(57)【要約】      （修正有）【課題】ヒアルロナン関連状態、疾患および障害を治療するための、可溶性ヒアルロニダーゼなどのヒアルロナン分解酵素を含有する、組合せ、組成物およびキットの提供。【解決手段】ポリマーとのコンジュゲーションによって修飾された可溶性ヒアルロニダーゼを含む医薬組成物であって、該対象が、（ａ）該対象由来のサンプル中のヒアルロナン発現またはヒアルロナンを測定する工程と、（ｂ）該対象由来のサンプル中のヒアルロナン発現またはヒアルロナンが上昇しているか、または該疾患もしくは状態を示すレベルである場合には、該可溶性ヒアルロニダーゼを含有する組成物を該対象に投与する工程とを含む方法によって治療されるところの、医薬組成物。特に、ポリマーがシアル化またはペグ化部分である、上記の方法、医薬組成物、または使用。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒアルロニダーゼ基質が蓄積する疾患または状態を治療するための、血漿中のヒアルロニダーゼ酵素の血漿レベルを少なくとも３Ｕ／ｍｌのレベルで少なくとも１週間維持するための医薬として処方された可溶性ヒアルロニダーゼ組成物の使用であって、前記組成物がポリマーとコンジュゲートしている可溶性ヒアルロニダーゼを前記レベルを維持するのに十分な量で含むところの、使用。
【請求項２】
血漿中のヒアルロニダーゼ酵素の血漿レベルを少なくとも３Ｕ／ｍＬのレベルで少なくとも１週間維持するのに十分な量で可溶性ヒアルロニダーゼを含む、ヒアルロニダーゼ基質が蓄積する疾患または状態の治療において使用するための医薬組成物であって、前記可溶性ヒアルロニダーゼがポリマーとコンジュゲートしているところの、医薬組成物。
【請求項３】
組成物が少なくとも週に２回、少なくとも１週間を超える投与のためのものである、請求項１に記載の使用または請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
組成物が、ポリマーとコンジュゲートしている可溶性ヒアルロニダーゼを少なくともまたは約２．０ｍｇ〜６０ｍｇ含有し、
前記ポリマーとコンジュゲートしている可溶性ヒアルロニダーゼが、少なくともまたは約２０，０００Ｕ／ｍｇ、２５，０００Ｕ／ｍｇ、３０，０００Ｕ／ｍｇ、３１，０００Ｕ／ｍｇ、３２，０００Ｕ／ｍｇ、３３，０００Ｕ／ｍｇ、３４，０００Ｕ／ｍｇ、３５，０００Ｕ／ｍｇ、３６，０００Ｕ／ｍｇ、３７，０００Ｕ／ｍｇ、３８，０００Ｕ／ｍｇ、３９，０００Ｕ／ｍｇ、４０，０００Ｕ／ｍｇ、４５，０００Ｕ／ｍｇ、５０，０００Ｕ／ｍｇ、５５，０００Ｕ／ｍｇ、６０，０００Ｕ／ｍｇまたはそれ以上の比活性を有する、請求項１から３のいずれかに記載の使用または組成物。
【請求項５】
組成物が投与あたり少なくとも１０ｍＬである、請求項１から４のいずれかに記載の使用または組成物。
【請求項６】
組成物が経口的、静脈内（ＩＶ）、皮下、筋肉内、腫瘍内、皮内、局所的、経皮的、直腸または表皮下投与のために処方される、請求項１から５のいずれかに記載の使用または組成物。
【請求項７】
組成物が静脈内投与のために処方される、請求項１から６のいずれかに記載の使用または組成物。
【請求項８】
組成物がヒスチジンおよび／またはＮａＣｌをさらに含む、請求項１から７のいずれかに記載の使用または組成物。
【請求項９】
組成物が１０ｍＭまたは約１０ｍＭヒスチジンおよび／または１３０ｍＭまたは約１３０ｍＭ  ＮａＣｌとともに処方される、請求項８に記載の使用または組成物。
【請求項１０】
組成物が、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１もしくは７．２または約６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１もしくは７．２であるｐＨを有する、請求項１から９のいずれかに記載の使用または組成物。
【請求項１１】
６．５または約６．５のｐＨを有する、請求項１０に記載の使用または組成物。
【請求項１２】
血漿中のヒアルロニダーゼのレベルが少なくともまたは約３Ｕ／ｍＬ〜１２Ｕ／ｍＬである、請求項１から１１のいずれかに記載の使用または組成物。
【請求項１３】
血漿中のヒアルロニダーゼのレベルが、少なくともまたは約５Ｕ／ｍＬ、６Ｕ／ｍＬ、７Ｕ／ｍＬ、８Ｕ／ｍＬ、９Ｕ／ｍＬ、１０Ｕ／ｍＬ、１５Ｕ／ｍＬ、２０Ｕ／ｍＬ、３０Ｕ／ｍＬ、４０Ｕ／ｍＬ、４５Ｕ／ｍＬまたは５０Ｕ／ｍＬである、請求項１から１１のいずれかに記載の使用または組成物。
【請求項１４】
血漿中のヒアルロニダーゼのレベルが、少なくともまたは約１０Ｕ／ｍＬである、請求項１から１３のいずれかに記載の使用または組成物。
【請求項１５】
ポリマーがシアル化またはペグ化部分である、請求項１から１４のいずれかに記載の使用または組成物。
【請求項１６】
ヒアルロニダーゼ基質がヒアルロナンである、請求項１から１５のいずれかに記載の使用または組成物。
【請求項１７】
可溶性ヒアルロニダーゼが可溶性ＰＨ２０である、請求項１から１６のいずれかに記載の使用または組成物。
【請求項１８】
ＰＨ２０がヒツジ、マウス、サル、ウシ、細菌およびヒトＰＨ２０の中から選択される、請求項１７に記載の使用または組成物。
【請求項１９】
ＰＨ２０の可溶性型がＣ末端ＧＰＩを除去するよう末端切断された可溶性ＰＨ２０である、請求項１７または請求項１８に記載の使用または組成物。
【請求項２０】
可溶性ヒアルロニダーゼが、配列番号１に含まれるアミノ酸の配列または配列番号１に含まれるアミノ酸の配列と少なくとも約９１％のアミノ酸配列同一性を有する配列を有し、それによって可溶性ヒアルロニダーゼが可溶性でＮ−グリコシル化された中性の活性である、請求項１から１９のいずれかに記載の使用または組成物。
【請求項２１】
可溶性ヒアルロニダーゼが、アミノ酸残基４６７〜４８３であるか、またはアミノ酸残基４６７〜４８３の間であるアミノ酸残基で末端切断されている、配列番号１に示されるアミノ酸の配列を含む、請求項１から２０のいずれかに記載の使用または組成物。
【請求項２２】
可溶性ヒアルロニダーゼが、４６７、４６８、４６９、４７０、４７１、４７２、４７３、４７４、４７５、４７６、４７７、４７８、４７９、４８０、４８１、４８２および４８３の中から選択されるアミノ酸残基で末端切断されている、配列番号１に示されるアミノ酸の配列を含む、請求項１から２１のいずれかに記載の使用または組成物。
【請求項２３】
可溶性ヒアルロニダーゼがＣＨＯ細胞において分泌される、請求項２２に記載の使用または組成物。
【請求項２４】
可溶性ヒアルロニダーゼが、配列番号１のアミノ酸３６〜４６７、３６〜４６８、３６〜４６９、３６〜４７０、３６〜４７１、３６〜４７２、３６〜４７３、３６〜４７４、３６〜４７５、３６〜４７６、３６〜４７７、３６〜４７８、３６〜４７９、３６〜４８０、３６〜４８１、３６〜４８２もしくは３６〜４８３として示されるアミノ酸の配列を有するか、または配列番号１のアミノ酸３６〜４６７、３６〜４６８、３６〜４６９、３６〜４７０、３６〜４７１、３６〜４７２、３６〜４７３、３６〜４７４、３６〜４７５、３６〜４７６、３６〜４７７、３６〜４７８、３６〜４７９、３６〜４８０、３６〜４８１、３６〜４８２もしくは３６〜４８３として示されるアミノ酸の配列と少なくとも約９１％のアミノ酸配列同一性を有する、請求項１から２３のいずれかに記載の使用または組成物。
【請求項２５】
可溶性ヒアルロニダーゼが、配列番号４〜９および４６〜４８のいずれかに示されるアミノ酸の配列を含有するポリペプチドならびにその対立遺伝子変異体、種変異体およびその他の変異体の中から選択される、請求項１から２４のいずれかに記載の使用または組成物。
【請求項２６】
可溶性ヒアルロニダーゼが、配列番号４に示されるアミノ酸の配列をコードする核酸の配列によってコードされるポリペプチドである、請求項１から２５のいずれかに記載の使用または組成物。
【請求項２７】
可溶性ヒアルロニダーゼが、配列番号４〜９のいずれかに示されるアミノ酸の配列をコードする核酸の配列によってコードされるポリペプチドの中から選択される、請求項１から２６のいずれかに記載の使用または組成物。
【請求項２８】
可溶性ヒアルロニダーゼがＣＨＯ細胞における発現によって産生される、請求項１から２７のいずれかに記載の使用または組成物。
【請求項２９】
可溶性ヒアルロニダーゼが指定されたｒＨｕＰＨ２０である、請求項２８に記載の使用または組成物。
【請求項３０】
可溶性ヒアルロニダーゼがグリコシル化されている、請求項１から２９のいずれかに記載の使用または組成物。
【請求項３１】
可溶性ヒアルロニダーゼとコンジュゲートしているポリマーがペグ化部分（ＰＥＧ）を含む、請求項１から３０のいずれかに記載の使用または組成物。
【請求項３２】
ポリマーが、メトキシ−ポリ（エチレングリコール）−スクシンイミジルブタノエート（ｍＰＥＧ−ＳＢＡ）（５ｋＤａ）；メトキシ−ポリ（エチレングリコール）−スクシンイミジルブタノエート（ｍＰＥＧ−ＳＢＡ）（２０ｋＤａ）；メトキシ−ポリ（エチレングリコール）−スクシンイミジルブタノエート（ｍＰＥＧ−ＳＢＡ）（３０ｋＤａ）；メトキシ−ポリ（エチレングリコール）−スクシンイミジルα−メチルブタノエート（ｍＰＥＧ−ＳＭＢ）（２０ｋＤａ）；メトキシ−ポリ（エチレングリコール）−スクシンイミジルα−メチルブタノエート（ｍＰＥＧ−ＳＭＢ）（３０ｋＤａ）；メトキシ−ポリ（エチレングリコール）−ブチルアルデヒド（ｍＰＥＧ−ブチルアルデヒド）（３０ｋＤａ）、メトキシ−ポリ（エチレングリコール）−スクシンイミジルプロピオネート（ｍＰＥＧ−ＳＰＡ）（２０ｋＤａ）；メトキシ−ポリ（エチレングリコール）−スクシンイミジルプロピオネート（ｍＰＥＧ−ＳＰＡ）（３０ｋＤａ）；（メトキシ−ポリ（エチレングリコール））２−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ｍＰＥＧ２−ＮＨＳ）（１０ｋＤａ、分岐）；（メトキシ−ポリ（エチレングリコール））２−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ｍＰＥＧ２−ＮＨＳ）（２０ｋＤａ、分岐）；（メトキシ−ポリ（エチレングリコール））２−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ｍＰＥＧ２−ＮＨＳ）（４０ｋＤａ、分岐）；（メトキシ−ポリ（エチレングリコール））２−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ｍＰＥＧ２−ＮＨＳ）（６０ｋＤａ、分岐）；ビオチン−ポリ（エチレングリコール）−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ビオチン−ＰＥＧ−ＮＨＳ）（５ｋＤａ、ビオチン化）；ポリ（エチレングリコール）−ｐ−ニトロフェニルカルボネート（ＰＥＧ−ｐ−ニトロフェニル−カルボネート）（３０ｋＤａ）；およびポリ（エチレングリコール）−プリオピオンアルデヒド（ＰＥＧ−プロピオンアルデヒド）（３０ｋＤａ）の中から選択される、請求項３１に記載の使用または組成物。
【請求項３３】
ＰＥＧが分岐または直鎖ＰＥＧである、請求項３２に記載の使用または組成物。
【請求項３４】
ＰＥＧが直鎖ＰＥＧである、請求項３３に記載の使用または組成物。
【請求項３５】
ＰＥＧがメトキシ−ＰＥＧ（ｍＰＥＧ）である、請求項３１から３４のいずれかに記載の使用または組成物。
【請求項３６】
ＰＥＧがメトキシポリ（エチレングリコール）ブタン酸の直鎖Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルである、請求項３５に記載の使用または組成物。
【請求項３７】
ＰＥＧが３０または約３０キロダルトンの分子量を有する、請求項３５または請求項３６に記載の使用または組成物。
【請求項３８】
血漿中のヒアルロニダーゼ酵素の血漿レベルを少なくとも３Ｕ／ｍＬのレベルで少なくとも１週間維持するのに十分な量で可溶性ヒアルロニダーゼを含む組成物であって、前記可溶性ヒアルロニダーゼがポリマーとコンジュゲートしているところの、組成物。
【請求項３９】
少なくとも週に２回、少なくとも１週間を超える投与のためのものである、請求項３８に記載の組成物。
【請求項４０】
組成物が、ポリマーとコンジュゲートしている可溶性ヒアルロニダーゼを少なくともまたは約２．０ｍｇ〜６０ｍｇ含有し、
前記ポリマーとコンジュゲートしている可溶性ヒアルロニダーゼが、少なくともまたは約２０，０００Ｕ／ｍｇ、２５，０００Ｕ／ｍｇ、３０，０００Ｕ／ｍｇ、３１，０００Ｕ／ｍｇ、３２，０００Ｕ／ｍｇ、３３，０００Ｕ／ｍｇ、３４，０００Ｕ／ｍｇ、３５，０００Ｕ／ｍｇ、３６，０００Ｕ／ｍｇ、３７，０００Ｕ／ｍｇ、３８，０００Ｕ／ｍｇ、３９，０００Ｕ／ｍｇ、４０，０００Ｕ／ｍｇ、４５，０００Ｕ／ｍｇ、５０，０００Ｕ／ｍｇ、５５，０００Ｕ／ｍｇ、６０，０００Ｕ／ｍｇまたはそれ以上の比活性を有する、請求項３８または請求項３９に記載の組成物。
【請求項４１】
組成物が投与あたり少なくとも１０ｍＬである、請求項３８から４０のいずれかに記載の組成物。
【請求項４２】
組成物が、経口的、静脈内（ＩＶ）、皮下、筋肉内、腫瘍内、皮内、局所的、経皮的、直腸または表皮下投与のために処方される、請求項３８から４１のいずれかに記載の組成物。
【請求項４３】
組成物が静脈内投与のために処方される、請求項３８から４２のいずれかに記載の組成物。
【請求項４４】
組成物がヒスチジンおよび／またはＮａＣｌをさらに含む、請求項３８から４３のいずれかに記載の組成物。
【請求項４５】
組成物が１０ｍＭまたは約１０ｍＭヒスチジンおよび／または１３０ｍＭ  ＮａＣｌとともに処方される、請求項４４に記載の組成物。
【請求項４６】
組成物が、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１もしくは７．２または約６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１もしくは７．２であるｐＨを有する、請求項３８から４５のいずれかに記載の組成物。
【請求項４７】
６．５または約６．５のｐＨを有する、請求項４６に記載の組成物。
【請求項４８】
血漿中のヒアルロニダーゼのレベルが、少なくともまたは約３Ｕ／ｍＬ〜１２Ｕ／ｍＬである、請求項３８から４７のいずれかに記載の組成物。
【請求項４９】
ポリマーがシアル化またはペグ化部分である、請求項３８から４８のいずれかに記載の組成物。
【請求項５０】
ポリマーとコンジュゲートしている可溶性ヒアルロニダーゼを、血漿中のヒアルロニダーゼ酵素の血漿レベルを少なくとも３Ｕ／ｍＬのレベルで少なくとも１週間維持するのに十分な量で含有する組成物と、
ヒアルロナン関連疾患または状態を治療するための第２の薬剤を含有する第２の組成物とを含む、組合せ。
【請求項５１】
可溶性ヒアルロニダーゼを含有する組成物が、少なくとも週に２回、少なくとも１週間を超える投与のためのものである、請求項５０に記載の組合せ。
【請求項５２】
可溶性ヒアルロニダーゼを含有する組成物が、ポリマーとコンジュゲートしている可溶性ヒアルロニダーゼを少なくともまたは約２．０ｍｇ〜６０ｍｇ含有し、
前記ポリマーとコンジュゲートしている可溶性ヒアルロニダーゼが、少なくともまたは約２０，０００Ｕ／ｍｇ、２５，０００Ｕ／ｍｇ、３０，０００Ｕ／ｍｇ、３１，０００Ｕ／ｍｇ、３２，０００Ｕ／ｍｇ、３３，０００Ｕ／ｍｇ、３４，０００Ｕ／ｍｇ、３５，０００Ｕ／ｍｇ、３６，０００Ｕ／ｍｇ、３７，０００Ｕ／ｍｇ、３８，０００Ｕ／ｍｇ、３９，０００Ｕ／ｍｇ、４０，０００Ｕ／ｍｇ、４５，０００Ｕ／ｍｇ、５０，０００Ｕ／ｍｇ、５５，０００Ｕ／ｍｇ、６０，０００Ｕ／ｍｇまたはそれ以上の比活性を有する、請求項５０または請求項５１に記載の組合せ。
【請求項５３】
第１および第２の組成物が同時に処方されるか、または別個に提供される、請求項５０から５２のいずれかに記載の組合せ。
【請求項５４】
ポリマーがシアル化またはペグ化部分である、請求項５０から５３のいずれかに記載の組合せ。
【請求項５５】
第２の薬剤が抗癌剤または治療である、請求項５０から５４のいずれかに記載の組合せ。
【請求項５６】
抗癌剤または治療が、化学療法薬、放射線療法、抗体、ペプチド、遺伝子療法ベクター、ウイルスおよび核酸の中から選択される、請求項５５に記載の組合せ。
【請求項５７】
第２の薬剤が、アシビシン；アクラルビシン；アコダゾール；アクロニン；アドゼレシン；アルデスロイキン；アレムツズマブ；アリトレチノイン（９−Ｃｉｓ−レチノイン酸）；アロプリノール；アルトレタミン；アルボシジブ；アンバゾン；アンボマイシン；アメタントロン；アミホスチン；アミノグルテチミド；アムサクリン；アナストロゾール；アナキシロン；アンシタビン；アントラマイシン；アパジコン；アルギメスナ；ヒ素三酸化物；アスパラギナーゼ；アスペルリン；アトリムスチン；アザシチジン；アゼテパ；アゾトマイシン；バノキサントロン；バタブリン；バチマスタット；生ＢＣＧ；ベナキシビン；ベンダムスチン；ベンゾデパ；ベキサロテン；ベバシズマブ；ビカルタミド；ビエタセルピン；ビリコダル；ビサントレン；ビサントレン；ビスナフィドジメシレート；ビゼレシン；ブレオマイシン；ボルテゾミブ；ブレキナル；ブロピリミン；ブドチタン；ブスルファン；カクチノマイシン；カルステロン；カネルチニブ；カペシタビン；カラセミド；カルベチマー；カルボプラチン；カルボコン；カルモフール；ポリフェプロザンを伴うカルムスチン；カルムスチン；カルビシン；カルゼレシン；セデフィンゴール；セレコキシブ；セマドチン；クロラムブシル；シオテロネル；シロレマイシン；シスプラチン；クラドリビン；クランフェヌル；クロファラビン；クリスナトール；シクロホスファミド；リポソーム型シタラビン；シタラビン；ダカルバジン；ダクチノマイシン；ダルベポエチンα；リポソーム型ダウノルビシン；ダウノルビシン／ダウノマイシン；ダウノルビシン；デシタビン；デニロイキンジフチトクス；デクスニグルジピン；デキソナプラチン；デクスラゾキサン；デザグアニン；ジアジコン；ジブロスピジウム；ジエノゲスト；ジナリン；ジセルモリド；ドセタキセル；ドフェキダル；ドキシフルリジン；リポソーム型ドキソルビシン；ドキソルビシンＨＣＬ；ドコルビシンＨＣＬリポソーム注射剤；ドキソルビシン；ドロロキシフェン；プロピオン酸ドロモスタノロン；デュアゾマイシン；エコムスチン；エダトレキサート；エドテカリン；エフロールニチン；エラクリダル；エリナフィド；エリオットＢ溶液；エルサミトルシン；エミテフル；エンロプラチン；エンプロメート；エンザスタウリン；エピプロピジン；エピルビシン；エポエチンα；エプタロプロスト；エルブロゾール；エソルビシン；エストラムスチン；エタニダゾール；エトグルシド；リン酸エトポシド；エトポシドＶＰ−１６；エトポシド；エトプリン；エキセメスタン；エクシスリンド；ファドロゾール；ファザラビン；フェンレチニド；フィルグラスチム；フロクスウリジン；フルダラビン；フルオロウラシル；５−フルオロウラシル；フルオキシメステロン；フルロシタビン；ホスキドン；ホストリエシン；ホストリエシン；ホトレタミン；フルベストラント；ガラルビシン；ガロシタビン；ゲムシタビン；ゲムツズマブ／オゾガマイシン；ゲロキノール；ギマテカン；ギメラシル；グロキサゾン；グルホスファミド；酢酸ゴセレリン；ヒドロキシ尿素；イブリツモマブ／チウキセタン；イダルビシン；イホスファミド；イルモホシン；イロマスタット；メシル酸イマチニブ；イメキソン；インプロ��ルファン；インジスラム；インプロコン；インターフェロンα２ａ；インターフェロンα２ｂ；インターフェロンα；インターフェロンβ；インターフェロンγ；インターフェロン；インターロイキン２および他のインターロイキン（組換えインターロイキンを含む）；イントプリシン；ヨーベングアン［１３１−Ｉ］；イプロプラチン；イリノテカン；イルソグラジン；イクサベピロン；ケトトレキサート；Ｌ−アラノシン；ランレオチド；ラパチニブ；レドキサントロン；レトロゾール；ロイコボリン；リュープロリド；リュープロレリン（リュープロレリド）；レバミソール；レキサカルシトール；リアロゾール；ロバプラチン；ロメトレキソール；ロムスチン／ＣＣＮＵ；ロムスチン；ロナファルニブ；ロソキサントロン；ルルトテカン；マホスファミド；マンノスルファン；マリマスタット；マソプロコール；メイタンシン；メクロレタミン；メクロレタミン／ナイトロジェンマスタード；酢酸メゲストロール；メゲストロール；メレンゲストロール；メルファラン；メルファランＩＬ−ＰＡＭ；メノガリル；メピチオスタン；メルカプトプリン；６−メルカプトプリン；メスナ；メテシンド；メトトレキサート；メトキサレン；メトミダート；メトプリン；メツレデパ；ミボプラチン；ミプロキシフェン；ミソニダゾール；ミチンドミド；ミトカルシン；ミトクロミン；ミトフラキソン；ミトギリン；ミトグアゾン；ミトマルシン；マイトマイシンＣ；マイトマイシン；ミトナフィド；ミトキドン；ミトスペル；ミトタン；ミトキサントロン；ミトゾロミド；ミボブリン；ミゾリビン；モファロテン；モピダモール；ムブリチニブ；ミコフェノール酸；フェンプロピオン酸ナンドロロン；ネダプラチン；ネルザラビン；ネモルビシン；ニトラクリン；ノコダゾール；ノフェツモバブ；ノガラマイシン；ノラトレキセド；ノルトピキサントロン；オクトレオチド；オプレルベキン；オルマプラチン；オルタタキセル；オテラシル；オキサリプラチン；オキシスラン；オキソフェナルシン；パクリタキセル；パミドロネート；パツビロン；ペガデマーゼ；ペガスパルガーゼ；ペグフィルグラスチム；ペルデシン；ペリオマイシン；ペリトレキソール；ペメトレキセド；ペンタムスチン；ペントスタチン；ペプロマイシン；ペルホスファミド；ペリホシン；ピコプラチン；ピナフィド；ピポブロマン；ピポスルファン；ピルフェニドン；ピロキサントロン；ピキサントロン；プレビトレキセド；プリカミシドミトラマイシン；プリカマイシン；プロメスタン；プロメスタン；ポルフィマーナトリウム；ポルフィマー；ポルフィロマイシン；プレドニムスチン；プロカルバジン；プロパミジン；プロスピジウム；プミテパ；ピューロマイシン；ピラゾフリン；キナクリン；ラニムスチン；ラスブリカーゼ；リボプリン；リトロスルファン；リツキシマブ；ログレチミド；ロキニメックス；ルホクロモマイシン；サバルビシン；サフィンゴール；サルグラモスチム；サトラプラチン；セブリプラチン；セムスチン；シムトラゼン；シゾフィラン；ソブゾキサン；ソラフェニブ；スパルホサート；スパルホス酸；スパルソマイシン；スピロゲルマニウム；スピロムスチン；スピロプラチン；スピロプラチン；スクアラミン；ストレプトニ���リン；ストレプトバリシン；ストレプトゾシン；スホスファミド；スロフェヌル；リンゴ酸スニチニブ；６−チオグアニン（６−ＴＧ）；タセジナリン；タルク；タリソマイシン；タリムスチン；タモキシフェン；タリキダール；タウロムスチン；テコガラン；テガフール；テロキサントロン；テモポルフィン；テモゾロミド；テニポシド／ＶＭ−２６；テニポシド；テロキシロン；テストラクトン；チアミプリン；チオグアニン；チオテパ；チアミプリン；チアゾフリン；チロミソール；チロロン；チムコダル；チモナシック；チラパザミン；トピキサントロン；トポテカン；トレミフェン；トシツモマブ；トラベクテジン（エクチナサイジン７４３）；トラスツズマブ；トレストロン；トレチノイン／ＡＴＲＡ；トリシリビン；トリロスタン；トリメトレキセート；四硝酸トリプラチン；トリプトレリン；トロホスファミド；ツブロゾール；ウベニメクス；ウラシルマスタード；ウレデパ；バルルビシン；バルスポダル；バプレオチド；ベルテポルフィン；ビンブラスチン；ビンクリスチン；ビンデシン；ビネピジン；ビンフルニン；ビンホルミド；ビングリシネート；ビンロイシノール；ビンロイロシン；ビノレルビン；ビンロシジン；ビントリプトール；ビンゾリジン；ボロゾール；キサントマイシンＡ（グアメシクリン）；ゼニプラチン；ジラスコルブ［２−Ｈ］；ジノスタチン；ゾレドロネート；ゾルビシン；およびゾスキダルの中から選択される抗癌剤である、請求項５０から５６のいずれかに記載の組合せ。
【請求項５８】
ヒアルロニダーゼ基質が蓄積する疾患または状態を治療する方法であって、
可溶性ヒアルロニダーゼ酵素を、治療前のレベルへの基質の再合成を防ぐように、少なくとも約３Ｕ／ｍＬまたは３Ｕ／ｍＬの血漿中のヒアルロニダーゼの薬理学的に活性なレベルを維持するのに十分な量で、１週間に１回以上、所定の数の週間、対象に投与する工程を含み、
前記ヒアルロニダーゼ酵素がポリマーとのコンジュゲーションによって修飾されており、
前記所定の数の週間が１週間を超える、方法。
【請求項５９】
所定の数の週間が少なくとも２週間である、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
所定の数の週間が２週間、３週間または４週間である、請求項５８または請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
所定の数の週間後、投与が、第１の所定の期間中断され、次いで、少なくとも１週間再開される、請求項５８から６０のいずれかに記載の方法。
【請求項６２】
第１の所定の期間が、少なくとも１週間である、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
第１の所定の期間が、１週間、２週間、３週間または４週間である、請求項６１または請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
第１の所定の期間後、治療前のレベルへの基質の再合成を防ぐように、少なくとも約３Ｕ／ｍＬまたは３Ｕ／ｍＬの血漿中のヒアルロニダーゼの薬理学的に活性なレベルを維持するのに十分な量で、１週間に１回以上、所定の数の週間、可溶性ヒアルロニダーゼを対象にさらに投与する、請求項６１から６３のいずれかに記載の方法。
【請求項６５】
投与および投与の中断の周期が複数回反復される、請求項６１から６４のいずれかに記載の方法。
【請求項６６】
ヒアルロニダーゼが少なくともまたは約３Ｕ／ｍＬ〜１２Ｕ／ｍＬの血漿中のヒアルロニダーゼの薬理学的に活性なレベルを維持するのに十分な量で投与される、請求項５８から６５のいずれかに記載の方法。
【請求項６７】
ヒアルロニダーゼが少なくともまたは約５Ｕ／ｍＬ、６Ｕ／ｍＬ、７Ｕ／ｍＬ、８Ｕ／ｍＬ、９Ｕ／ｍＬ、１０Ｕ／ｍＬ、１５Ｕ／ｍＬ、２０Ｕ／ｍＬ、３０Ｕ／ｍＬ、４０Ｕ／ｍＬ、４５Ｕ／ｍＬ、５０Ｕ／ｍＬまたはそれ以上の血漿中のヒアルロニダーゼの薬理学的に活性なレベルを維持するのに十分な量で投与される、請求項５８から６５のいずれかに記載の方法。
【請求項６８】
ヒアルロニダーゼが少なくともまたは約１０Ｕ／ｍＬの血漿中のヒアルロニダーゼの薬理学的に活性なレベルを維持するのに十分な量で投与される、請求項５８から６７のいずれかに記載の方法。
【請求項６９】
ヒアルロニダーゼが週に２回投与される、請求項５８から６８のいずれかに記載の方法。
【請求項７０】
ヒアルロニダーゼが、０．０２ｍｇ／ｋｇ、０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．０４ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．０６ｍｇ／ｋｇ、０．０７ｍｇ／ｋｇ、０．０８ｍｇ／ｋｇ、０．０９ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．１５ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．２５ｍｇ／ｋｇ、０．３０ｍｇ／ｋｇ、０．３５ｍｇ／ｋｇ、０．４０ｍｇ／ｋｇ、０．４５ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．５５ｍｇ．ｋｇ、０．６ｍｇ／ｋｇ、０．７ｍｇ／ｋｇ、０．８ｍｇ／ｋｇ、０．９ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、１．１ｍｇ／ｋｇ、１．２ｍｇ／ｋｇ、１．３ｍｇ／ｋｇ、１．４ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ（対象体重あたり）またはそれ以上の中から選択される量で投与される、請求項６８から６９のいずれかに記載の方法。
【請求項７１】
ヒアルロニダーゼが、０．０５ｍｇ／ｋｇ〜０．８ｍｇ／ｋｇの中から選択される量で投与される、請求項５８から７０のいずれかに記載の方法。
【請求項７２】
ヒアルロニダーゼが、５０，０００ユニット（Ｕ）；６０，０００Ｕ；７０，０００Ｕ；８０，０００Ｕ；９０，０００Ｕ；１００，０００Ｕ；２００，０００Ｕ；３００，０００Ｕ；４００，０００Ｕ；５００，０００Ｕ；６００，０００Ｕ；７００，０００Ｕ；８００，０００Ｕ；９００，０００Ｕ；１，０００，０００Ｕ；１，５００，０００Ｕ；２，０００，０００Ｕ；２，５００，０００Ｕ；３，０００，０００Ｕ；３，５００，０００Ｕ；４，０００，０００Ｕもしくはそれ以上、または約５０，０００ユニット（Ｕ）；６０，０００Ｕ；７０，０００Ｕ；８０，０００Ｕ；９０，０００Ｕ；１００，０００Ｕ；２００，０００Ｕ；３００，０００Ｕ；４００，０００Ｕ；５００，０００Ｕ；６００，０００Ｕ；７００，０００Ｕ；８００，０００Ｕ；９００，０００Ｕ；１，０００，０００Ｕ；１，５００，０００Ｕ；２，０００，０００Ｕ；２，５００，０００Ｕ；３，０００，０００Ｕ；３，５００，０００Ｕ；４，０００，０００Ｕもしくはそれ以上である量で投与される、請求項５８から７１のいずれかに記載の方法。
【請求項７３】
ヒアルロニダーゼ基質がヒアルロナンである、請求項５８から７２のいずれかに記載の方法。
【請求項７４】
対象由来のサンプル中のヒアルロナン発現を、治療前に測定する、請求項５８から７３のいずれかに記載の方法。
【請求項７５】
対象においてヒアルロナン関連疾患または状態を治療する方法であって、
（ａ）対象由来のサンプル中のヒアルロナン発現またはヒアルロンを測定する工程と、
（ｂ）対象由来のサンプル中のヒアルロナン発現またはヒアルロンが上昇しているか、または疾患もしくは状態を示すレベルである場合には、可溶性ヒアルロニダーゼを含有する組成物を対象に投与する工程と
を含み、前記可溶性ヒアルロニダーゼが、ポリマーとのコンジュゲーションによって修飾されている方法。
【請求項７６】
対象由来のサンプルが組織または体液である、請求項７４または請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
対象由来のサンプルが血液サンプル、腫瘍生検、脳脊髄液、尿、汗、精液または唾液サンプルである、請求項７４から７６のいずれかに記載の方法。
【請求項７８】
疾患または状態を治療するための第２の異なる薬剤を対象に投与する工程をさらに含む、請求項５８から７７のいずれかに記載の方法。
【請求項７９】
第２の薬剤および可溶性ヒアルロニダーゼを含有する組成物が単一組成物で投与される、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
第２の薬剤および可溶性ヒアルロニダーゼを含有する組成物が別個に投与される、請求項７８に記載の方法。
【請求項８１】
第２の薬剤および可溶性ヒアルロニダーゼを含有する組成物が、同時に、任意の順序で逐次または断続的に投与される、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
第２の薬剤が、可溶性ヒアルロニダーゼを含有する組成物の投与後に投与される、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
第２の薬剤が、投与の周期中、可溶性ヒアルロニダーゼの第１の投与後に投与され、また可溶性ヒアルロニダーゼの１回または複数のその後の投与後に投与されてもよい、請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
第２の薬剤が、可溶性ヒアルロニダーゼのその後の投与各々の後に投与される、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
第２の薬剤が、可溶性ヒアルロニダーゼの１回おきのその後の投与後に投与される、請求項８３に記載の方法。
【請求項８６】
第２の薬剤が、１週間に１回、２週間に１回、３週間に１回または１カ月に１回投与される、請求項８３に記載の方法。
【請求項８７】
第２の薬剤が、可溶性ヒアルロニダーゼを含有する組成物が投与された、少なくとも０．５分、少なくとも１分、少なくとも５分、少なくとも１５分、少なくとも３０分、少なくとも１時間または１時間超後に投与される、請求項８２から８６のいずれかに記載の方法。
【請求項８８】
第２の薬剤が、可溶性ヒアルロニダーゼを含有する組成物が投与された、少なくともまたは２時間、４時間、６時間、８時間、１０時間、１２時間、１４時間、１６時間、１８時間、２０時間、２２時間または２４時間後に投与される、請求項８２から８６のいずれかに記載の方法。
【請求項８９】
第２の薬剤が、可溶性ヒアルロニダーゼを含有する組成物の少なくとも４８時間後に投与される、請求項８２から８６のいずれかに記載の方法。
【請求項９０】
第２の薬剤が、可溶性ヒアルロニダーゼを含有する組成物の少なくとも７２時間後に投与される、請求項８２から８６のいずれかに記載の方法。
【請求項９１】
ポリマーがシアル化またはペグ化部分である、請求項５８から９０のいずれかに記載の方法。
【請求項９２】
第２の薬剤が抗癌剤または治療である、請求項１から９１のいずれかに記載の方法。
【請求項９３】
抗癌剤または治療が化学療法薬、放射線療法、抗体、ペプチド、遺伝子療法ベクター、ウイルスおよび核酸の中から選択される、請求項９２に記載の方法。
【請求項９４】
第２の薬剤が、アシビシン；アクラルビシン；アコダゾール；アクロニン；アドゼレシン；アルデスロイキン；アレムツズマブ；アリトレチノイン（９−Ｃｉｓ−レチノイン酸）；アロプリノール；アルトレタミン；アルボシジブ；アンバゾン；アンボマイシン；アメタントロン；アミホスチン；アミノグルテチミド；アムサクリン；アナストロゾール；アナキシロン；アンシタビン；アントラマイシン；アパジコン；アルギメスナ；ヒ素三酸化物；アスパラギナーゼ；アスペルリン；アトリムスチン；アザシチジン；アゼテパ；アゾトマイシン；バノキサントロン；バタブリン；バチマスタット；生ＢＣＧ；ベナキシビン；ベンダムスチン；ベンゾデパ；ベキサロテン；ベバシズマブ；ビカルタミド；ビエタセルピン；ビリコダル；ビサントレン；ビサントレン；ビスナフィドジメシレート；ビゼレシン；ブレオマイシン；ボルテゾミブ；ブレキナル；ブロピリミン；ブドチタン；ブスルファン；カクチノマイシン；カルステロン；カネルチニブ；カペシタビン；カラセミド；カルベチマー；カルボプラチン；カルボコン；カルモフール；ポリフェプロザンを伴うカルムスチン；カルムスチン；カルビシン；カルゼレシン；セデフィンゴール；セレコキシブ；セマドチン；クロラムブシル；シオテロネル；シロレマイシン；シスプラチン；クラドリビン；クランフェヌル；クロファラビン；クリスナトール；シクロホスファミド；リポソーム型シタラビン；シタラビン；ダカルバジン；ダクチノマイシン；ダルベポエチンα；リポソーム型ダウノルビシン；ダウノルビシン／ダウノマイシン；ダウノルビシン；デシタビン；デニロイキンジフチトクス；デクスニグルジピン；デキソナプラチン；デクスラゾキサン；デザグアニン；ジアジコン；ジブロスピジウム；ジエノゲスト；ジナリン；ジセルモリド；ドセタキセル；ドフェキダル；ドキシフルリジン；リポソーム型ドキソルビシン；ドキソルビシンＨＣＬ；ドコルビシンＨＣＬリポソーム注射剤；ドキソルビシン；ドロロキシフェン；プロピオン酸ドロモスタノロン；デュアゾマイシン；エコムスチン；エダトレキサート；エドテカリン；エフロールニチン；エラクリダル；エリナフィド；エリオットＢ溶液；エルサミトルシン；エミテフル；エンロプラチン；エンプロメート；エンザスタウリン；エピプロピジン；エピルビシン；エポエチンα；エプタロプロスト；エルブロゾール；エソルビシン；エストラムスチン；エタニダゾール；エトグルシド；リン酸エトポシド；エトポシドＶＰ−１６；エトポシド；エトプリン；エキセメスタン；エクシスリンド；ファドロゾール；ファザラビン；フェンレチニド；フィルグラスチム；フロクスウリジン；フルダラビン；フルオロウラシル；５−フルオロウラシル；フルオキシメステロン；フルロシタビン；ホスキドン；ホストリエシン；ホストリエシン；ホトレタミン；フルベストラント；ガラルビシン；ガロシタビン；ゲムシタビン；ゲムツズマブ／オゾガマイシン；ゲロキノール；ギマテカン；ギメラシル；グロキサゾン；グルホスファミド；酢酸ゴセレリン；ヒドロキシ尿素；イブリツモマブ／チウキセタン；イダルビシン；イホスファミド；イルモホシン；イロマスタット；メシル酸イマチニブ；イメキソン；インプロ��ルファン；インジスラム；インプロコン；インターフェロンα２ａ；インターフェロンα２ｂ；インターフェロンα；インターフェロンβ；インターフェロンγ；インターフェロン；インターロイキン２および他のインターロイキン（組換えインターロイキンを含む）；イントプリシン；ヨーベングアン［１３１−Ｉ］；イプロプラチン；イリノテカン；イルソグラジン；イクサベピロン；ケトトレキサート；Ｌ−アラノシン；ランレオチド；ラパチニブ；レドキサントロン；レトロゾール；ロイコボリン；リュープロリド；リュープロレリン（リュープロレリド）；レバミソール；レキサカルシトール；リアロゾール；ロバプラチン；ロメトレキソール；ロムスチン／ＣＣＮＵ；ロムスチン；ロナファルニブ；ロソキサントロン；ルルトテカン；マホスファミド；マンノスルファン；マリマスタット；マソプロコール；メイタンシン；メクロレタミン；メクロレタミン／ナイトロジェンマスタード；酢酸メゲストロール；メゲストロール；メレンゲストロール；メルファラン；メルファランＩＬ−ＰＡＭ；メノガリル；メピチオスタン；メルカプトプリン；６−メルカプトプリン；メスナ；メテシンド；メトトレキサート；メトキサレン；メトミダート；メトプリン；メツレデパ；ミボプラチン；ミプロキシフェン；ミソニダゾール；ミチンドミド；ミトカルシン；ミトクロミン；ミトフラキソン；ミトギリン；ミトグアゾン；ミトマルシン；マイトマイシンＣ；マイトマイシン；ミトナフィド；ミトキドン；ミトスペル；ミトタン；ミトキサントロン；ミトゾロミド；ミボブリン；ミゾリビン；モファロテン；モピダモール；ムブリチニブ；ミコフェノール酸；フェンプロピオン酸ナンドロロン；ネダプラチン；ネルザラビン；ネモルビシン；ニトラクリン；ノコダゾール；ノフェツモバブ；ノガラマイシン；ノラトレキセド；ノルトピキサントロン；オクトレオチド；オプレルベキン；オルマプラチン；オルタタキセル；オテラシル；オキサリプラチン；オキシスラン；オキソフェナルシン；パクリタキセル；パミドロネート；パツビロン；ペガデマーゼ；ペガスパルガーゼ；ペグフィルグラスチム；ペルデシン；ペリオマイシン；ペリトレキソール；ペメトレキセド；ペンタムスチン；ペントスタチン；ペプロマイシン；ペルホスファミド；ペリホシン；ピコプラチン；ピナフィド；ピポブロマン；ピポスルファン；ピルフェニドン；ピロキサントロン；ピキサントロン；プレビトレキセド；プリカミシドミトラマイシン；プリカマイシン；プロメスタン；プロメスタン；ポルフィマーナトリウム；ポルフィマー；ポルフィロマイシン；プレドニムスチン；プロカルバジン；プロパミジン；プロスピジウム；プミテパ；ピューロマイシン；ピラゾフリン；キナクリン；ラニムスチン；ラスブリカーゼ；リボプリン；リトロスルファン；リツキシマブ；ログレチミド；ロキニメックス；ルホクロモマイシン；サバルビシン；サフィンゴール；サルグラモスチム；サトラプラチン；セブリプラチン；セムスチン；シムトラゼン；シゾフィラン；ソブゾキサン；ソラフェニブ；スパルホサート；スパルホス酸；スパルソマイシン；スピロゲルマニウム；スピロムスチン；スピロプラチン；スピロプラチン；スクアラミン；ストレプトニ���リン；ストレプトバリシン；ストレプトゾシン；スホスファミド；スロフェヌル；リンゴ酸スニチニブ；６−チオグアニン（６−ＴＧ）；タセジナリン；タルク；タリソマイシン；タリムスチン；タモキシフェン；タリキダール；タウロムスチン；テコガラン；テガフール；テロキサントロン；テモポルフィン；テモゾロミド；テニポシド／ＶＭ−２６；テニポシド；テロキシロン；テストラクトン；チアミプリン；チオグアニン；チオテパ；チアミプリン；チアゾフリン；チロミソール；チロロン；チムコダル；チモナシック；チラパザミン；トピキサントロン；トポテカン；トレミフェン；トシツモマブ；トラベクテジン（エクチナサイジン７４３）；トラスツズマブ；トレストロン；トレチノイン／ＡＴＲＡ；トリシリビン；トリロスタン；トリメトレキセート；四硝酸トリプラチン；トリプトレリン；トロホスファミド；ツブロゾール；ウベニメクス；ウラシルマスタード；ウレデパ；バルルビシン；バルスポダル；バプレオチド；ベルテポルフィン；ビンブラスチン；ビンクリスチン；ビンデシン；ビネピジン；ビンフルニン；ビンホルミド；ビングリシネート；ビンロイシノール；ビンロイロシン；ビノレルビン；ビンロシジン；ビントリプトール；ビンゾリジン；ボロゾール；キサントマイシンＡ（グアメシクリン）；ゼニプラチン；ジラスコルブ［２−Ｈ］；ジノスタチン；ゾレドロネート；ゾルビシン；およびゾスキダルの中から選択される抗癌剤である、請求項１から９３のいずれかに記載の方法。
【請求項９５】
可溶性ヒアルロニダーゼおよび／または第２の薬剤が局所的または全身的に投与される、請求項５８から９４のいずれかに記載の方法。
【請求項９６】
可溶性ヒアルロニダーゼおよび／または第２の薬剤が、経口的に、静脈内に（ＩＶ）、皮下に、筋肉内に、腫瘍内に、皮内、局所的に、経皮的に、直腸性にまたは表皮下に投与される、請求項９５に記載の方法。
【請求項９７】
可溶性ヒアルロニダーゼおよび／または第２の薬剤が静脈内に投与される、請求項９６に記載の方法。
【請求項９８】
可溶性ヒアルロニダーゼおよび／または第２の薬剤が腫瘍内に投与される、請求項９６に記載の方法。
【請求項９９】
対象由来のサンプル中のヒアルロナンの発現を、対照サンプル中の発現または標準と比較する工程をさらに含む、請求項７４から９８のいずれかに記載の方法。
【請求項１００】
ヒアルロニダーゼ基質が蓄積する疾患または状態が高間質液圧と関連している、請求項５８から９９のいずれかに記載の方法。
【請求項１０１】
疾患または状態が椎間板圧迫、癌および浮腫の中から選択される、請求項５８から１００のいずれかに記載の方法。
【請求項１０２】
疾患または状態が浮腫であり、浮腫が臓器移植、卒中または脳外傷によって引き起こされる、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０３】
疾患または状態が癌であり、癌が腫瘍である、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０４】
疾患または状態が固形腫瘍である、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０５】
腫瘍が同一組織種の非癌性組織と比較して、または同一腫瘍種の非転移性腫瘍と比較して、ヒアルロナンの細胞発現および／または間質発現を増大させている、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０６】
疾患または状態が、後期癌、転移性癌および未分化癌のうち任意の１種または複数の中から選択される、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０７】
疾患または状態が、卵巣癌、ｉｎ  ｓｉｔｕ癌腫（ＩＳＣ）、扁平上皮癌（ＳＣＣ）、前立腺癌、膵臓癌、非小細胞肺癌、乳癌、脳癌および結腸癌のうち任意の１種または複数の中から選択される、請求項５８から１０６のいずれかに記載の方法。
【請求項１０８】
可溶性ヒアルロニダーゼが可溶性ＰＨ２０である、請求項５８から１０７のいずれかに記載の方法。
【請求項１０９】
ＰＨ２０がヒツジ、マウス、サル、ウシ、細菌およびヒトＰＨ２０の中から選択される、請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１０】
ＰＨ２０の可溶性型が、Ｃ末端ＧＰＩを除去するよう末端切断された可溶性ＰＨ２０である、請求項１０８または請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１１】
可溶性ヒアルロニダーゼが、配列番号１に含まれるアミノ酸の配列または配列番号１に含まれるアミノ酸の配列と少なくとも約９１％のアミノ酸配列同一性を有する配列を有し、それによって可溶性ヒアルロニダーゼが、可溶性でＮ−グリコシル化された中性の活性である、請求項５８から１１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１１２】
可溶性ヒアルロニダーゼが、アミノ酸残基４６７〜４８３であるか、またはアミノ酸残基４６７〜４８３の間であるアミノ酸残基で末端切断されている、配列番号１に示されるアミノ酸の配列を含む、請求項５８から１１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１１３】
可溶性ヒアルロニダーゼが、４６７、４６８、４６９、４７０、４７１、４７２、４７３、４７４、４７５、４７６、４７７、４７８、４７９、４８０、４８１、４８２および４８３の中から選択されるアミノ酸残基で末端切断されている、配列番号１に示されるアミノ酸の配列を含む、請求項５８から１１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１１４】
可溶性ヒアルロニダーゼがＣＨＯ細胞において分泌される、請求項５８から１１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１１５】
可溶性ヒアルロニダーゼが、配列番号１のアミノ酸３６〜４６７、３６〜４６８、３６〜４６９、３６〜４７０、３６〜４７１、３６〜４７２、３６〜４７３、３６〜４７４、３６〜４７５、３６〜４７６、３６〜４７７、３６〜４７８、３６〜４７９、３６〜４８０、３６〜４８１、３６〜４８２もしくは３６〜４８３として示されるアミノ酸の配列を有するか、または配列番号１のアミノ酸３６〜４６７、３６〜４６８、３６〜４６９、３６〜４７０、３６〜４７１、３６〜４７２、３６〜４７３、３６〜４７４、３６〜４７５、３６〜４７６、３６〜４７７、３６〜４７８、３６〜４７９、３６〜４８０、３６〜４８１、３６〜４８２もしくは３６〜４８３として示されるアミノ酸の配列と少なくとも約９１％のアミノ酸配列同一性を有する、請求項５８から１１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１１６】
可溶性ヒアルロニダーゼが、配列番号４〜９および４６〜４８のいずれかに示されるアミノ酸の配列を含有するポリペプチドならびにその対立遺伝子変異体、種変異体およびその他の変異体の中から選択される、請求項５８から１１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１１７】
可溶性ヒアルロニダーゼが、配列番号４に示されるアミノ酸の配列をコードする核酸の配列によってコードされるポリペプチドである、請求項５８から１１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１１８】
可溶性ヒアルロニダーゼが、配列番号４〜９のいずれかに示されるアミノ酸の配列をコードする核酸の配列によってコードされるポリペプチドの中から選択される、請求項５８から１１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１１９】
可溶性ヒアルロニダーゼがＣＨＯ細胞における発現によって産生される、請求項１１８に記載の方法。
【請求項１２０】
可溶性ヒアルロニダーゼが指定されたｒＨｕＰＨ２０である、請求項１１９に記載の方法。
【請求項１２１】
可溶性ヒアルロニダーゼがグリコシル化されている、請求項５８から１２０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２２】
可溶性ヒアルロニダーゼとコンジュゲートしているポリマーが、ペグ化部分（ＰＥＧ）を含む、請求項５８から１２１のいずれかに記載の方法。
【請求項１２３】
ポリマーが、メトキシ−ポリ（エチレングリコール）−スクシンイミジルブタノエート（ｍＰＥＧ−ＳＢＡ）（５ｋＤａ）；メトキシ−ポリ（エチレングリコール）−スクシンイミジルブタノエート（ｍＰＥＧ−ＳＢＡ）（２０ｋＤａ）；メトキシ−ポリ（エチレングリコール）−スクシンイミジルブタノエート（ｍＰＥＧ−ＳＢＡ）（３０ｋＤａ）；メトキシ−ポリ（エチレングリコール）−スクシンイミジルα−メチルブタノエート（ｍＰＥＧ−ＳＭＢ）（２０ｋＤａ）；メトキシ−ポリ（エチレングリコール）−スクシンイミジルα−メチルブタノエート（ｍＰＥＧ−ＳＭＢ）（３０ｋＤａ）；メトキシ−ポリ（エチレングリコール）−ブチルアルデヒド（ｍＰＥＧ−ブチルアルデヒド）（３０ｋＤａ）、メトキシ−ポリ（エチレングリコール）−スクシンイミジルプロピオネート（ｍＰＥＧ−ＳＰＡ）（２０ｋＤａ）；メトキシ−ポリ（エチレングリコール）−スクシンイミジルプロピオネート（ｍＰＥＧ−ＳＰＡ）（３０ｋＤａ）；（メトキシ−ポリ（エチレングリコール））２−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ｍＰＥＧ２−ＮＨＳ）（１０ｋＤａ、分岐）；（メトキシ−ポリ（エチレングリコール））２−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ｍＰＥＧ２−ＮＨＳ）（２０ｋＤａ、分岐）；（メトキシ−ポリ（エチレングリコール））２−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ｍＰＥＧ２−ＮＨＳ）（４０ｋＤａ、分岐）；（メトキシ−ポリ（エチレングリコール））２−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ｍＰＥＧ２−ＮＨＳ）（６０ｋＤａ、分岐）；ビオチン−ポリ（エチレングリコール）−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ビオチン−ＰＥＧ−ＮＨＳ）（５ｋＤａ、ビオチン化）；ポリ（エチレングリコール）−ｐ−ニトロフェニルカルボネート（ＰＥＧ−ｐ−ニトロフェニル−カルボネート）（３０ｋＤａ）；およびポリ（エチレングリコール）−プリオピオンアルデヒド（ＰＥＧ−プロピオンアルデヒド）（３０ｋＤａ）の中から選択される、請求項１２２に記載の方法。
