｍｉＲ−３１の検出および／もしくは定量のために選択されたかまたは最適化されたパラメータでプログラムされていてよい。システムは、複数の試料の並行したアッセイを行うように適合されていてよく、かつ／または結果の解釈を行う適切なソフトウェアを有してよい。システムは、適切な入力および出力デバイス、例えばキーボード、ディスプレイなどを含み得る。
【００４２】
いくつかの実施形態において、ｍｉＲ−３１に基づくアッセイは、アッセイを行い、場合によって結果の解釈を行うことを特別に限定していることもある１または複数の中央試験施設にて行われる。後者の場合、試料は実験室に送られ、アッセイの結果が提供される。本発明は、（ａ）試験施設に被験体から得られた試料と（ｂ）本発明のｍｉＲ−３１に基づくアッセイを行うための指示（および場合によって、ＩＣＨ、ＦＩＳＨ、遺伝子発現プロファイルまたは本明細書に記載されるその他のアッセイのような１または複数のさらなるアッセイを行うための指示）とを試験施設に提供するステップを含む方法を提供する。本発明は、（ａ）被験体から得られた試料を試験施設に提供するステップと、（ｂ）本発明の予後アッセイの結果を受領するステップとを含む方法も提供する。本発明は、さらに、本発明の予後アッセイの結果を例えば電子的に提供するステップを含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、提供される結果は、付随する予後情報とともにまたはなしで、試料に対して行った測定結果を含む。本発明は、被験体から試料を得た場所から離れた試験施設にてアッセイが行われ得ることを意図する。試料および／または結果が、本発明の１もしくは複数のステップを行い得るか、またはその結果を伝達もしくは受領し得る１または複数の異なる実体を通して伝達され得ることも意図する。このような作用の全ては、本発明の範囲内である。
【００４３】
ＩＩＩ．ｍｉＲ−３１もしくはｍｉＲ−３１標的遺伝子のレベルまたは活性の変調
本発明は、あるいくつかの実施形態において、ｍｉＲ−３１および／または１もしくは複数のｍｉＲ−３１標的遺伝子のレベルあるいは活性を変調するステップを含む多様な方法を提供する。変調は、細胞もしくは生物におけるｍｉＲ−３１および／または１もしくは複数のｍｉＲ−３１標的遺伝子の量あるいは活性における質的または量的な変化、変更または改変（例えば増加または減少）を引き起こすかあるいは促進することを含み得る。ｍｉＲＮＡのレベルまたは活性を変調するための多様な方法は、本発明において有用である。細胞を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにて、取り上げられかつｍｉＲＮＡ発現もしくは活性を変調する分子と接触させることができるか、またはそのような分子を被験体に投与できる。ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ前駆体またはｍｉＲＮＡもしくはｍｉＲＮＡ前駆体に似せた合成オリゴヌクレオチドを細胞に導入して、ｍｉＲＮＡ標的遺伝子発現の阻害の増加をもたらすことができる。例えば、Ｐｒｅ−ｍｉＲ（商標）ｍｉＲＮＡ前駆体分子（Ａｍｂｉｏｎ）は、内因性成熟ｍｉＲＮＡを模倣するように設計された小型化学改変２本鎖ＲＮＡ分子である。ｍｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ前駆体の転写のための鋳型を提供する核酸を細胞に導入し、その中で安定的または一過的に発現させることができる。ｍｉＲＮＡ前駆体を発現するベクターは、当該技術において周知であり、例えばＯｐｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから市販されている。このようなベクターは、目的のｍｉＲＮＡ配列を挿入して、ｍｉＲＮＡ前駆体の転写のための鋳型を創出するための部位、ｍｉＲＮＡフランキング配列、ｍｉＲＮＡ前駆体配列の転写を指図するプロモーターを含有してよい。例えば、Ｄｉｃｋｅｎｓ  ＮＧら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、３７巻（１１号）：１２８９〜１２９５頁、２００５年を参照されたい。
【００４４】
ｍｉＲＮＡは、多様なアプローチにより阻害できる。いくつかの実施形態において、ｍｉＲ−３１は、ｍｉＲ−３１またはｍｉＲ−３１前駆体に相補的なオリゴヌクレオチドを細胞に導入する（例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏで）か、またはこのようなオリゴヌクレオチドを被験体、例えばヒトに投与することにより阻害される。時に「ａｎｔａｇｏｍｉｒ」とも呼ばれるオリゴヌクレオチドは、ｍｉＲ−３１またはｍｉＲ−３１前駆体と完全に相補的である必要はなく、例えば、これは、１、２、３、４、５もしくはそれより多いミスマッチを有してよく、かつ／またはそれと少なくとも７０％、少なくとも８０％もしくは少なくとも９０％の相補性を有してよい。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、約１７ｎｔ〜約５０ｎｔの長さ、例えば約１９〜２５ｎｔの長さである。例えばＫｒｕｔｚｆｅｌｄｔ  Ｊら、Ｎａｔｕｒｅ  ４３８巻：６８５〜９頁、２００５年を参照されたい。いくつかの実施形態において、このようなオリゴヌクレオチドは、細胞において発現される（Ｓｃｈｅｒｒ，  Ｍ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、３５巻（２２号）：ｅ１４９頁、２００７年）。その他の実施形態において、ｍｉＲＮＡは、特定のｍｉＲＮＡについての多重結合部位を含むＲＮＡを細胞内で発現させるか、または特定のｍｉＲＮＡについての複数の結合部位を含む核酸を細胞に導入するステップを含むｍｉＲＮＡスポンジアプローチを用いて阻害される（例えば、Ｅｂｅｒｔ，  Ｍ．Ｓ．ら、ＭｉｃｒｏＲＮＡ  ｓｐｏｎｇｅｓ：  ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ｓｍａｌｌ  ＲＮＡｓ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ．  Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ４巻、７２１〜７２６頁ならびに実施例４および５を参照されたい）。
【００４５】
オリゴヌクレオチドは、１もしくは複数の非標準ヌクレオチド、改変ヌクレオチド（例えば改変塩基および／または糖を有する）またはヌクレオチド類似体を含有してよく、かつ／あるいは改変主鎖を有してよい。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、１または複数の非核酸部分と結合する。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、標準的ＲＮＡまたはＤＮＡと比較して１または複数の改変を有して、ＲＮアーゼからの保護ならびに／または組織および／もしくは細胞による取り込みの増進、半減期の増大などのような薬理学的特性を少なくとも部分的に提供する。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、糖の部分的もしくは完全な２’−Ｏ−メチル化または２’−Ｏ−メトキシエチル修飾、ホスホロチオエート主鎖および／あるいは３’末端のコレステロール部分を有することにより、標準的ＲＮＡまたはＤＮＡとは異なる。いくつかの実施形態において、モルホリノオリゴヌクレオチドを含む核酸またはロックド核酸が用いられる。米国特許出願公開第２００８０１７１７１５号、第２００７０２１３２９２号およびＰＣＴ公報ＷＯ／２００６／１３７９４１、ＷＯ／２００８／０２５０２５は、ｍｉＲＮＡを変調するために有用な多様な化合物および方法を開示する。ｍｉＲＮＡのレベルまたは活性を変調するいくつかのある作用物質が、多様な供給業者から入手可能である（例えばＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ａｍｂｉｏｎ）。
【００４６】
いくつかの実施形態において、ｍｉＲＮＡ変調剤は、細胞侵入性ペプチドのような細胞取り込みを増加させる部分と物理的に会合している。いくつかの実施形態において、ｍｉＲ−３１変調剤は、ターゲティング部分と物理的に会合し、該部分は、変調剤を目的の細胞タイプに向けて標的させる。いくつかの実施形態において、ターゲティング部分は、上皮細胞、例えば乳房上皮細胞の表面に曝露された分子またはその一部分と結合する。いくつかの実施形態において、ターゲティング部分は、癌細胞、例えば乳癌細胞の表面に曝露された分子またはその一部分と結合する。いくつかの実施形態において、ターゲティング部分は、腫瘍抗原と結合する。いくつかの実施形態において、ターゲティング部分は、受容体、例えばホルモン受容体と結合する。ターゲティング部分は、例えば抗体、アプタマー、ペプチド、糖、小分子などであり得る。「物理的に会合する」２つ以上の部分は、直接もしくは第３部分を介して互いに共有結合または非共有結合してよい。作用物質を細胞にｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで送達するために多様な組成物および方法を用いることができる。例えば、作用物質は、リポソーム、リポプレックスまたはポリマーに基づく粒子、例えば１もしくは複数の生体適合性ポリマーまたはポリ（ラクチド−グリコリド）、コポリオキサレート、ポリカプロラクトン、ポリエステルアミド、ポリオルトエステル、ポリヒドロキシ酪酸および／もしくはポリ無水物を含むコポリマーで少なくとも部分的に構成されたマイクロ粒子またはナノ粒子のような種々のタイプの粒子に組み込まれるか、あるいは結合させることができる。
【００４７】
ｍｉＲ−３１標的遺伝子の発現は、例えば、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）とも呼ばれるＲＮＡサイレンシングを用いて阻害でき、これは、遺伝子発現の配列特異的なサイレンシングが、組み込まれた短いＲＮＡ鎖を有するＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）により行われるプロセスを包含し、この鎖が、相補性を有するｍＲＮＡの配列特異的分解もしくは翻訳抑制を指図または「手引き」する。短いＲＮＡとｍＲＮＡとの相補性は、完全（１００％）である必要はないが、遺伝子発現の阻害をもたらすのに十分であることだけが必要である。例えば、ｍＲＮＡと短いＲＮＡ鎖のハイブリッド形成により形成される構造の相補性の程度および／または特徴は、鎖が、（ｉ）ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）中のｍＲＮＡの切断を手引きし、かつ／または（ｉｉ）ＲＩＳＣによるｍＲＮＡの翻訳抑制を引き起こすことができるようなものであり得る。短いＲＮＡは、しばしば、ＲＩＳＣに、短い２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の部分として組み込まれる。ＲＮＡｉは、哺乳類細胞において種々の方法で人工的に達成してよい。例えば、ＲＮＡｉは、適切な短い２本鎖核酸を細胞に導入するか、または細胞内でプロセシングされてこのような短いｄｓＲＮＡを生じる核酸を細胞内で発現させることにより達成してよい。用語「ＲＮＡｉ作用物質」は、哺乳類細胞においてＲＮＡサイレンシングを達成するために用い得る核酸を包含する。例示的なＲＮＡｉ作用物質は、短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）およびマイクロＲＮＡ前駆体である。ｓｉＲＮＡは、典型的には、互いにハイブリッド形成して２本鎖を形成する２つの別々の核酸鎖を含む。これらは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、例えば標準的な核酸合成技術を用いて合成できる。これらは、広範囲の改変ヌクレオシド（例えば改変塩基を含む）、改変主鎖などを含み得る。ＲＮＡｉもしくはオリゴヌクレオチドのその他の使用について有用であると当該技術で認識されている任意の改変または類似体を用いることができる。いくつかの改変は、安定性、細胞取り込み、効力などの増加をもたらす。あるいくつかの実施形態において、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡは、約１９ヌクレオチドの長さの２重鎖を含み、ここで、一方または両方の鎖は、１〜５ヌクレオチドの長さ（例えば２ヌクレオチド）の３’突出を有し、これはデオキシリボヌクレオチドで構成されてよい。ｓｈＲＮＡは、優勢に非自己相補性の領域で分けられている２つの相補性部分を含有する１本鎖核酸を含む。相補性部分がハイブリッド形成して２本鎖構造を形成し、非自己相補性領域が、２重鎖の一方の鎖の３’末端と他方の鎖の５’末端とを連結するループを形成する。ｓｈＲＮＡは、細胞内プロセシングを受けて、ｓｉＲＮＡを生じ得る。あるいくつかの実施形態において、用語「ＲＮＡｉ作用物質」は、ｓｉＲＮＡ（例えばハイブリッド形成できる２つの別々の鎖）、ｓｈＲＮＡまたはマイクロＲＮＡ前駆体の転写のための鋳型を含み、このような鋳型を哺乳類細胞に導入して、その一過性もしくは安定的な発現をもたらすように使用できるベクター、例えば発現ベクターも包含する。ｍｉＲ−３１標的遺伝子の発現または活性を阻害するその他の方法は、例え���小分子、抗体、アプタマー、ドミナントネガティブアプローチなどの使用を含む。
【００４８】
ＩＶ．薬物の発見および特徴決定
本発明は、例えば癌の治療用の化合物の同定、特徴決定および／または評価のための方法を提供する。本発明のあるいくつかの態様は、例えばｍｉＲ−３１を発現する細胞、例えばｍｉＲ−３１の発現が低減していないかもしくは不在でない細胞に対する効果と比較して、ｍｉＲ−３１の発現が低減しているかもしくは存在しない細胞を選択的に死滅させるかまたはその増殖を阻害する化合物を同定することに関する。このような化合物は、例えば転移の可能性を低減させ、かつ／またはｍｉＲ−３１発現が低減しているかもしくは存在しない細胞から生じる転移の成長を阻害するための抗腫瘍薬として有用であり得る。
【００４９】
理論と結び付けられることを望まないが、ｍｉＲＮＡの発現もしくは活性の異常な低減または不在は、ｍｉＲＮＡにより通常は調節される１または複数の遺伝子（複数可）の発現における変更の結果として、あるいくつかの化合物に対する脆弱性の増加をもたらすことがある。同様に、ｍｉＲＮＡの発現または活性の異常な増加は、ｍｉＲＮＡにより通常は調節される１または複数の遺伝子（複数可）の発現における変更の結果として、あるいくつかの化合物に対する脆弱性の増加をもたらすことがある。このような脆弱性は、変更されたｍｉＲＮＡ発現を有する細胞に対して選択的活性を有する化合物を同定するために利用できる。本発明は、この原理を用いて、目的のｍｉＲＮＡの発現が変更された、例えば低減された細胞に対して選択的活性を有する化合物を発見することを包含し、ここで、発現の低減は、疾患または望ましくない状態、例えば癌を引き起こすかまたはそれに寄与する能力の増加を細胞に与える。例えば、また理論と結び付けられることを望まないが、細胞に対して増加した転移能力を与えることに加えてｍｉＲ−３１の発現の低減または不在は、ｍｉＲ−３１により通常は調節される１または複数の遺伝子（複数可）の発現における変更の結果として、あるいくつかの化合物に対する脆弱性の増加をもたらすことがある。このような脆弱性は、ｍｉＲ−３１発現が低減しているかまたはそれらを欠く細胞に対して選択的活性を有する化合物を同定するために利用できる。本発明は、この原理を用いて、目的のｍｉＲＮＡの発現が増加された細胞に対して選択的活性を有する化合物を発見することも包含し、ここで、発現の増加は、疾患または望ましくない状態、例えば癌を引き起こすかまたはそれに寄与する能力の増加を細胞に与える。
【００５０】
一実施形態において、本発明は、（ａ）第２細胞と比較してｍｉＲ−３１発現または活性が低減しているかまたはそれらを欠く第１細胞を提供するステップと、（ｂ）第１細胞を試験化合物と接触させるステップと、（ｃ）第１細胞の生存または増殖が参照値と比べて低減される場合に、試験化合物を潜在的抗腫瘍化合物として同定するステップとを含む潜在的抗腫瘍化合物を同定する方法を提供する。第１細胞は、遺伝子的に実質的に同一であり得る細胞の集団のメンバーとしてしばしば提供されることが理解されよう。第２細胞と比較してｍｉＲ−３１の発現または活性が低減しているかまたはそれらを欠く（またはｍｉＲ−３１発現または活性が低減しているかまたはそれらを欠くように誘導できる）第１細胞は、本明細書において「試験細胞」ということがあり、第２細胞は、「対照細胞」ということがある。いくつかの実施形態において、対照細胞におけるｍｉＲ−３１の発現または活性は、試験細胞におけるものよりも少なくとも１．２倍、例えば約１．５倍〜約１００倍、５００倍、または１０００倍以上高いことがある。いくつかの実施形態において、試験細胞におけるｍｉＲ−３１発現または活性は、対照細胞と比較して、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％以上低減される。いくつかの実施形態において、参照値は、同じ化合物に曝露された（典型的には同じまたはほぼ同じ濃度で）対照細胞を用いて得られる値である。いくつかの実施形態において、ｍｉＲ−３１の発現もしくはｍｉＲ−３１の活性が低減しているかまたはそれらを欠く細胞は、癌細胞（例えば乳癌細胞）であり、参照値は、癌細胞でない細胞、例えば正常乳房上皮細胞を用いて得られる。本発明は、さらに、細胞の生存および／または増殖を阻害する化合物の能力を試験するための方法であって、（ａ）１または複数の試験細胞を化合物と接触させるステップであって、１または複数の試験細胞が、対照細胞と比較してｍｉＲ−３１の発現もしくはｍｉＲ−３１の活性が低減しているかまたはそれらを欠くステップと、（ｂ）化合物による１もしくは複数の試験細胞の生存および／または増殖の阻害のレベルを検出するステップとを含む方法を提供する。種々の実施形態において、試験および／または対照細胞は、初代細胞、不死化していない細胞株、不死化細胞株、形質転換不死化細胞株、良性腫瘍由来の細胞もしくは細胞株、悪性腫瘍由来の細胞もしくは細胞株（原発腫瘍または転移に由来してよい）、トランスジェニック細胞株などであり得る。場合によって、方法は、化合物による１もしくは複数の試験細胞の生存および／または増殖の阻害のレベルを、化合物による１もしくは複数の対照細胞の生存および／または増殖の阻害のレベルと比較するステップをさらに含み、対照細胞（複数可）よりも試験細胞（複数可）に対してより高い阻害効果を有する化合物を同定するステップをさらに含むこともある。化合物による１もしくは複数の対照細胞の生存および／または増殖の阻害のレベルの決定は、１もしくは複数の試験細胞の生存および／または増殖の阻害のレベルの決定の前、並行してあるいはその後に行うことができる。
【００５１】
試験化合物の生物活性のアッセイは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで、任意の適切な方法を用いて同定または作製された細胞を用いて、そして試験化合物の効果を試験するための任意の適切なシステムで行ってよい。いくつかの実施形態において、ｍｉＲ−３１の発現もしくはｍｉＲ−３１の活性が低減しているかまたはそれらを欠くように遺伝子改変されたかあるいは処理された非腫瘍原性または腫瘍原性細胞を試験細胞として用いる。例えば、このような細胞は、ｍｉＲ−３１遺伝子の変異または欠失を有し得る。ｍｉＲ−３１活性を低減または排除するその他の方法が用いられる試験細胞を、本発明において用いてよい。例えば、いくつかの実施形態において、試験細胞は、多重ｍｉＲ−３１結合部位を含む核酸を安定的に発現するように遺伝子改変された非腫瘍原性または腫瘍原性細胞である。場合によって、このような核酸の発現は、調節可能な発現制御要素（複数可）、例えば誘導性プロモーターの制御下にある。いくつかの実施形態において、ｍｉＲ−３１の発現が天然に（すなわち、意図的な遺伝子改変またはその他の処理によらない）低減しているかまたは存在しない癌細胞（初代細胞または細胞株）を、試験細胞として用いる。いくつかの実施形態において、癌細胞は、実験的に形質転換され、例えば１もしくは複数の癌遺伝子を発現し、かつ／または１もしくは複数の癌抑制遺伝子の発現が低減しているかまたはそれらを欠くようにそれらを工学的に改変することにより腫瘍原性にされている。ｍｉＲ−３１の発現もしくはｍｉＲ−３１の活性が低減しているかまたはそれらを欠く細胞を、対照細胞として用いてよい。対照細胞は、癌細胞であってもよいし、癌細胞でなくてもよい。いくつかの実施形態において、対照細胞は、ｍｉＲ−３１の発現が天然に低減しているかまたは存在しない細胞、例えば癌細胞に由来し、対照細胞は、ｍｉＲ−３１前駆体をコードするベクターを細胞に導入するか、またはそうでなければｍｉＲ−３１を発現するように細胞を遺伝子改変することにより作製される。
