(57)【要約】【課題】バイオサーファクタントを効率良く抽出・精製する方法を提供することを課題とする。【解決手段】バイオサーファクタントを産生する微生物を培養した培養液から、産生されたバイオサーファクタントを特定の脂肪族アルコールを用いて抽出・精製することを特徴とする、バイオサーファクタントの抽出・精製方法により、上記の課題を解決する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
バイオサーファクタントを産生する微生物を培養した培養液から、産生されたバイオサーファクタントを特定の脂肪族アルコールを用いて抽出・精製することを特徴とする、バイオサーファクタントの抽出・精製方法。
【請求項２】
前記培養液が、無処理であるか、または抽出・精製前もしくは後にアルカリ処理、またはアルカリおよび酸処理に付される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記バイオサーファクタントが、ソホロースリピッドである請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記脂肪族アルコールが、Ｃ4〜Ｃ7アルコールである請求項１〜３のいずれか１つに記載の方法。
【請求項５】
前記脂肪族アルコールが、1-ブタノール、1-ペンタノール、2-メチル-1-プロパノールまたはシクロヘキサノールである請求項１〜４のいずれか１つに記載の方法。
【請求項６】
前記微生物が、カンジダ  ボンビコラである請求項１〜５のいずれか１つに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオサーファクタントの抽出・精製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオサーファクタントは、広い意味では生物由来の界面剤の総称であり、より具体的には、微生物によって菌体外に生産される両親媒性脂質を意味する。
バイオサーファクタントは、微生物、特に酵母により産生され、高い界面活性を有するにもかかわらず、生分解性が高く、環境に対する負荷が小さいため、様々な産業分野での利用が期待される。最もよく研究されている糖脂質系のバイオサーファクタントとして、ラムノースリピッド、トレハロースリピッド、セルピオースリピッド、ソホロースリピッドがあり、これらは様々な培養方法で生産されている。
これらの中でも、ソホロースリピッドは、比較的安価な原料から高い生産性で得ることができるため、既に洗剤、化粧品、食品など幅広い分野で用いられており、さらにその簡便で効率良い製法が求められている。
【０００３】
一般的にバイオサーファクタントはグルコース等の糖、脂肪酸または植物油を原料として酵母による発酵法で製造される。しかしながら、バイオサーファクタント分子は、糖基および脂肪酸基を有するので、培養液から分離することが容易ではない。そのため、従来より様々な抽出・精製方法が検討されてきた。
【０００４】
特許文献１は、培養で生成したソホロースリピッドを酢酸エチルで抽出・精製する方法を開示している。しかし、酢酸エチルのソホロースリピッド抽出効率は決して高くなく、多量の酢酸エチルを必要としたり、抽出操作を繰り返す必要がある。
【０００５】
特許文献２は、有機溶剤を用いずにｐＨを調整して培養で生成したソホロースリピッドを沈降させて精製する方法を開示する。しかし、この方法では沈降に時間を要し、また無機塩などは完全な除去が難しい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００９−２０７４９３号公報
【特許文献２】特開２００３−９８９６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
このような背景から、本発明は、バイオサーファクタントを効率良く抽出・精製する方法の開発および提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記の課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、特定の脂肪族アルコールを用いて抽出・精製することにより、バイオサーファクタントを効率良く抽出・精製できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明によれば、バイオサーファクタントを産生する微生物を培養した培養液から、産生されたバイオサーファクタントを特定の脂肪族アルコールを用いて抽出・精製することを特徴とする、バイオサーファクタントの抽出・精製方法が提供される。
