(57)【要約】      （修正有）【課題】α−グルコシダーゼ酵素の活性を増加させる方法、および、ポンペ病を治療する方法の提供。【解決手段】細胞中のα−グルコシダーゼ酵素の活性を増加させる方法であって、式１−デオキシノジリマイシン誘導体の有効量を前記酵素と接触させるステップを含む方法。2014221759.tif 000054［式中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれＨ、または置換されていてもよいアルキル等を表し、Ｒ１及びＲ２の少なくとも１つはＨでない］また、該１−デオキシノジリマイシン誘導体であるシャペロン小分子化合物の投与によってポンペ病を治療する方法。置換α−グルコシダーゼ遺伝子または酵素との組合せ療法も提供される。【選択図】図１
2014221759.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞中のα−グルコシダーゼ酵素の活性を増加させる方法であって、
式：
【化１】
2014221759.tif 000048
［式中、
Ｒ１はＨ、または１〜１２の炭素原子を含有する直鎖または分岐鎖のアルキル、シクロ
アルキル、アルケニル、アルコキシアルキルもしくはアミノアルキル、５〜１２の環原子
を含有するアリール、アルキルアリール、ヘテロアリールもしくはヘテロアリールアルキ
ルであり、ここで、Ｒ１は、場合によって、１つ以上の−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、−Ｃｌ、−
Ｆ、−ＣＦ３、−ＯＣＦ３、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ−（アルキル）２で置換され；
Ｒ２はＨ、１〜９の炭素原子を含有する直鎖または分岐鎖のアルキル、シクロアルキル
、アルケニル、アルキルアリールもしくはアルコキシアルキル、または５〜１２の炭素原
子を含有するアリールであり、ここで、Ｒ２は、場合によって、−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、−
ＣＦ３、−ＯＣＦ３、または複素環で置換され；
かつ、Ｒ１およびＲ２の少なくとも１つはＨではない］
の化合物、またはその医薬上許容される塩を含む１−デオキシノジリマイシン誘導体（こ
こで、ＤＮＪ誘導体が、１−デオキシノジリマイシンまたはα−ホモノジリマイシンでは
ない）の有効量を前記酵素と接触させるステップを含む方法。
【請求項２】
細胞中のα−グルコシダーゼ酵素の活性を増加させる方法であって、
式：
【化２】
2014221759.tif 000049
［式中、
Ｒ１はＨ、または場合によって−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、−Ｃｌ、−Ｆ、−ＣＦ３、−ＯＣ
Ｆ３、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ−（アルキル）２で置換される１〜１２の炭素原子を含有する
直鎖または分岐鎖のアルキル、シクロアルキル、アルコキシアルキルもしくはアミノアル
キルであり；
Ｒ２はＨ、または１〜９の炭素原子を含有する直鎖または分岐鎖のアルキル、シクロア
ルキルもしくはアルコキシアルキルであり；
かつ、Ｒ１およびＲ２の少なくとも１つはＨではない］
の化合物、またはその医薬上許容される塩を含む１−デオキシノジリマイシン誘導体（こ
こで、ＤＮＪ誘導体は１−デオキシノジリマイシンまたはα−ホモノジリマイシンではな
い）の有効量を前記酵素と接触させるステップを含む方法。
【請求項３】
Ｒ１が場合によって−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、または−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ−
（Ｍｅ）２で置換される１〜９の炭素原子を含有する直鎖または分岐鎖のアルキル、
シクロアルキル、またはアルコキシアルキルであり；
かつ、Ｒ２がＨである、
請求項１に記載の方法。
【請求項４】
Ｒ１がｎ−メチル、ｎ−エチル、ｎ−ブチル、ｎ−シクロプロピルメチル、またはｎ−
ノニルである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
Ｒ１が−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、または−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ−（Ｍｅ）２で
置換されるｎ−エチル、ｎ−ブチルである、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
Ｒ１が
【化３】
2014221759.tif 000050
である、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
Ｒ１がＨであり、
かつ、Ｒ２が場合によって−ＣＦ３または複素環で置換される直鎖または分岐鎖のアル
キル、アルケニル、アリールまたはエーテルである、
請求項１に記載の方法。
【請求項８】
Ｒ２がｎ−ノニル基である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記化合物がＮ−メチル−ＤＮＪ、Ｎ−ブチル−ＤＮＪ、Ｎ−シクロプロピルメチル−
ＤＮＪ、Ｎ−（２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミド）エチルオキシ−ＤＮＪ、Ｎ−４−ｔ−ブ
チルオキシカルボニル−ピペリジニルメチル−ＤＮＪ、Ｎ−２−Ｒ−テトラヒドロフラニ
ルメチル−ＤＮＪ、Ｎ−２−Ｒ−テトラヒドロフラニルメチル−ＤＮＪ、Ｎ−（２−（２
，２，２−トリフルオロエトキシ）エチル−ＤＮＪ、Ｎ−２−メトキシエチル−ＤＮＪ、
Ｎ−２−エトキシエチル−ＤＮＪ、Ｎ−４−トリフルオロメチルベンジル−ＤＮＪ、Ｎ−
アルファ−シアノ−４−トリフルオロメチルベンジル−ＤＮＪ、Ｎ−４−トリフルオロメ
トキシベンジル−ＤＮＪ、Ｎ−４−ｎ−ペントキシベンジル−ＤＮＪ、およびＮ−４−ｎ
−ブトキシベンジル−ＤＮＪ、またはＣｌ−ノニルＤＮＪからなる群より選択される、請
求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記化合物がＮ−ブチル−デオキシノジリマイシンである、請求項９に記載の方法
【請求項１１】
ＤＮＪ誘導体の非存在下におけるＧａａ活性に対し、ＤＮＪ誘導体の存在下におけるＧ
ａａ活性の増加が、細胞中の最大Ｇａａ活性を提供するＤＮＪ誘導体の濃度において、少
なくとも１．５倍である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
ＤＮＪ誘導体の非存在下におけるＧａａ活性に対し、ＤＮＪ誘導体の存在下におけるＧ
ａａ活性の増加が、細胞中の最大Ｇａａ活性を提供するＤＮＪ誘導体の濃度において、少
なくとも５倍である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記化合物が、腸Ｇａａの阻害に対するＩＣ５０値以下の濃度で、リソソームＧａａ活
性を増加させる、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記α−グルコシダーゼ酵素が突然変異体α−グルコシダーゼである、請求項１に記載
の方法。
【請求項１５】
前記突然変異体α−グルコシダーゼが、Ｄ６４５Ｅ；Ｄ６４５Ｈ；Ｒ２２４Ｗ；Ｓ６１
９Ｒ；Ｒ６６０Ｈ；Ｔ１０６４Ｃ；Ｃ２１０４Ｔ；Ｄ６４５Ｎ；Ｌ９０１Ｑ；Ｇ２１９Ｒ
；Ｅ２６２Ｋ；Ｍ４０８Ｖ；Ｇ３０９Ｒ；Ｄ６４５Ｎ；Ｇ４４８Ｓ；Ｒ６７２Ｗ；Ｒ６７
２Ｑ；Ｐ５４５Ｌ；Ｃ６４７Ｗ；Ｇ６４３Ｒ；Ｍ３１８Ｔ；Ｅ５２１Ｋ；Ｗ４８１Ｒ；Ｌ
５５２Ｐ；Ｇ５４９Ｒ；Ｒ８５４Ｘ；Ｖ８１６Ｉ；およびＴ９２７Ｉ、およびその組合せ
からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記α−グルコシダーゼ酵素が精製された、または組換え機能的α−グルコシダーゼ酵
素である、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記接触がインビボで起こる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記接触がインビトロで起こる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
それを必要とする個人においてポンペ病を治療する方法であって、
式：
【化４】
2014221759.tif 000051
［式中、
Ｒ１は、Ｈ、または１〜１２の炭素原子を含有する直鎖または分岐鎖のアルキル、シク
ロアルキル、アルケニル、アルコキシアルキルもしくはアミノアルキル、５〜１２の環原
子を含有するアリール、アルキルアリール、ヘテロアリールもしくはヘテロアリールアル
キルであり、ここで、Ｒ１は、場合によって、１つ以上の−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、−Ｃｌ、
−Ｆ、−ＣＦ３、−ＯＣＦ３、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ−（アルキル）２で置換され；
Ｒ２はＨ、１〜９の炭素原子を含有する直鎖または分岐鎖のアルキル、シクロアルキル
、アルケニル、もしくはアルコキシアルキル、または５〜１２の炭素原子を含有するアリ
ールであり、ここで、Ｒ２は、場合によって、−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、−ＣＦ３、−ＯＣＦ
３、または複素環で置換され；
かつ、Ｒ１およびＲ２の少なくとも１つはＨではない］
の化合物、またはその医薬上許容される塩を含む１−デオキシノジリマイシン誘導体（こ
こで、ＤＮＪ誘導体は１−デオキシノジリマイシンまたはα−ホモノジリマイシンではな
い）の有効量を前記個人に投与するステップを含む方法。
【請求項２０】
それを必要とする個人においてポンペ病を治療する方法であって、
式：
【化５】
2014221759.tif 000052
［式中、
Ｒ１はＨ、または場合によって−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、−Ｃｌ、−Ｆ、−ＣＦ３、−ＯＣ
Ｆ３、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ−（アルキル）２で置換される１〜１２の炭素原子を含有する
直鎖または分岐鎖のアルキル、シクロアルキル、アルコキシアルキルもしくはアミノアル
キルであり；
Ｒ２はＨ、または１〜９の炭素原子を含有する直鎖または分岐鎖のアルキル、シクロア
ルキルもしくはアルコキシアルキルであり；
かつ、Ｒ１およびＲ２の少なくとも１つはＨではない］
の化合物、またはその医薬上許容される塩を含む１−デオキシノジリマイシン誘導体（こ
こで、ＤＮＪ誘導体は１−デオキシノジリマイシンまたはα−ホモノジリマイシンではな
い）の有効量を前記個人に投与するステップを含む方法。
【請求項２１】
Ｒ１が場合によって−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、または−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ−
（Ｍｅ）２で置換される１〜９の炭素原子を含有する直鎖または分岐鎖のアルキル、シク
ロアルキル、もしくはアルコキシアルキルであり；
かつ、Ｒ２がＨである、
請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
Ｒ１がｎ−メチル、ｎ−エチル、ｎ−ブチル、ｎ−シクロプロピルメチル、またはｎ−
ノニルである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
Ｒ１が−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、または−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ−（Ｍｅ）２で
置換されるｎ−エチルまたはｎ−ブチルである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
Ｒ１が
【化６】
2014221759.tif 000053
である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
Ｒ１がＨであり、
かつ、Ｒ２が場合によって−ＣＦ３または複素環で置換される、直鎖または分岐鎖のア
ルキル、アルケニル、アリールもしくはエーテルである、
請求項１９に記載の方法。
【請求項２６】
Ｒ２がｎ−ノニル基である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記化合物がＮ−メチル−ＤＮＪ、Ｎ−ブチル−ＤＮＪ、Ｎ−シクロプロピルメチル−
ＤＮＪ、Ｎ−（２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミド）エチルオキシ−ＤＮＪ、Ｎ−４−ｔ−ブ
チルオキシカルボニル−ピペリジニルメチル−ＤＮＪ、Ｎ−２−Ｒ−テトラヒドロフラニ
ルメチル−ＤＮＪ、Ｎ−２−Ｒ−テトラヒドロフラニルメチル−ＤＮＪ、Ｎ−（２−（２
，２，２−トリフルオロエトキシ）エチル−ＤＮＪ、Ｎ−２−メトキシエチル−ＤＮＪ、
Ｎ−２−エトキシエチル−ＤＮＪ、Ｎ−４−トリフルオロメチルベンジル−ＤＮＪ、Ｎ−
アルファ−シアノ−４−トリフルオロメチルベンジル−ＤＮＪ、Ｎ−４−トリフルオロメ
トキシベンジル−ＤＮＪ、Ｎ−４−ｎ−ペントキシベンジル−ＤＮＪ、およびＮ−４−ｎ
−ブトキシベンジル−ＤＮＪ、またはＣｌ−ノニル−ＤＮＪからなる群より選択される、
請求項１９に記載の方法。
【請求項２８】
前記化合物がＮ−ブチル−デオキシノジリマイシンである、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
ＤＮＪ誘導体の存在下におけるＧａａ活性の、ＤＮＪ誘導体を使用しないＧａａ活性に
対する比率が少なくとも１．５倍である、請求項１９に記載の方法。
【請求項３０】
ＤＮＪ誘導体を使用しないＧａａ活性に対し、ＤＮＪ誘導体の存在下におけるＧａａ活
性の増加が少なくとも５倍である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記化合物が腸Ｇａａの阻害に対するＩＣ５０値以下の濃度でリソソームＧａａを増強
させる、請求項１９に記載の方法。
【請求項３２】
前記有効量は一日当たり約１ｍｇ〜約３００ｍｇである、請求項１９に記載の方法。
【請求項３３】
前記有効量は一日当たり約５ｍｇ〜約１５０ｍｇである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記有効量は一日当たり約５ｍｇ〜約７５ｍｇである、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記１−デオキシノジリマイシン誘導体は経口投与形態で投与される、請求項１９に記
載の方法。
【請求項３６】
前記経口投与形態が錠剤またはカプセルである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記１−デオキシノジリマイシン誘導体はα−グルコシダーゼ置換酵素と組み合わせて
投与される、請求項１９に記載の方法。
【請求項３８】
前記α−グルコシダーゼが置換α−グルコシダーゼ遺伝子と組み合わせて投与される、
請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［関連出願への相互参照］
本出願は、２００５年５月１７日に出願された米国仮出願第６０／６８２，２４１号お
よび２００５年１０月２１日に出願された第６０／７２９，３２９号に基づいて米国特許
法第１１９条の下で優先権を主張するものであり、その全開示は参照として本明細書に組
み入れられる。
【０００２】
［発明の分野］
本発明は、α−グルコシダーゼ酵素の活性を増加させる方法、および、例えば、Ｎ−ブ
チル−１−デオキシノジリマイシン（ＮＢ−ＤＮＪ）を含めた、１−デオキシノジリマイ
シン（１−ＤＮＪ）および１−ＤＮＪ誘導体の有効量を個体に投与することを含むポンペ
病を治療する方法を提供する。予期せぬことに、これらの化合物は、ポンペ病の病理学の
原因となる酵素である酸性α−グルコシダーゼを増強することが示された。
【０００３】
［発明の背景］
ポンペ病
ポンペ病は、いくつかのリソソーム貯蔵障害の１つである。リソソーム貯蔵障害は、欠
陥がある加水分解酵素による、細胞グルコスフィンゴ脂質、グリコーゲンまたはムコ多糖
の蓄積によって引き起こされる１群の常染色体性劣性遺伝病である。リソソーム障害の例
は、限定されるものではないが、ゴーシェ病（Ｂｅｕｔｌｅｒら，Ｔｈｅ  Ｍｅｔａｂｏ
ｌｉｃ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｓｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ  Ｄｉｓ
ｅａｓｅ，８ｔｈ  ｅｄ．２００１  Ｓｃｒｉｖｅｒら，ｅｄ．ｐｐ．３６３５−３６６
８，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、ＧＭ１−ガングリオシドーシス（ｉ
ｄ．ａｔ  ｐｐ．３７７５−３８１０）、フコシドーシス（Ｔｈｅ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ
ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｓｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ  Ｄｉｓｅａｓ
ｅ  １９９５．Ｓｃｒｉｖｅｒ，  Ｃ．Ｒ．，Ｂｅａｕｄｅｔ，Ａ．Ｌ．，Ｓｌｙ，Ｗ．
Ｓ．ａｎｄ  Ｖａｌｌｅ，Ｄ．，ｅｄ  ｐｐ．２５２９−２５６１，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉ
ｌｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、ムコポリサッカリドーシス（ｉｄ．ａｔ  ｐｐ  ３４２１−
３４５２）、ポンペ病（ｉｄ．ａｔ  ｐｐ．３３８９−３４２０）、ハーラー・シャイエ
病（Ｗｅｉｓｍａｎｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９７０；１６９，７２−７４）、ニーマン
・ピックＡおよびＢ病（Ｔｈｅ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂ
ａｓｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ８ｔｈ  ｅｄ．２００１．Ｓｃ
ｒｉｖｅｒらＥｄ．，ｐｐ  ３５８９−３６１０，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ  Ｙ
ｏｒｋ）、およびファブリー病（Ｉｄ．ａｔ  ｐｐ．３７３３−３７７４）を含む。
【０００４】
ポンペ病は、酵素酸α−グルコシダーゼ（Ｇａａ）における欠陥によって引き起こされ
る。Ｇａａは、エネルギーで用いられる糖の貯蔵形態であるグリコーゲンをグルコースに
代謝させる。グリコーゲンの蓄積は、種々の体の組織、特に心臓、骨格筋、肝臓および神
経系に影響する体全体にわたる進行性筋障害に導くと考えられる。Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉ
ｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  ａｎｄ  Ｓ
ｔｒｏｋｅによると、ポンペ病は４０，０００人の新生児のうち約１人に発症すると推定
される。
【０００５】
ポンペ病には、乳児、若年、および成人発症型の、３つのタイプが認められている。幼
児型は最もひどく、筋緊張のひどい欠如、虚弱、拡大された肝臓および心臓、および心筋
障害を含む症状が存在する。嚥下が困難となり、舌が突出し、肥大することもある。ほと
んどの子供は２歳前に呼吸器系または心臓合併症で死亡する。若年型発症ポンペ病は、ま
ず、初期〜後期子供時代に存在し、体幹、横隔膜および下部四肢における呼吸器系筋肉の
進行性虚弱、ならびに運動非許容性を含む。ほとんどの若年型発症ポンペ病患者は、２０
代または３０代を越えて生き延びることはない。成人型発症の症状には、一般化された筋
肉虚弱および体幹の呼吸器系筋肉、下部四肢、および横隔膜の筋肉の萎縮がある。成人患
者の中には主な症状または運動制限がない患者もいる。
【０００６】
現在の治療
ポンペ病の現在の治療は、心臓および呼吸器系症状の対症療法を含む。基礎となる遺伝
的欠陥について認められた治療はない。最近、置換Ｇａａ（ミオザイム：Ｇｅｎｚｙｍｅ
，Ｉｎｃ．）の使用が合衆国におけるＦ．Ｄ．Ａ．によって承認された。しかしながら、
乳児性ポンペ患者における欠損Ｇａａを置き換えるために酵素置換療法を用いる臨床的評
価は、心臓および骨格機能を改善するのに中程度に成功したに過ぎなかった（Ｋｌｉｎｇ
ｅら、Ｎｅｕｒｏｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ．２００５；３６（１）：６−１１）。組換えＧ
ａａが、骨格筋の筋障害よりも心筋障害を解決するにおいてより効果的であることが示さ
れた（Ｒａｂｅｎら，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．２００５；１１（１）：４８−５６）。これは
多分に組換え酵素が結合組織に侵入できないからである。組換えＧａａを用いるポンペ病
を治療する方法は、具体的にはＣａｎｆｉｅｌｄに対する米国特許第６，５３７，７８５
号に記載されている。
【０００７】
酵素置換療法（ＥＲＴ）の主な問題の１つは、注入された酵素の迅速な分解による治療
上有効量の酵素の達成および維持である。その結果、ＥＲＴは多数の高用量投与を必要と
し、コストがかかり、かつ時間がかかる。ＥＲＴ療法は、適切にフォールディングされた
タンパク質の大規模生成、精製および貯蔵、グリコシル化天然タンパク質の入手、および
抗−タンパク質免疫応答の発生に伴う困難、およびタンパク質が、かなりの中枢神経系の
関与を有する病気に影響させるための十分な量の血液−脳関門を横切ることができないこ
とのようないくつかの更なる警告を有する。加えて、組換え酵素は腎臓などの器官を囲う
バリアを通過することができないし、結合組織に侵入することもできない、それゆえ、多
くの罹患した組織の機能を回復するのに効果的ではない。
【０００８】
機能的タンパク質をコードする核酸配列を含有する組換えベクター、または機能的タン
パク質を発現する遺伝子操作されたヒト細胞を用いる遺伝子治療もまた、タンパク質欠乏
症およびタンパク質置換によって利益を受ける他の障害を治療するのに用いられている。
有力ではあるが、このアプローチは、ベクターが分裂する細胞に感染、または伝達不能で
あること、標的遺伝子の低い発現量および一旦遺伝子が送達された場合の発現の調節のよ
うな技術的困難によって制限される（例えば、多くのウィルスベクターは細胞が効率のた
めには分裂することを必要とする）。
【０００９】
酵素欠乏症の治療に対する第３の比較的最近のアプローチは、小分子阻害剤を使用し、
欠損酵素タンパク質の天然基質を減少させ、それにより、観察される病状を軽減する。こ
の「基質抑制」アプローチは、糖脂質蓄積に関与するいくつかのリソソーム貯蔵障害の治
療のために具体的に記載されている（米国特許第５，７９８，３６６号、第６，２９１，
６５７号および第６，６６０，７４９号参照）。療法として用いるのに提案された小分子
阻害剤はＮ−アルキル−デオキシノジリマイシン（Ｎ−アルキル−ＤＮＪ）誘導体を含み
、これは、糖脂質の合成に関与する酵素の阻害に特異的であり、それにより、欠損酵素に
よって分解される必要がある細胞糖脂質の量を低下させると報告されている。このアプロ
ーチは、糖脂質が生物学的機能で必要であり、過剰の抑制が有害効果を引き起こしかねな
い点でまた制限される。具体的には、糖脂質は、１つのニューロンのガングリオシドから
のシグナルを別のニューロンへ送るために、脳によって使用される。もしあまりにも少な
い、またはあまりにも多い糖脂質が存在すると、シグナルを送るニューロンの能力は損な
われる。
【００１０】
第４のアプローチである特異的シャペロン戦略は、恐らくは、小胞体（ＥＲ）において
、または他の細胞タンパク質分解／処理システムにおいて、突然変異したタンパク質を分
解から救済する。以前の特許および刊行物には、ミスフォールディングされたリソソーム
酵素を含めた内因性酵素タンパク質を、ＥＲ品質管理機構による分解から救済するための
治療的戦略が記載してある。特定の実施形態において、この戦略は、特異的なリソソーム
疾患に関連する欠損リソソーム酵素に特異的に結合する小分子薬理学的シャペロンを使用
する。治療をしていない場合には、突然変異した酵素タンパク質はＥＲにおいて不安定で
あり、（Ｉｓｈｉｉら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１９９６
；２２０：８１２−８１５）、最終生成物への成熟が遅延し、引き続いて、ＥＲ内で分解
される。シャペロン戦略では、フォールディングを促し、突然変異したタンパク質の安定
性を増強させて、ＥＲ品質管理機構からの過度なまたは異常な分解を妨げる化合物を使用
する。これらの特異的シャペロンは活性部位−特異的シャペロンと命名されているか、あ
