(57)【要約】      （修正有）【課題】新規抗頻脈性不整脈の製剤及びその製造方法の提供。【解決手段】抗頻脈性不整脈の延胡索抽出物であって、延胡索粗粉末100重量部を、600-1000体積部の60-80%のエタノールで1-3回抽出し、濾液を合わせ、相対密度が0.2--0.5g/mLの流エキスに減圧濃縮すること、処理されたD101樹脂、調製された流エキスを取ってカラムにロードさせ、0.2--0.5mL/minの流速で、脱イオン水で不純物を除去し、0.2--0.5mL/minの流速で、60-90%のエタノールで溶出し、0.4--0.8mL/minの流速で、エタノールを回収し、濃縮して延胡索抽出物とする乾燥エキスを取得することを含む調製方法。該抽出物は通常の方法に従って通常の補助材料を加え、臨床的に許容可能な丸剤、カプセル剤、顆粒剤、錠剤、経口液体製剤又は注射剤に調製する。該抽出物は抗頻脈性不整脈の面で著しい効果を有する。【選択図】図１
2014005282.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗頻脈性不整脈の延胡索抽出物であって、
延胡索粗粉末１００重量部を、６００−１０００体積部の６０−８０%のエタノールで１−３回抽出し、濾液を合わせ、相対密度が０.２−０.５ｇ／ｍＬの流エキスに減圧濃縮すること、処理されたＤ１０１樹脂、調製された流エキスを取ってカラムにロードさせ、０.２−０.５ｍＬ／ｍｉｎの流速で、脱イオン水で不純物を除去し、０.２−０.５ｍＬ／ｍｉｎの流速で、６０−９０%のエタノールで溶出し、０.４−０.８ｍＬ／ｍｉｎの流速で、濃縮して延胡索抽出物とする乾燥エキスを得ることを含む調製方法で調製したことを特徴とする抗頻脈性不整脈の延胡索抽出物。
【請求項２】
延胡索粗粉末１００重量部を、８００体積部の７０%のエタノールで２回抽出し、濾液を合わせ、０.３ｇ／ｍＬの流エキスに減圧濃縮すること、処理されたＤ１０１樹脂、調製された流エキスを取ってカラムにロードさせ、０.４ｍＬ／ｍｉｎの流速で、脱イオン水で不純物を除去し、０.４ｍＬ／ｍｉｎの流速で、８０%のエタノールで８倍のカラム体積を溶出し、０.６ｍＬ／ｍｉｎの流速で、エタノールを回収し、濃縮して延胡索抽出物とする乾燥エキスを得ることを含む調製方法で調製したことを特徴とする請求項１に記載の延胡索抽出物。
【請求項３】
前記Ｄ１０１型マクロ多孔性吸着樹脂の直径・高さ比が１：４−８であることを特徴とする請求項１又は２に記載の延胡索抽出物。
【請求項４】
前記Ｄ１０１型マクロ多孔性吸着樹脂の直径・高さ比が１：７であることを特徴とする請求項３に記載の延胡索抽出物。
【請求項５】
前記マクロ多孔性吸着樹脂の流エキスのローディング溶液をｐＨ１−２に調節することを特徴とする請求項１、２又は４のいずれかに記載の延胡索抽出物。
【請求項６】
前記マクロ多孔性吸着樹脂の流エキスのローディング溶液をｐＨ１−２に調節することを特徴とする請求項３に記載の延胡索抽出物。
【請求項７】
前記マクロ多孔性吸着樹脂の流エキスのローディング溶液をｐＨ１.５に調節することを特徴とする請求項５に記載の延胡索抽出物。
【請求項８】
前記マクロ多孔性吸着樹脂の流エキスのローディング溶液をｐＨ１.５に調節することを特徴とする請求項６に記載の延胡索抽出物。
【請求項９】
該抽出物に通常の方法に従って通常の補助材料を加え、臨床的に許容可能な丸剤、カプセル剤、顆粒剤、錠剤、経口液体製剤又は注射剤に調製することを特徴とする請求項１、２、４、６、７又は８のいずれかに記載の延胡索抽出物。
【請求項１０】
該抽出物に通常の方法に従って通常の補助材料を加え、臨床的に許容可能な丸剤、カプセル剤、顆粒剤、錠剤、経口液体製剤又は注射剤に調製することを特徴とする請求項３に記載の延胡索抽出物。
【請求項１１】
該抽出物に通常の方法に従って通常の補助材料を加え、臨床的に許容可能な丸剤、カプセル剤、顆粒剤、錠剤、経口液体製剤又は注射剤に調製することを特徴とする請求項５に記載の延胡索抽出物。
【請求項１２】
抗頻脈性不整脈の延胡索抽出物の調製方法であって、
延胡索粗粉末１００重量部を、６００−１０００体積部の６０−８０%のエタノールで１−３回抽出し、濾液を合わせ、相対密度が０.２−０.５ｇ／ｍＬの流エキスに減圧濃縮すること、処理されたＤ１０１樹脂、調製された流エキスを取ってカラムにロードさせ、０.２−０.５ｍＬ／ｍｉｎの流速で、脱イオン水で不純物を除去し、０.２−０.５ｍＬ／ｍｉｎの流速で、６０−９０%のエタノールで溶出し、０.４−０.８ｍＬ／ｍｉｎの流速で、濃縮して延胡索抽出物とする乾燥エキスを得ることを含むことを特徴とする抗頻脈性不整脈の延胡索抽出物の調製方法。
【請求項１３】
延胡索粗粉末１００重量部を、８００体積部の７０%のエタノールで２回抽出し、濾液を合わせ、０.３ｇ／ｍＬの流エキスに減圧濃縮すること、処理されたＤ１０１樹脂、調製された流エキスを取ってカラムにロードさせ、０.４ｍＬ／ｍｉｎの流速で、脱イオン水で不純物を除去し、０.４ｍＬ／ｍｉｎの流速で、８０%のエタノールで８倍のカラム体積を溶出し、０.６ｍＬ／ｍｉｎの流速で、エタノールを回収し、濃縮して延胡索抽出物とする乾燥エキスを得ることを含むことを特徴とする請求項１２に記載の延胡索抽出物の調製方法。
【請求項１４】
前記Ｄ１０１型マクロ多孔性吸着樹脂の直径・高さ比が１：４−８であることを特徴とする請求項１２又は１３に記載の延胡索抽出物の調製方法。
【請求項１５】
前記Ｄ１０１型マクロ多孔性吸着樹脂の直径・高さ比が１：７であることを特徴とする請求項１４に記載の延胡索抽出物の調製方法。
【請求項１６】
前記マクロ多孔性吸着樹脂の流エキスのローディング溶液をｐＨ１−２に調節することを特徴とする請求項１２、１３又は１５のいずれかに記載の延胡索抽出物。
【請求項１７】
前記マクロ多孔性吸着樹脂の流エキスのローディング溶液をｐＨ１−２に調節することを特徴とする請求項１４に記載の延胡索抽出物の調製方法。
【請求項１８】
前記マクロ多孔性吸着樹脂の流エキスのローディング溶液をｐＨ１.５に調節することを特徴とする請求項１６に記載の延胡索抽出物の調製方法。
【請求項１９】
前記マクロ多孔性吸着樹脂の流エキスのローディング溶液をｐＨ１.５に調節することを特徴とする請求項１７に記載の延胡索抽出物の調製方法。
【請求項２０】
抽出物に通常の方法に従って通常の補助材料を加え、臨床的に許容可能な丸剤、カプセル剤、顆粒剤、錠剤、経口液体製剤又は注射剤に調製することを特徴とする請求項１２、１３、１５、１７、１８又は１９のいずれかに記載の延胡索抽出物の調製方法。
【請求項２１】
抽出物に通常の方法に従って通常の補助材料を加え、臨床的に許容可能な丸剤、カプセル剤、顆粒剤、錠剤、経口液体製剤又は注射剤に調製することを特徴とする請求項１４に記載の延胡索抽出物の調製方法。
【請求項２２】
抽出物に通常の方法に従って通常の補助材料を加え、臨床的に許容可能な丸剤、カプセル剤、顆粒剤、錠剤、経口液体製剤又は注射剤に調製することを特徴とする請求項１６に記載の延胡索抽出物の調製方法。
【請求項２３】
請求項１−２、４、６−８、１０−１１のいずれか一項に記載の延胡索抽出物の頻脈性不整脈を治療する薬物の調製における応用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は漢方薬製剤及びその調製方法に関し、特に抗頻脈性不整脈の製剤及びその調製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
頻脈性不整脈は急性心筋梗塞（acute myocardial infarction、AMI）の急性期死亡の重要な原因の1つである。血栓溶解又は介入療法は瀕死心筋の救い、又は心筋の血液供給の改善に効果的であるものの、その合併症とする不整脈に対して満足な結果を得ることができない。圧倒的多数の不整脈に対して、薬物治療は基本的かつ第一候補の治療方法であり、現在では臨床で一般に使用される薬物は、一定の副作用と治療制限性が存在するため、効き目が速く、安全かつ確実で、効果が独特の抗頻脈性不整脈の新規薬物の研究開発が大変求められている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は、抗頻脈性不整脈の製剤及びその調製方法を提供することを目的とする。
本発明の目的は、
延胡索抽出物であって、延胡索粗粉末100重量部を、600-1000体積部の60-80%のエタノールで1-3回抽出し、濾液を合わせ、相対密度が0.2--0.5g/mLの流エキスに減圧濃縮すること、処理されたD101樹脂、調製された流エキスを取ってカラムにロードさせ、0.2--0.5mL/minの流速で、脱イオン水で不純物を除去し、0.2--0.5mL/minの流速で、60-90%のエタノールで溶出し、0.4--0.8mL/minの流速で、濃縮して延胡索抽出物とする乾燥エキスを得ることを含む技術案によって実現される。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明の好適な技術案は、
延胡索粗粉末100重量部を、800体積部の70%のエタノールで2回抽出し、濾液を合わせ、0.3g/mLの流エキスに減圧濃縮すること、処理されたD101樹脂、調製された流エキスを取ってカラムにロードさせ、0.4mL/minの流速で、脱イオン水で不純物を除去し、0.4mL/minの流速で、80%のエタノールで8倍のカラム体積を溶出し、0.6mL/minの流速で、エタノールを回収し、濃縮して延胡索抽出物とする乾燥エキスを得ることを含むものである。
【０００５】
通常の方法に従って通常の補助材料を加え、延胡索の乾燥エキスを臨床的に許容可能な剤型に調製し、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、錠剤、経口液体製剤又は注射剤等を含むが、これらに限定されるものではない。
【０００６】
本発明のD101型マクロ多孔性吸着樹脂の直径・高さ比が1：4-8であり、流エキスのローディング溶液をpH1-2に調節し、沈殿を分解させる。D101型マクロ多孔性吸着樹脂の直径・高さ比が1：7であり、流エキスのローディング溶液をpH1.5に調節することが好ましい。本発明の前記重量部と体積部との関係はg/mlの関係である。
【０００７】
延胡索は一般的に使用される漢方薬であり、その薬性が温和で、味苦・辛で、心臓、肝臓、脾臓、肺経に入り、血行を促進し、気の循環を促進し、痛みを止める効果を有し、全身の痛みを治療でき、胸痺、狭心症の治療に用いられる。本発明の前期試験は複方から延胡索の単一の薬を選別して頻脈性不整脈を治療し、肯定的な治療効果を取得し、本発明は延胡索抽出物の極性の違いに基づき、水抽出部位、アルコール抽出部位、アルカロイド抽出有機相部位、アルカロイド抽出水相部位、マクロ多孔性樹脂濃縮部位、原薬材微粉、テトラヒドロパルマチン原薬という7つの異なる薬効選別部位を調製し、薬効選別試験を行う。薬効が最適な部位を好ましく選択して精製する。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図1はマクロ多孔性吸着樹脂のパルマチンに対する静的最大吸着量と解析量との効果の比較である。
【図２】図2はマクロ多孔性吸着樹脂のパルマチンに対する静的解析率の効果の比較である。
【図３】図3はマクロ多孔性吸着樹脂のテトラヒドロパルマチンに対する静的最大吸着量と解析量との効果の比較である。
【図４】図4はマクロ多孔性吸着樹脂のテトラヒドロパルマチンに対する静的解析率の効果の比較である。
【図５】図5は異なる濃度のローディング溶液における2種類の成分の樹脂カラムを流れた純度の比較である。
【図６】図6は異なる濃度のローディング溶液における2種類の成分の樹脂カラムを流れた転送率の比較である。
【図７】図7はHPD300型樹脂のリーク曲線である。
【図８】図8はD101型樹脂のリーク曲線である。
【図９】図9はHPD300型樹脂エタノールの溶出濃度の考察-溶出量の比較である。
【図１０】図10はHPD300型樹脂エタノールの溶出濃度の考察-転送率の比較である。
【図１１】図11はD101型樹脂エタノールの溶出濃度の考察-溶出量の比較である。
【図１２】図12はHPD300型樹脂エタノールの溶出体積の考察（n=2）である。
【図１３】図13はD101型樹脂エタノールの溶出体積の考察（n=2）である。
【図１４】図14はHPD300型樹脂のアルカリ性エタノールの溶出体積の考察（n=2）である。
【図１５】図15はHPD300型樹脂をアルカリ水で活性化した各成分の累積溶出率である。
【図１６】図16はD101樹脂の直径・高さ比、溶出率の考察である。
【図１７】図17はD101樹脂の直径・高さ比、純度の考察である。
【図１８】図18は薬材選別部位の調製略図である。
【図１９】図19は技術ロードマップである。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
