(57)【要約】【課題】中性スフィンゴミエリナーゼ１によるストレス誘導性アポトーシスの調節メカニズムを明らかにし、その解析ツールを提供すること。【解決手段】ＪＮキナーゼによるリン酸化標的であるセリン残基がリン酸化された、リン酸化中性スフィンゴミエリナーゼ１ポリペプチド、又は当該リン酸化セリン残基を含み、且つ１０アミノ酸以上の長さを有するその部分ポリペプチド。該リン酸化中性スフィンゴミエリナーゼ１ポリペプチドを特異的に認識する抗体。ＪＮキナーゼによるリン酸化標的であるセリン残基がセリン以外のアミノ酸残基に置換された、中性スフィンゴミエリナーゼ１変異体ポリペプチド。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（１）又は（２）のポリペプチド：
（１）ＪＮキナーゼによるリン酸化標的であるセリン残基がリン酸化された、リン酸化中性スフィンゴミエリナーゼ１ポリペプチド、及び
（２）（１）のポリペプチドの部分アミノ酸配列であって、ＪＮキナーゼによるリン酸化標的であるセリン残基を含み、且つ１０アミノ酸以上の長さを有する部分アミノ酸配列を含み、且つ当該セリン残基がリン酸化されている、ポリペプチド。
【請求項２】
リン酸化中性スフィンゴミエリナーゼ１ポリペプチドが、配列番号１、２又は３で表されるアミノ酸配列を含む、請求項１記載のポリペプチド。
【請求項３】
以下の（１’）又は（２’）のポリペプチドをＪＮキナーゼでリン酸化することを含む、請求項１記載のポリペプチドの製造方法：
（１’）中性スフィンゴミエリナーゼ１ポリペプチド、及び
（２’）（１’）のポリペプチドの部分アミノ酸配列であって、ＪＮキナーゼによるリン酸化標的であるセリン残基を含み、且つ１０アミノ酸以上の長さを有する部分アミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
【請求項４】
請求項１又は２記載のポリペプチドを特異的に認識する抗体。
【請求項５】
請求項４記載の抗体を含む、リン酸化中性スフィンゴミエリナーゼ１ポリペプチド検出用試薬。
【請求項６】
請求項４記載の抗体を用いることを含む、リン酸化中性スフィンゴミエリナーゼ１ポリペプチドの検出方法。
【請求項７】
細胞内における請求項１記載のポリペプチドを検出することを含む、該細胞におけるストレス誘導アポトーシスシグナルの活性化状態の評価方法。
【請求項８】
ＪＮキナーゼによるリン酸化標的であるセリン残基がセリン以外のアミノ酸残基に置換された、中性スフィンゴミエリナーゼ１変異体ポリペプチド。
【請求項９】
該セリン残基がアラニン残基に置換される、請求項８記載の変異体ポリペプチド。
【請求項１０】
該セリン残基がグルタミン酸残基に置換される、請求項８記載の変異体ポリペプチド。
【請求項１１】
請求項８〜１０のいずれか１項に記載の変異体ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項１２】
請求項１１記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項１３】
請求項１２記載の発現ベクターを含む形質転換体。
【請求項１４】
細胞内に請求項９記載の変異体ポリペプチド、又はその発現ベクターを導入することを含む、細胞のストレス誘導アポトーシスの阻害方法。
【請求項１５】
細胞内に請求項１０記載の変異体ポリペプチド、又はその発現ベクターを導入することを含む、細胞のストレス誘導アポトーシスの促進方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リン酸化中性スフィンゴミエリナーゼ１、リン酸化中性スフィンゴミエリナーゼ１を特異的に認識する抗体、リン酸化中性スフィンゴミエリナーゼ１の検出方法等に関する。また、本発明は、リン酸化されるセリン残基が他のアミノ酸残基へ置換された中性スフィンゴミエリナーゼ１変異体、当該変異体をコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、該発現ベクターを含む形質変換体、及びこれらの用途等に関する。
【背景技術】
【０００２】
中性スフィンゴミエリナーゼ１は、Mg2+依存的に中性条件でスフィンゴミエリンを加水分解しセラミドを生成する酵素である（非特許文献１〜４）。スフィンゴミエリナーゼには、微生物由来の細胞外酵素や動物細胞の細胞内局在性が異なる多数のアイソザイムが報告されている。これらのうち、遺伝子番号SMPD１からSMPD5までの５種類のアイソザイム遺伝子がほ乳類およびゼブラフィッシュで報告された（非特許文献１〜４）。SMPD１はリソゾームに由来する酸性スフィンゴミエリナーゼ（P17405）を、SMPD２〜５は中性スフィンゴミエリナーゼを、それぞれコードしているが、これらのスフィンゴミエリナーゼは細胞内局在性が異なることから、生体内での役割がそれぞれ異なっていると考えられている。魚類細胞を用いた研究から、ストレス条件下で活性化されて、細胞膜のスフィンゴミエリンからセラミドを遊離させアポトーシスを誘発するスフィンゴミエリナーゼとして、中性スフィンゴミエリナーゼ１（neutral sphingomyelin phosphodiesterase 2、遺伝子名SMPD2）が発見された（非特許文献４〜７）。これに相当するほ乳類由来のスフィンゴミエリナーゼは、ヒトおよびマウスから遺伝子配列が単離同定されているが、これらほ乳類の中性スフィンゴミエリナーゼ１がストレス誘導性アポトーシスに関与するかどうかは、十分な解析がなされておらず、リン酸化による活性調節も知られていない（特許文献１、非特許文献８）。現在、細胞生物学分野の研究によって、成長因子やサイトカイン、化学療法薬、放射線照射、飢餓、ストレス等に対する応答として、この中性スフィンゴミエリナーゼ１が活性化され、セラミド合成が亢進し、アポトーシスが誘導されることが多数の動物細胞で報告されている（非特許文献５〜７）。しかしながら、中性スフィンゴミエリナーゼ１がストレス誘導性アポトーシスの引き金となることはゼブラフィッシュ細胞由来のものしか確認されておらず、ほ乳類由来細胞で、中性スフィンゴミエリナーゼ１の活性化によってアポトーシスが誘導されるかどうかは依然不明である。また、中性スフィンゴミエリナーゼ１がストレス刺激によって活性化され、セラミドを生成する分子機序も不明である。中性スフィンゴミエリナーゼ１がリン酸化される生物応答は知られていないので、リン酸化された中性スフィンゴミエリナーゼ１の存在は知られておらず、その検出技術、リン酸化された酵素に対する抗体はこれまでに作製されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】国際公開第９９／０７８５５号
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Hofman, K et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2000; 97: 5895-5900.
【非特許文献２】Krut O et al., J. Biol. Chem. 2006; 281: 13784-13793.
【非特許文献３】Tomiuk S et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1998; 95: 3638-3643.
【非特許文献４】Yabu T et al., J. Biol. Chem. 2008; 283: 29971-29982.
【非特許文献５】Yabu T et al., Blood 2005; 106: 125-134.
【非特許文献６】Yabu T et al., Fish. Sci. 2003; 69: 1218-1223.
【非特許文献７】藪 健史、山下倫明、水産総合研究センター研究報告 ２００８；２６：１５-２１．
【非特許文献８】Sawai H et al., J. Biol. Chem. 1999; 274: 38131-38139.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、中性スフィンゴミエリナーゼ１によるストレス誘導性アポトーシスの調節メカニズムを明らかにし、その解析ツールを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記目的に鑑み、鋭意検討を行った結果、中性スフィンゴミエリナーゼ１は、c-jun N-terminal kinase (JN キナーゼ, JNK)によって、特異的にリン酸化されることによって、活性化する化学反応を見いだし、特異的なリン酸化部位がセリン残基（Ser-270）であることを明らかにした。このスフィンゴミエリナーゼ１のリン酸化部位の周辺に位置する特定のアミノ酸配列のペプチドを抗原とすることで、活性型の中性スフィンゴミエリナーゼ１に特異的に反応する抗体を作成することに成功した。更に、Ser-270を他のアミノ酸に置換することにより、ドミナントネガティブ型の中性スフィンゴミエリナーゼ１変異体や、恒常的に活性化した中性スフィンゴミエリナーゼ１変異体を作成することに成功した。本発明者らは、これらの知見に基づき更に検討を進め、本発明を完成した。
【０００７】
即ち、本発明は以下に関する。
［１］以下の（１）又は（２）のポリペプチド：
（１）ＪＮキナーゼによるリン酸化標的であるセリン残基がリン酸化された、リン酸化中性スフィンゴミエリナーゼ１ポリペプチド、及び
（２）（１）のポリペプチドの部分アミノ酸配列であって、ＪＮキナーゼによるリン酸化標的であるセリン残基を含み、且つ１０アミノ酸以上の長さを有する部分アミノ酸配列を含み、且つ当該セリン残基がリン酸化されている、ポリペプチド。
［２］リン酸化中性スフィンゴミエリナーゼ１ポリペプチドが、配列番号１、２又は３で表されるアミノ酸配列を含む、［１］のポリペプチド。
［３］以下の（１’）又は（２’）のポリペプチドをＪＮキナーゼでリン酸化することを含む、［１］のポリペプチドの製造方法：
（１’）中性スフィンゴミエリナーゼ１ポリペプチド、及び
（２’）（１’）のポリペプチドの部分アミノ酸配列であって、ＪＮキナーゼによるリン酸化標的であるセリン残基を含み、且つ１０アミノ酸以上の長さを有する部分アミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
［４］［１］又は［２］のポリペプチドを特異的に認識する抗体。
［５］［４］の抗体を含む、リン酸化中性スフィンゴミエリナーゼ１ポリペプチド検出用試薬。
［６］［４］の抗体を用いることを含む、リン酸化中性スフィンゴミエリナーゼ１ポリペプチドの検出方法。
［７］細胞内における［１］のポリペプチドを検出することを含む、該細胞におけるストレス誘導アポトーシスシグナルの活性化状態の評価方法。
［８］ＪＮキナーゼによるリン酸化標的であるセリン残基がセリン以外のアミノ酸残基に置換された、中性スフィンゴミエリナーゼ１変異体ポリペプチド。
［９］該セリン残基がアラニン残基に置換される、［８］の変異体ポリペプチド。
［１０］該セリン残基がグルタミン酸残基に置換される、［８］の変異体ポリペプチド。
［１１］［８］〜［１０］のいずれかに記載の変異体ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。