るいは、特異的薬理学的シャペロンともいう。
【００１１】
この戦略の背後にある元々の理論は以下の通りである：突然変異体酵素タンパク質はＥ
Ｒにおいて不適切にフォールディングされる（Ｉｓｈｉｉら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐ
ｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１９９６；２２０：８１２−８１５）ので、酵素タンパク質
は正常な輸送経路（ＥＲ→ゴルジ装置→エンドソーム→リソソーム）において遅延し、急
速に分解される。従って、突然変異体タンパク質の正しいフォールディングを促す化合物
は、突然変異体タンパク質のための活性部位−特異的シャペロンとして働いて、ＥＲ品質
管理機構からのスムーズな回避を促進するであろう。いくつかの酵素阻害剤は触媒中心を
占有することが知られており、その結果、インビトロにて酵素の立体構造が安定化する。
【００１２】
特異的薬理学的シャペロン戦略は、その全体が参照として本明細書に組み入れられる、
Ｆａｎらに対する米国特許第６，２７４，５９７号、第６，５８３，１５８号、第６，５
８９，９６４号、第６，５９９，９１９号および第６，９１６，８２９号におけるように
リソソーム貯蔵障害に関する多数の酵素に対して示されている。例えば、ガラクトース、
１−デオキシガラクトノジリマイシン（ＤＧＪ）の小分子誘導体、突然変異体ファブリー
酵素α−ガラクトシダーゼＡ（α−Ｇａｌ  Ａ；Ｇｌａ）の優れた競合阻害剤は、中性ｐ
Ｈにおいてヒト突然変異体α−Ｇａｌ  Ａ（Ｒ３０１Ｑ）のインビトロ安定性を効果的に
増加させ、それは、Ｒ３０１ＱまたはＱ２７９Ｅ突然変異体を持つファブリー患者から樹
立されたリンパ芽球における突然変異体酵素活性を増強した。更に、突然変異体（Ｒ３０
１Ｑ）α−Ｇａｌ  Ａを過剰発現するトランスジェニックマウスへのＤＧＪの経口投与は
、主な臓器において酵素活性を実質的に上昇させた（Ｆａｎら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．
１９９９；５：１１２−１１５）。米国特許第６，９１６，８２９号に記載された別のイ
ミノ糖、イソファゴミン（ＩＦＧ）およびその誘導体を用いる、および（共に２００４年
１１月１２日に出願された係属米国特許出願第１０／９８８，４２８号および第１０／９
８８，４２７号に記載された）グルコセレブロシダーゼに特異的な他の化合物を用いる、
ゴーシェ患者細胞からのグルコセレブロシダーゼ（酸性β−グルコシダーゼ，Ｇｂａ）の
同様な救済が記載されている。上記した米国特許第６，５８３，１５８号は、１−デオキ
シノジリマイシン（ＤＮＪ）、α−ホモノジリマイシンおよびカスタノスペリミン（ｃａ
ｓｔａｎｏｓｐｅｒｍｉｎｅ）を含めた、ポンペ病の治療のためにＧａａ救済で働くこと
が予測されるいくつかの小分子化合物を開示している。
【００１３】
本発明は、突然変異体Ｇａａのための効果的な特異的薬理学的シャペロンであることが
見いだされたＮ−ブチルＤＮＪのようなＤＮＪ誘導体を用いて得られた予期せぬ結果に基
づく。
【００１４】
［発明の概要］
本発明は、α−グルコシダーゼ（Ｇａａ）酵素、および１−デオキシノジリマイシン（
１）またはＮ−ブチルＤＮＪ（５）のようなデオキシノジリマイシン（ＤＮＪ）誘導体と
接触させることによって細胞における該酵素の適切な立体構造を誘発し、または安定化す
る方法を提供する。好ましくは、ＤＮＪ誘導体の存在下におけるＧａａ活性のＤＮＪ誘導
体の非存在下におけるＧａａ活性に対する比率は、最大Ｇａａ活性を提供するＤＮＪ誘導
体の濃度において少なくとも１．５倍である。別の実施形態においてＧａａ活性の増加は
少なくとも５倍である。
【００１５】
一実施形態において、ＤＮＪ誘導体は以下の構造：
【化１】
2014221759.tif 000003
［式中、
Ｒ１はＨ、または１〜１２の炭素原子を含有する直鎖または分岐鎖のアルキル、シクロ
アルキル、アルケニル、アルコキシアルキルもしくはアミノアルキル、５〜１２の環原子
を含有するアリール、アルキルアリール、ヘテロアリールもしくはヘテロアリールアルキ
ルであり、ここで、Ｒ１は場合によって１つ以上の−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、−Ｃｌ、−Ｆ、
−ＣＦ３、−ＯＣＦ３、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ−（アルキル）２で置換され；
Ｒ２はＨ、１〜９の炭素原子を含有する直鎖または分岐鎖のアルキル、シクロアルキル
、アルケニル、アルキルアリールもしくはアルコキシアルキル、または５〜１２の炭素原
子を含有するアリールであり、ここで、Ｒ２は場合によって−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、−ＣＦ
３、−ＯＣＦ３または複素環で置換され；
かつ、Ｒ１およびＲ２の少なくとも１つはＨではない］、
またはその医薬上許容される塩を有する。好ましくは、誘導体の存在下におけるＧａａ活
性の、ＤＮＪ誘導体非存在下におけるＧａａ活性に対するＤＮＪ増加は、細胞における最
大Ｇａａ活性を提供するＤＮＪ誘導体の濃度で少なくとも１．５倍であり、但し、ＤＮＪ
誘導体は１−デオキシノジリマイシンまたはα−ホモノジリマイシンではないものとする
。
【００１６】
別の実施形態において、ＤＮＪ誘導体は以下の構造：
【化２】
2014221759.tif 000004
［式中、
Ｒ１はＨ、または場合によって−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、−Ｃｌ、−Ｆ、−ＣＦ３、−ＯＣ
Ｆ３、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ−（アルキル）２で置換される１〜１２の炭素原子を含有する
直鎖または分岐鎖のアルキル、シクロアルキル、アルコキシアルキルもしくはアミノアル
キルである；
Ｒ２はＨ、または１〜９の炭素原子を含有する直鎖または分岐鎖のアルキル、シクロア
ルキルもしくはアルコキシアルキルである；
かつ、Ｒ１およびＲ２の少なくとも１つはＨではない］、
または医薬上許容される塩を有する。好ましくは、ＤＮＪ誘導体の存在下におけるＧａａ
活性のＤＮＪ誘導体非存在下におけるＧａａ活性に対する比率は、細胞において最大Ｇａ
ａ活性を提供するＤＮＪ誘導体の濃度で少なくとも１．５倍であり、但し、ＤＮＪ誘導体
は１−デオキシノジリマイシンまたはα−ホモノジリマイシンではない。
【００１７】
細胞における最大Ｇａａ活性は実施例に記載したようにインビトロまたはインビボで決
定することができ、いずれのＤＮＪ誘導体についての、この活性比率を示すために例示し
たアッセイのいずれを用いることもできる。
【００１８】
特別な実施形態において、Ｒ１は場合によって−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、ＣＦ３、ＯＣＦ３
、または−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ−（Ｍｅ）２で置換される１〜９の炭素原子を含有する直鎖また
は分岐鎖のアルキル、シクロアルキルもしくはアルコキシアルキルであり、かつ、Ｒ２は
Ｈである。別の実施形態においてＲ１はｎ−メチル、ｎ−エチル、ｎ−ブチル、ｎ−シク
ロプロピルメチル、またはｎ−ノニルである。なお別の実施形態において、Ｒ１は−ＯＨ
、−ＣＯＯＨ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、または−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ−（Ｍｅ）２で置換されたｎ−
エチルまたはｎ−ブチルである。
【００１９】
一実施形態において、Ｒ１は
【化３】
2014221759.tif 000005
である。
【００２０】
別の実施形態において、Ｒ１はＨであり、そしてＲ２は場合によって、−ＣＦ３または
複素環で置換される直鎖または分岐鎖のアルキル、アルケニル、アリールもしくはエーテ
ルである。
【００２１】
一実施形態において、Ｒ２はｎ−ノニル基である。
【００２２】
特許請求される方法の更なる実施形態において、該化合物は、Ｎ−メチル−ＤＮＪ、Ｎ
−ブチル−ＤＮＪ、Ｎ−シクロプロピルメチル−ＤＮＪ、Ｎ−（２−（Ｎ，Ｎ−ジメチル
アミド）エチルオキシ−ＤＮＪ、Ｎ−４−ｔ−ブチルオキシカルボニル−ピペリジニルメ
チル−ＤＮＪ、Ｎ−２−Ｒ−テトラヒドロフラニルメチル−ＤＮＪ、Ｎ−２−Ｒ−テトラ
ヒドロフラニルメチル−ＤＮＪ、Ｎ−（２−（２，２，２−トリフルオロエトキシ）エチ
ル−ＤＮＪ、Ｎ−２−メトキシエチル−ＤＮＪ、Ｎ−２−エトキシエチル−ＤＮＪ、Ｎ−
４−トリフルオロメチルベンジル−ＤＮＪ、Ｎ−アルファ−シアノ−４−トリフルオロメ
チルベンジル−ＤＮＪ、Ｎ−４−トリフルオロメトキシベンジル−ＤＮＪ、Ｎ−４−ｎ−
ペントキシベンジル−ＤＮＪ、およびＮ−４−ｎ−ブトキシベンジル−ＤＮＪ、またはＣ
ｌ−ノニルＤＮＪからなる群より選択される。
【００２３】
別の実施形態において、該化合物は、腸Ｇａａの阻害についてのＩＣ５０値以下の濃度
でリソソームＧａａ活性を増加させる。
【００２４】
一実施形態において、Ｇａａ酵素は突然変異体α−グルコシダーゼである。特別な実施
形態において、突然変異体α−グルコシダーゼはＤ６４５Ｅ；Ｄ６４５Ｈ；Ｒ２２４Ｗ；
Ｓ６１９Ｒ；Ｒ６６０Ｈ；Ｔ１０６４Ｃ；Ｃ２１０４Ｔ；Ｄ６４５Ｎ；Ｌ９０１Ｑ；Ｇ２
１９Ｒ；Ｅ２６２Ｋ；Ｍ４０８Ｖ；Ｇ３０９Ｒ；Ｄ６４５Ｎ；Ｇ４４８Ｓ；Ｒ６７２Ｗ；
Ｒ６７２Ｑ；Ｐ５４５Ｌ；Ｃ６４７Ｗ；Ｇ６４３Ｒ；Ｍ３１８Ｔ；Ｅ５２１Ｋ；Ｗ４８１
Ｒ；Ｌ５５２Ｐ；Ｇ５４９Ｒ；Ｒ８５４Ｘ；Ｖ８１６Ｉ；およびＴ９２７Ｉ、およびその
組合せからなる群より選択される。
【００２５】
別の実施形態において、Ｇａａは精製したまたは組換え機能的Ｇａａである。
【００２６】
更なる実施形態において、接触はインビボまたはインビトロで起こる。
【００２７】
また、本発明は、Ｎ−ブチルＤＮＪのようなデオキシノジリマイシン誘導体の有効量を
投与することによってポンペ病を治療する方法を提供する。
【００２８】
一実施形態において、ＤＮＪ誘導体は以下の構造：
【化４】
2014221759.tif 000006
［式中、
Ｒ１はＨ、または１〜１２の炭素原子を含有する直鎖または分岐鎖のアルキル、シクロ
アルキル、アルケニル、アルコキシアルキルもしくはアミノアルキル、または５〜１２の
環原子を含有するアリール、アルキルアリール、ヘテロアリールもしくはヘテロアリール
アルキルであり、ここで、Ｒ１は場合によって１つ以上の−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、−Ｃｌ、
−Ｆ、−ＣＦ３、−ＯＣＦ３、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ−（アルキル）２で置換され、
Ｒ２はＨ、１〜９の炭素原子を含有する直鎖または分岐鎖のアルキル、シクロアルキル
、アルケニルもしくはアルコキシアルキルであり、ここで、Ｒ２は場合によって−ＯＨ、
−ＣＯＯＨ、−ＣＦ３、−ＯＣＦ３または複素環で置換され、
かつ、Ｒ１およびＲ２の少なくとも１つはＨではない］、
または医薬上許容される塩を有する。好ましくは、ＤＮＪ誘導体の存在下におけるＧａａ
活性のＤＮＪ誘導体非存在下におけるＧａａ活性に対する比率は、細胞において最大Ｇａ
ａ活性を提供するＤＮＪ誘導体の濃度で少なくとも１．５であり、但し、ＤＮＪ誘導体は
１−デオキシノジリマイシンまたはα−ホモノジリマイシンではない。
【００２９】
別の実施形態において、ＤＮＪ誘導体は以下の構造：
【化５】
2014221759.tif 000007
［式中、
Ｒ１はＨ、または場合によって−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、−Ｃｌ、−Ｆ、−ＣＦ３、−ＯＣ
Ｆ３、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ−（アルキル）２で置換される１〜１２の炭素原子を含有する
直鎖または分岐鎖のアルキル、シクロアルキル、アルコキシアルキルもしくはアミノアル
キルであり；
Ｒ２はＨ、または１〜９の炭素原子を含有する直鎖または分岐鎖のアルキル、シクロア
ルキル、またはアルコキシアルキルであり；
かつ、Ｒ１およびＲ２の少なくとも１つはＨではない］、
または医薬上許容される塩を有する。好ましくは、ＤＮＪ誘導体の存在下におけるＧａａ
活性の、ＤＮＪ誘導体非存在下におけるＧａａ活性に対する比率は、細胞において最大Ｇ
ａａ活性を提供するＤＮＪ誘導体の濃度において少なくとも１．５であり、但し、ＤＮＪ
誘導体は１−デオキシノジリマイシンまたはα−ホモノジリマイシンではない。
【００３０】
一実施形態において、Ｒ１は場合によって−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ま
たは−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ−（Ｍｅ）２で置換される１〜９の炭素原子を含有する直鎖または分
岐鎖のアルキル、シクロアルキルもしくはアルコキシアルキルであり；かつ、Ｒ２はＨで
ある。特別な実施形態において、Ｒ１はｎ−メチル、ｎ−エチル、ｎ−ブチル、ｎ−シク
ロプロピルメチル、またはｎ−ノニルである。別の実施形態において、Ｒ１は−ＯＨ、−
ＣＯＯＨ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、または−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ−（Ｍｅ）２で置換されたｎ−エチ
ルまたはｎ−ブチルである。なお別の実施形態において、Ｒ１は
【化６】
2014221759.tif 000008
である。
【００３１】
別の実施形態において、Ｒ１はＨであり、かつ、Ｒ２は場合によってＣＦ３または複素
環で置換される直鎖または分岐鎖のアルキル、アルケニル、アリールもしくはエーテルで
ある。なお別の実施形態において、Ｒ２はｎ−ノニル基である。
【００３２】
特別な実施形態において、該化合物は、Ｎ−メチル−ＤＮＪ、Ｎ−ブチル−ＤＮＪ、Ｎ
−シクロプロピルメチル−ＤＮＪ、Ｎ−（２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミド）エチルオキシ
−ＤＮＪ、Ｎ−４−ｔ−ブチルオキシカルボニル−ピペリジニルメチル−ＤＮＪ、Ｎ−２
−Ｒ−テトラヒドロフラニルメチル−ＤＮＪ、Ｎ−２−Ｒ−テトラヒドロフラニルメチル
−ＤＮＪ、Ｎ−（２−（２，２，２−トリフルオロエトキシ）エチル−ＤＮＪ、Ｎ−２−
メトキシエチル−ＤＮＪ、Ｎ−２−エトキシエチル−ＤＮＪ、Ｎ−４−トリフルオロメチ
ルベンジル−ＤＮＪ、Ｎ−アルファ−シアノ−４−トリフルオロメチルベンジル−ＤＮＪ
、Ｎ−４−トリフルオロメトキシベンジル−ＤＮＪ、Ｎ−４−ｎ−ペントキシベンジル−
ＤＮＪ、およびＮ−４−ｎ−ブトキシベンジル−ＤＮＪまたはＣｌ−ノニルＤＮＪからな
る群より選択される。
【００３３】
別の実施形態において、該化合物は腸Ｇａａの阻害に対するＩＣ５０値以下の濃度でリ
ソソームＧａａを増強する。
【００３４】
別の実施形態において、１−デオキシノジリマイシン誘導体の有効量は１日当たり約１
ｍｇ〜３００ｍｇである。代替の実施形態において有効量は１日当たり約５ｍｇ〜約１５
０ｍｇである。なお別の実施形態において、有効量は１日当たり約５〜約７５ｍｇである
。
【００３５】
一実施形態において、デオキシノジリマイシン誘導体は錠剤またはカプセルのような経
口投与形態で投与される。
【００３６】
別の実施形態において、デオキシノジリマイシン誘導体はＧａａ置換酵素と組み合わせ
て投与される。
【００３７】
この実施形態において、デオキシノジリマイシン誘導体およびＧａａ置換酵素は別々の
処方にてまたは単一の処方として投与することができる。
【００３８】
例えば、このような一実施形態において、デオキシノジリマイシン誘導体は経口投与形
態で投与され、Ｇａａ置換酵素は非経口投与形態で投与される。
【００３９】
代替の実施形態において、デオキシノジリマイシン誘導体は遺伝子治療と組み合わせて
投与される。
【００４０】
本発明の一実施形態において、上記治療の結果、ポンペ病の病状の軽減がもたらされる
。
【００４１】
特別な実施形態において、病状は、Ｇａａの骨格組織における活性低下；心筋症；心臓
肥大；進行性筋力低下；筋緊張低下；巨舌症；嚥下、吸引、および／または摂食の困難性
；呼吸機能不全；肝臓肥大；顔面筋の弛緩；反射消失；運動不耐性；労作性呼吸困難；起
座呼吸；睡眠時無呼吸；起床時の頭痛；傾眠；脊柱前弯症および／または脊柱側弯症；深
部腱反射の低下；腰痛；および運動発達のマイルストーンの遅延、の内の少なくとも１つ
の存在によって特徴づけられる。
【００４２】
本発明は、デオキシノジリマイシン誘導体の有効量を投与することによって、ポンペ病
の症状を緩和または低下させる方法も提供する。
【００４３】
一実施形態において、該症状はＧａａの骨格組織における活性低下；心筋症；心臓肥大
；進行性筋力低下；筋緊張低下；巨舌症；嚥下、吸引、および／または摂食の困難性；呼
吸機能不全；肝臓肥大；顔面筋の弛緩；反射消失；運動不耐性；労作性呼吸困難；起座呼
吸；睡眠時無呼吸；起床時の頭痛；傾眠；脊柱前弯症および／または脊柱側弯症；深部腱
反射の低下；腰痛；および運動発達のマイルストーンの遅延の少なくとも１つである。
【００４４】
代替の実施形態において、デオキシノジリマイシン誘導体は置換α−グルコシダーゼタ
ンパク質または遺伝子と組み合わせて投与される。
【００４５】
本発明は、更に、ＤＮＪ誘導体、そのようなＤＮＪ誘導体を含む組成物、およびそのよ
うなＤＮＪ誘導体を含む医薬組成物を含む。ＤＮＪ誘導体は上記したような構造式を有す
るが、但し、ＤＮＪ誘導体は１−デオキシノジリマイシンまたはα−ホモノジリマイシン
ではない。
【００４６】
特許または出願ファイルには少なくとも１つのカラーの図面が入っている。カラー図面
とともに特許または特許出願公開の写しは、請求および必要な手数料の支払いに際して当
局によって提供されるであろう。
【００４７】
［詳細な記載］
本発明は、環窒素、または該窒素に隣接する環炭素において置換を特異的な薬理学的シ
ャペロンとして有する小分子イミノ糖ＤＮＪおよびＤＮＪの誘導体を用いる、突然変異体
Ｇａａの救済、およびポンペ病の治療のための方法を記載する。これらの分子は、不安定
であるＧａａ突然変異タンパク質に結合し、それらが安定な分子立体構造にフォールディ
ングされるよう誘発することができる。その結果、Ｇａａはリソソームまで進行し、また
は運ばれ、グリコーゲンに対する加水分解活性を示し、これにより、この病気に関連した
筋肉組織内での病的集積が低下する。
【００４８】
定義
本明細書中で用いる用語は、一般には、本発明の文脈内で、かつ各用語が用いられる特
別な文脈において、当分野におけるそれらの通常の意味を有する。特定の用語を以下に、
または明細書中の他の箇所で議論して、本発明の組成物および方法、およびそれらを製造
しかつ使用する方法を記載するにおいて実行者に対して更なるガイダンスを提供する。
【００４９】
酸性マルターゼ欠損症、グリコーゲン貯蔵病ＩＩ型（ＧＳＤＩＩ）、および糖原病ＩＩ
型ともいわれる「ポンペ病」は、グリコーゲンを代謝するＧａａ遺伝子における突然変異
によって特徴付けられる遺伝的リソソーム貯蔵障害である。本明細書中で用いるようにこ
の用語は該病気の乳児、若年および成人−発症型を含む。
【００５０】
「酸性α−グルコシダーゼ（Ｇａａ）」は、グリコーゲン、マルトース、およびイソマ
ルトーセに存在するα−１，４−およびα−１，６−結合−Ｄ−グルコースポリマーを加
水分解するリソソーム酵素である。代替の名称は以下の通りである：グルコアミラーゼ；
１，４−α−Ｄ−グルカングルコヒドロラーゼ；アミログルコシダーゼ；ガンマ−アミラ
ーゼ；およびエキソ−１，４−α−グルコシダーゼ、およびγ−アミラーゼ。ヒトＧａａ
遺伝子は染色体１７ｑ２５．２−２５．３にマッピングされており、（各々、配列番号：
１および配列番号：２に描かれた）ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｙ００８３９に示されるヌク
レオチドおよびアミノ酸配列を有する。７０を超える突然変異がポンペ病に関連付けられ
ている。Ｇａａ酵素のミスフォールディングまたは誤ったプロセッシングをもたらす突然
変異はＴ１０６４Ｃ（第３５５位におけるＬｅｕをＰｒｏに置換する）、およびＣ２１０
４Ｔ（Ａｒｇ７０２をＣｙｓに置換する）を含む（Ｍｏｎｔａｌｖｏら，Ｍｏｌ  Ｇｅｎ
ｅｔ  Ｍｅｔａｂ．２００４；８１（３）：２０３−８）。加えて、Ｈｅｒｍａｎｓら（
Ｈｕｍａｎ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  ２００４；２３：４７−５６）は、該酵素の成熟および
プロセッシングに影響するＧａａ突然変異のリストを記載する。そのような突然変異はＬ
ｅｕ４０５ＰｒｏおよびＭｅｔ５１９Ｔｈｒを含む。本発明の方法は、ＥＲにおいてα−
グルコシダーゼの不安定なフォールディングを引き起こす突然変異で有用であると予測さ
れる。
【００５１】
本明細書中で用いるように、用語「薬理学的シャペロン」または、時々は「特異的薬理
学的シャペロン」（「ＳＰＣ」）とは、Ｇａａに特異的に結合し、以下の効果のうち１つ
以上を有する分子をいう：（ｉ）タンパク質の安定な分子立体構造の形成の促進；（ｉｉ
）タンパク質のＥＲから細胞内での別の場所へ、好ましくは天然細胞内の場所への適切な
トラフィッキングを増強し、すなわち、ＥＲに関連したタンパク質分解の予防；（ｉｉｉ
）立体構造的に不安定な、すなわち、ミスフォールディングされたタンパク質の凝集の予
防；（ｉｖ）タンパク質の少なくとも部分的に野生型機能、安定性および／または活性の
回復／増強；および／または（ｖ）Ｇａａを有する細胞の表現型または機能の改善。この
ようにして、Ｇａａ対する薬理学的シャペロンは、Ｇａａに結合する分子であり、その結
果、Ｇａａの適切なフォールディング、トラフィッキング、非凝集、および活性をもたら
す。本明細書中で用いるように、この用語はＢｉＰのような内因性シャペロン、あるいは
グリセロール、ＤＭＳＯまたは重水のような、種々のタンパク質に対して非特異的シャペ
ロン活性を示した非特異的な物質、すなわち、化学的シャペロンのことではない（Ｗｅｌ
ｃｈら，Ｃｅｌｌ  Ｓｔｒｅｓｓ  ａｎｄ  Ｃｈａｐｅｒｏｎｅｓ  １９９６；１（２）
：１０９−１１５；Ｗｅｌｓｈら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｅｎｅｒｇｅｔｉｃｓ
ａｎｄ  Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｓ  １９９７；２９（５）：４９１−５０２；米国特
許第５，９００，３６０号；米国特許第６，２７０，９５４号；および米国特許第６，５
４１，１９５号参照）。それには、例えば、該酵素、阻害剤またはアンタゴニストおよび
アゴニストの活性部位に結合する活性部位特異的シャペロン（ＡＳＳＣ）などの特異的な
結合分子が含まれる。
【００５２】
本明細書中で用いるように、用語「特異的に結合する」とは、薬理学的シャペロンとＧ
ａａとの相互作用、特に、薬理学的シャペロンとの接触に直接的に参画するＧａａのアミ
ノ酸残基との相互作用をいう。薬理学的シャペロンは例えばＧａａなどの標的タンパク質
に特異的に結合して、Ｇａａに対してシャペロン効果を発揮するが、関連するまたは関連
しないタンパク質の属性群に対しては発揮しない。ある薬理学的シャペロンと相互作用す
るＧａａのアミノ酸残基はタンパク質の「活性部位」内にあってもなくてもよい。以下に
記載するように、アミノ酸残基５１２−５２０における保存されたヘキサペプチドＷｉＤ
ＭＮＥは、Ｇａａタンパク質の活性に必要である（参照配列として配列番号：２を用いる
）。加えて、Ｔｒｐ５１６およびＡｓｐ５１８はＧａａの触媒活性に必要である（Ｈｅｒ
ｍａｎｓら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９１．２６６：１３５０７−１２）。特異的
結合は、所定の結合アッセイ、または構造研究、例えば、共結晶化、ＮＭＲ等を通じて評
価することができる。
【００５３】
非限定的な一実施形態において、薬理学的シャペロンはＧａａの阻害剤またはアンタゴ
ニストである。別の非限定的な実施形態において、薬理学的シャペロンはＧａａのアゴニ
ストである。なお別の実施形態において、薬理学的シャペロンは混合アゴニスト／アンタ
ゴニストである。本明細書中で用いるように用語「アンタゴニスト」とは、タンパク質に
結合し、Ｇａａの活性を部分的にまたは完全にブロックし、阻害し、低下させ、または中
和する任意の分子のことをいう。用語「アゴニスト」とは、タンパク質に結合し、Ｇａａ
の活性を少なくとも部分的に増加させ、増強し、回復し、または模倣するいずれの分子も
いう。以下に議論するように、そのような分子がＧａａについて知られている。
【００５４】
本明細書中で用いるように、用語「Ｇａａ立体構造安定性を増強する」または「Ｇａａ
立体構造安定性を増加させる」とは、Ｇａａに特異的な薬理学的シャペロンに接触してい
ない細胞（好ましくは、例えば、それ以前における同一の細胞型、または同一の細胞）に
おけるＧａａに対する、Ｇａａに特異的な薬理学的シャペロンと接触している細胞におい
て機能的立体構造を採用するＧａａの量または割合を増加させることをいう。一実施形態
において、細胞は立体構造突然変異体Ｇａａを発現しない。別の実施形態において、例え