実験例一  薬効選別部位の調製
1  計器と材料
1.1  計器
LC-20AT高速液体クロマトグラフィー（SPD-20AVWD検出器、4元低圧ポンプ、カラムオーブン、オートサンプラー、日本島津会社、LCSolutionクロマトグラフィーワークステーション）、Dikma DiamonsilC18カラム(4.6mm×250mm、5um、カラム番号：8132893)、METTLER  AE  240型電子分析天秤（上海メトラー・トレド計器株式会社）、Sartorius  BS110S型電子分析天秤（北京ザルトリウス科学計器株式会社）、YP10002型電子天秤（上海越平科学計器株式会社）。
【００１０】
1.2  材料
101型マクロ多孔性吸着樹脂（滄州宝恩吸着材料科学技術株式会社、薬用グレード）、テトラヒドロパルマチン（鄭州リ諾生物科学技術株式会社）
1.2.1  試薬
エタノール（北京化学工場  分析グレード）、クロロホルム（北京化学工場  分析グレード）、塩酸（北京化学工場  分析グレード）、アンモニア水（汕頭市西隴化学工場株式会社  分析グレード）
1.2.2  対照品
テトラヒドロパルマチン対照（ロット番号：110726-200409）は中国薬品生物製品検証所から購入され、含有量の測定に用いられる。
【００１１】
2  方法と結果
2.1  アルコール抽出物の調製（5番サンプル）
延胡索粗粉末100gを、800mLの80%のエタノールで2回抽出し、濾液を合わせ、減圧濃縮して120mLの流エキスを取得し、乾燥し、固体アルコール抽出物を得る。
【００１２】
2.2  D101樹脂濃縮生成物（1番サンプル）
処理されたD101樹脂10mLを取って、内径が1.0cmのガラスカラムに入れ、アルコールの味がないまで水洗いし、方法2.1に従って調製された流エキス6.0mLをカラムにロードさせ、3.5mL/hの流速で、脱イオン水で不純物を除去し、3.5mL/hの流速で、80%のエタノールで36mL溶出し、3mL/minの流速で、濃縮して乾燥エキスを取得し、マクロ多孔性樹脂濃縮生成物である。
【００１３】
2.3  脂溶性アルカロイド抽出物及び水溶性アルカロイド部位の調製（2-3番サンプル）
200gの延胡索粉末を取って、1600mLの80%のエタノールを加え、1.5h還流し、2回抽出し、濾過して濾液を取得し、濃いエキスに減圧濃縮し、体積が約200mLであり、1.0mol/Lの塩酸でpH=1に調節し、5℃で24h静置し、濾過し、且つ沈殿を洗浄し、400mLになるまで濾液に水を加え、アンモニア水でpH値をpH=10に調節し、最後に体積を調節して500mLの総液体を取得し、ジクロロメタン（300mL×2）で2回抽出し、有機相を合わせ、溶剤を減圧回収して脂溶性アルカロイド部分（3番サンプル）を取得し、抽出された水の水液を濃縮し、乾燥して水溶性アルカロイド（2番サンプル）を取得する。
【００１４】
2.4  水抽出部位の調製（4番サンプル）
テトラヒドロパルマチン粗粉末100gを、800mLの水で1.5h煎じ、2回煎じ、紗で濾過し、濾液を400mLに濃縮し、乾燥して乾燥エキスを水抽出部位として取得する。延胡索の薬材選別部位の調製を模式図18に示す。 
【００１５】
【表１】
2014005282.tif 000003
【００１６】
実験例二  薬効選別試験（サンプルが実験例一と同じである）
1  実験材料
1.1実験動物
CDマウスは90個、雄性、体重28-30gであり、北京バイタルリバー実験動物技術株式会社で、ライセンス番号がSCXk（北京）2006-0009.である。
【００１７】
1.2薬品
1.3試薬
FeCl3.6H2O（北京化学工場生産、A.R.）、赤色テトラゾリウム（北京化学工場生産、ロット番号：950221）。
1.4計器
TT実体顕微鏡（北京電気光学科学計器工場）、定温水浴発振器SHZ-22型（江蘇大倉医療機器工場）、電子分析天秤（日本島津、AEG-220型）。
【００１８】
2  実験方法
2.1試験群分け
動物をランダムに9つの群に分け、各群が10個であり、モデル群（生理食塩水10mL/kg）で、対照薬とするアミオダロンが78mg/kg群であり、1番薬が18.2mg/kgであり、2番薬が157.6mg/kg群であり、3番薬が9.1mg/kg群であり、4番薬が462mg/kg群であり、5番薬が139mg/kg群であり、6番薬が1.16mg/kg群であり、7番薬が1.3g/kg群である。投与前、各薬はいずれも生理食塩水で必要な濃度に調合され、投与経路が十二指腸であり、投与量が10mL/kgである。
【００１９】
2.2手術方法
ペントバルビタールナトリウムで動物の腹腔を麻酔し（60mg/kg）、開腹し、十二指腸に生理食塩水又は薬物を供給し、閉腹し、45分間投与した後、生理記録装置（PowerLab）を接続して標準IIリード心電図を記録して、尾静脈にCaCl2（180m/kg、10mg/mL、10秒間内に等速で供給する）を注入し、不整脈心電図を誘導するかどうかを観察し、不整脈の持続時間を記録し、結果を統計学的に処理する。
【００２０】
2.3評価標準及び試験結果
不整脈心電図を誘導するかどうかを観察し、不整脈の持続時間を記録し、結果を統計学的に処理する。統計結果を表2に示す。
【００２１】
【表２】
2014005282.tif 000004
【００２２】
2.5  結論
モデル群は陰性対照群であり、アミオダロン群は陽性群であり、最後に不整脈の発生の持続時間が短い方が良い。結果から、4、5、7番サンプルの薬効が悪く、又は薬効がなく、3、6番サンプルの薬効が中等であり、1番と2番サンプル薬効が陽性群に比較的に近づくことを分かった。薬効結果から、延胡索において、脂溶性アルカロイド成分と水溶性アルカロイド成分はいずれも頻脈性不整脈に対して一定の役割を果たし、この7つの成分において、マクロ多孔性樹脂カラム溶出成分は脂溶性アルカロイドを含むだけでなく、水溶性アルカロイドを含み、薬効が著しい。 
【００２３】
実験例三  延胡索のマクロ多孔性吸着樹脂の濃縮純化プロセス
1  計器と材料
1.1  計器
LC-20AT高速液体クロマトグラフィー（SPD-20AVWD検出器、4元低圧グラジエントポンプ、カラムオーブン、オートサンプラー、日本島津会社、LCSolutionクロマトグラフィーワークステーション）、METTLER  AE  240型電子分析天秤（上海メトラー・トレド計器株式会社）、SartoriusBS110S型電子分析天秤（北京ザルトリウス科学計器株式会社）。
【００２４】
1.2  材料
1.2.1  試薬
メタノール（Fisher会社、クロマトグラフィーグレード）、アセトニトリル（邁瑞達会社  クロマトグラフィーグレード）、リン酸（天津市光復精密化学工業研究所、クロマトグラフィーグレード）、酢酸（Fisher会社、クロマトグラフィーグレード）、トリエチルアミン（天津市光復精密化学工業研究所、分析グレード）、純水（杭州ワッハッハー株式会社）、水酸化ナトリウム（天津市光復精密化学工業研究所、分析グレード）、塩酸（北京化学工場、分析グレード）
1.2.2  対照品
デヒドロコリダリン（ロット番号：042-30751和光純薬工業株式会社）、
テトラヒドロパルマチン（ロット番号：110726-201011、中国薬品生物製品検証所、含有量の測定に用いられる）
塩酸パルマチン（ロット番号：732-9002、中国薬品生物製品検証所、含有量の測定に用いられる）
【００２５】
2  マクロ多孔性吸着樹脂タイプの選別
静的吸着法で、最大吸着量と解析率を測定することによって、最適なマクロ多孔性吸着樹脂を選別する。8種類の型番のマクロ多孔性吸着樹脂を選択し、具体的なデータを表3に示す。
【００２６】
【表３】
2014005282.tif 000005
【００２７】
上記処理された樹脂をそれぞれに5mL取って、ストッパー付き三角フラスコに置いて、表面の水分を除去し、精密に0.3g生薬/mLに濃縮する延胡索抽出液200mLを加え、振動し、24時間置き、吸引濾過し、且つ30mLの蒸留水で樹脂を洗浄し、吸引濾液及び水洗浄液を合わせ、250mLのメスフラスコに定容し、均一に揺動し、高速液体でテトラヒドロパルマチンの含有量を測定し、最大吸着量を計算する。2つの操作を並行する。
【００２８】
上記水洗いしたマクロ多孔性吸着樹脂を取って、95%のエタノール200mLを加え、24h浸漬し、吸引濾過し、且つ95%のエタノール30mLで樹脂を洗浄し、エタノール溶液を合わせ、250mLのメスフラスコに定容し、均一に揺動し、高速液体で含有量を測定し、解析率を計算する。
【００２９】
最大吸着量=[(初期の溶液濃度−吸着後の溶液濃度)×吸着液の体積/樹脂体積]（mg/mL樹脂）
解析率=[(溶出液の濃度×溶出液の体積)/(比吸着量×樹脂体積)]×100%
【００３０】
【表４】
2014005282.tif 000006
【００３１】
実験結果から、HPD300の第四級アンモニウム型アルカロイドに対する吸着量はその他のタイプの樹脂よりはるかに高く、その脱着量も非常に高く、しかし、その解析率が8種類の樹脂において低いことを分かった。
D101型樹脂の第四級アンモニウム型アルカロイドに対する吸着量と解析量が最大ではなく、しかし、その解析率が高い。
【００３２】
【表５】
2014005282.tif 000007
【００３３】
実験結果から、HPD300のテトラヒドロパルマチンに対する吸着量が高く、解析量と解析率が低く、D101型樹脂のテトラヒドロパルマチンに対する吸着量、解析量及び解析率がいずれも高いことを分かった。
吸着量、解析量及び解析率という3つの面から考慮すると、HPD300型樹脂とD101型樹脂はいずれも各自の優越性を有するため、次の実験において、この2種類の樹脂を比較試験する。
【００３４】
3  カラムロード液体濃度の考察
一定量の抽出液を取って、0.15g生薬/mL、0.3g生薬/mL、0.5g生薬/mLという3つの濃度に濃縮し、体積が100mL、50mL、30mLであり、それぞれに10mLのマクロ多孔性樹脂カラムにロードさせ、3倍のカラム体積を水洗いし、95%のエタノールで3倍のカラム体積を溶出する。溶出液を高速液体クロマトグラフィーに入れて関連する成分の含有量を測定し、且つ転送率及び純度を計算する。結果を表6に示す。
【００３５】
【表６】
2014005282.tif 000008
【００３６】
転送率、純度及び遠心沈殿量を総合的に考慮し、最終に0.3g/mLの濃度をカラムロード液体の濃度として選択する。
【００３７】
4  ローディング溶液pHの考察
延胡索アルコール抽出液を0.3g生薬/mLに濃縮し、濃塩酸で順次にpHをそれぞれに6（pHを調節しない）、5、4、3、1.5に調節し、各pH点で20min超音波し、1h置いて、沈殿分解の状況を観察する。pHが1.5である時、沈殿を分解でき、ブロックを形成しないことを発見するため、カラムロード液体のpH値が1.5であると確定する。
【００３８】
5  マクロ多孔性吸着樹脂の前処理及びカラム充填
還流液を試験管に水を加えて希釈して濁ったことがなく、紫外分光光度法でエタノール還流液の吸収値が0.1より小さく測定されるまで、選別待ちの樹脂を95%のエタノールで還流処理し、処理された樹脂をクロマトカラムに入れて、使用前に、流出液をアルコール計でエタノール含有量を0に測量するまで、蒸留水でクロマトグラフィーカラムを洗い流し、次の使用のために用意する。2つの操作を並行する。
【００３９】
6  カラムロード液体の調製
延胡索薬材の粗粉末を秤量し、8倍量の80%のエタノールで2回還流抽出し、毎回1hで、抽出液を濾過し、濾液を合わせ、0.3g生薬/mLに減圧濃縮する。高速液体クロマトグラフィーでカラムロード液体におけるテトラヒドロパルマチンとパルマチンの含有量を測定し、次の使用のために用意する。
【００４０】
7  最大ローディング量の考察
7.1  HPD300型樹脂の最大ローディング量の考察
処理されたHPD300型マクロ多孔性樹脂20mLを取って、2本のクロマトカラムに入れて、pHが1.5のローディング溶液を取って0.4mL/minの流速でローディングし、1倍のカラム体積あたりに1回収集し、その中のデヒドロコリダリン、パルマチン、テトラヒドロパルマチンの含有量を測定し、リーク曲線を描く。結果を図7のように示す。
【００４１】
【表７】
2014005282.tif 000009
【００４２】
リーク曲線から、第7倍のカラム体積から、デヒドロコリダリンがリークし始め、ローディングする時にリークしにくいことを保証するために、最大ローディング量が6倍のカラム体積であると確定し、即ち、1.8g生薬/mL樹脂であることを分かった。
【００４３】
7.2  最大ローディング量の考察
処理されたD101型マクロ多孔性樹脂10mLを取って、2本のクロマトカラム（12mmI.D.）に入れて、ローディング溶液を取って0.4mL/minの流速でローディングし、1倍のカラム体積あたりに1回収集し、且つその中のデヒドロコリダリン、パルマチン、テトラヒドロパルマチンの含有量を測定し、リーク曲線を描く。結果を表8と図8に示す。