［１２］［１１］のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
［１３］［１２］の発現ベクターを含む形質転換体。
［１４］細胞内に［９］の変異体ポリペプチド、又はその発現ベクターを導入することを含む、細胞のストレス誘導アポトーシスの阻害方法。
［１５］細胞内に［１０］の変異体ポリペプチド、又はその発現ベクターを導入することを含む、細胞のストレス誘導アポトーシスの促進方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明のリン酸化中性スフィンゴミエリナーゼ１、抗リン酸化中性スフィンゴミエリナーゼ１抗体及び中性スフィンゴミエリナーゼ変異体を用いることにより、ストレス誘導性アポトーシスの調節メカニズムの詳細なメカニズム解析が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】中性スフィンゴミエリナーゼ１ポリペプチドのアミノ酸配列をコンピュータ解析した結果である。
【図２】抗リン酸化中性スフィンゴミエリナーゼ１抗体の特異性をＥＬＩＳＡにより解析した結果である。
【図３】抗リン酸化中性スフィンゴミエリナーゼ１抗体を用いたウエスタンブロットにより、ヒト由来培養細胞とヒラメ由来培養細胞の抽出物中にリン酸化中性スフィンゴミエリナーゼ１を検出した結果である。
【図４】ゼブラフィッシュ中性スフィンゴミエリナーゼ１のＪＮキナーゼによるリン酸化を、抗リン酸化中性スフィンゴミエリナーゼ１抗体を用いたウエスタンブロット法で検出した結果である。
【図５】ゼブラフィッシュ培養細胞へのストレスによる中性スフィンゴミエリナーゼ１のリン酸化誘導。熱ショックおよび紫外線照射で中性スフィンゴミエリナーゼ１がリン酸化された（実施例５）。
【図６】野生型中性スフィンゴミエリナーゼ1、又は中性スフィンゴミエリナーゼ1変異体の発現ベクター導入による、ゼブラフィッシュ培養細胞におけるアポトーシスの誘導。
【図７】抗リン酸化中性スフィンゴミエリナーゼ１抗体による、ヒト由来培養細胞におけるリン酸化中性スフィンゴミエリナーゼ１の検出。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
１．リン酸化中性スフィンゴミエリナーゼ１ポリペプチド
本発明は、
（１）ＪＮキナーゼによるリン酸化標的であるセリン残基がリン酸化された、リン酸化中性スフィンゴミエリナーゼ１ポリペプチド（本発明のリン酸化中性スフィンゴミエリナーゼ１ポリペプチド）、又は
（２）（１）のポリペプチドの部分アミノ酸配列であって、ＪＮキナーゼによるリン酸化標的であるセリン残基を含み、且つ１０アミノ酸以上の長さを有する部分アミノ酸配列を含み、且つ当該セリン残基がリン酸化されている、ポリペプチド（本発明のリン酸化部分ポリペプチド）
を提供する。上記（１）及び（２）を併せて、本発明のリン酸化ポリペプチドと称する場合がある。
【００１１】
好ましい態様において、本発明のリン酸化ポリペプチドは、非ヒト哺乳動物（例、ウサギ）に投与したときに、当該リン酸化ポリペプチドに対する特異的抗体産生を誘導し得る。当該特異的抗体のエピトープには、リン酸化された、ＪＮキナーゼによるリン酸化標的であるセリン残基が含まれる。
【００１２】
中性スフィンゴミエリナーゼ１は、Ｍｇ２＋依存的に中性条件でスフィンゴミエリンを加水分解しセラミドを生成する公知の酵素であり、neutral sphingomielin phosphodiesterase 2 (SMPD2)とも呼ばれる。
【００１３】
本明細書中、中性スフィンゴミエリナーゼ１ポリペプチドは、任意の真核生物由来のものであり得る。真核生物としては、例えば、哺乳動物、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、昆虫、酵母等を挙げることができるが、哺乳動物又は魚類が好ましい。哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類やウサギ等の実験動物；ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ、ミンク等の家畜；イヌ、ネコ等のペット；ヒト、サル、カニクイザル、アカゲザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類等を挙げることが出来るが、これらに限定されるものではない。哺乳動物は、好ましくは実験動物（例えば、マウス）又は霊長類（例えば、ヒト）である。魚類としては、特に限定されないが、例えば、食用としては、カレイ目に属する魚種（例えば、ヒラメ科の魚（ヒラメ等）、マコガレイ、ホシガレイ、ターボット等）、タイ科の魚（マダイ、チダイ等）、ブリ、ボラ、アイナメ、マグロ、ティラピア、サケ、コイ、マス、ニジマス、ヤマメ、アマゴ、ウナギ等が挙げられる。また、鑑賞用途としては、コイ、フナ、メダカ、キンギョ等が挙げられる。さらに、研究又は実験用途として、ゼブラフィッシュ、メダカ、キンギョ、ドジョウ等が挙げられる。魚類は好ましくは研究又は実験用であり、好ましくはゼブラフィッシュである。
【００１４】
本明細書において、ポリペプチドについて、「生物Ｘ（由来）ポリペプチドＹ」とは、ポリペプチドＹのアミノ酸配列が、生物Ｘにおいて天然に発現している該ポリペプチドのアミノ酸配列（野生型アミノ酸配列）と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列を有することを意味する。同様に、本明細書において、遺伝子（ポリヌクレオチド）について、「生物Ｘ（由来）遺伝子Ｚ」とは、遺伝子Ｚのヌクレオチド配列（好ましくはｃＤＮＡ配列）が、生物Ｘにおいて天然に発現している該遺伝子のヌクレオチド配列（野生型ヌクレオチド配列）（好ましくはｃＤＮＡ配列）と同一又は実質的に同一のヌクレオチド配列を有することを意味する。「実質的に同一」とは、着目したアミノ酸配列又はヌクレオチド配列が、生物Ｘにおいて天然に発現している因子（野生型因子）のアミノ酸配列又はヌクレオチド配列と７０％以上（好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９９％以上）の同一性を有しており、且つ当該タンパク質又は遺伝子の機能（活性）が維持されていることを意味する。
【００１５】
本明細書においてアミノ酸配列の「同一性」とは、当該技術分野において公知の数学的アルゴリズムを用いて２つのアミノ酸配列をアラインさせた場合の、最適なアラインメント（好ましくは、該アルゴリズムは最適なアラインメントのために配列の一方もしくは両方へのギャップの導入を考慮し得るものである）における、オーバーラップする全アミノ酸残基に対する、同一アミノ酸残基の割合（％）を意味する。
【００１６】
本明細書におけるアミノ酸配列の同一性は、例えば、ＮＣＢＩのインターネットホームページ上に公開されている相同性計算アルゴリズムNCBI blastp/Blast 2 sequences（National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool）を用い、以下の条件（Short queries=off／Expect threshold=10／Matrix=BLOSUM62／Gap Costs=Existence:11  Extension:1／Compositional adjustments=Conditional compositional score matrix adjustment／filter=off／Mask=off）にて計算することができる。
【００１７】
中性スフィンゴミエリナーゼ１の活性（即ち、Ｍｇ２＋依存的に中性条件でスフィンゴミエリンを加水分解しセラミドを生成する活性）は、例えばＷＯ９９／０７８５５に記載された方法により、中性条件下（例、ｐＨ７．０−７．５）にて評価対象のポリペプチドを［Ｎ−１４ＣＨ３］スフィンゴミエリンとともに、３７℃にて３０分インキュベートし、反応しなかった基質をクロロホルム−メタノール（２：１、ｖ／ｖ）抽出により除去し、酵素的に生成されたコリンリン酸を含む水相の放射能をシンチレーションカウンターで測定することにより評価することができる。また、蛍光性のＣ６-ＮＢＤスフィンゴミエリンを基質に用いて、評価対象のポリペプチドとともに、３７℃にて３０分インキュベートした後、水解されて生成したＣ６-ＮＢＤセラミドをクロロホルム−メタノール（２：１、ｖ／ｖ）抽出によって濃縮して回収し、薄相クロマトグラフィー（展開溶媒クロロホルム：メタノール：１２ｍＭ  ＭｇＣｌ２水溶液、６５：２５：４）によって分離して、蛍光測定することによって、中性スフィンゴミエリナーゼ１の活性を分析することもできる（非特許文献４）。
【００１８】
多くの真核生物について、中性スフィンゴミエリナーゼ１のアミノ酸配列が公知である。例えば、ゼブラフィッシュ中性スフィンゴミエリナーゼ１の代表的なアミノ酸配列が、GenBankアクセッション番号NP_001025390.1（2012年8月25日更新）（配列番号１）として登録されている。ヒト中性スフィンゴミエリナーゼ１の代表的なアミノ酸配列が、GenBankアクセッション番号NP_003071.2（2012年11月11日更新）（配列番号２）として登録されている。マウス中性スフィンゴミエリナーゼ１の代表的なアミノ酸配列が、GenBankアクセッション番号NP_033239.1（2012年6月28日更新）（配列番号３）として登録されている。
【００１９】
本発明のリン酸化ポリペプチドは、中性スフィンゴミエリナーゼ１におけるＪＮキナーゼによるリン酸化標的であるセリン残基がリン酸化されていることを特徴とする。
【００２０】
ＪＮキナーゼ（c-Jun N-terminal kinase）は、周知のキナーゼであり、ＭＡＰＫ(mitogen-activated protein kinase)-８〜１０またはストレス活性化プロテインキナーゼ（SAPK, stress activated protein kinase）とも呼ばれる。ＪＮキナーゼは好ましくはＪＮＫ１である。本明細書中、ＪＮキナーゼは、任意の真核生物由来のものであり得る。真核生物としては、上に列挙したものを挙げることができる。真核生物は、好ましくは、魚類（ゼブラフィッシュ等）又は哺乳類（ヒト、マウス等）である。多くの真核生物について、ＪＮキナーゼのアミノ酸配列が公知である。例えば、ゼブラフィッシュＪＮキナーゼの代表的なアミノ酸配列が、GenBankアクセッション番号NP_001103859.1（2012年8月27日更新）として登録されている。ヒトＪＮキナーゼの代表的なアミノ酸配列が、GenBankアクセッション番号NP_620637（2012年11月25日更新）として登録されている。マウスＪＮキナーゼの代表的なアミノ酸配列が、GenBankアクセッション番号NP_057909（2012年11月24日更新）として登録されている。
【００２１】
一態様において、中性スフィンゴミエリナーゼ１ポリペプチドが由来する動物種と、ＪＮキナーゼが由来する動物種は同一である。例えば、本発明のリン酸化中性スフィンゴミエリナーゼ１ポリペプチドがヒト由来である場合、該ポリペプチド中に含まれるリン酸化されたセリン残基は、ヒトＪＮキナーゼによるリン酸化標的である。