【請求項１２４】
ＰＥＧが分岐または直鎖ＰＥＧである、請求項１２３に記載の方法。
【請求項１２５】
ＰＥＧが直鎖ＰＥＧである、請求項１２４に記載の方法。
【請求項１２６】
ＰＥＧがメトキシ−ＰＥＧ（ｍＰＥＧ）である、請求項１２２から１２５のいずれかに記載の方法。
【請求項１２７】
ＰＥＧがメトキシポリ（エチレングリコール）ブタン酸の直鎖Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルである、請求項１２６に記載の方法。
【請求項１２８】
ＰＥＧが３０または約３０キロダルトンの分子量を有する、請求項１２６または請求項１２７に記載の方法。
【請求項１２９】
治療が対象において腫瘍の大きさの低減をもたらす、請求項５８から１２８のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
２００４年４月１４日に出願された、「ＣＯＭＢＩＮＡＴＩＯＮ  ＵＳＩＮＧ  Ａ  ＭＯＤＩＦＩＥＤ  ＳＯＬＵＢＬＥ  ＨＹＡＬＵＲＯＮＩＤＡＳＥ  ＡＮＤ  ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ  ＡＧＥＮＴＳ  ＡＮＤ  ＴＲＥＡＴＭＥＮＴＳ」と題されたＧｒｅｇｏｒｙ  Ｆｒｏｓｔの米国仮出願番号第６１／１２４，２７８号；２００８年５月２９日に出願された「ＣＯＭＢＩＮＡＴＩＯＮ  ＴＨＥＲＡＰＹ  ＵＳＩＮＧ  Ａ  ＳＯＬＵＢＬＥ  ＨＹＡＬＵＲＯＮＩＤＡＳＥ  ＡＮＤ  ＣＨＥＭＯＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ  ＡＧＥＮＴＳ」と題されたＧｒｅｇｏｒｙ  Ｆｒｏｓｔの米国仮出願番号第６１／１３０，３５７号；および２００８年１０月８日に出願された「ＭＯＤＩＦＩＥＤ  ＨＹＡＬＵＲＯＮＩＤＡＳＥＳ  ＡＮＤ  ＵＳＥＳ  ＩＮ  ＴＲＥＡＴＩＮＧ  ＨＹＡＬＵＲＯＮＡＮ−ＡＳＳＯＣＩＡＴＥＤ  ＤＩＳＥＡＳＥＳ  ＡＮＤ  ＣＯＮＤＩＴＩＯＮＳ」と題されたＧｒｅｇｏｒｙ  Ｆｒｏｓｔの米国仮出願番号第６１／１９５，６２４号の優先権の利益が主張される。
【０００２】
本願は、米国仮出願番号第６１／１２４，２７８号、同６１／１３０，３５７号および同６１／１９５，６２４号の優先権を主張する「ＭＯＤＩＦＩＥＤ  ＨＹＡＬＵＲＯＮＩＤＡＳＥＳ  ＡＮＤ  ＵＳＥＳ  ＩＮ  ＴＲＥＡＴＩＮＧ  ＨＹＡＬＵＲＯＮＡＮ−ＡＳＳＯＣＩＡＴＥＤ  ＤＩＳＥＡＳＥＳ  ＡＮＤ  ＣＯＮＤＩＴＩＯＮＳ」と題された、これと同日に出願された、米国特許出願番号第（代理人整理番号０１１９３７４−０００９１／  ３０６６）と関連する。上記の関連出願の主題は、その全文において参照により組み込まれる。
【０００３】
上記の参照される出願各々の主題は、その全文において参照によって組み込まれる。
【０００４】
ヒアルロナン関連状態、疾患および障害の治療のための、ヒアルロナン分解酵素、特に、可溶性ヒアルロニダーゼを含有する組合せ、組成物およびキットが提供される。一実施例では、製品は、さらなる薬剤または治療を含む。このような製品は、ヒアルロナン関連疾患および状態、例えば、ヒアルロナン関連癌、例えば、ヒアルロナンリッチな腫瘍を治療するために製品を投与するための方法において使用してもよい。これらの方法は、単独またはその他の治療と組み合わせた、ヒアルロナン分解酵素組成物、例えば、ヒアルロニダーゼ組成物の投与を含む。ヒアルロナン関連疾患および状態において持続した治療効果を提供するための方法および組成物も提供される。
【背景技術】
【０００５】
ヒアルロナン（ヒアルロン酸；ＨＡ）は、哺乳類において結合組織、皮膚、軟骨中に、および滑液中に主に存在するグリコサミノグリカンである。ヒアルロナンはまた、眼の硝子体の主要な成分である。結合組織では、ヒアルロナンと結合している水和の水は、組織間の水和マトリックスを作り出す。ＨＡは、多数の細胞の細胞外マトリックス中、特に、柔結合組織中に見られる。ＨＡは、細胞内マトリックスにおいて種々の生理学的過程において、例えば、水および血漿タンパク質ホメオスタシスにおいて役割を有する(Laurent TC et al(1992) FASEB J 6: 2397-2404)。特定の疾患は、ヒアルロナンの発現および／または産生と関連している。
【０００６】
ヒアルロニダーゼをはじめとするヒアルロナン分解酵素は、ヒアルロナンを分解する酵素である。種々のヒアルロナン分解酵素が、その他の治療薬と組み合わせて、通常、分散剤および展着剤として治療的に使用されている。特に、ヒアルロナン関連疾患および状態の治療のための、ヒアルロナン分解酵素の投与のための改善された組成物および方法が必要である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
ヒアルロナン関連疾患または状態を治療するための方法が提供される。これらの方法は、ヒアルロニダーゼなどのヒアルロナン分解酵素、特に、可溶性ヒアルロニダーゼ、例えば、動物または細菌ヒアルロニダーゼのいずれかを投与する工程を含む。ヒアルロナン分解酵素は、ペグ化部分などのポリマーで修飾される。このようなヒアルロナン分解酵素の例として、可溶性ヒトヒアルロニダーゼがある。このような可溶性ヒアルロニダーゼおよびその処方は、例えば、ＵＳ２００４０２６８４２５として公開される、同時係属米国特許出願番号第１０／７９５，０９５号、ＵＳ２００５０２６０１８６として公開される、米国特許出願番号第１１／０６５，７１６号、ＵＳ２００６０１０４９６８として公開される米国特許出願番号第１１／２３８，１７１号に記載されている。このような可溶性ヒアルロニダーゼは、ペグ化部分などのポリマーで修飾される。ヒアルロニダーゼなどのヒアルロナン分解酵素は、それだけには限らないが、半減期および薬物動態（ｐｈａｒｍｏｋｉｎｅｔｉｃｓ）などの特性を変更するようにポリマーで修飾される。修飾は、直接的またはリンカーを介して間接的に、例えば、共有結合によって、またはその他の適した連結によって、デキストラン、ペグ化もしくはシアル化（ｓｉａｌａｔｉｏｎ）部分などのポリマーまたは天然もしくは糖ポリマーなどのその他のこのようなポリマーを連結することを含む。本明細書において例示的実施形態では、ヒアルロナン分解酵素は、ペグ化される。
【０００８】
本明細書では、ヒアルロニダーゼ基質が蓄積する疾患または状態を治療する方法およびヒアルロナン関連疾患または状態を治療する方法が提供される。このような方法は、ポリマーとのコンジュゲーションによって修飾されている可溶性ヒアルロニダーゼ（ｈｙａｕｒｏｎｉｄａｓｅ）を投与することを含む。また、本明細書では、少なくとも３Ｕ／ｍＬのレベルで血漿におけるヒアルロニダーゼ酵素の血漿レベルを少なくとも１週間維持するのに十分な量で可溶性ヒアルロニダーゼを含有する組成物およびこのような組成物を含有する組合せも提供される。本明細書において提供される組成物および組合せ中の可溶性ヒアルロニダーゼは、ポリマーとコンジュゲートされている。
【０００９】
本明細書において、ヒアルロニダーゼ基質が蓄積する疾患または状態を治療する方法が提供される。これらの方法は、可溶性ヒアルロニダーゼ酵素を、治療前のレベルへの基質の再合成を防ぐよう、少なくとも約３Ｕ／ｍＬまたは３Ｕ／ｍＬの血漿中のヒアルロニダーゼの薬理学的に活性なレベルを維持するのに十分な量で、１週間に２回以上、所定の数の週間、対象に投与することを含む。本方法において使用されるヒアルロニダーゼ酵素は、ポリマーとのコンジュゲーションによって修飾されており、所定の数の週間は、１週間を超える。いくつかの実施例では、所定の数の週間は、少なくとも２週間、例えば、２週間、３週間または４週間である。治療されている状態または疾患において蓄積する例示的ヒアルロニダーゼ基質として、ヒアルロナンが挙げられる。一実施例では、対象由来のサンプルにおけるヒアルロナン発現を治療に先立って測定する。
【００１０】
ヒアルロニダーゼ基質が蓄積する疾患または状態を治療する方法のいくつかの例では、所定の数の週間後、投与が、最初の所定の期間、例えば、少なくとも１週間中断され、次いで、少なくとも１週間再開される。例えば、投与は、１週間、２週間、３週間または４週間中断され、次いで、少なくとも１週間再開され得る。さらなる例では、最初の所定の期間後、可溶性ヒアルロニダーゼが、治療前のレベルへの基質の再合成を防ぐよう、少なくとも約３Ｕ／ｍＬまたは３Ｕ／ｍＬの血漿中のヒアルロニダーゼの薬理学的に活性なレベルを維持するのに十分な量で、１週間に２回以上、所定の数の週間、さらに対象に投与される。これらの方法のいずれかのいくつかの実施形態では、投与および投与の中断の周期は、複数回反復される。
【００１１】
本明細書において提供される方法のいくつかの実施形態では、ヒアルロニダーゼは、少なくとも、または約３Ｕ／ｍＬ〜１２Ｕ／ｍＬの血漿中のヒアルロニダーゼの薬理学的に活性なレベルを維持するのに十分な量で投与される。例えば、ヒアルロニダーゼは、少なくとも、または約５Ｕ／ｍＬ、６Ｕ／ｍＬ、７Ｕ／ｍＬ、８Ｕ／ｍＬ、９Ｕ／ｍＬ、１０Ｕ／ｍＬ、１５Ｕ／ｍＬ、２０Ｕ／ｍＬ、３０Ｕ／ｍＬ、４０Ｕ／ｍＬ、４５Ｕ／ｍＬ、５０Ｕ／ｍＬまたはそれ以上の血漿中のヒアルロニダーゼの薬理学的に活性なレベルを維持するのに十分な量で投与され得る。本方法の特定の実施形態では、ヒアルロニダーゼは、少なくとも、または約１０Ｕ／ｍＬの血漿中のヒアルロニダーゼの薬理学的に活性なレベルを維持するのに十分な量で投与される。
【００１２】
ヒアルロニダーゼ基質が蓄積する疾患または状態を治療する方法の一実施形態では、ヒアルロニダーゼは、週に２回投与される。対象に投与されるヒアルロニダーゼの量は、例えば、０．０２ｍｇ／ｋｇ（対象の）、０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．０４ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．０６ｍｇ／ｋｇ、０．０７ｍｇ／ｋｇ、０．０８ｍｇ／ｋｇ、０．０９ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．１５ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．２５ｍｇ／ｋｇ、０．３０ｍｇ／ｋｇ、０．３５ｍｇ／ｋｇ、０．４０ｍｇ／ｋｇ、０．４５ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．５５ｍｇ．ｋｇ、０．６ｍｇ／ｋｇ、０．７ｍｇ／ｋｇ、０．８ｍｇ／ｋｇ、０．９ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、１．１ｍｇ／ｋｇ、１．２ｍｇ／ｋｇ、１．３ｍｇ／ｋｇ、１．４ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇまたはそれ以上であり得る。一例では、投与されるヒアルロニダーゼの量は、０．０５ｍｇ／ｋｇ〜０．８ｍｇ／ｋｇである。さらなる例では、投与されるヒアルロニダーゼ（ｈｙａｌｕｒｏｎｄａｓｅ）の量は、５０，０００ユニット（Ｕ）；６０，０００Ｕ；７０，０００Ｕ；８０，０００Ｕ；９０，０００Ｕ；１００，０００Ｕ；２００，０００Ｕ；３００，０００Ｕ；４００，０００Ｕ；５００，０００Ｕ；６００，０００Ｕ；７００，０００Ｕ；８００，０００Ｕ；９００，０００Ｕ；１，０００，０００Ｕ；１，５００，０００Ｕ；２，０００，０００Ｕ；２，５００，０００Ｕ；３，０００，０００Ｕ；３，５００，０００Ｕ；４，０００，０００Ｕまたはそれ以上、または約５０，０００ユニット（Ｕ）；６０，０００Ｕ；７０，０００Ｕ；８０，０００Ｕ；９０，０００Ｕ；１００，０００Ｕ；２００，０００Ｕ；３００，０００Ｕ；４００，０００Ｕ；５００，０００Ｕ；６００，０００Ｕ；７００，０００Ｕ；８００，０００Ｕ；９００，０００Ｕ；１，０００，０００Ｕ；１，５００，０００Ｕ；２，０００，０００Ｕ；２，５００，０００Ｕ；３，０００，０００Ｕ；３，５００，０００Ｕ；４，０００，０００Ｕまたはそれ以上である。
【００１３】
本明細書において、対象においてヒアルロナン関連疾患または状態を治療する方法が提供される。このような方法は、（ａ）対象由来のサンプル中のヒアルロナン発現またはヒアルロンを測定する工程；および（ｂ）対象由来のサンプル中のヒアルロナン発現またはヒアルロンが上昇している、または疾患もしくは状態を示すレベルである場合には、可溶性ヒアルロニダーゼを含有する組成物を対象に投与する工程を含む。これらの方法において使用される可溶性ヒアルロニダーゼは、ポリマーとのコンジュゲーションによって修飾される。いくつかの例では、対象から得られるサンプルは、例えば、血液サンプル、腫瘍生検、脳脊髄液、尿、汗、精液または唾液サンプルなどの組織または体液である。
【００１４】
ヒアルロナン関連疾患または状態を治療する方法の特定の実施形態では、疾患または状態を治療するための第２の、異なる薬剤が対象に投与される。いくつかの例では、第２の薬剤および可溶性ヒアルロニダーゼを含有する組成物が、単一の組成物で投与される。その他の例では、第２の薬剤および可溶性ヒアルロニダーゼ（ｈｙａｌｕｒｏｎｄｉａｓｅ）を含有する組成物は、別個に、例えば、同時に、任意の順序で逐次または断続的に投与される。一実施形態では、第２の薬剤は、可溶性ヒアルロニダーゼを含有する組成物の投与後に投与される。例えば、第２の薬剤は、投与の周期中、可溶性ヒアルロニダーゼの第１の投与後に、また所望により、可溶性ヒアルロニダーゼの１回または複数のその後の投与後に、例えば、可溶性ヒアルロニダーゼの各回のその後の投与後に、可溶性ヒアルロニダーゼの１回おきのその後の投与後に、または１週間に１回、２週間に１回、３週間に１回、１カ月に１回投与されてもよい。
【００１５】
本明細書に提供されるヒアルロナン関連疾患または状態を治療する方法のいくつかの態様では、第２の薬剤は、可溶性ヒアルロニダーゼを含有する組成物が投与された後、少なくとも０．５分、少なくとも１分、少なくとも５分、少なくとも１５分、少なくとも３０分、少なくとも１時間または１時間を超えて投与される。いくつかの例では、第２の薬剤は、可溶性ヒアルロニダーゼを含有する組成物が投与された、少なくともまたは２時間、４時間、６時間、８時間、１０時間、１２時間、１４時間、１６時間、１８時間、２０時間、２２時間または２４時間後に投与される。一例では、第２の薬剤は、可溶性ヒアルロニダーゼを含有する組成物の少なくとも４８時間後に投与される。別の例では、第２の薬剤は、可溶性ヒアルロニダーゼを含有する組成物の少なくとも７２時間後に投与される。ヒアルロナン関連疾患または状態を治療するための、本明細書において提供される方法のさらなる態様では、対象由来のサンプルにおけるヒアルロナンの発現を、対照サンプルにおける発現または標準と比較する。
【００１６】
ヒアルロニダーゼ基質が蓄積する疾患または状態を治療する方法およびヒアルロナン関連疾患または状態を治療する方法において使用されるヒアルロニダーゼは、ポリマーとコンジュゲートしている。いくつかの例では、ポリマーは、シアル化またはペグ化部分である。本明細書において提供される方法の一部では、第２の薬剤は、上記および本明細書において記載されるように対象に投与される。いくつかの例では、第２の薬剤は、抗癌剤または例えば、化学療法薬、放射線療法、抗体、ペプチド、遺伝子療法ベクター、ウイルスまたは核酸などの治療である。本明細書において提供される方法の一部において使用される例示的第２の薬剤として、例えば、アシビシン；アクラルビシン；アコダゾール；アクロニン；アドゼレシン；アルデスロイキン；アレムツズマブ；アリトレチノイン（９−Ｃｉｓ−レチノイン酸）；アロプリノール；アルトレタミン；アルボシジブ；アンバゾン；アンボマイシン；アメタントロン；アミホスチン；アミノグルテチミド；アムサクリン；アナストロゾール；アナキシロン；アンシタビン；アントラマイシン；アパジコン；アルギメスナ；ヒ素三酸化物；アスパラギナーゼ；アスペルリン；アトリムスチン；アザシチジン；アゼテパ；アゾトマイシン；バノキサントロン；バタブリン；バチマスタット；生ＢＣＧ；ベナキシビン；ベンダムスチン；ベンゾデパ；ベキサロテン；ベバシズマブ；ビカルタミド；ビエタセルピン；ビリコダル；ビサントレン；ビサントレン；ビスナフィドジメシレート；ビゼレシン；ブレオマイシン；ボルテゾミブ；ブレキナル；ブロピリミン；ブドチタン；ブスルファン；カクチノマイシン；カルステロン；カネルチニブ；カペシタビン；カラセミド；カルベチマー；カルボプラチン；カルボコン；カルモフール；ポリフェプロザンを伴うカルムスチン；カルムスチン；カルビシン；カルゼレシン；セデフィンゴール；セレコキシブ；セマドチン；クロラムブシル；シオテロネル；シロレマイシン；シスプラチン；クラドリビン；クランフェヌル；クロファラビン；クリスナトール；シクロホスファミド；リポソーム型シタラビン；シタラビン；ダカルバジン；ダクチノマイシン；ダルベポエチンα；リポソーム型ダウノルビシン；ダウノルビシン／ダウノマイシン；ダウノルビシン；デシタビン；デニロイキンジフチトクス；デクスニグルジピン；デキソナプラチン；デクスラゾキサン；デザグアニン；ジアジコン；ジブロスピジウム；ジエノゲスト；ジナリン；ジセルモリド；ドセタキセル；ドフェキダル；ドキシフルリジン；リポソーム型ドキソルビシン；ドキソルビシンＨＣＬ；ドコルビシンＨＣＬリポソーム注射剤；ドキソルビシン；ドロロキシフェン；プロピオン酸ドロモスタノロン；デュアゾマイシン；エコムスチン；エダトレキサート；エドテカリン；エフロールニチン；エラクリダル；エリナフィド；エリオットＢ溶液；エルサミトルシン；エミテフル；エンロプラチン；エンプロメート；エンザスタウリン；エピプロピジン；エピルビシン；エポエチンα；エプタロプロスト；エルブロゾール；エソルビシン；エストラムスチン；エタニダゾール；エトグルシド；リン酸エトポシド；エトポシドＶＰ−１６；エトポシド；エトプリン；エキセメ��タン；エクシスリンド；ファドロゾール；ファザラビン；フェンレチニド；フィルグラスチム；フロクスウリジン；フルダラビン；フルオロウラシル；５−フルオロウラシル；フルオキシメステロン；フルロシタビン；ホスキドン；ホストリエシン；ホストリエシン；ホトレタミン；フルベストラント；ガラルビシン；ガロシタビン；ゲムシタビン；ゲムツズマブ／オゾガマイシン；ゲロキノール；ギマテカン；ギメラシル；グロキサゾン；グルホスファミド；酢酸ゴセレリン；ヒドロキシ尿素；イブリツモマブ／チウキセタン；イダルビシン；イホスファミド；イルモホシン；イロマスタット；メシル酸イマチニブ；イメキソン；インプロスルファン；インジスラム；インプロコン；インターフェロンα２ａ；インターフェロンα２ｂ；インターフェロンα；インターフェロンβ；インターフェロンγ；インターフェロン；インターロイキン２および他のインターロイキン（組換えインターロイキンを含む）；イントプリシン；ヨーベングアン［１３１−Ｉ］；イプロプラチン；イリノテカン；イルソグラジン；イクサベピロン；ケトトレキサート；Ｌ−アラノシン；ランレオチド；ラパチニブ；レドキサントロン；レトロゾール；ロイコボリン；リュープロリド；リュープロレリン（リュープロレリド）；レバミソール；レキサカルシトール；リアロゾール；ロバプラチン；ロメトレキソール；ロムスチン／ＣＣＮＵ；ロムスチン；ロナファルニブ；ロソキサントロン；ルルトテカン；マホスファミド；マンノスルファン；マリマスタット；マソプロコール；メイタンシン；メクロレタミン；メクロレタミン／ナイトロジェンマスタード；酢酸メゲストロール；メゲストロール；メレンゲストロール；メルファラン；メルファランＩＬ−ＰＡＭ；メノガリル；メピチオスタン；メルカプトプリン；６−メルカプトプリン；メスナ；メテシンド；メトトレキサート；メトキサレン；メトミダート；メトプリン；メツレデパ；ミボプラチン；ミプロキシフェン；ミソニダゾール；ミチンドミド；ミトカルシン；ミトクロミン；ミトフラキソン；ミトギリン；ミトグアゾン；ミトマルシン；マイトマイシンＣ；マイトマイシン；ミトナフィド；ミトキドン；ミトスペル；ミトタン；ミトキサントロン；ミトゾロミド；ミボブリン；ミゾリビン；モファロテン；モピダモール；ムブリチニブ；ミコフェノール酸；フェンプロピオン酸ナンドロロン；ネダプラチン；ネルザラビン；ネモルビシン；ニトラクリン；ノコダゾール；ノフェツモバブ；ノガラマイシン；ノラトレキセド；ノルトピキサントロン；オクトレオチド；オプレルベキン；オルマプラチン；オルタタキセル；オテラシル；オキサリプラチン；オキシスラン；オキソフェナルシン；パクリタキセル；パミドロネート；パツビロン；ペガデマーゼ；ペガスパルガーゼ；ペグフィルグラスチム；ペルデシン；ペリオマイシン；ペリトレキソール；ペメトレキセド；ペンタムスチン；ペントスタチン；ペプロマイシン；ペルホスファミド；ペリホシン；ピコプラチン；ピナフィド；ピポブロマン；ピポスルファン；ピルフェニドン；ピロキサントロン；ピキサントロン；プレビトレキセド；プリカミシドミトラマイシン；プリカマイシン；プロメスタン；プロメスタン；ポルフィマー���トリウム；ポルフィマー；ポルフィロマイシン；プレドニムスチン；プロカルバジン；プロパミジン；プロスピジウム；プミテパ；ピューロマイシン；ピラゾフリン；キナクリン；ラニムスチン；ラスブリカーゼ；リボプリン；リトロスルファン；リツキシマブ；ログレチミド；ロキニメックス；ルホクロモマイシン；サバルビシン；サフィンゴール；サルグラモスチム；サトラプラチン；セブリプラチン；セムスチン；シムトラゼン；シゾフィラン；ソブゾキサン；ソラフェニブ；スパルホサート；スパルホス酸；スパルソマイシン；スピロゲルマニウム；スピロムスチン；スピロプラチン；スピロプラチン；スクアラミン；ストレプトニグリン；ストレプトバリシン；ストレプトゾシン；スホスファミド；スロフェヌル；リンゴ酸スニチニブ；６−チオグアニン（６−ＴＧ）；タセジナリン；タルク；タリソマイシン；タリムスチン；タモキシフェン；タリキダール；タウロムスチン；テコガラン；テガフール；テロキサントロン；テモポルフィン；テモゾロミド；テニポシド／ＶＭ−２６；テニポシド；テロキシロン；テストラクトン；チアミプリン；チオグアニン；チオテパ；チアミプリン；チアゾフリン；チロミソール；チロロン；チムコダル；チモナシック；チラパザミン；トピキサントロン；トポテカン；トレミフェン；トシツモマブ；トラベクテジン（エクチナサイジン７４３）；トラスツズマブ；トレストロン；トレチノイン／ＡＴＲＡ；トリシリビン；トリロスタン；トリメトレキセート；四硝酸トリプラチン；トリプトレリン；トロホスファミド；ツブロゾール；ウベニメクス；ウラシルマスタード；ウレデパ；バルルビシン；バルスポダル；バプレオチド；ベルテポルフィン；ビンブラスチン；ビンクリスチン；ビンデシン；ビネピジン；ビンフルニン；ビンホルミド；ビングリシネート；ビンロイシノール；ビンロイロシン；ビノレルビン；ビンロシジン；ビントリプトール；ビンゾリジン；ボロゾール；キサントマイシンＡ（グアメシクリン）；ゼニプラチン；ジラスコルブ［２−Ｈ］；ジノスタチン；ゾレドロネート；ゾルビシン；およびゾスキダルなどの抗癌剤が挙げられる。
【００１７】
本明細書において提供される、ヒアルロニダーゼ基質が蓄積する疾患または状態を治療する方法およびヒアルロナン関連疾患または状態を治療する方法のいずれにおいても、可溶性ヒアルロニダーゼおよび／または第２の薬剤は、例えば、経口的に、静脈内に（ＩＶ）、皮下に、筋肉内に、腫瘍内に、皮内に、局所的に、経皮的に、直腸に、または表皮下になど、局所的に投与しても、全身投与してもよい。本明細書において提供される方法の特定の例では、可溶性ヒアルロニダーゼおよび／または第２の薬剤は、静脈内に投与される。その他の例では、可溶性ヒアルロニダーゼおよび／または第２の薬剤は、腫瘍内に投与される。
【００１８】
本明細書において、ヒアルロニダーゼ基質が蓄積する疾患または状態を治療する方法およびヒアルロナン関連疾患または状態を治療する方法が提供される。いくつかの例では、ヒアルロニダーゼ基質が蓄積する疾患または状態は、高い間質液圧と関連している。さらなる例では、本明細書において提供される方法によって治療される疾患または状態は、椎間板圧迫、癌または浮腫である。浮腫は、例えば、臓器移植、卒中または脳外傷よって引き起こされ得る。治療される疾患または状態が癌である例では、癌は、固形腫瘍などの腫瘍であり得る。いくつかの例では、腫瘍は、同一組織種の非癌性組織と比較して、または同一腫瘍種の非転移性腫瘍と比較して、ヒアルロナンの細胞発現および／または間質発現が増大している。特定の例では、治療される疾患または状態は、後期癌、転移性癌および／または未分化癌である。一例では、疾患または状態は、卵巣癌、ｉｎ  ｓｉｔｕ癌腫（ＩＳＣ）、扁平上皮癌（ＳＣＣ）、前立腺癌、膵臓癌、非小細胞肺癌、乳癌、脳癌または結腸癌である。本明細書において提供される方法のいくつかの例では、治療は、対象における腫瘍の大きさの減少を達成する。
【００１９】
いくつかの実施形態では、提供される方法において使用される可溶性ヒアルロニダーゼは、それだけには限らないが、ヒツジ、マウス、サル、ウシ、細菌またはヒトＰＨ２０をはじめとする可溶性ＰＨ２０である。いくつかの例では、ＰＨ２０の可溶型は、Ｃ末端ＧＰＩを除去するよう末端切断された可溶性ＰＨ２０である。本明細書において提供される方法のいくつかの態様では、可溶性ヒアルロニダーゼは、配列番号１に含まれるアミノ酸の配列または配列番号１に含まれるアミノ酸の配列と少なくとも約９１％のアミノ酸配列同一性を有する配列を有し、それによって可溶性ヒアルロニダーゼは、可溶性で、Ｎ−グリコシル化され、中性で活性である。その他の例では、可溶性ヒアルロニダーゼは、アミノ酸残基４６７〜４８３であるか、またはアミノ酸残基４６７〜４８３の間であるアミノ酸残基で末端切断されている配列番号１に示されるアミノ酸の配列を含む。例えば、可溶性ヒアルロニダーゼは、４６７、４６８、４６９、４７０、４７１、４７２、４７３、４７４、４７５、４７６、４７７、４７８、４７９、４８０、４８１、４８２および４８３の中から選択されるアミノ酸残基で末端切断されている、配列番号１に示されるアミノ酸の配列を含み得る。
【００２０】
いくつかの態様では、本明細書において提供される方法において使用される可溶性ヒアルロニダーゼは、ＣＨＯ細胞において分泌される。その他の態様では、可溶性ヒアルロニダーゼは、配列番号１のアミノ酸３６〜４６７、３６〜４６８、３６〜４６９、３６〜４７０、３６〜４７１、３６〜４７２、３６〜４７３、３６〜４７４、３６〜４７５、３６〜４７６、３６〜４７７、３６〜４７８、３６〜４７９、３６〜４８０、３６〜４８１、３６〜４８２もしくは３６〜４８３として示されるアミノ酸の配列を有するか、または配列番号１のアミノ酸３６〜４６７、３６〜４６８、３６〜４６９、３６〜４７０、３６〜４７１、３６〜４７２、３６〜４７３、３６〜４７４、３６〜４７５、３６〜４７６、３６〜４７７、３６〜４７８、３６〜４７９、３６〜４８０、３６〜４８１、３６〜４８２もしくは３６〜４８３として示されるアミノ酸の配列と少なくとも約９１％のアミノ酸配列同一性を有する。特定の例では、可溶性ヒアルロニダーゼは、配列番号４〜９および４６〜４８のいずれかに示されるアミノ酸の配列を含有するポリペプチドならびにその対立遺伝子変異体、種変異体およびその他の変異体の中から選択される。一実施形態では、可溶性ヒアルロニダーゼは、配列番号４に示されるアミノ酸の配列をコードする核酸の配列によってコードされるポリペプチドである。別の実施形態では、可溶性ヒアルロニダーゼは、配列番号４〜９のいずれかに示されるアミノ酸の配列をコードする核酸の配列によってコードされるポリペプチド（ｐｏｌｐｅｐｔｉｄｅｓ）の中から選択される。このような例では、可溶性ヒアルロニダーゼは、ＣＨＯ細胞における発現によって産生され得る。例えば、一実施形態では、可溶性ヒアルロニダーゼは、指定されたｒＨｕＰＨ２０である。さらに、いくつかの態様では、本明細書において提供される方法において使用される可溶性ヒアルロニダーゼは、グリコシル化されている。
【００２１】
上記で論じたように、ヒアルロニダーゼ基質が蓄積する疾患または状態を治療するための、またはヒアルロナン関連疾患または状態を治療するための、本明細書において提供される方法では、ポリマーとのコンジュゲーションによって修飾されているヒアルロニダーゼ酵素が対象に投与される。いくつかの例では、可溶性ヒアルロニダーゼとコンジュゲートしているポリマーは、ペグ化部分（ＰＥＧ）、例えば、メトキシ−ポリ（エチレングリコール）−スクシンイミジルブタノエート（ｍＰＥＧ−ＳＢＡ）（５ｋＤａ）；メトキシ−ポリ（エチレングリコール）−スクシンイミジルブタノエート（ｍＰＥＧ−ＳＢＡ）（２０ｋＤａ）；メトキシ−ポリ（エチレングリコール）−スクシンイミジルブタノエート（ｍＰＥＧ−ＳＢＡ）（３０ｋＤａ）；メトキシ−ポリ（エチレングリコール）−スクシンイミジルα−メチルブタノエート（ｍＰＥＧ−ＳＭＢ）（２０ｋＤａ）；メトキシ−ポリ（エチレングリコール）−スクシンイミジルα−メチルブタノエート（ｍＰＥＧ−ＳＭＢ）（３０ｋＤａ）；メトキシ−ポリ（エチレングリコール）−ブチルアルデヒド（ｍＰＥＧ−ブチルアルデヒド）（３０ｋＤａ）、メトキシ−ポリ（エチレングリコール）−スクシンイミジルプロピオネート（ｍＰＥＧ−ＳＰＡ）（２０ｋＤａ）；メトキシ−ポリ（エチレングリコール）−スクシンイミジルプロピオネート（ｍＰＥＧ−ＳＰＡ）（３０ｋＤａ）；（メトキシ−ポリ（エチレングリコール））２−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ｍＰＥＧ２−ＮＨＳ）（１０ｋＤａ、分岐）；（メトキシ−ポリ（エチレングリコール））２−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ｍＰＥＧ２−ＮＨＳ）（２０ｋＤａ、分岐）；（メトキシ−ポリ（エチレングリコール））２−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ｍＰＥＧ２−ＮＨＳ）（４０ｋＤａ、分岐）；（メトキシ−ポリ（エチレングリコール））２−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ｍＰＥＧ２−ＮＨＳ）（６０ｋＤａ、分岐）；ビオチン−ポリ（エチレングリコール）−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ビオチン−ＰＥＧ−ＮＨＳ）（５ｋＤａ、ビオチン化）；ポリ（エチレングリコール）−ｐ−ニトロフェニルカルボネート（ＰＥＧ−ｐ−ニトロフェニル−カルボネート）（３０ｋＤａ）；またはポリ（エチレングリコール）−プリオピオンアルデヒド（ＰＥＧ−プロピオンアルデヒド）（３０ｋＤａ）などを含む。いくつかの態様では、ＰＥＧは、分岐または直鎖ＰＥＧである。特定の例では、ＰＥＧは、メトキシ−ＰＥＧ（ｍＰＥＧ）、または例えば、メトキシポリ（エチレングリコール）ブタン酸の直鎖Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルである。このようＰＥＧは、３０または約３０キロダルトンの分子量を有し得る。
【００２２】
本明細書において、少なくとも３Ｕ／ｍＬのレベルで血漿中のヒアルロニダーゼ酵素の血漿レベルを少なくとも１週間維持するのに十分な量で可溶性ヒアルロニダーゼを含有する組成物が提供され、可溶性ヒアルロニダーゼは、ポリマーとコンジュゲートしている。いくつかの態様では、血漿中のヒアルロニダーゼのレベルは、少なくともまたは約３Ｕ／ｍＬ〜１２Ｕ／ｍＬである。ヒアルロニダーゼとコンジュゲートしている例示的ポリマーとして、それだけには限らないが、シアル化およびペグ化部分が挙げられる。組成物は、１週間に少なくとも２回、少なくとも１週間を超えて投与してもよい。いくつかの例では、組成物は、少なくともまたは約２．０ｍｇ〜６０ｍｇのポリマーとコンジュゲートしている可溶性ヒアルロニダーゼを含み、ポリマーとコンジュゲートしている可溶性ヒアルロニダーゼは、少なくともまたは約２０，０００Ｕ／ｍｇ、２５，０００Ｕ／ｍｇ、３０，０００Ｕ／ｍｇ、３１，０００Ｕ／ｍｇ、３２，０００Ｕ／ｍｇ、３３，０００Ｕ／ｍｇ、３４，０００Ｕ／ｍｇ、３５，０００Ｕ／ｍｇ、３６，０００Ｕ／ｍｇ、３７，０００Ｕ／ｍｇ、３８、０００Ｕ／ｍｇ、３９，０００Ｕ／ｍｇ、４０，０００Ｕ／ｍｇ、４５，０００Ｕ／ｍｇ、５０，０００Ｕ／ｍｇ、５５，０００Ｕ／ｍｇ、６０，０００Ｕ／ｍｇ  またはそれ以上の比活性を有する。さらに、いくつかの態様では、組成物は、投与あたり少なくとも１０ｍＬである。
【００２３】
本明細書において提供される組成物は、経口的に、静脈内に（ＩＶ）、皮下に、筋肉内に、腫瘍内に、皮内に、局所的に、経皮的に、直腸性に、または表皮下に投与するために処方できる。一例では、組成物は、静脈内投与のために処方される。本明細書において提供される組成物はまた、ヒスチジンおよび／またはＮａＣｌを含み得る。例えば、一実施形態では、組成物は、１０ｍＭまたは約１０ｍＭのヒスチジンおよび／または１３０ｍＭ  ＮａＣｌを用いて処方される。組成物は、６．０、６．１．、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１または７．２であるまたは約６．０、６．１．、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１または７．２であるｐＨを有し得る。一例では、組成物は、６．５または約６．５のｐＨを有する。
【００２４】
少なくとも３Ｕ／ｍＬのレベルで血漿におけるヒアルロニダーゼ酵素の血漿レベルを少なくとも１週間維持するのに十分な量で可溶性ヒアルロニダーゼを含有する組成物（ここで、可溶性ヒアルロニダーゼは、ポリマーとコンジュゲートしている）と、ヒアルロナン関連疾患または状態を治療するための薬剤を含有する第２の組成物とを含有する組合せが、本明細書において提供される。いくつかの例では、可溶性ヒアルロニダーゼを含有する組成物は、１週間に少なくとも２回、少なくとも１週間を超えて投与されるためのものである。さらなる態様では、可溶性ヒアルロニダーゼを含有する組成物は、少なくとも、または約２．０ｍｇ〜６０ｍｇの、ポリマーとコンジュゲートしている可溶性ヒアルロニダーゼを含み；ポリマーとコンジュゲートしている可溶性ヒアルロニダーゼは、少なくとも、または約２０，０００Ｕ／ｍｇ、２５，０００Ｕ／ｍｇ、３０，０００Ｕ／ｍｇ、３１，０００Ｕ／ｍｇ、３２，０００Ｕ／ｍｇ、３３，０００Ｕ／ｍｇ、３４，０００Ｕ／ｍｇ、３５，０００Ｕ／ｍｇ、３６，０００Ｕ／ｍｇ、３７，０００Ｕ／ｍｇ、３８、０００Ｕ／ｍｇ、３９，０００Ｕ／ｍｇ、４０，０００Ｕ／ｍｇ、４５，０００Ｕ／ｍｇ、５０，０００Ｕ／ｍｇ、５５，０００Ｕ／ｍｇ、６０，０００Ｕ／ｍｇまたはそれ以上の比活性を有する。
【００２５】
本明細書において提供される組合せの第１および第２の組成物は、同時に処方されるか、または別個に提供される。いくつかの例では、本明細書において提供される組合せ中のヒアルロニダーゼとコンジュゲートしているポリマーは、シアル化またはペグ化部分である。さらなる実施形態では、組合せ中の第２の薬剤は、抗癌剤または例えば、化学療法薬、放射線療法、抗体、ペプチド、遺伝子療法ベクター、ウイルスまたは核酸などの治療である。特定の例では、第２の薬剤は、アシビシン；アクラルビシン；アコダゾール；アクロニン；アドゼレシン；アルデスロイキン；アレムツズマブ；アリトレチノイン（９−Ｃｉｓ−レチノイン酸）；アロプリノール；アルトレタミン；アルボシジブ；アンバゾン；アンボマイシン；アメタントロン；アミホスチン；アミノグルテチミド；アムサクリン；アナストロゾール；アナキシロン；アンシタビン；アントラマイシン；アパジコン；アルギメスナ；ヒ素三酸化物；アスパラギナーゼ；アスペルリン；アトリムスチン；アザシチジン；アゼテパ；アゾトマイシン；バノキサントロン；バタブリン；バチマスタット；生ＢＣＧ；ベナキシビン；ベンダムスチン；ベンゾデパ；ベキサロテン；ベバシズマブ；ビカルタミド；ビエタセルピン；ビリコダル；ビサントレン；ビサントレン；ビスナフィドジメシレート；ビゼレシン；ブレオマイシン；ボルテゾミブ；ブレキナル；ブロピリミン；ブドチタン；ブスルファン；カクチノマイシン；カルステロン；カネルチニブ；カペシタビン；カラセミド；カルベチマー；カルボプラチン；カルボコン；カルモフール；ポリフェプロザンを伴うカルムスチン；カルムスチン；カルビシン；カルゼレシン；セデフィンゴール；セレコキシブ；セマドチン；クロラムブシル；シオテロネル；シロレマイシン；シスプラチン；クラドリビン；クランフェヌル；クロファラビン；クリスナトール；シクロホスファミド；リポソーム型シタラビン；シタラビン；ダカルバジン；ダクチノマイシン；ダルベポエチンα；リポソーム型ダウノルビシン；ダウノルビシン／ダウノマイシン；ダウノルビシン；デシタビン；デニロイキンジフチトクス；デクスニグルジピン；デキソナプラチン；デクスラゾキサン；デザグアニン；ジアジコン；ジブロスピジウム；ジエノゲスト；ジナリン；ジセルモリド；ドセタキセル；ドフェキダル；ドキシフルリジン；リポソーム型ドキソルビシン；ドキソルビシンＨＣＬ；ドコルビシンＨＣＬリポソーム注射剤；ドキソルビシン；ドロロキシフェン；プロピオン酸ドロモスタノロン；デュアゾマイシン；エコムスチン；エダトレキサート；エドテカリン；エフロールニチン；エラクリダル；エリナフィド；エリオットＢ溶液；エルサミトルシン；エミテフル；エンロプラチン；エンプロメート；エンザスタウリン；エピプロピジン；エピルビシン；エポエチンα；エプタロプロスト；エルブロゾール；エソルビシン；エストラムスチン；エタニダゾール；エトグルシド；リン酸エトポシド；エトポシドＶＰ−１６；エトポシド；エトプリン；エキセメスタン；エクシスリンド；ファドロゾール；ファザラビン；フェンレチニド；フィルグラスチム；フロクスウリジン；フルダラビン；フルオロウラシル；５−フルオロウラシル；��ルオキシメステロン；フルロシタビン；ホスキドン；ホストリエシン；ホストリエシン；ホトレタミン；フルベストラント；ガラルビシン；ガロシタビン；ゲムシタビン；ゲムツズマブ／オゾガマイシン；ゲロキノール；ギマテカン；ギメラシル；グロキサゾン；グルホスファミド；酢酸ゴセレリン；ヒドロキシ尿素；イブリツモマブ／チウキセタン；イダルビシン；イホスファミド；イルモホシン；イロマスタット；メシル酸イマチニブ；イメキソン；インプロスルファン；インジスラム；インプロコン；インターフェロンα２ａ；インターフェロンα２ｂ；インターフェロンα；インターフェロンβ；インターフェロンγ；インターフェロン；インターロイキン２および他のインターロイキン（組換えインターロイキンを含む）；イントプリシン；ヨーベングアン［１３１−Ｉ］；イプロプラチン；イリノテカン；イルソグラジン；イクサベピロン；ケトトレキサート；Ｌ−アラノシン；ランレオチド；ラパチニブ；レドキサントロン；レトロゾール；ロイコボリン；リュープロリド；リュープロレリン（リュープロレリド）；レバミソール；レキサカルシトール；リアロゾール；ロバプラチン；ロメトレキソール；ロムスチン／ＣＣＮＵ；ロムスチン；ロナファルニブ；ロソキサントロン；ルルトテカン；マホスファミド；マンノスルファン；マリマスタット；マソプロコール；メイタンシン；メクロレタミン；メクロレタミン／ナイトロジェンマスタード；酢酸メゲストロール；メゲストロール；メレンゲストロール；メルファラン；メルファランＩＬ−ＰＡＭ；メノガリル；メピチオスタン；メルカプトプリン；６−メルカプトプリン；メスナ；メテシンド；メトトレキサート；メトキサレン；メトミダート；メトプリン；メツレデパ；ミボプラチン；ミプロキシフェン；ミソニダゾール；ミチンドミド；ミトカルシン；ミトクロミン；ミトフラキソン；ミトギリン；ミトグアゾン；ミトマルシン；マイトマイシンＣ；マイトマイシン；ミトナフィド；ミトキドン；ミトスペル；ミトタン；ミトキサントロン；ミトゾロミド；ミボブリン；ミゾリビン；モファロテン；モピダモール；ムブリチニブ；ミコフェノール酸；フェンプロピオン酸ナンドロロン；ネダプラチン；ネルザラビン；ネモルビシン；ニトラクリン；ノコダゾール；ノフェツモバブ；ノガラマイシン；ノラトレキセド；ノルトピキサントロン；オクトレオチド；オプレルベキン；オルマプラチン；オルタタキセル；オテラシル；オキサリプラチン；オキシスラン；オキソフェナルシン；パクリタキセル；パミドロネート；パツビロン；ペガデマーゼ；ペガスパルガーゼ；ペグフィルグラスチム；ペルデシン；ペリオマイシン；ペリトレキソール；ペメトレキセド；ペンタムスチン；ペントスタチン；ペプロマイシン；ペルホスファミド；ペリホシン；ピコプラチン；ピナフィド；ピポブロマン；ピポスルファン；ピルフェニドン；ピロキサントロン；ピキサントロン；プレビトレキセド；プリカミシドミトラマイシン；プリカマイシン；プロメスタン；プロメスタン；ポルフィマーナトリウム；ポルフィマー；ポルフィロマイシン；プレドニムスチン；プロカルバジン；プロパミジン；プロスピジウム；プミテパ；ピューロマイシン；ピラゾフリン；キナクリ���；ラニムスチン；ラスブリカーゼ；リボプリン；リトロスルファン；リツキシマブ；ログレチミド；ロキニメックス；ルホクロモマイシン；サバルビシン；サフィンゴール；サルグラモスチム；サトラプラチン；セブリプラチン；セムスチン；シムトラゼン；シゾフィラン；ソブゾキサン；ソラフェニブ；スパルホサート；スパルホス酸；スパルソマイシン；スピロゲルマニウム；スピロムスチン；スピロプラチン；スピロプラチン；スクアラミン；ストレプトニグリン；ストレプトバリシン；ストレプトゾシン；スホスファミド；スロフェヌル；リンゴ酸スニチニブ；６−チオグアニン（６−ＴＧ）；タセジナリン；タルク；タリソマイシン；タリムスチン；タモキシフェン；タリキダール；タウロムスチン；テコガラン；テガフール；テロキサントロン；テモポルフィン；テモゾロミド；テニポシド／ＶＭ−２６；テニポシド；テロキシロン；テストラクトン；チアミプリン；チオグアニン；チオテパ；チアミプリン；チアゾフリン；チロミソール；チロロン；チムコダル；チモナシック；チラパザミン；トピキサントロン；トポテカン；トレミフェン；トシツモマブ；トラベクテジン（エクチナサイジン７４３）；トラスツズマブ；トレストロン；トレチノイン／ＡＴＲＡ；トリシリビン；トリロスタン；トリメトレキセート；四硝酸トリプラチン；トリプトレリン；トロホスファミド；ツブロゾール；ウベニメクス；ウラシルマスタード；ウレデパ；バルルビシン；バルスポダル；バプレオチド；ベルテポルフィン；ビンブラスチン；ビンクリスチン；ビンデシン；ビネピジン；ビンフルニン；ビンホルミド；ビングリシネート；ビンロイシノール；ビンロイロシン；ビノレルビン；ビンロシジン；ビントリプトール；ビンゾリジン；ボロゾール；キサントマイシンＡ（グアメシクリン）；ゼニプラチン；ジラスコルブ［２−Ｈ］；ジノスタチン；ゾレドロネート；ゾルビシン；およびゾスキダルの中から選択される抗癌剤である。
【００２６】
一方法では、修飾されたヒアルロナン分解酵素を含有する組成物が、ヒアルロナン関連疾患または状態を有する、またはこのような疾患または状態を有し得る対象に投与され、続いて、疾患または状態を治療するための第２の、異なる薬剤または治療が投与される。第２の薬剤または治療は、ヒアルロナン分解酵素の投与後、２４時間を超えて投与される。投与は、静脈内に、経口的に、皮下に、または筋肉内になど、任意の適した経路によって、全身的に達成しても、局所的に達成してもよい。
【００２７】
対象においてヒアルロナン関連疾患または状態を治療するための別の方法では、修飾されたヒアルロナン分解酵素を含有する組成物は、ヒアルロナン関連疾患または状態を有するか、またはこのような疾患または状態を有し得る対象に全身的に投与される。修飾されたヒアルロナン分解酵素は、少なくとも、２４時間を超えて間質液圧を低下させるのに有効である量で投与される。ヒアルロナン分解酵素の投与によって、疾患または状態を治療でき、第２の薬剤または治療を続ける、または投与することができる。投与は、例えば、腫瘍内にをはじめとして、静脈内に、経口的に、皮下に、または筋肉内に達成できる。
【００２８】
また、対象に、有効量の、修飾されているヒアルロナン分解酵素を含有する組成物を投与することによって、対象において間質液圧を低下させる方法も提供される。ヒアルロナン分解酵素のこの量は、間質液圧を２４時間を超えて低下させ；ヒアルロナン分解酵素のこの量は、１０ユニット〜１，０００，０００ヒアルロニダーゼユニットもしくは約１０ユニット〜１，０００，０００ヒアルロニダーゼユニット、例えば、１０〜５０，０００，０００ユニットもしくは約１０〜５０，０００，０００ユニット、１０〜４０，０００，０００ユニット、１０〜３６，０００，０００ユニット、１０〜１２，０００，０００ユニット、１０〜１，２００，０００ユニット、１０〜１，０００，０００ユニット、１０〜５００，０００ユニット、１００〜１００，０００ユニット、５００〜５０，０００ユニット、１０００〜１０，０００ユニット、５０００〜７５００ユニット、５０００ユニット〜５０，０００ユニット、または１，０００〜１０，０００ユニットの間と機能的に同等である。ユニットは、通常、修飾されていないヒアルロニダーゼを参照して測定される。間質圧を低下させることは、対象におけるヒアルロナン関連疾患または状態の治療を達成し得る。
【００２９】
本明細書における方法のいずれかの実施では、対象由来のサンプルにおけるヒアルロナン発現は、治療に先立って、治療の間または治療後に測定（評価またはモニタリング）できる。必要に応じて、対象由来のサンプルにおけるヒアルロナンの発現を、対照サンプルにおける発現と、または標準と比較することができる。従って、例えば、対象由来のサンプルにおけるヒアルロナン発現を最初に測定すること、次いで、対象に修飾されたヒアルロナン分解酵素を含有する組成物を投与することによって対象においてヒアルロナン関連疾患または状態を治療する方法が提供される。投与は、それだけには限らないが、経口的に、静脈内に（ＩＶ）、皮下に、筋肉内に、腫瘍内に、皮内に、局所的に、経皮的に、経口的に、直腸に、または表皮下になどの局所投与および全身投与を含む。サンプルは、例えば、それだけには限らないが、血液サンプル、腫瘍生検、脳脊髄液、尿、汗、精液または唾液サンプルなどの組織または体液である。
【００３０】
本方法は、ヒアルロナン分解酵素以外であり、特定の疾患の治療のために使用される、第２の薬剤または治療を投与することによって実施できる。例えば、疾患が腫瘍である場合は、第２の薬剤は、化学療法薬およびまたは放射線照射プロトコール／療法であり得る。例示的な第２の薬剤は、抗癌剤である。
【００３１】
第２の薬剤が薬物または組成物である場合は、第２の薬剤およびヒアルロニダーゼを、別個に投与してもよく、単一組成物中で一緒に、または２種の組成物で同時に、または断続的に、または逐次、またはそのいずれかの組合せで投与してもよい。通常、ヒアルロナン分解酵素を含有する組成物は、第２の薬剤の投与に先立って投与される。いくつかの実施形態では、第２の薬剤または治療は、ヒアルロニダーゼ含有組成物の前に達成または投与され得る。本明細書において、時間が２４時間を超えるものである必要がない方法では、可溶性ヒアルロニダーゼを含有する組成物と、第２の薬剤または治療の投与間のタイミングは、先立って（または続いて）３０秒または６０秒、少なくとも１分、少なくとも５分、少なくとも１５分、少なくとも３０分少なくとも１時間内であり得る、または１時間を超え得る。時間差は、第２の薬剤または治療の投与に先立って、最小または２時間、４時間、６時間、８時間、１０時間、１２時間、１４時間、１６時間、１８時間、２０時間、２２時間、２４時間、４８時間または７２時間であり得る。
【００３２】
