(57)【要約】【課題】Ｎｏｇｏレセプターアンタゴニストの提供。【解決手段】免疫原性Ｎｏｇｏレセプター−１ポリペプチド、Ｎｏｇｏレセプター−１抗体、その抗原結合断片、その可溶性Ｎｏｇｏレセプターおよび融合タンパク質ならびにこれらをコードする核酸を開示する。また、Ｎｏｇｏレセプターアンタゴニストポリヌクレオチドを開示する。また、かかるＮｏｇｏレセプター抗体、その抗原結合断片、その可溶性Ｎｏｇｏレセプターおよび融合タンパク質、これらをコードする核酸ならびにアンタゴニストポリヌクレオチドを含む組成物、ならびにその作製および使用方法を開示する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載された発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、神経生物学および分子生物学に関する。より詳しくは、本発明は、免疫原性Ｎｏｇｏレセプター−１（ＮｇＲ１）ポリペプチド、Ｎｏｇｏレセプター−１抗体、その抗原結合断片、その可溶性Ｎｏｇｏレセプターおよび融合タンパク質ならびにこれらをコードする核酸に関する。本発明は、さらに、Ｎｏｇｏレセプター−１アンタゴニストポリヌクレオチドに関する。本発明は、さらに、かかるＮｏｇｏレセプター抗体、その抗原結合断片、免疫原性Ｎｏｇｏレセプター−１ポリペプチド、その可溶性Ｎｏｇｏレセプターおよび融合タンパク質、これらをコードする核酸ならびにアンタゴニストポリヌクレオチドを含む組成物、ならびにその作製方法および使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
ニューロンの軸索および樹状突起は、ニューロンからの長い細胞性伸長部である。伸長した軸索または神経突起の遠位先端部は、成長円錐として知られる特殊な領域を含む。成長円錐は、局所環境を感知し、軸索の成長を、ニューロンの標的細胞へと誘導する。成長円錐は、いくつかの環境刺激、例えば、表面接着性、成長因子、神経伝達物質および電場に応答する。成長円錐での成長の誘導は、種々の類型の接着分子、細胞間シグナル、ならびに成長円錐を刺激および阻害する因子を伴う。成長している神経突起の成長円錐は種々の速度で進行するが、典型的には、１日で１〜２ミリメートルの速度である。
【０００３】
成長円錐は、手のような形状をしており、胚内の表面に種々に付着する広く平坦な拡張部（微細棘状部すなわち糸状仮足）を有する。糸状仮足は継続的に活発であり、一部の糸状仮足は、収縮して成長円錐内に戻るが、一部は下層を通り抜けて伸張し続ける。この異なる糸状仮足間の伸張により、葉状仮足が形成される。
【０００４】
成長円錐により、その前方の葉状仮足および糸状仮足を有するいずれかの側面である領域が探究されている。伸張部は、成長に望ましくない表面と接触すると、後退する。伸張部が成長の都合のよい表面と接触すると、伸張し続け、成長円錐をおその方向に誘導する。成長円錐は、下層の表面特性の小さな変動によって誘導され得る。成長円錐が適切な標的細胞に達すると、シナプス結合がもたらされる。
【０００５】
神経細胞の機能は、その直の環境内でのニューロンと他の細胞間の接触によって大きく影響される（非特許文献１）。このような細胞としては、中枢神経系（ＣＮＳ）のとくしゅなグリア細胞、オリゴ樹状細胞、および末梢神経系（ＰＮＳ）のシュヴァン細胞（ニューロンの軸索をミエリンで覆う）（多層膜の絶縁構造）が挙げられる（非特許文献２）。
【０００６】
ＣＮＳのニューロンは、損傷後に再生する能力を有するが、ミエリン内に存在する阻害性タンパク質の存在のため、また、おそらく、その局所環境に通常見られる他の型の分子のため再生の実行は阻害される（非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５）。
【０００７】
オリゴ樹状細胞上に見られるいくつかのミエリン阻害性タンパク質、例えば、ＮｏｇｏＡ（非特許文献６；非特許文献７）、ミエリン会合糖タンパク質（非特許文献８；非特許文献９）およびオリゴ樹状細胞糖タンパク質（非特許文献１０）がキャラクタライズされている。これらのタンパク質は、各々個々に、ニューロンのＮｏｇｏレセプター−１のリガンドであることが示されている（非特許文献１１；非特許文献１２；非特許文献７；非特許文献６；非特許文献１３）。
【０００８】
Ｎｏｇｏレセプター−１は、８ロイシンリッチリピートを含有するＧＰＩアンカー膜タンパク質である（非特許文献１４）。阻害性タンパク質（例えば、ＮｏｇｏＡ，ＭＡＧおよびＯＭ−ｇｐ）と相互作用すると、Ｎｏｇｏレセプター−１複合体は、成長円錐の虚脱および神経突起伸長の阻害をもたらすシグナルを伝達する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｕ．Ｒｕｔｉｓｈａｕｓｅｒ，Ｔ．Ｍ．Ｊｅｓｓｅｌｌ，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．１９８８年，第６８巻，ｐ．８１９
【非特許文献２】Ｇ．Ｌｅｍｋｅ，Ａｎ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｚ．Ｈａｌｌ編（Ｓｉｎａｕｅｒ，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，Ｍａｓｓ．）、１９９２年、ｐ．２８１
【非特許文献３】ＢｒｉｔｔｉｓおよびＦｌａｎａｇａｎ，Ｎｅｕｒｏｎ，２００１年，第３０巻，ｐ．１１−１４
【非特許文献４】Ｊｏｎｅｓら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃ．２００２年，第２２巻，ｐ．２７９２−２８０３
【非特許文献５】Ｇｒｉｍｐｅら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２００２年，第２２巻，ｐ．３１４４−３１６０
【非特許文献６】Ｃｈｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ，２０００年，第４０３巻，ｐ．４３４−４３９
【非特許文献７】Ｇｒａｎｄｐｒｅら、Ｎａｔｕｒｅ，２０００年，第４０３巻，ｐ．４３９−４４４
【非特許文献８】ＭＡＧ、ＭｃＫｅｒｒａｃｈｅｒら、Ｎｅｕｒｏｎ，１９９４年，第１３巻，ｐ．８０５−８１１
【非特許文献９】Ｍｕｋｈｏｐａｄｈｙａｙら、Ｎｅｕｒｏｎ，１９９４年，第１３巻，ｐ．７５７−７６７
【非特許文献１０】ＯＭ−ｇｐ、ＭｉｋｏｌおよびＳｔｅｆａｎｓｓｏｎ、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１９８８年，第１０６巻，ｐ．１２７３−１２７９
【非特許文献１１】Ｗａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ，２００２年，第４１７巻，ｐ．９４１−９４４
【非特許文献１２】Ｌｉｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００２年，第２９７巻，ｐ．１１９０−９３
【非特許文献１３】Ｄｏｍｅｎｉｃｏｎｉら、Ｎｅｕｒｏｎ，２００２年，第３５巻ｐ．２８３−９０
【非特許文献１４】Ｆｏｕｒｎｉｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ，２００１年，第４０９巻，ｐ．３４１−３４６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
Ｎｏｇｏレセプター−１のそのリガンドへの結合を阻害し、ミエリン媒介性成長円錐の虚脱および神経突起伸長の阻害を減弱させる分子の早急な必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
（発明の概要）
本発明は、ＣＮＳのニューロンの神経突起伸長、ニューロンの生存および軸索の再生を促進させるためのＮｏｇｏレセプター−１アンタゴニストの使用に関する。本発明は、ＣＮＳのニューロンの神経突起伸長抑制の阻害ニューロンの生存の促進および／または軸索の再生の促進に有用な分子および方法を扱うものである。
【００１２】
本発明はまた、これらを含む可溶性Ｎｏｇｏレセプター−１ポリペプチドおよび融合タンパク質、ならびにＮｏｇｏレセプター−１の特異的免疫原性領域に指向される抗体およびその抗原性断片に関する。本発明はまた、本発明の抗体に結合する免疫原性Ｎｏｇｏレセプター−１ポリペプチドに関する。本発明はまた、Ｎｏｇｏレセプター−１に結合するモノクローナル抗体に結合されるＮｏｇｏレセプター−１ポリペプチドに関する。かかるポリペプチドは、とりわけ、免疫原として、または抗体をスクリーニングして本発明の抗体と同様の特異性を有するものを同定するために使用され得る。本発明は、さらに、本発明のポリペプチドをコードする核酸、かかる核酸を含むベクターおよび宿主細胞、ならびに該ペプチドの作製方法に関する。本発明の抗体、可溶性レセプターおよびレセプター融合タンパク質は、Ｎｏｇｏレセプター−１に拮抗するか、または該レセプターをブロックし、Ｎｏｇｏレセプター−１のそのリガンドへの結合の阻害、ニューロン内での成長円錐虚脱（ｃｏｌｌａｐｓｅ）の阻害、およびニューロン内での神経突起伸長もしくは出芽（ｓｐｒｏｕｔｉｎｇ）の抑制の低減に有用である。
【００１３】
一部のある実施形態において、本発明は、ＡＡＡＦＴＧＬＴＬＬＥＱＬＤＬＳＤＮＡＱＬＲ（配列番号２６）；ＬＤＬＳＤＮＡＱＬＲ（配列番号２７）；ＬＤＬＳＤＤＡＥＬＲ（配列番号２９）；ＬＤＬＡＳＤＮＡＱＬＲ（配列番号３０）；ＬＤＬＡＳＤＤＡＥＬＲ（配列番号３１）；ＬＤＡＬＳＤＮＡＱＬＲ（配列番号３２）；ＬＤＡＬＳＤＤＡＥＬＲ（配列番号３３）；ＬＤＬＳＳＤＮＡＱＬＲ（配列番号３４）；ＬＤＬＳＳＤＥＡＥＬＲ（配列番号３５）；ＤＮＡＱＬＲＶＶＤＰＴＴ（配列番号３６）；ＤＮＡＱＬＲ（配列番号３７）；ＡＤＬＳＤＮＡＱＬＲＶＶＤＰＴＴ（配列番号４１）；ＬＡＬＳＤＮＡＱＬＲＶＶＤＰＴＴ（配列番号４２）；ＬＤＬＳＤＮＡＡＬＲＶＶＤＰＴＴ（配列番号４３）；ＬＤＬＳＤＮＡＱＬＨＶＶＤＰＴＴ（配列番号４４）；およびＬＤＬＳＤＮＡＱＬＡＶＶＤＰＴＴ（配列番号４５）からなる群より選択されるポリペプチドを提供する。
【００１４】
一部のある実施形態において、本発明は、本発明のポリペプチドをコードする核酸を提供する。一部のある実施形態において、該核酸は発現制御配列に作動可能に連結されている。一部のある実施形態において、本発明は、本発明の核酸を含むベクターを提供する。
【００１５】
一部のある実施形態において、本発明は、本発明の核酸を含む、または本発明のベクターを含む宿主細胞を提供する。一部のある実施形態において、本発明は、本発明の核酸またはベクターを含む宿主細胞を培養すること、および本発明のポリペプチドを宿主細胞または培養培地から回収することを含む、本発明のポリペプチドの作製方法を提供する。
【００１６】
一部のある実施形態において、本発明は、宿主を本発明のポリペプチドまたは本発明の核酸もしくはベクターを含む宿主細胞で免疫処置する工程、および本発明の抗体を回収する工程を含む、抗体の作製方法を提供する。本発明はまた、該方法によって作製される抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【００１７】
一部のある実施形態において、本発明は、本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗体であって、ハイブリドーマ細胞株ＨＢ  ７Ｅ１１（ＡＴＣＣ（登録商標）受託番号ＰＴＡ−４５８７）によって産生されるモノクローナル抗体ではない抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【００１８】
本発明の一部のある実施形態において、該抗体または抗原結合断片は、（ａ）ニューロンの成長円錐の虚脱を抑制する；（ｂ）ニューロンにおける神経突起の伸長および出芽の抑制を低減させる；ならびに（ｃ）リガンドへのＮｏｇｏレセプター−１の結合を阻害する。一部のある実施形態において、神経突起の伸長および出芽は軸索の成長である。一部のある実施形態において、ニューロンは中枢神経系のニューロンである。
【００１９】
一部のある実施形態において、本発明の抗体はモノクローナルである。一部のある実施形態において、本発明の抗体はマウス抗体である。一部のある実施形態では、本発明の抗体は、ヒト化抗体、キメラ抗体および単鎖抗体からなる群より選択される。
【００２０】
一部のある実施形態において、本発明は、Ｎｏｇｏレセプター−１を本発明の抗体またはその抗原結合断片と接触させる工程を含む、リガンドへのＮｏｇｏレセプター−１の結合を阻害する方法を提供する。一部のある実施形態において、リガンドは、ＮｏｇｏＡ、ＮｏｇｏＢ、ＮｏｇｏＣ、ＭＡＧおよびＯＭ−ｇｐからなる群より選択される。
【００２１】
一部のある実施形態において、本発明は、ニューロンを本発明の抗体またはその抗原結合断片と接触させる工程を含む、ニューロンにおける成長円錐の虚脱を抑制するための方法を提供する。
【００２２】
一部のある実施形態において、本発明は、ニューロンを本発明の抗体またはその抗原結合断片と接触させる工程を含む、ニューロンにおける神経突起の伸長または出芽の抑制を低減させるための方法を提供する。一部のある実施形態において、神経突起の伸長または出芽は軸索の成長である。一部のある実施形態において、ニューロンは中枢神経系のニューロンである。
【００２３】
一部のある実施形態において、本発明は、薬学的に許容され得るキャリアおよび本発明の抗体またはその抗原結合断片を含む組成物を提供する。一部のある実施形態において、該組成物は、さらに、１種類以上のさらなる治療用薬剤を含む。
【００２４】
一部のある実施形態において、本発明は、ニューロンを、有効量の本発明の抗Ｎｏｇｏレセプター−１抗体またはその抗原結合断片と接触させることを含む、死滅するリスクのあるニューロンの生存を促進させる方法を提供する。一部のある実施形態において、ニューロンはインビトロである。一部のある実施形態では、ニューロンは哺乳動物のものである。一部のある実施形態において、哺乳動物は、多発性硬化症、ＡＬＳ、ハンティングトン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、糖尿病性ニューロパシー、脳卒中、外傷性脳損傷または脊髄損傷の徴候または症状を示している。
【００２５】
一部のある実施形態において、本発明は、（ａ）本発明の抗Ｎｏｇｏレセプター−１抗体またはその抗原結合断片を発現する培養宿主細胞を提供すること；および（ｂ）宿主細胞を哺乳動物内のニューロン部位またはその付近に導入することを含む、哺乳動物において死滅するリスクのあるニューロンの生存を促進させる方法を提供する。
【００２６】
一部のある実施形態において、本発明は、ニューロン部位またはその付近に、本発明の抗Ｎｏｇｏレセプター−１抗体またはその抗原結合断片をコードするヌクレオチド配列を含むウイルスベクターを投与することを含み、ここで、該抗Ｎｏｇｏレセプター−１抗体または抗原結合断片は、哺乳動物において該ヌクレオチド配列から、ニューロンの生存を促進するのに充分な量で発現される、死滅するリスクのあるニューロンであって哺乳動物のものであるニューロンの生存を促進させる方法である遺伝子療法を提供する。
【００２７】
一部のある実施形態において、本発明は、配列番号４９のアミノ酸３０９〜３３５；配列番号４９のアミノ酸３０９〜３３６；配列番号４９のアミノ酸３０９〜３３７；配列番号４９のアミノ酸３０９〜３３８；配列番号４９のアミノ酸３０９〜３３９；配列番号４９のアミノ酸３０９〜３４０；配列番号４９のアミノ酸３０９〜３４１；配列番号４９のアミノ酸３０９〜３４２；配列番号４９のアミノ酸３０９〜３４３；配列番号４９のアミノ酸３０９〜３４４；配列番号４９のアミノ酸３０９〜３４５；配列番号４９のアミノ酸３０９〜３４６；配列番号４９のアミノ酸３０９〜３４７；配列番号４９のアミノ酸３０９〜３４８；配列番号４９のアミノ酸３０９〜３４９；配列番号４９のアミノ酸３０９〜３５０；配列番号４９のアミノ酸３００〜３４４；配列番号４９のアミノ酸３０１〜３４４；配列番号４９のアミノ酸３０２〜３４４；配列番号４９のアミノ酸３０３〜３４４；配列番号４９のアミノ酸３０４〜３４４；配列番号４９のアミノ酸３０５〜３４４；配列番号４９のアミノ酸３０６〜３４４；配列番号４９のアミノ酸３０７〜３４４；配列番号４９のアミノ酸３０８〜３４４；配列番号４９のアミノ酸３３６〜３４４；配列番号４９のアミノ酸３３５〜３４４；配列番号４９のアミノ酸３３４〜３４４；配列番号４９のアミノ酸３３３〜３４４；配列番号４９のアミノ酸３３２〜３４４；配列番号４９のアミノ酸３３１〜３４４；配列番号４９のアミノ酸３３０〜３４４；配列番号４９のアミノ酸３２９〜３４４；配列番号４９のアミノ酸３２８〜３４４；配列番号４９のアミノ酸３２７〜３４４；配列番号４９のアミノ酸３２６〜３４４；配列番号４９のアミノ酸３２５〜３４４；配列番号４９のアミノ酸３２４〜３４４；配列番号４９のアミノ酸３２３〜３４４；配列番号４９のアミノ酸３２２〜３４４；配列番号４９のアミノ酸３２１〜３４４；配列番号４９のアミノ酸３２０〜３４４；配列番号４９のアミノ酸３１９〜３４４；配列番号４９のアミノ酸３１８〜３４４；配列番号４９のアミノ酸３１７〜３４４；配列番号４９のアミノ酸３１６〜３４４；配列番号４９のアミノ酸３１５〜３４４；配列番号４９のアミノ酸３１４〜３４４；配列番号４９のアミノ酸３１３〜３４４；配列番号４９のアミノ酸３１２〜３４４；配列番号４９のアミノ酸３１１〜３４４；配列番号４９のアミノ酸３１０〜３４４；配列番号４９のアミノ酸３３６〜３４４；配列番号４９のアミノ酸３３６〜３４５；配列番号４９のアミノ酸３３６〜３４６；配列番号４９のアミノ酸３３６〜３４７；配列番号４９のアミノ酸３３６〜３４８；配列番号４９のアミノ酸３３６〜３４９；配列番号４９のアミノ酸３３６〜３５０；前記ポリペプチド断片のいずれかのバリアントまたは誘導体、および前記ポリペプチド断片のいずれかの少なくとも２種類の組合せ；（３個までのアミノ酸置換を除く）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、６０残基以下の単離されたポリペプチドを提供する。
【００２８】
一部のある実施形態において、本発明は、配列番号４９のアミノ酸３１１〜３４４；配列番号４９のアミノ酸３１０〜３４８；配列番号４９のアミノ酸３２３〜３２８；配列番号４９のアミノ酸３３９〜３４８；配列番号４９のアミノ酸３７８〜４１４；配列番号４９のアミノ酸２７〜３８；配列番号４９のアミノ酸３９〜６１；配列番号４９のアミノ酸２５７〜２６７；配列番号４９のアミノ酸２８０〜２９２；配列番号４９のアミノ酸３０１〜３２３；配列番号４９のアミノ酸３３５〜３４３；配列番号４９のアミノ酸３１０〜３３５；配列番号４９のアミノ酸３２６〜３２８；前記ポリペプチド断片のいずれかのバリアントまたは誘導体、および前記ポリペプチド断片のいずれかの少なくとも２種類の組合せからなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、６０残基以下の単離されたポリペプチドを提供する。
【００２９】
一部のある実施形態において、本発明は、３個までの個々のアミノ酸置換以外は参照アミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含む６０残基以下の単離されたポリペプチド断片であって、前記参照アミノ酸配列が、（ａ）配列番号４９のアミノ酸ｘ〜３４４、（ｂ）配列番号４９のアミノ酸３０９〜ｙ、および（ｃ）配列番号４９のアミノ酸ｘ〜ｙ（ここで、ｘは３０５〜３２６の任意の整数であり、ｙは３２８〜３５０の任意の整数である）からなる群より選択され、Ｎｏｇｏ−レセプター媒介性神経突起伸長抑制を阻害するポリペプチド断片を提供する。一部のある実施形態において、本発明は、３個までの個々のアミノ酸置換以外は参照アミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含む６０残基以下の単離されたポリペプチド断片であって、前記参照アミノ酸配列が、（ａ）配列番号４９のアミノ酸ｘ’〜３４４、（ｂ）配列番号４９のアミノ酸３０９〜ｙ’、（ｃ）配列番号４９のアミノ酸ｘ’〜ｙ’（式中、ｘ’は３００〜３２６の任意の整数であり、ｙ’は３２８〜３６０の任意の整数である）からなる群より選択されるポリペプチド断片であって、Ｎｏｇｏ−レセプター媒介性神経突起伸長抑制を阻害するポリペプチド断片を提供する。一部のある実施形態において、本発明は、３個までの個々のアミノ酸置換以外は参照アミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含む６０残基以下の単離されたポリペプチド断片であって、前記参照アミノ酸配列が、配列番号４９のアミノ酸３０９〜３３５；配列番号４９のアミノ酸３０９〜３４４；配列番号４９のアミノ酸３１０〜３３５；配列番号４９のアミノ酸３１０〜３４４；配列番号４９のアミノ酸３０９〜３５０；配列番号４９のアミノ酸３００〜３４４；および配列番号４９のアミノ酸３１５〜３４４からなる群より選択されるポリペプチド断片を提供する。一部のある実施形態において、本発明は、３個までの個々のアミノ酸置換以外は参照アミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含む６０残基以下の単離されたポリペプチド断片であって、前記参照アミノ酸配列が、配列番号４９のアミノ酸３０９〜３４４であるポリペプチド断片を提供する。一部のある実施形態において、本発明は、３個までの個々のアミノ酸置換以外は参照アミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含む６０残基以下の単離されたポリペプチド断片であって、前記参照アミノ酸配列が、配列番号４９のアミノ酸３０９〜３３５であるポリペプチド断片を提供する。
【００３０】
一部のある実施形態において、本発明は、環状である本発明のポリペプチドを提供する。一部のある実施形態において、該環状ポリペプチドは、さらに、Ｎ末端に結合された第１の分子およびＣ末端に結合された第２の分子を含み、該第１の分子および前記第２の分子が互いに連結されて前記環状分子が形成されている。一部のある実施形態において、第１および第２の分子は、ビオチン分子、システイン残基およびアセチル化システイン残基からなる群より選択される。一部のある実施形態において、第１の分子は、本発明のポリペプチドのＮ末端に結合されたビオチン分子であり、第２の分子は、Ｃ末端に結合されたシステイン残基である。一部のある実施形態において、第１の分子は、本発明のポリペプチドのＮ末端に結合されたアセチル化システイン残基であり、第２の分子は、Ｃ末端に結合されたシステイン残基である。一部のある実施形態において、本発明のポリペプチドの第１の分子は、Ｎ末端に結合されたアセチル化システイン残基であり、第２の分子は、Ｃ末端に結合されたシステイン残基である。一部のある実施形態において、Ｃ末端システインは、結合されたＮＨ２部分を有する。
【００３１】
一部のある実施形態において、本発明は、第１のポリペプチド断片および第２のポリペプチド断片を含む単離されたポリペプチドであって、前記第１のポリペプチド断片が、２０個までの個々のアミノ酸置換以外は第１の参照アミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含み、前記第１の参照アミノ酸配列が、（ａ）配列番号４９のアミノ酸ａ〜４４５、（ｂ）配列番号４９のアミノ酸２７〜ｂ、および（ｃ）配列番号４９のアミノ酸ａ〜ｂ（ここで、ａは２５〜３５の任意の整数であり、ｂは３００〜４５０の任意の整数である）からなる群より選択され、前記第２のポリペプチド断片が、２０個までの個々のアミノ酸置換以外は第２の参照アミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含み、前記第２の参照アミノ酸配列が、（ａ）配列番号４９のアミノ酸ｃ〜４４５、（ｂ）配列番号４９のアミノ酸２７〜ｄ、および（ｃ）配列番号４９のアミノ酸ｃ〜ｄ（ここで、ｃは２５〜３５の任意の整数であり、ｄは３００〜４５０の任意の整数である）からなる群より選択される、Ｎｏｇｏ−レセプター媒介性神経突起伸長抑制を阻害するポリペプチドを提供する。一部のある実施形態において、本発明は、さらに、第１のポリペプチド断片および第２のポリペプチド断片を含む単離されたポリペプチドであって、第１のポリペプチド断片が、２０個までの個々のアミノ酸置換以外は第１の参照アミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含み、第１の参照アミノ酸配列が、（ａ）配列番号４９のアミノ酸２７〜３１０および（ｂ）配列番号４９のアミノ酸２７〜３４４からなる群より選択されるポリペプチドを提供する。一部のある実施形態において、本発明は、さらに、第１のポリペプチド断片および第２のポリペプチド断片を含む単離されたポリペプチドであって、第２のポリペプチド断片が、２０個までの個々のアミノ酸置換以外は第１の参照アミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含み、第２の参照アミノ酸配列が、（ａ）配列番号４９のアミノ酸２７〜３１０および（ｂ）配列番号４９のアミノ酸２７〜３４４からなる群より選択されるポリペプチドを提供する。一部のある実施形態において、本発明は、さらに、第１のポリペプチド断片および第２のポリペプチド断片を含む単離されたポリペプチドであって、第２のポリペプチド断片が、２０個までの個々のアミノ酸置換以外は第１の参照アミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含み、第１のポリペプチド断片が配列番号４９のアミノ酸２７〜３１０を含み、第２のポリペプチド断片が配列番号４９のアミノ酸２７〜３１０を含むか、または第１のポリペプチド断片が配列番号４９のアミノ酸２７〜３４４を含み、第２のポリペプチド断片が配列番号４９のアミノ酸２７〜３１０を含むか、または第１のポリペプチド断片が配列番号４９のアミノ酸２７〜３４４を含み、第２のポリペプチド断片が配列番号４９のアミノ酸２７〜３４４を含む、ポリペプチドを提供する。一部のある実施形態において、本発明は、さらに、第１のポリペプチド断片が第２のポリペプチド断片の上流に存在するものを提供する。一部のある実施形態において、本発明は、さらに、第１のポリペプチド断片と第２のポリペプチド断片の間に存在するペプチドリンカーを提供する。一部のある実施形態において、本発明は、さらに、該ペプチドリンカーが配列番号６５（Ｇ４Ｓ）３を含むものを提供する。一部のある実施形態において、本発明は、さらに、該ペプチドリンカーが配列番号６６（Ｇ４Ｓ）２を含むものを提供する。
【００３２】
一部のある実施形態において、本発明は、少なくとも１つのシステイン残基が、異種アミノ酸で置換されている本発明のポリペプチドを提供する。一部のある実施形態において、該少なくとも１つのシステイン残基はＣ２６６である。一部のある実施形態において、該少なくとも１つのシステイン残基はＣ３０９である。一部のある実施形態において、該少なくとも１つのシステイン残基はＣ３３５である。一部のある実施形態において、該少なくとも１つのシステイン残基はＣ３３６に存在する。一部のある実施形態において、該少なくとも１つのシステイン残基は、代替アミノ酸アラニン、セリンおよびトレオニンからなる群より選択されるで置換されている。一部のある実施形態において、該代替アミノ酸はアラニンである。
【００３３】
一部のある実施形態において、本発明は、（ａ）参照アミノ酸配列の少なくとも１つのシステイン残基が異なるアミノ酸で置換されている以外は前記参照アミノ酸配列と同一であるアミノ酸配、ここで、前記参照アミノ酸配列は、（ｉ）配列番号４９のアミノ酸ａ〜４４５、（ｉｉｉ）配列番号４９のアミノ酸２７〜ｂ、および（ｉｉｉ）配列番号４９のアミノ酸ａ〜ｂ（ここで、ａは２５〜３５の任意の整数であり、ｂは３００〜４５０の任意の整数である）からなる群より選択される；ならびに（ｂ）異種ポリペプチドを含む単離されたポリペプチドであって、ｎｏｇｏ−レセプター媒介性神経突起伸長抑制を阻害するポリペプチドを提供する。一部のある実施形態において、本発明は、さらに、前記参照アミノ酸配列のＣ２６６が異なるアミノ酸で置換されているものを提供する。一部のある実施形態において、本発明は、さらに、前記参照アミノ酸配列のＣ３０９が異なるアミノ酸で置換されているものを提供する。一部のある実施形態において、本発明は、さらに、前記参照アミノ酸配列のＣ３３５が異なるアミノ酸で置換されているものを提供する。一部のある実施形態において、本発明は、さらに、前記参照アミノ酸配列のＣ２６６とＣ３０９が異なるアミノ酸で置換されているものを提供する。一部のある実施形態において、本発明は、さらに、前記参照アミノ酸配列のＣ３０９とＣ３３５が異なるアミノ酸で置換されているものを提供する。一部のある実施形態において、本発明は、さらに、該異なるアミノ酸がアラニンであるものを提供する。
【００３４】
一部のある実施形態において、本発明は、（ａ）２０個までの個々のアミノ酸置換以外は参照アミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列、ここで、前記参照アミノ酸配列は、（ｉ）配列番号４９のアミノ酸ａ〜４４５、（ｉｉ）配列番号４９のアミノ酸２７〜ｂ、および（ｉｉｉ）配列番号４９のアミノ酸ａ〜ｂ（ここで、ａは２５〜３５の任意の整数であり、ｂは３００〜４５０の任意の整数である）からなる群より選択される；および（ｂ）異種ポリペプチドを含む単離されたポリペプチドであって、ｎｏｇｏ−レセプター媒介性神経突起伸長抑制を阻害するポリペプチドを提供する。
【００３５】
一部のある実施形態において、本発明は、第１のポリペプチド断片および第２のポリペプチド断片を含む単離されたポリペプチドであって、前記第１のポリペプチド断片が、２０個までの個々のアミノ酸置換以外は第１の参照アミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含み、前記第１の参照アミノ酸配列が、（ａ）配列番号４９のアミノ酸ａ〜３０５、（ｂ）配列番号４９のアミノ酸１〜ｂ、および（ｃ）配列番号４９のアミノ酸ａ〜ｂ（ここで、ａは１〜２７の任意の整数であり、ｂは２６４〜３０９の任意の整数である）からなる群より選択され、前記第２のポリペプチド断片が、２０個までの個々のアミノ酸置換以外は第２の参照アミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含み、前記第２の参照アミノ酸配列が、（ａ）配列番号６０のアミノ酸ｃ〜３３２、（ｂ）配列番号６０のアミノ酸２７５〜ｄ、および（ｃ）配列番号６０のアミノ酸ｃ〜ｄ（ここで、ｃは２６５〜３０６の任意の整数であり、ｄは３０８〜３４０の任意の整数である）からなる群より選択されるポリペプチドであって、ｎｏｇｏ−レセプター媒介性神経突起伸長抑制を阻害するポリペプチドを提供する。特定のある実施形態において、第１の参照アミノ酸配列は、（ａ）配列番号４９のアミノ酸１〜２７４；および（ｂ）配列番号４９のアミノ酸１〜３０５からなる群より選択される。特定のある実施形態において、第２の参照アミノ酸配列は、（ａ）配列番号６０のアミノ酸２７５〜３１１；（ｂ）配列番号６０のアミノ酸２７５〜３３２；（ｃ）配列番号６０のアミノ酸３０６〜３１１；（ｄ）配列番号６０のアミノ酸３０６〜３０８；および（ｅ）配列番号６０のアミノ酸３０６〜３０９からなる群より選択される。一実施形態において、第１のポリペプチド断片は配列番号４９のアミノ酸１〜２７４を含み、第２のポリペプチド断片はアミノ酸配列番号６０のアミノ酸２７５〜３１１を含む。一部のある実施形態において、第１のポリペプチド断片は配列番号４９のアミノ酸１〜２７４を含み、第２のポリペプチド断片は配列番号６０のアミノ酸２７５〜３３２を含む。一部のある実施形態において、第１のポリペプチド断片は配列番号４９のアミノ酸１〜３０５を含み、第２のポリペプチド断片は配列番号６０のアミノ酸３０６〜３１１を含む。一部のある実施形態において、第１のポリペプチド断片は配列番号４９のアミノ酸１〜３０５を含み、第２のポリペプチド断片は配列番号６０のアミノ酸３０６〜３０８を含む。一部のある実施形態において、第１のポリペプチド断片は配列番号４９のアミノ酸１〜３０５を含み、第２のポリペプチド断片は配列番号６０のアミノ酸３０６〜３０９を含む。一部のある実施形態において、少なくとも１つのさらなるアミノ酸が第２のポリペプチド断片のＣ末端に付加されている。一実施形態において、該少なくとも１つのさらなるアミノ酸はトリプトファンである。一部のある実施形態において、第１のポリペプチド断片のＡ２６９が異なるアミノ酸で置換されている。一実施形態において、該異なるアミノ酸はトリプトファンである。
【００３６】
一部のある実施形態において、本発明は、第１のポリペプチド断片および第２のポリペプチド断片を含む単離されたポリペプチドであって、前記第１のポリペプチド断片が、２０個までの個々のアミノ酸置換以外は配列番号４９のアミノ酸１〜３１０からなり、前記第２のポリペプチド断片が、５個までの個々のアミノ酸置換以外は配列番号６０のアミノ酸３１１〜３１８からなる、ｎｏｇｏ−レセプター媒介性神経突起伸長抑制を阻害するポリペプチドを提供する。
【００３７】
一部のある実施形態において、本発明は、さらに、該異種ポリペプチドが、（ａ）血清アルブミン、（ｂ）Ｆｃ領域、（ｃ）シグナルペプチド、（ｄ）ポリペプチドタグ、および（ｅ）前記異種ポリペプチドの２種類以上の組合せからなる群より選択されるものを提供する。一部のある実施形態において、本発明は、さらに、Ｆｃ領域が、ＩｇＡのＦｃ領域；ＩｇＤのＦｃ領域；ＩｇＧのＦｃ領域、ＩｇＥのＦｃ領域；およびＩｇＭのＦｃ領域からなる群より選択されるものを提供する。一実施形態において、Ｆｃ領域はＩｇＧのＦｃ領域である。一部のある実施形態において、本発明は、さらに、ペプチドリンカーが、該アミノ酸配列とＩｇＧのＦｃ領域の間に存在するものを提供する。一実施形態において、該ペプチドリンカーは配列番号６６（Ｇ４Ｓ）２を含む。一部のある実施形態において、本発明は、さらに、該ポリペプチドタグが、ＦＬＡＧタグ；Ｓｔｒｅｐタグ；ポリヒスチジンタグ；ＶＳＶ−Ｇタグ；インフルエンザウイルス血球凝集素（ＨＡ）タグ；およびｃ−Ｍｙｃタグからなる群より選択されるものを提供する。
【００３８】
一部のある実施形態において、本発明は、１つ以上のポリアルキレングリコール部分に結合されている本発明のポリペプチドを提供する。一部のある実施形態において、本発明は、さらに、該１つ以上のポリアルキレングリコール部分がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分であるものを提供する。一部のある実施形態において、本発明は、さらに、１〜５個のＰＥＧ部分に結合されている本発明のポリペプチドを提供する。
【００３９】
一部のある実施形態において、本発明は、本発明のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。一部のある実施形態において、本発明は、さらに、該ヌクレオチド配列が発現制御エレメント（例えば、誘導型プロモーター、構成的プロモーター、または分泌シグナル）に作動可能に連結されているものを提供する。さらなる実施形態には、本発明の単離されたポリヌクレオチドを含むベクター、および前記ベクターを含む宿主細胞が含まれる。
【００４０】
一部のある実施形態において、本発明は、（ｉ）アンチセンスポリヌクレオチド；（ｉｉ）リボザイム；（ｉｉｉ）低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）；および（ｉｖ）スモールヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）からなる群より選択される単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【００４１】
一部のある実施形態において、該単離されたポリヌクレオチドは、ＮｇＲ１  ｍＲＮＡのコード部分に相補的な少なくとも１０塩基を含むアンチセンスポリヌクレオチドである。一部のある実施形態において、該ポリヌクレオチドはリボザイムである。
【００４２】
さらなる実施形態において、該ポリヌクレオチドはｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡである。一部のある実施形態において、本発明は、該ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡがＮｇＲ１発現を阻害するものを提供する。一部のある実施形態において、本発明は、さらに、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡが、ＣＵＡＣＵＵＣＵＣＣＣＧＣＡＧＧＣＧまたはＣＣＣＧＧＡＣＣＧＡＣＧＵＣＵＵＣＡＡまたはＣＵＧＡＣＣＡＣＵＧＡＧＵＣＵＵＣＣＧを含むヌクレオチド配列と少なくとも９０％同一であるものを提供する。他の実施形態において、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡヌクレオチド配列は、ＣＵＡＣＵＵＣＵＣＣＣＧＣＡＧＧＣＧまたはＣＣＣＧＧＡＣＣＧＡＣＧＵＣＵＵＣＡＡまたはＣＵＧＡＣＣＡＣＵＧＡＧＵＣＵＵＣＣＧである。
【００４３】
一部のある実施形態において、本発明は、さらに、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡヌクレオチド配列が、ポリヌクレオチド配列ＧＡＴＧＡＡＧＡＧＧＧＣＧＴＣＣ  ＧＣＴまたはＧＧＧＣＣＴＧＧＣＴＧＣＡＧＡＡＧＴＴまたはＧＡＣＴＧＧＴＧＡＣＴＣＡＧＡＧＡＡＧＧＣによって生成されるｍＲＮＡに相補的であるものを提供する。
【００４４】
本発明のさらなる実施形態には、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクターまたは宿主細胞と、特定のある実施形態では、薬学的に許容され得るキャリアとを含む医薬組成物が含まれる。特定のある実施形態において、該組成物は、配列番号７のアミノ酸２７〜３１０と抗炎症剤を含むものである。他の実施形態において、該組成物は、配列番号９のアミノ酸２７〜３１０と抗炎症剤を含むものである。一部のある実施形態において、本発明は、さらに、炎症剤がステロイド系抗炎症剤および非ステロイド系抗炎症剤からなる群より選択されるものを提供する。特定のある実施形態において、ステロイド系抗炎症剤は、ヒドロコルチゾン、２１−アセトキシプレグネノロン、アルクロメラゾン、アルゲストン、アムシノニド、ベクロメタゾン、ベタメタゾン、吉草酸ベタメタゾン、ブデソニド、クロロプレドニゾン、クロベタゾール、プロピオン酸クロベタゾール、クロベタゾン、酪酸クロベタゾン、クロコルトロン、クロプレドノール、コルチコステロン、コルチゾン、コルチバゾール、デフラザコン、デソニド、デスオキシメラゾン（ｄｅｓｏｘｉｍｅｒａｓｏｎｅ）、デキサメタゾン、ジフロラゾン、ジフルコルトロン、ジフルプレドナート、エノキソロン、フルザコート、フルクロロニド、フルメタゾン、ピバリン酸フルメタゾン、フルニソリド、フルシノロン（ｆｌｕｃｉｎｏｌｏｎｅ）アセトニド、フルオシノニド、フルオロシノロンアセトニド、フルオコルチンブチル、フルオコルトロン、フルオロコルトロンヘキサノエート、吉草酸ジフルコルトロン、フルオロメトロン、酢酸フルペロロン、酢酸フルプレドニデン、フルプレドニゾロン、フルランデノリド、ホルモコルタル、ハルシノニド、ハロメタゾン、酢酸ハロプレドン、ヒドロコルタメート、ヒドロコルチゾン、酢酸ヒドロコルチゾン、酪酸ヒドロコルチゾン、リン酸ヒドロコルチゾン、コハク酸ヒドロコルチゾン２１−ナトリウム、ヒドロコルチゾンテブテート、マジプレドン、メドリソン、メプレドニゾン、メチルプレドニゾロン、フランカルボン酸モメタゾン、パラメタゾン、プレドニカルバート、プレドニゾロン、プレドニゾロン２１−ジエドライ（ｄｉｅｄｒｙ）アミノ酢酸塩、リン酸プレドニゾロンナトリウム、コハク酸プレドニゾロンナトリウム、２１−ｍ−スルホ安息香酸プレドニゾロンナトリウム、２１−ステアロ（ｓｔｅａｒｏ）グリコール酸プレドニゾロンナトリウム、プレドニゾロンテブテート、２１−トリメチル酢酸プレドニゾロン、プレドニゾン、プレドニバル、プレドニリデン、２１−ジエチルアミノ酢酸プレドニリデン、チキソコルトール、トリアムシノロン、トリアムシノロンアセトニド、トリアムシノロンベネトニドおよびトリアムシノロンヘキサアセトニドからなる群より選択される。特別な一実施形態において、ステロイド系抗炎症剤はメチルプレドニゾロンである。他の実施形態において、非ステロイド系抗炎症剤は、アルミノプロフェン、ベノキサプロフェン、ブクロキシ（ｂｕｃｌｏｘｉｃ）酸、カルプロフェン、フェンブフェン、フェノプロフェン、フルプロフェン、フルルビプロフェン、イブプロフェン、インドプロフェン、ケトプロフェン、ミロプロフェン、ナプロキセン、オキサプロジン、ピルプロフェン、プラノプロフェン、スプロフェン、チアプロフェン酸、チオキサプロフェン、インドメタシン、アセメタシン、アルクロフェナク、クリダナク、ジクロフェナク、フェンクロフェナク、フェンクロズ酸、フェンチアザク、フロフェナク、イブフェナク、イソキセパク、オキシピナク、スリンダク、チオピナク、トルメチン、ジドメタシン、ゾメピラック、フルフェナム酸、メクロフェナム酸、メフェナム酸、ニフルム酸、トルフェナム酸、ジフルニサル、フルフェニサル、イソキシカム、ピロキシカム、スドキシカム、テノキシカム、アセチルサリチル酸、スルファサラジン、アパゾン、ベズピペリロン、フェプラゾン、モフェブタゾン、オキシフェンブタゾンおよびフェニルブタゾンからなる群より選択される。
【００４５】
さらなる実施形態には、配列番号７または９のアミノ酸２７〜３１０が異種ポリペプチドに融合された組成物が含まれる。一部のある実施形態において、該異種ポリペプチドがＦｃである。
【００４６】
また、本発明の実施形態には、ニューロンを、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチドまたは組成物を含む薬剤であってＮｏｇｏレセプター１媒介性神経突起伸長抑制を阻害する薬剤と接触させることを含む、神経突起伸長を促進させるための方法が含まれる。
【００４７】
さらなる実施形態には、ニューロンを、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチドまたは組成物を含む薬剤であってＮｇＲ１シグナル伝達複合体によりシグナル伝達を阻害する薬剤の有効量と接触させることを含む、ＮｇＲ１シグナル伝達複合体によりシグナル伝達を阻害する方法が含まれる。
【００４８】
他の実施形態には、処置を必要とする哺乳動物に、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチドまたは組成物を含む薬剤であってＮｏｇｏレセプター１媒介性神経突起伸長抑制を阻害する薬剤の有効量を投与することを含む、哺乳動物において中枢神経系（ＣＮＳ）の疾患、障害または損傷を処置するための方法が含まれる。特定のある実施形態において、該疾患、障害または損傷は、多発性硬化症、ＡＬＳ、ハンティングトン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、糖尿病性ニューロパシー、脳卒中、外傷性脳損傷、脊髄損傷、視神経炎、緑内障、難聴、および副腎白質萎縮症からなる群より選択される。
【００４９】
一部のある実施形態において、本発明は、さらに、該ポリペプチドが、異種ポリペプチドに融合されているものを提供する。一部のある実施形態において、該異種ポリペプチドは血清アルブミンである。一部のある実施形態では、該異種ポリペプチドはＦｃ領域である。一部のある実施形態では、該異種ポリペプチドはシグナルペプチドである。一部のある実施形態では、該異種ポリペプチドはポリペプチドタグである。一部のある実施形態において、本発明は、さらに、Ｆｃ領域が、ＩｇＡのＦｃ領域；ＩｇＤのＦｃ領域；ＩｇＧのＦｃ領域、ＩｇＥのＦｃ領域；およびＩｇＭのＦｃ領域からなる群より選択されるものを提供する。一部のある実施形態において、本発明は、さらに、該ポリペプチドタグが、ＦＬＡＧタグ；Ｓｔｒｅｐタグ；ポリヒスチジンタグ；ＶＳＶ−Ｇタグ；インフルエンザウイルス血球凝集素（ＨＡ）タグ；およびｃ−Ｍｙｃタグからなる群より選択されるものを提供する。
例えば、本願発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
３個までの個々のアミノ酸置換以外は参照アミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含む、６０残基以下の単離されたポリペプチド断片であって、該参照アミノ酸配列が、
（ａ）配列番号４９のアミノ酸ｘ〜３４４；および
（ｂ）配列番号４９のアミノ酸３０９〜ｙ；
からなる群より選択され、
ここで、ｘが、３０５〜３２６の任意の整数であり、ｙが、３２８〜３５０の任意の整数であり；そして
該ポリペプチド断片が、ｎｏｇｏ−レセプター媒介性神経突起伸長抑制を阻害する；
単離されたポリペプチド断片。
（項目２）
ｘが、３００〜３２６の任意の整数であり、ｙが、３２８〜３６０の任意の整数である、項目１に記載のポリペプチド断片。
（項目３）
前記参照アミノ酸配列が、
（ｉ）配列番号４９のアミノ酸３０９〜３３５；
（ｉｉ）配列番号４９のアミノ酸３０９〜３４４；
（ｉｉｉ）配列番号４９のアミノ酸３１０〜３３５；
（ｉｖ）配列番号４９のアミノ酸３１０〜３４４；
（ｖ）配列番号４９のアミノ酸３０９〜３５０；
（ｖｉ）配列番号４９のアミノ酸３００〜３４４；および
（ｖｉｉ）配列番号４９のアミノ酸３１５〜３４４；
からなる群より選択される、項目２に記載のポリペプチド断片。
（項目４）
前記参照アミノ酸配列が、配列番号４９のアミノ酸３０９〜３３５である、項目３に記載のポリペプチド断片。
（項目５）
前記参照アミノ酸配列が、配列番号４９のアミノ酸３０９〜３４４である、項目３に記載のポリペプチド断片。
（項目６）
配列番号４９のアミノ酸ｘ〜ｙを含む、６０残基以下の単離されたポリペプチド断片であって、
ここで、ｘが、３００〜３１０の任意の整数であり、ｙが、３４０〜３６０の任意の整数であり；
該ポリペプチド断片が、ｎｏｇｏ−レセプター媒介性神経突起伸長抑制を阻害する；
単離されたポリペプチド断片。
（項目７）
前記ポリペプチドが、環状である、項目１〜６のいずれか１項に記載のポリペプチド。
（項目８）
前記環状ポリペプチドが、Ｎ末端に結合された第１の分子およびＣ末端に結合された第２の分子をさらに含み、該第１の分子および該第２の分子が、互いに連結されて該環状分子が形成されている、項目７に記載のポリペプチド。
（項目９）
前記第１の分子および前記第２の分子が、ビオチン分子、システイン残基およびアセチル化システイン残基からなる群より選択される、項目８に記載のポリペプチド。
（項目１０）
前記第１の分子が、前記Ｎ末端に結合されたビオチン分子であり、前記第２の分子が、前記ポリペプチドのＣ末端に結合されたシステイン残基である、項目９に記載のポリペプチド。
（項目１１）
前記第１の分子が、前記Ｎ末端に結合されたアセチル化システイン残基であり、前記第２の分子が、前記ポリペプチドのＣ末端に結合されたシステイン残基である、項目９に記載のポリペプチド。
（項目１２）
前記Ｃ末端システインが、結合されたＮＨ２部分を有する、項目１０または項目１１に記載のポリペプチド。
（項目１３）
第１のポリペプチド断片および第２のポリペプチド断片を含む単離されたポリペプチドであって、該第１のポリペプチド断片が、２０個までの個々のアミノ酸置換以外は第１の参照アミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含み、該第１の参照アミノ酸配列が、
（ａ）配列番号４９のアミノ酸ａ〜４４５；
（ｂ）配列番号４９のアミノ酸２７〜ｂ；および
（ｃ）配列番号４９のアミノ酸ａ〜ｂ；
からなる群より選択され、
ここで、ａが、２５〜３５の任意の整数であり、ｂが、３００〜４５０の任意の整数であり；
該第２のポリペプチド断片が、２０個までの個々のアミノ酸置換以外は第２の参照アミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含み、該第２の参照アミノ酸配列が、
（ａ）配列番号４９のアミノ酸ｃ〜４４５；
（ｂ）配列番号４９のアミノ酸２７〜ｄ；および
（ｃ）配列番号４９のアミノ酸ｃ〜ｄ；
からなる群より選択され、
ここで、ｃが、２５〜３５の任意の整数であり、ｄが、３００〜４５０の任意の整数であり；そして該ポリペプチドが、ｎｏｇｏ−レセプター媒介性神経突起伸長抑制を阻害する；
単離されたポリペプチド。
（項目１４）
前記第１の参照アミノ酸配列が、
（ａ）配列番号４９のアミノ酸２７〜３１０；および
（ｂ）配列番号４９のアミノ酸２７〜３４４；
からなる群より選択される、項目１３に記載のポリペプチド。
（項目１５）
前記第２の参照アミノ酸配列が、
（ａ）配列番号４９のアミノ酸２７〜３１０；および
（ｂ）配列番号４９のアミノ酸２７〜３４４；
からなる群より選択される、項目１３に記載のポリペプチド。
（項目１６）
前記第１のポリペプチド断片が、配列番号４９のアミノ酸２７〜３１０を含み、前記第２のポリペプチド断片が、配列番号４９のアミノ酸２７〜３１０を含む、項目１３に記載のポリペプチド。
（項目１７）
前記第１のポリペプチド断片が、配列番号４９のアミノ酸２７〜３４４を含み、前記第２のポリペプチド断片が、配列番号４９のアミノ酸２７〜３１０を含む、項目１３に記載のポリペプチド。
（項目１８）
前記第１のポリペプチド断片が、配列番号４９のアミノ酸２７〜３４４を含み、前記第２のポリペプチド断片が、配列番号４９のアミノ酸２７〜３４４を含む、項目１３に記載のポリペプチド。
（項目１９）
前記第１のポリペプチド断片が、前記第２のポリペプチド断片の上流に存在する、項目１３に記載のポリペプチド。
（項目２０）
前記第１のポリペプチド断片と前記第２のポリペプチド断片との間に存在するペプチドリンカーをさらに含む、項目１３に記載のポリペプチド。
（項目２１）
前記ペプチドリンカーが、配列番号６５（Ｇ４Ｓ）３を含む、項目２０に記載のポリペプチド。
（項目２２）
前記参照アミノ酸配列、前記第１の参照アミノ酸配列または前記第２の参照アミノ酸配列のうちの少なくとも１つのシステイン残基が、異なるアミノ酸で置換されている、項目１〜２１のいずれか１項に記載のポリペプチド。
（項目２３）
前記少なくとも１つのシステイン残基が、Ｃ２６６である、項目２２に記載のポリペプチド。
（項目２４）
前記少なくとも１つのシステイン残基が、Ｃ３０９である、項目２２に記載のポリペプチド。
（項目２５）
前記少なくとも１つのシステイン残基が、Ｃ３３５である、項目２２に記載のポリペプチド。
（項目２６）
前記少なくとも１つのシステイン残基が、Ｃ３３６に存在する、項目２２に記載のポリペプチド。
（項目２７）
前記異なるアミノ酸が、アラニン、セリンおよびトレオニンからなる群より選択される、項目２２に記載のポリペプチド。
（項目２８）
前記異なるアミノ酸が、アラニンである、項目２７に記載のポリペプチド。
（項目２９）
異種ポリペプチドに融合された、項目１〜２８のいずれか１項に記載のポリペプチド。
（項目３０）
前記異種ポリペプチドが、血清アルブミンである、項目２９に記載のポリペプチド。
（項目３１）
前記異種ポリペプチドが、Ｆｃ領域である、項目２９に記載のポリペプチド。
（項目３２）
前記異種ポリペプチドが、シグナルペプチドである、項目２９に記載のポリペプチド。
（項目３３）
前記異種ポリペプチドが、ポリペプチドタグである、項目２９に記載のポリペプチド。
（項目３４）
前記Ｆｃ領域が、ＩｇＡのＦｃ領域；ＩｇＤのＦｃ領域；ＩｇＧのＦｃ領域、ＩｇＥのＦｃ領域；およびＩｇＭのＦｃ領域からなる群より選択される、項目３１に記載のポリペプチド。
（項目３５）
前記ポリペプチドタグが、ＦＬＡＧタグ；Ｓｔｒｅｐタグ；ポリヒスチジンタグ；ＶＳＶ−Ｇタグ；インフルエンザウイルス血球凝集素（ＨＡ）タグ；およびｃ−Ｍｙｃタグからなる群より選択される、項目３３に記載のポリペプチド。
（項目３６）
前記ポリペプチドが、１つ以上のポリアルキレングリコール部分に結合されている、項目１〜３５のいずれか１項に記載のポリペプチド。
（項目３７）
前記１つ以上のポリアルキレングリコール部分が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分である、項目３６に記載のポリペプチド。
（項目３８）
前記ポリペプチドが１〜５個のＰＥＧ部分に結合されている、項目３７に記載のポリペプチド。
（項目３９）
（ａ）参照アミノ酸配列の少なくとも１つのシステイン残基が異なるアミノ酸で置換されている以外は該参照アミノ酸配列と同一であるアミノ酸配であって、該参照アミノ酸配列は、
（ｉ）配列番号４９のアミノ酸ａ〜４４５、
（ｉｉｉ）配列番号４９のアミノ酸２７〜ｂ、および
（ｉｉｉ）配列番号４９のアミノ酸ａ〜ｂ、
からなる群より選択され、
ここで、ａが、２５〜３５の任意の整数であり、ｂが、３００〜４５０の任意の整数である、アミノ酸配；ならびに（ｂ）異種ポリペプチド；を含む単離されたポリペプチドであって、
該ポリペプチドが、ｎｏｇｏ−レセプター媒介性神経突起伸長抑制を阻害する；
単離されたポリペプチド。
（項目４０）
前記参照アミノ酸配列のＣ２６６が、異なるアミノ酸で置換されている、項目３８に記載のポリペプチド。
（項目４１）
前記参照アミノ酸配列のＣ３０９が、異なるアミノ酸で置換されている、項目３９に記載のポリペプチド。
（項目４２）
前記参照アミノ酸配列のＣ３３５が、異なるアミノ酸で置換されている、項目３９に記載のポリペプチド。
（項目４３）
前記参照アミノ酸配列のＣ２６６およびＣ３０９が、異なるアミノ酸で置換されている、項目３９に記載のポリペプチド。
（項目４４）
前記参照アミノ酸配列のＣ３０９およびＣ３３５が、異なるアミノ酸で置換されている、項目３９に記載のポリペプチド。
（項目４５）
前記異なるアミノ酸が、アラニンである、項目３９〜４４のいずれか１項に記載のポリペプチド。
（項目４６）
前記異種ポリペプチドが、
（ａ）血清アルブミン、
（ｂ）Ｆｃ領域、
（ｃ）シグナルペプチド、
（ｄ）ポリペプチドタグ、および
（ｅ）該異種ポリペプチドの２種類以上の組合せ、
からなる群より選択される、項目３９に記載のポリペプチド。
（項目４７）
前記Ｆｃ領域が、ＩｇＡのＦｃ領域；ＩｇＤのＦｃ領域；ＩｇＧのＦｃ領域、ＩｇＥのＦｃ領域；およびＩｇＭのＦｃ領域からなる群より選択される、項目４６に記載のポリペプチド。
（項目４８）
前記Ｆｃ領域が、ＩｇＧのＦｃ領域である、項目４７に記載のポリペプチド。
（項目４９）
前記ポリペプチドタグが、ＦＬＡＧタグ；Ｓｔｒｅｐタグ；ポリヒスチジンタグ；ＶＳＶ−Ｇタグ；インフルエンザウイルス血球凝集素（ＨＡ）タグ；およびｃ−Ｍｙｃタグからなる群より選択される、項目４６に記載のポリペプチド。
（項目５０）
前記ポリペプチドが、１つ以上のポリアルキレングリコール部分に結合されている、項目３９〜４９いずれか１項に記載のポリペプチド。
（項目５１）
前記１つ以上のポリアルキレングリコール部分が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分である、項目５０に記載のポリペプチド。
（項目５２）
前記ポリペプチドが、１〜５個のＰＥＧ部分に結合されている、項目５１に記載のポリペプチド。
（項目５３）
（ａ）２０個までの個々のアミノ酸置換以外は参照アミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列であって、ここで該参照アミノ酸配列は、
（ｉ）配列番号４９のアミノ酸ａ〜４４５、
（ｉｉ）配列番号４９のアミノ酸２７〜ｂ、および
（ｉｉｉ）配列番号４９のアミノ酸ａ〜ｂ、
からなる群より選択され、
ここで、ａが、２５〜３５の任意の整数であり、ｂが、３００〜４５０の任意の整数である、アミノ酸配列；ならびに（ｂ）異種ポリペプチド；を含む単離されたポリペプチドであって、
該ポリペプチドが、ｎｏｇｏ−レセプター媒介性神経突起伸長抑制を阻害する；
単離されたポリペプチド。
（項目５４）
前記異種ポリペプチドが、
（ａ）血清アルブミン、
（ｂ）Ｆｃ領域、
（ｃ）シグナルペプチド、
（ｄ）ポリペプチドタグ、および
（ｅ）該異種ポリペプチドの２種類以上の組合せ、
からなる群より選択される、項目５３に記載のポリペプチド。
（項目５５）
前記Ｆｃ領域が、ＩｇＡのＦｃ領域；ＩｇＤのＦｃ領域；ＩｇＧのＦｃ領域、ＩｇＥのＦｃ領域；およびＩｇＭのＦｃ領域からなる群より選択される、項目５４に記載のポリペプチド。
（項目５６）
前記Ｆｃ領域が、ＩｇＧのＦｃ領域である、項目５５に記載のポリペプチド。
（項目５７）
前記アミノ酸配列および前記ＩｇＧのＦｃ領域の間に存在するペプチドリンカーをさらに含む、項目５６に記載のポリペプチド。
（項目５８）
前記ペプチドリンカーが、配列番号６６（Ｇ４Ｓ）２を含む、項目５７に記載のポリペプチド。
（項目５９）
前記ポリペプチドタグが、ＦＬＡＧタグ；Ｓｔｒｅｐタグ；ポリヒスチジンタグ；ＶＳＶ−Ｇタグ；インフルエンザウイルス血球凝集素（ＨＡ）タグ；およびｃ−Ｍｙｃタグからなる群より選択される、項目５４に記載のポリペプチド。
（項目６０）
前記ポリペプチドが、１つ以上のポリアルキレングリコール部分に結合されている、項目５３〜５９のいずれか１項に記載のポリペプチド。
（項目６１）
前記１つ以上のポリアルキレングリコール部分が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分である、項目６０に記載のポリペプチド。
（項目６２）
前記ポリペプチドが、１〜５個のＰＥＧ部分に結合されている、項目６１に記載のポリペプチド。
（項目６３）
第１のポリペプチド断片および第２のポリペプチド断片を含む単離されたポリペプチドであって、該第１のポリペプチド断片が、２０個までの個々のアミノ酸置換以外は第１の参照アミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含み、該第１の参照アミノ酸配列が、
（ａ）配列番号４９のアミノ酸ａ〜３０５、
（ｂ）配列番号４９のアミノ酸１〜ｂ、および
（ｃ）配列番号４９のアミノ酸ａ〜ｂ
からなる群より選択され、
ここで、ａが、１〜２７の任意の整数であり、ｂが、２６４〜３０９の任意の整数であり；そして該第２のポリペプチド断片が、２０個までの個々のアミノ酸置換以外は第２の参照アミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含み、該第２の参照アミノ酸配列が、
（ａ）配列番号６０のアミノ酸ｃ〜３３２、
（ｂ）配列番号６０のアミノ酸２７５〜ｄ、および
（ｃ）配列番号６０のアミノ酸ｃ〜ｄ
からなる群より選択され、
ここで、ｃが、２６５〜３０６の任意の整数であり、ｄが、３０８〜３４０の任意の整数であり；
該ポリペプチドが、ｎｏｇｏ−レセプター媒介性神経突起伸長抑制を阻害する；
単離されたポリペプチド。
（項目６４）
前記第１の参照アミノ酸配列が、
（ａ）配列番号４９のアミノ酸１〜２７４；および
（ｂ）配列番号４９のアミノ酸１〜３０５；
からなる群より選択される、項目６３に記載のポリペプチド。
（項目６５）
前記第２の参照アミノ酸配列が、
（ａ）配列番号６０のアミノ酸２７５〜３１１；
（ｂ）配列番号６０のアミノ酸２７５〜３３２；
（ｃ）配列番号６０のアミノ酸３０６〜３１１；
（ｄ）配列番号６０のアミノ酸３０６〜３０８；および
（ｅ）配列番号６０のアミノ酸３０６〜３０９；
からなる群より選択される、項目６３に記載のポリペプチド。
（項目６６）
前記第１のポリペプチド断片が、配列番号４９のアミノ酸１〜２７４を含み、前記第２のポリペプチド断片が、アミノ酸配列番号６０のアミノ酸２７５〜３１１を含む、項目６３に記載のポリペプチド。
（項目６７）
前記第１のポリペプチド断片が、配列番号４９のアミノ酸１〜２７４を含み、前記第２のポリペプチド断片が、配列番号６０のアミノ酸２７５〜３３２を含む、項目６３に記載のポリペプチド。
（項目６８）
前記第１のポリペプチド断片が、配列番号４９のアミノ酸１〜３０５を含み、前記第２のポリペプチド断片が、配列番号６０のアミノ酸３０６〜３１１を含む、項目６３に記載のポリペプチド。
（項目６９）
前記第１のポリペプチド断片が、配列番号４９のアミノ酸１〜３０５を含み、前記第２のポリペプチド断片が、配列番号６０のアミノ酸３０６〜３０９を含む、項目６３に記載のポリペプチド。
（項目７０）
少なくとも１つのさらなるアミノ酸が、前記第２のポリペプチド断片のＣ末端に付加されている、項目６９に記載のポリペプチド。
（項目７１）
前記少なくとも１つのさらなるアミノ酸が、トリプトファンである、項目７０に記載のポリペプチド。
（項目７２）
前記第１のポリペプチド断片のＡ２６９が、異なるアミノ酸で置換されている、項目７１に記載のポリペプチド。
（項目７３）
前記異なるアミノ酸が、トリプトファンである、項目７２に記載のポリペプチド。
（項目７４）
第１のポリペプチド断片および第２のポリペプチド断片を含む単離されたポリペプチドであって、該第１のポリペプチド断片が、２０個までの個々のアミノ酸置換以外は配列番号４９のアミノ酸１〜３１０からなり、該第２のポリペプチド断片が、５個までの個々のアミノ酸置換以外は配列番号６０のアミノ酸３１１〜３１８からなり；そして該ポリペプチドが、ｎｏｇｏ−レセプター媒介性神経突起伸長抑制を阻害する、単離されたポリペプチド。
（項目７５）
異種ポリペプチドに融合された、項目６３〜７４のいずれか１項に記載のポリペプチド。
（項目７６）
前記異種ポリペプチドが、血清アルブミンである、項目７５に記載のポリペプチド。
（項目７７）
前記異種ポリペプチドが、Ｆｃ領域である、項目７５に記載のポリペプチド。
（項目７８）
前記異種ポリペプチドが、シグナルペプチドである、項目７５に記載のポリペプチド。
（項目７９）
前記異種ポリペプチドが、ポリペプチドタグである、項目７５に記載のポリペプチド。
（項目８０）
前記Ｆｃ領域が、ＩｇＡのＦｃ領域；ＩｇＤのＦｃ領域；ＩｇＧのＦｃ領域、ＩｇＥのＦｃ領域；およびＩｇＭのＦｃ領域からなる群より選択される、項目７７に記載のポリペプチド。
（項目８１）
前記ポリペプチドタグが、ＦＬＡＧタグ；Ｓｔｒｅｐタグ；ポリヒスチジンタグ；ＶＳＶ−Ｇタグ；インフルエンザウイルス血球凝集素（ＨＡ）タグ；およびｃ−Ｍｙｃタグからなる群より選択される、項目７９に記載のポリペプチド。
（項目８２）
前記ポリペプチドが、１つ以上のポリアルキレングリコール部分に結合されている、項目６３〜８１のいずれか１項に記載のポリペプチド。
（項目８３）
前記１つ以上のポリアルキレングリコール部分が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分である、項目８２に記載のポリペプチド。
（項目８４）
前記ポリペプチドが、１〜５個のＰＥＧ部分に結合されている、項目８３に記載のポリペプチド。
（項目８５）
項目１〜８４のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
（項目８６）
前記ヌクレオチド配列が、発現制御エレメントに作動可能に連結されている、項目８５に記載のポリヌクレオチド。
（項目８７）
前記発現制御エレメントが、誘導型プロモーター；構成的プロモーター；および分泌シグナルからなる群より選択される、項目８６に記載のポリヌクレオチド。
（項目８８）
（ｉ）アンチセンスポリヌクレオチド；
（ｉｉ）リボザイム；
（ｉｉｉ）低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）；および
（ｉｖ）スモールヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）
からなる群より選択される、単離されたポリヌクレオチド。
（項目８９）
前記ポリヌクレオチドが、ＮｇＲ１  ｍＲＮＡのコード部分に相補的な少なくとも１０塩基を含むアンチセンスポリヌクレオチドである、項目８８に記載のポリヌクレオチド。
（項目９０）
前記ポリヌクレオチドが、リボザイムである、項目８８に記載のポリヌクレオチド。
（項目９１）
前記ポリヌクレオチドが、ｓｉＲＮＡである、項目８８に記載のポリヌクレオチド。
（項目９２）
前記ポリヌクレオチドが、ｓｈＲＮＡである、項目８８に記載のポリヌクレオチド。
（項目９３）
前記ｓｉＲＮＡまたは前記ｓｈＲＮＡが、ＮｇＲ１発現を阻害する、項目９１または９２に記載のポリヌクレオチド。
（項目９４）
前記ｓｉＲＮＡまたは前記ｓｈＲＮＡが、ＣＵＡＣＵＵＣＵＣＣＣＧＣＡＧＧＣＧ（配列番号５２）を含むヌクレオチド配列と少なくとも９０％同一である、項目９３に記載のポリヌクレオチド。
（項目９５）
前記ｓｉＲＮＡまたは前記ｓｈＲＮＡが、ヌクレオチド配列ＣＵＡＣＵＵＣＵＣＣＣＧＣＡＧＧＣＧ（配列番号５２）を含む、項目９３に記載のポリヌクレオチド。
（項目９６）
前記ｓｉＲＮＡまたは前記ｓｈＲＮＡが、配列ＧＡＴＧＡＡＧＡＧＧＧＣＧＴＣＣＧＣＴ（配列番号５３）を含むポリヌクレオチドによって生成されるｍＲＮＡに相補的なヌクレオチド配列を含む、項目９３に記載のポリヌクレオチド。
（項目９７）
前記ｓｉＲＮＡまたは前記ｓｈＲＮＡが、ＣＣＣＧＧＡＣＣＧＡＣＧＵＣＵＵＣＡＡ（配列番号５４）を含むヌクレオチド配列と少なくとも９０％同一である、項目９３に記載のポリヌクレオチド。
（項目９８）
前記ｓｉＲＮＡまたは前記ｓｈＲＮＡが、ヌクレオチド配列ＣＣＣＧＧＡＣＣＧＡＣＧＵＣＵＵＣＡＡ（配列番号５４）を含む、項目９３に記載のポリヌクレオチド。
（項目９９）
前記ｓｉＲＮＡまたは前記ｓｈＲＮＡが、配列ＧＧＧＣＣＴＧＧＣＴＧＣＡＧＡＡＧＴＴ（配列番号５５）を含むポリヌクレオチドによって生成されるｍＲＮＡに相補的なヌクレオチド配列を含む、項目９３に記載のポリヌクレオチド。
（項目１００）
前記ｓｉＲＮＡまたは前記ｓｈＲＮＡが、ＣＵＧＡＣＣＡＣＵＧＡＧＵＣＵＵＣＣＧ（配列番号５６）を含むヌクレオチド配列と少なくとも９０％同一である、項目９３に記載のポリヌクレオチド。
（項目１０１）