【００２２】
また、別の態様において、ＪＮキナーゼが由来する動物種はヒトである。
【００２３】
ＪＮキナーゼによるリン酸化標的であるセリン残基は、中性スフィンゴミエリナーゼ１ポリペプチドを、必要な基質（例、ＡＴＰ）の存在下で、ＪＮキナーゼと共にインキュベートし、リン酸化されたセリンまたはスレオニン残基を、質量分析によって解析する方法や［γ-３２Ｐ］標識ＡＴＰを用いて放射能標識されたセリンまたはスレオニン残基を分析することにより特定することができる。尚、ゼブラフィッシュ中性スフィンゴミエリナーゼ１ポリペプチド（配列番号１）、ヒト中性スフィンゴミエリナーゼ１ポリペプチド（配列番号２）及びマウス中性スフィンゴミエリナーゼ１ポリペプチド（配列番号３）においては、いずれも２７０番目のセリン残基（Ｓｅｒ２７０）がＪＮキナーゼによるリン酸化標的であるセリン残基に相当する。従って、より簡便には、解析対象である中性スフィンゴミエリナーゼ１ポリペプチドのアミノ酸配列を、配列解析ソフトを用いて配列番号１、２及び３とアラインし、Ｓｅｒ２７０に対応するセリン残基をＪＮキナーゼによるリン酸化標的であるセリン残基として特定することができる。
【００２４】
本発明のリン酸化中性スフィンゴミエリナーゼ１ポリペプチドは、ＪＮキナーゼによるリン酸化標的であるセリン残基がリン酸化されており、中性スフィンゴミエリナーゼ１の活性（即ち、Ｍｇ２＋依存的に中性条件でスフィンゴミエリンを加水分解しセラミドを生成する活性）を有する限り、野生型中性スフィンゴミエリナーゼ１のアミノ酸配列に、１以上のアミノ酸残基の欠失、置換及び／又は付加を有していてもよい。欠失、置換又は付加されるアミノ酸残基の数は、中性スフィンゴミエリナーゼ１の活性を維持している限り限定されないが、例えば、約１〜３０個、好ましくは約１〜２０個、より好ましくは約１〜１０個、更により好ましくは約１〜５個、最も好ましくは１または２個である。アミノ酸残基の欠失、置換又は付加が施される部位も、ポリペプチドが中性スフィンゴミエリナーゼ１の活性を維持している限り特に限定されない。
【００２５】
好ましい態様において、本発明のリン酸化中性スフィンゴミエリナーゼ１ポリペプチドは、ＪＮキナーゼによるリン酸化標的であるセリン残基がリン酸化されることにより、その活性（即ち、Ｍｇ２＋依存的に中性条件でスフィンゴミエリンを加水分解しセラミドを生成する活性）が、リン酸化されていない対照中性スフィンゴミエリナーゼ１ポリペプチドと比較して高い。
【００２６】
本発明のリン酸化部分ポリペプチドは、上記（１）のポリペプチドの部分アミノ酸配列であって、ＪＮキナーゼによるリン酸化標的であるセリン残基を含む部分アミノ酸配列を含む。
【００２７】
当該部分アミノ酸配列の長さは、本発明のリン酸化部分ポリペプチドを非ヒト哺乳動物に投与したときに、当該リン酸化部分ポリペプチドに対する特異的抗体（リン酸化された、ＪＮキナーゼによるリン酸化標的であるセリン残基をエピトープに含む）の産生を誘導する限り、特に限定されないが、通常１０アミノ酸以上、好ましくは１２アミノ酸以上である。該部分アミノ酸配列の長さの上限は、中性スフィンゴミエリナーゼ１の全長アミノ酸配列を超えない範囲で特に制限されないが、該部分アミノ酸配列が長すぎると、エピトープにリン酸化された、ＪＮキナーゼによるリン酸化標的であるセリン残基を含む抗体を誘導する効率が低下するので、該部分アミノ酸配列の長さは、通常３０アミノ酸以下、好ましくは２０アミノ酸以下、より好ましくは１５アミノ酸以下である。
【００２８】
当該部分アミノ酸配列の部位は、ＪＮキナーゼによるリン酸化標的であるセリン残基を含み、且つ本発明のリン酸化部分ポリペプチドを非ヒト哺乳動物に投与したときに、当該リン酸化部分ポリペプチドに対する特異的抗体（リン酸化された、ＪＮキナーゼによるリン酸化標的であるセリン残基をエピトープに含む）の産生を誘導する限り、特に限定されない。好ましくは、ＪＮキナーゼによるリン酸化標的であるセリン残基が、当該部分アミノ酸配列のＮ末端又はＣ末端とならないように、部分アミノ酸配列の部位を設定する。一態様において、当該部分アミノ酸配列には、ＪＮキナーゼによるリン酸化標的であるセリン残基のＮ末端側に３アミノ酸以上、好ましくは４アミノ酸以上の隣接配列が含まれる。一態様において、当該部分アミノ酸配列には、ＪＮキナーゼによるリン酸化標的であるセリン残基のＣ末端側に６アミノ酸以上、好ましくは７アミノ酸以上の隣接配列が含まれる。好ましい態様において、当該部分アミノ酸配列には、ＪＮキナーゼによるリン酸化標的であるセリン残基のＮ末端側に３アミノ酸以上、好ましくは４アミノ酸以上の隣接配列が含まれ、且つ該セリン残基のＣ末端側に６アミノ酸以上、好ましくは７アミノ酸以上の隣接配列が含まれる。
【００２９】
一態様において、本発明のリン酸化部分ポリペプチドは、配列番号４で表されるアミノ酸配列を含み、且つ、該アミノ酸配列に含まれるセリン残基がリン酸化されている。配列番号４で表されるアミノ酸配列は、ゼブラフィッシュ中性スフィンゴミエリナーゼ１の部分アミノ酸配列である。
【００３０】
本発明のリン酸化部分ポリペプチドの全長は、非ヒト哺乳動物に投与したときに、当該リン酸化部分ポリペプチドに対する特異的抗体（リン酸化された、ＪＮキナーゼによるリン酸化標的であるセリン残基をエピトープに含む）の産生を誘導する限り、特に限定されない。しかしながら、該リン酸化部分ポリペプチドが長すぎると、エピトープにリン酸化された、ＪＮキナーゼによるリン酸化標的であるセリン残基を含む抗体を誘導する効率が低下してしまうので、本発明のリン酸化部分ポリペプチドの全長は、好ましくは３０アミノ酸以下、より好ましくは２０アミノ酸以下、更に好ましくは１５アミノ酸以下である。
【００３１】
本発明のリン酸化ポリペプチドは、野生型中性スフィンゴミエリナーゼ１のアミノ酸配列と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列、又はそれらの部分配列に加え、１又は２個以上（例えば、１〜５００個、好ましくは１〜１００個、より好ましくは１〜１５個、最も好ましくは１又は２個）の付加的なアミノ酸を含んでいてもよい。付加されるアミノ酸配列は、特に限定されないが、例えば、ポリペプチドの検出や精製等を容易にならしめるためのタグを挙げることができる。タグとしては、Ｆｌａｇタグ、ヒスチジンタグ、ｃ−Ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、ＡＵ１タグ、ＧＳＴタグ、ＭＢＰタグ、蛍光タンパク質タグ（例えばＧＦＰ、ＹＦＰ、ＲＦＰ、ＣＦＰ、ＢＦＰ等）、イムノグロブリンＦｃタグ等を例示することができる。また、付加されるアミノ酸として、他のタンパク質とのコンジュゲーションを媒介するアミノ酸を挙げることができる。該アミノ酸としては、例えばシステインを挙げることができる。
【００３２】
本発明のポリペプチドは、ＪＮキナーゼによるリン酸化標的であるセリン残基のリン酸化に加え、更に修飾されていてもよい。該修飾としては、脂質鎖の付加（脂肪族アシル化（パルミトイル化、ミリストイル化等）、プレニル化（ファルネシル化、ゲラニルゲラニル化等）等）、リン酸化（セリン残基、スレオニン残基、チロシン残基等におけるリン酸化）、アセチル化、糖鎖の付加（Ｎグリコシル化、Ｏグリコシル化）等を挙げることが出来る。
【００３３】
本発明のリン酸化ポリペプチドは、適当な標識剤、例えば、放射性同位元素（例：１２５Ｉ、１３１Ｉ、３Ｈ、１４Ｃ等）、酵素（例：β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素等）、蛍光物質（例：フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネート等）、発光物質（例：ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニン等）、アフィニティタグ（例：ビオチン等）などで標識されていてもよい。
【００３４】
本発明のリン酸化ポリペプチドには、その塩の形態も包含される。塩としては生理学的に許容される酸（例：無機酸、有機酸）や塩基（例：アルカリ金属塩）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが挙げられる。
【００３５】
本発明のリン酸化ポリペプチドは、好ましくは単離又は精製されている。「単離又は精製」とは、目的とする成分以外の因子を除去する操作がなされ、天然に存在する状態を脱していることを意味する。「単離又は精製されたリン酸化ポリペプチド」の純度（総ポリペプチド重量に占める目的とするリン酸化ポリペプチド重量の百分率）は、通常７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは実質的に１００％である。
【００３６】
本発明のリン酸化ポリペプチドの製造方法については特に制限はなく、公知のペプチド合成法に従って製造してもよく、また公知の遺伝子組み換え技術を用いて製造してもよい。ペプチド合成法は、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれであってもよい。
【００３７】
一態様において、本発明のリン酸化ポリペプチドは、
（１’）中性スフィンゴミエリナーゼ１ポリペプチド、又は
（２’）（１’）のポリペプチドの部分アミノ酸配列であって、ＪＮキナーゼによるリン酸化標的であるセリン残基を含み、且つ１０アミノ酸以上の長さを有する部分アミノ酸配列を含む、ポリペプチド
を、ＪＮキナーゼでリン酸化することにより、製造することができる。本発明は、このような本発明のリン酸化ポリペプチドの製造方法をも提供する。
【００３８】
ＪＮキナーゼによるポリペプチドのインビトロリン酸化の方法は公知であり（例えば、Cell, vol. 76, no. 6, pages 1025-1037, 1994参照）、例えば、上記（１’）又は（２’）のポリペプチド（好ましくは、単離又は精製されている）を、必要な基質（例、ＡＴＰ）の存在下で、ＪＮキナーゼ（好ましくは、単離又は精製されている）と共にインキュベートすることにより、該ポリペプチドに含まれるＪＮキナーゼによるリン酸化標的であるセリン残基をリン酸化する。
【００３９】
反応混合液からの本発明のリン酸化ポリペプチドの単離又は精製は、例えば、菌体溶解液や培養上清を、逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィーなどの複数のクロマトグラフィーに供することにより達成することができる。或いは、リン酸化中性スフィンゴミエリナーゼ１を特異的に認識する抗体（後述）を用いた抗体カラムにより、反応混合液から本発明のリン酸化ポリペプチドを単離又は精製することができる。
【００４０】
本発明のリン酸化ポリペプチドは、ＪＮキナーゼによるリン酸化標的であるセリン残基がリン酸化された、リン酸化中性スフィンゴミエリナーゼ１ポリペプチドを特異的に認識する抗体を作成する際の抗原（免疫原）として有用である。
【００４１】
２．リン酸化中性スフィンゴミエリナーゼ１ポリペプチドを特異的に認識する抗体、及びその用途
本発明は、上記本発明のリン酸化ポリペプチドを特異的に認識する抗体（本発明の抗体）を提供する。
【００４２】