【００４４】
【表８】
2014005282.tif 000010
【００４５】
リーク曲線から、パルマチンが第9倍のカラム体積からリークし始め、デヒドロコリダリンが第8倍のカラム体積からリークし始め、テトラヒドロパルマチンがずっとリークせず、ローディングする時に各成分がリークしないことを保証するために、最大ローディング量が7倍のカラム体積であると確定し、即ち、2.1g生薬/mL樹脂であることを分かった。
【００４６】
8  ローディング流速の考察
8.1  HPD300型樹脂のローディング速度の考察
処理されたHPD300型マクロ多孔性樹脂10mLを取って、同一な型番のクロマトカラムに入れて、精密にローディング溶液60mLを吸い込み、それぞれに0.4mL/min、0.6mL/min、0.8mL/minの流速で動的に吸着し、ローディング流出液を測定し、結果としては、0.4mL/minと0.6mL/minの流速で6倍のカラム体積をローディングし、リークせず、0.8mL/minの流速で第5倍のカラム体積をローディングし、リークし始めるので、最終に0.6mL/minをローディング流速として選択する。
【００４７】
8.2  D101型樹脂のローディング速度の考察
処理されたD101型マクロ多孔性樹脂10mLを取って、2本のクロマトカラム（12mmI.D.）に入れて、精密にローディング溶液70mLを吸い込み、それぞれに0.4mL/min、0.6mL/min、0.8mL/minで動的に吸着し、1倍のカラム体積あたりに1回収集し、且つその中のデヒドロコリダリン、パルマチン、テトラヒドロパルマチンの含有量を測定し、0.4mL/minの速度でローディングする時、ローディング溶液がリークしないことを発見するので、0.4mL/minの速度をローディング流速として選択する。
【００４８】
9  エタノール溶出濃度の考察
9.1  HPD300型樹脂のエタノールの溶出濃度の考察
処理されたHPD300型マクロ多孔性樹脂10mLを取って2本のクロマトカラム（12mmI.D.）に入れて、精密にローディング溶液60mLを吸い込み、0.6mL/minの速度で動的にローディングし、3倍のカラム体積（0.6mL/min）を水洗いした後、順次に20%、40%、60%、80%、95%のエタノールでそれぞれに3倍のカラム体積を溶出し、0.6mL/minの流速で、それぞれに各濃度のアルコール洗浄液におけるテトラヒドロパルマチンとパルマチンの含有量と歩留りを測定し、溶出率と純度を計算する。
【００４９】
また、処理されたHPD300型マクロ多孔性樹脂10mLを取って2本のクロマトカラム（12mmI.D.）に入れて、精密にローディング溶液60mLを吸い込み、0.6mL/minの速度で動的にローディングし、3倍のカラム体積（0.6mL/min）を水洗いした後、95%のエタノールで3倍のカラム体積を直接溶出し、0.6mL/minの流速で、アルコール洗浄液におけるテトラヒドロパルマチンとパルマチンの含有量と歩留りを測定し、溶出率と純度を計算する。
図から分かるように、エタノールで勾配溶出し、水溶性アルカロイドと脂溶性アルカロイドが異なるアルコール濃度で溶出され、水溶性アルカロイドが40%のアルコールで溶出されることができ、脂溶性アルカロイドが95%のアルコールで溶出され、95%のエタノールで、同時に両者を直接溶出することができ、そのため、アルコールの溶出濃度を95%のエタノールに確定する。
【００５０】
9.2  D101型樹脂のエタノールの溶出濃度の考察
処理されたマクロ多孔性樹脂10mLを取って同一な型番のクロマトカラムに入れて、精密にローディング溶液70mLを吸い込み、0.4mL/minで動的にローディングして吸着し、4倍のカラム体積を水洗いし、0.4mL/minの溶出流速で、更に順次に20%、40%、60%、80%、95%のエタノールでそれぞれに3倍のカラム体積を溶出し、0.4mL/minの溶出流速で、それぞれに各濃度のアルコール溶出液における3種類の成分の含有量を測定し、結果を以下の図11に示す。
【００５１】
図から分かるように、水溶性アルカロイドが低濃度のアルコールで溶出されることができるが、テトラヒドロパルマチンが第三級アミン型水不溶性アルカロイドであり、80%のエタノールに溶出率が最大に達し、総合的に考慮すると、80%のエタノールを溶出溶剤として選択することを決定する。
【００５２】
10  エタノール溶出体積の考察
10.1  HPD300型樹脂エタノール溶出体積の考察
処理されたマクロ多孔性樹脂10mLを取って、同一な型番のクロマトカラムに入れて、精密にローディング溶液60mLを吸い込み、0.6mL/minで動的にローディングして吸着し、3倍のカラム体積を水洗いし、95%のエタノールで15BV溶出し、デヒドロコリダリン、パルマチン及びテトラヒドロパルマチンの累積溶出率を計算する。
【００５３】
【表９】
2014005282.tif 000011
【００５４】
実験結果図12から、95%のエタノールで溶出し、パルマチンが6BVである時、溶出率が95%以上に達することができ、テトラヒドロパルマチンが8BVである時、95%以上に達することができ、デヒドロコリダリンの溶出率が最終に78%であることを分かった。
【００５５】
10.2  D101型樹脂のエタノール溶出体積の考察
処理されたマクロ多孔性樹脂10mLを取って同一な型番のクロマトカラムに入れて、精密にローディング溶液70mLを吸い込み、0.4mL/minで動的にローディングして吸着し、4倍のカラム体積を水洗いし、0.4mL/minの溶出流速で、更に順次に80%のエタノールで10倍のカラム体積を溶出し、0.6mL/minの溶出流速で、10mLあたりに溶出液を1回収集し、それぞれに各体積のアルコール溶出液における3種類の成分の含有量と歩留りを測定する。結果を表10と図13に示す。
【００５６】
【表１０】
2014005282.tif 000012
【００５７】
結果図13から、溶出体積が8倍のカラム体積に達する場合に、3種類の成分の溶出率はいずれも95%以上であり、そのため、最終に溶出体積が8倍のカラム体積であると確定することを分かった。
【００５８】
11  HPD300型樹脂のプロセス条件の改善
HPD300型樹脂を応用し、デヒドロコリダリンの溶出率が低く、そのため、ローディングと溶出条件を改善することによって、デヒドロコリダリンに対する溶出率を最適化する。
11.1  アルカリ性エタノールによる溶出
処理されたマクロ多孔性樹脂10mLを取って、同一な型番のクロマトカラムに入れて、精密にローディング溶液60mLを吸い込み、0.6mL/minで動的にローディングして吸着し、3倍のカラム体積を水洗いする。
95%のエタノール120mLを取って、NaOHを加え、pH値を8.5まで調節し、溶出流速が0.6mL/minで、溶出体積が12BVで、溶出液を受け、3つの成分の累積溶出率を測定する。
【００５９】
【表１１】
2014005282.tif 000013
【００６０】
実験結果表11と図14から、エタノールをアルカリ性に調節した後、デヒドロコリダリンに対する溶出率の向上に有用であり、しかし、効果が明らかではなく、溶出率が80%程度のみであるが、パルマチンの溶出率が低下することを分かった。
【００６１】
11.2  水酸化ナトリウム溶液によるマクロ多孔性樹脂カラムの活性化
処理されたマクロ多孔性樹脂10mLを取って、同一型番のクロマトカラムに入れて、精密にローディング溶液60mLを吸い込み、0.6mL/minで動的にローディングして吸着し、3倍のカラム体積を水洗いする。
更に0.1mol/LのNaOH溶液で3BV溶出し、溶出流速が0.6mL/minであり、1h置き、95%のエタノールで10BV溶出し、3種類の成分の累積溶出率を計算する。
【００６２】
【表１２】
2014005282.tif 000014
【００６３】
実験結果表10と図15から、アルカリ水で活性化した後、水酸化第4級アンモニウム成分の溶出率はいずれも低下し、デヒドロコリダリンの累積溶出率が60%であり、パルマチンの累積溶出率が68%程度であり、テトラヒドロパルマチンの溶出が10BVである時、完全に溶出することができることを分かった。
デヒドロコリダリンの溶出率が低いので、樹脂の型番の選択が適切ではないと考慮する。総合的に考慮すると、D101樹脂を濃縮樹脂として採用することを決定する。
【００６４】
12  D101樹脂の水洗い流速及び体積
処理されたD101型マクロ多孔性樹脂10mLを取って、2本のクロマトカラム（12mmI.D.）に入れて、精密にローディング溶液70mLを吸い込み、それぞれに0.4mL/minのローディング流速で動的に吸着し、その後、蒸留水で0.4mL/minでMolish反応が陰性を呈するまで洗う。Molish反応としては、1mLの洗浄液を取って、2滴のMolish試薬を加え、均一に揺動する。試験管を傾斜し、管壁に沿って慎重に1mLの濃硫酸を加え、揺動せず、慎重に垂直した後に注意深く2層の液面接合箇所の色の変化を観察する。結果としては、4倍のカラム体積まで水洗いする時、洗浄液が無色に近づき、Molish反応が陰性を呈し、アルカロイド反応試薬は水洗浄液においてアルカロイドのリークがないことを測定し、そのため、水洗い体積が4BVであると確定する。
【００６５】
13  エタノール溶出速度の考察
処理されたマクロ多孔性樹脂10mLを取って同一型番のクロマトカラムに入れて、精密にローディング溶液70mLを吸い込み、0.4mL/minで動的にローディング吸着し、4倍のカラム体積を水洗いし、0.4mL/minの溶出流速で、更に80%のエタノールで10倍のカラム体積を順次溶出し、溶出流速が0.6mL/minと0.8mL/minであり、それぞれに各濃度のアルコール溶出液における3種類の成分の含有量と歩留りを測定する。溶出率と歩留りを計算する。結果を以下の表に示す。
【００６６】
【表１３】
2014005282.tif 000015
3種類の成分の溶出率の比較において、流速が0.6mL/minである群の溶出率が高く、歩留りがわずかに大きく、完全に溶出する原則に基づいて、流速を0.6mL/minに選択する。
【００６７】
14  直径・高さ比の考察
それぞれに処理された樹脂6.8mL、10mL、12.2mLを取って同一な型番のクロマトカラムに入れて、直径・高さ比が1：5、1：7、1：9とし、それぞれに精密にローディング溶液47.6mL、70mLと85.4mLを吸い込み、0.4mL/minでローディングし、3倍のカラム体積を水洗いし、（0.4mL/min）で、80%のエタノールで8倍のカラム体積を溶出し、（0.6mL/min）で、溶出液におけるデヒドロコリダリン、パルマチン及びテトラヒドロパルマチンの含有量と歩留りを測定し、溶出率と純度を計算する。
【００６８】
【表１４】
2014005282.tif 000016
【００６９】
結果から、直径・高さ比の結果への影響が小さく、実際に生産する必要性を考慮すると、確定される直径・高さ比を1:7に選択することを分かった。
【００７０】
15  小試験検証試験
上記マクロ多孔性吸着樹脂の濃縮純化プロセスに従って3つのバッチのサンプルを調製し、総アルカロイド含有量を測定する。
【００７１】
【表１５】
2014005282.tif 000017
【００７２】
実験結果図16、図17から、該純化プロセスが安定且つ実行可能であることを分かった。
マクロ多孔性吸着樹脂のプロセスのまとめ：D101型マクロ多孔性吸着樹脂としては、ローディング溶液の濃度が0.3g/mLであり、ローディング溶液をpH1.5に調節して沈殿を分解させ、直径・高さ比が1：7であり、ローディング量が2.1g生薬/mL樹脂であり、体積4BVを水洗いして不純物を除去し、流速が0.4mL/minであり、エタノールの溶出濃度が80%であり、溶出流速が0.6mL/minであり、溶出体積が8BVである。
【００７３】
実験例4
1.材料と方法
1.1実験材料
1.1.1実験動物
健康なWistarラットは雄性、体重200〜220gであり、北京華阜康科技股フン有限公司から提供される。免許証番号がSCXK北京2009-0007である。 
【００７４】
1.1.2計器と設備
ファントムV7スキャナーがマイクロテック科技から提供され、DT−2000型電子天秤が米国雙傑兄弟有限公司製であり、MPIDS-500マルチメディアカラー病理画像分析システムが北京空海公司製である。
【００７５】
2.1.3 薬品と試薬
延胡索抽出物は黄褐色粉末で、実施例3の方法により得られ、ロット番号1が201107であり、1グラムあたりの抽出物が生薬62.762gに相当し、ロット番号2が201107であり、1グラムあたりの抽出物が生薬65.50218gに相当する。
メトプロロールはアストラゼネカ製薬有限公司から提供され、規格が25mg/錠であり、ロット番号が1105031であり、