前記ｓｉＲＮＡまたは前記ｓｈＲＮＡが、ヌクレオチド配列ＣＵＧＡＣＣＡＣＵＧＡＧＵＣＵＵＣＣＧ（配列番号５６）を含む、項目９３に記載のポリヌクレオチド。
（項目１０２）
前記ｓｉＲＮＡまたは前記ｓｈＲＮＡが、配列ＧＡＣＴＧＧＴＧＡＣＴＣＡＧＡＧＡＡＧＧＣ（配列番号５７）を含むポリヌクレオチドによって生成されるｍＲＮＡに相補的なヌクレオチド配列を含む、項目９３に記載のポリヌクレオチド。
（項目１０３）
項目８５〜１０２のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
（項目１０４）
項目１０３に記載のベクターを含む、宿主細胞。
（項目１０５）
項目１〜８４のいずれか１項に記載のポリペプチドおよび薬学的に許容され得るキャリアを含む、組成物。
（項目１０６）
項目８５〜１０２のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドおよび薬学的に許容され得るキャリアを含む、組成物。
（項目１０７）
項目１０３に記載のベクターまたは項目１０４に記載の宿主細胞および薬学的に許容され得るキャリアを含む、組成物。
（項目１０８）
配列番号７のアミノ酸２７〜３１０および抗炎症剤を含む、組成物。
（項目１０９）
前記抗炎症剤が、ステロイド系抗炎症剤および非ステロイド系抗炎症剤からなる群より選択される、項目１０８に記載の組成物。
（項目１１０）
前記ステロイド系抗炎症剤が、ヒドロコルチゾン、２１−アセトキシプレグネノロン、アルクロメラゾン、アルゲストン、アムシノニド、ベクロメタゾン、ベタメタゾン、吉草酸ベタメタゾン、ブデソニド、クロロプレドニゾン、クロベタゾール、プロピオン酸クロベタゾール、クロベタゾン、酪酸クロベタゾン、クロコルトロン、クロプレドノール、コルチコステロン、コルチゾン、コルチバゾール、デフラザコン、デソニド、デスオキシメラゾン、デキサメタゾン、ジフロラゾン、ジフルコルトロン、ジフルプレドナート、エノキソロン、フルザコート、フルクロロニド、フルメタゾン、ピバリン酸フルメタゾン、フルニソリド、フルシノロンアセトニド、フルオシノニド、フルオロシノロンアセトニド、フルオコルチンブチル、フルオコルトロン、フルオロコルトロンヘキサノエート、吉草酸ジフルコルトロン、フルオロメトロン、酢酸フルペロロン、酢酸フルプレドニデン、フルプレドニゾロン、フルランデノリド、ホルモコルタル、ハルシノニド、ハロメタゾン、酢酸ハロプレドン、ヒドロコルタメート、ヒドロコルチゾン、酢酸ヒドロコルチゾン、酪酸ヒドロコルチゾン、リン酸ヒドロコルチゾン、コハク酸ヒドロコルチゾン２１−ナトリウム、ヒドロコルチゾンテブテート、マジプレドン、メドリソン、メプレドニゾン、メチルプレドニゾロン、フランカルボン酸モメタゾン、パラメタゾン、プレドニカルバート、プレドニゾロン、プレドニゾロン２１−ジエドライアミノ酢酸塩、リン酸プレドニゾロンナトリウム、コハク酸プレドニゾロンナトリウム、２１−ｍ−スルホ安息香酸プレドニゾロンナトリウム、２１−ステアログリコール酸プレドニゾロンナトリウム、プレドニゾロンテブテート、２１−トリメチル酢酸プレドニゾロン、プレドニゾン、プレドニバル、プレドニリデン、２１−ジエチルアミノ酢酸プレドニリデン、チキソコルトール、トリアムシノロン、トリアムシノロンアセトニド、トリアムシノロンベネトニドおよびトリアムシノロンヘキサアセトニドからなる群より選択される、項目１０９に記載の組成物。
（項目１１１）
前記ステロイド系抗炎症剤が、メチルプレドニゾロンである、項目１１０に記載の組成物。
（項目１１２）
前記非ステロイド系抗炎症剤が、アルミノプロフェン、ベノキサプロフェン、ブクロキシ酸、カルプロフェン、フェンブフェン、フェノプロフェン、フルプロフェン、フルルビプロフェン、イブプロフェン、インドプロフェン、ケトプロフェン、ミロプロフェン、ナプロキセン、オキサプロジン、ピルプロフェン、プラノプロフェン、スプロフェン、チアプロフェン酸、チオキサプロフェン、インドメタシン、アセメタシン、アルクロフェナク、クリダナク、ジクロフェナク、フェンクロフェナク、フェンクロズ酸、フェンチアザク、フロフェナク、イブフェナク、イソキセパク、オキシピナク、スリンダク、チオピナク、トルメチン、ジドメタシン、ゾメピラック、フルフェナム酸、メクロフェナム酸、メフェナム酸、ニフルム酸、トルフェナム酸、ジフルニサル、フルフェニサル、イソキシカム、ピロキシカム、スドキシカム、テノキシカム、アセチルサリチル酸、スルファサラジン、アパゾン、ベズピペリロン、フェプラゾン、モフェブタゾン、オキシフェンブタゾンおよびフェニルブタゾンからなる群より選択される、項目１０９に記載の組成物。
（項目１１３）
配列番号９のアミノ酸２７〜３１０および抗炎症剤を含む、組成物。
（項目１１４）
前記抗炎症剤が、ステロイド系抗炎症剤および非ステロイド系抗炎症剤からなる群より選択される、項目１１３に記載の組成物。
（項目１１５）
前記ステロイド系抗炎症剤が、ヒドロコルチゾン、２１−アセトキシプレグネノロン、アルクロメラゾン、アルゲストン、アムシノニド、ベクロメタゾン、ベタメタゾン、吉草酸ベタメタゾン、ブデソニド、クロロプレドニゾン、クロベタゾール、プロピオン酸クロベタゾール、クロベタゾン、酪酸クロベタゾン、クロコルトロン、クロプレドノール、コルチコステロン、コルチゾン、コルチバゾール、デフラザコン、デソニド、デスオキシメラゾン、デキサメタゾン、ジフロラゾン、ジフルコルトロン、ジフルプレドナート、エノキソロン、フルザコート、フルクロロニド、フルメタゾン、ピバリン酸フルメタゾン、フルニソリド、フルシノロンアセトニド、フルオシノニド、フルオロシノロンアセトニド、フルオコルチンブチル、フルオコルトロン、フルオロコルトロンヘキサノエート、吉草酸ジフルコルトロン、フルオロメトロン、酢酸フルペロロン、酢酸フルプレドニデン、フルプレドニゾロン、フルランデノリド、ホルモコルタル、ハルシノニド、ハロメタゾン、酢酸ハロプレドン、ヒドロコルタメート、ヒドロコルチゾン、酢酸ヒドロコルチゾン、酪酸ヒドロコルチゾン、リン酸ヒドロコルチゾン、コハク酸ヒドロコルチゾン２１−ナトリウム、ヒドロコルチゾンテブテート、マジプレドン、メドリソン、メプレドニゾン、メチルプレドニゾロン、フランカルボン酸モメタゾン、パラメタゾン、プレドニカルバート、プレドニゾロン、プレドニゾロン２１−ジエドライアミノ酢酸塩、リン酸プレドニゾロンナトリウム、コハク酸プレドニゾロンナトリウム、２１−ｍ−スルホ安息香酸プレドニゾロンナトリウム、２１−ステアログリコール酸プレドニゾロンナトリウム、プレドニゾロンテブテート、２１−トリメチル酢酸プレドニゾロン、プレドニゾン、プレドニバル、プレドニリデン、２１−ジエチルアミノ酢酸プレドニリデン、チキソコルトール、トリアムシノロン、トリアムシノロンアセトニド、トリアムシノロンベネトニドおよびトリアムシノロンヘキサアセトニドからなる群より選択される、項目１１４に記載の組成物。
（項目１１６）
前記ステロイド系抗炎症剤がメチルプレドニゾロンである、項目１１５に記載の組成物。
（項目１１７）
前記非ステロイド系抗炎症剤が、アルミノプロフェン、ベノキサプロフェン、ブクロキシ酸、カルプロフェン、フェンブフェン、フェノプロフェン、フルプロフェン、フルルビプロフェン、イブプロフェン、インドプロフェン、ケトプロフェン、ミロプロフェン、ナプロキセン、オキサプロジン、ピルプロフェン、プラノプロフェン、スプロフェン、チアプロフェン酸、チオキサプロフェン、インドメタシン、アセメタシン、アルクロフェナク、クリダナク、ジクロフェナク、フェンクロフェナク、フェンクロズ酸、フェンチアザク、フロフェナク、イブフェナク、イソキセパク、オキシピナク、スリンダク、チオピナク、トルメチン、ジドメタシン，ゾメピラック、フルフェナム酸、メクロフェナム酸、メフェナム酸、ニフルム酸、トルフェナム酸、ジフルニサル、フルフェニサル、イソキシカム、ピロキシカム、スドキシカム、テノキシカム、アセチルサリチル酸、スルファサラジン、アパゾン、ベズピペリロン、フェプラゾン、モフェブタゾン、オキシフェンブタゾンおよびフェニルブタゾンからなる群より選択される、項目１１４に記載の組成物。
（項目１１８）
前記配列番号７または９のアミノ酸２７〜３１０が、異種ポリペプチドに融合されている、項目１０８〜１１７のいずれか１項に記載の組成物。
（項目１１９）
前記異種ポリペプチドが、Ｆｃである、項目１１８に記載の組成物。
（項目１２０）
ニューロンを、
（ａ）項目１〜８４のいずれか１項に記載のポリペプチド；
（ｂ）項目８５〜１０２のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド；および
（ｃ）項目１０８〜１１９のいずれか１項に記載の組成物；
からなる群より選択される薬剤と接触させる工程を含む、神経突起伸長を促進させる方法であって；
該薬剤が、神経突起伸長抑制を阻害する、方法。
（項目１２１）
前記ニューロンが、哺乳動物のものである、項目１２０に記載の方法。
（項目１２２）
前記哺乳動物が、ヒトである、項目１２１に記載の方法。
（項目１２３）
ニューロンを、
（ａ）項目１〜８４のいずれか１項に記載のポリペプチド；
（ｂ）項目８５〜１０２のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド；および
（ｃ）項目１０８〜１１９のいずれか１項に記載の組成物；
からなる群より選択される薬剤の有効量と接触させる工程を含む、ＮｇＲ１シグナル伝達複合体によるシグナル伝達を阻害する方法。
（項目１２４）
前記ニューロンが、哺乳動物のものである、項目１２３に記載の方法。
（項目１２５）
前記哺乳動物が、ヒトである、項目１２４に記載の方法。
（項目１２６）
哺乳動物において中枢神経系（ＣＮＳ）の疾患、障害または損傷を処置する方法であって、処置を必要とする哺乳動物に、
（ａ）項目１〜８４のいずれか１項に記載のポリペプチド；
（ｂ）項目８５〜１０２のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド；および
（ｃ）項目１０８〜１１９のいずれか１項に記載の組成物；
からなる群より選択される薬剤の有効量を投与する工程を含む、方法。
（項目１２７）
前記疾患、障害または損傷が、多発性硬化症、ＡＬＳ、ハンティングトン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、糖尿病性ニューロパシー、脳卒中、外傷性脳損傷、脊髄損傷、視神経炎、緑内障、難聴、および副腎白質萎縮症からなる群より選択される、項目１２６に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】図１は、Ｎｏｇｏレセプター−１の構造の概略図である。ヒトＮｏｇｏＲ３１０は、配列番号７の残基２６〜３１０を含み、ｓＮｏｇｏＲ３４４は、配列番号６の残基２６〜３４４を含む。ラットｓＮｏｇｏＲ３１０は、配列番号９の残基２７〜３１０を含み、ｓＮｏｇｏＲ３４４は、配列番号８の残基２７〜３４４を含む。
【図２】図２は、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮｔｉＴＭソフトウェアを用いた、Ｎｏｇｏレセプター−１タンパク質の抗原性プロットを示す。ラットＰ−６１７は配列番号１０であり、ラットＰ−６１８は配列番号１１である。ヒトＰ−６１７は配列番号４７であり、ヒトＰ−６１８は配列番号４８である。
【図３】図３Ａは、抗Ｎｏｇｏレセプター−１抗体である７Ｅ１１の結合活性を示すグラフである。このグラフは、Ｎｏｇｏレセプター−１へのＮｏｇｏ６６の結合に対する７Ｅ１１濃度の効果を示す。図３Ｂは、抗Ｎｏｇｏレセプター−１抗体である１Ｈ２の結合活性を示す。このグラフは、ｓＮｏｇｏＲ３４４−Ｆｃ（本明細書および米国特許出願第６０／４０２，８６６号において、Ｆｃ−ｓＮｏｇｏＲ３４４またはＩｇ−ｓＮｏｇｏＲ３４４ともいう）へのＮｏｇｏ６６の結合に対する１Ｈ２濃度の効果を示す。Ｆｃ−ＭＡＧは、ｓＮｏｇｏＲ３４４−Ｆｃへの結合に関してＮｏｇｏ６６と競合しなかった。
【図４】図４は、抗Ｎｏｇｏ−Ｒ−１抗体である１Ｈ２、３Ｇ５および２Ｆ７に関するＥＬＩＳＡの結果を示す。固定化した抗原の存在下でのＯＤ４５０に対する該抗体の効果を測定した。固定化した抗原はｓＮｏｇｏＲ３１０−Ｆｃ（本明細書および米国特許出願第６０／４０２，８６６号において、Ｆｃ−ｓＮｏｇｏＲ３１０またはＩｇ−ｓＮｏｇｏＲ３１０ともいう）、ｓＮｏｇｏＲ３４４−Ｆｃ、ｐ−６１７、ｐ−６１８、ｐ−４、ｐ−５およびオボアルブミンならびにＢＳＡであった。
【図５】図５は、種々の量のミエリンの存在下での、ラットＤＲＧ神経突起伸長に対するモノクローナル抗体７Ｅ１１の効果を示すグラフである。
【図６】図６Ａは、以下の競合物質：Ｎｏｇｏ６６、Ｎｏｇｏ４０および抗Ｎｏｇｏレセプター−１モノクローナル抗体上清みの存在下での、１２５Ｉ−Ｎｏｇｏ６６および１２５Ｉ−Ｎｏｇｏ４０へのｓＮｏｇｏＲ３１０の結合の効果を示すグラフである。図６Ｂは、ｓＮｏｇｏＲ３１０への１２５Ｉ−Ｎｏｇｏ６６の結合活性を示す。
【図７】図７は、ｓＮｏｇｏＲ３１０への１２５Ｉ−Ｎｏｇｏ４０結合に対するｓＮｏｇｏＲ３１０−Ｆｃの効果を示すグラフである。
【図８】図８は、１２５Ｉ−Ｎｏｇｏ４０に対するｓＮｏｇｏＲ３１０−Ｆｃの結合活性を示すグラフである。
【図９Ａ】図９Ａは、ミエリンの存在下または非存在下での、神経突起伸長／細胞に対するｓＮｏｇｏＲ３１０の効果のグラフである。
【図９Ｂ】図９Ｂは、ミエリンの存在下または非存在下での、神経突起伸長に対するｓＮｏｇｏＲ３１０の効果のグラフである。
【図１０Ａ】図１０Ａは、漸増量のミエリンの存在下または非存在下での、Ｐ４ラットＤＲＧ神経突起伸長に対するｓＮｏｇｏＲ３１０−Ｆｃの効果を示すグラフである。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、ＰＢＳ、ＰＢＳ＋ｓＮｏｇｏＲ３１０−Ｆｃ、２０ｎｇミエリンおよびミエリン＋ｓＮｏｇｏＲ３１０−Ｆｃでの処理後の神経突起の数／細胞を示す。
【図１１】図１１は、漸増量のミエリンの存在下での、ＤＲＧ神経突起伸長／細胞に対するモノクローナル抗体５Ｂ１０の効果を示すグラフである。
【図１２】図１２は、ラット脊髄離断モデルにおいて損傷の誘導後３０日までの、ＢＢＢスコアに対するｓＮｏｇｏＲ３１０−Ｆｃの効果を示すグラフである。
【図１３】図１３Ａおよび１３Ｂに、ＷＴマウスまたはトランスジェニックマウスにおける第０８線（Ｌｉｎｅ  ０８）または第０１線からの背側半側切除後、運動機能（ｌｏｃｏｍｏｔｏｒ）ＢＢＢスコアを時間の関数として報告する。図１３Ｃは、ＷＴマウスおよびトランスジェニックマウスの損傷後の最大許容斜面角度を時間の関数としてグラフで示す。図１３Ｄは、傾斜グリッドよじ登り（ｉｎｃｌｉｎｅｄ  ｇｒｉｄ  ｃｌｉｍｂｉｎｇ）中の後肢異常（ｅｒｒｏｒ）を損傷後の時間の関数として示す。すべてのグラフにおいて、各群の７〜９匹のマウスの平均±ｓ．ｅ．ｍ．を報告する。トランスジェニック群の値はＷＴマウスと統計学的に異なる（二重アスタリスク、Ｐ＜０．０１；スチューデントのｔ−検定）。
【図１４】図１４Ａは、ビヒクルまたはｓＮｏｇｏＲ３１０−Ｆｃで処置した動物における背側半側切除後の運動機能ＢＢＢスコアを時間の関数として示す。図１４Ｂは、グリッド歩行中の後肢異常を損傷後の時間の関数として示す。図１４Ｃは、非損傷または損傷＋ｓＮｏｇｏＲ３１０−Ｆｃラットよりも対照マウスにおいて一股（ｓｔｒｉｄｅ）長さが短く、一股幅が大きいことを示すフットプリント解析を示す。すべてのグラフにおいて、各群の７〜９匹のラットの平均±ｓ．ｅ．ｍ．を報告する。ｓＮｏｇｏＲ３１０−Ｆｃ群の値は、対照と統計学的に異なる（図１４Ａ〜Ｂ）。対照の値は、図１４ＣのＳＣＩなしまたはＳＣＩ＋ｓＮｏｇｏＲ３１０−Ｆｃラットと統計学的に異なる（アスタリスク、ｐ＜０．０５；二重アスタリスク、ｐ＜０．０１；スチューデントのｔ−検定）。
【図１５】図１５は、ラットＮｇＲ１の可溶性断片（ｓｒＮｇＲ３１０）への抗ｒＮｇＲ１抗体である１Ｄ９の結合のモデルを示す。
【図１６Ａ】図１６Ａは、ヒトＮｏｇｏレセプターｃＤＮＡのヌクレオチド配列を示す。開始コドンおよび終止コドンに下線を付す。選択したＲＮＡｉ標的領域をイタリック体で示す。ＲＮＡｉ−１およびＲＮＡｉ−３はヒトＮｇＲ遺伝子を特異的に標的化するものであり、ＲＮＡｉ−２は、ヒト、マウスおよびラットのＮｇＲ遺伝子を標的化するように設計した。
【図１６Ｂ】図１６Ｂは、発現ベクターｐＵ６内でのＮｇＲ  ＲＮＡｉの構築に用いたＤＮＡオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列を示す。
【図１７】図１７は、マウスＬ細胞におけるＲＮＡｉノックダウンの一過性トランスフェクション試験の結果を示す。
【図１８】図１８は、ＳＫＮ細胞および２９３細胞内でのヒトＮｇＲ発現ベクターのトランスフェクションを示す。
【図１９】図１９は、ヒトＳＫＮ細胞におけるＲＮＡｉノックダウンの一過性トランスフェクション試験を示す。
【図２０】図２０は、ＲＮＡｉレンチウイルスベクターの概略図を示す。ＲＮＡｉ発現カセットは、ＰａｃＩ部位またはＥｃｏＲＩ部位に挿入され得る。ＬＴＲ−長い末端反復配列；ＲＲＥ−Ｒｅｖ応答エレメント；ｃＰＰＴ−中央ポリプリントラクト；ＣＢＡ−ニワトリβアクチン；ＷＰＲＥ−ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント；ＳＩＮ  ＬＴＲ−ｓｅｌｄ相互作用ＬＴＲ。
【図２１】図２１は、クローンＮｅｕｒｏＳｃｒｅｅｎ細胞におけるＮｇＲ１ノックダウンを示す、７Ｅ１１抗体を用いたウエスタンブロット解析を示す。
【図２２】図２２は、ＬＶ（クローン番号３Ｇ９、１Ｅ５  １Ｅ９  １Ｅ１０）、ＬＶ−ＮｇＲ  ＲＮＡｉで形質導入されたクローンＮｅｕｒｏＳｃｒｅｅｎ細胞または未処理細胞におけるＮｇＲ発現の概要を示す。ウエスタンブロット上のＮｇＲおよびＧＡＰＤＨシグナルの結果をデンシトメトリー走査によって定量した。
【図２３】図２３は、異なるレベルのＮｇＲノックダウンで樹立された４種類のＮｅｕｒｏＳｃｒｅｅｎ細胞クローンを示す。ＮｇＲ発現は、未処理ＮｅｕｒｏＳｃｒｅｅｎ細胞におけるＮｇＲ：ＧＡＰＤＨシグナル比のパーセンテージとして示す。
【図２４Ａ】図２４Ａ〜Ｂは、インビトロでの幼鳥の脊髄神経節（ＤＲＧ）における、神経突起伸長のミエリン誘導性阻害に対する、ラットＩｇＧに融合されたラットＮｇＲ１（２７〜３１０）のエクトドメイン［ＮｇＲ（３１０）エクト−Ｆｃ］およびメチルプレドニゾロン（ＭＰ）の効果を示す。（Ａ）解離した第１３日胚の幼鳥のＤＲＧニューロンを、ＮｇＲ（３１０）エクト−ＦｃまたはＭＰの存在下、リン酸干渉生理食塩水（ＰＢＳ）またはミエリン（４００ｎｇ／ウェル）上にプレーティングした。（Ｂ）細胞（η−３）あたりの神経突起伸長の定量（ＰＢＳ対照パーセンテージ±ＳＥＭ（η−３）として示す。スケールバー２００μｍ。ＰＢＳ対照と比べてＰ＜０／０５。
【図２４Ｂ】図２４Ａ〜Ｂは、インビトロでの幼鳥の脊髄神経節（ＤＲＧ）における、神経突起伸長のミエリン誘導性阻害に対する、ラットＩｇＧに融合されたラットＮｇＲ１（２７〜３１０）のエクトドメイン［ＮｇＲ（３１０）エクト−Ｆｃ］およびメチルプレドニゾロン（ＭＰ）の効果を示す。（Ａ）解離した第１３日胚の幼鳥のＤＲＧニューロンを、ＮｇＲ（３１０）エクト−ＦｃまたはＭＰの存在下、リン酸干渉生理食塩水（ＰＢＳ）またはミエリン（４００ｎｇ／ウェル）上にプレーティングした。（Ｂ）細胞（η−３）あたりの神経突起伸長の定量（ＰＢＳ対照パーセンテージ±ＳＥＭ（η−３）として示す。スケールバー２００μｍ。ＰＢＳ対照と比べてＰ＜０／０５。
【図２５Ａ】図２５Ａ〜Ｅは、脊髄損傷（ＳＣＩ）後の機能の回復に対する、ラットＩｇＧ［ＮｇＲ（３１０）エクト−Ｆｃ］に融合されたラットＮｇＲ１（２７〜３１０）エクトドメインおよびメチルプレドニゾロン（ＭＰ）の効果を示す。（Ａ）ＢＢＢスコアは、毎週４週間記録した。（Ｂ）ＳＣＩの２日後のＭＰ処置ラットのＢＢＢスコア。（Ｃ）個々の動物について第２日目に対して標準化したＢＢＢスコア。（Ｄ）一貫性の足底ステップ（ｐｌａｎｔａｒ  ｓｔｅｐｐｉｎｇ）の頻度および後肢−前肢協調、ＳＣＩの３週間後および４週間後に１４以上ののスコアを達成した各群のラットの割合を示す。（Ｅ）対照と比較した、ＮｇＲ（３１０）エクト−Ｆｃ−およびＭＰ＋ＮｇＲ（３１０）エクト−Ｆｃ処置群における平均一股長さ。
【図２５Ｂ】図２５Ａ〜Ｅは、脊髄損傷（ＳＣＩ）後の機能の回復に対する、ラットＩｇＧ［ＮｇＲ（３１０）エクト−Ｆｃ］に融合されたラットＮｇＲ１（２７〜３１０）エクトドメインおよびメチルプレドニゾロン（ＭＰ）の効果を示す。（Ａ）ＢＢＢスコアは、毎週４週間記録した。（Ｂ）ＳＣＩの２日後のＭＰ処置ラットのＢＢＢスコア。（Ｃ）個々の動物について第２日目に対して標準化したＢＢＢスコア。（Ｄ）一貫性の足底ステップ（ｐｌａｎｔａｒ  ｓｔｅｐｐｉｎｇ）の頻度および後肢−前肢協調、ＳＣＩの３週間後および４週間後に１４以上ののスコアを達成した各群のラットの割合を示す。（Ｅ）対照と比較した、ＮｇＲ（３１０）エクト−Ｆｃ−およびＭＰ＋ＮｇＲ（３１０）エクト−Ｆｃ処置群における平均一股長さ。
【図２５Ｃ】図２５Ａ〜Ｅは、脊髄損傷（ＳＣＩ）後の機能の回復に対する、ラットＩｇＧ［ＮｇＲ（３１０）エクト−Ｆｃ］に融合されたラットＮｇＲ１（２７〜３１０）エクトドメインおよびメチルプレドニゾロン（ＭＰ）の効果を示す。（Ａ）ＢＢＢスコアは、毎週４週間記録した。（Ｂ）ＳＣＩの２日後のＭＰ処置ラットのＢＢＢスコア。（Ｃ）個々の動物について第２日目に対して標準化したＢＢＢスコア。（Ｄ）一貫性の足底ステップ（ｐｌａｎｔａｒ  ｓｔｅｐｐｉｎｇ）の頻度および後肢−前肢協調、ＳＣＩの３週間後および４週間後に１４以上ののスコアを達成した各群のラットの割合を示す。（Ｅ）対照と比較した、ＮｇＲ（３１０）エクト−Ｆｃ−およびＭＰ＋ＮｇＲ（３１０）エクト−Ｆｃ処置群における平均一股長さ。
【図２５Ｄ】図２５Ａ〜Ｅは、脊髄損傷（ＳＣＩ）後の機能の回復に対する、ラットＩｇＧ［ＮｇＲ（３１０）エクト−Ｆｃ］に融合されたラットＮｇＲ１（２７〜３１０）エクトドメインおよびメチルプレドニゾロン（ＭＰ）の効果を示す。（Ａ）ＢＢＢスコアは、毎週４週間記録した。（Ｂ）ＳＣＩの２日後のＭＰ処置ラットのＢＢＢスコア。（Ｃ）個々の動物について第２日目に対して標準化したＢＢＢスコア。（Ｄ）一貫性の足底ステップ（ｐｌａｎｔａｒ  ｓｔｅｐｐｉｎｇ）の頻度および後肢−前肢協調、ＳＣＩの３週間後および４週間後に１４以上ののスコアを達成した各群のラットの割合を示す。（Ｅ）対照と比較した、ＮｇＲ（３１０）エクト−Ｆｃ−およびＭＰ＋ＮｇＲ（３１０）エクト−Ｆｃ処置群における平均一股長さ。
【図２５Ｅ】図２５Ａ〜Ｅは、脊髄損傷（ＳＣＩ）後の機能の回復に対する、ラットＩｇＧ［ＮｇＲ（３１０）エクト−Ｆｃ］に融合されたラットＮｇＲ１（２７〜３１０）エクトドメインおよびメチルプレドニゾロン（ＭＰ）の効果を示す。（Ａ）ＢＢＢスコアは、毎週４週間記録した。（Ｂ）ＳＣＩの２日後のＭＰ処置ラットのＢＢＢスコア。（Ｃ）個々の動物について第２日目に対して標準化したＢＢＢスコア。（Ｄ）一貫性の足底ステップ（ｐｌａｎｔａｒ  ｓｔｅｐｐｉｎｇ）の頻度および後肢−前肢協調、ＳＣＩの３週間後および４週間後に１４以上ののスコアを達成した各群のラットの割合を示す。（Ｅ）対照と比較した、ＮｇＲ（３１０）エクト−Ｆｃ−およびＭＰ＋ＮｇＲ（３１０）エクト−Ｆｃ処置群における平均一股長さ。
【図２６Ａ】図２６Ａ〜Ｂは、尾部から脊髄までの病変の軸索の数に対する、ラットＩｇＧ［ＮｇＲ（３１０）エクト−Ｆｃ］に融合されたラットＮｇＲ１（２７〜３１０）エクトドメインおよびメチルプレドニゾロン（ＭＰ）処置の効果を示す。
【図２６Ｂ】図２６Ａ〜Ｂは、尾部から脊髄までの病変の軸索の数に対する、ラットＩｇＧ［ＮｇＲ（３１０）エクト−Ｆｃ］に融合されたラットＮｇＲ１（２７〜３１０）エクトドメインおよびメチルプレドニゾロン（ＭＰ）処置の効果を示す。
【図２７】図２７は、前角内の運動ニューロンと接触するビオチンデキストランアミン（ＢＤＡ）標識軸索の数に対する、ラットＩｇＧ［ＮｇＲ（３１０）エクト−Ｆｃ］に融合されたラットＮｇＲ１（２７〜３１０）のエクトドメインおよびメチルプレドニゾロン（ＭＰ）処置の効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００５１】
（発明の詳細な説明）
（定義および一般手法）
特に規定のない限り、本明細書で用いるすべての科学技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者が一般に理解するものと同じ意味を有する。矛盾する場合は、その定義を記載する本出願書類に支配される。また、文脈によって必要とされない限り、単数形の用語は複数形のものを含むものとし、複数形の用語は単数形のものを含むものとする。本明細書に挙げたすべての刊行物、特許および他の参考文献は、あらゆる目的のために、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００５２】
本明細書に記載のものと類似または等価な方法および材料を本発明の実施および試験において使用することができるが、好適な方法および材料は以下に記載するものである。材料、方法および実施例は、例示にすぎず、限定を意図しない。発明の他の特徴および利点は、該詳細な説明および特許請求の範囲から明らかとなろう。
【００５３】
本明細書全体および特許請求の範囲において、語句「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」または「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形型は、記載の整数または整数の群を含むが、任意の他の整数または整数の群を排除しないことが示唆されることは理解されよう。
【００５４】
本発明をさらに規定するため、以下の用語および定義を本明細書に示す。
【００５５】
冠詞「ａ」または「ａｎ」を伴う用語存在体（存在体）は、１つ以上の該存在体をいうことに留意されたい。例えば、「免疫グロブリン分子」（ａｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）は、１つ以上の免疫グロブリン分子表すと理解されたい。したがって、用語「ａ」（または「ａｎ」）、「１つ（種類）以上の」および「少なくとも１つ（種類）の」は、本明細書において互換的に使用され得る。
【００５６】
本明細書で用いる場合、用語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ  ｏｆ）」または「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ  ｏｆ）」または「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」などの変形型は、本明細書全体および特許請求の範囲において用いる場合、任意の記載の整数または整数の群を含むが、さらなる整数または整数の群は、指定した方法、構造または組成に付加され得ないことを示す。
【００５７】
本明細書で用いる場合、用語「本質的に〜からなる（は、から本質的になる。）」または「ｃｏｎｓｉｓｔ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ」または「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ」などの変形型は、本明細書全体および特許請求の範囲において用いる場合、任意の記載の整数または整数の群を含み、指定した方法、構造または組成の基本的または新規な特性を実質的に変化させない任意選択の任意の記載の整数または整数の群を含むことを示す。
【００５８】
本明細書で用いる場合、「抗体」は、完全な免疫グロブリンまたはその抗原結合断片を意味する。本発明の抗体は、任意のアイソタイプまたはクラス（例えば、Ｍ、Ｄ、Ｇ、ＥおよびＡ）もしくは任意のサブクラス（例えば、Ｇ１−４、Ａ１−２）のものであり得、カッパ（κ）またはラムダ（λ）軽鎖のいずれかを有するものであり得る。
【００５９】
本明細書で用いる場合、「Ｆｃ」は、１つ以上の重鎖定常領域ドメインＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含む免疫グロブリン重鎖の一部分を意味する。例えば、抗体の重鎖定常領域の一部分は、パパイン消化によって得られ得る（ｔｈａｔ  ｉｓ  ｏｂｔａｉｎａｂｌｅ）。
【００６０】
本明細書で用いる場合、「ＮｏｇｏＲ融合タンパク質」は、異種ポリペプチドに融合された可溶性Ｎｏｇｏレセプター−１部分を含むタンパク質を意味する。
【００６１】
本明細書で用いる場合、「ヒト化抗体」は、非ヒト配列の少なくとも一部分がヒト配列で置き換えられた抗体を意味する。ヒト化抗体をどのようにして作製するかの例は、米国特許第６，０５４，２９７号、同第５，８８６，１５２号および同第５，８７７，２９３号を見るとよい。
【００６２】
本明細書で用いる場合、「キメラ抗体」は、第１の抗体由来の１つ以上の領域および少なくとも１つの他の抗体由来の１つ以上の領域を含む抗体を意味する。第１の抗体およびさらなる抗体は、同じまたは異なる種に由来するものであり得る。
【００６３】
本明細書および米国特許出願第６０／４０２，８６６号で用いる場合、「Ｎｏｇｏレセプター」、「ＮｏｇｏＲ」、「ＮｏｇｏＲ−１」、「ＮｇＲ」、「ＮｇＲ−Ｉ」、「ＮｇＲ１」および「ＮＧＲ１」は、各々、Ｎｏｇｏレセプター−１を意味する。
【００６４】
本明細書で用いる場合、用語「ポリペプチド」は、単一の「ポリペプチド」ならびに複数の「ポリペプチド」を包含することが意図され、アミド結合（ペプチド結合としても知られる）によって線形に連結されたモノマー（アミノ酸）で構成された分子をいう。用語「ポリペプチド」は、２つ以上のアミノ酸の任意の１つまたは複数の鎖をいい、特定の長さの生成物をいうのではない。したがって、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」または２つ以上のアミノ酸の１つもしくは複数の鎖を示すのに用いられる任意の他の用語が、「ポリペプチド」の定義の範囲に含まれ、用語「ポリペプチド」は、任意のこれらの用語の代わりに互換的に使用され得る。用語「ポリペプチド」はまた、ポリペプチドの発現後修飾、例えば限定されないが、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、既知の保護基／ブロック基による誘導体化、タンパク質分解的切断、または天然に存在しないアミノ酸による修飾の生成物を示すことが意図される。ポリペプチドは、天然の生物学的供給源に由来するもの、または組換え手法により作製されるものであり得るが、必ずしも、指定の核酸配列から翻訳されるものではない。ポリペプチドは、任意の様式で、例えば化学合成によって作製されるものであり得る。
【００６５】
本発明のポリペプチドは、大きさが、約３個以上、５個以上、１０個以上、２０個以上、２５個以上、５０個以上、７５個以上、１００個以上、２００個以上、５００個以上、１，０００個以上、または２，０００個以上のアミノ酸のものであり得る。ポリペプチドは、規定の３次元構造を有するものであり得るが、必ずしもかかる構造を有するものでない。規定の３次元構造を有するポリペプチドは、フォールディングされているといい、規定の３次元構造を有するのではなく、多数の異なるコンホメーションが採用され得るポリペプチドは、変性されているという。本明細書で用いる場合、糖タンパク質という用語は、少なくとも１つの糖質部分にカップリングされたタンパク質をいい、該糖質は該タンパク質に、アミノ酸残基、例えば、セリン残基またはアスパラギン残基の酸素含有または窒素含有側鎖によって結合されている。
【００６６】
「単離された」ポリペプチドまたはその断片、バリアントもしくは誘導体により、その天然の環境状態にないポリペプチドが意図される。具体的な精製レベルは必要とされない。例えば、単離されたポリペプチドは、その天然の環境または自然環境から取り出されたものであり得る。宿主細胞内で発現された組換え産生されたポリペプチドおよびタンパク質は、任意の適当な手法によって分離、分別、または一部もしくは実質的に精製された天然または組換えポリペプチドであるため、本発明の目的（目的ｄ）のために単離されているとみなす。
【００６７】
本発明において、「ポリペプチド断片」は、大きなポリペプチドの短いアミノ酸配列をいう。タンパク質断片は、「独立したもの（ｆｒｅｅ−ｓｔａｎｄｉｎｇ）」または該断片が一部の領域を構成するより大きなポリペプチド内に含まれたものであり得る。本発明のポリペプチド断片の代表例としては、例えば、約５アミノ酸、約１０アミノ酸、約１５アミノ酸、約２０アミノ酸、約３０アミノ酸、約４０アミノ酸、約５０アミノ酸、約６０アミノ酸、約７０アミノ酸、約８０アミノ酸、約９０アミノ酸、および約１００アミノ酸長以上を含む断片が挙げられる。
【００６８】
用語「断片」、「バリアント」、「誘導体」および「類縁体」には、本発明のポリペプチドに言及する場合、少なくとも一部の生物学的活性を保持している任意のポリペプチドが含まれる。本明細書に記載のポリペプチドには、限定されないが、依然としてその機能が果たされる限り該ポリペプチドの断片、バリアントまたは誘導体分子が含まれ得る。本発明のＮｇＲ１ポリペプチドおよびポリペプチド断片には、タンパク質分解断片、欠失断片および、特に、動物に送達する場合、より容易に作用部位に達する断片が含まれ得る。ポリペプチド断片には、さらに、天然のポリペプチドの抗原性または免疫原性のエピトープ（例えば、線形で３次元のエピトープ）を含むポリペプチドの任意の部分が含まれる。本発明のＮｇＲ１ポリペプチドおよびポリペプチド断片は、バリアント領域を含むもの、例えば、上記の断片、また、アミノ酸の置換、欠失または挿入によって改変されたアミノ酸配列を有するポリペプチドであり得る。バリアントは、天然に存在するもの、例えば、対立遺伝子バリアントなどであり得る。「対立遺伝子バリアント」により、生物体の染色体上の所与の遺伝子座を占める遺伝子の択一的形態が意図される。Ｇｅｎｅｓ  ＩＩ  Ｌｅｗｉｎ，Ｂ．編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８５）。天然に存在しないバリアントは、当該技術分野で知られた変異誘発手法を用いて作製され得る。本発明のＮｇＲ１ポリペプチドおよびポリペプチド断片は、同類または非同類アミノ酸置換、欠失または付加を含むものであり得る。また、本発明のＮｇＲ１ポリペプチドおよびポリペプチド断片には、誘導体分子が含まれ得る。バリアントポリペプチドはまた、本明細書において「ポリペプチド類縁体」と称することもある。本明細書で用いる場合、ポリペプチドまたはポリペプチド断片の「誘導体」は、側鎖官能基の反応によって化学的に誘導体化された１つ以上の残基を有する主題のポリペプチドをいう。また、「誘導体」として、２０個の標準アミノ酸の１つ以上の天然に存在するアミノ酸誘導体を含有するペプチドが含まれる。例えば、４−ヒドロキシプロリンはプロリンの代わりに使用され得る；５−ヒドロキシリシンは、リシンの代わりに使用され得る；３−メチルヒスチジンはヒスチジンの代わりに使用され得る；ホモセリンはセリンの代わりに使用され得る；およびオルニチンはリシンの代わりに使用され得る。
【００６９】
本明細書で用いる場合、用語「ジスルフィド結合」には、２つのイオウ原子間で形成される共有結合が含まれる。アミノ酸システインはチオール基を含み、これにより、第２のチオール基とのジスルフィド結合または橋絡が形成され得る。
【００７０】
本明細書で用いる場合、「融合タンパク質」は、第１のポリペプチドがペプチド結合によって第２のポリペプチドに線形に連結されて構成されたタンパク質を意味する。第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドは、同一であっても異なっていてもよく、直接連結されていても、ペプチドリンカー（下記参照）によって連結されていてもよい。
【００７１】
用語「ポリヌクレオチド」は、単一の核酸ならびに複数の核酸を包含することが意図され、単離された核酸の分子または構築物、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）またはプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）をいう。ポリヌクレオチドは、非翻訳５’および３’配列、コード配列を含む、完全長ｃＤＮＡ配列のヌクレオチド配列を含有するものであり得る。ポリヌクレオチドは、通常のホスホジエステル結合を含むもの、または非通常でない結合（例えば、アミド結合、例えばペプチド核酸（ＰＮＡ）に見られる）を含むものであり得る。該ポリヌクレオチドは、任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドで構成されたものであり得、これらは、未修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡまたは修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡであり得る。例えば、ポリヌクレオチドは、単鎖および二本鎖ＤＮＡ、単鎖領域と二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、単鎖および二本鎖ＲＮＡ、ならびに単鎖領域と二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、単鎖またはより典型的には二本鎖もしくは単鎖領域と二本鎖領域の混合物であり得るＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子で構成されたものであり得る。また、該ポリヌクレオチドは、ＲＮＡもしくはＤＮＡまたはＲＮＡとＤＮＡの両方を含む三本鎖領域で構成されたものであり得る。また、ポリヌクレオチドは、安定性のため、または他の理由で、１つ以上の修飾塩基または修飾されたＤＮＡもしくはＲＮＡ主鎖を含有するものであり得る。「修飾」塩基としては、例えば、トリチル化塩基および非通常塩基（例えば、イノシンなど）が挙げられる。さまざまな修飾がＤＮＡおよびＲＮＡに対して行なわれ得る。したがって、「ポリヌクレオチド」には、化学的、酵素的または代謝的に修飾された形態が包含される。
【００７２】
用語「核酸」は、任意の１つ以上の核酸セグメント、例えば、ポリヌクレオチド内に存在するＤＮＡまたはＲＮＡ断片をいう。「単離された」核酸またはポリヌクレオチドにより、その天然の環境から取り出された核酸分子、ＤＮＡまたはＲＮＡが意図される。例えば、ベクター内に含有された、本発明のＮｇＲポリペプチドまたはポリペプチド断片をコードする組換えポリヌクレオチドは、本発明の目的のために単離されているとみなす。単離されたポリヌクレオチドのさらなる例としては、異種宿主細胞内に維持された組換えポリヌクレオチド、または溶液中の（一部もしくは実質的に）精製されたポリヌクレオチドが挙げられる。単離されたＲＮＡ分子には、本発明のポリヌクレオチドのインビボまたはインビトロＲＮＡ転写物が含まれる。本発明による単離されたポリヌクレオチドまたは核酸には、さらに、合成により作製されるかかる分子が含まれる。また、ポリヌクレオチドまたは核酸は、調節エレメント、例えば、プロモーター、リボソーム結合部位、または転写ターミネーターなどを含むもの、または含まないものであり得る。
【００７３】
本明細書で用いる場合、「コード領域」は、アミノ酸に翻訳されるコドンからなる核酸の一部分である。「終止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡまたはＴＡＡ）は、アミノ酸に翻訳されないがコード領域の一部とみなされ得るが、任意のフランキング配列、例えば、プロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロンなどは、コード領域の一部ではない。２つ以上の本発明のコード領域が、単一のポリヌクレオチド構築物内（例えば、単一のベクター上）、または別々のポリヌクレオチド構築物内（例えば、別々の（異なる）ベクター上）に存在することがあり得る。さらにまた、任意のベクターは、単一のコード領域を含むものであり得るか、または２つ以上のコード領域を含むものであり得、例えば、単一のベクターが、免疫グロブリン重鎖可変領域および免疫グロブリン軽鎖可変領域を別々にコードすることがあり得る。また、本発明のベクター、ポリヌクレオチドまたは核酸は、本発明のＮｇＲポリペプチドまたはポリペプチド断片をコードする核酸に融合された、または融合されていないのいずれかである異種コード領域をコードするものであり得る。異種コード領域としては、限定されないが、特別なエレメントまたはモチーフ、例えば、分泌シグナルペプチドまたは異種機能性ドメインなどが挙げられる。
【００７４】
特定のある実施形態において、該ポリヌクレオチドまたは核酸はＤＮＡである。ＤＮＡの場合、ポリペプチドをコードする核酸を含むポリヌクレオチドは、通常、１つ以上のコード領域と作動可能に結合されたプロモーターおよび／または他の転写もしくは翻訳制御エレメントを含むものであり得る。作動可能な結合は、遺伝子産物（例えば、ポリペプチド）のコード領域が１つ以上の調節配列が、遺伝子産物の発現が調節配列（１つまたは複数）の影響または制御下に置かれるような様式で結合している場合に存在する。２つのＤＮＡ断片（例えば、ポリペプチドコード領域およびこれと結合しているプロモーターなど）は、プロモーター機能の誘導により、所望の遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの転写がもたらされる場合、および２つのＤＮＡ断片間の連結の性質によって、発現調節配列が遺伝子産物の発現を指令する能力が妨げられない、もしくはＤＮＡ鋳型が転写される可能性が妨げられない場合、「作動可能に結合」されている。したがって、プロモーター領域は、該プロモーターがポリペプチドをコードする核酸の転写を行うことができる場合、該核酸と作動可能に結合されていることになる。プロモーターは、所定の細胞内のみでＤＮＡの実質的な転写を指令する細胞特異的プロモーターであり得る。プロモーターの他に、他の転写制御エレメント、例えば、エンハンサー、オペレーター、リプレッサーおよび転写終結シグナルが該ポリヌクレオチドと作動可能に結合され、細胞特異的転写が指令され得る。好適なプロモーターおよび他の転写制御領域は、本明細書に開示されている。
【００７５】
さまざまな転写制御領域が当業者に知られている。これらとしては、限定されないが、脊椎動物細胞内で機能する転写制御領域、例えば限定されないが、サイトメガロウイルス（最初期プロモーター、イントロン−Ａと連結）、シミアンウイルス４０（初期プロモーター）、およびレトロウイルス（ラウス肉腫ウイルスなど）に由来するプロモーターおよびエンハンサーセグメントなどが挙げられる。他の転写制御領域としては、脊椎動物遺伝子に由来するもの（例えば、アクチン、熱ショックタンパク質、ウシ成長ホルモンおよびウサギ  β−グロビン）、ならびに真核生物細胞内で遺伝子発現を制御し得る他の配列などが挙げられる。さならる好適な転写制御領域としては、組織特異的プロモーターおよびエンハンサーならびにリンホカイン誘導型プロモーター（例えば、インターフェロンまたはインターロイキンによって誘導され得るプロモーター）が挙げられる。
【００７６】
同様に、さまざまな翻訳制御エレメントが当業者に知られている。これらとしては、限定されないが、リボソーム結合部位、翻訳開始および終結コドン、ならびにピコルナウイルス由来のエレメント（特に、内部リボソーム侵入部位、またはＩＲＥＳ（ＣＩＴＥ配列とも称される））が挙げられる。
【００７７】
他の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の形態のＲＮＡである。
【００７８】
本発明のポリヌクレオチドおよび核酸コード領域は、分泌またはシグナルペプチドをコードし、かつ本発明のポリヌクレオチドにコードされたポリペプチドの分泌を指令するさらなるコード領域と結合されていることがあり得る。このシグナル仮説によれば、哺乳動物細胞によって分泌されるタンパク質は、シグナルペプチドまたは分泌リーダー配列を有し、これは、粗製小胞体を超えて成長しているタンパク質鎖の輸送が開始されると、成熟タンパク質から切断される。当業者には、脊椎動物細胞によって分泌されるポリペプチドが、一般的に、該ポリペプチドのＮ末端に融合されたシグナルペプチドを有し、これは、完全なまたは「完全長」ポリペプチドから切断され、該ポリペプチドの分泌形態または「成熟」形態が生成されることは認識されよう。特定のある実施形態では、天然のシグナルペプチド（例えば、免疫グロブリン重鎖または軽鎖シグナルペプチド）、またはそれと作動可能に結合され、該ポリペプチドの分泌を指令する能力を保持している配列の機能性誘導体が使用される。あるいはまた、異種哺乳動物のシグナルペプチドまたはその機能性誘導体が使用され得る。例えば、野生型リーダー配列は、ヒト組織プラスミノゲン活性化因子（ＴＰＡ）またはマウスβ−グルクロニダーゼのリーダー配列と置換され得る。
【００７９】
本明細書で用いる場合、用語「操作された」には、合成手段（例えば、組換え手法、インビトロペプチド合成、ペプチドの酵素的もしくは化学的カップリングまたはこれらの手法のいくつかの組合せ）による核酸またはポリペプチド分子の操作が含まれる。
【００８０】
本明細書で用いる場合、用語「結合された」、「融合された」および「融合」は互換的に用いる。これらの用語は、どのような手段であれ（例えば、化学的結合体化または組換え手段）、２つ以上の（ｔｗｏ  ｍｏｒｅ）要素または成分が互いに連結されていることをいう。「インフレーム融合」は、２つ以上のポリヌクレオチドオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が、元のＯＲＦの正しい翻訳リーディングフレームが維持される様式で連結されて、より長い連続的なＯＲＦが形成されていることをいう。したがって、組換え融合タンパク質は、元のＯＲＦにコードされたポリペプチドに対応する２つ以上の（ｔｗｏ  ｏｒｅ  ｍｏｒｅ）セグメント（該セグメントは、通常、自然界ではこのように連結されていない）を含む単一のタンパク質である。したがって、リーディングフレームは融合セグメント全体において連続的となるが、該セグメントは、例えばインフレームリンカー配列によって、物理的または空間的に分断されていてもよい。
【００８１】
「リンカー」配列は、融合タンパク質内の２つのポリペプチドコード領域を分断する一連の１つ以上のアミノ酸である。典型的なリンカーは少なくとも５個のアミノ酸を含む。さらなるリンカーは、少なくとも１０または少なくとも１５個のアミノ酸を含むものである。特定のある実施形態において、ペプチドリンカーのアミノ酸は、該リンカーが親水性となるように選択される。リンカー（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）３（Ｇ４Ｓ）３（配列番号６５）は、充分な柔軟性をもたらすため、好ましいリンカーであり、多くの抗体に広く適用可能である。他のリンカーとしては、
【００８２】
【化１】
2014221076.tif 000002
が挙げられる。より短いリンカーの例としては、上記のリンカーの断片が挙げられ、より長いリンカーの例としては、上記のリンカーの組合せ、上記のリンカーの断片の組合せ、および上記のリンカーと上記のリンカーの断片との組合せが挙げられる。
【００８３】
ポリペプチドとの関連において、「線形配列」または「配列」は、アミノ末端からカルボキシル末端の方向におけるポリペプチド内のアミノ酸の順序であり、ここで、該配列内で互いに隣接する残基は、そのポリペプチドの一次構造において連続している。
【００８４】
用語「発現」は、本明細書で用いる場合、遺伝子により生化学物質、例えば、ＲＮＡまたはポリペプチドがもたらされるプロセスをいう。該プロセスとしては、細胞内の遺伝子の機能的存在の任意の顕現、例えば、限定されないが、遺伝子ノックダウンならびに一過性発現と安定な発現の両方などが挙げられる。これには、限定されないが、遺伝子が、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、スモールヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）または任意の他のＲＮＡ産物に転写されること、およびかかるｍＲＮＡがポリペプチド（１種類または複数種）に翻訳されること、ならびに転写または翻訳のいずれかが調節される任意のプロセスが含まれる。所望の最終産物が生化学物質である場合、発現には、該生化学物質および任意の前駆物質の作出が含まれる。遺伝子の発現により「遺伝子産物」がもたらされる。本明細書で用いる場合、遺伝子産物は、核酸（例えば、遺伝子の転写によってもたらされるメッセンジャーＲＮＡ）、または転写物から翻訳されるポリペプチドのいずれかであり得る。本明細書に記載の遺伝子産物には、さらに、転写後修飾（例えば、ポリアデニル化）を有する核酸、または翻訳後修飾（例えば、メチル化、グリコシル化、脂質の付加、他のタンパク質サブユニットとの会合、タンパク質分解的切断）を有するポリペプチドなどが包含される。
【００８５】
用語「ＲＮＡ干渉」または「ＲＮＡｉ」は、ｓｉＲＮＡによる遺伝子発現のサイレンシングまたは減少をいう。これは、動物および植物における配列特異的な転写後遺伝子サイレンシングのプロセスであり、その二本鎖領域においてサイレンシングされた遺伝子の配列に相同なｓｉＲＮＡによって開始される。該遺伝子は、その生物体に対して内因性および外因性であり得、染色体内に組み込まれたものであり得るか、またはゲノム内に組み込まれていないトランスフェクションベクター内に存在させ得る。遺伝子の発現は、完全に阻害されるか、または一部阻害されるかのいずれかである。ＲＮＡｉはまた、標的ＲＮＡの機能を阻害すると考えられ得、標的ＲＮＡの機能は完全または一部であり得る。
【００８６】
本明細書で用いる場合、用語「処置する」または「処置」は、治療的処置および予防的（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ／ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）手段の両方をいい、ここで、その目的は、望ましくない生理学的変化または障害（例えば、多発性硬化症の進行など）を妨げるか、または遅滞（低減）させることである。有益な、または所望の臨床的成果としては、限定されないが、症状の軽減、疾患の程度の減弱、疾患の安定化された（すなわち、悪化しない）状態、疾患進行の遅滞または遅延、疾患状態の改善または待期、および寛解（一部または完全のいずれも）（検出可能なもの、または検出可能でないものいずれも）が挙げられる。「処置」はまた、処置を受けなかった場合に予測される生存と比べたときの生存の延長を意味し得る。処置を必要とする対象としては、既に該状態または障害を有する対象、ならびに該状態または障害を有する傾向にある対象、または該状態または障害が予防されるべき対象が挙げられる。
【００８７】
「被験体」または「個体」または「動物」または「患者」または「哺乳動物」により、診断、予後または治療が所望される任意の被験体、特に哺乳動物被験体が意図される。哺乳動物被験体としては、限定されないが、ヒト、家畜、飼養動物、動物園の動物、競技用動物、愛玩動物（例えば、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、畜牛、ウシなど）；霊長類（例えば、類人猿、サル、オランウータンおよびチンパンジーなど）；イヌ科（例えば、イヌおよびオオカミなど）；ネコ科（例えば、ネコ、ライオンおよびトラなど）；ウマ科（例えば、ウマ、ロバおよびシマウマなど）；食用動物（例えば、ウシ、ブタおよびヒツジなど）；有蹄動物（例えば、シカおよびキリンなど）；齧歯類（例えば、マウス、ラット、ハムスターおよびモルモットなど）；などが挙げられる。特定のある実施形態において、哺乳動物はヒト被験体である。
【００８８】
本明細書で用いる場合、「治療有効量」は、投薬量において必要な期間、所望の治療成果が達成されるのに有効な量をいう。治療成果は、例えば、症状の軽減、生存の延長、運動性の改善などであり得る。治療成果は「治癒」である必要はない。
【００８９】
本明細書で用いる場合、「予防有効量」は、投薬量において必要な期間、所望の予防成果が達成されるのに有効な量をいう。典型的には、予防用量は、被験体において疾患前または疾患病期の早期に使用されるため、予防有効量は治療有効量より少ない。
【００９０】
本発明は、ニューロンの生存、神経突起伸長およびニューロン（例えば、ＣＮＳのニューロン）の軸索の再生を促進させるある種のＮｇＲ１アンタゴニストに関する。例えば、本発明は、ＮｇＲ１ポリペプチドならびにそのポリペプチド断片、抗体および断片、ならびに軸索の成長が通常阻害される条件下で軸索の成長を刺激するポリヌクレオチドを提供する。したがって、本発明のＮｇＲ１アンタゴニストは、ニューロンの生存を促進させることにより、またはＣＮＳにおける軸索の成長もしくは再生の刺激によって軽減され得る損傷、疾患または障害の処置に有用である。
【００９１】
例示的なＣＮＳの疾患、障害または損傷としては、限定されないが、多発性硬化症（ＭＳ）、進行性多病巣性白質脳障害（ＰＭＬ）、脳脊髄炎（ＥＰＬ）、橋中央ミエリン溶解（ＣＰＭ）、副腎脳白質ジストロフィ、アレグザンダー病、ペリツェーウス‐メルツバッヒャー病（ＰＭＺ）、球様細胞白質萎縮症（クラッベ病）およびウォーラー変性、視神経炎、横断脊髄炎、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハンティングトン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、脊髄損傷、外傷性脳損傷、放射線療法後損傷、化学療法の神経病の合併症、脳卒中、急性虚血性視神経障害、ビタミンＥ欠乏症、孤立性ビタミンＥ欠乏症候群、ＡＲ、バッセン‐コルンツヴァイク症候群、マルキアファーヴァ‐ビニャーミ症候群、異染性白質萎縮症、三叉神経痛、ならびにベル麻痺が挙げられる。これらの疾患のうち、ＭＳは最も広範に見られ、世界中でほぼ２５０万人が罹患している。
Ｎｏｇｏレセプター１ポリペプチド
一態様において、本発明は、免疫原性であるＮｏｇｏレセプター−１ポリペプチドに関する。本発明の一部のある実施形態において、該免疫原性ポリペプチドは、本質的に、ＬＤＬＳＤＮＡＱＬＲＶＶＤＰＴＴ（ラット）（配列番号１）；ＬＤＬＳＤＮＡＱＬＲＳＶＤＰＡＴ（ヒト）（配列番号２）；ＡＶＡＳＧＰＦＲＰＦＱＴＮＱＬＴＤＥＥＬＬＧＬＰＫＣＣＱＰＤＡＡＤＫＡ（ラット）（配列番号３）；ＡＶＡＴＧＰＹＨＰＩＷＴＧＲＡＴＤＥＥＰＬＧＬＰＫＣＣＱＰＤＡＡＤＫＡ（ヒト）（配列番号４）；およびＣＲＬＧＱＡＧＳＧＡ（マウス）（配列番号５）からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる。
【００９２】
一部のある実施形態において、本発明は、Ｎｏｇｏレセプター−１に結合するモノクローナル抗体に結合されるＮｏｇｏレセプター１ポリペプチドに関する。一部のある実施形態において、該ポリペプチドは、７Ｅ１１モノクローナル抗体によって認識される。一部のある実施形態において、該ポリペプチドは、ＬＤＬＳＤＮＡＱＬＲ（配列番号２７）；ＬＤＬＳＤＤＡＥＬＲ（配列番号２９）；ＬＤＬＡＳＤＮＡＱＬＲ（配列番号３０）；ＬＤＬＡＳＤＤＡＥＬＲ（配列番号３１）；ＬＤＡＬＳＤＮＡＱＬＲ（配列番号３２）；ＬＤＡＬＳＤＤＡＥＬＲ（配列番号３３）；ＬＤＬＳＳＤＮＡＱＬＲ（配列番号３４）；ＬＤＬＳＳＤＥＡＥＬＲ（配列番号３５）；ＤＮＡＱＬＲＶＶＤＰＴＴ（配列番号３６）；ＤＮＡＱＬＲ（配列番号３７）；ＡＤＬＳＤＮＡＱＬＲＶＶＤＰＴＴ（配列番号４１）；ＬＡＬＳＤＮＡＱＬＲＶＶＤＰＴＴ（配列番号４２）；ＬＤＬＳＤＮＡＡＬＲＶＶＤＰＴＴ（配列番号４３）；ＬＤＬＳＤＮＡＱＬＨＶＶＤＰＴＴ（配列番号４４）；およびＬＤＬＳＤＮＡＱＬＡＶＶＤＰＴＴ（配列番号４６）からなる群より選択される。
【００９３】
一部のある実施形態において、本発明は、配列番号１〜５、２６〜２７、２９〜３７および４１〜４５のポリペプチドをコードする核酸に関する。本発明の一部のある実施形態において、該核酸分子は、発現制御配列（例えば、ｐＣＤＮＡ（Ｉ））に連結されている。
【００９４】
本発明はまた、本発明のポリペプチドをコードする核酸を含むベクターに関する。本発明の一部のある実施形態において、該ベクターは、クローニングベクターである。本発明の一部のある実施形態において、該ベクターは発現ベクターである。本発明の一部のある実施形態では、該ベクターは、少なくとも１種類の選択可能マーカーを含有するものである。
【００９５】
本発明はまた、上記の核酸またはベクターを含む宿主細胞に関する。
【００９６】
本発明はまた、宿主細胞を培養する工程を含む、本発明の免疫原性ポリペプチドの作製方法に関する。一部のある実施形態において、宿主細胞は原核生物のものである。一部のある実施形態では、宿主細胞は真核生物のものである。一部のある実施形態において、宿主細胞は酵母である。
【００９７】
本発明はまた、例えば、神経突起伸長の促進、ニューロンの生存の促進、軸索の生存の促進、またはＮｇＲ１シグナル伝達複合体によるシグナル伝達の阻害のために有用な、ある種のＮｏｇｏレセプター−１ポリペプチドおよびポリペプチド断片に関する。典型的には、本発明のポリペプチドおよびポリペプチド断片は、ニューロンの生存、神経突起伸長または中枢神経系（ＣＮＳ）ニューロンの軸索の再生のＮｇＲ１媒介性阻害をブロックする機能を果たす。
【００９８】
ヒトＮｇＲ１ポリペプチドを以下に配列番号４９として示す。
【００９９】
完全長ヒトＮｇＲ１（配列番号４９）：
【０１００】
【化２】
2014221076.tif 000003
ラットＮｇＲ１ポリペプチドを以下に配列番号５０として示す。
【０１０１】
完全長ラットＮｇＲ１（配列番号５０）：
【０１０２】
【化３】
2014221076.tif 000004
マウスＮｇＲ１ポリペプチドを以下に配列番号５１として示す。
【０１０３】
完全長マウスＮｇＲ１（配列番号５１）：
【０１０４】
【化４】
2014221076.tif 000005
（抗体）
本発明は、さらに、本発明のＮｏｇｏレセプター−１ポリペプチドに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片に関する。一部のある実施形態において、該抗体または抗原結合断片は、本質的に、配列番号１〜５、２６〜２７、２９〜３７および４１〜４５からなる群より選択されるアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合する。本発明の該抗体または抗原結合断片は、インビボまたはインビトロで作製され得る。抗体または抗原結合断片の作製を、以下に論考する。
【０１０５】
本発明の抗体またはその抗原結合断片は、リガンド（例えば、ＮｏｇｏＡ、ＮｏｇｏＢ、ＮｏｇｏＣ、ＭＡＧ、ＯＭ−ｇｐ）へのＮｏｇｏレセプター−１の結合を阻害し、神経突起の伸長および出芽（特に、軸索の成長）のミエリン媒介性阻害を低減させ、ミエリン媒介性成長円錐の虚脱を減衰させる。
【０１０６】
一部のある実施形態において、抗Ｎｏｇｏレセプター−１抗体またはその抗原結合断片は、マウスのものである。一部のある実施形態では、Ｎｏｇｏレセプター−１はラット由来のものである。他の実施形態では、Ｎｏｇｏレセプター−１はヒトのものである。一部のある実施形態において、抗Ｎｏｇｏレセプター−１抗体またはその抗原結合断片は、組換えられた、操作された、ヒト化された、および／またはキメラのものである。
【０１０７】
一部のある実施形態において、該抗体は、モノクローナル７Ｅ１１（ＡＴＣＣ（登録商標）受託番号ＰＴＡ−４５８７）；モノクローナル１Ｈ２（ＡＴＣＣ（登録商標）受託番号ＰＴＡ−４５８４）；モノクローナル２Ｆ７（ＡＴＣＣ（登録商標）受託番号ＰＴＡ−４５８５）；モノクローナル３Ｇ５（ＡＴＣＣ（登録商標）受託番号ＰＴＡ−４５８６）；およびモノクローナル５Ｂ１０（ＡＴＣＣ（登録商標）受託番号ＰＴＡ−４５８８）からなる群より選択される。一部のある実施形態において、該抗体は、ポリクローナル抗体４６である。
【０１０８】
例示的な抗原結合断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｆｄ、ｄＡｂ、および相補性決定領域（ＣＤＲ）断片を含有する断片、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、キメラ抗体、ダイアボディならびにポリペプチドに特異的抗原結合性を付与するのに充分な免疫グロブリンの少なくとも一部分を含む該ポリペプチド（例えば、イムノアドヘシン）である。
【０１０９】
本明細書で用いる場合、Ｆｄは、ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなる断片を意味し、Ｆｖは、抗体の単一のアームのＶＬおよびＶＨドメインからなる断片を意味し、ｄＡｂは、ＶＨドメインからなる断片を意味する（Ｗａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６（１９８９））。本明細書で用いる場合、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）は、ＶＬ領域とＶＨ領域が対合し、これらが単一のタンパク質の鎖となることを可能にする合成リンカーによって一価の分子を形成している抗体を意味する（Ｂｉｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６（１９８８）およびＨｕｓｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３（１９８８））。本明細書で用いる場合、ダイアボディは、ＶＨおよびＶＬドメインが単一のポリペプチド鎖上で発現されるが、同じ鎖上の２つのドメイン間の対合を可能にするには短すぎるリンカーが使用されており、それにより、該ドメインが強制的に別の鎖相補的なドメインと対合され、２つの抗原結合部位が作出された二重特異性抗体を意味する（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８（１９９３）およびＰｏｌｊａｋ、Ｒ．Ｊ．ら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２：１１２１−１１２３（１９９４）を参照のこと）。本明細書で用いる場合、目的の抗原に特異的に結合するイムノアドヘシンは、１つ以上のＣＤＲが共有結合または非共有結合のいずれかにより組み込まれたものであり得る分子を意味する。
【０１１０】
一部のある実施形態において、本発明は、本発明のＮｏｇｏレセプター−１抗体のサブユニットポリペプチドであって、（ａ）重鎖またはその可変領域；および（ｂ）軽鎖またはその可変領域からなる群より選択されるサブユニットポリペプチドを提供する。
【０１１１】
一部のある実施形態において、本発明は、本発明のＮｏｇｏレセプター−１抗体のサブユニットポリペプチドの重鎖もしくはその可変領域、または軽鎖およびその可変領域をコードする核酸を提供する。
【０１１２】
一部のある実施形態において、本発明は、本発明のＮｏｇｏレセプター−１抗体の超可変領域（ＣＤＲ）またはＣＤＲをコードする核酸を提供する。
【０１１３】
（免疫処置）
本発明の抗体は、適当な宿主（例えば、脊椎動物、例えば、ヒト、マウス  、ラット、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマ、爬虫類、魚類、両生類、ならびに鳥類、爬虫類および魚類の卵）の免疫処置によって生成され得る。かかる抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルであり得る。
【０１１４】
一部のある実施形態において、宿主は、本発明の免疫原性Ｎｏｇｏレセプター−１ポリペプチドで免疫処置される。他の実施形態では、宿主は、完全な細胞または破砕細胞の細胞膜と会合したＮｏｇｏレセプター−１で免疫処置され、本発明の抗体は、本発明のＮｏｇｏレセプター−１ポリペプチドへの結合によって同定される。
【０１１５】
一部のある実施形態において、Ｎｏｇｏレセプター−１抗原は、免疫応答を刺激するためにアジュバントとともに投与される。アジュバントは、多くの場合、抗原への免疫応答を惹起するために抗原に加えて投与する必要がある。このようなアジュバントは、通常、非特異的炎症を促進させて免疫処置の部位に単核食細胞を漸増させる不溶性または非分解性の物質である。アジュバントの例としては、限定されないが、フロイントアジュバント、ＲＩＢＩ（ムラミルジペプチド）、ＩＳＣＯＭ（免疫賦活複合体）またはその断片が挙げられる。
【０１１６】
抗体の作製方法の概説については、例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８８）；Ｙｅｌｔｏｎ，Ｄ．Ｅ．ら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．５０：６５７−８０．（１９８１）；ならびにＡｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ）（１９８９）を参照のこと。本発明の免疫原性Ｎｏｇｏレセプター−１ポリペプチドとの免疫反応性の測定は、当該技術分野でよく知られた任意のいくつかの方法、例えば、イムノブロットアッセイおよびＥＬＩＳＡによって行われる。
【０１１７】
（抗体の作製および抗体産生細胞株）
本発明のモノクローナル抗体は、例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８８）（上掲）に記載のような標準的な手順によって作製され得る。
【０１１８】