例示的な第２の薬剤および治療として、例えば、化学療法薬である抗癌剤、放射線療法、抗体、ペプチド、遺伝子療法ベクター、腫瘍退縮性ウイルスなどのウイルス、および抗癌タンパク質またはその他の治療タンパク質をデリバリーする遺伝子療法ベクターなどの核酸が挙げられる。その他の例示的な第２の薬剤または治療として、それだけには限らないが、鎮痛薬、抗炎症薬、抗菌薬、殺アメーバ剤（ａｍｏｅｂｉｃｉｄａｌ  ａｇｅｎｔ）、殺トリコモナス剤（ｔｒｉｃｈｏｍｏｎｏｃｉｄａｌ  ａｇｅｎｔ）、抗パーキンソン病薬、抗マラリア薬、抗痙攣薬、抗うつ薬、抗関節炎薬、抗真菌薬、抗高血圧薬、解熱剤、抗寄生虫薬、抗ヒスタミン薬、α−アドレナリン作動性アゴニスト剤、α遮断薬、麻酔薬、気管支拡張剤、殺生物剤、殺菌剤、静菌剤、βアドレナリン作動性遮断薬、カルシウムチャネル遮断薬、心血管薬物、避妊薬、化粧剤または審美剤、鬱血除去薬、利尿薬、抑制薬、診断薬、治療用抗体、電解質物質、催眠薬、ホルモン剤、血糖上昇剤、筋弛緩剤、筋肉収縮剤、眼科用剤、副交感神経作動薬、精神賦活剤、鎮静剤、睡眠誘導物質、交感神経作用剤、トランキライザー剤、泌尿器剤、膣剤、抗ウイルス剤、ビタミン剤、非ステロイド系抗炎症薬およびアンジオテンシン変換酵素阻害剤が挙げられる。このような薬剤の例示的なものとして、アシビシン；アクラルビシン；アコダゾール；アクロニン；アドゼレシン；アルデスロイキン；アレムツズマブ；アリトレチノイン（９−Ｃｉｓ−レチノイン酸）；アロプリノール；アルトレタミン；アルボシジブ；アンバゾン；アンボマイシン；アメタントロン；アミホスチン；アミノグルテチミド；アムサクリン；アナストロゾール；アナキシロン；アンシタビン；アントラマイシン；アパジコン；アルギメスナ；ヒ素三酸化物；アスパラギナーゼ；アスペルリン；アトリムスチン；アザシチジン；アゼテパ；アゾトマイシン；バノキサントロン；バタブリン；バチマスタット；生ＢＣＧ；ベナキシビン；ベンダムスチン；ベンゾデパ；ベキサロテン；ベバシズマブ；ビカルタミド；ビエタセルピン；ビリコダル；ビサントレン；ビスナフィドジメシレート；ビゼレシン；ブレオマイシン；ボルテゾミブ；ブレキナル；ブロピリミン；ブドチタン；ブスルファン；カクチノマイシン；カルステロン；カネルチニブ；カペシタビン；カラセミド；カルベチマー；カルボプラチン；カルボコン；カルモフール；ポリフェプロザンを伴うカルムスチン；カルムスチン；カルビシン；カルゼレシン；セデフィンゴール；セレコキシブ；セマドチン；クロラムブシル；シオテロネル；シロレマイシン；シスプラチン；クラドリビン；クランフェヌル；クロファラビン；クリスナトール；シクロホスファミド；リポソーム型シタラビン；シタラビン；ダカルバジン；ダクチノマイシン；ダルベポエチンα；リポソーム型ダウノルビシン；ダウノルビシン／ダウノマイシン；ダウノルビシン；デシタビン；デニロイキンジフチトクス；デクスニグルジピン；デキソナプラチン；デクスラゾキサン；デザグアニン；ジアジコン；ジブロスピジウム；ジエノゲスト；ジナリン；ジセルモリド；ドセタキセル；ドフェキダル；ドキシフルリジン；リポソーム型ドキソルビシン；ドキソルビシンＨＣＬ；ドコルビシンＨＣＬリポソーム注射剤；ドキソルビシン；ドロロキシフェン；プロピオン酸ドロモスタノロン；デュアゾマイシン；エコムスチン；エダトレキサート；エドテカリン；エフロールニチン；エラクリダル；エリナフィド；エリオットＢ溶液；エルサミトルシン；エミテフル；エンロプラチン；エンプロメート；エンザスタウリン；エピプロピジン；エピルビシン；エポエチンα；エプタロプロスト；エルブロゾール；エソルビシン；エストラムスチン；エタニダゾール；エトグルシド；リン酸エトポシド；エトポシドＶＰ−１６；エトポシド；エトプリン；エキセメスタン；エクシスリンド；ファドロゾール；ファザラビン；フェンレチニド；フィルグラスチム；フロクスウリジン；フルダラビン；フルオロウラシル；５−フルオロウラシル；フルオキシメステロン；フルロシタビン；ホスキドン；ホストリエシン；ホストリエシン；ホトレタミン；フルベストラント；ガラルビシン；ガロシタビン；ゲムシタビン；ゲムツズマブ／オゾガマイシン；ゲロキノール；ギマテカン；ギメラシル；グロキサゾン；グルホスファミド；酢酸ゴセレリン；ヒドロキシ尿素；イブリツモマブ／チウキセタン；イダルビシン；イホスファミド；イルモホシン；イロマスタット；メシル酸イマチニブ；イメキソン；インプロスルファン；インジスラム；インプロコン；インターフェロンα２ａ；インターフェロンα２ｂ；インターフェロンα；インターフェロンβ；インターフェロンγ；インターフェロン；インターロイキン２および他のインターロイキン（組換えインターロイキンを含む）；イントプリシン；ヨーベングアン［１３１−Ｉ］；イプロプラチン；イリノテカン；イルソグラジン；イクサベピロン；ケトトレキサート；Ｌ−アラノシン；ランレオチド；ラパチニブ；レドキサントロン；レトロゾール；ロイコボリン；リュープロリド；リュープロレリン（リュープロレリド）；レバミソール；レキサカルシトール；リアロゾール；ロバプラチン；ロメトレキソール；ロムスチン／ＣＣＮＵ；ロムスチン；ロナファルニブ；ロソキサントロン；ルルトテカン；マホスファミド；マンノスルファン；マリマスタット；マソプロコール；メイタンシン；メクロレタミン；メクロレタミン／ナイトロジェンマスタード；酢酸メゲストロール；メゲストロール；メレンゲストロール；メルファラン；メルファランＩＬ−ＰＡＭ；メノガリル；メピチオスタン；メルカプトプリン；６−メルカプトプリン；メスナ；メテシンド；メトトレキサート；メトキサレン；メトミダート；メトプリン；メツレデパ；ミボプラチン；ミプロキシフェン；ミソニダゾール；ミチンドミド；ミトカルシン；ミトクロミン；ミトフラキソン；ミトギリン；ミトグアゾン；ミトマルシン；マイトマイシンＣ；マイトマイシン；ミトナフィド；ミトキドン；ミトスペル；ミトタン；ミトキサントロン；ミトゾロミド；ミボブリン；ミゾリビン；モファロテン；モピダモール；ムブリチニブ；ミコフェノール酸；フェンプロピオン酸ナンドロロン；ネダプラチン；ネルザラビン；ネモルビシン；ニトラクリン；ノコダゾール；ノフェツモバブ；ノガラマイシン；ノラトレキセド；ノルトピキサントロン；オクトレオチド；オプレルベキン；オルマプラチン；オルタタキセル；オテラシル；オキサリプラチン；オキシスラン；オキソフェナルシン；パクリタキセル；パミドロネート；パツビロン；ペガデマーゼ；ペガスパルガーゼ；ペグフィルグラスチム；ペルデシン；ペリオマイシン；ペリトレキソール；ペメトレキセド；ペンタムスチン；ペントスタチン；ペプロマイシン；ペルホスファミド；ペリホシン；ピコプラチン；ピナフィド；ピポブロマン；ピポスルファン；ピルフェニドン；ピロキサントロン；ピキサントロン；プレビトレキセド；プリカミシドミトラマイシン；プリカマイシン；プロメスタン；プロメスタン；ポルフィマーナトリウム；ポルフィマー；ポルフィロマイシン；プレドニムスチン；プロカルバジン；プロパミジン；プロスピジウム；プミテパ；ピューロマイシン；ピラゾフリン；キナクリン；ラニムスチン；ラスブリカーゼ；リボプリン；リトロスルファン；リツキシマブ；ログレチミド；ロキニメックス；ルホクロモマイシン；サバルビシン；サフィンゴール；サルグラモスチム；サトラプラチン；セブリプラチン；セムスチン；シムトラゼン；シゾフィラン；ソブゾキサン；ソラフェニブ；スパルホサート；スパルホス酸；スパルソマイシン；スピロゲルマニウム；スピロムスチン；スピロプラチン；スピロプラチン；スクアラミン；ストレプトニグリン；ストレプトバリシン；ストレプトゾシン；スホスファミド；スロフェヌル；リンゴ酸スニチニブ；６−チオグアニン（６−ＴＧ）；タセジナリン；タルク；タリソマイシン；タリムスチン；タモキシフェン；タリキダール；タウロムスチン；テコガラン；テガフール；テロキサントロン；テモポルフィン；テモゾロミド；テニポシド／ＶＭ−２６；テニポシド；テロキシロン；テストラクトン；チアミプリン；チオグアニン；チオテパ；チアミプリン；チアゾフリン；チロミソール；チロロン；チムコダル；チモナシック；チラパザミン；トピキサントロン；トポテカン；トレミフェン；トシツモマブ；トラベクテジン（エクチナサイジン７４３）；トラスツズマブ；トレストロン；トレチノイン／ＡＴＲＡ；トリシリビン；トリロスタン；トリメトレキセート；四硝酸トリプラチン；トリプトレリン；トロホスファミド；ツブロゾール；ウベニメクス；ウラシルマスタード；ウレデパ；バルルビシン；バルスポダル；バプレオチド；ベルテポルフィン；ビンブラスチン；ビンクリスチン；ビンデシン；ビネピジン；ビンフルニン；ビンホルミド；ビングリシネート；ビンロイシノール；ビンロイロシン；ビノレルビン；ビンロシジン；ビントリプトール；ビンゾリジン；ボロゾール；キサントマイシンＡ（グアメシクリン）；ゼニプラチン；ジラスコルブ［２−Ｈ］；ジノスタチン；ゾレドロネート；ゾルビシン；およびゾスキダルがある。
【００３３】
ヒアルロナン関連疾患または状態として、例えば、高い間質液圧と関連している、または含む疾患または状態、例えば、椎間板圧迫、癌および浮腫が挙げられる。浮腫は、例えば、臓器移植、卒中または脳外傷に起因し得る、またはそれで現れる。癌は、固形腫瘍およびリンパ性／血液腫瘍および転移性疾患ならびに未分化腫瘍を含む。治療に適している腫瘍は、通常、同一組織種の非癌性組織と比較して、または同一腫瘍種の非転移性腫瘍と比較して、ヒアルロナンの細胞性発現および／または間質性発現を示す。癌として、任意の１種以上の卵巣癌、ｉｎ  ｓｉｔｕ癌（ＩＳＣ）、扁平上皮癌（ＳＣＣ）、前立腺癌、膵臓癌、その他の胃癌、非小細胞肺癌、乳癌、脳癌および結腸癌のいずれかが挙げられる。
【００３４】
記載したように、本明細書における方法、組成物および組合せにおいて使用するためのヒアルロナン分解酵素として、可溶性ヒアルロニダーゼ、例えば、非ヒト動物ヒアルロニダーゼ、細菌ヒアルロニダーゼおよびヒトヒアルロニダーゼが挙げられる。可溶性ヒアルロニダーゼの例示的なものとして、ＰＨ２０、例えば、ヒツジ、ウシおよびヒトＰＨ２０の可溶性活性部分がある。ヒトＰＨ２０などのＰＨ２０を可溶性にするには、Ｃ末端ＧＰＩアンカー付着シグナル配列を除去するようＰＨ２０を末端切断する。ヒトＰＨ２０に関しては、末端切断は、残基４６７〜４８２のいずれかまたはヒトにおける配列番号１の残基４６７〜４８２のいずれかに対応するもの、対立遺伝子変異体または種変異体またはその他の変異体で終わる。例えば、ヒアルロナン分解酵素は、配列番号４〜９および４７〜４８のいずれかに示されるアミノ酸の配列を含有するポリペプチドならびにその対立遺伝子変異体、種変異体およびその他の変異体の中から選択され得る。ヒアルロナン分解酵素は、配列番号３または配列番号４〜９および４７〜４８のいずれかに示されるアミノ酸の配列をコードする核酸の配列、例えば、配列番号４９に示される核酸の配列によってコードされるものであり得る。それらは、このようなアミノ酸の配列を有するヒアルロナン分解酵素であり得る。ヒアルロナン分解酵素は、その他の変異体の中から選択される。その他の変異体は、ポリペプチドが可溶性であり、本明細書に記載される方法をはじめとする当業者に公知の方法によって評価できるヒアルロニダーゼ活性を示す（すなわち、ヒアルロナンを分解できる）限り、配列番号１、４〜９および４７〜４８に示されるものに由来するアミノ酸の隣接配列に対して、その全長に沿って、少なくとも６０％、６５、７０、７５、８０、８５、８８％、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％またはそれ以上の配列同一性を有するポリペプチドの中から選択される。
【００３５】
特に、ヒアルロナン分解酵素は、ヒトＰＨ２０可溶性ヒアルロニダーゼのアミノ酸１〜４８２または３６〜４８２（すなわち、配列番号１に示されるような）をコードする核酸分子またはその対立遺伝子またはその他の変異体の発現によって産生されるポリペプチドであり得る。発現は、ＣＨＯ細胞などの細胞における発現および分泌を含み得る。例えば、組成物は、指定された組換えヒトＰＨ２０（ｒＨｕＰＨ２０）であり、これは、分泌のためのシグナル配列をコードする核酸、例えば、ＣＨＯ細胞におけるアミノ酸１〜３５と連結している、アミノ酸３６〜４８２をコードする核酸の発現によって産生される。ｒＨｕＰＨ２０は、培地から単離される。単離後、１以上のペグ化部分（ＰＥＧ）またはその他のポリマーとの反応などによって修飾される。その他のヒアルロナン分解酵素は、同様に修飾され得、組換え発現によって産生されるか、または天然供給源から単離され得る。このような方法および製品は、当業者に公知である。
【００３６】
ヒアルロナン分解酵素の修飾のための例示的ポリマーとして、それだけには限らないが、メトキシ−ポリ（エチレングリコール）−スクシンイミジルブタノエート（ｍＰＥＧ−ＳＢＡ）（５ｋＤａ）；メトキシ−ポリ（エチレングリコール）−スクシンイミジルブタノエート（ｍＰＥＧ−ＳＢＡ）（２０ｋＤａ）；メトキシ−ポリ（エチレングリコール）−スクシンイミジルブタノエート（ｍＰＥＧ−ＳＢＡ）（３０ｋＤａ）；メトキシ−ポリ（エチレングリコール）−スクシンイミジルα−メチルブタノエート（ｍＰＥＧ−ＳＭＢ）（２０ｋＤａ）；メトキシ−ポリ（エチレングリコール）−スクシンイミジルα−メチルブタノエート（ｍＰＥＧ−ＳＭＢ）（３０ｋＤａ）；メトキシ−ポリ（エチレングリコール）−ブチルアルデヒド（ｍＰＥＧ−ブチルアルデヒド）（３０ｋＤａ）、メトキシ−ポリ（エチレングリコール）−スクシンイミジルプロピオネート（ｍＰＥＧ−ＳＰＡ）（２０ｋＤａ）；メトキシ−ポリ（エチレングリコール）−スクシンイミジルプロピオネート（ｍＰＥＧ−ＳＰＡ）（３０ｋＤａ）；（メトキシ−ポリ（エチレングリコール））２−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ｍＰＥＧ２−ＮＨＳ）（１０ｋＤａ、分岐）；（メトキシ−ポリ（エチレングリコール））２−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ｍＰＥＧ２−ＮＨＳ）（２０ｋＤａ、分岐）；（メトキシ−ポリ（エチレングリコール））２−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ｍＰＥＧ２−ＮＨＳ）（４０ｋＤａ、分岐）；（メトキシ−ポリ（エチレングリコール））２−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ｍＰＥＧ２−ＮＨＳ）（６０ｋＤａ、分岐）；ビオチン−ポリ（エチレングリコール）−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ビオチン−ＰＥＧ−ＮＨＳ）（５ｋＤａ、ビオチン化）；ポリ（エチレングリコール）−ｐ−ニトロフェニルカルボネート（ＰＥＧ−ｐ−ニトロフェニル−カルボネート）（３０ｋＤａ）；およびポリ（エチレングリコール）−プリオピオンアルデヒド（ＰＥＧ−プロピオンアルデヒド）（３０ｋＤａ）が挙げられる。
【００３７】
ＰＥＧ部分は、よく知られており、市販されているものまたは合成できるものが挙げられる。ＰＥＧ部分は、分岐ＰＥＧであっても、直鎖ＰＥＧであってもよく、例えば、メトキシポリ（エチレングリコール）ブタン酸の直鎖Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルをはじめとするメトキシ−ＰＥＧ（ｍＰＥＧ）であってもよい。ＰＥＧの分子量は、適したどんなものであってもよく、例えば、３０または約３０キロダルトンであってもよい。
【００３８】
ヒアルロナン分解酵素が修飾されている場合は、比活性は、低減され得る。補償するために、より多量（重量）の修飾された種が使用される。例えば、ＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０の比活性は、天然ｒＨｕＰＨ２０の比活性より２倍もしくは３倍もしくは４倍少ない、または約２倍もしくは３倍もしくは４倍少ないものであり得る。投与量は、所望のユニットをデリバリーするよう相応に調整される。投与量は、疾患または状態および特定のヒアルロナン分解酵素、例えば、特定のヒアルロニダーゼ、およびその修飾に応じて変わる。一般的な投与量は、１０〜５０，０００，０００ユニット、１０〜４０，０００，０００ユニット、１０〜３６，０００，０００ユニット、１０〜１２，０００，０００ユニット、１０〜１，２００，０００ユニット、１０〜１，０００，０００ユニット、１０〜５００，０００ユニット、１００〜１００，０００ユニット、５００〜５０，０００ユニット、１０００〜１０，０００ユニット、５０００〜７５００ユニット、５０００ユニット〜５０，０００ユニット、もしくは１，０００〜１０，０００ユニットの、または約１０〜５０，０００，０００ユニット、１０〜４０，０００，０００ユニット、１０〜３６，０００，０００ユニット、１０〜１２，０００，０００ユニット、１０〜１，２００，０００ユニット、１０〜１，０００，０００ユニット、１０〜５００，０００ユニット、１００〜１００，０００ユニット、５００〜５０，０００ユニット、１０００〜１０，０００ユニット、５０００〜７５００ユニット、５０００ユニット〜５０，０００ユニット、もしくは１，０００〜１０，０００ユニットの可溶性ヒアルロニダーゼである。ヒアルロナン分解酵素が、ヒアルロニダーゼではない場合には、一般的な投与量は、１０〜５０，０００，０００ヒアルロニダーゼユニット、１０〜４０，０００，０００ユニット、１０〜３６，０００，０００ユニット、１０〜１２，０００，０００ユニット、１０〜１，２００，０００ユニット、１０〜１，０００，０００ユニット、１０〜５００，０００ユニット、１００〜１００，０００ユニット、５００〜５０，０００ユニット、１０００〜１０，０００ユニット、５０００〜７５００ユニット、５０００ユニット〜５０，０００ユニット、もしくは１，０００〜１０，０００または約１０〜５０，０００，０００ヒアルロニダーゼユニット、１０〜４０，０００，０００ユニット、１０〜３６，０００，０００ユニット、１０〜１２，０００，０００ユニット、１０〜１，２００，０００ユニット、１０〜１，０００，０００ユニット、１０〜５００，０００ユニット、１００〜１００，０００ユニット、５００〜５０，０００ユニット、１０００〜１０，０００ユニット、５０００〜７５００ユニット、５０００ユニット〜５０，０００ユニット、もしくは１，０００〜１０，０００のヒアルロニダーゼユニットと機能的に同等である。このような投与量は、対象の組織における間質液圧の少なくとも２５％、約２５％、５０％または約５０％の低減を達成し、これが、投与後、約１もしくは２時間または１もしくは２時間を超えて、または少なくとも８時間もしくは少なくとも約８時間、少なくとも２４時間もしくは少なくとも約２４時間、または少なくとも４８時間もしくは少なくとも約４８時間、または少なくとも７２時間もしくは少なくとも約７２時間維持され得るよう選択されるか、または使用され得る。
【００３９】
修飾されたヒアルロニダーゼ組成物などの修飾されたヒアルロナン分解酵素組成物の投与は、腫瘍中などの血管容積の変化を達成し得る。このような変化は、対象における組織の血管容積の少なくとも２倍もしくは約２倍または少なくとも３倍もしくは約３倍の増大であり得る。ヒアルロナン分解酵素を含有する組成物の投与は、対象の組織における水分含量の少なくとも２５％もしくは約２５％または少なくとも５０％もしくは約５０％の低減を達成し得る。これらの変化は、ヒアルロナン分解酵素を含有する組成物の投与後少なくとも８時間もしくは約８時間、少なくとも２４時間もしくは約２４時間、少なくとも４８時間もしくは約４８時間、または少なくとも７２時間もしくは約７２時間維持され、または現れ得る。
【００４０】
ヒアルロナン分解酵素を含有する組成物の投与によって、対象の組織におけるヒアルロナン陽性細胞のパーセンテージの減少を達成できる。ヒアルロナン−陽性細胞は、固形腫瘍などの腫瘍中に生じ得る。治療は、対象において腫瘍の大きさの低減を達成できる。
【００４１】
ヒアルロナン分解酵素を含有する組成物の投与は、対象の血液におけるヒアルロニダーゼ活性として現れるおよび／または観察できる。対象の血液におけるヒアルロニダーゼの半減期は、少なくとも１もしくは約１、５もしくは約５、８もしくは約８、１０もしくは約１０、１５もしくは約１５、２４もしくは約２４、４８もしくは約４８、または７２もしくは約７２時間である。例えば、ヒアルロナン分解酵素を含有する組成物の投与が、対象の血液におけるヒアルロニダーゼ活性をもたらす場合には、対象から得られる１ミリリットルの血漿は、患者に投与された総ヒアルロニダーゼ活性の少なくとも５％または約５％を、少なくとも１もしくは約１、５もしくは約５、８もしくは約８、１０もしくは約１０、１５もしくは約１５、２４もしくは約２４、４８もしくは約４８、または７２もしくは約７２時間有する。
【００４２】
また、間質液圧を低下させるための、有効量のヒアルロナン分解酵素を含有し、この量が間質液圧を２４時間を超えて低下させ、ヒアルロナン分解酵素の量が、１０〜１，０００，０００、約１０〜５０，０００，０００ユニット、１０〜４０，０００，０００ユニット、１０〜３６，０００，０００ユニット、１０〜１２，０００，０００ユニット、１０〜１，２００，０００ユニット、１０〜１，０００，０００ユニット、１０〜５００，０００ユニット、１００〜１００，０００ユニット、５００〜５０，０００ユニット、１０００〜１０，０００ユニット、５０００〜７５００ユニット、５０００ユニット〜５０，０００ユニット、または１，０００〜１０，０００ヒアルロニダーゼの間、または約１０〜１，０００，０００、約１０〜５０，０００，０００ユニット、１０〜４０，０００，０００ユニット、１０〜３６，０００，０００ユニット、１０〜１２，０００，０００ユニット、１０〜１，２００，０００ユニット、１０〜１，０００，０００ユニット、１０〜５００，０００ユニット、１００〜１００，０００ユニット、５００〜５０，０００ユニット、１０００〜１０，０００ユニット、５０００〜７５００ユニット、５０００ユニット〜５０，０００ユニット、または１，０００〜１０，０００ヒアルロニダーゼの間と機能的に同等である第１の組成物と；ヒアルロナン関連疾患または状態を治療するための薬剤を含有する第２の組成物とを含む組合せも提供される。
【００４３】
ヒアルロナン分解酵素は、ポリマー、例えば、ヒアルロニダーゼの半減期を増大するものとのコンジュゲーションによって修飾される。例示的ポリマーとして、デキストラン、シアル化またはペグ化部分および／またはその組合せが挙げられる。ヒアルロナン分解酵素は、可溶性ヒアルロニダーゼであり得、これとして、上記の非ヒト動物ヒアルロニダーゼ、ヒトヒアルロニダーゼおよび細菌ヒアルロニダーゼの中から選択されるものが挙げられ、本方法において使用するための上記のＰＨ２０の可溶性型である可溶性ヒアルロニダーゼを含む。第２の薬剤または治療は、本方法において使用するための上記で示されるものいずれも含む。
【００４４】
本明細書における方法によって、癌およびヒアルロナンを含むプロテオグリカンの豊富な細胞周囲マトリックスを含むその他の疾患が治療される。このような癌およびその他の疾患が、修飾された可溶性ヒアルロニダーゼおよび本明細書において記載される（上記および下記）その他の薬剤を用いる治療に適している。本明細書に詳述されるように、ＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０のような修飾されたヒアルロナン分解酵素との接触は、細胞周囲コートの崩壊をもたらす。例示されるように、ＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０（ＰＥＧｒＨｕＰＨ２０）は、用量依存的に腫瘍ＩＦＰを低下させ、ＩＶ投与後にＩＦＰの８５％を超える低下を達成した。腫瘍周囲ＨＡは、ＰＥＧｒＨｕＰＨ２０の単回用量後３日にわたって枯渇したままであった。腫瘍細胞の周囲の細胞周囲ヒアルロナンの組織学的崩壊とともに、腫瘍水分含量が３日にわたって大幅に減少したが、これは見かけの拡散係数（ＡＤＣ）ＭＲＩおよびＩＦＰモニタリングによって腫瘍において検出された変化と一致する。さらに、例示されるように腫瘍血管容積の３．５倍の選択的増大が、腫瘍内の血管の血管除圧の結果として、投薬後８時間内に達成された。これは、組織診断および超音波によって確認された。腫瘍微小環境中のこのようなヒアルロナンは、可溶性の修飾されたヒアルロニダーゼ、例えばＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０（ＰＥＧｒＨｕＰＨ２０）を用いてターゲッティングできる。また、例示されるように、ＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０の、ドセタキセルまたはリポソームドキソルビシンなどの化学療法薬との同時投与は、化学療法薬が単独で投与される場合と比較して、動物モデルにおける化学療法薬の抗腫瘍活性を増大させ得る。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】図１は、腫瘍を確立するよう、ヒトＰＣ３前立腺癌細胞を用いて筋肉内に接種されたヌードマウスにおける腫瘍量を表す（ＰＣ３前立腺癌腫モデル）。接種後、マウスを、活性な薬剤成分（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｉｎｇｒｅｄｉｅｔｎ）（ＡＰＩ）バッファー、３０ｍｇ／ｋｇドセタキセル、１０ｍｇ／ｋｇドセタキセル、ＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０（Ｐ）またはＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０および１０ｍｇ／ｋｇドセタキセル（Ｔ＋Ｐ）のいずれかの用量が投与される治療計画に付した。腫瘍量は、種々の時点で測定し、ドセタキセルの抗腫瘍活性に対する、ＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０とドセタキセルの同時投与の効果を評価した。
【図２】図２は、ヒトＰＣ３前立腺癌細胞の筋肉内注射と、それに続くバッファー（対照マウス）、ドセタキセル、ＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０またはＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０／ドセタキセルのいずれかでの治療後、種々の点での、１５００ｍｍ３腫瘍量までのマウス生存のパーセンテージを表す。
【図３】図３は、腫瘍を確立するよう、ヒトＰＣ３前立腺癌細胞を用いて筋肉内に接種されたヌードマウス（ＰＣ３前立腺癌腫モデル）中の腫瘍量を表す。接種後、マウスを、ＡＰＩバッファー、ＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０（Ｐ）、リポソームドキソルビシン（Ｄ）またはＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０およびリポソームドキソルビシン（Ｄ＋Ｐ）のいずれかの用量が投与される治療計画に付した。腫瘍量を、種々の時点で測定して、リポソームドキソルビシンの抗腫瘍活性に対する、ＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０とリポソームドキソルビシンの同時投与の効果を評価した。
【図４】図４は、０、３、７、１０、１４、１７、２１、２４日目での、３０００、７０００、１００００、または３００００ユニットのＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０（Ｐ）の投与後の体重変化（パーセンテージで）を表す。
【図５】図５は、０、７、１４および２１日目での、ヌードマウスへの１０ｍｇ／ｋｇドセタキセルと、３０００、７０００、または１００００ユニットいずれかのＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０（Ｔ＋Ｐ）の同時投与後の、体重変化（パーセンテージで）を表す。これらのマウスはまた、３、１０、１７および２４日目に、３０００、７０００、または１００００ユニットいずれかのＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０も投与された。ＡＰＩバッファーまたは１０ｍｇ／ｋｇドセタキセル（ｄｏｃｔａｘｅｌ）のみを投与されたマウスの体重変化も表されている。
【図６】図６は、種々の用量のＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０および１０ｍｇ／ｋｇタキソテール（登録商標）（ドセタキセル）、ＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０単独、タキソテール（登録商標）（ドセタキセル）単独またはＡＰＩバッファー単独のいずれかを投与されたヌードマウスの血液中の顆粒球の数を表す。０、３、７、１０、１４、１７、２１、２４日目にＡＰＩバッファーを投与された群１中のマウス；０、３、７、１０、１４、１７、２１、２４日目に、それぞれ、３０００、７０００、１００００または３００００ユニット／マウスのいずれかの用量でＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０を投与された群２〜５；群６〜８は、０、７、１４、２１日目にタキソテール（登録商標）（ドセタキセル）およびそれぞれ、３０００、７０００、１００００ユニット／マウスのＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０のいずれかを同時投与され、次いで、３、１０、１７、２４日目にＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０単独；０、７および１４日目に、それぞれ、１０ｍｇ／ｋｇタキソテール（登録商標）（ドセタキセル）または３０ｍｇ／ｋｇタキソテール（登録商標）（ドセタキセル）投与された群９および１０。次いで、種々の時点での血液中の顆粒球の数を評価した。
【図７】図７は、ＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０および１０ｍｇ／ｋｇタキソテール（登録商標）（ドセタキセル）、ＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０単独、タキソテール（登録商標）（ドセタキセル）単独またはＡＰＩバッファー単独のいずれかの種々の用量を投与されたマウスヌードマウスの血清中のアルブミンレベルを表す。０、３、７、１０、１４、１７、２１、２４日目にＡＰＩバッファーを投与された群１中のマウス；０、３、７、１０、１４、１７、２１、２４日目に、それぞれ、３０００、７０００、１００００または３００００ユニット／マウスのいずれかの用量でＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０を投与された群２〜５；群６〜８は、０、７、１４、２１日目に、タキソテール（登録商標）（ドセタキセル）およびそれぞれ、３０００、７０００、１００００ユニット／マウスＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０を同時投与され、次いで、３、１０、１７、２４日目にＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０単独；０、７および１４日目に、それぞれ、１０ｍｇ／ｋｇタキソテール（登録商標）（ドセタキセル）または３０ｍｇ／ｋｇタキソテール（登録商標）（ドセタキセル）を投与された群９および１０。
【図８】図８は、ＨＡが豊富なヒト前立腺腫瘍異種移殖モデル、ＰＣ３におけるＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０単独の反復投与の効果を表す。実施例１６Ａに記載のとおり、０、３、５、７、１０、１２、１４および１７日目に、対照バッファーおよび種々の量（酵素単位（Ｕ））のＰＥＧ化ＨｕＰＨ２０を用いてマウスに注射した。Ｖｉｓｕａｌ  Ｓｏｎｉｃｓ（登録商標）超音波システムを使用し、超音波画像診断ソフトウェアプログラムを使用して像を得ることによって、２、４、７、１１、１４および１８日目に各群の動物において、研究の過程にわたって腫瘍量（ｍｍ３）を測定した。これらの結果も表２９に示されている。
【図９Ａ】図９は、ＡＰＩバッファーまたは３０００ＵのＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０の投与後の、さまざまな程度のヒアルロナン（ＨＡ）腫瘍発現（＋＋＋、＋＋および＋）を有する３種の異なる腫瘍モデル（ＰＣ３、４Ｔ１−ＧＦＰ、Ｍａｔ  ＬｙＬｕ）における腫瘍量および生存パーセントを表す。結果は実施例１７Ｃに記載され、また、表３３〜３７に示されている。実施例１７に記載されるように、各群において各時点で「生存している」動物のパーセンテージを決定することによって各モデルにおける効果を評価した。この研究のために、瀕死（生存していない）状態と類似していると考えられる１５００ｍｍ３  以上の腫瘍量をエンドポイントとして選択し、１５００ｍｍ３未満の腫瘍量を有する動物は生存していると考え、一方で、腫瘍量１５００ｍｍ３以上を有する動物は病的と考えた。
【図９Ｂ】図９は、ＡＰＩバッファーまたは３０００ＵのＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０の投与後の、さまざまな程度のヒアルロナン（ＨＡ）腫瘍発現（＋＋＋、＋＋および＋）を有する３種の異なる腫瘍モデル（ＰＣ３、４Ｔ１−ＧＦＰ、Ｍａｔ  ＬｙＬｕ）における腫瘍量および生存パーセントを表す。結果は実施例１７Ｃに記載され、また、表３３〜３７に示されている。実施例１７に記載されるように、各群において各時点で「生存している」動物のパーセンテージを決定することによって各モデルにおける効果を評価した。この研究のために、瀕死（生存していない）状態と類似していると考えられる１５００ｍｍ３  以上の腫瘍量をエンドポイントとして選択し、１５００ｍｍ３未満の腫瘍量を有する動物は生存していると考え、一方で、腫瘍量１５００ｍｍ３以上を有する動物は病的と考えた。
【図９Ｃ】図９は、ＡＰＩバッファーまたは３０００ＵのＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０の投与後の、さまざまな程度のヒアルロナン（ＨＡ）腫瘍発現（＋＋＋、＋＋および＋）を有する３種の異なる腫瘍モデル（ＰＣ３、４Ｔ１−ＧＦＰ、Ｍａｔ  ＬｙＬｕ）における腫瘍量および生存パーセントを表す。結果は実施例１７Ｃに記載され、また、表３３〜３７に示されている。実施例１７に記載されるように、各群において各時点で「生存している」動物のパーセンテージを決定することによって各モデルにおける効果を評価した。この研究のために、瀕死（生存していない）状態と類似していると考えられる１５００ｍｍ３  以上の腫瘍量をエンドポイントとして選択し、１５００ｍｍ３未満の腫瘍量を有する動物は生存していると考え、一方で、腫瘍量１５００ｍｍ３以上を有する動物は病的と考えた。
【図９Ｄ】図９は、ＡＰＩバッファーまたは３０００ＵのＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０の投与後の、さまざまな程度のヒアルロナン（ＨＡ）腫瘍発現（＋＋＋、＋＋および＋）を有する３種の異なる腫瘍モデル（ＰＣ３、４Ｔ１−ＧＦＰ、Ｍａｔ  ＬｙＬｕ）における腫瘍量および生存パーセントを表す。結果は実施例１７Ｃに記載され、また、表３３〜３７に示されている。実施例１７に記載されるように、各群において各時点で「生存している」動物のパーセンテージを決定することによって各モデルにおける効果を評価した。この研究のために、瀕死（生存していない）状態と類似していると考えられる１５００ｍｍ３  以上の腫瘍量をエンドポイントとして選択し、１５００ｍｍ３未満の腫瘍量を有する動物は生存していると考え、一方で、腫瘍量１５００ｍｍ３以上を有する動物は病的と考えた。
【図９Ｅ】図９は、ＡＰＩバッファーまたは３０００ＵのＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０の投与後の、さまざまな程度のヒアルロナン（ＨＡ）腫瘍発現（＋＋＋、＋＋および＋）を有する３種の異なる腫瘍モデル（ＰＣ３、４Ｔ１−ＧＦＰ、Ｍａｔ  ＬｙＬｕ）における腫瘍量および生存パーセントを表す。結果は実施例１７Ｃに記載され、また、表３３〜３７に示されている。実施例１７に記載されるように、各群において各時点で「生存している」動物のパーセンテージを決定することによって各モデルにおける効果を評価した。この研究のために、瀕死（生存していない）状態と類似していると考えられる１５００ｍｍ３  以上の腫瘍量をエンドポイントとして選択し、１５００ｍｍ３未満の腫瘍量を有する動物は生存していると考え、一方で、腫瘍量１５００ｍｍ３以上を有する動物は病的と考えた。
【図９Ｆ】図９は、ＡＰＩバッファーまたは３０００ＵのＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０の投与後の、さまざまな程度のヒアルロナン（ＨＡ）腫瘍発現（＋＋＋、＋＋および＋）を有する３種の異なる腫瘍モデル（ＰＣ３、４Ｔ１−ＧＦＰ、Ｍａｔ  ＬｙＬｕ）における腫瘍量および生存パーセントを表す。結果は実施例１７Ｃに記載され、また、表３３〜３７に示されている。実施例１７に記載されるように、各群において各時点で「生存している」動物のパーセンテージを決定することによって各モデルにおける効果を評価した。この研究のために、瀕死（生存していない）状態と類似していると考えられる１５００ｍｍ３  以上の腫瘍量をエンドポイントとして選択し、１５００ｍｍ３未満の腫瘍量を有する動物は生存していると考え、一方で、腫瘍量１５００ｍｍ３以上を有する動物は病的と考えた。
【図１０】図１０は、実施例１８に記載される、ＰＣ３脳腫瘍モデルにおけるＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０または対照バッファーを用いる治療後の、種々の点での生存しているマウスのパーセンテージを表す。生存は、示された時間で生きていたマウスの数を評価することによって決定した。
【図１１】図１１は、実施例１８に記載される、ＰＣ３脳腫瘍モデルにおける、対照バッファー、照射、または照射およびＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０の併用療法を用いる治療後の種々の点で生存しているマウスのパーセンテージを表す。生存は、示された時間で生きていたマウスの数を評価することによって決定した。
【図１２】図１２は、マウスにおけるＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０の投与後のＰＫ回帰曲線を表す。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
概要
Ａ．定義
Ｂ．ヒアルロナン関連状態、疾患および障害を治療するための方法および組成物の概説
１．ヒアルロナン
２．ヒアルロナン関連疾患
３．治療の方法および組成物
４．その治療の組合せおよび方法
Ｃ．ヒアルロナン分解酵素を含有する組成物
１．ヒアルロニダーゼ
ａ．哺乳類種ヒアルロニダーゼ
ｂ．細菌ヒアルロニダーゼ
ｃ．ヒル、その他の寄生生物および甲殻類に由来するヒアルロニダーゼ
２．その他のヒアルロナン分解酵素
３．可溶性ヒアルロナン分解酵素
ａ．可溶性ヒトＰＨ２０
ｂ．ｒＨｕＰＨ２０
４．ヒアルロナン分解酵素のグリコシル化
５．修飾された（ポリマーがコンジュゲートしている）ヒアルロナン分解酵素
ａ．ＰＥＧ化可溶性ヒアルロナン分解酵素
Ｄ．ヒアルロナン分解酵素をコードする核酸およびそのポリペプチドを製造する方法
１．ベクターおよび細胞
２．発現
ａ．原核細胞
ｂ．酵母細胞
ｃ．昆虫細胞
ｄ．哺乳類細胞
ｅ．植物
３．精製技術
４．ヒアルロナン分解酵素ポリペプチドのペグ化
Ｆ．組成物の調製、処方および投与
１．処方
ａ．注射用、溶液およびエマルジョン
ｂ．凍結乾燥粉末
ｃ．局所投与
ｄ．その他の経路の投与のための組成物
２．投与量および投与
３．併用療法
４．パッケージングおよび製造の品目
Ｇ．活性、バイオアベイラビリティおよび薬物動態を評価する方法
１．ヒアルロナン分解酵素の活性を評価するためのアッセイ
２．薬物動態および耐容性
３．動物モデル
Ｈ．ヒアルロナン関連状態、疾患および障害の治療におけるヒアルロナン分解酵素の使用
１．ヒアルロナン関連状態および疾患
ヒアルロナンリッチな癌をはじめとする癌
２．ヒアルロナン関連状態および疾患の治療における使用
ａ．ヒアルロナン関連疾患マーカーの検出（治療および治療効果を評価するための対象の選択）
ｉ．ヒアルロナン関連疾患マーカーの検出のためのアッセイ
ｉｉ．対照サンプルと比較した、ヒアルロナン関連マーカーの検出
ｂ．癌の治療における使用
抗癌剤およびその他の治療
ｃ．間質液圧の上昇を伴うその他の疾患の治療における使用
３．展着剤としての使用
４．皮下点滴療法における使用
５．硝子体切除術および眼部障害および状態に対する適用
６．遺伝子療法適用
７．化粧的使用
８．臓器移植における使用
９．脳におけるグリコサミノグリカン蓄積の治療における使用
１０．心血管疾患におけるグリコサミノグリカン蓄積の治療における使用
１１．肺疾患における使用
１２．その他の使用
Ｉ．実施例
【００４７】
Ａ．定義
特に断りのない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるような同一の意味を有する。本明細書の全開示内容を通じて言及される、すべての特許、特許出願、公開された出願および刊行物、Ｇｅｎｂａｎｋ配列、データベース、ウェブサイトおよびその他の公開された資料は、特に断りのない限り、その全文において参照により組み込まれる。本明細書において用語に複数の定義が存在する場合には、この節におけるものが優先する。ＵＲＬまたはその他のこのような識別子またはアドレスが言及される場合には、このような識別子は変わる場合があり、インターネット上の特定の情報は移り変わり得るが、インターネットを検索することによって同等の情報を見い出すことができるということは理解される。それへの言及は、このような情報の有効性および公的普及を証明する。
【００４８】
本明細書において、投与計画とは、投与される薬剤、例えば、可溶性ヒアルロニダーゼを含有する組成物またはその他の薬剤の量および投与頻度を指す。投与計画は、治療される疾患または状態の関数であり、従って、変わり得る。
【００４９】
本明細書において、投与頻度とは、治療の連続投与間の時間を指す。例えば、頻度は、数日、数週または数カ月であり得る。例えば、頻度は、週に１回を超える、例えば、週に２回、週に３回、週に４回、週に５回、週に６回または毎日であり得る。また、頻度は、１、２、３または４週間であり得る。個々の頻度は、治療される個々の疾患または状態の関数である。通常、頻度は、週に１回を超え、通常、週に２回である。
【００５０】
本明細書において、「投与の周期」とは、連続投与にわたって反復される、酵素および／または第２の薬剤の投与の投与計画の反復されるスケジュールを指す。例えば、例示的な投与の周期は、３週間の週に２回の投与と、それに続く１週間の投薬の中断を含む２８日周期である。
【００５１】
本明細書において、数週間の投与または投与の中断に関して「所定の」とは、前もって決定または確立された期間を指す。期間は、経験的に決定することができ、疾患または状態、状態の重篤度、個々の患者および治療している医師の技術のレベル内のその他の因子の関数である。
【００５２】
本明細書において、ヒアルロナン分解酵素とは、ヒアルロナンポリマー（ヒアルロン酸またはＨＡとも呼ばれる）の、より低分子量の断片への切断を触媒する酵素を指す。ヒアルロナン分解酵素の例示的なものとして、ヒアルロニダーゼ、および特定のコンドロイチナーゼおよびヒアルロナンを脱重合する能力を有するリアーゼがある。ヒアルロナン分解酵素である例示的コンドロイチナーゼとして、それだけには限らないが、コンドロイチンＡＢＣリアーゼ（コンドロイチナーゼＡＢＣとしても知られる）、コンドロイチンＡＣリアーゼ（コンドロイチン硫酸リアーゼまたはコンドロイチン硫酸エリミナーゼとしても知られる）およびコンドロイチンＣリアーゼが挙げられる。コンドロイチンＡＢＣリアーゼは、２種の酵素、コンドロイチン硫酸−ＡＢＣエンドリアーゼ（ＥＣ４．２．２．２０）およびコンドロイチン硫酸−ＡＢＣエキソリアーゼ（ＥＣ４．２．２．２１）を含む。例示的なコンドロイチン硫酸−ＡＢＣエンドリアーゼおよびコンドロイチン硫酸−ＡＢＣエキソリアーゼとして、それだけには限らないが、プロテウス・ブルガリス（ｐｒｏｔｅｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）およびフラボバクテリウム・ヘパリナム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｈｅｐａｒｉｎｕｍ）に由来するもの（プロテウス・ブルガリスコンドロイチン硫酸−ＡＢＣエンドリアーゼは、配列番号９８に示されている;Sato et al. (1994) Appl. Microbiol. Biotechnol. 41(1):39-46）が挙げられる。細菌由来の例示的なコンドロイチナーゼＡＣ酵素として、それだけには限らないが、配列番号９９に示される、フラボバクテリウム・ヘパリナムビクチバリス・バデンシス（Ｖｉｃｔｉｖａｌｌｉｓ  ｖａｄｅｎｓｉｓ）に由来するもの、およびアンスロバクター・アウレッセンス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｕｒｅｓｃｅｎｓ）に由来するもの(Tkalec et al. (2000) Applied and Environmental Microbiology 66(1):29-35; Ernst et al. (1995) Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology 30(5):387-444)が挙げられる。細菌由来の例示的コンドロイチナーゼＣ酵素として、それだけには限らないが、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）およびフラボバクテリウムに由来するもの(Hibi et al. (1989) FEMS-Microbiol-Lett. 48(2):121-4; Michelacci et al. (1976) J. Biol. Chem. 251:1154-8; Tsuda et al. (1999) Eur. J. Biochem. 262:127-133)が挙げられる。
【００５３】
本明細書において、ヒアルロニダーゼとは、ヒアルロナン分解酵素の１クラスを指す。ヒアルロニダーゼは、細菌ヒアルロニダーゼ（ＥＣ４．２．２．１またはＥＣ４．２．９９．１）、ヒル、その他の寄生生物、および甲殻類に由来するヒアルロニダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．３６）、ならびに哺乳類種ヒアルロニダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．３５）を含む。ヒアルロニダーゼは、それだけには限らないが、ネズミ、イヌ、ネコ、ウサギ、鳥類、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、魚、カエル、細菌をはじめとする非ヒト起源のいずれか、ならびにヒル、その他の寄生生物、および甲殻類に由来するいずれかを含む。例示的非ヒトヒアルロニダーゼとして、ウシ由来のヒアルロニダーゼ（配列番号１０、１１、６４およびＢＨ５５（米国特許第５，７４７，０２７号および同５，８２７，７２１号）、イエロージャケットワスプ（ｙｅｌｌｏｗ  ｊａｃｋｅｔ  ｗａｓｐ）配列番号１２および１３）、ミツバチ（配列番号１４）、ホワイト−フェースホーネット（ｗｈｉｔｅ−ｆａｃｅ  ｈｏｒｎｅｔ）（配列番号１５）、アシナガバチ（ｐａｐｅｒ  ｗａｓｐ）（配列番号１６）、マウス（配列番号１７〜１９、３１）、ブタ（配列番号２０〜２１）、ラット（配列番号２２〜２４、３０）、ウサギ（配列番号２５）、ヒツジ（配列番号２６、２７、６３および６５）、チンパンジー（配列番号１０１）、アカゲザル（配列番号１０２）、オランウータン（配列番号２８）、カニクイザル（配列番号２９）、モルモット（配列番号３２）、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）種（ＦＢ２４株）（配列番号６７）、デロビブリオ  バクテリオボラス（Ｂｄｅｌｌｏｖｉｂｒｉｏ  ｂａｃｔｅｒｉｏｖｏｒｕｓ）（配列番号６８）、プロピオニバクテリウム・アクネス（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓ）（配列番号６９）、ストレプトコッカス・アガラクチア（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）（配列番号７０）；１８ＲＳ２１（配列番号７１）；血清型Ｉａ（配列番号７２）；血清型ＩＩＩ（配列番号７３）、黄色ブドウ球菌（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）（ＣＯＬ株（配列番号７４）；ＭＲＳＡ２５２株（配列番号７５および７６）；ＭＳＳＡ４７６株（配列番号７７）；ＮＣＴＣ  ８３２５株（配列番号７８）；ウシＲＦ１２２株（配列番号７９および８０）；ＵＳＡ３００株（配列番号８１）、肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（（配列番号８２）；ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−２５５／Ｒ６株（配列番号８３）；血清型２、Ｄ３９／ＮＣＴＣ７４６６株（配列番号８４）、化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（血清型Ｍ１）（配列番号８５）；血清型Ｍ２、ＭＧＡＳ１０２７０株（配列番号８６）；血清型Ｍ４、ＭＧＡＳ１０７５０株（配列番号８７）；血清型Ｍ６（配列番号８８）；血清型Ｍ１２、ＭＧＡＳ２０９６株（配列番号８９および９０）；血清型Ｍ１２、ＭＧＡＳ９４２９株（配列番号９１）；血清型Ｍ２８（配列番号９２）；ブタ連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓ）（配列番号：９３〜９５）；ビブリオ・フィシェリ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｆｉｓｃｈｅｒｉ）（ＡＴＣＣ７００６��１／ＥＳ１１４株（配列番号９６））、およびヒアルロン酸に特異的であり、コンドロイチンまたはコンドロイチン硫酸を切断しないストレプトマイセス・ヒアルロノリチクス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｈｙａｌｕｒｏｎｏｌｙｔｉｃｕｓ）ヒアルロニダーゼ酵素(Ohya、T. and Kaneko、Y. (1970) Biochim. Biophys. Acta 198:607)が挙げられる。ヒアルロニダーゼはまた、ヒト起源のものも含む。例示的ヒトヒアルロニダーゼとして、ＨＹＡＬ１（配列番号３６）、ＨＹＡＬ２（配列番号３７）、ＨＹＡＬ３（配列番号３８）、ＨＹＡＬ４（配列番号３９）およびＰＨ２０（配列番号１）が挙げられる。また、ヒアルロニダーゼの中には、ヒツジおよびウシＰＨ２０、可溶性ヒトＰＨ２０および可溶性ｒＨｕＰＨ２０をはじめとする可溶性ヒアルロニダーゼも含まれる。市販のウシまたはヒツジ可溶性ヒアルロニダーゼの例として、Ｖｉｔｒａｓｅ（登録商標）（ヒツジヒアルロニダーゼ）およびＡｍｐｈａｄａｓｅ（登録商標）（ウシヒアルロニダーゼ）がある。