ば、立体構造突然変異体Ｇａａなどの、ポリペプチドをコードする突然変異体Ｇａａポリ
ヌクレオチドを発現しない。
【００５５】
本明細書中で用いるように、用語「Ｇａａトラフィッキングを増強する」または「Ｇａ
ａトラフィッキングを増加させる」とは、Ｇａａに特異的な薬理学的シャペロンに接触し
ていない細胞（好ましくは、例えば、初期における同一の細胞型または同一細胞）におけ
るＧａａの輸送の効率に対する、Ｇａａに特異的な薬理学的シャペロンに接触している細
胞中おけるＧａａのリソソームへの輸送の効率の増加をいう。
【００５６】
本明細書中で用いるように、用語「Ｇａａ活性を増強させる」または「Ｇａａ活性を増
加させる」とは、Ｇａａに特異的な薬理学的シャペロンに接触していない細胞（好ましく
は、例えば、初期における同一の細胞型または同一細胞）におけるＧａａの活性に対する
、Ｇａａに特異的な薬理学的シャペロンに接触している細胞における、本明細書中に記載
したようなＧａａの活性の増加をいう。
【００５７】
本明細書中で用いるように、用語「Ｇａａレベルを増強させる」または「Ｇａａレベル
を増加させる」とは、Ｇａａに特異的な薬理学的シャペロンに接触していない細胞（好ま
しくは、例えば、初期における同一の細胞型または同一細胞）におけるＧａａのレベルに
対する、Ｇａａに特異的な薬理学的シャペロンに接触している細胞におけるＧａａのレベ
ルの増加をいう。
【００５８】
用語「適切な立体構造を安定化する」とは、野生型Ｇａａタンパク質の立体構造と機能
的に同一である突然変異したＧａａタンパク質の立体構造を誘発または安定化させるＧａ
ａ薬理学的シャペロンの能力をいう。用語「機能的に同一」とは、立体構造における些細
な変動があり得るが（ほとんど全てのタンパク質はそれらの生理学的状態においていく分
かの立体構造柔軟性を呈する）、立体構造柔軟性の結果（１）タンパク質の凝集、（２）
小胞体−関連分解経路を通じての排除、（３）例えば、Ｇａａ活性などのタンパク質の機
能的障害、および／または（４）例えば、リソソームへの局所化などの、野生型タンパク
質に比べて、大なり小なりの細胞内での不適切な輸送を引き起こさないことを意味する。
【００５９】
用語「安定な分子立体構造」とは、細胞において少なくとも部分的な野生型機能を提供
する、薬理学的シャペロンによって誘発された、タンパク質、すなわち、Ｇａａの立体構
造をいう。例えば、突然変異体Ｇａａの安定な分子立体構造は、ＧａａがＥＲから逃れ、
ミスフォールディングされ、分解される代わりに、野生型Ｇａａと同様にリソソームにト
ラフィッキングされるものであろう。加えて、突然変異したＧａａの安定な分子立体構造
は、全または部分的Ｇａａ活性、例えば、グリコーゲン、マルトースおよびイソマルトー
スにおけるα−１，４−およびα−１，６結合の加水分解なども有していることがある。
しかしながら、安定な分子立体構造は野生型タンパク質の機能的属性の全てを有している
とは限らない。
【００６０】
用語「野生型活性」とは、細胞におけるＧａａの正常な生理学的機能をいう。例えば、
Ｇａａ活性は、グリコーゲン、マルトース、およびイソマルトースに存在するα−１，４
−およびα−１，６−結合−Ｄ−グルコースポリマーを加水分解する同時能力と共に、フ
ォールディングし、およびＥＲからリソソームへのトラフィッキングを含む。
【００６１】
用語「野生型Ｇａａ」とはＧａａをコードするヌクレオチド（配列番号１）配列、およ
び上記したヌクレオチド配列（ヒトＧａａ  ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｙ００８３９）によ
ってコードされるポリペプチド（配列番号：２）配列、およびＥＲにおいて機能的立体構
造を達成し、細胞内で適切な局所化を達成し、かつ野生型の活性（例えば、グリコーゲン
の加水分解）を呈する能力を有する、正常な個体における対立遺伝子変種のような、（上
記したポリペプチド配列と同一の機能的特性および結合親和性を有する）Ｇａａポリペプ
チドをコードするいずれかの他のヌクレオチド配列をいう。
【００６２】
本明細書中で用いるように、用語「突然変異体α−グルコシダーゼ」または「突然変異
体Ｇａａ」とは、変異α−グルコシダーゼアミノ酸配列をもたらす遺伝的突然変異を含有
する遺伝子から翻訳されたα−グルコシダーゼポリペプチドをいう。一実施形態において
、突然変異によって、野生型α−グルコシダーゼと比較した場合に、ＥＲに通常は存在す
る条件下で天然立体構造を達成しない、または野生型α−グルコシダーゼと比較して低い
安定性または活性を呈するα−グルコシダーゼタンパク質がもたらされる。このタイプの
突然変異は、本明細書中においては、「立体構造突然変異」といい、そのような突然変異
を担うタンパク質は「立体構造突然変異体」という。この立体構造を達成できないと、タ
ンパク質輸送系における正常な経路を通じて細胞中のその天然の位置まで輸送されるか、
または細胞外環境へ輸送されるよりはむしろ分解されるかまたは凝集されるα−グルコシ
ダーゼタンパク質がもたらされる。いくつかの実施形態において、突然変異（例えば、転
写効率、スプライシング効率、ｍＲＮＡ安定性等に影響する突然変異）は、タンパク質の
効率がより低い発現をもたらすα−グルコシダーゼをコードする遺伝子の非コーディング
部分で起こり得る。野生型ならびにα−グルコシダーゼの立体構造突然変異体変種の発現
のレベルを増強させることによって、α−グルコシダーゼ薬理学的シャペロンの投与は、
そのような効率的でないタンパク質発現に由来する欠陥を緩和することができる。代替と
して、ＥＲに蓄積できる突然変異体またはナンセンス突然変異体をスプライシングするた
めには、リソソームヒドロラーゼ活性を回復することなく、ＥＲに存在する突然変異体に
結合し、それを援助するシャペロンの能力は、ポンペ患者においていくらか細胞の病理を
緩和し、それにより、症状を改善するのに十分であろう。
【００６３】
Ｇａａの例示的な立体構造突然変異は以下の：Ｄ６４５Ｅ（Ｌｉｎら，Ｚｈｏｎｇｈｕ
ａ  Ｍｉｎ  Ｇｕｏ  Ｘｉａｏ  Ｅｒ  Ｋｅ  Ｙｉ  Ｘｕｅ  Ｈｕｉ  Ｚａ  Ｚｈｉ．１
９９６；３７（２）：１１５−２１）；Ｄ６４５Ｈ（Ｌｉｎら，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏ
ｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．１９９５  １７；２０８（２）：８８６−９３）；Ｒ
２２４Ｗ，Ｓ６１９Ｒ，およびＲ６６０Ｈ（Ｎｅｗら，Ｐｅｄｉａｔｒ  Ｎｅｕｒｏｌ．
２００３；２９（４）：２８４−７）；Ｔ１０６４ＣおよびＣ２１０４Ｔ（Ｍｏｎｔａｌ
ｖｏら，Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  Ｍｅｔａｂ．２００４；８１（３）：２０３−８）；Ｄ６
４５ＮおよびＬ９０１Ｑ（Ｋｒｏｏｓら，Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌ  Ｄｉｓｏｒｄ．２０
０４；１４（６）：３７１−４）；Ｇ２１９Ｒ，Ｅ２６２Ｋ，Ｍ４０８Ｖ（Ｆｅｒｎａｎ
ｄｅｚ−Ｈｏｊａｓら，Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌ  Ｄｉｓｏｒｄ．２００２；１２（２）
：１５９−６６）；Ｇ３０９Ｒ（Ｋｒｏｏｓら，Ｃｌｉｎ  Ｇｅｎｅｔ．１９９８；５３
（５）：３７９−８２）；Ｄ６４５Ｎ，Ｇ４４８Ｓ，Ｒ６７２Ｗ，およびＲ６７２Ｑ（Ｈ
ｕｉｅら，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．１９９８；２７；
２４４（３）：９２１−７）；Ｐ５４５Ｌ（Ｈｅｒｍａｎｓら，Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎ
ｅｔ．１９９４；３（１２）：２２１３−８）；Ｃ６４７Ｗ（Ｈｕｉｅら，Ｈｕｉｅら，
Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ．１９９４；３（７）：１０８１−７）；Ｇ６４３Ｒ（Ｈｅ
ｒｍａｎｓら，Ｈｕｍ  Ｍｕｔａｔ．１９９３；２（４）：２６８−７３）；Ｍ３１８Ｔ
（Ｚｈｏｎｇら，Ａｍ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ．１９９１；４９（３）：６３５−４５
）；Ｅ５２１Ｋ（Ｈｅｍａｎｓら，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍ
ｕｎ．１９９１；１７９（２）：９１９−２６）；Ｗ４８１Ｒ（Ｒａｂｅｎら，Ｈｕｍ  
Ｍｕｔａｔ．１９９９；１３（１）：８３−４）；およびＬ５５２ＰおよびＧ５４９Ｒ（
未公表データ）を含む。
【００６４】
スプライシング突然変異体はＩＶＳ１ＡＳ、Ｔ＞Ｇ、−１３およびＩＶＳ８＋１Ｇ＞Ａ
を含む。
【００６５】
更なるＧａａ突然変異体は同定されており、当分野で既知である。立体構造突然変異体
は当業者によって容易に同定可能である。
【００６６】
Ｇａａのフォールディング、よって、トラフィッキングを損なう突然変異は、タンパク
質が細胞内のＧａａ局所化のためにゴルジ装置または蛍光免疫染色に入るか否かを決定す
るためのグルコシダーゼ処理の有りおよび無しにて、パルス−チェイス代謝標識のような
、当分野で周知のルーチンアッセイによって決定することができる。野生型Ｇａａは、１
１０ｋＤ前駆物質として分泌され、次いで、これは９５ｋＤの中間体を介して７６ｋＤの
成熟Ｇａａに変換される。
【００６７】
そのような機能性は、そのようなタンパク質の機能性を確立することが知られているい
ずれかの手段によってテストすることができる。例えば、４−αメチルウンベリフェリル
−Ｄ−グルコピラノシドのような蛍光基質を用いるアッセイを用いて、Ｇａａの活性を測
定するために使用することができる。そのようなアッセイは当分野で周知である（例えば
、Ｈｅｒｍａｎｓら，上記参照）。
【００６８】
ある種のテストは、その現実のインビボ活性に対応しても対応しなくてもよいが、それ
にもかかわらず、タンパク質機能性の適切な代わりのものであるタンパク質の属性を評価
することができ、そのようなテストにおける野生型の挙動は、本発明のタンパク質フォー
ルディング救済または増強技術を裏付ける証拠を示す。本発明による１つのそのような活
性は、小胞体からリソソームへの機能的Ｇａａの適切な輸送である。
【００６９】
インビトロにて、例えば、ある処方において、シャペロン化合物は、野生型または突然
変異したタンパク質をその天然または適切な形態で維持することも補助することができる
。この効果は、（ｉ）（すなわち、ＥＲＴについての）タンパク質の増大したシェルライ
フ；（ｉｉ）タンパク質の単位／量当たりのより高い活性；または（ｉｉｉ）より高いイ
ンビボ効率の１つ以上を介してそれを現実的に発現させることができる。それは、発現の
間のＥＲからの増大した収率；温度上昇、またはカオトロピック剤の存在による、および
同様な手段によるフォールディング解除に対するより大きな抵抗性を通じて実験的に観察
することができる。
【００７０】
用語「内因性発現」および「内因的に発現された」とは、その発現、活性または安定性
を阻害するＧａａ核酸またはポリペプチド配列における突然変異のような、Ｇａａの欠乏
、過剰発現、または他の欠陥に関連する病気または障害、例えば、ポンペ病を有しない、
または有することが疑われない個体における細胞でのＧａａの正常な生理学的発現をいう
。この用語は、Ｇａａが発現されるのが正常である細胞型におけるＧａａの発現もいい、
細胞または細胞型における発現、例えば、Ｇａａが健康な個体で発現されない腫瘍を含ま
ない。
【００７１】
本明細書中で用いるように、用語「輸送の効率」とは、小胞体から細胞内のその天然の
位置、細胞膜へ、または細胞外環境へ輸送される突然変異体タンパク質の能力をいう。
【００７２】
酵素の「競合的阻害剤」とは、酵素基質に化学的構造および分子的幾何学と構造的に類
似して、基質とほぼ同一の位置における酵素に結合する化合物をいうことができる。この
ようにして、阻害剤は基質分子と同一の活性部位について競合し、このようにして、Ｋｍ
を増大させる。もし十分な基質分子が阻害剤を置き換えるのに利用できるならば、すなわ
ち、競合阻害剤が可逆的に結合できるならば、競合阻害は通常は可逆的である。従って、
酵素阻害の量は阻害剤の濃度、基質濃度、および活性部位に対する阻害剤および基質の相
対的親和性に依存する。
【００７３】
非古典的競合阻害は、阻害剤は活性部位に遠隔的に結合し、基質がもはやそれに結合で
きないように、酵素において立体構造の変化を作り出す場合に起こる。非古典的競合阻害
において、活性部位における基質の結合は別々の部位における阻害剤の結合を阻害し、逆
も成立する。これはアロステリック阻害を含む。
【００７４】
酵素の「線状混合−タイプの阻害剤」は、基剤を結合させるが、その親和性を低下させ
る競合阻害剤のタイプであり、従って、Ｋｍは増大し、Ｖｍａｘは減少する。
【００７５】
「非競合阻害剤」とは、酵素とで強い結合を形成し、過剰な基質の添加によって置き換
えることができない化合物をいい、すなわち、非競合阻害剤は不可逆的であり得る。非競
合阻害剤は酵素またはタンパク質の活性部位において、その近くに、またはそれから離れ
て結合することができ、酵素との関連では、Ｋｍに対して効果を有しないが、Ｖｍａｘを
減少させる。非競合阻害とは、阻害剤が酵素−基質（ＥＳ）複合体のみに結合する状況を
いう。阻害剤が結合する場合、酵素は不活性となる。これは、基質の不存在下において酵
素に結合することができる非古典的競合阻害剤とは異なる。
【００７６】
用語「Ｖｍａｘ」とは、すなわち、基質レベルを飽和させるにおいて酵素触媒反応の最
大初期速度をいう。用語「Ｋｍ」は、１／２Ｖｍａｘを達成するのに必要な基質濃度であ
る。
【００７７】
酵素「増強剤」は、Ｇａａに結合し、酵素反応速度を増大させる化合物である。
【００７８】
用語「治療上有効な用量」および「有効量」とは、（アンタゴニストの場合には）適当
な細胞位置において既に発現されたタンパク質を阻害することなく、または（アゴニスト
の場合には）適当な細胞位置からのタンパク質のリガンド−媒介受容体内部化を誘発する
ことなく、（機能的立体構造を可能とする）ＥＲにおけるタンパク質プロセッシングを増
強させ、かつ標的タンパク質の活性を増強させ、このようにして、対象において治療的応
答をもたらすのに十分な量をいう。治療応答は、本明細書中に記載され、かつ当分野で既
知の症状、およびいずれかの代替臨床マーカーを含めた療法に対する効果的な応答として
ユーザー（例えば、臨床化）が認識するいずれの応答でもあり得る。このようにして、治
療的応答は、一般には、病気または障害について当分野で既知のもののような、病気また
は障害、例えば、ポンペ病の１つ以上の症状、例えば、減少したＧａａ活性および進行し
た筋肉虚弱の軽減または阻害であろう。
【００７９】
精製された治療タンパク質のインビトロ生産、輸送または貯蔵の間に阻害的であるシャ
ペロン化合物の濃度は、インビボでの投与に際してシャペロンの希釈（および平衡の変化
による結合の結果としてのシフト）、生物学的利用性および代謝のため、本発明の目的で
は依然として「有効量」を構成することができることに留意されたい。
【００８０】
「リスポンダー」とは、１つ以上の臨床的症状の改善、緩和または予防、あるいは病気
の病理学のインジケーターである１つ以上の代替臨床マーカーの改良または逆行を呈する
、ポンペ病と診断された、および現在特許請求する方法に従って治療された個体である。
ポンペ病の症状またはマーカーは、限定されるものではないが、減少したＧａａ組織活性
；心筋症；心臓肥大；特に、体幹または下部四肢における進行性筋肉虚弱；ひどい緊張低
下；巨舌症（およびある場合には、舌の突き出し）；嚥下、吸引、および／または摂食の
困難性；呼吸機能不全；肝臓肥大（中程度）；顔面筋の弛緩；反射消失；運動不耐性；労
作性呼吸困難；起座呼吸；睡眠時無呼吸；起床時の頭痛；傾眠；脊柱前弯症および／また
は脊柱側弯症；減少した深部腱反射；腰痛；および運動発達のマイルストーンの遅延を含
む。
【００８１】
用語「酵素置換療法」または「ＥＲＴ」とは、非天然の精製された酵素の、そのような
酵素の欠乏を有する個体への導入をいう。投与されたタンパク質は天然源から、あるいは
（以下にかなり詳細に記載する）組換え発現によって得ることができる。該用語は、そう
でなければ精製された酵素の投与を必要とし、またはそれから利益を受ける、例えば、酵
素不全に罹った個体への精製された酵素の導入もいう。導入された酵素はインビトロにて
生産された精製で組換え酵素、または例えば胎盤または動物乳のような摘出された組織ま
たは流体から、または植物から精製されたタンパク質であり得る。
【００８２】
フレーズ「医薬上許容される」とは、生理学的に許容でき、かつヒトに投与された場合
に典型的には望まない反応を生じない分子体および組成物をいう。好ましくは、本明細書
中で用いるように、用語「医薬上許容される」は、連邦または州政府の規制当局によって
承認された、または合衆国薬局方、または動物、より特別にはヒトで用いるための他の一
般的に認められた薬局方でリストされたことを意味する。用語「担体」とは、それと共に
化合物が投与される希釈剤、補助剤、賦形剤、またはビークルをいう。そのような医薬担
体は水および油のような滅菌液体であり得る。水または水性溶液、生理食塩水溶液および
水性デキストロースおよびグリセロール溶液は、特に、注射溶液のための担体として好ま
しくは使用される。適当な医薬担体はＥ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ
’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、第１８版、または他の版に
記載されている。
【００８３】
本明細書中で用いるように、用語「精製された」とは、無関係な物質、すなわち、汚染
物を低下させ、または排除する条件下で隔離されているＧａａ核酸またはポリペプチドの
ような物質をいう。例えば、精製されたタンパク質は、それが細胞中で会合する他のタン
パク質または核酸を好ましくは実質的に含まない。本明細書中で用いるように、用語「実
質的に含まない」は物質の分析テストの関係で使用可能に用いられ、好ましくは、汚染物
を実質的に含まない精製された物質は少なくとも５０％純粋；より好ましくは少なくとも
９０％純粋、尚より好ましくは少なくとも９９％純粋である。純度は従来の手段、例えば
、クロマトグラフィー、ゲル電気詠動、イムノアッセイ、組成分析、生物学的アッセイ、
および当分野で既知の他の方法によって評価することができる。
【００８４】
用語「約」および「ほぼ」は、一般には、測定の性質または精度を仮定して測定された
量についての誤差の許容される程度を意味する。誤差の典型的な例示的程度は、与えられ
た値または値の範囲の２０パーセント（％）内、好ましくは１０％内、より好ましくは５
％内である。代替として、特に生物学的系においては、用語「約」および「ほぼ」は、大
きさのオーダー内、好ましくは与えられた値の５倍内、より好ましくは２倍内である値を
意味することができる。本明細書中で与えられる数的量は特に断りのない限り近似であり
、用語「約」または「ほぼ」は明示的に述べられていない場合に推定できることを意味す
る。
【００８５】
化学的定義
用語「アルキル」とは、不飽和を含有せず、単一の結合によって分子の残りに結合した
炭素および水素原子のみからなる直鎖または分岐鎖のＣ１−Ｃ２０炭化水素基をいい、例
えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、１−メチルエチル（イソプロピル）、ｎ−ブチル
、ｎ−ペンチル、１，１−ジメチルエチル（ｔ−ブチル）をいう。本明細書中で用いられ
るアルキルは、好ましくは、Ｃ１−Ｃ８アルキルである。
【００８６】
用語「アルケニル」とは、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を含有し、直鎖または
分岐鎖であってもよいＣ２−Ｃ２０脂肪族炭化水素基、例えば、エテニル、１−プロペニ
ル、２−プロペニル（アリル）、イソ−プロペニル、２−メチル−１−プロペニル、１−
ブテニル、２−ブテニルをいう。
【００８７】
用語「シクロアルキル」とは、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シク
ロヘキシルのような不飽和の非芳香族単環または多環炭化水素環系を示す。多環シクロア
ルキル基の例はペルヒドロナフチル、アダマンチルおよびノルボルニル基架橋環状基また
はスピロ二環基、例えば、スピロ（４，４）ノナ−２−イルを含む。
【００８８】
用語「シクロアルカルキル」とは、シクロプロピルメチル、シクロブチルエチル、シク
ロペンチルエチルのような安定な構造の形成をもたらす、上記定義のアルキル基に直接結
合した上記定義のシクロアルキルをいう。
【００８９】
用語「アルキルエーテル」とは、アルキル鎖に取り込まれた少なくとも１つの酸素を有
する上記定義のアルキル基またはシクロアルキル基、例えば、メチルエチルエーテル、ジ
エチルエーテル、テトラヒドロフランをいう。
【００９０】
用語「アルキルアミン」とは、少なくとも１つの窒素原子を有する上記定義のアルキル
基またはシクロアルキル基、例えば、ｎ−ブチルアミンおよびテトラヒドロオキサジンを
いう。
【００９１】
用語「アリール」とは、フェニル、ナフチル、テトラヒドロナフチル、インダニル、ビ
フェニルのような約６〜約１４の炭素原子の範囲を有する芳香族基をいう。
【００９２】
用語「アリールアルキル」とは、上記定義のアルキル基に直接結合した上記定義のアリ
ール基、例えば、−ＣＨ２Ｃ６Ｈ５、および−Ｃ２Ｈ４Ｃ６Ｈ５をいう。
【００９３】
用語「複素環」とは、炭素原子、および窒素、リン、酸素および硫黄からなる群より選
択される１〜５のヘテロ原子からなる安定な３〜１５員環基をいう。本発明の目的では、
複素環基は単環、二環または三環の環系であってもよく、これは融合した、架橋またはス
ピロ環系を含むことができ、複素環基中の窒素、リン、炭素、酸素または硫黄原子は場合
によって種々の酸化状態まで酸化されていてもよい。加えて、窒素原子は場合によって第
四級化されていてもよく；および環基は部分的にまたは十分に飽和されていてもよい（す
なわちヘテロ芳香族またはヘテロアリール芳香族）。そのような複素環基の例は、限定さ
れるものではないが、アゼチジニル、アクリジニル、ベンゾジオキソリル、ベンゾジオキ
サニル、ベンゾフルニル（ｂｅｎｚｏｆｕｒｎｙｌ）、カルバゾリル、シンノリニル、ジ
オキソラニル、インドリジニル、ナフチリジニル、ペルヒドロアゼピニル、フェナジニル
、フェノチアジニル、フェノキサジニル、フタラジニル、ピリジル、プテリジニル、プリ
ニル、キナゾリニル、キノキサリニル、キノリニル、イソキノリニル、テトラゾイル、イ
ミダゾリル、テトラヒドロイソウイノリル（ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｉｓｏｕｉｎｏｌｙｌ
）、ピペリジニル、ピペラジニル、２−オキソピペラジニル、２−オキソピペリジニル、
２−オキソピロリジニル、２−オキソアゼピニル、アゼピニル、ピロリル、４−ピペリド
ニル、ピロリジニル、ピラジニル、ピリミジニル、ピリダジニル、オキサゾリル、オキサ
ゾリニル、オキサゾリジニル、トリアゾリル、インダニル、イソキサゾリル、イソキサゾ
リジニル、モルホリニル、チアゾリル、チアゾリニル、チアゾリジニル、イソチアゾリル
、キヌクリジニル、イソチアゾリジニル、インドリル、イソインドリル、インドリニル、
イソインドリニル、オクタヒドロインドリル、オクタヒドロイソインドリル、キノリル、
イソキノリル、デカヒドロイソキノリル、ベンズイミダゾリル、チアジアゾリル、ベンゾ
ピラニル、ベンゾチアゾリル、ベンゾオキサゾリル、フリル、テトラヒドロフルチル（ｔ
ｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｕｒｔｙｌ）、テトラヒドロピラニル、チエニル、ベンゾチエニル
、チアモルホリニル、チアモルホリニルスルホキシド、チアモルホリニルスルホン、ジオ
キサホスホラニル、オキサジアゾリル、クロマニル、イソクロマニルを含む。
【００９４】
複素環基は、安定な構造の形成をもたらすいずれかのヘテロ原子または炭素原子におけ
る主要構造に結合することができる。
【００９５】
用語「ヘテロアリール」とは複素環をいい、ここで該環は芳香族である。
【００９６】
用語「ヘテロアリールアルキル」とは、アルキル基に直接結合した上記定義のヘテロア
リール環基をいう。ヘテロアリールアルキル基は、安定な構造の形成をもたらすアルキル
基からのいずれかの炭素原子における主要構造に結合することができる。
【００９７】
用語「ヘテロシクリル」とは上記定義の複素環基をいう。ヘテロシクリル環基は、安定
な構造の形成をもたらすいずれかのヘテロ原子または炭素原子における主要構造に結合す
ることができる。
【００９８】
用語「ヘテロシクリルアルキル」とは、アルキル基に直接結合した上記定義の複素環基
をいう。ヘテロシクリルアルキル基は、安定な構造の形成をもたらすアルキル基中の炭素
原子における主要構造に結合することができる。
【００９９】
「置換されたアルキル」、「置換されたアルケニル」、「置換されたアルキニル」、「
置換されたシクロアルキル」、「置換されたシクロアルカルキル」、「置換されたシクロ
アルケニル」、「置換されたアリールアルキル」、「置換されたアリール」、「置換され
た複素環」、「置換されたヘテロアリール環」、「置換されたヘテロアリールアルキル」
、または「置換されたヘテロシクリルアルキル環」における置換基は、水素、ヒドロキシ