【００５２】
いくつかの実施形態において、試験細胞および対照細胞は、遺伝子的に一致する。「遺伝子的に一致する」とは、ほぼ同一のゲノムを有する細胞または細胞の集団を含み、例えばそれらのゲノムは、少なくとも９５％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、または９９．９９％以上同一である。必要に応じて、例えば試験細胞と対照細胞のゲノムの全てまたは重要な部分（例えば少なくとも１％、５％または１０％）を配列決定して比較することにより、正確なまたはおおよその同一性レベルの測定を確立できる。典型的には、遺伝子的に一致する細胞は、同じ被験体に由来するか、またはマウスもしくはラットのようなある特定の種の場合は、特定の近交系に属する異なる対照に由来する。本発明のいくつかの実施形態において、遺伝子的に一致する細胞は、同じ組織試料に由来する。本発明のいくつかの実施形態において、試験細胞および対照細胞は、同じ細胞または遺伝子的に一致する細胞の同じ最初の集団に由来し、本発明の方法で用いられる前に２回、５回、１０回、１５回、２０回、２５回、３０回、３５回、４０回、５０回、６０回、７０回、８０回、９０回または１００回を超えない細胞分裂を受けることになる。本発明は、本発明の方法を行うために適する細胞株の遺伝子的に一致する対を提供し、ここで、対の一方の細胞株は、他方の細胞株と比較してｍｉＲ−３１の発現もしくはｍｉＲ−３１の活性が低減しているかまたはそれらを欠く（またはｍｉＲ−３１の発現もしくはｍｉＲ−３１の活性が低減しているかまたはそれらを欠くように誘導できる）。例えば、いくつかの実施形態において、試験細胞または対照細胞のいずれかは、ｍｉＲ−３１遺伝子における工学的に作製された変異のような特異的遺伝子改変を有する。いずれの理論にも結び付けられることを望まず、そして本発明をいずれの方法でも限定することなく、遺伝子的に一致し、かつ試験細胞ではｍｉＲ−３１発現（または等価のもの）が低減しているかまたは存在せず、対照細胞が「通常の」ｍｉＲ−３１発現を有することにおいて主にまたは本質的に異なる試験細胞および対照細胞を用いることにより、本発明は、試験細胞と対照細胞におけるその他のおそらくは未知の遺伝子的または後成的な違いによるよりもむしろ、ｍｉＲ−３１発現レベルの違いの結果として生じる試験細胞と対照細胞における違いの結果として、試験細胞対対照細胞に異なって影響する化合物（例えば試験細胞の生存および／または増殖を、それらが対照細胞の成長を阻害する程度よりも著しく大きい程度で阻害する化合物）を同定することを可能にする。
【００５３】
いくつかの実施形態において、試験細胞および対照細胞は、乳房細胞、例えば乳房上皮細胞である。多数の乳房細胞株が公知であり、本発明の実施形態において用いることができる。その例は、１８４Ａ１、ＢＴ２０、ＢＴ４７４、ＢＴ４８３、ＢＴ５４９、Ｈｓ５７８Ｔ、ｈＴＥＲＴ−ＨＭＥ１、ＭＣＦ７、ＭＣＦ１０Ａ、ＭＤＡ−ＭＢ１３４、ＭＤＡ−ＭＢ１５７、ＭＤＡ−ＭＢ１７５、ＭＤＡ−ＭＢ２３１、ＭＤＡ−ＭＢ３６１、ＭＤＡ−ＭＢ４３６、ＭＤＡ−ＭＢ４５３、ＭＤＡ−ＭＢ４６８、ＳＫＢＲ３、Ｔ４７Ｄ、ＵＡＣＣ８１２、ＵＡＣＣ８９３、ＺＲ７５−１およびＺＲ７５−３０（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ、ＵＳＡから入手可能）を含む。ＥＦＭ１９およびＥＦＭ１９２Ａ（ＤＳＭＺ、Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、Ｇｅｒｍａｎｙから入手可能）。ＨＣＣ３８、ＨＣＣ７０、ＨＣＣ２０２、ＨＣＣ７１２、ＨＣＣ１００７、ＨＣＣ１１４３、ＨＣＣ１３９５、ＨＣＣ１４１９、ＨＣＣ１４２８、ＨＣＣ１５００、ＨＣＣ１５６９、ＨＣＣ１５９９、ＨＣＣ１８０６、ＨＣＣ１９３７、ＨＣＣ１９５４、ＨＣＣ２１５７、ＨＣＣ２１８５、ＨＣＣ２２１８、ＨＣＣ２６８８およびＨＣＣ３１５３（Ｈａｍｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、ＵＴ  Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔｅｒｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒの細胞リポジトリおよび／またはＡＴＣＣから入手可能）。ＳＵＭ４４ＰＥ、ＳＵＭ５２ＰＥ、ＳＵＭ１０２ＰＴ、ＳＵＭ１４９ＰＴおよびＳＵＭ１９０ＰＴ（Ａｓｔｅｒａｎｄ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＩから入手可能）。さらにその他の細胞株は、実施例で論じる。いくつかの実施形態において、細胞株は、例えば１もしくは複数の不死化遺伝子および／または癌遺伝子を発現するベクターを導入することにより実験的に作製される。例えば、細胞は、ｈＴＥＲＴ、ＳＶ４０ＬＴおよびＨ−Ｒａｓを発現するようにそれらを工学的に遺伝子改変することにより腫瘍原性にすることができる。
【００５４】
当業者は、場合によって腫瘍原性または非腫瘍原性の系統を選択できる。当業者は、組織学的サブタイプ、分子サブタイプ、ＥＲおよび／またはＰＲ受容体の状態、ＨＥＲ２状態、増殖速度などのような目的であり得る特徴に少なくとも部分的に基づいて細胞株を選択することもできる。その他の実施形態において、試験細胞および対照細胞は、非乳癌細胞である。任意のタイプの癌細胞を種々の実施形態において用いてよい。さらにその他の実施形態において、試験細胞および対照細胞は、癌細胞でない。
【００５５】
いくつかの実施形態において、試験細胞および対照細胞は、アッセイを行うために実質的に同一の条件下で別々の容器（例えばマイクロウェルプレートの別々のウェル）中で維持される。試験細胞、対照細胞および１または複数の試験化合物、例えば１０、１００、１０００、１０，０００またはそれより多くの試験化合物を含むアッセイ系であって、細胞および試験化合物（複数可）が、細胞に対する試験化合物（複数可）の影響を評価するのに適する様式で１または複数の容器内に配置されているアッセイ系は、本発明の態様である。典型的には、容器は、適切な組織培養培地を含有し、試験化合物は、組織培養培地中に存在する。当業者は、特定の細胞タイプを培養するために適切な培地を選択できる。いくつかの実施形態において、培地は、血清または組織抽出物を含有せず、例えば培地は化学的に明確であるが、その他の実施形態において、このような成分が存在する。いくつかの実施形態において、培地は、０．０１％、０．０５％もしくは０．１重量または容量％以下の血清または組織抽出物を含有する。いくつかの実施形態において、細胞は、プラスチックまたはガラスの表面で培養される。いくつかの実施形態において、細胞は、少なくともいくつかの点において多くの組織で見出される細胞外環境に似せた環境を提供することを意図して、コラーゲン、ラミニン、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）または合成材料、例えば合成ヒドロゲルを含む材料上または材料中で培養される。いくつかの実施形態において、試験細胞および／または対照細胞は、非癌性間質細胞と培養される。いくつかの実施形態において、試験細胞および／または対照細胞は、線維芽細胞と培養される。
【００５６】
いくつかの実施形態において、細胞に対する試験化合物の影響を評価するために、アッセイがｅｘ  ｖｉｖｏで（例えば培養で）行われる。このようなアッセイは、例えば細胞生存、増殖、浸潤、遊走、アポトーシス、アノイキス、コロニー形成などを測定できる。適切なアッセイは、当該技術において公知である。いくつかの実施形態において、細胞は、３次元培養マトリクスまたは軟寒天で培養される。試験化合物を、典型的に培養培地に加える。いくつかの実施形態において、化合物を、試験細胞（および場合によって対照細胞）と、予め決められた用量（例えば予め決められた濃度）で接触させる。一実施形態において、用量は、約１ｎＭまでであってよい。別の実施形態において、用量は、約１ｎＭ〜約１００ｎＭであってよい。別の実施形態において、用量は、約１００ｎＭ〜約１μＭであってよい。別の実施形態において、用量は、１μＭ以上、例えば約１０μＭまたは１００μＭまでであってよい。適切な時間、場合によって予め決められた時間のインキュベーションの後に、試験細胞の成長および／または生存に対する化合物または組成物の影響を、当業者に公知の適切な方法により決定する。細胞を化合物と種々の期間接触させることができる。あるいくつかの実施形態において、細胞を、１２時間〜２０日間、例えば１〜１０日間、２〜５日間、または任意の介在する範囲もしくは特定の値にわたって接触させる。細胞は、一過的または連続的に接触させ得る。必要に応じて、化合物を除去した後に生存および／または増殖（またはその他の特徴）を評価できる。本明細書で用いる場合、「抑制する」、「阻害する」または「低減する」および類似の用語は、完全であってもまたはそうでなくてもよい。例えば、細胞増殖は、細胞増殖の抑制、阻害または低減のうちの１つの考慮される影響のせいで完全な停止状態まで低減されてもまたはそうでなくてもよい。いくつかの実施形態において、「抑制する」、「阻害する」または「低減する」は、増殖細胞の増殖を阻害することを含む。いくつかの実施形態において、「抑制する」、「阻害する」または「低減する」は、現在の状態を維持することを含んでよい。例えば、細胞増殖を阻害することとは、非増殖細胞の増殖を妨げること（非増殖状態を維持すること）についていうことがある。細胞生存を阻害することとは、壊死もしくはアポトーシス（例えばアノイキス）によるような１または複数の細胞を死滅させること、および細胞を死に対して感受性にするプロセスについていうことがある。抑制、阻害または低減は、参照レベル（例えば対照レベル）の少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％であってよい。いくつかの実施形態において、対照レベルと比較した変調（例えば抑制、阻害または低減）のレベルは、統計学的に有意である。本明細書で用いる場合、「統計学的に有意」とは、適切な統計学的検定（例えばＡＮＯＶＡ、ｔ検定など）を用いて０．０５未満のｐ値、例えば０．０２５未満のｐ値または０．０１未満のｐ値のことをいう。あるいくつかの実施形態において、試験細胞および／もしくは��照細胞の生存ならびに／または増殖は、細胞計数アッセイ、細胞膜完全性アッセイ、細胞性ＡＴＰに基づく生存性アッセイ、ミトコンドリア還元酵素活性アッセイ、カスパーゼ活性アッセイ、アネキシンＶ染色アッセイ、ＤＮＡ含量アッセイ、ＤＮＡ分解アッセイおよび核断片化アッセイから選択されるアッセイにより決定される。例示的なアッセイは、ＢｒｄＵ、ＥｄＵまたはＨ３−チミジン組み込みアッセイ；ヘキスト色素、ＤＡＰＩ、アクチノマイシンＤ、７−アミノアクチノマイシンＤまたはヨウ化プロピジウムのような核酸色素を用いるＤＮＡ含量アッセイ；ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ、ＭＴＴ、ＸＴＴおよびＣｅｌｌＴｉｔｒｅ  Ｇｌｏ（登録商標）のような細胞代謝アッセイ；細胞質ヒストン関連ＤＮＡ断片化アッセイ；ＰＡＲＰ切断アッセイ；ならびにＴＵＮＥＬアッセイを含む。
【００５７】
いくつかの実施形態において、少なくとも２つの別個の細胞集団を含む細胞の混合物を用い、ここで、これらの集団は、ｍｉＲ−３１の発現または活性に関して異なる。例えば、いくつかの実施形態において、第１集団の細胞は、ｍｉＲ−３１の発現が低減しているかまたは存在せず、第２集団の細胞はそうでない。いくつかの実施形態において、少なくとも２つの別個の細胞集団を含む細胞の混合物を用い、ここで、これらの集団は、１または複数のｍｉＲ−３１標的遺伝子の発現に関して異なる。いくつかの実施形態において、第１集団の細胞は、少なくとも１つ（例えば２、３またはそれより多く）のｍｉＲ−３１標的遺伝子の発現が、同じ細胞タイプの正常細胞と比べて増加しており、第２集団の細胞はそうでない。典型的には、各細胞集団は、検出可能であり、混合物中のその他の細胞集団（複数可）から細胞を区別するために用い得る識別性の特徴を有するであろう。いくつかの実施形態において、識別性の特徴は、容易に検出可能なタンパク質の発現のレベルを含む。容易に検出可能なタンパク質は、例えば蛍光タンパク質（例えばＧＦＰ）または基質に対して働いてそれを検出可能にする酵素（例えばルシフェラーゼ、ベータ−グルクロニダーゼ）であり得る。混合物中の２つ以上の細胞集団のそれぞれの検出および場合によって定量を可能にする（例えばＦＡＣＳまたはその他の適切な方法により）その他の識別性の特徴を用いることができる。細胞表面上で発現されるエピトープと結合する検出可能に標識された結合性物質、例えば抗体を用いることができる。このような物質は、放射活性部分、金属原子もしくはクラスタ、磁性部分、同位元素、蛍光部分、量子ドットなどで標識できる。組成物は、例えば第１集団の１％〜９９％の細胞と、第２集団の少なくともいくつかの細胞（例えば１％〜９９％）を含むことができ、これは本発明の態様である。いくつかの実施形態において、第１集団の細胞のパーセンテージは、１０％〜９０％、２０％〜８０％、３０％〜７０％、４０％〜６０％、例えば約５０％である。いくつかの実施形態において、２つの集団は、試験化合物の存在下で一緒に培養される。培養は、種々の時点で評価して、ｍｉＲ−３１（または１もしくは複数のｍｉＲ−３１標的遺伝子）の発現が低減しているかまたはそれらを欠く細胞の割合が時間とともに変化したかどうかを決定する。ｍｉＲ−３１の発現が低減しているかまたはそれらを欠く細胞の割合が、時間とともに、試験化合物の非存在下でよりも大きい程度で減少する場合、試験化合物は、ｍｉＲ−３１の発現が低減しているかまたはそれらを欠く細胞に対して選択的に毒性であり得る。
【００５８】
本方法のいくつかの実施形態において、試験および／または対照細胞の集団を、異なる用量の化合物と接触させる。用量応答曲線を作製でき、ここで、試験用量応答曲線は、複数の用量の化合物による試験細胞の生存、増殖（または任意のその他の関連する特徴、例えば転移関連特徴）の阻害のレベルを示し、対照用量応答曲線は、複数の用量の化合物による対照細胞の生存、増殖（または任意のその他の関連する特徴）の阻害のレベルを示す。いくつかの実施形態において、方法は、試験細胞および／または対照細胞に対する化合物のＩＣ５０またはＥＣ５０の値を決定するステップを含む。いくつかの実施形態において、試験細胞に対する化合物のＩＣ５０またはＥＣ５０の値が、対照細胞に対する化合物のＩＣ５０またはＥＣ５０の値よりも統計学的に有意により小さい場合、化合物は、ｍｉＲ−３１の発現が低減しているかまたはそれらを欠く細胞に対して選択的であると同定される。いくつかの実施形態において、試験細胞に対する化合物のＩＣ５０またはＥＣ５０の値が、対照細胞に対する化合物のＩＣ５０またはＥＣ５０の値よりも統計学的に有意により小さい場合、化合物は、転移細胞および／または転移する傾向を有する細胞に対して選択的であると同定される。
【００５９】
ｍｉＲ−３１の発現もしくは活性が低減しているかまたはそれらを欠く細胞は、ｍｉＲ−３１の発現が低減していないかまたは不在でない対照細胞に対する化合物の影響の比較を含まない方法においても用いることができる。例えば、本発明は、（ａ）正常細胞と比較してｍｉＲ−３１の発現が低減しているかまたはそれらを欠く第１細胞を提供するステップと、（ｂ）第１細胞を試験化合物と接触させるステップと、（ｃ）第１細胞の生存または増殖が参照値と比べて低減している場合に、試験化合物を潜在的抗腫瘍化合物として同定するステップとを含む、潜在的抗腫瘍化合物を同定する方法を提供する。いくつかの実施形態において、参照値は、化合物と接触させない細胞を用いて得られる値である。
【００６０】
いくつかの実施形態において、試験化合物は、ｉｎ  ｖｉｖｏで、化合物を被験体、例えば非ヒト被験体に投与することにより試験される。いくつかの実施形態において、試験化合物は、上記のもののようなｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを用いてまず同定されることがある。いくつかの実施形態において、試験化合物は、複数の癌細胞、例えば１もしくは複数の腫瘍の形成を誘導するのに十分ないくつかの癌細胞、腫瘍異種移植片などを投与した（例えば移植または注射により）非ヒト被験体に投与される。いくつかの実施形態において、癌細胞は、ヒト起源のもの、例えばヒト乳癌細胞である。いくつかの実施形態において、癌細胞は、例えば注射により循環に導入され、例えば肺、肝臓、骨などにおける腫瘍成長のサイズおよび／または数を監視する。いくつかの実施形態において、癌細胞は、局所的に、例えば器官に、例えば同所的に導入される。いくつかの実施形態において、癌細胞は、皮下導入される。いくつかの実施形態において、癌細胞は、乳腺、例えば乳腺脂肪パッドに導入される。細胞は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）、コラーゲンまたは例えば間質環境もしくは細胞外基質を模倣するその他の材料のような物質と一緒に導入できる。いくつかの実施形態において、癌細胞は、非癌性細胞、例えば非癌性線維芽細胞、例えば非癌性乳腺線維芽細胞と一緒に導入される。細胞株は、遺伝子改変して、例えば転移の検出および／または測定を促進するための容易に検出可能なタンパク質を発現できる。非ヒト被験体は、例えばマウスまたはラットのようなげっ歯類であり得る。場合によって、非ヒト被験体は、易感染性、例えばヌード、ＳＣＩＤ、ＮＯＤ−ＳＣＩＤ、Ｒａｇ１−／−、Ｒａｇ２−／−、および／もしくは胸腺欠損マウスまたは免疫抑制剤の投与により免疫抑制にされたものである。いくつかの実施形態において、試験被験体は、癌になりやすい動物、例えば活性化癌遺伝子を有し、かつ／もしくは癌抑制遺伝子を欠いている動物モデル、または動物が癌を発生しやすくなるようにする条件、化合物もしくは刺激物質に曝露した動物であり、すなわち、動物は、その他の点では実質的に同一であるが、それぞれ、活性化癌遺伝子を有さないか、癌抑制遺伝子を欠いているか、または条件、化合物もしくは刺激物質に曝露されていない動物と比べて癌を発生する可能性が増加している。場合によって、ホルモン、例えばエストロゲンまたはエストロゲン受容体刺激薬を試験被験体に投与する。当該技術において公知の癌の任意の動物モデルを用いることができる。乳癌モデルが特に興味深い。このようなモデルは、例えば、変異体もしくは野生型のＥＲＢＢ−２、ＴＧＦアルファ、Ｗｎｔ−１、ｃ−Ｍｙｃ、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、変異体ｐ５３、ＳＶ−４０Ｔ抗原および／またはサイクリンＤを、場合によって組織特異的調節要素（複数可）の制御下で発現するように工学的に改変されたげっ歯類、例えばマウスまたはラットを含む。いくつかの実施形態において、米国特許出願第１０／９９０，９９３号またはＰＣＴ／ＵＳ２００８／０８５０４０（公開番号ＷＯ／２００９／０７０７６７）に記載されるもののような動物モデルを用いる。いくつかの実施形態において、動物モデルは、そこから腫瘍��生じると予測されるタイプの細胞、例えば乳癌上皮細胞において容易に検出可能なタンパク質を発現する。このようなタンパク質は、例えば適切なイメージング方法を用いて転移の検出および／または測定を促進し得る。
【００６１】
試験化合物は、被験体に、当該技術において公知の任意の計画により投与できる。例えば、試験化合物を、癌細胞の投与もしくは癌の発生を促進する条件への曝露の前、同時および／または後に投与できる。試験化合物は、定期的に、例えば１日に１、２、３回以上、毎週、２週間毎、もしくは毎月、癌細胞の投与が開始される前または癌細胞が投与された後に投与することもできる。その他の実施形態において、試験化合物は、被験体に継続的に投与される（例えば、インプラント、ポンプ、持続放出製剤などからの放出により）。投与される試験化合物の用量は、化合物の種類、被験体の体重、投与頻度などを含む複数の因子に依存し得る。投与量の決定は、当業者にとって日常的である。あるいくつかの実施形態における例示的用量は、０．１μｇ〜１０，０００ｍｇ、例えば約１μｇ〜５０００ｍｇ、例えば約１０μｇ〜１００ｍｇを１日、１週間、１カ月あたり１回もしくはそれより多くまたはその他の時間間隔である。体重の点について、あるいくつかの実施形態における例示的投与量は、０．０１〜２００ｍｇ／ｋｇ／日（例えば０．１〜２０または１〜１０ｍｇ／ｋｇ／日、例えば約１〜５ｍｇ／ｋｇ／日）である。
