(57)【要約】【課題】無菌性を担保しながら健全な細胞を高収率でかつ分散した状態で回収する。【解決手段】細胞懸濁液を収容する懸濁液容器３と、該懸濁液容器３に接続され、該懸濁液容器３から流入された細胞懸濁液に含まれる細胞を捕捉する細胞捕捉フィルタ２と、懸濁液容器３とは反対側において細胞捕捉フィルタ２に接続され、細胞捕捉フィルタ２に回収液を導入する回収液導入部５と、懸濁液容器３と同一の側において細胞捕捉フィルタ２に接続され、細胞捕捉フィルタ２から流出した回収液に含まれる細胞を分散させる細胞分散部７と、細胞捕捉フィルタ２から細胞分散部７に流入する細胞の流速を低減する減速手段８とを備える細胞分離装置１を提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞懸濁液を収容する懸濁液容器と、
該懸濁液容器に接続され、該懸濁液容器から流入された前記細胞懸濁液に含まれる細胞を捕捉する細胞捕捉フィルタと、
前記懸濁液容器とは反対側において前記細胞捕捉フィルタに接続され、前記細胞捕捉フィルタに回収液を導入する回収液導入部と、
前記懸濁液容器と同一の側において前記細胞捕捉フィルタに接続され、前記細胞捕捉フィルタから流出した前記回収液に含まれる前記細胞を分散させる細胞分散部と、
前記細胞捕捉フィルタから前記細胞分散部に流入する前記細胞の流速を低減する減速手段とを備える細胞分離装置。
【請求項２】
前記細胞捕捉フィルタと前記細胞分散部とを接続する管路を備え、
前記減速手段が、前記管路の、他の部分よりも細径に形成された前記細胞分散部側の端部からなる請求項１に記載の細胞分離装置。
【請求項３】
前記減速手段が、前記細胞捕捉フィルタと前記細胞分散部との間において前記回収液の流体圧力を受けて運動させられる可動体を備える請求項１または請求項２に記載の細胞分離装置。
【請求項４】
前記可動体が、前記細胞捕捉フィルタと前記細胞分散部との間に接続され、周方向に弾性伸縮可能な弾性管路からなる請求項３に記載の細胞分離装置。
【請求項５】
前記細胞捕捉フィルタと前記細胞分散部とを接続する管路を備え、
前記減速手段が、前記管路の途中位置に配置された前記可動体としての弁体と、該弁体を前記細胞捕捉フィルタとは反対側において支持し、前記管路内の前記回収液の流動方向に弾性伸縮可能な弾性体とを備える請求項３または請求項４に記載の細胞分離装置。
【請求項６】
前記細胞分散部が、前記回収液に乱流を発生させる分散流路を備える請求項１から請求項５のいずれかに記載の細胞分離装置。
【請求項７】
前記細胞分散部は、前記回収液が流入する入口と、該入口に対して並列に接続され互いに等しい流路抵抗を有する複数の前記分散流路とを備え、
前記減速手段が、前記複数の分散流路からなる請求項６に記載の細胞分離装置。
【請求項８】
前記減速手段が、前記分散流路を流動する細胞に対して捕捉力を作用させる細胞捕捉機構を備える請求項６または請求項７に記載の細胞分離装置。
【請求項９】
前記細胞捕捉機構が、誘電泳動力、電気泳動力、超音波、磁力、光ピンセットまたは親和性によって前記細胞を捕捉する請求項８に記載の細胞分離装置。
【請求項１０】
前記細胞捕捉機構が、前記分散流路の壁面近傍に前記細胞を捕捉する請求項８または請求項９に記載の細胞分離装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞分離装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、再生医療において、生体から採取した脂肪組織から幹細胞のような治療に有効な細胞を分離する細胞分離装置が知られている（例えば、特許文献１参照。）。特許文献１によれば、脂肪組織を酵素によって分解することにより脂肪組織から細胞を遊離させ、遊離した細胞の懸濁液をフィルタに通過させることにより細胞をフィルタに捕捉し、フィルタに回収液を勢い良く反対方向に流すことによりフィルタから細胞を解放して回収している。このときに、フィルタに捕捉された細胞は互いに凝集しやすい。細胞が互いに凝集していると生体に均一の密度で移植することができないため、移植の際には細胞は単一に分散した状態であることが好ましい。
【０００３】