、ハロゲン、カルボキシル、シアノ、アミノ、ニトロ、オキソ（＝Ｏ）、チオ（＝Ｓ）か
らなる群より選択される１つ以上、あるいはアルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキ
ニル、アリール、アリールアルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテ
ロアリールアルキル、複素環、−ＣＯＯＲｘ、−Ｃ（Ｏ）Ｒｘ、−Ｃ（Ｓ）Ｒｘ、−Ｃ（
Ｏ）ＮＲｘＲｙ、−Ｃ（Ｏ）ＯＮＲｘＲｙ、−ＮＲｘＣＯＮＲｙＲｚ、−Ｎ（Ｒｘ）ＳＯ
Ｒｙ、−Ｎ（Ｒｘ）ＳＯ２Ｒｙ、−（＝Ｎ−Ｎ（Ｒｘ）Ｒｙ）、−ＮＲｘＣ（Ｏ）ＯＲｙ
、−ＮＲｘＲｙ、−ＮＲｘＣ（Ｏ）Ｒｙ−、−ＮＲｘＣ（Ｓ）Ｒｙ−ＮＲｘＣ（Ｓ）ＮＲ
ｙＲｚ、−ＳＯＮＲｘＲｙ−、−ＳＯ２ＮＲｘＲｙ−、−ＯＲｘ、−ＯＲｘＣ（Ｏ）ＮＲ
ｙＲｚ、−ＯＲｘＣ（Ｏ）ＯＲｙ−、−ＯＣ（Ｏ）Ｒｘ、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲｘＲｙ、−Ｒ
ｘＮＲｙＲｚ、−ＲｘＲｙＲｚ、−ＲｘＣＦ３、−ＲｘＮＲｙＣ（Ｏ）Ｒｚ、−ＲｘＯＲ
ｙ、−ＲｘＣ（Ｏ）ＯＲｙ、−ＲｘＣ（Ｏ）ＮＲｙＲｚ、−ＲｘＣ（Ｏ）Ｒｘ、−ＲｘＯ
Ｃ（Ｏ）Ｒｙ、−ＳＲｘ、−ＳＯＲｘ、−ＳＯ２Ｒｘ、−ＯＮＯ２から選択される場合に
よって置換される群と同一または異なってもよく、ここで、上記群の各々におけるＲｘ、
ＲｙおよびＲｚは水素原子、置換されたまたは置換されていないアルキル、ハロアルキル
、置換されたまたは置換されていないアリールアルキル、置換されたまたは置換されてい
ないアリール、置換されたまたは置換されていないシクロアルキル置換されたまたは置換
されていないシクロアルカルキル、置換されたまたは置換されていない複素環、置換され
たまたは置換されていないヘテロシクリルアルキル、置換されたまたは置換されていない
ヘテロアリール、または置換されたまたは置換されていないヘテロアリールアルキルであ
り得る。
【０１００】
用語「ハロゲン」とは、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素の基をいう。
【０１０１】
ＤＮＪおよびＤＮＪ誘導体
１−デオキシノリジマイシン（化合物１、ＤＮＪ；１，５−イミノ−１，５−ジデオキ
シ−Ｄ−グルシトール−ＣＡＳ番号１９１３０−９６−２）の誘導体はポンペ病を治療す
るのに有用であることが判明した。ＤＮＪは分子式Ｃ６Ｈ１３ＮＯ４および１６３．２の
分子量を有する。ＤＮＪはＳｃｈｒｏｄｅｒらに対する米国特許第４，８０６，６５０号
に記載されており、以下の構造式：
【化７】
2014221759.tif 000009
を有する。
【０１０２】
本発明で有用なＤＮＪの誘導体は式：
【化８】
2014221759.tif 000010
［式中、Ｒ１はＨ、または１〜１２の炭素原子を含有する直鎖または分岐鎖のアルキル、
アルケニル、アルキルエーテルもしくはアルキルアミン、５〜１２の環原子を含有するア
ルキルアリール、ヘテロアリールもしくはヘテロアリールアルキルであり、ここで、Ｒ１
は場合によって１つ以上の−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、−Ｃｌ、−Ｆ、−ＣＦ３、−ＯＣＦ３、
−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ−（アルキル）２（すなわち、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ−（Ｍｅ）２）で置換
され、Ｒ２はＨ、１〜９の炭素原子を含有する直鎖または分岐鎖のアルキル、シクロアル
キル、アルケニルもしくはアルキルエーテル、または５〜１２の炭素原子を含有するアリ
ールであり、ここで、Ｒ２は場合によって−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、−ＣＦ３、−ＯＣＦ３ま
たは複素環で置換される］
によって記載することができる。
【０１０３】
Ｒ１およびＲ２の少なくとも１つはＨではない。
【０１０４】
好ましいＤＮＪ誘導体は１〜１２の炭素原子を有するＮ−アルキル誘導体を含む。より
好ましくは、これらの誘導体が１〜９の炭素原子を有する直鎖、分岐鎖または環状化合物
である。例示的な化合物は、限定されるものではないが、Ｎ−メチル−ＤＮＪ（２）、Ｎ
−エチル−ＤＮＪ（３）、Ｎ−プロピル−ＤＮＪ（４）、Ｎ−ブチル−ＤＮＪ（５）、Ｎ
−ペンチル−ＤＮＪ（６）、Ｎ−ヘキシル−ＤＮＪ（７）、Ｎ−ヘプチル−ＤＮＪ（８）
、Ｎ−オクチル−ＤＮＪ（９）、Ｎ−ノニル−ＤＮＪ（１０）、Ｎ−メチルシクロプロピ
ル−ＤＮＪ（１１）およびＮ−メチルシクロペンチル−ＤＮＪ（１２）を含む。
【化９】
2014221759.tif 000011
【０１０５】
１つの好ましいアルキルＤＮＪ誘導体はＮ−メチル−１−デオキシノリジマイシン（化
合物２、Ｎ−メチルＤＮＪ；Ｎ−メチルモラノリン、１，５−（メチルイミノ）−１，５
−ジデオキシ−Ｄ−グルシトール）であり、Ｔｏｒｏｎｔｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅ
ｍｉｃａｌｓ，Ｃａｔ．Ｎｕｍｂｅｒ  Ｍ２９７０００，ＣＡＳ  ６９５６７−１−０８
から市販の合成グルコースアナログである。Ｎ−メチルＤＮＪは肝臓においてグリコーゲ
ン−脱分岐酵素のα−１、６−グルコシダーゼを阻害することによってグリコーゲン分解
速度を低下させ、α−１，４−グルコシダーゼをブロックすることによって抗高脂血症作
用を有する（Ａｒａｉ  Ｍら，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．１９９８  Ａｐｒ  ７；９７（
１３）：１２９０−７）。
【０１０６】
別の好ましいアルキルＤＮＪ誘導体はＮ−ノニル−デオキシノジリマイシン（化合物１
０、Ｎ−ノニルＤＮＪ；１，５−（ノニルイミノ）−１，５−ジデオキシ−Ｄ−グルシト
ール）、ゴーシェ病（糖脂質蓄積によって特徴付けられるリソソーム貯蔵病）の治療で有
用な合成グルコースアナログである（Ｓａｗｋａｒ  ＡＲ，ら．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  
Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２００２；２６；９９（２４）：１５４２８−３３）。
【０１０７】
−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、またはＯＣＦ３のような置換基を有するアルキルＤＮＪ誘導体は
好ましい化合物でもある。例示的な置換されたアルキルＤＮＪ誘導体は、限定されるもの
ではないが；
【化１０】
2014221759.tif 000012
を含む。
【０１０８】
好ましいＤＮＪ誘導体はＮ−２−ヒドロキシエチル−デオキシノジリマイシン（化合物
１３、Ｎ−エトキシＤＮＪ；１．５−（２−ヒドロキシエチルイミノ）−１，５−ジデオ
キシ−Ｄ−グルシトール；ミグリトール）、すなわち、２型真性糖尿病を治療するのに用
いられる合成グルコースアナログである。Ｄｒｅｎｔら，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｎｕｔｒ  
Ｍｅｔａｂ．２００２；１５（３）：１５２−９；  ｄｅ  Ｌｕｉｓ  Ｒｏｍａｎ  Ｄａ
，Ｒｅｖ  Ｃｌｉｎ  Ｅｓｐ．２００４  Ｊａｎ；２０４（１）：３２−４。
【０１０９】
別の好ましいＤＮＪ誘導体は５−Ｎ−カルボキシペンチルデオキシノジリマイシン（化
合物１４、５−Ｎ−カルボキシペンチルＤＮＪ；１，５−（５−Ｎ−カルボキシペンチル
イミノ）−１，５−ジデオキシ−Ｄ−グルシトール）である。この合成グルコースアナロ
グは、Ｂｅｒｎｏｔａｓ  ＲＣ，ら，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．１９９０  Ｓｅｐ  １；２７
０（２）：５３９−４０によって記載された経路によって合成することができる。
【０１１０】
更なるＤＮＪ誘導体は化合物：
【化１１】
2014221759.tif 000013
のようなアルキルエーテル誘導体である。
【０１１１】
他の好ましい化合物は式：
【化１２】
2014221759.tif 000014
によって表されるＮ−ベンジル置換ＤＮＪ誘導体のような誘導体を含む。
【０１１２】
他の好ましい化合物は式：
【化１３】
2014221759.tif 000015
［式中、Ａｒは芳香族複素環である。］
によって表されるＮ−ＣＨ２−Ａｒ置換ＤＮＪ誘導体のような誘導体を含む。
【０１１３】
窒素−置換ＤＮＪ誘導体に加えて、環窒素に隣接するＣ−１炭素に結合した置換基を有
するＤＮＪ誘導体もまた本発明の好ましい化合物である。これらの化合物は、限定される
のではないが、：
【化１４】
2014221759.tif 000016
を含む。ここで、直鎖炭化水素アナログは、限定されるものではないが、１〜１２の炭素
原子を含み、Ｒは限定されるものではないが：場合によって−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、−ＣＦ
３、−ＯＣＦ３、ＮＨＲ、ＮＨＣＯＲ’で置換される分岐したアルキル、シクロアルキル
、もしくはアルキル、または芳香族または複素環を含み、ここで、Ｒ’はアルキル基であ
る。
【０１１４】
【化１５】
2014221759.tif 000017
式中、ＨＥＴはテトロヒドロフラン、ピリジン、フラン、ピロール、イミダゾール、トリ
アゾール、テトラゾール、オキサゾール、チアゾールおよび結合したベンゾ−アナログ等
のような複素環基であり、Ａｒはフェニルまたは置換されたフェニルである。フェニル置
換基は官能基（例えば、ＣＨ３、Ｃｌ、Ｆ、またはＣＨ２−Ｏ−ＣＦ３）であるＧからな
ることができ、およびｎは０〜５の整数である。
【０１１５】
ＤＮＪ誘導体の合成
Ｒ１において置換を有する本発明の化合物は：欧州特許第４９８５８号、国際公開公報
第２００５／０６３７０６号、米国特許第４，６３９，４３６号；国際公開公報第２００
４／０３７３７３号；国際公開公報第９５／２２９７５号；米国特許第５，３９９，５６
７号；米国特許第５，３１０，７４５号；Ｂｏｌｓら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｒｂ
ｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２００４  ２３（４），２２３−２３８，Ｓａ
ｗｋｅｒら，Ｃｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２００５；１２，１２３５−
１２４４，Ｏｖｅｒｋｌｅｅｆ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ．２００５；２７３（４１），２６５２２−２６５２７；Ｔａｎら，Ｊｏｕ
ｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．１９９１，２６６（２２
），１４５０４−１４５１０；Ｒｏｍａｎｉｏｕｋら，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ．２０
０４；１４（４），３０１−３１０；Ｌｅｓｕｒ，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ａｎｄ  Ｍｅ
ｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １９９７；７（３），３５５−
３６０；Ｙｏｓｈｉｋｕｎｉ，Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ  １９９８；５２（１）
，１２１に記載したように、およびこれらの方法の既知の修飾によってＤＮＪから合成す
ることができる。
【０１１６】
Ｒ２において置換を有する本発明の化合物は、Ａｎｚｅｖｅｎｏ，ら，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃ
ｈｅｍ．１９８９；５４（１１），２５３９；国際公開公報第００／５６７１３号；米国
特許第４，８８０，９１７号；欧州特許第０３１５０１７号；および米国特許第５，０５
１，４０７号に記載されたように、およびＢｏｓｈａｇｅら，Ａｎｇｅｗａｎｔｅ  Ｃｈ
ｅｍｉｅ，Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．１９８１；２０（９），８０６−８０７および報告
されている更なる方法によって、ＤＮＪから合成することができ、これらの方法の既知の
修飾は国際公開公報第００／５６７１３号，米国特許第５，０５１，４０７号、および欧
州特許第０３１５０１７号に示されている。これらの分子の合成に対する別のアプローチ
は、Ａｎｇｅｗａｎｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．２００３；４２，３
７８８−３７９２においてＤａｖｉｓによって報告されている。
【０１１７】
本発明の化合物は、テトラ−ＯＢｎグルコノラクトンから合成することもできる。この
合成は、Ｐｅｒｒｉｎｅら，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９６７；３２，６６４；Ｍａｔｏ
ｓ，Ｌｏｐｅｓ  ＆  Ｌｏｐｅｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  １９９９；４，５７１；Ｒａｏ
＆  Ｐｅｒｌｉｎ；Ｃａｎ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．１９８１；５９，３３３；Ｈｏｏｓ，Ｎａ
ｕｇｈｔｏｎ  ａｎｄ  Ｖａｓｓｅｌｌａ，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｅｍ．Ａｃｔａ，１９９３；
７６，１８０２，ａｎｄ  Ｂａｘｔｅｒ  ＆  Ｒｅｉｔｚ，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９
９４；５９，３１７５に記載された合成から適合させることができる。
【０１１８】
半合成アプローチは、本発明のＤＮＪ誘導体を形成するために用いることもできる。こ
の酵素経路はＧｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  Ｏｘｙｄａｎｓを用い、米国特許第４，２６
６，０２５号；米国特許第５，６９５，９６９号；米国特許第４，２４６，３４５号；米
国特許第４，８０６，６５０号；０４３０３０７；およびＫｉｎａｓｔ  ＆  Ｓｃｈｅｄ
ｅｌ；Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，２０，８０５（１９８１）に
記載された方法から適合されることができる。
【０１１９】
本発明で有用ないくつかの化合物は購入することができ、例えば、以下の化合物はＴｏ
ｒｏｎｔｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓから購入した：１−デオキシノジリ
マイシン（カタログ番号Ｄ２４５０００）、１−デオキシノジリマイシン塩酸（カタログ
番号Ｄ２４５００５）、Ｎ−ブチル−１−デオキシノジリマイシン（カタログ番号Ｂ６９
１０００、ＣＡＳ［２１０１１−９０−０］）、ミグリトール（Ｍｉｇｌｉｔｏｌ）（カ
タログ番号Ｍ３４４２００、ＣＡＳ［７２４３２−０３−２］）、Ｎ−メチル−１−デオ
キシノジリマイシン（カタログ番号２９７０００、ＣＡＳ［６９５６７−１−８］）、Ｎ
−５−カルボキシペンチル−１−デオキシノジリマイシン（カタログ番号Ｃ１８１２００
）、Ｎ−（５−アダマンタン−１−イルーメトキシ）−ペンチル−１−デオキシノジリマ
イシン（カタログ番号Ａ２１０００）；α−ホモノジリマイシンはＴＣＩ  Ａｍｅｒｉｃ
ａ（カタログ番号Ｈ１１４４、ＣＡＳ  １１９５５７−９９−２）から購入した。
【０１２０】
本発明で用いることができる化合物の非限定的リストは：ＤＮＪ、Ｎ−ブチルＤＮＪ、
Ｎ−（シクロプロピル）メチルＤＮＪ、Ｎ−２−（テトラヒドロフラン）メチルＤＮＪ、
Ｎ−２−オキソエチルＤＮＪトリフルオロエチル  エーテル／Ｎ−（２−（２，２，２−
トリフルオロエトキシ）エチルＤＮＪ、Ｎ−エチルオキシＤＮＪジメチルカルバメート／
Ｎ−（２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミド）エチルオキシ）ＤＮＪ、Ｎ−メチルーＤＮＪ、２
−メトキシエチルＤＮＪ、２−エトキシエチルＤＮＪ、４−トリフルオロメチル−ベンジ
ルＤＮＪ、α−シアノ−４−トリフルオロメチル−ベンジルＤＮＪ，４−ペントキシベン
ジルＤＮＪ、４−ブトキシベンジルＤＮＪ、４−ｔ−ＢＯＣ−ピペリジニルメチルＤＮＪ
，α−Ｃ６−ｎ−ノニル−ＤＮＪ，およびα−ホモーＤＮＪを含む。最大増強の半分が観
察される１ｍＭのＤＮＪに対するパーセント増強はこれらの化合物について以下の表１お
よび２に掲げる（実施例２）。
【０１２１】
本発明で用いることが考えられる更なる化合物はＮ−ノニルＤＮＪ（１０）；ミグリト
ール（１３）；Ｎ−５−カルボキシ−ペンチル−１−ＤＮＪ（１４）；メチル−２−ベン
ゾフラニルＤＮＪ（３０）；メチル−２−ベンゾチアフェニルＤＮＪ（３１）；α−Ｃ６
−ｎ−ブチル−ＤＮＪ（３３）；メチル−２−フラニルＤＮＪ（２９）；Ｎ−ｎ−ヘキシ
ルＤＮＪ（７）；Ｎ−エチルＤＮＪ（３）；Ｎ−ｎ−プロピルＤＮＪ（４）；Ｎ−ｎ−ペ
ンチルＤＮＪ（６）；およびβ−Ｃ６−ベンジル−ＤＮＪ（３６）；２−（Ｎ−（ベンゾ
［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−Ｎ−メチルアミノ）エチル）−ＤＮＪ（２
８）；およびＮ−２−（Ｎ−メチル−Ｎ−メチレンジオキシフェニルアミノ）エチル−Ｄ
ＮＪ（３７）を含む。
【０１２２】
活性および局所化アッセイ
Ｇａａの増強された活性、安定性および／またはトラフィッキングは、細胞Ｇａａポリ
ペプチドの増加を測定することによって、リソソームへのトラフィッキングの増加を決定
することによって、例えば、または増大したＧａａ活性または安定性を決定することによ
って決定することができる。上記の各々を評価するための非限定的で例示的な方法は以下
に記載する。
【０１２３】
Ｇａａ細胞内発現の決定  細胞内ＬＰＬタンパク質レベルを決定する方法は当分野で既
知である。このような方法はウエスタンブロッティング、ウエスタンブロッティング（Ｉ
Ｐウエスタン）に続く免疫沈澱、またはタグドＬＰＬタンパク質を用いる免疫蛍光法を含
む。
【０１２４】
Ｇａａトラフィッキングの測定  生合成経路を介するタンパク質のトラフィッキングの
評価は、例えば、グルコシダーゼと組み合わせて、３５Ｓ−標識受容体タンパク質でのパ
ルス−チェイス実験を用いて；あるいは好ましくは、トラフィッキングの間にタンパク質
修飾を決定するための間接的または直接的免疫蛍光によって達成することができる。これ
らのおよび他の方法は、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ
Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２００１；Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓに記載されている。
Ｇａａのリソソームトラフィッキングを検出するための例示的な免疫蛍光実験は、以下に
実施例３および４で詳細に記載する。
【０１２５】
タンパク質の損なわれたトラフィッキングを検出するための他の方法は、当分野でも周
知である。例えば、ゴルジ装置中でＮ−および／またはＯ−グリコシル化されるタンパク
質については、グリコシダーゼ処理および免疫沈澱と組み合わせて、放射性標識タンパク
質を用いるパルス−チェイス代謝産物標識を用いて、タンパク質がゴルジにおいて十分な
グリコシル化を受けているか否か、あるいはそれらが更なるグリコシル化のためにゴルジ
へのトラフィッキングの代わりにＥＲにおいて保持されているか否かを検出することがで
きる。
【０１２６】
細胞局所化を肉眼で検出するための感度のよい方法は、蛍光タンパク質または蛍光抗体
を用いる蛍光顕微鏡も含む。例えば、注目するＬＰＬタンパク質は、例えば、緑色蛍光タ
ンパク質（ＧＦＰ）、シアン蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、および赤色蛍光タン
パク質、続いて、マルチカラーおよび時間−経過顕微鏡観察および電子顕微鏡観察でタグ
を付して、固定された細胞における、および生きた細胞におけるこれらのタンパク質の運
命を調べることができる。タンパク質トラフィッキングでの蛍光イメージングの使用のレ
ビューについては、Ｗａｔｓｏｎら，Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ  ２００５
；５７（１）：４３−６１参照。タンパク質の細胞内共局所化のために共焦点顕微鏡観察
の使用の記載については、Ｍｉｙａｓｈｉｔａら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．
２００４；２６１：３９９−４１０参照。
【０１２７】
蛍光修正分光測定（ＦＣＳ）は、単一分子およびリアルタイム分解が可能な超感受性か
つ非侵入性検出方法である（Ｖｕｋｏｊｅｖｉｃら，Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃ
ｉ  ２００５；６２（５）：５３５−５０）。ＳＰＦＩ（単一粒子蛍光イメージング）は
、小さな蛍光粒子で選択的に標識された個々の分子を可視化するために高感度の蛍光を用
いる（Ｃｈｅｒｒｙら，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  Ｔｒａｎｓ  ２００３；３１（Ｐｔ５
）：１０２８−３１）。生きた細胞のイメージングのレビューについては、Ｈａｒｉｇｕ
ｃｈｉ，Ｃｅｌｌ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｆｕｎｃｔ  ２００２；２７（５）：３３３−４参照
。
【０１２８】
生理学的条件下でタンパク質の構造および局所化を調べるのに、蛍光共鳴エネルギー移
動（ＦＲＥＴ）顕微鏡観察も用いられる（Ｐｅｒｉａｓａｍｙ，Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｏｐ
ｔ  ２００１；６（３）：２８７−９１）。
【０１２９】
Ｇａａ活性の増加の決定  インビトロでは、Ｇａａ活性は実施例２にて以下に記載する
ように決定することができる。Ｇａａ活性は、Ｏｋｕｍｉｙａら，Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  
Ｍｅｔａｂ．２００６  Ｍａｙ；８８（１）：２２−８に記載されているように、混合さ
れたリンパ球を用いて薬理学的シャペロンでの処理後にインビボで決定することができる
。該方法は、リソソーム酸α−グルコシダーゼ活性を測定するための基質としてグリコー
ゲンおよび４−メチルウンベリフェリル−アルファ−ｄ−グルコピラノシド（４ＭＵ−ア
ルファＧｌｃ）を使用し、アカルボースを取り込んで、無関係なα−グルコシダーゼ（圧
倒的にマルトース−グルコアミラーゼ）の緩衝を排除する。
【０１３０】
処方、用量および投与
一実施形態において、シャペロン化合物は、好ましくは（以下に更に記載する）経口投
与形態で単一療法として投与するが、他の投与形態も考えられる。この実施形態において
、投与方法は、ポンペ患者の血漿中の化合物の一定の定常状態レベルを提供するものであ
るべきと考えられる。これは、分割用量、または制御−放出処方での毎日の投与によって
、あるいは維持−放出投与形態の頻度が低い投与によって得ることができる。シャペロン
化合物の投与の処方、用量および経路は、以下に詳細に記載する。
【０１３１】
処方
本発明の一実施形態において、シャペロン化合物は単一療法として投与され、例えば、
錠剤またはカプセルまたは液体の形態での経口投与にて、注射用の滅菌水性溶液にて、ま
たは投与に先立ってインビトロでの酵素凝集を妨げるために復元の間にまたはその後直ち
に置換Ｇａａ（以下参照）の処方に加えるべき凍結乾燥粉末での形態を含めたいずれかの
投与経路に適した投与形態とすることができる。
【０１３２】
シャペロン化合物を経口投与用に処方する場合、錠剤またはカプセルは、結合剤（例え
ば、予めゼラチン化されたトウモロコシ澱粉、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプ
ロピルメチルセルロース）；充填剤（例えば、ラクトース、マイクロクリスタリンセルロ
ースまたはリン酸水素カルシウム）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タル
クまたはシリカ）；崩壊剤（例えば、ジャガイモ澱粉またはナトリウム澱粉グリコレート
）；または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）のような医薬上許容される賦形剤
での従来の手段によって調製することができる。錠剤は当分野でも周知の方法によって被
覆することができる。経口投与のための液体製剤は、例えば、溶液、シロップまたは懸濁
液の形態を取ることができ、あるいはそれらが、使用の前に水または別の適当なビークル
での復元のための乾燥した製品として供することができる。そのような液体製剤は、懸濁
化剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体または水素化食用脂）；乳化剤