【００１０】
本発明に使用し得るバイオサーファクタントを産生可能な微生物は、特に限定されるものではない。
上記微生物としては、具体的には、ソホロースリピッドを産生可能なカンジダ  ボンビコラ(Candida bombicola)、カンジダ  ボゴリエンシス(C. bogoriensis)、カンジダ  マグノリエ(C. magnoliae)、カンジダ  グロペンギッセリ(C. gropengisseri)、およびカンジダ  アピコラ(C. apicola)；トレハロースリピッドを産生可能なロドコッカス  エリスロポリス(Rodococcus erythropolis)；セロビオースリピッドを産生可能なウスチラゴ  マイディス(Ustilago maydis)、クリプトコッカス  フミコラ(Cryptococcus humicola)、シュードザイマ  フロキュロサ(Pseudozyma flocculosa)、シュードザイマ  フジフォルマタ(P. fusiformata)；ラムノースリピッドを産生可能なシュードモナス  アエルギノサ(Pseudomonas aeruginosa)；サーファクチンを産生可能なバシラス  サブチリス(Bacillus subtilis)；ならびにマンノシルアラビトールリピッドおよびマンノシルエリスリトールリピッドを産生可能なシュードザイマ  アンタークティカ(P. antarctica)が挙げられる。
ソホロースリピッドを産生する微生物は、好ましくはカンジダ  ボンビコラである。
【００１１】
本発明に使用し得る特定の脂肪族アルコールとは、好ましくはＣ4〜Ｃ10の直鎖状、分枝鎖状または環状の飽和または不飽和の一価アルコールである。
上記の脂肪族アルコールとしては、具体的には、1-ブタノール、2-ブタノール、2-メチル-1-プロパノール、2-メチル-2-プロパノール、1-ペンタノール、2-ペンタノール、3-ペンタノール、2-メチル-1-ブタノール、2-メチル-2-ブタノール、3-メチル-1-ブタノール、3-メチル-2-ブタノール、3-メチル-1-ブチン-3-オール、2,2-ジメチル-1-プロパノール、フルフリルアルコール、テトラヒドロフルフリルアルコール、1-ヘキサノール、3-メトキシ-3-メチル-1-ブタノール、4-メチル-2-ペンタノール、2-エチル-1-ブタノール、シクロヘキサノール、ベンジルアルコール、1-ヘプタノール、2-へプタノール、3-ヘプタノール、2-メチルシクロヘキサノール、3-ジアセトキシ-3-メチル-1-ブタノール、1-オクタノール、2-オクタノール、3-オクタノール、2-エチル-1-ヘキサノール、3,5-ジメチル-1-ヘキサノール、テルピネオール、ジヒドロテルピネオールならびにこれらの構造異性体および立体異性体を挙げることができる。
上記の脂肪族アルコールは、好ましくはＣ4〜Ｃ7の直鎖状、分枝鎖状または環状の飽和または不飽和の一価アルコールであり、より好ましくは1-ブタノール、1-ペンタノール、2-メチル-1-プロパノールまたはシクロヘキサノールである。特に、1-ブタノールは、安価で抽出能力が高いのでより好ましい。
上記の脂肪族アルコールの使用量は、バイオサーファクタントを含む培養液に対して好ましくは０．５〜２倍重量、より好ましくは０．７〜１．５倍重量である。０．５倍重量未満であると、バイオサーファクタントを効率良く抽出・精製することができず、２倍重量を超えると、多量の脂肪族アルコールを用いることになるので経済的ではない。上記の脂肪族アルコールは、単独で用いてもよいし、２種類以上の脂肪族アルコールを任意の割合で混合して用いてもよい。
【００１２】
なお、本発明の方法で、培養液のアルコール処理前または後に、アルカリまたは酸処理をしてもよい。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の抽出・精製方法によれば、バイオサーファクタントを効率良く抽出・精製することが可能となる。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明において用いられる用語「培養液」とは、バイオサーファクタントを産生する微生物を液体培地に加え、培養して得られた培養混合物を意味する。
