(57)【要約】      （修正有）【課題】１列に並べられたキャピラリアレイにレーザ光を照射して検出を行うマルチフォーカス方式において、レーザ光の反射及び戻り光によるレーザーの発振が不安定とならない、並びにレーザ光が各キャピラリーに均一に照射される電気泳動装置を提供する。【解決手段】キャピラリアレイ３０５のキャピラリ表面の垂線に対して角度を付けて、キャピラリアレイの片側からレーザ光を照射する。光透過側では、光吸収材３０７を備え付け、レーザの反射光を抑制する。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
レーザ光源と、
複数本のキャピラリからなるキャピラリアレイと、
前記キャピラリアレイを平面状に整列させた検出部と、
前記レーザ光源から出射したレーザ光を、前記検出部に平面状に整列した前記キャピラリアレイの片側側方から照射し、当該レーザ光を隣接するキャピラリを次々と伝搬させて前記複数本のキャピラリを横断させる照射系と、
前記レーザ光照射によって前記キャピラリアレイから発生する発光を検出する検出系とを備え、
前記照射系は、キャピラリ表面の垂線に対して角度をつけてレーザ光を照射するとともに、前記キャピラリアレイの光透過側に光吸収材を備え前記キャピラリアレイを透過したレーザ光を前記光吸収材に入射させることを特徴とする電気泳動装置。
【請求項２】
請求項１記載の電気泳動装置において、前記キャピラリアレイの光透過側にミラーを配置し、前記キャピラリアレイを透過したレーザ光を前記ミラーで反射させて前記光吸収材に入射させることを特徴とする電気泳動装置。
【請求項３】
請求項１記載の電気泳動装置において、前記検出系は前記キャピラリアレイの各キャピラリからの信号強度を均一化するために、それぞれのキャピラリから発生した発光が透過する領域ごとに光学濃度が異なる可変濃度フィルタを備えることを特徴とする電気泳動装置。
【請求項４】
請求項１記載の電気泳動装置において、前記検出系は前記キャピラリアレイの各キャピラリから得られた信号強度を補正し、キャピラリ間の信号強度を均一にすることを特徴とする電気泳動装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸やタンパク質等を電気泳動により分離分析する技術に関し、例えば、キャピラリ電気泳動装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡの塩基配列及び塩基長の決定等を目的として、キャピラリを用いた電気泳動法が利用されている。キャピラリ電気泳動装置においては、複数のキャピラリに励起光を照射する必要があるが、複数のキャピラリへの光照射方式の一つに、特開２００１−３２４４７２公報（特許文献１）に記載されているマルチフォーカス方式がある。
【０００３】
図１４は、マルチフォーカス方式の概略図である。この方式では、蛍光色素によって標識されたＤＮＡを含む試料をキャピラリ内に導入し、１列に並べられた複数のキャピラリ（キャピラリアレイ１０１）を伝播するようにレーザ光１０２を照射している。平面基板上に並んだ複数のキャピラリからなるキャピラリアレイ１０１の両端の端にレーザ光１０２を照射する。レーザ光１０２は、隣接するキャピラリに次々と伝播してキャピラリアレイ１０１を横断する。キャピラリに照射されたレーザ光によって、蛍光標識されたＤＮＡは蛍光を発する。キャピラリアレイ１０１から発生する発光は、光検出器によって検出される。キャピラリの各々からの蛍光を測定することにより、各キャピラリに導入された試料のＤＮＡ解析を行うことが出来る。タンパク質等の解析を行う場合も同様である。
【０００４】
マルチフォーカス方式において、キャピラリアレイの両端の端にレーザを照射した場合、キャピラリ各々にほぼ均一にレーザ光が照射される。各キャピラリに均一にレーザ光が照射されるため、検出される信号強度は同程度となる。一方、キャピラリアレイの片側の端のみにレーザを照射した場合、キャピラリを透過するごとにレーザ光が減衰する。キャピラリに照射されるレーザ光が減衰するため、検出される信号強度にバラツキが生じる。このように片側照射においてはキャピラリごとに信号強度が異なる。すなわちキャピラリ内に導入されている試料ごとに検出精度に差が生じるため、マルチフォーカス方式においては両側照射が用いられている。