一方、液体と流路の壁面または液体同士を衝突させて乱流を発生させることにより２種類の液体を混合し、液体に含まれる微粒子をより微細化する分散装置が知られている（例えば、特許文献２参照。）。このような乱流を利用した分散装置は閉鎖系で粒子を分散させることができるため、無菌性が担保されなければならない移植用の細胞を分散させるのに好適に適用することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００７−２８９０７６号公報
【特許文献２】特許第２７８８０１０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、特許文献２の分散装置を特許文献１の細胞分離装置に適用し、フィルタから解放した細胞を分散装置によって分散してから回収しようとした場合、次のような問題が発生する。フィルタから細胞を確実に解放するためには回収液を勢い良くフィルタに導入する必要がある。一方、細胞を分散させるために必要とされる乱流の流速は十分に遅く、流速が過度に速い乱流が細胞に作用した場合には、互いに凝集している細胞間に大きなせん断力が発生することにより細胞に影響を及ぼす。すなわち、フィルタから解放された細胞が勢い良く分散装置に流入し、分散装置の内部において細胞が過度な乱流にさらされることにより、健全な細胞の回収率が低下してしまう。
【０００６】
本発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、無菌性を担保しながら健全な細胞を高収率でかつ分散した状態で回収することができる細胞分離装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記目的を達成するため、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、細胞懸濁液を収容する懸濁液容器と、該懸濁液容器に接続され、該懸濁液容器から流入された前記細胞懸濁液に含まれる細胞を捕捉する細胞捕捉フィルタと、前記懸濁液容器とは反対側において前記細胞捕捉フィルタに接続され、前記細胞捕捉フィルタに回収液を導入する回収液導入部と、前記懸濁液容器と同一の側において前記細胞捕捉フィルタに接続され、前記細胞捕捉フィルタから流出した前記回収液に含まれる前記細胞を分散させる細胞分散部と、前記細胞捕捉フィルタから前記細胞分散部に流入する前記細胞の流速を低減する減速手段とを備える細胞分離装置を提供する。
【０００８】
本発明によれば、懸濁液容器から細胞捕捉フィルタへ細胞懸濁液が流入され、次に回収液導入部から細胞捕捉フィルタへ先ほどとは反対方向に回収液が導入されることにより、細胞捕捉フィルタに捕捉されていた細胞が回収液と共に細胞捕捉フィルタから押し出され、細胞分散部において分散される。これにより、閉鎖系において無菌性を担保しながら分散した状態の細胞を得ることができる。
【０００９】
この場合に、細胞捕捉フィルタから押し出されて細胞分散部に流入する細胞の流速が減速手段によって低減される。すなわち、細胞捕捉フィルタへ速い流速で回収液を導入して細胞を確実に解放しつつ、細胞分散部においては遅い流速で細胞が流れることにより細胞の受ける影響が低減される。これにより、健全な細胞を高収率でかつ分散した状態で回収することができる。
【００１０】
上記発明においては、前記細胞捕捉フィルタと前記細胞分散部とを接続する管路を備え、前記減速手段が、前記管路の、他の部分よりも細径に形成された前記細胞分散部側の端部からなってもよい。
このようにすることで、流路径の小さい端部においては、他の部分よりも流路抵抗が増加することにより、回収液および該回収液に含まれる細胞の流速が低減する。これにより、簡易な構成および動作で細胞の流速を低減することができる。
【００１１】
また、上記発明においては、前記減速手段が、前記細胞捕捉フィルタと前記細胞分散部との間において前記回収液の流体圧力を受けて運動させられる可動体を備えてもよい。
このようにすることで、回収液の運動量の一部が可動体の運動量に変換されて消費されることにより、回収液および該回収液に含まれる細胞の流速が低減する。これにより、簡易な構成および動作で細胞の流速を低減することができる。