抗体による抗原Ｘの「特異的認識」とは、抗原抗体反応における、抗体の抗原Ｘに対する結合親和性が、非特異的な抗原（例、ＢＳＡ）に対する結合親和性よりも高いことを意味する。
【００４３】
好ましい態様において、本発明の抗体のエピトープには、上記本発明のリン酸化ポリペプチド中の、リン酸化された、ＪＮキナーゼによるリン酸化標的であるセリン残基が含まれる。従って、本態様において、本発明の抗体の本発明のリン酸化ポリペプチドに対する結合親和性は、対応するリン酸化されていない対照ポリペプチド（ＪＮキナーゼによるリン酸化標的であるセリン残基がリン酸化されていない点を除き、比較対象である本発明のリン酸化ポリペプチドと、同一の構成を有するポリペプチド）に対する結合親和性よりも高い。
【００４４】
本明細書において、抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）等の天然型抗体；及び遺伝子組換技術を用いて製造され得る組換え抗体（例えば、single-chain Fv fragments (scFv)、bispecific-chimeric scFV (χ-scFv)、tandem scFV (scFv)2、bispecific-(scFv)2、disulfide-linked scFv、disulfide-stabilized Fv fragments(dsFv)、diabody、single-chain diabody (scDb)、bivalent diabody、bispecific diabody、knob-into-hole stabilized diabody、disulfide-stabilized diabody、triabody、tetrabody、trispecific triabody、CL-dimerized scFv、CH1-CL-dimerized scFv、CH3-dimerized scFv、knob-into-hole CH3-dimerized scFv、CH3-dimerized bivalent diabody、Fc-dimerized scFv、Fab-scFv fusions、Ig-scFv fusions、leucine-zipper stabilized scFv dimers、helix-stabilized scFv dimers、4 helix-bundle stabilized scFv tetramers、streptavidin-scFv、intrabody、Fab’fragments、F(ab’) fragments、Fv fragments (Fv)、キメラ抗体、ヒト化抗体、一本鎖抗体等）、ヒト抗体産生トランスジェニック動物等を用いて製造され得るヒト抗体等が挙げられるが、これらに限定されない。抗体は、作成の容易さ等の点から、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体が、好ましく用いられる。抗体のクラスは、特に限定されず、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤあるいはＩｇＥ等のいずれのアイソタイプを有する抗体をも包含する。
【００４５】
また、本発明において、「抗体」は、その結合性断片をも含む概念である。抗体の結合性断片とは、前述の抗体の一部分の領域を意味し、具体的には例えばF(ab')2、Fab'、Fab、Fv（variable fragment of antibody）、scFv、dsFv（disulfide stabilised Fv）、dAb（single domain antibody）、等や（Exp. Opin. Ther. Patents， Vol.6, No.5, p.441-456, 1996）、Fab発現ライブラリーによって作製された抗体断片等が例示される。
【００４６】
本発明の抗体は、上記本発明のリン酸化ポリペプチド、又は当該リン酸化ポリペプチドとキャリアタンパク質との結合体で非ヒト哺乳動物を免疫感作し、本発明のリン酸化ポリペプチドを特異的に認識する抗体を単離することで製造することができる。
【００４７】
キャリアタンパク質としては、ヘモシアニン（ｋｅｙｈｏｌｅ ｌｉｍｐｅｔ ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ、以下、ＫＬＨとする）、ウシ血清アルブミン、卵アルブミン等を用いることができるが、ＫＬＨを用いることが好ましい。本発明のリン酸化ポリペプチドとして、Ｃ末端にシステインを付加したリン酸化ポリペプチドを用いた場合、当該リン酸化ペプチドとキャリアタンパク質と結合は、ｍａｌｅｉｍｉｄｏｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ‐Ｎ‐ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ ｅｓｔｅｒ（ＭＢＳ）を用いて抗原ペプチドのＣ末端に付加したシステイン残基のチオール基に対してキャリアタンパク質を架橋することにより実施することができる。また、グルタールアルデヒド、カルボジイミドなど他の架橋剤を用いて本発明のリン酸化ポリペプチドとキャリアタンパク質とを結合させる方法や多重抗原ペプチド（ＭＡＰ）によってキャリアタンパク質を用いないで抗原性を高める方法も利用できる。
【００４８】
モノクローナル抗体を製造する場合は、本発明のリン酸化ポリペプチド又は上述の結合体を非ヒト哺乳動物に対して、それ自体あるいは担体、希釈剤等とともに投与し、当該リン酸化ポリペプチド又は結合体で非ヒト哺乳動物を免疫感作する。投与に際しては抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを用いてもよい。投与は通常２〜６週毎に１回ずつ、計２〜１０回程度行なうことができる。用いられる非ヒト哺乳動物としては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ニワトリが挙げられるが、マウス、ラット又はニワトリが好ましく用いられる。
【００４９】
免疫感作された哺乳動物から抗体価の認められた個体を選択し、最終免疫の２〜５日後に脾臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合させることにより、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを製造することができる。融合操作は既知の方法、例えば、ケーラーとミルスタインの方法〔ネイチャー（Nature）、256、495 (1975)〕および公知のその変法に従い実施できる。モノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、自体公知あるいはそれに準ずる方法に従って培養される。通常ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加した動物細胞用培地で行なうことができる。
【００５０】
引き続き、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマから、本発明のリン酸化ポリペプチドを特異的に認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマが選択される。当該選択には種々の方法が使用できるが、例えば、ＥＬＩＳＡ法により、本発明のリン酸化ポリペプチドを吸着させた固相（例、マイクロプレート）にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質や酵素（西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ等）などで標識した抗免疫グロブリン抗体（細胞融合に用いられる脾臓細胞がマウス由来の場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる）またはプロテインＡを加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法などが用いられる。以上により、本発明のリン酸化ポリペプチドを特異的に認識する抗体を産生するハイブリドーマが得られる。
【００５１】
本発明のリン酸化ポリペプチド中の、リン酸化された、ＪＮキナーゼによるリン酸化標的であるセリン残基をエピトープに含む抗体を選択するため、上記ＥＬＩＳＡにおいて、固相に吸着させる抗原として、本発明のリン酸化ポリペプチドと、対応するリン酸化されていない対照ポリペプチドを平行して用いて、対照ポリペプチドよりも、本発明のリン酸化ポリペプチドへの結合親和性が高い抗体を産生するハイブリドーマを選択することが好ましい。
【００５２】
引き続き、上記ハイブリドーマの培養上清や、上記ハイブリドーマをプリスタン処理ヌードマウスに移入することにより得られる腹水から、本発明のリン酸化ポリペプチドを特異的に認識するモノクローナル抗体が単離される。モノクローナル抗体の単離は、自体公知の方法、例えば、免疫グロブリンの分離精製法〔例、塩析法、アルコール沈澱法、等電点沈澱法、電気泳動法、イオン交換体（例、ＤＥＡＥ）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相あるいはプロテインＡあるいはプロテインＧなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕に従って行なうことができる。
【００５３】
本発明のリン酸化ポリペプチドを特異的に認識するポリクローナル抗体を製造する場合、モノクローナル抗体と同様に、本発明のリン酸化ポリペプチド、又は上記結合体を哺乳動物に対してそれ自体あるいは担体、希釈剤等とともに投与し、当該結合体で哺乳動物を免疫感作する。用いられる哺乳動物としては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ニワトリが挙げられるが、ウサギ、ヒツジ、ヤギ等が好ましく用いられる。
【００５４】
ポリクローナル抗体は、上記の方法で免疫感作された哺乳動物の血清、腹水など、好ましくは血清から単離することができる。ポリクローナル抗体の単離は、上記のモノクローナル抗体の単離と同様の免疫グロブリンの分離精製法に従って行なうことができる。好ましくは、ポリクローナル抗体は、本発明のリン酸化ポリペプチドを結合させたカラムを用いたアフィニティクロマトグラフィーにより、本発明のリン酸化ポリペプチドを特異的に認識する抗体画分を分離することにより精製される。
【００５５】
更に、目的としないリン酸化されていない対照ポリペプチドを結合させたカラムで抗体分画を処理することにより、リン酸化されていない対照ポリペプチドに交差反応性を有する抗体分画を除去することにより、本発明のリン酸化ポリペプチド中の、リン酸化された、ＪＮキナーゼによるリン酸化標的であるセリン残基をエピトープに含む抗体を得ることが出来る。
【００５６】
或いは、まずリン酸化されていない対照ポリペプチドを結合させたカラムで抗血清中の抗体分画を処理することにより、リン酸化されていない対照ポリペプチドに交差反応性を有する抗体分画を除去し、その後、本発明のリン酸化ポリペプチドを結合させたカラムを用いてアフィニティ精製してもよい。
【００５７】