参松養心カプセルは河北以嶺薬業有限公司から提供され、規格が0.4g/錠であり、ロット番号が1104007であり、
ニトロテトラゾリウムブルークロリド（N-BT）は、ロット番号が2541C012であり、Amresco公司から提供され、
抱水クロラールは、ロット番号が20110210であり、国薬集団化学試薬有限公司から提供される。
【００７６】
1.2実験方法
1.2.1モデリング方法
ラットは3.5%の抱水クロラールで10mL/kgで腹腔に注射して麻酔し、仰臥してラットボードに固定する。ラットの左側の第4、5肋間に切り口して、胸腔を開き、心膜を引き裂き、胸郭をゆっくりと押して心臓を押し出し、0番手術糸で左心耳下の2mmで左冠動脈前下行枝を結紮し、すぐに心臓を胸腔に入れて、切り口を閉め、皮膚を縫合し、局所的にペニシリン8万単位を応用して感染を防止する。
【００７７】
1.2.2 群分け
モデリングが成功したラット66個をランダムに6つの群に分け、各群が11個である。即ち、１．モデル群、２．メトプロロール群、３．参松養心カプセル群、４．延胡索抽出物高投与量群（高投与量群）、５．延胡索抽出物中間投与量群（中投与量群）、６．延胡索抽出物低投与量群（低投与量群）であり、翌日に胃内投与を開始する。
【００７８】
1.2.3 薬物調製方法
１．メトプロロール群：臨床上急性心筋梗塞ので死亡した後、β受容体遮断剤を使用し、一般的に低投与量12.5mg bidから投与し、即ち25mg/dであり、ラットに変換すると、25×0.018×5=2.25mg/kgである。精確にメトプロロール67.5mgを秤量し、300ml0.9%の生理食塩水を加え、均一に混合すればよい。
２．参松養心カプセル群：参松養心カプセルの臨床使用投与量が4# tid、0.4g/錠であり、即ち4.8gであり、ラットに変換すると、4.8×0.018×5=0.432g/kgである。精確に参松養心カプセル12.96gを秤量し、300ml 0.9%の生理食塩水を加え、均一に混合すればよい。
３．延胡索抽出物：延胡索生薬薬局方が規定する最大使用投与量は9gであり、ラットに変換すると、9×0.018×5=0.81g/kgであるので、0.81g/kgを低投与量群として取り、1.62g/kgを中間投与量群として取り、3.24g/kgを高投与量群として取る。10ml/kgで投与し、延胡索3.24g/kg群濃度が0.324g/mlであり、400ml調製し、即ち400×0.324=129.6gの生薬である。4.78g延胡索エキス=300g生薬であり、129.6g生薬=2.06496gエキスである。精確に延胡索抽出物エキス2.06496gを称量し、400mlの生理食塩水を加えて薬を溶解し、400mlのコリダリン高投与量群を調製する。高投与量群から110ml抽出し、110mlの生理食塩水を加え、均一に混合し、220mlの中間投与量群の薬品である。高投与量群から60ml抽出し、180mlの生理食塩水を加え、均一に混合し、240mlの低投与量群の薬品である。
【００７９】
1.2.4 投与方法
1ml/100gで胃内投与し、モデル群は等体積の生理食塩水を与える。メトプロロール群、参松養心カプセル群、延胡索抽出物の高、中、低投与量はそれぞれに対応する薬品を与える。7日間連続的に胃内投与する。最終回に薬又は生理食塩水を投与して2時間材料を集める。備考：そのうち、モデル群の2個、メトプロロール群の1個、参松養心カプセル群の2個、中投与量群の1個、低投与量群の1個は翌日に胃内投与する前に、死亡する。
【００８０】
1.3指標検出--心筋梗塞面積  
心臓を取り出し、生理食塩水で心腔に残留する血液を洗い流し、濾紙で余分な液体を乾燥するまで吸い取って、量り、結紮糸下から冠状動脈溝に平行して均一に心室を同じ厚さの5個に切り、それぞれに量り、0.2%N-BTに置いて、常温で2-3min染色し、スキャナーがそれぞれに5個の心筋の両面をスキャンし、スキャン画像を得て、得られた画像に対して盲検法で、再採番を行い、2人でマルチメディアカラー病理画像分析システムで各心筋両側の梗塞区域を測定して非盲検し、結果が2人の平均値を取り、心室の合計面積、梗塞区域の合計面積及び心室面積を占める梗塞区域面積の百分率を計算する。
【００８１】
1.4.統計分析
データ統計分析はSPSS16.0統計分析ソフトウェアで計算する。データは
2014005282.tif 000018
で示され、一元配置分散分析は統計学的に処理し、有意水準Pが0.05より小さい。
【００８２】
2.技術ロードマップ（図面19に示す）
3. 結果
【００８３】
【表１６】
2014005282.tif 000019
モデル群と比較すると、* Pが0.05より小さく、** Pが0.01より小さく、メトプロロール群と比較すると、△Pが0.05より小さく、△△Pが0.01より小さい。参松養心カプセル群と比較すると、▲Pが0.05より小さく、▲▲Pが0.01より小さい。
【００８４】
各群間の心室の合計面積の間の比較には、統計学的差異がなく、比較可能性（P=0.425）を有する。梗塞区域面積において、モデル群と比較すると、延胡索抽出物の高投与量群の以外に、メトプロロール群、参松養心カプセル群、延胡索抽出物の低、中投与量群の心筋梗塞面積がいずれも減少し、差異には統計学的有意性（P＜0.05）を有し、メトプロロール群と比較すると、延胡索抽出物の高投与量群の心筋梗塞面積作用のみがわずかに悪く、差異には統計学的有意性（P＜0.05）を有し、その他の治療群との間の差異には統計学的有意性がなく、参松養心カプセル群と比較すると、延胡索抽出物の高投与量群の心筋梗塞面積作用のみがわずかに悪く、その他の治療群の間に梗塞区域面積には統計学的差異がない。同時に梗塞区域面積/心室の合計面積には、モデル群と比較すると、各薬物治療群はいずれもモデル群より縮小し、差異には統計学的有意性（P＜0.05）を有する。メトプロロール群と比較すると、延胡索抽出物の低投与量群は梗塞区域面積/心室の合計面積には効果がもっとよく、その他の治療群には統計学的有意性がなく、参松養心カプセル群と比較すると、各治療群の間には著しい統計学的差異がない。研究は、延胡索抽出物の低、中間投与量群がいずれも著しい心筋梗塞面積の縮小作用を有し、心筋虚血を改善することによって、虚血性不整脈の発生を減少させ、且つその作用がメトプロロール群、参松養心カプセル群の作用に相当し、更に強いことを提示する。
【００８５】
4.討論
左冠動脈前下行枝の結紮が心筋虚血を引き出して誘導する不整脈モデルは、臨床急性心筋梗塞の患者が発生する不整脈に非常に類似する。不整脈の発生周波数が心筋虚血の程度と正相関し、重度の心筋虚血を発生する時、心筋代謝、細胞構造及びイオンチャネルの異質性は深刻に変化し、ミトコンドリア酸化代謝が減少し、心筋ホスファターゼを活性化させ、脂質リン酸を劣化させ、血液循環において遊離脂肪酸の含有量が増加し、酸素フリーラジカルが虚血組織に蓄力し、心筋虚血損傷を引き出し、カテコールアミンに対する局所的な心筋の反応性が下降し、瞬時に外膜での外向きカリウム電流（Ito）と中、内膜での外向きカリウム電流（Ito）との差異が増加し、J波とST上昇を発生し、貫壁性再分極分散が増加し、心筋再分極の不均一性を引き出し、リエントリーを形成しやすく、不整脈を誘導する。冠状動脈によってイヌの左心室楔形組織ブロックモデルを灌流し、フローティングガラス微小電極と心電図同期記録技術を応用し、急性心筋虚血20minの後、心筋組織ブロックの全体の心室性期外収縮発生率が63.6%であり、「R on T」心室性期外収縮と心室頻拍を出現できることを観察する。且つ急性心筋虚血の早期で、内、中、外3層の心筋Itoが増大し、活動電位持続発生する重要なメカニズムである。また、心筋虚血後、局所的な心筋細胞コネキシンが脱共役し、数量が減少し、伝導速度が低下し、自発又は続発的に心室性期外収縮を行い心室細動を誘導しやすい。
【００８６】
本実験例の結果から、本発明の上記延胡索抽出物は著しくラットの心筋梗塞面積及び心筋梗塞面積/心室の面積百分率を縮小させ、心筋虚血を改善させ、不整脈の発生を低下させることができるを示す。
【００８７】
実験例5  
1.材料と方法
1.1実験材料1.1.1実験動物
健康なWistarラットは、雄性、体重200〜220gであり、北京華阜康科技股フン有限公司から提供される。免許証番号がSCXK北京2009-0007である。
【００８８】
1.1.2計器と設備
電子天秤は米国雙傑兄弟有限公司製であり、計器型番がDT−2000であり、 
マイクロプレートリーダーはフィンランド（Labsystems Multiskan MS）から提供され、計器型番が352型であり、
プレートウォッシャーはフィンランド（Thermo Labsystems）から提供され、計器型番がAC8であり、
遠心機は微量高速遠心機（中国製）であり、計器型番がTG16Wであり、
インキュベーターは水ジャケット式恒温インキュベーター（中国製）であり、計器型番がGNP-9080型である。
ホモジネート分散器は金壇市金南計器製造有限公司から提供され、計器型番がFSH-2である。
【００８９】
1.1.3 薬品と試薬
延胡索抽出物は黄褐色粉末で、実施例3の方法により得られ、ロット番号1は201107で、1グラムあたりの抽出物は生薬62.762gに相当し、ロット番号2は201107であり、1グラムあたりの抽出物は生薬65.50218gに相当する。
メトプロロールはアストラゼネカ製薬有限公司から提供され、規格は25mg/錠であり、ロット番号は1105031であり、 
参松養心カプセルは河北以嶺薬業有限公司から提供され、規格は0.4g/錠であり、ロット番号は1104007であり、 
抱水クロラールは、ロット番号が20110210であり、国薬集団化学試薬有限公司から提供され、
Na+-K+-ATPase試薬キット、Ca2+-ATPase試薬キットはドイツIBL公司から提供され、ロット番号は201108である。
【００９０】
1.2実験方法
1.2.1モデリング方法
ラットは3.5%の抱水クロラールで10mL/kgで腹腔に注射して麻酔し、仰臥してラットボードに固定する。ラットの左側の第4、5肋間に切り口して、胸腔を開き、心膜を引き裂き、胸郭をゆっくりと押して、心臓を押し出し、0番号の手術糸で左心耳下の2mmで左冠動脈前下行枝を結紮し、すぐに心臓を胸腔に入れて、切り口を閉め、皮膚を縫合し、局所的にペニシリン8万単位を応用して感染を防止する。
【００９１】
1.2.2 群分け
モデリングが成功した42個をランダムに6つの群に分け、各群が7個である。即ち、１．モデル群、２．メトプロロール群、３．参松養心カプセル群、４．延胡索抽出物の高投与量群（高投与量群）、５．延胡索抽出物の中間投与量群（中投与量群）、６．延胡索抽出物の低投与量群（低投与量群）であり、正常群6個、偽手術群6個を加え、ともに8群である。翌日に胃内投与を開始する。
【００９２】
1.2.3 薬物調製方法：実験例1における「薬物調製方法」と同じである。
1.2.4 投与方法
1ml/100gで胃内投与し、モデル群、正常対照群、偽手術群は等体積の生理食塩水を与える。メトプロロール群、参松養心カプセル群、延胡索抽出物の高（高）、中、低投与量はそれぞれに対応する薬品を与える。7日間連続胃内投与する。最終回に薬又は生理食塩水を投与して2時間材料を集める。備考：そのうち、モデル群の1個、偽手術群の1個は翌日に胃内投する前に、死亡する。
【００９３】
1.3材料の集め及び指標検出
心臓を取り出し、生理食塩水で心腔に残留する血液を洗い流し、快速に結紮糸下から梗塞部位を切り取り、濾紙で余分な液体を乾燥するまで吸い取って、量り、一定量のPBSを加え、PHは 7.4である。液体窒素で迅速に冷凍保存して次の使用のために用意する。
Na+-K+-ATPase、Ca2+-ATPaseの検出：試薬キットの説明書により操作測定する。
操作ステップは
（1）サンプルを融解して2-8℃の温度を保持し、心筋組織を量り、一定量のPBSを加えて調製し、ホモジナイザーで標本を十分にホモジネートし、20%の心筋組織ホモジネート液体に調製する。遠心機で遠心し、2000回転/分間で、20分間遠心し、上澄みを取って測定するステップと、
（2）標準品を説明書により5個の勾配に希釈して、濃度がそれぞれに1200ug/L、800 ug/L 、400 ug/L、200 ug/L、 100 ug/Lであり、各勾配の各ウエルのサンプル添加量はいずれも50ulである標準品の希釈とサンプル添加ステップと、
（3）それぞれにブランクウェル、測定待ちのサンプルウェルを設け、エライサストレプトアビジンコートプレートで測定するサンプルウェルにまずサンプル希釈液40ulを加え、その後、測定待ちのサンプル10ulを加え、サンプル添加はサンプルをエライサプレートウエルの底部に加え、できるだけウエル壁をタッチせず、ゆっくりと揺れ、均一に混合するサンプル添加ステップと、
（4）封止膜で封止して37℃のサーモスタットに置いて、30分間インキュベートするインキュベーションステップと、