【００６２】
被験体における原発腫瘍および／もしくは転移のサイズならびに／または数、ならびに／あるいは浸潤性、運動性、血管外遊走、遠位部位（導入部位に対して）での生存などのような細胞特性もしくはプロセスは、腫瘍細胞および試験化合物の投与の後に決定できる。このような特徴は、当該技術において公知の任意の手段により非侵襲的に決定できる。例えば、標識された腫瘍細胞（例えば蛍光タンパク質を発現することにより）を、種々のイメージング技術または装置により監視できる。有用なイメージング方法は、核イメージング、光学イメージング（例えば近赤外（ＮＩＲ）光学イメージング）、陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）（場合によって（１８）Ｆ−フルオロデオキシグルコース（ＦＤＧ）を用いる）および核磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）を含む。標識されたイメージング剤を投与でき、これは、それらを導入された細胞またはその子孫に選択的に標的させるターゲティング部分と物理的に会合してよい。化合物が腫瘍サイズおよび／または転移に影響するかどうかを決定するために、被験体における腫瘍のサイズおよび／または数（または任意の目的の細胞特性もしくはプロセス）を、参照標準（例えば対照値）と比較できる。参照標準は、癌細胞の投与の同じ計画と、場合によってモック化合物投与を与えられた対照の被験体を用いて得ることができる。モック投与は、試験化合物を欠くか、または不活性であると考えられる化合物を含有することができる。参照標準は、未処理の被験体において予測される腫瘍もしくは転移のサイズおよび／または数（または任意の目的の細胞特性もしくはプロセス）を表す１つの数値、複数の数値または数値の範囲であり得、これは、未処理被験体の代表的な試料を観察することにより決定できる。
【００６３】
任意の化合物またはその組合せを、本発明の方法において試験できる。化合物は、有機小分子、無機分子、核酸、ポリペプチド、抗体などであり得る。いくつかの実施形態において、評価される核酸またはポリペプチドは、例えば核酸またはポリペプチドをコードするベクターを細胞に導入することにより、組換え核酸技術を用いて細胞において発現される。例えば、多様なタンパク質をコードするｃＤＮＡライブラリー（天然または人工的配列を有してよい）を評価してよい。化合物は、例えば化学物質ライブラリー、天然物ライブラリー、コンビナトリアルライブラリーなどのメンバーであり得る。化学物質ライブラリーは、種々の化学構造を含むことができ、そのうちのいくつかは、公知化合物、公知化合物の類似体または別の薬物発見スクリーニングにおいて「ヒット」もしくは「リード」として同定された類似体もしくは化合物であってよく、他のものは、天然物に由来し、さらに他のものは無向性の合成有機化学から生じる。このようなライブラリーからの化合物は、しばしば、マルチウェルプレートに配置される（例えば９６、３８４または１５３６ウェルプレート）。これらは、適切な溶剤、例えばＤＭＳＯに溶解してよい。天然物ライブラリーは、例えば、例えば（１）微生物からのブロスの発酵および抽出または（２）植物もしくは海洋生物の抽出によりスクリーニングのための混合物を創出するために用いられる微生物、動物、植物または海洋生物のコレクションから調製できる。化合物ライブラリーは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＴｉｍＴｅｃ（Ｎｅｗａｒｋ、ＤＥ）およびＣｈｅｍＢｒｉｄｇｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）のようないくつかの会社から市販されている。種々の政府および非営利研究機関は、科学界が利用可能な化合物ライブラリーを有する。例えば、国立衛生研究所（ＮＩＨ）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  Ｐｒｏｇｒａｍを構成するＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  Ｓｍａｌｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ（ＭＬＳＭＲ）は、例えばハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）アッセイにおいて用いるための公知および未知の生物活性を有する＞３００，０００の化学的に多様な化合物のコレクションを同定、獲得、維持および分配するために設計されている（ｈｔｔｐｓ：／／ｍｌｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｍｌｉ／を参照されたい）。ＮＩＨ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＮＣＣ）は、ヒト臨床試験で有用な経歴を有するおよそ４５０の小分子のめっきアレイである。これらの化合物は、公知の安全性プロファイルを有し、非常に薬物に近い。いくつかの実施形態において、薬物は、米国食品医薬品局のような政府取締機関により承認されたもの、あるいは前臨床もしくは臨床開発中または治療薬剤として開発が考慮されている化合物である。いくつかの実施形態において、薬物は、癌、例えば乳癌における使用が承認されており、その他の実施形態において、承認されていない。化合物は、典型的には、標準的な細胞培養培地中に存在しないか、または存在するならば本発明で用いた場合よりも低い量で存在するものである。
【００６４】
本出願人らは、「試験化合物」の範囲ならびに／または本発明の組成物および方法から任意の特定の１つの化合物、複数の化合物または化合物クラスを除外する権利を留保する。いくつかの実施形態において、「試験化合物」は、組織培養培地中で見出されるかまたは組織培養培地の成分として当該技術において公知である化合物、例えば細胞を培養する目的で用いられる化合物でない。いくつかの実施形態において、試験化合物は、組織培養培地中で見出されるかまたは組織培養培地の成分として当該技術において公知であるものであってよいが、組織培養培地の成分として典型的に用いられるものとは異なる濃度で試験化合物として用いられる。いくつかの実施形態において、化合物は、癌を治療するためおよび／または化学療法に付随する副作用を低減するために有用であると当該技術において公知である化合物でない。
【００６５】
本明細書に開示される化合物同定および特徴決定の方法のあるいくつかの結果は、化合物が転移の抑制因子（例えば浸潤−転移カスケードの１または複数のステップの抑制因子）である場合、および／または化合物が転移する傾向を有する細胞の生存または増殖を阻害する場合のように、治療上の目的であり得る。その他の有益な結果は、（ａ）本発明により同定される作用物質を投与することにより、転帰を損なうことなく化学療法の用量または期間を低減する（または化学療法を全く回避する）能力、（ｂ）本発明により同定される作用物質を投与することにより、転帰を損なうことなく、その他の作用物質と比較して毒性が低減された化学療法剤を用いる能力、および（ｃ）試験被験体の生存の延長を含み得る。臨床上有益な結果を有する化合物は、潜在的化学療法剤であり、そのまま処方してよい。
【００６６】
有用な効果を有すると同定された化合物を選択して、例えば合理的設計を用いて系統的に変更して、結合親和性、結合活性、特異性またはその他のパラメータを最適化できる。例えば、本明細書に記載される方法を用いて第１化合物ライブラリーをスクリーニングし、「ヒット」もしくは「リード」である１または複数の化合物を（例えば転移を阻害するそれらの能力により）同定し、これらのヒットを系統的構造変化に供して、ヒットまたはリードと構造的に関連する第２化合物ライブラリーを創出できる。第２ライブラリーは、次いで、本明細書に記載される方法または当該技術において公知のその他の方法を用いてスクリーニングできる。化合物は、（ｉ）効力の改善、（ｉｉ）毒性の低下および／または副作用の低下、（ｉｉｉ）治療作用の開始および／または効果の期間の改変、ならびに／あるいは（ｉｖ）薬物動態学的パラメータの改変（吸収、分布、代謝および／または排泄）を達成するように改変または選択できる。
【００６７】
本発明のあるいくつかの実施形態において、本発明の方法を用いて同定または開発された化合物は、対照細胞に対するその活性と比べて試験細胞に対して選択的な活性（例えば生存および／または増殖の選択的阻害、選択的毒性）を示す。例えば、化合物のＩＣ５０は、対照細胞に対して、試験細胞について約２、５、１０、２０、５０、１００、２５０、５００または１０００倍低いことがある。いくつかの実施形態において、化合物のＩＣ５０は、ｍｉＲ−３１を発現する遺伝子的に一致する細胞についてよりも（例えばそのタイプの細胞について通常のレベルにて）、ｍｉＲ−３１の発現が低減しているかまたはそれらを欠く細胞について約２、５、１０、２０、５０、１００、２５０、５００または１０００倍低いことがある。いくつかの実施形態において、化合物のＩＣ５０は、非癌細胞についてよりも癌細胞について約２、５、１０、２０、５０、１００、２５０、５００または１０００倍低いことがある。いくつかの実施形態において、化合物のＩＣ５０は、ｍｉＲ−３１発現を欠く非癌細胞についてよりもｍｉＲ−３１発現を欠く癌細胞について約２、５、１０、２０、５０、１００、２５０、５００または１０００倍低いことがある。
【００６８】
本発明は、本発明の方法を用いて同定された化合物、例えばｍｉＲ−３１の発現を欠く癌細胞の生存または増殖を選択的に阻害する化合物の生物学的標的（複数可）を同定することを包含する。用語「生物学的標的」は、本明細書において、生物活性作用物質がそれに対して効果、例えば癌細胞の生存、増殖および／または転移を阻害するような治療上の利益を導く効果を奏する生体分子（例えば被験体の体内に存在する生体分子）について言及する当該技術におけるその意味と一貫して用いられる。例えば、化合物は、１または複数の細胞遺伝子産物に対して直接（物理的相互作用により）または間接的に作用してよい。生物学的標的は、例えば細胞表面または細胞内受容体、酵素、チャネル、分泌タンパク質などであってよい。本発明の方法を用いて同定された化合物の生物学的標的は、さらなる薬物発見の取り組みのための候補である（このような候補は、時には、「薬物発見標的」という）。本発明は、よって、薬物発見取り組みが有用にそれに対して向けられ得る候補生体分子を同定するための方法を提供する。このような生体分子に対して作用することが当該技術において既に公知である化合物は、ｍｉＲ−３１発現が低減しているかまたはそれらを欠く癌細胞に対する選択的活性を有する作用物質として有用であり得る。このような作用物質は、本明細書に記載される方法を用いて試験してよい。さらに、当該技術において公知の標準的なスクリーニング方法を、このような生体分子に対して作用する小分子、タンパク質、アプタマー、抗体、核酸（例えばｓｉＲＮＡ）などのようなさらなる化合物を同定するために用いることができる。多様なアプローチを用いて、目的の化合物の１または複数の生物学的標的（複数可）を同定できる。いくつかの実施形態において、ＲＮＡｉライブラリー（例えばｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡライブラリー）または遺伝子抑制要素（ＧＳＥ）ライブラリーを用いて、細胞、例えばｍｉＲ−３１の発現が低減しているかまたは存在せず、化合物による阻害に対して感受性である細胞における個別の遺伝子を阻害する。一実施形態において、ｃＤＮＡライブラリーを用いて、細胞、例えばｍｉＲ−３１の発現が低減しているかまたは存在せず、化合物による阻害に対して感受性である癌細胞において各遺伝子を過剰発現させる。特定の遺伝子の阻害または過剰発現が、化合物に対する細胞の感受性を変調する（本発明の種々の実施形態において例えば廃止する、低減するまたは増加する）場合に、遺伝子またはこのような遺伝子の産物は、化合物の標的および／または薬物発見のための標的の候補である。当業者は、適切なアッセイまたはアッセイの組合せを選択するであろう。
【００６９】
その他の実施形態において、化合物を用いて、その分子標的を同定する。任意の適切な方法を標的同定のために用いることができる。化合物は、反応性基またはタグを含むように標識または改変されてよい。反応性基またはタグは、例えばこのような組み込みが化合物の活性に実質的に影響しない部位にて組み込まれてよい。細胞を化合物と接触させ、化合物がその標的（複数可）と相互作用する条件下に維持する。細胞は、試験細胞、例えばｍｉＲ−３１の発現もしくはｍｉＲ−３１の活性が低減しているかまたはそれらを欠く細胞であってよいが、そのような細胞である必要はない。これらは、化合物を最初に同定するために用いたものと同じタイプであってよいが、そうである必要はない。場合によって、化合物は、それが物理的に相互作用する生体分子（複数可）と架橋されている。化合物は、次いで、それが結合している生体分子（複数可）と一緒に単離される（例えばいくらかまたは全てのその他の細胞構成成分から除去される、部分的に精製される）。化合物にタグが付加されている場合、タグを用いて化合物を単離してよい。別の実施形態において、アフィニティクロマトグラフィーを用いて、化合物の生物学的標的（複数可）を同定する。化合物は、支持体、例えばクロマトグラフィー樹脂またはその他の支持体と結合し、そのことによりアフィニティマトリクスを形成する。アフィニティマトリクスを細胞可溶化液（例えば試験細胞可溶化液、対照細胞可溶化液）とインキュベートし、次いで洗浄し、結合した生体分子、例えばタンパク質を、例えばＳＤＳ含有緩衝液中での煮沸により溶出する。アフィニティマトリクスにより保持されるタンパク質は、例えばＳＤＳ／ＰＡＧＥにより分離し、例えば銀染色または任意の適切な方法により視覚化してよい。これらは、次いで、ゲルから単離してよい。生体分子は、次いで、例えばペプチド配列決定、質量分析法などを用いて同定される。いくつかの実施形態において、試験細胞に選択的に存在し、かつ／または対照細胞に対して試験細胞において化合物と選択的に結合する生体分子は、目的である。その他の実施形態において、マイクロアレイ分析、遺伝子発現の連続分析（ＳＡＧＥ）または類似の技術を用いて、選択されたタイプの細胞、例えば試験細胞、対象細胞、癌細胞などにおける遺伝子発現に対する本発明の方法を用いて同定された化合物の効果を評価する。その発現が化合物への曝露の結果として変調された遺伝子は、化合物の標的および／または薬物送達のための標的であることについての候補である。本発明のその他の実施形態において、当該技術において公知の方法を用いて、タンパク質レベル、局在化および／または改変状態（例えばリン酸化状態）などに対する化合物の影響を決定する。そのレベル、局在化および／または改変状態が、化合物への曝露の結果として変調されたタンパク質は、化合物の標的および／または薬物送達のための標的であることについての候補である。本発明の方法を用いて同定された化合物は、よって、癌の生物学、例えば転移および／または転移する傾向を有する細胞の生存もしくは増殖において重要な役割を有する遺伝子および遺伝子産物を同定するためのプローブとして有用である。このような遺伝子および遺伝子産物は、限定することなく、転移細胞および／もしくは転移する傾向を有する細胞の成長ならびに／または増殖を選択的に阻害するさらなる作用物質を同定する目的のための薬物発見の標的として有用である。
【００７０】
その他の実施形態において、スクリーニングを行って、その阻害が、例えばｍｉＲ−３１発現が低減していないかまたは不在でない細胞（例えば遺伝子的に一致する細胞）と比較して、ｍｉＲ−３１発現が低減しているかもしくは存在しない細胞、例えば癌細胞の生存または増殖の変更、例えば低下をもたらす（または任意のその他の関連する特徴、例えば浸潤能力のような転移と関連する特徴の変更をもたらす）遺伝子を同定する。スクリーニングは、例えばｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡライブラリーを用いて行ってよい。このような遺伝子、例えばｍｉＲ−３１を用いて生存性の著しい低減、例えば「合成致死性」を示す遺伝子（すなわちｍｉＲ−３１および同定された遺伝子の両方の喪失が、生存性の大きい低減をもたらす）も、薬物送達についての標的である。
【００７１】
上記のように、本方法は、その異常な発現が疾患、例えば癌に寄与するその他のｍｉＲＮＡに対して用いることができる。例えば、本発明は、（ａ）第２細胞と比較してｍｉＲＮＡの発現もしくは活性が低減しているかまたはそれらを欠く第１細胞を提供するステップであって、ｍｉＲＮＡの発現もしくは活性の低減または不在が、腫瘍の発生、進行または転移に寄与するステップと、（ｂ）第１細胞を試験化合物と接触させるステップと、（ｃ）第１細胞の生存または増殖が参照値と比べて低減される場合に、試験化合物を潜在的抗腫瘍化合物として同定するステップとを含む、潜在的抗腫瘍化合物を同定する方法を提供する。参照値は、例えばｍｉＲＮＡの発現もしくは活性が低減していないかまたは不在でない細胞、例えば非腫瘍細胞を用いて得られた値であってよい。別の実施形態において、本発明は、（ａ）第２細胞と比較してｍｉＲＮＡの発現が増加している第１細胞を提供するステップであって、ｍｉＲＮＡの発現もしくは活性の増加が、腫瘍の発生、進行または転移に寄与するステップと、（ｂ）第１細胞を試験化合物と接触させるステップと、（ｃ）第１細胞の生存または増殖が参照値と比べて低減される場合に、試験化合物を潜在的抗腫瘍化合物として同定するステップとを含む、潜在的抗腫瘍化合物を同定する方法を提供する。参照値は、例えばｍｉＲＮＡの発現もしくは活性が増加していない細胞、例えば非腫瘍細胞を用いて得られる値であってよい。
【００７２】
Ｖ．細胞に基づくモデル、動物モデルおよびそれらの使用
上で論じたように、本発明は、ｍｉＲ−３１発現および／または活性が変更される（例えば増加または減少する）ように遺伝子改変された細胞、例えば癌細胞を提供する。このような細胞（例えばセクションＩＶおよび／または実施例に記載される任意の細胞）は、薬物送達および／もしくは特徴決定に加えてまたはその代わりに多様な目的のために用いることができる。例えば、このような細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ前臨床毒性研究において用いて、例えば（例えば癌以外の疾患のための）潜在的治療薬剤が転移を促進するかどうかを試験できる。ｉｎ  ｖｉｖｏ研究は、典型的には、細胞を非ヒト動物に導入することを含むであろう。このような細胞は、食品の成分もしくは添加物、農薬またはヒトが接触することがある任意の作用物質のような作用物質のｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ毒性研究において用いて、例えばこのような作用物質が転移を促進（または阻害）するかどうかを試験できる。このような細胞は、転移に対する放射線照射、食餌もしくは任意の目的のパラメータのような条件または治療の影響を評価するために用いることもできる。いくつかの実施形態において、このような細胞は、転移に対する免疫系の状態および／または免疫系調節剤（例えば「癌ワクチン」）の影響を評価するために用いる。別の態様において、このような細胞は、転移に関与する事象についてのさらなる理解を深めることを目的とする研究において用いることができる。例えば、このような細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏモデルにおいて用いて、細胞浸潤、運動性などを研究できる。
【００７３】