本発明の抗体を用いて、免疫学的手法により、リン酸化中性スフィンゴミエリナーゼ１ポリペプチドを特異的に検出することができる。従って、本発明は、上記本発明の抗体を用いることを含む、リン酸化中性スフィンゴミエリナーゼ１ポリペプチドの検出方法を提供するものである。
【００５８】
より具体的には、上記本発明のリン酸化中性スフィンゴミエリナーゼ１ポリペプチドを含む試料を、本発明の抗体と接触し、当該リン酸化中性スフィンゴミエリナーゼ１ポリペプチドと本発明の抗体との抗原抗体複合体を形成させ、形成された抗原抗体複合体を定量することにより、試料中のリン酸化中性スフィンゴミエリナーゼ１ポリペプチドを検出・定量する。
【００５９】
免疫化学的手法としては、フローサイトメトリー解析、放射性同位元素免疫測定法（RIA法）、ELISA法（Methods in Enzymol. 70: 419-439 (1980)）、ウエスタンブロッティング、免疫組織染色等を挙げることができるが、これらに限定されない。
【００６０】
後述する実施例に示すように、細胞において、ストレス（熱、放射線、紫外線、過酸化物（過酸化水素等）、ＦＡＳアゴニスト（ＦＡＳＬ、抗ＦＡＳ抗体等）、炎症性サイトカイン（IL1β，IFNγ等）、飢餓、化学療法薬等）によりアポトーシスが誘導される際に、中性スフィンゴミエリナーゼ１のＪＮキナーゼによるリン酸化が重要な調節メカニズムとして介在している。即ち、細胞がストレス刺激を受けると、ＪＮキナーゼにより、中性スフィンゴミエリナーゼ１中のＪＮキナーゼのリン酸化標的であるセリン残基（ゼブラフィッシュ、ヒト、マウスの場合、Ser-270）が、リン酸化され、中性スフィンゴミエリナーゼ１が活性化し、スフィンゴミエリンを加水分解しセラミドを生成することによりアポトーシスを誘導する。従って、細胞内における、本発明のリン酸化中性スフィンゴミエリナーゼ１ポリペプチドを検出することにより、当該細胞におけるストレス誘導アポトーシスシグナルの活性化状態を評価することが出来る。
【００６１】
細胞内における、リン酸化中性スフィンゴミエリナーゼ１ポリペプチドの検出は、上記本発明のリン酸化中性スフィンゴミエリナーゼ１ポリペプチドの検出方法により実施することができる。
【００６２】
検出の結果、リン酸化中性スフィンゴミエリナーゼ１ポリペプチドが検出された場合、あるいはストレス刺激を受けていないコントロール細胞と比較して、リン酸化中性スフィンゴミエリナーゼ１ポリペプチドの増大が検出された場合には、当該細胞においてはストレス誘導アポトーシスシグナルが活性化していると評価することができる。一方、リン酸化中性スフィンゴミエリナーゼ１ポリペプチドが検出されない場合、或いはストレス刺激を受けていないコントロール細胞と同程度のリン酸化中性スフィンゴミエリナーゼ１ポリペプチドが検出された場合、当該細胞においては、ストレス誘導アポトーシスシグナルが活性化していないと評価することができる。
【００６３】
また、本発明は、上述のリン酸化中性スフィンゴミエリナーゼ１ポリペプチドを特異的に認識する抗体を含む、リン酸化中性スフィンゴミエリナーゼ１ポリペプチド検出用試薬を提供するものである。本発明の試薬は、リン酸化中性スフィンゴミエリナーゼ１ポリペプチドを検出するためのキットであり得る。本発明の試薬を用いることにより、上述の方法により容易にリン酸化中性スフィンゴミエリナーゼ１ポリペプチドを検出したり、細胞におけるストレス誘導アポトーシスシグナルの活性化状態を評価したりすることができる。
【００６４】
リン酸化中性スフィンゴミエリナーゼ１ポリペプチドを特異的に認識する抗体は、水もしくは適当な緩衝液（例：TEバッファー、PBSなど）中に適当な濃度となるように溶解し、約-20℃〜4℃で保存することができる。
【００６５】
本発明の試薬は、採用する免疫学的手法の種類に応じて、当該方法の実施に必要な他の成分を構成としてさらに含んでいてもよい。
【００６６】
例えば、本発明の試薬は、標識二次抗体、発色基質、ブロッキング液、洗浄緩衝液、ELISAプレート、ブロッティング膜等をさらに含むことができる。
【００６７】
３．中性スフィンゴミエリナーゼ１変異体ポリペプチド
本発明は、ＪＮキナーゼによるリン酸化標的であるセリン残基がセリン以外のアミノ酸残基に置換された、中性スフィンゴミエリナーゼ１変異体ポリペプチド（本発明の変異体ポリペプチド）を提供する。本発明の変異体ポリペプチドは、野生型の中性スフィンゴミエリナーゼ１のアミノ酸配列を含み、但し、該アミノ酸配列におけるＪＮキナーゼによるリン酸化標的であるセリン残基がセリン以外のアミノ酸残基に置換されている。
【００６８】
上述の通り、細胞がストレス刺激を受けると、ＪＮキナーゼにより、中性スフィンゴミエリナーゼ１中のＪＮキナーゼのリン酸化標的であるセリン残基（ゼブラフィッシュ、ヒト、マウスの場合、Ser-270）が、リン酸化され、中性スフィンゴミエリナーゼ１が活性化し、スフィンゴミエリンを加水分解しセラミドを生成することによりアポトーシスを誘導する。従って、ＪＮキナーゼによるリン酸化標的であるセリン残基がセリン以外のアミノ酸残基に置換されると、ＪＮキナーゼによるリン酸化の制御を受けないので、本発明の変異体ポリペプチドを用いることにより、細胞におけるストレス誘導アポトーシスシグナルを意図的に阻害したり、活性化したりすることが可能となる。従って、本発明の変異体ポリペプチドは、細胞におけるストレス誘導アポトーシスシグナルを解析するためのツールとして有用である。
【００６９】
例えば、本発明の変異体ポリペプチドは、配列番号１、２又は３で表されるアミノ酸配列を含み、但し、該アミノ酸配列における２７０番目のセリン残基（Ｓｅｒ２７０）が、セリン以外のアミノ酸残基に置換されている。
【００７０】
セリン以外のアミノ酸としては、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、及びバリンを挙げることができる。
【００７１】
一態様において、本発明の変異体ポリペプチドは、ドミナントネガティブ変異体である。ドミナントネガティブ変異体とは、野生型の中性スフィンゴミエリナーゼ１のアミノ酸配列への変異の導入により、細胞内において、野生型の中性スフィンゴミエリナーゼ１の活性を阻害することが可能となったものをいう。当該ドミナントネガティブ変異体は、細胞内において、野生型中性スフィンゴミエリナーゼ１と競合することにより、間接的に野生型中性スフィンゴミエリナーゼ１の活性（即ち、Ｍｇ２＋依存的に中性条件でスフィンゴミエリンを加水分解しセラミドを生成する活性）を阻害することができ、その結果、細胞におけるストレス誘導アポトーシスを阻害することができる。ドミナントネガティブ変異体を可能とする置換としては、ＪＮキナーゼによるリン酸化標的であるセリン残基の、酸性アミノ酸以外のアミノ酸（即ち、アラニン、アルギニン、アスパラギン、システイン、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、又はバリン）の残基への置換を挙げることができる。好ましくは、ＪＮキナーゼによるリン酸化標的であるセリン残基がアラニン残基へ置換される。
【００７２】
好ましい態様において、本発明のドミナントネガティブ変異体ポリペプチドは、配列番号１、２又は３で表されるアミノ酸配列を含み、但し、該アミノ酸配列における２７０番目のセリン残基（Ｓｅｒ２７０）が、アラニン残基に置換されている。
【００７３】
一態様において、本発明の変異体ポリペプチドは、活性化型変異体である。活性化型変異体とは、野生型の中性スフィンゴミエリナーゼ１のアミノ酸配列への変異の導入により、ＪＮキナーゼによるリン酸化を要することなく、恒常的に、野生型の中性スフィンゴミエリナーゼ１を上回る活性（Ｍｇ２＋依存的に中性条件でスフィンゴミエリンを加水分解しセラミドを生成する活性）を獲得したポリペプチドをいう。当該活性化型変異体は、細胞内において、恒常的に、Ｍｇ２＋依存的に中性条件でスフィンゴミエリンを加水分解しセラミドを生成し、その結果、ストレス刺激を要することなく、当該細胞のアポトーシスを誘導することができる。活性化型変異体を可能とする置換としては、ＪＮキナーゼによるリン酸化標的であるセリン残基の、酸性アミノ酸（アスパラギン酸、グルタミン酸）残基への置換を挙げることができる。好ましくは、ＪＮキナーゼによるリン酸化標的であるセリン残基がグルタミン酸残基へ置換される。
【００７４】
好ましい態様において、本発明の活性化型変異体ポリペプチドは、配列番号１、２又は３で表されるアミノ酸配列を含み、但し、該アミノ酸配列における２７０番目のセリン残基（Ｓｅｒ２７０）が、グルタミン酸残基に置換されている。
【００７５】
本発明の変異体ポリペプチドは、野生型中性スフィンゴミエリナーゼ１のアミノ酸配列（但し、ＪＮキナーゼによるリン酸化標的であるセリン残基がセリン以外のアミノ酸残基に置換されている）に加え、１又は２個以上（例えば、１〜５００個、好ましくは１〜１００個、より好ましくは１〜１５個、最も好ましくは１又は２個）の付加的なアミノ酸を含んでいてもよい。付加されるアミノ酸配列は、特に限定されないが、例えば、ポリペプチドの検出や精製等を容易にならしめるためのタグを挙げることができる。タグとしては、Ｆｌａｇタグ、ヒスチジンタグ、ｃ−Ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、ＡＵ１タグ、ＧＳＴタグ、ＭＢＰタグ、蛍光タンパク質タグ（例えばＧＦＰ、ＹＦＰ、ＲＦＰ、ＣＦＰ、ＢＦＰ等）、イムノグロブリンＦｃタグ等を例示することができる。また、付加されるアミノ酸として、他のタンパク質とのコンジュゲーションを媒介するアミノ酸を挙げることができる。該アミノ酸としては、例えばシステインを挙げることができる。
【００７６】
本発明の変異体ポリペプチドは修飾されていてもよい。該修飾としては、脂質鎖の付加（脂肪族アシル化（パルミトイル化、ミリストイル化等）、プレニル化（ファルネシル化、ゲラニルゲラニル化等）等）、リン酸化（セリン残基、スレオニン残基、チロシン残基等におけるリン酸化）、アセチル化、糖鎖の付加（Ｎグリコシル化、Ｏグリコシル化）等を挙げることが出来る。
【００７７】
本発明の変異体ポリペプチドは、適当な標識剤、例えば、放射性同位元素（例：１２５Ｉ、１３１Ｉ、３Ｈ、１４Ｃ等）、酵素（例：β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素等）、蛍光物質（例：フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネート等）、発光物質（例：ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニン等）、アフィニティタグ（例：ビオチン等）などで標識されていてもよい。
【００７８】
本発明の変異体ポリペプチドには、その塩の形態も包含される。塩としては生理学的に許容される酸（例：無機酸、有機酸）や塩基（例：アルカリ金属塩）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが挙げられる。
【００７９】