【００１２】
また、上記発明においては、前記可動体が、前記細胞捕捉フィルタと前記細胞分散部との間に接続され、周方向に弾性伸縮可能な弾性管路からなってもよい。また、上記発明においては、前記細胞捕捉フィルタと前記細胞分散部とを接続する管路を備え、前記減速手段が、前記管路の途中位置に配置された前記可動体としての弁体と、該弁体を前記細胞捕捉フィルタとは反対側において支持し、前記管路内の前記回収液の流動方向に弾性伸縮可能な弾性体とを備えてもよい。
このようにすることで、回収液の運動量を弾性管路または弾性体の弾性変形として消費することができる。
【００１３】
また、上記発明においては、前記細胞分散部が、前記回収液に乱流を発生させる分散流路を備えてもよい。
このようにすることで、回収液が乱流によって撹拌されることにより細胞を効率的に分散することができる。
【００１４】
また、上記発明においては、前記細胞分散部は、前記回収液が流入する入口と、該入口に対して並列に接続され互いに等しい流路抵抗を有する複数の前記分散流路とを備え、前記減速手段が、前記複数の分散流路からなってもよい。
このようにすることで、入口から流入した回収液が分散流路に分配されるときに、回収液の流速も分散流路の数で等分されて低減する。これにより、簡易な構成および動作で細胞の流速を低減することができる。
【００１５】
また、上記発明においては、前記減速手段が、前記分散流路を流動する細胞に対して捕捉力を作用させる細胞捕捉機構を備えてもよい。
このようにすることで、分散流路において細胞が捕捉力によって回収液の流れに逆らうことにより、細胞の流速を低減することができる。
【００１６】
また、上記発明においては、前記細胞捕捉機構が、前記捕捉力として、誘電泳動力、電気泳動力、超音波、光ピンセットまたは親和性を前記細胞に作用させてもよい。
このようにすることで、細胞に対して非接触で捕捉力を作用させることができる。
【００１７】
また、上記発明においては、前記細胞捕捉機構が、前記分散流路の壁面近傍に前記細胞を捕捉してもよい。
このようにすることで、比較的流速の遅い壁面近傍において細胞を捕捉することにより、細胞の流速を効果的に低減することができる。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、無菌性を担保しながら健全な細胞を高収率でかつ分散した状態で回収することができるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本発明の一実施形態に係る細胞分離装置の全体構成図である。
【図２】図１の細胞分離装置が備える減速手段を示す構成図である。
【図３】図１の細胞分離装置が備える減速手段の変形例を示す構成図である。
【図４】図１の細胞分離装置が備える減速手段のもう１つの変形例を示す構成図である。
【図５】図１の細胞分離装置が備える減速手段のもう１つの変形例を示す（ａ）細胞分散部の側面図、（ｂ）Ｉ−Ｉ線における断面図および（ｃ）ＩＩ−ＩＩ線における断面図である。
【図６】図１の細胞分離装置が備える減速手段のもう１つの変形例を示す構成図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下に、本発明の一実施形態に係る細胞分離装置１について図面を参照して説明する。
本実施形態に係る細胞分離装置１は、図１に示されるように、細胞懸濁液に含まれる細胞を捕捉する細胞捕捉フィルタ２と、該細胞捕捉フィルタ２に管路９によって無菌的に接続された懸濁液容器３、回収容器４、回収液導入部５および排液容器６とを備えている。図１において、紙面の上下方向は鉛直上下方向に対応している。
【００２１】
細胞捕捉フィルタ２は、細胞よりも小さい孔径を有し、細胞懸濁液に含まれる細胞を選択的に捕捉可能である。細胞捕捉フィルタ２の濾材は、織布、不織布または多孔質体からなる。濾材が不織布からなる場合、繊維径は２０μｍ〜１００μｍであることが好ましい。濾材が多孔質材料からなる場合、孔径は２０μｍ〜１００μｍであることが好ましい。
【００２２】