【０００５】
マルチフォーカス方式においては、反射及び戻り光によるレーザ不安定が生じる。具体的には、キャピラリアレイの一方の端からレーザ光を照射する場合、キャピラリアレイ表面からの反射光がレーザ発振器に戻り、レーザの発振を不安定にするという問題がある。また、キャピラリアレイの両側の端からレーザ光を照射する場合には、キャピラリアレイ表面からの反射光だけでなく、キャピラリアレイを通過した光がレーザ発振器に戻ってしまいレーザ発振を不安定にするという問題がある。
【０００６】
これらの問題を解決するために、特許文献１では、キャピラリアレイの両端から導入するレーザ光に角度を設ける手法が用いられている。また、特開２００９−２５７８０４公報（特許文献２）では、レーザ光軸上にλ／４板と偏光子を配置し、透過戻り光及び反射戻り光を阻止する手法が用いられている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００１−３２４４７２公報
【特許文献２】特開２００９−２５７８０４公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
マルチフォーカス方式において、特許文献１のようにキャピラリからの透過戻り光を防ぐために、キャピラリ両端からのレーザ光軸に角度をつけ、両側からの照射強度がほぼ等しくなる中心付近でレーザ位置を合わせた場合、キャピラリアレイ両端付近では両側からのレーザ位置がずれるため、レーザ光径は見かけ上太くなる。そのことにより、レーザ光の強度分布の広がりが大きくなり、計測したデータにスペクトルシフトをもたらし、擬似信号が発生してしまう。また、擬似信号の発生を防ぐためには特許文献２のようにレーザ光軸上にλ／４板と偏光子が必要となる。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明では、マルチフォーカス方式に関して、キャピラリアレイへのレーザ光照射を片側側方から行い、透過側では反射防止材などを備え付けレーザ光の反射光を抑制する。
【００１０】
すなわち、本発明の電気泳動装置は、レーザ光源と、複数本のキャピラリからなるキャピラリアレイと、キャピラリアレイを平面状に整列させた検出部と、レーザ光源から出射したレーザ光を、検出部に平面状に整列したキャピラリアレイの片側側方から照射し、当該レーザ光を隣接するキャピラリを次々と伝搬させて複数本のキャピラリを横断させる照射系と、レーザ光照射によってキャピラリアレイから発生する発光を検出する検出系とを備え、照射系は、キャピラリ表面の垂線に対して角度をつけてレーザ光を照射するとともに、キャピラリアレイの光透過側に光吸収材を備えキャピラリアレイを透過したレーザ光を前記光吸収材に入射させて吸収する。
【００１１】
また、片側入射に伴うキャピラリアレイの各キャピラリからの信号強度の不均一は、それぞれのキャピラリから発生した発光が透過する領域ごとに光学濃度が異なる可変濃度フィルタを用いることで、あるいは信号強度をソフトウェア上で補正することで均一化する。
【発明の効果】
【００１２】
キャピラリへの照射を片側で行うことで、両側照射に比べ照射されるレーザ光径が細くなり、かつ透過戻り光を根本的に排除できる。それにより、両側照射において発生していた擬似信号を抑制できる。
上記した以外の、課題、構成及び効果は、以下の実施形態の説明により明らかにされる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】電気泳動装置の概略図。
【図２】実施例１の照射系の概略図。
【図３】実施例１の照射系の概略図。
【図４】実施例１の検出系の概略図。
【図５】二次元撮像素子の受光面で得られる像の概略図。
【図６】片側照射における信号強度分布の概略図。
【図７】可変濃度フィルタの性能の一例を示す図。