本発明は、動物の少なくともいくつかの細胞において、例えば動物の全てもしくは実質的に全ての細胞において、ｍｉＲ−３１遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子が無能もしくは欠失されたか、またはｍｉＲ−３１活性が少なくとも２０％安定的に阻害されている工学的に遺伝子改変された非ヒト動物を提供する。本発明の目的のために、このような動物を、「ｍｉＲ−３１欠損動物」とよぶ。いくつかの実施形態において、ｍｉＲ−３１遺伝子は、例えばｍｉＲ−３１の発現を低減し、かつ／またはｍｉＲ−３１配列を変更することによりｍｉＲ−３１活性が少なくとも２０％低減されるような方法でそれが変更される場合に、「無能にされている」とみなされる。いくつかの実施形態において、無能にされたｍｉＲ−３１遺伝子は、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％またはそれより多いｍｉＲ−３１活性の低減をもたらす。いくつかの実施形態において、ｍｉＲ−３１活性は、約１．５〜約２０の係数で低減される。いくつかの実施形態において、ｍｉＲ−３１遺伝子の両方の対立遺伝子が、動物の少なくともいくつかの細胞において、例えば動物の全てもしくは実質的に全ての細胞において、無能または欠失される。いくつかの実施形態において、ｍｉＲ−３１活性は、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％またはそれより多く安定的に阻害される。いくつかの実施形態において、ｍｉＲ−３１活性は、約１．５〜約２０の係数で低減される。いくつかの実施形態において、乳房細胞、例えば乳房上皮細胞において、ｍｉＲ−３１遺伝子が無能もしくは欠失されるか、またはｍｉＲ−３１活性が安定的に阻害される。いくつかの実施形態において、動物がの少なくともいくつか（例えば全てまたは実質的に全て）の細胞は、１または複数のｍｉＲ−３１結合部位を含む核酸をコードする導入遺伝子を含有して、ｍｉＲ−３１標的遺伝子のｍｉＲ−３１阻害の低減をもたらす。いくつかの実施形態において、導入遺伝子は、調節可能な発現制御要素（複数可）例えば調節可能なプロモーター、例えば誘導性プロモーターを含む。いくつかの実施形態において、導入遺伝子は、組織特異的発現制御要素（複数可）、例えば組織の部分集合、例えば乳房上皮細胞において主にまたは独占的に活性であるプロモーターを含む。いくつかの実施形態において、プロモーターは、ＭＭＴＶプロモーターまたは乳清酸性タンパク質（ＷＡＰ）プロモーターである。いくつかの実施形態において、欠失または変更を、発生の後胚期もしくは出生後段階でおよび／またはあるいくつかの組織もしくは細胞タイプにおいて誘導できる。例えば、ｍｉＲ−３１遺伝子は、遺伝子の少なくとも一部が、特定の細胞もしくは組織でおよび／または発生の特定の段階にて発現あるいは誘導され得るリコンビナーゼの部位で挟まれているバージョンで置き換えることができる。例えば、Ｆｒｔ−Ｆｌｐ系のＣｒｅ−Ｌｏｘを用いることができる、例えば、Ｗａｎｇ，  Ｘ．、Ｃｒｅ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｏｕｓｅ  ｌｉｎｅｓ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．、５６１巻：２６５〜７３頁、２００９年を参照されたい。いくつかの実施形態において、ｍｉＲ−���１欠損動物は、動物が腫瘍、例えば乳癌を発生する可能性を増加させる１または複数の天然または工学的に遺伝子改変された変異もしくは改変を有する。本発明は、当該技術において公知の乳癌についての任意の動物モデルにおいてｍｉＲ−３１を欠失または無能にすることを意図する。このような動物は、本発明の態様である。これらは、例えばｍｉＲ−３１欠損動物、例えば癌になりやすいことが公知ではないｍｉＲ−３１欠損動物を、上記のもののような癌になりやすい動物に育種すること、またはこのような動物を遺伝子改変することにより得てよい。いくつかの実施形態において、動物は、無能もしくは欠失されたｍｉＲ−３１遺伝子および／または動物を癌になりやすくする遺伝子変更についてヘテロ接合性である。いくつかの実施形態において、動物は、無能もしくは欠失されたｍｉＲ−３１遺伝子および／または動物を癌になりやすくする遺伝子変更についてホモ接合性である。本発明は、当該技術において公知の乳癌についての任意の動物モデルにおいてｍｉＲ−３１を欠失または無能にすることを意図する。いくつかの実施形態において、非ヒト動物は、対照動物、例えばｍｉＲ−３１の発現もしくはｍｉＲ−３１の活性が低減しているかまたはそれらを欠くように工学的に遺伝子改変されていない、その他の点では遺伝子的に同一の動物と比較して腫瘍の転移についての傾向の増加を示す。例えば、動物は、対照動物と比較して、平均してより多くの転移を発生し、かつ／またはより短い潜伏期でそれらを発生する。
【００７４】
非ヒト動物は、例えば抗悪性腫瘍化合物、腫瘍診断物理療法、例えばイメージング技術および試薬などを試験するかまたは特徴決定するための動物モデルとして用いてよい。非ヒト動物は、例えば潜在的治療薬剤（例えば癌以外の疾患のため）が転移を促進するかどうかを試験するためのｉｎ  ｖｉｖｏ前臨床毒性研究のために用いてよい。このような動物は、食品の成分もしくは添加物、農薬またはヒトが接触することがある任意の作用物質のような作用物質のｉｎ  ｖｉｖｏ毒性研究において用いて、例えばこのような作用物質が転移を促進（または阻害）するかどうかを試験し、かつ／または転移に対する放射線照射、食餌もしく任意の目的のパラメータのような条件または治療の影響を評価できる。いくつかの実施形態において、このような動物は、転移に対する免疫系の状態および／または免疫系調節剤（例えば「癌ワクチン」）の影響を評価するために用いられる。その他の態様において、このような動物は、転移に関与する事象についてのさらなる理解を深めることを目的とする研究において用いることができる。いくつかの実施形態において、化合物は、それらが転移を促進するかどうかを決定するために試験される。例えば、試験化合物を動物に投与して、例えばｉｎ  ｖｉｖｏイメージング、例えば生物発光イメージングを用いて転移の出現を決定してよい。ｍｉＲ−３１欠損非ヒト動物を用いて例えば転移に対する影響に関して化合物を試験または特徴決定する方法は、本発明の態様である。例えば転移を検出および／または定量するそれらの能力に関して腫瘍診断物理療法を試験または特徴決定する方法は、本発明の態様である。
【００７５】
ＶＩ．治療への応用
本発明は、癌に罹患しているかまたは癌もしくは癌再発の危険性がある被験体を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態において、癌は、乳癌である。癌の危険性がある被験体は、例えば、癌と診断されていないが、同じ性別の年齢一致対照と比較して癌を発生する危険性が増加している被験体であってよい。例えば、被験体は、年齢および性別一致対照のものの少なくとも１．２倍の危険性を有してよい。被験体が癌の「危険性がある」とみなされるかどうかを決定することは、被験体を手当する熟練した医師の自由裁量の範囲内であり得る。任意の適切な診断試験（複数可）および／または基準を用いることができる。例えば、被験体は、（ｉ）被験体が、変異もしくは遺伝子多型を有さない一般的な集団のその他のメンバーと比べて癌を発生するかまたは癌である危険性の増加と関連する変異、遺伝子多型、遺伝子もしくはタンパク質発現プロファイルおよび／または血液中の特定の物質の存在を有するか、（ｉｉ）被験体が、癌の家族歴を有する、発癌物質または癌促進性作用物質もしくは条件、例えばアスベスト、喫煙、アフラトキシン、放射線照射、慢性の感染／炎症などに曝露されている、高齢のような１または複数の危険因子を有するか、（ｉｉｉ）被験体が、１または複数の癌の症状を有するなどの場合に、癌を発生する「危険性がある」とみなされることがある。本明細書で用いる場合、治療または治療するとは、癌の改善、治癒および／または治癒の維持（すなわち再発の防止または遅延）を含み得る。障害後の治療は、障害および／もしくはそれに関連する症状の少なくともいくらかを低減、改善または完全に排除すること、それがより重症になることを妨げること、進行速度を遅くすること、または障害が最初に一旦排除されたらそれが再発することを妨げることを目的として開始された。治療は、予防的であり得、例えば癌と診断されていない被験体、例えば癌を発生する危険性が著しい被験体に施与できる。癌再発の危険性がある被験体は、癌と診断され、癌がほとんどまたは完全に根絶されたとみられるように治療されている。いくつかの実施形態において、本発明の治療方法は、癌、例えば乳癌の治療を必要とする被験体を準備するステップを含む。いくつかの実施形態において、本発明の治療方法は、癌、例えば乳癌の治療を必要とする被験体を診断するステップを含む。
【００７６】
いくつかの態様において、本発明は、転移を阻害する方法を提供する（例えば、被験体が明らかな転移を（例えば診断の５または１０年後のような規定された期間内に）発生する可能性を低減させ、かつ／または成長を遅くし、かつ／または転移の平均数を低減させる）。乳癌は、上記の種々の実施形態に記載される任意の臨床病理学的および／または分子的特徴を有し得る。いくつかの実施形態において、方法は、本明細書のセクションＩＶに記載されるようにして同定された化合物を、癌、例えば乳癌に罹患しているかまたはその危険性がある被験体に投与するステップを含む。いくつかの実施形態において、方法は、少なくともいくらかの目的細胞におけるｍｉＲ−３１活性またはｍｉＲ−３１様活性を機能的に増加させるステップを含む。いくつかの実施形態において、目的の細胞は、同じ細胞タイプの正常細胞と比較して（例えば癌細胞がそこから生じた細胞と比較して）ｍｉＲ−３１の発現が低減しているかまたはそれらを欠く細胞、例えば癌細胞を含む。いくつかの実施形態において、ｍｉＲ−３１の発現が低減しているかまたはそれらを欠く細胞は、乳癌上皮細胞を含む。（方法が、目的細胞でない少なくともいくらかの細胞におけるｍｉＲ−３１活性またはｍｉＲ−３１様活性の増加ももたらし得ることが理解されよう。）「ｍｉＲ−３１様活性」は、少なくともいくらかのｍｉＲ−３１標的遺伝子またはそれによりコードされるタンパク質、例えば少なくとも２、３、４もしくはそれより多くのｍｉＲ−３１標的遺伝子またはそれによりコードされるタンパク質の発現あるいは活性を抑制（阻害、低減）する能力のことをいう。いくつかの実施形態において、ｍｉＲ−３１標的遺伝子は、以下の遺伝子の少なくとも２つを含む：インテグリン−α５（ＩＴＧＡ５）、ラディキシン（ＲＤＸ）およびＲｈｏＡ。いくつかの実施形態において、ｍｉＲ−３１標的遺伝子は、これらの遺伝子の３つ全てを含む。いくつかの実施形態において、方法は、少なくともいくつかの目的細胞におけるｍｉＲ−３１のレベルを増加させるステップを含む。例えば、ｍｉＲ−３１またはｍｉＲ−３１前駆体（例えばプリｍｉＲ−３１またはプレｍｉＲ−３１）の配列を有する核酸を投与できる。いくつかの実施形態において、ｍｉＲ−３１前駆体をコードするベクターを全身的または局所的に投与する。例えば、ｍｉＲ−３１の発現を、ＡＡＶベクターのようなウイルスベクターを用いて再確立してよい（例えばＫｏｔａ，  Ｊ．ら、Ｃｅｌｌ．、１３７巻（６号）：１００５〜１７頁、２００９年を参照されたい）。
【００７７】
本発明のある態様は、３つの遺伝子、すなわちＩＴＧＡ５、ＲＤＸおよびＲｈｏＡの抑制が、乳癌細胞におけるｍｉＲ−３１の転移抑制活性の根拠になり得るという認識である。理論と結び付けられることを望まないが、これらの遺伝子もしくはそれらのコードされるタンパク質の少なくとも２つの同時の阻害／拮抗は、転移を阻害するために特に有益であり得る。本発明は、よって、最少で２つのｍｉＲ−３１標的遺伝子もしくはそれらのコードされるタンパク質の発現または活性を阻害するステップを含み、遺伝子がＩＴＧＡ５、ＲＤＸおよびＲｈｏＡから選択される癌、例えば乳癌に罹患しているかまたはその危険性がある被験体を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態において、方法は、これらの遺伝子もしくはそれらのコードされるタンパク質の３つ全ての発現または活性を阻害するステップを含む。ＩＴＧＡ５、ＲＤＸおよび／またはＲｈｏＡを阻害するために任意の適切な方法、例えばＲＮＡサイレンシングに基づくアプローチ、小分子、抗体、ドミナントネガティブアプローチなどを用いてよい。例えば、ＲｈｏＡは、小分子（例えばスタチン）を用いて阻害してよく、ＲＤＸは、ｓｉＲＮＡを用いて阻害してよく、ＩＴＧＡ５は、モノクローナル抗体またはＪＳＭ６４２７のような小分子を用いて阻害してよい。
【００７８】
本発明は、本明細書のセクションＩＶに記載されるようにして同定された化合物を含む医薬組成物を提供する。本発明は、さらに、ｍｉＲ−３１標的遺伝子の発現または活性を阻害する化合物を含む医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、第１のｍｉＲ−３１標的遺伝子もしくはそれによりコードされるタンパク質の発現または活性を阻害する第１化合物と、第２のｍｉＲ−３１標的遺伝子もしくはそれによりコードされるタンパク質の発現または活性を阻害する第２化合物とを含む。医薬組成物は、多様な医薬的に許容され得る担体を含んでよい。
【００７９】
化合物は、有効量で送達でき、これは、目的の生物学的応答、例えば遺伝子発現もしくはタンパク質活性をある量低減すること、疾患もしくは状態の１または複数の症状もしくは発現を低減すること、例えば転移の可能性を低減することを達成するために十分な量を意味する。医薬的に許容され得る担体は、当該技術において周知であり、例えば水、５％ブドウ糖もしくは生理緩衝食塩水のような水溶液、あるいはグリコール類、グリセロール、オリーブ油のような油またはヒトもしくは非ヒト被験体に投与するために適する注射用有機エステル類のようなその他の溶剤または媒体を含む。いくつかの実施形態において、医薬的に許容され得る担体または組成物は、滅菌されている。医薬組成物は、活性物質に加えて、例えば充填剤、増量剤、可溶化剤、安定化剤、浸透圧剤、取り込み促進剤などとして作用する生理的に許容され得る化合物を含み得る。生理的に許容され得る化合物は、例えばグルコース、スクロース、ラクトースのような炭水化物；デキストラン類；マンニトールのようなポリオール類；アスコルビン酸もしくはグルタチオンのような抗酸化剤；防腐剤；キレート剤；緩衝剤；またはその他の安定化剤もしくは賦形剤を含む。医薬的に許容され得る担体（複数可）および／または生理的に許容され得る化合物（複数可）の選択は、例えば活性物質の性質、例えば組成物の溶解性、適合性（通常の使用状況の下で医薬組成物の医薬的な効力を実質的に低減する様式で相互作用することなく組成物中に物質が一緒に存在できることを意味する）、および／または投与経路に依存し得る。医薬組成物は、液剤、ゲル剤、ローション剤、錠剤、カプセル剤、軟膏剤、経皮パッチなどの形態であり得る。医薬組成物は、例えば非経口投与を含む種々の経路により被験体に投与できる。例示的な投与経路は、静脈内投与、呼吸器投与（例えば吸入により）、鼻投与、腹腔内投与、経口投与、皮下投与および局所投与を含む。経口投与のために、化合物は、医薬的に許容され得る担体とともに、錠剤、丸剤、糖衣剤、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー、懸濁剤などに処方できる。いくつかの実施形態において、化合物は、組織、例えば癌細胞が存在するかもしくは存在する可能性があるか、または癌が生じる可能性がある組織に直接投与してよい。直接投与は、例えば注射または組織内に持続放出インプラントを移植することにより達成できる。もちろん、持続放出インプラントは、任意の適切な部位に移植できる。いくつかの実施形態において、持続放出インプラントは、再発癌を発生する危険性がある被験体の予防的治療のために特に適切であり得る。いくつかの実施形態において、持続放出インプラントは、活性物質の治療レベルを少なくとも３０日間、例えば少なくとも６０日間、例えば３カ月、６カ月またはそれより長くまで送達する。当業者は、患者の体重および全身の健康、治療される特定の状態などの因子を考慮して、有効な用量および投与計画を選択するであろう。例示的な用量は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究を用いて選択し、動物モデル、かつ／または当該技術において標準的なヒト臨床試験において試験してよい。
【００８０】
いくつかの実施形態において、医薬組成物は、マイクロ粒子またはナノ粒子またはリポソームまたはその他の送達媒体もしくはマトリクスにより送達される。薬物送達目的のために有用ないくつかの生体適合性の合成または天然のポリマー材料が、当該技術において公知である。それらの例は、ポリラクチド−ｃｏ−グリコリド、ポリカプロラクトン、ポリ無水物、セルロース誘導体およびそれらのコポリマーまたはブレンドを含む。例えばリン脂質またはその他の脂質からなるリポソームは、作製および投与が比較的単純な、非毒性で生理的に許容され得る代謝可能な担体である。
【００８１】
いくつかの実施形態において、本発明の化合物は、１または複数のその他の抗腫瘍薬と共投与される。このような薬剤は、化学療法剤、ホルモン剤、抗ＨＥＲ２抗体などであってよい。薬剤は、同じ組成物または別々の組成物で投与してよい。
【００８２】
ＶＩＩ．ｍｉＲＮＡ発現を阻害するための組成物および方法
本発明は、細胞または被験体、例えば動物においてマイクロＲＮＡ発現を阻害することに関する組成物および方法を提供する。あるいくつかの実施形態において、本発明は、マイクロＲＮＡスポンジ技術の改良を提供する。本発明は、ヒトまたはげっ歯類の細胞のような哺乳類細胞におけるｍｉＲＮＡの活性を阻害する方法であって、細胞においてｍｉＲＮＡのための複数の結合部位を含むかまたはコードする核酸を安定的に発現させるステップを含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、核酸は、ゲノムに組み込まれる。いくつかの実施形態において、核酸は、ウイルスベクター、例えばレトロウイルスベクター、例えばレンチウイルスベクターを用いて発現される。いくつかの実施形態において、ベクターは、ｐＢＡＢＥベクターである。いくつかの実施形態において、ｍｉＲＮＡのための少なくとも５つの結合部位、例えば５〜１０の部位、例えば２０、５０またはそれより多くまでの部位が提供される。結合部位は、同じ配列を有してよいか、または異なる配列を有する部位を含み得る。いくつかの実施形態において、細胞は、培養される。いくつかの実施形態において、細胞は、多細胞生物、例えばヒトまたはげっ歯類の部分である。いくつかの実施形態において、本発明のｍｉＲＮＡスポンジは、ｍｉＲＮＡの機能（例えば標的遺伝子の発現を阻害するｍｉＲＮＡの能力により評価される）を、２〜１０倍、例えば約２．５倍または約５倍安定的に低減する。いくつかの実施形態において、ｍｉＲＮＡは、その発現または過剰発現が、ヒト疾患、例えば癌において原因因子または寄与因子であると関連付けられており、ｍｉＲＮＡの阻害が疾患を治療するために有用であり得るものである。本発明は、さらに、目的のｍｉＲＮＡについての複数の結合部位をある位置に挿入でき、そのことにより、哺乳類細胞における安定的発現のための適切な発現制御要素と機能的に連結されるベクター、例えばレトロウイルスベクターを提供する。本発明のベクターは、研究または治療の目的のために用いることができる。いくつかの実施形態において、ベクターは、キットとして提供される。
【実施例】
【００８３】
（実施例１）
ｍｉＲ−３１発現は、転移性乳癌細胞株において特異的に減弱化される
注：実施例１〜９においてＳ３、Ｓ６、Ｓ７、Ｓ１０、Ｓ１１、Ｓ１２、Ｓ１３、Ｓ１４、Ｓ１５およびＳ１７と言及される図面は、Ｖａｌａｓｔｙａｎ，  Ｓ．ら、Ａ  ｐｌｅｉｏｔｒｏｐｉｃａｌｌｙ  ａｃｔｉｎｇ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ，  ｍｉＲ−３１，  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ、Ｃｅｌｌ、１３７巻（６号）：１０３２〜４６頁（Ｖａｌａｓｔｙａｎ、２００９年）および本出願が優先権を主張する米国特許出願第６１／１２０，３２２号で見出される。
【００８４】
乳癌転移を調節するｍｉＲＮＡを同定するために、本発明者らは、さらなる特徴決定のための１０の癌関連ｍｉＲＮＡを、臨床的乳腺腫瘍の発現プロファイリングの研究（Ｉｏｒｉｏら、２００５年；Ｖｏｌｉｎｉａら、２００６年）と、ヒト乳癌におけるｍｉＲＮＡコピー数変動の全体的分析（Ｚｈａｎｇら、２００６年）と、染色体異常の癌関連部位へのｍｉＲＮＡ遺伝子座の局在化（Ｃａｌｉｎら、２００４年）との間で調和したそれらの同定により選択した（表１）。これらの研究は、転移状態に基づいて患者を階層分けしていなかった。
【００８５】
【表１】
2014221834.tif 000003
ａ下方制御、上方制御および変化なしとは、正常乳腺組織と比べた原発ヒト乳腺腫瘍検体における、記載されるｍｉＲＮＡの発現のことである。
【００８６】