（例えば、レシチンまたはアカシア）；非水性ビークル（例えば、アーモンド油、油性エ
ステル、エチルアルコールまたは分別植物油）；および保存剤（例えば、メチルまたはプ
ロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾエートまたはソルビン酸）のような医薬上許容される添加
剤での従来の手段によって調製することができる。製剤は、必要に応じて、緩衝塩、フレ
ーバー、着色および甘味料も含有することができる。経口投与用の製剤は、活性シャペロ
ン化合物が制御された放出を与えるように適切に処方することができる。
【０１３３】
本発明の方法で用いることが考えられるシャペロン化合物であるＺＡＶＥＳＣＡ（登録
商標）は、ハードゼラチンカプセルとして市販されており、各カプセルは１００ｍｇのＤ
ＮＪ、ナトリウム澱粉グリコレート、ポビドン（Ｋ３０）およびステアリン酸マグネシウ
ムを含有する。カプセルシェルはゼラチンおよび二酸化チタンを含む。
【０１３４】
非経口／注射用途に適したシャペロン化合物の医薬処方は、一般には、（水溶性である
場合）滅菌水性溶液、または分散液、滅菌注射溶液および分散液の即席調製用の滅菌粉末
を含む。全ての場合において、該形態は滅菌されていなければならず、かつ容易なシリン
ジ性が存在する程度まで流動的でなければならない。それは製造および貯蔵の条件下で安
定でなければならず、細菌および真菌のような微生物の汚染作用に対して保持されなけれ
ばならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プ
ロピレングリコール、およびポリエチレングリコール等）、その適当な混合物、および植
物油を含有する溶媒または分散媒体でもよい。適切な流動性は、例えば、レシチンのよう
なコーティングの使用によって、分散液の場合には必要な粒子サイズの維持によって、お
よび界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物の作用の防止は、種々の抗
菌および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ベンジルアルコ
ール、ソルビン酸などによって実現することができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖
または塩化ナトリウムを含めるのが合理的であろう。注射組成物の延長された吸収は、吸
収を遅延する剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの組成物におけ
る使用によって実現することができる。
【０１３５】
滅菌注射用液は、必要な量の精製されたＧａａおよびシャペロン化合物を先に例示した
種々の他の成分と共に適当な溶媒に配合し、必要であれば続いて濾過または最終滅菌する
ことによって調製される。一般に、分散液は、基本的な分散媒体、および先に列挙したも
のからの必要な他の成分を含有する滅菌ビークルに種々の滅菌された有効成分を取り込む
ことによって調製される。滅菌注射溶液の調製のための滅菌粉末の場合には、好ましい調
製方法は真空乾燥および凍結乾燥技術であり、これは、有効成分に加えて、それ以前に滅
菌濾過された溶液からのいずれかの更なる所望の成分の粉末を生じる。
【０１３６】
処方は賦形剤を含有することができる。処方に含めることができる医薬上許容される賦
形剤はクエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、および炭酸水素緩衝液のような緩衝
液、アミノ酸、尿素、アルコール、アスコルビン酸、リン脂質；血清アルブミン、コラー
ゲンおよびゼラチンのようなタンパク質；ＥＤＴＡまたはＥＧＴＡ、および塩化ナトリウ
ムのような塩；リポソーム；ポリビニルピロリドン；デキストラン、マンニトール、ソル
ビトールおよびグリセロールのような糖；プロピレングリコールおよびポリエチレングリ
コール（例えば、ＰＥＧ−４０００、ＰＥＧ−６０００）；グリセロール；グリシンまた
は他のアミノ酸；および脂質である。処方で用いるための緩衝液系はクエン酸；酢酸；炭
酸水素；およびリン酸緩衝液を含む。リン酸緩衝液は好ましい実施形態である。
【０１３７】
処方は非イオン性洗剤を含有することもできる。好ましい非イオン性洗剤はポリソルベ
ート２０、ポリソルベート８０、トリトンＸ−１００、トリトンＸ−１１４、ノニデット
（Ｎｏｎｉｄｅｔ）Ｐ−４０、オクチルα−グルコシド、オクチルβ−グルコシド、Ｂｒ
ｉｊ３５、プルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）およびツイーン（Ｔｗｅｅｎ）２０を含む
。
【０１３８】
投与
シャペロン化合物の投与経路は経口（好ましい）または非経口であってもよく、静脈内
、皮下、動脈内、腹腔内、目、筋肉内、口腔内、直腸内、膣内、眼窩内、大脳内、皮内、
頭蓋内、脊髄内、心室内、クモ膜下腔、嚢内、関節包内、肺内、鼻内、経粘膜、経皮また
は吸入であってもよい。
【０１３９】
シャペロン化合物の上記非経口処方の投与は製剤のボーラスの周期的注射によることが
でき、あるいは外部（例えば、静脈内バッグ）または内部（例えば、生体分解性インプラ
ント）である貯蔵庫からの静脈内または腹腔内投与によって投与してもよい。例えば、各
々を参照として本明細書に組み入れられる米国特許第４，４０７，９５７号および第５，
７９８，１１３号参照。肺内送達方法および装置は、例えば、各々を参照として本明細書
に組み入れられる、米国特許第５，６５４、００７号、第５，７８０，０１４号および第
５、８１４、６０７号に記載されている。他の有用な非経口送達系は、エチレン−酢酸ビ
ニルコポリマー粒子、浸透圧ポンプ、移植可能注入系、ポンプ送達、カプセル化細胞送達
、リポソーム送達、ニードル−送達注射、無ニードル注射、ネブライザー、エアロゾライ
ザー、エレクトロポレーションおよび経皮貼布を含む。無ニードル注射デバイスは、その
明細書が参照として本明細書に組み入れられている、米国特許第５，８７９，３２７号；
第５，５２０，６３９号；第５，８４６，２３３号および第５，７０４，９１１号に記載
されている。上記処方のいずれもこれらの方法を用いて投与することができる。
【０１４０】
皮下注射は、静脈内投与と比較して長い血漿内半減期も持ちつつ、自己投与が可能であ
るという利点がある。更に、再充填可能注射ペンおよび無ニードル注射デバイスのような
患者の便宜のために設計された種々のデバイスを、本明細書中で議論する本発明の処方で
用いることができる。
【０１４１】
用量
内因性突然変異体Ｇａａを救済し、（および／または投与された精製Ｇａａを安定化さ
せる；以下の組合せ療法のセクション参照）するのに有効なシャペロン化合物の量は、当
業者がケースバイケースに基づいて決定することができる。半減期（ｔ１／２）、ピーク
血漿内濃度（Ｃｍａｘ）、ピーク血漿内濃度までの時間（ｔｍａｘ）、曲線下面積（ＡＵ
Ｃ）によって測定された暴露、および置換タンパク質およびシャペロン化合物双方につい
ての組織分布、ならびにシャペロン／置換Ｇａａ結合についてのデータ（親和性定数、会
合および解離定数、および価性）のような薬物動態および薬力学は、その活性を阻害する
ことなく、置換タンパク質を安定化し、このようにして、治療効果を付与するのに必要な
適合する量を決定するための当分野で既知の通常の方法を用いて得ることができる。
【０１４２】
細胞培養アッセイまたは動物実験から得られたデータを用いて、ヒトおよびヒト以外の
動物で用いられる治療用量範囲を処方することができる。本発明の治療方法で用いられる
化合物の用量は、好ましくは、ほとんどまたは全く毒性がなくして、（テストされた集団
の５０％に対して有効な）ＥＤ５０濃度を含むある範囲の循環濃度内にある。いずれかの
治療で用いられる特定の用量は、使用される特定の投与形態、利用される投与の経路、個
人（例えば患者）の状態などのような因子に依存して、この範囲内で変化させることがで
きる。
【０１４３】
治療的に有効な用量は、細胞培養アッセイから最初に推定し、動物モデルで処方して、
ＩＣ５０を含む循環濃度範囲を達成することができる。化合物のＩＣ５０濃度は、（例え
ば、細胞培養アッセイから決定される）症状の最大の半分の抑制を達成する濃度である。
特定の個人、例えば、ヒト患者で用いられる適当な用量は、そのような情報を用いてより
正確に決定することができる。
【０１４４】
血漿中の化合物の尺度は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）またはガスクロマ
トグラフィーのような技術によって患者のような個人でルーチン測定することができる。
【０１４５】
組成物の毒性および治療効果は、例えば、細胞培養アッセイにおいて、または実験動物
を用いて標準的な医薬的手法によって決定して、ＬＤ５０およびＥＤ５０を決定すること
ができる。パラメーターＬＤ５０およびＥＤ５０は当分野でもよく知られており、各々、
集団の５０％に対して致死効果がある、および集団の５０％において治療的に有効である
化合物の用量をいう。毒性および治療効果の間の用量比率を治療指数といい、比率：ＬＤ
５０／ＥＤ５０として表すことができる。大きな治療指数を呈するシャペロン化合物が好
ましい。
【０１４６】
１つの例示的な用量養生法として、Ｎ−ブチル−ＤＮＪ（ＺＡＶＥＳＣＡ（登録商標）
）は、分割用にて１日当たり１００〜３００ｍｇの経口用量にてゴーシェ病の治療で投与
される（１日当たり２〜３回）。１００ｍｇの投与に続き、ｔｍａｘはゴーシェ患者にお
いて２〜２．５時間の範囲であった。ＺＡＶＥＳＣＡ（登録商標）の半減期は約６〜７時
間であり、これは、３回の毎日の投与後１，５〜２日までに定常状態が達成されることを
予測する。ＺＡＶＥＳＣＡ（登録商標）がヒトにおいて代謝される証拠はない。
【０１４７】
Ｇａａの最適シャペロン活性については、糖脂質合成を妨げるのに必要なものよりもよ
り低い用量のＤＮＪ誘導体が有効であると予測される。例えば、５および１５０ｍｇ／日
の間、特に５〜７５ｍｇ／日の間の用量が、より高いＧａａ−増強活性を有するＤＮＪ誘
導体で好ましい。いくつかのＤＮＪ誘導体は、低下したＧａａ−増強活性のためわずかに
より高い用量を必要とするであろう。
【０１４８】
シャペロン化合物の最適濃度は、組織における、または血液循環におけるシャペロン化
合物のその活性、生物学的利用性、および組織における、または血液循環におけるシャペ
ロン化合物の代謝を妨げることなく、組織または血液循環において、インビボにて組換え
タンパク質の適切な立体構造を安定化し、誘発するのに必要な量に従って決定されるであ
ろう。例えば、シャペロン化合物は酵素阻害剤である場合、阻害剤の濃度は、該酵素につ
いての特異的シャペロンのＩＣ５０値を計算することによって決定することができる。化
合物の生物学的利用性および代謝を考慮し、ＩＣ５０値のまわりの、またはＩＣ５０値を
わずかに上回る濃度を、次いで、酵素活性に対する効果、例えば、酵素活性の量を増加さ
せる、または投与された酵素の酵素活性を延長するのに必要な阻害剤の量に基づいて評価
することができる。その例として、α−Ｇａｌ  Ａ酵素についての化合物デオキシガラク
トノジリマイシン（ＤＧＪ）のＩＣ５０値は０，０４μＭであり、ＤＧＪは優れた阻害剤
であることを示す。従って、α−Ｇａｌ  Ａの細胞内濃度は投与されたα−Ｇａｌ  Ａの
それよりもかなり低いであろうと予測される。
【０１４９】
酵素置換療法との組合せ療法
酵素置換療法は、注入によって野生型または生物学的に機能的な酵素を外因的に導入す
ることによってタンパク質の量を増加させる。この療法は、先に参照したリソソーム貯蔵
障害、ゴーシェ病およびファブリー病を含めた多くの遺伝的障害のために開発されてきた
。野生型酵素は、組換え細胞発現系（例えば、哺乳動物細胞または昆虫細胞−Ｄｅｓｎｉ
ｃｋらに対する米国特許第５，５８０，７５７号；Ｓｅｌｄｅｎらに対する米国特許第６
，３９５，８８４号および第６，４５８，５７４号；Ｃａｌｈｏｕｎらに対する米国特許
第６，４６１，６０９号；Ｍｉｙａｍｕｒａらに対する米国特許第６，２１０，６６６号
；Ｓｅｌｄｅｎらに対する米国特許第６，０８３，７２５号；Ｒａｓｍｕｓｓｅｎらに対
する米国特許第６，４５１，６００号；Ｒａｓｍｕｓｓｅｎらに対する米国特許第５，２
３６，８３８号；およびＧｉｎｎｓらに対する米国特許第５，８７９，６８０号）、ヒト
胎盤、または動物乳（Ｒｅｕｓｅｒらに対する米国特許第６，１８８，０４５号参照）か
ら精製される。注入の後、外因性酵素は、非特異的または受容体−特異的メカニズムを介
して組織によって摂取されると予測される。一般には、摂取効率は高くなく、外因性タン
パク質の循環時間は短い（Ｉｏａｎｎｕら，Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．２００１；
６８：１４−２５）。加えて、外因性タンパク質は不安定であって、迅速な細胞内分解に
付され、ならびに引き続いての処理での有害な免疫学的反応の可能性を有する。
【０１５０】
ポンペ病の酵素置換は、いくつかのグループ、Ｋｌｉｎｇｅら、Ｎｅｕｒｏｐｅｄｉａ
ｔｒｉｃｓ．２００５；３６（１）：６−１１；Ｋｌｉｎｇｅら、Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕ
ｌ  Ｄｉｓｏｒｄ．２００５；１５（１）：２４−３１；Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｈｏｕｔら，
Ｊ  Ｉｎｈｅｒｉｔ  Ｍｅｔａｂ  Ｄｉｓ．２００１；２４（２）：２６６−７４；およ
びＡｍａｌｆｉｔａｎｏら，Ｇｅｎｅｔ  Ｍｅｄ．２００１；３（２）：１３２−８によ
って記載されているが、限定的な成功に過ぎなかった。ヒト投与のための組換えＧａａは
Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｈｏｕｔら，Ｌａｎｃｅｔ．２０００；５６：３９７−８に記載されて
いる。
【０１５１】
本発明は、インビトロにて処方または組成物中でタンパク質についてのＡＳＳＣの共投
与によって、ミスフォールディングによって特徴付けられる突然変異したＧａａを有する
ポンペ患者においてインビボにて精製されたタンパク質の安定性を増大させることによっ
て、タンパク質置換療法の有効性を増大させる。
【０１５２】
一実施形態において、置換Ｇａａおよびシャペロン化合物は別々の組成物に処方される
。一実施形態において、ＤＮＪ誘導体シャペロン化合物および置換Ｇａａは同一の経路、
例えば、静脈内注入に従って、あるいは好ましくは、異なる経路、例えば、置換酵素につ
いては静脈内注入、および上記セクションに記載されたシャペロン化合物については経口
投与によって、投与することができる。
【０１５３】
置換Ｇａａはシャペロンの投与について上記した経路のいずれかによって投与するが、
好ましくは、投与は非経口である。より好ましくは、投与は注射用の滅菌溶液中にて静脈
内である。
【０１５４】
別の実施形態において、シャペロン化合物および置換Ｇａａは１つの組成物に処方され
る。そのような組成物は貯蔵およびインビボ投与の間に酵素の安定を増強させ、それによ
り、コストを低下させ、治療効果を増大させる。処方は好ましくは静脈内、皮下および腹
腔内を含めた非経口投与に適しているが、経口、鼻内、または経皮のような他の投与経路
に適した処方も考えられる。
【０１５５】
投与のタイミング  置換Ｇａａおよびシャペロン化合物が別々の処方内にある場合、投
与は同時としてもよく、またはシャペロン化合物を置換Ｇａａに先立って、または後に投
与してもよい。例えば、置換酵素を静脈内投与する場合、シャペロン化合物を０時間から
６時間後の期間の間に投与することができる。代替として、シャペロン化合物はタンパク
質に先立って０〜６時間に投与することができる。
【０１５６】
好ましい実施形態において、シャペロン化合物および置換タンパク質を別々に投与する
場合、およびシャペロン化合物が短い循環半減期を有する場合（例えば、小分子）、シャ
ペロン化合物を毎日のように連続的に経口投与して、血液循環中の一定レベルを維持する
ことができる。そのような一定レベルは、患者にとって非毒性であり、および非阻害性治
療効果を付与するのに、投与の間の標的置換タンパク質との干渉に関して最適であると決
定されたものであろう。
【０１５７】
別の実施形態において、シャペロン化合物は、（シャペロン化合物の投与によって延長
されるであろう）置換Ｇａａの代謝回転に必要な期間の間に投与される。
【０１５８】
置換Ｇａａの用量  現行の方法によると、置換酵素の濃度は、一般には、約０．０５〜
５．０ｍｇ／ｋｇ体重の間であり、典型的には、毎週または２週間毎に投与される。酵素
は０．１μｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの範囲で、好ましくは約０．１ｍｇ／ｋｇ約２ｍ
ｇ／ｋｇの範囲の量で投与することができる。例えば、ファブリー病の治療では、投与さ
れる組換えα−Ｇａｌ  Ａの用量は、典型的には、０．１〜０．３ｍｇ／ｋｇの間あって
、毎週または２週間毎に投与される。タンパク質の規則的に反復される用量は患者の生涯
にわたって必要である。皮下注射は薬物へのより長い期間の全身暴露を維持する。皮下用
量は、好ましくは、２週間毎のまたは毎週の０．１〜５．０ｍｇの体重１ｋｇ当たりのα
−Ｇａｌ  Ａである。また、該α−Ｇａｌ  Ａは、例えば、静脈内ボーラス注射にて、ゆ
っくりと押す静脈内注射にて、または連続的静脈内注射によって静脈内投与される。（例
えば、２〜６時間にわたる）連続的静脈内注入は、血液中での特異的レベルの維持を可能
とする。
【０１５９】
組換えまたは精製されたＧａａの有効用量は、ポンペにおける標的組織、骨格筋が内皮
および間質組織によって組換え投与される酵素から守られるという事実により、ファブリ
ーまたはゴーシェ病で必要とされるものよりも、高いであろうと予測される。組換えＧａ
ａ（Ｍｙｏｚｙｍｅ，Ｇｅｎｚｙｍｅ，Ｉｎｃ．）は、ポンペ病の治療で現在承認されて
いる。更なる試験がＳｙｎｐａｃ，Ｉｎｃ．と連携してデューク（Ｄｕｋｅ）大学、およ
び欧州で進行中である。１つの欧州の実験では、乳児性ポンペ患者はウサギ乳からの組換
えヒトＧａａの１週間当たり１５および２０ｍｇ／ｋｇの用量で開始し、他方、実験の間
には、筋肉組織活動レベルのモニタリングに基づいて、用量は１週間に１回の静脈内注入
にて４０ｍｇ／ｋｇまで増大させた。実験は３６週間にわたって１４４回の注入の間継続
した。（Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｈｏｕｔら，Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ．２００４；１１３：４４
８−５７）。数人の後期−発症ポンペ患者での１つの試験において、ウサギ乳からの組換
えヒトＧａａは５％グルコースおよび０，１％ヒト血清アルブミンを含む生理食塩水中の
１〜２ｍｇ／ｍｌ溶液として静脈投与され、最初は、１０ｍｇ／ｋｇの毎週の用量であり
、２０ｍｇ／ｋｇまで増大させた（Ｗｉｎｋｅｌら，Ａｎｎ  Ｎｅｕｒｏｌ．２００４；
５５：４９５−５０２）。
【０１６０】
遺伝子治療との組換え療法
合衆国においては治療的処置について未だ承認されていないが、多数の遺伝的障害のた
めの遺伝子治療（エクスビボおよび直接的導入の双方）は研究中である。本発明では、ポ
ンペ病において欠陥があるＧａａを置き換えるための遺伝子治療と組み合わせたシャペロ
ン化合物の使用も考えられる。そのような組合せは、インビボにて治療Ｇａａの発現のレ
ベルを増大させることによって遺伝子治療の効率を増強させる。というのは、突然変異し
た酵素のフォールディングおよびプロセッシングの増強に加えて、小分子シャペロンが、
野生型または立体構造的に安定なカウンターパートのフォールディングおよびプロセッシ
ングを増強させることが示されているからである（例えば、Ｆａｎらに対する米国特許第
６，２７４，５９７号、実施例３参照）。
【０１６１】
最近、Ｓｕｎら（Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．２００５；１１（１）：５７−６５）は、ポンペ
病の免疫欠陥マウスモデル（Ｇａａノックアウト／ＳＣＩＤマウス）への徐脈内注射のた
めにヒトＧａａ（ｈＧａａ；ＡＡＶ８としてシュードタイプ化（ＡＡＶ２／８））をコー
ドするアデノ−関連ウィルス（ＡＡＶ）ベクターを使用した。ｈＧａａの高いレベルを、
ＡＡＶ２／８ベクター投与後に２４時間血漿中で維持した。心臓および骨格筋中でのＧａ
ａの欠乏はオスマウスにおいてＡＡＶ２／８ベクターで修正し、他方、メスマウスは心臓
においてのみ修正を有した。
【０１６２】
当分野で利用可能である、または利用可能となった遺伝子治療の方法のいずれも、治療
遺伝子を送達するのに用いることができる。例示的な方法は以下に記載されている。遺伝
子治療の方法の一般的なレビューについては、Ｇｏｌｄｓｐｉｅｌら，Ｃｌｉｎｉｃａｌ
Ｐｈａｒｍａｃｙ  １９９３，１２：４８８−５０５；Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｕ，Ｂｉｏｔ
ｈｅｒａｐｙ  １９９１，３：８７−９５；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐ
ｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．１９９３，３２：５７３−５９６；Ｍｕｌｌｉｇａ
ａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９３，２６０：９２６−９３２；およびＭｏｒｇａａｎ  ａ
ｎｄ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９３，６２：１９１−
２１７；Ｍａｙ，ＴＩＢＴＥＣＨ  １９９３，１１：１５５−２１５参照。用いることが
できる組換えＤＮＡ技術の当分野で普通に知られている方法は、Ａｕｓｕｂｅｌら，（ｅ
ｄｓ．），１９９３，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｒｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹ；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，１
９９０，Ｇｅｎｅ，Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａ  Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ  Ｍａｎｎｕａｌ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹにおいて、およびＣ
ｈａｐｔｅｒｓ  １２  ａｎｄ  １３，Ｄｒａｃｏｐｏｌｉら，（ｅｄｓ．），１９９４
，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｊｏｈ
ｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹ；およびＣｏｌｏｓｉｍｏら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉ
ｃｓ  ２０００；２９（２）：３１４−８，３２０−２，３２４に記載されている。
【０１６３】
本発明の方法で投与すべきＧａａ遺伝子は、当業者の技量内にある通常の分子生物学微
生物学、および組換えＤＮＡ技術を用いて単離し、精製することができる。例えば、標的
タンパク質をコードする核酸は、文献に記載されているように、組換えＤＮＡ発現を用い
て単離することができる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ  ＆  Ｍａｎｉａ
ｔｉｓ，Ｍｏｒｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｎ
ｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  （１９８９）  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａ
ｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ
，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒ
ｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ  ｅｄ．１９８５
）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｍｐｈｅｓｉｓ  （Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ  ｅｄ
．１９８４）；Ｎｕｃｌｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ［Ｂ．Ｄ．Ｈａ
ｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｊ．Ｅｉｇｇｉｎｓ  ｅｄｓ．（１９８５）］：Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ
ｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ［Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｊ．Ｅｉｇ