【図８】可変濃度フィルタを用いたことによる効果の説明図。
【図９】実施例２の照射系の概略図。
【図１０】実施例３の信号均一化の説明図。
【図１１】実施例３の信号均一化の説明図。
【図１２】実施例３の信号均一化の説明図。
【図１３】実施例３の信号均一化の説明図。
【図１４】マルチフォーカス方式の概略図。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、上記及びその他の本発明の新規な特徴と効果を、図面を参酌して説明する。ただし、図面はもっぱら解説のためのものであって、本発明の範囲を限定するものではない。
【００１５】
図１は、電気泳動装置の概要図である。本装置は、サンプルに励起光を照射する照射系２０１、サンプルを光学的に検出するための検出系２０２、キャピラリを恒温に保つための恒温槽２０３、キャピラリに高電圧を加えるための高電圧印加部２０４、単数もしくは複数本のキャピラリにより構成されるキャピラリアレイ２０５、キャピラリに緩衝液２０６及び分離媒体２０７を注入するためのポンプ機構２０８を有する。
【００１６】
キャピラリアレイ２０５は、単数もしくは複数のキャピラリ（本例では８本）を含む交換部材であり、ロードヘッダ２０９、検出部２１０、及びキャピラリヘッド２２１を含む。キャピラリアレイ２０５は、測定手法を変更する場合、既定の使用回数により交換時期となった場合、もしくはキャピラリに破損や品質の劣化が見られた場合、新品のキャピラリアレイと交換される。
【００１７】
キャピラリは、内径数十〜数百ミクロン、外形数百ミクロンのガラス管で構成され、強度を向上させるために表面をポリイミドでコーティングしている。ただし、レーザ光が照射される照射部分は内部の発光が外部に漏れやすいように、ポリイミド被膜が除去された構造になっている。キャピラリの内部は、電気泳動時に移動速度差を与えるための分離媒体２０７が充填される。分離媒体２０７には流動性と非流動性の双方が存在するが、本実施例では流動性のポリマーを用いる。
【００１８】
キャピラリ電気泳動装置の光学系は、光源を含む照射系２０１、検出部２１０、キャピラリから生じる蛍光を検出する検出系２０２から構成される。光源は、コヒーレント光であるレーザ光２１１を照射する。光源には、Ａｒガスレーザ、固体レーザ、半導体レーザなどが用いられる。検出部２１０では、キャピラリアレイを構成する複数本のキャピラリが平面状に整列して並べられ、レーザ光２１１が複数本のキャピラリを貫くようにキャピラリアレイの側方から照射される。このレーザ光がキャピラリ中を泳動している試料を励起し、試料から蛍光などの発光が放出される。この蛍光を二次元ＣＣＤを含む検出系２０２により検出して、ＤＮＡ分子配列等の検査試料に依存した情報を取得できる。
【００１９】
[実施例１]
前述の通り、キャピラリ電気泳動装置は、照射系と検出系を備える。
図２、図３は、実施例１における照射系の構成を示す概略図である。図２はキャピラリアレイの泳動方向を紙面の表裏方向とした概略図、図３はキャピラリアレイの泳動方向を紙面の左右方向にとった概略図である。
【００２０】
照射系は、光源である半導体レーザ３０１、反射ミラー３０３、集光レンズ３０４、光吸収材３０７を備える。半導体レーザ３０１から出射されたレーザ光３０２は反射ミラー３０３により進行方向を変え、反射戻り光を防止するために角度θ（図３参照）を付けて検出部に平面状に整列して並べられたキャピラリアレイ３０５に片側側方からキャピラリ表面に対して斜め照射、すなわちキャピラリ表面に垂直入射ではなく、キャピラリ表面に立てた垂線に対して角度をつけて照射される。キャピラリアレイ３０５に照射されるレーザ光のビーム径は約０．８ｍｍであるため、キャピラリアレイ表面での反射光３０８が半導体レーザ３０１に戻らないためには入射角度θは少なくとも０．５８°程度必要となる。
【００２１】
角度θで入射されたレーザ光３０２は集光レンズ３０４で集光され、キャピラリアレイにおける照射部に片側から照射される。照射されたレーザ光３０２は、隣接するキャピラリを泳動方向と交差する方向に次々と伝搬して複数のキャピラリを横断し、検出部外へ透過する。キャピラリアレイを透過した透過レーザ光３０６は、光吸収材３０７に入射して吸収される。