【００５４】
ヒアルロナン分解酵素への言及は、前駆体ヒアルロナン分解酵素ポリペプチドおよび成熟ヒアルロナン分解酵素ポリペプチド（例えば、シグナル配列が除去されているもの）、活性を有するその末端切断型を含み、対立遺伝子変異体および種変異体、スプライシング変異体によってコードされる変異体、および配列番号１および１０〜４８、６３〜６５、６７〜１０２に示される前駆体ポリペプチドに対して少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有するポリペプチドまたはその成熟型を含むその他の変異体を含む。例えば、ヒアルロナン分解酵素への言及は、配列番号５０〜５１に示されるヒトＰＨ２０前駆体ポリペプチド変異体も含む。ヒアルロナン分解酵素はまた、化学修飾または翻訳後修飾を含むものおよび化学修飾または翻訳後修飾を含まないものを含む。このような修飾として、それだけには限らないが、ペグ化、アルブミン化（ａｌｂｕｍｉｎａｔｉｏｎ）、グリコシル化、ファルネシル化、カルボキシル化、水酸化、リン酸化、および当技術分野で公知のその他のポリペプチド修飾が挙げられる。
【００５５】
本明細書において、可溶性ヒアルロニダーゼとは、生理学的状態下でのその溶解度を特徴とするポリペプチドを指す。可溶性ヒアルロニダーゼは、例えば、３７℃に加温されたＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４溶液の水相へのその分配によって識別することができる(Bordier et al., (1981) J. Biol. Chem., 256:1604-7)。膜に固定された、例えば、脂質に固定されたヒアルロニダーゼは、界面活性剤の豊富な相に分配するが、ホスホリパーゼ−Ｃで処理した後は、界面活性剤の乏しい相または水相に分配する。可溶性ヒアルロニダーゼの中には、ヒアルロニダーゼの膜との固定と関連している１以上の領域が、除去または修飾されており、可溶性形態がヒアルロニダーゼ活性を保持している、膜に固定されたヒアルロニダーゼが含まれる。可溶性ヒアルロニダーゼは、組換え可溶性ヒアルロニダーゼおよび例えば、ヒツジまたはウシに由来する精巣抽出物などの天然供給源中に含まれるものまたはそれから精製された形態を含む。このような可溶性ヒアルロニダーゼの例示的なものとして、可溶性ヒトＰＨ２０がある。その他の可溶性ヒアルロニダーゼとして、ヒツジ（配列番号２７、６３、６５）およびウシ（配列番号１１、６４）ＰＨ２０が挙げられる。
【００５６】
本明細書において、可溶性ヒトＰＨ２０またはｓＨｕＰＨ２０は、Ｃ末端のグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）結合部位のすべてまたは一部を欠き、その結果、発現時に、ポリペプチドが可溶性である成熟ポリペプチドを含む。例示的ｓＨｕＰＨ２０ポリペプチドとして、配列番号４〜９および４７〜４８のいずれか１種に示されるアミノ酸配列を有する成熟ポリペプチドが挙げられる。このような例示的ｓＨｕＰＨ２０ポリペプチドの前駆体ポリペプチドは、シグナル配列を含む。前駆体の例示的なものとして、配列番号３および４０〜４６に示されるものがあり、その各々は、アミノ酸位置１〜３５に３５アミノ酸のシグナル配列を含む。可溶性ＨｕＰＨ２０ポリペプチドはまた、本明細書に記載される製造および精製方法の間またはその後に分解されたものを含む。
【００５７】
本明細書において、可溶性組換えヒトＰＨ２０（ｒＨｕＰＨ２０）とは、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞において組換えによって発現されるヒトＰＨ２０の可溶性形態を指す。可溶性ｒＨｕＰＨ２０は、シグナル配列を含み、配列番号４９に示される核酸によってコードされる。また、その対立遺伝子変異体およびその他の可溶性変異体であるＤＮＡ分子も含まれる。可溶性ｒＨｕＰＨ２０をコードする核酸は、ＣＨＯ細胞において発現され、ＣＨＯ細胞は成熟ポリペプチドを分泌する。培養培地中に産生されるので、Ｃ末端に不均一性があり、その結果、生成物は、種々の量で配列番号４〜９のうちいずれか１種以上を含み得る種の混合物を含む。対応する対立遺伝子変異体およびその他の変異体、例えば、配列番号５０〜５１に示される前駆体ヒトＰＨ２０ポリペプチドに対応するものも含まれる。その他の変異体は、それらが、ヒアルロニダーゼ活性を保持し、可溶性である限り、配列番号４〜９および４７〜４８のいずれかと、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有し得る。
【００５８】
本明細書において、ヒアルロニダーゼ基質とは、ヒアルロニダーゼ酵素によって切断および／または脱重合される基質（例えば、タンパク質または多糖）を指す。通常、ヒアルロニダーゼ基質は、グリコサミノグリカンである。例示的ヒアルロニダーゼ基質として、ヒアルロナン（ＨＡ）がある。
【００５９】
本明細書において、ヒアルロナン関連疾患、障害または状態とは、ヒアルロナンレベルが、原因、結果として上昇している、そうでなければ、疾患または状態において観察される任意の疾患または状態を指す。ヒアルロナン関連疾患および状態は、組織または細胞におけるヒアルロナン発現の上昇、間質液圧の上昇、血管容積の減少、および／または組織中の水分含量の増大と関連している。ヒアルロナン関連疾患、障害または状態は、ヒアルロニダーゼなどのヒアルロナン分解酵素、例えば、可溶性ヒアルロニダーゼを含有する組成物を、単独または別の治療および／または薬剤と組み合わせて、別の治療および／または薬剤に加えてのいずれかで投与することによって治療できる。例示的疾患および状態として、それだけには限らないが、ヒアルロナンリッチな癌、例えば、腫瘍、例えば、後期癌、転移性癌、未分化癌、卵巣癌、ｉｎ  ｓｉｔｕ癌腫（ＩＳＣ）、扁平上皮癌（ＳＣＣ）、前立腺癌、膵臓癌、非小細胞肺癌、乳癌、結腸癌およびその他の癌などの固形腫瘍が挙げられる。また、ヒアルロナン関連疾患および状態の例示的なものとして、間質液圧の上昇と関連している疾患、例えば、椎間板圧迫と関連している疾患、および浮腫、例えば、臓器移植、卒中、脳外傷またはその他の損傷によって引き起こされる浮腫がある。例示的ヒアルロナン関連疾患および状態として、間質液圧の上昇、血管容積の減少、および／または組織における水分含量の増大と関連している疾患および状態、例えば、癌、椎間板圧迫および浮腫が挙げられる。一実施例では、ヒアルロナン関連状態、疾患または障害の治療として、間質液圧（ＩＦＰ）の上昇、血管容積の減少および組織における水分含量の増大のうち１以上に対する、回復、低減またはその他の有益な効果が挙げられる。
【００６０】
本明細書において、ヒアルロナンレベルの上昇とは、疾患または状態、結果に応じた、そうでなければ疾患において観察される、特定の組織、体液または細胞中のヒアルロナンの量を指す。例えば、ヒアルロナンリッチな腫瘍の存在の結果として、ヒアルロナン（ＨＡ）レベルは、血液、尿、唾液および血清などの体液において、および／または腫瘍組織または細胞において上昇し得る。レベルは、標準またはその他の適した対照、例えば、ＨＡ関連疾患を有さない対象由来の比較できるサンプルと比較することができる。
【００６１】
本明細書において、ヒアルロニダーゼなどのヒアルロナン分解酵素とコンジュゲートしているポリマーとは、ヒアルロナン分解酵素と直接的に、またはリンカーを介して、共有結合によって、または別の方法で安定に連結されている任意のポリマーを指す。このようなポリマーは、通常、血清半減期を増大し、これとして、それだけには限らないがシアル部分、ペグ化部分、デキストラン、ならびに糖およびグリコシル化などのためのその他の部分が挙げられる。
【００６２】
本明細書において、天然ヒアルロナン分解酵素、例えば、天然可溶性ヒアルロニダーゼは、ポリマー、例えば、ペグ化部分（ＰＥＧ）またはシアル化部分で修飾されていないヒアルロナン分解酵素である。したがって、天然ヒアルロナン分解酵素は、修飾されていない。通常、天然可溶性ヒアルロニダーゼなどの天然ヒアルロナン分解酵素は、ポリマー、例えば、ＰＥＧのコンジュゲーションによって修飾されているヒアルロナン分解酵素と比較して、生物環境では（例えば、対象では）、減少した半減期を有する。
【００６３】
本明細書において、比活性とは、ｍｇタンパク質あたりの活性のユニットを指す。ヒアルロニダーゼのミリグラムは、Ｍ−１  ｃｍ−１のユニットで約１．７のモル吸光係数と仮定する２８０ｎｍでの溶液の吸収によって定義される。
【００６４】
本明細書において、活性とは、全長（完全）タンパク質と関連している、ポリペプチドまたはその一部の機能活性または複数の活性を指す。機能的活性として、それだけには限らないが、生物活性、触媒または酵素活性、抗原性（抗ポリペプチド抗体と結合する能力または抗ポリペプチド抗体との結合についてポリペプチド競合する能力）、免疫原性、多量体を形成する能力、およびポリペプチドの受容体またはリガンドと特異的に結合する能力が挙げられる。
【００６５】
本明細書において、ヒアルロニダーゼ活性とは、ヒアルロン酸の切断を酵素的に触媒する能力を指す。ヒアルロニダーゼについての米国薬局方（ＵＳＰ）ＸＸＩＩアッセイは、高分子量ヒアルロン酸、またはヒアルロナン、酵素をＨＡと３７℃で３０分間反応させた後に残存する（ＨＡ）基質の量を測定することによってヒアルロニダーゼ活性を間接的に決定する（USP XXII-NF XVII (1990) 644-645 United States Pharmacopeia Convention、Inc、Rockville、MD）。参照標準溶液をアッセイにおいて使用して、任意のヒアルロニダーゼのユニットでの相対活性を確認することができる。可溶性ｒＨｕＰＨ２０などのヒアルロニダーゼのヒアルロニダーゼ活性を決定するためのＩｎ  ｖｉｔｒｏアッセイは、当技術分野で公知であり、本明細書に記載されている。例示的アッセイとして、切断されていないヒアルロン酸が血清アルブミンと結合する場合に形成される不溶性沈殿を検出することによって、ヒアルロニダーゼによるヒアルロン酸の切断を間接的に測定する、以下に記載されるマイクロ濁度アッセイ（例えば、実施例３を参照）が挙げられる。参照標準を使用して、例えば、標準曲線を作製し、調べられているヒアルロニダーゼのユニットでの活性を決定することができる。
【００６６】
本明細書において、ヒアルロニダーゼの活性のユニットとは、標準ヒアルロニダーゼサンプル（例えば、ＵＳＰまたはＷＨＯ標準）と比較することによって、例えば、濁度低減ユニットが、Ｕ．Ｓ．Ｐ．によって標準化されたヒアルロニダーゼのサンプルの標準曲線（例えば、ＵＳＰまたはＷＨＯ標準）によってＮＦＵ、およびＵ．Ｓ．Ｐ．ユニットと関連づけられる、本明細書において実施例２に記載される濁度低減ＥＬＩＳＡベースのアッセイを使用して決定されるＵ．Ｓ．Ｐ．国民医薬品集（ＮＦ  ＸＩＩＩ）ユニット（ＮＦＵ）を指す。したがって、実施例２において決定される酵素活性は、相対ＴＲＵである（例えば、Dorfman et al.、1948、J. Biol. Chem. 172:367を参照）。ヒアルロニダーゼユニットは、標準活性に対して正規化される。したがって、例えば、ＰＥＧ化ヒアルロニダーゼは、低い活性／ｍｇを示し得る。本明細書における目的上、投与量はユニットを基準とする。特定の修飾されたヒアルロニダーゼのユニット／ｍｇ（標準活性）は、必要に応じて、経験的に決定することができる。
【００６７】
本明細書において、「機能的に同等な量」またはその文法的変化は、ヒアルロナン分解酵素に関して、ヒアルロニダーゼなどの参照酵素の量と同じ効果を達成するヒアルロナン分解酵素の量を指す。例えば、任意のヒアルロナン分解酵素の活性をｒＨｕＰＨ２０の活性と比較して、既知量のｒＨｕＰＨ２０と同じ効果を達成するヒアルロナン分解酵素の機能的に同等な量を決定することができる。例えば、ヒアルロナン分解酵素の、展着剤または拡散剤として作用する能力は、トリパンブルーとともにマウスの側面の皮膚に注入することによって評価でき（例えば、米国特許公開番号第２００５０２６０１８６号参照）、例えば、１００ユニットのヒアルロニダーゼ参照標準と同じ拡散量を達成するのに必要なヒアルロナン分解酵素の量を決定できる。したがって、必要なヒアルロナン分解酵素の量は、１００ユニットと機能的に同等である。別の実施例では、同時投与される薬剤のｉｎ  ｖｉｖｏ活性（例えば、化学療法薬の抗腫瘍活性）を増大するヒアルロナン分解酵素の能力は、実施例１４に記載されるような動物モデルまたはヒト対象における評価することができ、例えば、同時投与された薬剤の活性の、投与される量のｒＨｕＰＨ２０と同じ増大を達成するのに必要なヒアルロナン分解酵素の量を決定することができる。
【００６８】
本明細書において、天然に存在するα−アミノ酸の残基は、荷電ｔＲＮＡ分子の、ヒトにおけるその同族ｍＲＮＡコドンを用いる特異的認識によってタンパク質に組み込まれる天然に見られる２０個のα−アミノ酸の残基である。
【００６９】
本明細書において、核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびペプチド核酸（ＰＮＡ）をはじめとするその類似体ならびにそれらの混合物を含む。核酸は、一本鎖であっても、二本鎖であってもよい。検出可能な標識、例えば、蛍光または放射標識などで所望により標識されていてもよいプローブまたはプライマーに言及する場合には、一本鎖分子が考慮される。このような分子は、ライブラリーのプロービングまたはプライミングのために、通常、その標的が統計的に独特であるような長さのもの、または低コピー数（通常、５未満、一般に、３未満）のものである。一般に、プローブまたはプライマーは、注目する遺伝子と相補的であるか、またはそれと同一である、少なくとも１４、１６または３０の隣接するヌクレオチドの配列を含む。プローブおよびプライマーは、１０、２０、３０、５０、１００またはそれ以上の核酸長であり得る。
【００７０】
本明細書において、ペプチドとは、２〜４０のアミノ酸の長さであるポリペプチドを指す。
【００７１】
本明細書において、本明細書において提供されるアミノ酸の種々の配列中に生じるアミノ酸は、その既知の、３文字または１文字略語に従って同定される（表１）。種々の核酸断片中に生じるヌクレオチドは、当技術分野で日常的に使用される標準の１文字指定を用いて指定される。
【００７２】
本明細書において、「アミノ酸」は、アミノ基およびカルボン酸基を含有する有機化合物である。ポリペプチドは、２個以上のアミノ酸を含む。本明細書における目的上、アミノ酸は、２０種の天然に存在するアミノ酸、非天然アミノ酸およびアミノ類似体（すなわち、α−炭素が側鎖を有するアミノ酸）を含む。
【００７３】
本明細書において、「アミノ酸残基」とは、ポリペプチドのそのペプチド結合での化学消化（加水分解）の際に形成されるアミノ酸を指す。本明細書において記載されるアミノ酸残基は、「Ｌ」異性体の形態であると推定される。そのように指定される「Ｄ」異性体の形態の残基は、ポリペプチドによって所望の機能特性が保持される限り、任意のＬ−アミノ酸残基と置換してもよい。ＮＨ２とは、ポリペプチドのアミノ末端に存在する遊離アミノ基を指す。ＣＯＯＨとは、ポリペプチドのカルボキシル末端に存在する遊離カルボキシ基を指す。J. Biol. Chem., 243: 3557-3559 (1968)に記載され、３７  Ｃ．Ｆ．Ｒ．§§１．８２１−１．８２２に採用される標準ポリペプチド命名法に沿って、アミノ酸残基の略語は表１に示されている。
表１−対応の表
【００７４】
【表１】
2014041131.tif 000002
【００７５】
式によって本明細書に表されるすべてのアミノ酸残基配列は、アミノ末端からカルボキシル末端の従来の方向に左から右の方向性を有するということは留意されるべきである。さらに、語句「アミノ酸残基」は、対応の表（表１）に列挙されるアミノ酸および修飾された、普通ではないアミノ酸、例えば、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§§１．８２１−１．８２２に言及され、参照によって本明細書に組み込まれるものも含むよう広く定義される。さらに、アミノ酸残基配列の最初または最後のダッシュは、１個以上のアミノ酸残基のさらなる配列との、ＮＨ２などのアミノ末端基との、またはＣＯＯＨなどのカルボキシル末端基とのペプチド結合を示すということは留意されるべきである。
【００７６】
本明細書において、「天然に存在するアミノ酸」とは、ポリペプチド中に生じる２０個のＬ−アミノ酸を指す。
【００７７】
本明細書において、「非天然アミノ酸」とは、天然アミノ酸と同様の構造を有するが、天然アミノ酸の構造および反応性を摸倣するよう構造的に修飾されている有機化合物を指す。したがって、天然に存在しないアミノ酸として、例えば、２０種の天然に存在するアミノ酸以外のアミノ酸またはアミノ酸の類似体が挙げられ、それだけには限らないが、アミノ酸のＤ−イソステレオマー（ｉｓｏｓｔｅｒｅｏｍｅｒｓ）が挙げられる。例示的非天然アミノ酸は、本明細書に記載されており、当業者に公知である。
【００７８】
本明細書において、ＤＮＡ構築物とは、天然には見られない方法で組み合わされ、並列されたＤＮＡのセグメントを含む、一本鎖または二本鎖の、直鎖または環状ＤＮＡ分子である。ＤＮＡ構築物は、ヒトの操作の結果として存在し、操作された分子のクローンおよびその他のコピーを含む。
【００７９】
本明細書において、ＤＮＡセグメントとは、特定の性状を有する大きなＤＮＡ分子の一部である。例えば、特定のポリペプチドをコードするＤＮＡセグメントは、大きなＤＮＡ分子の一部、例えば、プラスミドまたはプラスミド断片であり、これは、５’から３’の方向に読むと、特定のポリペプチドのアミノ酸の配列をコードする。
【００８０】
本明細書において、用語ポリヌクレオチドとは、５’から３’末端に読まれる、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド塩基の一本鎖または二本鎖ポリマーを意味する。ポリヌクレオチドは、ＲＮＡおよびＤＮＡを含み、天然供給源から単離してもよく、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成してもよく、天然および合成分子の組合せから調製してもよい。ポリヌクレオチド分子の長さは、本明細書では、ヌクレオチド（「ｎｔ」と略される）または塩基対（「ｂｐ」と略される）を単位として示される。用語ヌクレオチドは、文脈が許す場合には一本鎖および二本鎖分子のために使用される。この用語が二本鎖分子に適用される場合には、長さ全体を示すよう使用され、用語塩基対と同等であると理解される。二本鎖ポリヌクレオチドの２つの鎖は、長さがわずかに異なり得るということおよびその末端がねじれ型であり得；従って、二本鎖ポリヌクレオチド分子内のすべてのヌクレオチドが対を形成していない場合があるということは当業者によって認識されよう。このような対を形成していない末端は、通常、２０ヌクレオチドの長さを超えない。
【００８１】
本明細書において、２種のタンパク質または核酸間の「類似性」とは、タンパク質のアミノ酸の配列または核酸のヌクレオチド配列間の関連性を指す。類似性は、残基の配列およびそれに含まれる残基の同一性および／または相同性の程度に基づくものであり得る。タンパク質または核酸間の類似性の程度を評価する方法は、当業者には公知である。例えば、配列類似性を評価する一方法では、２種のアミノ酸またはヌクレオチド配列を、配列間で最大レベルの同一性が生じる方法でアラインする。「同一性」とは、アミノ酸またはヌクレオチド配列が不変である程度を指す。アミノ酸配列およびある程度までのヌクレオチド配列のアラインメントはまた、アミノ酸（またはヌクレオチド）における保存的相違および／または頻繁な置換を考慮し得る。保存的相違とは、関係する残基の物理化学的特性を保存するものである。アラインメントは、包括的（配列の全長にわたり、すべての残基を含む、比較される配列のアラインメント）または局所的（最も類似した領域または複数の領域のみを含む配列の一部のアラインメント）であり得る。
【００８２】
「同一性」はそれ自体、技術分野で認識された意味を有し、公開された技術を使用して算出できる。（例えば:Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press、New York、1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data、Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; and Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York、1991参照）。２種のポリヌクレオチドまたはポリペプチド間の同一性を測定するためのいくつかの方法が存在するが、用語「同一性」は、当業者には周知である(Carillo, H. & Lipton, D., SIAM J Applied Math 48:1073 (1988))。
【００８３】
本明細書において、相同（核酸および／またはアミノ酸配列に関して）とは、約２５％以上の配列相同性、通常、２５％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％または９５％以上の配列相同性を意味し；正確なパーセンテージは、必要に応じて、指定できる。本明細書における目的上、用語「相同性」および「同一性」は、特に断りのない限り、同義的に使用されることが多い。通常、パーセンテージ相同性または同一性を決定するには、配列を、最高次数のマッチが得られるようにアラインする（例えば: Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I,  Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; and Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; Carillo et al. (1988) SIAM J Applied Math 48:1073参照）。配列相同性によって、保存されたアミノ酸の数が標準アラインメントアルゴリズムプログラムによって決定され、各供給業者によって確立されたデフォルトギャップペナルティーを用いて使用できる。実質的に相同な核酸分子は、通常、注目する核酸の長さのすべてに沿って、中程度のストリンジェンシーで、または高ストリンジェンシーでハイブリダイズする。また、ハイブリダイズする核酸分子中のコドンの代わりに縮重コドンを含む核酸分子も考慮される。
【００８４】
任意の２種の分子が、少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％「同一」または「相同」であるヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を有するかどうかは、「ＦＡＳＴＡ」プログラムなどの既知コンピュータアルゴリズムを使用し、例えば、Pearson et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444におけるようなデフォルトパラメータを使用して調べることができる（その他のプログラムとして、ＧＣＧプログラムパッケージ(Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12(I):387 (1984))、BLASTP、BLASTN、FASTA(Atschul, S.F., et al., J Molec Biol 215:403 (1990)); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, ed., Academic Press, San Diego, 1994およびCarillo et al. (1988) SIAM J Applied Math 48:1073が挙げられる）。例えば、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｄａｔａｂａｓｅのＢＬＡＳＴ関数を使用して、同一性を求めることができる。その他の市販のまたは公的に入手可能なプログラムとして、ＤＮＡＳｔａｒ「ＭｅｇＡｌｉｇｎ」プログラム（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）およびＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＵＷＧ）「Ｇａｐ」プログラム（Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ）が挙げられる。タンパク質および／または核酸分子の相同性または同一性パーセントは、例えば、ＧＡＰコンピュータプログラムを使用して配列情報を比較することによって決定することができる（例えば、Ｓｍｉｔｈによって修正されたNeedleman et al. (1970) J. Mol. Biol. 48:443およびWaterman ((1981) Adv. Appl. Math. 2:482)。手短には、ＧＡＰプログラムは、２つの配列の短いほうの中の記号の総数によって除した、類似であるアラインされた記号（すなわち、ヌクレオチドまたはアミノ酸）の数として類似性を定義する。ＧＡＰプログラムのデフォルトパラメータとして、（１）Schwartz and Dayhoff, eds., ATLAS OF PROTEIN SEQUENCE AND STRUCTURE, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979)によって記載される、単項比較マトリックス（同一性に対して１および非同一性に対して０の値を含む）およびGribskov et al. (1986) Nucl. Acids Res. 14:6745の加重比較マトリックス；２）各ギャップに対して３．０のペナルティーおよび各ギャップ中の各記号に対してさらなる０．１０ペナルティー；ならびに（３）末端のギャップに対してペナルティーなしを挙げることができる。
【００８５】
したがって、本明細書において、用語「同一性」または「相同性」は、試験および参照ポリペプチドまたはポリヌクレオチド間の比較を表す。本明細書において、用語少なくとも「９０％同一である」とは、参照核酸またはポリペプチドのアミノ酸配列に対して９０〜９９．９９の同一性パーセントを指す。９０％以上のレベルの同一性は、例示目的で、１００個のアミノ酸の試験および参照ポリペプチドの長さが比較されると仮定して、試験ポリペプチド中のアミノ酸の１０％（すなわち、１００のうち１０）以下が、参照ポリペプチドのものと異なるという事実を示す。試験および参照ポリヌクレオチド間で同様の比較を行うことができる。このような相違は、ポリペプチドの全長にわたって無作為に分配される点突然変異として表される場合もあり、または、それらは、最大に許容される、例えば、１０／１００アミノ酸相違までの変動する長さの１または複数の位置に集まっている場合もある（約９０％の同一性）。相違は、核酸またはアミノ酸置換、挿入または欠失として定義される。約８５〜９０％を上回る相同性または同一性のレベルで、結果はプログラムおよびギャップパラメータセットと無関係であるはずであり；このような高レベルの同一性は、しばしば、ソフトウェアに頼ることなく手作業によるアラインメントによって容易に評価できる。
【００８６】
本明細書において、アラインされた配列とは、ヌクレオチドまたはアミノ酸の配列中の対応する位置をアラインするための相同性（類似性および／または同一性）の使用を指す。通常、５０％以上の同一性によって関連している２種以上の配列をアラインする。アラインされた配列のセットとは、対応する位置でアラインされる２種以上の配列を指し、ゲノムＤＮＡ配列とアラインされるＥＳＴおよびその他のｃＤＮＡなどのＲＮＡに由来するアラインする配列を挙げることができる。
【００８７】
本明細書において、「プライマー」とは、適した温度で、適当なバッファー中、適当な条件（例えば、４種の異なるヌクレオシド三リン酸およびＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素などの重合剤の存在下）下で鋳型によって導かれるＤＮＡ合成の開始点として作用し得る核酸分子を指す。当然のことではあるが、特定の核酸分子は、「プローブ」として、また「プライマー」として働き得る。しかし、プライマーは、伸長のための３’ヒドロキシル基を有する。プライマーは、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写酵素（ＲＴ）−ＰＣＲ、ＲＮＡ  ＰＣＲ、ＬＣＲ、マルチプレックスＰＣＲ、パンハンドルＰＣＲ、キャプチャーＰＣＲ、発現ＰＣＲ、３’および５’ＲＡＣＥ、ｉｎ  ｓｉｔｕＰＣＲ、ライゲーション媒介性ＰＣＲおよびその他の増幅プロトコールをはじめとする種々の方法において使用できる。
【００８８】
本明細書において、「プライマー対」とは、増幅される（例えば、ＰＣＲによって）配列の５’末端とハイブリダイズする５’（上流）プライマーと、増幅される配列の３’末端の相補体とハイブリダイズする３’（下流）プライマーとを含むプライマーのセットを指す。
【００８９】
本明細書において、「特異的にハイブリダイズする」とは、核酸分子（例えば、オリゴヌクレオチド）と標的核酸分子の相補的な塩基対形成によるアニーリングを指す。当業者ならば、特異的ハイブリダイゼーションに影響を及ぼすｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏパラメータ、例えば、特定の分子の長さおよび組成に精通している。ｉｎ  ｖｉｔｒｏハイブリダイゼーションと特に関連するパラメータとして、アニーリングおよび洗浄温度、バッファー組成および塩濃度がさらに挙げられる。高ストリンジェンシーで非特異的に結合している核酸分子を除去するための例示的洗浄条件は、０．１×ＳＳＰＥ、０．１％  ＳＤＳ、６５℃であり、中程度のストリンジェンシーで、０．２×ＳＳＰＥ、０．１％  ＳＤＳ、５０℃である。同等のストリンジェンシー条件は、当技術分野で公知である。当業者ならば、核酸分子と特定の適用にとって適当な標的核酸分子の特異的ハイブリダイゼーションを達成するよう、これらのパラメータを容易に調整することができる。２種のヌクレオチド配列に関して相補性とは、ヌクレオチドの２種配列が、通常、向かい合うヌクレオチド間で２５％、１５％または５％未満のミスマッチしか伴わずにハイブリダイズできることを意味する。必要に応じて、相補性のパーセンテージは指定される。通常、２種の分子は、それらが高ストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズするよう選択される。
【００９０】
本明細書において、生成物と実質的に同一であるとは、十分に類似しており、その結果、注目する特性が十分に不変であり、その結果、生成物の代わりに実質的に同一の生成物を使用できることを意味する。
【００９１】
本明細書において、用語「実質的に同一である」または「類似している」は関連技術分野の当業者によって理解される関連で変わるということも理解される。
【００９２】
本明細書において、対立遺伝子変異体または対立遺伝子変異は、同一染色体遺伝子座を占める遺伝子の２種以上の代替形態のいずれにも言及する。対立遺伝子変異は、突然変異によって天然に生じ、集団内で表現型多形をもたらし得る。遺伝子突然変異はサイレント（コードされるポリペプチドに変化なし）である場合もあり、変更されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする場合もある。用語「対立遺伝子変異体」はまた、遺伝子の対立遺伝子変異体によってコードされるタンパク質を示すために本明細書において使用される。通常、遺伝子の参照型は、野生型および／または集団に由来するポリペプチドの優性型または種の単一の参照メンバーをコードする。通常、種の間および種の中の変異体を含む対立遺伝子変異体は、野生型および／または同一種に由来する優性型と、通常、少なくとも８０％、９０％以上のアミノ酸同一性を有し；同一性の程度は、遺伝子および比較が種間であるか、種内であるかどうかに応じて変わる。一般に、種内対立遺伝子変異体は、野生型および／または優性型と、少なくとも約８０％、８５％、９０％または９５％以上の同一性、例えば、ポリペプチドの野生型および／または優性型と、９６％、９７％、９８％、９９％以上の同一性を有する。本明細書において、対立遺伝子変異体への言及は、通常、同一種のメンバー中のタンパク質における変異を指す。
【００９３】
本明細書において、「対立遺伝子変異体」と同義的に使用される「対立遺伝子」とは、遺伝子またはその一部の代替形態を指す。対立遺伝子は、同一の遺伝子座または相同染色体上の位置を占める。対象が、遺伝子の２つの同一の対立遺伝子を有する場合には、対象は、その遺伝子または対立遺伝子についてホモ接合性であるといわれる。対象が、遺伝子の２つの異なる対立遺伝子を有する場合には、対象は、その遺伝子についてヘテロ接合性であるといわれる。特定の遺伝子の対立遺伝子は、単一のヌクレオチドまたはいくつかのヌクレオチドで互いに異なり得、ヌクレオチドの置換、欠失および挿入を含み得る。遺伝子の対立遺伝子はまた、突然変異を含有する遺伝子の形態であり得る。
【００９４】
本明細書において、種変異体とは、異なる哺乳類種、例えば、マウスおよびヒトをはじめとする異なる種の中のポリペプチドにおける変異体を指す。
【００９５】
本明細書において、スプライス変異体とは、２種以上のｍＲＮＡをもたらすゲノムＤＮＡの一次転写物の差次的プロセシングによって生じる変異体を指す。
【００９６】
本明細書において、修飾とは、アミノ酸の配列の修飾に関連して使用される場合には、ポリペプチドまたは核酸分子中のヌクレオチドの配列の修飾を説明するよう使用され、それぞれ、アミノ酸およびヌクレオチドの欠失、挿入および置換を含む。ポリペプチドを修飾する方法は、例えば、組換えＤＮＡ法を使用することによる、当業者にとって日常的なものである。
【００９７】
本明細書において、用語プロモーターとは、ＲＮＡポリメラーゼの結合および転写に開始を提供するＤＮＡ配列を含有する遺伝子の一部を意味する。プロモーター配列は、いつもではないが通常、遺伝子の５’非コード領域中に見られる。
【００９８】
本明細書において、単離または精製されたポリペプチドまたはタンパク質またはその生物学的に活性な部分は、そのタンパク質が由来する細胞または組織に由来する細胞性物質またはその他の夾雑タンパク質を実質的に含まないか、または化学的に合成される場合には、化学的前駆体またはその他の化学物質を実質的に含まない。調製物は、容易に検出可能な不純物を含まないと思われると、このような純度を評価するために当業者によって使用される、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、ゲル電気泳動および高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などの分析の標準法によって決定される場合に、または十分に純粋であり、その結果、さらなる精製によって、物質の酵素活性および生物活性などの物理的および化学的特性が検出可能には変更されない場合に、実質的に含まないと決定され得る。化合物を精製して、実質的に化学的に純粋な化合物を製造する方法は、当業者には公知である。しかし、実質的に化学的に純粋な化合物は、立体異性体の混合物である場合がある。このような例では、さらなる精製は、化合物の比活性を増大し得る。
【００９９】
用語細胞性物質を実質的に含まないとは、タンパク質が、それが単離または組換えによって産生された細胞の細胞成分から分離されているタンパク質の調製物を含む。一実施形態では、用語細胞性物質を実質的に含まないとは、約３０％（乾重で）未満の非酵素タンパク質（本明細書において、夾雑タンパク質とも呼ばれる）、通常、約２０％未満の非酵素タンパク質または１０％の非酵素タンパク質または約５％未満の非酵素タンパク質を有する酵素タンパク質の調製物を含む。酵素タンパク質が組換えによって産生される場合には、培養培地も実質的に含まない、すなわち、培養培地は、酵素タンパク質調製物の容量の約２０％、１０％もしくは５％または２０％、１０％もしくは５％未満に相当する。
【０１００】
本明細書において、用語化学的前駆体またはその他の化学物質を実質的に含まないとは、タンパク質が、タンパク質の合成に関与している化学的前駆体またはその他の化学物質から分離されている、酵素タンパク質の調製物を含む。この用語は、約３０％（乾重で）２０％、１０％、５％未満またはそれよりも少ない化学的前駆体または非酵素化学物質または成分を有する酵素タンパク質の調製物を含む。
【０１０１】
本明細書において、例えば、合成核酸分子または合成遺伝子または合成ペプチドに関して合成とは、組換え法によって、および／または化学合成法によって製造される核酸分子またポリペプチド分子を指す。
【０１０２】
本明細書において、組換えＤＮＡ法を使用することによる組換え手段による製造とは、クローニングされたＤＮＡによってコードされるタンパク質を発現させるための分子生物学の周知の方法の使用を意味する。
【０１０３】
本明細書において、ベクター（またはプラスミド）とは、その発現または複製のいずれかのために、異種核酸を細胞に導入するために使用される個別的な要素を指す。ベクターは、通常、エピソームのままであるが、遺伝子またはその一部のゲノムの染色体中への組み込みを達成するよう設計することができる。酵母人工染色体および哺乳類人工染色体などの人工染色体であるベクターも考慮される。このような媒体の選択および使用は、当業者にはよく知られている。
【０１０４】
本明細書において、発現ベクターとは、調節配列、例えば、このようなＤＮＡ断片の発現を達成できるプロモーター領域と機能し得る形で連結しているＤＮＡを発現できるベクターを含む。このようなさらなるセグメントとして、プロモーターおよびターミネーター配列を挙げることができ、場合により、その他の調節配列、例えば、それだけには限らないが、１種以上の複製起点、１種以上の選択マーカー、エンハンサーおよびポリアデニル化シグナルを挙げることができる。発現ベクターは、通常、プラスミドまたはウイルスＤＮＡに由来するか、両方のエレメントを含み得る。したがって、発現ベクターとは、プラスミド、ファージ、組換えウイルスまたは適当な宿主細胞に導入されると、クローニングされたＤＮＡの発現をもたらすその他のベクターなどの組換えＤＮＡまたはＲＮＡ構築物を指す。適当な発現ベクターは、当業者には周知であり、真核細胞および／または原核細胞において複製可能なものおよびエピソームのままであるものまたは宿主細胞ゲノムに組み込むものが挙げられる。
【０１０５】
本明細書において、ベクターとしてまた、「ウイルスベクター（ｖｉｒｕｓ  ｖｉｃｔｏｒｓ）」または「ウイルスベクター（Ｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ）」が挙げられる。ウイルスベクターとは、外因性遺伝子を細胞に移す（媒体またはシャトルとして）ために外因性遺伝子と作用可能に連結している、操作されたウイルスである。
【０１０６】
本明細書において、ＤＮＡセグメントに言及する場合に、機能し得る形で（ｏｐｅｒａｂｌｙ）または機能し得る形で（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ）連結しているとは、セグメントが、それらが、その意図される目的と一致して機能する、例えば、転写が、プロモーターで開始し、コードセグメントを通ってターミネーターに向かって進行するよう配置していることを意味する。
【０１０７】
本明細書において、用語評価するとは、サンプル中に存在するプロテアーゼまたはそのドメインの活性の絶対値を得る、または活性のレベルを示す、指数、割合、パーセンテージ、視覚的もしくはその他の価を得るという意味で定量的および定性的決定を含むよう意図される。評価は、直接である場合も間接である場合もあり、実際に検出される化学種は、当然、それ自体がタンパク質分解産物である必要はないが、例えば、その誘導体または幾分かさらなる物質であり得る。例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクマシーブルーでのタンパク質染色などによる補体タンパク質の切断産物の検出。
【０１０８】
本明細書において、生物活性とは、化合物、組成物またはその他の混合物のｉｎ  ｖｉｖｏ投与の際に起こる化合物のｉｎ  ｖｉｖｏ活性または生理反応を指す。したがって、生物活性は、このような化合物、組成物および混合物の治療効果および薬剤活性を包含する。生物活性は、このような活性を試験または使用するよう設計されたｉｎ  ｖｉｔｒｏ系で観察できる。従って、本発明における目的上、プロテアーゼの生物活性は、ポリペプチドが加水分解されるその触媒活性である。
【０１０９】
本明細書において、同等とは、核酸の２種の配列に言及する場合は、問題の２種の配列がアミノ酸の同一配列または同等のタンパク質をコードすることを意味する。同等が、２種のタンパク質またはペプチドへの言及において使用される場合には、２種のタンパク質またはペプチドが、タンパク質またはペプチドの活性または機能を実質的に変更しないアミノ酸置換しか含まない、実質的に同一のアミノ酸配列を有することを意味する。同等が、特性を指す場合には、特性は同程度に存在する必要はない（例えば、２種のペプチドは、異なる割合の同一種類の酵素活性を示し得る）が、活性は、通常、実質的に同じである。
【０１１０】
本明細書において、「調節する」および「調節」または「変更する」とは、タンパク質などの分子の活性の変化を指す。例示的活性として、それだけには限らないが、シグナル変換などの生物活性が挙げられる。調節は、活性の増大（すなわち、アップレギュレーションまたはアゴニスト活性）活性の低下（すなわち、ダウンレギュレーションまたは阻害）または活性の任意のその他の変更（例えば、周期性、頻度、期間、速度論またはその他のパラメータの変化）を含み得る。調節は、文脈依存性であり得、通常、調節は、指定された状態、例えば、野生型のタンパク質、恒常的状態にあるタンパク質または指定された細胞種もしくは状態で発現されるタンパク質と比較される。
【０１１１】
本明細書において、組成物とは、任意の混合物を指す。それは、溶液、懸濁液、液体、粉末、ペースト、水性、非水性またはその任意の組合せであり得る。
【０１１２】
本明細書において、組合せとは、２種以上の品目間またはそれらの間の任意の関連を指す。組合せは、２種の組成物または２種の収集物などの２種以上の別個の品目であり得、２種以上の品目またはその任意の変異体の単一の混合物などのそれらの混合物であり得る。組合せの要素は、通常、機能的に関連または関係している。
【０１１３】
本明細書において、キットとは、さらなる試薬などのその他の要素および組合せまたはその要素の使用のための機器を所望により含む、パッケージングされた組合せである。
【０１１４】
本明細書において、「疾患または障害」とは、それだけには限らないが、感染、後天的な状態、遺伝状態をはじめとする原因または状態に起因する生物における病状を指し、同定可能な症状を特徴とする。本明細書において注目する疾患および障害として、ヒアルロナン関連疾患および障害がある。
【０１１５】
本明細書において、疾患または状態を有する対象を「治療すること」とは、対象の症状が部分的にまたは完全に軽減されること、または治療後に静止のままであることを意味する。したがって、治療は、予防、治療および／または治癒を包含する。予防とは、可能性ある疾患の予防および／または症状の悪化または疾患の進行の予防を指す。治療はまた、修飾されたインターフェロンおよび本明細書において提供される組成物の任意の薬剤的使用を包含する。
【０１１６】
本明細書において、製薬上有効な薬剤として、それだけには限らないが、例えば、麻酔薬、血管収縮剤、分散剤、小分子薬および治療用タンパク質をはじめとする従来の治療薬を含めた任意の治療薬または生物活性剤が挙げられる。
【０１１７】
本明細書において、治療とは、状態、障害または疾患またはその他の適応症の症状が、回復される、そうでなければ、有益に変更される任意の方法を意味する。
【０１１８】
本明細書において、治療効果とは、疾患もしくは状態の症状を変更する、通常、改善もしくは回復させる、または疾患もしくは状態を治癒させる、対象の治療に起因する効果を意味する。治療上有効な量とは、対象への投与後に治療効果をもたらす、組成物、分子または化合物の量を指す。
【０１１９】
本明細書において、用語「対象」とは、ヒトなどの哺乳類をはじめとする動物を指す。
【０１２０】
本明細書において、患者とは、ヒト対象を指す。
【０１２１】
本明細書において、医薬組成物またはその他の治療薬の投与などによる治療による、特定の疾患または障害の症状の回復とは、組成物または治療薬の投与に起因し得るまたはそれと関連する症状の、永久であるか、一時的であるか、持続性であるか一過性であるかに関わらない任意の緩和を指す。
【０１２２】
本明細書において、防止または予防とは、疾患または状態を発症する危険が低減される方法を指す。
【０１２３】
本明細書において、「治療上有効な量」または「治療上有効な用量」とは、薬剤、化合物、物質、または治療効果を引き起こすのに少なくとも十分である化合物を含有する組成物の量を指す。したがって、それは、疾患または障害の症状を予防、治癒、回復、停止または部分的に停止するのに必要な量である。
【０１２４】
本明細書において、単位用量形態とは、ヒトおよび動物対象に適しており、当技術分野で公知のように個別のパッケージングされている物理的に別個の単位を指す。
【０１２５】
本明細書において、単一剤形処方とは、直接投与用の処方を指す。
【０１２６】
本明細書において、「製品」とは、製造され、販売される生成物である。本願を通じて使用されるように、この用語は、ヒアルロニダーゼなどのヒアルロナン分解酵素、およびパッケージングの品目中に含まれる第２の医薬組成物を包含するものとする。
【０１２７】
本明細書において、流体とは、流れることができる任意の組成物を指す。したがって、流体とは、半固体、ペースト、溶液、水性混合物、ゲル、ローション、クリームの形態である組成物およびその他のこのような組成物を包含する。
【０１２８】
本明細書において、「キット」とは、本明細書において提供される組成物と、それだけには限らないが、活性化、投与、診断および生物活性または特性の評価をはじめとする目的のための別の品目の組合せを指す。キットは、所望により、使用するための機器を含んでもよい。
【０１２９】
本明細書において、細胞抽出物または溶解物とは、溶解された、または破壊された細胞からできている調製物または画分を指す。
【０１３０】
本明細書において、動物は、それだけには限らないが、ヒト、ゴリラおよびサルを含めた霊長類；マウスおよびラットなどのげっ歯類；ニワトリなどの家禽；ヤギ、ウシ、シカ、ヒツジなどの反芻動物；ブタおよびその他の動物などのヒツジなどの任意の動物を含む。非ヒト動物は、考慮される動物としてヒトを除外する。本明細書において提供される酵素は、任意の供給源、動物、植物、原核生物および真菌に由来する。ほとんどの酵素は、哺乳類起源を含めた動物起源のものである。
【０１３１】
本明細書において、対照とは、試験パラメータで処理されていない点を除き、試験サンプルと実質的に同一であるサンプルを指し、それが、血漿サンプルである場合には、注目する状態の影響を受けていない正常なボランティアに由来するものであり得る。対照はまた、内部対照でもあり得る。
【０１３２】
本明細書において、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、文脈上明確に他に指示されない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「細胞外ドメイン」を含んでなる化合物への言及は、１つまたは複数の細胞外ドメインを含む化合物を含む。
【０１３３】
本明細書において、範囲および量は、「約」特定の値または範囲として表すことができる。約はまた、正確な量も含む。したがって、「約５個の塩基」とは、「約５個の塩基」および「５個の塩基」も意味する。
【０１３４】
本明細書において、「任意選択の」または「所望により」とは、続いて記載される事象または状況が生じるか生じないこと、およびこの記載が前記事象または状況が生じる場合およびそうではない場合を含むことを意味する。例えば、所望により置換されていてもよい基とは、基が非置換であるか、置換されていることを意味する。
【０１３５】
本明細書において、抗癌治療は、癌を治療するための、薬物およびその他の薬剤の投与、ならびにまた照射などの治療プロトコールも含む。