ｇｉｎｓ，ｅｄｓ．（１９８４）］；Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ［Ｒ．
Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．（１９８６）］；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  
Ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  ［ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，（１９８６）］；Ｂ．Ｅ  Ｐｅｒｂａ
ｌ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｒｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ
（１９８４）参照。タンパク質をコードする核酸は、該遺伝子が生物学的活性なタンパ
ク質をコードする限り、全長または切形されていてもよい。
【０１６４】
次いで、同定され単離されたＧａａ遺伝子を適当なクローニングベクターに挿入するこ
とができる。遺伝子治療に適したベクターはアデノウィルス、アデノ−関連ウィルス（Ａ
ＡＶ）、ワクシニア、ヘルペスウィルス、バキュロウィルスおよびレトロウィルス、パル
ボウィルス、レンチウィルス、バクテリオファージ、コスミッド、プラスミド、真菌ベク
ター、および種々の真核生物および原核生物宿主での発現で記載されており、遺伝子治療
で、ならびに単純なタンパク質発現で用いることができる、当分野で典型的に用いられる
他の組換えビークルのようなウィルスを含む。
【０１６５】
好ましい実施形態において、ベクターはウィルスベクターである。ウィルスベクター、
特にアデノウィルスベクター、標的細胞のウィルス感染の増大した効率を提供する、カチ
オン性脂質、ポリＬ−リシン（ＰＬＬ）、およびジエチルアミノエチルデキストラン（Ｄ
ＥＬＡＥ−デキストラン）のようなカチオン性両親媒体と複合体化することができる（例
えば、本明細書に参照として組み入れられる１９９７年１１月２０日に出願されたＰＣＴ
／ＵＳ９７／２１４９６参照）。本発明で用いられる好ましいウィルスベクターはワクシ
ニア、ヘルペスウィルス、ＡＡＶおよびレトロウィルスに由来するベクターを含む。特に
、ヘルペスウィルス、特に、その開示が本明細書に組み入れられる米国特許第５，６７２
，３４４号に開示されたもののような単純疱疹ウィルス（ＨＳＶ）は、導入遺伝子のニュ
ーロン細胞への送達で特に有用である。その開示が本明細書に組み入れられる米国特許第
５，１３９，９４１号、第５，２５２，４７９号および第５，７５３，５００号、および
ＰＣＴ国際公開公報第９７／０９４４１号に開示されたもののようなＡＡＶベクターも有
用である。というのは、これらのベクターは宿主染色体へ組み込まれ、ベクターの反復投
与の必要性が最小だからである。遺伝子治療におけるウィルスベクターのレビューについ
ては、ＭｃＣｏｎｎｅｌｌら，Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２００４（１１）：１０２
２−３３；Ｍｃｃａｒｔｙら，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ．２００４；３８：８１９
−４５；Ｍａｈら，Ｃｌｉｎ．ＰＨａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ．２００２；４１（１２）：
９０１−１１；Ｓｃｏｔｔら，Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌ．Ｄｉｓｏｒｄ．２００２；１２
Ｓｕｐｐｌ  １：Ｓ２３−９参照。加えて、米国特許第５，６７０，４８８号参照。Ｂ
ｅｃｋら，Ｃｕｒｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２００４；４（４）：４５７−６７は、特に
、心血管細胞における遺伝子治療を記載する。
【０１６６】
送達すべき遺伝子のコーディング配列は、発現制御配列、例えば、遺伝子の発現を指令
するプロモーターに操作可能に連結されている。本明細書中で用いるように、フレーズ「
操作可能に連結された」とは、プロモーター、エンハンサー、転写および翻訳停止部位、
および他のシグナル配列のようなヌクレオチドの調節およびエフェクター配列とポリヌク
レオチド／遺伝子との機能的関係をいう。例えば、プロモーターに対する核酸の操作的結
合とは、ＤＮＡの転写が、プロモーターを特異的に認識し、それに結合するＲＮＡポリメ
ラーゼによってプロモーターから開始されるように、ポリヌクレオチドおよびプロモータ
ーの間の物理的および機能的関係をいい、ここで、プロモーターはポリヌクレオチドから
のＲＮＡの転写を指令する。
【０１６７】
他の特別な実施形態において、コーディング配列およびいずれかの他の所望の配列に、
ゲノム中の所望の部位における相同組換えを促進する領域が均質したベクターを用い、こ
のようにして、ゲノムに組み込まれた核酸分子からの構築体の発現を提供する（Ｋｏｌｌ
ｅｒ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈｉｅｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．１
９８９，８６：８９３２−８９３５；Ｚｉｊｌｓｔｒａら，Ｎａｔｕｒｅ．１９８９，３
４２：４３５−４３８；Ｚａｒｌｉｎｇらに対する米国特許第６，２４４，１１３号：お
よびＰａｔｉらに対する米国特許第６，２００，８１２号）。
【０１６８】
遺伝子送達
患者へのベクターの送達は直接的であってもよく、その場合、患者は直接的にベクター
または送達複合体に暴露され、あるいは間接的であってもよく、この場合、細胞をまずイ
ンビトロにてベクターで形質転換し、次いで、患者に移植する。これらの２つのアプロー
チは、各々、インビボおよびエクスビボ遺伝子治療として知られている。
【０１６９】
直接的導入  特別な実施形態において、ベクターはインビボにて直接的に投与され、そ
こでは、それは生物の細胞に入り、遺伝子の発現を媒介する。これは、当分野で知られ、
かつ上記で議論した多数の方法のいずれかによって、例えば、それを適当な発現ベクター
の一部として構築し、それが細胞内になるようにそれを投与することによって、例えば、
欠陥があるまたは弱毒化レトロウィルスまたは他のウィルスベクターを用いて感染するこ
とによって（米国特許第４，９８０，２８６号参照）、または裸のＤＮＡの直接的注射に
よって、あるいはミクロ粒子衝撃（例えば、遺伝子銃；Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ，Ｄｕｐｏｎ
ｔ）の使用によって；または脂質または細胞−表面受容体またはトランスフェクト剤での
被覆、バイオポリマー（例えば、ポリ−β−１−６４−Ｎ−アセチルグルコサミン多糖；
米国特許第５，６３５，４９３号参照）へのカプセル化、リポソーム、ミクロ粒子または
マイクロカプセルへのカプセル化；ペプチドまたは核に入ることが知られている他のリガ
ンドへ結合したそれを投与することによって；または受容体−媒介エンドサイトーシスに
従うリガンドに結合したそれを投与することによって（例えば、Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｕ，Ｊ
．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９８７，６２：４４２９−４４３２参照）達成することができ
る。別の実施形態において、核酸−リガンド複合体を形成することができ、そこでは、リ
ガンドは、エンドソームを破壊し、核酸がリソソーム分解を回避するのを可能とするため
の融合形成ウィルスペプチド、または治療ＤＮＡを細胞に導入するのに用いることができ
る、例えば、アンテナペディアに由来するカチオン性１２−量体ペプチド（Ｍｉら，Ｍｏ
ｌ．Ｔｈｅｒａｐｙ．２０００，２：３３９−４７）を含む。なお別の実施形態において
、核酸は、特異的受容体を標的化することによって、細胞特異的摂取および発現のために
インビボで標的化することができる（例えば、ＰＣＴ国際公開公報第９２／０６１８０号
、国際公開公報第９２／２２６３５号、国際公開公報第９２／２０３１６号および国際公
開公報第９３／１４１８８号参照）。最近、マグネトフェクションといわれる技術がベク
ターを哺乳動物に送達するのに用いられてきた。この技術は、ベクターを、磁場の影響下
で、送達用の超常磁性ナノ粒子と会合させる。この適用は送達時間を低下させ、ベクター
効率を増強させる（Ｓｃｈｅｒｅｒら，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ．２００２；９：１０
２−９）。更なる標的化および送達方法が以下のベクターの記載で考えられる。
【０１７０】
特別な実施形態において、核酸は脂質担体を用いて投与することができる。脂質担体を
裸の核酸（例えば、プラスミドＤＮＡ）と会合させて、細胞膜を通っての通過を容易とす
ることができる。カチオン性、アニオン性または中性脂質をこの目的で用いることができ
る。しかしながら、カチオン性脂質が好ましい。なぜならば、それらは一般に負の電荷を
有するＤＮＡと両方に会合することが示されているからである。カチオン性脂質もまたプ
ラスミドＤＮＡの細胞内送達を媒介することが示されている（Ｆｅｌｇｎｅｒ  ａｎｄ  
Ｒｉｎｇｏｌｄ，Ｎａｔｕｒｅ．１９８９；３３７：３８７）。マウスへのカチオン性脂
質−プラスミド複合体の静脈内注射は、肺におけるＤＮＡの発現をもたらすことが示され
ている（Ｂｒｉｇｈａｍら，Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．１９８９；２９８：２７８）。
また、Ｏｓａｋａら，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．１９９６；８５（６）：６１２−６１８
；Ｓａｎら，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ．１９９３；４：７８１−７８８；
Ｓｅｎｉｏｒら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ．１９
９１；１０７０：１７３−１７９）；Ｋａｂａｎｏｖ  ａｎｄ  Ｋａｂａｎｏｖ，Ｂｉｏ
ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．１９９５；６：７−２０；Ｌｉｕら，Ｐｈａｒｍａｃｅ
ｕｔ．Ｒｅｓ．１９９６；１３；Ｒｅｍｙら，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．１
９９４；５：６４７−６５４；Ｂｅｈｅｒ，Ｊ−Ｐ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈ
ｅｍ．１９９４；５：３８２−３８９；Ｗｙｍａｎら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９７；３６
：３００８−３０１７；Ｍａｒｓｈａｌｌら，に対する米国特許第５，９３９，４０１号
；およびＳｃｈｅｕｌｅら，に対する米国特許第６，３３１，５２４号参照。
【０１７１】
代表的なカチオン性脂質は、例えば、その開示が参照として本明細書に組み入れられる
米国特許第５，２８３，１８５号；および例えば米国特許第５，７６７，０９９号に開示
されたものを含む。好ましい実施形態において、カチオン性脂質は米国特許第５，７６７
，０９９号に開示されたＮ４−スペルミンコレステリルカルバメート（ＧＬ−６７）であ
る。更なる好ましい脂質はＮ４−スペルミジンコレステリルカルバメート（ＧＬ−５３）
および１−（Ｎ４−スペルミン）−２，３−ジラウリルグリセロールカルバメート（ＧＬ
−８９）を含む。
【０１７２】
好ましくは、ウィルスベクターのインビボ投与では、適当な免疫抑制処置を、ウィルス
ベクター、例えば、アデノウィルスベクターと組み合わせて使用して、ウィルスベクター
およびトランスフェクトされた細胞の免疫−脱活性化を回避する。例えば、インターロイ
キン−１２（ＩＬ−１２）、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）または抗−ＣＤ４抗体
のような免疫抑制サイトカインを投与して、ウィルスベクターに対する液性または細胞性
免疫応答をブロックする。その点に関して、最少数の抗原を発現するように設計されたウ
ィルスベクターを使用するのが有利である。
【０１７３】
間接的導入  体細胞は、上記した方法のいずれかを用いて野生型タンパク質をコードす
る構築体にてエクスビボで作製し、個体に再度移植することができる。この方法は、一般
には、Ｓｅｌｄｅｎら，に対する国際公開公報第９３／０９２２２号に記載されている。
加えて、この技術はＰａｙｕｍｏら，Ｃｌｉｎ．Ｏｒｔｈｏｐａｅｄ．ａｎｄ  Ｒｅｌａ
ｔｅｄ  Ｒｅｓ．２００２；４０３Ｓ：Ｓ２２８−Ｓ２４２に記載された細胞ベースの送
達の所有されたＩｍＰＡＣＴ技術で用いられる。そのような遺伝子治療系においては、体
細胞（例えば、線維芽細胞、肝細胞または内皮細胞）を患者から取り出し、インビトロに
て培養し、当該治療に係る遺伝子でトランスフェクトし、特徴付け、患者に再度導入する
。（個体または組織に由来し、継体に先立って作製された）双方の初代細胞、および（イ
ンビボでの導入に先立ってインビトロにて継体した）二次細胞、ならびに当分野で既知の
不滅化細胞系を用いることができる。本発明の方法で有用な体細胞は、限定されるもので
はないが、線維芽細胞、ケラチノサイト、上皮細胞、内皮細胞、神経膠細胞、神経細胞、
血液の形成されたエレメント、筋肉細胞、培養することができる他の体細胞、および体細
胞前駆体のような体細胞を含む。好ましい実施形態において、細胞は線維芽細胞または間
葉幹細胞である。
【０１７４】
受容者初代または二次細胞における外因性遺伝子の発現で必要な更なる配列と共に、外
因性遺伝子および、場合によって、選択マーカーをコードする核酸を含む核酸構築体を用
いて、コードされた産物は生産される初代または二次細胞をトランスフェクトする。その
ような構築体は、限定されるものではないが、レトロウィルス、ヘルペス、アデノウィル
ス、アデノウィルス−関連、おたふく風邪およびポリオウィルスベクターのような感染性
ベクターを含み、この目的で用いることができる。
【０１７５】
経皮送達は、ケラチノサイト、メラノサイト、および樹状細胞を含めた表皮の細胞型を
用いる間接的導入で特に適している（Ｐｆｕｔｚｎｅｒら，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｉ
ｎｖｅｓｔｉｇ．Ｄｒｕｇｓ．２０００；９：２０６９−８３）。
【０１７６】
間葉幹細胞（ＭＳＣ）は、骨髄で生産される非血液−生産幹細胞である。ＭＳＣは分化
し、特殊化された非血液組織に増殖させることができる。レトロウィルスでトランスフェ
クトされた幹細胞は、自己−更新のためのそれらの能力により療法での良好な候補である
。この能力は、遺伝子治療の反復的投与を排除する。別の利点は、もし注射された幹細胞
が標的器官に到達し、次いで、分化するならば、それらは器官における損傷しまたは異常
に形成された細胞を置き換えることができる。
【０１７７】
インビトロ安定性
そのシェルフライフの間における医薬処方の安定性の確保は主な挑戦である。タンパク
質医薬の開発に先立って、有効成分内の固有のまたは潜在的不安定性が研究し、取り組ま
れなければならない。タンパク質およびペプチド治療剤の不安定性が化学的不安定性また
は物理的不安定性として分類される。化学的不安定性の例は加水分解、酸化および脱アミ
ド化である。物理的不安定性の例は凝集、沈殿および表面への吸着である。加えて、タン
パク質はｐＨ、温度、剪断応力、凍結／解凍応力、およびこれらの応力の組合せのような
応力に付すことができる。
【０１７８】
最も普及している処方の問題の１つは生成物の凝集であり、生物活性の喪失をもたらす
。賦形剤の添加はプロセスを遅らせることができるが、それを完全には妨げることはでき
ない。活性の喪失は物理的アッセイによって検出してもよく、またはそうでなくてもよく
、変動の大きな（時々、１５〜２０％）係数でもってバイオアッセイまたは効力アッセイ
で明らかであるに過ぎず、実質的な喪失の決定を困難としている。
【０１７９】
投与すべき置換酵素を安定化させるに加えて、シャペロン化合物の存在によって医薬処
方を約７．０〜約７．５の中性ｐＨでの貯蔵が可能になる。これは、通常はより低いｐＨ
で貯蔵して安定性を維持しなければならない酵素に利点を付与するであろう。例えば、Ｇ
ａａを含めたリソソーム酵素は低いｐＨ（例えば、５．０以下）において安定した立体構
造を維持する。しかしながら、低いｐＨにおける置換酵素の延長された貯蔵は、酵素およ
び／または処方の分解を早めかねない。安定化シャペロン化合物の添加は酸中で置換タン
パク質を貯蔵する必要性を排除できる。
【０１８０】
［実施例］
以下に示す実施例によって本発明を更に記載する。そのような実施例の使用は説明のた
めだけであり、本発明の、およびいずれかの例示された用語の範囲および意味を断じて限
定するものではない。同様に、本発明は本明細書中に記載されたいずれかの特別な好まし
い実施形態に限定されない。事実、本発明の多くの修飾および異形は、本明細書を読むに
際して当業者に明らかであり、その精神および範囲から逸脱することなくなすことができ
る。したがって、本発明は、特許請求の範囲がその権利を有する同等な全範囲と共に特許
請求の範囲の事項によってのみ限定されるべきである。
【０１８１】
［実施例１］
ＤＮＪおよび誘導体の合成
テトラ−Ｏ−ベンジル−１−デオキシノルジマイシン［一般的なイミノ糖調製−１］
【化１６】
2014221759.tif 000018
【０１８２】
乾燥したＣＨ２Ｃｌ２（７５ｍＬ）中のＤＭＳＯ（４．４ｍＬ、０．１２４モル）の溶
液をアルゴン雰囲気下に置き、−７８℃まで冷却した。乾燥したＣＨ２Ｃｌ２（５０ｍＬ
）中の無水トリフルオロ酢酸（６．１ｍＬ、０．０８８モル）の溶液をゆっくりと加え、
温度を−７８℃に維持した。添加が完了した後、反応を更に３０分間撹拌する。ＣＨ２Ｃ
ｌ２中の２，３，４，６−テトラ−Ｏ−ベンジルグルシトール（５．４ｇ、１０ミリモル
）の溶液を滴下する。反応を−７８℃で９０分間撹拌し、次いで、ＣＨ２Ｃｌ２（５０ｍ
Ｌ）中のトリエチルアミン（１１．２ｍＬ、０．０８モル）の添加によってクエンチする
。反応を０℃まで暖め、次いで、ロトバップ（ｒｏｔｏｖａｐ）を用いて濃縮する。残渣
をＭｅＯＨ（７５ｍＬ）で希釈し、ＭｅＯＨ（１０．０ｍＬ、２０．０ミリモル）中の２
Ｍ  ＮＨ３の溶液、続いて、ギ酸（０．７７ｍＬ、２０．０ミリモル）、３Åモレキュラ
シーブおよび最終的に、ＮａＣＮＢＨ３（１．５７ｇ、２５．０ミリモル）を加える。混
合物を室温にて一晩撹拌する。溶媒をロトバップを用いて蒸発させる。残渣をＥｔＯＡｃ
に溶解させ、１０％Ｎａ２ＣＯ３で洗浄し、次いで、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥する。濾過の
後、溶媒を蒸発させ、生成物をフラッシュクロマトグラフィー（ヘキサン中の段階グラジ
エント２０〜４０％ＥｔＯＡｃ）によって精製して、２，３，４，６−テトラベンジル−
１−デオキシノジリマイシンを得る。
【０１８３】
１−デオキシノジリマイシン塩酸塩（化合物１）
【化１７】
2014221759.tif 000019
【０１８４】
ＥｔＯＨ（１００ｍＬ）中の２，３，４，６−テトラベンジル−１−デオキシノジリマ
イシン（５．０ｇ、９．５ミリモル）の溶液を２−ＰｒＯＨ（３．０ｍＬ、１５．０ミリ
モル）中の５Ｎ  ＨＣｌと共に撹拌し、次いで、ロトバップを用いて蒸発させる。残渣を
ＥｔＯＨに溶解させ、ロトバップを用いて再度蒸発させる。残渣をＥｔＯＨ（１５０ｍＬ
）に溶解させ、０．５ｇのＰｄ（ＯＨ）２で室温にて一晩水素化する（５０ｐｓｉ）。触
媒を濾過によって除去し、濾過ケーキをＥｔＯＨ／Ｈ２Ｏおよび、次いで、最後にＥｔＯ
Ｈで洗浄する。濾液をロトバップで蒸発させ、次いで、ＥｔＯＨで共蒸発させて、白色固
体を得る。固体をＥｔＯＨでトリチュレート（ｔｒｉｔｕｒａｔｅｄ）し、濾過して、白
色固体を得る。ＥｔＯＨ／Ｈ２Ｏからの再結晶により、標記化合物を白色固体として得る
。ＭＰ  ２１２−２１５℃，ＭＨ＋＝１６４。
【０１８５】
Ｎ−（２−ヒドロキシエチル−１−デオキシノジリマイシンジメチルカルバメート（化合
物１５）
【化１８】
2014221759.tif 000020
【０１８６】
Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−テトラ−Ｏ−ベンジル−１−デオキシノジリマイシン
ジメチルカルバメート（０．６３ｇ、０．９９ミリモル）を５０ｍｌのメタノールに溶解
させ、１３０マイクロリットルの濃塩酸（１．６ミリモル）および触媒としての２０％水
酸化パラジウム（０．２ｇ、０．３ミリモル）で処理する。不均一な反応混合物を水素の
雰囲気下に置き、１５時間撹拌する。触媒をセライトを通す濾過によって除去し、これを
更にメタノールで洗浄する。濾液をロトバップを用いて濃縮し、クロロホルム：メタノー
ル（４：１）で溶出するフラッシュシリカゲルクロマトグラフィーを用いて粗生成物を精
製する。適当な画分をロトバップを用いて濃縮し、次いで、水から凍結乾燥して、Ｎ−（
２−ヒドロキシエチル）−１−デオキシノジリマイシンジメチルカルバメート誘導体（Ｖ
，化合物１４）（ＭＳ＝２７９．４，Ｍ＋Ｈ）を得る。
【０１８７】
Ｎ−（２−（２，２，２−トリフルオロエトキシエチル）−１−デオキシノジリマイシン
（化合物１９）
【化１９】
2014221759.tif 000021
【０１８８】
トリフルオロエチルエーテル中間体（ＩＸ）（０．４０ｇ、０．６２ミリモル）を１５
０ｍｌのメタノールに溶解させ、１３０マイクロリットルの濃塩酸（１．６ミリモル）お
よび２０％水酸化パラジウム（０．２ｇ、０．３ミリモル）で処理する。不均一な反応混
合物を水素の雰囲気下に置き、パールシェーカーを用いて４０ｐｓｉまで圧縮する。３２
時間後、触媒をセライトを通す濾過によって除去し、これを更なるメタノールで洗浄する
。濾液をロトバップを用いて濃縮し、クロロホルム：メタノール（４：１）で溶出するフ
ラッシュ／シリカ−ゲルクロマトグラフィーを用いて粗生成物を精製する。適当な画分を
ロトバップを用いて濃縮し、次いで、水から凍結乾燥して、Ｎ−（２−（２，２，２−ト
リフルオロエトキシエチル）−１−デオキシノジリマイシンを黄色フォーム（ＭＳ＝２９
０．２，Ｍ＋Ｈ）を得る。
【０１８９】
Ｎ−（メトキシエチル）ＤＮＪ（化合物２０）
【化２０】
2014221759.tif 000022
【０１９０】
２−メトキシエチルアミンをＮＨ３の代わりに用いる以外は一般的なイミノ糖調製−１
を用いて標記化合物を得る。ＭＳ（ＥＳ＋）：２２２［Ｍ＋１］。
【０１９１】
Ｎ−（エトキシエチル）ＤＮＪ（化合物２１）
【化２１】
2014221759.tif 000023
【０１９２】
２−エトキシエチルアミンをＮＨ３の代わりに用いる以外は一般的なイミノ糖調製−１
を用いて標記化合物を得る。ＭＳ（ＥＳ＋）：２５８［Ｍ＋Ｎａ］。
【０１９３】
Ｎ−Ｒ−（−）−テトラヒドロフリルメチル−１−デオキシノジリマイシン（化合物１７
）
【化２２】
2014221759.tif 000024
【０１９４】
６０℃まで暖めつつ、６０ｐｓｉの水素雰囲気下で、テトラヒドロフリルメチル−テト
ラ−Ｏ−ベンジル−１−デオキシノジリマイシンをエタノール中の水酸化パラジウムを用
いて脱ベンジル化する。クロロホルム−メタノール：水酸化アンモニウム（８０：２０：
２）の混合物で溶出するフラッシュシリカ−ゲルクロマトグラフィーを用いて粗生成物を
精製して、標記化合物の遊離塩基を白色フォームとして得る。次いで、精製された遊離塩
基を２−プロパノール中の１．０当量の無水塩酸での処理によって塩酸塩に変換する。溶
媒をロトバップを用いる蒸発によって除去して、所望の塩酸塩を白色固体として得る（Ｍ
Ｓ＝２４８．２，Ｍ＋Ｈ）。
【０１９５】
Ｎ−Ｓ−（＋）−テトラヒドログラニルメチル−１−デオキシノジリマイシン（化合物１
８）
【化２３】
2014221759.tif 000025
【０１９６】
６０℃まで暖めつつ、６０ｐｓｉの水素雰囲気下で、Ｎ−Ｓ−（＋）−テトラヒドログ
ラニルメチル−テトラ−Ｏ−ベンジル−１−デオキシノジリマイシンをメタノール中の水
酸化パラジウムを用いて脱ベンジル化する。クロロホルム：メタノール：水酸化アンモニ
ウム（８０：２０：２）の混合液で溶出するフラッシュシリカ−ゲルクロマトグラフィー
を用いて粗生成物を精製して、標記化合物を白色フォームとして得る（ＭＳ＝２４８．２
，Ｍ＋Ｈ）。
【０１９７】
Ｎ−エチル−ＤＮＪ（化合物３）［一般的なイミノ糖調製−２］
【化２４】
2014221759.tif 000026
【０１９８】
１−ＤＮＪ（１．０ｇ、６．１ミリモル）、メタノール（６０ｍＬ）、ＤＩ水（３．０
ｍＬ）、アセトアルデヒド（６．２ｇ、１４１ミリモル）およびＰｄブラック（５０ｍｇ
）の混合物を迅速に撹拌し、Ｈ２の６０ｐｓｉ圧力下で２０〜２２℃にて２０時間水素化
する。触媒をセライト−５４５のベッドを通す濾過によって除去する。濾液をロトバップ
を用いて蒸発させる。非揮発性残渣をフラッシュシリカゲルカラムに適用し、塩化メチレ
ン：メタノール：２９％の濃ＮＨ４ＯＨ（７０：３０：５）からなる混合液で溶出させる
。適当な画分を収集し、合わせ、ロトバップを用いて蒸発させる。凍結乾燥により所望の
単離された生成物を得る。融点１６８．３〜１６９．６℃，ｍ／ｚ１９２（ＥＳ，［Ｍ＋
Ｈ］＋）。
【０１９９】