簡単には、適切な期間で動物を致死させ、リンパ節および／または脾臓Ｂ細胞を、当該技術分野でよく知られたいくつかの手法の任意の１つ、例えば限定されないが、ＥＢＶなどでの形質転換または骨髄腫細胞などの不死化細胞株との融合によって不死化させる。その後、該細胞をクローン毎に分離し、各クローンの上清みを、本発明の免疫原性Ｎｏｇｏレセプター−１ポリペプチドに特異的な抗体の産生について試験する。ハイブリドーマの選択、クローニングおよび拡大培養の方法は、当該技術分野でよく知られている。同様に、免疫グロブリン遺伝子のヌクレオチドおよびアミノ酸配列の同定の方法も、当該技術分野で知られている。
【０１１９】
本発明の抗体を作製するための他の適当な手法は、Ｎｏｇｏレセプター−１または本発明の免疫原性ポリペプチドに対するリンパ球のインビトロ曝露、あるいはまた、ファージまたは同様のベクターにおける抗体ライブラリーの選択を伴う。Ｈｕｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４６：１２７５−８１（１９８９）を参照のこと。本発明に有用な抗体は、修飾を伴って、またはなしで使用され得る。
【０１２０】
抗原（この場合、本発明のＮｏｇｏレセプター−１または免疫原性ポリペプチド）および抗体は、検出可能なシグナルをもたらす物質に、共有結合または非共有結合のいずれかによって連結することにより標識され得る。種々の標識および結合体化手法が当該技術分野で知られており、本発明の実施に使用され得る。好適な標識としては、限定されないが、放射性ヌクレオチド、酵素、基質、補因子、インヒビター、蛍光因子、化学発光因子、磁気粒子などが挙げられる。かかる標識の使用を教示する特許としては、米国特許第３，８１７，８３７号；同第３，８５０，７５２号；同第３，９３９，３５０号；同第３，９９６，３４５号；同第４，２７７，４３７号；同第４，２７５，１４９号および同第４，３６６，２４１号が挙げられる。また、組換え免疫グロブリンが作製され得る（米国特許第４，８１６，５６７号参照）。
【０１２１】
本発明の一部のある実施形態において、抗体は多重結合特異性を有するものであり、二機能性抗体などは、当業者に知られたいくつかの手法（ハイブリッドハイブリドーマの作製、ジスルフィド交換、化学的架橋、２つのモノクローナル抗体間へのペプチドリンカーの付加、特定の細胞株内への２組の免疫グロブリン重鎖および軽鎖の導入など（より詳細な論考については下記参照））の任意の１つによって調製される。
【０１２２】
本発明の抗体はまた、ヒトモノクローナル抗体、例えば、不死化ヒト細胞、ＳＣＩＤ−ｈｕマウスまたは「ヒト」抗体を産生し得る他の非ヒト動物によって産生されるものであり得る。
【０１２３】
（ファージディスプレイライブラリー）
本発明の抗Ｎｏｇｏレセプター−１抗体は、組換えコンビナトリアル抗体ライブラリーをスクリーニングすることにより単離され得る。例示的なコンビナトリアルライブラリーは、本発明の免疫原性Ｎｏｇｏレセプター−１ポリペプチドに対する結合に関するものである（例えば、ｓｃＦｖファージディスプレイライブラリーなど、本発明の免疫原性Ｎｏｇｏレセプター−１ポリペプチドで免疫処置した動物由来のｍＲＮＡから調製されるＶＬおよびＶＨのｃＤＮＡを用いて調製される）。かかるライブラリーの調製およびスクリーニングのための方法論は、当該技術分野で知られている。ファージディスプレイライブラリーの作製のための方法および材料には市販のものがある（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ
Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｐｈａｇｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｓｙｓｔｅｍ、カタログ番号２７−９４００−０１；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  ＳｕｒｆＺＡＰＴＭファージディスプレイキット、カタログ番号２４０６１２；およびＭｏｒｐｈｏＳｙｓ製の他のもの）。また、抗体ディスプレイライブラリーの作製およびスクリーニングに使用され得る方法および試薬が他にもある（例えば、Ｌａｄｎｅｒらの米国特許第５，２２３，４０９号；ＫａｎｇらのＰＣＴ公開公報ＷＯ  ９２／１８６１９；ＤｏｗｅｒらのＰＣＴ公開公報ＷＯ  ９１／１７２７１；ＷｉｎｔｅｒらのＰＣＴ公開公報ＷＯ  ９２／２０７９１；ＭａｒｋｌａｎｄらのＰＣＴ公開公報ＷＯ  ９２／１５６７９；ＢｒｅｉｔｌｉｎｇらのＰＣＴ公開公報ＷＯ  ９３／０１２８８；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙらのＰＣＴ公開公報ＷＯ  ９２／０１０４７；ＧａｒｒａｒｄらのＰＣＴ公開公報ＷＯ  ９２／０９６９０；Ｆｕｃｈｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１３７０−１３７２（１９９１）；Ｈａｙら、Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄ．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ３：８１−８５；（１９９２）Ｈｕｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−１２８１（１９８９）；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５４（１９９０）；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら、ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：７２５−７３４（１９９３）；Ｈａｗｋｉｎｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２６：８８９−８９６（１９９２）；Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８（１９９１）；Ｇｒａｍら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：３５７６−３５８０（１９９２）；Ｇａｒｒａｄら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１３７３−１３７７（１９９１）；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．７Ｐ：４１３３−４１３７（１９９１）；およびＢａｒｂａｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ５５：７９７８−７９８２（１９９１）を参照のこと。
【０１２４】
組換え免疫グロブリンディスプレイライブラリーからの本発明の抗Ｎｏｇｏレセプター−１抗体のスクリーニングおよび単離後、選択した抗体をコードする核酸は、ディスプレイパッケージ（例えば、ファージゲノム）から回収され、他の発現ベクター内に、標準的な組換えＤＮＡ手法によってサブクローニングされ得る。所望の場合には、該核酸は、本発明の他の抗体形態（後述）を作出するために、さらに操作され得る。コンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることにより単離された抗体を発現させるため、抗体の重鎖および軽鎖またはその可変領域をコードするＤＮＡを、組換え発現ベクター内にクローニングし、上記のような哺乳動物宿主細胞内に導入される。
【０１２５】
（クラススイッチング）
本発明の抗Ｎｏｇｏレセプター−１抗体は、任意のアイソタイプのものであり得る。任意の所望のアイソタイプの抗体が、クラススイッチングによって作製され得る。クラススイッチングには、ＶＬまたはＶＨをコードする核酸であって、ＣＬまたはＣＨをコードするヌクレオチド配列をなんら含まない核酸が、当該技術分野でよく知られた方法を用いて単離される。ＶＬまたはＶＨをコードする核酸は、次いで、所望のクラスの免疫グロブリン分子由来のＣＬまたはＣＨをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結される。これは、上記のようなＣＬまたはＣＨ鎖を含むベクターまたは核酸を用いてなされ得る。例えば、元はＩｇＭであった本発明の抗Ｎｏｇｏレセプター−１抗体が、ＩｇＧにクラススイッチングされ得る。さらに、クラススイッチングを用いて、１つのＩｇＧサブクラスが別のものに、例えば、ＩｇＧｌかＩｇＧ２に変換され得る。
【０１２６】
（変異抗体）
他の実施形態において、本発明の抗体または抗原結合断片は、抗体の結合特性を改変するために、重鎖および／または軽鎖の可変ドメインが変異されたものであり得る。例えば、Ｎｏｇｏレセプター−１に対する抗体のＫｄを大きくまたは小さくするため、Ｋｏｆｆを大きくまたは小さくするため、抗体の結合特異性を改変するために、変異は１つ以上のＣＤＲ領域に行われ得る。部位特異的変異誘発の手法は、当該技術分野でよく知られている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）およびＡｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ）（１９８９）を参照のこと。好ましい実施形態において、変異は、本発明の抗Ｎｏｇｏレセプター−１抗体の可変領域内の生殖細胞系と比べて変化されることがわかっている１つのアミノ酸残基において行われる。一部のある実施形態において、変異は、本発明の抗Ｎｏｇｏレセプター−１抗体の可変領域内の生殖細胞系と比べて変化されることがわかっている１つ以上のアミノ酸残基において行われる。別の実施形態において、抗体重鎖または軽鎖可変領域をコードする核酸は、１つ以上のフレームワーク領域において変異される。半減期を増大させるため、変異がフレームワーク領域または定常ドメイン内に行われ得る。フレームワーク領域または定常ドメイン内の変異はまた、抗体の免疫原性を改変するため、別の分子への共有もしくは非共有結合のための部位を提供するため、または補体結合などの特性を改変するために行われ得る。変異は、単一の変異抗体内のフレームワーク領域、定常ドメインおよび可変領域の各々に行われ得る。あるいはまた、変異は、単一の変異抗体内のフレームワーク領域、可変領域または定常ドメインのうちの１つのみに行われ得る。
【０１２７】
（融合抗体およびイムノアドヘシン）
別の実施形態において、別のポリペプチドに連結された本発明の抗Ｎｏｇｏレセプター−１抗体の全部または一部を含む、融合抗体またはイムノアドヘシンが作製され得る。一部のある実施形態では、抗Ｎｏｇｏレセプター−１抗体の可変領域のみが、該ポリペプチドに連結されている。他の実施形態では、本発明の抗Ｎｏｇｏレセプター−１抗体のＶＨドメインが第１のポリペプチドに連結されており、一方、該抗体のＶＬドメインは、ＶＨおよびＶＬドメインが互いに相互作用して抗体結合部位を形成することを可能にする様式で第１のポリペプチドと会合している第２のポリペプチドに連結されている。他の実施形態において、ＶＨドメインはＶＬドメインと、ＶＨおよびＶＬドメインが互いに相互作用することを可能にするリンカーによって分断されている（下記の単鎖抗体を参照のこと）。次いで、ＶＨ−リンカー−ＶＬ抗体を、目的のポリペプチドに連結させる。融合抗体は、ポリペプチドを、Ｎｏｇｏレセプター−１リガンドを発現する細胞または組織に指向させるのに有用である。目的のポリペプチドは、治療用薬剤（毒素など）であり得るか、または診断用薬剤、例えば、容易に可視化され得る酵素（ホースラディッシュペルオキシダーゼなど）であり得る。また、２つ（またはそれ以上）の単鎖抗体が互いに連結された融合抗体が作出され得る。これは、単一のポリペプチド鎖で二価もしくは多価の抗体の作出が望まれる場合、または二重特異性抗体の作出が望まれる場合に有用である。
【０１２８】
（単鎖抗体）
本発明には、本発明のＮｏｇｏレセプター−１ポリペプチドに結合する単鎖抗体（ｓｃＦｖ）が含まれる。ＳｃＦｖを作製するために、ＶＨ−およびＶＬ−コードＤＮＡを、フレキシブルリンカーをコードするＤＮＡに（例えば、アミノ酸配列（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）３（配列番号１０）をコードするＤＮＳに）、ＶＨおよびＶＬ配列が、該ＶＬおよびＶＨ領域がフレキシブルリンカーによって連結された隣接単鎖タンパク質として発現され得るように作動可能に連結させる（例えば、Ｂｉｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６（１９８８）；Ｈｕｓｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８５：５８７９−５８８３（１９８８）；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５４（１９９０）を参照のこと）。単鎖抗体は、単独のＶＨおよびＶＬが使用される場合は一価であり得、２種類のＶＨおよびＶＬが使用される場合は二価であり得、または２種類以上のＶＨおよびＶＬが使用される場合は多価であり得る。
【０１２９】
（キメラ抗体）
本発明には、さらに、一方の特異性が本発明のＮｏｇｏレセプター−１ポリペプチドに対するものである二重特異性抗体またはその抗原結合断片が含まれる。一実施形態において、１つの結合ドメインを介して本発明のＮｏｇｏレセプター−１ポリペプチドに、および第２の結合ドメインを介して第２の分子に特異的に結合するキメラ抗体が作製され得る。キメラ抗体は、組換え分子生物学的手法により作製されたものであり得るか、または互いに物理的に結合体化させたものであり得る。また、１種類より多くのＶＨおよびＶＬを含有し、本発明のポリペプチドと、ミエリン媒介性成長円錐の虚脱の減弱ならびに神経突起の伸長および出芽の阻害と関連する別の分子とに特異的に結合する単鎖抗体が作製され得る。かかる二重特異性抗体は、よく知られた手法（例えば、Ｆａｎｇｅｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ４：７２−８１（１９９４）ならびにＷｒｉｇｈｔおよびＨａｒｒｉｓ（上掲））を用いて作製され得、（ｉｉｉ）に関しては、例えば、Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら  Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ（増補版）７：５１−５２（１９９２）を参照のこと。
【０１３０】
一部のある実施形態において、キメラ抗体は、本発明の抗体由来の１つ以上の可変領域を用いて調製される。別の実施形態では、キメラ抗体は、前記抗体由来の１つ以上のＣＤＲ領域を用いて調製される。
【０１３１】
（誘導体化抗体および標識された抗体）
本発明の抗体または抗原結合断片は、誘導体化されたもの、または別の分子（例えば、別のペプチドまたはタンパク質）に連結されたものであり得る。一般に、該抗体または抗原結合断片は、本発明のポリペプチドへの結合が誘導体化または標識によって悪影響を受けないように誘導体化される。例えば、本発明の抗体または抗体の一部は、１つ以上の他の分子存在体、例えば、別の抗体（例えば、二重特異性抗体もしくはダイアボディ）、検出剤、細胞傷害剤、医薬用薬剤および／または該抗体または抗原結合断片と別の分子（ストレプトアビジンコア領域もしくはポリヒスチジンタグなど）との会合を媒介し得るタンパク質もしくはペプチドなどに、機能的に連結され得る（化学的カップリング、遺伝子融合、非共有結合またはその他）。
【０１３２】
一部のある実施形態において、誘導体化抗体は、２種類以上の抗体（同じ型または異なる型のもの、例えば、二重特異性抗体を作出するため）を架橋することにより作製される。好適な架橋剤としては、ヘテロ二機能性であって、適切なスペーサーによって分断された２つの異なる反応性基を有するもの（例えば、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）、またはホモ二機能性のもの（例えば、ジスクシンイミジルスベレート）が挙げられる。かかるリンカーは、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ、ロックフォード、Ｉｌｌから入手可能である。
【０１３３】
一部のある実施形態において、誘導体化抗体は標識された抗体である。本発明の抗体または抗体の一部が誘導体化され得る例示的な検出剤は、蛍光化合物、例えば、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、５−ジメチルアミン−１−ナフタレンスルホニルクロリド、フィコエリトリン、ランタニドリン光体などである。抗体はまた、検出に有用な酵素、例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼなどで標識されたものであり得る。検出可能な酵素で標識された実施形態において、抗体は、検出可能な反応生成物をもたらすために該酵素によって利用されるさらなる試薬を添加することにより検出される。例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼとともに過酸化水素およびジアミノベンジジン。抗体はまた、ビオチンで標識され、アビジンまたはストレプトアビジン結合の間接的測定により検出され得る。抗体はまた、第２のレポーター（例えば、ロイシンジッパーペア配列、二次抗体の結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）によって認識される所定のポリペプチドエピトープで標識され得る。
【０１３４】
また、抗Ｎｏｇｏレセプター−１抗体またはその抗原−断片は、放射能標識アミノ酸で標識され得る。放射能標識は、診断目的および治療目的の両方に使用され得る。放射能標識された抗Ｎｏｇｏレセプター−１抗体は、例えば、被験体においてＮｏｇｏレセプター−１レベルを測定するために診断的に使用され得る。さらに、放射能標識された抗Ｎｏｇｏレセプター−１抗体は、脊髄損傷を処置するために治療的に使用され得る。ポリペプチド用の標識の例としては、限定されないが、以下：３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉの放射性同位体または放射性ヌクレオチドが挙げられる。
【０１３５】
また、抗Ｎｏｇｏレセプター−１抗体またはその抗原−断片は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、メチルもしくはエチル基、または糖鎖基などの化学基で誘導体化され得る。これらの基は、抗体の生物学的特性を改善するため、例えば、血清半減期を増大させるため、または組織結合を増大させるために有用であり得る。
【０１３６】
（抗Ｎｏｇｏレセプター−１抗体の特徴付け）
（抗Ｎｏｇｏレセプター−１抗体のクラスおよびサブクラス）
抗Ｎｏｇｏレセプター−１抗体のクラスおよびサブクラスは、当該技術分野で知られた任意の方法によって決定され得る。一般に、該抗体のクラスおよびサブクラスは、抗体の特定のクラスおよびサブクラスに特異的な抗体を用いて決定され得る。かかる抗体は市販されている。該クラスおよびサブクラスは、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロットならびに他の手法によって決定され得る。あるいはまた、クラスおよびサブクラスは、該抗体の重鎖および／または軽鎖の定常ドメインの全部または一部を配列決定し、そのアミノ酸配列を免疫グロブリンの種々のクラスおよびサブクラスの既知アミノ酸配列と比較し、該抗体のクラスおよびサブクラスを決定することにより決定され得る。
Ｎｏｇｏレセプター−１に対する抗Ｎｏｇｏレセプター−１抗体の結合親和性
本発明のＮｏｇｏレセプター−１ポリペプチドに対する本発明の抗Ｎｏｇｏレセプター−１抗体の結合親和性および解離速度は、当該技術分野で知られた任意の方法によって測定され得る。例えば、結合親和性は、競合的ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＢＩＡｃｏｒｅまたはＫｉｎＥｘＡ手法によって測定され得る。また、解離速度は、ＢＩＡｃｏｒｅまたはＫｉｎＥｘＡ手法によって測定され得る。結合親和性および解離速度は、表面プラズモン共鳴によって（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅのものを使用）測定される。７Ｅ１１および１Ｈ２のＫｄは、それぞれ、１×１０−７Ｍおよび２×１０−８Ｍであると測定された。
抗Ｎｏｇｏレセプター−１抗体によるＮｏｇｏレセプター−１活性の阻害
一部のある実施形態において、本発明の抗Ｎｏｇｏレセプター−１抗体またはその抗原結合断片は、リガンドへのＮｏｇｏレセプター−１の結合を阻害する。かかる阻害のＩＣ５０は、当該技術分野で知られた任意の方法によって、例えば、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、または機能的拮抗（Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ａｎｔａｇｏｎｉｓｍ）によって測定され得る。一部のある実施形態において、ＩＣ５０は０．１〜５００ｎＭである。一部のある実施形態では、ＩＣ５０は１０〜４００ｎＭである。また他の実施形態において、該抗体またはその一部分は、６０ｎＭ〜４００ｎＭのＩＣ５０を有する。７Ｅ１１および１Ｈ２のＩＣ５０は、それぞれ、結合アッセイにおいて４００ｎＭ〜６０ｎＭであると測定された。表３（下記）も参照のこと。
【０１３７】
一部のある実施形態において、本発明にはまた、ＮｇＲ１活性のアンタゴニストであるＮｇＲ１特異的抗体または抗原結合断片、バリアントもしくは誘導体が含まれる。例えば、ＮｇＲ１へのある種のＮｇＲ１抗体の結合により、ニューロンの生存、神経突起伸長または中枢神経系（ＣＮＳ）ニューロンの軸索の再生のＮｇＲ１媒介性阻害が遮断される。
【０１３８】
他の実施形態において、本発明には、ＮｇＲ１の少なくとも１つのエピトープに特異的または優先的に結合する抗体またはその抗原結合断片、バリアントもしくは誘導体が含まれ、ここで、該エピトープは、配列番号４９の少なくとも約４〜５個のアミノ酸、配列番号４９の少なくとも７、少なくとも９または少なくとも約１５〜約３０個のアミノ酸を含むか、該アミノ酸から本質的になるか、または該アミノ酸からなるものである。上記の配列番号４９の所与のエピトープアミノ酸は、隣接または線形であり得るが、そうである必要はない。特定のある実施形態において、ＮｇＲ１の少なくとも１つのエピトープは、細胞表面上に発現されるか、または例えば、ＩｇＧのＦｃ領域に融合された可溶性断片として発現されるＮｇＲ１の細胞外ドメインによって形成された非線形エピトープを含むか、該エピトープから本質的になるか、または該エピトープからなるものである。したがって、特定のある実施形態において、ＮｇＲ１の少なくとも１つのエピトープは、配列番号４９の少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、約１５〜約３０個、または少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、もしくは１００個の隣接するまたは隣接しないアミノ酸（ここで、隣接しないアミノ酸は、タンパク質フォールディングによりエピトープを構成する）を含むか、該アミノ酸から本質的になるか、または該アミノ酸からなるものである。
【０１３９】
他の実施形態において、本発明には、ＮｇＲ１の少なくとも１つのエピトープに特異的または優先的に結合する抗体またはその抗原結合断片、バリアントもしくは誘導体が含まれ、ここで、該エピトープは、上記の配列番号４９の１、２、３、４、５、６個またはそれ以上の隣接するまたは隣接しないアミノ酸に加えて、該タンパク質を修飾するさらなる部分（例えば、糖質部分を、ＮｇＲ１抗体が、該タンパク質の未修飾異形に結合するよりも高い親和性で修飾標的タンパク質に結合するように含め得る）を含むか、該部分から本質的になるか、または該部分からなるものである。あるいはまた、ＮｇＲ１抗体は、標的タンパク質の未修飾異形には全く結合しないものである。
【０１４０】
特定のある実施形態において、本発明の抗体またはその抗原結合断片、バリアントもしくは誘導体は、上記のＮｇＲ１または断片もしくはバリアントの少なくとも１つのエピトープに特異的に結合する、すなわち、かかるエピトープに対して、無関連またはランダムなエピトープに結合するよりも容易に結合する、上記のＮｇＲ１または断片もしくはバリアントの少なくとも１つのエピトープに優先的に結合する、すなわち、かかるエピトープに対して、関連の類似した同族または類縁のエピトープに結合するよりも容易に結合する；それ自体が上記のＮｇＲ１または断片もしくはバリアントのある特定のエピトープに特異的または優先的に結合する参照抗体の結合を競合的に阻害する；あるいは、上記のＮｇＲ１または断片もしくはバリアントの少なくとも１つのエピトープに、約５×１０−２Ｍ、約１０−２Ｍ、約５×１０−３Ｍ、約１０−３Ｍ、約５×１０−４Ｍ、約１０−４Ｍ、約５×１０−５Ｍ、約１０−５Ｍ、約５×１０−６Ｍ、約１０−６Ｍ、約５×１０−７Ｍ、約１０−７Ｍ、約５×１０−８Ｍ、約１０−８Ｍ、約５×１０−９Ｍ、約１０−９Ｍ、約５×１０−１０Ｍ、約１０−１０Ｍ、約５×１０−１１Ｍ、約１０−１１Ｍ、約５×１０−１２Ｍ、約１０−１２Ｍ、約５×１０−１３Ｍ、約１０−１３Ｍ、約５×１０−１４Ｍ、約１０−１４Ｍ、約５×１０−ｌ５Ｍ、または約１０−１５Ｍ未満の解離定数ＫＤを特徴とする親和性で結合する。特別な一態様において、該抗体またはその断片は、マウスＮｇＲ１ポリペプチドまたはその断片と比べ、ヒトＮｇＲ１ポリペプチドまたはその断片に優先的に結合する。
【０１４１】
抗体結合解離定数との関連で用いる場合、用語「約」は、抗体親和性の測定に用いた方法に固有の変動の程度を許容する。例えば、使用する器具類の制度のレベル、測定対象の試料の数に基づく標準誤差および丸め誤差に応じて、用語「約１０−２Ｍ」は、例えば０．０５Ｍ〜０．００５Ｍを包含し得る。
【０１４２】
具体的なある実施形態において、本発明の抗体またはその抗原結合断片、バリアントもしくは誘導体は、ＮｇＲ１ポリペプチドまたはその断片もしくはバリアントに、５×１０−２秒−１、１０−２秒−１、５×１０−３秒−１または１０−３秒−１以下のオフレート（ｏｆｆ  ｒａｔｅ）（ｋ（ｏｆｆ））で結合する。あるいはまた、本発明の抗体またはその抗原結合断片、バリアントもしくは誘導体は、ＮｇＲ１ポリペプチドまたはその断片もしくはバリアントに、５×１０−４秒−１、１０４秒−１、５×１０−５秒−１または１０−５秒−１  ５×１０−６秒−１、１０−６秒−１、５×１０−７秒−１または１０−７秒−１以下のオフレート（ｋ（ｏｆｆ））で結合する。
【０１４３】
他の実施形態において、本発明の抗体またはその抗原結合断片、バリアントもしくは誘導体は、ＮｇＲ１ポリペプチドまたはその断片もしくはバリアントに、１０３Ｍ−１秒−１、５×１０３Ｍ−１秒−１、１０４Ｍ−１秒−１または５×１０４Ｍ−１秒−１以上のオンレート（ｏｎ  ｒａｔｅ）（ｋ（ｏｎ））で結合する。あるいはまた、本発明の抗体またはその抗原結合断片、バリアントもしくは誘導体は、ＮｇＲ１ポリペプチドまたはその断片もしくはバリアントに、１０５Ｍ−１秒−１、５×１０５Ｍ−１秒−１、１０６Ｍ−１秒−１または５×１０６Ｍ−１秒−１または１０７Ｍ−１秒−１以上のオンレート（ｋ（ｏｎ））で結合する。
【０１４４】
一実施形態において、本発明の方法における使用のためのＮｇＲ１アンタゴニストは、抗体分子またはその免疫特異的断片である。特に記載のない限り、本明細書で用いる場合、抗体に関する「その断片」は、免疫特異的断片、すなわち、抗原特異的断片をいう。一実施形態において、本発明の抗体は、二重特異性結合分子、結合ポリペプチド、または抗体（例えば、二重特異性抗体、ミニボディ、ドメイン欠失抗体）、または１つより多くのエピトープ（例えば、１つより多くの抗原もしくは同じ抗原上の１つより多くのエピトープ）に対する結合特異性を有する融合タンパク質である。一実施形態において、二重特異性抗体は、ＮｇＲ１上の少なくとも１つのエピトープに特異的な少なくとも１つの結合ドメインを有する。二重特異性抗体は、ＮｇＲ１のエピトープに特異的な２つの標的結合ドメインおよび第２の標的に特異的な２つの標的結合ドメインを有する四価抗体であり得る。したがって、四価の二重特異性抗体は、各特異性に対して二価のものであり得る。
【０１４５】
特定のある実施形態において（Ｉｎ  ｃｅｒｔａｉｎ  ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔｓ  ｏｆ）、本発明は、定常領域ドメインの１つ以上の少なくとも一画分が、所望の生化学的特性、例えば、エフェクター機能の低減、非共有結合により二量体化する能力、腫瘍部位に局在する能力の増大、血清半減期の減少、またはほぼ同じ免疫原性の完全体の非改変抗体と比べた場合の血清半減期の増大などがもたらされるように欠失あるいは改変されたＮｇＲ１アンタゴニスト抗体、またはその免疫特異的断片の投与を含む。例えば、本明細書に記載の処置方法における使用のためのある種の抗体は、免疫グロブリン重鎖に類似したポリペプチド鎖を含むが、１つ以上のその重鎖ドメインの少なくとも一部分を欠くドメイン欠失抗体である。例えば、ある種の抗体では、修飾抗体の定常領域の１つのドメイン全体が欠失しており、例えば、ＣＨ２ドメインの全部または一部が欠失している。
【０１４６】
本明細書に記載の治療方法における使用のためのある種のＮｇＲ１アンタゴニスト抗体またはその免疫特異的断片において、Ｆｃ部分が、当該技術分野で知られた手法を用いて、エフェクター機能が改変（例えば、増大、低減またはモジュレート）されるように変異され得る。例えば、定常領域ドメインの（点変異もしくは他の手段による）欠失または不活化により、循環修飾抗体のＦｃレセプター結合が低減され、それにより、腫瘍局在が増大され得る。他の場合では、本発明と整合する該定常領域の修飾により、補体結合がモジュレートされ、したがって、結合体化細胞毒素の血清半減期および非特異的会合が低減され得る。定常領域のまた他の修飾が、抗原特異性または抗体柔軟性の増大による局在の増強を可能にするジスルフィド結合またはオリゴ糖部分の修飾に使用され得る。該修飾で得られる生理学的プロフィール、バイオアベイラビリティおよび他の生化学的効果、例えば、腫瘍局在、生体分布および血清半減期などは、必要以上の実験を行なうことなく、よく知られた免疫学的手法を用いて容易に測定および定量され得る。
【０１４７】
本明細書に開示された診断および治療方法における使用のための抗体またはその免疫特異的断片の修飾形態は、完全体の前駆体または親抗体から当該技術分野で知られた手法を用いて作製され得る。例示的な手法を、本明細書においてより詳細に論考する。
【０１４８】
特定のある実施形態において、本明細書に開示された処置方法における使用のためのＮｇＲ１アンタゴニスト抗体またはその免疫特異的断片の可変領域および定常領域の両方が完全にヒトのものである。完全ヒト抗体は、当該技術分野で知られた手法を用いて、および本明細書に記載のようにして作製され得る。例えば、ある特定の抗原に対する完全ヒト抗体は、該抗原を、抗原刺激に応答してかかる抗体を産生するように変更されているが、その内因性遺伝子座は障害されているトランスジェニック動物に投与することにより作製され得る。かかる抗体を作製するために使用され得る例示的な手法は、米国特許第６，１５０，５８４号；同第６，４５８，５９２号；同第６，４２０，１４０号に記載されている。他の手法が当該技術分野で知られている。完全ヒト抗体は、種々のディスプレイ手法、例えば、本明細書の他の箇所により詳細に記載しているようなファージディスプレイまたは他のウイルスディスプレイ系によって同様に作製され得る。
【０１４９】
本明細書に開示された診断および処置方法における使用のためのＮｇＲ１アンタゴニスト抗体またはその免疫特異的断片は、当該技術分野で知られた手法を用いて作製または製造され得る。特定のある実施形態において、抗体分子またはその断片は、「組換えにより作製」されたもの、すなわち、組換えＤＮＡ手法を用いて作製されたものである。抗体分子またはその断片を作製するための例示的な手法は、本明細書の他の箇所でより詳細に論考している。
【０１５０】
本明細書に開示された処置方法における使用のためのＮｇＲ１アンタゴニスト抗体またはその免疫特異的断片には、例えば、該抗体がその類縁（ｃｏｇｎａｔｅ）エピトープに特異的に結合するのが妨げられないような該抗体への任意の型の分子の共有結合によって修飾された誘導体が含まれる。例えば、なんら限定されないが、抗体誘導体としては、例えば、グリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、既知の保護基／ブロック基による誘導体化、タンパク質分解的切断、細胞リガンドもしくは他のタンパク質への連結などによって修飾された抗体が挙げられる。任意の数多くの化学的修飾が、既知の手法、例えば、限定されないが、特異的化学的切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝的合成などによって行なわれ得る。さらに、該誘導体は１つ以上の非古典的アミノ酸を含むものであり得る。
【０１５１】
好ましい実施形態において、本明細書に開示された処置方法における使用のためのＮｇＲ１アンタゴニスト抗体またはその免疫特異的断片は、処置対象の動物、例えばヒトにおいて有害な免疫応答を惹起しない。一実施形態において、本明細書に開示された処置方法における使用のためのＮｇＲ１アンタゴニスト抗体またはその免疫特異的断片は、当該技術分野で認められた手法を用いて、その免疫原性が低減されるように修飾され得る。例えば、抗体は、ヒト化、霊長類化、脱免疫処置（ｄｅｉｍｍｕｎｉｚｅ）されたものであり得るか、またはキメラ抗体が作製され得る。これらの型の抗体は、親抗体の抗原結合特性を保持または実質的に保持しているが、ヒトにおける免疫原性が低い非ヒト抗体、典型的にはマウスまたは霊長類抗体から誘導される。これは、種々の方法、例えば、（ａ）非ヒト可変ドメイン全体をヒト定常領域にグラフティングしてキメラ抗体を作製すること；（ｂ）非ヒト相補性決定領域（ＣＤＲ）の１つ以上の少なくとも一部を、必須フレームワーク残基を保持している、もしくは保持していないヒトフレームワークおよび定常領域内にグラフティングすること；または（ｃ）非ヒト可変ドメイン全体を移植するが、表面残基の置換によってこれをヒト様部分で「覆う（ｃｌｏａｋ）」ことによって得られ得る。かかる方法は、Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：６８５１−６８５５（１９８４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４４：６５−９２（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６（１９８８）；Ｐａｄｌａｎ、Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．２８：４８９−４９８（１９９１）；Ｐａｄｌａｎ、Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．３１：１６９−２１７（１９９４）、ならびに米国特許第５，５８５，０８９号、同第５，６９３，７６１号、同第５，６９３，７６２号および同第６，１９０，３７０号（これらはすべて、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）に開示されている。
【０１５２】
脱免疫処置はまた、抗体の免疫原性を減少させるために使用され得る。本明細書で用いる場合、用語「脱免疫処置」には、Ｔ細胞エピトープを修飾するための抗体の改変が含まれる（例えば、ＷＯ９８５２９７６Ａ１、ＷＯ００３４３１７Ａ２を参照のこと）。例えば、出発抗体由来のＶＨおよびＶＬ配列を解析し、ヒトＴ細胞エピトープを各Ｖ領域から「マッピング」し、該配列内の相補性決定領域（ＣＤＲ）および他の重要な残基と関連するエピトープの位置を示す。Ｔ細胞エピトープマップの個々のＴ細胞エピトープを、最終の抗体の活性を改変するリスクの少ない選択的アミノ酸置換を同定するために解析する。アミノ酸置換の組合せを含む一連の選択的ＶＨおよびＶＬ配列を設計し、このような配列を、続いて、一連の結合ポリペプチド、例えば、本明細書に開示された診断および処置方法における使用のためのＮｇＲ１アンタゴニスト抗体またはその免疫特異的断片内に組み込み、次いで、機能について試験する。典型的には、１２〜２４種のバリアント抗体を作製し、試験する。次いで、修飾されたＶ領域およびヒトＣ領域を含む完全な重鎖および軽鎖の遺伝子を、発現ベクター内にクローニングし、続いて、そのプラスミドを細胞株内に導入すると、完全体の抗体が産生される。次いで、該抗体を適切な生化学的および生物学的アッセイにおいて比較し、最適なバリアントを同定する。
【０１５３】
本発明における方法のためのＮｇＲ１アンタゴニスト抗体またはその断片は、当該技術分野で知られた任意の適当な方法によって作製され得る。ポリクローナル抗体は、当該技術分野でよく知られた種々の手順によって作製され得る。例えば、ＮｇＲ１免疫特異的断片は、種々の宿主動物、例えば、限定されないが、ウサギ、マウス、ラットなどに投与され、該抗原に特異的なポリクローナル抗体を含有する血清の生成が誘導され得る。宿主の種に応じて、免疫学的応答を増大させるために種々のアジュバントが使用され得、限定されないが、フロイント（完全および不完全）、無機質ゲル（例えば水酸化アルミニウムなど）、表面活性物質（例えば、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオンなど）、ペプチド、油性エマルジョン、スカシガイヘモシアニン、ジニトロフェノール、ならびに潜在的に有用なヒトアジュバント、例えば、ＢＣＧ（ｂａｃｉｌｌｅ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍなどが挙げられる。かかるアジュバントもまた、当該技術分野でよく知られている。
【０１５４】
モノクローナル抗体は、当該技術分野で知られた多種多様な手法を用いて、例えば、ハイブリドーマ、組換え手法およびファージディスプレイ手法、またはその組合せの使用により作製され得る。例えば、モノクローナル抗体はハイブリドーマ手法を用いて作製され得、該手法としては、当該技術分野で知られ、例えば、Ｈａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、第２版（１９８８）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら、ｉｎ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎ．Ｙ．、５６３−６８１（１９８１）（前記参考文献は、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）に教示されたものなどが挙げられる。用語「モノクローナル抗体」は、本明細書で用いる場合、ハイブリドーマ手法により作製された抗体に限定されない。用語「モノクローナル抗体」は、単一のクローン（例えば、任意の真核生物、原核生物またはファージのクローン）に由来する抗体をいい、その作製方法をいうのではない。したがって、用語「モノクローナル抗体」は、ハイブリドーマ手法により作製される抗体に限定されない。モノクローナル抗体は、当該技術分野で知られた多種多様な手法を用いて、例えば、ハイブリドーマおよび組換え手法およびファージディスプレイ手法を用いて作製され得る。
【０１５５】
当該技術分野で認められたプロトコルを用い、一例において、抗体は哺乳動物において、関連する抗原（例えば、精製ＮｇＲ１抗原またはかかる抗原を含む細胞もしくは細胞抽出物）およびアジュバントの多数回の皮下注射または腹腔内注射によって生成させる。この免疫処置により、典型的には、活性化された脾細胞またはリンパ球からの抗原反応性抗体の産生を含む免疫応答が惹起される。生じた抗体を動物の血清から回収してポリクローナル調製物を得てもよいが、多くの場合、リンパ球を脾臓、リンパ節または末梢血から単離し、モノクローナル抗体（ＭＡｂ）の均一な調製物を得るすることが望ましい。好ましくは、リンパ球は脾臓から得る。
【０１５６】
このよく知られた方法（Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５（１９７５））では、抗原が注射された哺乳動物由来の比較的短寿命または致死性のリンパ球を、不死化腫瘍細胞株（例えば、骨髄腫細胞株）と融合させ、したがって、不死化され、かつＢ細胞の遺伝子コード抗体産生能を有するハイブリッド細胞すなわち「ハイブリドーマ」が生成される。得られたハイブリッドは、選択、希釈および再培養（ｒｅｇｒｏｗｔｈ）によって単一の遺伝子系統に分離され、個々の各系統は特定の遺伝子を含み、単一の抗体が形成される。これは、純粋な親遺伝子と関連して所望の抗原に対して均一な抗体を産生し、「モノクローナル」と呼ばれる。
【０１５７】
このようにして作製されたハイブリドーマ細胞を、好ましくは非融合骨髄腫親細胞の増殖または生存を阻害する１種類以上の物質を含有する適当な培養培地に播種し、培養する。当業者には、ハイブリドーマの形成、選択および培養のための試薬、細胞株および培地がいくつかの供給元から市販されており、標準化されたプロトコルが充分確立されていることが認識されよう。一般的に、ハイブリドーマ細胞を培養している培養培地が、所望の抗原に対するモノクローナル抗体の生成についてアッセイされる。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって産生されたモノクローナル抗体の結合特異性は、インビトロアッセイ、例えば、免疫沈降、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）などによって測定される。所望の特異性、親和性および／または活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が同定された後、クローンは、限界希釈手順によりサブクローニングされ、標準的な方法（Ｇｏｄｉｎｇ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、ｐｐ５９−１０３（１９８６））によって培養され得る。サブクローンによって分泌されるモノクローナル抗体は、培養培地、腹水または血清から慣用的な精製手順、例えば、例えば、プロテイン−Ａ、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析またはアフィニティークロマトグラフィーなどによって分離され得ることはさらに認識されよう。
【０１５８】
特異的エピトープを認識する抗体断片は、既知の手法によって作製され得る。例えば、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片は、パパイン（Ｆａｂ断片を作製するため）またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）２断片を作製するため）などの酵素を使用し、免疫グロブリン分子のタンパク質分解的切断によって作製され得る。Ｆ（ａｂ’）２断片は、可変領域、軽鎖の定常領域および重鎖のＣＨ１ドメインを含む。
【０１５９】
当業者にはまた、抗体または抗体断片（例えば、抗原結合部位）をコードするＤＮＡが、抗体ファージライブラリーからも誘導され得ることが認識されよう。特に（Ｉｎ  ａ  ｐａｒｔｉｃｕｌａｒ）、かかるファージを利用し、レパートリーまたはコンビナトリアル抗体ライブラリー（例えば、ヒトもしくはマウス）から発現される抗原結合ドメインをディスプレイさせ得る。目的の抗原に結合する抗原結合ドメインを発現するファージは、抗原を用いて、例えば、標識抗原または固相表面もしくはビーズに結合もしくは捕捉させた抗原を用いて選択または同定され得る。これらの方法に使用されるファージは、典型的には、糸状ファージ、例えば、ファージ遺伝子ＩＩＩまたは遺伝子ＶＩＩＩタンパク質のいずれかに組換えにより融合させたＦａｂ、Ｆｖまたはジスルフィド安定化Ｆｖ抗体ドメインを有するファージから発現されるｆｄおよびＭ１３結合ドメインである。例示的な方法は、例えば、ＥＰ  ３６８  ６８４  Ｂ１；米国特許第５，９６９，１０８号、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ、Ｈ．Ｒ．およびＣｈａｍｅｓ、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  ２１：３７１（２０００）；ＮａｇｙらＮａｔ．Ｍｅｄ．８：８０１（２００２）；Ｈｕｉｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８：２６８２（２００１）；Ｌｕｉら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３１５：１０６３（２００２）（その各々は、引用により本明細書に組み込まれる）に示されている。いくつかの刊行物（例えば、Ｍａｒｋｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７７９−７８３（１９９２））には、大きなファージライブラリーを構築するためのストラテジーとして、鎖シャッフリングによる高親和性ヒト抗体の作製、ならびにコンビナトリアル感染およびインビボ組換えが記載されている。別の実施形態において、リポソームディスプレイが、ディスプレイ基盤としてバクテリオファージの代わりに使用され得る（例えば、Ｈａｎｅｓら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：１２８７（２０００）；Ｗｉｌｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８：３７５０（２００１）；またはＩｒｖｉｎｇら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４８：３１（２００１）を参照のこと）。また別の実施形態において、細胞表面ライブラリーが、抗体についてスクリーニングされ得る（Ｂｏｄｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：１０７０１（２０００）；Ｄａｕｇｈｅｒｔｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４３：２１１（２０００））。かかる手順は、モノクローナル抗体の単離およびその後のクローニングのための従来のハイブリドーマ手法の代替法を提供する。
【０１６０】
ファージディスプレイ法では、機能性抗体ドメインが、これをコードするポリヌクレオチド配列を担持するファージ粒子の表面上にディスプレイされる。特に、ＶＨおよびＶＬ領域をコードするＤＮＡ配列が、動物ｃＤＮＡライブラリー（例えば、リンパ系組織のヒトもしくはマウスｃＤＮＡライブラリー）または合成ｃＤＮＡライブラリーから増幅される。特定のある実施形態において、ＶＨおよびＶＬ領域をコードするＤＮＡを、ＰＣＲによりｓｃＦｖリンカーによって互いに連結し、ファージミドベクター（例えば、ｐ  ＣＡＮＴＡＢ  ６またはｐＣｏｍｂ  ３  ＨＳＳ）内にクローニングする。該ベクターを大腸菌内にエレクトロポレーションし、該大腸菌をヘルパーファージに感染させる。このような方法に使用されるファージは、典型的には、糸状ファージ、例えばｆｄおよびＭ１３であり、ＶＨまたはＶＬ領域は、通常、ファージ遺伝子ＩＩＩまたは遺伝子ＶＩＩＩのいずれかに組換えにより融合される。目的の抗原（すなわち、ＮｇＲ１ポリペプチドまたはその断片）に結合する抗原結合ドメインを発現するファージは、抗原を用いて、例えば、標識抗原または固相表面もしくはビーズに結合もしくは捕捉させた抗原を用いて選択または同定され得る。
【０１６１】
抗体を作製するために使用され得るファージディスプレイ法のさらなる例としては、Ｂｒｉｎｋｍａｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １８２：４１−５０（１９９５）；Ａｍｅｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １８４：１７７−１８６（１９９５）；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：９５２−９５８（１９９４）；Ｐｅｒｓｉｃら、Ｇｅｎｅ  １８７：９−１８（１９９７）；Ｂｕｒｔｏｎら、Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ５７：１９１−２８０（１９９４）；ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＧＢ９１／０１１３４；ＰＣＴ公開公報ＷＯ９０／０２８０９；ＷＯ９１／１０７３７；ＷＯ９２／０１０４７；ＷＯ９２／１８６１９；ＷＯ９３／１１２３６；ＷＯ９５／１５９８２；ＷＯ９５／２０４０１；および米国特許第５，６９８，４２６号；同第５，２２３，４０９号；同第５，４０３，４８４号；同第５，５８０，７１７号；同第５，４２７，９０８号；同第５，７５０，７５３号；同第５，８２１，０４７号；同第５，５７１，６９８号；同第５，４２７，９０８号；同第５，５１６，６３７号；同第５，７８０，２２５号；同第５，６５８，７２７号；同第５，７３３，７４３号および同第５，９６９，１０８号（これらの各々は、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）に開示されたものが挙げられる。
【０１６２】
上記の参考文献に記載されているように、ファージ選択後、ファージ由来の抗体コード領域は、単離され、完全体の抗体（例えば、ヒト抗体）または任意の他の所望の抗原結合断片を作製するために使用され、任意の所望の宿主、例えば、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母および細菌内で発現させ得る。例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２断片を組換えにより作製するための手法もまた、当該技術分野で知られた方法、例えば、ＰＣＴ公開公報ＷＯ９２／２２３２４；Ｍｕｌｌｉｎａｘら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １２（６）：８６４−８６９（１９９２）；およびＳａｗａｉら、ＡＪＲＩ  ３４：２６−３４（１９９５）；およびＢｅｔｔｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０４１−１０４３（１９８８）（前記参考文献は、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）に開示された方法などを用いて採用され得る。
【０１６３】
単鎖のＦｖおよび抗体を作製するために使用され得る手法の例としては、米国特許第４，９４６，７７８号および同第５，２５８，４９８号；Ｈｕｓｔｏｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２０３：４６−８８（１９９１）；Ｓｈｕら、ＰＮＡＳ
９０：７９９５−７９９９（１９９３）；およびＳｋｅｒｒａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０３８−１０４０（１９８８）に記載のものが挙げられる。一部の用途、例えば、ヒトにおける抗体のインビボ使用およびインビトロ検出アッセイでは、キメラ、ヒト化またはヒト抗体を使用することが好ましいことがあり得る。キメラ抗体は、抗体の種々の部分が異なる動物種に由来している分子、例えば、マウスモノクローナル抗体由来の可変領域とヒト免疫グロブリン定常領域とを有する抗体などである。キメラ抗体の作製方法は、当該技術分野で知られている。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２（１９８５）；Ｏｉら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：２１４（１９８６）；Ｇｉｌｌｉｅｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １２５：１９１−２０２（１９８９）；米国特許第５，８０７，７１５号；同第４，８１６，５６７号；および同第４，８１６３９７号（これらは、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照のこと。ヒト化抗体は、非ヒト種由来の１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）およびヒト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域を有する所望の抗原に結合する非ヒト種抗体由来の抗体分子である。多くの場合、ヒトフレームワーク領域内のフレームワーク残基は、抗原結合を改変するため、好ましくは改善するために、ＣＤＲドナー抗体由来の対応する残基で置換される。このようなフレームワーク置換は、当該技術分野でよく知られた方法によって、例えば、ＣＤＲとフレームワーク残基の相互作用のモデル設計により抗原結合に重要なフレームワーク残基を同定すること、および配列比較により特定の位置の非通常フレームワーク残基を同定することにより同定される（例えば、Ｑｕｅｅｎら、米国特許第５，５８５，０８９号；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３（１９８８）（これらは、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照のこと）。抗体は、当該技術分野で知られたさまざまな手法、例えば、ＣＤＲ−グラフティング（ＥＰ  ２３９，４００；ＰＣＴ公開公報ＷＯ９１／０９９６７；米国特許第５，２２５，５３９号；同第５，５３０，１０１号および同第５，５８５，０８９号）、ベニア化（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）または再表面処理（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）（ＥＰ  ５９２，１０６；ＥＰ  ５１９，５９６；Ｐａｄｌａｎ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２８（４／５）：４８９−４９８（１９９１）；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ７（６）：８０５−８１４（１９９４）；Ｒｏｇｕｓｋａ．ら、ＰＮＡＳ  ９１：９６９−９７３（１９９４））、ならびに鎖シャッフリング（米国特許第５，５６５，３３２号）を用いてヒト化され得る。
【０１６４】
完全ヒト抗体は、ヒト患者の治療的処置に特に望ましい。ヒト抗体は、当該技術分野で知られたさまざまな方法、例えば、ヒト免疫グロブリン配列由来の抗体ライブラリーを使用する上記のファージディスプレイ法によって作製され得る。米国特許第４，４４４，８８７号および同第４，７１６，１１１号；ならびにＰＣＴ公開公報ＷＯ９８／４６６４５、ＷＯ９８／５０４３３、ＷＯ９８／２４８９３、ＷＯ９８／１６６５４、ＷＯ９６／３４０９６、ＷＯ９６／３３７３５およびＷＯ９１／１０７４１（これらの各々は、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）もまた参照のこと。
【０１６５】
ヒト抗体はまた、機能性内因性免疫グロブリンを発現する能力を持たないが、ヒト免疫グロブリン遺伝子は発現することができるトランスジェニックマウスを用いて作製され得る。例えば、ヒト重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子複合体が、マウス胚性幹細胞内に無作為に、または相同組換えによって導入され得る。あるいはまた、ヒト可変領域、定常領域および多様な領域が、ヒト重鎖および軽鎖遺伝子に加えてマウス胚性幹細胞内に導入され得る。マウスの重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子は、相同組換えによるヒト免疫グロブリン遺伝子座の導入とは独立して、または同時に非機能性とされ得る。特に、ＪＨ領域のホモ接合性欠失により、内因性抗体産生が抑制される。修飾された胚性幹細胞を拡大培養し、胚盤胞内にマイクロインジェクションしてキメラマウスを作製する。次いで、キメラマウスを交配してヒト抗体を発現するホモ接合性子孫を作製する。トランスジェニックマウスを通常の様式で、選択した抗原、例えば、所望の標的ポリペプチドの全部または一部分を用いて免疫処置する。該抗原に対して指向されるモノクローナル抗体は、免疫処置したトランスジェニックマウスから、慣用的なハイブリドーマ手法を用いて得られ得る。トランスジェニックマウスが保有するヒト免疫グロブリン導入遺伝子は、Ｂ細胞分化中に再配列され、続いて、クラススイッチングおよび体細胞変異を受ける。したがって、かかる手法を用い、治療上有用なＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭおよびＩｇＥ抗体を作製することが可能である。ヒト抗体を作製するためのこの手法の概説については、ＬｏｎｂｅｒｇおよびＨｕｓｚａｒ，  Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３（１９９５）を参照のこと。ヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体を作製するためのこの手法ならびにかかる抗体を作製するためのプロトコルの詳細な論考については、例えば、ＰＣＴ公開公報ＷＯ９８／２４８９３；ＷＯ９６／３４０９６；ＷＯ９６／３３７３５；米国特許第５，４１３，９２３号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；同第５，５６９，８２５号；同第５，６６１，０１６号；同第５，５４５，８０６号；同第５，８１４，３１８号；および同第５，９３９，５９８号（これらは、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照のこと。また、Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．（Ｆｒｅｅｍｏｎｔ、Ｃａｌｉｆ．）およびＧｅｎＰｈａｒｍ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、Ｃａｌｉｆ．）などの企業は、上記のものと類似した手法を用い、選択した抗原に対して指向されるヒト抗体の提供に従事することがあり得る。
【０１６６】
選択したエピトープを認識する完全ヒト抗体は、「誘導（ｇｕｉｄｅｄ）選択」と呼ばれる手法を用いて作製され得る。このアプローチでは、選択した非ヒトモノクローナル抗体、例えばマウス抗体を使用し、同じエピトープを認識する完全ヒト抗体の選択が誘導される（Ｊｅｓｐｅｒｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２：８９９−９０３（１９８８））。米国特許第５，５６５，３３２号もまた参照のこと。
【０１６７】
別の実施形態では、所望のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡが、慣用的な手順を用いて（例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合し得るオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより）容易に単離され、配列決定され得る。単離されサブクローニングされたハイブリドーマ細胞は、かかるＤＮＡの好ましい供給源として供される。単離したら、該ＤＮＡは発現ベクター内に配置され得、次いで、これを、他の場合では免疫グロブリンを産生しない原核生物または真核生物の宿主細胞、例えば、大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞または骨髄腫細胞内などにトランスフェクトする。より詳しくは、単離されたＤＮＡ（これは、本明細書に記載のような合成のものであり得る）を用い、Ｎｅｗｍａｎら、米国特許第５，６５８，５７０号（１９９５年１月２５日に出願）（これは、引用により本明細書に組み込まれる）に記載のようにして、抗体の製造のために、定常および可変領域の配列をクローニングし得る。本質的に、これは、選択した細胞からのＲＮＡの抽出、ｃＤＮＡへの変換、およびＩｇ特異的プライマーを用いたＰＣＲによる増幅を必然的に伴う。この目的に好適なプライマーもまた、米国特許第５，６５８，５７０号に記載されている。以下により詳細に論考するように、所望の抗体を発現する形質転換細胞は、臨床用および市販用の免疫グロブリン供給物を提供するために比較的大量に培養され得る。
【０１６８】
具体的な一実施形態において、重鎖および／または軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列を、当該技術分野でよく知られた方法によって、例えば、他の重鎖および軽鎖可変領域の既知アミノ酸配列と比較して配列が超多様性の領域を決定することにより調べ、相補性決定領域（ＣＤＲ）の配列が同定され得る。常套的な組換えＤＮＡ手法を使用し、１つ以上のＣＤＲがフレームワーク領域内に、例えば、非ヒト抗体をヒト化するためにヒトフレームワーク領域内に挿入され得る。フレームワーク領域は、天然に存在するものであっても、コンセンサスフレームワーク領域であってもよく、好ましくは、ヒトフレームワーク領域である（例えば、ヒトフレームワーク領域の一覧についてはＣｈｏｔｈｉａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７８：４５７−４７９（１９９８）を参照のこと）。好ましくは、フレームワーク領域とＣＤＲの組合せによって作製されるポリヌクレオチドは、所望のポリペプチド（例えば、ＮｇＲ１）の少なくとも１つのエピトープに特異的に結合する抗体をコードする。好ましくは、１つ以上のアミノ酸置換がフレームワーク領域内において行われ得、好ましくは、該アミノ酸置換により、該抗体のその抗原に対する結合が改善される。さらに、かかる方法を用いて、鎖内ジスルフィド結合に関与する１つ以上の可変領域システイン残基のアミノ酸置換または欠失を作製し、１つ以上の鎖内ジスルフィド結合を欠く抗体分子が作製され得る。ポリヌクレオチドに対する他の改変は、本発明に包含され、当該技術分野の技量の範囲内である。
【０１６９】
また、「キメラ抗体」の作製のために開発された、適切な抗原特異性のマウス抗体分子由来の遺伝子を適切な生物学的活性のヒト抗体分子由来の遺伝子とともにスプライシングすることによる手法（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：８５１−８５５（１９８４）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：６０４−６０８（１９８４）；Ｔａｋｅｄａら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：４５２−４５４（１９８５））が使用され得る。本明細書で用いる場合、キメラ抗体は、種々の部分が異なる動物種に由来する分子、例えば、マウスモノクローナル抗体に由来する可変領域とヒト免疫グロブリン定常領域を有するもの（例えば、ヒト化抗体など）である。
【０１７０】
あるいはまた、単鎖抗体の作製について記載された手法（米国特許第４，６９４，７７８号；Ｂｉｒｄ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４４２（１９８８）；Ｈｕｓｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３（１９８８）；およびＷａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３４：５４４−５５４（１９８９））を適合させて、単鎖抗体を作製してもよい。単鎖抗体は、Ｆｖ領域の重鎖および軽鎖断片をアミノ酸橋絡を介して連結して単鎖抗体をもたらすことにより形成される。また、大腸菌内での機能性Ｆｖ断片の合成のための手法も使用され得る（Ｓｋｅｒｒａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：１０３８−１０４１（１９８８））。
【０１７１】
ＮｇＲ１アンタゴニスト抗体はまた、内因性免疫グロブリンを産生する能力を持たないトランスジェニック動物（例えば、マウス）において生成されたヒト抗体または実質的にヒト抗体であり得る（例えば、米国特許第６，０７５，１８１号、同第５，９３９，５９８号、同第５，５９１，６６９号および同第５，５８９，３６９号（これらの各々は、引用により本明細書に組み込まれる）を参照のこと）。例えば、キメラおよび生殖細胞系変異型マウスにおける抗体の重鎖連結領域のホモ接合性欠失により、内因性抗体産生の完全な阻害がもたらされることが報告されている。かかる生殖細胞系変異型マウスへのヒト免疫グロブリン遺伝子アレイの導入により、抗原刺激されるとヒト抗体の産生がもたらされる。ＳＣＩＤマウスを用いてヒト抗体を作製する別の好ましい手段は、米国特許第５，８１１，５２４号（これは、引用により本明細書に組み込まれる）に開示されている。このようなヒト抗体と関連する遺伝物質もまた、本明細書に記載のようにして単離および操作され得ることは認識されよう。
【０１７２】