（5）30倍の濃縮洗浄液を蒸留水で30倍希釈して次の使用のために用意し、注意深く封止膜を取り外し、液体を除去し、振り乾燥し、各ウエルに洗浄液を完全に注入し、30秒間静置して除去し、このように5回繰り返し、押して乾燥する混合液洗浄ステップと、
（6）ブランクウェルの以外に、各ウエルにエライサ試薬50ulを加える酵素添加ステップと、
（7）封止膜で封止して37℃のインキュベーションに置いて、30分間インキュベートするインキュベーションステップと、
（8）注意深く封止膜を取り外し、液体を除去し、振り乾燥し、各ウエルに洗浄液を完全に注入し、30秒間静置して除去し、このように5回繰り返し、押して乾燥する洗浄ステップと、
（9）各ウエルにまず発色剤A50ulを加えて、更に発色剤B50ulを加え、ゆっくり振動して均一に混合し、37℃で日に当たらなく、15分間発色する発色ステップと、 
（10）各ウエルに停止液50ulを加え、反応を停止する停止ステップと、
（11）ブランクウェルでゼロに調節し、450nm波長で順次に各ウエルの吸光度（OD値）を測定し、 停止液を加えた15分間の内に測定すべきである測定ステップと、
（12）標準物の濃度を横座標として、OD値を縦座標として、座標紙で標準曲線を描き、サンプルのOD値により標準曲線から対応する濃度を調べて、更に希釈倍数をかけ、又は標準物の濃度とOD値により標準曲線の直線回帰方程式を算出し、サンプルのOD値を方程式に代入し、サンプルの濃度を算出し、更に希釈倍数をかけ、サンプルの実際濃度になる計算ステップとを含む。  
【００９４】
1.4.統計分析
データ統計分析はSPSS16.0統計分析ソフトウェアで計算する。データは
2014005282.tif 000020
で示され、一元配置分散分析が統計学的に処理し、OD値と濃度が単純線形回帰を行う。有意水準Pが0.05より小さい。
【００９５】
2.技術ロードは実験例1の「技術ロードマップ」と同じである（図面19に示す）。
【００９６】
3.結果
3.1 Na+-K+-ATPase濃度の測定結果
3.1.1 標準品測定による回帰方程
【００９７】
【表１７】
2014005282.tif 000021
【００９８】
表における測定されたOD値と濃度から、回帰方程Y=-0.725+5.071X r=0.996を得る。
【００９９】
3.1.2 各群サンプルのNa+-K+-ATPase濃度値の比較
【０１００】
【表１８】
2014005282.tif 000022
【０１０１】
正常群と比較すると、* Pが0.05小さく、** Pが0.01より小さく、モデル群と比較すると、△Pが0.05より小さく、△△Pが0.01より小さく、メトプロロール群と比較すると、▲Pが0.05より小さく、▲▲Pが0.01より小さい。
【０１０２】
結果から、正常群と比較すると、その他の各群のNa+-K+-ATPase濃度値がいずれも低下し、特にモデル群が著しく低下し、差異には統計学的有意性（P＜0.01）を有し、モデル群と比較すると、各治療群のNa+-K+-ATPase濃度値がいずれも向上し、差異には統計学的有意性（P＜0.01）を有し、メトプロロール群と比較すると、参松養心カプセル群、延胡索抽出物の高、中、低投与量群のNa+-K+-ATPase濃度値がわずかに低く、治療効果がメトプロロール群より悪いことを示す。実験結果から、延胡索抽出物の中、低投与量群がNa+-K+-ATPaseの活性を向上させ、Na+- Ca2+交換を促進させ、細胞におけるカルシウム過負荷を軽減させ、心筋虚血を改善させ、心筋損傷修復を促進させることによって、虚血性不整脈の発生を低下させることができることを示す。
【０１０３】
3.2 Ca2+-ATPase濃度の測定結果
3.2.1標準品測定による回帰方程
【０１０４】
【表１９】
2014005282.tif 000023
【０１０５】
表における測されたOD値と濃度から、回帰方程Y=-0.871+8.473X r=0.997を得る。
【０１０６】
3.2.2 各群サンプルのCa2+-ATPase濃度値の比較
【０１０７】
【表２０】
2014005282.tif 000024
【０１０８】
正常群と比較すると、* Pが0.05より小さく、** Pが0.01より小さく、モデル群と比較すると、△Pが0.05より小さく、△△Pが0.01より小さく、メトプロロール群と比較すると、▲Pが0.05より小さく、▲▲Pが0.01より小さい。
【０１０９】
結果から、正常群と比較すると、その他の各群のCa2+-ATPase濃度値がいずれも低下し、特にモデル群が著しく低下し、差異には統計学的有意性（P＜0.01）を有し、モデル群と比較すると、各治療群のCa2+-ATPase濃度値がいずれも向上し、差異には統計学的有意性（P＜0.01）を有し、メトプロロール群と比較すると、参松養心カプセル群、延胡索抽出物の高、中、低投与量群のCa2+-ATPase濃度値がわずかに低く、治療効果がメトプロロール群より悪いことを示す。結果から、延胡索抽出物の中、低投与量群がCa2+-ATPaseの活性を著しく向上させ、カルシウム過負荷を軽減させ、ナトリウムカルシウム交換を促進させ、心筋虚血を改善させることによって、不整脈の発生を減少させることができることを示す。
【０１１０】
4.討論
4.1 Na+-K+-ATPaseの生理作用
Na+-K+-ATPaseがナトリウム - カリウムポンプとしても知られ、ナトリウムポンプと略称され、細胞膜における非常に重要なイオンポンプである。大きさが異なる2つのサブユニットを有し、大きなサブユニットが触媒してATPを加水分解させ、小さなサブユニットが糖タンパク質である。Na+-K+-ATPaseはリン酸化と脱リン酸化過程によって配座が変化し、Na+、K+との親和力が変化することを引き出す。大きなサブユニットがNa+との親和性状態でNa+に結合して、ATPの加水分解をトリガーし、1分子のATPを分解するごとに3個のNa+を細胞の外に移動すると同時に、2つのK+を細胞の内に移動し、膜貫通勾配と電位差に作り、神経筋肉興奮性の基礎である。細胞の内にNa+濃度を向上させ、又は細胞の外にK+濃度を向上させ、共にNa+-K+-ATPaseを活性化させることができる。Na+-K+-ATPaseの特性は、イオンへの輸送循環がリン酸化過程に依存し、ATPにおけるリン酸基をNa+-K+-ATPaseのアスパラギン酸残基に転移し、配座の変化を引き出す。
【０１１１】
Na+-K+-ATPaseが重要な生理意義を有し、（1）細胞における高カリウムを維持でき、細胞における高カリウム環境は細胞が正常に代謝活動する必要条件であることと、（2）細胞の外が高ナトリウムになり、細胞の正常形態を維持し、正常体液量を保持する方面で重要な作用を有することと、（3）細胞の内、外にイオンの分布を不均一化にさせ、生物電気を発生する基礎であり、即ち、K+が流出して静止電位を発生できるが、Na+が流出して活動電位を発生できることと、（4）その他の物質の能動輸送にエネルギーを提供することと、（5）細胞におけるPHの安定性を維持し、Na+-K+-ATPaseがNa+-H+の交換に動力を提供することとを含む。
【０１１２】
4.2 Ca2+-ATPaseの生理作用
Ca2+-ATPaseがカルシウムポンプとしても知られ、細胞膜、筋小胞体及び小胞体膜に位置する。細胞膜に、Ca2+-ATPase、即ち、（Plasma membrane Calcium pump,PMCA）は1分子のATPを分解するごとに1個のCa2+を細胞質で細胞の外に輸送でき、筋小胞体又は小胞体に、Ca2+-ATPase、即ち、（sarcoplasmic reticulum Calcium）は、1分子のATPを分解するごとに2個のCa2+を細胞質で筋小胞体又は小胞体に輸送できる。その輸送メカニズムがNa+-K+-ATPaseに類似し、即ち、リン酸化と脱リン酸化反応により異なる配座の間の酵素タンパク質の相互変換を引き出してCa2+の輸送を完成する。Ca2+-ATPaseがペプチド鎖からなり、10個の膜貫通αが螺旋し、そのN端とC端がいずれも膜の細胞質側に位置する。そのATP結合サイト、リン酸化サイト及びCa2+結合サイトがいずれも細胞質側に位置する。その上、細胞質に位置するC端がCa2+とカルモジュリン（Calmodulin、CaM）複合物にお互いに結合可能なドメインを有し、該部位はCa2+-ATPase自身の活性に対して抑制の役割を果たし、即ち所謂自己抑制作用である。細胞質にCa2+濃度が向上する時、多くのCa2+-CaM複合物を生成し、後者が該部位に結合でき、且つその酵素活性への抑制作用を取り除くことによって、Ca2+に対する酵素タンパク質の親和力と輸送速率を向上させ、Ca2+の外への排出を加速させ、これは細胞におけるCa2+定常状態のネガティブフィードバックメカニズムである。筋小胞体におけるCa2+-ATPaseにも類似する調節メカニズムを有するが、酵素活性を抑制する部位は酵素分子のC端ではなく、酵素分子と離れるホスホランバン（phosphlamban）である。
【０１１３】
Ca2+-ATPaseの作用は主に細胞質におけるCa2+濃度を低レベルに維持し、細胞の正常生理機能の維持に対して重要な意義を有する。膜内外のCa2+濃度勾配は多種のメカニズムによって維持され、筋小胞体又は小胞体のCa2+-ATPase、細胞膜におけるNa+- Ca2+交換体及びCa2+-ATPaseの機能活動を含む。細胞質における遊離Ca2+濃度が長時間に、不可逆的に向上する時、カルシウム過負荷を発生し、細胞に毒性を有し、更に細胞死亡を引き出す。
【０１１４】
4.3 Na+- Ca2+交換メカニズム
Na+- Ca2+交換体は細胞膜における双方向輸送システムであり、3個のNa+を転入して1個のCa2+を排除することによって活動する。Na+- Ca2+におけるイオン膜貫通輸送の方向が、細胞膜内外のNa+濃度差、Ca2+濃度差及び膜電位レベルという3個の因子に依存する。静止電位と活動電位の大部分の時間において、Ca2+はNa+- Ca2+交換によって細胞が排除されるが、Na+が細胞に入り、内向き電流を発生し、細胞膜における電位が正になる。活動電位が脱分極する時だけに、大量のNa+が細胞に流入し、Na+- Ca2+交換体が短時間に反対方向に運転し、3個のNa+を排除し、1個のCa2+に交換して細胞に入ることによって、一過性外向き電流を発生することを引き出す。その主な機能は、ナトリウムポンプによる膜両側のNa+の濃度勾配の位置エネルギーで細胞におけるCa2+を外へ排出することによって、細胞質における低い有利なCa2+濃度を維持することである。Na+- Ca2+交換メカニズムは、心筋細胞がCa2+定常状態を維持する重要なメカニズムであり、活動電位が3相のエンドに再分極する時、Na+- Ca2+交換メカニズムを起動してカルシウムを流出させ、L型カルシウムチャンネルによって流入するカルシウムイオンを排出する。トランスNa+- Ca2+は同様にカルシウムの流入を引き出すことができるので、L型カルシウムチャンネルによるカルシウム流入は筋小胞体カルシウムの放出の主なトリガー信号であると考えられる。心筋虚血時、Na+- Ca2+の交換機能が低下し、細胞におけるカルシウムイオン濃度の増加、不整脈を引き出し、心筋を抑制して更に壊死する。
【０１１５】
4.4 Na+-K+-ATPase、Ca2+-ATPase活性及び心筋虚血、不整脈
心筋虚血時、心筋細胞が迅速に好気的代謝から嫌気性解糖に変換し、心筋細胞におけるATPを全部に消耗する。ATPレベルの低下が更に一連の代謝的異常と紊乱を引き出し、ATPによるNa+-K+-ATPase、Ca2+-ATPaseの活性が低下する。Na+-K+-ATPaseの活性の低下が、K+の過剰損失と細胞におけるNa+の増加を引き出すことによって、更にNa+- Ca2+の交換を影響し、細胞におけるCa2+濃度を向上させ、Ca2+-ATPaseの活性の低下が細胞質基質から細胞外へのカルシウムの転移を緩やかにさせ、細胞におけるCa2+濃度を増加させる。両者の相乗効果によって、細胞におけるカルシウムを過負荷にさせ、カルシウム過負荷がRyanoodine受容体(RyR)とナトリウムカリウムが交換された内向き電流によって脱分極して自発的にCa2+を発生して放出し、これは遅延して脱分極して、不整脈の産生を誘導する。
【０１１６】
4.4.1 Na+-K+-ATPaseの活性の低下と心筋虚血、不整脈