１０の候補ｍｉＲＮＡの発現を、１５のヒトおよびマウス乳腺細胞株においてアッセイしたが、これらは、正常上皮細胞、腫瘍原性であるが非転移性細胞、および転移性腫瘍細胞を含んでいた（表２）。１つのｍｉＲＮＡ、ｍｉＲ−３１のレベルが、初代正常ヒト乳腺上皮細胞（ＨＭＥＣ）と比較した場合に攻撃性ヒト乳癌細胞において特異的に減弱化されていた。非転移性腫瘍細胞（ＨＭＬＥＲ、ＭＣＦ７−ＲａｓおよびＳＵＭ−１４９）は４倍低減されたｍｉＲ−３１を示したが、転移性ＳＵＭ−１５９およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞におけるこのｍｉＲＮＡの発現は、１００倍を超えて減少した（図１Ａ）。
【００８７】
【表２】
2014221834.tif 000004
ａ免疫不全宿主マウス（ヒト細胞株）または同質遺伝子背景（マウス細胞株）への同所性移植の場合。
【００８８】
正常マウス乳腺（ＮＭｕＭＧ）細胞におけるそれらの発現と比べて、単一のマウス乳腺腫瘍に由来する亜系統におけるｍｉＲ−３１のレベルは、転移するそれらの能力を反映した：ｍｉＲ−３１は、転移性Ｄ２．１およびＤ２Ａ１細胞において２倍低減されたが、非攻撃性Ｄ２．ＯＲ細胞においてはそうでなかった（図１Ｂ）。ｍｉＲ−３１レベルは、単一の自然発症腫瘍に由来する４つのマウス乳癌亜系統における転移能力とも逆の相関があった：非攻撃性６７ＮＲ細胞におけるｍｉＲ−３１レベルは、ＮＭｕＭＧにおけるものと同様であったが、ｍｉＲ−３１発現は、局所的に浸潤し（１６８ＦＡＲＮ）、微小転移を形成し（４ＴＯ７）、巨視的な転移を生じる（４Ｔ１）能力の獲得とともに漸進的に減少した（図１Ｂ）。よって、ｍｉＲ−３１レベルは、攻撃性乳癌細胞において特異的に減弱化される。
【００８９】
ｍｉＲ−３１発現は、４Ｔ１細胞原発乳腺腫瘍において不均質であった。特に、ｍｉＲ−３１を発現する細胞の割合は、肺転移において、それらが由来する原発腫瘍におけるｍｉＲ−３１陽性細胞の画分と比べて１０倍低減していた（図１Ｃ）。また、４Ｔ１細胞乳腺腫瘍の浸潤先進部付近にあるｍｉＲ−３１を発現する細胞は、これらの腫瘍の内部にある細胞と比較して、５倍少なかった（図１Ｄ）。これらのデータにより、選択圧が、転移の進行の経過中にうまく転移した細胞のプール内でのｍｉＲ−３１発現細胞の普及を減少させる可能性が高まる。
【００９０】
（実施例２）
ｍｉＲ−３１発現は、転移関連形質をｉｎ  ｖｉｔｒｏで抑制する
実施例１に記載するｍｉＲ−３１レベルと悪性表現型との逆の相関関係に鑑みて、本発明者らは、ｍｉＲ−３１についての転移抑制性の役割の潜在性を評価した。つまり、本発明者らは、ｍｉＲ−３１を転移性ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳癌細胞（「２３１細胞」）にクローニングして安定的に発現させた。この過剰発現により、ｍｉＲ−３１レベルが、ＨＭＥＣにおけるものと同等になった（図８Ａ）。
【００９１】
異所性ｍｉＲ−３１は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖に影響しなかったが、浸潤を２０倍、そして運動性を１０倍低減した（図２Ａおよび８Ｂ〜８Ｃ）。これらの効果は、ｍｉＲ−３１の生物活性に特異的に起因した。なぜなら、対照ｍｉＲＮＡであるｍｉＲ−１４５の等価な過剰発現は、浸潤または運動性に影響できなかったからである（図２Ａ、およびデータは示さず）。また、ｍｉＲ−３１発現細胞は、アノイキス媒介細胞死に対して６０％減少した耐性を示した（図２Ｂ）。
【００９２】
これらの欠損は、異所性ｍｉＲ−３１によりもたらされる毒性に起因し得なかった（図Ｓ１Ｄ）。ｍｉＲ−３１発現の結果は、２３１細胞に独特でなかった：ｍｉＲ−３１は、攻撃性ＳＵＭ−１５９ヒト乳癌細胞において、浸潤、運動性およびアノイキス耐性を低減したが、それでも増殖に影響しなかった（図９）。よって、ｍｉＲ−３１は、転移能力のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの代替を損なう。
【００９３】
（実施例３）
ｍｉＲ−３１発現は、ｉｎ  ｖｉｖｏで転移を抑制する
高いグレードの悪性と関連するｉｎ  ｖｉｔｒｏ形質に対するその影響により、本発明者らは、異所性ｍｉＲ−３１がその他の点では攻撃性の細胞における転移を阻害できるかという疑問を持った。よって、ｍｉＲ−３１を発現する２３１細胞を、マウスの同所性の部位、すなわち乳腺脂肪パッドに注射した。予期せぬことに、ｍｉＲ−３１は、原発腫瘍成長を１．５倍増進し、それに対応して細胞増殖を増加させた（図２ＣおよびＳ３Ａ）。対照２３１細胞原発腫瘍は、局所浸潤の証拠を示した。しかし、ｍｉＲ−３１発現腫瘍は、うまく被包され、非浸潤性であった（図２Ｄおよび２Ｅ）。これらの変化は、新血管新生の変更を伴わなかった（図Ｓ３Ｂ）。
【００９４】
より大きい原発腫瘍を生じるそれらの能力にもかかわらず、ｍｉＲ−３１を発現する２３１細胞は、肺転移の種をまくそれらの能力が著しく損なわれた。ｍｉＲ−３１発現細胞は、移植の６２日後に対照が行ったよりも９５％少ない病変を形成した（図２Ｆ）。つまり、ｍｉＲ−３１は、表面上は、少なくとも部分的には局所浸潤を妨害するその能力により、同所性部位からの転移を抑制する。
【００９５】
本発明者らは、これらのパラメータに対するｍｉＲ−３１の影響が本発明者らの２３１細胞におけるクローンの変動に起因する可能性について、ｍｉＲ−３１を親の２３１細胞から単離した単細胞由来集団において発現させることにより対処した（図１０Ａ）（Ｍｉｎｎら、２００５年）。以前と同様に、同所的に注射した場合に、ｍｉＲ−３１発現細胞は大きく、うまく被包された原発腫瘍を形成し、肺転移も５倍低減した（図１０Ｂ〜１０Ｄ）。ｍｉＲ−３１を発現するＳＵＭ−１５９細胞の同所性注射は、本発明者らの初期の研究結果をさらに支持した：ｍｉＲ−３１は原発腫瘍成長を増進したが、ｍｉＲ−３１発現腫瘍は、対照腫瘍よりも良好に限局されていた（図１１）。これらの観察結果は、より大きく、浸潤性がより低い原発腫瘍を形成し、かつより少ない転移の種をまくｍｉＲ−３１発現細胞の能力が、ｍｉＲ−３１の生物活性の特異的結果であることを示した。
【００９６】
本発明者らは、転移に対するｍｉＲ−３１の影響も、局所浸潤に対するその影響とは独立して、浸潤−転移カスケードのより後のステップに対する影響に起因するかどうかを決定した。つまり、本発明者らは、ｍｉＲ−３１発現２３１細胞をマウスの循環に直接注射することにより、局所浸潤および血管内異物侵入の最初のステップを回避した。１日後に、ｍｉＲ−３１発現細胞は、肺において存続するそれらの能力を４倍損なった（図２Ｇ）。この違いは、ｍｉＲ−３１発現細胞が肺の微小脈管構造において最初にとどまるようになることができないことの結果によるのではなかった。なぜなら、同数のｍｉＲ−３１発現細胞と対照細胞が、注射の１０分後および２時間後に肺において検出されたからである（図２ＧおよびＳ６Ａ）。これらの観察結果は、ｍｉＲ−３１が、管腔内生存性、血管外遊走および／または肺実質における最初の生存のような初期の血管内異物侵入後事象を調節することを示唆した。
【００９７】
尾静脈注射の３カ月後に、ｍｉＲ−３１発現２３１細胞は、対照が生じたよりも４０倍少ない肺転移を生じた（図２Ｇ）。本発明者らは、最終的に形成された病変のサイズに対する劇的な影響も観察した：３カ月後に、ｍｉＲ−３１発現細胞は、小さい微小転移のみを生じたが、対照細胞は巨視的な転移を形成した。このことは、ｍｉＲ−３１発現細胞および対照細胞が、注射の１カ月後に同等のサイズの微小転移を確立したにもかかわらず発生した（図２ＧおよびＳ６Ｂ）。病変サイズに対するこのような効果は、ｍｉＲ−３１が、局所浸潤および初期の血管内異物侵入後事象に対するその影響に加えて、転移定着にも影響することを意味した。
【００９８】
（実施例４）
ｍｉＲ−３１の阻害は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで転移関連形質を促進する
上記の実施例に記載した観察結果は、ｍｉＲ−３１発現が、高いグレードの悪性度に関連する属性を転移細胞から奪うことを示した。本発明者らは、次に、ｍｉＲ−３１が、その他の点では非転移性のヒト乳癌細胞により攻撃性の形質の獲得を妨げるかという疑問を持った。これを行うために、本発明者らは、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｍｉＲＮＡスポンジのいずれかを用いて、非浸潤性ＭＣＦ７−Ｒａｓ細胞においてｍｉＲ−３１を一過的に阻害した。ｍｉＲＮＡスポンジは、その３’ＵＴＲに、ｍｉＲＮＡと結合し、よってそれを力価決定するｍｉＲＮＡ認識モチーフを有する発現構築物である（Ｅｂｅｒｔら、２００７年）。両方のアプローチは、ｍｉＲ−３１機能を＞４．５倍阻害した（図Ｓ７Ａ）。ｍｉＲ−３１の抑制は、浸潤を２０倍、そして運動性を５倍増進したが、細胞生存性はいずれの阻害因子によっても影響されなかった（図３ＡおよびＳ７Ｂ）。
【００９９】
安定的なｍｉＲＮＡの阻害のための技術は、利用可能でなかった（Ｋｒｕｔｚｆｅｌｄｔら、２００６年）。この問題に対処するために、本発明者らは、一過的に発現されたｍｉＲＮＡスポンジに由来する要素を改変し、それらをレトロウイルスベクターにクローニングし、改変ｍｉＲＮＡスポンジを安定的に発現するＭＣＦ７−Ｒａｓ細胞を創出した。ｍｉＲ−３１スポンジは、ｍｉＲ−３１機能を２．５倍低減したが、その他の公知の転移抑制性ｍｉＲＮＡの活性には影響しなかった（図１２Ａおよび１２Ｂ）。安定的なスポンジ発現により与えられたｍｉＲ−３１の比較的穏やかな抑制は、強い応答を惹起した：浸潤は１２倍、運動性は８倍、そしてアノイキス耐性は２．５倍増進された（図３Ｂおよび１２Ｃ）。ｍｉＲ−３１スポンジは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖を変更できなかった（図１２Ｄ）。
【０１００】
不死化ＨＭＥＣまたは腫瘍原性であるが非転移性のＳＵＭ−１４９ヒト乳癌細胞で安定的に発現させた場合に、ｍｉＲ−３１スポンジは、浸潤、運動性およびアノイキス耐性の増加を、増殖に影響することなく惹起した（図１３、およびデータは示さず）。これらのデータはまとめて、持続性ｍｉＲ−３１活性が、腫瘍細胞および変換していない乳房上皮細胞の両方による攻撃性の形質の獲得を妨げるために必要であることを示した。
【０１０１】
（実施例５）
ｍｉＲ−３１の阻害は、ｉｎ  ｖｉｖｏで転移を促進する
本発明者らは、ｍｉＲＮＡを安定的に阻害する本発明者らの能力を、ｍｉＲ−３１活性がｉｎ  ｖｉｖｏで転移を妨げるために必要であるかどうかを評価するために利用した。これを行うために、ｍｉＲ−３１スポンジを安定的に発現する、その他の点では非転移性のＭＣＦ７−Ｒａｓ細胞を、マウスに同所性移植した。ｍｉＲ−３１の阻害は、ｉｎ  ｖｉｖｏ増殖および原発腫瘍成長を変更できなかった（図３ＣおよびＳ１０Ａ）。ｍｉＲ−３１スポンジ発現細胞に由来する原発腫瘍は、ほとんど被包されず局所的に浸潤性であったが、対照ＭＣＦ７−Ｒａｓ腫瘍は、良好に限局され、非浸潤性であるとみられた（図３Ｄおよび３Ｅ）。ここでもまた、新血管新生は異ならなかった（図Ｓ１０Ｂ）。
【０１０２】
ｍｉＲ−３１スポンジ発現ＭＣＦ７−Ｒａｓ細胞は、著しい数で肺に著しく転移したが、対照腫瘍を有する宿主の肺には、ほとんど腫瘍細胞がなかった。損なわれたｍｉＲ−３１活性を有する細胞は、対照よりも１０倍多い病変を形成した（図３Ｆ）。よって、連続的なｍｉＲ−３１機能が、同所性部位からの転移を妨げるために必要である。
【０１０３】
本発明者らは、ｍｉＲ−３１活性の喪失も、局所浸潤の後の浸潤−転移カスケードのステップに介在することにより転移を促進するかという疑問を持った。よって、本発明者らは、ｍｉＲ−３１スポンジ発現ＭＣＦ７−Ｒａｓ細胞をマウスに静脈内注射した。１日以内に、ｍｉＲ−３１阻害は、肺における細胞数を６倍増進した。同様に、注射後からさらに後で、ｍｉＲ−３１スポンジ発現細胞は、対照よりも、肺において１０倍多く普及していた（図３Ｇ）。対照細胞とｍｉＲ−３１スポンジ発現細胞との転移能力の違いは、肺の脈管構造に対照細胞が最初にとどまることができないことにより生じるのではなかった。なぜなら、各コホートからの同数の細胞が、注射の１０分後に存在していたからである（図３ＧおよびＳ１１）。
【０１０４】
ｍｉＲ−３１の抑制は、尾静脈注射の４カ月後の病変サイズにも影響した：対照細胞は小さい微小転移のみを形成したが、ｍｉＲ−３１スポンジ発現細胞は、巨視的な転移を生成した（図３Ｇ）。これらのデータはまとめて、ｍｉＲ−３１が局所浸潤、初期の血管内異物侵入後事象および転移定着に影響することを示すことにより、本発明者らの異所性発現研究を拡張して強化した。
【０１０５】
（実施例６）
ｍｉＲ−３１は、転移促進性遺伝子のコホートを直接調節する
浸潤−転移カスケードの複数のステップを妨害するｍｉＲ−３１の能力は、転移散在の多様な局面に関与する遺伝子を多指向的に調節するその能力に由来する場合がある。ｍｉＲ−３１のエフェクターを同定するために、本発明者らは、ｍｉＲＮＡのｍＲＮＡ標的を予測する２つのアルゴリズム、すなわちＰｉｃＴａｒ（Ｋｒｅｋら、２００５年）およびＴａｒｇｅｔＳｃａｎ（Ｇｒｉｍｓｏｎら、２００７年）を用いた。それらの３’ＵＴＲ中のｍｉＲ−３１部位の提示に基づいて、＞２００のｍＲＮＡがｍｉＲ−３１により調節されると予測された。遺伝子オントロジー（Ａｓｈｂｕｒｎｅｒら、２０００年）により、これらの標的が、細胞接着、細胞骨格リモデリングおよび細胞極性のような運動性に関連するプロセスにおける役割を有するタンパク質をコードする不均衡に多数の遺伝子を含めたことが明らかになった（データは示さず）。
【０１０６】
この遺伝子オントロジー分析に誘導されて、本発明者らは、腫瘍浸潤に関わるいくつかのもの（ＳａｈａｉおよびＭａｒｓｈａｌｌ、２００２年；ＭｃＣｌａｔｃｈｅｙ、２００３年）を含む、これらの大きな比率を占めるカテゴリーからの１６の推定ｍｉＲ−３１標的の３’ＵＴＲを、ルシフェラーゼ構築物にクローニングした。ｍｉＲ−３１発現２３１細胞を用いるレポーターアッセイにより、ｍｉＲ−３１がＵＴＲの６つ：ｆｒｉｚｚｌｅｄ３（Ｆｚｄ３）、インテグリンα５（ＩＴＧＡ５）、ミオシンホスファターゼ−Ｒｈｏ相互作用タンパク質（Ｍ−ＲＩＰ）、マトリクスメタロペプチダーゼ１６（ＭＭＰ１６）、ラディキシン（ＲＤＸ）およびＲｈｏＡを抑制したことが明らかになった（図４Ａ）。これらの６つの３’ＵＴＲにおける推定ｍｉＲ−３１部位（複数可）の変異（表３）は、ｍｉＲ−３１に対する反応性を廃止した（図４Ｂ）。そのＵＴＲが１５２ヌクレオチドにより分けられた２つのｍｉＲ−３１部位を含有するＲｈｏＡの場合、いずれのモチーフの変異も、ｍｉＲ−３１反応性を廃止し（図４Ｂ）、このことは、これらの部位の間の機能的相互作用を示唆している（Ｇｒｉｍｓｏｎら、２００７年）。
【０１０７】
【表３】
2014221834.tif 000005
ａヒトＲｈｏＡ３’ＵＴＲのヌクレオチド１４５〜１５１でのｍｉＲ−３１モチーフ。ｂＲｈｏＡ３’ＵＴＲのヌクレオチド３０３〜３０９にまたがるｍｉＲ−３１モチーフ。太字（およびカラーならば赤色）：変異誘発レポーター構築物中で変更されたヌクレオチド。
【０１０８】
内因性Ｆｚｄ３、ＩＴＧＡ５、ＭＭＰ１６、ＲＤＸおよびＲｈｏＡのタンパク質レベルを、ｍｉＲ−３１発現２３１細胞においてアッセイした。ｍｉＲ−３１は、これらのタンパク質のレベルを４０〜６０％抑制した（図４Ｃ）。Ｍ−ＲＩＰタンパク質のレベルに対するｍｉＲ−３１の影響は、適切な抗体がないことにより評価できなかった。また、ｍｉＲ−３１は、これらの６つの標的の内因性ｍＲＮＡのレベルをＳＵＭ−１５９細胞において２倍低減し、Ｆｚｄ３、ＩＴＧＡ５、ＭＭＰ１６、ＲＤＸおよびＲｈｏＡのｍＲＮＡレベルも２３１細胞において低減した（図４Ｄ）。ｍｉＲ−３１は、このｍｉＲＮＡにより調節されないことが見出された計算的に推測されたｍｉＲ−３１標的であるＣＸＣＬ１２のｍＲＮＡレベルに、いずれの細胞タイプにおいても影響しなかった（図４Ａおよび４Ｄ）。これらのデータは、ｍｉＲ−３１が、内因性Ｆｚｄ３、ＩＴＧＡ５、Ｍ−ＲＩＰ、ＭＭＰ１６、ＲＤＸおよびＲｈｏＡ発現をヒト乳癌細胞において直接調節することを示した。
【０１０９】
本発明者らは、Ｆｚｄ３、ＩＴＧＡ５、Ｍ−ＲＩＰ、ＭＭＰ１６、ＲＤＸおよびＲｈｏＡの同時の抑制が、臨床的乳癌における疾患進行と相関するかを、２９５の原発乳腺腫瘍からの発現プロファイリングデータを調べることにより決定した（表４）（ｖａｎ  ｄｅ
Ｖｉｊｖｅｒら、２００２年）。これを行うために、本発明者らは、これらの６つの遺伝子の協調した示差的発現に基づいてｍｉＲ−３１標的シグネチャーを構築した。このコホート内で、ｍｉＲ−３１標的シグネチャーの高い発現は、シグネチャー陰性腫瘍と比べて、転移および乏しい生存と関連した。標的シグネチャーについて陰性の患者のうちの５年生存率は、９０％であったが、標的シグネチャー陽性患者の＞３５％が、この期間中に疾患に屈した（図５Ａおよび５Ｂ）。よって、Ｆｚｄ３、ＩＴＧＡ５、Ｍ−ＲＩＰ、ＭＭＰ１６、ＲＤＸおよびＲｈｏＡの協調した抑制が、臨床的乳腺腫瘍におけるより好ましい転帰と相関していた。
【０１１０】
【表４】
2014221834.tif 000006
攻撃性表現型に対するこれらのｍｉＲ−３１標的の機能的な寄与を評価するために、本発明者らは、まず、それらの阻害が、２３１細胞の浸潤または運動性に影響するかを調べた。ｓｉＲＮＡの形質移入は、細胞生存性に影響することなく標的タンパク質のレベルを強力に低減した（図Ｓ１２ＡおよびＳ１２Ｂ）。Ｆｚｄ３、ＩＴＧＡ５、ＲＤＸまたはＲｈｏＡを標的にするｓｉＲＮＡは、浸潤性および運動性を低減したが、Ｍ−ＲＩＰまたはＭＭＰ１６に対するｓｉＲＮＡは、これらの形質に影響できなかった（図５ＣおよびＳ１２Ｃ）。
【０１１１】
本発明者らは、これらのエフェクターの阻害が、アノイキスへの耐性を損なうかという疑問を持った。ＩＴＧＡ５、ＲＤＸまたはＲｈｏＡに対するｓｉＲＮＡは、２３１細胞をアノイキスに対して感作した。これとは対照的に、Ｆｚｄ３、Ｍ−ＲＩＰまたはＭＭＰ１６を標的にするｓｉＲＮＡは、アノイキス耐性に対して影響しなかった（図５Ｄ）。よって、Ｆｚｄ３、ＩＴＧＡ５、ＲＤＸまたはＲｈｏＡの抑制は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで転移関連形質を損なった。
【０１１２】
（実施例７）
Ｆｚｄ３、ＩＴＧＡ５、ＲＤＸおよびＲｈｏＡの再発現は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでｍｉＲ−３１依存性転移関連表現型を反転する  ｍｉＲ−３１発現と関連するｉｎ  ｖｉｔｒｏ表現型を、Ｆｚｄ３、ＩＴＧＡ５、Ｍ−ＲＩＰ、ＭＭＰ１６、ＲＤＸまたはＲｈｏＡレベルの回復により反転できるかを決定するために、本発明者らは、ｍｉＲ−３１発現２３１細胞に、それらの３’ＵＴＲの欠失によりｍｉＲＮＡ非感受性にした個別の発現構築物を形質移入した。これは、細胞傷害性でなかった（図Ｓ１３Ａ〜Ｓ１３Ｂ、およびデータは示さず）。ｍｉＲ−３１発現細胞において、Ｆｚｄ３、ＩＴＧＡ５、ＲＤＸまたはＲｈｏＡは、少なくとも部分的に、ｍｉＲ−３１により強制される浸潤および運動性の欠損を反転した。これとは対照的に、Ｍ−ＲＩＰまたはＭＭＰ１６は、これらの形質に対して影響しなかった（図５ＥおよびＳ１３Ｃ）。驚くべきことに、ＲＤＸまたはＲｈｏＡの再発現は、ｍｉＲ−３１により媒介される浸潤および運動性の欠損を完全に救済した。６つの標的の発現は、対照２３１細胞の浸潤または運動性を増進できなかった（図５ＥおよびＳ１３Ｃ）。
【０１１３】
本発明者らは、６つの標的のうちのいずれかの再発現が、アノイキスに対するｍｉＲ−３１の影響を救済するかについて評価した。ＩＴＧＡ５、ＲＤＸまたはＲｈｏＡは、少なくとも部分的に、異所性ｍｉＲ−３１に起因するアノイキス感受性を反転した。これとは対照的に、Ｆｚｄ３、Ｍ−ＲＩＰまたはＭＭＰ１６は、この形質に影響できなかった（図５Ｆ）。実際に、ＩＴＧＡ５またはＲｈｏＡは、ｍｉＲ−３１依存性アノイキス表現型を完全に救済した。６つの標的は、対照２３１細胞におけるアノイキス耐性を増進しなかった（図５Ｆ）。よって、Ｆｚｄ３、ＩＴＧＡ５、ＲＤＸおよびＲｈｏＡは、悪性形質をｉｎ  ｖｉｔｒｏで与えるためのｍｉＲ−３１の機能的に関連するエフェクターである。
【０１１４】
（実施例８）
ＲｈｏＡの再発現は、ｍｉＲ−３１により強制される転移欠損をｉｎ  ｖｉｖｏで部分的に反転する
ＲｈｏＡは、ｍｉＲ−３１により媒介される表現型を最も著しく反転した。よって、本発明者らは、ｍｉＲ−３１または対照ベクターのいずれかに既に感染させた２３１細胞においてｍｉＲＮＡ耐性ＲｈｏＡを安定的に再発現させた（図Ｓ１４ＡおよびＳ１４Ｂ）。ＲｈｏＡは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖に影響しなかったが、ｍｉＲ−３１により強制される浸潤、運動性およびアノイキス耐性の欠損を廃止した（図Ｓ１４Ｃ〜Ｓ１４Ｆ）。