濾材の材料は、成形や滅菌の容易性および生体親和性の観点から、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、アクリル樹脂、ナイロン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリアクリルアミド、ポリウレタン等の合成高分子、アガロース、セルロース、酢酸セルロース、キチン、キトサン、アルギン酸塩等の天然高分子、ヒドロキシアパタイト、ガラス、アルミナ、チタニア等の無機材料、もしくは、ステンレス、チタン、アルミニム等の金属が好ましい。
【００２３】
懸濁液容器３および回収容器４は、細胞捕捉フィルタ２の上部にバルブＶ１を介して並列に接続され、バルブＶ１の切り替えによって択一的に細胞捕捉フィルタ２と連通可能になっている。
【００２４】
懸濁液容器３は、細胞懸濁液を収容している。この細胞懸濁液は、例えば、生体から採取した脂肪組織を消化酵素液内で撹拌して分解することによって得られた、脂肪組織由来細胞を含む消化酵素液である。懸濁液容器３は、細胞捕捉フィルタ２よりも高い位置に配置されるとともに、無菌的に内部を大気圧に開放するエアベントバルブを有している。バルブＶ１によって細胞捕捉フィルタ２と連通した状態でエアベントバルブを開放することによって、懸濁液容器３から細胞捕捉フィルタ２へ向かって細胞懸濁液が重力によって下降するようになっている。
【００２５】
回収容器４は、例えば、培養用の容器であって、回収された細胞をそのまま培養することができる。回収容器４は、移植材のようなスキャホールドを収容し、回収容器４内において細胞がスキャホールドに播種されるようになっていてもよい。
【００２６】
回収液導入部５および排液容器６は、細胞捕捉フィルタ２の下部にバルブＶ２を介して並列に接続され、バルブＶ２の切り替えによって択一的に細胞捕捉フィルタ２と連通可能になっている。
回収液導入部５は、例えば、回収液を収容したシリンジを備え、バルブＶ２を介して連通した細胞捕捉フィルタ２に回収液を圧入する。これにより、細胞捕捉フィルタ２に捕捉されていた細胞は、下から上へ向かう回収液の流体圧力によって細胞捕捉フィルタ２から解放され、回収液とともに細胞捕捉フィルタ２から押し出されるようになっている。
【００２７】
また、細胞分離装置１は、細胞捕捉フィルタ２と回収容器４との間に接続された細胞分散部７と、該細胞分散部７に流入する回収液の流速を低減する減速手段８とを備えている。
【００２８】
細胞分散部７は、細胞捕捉フィルタ２から流入した回収液に乱流を発生させる構造を有している。具体的には、細胞分散部７は、５０μｍ〜５００μｍ程度の流路径を有する分散流路が形成されている。分散流路は、途中位置で屈曲および分岐し、分岐した分散流路は再び合流している。分散流路の屈曲または分岐した位置においては回収液が分散流路の壁面に衝突することによって、また、分散流路が合流する位置においては互いに異なる方向から流れてきた回収液同士が衝突することによって、回収液に効果的に乱流が発生する。分散流路を流れる回収液がこのような乱流によって撹拌されることにより、凝集した細胞がばらばらに分散するようになっている。
【００２９】
減速手段８は、図２に示されるように、細胞捕捉フィルタ２と細胞分散部７とを接続する管路９の細胞分散部７側の端部（以下、細径部ともいう。）８１が、細胞捕捉フィルタ２側の他の部分よりも細径化されていることによって構成されている。管路径が他の部分よりも小さい細径部８１は、他の部分よりも大きな流路抵抗を有する。したがって、細胞捕捉フィルタ２から細胞分散部７へ流れる回収液Ａは、管路径が小さくなった細径部８１において流速が低減される。
【００３０】
具体的には、細径部８１が回収液Ａに与える圧力損失Δｐは、下式（１）のファニング式よって表わされる。ここで、Ｌは細径部８１の長さ、Ｄは細径部８１の内径、ρは回収液Ａの流体密度、Ｖは細径部８１の断面平均流速、ｆは摩擦損失係数である。
【００３１】
【数１】
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【００３２】
摩擦損失係数は、下式（２）に示されるブラジウスの式によって表わされる。ここで、Ｒｅはレイノルズ数である。
【００３３】
【数２】