Na+-K+-ATPaseはエネルギー変換ポンプであり、細胞膜に位置する。クラシックなイオン輸送機能の以外に、更に異なるチロシンリン酸化タンパク質を調節することによって、細胞外の信号を細胞内に伝導する。Na+-K+-ATPaseが細胞質チロシンキナーゼSrcを活性化させることができ、Srcはリン酸化でき、その他のタンパクを異なる信号ユニットに入れるように統合されることができる。活性化したタンパクキナーゼカスケードはMAPK、P13/Akt及びPKCを含む。且つSrc/細胞外信号キナーゼ1/2(ERK1/2)信号カスケード反応によって、SSA412とNa+-K+-ATPaseにおけるH7-H8区域が組み合わせるによってNa+-K+-ATPaseを活性化させ、カルシウムの流入を増加させ、これによって心筋収縮を増加させ、心機能を保護させ、心筋虚血を防止させる。NKA-αサブユニット897DVEDSYGQQWTYEQR911区域のポリクローナル抗体DRRSAbに対して、濃度に依存可能にNKA活性を向上させ、且つ身体から離れる心臓の24時間後の細胞生存率を著しく向上させることができる。急性心筋梗塞時、心筋気絶が発生し、同時に細胞膜におけるNa+-K+-ATPaseの活性も著しく低下する。左前下行枝が結紮された心筋梗塞群及び偽手術群に対する3日間と30日間のNa+-K+-ATPase活性及び左心室収縮期圧によって、その結果から心筋梗塞後の3日間及び30日間に、心筋Na+-K+-ATPaseの活性と心筋収縮力が著しく低下することを示す。Na+-K+-ATPaseの活性の低下がNa+、K+及びCa2+を変化させ、筋小胞体によって輸送させることができ、左心室の機能障碍を引き出すことによって、不整脈の発生を促進させる。
【０１１７】
その上、心筋虚血時、Na+-K+-ATPaseの活性が低下し、細胞におけるNa+が増加し、 アシドーシス時のNa+/H+交換し、酸中毒時のNa+/HCO3-の作用を快速に修正させ、及びギャップ結合によって接続する細胞のNa+の輸送において、これらはいずれも細胞におけるナトリウムの過負荷を引き出し、Na+- Ca2+交換体に逆輸送を発生させ、Na+を細胞外に輸送させるが、Ca2+を細胞内に輸送させ、カルシウムの過負荷を引き出す。拡張期のカルシウム過負荷が後脱分極及び細胞の電気的不安定性に関連する後収縮を引き出すことによって、心室性不整脈の発生を引き出す。再灌流する前に、虚血プレコンディショニング処理（IPC）を行わない心筋虚血心臓において、5min再灌流する時、Na+-K+-ATPaseの活性が著しく低下し、且つNa+-K+-ATPaseのα1とα2サブユニットが細胞骨格から分離され、且つカルモジュリンおよびα-ホドリン、固定タンパクBと加水分解して一致する。虚血プレコンディショニングがナトリウム電流の回復を加速させ、Na+-K+-ATPaseの活性を増加させ、細胞膜骨格からのNa+-K+-ATPaseの解離を防止できる。虚血プレコンディショニングは更にα-ホドリン、固定タンパクB及びカルモジュリンの活性化を防止させ、LDHの放出を軽減させ、心筋梗塞面積及び損傷を縮小させることができる。再灌流時、虚血プレコンディショニングがナトリウムカリウムポンプの活性を向上させることによって、心筋損傷を保護させ、再灌流の不整脈を減少する役割を果たすことを提示する。
【０１１８】
4.4.2 Ca2+-ATPaseの活性の低下及び心筋虚血、不整脈
筋小胞体におけるCa2+-ATPaseは心筋細胞におけるカルシウムレベルの調節および興奮収縮連関に対して非常に重要である。拡張期に、筋小胞体Ca2+-ATPaseが細胞質基質に遊離するCa2+を再び筋小胞体に戻し、カルシウムの再取込みを完成する。心筋収縮時、筋小胞体におけるCa2+が筋小胞体膜におけるRyR2によって細胞質基質に放出し、且つトロポニンに結合して筋フィラメント収縮を引き起こし、心筋の興奮-収縮連関を完成する。筋小胞体のCa2+-ATPaseの活性が低下する時、細胞質基質からのカルシウムの転移を緩やかにさせ、拡張期に収縮タンパクを損害させる。同時に、筋小胞体Ca2+-ATPaseの活性の低下によって、細胞におけるCa2+の再摂取を低下させ、細胞におけるカルシウム過負荷を引き出す。筋小胞体におけるカルシウムの過負荷はryanoodine 受容体とナトリウムカリウム交換で調節する内向き電流によって脱分極して、自発にCa2+を発生して放出し、即ち、遅延して脱分極する。これは不整脈のが発生する基礎であり、また心房細動の発作と維持にも関連する。また、筋小胞体のカルシウム過負荷によって、拡張期の細胞におけるカルシウムを増加させ、ナトリウムとカルシウムの交換活性が後脱分極を引き起こし、活動と最終の致死性心室性不整脈をトリガーする可能である。
【０１１９】
筋小胞体Ca2+-ATPaseの活性は主に52個ののアミノ酸からなる小分子ホスホランバンによって調節する。非リン酸化状態で、ホスホランバンがCa2+に対するCa2+-ATPaseの感度を低下させるが、リン酸化状態時、Ca2+に対する感度を向上させる。心筋ホスホランバンのリン酸化が多くの酵素で触媒されることができ、カルシウム/カルモジュリンが依存するタンパクキナーゼとc-AMPが依存するタンパクキナーゼAとを含む。ラットの左前下行枝をブロック後、数週間に慢性心筋梗塞のモデルに、心筋の筋小胞体Ca2+-ATPaseのmRNAとタンパクのレベルが下降することを発現する。且つ心筋梗塞による左心室の再構成時、筋小胞体にCa2+-ATPaseの活性が低下することも発現する。また、ナトリウム制限介入は虚血又は再灌流による多すぎるCa2+の累積を予防できることによって、心筋損傷と機能障害を改善させる。また、心筋虚血時、ATPの消費がNa+-K+-ATPaseの活性低下を引き出し、電気化学ポテンシャルを低下させ、Ca2+流入を促進させる。虚血プレコンディショニングは相対にカルシウム過負荷を減少させることによって、心筋を保護させ、不整脈の発生を減少させることができる。
【０１２０】
4.5 Na+-K+-ATPase、Ca2+-ATPaseへの延胡索抽出物の影響
本実験例の結果から、急性心筋梗塞後、ラット心筋細胞におけるNa+-K+-ATPase、Ca2+-ATPaseの活性が著しく減る。延胡索抽出物又はメトプロロール、参松養心カプセルを与えて、ラット心筋のNa+-K+-ATPase、Ca2+-ATPaseの活性が異なるレベルに向上するを示す。且つ実験例1は延胡索抽出物が更に心筋梗塞面積を著しく縮小させ、心筋機能を保護させることができるを更に提示する。
【０１２１】
前記論述と同じように、心筋虚血時、Na+-K+-ATPase、Ca2+-ATPaseの活性が低下するため、細胞におけるNa+過負荷を引き出し、Na+- Ca2+交換によって、ナトリウムカルシウム交換体を逆転に輸送させ、細胞におけるカルシウム過負荷を引き出す。カルシウム過負荷が遅延後の脱分極を引き出すことによって、不整脈をトリガーする。Na+-K+-ATPase、Ca2+-ATPaseの活性が増加する時、カルシウム過負荷を軽減させることによって、心筋を保護させ、電気信号を安定にさせ、不整脈の発生を減少させることができる。
【０１２２】
虚血再灌流心筋Na+-K+-ATPase、Ca2+-ATPaseの活性へのコリダリン薬物前処理の影響を観察することによって、結果から、偽手術群と比較すると、心筋虚血の再灌流損傷後、心筋細胞膜Na+-K+-ATPase、Ca2+-ATPaseの活性が著しく低下するが、虚血前処理して及びコリダリン薬物で処理されたNa+-K+-ATPase、Ca2+-ATPaseの活性が虚血再灌流モデル群と比較して著しく向上することを示し、コリダリン薬物前処理が心筋Na+-K+-ATPase、Ca2+-ATPaseの活性を向上させることによって、Na+- Ca2+交換を促進させ、細胞におけるカルシウム過負荷を軽減させ、虚血心筋損傷を保護させ、不整脈発生を減少させることができることを提示する。
【０１２３】
これによって、本発明の上記延胡索抽出物はNa+-K+-ATPase、Ca2+-ATPaseの活性を向上させ、細胞におけるカルシウム過負荷を軽減させ、心筋虚血を改善させ、心梗面積を減少させ、遅延後の脱分極の発生を減少させることによって、抗不整脈の働きをする。
【０１２４】
実験例6
1.材料と方法
1.1実験材料
1.1.1実験動物
健康なWistarラットは、雄性、体重200〜220gであり、北京華阜康科技股フン有限公司から提供される。免許証番号はSCXK北京2009-0007である。
【０１２５】
1.1.2計器と設備
電子天秤は米国雙傑兄弟有限公司から提供され、計器型番がDT−2000であり、マイクロプレートリーダーはフィンランド（Labsystems Multiskan MS）から提供され、計器型番が352型であり、プレートウォッシャーはフィンランド（Thermo Labsystems）から提供され、計器型番がAC8であり、遠心機は微量高速遠心機（中国製）であり、計器型番がTG16Wであり、インキュベーターは水ジャケット式恒温インキュベーター（中国製）であり、計器型番がGNP-9080型であり、定電圧定電流電気泳動装置は米国Bio-Radから提供され、型番がPowerpac HQであり、垂直電気泳動槽は米国Bio-Radから提供され、型番がMP3であり、セミドライエレクトロブロッティング装置は米国Bio-Radから提供され、型番がTrans-Blot SDであり、コンピュータ画像分析装置はImage-Pro Plus Analysis Software 6.0であり、4℃の低温高速遠心機は米国Thermoから提供され、型番がMR 23iであり、常温高速遠心機はドイツeppendorfから提供され、型番が5417Cであり、電子天秤はドイツSartourisから提供され、型番がBS224Sであり、紫外線分光光度計はドイツeppendorfから提供され、型番がBiophotometerであり、微量サンプル添加装置はドイツeppendorfから提供され、型番がeppendorf Research plusであり、恒温水浴は上海から提供され、型番がHHW-420であり、液体窒素及び携帯式標本貯蔵タンクは四川から提供され、型番がYDS-30-125である。
【０１２６】
2.1.3 薬品と試薬
延胡索抽出物は黄褐色粉末であり、実施例3の方法により得られ、ロット番号1が201107である、1グラムあたりの抽出物が生薬62.762gに相当し、ロット番号2が201107である、1グラムあたりの抽出物が生薬65.50218gに相当する。メトプロロールはアストラゼネカ製薬有限公司から提供され、規格が25mg/錠であり、ロット番号が1105031であり、参松養心カプセルは河北以嶺薬業有限公司から提供され、規格が0.4g/錠であり、ロット番号が1104007であり、抱水クロラールはロット番号が20110210であり、国薬集団化学試薬有限公司から提供される。 
【０１２７】
Western Blot用：アクリルアミド、ビスアクリルアミド、暗渠、ドデシル硫酸ナトリウム、β-メルカプトエタノールであり、タンパク質分子量Markerは米国Bio-radから提供され、品目番号が161-0374であり、ロット番号が310007919であり、ニトロセルロース膜はドイツMilliporeから提供され、品目番号がIPVH00010であり、ロット番号がK1EA1531FKであり、感光フィルムは米国コダックから提供され、品目番号がXBT-1であり、ロット番号が020901701であり、第一抗体connexin 43とphospho-connexin 43(ser 368)はウサギポリクローナル抗体であり、米国CST公司から提供され、ロット番号が08/2011であり、第二抗体はホースラディッシュペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギIgGとホースラディッシュペルオキシダーゼ標識ウサギ抗ヤギIgGであり、北京中杉金橋公司から提供される。
【０１２８】
免疫組織化学用：第一抗体：connexin43であり、ウサギポリクローナル抗体であり、米国CST公司から提供され、ロット番号が08/2011である。phospho-connexin43（ser368）はウサギポリクローナル抗体であり、米国Santa Cruz公司から提供され、ロット番号がG2011である。
【０１２９】
第二抗体：SPツーステップユニバーサル試薬キットであり、北京中杉金橋公司から提供され、ロット番号がK116812Cである。無水エタノールは北京化学工場から提供され、規格が2500ml/ボトルであり、ロット番号が20110808であり、95%のエタノールは北京化学工場から提供され、規格が2500ml/ボトルであり、ロット番号が20110808であり、ホルムアルデヒド溶液は西隴化学工業股フン有限公司から提供され、規格が500ml/ボトルであり、ロット番号が1110082であり、キシレン溶液は北京化学工場から提供され、規格が500ml/ボトルであり、ロット番号が20110808であり、切片パラフィンは54-56℃であり、北京北化康泰臨床試薬有限公司から提供され、ロット番号が20110428であり、DAB試薬キットは北京康為世紀有限公司から提供され、生産ロット番号が03911Hであり、ポリリジンは、規格が25mgであり、上海sigma-aldrich Trading公司から提供され、ロット番号がP1399であり、顕微鏡カバースリップは北京市通州區川港樺新実験計器商社から提供され、規格が24x24mmである。