本発明の変異体ポリペプチドは、好ましくは単離又は精製されている。「単離又は精製」とは、目的とする成分以外の因子を除去する操作がなされ、天然に存在する状態を脱していることを意味する。「単離又は精製された変異体ポリペプチド」の純度（総ポリペプチド重量に占める目的とする変異体ポリペプチド重量の百分率）は、通常７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは実質的に１００％である。
【００８０】
本発明の変異体ポリペプチドの製造方法については特に制限はなく、該ポリペプチドは公知のペプチド合成法に従って製造してもよく、また公知の遺伝子組み換え技術を用いて製造してもよい。ペプチド合成法は、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれであってもよい。
【００８１】
遺伝子組み換え技術を用いて本発明のポリペプチドを製造する場合には、先ず後述するような本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを取得し、該ポリヌクレオチドを含む発現ベクターで宿主を形質転換し、得られる形質転換体を培養することによって、該ポリペプチドを製造することができる。
【００８２】
４．中性スフィンゴミエリナーゼ１変異体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
本発明は上記本発明の変異体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供するものである。該ポリヌクレオチドは、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよく、あるいはＤＮＡ／ＲＮＡキメラであってもよいが、好ましくはＤＮＡが挙げられる。また、該ポリヌクレオチドは二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。二本鎖の場合は、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡ：ＲＮＡのハイブリッドでもよい。
【００８３】
本発明のポリヌクレオチドは、公知の配列情報や本明細書の配列表に記載された配列情報を利用することにより適当なプライマーを設計し、野生型の中性スフィンゴミエリナーゼ１をコードするＤＮＡクローンやｃＤＮＡ等を鋳型として用い、ＰＣＲ等の変異を導入することにより得ることができる。或いは、配列情報に基づいて、ポリヌクレオチド合成装置により変異体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを合成してもよい。
【００８４】
取得された本発明のポリヌクレオチドは、目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化するか、リンカーを付加した後に、使用することができる。該ポリヌクレオチドはその５’末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３’末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することができる。
【００８５】
本発明のポリヌクレオチドは、好ましくは、単離又は精製されている。
【００８６】
本発明のポリヌクレオチドは、本発明の変異体ポリペプチドの製造に有用である。
【００８７】
５．発現ベクター
また、本発明は、上記本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供するものである。該発現ベクターは、本発明のポリヌクレオチドを適当な発現ベクター中の、宿主となる細胞で機能し得るプロモーターの下流に機能的に連結することにより製造することができる。ベクターの種類としては、プラスミドベクター、ウイルスベクター等を挙げることができ、用いる宿主に応じて適宜選択することが出来る。
【００８８】
宿主としては、例えば、エシェリヒア属菌（エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）等）、バチルス属菌（バチルス・サブチルス（Bacillus subtilis）等）、酵母（サッカロマイセス  セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）等）、昆虫細胞（夜盗蛾の幼虫由来株化細胞（Spodoptera frugiperda cell；Ｓｆ細胞）等）、昆虫（カイコの幼虫等）、哺乳動物細胞（ラット神経細胞、サル細胞（COS-7等）、チャイニーズハムスター細胞（CHO細胞等）等）などが用いられる。
【００８９】
哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類やウサギ等の実験動物、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ、ミンク等の家畜、イヌ、ネコ等のペット、ヒト、サル、アカゲザル、マーモセット、オラウータン、チンパンジーなどの霊長類を挙げることが出来る。
【００９０】
プラスミドベクターとしては、大腸菌由来のプラスミドベクター（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１２，ｐＵＣ１３）、枯草菌由来のプラスミドベクター（例、ｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミドベクター（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５）等を挙げることができ、用いる宿主の種類や使用目的に応じて適宜選択することが出来る。
【００９１】
ウイルスベクターの種類は、用いる宿主の種類や使用目的に応じて適宜選択することが出来る。例えば、宿主として昆虫細胞を用いる場合には、バキュロウイルスベクター等を用いることが出来る。また、宿主として哺乳動物細胞を用いる場合には、モロニーマウス白血病ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、シンドビスウイルスベクター等のレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、パルボウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、センダイウイルスベクター等を用いることが出来る。
【００９２】
また、プロモーターは、用いる宿主の種類に対応して、該宿主内で転写を開始可能なものを選択することが出来る。例えば、宿主がエシェリヒア属菌である場合、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、Ｔ７プロモーターなどが好ましい。宿主がバチルス属菌である場合、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなどが好ましい。宿主が酵母である場合、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーターなどが好ましい。宿主が昆虫細胞である場合、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーターなどが好ましい。宿主が哺乳動物細胞である場合、サブゲノミック（２６Ｓ）プロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＳＲαプロモーターなどが好ましい。
【００９３】
本発明の発現ベクターは、プロモーターの他に、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン（以下、ＳＶ４０ｏｒｉと略称する場合がある）などを、それぞれ機能可能な態様で含有していてもよい。
【００９４】
６．形質変換体
上記本発明の発現ベクターを、自体公知の遺伝子導入法（例えば、リポフェクション法、リン酸カルシウム法、マイクロインジェクション法、プロプラスト融合法、エレクトロポレーション法、DEAEデキストラン法、Gene Gunによる遺伝子導入法等）に従って上記宿主へ導入することにより、該発現ベクターが導入された形質転換体（本発明の形質転換体）を製造することができる。導入されるベクターとして発現ベクターを使用することにより、該形質転換体は本発明のポリペプチドを発現し得る。本発明の形質転換体は、本発明の変異体ポリペプチドの製造などに有用である。
【００９５】
本発明の形質転換体を、宿主の種類に応じて、自体公知の方法で培養し、培養物から本発明の変異体ポリペプチドを単離することにより、本発明の変異体ポリペプチドを製造することが出来る。培養物からの本発明のポリペプチドの単離・精製は、例えば、菌体溶解液や培養上清を、逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィーなどの複数のクロマトグラフィーに供することにより達成することができる。
【００９６】
７．ストレス誘導アポトーシスの阻害又は促進方法
本発明は、上述の本発明のドミナントネガティブ変異体ポリペプチド、又はその発現ベクターを導入することを含む、該細胞のストレス誘導アポトーシスの阻害方法（本発明の阻害方法）を提供する。本発明のドミナントネガティブ変異体ポリペプチド、又はその発現ベクターを細胞内に導入すると、ドミナントネガティブ変異体ポリペプチドが、野生型中性スフィンゴミエリナーゼ１と競合することにより、間接的に野生型中性スフィンゴミエリナーゼ１の活性（即ち、Ｍｇ２＋依存的に中性条件でスフィンゴミエリンを加水分解しセラミドを生成する活性）を阻害することができ、その結果、細胞におけるストレス誘導アポトーシスを阻害することができる。
【００９７】
また、本発明は、上述の本発明の活性化型変異体ポリペプチド、又はその発現ベクターを導入することを含む、該細胞のストレス誘導アポトーシスの促進方法（本発明の促進方法）を提供する。本発明の活性化型変異体ポリペプチド、又はその発現ベクターを細胞内に導入すると、活性化型変異体ポリペプチドが、細胞内において、恒常的に、Ｍｇ２＋依存的に中性条件でスフィンゴミエリンを加水分解しセラミドを生成し、当該細胞のストレス誘導性アポトーシスを促進する。
【００９８】
好ましい態様において、本発明の阻害方法及び促進方法において用いられる変異体ポリペプチドに含まれる中性スフィンゴミエリナーゼ１のアミノ酸配列が由来する動物種は、導入対象の細胞が由来する動物種と同一である。例えば、ヒト細胞のストレス誘導性アポトーシスを阻害、及び促進する場合には、ヒト中性スフィンゴミエリナーゼ１のドミナントネガティブ変異体ポリペプチド及び活性化型変異体ポリペプチドが、それぞれ用いられる。
【００９９】