【０１３６】
本明細書において、治療用抗体とは、治療に使用するための任意の抗体を指し、これとして、それだけには限らないが、モノクローナル抗体、ヒト抗体、ｓｃＦｖ、ダイアボディー、Ｆａｂおよびその他の抗体の断片が挙げられる。
【０１３７】
本明細書において、抗体断片とは、全長抗体の特異的結合能力の少なくとも一部を保持する、全長未満である抗体の任意の誘導体を指す。抗体断片の例として、それだけには限らないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、一本鎖Ｆｖｓ  （ｓｃＦｖ）、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、ダイアボディーおよびＦｄ断片が挙げられる。断片は、ジスルフィド橋などによって一緒になって連結している複数の鎖を含み得る。抗体断片は、一般に、少なくとも約５０個のアミノ酸、通常、少なくとも２００個のアミノ酸を含む。
【０１３８】
本明細書において、Ｆｖ抗体断片は、非共有相互作用によって連結している、１つの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および１つの軽鎖可変（ＶＬ）ドメインからなる。
【０１３９】
本明細書において、ｄｓＦｖとは、ＶＨ−ＶＬ対を安定させる、操作された分子間ジスルフィド結合を含むＦｖを指す。
【０１４０】
本明細書において、Ｆ（ａｂ）２断片とは、ｐＨ４．０〜４．５でのペプシンを用いる免疫グロブリンの消化に起因する抗体断片である；組換えによって製造できる。
【０１４１】
本明細書において、Ｆａｂ断片とは、パパインを用いる免疫グロブリンの消化に起因する抗体断片であり；組換えによって製造できる。
【０１４２】
本明細書において、ｓｃＦｖｓとは、任意の順序でポリペプチドリンカーによって共有結合によって接続している軽鎖可変鎖（ＶＬ）および重鎖可変鎖（ＶＨ）を含む抗体断片を指す。リンカーは、２つの可変ドメインが、実質的に干渉することなく架橋されるような長さのものである。例示的リンカーとして、溶解度を高めるよういくつかのＧｌｕまたはＬｙｓ残基がいたるところに分散している、（Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）ｎ残基がある。
【０１４３】
本明細書において、ｈｓＦｖとは、普通は、Ｆａｂ断片中に存在する定常ドメインが、ヘテロ二量体コイルドコイルドメインで置換されている抗体断片を指す（例えば、Arndt et al. (2001) J Mol Biol. 7:312:221-228参照）。
【０１４４】
本明細書において、ダイアボディーは、二量体のｓｃＦｖであり；ダイアボディーは、通常、ｓｃＦｖよりも短いペプチドリンカーを有し、選択的に二量化する。
【０１４５】
本明細書において、ヒト化抗体とは、ヒトへの投与が免疫応答を誘発しないようアミノ酸の「ヒト」配列を含むよう改変された抗体を指す。このような抗体を調製する方法は公知である。例えば、モノクローナル抗体を発現するハイブリドーマは、非可変領域のアミノ酸組成がヒト抗体に基づいている抗体を発現するよう、組換えＤＮＡ技術によって変更される。コンピュータプログラムは、このような領域を同定するよう設計されている。
【０１４６】
本明細書において、任意の保護基、アミノ酸およびその他の化合物の略語は、特に断りのない限り、その一般的な用法、認識された略語、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢの生化学命名法に関する委員会（ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  ｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ）（(1972) Biochem. 11:1726参照）に一致する。
【０１４７】
Ｂ．ヒアルロナン関連状態、疾患および障害を治療するための方法および組成物の概説
ヒアルロナン関連状態、疾患および障害を治療するための方法、組成物および組合せが、本明細書において提供される。本明細書において提供される方法、組成物および組合せは、ヒアルロン酸（ヒアルロナンとも呼ばれる）を分解できるヒアルロナン分解酵素を使用し、ヒアルロン酸は、細胞外マトリックスの必須成分であり、間質バリアの主要な成分である。多数の疾患および状態が、ヒアルロナンなどのヒアルロニダーゼ基質の蓄積された発現または過剰発現と関係しており、これが、疾患または状態の進行および／または重篤度の原因となる。したがって、基質を脱重合することを目的としたこのような酵素の投与は、このような疾患および状態の治療をもたらし得る。
【０１４８】
任意のヒアルロナン分解酵素、例えば、その任意の変異体（例えば、末端切断型変異体）を、その酵素が酵素活性を示すならば、本明細書において使用できる。一般に、ヒアルロナン分解酵素は、酵素の半減期を増大するようポリマー（例えば、ＰＥＧ）とのコンジュゲーションによって修飾される。半減期の増大は、全身性ヒアルロニダーゼ活性およびヒアルロナン分解のための作用の持続期間を増大し得る。さらに、半減期の増大はまた、疾患または状態と関連しているヒアルロニダーゼ基質の再合成および再生の防止にも寄与し得る。例えば、本明細書に記載されるように、ポリマーとのコンジュゲーションによる半減期の増大を示す修飾されたヒアルロナン分解酵素は、腫瘍内のヒアルロナン再生を防ぎ得る。本明細書において提供される修飾されたヒアルロナン（ｈｙａｌｕｏｎａｎ）分解酵素はまた、ヒアルロナン関連状態、疾患および／または障害を治療するための第２の薬剤と組み合わせてもよく、かつ／または同時に処方されてもよい。
【０１４９】
１．ヒアルロナン
グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の複雑な直鎖ポリサッカライドである。ＧＡＧは、Ｎ−置換されたヘキソサミンおよびウロン酸（例えば、ヒアルロナン（ＨＡ）、コンドロイチン硫酸（ＣＳ）、コンドロイチン（Ｃ）、デルマタン硫酸（ＤＳ）、ヘパラン硫酸（ＨＳ）、ヘパリン（Ｈ））またはガラクトース（例えば、ケラタン硫酸（ＫＳ））の反復する二糖構造を特徴とする。ＨＡを除いて、すべては、コアタンパク質と共有結合によって結合して存在する。そのコアタンパク質を含むＧＡＧは、構造的にプロテオグリカン（ＰＧ）と呼ばれる。
【０１５０】
ＨＡは、直鎖の、Ｎ−アセチルグルコサミンおよびグルクロン酸二糖単位で構成されている反復性多糖である。ＨＡの代謝（ｍｅｔｈａｂｏｌｉｓｍ）は、動的過程であり、皮膚では数週間〜１日未満の範囲の組織における正常なターンオーバーを伴う。ＨＡは、３種の保存されたＨＡシンターゼ（ＨＡＳ）によって細胞膜で合成され、受容体媒介性エンドサイトーシス後に、細胞結合型または酸性活性ヒアルロニダーゼ(Culty 1992; Zhou 2000)およびエキソグリコシダーゼ酵素によって単糖に分解される。
【０１５１】
ＨＡは、多数の細胞の細胞外マトリックス中に、特に、軟結合組織中に生じる。ヒアルロナン（ＨＡ）は、大部分は、結合組織、皮膚、軟骨中に、哺乳類では滑液中に生じる。ヒアルロナンはまた、眼の硝子体の主な成分である。ＨＡには、水中で、および細胞内マトリックスにおける血漿タンパク質ホメオスタシスなど種々の生理学的機能が割り当てられてきた(Laurent TC et al. (1992) FASEB J 6: 2397-2404)。結合組織では、ヒアルロナンと会合している水和の水は、組織間の空間を増大させ、したがって、細胞移動および増殖の助けとなる環境を作り出す。身体では、例えば、対象の組織では、ヒアルロナン（ヒアルロン酸）は、約５時間の半減期で置き換えられ、組織を通る流体流動に対する抵抗に大きく関与している。ヒアルロナンは、細胞運動性と関連している生物学的現象、例えば、迅速な発達、再生、修復、胚発生、発生学的発達、創傷治癒、脈管形成、および腫瘍形成において役割を果たす（例えば、Toole 1991 Cell Biol. Extracell. Matrix, Hay (ed)，Plenum Press，New York、1384-1386; Bertrand et al.. 1992 Int. J. Cancer 52:1-6; Knudson et al.，1993 FASEB J. 7:1233-1241参照）。ＨＡ産生は、増殖中の細胞において増大し、有糸分裂において役割を果たす可能性がある。また、歩行運動および細胞遊走ならびに細胞調節、発達および分化における役割と関係している(Laurent et al.. (1992) FASEB J 6: 2397-2404)。
【０１５２】
ＨＡは、臨床医学において使用されている。その組織保護的および流体力学的特性は、白内障手術の際に角膜内皮を保護するために眼部手術において有用であると証明されている。血清ＨＡは、肝臓疾患および関節リウマチなどの種々の炎症状態の診断に用いる。ＨＡの蓄積によって引き起こされる間質性浮腫は、種々の臓器において機能障害を引き起こし得る(Laurent et al. (1992) FASEB J 6: 2397-2404)。ヒアルロナンタンパク質相互作用はまた、細胞外マトリックスまたは「基質」の構造に関与している。
【０１５３】
ＨＡ合成は、発癌性ウイルスが、線維芽細胞を癌化する場合に増大し、ＨＡの上昇したレベルは、メラノーマおよびいくつかの癌腫などの種々の癌において、過剰増殖および悪性形質と関連している（例えば、Itano et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.  99;3609-3614.参照）。さらに、ヒアルロナンレベルは、腫瘍攻撃性と相関する(Ozello et al.. 1960 Cancer Res. 20:600-604; Takeuchi et al.. 1976, Cancer Res. 36:2133-2139; Kimata et al.. 1983 Cancer Res. 43:1347-1354)。多数の固形腫瘍悪性病変においてＨＡ代謝の局所的異常が報告されており、これでは、ＨＡのレベルの上昇が、乳癌、胃癌、結腸直腸癌、卵巣癌、前立腺癌および肺癌などの腫瘍における予後不良と相関することが多い。ＨＡ蓄積は、腫瘍細胞間および腫瘍細胞中の接触阻害を低減する（（例えば、Itano et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.  99;3609-3614.参照）。
【０１５４】
２．ヒアルロナン関連疾患
多数の疾患または状態は、ヒアルロニダーゼ基質、例えば、ＨＡの過剰発現または蓄積された発現と関連しており、これが、疾患または状態の重篤度または予後を増悪させるか、またはその原因となり得る。ＨＡ蓄積の根底にある原因は、ＨＡシンターゼ過剰発現、リンパ排液の不良または基質の不均衡な合成および分解のうち１つ以上による可能性が高い。
【０１５５】
したがって、提供された組成物、化合物および方法で治療できるヒアルロナン関連疾患、状態および障害の中には、疾患、状態または障害の原因、結果または症状として、ヒアルロンを発現または蓄積する状態、疾患および障害がある。このような疾患、状態および／または障害として、例えば、間質液圧の上昇、血管容積の減少、組織における水分含量の増大と関連しているもの、椎間板圧迫および浮腫が挙げられる。ヒアルロナン関連疾患、状態および／または障害として、それだけには限らないが、ヒアルロナンリッチな癌、例えば、腫瘍、例えば、固形腫瘍、例えば、後期癌、転移性癌、未分化癌、卵巣癌、ｉｎ  ｓｉｔｕ癌腫（ＩＳＣ）、扁平上皮癌（ＳＣＣ）、前立腺癌、膵臓癌、非小細胞肺癌、乳癌、結腸癌およびその他の癌が挙げられる。また、ヒアルロナン関連疾患および障害の例示的なものとして、椎間板圧迫、癌および浮腫、例えば、臓器移植、卒中、脳外傷またはその他の傷害によって引き起こされる浮腫がある。
【０１５６】
例えば、ヒアルロナン関連疾患または状態として、良性および悪性腫瘍を含めた固形腫瘍が挙げられる。固形腫瘍悪性病変の例示的なものとして、例えば、乳癌、胃癌、結腸直腸癌、卵巣癌、前立腺癌および肺癌と関連しているものが挙げられる。腫瘍、特に、悪性腫瘍におけるＨＡレベルの異常な蓄積は、間質または細胞内コンパートメントと関連している場合に予後不良の指標である。
【０１５７】
例えば、Auvinen(2000)による乳癌を有する患者の生存の研究では、５年生存は、間質ＨＡレベルの増大の関数として低下し；低、中および高ＨＡレベルそれぞれについて、５年の全生存は、４５％、３９％および２６％（ｐ＝０．００２）であり、再発を含まない生存は、６６％、５６％および４０％であった（ｐ＝０．００８）。ＨＡ陽性癌腫細胞の存在は、腋窩リンパ節陽性および分化不良と有意に相関していた。ＨＡ陽性癌腫細胞を示す患者の５年の全生存は、ＨＡ陽性癌腫細胞を有さない患者と比較して大幅に低かった（それぞれ、５４％対８１％、ｐ＝０．０１）。
【０１５８】
胃癌では、Setala et al. (1999)によって、２１５人のステージＩ〜ＩＶの胃癌患者のＨＡプロフィールが調べられた。高割合のＨＡ陽性細胞が見られ、深い腫瘍浸潤、結節性転移、陽性リンパ浸潤、分化段階の不良と、ならびに一変量生存率解析において予後が劣ることと有意に関連していた。評価された腫瘍の４４パーセントが、３０〜１００％のＨＡ陽性細胞というＨＡ標識指数を有していた。
【０１５９】
結腸直腸癌では、Ropponen et al. (1998)は、２０２人の、平均１４年フォローアップした結腸直腸癌サンプルにおいて、全生存および無再発生存との、細胞におけるＨＡの関連を調べた。高いＨＡ強度および標識指数の両方が見られることが多く、より低い全生存、より短い無再発生存期間および１８７人の評価可能患者のデュークス分類の上昇と有意に関連していた。
【０１６０】
Anttila et al. (2000)は、３０９人の卵巣上皮癌および４５の対応した転移病巣においてＨＡレベルを研究した。症例の７３％（３０９人のうち２２７人）では、ヒアルロナン陽性癌細胞の割合が＜１０％であったのに対し、高い間質ＨＡレベルは、分化不良、重篤な組織型、進行したステージ、および大きな原発残存腫瘍と有意に相関していた。
【０１６１】
ヒアルロナン関連疾患は、ヒアルロニダーゼなどのヒアルロナン分解酵素、例えば、可溶性ヒアルロニダーゼを含有する組成物を、単独または別の治療および／または薬剤と組み合わせた、または別の治療および／または薬剤に加えてのいずれかで投与することによって治療できる。ヒアルロナン関連状態、疾患または障害の治療は、間質液圧（ＩＦＰ）の上昇、血管容積の減少、および／または組織における水分含量の増大などの任意の関連物理的発現または症状のうち１つまたは複数に対する、回復、低減またはその他の有益な効果を含む。
【０１６２】
一例では、ヒアルロナン関連状態、疾患または障害の治療は、間質液圧（ＩＦＰ）の上昇、血管容積の減少、および組織における水分含量の増大のうち１つまたは複数に対する回復、低減またはその他の有益な効果を含む。別の例では、治療は、別の症状、例えば、腫瘍の大きさ（例えば、質量／容量）、対象の生存および／または無再発生存を含めた予後に対する回復または有益な効果を含み得る。
【０１６３】
３．治療の方法および組成物
したがって、ヒアルロナン（ＨＡ）関連状態、疾患および障害を治療するための方法および組成物が本明細書において提供される。治療方法などの方法は、修飾されたヒアルロナン分解酵素を単独で含有する組成物または修飾されたヒアルロナン分解酵素を含有し、さらにヒアルロナン関連状態、疾患および／または障害を治療するための１種または複数のさらなる薬剤を含有する組成物もしくは組合せを使用する。本明細書における方法において使用される組成物および組合せでは、ヒアルロニダーゼなどのヒアルロナン分解酵素は、１種または複数のポリマーとのコンジュゲーションなどによって修飾され、それによって、可溶性ヒアルロニダーゼなどのヒアルロニダーゼの半減期が増大する。本明細書において提供される修飾されたヒアルロナン分解酵素は、ヒアルロナン関連状態、疾患および障害を治療するために単独で使用してもよく、または例えば、治療薬（例えば、化学療法薬）などのその他の薬剤と組み合わせて使用してもよい。ヒアルロナン分解酵素およびその他の薬剤（単数または複数）を含有する組成物は組み合わせて別個に提供されていもよく、または単一組成物中で提供されてもよい。
【０１６４】
いくつかの例では、修飾されたヒアルロナン分解酵素は、ヒアルロナン関連疾患または状態の治療のために単独で投与される。したがって、修飾された可溶性ヒアルロニダーゼなどのヒアルロナン分解酵素を含有する組成物、および、ヒアルロナン関連疾患、すなわち、ヒアルロニダーゼ基質の蓄積された発現と関連している疾患を治療するために修飾されたヒアルロナン分解酵素を投与する方法も、本明細書において提供される。例えば、このような治療は、ヒアルロナン関連疾患、例えば、ヒアルロナンリッチな癌において間質液圧の低下を達成するために使用できる。本明細書において示されるように、修飾されたヒアルロニダーゼなどの修飾されたヒアルロナン分解酵素を用いる治療は、ヒアルロナンを除去し、間質液圧（ＩＦＰ）を低下させるだけでなく、接触阻害も回復させ得る。したがって、ヒアルロナン分解酵素の投与は、細胞間および細胞の間の接触の回復によって治療を達成し得る。本明細書において示されるように、ペグ化などによるヒアルロナン分解酵素の修飾は、腫瘍の治療としてのヒアルロナン分解酵素の有効性を改善する。
【０１６５】
特に、修飾されたヒアルロナン分解酵素の全身投与は、脳腫瘍を含めた腫瘍を治療するのに有効である。例えば、修飾された可溶性ヒアルロニダーゼなどの修飾されたヒアルロナン分解酵素の全身投与は、ヒアルロナンリッチな腫瘍において間質液圧（ＩＦＰ）を低下させ、ＩＦＰの用量依存性の、持続した低減、例えば、１時間、２時間、４時間、８時間、１０時間、１２時間、１６時間、２４時間、４８時間または７２時間を超えて持続する低減を達成する。ヒアルロニダーゼは、このような低減をヒアルロナン特異的に達成できる。
【０１６６】
さらに、ヒアルロナン関連腫瘍を有する対象において、投与後にヒアルロナン発現を低減する能力と一致して、修飾された可溶性ヒアルロニダーゼなどの修飾されたヒアルロナン分解酵素の全身投与は、腫瘍水分含量の、例えば、少なくとも１時間、２時間、４時間、８時間、１０時間、１２時間、１６時間２４時間、４８時間または７２時間の持続した低減および腫瘍中の血管の血管除圧に起因する、ヒアルロナン関連腫瘍中の血管容積の減少を達成し得る。したがって、さらに、修飾された可溶性ヒアルロニダーゼなどの修飾されたヒアルロナン分解酵素を含有する組成物、ならびにヒアルロナン関連疾患または状態、例えば、ヒアルロナン関連癌を有する対象における、血管容積の持続した増大および／または組織中の水分含量の持続した増大を達成するための投与方法が、本明細書において提供される。
【０１６７】
修飾されていないヒアルロナン分解酵素は、通常、数分、一般に、５分未満の、血液中での酵素活性の短い半減期を有する。これは、このような酵素が、一般に、静脈内投与およびその作用期間が短命であるその他の投与において使用するのに適していないことを意味する。本明細書における組成物および方法において使用される可溶性ヒアルロニダーゼなどのヒアルロナン（ｈｙａｕｌｒｏｎａｎ）分解酵素は、ポリマー、例えば、シアル化部分またはペグ化部分（ＰＥＧ）とのコンジュゲーションによって修飾される。概して、またはポリマーは、対象に投与した後の、ヒアルロニダーゼなどのヒアルロナン分解酵素の半減期を増大する。本明細書において提供される修飾されたヒアルロナン分解酵素（例えば、ポリマーとのコンジュゲーションによって）の酵素活性の血漿半減期は、概して、または約１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、２０時間、２５時間、３０時間、３５時間、４０時間、４５時間、５０時間、５５時間、６０時間またはそれ以上である。一例では、ポリマーとのコンジュゲーションによって修飾された可溶性ヒアルロニダーゼは、修飾されていない酵素と比較して、血漿半減期の１００倍、２００倍、２５０倍、３００倍、４００倍、５００倍、６００倍、７００倍、８００倍、９００倍、１０００倍、１５００倍、２０００倍超またはそれ以上の増大を達成する。一例では、血漿における酵素の半減期は、２４時間を超える。
【０１６８】
半減期の相違によって、修飾されたヒアルロニダーゼの活性の期間は、天然の（ポリマーとのコンジュゲーションによって修飾されていない）ヒアルロニダーゼと比較して増大する。例えば、天然の（修飾されていない）可溶性ヒアルロニダーゼの投与後、例えば、ヒアルロン酸は２４時間内に回復し得、観察可能な変化は残らない。ヒアルロナン分解酵素の半減期を増大させるポリマー（例えば、ＰＥＧ）とのコンジュゲーションによって修飾されているヒアルロニダーゼなどのヒアルロナン分解酵素の投与後、ヒアルロナンの発現は、投与後２４時間、４８時間、７２時間またはそれ以上で低減したままである。
【０１６９】
一般に、ポリマーとコンジュゲートしている修飾されたヒアルロナン分解酵素は、修飾されていないヒアルロナン分解酵素と比較して、低下した比活性を有していた。比活性は、通常、約２倍、３倍、４倍、５倍またはそれ以上低下する。例えば、本明細書において別に記載されるように、修飾されていないＰＨ２０である指定されたｒＨｕＰＨ２０の比活性は、約１２０，０００Ｕ／ｍｇである。ＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０の比活性は、約３０，０００Ｕ／ｍｇである。それにもかかわらず、半減期の増大によって、修飾されたヒアルロナン分解酵素は、活性期間の増大を示す。ＨＡは再生され得るので、持続した作用期間を有する酵素は、ＨＡ再合成およびＥＣＭにおける沈着に対抗し得る。
【０１７０】
したがって、本明細書において提供される方法、組合せおよび組成物では、修飾されたヒアルロナン分解酵素、例えば、可溶性ヒアルロニダーゼは、血漿中、少なくとも３Ｕ／ｍＬの酵素のＨＡの最小の血漿レベルを持続するのに十分な量で提供される。例えば、ＨＡの最小血漿レベルは、３Ｕ／ｍＬ〜１２Ｕ／ｍＬもしくはそれ以上である、または約３Ｕ／ｍＬ〜１２Ｕ／ｍＬもしくはそれ以上であるレベル、例えば、約４Ｕ／ｍＬ、５Ｕ／ｍＬ、６Ｕ／ｍＬ、７Ｕ／ｍＬ、８Ｕ／ｍＬ、９Ｕ／ｍＬ、１０Ｕ／ｍＬ、１１Ｕ／ｍＬ、１２Ｕ／ｍＬ、１３Ｕ／ｍＬ、１４Ｕ／ｍＬ、１５Ｕ／ｍＬ、１６Ｕ／ｍＬ、１７Ｕ／ｍＬ、１８Ｕ／ｍＬ、１９Ｕ／ｍＬ、２０Ｕ／ｍＬ、２５Ｕ／ｍＬ、３０Ｕ／ｍＬ、３５Ｕ／ｍＬ、４０Ｕ／ｍＬ、４５Ｕ／ｍＬ、５０Ｕ／ｍＬもしくはそれ以上のレベルまたは４Ｕ／ｍＬ、５Ｕ／ｍＬ、６Ｕ／ｍＬ、７Ｕ／ｍＬ、８Ｕ／ｍＬ、９Ｕ／ｍＬ、１０Ｕ／ｍＬ、１１Ｕ／ｍＬ、１２Ｕ／ｍＬ、１３Ｕ／ｍＬ、１４Ｕ／ｍＬ、１５Ｕ／ｍＬ、１６Ｕ／ｍＬ、１７Ｕ／ｍＬ、１８Ｕ／ｍＬ、１９Ｕ／ｍＬ、２０Ｕ／ｍＬ、２５Ｕ／ｍＬ、３０Ｕ／ｍＬ、３５Ｕ／ｍＬ、４０Ｕ／ｍＬ、４５Ｕ／ｍＬ、５０Ｕ／ｍＬもしくはそれ以上のレベルで維持される。血漿中、少なくとも３Ｕ／ｍＬの酵素を維持することによって、酵素は、疾患または状態と関連しているＨＡ、例えば、腫瘍のＨＡを除去し、ＨＡ再合成に対抗できる。したがって、このような治療では、ヒアルロニダーゼ基質は、蓄積することが許されない。予後がＨＡ発現と関連している、悪性固形腫瘍を有する癌などの疾患または状態について、状態（例えば癌性状態）は治療および／または回復させることができる。
【０１７１】
したがって、提供された、ポリマーとコンジュゲートしている可溶性ヒアルロニダーゼなどのヒアルロナン分解酵素を含有する組成物は、蓄積されたヒアルロニダーゼ基質と関連している疾患または状態の延長または持続された治療、例えば、１種または複数の症状の延長または持続された回復を提供し得る。例えば、ポリマーとのコンジュゲーションによって修飾されている修飾された可溶性ヒアルロニダーゼの全身（例えば、静脈内の）投与は、ヒアルロナンリッチな腫瘍の組織中の細胞周囲（ｐｅｒ  ｃｅｌｌｕｌａｒ）マトリックスにおける、ヒアルロナン発現の持続された（例えば、少なくとも２４、４８および７２時間）低減を達成し得る。
【０１７２】
血漿中での修飾された酵素の効果を、長期間持続するよう、投与の周期を達成できる。したがって、血漿中の修飾されたヒアルロニダーゼの一定レベルを任意の所望の時間維持するために、修飾された酵素を、投与計画にわたって連続的に投与できる。血漿中のレベルは、血漿中の修飾されたヒアルロニダーゼのレベルを測定することによって、本明細書に記載される治療の過程の間モニタリングできる。これは、治療の過程にわたって、疾患または状態と関連しているＨＡを除去するだけでなく、ＨＡ再合成に対抗するのに十分な最小レベルのヒアルロニダーゼが血漿中に存在するということを意味する。連続投与は、血漿中のレベルが少なくとも３Ｕ／ｍＬまたは約３Ｕ／ｍＬを下回って低下するときはいつでも周期的に行うことができる。しかし、各投与の前に血漿レベルを測定する必要はない。通常、少なくとも３Ｕ／ｍＬのヒアルロニダーゼの血漿中レベルを維持するには、ポリマーとコンジュゲートしている可溶性ヒアルロニダーゼなどのヒアルロナン分解酵素を含有する組成物を、１カ月に数回、通常、１週間に少なくとも１回、通常、１週間に２回以上投与する。例えば、修飾されたヒアルロナン分解酵素、例えば、修飾された可溶性ヒアルロニダーゼを、１週間に２回、１週間に３回、１週間に４回、１週間に５回、１週間に６回または毎日投与する。通常、このような酵素を、１週間に２回投与する。
【０１７３】
本明細書において別に論じられるように、少なくとも３Ｕ／ｍＬのヒアルロニダーゼの血漿レベルを維持するのに必要な修飾されたヒアルロニダーゼ酵素の用量は、経験的に決定することができる。本明細書に例示されるように、通常、血漿中、少なくとも３Ｕ／ｍＬを維持するための修飾された可溶性ヒアルロニダーゼの単回投与の用量は、投与の周期にわたって、０．０２ｍｇ／ｋｇ（対象の）、０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．０４ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．０６ｍｇ／ｋｇ、０．０７ｍｇ／ｋｇ、０．０８ｍｇ／ｋｇ、０．０９ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．１５ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．２５ｍｇ／ｋｇ、０．３０ｍｇ／ｋｇ、０．３５ｍｇ／ｋｇ、０．４０ｍｇ／ｋｇ、０．４５ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．５５ｍｇ．ｋｇ、０．６ｍｇ／ｋｇ、０．７ｍｇ／ｋｇ、０．８ｍｇ／ｋｇ、０．９ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、１．１ｍｇ／ｋｇ、１．２ｍｇ／ｋｇ、１．３ｍｇ／ｋｇ、１．４ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇもしくはそれ以上である、または約０．０２ｍｇ／ｋｇ（対象の）、０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．０４ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．０６ｍｇ／ｋｇ、０．０７ｍｇ／ｋｇ、０．０８ｍｇ／ｋｇ、０．０９ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．１５ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．２５ｍｇ／ｋｇ、０．３０ｍｇ／ｋｇ、０．３５ｍｇ／ｋｇ、０．４０ｍｇ／ｋｇ、０．４５ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．５５ｍｇ．ｋｇ、０．６ｍｇ／ｋｇ、０．７ｍｇ／ｋｇ、０．８ｍｇ／ｋｇ、０．９ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、１．１ｍｇ／ｋｇ、１．２ｍｇ／ｋｇ、１．３ｍｇ／ｋｇ、１．４ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇもしくはそれ以上である。通常、用量は、０．０５ｍｇ／ｋｇまたは約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜０．８ｍｇ／ｋｇまたは約０．８ｍｇ／ｋｇである。以下に論じられるように、このような量は、所望の時間血漿レベルを維持するよう、投与の周期にわたって周期的に（例えば、週に２回）投与されるということは理解される。平均ヒトが７５ｋｇであるとすれば、２０，０００Ｕ／ｍｇ〜６０，０００Ｕ／ｍｇのまたは約２０，０００Ｕ／ｍｇ〜６０，０００Ｕ／ｍｇの、通常、３５，０００Ｕ／ｍｇまたは約３５，０００Ｕ／ｍｇの比活性を有する修飾された可溶性ヒアルロニダーゼを、６０，０００Ｕ；７０，０００Ｕ；８０，０００Ｕ；９０，０００Ｕ；１００，０００Ｕ；２００，０００Ｕ；３００，０００Ｕ；４００，０００Ｕ；５００，０００Ｕ；６００，０００Ｕ；７００，０００Ｕ；８００，０００Ｕ；９００，０００Ｕ；１，０００，０００Ｕ；１，５００，０００Ｕ；２，０００，０００Ｕ；２，５００，０００Ｕ；３，０００，０００Ｕ；３，５００，０００Ｕ；４，０００，０００Ｕもしくはそれ以上または約６０，０００Ｕ；７０，０００Ｕ；８０，０００Ｕ；９０，０００Ｕ；１００，０００Ｕ；２００，０００Ｕ；３００，０００Ｕ；４００，０００Ｕ；５００，０００Ｕ；６００，０００Ｕ；７００，０００Ｕ；８００，０００Ｕ；９００，０００Ｕ；１，０００，０００Ｕ；１，５００，０００Ｕ；２，０００，０００Ｕ；２，５００，０００Ｕ；３，０００，０００Ｕ；３，５００，０００Ｕ；４，０００，０００Ｕもしくはそれ以上で投与する。例えば、２．０〜６０ｍｇまたは約２．０〜６０ｍｇの修飾されたヒアルロニダーゼを含有する修飾されたヒアルロニダーゼの組成物を投与できる。また、このような組成物が本明細書において提供される。
【０１７４】
投与の周期の時間の長さは、経験的に決定でき、治療される疾患、疾患の重篤度、個々の患者および治療医師の技術のレベル内のその他の考慮すべき事柄に応じて変わる。修飾されたヒアルロニダーゼ酵素を用いる治療の時間の長さは、１週間、２週間、１カ月、数カ月、１年、数年またはそれ以上であり得る。例えば、修飾されたヒアルロニダーゼ酵素を、１年またはそれ以上の期間にわたって週に２回投与できる。治療の中断がなく疾患症状が持続する場合には、治療を、さらなる時間の長さ継続してもよい。治療の過程にわたって、疾患および／または治療に関連する毒性または副作用の証拠をモニタリングできる。
【０１７５】
さらに、投与の周期は、酵素の曝露からの休止期間を提供するよう治療の中断の期間を加えるよう目的に合わせることができる。治療の中断の時間の長さは、所定の時間であり得、または患者がどのように応答しているかに応じて、もしくは観察される副作用に応じて経験的に決定できる。例えば、治療は、１週間、２週間、１カ月または数カ月中断してもよい。治療の中断期間の間、ヒアルロニダーゼの血漿レベルは、３Ｕ／ｍＬより低く低下するということは理解され、予想される。通常、治療の中断の期間は、患者の投与周期計画に組み込まれる。例えば、例示的投与計画は、２８日の治療周期であり、修飾された酵素が最初の３週間、週に２回投与され、投薬を伴わない１週間を続ける。一例では、０．０５ｍｇ／ｋｇ〜０．８ｍｇ／ｋｇの修飾された酵素は、週に２回３週間投与し、投薬を伴わない１週間を続けることができる。したがって、２８日周期の過程にわたって、例えば、１、４、８、１１、１５および１８日目に修飾された酵素を用いて患者に投薬し、１週間の治療の中断を続けることができる。上記のように、投与の周期は、任意の所望の時間の長さであり得る。したがって、２８日周期の投与を、任意の時間の長さ反復してもよい。患者にとって固有の個人的な考慮すべき事柄および治療される疾患に応じて患者の要求を満たす投与の周期および投与計画を選ぶことは、治療医師の技術レベルの範囲内である。
【０１７６】
４．組合せおよびその治療方法
ヒアルロニダーゼなどのヒアルロナン分解酵素は、ヒアルロン酸を一時的に消化し、それによって、薬剤のデリバリーを促進する。したがって、例えば、ヒアルロナン分解酵素の、グリコサミノグリカンの分解によって間質空間にチャネルを開ける能力によって、可溶性ヒアルロニダーゼなどのヒアルロナン分解酵素の投与が、分子の拡散を可能にし、それによって、同時に処方される、または同時に投与される分子の、またはヒアルロニダーゼの投与後に投与される分子のバイオアベイラビリティ、薬物動態および／または  薬力学的特徴を改善する。いくつかの例では、ヒアルロニダーゼを伴う分子のバイオアベイラビリティは、ヒアルロニダーゼ投与を伴わない分子のバイオアベイラビリティの７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％である。一般に、バイオアベイラビリティは、９０％を超える。さらに、上記で論じたように、修飾されたヒアルロナン分解酵素をはじめとするヒアルロナン分解酵素は、その他の機構によって腫瘍を治療できる。
【０１７７】
したがって、一例では、ヒアルロナン関連状態、疾患または障害の治療は、修飾された可溶性ヒアルロニダーゼのような修飾されたヒアルロナン分解酵素と、疾患または障害を治療するための１種または複数のさらなる薬剤および／または治療、例えば、化学療法などの抗癌剤、癌を治療するための抗体、ベクターまたは核酸とを含有する組成物の投与を含む。この例では、第２の治療または薬剤を、ヒアルロニダーゼと別個に、または一緒に投与できる。例えば、修飾されたヒアルロナン分解酵素を、さらなる薬剤または治療の前、後またはそれとともに投与する。したがって、ヒアルロナン分解酵素、特に、ＰＥＧ化可溶性ヒアルロニダーゼなどの修飾されたヒアルロナン分解酵素は、単独で、またはその他の治療薬と組み合わせて治療薬として投与できる。ヒアルロニダーゼなどのヒアルロナン分解酵素、投与は、特に、細胞外ヒアルロナンの高発現を有する組織、例えば、ＨＡＬＯ（ヒアルロナンをはじめとするプロテオグリカンが豊富である細胞周囲マトリックス領域）形成を示す組織への治療または薬剤のデリバリーのための、例えば静脈内、皮下および／または腫瘍内デリバリーによる治療薬デリバリーを促進し得る。ヒアルロニダーゼなどのヒアルロナン分解酵素の、細胞外マトリックスにおいてヒアルロナンを分解する能力のために、ヒアルロナン分解酵素は、所望の位置への治療薬の投与を容易にする。
【０１７８】
通常、第２の薬剤および修飾されたヒアルロナン分解酵素、例えば、修飾されたヒアルロニダーゼ酵素は、別個に投与される。例えば、さらなる薬剤または治療は、任意の順序で同時に、逐次、または断続的に投与してよい。通常、ヒアルロニダーゼなどの修飾されたヒアルロナン分解酵素を、さらなる薬剤および／または治療に先立って、例えば、さらなる薬剤または治療に少なくとも０．５、１、５、１５、もしくは３０分、または１、２、３、４、５、６、７、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、３６、４８、７２もしくはそれ以上の時間先立って投与する。いくつかの例では、修飾された酵素の長い半減期およびその作用期間のために、修飾された酵素を、さらなる薬剤または治療の投与に少なくとも２４もしくは約２４時間、少なくとも４８もしくは約４８時間、または少なくとも７２もしくは約７２時間またはそれ以上先立って投与してもよい。
【０１７９】
第２の薬剤の投与頻度は経験的に決定できる。投与頻度の決定は、熟練した医師のレベルの範囲内であり、治療されている個々の疾患または状態、疾患の重篤度、治療される患者、および修飾された酵素の投与の周期をはじめとするいくつかの因子に応じて変わる。一般に、第２の薬剤、例えば、抗癌剤または治療（例えば、化学療法薬）の投与のタイミングは、通常、修飾された酵素の投与の周期の関数である。例えば、第２の薬剤は、投与の周期中、修飾された酵素の第１の投与後に、および／または周期中、任意の１回または複数のその後の投与の後に投与してよい。その他の例では、第２の薬剤を、周期中、修飾された酵素のその後の各投与の後に、周期中、修飾された酵素のその後の投与の１回おきの後に投与する、または修飾された酵素の投与の周期の間、１週間に１回、２週間に１回、３週間に１回または１カ月に１回投与する。いくつかの例では、第２の薬剤を修飾された酵素の投与の１周期あたり１回投与するだけである。さらなる例では、第２の薬剤を、投与の周期間で断続的に投与する。例えば、第２の薬剤を、第１の投与の周期の間は投与しないが、第２の周期の間は投与し、続いて、第３の周期を飛ばして、第４の周期の間に再度投与するなど、またはその任意の変法で投与する。
【０１８０】
以下の節は、修飾された可溶性ヒアルロニダーゼなどの修飾されたヒアルロナン分解酵素および／またはその他の薬剤を含有する例示的組成物および化合物、その製造方法、およびヒアルロナン関連疾患、障害および状態を治療するためのその使用方法を記載する。
【０１８１】
Ｃ．ヒアルロナン分解酵素を含有する組成物
修飾されたヒアルロナン分解酵素、特に、可溶性ヒアルロニダーゼを含有する組成物、およびヒアルロナン関連疾患および状態の治療のために投与するためのこのような組成物を使用する方法が、本明細書において提供される。本明細書において提供される組成物中に含有されるヒアルロナン分解酵素は、ポリマー（例えば、ＰＥＧ）とのコンジュゲーションによって修飾される。酵素がヒアルロン酸に対する酵素活性（例えば、ヒアルロニダーゼ活性）を示す限り、任意のこのような修飾されたヒアルロナン分解酵素をここで使用できる。いくつかの例では、本明細書における方法、組成物および組合せにおいて使用される修飾されたヒアルロナン分解酵素は、修飾されていないヒアルロナン分解酵素（例えば、ポリマーとコンジュゲートされていない）と比較して増大されたヒアルロニダーゼ活性を示す。全般的に、本明細書において別に論じられるように、修飾されたヒアルロナン分解酵素は、修飾されていないヒアルロナン分解酵素と比較して増大された半減期を示す。
【０１８２】
ヒアルロナンはまた、ヒアルロン酸もしくはヒアルロネートとも呼ばれ、結合組織、上皮組織および神経組織中に広く分布している非硫酸化グリコサミノグリカンである。ヒアルロナンは、細胞外マトリックスの必須成分であり、間質バリアの主要な成分である。ヒアルロナン分解酵素は、ヒアルロナンの加水分解を触媒することによって、ヒアルロナンの粘度を低下させ、それによって、組織透過性を増大し、非経口的に投与された流体の吸収速度を高める。そのようなものとして、ヒアルロニダーゼなどのヒアルロナン分解酵素は、例えば、その他の薬剤、薬物およびタンパク質とともに、その分散およびデリバリーを増強するための展着剤または分散剤として使用されてきた。
【０１８３】
ヒアルロナン分解酵素は、交互のβ−１→４およびβ−１→３グリコシド結合によって一緒になって連結している反復性二糖類単位、Ｄ−グルクロン酸（ＧｌｃＡ）およびＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）からなる、ヒアルロナンポリマーを切断することによってヒアルロナンを分解するよう作用する。ヒアルロナン鎖は、約２５，０００の二糖反復またはそれ以上の長さに達する場合があり、ヒアルロナンのポリマーは、ｉｎ  ｖｉｖｏで約５，０００〜２０，０００，０００Ｄａの大きさの範囲であり得る。したがって、提供される使用および方法のためのヒアルロナン分解酵素として、ヒアルロナン二糖鎖またはポリマーの切断を触媒する能力を有する任意の酵素が挙げられる。いくつかの例では、ヒアルロナン分解酵素は、ヒアルロナン鎖またはポリマー中のβ−１→４グリコシド結合を切断する。その他の例では、ヒアルロナン分解酵素は、ヒアルロナン鎖またはポリマー中のβ−１→３グリコシド結合の切断を触媒する。
【０１８４】
したがって、ヒアルロニダーゼなどのヒアルロナン分解酵素は、細胞外マトリックスの必須成分であり、間質バリアの主要な成分であるヒアルロン酸を分解する酵素のファミリーである。ヒアルロナン分解酵素は、ヒアルロン酸、間質バリアの主要な成分の加水分解を触媒することによって、ヒアルロン酸の粘度を低下させ、それによって組織透過性を増大する。そのようなものとして、ヒアルロニダーゼなどのヒアルロナン分解酵素は、例えば、その他の薬剤、薬物およびタンパク質とともに、その分散およびデリバリーを増強するための展着剤または分散剤として使用されてきた。ヒアルロナン分解酵素はまた、皮下点滴療法（皮下流体投与）のためのその他の注射薬の吸収および分散を増大するためのアジュバントとして、また、放射不透過剤の吸収を改善するための皮下尿路造影における補助剤として使用される。ヒアルロナン分解酵素、例えば、ヒアルロニダーゼは、眼部手順、例えば、眼部手術に先立つ局所麻酔における眼球周囲およびテノン嚢下ブロックの適用において使用できる。ヒアルロニダーゼはまた、例えば、眼瞼形成術および頬部除皺術などの美容整形において無動を促進することによって、その他の治療的使用および化粧的使用において使用できる。
【０１８５】
ヒアルロニダーゼをはじめとするヒアルロナン分解酵素の種々の形態は、ヒトを含めた対象における治療的使用のために調製され、認可されている。提供された組成物および方法は、これらおよびその他の治療的使用によって、ヒアルロナン関連疾患および状態を治療するために使用できる。例えば、動物由来ヒアルロニダーゼ調製物として、Ｖｉｔｒａｓｅ（登録商標）（ＩＳＴＡ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、精製ヒツジ精巣ヒアルロニダーゼおよびＡｍｐｈａｄａｓｅ（登録商標）（Ａｍｐｈａｓｔａｒ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ウシ精巣ヒアルロニダーゼが挙げられる。Ｈｙｌｅｎｅｘ（登録商標）（Ｈａｌｏｚｙｍｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）は、可溶性ｒＨｕＰＨ２０をコードする核酸を含有する遺伝子操作されたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞によって産生されるヒト組換えヒアルロニダーゼである。
【０１８６】
本明細書において提供される組成物および方法では、ヒアルロナン分解酵素の例示的なものとして、可溶性ヒアルロニダーゼがある。その他の例示的ヒアルロナン分解酵素として、それだけには限らないが、特定のコンドロイチナーゼおよびヒアルロナンを切断する能力を有するリアーゼが挙げられる。
【０１８７】
以下に記載されるように、ヒアルロナン分解酵素は、膜結合型または可溶性型で存在する。本明細書における目的上、可溶性ヒアルロナン分解酵素は、本明細書における方法、使用、組成物または組合せにおける使用のために提供される。したがって、ヒアルロナン分解酵素が、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカーを含む、および／または別の方法で膜に固定されている、もしくは不溶性である場合には、ヒアルロナン分解酵素は、本明細書において不溶性型で提供される。したがって、ヒアルロナン分解酵素は、末端切断型変異体、例えば、ＧＰＩアンカーのすべてまたは一部を除去するよう末端切断されたものを含む。本明細書において提供される（ｐｒｏｖｉｄｅ）ヒアルロナン分解酵素はまた、可溶性ヒアルロナン分解酵素の対立遺伝子または種変異体またはその他の変異体を含む。例えば、ヒアルロナン分解酵素は、その一次配列中に、アミノ酸置換、付加および／または欠失などの１つまたは複数の変異を含有し得る。ヒアルロナン分解酵素の変異体は、通常、変異を含有しないヒアルロナン分解酵素と比較して少なくともまたは約６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を示す。本明細書における目的上、酵素が、変異を含有しないヒアルロナン分解酵素の活性の少なくともまたは約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれ以上などのヒアルロニダーゼ活性を保持する限り（当技術分野で公知であり、本明細書に記載されるｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｖｏアッセイによって測定される）、ヒアルロナン分解酵素中に任意の変異が含まれてもよい。
【０１８８】
本明細書において提供される方法および使用が、可溶性ヒアルロニダーゼの使用を記載する場合には、それに応じて、任意のヒアルロナン分解酵素、通常、可溶性ヒアルロナン分解酵素を使用できる。
【０１８９】
１．ヒアルロニダーゼ
ヒアルロニダーゼは、ヒアルロナン分解酵素の大きなファミリーのメンバーである。３つの一般的なクラスのヒアルロニダーゼ：哺乳類種ヒアルロニダーゼ、細菌ヒアルロニダーゼならびにヒル、その他の寄生生物および甲殻類に由来するヒアルロニダーゼがある。このような酵素は、提供される組成物、組合せおよび方法において使用できる。
【０１９０】
ａ．哺乳類種ヒアルロニダーゼ
哺乳類種ヒアルロニダーゼ（ＥＣ３．２．１．３５）は、ヒアルロナンのβ−１→４グリコシド結合を、四糖および六糖などの種々のオリゴ糖の長さに加水分解するエンド−β−Ｎ−アセチル−ヘキソサミニダーゼである。これらの酵素は、加水分解活性およびトランスグリコシダーゼ活性の両方を有し、ヒアルロナンおよびコンドロイチン硫酸（ＣＳ）、通常、Ｃ４−ＳおよびＣ６−Ｓを分解できる。この種のヒアルロニダーゼとして、それだけには限らないが、雌ウシ（ウシ）（配列番号１０、１１および６４およびＢＨ５５（米国特許第５，７４７，０２７号および同５，８２７，７２１号））、ヒツジ（ヒツジ（ｏｖｉｓ  ａｒｉｅｓ））（配列番号２６、２７、６３および６４）、イエロージャケットワスプ（ｙｅｌｌｏｗ  ｊａｃｋｅｔ  ｗａｓｐ）（配列番号１２および１３）、ミツバチ（配列番号１４）、ホワイト−フェースホーネット（ｗｈｉｔｅ−ｆａｃｅ  ｈｏｒｎｅｔ）（配列番号１５）、アシナガバチ（ｐａｐｅｒ  ｗａｓｐ）（配列番号１６）、マウス（配列番号１７〜１９、３１）、ブタ（配列番号２０〜２１）、ラット（配列番号２２〜２４、３０）、ウサギ（配列番号２５）、オランウータン（配列番号２８）、カニクイザル（配列番号２９）、モルモット（配列番号３２）由来のヒアルロニダーゼおよびヒトヒアルロニダーゼが挙げられる。本明細書において提供される組成物、組合せおよび方法におけるヒアルロニダーゼの例示的はものとして、可溶性ヒアルロニダーゼがある。
【０１９１】
哺乳類ヒアルロニダーゼは、主に精巣抽出物中に見られる中性で活性であるもの、および主に肝臓などの臓器で見られる酸性で活性なものにさらに細分できる。例示的な中性で活性なヒアルロニダーゼとして、それだけには限らないが、ヒツジ（配列番号２７）、ウシ（配列番号１１）およびヒト（配列番号１）などの種々の種に由来するＰＨ２０をはじめとするＰＨ２０が挙げられる。ヒトＰＨ２０（ＳＰＡＭ１または精子表面タンパク質ＰＨ２０としても知られる）は、通常、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカーを介して細胞膜と結合している。精子−卵子接着に天然に関与しており、ヒアルロン酸を消化することによって卵丘細胞の層の精子による浸透を補助する。
【０１９２】
ヒトＰＨ２０（ＳＰＡＭ１とも呼ばれる）に加えて、ヒトゲノムでは５種のヒアルロニダーゼ様遺伝子が同定されている、ＨＹＡＬ１、ＨＹＡＬ２、ＨＹＡＬ３、ＨＹＡＬ４およびＨＹＡＬＰ１。ＨＹＡＬＰ１は、偽遺伝子であり、ＨＹＡＬ３（配列番号３８）は、任意の既知基質に対する酵素活性を有するとはわかっていない。ＨＹＡＬ４（配列番号３９に示される前駆体ポリペプチド）は、コンドロイチナーゼであり、ヒアルロナンに対して活性をほとんど示さない。ＨＹＡＬ１（配列番号３６に示される前駆体ポリペプチド）は、原型的酸性活性な酵素であり、ＰＨ２０（配列番号１に示される前駆体ポリペプチド）は、原型的中性活性な酵素である。ＨＹＡＬ１およびＨＹＡＬ２（配列番号３７に示される前駆体ポリペプチド）などの酸性で活性なヒアルロニダーゼは、通常、中性ｐＨ（すなわち、ｐＨ７）で触媒活性を欠く。例えば、ＨＹＡＬ１は、ｐＨ４．５を上回ってｉｎ  ｖｉｔｒｏで触媒活性をほとんど有さない(Frost et al. (1997) Anal. Biochem. 251:263-269)。ＨＹＡＬ２は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで極めて低い比活性を有する酸性で活性な酵素である。ヒアルロニダーゼ様酵素はまた、通常、ヒトＨＹＡＬ２およびヒトＰＨ２０などのグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカーを介して細胞膜と結合しているもの(Danilkovitch-Miagkova, et al. (2003) Proc Natl Acad Sci USA 100(8):4580-5)、およびヒトＨＹＡＬ１などの通常、可溶性であるもの(Frost et al. (1997) Biochem Biophys Res Commun. 236(1):10-5)を特徴とし得る。
【０１９３】
ＰＨ２０