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【００３４】
例えば、細胞捕捉フィルタとして市販されている間葉系幹細胞分離デバイス（カネカ社製）において、回収液の導入速度の推奨値は、１６．７ｍＬ／ｓｅｃである。細径部８１の内径を１ｍｍとし、細胞捕捉フィルタ２から細径部８１に流速１６．７ｍＬ／ｓｅｃで回収液Ａが流入した場合、回収液Ａの流体圧力は細径部８１を１ｃｍ流れる間に６０ｋＰａ低減することになる。
【００３５】
次に、このように構成された細胞分離装置１の作用について以下に説明する。
本実施形態に係る細胞分離装置１を用いて細胞懸濁液から細胞を分離回収するには、バルブＶ１の切り替えによって懸濁液容器３から細胞捕捉フィルタ２を介して排液容器６まで連通させ、懸濁液容器３のエアベントバルブを開放する。これにより、懸濁液容器３内の細胞懸濁液が重力によって下降して細胞捕捉フィルタ２を上から下へ流れる。細胞捕捉フィルタ２において、細胞懸濁液内の細胞は捕捉され、細胞懸濁液の他の成分は排液容器６へ流出する。
【００３６】
次に、バルブＶ１，Ｖ２の切り替えによって回収液導入部５から細胞捕捉フィルタ２を介して回収容器４まで連通させ、回収液導入部５から細胞捕捉フィルタ２へ回収液を勢い良く圧入する。これにより、細胞捕捉フィルタ２に捕捉されていた細胞が回収液とともに回収容器４へ向かって押し出される。
【００３７】
押し出された回収液は、減速手段８を構成する細径部８１において減速されてから細胞分散部７に流入し、該細胞分散部７において撹拌されながら分散流路を流れることにより、回収液に含まれている凝集した細胞が分散する。これにより、回収容器４において、単一に分散した状態の細胞を無菌的に回収することができる。
【００３８】
なお、細胞捕捉フィルタ２に捕捉された細胞を洗浄液によって洗浄してから細胞捕捉フィルタ２に回収液を導入してもよい。この場合、細胞捕捉フィルタ２の上部に懸濁液容器３と並列に接続された図示しない洗浄液容器から排液容器６に向かって洗浄液を流せばよい。
【００３９】
このように、本実施形態によれば、細胞捕捉フィルタ２へ勢い良く導入された回収液の流速が、減速手段８によって低減されてから細胞分散部７に流入する。したがって、細胞捕捉フィルタ２において細胞を確実に解放させつつ、細胞分散部７には細胞の分散に必要十分な流速で回収液を導入して細胞への影響を抑えることが可能となる。これにより、健全な細胞を高収率でかつ分散した状態で回収することができる。
【００４０】
なお、本実施形態においては、減速手段８が、細胞分散部７の入口に接続された細径部８１によって回収液の流速を低減することとしたが、これに代えて、細胞捕捉フィルタ２と細胞分散部７との間の途中位置に、回収液の流体圧力を受けて運動させられる可動体を備え、回収液の運動量の一部を可動体の運動量に変換することによって、回収液の流速を低減してもよい。
【００４１】
例えば、減速手段８は、図３に示されるように、管路９の途中位置に移動可能に配置された可動体としての弁体８２と、該弁体８２を細胞捕捉フィルタ２とは反対側において支持し、回収液Ａの流動方向に伸縮可能な弾性部材８３とからなるダンパ弁を備える。細胞捕捉フィルタ２からの回収液Ａの流体圧力によって弁体８２が押圧されると、弾性部材８３が収縮することによって弁体８２が管路９を開放するようになっている（２点鎖線参照。）。このときに、回収液Ａの運動量の一部が弾性部材８３の収縮運動として消費されることにより、回収液Ａの流速が低減する。
このようにしても、簡便な構成によって特別な操作を必要とすることなく回収液Ａの流速を低減することができる。
【００４２】
また、減速手段８は、図４に示されるように、可動体として弾性管路８４を備えていてもよい。弾性管路８４は、周方向に伸縮可能なゴムなどの弾性部材からなり、回収液Ａの流体圧力によって半径方向に拡張可能になっている。弾性管路８４は、管路９の周方向の一部のみを弾性部材から構成することによって形成されていてもよい。
【００４３】
この場合、細胞分散部７は、その入口に回収液Ａの流入量を制限するオリフィス７ａを有し、弾性管路８４は、オリフィス７ａの直前段に設けられていることが好ましい。このようにすることで、オリフィス７ａの手前で局所的に上昇した回収液Ａの圧力が弾性管路８４の周方向の伸展運動に効果的に変換されるので、細胞分散部７に流入する回収液Ａの流速を効果的に低減することができる。