組換え抗体を作製するためのまた別の非常に効率的な手段が、Ｎｅｗｍａｎ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１４５５−１４６０（１９９２）に開示されている。具体的には、この手法により、サル可変ドメインとヒト定常配列を含む霊長類化抗体の生成がもたらされる。この参考文献は、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる。さらに、この手法はまた、同一出願人による米国特許第５，６５８，５７０号、同第５，６９３，７８０号および同第５，７５６，０９６号（これらの各々は、引用により本明細書に組み込まれる）にも記載されている。
【０１７３】
別の実施形態では、リンパ球を顕微操作によって選択し、種々の遺伝子を単離し得る。例えば、免疫処置した哺乳動物から末梢血単核細胞を単離し、約７日間インビトロで培養し得る。培養物は、スクリーニング基準を満たす特異的ＩｇＧについてスクリーニングされ得る。陽性ウェルの細胞が単離され得る。個々のＩｇ産生Ｂ細胞は、ＦＡＣＳによって、または該細胞を補体媒介型溶血斑形成法において同定することにより単離され得る。Ｉｇ産生Ｂ細胞はチューブ内で顕微操作され得、ＶＨおよびＶＬ遺伝子は、例えばＲＴ−ＰＣＲを用いて増幅され得る。ＶＨおよびＶＬ遺伝子は、抗体発現ベクター内にクローニングされ、発現のために細胞（例えば、真核生物または原核生物の細胞）内にトランスフェクトされ得る。
【０１７４】
あるいはまた、抗体産生細胞株は、当業者によく知られた手法を用いて選択および培養され得る。かかる手法は、さまざまな実験マニュアルおよび主要な刊行物に記載されている。これとの関連において、後述の本発明における使用に適した手法は、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｃｏｌｉｇａｎら編、Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９１）（これは、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）（増補版を含む）に記載されている。
【０１７５】
本明細書に開示された治療方法における使用のための抗体は、抗体合成のための当該技術分野で知られた任意の方法によって、特に、化学合成または好ましくは本明細書に記載の組換え発現手法によって作製され得る。
【０１７６】
本発明の範囲には、さらに、抗原結合ＤＮＡ配列のあらゆる対立遺伝子、バリアントおよび変異が包含されることはさらに認識されよう。
【０１７７】
よく知られているように、ＲＮＡは、元のハイブリドーマ細胞または他の形質転換細胞から、標準的な手法、例えば、グアニジニウムイソチオシアネート抽出および沈殿の後、遠心分離またはクロマトグラフィーを行なうことなどによって単離され得る。所望の場合は、ｍＲＮＡは全ＲＮＡから標準的な手法によって、例えば、オリゴｄＴセルロース上でのクロマトグラフィーなどによって単離され得る。好適な手法は当該技術分野で熟知されている。
【０１７８】
一実施形態において、該抗体の軽鎖および重鎖をコードするｃＤＮＡは、よく知られた方法に従い、逆転写酵素およびＤＮＡポリメラーゼを用いて同時または別々のいずれかで作製される。ＰＣＲは、コンセンサス定常領域プライマーによって、または公表された重鎖および軽鎖のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列に基づいたより特異的なプライマーによって開始され得る。上記のように、ＰＣＲはまた、該抗体の軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡクローンを単離するために使用され得る。この場合、そのライブラリーが、コンセンサスプライマーまたはより大きな相同プローブ（例えば、マウス定常領域プローブなど）によってスクリーニングされ得る。
【０１７９】
ＤＮＡ、典型的にはプラスミドＤＮＡは、細胞から当該技術分野で知られた手法を用いて単離され、例えば、組換えＤＮＡ手法に関する前述の参考文献に詳細に示された標準的なよく知られた手法に従って制限マッピングされ、配列決定され得る。もちろん、該ＤＮＡは、単離プロセスまたはその後の解析中の任意の時点で本発明に従って合成されたものであってもよい。
【０１８０】
抗体、またはその断片、誘導体もしくは類縁体、例えば、ＮｇＲ１アンタゴニストである抗体の重鎖または軽鎖の組換え発現には、該抗体をコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターの構築が必要とされる。本発明の抗体分子または抗体の重鎖もしくは軽鎖、あるいはその一部分（好ましくは、該重鎖または軽鎖の可変ドメインを含有する）をコードするポリヌクレオチドが得られたら、該抗体分子の産生のためのベクターが、当該技術分野でよく知られた手法を用い、組換えＤＮＡ手法によって作製され得る。したがって、抗体コードヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを発現させることによるタンパク質の調製方法を本明細書に記載する。当業者によく知られた方法を用いて、抗体コード配列ならびに適切な転写および翻訳制御シグナルを含む発現ベクターが構築され得る。このような方法としては、例えば、インビトロ組換えＤＮＡ手法、合成手法およびインビボ遺伝子組換えが挙げられる。したがって、本発明は、本発明の抗体分子、またはその重鎖もしくは軽鎖、または重鎖もしくは軽鎖可変ドメインをコードし、プロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含む複製可能なベクターを提供する。かかるベクターには、該抗体分子の定常領域をコードするヌクレオチド配列が含まれ得（例えば、ＰＣＴ公開公報ＷＯ８６／０５８０７；ＰＣＴ公開公報ＷＯ８９／０１０３６；および米国特許第５，１２２，４６４号を参照のこと）、重鎖または軽鎖全体の発現のために、該抗体の可変ドメインがかかるベクター内にクローニングされ得る。
【０１８１】
該発現ベクターは宿主細胞に、慣用的な手法によって導入され、次いで、トランスフェクト細胞を慣用的な手法によって培養し、本明細書に記載の方法における使用のための抗体を産生させる。したがって、本発明は、本発明の抗体、またはその重鎖もしくは軽鎖をコードし、異種プロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチドを含む宿主細胞を含む。二本鎖抗体の発現のための好ましい実施形態において、重鎖および軽鎖の両方をコードするベクターは、以下に詳述するようにして、免疫グロブリン分子全体の発現のために宿主細胞において共発現され得る。
【０１８２】
さまざまな宿主−発現ベクター系が、本明細書に記載の方法における使用のための抗体分子を発現させるために利用され得る。かかる宿主−発現系とは、目的のコード配列が作製され、続いて精製され得る媒体を表すだけでなく、適切なヌクレオチドコード配列で形質転換またはトランスフェクトされると、本発明の抗体分子をインサイチュで発現する細胞も表す。このようなものとしては、限定されないが、抗体コード配列を含む組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された微生物、例えば細菌など（例えば、大腸菌、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）；抗体コード配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ）；抗体コード配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染させた昆虫細胞系；抗体コード配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）に感染させた、または抗体コード配列を含む組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換された植物細胞系；あるいは哺乳動物細胞のゲノム由来のプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）または哺乳動物のウイルス由来のプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）を含む組換え発現構築物を保有する哺乳動物細胞系（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＬＫ、２９３、３Ｔ３細胞）が挙げられる。好ましくは、大腸菌などの細菌細胞、より好ましくは真核生物の細胞（特に、完全体の組換え抗体分子の発現用）が、組換え抗体分子の発現に使用される。例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）などの哺乳動物細胞を、ヒトサイトメガロウイルス由来の主要中間体初期遺伝子プロモーターエレメントなどのベクターと合わせたものは、抗体の有効な発現系である（Ｆｏｅｃｋｉｎｇら、Ｇｅｎｅ  ４５：１０１（１９８６）；Ｃｏｃｋｅｔｔら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：２（１９９０））。
【０１８３】
細菌系において、いくつかの発現ベクターが、発現される抗体分子の意図される用途に応じて好都合に選択され得る。例えば、抗体分子の医薬組成物の作製のため、大量のかかるタンパク質が産生されるべきである場合、容易に精製される高レベルの融合タンパク質生成物の発現を指令するベクターが望ましいことがあり得る。かかるベクターとしては、限定されないが、大腸菌発現ベクターｐＵＲ２７８（Ｒｕｔｈｅｒら、ＥＭＢＯ  Ｊ．２：１７９１（１９８３））（これは、抗体コード配列が個々にベクター内に、融合タンパク質が産生されるようにｌａｃＺコード領域とインフレームにライゲートされたものであり得る）；ｐＩＮベクター（Ｉｎｏｕｙｅ  ＆  Ｉｎｏｕｙｅ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：３１０１−３１０９（１９８５）；Ｖａｎ  Ｈｅｅｋｅ  ＆  Ｓｃｈｕｓｔｅｒ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４：５５０３−５５０９（１９８９））；などが挙げられる。また、ｐＧＥＸベクターは、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として外来ポリペプチドを発現させるために使用され得る。一般に、かかる融合タンパク質は可溶性であり、マトリックスのグルタチオン−アガロースビーズへの吸着および結合の後、遊離グルタチオンの存在下での溶出によって、溶解細胞から容易に精製され得る。ｐＧＥＸベクターは、クローニングされた標的遺伝子産物がＧＳＴ部分から放出され得るようにトロンビンまたは第Ｘａ因子プロテアーゼ切断部位を含むように設計される。
【０１８４】
昆虫系では、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）が、外来遺伝子を発現させるためのベクターとして典型的に使用される。該ウイルスは、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞内で増殖する。その抗体コード配列は、該ウイルスの非必須領域（例えば、ポリヘドリン遺伝子）内に個々にクローニングされ、ＡｃＮＰＶプロモーター（例えば、ポリヘドリンプロモーター）の制御下に配置される。
【０１８５】
哺乳動物宿主細胞では、いくつかのウイルス系の発現系が利用され得る。アデノウイルスが発現ベクターとして使用される場合、目的の抗体コード配列は、アデノウイルス転写／翻訳制御複合配列、例えば、後期プロモーターおよび三連（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ）リーダー配列にライゲートされ得る。このキメラ遺伝子は、次いで、アデノウイルスゲノム内にインビトロまたはインビボ組換えによって挿入され得る。ウイルスゲノムの非必須領域（例えば、領域Ｅ１またはＥ３）内への挿入により、感染宿主内で生存可能であり、抗体分子を発現する能力をもつ組換えウイルスがもたらされる（例えば、Ｌｏｇａｎ  ＆  Ｓｈｅｎｋ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：３５５−３５９（１９８４）を参照のこと）。また、挿入された抗体コード配列の効率的な翻訳には、特異的開始シグナルも必要とされ得る。このようなシグナルとしては、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列が挙げられる。さらにまた、開始コドンは、挿入配列全体の翻訳を確実にするため、所望のコード配列のリーディングフレームとインフェーズ（ｉｎ  ｐｈａｓｅ）でなければならない。このような外因性翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、天然および合成両方のさまざまな起源のものであり得る。発現の効率は、適切な転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどを含めることによって増強され得る（Ｂｉｔｔｎｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：５１−５４４（１９８７）を参照のこと）。
【０１８６】
また、挿入配列の発現をモジュレートするか、または所望の特定の様式で遺伝子産物を修飾およびプロセッシングする宿主細胞株が選択され得る。タンパク質生成物のかかる修飾（例えば、グリコシル化）およびプロセッシング（例えば、切断）は、該タンパク質の機能に重要であり得る。異なる宿主細胞は、翻訳後プロセッシングならびにタンパク質および遺伝子産物の修飾のための特徴的および特異的な機構を有する。発現される外来タンパク質の正しい修飾およびプロセッシングを確実にするため、適切な細胞株または宿主系が選択され得る。この目的のため、一次転写物の適正なプロセッシング、グリコシル化、および遺伝子産物のリン酸化のための細胞機構を有する真核生物宿主細胞が使用され得る。かかる哺乳動物宿主細胞としては、限定されないが、ＣＨＯ、ＶＥＲＹ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、ＷＩ３８、特に、乳癌細胞株（例えば、ＢＴ４８３、Ｈｓ５７８Ｔ、ＨＴＢ２、ＢＴ２０およびＴ４７Ｄなど）、ならびに正常乳腺細胞株（例えば、ＣＲＬ７０３０およびＨｓ５７８Ｂｓｔなど）が挙げられる。
【０１８７】
長期間で抗収率の組換えタンパク質の産生のためには、安定な発現が好ましい。例えば、抗体分子を安定に発現する細胞株は、操作されたものであり得る。ウイルスの複製起点を含む発現ベクターを用いるのではなく、宿主細胞を、適切な発現制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など）および選択可能なマーカーによって制御され得るＤＮＡで形質転換させ得る。外来ＤＮＡの導入後、操作された細胞を１〜２日間、富化培地中で培養し得、次いで、選択培地に切り替える。組換えプラスミド内の選択可能なマーカーは、選択に対する耐性を付与し、細胞がその染色体内にプラスミドを安定に組み込み、培養されて増殖巣を形成するのを可能にし、次いで、該増殖巣をクローニングおよび拡大培養して細胞株とし得る。この方法は、細胞株を操作して抗体分子を安定に発現させるのに好都合に使用され得る。
【０１８８】
いくつかの選択系、例えば限定されないが、単純疱疹ウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒら、Ｃｅｌｌ  １１：２２３（１９７７））、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ  ＆  Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ４８：２０２（１９９２））が使用され得、アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙら、Ｃｅｌｌ  ２２：８１７  １９８０）遺伝子は、それぞれ、ｔｋ−、ｈｇｐｒｔ−またはａｐｒｔ−細胞において使用され得る。また、代謝拮抗物質耐性が、以下の遺伝子：ｄｈｆｒ、これは、メトトレキサートに対する耐性を付与する（Ｗｉｇｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：３５７（１９８０）；Ｏ’Ｈａｒｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：１５２７（１９８１））；ｇｐｔ、これは、ミコフェノール酸に対する耐性を付与する（Ｍｕｌｌｉｇａｎ  ＆  Ｂｅｒｇ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：２０７２（１９８１））；ｎｅｏ、これは、アミノグリコシドＧ−４１８に対する耐性を付与するＣｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  １２：４８８−５０５；ＷｕおよびＷｕ、Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ３：８７−９５（１９９１）；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３２：５７３−５９６（１９９３）；Ｍｕｌｌｉｇａｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０：９２６−９３２（１９９３）；ならびにＭｏｒｇａｎおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１９１−２１７（１９９３）；ＴＩＢ  ＴＥＣＨ  １１（５）：１５５−２１５（１９９３年５月）；ならびにｈｙｇｒｏ、これは、ハイグロマイシンに対する耐性を付与する（Ｓａｎｔｅｒｒｅら、Ｇｅｎｅ  ３０：１４７（１９８４）の選択の根拠として使用され得る。使用され得る組換えＤＮＡ手法の一般に当該技術分野で知られた方法は、Ａｕｓｕｂｅｌら（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、ＮＹ（１９９３）；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ、Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ（１９９０）；ならびにＤｒａｃｏｐｏｌｉら（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｌｏｃｏｌｓ
ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、ＮＹ（１９９４）の第１２章および第１３章；Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５０：１（１９８１）（これらは、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【０１８９】
抗体分子の発現レベルは、ベクター増幅によって増大され得る（概説については、ＢｅｂｂｉｎｇｔｏｎおよびＨｅｎｔｓｃｈｅｌ、Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｇｅｎｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｌｏｎｅｄ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ＤＮＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、第３巻（１９８７）を参照のこと）。抗体を発現するベクター系内のマーカーが増幅可能な場合、宿主細胞の培養物中に存在する阻害因子のレベルの増大により、マーカー遺伝子のコピー数が増加する。増幅される領域は抗体遺伝子と関連しているため、該抗体の産生もまた増大する（Ｃｒｏｕｓｅら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２５７（１９８３））。
【０１９０】
宿主細胞は、本発明の２つの発現ベクターである重鎖由来ポリペプチドをコードする第１のベクターと軽鎖由来ポリペプチドをコードする第２のベクターでコトランスフェクトされ得る。該２つのベクターは、重鎖および軽鎖ポリペプチドの等しい発現を可能にする同一の選択可能なマーカーを含むものであってもよい。あるいはまた、重鎖および軽鎖両方のポリペプチドをコードする単一のベクターを使用してもよい。かかる状況では、過剰の毒性の遊離重鎖を回避するため、軽鎖は重鎖の前に好都合には配置される（Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ、Ｎａｔｕｒｅ  ３２２：５２（１９８６）；Ｋｏｈｌｅｒ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：２１９７（１９８０））。重鎖および軽鎖のコード配列は、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを構成するものであり得る。
【０１９１】
本発明の抗体分子が組換えにより発現されたら、これは、免疫グロブリン分子の精製のための当該技術分野で知られた任意の方法、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換クロマトグラフィー、特にプロテインＡおよびサイズ排除（ｓｉｚｉｎｇ）カラムクロマトグラフィー後の特異的抗原に対する親和性により）、遠心分離、差示的（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ）可溶性、または任意の他のタンパク質の標準的な精製手法によって精製され得る。あるいはまた、本発明の抗体の親和性を増大させるための好ましい方法は、ＵＳ２００２  ０１２３０５７  Ａ１に開示されている。
【０１９２】
一実施形態において、本発明における方法のための結合分子または抗原結合分子は、１つ以上のドメインが部分的または完全に欠失した合成の定常領域を含む（「ドメイン欠失抗体」）。特定のある実施形態において、適合性の修飾抗体は、ＣＨ２ドメイン全体が除去されたドメイン欠失構築物（ΔＣＨ２構築物）またはバリアントを含む。他の実施形態では、短鎖の連結ペプチドが該欠失ドメインで置換され、可変領域に対して柔軟性および運動の自由度がもたらされたものであり得る。当業者には、かかる構築物は、抗体の異化作用の割合に対するＣＨ２ドメインの調節特性のため、特に好ましいことが認識されよう。
【０１９３】
特定のある実施形態において、本明細書に開示された方法における使用のための修飾抗体はミニボディである。ミニボディは、当該技術分野で報告された方法を用いて作製され得る（例えば、米国特許第５，８３７，８２１号またはＷＯ９４／０９８１７Ａ１を参照のこと）。
【０１９４】
別の実施形態において、本明細書に開示された方法における使用のための修飾抗体は、当該技術分野で知られたＣＨ２ドメイン欠失抗体である。ドメイン欠失構築物は、ＩｇＧ１ヒト定常ドメインをコードするベクター（例えば、Ｂｉｏｇｅｎ  ＩＤＥＣ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ製）（例えば、ＷＯ  ０２／０６０９５５Ａ２およびＷＯ０２／０９６９４８Ａ２を参照のこと）を用いて誘導され得る。この例示的なベクターは、ＣＨ２ドメインが欠失され、ドメイン欠失ＩｇＧ１定常領域を発現する合成ベクターが得られるように操作された。
【０１９５】
一実施形態において、本明細書に開示された処置方法における使用のためのＮｇＲ１アンタゴニスト抗体またはその断片は、数個のアミノ酸の欠失もしくは置換、または単量体サブユニット間の会合が許容される限り１個ですらあるアミノ酸の欠失もしくは置換を有する免疫グロブリン重鎖を含む。例えば、ＣＨ２ドメインの選択した領域において、単一のアミノ酸の変異が、実質的にＦｃ結合を低減し、それにより腫瘍局在を増大させるのに充分であり得る。同様に、モジュレートする対象のエフェクター機能（例えば、相補鎖結合）を制御する１つ以上の定常領域ドメインの当該部分を単純に欠失させることが望ましい場合があり得る。定常領域のかかる部分の欠失により、被験体定常領域ドメインと関連する他の望ましい機能はそのままで、抗体の選択した特性（血清半減期）が改善され得る。さらに、上記において示唆したように、開示した抗体の定常領域は、得られる構築物のプロフィールを向上させる１つ以上のアミノ酸の変異または置換による合成のものであり得る。これに関して、修飾抗体の立体配置および免疫原性のプロフィールを実質的に維持したまま、保存された結合部位（例えば、Ｆｃ結合）によってもたらされる活性を破壊することが可能であり得る。また他の実施形態は、エフェクター機能などの望ましい特性を増強するため、またはより多くの細胞毒素もしくは糖鎖結合をもたらすための、定常領域への１つ以上のアミノ酸の付加を含む。かかる実施形態において、選択した定常領域ドメインに由来する特異的配列を挿入または複製させることが望ましい場合があり得る。
【０１９６】
本発明はまた、ＮｇＲ１ポリペプチドに免疫特異的に結合する抗体またはその断片である本明細書に記載の抗体分子（例えば、ＶＨ領域および／またはＶＬ領域）のバリアント（誘導体を含む）を含む、本質的に該バリアントからなる、またはバリアントからなる抗体の使用を提供する。当業者に知られた標準的な手法、例えば、限定されないが、アミノ酸置換をもたらす部位特異的変異誘発およびＰＣＲ媒介型変異誘発を用いて、変異が、結合分子をコードするヌクレオチド配列に導入され得る。好ましくは、該バリアント（誘導体を含む）は、参照ＶＨ領域、ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、ＶＨＣＤＲ３、ＶＬ領域、ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２またはＶＬＣＤＲ３に対して５０アミノ酸未満の置換、４０アミノ酸未満の置換、３０アミノ酸未満の置換、２５アミノ酸未満の置換、２０アミノ酸未満の置換、１５アミノ酸未満の置換、１０アミノ酸未満の置換、５アミノ酸未満の置換、４アミノ酸未満の置換、３アミノ酸置換、または２アミノ酸未満の置換をコードするものである。「同類アミノ酸置換」は、そのアミノ酸残基が、電荷が同様の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられたものである。電荷が同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野で規定されている。このようなファミリーとしては、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン，システイン）、無極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β−分枝側鎖を有するアミノ酸（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が挙げられる。あるいはまた、変異は、コード配列の全部または一部に沿って無作為に、例えば、飽和突然変異誘発などによって導入され得、得られた変異型は、活性を保持している変異型を同定するために、生物学的活性についてスクリーニングされ得る。
【０１９７】
例えば、フレームワーク領域内のみ、または抗体分子のＣＤＲ領域内のみに変異を導入することが可能である。導入された変異は、サイレントまたは中性のミスセンス変異であり得る、すなわち、抗体の抗原結合能力に対する効果を全くまたはほとんど有しない。このような型の変異は、コドン使用頻度を最適化するため、またはハイブリドーマの抗体産生を改善するために有用であり得る。あるいはまた、非中性のミスセンス変異により、抗体の抗原結合能力が改変され得る。最もサイレントで中性のミスセンス変異の位置は、おそらくフレームワーク領域内であり、一方、最も非中性のミスセンス変異の位置は、おそらくＣＤＲ内であるが、これは絶対要件ではない。当業者であれば、所望の特性（例えば、抗原結合活性の改変がない、または結合活性の改変がない（例えば、抗原結合活性における改善または抗体特異性における変更）など）を有する変異体分子を設計し、試験することができよう。変異誘発後、コードタンパク質を常套的に発現させ得、該コードタンパク質の機能的および／または生物学的活性は、本明細書に記載の手法を用いて、または当該技術分野で知られた手法を常套的に変形することにより測定され得る。
【０１９８】
まとめると、当業者は、本発明の教示が提供されると、本発明の抗体の生物学的特性を改変するため（例えば、所与の抗体分子の安定性または半減期、免疫原性、毒性、親和性または収率を増大または低減させ得る方法）、または特定の適用用途により適したものとし得る任意の他の様式で計変するために使用され得るさまざまな方法が利用可能となろう。
【０１９９】
本発明の抗体を含む組成物およびその使用を以下に記載する。
【０２００】
（可溶性Ｎｏｇｏレセプター１ポリペプチドタンパク質）
完全長のＮｏｇｏレセプター−１は、シグナル配列、Ｎ末端領域（ＮＴ）、８ロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）、ＬＲＲＣＴ領域（８ロイシンリッチリピートのロイシンリッチリピートドメインＣ末端）、Ｃ末端領域（ＣＴ）およびＧＰＩアンカーからなる（図１参照）。
【０２０１】
本明細書で用いるＮｇＲドメインの表示を、以下のとおりに規定する。
【０２０２】
（表１．ＮｇＲドメインの例）
【０２０３】
【表１−１】
2014221076.tif 000006
本発明の一部のある実施形態は、可溶性Ｎｏｇｏレセプター−１ポリペプチドを提供する。本発明の可溶性Ｎｏｇｏレセプター−１ポリペプチドは、ＮＴドメイン；８  ＬＲＲおよびＬＲＲＣＴドメインを含み、シグナル配列および機能性ＧＰＩアンカーを欠く（すなわち、ＧＰＩアンカーがないか、ＧＰＩアンカーが効率的に細胞膜と結合する能力を欠く）。
【０２０４】
一部のある実施形態において、可溶性Ｎｏｇｏレセプター−１ポリペプチドは、異種ＬＲＲを含む。一部のある実施形態において、可溶性Ｎｏｇｏレセプター−１ポリペプチドは、２、３、４、５、６、７または８個の異種ＬＲＲを含む。異種ＬＲＲは、Ｎｏｇｏレセプター−１以外のタンパク質から得られるＬＲＲを意味する。異種ＬＲＲが得られ得る例示的なタンパク質は、ｔｏｌｌ様レセプター（ＴＬＲ１．２）；Ｔ細胞活性化ロイシン反復配列高含有タンパク質；デセオリン（ｄｅｃｅｏｒｉｎ）；ＯＭ−ｇｐ；インスリン様成長因子結合タンパク質酸性不安定性サブユニットスリットおよびロボ（ｒｏｂｏ）；ならびにｔｏｌｌ様レセプター４である。
【０２０５】
一部のある実施形態において、本発明は、３１９アミノ酸の可溶性Ｎｏｇｏレセプター−１ポリペプチド（可溶性Ｎｏｇｏレセプター−１  ３４４、ｓＮｏｇｏＲ１−３４４、またはｓＮｏｇｏＲ３４４）（配列番号６と８の残基２６〜３４４または配列番号８の残基２７〜３４４）を提供する。一部のある実施形態において、本発明は、２８５アミノ酸の可溶性Ｎｏｇｏレセプター−１ポリペプチド（可溶性Ｎｏｇｏレセプター−１  ３１０、ｓＮｏｇｏＲ１−３１０、またはｓＮｏｇｏＲ３１０）（配列番号７と９の残基２６〜３１０または配列番号９の残基２７〜３１０）を提供する。図１を参照のこと。
表１．ヒトおよびラットのＮｏｇｏレセプター−１ポリペプチドの配列
【０２０６】
【表１−２】
2014221076.tif 000007
本発明の一部のある実施形態において、本発明の可溶性Ｎｏｇｏレセプター−１ポリペプチドは、Ｎｏｇｏレセプター−１へのリガンドの結合を阻害し、Ｎｏｇｏレセプター−１リガンドのアンタゴニストとして作用させるために使用される。本発明の一部のある実施形態において、本発明の可溶性Ｎｏｇｏレセプター−１ポリペプチドは、ニューロンにおける神経突起の伸長および出芽（例えば、軸索の成長など）の阻害を減少させるため、およびニューロンにおけるミエリン媒介性成長円錐の虚脱を阻害するために使用される。一部のある実施形態において、ニューロンはＣＮＳのニューロンである。
【０２０７】
ｓＮｏｇｏＲ３１０およびｓＮｏｇｏＲ３４４は、驚くべきことに、Ｎｏｇｏレセプター−１へのＮｏｇｏ  Ａ、ＮｏｇｏＢ、ＮｏｇｏＣ、ＭＡＧおよびＯＭ−ｇｐの結合をブロックする。
【０２０８】
別の実施形態において、本発明は、１、２、３、４、１０または２０個までの個々のアミノ酸置換以外は参照アミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含む６０残基以下の単離されたポリペプチド断片であって、前記参照アミノ酸配列が、（ａ）配列番号４９のアミノ酸ｘ〜３４４、（ｂ）配列番号４９のアミノ酸３０９〜ｙ、および（ｃ）配列番号４９のアミノ酸ｘ〜ｙ（ここで、ｘは３０５〜３２６の任意の整数であり、ｙは３２８〜３５０の任意の整数である）からなる群より選択される、Ｎｏｇｏ−レセプター媒介性神経突起伸長抑制を阻害するポリペプチド断片を提供する。一部のある実施形態において、本発明は、１、２、３、４、１０または２０個までの個々のアミノ酸置換以外は参照アミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含む６０残基以下の単離されたポリペプチド断片であって、前記参照アミノ酸配列が、（ａ）配列番号４９のアミノ酸ｘ’〜３４４、（ｂ）配列番号４９のアミノ酸３０９〜ｙ’、および（ｃ）配列番号４９のアミノ酸ｘ’〜ｙ’（ここで、ｘ’は３００〜３２６の任意の整数であり、ｙ’は３２８〜３６０の任意の整数である）からなる群より選択される、Ｎｏｇｏ−レセプター媒介性神経突起伸長抑制を阻害するポリペプチド断片を提供する。
【０２０９】
「ＮｇＲ１参照アミノ酸配列、」または「参照アミノ酸配列」により、なんらアミノ酸置換の導入がない指定された配列が意図される。当業者には理解されようが、置換がない場合、本発明の「単離されたポリペプチド」は、参照アミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含むものである。
【０２１０】
一部のある実施形態において、本発明は、１、２または３個までの個々のアミノ酸置換以外は参照アミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含む６０残基以下の単離されたポリペプチド断片であって、前記参照アミノ酸配列が、配列番号４９のアミノ酸３０９〜３３５；配列番号４９のアミノ酸３０９〜３４４；配列番号４９のアミノ酸３１０〜３３５；配列番号４９のアミノ酸３１０〜３４４；配列番号４９のアミノ酸３０９〜３５０；配列番号４９のアミノ酸３００〜３４４；および配列番号４９のアミノ酸３１５〜３４４からなる群より選択されるポリペプチド断片を提供する。
【０２１１】
一実施形態において、本発明は、３個までの個々のアミノ酸置換以外は参照アミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含む６０残基以下の単離されたポリペプチド断片であって、前記参照アミノ酸配列が、配列番号４９のアミノ酸３０９〜３４４であるポリペプチド断片を提供する。
【０２１２】
一実施形態において、本発明は、３個までの個々のアミノ酸置換以外は参照アミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含む６０残基以下の単離されたポリペプチド断片であって、前記参照アミノ酸配列が、配列番号４９のアミノ酸３０９〜３３５であるポリペプチド断片を提供する。
【０２１３】
一実施形態において、本発明は、（ａ）参照アミノ酸配列の少なくとも１つのシステイン残基が異なるアミノ酸で置換されている以外は前記参照アミノ酸配列と同一であるアミノ酸配、ここで、前記参照アミノ酸配列は、（ｉ）配列番号４９のアミノ酸ａ〜４４５、（ｉｉ）配列番号４９のアミノ酸２７〜ｂ、および（ｉｉｉ）配列番号４９のアミノ酸ａ〜ｂ（ここで、ａは２５〜３５の任意の整数であり、ｂは３００〜４５０の任意の整数である）からなる群より選択される：および（ｂ）異種ポリペプチドを含む単離されたポリペプチドであって、ｎｏｇｏ−レセプター媒介性神経突起伸長抑制を阻害するポリペプチドを提供する。
【０２１４】
この実施形態によるポリペプチド断片に対する例示的なアミノ酸置換としては、本発明のポリペプチドの個々のシステイン残基の異なるアミノ酸での置換が挙げられる。任意の異なるアミノ酸が、本発明のポリペプチドのシステインの代わりに使用され得る。どの異なるアミノ酸が使用されるかは、いくつかの基準、例えば、該ポリペプチド断片に対するコンホメーションに対する置換の効果、該ポリペプチド断片の電荷、または該ポリペプチド断片の親水性に依存する。本発明のポリペプチドおよび参照アミノ酸配列のアミノ酸に対するアミノ酸置換としては、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、無極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β−分枝側鎖を有するアミノ酸（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が挙げられ得る。参照アミノ酸のシステインの代わりに使用される典型的なアミノ酸としては、アラニン、セリン、トレオニンが挙げられ、特にアラニンである。該ポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドの操作によりかかる置換を行うことは、充分、当業者の常套的な専門知識の範囲内である。
【０２１５】
別の実施形態において、本発明は、少なくとも１つのシステイン残基が異なるアミノ酸で置換されている単離された本発明のポリペプチドを提供する。ヒトＮｇＲ１において置換され得るシステイン残基としては、Ｃ２７、Ｃ３１、Ｃ３３、Ｃ４３、Ｃ８０、Ｃ１４０、Ｃ２６４、Ｃ２６６、Ｃ２８７、Ｃ３０９、Ｃ３３５、Ｃ３３６、Ｃ４１９、Ｃ４２９、Ｃ４５５およびＣ４７３が挙げられる。ラットＮｇＲ１において置換され得るシステイン残基としては、Ｃ２７、Ｃ３１、Ｃ３３、Ｃ８０、Ｃ１４０、Ｃ２６４、Ｃ２６６、Ｃ２８７、Ｃ３０９、Ｃ３３５、Ｃ３３６、Ｃ４１９、Ｃ４２９、Ｃ４５５およびＣ４７３が挙げられる。マウスＮｇＲ１において置換され得るシステイン残基としては、Ｃ２７、Ｃ３１、Ｃ３３、Ｃ４３、Ｃ８０、Ｃ１４０、Ｃ２６４、Ｃ２６６、Ｃ２８７、Ｃ３０９、Ｃ３３５、Ｃ３３６、Ｃ４１９、Ｃ４２９、Ｃ４５５およびＣ４７３が挙げられる。
【０２１６】
本発明は、さらに、４０残基以下の単離されたポリペプチド断片であって、Ｃ３０９が置換されている、Ｃ３３５が置換されている、Ｃ３３６が置換されている、Ｃ３０９およびＣ３３５が置換されている、Ｃ３０９およびＣ３３６が置換されている、Ｃ３３５およびＣ３３６が置換されている、またはＣ３０９、Ｃ３３５、およびＣ３３６が置換されていること以外は配列番号４９のアミノ酸３０９〜３４４と同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド断片を提供する。
【０２１７】
本発明のポリペプチドのシステイン残基は、任意の異種アミノ酸で置換され得る。特定のある実施形態において、該システインは、該ポリペプチドの３次元コンホメーションを最も改変しにくい小さな非荷電アミノ酸、例えば、アラニン、セリン、トレオニン、好ましくはアラニンで置換されている。
【０２１８】
一部のある実施形態において、本発明の可溶性Ｎｏｇｏレセプター−１ポリペプチドは、異種ポリペプチドさらに含む融合タンパク質の一構成成分である。一部のある実施形態において、異種ポリペプチドは免疫グロブリン定常ドメインである。一部のある実施形態において、免疫グロブリン定常ドメインは重鎖定常ドメインである。一部のある実施形態において、異種ポリペプチドはＦｃ断片である。一部のある実施形態において、Ｆｃは、本発明の可溶性Ｎｏｇｏレセプター−１ポリペプチドのＣ末端に連結されている。一部のある実施形態において、融合Ｎｏｇｏレセプター−１タンパク質は二量体である。本発明には、さらに、上記のようなポリペプチド断片のバリアント、類縁体または誘導体が包含される。
【０２１９】
一部のある実施形態において、本発明は、（ａ）２０個までの個々のアミノ酸置換以外は参照アミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列、前記参照アミノ酸配列が、（ｉ）配列番号４９のアミノ酸ａ〜４４５、（ｉｉ）配列番号４９のアミノ酸２７〜ｂ、および（ｉｉｉ）配列番号４９のアミノ酸ａ〜ｂ（ここで、ａは１〜３５の任意の整数であり、ｂは３００〜４５０の任意の整数である）からなる群より選択される；および（ｂ）異種ポリペプチドを含む単離されたポリペプチドであって、ｎｏｇｏ−レセプター媒介性神経突起伸長抑制を阻害するポリペプチドを提供する。一部のある実施形態において、該単離されたポリペプチドは、配列番号４９のアミノ酸１〜３１０であり、Ｒ２６９およびＡ３１０が異なるアミノ酸で置換されている。該ポリペプチドにおいて置換され得る例示的なアミノ酸としては、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、無極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β−分枝側鎖を有するアミノ酸（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が挙げられる。一実施形態において、該異なるアミノ酸はトリプトファンである。
【０２２０】
例示的な可溶性ＮｇＲ−Ｆｃ融合タンパク質はヒトＮｇＲ１（３１９）−Ｆｃであり、これは、配列番号４９のアミノ酸１〜３１９Ｃ末端に連結されたＦｃを含む。
【０２２１】
システイン置換を有する例示的な可溶性ＮｇＲ−Ｆｃ融合タンパク質は、Ａｌａ−Ａｌａ−ヒト（ｈ）ＮｇＲ１（３１０）−Ｆｃ（これは、配列番号５８のアミノ酸配列を有する可溶性ポリペプチドのＣ末端に連結されたＦｃを含む）、Ａｌａ−Ａｌａ−ラット（ｒ）ＮｇＲ１（３１０）−Ｆｃ（これは、配列番号５９のアミノ酸配列を有する可溶性ポリペプチドのＣ末端に連結されたＦｃを含む）、およびＡｌａ−Ａｌａ−ヒト（ｈ）ＮｇＲ１（３４４）−Ｆｃ（これは、配列番号６４のアミノ酸配列を有する可溶性ポリペプチドのＣ末端に連結されたＦｃを含む）である。
【０２２２】
本発明において、ポリペプチドは、ペプチド結合または修飾ペプチド結合、すなわちペプチド同配体によって互いに連結されたアミノ酸で構成されたものであり得、遺伝子にコードされた２０種類のアミノ酸以外のアミノ酸（例えば、天然に存在しないアミノ酸）を含有するものであり得る。本発明のポリペプチドは、天然プロセス（例えば、翻訳後プロセッシングなど）または当該技術分野でよく知られた化学的修飾手法のいずれかによって修飾されたものであり得る。かかる修飾は、基礎的な教科書およびより詳細なモノグラフ、ならびに膨大な研究文献に充分記載されている。修飾は、ポリペプチド内の任意の場所、例えば、ペプチド主鎖、アミノ酸側鎖およびアミノまたはカルボキシル末端に行なわれ得る。所与のポリペプチドにおいて、同じ型の修飾が同じまたは異なる程度でいくつかの部位に存在し得ることは認識されよう。また、所与のポリペプチドは多くの型の修飾を含むものであり得る。ポリペプチドは、例えばユビキチン化の結果として分枝鎖のものであり得、また、分枝を伴う、または伴わない環状のものであり得る。環状で分枝鎖の、および分枝鎖で環状のポリペプチドは、翻訳後天然プロセスから生成したものであり得るか、または合成方法によって作製されたものであり得る。修飾としては、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトール（ｐｈｏｓｐｈｏｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ）の共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合性架橋の形成、システインの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨード化、メチル化、ミリストイル化、酸化、ペグ化、タンパク質分解的プロセッシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、タンパク質へのアミノ酸のトランスファーＲＮＡ媒介型付加、例えばアルギニル化など、ならびにユビキチン化が挙げられる（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ、第２版、Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９３）；Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｖａｌｅｎｔ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、第１〜１２頁（１９８３）；Ｓｅｉｆｔｅｒら、Ｍｅｔｈ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １８２：６２６−６４６（１９９０）；Ｒａｔｔａｎら、Ａｎｎ  ＮＹ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ６６３：４８−６２（１９９２）を参照のこと）。
【０２２３】
本明細書に記載のポリペプチドは環状であり得る。該ポリペプチドの環化により、線状ペプチド立体配座の自由度が低減され、構造的により拘束された分子がもたらされる。多くのペプチド環化方法が当該技術分野で知られている。例えば、ペプチドのＮ末端とＣ末端のアミノ酸残基間のアミド結合の形成による「主鎖対主鎖」環化。「主鎖対主鎖」環化方法としては、２つのα−チオアミノ酸残基（例えば、システイン、ホモシステイン）間のジスルフィド結合の形成が挙げられる。本発明のある種のペプチドは、そのペプチドのＮ−およびＣ−末端上に環状ポリペプチドを形成するための修飾を含むものである。かかる修飾としては、限定されないが、システイン残基、アセチル化システイン残基、ＮＨ２部分を有するシステイン残基およびビオチンが挙げられる。他のペプチド環化方法は、Ｌｉ  ＆  Ｒｏｌｌｅｒ．Ｃｕｒｒ，Ｔｏｐ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３：３２５−３４１（２００２）および米国特許出願公開公報Ｕ．Ｓ．２００５−０２６０６２６  Ａ１（引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【０２２４】
本発明の方法において、本発明のＮｇＲ１ポリペプチドまたはポリペプチド断片は、予め形成されたポリペプチドとして直接、または核酸ベクターにより間接的に投与され得る。本発明の一部のある実施形態において、本発明のＮｇＲ１ポリペプチドまたはポリペプチド断片は、（１）移植可能な宿主細胞を、本発明のＮｇＲ１ポリペプチドまたはポリペプチド断片を発現する核酸（例えば、ベクター）で形質転換またはトランスフェクトすること；および（２）形質転換された宿主細胞を哺乳動物に、その疾患、障害または損傷の部位に移植することを含む処置方法において投与される。例えば、形質転換された宿主細胞は、ＭＳの慢性病変部位に移植され得る。本発明の一部のある実施形態において、移植可能な宿主細胞を哺乳動物から取り出し、一時的に培養し、本発明のＮｇＲ１ポリペプチドまたはポリペプチド断片をコードする単離された核酸で形質転換またはトランスフェクトし、取り出された同じ哺乳動物に移植し戻す。該細胞は、移植されたのと同じ部位から取り出されるのがよいが、そうである必要はない。かかる実施形態は、場合によってはエキソビボ遺伝子療法として知られるものであり、限定的な期間、作用部位に限局的に、本発明のＮｇＲ１ポリペプチドまたはポリペプチド断片の連続供給をもたらし得る。
【０２２５】
本発明を実施するためのさらなる例示的な本発明のＮｇＲポリペプチドならびに、このような分子を得るための方法および材料を以下に記載する。
【０２２６】
（融合タンパク質および結合体化ポリペプチド）
本発明の一部のある実施形態は、完全長ＮｇＲ１タンパク質でないＮｇＲ１ポリペプチドの使用、例えば、異種ポリペプチド部分に融合されて融合タンパク質を形成するＮｇＲ１のポリペプチド断片の使用を伴う。かかる融合タンパク質は、種々の目的、例えば、血清半減期の増大、バイオアベイラビリティの改善、特定の器官または組織型へのインビボ標的化、組換え発現効率の改善、宿主細胞の分泌の改善、容易な精製、およびより高いアビディティを達成するために使用され得る。達成されるべき目的（１つまたは複数）に応じて、異種部分は、不活性または生物学的に活性であり得る。また、これは、本発明のＮｇＲ１ポリペプチド部分に安定に融合されるように、またはインビトロもしくはインビボで切断可能なように選択され得る。これら他の目的を達成するための異種部分は、当該技術分野で知られている。
【０２２７】
本発明の一部のある実施形態において、ＮｇＲ１ポリペプチド断片は、別のＮｇＲポリペプチド断片、例えばＮｇＲ２またはＮｇＲ３ポリペプチド断片にＦｃとともに融合され得る。
【０２２８】
ヒトＮｇＲ２ポリペプチドを以下に配列番号６０として示す。
【０２２９】
完全長ヒトＮｇＲ２（配列番号６０）：
【０２３０】
【化５】
2014221076.tif 000008
マウスＮｇＲ２ポリペプチドを以下に配列番号６１として示す。
【０２３１】
完全長マウスＮｇＲ２（配列番号６１）：
【０２３２】
【化６】
2014221076.tif 000009
ヒトＮｇＲ３ポリペプチドを以下に配列番号６２として示す。
【０２３３】
完全長ヒトＮｇＲ３（配列番号６２）：
【０２３４】
【化７】
2014221076.tif 000010
マウスＮｇＲ３ポリペプチドを以下に配列番号６３として示す。
【０２３５】
完全長マウスＮｇＲ３（配列番号６３）：
【０２３６】
【化８】
2014221076.tif 000011
一部のある実施形態において、本発明は、第１のポリペプチド断片および第２のポリペプチド断片を含む単離されたポリペプチドであって、前記第１のポリペプチド断片は、１、２、３、４、１０または２０個までの個々のアミノ酸置換以外は第１の参照アミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含み、前記第１の参照アミノ酸配列が、（ａ）配列番号４９のアミノ酸ａ〜３０５、（ｂ）配列番号４９のアミノ酸１〜ｂ、および（ｃ）配列番号４９のアミノ酸ａ〜ｂ（ここで、ａは１〜２７の任意の整数であり、ｂは２６４〜３０９の任意の整数である）からなる群より選択され、前記第２のポリペプチド断片は、１、２、３、４、１０または２０個までの個々のアミノ酸置換以外は第２の参照アミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含み、前記第２の参照アミノ酸配列が、（ａ）配列番号６０のアミノ酸ｃ〜３３２、（ｂ）配列番号６０のアミノ酸２７５〜ｄ、および（ｃ）配列番号６０のアミノ酸ｃ〜ｄ，（ここで、ｃは２６５〜３０６の任意の整数であり、ｄは３０８〜３４０の任意の整数である）からなる群より選択される、ｎｏｇｏ−レセプター媒介性神経突起伸長抑制を阻害するポリペプチドを提供する。
【０２３７】
一実施形態において、本発明は、第１のポリペプチド断片および第２のポリペプチド断片を含むを含む単離されたポリペプチドであって、前記第１のポリペプチド断片は、１、２、３、４、１０または２０個までの個々のアミノ酸置換以外は第１の参照アミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含み、前記第１の参照アミノ酸配列が配列番号４９のアミノ酸１〜２７４であり、前記第２のポリペプチド断片は、１、２、３、４、１０または２０個までの個々のアミノ酸置換以外は第２の参照アミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含み、前記第２の参照アミノ酸配列が配列番号６０のアミノ酸２７５〜３１１である、ｎｏｇｏ−レセプター媒介性神経突起伸長抑制を阻害するポリペプチドを提供する。
【０２３８】
一実施形態において、本発明は、第１のポリペプチド断片および第２のポリペプチド断片を含むを含む単離されたポリペプチドであって、前記第１のポリペプチド断片は、１、２、３、４、１０または２０個までの個々のアミノ酸置換以外は第１の参照アミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含み、前記第１の参照アミノ酸配列が配列番号４９のアミノ酸１〜２７４であり、前記第２のポリペプチド断片は、１、２、３、４、１０または２０個までの個々のアミノ酸置換以外は第２の参照アミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含み、前記第２の参照アミノ酸配列が配列番号６０のアミノ酸２７５〜３３２である、ｎｏｇｏ−レセプター媒介性神経突起伸長抑制を阻害するポリペプチドを提供する。
【０２３９】
一実施形態において、本発明は、第１のポリペプチド断片および第２のポリペプチド断片を含むを含む単離されたポリペプチドであって、前記第１のポリペプチド断片は、１、２、３、４、１０または２０個までの個々のアミノ酸置換以外は第１の参照アミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含み、前記第１の参照アミノ酸配列が配列番号４９のアミノ酸１〜３０５であり、前記第２のポリペプチド断片は、１、２、３、４、１０または２０個までの個々のアミノ酸置換以外は第２の参照アミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含み、前記第２の参照アミノ酸配列が配列番号６０のアミノ酸３０６〜３１１である、ｎｏｇｏ−レセプター媒介性神経突起伸長抑制を阻害するポリペプチドを提供する。
【０２４０】
一実施形態において、本発明は、第１のポリペプチド断片および第２のポリペプチド断片を含むを含む単離されたポリペプチドであって、前記第１のポリペプチド断片は、１、２、３、４、１０または２０個までの個々のアミノ酸置換以外は第１の参照アミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含み、前記第１の参照アミノ酸配列が配列番号４９のアミノ酸１〜３０５であり、前記第２のポリペプチド断片は、１、２、３、４、１０または２０個までの個々のアミノ酸置換以外は第２の参照アミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含み、前記第２の参照アミノ酸配列が配列番号６０のアミノ酸３０６〜３０９である、ｎｏｇｏ−レセプター媒介性神経突起伸長抑制を阻害するポリペプチドを提供する。別の実施形態において、少なくとも１つのさらなるアミノ酸は第２のポリペプチド断片のＣ末端に付加されている。該ポリペプチドに付加され得る例示的なアミノ酸としては、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、無極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β−分枝側鎖を有するアミノ酸（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が挙げられる。一実施形態において、付加されたアミノ酸はトリプトファンである。さらなる一実施形態において、配列番号４９の２６９位のアルギニンがトリプトファンで置換されている。
【０２４１】
一実施形態において、本発明は、第１のポリペプチド断片および第２のポリペプチド断片を含む単離されたポリペプチドであって、前記第１のポリペプチド断片が、１、２、３、４、１０または２０個までの個々のアミノ酸置換以外はからなり、配列番号４９のアミノ酸１〜３１０、前記第２のポリペプチド断片が、１，２、３、４または５個までの個々のアミノ酸置換以外は配列番号６０のアミノ酸３１１〜３１８からなる、ｎｏｇｏ−レセプター媒介性神経突起伸長抑制を阻害するポリペプチドを提供する。
【０２４２】
一部のある実施形態において、本発明のポリペプチドは、さらに異種ポリペプチドを含む。一部のある実施形態において、異種ポリペプチドは免疫グロブリン定常ドメインである。一部のある実施形態において、免疫グロブリン定常ドメインは重鎖定常ドメインである。一部のある実施形態において、異種ポリペプチドはＦｃ断片である。一部のある実施形態において、Ｆｃは、本発明のポリペプチドのＣ末端に連結されている。一部のある実施形態において、該融合体は二量体である。本発明には、さらに、上記のようなポリペプチド断片のバリアント、類縁体または誘導体が包含される。
【０２４３】
融合タンパク質の発現に対する択一法として、選択した異種部分を予め形成し、本発明のＮｇＲポリペプチド部分に化学的に結合体化することができる。ほとんどの場合、選択した異種部分は、ＮｇＲポリペプチド部分に融合されたもの、結合体化されたもの、いずれも同様に機能する。したがって、異種アミノ酸配列の以下の論考において、特に記載のない限り、異種配列は、ＮｇＲポリペプチド部分に融合タンパク質の形態で、または化学的結合体として連結され得ることを理解されたい。
【０２４４】
また、本明細書に開示された処置方法における使用のためのＮｇＲ１アプタマーおよび抗体ならびにその断片は、Ｎ−もしくはＣ末端で異種ポリペプチドに組換えにより融合されたもの、またはポリペプチドもしくは他の組成物に化学的に結合体化されたもの（共有結合性および非共有結合性結合体化を含む）であり得る。例えば、ＮｇＲ１アンタゴニストアプタマーおよび抗体ならびにその断片は、検出アッセイにおける標識およびエフェクター分子として有用な分子（例えば、異種ポリペプチド、薬物、放射性核種または毒素など）に、組換えにより融合されたもの、または結合体化されたものであり得る。例えば、ＰＣＴ公開公報ＷＯ９２／０８４９５；ＷＯ９１／１４４３８；ＷＯ８９／１２６２４；米国特許第５，３１４，９９５号；およびＥＰ３９６，３８７を参照のこと。
【０２４５】
本明細書に開示された処置方法における使用のためのＮｇＲ１アンタゴニストポリペプチド、アプタマーおよび抗体ならびにその断片としては、修飾された誘導体、すなわち、ＮｇＲ１アンタゴニストポリペプチド、アプタマー復は抗体がＮｇＲ１の生物学的機能を阻害することが妨げられないような共有結合により任意の型の分子が結合された修飾誘導体が挙げられる。例えば、限定を意図しないが、本発明のＮｇＲ１アンタゴニストポリペプチド、アプタマーおよび抗体ならびにその断片は、例えば、グリコシル化、アセチル化、ペグ化、ホスフィル化（ｐｈｏｓｐｈｙｌａｔｉｏｎ）、リン酸化、アミド化、既知の保護基／ブロック基による誘導体化、タンパク質分解的切断、細胞リガンドまたは他のタンパク質への連結などによって修飾されたものであり得る。任意の数多くの化学的修飾が、既知の手法、例えば、限定されないが、特異的化学的切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝的合成などによって行なわれ得る。さらに、該誘導体は１つ以上の非古典的アミノ酸を含むものであり得る。
【０２４６】
本明細書に開示された処置方法における使用のためのＮｇＲ１アンタゴニストポリペプチド、アプタマーおよび抗体ならびにその断片は、ペプチド結合または修飾ペプチド結合によって互いに連結されたアミノ酸、すなわちペプチド同配体で構成されたものであり得、２０種類の遺伝子にコードされたアミノ酸以外のアミノ酸を含むものであり得る。ＮｇＲ１アンタゴニストポリペプチド、アプタマーおよび抗体ならびにその断片は、天然のプロセッシング（例えば、翻訳後プロセッシングなど）または当該技術分野でよく知られた化学的修飾手法によって修飾されたものであり得る。かかる修飾は、基礎的な教科書およびより詳細なモノグラフ、ならびに膨大な研究文献に充分記載されている。修飾は、ＮｇＲ１アンタゴニストポリペプチド、アプタマーもしくは抗体またはその断片内の任意の場所、例えば、ペプチド主鎖、アミノ酸側鎖およびアミノもしくはカルボキシル末端、または糖鎖などの部分に行われ得る。所与のＮｇＲ１アンタゴニストポリペプチド、アプタマーもしくは抗体またはその断片において、同じ型の修飾が同じまたは異なる程度でいくつかの部位に存在し得ることは認識されよう。また、所与のＮｇＲ１アンタゴニストポリペプチド、アプタマーもしくは抗体またはその断片は多くの型の修飾を含むものであり得る。ＮｇＲ１アンタゴニストポリペプチド、アプタマーもしくは抗体またはその断片は、例えば例えばユビキチン化の結果として分枝鎖のものであり得、また、分枝を伴う、または伴わない環状のものであり得る。環状で分枝鎖の、および分枝鎖で環状のＮｇＲ１アンタゴニストポリペプチド、アプタマーａｎｄ抗体またはその断片は、天然の翻訳後プロセッシングにより生成したものであり得るか、または合成方法によって作製されたものであり得る。修飾としては、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合性架橋の形成、システインの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨード化、メチル化、ミリストイル化、酸化、ペグ化、タンパク質分解的プロセッシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、タンパク質へのアミノ酸のトランスファーＲＮＡ媒介型付加、例えばアルギニル化など、ならびにユビキチン化が挙げられる（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ、Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  第２版（１９９３）；Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｖａｌｅｎｔ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、第１〜１２頁（１９８３）；Ｓｅｉｆｔｅｒら、Ｍｅｔｈ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １８２：６２６−６４６（１９９０）；Ｒａｔｔａｎら、Ａｎｎ  ＮＹ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ６６３：４��−６２（１９９２））を参照のこと。
【０２４７】
ＮｇＲ１アンタゴニストポリペプチド、アプタマーもしくは抗体またはその断片が融合される異種ポリペプチドは、治療上有用なもの、あるいはＮｇＲ１アンタゴニストポリペプチド、アプタマーもしくは抗体またはその断片を標的化するのに有用なものである。ＮｇＲ１アンタゴニスト融合タンパク質、アプタマー  ａｎｄ抗体またはその断片は、種々の目的、例えば、血清半減期の増大、バイオアベイラビリティの改善、特定の器官または組織型へのインビボ標的化、組換え発現効率の改善、宿主細胞の分泌の改善、容易な精製、およびより高いアビディティを達成するために使用され得る。達成されるべき目的（１つまたは複数）に応じて、異種部分は、不活性または生物学的に活性であり得る。また、これは、ＮｇＲ１アンタゴニストポリペプチド、アプタマーもしくは抗体またはその断片に安定に融合されるように、またはインビトロもしくはインビボで切断可能なように選択され得る。これら他の目的を達成するための異種部分は、当該技術分野で知られている。
【０２４８】
ＮｇＲ１アンタゴニスト融合ポリペプチド、アプタマーもしくは抗体またはその断片の発現に対する択一法として、選択した異種部分を予め形成し、該アンタゴニストポリペプチド、アプタマーまたは抗体に化学的に結合体化することができる。ほとんどの場合において、選択した異種部分は、ＮｇＲ１アンタゴニストポリペプチド、アプタマーもしくは抗体またはその断片に融合されていようと、結合体化されていようと、同様に機能する。したがって、異種アミノ酸配列の以下の論考において、特に記載のない限り、異種配列はＮｇＲ１アンタゴニストポリペプチド、アプタマーもしくは抗体またはその断片に、融合タンパク質の形態で、または化学的結合体として結合体化されたものであり得ることを理解されたい。
【０２４９】
ＮｇＲ１アンタゴニストポリペプチド、アプタマーもしくは抗体またはその断片などの薬理学的に活性なポリペプチドは、多くの場合、急速なインビボクリアランスを示し、体内で治療有効濃度を達成するためには、大用量が必要とされる。また、約６０ｋＤａより小さなポリペプチドは、糸球体濾過を受ける可能性があり、これは、場合よっては腎臓毒性をもたらす。ＮｇＲシグナル伝達ドメインのポリペプチド断片などの比較的小さいポリペプチドの融合または結合体化は、かかる腎臓毒性のリスクを低減または回避するために使用され得る。種々の異種アミノ酸配列、すなわち、治療用ポリペプチドのインビボ安定性、すなわち血清半減期を増大させるためのポリペプチド部分または「キャリア」が知られている。例としては、血清アルブミン、例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）が挙げられる。
【０２５０】
その長い半減期、広範なインビボ分布および酵素的もしくは免疫学的機能の欠如のため、本質的に完全長のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）またはＨＳＡ断片が異種部分として一般に使用される。Ｙｅｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：１９０４−０８（１９９２）およびＳｙｅｄら、Ｂｌｏｏｄ  ８９：３２４３−５２（１９９７）に教示されたものなどの方法および材料の適用により、ＨＳＡは、ＮｇＲポリペプチド部分のおかげで薬理学的活性を示すとともに、有意に増大したインビボ安定性（例えば、１０倍〜１００倍高い）を示す融合タンパク質またはポリペプチド結合体を形成するために使用され得る。ＨＳＡのＣ末端は、ＮｇＲポリペプチド部分のＮ末端に融合され得る。ＨＡＳは天然に分泌されるタンパク質であるため、ＨＳＡシグナル配列は、該融合タンパク質を真核生物（例えば、哺乳動物）の発現系において産生させる場合に、細胞培養培地中への該融合タンパク質の分泌を得るために利用され得る。