本発明の阻害方法及び促進方法に用いられる細胞としては、任意の真核生物細胞が使用され得る。真核生物としては、例えば、哺乳動物、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、昆虫、酵母等を挙げることができるが、哺乳動物又は魚類が好ましい。哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類やウサギ等の実験動物；ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ、ミンク等の家畜；イヌ、ネコ等のペット；ヒト、サル、カニクイザル、アカゲザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類等を挙げることが出来るが、これらに限定されるものではない。哺乳動物は、好ましくは実験動物（例えば、マウス）又は霊長類（例えば、ヒト）である。魚類としては、特に限定されないが、例えば、食用としては、カレイ目に属する魚種（例えば、ヒラメ科の魚（ヒラメ等）、マコガレイ、ホシガレイ、ターボット等）、タイ科の魚（マダイ、チダイ等）、ブリ、ボラ、アイナメ、マグロ、ティラピア、サケ、コイ、マス、ニジマス、ヤマメ、アマゴ、ウナギ等が挙げられる。また、鑑賞用途としては、コイ、フナ、メダカ、キンギョ等が挙げられる。さらに、研究又は実験用途として、ゼブラフィッシュ、メダカ、キンギョ、ドジョウ等が挙げられる。魚類は好ましくは研究又は実験用であり、好ましくはゼブラフィッシュである。
【０１００】
変異ポリペプチドの細胞への導入は、自体公知の細胞へのタンパク質導入方法を用いて実施することができる。そのような方法としては、例えば、タンパク質導入試薬を用いる方法、タンパク質導入ドメイン（PTD）融合タンパク質を用いる方法、マイクロインジェクション法などが挙げられる。タンパク質導入試薬としては、カチオン性脂質をベースとしたBioPOTER Protein Delivery Reagent (Gene Therapy Systems)、カチオン性脂質をベースとしたBioPOTER Transfection Reagent (PIERCE)及びProVctin (IMGENEX)、脂質をベースとしたProfect-1 (Targeting Systems)、膜透過性ペプチドをベースとしたPenetratin Peptide (Q Biogene)及びChariot Kit (Active Motif)等が市販されている。導入はこれらの試薬に添付のプロトコルに従って行うことができるが、一般的な手順は以下の通りである。本発明の変異体ポリペプチドを適当な溶媒（例えば、PBS、HEPES等の緩衝液）に希釈し、導入試薬を加えて室温で５〜１５分インキュベートして複合体を形成させ、これを無血清培地に添加して、細胞を当該培地中で３７℃にて１〜数時間インキュベートする。その後、培地を除去して血清含有培地に交換する。
【０１０１】
PTDとしては、ショウジョウバエ由来のAntP、HIV由来のTAT、HSV由来のVP22等のタンパク質の細胞通過ドメインを用いたものが開発されている。本発明の変異体ポリペプチドをコードするｃDNAととPTD配列とを組み込んだ融合タンパク質発現ベクターを作成して組換え発現させ、融合タンパク質を回収して導入に用いる。導入は、タンパク質導入試薬を添加しない以外は上記と同一である。
【０１０２】
マイクロインジェクションは、先端約１μｍ程度のガラス管に、タンパク質溶液をいれ、細胞内に穿刺導入する方法であり、確実に細胞内にタンパク質を導入することができる。
【０１０３】
発現ベクターは、ベクターの種類に応じて、自体公知の方法により細胞へ導入することができる。例えばウイルスベクターの場合、該核酸を含むプラスミドを適当なパッケージング細胞（例、Plat-E）や相補細胞株（例、２９８細胞）に導入して、培養上清中に産生されるウイルスベクターを回収し、各ウイルスベクターに応じた適切な方法により、該ベクターを細胞に感染させる。一方、プラスミドベクターの場合には、リポフェクション法、リポソーム法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム共沈殿法、DEAEデキストラン法、マイクロインジェクション法、遺伝子銃法などを用いて該ベクターを細胞に導入することができる。
【０１０４】
導入後、所望により、細胞へストレス刺激（例、熱ショック、化学療法薬、放射線照射、飢餓）を加えてもよい。
【０１０５】
従って、本発明のドミナントネガティブ変異体ポリペプチド、又はその発現ベクターは、細胞のストレス誘導アポトーシスの阻害剤として、本発明の活性化型変異体ポリペプチド、又はその発現ベクターは、細胞のストレス誘導性アポトーシスの促進剤として、それぞれ有用である。
【０１０６】
刊行物、特許文献等を含む、本明細書に引用されたすべての参考文献は、引用により、それらが個々に具体的に参考として援用されかつその内容全体が具体的に記載されているのと同程度まで、本明細書に援用される。
【０１０７】
以下、実施例を示して本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下に示す実施例によって何ら限定されるものではない。
【実施例】
【０１０８】
［実施例１］
１．抗原の作製
配列番号２で表されるアミノ酸配列及びそのＣ末端に導入されたシステイン残基からなるペプチドを、株式会社日本バイオサービスによって化学合成し、抗原として用いた。キャリアーとしてＫＬＨを用い、抗原ペプチドのＣ末端のシステイン残基におけるチオール基とＫＬＨとを架橋試薬ＭＢＳ（ＰＩＥＲＣＥ社製）を用いて結合させ、免疫源とした（T. Kitagawa and T. Aikawa., J. Biochem., 79, 233‐236, 1976；大海忍・辻村邦夫・稲垣昌樹： 抗ペプチド抗体実験プロトコール、秀潤社、ｐｐ．１‐３１２、１９９４年）。
【０１０９】
２．抗体の作製
セリン残基がリン酸化された、配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるペプチドをハプテン抗原としてＫＬＨにコンジュゲートした抗原タンパク質の溶液（タンパク質濃度２ｍｇ／ｍＬ）を等量のフロイント完全アジュバンド（ＰＩＥＲＣＥ社製）と混合し、得られたエマルジョンを、ウサギに２週間に１回の頻度で免疫した。１３３日後に、静脈血を採取し、抗血清を得た。こうして得られたウサギ抗血清をＰＢＳで二倍に希釈し、リン酸化されていない中性スフィンゴミエリナーゼ１ペプチド抗原（配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるペプチド）を固定化したセファロース４Ｂゲルと３７℃で１時間震盪することにより混合、反応させた。非吸着画分を溶出し、その溶出液をリン酸化中性スフィンゴミエリナーゼ１ペプチド抗原（セリン残基がリン酸化された、配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるペプチド）を固定化したセファロース４Ｂゲルと３７℃で１時間震盪することにより混合、反応させた。次いで、ゲルをカラムに充填し、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳおよびＰＢＳで未反応の成分を洗浄し除去した。２８０ｎｍにてタンパク質の溶出位置をモニターしながら、０．１Ｍグリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ２）にて抗体をカラムから溶出した。溶離した抗体溶液に対して、１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８）を添加して中和した。こうして、アフィニティ精製抗体３４．４μｇ（タンパク質濃度３４．４μｇ／ｍＬ）を得た。
【０１１０】
［実施例２］
抗体の特異性の確認
実施例１で得た抗体が、セリン残基（Ｓｅｒ２７０）がリン酸化された中性スフィンゴミエリナーゼ１に特異的に反応するかどうかをＥＬＩＳＡ法により調べた。すなわち、ペプチド抗原（配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるペプチド）の希釈液を９６穴マイクロプレートに分注し、ウェルにペプチド抗原を吸着させた後、ＢＳＡのブロッキング溶液でブロッキングすることで抗原ペプチドをウェルに固相化した。ウェルを洗浄し、一次抗体として実施例１で得た抗体の希釈液を加え反応させたのち、ＰＢＳで洗浄した。さらにペルオキシダーゼ標識二次抗体を各ウェルに添加し反応させたのち、ＰＢＳで洗浄した。各ウェルにＴＭＢＺ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン）基質を加え発色させ、４５０ｎｍで吸光度を測定した。その結果、図２に示すように、精製した抗体はいずれもリン酸化ペプチド抗原に対して反応した。一方、リン酸化していないペプチド抗原を用いたＥＬＩＳＡ分析では、実施例１で得た抗体の反応は弱かった。これらの結果から、実施例１で得た抗体は、セリン残基（Ｓｅｒ２７０）がリン酸化された中性スフィンゴミエリナーゼ１由来ポリペプチドに対して特異性を有することが確認された。
【０１１１】
［実施例３］
リン酸化中性スフィンゴミエリナーゼ１の測定法
（ウエスタンブロット法による抗体解析）
実施例１で作成した抗リン酸化中性スフィンゴミエリナーゼ１抗体を用い、ウエスタンブロット法により既報の分析法（大海忍・辻村邦夫・稲垣昌樹： 抗ペプチド抗体実験プロトコル、秀潤社、ｐｐ．１‐３１２、１９９４年）に従って対象試料を解析した。
【０１１２】
すなわち、ヒラメ普通筋を５ｍＭ塩化マグネシウム、２５ｍＭ塩化カリウム、プロテアーゼ阻害剤カクテル（コンプリートミニ、ロッシュ社）、１ｍＭフッ化ナトリウム及び１ｍＭバナジン酸ナトリウムを含む５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）でホモジナイズし、８，０００×ｇで１０分間遠心した。得られた上清に、サンプルバッファー（２％ＳＤＳ及び０．１％ブロモフェノールブルーを含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ６．８））を加え、電気泳動用試料を調製した。また、直径６ｃｍのシャーレ中で、牛胎児血清（５％）、ペニシリン（５ｕｎｉｔｓ／ｍＬ）およびストレプトマイシン（５０μｇ／ｍＬ）含むＤＭＥＭ培地（インビトロジェン社）でヒト腎臓由来培養細胞ＨＥＫ２９３を３７℃にて培養した。それぞれのシャーレに２ｍｌの１０％トリクロロ酢酸を加えることにより細胞を固定し、スクレーパーで剥離回収した。遠心分離によりトリクロロ酢酸を除去した後、それぞれの細胞ペレットに１ｍＭフッ化ナトリウム、１ｍＭバナジン酸ナトリウム及びプロテアーゼ阻害剤カクテル（コンプリートミニ、ロッシュ社）を含む上記サンプルバッファーを加え、さらに２ＭＴｒｉｓを加えて中和し、１００℃で２分間加熱処理することにより細胞を溶解し、電気泳動用試料を調製した。これらの試料を１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離したのち、ＰＶＤＦ膜（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）に電気的に転写した。ＰＶＤＦ膜を、一次抗体として実施例１で作成した抗リン酸化中性スフィンゴミエリナーゼ１抗体の希釈液（５００ｎｇ／ｍｌ）と、二次抗体としてペルオキシダーゼ標識抗ウサギＩｇＧ抗体（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ社）の２，０００倍希釈液と、段階的に反応させた。ＴＢＳＴで洗浄後、化学発光分析用試薬ケミルミワンＬ（ナカライテスク社）を用いて抗原抗体反応による化学発光を生じさせ、ＬＡＳ-１０００ｍｉｎｉ（富士フイルム社）にて検出した。分子量マーカーはタンパク質分子量マーカー（ＴＥＦＣＯ社）を用い、クマシーブリリアントブルーＲ２５０により染色した。