ＰＨ２０は、その他の哺乳類ヒアルロニダーゼと同様に、ヒアルロン酸のβ１→４グリコシド結合を、四糖および六糖などの種々のオリゴ糖の長さに加水分解するエンド−β−Ｎ−アセチル−ヘキソサミニダーゼである。それらは、加水分解活性およびトランスグリコシダーゼ活性の両方を有し、ヒアルロン酸ならびにＣ４−ＳおよびＣ６−Ｓなどのコンドロイチン硫酸を分解できる。ＰＨ２０は、精子−卵子接着に天然に関与しており、ヒアルロン酸を消化することによって卵丘細胞の層の精子による浸透を補助する。ＰＨ２０は、精子表面に、およびリソソーム由来先体中に位置し、ここで、先体内膜と結合している。細胞膜ＰＨ２０は、中性ｐＨでのみヒアルロニダーゼ活性を有するが、先体内膜ＰＨ２０は、中性および酸性ｐＨの両方で活性を有する。ＰＨ２０は、ヒアルロニダーゼであることに加え、ＨＡ誘導性細胞シグナル伝達の受容体および卵母細胞を囲む透明帯の受容体でもあると思われる。
【０１９４】
例示的ＰＨ２０タンパク質として、それだけには限らないが、ヒト（配列番号１に示される前駆体ポリペプチド、配列番号２に示される成熟ポリペプチド）、チンパンジー（配列番号１０１）、アカゲザル（配列番号１０２）ウシ（配列番号１１および６４）、ウサギ（配列番号２５）、ヒツジＰＨ２０（配列番号２７、６３および６５）、カニクイザル（配列番号２９）、モルモット（配列番号３２）、ラット（配列番号３０）およびマウス（配列番号３１）ＰＨ２０ポリペプチドが挙げられる。
【０１９５】
ウシＰＨ２０は、５５３個のアミノ酸の前駆体ポリペプチド（配列番号１１）である。ウシＰＨ２０の、ヒトＰＨ２０とのアラインメントは、ウシポリペプチド中にＧＰＩアンカーがないために、弱い相同性しか示さず、アミノ酸４７０からそれぞれのカルボキシ末端に複数のギャップが存在する（例えば、Frost GI (2007) Expert Opin. Drug. Deliv. 4: 427-440参照）。実際、ヒト以外の多数のその他のＰＨ２０種では明確なＧＰＩアンカーは、予測されない。したがって、ヒツジおよびウシから産生されるＰＨ２０ポリペプチドは、可溶性型として天然に存在する。ウシＰＨ２０は、細胞膜と極めて緩く結合して存在するが、ホスホリパーゼ感受性アンカーを介して固定されてない(Lalancette et al. (2001) Biol Reprod. 65(2):628-36)。ウシヒアルロニダーゼのこの独特の特徴によって、臨床使用のための抽出物としての可溶性ウシ精巣ヒアルロニダーゼ酵素の使用が可能となっている（Ｗｙｄａｓｅ（登録商標）、Ｈｙａｌａｓｅ（登録商標））。
【０１９６】
ヒトＰＨ２０ｍＲＮＡ転写物は、正常に翻訳されて、Ｎ末端（アミノ酸残基位置１〜３５）に３５個のアミノ酸のシグナル配列およびＣ末端（アミノ酸残基位置４９１〜５０９）に１９個のアミノ酸のグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカー付着シグナル配列を含有する、５０９個のアミノ酸の前駆体ポリペプチド（配列番号１）を生成する。したがって、成熟ＰＨ２０は、配列番号２に示される４７４個のアミノ酸ポリペプチドである。ＥＲへの前駆体ポリペプチドの輸送およびシグナルペプチドの除去後、Ｃ末端ＧＰＩ付着シグナルペプチドが切断されて、配列番号１に示される前駆体ポリペプチドの位置４９０に対応するアミノ酸位置に新規に形成されるＣ末端アミノ酸とのＧＰＩアンカーの共有結合が容易になる。したがって、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有する、４７４個のアミノ酸のＧＰＩで固定された成熟ポリペプチドが生じる。
【０１９７】
ヒトＰＨ２０は、中性および酸性ｐＨの両方でヒアルロニダーゼ活性を示す。一態様では、ヒトＰＨ２０は、通常、ＧＰＩアンカーを介して細胞膜に固定されている、原型的な中性で活性なヒアルロニダーゼである。別の態様では、ＰＨ２０は、先体内膜上に発現され、ここでは、中性および酸性ｐＨの両方でヒアルロニダーゼ活性を有する。ＰＨ２０は、ポリペプチドの別個の領域に２つの触媒部位：ペプチド１およびペプチド３領域を含むと思われる(Cherr et al. (2001) Matrix Biology 20:515-525)。証拠は、配列番号２に示される成熟ポリペプチドのアミノ酸位置１０７〜１３７および配列番号１に示される前駆体ポリペプチドの位置１４２〜１７２に対応するＰＨ２０のペプチド１領域が、中性ｐＨでの酵素活性にとって必要であるということを示唆する。この領域内の位置１１１および１１３のアミノ酸（配列番号２に示される成熟ＰＨ２０ポリペプチドに対応する）は、アミノ酸置換による突然変異誘発が、野生型ＰＨ２０と比較してそれぞれ、３％ヒアルロニダーゼ（ｈｙａｌｕｔｏｎｉｄａｓｅ）活性または検出できないヒアルロニダーゼ活性を有するＰＨ２０ポリペプチドをもたらすので、活性にとって重要であると思われる(Arming et al.、(1997) Eur. J. Biochem. 247:810-814)。
【０１９８】
配列番号２に示される成熟ポリペプチドのアミノ酸位置２４２〜２６２、および配列番号１に示される前駆体ポリペプチドの位置２７７〜２９７に対応するペプチド３領域は、酸性ｐＨでの酵素活性にとって重要であると思われる。この領域内で、成熟ＰＨ２０ポリペプチドの位置２４９および２５２のアミノ酸が、活性にとって必須であると思われ、いずれかの一方の突然変異誘発が、本質的に活性を欠いているポリペプチドをもたらす(Arming et al., (1997) Eur. J. Biochem. 247:810-814)。
【０１９９】
ＰＨ２０はまた、触媒部位に加え、ヒアルロナン結合部位を含む。実験的証拠により、この部位は、ペプチド２領域中に位置しており、配列番号１に示される前駆体ポリペプチドのアミノ酸位置２０５〜２３５および配列番号２に示される成熟ポリペプチドの位置１７０〜２００に対応するということが示唆される。この領域は、ヒアルロニダーゼ間で高度に保存されており、ヘパリン結合モチーフと類似している。位置１７６のアルギニン残基（配列番号２に示される成熟ＰＨ２０ポリペプチドに対応する）の、グリシンへの突然変異は、野生型ポリペプチドのヒアルロニダーゼ活性の約１％しか有さないポリペプチドをもたらす(Arming et al., (1997) Eur. J. Biochem. 247:810-814)。
【０２００】
配列番号１に示されるポリペプチドのＮ８２、Ｎ１６６、Ｎ２３５、Ｎ２５４、Ｎ３６８、Ｎ３９３、Ｎ４９０に、ヒトＰＨ２０中の７つの潜在的なＮ結合型グリコシル化部位がある。配列番号１のアミノ酸３６〜４６４は、最小に活性なヒトＰＨ２０ヒアルロニダーゼドメインを含むようであるので、Ｎ結合型グリコシル化部位Ｎ−４９０は、適切なヒアルロニダーゼ活性にとって必要ではない。ヒトＰＨ２０中には、６つのジスルフィド結合がある。配列番号１に示されるポリペプチドのシステイン残基Ｃ６０とＣ３５１間およびＣ２２４とＣ２３８間の２つのジスルフィド結合（それぞれ、配列番号２に示される成熟ポリペプチドの残基Ｃ２５とＣ３１６、およびＣ１８９とＣ２０３に対応する）。さらなる４つのジスルフィド結合が、配列番号１に示されるポリペプチドのシステイン残基Ｃ３７６とＣ３８７の間；Ｃ３８１とＣ４３５の間；Ｃ４３７とＣ４４３の間；およびＣ４５８とＣ４６４の間に形成される（それぞれ、配列番号２に示される成熟ポリペプチドの残基Ｃ３４１とＣ３５２；Ｃ３４６とＣ４００の間；Ｃ４０２とＣ４０８の間；およびＣ４２３とＣ４２９の間に対応する）。
【０２０１】
ｂ．細菌ヒアルロニダーゼ
細菌ヒアルロニダーゼ（ＥＣ４．２．２．１またはＥＣ４．２．９９．１）は、ヒアルロナンを種々の程度に、コンドロイチン硫酸およびデルマタン硫酸を分解する。細菌から単離されたヒアルロナンリアーゼは、その作用様式によってヒアルロニダーゼ（その他の供給源に由来する、例えば、ヒアルロノグルコサミニダーゼ、ＥＣ３．２．１．３５）とは異なる。それらは、ヒアルロナン中のＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミンとＤ−グルクロン酸残基間のβ１→４−グリコシド結合の加水分解ではなく、排出反応を触媒するエンド−β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼであり、３−（４−デオキシ−β−Ｄ−グルカ−４−エヌロノシル）−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン四糖および六糖、ならびに二糖最終産物を生じる。この反応は、その非還元末端に不飽和ヘキスロン酸残基を有するオリゴ糖の形成をもたらす。
【０２０２】
提供される組成物、組合せおよび方法において使用するための細菌由来の例示的ヒアルロニダーゼとして、それだけには限らないが、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、デロビブリオ（Ｂｄｅｌｌｏｖｉｂｒｉｏ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、ミクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ペプトコッカス（Ｐｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、プロピオニバクテリウム（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、バクテロイド（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）およびストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）の株をはじめとする微生物中のヒアルロナン分解酵素が挙げられる。このような酵素の特定の例として、それだけには限らないが、アルスロバクター種（ＦＢ２４株）（配列番号６７）、デロビブリオ・バクテリオボラス（Ｂｄｅｌｌｏｖｉｂｒｉｏ  ｂａｃｔｅｒｉｏｖｏｒｕｓ）（配列番号６８）、アクネ菌（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓ）（配列番号６９）、ストレプトコッカス・アガラクチエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）（（配列番号７０）；１８ＲＳ２１（配列番号７１）；血清型Ｉａ（配列番号７２）；血清型ＩＩＩ（配列番号７３）、黄色ブドウ球菌（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）（ＣＯＬ株（配列番号７４）；ＭＲＳＡ２５２株（配列番号７５および７６）；ＭＳＳＡ４７６株（配列番号７７）；ＮＣＴＣ８３２５株（配列番号７８）；ウシＲＦ１２２株（配列番号７９および８０）；ＵＳＡ３００株（配列番号８１）、肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（（配列番号８２）；ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−２５５／Ｒ６株（配列番号８３）；血清型２、Ｄ３９／ＮＣＴＣ７４６６株（配列番号８４）、化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（血清型Ｍ１）（配列番号８５）；血清型Ｍ２、ＭＧＡＳ１０２７０株（配列番号８６）；血清型Ｍ４、ＭＧＡＳ１０７５０株（配列番号８７）；血清型Ｍ６（配列番号８８）；血清型Ｍ１２、ＭＧＡＳ２０９６株（配列番号８９および９０）；血清型Ｍ１２、ＭＧＡＳ９４２９株（配列番号９１）；血清型Ｍ２８（配列番号９２）；ブタ連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓ）（配列番号：９３〜９５）；ビブリオ・フィシェリ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｆｉｓｃｈｅｒｉ）（ＡＴＣＣ  ７００６０１／ＥＳ１１４株（配列番号９６））、およびヒアルロン酸に特異的であり、コンドロイチンまたはコンドロイチン硫酸を切断しないストレプトマイセス・ヒアルロノリチクス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｈｙａｌｕｒｏｎｏｌｙｔｉｃｕｓ）ヒアルロニダーゼ酵素(Ohya, T. and Kaneko, Y. (1970) Biochim. Biophys. Acta 198:607)が挙げられる。
【０２０３】
ｃ．ヒル、その他の寄生生物および甲殻類に由来するヒアルロニダーゼ
ヒル、その他の寄生生物、および甲殻類由来のヒアルロニダーゼ（ＥＣ３．２．１．３６）は、四糖および六糖最終産物を生成するエンド−β−グルクロニダーゼである。これらの酵素は、ヒアルロネート中のβ−Ｄ−グルクロネートおよびＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン残基間の１→３結合の加水分解を触媒する。ヒル由来の例示的ヒアルロニダーゼとして、それだけには限らないが、ヒルド科（Ｈｉｒｕｄｉｎｉｄａｅ）（例えば、ヒルド・メディシナリス（Ｈｉｒｕｄｏ  ｍｅｄｉｃｉｎａｌｉｓ））、イシビル科（Ｅｒｐｏｂｄｅｌｌｉｄａｅ）（例えば、ネフェロプシス・オブスクラ（Ｎｅｐｈｅｌｏｐｓｉｓ  ｏｂｓｃｕｒａ）およびエルポデラ・プンクタタ（Ｅｒｐｏｂｄｅｌｌａ  ｐｕｎｃｔａｔａ））、グロシフォニ科（Ｇｌｏｓｓｉｐｈｏｎｉｉｄａｅ）（例えば、デセロデラ・ピクタ（Ｄｅｓｓｅｒｏｂｄｅｌｌａ  ｐｉｃｔａ）、ヘロデラ・スタグナリス（Ｈｅｌｏｂｄｅｌｌａ  ｓｔａｇｎａｌｉｓ）、グロシフォニア・コンプラナタ（Ｇｌｏｓｓｉｐｈｏｎｉａ  ｃｏｍｐｌａｎａｔａ）、プラコデラ・オルナタ（Ｐｌａｃｏｂｄｅｌｌａ  ｏｒｎａｔａ）およびテロミゾン（Ｔｈｅｒｏｍｙｚｏｎ）種）およびヘモビ科（Ｈａｅｍｏｐｉｄａｅ）（ヘモピス・マルモラタ（Ｈａｅｍｏｐｉｓ  ｍａｒｍｏｒａｔａ））(Hovingh et al. (1999) Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol. 124(3):319-26)由来のヒアルロニダーゼが挙げられる。ヒルヒアルロニダーゼと同一の作用機序を有する細菌由来の例示的ヒアルロニダーゼとして、シアノバクテリア、シネココッカス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）種（ＲＣＣ３０７株、配列番号９７）由来のものがある。
【０２０４】
２．その他のヒアルロナン分解酵素
提供される組成物、組合せおよび方法において、ヒアルロニダーゼファミリーに加えて、その他のヒアルロナン分解酵素を使用できる。例えば、ヒアルロナンを切断する能力を有する、特定のコンドロイチナーゼおよびリアーゼを含めた酵素を使用できる。ヒアルロナンを分解できる例示的コンドロイチナーゼとして、それだけには限らないが、コンドロイチンＡＢＣリアーゼ（コンドロイチナーゼＡＢＣとしても知られる）、コンドロイチンＡＣリアーゼ（コンドロイチン硫酸リアーゼまたはコンドロイチン硫酸エリミナーゼとしても知られる）およびコンドロイチンＣリアーゼが挙げられる。提供される組成物、組合せ、および方法において使用するためのこのような酵素の製造および精製方法は、当技術分野で公知である（例えば、米国特許第６，０５４，５６９号； Yamagata, et al. (1968) J. Biol. Chem. 243(7):1523-1535; Yang et al. (1985) J. Biol. Chem. 160(30):1849-1857）。
【０２０５】
コンドロイチンＡＢＣリアーゼは、２種の酵素、コンドロイチン硫酸−ＡＢＣエンドリアーゼ（ＥＣ４．２．２．２０）およびコンドロイチン硫酸−ＡＢＣエキソリアーゼ（ＥＣ４．２．２．２１）(Hamai et al. (1997) J Biol Chem. 272(14):9123-30)を含み、コンドロイチン硫酸型の、およびデルマタン硫酸型の種々のグリコサミノグリカンを分解する。コンドロイチン硫酸、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンおよびデルマタン硫酸が、コンドロイチン硫酸−ＡＢＣエンドリアーゼの好ましい基質であるが、この酵素はまた、少ない割合でヒアルロナンにも作用し得る。コンドロイチン硫酸−ＡＢＣエンドリアーゼは、コンドロイチン硫酸型およびデルマタン硫酸型の種々のグリコサミノグリカンを分解し、最終的にΔ４−不飽和四糖および二糖に分解される、種々の大きさのΔ４−不飽和オリゴ糖のの混合物を生成する。コンドロイチン硫酸−ＡＢＣエキソリアーゼは、同じ基質特異性を有するが、ポリマーのコンドロイチン硫酸およびコンドロイチン硫酸−ＡＢＣエンドリアーゼによって生じたそのオリゴ糖断片両方の非還元末端から二糖残基を除去する(Hamai, A. et al. (1997) J. Biol. Chem. 272:9123-9130)。例示的コンドロイチン硫酸−ＡＢＣエンドリアーゼおよびコンドロイチン硫酸−ＡＢＣエキソリアーゼとして、それだけには限らないが、プロテウス・ブルガリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）およびフラボバクテリウム・ヘパリナム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｈｅｐａｒｉｎｕｍ）に由来するものが挙げられる（プロテウス・ブルガリスコンドロイチン硫酸−ＡＢＣエンドリアーゼが、配列番号９８に示される(Sato et al. (1994) Appl. Microbiol. Biotechnol. 41(1):39-46)。
【０２０６】
コンドロイチンＡＣリアーゼ（ＥＣ４．２．２．５）は、コンドロイチン硫酸ＡおよびＣ、コンドロイチンおよびヒアルロン酸に対して活性であるが、デルマタン硫酸（コンドロイチン硫酸Ｂ）に対しては活性でない。細菌由来の例示的コンドロイチナーゼＡＣ酵素として、それだけには限らないが、それぞれ、配列番号９９および１００に示される、フラボバクテリウム・ヘパリナムおよびビクチバリス・バデンシス（Ｖｉｃｔｉｖａｌｌｉｓ  ｖａｄｅｎｓｉｓ）由来のもの、およびアルスロバクター・アウレッセンス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｕｒｅｓｃｅｎｓ）由来のものが挙げられる(Tkalec et al. (2000) Applied and Environmental Microbiology 66(1):29-35; Ernst et al. (1995) Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology 30(5):387-444)。
【０２０７】
コンドロイチナーゼＣは、コンドロイチン硫酸Ｃを切断して、四糖および不飽和６硫酸化二糖（デルタＤｉ−６Ｓ）を生成する。コンドロイチナーゼＣは、ヒアルロン酸も切断し、不飽和非硫酸化二糖（デルタＤｉ−ＯＳ）を生成する。細菌由来の例示的コンドロイチナーゼＣ酵素として、それだけには限らないが、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）およびフラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）に由来するものが挙げられる(Hibi et al. (1989) FEMS-Microbiol-Lett. 48(2):121-4; Michelacci et al. (1976) J. Biol. Chem. 251:1154-8; Tsuda et al. (1999) Eur. J. Biochem. 262:127-133)。
【０２０８】
３．可溶性ヒアルロナン分解酵素
本明細書における組成物、組合せ、使用および方法において提供されるものとして、修飾された可溶性ヒアルロニダーゼを含めた修飾された可溶性ヒアルロナン分解酵素がある。可溶性ヒアルロナン分解酵素として、それだけには限らないが、非ヒト動物可溶性ヒアルロニダーゼ、細菌可溶性ヒアルロニダーゼおよびヒトヒアルロニダーゼ、Ｈｙａｌ１、ウシＰＨ２０およびヒツジＰＨ２０、その対立遺伝子変異体およびそのその他の変異体をはじめとする非ヒト可溶性ヒアルロニダーゼを含めた可溶性ヒアルロニダーゼをはじめとする可溶性型で存在する任意のヒアルロナン分解酵素が挙げられる。例えば、可溶性ヒアルロナン分解酵素の中には、可溶性であるよう修飾されている任意のヒアルロナン分解酵素が含まれる。例えば、ＧＰＩアンカーを含むヒアルロナン分解酵素は、ＧＰＩアンカーのすべてまたは一部を末端切断することおよび除去することによって可溶性にできる。一例では、通常、ＧＰＩアンカーを介して膜に固定されているヒトヒアルロニダーゼＰＨ２０を、Ｃ末端のＧＰＩアンカーのすべてまたは一部を末端切断することおよび除去することによって可溶性にできる。
【０２０９】
可溶性ヒアルロナン分解酵素はまた、中性で活性なおよび酸性で活性なヒアルロニダーゼも含む。中性で活性なおよび酸性で活性なヒアルロニダーゼは、それだけには限らないが、投与後の酵素の活性の所望のレベルおよび／または投与部位などの因子に応じて選択することができる。特定の例では、本明細書における組成物、組合せおよび方法において使用するためのヒアルロナン分解酵素は、可溶性の中性で活性なヒアルロニダーゼである。
【０２１０】
可溶性ヒアルロニダーゼの例示的なものとして、ヒアルロニダーゼが可溶性であり、ヒアルロニダーゼ活性を保持する限り、配列番号１、２、１１、２５、２７、３０、３１、６３〜６５および１０１〜１０２のいずれかに示される任意のもの、またはＣ末端ＧＰＩアンカーのすべてもしくは一部を欠くその末端切断型など、任意の種に由来するＰＨ２０がある。また、可溶性ヒアルロニダーゼの中には、配列番号１、２、１１、２５、２７、３０  ３１、６３〜６５および１０１〜１０２のいずれか、またはその末端切断型の対立遺伝子変異体またはその他の変異体が含まれる。対立遺伝子変異体およびその他の変異体は、当業者に公知であり、配列番号１、２、１１、２５、２７、３０  ３１、６３〜６５および１０１〜１０２のいずれかと６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％またはそれ以上の配列同一性を有するポリペプチドまたはその末端切断型が挙げられる。アミノ酸変異体は、保存的および非保存的突然変異を含む。上記のいずれかまたは当業者に公知のものなどのヒアルロニダーゼの活性にとって重要であるか、そうではなく必要である残基は、通常、不変であるか、変更できないということは理解される。これらとして、例えば、活性部位残基が挙げられる。したがって、例えば、ヒトＰＨ２０ポリペプチド、またはその可溶性型のアミノ酸残基１１１、１１３および１７６（配列番号２に示される成熟ＰＨ２０ポリペプチド中の残基に対応する）は、通常、不変であるか変更されていない。適切なフォールディングにとって必要なグリコシル化およびジスルフィド結合の形成をもたらすその他の残基も、不変であり得る。
【０２１１】
いくつかの例では、可溶性ヒアルロナン分解酵素は、通常、ＧＰＩによって固定されており（例えば、ヒトＰＨ２０など）、Ｃ末端での末端切断によって可溶性にされる。このような末端切断は、ＧＰＩアンカー付着シグナル配列のすべてを除去してもよく、またはＧＰＩアンカー付着シグナル配列の一部のみを除去してもよい。しかし、得られたポリペプチドは可溶性である。可溶性ヒアルロナン分解酵素がＧＰＩアンカー付着シグナル配列の一部を保持する場合には、ポリペプチドが可溶性である限り、ＧＰＩアンカー付着シグナル配列中の１、２、３、４、５、６、７個またはそれ以上のアミノ酸残基が保持され得る。ＧＰＩアンカーの１個または複数のアミノ酸を含有するポリペプチドは、延長された可溶性ヒアルロナン分解酵素と呼ばれる。当業者ならば、当技術分野で周知の方法を使用して、ポリペプチドがＧＰＩによって固定されているかどうかを容易に決定できる。このような方法として、それだけには限らないが、ＧＰＩアンカー付着シグナル配列およびω部位の存在および位置を予測する既知アルゴリズムを使用することおよびホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼＣ（ＰＩ−ＰＬＣ）またはＤ（ＰＩ−ＰＬＤ）を用いて消化の前後に溶解度分析を実施することが挙げられる。
【０２１２】
延長された可溶性ヒアルロナン分解酵素は、得られるポリペプチドが、可溶性であり、ＧＰＩアンカー付着シグナル配列に由来する１個または複数のアミノ酸残基を含有するように、任意の天然にＧＰＩによって固定されたヒアルロナン分解酵素にＣ末端末端切断を行うことによって製造できる。Ｃ末端で末端切断されているが、ＧＰＩアンカー付着シグナル配列の一部を保持する、例示的な延長された可溶性ヒアルロナン分解酵素として、それだけには限らないが、例えば、ヒトおよびチンパンジーｅｓＰＨ２０ポリペプチドなどの、霊長類起源の延長された可溶性ＰＨ２０（ｅｓＰＨ２０）ポリペプチドが挙げられる。例えば、ｅｓＰＨ２０ポリペプチドは、配列番号１、２または１０１に示される成熟または前駆体ポリペプチドのいずれか、またはその対立遺伝子もしくはその活性な断片を含めたその他の変異体のＣ末端末端切断によって製造でき、得られるポリペプチドは、可溶性であり、ＧＰＩアンカー付着シグナル配列由来の１個または複数のアミノ酸残基を保持する。対立遺伝子変異体およびその他の変異体は、当業者に公知であり、配列番号１または２のいずれかと６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％またはそれ以上の配列同一性を有するポリペプチドを含む。本明細書において提供されるｅｓＰＨ２０ポリペプチドは、得られるｅｓＰＨ２０ポリペプチドが可溶性であり、ＧＰＩアンカー付着シグナル配列に由来する１個または複数のアミノ酸残基を保持する限り、配列番号１、２または１０１に示される配列を有するポリペプチドなどの野生型ポリペプチドと比較して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれ以上のアミノ酸がＣ末端で末端切断され得る。
【０２１３】
通常、本明細書における組成物、組合せおよび方法において使用するために、可溶性ヒトＰＨ２０などの可溶性ヒトヒアルロナン（ｈｙｌａｕｒｏｎａｎ）分解酵素が使用される。その他の動物由来のＰＨ２０などのヒアルロナン分解酵素を利用できるが、このような調製物は、それらが動物タンパク質であるので潜在的に免疫原性である。例えば、相当な割合の患者が、食物摂取に続発する事前感作を示し、これらが動物タンパク質であるので、すべての患者が後の感作の危険を有する。したがって、非ヒト調製物は、慢性使用には適したものでない場合がある。非ヒト調製物が望ましい場合には、このようなポリペプチドは、低減された免疫原性を有するよう調製できるということが本明細書において考慮される。このような修飾は、当業者のレベル内であり、例えば、分子上の１つまたは複数の抗原性エピトープの除去および／または置換を挙げることができる。
【０２１４】
本明細書における方法において使用されるヒアルロニダーゼ（例えば、ＰＨ２０）を含めたヒアルロナン分解酵素は、組換えによって製造できる、または天然供給源から、例えば、精巣抽出物などから精製または部分精製できる。組換えヒアルロナン分解酵素をはじめとする組換えタンパク質を製造する方法は、本明細書において別の場所で提供され、当技術分野で周知である。
【０２１５】
ａ．可溶性ヒトＰＨ２０
可溶性ヒアルロニダーゼの例示的なものとして、可溶性ヒトＰＨ２０がある。可溶性型の組換えヒトＰＨ２０が製造されており、本明細書に記載される組成物、組合せおよび方法において使用できる。このような可溶性型のＰＨ２０の製造は、米国公開特許出願番号ＵＳ２００４０２６８４２５；ＵＳ２００５０２６０１８６およびＵＳ２００６０１０４９６８に、および以下の実施例に記載されている。例えば、可溶性ＰＨ２０ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸の配列を含む、または配列番号１に含まれるアミノ酸の配列と少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５％、９７％、９８％の配列同一性を有するＣ末端で末端切断された変異体ポリペプチドを含み、ヒアルロニダーゼ活性を保持し、可溶性である。これらのポリペプチドの中には、ＧＰＩアンカー付着シグナル配列のすべてまたは一部を完全に欠く可溶性ＰＨ２０ポリペプチドが含まれる。また、ＧＰＩアンカーの少なくとも１個のアミノ酸を含有する延長された可溶性ＰＨ２０（ｅｓＰＨ２０）ポリペプチドも含まれる。したがって、これらのポリペプチドは、ＥＲにおいてタンパク質のＣ末端と共有結合しているＧＰＩアンカーを有し、細胞膜の細胞の外の単分子層に固定される代わりに、分泌され、可溶性である。Ｃ末端で末端切断されたＰＨ２０ポリペプチドは、配列番号１または２に示される配列またはその対立遺伝子または種変異体またはその他の変異体を有する全長野生型ポリペプチドなどの全長野生型ポリペプチドと比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５、６０個またはそれ以上のアミノ酸がＣ末端で末端切断され得る。
【０２１６】
本明細書において提供される例示的なＣ末端で末端切断されたヒトＰＨ２０ポリペプチドとして、配列番号１に示されるアミノ酸の配列の、アミノ酸１〜アミノ酸４６５、４６６、４６７、４６８、４６９、４７０、４７１、４７２、４７３、４７４、４７５、４７６、４７７、４７８、４７９、４８０、４８１、４８２、４８３、４８４、４８５、４８６、４８７、４８８、４８９、４９０、４９１、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９７の配列、またはその対立遺伝子または種変異体中の対応する位置を含有するポリペプチドを生じるようなＣ末端末端切断を有するいずれかのものが挙げられる。哺乳類細胞において発現される場合には、プロセシングの間に、３５個のアミノ酸のＮ末端シグナル配列が切断され、成熟型のタンパク質が分泌される。したがって、例示的な成熟したＣ末端で末端切断された可溶性ＰＨ２０ポリペプチドは、配列番号１に示されるアミノ酸の配列のアミノ酸３６〜４６５、４６６、４６７、４６８、４６９、４７０、４７１、４７２、４７３、４７４、４７５、４７６、４７７、４７８、４７９、４８０、４８１、４８２、４８３、４８４、４８５、４８６、４８７、４８８、４８９、４９０、４９１、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９７またはその対立遺伝子または種変異体中の対応する位置を含有し得る。表２は、Ｃ末端で末端切断された可溶性ＰＨ２０ポリペプチドを含めた例示的なＣ末端で末端切断されたＰＨ２０ポリペプチドの限定されない例を提供する。以下の表２では、、前駆体および成熟ポリペプチドの長さ（アミノ酸での）、ならびにＣ末端で末端切断されたＰＨ２０タンパク質の前駆体および成熟ポリペプチドの例示的アミノ酸配列が示される配列識別子（配列番号）が提供される。野生型ＰＨ２０ポリペプチドもまた、比較のために表２に含まれる。
表２．例示的なＣ末端で末端切断されたＰＨ２０ポリペプチド
【０２１７】
【表２】
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【０２１８】
可溶性型として、それだけには限らないが、配列番号１に示されるアミノ酸配列のアミノ酸１〜アミノ酸４６７、４７７、４７８、４７９、４８０、４８１、４８２および４８３を含有するポリペプチドを生じるようなＣ末端末端切断を有するいずれかのものが挙げられる。哺乳類細胞において発現される場合には、プロセシングの間に、３５個のアミノ酸のＮ末端シグナル配列が切断され、成熟型のタンパク質が分泌される。したがって、成熟した可溶性ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸３６〜４６７、４７７、４７８、４７９、４８０、４８１、４８２および４８３を含有する。アミノ酸位置４７７〜４８３で終わる（配列番号１に示される前駆体ポリペプチドに対応する）欠失突然変異体は、全長のＧＰＩによって固定される型よりも高い分泌型のヒアルロニダーゼ活性を示す。したがって、配列番号４〜９のいずれかに示されるもの、またはその対立遺伝子または種変異体またはその他の変異体などの、４４２、４４３、４４４、４４５、４４６または４４７個のアミノ酸長である可溶性ヒアルロニダーゼ可溶性ヒトＰＨ２０ポリペプチドの例示的なもの。
【０２１９】
グリコシル化が、ヒアルロニダーゼの触媒活性および安定性にとって重要であるので、可溶性型のＰＨ２０は、通常、ポリペプチドが活性を確実に保持するための正しいＮ−グリコシル化を促進するタンパク質発現系を使用して製造される。このような細胞として、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（例えば、ＤＧ４４  ＣＨＯ細胞）が挙げられる。
【０２２０】
ｂ．ｒＨｕＰＨ２０
組換え可溶性型ヒトＰＨ２０が作製されており、本明細書において提供される組成物、組合せおよび方法において使用できる。組換えヒトＰＨ２０のこのような可溶性型の作製は、米国公開特許出願番号ＵＳ２００４０２６８４２５；ＵＳ２００５０２６０１８６およびＵＳ２００６０１０４９６８に、および以下の実施例２〜６に記載されている。このようなポリペプチドの例示的なものとして、アミノ酸１〜４８２（配列番号３に示される）をコードする核酸分子から作製したものがある。このような例示的核酸分子は、配列番号４９に示されている。翻訳後プロセシングによって、３５個のアミノ酸のシグナル配列が除去され、４４７個のアミノ酸の可溶性組換えヒトＰＨ２０（配列番号４）が残る。培養培地中で産生されるので、Ｃ末端に不均一性があり、その結果、指定されたｒＨｕＰＨ２０は、配列番号４〜９のうち任意の１種または複数を種々の存在量で含み得る種の混合物を含む。通常、ｒＨｕＰＨ２０は、活性を保持するよう正しいＮ−グリコシル化を促進する、ＣＨＯ細胞などの（例えば、ＤＧ４４  ＣＨＯ細胞）細胞において産生される。
【０２２１】
４．ヒアルロナン分解酵素のグリコシル化
ヒアルロニダーゼを含めたいくつかのヒアルロナン分解酵素のＮ結合型およびＯ結合型グリコシル化を含めたグリコシル化は、その触媒活性および安定性にとって重要であり得る。糖タンパク質を修飾するグリカンの種類を変更することは、タンパク質の抗原性、構造的フォールディング、溶解度および安定性に劇的な影響を有し得るが、ほとんどの酵素は、最適酵素活性にグリコシル化必要とすると考えられていない。一部のヒアルロニダーゼについて、Ｎ結合型グリコシル化の除去が、ヒアルロニダーゼ活性のほぼ完全な不活性化をもたらし得る。したがって、このようなヒアルロニダーゼについては、Ｎ結合型グリカンの存在が活性な酵素の作製にとって不可欠である。
【０２２２】
Ｎ結合型オリゴ糖は、いくつかの主要な種類（オリゴマンノース、複合体、ハイブリッド、硫酸化）に分類され、そのすべてが、−Ａｓｎ−Ｘａａ−Ｔｈｒ／Ｓｅｒ−配列内に含まれる（ここで、ＸａａはＰｒｏではない）Ａｓｎ残基のアミド窒素を介して結合している（Ｍａｎ）３−ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＮＡｃ−コアを有する。−Ａｓｎ−Ｘａａ−Ｃｙｓ−部位でのグリコシル化が、血液凝固タンパク質Ｃについて報告されている。いくつかの例では、ヒアルロニダーゼなどのヒアルロナン分解酵素は、Ｎ−グリコシド結合およびＯ−グリコシド結合の両方を含有し得る。例えば、ＰＨ２０は、Ｏ結合型オリゴ糖ならびＮ結合型オリゴ糖を有する。配列番号１に例示されるヒトＰＨ２０のＮ８２、Ｎ１６６、Ｎ２３５、Ｎ２５４、Ｎ３６８、Ｎ３９３、Ｎ４９０に、７つの潜在的Ｎ結合型グリコシル化部位がある。上記のように、Ｎ４９０でのＮ結合型グリコシル化は、ヒアルロニダーゼ活性にとって必要ではない。
【０２２３】
いくつかの例では、提供される組成物、組合せおよび／または方法において使用するためのヒアルロナン分解酵素は、グリコシル化部位のうちの１つまたはすべてでグリコシル化されている。例えば、ヒトＰＨ２０またはその可溶性型については、配列番号１のアミノ酸Ｎ８２、Ｎ１６６、Ｎ２３５、Ｎ２５４、Ｎ３６８およびＮ３９３に相当するＮ−グリコシル化部位のうちの２、３、４、５または６つがグリコシル化されている。いくつかの例では、ヒアルロナン分解酵素は、１つまたは複数の天然のグリコシル化部位でグリコシル化されている。その他の例では、ヒアルロナン分解酵素は、１つまたは複数のさらなる部位でのポリペプチドのグリコシル化を付与するよう１つまたは複数の非天然グリコシル化部位で修飾される。このような例では、さらなる糖部分の結合は、半減期の改善および／または活性の改善など、分子の薬物動態特性を増強し得る。
【０２２４】
その他の例では、本明細書において提供される組成物、組合せおよび／または方法において使用するためのヒアルロナン分解酵素は、部分的に脱グリコシル化されている（またはＮ−部分的グリコシル化ポリペプチド）。例えば、完全グリコシル化ヒアルロニダーゼのヒアルロニダーゼ活性のすべてはまた一部を保持する部分的に脱グリコシル化された可溶性ＰＨ２０ポリペプチドを、本明細書において提供される組成物、組合せおよび／または方法において使用できる。例示的部分脱グリコシル化ヒアルロニダーゼ（ｈｙａｌｕｒｏｄｉｎａｓｅｓ）として、配列番号１、２、１１、２５、２７、２９、３０、３１、３２、６３、６５、１０１および１０２のいずれかに示されるいずれかなど、任意の種に由来する部分脱グリコシル化ＰＨ２０ポリペプチドまたはその対立遺伝子変異体、末端切断変異体またはその他の変異体の可溶性型が挙げられる。このような変異体は、当業者に公知であり、これとして、配列番号１、２、１１、２５、２７、２９、３０、３１、３２、６３、６５、１０１および１０２のいずれかと６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％またはそれ以上の配列同一性を有するポリペプチドまたはその末端切断型が挙げられる。本明細書において提供される部分脱グリコシル化ヒアルロニダーゼはまた、ハイブリッド、融合およびキメラ部分脱グリコシル化ヒアルロニダーゼ、ならびに部分脱グリコシル化ヒアルロニダーゼコンジュゲートを含む。
【０２２５】
グリコシダーゼまたはグリコシドヒドロラーゼは、グリコシド結合の加水分解を触媒して２つの小さな糖を生成する酵素である。脊椎動物におけるＮ−グリカンの主要な種類として、高マンノースグリカン、ハイブリッドグリカンおよび複合グリカンが挙げられる。高マンノースおよびハイブリッド型グリカンを切断するＥｎｄｏＦ１；二分岐複合体型グリカンを切断するＥｎｄｏＦ２；二分岐およびより分岐した複合グリカンを切断するＥｎｄｏＦ３；および高マンノースおよびハイブリッド型グリカンを切断するＥｎｄｏＨをはじめ、部分タンパク質脱グリコシル化しかもたらさないいくつかのグリコシダーゼがある。可溶性ＰＨ２０などの可溶性ヒアルロニダーゼなどのヒアルロナン分解酵素の、これらのグリコシダーゼの１種またはすべてでの処理は、部分脱グリコシル化のみもたらし、従って、ヒアルロニダーゼ活性の保持をもたらし得る。
【０２２６】
部分脱グリコシル化可溶性ヒアルロニダーゼなど、部分脱グリコシル化ヒアルロナン分解酵素は、１種または複数のグリコシダーゼ、通常、すべてのＮ−グリカンを除去せずに、タンパク質を部分的に脱グリコシル化するだけであるグリコシダーゼでの消化によって製造できる。例えば、ＰＨ２０（例えば、組換えＰＨ２０である指定されたｒＨｕＰＨ２０）の、上記のグリコシダーゼの１種またはすべて（例えば、ＥｎｄｏＦ１、ＥｎｄｏＦ２および／またはＥｎｄｏＦ３）での処理は、部分脱グリコシル化をもたらす。これらの部分脱グリコシル化ＰＨ２０ポリペプチドは、完全グリコシル化ポリペプチドに匹敵するヒアルロニダーゼ酵素活性を示し得る。対照的に、ＰＨ２０の、ＰＮＧａｓｅＦというすべてのＮ−グリカンを切断するグリコシダーゼでの処理は、すべてのＮ−グリカンの完全除去をもたらし、それによって、ＰＨ２０を酵素的不活性にする。したがって、すべてのＮ結合型グリコシル化部位（例えば、配列番号１に例示されるヒトＰＨ２０のアミノ酸Ｎ８２、Ｎ１６６、Ｎ２３５、Ｎ２５４、Ｎ３６８およびＮ３９３のものなど）がグリコシル化され得るが、１種または複数のグリコシダーゼでの処理は、１種または複数のグリコシダーゼで消化されていないヒアルロニダーゼと比較してグリコシル化度を低減させ得る。
【０２２７】
部分脱グリコシル化された可溶性ＰＨ２０ポリペプチドをはじめとする部分脱グリコシル化ヒアルロナン分解酵素は、完全グリコシル化ポリペプチドのグリコシル化のレベルの１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％または８０％を有し得る。一般に、部分脱グリコシル化可溶性ＰＨ２０ポリペプチドをはじめとする部分脱グリコシル化ヒアルロナン分解酵素は、完全グリコシル化ポリペプチドによって示されるヒアルロニダーゼ活性の１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、２００％、３００％、４００％、５００％、１０００％またはそれ以上であるヒアルロニダーゼ活性を示す。
【０２２８】
５．修飾された（ポリマーがコンジュゲートした）ヒアルロナン分解酵素
一例では、提供される組成物および組合せは、通常、対象においてヒアルロナン分解酵素の半減期を増大するよう、例えば、延長された／持続された治療効果を促進するよう１個または複数ポリマー分子（ポリマー）とのコンジュゲーションによって修飾されている、ヒアルロナン分解酵素、特に、可溶性ヒアルロニダーゼを含有する。
【０２２９】
ポリエチレングリコール（ペグ化部分（ＰＥＧ））などのポリマー分子の、ヒアルロニダーゼなどのヒアルロナン分解酵素との共有結合またはその他の安定な結合（コンジュゲーション）は、得られるヒアルロナン分解酵素−ポリマー組成物に有益な特性を付与する。このような特性として、生体適合性の改善、血液、細胞における、および／または、対象内のその他の組織におけるタンパク質（および酵素活性）半減期の延長、プロテアーゼおよび加水分解からのタンパク質の有効な遮断、体内分布の改善、薬物動態および／または薬動力学の増強、ならびに水溶性の増大が挙げられる。
【０２３０】
ヒアルロニダーゼなどのヒアルロナン分解酵素にコンジュゲートされ得る例示的ポリマーとして、天然および合成ホモポリマー、例えば、ポリオール（すなわち、ポリ−ＯＨ）、ポリアミン（すなわち、ポリ−ＮＨ２）およびポリカルボン酸（すなわち、ポリ−ＣＯＯＨ）、ならびにさらなるヘテロポリマー、すなわち、１種または複数の異なるカップリング基、例えば、ヒドロキシル基およびアミン基を含むポリマーが挙げられる。適したポリマー分子の例として、ポリプロピレングリコール（ＰＥＧ）、メトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）およびポリプロピレングリコールをはじめとするポリアルキレングリコール（ＰＡＧ）などのポリアルキレンオキシド（ＰＡＯ）、ＰＥＧ−グリシジルエーテル（Ｅｐｏｘ−ＰＥＧ）、ＰＥＧ−オキシカルボニルイミダゾール（ＣＤＩ−ＰＥＧ）分岐ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリカルボキシレート、ポリビニルピロリドン、ポリ−Ｄ，Ｌ−アミノ酸、ポリエチレン−コ−マレイン酸無水物、ポリスチレン−コ−マレイン酸無水物、カルボキシメチル−デキストランをはじめとするデキストラン、ヘパリン、相同アルブミン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシエチルセルロースおよびヒドロキシプロピルセルロースをはじめとするセルロース、キトサンの加水分解産物、ヒドロキシエチルデンプンおよびヒドロキシプロピルデンプンなどのデンプン、グリコーゲン、アガロースおよびその誘導体、グアーガム、プルラン、イヌリン、キサンタンガム、カラギーナン、ペクチン、アルギン酸加水分解産物およびバイオポリマーの中から選択されるポリマー分子が挙げられる。
【０２３１】
通常、ポリマーは、デキストランおよびプルランなどの多糖と比較して、架橋できる反応性基をほとんど有さない、ＰＥＧ、通常、ｍＰＥＧなどのポリエチレンオキシドなどのポリアルキレンオキシド（ＰＡＯ）である。通常、ポリマーは、比較的簡単な化学を使用して、ヒアルロニダーゼなどのヒアルロナン分解酵素に（例えば、タンパク質表面上の結合基に）共有結合によってコンジュゲートできる、（ｍ）ポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）などの非毒性ポリマー分子である。
【０２３２】
治療薬のペグ化は、タンパク質分解に対する抵抗性を増大し、血漿半減期を増大し、抗原性および免疫原性を低減させると報告されている。ペグ化法の例は、当技術分野で公知である(例えば、Lu and Felix, Int. J. Peptide Protein Res., 43: 127-138, 1994; Lu and Felix, Peptide Res., 6: 142-6, 1993; Felix et al., Int. J. Peptide Res., 46 : 253-64, 1995; Benhar et al., J. Biol. Chem., 269: 13398-404, 1994; Brumeanu et al., J Immunol., 154: 3088-95, 1995参照; Caliceti et al. (2003) Adv. Drug Deliv. Rev. 55(10):1261-77およびMolineux (2003) Pharmacotherapy 23 (8 Pt 2):3S-8Sも参照）。ペグ化はまた、ｉｎ  ｖｉｖｏで核酸分子のデリバリーにおいて使用できる。例えば、アデノウイルスのペグ化は、安定性および遺伝子導入を増大し得る(例えば、Cheng et al. (2003) Pharm. Res. 20(9): 1444-51参照）。
【０２３３】
ヒアルロニダーゼをはじめとするヒアルロナン分解酵素との結合のための適したポリマー分子として、それだけには限らないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびメトキシ−ポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）、ＰＥＧ−グリシジルエーテル（Ｅｐｏｘ−ＰＥＧ）、ＰＥＧ−オキシカルボニルイミダゾール（ＣＤＩ−ＰＥＧ）、分岐ＰＥＧおよびポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）などのＰＥＧ誘導体が挙げられる（例えば Roberts et al., Advanced Drug Delivery Review 2002, 54: 459-476; Harris and Zalipsky, S (eds.) "Poly(ethylene Glycol), Chemistry and Biological Applications" ACS Symposium Series 680, 1997; Mehvar et al., J. Pharm. Pharmaceut. Sci., 3(1):125-136, 2000; Harris, Nature Reviews 2:215 et seq. (2003);およびTsubery, J Biol. Chem 279(37):38118-24, 2004参照）。ポリマー分子は、通常、約３ｋＤａ〜約６０ｋＤａの範囲の分子量のものであり得る。いくつかの実施形態では、ｒＨｕＰＨ２０などのタンパク質にコンジュゲートされるポリマー分子は、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０または６０ｋＤａを超える分子量を有する。
【０２３４】
ａ．ＰＥＧ化可溶性ヒアルロナン分解酵素
本明細書における方法、組成物および組合せにおいて使用されるヒアルロナン分解酵素は、ＰＥＧ化可溶性ヒアルロナン分解酵素などのＰＥＧ化ヒアルロナン分解酵素であり得る。一例では、ＰＥＧ化可溶性ヒアルロニダーゼ、例えば、ＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０である。ＰＥＧまたはＰＥＧ誘導体を共有結合すること（コンジュゲートすること）によってポリペプチドを修飾する（すなわち「ペグ化」）種々の方法は、当技術分野で公知である（例えば、Ｕ．Ｓ．２００６／０１０４９６８；Ｕ．Ｓ．５，６７２，６６２；Ｕ．Ｓ．６，７３７，５０５；およびＵ．Ｓ．２００４／０２３５７３４参照）。ペグ化のための技術として、それだけには限らないが、特殊化されたリンカーおよびカップリング化学（例えば、Harris, Adv. Drug Deliv. Rev. 54:459-476, 2002参照）、単一コンジュゲーション部位との複数のＰＥＧ部分の結合（分岐ＰＥＧの使用などによる；例えば、Veronese et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 12:177-180, 2002参照）、部位特異的ペグ化および／またはモノペグ化（例えば、Chapman et al., Nature Biotech. 17:780-783, 1999参照）および部位特異的酵素的ペグ化（例えば、Sato, Adv. Drug Deliv. Rev., 54:487-504, 2002参照）が挙げられる。当技術分野で記載される方法および技術は、単一タンパク質分子に結合される、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１０を超えるＰＥＧまたはＰＥＧ誘導体を有するタンパク質を製造できる（例えば、Ｕ．Ｓ．２００６／０１０４９６８参照）。