【０２５１】
特定のある実施形態において、本発明の方法における使用のためのＮｇＲ１アンタゴニストポリペプチド、アプタマー、抗体およびその抗体断片は、さらに、標的化部分を含む。標的化部分としては、身体のある特定の部分、例えば、脳またはその内部の区画への局在化を指向するタンパク質またはペプチドが挙げられる。特定のある実施形態において、本発明の方法における使用のためのＮｇＲ１アンタゴニストポリペプチド、アプタマー、抗体またはその抗体断片は、脳標的化部分に結合または融合されている。脳標的化部分は、共有結合により（例えば、翻訳による直接融合、または直接もしくはスペーサー分子（これは、任意選択的に切断可能であり得る）を介してのいずれかによる化学的連結によって結合されるか、または非共有結合により（例えば、可逆的相互作用、例えば、アビジン：ビオチン、タンパク質Ａ：ＩｇＧなどによって）結合される。他の実施形態において、本発明の方法における使用のためのＮｇＲ１アンタゴニストポリペプチド、アプタマー、抗体またはその抗体断片は、１つ以上の（ｏｎｅ  ｍｏｒｅ）脳標的化部分に結合される。さらなる実施形態において、脳標的化部分は、本発明の方法における使用のための複数のＮｇＲ１アンタゴニストポリペプチド、アプタマー、抗体またはその抗体断片に結合される。
【０２５２】
ＮｇＲ１アンタゴニストポリペプチド、アプタマー、抗体またはその抗体断片に結合された脳標的化部分により、かかるＮｇＲ１アンタゴニストポリペプチド、抗体またはその抗体断片の脳送達が増強される。タンパク質または治療用薬剤に融合させると、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過して該タンパク質または治療用薬剤を送達するいくつかのポリペプチドが報告されている。非限定的な例としては、単一ドメイン抗体ＦＣ５（Ａｂｕｌｒｏｂら（２００５）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．９５，１２０１−１２１４）；ヒトインスリンレセプターに対するモノクローナル抗体であるｍＡＢ  ８３−１４（Ｐａｒｄｒｉｄｇｅら（１９９５）Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｓ．１２，８０７−８１６）；ヒトトランスフェリンレセプター（ｈＴｆＲ）に結合するＢ２、Ｂ６およびＢ８ペプチド（Ｘｉａら（２０００）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４，１１３５９−１１３６６）；トランスフェリンレセプターに対するＯＸ２６モノクローナル抗体（Ｐａｒｄｒｉｄｇｅら（１９９１）Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２５９，６６−７０）；ジフテリア（ｄｉｐｔｈｅｒｉａ）毒素結合体（例えば、Ｇａｉｌｌａｒｄら，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｇｒｅｓｓ  Ｓｅｒｉｅｓ  １２７７：１８５−１９８（２００５）；および米国特許第６，３０６，３６５号の配列番号１〜１８）が挙げられる。上記の参考文献の内容は、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０２５３】
ＮｇＲ１組成物の脳送達の増強は、当該技術分野で充分確立されたいくつかの手段によって測定される。例えば、脳標的化部分に連結された放射性標識されたＮｇＲ１アンタゴニストポリペプチド、アプタマー、抗体またはその抗体断片を、動物に投与すること；脳局在化を調べること；および局在化を、脳標的化部分に結合されていない対応の放射性標識されたＮｇＲ１アンタゴニストポリペプチド、アプタマー、抗体またはその抗体断片と比較すること。標的化の増強の他の測定手段は、上記の参考文献に記載されている。
【０２５４】
本発明の一部のある実施形態では、ヒンジ領域およびＦｃ領域、すなわち、Ｉｇ重鎖定常領域のＣ末端部分に融合されたＮｇＲポリペプチド部分が使用される。一部のある実施形態では、ヒンジ領域内のアミノ酸が異なるアミノ酸で置換されていてもよい。このような実施形態によるヒンジ領域に対する例示的なアミノ酸置換としては、ヒンジ領域内の個々のシステイン残基の異なるアミノ酸での置換が挙げられる。任意の異なるアミノ酸が、ヒンジ領域内のシステインの代わりに使用され得る。本発明のポリペプチドおよび参照アミノ酸配列のアミノ酸に対するアミノ酸置換としては、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、無極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β−分枝側鎖を有するアミノ酸（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が挙げられ得る。参照アミノ酸のシステインの代わりに使用される典型的なアミノ酸としては、アラニン、セリン、トレオニンが挙げられ、特にセリンおよびアラニンである。該ポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドの操作によりかかる置換を行うことは、充分、当業者の常套的な専門知識の範囲内である。
【０２５５】
ＮｇＲ−ポリペプチド−Ｆｃ融合体の潜在的な利点としては、可溶性、インビボ安定性および多価性（例えば、二量体化）が挙げられる。使用されるＦｃ領域は、ＩｇＡ、ＩｇＤまたはＩｇＧ  Ｆｃ領域（ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）であり得る。あるいはまた、ＩｇＥまたはＩｇＭ  Ｆｃ領域（ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３−ＣＨ４）であり得る。ＩｇＧ  Ｆｃ領域、例えば、ＩｇＧ１  Ｆｃ領域またはＩｇＧ４  Ｆｃ領域が一般的に使用される。Ｆｃ融合体をコードするＤＮＡを構築するため、および発現させるための材料および方法は当該技術分野で知られており、必要以上の実験を行なうことなく、融合体を得るために適用され得る。本発明の一部の実施形態では、Ｃａｐｏｎら、米国特許第５，４２８，１３０号および同第５，５６５，３３５号に記載のものなどの融合タンパク質が使用される。
【０２５６】
シグナル配列は、小胞体の膜を通過するタンパク質の輸送を開始するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドである。免疫融合体（ｉｍｍｕｎｏｆｕｓｉｎ）の構築に有用なシグナル配列としては、抗体軽鎖シグナル配列、例えば、抗体１４．１８（Ｇｉｌｌｉｅｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．，１２５：１９１−２０２（１９８９））、抗体重鎖シグナル配列、例えば、ＭＯＰＣ１４１抗体重鎖シグナル配列（Ｓａｋａｎｏら、Ｎａｔｕｒｅ  ２８６：５７７４（１９８０））が挙げられる。あるいはまた、他のシグナル配列が使用され得る。例えば、Ｗａｔｓｏｎ、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：５１４５（１９８４）を参照のこと。シグナルペプチドは、通常、シグナルペプチダーゼによって小胞体の内腔内で切断される。これにより、Ｆｃ領域およびＮｇＲポリペプチド部分を含む免疫融合体タンパク質の分泌がもたらされる。
【０２５７】
一部のある実施形態において、該ＤＮＡ配列は、分泌カセットとＮｇＲポリペプチド部分の間のタンパク質分解的切断部位をコードするものであり得る。かかる切断部位により、例えば、コードされた融合タンパク質のタンパク質分解的切断がもたらされ得、したがってＦｃドメインが標的タンパク質から分離され得る。有用なタンパク質分解的切断部位としては、タンパク質分解性酵素、例えば、トリプシン、プラスミン、トロンビン、第Ｘａ因子またはエンテロキナーゼＫなどによって認識されるアミノ酸配列が挙げられる。
【０２５８】
分泌カセットは、複製可能な発現ベクターに組み込まれ得る。有用なベクターとしては、線状核酸、プラスミド、ファージミド、コスミドなどが挙げられる。例示的な発現ベクターはｐｄＣであり、これは、免疫融合体のＤＮＡの転写がヒトサイトメガロウイルスのエンハンサーおよびプロモーターの制御下に置かれたものである。例えば、Ｌｏら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １０８８：７１２（１９９１）；およびＬｏら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １１：４９５−５００（１９９８）を参照のこと。適切な宿主細胞が、本発明のＮｇＲ１ポリペプチドまたはポリペプチド断片をコードするＤＮＡで形質転換またはトランスフェクトされ得、該ポリペプチドの発現および分泌のために使用され得る。典型的に使用される宿主細胞としては、不死化ハイブリドーマ細胞、骨髄腫細胞、２９３細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、Ｈｅｌａ細胞およびＣＯＳ細胞が挙げられる。
【０２５９】
完全にインタクトな野生型Ｆｃ領域は、本発明の方法に使用されるＦｃ融合タンパク質において通常は不必要であり、望ましくないエフェクター機能を示す。したがって、典型的には、分泌カセットの構築の際に特定の結合部位をＦｃ領域から欠失させる。例えば、軽鎖との共発現は不必要であるため、重鎖結合タンパク質の結合部位であるＢｉｐ（Ｈｅｎｄｅｒｓｈｏｔら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  ８：１１１−１４（１９８７））を、ＩｇＥのＦｃ領域のＣＨ２ドメインから欠失させ、その結果、この部位により免疫融合体の効率的な分泌が妨げられない。膜貫通ドメイン配列（例えば、ＩｇＭ内に存在するものなど）もまた一般的に、欠失されている。
【０２６０】
ＩｇＧ１  Ｆｃ領域は、ほとんどの場合で使用される。あるいはまた、免疫グロブリンγのその他のサブクラス（γ−２、γ−３およびγ−４）のＦｃ領域が、分泌カセットに使用され得る。免疫グロブリンγ−１のＩｇＧ１  Ｆｃ領域は、分泌カセットに一般的に使用され、ヒンジ領域の少なくとも一部分、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域を含む。一部のある実施形態において、免疫グロブリンγ−１のＦｃ領域はＣＨ２欠失Ｆｃであり、これは、ヒンジ領域の一部分とＣＨ３領域を含むが、ＣＨ２領域は含まない。ＣＨ２欠失Ｆｃは、Ｇｉｌｌｉｅｓら、Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄ．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  １：４７（１９９０）に記載されている。一部のある実施形態において、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥまたはＩｇＭのうちの１つのＦｃ領域が使用される。
【０２６１】
ＮｇＲ−ポリペプチド部分−Ｆｃ融合タンパク質は、いくつかの異なる立体配置で構築され得る。立体配置の一例では、ＮｇＲポリペプチド部分のＣ末端がＦｃヒンジ部分のＮ末端に直接融合されている。わずかに異なる立体配置では、短鎖ポリペプチド（例えば２〜１０個のアミノ酸）が融合体内のＮｇＲポリペプチド部分のＮ末端とＦｃ部分のＣ末端の間に組み込まれる。択一的な立体配置では、該短鎖ポリペプチドは、融合内のＮｇＲポリペプチド部分のＣ末端とＦｃ部分のＮ末端の間に組み込まれる。この立体配置の例示的な実施形態はＮｇＲ１（３１０）−２ＸＧ４Ｓ−Ｆｃであり、これは、Ｆｃに連結された（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）２（配列番号６６）に連結された配列番号４９のアミノ酸２６〜３１０である。かかるリンカーにより立体配座の柔軟性がもたらされ、これにより、状況によっては生物学的活性が改善され得る。ヒンジ領域の充分な部分がＦｃ部分において保持されている場合、ＮｇＲポリペプチド部分−Ｆｃ融合体は二量体化し、したがって２価の分子が形成される。単量体Ｆｃ融合の均一な集団では、単一特異性の二価二量体が得られる。各々が異なる特異性を有する２種類の単量体Ｆｃ融合体の混合物では、二重特異性の二価二量体が得られる。
【０２６２】
対応するアミノ反応性基およびチオール反応性基を含有する任意のいくつかの架橋剤を用い、本発明のＮｇＲ１ポリペプチドまたはポリペプチド断片を血清アルブミンに連結させ得る。適当なリンカーの例としては、チオール反応性マレイミドを挿入するアミン反応性架橋剤、例えば、ＳＭＣＣ、ＡＭＡＳ、ＢＭＰＳ、ＭＢＳ、ＥＭＣＳ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、ＫＭＵＳおよびＧＭＢＳが挙げられる。他の適当なリンカー、例えば、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢは、チオール反応性ハロアセテート基を挿入する。保護または非保護チオールをスルフヒドリル基との反応に提供して還元可能な連結を生成させるリンカーとしては、ＳＰＤＰ、ＳＭＰＴ、ＳＡＴＡおよびＳＡＴＰが挙げられる。かかる試薬は市販されている（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ、ロックフォード，ＩＬ）。
【０２６３】
結合体化は、本発明のＮｇＲ１ポリペプチドまたはポリペプチド断片のＮ末端または血清アルブミン上のチオール部分を伴うものである必要はない。例えば、ＮｇＲポリペプチド−アルブミン融合体は遺伝子操作手法を用いて得られ得、この場合、ＮｇＲポリペプチド部分は、血清アルブミン遺伝子に、そのＮ末端、Ｃ末端または両方で融合される。
【０２６４】
本発明のＮｇＲポリペプチドは、ポリペプチドタグに融合され得る。用語「ポリペプチドタグ」は、本明細書で用いる場合、ＮｇＲポリペプチドに結合、接続または連結され得る任意のアミノ酸配列、およびＮｇＲポリペプチドを同定、精製、濃縮または単離するために使用され得る任意のアミノ酸配列を意味することが意図される。ＮｇＲポリペプチドへのポリペプチドタグの結合は、例えば、（ａ）ポリペプチドタグをコードする核酸配列、および（ｂ）ＮｇＲポリペプチドをコードする核酸配列を含む核酸分子を構築することにより行われ得る。例示的なポリペプチドタグとしては、例えば、翻訳後修飾され得るアミノ酸配列、例えば、ビオチン化されるアミノ酸配列が挙げられる。他の例示的なポリペプチドタグとしては、例えば、抗体（もしくはその断片）または他の特異的結合試薬によって認識および／または結合され得るアミノ酸配列が挙げられる。抗体（もしくはその断片）または他の特異的結合試薬によって認識され得るポリペプチドタグとしては、例えば、当該技術分野「エピトープタグ」として知られるものが挙げられる。エピトープタグは、天然または人工のエピトープタグであり得る。天然または人工のエピトープタグは、当該技術分野で知られており、例えば、ＦＬＡＧ、Ｓｔｒｅｐまたはポリヒスチジンペプチドなどの人工エピトープが挙げられる。ＦＬＡＧペプチドは、配列Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ（配列番号７４）またはＡｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ（配列番号７５）を含む（Ｅｉｎｈａｕｅｒ，Ａ．およびＪｕｎｇｂａｕｅｒ，Ａ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ４９：１−３：４５５−４６５（２００１））。Ｓｔｒｅｐエピトープは、配列Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列番号７６）を有する。ＶＳＶ−Ｇエピトープもまた使用され得、配列Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（配列番号７７）を有する。別の人工エピトープは、６つのヒスチジン残基（Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ（配列番号７８）を有するポリＨｉｓ配列である。天然に存在するエピトープとしては、モノクローナル抗体１２ＣＡ５によって認識されるインフルエンザウイルス血球凝集素（ＨＡ）配列Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（配列番号７９）（Ｍｕｒｒａｙら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２９：１７０−１７９（１９９５））およびモノクローナル抗体９Ｅ１０によって認識されるヒトｃ−ｍｙｃ（Ｍｙｃ）由来１１アミノ酸配列（Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ（配列番号８０）（Ｍａｎｓｔｅｉｎら、Ｇｅｎｅ  １６２：１２９−１３４（１９９５））が挙げられる。別の有用な  エピトープはトリペプチドＧｌｕ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅであり、これは、モノクローナル抗体ＹＬ  １／２によって認識される（Ｓｔａｍｍｅｒｓら  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２８３：２９８−３０２（１９９１））。
【０２６５】
特定のある実施形態において、ＮｇＲポリペプチドとポリペプチドタグは、連結アミノ酸配列によって接続され得る。本明細書で用いる場合、「連結アミノ酸配列」は、１種類以上のプロテアーゼによって認識および／または切断され得るアミノ酸配列であり得る。１種類以上のプロテアーゼによって認識および／または切断され得るアミノ酸配列は、当該技術分野で知られている。例示的なアミノ酸配列は、以下のプロテアーゼ：第ＶＩＩａ因子、第ＩＸａ因子、第Ｘａ因子、ＡＰＣ、ｔ−ＰＡ、ｕ−ＰＡ、トリプシン、キモトリプシン、エンテロキナーゼ、ペプシン、カテプシンＢ、Ｈ、Ｌ、Ｓ、Ｄ、カテプシンＧ、レニン、アンギオテンシン変換酵素、マトリックスメタロプロテアーゼ（コラゲナーゼ、ストロメライシン、ゼラチナーゼ）、マクロファージエラスターゼ、Ｃｉｒ、およびＣｉｓによって認識されるものである。上記のプロテアーゼによって認識されるアミノ酸配列は、当該技術分野で知られている。特定のプロテアーゼによって認識される例示的な配列は、例えば、米国特許第５，８１１，２５２号を見るとよい。
【０２６６】
ポリペプチドタグにより、市販のクロマトグラフィー媒体を用いた精製が容易になり得る。
【０２６７】
本発明の一部のある実施形態において、ＮｇＲポリペプチド融合構築物は、細菌内でのＮｇＲポリペプチド部分の産生を増強するために使用される。かかる構築物には、通常、高レベルで発現および／または分泌される細菌タンパク質が、本発明のＮｇＲ１ポリペプチドまたはポリペプチド断片のＮ末端融合パートナーとして使用される。例えば、Ｓｍｉｔｈら、Ｇｅｎｅ  ６７：３１（１９８８）；Ｈｏｐｐら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１２０４（１９８８）；Ｌａ  Ｖａｌｌｉｅら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １１：１８７（１９９３）  を参照のこと。
【０２６８】
ＮｇＲポリペプチド部分を適当な融合パートナーのアミノ末端およびカルボキシ末端に融合させることにより、２価または４価の形態の本発明のＮｇＲ１ポリペプチドまたはポリペプチド断片が得られ得る。例えば、ＮｇＲポリペプチド部分をＩｇ部分のアミノ末端およびカルボキシ末端を融合させると、２つのＮｇＲポリペプチド部分を含む２価の単量体ポリペプチドが生成され得る。Ｉｇ部分のおかげでこのような単量体の２つが二量体化すると、４価形態のＮｇＲポリペプチドが得られる。かかる多価形態は、標的に対する結合親和性の増大を達成するために使用され得る。多価形態の本発明のＮｇＲ１ポリペプチドまたはポリペプチド断片はまた、ＮｇＲポリペプチド部分をタンデムに配置してコンカテマーを形成することにより得られ得、これは、単独で、または融合パートナー（例えば、ＩｇもしくはＨＳＡなど）と融合させて使用され得る。
【０２６９】
（結合体化されるポリマー（ポリペプチド以外））
本発明の一部のある実施形態では、１つ以上のポリマーをＮｇＲポリペプチドに結合体化（共有結合により連結）させた本発明のＮｇＲ１ポリペプチドまたはポリペプチド断片を伴う。かかる結合体化に適したポリマーの例としては、ポリペプチド（上記）、糖ポリマーおよびポリアルキレングリコール鎖が挙げられる。典型的には、必ずしもそうではないが、ポリマーは、本発明のＮｇＲ１ポリペプチドまたはポリペプチド断片に、以下：可溶性、安定性またはバイオアベイラビリティの１つ以上を改善する目的で結合体化させる。
【０２７０】
本発明のＮｇＲ１ポリペプチドまたはポリペプチド断片への結合体化に一般的に使用されるポリマーの類型は、ポリアルキレングリコールである。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、最も高頻度に使用される。ＮｇＲポリペプチド単独と比べて血清半減期を増大させるため、ＰＥＧ部分、例えば、１、２、３、４または５つのＰＥＧポリマーを、各ＮｇＲポリペプチドに結合体化させ得る。ＰＥＧ部分は、非抗原性で本質的に生物学的に不活性である。本発明の実施に使用されるＰＥＧ部分は分枝鎖または非分枝鎖であり得る。
【０２７１】
ＮｇＲポリペプチドに結合されるＰＥＧ部分の数および個々のＰＥＧ鎖の分子量は種々であり得る。一般に、ポリマーの分子量が大きいほど、ポリペプチドに結合されるポリマー鎖は少ない。通常、ＮｇＲポリペプチドまたはポリペプチド断片に結合させるポリマーの総質量は２０ｋＤａ〜４０ｋＤａである。したがって、１つのポリマー鎖を結合させる場合、その鎖の分子量は、一般的に２０〜４０ｋＤａである。２つの鎖を結合させる場合、各鎖の分子量は、一般的に１０〜２０ｋＤａである。３つの鎖を結合させる場合、分子量は、一般的に７〜１４ｋＤａである。
【０２７２】
該ポリマー、例えばＰＥＧはＮｇＲポリペプチドに、該ポリペプチド上の任意の適当な露出した反応性基を介して連結され得る。露出した反応性基（１つまたは複数）は、例えば、Ｎ末端アミノ基もしくは内部リシン残基のεアミノ基または両方であり得る。活性化ポリマーは、ＮｇＲポリペプチド上の任意の遊離アミノ基と反応し、これに共有結合によって連結され得る。ＮｇＲポリペプチドの遊離カルボン酸基、適当に活性化されたカルボニル基、ヒドロキシル、グアニジル、イミダゾール、酸化糖鎖部分およびメルカプト基（利用可能な場合）もまた、ポリマー結合のための反応性基として使用され得る。
【０２７３】
結合体化反応では、ポリペプチド濃度に応じて、ポリペプチド１モルあたり約１．０〜約１０モルの活性化ポリマーが、典型的に使用される。通常、選択される比率は、反応の最大化と、ＮｇＲポリペプチド部分の所望の薬理学的活性を障害し得る副反応（多くの場合、非特異的）の最小化との均衡を示すものである。好ましくは、ＮｇＲポリペプチドの少なくとも５０％の生物学的活性（例えば、任意の本明細書に記載のアッセイまたは当該技術分野で知られたアッセイにおいて示される）が保持され、最も好ましくは、ほぼ１００％が保持されるものである。
【０２７４】
ポリマーはＮｇＲポリペプチドに、慣用的な化学反応を用いて結合体化させ得る。例えば、ポリアルキレングリコール部分を、ＮｇＲポリペプチドのリシンのεアミノ基にカップリングさせ得る。リシン側鎖への連結は、Ｎ−ヒドロキシルスクシンイミド（ＮＨＳ）活性エステル、例えば、ＰＥＧスクシンイミジルスクシネート（ＳＳ−ＰＥＧ）およびスクシンイミジルプロピオネート（ＳＰＡ−ＰＥＧ）などにより行なわれ得る。好適なポリアルキレングリコール部分としては、例えば、カルボキシメチル−ＮＨＳおよびノルロイシン−ＮＨＳ、ＳＣが挙げられる。これらの試薬は市販されている。さらなるアミン反応性ＰＥＧリンカーが、スクシンイミジル部分の代わりに使用され得る。このようなものとしては、例えば、イソチオシアネート、ニトロフェニルカーボネート（ＰＮＰ）、エポキシド、ベンゾトリアゾールカーボネート、ＳＣ−ＰＥＧ、トレシレート、アルデヒド、エポキシド、カルボニルイミダゾールおよびＰＮＰカーボネートが挙げられる。条件は、通常、反応の選択性および程度が最大限となるように最適化される。かかる反応条件の最適化は、当業者の技量の範囲内である。
【０２７５】
ＰＥＧ化は、当該技術分野で知られた任意のＰＥＧ化反応によって行なわれ得る。例えば、Ｆｏｃｕｓ  ｏｎ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ，３：４−１０（１９９２）、ならびに欧州特許出願ＥＰ  ０１５４３１６およびＥＰ  ０４０１３８４を参照のこと。ＰＥＧ化は、反応性ポリエチレングリコール分子（もしくは類縁の反応性水溶性ポリマー）によるアシル化反応またはアルキル化反応を用いて行なわれ得る。
【０２７６】
アシル化によるＰＥＧ化は、一般的に、ポリエチレングリコールの活性エステル誘導体の反応を伴う。任意の反応性ＰＥＧ分子がＰＥＧ化に使用され得る。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）にエステル化されたＰＥＧは、高頻度に使用される活性化ＰＥＧエステルである。本明細書で用いる場合、「アシル化」には、限定されないが、以下の型：治療用タンパク質と水溶性ポリマー、例えば、ＰＥＧ：アミド、カルバメート、ウレタンなどとの連結が含まれる。例えば、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．５：１３３−１４０、１９９４を参照のこと。反応パラメータは、一般的に、ＮｇＲポリペプチドを損傷または不活化し得る温度、溶媒およびｐＨ条件が回避されるように選択される。
【０２７７】
一般的に、連結結合部はアミドであり、典型的には、生じる生成物の少なくとも９５％がモノ−、ジ−またはトリ−ＰＥＧ化されている。しかしながら、より高度にＰＥＧ化された種が一部、使用した具体的な反応条件に応じた量で形成され得る。任意選択で、精製ＰＥＧ化種は混合物から、特に未反応種から慣用的な精製方法、例えば、透析、塩析、限外濾過、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、疎水性交換クロマトグラフィーおよび電気泳動などによって分離される。
【０２７８】
アルキル化によるＰＥＧ化は、一般的に、還元剤の存在下での、ＰＥＧの末端アルデヒド誘導体と本発明のＮｇＲ１ポリペプチドまたはポリペプチド断片との反応を伴う。また、ＰＥＧ化が、実質的にＮｇＲポリペプチドのＮ末端アミノ基においてのみ好都合となるように（すなわち、モノＰＥＧ化タンパク質）、反応条件を操作してもよい。モノＰＥＧ化またはポリＰＥＧ化いずれの場合も、ＰＥＧ基は、典型的には該タンパク質に−ＣＨ２−ＮＨ−基によって結合される。特に−ＣＨ２−基に関して、この型の結合は「アルキル」結合として知られている。
【０２７９】
Ｎ末端標的化モノＰＥＧ化生成物を作製するための還元的アルキル化による誘導体化では、誘導体化に利用可能な種々の型の一次アミノ基（リシン対Ｎ末端）差示的反応性が利用される。該反応は、リシン残基のε−アミノ基と該タンパク質のＮ末端アミノ基とのｐＫａの差を利用することが可能なｐＨで行なわれる。かかる選択的誘導体化によって、アルデヒドなどの反応性基を含有する水溶性ポリマーの該タンパク質への結合が制御される、すなわち、該ポリマーとの結合体化が主として該タンパク質のＮ末端で起こり、他の反応性基（例えば、リシン側鎖のアミノ基など）の有意な修飾は起こらない。
【０２８０】
アシル化およびアルキル化両方のアプローチに使用されるポリマー分子は、水溶性ポリマーの中から選択される。選択されるポリマーは、典型的には、本発明の方法に提供された場合に重合度が制御され得るように、単一の反応性基（例えば、アシル化のための活性エステルまたはアルキル化のためのアルデヒド）を有するように修飾されたものである。例示的な反応性ＰＥＧアルデヒドは、ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドであり、これは、水安定性であるか、またはモノＣ１〜Ｃ１０アルコキシもしくはそのアリールオキシ誘導体である（例えば、Ｈａｒｒｉｓら、米国特許第５，２５２，７１４号を参照のこと）。該ポリマーは分枝鎖または非分枝鎖であり得る。アシル化反応では、選択されるポリマー（１つまたは複数）は、典型的には単一の反応性エステル基を有する。還元性アルキル化では、選択されるポリマー（１つまたは複数）は、典型的には単一の反応性アルデヒド基を有する。一般的に、水溶性ポリマーは、これらが、通常、哺乳動物組換え発現系によってより簡便に作製されるため、天然に存在するグリコシル残基からは選択されない。
【０２８１】
ＰＥＧ化された本発明のＮｇＲポリペプチドの作製方法は、一般的に、（ａ）本発明のＮｇＲ１ポリペプチドまたはポリペプチド断片をポリエチレングリコール（例えば、ＰＥＧの反応性エステルまたはアルデヒド誘導体など）と、該分子が１つ以上のＰＥＧ基に結合された状態になる条件下で反応させる工程、および（ｂ）反応生成物（１種類または複数種）を得る工程を含む。一般に、アシル化反応に最適な反応条件は、既知パラメータおよび所望される結果に基づいて個別に決定される。例えば、タンパク質に対するＰＥＧの比率が大きいと、一般的に、より高いパーセンテージでポリＰＥＧ化生成物がもたらされる。
【０２８２】
実質的に均一な集団のモノ−ポリマー／ＮｇＲポリペプチドを作製するための還元的アルキル化は、一般的に、（ａ）本発明のＮｇＲ１ポリペプチドまたはポリペプチド断片を反応性ＰＥＧ分子と、還元性アルキル化条件下、ＮｇＲのＮ末端アミノ基の選択的修飾を可能にするのに適したｐＨで反応させる工程；および（ｂ）反応生成物（１種類または複数種）を得る工程を含む。
【０２８３】
実質的に均一な集団のモノ−ポリマー／ＮｇＲポリペプチドのためには、還元性アルキル化反応条件は、本発明のＮｇＲ１ポリペプチドまたはポリペプチド断片のＮ末端への水溶性ポリマー部分の選択的結合を可能にするものである。かかる反応条件は、一般的に、リシン側鎖アミノ基と該Ｎ末端アミノ基の間にｐＫａの差をもたらすものである。本発明の目的には、ｐＨは、一般的に３〜９、典型的には３〜６の範囲である。
【０２８４】
本発明のＮｇＲポリペプチドは、タグ、例えば、後にタンパク質分解によって放出され得る一部分を含むものであり得る。したがって、リシン部分は、まず、低分子量リンカー（例えば、トラウト試薬（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ、ロックフォード、ＩＬ）、これは、リシンおよびＮ末端の両方と反応する）で修飾されたＨｉｓ−タグ反応させ、次いで、該Ｈｉｓタグを放出させることにより選択的に修飾され得る。その結果、該ポリペプチドは、チオール反応性頭部（ｈｅａｄ）基（例えば、マレイミド基、ビニルスルホン基、ハロアセテート基または遊離もしくは保護ＳＨ）を含有するＰＥＧで選択的に修飾され得る遊離ＳＨ基を含むことになる。
【０２８５】
トラウト試薬は、ＰＥＧ結合のための特異的部位を設定する任意のリンカーで置き換えられ得る。例えば、トラウト試薬は、ＳＰＤＰ、ＳＭＰＴ、ＳＡＴＡまたはＳＡＴＰ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ、ロックフォード、ＩＬ）で置き換えられ得る。同様に、該タンパク質を、マレイミドを挿入するアミン反応性リンカー（例えば、ＳＭＣＣ、ＡＭＡＳ、ＢＭＰＳ、ＭＢＳ、ＥＭＣＳ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、ＫＭＵＳもしくはＧＭＢＳ）、ハロアセテート基を挿入するアミン反応性リンカー（ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ）、またはビニルスルホン基を挿入するアミン反応性リンカーと反応させ、得られた生成物を遊離ＳＨを含有するＰＥＧと反応させ得る。
【０２８６】
一部のある実施形態では、ポリアルキレングリコール部分を、ＮｇＲポリペプチドのシステイン基にカップリングさせる。カップリングは、例えば、マレイミド基、ビニルスルホン基、ハロアセテート基またはチオール基を用いて行なわれ得る。
【０２８７】
任意選択で、ＮｇＲポリペプチドはポリエチレン−グリコール部分に、不安定結合を介して結合体化させる。不安定結合は、例えば、生化学的加水分解、タンパク質分解またはスルフヒドリル切断にて切断され得る。例えば、該結合は、インビボ（生理学的）条件下で切断されるものであり得る。
【０２８８】
該反応は、生物学的に活性な物質と不活性ポリマーとの反応に使用される任意の適当な方法によって、一般的にはｐＨ約５〜８で、例えば、ｐＨ５、６、７または８のｐＨ（反応性基がＮ末端のαアミノ基上に存在する場合）で行なわれ得る。一般的に、該方法は、活性化ポリマーの調製すること、およびその後、タンパク質を該活性化ポリマーと反応させて製剤化に適した可溶性タンパク質を作製することを伴う。
【０２８９】
本発明のＮｇＲポリペプチドは、特定のある実施形態では、可溶性ポリペプチドである。ポリペプチドを可溶性にするための方法、またはポリペプチドの可溶性を改善するための方法は、当該技術分野でよく知られている。
【０２９０】
（本発明の核酸分子）
本発明は、本発明のポリペプチド、例えば、配列番号１〜９、２６〜２７、２９〜３７および４１〜４５の任意の１つのポリペプチドをコードする核酸を提供する。一部のある実施形態において、該核酸は、配列番号６および８のＮｏｇｏレセプター−１のアミノ酸残基２６〜３４４または配列番号８に示すＮｏｇｏレセプター−１のアミノ酸残基２７〜３４４からなる群より選択されるポリペプチドをコードする。一部のある実施形態において、該核酸分子は、配列番号７および９に示すＮｏｇｏレセプター−１のアミノ酸残基２６〜３１０または配列番号９に示すＮｏｇｏレセプター−１のアミノ酸残基２７〜３１０からなる群より選択されるポリペプチドをコードする。本明細書で用いる場合、「核酸」は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡおよびアンチセンス分子、ならびに択一的主鎖を主とする核酸または択一的塩基を含む核酸（天然の供給源由来または合成のものいずれも）を意味する。一部のある実施形態において、該核酸は、さらに、転写プロモーターおよび任意選択でシグナル配列を含み、これらは各々、本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。
【０２９１】
一部のある実施形態において、本発明は、本発明のＮｏｇｏレセプター−１融合タンパク質コードする核酸、例えば、配列番号６および８に示すＮｏｇｏレセプター−１のアミノ酸残基２６〜３４４、または配列番号８のアミノ酸残基２７〜３４４および配列番号７および９に示すＮｏｇｏレセプター−１のアミノ酸残基２６〜３１０または配列番号９のアミノ酸残基２７〜３１０からなる群より選択されるポリペプチドを含む融合タンパク質をコードする核酸を提供する。一部のある実施形態において、該核酸は、配列番号２６〜２７、２９〜３７および４１〜４５からなる群より選択されるポリペプチドを含むＮｏｇｏレセプター−１融合タンパク質をコードする。一部のある実施形態において、Ｎｏｇｏレセプター−１融合タンパク質をコードする核酸は、さらに、転写プロモーターおよび任意選択でシグナル配列を含む。一部のある実施形態において、該ヌクレオチド配列は、さらに、免疫グロブリン定常領域をコードする。一部のある実施形態において、免疫グロブリン定常領域は重鎖定常領域である。一部のある実施形態では、該ヌクレオチド配列は、さらに、ヒンジ領域に連結された免疫グロブリン重鎖定常領域をコードする。一部のある実施形態では、該核酸は、さらにＦｃをコードする。一部のある実施形態において、Ｎｏｇｏレセプター−１融合タンパク質はＦｃ断片を含む。
【０２９２】
本発明のコード核酸は、診断目的およびプローブ目的のための検出可能な標識を含むようにさらに修飾されたものであり得る。さまざまなかかる標識が当該技術分野で知られており、本明細書に記載のコード分子に容易に使用され得る。好適な標識としては、限定されないが、ビオチン、放射性標識ヌクレオチドなどが挙げられる。当業者は、標識されたコード核酸分子を得るために、当該技術分野で知られた任意の標識を使用することができよう。
【０２９３】
本発明にはまた、適度にストリンジェントな条件ならびに高ストリンジェンシー条件下で、本発明のポリペプチドの任意の１つをコードするポリヌクレオチドの非コード鎖または相補配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドが含まれる。ストリンジェントな条件は当業者に知られており、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）、６．３．１〜６．３．６を見るとよい。
【０２９４】
ヒトＮｏｇｏレセプター−１ポリヌクレオチドを以下に配列番号８１として示す。
【０２９５】
完全長ヒトＮｏｇｏレセプター−１は、配列番号８１のヌクレオチド１６６〜ヌクレオチド１５８７にコードされている。
【０２９６】
【化９】
2014221076.tif 000012
ラットＮｏｇｏレセプター−１ポリヌクレオチドを以下に配列番号８２として示し、Ｇｅｎｂａｎｋの受託番号はＮＭ＿０５３６１３である。
【０２９７】
【化１０】
2014221076.tif 000013
マウスＮｏｇｏレセプター−１ポリヌクレオチドを以下に配列番号８３として示し、Ｇｅｎｂａｎｋの受託番号はＮＭ＿０２２９８２である。
【０２９８】
【化１１】
2014221076.tif 000014
ヒトＮｏｇｏレセプター２−ポリヌクレオチドを以下に配列番号８４として示し、Ｇｅｎｂａｎｋの受託番号はＢＫ００１３０２である。
【０２９９】
【化１２】
2014221076.tif 000015
マウスＮｏｇｏレセプター２−ポリヌクレオチドを以下に配列番号  ８５として示し、Ｇｅｎｂａｎｋの受託番号はＮＭ＿１９９２２３である。
【０３００】
【化１３】
2014221076.tif 000016
ヒトＮｏｇｏレセプター−３  ポリヌクレオチドを以下に配列番号８６として示し、Ｇｅｎｂａｎｋの受託番号はＢＫ００１３０５である。
【０３０１】
【化１４】
2014221076.tif 000017
マウスＮｏｇｏレセプター−３  ポリヌクレオチドを以下に配列番号８７として示し、Ｇｅｎｂａｎｋの受託番号はＢＫ００１３０４である。
【０３０２】
【化１５】
2014221076.tif 000018
（ＮｇＲ１ポリヌクレオチドアンタゴニスト）
具体的なある実施形態は、ＮｇＲ１の発現を抑制（ノックダウン）するＮｇＲ１ポリヌクレオチドアンタゴニストを含む。ＮｇＲ１ポリヌクレオチドアンタゴニストとしては、限定されないが、アンチセンス分子、リボザイム、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡおよびＲＮＡｉが挙げられる。典型的には、かかる結合分子は、動物に別々に投与される（例えば、Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．５６：５６０（１９９１）を参照のこと）、が、かかる結合分子はまた、宿主細胞に取り込ませ、インビボで発現させたポリヌクレオチドからもインビボで発現させ得る。Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｓ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、ボーカラトーン、ＦＬ（１９８８）もまた参照のこと。
【０３０３】
ＮｇＲ遺伝子の発現は、一部のある実施形態では、ＲＮＡ干渉（「ＲＮＡｉ」）を用いて阻害され得る。ＲＮＡｉは、標的ｍＲＮＡの発現に干渉するＲＮＡの発現をいう。ＲＮＡｉは、細胞内への二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の導入により、相同ｍＲＮＡの分解が引き起こされる現象である。最初に線虫Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓにおいて発見されたが、ＲＮＡｉは、それ以来、広範な生物体において作用することがわかっている。「ＲＮＡｉ核酸」は、本明細書で用いる場合、一般に５０ヌクレオチド長より短い核酸配列であって、ｍＲＮＡレベルで遺伝子サイレンシングを引き起こすものである。
【０３０４】
例えば、哺乳動物細胞では、長鎖ｄｓＲＮＡ（＞３０ヌクレオチド）の導入により、強力な抗ウイルス性応答が開始され得る（タンパク質合成およびＲＮＡ分解の非特異的阻害によって例示される）。ＲＮＡ干渉は、ｍＲＮＡレベルでの遺伝子サイレンシングの機構を提供する。近年、ＲＮＡｉは、内因性の強力な遺伝子特異的サイレンシング手法となっており、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を用いてインビボでの分解について特定の転写物をマークする。また、これは、遺伝子ノックアウトのための効率的で広く適用可能なアプローチを提供する。また、ＲＮＡｉ手法は治療目的に使用され得る。例えば、ＲＮＡｉ標的化Ｆａｓ媒介性アポトーシスにより、マウスが劇症肝炎から保護されることが示されている。ＲＮＡｉ手法は、数多くの刊行物、例えば、米国特許第５，９１９，６１９号、同第６，５０６，５５９号およびＰＣＴ公開公報ＷＯ９９／１４３４６、ＷＯ０１／７０９４９、ＷＯ０１／３６６４６、ＷＯ００／６３３６４、ＷＯ００／４４８９５、ＷＯ０１／７５１６４、ＷＯ０１／９２５１３、ＷＯ０１／６８８３６およびＷＯ０１／２９０５８などに開示されている。
【０３０５】
具体的には、ＲＮＡｉにより、標的化遺伝子は、ｓｉＲＮＡ（短鎖干渉ＲＮＡ）を介した特定のｍＲＮＡ（例えば、ＮｇＲ１）との相互作用によってサイレンシングされる。該ｄｓＲＮＡ複合体は、次いで、細胞による分解のために標的化される。さらなるＲＮＡｉ分子としては、ショートヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）（またショート干渉ヘアピン）が挙げられる。ｓｈＲＮＡ分子は、ループによって連結された標的遺伝子由来のセンス配列およびアンチセンス配列を含む。ｓｈＲＮＡは、核から細胞質内に輸送され、ｍＲＮＡとともに分解される。ＲＮＡｉのＲＮＡを発現させるためには、Ｐｏｌ  ＩＩＩまたはＶ６プロモーターが使用され得る。ＲＮＡ干渉によって遺伝子発現を阻害し得る配列は、任意の長さを有するものであり得る。例えば、該配列は、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００個またはそれ以上の連続したヌクレオチドを有するものであり得る。該配列は、ｄｓＲＮＡまたは任意の他の型のポリヌクレオチドであり得るが、標的ｍＲＮＡ転写物を分解する機能性サイレンシング複合体を形成し得るものとする。
【０３０６】
ＲＮＡｉは、その「標的」ｍＲＮＡに対して配列特異的相同性を有する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子によって媒介される（Ｃａｐｌｅｎら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９８：９７４２−９７４７、２００１）。ショウジョウバエの細胞無含有ライセートにおける生化学的研究により、ＲＮＡ依存性遺伝子サイレンシングのメディエイターは、１８〜２５ヌクレオチドの「低分子干渉」ＲＮＡ二本鎖（ｓｉＲＮＡ）であることが示されている。したがって、ｓｉＲＮＡ分子は、本発明の方法に好都合に使用される。ｓｉＲＮＡは、Ｄｉｃｅｒと称されるＲＮアーゼＩＩＩ関連ヌクレアーゼによるより長鎖のｄｓＲＮＡの分解によって内因的に生成され得る（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ４０９：３６３−３６６、２００１）。また、ｓｉＲＮＡは、細胞内に外来的に、または発現構築物の転写によって導入され得る。形成されると、ｓｉＲＮＡはタンパク質成分とともに、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体ＲＮＡ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  Ｃｏｍｐｌｅｘ）（ＲＩＳＣ）として知られるエンドリボヌクレアーゼ含有複合体に集結される。ｓｉＲＮＡのＡＴＰ生成型巻き戻しにより、ＲＩＳＣが活性化され、これにより、ワトソン−クリック塩基対合によって相補ｍＲＮＡの転写物が標的化される。なんら特定の理論に拘束されることを望まないが、ＲＩＳＣは標的ｍＲＮＡに誘導され、そこでｓｉＲＮＡ二本鎖が配列特異的に相互作用して触媒的に切断を媒介すると考えられる（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ４０９：３６３−３６６、２００１；Ｂｏｕｔｌａら、Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ  １１：１７７６−１７８０、２００１）。ｍＲＮＡの切断は、ｓｉＲＮＡ鎖が結合した領域の中央付近で起こる。この配列特異的ｍＲＮＡ分解により、遺伝子サイレンシングがもたらされる。
【０３０７】
ＲＮＡｉは、遺伝子機能を解析するため、および哺乳動物細胞の必須遺伝子を同定するために使用されている（Ｅｌｂａｓｈｉｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２６：１９９−２１３、２００２；Ｈａｒｂｏｒｔｈら、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ  １１４：４５５７−４５６５、２００１）（非限定的な一例として、ニューロンが挙げられる（Ｋｒｉｃｈｅｖｓｋｙら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９９：１１９２６−１１９２９、２００２）。ＲＮＡｉはまた、治療モダリティ、例えば、ウイルス、例えば限定されないが、ポリオウイルス（Ｇｉｔｌｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ４１８：３７９−３８０、２００２）およびＨＩＶ（Ｃａｐｏｄｉｃｉら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６９：５１９６−５２０１、２００２）の感染、複製および／または増殖の阻害または阻止、ならびに癌遺伝子（例えば、ｂｃｒ−ａｂｌ遺伝子；Ｓｃｈｅｒｒら、Ｂｌｏｏｄ  Ｓｅｐ  ２６（出版前に電子公開（ｅｐｕｂ  ａｈｅａｄ  ｏｆ  ｐｒｉｎｔ）），２００２）の発現の低減について評価されている。ＲＮＡｉは、哺乳動物（マウス）および両生類（ツメガエル）の胚における遺伝子発現をモジュレートするため（それぞれ、Ｃａｌｅｇａｒｉら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９９：１４２３６−１４２４０、２００２；およびＺｈｏｕら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３０：１６６４−１６６９、２００２）、ならびに生後のマウスにおける遺伝子発現をモジュレートするため（Ｌｅｗｉｓら、Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ３２：１０７−１０８、２００２）、ならびに成体トランスジェニックマウスにおいて導入遺伝子発現を低減するため（ＭｃＣａｆｆｒｅｙら、Ｎａｔｕｒｅ  ４１８：３８−３９、２００２）に使用されている。細胞培養物中およびインビボでのｓｉＲＮＡの有効性および特異性を測定するための方法が報告されている（例えば、Ｂｅｒｔｒａｎｄら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２９６：１０００−１００４、２００２；Ｌａｓｓｕｓら、Ｓｃｉ  ＳＴＫＥ  ２００２（１４７）：ＰＬ１３、２００２；およびＬｅｉｒｄａｌら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２９５：７４４−７４８、２００２を参照のこと）。
【０３０８】
ＲＮＡｉを媒介する分子、例えば限定されないが、ｓｉＲＮＡは、インビトロでの化学合成（Ｈｏｈｊｏｈ、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ５２１：１９５−１９９、２００２）、ｄｓＲＮＡの加水分解（Ｙａｎｇら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９９：９９４２−９９４７、２００２）、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを用いたインビトロ転写（Ｄｏｎｚｅｅｔら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３０：ｅ４６、２００２；Ｙｕら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９９：６０４７−６０５２、２００２）、および大腸菌ＲＮアーゼＩＩＩなどのヌクレアーゼを用いた二本鎖ＲＮＡの加水分解（Ｙａｎｇら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９９：９９４２−９９４７、２００２）によって作製され得る。
【０３０９】
ｓｉＲＮＡ分子はまた、２つのオリゴヌクレオチドの互いへのアニーリングによっても形成され得、典型的には、二本鎖部分と単鎖部分の両方を含む以下の一般構造を有する。
【０３１０】
【化１６】
2014221076.tif 000019
式中、Ｎ、ＸおよびＹはヌクレオチドである；ＸはＹに水素結合する；「：」は、２つの塩基間の水素結合を意味する；ｘは、１〜約１００の値を有する自然数の整数である；ならびにｍおよびｎは独立して、０〜約１００の値を有する自然数の整数である。一部のある実施形態において、Ｎ、ＸおよびＹは独立して、Ａ、Ｇ、ＣおよびＴまたはＵである。天然に存在しない塩基およびヌクレオチドが、特に合成ｓｉＲＮＡの場合に存在し得る（すなわち、２つのオリゴヌクレオチドのアニーリング産物）。二本鎖の中央部分は、「コア」と呼ばれ、測定単位として塩基対（ｂｐ）を有する。単鎖部分は突出端であり、測定単位としてヌクレオチド（ｎｔ）を有する。図示された突出端は３’突出端であるが、５’突出端を有する分子もまた本発明の範囲内である。また、突出端のないｓｉＲＮＡ分子（すなわち、ｍ＝０およびｎ＝０）、ならびにコアの一方側には突出端を有するが他端にはないもの（例えば、ｍ＝０およびｎ＞１、またはその逆）も本発明の範囲内である。
【０３１１】
最初は、ＲＮＡｉ手法は、哺乳動物系に容易に適用可能であるとは思われていなかった。これは、哺乳動物では、ｄｓＲＮＡがｄｓＲＮＡ活性化プロテインキナーゼ（ＰＫＲ）を活性化し、アポトーシスカスケードおよび細胞死がもたらされるためである（Ｄｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：３２７９−３２８３、１９９７）。また、以前から、ｄｓＲＮＡが哺乳動物細胞においてインターフェロンカスケードを活性化し、また、それにより細胞生理機能の改変がもたらされ得ることが知られている（Ｃｏｌｂｙら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２５：３３３、１９７１；Ｋｌｅｉｎｓｃｈｍｉｄｔら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４１：５１７、１９７２；Ｌａｍｐｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ５８Ｌ７８２、１９６７；Ｌｏｍｎｉｃｚｉら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８：５５、１９７０；およびＹｏｕｎｇｅｒら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．９２：８６２、１９６６）。しかしながら、ＰＫＲおよびインターフェロンカスケードのｄｓＲＮＡ媒介型活性化には、約３０塩基対より長いｄｓＲＮＡが必要とされる。対照的に、３０塩基対未満の長さのｄｓＲＮＡは、哺乳動物細胞においてＲＮＡｉを引き起こすことが知られている（Ｃａｐｌｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８：９７４２−９７４７、２００１）。したがって、長鎖ｄｓＲＮＡを実質的に含まない短鎖ＲＮＡを作製することにより、長鎖ｄｓＲＮＡ分子に伴う望ましくない非特異的効果が回避され得ることが予測される。
【０３１２】
ｓｉＲＮＡに関する参考文献：Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ４０９：３６３−３６６、２００１；Ｂｏｕｔｌａら、Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ  １１：１７７６−１７８０、２００１；Ｃｕｌｌｅｎ、Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．３：５９７−５９９、２００２；Ｃａｐｌｅｎら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９８：９７４２−９７４７、２００１；Ｈａｍｉｌｔｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８６：９５０−９５２、１９９９；Ｎａｇａｓｅら、ＤＮＡ  Ｒｅｓ．６：６３−７０、１９９９；Ｎａｐｏｌｉら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ２：２７９−２８９、１９９０；Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎら、Ｍａｍｍ．Ｇｅｎｏｍｅ  １３：６７−７３、２００２；Ｐａｒｒｉｓｈら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ６：１０７７−１０８７、２０００；Ｒｏｍａｎｏら、Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ６：３３４３−３３５３、１９９２；Ｔａｂａｒａら、Ｃｅｌｌ  ９９：１２３−１３２、１９９９；およびＴｕｓｃｈｌ、Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ．２：２３９−２４５、２００１。
【０３１３】
Ｐａｄｄｉｓｏｎら（Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖ．１６：９４８−９５８、２００２）により、ヘアピン状にフォールディングされた低分子ＲＮＡ分子が、ＲＮＡｉを行なうための手段として使用された。したがって、かかるショートヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子もまた、本発明の方法に好都合に使用される。機能性ｓｈＲＮＡの幹部およびループの長さは種々である。幹の長さは、約２５〜約３０ｎｔの任意の範囲であり得、ループの大きさは、４〜約２５ｎｔの範囲であり得、サイレンシング活性に影響しない。なんら特定の理論に拘束されることを望まないが、このようなｓｈＲＮＡは、ＤＩＣＥＲ  ＲＮアーゼのｄｓＲＮＡ産物と類似しており、任意の事象において、特定の遺伝子の発現の阻害に対して同じ能力を有すると考えられる。
【０３１４】
一部のある実施形態において、本発明は、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡがＮｇＲ１発現を阻害するものを提供する。一部のある実施形態において、本発明は、さらに、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡが、ＣＵＡＣＵＵＣＵＣＣＣＧＣＡＧＧＣＧ（配列番号５２）またはＣＣＣＧＧＡＣＣＧＡＣＧＵＣＵＵＣＡＡ（配列番号５４）またはＣＵＧＡＣＣＡＣＵＧＡＧＵＣＵＵＣＣＧ（配列番号５６）を含むヌクレオチド配列と少なくとも８０％、９０％または９５％同一であるものを提供する。他の実施形態において、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡヌクレオチド配列は、ＣＵＡＣＵＵＣＵＣＣＣＧＣＡＧＧＣＧ（配列番号５２）またはＣＣＣＧＧＡＣＣＧＡＣＧＵＣＵＵＣＡＡ（配列番号５４）またはＣＵＧＡＣＣＡＣＵＧＡＧＵＣＵＵＣＣＧ（配列番号５６）である。
【０３１５】
一部のある実施形態において、本発明は、さらに、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡヌクレオチド配列が、ポリヌクレオチド配列ＧＡＴＧＡＡＧＡＧＧＧＣＧＴＣＣ  ＧＣＴ（配列番号５３）またはＧＧＧＣＣＴＧＧＣＴＧＣＡＧＡＡＧＴＴ（配列番号５５）またはＧＡＣＴＧＧＴＧＡＣＴＣＡＧＡＧ  ＡＡＧＧＣ（配列番号５７）によって生成するｍＲＮＡに相補的であるものを提供する。
【０３１６】
本発明の一部のある実施形態において、ｓｈＲＮＡは、実施例２６に記載のように、レンチウイルスベクターから発現される。
【０３１７】
修飾を有する（塩基、糖鎖および／またはリン酸基）核酸分子を化学合成することにより、血清リボヌクレアーゼによるその分解が抑制され得、その効力が増大され得る（例えば、Ｅｃｋｓｔｅｉｎら、国際特許公開公報ＷＯ９２／０７０６５；Ｐｅｒｒａｕｌｔら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４４：５６５（１９９０）；Ｐｉｅｋｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５３：３１４（１９９１）；ＵｓｍａｎおよびＣｅｄｅｒｇｒｅｎ，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．７７：３３４（１９９２）；Ｕｓｍａｎら、国際特許公開公報ＷＯ９３／１５１８７；およびＲｏｓｓｉら、国際特許公開公報ＷＯ９１／０３１６２；Ｓｐｒｏａｔ，米国特許第５，３３４，７１１号；Ｇｏｌｄら、米国特許第６，３００，０７４号；およびＢｕｒｇｉｎら（上掲）（これらはすべて、引用により本明細書に組み込まれる）を参照のこと）。上記の参考文献はすべて、本明細書に記載の核酸分子の塩基、リン酸基および／または糖鎖部分に対して行われ得る種々の化学的修飾を記載したものである。細胞内でのその有効性を増強し、核酸分子からの塩基の除去を増強するオリゴヌクレオチド合成時間を短縮し、化学的要件を低減する修飾が望ましい。
【０３１８】
当該技術分野では、そのヌクレアーゼの安定性および有効性の有意な増強を伴って核酸分子内に導入され得る糖鎖、塩基およびリン酸基の修飾を示すいくつかの例がある。例えば、オリゴヌクレオチドは、安定性を増強するため、および／または生物学的活性を増強するために、ヌクレアーゼ抵抗性基、例えば、２’−アミノ、２’−Ｃ−アリル、２’−フルオロ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−アリル、２’−Ｈ、ヌクレオチド塩基修飾による修飾によって修飾される（概説については、ＵｓｍａｎおよびＣｅｄｅｒｇｒｅｎ、ＴＩＢＳ．１７：３４（１９９２）；Ｕｓｍａｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．３１：１６３（１９９４）；Ｂｕｒｇｉｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３５：１４０９０（１９９６）を参照のこと）。核酸分子の糖鎖の修飾は、当該技術分野において広く報告されている（Ｅｃｋｓｔｅｉｎら、国際特許ＰＣＴ公開公報番号ＷＯ９２／０７０６５；Ｐｅｒｒａｕｌｔら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４４：５６５−５６８（１９９０）；Ｐｉｅｋｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５３：３１４−３１７（１９９１）；ＵｓｍａｎおよびＣｅｄｅｒｇｒｅｎ、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１７：３３４−３３９（１９９２）；Ｕｓｍａｎら、国際特許ＰＣＴ公開公報番号ＷＯ９３／１５１８７；Ｓｐｒｏａｔ、米国特許第５，３３４，７１１号およびＢｅｉｇｅｌｍａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２５７０２（１９９５）；Ｂｅｉｇｅｌｍａｎら、国際特許ＰＣＴ公開公報番号ＷＯ９７／２６２７０；Ｂｅｉｇｅｌｍａｎら、米国特許第５，７１６，８２４号；Ｕｓｍａｎら、米国特許第５，６２７，０５３号；Ｗｏｏｌｆら、国際特許ＰＣＴ公開公報ＷＯ９８／１３５２６；Ｋａｒｐｅｉｓｋｙら、１９９８、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．３９：１１３１（１９９８）；ＥａｒｎｓｈａｗおよびＧａｉｔ、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）４８：３９−５５（１９９８）；ＶｅｒｍａおよびＥｃｋｓｔｅｉｎ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６７：９９−１３４（１９９８）；およびＢｕｒｌｉｎａら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．５：１９９９−２０１０（１９９７）（該参考文献はすべて、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照のこと）。かかる刊行物には、触媒作用をモジュレートすることなく核酸分子内への糖、塩基および／またはリン酸基の修飾などの組込みの位置を調べるための、一般的な方法およびストラテジーが記載されており、引用により本明細書に組み込まれる。かかる教示に鑑み、細胞内での（ｉｓ  ｃｅｌｌｓ）ｓｉＲＮＡがＲＮＡｉを促進する能力が有意に阻害されない限り、同様の修飾を本明細書に記載のようにして使用し、本発明のｓｉＲＮＡ核酸分子が修飾され得る。
【０３１９】
本発明は、リン酸基主鎖の修飾が、１つ以上のホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、モルホリノ、アミデート  カルバメート、カルボキシメチル、アセトアミデート、ポリアミド、スルホネート、スルホンアミド、スルファメート、ホルムアセタール、チオホルムアセタールおよび／またはアルキルシリル置換を含む、修飾されたｓｉＲＮＡ分子を扱う。オリゴヌクレオチド主鎖修飾の概説については、ＨｕｎｚｉｋｅｒおよびＬｅｕｍａｎｎ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，ｉｎ  Ｍｏｄｅｒｎ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、ＶＣＨ、３３１−４１７（１９９５）、ならびにＭｅｓｍａｅｋｅｒら、Ｎｏｖｅｌ  Ｂａｃｋｂｏｎｅ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，ｉｎ  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、ＡＣＳ、２４−３９（１９９４）を参照のこと。
【０３２０】
ホスホロチオエート、ホスホロチオエートおよび／または５’−メチルホスホネート連結によるオリゴヌクレオチドのヌクレオチド間連結の化学的修飾によって、安定性が改善されるが、過剰な修飾は、いくらかの毒性または活性の低下をもたらし得る。したがって、核酸分子を設計する場合、これらのヌクレオチド間連結の量は、最小限にとどめるのがよい。このような連結の濃度の低減により、毒性が低下し、これらの分子の有効性の増大およびより高い特異性がもたらされるはずである。
【０３２１】
活性を維持または増強する化学的修飾を有するｓｉＲＮＡ分子が提供される。また、かかる核酸は、一般的に、未修飾核酸よりもヌクレアーゼに対して抵抗性である。したがって、インビトロおよび／またはインビボ活性は、有意に低下しないはずである。モジュレーションが目的である場合、体外から送達される治療用核酸分子は、不要なタンパク質のレベルを低下させるのに充分長期間、標的ＲＮＡの翻訳がモジュレートされるまで、細胞内で最適に安定であるのがよい。この期間は、疾患状態に応じて数時間〜数日間の間で種々である。ＲＮＡおよびＤＮＡの化学合成の改善（Ｗｉｎｃｏｔｔら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３：２６７７（１９９５）；Ｃａｒｕｔｈｅｒｓら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｔｏｇｙ  ２１１：３−１９（１９９２）（引用により本明細書に組み込まれる））により、上記のようなヌクレアーゼ安定性を増強するためにヌクレオチド修飾を導入することにより核酸分子を修飾できる可能性が拡大された。
【０３２２】