【００２２】
光吸収材３０７は、例えば吸収率９９．９９％の光吸収膜シート（Metal VelvetTM）を使用する。これを透過側に備えることで、両側照射により発生していた透過戻り光を根本的に排除出来る。さらにはキャピラリへの散乱光や背景光なども抑制できる。
【００２３】
次に、キャピラリ内で励起された試料の蛍光を検出する検出系について説明する。図４に検出系の構成を示す。検出系は、光学フィルタ４０１、蛍光集光レンズ４０２、透過型回折格子４０３、フォーカスレンズ４０４、可変濃度フィルタ４０５、ＣＣＤなどの二次元撮像素子４０６で構成される。
【００２４】
キャピラリ内の試料から発光された蛍光は、光学フィルタ４０１を通過することにより励起光が除去された後、例えばＦ＝１．４の蛍光集光レンズ４０２で平行光になり、透過型回折格子４０３によって分光される。蛍光は波長ごとに分光され、可変濃度フィルタ４０５でキャピラリごとの信号を均一化され、フォーカスレンズ４０４で二次元撮像素子４０６に結像される。図５に二次元撮像素子上の像の様子を示す。Ｙ軸方向に８本のキャピラリが並び、Ｘ軸方向に各キャピラリからの蛍光が分光される。Ｘ軸方向は蛍光波長に対応する。
【００２５】
次に、可変濃度フィルタ４０５による信号の均一化について説明する。可変濃度フィルタを搭載しない場合、図６のように二次元撮像素子に結像される同一波長の蛍光の信号強度はキャピラリを通過するごとに減衰していく。信号強度を示す図において、横軸がＹ軸（キャピラリ位置）、縦軸が信号強度であり、半導体レーザ３０１からの照射位置が遠くなるほど信号強度が減衰していく様子が分かる。
【００２６】
このように減衰する信号を可変濃度フィルタ４０５で均一化する。図７に可変濃度フィルタの性能の一例を示す。可変濃度フィルタは領域ごとに光学濃度及び光透過率が異なるフィルタであり、図７のように領域に対して光学濃度がリニアに変化している。片側照射でキャピラリごとに強度の異なった蛍光を、可変濃度フィルタ４０５を通して検出信号を均一にすることで、図６に示したようにキャピラリ位置によって変化する信号を、図８のようにキャピラリ位置によらず均一な信号にすることが出来る。
【００２７】
以上のように、本実施例では片側照射による透過光を光吸収材により吸収することで反射を防止し、両側照射において発生する透過戻り光を排除した。これによりレーザ発振の安定化や擬似信号の発生が抑制できる。本実施例では光吸収材として光吸収膜シート（Metal VelvetTM）を使用したが、例えばアルマイト処理された金属でもよい。他の材料であっても、光を吸収するものであれば材料は限定しない。
【００２８】
[実施例２]
本実施例では、実施例１と異なりキャピラリ透過側に角度を持ったミラーを備えることで、透過光を排除する。図９は、本実施例による照射系の概略図である。
【００２９】
片側照射でキャピラリアレイ７０５内を伝搬し、キャピラリアレイを透過した透過レーザ光７０６はミラー７０８によって進行方向を変え、光吸収材７０７に入射して吸収される。光吸収材７０７は実施例１と同様、光を吸収するものであれば材料は限定しない。
【００３０】
本実施例においては、透過レーザ光７０６をより確実に吸収できる。例えば、光吸収率９９％の光吸収材７０７を実施例１のように透過側に備えた場合、キャピラリを伝搬した透過光の９９％は吸収されるが、残り１％は反射し、キャピラリアレイを通り、半導体レーザ７０１に戻る可能性がある。そのような反射光が半導体レーザ７０１に戻るのを防止するために、ミラー７０８で透過レーザ光７０６の進行方向を変え、角度を付けた光吸収材７０７で透過光を吸収する。この配置によると、キャピラリアレイを透過した透過レーザ光７０６が半導体レーザ７０１に戻る確率を更に低減することができる。
【００３１】
[実施例３]
実施例１、２では片側照射の信号強度の均一化を可変濃度フィルタで行ったが、本実施例ではソフトウェア上で行う。以下、詳細を説明する。