【００４４】
また、本実施形態においては、減速手段８が、図５（ａ）〜（ｃ）に示されるように、細胞分散部７に設けられた複数の分散流路７１から構成されていてもよい。複数の分散流路７１は、細胞分散部７の入口７ｂに対して互いに並列に設けられている。これら複数の分散流路７１は、内径および長さが互いに等しく、同一の流路抵抗を有している。入口７ｂから流入した回収液は、複数の分散流路７１に均等に分配され、出口７ｃおいて合流する。このときに、分散流路７１を流れる回収液の流速は、入口７ｂにおける流速を分散流路７１の数によって等分したものとなる。
このようにしても、簡便な構成によって特別な操作を必要とすることなく回収液Ａの流速を低減することができる。
【００４５】
また、本実施形態においては、減速手段８が、細胞分散部７を流れる細胞を捕捉する細胞捕捉機構を備えていてもよい。
図６は、細胞分散部７の分散流路７１の横断面図であり、誘電泳動力を利用して細胞を捕捉する構成を示している。図６において、細胞捕捉機構は、分散流路７１において回収液の流動方向（紙面に垂直な方向）に交差する方向に間隔を空けて対向配置された２つの電極１０ａ，１０ｂと、これら電極１０ａ，１０ｂ間に交流電圧を印加する交流電源１２とを備えている。２つの電極１０ａ，１０ｂのうち一方は、多数の細孔を有する絶縁膜１１によって表面が被覆されている。
【００４６】
２つの電極１０ａ，１０ｂ間に交流電源１２から交流電圧が印加されることにより、分散流路７１内に交流電界が形成される。このときに、電極１０ａ，１０ｂの対向方向に電界勾配が形成され、電極１０ａ，１０ｂに近い程電界が強くなる。細胞には該細胞が有する誘電泳動特性に応じた誘電泳動力が作用し、この誘電泳動力によって細胞は一方の電極１０ａ，１０ｂに引き寄せられて捕捉される。
【００４７】
一方、十分に細径の分散流路７１内において、回収液は層流を形成する。この層流の流速は、分散流路７１の中心において速くなり、分散流路７１の壁面近傍において遅くなる。すなわち、電極１０ａ，１０ｂが配置されている分散流路７１の壁面近傍においては回収液の流れが遅いため、電極１０ａ，１０ｂに引き寄せられた細胞を誘電泳動力によって十分に捕捉し、細胞の流速を低減することができる。
【００４８】
細胞が撹拌によってばらばらに分散される際、凝集した細胞同士の間に発生するせん断力が細胞に大きな影響を及ぼす。すなわち、比較的速く流れる回収液中において細胞を捕捉して細胞の流速を低減することにより、細胞間に発生するせん断力を低減し、細胞に与える影響を低減することができる。さらに、交流電界の周波数を、所望の細胞に作用する誘電泳動力が最大となるように設定することで、所望の細胞、例えば、生きた細胞を選択的に回収することができる。
【００４９】
なお、細胞捕捉機構は、非接触で細胞に捕捉力を作用させることができればよく、誘電泳動力の他に、電気泳動力、超音波、磁力、光ピンセットまたは抗体などの親和性を利用して細胞を捕捉してもよい。
【符号の説明】
【００５０】
１  細胞分離装置
２  細胞捕捉フィルタ
３  懸濁液容器
４  回収容器
５  回収液導入部
６  排液容器
７  細胞分散部
７ａ  オリフィス
８  減速手段
８１  細径部
８２  弁体
８３  弾性部材
８４  弾性管路
９  管路
１０ａ，１０ｂ  電極
１１  絶縁膜
１２  交流電源
Ａ  回収液
Ｖ１，Ｖ２  バルブ
【図１】
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【図２】
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【図３】
2014117220.tif 000007
【図４】
2014117220.tif 000008
【図５】
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【図６】
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