本発明のポリヌクレオチドは、１個以上（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれ以上）のＧ−クランプヌクレオチドを含むものであり得る。Ｇ−クランプヌクレオチドは、修飾シトシン類縁体であって、該修飾により、二本鎖内の相補グアニンのワトソン−クリック面とフーグスティーン面の両方に水素結合する能力が付与されたものである（例えば、ＬｉｎおよびＭａｔｔｅｕｃｃｉ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２０：８５３１−８５３２（１９９８）を参照のこと）。オリゴヌクレオチド内の単一のＧ−クランプ類縁体置換は、相補オリゴヌクレオチドにハイブリダイズしたとき、相当ならせんの熱安定性の増強およびミスマッチの識別をもたらし得る。かかるヌクレオチドを本発明のポリヌクレオチド内に含めることにより、核酸標的、相補配列または鋳型鎖に対する親和性と特異性の両方の向上がもたらされる。本発明のポリヌクレオチドはまた、１個以上（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれ以上）のＬＮＡ「ロックト核酸」ヌクレオチド、例えば、２’，４’−Ｃミチレン（ｍｙｔｈｙｌｅｎｅ）ビシクロヌクレオチドなど（例えば、Ｗｅｎｇｅｌら、国際特許ＰＣＴ公開公報ＷＯ００／６６６０４およびＷＯ９９／１４２２６を参照のこと）を含むものであり得る。
【０３２３】
本発明はまた、本発明のｓｉＲＮＡ分子の結合体および／または複合体を扱う。かかる結合体および／または複合体は、生物学的系（例えば、細胞）内へのｓｉＲＮＡ分子の送達を助長するために使用され得る。本発明によって提供される結合体および複合体は治療用化合物を、細胞膜を越えて移送し、本発明の核酸分子の薬物動態を改変および／または局在をモジュレートすることにより、治療活性を提供し得るものである。本発明には、分子、例えば限定されないが、小分子、脂質、リン脂質、ヌクレオシド、ヌクレオチド、核酸、抗体、毒素、負電荷を有するポリマーおよび他のポリマー、例えば、タンパク質、ペプチド、ホルモン、糖質、ポリエチレングリコールまたはポリアミンを、細胞膜を越えて送達するための新規な結合体および複合体の設計および合成が包含される。一般に、記載の輸送体は、個々に、または多成分系の一部として分解性リンカーとともにもしくはなしでのいずれかで使用されるように設計される。これらの化合物は、血清の存在下または非存在下で、異なる組織由来のいくつかの細胞への本発明の核酸分子の送達および／または局在化を改善することが予測される（ＳｕｌｌｅｎｇｅｒおよびＣｅｃｈ、米国特許第５，８５４，０３８号を参照のこと）。本明細書に記載の分子の結合体は生物学的に活性な分子に、生分解性であるリンカー、例えば、生分解性の核酸リンカー分子によって結合され得る。
【０３２４】
体外から送達される治療用ポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＲＮＡ分子）は、ＲＮＡ転写物のレベルを低下させるのに充分長期間、ＲＮＡの逆転写がモジュレートされるまで、細胞内で最適に安定である。該核酸分子は、有効な細胞内治療用薬剤としての機能を果たすため、ヌクレアーゼに対して抵抗性である。本明細書に記載および当該技術分野で報告された核酸分子の化学合成の改善により、上記のようなヌクレアーゼ安定性を増強するためにヌクレオチド修飾を導入することにより核酸分子を修飾できる可能性が拡大された。
【０３２５】
本発明はまた、ＲＮＡｉに関与するタンパク質の酵素的活性を維持または増強する化学的修飾を有するｓｉＲＮＡ分子を提供する。また、かかる核酸は、一般的に、未修飾核酸よりもヌクレアーゼに対して抵抗性である。したがって、インビトロおよび／またはインビボ活性は、有意に低下しないはずである。
【０３２６】
本発明のポリヌクレオチド系分子の使用は、併用療法（例えば、異なる遺伝子に標的化される多数のｓｉＲＮＡ分子；既知の小分子モジュレータとカップリングさせた核酸分子；あるいは分子（例えば、異なるモチーフおよび／または他の化学的もしくは生物学的分子）の組合せによる断続的処置）の可能性を提供することにより、疾患進行のより良好な処置をもたらす。また、ｓｉＲＮＡ分子での被検体の処置としては、異なる型の核酸分子、例えば、酵素的核酸分子（リボザイム）、アロザイム、アンチセンス、２，５−Ａオリゴアデニレート、おとり（ｄｅｃｏｙ）、アプタマーなどの組合せが挙げられ得る。
【０３２７】
別の態様において、本発明のｓｉＲＮＡ分子は、１つ以上の５’および／または３’−キャップ構造を、例えば、センスｓｉＲＮＡ鎖のみ、アンチセンスｓｉＲＮＡ鎖のみまたは両方のｓｉＲＮＡ鎖に含むものであり得る。「キャップ構造」により、オリゴヌクレオチドのいずれかの末端に組み込まれた化学的修飾が意図される（例えば、Ａｄａｍｉｃら、米国特許第５，９９８，２０３号（引用により本明細書に組み込まれる）を参照のこと）。これらの末端修飾により、核酸分子がエキソヌクレアーゼ分解から保護され、細胞内での送達および／または局在化が補助され得る。キャップは、５’末端（５’−キャップ）もしくは３’末端（３’−キャップ）に存在させ得るか、または両方の末端に存在させ得る。非限定的な例において、５’−キャップは、逆位無塩基残基（部分）；４’，５’−メチレンヌクレオチド；１−（β−Ｄ−エリトロフラノシル）ヌクレオチド、４’−チオヌクレオチド；炭素環式ヌクレオチド；１，５−アンヒドロヘキシトールヌクレオチド；Ｌ−ヌクレオチド；α−ヌクレオチド；修飾塩基ヌクレオチド；ホスホロジチオエート結合；トレオ−ペントフラノシルヌクレオチド；非環式３’，４’−セコヌクレオチド；非環式３，４−ジヒドロキシブチルヌクレオチド；非環式３，５−ジヒドロキシペンチルヌクレオチド、３’−３’−逆位ヌクレオチド部分；３’−３’−逆位無塩基部分；３’−２’−逆位ヌクレオチド部分；３’−２’−逆位無塩基部分；１，４−ブタンジオールホスフェート；３’−ホスホルアミデート；ヘキシルホスフェート；アミノヘキシルホスフェート；３’−ホスフェート；３’−ホスホロチオエート；ホスホロジチオエート；または橋絡もしくは非橋絡メチルホスホネート部分を含む群から選択される。
【０３２８】
３’−キャップは、４’、５’−メチレンヌクレオチド；ｌ−（β−Ｄ−エリトロフラノシル）ヌクレオチド；４’−チオヌクレオチド、炭素環式ヌクレオチド；５’−アミノ−アルキルホスフェート；１，３−ジアミノ２−プロピルホスフェート；３−アミノプロピルホスフェート；６−アミノヘキシルホスフェート；１，２−アミノドデシルホスフェート；ヒドロキシプロピルホスフェート；１，５−アンヒドロヘキシトールヌクレオチド；Ｌ−ヌクレオチド；α−ヌクレオチド；修飾塩基ヌクレオチド；ホスホロジチオエート；トレオ−ペントフラノシルヌクレオチド；非環式３’，４’−セコヌクレオチド；３，４−ジヒドロキシブチルヌクレオチド；３，５−ジヒドロキシペンチルヌクレオチド、５’−５’−逆位ヌクレオチド部分；５’−５’−逆位無塩基部分；５’−ホスホルアミデート；５’−ホスホロチオエート；１，４−ブタンジオールホスフェート；５’−アミノ；橋絡および／または非橋絡５’−ホスホルアミデート、ホスホロチオエートおよび／またはホスホロジチオエート、橋絡または非橋絡メチルホスホネートまたは５’−メルカプト部分を含む群から選択され得る（さらなる詳細については、ＢｅａｕｃａｇｅおよびＩｙｅｒ、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ４９：１９２５（１９９３）（引用により本明細書に組み込まれる）を参照のこと）。
【０３２９】
このような分子の有用性を向上させるため、核酸ｓｉＲＮＡ構造に対して種々の修飾が行われ得る。かかる修飾により、貯蔵寿命、インビトロ半減期、安定性、および標的部位へのかかるオリゴヌクレオチドの導入し易さが向上し、例えば、細胞膜の透過性が向上し、標的化細胞を認識して結合する能力が付与される。
【０３３０】
アンチセンス手法は、アンチセンスＤＮＡもしくはＲＮＡにより、または三重らせんの形成により遺伝子発現を制御するために使用され得る。アンチセンス手法は、例えば、Ｏｋａｎｏ、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．５６：５６０（１９９１）；Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｓ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、ボーカラトーン、ＦＬ（１９８８）に論考されている。三重らせんの形成は、例えば、Ｌｅｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６：３０７３（１９７９）；Ｃｏｏｎｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ
２４１：４５６（１９８８）；およびＤｅｒｖａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５１：１３００（１９９１）に論考されている、該方法は、相補的なＤＮＡまたはＲＮＡへのポリヌクレオチドの結合に基づくものである。
【０３３１】
例えば、ＮｇＲ１をコードするポリヌクレオチドの５’コード部分を用いて、約１０〜４０塩基対の長さのアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドが設計され得る。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、転写に関与する遺伝子の領域に相補的であり、それにより標的タンパク質の転写および産生が妨げられるように設計される。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドはｍＲＮＡにインビボでハイブリダイズし、標的ポリペプチドへのｍＲＮＡ分子の翻訳を阻止する。
【０３３２】
一実施形態において、ＮｇＲ１遺伝子に特異的なアンチセンス核酸は、外因性配列からの転写によって細胞内で生成される。例えば、ベクターまたはその一部分が転写され、アンチセンス核酸（ＲＮＡ）が生成される。かかるベクターは、転写されて所望のアンチセンスＲＮＡをもたらす限り、エピソームのまま維持されていてもよく、染色体に組み込まれた状態であってもよい。かかるベクターは、当該技術分野で標準的な組換えＤＮＡ手法方法によって構築され得る。ベクターは、プラスミド、ウイルス、または脊椎動物細胞での複製および発現に使用される当該技術分野で知られたその他のものであり得る。アンチセンス分子の発現は、脊椎動物（好ましくはヒト細胞）において作用する当該技術分野で知られた任意のプロモーター（例えば、本明細書の他の箇所に記載のものなど）によるものであり得る。
【０３３３】
アンチセンス分子の絶対的な相補性は、好ましいが必要ではない。ＮｇＲ１をコードするＲＮＡの少なくとも一部分に相補的な配列は、該ＲＮＡとハイブリダイズして安定な二本鎖が形成され得るか、または三重らせん形成がアッセイされ得るのに充分な相補性を有する配列を意味する。ハイブリダイズする能力は、アンチセンス核酸の相補性の程度および長さの両方に依存する。一般的に、ハイブリダイズする核酸が長いほど、内包され得る塩基ミスマッチが多くなるが、依然として安定な二本鎖（または場合によっては三重らせん）が形成され得る。当業者には、標準的な手順を使用してハイブリダイズ複合体の融解点を測定することにより、許容されるミスマッチの程度を確認することができよう。
【０３３４】
メッセンジャーＲＮＡの５’末端、例えば、ＡＵＧ開始コドン（該コドンを含む）までの５’非翻訳配列に相補的なオリゴヌクレオチドは、翻訳の阻害において最も効率的に機能を果たすはずである。しかしながら、ｍＲＮＡの３’非翻訳配列に相補的な配列も同様に、ｍＲＮＡの翻訳の阻害に有効ことが示されている。一般的には、Ｗａｇｎｅｒ，Ｒ．、Ｎａｔｕｒｅ  ３７２：３３３−３３５（１９９４）を参照のこと。したがって、５’または３’いずれかの非翻訳非コード領域に相補的なオリゴヌクレオチドが、ＮｇＲ１の翻訳を阻害するためのアンチセンスアプローチにおいて使用され得る。ｍＲＮＡの５’非翻訳領域に相補的なオリゴヌクレオチドは、ＡＵＧ開始コドンの相補鎖を含むものであるのがよい。ｍＲＮＡコード領域に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、効率性の低い翻訳阻害因子であるが、本発明に従って使用され得る。アンチセンス核酸は、少なくとも６ヌクレオチド長であるのがよく、好ましくは、６〜約５０ヌクレオチド長の範囲のオリゴヌクレオチドである。具体的なある態様において、該オリゴヌクレオチドは、少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも１７ヌクレオチド、少なくとも２５ヌクレオチドまたは少なくとも５０ヌクレオチドである。
【０３３５】
本明細書に開示された治療方法における使用のためのポリヌクレオチド、例えば、後述するアプタマーは、ＤＮＡもしくはＲＮＡもしくはキメラ混合物もしくは誘導体、またはその修飾異形、単鎖または二本鎖であり得る。該オリゴヌクレオチドは、例えば、分子の安定性、ハイブリダイゼーションなどを改善するために、塩基部分、糖鎖部分またはリン酸主鎖が修飾されたものであり得る。該オリゴヌクレオチドは、他の懸垂基、例えば、ペプチド（例えば、宿主細胞レセプターのインビボでの標的化のため）、または細胞膜を超える輸送を助長する薬剤（例えば、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：６５５３−６５５６（１９８９）；Ｌｅｍａｉｔｒｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４：６４８−６５２（１９８７））；ＰＣＴ公開公報番号ＷＯ８８／０９８１０（１９８８年１２月１５日公開）を参照のこと）もしくは血液脳関門を越える輸送を助長する薬剤（例えば、ＰＣＴ公開公報番号ＷＯ８９／１０１３４（１９８８年４月２５日公開）を参照のこと）、ハイブリダイゼーション誘発型切断剤（例えば、Ｋｒｏｌら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：９５８−９７６（１９８８）を参照のこと）またはインターカレート剤などを含むものであり得る（例えば、Ｚｏｎ、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．５：５３９−５４９（１９８８）を参照のこと）。この目的のため、該オリゴヌクレオチドを、別の分子、例えば、ペプチド、ハイブリダイゼーション誘発型架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーション誘発型切断剤などに結合体化させ得る。
【０３３６】
本明細書に開示された治療方法における使用のためのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾塩基部分を含むものであり得、該修飾塩基部分は、限定されないが、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルケオシン、イノシン、Ｎ−６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２、２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ−６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルケオシン、５’メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ−６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン、プソイドウラシル、ケオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３（３−アミノ−３−Ｎ２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリンを含む群から選択される。
【０３３７】
本明細書に開示された治療方法における使用のためのアンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、限定されないが、アラビノース、２−フルオロアラビノース、キシルロースおよびヘキソースを含む群から選択される少なくとも１つの修飾糖鎖部分を含むものであり得る。
【０３３８】
また別の実施形態において、本明細書に開示された治療方法における使用のためのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、限定されないが、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホルアミドチオエート、ホスホルアミデート、ホスホルジアミデート、メチルホスホネート、アルキルホスホトリエステルおよびホルムアセタールまたはその類縁体を含む群から選択される少なくとも１つの修飾リン酸主鎖を含むものである。
【０３３９】
また別の実施形態において、本明細書に開示された治療方法における使用のためのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、α−アノマーオリゴヌクレオチドである。α−アノマーオリゴヌクレオチドは、相補ＲＮＡと特異的二本鎖ハイブリッドを形成するが、この場合、通常の状況とは逆に、鎖は互いに平行である（Ｇａｕｔｉｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：６６２５−６６４１（１９８７））。該オリゴヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド（Ｉｎｏｕｅら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：６１３１−６１４８（１９８７））、またはキメラＲＮＡ−ＤＮＡ類縁体（Ｉｎｏｕｅら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２１５：３２７−３３０（１９８７））である。
【０３４０】
本発明のポリヌクレオチド、例えば、アプタマーは、当該技術分野で知られた標準的な方法によって、例えば、自動ＤＮＡ合成装置（例えば、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから市販されたものなど）の使用によって合成され得る。一例として、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、Ｓｔｅｉｎら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：３２０９（１９８８）の方法によって合成され得、メチルホスホネートオリゴヌクレオチドは、コントロールド・ポア・ガラスポリマー支持体の使用によって作製され得る（Ｓａｒｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：７４４８−７４５１（１９８８））などである。
【０３４１】
本明細書に開示された治療方法における使用のためのポリヌクレオチド組成物は、さらに、触媒性ＲＮＡまたはリボザイムを含む（例えば、ＰＣＴ国際特許公開公報ＷＯ９０／１１３６４（１９９０年１０月４日公開）；Ｓａｒｖｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：１２２２−１２２５（１９９０）を参照のこと）。ハンマーヘッド型リボザイムの使用が好ましい。ハンマーヘッド型リボザイムはｍＲＮＡを、標的ｍＲＮＡと相補的な塩基対を形成するフランキング領域によって指令される位置で切断する。唯一の要件は、標的ｍＲＮＡが２つの塩基の以下の配列：５’−ＵＧ−３’を有することである。ハンマーヘッド型リボザイムの構築および作製は当該技術分野でよく知られており、ＨａｓｅｌｏｆｆおよびＧｅｒｌａｃｈ、Ｎａｔｕｒｅ  ３３４：５８５−５９１（１９８８）により充分に記載されている。好ましくは、リボザイムは、切断認識部位が標的ｍＲＮＡの５’末端付近に位置するように、すなわち、効率が増大し、非機能的ｍＲＮＡ転写物の細胞内蓄積が最小限となるように操作される。
【０３４２】
アンチセンスアプローチの場合ように、本明細書に開示された診断および治療方法における使用のためのリボザイムは、修飾オリゴヌクレオチド（例えば、安定性、標的化の改善のためなど）で構成されたものであり得、ＮｇＲ１をインビボで発現する細胞に送達され得る。リボザイムをコードするＤＮＡ構築物は、アンチセンスコードＤＮＡの導入について上記と同様にして細胞内に導入され得る。好ましい送達方法は、強力な構成的プロモーター（例えば、ｐｏｌ  ＩＩＩまたはｐｏｌ  ＩＩプロモーターなど）の制御下にあるリボザイム「コード」ＤＮＡ構築物の使用を伴い、その結果、トランスフェクト細胞は、充分な量のリボザイムを産生し、内因性ＮｇＲ１メッセージが破壊され、翻訳が阻害される。リボザイムは、アンチセンス分子とは異なり触媒性であるため、効率性に必要とされる細胞内濃度はより低い。
【０３４３】
（アプタマー）
別の実施形態において、本発明の方法における使用のためのＮｇＲ１アンタゴニストはアプタマーである。アプタマーは、特殊な配列を有し、所望の標的（例えば、ポリペプチド）に対する特異的結合特性を有し、所与の標的の特異的リガンドであるヌクレオチドまたはポリペプチドであり得る。本発明のヌクレオチドアプタマーとしては、ＮｇＲ１に結合する二本鎖ＤＮＡおよび単鎖ＲＮＡ分子が挙げられる。
【０３４４】
核酸アプタマーは、当該技術分野で知られた方法を用いて、例えば、試験管内人工進化（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）（ＳＥＬＥＸ）法によって選択される。ＳＥＬＥＸは、標的分子に対して高度に特異的な結合性を有する核酸分子のインビトロ進化のための方法であり、例えば、米国特許第５，４７５，０９６号、同第５，５８０，７３７号、同第５，５６７，５８８号、同第５，７０７，７９６号、同第５，７６３，１７７号、同第６，０１１，５７７号および同第６，６９９，８４３号（引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。アプタマーを同定するための別のスクリーニング方法は、米国特許第５，２７０，１６３号（これも、引用により本明細書に組み込まれる）に記載されている。ＳＥＬＥＸ法は、さまざまな２次元および３次元構造を形成する核酸の能力、ならびに実質的に任意の化合物（モノマーまたはポリマーいずれも）、例えば、他の核酸分子およびポリペプチドのリガンドとして作用する（特異的結合対を形成する）ためのヌクレオチドモノマー内で利用可能な化学的多能性に基づく。任意の大きさまたは組成の分子が標的として供され得る。
【０３４５】
ＳＥＬＥＸ法は、候補オリゴヌクレオチドの混合物からの選択、ならびに結合、分離および増幅の段階的相互作用を伴ない、所望の結合親和性および選択性を得るための同じ一般的な選択スキームを使用する。核酸の混合物（好ましくは、無作為配列のセグメントを含む）から開始し、ＳＥＬＥＸ法は、該混合物を標的と結合に好都合な条件下で接触させる工程；未結合核酸を、標的分子に特異的に結合した核酸と分離する工程；核酸−標的複合体を解離させる工程；核酸−標的複合体から解離させた核酸を増幅し、リガンド高含有核酸混合物を得る工程を含む。結合、分離、解離および増幅の工程は、標的分子に対する高度に特異的な高親和性核酸リガンドを得るのに所望されるだけ多くのサイクル反復される。
【０３４６】
ヌクレオチドアプタマーは、例えば、診断用ツールとして、または細胞内シグナル伝達および輸送経路を分析するための特異的インヒビターとして使用され得る（Ｊａｍｅｓ（２００１）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１：５４０−５４６）。ヌクレオチドアプタマーは、その高い親和性および特異性により、創薬のための良好な候補となる。例えば、毒素リシンに対するアプタマーアンタゴニストが単離されており、ナノモル範囲のＩＣ５０値を有する（Ｈｅｓｓｅｌｂｅｒｔｈ  ＪＲら（２０００）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７５：４９３７−４９４２）。ヌクレオチドアプタマーはまた、感染性疾患、悪性腫瘍およびウイルス表面タンパク質に対して、細胞感染性を低下させるために使用され得る。
【０３４７】
本発明の方法における使用のためのヌクレオチドアプタマーは、他のポリヌクレオチドについて本明細書に記載のようにして修飾されたものであり得る（例えば、主鎖もしくは塩基の修飾またはペプチドへの結合体化によって）。
【０３４８】
ＮｇＲ１のタンパク質構造を使用し、ＳＥＬＥＸ法を用いたＮｇＲ１に作用するアプタマーのスクリーニングにより、ＮｇＲ１媒介性プロセス（例えば、軸索の再生のＮｇＲ１媒介性阻害）を阻害するアプタマーの同定が可能となる得る。
【０３４９】
本発明の方法における使用のためのポリペプチドアプタマーは、ＮｇＲ１に結合し、それによりその作用をブロックする能力について選択されたランダムペプチドである。ポリペプチドアプタマーは、両端がタンパク質骨格に結合された短い可変ペプチドドメインを含むものであり得る。この二重構造の拘束により、ペプチドアプタマーの結合親和性が、抗体に匹敵するレベル（ナノモル範囲）まで大きく増大する。例えば、Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ  Ｆら（２０００）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  ７８（８）：４２６−４３０を参照のこと。該短い可変ペプチドの長さは、典型的には、約１０〜２０アミノ酸であり、その骨格は、良好な可溶性と小型化特性を有する任意のタンパク質であり得る。骨格タンパク質の非限定的な一例は、細菌タンパク質チオレドキシン−Ａである。例えば、Ｃｏｈｅｎ  ＢＡら（１９９８）ＰＮＡＳ  ９５（２４）：１４２７２−１４２７７を参照のこと。
【０３５０】
ポリペプチドアプタマーは、タンパク質機能のドミナント阻害因子としての機能を果たすペプチドまたは小ポリペプチドである。ペプチドアプタマーは、標的タンパク質に特異的に結合し、その機能性能力をブロックする（Ｋｏｌｏｎｉｎら（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９５：１４、２６６−１４、２７１）。高い親和性および特異性で標的タンパク質に結合するペプチドアプタマーは、当該技術分野で知られたさまざまな手法によって単離され得る。ペプチドアプタマーは、ランダムペプチドライブラリーから酵母ツーハイブリッドスクリーニング（Ｘｕ、Ｃ．Ｗ．、ら（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９４：１２、４７３−１２、４７８）またはリボソームディスプレイ（Ｈａｎｅｓら（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９４：４９３７−４９４２）によって単離され得る。該アプタマーはまた、ファージライブラリー（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，Ｈ．Ｒ．、ら（１９９８）Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ４：１−２０）または化学的に作製されたペプチドライブラリーから単離され得る。さらに、ポリペプチドアプタマーは、リガンド調節型ペプチドアプタマー（Ｌｉｇａｎｄ  Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ａｐｔａｍｅｒｓ）（ＬｉＲＰＡ）選択を用いて選択され得る。例えば、Ｂｉｎｋｏｗｓｋｉ  ＢＦら、（２００５）Ｃｈｅｍ  ＆  Ｂｉｏｌ  １２（７）：８４７−８５５（引用により本明細書に組み込まれる）を参照のこと。ペプチドアプタマーは、合成手段が難しいことから、その使用はポリヌクレオチドアプタマーよりも複雑となっているが、無限の化学的多様性を有する。ポリヌクレオチドアプタマーは限定的である、それは、４種類のヌクレオチド塩基しか使用されないが、ペプチドアプタマーでは、ずっと広いレパートリー（すなわち、２０種類のアミノ酸）を有し得るからである。
【０３５１】
本発明の方法における使用のためのペプチドアプタマーは、本明細書の他の箇所で他のポリペプチドについて記載のようにして修飾（例えば、ポリマーに結合体化またはタンパク質に融合）されたものであり得る。
【０３５２】
（組成物）
一部のある実施形態において、本発明は、配列番号１〜５、２６〜２７、２９〜３７および４１〜４５からなる群より選択されるポリペプチドを含む組成物を提供する。
【０３５３】
一部のある実施形態において、本発明は、本発明の抗Ｎｏｇｏレセプター−１抗体もしくはその抗原結合断片または可溶性Ｎｏｇｏレセプター−１ポリペプチドまたは融合タンパク質を含む組成物を提供する。
【０３５４】
一部のある実施形態において、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含む組成物を提供する。
【０３５５】
一部のある実施形態において、本発明は、本発明のポリペプチドおよび抗炎症剤を含む組成物を提供する。
【０３５６】
一部のある実施形態において、本発明は、活性化合物を調製物に加工処理するのを助長し、作用部位への送達のために医薬として使用され得る適当な薬学的に許容され得るキャリア（賦形剤および助剤など）を含有するものであり得る。非経口投与に好適な製剤としては、水溶性形態（例えば、水溶性の塩）の活性化合物の水性液剤が挙げられる。また、活性化合物の懸濁剤、適宜、油性の注射用懸濁剤が投与され得る。好適な親油性溶媒またはビヒクルとしては、脂肪油（例えば、ゴマ油）、または合成脂肪酸エステル（例えば、オレイン酸エチルもしくはトリグリセリド）が挙げられる。水性注射用懸濁剤は、該懸濁剤の粘性を増大させる物質、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールおよびデキストランを含有するものであり得る。任意選択で、懸濁剤は、安定剤もまた含有するものであり得る。また、リポソームを用いて、細胞内への送達用の本発明の分子を封入してもよい。例示的な「薬学的に許容され得るキャリア」は、生理学的に適合性の任意すべての溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤など、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、ならびにその組合せである。一部のある実施形態において、該組成物は、等張剤、例えば、糖類、多価アルコール（マンニトール、ソルビトールまたは塩化ナトリウムなど）を含む。一部のある実施形態において、該組成物は、湿潤剤または微量の補助物質、例えば、湿潤剤または乳化剤、保存剤または緩衝剤などの、本発明の抗体、抗原結合断片、可溶性Ｎｏｇｏレセプターまたは融合タンパク質の貯蔵寿命または有効性を向上させる薬学的に許容され得る物質を含む。
【０３５７】
本発明の組成物は、さまざまな形態、例えば、液状、半固形および固形投薬形態、例えば、液状の液剤（例えば、注射用および浸剤用の液剤）、分散剤または懸濁剤などであり得る。好ましい形態は、意図される投与様式および適用治療に依存する。一実施形態において、組成物は、注射用または浸剤用の液剤、例えば、他の抗体でのヒトの受動免疫処置に使用されるものと同様の組成物の形態である。
【０３５８】
該組成物は、液剤、マイクロエマルジョン剤、分散剤、リポソーム、または高い薬物濃度に適した他の整列構造体として剤化され得る。滅菌注射用液剤は、必要量の抗Ｎｏｇｏレセプター−１抗体を適切な溶媒中に、必要に応じて、上記の成分のうちの１種類または組合せとともに組み込んだ後、濾過滅菌することにより調製され得る。一般的に、分散剤は、活性化合物を、基剤分散媒体および必要な他の成分（上記のもの）を含有する滅菌ビヒクル中に組み込むことにより調製される。滅菌注射用液剤の調製用の滅菌粉末剤の場合、好ましい調製方法は真空乾燥および凍結乾燥であり、これにより、先に滅菌濾過した液剤から活性成分＋任意のさらなる所望の成分の粉末が得られる。液剤の適正な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用、分散剤の場合は必要とされる粒径の維持、および界面活性剤の使用によって維持され得る。注射用組成物の長期吸収は、組成物中に、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸塩およびゼラチンを含めることによってもたらされ得る。
【０３５９】
一部のある実施形態において、活性化合物は、該化合物を急速放出から保護するキャリアとともに調製され得、例えば、制御放出製剤、例えば、埋入物、経皮パッチ剤およびマイクロカプセル封入送達系などである。生分解性で生体適合性のポリマー、例えば、エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸などが使用され得る。かかる製剤の調製のための多くの方法が特許を受けており、一般的に当業者に知られている、例えば、Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ編、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９７８）を参照のこと。
【０３６０】
また、補助的活性化合物を該組成物に組み込んでもよい。一部のある実施形態において、本発明のＮｏｇｏレセプター−１抗体もしくはその抗原結合断片または可溶性Ｎｏｇｏレセプター−１ポリペプチドまたは融合タンパク質は、１種類以上のさらなる治療用薬剤、例えば、抗炎症剤などとともに共製剤化および／または共投与される。一実施形態において、抗炎症剤は非ステロイド系抗炎症剤である。別の実施形態において、抗炎症剤はステロイド系抗炎症剤である。特別な一実施形態において、抗炎症剤はメチルプレドニゾロンである。
【０３６１】
一実施形態において、本発明は、非ステロイド系抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）、そのプロドラッグエステルまたは薬学的に許容され得る塩との組合せでのＮｏｇｏレセプターアンタゴニストの使用に関する。当該技術分野でよく知られたＮＳＡＩＤの例としては、プロピオン酸誘導体（例えば、アルミノプロフェン、ベノキサプロフェン、ブクロキシ酸、カルプロフェン、フェンブフェン、フェノプロフェン、フルプロフェン、フルルビプロフェン、イブプロフェン、インドプロフェン、ケトプロフェン、ミロプロフェン、ナプロキセン、オキサプロジン、ピルプロフェン、プラノプロフェン、スプロフェン、チアプロフェン酸およびチオキサプロフェン）、酢酸誘導体（例えば、インドメタシン、アセメタシン、アルクロフェナク、クリダナク、ジクロフェナク、フェンクロフェナク、フェンクロズ酸、フェンチアザク、フロフェナク、イブフェナク、イソキセパク、オキシピナク、スリンダク、チオピナク、トルメチン、ジドメタシンおよびゾメピラック）、フェナム酸誘導体（例えば、フルフェナム酸、メクロフェナム酸、メフェナム酸、ニフルム酸およびトルフェナム酸）、ビフェニルカルボン酸誘導体（例えば、ジフルニサルおよびフルフェニサル）、オキシカム系（例えば、イソキシカム、ピロキシカム、スドキシカムおよびテノキシカム）、サリチル酸系（例えば、アセチルサリチル酸およびスルファサラジン）ならびにピラゾロン系（例えば、アパゾン、ベズピペリロン、フェプラゾン、モフェブタゾン、オキシフェンブタゾンおよびフェニルブタゾン）が挙げられる；同様の鎮痛特性および抗炎症特性を有するＮＳＡＤＤと構造的に関連するＮＳＡＩＤもまた、この群に包含されることが意図される。
【０３６２】
別の実施形態において、本発明は、任意の１種類以上のステロイド系抗炎症剤（コルチコステロイドなど）、そのプロドラッグエステルまたは薬学的に許容され得る塩などとの組合せでＮｏｇｏレセプターアンタゴニストに関する。かかるステロイド系薬剤の非限定的な例としては、ヒドロコルチゾンおよびヒドロコルチゾンから誘導される化合物、例えば、２１−アセトキシプレグネノロン、アルクロメラゾン、アルゲストン、アムシノニド、ベクロメタゾン、ベタメタゾン、吉草酸ベタメタゾン、ブデソニド、クロロプレドニゾン、クロベタゾール、プロピオン酸クロベタゾール、クロベタゾン、酪酸クロベタゾン、クロコルトロン、クロプレドノール、コルチコステロン、コルチゾン、コルチバゾール、デフラザコン、デソニド、デスオキシメラゾン、デキサメタゾン、ジフロラゾン、ジフルコルトロン、ジフルプレドナート、エノキソロン、フルザコート、フルクロロニド、フルメタゾン、ピバリン酸フルメタゾン、フルニソリド、フルシノロンアセトニド、フルオシノニド、フルオロシノロンアセトニド、フルオコルチンブチル、フルオコルトロン、フルオロコルトロンヘキサノエート、吉草酸ジフルコルトロン、フルオロメトロン、酢酸フルペロロン、酢酸フルプレドニデン、フルプレドニゾロン、フルランデノリド、ホルモコルタル、ハルシノニド、ハロメタゾン、酢酸ハロプレドン、ヒドロコルタメート、ヒドロコルチゾン、酢酸ヒドロコルチゾン、酪酸ヒドロコルチゾン、リン酸ヒドロコルチゾン、コハク酸ヒドロコルチゾン２１−ナトリウム、ヒドロコルチゾンテブテート、マジプレドン、メドリソン、メプレドニゾン、メチルプレドニゾロン、フランカルボン酸モメタゾン、パラメタゾン、プレドニカルバート、プレドニゾロン、プレドニゾロン２１−ジエドライアミノ酢酸塩、リン酸プレドニゾロンナトリウム、コハク酸プレドニゾロンナトリウム、２１−ｍ−スルホ安息香酸プレドニゾロンナトリウム、２１−ステアログリコール酸プレドニゾロンナトリウム、プレドニゾロンテブテート、２１−トリメチル酢酸プレドニゾロン、プレドニゾン、プレドニバル、プレドニリデン、２１−ジエチルアミノ酢酸プレドニリデン、チキソコルトール、トリアムシノロン、トリアムシノロンアセトニド、トリアムシノロンベネトニドおよびトリアムシノロンヘキサアセトニドが挙げられる。同様の鎮痛特性および抗炎症特性を有する構造的に関連するコルチコステロイドもまた、この群に包含されることが意図される。特別な一実施形態において、Ｎｏｇｏレセプターアンタゴニストは、メチルプレドニゾロンとの組合せで使用される。
【０３６３】
本発明の医薬組成物は、「治療有効量」または「予防有効量」の本発明の抗体、抗原結合断片、ポリペプチド（１種類または複数種）または融合タンパク質を含むものであり得る。「治療有効量」は、投薬量において必要な期間、所望の治療成果が達成されるのに有効な量をいう。Ｎｏｇｏレセプター−１抗体もしくはその抗原結合断片、可溶性Ｎｏｇｏレセプター−１ポリペプチドまたはＮｏｇｏレセプター融合タンパク質の治療有効量は、個体の疾患状態、年齢、性別および体重などの要素に従って異なり得る。治療有効量はまた、抗体、抗原結合断片、可溶性Ｎｏｇｏレセプター−１ポリペプチドまたはＮｏｇｏレセプター融合タンパク質の任意の毒性効果または有害効果よりも治療上有益な効果が上回るものである。「予防有効量」は、投薬量において必要な期間、所望の予防成果が達成されるのに有効な量をいう。典型的には、予防用量は、被験体において疾患前または疾患病期の早期に使用されるため、予防有効量は治療有効量より少ない。
【０３６４】
投薬レジメンは、最適な所望の応答（例えば、治療的または予防的応答）がもたらされるように調整され得る。例えば、単独ボーラスで投与してもよく、数回の分割用量を経時的に投与してもよく、用量を、治療状況の要件によって示されるとおりに比例的に減少または増加させてもよい。非経口組成物を、容易な投与のために単位投薬形態で製剤化することは、特に好都合であり、単位投薬形態の均一性は、本明細書で用いる場合、処置対象の哺乳動物被検体のための単回の投薬に適した物理的に分離された単位であって、各々が、必要とされる医薬用キャリアと共同して所望の治療効果をもたらすように計算された所定の量の活性化合物を含む単位をいう。本発明の単位投薬形態の仕様は、は、（ａ）抗体、抗原結合断片および可溶性レセプター−１ポリペプチドまたはＮｏｇｏレセプター融合タンパク質の特殊な特性と、達成されるべき具体的な治療効果または予防効果、ならびに（ｂ）個体における感受性の処置のためにかかる抗体、抗原結合断片および可溶性レセプター−１ポリペプチドまたはＮｏｇｏレセプター融合タンパク質を配合することの当該技術分野における固有の制限によって決定され、これらに直接的に依存性である。一部のある実施形態において、Ｎｏｇｏレセプター−１抗体またはその抗原結合断片の治療有効用量は、０．１〜４ｍｇ／Ｋｇ／日の範囲である。一部のある実施形態において、Ｎｏｇｏレセプター−１抗体またはその抗原結合断片の治療有効用量は、０．２〜４ｍｇ／Ｋｇ／日の範囲である。一部のある実施形態において、Ｎｏｇｏレセプター−１抗体またはその抗原結合断片の治療有効用量は０．２ｍｇ／Ｋｇ／日である。
【０３６５】
本発明の方法において、ＮｇＲ１アンタゴニストは、一般的に、直接神経系に脳室内（ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒｏｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒｌｙ）、または髄腔内、例えば、ＭＳの慢性病変内に投与される。本発明の方法による投与のための組成物は、０．００１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重／日の投薬量のＮｇＲ１アンタゴニストが投与されるように製剤化され得る。本発明の一部のある実施形態において、投薬量は０．０１〜１．０ｍｇ／ｋｇ体重／日である。一部のある実施形態では、投薬量は０．００１〜０．５ｍｇ／ｋｇ体重／日である。
【０３６６】
本発明のＮｇＲ１アンタゴニストでの処置のためには、投薬量は、例えば約０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇ、より通常では０．０１〜５ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．０２ｍｇ／ｋｇ、０．２５ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．７５ｍｇ／ｋｇ、ｌｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇなど）（宿主の体重１ｋｇ）の範囲であり得る。例えば、投薬量は、１ｍｇ／ｋｇ体重もしくは１０ｍｇ／ｋｇ体重または１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲内、好ましくは少なくとも１ｍｇ／ｋｇであり得る。上記の範囲の中間の用量もまた本発明の範囲内であることが意図される。被験体検体には、かかる用量が、毎日、１日毎、毎週または経験的分析によって決定される任意の他のスケジュールに従って投与され得る。例示的な処置は、ある期間にわたる（例えば、少なくとも６ヶ月間）反復投与での投与を含む。さらなる例示的な処置レジメンは、２週間に１回、または１ヶ月に１回または３〜６ヶ月に１回の投与を含む。例示的な投薬スケジュールとしては、１〜１０ｍｇ／ｋｇまたは１５ｍｇ／ｋｇを連続毎日、３０ｍｇ／ｋｇを１日毎または６０ｍｇ／ｋｇを毎週が挙げられる。
【０３６７】
一部の方法では、２種類以上のＮｇＲ１アンタゴニストが同時に投与され、その場合、投与される各アンタゴニストの投薬量は、示した範囲内である。また、補助的活性化合物も、本発明の方法で使用される組成物内に組み込まれ得る。例えば、ＮｇＲ１アンタゴニストは、抗炎症剤（例えば、メチルプレドニゾロン）などの１種類以上のさらなる治療用薬剤とともに共製剤化および／または共投与され得る。
【０３６８】
本発明には、選択した標的組織へのＮｇＲ１アンタゴニストの任意の適当な送達方法、例えば、水性液剤のボーラス注射または制御放出系の埋入が包含される。制御放出埋入物の使用により、反復注射の必要性が低減される。
【０３６９】
本発明の方法に使用されるＮｇＲ１アンタゴニストは、直接脳内に注入される。化合物を直接脳内に注入するための種々の埋入物が知られており、神経障害に罹患しているヒト患者への治療用化合物の送達に有効である。このようなものとしては、ポンプを用いた脳内への長期注入、定位固定移植、一時的介在的カテーテル、永続的頭蓋内カテーテル埋入、および外科的移植生分解性埋入物が挙げられる。例えば、Ｇｉｌｌら（上掲）；Ｓｃｈａｒｆｅｎら、「Ｈｉｇｈ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｉｏｄｉｎｅ−１２５  Ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ  Ｉｍｐｌａｎｔ  Ｆｏｒ  Ｇｌｉｏｍａｓ」、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｂｉｏｌ．Ｐｈｙｓ．２４（４）：５８３−５９１（１９９２）；Ｇａｓｐａｒら、「Ｐｅｒｍａｎｅｎｔ  １２５１  Ｉｍｐｌａｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍａｌｉｇｎａｎｔ  Ｇｌｉｏｍａｓ」、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｂｉｏｌ．Ｐｈｙｓ．４３（５）：９７７−９８２（１９９９）；第６６章、第５７７〜５８０頁、Ｂｅｌｌｅｚｚａら、「Ｓｔｅｒｅｏｔａｃｔｉｃ  Ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ  Ｂｒａｃｈｙｔｈｅｒａｐｙ」、Ｇｉｌｄｅｎｂｅｒｇら、Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｓｔｅｒｅｏｔａｃｔｉｃ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ（１９９８）；およびＢｒｅｍら、「Ｔｈｅ  Ｓａｆｅｔｙ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ｗｉｔｈ  ＢＣＮＵ−Ｌｏａｄｅｄ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｆｏｌｌｏｗｅｄ  ｂｙ  Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｎｅｗｌｙ  Ｄｉａｇｎｏｓｅｄ  Ｍａｌｉｇｎａｎｔ  Ｇｌｉｏｍａｓ：Ｐｈａｓｅ  Ｉ  Ｔｒｉａｌ」、Ｊ．Ｎｅｕｒｏ−Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ２６：１１１−２３（１９９５）を参照のこと。
【０３７０】
該組成物はまた、化合物の適当な送達または支持体系としての機能を果たす生体適合性のキャリア材料中に分散された本発明のＮｇＲ１アンタゴニストを含むものであり得る。徐放性キャリアの好適な例としては、坐剤またはカプセル剤などの成形体の形態の半透過性ポリマーマトリックスが挙げられる。埋入可能なマイクロカプセル型徐放性マトリックスとしては、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，３１９号；ＥＰ５８，４８１）、Ｌ−グルタミン酸とγ−エチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー（Ｓｉｄｍａｎら、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ２２：５４７−５６（１９８５））；ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、エチレン酢酸ビニル（Ｌａｎｇｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７−２７７（１９８１）；Ｌａｎｇｅｒ、Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８−１０５（１９８２））またはポリ−Ｄ−（−）−３ヒドロキシ酪酸（ＥＰ１３３，９８８）が挙げられる。
【０３７１】
一部のある実施形態において、本発明のＮｇＲ１アンタゴニストは患者に、脳の適切な領域への直接注入によって投与される。例えば、Ｇｉｌｌら、「Ｄｉｒｅｃｔ  ｂｒａｉｎ  ｉｎｆｕｓｉｏｎ  ｏｆ  ｇｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｎ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ  ｄｉｓｅａｓｅ」、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．９：５８９−９５（２００３）を参照のこと。択一的な手法が利用可能であり、本発明によるＮｇＲアンタゴニストの投与に適用され得る。例えば、カテーテルまたは埋入物の定位固定配置は、Ｒｉｅｃｈｅｒｔ−ＭｕｎｄｉｎｇｅｒユニットおよびＺＤ（Ｚａｍｏｒａｎｏ−Ｄｕｊｏｖｎｙ）多目的局在化ユニットを用いて行われ得る。コントラスト増強コンピュータ連動断層撮影（ＣＴ）スキャン（１２０ｍｌのオムニペイクの注入、３５０ｍｇのヨウ素／ｍｌ、２ｍｍ切片厚）により、３次元多面処理計画（ＳＴＰ、Ｆｉｓｃｈｅｒ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）が可能となり得る。この装置によって、磁気共鳴画像法による試験に基づく計画によって明白な標的の立体配置のためのＣＴおよびＭＲＩ標的情報を併合することが可能となる。
【０３７２】
ＧＥ  ＣＴスキャナー（Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃ  Ｃｏｍｐａｎｙ、ミルウォーキー、ＷＩ）での使用のために改良されたＬｅｋｓｅｌｌ定位固定システム（Ｄｏｗｎｓ  Ｓｕｒｇｉｃａｌ、Ｉｎｃ．、ジケーター、ＧＡ）ならびにＢｒｏｗｎ−Ｒｏｂｅｒｔｓ−Ｗｅｌｌｓ（ＢＲＷ）定位固定システム（Ｒａｄｉｏｎｉｃｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）は、この目的のために使用され得る。したがって、埋入物をモニタリングする際、ＢＲＷ定位固定フレームの環状のベースリングが患者の頭蓋に装着され得る。ベースプレートに挟持されたグラファイトロッドローカライザーフレームにより、連続ＣＴ切片が（標的組織）領域全体に３ｍｍ間隔で得られ得る。コンピュータ処理された計画プログラムが、グラファイトロッド画像のＣＴ座標を用いて、ＶＡＸ  １１／７８０コンピュータ（Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍａｙｎａｒｄ、Ｍａｓｓ．）にて実行され、ＣＴ空間とＢＲＷ空間の間がマッピングされ得る。
【０３７３】
（抗体、抗原結合断片、可溶性レセプター、融合タンパク質、ポリヌクレオチドおよび組成物の使用）
一部のある実施形態において、本発明は、抗Ｎｏｇｏレセプター−１抗体、かかる抗体の抗原結合断片、可溶性Ｎｏｇｏレセプター−１ポリペプチド、またはポリペプチドかかるを含む融合タンパク質を、それを必要とする哺乳動物に投与することにより、Ｎｏｇｏレセプター−１活性を阻害するための方法を提供する。
【０３７４】
一部のある実施形態において、本発明は、Ｎｏｇｏレセプター−１を本発明の抗体または抗原結合断片と接触させる工程を含む、リガンドへのＮｏｇｏレセプター−１の結合を阻害する方法を提供する。一部のある実施形態において、リガンドは、ＮｏｇｏＡ、ＮｏｇｏＢ、ＮｏｇｏＣ、ＭＡＧおよびＯＭ−ｇｐからなる群より選択される。
【０３７５】
一部のある実施形態において、本発明は、ニューロンを本発明の抗体または抗原結合断片接触させる工程を含む、ニューロンにおける成長円錐の虚脱を抑制するための方法を提供する。一部のある実施形態において、本発明は、ニューロンを本発明の抗体または抗原結合断片と接触させる工程を含む、ニューロンにおける神経突起の伸長または出芽の抑制を低減させるための方法を提供する。一部のある実施形態において、ニューロンはＣＮＳのニューロンである。一部のこのような方法では、神経突起の伸長または出芽は軸索の成長である。
【０３７６】
一部のある実施形態において、本発明は、（ａ）（ｉ）抗Ｎｏｇｏレセプター−１抗体もしくはその抗原結合断片；または（ｉｉ）可溶性Ｎｏｇｏレセプター−１ポリペプチドを発現する培養宿主細胞を提供すること；および（ｂ）宿主細胞を哺乳動物内のニューロン部位またはその付近に導入することを含む、哺乳動物において死滅するリスクのあるニューロンの生存を促進させる方法を提供する。Ａｌｍｕｄｅｎａ  Ｒａｍｏｎ−Ｃｕｅｔｏ、Ｍ  Ｉｓａｂｅｌ  Ｃｏｒｄｅｒｏ、Ｆｅｒｎａｎｄｏ  Ｆ  Ｓａｎｔｏｓ−ＢｅｎｉｔｏおよびＪｅｓｕｓ  Ａｖｉｌａ（２０００）Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｒｅｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ｐａｒａｌｅｇｉｃ  ｒａｔｓ  ａｎｄ  ｍｏｔｏｒ  ａｘｏｎ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅｉｒ  ｓｐｉｎａｌ  ｃｏｒｄｓ  ｂｙ  ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｅｎｓｈｅａｔｈｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ．Ｎｅｕｒｏｎ  ２５、４２５−４３５。
【０３７７】
一部のある実施形態において、本発明は、ニューロン部位またはその付近に、（ａ）抗Ｎｏｇｏレセプター−１抗体もしくはその抗原結合断片；または（ｂ）可溶性Ｎｏｇｏレセプター−１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むウイルスベクターを投与することを含み、ここで、該抗Ｎｏｇｏレセプター−１抗体、抗原結合断片または可溶性Ｎｏｇｏレセプター−１ポリペプチドは、哺乳動物において該ヌクレオチド配列から、ニューロンの生存を促進するのに充分な量で発現される、死滅するリスクのあるニューロンであって、哺乳動物のものであるニューロンの生存を促進させる方法である遺伝子療法を提供する。このような実施形態に有用なウイルスベクターおよび方法は、例えば、Ｎｏｅｌら、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、７３：１４８３−９３（２００２）に記載されている。
【０３７８】
一部のある実施形態において、本発明は、リガンドを、本発明の可溶性Ｎｏｇｏレセプター−１ポリペプチドまたはＮｏｇｏレセプター−１融合タンパク質と接触させる工程を含む、リガンドへのＮｏｇｏレセプター−１の結合を阻害する方法を提供する。
【０３７９】
一部のある実施形態において、本発明は、Ｎｏｇｏレセプター−１リガンドを、本発明の可溶性Ｎｏｇｏレセプター−１ポリペプチドまたはＮｏｇｏレセプター−１融合タンパク質を接触させる工程を含む、Ｎｏｇｏレセプター−１リガンドの活性をモジュレートする方法を提供する。
【０３８０】
一部のある実施形態において、本発明は、Ｎｏｇｏレセプター−１リガンドを、本発明の可溶性Ｎｏｇｏレセプター−１ポリペプチドまたはＮｏｇｏレセプター−１融合タンパク質と接触させる工程を含む、ニューロンにおける成長円錐の虚脱を抑制するための方法を提供する。一部のある実施形態において、本発明は、Ｎｏｇｏレセプター−１リガンドを、本発明の可溶性Ｎｏｇｏレセプター−１ポリペプチドまたはＮｏｇｏレセプター−１融合タンパク質と接触させる工程を含む、ニューロンにおける神経突起の伸長または出芽の抑制を低減させるための方法を提供する。一部のある実施形態において、ニューロンはＣＮＳのニューロンである。一部のある実施形態において、リガンドは、ＮｏｇｏＡ、ＮｏｇｏＢ、ＮｏｇｏＣ、ＭＡＧおよびＯＭ−ｇｐからなる群より選択される。一部のある実施形態において、神経突起の伸長または出芽は軸索の成長である。
【０３８１】
一部のある実施形態において、本発明は、ニューロンを、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチドまたは組成物と接触させることを含む、神経突起伸長を促進させるための方法を提供する。一部のある実施形態において、該ポリペプチド、ポリヌクレオチドまたは組成物は、神経突起伸長抑制を阻害する。一部のある実施形態において、ニューロンは哺乳動物のものである。一部のある実施形態において、哺乳動物はヒトである。
【０３８２】
一部のある実施形態において、本発明は、ニューロンを、有効量の本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチドまたは組成物と接触させることを含む、ＮｇＲ１シグナル伝達複合体によりシグナル伝達の阻害方法を提供する。一部のある実施形態において、ニューロンは哺乳動物のものである。一部のある実施形態において、哺乳動物はヒトである。
【０３８３】
一部のある実施形態において、本発明は、処置を必要とする哺乳動物に、有効量の本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチドまたは組成物を投与することを含む、哺乳動物において中枢神経系（ＣＮＳ）疾患、障害または損傷の処置方法を提供する。一部のある実施形態において、該疾患、障害または損傷は、多発性硬化症、ＡＬＳ、ハンティングトン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、糖尿病性ニューロパシー、脳卒中、外傷性脳損傷、脊髄損傷、視神経炎、緑内障、難聴、および副腎白質萎縮症である。
【０３８４】
本明細書に記載の任意型の抗体またはレセプターが、治療的に使用され得る。一部のある実施形態において、抗Ｎｏｇｏレセプター−１抗体はヒト抗体である。一部のある実施形態において、哺乳動物ヒト患者である。一部のある実施形態において、該抗体またはその抗原結合断片は、該抗体と交差反応するＮｏｇｏレセプター−１を発現する非ヒト哺乳動物（例えば、霊長類、カニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）またはアカゲザル）に、獣医学的目的のため、またはヒト疾患の動物モデルとして投与される。かかる動物モデルは、本発明の抗体治療有効性の評価に有用であり得る。
【０３８５】
一部のある実施形態において、抗Ｎｏｇｏレセプター−１抗体もしくは抗原結合断片または可溶性Ｎｏｇｏレセプター−１ポリペプチドまたは融合タンパク質の投与は、脊髄損傷を処置し、損傷部位全体における軸索の成長を促進するために使用される。
【０３８６】
本発明の抗Ｎｏｇｏレセプター−１抗体もしくは抗原結合断片または可溶性Ｎｏｇｏレセプター−１ポリペプチドまたは融合タンパク質は、単独、または特定の病理学的プロセスをモジュレートする他の薬剤との組合せ、もしくは逐次的組合せで提供され得る。例えば、抗炎症剤は、脳卒中後に、さらなるニューロンの損傷および軸索の再生抑制を阻止するための手段として共投与され得る。本明細書で用いる場合、Ｎｏｇｏレセプター−１抗体、抗原結合断片、可溶性Ｎｏｇｏレセプター−１  ａｎｄ  Ｎｏｇｏレセプター融合タンパク質は１種類以上のさらなる治療用薬剤と、両者が同時、連続的または独立して投与される場合、組合せて投与されるという。
【０３８７】
本発明の抗Ｎｏｇｏレセプター−１抗体、抗原結合断片、可溶性Ｎｏｇｏレセプター−１ポリペプチド、Ｎｏｇｏレセプター−１融合タンパク質は、非経口、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、経皮、吸入または口腔内経路によって投与され得る。例えば、薬剤は、マイクロインジェクションによって損傷部位に局所投与され得る。典型的な部位としては、限定されないが、損傷による脊髄損傷領域が挙げられる。投与される投薬量は、レシピエントの年齢、健康状態および体重、併用処置（あれば）の種類、処置の頻度、ならびに所望される効果の性質に依存性である。
【０３８８】
本発明の化合物は、インビボで、通常、哺乳動物、例えば、ヒト、ヒツジ、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、ラットおよびマウスなどにおいて、またはインビトロで利用され得る。
【０３８９】
（本発明のベクター）
一部のある実施形態において、本発明は、コード配列を含む組換えＤＮＡ分子（ｒＤＮＡ）を提供する。本明細書で用いる場合、ｒＤＮＡ分子は、分子操作に供されたＤＮＡ分子である。ｒＤＮＡ分子の作製方法は、当該技術分野でよく知られており、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）を参照のこと。一部ｒＤＮＡ分子では、コードＤＮＡ配列は、発現制御配列およびベクター配列に作動可能に連結されている。
【０３９０】
一部のある実施形態において、本発明は、本発明のポリペプチドをコードする核酸を含むベクターを提供する。本発明の核酸と作動可能に連結されるベクターおよび発現制御配列は、当該技術分野でよく知られているように、所望される機能的特性（例えば、タンパク質発現、および形質転換される宿主細胞）に直接依存する。本発明のベクターは、ｒＤＮＡ分子内の構造遺伝子の宿主の染色体内での複製または挿入を少なくとも指令し、また、好ましくは発現も指令する能力を有するものであり得る。
【０３９１】
作動可能に連結されたタンパク質コード配列の発現の調節に使用される発現制御エレメントは当該技術分野で知られており、限定されないが、誘導プロモーター、構成的プロモーター、分泌シグナル、および他の調節エレメントが挙げられる。好ましくは、誘導型プロモーターは、容易に制御されるのも、例えば、宿主細胞の培地中の栄養分に対して応答性のものである。
【０３９２】
一実施形態において、コード核酸分子を含有するベクターは、原核生物のレプリコン、すなわち、該ベクターで形質転換された細菌宿主細胞（細菌宿主細胞など）において自律複製および染色体外での組換えＤＮＡ分子の維持を指令する能力を有するＤＮＡ配列を含むものである。かかるレプリコンは当該技術分野でよく知られている。また、原核生物レプリコンを含むベクターは、その発現により薬物耐性などの検出可能なマーカーが付与される遺伝子も含むものであり得る。細菌の薬物耐性遺伝子の典型的な例は、アンピシリンまたはテトラサイクリンに対する耐性を付与するものである。
【０３９３】
原核生物レプリコンを含むベクターは、さらに、細菌宿主細胞（大腸菌など）内でのコード遺伝子配列の発現（転写および翻訳）を指令し得る原核生物またはバクテリオファージ系プロモーターを含むものであり得る。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼの結合および転写の実行を可能にするＤＮＡ配列によって形成される発現制御エレメントである。細菌宿主と適合性であるプロモーター配列は、典型的には、本発明のＤＮＡセグメントの挿入のための簡便な制限部位を含有するプラスミドベクターにおいて提供される。かかるプラスミドベクターの例は、ｐＵＣ８、ｐＵＣ９、ｐＢＲ３２２およびｐＢＲ３２９（Ｂｉｏ−Ｒａｄ（登録商標）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ｐＰＬおよびｐＫＫ２２３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）である。任意の適当な原核生物宿主を用いて、本発明のタンパク質をコードする組換えＤＮＡ分子を発現させ得る。
【０３９４】
真核生物細胞と適合性である発現ベクター、好ましくは、脊椎動物細胞と適合性であるものもまた、コード配列を含むｒＤＮＡ分子を形成するのに使用され得る。真核生物細胞発現ベクターは、当該技術分野でよく知られており、いくつかの市販供給元から入手可能である。典型的には、かかるベクターは、所望のＤＮＡセグメントの挿入のための簡便な制限部位を含むように提供される。かかるベクターの例は、ｐＳＶＬおよびｐＫＳＶ−１０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＢＰＶ−１、ｐＭＬ２ｄ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ｐＴＤＴ１（ＡＴＣＣ（登録商標）３１２５５）ならびに他の真核生物系の発現ベクターである。
【０３９５】
本発明のｒＤＮＡ分子を構築するために使用される真核生物細胞発現ベクターは、さらに、真核生物細胞において有効な選択可能マーカー、好ましくは薬物耐性選択マーカーを含むものであり得る。好ましい薬物耐性マーカーは、その発現によりネオマイシン耐性がもたらされる遺伝子、すなわち、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ）遺伝子である（Ｓｏｕｔｈｅｒｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｎａｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：３２７−３４１（１９８２））。あるいはまた、選択可能マーカーは、別のプラスミド上に存在していてもよく、この２種類のベクターは、宿主細胞のコトランスフェクションによって導入され得、形質転換体は、選択可能マーカーに適切な薬物中で培養することにより選択され得る。
【０３９６】