【０１１５】
回復したＲｈｏＡレベルが、ｍｉＲ−３１に起因するｉｎ  ｖｉｖｏ転移表現型を反転するかを確認するために、本発明者らは、ｍｉＲ−３１、ＲｈｏＡおよび対照ベクターの組合せを発現する２３１細胞をマウスに同所的に注射した。以前に観察されたことと同様に、ｍｉＲ−３１は、原発腫瘍成長を増進した（図６Ａ）。ＲｈｏＡは、異所性ｍｉＲ−３１の存在下で原発腫瘍成長を最初は増強したが、対照２３１細胞ではそのようにできなかった（図６Ａ）。本発明者らの初期の研究結果と調和して、対照２３１原発腫瘍は局所的に浸潤性であったが、ｍｉＲ−３１発現腫瘍は非浸潤性であった（図６Ｂおよび６Ｃ）。対照２３１細胞において、異所性ＲｈｏＡは、局所浸潤の程度を悪化させることができなかった。これとは対照的に、ＲｈｏＡは、ｍｉＲ−３１発現腫瘍の前もって被包された外観を廃止し、周囲の正常組織への浸潤を可能にした（図６Ｂおよび６Ｃ）。
【０１１６】
ＲｈｏＡの再発現は、ｍｉＲ−３１発現２３１細胞における肺転移を、対照細胞レベルの７５％まで回復したが、ＲｈｏＡは、対照２３１細胞における転移を増進できなかった（図６Ｄ）。つまり、ＲｈｏＡの再発現は、部分的に、そして堅固に、ｍｉＲ−３１により強制される転移抑制を反転する。観察された救済の大きさは、驚異的である。なぜなら、ＲｈｏＡは、ｍｉＲ−３１により抑制される転移関連遺伝子のより大きいコホートのうちの唯一のメンバーであるからである。
【０１１７】
ｍｉＲ−３１および／またはＲｈｏＡを発現する２３１細胞をマウスに静脈内注射することにより、本発明者らは、ｍｉＲ−３１により強制される転移欠損がＲｈｏＡにより媒介されて反転することが、局所浸潤に対する影響にのみ起因するかを測定した。ｍｉＲ−３１および／またはＲｈｏＡの発現は、腫瘍細胞が肺の脈管構造に最初にとどまることに影響できなかったが、肺に存続した細胞の数は、注射の１日以内に変わった（図６ＥおよびＳ１５）。以前と同様に、ｍｉＲ−３１は、形成された転移の数およびそれらの最終的なサイズの両方を阻害した（図６Ｅ）。対照２３１細胞におけるＲｈｏＡの発現は、転移を増強できなかったが、ＲｈｏＡは、肺転移の数を、対照細胞レベルの６０％まで、ｍｉＲ−３１発現細胞において回復した。しかし、ＲｈｏＡは、異所性ｍｉＲ−３１とともに細胞における巨視的な転移の形成を促進しなかった（図６Ｅ）。
【０１１８】
これらのデータはまとめて、転移を阻害するｍｉＲ−３１の能力が、著しい部分において、ＲｈｏＡを阻害するその能力に起因することを示した。ＲｈｏＡのｍｉＲ−３１媒介抑制は、局所浸潤および初期の血管内異物侵入後事象にともに影響する。しかし、これらのデータは、転移に対するｍｉＲ−３１の影響の全範囲が、複数の標的の協調した抑制によってのみ惹起されることも意味する。なぜなら、ＲｈｏＡ単独の抑制は、形成された転移の数に対するｍｉＲ−３１の完全な影響または転移定着に対するその影響を説明できなかったからである。
【０１１９】
（実施例９）
ｍｉＲ−３１発現は、ヒト乳腺腫瘍における転移と逆の相関がある
樹立された細胞株および異種移植研究は、臨床的悪性腫瘍を完全に再現できないので、本発明者らは、５６名のヒト乳癌患者からの検体におけるｍｉＲ−３１発現をアッセイすることにより本発明者らの分析を拡張した（表５；フォローアップの中央値＝５９カ月）。より好ましい疾患転帰と関連する（Ｓｏｒｌｉｅら、２００１年）グレード一致エストロゲン受容体（ＥＲ）＋腫瘍と比べて、基底膜細胞型腫瘍は、４０％低減したｍｉＲ−３１を示した。ｍｉＲ−３１レベルの差は、ＥＲ＋腫瘍とＨＥＲ２＋腫瘍の間で観察されなかった（図１４）。
【０１２０】
【表５−１】
2014221834.tif 000007
【０１２１】
【表５−２】
2014221834.tif 000008
ａ最初の症状のとき。ＥＲ＝エストロゲン受容体；ＰＲ＝プロゲステロン受容体；ＬＮ＝リンパ節；Ｕ＝未知；Ｄ＝乳管；Ｌ＝小葉；Ｍ＝混合型；ＥＲＬＧ＝ＥＲ陽性低グレード；ＥＲＨＧ＝ＥＲ陽性高グレード；ｐ＝陽性；ｎ＝陰性；ｐｌ＝陽性−低い；ｌｐ＝低い−陽性。
【０１２２】
これらの５６の腫瘍を、臨床的進行に基づいて階層分けした場合に、本発明者らは、ｍｉＲ−３１発現が、その後に転移した原発腫瘍において、正常乳房組織および再発しなかった原発腫瘍と比較して減少したことを見出した。さらに、低いｍｉＲ−３１のレベルは、高いｍｉＲ−３１の腫瘍と比べて、遠位疾患なしの生存の低減と強く相関した（図７Ａおよび７Ｂ）。同様に、腫瘍のこのコホート内で、高いＲｈｏＡ発現が、遠位の転移の出現の増加と関連した（図Ｓ１７）。
【０１２３】
低いｍｉＲ−３１のレベルと転移との関連は、腫瘍グレードおよび分子サブタイプの両方とは独立して存続した（図１５）。このようなグレードおよびサブタイプ独立性は、かなり驚くべきことである。なぜなら、乳癌のために臨床的に用いられる予後マーカーはほとんど、これらのパラメータと相関し、さらに、現在利用可能なマーカーは、より攻撃的な基底膜細胞型またはＨＥＲ２＋サブタイプ内のより不良の予後の群を同定しないからである（Ｄｅｓｍｅｄｔら、２００８年）。結果として、ｍｉＲ−３１は、原発乳癌における攻撃性疾患についての遍在性マーカーであるとみられ、このｍｉＲＮＡのレベルは、よって、ヒト乳癌についてのむしろ独特に指導的な予後因子であるとみられる。要するに、原発乳腺腫瘍におけるｍｉＲ−３１発現は、転移再発と逆の相関があった。よって、この一連のヒト乳腺腫瘍試料から得られたデータに基づいて、ｍｉＲ−３１は、この一連のヒト乳腺腫瘍試料から得られたデータに基づく多様な乳癌サブタイプにおける転移のマーカーであるとみられる。予後指標としてのその有用性をさらに評価することは、より大きいコホートの分析のようなこれらの最初の観察結果の拡張を含み得る。
【０１２４】
本発明者らは、次に、ヒト原発乳腺腫瘍におけるｍｉＲ−３１発現の不均質性、および同じ患者で生じる遠位転移を評価した。ｍｉＲ−３１は、これらの原発腫瘍における細胞の６５％で発現された。しかし、ｍｉＲ−３１は、患者一致遠位転移における細胞の１２〜３０％でしか検出されなかった（図７Ｃ）。これらのデータは、乳癌進行の経過中に働く選択圧が、うまく転移した細胞の集団内のｍｉＲ−３１発現細胞の提示を減らす可能性を高める。
【０１２５】
最後に、本発明者らは、ＩＴＧＡ５、ＲＤＸおよびＲｈｏＡの発現が、原発ヒト乳腺腫瘍においても不均質であるかという疑問を持った。ＲＤＸおよびＲｈｏＡは、調べた原発腫瘍の細胞の６０〜７５％で発現されたが、ＩＴＧＡ５は、細胞の＞８０％で検出された（図７Ｄ）。転移における細胞の＞９０％がＲＤＸおよびＲｈｏＡを発現したので（図７Ｄ）、遠位転移は、ＲＤＸおよびＲｈｏＡの発現について、それらが由来する原発腫瘍よりも均質であった。同様に、転移における細胞の＞９０％がＩＴＧＡ５を発現した。しかし、患者一致原発腫瘍で観察された広範なＩＴＧＡ５発現は、遠位転移におけるその発現の解釈を複雑にする（図７Ｄ）。
【０１２６】
実施例１〜９の考察
ｍｉＲＮＡは、広い多様性の生物学的プロセスを変調できる。上記の実施例において、本発明者らは、単一のヒトｍｉＲＮＡ、ｍｉＲ−３１が、複数の転移促進性標的を同時に抑制し、それにより浸潤−転移カスケードのいくつかの別個のステップを阻害する能力を有することを証明する。さらに、ｍｉＲ−３１レベルは、腫瘍グレードおよびサブタイプの両方とは独立して存続するとみられる群集であるヒト乳腺腫瘍のコホートにおける転移再発と逆の相関がある。
【０１２７】
転移促進性または転移抑制性の機能を有すると報告されている種々のその他のｍｉＲＮＡとは対照的に、ｍｉＲ−３１は、原発腫瘍の発生に対して混乱性の影響を奏することなく転移を妨げる。それ自体で、ｍｉｒ−３１は、「転移抑制因子遺伝子」として分類されやすいこともある（Ｓｔｅｅｇ、２００２年）。ｍｉＲ−３１機能のこの独特の局面は、なかでも、正常細胞および生物生理機能におけるこのｍｉＲＮＡのまだ特徴づけられていない役割に関する疑問を呈する。重要なことに、ｍｉＲ−３１活性の喪失は、変換していないヒト乳腺上皮細胞における浸潤性、運動性およびアノイキス耐性を増進する。よって、正常上皮におけるｍｉＲ−３１の不活性化は、完全な腫瘍性状態への変換前に散在を促進し得る。このことは、臨床的な乳腺腫瘍において最近観察された現象である（Ｈｕｓｅｍａｎｎら、２００８年）、腫瘍進行の経過中の非常に初期に浸潤−転移カスケードを開始し得る１つの推定的な機構を示唆する。
【０１２８】
原発腫瘍成長を増進するｍｉＲ−３１の能力に鑑みて、このｍｉＲＮＡの発癌性の役割（その転移抑制性の機能とは機械論的に独立する）を、形式的に除外できない。このような作用の二元性は新奇でなく（Ｍａｓｓａｇｕｅ、２００８年）、転移を可能にする属性および腫瘍発生を可能にする属性が生物学的に異なり、悪性腫瘍進行中の独立した選択圧により獲得され得るという考え方と一致する。
【０１２９】
以前の研究は、浸潤−転移カスケードの初期段階である局所浸潤に対する特定のｍｉＲＮＡの影響について記載している。本研究は、ｍｉＲＮＡが、転移のより後のステップにも影響でき、個別のｍｉＲＮＡが浸潤−転移カスケードの複数の別個の段階に干渉し得ることを証明する。ｍｉＲ−３１は、原発乳腺腫瘍の局所浸潤、ならびに管腔内生存、血管外遊走および／または外来微小環境における最初の生存性を調節する。ｍｉＲ−３１は、転移の最終の律速ステップである定着も抑制する（Ｆｉｄｌｅｒ、２００３年）。ｍｉＲ−３１により強制されるＲｈｏＡ抑制は、局所浸潤および初期の血管内異物侵入後事象に対するこのｍｉＲＮＡの影響を部分的に説明する。しかし、ｍｉＲ−３１が転移定着を抑制する機構は、その他の遺伝子に対するその影響に少なくとも部分的に依存する。
【０１３０】
実施例１〜９で用いた実験手順
細胞培養。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＭＣＦ７−Ｒａｓ細胞は、ＡＴＣＣから得て、標準的な条件下で培養した。ＨＭＥＣおよびＨＭＥ細胞は、記載されている（Ｍａら、２００７年）。ＳＣＰ３細胞は、Ｊ．  Ｍａｓｓａｇｕｅから得た（Ｍｉｎｎら、２００５年）。ＳＵＭ−１４９および−１５９細胞は、Ｓ．  Ｅｔｈｉｅｒから提供された（Ｍａら、２００７年）。Ｄ２細胞は、記載されている（Ｍｏｒｒｉｓら、１９９３年）。６７ＮＲ、１６８ＦＡＲＮ、４ＴＯ７および４Ｔ１細胞は、Ｆ．  Ｍｉｌｌｅｒから得た（ＡｓｌａｋｓｏｎおよびＭｉｌｌｅｒ、１９９２年）。
【０１３１】
ｍｉＲＮＡ検出。小型ＲＮＡ画分を含むトータルＲＮＡを、培養細胞から、ｍｉｒＶａｎａ  ｍｉＲＮＡ単離キット（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて抽出した。成熟ｍｉＲ−３１および５Ｓ  ｒＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲに基づく検出を、ｍｉｒＶａｎａ  ｍｉＲＮＡ検出キットおよび遺伝子特異的プライマー（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて達成した。
【０１３２】
ｍｉＲＮＡ  ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成法。ｍｉＲＮＡ発現を、パラフィン切片から、Ｓｉｌａｈｔａｒｏｇｌｕら（２００７年）から適合したプロトコルを用いて評価した。簡単に述べると、４時間のプレハイブリダイゼーションの後に、ｍｉＲ−３１を標的にする５’ＦＩＴＣ標識ｍｉＲＣＵＲＹ  ＬＮＡプローブ（Ｅｘｉｑｏｎ）を、プロテイナーゼＫ処理した１０μｍ切片と５５℃にて１２時間ハイブリッド形成させた。スライドを、次いで、抗ＦＩＴＣ−ＨＲＰ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）とインキュベートし、得られたシグナルを、ＴＳＡ  Ｐｌｕｓフルオレセインシステム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて強めた。
【０１３３】
ヒト乳腺腫瘍。原発乳腺腫瘍、遠位転移および正常乳房組織を、Ｂｒｉｇｈａｍ  ａｎｄ  Ｗｏｍｅｎ’ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  ＩＲＢにより承認されたプロトコルを遵守して回収して加工した。新鮮な組織を患者から採集し、ＯＣＴ包埋し、急速凍結し、−８０℃にて保存した。再発の事例は、遠位転移を発生した患者からの原発腫瘍であった。それぞれの再発事例について、２つの非再発事例を選択して、診断日時、分子サブタイプ、リンパ節状態およびフォローアップの時間について制御した。トータルＲＮＡを、３５μｍ切片からＴＲＩｚｏｌ抽出およびｍｉｒＶａｎａ  ｍｉＲＮＡ単離キットにより単離した。ｍｉＲ−３１レベルが遠位転移と相関するかを識別するために、原発腫瘍をｍｉＲ−３１陽性または陰性として分類した。ｍｉＲ−３１の正規化した発現がこのコホートの腫瘍のそれぞれ上位または下位３０％にある場合に、腫瘍をｍｉＲ−３１陽性または陰性とみなした。同様に、腫瘍を、それらのＲｈｏＡレベルが調べた腫瘍の上位または下位３０％にある場合に、高ＲｈｏＡまたは低ＲｈｏＡと分類した。
【０１３４】
浸潤および運動性アッセイ。浸潤アッセイのために、１．０×１０５細胞を、８．０μｍの孔を有するＭａｔｒｉｇｅｌ被覆チャンバ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に播種した。運動性アッセイのために、５．０×１０４細胞を、８．０μｍの孔を有する非被覆メンブレン（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の頂上で培養した。細胞を無血清培地に播種し、完全成長培地に向かって２０時間移動させた。Ｆｕｇｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ）を用いて細胞を形質移入し、２４時間後に培養した。２００ｎＭのｍｉＲＩＤＩＡＮ  ｍｉＲＮＡ阻害剤（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）を用いてｍｉＲ−３１を一過的に阻害した。Ｆｚｄ３、ＩＴＧＡ５、Ｍ−ＲＩＰ、ＭＭＰ１６、ＲＤＸまたはＲｈｏＡに対するＳＭＡＲＴｐｏｏｌ  ｓｉＲＮＡ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）は、１００ｎＭで用いた。アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびｓｉＲＮＡは、播種の４８時間前にＯｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて形質移入した。
【０１３５】
アノイキスアッセイ。アノイキス耐性は、７．５×１０４細胞を超低接着性プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に播種することにより評価した。２４時間の足場非依存性培養の後に、細胞を０．４％トリパンブルー（Ｓｉｇｍａ）に再懸濁し、細胞生存性を評価した。
【０１３６】
動物実験。動物が関与する全ての研究は、ＭＩＴ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅにより承認されたプロトコルを遵守した。自発的転移アッセイについて、年齢一致雌性ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス（現場で繁殖）に、１：２のＭａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と通常成長培地中の記載する数の腫瘍細胞を、乳腺脂肪パッドに両側注射した。実験的転移アッセイのために、年齢一致雌性ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに、５．０×１０５細胞（ＰＢＳに再懸濁）を、尾静脈から注射した。転移を、検体単離の３時間以内に蛍光顕微鏡を用いて定量した。
【０１３７】
ルシフェラーゼアッセイ。５．０×１０４細胞に、５０ｎｇの記載されるｐＩＳ１  Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ構築物と５０ｎｇのｐＩＳ０ホタルルシフェラーゼ正規化対照とを同時形質移入した。可溶化液を形質移入の２４時間後に回収し、Ｒｅｎｉｌｌａおよびホタルルシフェラーゼ活性を、二重ルシフェラーゼレポーターシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて測定した。
【０１３８】
イムノブロット。可溶化液を電気泳動で分離し、ＰＶＤＦメンブレンに移し、β−アクチン（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、Ｆｚｄ３（Ａｂｃａｍ）、ＩＴＧＡ５（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、ＭＭＰ１６（Ａｂｃａｍ）、ＲＤＸ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）またはＲｈｏＡ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）に対する抗体で調べた。
【０１３９】
ｍｉＲ−３１標的シグネチャー。２９５のヒト乳腺腫瘍の発現プロファイリング（ｖａｎ  ｄｅ  Ｖｉｊｖｅｒら、２００２年）を用いて、腫瘍を、ｍｉＲ−３１標的シグネチャー陽性または陰性として分類した。本明細書で同定する６つのｍｉＲ−３１標的の複数の正規化された発現が、このコホートにおける腫瘍のそれぞれ上位または下位１５％にある場合に、腫瘍を、標的シグネチャー陽性または陰性とみなした。
【０１４０】
免疫組織化学法。Ｋｉ−６７（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ＭＥＣＡ−３２（Ｕ．ｏｆ  Ｉｏｗａ）、ＩＴＧＡ５（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、ＲＤＸ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）またはＲｈｏＡ（Ａｂｃａｍ）の検出を、５μｍパラフィン切片上で、記載される抗体、Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ  Ｅｌｉｔｅ  ＡＢＣキット（Ｖｅｃｔｏｒ）およびＩｍｍＰＡＣＴ
ＤＡＢ基質（Ｖｅｃｔｏｒ）を用いて行った。
【０１４１】
統計解析。データは、平均±ｓ．ｅ．ｍ．として表す。そうでないと記載しない限り、スチューデントのｔ検定を比較のために用い、Ｐ＜０．０５を有意とみなした。
【０１４２】
プラスミド構築および安定細胞株の作製。ヒトｍｉＲ−３１遺伝子を、ゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅し、ｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、次いで、ｐＢＡＢＥ−ｐｕｒｏレトロウイルスベクター（ＭｏｒｇｅｎｓｔｅｒｎおよびＬａｎｄ、１９９０年）のＢａｍＨＩおよびＳａｌＩ部位にサブクローニングした。合成ｍｉＲ−３１、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−２０６およびｍｉＲ−３３５結合部位含有Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼレポーター遺伝子を、アニーリング、精製および対応する短いオリゴヌクレオチドをＤ．  Ｂａｒｔｅｌにより提供される（Ｆａｒｈら、２００５年）ｐＩＳ１ベクター主鎖の３’ＵＴＲのＳａｃＩおよびＡｇｅＩ部位にクローニングすることにより構築した。一過性ＣＭＶ駆動ｍｉＲＮＡスポンジ主鎖は、Ｐ．  Ｓｈａｒｐにより提供された。直列型非ターゲティング結合部位を含有する対照スポンジは、以前に用いたものと同一であったが（Ｅｂｅｒｔら、２００７年）、ｍｉＲ−３１スポンジは、アニーリング、精製、および７つの直列型「バルジ含有」（９位〜１２位にて）ｍｉＲ−３１結合モチーフを含有するオリゴヌクレオチドを、ＣＭＶスポンジ主鎖のＸｈｏＩおよびＡｐａＩ部位にクローニングすることにより構築した。安定発現研究のために、ｍｉＲ−３１および対照ＣＭＶスポンジ構築物のＢａｍＨＩ−ＡｐａＩ断片を、ｐＢＡＢＥ−ｐｕｒｏレトロウイルスベクターにサブクローニングした。記載されるコンピュータ推定ｍｉＲ−３１標的の３’ＵＴＲにより駆動されるルシフェラーゼレポーター遺伝子を、ＰＣＲに基づく増幅によりヒトゲノムＤＮＡから創出し、次いで、ｐＩＳ１  Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼレポーター主鎖の３’ＵＴＲ内のＡｇｅＩ，ＳａｃＩ、ＳｐｅＩおよび／またはＸｂａＩ部位にクローニングした。記載される変異誘発ｍｉＲ−３１認識部位含有ルシフェラーゼレポーター遺伝子を、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅＩＩ  ＸＬ部位特異的変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を製造者の使用説明書に従って用いて作製した。一過性過剰発現実験のために、Ｆｚｄ３（Ｄｅａｒｄｏｒｆｆら、２００１年）、ＩＴＧＡ５（ＫｕｗａｄａおよびＬｉ、２０００年）、Ｍ−ＲＩＰ（Ｓｕｒｋｓら、２００３年）、ＭＭＰ１６（Ｈｏｔａｒｙら、２００６年）、ＲＤＸ（Ｂａｔｃｈｅｌｏｒら、２００４年）およびＲｈｏＡ（Ｓｕｂａｕｓｔｅら、２０００年）をコードする以前に記載された構築物が、それぞれＰ．  Ｋｌｅｉｎ、Ｓ．  Ｋｕｗａｄａ、Ｈ．  Ｓｕｒｋｓ、Ｓ．  Ｗｅｉｓｓ、Ｓ．  ＣｒｏｕｃｈおよびＧ．  Ｂｏｋｏｃｈより提供された。安定過剰発現研究のために、ＲｈｏＡを、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からレトロウイルスベクターｐＢＡＢＥ−ｚｅｏ（ＭｏｒｇｅｎｓｔｅｒｎおよびＬａｎｄ、１９９０年）に直接サブクローニングした。