【０１３０】
スライドは北京市通州區川港樺新実験計器商社から提供され、型番が7105であり、ステンレス鋼の圧力鍋、電子レンジ、恒温水浴、免疫組織化学専用湿気ボックス、抗原修復ボックス、光学顕微鏡である。
【０１３１】
1.2実験方法
1.2.1モデリング方法
ラットは3.5%の抱水クロラールで10mL/kgで腹腔に注射して麻酔し、仰臥してラットボードに固定する。ラットの左側の第4、5肋間に切り口して、胸腔を開き、心膜を引き裂き、胸郭をゆっくりと押して心臓を押し出し、0番号の手術糸で左心耳下の2mmで左冠動脈前下行枝を結紮し、すぐに心臓を胸腔に入れて、切り口を閉め、皮膚を縫合し、局所的にペニシリン8万単位を応用して感染を防止する。
【０１３２】
1.2.2 群分け
モデリングが成功したラット84個をランダムに6個の群に分け、各群が14個である。即ち、１．モデル群、２．メトプロロール群、３．参松養心カプセル群、４．延胡索抽出物高投与量群（高投与量群）、５．延胡索抽出物中間投与量群（中投与量群）、６．延胡索抽出物低投与量群（低投与量群）である。正常群13個、偽手術群13個を加え、ともに8群である。翌日に胃内投与を開始する。
【０１３３】
1.2.3 薬物調製方法：実験例1における「薬物調製方法」と同じである。
1.2.4 投与方法
1ml/100gで胃内投与し、モデル群、正常対照群、偽手術群は等体積の生理食塩水を与える。メトプロロール群、参松養心カプセル群、延胡索抽出物の高、中、低投与量はそれぞれに対応する薬品を与える。7日間連続胃内投与する。最終回に薬又は生理食塩水を投与して2時間材料を集める。そのうち、各群はランダムに3個をWestern Blotとして取って、その他が免疫組織化学する。備考：そのうち、偽手術群の1個、モデル群の1個、メトプロロール群の1個、参松養心カプセル群の1個、高投与量群の1個、中投与量群の1個、低投与量群の2個は翌日に胃内投与する前に、死亡する。
【０１３４】
1.3材料の集めおよび指標検出
心臓を取り出し、生理食塩水で心腔に残留する血液を洗い流し、快速に結紮糸下から梗塞部位を切り取り、液体窒素で迅速的に冷凍保存し、Western Blotとして次の使用のために用意する。各群のその他の動物については、心臓を取り出し、鋭い刃で、心臓の左心室を取り、群をマークした10%のホルマリン溶液に入れて24時間固定し、免疫組織化学して次の使用のために用意する。
【０１３５】
2.Western Blot実験
2.1 Western Blot に必要な試薬
（1）タンパク分解緩衝液：50mmol/LのTris.cl (pH8.0)、150mmol/LのNaCl、0.025%のNaN3（アジ化ナトリウム）、0.1%のSDS、100ug/mlのPMSF（フッ化フェニルメチルスルホニル）、1ug/mlのAprotinin、0.5%のデオキシコール酸ナトリウム、0.1%のNP-40。
（2）A 液(30％のアクリルアミド貯蔵液)：29.0グラムのアクリルアミド、1グラムのN,N’-メチレンビスアクリルアミドを取り、H2Oを100mlまで加え、茶褐色のボトルに貯蔵し、4℃で日に当たらないように保存し、PHが7.0以上であると注意する。
B 液(濃縮ゲル緩衝液)：6gのTrisを秤量して40mlのH20に溶解し、lmol/LのHCl(約48ml)でpHを6.8に調整し、さらに水を加えて100mlの最終体積に希釈してPH6.8、0.5mol/LのTris-HCl緩衝液になる。濾過して4℃で保存する。
C 液(分離ゲル緩衝液)：36.6グラムのTris を秤量して48ml  1mol/Lの HCl に混合させ、水を加えて100mlの最終体積に希釈する。pH8.8、3mol/L のTris-HCl緩衝液になる。濾過して4℃で保存する。
D 液(電極緩衝液貯蔵液)：30.3gのTris、144gのグリシン、10gのSDSを秤量し、蒸留水で100mlまで溶解し、0.25mol/LのTris-1.92mol/Lのグリシン電気泳動緩衝貯蔵液になる。使用する前に10 倍希釈する。
E 液：1グラムのSDSを10mlのH2Oに溶解して10％のSDS溶液になる。
F 液：10％の過硫酸アンモニウム(AP)であり、当日に調製すべきで、最多で1週間を超えないようにする。
G 液：TEMED原溶液である。
H 液(サンプル緩衝液)：１．B 液8ml、２．グリセリン6.4 ml、３．E 液12.8ml、４．ジメルカプトエタノール 3.2ml、５．0.05％のブロモフェノールブルー1.6ml、６．蒸留水32.0mlを均一に混合して次の使用のために用意する方法によって調製する。
I 液(10％のSDS-PAGE分離ゲル)：30％のアクリルアミド貯蔵液6.65ml、分離ゲル緩衝液5ml、脱イオン水 8.25ml、10%の過硫酸アンモニウム溶液 150ul、TEMED 20ulであり、合計体積は約20mlであり、均一に混合してすぐに使用する。
J 液(5%の濃縮ゲル)：アクリルアミド貯蔵液2.10ml、濃縮ゲル緩衝液3.76ml、脱イオン水9.0ml、10%の過硫酸アンモニウム溶液45ul、TEMED 15ulであり、合計体積は約15mlであり、均一に混合してすぐに使用する。
【０１３６】
（3）0.45umのニトロセルロース膜は米国Millipore 公司から提供される。
（4）転移緩衝液：3gのTrisアルカリ、1gのSDSと14.4gのグリシンであり、さらに200mlのメタノールを加え、蒸留水を補充して1Lまで定容する。
（5）クマシーブリリアントブルーG250液（固定染色液）：クマシーブリリアントブルーG250 1.25 グラム、230mlのメタノール、230mlの蒸留水、40mlの氷酢酸を混合して使用する。
（6）脱色液：230mlのメタノール、230mlの蒸留水、40mlの氷酢酸を混合して使用する。
（7）密封緩衝液：5%の脱脂粉乳、0.01%の消泡剤を含み、0.025% のNaN3をTBS-T緩衝液に溶解する。
（8）5×TBS 緩衝液：12.1gのTrisアルカリ、40gのNaCLをダブル蒸留水に溶解し、濃HCLでPH値を7.6 まで調整して、ダブル蒸留水で1Lまで定容する。
（9）TBS-T洗浄液：0.1%のTween-20のTBSを含む。
（10）タンパク質Markerは 米国MBI公司から提供される
（11）現像液、定着液は保定楽凱写真化学有限公司から提供される。
【０１３７】
2.2 Western-blot 測定方法
2.2.1 組織タンパク抽出及びタンパク定量
組織を液体窒素から取り出し、予備冷却するあたり鉢に入れて液体窒素を加えて快速に研磨を行い、その後、粉末を予備冷却するEP管に入れ、各管に細胞分解液50ulを加え、氷の上に20min置く。その後、4℃で10000r/minで10min遠心し、上澄みを別の予冷するEP管に移動し、沈殿して取り除き、Bradford 法でタンパクの含有量を測定して、残りのタンパクサンプルを等体積の2×SDSローディング緩衝液に加え、お湯の中で5min煮る。
2.2.2ゲル製造及びローディング
10％のSDS-PAGE分離ゲル溶液を調製し、均一に混合してすぐにそれをストリップ厚さが2mmであるストリップに注ぎ、垂直に置いて、脱イオン水層を注ぎ出し、吸水紙でゲルにおける残存する水を全部に吸い取る。サンプル添加櫛を挿入し、5%の濃縮ゲルをゆっくりと加え、室温で静置する。ゲルが完全に凝結して、その下方のストリップを取り除き、調製されたゲルガラス板をゲル電気泳動装置に垂直固定し、電気泳動装置の上下両槽にそれぞれ電気泳動緩衝液を加えてそれをゲルに超えさせる。注意深くサンプル添加櫛を抜き、電気泳動緩衝液でサンプル添加ウエルを複数回洗い流す。それぞれに40ugのタンパク量の組織合計タンパクサンプル及びタンパク質分子量Markerを取り、1：4 の体積比によって5×サンプル緩衝液を加え、1×サンプル緩衝液でローディング体積にトリムして、沸水浴で5min 煮てタンパクを変性させる。処理されたサンプルを所定順序によって濃縮ゲルのローディングウエルに加える。
【０１３８】
2.2.3 電気泳動
ゲル電気泳動装置の電源を入れて、初期電圧が80Vである。ブロモフェノールブルー染料の前縁が分離ゲルの上縁に入った後、電圧を100Vまで向上させ、ブロモフェノールブルーが分離ゲルの下縁から泳動して出るまで電気泳動を続ける。
2.2.4タンパク質の電気転移と膜密封
電気泳動ゲルの大きさと一致するWhatman 3mm 濾紙6枚とPVDF膜1枚を切り、転移緩衝液で15min浸す。セミドライエレクトロブロッティング装置でタンパク質の電気転移を行う。30mAの恒流で、90min電気転移する。転移が終わった後、PVDF膜を取り出し、膜の方向をマークする。5%TBS-Tの脱脂粉乳で密封し、室温で60min振動する。
【０１３９】
2.2.5抗原抗体反応及び現像
密封が終わった後、TBS-Tの洗浄液で膜を10min×3 回洗い、膜をハイブリダイゼーションバッグに移動し、適切な洗浄液で希釈する抗体（connexin 43とp-connexin 43がいずれも1：2000である）を加え、密閉して、4℃でインキュベートして夜間を過ごし、更に大量のTBS-T洗浄液で膜を10min×3 回洗い、その後、PVDF膜を別の新しいハイブリダイゼーションバッグに移動し、洗浄液で希釈するホースラディッシュペルオキシダーゼで標識する第二抗体（connexin 43とp-connexin 43がいずれも1：2000である）を加え、37℃で60min振動し、大量のTBS-Tの洗浄液で膜を10min×3回洗い、PVDF膜をECL混合液に置いて室温で5分間振動インキュベートし、平方センチメートルあたりのダイアフラムが少なくとも0.125mlECLの混合液を使用して全体のダイアフラムを覆い、ブラント鉗子でダイアフラムを挟み、垂直に吸水紙に置いて過量の試薬を吸収し、ダイアフラムを2層の防腐フィルムの間に置いて、注意深く気泡を全部に除去する。ダイアフラムにタンパクを吸着して上に向かい、X線フィルムカセットに置いて、暗室においてX線フィルムを押して、数分間感光し、鮮明な画像を出現するまで、露出されたフィルムを現像液に入れて現像し、その後、フィルムを清水に移動して、片時にすすぎ、すぐにフィルムを定着液に入れて定着する。最後に清水で洗い流し、乾かして保存し、スキャンし、且つ電気泳動ストリップに対してグレースケール分析を行い、試験を3回繰り返す。
【０１４０】
3.免疫組織化学及びHE染色実験
3.1免疫組織化学に必要な試薬
（1）PH7.2 0.01PBS緩衝液
A液：0.2mol/l NaH2PO4、NaH2PO4・H2O 27.6gであり、ddH2Oに溶解し、1000mlに希釈する。
B液：0.2mol/l Na2HPO4、Na2HPO4・7 H2O 53.6g （又はNa2HPO4・12 H2O 71.6g又はNa2HPO4・2H2O 35.6g）であり、ddH2Oを加えて溶解し、1000mlに希釈する。
使用時、A液28ml+B液72ml+NaCl18g+ddH2O1900MLを取る。
（2）0.01mol/l PH 6.0抗原修復液
A液：0.1Mのクエン酸溶液（C6H8O・7H2O21.01g、ddH2Oで溶解して且つ1000mlに希釈する）である。
B液：0.1Mクエン酸ナトリウム溶液（C6H5O7・3H2O29.41g、ddH2Oで溶解して且つ1000mlに希釈する）である。
使用時、A液18ml、B液82mlを取って混合し、ddH2Oで1000mlに希釈する。
0.01%のTriton-100：100%のTriton-100で調製される。
3%H2O2-CH3OH溶液：30%H2O2と80%のメタノール溶液で調製される。1：9の割合である。
（5） マウンティング溶液：中性ガムである。
【０１４１】
4.統計学的な処理
すべてのデータはSPSS16.0ソフトウェアで統計分析し、計数資料はカイ二乗検定又は順位和検定を使用し、計測資料は分散で分析し、P＜0.05が統計学的有意性を有すると考えられる。
【０１４２】
5.結果
5.1 各群Western Blotの結果比較
5.1.1 connexin43の比較
【０１４３】
【表２１】
2014005282.tif 000025
【０１４４】
正常群と比較すると、*Pが0.05より小さく、** Pが0.01より小さく、モデル群と比較すると、△Pが0.05より小さく、△△Pが0.01より小さく、メトプロロール群と比較すると、▲Pが0.05より小さく、▲▲Pが0.01より小さく、参松養心カプセル群と比較すると、★Pが0.05小さく、★★Pが0.01より小さい。
【０１４５】
結果から、正常群と比較すると、モデル群と各治療群のconnexin43タンパクの含有量がいずれも減少し、特にモデル群タンパクが最も著しく減少し、統計学的差異（P＜0.05）を有し、モデル群と比較すると、延胡索抽出物の高投与量群の以外に、その他の各治療群のconnexin43タンパクの含有量が著しく向上し、統計学的差異（P＜0.05）を有し、メトプロロール群と比較すると、参松養心カプセルは延胡索抽出物の高、中、低投与量群と比較して統計学的差異がなく、治療効果が相当（P＞0.05）するが、延胡索抽出物における投与量が向上し、connexin43タンパクの含有量の治療効果はメトプロロール群を超える傾向を有することを示す。