本発明は、バイオサーファクタントを産生する微生物を培養した培養液から、産生されたバイオサーファクタントを特定の脂肪族アルコールを用いて抽出・精製することを特徴とする、バイオサーファクタントの抽出・精製方法である。
【００１５】
バイオサーファクタントとは、微生物、特に酵母により産生される親水性基および疎水性基が直接または間接的に結合した化合物であって、かつ界面活性を有する化合物を意味する。
バイオサーファクタントとしては、ソホロースリピッド、トレハロースリピッド、セロビオースリピッド、ラムノースリピッド、サーファクチン、エマルザン、マンノシルエリスリトールリピッド、マンノシルマンニトールリピッド、マンノシルソルビトールリピッド、マンノシルアラビトールリピッド、マンノシルリビトールリピッド、スピクルスポル酸などが挙げられる。バイオサーファクタントは、好ましくはソホロースリピッドである。
【００１６】
バイオサーファクタントは、その親水基の構造から、糖型、アミノ酸型、有機酸型、高分子型に分類され、現在では数十種類のものが知られている。
親水基としては、上記の分類にあるように糖、アミノ酸またはカルボン酸類が、疎水基としては各種飽和、不飽和、直鎖状もしくは分枝鎖状の中鎖および長鎖脂肪酸が知られている。
具体的な疎水基としては、Ｃ6〜Ｃ28の、アルキレンまたは少なくとも１つの二重結合を有する二価の不飽和脂肪族炭化水素基などが挙げられる。該脂質は、好ましくはＣ8〜Ｃ24アルキレンであり、より好ましくはＣ12〜Ｃ20アルキレンである。
【００１７】
バイオサーファクタントの一例としてソホロースリピッドを用い本発明の一つの態様を以下、説明する。
下記の一般式(I)および(II)で表される化合物は、ソホロースリピッドの構造式の一例である。
ソホロースリピッドは、一般式(I)：
【００１８】
【化１】
2014117240.tif 000002
（式中、Ｒ1およびＲ2は、それぞれ独立して、Ｈまたはアセチル基などに代表される任意の基から選択される。ｎは、３〜２５の整数である。）
で表される酸型ソホロースリピッドであってもよいし、一般式(II)：
【００１９】
【化２】
2014117240.tif 000003
（式中、Ｒ1およびＲ2は、それぞれ独立して、Ｈまたはアセチル基などに代表される任意の基から選択される。ｎは、３〜２５の整数である。）
で表されるラクトン型ソホロースリピッドであってもよい。
【００２０】
また、上記の一般式(I)および(II)における疎水基は、上記の一般式に記載の疎水基に限定されるものではなく、Ｃ6〜Ｃ28の、飽和もしくは不飽和および直鎖もしくは分枝鎖状の炭化水素基であってもよく、これらの基はさらにアミノ基、ヒドロキシ基および１以上のカルボキシ基を有していてもよい。
なお、ラクトン型ソホロースリピッドは、下記のアルカリ処理などの処理により、酸型ソホロースリピッドに変換できる。
【００２１】
なお、本発明により得られるソホロースリピッドは、そのまま洗剤に用いることもできるが、ラクトン型または酸型もしくはその塩であるソホロースリピッドをさらに親水性誘導体もしくはデシルなどＣ8〜Ｃ10アルキルアミド誘導体あるいはプロピレンオキサイドを付加させて洗剤や香粧品の原料とすることができる。
【００２２】
なお、本発明によるバイオサーファクタントの抽出・精製方法の適用対象は、上記のソホロースリピッドに限られるものではなく、前記の種々のバイオサーファクタントを適用できるのも、本発明の一つの特徴である。
【００２３】
バイオサーファクタントを産生する微生物は、上記のとおりである。
バイオサーファクタントを産生する微生物の培養は、特に限定されず、当業者に公知の任意の培養方法を用いて行うことができる。
具体的には、流加培養、回分培養、反復回分培養、連続培養(例えばケモスタット又はタービドスタット)、半連続培養などの培養プロセス及びこれらの組合せが挙げられる。培養条件は、微生物の種類、使用するバイオリアクターなどの様々な要因を考慮して、当業者が適宜決定することができる。微生物の培養は、好ましくは液体培地を用いる回分培養あるいは培養系に糖質および/または有機窒素源を連続添加する流加培養であり、通気攪拌することがより好ましい。
バイオリアクターとしては、特に限定されず、微生物の種類などに基づいて、当業者に公知のものから選択できる。具体的な例としては、気泡塔型培養槽、通気撹拌培養槽、ジャーファーメンターなどが挙げられる。