本発明の抗体または抗体の一部分を発現させるため、一部または完全長の軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡを発現ベクター内に、該遺伝子が転写および翻訳制御配列に作動可能に連結されるように挿入する。発現ベクターとしては、プラスミド、レトロウイルス、コスミド、ＹＡＣ、ＥＢＶ由来エピソームなどが挙げられる。該抗体遺伝子はベクター内に、該ベクター内の転写および翻訳制御配列が、該抗体遺伝子の転写および翻訳を調節するというその意図される機能を発揮するようにライゲートされる。発現ベクターおよび発現制御配列は、使用する発現宿主細胞と適合性となるように選択される。抗体軽鎖遺伝子および抗体重鎖遺伝子は、別々のベクターに挿入されていてもよい。一部のある実施形態において、両方遺伝子が同じ発現ベクター内に挿入される。該抗体遺伝子は発現ベクター内に、標準的な方法（例えば、抗体遺伝子断片およびベクター上の相補的制限部位のライゲーション、または制限部位が存在しない場合は平滑端ライゲーション）によって挿入される。
【０３９７】
簡便なベクターは、機能的完全なヒトＣＨまたはＣＬ免疫グロブリン配列をコードし、上記のような任意のＶＨまたはＶＬ配列が容易に挿入され発現され得るように操作された適切な制限部位を有するものである。かかるベクターでは、通常、スプライシングが、挿入Ｊ領域内のスプライスドナー部位とヒトＣ領域の前のスプライスアクセプター部位との間で起こり、ヒトＣＨエキソン内のスプライス領域でも起こる。ポリアデニル化および転写終結は、コード領域の下流の天然の染色体部位で起こる。また、組換え発現ベクターは、宿主細胞からの該抗体鎖の分泌を助長するシグナルペプチドもコードするものであり得る。抗体鎖遺伝子はベクター内に、シグナルペプチドが該抗体鎖遺伝子のアミノ末端に対してインフレームに連結されるようにクローニングされ得る。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチドまたは異種シグナルペプチド（すなわち、非免疫グロブリンタンパク質由来のシグナルペプチド）であり得る。
【０３９８】
本発明の免疫原性ポリペプチド、Ｎｏｇｏレセプター−１抗体、抗原結合断片、可溶性Ｎｏｇｏレセプター−１ポリペプチドおよび可溶性Ｎｏｇｏレセプター−１融合タンパク質に加え、本発明の組換え発現ベクターも、宿主細胞内でのその発現を制御する調節配列をを有する。当業者には、発現ベクターの設計（例えば、調節配列の選択）は、形質転換する宿主細胞の選択、所望されるタンパク質発現レベルなどの要素に依存し得ることが認識されよう。哺乳動物宿主細胞発現に好ましい調節配列としては、哺乳動物細胞においてにおいて高レベルのタンパク質発現を指令するウイルス系エレメント、例えば、レトロウイルスのＬＴＲ由来のプロモーターおよび／またはエンハンサー、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）由来（ＣＭＶプロモーター／エンハンサーなど）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）由来（ＳＶ４０プロモーター／エンハンサーなど）、アデノウイルス由来（例えば、アデノウイルス主要（ｍａｊｏｒ）後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ））、ポリオーマおよび強力哺乳動物系プロモーター（天然免疫グロブリンおよびアクチンプロモーターなど）が挙げられる。ウイルス系の調節エレメントおよびその配列のさらなる説明については、例えば、米国特許第５，１６８，０６２号（Ｓｔｉｎｓｋｉによる）、米国特許第４，５１０，２４５号（Ｂｅｌｌらによる）および米国特許第４，９６８，６１５号（Ｓｃｈａｆｆｎｅｒらによる）を参照のこと。
【０３９９】
一実施形態において、ＮＥＯＳＰＬＡと称されるＢｉｏｇｅｎ  ＩＤＥＣ，Ｉｎｃ．のプロプライエタリ発現ベクター（米国特許第６，１５９，７３０号）が使用され得る。このベクターは、サイトメガロウイルスプロモーター／エンハンサー、マウスβグロビン主要プロモーター、ＳＶ４０複製起点、ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼエキソン１およびエキソン２、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子およびリーダー配列を含有する。このベクターは、ＣＨＯ細胞にトランスフェクションした後、Ｇ４１８含有培地中で選択し、メトトレキサート増幅すると、非常に高レベル発現をもたらすことがわかっている。もちろん、真核生物細胞内での発現を誘発し得る任意の発現ベクターが、本発明において使用され得る。好適なベクターの例としては、限定されないが、プラスミドｐｃＤＮＡ３、ｐＨＣＭＶ／Ｚｅｏ、ｐＣＲ３．１、ｐＥＦ１／Ｈｉｓ、ｐＩＮＤ／ＧＳ、ｐＲｃ／ＨＣＭＶ２、ｐＳＶ４０／Ｚｅｏ２、ｐＴＲＡＣＥＲ−ＨＣＭＶ、ｐＵＢ６／Ｖ５−Ｈｉｓ、ｐＶＡＸ１およびｐＺｅｏＳＶ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、サンディエゴ、ＣＡから入手可能）、ならびにプラスミドｐＣＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ、マディソン、ＷＩから入手可能）が挙げられる。さらなる真核生物細胞系発現ベクターは当該技術分野で知られており、市販されている。典型的には、かかるベクターは、所望のＤＮＡセグメントの挿入のための簡便な制限部位を含有する。例示的なベクターとしては、ｐＳＶＬおよびｐＫＳＶ−１０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＢＰＶ−１、ｐｍｌ２ｄ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ｐＴＤＴ１（ＡＴＣＣ  ３１２５５）、レトロウイルス系発現ベクターｐＭＩＧおよびｐＬＬ３．７、アデノウイルスシャトルベクターｐＤＣ３１５、ならびにＡＡＶベクターが挙げられる。他の例示的なベクター系は、例えば、米国特許第６，４１３，７７７号に開示されている。
【０４００】
本発明の他の実施形態では、本発明のポリヌクレオチド、例えば、ＮｇＲアンタゴニストポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＲＮＡ分子）の発現のために、レンチウイルスベクターが使用される。レンチウイルスは、非周期（ｎｏｎｃｙｃｌｉｎｇ）分裂後期細胞に感染することができ、また、発生中にサイレンシングされず、胚性幹細胞の感染によるトランスジェニック動物の作製を可能にするという利点を提供し得る。Ｍｉｌｈａｖｅｔら、Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖ．５５：６２９−６４８（２００３）。ウイルスベクターを発現する他のポリヌクレオチドは、限定されないが、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、アデノウイルスまたはアルファウイルスを主体として構築され得る。
【０４０１】
本発明のポリヌクレオチド、例えば、ｓｉＲＮＡ分子配列の転写は、真核生物のＲＮＡポリメラーゼＩ（ｐｏｌ  Ｉ）、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ｐｏｌ  ＩＩ）、またはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（ｐｏｌ  ＩＩＩ）のためのプロモーターから誘導され得る。ｐｏｌ  ＩＩまたはｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターからの転写物は、あらゆる細胞内で高レベルで発現され、所与の細胞における所与のｐｏｌ  ＩＩプロモーターのレベルは、近傍に存在する遺伝子調節配列の性質（エンハンサー、サイレンサーなど）に依存する。真核生物系ＲＮＡポリメラーゼプロモーターもまた使用されるが、適切な細胞において原核生物系ＲＮＡポリメラーゼ酵素が発現されものとする（Ｅｌｒｏｙ−ＳｔｅｉｎおよびＭｏｓｓ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：６７４３−７（１９９０）；ＧａｏおよびＨｕａｎｇ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２１：２８６７−７２（１９９３）；Ｌｉｅｂｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：４７−６６（１９９３）；Ｚｈｏｕら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０：４５２９−３７（１９９０））。何人かの研究者らにより、かかるプロモーターから発現されるポリヌクレオチドは、哺乳動物細胞において機能し得ることが示されている（例えば、Ｋａｓｈａｎｉ−Ｓａｂｅｔら、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．２：３−１５（１９９２）；Ｏｊｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０８０２−６（１９９２）；Ｃｈｅｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０：４５８１−９（１９９２）；Ｙｕら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６３４０−４（１９９３）；Ｌ’Ｈｕｉｌｌｉｅｒら、ＥＭＢＯ  Ｊ．１１：４４１１−８（１９９２）；Ｌｉｓｚｉｅｗｉｃｚら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ  ９０：８０００−４（１９９３）；Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．２３：２２５９（１９９５）；Ｓｕｌｌｅｎｇｅｒ  ＆  Ｃｅｃｈ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６２：１５６６（１９９３））。より具体的には、Ｕ６核内低分子（ｓｎＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）およびアデノウイルスＶＡ  ＲＮＡをコードする遺伝子由来のものなどの転写単位が、高濃度の所望のＲＮＡ分子（ｓｉＲＮＡなど）細胞内で生成させるのに有用である（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら（上掲）；ＣｏｕｔｕｒｅおよびＳｔｉｎｃｈｃｏｍｂ，１９９６（上掲）；Ｎｏｏｎｂｅｒｇら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．２２：２８３０（１９９４）；Ｎｏｏｎｂｅｒｇら、米国特許第５，６２４，８０３号；Ｇｏｏｄら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．４：４５（１９９７）；Ｂｅｉｇｅｌｍａｎら、国際特許ＰＣＴ公開公報ＷＯ９６／１８７３６）。ｓｉＲＮＡ転写単位は、哺乳動物細胞内への導入用のさまざまなベクター内に、例えば、限定されないが、プラスミドＤＮＡベクター、ウイルス系ＤＮＡベクター（アデノウイルスもしくはアデノ随伴ウイルスベクターなど）、またはウイルス系ＲＮＡベクター（レトロウイルスもしくはアルファウイルス系ベクター）内に組み込まれ得る（概説については、ＣｏｕｔｕｒｅおよびＳｔｉｎｃｈｃｏｍｂ，１９９６（上掲）を参照のこと）。
【０４０２】
異種遺伝子および調節配列に加え、本発明の組換え発現ベクターは、さらなる配列、例えば、宿主細胞内でのベクターの複製を調節する配列（例えば、複製起点）および選択可能マーカー遺伝子などを有するものであり得る。選択可能マーカー遺伝子により、ベクターが導入された宿主細胞の選択が容易になる（例えば、米国特許第４，３９９，２１６号、同第４，６３４，６６５号および同第５，１７９，０１７号（すべてＡｘｅｌらによる）を参照のこと）。例えば、典型的には、選択可能マーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞に対して、薬物（Ｇ４１８、ハイグロマイシンまたはメトトレキサート）に対する耐性を付与するものである。好ましい選択可能マーカー遺伝子としては、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子（メトトレキサート選択／増幅を用いたｄｈｆｒ宿主細胞における使用のため）およびｎｅｏ遺伝子（Ｇ４１８選択用）が挙げられる。
【０４０３】
（宿主細胞および本発明のタンパク質の組換えによる作製方法）
本発明の抗Ｎｏｇｏレセプター−１抗体、免疫原性ペプチド、可溶性Ｎｏｇｏレセプター−１ポリペプチド、可溶性Ｎｏｇｏレセプター−１融合タンパク質をコードする核酸分子およびこれらの核酸分子を含むベクターは、適当な宿主細胞の形質転換ために使用され得る。形質転換は、ポリヌクレオチドを宿主細胞内に導入するための任意の既知の方法によるものであり得る。哺乳動物細胞内への異種ポリヌクレオチドの導入方法は当該技術分野でよく知られており、デキストラン媒介性トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン媒介性トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソーム内へのポリヌクレオチド（１種または複数種）の封入、および核内へのＤＮＡの直接マイクロインジェクションが挙げられる。また、核酸分子は、ウイルスベクターによって哺乳動物細胞内に導入され得る。
【０４０４】
本発明のｒＤＮＡ分子による適切な宿主細胞の形質転換は、よく知られた方法によって行われ、該方法は、典型的には、使用するベクターおよび使用する宿主系の型に依存する。原核生物宿主細胞の形質転換に関しては、エレクトロポレーションおよび塩処理法が使用され得る。（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）；Ｃｏｈｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ６９：２１１０−２１１４（１９７２）を参照のこと）。ｒＤＮＡを含有するベクターによる脊椎動物細胞の形質転換に関しては、エレクトロポレーション、カチオン系脂質または塩処理法が使用され得る。（例えば、Ｇｒａｈａｍら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５２：４５６−４６７（１９７３）；Ｗｉｇｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７（６：１３７３−１３７６（１９７９）を参照のこと）。
【０４０５】
成功裏に形質転換される細胞、すなわち、本発明のｒＤＮＡ分子を含有する細胞は、よく知られた手法、例えば、選択可能マーカーに関する選択によって同定され得る。例えば、本発明のｒＤＮＡの導入により得られる細胞をクローニングし、単一のコロニーを生成させ得る。該コロニー由来の細胞を、回収し、溶解させ、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９８：５０３−５１７（１９７５）になどの記載のものなどの方法を用いてそのＤＮＡ含量をｒＤＮＡの存在について調べるか、または該細胞から産生されたタンパク質が免疫学的方法によってアッセイされ得る。
【０４０６】
本発明の方法における使用のための本発明のポリペプチドまたは抗体の発現のための宿主細胞は、原核生物系または真核生物系であり得る。発現のための宿主として利用可能な哺乳動物細胞株は当該技術分野でよく知られており、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ（登録商標））から入手可能な多くの不死化細胞株が挙げられる。このようなものとしては、とりわけ、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＳＯ、ＳＰ２細胞、ＨｅＬａ細胞、乳児ハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えば、Ｈｅｐ  Ｇ２）、Ａ５４９細胞、およびいくつかの他の細胞株が挙げられる。特に好ましい細胞株は、どの細胞株が高発現レベルを有するかを調べることにより選択される。他の有用な真核生物宿主細胞としては、植物細胞が挙げられる。使用され得る他の細胞株は、昆虫細胞株、例えば、Ｓｆ９細胞などである。例示的な原核生物宿主細胞は、大腸菌およびストレプトミセスである。
【０４０７】
本発明の免疫原性ポリペプチド、Ｎｏｇｏレセプター−１抗体または抗原結合断片、可溶性Ｎｏｇｏレセプター−１ポリペプチドおよび可溶性Ｎｏｇｏレセプター−１融合タンパク質をコードする組換え発現ベクターを哺乳動物宿主細胞内に導入すると、これらは、宿主細胞を、該宿主細胞内での抗体、ポリペプチドおよび融合ポリペプチドの発現を可能にするのに充分な期間培養することにより産生され、または、より好ましくは、本発明の免疫原性ポリペプチド、Ｎｏｇｏレセプター−１抗体または抗原結合断片、可溶性Ｎｏｇｏレセプター−１ポリペプチドおよび可溶性Ｎｏｇｏレセプター−１融合タンパク質が、宿主細胞が培養された培養培地中に分泌される。本発明の免疫原性ポリペプチド、Ｎｏｇｏレセプター−１抗体または抗原結合断片、可溶性Ｎｏｇｏレセプター−１ポリペプチドおよび可溶性Ｎｏｇｏレセプター−１融合タンパク質は培養培地から、標準的なタンパク質精製法を用いて回収され得る。
【０４０８】
さらに、産生細胞株からの本発明の（ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｎｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｎｖｅｎｔｉｏｎ）免疫原性ポリペプチド、Ｎｏｇｏレセプター−１抗体または抗原結合断片、可溶性Ｎｏｇｏレセプター−１ポリペプチドおよび可溶性Ｎｏｇｏレセプター−１融合タンパク質（またはこれらの由来する他の部分）の発現は、いくつかの既知の手法を用いて増強され得る。例えば、グルタミンシンテターゼ（ＧＳ）系は、ある種の条件下での発現を増強するための一般なアプローチである。例えば、欧州特許第０２１６８４６号、同第０２５６０５５号および同第０３２３９９７号ならびに欧州特許出願第８９３０３９６４．４号を参照のこと。
【０４０９】
（宿主細胞）
本発明は、さらに、本発明のＮｏｇｏレセプター−１抗体、抗原結合断片、可溶性Ｎｏｇｏレセプター−１ポリペプチドおよび／または可溶性Ｎｏｇｏレセプター−１融合タンパク質をコードする核酸分子で形質転換された宿主細胞を提供する。宿主細胞は、原核生物系または真核生物系のいずれかであり得る。本発明のタンパク質の発現に有用な真核生物細胞は、その細胞株が細胞培養法と適合性であり、発現ベクターの増殖および遺伝子産物の発現と適合性である限り、限定されない。好ましい真核生物宿主細胞としては、限定されないが、酵母、昆虫および哺乳動物細胞、好ましくは、脊椎動物細胞（マウス、ラット、サルまたはヒト細胞株に由来するものなど）が挙げられる。有用な真核生物宿主細胞の例としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）からＣＣＬ６１として入手可能）、ＮＩＨスイスマウス胚細胞ＮＩＨ−３Ｔ３（ＡＴＣＣからＣＲＬ１６５８として入手可能）、乳児ハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）など、真核生物組織培養細胞株が挙げられる。
【０４１０】
他の有用な真核生物宿主細胞としては、植物細胞が挙げられる。使用され得る他の細胞株は、昆虫細胞株、例えば、Ｓｆ９細胞などである。例示的な原核生物宿主細胞は、大腸菌およびストレプトミセスである。
【０４１１】
（ｒＤＮＡ分子を用いた組換えタンパク質の作製）
本発明は、さらに、本明細書に記載の核酸分子を用いた、本発明のＮｏｇｏレセプター−１抗体または抗原結合断片、可溶性Ｎｏｇｏレセプター−１ポリペプチドおよび／または可溶性Ｎｏｇｏレセプター−１融合タンパク質の作製方法を提供する。一般的に、タンパク質の組換え形態の作製は、典型的には、以下の工程を伴う。
【０４１２】
まず、本発明のタンパク質をコードする核酸分子を得る。コード配列がイントロンによって分断されていない場合は、これは、任意の宿主での発現にそのまま適する。
【０４１３】
次いで、該核酸分子を、任意選択で、上記のような適当な制御配列と作動可能な連結状態に配置し、タンパク質オープンリーディングフレームを含有する発現単位を形成する。発現単位を用いて適当な宿主を形質転換し、形質転換宿主を、組換えタンパク質の産生を可能にする条件下で培養する。任意選択で、組換えタンパク質を培地または細胞から単離する。タンパク質の回収および精製は、いくらかの不純物が許容範囲であり得る場合は、必要でないことがあり得る。
【０４１４】
前述の工程の各々は、さまざまな様式で行なわれ得る。例えば、所望のコード配列は、適切な宿主内で、ゲノム断片から得られ、直接使用され得る。さまざまな宿主において作動可能な発現ベクターの構築は、上記のような適切なレプリコンおよび制御配列を用いて行なわれる。制御配列、発現ベクターおよび形質転換方法は、使用する遺伝子発現宿主細胞の型に依存性であり、先に詳細に論考した。好適な制限部位は、通常入手可能ではなかもしれないが、コード配列末端に、このようなベクター内に挿入される切断可能な遺伝子が提供されるように付加され得るものである。当業者は、当該技術分野で知られた任意の宿主／発現系を、組換えタンパク質を作製するための本発明の核酸分子での使用のために容易に適合させることができよう。
【０４１５】
当業者には、本明細書に記載の方法および適用に対する他の適当は修正および適合は、自明であり、本発明またはその任意の実施形態の範囲から逸脱することなく行なわれ得ることが容易にわかるであろう。本発明がより良好に理解され得るように、以下の実施例を示す。これらの実施例は、例示目的にすぎず、本発明の範囲をなんら限定するものと解釈されるべきでない。
【実施例】
【０４１６】
（実施例１）
（マウスモノクローナル抗Ｎｏｇｏレセプター−１抗体の作製）
本発明の免疫原性Ｎｏｇｏレセプター−１ポリペプチドに特異的に結合する抗Ｎｏｇｏレセプター−１抗体を、以下の方法および手順を用いて作製した。
免疫処置
２通りの免疫処置アプローチを使用した。
【０４１７】
（１．免疫原としてＮｏｇｏレセプター−１（ＮｏｇｏＲ−１）を含むＣＯＳ−７細胞または細胞膜）
ラットＮｏｇｏレセプター−１遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋＴＭ番号ＡＦ４６２３９０）を、ＣＭＶプロモーターおよび薬物選択のためのジェネティシン耐性遺伝子を含有する哺乳動物発現ベクターｐＥＡＧ１２５６（Ｂｉｏｇｅｎ（登録商標））内にサブクローニングした。組換えプラスミドをＣＯＳ−７細胞内に、Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ（Ｑｉａｇｅｎ（登録商標））を用いてトランスフェクトした。形質転換体を、ジェネティシン（ＧｉｂｃｏＴＭ、２ｍｇ／ｍｌ）を用いて選択し、クローニングし、ＦＡＣＳ  によりＮｏｇｏレセプター−１タンパク質の表面発現について確認した。この細胞から既報［Ｗａｎｇら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．７５：１１５５−１１６１（２０００）］の手順に従ってＣＯＳ−７膜を調製し、２回洗浄し、１ｍｇ／ｍｌ［タンパク質濃度］で１０％グリセロール中に−７０℃にて保存した。
【０４１８】
８週齢の雌ＲＢＦマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓ、バー・ハーバー、ＭＥ）を、５０μｇのラットＮｏｇｏレセプター−１−ＣＯＳ−７膜を含有するエマルジョン、またはＮｏｇｏレセプター−１をその表面上に発現する完全体ＣＯＳ−７細胞のいずれか、および５０μｌのＲＩＢＩ  ＭＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳアジュバント（Ｓｉｇｍａ（登録商標）Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、セントルイス、ＭＯ）で、２週間に１回腹腔内免疫処置した（Ｌｉｐｍａｎら、１９９２）。免疫処置マウスの血清を、最初の免疫処置前、２回目および３回目の免疫処置の７日後、ならびに３回目の免疫処置の３８日後に回収し、抗Ｎｏｇｏレセプター−１抗体力価を、ＥＬＩＳＡによって後述のようにして測定した。
【０４１９】
（２．免疫原としての特異的Ｎｏｇｏレセプター−１ペプチド）
ラットＮｏｇｏレセプター−１遺伝子配列を、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴｉＴＭソフトウェアを用いた抗原性解析に供した（図２）。この解析で同定された抗原性ペプチドを、標準的なグルタルアルデヒド手順を用いて、スカシガイヘモシアニン（ＫＬＨ）に結合体化させた。
【０４２０】
８週齢の雌ＲＢＦマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓ、バー・ハーバー、ＭＥ）を、５０μｇのＫＬＨ−結合体ペプチドおよび５０μｌの完全フロイントアジュバント（Ｓｉｇｍａ（登録商標）Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、セントルイス、ＭＯ）を含有するエマルジョンで、２週間に１回腹腔内免疫処置した。免疫処置マウスの血清を、最初の免疫処置前ならびに２回目および３回目の免疫処置１週間後に回収し、抗Ｎｏｇｏレセプター−１抗体力価を測定した。３回目の免疫処置後に追加免疫用量を与えた。この追加免疫用量免疫処置の３日後、融合実験を開始した。
【０４２１】
（ハイブリドーマの作製およびスクリーニング）
抗原性Ｎｏｇｏレセプター−１ペプチドで免疫処置したマウスの血清をＥＬＩＳＡによってスクリーニングし、一方、Ｎｏｇｏレセプター−１を発現するＣＯＳ−７細胞で免疫処置したマウスの血清はフローサイトメトリーによってスクリーニングした。Ｎｏｇｏレセプター−１−ＣＯＳ−７細胞に特異的に結合する抗体について陽性であったマウスをフローサイトメトリーによって同定し、致死させた。脾細胞をマウスから単離し、ＦＬ６５３骨髄腫（Ｉｇ−／ＨＧＰＲＴ−Ｂａｌｂ／ｃマウス骨髄腫のＡＰＲＴ−誘導体、１０％ＦＢＳ、４５００ｍｇ／Ｌのグルコース、４ｍＭ  Ｌ−グルタミンおよび２０ｍｇ／ｍｌの８−アザグアニンを含有するＤＭＥＭ中で維持）に、既報（Ｋｅｎｎｅｔｔら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｎｅｗ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ解析、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９３））のようにして融合させた。融合細胞を２４−または４８ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｇｌａｓｓ  Ｗｏｒｋｓ、コーニング、ＮＹ）内にプレーティングし、アデニン、アミノプテリンおよびチミジン含有培養培地を供給した。ＡＡＴ耐性培養物をＥＬＩＳＡまたはフローサイトメトリーにより、Ｎｏｇｏレセプター−１−ＣＯＳ−７細胞またはＮｏｇｏレセプター−１抗原性のペプチドのいずれかに対する結合に関して、後述のようにしてスクリーニングした。陽性ウェル内の細胞を、限界希釈法によって、さらにサブクローニングした。
【０４２２】
Ｎｏｇｏレセプター−１抗原性のペプチドに対する抗体結合に関してスクリーニングするため、免疫原として使用するペプチドをＢＳＡに結合体化させた。０．５μｇの結合体ペプチドを含有する５０μｌの０．１Ｍ重炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ９．０を、９６ウェルＭａｘｉＳｏｒｐＴＭプレート（ＮｕｎｃＴＭ）の各ウェルに添加した。次いで、プレートを３７℃で１時間または４℃で１６時間インキュベートし、非特異的結合部位を、０．１％ＢＳＡ、０．１％オボアルブミン、０．１％ブロット（ｂｌｏｔｔｏ）および０．００１％アジドを含有する２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４を用いてブロックした。ハイブリドーマ上清みを添加し、２５℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳで３回洗浄後、ホースラディッシュペルオキシダーゼ−結合体化ヤギ抗マウス二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｒｎｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ．）の１：１０，０００希釈物５０μｌを、各ウェルに添加し、さらに１時間インキュベートした。３回洗浄後、ＴＭＢ（Ｐｉｅｒｃｅ）によって発色させ、２Ｍ硫酸で停止させた。発色強度を分光光度計にて４５０ｎｍでモニターした。
【０４２３】
抗体を、完全長Ｎｏｇｏレセプター−１に対する結合について以下のようにしてスクリーニングした。ＣＯＳ−７細胞を０．１  ｕＭ  ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒＴＭ  Ｇｒｅｅｎ  ＣＭＦＤＡ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）で販売元によって示されたようにして標識した。等容量のＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒＴＭ標識対照細胞を、洗浄Ｎｏｇｏレセプター−１−ＣＯＳ−７細胞を混合した後、抗Ｎｏｇｏレセプター−１試験血清とともにインキュベーションした。５０マイクロリットルの細胞混合物を、９６ウェルＶ字底ポリスチレン製プレート（Ｃｏｓｔａｒ（登録商標）３８７７、コーニング、ＮＹ）の各ウェル内に分注し、１００μｌのハイブリドーマ上清みまたは対照抗Ｎｏｇｏレセプター−１抗体を添加した。４℃で３０分間インキュベーション後、細胞を洗浄し、５０μｌのＲ−フィコエリトリン−結合体化親和性純粋Ｆ（ａｂ’）２断片ヤギ抗マウスＩｇＧ  Ｆｃ  γ特異的二次抗体（１：２００、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ウエストグルーブ、ＰＡ）とともにＰＢＳ中でインキュベートした。インキュベーションの最後に、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、２００μｌの１％ＦＢＳ含有ＰＢＳ中に懸濁し、ＦＡＣＳ解析に供した。あるいはまた、Ｎｏｇｏレセプター−１−ＣＯＳ−７細胞をハイブリドーマ上清みと混合し、次いで、Ｒ−フィコエリトリン−結合体化ヤギ抗マウス二次抗体で処理し、直接、標準的なＦＡＣＳ解析に供した。
【０４２４】
本発明者らは、さまざまな免疫原を用いて、２５種類の抗Ｎｏｇｏレセプター−１抗体を作製した。本発明者らは、ラットＮｏｇｏレセプター−１残基１１０〜１２５に対応するペプチド配列を免疫原として使用し、２種類の抗体７Ｅ１１および５Ｂ１０を作製した。本発明者らは、完全長ラットＮｏｇｏレセプター−１でトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞から調製した膜を免疫原として使用し、３種類の抗体１Ｈ２、３Ｇ５および２Ｆ７を作製した。本発明者らは、ｓＮｏｇｏＲ３１０−Ｆｃを免疫原として用いて１３種類の抗体（１Ｄ９．３、１Ｅ４．７、１Ｂ４．３、２Ｃ４．３、１Ｆ１０．３、２Ｈｌ．４、１Ｈ３．３、１Ｇ４．１．１Ｅ４．１、２Ｇ７．１、２Ｃ４．１、２Ｆ１１．１、および１Ｈ４．１）を作製し、ラットＮｏｇｏレセプター−１残基４２３〜４３４に対応するペプチド配列を免疫原として用いて７種類の抗体（２Ｅ８．１、２Ｇｌ１．２および１Ｂ５．１）作製した。
【０４２５】
（モノクローナル抗体７Ｅ１１および５Ｂ１０配列解析）
本発明者らは、Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）ＲＮｅａｓｙ（登録商標）ミニキットを用いて全ＲＮＡを抽出し、単離したＲＮＡからｃＤＮＡを作製した。本発明者らは、ＰＣＲにより、プライマー５’−ＴＧＡＧＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＧＴＣＣＣＴＴＧＧＣＣＣＣＡＧ−３’（配列番号１２）および５’−ＡＧＧＴＳＭＡＲＣＴＧＣＡＧＳＡＧＴＣＷＧＧ−３’（配列番号２５）を用いて軽鎖配列を増幅した。本発明者らは、ＰＣＲにより、プライマー５’−ＧＧＧＧＡＴＡＴＣＣＡＣＣＡＴＧＡＡＧＴＴＧＣＣＴＧＴＴＡＧＧＣＴＧＴＴＧ−３’（配列番号１３）および５’−ＧＧＧＧＡＴＡＴＣＣＡＣＣＡＴＧＡＧＧＫＣＣＣＣＷＧＣＴＣＡＧＹＴＹＣＴＫＧＧＡ−３’（配列番号１４）を用いて重鎖配列を増幅した。これらのプライマーは、以下のように縮重するヌクレオチドを含む。Ｓは、ＧまたはＣを表す；Ｍは、ＡまたはＣを表す、Ｒは、ＧまたはＡを表す；Ｗは、ＡまたはＴを表す；Ｋは、ＧまたはＴを表す；およびＹは、ＴまたはＣを表す。本発明者らは、ＰＣＲ断片を配列決定ベクター内にクローニングし、ジデオキシ鎖終結法により、配列決定ベクターに特異的なプライマーを用いてＣＤＲのＤＮＡ配列を決定した。本発明者らは、該ＤＮＡ配列を理論的に翻訳し、モノクローナル抗体７Ｅ１１および５Ｂ１０の重鎖および（ｏｆ）軽鎖のＣＤＲ領域の部分アミノ酸配列をを表２に示す。表２において、該ｍＡｂの重鎖および軽鎖の３つのＣＤＲに下線を付す。７Ｅ１１および５Ｂ１０の軽鎖は９４％のアミノ酸配列同一性を有し、重鎖は９１％のアミノ酸配列同一性を有する。ｍＡｂ  ７Ｅ１１、５Ｂ１０および１Ｈ２はＩｇＧ１アイソタイプであり、ｍＡｂ  ３Ｇ５および２Ｆ７はＩｇＧ２ａアイソタイプである。これらの５種類のｍＡｂは各々、κアイソタイプの軽鎖を有する。本発明者らは、その他のモノクローナル抗体の配列をこのアプローチによって解析する。
【０４２６】
（表２．Ｍａｂ  ７Ｅ１１および５Ｂ１０のアミノ酸配列）
【０４２７】
【表２】
2014221076.tif 000020
（モノクローナル抗体７Ｅ１１のエピトープマッピング
ｍＡｂ  ７Ｅ１１は、ラットＮｇＲ１およびヒトＮｇＲ１の両方に結合する。７Ｅ１１結合を担うエピトープを決定するため、本発明者らは、ラットＮｇＲ１の断片および合成ペプチドを作製し、７Ｅ１１結合について試験した。
【０４２８】
８個すべてのＬＲＲドメインならびにＮ−およびＣ−末端キャップ（ｓＮｇＲ３１０）を含有するラットＮｇＲ１の組換え断片を酸または臭化シアン（ＣＮＢｒ）のいずれかで処理し、ゲ電気泳動によって断片を分離した。未処理ｓＮｇＲ３１０は、見かけ分子量４２ｋＤａを有するように泳動する。ｓＮｇＲ３１０の酸処置により、１５ｋＤａ（ａａ２７〜ａａ１２２）および３０ｋＤａ（ａａ１２３〜ａａ３１０）の主に２つの切断生成物がもたらされた。ＣＮＢｒ処置により、３つの断片、３３／３５ｋＤａ二重項（ａａ２７〜ａａ２２９）が生成し、これらは、不均質グリコシル化を有する断片、１０ｋＤａ生成物（ａａ２４１〜ａａ３１０）、および１１−アミノ酸断片（ａａ２３０〜ａａ２４０）（これは、ゲル上に保持されない）を表している可能性がある。ゲルのウエスタンブロットを、７Ｅ１１を用いてプローブ検索すると、これは、完全ラットＮｇＲ１（ａａ２７〜ａａ３１０）、１５ｋＤａ酸断片（ａａ２７〜ａａ１２２）および３５ｋＤａ  ＣＮＢｒ断片（ａａ２７〜ａａ２２９）に結合することが示された。７Ｅ１１は、３０ｋＤａ酸断片（ａａ１２３〜ａａ３１０）または１０ｋＤａ  ＣＮＢｒ断片（ａａ２４１〜ａａ３１０）に結合しなかった。１５ｋＤａ酸断片および３５ｋＤａＣＮＢｒ断片はともに、配列ＬＤＬＳＤＮＡＱＬＲＶＶＤＰＴＴ（配列番号１）を含むものであり、ＮｇＲ１上の単一のエピトープに対する７Ｅ１１結合と整合する。
【０４２９】
７Ｅ１１結合部位を、ｓＮｇＲ３１０のトリプシンペプチド消化物を試験することによりさらに解析した。ＨＰＬＣ解析によりいくつかの断片が示され、これは、いくつかのトリプシン感受性のリシンおよびアルギニン残基がＮｇＲ１配列内に存在することを示した。７Ｅ１１は単一のトリプシン消化物ペプチドのみに結合し、７Ｅ１１がＮｇＲ１上の単一のエピトープに結合するというさらなる証拠を提供した。続く質量分析（ＭＳ）および配列解析により、結合ペプチドはＡＡＡＦＴＧＬＴＬＬＥＱＬＤＬＳＤＮＡＱＬＲ（配列番号２６）であると同定された。
【０４３０】
ＬＤＬＳＤＮＡＱＬＲＶＶＤＰＴＴペプチド（配列番号１）をさらなるマッピング解析に供した。該ペプチドをトリプシンで消化すると、主に２つの断片ＬＤＬＳＤＮＡＱＬＲ（配列番号２７）およびＷＤＰＴＴ（配列番号２８）がもたらされ、７Ｅ１１がこれらに結合する能力を試験した。ＭＳ解析により、該抗体がペプチドＬＤＬＳＤＮＡＱＬＲ（配列番号２７）に結合し、したがって、このペプチドは７Ｅ１１に対する結合エピトープを含有することが示された。このペプチド画分内で、詳細なＭＳ解析により、同様に７Ｅ１１に結合するいくつかの混交ペプチド（例えば、Ａｓｎｌ  ｌ５およびＧｌｎ  １１７に脱アミノ化、１１２位もしくは１１３位にアラニンの付加、または１１４位にセリンの付加を有するペプチド）が同定された（表３）。これらのデータは、このペプチド断片内に存在するいくつかのアミノ酸残基は７Ｅ１１結合に重要でない可能性があることを示す。
【０４３１】
（表３．７Ｅ１１によって結合される変異型ペプチド）
【０４３２】
【表３】
2014221076.tif 000021
また、ＬＤＬＳＤＮＡＱＬＲＶＶＤＰＴＴ（配列番号１）ペプチドをエンドプロテアーゼＡｓｐ−Ｎで消化し、７Ｅ１１結合を試験した。エンドプロテアーゼＡｓｐ−Ｎは、該ペプチドを３つのペプチド断片、Ｌ、ＤＬＳおよびＤＮＡＱＬＲＶＶＤＰＴＴ（配列番号３６）に切断した。これらの生成物のうち、７Ｅ１１は、ＤＮＡＱＬＲＶＶＤＰＴＴ（配列番号３６）ペプチドに結合した。総合すると、トリプシンおよびＡｓｐ−Ｎ切断データにより、７Ｅ１１結合エピトープは、これらの間に共有される配列ＤＮＡＱＬＲ（配列番号３７）にさらに位置限定される。
【０４３３】
種々の種由来のＮｇＲ１、ＮｇＲ２およびＮｇＲ３のアミノ酸配列を解析し、７Ｅ１１がラットおよびヒトＮｇＲ１に結合したが、マウスＮｇＲ１、ヒトＮｇＲ２またはマウスＮｇＲ３には結合しなかったという観察結果に基づき、７Ｅ１１結合エピトープ内の重要な残基を予測した。配列アラインメントにより、ラットＮｇＲ１アミノ酸１１０〜１２５と対応するヒトＮｇＲ１配列が同一であること、およびマウスＮｇＲ１配列は、１１９位の１つのアミノ酸（ラットおよびヒトＮｇＲ１のＡｒｇｌ  ｌ９、ならびにマウスＮｇＲ１のＨｉｓ  １１９；表４）のみが異なることが示された。
【０４３４】
（表４．種々の種由来のＮｇＲ配列アラインメント）
【０４３５】
【表４】
2014221076.tif 000022
ＮｇＲ１上のＡｒｇ  １１９は、ラットおよびヒトＮｇＲ１に充分結合するが、マウスＮｇＲ１に対しては不十分なため、７Ｅ１１結合に寄与する。同様に、７Ｅ１１はＮｇＲ３に充分結合しないため、ＤＮＡＱＬＲ配列（配列番号３７）内ではＮｇＲ３はＮｇＲ１と対応する配列のアルギニンのみが異なることから、Ａｌａ  １１６はエピトープに関与している。ＤＮＡＱＬＲ（配列番号３７）配列内では、ＮｇＲ２内の６個の残基のうち４個がラットＮｇＲ１と同一である。Ａｌａ  １１６およびＧｌｎ  １１７は、それぞれ、アルギニンおよびヒスチジンで置き換えられる。これにより、Ａｌａ  ｌｌ６は、７Ｅ１１結合に寄与する重要なアミノ酸残基であるが、Ｇｌｎ  １１７の関与を必ずしも除外しないことが確認される。
【０４３６】
これらの接触点を確認するため、ＬＤＬＳＤＮＡＱＬＲ配列（配列番号２７）内に点変異を含有するいくつかのペプチドを作製し、７Ｅ１１結合について試験した。ペプチドをＭａｘｉＳｏｒｐＴＭプレート（ＮｕｎｃＴＭ）上に固定化し、７Ｅ１１の連続希釈物を適用した。得られたＥＣ５０値を表５に示す。７Ｅ１１は、変異型  Ｌｅｕ１１０ＡｌａおよびＡｓｐ１１１Ａｌａに、元のペプチドと同様のＥＣ５０値で結合した。Ｇｌｎ  １１７Ａｌａを試験すると、ＥＣ５０は３０倍増大しており、Ａｒｇ１１９Ｈｉｓを試験すると、ＥＣ５０は２５倍増大していた。ＥＣ５０おける最も有意な変化は、Ａｒｇ  １１９がアラニンに変異された場合に観察された。
【０４３７】
（表５．７Ｅ１１は、種々のＥＣ５０を有する変異型ペプチドに結合する）
【０４３８】
【表５】
2014221076.tif 000023
また、７Ｅ１１結合エピトープの位置を、最近解像（ｒｅｓｏｌｖｅ）されたｓＮｇＲ３１０の結晶構造において決定した。予測どおり、構造は、７Ｅ１１  エピトープが分子表面上に露出していることを示す。残基Ａｒｇ  １１９、Ｇｌｎ  １１７、Ａｌａ  １１６およびＡｓｐ  １１４は、該構造から外方に突出しているが、Ｌｅｕ  １１８およびＡｓｎ  １１５は、内方に存在している。エピトープは、該構造の陥凹表面内の酸性斑および両側面の一方と対向する塩基性表面の上面に存在する。
【０４３９】
（モノクローナル抗Ｎｏｇｏレセプター−１抗体による可溶性Ｎｏｇｏレセプター−１に対するリガンドの阻害）
上記のようにして作製した抗Ｎｏｇｏレセプター−１  モノクローナル抗体を、Ｎｏｇｏレセプター−１に対するリガンド結合を阻害するか否かを調べるために試験した。
【０４４０】
ラットＮｏｇｏレセプター−１のアミノ酸残基２６〜３４４ならびにラットＩｇＧ１分子（ｓＮｏｇｏＲ３４４−Ｆｃ）のヒンジ領域およびＦｃ領域を含む０．５μｇの可溶性Ｎｏｇｏレセプター−１融合タンパク質（後述のようにして作製）を、２５０μｇのプロテインＡ−または小麦胚芽凝集素−結合体化ＳＰＡビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）上に、２５℃で２時間固定化した。Ｆｃ−ｓＮｏｇｏＲ−１、抗Ｎｏｇｏレセプター−１  ｍＡｂおよび１μｌの１２５Ｉ−Ｎｏｇｏ６６（Ａｍｅｒｓｈａｍ、２０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ、１ｎＭ）とカップリングさせたＳＰＡビーズを５０μｌのＨＥＰＥＳ緩衝インキュベーション培地（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％オボアルブミン、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２ｍＭ  ＣａＣｌ２およびプロテアーゼインヒビター）を、各試料ウェルに添加した。１６時間後、放射能を、４連の試料においてＴｏｐＣｏｕｎｔ（登録商標）（Ｐａｃｋａｒｄ）を用いて測定した。ＩＣ５０値を曲線フィット解析（図３）（ＰＲＩＳＭ、ＧｒａｐｈＰａｄ
Ｓｏｆｔｗａｒｅ、ＮＪ）から算出した。一部の実験では、本発明者らは、ＡＰ−リガンド結合体（例えば、ＡＰ−Ｎｏｇｏ６６）もまた使用し、アルカリホスファターゼ活性をモニタリングすることにより結合を検出した。また、本発明者らは、該ｍＡｂが、Ｎｏｇｏレセプター−１に対するリガンドＭＡＧ−ＦｃおよびＡＰ−ＯＭ−ｇｐの結合をブロックする能力をアッセイした。
【０４４１】
モノクローナル抗体７Ｅ１１、５Ｂ１０、１Ｈ２、３Ｇ５および２Ｆ７はすべて、ｓＮｏｇｏＲ３４４−Ｆｃに対するＮｏｇｏ６６、ＭＡＧおよびＯＭ−ｇｐの結合を阻害した。７Ｅ１１および１Ｈ２に対するＮｏｇｏ６６の算出ＩＣ５０は、それぞれ４００ｎＭおよび６０ｎＭであった。Ｎｏｇｏレセプター−１に対する該３つのリガンドの結合のｍＡｂ媒介性阻害をＥＬＩＳＡモニタリングしたデータを表６にまとめる。
【０４４２】
（表６．ｍＡｂは、Ｎｏｇｏレセプター−１に対するＮｏｇｏ６６、ＭＡＧおよびＯＭ−ｇｐの結合を阻害する）
【０４４３】
【表６】
2014221076.tif 000024
置換（ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）パーセントは、抗体３０ｎＭおよび記載の曲線フィット解析から測定された特定のｍＡｂのＥＣ５０でのものを示す。「−」は、検出可能な活性がないことを示し、「ＮＤ」は測定不可を示す。
実施例２
（ＦＡＢファージ抗−Ｎｏｇｏレセプター−１抗体の作製）
また、本発明の免疫原性Ｎｏｇｏレセプター−１ポリペプチドに特異的に結合する抗Ｎｏｇｏレセプター−１  Ｆａｂ−ファージ抗体を、以下のようにしてＦａｂ−ファージライブラリーをスクリーニングすることにより作製した。
【０４４４】
ＭｏｒｐｈｏＳｙｓ  Ｆａｂ−ファージライブラリーＨｕＣＡＬ（登録商標）ＧＯＬＤを、組換えラット可溶性ｓＮｏｇｏＲ３１０−Ｆｃタンパク質およびラットＮｏｇｏレセプター−１を発現するＣＯＳ７細胞に対してスクリーニングした。Ｎｏｇｏレセプター−１に特異的に結合したＦａｂ−ファージを精製し、キャラクタライズした。１４Ｄ５の重鎖はＶＨ２遺伝子に由来のものであり、軽鎖はＶＫ１遺伝子に由来ものである。これらのＦａｂ−ファージの１つである１４Ｄ５の重鎖および軽鎖のＣＤＲのアミノ酸配列を表７に示す。
【０４４５】
（表７．１４Ｄ５のＣＤＲのアミノ酸配列）
【０４４６】
【表７】
2014221076.tif 000025
１４Ｄ５は、一価形態および二価形態どちらでもラットＮｏｇｏレセプター−１に結合する。また、１４Ｄ５は、マウスおよびヒトのＮｏｇｏレセプター−１ならびにヒトＮｏｇｏレセプター−２に結合するが、マウスＮｏｇｏレセプター−３には結合しない。
【０４４７】
（実施例３）
（抗Ｎｏｇｏレセプター−１モノクローナル抗体によるＮｏｇｏレセプター−１の免疫沈降）
免疫沈降を行なうため、１００μｌの細胞溶解液または５０μｌのＰｉＰＬＣ処理細胞を、４００または４５０μｌの抽出緩衝液［１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．２、０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０ＴＭ、０．２ｍＭ  ＰＭＳＦ］またはＲＩＰＡ緩衝液と、それそれ、３０μｌのプロテインＡまたはＧおよび１〜２μｇの抗体の存在下で混合した。混合物を振とう機内で、４℃にて１６時間インキュベートした。
【０４４８】
試料を穏やかにスピンし、プロテインＡまたはＧカップリングビーズをペレット化した。ビーズを１ｍｌの洗浄緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．２、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０ＴＭ）で３回洗浄した。最後の洗浄は、オリジナルの１０％の洗浄緩衝液を用いて行なった。
【０４４９】
ビーズを１００μｌの２×ＳＤＳ（１０％β−メルカプトエタノール含有）中に再懸濁した。試料を室温でインキュベートした後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥのための４〜２０％Ｔｒｉｓ−グリシンゲル上で泳動させた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル解析から測定されるように、モノクローナル抗体３Ｇ５および２Ｆ７は、Ｎｏｇｏレセプター−１を免疫沈降させた。
【０４５０】
（実施例４）
（ＥＬＩＳＡによる抗体特異性の測定）
実施例１および２で作製したモノクローナルおよびＦａｂ−ファージ抗体の特異性を調べるため、本発明者らは、一連のＮｏｇｏレセプター−１ポリペプチドを用いてＥＬＩＳＡを行なった。この一連のものは、ｓＮｏｇｏＲ３１０−Ｆｃ（ラットＮｏｇｏレセプター−１のアミノ酸２６〜３１０ラットＦｃ断片を含む融合タンパク質）、ｓＮｏｇｏＲ３４４−Ｆｃ（上掲参照）、ポリペプチドｐ−６１７（配列番号１）、ポリペプチドｐ−６１８（ラットＮｏｇｏレセプター−１のＬＲＲ７  領域由来の１９−アミノ酸ポリペプチド；図２；配列番号１１）ならびにポリペプチドｐ−４およびｐ−５（それぞれ、Ｎｏｇｏレセプター−１のＬＲＲ５およびＬＲＲＣＴ領域由来のポリペプチド）からなるものであった。オボアルブミンおよびＢＳＡを対照として使用した。図４に示されるように、ｍＡｂ  １Ｈ２、３Ｇ５および２Ｆ７はすべて、ｓＮｏｇｏＲ３４４−Ｆｃに特異的に結合した。同様の実験では、該抗体は、ラットＮｏｇｏレセプター−１のアミノ酸３１０〜３４４からなるポリペプチド（配列番号３）にも特異的に結合し、ｍＡｂ  ７Ｅ１１および５Ｂ１０は、ポリペプチドｐ−６１７（配列番号１）に特異的に結合した。
【０４５１】
ｓＮｏｇｏＲ３１０−Ｆｃ免疫処置した抗体のうち１０種類（１Ｄ９．３、１Ｅ４．７、１Ｂ４．３、２Ｃ４．３、１Ｆ１０．３、２Ｈ１．４、１Ｈ３．３、１Ｇ４．１、１Ｅ４．１および２Ｇ７１．１）は、結合に関して互いに置換され、これは、ｓＮｏｇｏＲ３１０−Ｆｃ上の同様または重複するエピトープ認識することを示す。ｓＮｏｇｏＲ３１０−Ｆｃ免疫処置したその他の３種類の抗体（２Ｃ４．１、２Ｆ１１．１および１Ｈ４．１）は、アミノ酸残基２６〜３１０に存在する異なるエピトープを認識する。
【０４５２】
本発明者らはまた、Ｆａｂ−ファージ１４Ｄ５を用いてＥＬＩＳＡ結合アッセイを行なった。ＡＰ−Ｎｏｇｏ６６、ＡＰ−ＯＭ−ｇｐおよびＭＡＧ−Ｆｃリガンドを固定化ｓＮｏｇｏＲ３４４−Ｆｃに対して結合させた場合、１μＭ  １４Ｄ５は、ＮｏｇｏおよびＭＡＧの結合を完全に阻害した。ｓＮｏｇｏＲ３４４−Ｆｃに対するＯＭ−ｇｐの結合を完全に阻害するためには、１０μＭの１４Ｄ５が必要とされた。
【０４５３】
（実施例５）
（神経突起伸長のアッセイ）
上記のようにして作製した該モノクローナルおよびＦａｂ−ファージ抗体が、ニューロンに対するＣＮＳミエリンの阻害効果を弱める能力を試験するため、Ｌａｂ−Ｔｅｋ（登録商標）培養スライド（４ウェル）に、０．１ｍｇ／ｍｌのポリ−Ｄ−リシン（Ｓｉｇｍａ（登録商標））をコートした。ＣＮＳミエリンまたはＰＢＳを３μｌの液滴としてスポットした。蛍光ミクロスフィア（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）をミエリン／ＰＢＳに添加し、後に該液滴が同定されるようにした（Ｇｒａｎｄｐｒｅら、Ｎａｔｕｒｅ  ４０３：４３９−４４４（２０００））。次いで、Ｌａｂ−Ｔｅｋ（登録商標）スライドをリンス処理し、１０μｇ／ｍｌのラミニン（ＧｉｂｃｏＴＭ）をコートした。Ｐ３−４  Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットの幼獣由来の脊髄神経節（ＤＲＧ）を、１ｍｇ／ｍｌの１型コラゲナーゼ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）を用いて解離させ、火炎研磨したＰａｓｔｅｕｒピペットを用いて摩砕し、予備プレーティングしてニューロン細胞を富化させ、最後に、２３，０００細胞／ウェルで、プレコートしたＬａｂ−Ｔｅｋ（登録商標）培養スライド上にプレーティングした。培養培地は、５％の熱不活化ドナーウマ血清、５％の熱不活化ウシ胎仔血清および５０ｎｇ／ｍｌのｍＮＧＦを含有するＦ１２とし、３７℃および５％ＣＯ２で６時間インキュベートした。１５μｇ／ｍｌのｍＡｂ  ７Ｅ１１を、プレーティングの直後に添加した。
【０４５４】
スライドを２０分間、４％パラホルムアルデヒド（２０％スクロース含有）で固定し、ニューロンマーカー抗β−ＩＩＩ−チューブリン（Ｃｏｖａｎｃｅ  ＴＵＪｌ）（１：５００希釈）について染色した。二次抗体として、抗マウスＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を１：３００に希釈し、スライドをＧｅｌ／ＭｏｕｎｔＴＭ（ＢｉｏｍｅｄａＴＭ）とともにカバーガラスで覆った。ＯｐｅｎＬａｂＴＭソフトウェアにより５×デジタル画像を取得し、ＭｅｔａＭｏｒｐｈ（登録商標）ソフトウェアを使用することにより神経突起伸長の定量について解析した。
【０４５５】
ＭＡｂ  ７Ｅ１１は、ＤＲＧニューロンをミエリン媒介性神経突起伸長の阻害から保護した（図５）。同様の結果がｍＡｂ  １Ｈ２および３Ｇ５で観察された。
【０４５６】
ラットＰ７  ＤＲＧニューロンをＣＮＳミエリン基質上で培養した神経突起伸長保護アッセイでは、二価の１４Ｄ５もまた、神経突起伸長を効率的に促進した。
【０４５７】
（実施例６）
（Ｎｏｇｏレセプター−１でトランスフェクトした細胞における７Ｅ１１を用いた免疫組織化学）
実施例１に記載のようにして作製した抗Ｎｏｇｏレセプター−１  ｍＡｂの結合特性をさらに特性評価するため、本発明者らは、ラットまたはヒトＮｏｇｏレセプター−１を発現するＣＯＳ−７または２９３固定細胞および生細胞両方に対する結合を比較した。
【０４５８】
固定細胞：
Ｎｏｇｏレセプター−１トランスフェクト細胞および非トランスフェクト細胞を、８ウェルＬａｂ−Ｔｅｋ（登録商標）培養スライドにプレーティングし、４％パラホルムアルデヒドで１５分間固定し、１０％正常ヤギ血清、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００含有ＰＢＳ中で１時間ブロックした。Ｍａｂ  ７Ｅ１１を、ブロック溶液中１５μｇ／ｍｌおよび１．５μｇ／ｍｌで添加し、室温で２時間インキュベートした。抗マウスＡｌｅｘａ（登録商標）結合体化二次抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を、ブロック溶液中１：３００希釈で１時間インキュベートした。ＤＡＰＩを５μｇ／ｍｌで、該二次抗体に添加し、すべての核を標識した。
【０４５９】
生細胞：
トランスフェクト細胞および非トランスフェクト細胞を８ウェルＬａｂ−Ｔｅｋ培養スライドにプレーティングし、ＦＡＣＳ緩衝液（４％ドナーウマ血清含有）で４℃にて３０分間ブロックし、１５μｇ／ｍｌおよび１．５μｇ／ｍｌの７Ｅ１１とともにＦＡＣＳ緩衝液中、４℃で１時間インキュベートし、リンス処理し、二次抗体抗マウス−Ａｌｅｘａ（登録商標）（ＦＡＣＳ緩衝液中１：３００）とともに４℃で３０分間インキュベートした。
【０４６０】
免疫組織化学的染色実験により、すべてのｍＡｂがラットＮｏｇｏレセプター−１発現細胞に結合することが示された。ｍＡｂ  ７Ｅ１１、２Ｇ７．１および２Ｃ４．１は、ヒトＮｏｇｏレセプター−１を発現する固定細胞および生細胞の両方に結合した。
【０４６１】
（実施例７）
（脊髄挫傷性損傷のマウスモデル）
実施例１で作製した抗Ｎｏｇｏレセプター−１  ｍＡｂのインビボでのニューロンに対する効果を試験するため、本発明者らは、マウス脊髄挫傷損傷モデルを使用する。
【０４６２】
雌マウス（１８〜２２ｇ）を鎮痛剤および抗生物質で予防的に処置する。マウスを麻酔し、定位装置内に配置し、脊柱を実体顕微鏡下に固定する。変形ウェイト−ドロップ（ｗｅｉｇｈｔ−ｄｒｏｐ）法（Ｍ．Ｌｉら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＰＰ：３３３−３４２（２０００）によって、外傷を脊髄に導入する。
【０４６３】
簡単には、Ｔ９およびＴ１０椎弓切除術を行ない、Ｔ９−Ｔ１０横突起を左右に支持する１対ののマウス用横断鉗子を用いて脊柱を安定させる。直径１．４ｍｍおよび重量２ｇのステンレス鋼打撃ロッドを硬膜の上部２．５ｃｍに上昇させ、脊髄のＴ１０レベルに落下させる。外科処置中、マウスを３７℃の加温ブランケット上に維持し、脱水を回避するため、外科処置後、各マウスに１ｍｌの加温滅菌生理食塩水を皮下投与する。膀胱を、反射性膀胱制御が回復するまで、手作業で１日１回露出させる。
【０４６４】
すべての動物に、外科処置後８〜１２時間毎に術後無痛法を、その後７日間、１日２回、抗生物質処置を施す。動物には、試験期間中、自由に食餌および水を摂取させる。抗Ｎｏｇｏレセプター−１抗体を損傷部位に、髄腔内注射によって２８日間、以下のラット脊髄離断モデルに記載のようにして送達する。
【０４６５】
（実施例８）
（可溶性Ｎｏｇｏレセプター−１融合タンパク質の特徴付け）
可溶性Ｎｏｇｏレセプター−１ポリペプチド（ｓＮｏｇｏＲ−１）および融合タンパク質（Ｆｃ−ｓＮｏｇｏＲ−１）をキャラクタライズするため、本発明者らは、以下の実験を行なった。
【０４６６】
３μｇの可溶性Ｎｏｇｏレセプター（ｓＮｏｇｏＲ３１０−ＦｃおよびｓＮｏｇｏＲ３４４−Ｆｃ）を、２５０μｇのＷＧＡ−ＳＰＡビーズ上に固定化し、０．５μＬの放射性リガンド（終濃度０．５ｎＭ）を、最終容量１００μＬの結合緩衝液（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、２ｍＭ  Ｃａ、２ｍＭ  Ｍｇ、０．１％ＢＳＡ、０．１％オボアルブミンおよびプロテアーゼインヒビター）中で与えた。リガンドには、各リガンドの組に対して、１０μＭ  Ｎｏｇｏ６６、１０μＭ  １２５Ｉ−Ｎｏｇｏ４０（Ｎｏｇｏ  Ａのアミノ酸１〜４０）および１０μＬの抗Ｎｏｇｏレセプター−１抗体上清みを含めた。Ｎｏｇｏ４０上の３つのチロシンを別々にヨウ素化し、それぞれＮｏｇｏ４０−Ａ、−Ｂおよび−Ｃと命名した。３連の平均値を標準化結合放射能％として示す（図６、７および８）。エラーバーはＳＥＭを示す。データ標準化では、インヒビター非存在下での結合放射能を１００％とし、１０μＭ  Ｎｏｇｏ４０の存在下での最小結合放射能を０％とした。
【０４６７】
（実施例９）
（可溶性Ｎｏｇｏレセプター−１融合タンパク質に対するリガンド結合の阻害）
実施例８の結合アッセイと同様の結合アッセイを用い、実施例１で作製した２種類のｍＡｂが、ｓＮｏｇｏＲ３４４−Ｆｃに対する１２５Ｉ−Ｎｏｇｏ６６結合を阻害する能力を試験した。ｍＡｂ  ２Ｆ７および３Ｇ５は、ｓＮｏｇｏＲ３４４−Ｆｃに対する１２５Ｉ−Ｎｏｇｏ６６結合を阻害した。
【０４６８】
（実施例１０）
（神経突起伸長のアッセイ）
Ｌａｂ−Ｔｅｋ（登録商標）培養スライド（４ウェル）に０．１ｍｇ／ｍｌのポリ−Ｄ−リシン（Ｓｉｇｍａ（登録商標））をコートした。ＣＮＳミエリンを、単独またはｓＮｏｇｏＲ３１０、ｓＮｏｇｏＲ３１０−Ｆｃ融合タンパク質、ｍＡｂ  ５Ｂ１０もしくは対照ＰＢＳと混合して、別々に、３μｌの液滴としてスポットした。蛍光ミクロスフィア（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）をミエリン／ＰＢＳに添加し、後に該液滴が同定されるようにした（Ｇｒａｎｄｐｒｅら、Ｎａｔｕｒｅ  ４０３：４３９−４４４（２０００））。次いで、Ｌａｂ−Ｔｅｋ（登録商標）スライドをリンス処理し、１０μｇ／ｍｌのラミニン（ＧｉｂｃｏＴＭ）をコートした。
【０４６９】
Ｐ３−４  Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラット幼獣由来の脊髄神経節（ＤＲＧ）を、１ｍｇ／ｍｌの１型コラゲナーゼ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）を用いて解離させ、火炎研磨したＰａｓｔｅｕｒピペットを用いて摩砕し、予備プレーティングしてニューロン細胞を富化させ、最後に、２３，０００細胞／ウェルで、プレコートしたＬａｂｔｅｋ培養スライド上にプレーティングした。培養培地は、５％熱不活化ドナーウマ血清、５％熱不活化ウシ胎仔血清および５０ｎｇ／ｍｌのｍＮＧＦを含有するＦ１２とし、３７℃および５％ＣＯ２で６時間インキュベートした。
【０４７０】
スライドを２０分間、４％パラホルムアルデヒド（２０％スクロース含有）で固定し、ニューロンマーカー抗β−ＩＩＩ−チューブリン（Ｃｏｖａｎｃｅ  ＴＵＪｌ）（１：５００希釈）について染色した。二次抗体として、抗マウスＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を１：３００に希釈し、スライドをＧｅｌ／ＭｏｕｎｔＴＭ（ＢｉｏｍｅｄａＴＭ）とともにカバーガラスで覆った。ＯｐｅｎＬａｂＴＭソフトウェアにより５×デジタル画像を取得し、ＭｅｔａＭｏｒｐｈ（登録商標）ソフトウェアを使用することにより神経突起伸長の定量について解析した。
【０４７１】
ｓＮｏｇｏＲ３１０、ｓＮｏｇｏＲ３１０−ＦｃおよびｍＡｂ  ５Ｂ１０はすべて、ＤＲＧニューロンをミエリン媒介性神経突起伸長の阻害から保護した（図９〜１１）。ｓＮｏｇｏＲ３１０を、幼鳥のニューロンを用いた同様のアッセイにおいて使用すると、保護性であることがわかった。
【０４７２】
本発明者らはまた、ラミニンの存在下および非存在下での細胞培養を伴う実験を行なうことにより、可溶性Ｎｏｇｏレセプターの神経保護効果を試験した。ラミニンなしの培地中でのニューロン細胞の成長は不充分であり、ニューロンストレス条件のモデルとなる。
【０４７３】
ＤＲＧを生後第６〜７日のラット幼獣（Ｐ６−７）から切開し、単一の細胞に解離させ、上記のようにしてポリ−Ｄ−リシンをプレコートした９６ウェルプレート上にプレーティングし、一部のウェルには、２μｇ／ｍｌのラミニンを２〜３時間添加し、リンス処理した後、細胞をプレーティングした。１８〜２０時間のインキュベーション後、プレートを４％パラホルムアルデヒドで固定し、ウサギ抗β−ＩＩＩ−チューブリン抗体（１：５００に希釈）（Ｃｏｖａｎｃｅ（登録商標））および抗ＨｕＣ／Ｄ（１：１００に希釈）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）で染色し、蛍光二次抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を１：２００の希釈度で添加した。ＡｒｒａｙＳｃａｎ（登録商標）ＩＩ（Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ（登録商標））を用いて５×デジタル画像を取得し、神経突起伸長アプリケーションを使用することにより、神経突起伸長を平均神経突起伸長／ニューロン／ウェルとして定量した。３ウェル／条件で９枚の５×画像を解析した。
【０４７４】
一部の実験では、ＰＣ１２細胞（ＮｅｕｒｏｓｃｒｅｅｎＴＭ）のサブクローンを使用した（Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ（登録商標））。ＮｅｕｒｏｓｃｒｅｅｎＴＭ細胞を７日間、２００ｎｇ／ｍｌのＮＧＦで予備分化させ、剥がし、ポリ−Ｄ−リシンをプレコートした９６ウェルプレート上に再プレーティングした。一部のウェルでは、５μｇ／ｍｌのラミニンを２〜３時間添加し、リンス処理した後、細胞をプレーティングした。２日間のインキュベーション後、プレートを４％パラホルムアルデヒドで固定し、ウサギ抗β−ＩＩＩ−チューブリン抗体（１：５００に希釈）（Ｃｏｖａｎｃｅ（登録商標））およびＨｏｅｃｈｓｔ（核染色）で染色した。ＡｒｒａｙＳｃａｎ（登録商標）ＩＩを用いて神経突起伸長をＤＲＧ細胞の場合のようにして定量した。
【０４７５】
ｓＮｏｇｏＲ３４４−ＦｃまたはラットＩｇＧを溶液状態で、Ｐ６−７  ＤＲＧニューロンおよび分化ＮｅｕｒｏｓｃｒｅｅｎＴＭ細胞に、プレーティング時に添加した。
【０４７６】
Ｐ６  ＤＲＧニューロンをラミニンの非存在下で培養した場合のｓＮｏｇｏＲ３４４−Ｆｃの神経保護効果を１μＭおよび１０μＭで観察した。神経突起伸長の定量により、ｓＮｏｇｏＲ３４４−Ｆｃの添加によって、用量依存的増大が示された。ラミニン基質上で培養中のＤＲＧニューロンへの同濃度でのｓＮｏｇｏＲ３４４−Ｆｃの添加では、なんら非通常の効果はもたらされず、これは、ｓＮｏｇｏＲ３４４−Ｆｃがストレス細胞においてのみ活性であることを示す。また、ラミニンの非存在下での同濃度のｓＮｏｇｏＲ３４４−Ｆｃの神経保護効果は、ＮｅｕｒｏｓｃｒｅｅｎＴＭ細胞でも見られた。
【０４７７】
（実施例１１）
（ＦＣ−ｓＮｏｇｏＲ−１融合タンパク質の作製および精製）
ラットＮｏｇｏレセプター−１のアミノ酸１〜３１０をコードするｃＤＮＡ構築物を、哺乳動物発現ベクター内に含有されるラットＩｇＧ  １Ｆｃに融合させ、このベクターを、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）（ＤＧ４４）細胞にエレクトロポレーションした。細胞を、１０％透析ウシ胎仔血清、２ｍＭグルタミンおよび抗生物質−抗真菌剤試薬を補給したα−ＭＥＭ中に維持した。トランスフェクションの２日後、馴化培地を回収し、還元条件下でウエスタンブロットにより解析した。約６０ｋＤａのタンパク質バンドが、ポリクローナルウサギ抗Ｎｏｇｏレセプター−１抗体を用いて検出された。細胞を拡大培養し、Ｒ−ＰＥ結合体化ヤギ抗ラットＩｇＧ抗体を用いて分取した。２回目の分取後、細胞を１細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレート内にプレーティングした。個々のウェルの分泌された可溶性Ｎｏｇｏレセプター−１タンパク質レベルを、サンドイッチＥＬＩＳＡを試験および比較した。ＥＬＩＳＡプレートには、ヤギ抗ラットＩｇＧ  Ｆｃκ特異的抗体をコートした。馴化培地を供給した。結合された可溶性Ｎｏｇｏレセプター−１タンパク質を、ＨＲＰ結合体化ロバ抗ラットＩｇＧ  Ｆａｂ、Ｆｃ特異的抗体によって検出した。クローン４Ｃ１２は、最大分泌レベルを有した。４Ｃ１２を拡大培養し、スピナーフラスコ内のＣＨＯ−Ｍ７培地中で培養した。分泌レベルは、３７℃で約１０ｍｇ／Ｌであった。
【０４７８】
ｓＮｏｇｏＲ３１０−Ｆｃ融合タンパク質を発現するＣＨＯ細胞を大規模で培養した。１．７Ｌの濃縮馴化培地を、１０Ｌバイオリアクター稼動から得た。ｐＨを、１０分の１容量の１．０Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．９）の添加によって上昇させた。固形塩化ナトリウムおよびグリシンを、それぞれ、３．０Ｍおよび１．５Ｍで添加した。１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、３Ｍ塩化ナトリウム、１．５Ｍグリシン（ｐＨ８．９）で平衡化した６０ｍＬ容のプロテインＡ−セファロースＴＭカラムを調製した。濃縮馴化培地をカラムに、蠕動ポンプを用いて１．５ｍＬ／分で適用した。カラムを、３００ｍＬの１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、３Ｍ塩化ナトリウム、１．５Ｍグリシン（ｐＨ８．９）で洗浄した後、１２０ｍＬ  ５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、３Ｍ塩化ナトリウム（ｐＨ８．９）で洗浄した。タンパク質を２５ｍＭリン酸ナトリウム、１００ｍＭ塩化ナトリウム（ｐＨ２．８）で溶出した。１０ｍＬの画分を、１．０ｍＬの１．０Ｍ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．５）を入れたチューブ内に回収した。タンパク質画分をプールし、３×２Ｌの５ｍＭリン酸ナトリウム、３００ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．４）に対して透析した。