【０２３５】
当技術分野では、ペグ化のための多数の試薬が記載されている。このような試薬として、それだけには限らないが、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル（ＮＨＳ）活性化ＰＥＧ、スクシンイミジルｍＰＥＧ、ｍＰＥＧ２−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、ｍＰＥＧスクシンイミジルα−メチルブタノエート、ｍＰＥＧスクシンイミジルプロピオネート、ｍＰＥＧスクシンイミジルブタノエート、ｍＰＥＧカルボキシメチル３−ヒドロキシブタン酸スクシンイミジルエステル、ホモ二官能性ＰＥＧ−スクシンイミジルプロピオネート、ホモ二官能性ＰＥＧプロピオンアルデヒド、ホモ二官能性ＰＥＧブチルアルデヒド、ＰＥＧマレイミド、ＰＥＧヒドラジン、ｐ−ニトロフェニル−カルボネートＰＥＧ、ｍＰＥＧ−ベンゾトリアゾールカルボネート、プロピオンアルデヒドＰＥＧ、ｍＰＥＧブトリアルデヒド（ｂｕｔｒｙａｌｄｅｈｙｄｅ）、分岐ｍＰＥＧ２ブチルアルデヒド、ｍＰＥＧアセチル、ｍＰＥＧピペリドン、ｍＰＥＧメチルケトン、ｍＰＥＧ「リンカーなし」マレイミド、ｍＰＥＧビニルスルホン、ｍＰＥＧチオール、ｍＰＥＧオルトピリジルチオエステル、ｍＰＥＧオルトピリジル  ジスルフィド、Ｆｍｏｃ−ＰＥＧ−ＮＨＳ、Ｂｏｃ−ＰＥＧ−ＮＨＳ、ビニルスルホンＰＥＧ−ＮＨＳ、アクリレートＰＥＧ−ＮＨＳ、フルオレセインＰＥＧ−ＮＨＳおよびビオチンＰＥＧ−ＮＨＳが挙げられる（例えば、Monfardini et al., Bioconjugate Chem. 6:62-69、1995; Veronese et al., J. Bioactive Compatible Polumers 12:197-207、1997; Ｕ．Ｓ．５，６７２，６６２；Ｕ．Ｓ．５，９３２，４６２；Ｕ．Ｓ．６，４９５，６５９；Ｕ．Ｓ．６，７３７，５０５；Ｕ．Ｓ．４，００２，５３１；Ｕ．Ｓ．４，１７９，３３７；Ｕ．Ｓ．５，１２２，６１４；Ｕ．Ｓ．５，１８３，５５０；Ｕ．Ｓ．５，３２４，８４４；Ｕ．Ｓ．５，４４６，０９０；Ｕ．Ｓ．５，６１２，４６０；Ｕ．Ｓ．５，６４３，５７５；Ｕ．Ｓ．５，７６６，５８１；Ｕ．Ｓ．５，７９５，５６９；Ｕ．Ｓ．５，８０８，０９６；Ｕ．Ｓ．５，９００，４６１；Ｕ．Ｓ．５，９１９，４５５；Ｕ．Ｓ．５，９８５，２６３；Ｕ．Ｓ．５，９９０，２３７；Ｕ．Ｓ．６，１１３，９０６；Ｕ．Ｓ．６，２１４，９６６；Ｕ．Ｓ．６，２５８，３５１；Ｕ．Ｓ．６，３４０，７４２；Ｕ．Ｓ．６，４１３，５０７；Ｕ．Ｓ．６，４２０，３３９；Ｕ．Ｓ．６，４３７，０２５；Ｕ．Ｓ．６，４４８，３６９；Ｕ．Ｓ．６，４６１，８０２；Ｕ．Ｓ．６，８２８，４０１；Ｕ．Ｓ．６，８５８，７３６；Ｕ．Ｓ．２００１／００２１７６３；Ｕ．Ｓ．２００１／００４４５２６；Ｕ．Ｓ．２００１／００４６４８１；Ｕ．Ｓ．２００２／００５２４３０；Ｕ．Ｓ．２００２／００７２５７３；Ｕ．Ｓ．２００２／０１５６０４７；Ｕ．Ｓ．２００３／０１１４６４７；Ｕ．Ｓ．２００３／０１４３５９６；Ｕ．Ｓ．２００３／０１５８３３３；Ｕ．Ｓ．２００３／０２２０４４７；Ｕ．Ｓ．２００４／００１３６３７；ＵＳ２００４／０２３５７３４；Ｕ．Ｓ．２００５／０００３６０；Ｕ．Ｓ．２００５／０１１４０３７；Ｕ．Ｓ．２００５／０１７１３２８；Ｕ．Ｓ．２００５／０２０９４１６；ＥＰ０１０６４９５１；ＥＰ０８２２１９９；ＷＯ００１７６６４０；ＷＯ０００２０１７；Ｗ��０２４９６７３；ＷＯ９４２８０２４；およびＷＯ０１８７９２５参照）。
【０２３６】
Ｄ．ヒアルロナン分解酵素をコードする核酸およびそのポリペプチドを製造する方法
本明細書に示される可溶性ヒアルロニダーゼなどのヒアルロナン分解酵素のポリペプチドは、タンパク質精製および組換えタンパク質発現のための当技術分野で周知の方法によって得ることができる。所望の遺伝子をコードする核酸の同定のための当業者に公知の任意の方法を使用できる。当技術分野で利用可能な任意の方法を使用して、細胞または組織供給源などから、ヒアルロニダーゼをコードする、全長（すなわち、全コード領域を包含する）ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡクローンを得ることができる。修飾された、または変異体の可溶性ヒアルロニダーゼは、位置特異的突然変異誘発などによって、野生型ポリペプチドから操作することができる。
【０２３７】
ポリペプチドは、核酸分子をクローニングおよび単離するための当技術分野で公知の任意の利用可能な方法を使用してクローニングまたは単離できる。このような方法として、核酸のＰＣＲ増幅ならびに核酸ハイブリダイゼーションスクリーニング、抗体ベースのスクリーニングおよび活性ベースのスクリーニングをはじめとするライブラリーのスクリーニングが挙げられる。
【０２３８】
例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法をはじめとする核酸を増幅する方法を使用して、所望のポリペプチドをコードする核酸分子を単離できる。核酸を含有する物質を、所望のポリペプチドをコードする核酸分子が単離され得る出発物質として使用してもよい。増幅方法では、例えば、ＤＮＡおよびｍＲＮＡ調製物、細胞抽出物、組織抽出物、流体サンプル（例えば、血液、血清、唾液）、健常および／または病気の対象由来のサンプルを使用できる。核酸ライブラリーはまた、出発物質の供給源としても使用できる。プライマーは、所望のポリペプチドを増幅するよう設計できる。例えば、プライマーは、所望のポリペプチドが生成する発現される配列に基づいて設計できる。プライマーは、ポリペプチドアミノ酸配列の逆翻訳に基づいて設計できる。増幅によって生じた核酸分子を配列決定し、所望のポリペプチドをコードすると確認することができる。
【０２３９】
合成遺伝子をベクター、例えば、タンパク質発現ベクターまたはコアタンパク質コーディングＤＮＡ配列の増幅のために設計されたベクターにクローニングすることを目的として、ポリペプチドをコードする核酸分子に、制限エンドヌクレアーゼ部位を含有するリンカー配列をはじめとするさらなる核酸配列を結合してもよい。さらに、機能的ＤＮＡエレメントを規定するさらなる核酸配列を、ポリペプチドをコードする核酸分子と作用可能に連結してもよい。このような配列の例として、それだけには限らないが、細胞内タンパク質発現を促進するよう設計されたプロモーター配列、およびタンパク質分泌を促進するよう設計された分泌配列、例えば、異種シグナル配列が挙げられる。このような配列は、当業者には公知である。タンパク質結合領域を規定する塩基の配列などのさらなるヌクレオチド残基配列も、酵素をコードする核酸分子に連結してもよい。このような領域として、それだけには限らないが、酵素の特定の標的細胞への取り込みを促進する、あるいは、合成遺伝子の生成物の薬物動態を変更するタンパク質を促進またはコードする残基の配列が挙げられる。例えば、酵素をＰＥＧ部分に連結してもよい。
【０２４０】
例えば、ポリペプチドの検出またはアフィニティー精製において役立つよう、さらに、タグまたはその他の部分を加えてもよい。例えば、エピトープタグまたはその他の検出可能なマーカーを規定する塩基の配列などのさらなるヌクレオチド残基配列も、酵素をコードする核酸分子に連結できる。このような配列の例示的なものとして、Ｈｉｓタグ（例えば、６ｘＨｉｓ、ＨＨＨＨＨＨ；配列番号５４）またはＦｌａｇタグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ；配列番号５５）をコードする核酸配列が挙げられる。
【０２４１】
次いで、同定および単離された核酸を、適当なクローニングベクターに挿入できる。当技術分野で公知の多数のベクター−宿主系を使用できる。可能性のあるベクターとして、それだけには限らないが、プラスミドまたは修飾されたウイルスが挙げられるが、ベクター系は、使用される宿主細胞と適合しなければならない。このようなベクターとして、それだけには限らないが、λ誘導体などのバクテリオファージまたはｐＣＭＶ４、ｐＢＲ３２２もしくはｐＵＣプラスミド誘導体などのプラスミドまたはＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，  Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，  ＣＡ）が挙げられる。その他の発現ベクターとして、本明細書に例示されるＨＺ２４発現ベクターが挙げられる。クローニングベクターへの挿入は、例えば、ＤＮＡ断片を、相補的な付着末端を有するクローニングベクター中にライゲーションすることによって達成できる。挿入は、ＴＯＰＯクローニングベクター（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）を使用して達成できる。ＤＮＡを断片化するために使用された相補的制限部位が、クローニングベクター中に存在しない場合には、ＤＮＡ分子の末端を酵素的に修飾できる。あるいは、ＤＮＡ末端にヌクレオチド  （リンカー）配列をライゲーションすることによって望まれる任意の部位を製造してもよく；これらのライゲーションされるリンカーは、制限エンドヌクレアーゼ認識配列をコードする特定の化学合成されたオリゴヌクレオチドを含有し得る。代替法では、切断されたベクターおよびタンパク質遺伝子を、ホモポリマーテーリングによって修飾できる。組換え分子は、例えば、形質転換、トランスフェクション、感染、エレクトロポレーションおよびソノポレーションによって宿主細胞に導入でき、その結果、遺伝子配列の多数のコピーが作製される。
【０２４２】
特定の実施形態では、単離されたタンパク質遺伝子、ｃＤＮＡまたは合成ＤＮＡ配列を組み込む、宿主細胞の組換えＤＮＡ分子を用いる形質転換によって、遺伝子のマルチプルコピーの作製が可能となる。したがって、形質転換体を増殖させること、形質転換体から組換えＤＮＡ分子を単離することおよび必要に応じて、単離された組換えＤＮＡから挿入された遺伝子を回収することとによって遺伝子を多量に得ることができる。
【０２４３】
１．ベクターおよび細胞
本明細書に記載されるいずれかなどの所望のタンパク質の１種または複数の組換え発現のために、タンパク質をコードするヌクレオチド配列のすべてまたは一部を含有する核酸を、適当な発現ベクター、すなわち、挿入されたタンパク質コード配列の転写および翻訳のための必要なエレメントを含有するベクターに挿入できる。必要な転写および翻訳シグナルはまた、酵素遺伝子の天然プロモーターおよび／またはそのそれぞれの両端に位置する領域によっても供給され得る。
【０２４４】
また、酵素をコードする核酸を含有するベクターも提供される。ベクターを含有する細胞も提供される。細胞は、真核細胞および原核細胞を含み、ベクターは、それにおいて使用するための任意の適したものである。
【０２４５】
ベクターを含有する、内皮細胞をはじめとする原核細胞および真核細胞が提供される。このような細胞として、細菌細胞、酵母細胞、真菌細胞、古細菌、植物細胞、昆虫細胞および動物細胞が挙げられる。細胞は、コードされるタンパク質が細胞によって発現される条件下で上記の細胞を増殖させることおよび発現されたタンパク質を回収することによってそのタンパク質を産生するよう使用される。本明細書における目的上、例えば、酵素は、培地中に分泌され得る。
【０２４６】
天然または異種シグナル配列と結合している、ヒアルロナン分解酵素ポリペプチド、いくつかの例では、可溶性ヒアルロニダーゼポリペプチドをコードするヌクレオチドの配列、ならびにそのマルチプルコピーを含有するベクターが提供される。ベクターは、細胞における酵素タンパク質の発現が得られるように、または酵素タンパク質が分泌タンパク質として発現されるように選択され得る。
【０２４７】
タンパク質コード配列を発現するために種々の宿主−ベクター系を使用できる。これらとして、それだけには限らないが、ウイルス（例えば、ワクシニアウイルス、アデノウイルスおよびその他のウイルス）に感染した哺乳類細胞系；ウイルス（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系；酵母ベクターを含有する酵母などの微生物；またはバクテリオファージで形質転換された細菌、ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡが挙げられる。ベクターの発現エレメントは、その強度および特異性が異なる。使用される宿主−ベクター系に応じて、いくつかの適した転写および翻訳エレメントのうち任意の１種を使用できる。
【０２４８】
適当な転写／翻訳制御シグナルおよびタンパク質コード配列を含有するキメラ遺伝子を含有する発現ベクターを構築するために、ＤＮＡ断片をベクターに挿入するための当業者に公知の任意の方法を使用できる。これらの方法として、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡおよび合成技術およびｉｎ  ｖｉｖｏ組換え（遺伝子組換え）が挙げられる。タンパク質またはそのドメイン、誘導体、断片もしくは相同体をコードする核酸配列の発現は、組換えＤＮＡ分子（単数または複数）で形質転換された宿主において遺伝子またはその断片が発現されるよう第２の核酸配列によって調節できる。例えば、タンパク質の発現は、当技術分野で公知の任意のプロモーター／エンハンサーによって制御できる。特定の実施形態では、プロモーターは、所望のタンパク質の遺伝子にとって天然ではない。使用できるプロモーターとして、それだけには限らないが、ＳＶ４０初期プロモーター(Bernoist and Chambon, Nature 290:304-310 (1981))、ラウス肉腫ウイルスの３’長い末端反復配列に含まれるプロモーター(Yamamoto et al. Cell 22:787-797 (1980))、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター(Wagner et al.、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1441-1445 (1981))、メタロチオネイン遺伝子の調節配列(Brinster et al., Nature 296:39-42 (1982))；β−ラクタマーゼプロモーターなどの原核生物の発現ベクター(Jay et al., (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:5543)またはｔａｃプロモーター(DeBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:21-25 (1983));Scientific American 242:79-94 (1980)中の"Useful Proteins from Recombinant Bacteria"も参照）;ノパリンシンセターゼプロモーターを含有する植物発現ベクター(Herrara-Estrella et al., Nature 303:209-213 (1984))またはカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ  ＲＮＡプロモーター(Garder et al., Nucleic Acids Res. 9:2871 (1981))および光合成酵素リブロース二リン酸カルボキシラーゼのプロモーター(Herrera-Estrella et al., Nature 310:115-120 (1984))；Ｇａｌ４プロモーターなどの酵母およびその他の真菌に由来するプロモーターエレメント、アルコールデヒドロゲナーゼプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼプロモーター、アルカリホスファターゼプロモーターならびに組織特異性を示し、トランスジェニック動物において使用されてきた以下の動物転写制御領域：膵臓腺房細胞において活性であるエラスターゼＩ遺伝子制御領域(Swift et al., Cell 38:639-646 (1984);Ornitz et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409 (1986);MacDonald, Hepatology 7:425-515 (1987));膵臓β細胞において活性であるインスリン遺伝子制御領域(Hanahan et al., Nature 315:115-122 (1985))、リンパ球細胞において活性である免疫グロブリン遺伝子制御領域(Grosschedl et al., Cell, 38:647-658 (1984);Adams et al., Nature 318:533-538 (1985);Alexander et al., Mol. Cell Biol. 7:1436-1444 (1987))、精巣、乳房、リンパ系および肥満細胞において活性であるマウス乳房腫瘍ウイルス制御領域(Leder et al., Cell 45:485-495 (1986))、肝臓において活性であるアルブミン遺伝子制御領域(Pinckert et al., Genes and Devel. 1:268-276 (1987))、肝臓において活性であるαフェトプロテイン遺伝子制御領域(Krumlauf et al., Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648 (1985);Hammer et al., Science 235:53-58 1987))、肝臓において活性であるα−１アンチトリプシン遺伝子制御領域(Kelsey et al., Genes and Devel. 1:161-171 (1987))、骨髄系細胞において活性であるβグロビン遺伝子制御領域(Magram et al., Nature 315:338-340 (1985);Kollias et al., Cell 46:89-94 (1986))、脳の乏突起神経膠細胞において活性であるミエリン塩基性タンパク遺伝子制御領域(Readhead et al., Cell 48:703-712 (1987))、骨格筋において活性であるミオシン軽鎖-2遺伝子制御領域(Shani, Nature 314:283-286 (1985))および視床下部の性腺刺激ホルモン分泌細胞において活性であるゴナドトロフィン放出ホルモン遺伝子制御領域(Mason et al., Science 234:1372-1378 (1986))が挙げられる。
【０２４９】
特定の実施形態では、所望のタンパク質またはそのドメイン、断片、誘導体または相同体をコードする核酸、１つまたは複数の複製起点、および所望により、１種または複数の選択マーカー（例えば、抗生物質耐性遺伝子）と作用可能に連結しているプロモーターを含有するベクターが使用される。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞の形質転換のための例示的プラスミドベクターとして、例えば、ｐＱＥ発現ベクター（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡから入手可能；Ｑｉａｇｅｎによって公開された、このシステムを説明する文献も参照）が挙げられる。ｐＱＥベクターは、ファージＴ５プロモーター（大腸菌ＲＮＡポリメラーゼによって認識される）および厳重に調節された、大腸菌における組換えタンパク質の高レベル発現を提供するための二重ｌａｃオペレーター抑制モジュール、効率的な翻訳のための合成リボソーム結合部位（ＲＢＳ  ＩＩ）、６ＸＨｉｓタグコード配列、ｔ０およびＴ１転写ターミネーター、ＣｏｌＥ１複製起点およびアンピシリン耐性を付与するためのβ−ラクタマーゼ遺伝子を有する。ｐＱＥベクターは、６ｘＨｉｓタグを組換えタンパク質のＮ−またはＣ末端のいずれかに配置することができる。このようなプラスミドとして、３種のリーディングフレームすべての多重クローニング部位を提供し、Ｎ末端に６ｘＨｉｓタグのついたタンパク質の発現を提供する、ｐＱＥ３２、ｐＱＥ３０およびｐＱＥ３１が挙げられる。大腸菌細胞の形質転換のためのその他の例示的プラスミドベクターとして、例えば、ｐＥＴ発現ベクター（米国特許第４，９５２，４９６号；ＮＯＶＡＧＥＮ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩから入手可能；Ｎｏｖａｇｅｎによって公開され、このシステムを説明する文献も参照）が挙げられる。このようなプラスミドとして、Ｔ７ｌａｃプロモーター、Ｔ７ターミネーター、誘導可能な大腸菌ｌａｃオペレーターおよびｌａｃレプレッサー遺伝子を含有するｐＥＴ  １１ａ；Ｔ７プロモーター、Ｔ７ターミネーターおよび大腸菌ｏｍｐＴ分泌シグナルを含有するｐＥＴ  １２ａ−ｃ；ならびにＨｉｓカラムを用いる精製において使用するためのＨｉｓ−Ｔａｇ（商標）リーダー配列およびカラムを通した精製後の切断を可能にするトロンビン切断部位、Ｔ７−ｌａｃプロモーター領域およびＴ７ターミネーターを含有するｐＥＴ  １５ｂおよびｐＥＴ１９ｂ（ＮＯＶＡＧＥＮ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）が挙げられる。
【０２５０】
哺乳類細胞発現のためのベクターの例示的なものとして、ＨＺ２４発現ベクターがある。ＨＺ２４発現ベクターは、ｐＣＩベクター骨格（Ｐｒｏｍｅｇａ）から導いた。それは、β−ラクタマーゼ耐性遺伝子（ＡｍｐＲ）、Ｆ１複製起点、サイトメガロウイルス最初期エンハンサー／プロモーター領域（ＣＭＶ）およびＳＶ４０後期ポリアデニル化シグナル（ＳＶ４０）をコードするＤＮＡを含有する。発現ベクターはまた、ＥＣＭＶウイルス（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）由来の配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）およびマウスジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子も有する。
【０２５１】
２．発現
可溶性ヒアルロニダーゼポリペプチドをはじめとするヒアルロナン分解酵素ポリペプチドは、ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏ法を含めた当業者に公知の任意の方法によって製造できる。所望のタンパク質は、例えば、投与および治療に必要とされるなど、必要である量および形態のタンパク質を産生するのに適した任意の生物において発現させることができる。発現宿主として、大腸菌、酵母、植物、昆虫細胞、ヒト細胞株およびトランスジェニック動物を含めた哺乳類細胞などの原核生物および真核生物が挙げられる。発現宿主は、そのタンパク質製造レベルならびに発現されるタンパク質に存在する翻訳後修飾の種類において異なり得る。発現宿主の選択は、これらならびに調節性および安全性の検討事項、製造コストおよび精製に必要なものおよび精製方法などのその他の因子に基づいて行うことができる。
【０２５２】
多数発現ベクターが利用可能であり、当業者に公知であり、タンパク質の発現のために使用できる。発現ベクターの選択は、宿主発現系の選択によって影響を受ける。一般に、発現ベクターは、転写プロモーター、および所望により、エンハンサー、翻訳シグナルならびに転写および翻訳終結シグナル含み得る。安定な形質転換に使用される発現ベクターは、通常、形質転換細胞の選択および維持を可能にする選択マーカーを有する。いくつかの場合には、複製起点をベクターのコピー数を増幅するために使用できる。
【０２５３】
可溶性ヒアルロニダーゼポリペプチドなどのヒアルロナン分解酵素ポリペプチドを、タンパク質融合物として利用または発現させることができる。例えば、酵素にさらなる機能性を付加するために酵素融合物を作製できる。酵素融合タンパク質の例として、それだけには限らないが、シグナル配列、局在のためなどのタグ、例えば、ｈｉｓ６タグもしくはｍｙｃタグ、または精製のためのタグ、例えば、ＧＳＴ融合物、およびタンパク質分泌および／または膜結合に向かわせる配列の融合物が挙げられる。
【０２５４】
ａ．原核細胞
原核生物、特に、大腸菌は、多量のタンパク質を産生する系を提供する。大腸菌の形質転換は、当業者に周知の簡単で迅速な技術である。大腸菌の発現ベクターは、誘導プロモーターを含有し得、このようなプロモーターは、高レベルのタンパク質発現を誘導するのに、また宿主細胞にとって幾分か毒性を示すタンパク質を発現するのに有用である。誘導プロモーターの例として、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ハイブリッドｔａｃプロモーター、Ｔ７およびＳＰ６  ＲＮＡプロモーターおよび温度調節λＰＬプロモーターが挙げられる。
【０２５５】
本明細書において提供されるいずれかのものなどのタンパク質は、大腸菌の細胞質環境中に発現させることができる。細胞質は、還元性環境であり、一部の分子にとっては、これが、不溶性封入体の形成をもたらし得る。ジチオトレイトールおよびβ−メルカプトエタノールなどの還元剤およびグアニジン−ＨＣｌおよび尿素などの変性剤を使用して、このようなタンパク質を再可溶化できる。代替アプローチは、酸化環境およびシャペロニン様およびジスルフィドイソメラーゼを提供し、可溶性タンパク質の産生をもたらし得る細菌の細胞膜周辺腔におけるタンパク質の発現である。通常、リーダー配列が、発現されるタンパク質に融合され、これがタンパク質を周辺質に向ける。次いで、リーダーは、周辺質の内側のシグナルペプチダーゼによって除去される。細胞膜周辺にターゲッティングするリーダー配列の例として、ペクチン酸リアーゼ遺伝子由来のｐｅｌＢリーダーおよびアルカリホスファターゼ遺伝子由来のリーダーが挙げられる。いくつかの場合には、細胞膜周辺の発現によって、発現されたタンパク質の培養培地中への漏出が可能となる。タンパク質の分泌によって、培養上清からの迅速で、簡単な精製が可能となる。分泌されないタンパク質は、浸透圧溶解によって周辺質から得ることができる。いくつかの場合には、細胞質発現と同様に、タンパク質が不溶性となる場合があり、変性剤および還元剤を使用して可溶化および再フォールディングを促進できる。誘導および増殖の温度も、発現レベルおよび溶解度に影響を及ぼす場合があり、一般に、２５℃から３７℃の間の温度が使用される。通常、細菌は、グリコシル化されたタンパク質を産生する。したがって、タンパク質が機能のためにグリコシル化を必要とする場合、宿主細胞から精製した後にグリコシル化をｉｎ  ｖｉｔｒｏで加えることができる。
【０２５６】
ｂ．酵母細胞
サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓａｅ）、分裂酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、クルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）およびピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）などの酵母は、本明細書に記載されるいずれかのものなどのタンパク質の製造に使用できる周知の酵母発現宿主である。酵母は、エピソーム複製ベクターを用いてまたは相同組換えによる安定な染色体組込みによって形質転換できる。通常、誘導プロモーターを使用して、遺伝子発現を調節する。このようなプロモーターの例として、ＧＡＬ１、ＧＡＬ７およびＧＡＬ５ならびにＣＵＰ１、ＡＯＸ１などのメタロチオネインプロモーターまたはその他のピチア（Ｐｉｃｈｉａ）またはその他の酵母プロモーターが挙げられる。発現ベクターは、形質転換ＤＮＡの選択および維持のために、ＬＥＵ２、ＴＲＰ１、ＨＩＳ３およびＵＲＡ３などの選択マーカーを含むことが多い。酵母において発現されるタンパク質は、可溶性であることが多い。Ｂｉｐなどのシャペロニンおよびタンパク質ジスルフィドイソメラーゼの同時発現によって、発現レベルおよび溶解度を改善できる。さらに、酵母において発現されるタンパク質は、サッカロミセス・セレビシエ由来の酵母接合型α因子分泌シグナルなどの分泌シグナルペプチド融合物およびＡｇａ２ｐ接合接着受容体またはアークスラ・アデニニボランス（Ａｒｘｕｌａ  ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓ）グルコアミラーゼなどの酵母細胞表面タンパク質との融合物を使用して分泌に向けることができる。Ｋｅｘ−２プロテアーゼなどのプロテアーゼ切断部位を操作して、それらが分泌経路から出る時に発現されたポリペプチドから融合している配列を除去できる。酵母はまた、Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒモチーフでグリコシル化できる。
【０２５７】
ｃ．昆虫細胞
特に、バキュロウイルス発現を使用する昆虫細胞は、ヒアルロニダーゼポリペプチドなどのポリペプチドを発現するのに有用である。昆虫細胞は、高レベルのタンパク質を発現し、高等真核生物によって使用される翻訳後修飾のほとんどが可能である。バキュロウイルスは、安全性を改善し、真核細胞の発現の調節上の懸念を低減する限定的宿主域を有する。通常の発現ベクターは、バキュロウイルスのポリヘドリンプロモーターなどの高レベル発現のためのプロモーターを使用する。よく使用されるバキュロウイルス系として、オートグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）およびカイコ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）核多角体病ウイルス（ＢｍＮＰＶ）などのバキュロウイルス、ならびにスポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）、シューダレチア・ウニプンクタ（Ｐｓｅｕｄａｌｅｔｉａ  ｕｎｉｐｕｎｃｔａ）（Ａ７Ｓ）およびダナウス・プレクシップス（Ｄａｎａｕｓ  ｐｌｅｘｉｐｐｕｓ）（ＤｐＮ１）由来のＳｆ９などの昆虫細胞株が挙げられる。高レベル発現のために、発現される分子のヌクレオチド配列を、ウイルスのポリヘドリン開始コドンのすぐ下流に融合する。哺乳類分泌シグナルは、昆虫細胞において正確にプロセシングされ、これを使用して発現されるタンパク質を培養培地中に分泌できる。さらに、細胞株シューダレチア・ウニプンクタ（Ａ７Ｓ）およびダナウス・プレクシップス（ＤｐＮ１）は、哺乳類細胞系と同様のグリコシル化パターンを有するタンパク質を産生する。
【０２５８】
昆虫細胞における代替発現系は、安定に形質転換された細胞の使用である。Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ２（Ｓ２）およびＫｃ細胞（キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ））およびＣ７細胞（ヒトスジシマカ（Ａｅｄｅｓ  ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ））などの細胞株を、発現のために使用できる。ドロソフィラ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）メタロチオネインプロモーターを使用して、カドミウムまたは銅を用いる重金属誘導の存在下で高レベルの発現を誘導できる。発現ベクターは、通常、ネオマイシンおよびハイグロマイシンなどの選択マーカーの使用によって維持される。
【０２５９】
ｄ．哺乳類細胞
哺乳類発現系を使用して、可溶性ヒアルロニダーゼポリペプチドなどのヒアルロナン分解酵素ポリペプチドをはじめとするタンパク質を発現できる。発現構築物を、アデノウイルスなどのウイルス感染によって、またはリポソーム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストランなどの直接ＤＮＡ導入によって、およびエレクトロポレーションおよびマイクロインジェクションなどの物理的手段によって哺乳類細胞に導入することができる。哺乳類細胞のための発現ベクターは、通常、ｍＲＮＡキャップ部位、ＴＡＴＡボックス、翻訳開始配列（Ｋｏｚａｋコンセンサス配列）およびポリアデニル化エレメントを含む。また、ＩＲＥＳエレメントを加えて、選択マーカーなどの別の遺伝子を用いてバイシストロニック発現を可能にすることができる。このようなベクターは、高レベル発現のための転写プロモーター−エンハンサー、例えば、ＳＶ４０プロモーター−エンハンサー、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターおよびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）の長い末端反復配列を含むことが多い。これらのプロモーター−エンハンサーは、多数の細胞種において活性である。組織および細胞種プロモーターおよびエンハンサー領域もまた、発現のために使用できる。例示的プロモーター／エンハンサー領域として、それだけには限らないが、エラスターゼＩ、インスリン、免疫グロブリン、マウス乳房腫瘍ウイルス、アルブミン、αフェトプロテイン、α１アンチトリプシン、βグロビン、ミエリン塩基性タンパク質、ミオシン軽鎖２および性腺刺激放出ホルモン遺伝子制御などの遺伝子に由来するものが挙げられる。選択マーカーを使用して、発現構築物を含む細胞を選択および維持することができる。選択マーカー遺伝子の例として、それだけには限らないが、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ、アデノシンデアミナーゼ、キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）およびチミジンキナーゼが挙げられる。例えば、発現は、ＤＨＦＲ遺伝子を発現する細胞のみを選択するようメトトレキサートの存在下で実施できる。ＴＣＲ−ζおよびＦｃεＲＩ−γなどの細胞表面シグナル伝達分子との融合物は、活性な状態のタンパク質の発現を細胞表面に向けることができる。
【０２６０】
マウス、ラットヒト、サル、ニワトリおよびハムスター細胞をはじめとする多数の細胞株が哺乳類発現に利用可能である。例示的細胞株として、それだけには限らないが、ＣＨＯ、Ｂａｌｂ／３Ｔ３、ＨｅＬａ、ＭＴ２、マウスＮＳ０（非分泌性）およびその他の骨髄腫細胞株、ハイブリドーマおよびヘテロハイブリドーマ細胞株、リンパ球、線維芽細胞、Ｓｐ２／０、ＣＯＳ、ＮＩＨ３Ｔ３、ＨＥＫ２９３、２９３Ｓ、２Ｂ８およびＨＫＢ細胞が挙げられる。細胞培養培地からの分泌されたタンパク質の精製を容易にする血清不含培地に適応している細胞株も利用可能である。例として、ＣＨＯ−Ｓ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、カタログ番号１１６１９−０１２）および血清不含ＥＢＮＡ−１細胞株(Pham et al., (2003) Biotechnol. Bioeng. 84:332-42.)が挙げられる。最大発現のために最適化された特定の培地で増殖するよう適応している細胞株も利用可能である。例えば、ＤＧ４４  ＣＨＯ細胞は、化学的に定義された動物産物を含まない培地で懸濁培養において増殖するよう適応している。
【０２６１】
ｅ．植物
トランスジェニック植物細胞および植物を使用して、本明細書に記載されるいずれかのものなどのタンパク質を発現できる。発現構築物は、通常、微粒子銃およびプロトプラストへのＰＥＧ媒介性導入などの直接ＤＮＡ導入を使用して、またアグロバクテリウム媒介性形質転換を用いて植物に導入される。発現ベクターは、プロモーターおよびエンハンサー配列、転写終結エレメントおよび翻訳制御エレメントを含み得る。発現ベクターおよび形質転換技術は、通常、シロイヌナズナおよびタバコなどの双子葉植物宿主と、トウモロコシおよびイネなどの単子葉植物宿主の間に分けられる。発現のための植物プロモーターの例として、カリフラワーモザイクウイルスプロモーター、ノパリンシンセターゼプロモーター、リボースビスホスフェートカルボキシラーゼプロモーターおよびユビキチンおよびＵＢＱ３プロモーターが挙げられる。形質転換細胞の選択および維持を容易にするために、ハイグロマイシン、ホスホマンノースイソメラーゼおよびネオマイシンホスホトランスフェラーゼなどの選択マーカーが使用されることが多い。形質転換された植物細胞は、細胞、凝集塊（カルス組織）として培養物で維持でき、または植物全体に再生できる。トランスジェニック植物細胞はまた、ヒアルロニダーゼポリペプチドを産生するよう操作された藻類を含み得る。植物は、哺乳類細胞とは異なるグリコシル化パターンを有するので、これは、これらの宿主において産生されるタンパク質の選択に影響を及ぼし得る。
【０２６２】
３．精製技術
宿主細胞からヒアルロナン分解酵素ポリペプチド（例えば、可溶性ヒアルロニダーゼポリペプチド）またはその他のタンパク質を含めたポリペプチドを精製する方法は、選択された宿主細胞および発現系に応じて変わる。分泌される分子については、タンパク質は、通常、細胞を回収した後に培養培地から精製される。細胞内発現については、細胞を溶解し、抽出物からタンパク質を精製することができる。トランスジェニック植物および動物などのトランスジェニック生物が発現のために使用される場合には、組織または臓器を出発物質として使用し、溶解した細胞抽出物を製造できる。さらに、トランスジェニック動物製造は、ミルクまたは卵中でのポリペプチドの製造を含み得、ポリペプチドは回収でき、必要に応じて、タンパク質を抽出し、当技術分野における標準方法を使用してさらに精製できる。
【０２６３】
可溶性ヒアルロニダーゼポリペプチドなどのタンパク質は、それだけには限らないが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、サイズ分画およびサイズ排除クロマトグラフィー、硫酸アンモニウム沈殿および陰イオン交換などのイオン交換クロマトグラフィーをはじめとする当技術分野で公知の標準タンパク質精製技術を使用して精製できる。また、アフィニティー精製技術を利用して、調製物の効率および純度を改善できる。例えば、抗体、受容体およびヒアルロニダーゼ酵素と結合するその他の分子を、アフィニティー精製において使用できる。発現構築物はまた、ｍｙｃエピトープ、ＧＳＴ融合物またはＨｉｓ６などの親和性タグをタンパク質に付加するよう操作し、それぞれ、ｍｙｃ抗体、グルタチオン樹脂およびＮｉ樹脂を用いてアフィニティー精製できる。純度は、ゲル電気泳動および染色および分光光度的技術をはじめとする当技術分野で公知の任意の方法によって評価できる。本明細書において提供されるような、精製されたｒＨｕＰＨ２０組成物は、通常、実施例２において決定されるような、約１２０，０００ユニット／ｍｇの比活性を有する。
【０２６４】
４．ヒアルロナン分解酵素ポリペプチドのペグ化
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、主に、ＰＥＧが生体適合性、非毒性、非免疫原性および水溶性ポリマーであるために、生体材料、バイオテクノロジーおよび医薬において広く使用されてきた(Zhao and Harris、ACS Symposium Series 680: 458-72, 1997)。薬物デリバリーの領域では、ＰＥＧ誘導体が、免疫原性、タンパク質分解および腎臓クリアランスを低減し、溶解度を高めるためのタンパク質との共有結合（すなわち、「ペグ化」）において広く使用されてきた(Zalipsky, Adv. Drug Del. Rev. 16:157-82, 1995)。同様に、ＰＥＧは、溶解度を高め、毒性を低減し、体内分布を変更するために、低分子量の、比較的疎水性の薬物と結合されてきた。一般に、ＰＥＧ化薬物は、溶液として注射される。
【０２６５】
分解可能な、可溶性の薬剤担体の設計において使用されるものと同様の化学のほとんどを、分解可能なゲルの設計においても使用できるので、密接に関連している適用は、薬物デリバリーにおいて使用するための、架橋した分解可能なＰＥＧネットワークまたは処方の合成である(Sawhney et al., Macromolecules 26: 581-87, 1993)。また、２種の相補的ポリマーの溶液を混合することによって高分子間錯体が形成され得るということも知られている。このような錯体は、通常、関与するポリマー間の静電気的相互作用（ポリアニオン−ポリカチオン）および／もしくは水素結合（ポリ酸−ポリ塩基）によって、ならびに／または水性環境中のポリマー間の疎水性相互作用によって安定化される（Krupers et al., Eur. Polym J. 32:785-790，1996）。例えば、適切な条件下でポリアクリル酸（ＰＡＡｃ）およびポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）の溶液を混合することは、主に水素結合に基づく錯体の形成をもたらす。生理学的状態でのこれらの錯体の解離は、遊離薬物のデリバリーのために使用されてきた（すなわち、非ＰＥＧ化）。さらに、相補的ポリマーの錯体は、ホモポリマーおよびコポリマーの両方から形成されてきた。
【０２６６】
ペグ化のための多数の試薬が、当技術分野で記載されている。このような試薬として、それだけには限らないが、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル（ＮＨＳ）活性化ＰＥＧ、スクシンイミジルｍＰＥＧ、ｍＰＥＧ２−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、ｍＰＥＧスクシンイミジルα−メチルブタノエート、ｍＰＥＧスクシンイミジルプロピオネート、ｍＰＥＧスクシンイミジルブタノエート、ｍＰＥＧカルボキシメチル３−ヒドロキシブタン酸スクシンイミジルエステル、ホモ二官能性ＰＥＧ−スクシンイミジルプロピオネート、ホモ二官能性ＰＥＧプロピオンアルデヒド、ホモ二官能性ＰＥＧブチルアルデヒド、ＰＥＧマレイミド、ＰＥＧヒドラジン、ｐ−ニトロフェニル−カルボネートＰＥＧ、ｍＰＥＧ−ベンゾトリアゾールカルボネート、プロピオンアルデヒドＰＥＧ、ｍＰＥＧブトリアルデヒド（ｂｕｔｒｙａｌｄｅｈｙｄｅ）、分岐ｍＰＥＧ２ブチルアルデヒド、ｍＰＥＧアセチル、ｍＰＥＧピペリドン、ｍＰＥＧメチルケトン、ｍＰＥＧ「リンカーなし」マレイミド、ｍＰＥＧビニルスルホン、ｍＰＥＧチオール、ｍＰＥＧオルトピリジルチオエステル、ｍＰＥＧオルトピリジルジスルフィド、Ｆｍｏｃ−ＰＥＧ−ＮＨＳ、Ｂｏｃ−ＰＥＧ−ＮＨＳ、ビニルスルホンＰＥＧ−ＮＨＳ、アクリレートＰＥＧ−ＮＨＳ、フルオレセインＰＥＧ−ＮＨＳおよびビオチンＰＥＧ−ＮＨＳが挙げられる（例えば、Monfardini et al., Bioconjugate Chem. 6:62-69, 1995; Veronese et al., J. Bioactive Compatible Polymers 12:197-207, 1997;Ｕ．Ｓ．５，６７２，６６２；Ｕ．Ｓ．５，９３２，４６２；Ｕ．Ｓ．６，４９５，６５９；Ｕ．Ｓ．６，７３７，５０５；Ｕ．Ｓ．４，００２，５３１；Ｕ．Ｓ．４，１７９，３３７；Ｕ．Ｓ．５，１２２，６１４；Ｕ．Ｓ．５，１８３，５５０；Ｕ．Ｓ．５，３２４，８４４；Ｕ．Ｓ．５，４４６，０９０；Ｕ．Ｓ．５，６１２，４６０；Ｕ．Ｓ．５，６４３，５７５；Ｕ．Ｓ．５，７６６，５８１；Ｕ．Ｓ．５，７９５，５６９；Ｕ．Ｓ．５，８０８，０９６；Ｕ．Ｓ．５，９００，４６１；Ｕ．Ｓ．５，９１９，４５５；Ｕ．Ｓ．５，９８５，２６３；Ｕ．Ｓ．５，９９０，２３７；Ｕ．Ｓ．６，１１３，９０６；Ｕ．Ｓ．６，２１４，９６６；Ｕ．Ｓ．６，２５８，３５１；Ｕ．Ｓ．６，３４０，７４２；Ｕ．Ｓ．６，４１３，５０７；Ｕ．Ｓ．６，４２０，３３９；Ｕ．Ｓ．６，４３７，０２５；Ｕ．Ｓ．６，４４８，３６９；Ｕ．Ｓ．６，４６１，８０２；Ｕ．Ｓ．６，８２８，４０１；Ｕ．Ｓ．６，８５８，７３６；Ｕ．Ｓ．２００１／００２１７６３；Ｕ．Ｓ．２００１／００４４５２６；Ｕ．Ｓ．２００１／００４６４８１；Ｕ．Ｓ．２００２／００５２４３０；Ｕ．Ｓ．２００２／００７２５７３；Ｕ．Ｓ．２００２／０１５６０４７；Ｕ．Ｓ．２００３／０１１４６４７；Ｕ．Ｓ．２００３／０１４３５９６；Ｕ．Ｓ．２００３／０１５８３３３；Ｕ．Ｓ．２００３／０２２０４４７；Ｕ．Ｓ．２００４／００１３６３７；ＵＳ  ２００４／０２３５７３４；Ｕ．Ｓ．２００５／０００３６０；Ｕ．Ｓ．２００５／０１１４０３７；Ｕ．Ｓ．２００５／０１７１３２８；Ｕ．Ｓ．２００５／０２０９４１６；ＥＰ  ０１０６４９５１；ＥＰ  ０８２２１９９；ＷＯ  ００１７６６４０；ＷＯ  ０００２０１７；ＷＯ  ０２４９６７３；ＷＯ  ９４２８０２４；およびＷＯ  ０１８７９２５参照）。
【０２６７】
一例では、ポリエチレングリコールは、約３ｋＤから約５０ｋＤ、好ましくは、約５ｋＤから約３０ｋＤの範囲の分子量を有する。ＰＥＧの薬物との共有結合（「ペグ化」として知られる）は、公知の化学合成技術によって達成できる。例えば、タンパク質のペグ化は、適した反応条件下でＮＨＳ活性化ＰＥＧを、タンパク質と反応させることによって達成できる。
【０２６８】
ペグ化について多数の反応が記載されているが、最も一般的に適用可能なものは、方向性を付与し、穏やかな反応条件を利用し、毒性触媒または副生成物（ｂｉｐｒｏｄｕｃｔ）を除去するための大規模な下流処理を必要としない。例えば、モノメトキシＰＥＧ（ｍＰＥＧ）は、１個の反応性末端ヒドロキシルしか有さず、したがって、その使用によって、得られるＰＥＧ−タンパク質生成物混合物の不均一性の一部が制限される。通常、末端メトキシ基の反対側のポリマーの末端のヒドロキシル基の活性化が、誘導体化ＰＥＧを求核攻撃に対してより感受性にすることを目的とした効率的なタンパク質ペグ化を達成するために必要である。攻撃性求核試薬は、通常、リシル残基のε−アミノ基であるが、局所条件が好都合である場合には、その他のアミンも反応し得る（例えば、Ｎ末端α−アミンまたはヒスチジンの環アミン）。単一のリシンまたはシステインを含有するタンパク質では、より指向性のある結合が起こり得る。後者の残基は、チオール特異的修飾のためにＰＥＧ−マレイミドによって標的とされ得る。あるいは、ＰＥＧヒドラジンを、過ヨウ素酸酸化されたヒアルロナン分解酵素と反応させ、ＮａＣＮＢＨ３の存在下で還元することができる。より詳しくは、ＰＥＧ化ＣＭＰ糖を、適当なグリコシル−トランスフェラーゼの存在下でヒアルロナン分解酵素と反応させることができる。１つの技術として、いくつかのポリマー分子が、問題のポリペプチドとカップリングされる「ペグ化」技術がある。この技術を使用する場合には、免疫系が、抗体の形成に関与するポリペプチドの表面上のエピトープを認識することが困難になり、それによって、免疫応答が低減する。特定の生理学的効果を与えるようヒト身体の循環系に直接導入されるポリペプチド（すなわち、医薬品）については、通常の可能性ある免疫応答は、ＩｇＧおよび／またはＩｇＭ応答であるが、呼吸器系によって吸入されるポリペプチド（すなわち、工業用ポリペプチド）は、ＩｇＥ応答（すなわち、アレルギー反応）を潜在的に引き起こし得る。免疫応答の低減を説明する理論の１つは、ポリマー分子（単数または複数）が、抗体形成につながる免疫応答に関与するポリペプチドの表面上にあるエピトープ（単数または複数）を遮蔽するということである。別の理論または少なくとも部分的な要因は、コンジュゲートが重いほど、より低減された免疫応答が得られるということである。
【０２６９】
通常、ＰＥＧ化ヒアルロニダーゼをはじめとする本明細書において提供されるＰＥＧ化ヒアルロナン分解酵素を製造するには、ＰＥＧ部分を共有結合によってポリペプチドにコンジュゲートさせる。ペグ化のための技術として、それだけには限らないが、特殊化されたリンカーおよびカップリング化学（例えば、Harris, Adv. Drug Deliv. Rev. 54:459-476, 2002）、単一コンジュゲーション部位との複数のＰＥＧ部分の結合（分岐ＰＥＧの使用などによる；例えば、Veronese et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 12:177-180, 2002参照）、部位特異的ペグ化および／またはモノペグ化（例えば， Chapman et al., Nature Biotech. 17:780-783, 1999参照）および部位特異的酵素的ペグ化(例えば, Sato, Adv. Drug Deliv. Rev., 54:487-504, 2002参照）が挙げられる。当技術分野で記載されている方法および技術によって、単一のタンパク質分子と結合している１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１０を超えるＰＥＧまたはＰＥＧ誘導体を有するタンパク質を製造できる（例えば、Ｕ．Ｓ．２００６／０１０４９６８参照）。
【０２７０】
ＰＥＧ化ヒアルロニダーゼなどのＰＥＧ化ヒアルロナン分解酵素を製造するための例示的方法のペグ化の例示的例として、ＰＥＧ部分、通常、スクシンイミジルＰＥＧをｒＨｕＰＨ２０とコンジュゲートするために、ＰＥＧアルデヒド、スクシンイミドおよびカルボネートが各々適用されている。例えば、ｒＨｕＰＨ２０は、ｍＰＥＧ−スクシンイミジルプロピオネート（ｍＰＥＧ−ＳＰＡ）、ｍＰＥＧ−スクシンイミジルブタノエート（ｍＰＥＧ−ＳＢＡ）および（「分岐」ＰＥＧを結合するための）ｍＰＥＧ２−Ｎ−ヒドロキシルスクシンイミドをはじめとする例示的スクシンイミジルモノＰＥＧ（ｍＰＥＧ）試薬を用いてコンジュゲートされている。これらのＰＥＧ化スクシンイミジルエステルは、ＰＥＧ基および活性化されたクロスリンカー、および単一または分岐ＰＥＧ基のいずれかの間に種々の長さの炭素骨格を含有する。これらの相違を使用して、例えば、コンジュゲーション過程の間の異なる反応速度論およびｒＨｕＰＨ２０とのＰＥＧ結合に利用可能な潜在的な制限部位を提供できる。