【００２４】
培地は、特に限定されず、当業者に公知のものを用いることができる。
具体的には、半合成培地、すなわち複合化合物(例えば酵母抽出物、大豆ペプトン、カザミノ酸)を含む培地(例えばＬＢ培地など)、複合化合物を含まない化学的に定義された物質(例えば、グルコース、塩(ＮａＣｌ)などの重量に基づいて分子量を算出できる物質)からなる合成培地(例えばＤａｖｉｓ培地など)、および天然培地などが挙げられる。
培地は、好ましくは半合成培地である。
ソホロースリピッド生産を効率よく行うために、炭素源としてグルコース、ショ糖、廃糖蜜などの糖質を用いることが望ましい。糖質に加えて、もしくは糖質の代わりに、油脂類などを炭素源として用いてもよい。
窒素源としては、有機窒素源と無機窒素源とを組み合わせて用いることが望ましい。
【００２５】
培養に用いられ得る糖類は、培養に用いる微生物が資化できるものであれば、特に限定されない。このような糖類としては、例えば、グルコース、ガラクトース、フルクトースなどの単糖類、ショ糖およびマルトースなどの二糖類が挙げられる。
糖類は、好ましくはグルコースである。
糖類の培養開始時の濃度は、１０〜１５０ｇ／Ｌである。
【００２６】
培養に用いられ得る油脂類としては、特に限定されず、当業者に公知のものを用いることができる。上記の油脂類は、植物油および脂肪酸もしくはそのエステル類、またはそれらの混合物であってもよい。
培養に用いられ得る植物油としては、例えば大豆油、菜種油、とうもろこし油、綿実油、ひまわり油、カポック油、ゴマ油、米油、落花生油、ベニバナ油、オリーブ油、亜麻仁油、蓖麻子油、パーム油、パーム核油およびやし油またはこれらの混合物などが挙げられる。
【００２７】
上記油脂類としての脂肪酸および脂肪酸エステルは、Ｃ10〜Ｃ24、好ましくはＣ16〜Ｃ18の脂肪酸または脂肪酸エステルである。このような脂肪酸または脂肪酸エステルは、分子内に１〜３個の不飽和結合を含んでいてもよい。
上記の脂肪酸および脂肪酸エステルとしては、例えばデカン酸、ウンデカン酸、ラウリン酸、トリデカン酸、ミリスチン酸、ペンタデカン酸、パルミチン酸、マルガリン酸、ノナデカン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸などの飽和脂肪酸またはそのエステル、あるいはトウハク酸、リンデル酸、ツズ酸、ミリストレイン酸、パルミトレイン酸、ペトロセリン酸、オレイン酸、エライジン酸、バクセン酸、エルカ酸、ソルビン酸、リノール酸、リノエライジン酸、γ−リノレン酸、リノレン酸およびアラキドン酸などの不飽和脂肪酸またはそのエステルが挙げられる。
【００２８】
上記油脂類は、培地中濃度が好ましくは２０〜２００ｇ／Ｌ、より好ましくは５０〜１５０ｇ／Ｌの範囲となるように添加する。流加培養の場合には、上記油脂類の培地中濃度が上記の範囲に収まるように培養期間中に連続的もしくは断続的に添加する。
【００２９】
有機窒素源としては、酵母エキス、麦芽エキス、ペプトン、ポリペプトン、コーンスティープリカー、カザミノ酸および尿素などのうち、一種類もしくは二種類以上を組み合わせて用いることができる。
有機窒素源は、好ましくは１〜８ｇ／Ｌの酵母エキスである。
無機窒素源としては、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウムおよびアンモニアなどのうち、１種類もしくは２種類以上を組み合わせて用いることができる。
無機窒素源は、好ましくは硝酸ナトリウムである。
【００３０】
培地の初期ｐＨは、酸性〜中性の範囲であれば特に問題は無いが、ｐＨ３．０〜９．０に調整することが好ましく、ｐＨ６．０〜８．０に調整することがより望ましい。
培地の量は、微生物の種類、使用するバイオリアクター、培養時間などの様々な要因を考慮して、当業者が適宜決定することができる。
培養温度は、好ましくは２０〜３５℃であり、より好ましくは２８〜３０℃である。
培養時間は、好ましくは４８〜１６８時間であり、より好ましくは４８〜１２０時間である。
【００３１】
得られた培養液はそのまま、あるいは濾過または遠心分離後に、抽出・精製に付すことができる。
通常、発酵によって得られたバイオサーファクタントは様々な形態で存在している。例えばソホロースリピッドは、上記の式(I)で表される酸型ソホロースリピッドおよび式(II)で表されるラクトン型ソホロースリピッドの混合物として存在している。