Ｎ−プロピル−ＤＮＪ（化合物４）
【化２５】
2014221759.tif 000027
【０２００】
１−ＤＮＪ（１．０ｇ、６．１ミリモル）、メタノール（６０ｍＬ）、ＤＩ水（１０．
０ｍＬ）、プロピオンアルデヒド（８．１，１３９ミリモル）およびＰｄブラック（１０
０ｍｇ）の混合物を迅速に撹拌し、Ｎ−エチル−ＤＮＪの調製で記載したのと同様な条件
を用いて処理する。標記化合物を白色固体として得る。融点：５６．６〜５７．２℃，ｍ
／ｚ２０６（ＥＳ，［Ｍ＋Ｈ］＋）。
【０２０１】
Ｎ−ペンチル−ＤＮＪ（化合物６）
【化２６】
2014221759.tif 000028
【０２０２】
１−ＤＮＪ（１．０ｇ、６．１ミリモル）、メタノール（１００ｍＬ）、ＤＩ水（１０
．０ｍＬ）、バレルアルデヒド（４．２２ｇ、４９ミリモル）およびＰｄブラック（１０
０ｍｇ）の混合物を迅速に撹拌し、Ｎ−エチル−ＤＮＪの調製で記載したのと同様な条件
を用いて処理する。標記化合物を白色固体として得る。融点：７０〜７１℃，ｍ／ｚ２３
４（ＥＳ，［Ｍ＋Ｈ］＋）。
【０２０３】
Ｎ−ヘキシル−ＤＮＪ（化合物７）
【化２７】
2014221759.tif 000029
【０２０４】
１−ＤＮＪ（１．０ｇ、６．１ミリモル）、メタノール（１００ｍＬ）、ＤＩ水（３．
０ｍＬ）、ヘキサナール（４．３ｇ、４２．９ミリモル）およびＰｄブラック（５０ｍｇ
）の混合物を迅速に撹拌し、Ｎ−エチル−ＤＮＪの調製で記載したのと同様な条件を用い
て処理する。標記化合物を白色固体として得る。融点：６４．４〜６５．６℃，ｍ／ｚ２
４８（ＥＳ，［Ｍ＋Ｈ］＋）。
【０２０５】
Ｎ−ヘプチル−ＤＮＪ（化合物８）
【化２８】
2014221759.tif 000030
【０２０６】
１−ＤＮＪ−ＨＣｌ（１．０ｇ、５．０ミリモル）、メタノール（１００ｍＬ）、ヘプ
タアルデヒド（４．９ｇ、４２．９ミリモル）およびＰｄブラック（５０ｍｇ）の混合物
を迅速に撹拌し、Ｎ−エチル−ＤＮＪの調製で記載したのと同様な条件を用いて処理する
。標記化合物を白色固体として得る。融点：１０７〜１０８℃，ｍ／ｚ２６２（ＥＳ，［
Ｍ＋Ｈ］＋）。
【０２０７】
Ｎ−オクチル−ＤＮＪ（化合物９）
【化２９】
2014221759.tif 000031
【０２０８】
１−ＤＮＪ−ＨＣｌ（１．０ｇ、５．０ミリモル）、メタノール（１００ｍＬ）、オク
チルアルデヒド（４．９ｇ、４２．９ミリモル）およびＰｄブラック（５０ｍｇ）の混合
物を迅速に撹拌し、Ｎ−エチル−ＤＮＪの調製で記載したのと同様な条件を用いて処理す
る。標記化合物を白色固体として得る。融点：１９３〜１９５℃，ｍ／ｚ２７６（ＥＳ，
［Ｍ＋Ｈ］＋）。
【０２０９】
Ｎ−（（ベンゾフラン−２−イル）メチル）デオキシノジリマイシン（化合物３０）
【化３０】
2014221759.tif 000032
【０２１０】
ＥｔＯＨ（３０ｍＬ）中のデオキシノジリマイシン塩酸（０．５ｇ、２．５ミリモル）
の懸濁液をベンゾフラン−２−カルボキシアルデヒド（０．５５ｇ、３．７５ミリモル）
、ＨＯＡｃ（０．１５ｍＬ、３．７５ミリモル）およびシアノホウ水素化ナトリウム（０
．２３ｇ、３．７５ミリモル）で処理する。混合物を室温にて２４〜３６時間撹拌する。
溶媒をロトバップを用いて蒸発させ、残渣を９／１のＭｅＯＨ／ＮＨ４ＯＨの混合液に溶
解させ、シリカ上で蒸発させる。精製は、ＣＨＣｌ３中の０〜２０％（９／１  ＭｅＯＨ
／ＮＨ４ＯＨ）のグラジエントでのフラッシュクロマトグラフィーを用いて達成される。
適当な画分を合わせ、溶媒を蒸発させて、標記化合物を白色固体として得る。融点１６９
〜１７５℃。ＭＨ＋＝２９４。
【０２１１】
Ｎ−（（ベンゾチオヘン−３−イル）メチル）デオキシノジリマイシン（化合物３１）
【化３１】
2014221759.tif 000033
【０２１２】
ゼンゾチオヘン−３−カルボキシアルデヒドをベンゾフラン−２−カルボキシアルデヒ
ドの代わりに用いる以外は上記で直接的に化合物について記載した方法を用いて、標記化
合物を白色固体として得る。融点１４５〜１４９℃。ＭＨ＋＝３１０。
【０２１３】
Ｎ−（（フラン−２−イル）メチル）デオキシノジリマイシン（化合物２９）
【化３２】
2014221759.tif 000034
【０２１４】
フルフラールをベンゾフラン−２−カルボキシアルデヒドの代わりに用いる以外は上記
で直接的に化合物について記載した方法を用いて、標記化合物を無色油として得る。ＭＨ
＋＝２４４。
【０２１５】
Ｎ−（（１，４−ベンゾジオキサン−６−イル）メチル）デオキシノジリマイシン（化合
物２８）
【化３３】
2014221759.tif 000035
【０２１６】
１，４−ベンゾジオキサン−６−カルボキシアルデヒドをベンゾフラン−２−カルボキ
シアルデヒドの代わりに用いる以外は上記で直接的に化合物について記載した方法を用い
て、標記化合物をアモルファス固体として得る。ＭＨ＋＝３１２。
【０２１７】
Ｎ−シクロプロピルメチル−１−デオキシノジリマイシン（化合物１１）［一般的なイミ
ノ糖調製−３］
【化３４】
2014221759.tif 000036
【０２１８】
１−デオキシノジリマイシン（Ｔｏｒｏｎｔｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ
ｓ，カタログ番号Ｄ２４５０００，３．０ｇ、１８．４ミリモル）を３００ｍｌの無水メ
タノールに溶解させ、シクロプロパンカルボキシアルデヒド（Ａｌｄｒｉｃｈ，２．５ｍ
ｌ，３３．１ミリモル）と合わせる。３オングストロームのモレキュラシーブ（６．０ｇ
）加え、混合物を１５分間撹拌する。ＭＰ−シアノボロハイドライド（Ａｒｇｏｎａｕｔ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，１９．２ｇ、４６．０ミリモル）、続いて氷酢酸（１．１
ｍｌ、１８．４ミリモル）を加える。反応混合物を４８時間で４５℃まで暖める。溶液を
ロトバップを用いて濃縮し、まずクロロホルム、次いで、５：１のクロロホルム：メタノ
ール／水酸化アンモニウム（１０／１）、次いで、３：１のクロロホルム：メタノール／
水酸化アンモニウム（１０／１）、および最後に、１：１クロロホルム：メタノール／水
酸化アンモニウム（１０／１）で溶出するフラッシュシリカ−ゲルクロマトグラフィーを
用いて粗生成物を精製する。ロトバップを用いる適当な画分の濃縮に際し、標記化合物が
白色フォームとして単離される（ＭＳ＝２１８．８，Ｍ＋Ｈ）。
【０２１９】
４−トリフルオロメチル（ベンジル）−ＤＮＪ（化合物２３）およびアルファ−シアノ−
４−トリフルオロメチル（ベンジル）−ＤＮＪ（化合物２４）
【化３５】
2014221759.tif 000037
【０２２０】
一般的なイミノ糖調製−３を用い、１−デオキシノジリマイシン（３００ｍｇ、１．８
３９ミリモル）、４−トリフルオロメチルベンズアルデヒド（Ａｌｄｒｉｃｈ，５７６．
２ｍｇ、３．３０９ミリモル）、ＭＰ−シアノボロハイドライド（Ａｒｇｏｎａｕｔ  Ｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  １．９２ｇ、４．５９６ミリモル）、酢酸（１１０．４ｍｇ
、１．８３９ミリモル）を合わせ、一般的手法に記載したように撹拌する。精製は、まず
クロロホルム、次いで、１０：１クロロホルム：メタノール／水酸化アンモニウム（１０
：１）、次いで、８：１のクロロホルム：メタノール／水酸化アンモニウム（１０：１）
、次いで、６：１のクロロホルム：メタノール／水酸化アンモニウム（１０：１）、次い
で、４：１のクロロホルム：メタノール／水酸化アンモニウム（１０：１）で溶出するフ
ラッシュシリカ−ゲルクロマトグラフィーを用いて達成して、４−トリフルオロメチル（
ベンジル）−ＤＮＪを白色固体として（ＭＳ＝３２２，Ｍ＋Ｈ）およびアルファ−シアノ
−４−トリフルオロメチル（ベンジル）−ＤＮＪを白色固体（ＭＳ＝３４７，Ｍ＋Ｈ）と
して得る。
【０２２１】
４−トリフルオロメトキシ（ベンジル）−ＤＮＪ（化合物２５）
【化３６】
2014221759.tif 000038
【０２２２】
一般的イミノ糖調製−３を用い、１−デオキシノジリマイシン（３００ｍｇ、１．８３
９ミリモル）、４−トリフルオロメトキシベンズアルデヒド（Ａｌｄｒｉｃｈ，６２９．
２ｍｇ、３．３０９ミリモル）、ＭＰ−シアノボロハイドライド（Ａｒｇｏｎａｕｔ  Ｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，１．９２ｇ、４．５９６ミリモル）、酢酸（１１０．４ｍｇ、
１．８３９ミリモル）を合わせ、一般的手法に記載したように撹拌する。精製はまずクロ
ロホルム、次いで、１０：１のクロロホルム：メタノール／水酸化アンモニウム（１０：
１）、次いで、８：１のクロロホルム：メタノール／水酸化アンモニウム（１０：１）、
次いで、６：１のクロロホルム：メタノール／水酸化アンモニウム（１０：１）、次いで
、４：１のクロロホルム：メタノール／水酸化アンモニウム（１０：１）で溶出するフラ
ッシュシリカ−ゲルクロマトグラフィーを用いて達成して、標記化合物を白色固体として
得る（ＭＳ＝３３８，Ｍ＋Ｈ，融点１０１〜１０３℃）。
【０２２３】
４−ｎ−ブトキシ（ベンジル）−ＤＮＪ（化合物２７）
【化３７】
2014221759.tif 000039
【０２２４】
一般的なイミノ糖調製−３を用い、１−デオキシノジリマイシン（１．０ｇ、６．１ミ
リモル）、４−ブトキシベンズアルデヒド（Ａｌｄｒｉｃｈ，２．０ｇ、１１．２ミリモ
ル）、ＭＰ−シアノボロハイドライド（Ａｒｇｏｎａｕｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，
６．４ｇ、１５．３ミリモル）、酢酸（０．３７ｍｌ，６．４ミリモル）を合わせ、一般
的な手法に記載したように撹拌する。精製はまずクロロホルム、次いで、１０：１のクロ
ロホルム：メタノール／水酸化アンモニウム（１０：１）、次いで、８：１のクロロホル
ム：メタノール／水酸化アンモニウム（１０：１）、次いで、６：１のクロロホルム：メ
タノール／水酸化アンモニウム（１０：１）、次いで、４：１のクロロホルム：メタノー
ル／水酸化アンモニウム（１０：１）で溶出するフラッシュシリカ−ゲルクロマトグラフ
ィーを用いて達成して、標記化合物を白色固体として得る（融点１５３〜１５５℃）。
【０２２５】
４−ｎ−ペントキシ（ベンジル）−ＤＮＪ（化合物２６）
【化３８】
2014221759.tif 000040
【０２２６】
一般的なイミノ糖調製−３を用い、１−デオキシノジリマイシン（１．０ｇ、６．１ミ
リモル）、４−ブトキシベンズアルデヒド（Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ，２．２ｇ、１１．２
ミリモル）、ＭＰ−シアノボロハイドライド（Ａｒｇｏｎａｕｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉ
ｅｓ，６．４ｇ、１５．３ミリモル）、酢酸（０．３７ｍｌ，６．４ミリモル）を合わせ
、一般的手法に記載したように撹拌する。精製はまずクロロホルム、次いで、１０：１の
クロロホルム：メタノール／水酸化アンモニウム（１０：１）、次いで、８：１のクロロ
ホルム：メタノール／水酸化アンモニウム（１０：１）、次いで、６：１クロロホルム：
メタノール／水酸化アンモニウム（１０：１）、次いで、４：１のクロロホルム：メタノ
ール／水酸化アンモニウム（１０：１）で溶出するフラッシュシリカ−ゲルクロマトグラ
フィーを用いて達成して、標記化合物を白色固体として得る（ＭＳ＝３４０，Ｍ＋Ｈ；融
点１５５〜１５７℃）。
【０２２７】
Ｎ−（１−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−４−ピペリジニルメチル）−１−デオキ
シノジリマイシン（化合物１６）
【化３９】
2014221759.tif 000041
【０２２８】
一般的イミノ糖調製−３を用い、１−デオキシノジリマイシン（５００ｍｇ、３．０６
４ミリモル）、１−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−４−ピペリジンカルボキシアル
デヒド（ＣＮＨ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，１．１８ｇ、５．５１６ミリモル）、ＭＰ
−シアノボロハイドライド（Ａｒｇｏａｕｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，３．１９ｇ、
４．５９６ミリモル）、酢酸（１８４ｍｇ、３．０６４ミリモル）を合わせ、一般的手法
に記載したように撹拌する。精製はまずクロロホルム、次いで、１０：１のクロロホルム
：メタノール／水酸化アンモニウム（１０：１）で溶出するフラッシュシリカ−ゲルクロ
マトグラフィーを用いて達成して、Ｎ−（１−（ｔｅｒｔブトキシカルボニル）−４−ピ
ペルジニルメチル）−１−デオキシノジリマイシンを灰色がかった白色固体として得る（
ＭＳ＝３６１、Ｍ＋Ｈ、融点４６〜５０℃）
【０２２９】
Ｎ−シクロペンチル−メチル−１−デオキシノジリマイシン（化合物１２）
【化４０】
2014221759.tif 000042
【０２３０】
一般的なイミノ糖調製−３を用い、１−デオキシノジリマイシン（５００ｍｇ、３．０
６４ミリモル）、シクロペンタンカルボキシアルデヒド（Ａｌｄｒｉｃｈ、５４１ｍｇ、
５．５１６ミリモル）、ＭＰ−シアノボロハイドライド（Ａｒｇｏｍａｕｔ  Ｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｉｅｓ，３．１９ｇ、７．６６１ミリモル）、酢酸（１８４ｍｇ、３．０６４ミ
リモル）を合わせ、一般的な手法に記載したように撹拌する。精製はまずクロロホルム  
８：１クロロホルム：メタノール／水酸化アンモニウム（１０：１）、次いで、４：１の
クロロホルム：メタノール／水酸化アンモニウム（１０：１）で溶出するフラッシュシリ
カ−ゲルクロマトグラフィーを用いて達成して、Ｎ−シクロペンチルメチル−１−デオキ
シノジリマイシンを粘性黄褐色油として得る（ＭＳ＝２４６、Ｍ＋Ｈ）。
【０２３１】
Ｃ−１−α−ノニル−１−デオキシノジリマイシンおよびＣ−１−β−ノニル−１−デオ
キシノジリマイシン（化合物３２）［一般的なイミノ糖調製−４］
【化４１】
2014221759.tif 000043
【０２３２】
Ｂｏｓｈａｇｅｎ，Ｇｅｉｇｅｒ  ａｎｄ  Ｊｕｎｇｅ（Ａｎｇｅｗａｎｔｅ  Ｃｈｅ
ｍｉｅ，Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，２０（９），８０６−８０７（１９８１））によっ
て記載されたのと類似の手法を用い、１−α−シアノ−１−デオキシノジリマイシンをＭ
ａｒｃｕｃｃｉｏ（国際公開公報第００／５６７１３号）（１．０ｇ、５．３ミリモル）
の方法に従って調製し、ヘキサメチルジシラザン（１１ｍｌ）に懸濁させる。懸濁液をイ
ミダゾール（１５６．３３ｍｇ、２．５ミリモル）で処理し、アルゴン雰囲気下にて５時
間で６０℃まで加熱する。混合物を濾過して、固体を除去し、ロトバップを用いて濾液を
５５〜６０℃にて濃縮する。残渣を乾燥したＴＨＦ（５０ｍＬ）に溶解させ、ｎ−ノニル
マグネシウムブロマイドの溶液（エーテル中１Ｍ、３１．９ミリモル、３８ｍＬ）を１５
〜２０℃で加える。混合物を室温まで温め、５時間撹拌する。混合物を氷浴中で冷却し、
１Ｎ  ＨＣｌ（３０ｍＬ）と共に３時間撹拌する。混合物のｐＨを２Ｎ  ＮａＯＨを加え
ることによって８．０に調整する。有機層を除去し、水性相を凍結乾燥する。残渣をメタ
ノール（５０ｍＬ）に溶解させ、濾過して、固体を除去する。濾液を真空下で蒸発乾固す
る。蒸発の後に得られた残渣を、塩化メチレン：メタノール：２９％ＮＨ４ＯＨ（８５：
１５：１．５）を用いるシリカゲルコラムでのクロマトグラフィーに付す。β−異性体（
Ｒｆ  ０．５）を含有する適当な画分を合わせ、ロトバップを用いて蒸発させ、次いで、
凍結乾燥して、Ｃ−１−β−ノニル−ＤＮＪを得る（ＭＳ＝ｍ／ｚ２９０）。
【０２３３】
Ｃ１−α−ブチル−ＤＮＪ（化合物３３）
【化４２】
2014221759.tif 000044
【０２３４】
一般的なイミノ糖調製−４を用い、１−α−シアノ−１−デオキシノジリマイシン（２
．０ｇ、９．５ミリモル）をＣ−１−α−ブチル−ＤＮＪに変換する。生成物を以下の比
率：８５：１５：１．５）の塩化メチレン：メタノール：２９％ＮＨ４ＯＨを用いるシリ
カゲルクロマトグラフィーによって精製する。α−異性体（Ｒｆ０．３）を含有する適当
な画分を合わせ、蒸発させて、溶媒を除去し、凍結乾燥して、標記化合物を得る（ＭＳ＝
ｍ／ｚ２２０）
【０２３５】
１−α−ベンジル−ＤＮＪ（化合物３５）
【化４３】
2014221759.tif 000045
【０２３６】
一般的なイミノ糖調製−４を用い、テトラ−（Ｏ−トリメチルシリル）−１−α−シア
ノ−１−デオキシノジリマイシン（２．０ｇ、９．４４８ミリモル）を調製する。保護さ
れた化合物を乾燥したＴＨＦ（２０ｍｌ）に溶解させ、ベンジルマグネシウムブロマイド
（ＴＨＦ中２．０Ｍ、２０ｍＬ）を滴下する。混合物を撹拌し、４５℃にて一晩加熱する
。混合物を室温まで冷却し、２Ｎ  ＨＣｌ（３０ｍＬ）を加え、混合物を３時間撹拌する
。ロトバップを用いて溶媒を蒸発させ、残渣を２９％ＮＨ４ＯＨの溶液で処理して、酸を
中和する。溶液をエーテル（２×２０ｍＬ）で洗浄し、水性相を分離し、凍結乾燥する。
固体を塩化メチレン：メタノール：２９％ＮＨ４ＯＨ（８０：２０：４）と共に撹拌し、
濾過し、濾液をロトバップを用いて蒸発させる。残渣を、塩化メチレン：メタノール：２
９％ＮＨ４ＯＨ（８０：２０：４）を用いるシリカゲルカラムでのクロマトグラフィーに
付す。α−異性体（Ｒｆ０．３）を含有する適当な画分を合わせ、ロトバップを用いて蒸
発させ、次いで、凍結乾燥して標記化合物を得る（融点＝７３〜７４℃、ＭＳ＝ｎ／ｚ２
５４）。１Ｈ−ＮＭＲ，３００ＭＨｚ（Ｄ２Ｏ）２．２８（ｍ，２Ｈ），２．５５（ｄｄ
ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．８，５．６，１０Ｈｚ），２．９９（ｍ，２Ｈ），３．０６（ｄｄ、
１Ｈ，Ｊ＝２．８，１３．６Ｈｚ），３．１１（ｍ，１Ｈ），３．２２（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ
＝７．６，１１．２Ｈｚ），３．５６（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．２，１１．６Ｈｚ），およ
び７．２（ｍ、５Ｈ）。
【０２３７】
［実施例２］
ＧａａのＤＮＪおよびＤＮＪ誘導体での増強
以下に記載する実験は、糖脂質合成を担う酵素の既知の阻害剤であるＤＮＪおよびＤＮ
Ｊ誘導体をＮ−ブチル−ＤＮＪを用いて、糖脂質合成を阻害することなく突然変異体Ｇａ
ａに結合し、その活性を増強することができることを示す。
【０２３８】
方法
細胞培養およびシーディング  ＰＭ１１（Ｐ５４５Ｌ）、ＰＭ８およびＰＭ１２（共に
スライシング欠陥）、線維芽細胞系を増強実験で用いた。これらの細胞はポンペ患者から
単離した線維芽細胞である。細胞を、滅菌された底が黒色透明の９６ウェルＣｏｓｔａｒ
プレートにて１８０μＬ培地中にウェル当たり約５０００細胞で蒔き、５％ＣＯ２にて３
７℃で約３〜６時間インキュベートする。培地は１０％ＦＢＳおよび１％ペニシリン／ス
トレプトマイシンを含むＤＭＥＭからなるものであった。
【０２３９】
薬物処理  全てのテスト化合物を１：１ＤＭＳＯ：Ｈ２Ｏを１００ｍＭストック濃度ま
で溶解させる。別の滅菌された底が黒色透明のＣｏｓｔａｒプレートを用いる細胞の系列
希釈は以下のように行った：
１．２０μＬＬの１：１  ＤＭＳＯ：Ｈ２Ｏおよび１８０μＬの培地を、培地中５％Ｄ
ＭＳＯ、５％Ｈ２Ｏの濃度について、列３〜１１および列１、行Ｅ〜Ｈに加えた。
２．２０μＬの１００ｍＭ  ＤＮＪおよび１８０μＬの培地を、１０ｍＭ  ＤＮＪの濃
度について、列１、行Ａ〜Ｄに加えた。
３．テストすべき３０μＬの各１００ｍＭストック溶液を、１０ｍＭの濃度について、
２７０μＬの培地と共に列２中の適当なウェルに加えた。
４．列１を、マルチ−チャネルピペットを用いて３回上下に混合した。
５．列２を上記したように混合し、１００μＬを列２から列３に移した。列３を上記し
たように混合し、１００μＬを１１を通って列４の各々に順次移して（列１２は左側ブラ
ンク）、系列的な３倍希釈を生じさせた。
４．表１に従い、２０μＬを系列希釈プレートから移した。
５．プレートを３７℃、５％ＣＯ２にて６日間インキュベートし、１日は投与の日に等
しい。
【０２４０】
酵素活性アッセイ  細胞を２００μＬのｄＰＢＳで２回洗浄し、続いて、クエン酸−リ
ン酸緩衝液（３０ｍＭクエン酸ナトリウム、４０ｍＭ二塩基性リン酸ナトリウム、ｐＨ４
．０）中の７０μＬの基質（２．１１ｍＭ  ３ｍＭ  ４−ＭＵ−α−Ｄ−ｇｌｕ）、およ
び２．５％ＤＭＳＯを列１〜１２に加えた。５％ＣＯ２での３７℃における約３時間のイ
ンキュベーションに続き、７０μＬの停止緩衝液（０．４Ｍグリシン、ｐＨ１０．８）を
列１〜１２に加えた。プレートをＶｉｃｔｏｒ２マルチ標識カウント−Ｗａｌｌａｃ蛍光
プレートリーダーで読み、Ｆ４６０ｎｍにおける蛍光を、ウェル当たり１秒の読み時間を
用い、３５５ｎｍの励起および４６０ｎｍの発光にて測定した。上清中のタンパク質μｇ
当たりの酵素活性を、発光された蛍光の量から計算し、これは加水分解された基質の量お
よび、よって、溶解物中のＧａａ活性の量に直接的に比例する。増強比率は、ＤＮＪ誘導
体の存在下でのＧａａ活性を、化合物を含まないＧａａ活性で割ったＧａａ活性である。
【０２４１】
結果
ＤＮＪ、ＮＢ−ＤＮＪ、およびＮ−（シクロプロピル）メチルＤＮＪ  図１に示すよう
に、ＤＮＪ（１）、Ｎ−ブチル−ＤＮＪ、（５）およびＮ−（シクロプロピル）メチルＤ
ＮＪ（１１）で処理した細胞は、ＰＭ１１細胞系における未処理対照細胞と比較して、Ｇ
ａａ活性の用量−依存性増加を呈した。ＤＮＪの最高濃度である１ｍＭは、未処理細胞に
おけるＧａａ活性と比較してＧａａ活性を約７．８倍増大させる（データは示さず）。
【０２４２】
ＤＮＪおよびＮＢ−ＤＮＪは、５０μＭの濃度においてＰＭ１２細胞系でのＧａａ活性
を有意に増加させた（２倍を超える）。ＤＮＪによるＰＭ８細胞系でのＧａａ活性の増加
もまた観察されなかった（データは示さず）。ＤＮＪおよびＮＢ−ＤＮＪによるＧａａの
増強は用量依存性であり、プラトーに先立って３．０〜１００μＭの範囲において示され
た増大する増強が伴う。
【０２４３】
他のＤＮＪ誘導体  表１および２に報告するように、以下の、ＤＮＪ誘導体Ｎ−メチル
−ＤＮＪ、Ｎ−（２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミド）エチルオキシ−ＤＮＪ（１５）、Ｎ−
４−ｔ−ブチルオキシカルボニル−ピペリジニルメチル−ＤＮＪ（１６）、Ｎ−２−Ｒ−
テトラヒドロフラニルメチル−ＤＮＪ（１７）、Ｎ−２−Ｒ−テトラヒドロフラニルメチ
ル−ＤＮＪ（１８）、Ｎ−（２−（２，２，２−トリフルオロエトキシ）エチル−ＤＮＪ
（１９）、Ｎ−２−メトキシエチル−ＤＮＪ（２０）、Ｎ−２−エトキシエチル−ＤＮＪ
（２１）、Ｎ−４−トリフルオロメチルベンジル−ＤＮＪ（２３）、Ｎ−アルファ−シア
ノ−４−トリフルオロメチルベンジル−ＤＮＪ（２４）、Ｎ−４−トリフルオロメトキシ
ベンジル−ＤＮＪ（２５）、Ｎ−４−ｎ−ペントキシベンジル−ＤＮＪ（２６）、および
Ｎ−４−ｎ−ブトキシベンジル−ＤＮＪ（２７）もまたＰＭ−１１におけるＧａａ活性を
有意に増大させた。Ｎ−メチルＤＮＪおよびＮ−カルボキシペンチルＤＮＪを用いる増大
したＧａａ活性は約３〜１００μＭから用量依存性であった（データは示さず）。
【０２４４】
％Ｅｍａｘは、１ｍＭ  ＤＮＪの存在下で観察された増強に対する実験化合物のパーセ
ント最大増強をいう。それは、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍバージョン３．０２を用い
て分析された理論的非線形回帰曲線の頂部として計算される。増強は、１ｍＭ  ＤＮＪの
存在下における平均最大カウントに対して、および化合物の不存在下における最小平均カ
ウントに対して正規化された複数蛍光カウントの平均として定義される。蛍光カウントは
バックグラウンドを差し引いた。バックグラウンドは細胞の存在から不存在を引いた平均
カウントによって定義される。ＥＣ５０（μＭ）とは、Ｅｍａｘの５０％を達成する化合
物の濃度をいう。
【０２４５】
特定のメカニズムに限定されるものではないが、ＤＮＪおよびＤＮＪ誘導体はＥＲにお
ける突然変異体Ｇａａに結合し、突然変異したタンパク質の適切なフォールディングを誘
発し、該酵素がＥＲを出て、リソソームまでトラフィッキングされるのを可能とし、そこ
で、それはいくらかの酵素活性を呈することができると推定される。
【０２４６】
【表１】
2014221759.tif 000046
【０２４７】
【表２】
2014221759.tif 000047
【０２４８】
［実施例３］
ＤＮＪおよびＤＮＪ誘導体での処理に際してのインビボＧａａ活性
薬物の投与  本実施例は、マウスに対するＤＮＪ誘導体の効果についての情報を提供す
る。ＤＮＪ誘導体テスト化合物を０、１ｍｇ／ｋｇ／日；１０ｍｇ／ｋｇ／日；および１
００ｍｇ／ｋｇ／日においてマウスに投与した；器官および血漿を実験の開始から２およ
び４週間後に収集した群当たり２０匹の雄Ｃ５７ＢＬ６（２５ｇ）を用いた。薬物を飲料
水中で与え、従って、水の消費を毎日モニターした。
【０２４９】
対照群（０ｍｇ／ｋｇ／日）においては、飲料水（薬物なし）にてマウスに毎日投与し
、２つの群に分けた。処理から２週間後に１０匹の動物を安楽死させ、血液を下行大動脈