【０４７９】
（実施例１２）
（脊髄離断アッセイ）
機能回復をインビボで促進する能力を試験するため、ｓＮｏｇｏＲ−１  融合タンパク質をラット脊髄離断アッセイにおいて試験した。
【０４８０】
Ａｌｚｅｔ（登録商標）浸透圧ポンプに、使用当日に新たに作製した試験溶液（ｓＮｏｇｏＲ３１０−Ｆｃ含有ＰＢＳ）を負荷した。負荷濃度は、５および５０μＭと算出された。ポンプに＞４０時間３７℃で呼び水を入れた後、動物に埋入した。雌Ｌｏｎｇ  Ｅｖａｎｓラットに術前無痛法および精神安定薬を与え、イソフルラン（Ｏ２中３％）を用いて麻酔した。
【０４８１】
ラットを定位フレーム内に配置し、路のトレース剤ＢＤＡ（１０，０００  ＭＷ）を左右方向に注入するために運動皮質を露出させた。次いで、ラットに脊髄のＴ５−Ｔ６に背側半側切除を行なった後、試験化合物を送達するための髄腔内カテーテルおよびポンプシステムを埋入した（ｎ＝１１／群）。
【０４８２】
外科処置後、２８日間までラットを回復および生存させた。ＢＢＢシステムを用いた挙動スコアリングを、損傷誘導後２８日間、該試験中の生存期間の終了直前まで記録した。灌流および固定後、脊髄を取り出し、凍結保護し、切片化し、染色し、軸索計数を行なった。
【０４８３】
Ｂａｓｓｏ−Ｂｅａｔｔｉｅ−Ｂｒｅｓｎａｈａｎ（ＢＢＢ）運動機能評定尺度（Ｂａｓｓｏら、Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ  １３：３４３−３５９（１９９６））、斜面試験および傾斜グリッド歩行試験（ＬｉおよびＳｔｒｉｔｔｍａｔｔｅｒ、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２５：４２１９−２７（２００３））を、損傷後のラットおよびマウスにおいてモニターした。斜面試験では、本発明者らは、５秒間マウスが滑り落ちることなく５０ｃｍ×６０ｃｍのボードを傾けることができる最大角度を測定した。傾斜グリッド歩行では、マウスを、４５度の角度のワイヤグリッド（３５ｃｍ長さで２．５４平方ｃｍ）をよじ登るように訓練した。後足がグリッド平面より下に落ちた場合の数を、下から上までの各偏倚運動についてスコアリングした。ラット挙動試験では、ＢＢＢ運動機能尺度、グリッド歩行およびフットプリント解析を行なった。グリッド歩行では、ラットを、ワイヤグリッド（７０ｃｍ長さで２．５４平方ｃｍ）上を歩行するように訓練し、後足がグリッド平面より下に落ちた場合の数を計数した。フットプリント解析では、ラット後足の歩行パターンを、９０ｃｍの通路での連続移動運動中、インクで記録し、両側での一股長さおよび一股幅を算出した（Ｍｅｔｚら、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．８８３：１６５−１７７（２０００））。これらの挙動試験はすべて、少なくとも２匹の個体で行なった。外科処置、挙動試験および組織学的解析全体を通して研究者らは、ミニポンプ内の化合物の実体について知らされていなかった。
【０４８４】
ｓＮｏｇｏＲ３１０−Ｆｃは機能回復を回復した（図１２）。
【０４８５】
（実施例１３）
（ＲＡＴ脊髄挫傷アッセイ）
インビボでのニューロンに対する可溶性Ｎｏｇｏレセプター−１ポリペプチドおよび融合タンパク質の効果を、ラット脊髄挫傷アッセイにおいて試験する。
【０４８６】
雌Ｈｏｏｄｅｄ型Ｌｏｎｇ  Ｅｖａｎｓラット（１７０〜１９０ｇ）を鎮痛剤および抗生物質で予防的に処置する。外科処置の１０分前、動物を２．５ｍｇ／ｋｇの腹腔内ミダゾラム沈静させ、２〜３％のイソフルラン含有Ｏ２で麻酔する。次いで、ラットを剃毛し、アルコールおよびベタジンで隅々まで拭き、眼用潤滑剤を目に適用する。次に、切開を正中切開で行ない、Ｔ７からＴ１２までの脊椎を露出させる。
【０４８７】
背側椎弓切除術をＴ９  １／２およびＴ１０において行ない、該索部を露出させる。ラットを衝撃部材上に置く。Ｔ７およびＴ８セグメントをまず、鉗子で把持し、次いで、Ｔ１１およびＴ１２セグメントを尾側鉗子に結合する。軟質物質をラットの胸部の下部に配置する。衝撃部材ロッドをゼロの位置に設定し、電気アースクリップを損傷端に結合する。次いで、衝撃部材ロッドを２５．０ｍｍまで上昇させ、露出脊髄のすぐ上部の位置に適切に調整する。次に、衝撃部材ロッドを放して露出させた索に当て、衝撃部材ロッドをすぐに持ち上げる。
【０４８８】
次いで、ラットを台から下ろし、Ｇｅｌｆｏａｍ（登録商標）を創傷部に配置する。創傷部上部の筋肉を縫合し、切開部を外科的に閉じる。動物を、麻酔から回復するまでインキュベータ内に配置する。ラットに抗生物質、鎮痛剤および生理食塩水を必要に応じて与える。その後、機能が回収されるまで膀胱を毎朝晩露出させる。
【０４８９】
可溶性Ｎｏｇｏレセプター−１融合タンパク質（例えば、ｓＮｏｇｏＲ３１０−Ｆｃ）を、上記のラット脊髄離断モデルで記載のようにして髄腔内投与する。ＢＢＢスコアリングを、外科処置の１日後、次いで、その後は毎週４〜６週間まで行う。
【０４９０】
（実施例１４）
（トランスジェニックマウスにおけるｓＮｏｇｏＲ３１０の発現）
本発明者らは、インビボで発現されたときの効果を試験するため、可溶性Ｎｏｇｏレセプター−１タンパク質を発現するトランスジェニックマウスを作製した。
【０４９１】
本発明者らは、マウスｓＮｏｇｏＲ３１０  ｃＤＮＡ（Ｎｏｇｏレセプター−１のアミノ酸１〜３１０に対応）をＣ−３１２３ベクターのＮｏｔｌ部位内にクローニングした。このベクターでは、ｓＮｏｇｏＲ３１０発現は、グリア線維性酸性タンパク質（ｇｆａｐ）遺伝子調節エレメントの制御下にあり、これにより、損傷部位の反応性星状細胞からの分泌の増強を伴う高レベル発現が可能になる。本発明者らは、得られたベクターを、逐次ＡａｔＩＩおよびＳｆｉＩで消化し、３．４ｋｂ断片においてｇｆａｐ：：ｓＮｏｇｏＲ３１０構築物を単離した。本発明者らは、胚内へのこの断片のマイクロインジェクションを行ない、トランスジェニックマウスを作製した。本発明者らは、ＰＣＲにより、導入遺伝子が組み込まれたことを確認し、５つの創始系統を同定した。本発明者らは、最大発現レベルを有する２つの創始系統のヘテロ接合型雄を雌Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスと交配させた。本発明者らは、ヘテロ接合型トランスジェニックマウスにおいて、ＧＦＡＰ陽性細胞がｓＮｏｇｏＲ３１０を発現および分泌することを、Ｎｏｇｏレセプター−１に対して生成させた抗体を用いたウエスタンブロットにより解析確認した。
【０４９２】
本発明者らは、皮質および脊髄を、プロテアーゼインヒビター（Ｒｏｃｈｅ）を補給したＴｒｉｓ緩衝生理食塩水中でホモジナイズし、ホモジネートを４０，０００ｒｐｍで２０分間４℃にて遠心分離した。本発明者らは、上清みを４％パラホルムアルデヒドで２０分間処理して抗体特異性を増強し、イムノブロッティング前に透析した。本発明者らは、微粒状画分を、ＲＩＰＡ緩衝液（１％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、ＰＢＳ中０．１％ＳＤＳ）中での超音波処理によってホモジナイズし、得られたホモジネートを遠心分離し、この上清み（デタージェント可溶性微粒状画分）を上記のようにして処理した。本発明者らは、２０μｇの脳または脊髄タンパク質を、Ｎｏｇｏレセプター−１に対して生成させたウサギ抗血清（１：２０００希釈）を用いたイムノブロットによって解析した。本発明者らは、免疫反応性を、ＡＰ−結合体化抗ウサギＩｇＧおよびＮＢＴ／ＢＣＩＰ  ＡＰ基質とのインキュベーションによって可視化した。
【０４９３】
本発明者らは、分泌された３７ｋＤａのｓＮｏｇｏＲ３１０を、２つのトランスジェニック系統Ｔｇ０８およびＴｇ０１由来の皮質および脊髄のデタージェント無含有可溶性抽出物を検出したが、同腹子野生型（ＷＴ）マウスでは、３７または８１ｋＤａの可溶性Ｎｏｇｏレセプター−１タンパク質は、存在するとしてもごくごく少量である。微粒状画分を調べると、ＷＴマウスおよびトランスジェニックマウスの両方で、同等レベルの内因性Ｎｏｇｏレセプター−１が存在することが示された。
【０４９４】
（実施例１５）
（損傷後のトランスジェニックマウスにおけるｓＮｏｇｏＲ３１０の発現）
本発明者らは、背側過半側切除損傷を行うことにより、トランスジェニックマウスにおけるｓＮｏｇｏＲ３１０発現に対するＣＮＳ損傷の効果を試験した。本発明者らは、実施例１４に記載のようにして、ヘテロ接合型雄をＣ５７／ＢＬ６雌と交配することにより、ｓＮｏｇｏＲ３１０トランスジェニック動物および非トランスジェニック対照動物を得た。
【０４９５】
本発明者らは、成体雌ヘテロ接合型トランスジェニックマウスまたは同腹子ＷＴマウス（１０〜１６週齢）に深く麻酔し、完全椎弓切除術を行ない、Ｔ６およびＴ７レベルの脊髄の背側部分を完全に露出させた。本発明者らは、Ｔ６において、３０ゲージ針および１本のマイクロ剪刀を用いて背側過半側切除を行ない、背側と側背の皮質脊髄路（ＣＳＴ）を完全に分断した。本発明者らは、市販の針を脊髄の背側部分に数回通し、病変部が１．０ｍｍの深さであることを確実にした。本発明者らは、椎弓切除術上部の筋肉層を縫合し、外科用ステープルで背部の皮膚を閉じた。皮質脊髄路をトレースするため、本発明者らは、脊髄損傷１４日後、重層している大脳皮質の右側に頭蓋内までギザギザの（ｂｕｒｒ）穴を開けた。本発明者らは、トレーサーＢＤＡ（ＭＷ  １０，０００、ＰＢＳ中１０％）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、ユージーン、ＯＲ）を４つの注射部位に、該皮質表面から０．７ｍｍの深さで適用した。損傷４週間後、マウスに噴門経由で（ｔｒａｎｓｃａｒｄｉａｌｌｙ）ＰＢＳを、その後４％パラホルムアルデヒドを灌流した。ｓＮｏｇｏＲ３１０発現実験に使用したマウスには、トレーサー注射をなんら行なわなかった。
【０４９６】
ウエスタンブロット解析に使用したマウスでは、損傷後１４日間灌流せずに、Ｔ３とＬ３の間のレベルの脊髄を回収した。Ｎｏｇｏレセプター−１免疫組織化学的染色に使用したマウスには、半側切除後、４％パラホルムアルデヒドを１０日間灌流し、損傷脊髄を取り出して切片化した。トランスジェニックマウスおよびＷＴマウスの損傷脳においてｓＮｏｇｏＲ３１０発現を調べるため、皮質の穿刺損傷を、定位装置（Ｄａｖｉｄ  Ｋｏｐｆ、タハンガ、ＣＡ）に保持した１１番ブレードを用いて行なった。４ｍｍの傍矢状断面で、ブレグマの後方０．５ｍｍ、正中切開部の側方１．５ｍｍおよび３．５ｍｍ深さの切開を行なった。
【０４９７】
本発明者らは、トランスジェニックマウスにおいて、損傷１０日後、脊髄の可溶性抽出物においてｓＮｏｇｏＲ３１０のレベルの増大を検出したが、ＷＴマウスでは検出されず、病変部周辺のＧＦＡＰの損傷後上方調節と整合する。これがＮｏｇｏ−Ａの代償性上方調節のためでないことを確認するため、本発明者らは、その発現を試験した。ＷＴマウスおよびトランスジェニックマウスのいずれかに由来の完全な皮質または損傷皮質および脊髄いずれにおいても同様であることを見出した。
【０４９８】
本発明者らは、損傷ＣＮＳにおけるｓＮｏｇｏＲ３１０の細胞発現を、損傷脳および病変領域を含む脊髄を、Ｎｏｇｏレセプター−１およびＧＦＡＰに対する抗体で免疫染色することにより調べた。反応性星状細胞グリアの一般的な形態は、ＷＴマウスとトランスジェニックマウス間で異ならないが、Ｎｏｇｏレセプター−１について染色された密度は、細胞内空間および細胞外空間いずれにおいても、ＷＴマウスよりもｇｆａｐ：：ｓＮｏｇｏＲ３１０トランスジェニックマウスで著しく高く、これは、トランスジェニックマウスにおける病変部周辺でのｓＮｏｇｏＲ３１０発現の増大を示す。Ｎｏｇｏレセプター−１タンパク質は、トランスジェニックマウスにおいてのみ、星状細胞マーカーＧＦＡＰと共局在する。また、トランスジェニック試料では、広範な非細胞染色の大きな増強が見られ、細胞外空間におけるｓＮｏｇｏＲ３１０と整合する。ニューロン細胞体Ｎｏｇｏレセプター−１染色は、ＷＴマウスおよびトランスジェニックマウス両方において検出される。
【０４９９】
（実施例１６）
（分泌ｓＮｏｇｏＲ３１０は、トランスジェニックマウスにおいてＣＳＴ出芽を誘導する）
本発明者らは、トランスジェニックマウスの病変周囲でのｓＮｏｇｏＲ３１０の発現の増大により損傷軸索の再生がもたらされるか否かを試験した。
【０５００】
本発明者らは、順行性トレーサービオチンデキストランアミン（ＢＤＡ）を、ＬｉおよびＳｔｒｉｔｔｍａｔｔｅｒ、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２３：４２１９−２７（２００３）に記載のようにして右運動皮質内に注射することにより、下行皮質脊髄路（ＣＳＴ）の完全性を調べた。同腹子ＷＴマウスにおいて、明白な背側ＣＳＴ（ｄＣＳＴ）が病変の吻側に密に結束し、少量の側背ＣＳＴ線維が同側に見られる。少数の短いＢＤＡ標識側副枝出芽部が灰白質内、特に前索内に突出しているが、出芽部は、大部分が、トレーサー注射の反対側の索側に限定される。しかしながら、損傷ｓＮｏｇｏＲ３１０トランスジェニックマウスの背側半側切除の吻側の切開面は、全く異なるＢＤＡ標識パターンを示す。高密度のＢＤＡ標識ＣＳＴ線維が、すべてのトランスジェニックマウスにおいて、ライン（ｌｉｎｅ）Ｔｇ０８またはラインＴｇ０ｌから明白なｄＣＳＴの外側に観察される。異所性線維が灰白質領域を貫けて伸張し、一部の線維は、側方および側背白質内に達している。いくつかの線維（４〜１２の出芽部／横断面）が反対側の脊髄（トレーサー注射部位と同側）に見られる。側副枝出芽部のマイクロデンシトメトリー測定は、ｓＮｏｇｏＲ３１０トランスジェニックマウスにおいて、ほぼ１０倍の出芽密度の増加を示す。病変の吻側の１〜４ｍｍの長軸方向の傍矢状断面を調べると、ｓＮｏｇｏＲ３１０トランスジェニックマウスでは、同腹子ＷＴ動物とは対照的に、ｄＣＳＴ線維によって、多数の分岐出芽部が腹側灰白質領域内に伸張していることが示される。一般的に、トランスジェニックマウスにおける病変の吻側の出芽のパターンおよび程度は、Ｎｏｇｏレセプター−１アンタゴニストペプチドＮＥＰ１−４０で全身性処置されたマウスで観察されるものと同様である（ＬｉおよびＳｔｒｉｔｔｍａｔｔｅｒ、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、２３：４２１９−２７（２００３））。
【０５０１】
これらの結果は、該トランスジェニックマウスにおいて分泌ｓＮｏｇｏＲ３１０がＣＳＴ出芽を誘導することを示す。
【０５０２】
（実施例１７）
（ｓＮｏｇｏＲ３１０トランスジェニックマウスにおいて、ＣＳＴ軸策の再生により、遠位脊髄内への病変部位の進入が回避される）
本発明者らは、病変部位の吻側４ｍｍおよび尾側４ｍｍ（計８ｍｍの長さ）の脊髄をトランスジェニックマウスから単離し、グルタルアルデヒド重合アルブミンマトリックス中に包埋し、ビブラトームにおいて傍矢状断面に沿って切断した（３０μｍ厚）。本発明者らは、損傷部位の吻側５〜７ｍｍおよび尾側５〜７ｍｍの脊髄から横断面（５０μｍ）を回収した。ラットにおけるｓＮｏｇｏＲ３１０−Ｆｃ注射実験のため、病変部位の吻側１０ｍｍおよび尾側１０ｍｍに伸張している脊髄を、振動型ミクロトームにおいて側矢状平面に沿って切断した。（５０μｍ）横断面を損傷部位の吻側１１〜１６ｍｍおよび尾側１１〜１６ｍｍ脊髄から回収した。本発明者らは、該切片をアビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ複合体とともにインキュベートし、ＢＤＡトレーサーをニッケル増強型ジアミノベンジジンＨＲＰ反応によって可視化した（Ｇｒａｎｄｐｒｅ、Ｎａｔｕｒｅ  ４１７：５４７−５５１（２００２））。本発明者らは、一部の切片を、間接的な免疫蛍光によるセロトニン免疫組織化学検査（抗５−ＨＴ抗体）のために加工処理した。病変領域を可視化するため、本発明者らは、一部の切片をＧＦＡＰに指向される抗体（Ｓｉｇｍａ（登録商標）、セントルイス、ＭＯ）で二重染色した。本発明者らは、該切片をマウント培地にマウントし、脱水し、被覆した。
【０５０３】
本発明者らは、損傷後のトランスジェニックマウス（実施例１６を参照のこと）において発現されたｓＮｏｇｏＲ３１０によって誘導される線維が、病変領域を尾側脊髄内に交差（ｃｒｏｓｓ）させ、機能回復をもたらすか否かを試験した。
【０５０４】
カメラルーシダ内に誘導した損傷部位における連続的な側矢状平面は、病変から数ミリメートルに再生ＣＳＴ線維の全体的分布パターンを示す。ＷＴマウス由来の切片は、損傷部位を越えて伸張するＣＳＴ線維を示さない。ｓＮｏｇｏＲ３１０トランスジェニックマウス由来の同様の切片は、離断領域と交差し、高度に分岐したパターンで遠位灰白質および白質領域内に突出する数多くのＣＳＴ線維を示す。半側切除のすぐ吻側では、明白なｄＣＳＴ由来の高密度のＢＤＡ標識ＣＳＴ出芽が病変領域内に突出しているが、大部分のＣＳＴ出芽部は、瘢痕形成および組織空洞化が明白である離断領域を超えなかった。少量だが高度に有意な割合の再生軸索により、灰白質および白質の腹側および腹側外側の残留組織橋絡部を通って病変部位を迂回させる。また、ＣＳＴ線維は、病変部の背側および側背脊髄によって離断領域それ自体と交差し、遠位領域に進入することはほとんどないようである。病変部近傍では、再生線維の進路は、典型的には蛇行性であり、吻側ＣＳＴにおける通常の直線状の線維とは全く異なっていた。側副枝および分岐線維は、遠位脊髄の灰白質領域において最も高頻度で見られる。この再構成により、各トランスジェニックマウスにおいて、病変部の尾側１〜４ｍｍにおいて任意のレベルで吻側−尾側軸に進行している５〜１５のＢＤＡ標識再生線維が示される。背側半側切除の尾側５〜７ｍｍの横断面では、各トランスジェニックマウスにおいて、ＢＤＡ標識ＣＳＴ軸索が灰白質領域および白質領域の両方で見られる。トランスジェニックマウスの線維計数は、矢状断面における近位レベルとほぼ同数のＢＤＡ標識ＣＳＴ線維を示す。
【０５０５】
ＣＳＴ線維に加え、その他の下行路、例えば縫線脊髄線維などもまた、マウスの運動機能に寄与する。このマウス背側過半側切除モデルにおいて、離断により、大部分のセロトニン作動性線維が損傷され、この線維の密度は前角において、ほぼ８０％減少する。尾側脊髄の前角におけるセロトニン線維の全長の解析は、トランスジェニックマウスでは、ＷＴ群よりもこの線維の数がずっと多いことを示し、トランスジェニックマウスにおけるｓＮｏｇｏＲ３１０の成長促進効果は、１つの軸索下行経路に限定されないことを示す。
【０５０６】
（実施例１８）
（ｓＮｏｇｏＲ３１０の遺伝子導入発現により運動機能回復が改善される）
ＣＳＴ軸索のトレースおよびセロトニン作動性線維解析は、トランスジェニックマウスの星状細胞から放出されるｓＮｏｇｏＲ３１０が、脊髄において損傷下行軸索の広範な解剖学的再生を刺激することを示す。本発明者らは、これらの再生線維が機能回復に有益であるか否かを調べるため、実施例１２に記載のようないくつかの挙動試験を行った。
【０５０７】
ＢＢＢ試験によって評価されたように、ＷＴマウスでは、一部、４週間の生存期間の間に運動機能が回復される。損傷４週間後、ほとんどのＷＴマウスは、一貫性の体重支持を伴う一貫性の足底ステップを特徴とするレベルを回復するが、偶発的ないし高頻度しか前肢−後肢協調を示さず、表面と最初に接触したとき、主な足の位置が回転する。対照的に、ラインＴｇ０８およびＴｇ０１両方のｓＮｏｇｏＲ３１０トランスジェニックマウスのＢＢＢスコアは、７〜２８日間の観察期間を通して対照群よりも有意に高い（図１３Ａおよび１３Ｂ）。損傷２８日後、ほとんどのトランスジェニックマウスは、一貫性の前肢−後肢協調を示す。主な足の位置は身体と平行である。
【０５０８】
本発明者らは、ｓＮｏｇｏＲ３１０トランスジェニックマウスの動作の特徴を調べるため、さらに２つの挙動試験を使用した。まず、本発明者らは、５秒以内にマウスがその握力を弱めないボードの最大傾斜角度を測定した。背側半側切除損傷前は、トランスジェニックマウスおよびＷＴマウスはともに、５５度の角度をなすボード上で、その姿勢を維持することができる。損傷７〜２８日後、維持可能な角度は、すべてのマウスにおいて減少するが、トランスジェニックマウスが維持可能な角度は、対照群よりも有意に大きい（図１３Ｃ）。別の挙動試験では、マウスに、垂直線に対して４５度の角度に配置されたグリッドよじ登らせ、グリッドの水平面より下の後肢の偏倚運動を計数した（Ｍｅｔｚら、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．８８３：１６５−１７７（２０００））。マウスは、損傷前訓練中のこの試験では、後肢異常を示さなかった。ＷＴマウスでは、損傷後２〜６週間の期間で、数多くのフットフォールト（ｆｏｏｔ  ｆａｕｌｔ）後肢異常が認められ、改善は最小限にすぎない。対照的に、ｓＮｏｇｏＲ３１０トランスジェニックマウスは、この期間、グリッドよじ登りにおいて進行性の改善を示し、大部分の改善は、損傷後１〜３週間の間に起こる（図１３Ｄ）。したがって、星状細胞からｓＮｏｇｏＲ３１０を分泌するトランスジェニックマウスは、脊柱胸部半側切除後にＣＳＴ再生、縫線脊髄出芽および運動機能改善を示す。
【０５０９】
（実施例１９）
（ｓＮｏｇｏＲ３３１０−ＦＣタンパク質の髄腔内投与によりＣＳＴ出芽が誘導される）
脊椎外傷性損傷後の可溶性Ｎｏｇｏレセプター−１の成長促進有益性の第２の試験として、本発明者らは、精製した該タンパク質を髄腔内投与した。
【０５１０】
本発明者らは、安定性および精製を向上させるため、ラットＮｏｇｏレセプター−１のリガンド結合ドメイン（２７〜３１０）をラットＩｇＧ１Ｆｃドメイン融合した。本発明者らは、安定にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞由来のタンパク質を精製した。このタンパク質は、以前にマウスｓＮｏｇｏＲ３１０−Ｍｙｃ  Ｈｉｓについて示されているように（Ｆｏｕｒｎｉｅｒら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２２：８８７６−８８８３（２００２）；Ｌｉｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９７：１１９０−１１９３（２００２））Ｎｏｇｏ−６６、ＭＡＧおよびミエリン作用をインビトロでブロックする。本発明者らは、ｓＮｏｇｏＲ３１０−Ｆｃタンパク質を、中央胸郭背側半側切除損傷を有するラットの髄腔内に、浸透圧ミニポンプによって送達した。損傷後４週間の生存期間中、１．２ｍｇのｓＮｏｇｏＲ３１０−Ｆｃタンパク質を、各ラットに局所投与した。ビヒクル処置（１．２ｍｇのラットＩｇＧ）を受けたラットでは、半側切除の吻側の切開面は、病変部位上部に、密に結束した明白な背側ＣＳＴおよび非常に少ない異所性ＢＤＡ標識ＣＳＴ線維を示す。ｓＮｏｇｏＲ３１０−Ｆｃタンパク質を受けた損傷ラットの病変の吻側の切開面は、全く異なるパターンの標識を示す。ＢＤＡ標識ＣＳＴからの無数の異所性線維出芽が、横断面から傍矢状断面に観察される。場合によっては、該突出部は、正中切開部付近のｄＣＳＴ領域から該索部の周縁部まで交差しており、側背ＣＳＴと交絡状態となっている。出芽軸索は、灰白質を通過して大部分の白質まで伸張している。ｄＣＳＴに隣接した異所性出芽線維の測定（横断面では≧１００μｍ、矢状断面では≧２００μｍ）は、ｓＮｏｇｏＲ３１０−Ｆｃ処置ラットにおけるより大きな増加を示す。
【０５１１】
（実施例２０）
（ｓＮｏｇｏＲ３１０−ＦＣ処置ラットにおいて、ＣＳＴ軸索は遠位脊髄内に再生する）
本発明者らは、雌Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（１９０〜２５０ｇ）を深く麻酔し、脊椎レベルＴ６〜７で椎弓切除術を行ない、脊髄を露出させた。本発明者らは、脊髄の背側半分を、３０ゲージ針および１本のマイクロ剪刀で切断してＣＳＧＴ路の背側部分を切断し、１１番ブレードの鋭利な部分を該索部の背側半分に沿って通過させることにより病変部の深さ（１．８ｍｍ）を確保した（Ｇｒａｎｄｐｒｅら、Ｎａｔｕｒｅ  ４１７：５４７−５５１（２００２））。浸透圧ミニポンプ（Ａｌｚｅｔ（登録商標）２ＭＬ４、２ｍｌ容積、２．５μｌ／ｈ、２８日間送達）に１．２ｍｇのラットＩｇＧ含有ＰＢＳまたは１．２ｍｇのｓＮｏｇｏＲ３１０−Ｆｃ融合タンパク質含有ＰＢＳを充填し、これを、動物の背部の皮下の筋肉に縫い付けた。ミニポンプの排出口に接続したカテーテルをＴ７〜８レベルの脊髄の髄腔内に、硬膜にあけた小さな穴から挿入した。
【０５１２】
Ｎｏｇｏレセプター−１アンタゴニストタンパク質の注入により、ラット半側切除部の吻側で広範な出芽が誘導されたが、より重要な問題は、出芽ＣＳＴ線維が遠位脊髄まで突出し、運動機能回復に寄与するか否かである。ビヒクル処置ラットの病変部位おける長軸方向の切片は、病変部レベル未満で検出可能なＢＤＡ標識腹側ＣＳＴ線維をを示さないか、数が非常に少ない（Ｇｒａｎｄｐｒｅら、Ｎａｔｕｒｅ  ４１７：５４７−５５１（２００２）；Ｗｅｉｄｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８：３５１３−３５１８（２００１））。ｓＮｏｇｏＲ３１０−Ｆｃ処置ラットの同様の切片は、多くのＢＤＡ標識線維が離断部位を回避し、尾側脊髄に、腹側および腹側外側の脊髄の橋絡組織部全体に広く突出していることを示す。星状細胞マーカーＧＦＡＰの免疫染色は、離断の程度は、中心の管状領域よりも深く達したことを示す。明白な背側ＣＳＴにおける吻側線維の線形プロフィールとは異なり、再生ＣＳＴ線維は、通常、遠位脊髄、特に灰白質領域において高度に分岐軌道に従う。このような線維は、脊髄の多くの領域において検出されるが、脊髄全体の中心部分および脊髄の背側半分でより容易に見られる。矢状断面からのＣＳＴ線維の計数は、各ｓＮｏｇｏＲ３１０−Ｆｃ処置ラットの病変部の尾側１〜２ｍｍでほぼ２０個のＢＤＡ標識軸索、および病変部の遠位７〜８ｍｍで１５個のトレース軸索を示す。
【０５１３】
一般的に、このような線維の分岐パターンは、局所ＮＥＰ  １−４０ペプチド処置動物で観察されるものと同様であるが、ｓＮｏｇｏＲ３１０−Ｆｃタンパク質で処置した切片では、各出芽部において、より多くの側副枝分岐が見られる。遠位脊髄からの出芽部の測定は、ｓＮｏｇｏＲ３１０−Ｆｃ処置ラットにおける各出芽部の側副枝の全長は、ＮＥＰ
１−４０処置動物より２倍大きいことを示す。両方のＮｏｇｏレセプター−１アンタゴニスト処置群では、脊髄の尾側１〜１０ｍｍの出芽部（≧２００μｍの長さ）の数は、対照群よりほぼ２０〜４０倍多い。ｓＮｏｇｏＲ３１０−Ｆｃ処置ラットでは、局所ＮＥＰ
１−４０処置よりも多くの出芽部が見られる（約５０個に対して２５個の出芽部／ラット）が、この差は統計学的に有意ではない（ｐ＝０．１７１３、ｔ−検定）。
【０５１４】
ＣＳＴ軸索の再生は、ｓＮｏｇｏＲ３１０−Ｆｃ処置を受けたラットにおいて、半側切除部の尾側１１〜１５ｍｍの脊髄の横断面に観察される。このような線維は、脊髄の灰白質および白質の両方で検出される。灰白質で検出される線維は、多くの場合、白質領域よりも多くの側副枝分岐を示す。対照的に、ビヒクル処置群の横断面では、偶発的ＢＤＡ標識物のみが腹側白質領域で見られ、非損傷腹側ＣＳＴ軸索と整合する。このレベルの遠位脊髄では、両方のＮｏｇｏレセプター−１アンタゴニスト処置群［ｓＮｏｇｏＲ３１０−ＦｃおよびＮＥＰ  １−４０］のＢＤＡ標識ＣＳＴ線維の平均数は、ビヒクル処置ラットよりほぼ２０倍多い。総合すると、両方のＮｏｇｏレセプターアンタゴニストｓＮｏｇｏＲ３１０−Ｆｃタンパク質およびＮＥＰ  １−４０ペプチドは、遠位脊髄において劇的なＣＳＴ軸索再生をもたらすが、前者によって誘導される出芽は、より高度に分岐したパターンを示す。
【０５１５】
（実施例２１）
（局所ｓＮｏｇｏＲ３３１０−ＦＣは、損傷ラット脊髄において赤核脊髄（ｒｕｂｒｏｐｉｎａｌ）およびセロトニン作動性軸索の出芽を誘導する）
半側切除の１４日後、下肢の感覚運動皮質を被覆する頭蓋の各側面に、ギザギザの穴を開け、ＣＳＴ線維をトレースした。順行性ニューロントレーサーＢＤＡ（ＰＢＳ中１０％、３．５μｌ／皮質）を７つの注射部位に、硬膜から１．５ｍｍの深さで各側面に適用した（Ｇｒａｎｄｐｒｅら、Ｎａｔｕｒｅ  ４１７：５４７−５５１（２００２））。ラットにおける赤核脊髄路のトレースのため、トレーサーＢＤＡ（１μｌ；ＭＷ  １０，０００；ＰＢＳ中１０％）を左側の赤核内に注射した（ブレグマの後方５．８ｍｍ、側方０．７ｍｍ、頭蓋表面の腹側７．０ｍｍ）。ＢＤＡ注射の２週間後、これらの動物にＰＢＳを灌流した後、４％パラホルムアルデヒドを灌流し、組織学検査のために組織を採取した。
【０５１６】
損傷赤核脊髄路（ＲＳＴ）線維の修復は、脊髄損傷後の機能改善に寄与する（Ｌｉｕら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、１９：４３７０−４３８７（１９９９））。ＣＮＳのニューロン内のＮｏｇｏレセプター−１の広範な分布（Ｗａｎｇら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２２：５５０５−５５１５（２００２））により、Ｎｏｇｏレセプター−１のそのアンタゴニストによる阻害により、ＲＳＴ軸索損傷後の再成長をもたらし得ることが可能になる。損傷ＲＳＴに対するｓＮｏｇｏＲ３１０−Ｆｃの効果を試験すうるため、この経路の完全性を、ＢＤＡを左赤核内に注射することによってトレースした。脊髄レベルでは、ＲＳＴ線維は、通常、脊髄の側背白質領域に存在するが、この試験では、背側半側切除によって離断する。対照ラットの病変の吻側１１〜１５ｍｍの横断面では、少数のＢＤＡ標識短線維が、明白なＲＳＴと背側角状灰白質の間に見られる。ｓＮｏｇｏＲ３１０−Ｆｃで処置した同じレベルの切片は、主要ＲＳＴと背側角状灰白質の間に多くの連結線維を示す。ＳＣＩの遠位１１〜１５ｍｍの横断面では、ビヒクル処置ラットにおいてＢＤＡ標識ＲＳＴ線維は見られない。対照的に、ｓＮｏｇｏＲ３１０−Ｆｃ処置を受けた同じレベルの切片は、トレーサー注射と反対側の灰白質および白質の両方において多くのＢＤＡ標識ＲＳＴ線維を示す。分岐パターンを有する一部の出芽部が、ＢＤＡ注射と同側の灰白質に見られる。
【０５１７】
Ｒｕｐｈｅｓｐｉｎａｌ脊髄線維もまた、ｓＮｏｇｏＲ３１０−Ｆｃ処置脊髄損傷ラットにおいて調べた。免疫染色は、ビヒクル群とｓＮｏｇｏＲ３１０−Ｆｃ処置群間と同様である病変の吻側１１〜１５ｍｍのセロトニン作動性線維の密度を示す。病変より下方１１〜１５ｍｍの切片では、ｓＮｏｇｏＲ３１０−Ｆｃ処置ラットにおけるセロトニン線維は、対照群よりも２倍数が多い。これらの結果は、ｓＮｏｇｏＲ３１０−Ｆｃタンパク質によるＮｏｇｏレセプター−１阻害に対する応答性がＣＳＴ線維に限定されないこと、およびその他の下行路、例えば、赤核脊髄およびセロトニン作動性の軸索などもまた、Ｎｏｇｏレセプター−１拮抗作用に応答性であることを示す。
【０５１８】
（実施例２２）
（ラットにおいてｓＮｏｇｏＲ３１０−ＦＣでの局所処置により機能回復が改善される）
ｓＮｏｇｏＲ３１０−Ｆｃタンパク質の髄腔内投与により、外傷性脊髄損傷後、いくつかの下行経路において軸索再生が刺激される。本発明者らは、該タンパク質がまた、損傷脊髄において機能回復を改善するか否かを試験した。
【０５１９】
半側切除の２週間後、ビヒクル処置ラットの運動機能ＢＢＢスコアは安定レベル１２に達する（図１４Ａ）。病変４週間後、ほとんどの対照（７匹中６匹）は、高頻度の一貫性体重支持足底ステップおよび高頻度の一貫性の前肢−後肢協調を有するが、表面と最初に接触したとき、主な足の位置の回転を有する。対照的に、ｓＮｏｇｏＲ３１０−Ｆｃタンパク質処置を受けたラットでは、運動機能スコアは、外傷後２〜４週間の間で継続して改善される。損傷４週間後、９匹のｓＮｏｇｏＲ３１０−Ｆｃ処置動物はすべて、試験表面と最初に接触したとき、一貫性の前肢−後肢協調および平行な足の位置を有した。
【０５２０】
グリッド歩行を用い、脊髄損傷後の下行細かい運動制御における欠陥を評価した（Ｍｅｔｚら、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．８８３：１６５−１７７（２０００））。この動作は、腹側外側の皮質脊髄線維および赤核脊髄線維によって媒介される前肢−後肢協調および随意運動制御を必要とする。損傷前訓練中、ラットはすべて、後肢をグリッドバー上に正確に置く。損傷２〜４週間後、対照ラットは、８〜９例の後肢異常／セッションを示し、経時的な改善は最小限にすぎない。対照的に、ｓＮｏｇｏＲ３１０−Ｆｃで処置したラットは、グリッド歩行において進行性の改善を示し、示される後肢異常は有意に少ない（平均４〜７例／セッション）。改善の大部分は、損傷の２〜３週間後に起こる。対照群における後足フットプリントの解析は、半側切除４週間後、非損傷ラットまたはｓＮｏｇｏＲ３１０−Ｆｃ処置を受けた損傷動物と比べ、一股長さが有意に減少し、姿勢（ｓｔａｎｃｅ）幅が増加していることを示す（図１４Ｃ）。したがって、これらの多数の挙動試験は、アンタゴニストタンパク質の局所注射によるＮｏｇｏレセプター−１機能のブロックによって、損傷後の運動機能回復が改善されることを示す。
【０５２１】
（実施例２３）
（可溶性ラットＮｏｇｏレセプター３１０（ｓｒＮｇＲ３１０）に対するモノクローナル抗ＮｇＲ１抗体１Ｄ９の結合）
ラットＮｇＲ１（ｓｒＮｇＲ３１０）の１Ｄ９  Ｆａｂおよび可溶性断片の共結晶複合体において行った構造解析は、この抗体が、ラットＮｇＲ１上のＮ末端キャップとロイシンリッチリピートドメインの連結部付近に結合することを示す。図１５。１Ｄ９は、ラットＮｇＲ１のみに結合し、ヒトまたはマウスのＮｇＲ１もＮｇＲ２もＮｇＲ３も認識しない。ラットｓｒＮｇＲ３１０−Ｆｃと１Ｄ９  Ｆａｂとの結晶化のため、各巨大分子をパパインで切断し、Ｆｃ部分から精製し、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７、５０ｍＭ  ＮａＣｌ中に保存した。該複合体は各々８０μＭで調製し、２：１の容量測定比で、１４％Ｐｅｇ３３５０、０．４Ｍ酢酸亜鉛、０．１Ｍ塩化マグネシウムからなるレザーバー溶液と混合した。溶液を２０℃で１時間インキュベートし、１２、０００×ｇで３分間遠心分離して、沈殿物を除去した。３〜５μＬの上清みを、５０％〜１００％のレザーバー溶液（２０℃）を入れたウェ上上に入れることにより結晶を成長させた。薄いプレート様結晶が、２０℃で１週間にわたって成長した。この結晶を、速やかに０．２Ｍ酢酸亜鉛、８％Ｐｅｇ３３５０、２５％エチレングリコール中に移して２分間凍結保護し、次いで、速やかに液体窒素中に移して凍結させた、
結晶は、ほぼ１０μｍ厚であり、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｙｎｃｈｒｏｔｒｏｎ  Ｌｉｇｈｔ  Ｓｏｕｒｃｅ（Ｕｐｔｏｎ、ＮＹ）の光線Ｘ２５で３．２Å回折した。ＨＫＬプログラムパッケージｖ．１．９７（Ｏｔｗｉｎｏｗｓｋｉ，Ｚ．、およびＭｉｎｏｒ，Ｗ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ２７６：３０７−３２６（１９９７））によるデータ処理により、結晶は、Ｐ２１２１２空間群に属すること、およびおよその細胞寸法ａ＝９０．６Å、ｂ＝１８８．６Å、ｃ＝１２５．５Å、およびα＝β＝γ＝９０が示され、２  Ｆａｂ−ＮｇＲＩ複合体非対称ユニットと整合した。
【０５２２】
ＮｇＲに結合する共通の水銀部位を同定するための浸漬結晶における多数の同型の置き換え実験ならびに分子交換に関する情報を利用することにより結晶構造を分解（ｓｏｌｖｅ）した。該空間群は、一貫した５つのσピークがｗ＝０ハーカー（ｈａｒｋｅｒ）セクションに同定された水銀および金の同型差のパターソンマップを調べることにより同定した。ヒトＮｇＲ１構造（ｐｄｂコード１ＯＺＮ）（Ｈｅ，Ｘ．Ｌ．ら、Ｎｅｕｒｏｎ  ３８：１１１（２００３））に基づくラットＮｇＲ相同モデル、および１Ｄ９  Ｆａｂに対する相同モデルを用いるＭＯＬＲＥＰ（Ｖａｇｉｎ，Ａ．およびＴｅｐｌｙａｋｏｖ，Ａ．、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｃｒｙｓｔ．３０：１０２２−１０２５（１９９７））との分子交換により、第１のＮｇＲ１、第１のＦａｂおよび第２のＮｇＲ１分子の交換がもたらされ、得られたＲ−因子は４８％であり、ＦａｂのＣＤＲ領域は明らかに密であった。この交換モデルは、相違パターソンマップから同定された水銀部位を、両方のＮｇＲ１分子上のＡｓｐ  １３８およびＨｉｓ  １８２付近の対応する位置にマッピングすることにより確認した。さらなるＦａｂ断片は、密に明白に同定されなかった。この２つのＮｇＲ１および１つのＦａｂを、ＣＮＸ（Ｂｒｕｎｇｅｒ，Ａ．Ｔ．ら、Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  Ｄ  Ｂｉｏｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  ５４：９０５−９２１（１９９８））を用いて３．２Å分解能まで精製すると、現状ではＲ因子は４２％、Ｒ無含有は４６％となった。
【０５２３】
表８は、１Ｄ９  ＦａｂとラットＮｇＲ１間の接触部を示す。Ｆａｂ由来の原子が、ラットＮｇＲ１内の原子からの距離３．９Å以内である接触部を示し、主鎖または側鎖のいずれかと水素結合を形成し得る接触部にアスタリスク（＊）を付す。
【０５２４】
（表８）
【０５２５】
【表８】
2014221076.tif 000026
＊は、Ｈ結合相互作用を示す
（実施例２４）
（一過性トランスフェクションによるＮｇＲ  ＲＮＡｉスクリーニング）
ヒトＮｏｇｏＲ１（図１６Ａ）転写物に対して３種類のＲＮＡｉ構築物を設計した。ＲＮＡｉ−１およびＲＮＡｉ−３は、ヒトＮｇＲ遺伝子を特異的に標的化する。ＲＮＡｉ−２は、ヒト、マウスおよびラットＮｇＲ遺伝子を標的化するように設計した。ＤＮＡオリゴヌクレオチド対を合成し、ＰｏｌＩＩＩプロモーター系ＲＮＡｉ発現ベクターｐＵ６（これは、ヒトＵ６プロモーター、ｋａｒ耐性遺伝子およびＰａｃＩクローニング部位を含有する）内に構築した。Ｎｏｇｏｒ  ２ｍは、標的配列に対して２つのミスマッチを有し、陰性対照として供されるように設計した。このようなオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列を図１６Ｂに示す。
【０５２６】
最初に、ＲＮＡｉ構築物を、マウスＬ細胞においてヒトＮｇＲ発現ベクターをＲＮＡｉ発現プラスミド（ｐｈＵ６ＮｇＲ−ＲＮＡｉ−１、２および３）と一緒にコトランスフェクトすることによりスクリーニングした。マウスＬ細胞を６ウェル培養プレート内にプレーティングし、次いで、対照ＧＦＰレポータープラスミド単独またはＧＦＰに対するＲＮＡｉベクターｐＵ６ＧＦＰＲＮＡｉでトランスフェクトした（レーン２および３）。ＧＦＰ遺伝子サイレンシングの対照としてＧＦＰの発現をモニターした。マウスＬ細胞を０．５、１または２μｇのｈＮｇＲ発現ベクターでトランスフェクトした（レーン４〜６）。各ウェル内のＤＮＡ量を、ｐＵＣ１９プラスミドを添加することにより合計４μｇのＤＮＡに調整した。ＲＮＡｉ：標的比は４：１であった。５マイクログラムのｈＮｇＲベクターを２μｇのＮｇＲ  ＲＮＡｉ−１、２、３、または２ｍプラスミドとともにコトランスフェクトした（レーン７〜１０）。トランスフェクションの４８時間後、細胞をＳＤＳ負荷緩衝液中に回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。ｈＮｇＲの発現を、ポリクローナルｈＮｇＲ抗体Ｒ１５０に対するウサギ血清（パネルＡ）またはモノクローナル抗体７Ｅ１１（パネルＢ）を用いてウエスタンブロットにより解析した。
【０５２７】
有効なＮｇＲ発現サイレンシングが、ｐｈＵ６ＮｇＲ−ＲＮＡｉ−１および−２でトランスフェクトされた細胞で、ＮｇＲ抗体７Ｅ１１（モノクローナル）およびＲ１５０（ウサギポリクローナル）を用いたウエスタンブロットにおいて観察された。結果を図１７に示す。ＮｇＲの発現は、ＮｇＲ  ＲＮＡｉ−１および−２でトランスフェクトされた細胞では基底レベルまで低減された。対照的に、ＮｇＲ  ＲＮＡｉ−３では、ＮｇＲの有意な低減はなんら示されず、対照変異型ＮｇＲ  ＫＮＡｉ−２ｍと同様であった。したがって、ＮｇＲ  ＲＮＡｉ−１および−２は、ｈＮｇＲ遺伝子サイレンシングに有効である。
一過性トランスフェクションの結果により、ＮｇＲ発現の＞９０％阻害が示された。
【０５２８】
（実施例２５）
（ヒトＮｇＲサイレンシングの確認）
検出されたシグナルは、２つの型の抗体で、ｈＮｇＲに特異的であるが（ｈＮｇＲ  ｃＤＮＡトランスフェクト細胞でのみ）（図１７）、検出されたバンドの見かけＭＷ（約５０ｋＤ）は、予測よりも小さかった。理論に拘束されることを望まないが、これは、おそらく、マウスＬ細胞におけるヒトＮｇＲのグリコシル化の改変のためである。ＮｇＲ  ＭＷの矛盾に関する観察結果を確認するため、ｈＮｇＲ  ｃＤＮＡトランスフェクションを、再度ヒトＳＫＮ細胞および２９３細胞において、リポフェクションを用いて行った。トランスフェクションの４８時間後、細胞をＳＤＳ負荷緩衝液中に回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。ＮｇＲの発現を、７Ｅ１１およびＲ１５０の両方を用い、上記のようにしてウエスタンブロットにより検出した。親ＳＫＮまたは２９３細胞では、ｈＮｇＲ特異的シグナルは検出されず、Ｒ１５０で検出されたｈＮｇＲの見かけＭＷは、ＳＫＮおよび２９３細胞の両方において予測どおり＞６５ｋＤである（図１８）。
【０５２９】
ＲＮＡｉ媒介性ｈＮｇＲサイレンシングを、ＳＫＮ細胞において確認した。ＳＫＮ細胞を６ウェル培養プレート内にプレーティングし、次いで、対照ＧＦＰレポータープラスミド単独またはＧＦＰに対するＲＮＡｉベクターｐＵ６ＧＦＰＲＮＡｉでトランスフェクトした（レーン２および３）。ＧＦＰの発現をＧＦＰ遺伝子サイレンシングの対照としてモニターした。ＳＫＮ細胞を２μｇのｈＮｇＲ発現ベクターでトランスフェクトした（レーン４）。ｐＵＣ１９プラスミドＤＮＡを添加することにより、各ウェル内のＤＮＡ量を合計４μｇのＤＮＡに調整した。０．５μｇのｈＮｇＲベクターを２μｇのＮｇＲ  ＲＮＡｉ−１、２、３または２ｍプラスミドとともにコトランスフェクトした（レーン５〜８）。トランスフェクションの４８時間後、細胞をＳＤＳ負荷緩衝液中に回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。ｈＮｇＲの発現を、ｈＮｇＲ  Ｒ１５０に対するウサギ血清を用いてウエスタンブロットにより解析した。この場合も、９０％より多いＮｇＲノックダウンがＮｇＲ  ＲＮＡｉ−１および−２のすべてにおいて示されたが、ＮｇＲ  ＲＮＡｉ−３および−２ｍでは効率が低かった（図１９）。
【０５３０】
（実施例２６）
（ＮｅｕｒｏＳｃｒｅｅｎ細胞におけるＮｇＲノックダウン）
ＮｇＲ機能解析のため、ＮｇＲを発現するＮｅｕｒｏＳｃｒｅｅｎ細胞をＣｅｌｌｏｍｉｃｓ  Ｉｎｃ．から入手した。ＮｅｕｒｏＳｃｒｅｅｎ細胞において安定なＮｇＲノックダウンを達成するため、すべてのＲＮＡｉ構築物を、レンチウイルスベクター内のβ−ｇａｌまたはＧＦＰ主鎖のいずれかに変換した。レンチウイルスベクターの概略図を図２０に示す。レンチウイルスベクターは、パッケージングプラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）による２９３細胞のトランスフェクションによって作製した。安定なＮｇＲ１  ＲＮＡｉの発現のためのレンチウイルスベクターを構築するため、ヘアピン型（すなわち、Ｎｏｇｏ−１、Ｎｏｇｏ−２、Ｎｏｇｏ−２ｍおよびＮｏｇｏ−３）の発現を駆動するｈＵ６プロモーターからなるＲＮＡｉカセットを、ｐｈＵ６ベクター（実施例２４に記載）からＰａｃＩ消化によって切り出し、ＳＳＭ００７プラスミドの特殊なＰａｃＩ部位内にクローニングした。例えば、Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３．３：４０１−４０６（２００３）に記載の方法を参照のこと。レンチウイルスベクター形質導入を追跡するため、ＣＢＡ−ＧＦＰ発現カセットまたはＣＭＶ−ＬａｃＺ発現カセットをＳＳＭ００７プラスミド内のＸｂａＩ部位に挿入し、得られた構築物を、それぞれ、ＳＭ００７−ＢＦＧＷおよびＳＳＭ００７−ＢＦＺＷと命名した。
【０５３１】
すべてのＮｇＲ１  ＲＮＡｉ構築物をＳＳＭ００７−ＢＦＧＷおよびＳＳＭ００７−ＢＦＺＷ主鎖に変換した後、該ベクターを、パッケージングプラスミドｐＬＰ１、ｐＬＰ２およびｐＬＰ／ＶＳＶＧとともにＦＴ２９３細胞内にコトランスフェクトし、レンチウイルスベクターを生成させた（Ｖｉｒｏｐｏｗｅｒキット、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。ｐＬＰ１は、ＨＩＶ−Ｉ  ｇａｇ／ｐｏｌ配列およびＣＭＶプロモーターから発現されるｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）をｂ−グロビンポリＡとともに含有する８８８９ｂｐ構築物であり、ｐＬＰ２は、ＲＳＶプロモーターからＲｅｖを発現し、転写物を終結させるためのＨＩＶ−１ポリＡを有する４１８０ｂｐ構築物であり、ｐＬＰ／ＶＳＶＧは、５８２１ｂｐプラスミドであり、ＣＭＶプロモーターから水疱性口内炎ウイルス糖プロテインＧを発現し、β−グロビンポリＡを有する。
【０５３２】
レンチウイルス力価に対するＲＮＡｉ干渉の自己制限的効果のため、すべてのウイルスストック力価は、培養培地中で４〜５×１０５形質導入単位の範囲である通常のレンチウイルスベクターより低いようであった。ＮｇＲ  ＲＮＡｉレンチベクター（ＬＶ−ＮｇＲ
ＲＮＡｉ）を使用し、ｍｏｉ（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ：感染多重度）１で、ＮｅｕｒｏＳｃｒｅｅｎ細胞を形質導入した。形質導入効率は約１％であった（ＧＦＰ発現またはβ−ガラクトシダーゼ染色によって表示）。
【０５３３】
ＮｇＲ  ＲＮＡｉ−２はＮｇＲサイレンシングに有効であり、ヒト、マウスおよびラットのＮｇＲすべてを標的化することが示されたため、ＬＶ−ＮｇＲ  ＲＮＡｉ−２をＮｅｕｒｏＳｃｒｅｅｎ細胞の形質導入に選択した。形質導入細胞は、９６ウェルプレート内での限界希釈によってクローニングした。β−ガラクトシダーゼ陽性またはＧＦＰ陽性クローンを同定し、さらなるＮｇＲ発現解析のために拡大培養した。
【０５３４】
約２０のクローニング細胞株をＮｇＲ発現について、７Ｅ１１モノクローナル抗体を用いたウエスタンブロットにより解析した。典型的なウエスタンブロットの結果を図２１に示す。ＧＡＰＤＨを負荷標準化の対照として使用した。すべてのクローンにおけるＮｇＲ発現を、ウエスタンブロット上のＮｇＲバンドのデンシトメトリー走査によって定量し、ＧＡＰＤＨレベルに対して標準化した。ＮｇＲ対ＧＡＰＤＨの比を用いてＮｇＲ発現レベルを測定した。スクリーニングした１２個のクローンのうち、その１１個でＮｇＲ発現が低下した（ＬＶ−ＧＦＰ形質導入細胞の最少ＮｇＲ発現クローン１Ｅ９を参照として使用）。対照的に、４つのＬＶ−ＧＦＰ形質導入されクローンはすべて、天然ＮｅｕｒｏＳｃｒｅｅｎ細胞と同等のＮｇＲレベルを有する。図２２。これらの結果は、ＮｇＲ発現が低下した安定な細胞株が樹立されたことを示す。
【０５３５】
（実施例２７）
（ＬＶ−ＮｇＲ  ＲＮＡｉ細胞の機能解析）
本発明者らは、機能解析のため、ＬＶ−ＮｇＲ  ＲＮＡｉ形質導入細胞から４つのクローンを選択した。天然ＮｅｕｒｏＳｃｒｅｅｎ細胞のＮｇＲレベルを参照として使用すると、これらの４つのクローンのＮｇＲレベルは、それぞれ、天然細胞の３ｃ１２ｂでほぼ１０％、３ｃ４ｂで２０％、５ｄ１２で３０％および４ａ１２で６０％である（図２３）。
【０５３６】
（実施例２８）
（モノクローナル抗ＮｇＲ１抗体１Ｄ９の変異によりヒトＮｇＲ１の認識が可能になる）
コンピュータモデル設計により、１Ｄ９抗体における変異により、ヒトＮｇＲ１の認識が可能になることが示された。１Ｄ９重鎖のＮ５６は、ヒトＮｇＲ１のＲ７８と相互作用するように、コンピュータモデル設計によってセリン、グルタミン酸、アスパラギン酸またはグルタミンに変異され得る。また、軽鎖のＲ３３は、ヒトＮｇＲ１のＲ９５との静電気的および立体的衝突が回避されるように、コンピュータモデル設計によってアラニンまたはセリンに変異され得る。
【０５３７】
（実施例２９）
（ラットＩｇＧに融合されているがメチルプレドニゾロンに融合されていないラットＮＧＲ１のエクトドメイン（２７〜３１０）は、脊髄神経節細胞においてミエリンの神経突起伸長阻害効果を保持した）
脊髄損傷（ＳＣＩ）のためのメチルプレドニゾロン（ＭＰ）とＮｇＲ（３１０）エクト−Ｆｃでの併用処置の調査において、本発明者らは、これらの試薬が独立した作用機序を有することの確認を模索した。簡単には、ミエリンを一晩、ポリ−Ｌ−リシンプレコートプレート（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ、ＵＳＡ）内で、８０または４００ｎｇ／ウェル（それぞれ、２．５および１２．７ｎｇ／ｍｍ２）にて乾燥させた。次いで、ウェルに１０μｇ／ｍｌのラミニン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、ラ・ホーヤ、ＣＡ、ＵＳＡ）を１時間室温（ｆｏｏｍ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）（２２〜２４℃）でコートした。第１３日胚の幼鳥の脊髄神経節ニューロンを、既報（ＧｒａｎｄＰｒｅら、２０００；Ｆｏｕｒｎｉｅｒら、２００１）のようにして解離し、６〜８時間プレーティングした。ニューロンを、１０μｇ／ｎｌ  ＭＰ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、カラマズー、ＭＩ、ＵＳＡ）の存在下または非存在下、８μＭ  ＮｇＲ（３１０）エクト−Ｆｃで全伸長期間中処理した。次いで、ニューロンを固定し、βＩＩＩチューブリン抗体（Ｃｏｖａｎｃｅ、プリンストン、ＮＪ、ＵＳＡ）で染色し、神経突起伸長を、自動細胞画像形成解析システム（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ、ユニオンシティー、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて定量した。細胞あたりの神経突起伸長を、各実験（ｎ＝３）について２連対照ウェルの平均に対して標準化した。ＮｇＲ（３１０）エクト−Ｆｃの活性は、ミエリンによる軸索成長の阻害を逆転させるその能力に基づく。図２４Ａ〜Ｂ。対照的に、ＭＰ単独は、ミエリン基材上の脊髄神経節ニューロンからの神経突起伸長に対して効果がなく、ＭＰの存在によってＮｇＲ（３１０）エクト−Ｆｃによる軸索成長刺激は改変されなかった。これらのデータは、ＭＰがミエリン誘導性神経突起伸長抑制に直接影響を及ぼさないこと、およびＭＰとＮｇＲ（３１０）エクト−Ｆｃが独立した作用を有することを示す。これらのインビトロデータは、ＭＰおよびＮｇＲ（３１０）エクト−ＦｃがＳＣＩ回復を逐次的有効な様式で増強するという仮説を支持する。
【０５３８】
（実施例３０）
（ラットＩｇＧとメチルプレドニゾロンと融合させたラットＮｇＲのエクトドメイン（２７〜３１０）での処置は、脊髄離断後の機能回復に対して一時的に明白な効果を有した）
ＭＰおよびＮｇＲ（３１０）エクト−Ｆｃ処置はともに、脊髄離断後の機能回復に対して一時的に明白な効果を有した。簡単には、雌Ｌｏｎｇ  Ｅｖａｎｓラット（７週齢；Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ、ＵＳＡ）に、２５ｍｇ／ｋｇ腹腔内ミダゾラム（Ａｂｏｒｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、シカゴ、ＩＬ、ＵＳＡ）および２〜３％のフローセン（Ｂａｘｔｅｒ、ディアフィールド、ＩＬ、ＵＳＡ）含有Ｏ２を用いて麻酔し、背側椎弓切除術を脊椎レベルＴ６およびＴ７において行なった。全身麻酔を１．５〜２％フローセン含有Ｏ２で維持した。背側半側切開を行ない、主要背内側と小（ｍｉｎｏ）側背（ｄｏｒｓｐｌａｔｅｒａｌ）皮質脊髄路（ＣＳＴ）成分とを完全分断した。顕微鏡（ｍｉｃｒｏｓｃａｐｅｌ）を用い、該索部の表面から１．８ｍｍの深さで定位的に（ｓｔｅｒｏｔａｘｉｃａｌｌｙ）該索部を離断した。ＣＳＴ離断直後、髄腔内カテーテルをクモ膜下腔内のＴ７に挿入し、皮下空間内に挿入したミニ浸透圧ポンプ（呼び水を入れた）に連結した。ミニ浸透圧ポンプにより、ラットＩｇＧアイソタイプ対照タンパク質またはリン酸干渉生理食塩水（ＰＢＳ）（５ｍｇ／ｍｌ、ｎ＝８）またはＮｇＲ（３１０）エクト−Ｆｃ（５０μＭ、ｎ＝１９）を０．２５μＬ／時の速度で送達した。また、ＮｇＲ（３１０）エクト−Ｆｃ処置ラット（ｎ＝８）のコホートをＭＰ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ；３０ｍｇ／ｋｇ  ｉｖ）で処置し、別のコホートをＭＰ単独（３０ｍｇ／ｋｇ  ｉｖ）で、損傷直後ならびに４および８時間後に再度処置した。機能回復を、ＢＢＢオープンフィールドスコアリング法（Ｂａｓｓｏら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ  １２：１−２１（１９９５））を用いて、翌日およびその後毎週評価した。対照動物は、試験期間の過程で後肢機能を回復し、４週間後に平均ＢＢＢスコア１２±０．８７に達した。同じ時点での処置群の平均ＢＢＢスコアは、ＭＰ、１４．９±０．２３；ＮｇＲ（３１０）エクト−Ｆｃ、１４．８±０．２４およびＮｇＲ（３１０）エクト−Ｆｃ＋ＭＰ、１５．６３±０．１８であった。すべての処置群は、試験期間の過程で、対照と比べてＢＢＢスコアの改善を示した。Ｐ＜０／０５（対照に対して）、Ｔｕｋｅｙのｐｏｓｔ  ｈｏｃ検定による二元配置反復測定ＡＮＯＶＡ（図２５Ａ）。ＢＢＢスコアの統計学的に有意な増加が、外科処置後の日、対照動物またはＮｇＲ（３１０）エクト−Ｆｃ単独で処置した動物と比べて、ＭＰ−およびＭＰ＋ＮｇＲ（３１０）エクト−Ｆｃ処置ラットにおいて観察された。ＢＢＢスコアは、ＳＣＩの２日後、ＭＰ処置ラットにおいて有意に改善された。Ｐ＜０／０５（対照に対して）、Ｔｕｋｅｙのｐｏｓｔ  ｈｏｃ検定による二元配置反復測定ＡＮＯＶＡ（図２５Ｂ）。この観察結果により、回復に対するＭＰ処置の早期効果が示された。ＭＰのこの非常に早期効果を考慮し、ＢＢＢスコアを第２日目に対して標準化してＭＰのこの早期効果を差し引くと（図２５Ｃ）、ＮｇＲ（３１０）エクト−Ｆｃの効果のずっと遅い発現が示された。ＢＢＢスコアを個々の動物について第２日目に対して標準化すると、ＳＣＩの２、３および４週間後、ＮｇＲ（３１０）エクト−Ｆｃ処置ラット±ＭＰにおいて機能回復の有意な改善示される。Ｐ＜０／０５（対照に対して）、Ｔｕｋｅｙのｐｏｓｔ  ｈｏｃ検定による二元配置反復測定ＡＮＯＶＡ（図２５Ｃ）。併用処置群では、標準化ＢＢＢスコアにより、ＮｇＲ（３１０）（ｅｃｔｏ）−Ｆｃ処置に対するＭＰの効果の増強が消去され、これは、（ｉ）併用処置群では、ＭＰの効果は、ＳＣＩ後、早期に生じた、および（ｉｉ）この効果を差し引くことにより、併用処置群およびＮｇＲ（３１０）エクト−Ｆｃ群における機能回復の速度および程度が同一であり、ＭＰ処置単独よりも顕著であったことを示す。
【０５３９】
ＢＢＢスコアにおける差別（ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｎｇ）点は、一貫性の体重支持足底ステップおよび一貫性の後肢−前肢協調に対応するスコア１４である。一貫性の足底ステップおよび後肢−前肢協調の頻度は、ＳＣＩの３〜４週間後に１４以上のスコアに達した各群のラットの割合を示す。したがって、結果を、ラットが１４以上のスコアに達した頻度として示し、対照ラットの５０％は、損傷後４週間までに１４以上のスコアに達した（図２５Ｄ）。ＮｇＲ（３１０）エクト−ＦｃおよびＭＰでの併用処置により、機能回復の速度が有意に改善された。Ｐ＜０／０５（対照に対して）、フィッシャーの正確確率検定。ＮｇＲ（３１０）エクト−ＦｃもしくはＭＰまたは併用療法で処置したラットはすべて（１００％）、４週間までに一貫性の足底ステップおよび協調移動を示した。併用療法により、対照またはＮｇＲ（３１０）エクト−ＦｃもしくはＭＰ処置単独のいずれかと比べて、この処置群の有意に高い割合が３週間までに１４以上のスコアに達したため、協調機能の回復の速度が増大した（図２５Ｄ）。また、機能回復の改善は、対照と比べ、ＮｇＲ（３１０）エクト−ＦｃおよびＮｇＲ（３１０）エクト−Ｆｃ＋ＭＰ処置群において有意に改善された平均一股長さとしても示された（図２５Ｅ）。ＭＰ処置単独では、ＳＣＩ４週間後に測定された一股長さは有意に改善されなかった。Ｐ＜０／０５、Ｄｕｎｎｅｔｔのｐｏｓｔ  ｈｏｃ検定による一元配置ＡＮＯＶＡ。
【０５４０】
（実施例３１）
（ラットＩｇＧおよびメチルプレドニゾロンに融合させたラットＮｇＲ１のエクトドメイン（２７〜３１０）での処置により、脊髄離断後の軸索の形成性（ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ）／再生が増大した）
ＮｇＲ（３１０）エクト−Ｆｃでの処置またはＭＰとＮｇＲ（３１０）エクト−Ｆｃでの併用処置により、脊髄離断後の軸索の形成性／再生が増強された。簡単には、ＣＳＴの組織学的トレースのため、ＣＳＴ離断の２週間後、動物に再度−麻酔し、頭皮において切開を行った。皮膚切開部周辺の領域に、局所麻酔剤を注射し、左の感覚運動皮質を開頭術によって露出させ、７μＬの１０％ビオチンデキストランアミン（ＢＤＡ；１０，０００
ＭＷ；Ｍｏｌｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、ユージーン、ＯＲ、ＵＳＡ）含有ＰＢＳを、ナノリットル容注射器およびｍｉｃｒｏ４コントローラを用い、ブレグマの後方０〜３．５ｍｍ、正中切開部の側方０〜２．５ｍｍおよび皮質表面の下方１ｍｍの深さの１２点に注射した。場合によっては、ＣＳＴを、同じ手順を用いて左右対称に標識した。
【０５４１】
ＣＳＴ離断後２８日目、ラットにイナクチン（１００〜１１０ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ．）を麻酔し、噴門経由でヘパリン加生理食塩水（１００ｍｌ、１０ｉｕヘパリン）を、その後４％パラホルムアルデヒド（１５０ｍｌ）を灌流した。脊髄を取り出し、４％パラホルムアルデヒド中で後固定し、次いで、３０％スクロースを４８時間含浸させた。離断部位の吻側１０ｍｍおよび尾側１５ｍｍの２５ｍｍ長の脊髄を、至切断温度化合物（ＯＣＴ）中に包埋し、索の横断切片を、病変の吻側１０〜１５ｍｍおよび尾側１５〜２０ｍｍから採取した。
【０５４２】
凍結切片（５０μｍ）を滅菌的に切断し、ストレプトアビジン−結合体化ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ−５９４（１：２００；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）で染色して標識ＣＳＴ軸索を可視化させた。軸索計数を離断部位の尾側１０〜１５ｍｍから採取した横断面において行なった。すべての測定は盲検的に行った。８切片ごとに、すなわち、セクション  ４００μｍずつ離れた切片を各動物について各レベルの該索部で計数し、値を軸索／切片の平均数として示した。
【０５４３】
ＮｇＲ（３１０）エクト−Ｆｃでの処置またはＭＰとＮｇＲ（３１０）エクト−Ｆｃでの併用処置により、損傷部位の尾側１５ｍｍで、ビオチンデキストランアミン（ＢＤＡ）標識軸索の有意に大きな計測数がもたらされた（図２６Ａ）。ＢＤＡ標識軸索は、後柱から背側角状灰白質内、および空間の開いた腹側ＣＳＴ内の両方に出芽し、腹側灰白質内に突出するようであった。該索部の個々の領域における軸索計数により、灰白質において軸索数の最大の増加が示された。この軸索数の最大の増加は、腹側白質（ｖＷＭ）および背側白質（ｄＷＭ）と比べると、灰白質（ＧＭ）において観察された（図２６Ｂ）。Ｐ＜０／０５、Ｄｕｎｎｅｔｔのｐｏｓｔ  ｈｏｃ検定による一元配置ＡＮＯＶＡ。これらのデータは、ＭＰとともに、またはなしでのＮｇＲ（３１０）エクト−Ｆｃでの処置により、脊髄損傷後の形成性が促進されることを示唆する。
【０５４４】
（実施例３２）
（ラットＩｇＧおよびメチルプレドニゾロンに融合させたラットＮｇＲ１のエクトドメイン（２７〜３１０）での併用療法により、ビオチンデキストランアミン標識皮質脊髄路線維と腰椎運動ニューロン間の軸索接続の数が増大した）
抗小胞性グルタミン酸輸送体１（ｖＧＬＵＴｌ）抗体（希釈度度１：２５００）を用いてニューロン細胞体を染色し、第９髄板におけるα−およびγ−運動ニューロンを、その大きさおよび形態によって同定した。α−またはγ−運動ニューロンと接触している軸索の数は、対照動物と比べてＭＰ＋ＮｇＲ（３１０）エクト−Ｆｃ−処置群において有意に増加し、最も顕著で有意な効果は、ＮｇＲ（３１０）エクト−ＦｃおよびＭＰでの併用処置を受けた動物において観察された（図２７）。Ｐ＜０／０５、Ｄｕｎｎｅｔｔのｐｏｓｔ  ｈｏｃ検定による一元配置ＡＮＯＶＡ。
【０５４５】
（生物寄託）
ハイブリドーマＨＢ  ７Ｅ１１（ＡＴＣＣ（登録商標）受託番号ＰＴＡ−４５８７）、ＨＢ  １Ｈ２（ＡＴＣＣ（登録商標）受託番号ＰＴＡ−４５８４）、ＨＢ  ３Ｇ５（ＡＴＣＣ（登録商標）受託番号ＰＴＡ−４５８６）、ＨＢ  ５Ｂ１０（ＡＴＣＣ（登録商標）受託番号ＰＴＡ−４５８８）およびＨＢ  ２Ｆ７（ＡＴＣＣ（登録商標）受託番号ＰＴＡ−４５８５）は、２００２年８月９日、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（「ＡＴＣＣ（登録商標）」）、１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ  ２０１１０−２２０９、ＵＳＡに寄託した。
【０５４６】
当業者には認識されるように、本発明の精神から逸脱することなく、本発明の好ましい実施形態に対して数多くの変更および修正が行われ得る。かかる変形型はすべて、本発明の範囲に包含されることが意図される。
【表９】
2014221076.tif 000027
【表１０】
2014221076.tif 000028
【表１１】
2014221076.tif 000029
【表１２】
2014221076.tif 000030
【表１３】
2014221076.tif 000031
【表１４】
2014221076.tif 000032
【表１５】
2014221076.tif 000033
【表１６】
2014221076.tif 000034
【表１７】
2014221076.tif 000035
【表１８】
2014221076.tif 000036
【表１９】
2014221076.tif 000037
【図１】
2014221076.tif 000038
【図２】
2014221076.tif 000039
【図３】
2014221076.tif 000040
【図４】
2014221076.tif 000041
【図５】
2014221076.tif 000042
【図６】
2014221076.tif 000043
【図７】
2014221076.tif 000044
【図８】
2014221076.tif 000045
【図９Ａ】
2014221076.tif 000046
【図９Ｂ】
2014221076.tif 000047
【図１０Ａ】
2014221076.tif 000048
【図１０Ｂ】
2014221076.tif 000049
【図１１】
2014221076.tif 000050
【図１２】
2014221076.tif 000051
【図１３】
2014221076.tif 000052
【図１４】
2014221076.tif 000053
【図１５】
2014221076.tif 000054
【図１６Ａ】
2014221076.tif 000055
【図１６Ｂ】
2014221076.tif 000056
【図１７】
2014221076.tif 000057
【図１８】
2014221076.tif 000058
【図１９】
2014221076.tif 000059
【図２０】
2014221076.tif 000060
【図２１】
2014221076.tif 000061
【図２２】
2014221076.tif 000062
【図２３】
2014221076.tif 000063
【図２４Ａ】
2014221076.tif 000064
【図２４Ｂ】
2014221076.tif 000065
【図２５Ａ】
2014221076.tif 000066
【図２５Ｂ】
2014221076.tif 000067
【図２５Ｃ】
2014221076.tif 000068
【図２５Ｄ】
2014221076.tif 000069
【図２５Ｅ】
2014221076.tif 000070
【図２６Ａ】
2014221076.tif 000071
【図２６Ｂ】
2014221076.tif 000072
【図２７】
2014221076.tif 000073
【配列表】
2014221076000001.app
【外国語明細書】
2014221076000001.pdf