培養後、上記のようにして得られる培養液は、任意にアルカリおよび酸処理に付してもよい。このアルカリおよび酸処理は、下記の抽出・精製の前後に行うことができる。
しかしながら、得られたバイオサーファクタントを洗浄剤などの用途に用いる場合には、より洗浄能力を高めるために、得られる培養液をアルカリ処理してラクトン型ソホロースリピッドを酸型ソホロースリピッドに変換することが望ましい。
【００３２】
アルカリ処理は、上記のようにして得られたバイオサーファクタントを含む培養液にアルカリ水溶液を加えることにより行う。
アルカリ処理に用いられるアルカリとしては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム、重炭酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、重炭酸カリウム、炭酸カリウムなどのアルカリ金属の固体またはこれらの水溶液などが挙げられる。アルカリは、好ましくは水酸化ナトリウム溶液である。
アルカリの使用量は、アルカリ処理液のｐＨは、好ましくは９．０以上、より好ましくは１１以上となる量である。
アルカリ処理時間は、好ましくは１分〜１０時間であり、より好ましくは３０分〜１時間３０分である。
アルカリ処理温度は、好ましくは０〜１００℃であり、より好ましくは室温〜６０℃である。
なお、アルカリ処理後の処理液中のバイオサーファクタントは金属塩の形態にあり、そのまま洗浄剤などに用いてもよいし、水を常圧あるいは減圧下留去するか、または水を更に加えることにより濃度を調製して用いてもよい。
【００３３】
上述のように、培養液をアルカリまたは酸処理に付した後、下記の抽出・精製を行ってもよい。
酸処理に用いる酸としては、塩酸、硫酸、燐酸などの酸などが挙げられる。酸は、好ましくは塩酸である。
酸の使用量は、酸処理液のｐＨが好ましくはｐＨ０．１〜０．９、より好ましくはｐＨ０．２〜０．８となる量である。
酸処理時の温度は、好ましくは０〜８０℃、より好ましくは１５〜５０℃、更に好ましくは室温である。
【００３４】
上記のようにして得られた培養液、アルカリ処理液、またはアルカリおよび酸処理液に含まれるバイオサーファクタントは、特定の脂肪族アルコールを用いて抽出・精製できる。
特定の脂肪族アルコールとは、上記のとおり、Ｃ4〜Ｃ10の直鎖状、分枝鎖状または環状の飽和または不飽和の一価アルコールを意味する。
Ｃ4〜Ｃ10アルコールは、水酸基を持っているため、酢酸エチルなどのエステル系溶剤に比べてバイオサーファクタントを抽出する能力が高く、また培養液の水層と分液する条件を選べば、培養液から効率良くバイオサーファクタントを抽出・精製することができることが判った。
【００３５】
抽出・精製の前には、培養液のｐＨを調整することが好ましい。
培養液のｐＨは、好ましくはｐＨ０．１〜０．９、より好ましくはｐＨ０．２〜０．８に調整する。ｐＨ調整には、塩酸、硫酸、酢酸、燐酸などの酸性化合物または水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム、重炭酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、重炭酸カリウム、炭酸カリウムなどのアルカリ性化合物を用いることができる。
【００３６】
上記のようにして任意にｐＨ調整した培養液に、上記アルコールを加えて振盪または攪拌し、抽出・精製後静置して分液する。
抽出・精製は、分液ロートまたは密閉もしくは開放容器を用い、任意の振盪機、撹拌機または超音波発生機の使用下に振盪または撹拌して行うことができる。
振盪または撹拌による抽出・精製時の温度は、好ましくは１０〜８０℃、より好ましくは１５〜６０℃、更に好ましくは２０〜３５℃である。
振盪または撹拌による抽出・精製時間は、懸濁液の状態に基づいて当業者が任意に決定できるが、好ましくは５〜６０分、より好ましくは１０〜４０分、更に好ましくは１５〜３０分継続してもよい。
【００３７】
なお、分液性をより良好にし、抽出・精製効率を上げるために、食塩、塩化カリウム、塩化カルシウムなどの無機塩を添加してもよい。これら無機塩の添加量は、好ましくは、培養液に対して０〜３０％である。