【０１４３】
全ての安定細胞株は、以前に記載されたようにして（Ｅｌｅｎｂａａｓら、  ２００１年）、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を用いるレトロウイルス感染により作製した。ＧＦＰ標識ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＭＣＦ７−Ｒａｓ細胞は、ｐＷＺＬ−ｂｌａｓｔ−ＥＧＦＰを感染させることにより創出した。
【０１４４】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞増殖の測定。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖動態を、７．５×１０４細胞を６ウェルプレートのウェルあたりに播種することによりアッセイした。全細胞数は、トリプシン処理および血球計数器を用いる手動計数により、記載されるように２〜３日毎に評価した。
【０１４５】
細胞生存性アッセイ。細胞生存性に対する種々の構築物および反応物での一過性形質移入の影響を、トリパンブルー色素排除アッセイにより評価した。簡単に述べると、対応する浸潤、運動性およびアノイキスアッセイと並行して、２．０×１０５細胞を６ウェルプレートに播種し、次いで、記載される発現構築物、ｓｉＲＮＡまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドを、実験手順に記載されるようにして形質移入した。２４時間（発現構築物）または４８時間（ｓｉＲＮＡおよびアンチセンスオリゴヌクレオチド）後に、細胞をトリプシン処理し、０．４％トリパンブルー染色溶液（Ｓｉｇｍａ）に再懸濁し、血球計数器を用いて手動で計数した。
【０１４６】
ｃＤＮＡ合成およびリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ。記載される場合、ｃＤＮＡは、２００ｎｇのトータルＲＮＡから、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩ第１鎖合成システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて調製し、標的レベルを、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎに基づくリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）により評価した。
【０１４７】
オリゴヌクレオチド配列。本研究で用いたオリゴヌクレオチドは、次のとおりであった：
【０１４８】
【化１】
2014221834.tif 000009
【０１４９】
【化２】
2014221834.tif 000010
【０１５０】
【化３】
2014221834.tif 000011
【０１５１】
【化４】
2014221834.tif 000012
【０１５２】
【化５】
2014221834.tif 000013
【０１５３】
【化６】
2014221834.tif 000014
【０１５４】
【化７】
2014221834.tif 000015
【０１５５】
【化８】
2014221834.tif 000016
（実施例１０）
ヒト乳癌におけるｍｉＲ−３１のさらなる分析
実施例９を、より大きい乳腺腫瘍コホートを用いて繰り返す。ｍｉＲ−３１発現が高いまたは低い患者のうちでの５年および１０年の転移なし生存および全体的な生存率を、適切な統計学的検定を用いて比較する。
【０１５６】
（実施例１１）
３つの標的遺伝子の同時抑制は、転移に対するｍｉＲ−３１の影響を説明できる
注：実施例１１で言及する図および表は、Ｖａｌａｓｔｙａｎ，  Ｓ．ら、Ｃｏｎｃｏｍｉｔａｎｔ  Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｈｒｅｅ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｇｅｎｅｓ  Ｃａｎ  Ｅｘｐｌａｉｎ  ｔｈｅ  Ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  ａ  ＭｉｃｒｏＲＮＡ  ｏｎ  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ、Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、２３巻（２２号）：２５９２〜７頁、２００９年、Ｅｐｕｂ  ２００９年１０月２９日（Ｖａｌａｓｔｙａｎ、２００９ｂ）で見出される。
【０１５７】
上記のように、本発明者らは、ｍｉＲ−３１が、細胞運動性および腫瘍進行において役割を有するタンパク質をコードする６つのｍＲＮＡ：ｆｒｉｚｚｌｅｄ３（Ｆｚｄ３）、インテグリン−α５（ＩＴＧＡ５）、マトリクスメタロペプチダーゼ１６（ＭＭＰ１６）、ミオシンホスファターゼ−Ｒｈｏ相互作用タンパク質（Ｍ−ＲＩＰ）、ラディキシン（ＲＤＸ）およびＲｈｏＡを調節することを証明した（Ｖａｌａｓｔｙａｎら、２００９年）。これらのエフェクターの１または複数のｍｉＲ−３１により強制される阻害がｍｉＲ−３１の転移抑制性影響を媒介することを担うかどうかに取り組むことを開始するために、本発明者らは、これらの６つのｍＲＮＡを個別に、その他の点では転移性のＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳癌細胞（「２３１細胞」）において、短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を用いて安定的に抑制した。２３１細胞は、内因性ｍｉＲ−３１をほぼ有さず、これらの６つのエフェクターを堅固に発現する。さらに、異所性ｍｉＲ−３１は、これらの細胞による転移を損なう。
【０１５８】
それぞれの遺伝子について、ｓｈＲＮＡオフターゲットの影響からの混乱性の影響を最小限にするために、本発明者らは、コードされたｍＲＮＡ中に別々のｓｈＲＮＡターゲティングユニーク配列を安定的に発現する複数の細胞株を導いた（補足の図１Ａおよび２Ａ）。６つのエフェクターのそれぞれに対する少なくとも１つのｓｈＲＮＡは、その標的のレベルを、ｍｉＲ−３１発現により惹起されるものと同等の係数で低減した（Ｖａｌａｓｔｙａｎら、２００９年）。このことにより、本発明者らは、それぞれ個別の下流エフェクターに対するｍｉＲ−３１の作用の結果を適度に見積もることが可能になった。
【０１５９】
これらのｓｈＲＮＡ発現２３１細胞を、転移のために重要な形質のモデルとなるｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイに供した。本発明者らは、ＩＴＧＡ５、ＲＤＸまたはＲｈｏＡの個別の抑制が、浸潤、運動性およびアノイキス媒介細胞死に対する耐性をｉｎ  ｖｉｔｒｏで低減したことを観察した。これとは対照的に、Ｆｚｄ３、ＭＭＰ１６またはＭ−ＲＩＰのｓｈＲＮＡは、これらの挙動に実質的に影響することができなかった（補足の図１Ｂ〜Ｄおよび２Ｂ〜Ｄ）。測定可能な応答を有したｓｈＲＮＡについて、これらの応答の大きさは、達成されたノックダウンの程度と直接相関し、このことは、これらの影響が、標的にされたタンパク質のレベルの低減の特異的な結果として起こったことを示唆した。Ｆｚｄ３、ＩＴＧＡ５、ＭＭＰ１６、Ｍ−ＲＩＰ、ＲＤＸまたはＲｈｏＡの阻害は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖に影響できなかった（補足の図１Ｅおよび２Ｅ）。また、ＩＴＧＡ５、ＲＤＸおよびＲｈｏＡのｓｈＲＮＡにより誘発された応答は、ｍｉＲＮＡ生合成装置の飽和に起因し得なかった。なぜなら、８つの対照ｍｉＲＮＡの成熟レベルは、これらの細胞において影響されなかったからである（補足の図３）。
【０１６０】
本発明者らは、これらの６つのｍＲＮＡの抑制が、転移能力をｉｎ  ｖｉｖｏで変更するかどうかを、ｓｈＲＮＡ発現２３１細胞をマウスに静脈内注射することにより決定した。１カ月後に、ＩＴＧＡ５、ＲＤＸまたはＲｈｏＡを標的にするｓｈＲＮＡを有する細胞は、対照よりもそれぞれ８０％、８５％および５５％少ない肺転移を生じた。しかし、Ｆｚｄ３、ＭＭＰ１６またはＭ−ＲＩＰの下方制御は、生じた転移の数に影響しなかった（補足の図４）。よって、Ｆｚｄ３、ＭＭＰ１６またはＭ−ＲＩＰではそうではないが、ＩＴＧＡ５、ＲＤＸまたはＲｈｏＡの阻害は、転移能力のｉｎ  ｖｉｔｒｏ代替およびｉｎ
ｖｉｖｏ転移に影響する。
【０１６１】
これらの分析を拡張するために、本発明者らは、ｍｉＲＮＡ非感受性バージョンのＦｚｄ３、ＩＴＧＡ５、ＭＭＰ１６、Ｍ−ＲＩＰ、ＲＤＸまたはＲｈｏＡをコードするｍＲＮＡを個別に、ｍｉＲ−３１または対照ベクターのいずれかを既に発現している２３１細胞で安定的に再発現させた（補足の図５Ａ）。このことにより、本発明者らは、再発現されたときにｉｎ  ｖｉｖｏ転移に対するｍｉＲ−３１の影響を反転するこれらのエフェクターのそれぞれの能力を測定することが可能になった。マウスの静脈循環に導入した場合に、ｍｉＲ−３１発現細胞は、注射の１カ月後に対照よりも８５％少ない肺転移を形成し（補足の図５Ｂ）、これは本発明者らの以前の研究結果と一貫していた（Ｖａｌａｓｔｙａｎら、２００９年）。ＩＴＧＡ５、ＲＤＸまたはＲｈｏＡの個別の再発現は、ｍｉＲ−３１発現細胞における肺転移の数を、対照レベルのそれぞれ５５％、５０％および６５％まで回復した。これとは対照的に、Ｆｚｄ３、ＭＭＰ１６またはＭ−ＲＩＰは、病変の数を増加できなかった（補足の図５Ｂ）。ＩＴＧＡ５、ＲＤＸまたはＲｈｏＡの過剰発現は、対照２３１細胞において転移をさらに増進せず（補足の図５Ｂ）、このことは、これらの経路からのシグナル伝達が、ＲｈｏＡ制御ネットワークについて以前に確立されたように（Ｐｉｌｌｅら、２００５年）、２３１細胞において既に飽和していたことを示唆した。これらの研究結果はまとめて、ｍｉＲ−３１が多数のｍＲＮＡ種を抑制できるが、これらのエフェクターの部分集合のみを調節するこの能力は、転移を損なうその能力にとって重要であるとみられることを意味した。
【０１６２】
この考えを支持するものとして、２３１細胞において安定的に再発現させた場合に、Ｆｚｄ３、ＭＭＰ１６またはＭ−ＲＩＰは、浸潤、運動性およびアノイキス耐性のｍｉＲ−３１により強制される減弱化をｉｎ  ｖｉｔｒｏで反転できなかった（補足の図６）。これとは対照的に、本発明者らの以前の研究は、ＩＴＧＡ５、ＲＤＸまたはＲｈｏＡの回復されたレベルは、少なくとも部分的に、これらの表現型におけるｍｉＲ−３１により誘発される欠損を救済したことを明らかにした（Ｖａｌａｓｔｙａｎら、２００９年）。これらのｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの再発現データ、ならびに上記のｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでの機能喪失の研究結果に基づいて、本発明者らは、ｍｉＲ−３１の転移抑制性活性の根拠になるＩＴＧＡ５、ＲＤＸおよびＲｈｏＡの阻害の能力について本発明者らのその後の分析を集中することにした。
【０１６３】
このために、本発明者らは、ＩＴＧＡ５、ＲＤＸまたはＲｈｏＡを個別に抑制することの結果について、同所性注射アッセイにおいて調べた。よって、本発明者らは、ＩＴＧＡ５、ＲＤＸまたはＲｈｏＡのいずれかを標的にするｓｈＲＮＡを発現する２３１細胞を、マウスの乳腺脂肪パッドに移植した。ＩＴＧＡ５またはＲｈｏＡの抑制は、原発腫瘍成長に影響しなかった。逆に、ＲＤＸの阻害は、得られる乳腺腫瘍のサイズを低減した（図１Ａ）。原発腫瘍成長における差について正規化した後に、ＩＴＧＡ５、ＲＤＸまたはＲｈｏＡに対するｓｈＲＮＡを発現する細胞は、注射の２．５カ月後に対照よりもそれぞれ８５％、７０％および５０％少ない肺転移を形成した（図１Ｂ）。つまり、ＩＴＧＡ５、ＲＤＸまたはＲｈｏＡの阻害は、それぞれ転移を妨害する。しかし、このアッセイは、ＩＴＧＡ５、ＲＤＸまたはＲｈｏＡの抑制により損なわれた浸潤−転移カスケードの特定のステップ（複数可）を明らかにしなかった。
【０１６４】
本発明者らの以前の研究において、本発明者らは、ｍｉＲ−３１が、浸潤−転移カスケードの３つのステップ、すなわち局所浸潤、初期の血管内異物侵入後事象（管腔内生存性、血管外遊走および／または遠位組織での最初の生存）ならびに定着にｉｎ  ｖｉｖｏで影響することを観察した（Ｖａｌａｓｔｙａｎら、２００９年）。したがって、本発明者らは、ＩＴＧＡ５、ＲＤＸまたはＲｈｏＡの個別の抑制が、転移プロセスに対するｍｉＲ−３１の複数の影響の１または複数を再現するために十分かどうかを評価した。本発明者らは、ＩＴＧＡ５、ＲＤＸまたはＲｈｏＡのいずれかに対するｓｈＲＮＡを含有する２３１細胞が、組織学的に浸潤性であると考えられ、対照と区別できない原発腫瘍を形成したことを見出した（図１Ｃ）。よって、ＩＴＧＡ５、ＲＤＸまたはＲｈｏＡ単独の阻害は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの局所浸潤を廃止しない。
【０１６５】
初期の血管内異物侵入後事象に対する推定の影響を、静脈内注射の１日後に肺におけるｓｈＲＮＡ発現２３１細胞を定量することにより調べた。ＩＴＧＡ５またはＲｈｏＡのいずれかが抑制された細胞は、対照よりそれぞれ４０％および３０％少なく普及していた。しかし、ＲＤＸノックダウンは、肺における存続性を低減しなかった（図１Ｄ）。これらの影響は、肺の微小脈管構造において最初にとどまるようになる細胞の能力の差に起因しなかった。なぜなら、同数の細胞が、静脈内注射の１０分後に肺において検出されたからである（補足の図７）。これらのデータは、ＩＴＧＡ５またはＲｈｏＡのいずれかの阻害が、ｉｎ  ｖｉｖｏでの初期の血管内異物侵入後事象を損なうことを示した。
【０１６６】
定着（すなわち大きい多細胞転移を生じる散在単細胞の能力）に対する可能性のある影響を調べるために、静脈内注射した動物における肺転移のサイズを、移植の３カ月後に分析した。ＩＴＧＡ５またはＲＤＸのいずれかのｓｈＲＮＡを発現する２３１細胞は、小さい微小転移のみを形成したが、ＲｈｏＡ  ｓｈＲＮＡ含有細胞は、対照細胞により生じるものと同等の巨視的な転移を生じた（図１Ｅ）。よって、ＩＴＧＡ５またはＲＤＸいずれか単独の抑制は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの定着を妨げる。
【０１６７】
これらの観察結果はまとめて、ＩＴＧＡ５、ＲＤＸまたはＲｈｏＡの個別の抑制は、浸潤−転移カスケードの１または複数のステップを損なうが、これらのタンパク質単独のいずれか１つの阻害は、転移に対するｍｉＲ−３１の影響の全範囲を表現型模写できないことを明らかにした。このことは、ｍｉＲ−３１が、いくつかの下流エフェクターの同時の抑制により転移プロセスの複数の異なる段階に対するその影響を達成し得ることを示唆した。刺激的に、本発明者らの機能喪失分析は、ＩＴＧＡ５、ＲＤＸおよびＲｈｏＡが、浸潤−転移カスケードの少なくとも部分的に異なるステップ中に作用することを示した（例えば、ＲｈｏＡは初期の血管内異物侵入後事象に影響したが定着には影響せず、ＲＤＸは初期の血管内異物侵入後事象に影響しなかったが定着を変更させた）。よって、これらの同時の調節は、それによりｍｉＲ−３１がその複数の転移抑制性効果を惹起し得るもっともらしい機構を提供する。
【０１６８】
この仮説を試験するために、本発明者らは、ＩＴＧＡ５、ＲＤＸおよびＲｈｏＡをｍｉＲ−３１または対照ベクターのいずれかとともに一緒に組み合わせてコードするｍｉＲＮＡ非感受性ｍＲＮＡを、２３１細胞において安定的に再発現させた。これらの細胞をマウスに同所性注射した場合に、ｍｉＲ−３１は原発腫瘍成長を増進し、本発明者らの先行の研究結果を再現した（Ｖａｌａｓｔｙａｎら、２００９年）。ＩＴＧＡ５、ＲＤＸおよびＲｈｏＡの同時再発現は、ｍｉＲ−３１含有または対照の原発腫瘍のサイズを変更できなかった（図２Ａ）。より大きい原発腫瘍を生じるそれらの能力にもかかわらず、ｍｉＲ−３１発現２３１細胞は、肺転移を生じるそれらの能力の＞８０％を損なった（図２Ｂ）。ＩＴＧＡ５、ＲＤＸおよびＲｈｏＡは、対照２３１細胞において転移を増進しなかった。しかし、ｍｉＲ−３１を含有する２３１細胞でのＩＴＧＡ５、ＲＤＸおよびＲｈｏＡの同時再発現は、ｍｉＲ−３１により強制される転移抑制を完全に廃止した（図２Ｂ）。これらのデータは、ｉｎ  ｖｉｖｏ転移に対するｍｉＲ−３１の影響が、３つの下流エフェクターのコホートを阻害するｍｉＲ−３１の能力により説明できることを意味した。このことは、かなり驚異的であった。なぜなら、コンピュータアルゴリズムは、ｍｉＲ−３１が＞２００のｍＲＮＡを調節することを予測し、これらの多くが転移関連プロセスにおいて機能するタンパク質をコードするからである（Ｋｒｅｋら、２００５年；Ｇｒｉｍｓｏｎら、２００７年）。
【０１６９】
ＩＴＧＡ５、ＲＤＸおよびＲｈｏＡの組み合わせた再発現が、ｍｉＲ−３１により誘発される転移抑制を完全に廃止したので、本発明者らは、これらの３つのエフェクターが、個別にまたは異なる組合せでのいずれかで再発現された場合に、転移に対するｍｉＲ−３１の影響の部分集合を反転できるかどうかについても決定した。よって、本発明者らは、ｍｉＲ−３１または対照ベクターと、これらのｍｉＲ−３１標的の０、１、２または３つの全ての可能な順列とを安定的に発現する２３１細胞（全てｍｉＲＮＡ耐性にされる）を創出した（補足の図８）。ｍｉＲ−３１、ＩＴＧＡ５、ＲＤＸおよびＲｈｏＡは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞増殖に影響できなかった（補足の図９Ａ）。しかし、ＩＴＧＡ５、ＲＤＸまたはＲｈｏＡの個別の再発現は、少なくとも部分的に、異所性ｍｉＲ−３１により与えられる浸潤、運動性およびアノイキス耐性におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏ欠損を救済した。この反転の程度は、複数のエフェクターを組み合わせて再発現させた場合に、より著しかった（補足の図９Ｂ〜Ｄ）。つまり、ＩＴＧＡ５、ＲＤＸおよびＲｈｏＡは、ｍｉＲ−３１の下流の転移のために重要なｉｎ  ｖｉｔｒｏ挙動を制御する。
【０１７０】