【００３２】
照射系は実施例１、２のどちらでも良い。透過戻り光が排除されれば照射系の方式は限定しない。検出系は実施例１、２と異なり、可変濃度フィルタを備えないため、図６で説明したように、片側照射で次第に減衰した各キャピラリの信号の像がそのまま二次元撮像素子に入射する。
【００３３】
片側照射により減衰した信号をそのまま使用すると、前述の通り検出精度に差が生じてしまう。そのため、図６のように減衰した信号を解析時に補正する。以下補正方法について説明する。
【００３４】
図１０〜１３に補正方法の略図を示す。図１０のように片側照射においてキャピラリごとに得られた信号を二次元撮像素子８０１で検出する。キャピラリごとに信号強度をＸ軸で検出する。二次元撮像素子８０１のＸ軸方向は蛍光波長に対応し、Ｙ軸方向はキャピラリ位置に対応する。信号強度は、キャピラリアレイの励起光入射側のキャピラリから励起光出射側のキャピラリに向かって次第に低下する。
【００３５】
図１１では、簡略化のため１本目のキャピラリ（Ｃｈ１）と８本目のキャピラリ（Ｃｈ８）の信号強度の一例を示す。信号強度は下記式で算出される。
信号強度＝Peak−Offset
Peakは最も高い信号、Offsetはベースラインの最小値である。ここで述べるPeakは蛍光色素の信号、ベースラインは分離媒体であるポリマーのラマン散乱光である。
【００３６】
このように信号強度を各キャピラリで算出し、図１２のように、横軸をキャピラリ位置とし縦軸に信号強度をプロットする。通常最も高い信号強度をもつキャピラリはＣｈ１であるため、各キャピラリの信号強度がＣｈ１となるように補正する。すなわち、Ｃｈ８の補正を行う場合補正値は次式のようになる。
補正値（Ｃｈ８）＝信号強度（Ｃｈ１）／信号強度（Ｃｈ８）
この補正値はキャピラリごとに異なる。この補正値を検出の際に信号強度に乗算することにより、図１３に示すように、各キャピラリの信号を擬似的に均一化することが出来る。
【００３７】
補正値、すなわち片側照射における信号強度のバラツキは光軸、二次元撮像素子の性能、透過型回折格子の性能等に依存するため装置ごとに異なる。そのため、装置ごとに補正値を算出し、メモリに記憶させる。光源、光学部品、二次元撮像素子の交換等が発生した場合には再度補正値を算出し記憶させる。
【００３８】
以上のように、本実施例では片側照射による発光強度の減衰を、ソフトウェアで補正することにより発光強度を均一化する。
【００３９】
なお、本発明は上記した実施例に限定されるものではなく、様々な変形例が含まれる。例えば、上記した実施例は本発明を分かりやすく説明するために詳細に説明したものであり、必ずしも説明した全ての構成を備えるものに限定されるものではない。また、ある実施例の構成の一部を他の実施例の構成に置き換えることが可能であり、また、ある実施例の構成に他の実施例の構成を加えることも可能である。また、各実施例の構成の一部について、他の構成の追加・削除・置換をすることが可能である。
【符号の説明】
【００４０】
１０１，２０５，３０５，７０５  キャピラリアレイ
１０２，２１１，３０２，７０２  レーザ光
２０１  照射系
２０２  検出系
２０３  恒温槽
２０４  高電圧印加部
２０６  緩衝液  
２０７  分離媒体
２０８  ポンプ機構
２０９  ロードヘッダ
２１０  キャピラリアレイの検出部
２２１  キャピラリヘッド
３０１，７０１  半導体レーザ
３０３，７０３  入射光反射ミラー
３０４，７０４  集光レンズ
３０６，７０６  透過レーザ光
３０７，７０７  光吸収材
３０８  反射光
４０１  光学フィルタ
４０２  蛍光集光レンズ
４０３  透過型回折格子
４０４  フォーカスレンズ
４０５  可変濃度フィルタ
４０６  二次元撮像素子
７０８  透過光反射ミラー
８０１  二次元撮像素子
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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