【０１４６】
5.1.2 phospho-connexin43の各群の比較
【０１４７】
【表２２】
2014005282.tif 000026
【０１４８】
正常群と比較すると、* Pが0.05より小さく、** Pが0.01より小さく、モデル群と比較すると、△Pが0.05より小さく、△△Pが0.01より小さく、メトプロロール群と比較すると、▲Pが0.05より小さく、▲▲Pが0.01より小さく、参松養心カプセル群と比較すると、★Pが0.05より小さく、★★Pが0.01より小さい。
【０１４９】
結果から、正常群と比較すると、モデル群のphospho-connexin43タンパクの含有量が著しく低下し、統計学的差異（P＜0.01）を有し、延胡索抽出物の中間投与量群phospho-connexin43タンパクの含有量が低下するものの、正常群と比較して統計学的差異（P＞0.05）がないが、その他の各治療群phospho-connexin43タンパクの含有量が低下し、差異には統計学的有意性（P＜0.05）を有し、モデル群と比較すると、メトプロロール群と延胡索抽出物の中間投与量群がphospho-connexin43含有量の作用を著しく向上させ、差異には統計学的有意性（P＜0.05）を有するが、その他の治療群にもphospho-connexin43含有量を向上させる傾向を有するが、差異には統計学的有意性（P＞0.05）がなく、メトプロロール群と比較すると、各治療群間のphospho-connexin43タンパクの含有量を向上させる治療効果が相当し、差異には統計学的有意性（P＞0.05）がないが、延胡索抽出物の中間投与量群の作用がメトプロロール群よりよい傾向を有することを示す。 
【０１５０】
5.2 各群の免疫組織化学結果
5.2.1 各群connexin43免疫組織化学の表現量結果
【０１５１】
【表２３】
2014005282.tif 000027
【０１５２】
正常群と比較すると、* Pが0.05より小さく、** Pが0.01より小さく、モデル群と比較すると、△Pが0.05より小さく、△△Pが0.01より小さく、メトプロロール群と比較すると、▲Pが0.05より小さく、▲▲Pが0.01より小さく、参松養心カプセル群と比較すると、★Pが0.05より小さく、★★Pが0.01より小さい。
【０１５３】
本研究結果から、正常群と比較すると、その他の各群のconnexin43表現の面積とIOD値がいずれも著しく減少し、差異には統計学的有意性（P＜0.01）を有し、特にモデル群connexin43の表現量が最も著しく減少し、モデル群と比較すると、各治療群のconnexin43表現量がいずれも著しく向上し、各治療群がいずれもconnexin43表現の作用を増加させることを説明し、且つ特に延胡索抽出物中間投与量群が最も著しく、差異には統計学的有意性（P＜0.01）を有し、メトプロロール群と比較すると、延胡索抽出物中間投与量がconnexin43の表現を著しく向上させ、connexin43表現を向上させる役割を果たし、差異には統計学的有意性（P＜0.01）を有するが、その他の治療群の作用はメトプロロール群と比較して統計学的差異（P＞0.05）がなく、参松養心カプセル群と比較すると、延胡索抽出物の中間投与量群のconnexin43表現を向上させる作用が参松養心カプセルよりよく、差異には統計学的有意性（P＜0.01）を有するが、高投与量、低投与量群の治療効果と参松養心カプセルは、差異には統計学的差異（P＞0.05）がないことを示す。
5.2.2 各群phospho-connexin43免疫組織化学表現量の結果
【０１５４】
【表２４】
2014005282.tif 000028
【０１５５】
正常群と比較すると、*Pが0.05より小さく、**Pが0.01より小さく、モデル群と比較すると、△Pが0.05より小さく、△△Pが0.01より小さく、メトプロロール群と比較すると、▲Pが0.05より小さく、▲▲Pが0.01より小さく、参松養心カプセル群と比較すると、★Pが0.05より小さく、★★Pが0.01より小さい。
【０１５６】
本実験例の結果から、正常群と比較すると、その他の各群のP-connexin43表現の面積とIOD値がいずれも著しく減少し、差異には統計学的有意性（P＜0.01）を有し、特にモデル群connexin43表現量が最も著しく減少し、モデル群と比較すると、参松養心カプセル群はP-connexin43表現作用を向上させる傾向を有するが、統計学的差異（P＞0.05）がなく、その他の各治療群のP-connexin43表現量がいずれも著しく向上し、各治療群がいずれもconnexin43表現を増加させる作用を有し、且つ特に延胡索抽出物の中間投与量群が最も著しく、差異には統計学的有意性（P＜0.05）を有し、メトプロロール群と比較すると、延胡索抽出物の高、中、低投与量のconnexin43の表現向上の作用がメトプロロール群に相当し、差異には統計学的有意性（P＞0.05）がないことを示す。
【０１５７】
6.討論
本実験例はWestern Blot技術でタンパク含有量を検出し、結果から、リン酸化CX43-s368（Ps368-CX43）のタンパク表現量について、正常群、偽手術群と比較すると、モデル群の表現量が著しく下降するが、薬物治療群の表現量はモデル群と比較して増加することを示す。同様に、免疫組織化学結果から、正常群と比較すると、モデル群のPs368-CX43表現の面積及びIOD値が著しく低下するが、薬物治療群とモデル群比較して異なるレベルに向上することも示す。且つモデル群Ps368-CX43に周辺化現象を出現し、薬物治療群の周辺化現象を改善させる。上記延胡索抽出物は心筋細胞CX43のリン酸化を改善させ、細胞間の透過性を低下させ、細胞間の有害物質の拡散を減少させ、CX43分布の不均一性を改善させ、電気結合を改善させ、心筋梗塞面積を減少させ、心筋虚血を改善させ、不整脈の発生を低下させることができる。
【０１５８】
上記をまとめると、本発明の上記延胡索抽出物は心筋梗塞面積を縮小させ、心筋虚血を改善させることができる。本発明の上記延胡索抽出物は心筋Na+-K+-ATPase、Ca2+-ATPaseの活性を向上させ、Na+- Ca2+交換を促進させ、細胞におけるカルシウム過負荷を軽減させ、虚血心筋損傷を保護させ、減少遅延後の脱分極の発生を減少させ、不整脈の発生を減少させることができる。本発明の上記延胡索抽出物は虚血後の心筋のCX43とP-CX43 S368タンパクの含有量を増加させ、CX43が発生する周辺化を減少させ、細胞間の透過性を低下させ、有害物質の拡散を減少させ、CX43及びP-CX43 S368分布の不均一性、電気結合、心筋虚血を改善させ、不整脈の発生を低下させることができる。
【実施例１】
【０１５９】
延胡索粗粉末100gを、800mlの70%のエタノールで2回抽出し、濾液を合わせ、0.3g/mLの流エキスに減圧濃縮し、処理されたD101樹脂、調製された流エキスを取ってカラムにロードさせ、0.4mL/minの流速で、脱イオン水で不純物を除去し、0.4mL/minの流速で、80%のエタノールで8倍のカラム体積を溶出し、0.6mL/minの流速で、エタノールを回収し、濃縮して延胡索抽出物とする乾燥エキスを取得する。
【実施例２】
【０１６０】
延胡索抽出物であって、延胡索粗粉末100gを、700mlの70%のエタノールで3回抽出し、濾液を合わせ、相対密度が0.5g/mLの流エキスに減圧濃縮し、処理されたD101樹脂、調製された流エキスを取ってカラムにロードさせ、0.2mL/minの流速で、脱イオン水で不純物を除去し、0.5mL/minの流速で、60%のエタノールで溶出し、0.8mL/minの流速で、濃縮して延胡索抽出物とする乾燥エキスを取得する。
【実施例３】
【０１６１】
延胡索粗粉末100gを、800mlの70%のエタノールで2回抽出し、濾液を合わせ、0.3g/mLの流エキスに減圧濃縮し、処理されたD101樹脂を取って、樹脂の直径・高さ比が1：7であり、流エキスのローディング溶液をpH2に調節し、沈殿を分解させ、調製された流エキスを取ってカラムにロードさせ、0.4mL/minの流速で、脱イオン水で不純物を除去し、0.4mL/minの流速で、80%のエタノールで8倍のカラム体積を溶出し、0.6mL/minの流速で、エタノールを回収し、濃縮して延胡索抽出物とする乾燥エキスを取得する。通常の方法に従って通常の補助材料を加え、延胡索の乾燥エキスをドリッピングピルに調製する。
【実施例４】
【０１６２】
延胡索抽出物であって、延胡索粗粉末100gを、700mlの70%のエタノールで3回抽出し、濾液を合わせ、相対密度が0.5g/mLの流エキスに減圧濃縮し、処理されたD101樹脂を取って、樹脂の直径・高さ比が1：8であり、流エキスのローディング溶液をpH1.5に調節し、沈殿を分解させ、調製された流エキスを取ってカラムにロードさせ、0.2mL/minの流速で、脱イオン水で不純物を除去し、0.5mL/minの流速で、60%のエタノールで溶出し、0.8mL/minの流速で、濃縮して延胡索抽出物とする乾燥エキスを取得する。通常の方法に従って通常の補助材料を加え、延胡索の乾燥エキスをカプセル剤に調製する。
【実施例５】
【０１６３】
延胡索粗粉末100gを、1000mlの80%のエタノールで2回抽出し、濾液を合わせ、0.3g/mLの流エキスに減圧濃縮し、処理されたD101樹脂、調製された流エキスを取ってカラムにロードさせ、0.4mL/minの流速で、脱イオン水で不純物を除去し、0.4mL/minの流速で、80%のエタノールで8倍のカラム体積を溶出し、0.6mL/minの流速で、エタノールを回収し、濃縮して延胡索抽出物とする乾燥エキスを取得する。通常の方法に従って通常の補助材料を加え、延胡索の乾燥エキスを錠剤に調製する。
【実施例６】
【０１６４】
延胡索抽出物であって、延胡索粗粉末100gを、700mlの70%のエタノールで3回抽出し、濾液を合わせ、相対密度が0.5g/mLの流エキスに減圧濃縮し、処理されたD101樹脂、調製された流エキスを取ってカラムにロードさせ、0.2mL/minの流速で、脱イオン水で不純物を除去し、0.5mL/minの流速で、60%のエタノールで溶出し、0.8mL/minの流速で、濃縮して延胡索抽出物とする乾燥エキスを取得する。通常の方法に従って通常の補助材料を加え、延胡索の乾燥エキスを経口液体製剤に調製する。
【実施例７】
【０１６５】
延胡索粗粉末100gを、800mlの70%のエタノールで2回抽出し、濾液を合わせ、0.3g/mLの流エキスに減圧濃縮し、処理されたD101樹脂を取って、樹脂の直径・高さ比が1：7であり、流エキスのローディング溶液をpH2に調節し、沈殿を分解させ、調製された流エキスを取ってカラムにロードさせ、0.4mL/minの流速で、脱イオン水で不純物を除去し、0.4mL/minの流速で、80%のエタノールで8倍のカラム体積を溶出し、0.6mL/minの流速で、エタノールを回収し、濃縮して延胡索抽出物とする乾燥エキスを取得する。通常の方法に従って通常の補助材料を加え、延胡索の乾燥エキスを顆粒剤に調製する。
【実施例８】
【０１６６】
延胡索抽出物であって、延胡索粗粉末100gを、700mlの70%のエタノールで3回抽出し、濾液を合わせ、相対密度が0.5g/mLの流エキスに減圧濃縮し、処理されたD101樹脂を取って、樹脂の直径・高さ比が1：8であり、流エキスのローディング溶液をpH1.5に調節し、沈殿を分解させ、調製された流エキスを取ってカラムにロードさせ、0.2mL/minの流速で、脱イオン水で不純物を除去し、0.5mL/minの流速で、60%のエタノールで溶出し、0.8mL/minの流速で、濃縮して延胡索抽出物とする乾燥エキスを取得する。通常の方法に従って通常の補助材料を加え、延胡索の乾燥エキスを注射剤に調製する。
【図１】
2014005282.tif 000029
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
2014005282.tif 000040
【図１３】
2014005282.tif 000041
【図１４】
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【図１５】
2014005282.tif 000043
【図１６】
2014005282.tif 000044
【図１７】
2014005282.tif 000045
【図１８】
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【図１９】
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