または大静脈から収集し、組織を摘出し、次いで、剖検した。処理から４週間後に残りの
１０匹の動物を安楽死させ、同一の評価に付した。
【０２５０】
最初のテスト群においては、２０匹のマウスに１ｍｇ／ｋｇ−日の投与目的で飲料水中
にて毎日投与した（２５ｇのマウスは毎日５ｍＬ／日の飲水速度を有し、従って、飲料水
は０．０２５ｍｇ／５ｍｌまたは５マイクログラム／ｍｌの濃度を有するはずであると仮
定）。対照と同様に、１０匹のマウスを処理から２週間後に安楽死させ、評価した。処理
から４週間後に、残りの１０匹のマウスを安楽死させ、評価する。
【０２５１】
１０ｍｇ／ｋｇ−日を目的とするテスト化合物では、２０匹のマウスに飲料水中にて毎
日投与し（５０マイクログラム／ｍｌの化合物濃度と見積もる）、上記した群について記
載されたようにテスト用の２つの群に分けた。
【０２５２】
１００ｍｇ／ｋｇ−日を目的とするテスト化合物では、２０匹のマウスに飲料水中で毎
日投与し（５００マイクログラム／ｍｌの化合物濃度と見積もる）、２つの群に分け、上
記した群について記載されたようにテストした。
【０２５３】
血液試料はリチウムヘパリンに吸い取り、血漿のために回転させた。出血の後、心臓、
肝臓、腓腹筋、ヒラメ筋、舌、腎臓および脳を摘出し、バイアルに入れた。バイアルを迅
速な凍結のためにドライアイスに入れた。次いで、Ｇａａおよびグリコーゲンの組織レベ
ルについて組織および血漿を分析した。
【０２５４】
組織調製  組織の小さな割合を取り出し、５００μｌの溶解緩衝液（０．１％トリトン
Ｘ−１００を含む、２０ｍＭクエン酸ナトリウムおよび４０ｍＭリン酸水素二ナトリウム
、ｐＨ４．０）に加えた。次いで、ミクロホモゲナイザーを用いて組織を短時間で均質化
し、続いて、１０，０００ｒｐｔにおいて４℃にて１０分間遠心した。上清を新しいチュ
ーブに移し、酵素アッセイのために用いた。
【０２５５】
組織酵素アッセイ  （９６−ウェルプレート中の）２．５μｌの上清に１７．５μｌの
反応緩衝液（クエン酸リン酸緩衝液、トリトンを含まず）、および５０μｌの４−メチル
ウンベルフェロン（４−ＭＵ）−標識基質、α−グルコピラノシド、または標識された陰
性対照、β−グルコピラノシドおよびα−ガラクトピラノシドを加えた。プレートを３７
℃にて１時間インキュベートし、続いて、７０μｌの停止緩衝液（０．４Ｍグリシン−Ｎ
ａＯＨ、ｐＨ１０．６）を加えた。Ｇａａの活性は、ウェル当たり１秒のリアルタイムを
用いて３５５ｎｍで励起することにより４６０ｎｍでの吸光度を測定することによって決
定した（Ｖｉｃｔｏｒ２マルチ標識カウンター−Ｗａｌｌａｃ）。酵素活性を加えた溶解
物の１μｌ中の量に対して正規化し、溶解物１μｌ当たりの酵素活性を見積もった。増強
比率は、化合物なくしての活性を超える化合物ありでの活性と等しい。
【０２５６】
結果
図２Ａ〜Ｄおよび３Ａ〜Ｄによって示されるように、Ｇａａレベルは、脳、肝臓、腓腹
筋、舌（図２Ａ〜Ｄ）および、腎臓、横隔膜、心臓およびヒラメ筋（図３Ａ〜Ｄ）におい
ても、ＤＮＪおよびＮ−ブチル−ＤＮＪでの２週間の処理の後に増大した。結果は直線的
傾向について有意であった。ＤＮＪでは、増加は、脳、腓腹筋、舌、腎臓、横隔膜、心臓
およびヒラメ筋においては用量−依存的であった（直線傾向については有意）。Ｎ−ブチ
ル−ＤＮＪでは、増加は脳、肝臓、腓腹筋、舌および腎臓において用量−依存的であった
。
【０２５７】
４週間の処理の後、Ｇａａ活性は、脳、肝臓、腓腹筋、および舌（図４Ａ〜Ｄ）および
、腎臓、横隔膜、心臓およびヒラメ筋（図５Ａ〜Ｄ）においても、ＤＮＪでの処理の後に
観察された。Ｎ−ブチルＤＮＪでの結果は、増加が観察されなかった横隔膜、心臓および
ヒラメ筋を除いて同様であった。増加は、脳、腓腹筋、舌、腎臓（ＤＮＪのみ）、横隔膜
（ＤＮＪのみ）、心臓（ＤＮＪのみ）、およびヒラメ筋（ＤＮＪのみ）において用量−依
存的であるように見えた。
【０２５８】
これらの結果により、特定の薬理学的シャペロンはインビボにて突然変異していないＧ
ａａの活性を増加させることができることが確認できる。
【０２５９】
［実施例４］
ＤＮＪ誘導体への暴露の有りおよび無しでのＧａａの蓄積および局所化
本実験においては、残存するＧａａ活性を呈しないまたはほとんど呈しないポンペ患者
に由来する４つの細胞系を、Ｇａａの蓄積および局所化について野生型線維芽細胞と比較
した。
【０２６０】
方法
細胞系  ＰＭ８、ＰＭ９、ＰＭ１１、およびＰＭ１２細胞系を評価した。ＰＭ８はスプ
ライシング欠陥を保有し、その結果、いくらかの残存するＧａａ活性をもたらし（ＩＶＳ
１ＡＳ、Ｔ＞Ｇ、−１３）：ＰＭ９は１つの対立遺伝子上にナンセンス突然変異（Ｒ８５
４Ｘ）、および他の対立遺伝子上に３つのミスセンス突然変異（Ｄ６４５Ｅ、Ｖ８１６Ｉ
、およびＴ９２７Ｉ）を保有し、残存Ｇａａ活性は実質的に有さず（＜１％）；ＰＭ１１
はミスセンス突然変異（Ｐ５４５Ｌ）を含有し、いくらかの残存するＧａａ活性を有する
。ＰＭ１２もまたスプライシング欠陥を有する（ＩＶＳ８+Ｇ＞Ａ／Ｍ５１９Ｖ）。
【０２６１】
免疫蛍光および顕微鏡観察  含有または非含有で５日間培養した細胞を、ＮＢ−ＤＮＪ
を含むガラスカバースリップ上で５日間増殖させた。細胞を３．７％パラホルムアルデヒ
ドで１５分間固定し、０．５％サポニンで５分間浸透させ、次いで、ウサギ抗−ヒトＧａ
ａ（Ｂａｒｒｙ  Ｂｙｒｎｅからの贈物）および／またはマウスモノクローナル抗−ＬＡ
ＭＰ１（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，カタログ番号５５５７９８）の１：３００希釈で
室温にて１時間標識した。ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８をコンジュゲートさせた二次抗体
であるヤギ抗−ウサギＩｇＧ、およびＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｐｒｏｂｅｓ）をコンジュゲートさせたヤギ−抗−マウスＩｇＧを、次いで、１：５０
０希釈で加え、室温にて１時間インキュベートした。カバースリップを１０μｌのＶｅｃ
ｔａｓｈｉｅｌｄを備えたスライド上に置き、速乾燥ネイルポリッシュでシールし、９０
ｉ  Ｎｋｏｎ  Ｃ１共焦点顕微鏡で観察とした。
【０２６２】
結果
ＰＭ８  残存Ｇａａ活性をほとんど有しないにも拘らず、ＰＭ８細胞は、野生型線維芽
細胞と比べて、増大したＬＡＭＰ−１およびＧａａサイトゾル染色を呈し、異なる染色パ
ターンを有した。図６に示すように、ＮＢ−ＤＮＪで処理した野生型線維芽細胞がＬＡＭ
Ｐ−１およびＧａａ双方について断続的な染色パターンを呈し（図６Ｃ〜Ｄ）、それはリ
ソソーム中に共局所化するように見えた。対照的に、ＰＭ８線維芽細胞においては、染色
はＬＡＭＰ−１およびＧａａ双方について細胞質に行き渡っていた（図６Ａ〜Ｂおよび図
６Ｅ〜Ｆ）。コンフルエント野生型線維芽細胞におけるＬＡＭＰ−１およびＧａａ双方の
オーバーレイにより、リソソームへの共局所化が確認され（図６Ｈ）、他方、コンフルエ
ントＰＭ８線維芽細胞におけるオーバーレイにより、細胞質過剰のＬＡＭＰ−１およびＧ
ａａが確認される（図６Ｇ）。上記の結果は、リソソーム形成における可能な欠陥、また
は異常に形成されたエンドソーム／リソソーム構造の大きな凝集体（アグレソーム）の存
在を示唆する。
【０２６３】
ＰＭ９  ＰＭ９線維芽細胞はサイトゾル（図７Ｂ）における過剰のＧａａ（図７Ｂおよ
び７Ｄ）およびＬＡＭＰ−１（図７Ｅ）も呈した。オーバーレイは、アグレソームに似た
Ｇａａ凝集体の形成を示す（図７Ａ、図７Ｃおよび７Ｆ、矢印およびインレイはアグレソ
ームを示す）。ＤＮＪ誘導体での処理は、Ｇａａのリソソームへの局所化を回復させ、ア
グレソーム形成を低下させると予期される。ＤＮＪ誘導体での処理は、Ｇａａのリソソー
ムへの適切な局所化を回復させ、サイトゾルアグレソームの存在を低下させると予測され
る。
【０２６４】
ＰＭ１１  ＰＭ１１線維芽細胞は、低下したＧａａ活性を呈する。ＮＢ−ＤＮＪ（５０
μＭ）およびＤＮＪ（１００μＭ）で処理した場合、ＰＭ１１細胞は、リソソームマーカ
ーＬＡＭＰ−１で共標識することによって評価したように、リソソームにおけるＧａａの
標識につき強度の増大を呈し、これは、トラフィッキングの回復を示す（図８）。未処理
ＰＭ１１線維芽細胞はいくらかのＧａａ染色を呈し、そのほとんどはＬＡＭＰ−１と共局
所化しない。
【０２６５】
加えて、ＰＭ１１細胞における欠陥が、リソソーム酵素（Ｇａａ）のリソソームへのト
ラフィッキングであることを確認するために、野生型線維芽細胞およびＰＭ１１細胞を、
各々、初期および後期エンドソームマーカーＥＥＡ１およびＭ６ＰＲにつき染色した。野
生型線維芽細胞およびポンペＰＭ１１線維芽細胞の間で初期および後期エンドソームにつ
いての局所化パターンに差はなかった（データは示さず）。
【０２６６】
ＰＭ１２  Ｇａａ染色強度の有意な増加もまた、ＮＢ−ＤＮＪで処理したＰＭ１２線維
芽細胞で観察された（データは示さず）。
【０２６７】
考察
本実施例は、本発明の薬理学的シャペロンが、Ｇａａを不安定とし、合成の間にＥＲか
ら出られなくする突然変異以外の（およびそれに加えての）Ｇａａ中の突然変異を保有す
る細胞の表現型を回復することができることを示す。これは、突然変異体ＧａａのＥＲか
らリソソームへのトラフィッキングの改良は、リソソームにおけるＧａａヒドロラーゼ活
性を回復さえすることなく、筋肉のような組織においてポンペ病のいくらかの病原体効果
を軽減するのに十分であり得るという仮説を支持する。グリコーゲンの代謝回転は、ポン
ペ病における患者表現型を改善するのに十分でないのは明らかである。このようにして、
トラフィッキングの改善が何故ポンペ病理学を改善できる一仮説では、Ｇａａ活性の欠如
が細胞におけるグルコース欠乏を引き起こし、これが（グルコースの迅速な放出のために
細胞質グリコーゲンを用いるための）自己貪食応答をトリガし、または攪拌し得るという
ことである。この自己貪食応答はエンドソームトラフィッキング経路を通じてのトラフィ
ッキングを損ない、その結果、膜安定化タンパク質のミストラフィッキング、および筋肉
繊維の最終的な分解をもたらす。
【０２６８】
シャペロン利用法はＧａａ活性を救済し、グルコース欠乏によって誘発されたグルコー
ス欠乏および自己貪食応答を軽減し、結局は、膜安定化タンパク質のトラフィッキングを
回復して、更なる筋肉損傷を妨げることができる。
【０２６９】
［実施例５］
腸Ｇａａに対するＤＮＪ誘導体の効果：逆スクリーニング
理想的な特異的薬理学的シャペロンは、サブ抑制濃度以下において、腸Ｇａａを阻害す
ることなく、リソソームＧａａを増強させるであろう。従って、腸Ｇａａ活性は、７．０
のｐＨにおいて、マウス腸からの粗抽出物において評価した。加えて、腸Ｇａａ酵素阻害
アッセイを確立して、ＤＮＪおよびＮＢ−ＤＮＪのような化合物が腸Ｇａａに対して阻害
効果を発揮したか否かを判断した。
【０２７０】
方法
組織調製  粗抽出物は上記したように、Ｃ５７ＢＫ６マウスからのマウス腸から調製し
た。上清を新しいチューブに移し、酵素アッセイのために用いた。
【０２７１】
結果
ＤＮＪは１μＭのＩＣ５０値を持つ腸Ｇａａのより優れた阻害剤であり、他方、ＮＢ−
ＤＮＪは２１μＭのＩＣ５０阻害値を有した（データは示さず）。
【０２７２】
［実施例６］
ＤＮＪ誘導体でのポンペ患者の治療
上記の結果に鑑み、本発明のＤＮＪおよびＤＮＪ誘導体でのポンペ患者の治療は、筋肉
組織でのグリコーゲンの病理学的蓄積を低下させ、それにより、病気状態を緩和する。組
換酵素は筋肉組織に侵入できないので、ポンペ病についての現在承認された唯一の治療Ｅ
ＲＴは骨格筋においてグリコーゲン蓄積を低下させるのに効果的ではないという事実に鑑
み、この方法は当分野における長く感じられた必要性を解決する。
【０２７３】
方法
患者の集団  乳児性、若年性および／または成人−発症型ポンペ病と診断された患者は
、経口投与されるＤＮＪ誘導体のランダム化、二重盲式、複数−用量、開放−標識実験で
補充され、評価されるであろう。実験対象として適している患者は以下の：ａ）断面エコ
ーカルジオグラフィーによって決定された左心室質量指標（ＬＶＭＩ）と定義される心筋
障害；ｂ）非侵入性ベンティレーションが、気管内チューブを用いることなく適用される
換気支持体のいずれかの形態と定義される、侵入性または非侵入性換気支持体についての
要件；またはｃ）Ｄｅｎｖｅｒ発生スクリーニングテスト（ＤＤＳＴ−２；Ｈａｌｌｉｏ
ｇｌｏら，Ｐｅｄｉａｔｒ  Ｉｎｔ．２００１；４３（４）：４００−４）にて通常の年
齢の対等者の９０％によって達成される粗大運動技術を行うことができないと定義される
ひどい運動遅延を少なくとも有している必要がある。
【０２７４】
薬物の投与  １０の対象の２つの群は５０または１００ｍｇのＤＮＪまたはＤＮＪ誘導
体のいずれかを１日に２回２４週間受けるであろう。これは、ゴーシェ病における糖スフ
ィンゴ脂質の基質剥奪で示された量未満である。
【０２７５】
終点  臨床的効果は、例えば、Ｄｅｎｖｅｒ発生スクリーニングテストおよびＡｌｂｅ
ｒｔａ幼児運動スケール（Ｐｉｐｅｒら，Ｍｏｔｏｒ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔ
ｈｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  Ｉｎｆａｎｔ．Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，  ＰＡ，  Ｗ
．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ  Ｃｏ．，１９９４）、幼児発育ＩＩのＢａｙｌｅｙスケール（
ＢＳＩＤＩＩ）；Ｂａｙｌｅｙら，Ｂａｙｌｅｙ  Ｓｃｏｒｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｆａｎｔ  
Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｓａｎ  Ａｎｔｏｎｉｏ，Ｔｘ：Ｈａｒｃｏ
ｕｒｔ  Ｂｒａｃｅ  ＆  Ｃｏ．１９９３）、ならびに筋肉バイオプシーの組織学および
生化学分析、すなわち、周期的酸−シッフ（ＰＡＳ）−陽性染色および酵素活性アッセイ
を用いる処理−対−未処理患者におけるグリコーゲンレベルの測定、および患者から得ら
れた線維芽細胞におけるＧａａ活性の測定を用いて測定された、ベンティレーター−フリ
ー生存、左心室質量指標、運動発達および骨格筋機能によって評価されるであろう。臨床
測定は、４、１２および２４週間において評価されるであろう筋肉バイオプシーを除いて
２週間毎に評価されるであろう。
【０２７６】
結果
ＤＮＪ誘導体での処理は、症状のいくつかを緩和し、グリコーゲンの筋肉組織レベルを
低下させることによって、ポンペ病の治療で効果的であろう。例えば、１２週間以内に、
筋肉におけるＧａａ活性の増加が観察され、グリコーゲンの蓄積が低下されるであろうと
予測される。加えて、ＬＶＭＩは低下し、呼吸器系症状は改善されるであろうと予測され
る。最後に、特に若い患者における運動発育および筋肉調子の進行が期待される。
【０２７７】
結論
本発明の方法は、唯一の現在の治療がＥＲＴであるポンペ病の治療において予期せぬ利
点を提供する。好ましくは経口による小分子シャペロンの投与はコスト的に有利であり、
ＥＲＴが浸透できない組織、すなわち、脳において酵素の救済を可能とする。加えて、シ
ャペロン化合物および置換タンパク質での組合せ療法は、必要な組換または精製酵素の注
入の数および／またはその量を低下させることができ、それにより、コストを低下させ、
患者に対して利点を提供する。最後に、本発明のシャペロン化合物と組み合わせた置換Ｇ
ａａの処方は組換酵素を安定化させ、凝集および／または分解を妨げることができ、また
それにより、酵素のシェルライフを増大させる。
【０２７８】
本発明は、範囲が、本明細書中に記載された特別な実施形態によって限定されない。事
実、本明細書中に記載されたものに加えて本発明の種々の修飾は、これまでの記載または
添付の図面から当業者に明らかとなるであろう。そのような修飾は添付の特許請求の範囲
の範囲内にあることを意図する。
【０２７９】
特許、特許出願、刊行物、製品の記載、登録番号、およびプロトコルは本出願を通じて
引用され、その開示はすべての目的についてその全体が参照として本明細書に組み入れら
れる。
【図面の簡単な説明】
【０２８０】
【図１】ポンペ病細胞系ＰＭ−１１における酸性α−グルコシダーゼの活性に対する１−ＤＮＪ、ＮＢ−ＤＮＪおよびＮ−（シクロプロピル）メチルＤＮＪイミノ糖誘導体の効果を示す。
【図２Ａ】種々の濃度のＤＮＪおよびＮＢ−ＤＮＪで２週間処理した正常なＣ５７ＢＬ６マウスの脳におけるＧａａ増強を示す。
【図２Ｂ】種々の濃度のＤＮＪおよびＮＢ−ＤＮＪで２週間処理した正常なＣ５７ＢＬ６マウスの肝臓におけるＧａａ増強を示す。
【図２Ｃ】種々の濃度のＤＮＪおよびＮＢ−ＤＮＪで２週間処理した正常なＣ５７ＢＬ６マウスの腓腹筋におけるＧａａ増強を示す。
【図２Ｄ】種々の濃度のＤＮＪおよびＮＢ−ＤＮＪで２週間処理した正常なＣ５７ＢＬ６マウスの舌におけるＧａａ増強を示す。
【図３Ａ】種々の濃度のＤＮＪおよびＮＢ−ＤＮＪで２週間処理した正常なＣ５７ＢＬ６マウスの腎臓におけるＧａａ増強を示す。
【図３Ｂ】種々の濃度のＤＮＪおよびＮＢ−ＤＮＪで２週間処理した正常なＣ５７ＢＬ６マウスの横隔膜におけるＧａａ増強を示す。
【図３Ｃ】種々の濃度のＤＮＪおよびＮＢ−ＤＮＪで２週間処理した正常なＣ５７ＢＬ６マウスの心臓におけるＧａａ増強を示す。
【図３Ｄ】種々の濃度のＤＮＪおよびＮＢ−ＤＮＪで２週間処理した正常なＣ５７ＢＬ６マウスのヒラメ筋におけるＧａａ増強を示す。
【図４Ａ】種々の濃度のＤＮＪおよびＮＢ−ＤＮＪで４週間処理した正常なＣ５７ＢＬ６マウスの脳におけるＧａａ増強を示す。
【図４Ｂ】種々の濃度のＤＮＪおよびＮＢ−ＤＮＪで４週間処理した正常なＣ５７ＢＬ６マウスの肝臓におけるＧａａ増強を示す。
【図４Ｃ】種々の濃度のＤＮＪおよびＮＢ−ＤＮＪで４週間処理した正常なＣ５７ＢＬ６マウスの腓腹筋におけるＧａａ増強を示す。
【図４Ｄ】種々の濃度のＤＮＪおよびＮＢ−ＤＮＪで４週間処理した正常なＣ５７ＢＬ６マウスの舌におけるＧａａ増強を示す。
【図５Ａ】種々の濃度のＤＮＪおよびＮＢ−ＤＮＪで４週間処理した正常なＣ５７ＢＬ６マウスの腎臓におけるＧａａ増強を示す。
【図５Ｂ】種々の濃度のＤＮＪおよびＮＢ−ＤＮＪで４週間処理した正常なＣ５７ＢＬ６マウスの横隔膜におけるＧａａ増強を示す。
【図５Ｃ】種々の濃度のＤＮＪおよびＮＢ−ＤＮＪで４週間処理した正常なＣ５７ＢＬ６マウスの心臓におけるＧａａ増強を示す。
【図５Ｄ】種々の濃度のＤＮＪおよびＮＢ−ＤＮＪで４週間処理した正常なＣ５７ＢＬ６マウスのヒラメ筋におけるＧａａ増強を示す。
【図６Ａ】野生型（６Ｃ）およびポンペＰＭ８（６Ａおよび６Ｆ）線維芽細胞におけるＧａａ免疫染色を示す。この図面は、野生型（６Ｄ）およびポンペＰＭ８線維芽細胞（６Ｂおよび６Ｅ）におけるリソソームマーカーＬＡＭＰ−１についてのリソソーム染色も示す。野生型（６Ｈ）およびＰＭ８（６Ｇ）線維芽細胞についてのＧａａおよびＬＡＭＰ−１染色のオーバーレイも示される。
【図６Ｂ】野生型（６Ｃ）およびポンペＰＭ８（６Ａおよび６Ｆ）線維芽細胞におけるＧａａ免疫染色を示す。この図面は、野生型（６Ｄ）およびポンペＰＭ８線維芽細胞（６Ｂおよび６Ｅ）におけるリソソームマーカーＬＡＭＰ−１についてのリソソーム染色も示す。野生型（６Ｈ）およびＰＭ８（６Ｇ）線維芽細胞についてのＧａａおよびＬＡＭＰ−１染色のオーバーレイも示される。
【図６Ｃ】野生型（６Ｃ）およびポンペＰＭ８（６Ａおよび６Ｆ）線維芽細胞におけるＧａａ免疫染色を示す。この図面は、野生型（６Ｄ）およびポンペＰＭ８線維芽細胞（６Ｂおよび６Ｅ）におけるリソソームマーカーＬＡＭＰ−１についてのリソソーム染色も示す。野生型（６Ｈ）およびＰＭ８（６Ｇ）線維芽細胞についてのＧａａおよびＬＡＭＰ−１染色のオーバーレイも示される。
【図６Ｄ】野生型（６Ｃ）およびポンペＰＭ８（６Ａおよび６Ｆ）線維芽細胞におけるＧａａ免疫染色を示す。この図面は、野生型（６Ｄ）およびポンペＰＭ８線維芽細胞（６Ｂおよび６Ｅ）におけるリソソームマーカーＬＡＭＰ−１についてのリソソーム染色も示す。野生型（６Ｈ）およびＰＭ８（６Ｇ）線維芽細胞についてのＧａａおよびＬＡＭＰ−１染色のオーバーレイも示される。
【図６Ｅ】野生型（６Ｃ）およびポンペＰＭ８（６Ａおよび６Ｆ）線維芽細胞におけるＧａａ免疫染色を示す。この図面は、野生型（６Ｄ）およびポンペＰＭ８線維芽細胞（６Ｂおよび６Ｅ）におけるリソソームマーカーＬＡＭＰ−１についてのリソソーム染色も示す。野生型（６Ｈ）およびＰＭ８（６Ｇ）線維芽細胞についてのＧａａおよびＬＡＭＰ−１染色のオーバーレイも示される。
【図６Ｆ】野生型（６Ｃ）およびポンペＰＭ８（６Ａおよび６Ｆ）線維芽細胞におけるＧａａ免疫染色を示す。この図面は、野生型（６Ｄ）およびポンペＰＭ８線維芽細胞（６Ｂおよび６Ｅ）におけるリソソームマーカーＬＡＭＰ−１についてのリソソーム染色も示す。野生型（６Ｈ）およびＰＭ８（６Ｇ）線維芽細胞についてのＧａａおよびＬＡＭＰ−１染色のオーバーレイも示される。
【図６Ｇ】野生型（６Ｃ）およびポンペＰＭ８（６Ａおよび６Ｆ）線維芽細胞におけるＧａａ免疫染色を示す。この図面は、野生型（６Ｄ）およびポンペＰＭ８線維芽細胞（６Ｂおよび６Ｅ）におけるリソソームマーカーＬＡＭＰ−１についてのリソソーム染色も示す。野生型（６Ｈ）およびＰＭ８（６Ｇ）線維芽細胞についてのＧａａおよびＬＡＭＰ−１染色のオーバーレイも示される。
【図６Ｈ】野生型（６Ｃ）およびポンペＰＭ８（６Ａおよび６Ｆ）線維芽細胞におけるＧａａ免疫染色を示す。この図面は、野生型（６Ｄ）およびポンペＰＭ８線維芽細胞（６Ｂおよび６Ｅ）におけるリソソームマーカーＬＡＭＰ−１についてのリソソーム染色も示す。野生型（６Ｈ）およびＰＭ８（６Ｇ）線維芽細胞についてのＧａａおよびＬＡＭＰ−１染色のオーバーレイも示される。
【図７Ａ】ＰＭ９ポンペ線維芽細胞におけるＧａａ（７Ｂおよび７Ｄ）ＬＡＭＰ−１（７Ｅ）についての免疫蛍光染色を示す。ＧａａおよびＬＡＭＰ−１染色のオーバーレイも示される（７Ａ、７Ｃおよび７Ｆ）。
【図７Ｂ】ＰＭ９ポンペ線維芽細胞におけるＧａａ（７Ｂおよび７Ｄ）ＬＡＭＰ−１（７Ｅ）についての免疫蛍光染色を示す。ＧａａおよびＬＡＭＰ−１染色のオーバーレイも示される（７Ａ、７Ｃおよび７Ｆ）。
【図７Ｃ】ＰＭ９ポンペ線維芽細胞におけるＧａａ（７Ｂおよび７Ｄ）ＬＡＭＰ−１（７Ｅ）についての免疫蛍光染色を示す。ＧａａおよびＬＡＭＰ−１染色のオーバーレイも示される（７Ａ、７Ｃおよび７Ｆ）。
【図７Ｄ】ＰＭ９ポンペ線維芽細胞におけるＧａａ（７Ｂおよび７Ｄ）ＬＡＭＰ−１（７Ｅ）についての免疫蛍光染色を示す。ＧａａおよびＬＡＭＰ−１染色のオーバーレイも示される（７Ａ、７Ｃおよび７Ｆ）。
【図７Ｅ】ＰＭ９ポンペ線維芽細胞におけるＧａａ（７Ｂおよび７Ｄ）ＬＡＭＰ−１（７Ｅ）についての免疫蛍光染色を示す。ＧａａおよびＬＡＭＰ−１染色のオーバーレイも示される（７Ａ、７Ｃおよび７Ｆ）。
【図７Ｆ】ＰＭ９ポンペ線維芽細胞におけるＧａａ（７Ｂおよび７Ｄ）ＬＡＭＰ−１（７Ｅ）についての免疫蛍光染色を示す。ＧａａおよびＬＡＭＰ−１染色のオーバーレイも示される（７Ａ、７Ｃおよび７Ｆ）。
【図８】ＤＮＪまたはＮＢ−ＤＮＪで処理された、Ｇａａ、ＬＡＭＰ−１、およびＧａａ／ＬＡＭＰ−１デュアル染色ＰＭ１１ポンペ細胞系を示す。
【図１】
2014221759.tif 000055
【図２Ａ】
2014221759.tif 000056
【図２Ｂ】
2014221759.tif 000057
【図２Ｃ】
2014221759.tif 000058
【図２Ｄ】
2014221759.tif 000059
【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
2014221759.tif 000061
【図３Ｃ】
2014221759.tif 000062
【図３Ｄ】
2014221759.tif 000063
【図４Ａ】
2014221759.tif 000064
【図４Ｂ】
2014221759.tif 000065
【図４Ｃ】
2014221759.tif 000066
【図４Ｄ】
2014221759.tif 000067
【図５Ａ】
2014221759.tif 000068
【図５Ｂ】
2014221759.tif 000069
【図５Ｃ】
2014221759.tif 000070
【図５Ｄ】
2014221759.tif 000071
【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図６Ｇ】
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【図６Ｈ】
2014221759.tif 000079
【図７Ａ】
2014221759.tif 000080
【図７Ｂ】
2014221759.tif 000081
【図７Ｃ】
2014221759.tif 000082
【図７Ｄ】
2014221759.tif 000083
【図７Ｅ】
2014221759.tif 000084
【図７Ｆ】
2014221759.tif 000085
【図８】
2014221759.tif 000086
【配列表】
2014221759000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成26年6月25日(2014.6.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載された発明。
【外国語明細書】
2014221759000001.pdf
2014221759000002.pdf
2014221759000003.pdf
2014221759000004.pdf