静置して層が分離した後、バイオサーファクタントを含むアルコール層と水層を分離する。水層に残っているバイオサーファクタントを可能な限りアルコール層側に分離するために、さらに新たな抽出溶媒を用いて抽出を繰り返すのが、抽出・精製効率の観点から好ましい。
なお、得られた培養液をそのまま抽出・精製に付した場合、菌体が水層に存在し、アルコール層に含まれないことも本発明の特徴の１つである。
【００３８】
上記のようにして得られた抽出液は、更なる処理に付してもよい。
すなわち、抽出液を濃縮するか、濃縮乾固などに付すことができる。
また、アルコール抽出液を水、または無機塩を含む上記の水溶液を用いて、１回以上洗浄してもよい。
水または無機塩を含む水溶液の使用量は、バイオサーファクタントを含むアルコール溶液に対して好ましくは０．５〜４倍量であり、より好ましくは０．８〜１．５倍量である。
あるいは、アルコール抽出液に含まれるアルコールを、減圧蒸留などによって除去してもよい。減圧蒸留などによって除去されたアルコールは、回収し、再利用してもよい。
これにより、酸型のバイオサーファクタントを得ることができる。
【００３９】
また、バイオサーファクタント金属塩を得たい場合は、得られた培養液に水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム、重炭酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、重炭酸カリウム、炭酸カリウムなどのアルカリ金属の水溶液を加えて、好ましくはｐＨ７〜１２、より好ましくはｐＨ８〜１１に調整して上記の抽出・精製に付すことによりバイオサーファクタント金属塩を得ることが可能となる。
【００４０】
このようにして得られたバイオサーファクタントおよびバイオサーファクタント金属塩は、洗浄剤、化粧品、食品、高分子添加剤など様々な用途に使用することができる。
【実施例】
【００４１】
以下、具体的な実施例を説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００４２】
製造例
ソホロースリピッドの培養方法
カンジダ  ボンビコラを用いた種培養
ディープフリーザー(−８０℃)で冷凍保存したカンジダ  ボンビコラＮＢＲＣ１０２４３を４００ｍＬのＨＢＧ培地(グルコース２％、酵母エキス０．５％、ペプトン０．５％、ｐＨ６)に移し、３０℃で４８時間振盪培養した。
【００４３】
本培養
３０Ｌ容ジャーファーメンターに本培養培地(グルコース１５％、大豆油１５％、ＫＨ2ＰＯ4 ０．１％、ＭｇＳＯ4 ０．０５％、尿素０．１％、酵母エキス０．５％、ｐＨ６)１８Ｌを入れ、１２１℃で２０分間加圧蒸気滅菌した。上述の種培養液４００ｍＬを加え、３０℃で４日間通気撹拌培養を行った。
得られたソホロースリピッドを含む培養液をＨＰＬＣで分析したところ、ラクトン型ソホロースリピッドおよび酸型ソホロースリピッドの含有率は、それぞれ５４．７％および４２．１％であった。
【００４４】
＜ＨＰＬＣ分析条件＞
カラム：ドイツナーゲル社ヌクレオシル５Ｃ１８  ４．６ｍｍ×１５ｃｍ、４０℃
移動相：アセトニトリル：０．７％過塩素酸水＝７：３  １ｍＬ／ｍｉｎ
検  出：ＵＶ２０５ｎｍ
【００４５】
実施例１
1-ブタノールを用いるソホロースリピッドの抽出
製造例で得られたソホロースリピッドを含む培養液２７５．１ｇ、次いで1-ブタノール２３１．８ｇを１Ｌの分液ロートに加え、常法に従って室温で抽出後分液した。下層を取り除いた後、エバポレーターを用いて上層を減圧濃縮したところ、残渣４２．９ｇを得た。これをＨＰＬＣで分析したところ、ラクトン型ソホロースリピッドが５０．５％、酸型ソホロースリピッドが３６．０％含まれており、ソホロースリピッドを含む培養液からの収率は１６．０％であることがわかった。
【００４６】
実施例２
2-メチル-1-プロパノールを用いるソホロースリピッドの抽出
製造例で得られたソホロースリピッドを含む培養液３０．２ｇ、次いで2-メチル-1-プロパノール３０．２ｇを１００ｍＬの分液ロートに加え、常法に従って室温で抽出後分液した。下層を分離後、エバポレーターを用いて上層を減圧濃縮したところ、残渣３．７０ｇを得た。これをＨＰＬＣで分析したところ、ラクトン型ソホロースリピッドが４４．７％、酸型ソホロースリピッドが４３．３％含まれており、ソホロースリピッドを含む培養液からの収率は１２．３％であることがわかった。
【００４７】