再発現されたＩＴＧＡ５、ＲＤＸおよび／またはＲｈｏＡの全ての可能な組合せのそれぞれの、ｉｎ  ｖｉｖｏ転移に対するｍｉＲ−３１の影響を反転する能力をアッセイするために、ｍｉＲ−３１、ＩＴＧＡ５、ＲＤＸおよび／またはＲｈｏＡを発現する２３１細胞を、マウスに同所性移植した。ｍｉＲ−３１は、全般的に原発腫瘍成長を促進したが、ＩＴＧＡ５、ＲＤＸおよびＲｈｏＡの回復されたレベルは、原発腫瘍の成長に一貫して影響できなかった（図３Ａおよび補足の表１）。ｍｉＲ−３１は、肺における転移病変の出現を＞９０％低減した（図３Ｂ）。ｍｉＲ−３１含有細胞において個別に再発現させた場合に、ＩＴＧＡ５、ＲＤＸまたはＲｈｏＡは、転移を対照レベルのそれぞれ４０％、４５％および６５％まで増加させた。ｍｉＲ−３１陽性細胞におけるこれらの標的のいずれか２つの再発現は、対照の８５％ほど多くの転移を生じた（図３Ｂ）。以前と同様に、ｍｉＲ−３１を含有する細胞におけるＩＴＧＡ５、ＲＤＸおよびＲｈｏＡの同時再発現は、肺転移の数を、対照で観察されるものの１００％まで回復した（図３Ｂ）。よって、これらの３つのエフェクターは、ｉｎ  ｖｉｖｏ転移に対して異なって寄与し、これらの寄与は、このプロセスに対するｍｉＲ−３１の影響を説明するために共同して働くことができる。しかし、これらの観察結果は、再発現されたＩＴＧＡ５、ＲＤＸおよび／またはＲｈｏＡの種々の組合せにより影響される浸潤−転移カスケードの特定のステップ（複数可）を詳細に示すことができなかった。
【０１７１】
ｍｉＲ−３１は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの浸潤−転移カスケードの３つのステップ、すなわち局所浸潤、初期の血管内異物侵入後事象および定着に影響する（Ｖａｌａｓｔｙａｎら、２００９年）。ＩＴＧＡ５、ＲＤＸおよびＲｈｏＡが、過剰発現された場合に、局所浸潤に対するｍｉＲ−３１の影響を相乗して反転できるかを調べるために、本発明者らは、同所性注射されたマウスにおいて発生した原発腫瘍の組織学的外観を調べた。対照２３１細胞腫瘍は浸潤の明確な証拠を示したが、ｍｉＲ−３１発現腫瘍は、本発明者らが以前に文書化したように（Ｖａｌａｓｔｙａｎら、２００９年）、良好に限局された（図３Ｃ）。ＩＴＧＡ５、ＲＤＸおよびＲｈｏＡは対照２３１細胞腫瘍において浸潤を変更しなかったが、これらの３つの標的の組み合わせた再発現は、ｍｉＲ−３１発現腫瘍の以前にうまく被包された表現型を廃止した（図３Ｃ）。ＲＤＸまたはＲｈｏＡいずれか単独の回復されたレベルを有するｍｉＲ−３１含有細胞は、浸潤性であるとみられる原発腫瘍を形成したが、ｍｉＲ−３１により強制される浸潤欠損の反転は、不完全であった。ＩＴＧＡ５は、被包化に影響しなかった（図３Ｃ）。これらの観察結果は、局所浸潤のｍｉＲ−３１依存性減弱化が、ＲＤＸおよびＲｈｏＡを調節するｍｉＲ−３１の能力に起因し得ることを明らかにした。表面上、本発明者らのｓｈＲＮＡ研究（図１Ｃ）に鑑みて、ＲＤＸおよびＲｈｏＡは、互いに一緒にまたはさらなる未同定のｍｉＲ−３１標的とともに重複して機能して、ｉｎ  ｖｉｖｏでの浸潤を促進する。
【０１７２】
本発明者らは、これらの３つの標的の再発現が、初期の血管内異物侵入後事象に対するｍｉＲ−３１の影響を反転できるかどうかについても調べた。これを行うために、本発明者らは、２３１細胞をマウスの静脈循環に導入し、注射の１日後の肺における細胞数をアッセイした。本発明者らの以前の研究結果と一致して（Ｖａｌａｓｔｙａｎら、２００９年）、ｍｉＲ−３１発現細胞は、肺に存続するそれらの能力が５倍損なわれており（図４Ａ）、このことは、ｍｉＲ−３１が１または複数の初期の血管内異物侵入後事象を妨害したことを示した。ＩＴＧＡ５、ＲＤＸおよびＲｈｏＡは、対照２３１細胞において初期の血管内異物侵入後事象に影響できなかった（図４Ａ）。これとは対照的に、ＩＴＧＡ５またはＲｈｏＡのいずれかの個別の再発現は、肺におけるｍｉＲ−３１発現細胞数を、対照レベルの５０％まで回復した。ＲＤＸは、この時点で、肺に存続するｍｉＲ−３１含有細胞の能力を強化しなかった（図４Ａ）。ｍｉＲ−３１発現細胞へのＩＴＧＡ５およびＲｈｏＡの同時再導入は、初期の血管内異物侵入後事象のｍｉＲ−３１により強制される妨害を完全に覆すのに十分であった（図４Ａ）。これらの影響は、肺の微小脈管構造において最初にとどまるようになるＩＴＧＡ５、ＲＤＸ、ＲｈｏＡおよび／またはｍｉＲ−３１発現細胞の能力の変更の結果ではなかった。なぜなら、同数の細胞が、静脈内注射の１０分後に肺において検出されたからである（補足の図１０）。これらのデータは、初期の血管内異物侵入後事象のｍｉＲ−３１により誘発される抑制が、ＩＴＧＡ５およびＲｈｏＡを変調するｍｉＲ−３１の能力に起因し得ることの証拠を提供した。
【０１７３】
静脈内注射の３カ月後に、対照２３１細胞は、大きい巨視的な転移を生じたが、ｍｉＲ−３１発現細胞は、小さい微小転移のみを生じた（図４Ｂ）。よって、定着に対するｍｉＲ−３１の報告されている影響と調和して（Ｖａｌａｓｔｙａｎら、２００９年）、ｍｉＲ−３１は、散在腫瘍細胞が転移部位にてそれらの増殖プログラムを再開することを妨げた。ｍｉＲ−３１含有細胞におけるＩＴＧＡ５、ＲＤＸおよびＲｈｏＡの同時再発現は、ｍｉＲ−３１により強制される定着抑制を廃止したが、対照２３１細胞におけるこれら３つの標的の過剰発現は、病変サイズを増加できなかった（図４Ｂ）。ｍｉＲ−３１発現細胞におけるＩＴＧＡ５またはＲＤＸのいずれかの個別に回復されたレベルは、定着に対するｍｉＲ−３１の影響を反転した。ＲｈｏＡは、このパラメータに影響しなかった（図４Ｂ）。よって、定着を阻害するｍｉＲ−３１の能力は、ＩＴＧＡ５およびＲＤＸを抑制するその能力に由来し得る。
【０１７４】
この同じアッセイにおいて、ｍｉＲ−３１発現２３１細胞は、対照よりも２０倍少ない肺転移を形成した（図４Ｃ）。ｍｉＲ−３１含有細胞において個別に再発現させた場合、ＩＴＧＡ５、ＲＤＸまたはＲｈｏＡは、形成された転移の数を対照レベルのそれぞれ６０％、６０％および５０％まで増加させた（図４Ｃ）。ｍｉＲ−３１発現細胞におけるこれら３つの標的の２つ１組の組合せの回復されたレベルは、病変の数を対照の＞７０％まで増進した。重要なことに、ｍｉＲ−３１含有細胞におけるＩＴＧＡ５、ＲＤＸおよびＲｈｏＡの同時再発現は、ｍｉＲ−３１により媒介される転移抑制を完全に廃止した（図４Ｃ）。上記の実験はまとめて、転移に対するｍｉＲ−３１の影響が、ＩＴＧＡ５、ＲＤＸおよびＲｈｏＡを調節するｍｉＲ−３１の能力により完全に説明できることを示した。これらの３つの標的は、ｉｎ  ｖｉｖｏでｍｉＲ−３１の下流の浸潤−転移カスケードの部分的に重複するステップにて作用する（表１）。
【０１７５】
ｍｉＲ−３１の作用を覆すＩＴＧＡ５、ＲＤＸおよびＲｈｏＡの能力が、２３１細胞系のいくらかの特殊性により起こることがまだ可能であった。このことに対処するために、本発明者らは、本発明者らの分析を、ＳＵＭ−１５９ヒト乳癌細胞に拡張した。２３１細胞と同様に、ＳＵＭ−１５９細胞は、内因性ｍｉＲ−３１を欠き、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで高度に攻撃性であり、異所性ｍｉＲ−３１により損なわれた浸潤、運動性およびアノイキス耐性を示す（Ｖａｌａｓｔｙａｎら、２００９年）。本発明者らは、ｍｉＲ−３１または対照ベクターのいずれかとＩＴＧＡ５、ＲＤＸおよび／またはＲｈｏＡをコードするｍｉＲＮＡ耐性ｍＲＮＡとの１６全ての可能な組合せを安定的に発現するＳＵＭ−１５９細胞を創出した。全ての系統は、同等のｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖動態を示した（補足の図１１Ａ〜Ｂ）。２３１細胞における本発明者らの観察結果と一致して、ｍｉＲ−３１含有ＳＵＭ−１５９細胞におけるＩＴＧＡ５、ＲＤＸまたはＲｈｏＡの個別の再発現は、異所性ｍｉＲ−３１に起因し得る浸潤、運動性およびアノイキス耐性のｉｎ  ｖｉｔｒｏ欠損を少なくとも部分的に救済した。以前と同様に、救済の程度は、複数のエフェクターを同時に再発現させた場合に、より著しかった（補足の図１１Ｃ〜Ｅ）。よって、ｍｉＲ−３１の作用を覆すＩＴＧＡ５、ＲＤＸおよびＲｈｏＡの再発現の能力は、２３１細胞に限定されない。
【０１７６】
ＩＴＧＡ５、ＲＤＸまたはＲｈｏＡの個別の再発現は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのあるいくつかのｍｉＲ−３１により強制される転移関連欠損を大部分反転させた（補足の図９および１１）が、ＩＴＧＡ５、ＲＤＸまたはＲｈｏＡレベルの個別の回復は、転移に対するｍｉＲ−３１の影響をｉｎ  ｖｉｖｏで部分的にしか救済しなかった（図３〜４）。このことは、利用可能なｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイが、ｉｎ  ｖｉｖｏ転移の十分な複雑さのモデルになるには適当でないという事実を強調する。よって、これらの技術を導入する場合、特に並行するｉｎ  ｖｉｖｏ分析がない場合には注意を払わなければならない。
【０１７７】
まとめると、この実施例に記載した研究結果は、転移に対するｍｉＲ−３１の影響が、比較的少数の下流標的を抑制するその能力により説明できることを示唆する。今回の場合、関連するエフェクターは、このｍｉＲＮＡが標的にするｍＲＮＡの全体のリストの小さいパーセンテージしか含まない。本発明者らのデータは、ＩＴＧＡ５、ＲＤＸおよびＲｈｏＡが、その調節が転移に対するｍｉＲ−３１の影響を説明するのに十分であるエフェクターの最小限のコホートであることを示すが、これらの観察結果は、ＩＴＧＡ５、ＲＤＸおよび／またはＲｈｏＡの作用と表面上は機能的に重複する様式で転移関連経路に影響するさらなるｍｉＲ−３１標的の存在を除外しない。また、転移関連性を有するｍｉＲ−３１の１または複数の真の標的が、２３１細胞においてこのｍｉＲＮＡにより著しく下方制御され得なかったという可能性がある。全体として、転移が、癌腫からの患者の死亡率の圧倒的大部分を担うという事実により、この研究は、ｍｉＲ−３１およびそのエフェクターの変調が、臨床的に有用であると判明し得ることをさらに強調する。
【０１７８】
プラスミド構築。ｍｉＲ−３１は、本発明者らが（Ｖａｌａｓｔｙａｎら、２００９年）に詳細に述べるように、ｐＢＡＢＥ−ｐｕｒｏから発現させた。Ｆｚｄ３（Ｄｅａｒｄｏｒｆｆら、２００１年）、ＩＴＧＡ５（ＫｕｗａｄａおよびＬｉ、２０００年）、ＭＭＰ１６（Ｈｏｔａｒｙら、２００６年）、Ｍ−ＲＩＰ（Ｓｕｒｋｓら、２００３年）、ＲＤＸ（Ｂａｔｃｈｅｌｏｒら、２００４年）およびＲｈｏＡ（Ｓｕｂａｕｓｔｅら、２０００年）をコードする構築物（但し内因性３’ＵＴＲ配列を欠き、よってそれらはｍｉＲＮＡ耐性になっている）は、それぞれｐＢＡＢＥ−ｈｙｇｒｏ、ｐＢＡＢＥ−ｎｅｏ、ｐＢＡＢＥ−ｈｙｇｒｏ、ｐＢＡＢＥ−ｈｙｇｒｏ、ｐＢＡＢＥ−ｈｙｇｒｏおよびｐＢＡＢＥ−ｚｅｏにサブクローニングした（Ｅｌｅｎｂａａｓら、２００１年）。Ｆｚｄ３、ＩＴＧＡ５、ＭＭＰ１６、Ｍ−ＲＩＰ、ＲＤＸおよびＲｈｏＡを標的にするｓｈＲＮＡは、ｐＬＫＯ．１−ｐｕｒｏ（Ｏｐｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）から発現させた。
【０１７９】
イムノブロッティング。可溶化液をＮｕＰＡＧＥゲル電気泳動（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で分離し、ＰＶＤＦメンブレンに移し、β−アクチン（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、ＩＴＧＡ５（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、ＲＤＸ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）またはＲｈｏＡ（Ａｂｃａｍ）に対する抗体で調べた。
【０１８０】
マイクロＲＮＡ検出およびＲＴ−ＰＣＲ。小型ＲＮＡを含むトータルＲＮＡを、記載される２３１細胞から、ｍｉｒＶａｎａマイクロＲＮＡ単離キット（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて抽出した。成熟マイクロＲＮＡおよび５Ｓ  ｒＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲに基づく検出を、ｍｉｒＶａｎａマイクロＲＮＡ検出キットおよび遺伝子特異的プライマーセット（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて達成した。Ｆｚｄ３、ＧＡＰＤＨ、ＩＴＧＡ５、ＭＭＰ１６、Ｍ−ＲＩＰ、ＲＤＸおよびＲｈｏＡの転写産物レベルを検出するために、ｃＤＮＡを、２００ｎｇのトータルＲＮＡからＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩ第１鎖合成システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて調製し、ＳＹＢＲ  ＧｒｅｅｎリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）により定量した。
【０１８１】
浸潤および運動性アッセイ。浸潤アッセイのために、１．０×１０５細胞を、８．０μｍの孔を有するＭａｔｒｉｇｅｌ被覆チャンバ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で培養した。運動性アッセイのために、５．０×１０４細胞を、８．０μｍの孔を有する非被覆メンブレン（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の頂上に播種した。細胞を無血清培地に播種し、完全成長培地に向かって２０時間移動させた。非浸潤または非遊走細胞を、次いで、物理的に除去した。うまく移動した細胞を、Ｄｉｆｆ−Ｑｕｉｃｋ染色セット（Ｄａｄｅ）を用いて視覚化して、計数した。
【０１８２】
アノイキスアッセイ。アノイキス耐性は、７．５×１０４細胞を超低接着性プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に播種することにより評価した。２４時間後に、細胞を０．４％トリパンブルー（Ｓｉｇｍａ）に再懸濁し、生存細胞の割合を、血球計数器を用いて定量した。
【０１８３】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞増殖の測定。そうでないと記載しない限り、増殖動態は、１．０×１０５細胞を６ウェルプレートのウェルあたりに播種することによりアッセイした。全細胞数は、トリプシン処理および血球計数器を用いる手動計数により、２〜３日毎に評価した。代わりに、細胞増殖は、９６ウェルプレートのウェルあたり５．０×１０２または１．０×１０３細胞を播種し、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６  ＡＱｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ＭＴＳ細胞増殖アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いることにより測定した。細胞を、ＭＴＳ試薬と１．５時間インキュベートし、次いで、全細胞数を、９６ウェルプレートリーダーで４９２ｎｍにて吸光度を測定することにより定量した。
【０１８４】
【化９】
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【０１８５】
【化１０】
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【０１８６】
【化１１】
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【０１８７】
【化１２】
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当業者は、本明細書に記載される本発明の具体的な実施形態についての多くの等価物について、認識するか、または日常的な実験を超えずに確かめることができる。本発明の範囲は、上記の実施形態に限定されることを意図しない。本発明は、本明細書に記載されるそれぞれ個別の特徴、システム、物品、材料、キットおよび／または方法を対象とする。さらに、このような特徴、システム、物品、材料、キットおよび／または方法が互いに矛盾するのでなければ、このような特徴、システム、物品、材料、キットおよび／または方法の２つ以上の任意の組合せは、本発明の範囲内に含まれる。
【０１８８】
「ａ」および「ａｎ」などのような冠詞は、反対であると記載しない限りまたは文脈からそうでないと明確でない限り、１または１より多くを意味し得る。
【０１８９】
本明細書および特許請求の範囲において用いられるように「および／または」の句は、このように連結される要素の「いずれかまたは両方」を意味すると理解されよう。「および／または」を用いて列挙される複数の要素は、同じ様式、すなわち、そのように連結される要素の「１または複数」で解釈されよう。「および／または」の節で具体的に同定される要素以外のその他の要素も場合によって存在してよい。明細書および特許請求の範囲において用いる場合、「または」は、上で定義する「および／または」と同じ意味を有すると理解されよう。例えば、一連の要素において用いる場合、「または」または「および／または」は、包含的、すなわち一連の要素の少なくとも１つ、しかし場合によって１より多くと、場合によってさらなる列挙されていない要素を含めると解釈されるものとする。「１つのみの」または「厳密に１つの」のような明確に反対を示す用語のみが、いくつかまたは一連の要素のうちの厳密に１つの要素の包含について言及することになる。よって、群の１または複数のメンバー間に「または」を含む請求項は、反対であると記載しない限り、群のメンバーの１つ、１より多くまたは全てが、ある所定の製品またはプロセスに存在するか、用いられるかまたはそうでなければ関連する場合に、満たされると考えられる。本発明は、群のうちの厳密に１つのメンバーが、ある所定の製品またはプロセスに存在するか、用いられるかまたはそうでなければ関連する実施形態を提供する。本発明は、群のメンバーの１より多くまたは全てが、ある所定の製品またはプロセスに存在するか、用いられるかまたはそうでなければ関連する実施形態も提供する。本発明は、ある請求項の１または複数の限定、要素、条項、記述的用語などが別の請求項に導入される実施形態を包含する。例えば、別の請求項に従属する請求項は、同じ基本請求項に従属する任意のその他の請求項で見出される１もしくは複数の要素または限定を含むように改変できる。
【０１９０】
請求項が組成物を記載する場合、本明細書に開示されるような組成物を用いる方法が提供され、本明細書に開示される任意の製造方法に従う該組成物の製造方法が提供されると理解される。請求項が方法を記載する場合、その方法を行うための組成物が提供されると理解される。要素が一覧または群として表される場合、それぞれのサブグループも開示される。一般的に、発明または発明の態様が、具体的な要素、特徴などを含むと言及される場合、発明または発明の態様のあるいくつかの実施形態は、このような要素、特徴などからなるかまたはそれから本質的になる。
【０１９１】
反対であると明確に記載しない限り、１より多いステップまたは活動を含む本明細書で請求される任意の方法において、方法のステップまたは活動の順序は、方法のステップまたは活動が記載される順序に必ずしも限定されないことも理解されよう。
【０１９２】
本明細書において範囲を記載する場合、本発明は、終点が含まれる実施形態、両方の終点が除外される実施形態、および一方の終点が含まれ、他方が除外される実施形態を提供する。そうでないと記載しない限り、両方の終点が含まれると考えられる。さらに、そうでないと記載しない限りまたは文脈および当業者の理解からそうでないと明確でない限り、範囲として表される値は、文脈がそうでないと明確に指図しない限り、本発明の種々の実施形態において記載される範囲内の任意の特定の値または部分範囲を、範囲の下限の単位の１０分の１まで呈することができる。数値についての「約」とは、全般的に、そうでないと記載しない限りまたは文脈からそうでないと明確でない限り、値の±１０％、いくつかの実施形態において±５％、いくつかの実施形態において±１％、いくつかの実施形態において±０．５％内になる値の範囲のことをいう。数値が「約」で始まる本発明における任意の実施形態において、本発明は、厳密な値が記載される実施形態を提供する。数値が「約」で始まらない本発明の任意の実施形態において、本発明は、値が「約」で始まる実施形態を提供する。一連の数が「少なくとも」の句で始まる場合、この句は、列挙されるそれぞれの数に用いられることが理解されよう（パーセント同一性について記載するような文脈によっては、１００％の値が上限であり得ることが理解される）。本発明の任意の具体的な実施形態、特徴または態様は、任意の１または複数の請求項から明示的に除外される場合があることも理解される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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