【０１１３】
その結果、図３に示すように、実施例１で作成した抗リン酸化中性スフィンゴミエリナーゼ１抗体を用いることによって、ヒト由来培養細胞とヒラメ由来培養細胞の抽出物中に分子量５万のリン酸化中性スフィンゴミエリナーゼ１が存在することが確認された。抗体リン酸化中性スフィンゴミエリナーゼ１抗体を、セリン残基がリン酸化した配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるペプチドで処理する吸収試験を行うと、ヒト細胞でのリン酸化中性スフィンゴミエリナーゼ１に対するシグナルが消失したことから、ヒト細胞由来の中性スフィンゴミエリナーゼ１においても２７０位のセリン残基のリン酸化がストレス条件で特異的に生じることが判明した。
【０１１４】
［実施例４］
ＪＮキナーゼによる中性スフィンゴミエリナーゼ１のリン酸化
配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるゼブラフィッシュ由来ＳＭａｓｅ１の組換えタンパク質を大腸菌発現系を用いて、非特許文献４の方法で作製した。野生型ＳＭａｓｅ１以外に、Ｓｅｒ−２７０のリン酸化部位をアラニンに置換した変異型ＳＭａｓｅ１（Ｓ２７０Ａ）を作製した。市販のＪＮキナーゼ（JNK1、Cell Signaling社製）を野生型ＳＭａｓｅ１および変異型ＳＭａｓｅ１（Ｓ２７０Ａ）に作用させた後、反応液を１０％ゲルを用いたＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、ＰＶＤＦ膜（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）に電気的に転写した。ＰＶＤＦ膜を、一次抗体として実施例１で作成した抗リン酸化中性スフィンゴミエリナーゼ１抗体の希釈液（５００ｎｇ／ｍｌ）と、二次抗体としてペルオキシダーゼ標識抗ウサギＩｇＧ抗体（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ社）の１０，０００倍希釈液と、段階的に反応させた。ＴＢＳＴで洗浄後、化学発光分析用試薬ケミルミワンＬ（ナカライテスク社）を用いて抗原抗体反応による化学発光を生じさせ、ハイパーフィルムＥＣＬ（ＧＥヘルスケア・ジャパン社）に露光して検出した。分子量マーカーはタンパク質分子量マーカー（ＴＥＦＣＯ社）を用い、クマシーブリリアントブルーＲ２５０により染色した。
【０１１５】
その結果、ＳＭａｓｅ１組換えタンパク質がＪＮキナーゼによってリン酸化され、酵素活性が約４倍増加することが確認された（図４）。抗リン酸化中性スフィンゴミエリナーゼ１抗体は、変異体ＳＭａｓｅ１（Ｓ２７０Ａ）には反応せず、シグナルは得られなかった。また、ＪＮキナーゼ阻害剤ＳＰ６００１２５（シグマアルドリッチジャパン）を添加すると、リン酸化が阻害された。
【０１１６】
以上の結果から、本発明のリン酸化中性スフィンゴミエリナーゼ１は、中性スフィンゴミエリナーゼ１をＪＮキナーゼによりリン酸化することによって、調製し得ることが示された。また、実施例１で作成した抗リン酸化中性スフィンゴミエリナーゼ抗体は、リン酸化されたゼブラフィッシュ由来野生型中性スフィンゴミエリナーゼ１に結合するが、２７０位セリン残基がアラニンに置換された変異型分子には結合しないことが示された。
【０１１７】
［実施例５］
ゼブラフィッシュ培養細胞への紫外線照射によるストレス試験
ゼブラフィッシュ胚由来ＺＥ細胞を、２％牛胎児血清を含むライボビッツＬ．１５培地を用いて、２８℃で培養した。培養した細胞を熱ショックまたは紫外線照射して、ストレス条件での中性スフィンゴミエリナーゼ１のリン酸化応答を調べた（図５）。熱ショック処理は、３８℃で１時間培養することにより行った。紫外線処理は、５ｍＪ／ｃｍ２の紫外線を紫外線照射装置（ＵＶクロスリンカー、フナコシ製、ＣＬ-１０００）を用いて照射することにより行った。熱ショックまたは紫外線照射によってストレス処理した細胞を、２８℃の通常の培養条件に戻して、培養した。未処理の培養細胞および熱ショックまたは紫外線照射によりストレス処理した培養細胞をそれぞれ回収し、１０％ゲルのＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離した後、実施例１で作成した抗リン酸化中性スフィンゴミエリナーゼ１抗体を用いて、実施例４と同じ方法で、ウエスタンブロット法によって、リン酸化中性スフィンゴミエリナーゼ１を検出した。対照実験として、リン酸化の有無を認識しない通常の抗中性スフィンゴミエリナーゼ１抗体（非特許文献４）を用いて、中性スフィンゴミエリナーゼ１を検出した。また、クマシーブリリアントブルーＲ-２５０を用いたタンパク質染色によって、アクチンのバンドを検出した。
【０１１８】
本実験の結果、ストレス処理を開始して１時間で、リン酸化された中性スフィンゴミエリナーゼ１のシグナルが増大したが、中性スフィンゴミエリナーゼ１およびアクチンのシグナル強度は変化がなかった（図５）。これらの結果から、ストレス条件によって、中性スフィンゴミエリナーゼ１のリン酸化が誘導されることが明らかとなった。
【０１１９】
［実施例６］
ゼブラフィッシュ由来中性スフィンゴミエリナーゼ１のアミノ酸配列（配列番号１）におけるリン酸化部位である２７０位のセリン残基をアラニンまたはグルタミン酸に改変した中性スフィンゴミエリナーゼ１変異体の組換えタンパク質を大腸菌発現系を用いて、非特許文献４の方法で作製した。精製した酵素の活性をＣ６-ＮＢＤスフィンゴミエリンを基質に用いて測定した（図６）。その結果、野生型（ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ）の中性スフィンゴミエリナーゼ１と２７０位のセリン残基をアラニンに置換した中性スフィンゴミエリナーゼ１変異体（Ｓ２７０Ａ）の活性はほとんど検出されなかったが、２７０位のリン酸化部位をグルタミン酸に置換した中性スフィンゴミエリナーゼ１変異体（Ｓ２７０Ｅ）は強い酵素活性が認められた。また、これら野生型および変異体の中性スフィンゴミエリナーゼ１をコードするｃＤＮＡを含む発現ベクターを非特許文献４の方法でp３×ＦＬＡＧ-ＣＭＶ-１４ベクター（シグマアルドリッチジャパン）を作製した。該発現ベクターをＺＥ細胞に導入し、培養２４時間後に死細胞を非特許論文４記載の方法に従って計数して、アポトーシス誘導を調べた。中性スフィンゴミエリナーゼ１ ｃＤＮＡを含まない空のベクター（Ｍｏｃｋ）では、アポトーシスの誘導はほとんど起こらなかった（図６）。中性スフィンゴミエリナーゼ１ ｃＤＮＡを含む発現ベクター（ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ）では、細胞死が生じた（図６）。一方、リン酸化が生じないように２７０位のセリン残基をアラニンに置換した中性スフィンゴミエリナーゼ１変異体 ｃＤＮＡ発現ベクター（Ｓ２７０Ａ）では、アポトーシスの誘導が抑制された。また、２７０位のリン酸化部位をグルタミン酸に置換した中性スフィンゴミエリナーゼ１変異体 ｃＤＮＡ発現ベクター（Ｓ２７０Ｅ）では、アポトーシスが野生型分子よりも強く誘導された（図６）。
【０１２０】
これらの結果から、中性スフィンゴミエリナーゼ１の２７０位のリン酸化部位のセリン残基をリン酸化されないアラニン残基に置き換えると、ストレスによっても活性化されないドミナントネガティブ型の不活性の酵素に変換され、酸性アミノ酸側鎖をもつグルタミン酸に置換すると、リン酸化されたセリン残基と同様の活性をもつ活性型の酵素に変換されることが示唆された。
【０１２１】
［実施例７］
ヒト由来のリン酸化中性スフィンゴミエリナーゼ１の検出
ほ乳類細胞における中性スフィンゴミエリナーゼ１のリン酸化を調べた。ヒトＴ細胞白血病由来Ｊｕｒｋａｔ細胞（ＡＴＣＣ  ＴＩＢ−１５２）を３７℃の２％牛胎仔血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地で培養した。アポトーシスを誘導する条件として、４３℃、１時間での熱ショック、５ｍＪ／ｃｍ２での紫外線（２５４ｎｍ）照射、１ｍＭ過酸化水素または抗ｆａｓ抗体（ロッシュ社製、５０ｎｇ／ｍｌ）で処理して培養し、経時的に細胞を回収し、実施例１で作製したリン酸化中性スフィンゴミエリナーゼ１に対する抗体を用いて、実施例３と同様の方法でウエスタンブロットを行った（図７）。また、ＪＮキナーゼを活性化するリン酸化酵素ＭＫＫ４のリン酸化（Ｓ２５７／Ｔ２６１）抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製）、ＪＮキナーゼのリン酸化抗体（Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ  ＪＮＫ１／２）（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製）、ＪＮキナーゼのリン酸化を識別しないＪＮキナーゼ抗体（Ｔｏｔａｌ  ＪＮＫ１／２）（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製）、ＪＮキナーゼの基質タンパク質であるｃ−ｊｕｎのリン酸化抗体（Ｓ７３）（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製）、対照実験としてアクチン抗体（Ａｃｔｉｎ）（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製）を用いて、それぞれの分子のストレスに対する応答を検出した。ストレス処理を行った細胞では２７０位のセリンのリン酸化のシグナルが検出されたが、ストレス処理前の通常の培養条件ではリン酸化のシグナルは検出されなかった（図７）。この中性スフィンゴミエリナーゼ１がリン酸化に対応して、ＭＫＫ４（Ｓ２５７／Ｔ２６１）、ＪＮキナーゼ（ＪＮＫ１／２）およびｃ−ｊｕｎのリン酸化が生じた。これらの結果から、ほ乳類細胞においてもストレスに伴って、ＪＮキナーゼのストレス応答性リン酸化シグナルによって、中性スフィンゴミエリナーゼ１がリン酸化することが判明した。
【産業上の利用可能性】
【０１２２】
本発明のリン酸化中性スフィンゴミエリナーゼ１、抗リン酸化中性スフィンゴミエリナーゼ１抗体及び中性スフィンゴミエリナーゼ変異体を用いることにより、ストレス誘導性アポトーシスの調節メカニズムの詳細なメカニズム解析が可能となる。
【図１】
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【図２】
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【図６】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図７】
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【配列表】
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