実施例３
シクロヘキサノールを用いるソホロースリピッドの抽出
製造例で得られたソホロースリピッドを含む培養液３０．５ｇ、次いでシクロヘキサノール３０．１ｇを１００ｍＬの分液ロートに加え、常法に従って室温で抽出後分液した。下層を分離後、エバポレーターを用いて上層を減圧濃縮したところ、残渣３．９３ｇを得た。これをＨＰＬＣで分析したところ、ラクトン型ソホロースリピッドが４２．７％、酸型ソホロースリピッドが４８．６％含まれており、ソホロースリピッドを含む培養液からの収率は１２．９％であることがわかった。
【００４８】
実施例４
培養液から1-ブタノールでソホロースリピッドを抽出後、アルカリ−酸処理で酸型ソホロースリピッドの製造
製造例で得られたソホロースリピッドを含む培養液１０４．７ｇ、次いで1-ブタノール９６．４ｇを５００ｍＬの分液ロートに加え、常法に従って室温で抽出後分液した。下層を分離後、上層に４８％水酸化ナトリウム水溶液５．２９ｇ（ＮａＯＨ  ６４ｍｍｏｌ）を加えてｐＨ１０とし、８５℃で１時間攪拌後、冷却した。これをエバポレーターで減圧濃縮したところ、残渣２０．５ｇを得た。これをＨＰＬＣで分析したところ、ラクトン型ソホロースリピッドは検出されず、酸型ソホロースリピッドが７８．８％含まれており、ソホロースリピッドを含む培養液からの収率は１５．４％であることがわかった。
【００４９】
実施例５
培養液をアルカリ−酸処理した後1-ブタノールでソホロースリピッドを抽出する酸型ソホロースリピッドの製造
製造例で得られたソホロースリピッドを含む培養液１７８．７ｇに４８％水酸化ナトリウム水溶液１２．０２ｇ（ＮａＯＨ  １４４ｍｍｏｌ）を加え、ｐＨ１０とした。これを８５℃で１時間攪拌して室温に冷却した。２１％塩酸水溶液２５ｇ（ＨＣｌ  ４４ｍｍｏｌ）を加え、ｐＨ２．０とした後、1-ブタノール１１６．８ｇを５００ｍＬの分液ロートに加え、常法に従って室温で抽出後分液した。下層を取り除いた後、上層を水３０．８ｇ、さらに水４３．７ｇを用いて２回水洗した。その後上層に４８％ＮａＯＨ水溶液５．４ｇ（ＮａＯＨ  ６５ｍｍｏｌ）を加え、ｐＨ１０とした後、エバポレーターで減圧濃縮し、残渣２１．１６ｇを得た。これをＨＰＬＣで分析したところ、ラクトン型ソホロースリピッドは検出されず、酸型ソホロースリピッド８４％が含まれており、ソホロースリピッドを含む培養液からの収率は９．９％であることがわかった。
【００５０】
比較例１
酢酸エチルを用いるソホロースリピッドの抽出
製造例で得られたソホロースリピッドを含む培養液１７９．６ｇ、次いで酢酸エチル１５２．０６ｇを５００ｍＬの分液ロートに加え、常法に従って室温で抽出後分液した。分液した下層に再び酢酸エチル１００．８４ｇを加えて分液し、下層を分離した。得られた酢酸エチル抽出液をあわせ、エバポレーターで減圧濃縮したところ、残渣１０．９９ｇを得た。これをＨＰＬＣで分析したところ、ラクトン型ソホロースリピッドが６５．０％、酸型ソホロースリピッドが２２．２％含まれており、ソホロースリピッドを含む培養液からの収率は５．３％であった。
【００５１】
比較例２
クロロホルムを用いるソホロースリピッドの抽出
製造例で得られたソホロースリピッドを含む培養液１００．６ｇ、次いでクロロホルム１００ｇを５００ｍＬの分液ロートに加え、常法に従って室温で抽出後分液した。分液後、下層をエバポレーターで減圧濃縮したところ、残渣２．２ｇを得た。これをＨＰＬＣで分析したところ、ラクトン型ソホロースリピッドが７１．０％、酸型ソホロースリピッドが１２．２％含まれており、ソホロースリピッドを含む培養液からの収率は１．８％であった。
【００５２】
比較例３
1-ヘキサンを用いるソホロースリピッドの抽出
製造例で得られたソホロースリピッドを含む培養液１００．６ｇ、次いで1-ヘキサン８５ｇを５００ｍＬの分液ロートに加え、常法に従って室温で抽出後分液した。下層を分離後、エバポレーターを用いて上層を減圧濃縮したところ、残渣１．２ｇを得た。これをＨＰＬＣで分析したところ、ラクトン型ソホロースリピッドが３２．０％、酸型ソホロースリピッドが５．０％含まれており、ソホロースリピッドを含む培養液からの収率は０．４％であった。
【００５３】
【表１】
2014117240.tif 000004
【００５４】
上記の結果を表１にまとめる。本発明によるバイオサーファクタントの抽出・精製方法は、比較例に比べて非常に優れていることが判った。