【０２７１】
直鎖または分岐ＰＥＧのいずれかを含むスクシンイミジルＰＥＧ（上記の）を、ｒＨｕＰＨ２０にコンジュゲートできる。ＰＥＧを使用して、ヒアルロニダーゼあたり約３〜６個のＰＥＧ分子を有する分子の組合せを含むｒＨｕＰＨ２０を再現性よく作製できる。このようなＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０組成物は、容易に精製し、約２５，０００または３０，０００ユニット／タンパク質１ｍｇのヒアルロニダーゼ活性の比活性を有し、非ＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０を実質的に含まない（５％未満の非ＰＥＧ化）組成物を得ることができる。
【０２７２】
種々のＰＥＧ試薬を使用して、例えば、ｍＰＥＧ−ＳＢＡ（３０ｋＤ）、ｍＰＥＧ−ＳＭＢ（３０ｋＤ）を使用して、ヒアルロナン分解酵素の例示的なもの、特に、可溶性ヒト組換えヒアルロニダーゼ（例えば、ｒＨｕＰＨ２０）を、また、ｍＰＥＧ２−ＮＨＳ（４０ｋＤ）、ｍＰＥＧ２−ＮＨＳ（６０ｋＤ）に基づいて分岐型を調製できる。ｒＨｕＰＨ２０のＰＥＧ化型は、以下の試薬の各々を使用して、ＮＨＳ化学ならびにカルボネートおよびアルデヒドを使用して作製されている：ｍＰＥＧ２−ＮＨＳ−４０Ｋ分岐、ｍＰＥＧ−ＮＨＳ−１０Ｋ分岐、ｍＰＥＧ−ＮＨＳ−２０Ｋ分岐、ｍＰＥＧ−ＮＨＳ−４０Ｋ分岐、ｍＰＥＧ２−ＮＨＳ−６０Ｋ分岐；ｍＰＥＧ−ＳＢＡ−５Ｋ；ｍＰＥＧ−ＳＢＡ−２０Ｋ；ｍＰＥＧ−ＳＢＡ−３０Ｋ；ｍＰＥＧ−ＳＭＢ−２０Ｋ；ｍＰＥＧ−ＳＭＢ−３０Ｋ；ｍＰＥＧ−ブチリルデヒド（ｂｕｔｙｒｌｄｅｈｙｄｅ）−；ｍＰＥＧ−ＳＰＡ−２０Ｋ；ｍＰＥＧ−ＳＰＡ−３０Ｋ；およびＰＥＧ−ＮＨＳ−５Ｋ−ビオチン。ＰＥＧ化ヒアルロニダーゼはまた、Ｄｏｗ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎの一部門であるＤｏｗｐｈａｒｍａから入手可能なＰＥＧ試薬を使用して調製されており；Ｄｏｗｐｈａｒｍａのｐ−ニトロフェニル−カルボネートＰＥＧ（３０ｋＤａ）およびプロピオンアルデヒドＰＥＧ（３０ｋＤａ）を用いてＰＥＧ化されたヒアルロニダーゼが挙げられる。
【０２７３】
一例では、ペグ化は、可溶性ヒアルロニダーゼへのｍＰＥＧ−ＳＢＡ、例えば、ｍＰＥＧ−ＳＢＡ−３０Ｋ（約３０Ｋｄａの分子量を有する）またはＰＥＧブタン酸誘導体の別のスクシンイミジルエステルのコンジュゲーションを含む。ｍＰＥＧ−ＳＢＡ−３０ＫなどのＰＥＧブタン酸誘導体のスクシンイミジルエステルは、タンパク質のアミノ基と容易にカップリングする。例えば、以下のスキーム１に示されるように、ｍ−ＰＥＧ−ＳＢＡ−３０ＫおよびｒＨｕＰＨ２０の共有結合コンジュゲーション（大きさが約６０ＫＤａである）は、ｒＨｕＰＨ２０およびｍＰＥＧの間の安定なアミド結合を提供する。
スキーム１：
【０２７４】
【化１】
2014041131.tif 000004
【０２７５】
通常、ｍＰＥＧ−ＳＢＡ−３０Ｋまたはその他のＰＥＧをヒアルロナン分解酵素、いくつかの例では、ヒアルロニダーゼに、適したバッファー、例えば、ｐＨ６．８の１３０ｍＭ  ＮａＣｌ／１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ中、１０：１のＰＥＧ：ポリペプチドモル比で付加し、続いて、滅菌、例えば、無菌濾過し、例えば、低温室中４℃で一晩撹拌しながらコンジュゲーションを継続する。一例では、コンジュゲートしているＰＥＧ−ヒアルロナン分解酵素を濃縮し、バッファーを交換する。
【０２７６】
ｍＰＥＧ−ＳＢＡ−３０ＫなどのＰＥＧブタン酸誘導体のスクシンイミジルエステルをカップリングするその他の方法は、当技術分野で公知である（例えば、Ｕ．Ｓ．５，６７２，６６２；Ｕ．Ｓ．６，７３７，５０５；およびＵ．Ｓ．２００４／０２３５７３４参照）。例えば、ホウ酸塩バッファー（０．１Ｍ、ｐＨ８．０）中、４℃で１時間の反応によって、ヒアルロナン分解酵素（例えば、ヒアルロニダーゼ）などのポリペプチドを、ＮＨＳ活性化ＰＥＧ誘導体にカップリングできる。得られたＰＥＧ化タンパク質は、限外濾過によって精製できる。あるいは、ウシアルカリホスファターゼのペグ化は、０．２Ｍリン酸ナトリウムおよび０．５Ｍ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）を含有するバッファー中、４℃で３０分間、ホスファターゼをｍＰＥＧ−ＳＢＡと混合することによって達成できる。未反応のＰＥＧは、限外濾過によって除去できる。別の方法は、ｐＨを７．２〜９に上げるためにトリエチルアミンが加えられている脱イオン水中で、ポリペプチドをｍＰＥＧ−ＳＢＡと反応させる。得られた混合物を、室温で数時間撹拌し、ペグ化を完了する。
【０２７７】
Ｆ．組成物の調製、処方および投与
ポリマーとコンジュゲートしている修飾された可溶性ヒアルロニダーゼなどの修飾されたヒアルロナン分解酵素の医薬組成物が、本明細書において提供される。また、ヒアルロナン関連疾患または状態と関連している疾患または障害を治療するために使用される第２の薬剤を含有する医薬組成物も提供される。このような薬剤の例示的なものとして、それだけには限らないが、薬物をはじめとする抗癌剤、ポリペプチド、核酸、抗体、ペプチド、小分子、遺伝子療法ベクター、ウイルスおよびその他の治療薬が挙げられる。修飾された可溶性ヒアルロニダーゼをはじめとする修飾されたヒアルロナン分解酵素は、過剰のヒアルロナンまたは蓄積されたヒアルロナンと関連している身体内の所望の部位または組織へのそのデリバリーを増強するために、第２の薬剤のような医薬処方と同時処方または同時投与投与できる。例えば、腫瘍は、蓄積されたヒアルロナンと関連している。このような過剰のヒアルロナンは、透水係数を妨げる一因となり得る。可溶性ヒアルロニダーゼ、特に、半減期を増大するようポリマーとコンジュゲートしている可溶性ヒアルロニダーゼなどのヒアルロナン分解酵素の導入は、このような組織におけるヒアルロナンの蓄積を相殺し、それによって、部位または組織内の透水係数を改善し、部位または組織を、局所または全身デリバリーのいずれかによる１つまたは複数の第２の薬剤のデリバリーに対してより感受性にできる。例えば、抗癌剤を含有する組成物と一緒にまたは別個に（断続的に、同時にまたは逐次）腫瘍に投与される場合に、腫瘍を、このような抗腫瘍物質に対してより感受性にできる、ｒＨｕＰＨ２０などのＰＥＧ化可溶性ヒアルロニダーゼの組成物が、本明細書において提供される。本明細書において別の場所で論じられるように、ＰＥＧ化可溶性ヒアルロニダーゼの組成物はまた、蓄積されたヒアルロニダーゼ基質発現と関連している疾患または状態を治療するために単独で投与してもよい。
【０２７８】
化合物は、経口投与のための溶液、懸濁液、錠剤、分散性錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、持続放出処方またはエリキシル、ならびに、経皮パッチ処方および乾燥散剤吸入剤などの適した医薬処方に処方できる。通常、化合物は、当技術分野で周知の技術および手順を使用して医薬組成物に処方される(例えば、Ansel Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, Fourth Edition, 1985, 126参照）。一般に、処方の様式は、投与経路の関数である。組成物は同時処方してもよく、または別個の組成物として提供してもよい。
【０２７９】
一般に、組成物は、凍結乾燥形態または液体形態に処方される。組成物が凍結乾燥形態で提供される場合には、それらは、適当なバッファー、例えば、滅菌生理食塩水溶液によって使用の直前に再構成され得る。組成物は、一緒に提供されてもよく、または別個に提供されてもよい。本明細書における目的上、このような組成物は、通常、別個に提供される。可溶性ヒアルロニダーゼなどのヒアルロナン分解酵素および第２の薬剤は、一緒に、逐次または断続的に投与するための別個の組成物としてパッケージングされ得る。組合せはキットとしてパッケージングされ得る。
【０２８０】
組成物は、筋肉内、静脈内、皮内、病巣内、腹膜内注射、皮下、腫瘍内、硬膜外、鼻腔、経口、経膣、直腸、局所（ｔｏｐｉｃａｌ）、局所（ｌｏｃａｌ）、耳、吸入、口内（例えば、舌下）および経皮投与または任意の経路を含めた、当業者に公知の任意の経路による投与のために処方され得る。投与は、治療の部位に応じて局所、局所または全身であり得る。治療を必要とする領域への局所投与は、例えば、それだけには限らないが、手術の際の局所注入、例えば、術後の創傷被覆材と併せた、注射による、カテーテルによる、坐剤による、または植込錠による局所適用によって達成できる。組成物はまた、その他の生物学的に活性な薬剤とともに、逐次、断続的に、または同一組成物中のいずれかで投与してよい。投与はまた、制御放出処方およびポンプなどによる装置によって制御された放出をはじめとする制御放出系を含み得る。
【０２８１】
任意の所与の場合における最も適した経路は、疾患の性質、疾患の進行、疾患の重篤度、使用される個々の組成物など、種々の因子に応じて変わる。本明細書における目的上、可溶性ヒアルロニダーゼなどのヒアルロナン分解酵素および／または第２の薬剤は、製薬上利用可能な量またはレベルが血漿中に存在するように投与されることが望ましい）。例えば、組成物は、例えば、静脈内投与によって全身投与される。いくつかの場合には、このような組成物は、それらが蓄積されたヒアルロナンを有する皮膚または組織の間質に達するように投与される。例えば、可溶性ヒアルロニダーゼの腫瘍間質への導入は、間質液圧が低下し、拡散および／または結合性輸送が増大すると、腫瘍に、より容易に浸透できる、局所的にデリバリーされる、ならびに全身的に利用可能な抗癌剤のデリバリーを増強する。したがって、可溶性ヒアルロニダーゼなどのヒアルロナン分解酵素および１つまたは複数の第２の薬剤は、種々の投与経路によって投与できる。したがって、一例では、可溶性ヒアルロニダーゼは、局所的に（ｌｏｃａｌｌｙ）、例えば、腫瘍内に、蓄積されたヒアルロナンと関連している部位または組織に投与され、第２の薬剤は、例えば、静脈内投与によって全身的に投与される。その他の投与様式も考慮される。医薬組成物は、各投与経路にとって適当な剤形に処方できる。
【０２８２】
投与方法を使用して、タンパク質分解などの分解過程ならびに抗原性および免疫原性応答による免疫学的介入への、ヒアルロナン分解酵素、例えば、可溶性ヒアルロニダーゼのおよびその他の分子の曝露を低減できる。このような方法の例として、治療部位での局所投与が挙げられる。
【０２８３】
１．処方
製薬上許容される組成物は、動物において、およびヒトにおいて使用するための一般に認識される薬局方に一致して用意された監督官庁またはその他の機関の承認を考慮して調製される。組成物は、溶液、懸濁液、エマルジョン、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤および持続放出処方の形態をとり得る。組成物は、従来の結合剤およびトリグリセリドなどの担体ととも坐剤として処方できる。経口処方は、医薬品等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムおよびその他のこのような薬剤などの標準担体を含み得る。処方は、投与様式に適合するべきである。
【０２８４】
医薬組成物は、一緒に酵素またはアクチベーターが投与される、希釈液、アジュバント、賦形剤またはビヒクルなどの担体を含み得る。適した製薬担体の例は、E. W. Martinによる"Remington's Pharmaceutical Sciences"に記載されている。このような組成物は、一般に、精製された形態の、治療上有効な量の化合物を、患者への適切な投与のための形態を提供するのに適した量の担体と一緒に含有する。このような製薬担体は、ピーナッツオイル、ダイズオイル、鉱油およびゴマ油などの、石油、動物、植物または合成起源のものをはじめとする、水および油状物質などの滅菌液体であり得る。医薬組成物が静脈内に投与される場合には、水が代表的な担体である。生理食塩水溶液およびデキストロース水溶液およびグリセロール溶液も特に、注射用溶液のための液体担体として使用できる。組成物は、有効成分とともに、ラクトース、スクロース、リン酸二カルシウムまたはカルボキシメチルセルロースなどの希釈液；ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウムおよびタルクなどの滑沢剤；ならびにデンプン、アカシアゴムなどの天然ゴム、ゼラチン、グルコース、糖蜜、ポルビニルピロリドン（ｐｏｌｖｉｎｉｌｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｅ）、セルロースおよびその誘導体、ポビドン、クロスポビドンおよび当業者に公知のその他のこのような結合剤などの結合剤を含有し得る。適した製薬賦形剤として、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水およびエタノールが挙げられる。組成物はまた、必要に応じて、微量の湿潤剤または乳化剤、またはｐＨ緩衝剤、例えば、酢酸、クエン酸ナトリウム、シクロデキストリン誘導体、モノラウリン酸ソルビタン、酢酸トリエタノールアミンナトリウム、オレイン酸トリエタノールアミンおよびその他のこのような薬剤を含有し得る。
【０２８５】
一例では、医薬品は液体の形態、例えば、溶液、シロップまたは懸濁液であり得る。このような液体調製物は、懸濁剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体または硬化食用油脂）；乳化剤（例えば、レシチンまたはアラビアガム）；非水性ビヒクル（例えば、アーモンドオイル、油性エステルまたは精留植物油）；および保存料（例えば、メチルまたはプロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾエートまたはソルビン酸）などの製薬上許容される添加物を用いて従来の手段によって調製できる。別の例では、医薬品は、使用前に水またはその他の適したビヒクルで再構成するための凍結乾燥形態で提示され得る。
【０２８６】
製薬上治療上活性な化合物およびその誘導体は、通常、単位剤形または複数回剤形で単位処方され、投与される。各単位用量は、必要な製薬担体、ビヒクルまたは希釈液と関連して、所望の治療効果を生じるのに十分な所定の量の治療上活性な化合物を含有する。単位剤形として、それだけには限らないが、適した量の化合物またはその製薬上許容される誘導体を含有する、錠剤、カプセル剤、丸剤、散剤、顆粒剤、滅菌非経口溶液または懸濁液および経口溶液または懸濁液、およびオイル水エマルジョンが挙げられる。ユニット用量形態は、アンプルおよびシリンジまたは個々に包装された錠剤またはカプセル剤に含有され得る。単位用量形態は、画分またはその複数のもので投与され得る。複数回用量形態は、分離された単位用量形態で投与される、単一容器中にパッケージングされている複数の同一の単位剤形である。複数回用量形態の例として、バイアル、錠剤またはカプセル剤の瓶またはパイントもしくはガロンの瓶が挙げられる。したがって、複数回用量形態は、パッケージング中で分離されていない単位用量の複数である。一般に、非毒性担体から作られる平衡を有する０．００５％〜１００％の範囲の有効成分を含有する剤形または組成物を調製できる。
【０２８７】
医薬組成物は、各投与経路にとって適当な剤形で処方できる。
【０２８８】
ａ．注射用医薬品、溶液およびエマルジョン
一般に、皮下に、筋肉内に、腫瘍内に、静脈内に、または皮内にのいずれかでの注射を特徴とする非経口投与が、本明細書において考慮される。注射物質は、液体溶液または懸濁液、注射前の液体での溶液または懸濁液に適した固体形態、またはエマルジョンのいずれかとして従来の形態で調製できる。適した賦形剤として、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロールまたはエタノールがある。さらに、必要に応じて、投与される医薬組成物は、ｐＨ緩衝剤、金属イオン塩またはその他のこのようなバッファーなどの溶媒の形態でアクチベーターを含有してもよい。医薬組成物はまた、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、安定化剤、溶解度エンハンサー、ならびに例えば、酢酸ナトリウム、モノラウリン酸ソルビタン、オレイン酸トリエタノールアミンおよびシクロデキストリンなどのその他のこのような薬剤などのその他の微量の非毒性補助物質も含有し得る。一定レベルの投与量が維持されるような徐放系または持続放出系の埋め込み（例えば、米国特許第３，７１０，７９５号参照）も本明細書において考慮される。このような非経口組成物に含有される活性な化合物のパーセンテージは、その固有の性質ならびに化合物の活性および対象の要求に高度に依存している。
【０２８９】
例えば、本明細書において提供される修飾された可溶性ヒアルロニダーゼの標準の安定化処方は、ＥＤＴＡ、ＮａＣｌ、ＣａＣｌ２、ヒスチジン、ラクトース、アルブミン、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８、ＴＷＥＥＮ（登録商標）および／またはその他の界面活性剤またはその他の同様の薬剤のうち１種または複数とともに処方される。例えば、本明細書において提供される組成物は、ｐＨバッファー（例えば、ヒスチジン、リン酸またはその他のバッファーなど）、または酸性バッファー（酢酸、クエン酸、ピルビン酸、Ｇｌｙ−ＨＣｌ、コハク酸、乳酸、マレイン酸またはその他のバッファーなど）、張性調節剤（ｔｏｎｉｃｉｔｙ  ｍｏｄｉｆｉｅｒ）（例えば、アミノ酸、ポリアルコール、ＮａＣｌ、トレハロース、その他の塩および／または糖など）、安定剤、エチレンジアミン四酢酸、エチレンジアミン四酢酸塩またはカルシウムＥＤＴＡなどのキレート化剤、メチオニン、アスコルビン酸／アスコルビン酸塩、クエン酸／クエン酸塩またはアルブミンなどの脱酸素剤および／または芳香環を含有する防腐剤（例えば、フェノールまたはクレゾール）などの防腐剤のうち１種または複数を含有し得る。ヒアルロナン分解酵素を含有する組成物にとって有用な例示的安定化剤として、ポリソルベートなどの界面活性剤およびヒト血清アルブミンなどのタンパク質が挙げられる。本明細書における組成物において有用である血清アルブミンの例示的濃度として、０．１ｍｇ／ｍＬ、０．２ｍｇ／ｍＬ、０．３ｍｇ／ｍＬ、０．４ｍｇ／ｍＬ、０．５ｍｇ／ｍＬ、０．６ｍｇ／ｍＬ、０．７ｍｇ／ｍＬ、０．８ｍｇ／ｍＬ、０．９ｍｇ／ｍＬまたは１ｍｇ／ｍＬが挙げられるが、程度の差はあり得る。ポリソルベートはまた、例えば、０．００１％、０．００２％、０．００３％、０．００４％、０．００５％、０．００６％、００．００７％、０．００８％、０．００９％、０．０１％、０．０２％、０．０３％、０．０４％、０．０５％、０．０６％、０．０７％、０．０８％、０．０９％もしくは０．１％または約０．００１％、０．００２％、０．００３％、０．００４％、０．００５％、０．００６％、００．００７％、０．００８％、０．００９％、０．０１％、０．０２％、０．０３％、０．０４％、０．０５％、０．０６％、０．０７％、０．０８％、０．０９％もしくは０．１％の濃度で組成物に存在し得る。カルシウムＥＤＴＡ（ＣａＥＤＴＡ）などの金属キレート化剤も、例えば、約０．０２ｍＭ〜２０ｍＭの間、例えば、０．０２ｍＭ、０．０４ｍＭ、０．０６ｍＭ、０．０８ｍＭ、０．１ｍＭ、０．２ｍＭ、０．３ｍＭ、０．４ｍＭ、０．５ｍＭ、０．６ｍＭ、０．７ｍＭ、０．８ｍＭ、０．９ｍＭ、１ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭまたはそれ以上の濃度で存在し得る。組成物のｐＨおよび浸透圧は、組成物の所望の活性および安定性の条件を最適化するよう当業者によって調整できる。いくつかの例では、本明細書において提供される組成物は、１００ｍＯｓｍ／ｋｇ、１２０ｍＯｓｍ／ｋｇ、１４０ｍＯｓｍ／ｋｇ、１６０ｍＯｓｍ／ｋｇ、１８０ｍＯｓｍ／ｋｇ、２００ｍＯｓｍ／ｋｇ、２２０ｍＯｓｍ／ｋｇ、２４０ｍＯｓｍ／ｋｇ、２６０ｍＯｓｍ／ｋｇ、２８���ｍＯｓｍ／ｋｇ、３００ｍＯｓｍ／ｋｇ、３２０ｍＯｓｍ／ｋｇ、３４０ｍＯｓｍ／ｋｇ、３６０ｍＯｓｍ／ｋｇ、３８０ｍＯｓｍ／ｋｇ、４００ｍＯｓｍ／ｋｇ、４２０ｍＯｓｍ／ｋｇ、４４０ｍＯｓｍ／ｋｇ、４６０ｍＯｓｍ／ｋｇ、５００ｍＯｓｍ／ｋｇもしくはそれ以上または約１００ｍＯｓｍ／ｋｇ、１２０ｍＯｓｍ／ｋｇ、１４０ｍＯｓｍ／ｋｇ、１６０ｍＯｓｍ／ｋｇ、１８０ｍＯｓｍ／ｋｇ、２００ｍＯｓｍ／ｋｇ、２２０ｍＯｓｍ／ｋｇ、２４０ｍＯｓｍ／ｋｇ、２６０ｍＯｓｍ／ｋｇ、２８０ｍＯｓｍ／ｋｇ、３００ｍＯｓｍ／ｋｇ、３２０ｍＯｓｍ／ｋｇ、３４０ｍＯｓｍ／ｋｇ、３６０ｍＯｓｍ／ｋｇ、３８０ｍＯｓｍ／ｋｇ、４００ｍＯｓｍ／ｋｇ、４２０ｍＯｓｍ／ｋｇ、４４０ｍＯｓｍ／ｋｇ、４６０ｍＯｓｍ／ｋｇ、５００ｍＯｓｍ／ｋｇもしくはそれ以上の浸透圧および６、６．２、６．４、６．６、６．８、７、７．２、７．４、７．６、７．８もしくは８のｐＨまたは約６、６．２、６．４、６．６、６．８、７、７．２、７．４、７．６、７．８もしくは８のｐＨを有する。
【０２９０】
通常、本明細書における処方中、ＮａＣｌは、例えば、１００ｍＭ〜１５０ｍＭもしくはそれ以上または約１００ｍＭ〜１５０ｍＭもしくはそれ以上の量で提供される。例えば、例示的処方は、１０ｍＭまたは約１０ｍＭヒスチジンおよび／または１３０ｍＭもしくは約１３０ｍＭ  ＮａＣｌで含有し得る。その他の処方は、さらに、あるいは、ラクトースを例えば、１３ｍｇ／ｍｌまたは約１３ｍｇ／ｍｌで含有し得る。さらに、それだけには限らないが、チオメルサールをはじめとする抗菌剤または抗真菌剤が処方中に存在し得る。処方は、アルブミン、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８、ＴＷＥＥＮ（登録商標）および／またはその他の界面活性剤をさらに含有し得る。処方は、６．０、６．１．、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３もしくは７．４または約６．０、６．１．、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３もしくは７．４、通常、ｐＨ６．５または約ｐＨ６．５であるｐＨで提供される。本明細書において使用するための修飾された可溶性ヒアルロニダーゼの濃縮処方は、通常、適当な塩濃度を維持するよう、投与に先立って生理食塩水溶液またはその他の塩緩衝溶液で希釈される。
【０２９１】
注射物質は、局所投与および全身投与のために設計される。本明細書における目的上、蓄積された、または過剰のヒアルロナンと関連している患部間質への直接投与のために局所投与が望ましい。非経口投与のための処方として、注射用に準備された滅菌溶液、皮下錠剤をはじめとする、使用の直前に溶媒と組み合わせられるよう準備された凍結乾燥散剤などの滅菌乾燥可溶性製品、注射のために準備された滅菌懸濁液、使用の直前にビヒクルと組み合わせられるよう準備された滅菌乾燥不溶性製品および滅菌エマルジョンが挙げられる。溶液は、水性または非水性のいずれかであり得る。静脈内に投与される場合には、適した担体として、生理食塩水またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ならびにグルコース、ポリエチレングリコールおよびポリプロピレングリコールおよびそれらの混合物などの増粘剤および可溶化剤を含有する溶液が挙げられる。
【０２９２】
非経口処方において使用される製薬上許容される担体として、水性ビヒクル、非水性ビヒクル、抗菌剤、等張剤、バッファー、抗酸化物質、局所麻酔、懸濁剤および分散剤、乳化剤、金属イオン封鎖剤またはキレート化剤およびその他の製薬上許容される物質が挙げられる。水性ビヒクルの例として、塩化ナトリウム注射液、リンガー注射液、等張ブドウ糖注射液、注射用滅菌水、ブドウ糖および乳酸リンガー注射液が挙げられる。非水性非経口ビヒクルとして、植物起源の硬化油、綿実油、コーンオイル、ゴマ油およびピーナッツオイルが挙げられる。静菌濃度または静真菌濃度の抗菌剤を、複数回用量容器にパッケージングされた非経口処方に加えることができ、これとして、フェノールまたはクレゾール、水銀剤、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルおよびプロピルｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル、チメロサール、塩化ベンザルコニウムおよび塩化ベンゼトニウムが挙げられる。等張剤として、塩化ナトリウムおよびデキストロースが挙げられる。バッファーとして、リン酸およびクエン酸が挙げられる。抗酸化物質として、重硫酸ナトリウムが挙げられる。局所麻酔として、塩酸プロカインが挙げられる。懸濁剤および分散剤として、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロースおよびポリビニルピロリドンが挙げられる。乳化剤として、ポリソルベート８０（ＴＷＥＥＮｓ  ８０）が挙げられる。金属イオンの金属イオン封鎖剤またはキレート化剤として、ＥＤＴＡが挙げられる。製薬担体としてまた、水混和性ビヒクルのためのエチルアルコール、ポリエチレングリコールおよびプロピレングリコールおよびｐＨ調整のための水酸化ナトリウム、塩酸、クエン酸または乳酸も挙げられる。
【０２９３】
静脈内に投与される場合には、適した担体として、生理食塩水またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ならびにグルコース、ポリエチレングリコールおよびポリプロピレングリコールおよびそれらの混合物などの増粘剤および可溶化剤を含有する溶液が挙げられる。
【０２９４】
製薬上活性な化合物の濃度は、注射が、所望の薬理学的効果を生じるのに有効な量を提供するよう調整される。本明細書において別の場所で論じられるように、修飾された可溶性ヒアルロニダーゼは、３Ｕ／ｍＬまたは約３Ｕ／ｍＬの血漿中のヒアルロニダーゼを維持するのに十分な量で提供される。正確な用量は、当技術分野で公知であるように、年齢、体重および患者または動物の状態に応じて変わる。単位用量非経口処方は、アンプル、バイアルまたは針をつけたシリンジ中にパッケージングされる。製薬上活性な化合物を含有する、液体溶液または再構成された粉末処方の容量は、治療される疾患およびパッケージのために選択される個々の製品の関数である。非経口投与用のすべての処方は、当技術分野で公知であり、実施されているように無菌でなくてはならない。
【０２９５】
ｂ．凍結乾燥散剤
溶液、エマルジョンおよびその他の混合物として投与するために再構成され得る凍結乾燥散剤が、本明細書において注目される。それらはまた、固体またはゲルとしても再構成され処方され得る。
【０２９６】
滅菌凍結乾燥散剤は、可溶性ヒアルロニダーゼの化合物および／または第２の薬剤を、バッファー溶液に溶解することによって調製する。バッファー溶液は、散剤または散剤から調製された再構成された溶液の安定性またはその他の薬理学的成分を改善する賦形剤を含有し得る。その後の溶液の滅菌濾過と、それに続く、当業者に公知の標準条件下での凍結乾燥によって、所望の処方が提供される。手短には、デキストロース、ソルビタル、フルクトース、コーンシロップ、キシリトール、グリセリン、グルコース、スクロースまたはその他の適した薬剤などの賦形剤を、クエン酸、リン酸ナトリウムもしくはカリウムなどの適したバッファーまたは当業者に公知のその他のこのようなバッファーに溶解することによって凍結乾燥散剤を調製する。次いで、得られた混合物に選択された酵素を加え、溶解するまで撹拌する。得られた混合物を滅菌濾過し、粒子状物質を除去するよう処理し、無菌性を確実にし、凍結乾燥のためのバイアルに分配する。各バイアルは、化合物の単回投与量（１ｍｇ〜１ｇ、通常、１〜１００ｍｇ、例えば、１〜５ｍｇ）または複数回投与量を含有する。凍結乾燥散剤は、約４℃〜室温でなど、適当な条件下で保存できる。
【０２９７】
この凍結乾燥散剤のバッファー溶液を用いる再構成によって、非経口投与において使用するための処方が提供される。正確な量は、治療される適応症および選択される化合物に応じて変わる。このような量は、経験的に決定することができる。
【０２９８】
ｃ．局所投与
局所混合物は、局所投与および全身投与について記載されたとおりに調製する。得られた混合物は、溶液、懸濁液、エマルジョンなどであり得、クリーム、ゲル、軟膏、エマルジョン、溶液、エリキシル、ローション、懸濁液、チンキ、ペースト、発泡物質、エアロゾル、灌水、噴霧剤、坐剤、絆創膏、皮膚パッチまたは任意の局所投与に適したその他の処方として処方される。
【０２９９】
化合物またはその製薬上許容される誘導体は、吸入などによる局所適用のためのエアロゾルとして処方できる（例えば、炎症性疾患、特に喘息を治療するために有用なステロイドのデリバリーのためのエアロゾルを記載する米国特許第４，０４４，１２６号、同４，４１４，２０９号および同４，３６４，９２３号参照）。気道に投与するためのこれらの処方は、単独またはラクトースなどの不活性担体と組み合わせた、噴霧器用のエアロゾルもしくは溶液、または吹送用の超微粒粉末のような形態であり得る。このような場合には、処方の粒子は、通常、５０ミクロン未満、好ましくは、１０ミクロン未満のの直径となる。
【０３００】
化合物は、ゲル、クリームおよびローションの形態で、皮膚および眼などにおける粘膜への局所適用用、眼への適用用に、または大槽内もしくは脊髄内適用用など、局所適用または局所適用用に処方できる。局所投与は、経皮デリバリー用に、また眼もしくは粘膜への投与用に、または吸入治療用に考慮される。活性な化合物の、単独またはその他の製薬上許容される賦形剤と組み合わせた鼻腔溶液も投与できる。
【０３０１】
経皮投与に適した処方が提供される。それらは、レシピエントの表皮と長期間密接に接触したままにするよう適合された個別のパッチなど、任意の適した形式で提供され得る。このようなパッチは、例えば、活性な化合物に関して０．１〜０．２Ｍの濃度の活性な化合物を、所望により緩衝された水溶液中に含有する。経皮投与に適した処方はまた、イオン導入法によってデリバリーでき（例えば、Pharmaceutical Research 3(6)、318 (1986)参照）、通常、活性な化合物の所望により緩衝された水溶液の形態をとる。
【０３０２】
ｄ．その他の投与経路のための組成物
本明細書では、治療される状態に応じて、局所適用、経皮パッチ、経口および直腸投与などのその他の投与経路も考慮される。例えば、直腸投与のための薬剤剤形として、全身効果のための、直腸用坐剤、カプセル剤および錠剤がある。直腸用坐剤は、体温で融解または軟化し、１種または複数の薬理学的に、または治療上有効な成分を放出する、直腸への挿入のための固形物を含む。直腸用坐剤に使用される製薬上許容される物質として、融点を挙げるための、基剤またはビヒクルおよび薬剤がある。基剤の例として、ココアバター（テオブロマ（ｔｈｅｏｂｒｏｍａ）油）、グリセリン−ゼラチン、カルボワックス（ｃａｒｂｏｗａｘ）（ポリオキシエチレングリコール）ならびに脂肪酸のモノ−、ジ−およびトリグリセリドの適当な混合物が挙げられる。種々の基剤の組合せを使用できる。坐剤の融点を上げるための薬剤として、鯨蝋およびワックスが挙げられる。直腸用坐剤は、圧縮法または成形のいずれかによって調製できる。直腸用坐剤の通常の重量は、約２〜３ｇｍである。直腸投与のための錠剤およびカプセル剤は、経口投与のための処方についてと同じ製薬上許容される物質を使用し、同じ方法によって製造する。
【０３０３】
直腸投与に適した処方は、単位用量坐剤として提供され得る。これらは、活性化合物を、１種または複数の従来の固体担体、例えば、ココアバターと混合すること、次いで、得られた混合物を成形することによって調製できる。
【０３０４】
経口投与には、医薬組成物は、例えば、結合剤（例えば、プレゼラチン化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロースなどの）；増量剤（例えば、ラクトース、微晶質セルロースまたはリン酸水素カルシウム）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルクまたはシリカ）；崩壊剤（例えば、ジャガイモデンプナンまたはグリコール酸ナトリウムデンプン）；または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウムなどの製薬上許容される賦形剤を用いて従来の手段によって調製される錠剤またはカプセル剤の形態をとり得る。錠剤は、当技術分野で周知の方法によってコーティングしてもよい。
【０３０５】
口内（舌下）投与に適した処方として、例えば、フレーバーのつけられた基剤、通常、スクロースおよびアラビアガムまたはトラガカント中に活性な化合物を含有するロゼンジ剤；およびゼラチンおよびグリセリンまたはスクロースおよびアラビアガムなどの不活性基剤中に化合物を含有するトローチ剤が挙げられる。
【０３０６】
医薬組成物はまた、制御放出処方および／またはデリバリー装置によって投与できる（例えば、米国特許第３，５３６，８０９号；同３，５９８，１２３号；同３，６３０，２００号；同３，８４５，７７０号；同３，８４７，７７０号；同３，９１６，８９９号；同４，００８，７１９号；同４，６８７，６１０号；同４，７６９，０２７号；同５，０５９，５９５号；同５，０７３，５４３号；同５，１２０，５４８号；同５，３５４，５６６号；同５，５９１，７６７号；同５，６３９，４７６号；同５，６７４，５３３号および同５，７３３，５６６号中を参照）。
【０３０７】
それだけには限らないが、リポソームへの封入、微粒子、マイクロカプセル、化合物を発現できる組換え細胞、受容体媒介性エンドサイトーシスおよびレトロウイルスデリバリー系などの可溶性ヒアルロニダーゼをコードする核酸分子またはその他の薬剤のデリバリーなど、種々のデリバリー系が公知であり、選択された組成物を投与するために使用できる。
【０３０８】
したがって、特定の実施形態では、本明細書における組成物の投与に関してリポソームおよび／またはナノ粒子も使用できる。リポソームは、水性媒体中に分散され、多重膜同心性二層小胞（多重膜小胞（ＭＬＶ）とも呼ばれる）を自発的に形成するリン脂質から形成される。ＭＬＶは、通常、２５ｎｍ〜４μｍの直径を有する。ＭＬＶの超音波処理は、コア中に水溶液を含有する２００〜５００オングストロームの範囲の直径を有する小さな一枚膜小胞（ｓｍａｌｌ  ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ  ｖｅｓｉｃｌｅｓ）（ＳＵＶ）の形成をもたらす。
【０３０９】
リン脂質は、脂質対水のモル比に応じて、水中に分散されると、リポソーム以外の種々の構造を形成し得る。低い比では、リポソームが生じる。リポソームの物理的特性は、ｐＨ、イオン強度および二価のカチオンの存在に応じて変わる。リポソームは、イオン性物質および極性物質に対して低い透過性を示し得るが、高温下では、その透過性を著しく変更する相転移を受ける。相転移は、ゲル状態として知られる、ぎっしりと詰まっている、正しく並べられた構造から、流体状態として知られる、ゆるく詰まっている、あまり正しく並べられていない構造への変化を含む。これは、特有の相転移温度で起こり、イオン、糖および薬物に対する透過性の増大をもたらす。
【０３１０】
リポソームは、種々の機序：マクロファージおよび好中球などの細網内皮系の食細胞によるエンドサイトーシス；非特異的な弱い疎水性力もしくは静電気力、または細胞表面成分との特異的相互作用のいずれかによる細胞表面への吸着；細胞膜へのリポソームの脂質二重層の挿入による形質細胞膜との融合およびリポソーム内容物の細胞室への同時放出；およびリポソーム内容物の関連は全くない、細胞膜または細胞内膜へのリポソーム脂質の、またはその逆の移動によって細胞と相互作用する。リポソーム処方を変更することは、どの機序が働くかを変更し得るが、２以上が同時に働く場合もある。ナノカプセルは、通常、安定な再現性のある方法で化合物を封入できる。細胞内ポリマー過負荷による副作用を避けるために、このような超微粒子（約０．１μｍの大きさの）は、ｉｎ  ｖｉｖｏで分解され得るポリマーを使用して設計されなくてはならない。これらの必要条件を満たす生分解性ポリアルキル−シアノアクリレートナノ粒子が、本明細書における使用のために考慮され、このような粒子は容易に製造できる。
【０３１１】
２．用法用量
活性な薬剤、例えば、ヒアルロニダーゼなどのヒアルロナン分解酵素および／または第２の薬剤は、治療される患者に対する望ましくない副作用がなく、治療上有用な効果を発揮するのに十分な量で含まれる。例えば、本明細書において別の場所に記載されるように、修飾された可溶性ヒアルロニダーゼは、血漿中少なくとも３Ｕ／ｍＬまたは約３Ｕ／ｍＬ、通常、３Ｕ／ｍＬ〜１２Ｕ／ｍＬ以上、例えば、約４Ｕ／ｍＬ、５Ｕ／ｍＬ、６Ｕ／ｍＬ、７Ｕ／ｍＬ、８Ｕ／ｍＬ、９Ｕ／ｍＬ、１０Ｕ／ｍＬ、１１Ｕ／ｍＬ、１２Ｕ／ｍＬ、１３Ｕ／ｍＬ、１４Ｕ／ｍＬ、１５Ｕ／ｍＬ、１６Ｕ／ｍＬ、１７Ｕ／ｍＬ、１８Ｕ／ｍＬ、１９Ｕ／ｍＬ、２０Ｕ／ｍＬ、２５Ｕ／ｍＬ、３０Ｕ／ｍＬ、３５Ｕ／ｍＬ、４０Ｕ／ｍＬ、４５Ｕ／ｍＬ、５０Ｕ／ｍＬ以上のレベルで維持するのに十分な量で全身投与のために処方される。
【０３１２】
血液中、少なくとも３Ｕ／ｍＬのヒアルロニダーゼを維持するための、修飾されたヒアルロナン（ｈｙａｌｕｒｏｎ）分解酵素、例えば、修飾された可溶性ヒアルロニダーゼの量を決定することは、当業者のレベルの範囲内である。血液中のヒアルロニダーゼのレベルは、血液中に十分な量のヒアルロニダーゼが存在することを確実にするために経時的にモニタリングできる。血漿中のヒアルロニダーゼを測定するための当業者に公知の任意のアッセイを実施してよい。例えば、本明細書において例に記載されるマイクロ濁度アッセイまたは酵素アッセイを、血漿中のタンパク質で実施できる。血漿は、通常、ヒアルロニダーゼ酵素を含むということは理解される。このような血漿ヒアルロニダーゼ酵素は、通常、酸性ｐＨで活性を有する（米国特許第７，１０５，３３０号）。従って、修飾された酵素を用いる治療の前に、ヒアルロニダーゼの血漿レベルを決定し、ベースラインとして使用するべきである。治療後の血漿ヒアルロニダーゼレベルのその後の測定を、治療前のレベルと比較することができる。あるいは、アッセイは、普通は、酸性ｐＨで活性を示す血漿中の内因性リポソームヒアルロニダーゼ活性を抑制するｐＨ条件下で実施してもよい。したがって、修飾された可溶性ヒアルロニダーゼが中性ｐＨで活性である場合は（例えば、ヒトＰＨ２０）、修飾された中性で活性な可溶性ヒアルロニダーゼのレベルのみが測定される。
【０３１３】
活性な薬剤を含有する組成物は、製薬上許容される担体を含み得る。治療上有効な濃度は、本明細書において提供されるアッセイなどの公知のｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ系で化合物を調べることによって経験的に決定できる。組成物中の可溶性ヒアルロニダーゼなどのヒアルロナン分解酵素または第２の薬剤の濃度は、複合体の吸収、不活性化および排泄速度、複合体の物理化学的特徴、投与スケジュールおよび投与される量ならびに当業者に公知のその他の因子に応じて変わる。例えば、正確な投与量および治療期間は、治療されている組織の関数であり、公知の試験プロトコールを使用して経験的に、またはｉｎ  ｖｉｖｏもしくはｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験データからの外挿によって決定でき、および／または個々の薬剤の既知投与計画から決定できるということは理解される。例えば、抗癌剤などのヒアルロナン関連疾患および状態の治療のための薬剤および治療は、当技術分野で周知である。したがって、組成物中の第２の薬剤の投与量は、所与の投与経路下のその薬剤の標準的な投与計画に基づいて選択できる。
【０３１４】
濃度および投与量の値はまた、治療される個体の年齢とともに変わるということは留意すべきである。任意の特定の対象について、固有の投与計画は、個体の必要性および処方を投与するか、処方の投与を監督する専門家としての判断にしたがって経時的に調整されるべきであるということ、および本明細書において示される濃度範囲は、単に例示的なものであって、その範囲を制限するよう意図されるものではないということはさらに理解されるべきである。組成物は、毎時間、毎日、毎週、毎月、毎年または１度だけ投与してもよい。通常、投与計画は、毒性を制限するよう選択される。主治医は、毒性または骨髄、肝臓もしくは腎臓もしくはその他の組織機能障害のために投与量を下げるために、治療をどのように、いつ、終結、中断または調整するかを承知しているということは留意されるべきである。反対に、主治医はまた、臨床反応が適切ではない場合に（毒性副作用を除いて）、治療を、より高いレベルにどのように、いつ調整するかを承知している。
【０３１５】
疾患または状態、例えば、ＨＡが豊富な腫瘍などのヒアルロナン関連疾患または状態の治療のために投与されるべき、可溶性ヒアルロニダーゼなどのヒアルロナン分解酵素の量は、標準臨床技術によって決定できる。さらに、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイおよび動物モデルを使用して、最適投与量範囲を同定するのを補助することができる。経験的に決定できる正確な投与量は、個々の酵素、投与経路、治療される疾患の種類および疾患の重篤度に応じて変わり得る。例示的投与量範囲は、ポリマーとコンジュゲートしている、５０ユニット〜５０，０００，０００ユニットまたは約５０ユニット〜５０，０００，０００ユニットの可溶性ヒアルロニダーゼあるいはポリマーとコンジュゲートしている、機能的に同等な量の別のヒアルロナン分解酵素である。本明細書において、活性のユニットは、標準活性、例えば、ヒアルロニダーゼ活性をアッセイするマイクロ濁度アッセイにおいて測定されるような活性に対して正規化されるということは理解される。
【０３１６】
ポリマーとコンジュゲートしている可溶性ヒアルロニダーゼ、例えば、ＰＥＧ化可溶性ヒアルロニダーゼは、１ｍｇの総タンパク質あたり、より低い活性を示す、すなわち、そのようにコンジュゲートしていない天然可溶性ヒアルロニダーゼと比較して、より低い比活性を示し得る。例えば、本明細書において別の場所で記載されるように、例示的ｒＨｕＰＨ２０調製物は、１２０，０００ユニット／ｍｇの比活性を示すのに対し、ｒＨｕＰＨ２０のＰＥＧ化型は、３０，０００ユニット／ｍｇの比活性を示す。通常、ｒＨｕＰＨ２０のＰＥＧ化型は、２６，０００または約２６，０００から３８，０００または約３８，０００Ｕ／ｍｇの間の範囲内の比活性を示す。したがって、同等のユニットの活性を達成するには、より多量の総タンパク質が必要である。例えば、ポリマーとコンジュゲートしている、可溶性ヒアルロニダーゼなどのヒアルロナン分解酵素は、同一ユニットの、そのようにコンジュゲートしていない可溶性ヒアルロニダーゼなどのヒアルロナン分解酵素の活性を達成するには、１．５倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍またはそれ以上の総タンパク質（ｍｇで）を必要とする。しかし、本明細書における目的上、投与量はユニットを基準にしている。
【０３１７】
したがって、例えば、ポリマー、例えば、ＰＥＧとコンジュゲートしている、本明細書において提供される可溶性ヒアルロニダーゼは、１０〜５０，０００，０００ユニット、１０〜４０，０００，０００ユニット、１０〜３６，０００，０００ユニット、１０〜１２，０００，０００ユニット、１０〜１，２００，０００ユニット、１０〜１，０００，０００ユニット、１０〜５００，０００ユニット、１００〜１００，０００ユニット、５００〜５０，０００ユニット、１０００〜１０，０００ユニット、５０００〜７５００ユニット、５０００ユニット〜５０，０００ユニット、もしくは１，０００〜１０，０００ユニットまたは約１０〜５０，０００，０００ユニット、１０〜４０，０００，０００ユニット、１０〜３６，０００，０００ユニット、１０〜１２，０００，０００ユニット、１０〜１，２００，０００ユニット、１０〜１，０００，０００ユニット、１０〜５００，０００ユニット、１００〜１００，０００ユニット、５００〜５０，０００ユニット、１０００〜１０，０００ユニット、５０００〜７５００ユニット、５０００ユニット〜５０，０００ユニット、もしくは１，０００〜１０，０００ユニットで投与できる。ヒアルロニダーゼではないヒアルロナン分解酵素がポリマーとコンジュゲートしている場合には、１０〜５０，０００，０００ユニット、１０〜４０，０００，０００ユニット、１０〜３６，０００，０００ユニット、１０〜１２，０００，０００ユニット、１０〜１，２００，０００ユニット、１０〜１，０００，０００ユニット、１０〜５００，０００ユニット、１００〜１００，０００ユニット、５００〜５０，０００ユニット、１０００〜１０，０００ユニット、５０００〜７５００ユニット、５０００ユニット〜５０，０００ユニットもしくは１，０００〜１０，０００ユニットまたは約１０〜５０，０００，０００ユニット、１０〜４０，０００，０００ユニット、１０〜３６，０００，０００ユニット、１０〜１２，０００，０００ユニット、１０〜１，２００，０００ユニット、１０〜１，０００，０００ユニット、１０〜５００，０００ユニット、１００〜１００，０００ユニット、５００〜５０，０００ユニット、１０００〜１０，０００ユニット、５０００〜７５００ユニット、５０００ユニット〜５０，０００ユニットもしくは１，０００〜１０，０００ユニットと機能的に同等である量で投与できる。
【０３１８】
一般に、本明細書における目的上、血漿中、少なくとも３Ｕ／ｍＬのヒアルロニダーゼを維持するために、０．０２ｍｇ／ｋｇ（対象の）、０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．０４ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．０６ｍｇ／ｋｇ、０．０７ｍｇ／ｋｇ、０．０８ｍｇ／ｋｇ、０．０９ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．１５ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．２５ｍｇ／ｋｇ、０．３０ｍｇ／ｋｇ、０．３５ｍｇ／ｋｇ、０．４０ｍｇ／ｋｇ、０．４５ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．５５ｍｇ．ｋｇ、０．６ｍｇ／ｋｇ、０．７ｍｇ／ｋｇ、０．８ｍｇ／ｋｇ、０．９ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、１．１ｍｇ／ｋｇ、１．２ｍｇ／ｋｇ、１．３ｍｇ／ｋｇ、１．４ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇもしくはそれ以上または約０．０２ｍｇ／ｋｇ（対象の）、０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．０４ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．０６ｍｇ／ｋｇ、０．０７ｍｇ／ｋｇ、０．０８ｍｇ／ｋｇ、０．０９ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．１５ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．２５ｍｇ／ｋｇ、０．３０ｍｇ／ｋｇ、０．３５ｍｇ／ｋｇ、０．４０ｍｇ／ｋｇ、０．４５ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．５５  ｍｇ．ｋｇ、０．６ｍｇ／ｋｇ、０．７ｍｇ／ｋｇ、０．８ｍｇ／ｋｇ、０．９ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、１．１ｍｇ／ｋｇ、１．２ｍｇ／ｋｇ、１．３ｍｇ／ｋｇ、１．４ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇもしくはそれ以上が投与される。一般に、修飾されたヒアルロニダーゼの比活性は、２０，０００Ｕ／ｍｇ〜６０，０００Ｕ／ｍｇまたは約２０，０００Ｕ／ｍｇ〜６０，０００Ｕ／ｍｇであり、一般に、３５，０００Ｕ／ｍｇ、６０，０００Ｕ；７０，０００Ｕ；８０，０００Ｕ；９０，０００Ｕ；１００，０００Ｕ；２００，０００Ｕ；３００，０００Ｕ；４００，０００Ｕ；５００，０００Ｕ；６００，０００Ｕ；７００，０００Ｕ；８００，０００Ｕ；９００，０００Ｕ；１，０００，０００Ｕ；１，５００，０００Ｕ；２，０００，０００Ｕ；２，５００，０００Ｕ；３，０００，０００Ｕ；３，５００，０００Ｕ；４，０００，０００Ｕもしくはそれ以上または約３５，０００Ｕ／ｍｇ、６０，０００Ｕ；７０，０００Ｕ；８０，０００Ｕ；９０，０００Ｕ；１００，０００Ｕ；２００，０００Ｕ；３００，０００Ｕ；４００，０００Ｕ；５００，０００Ｕ；６００，０００Ｕ；７００，０００Ｕ；８００，０００Ｕ；９００，０００Ｕ；１，０００，０００Ｕ；１，５００，０００Ｕ；２，０００，０００Ｕ；２，５００，０００Ｕ；３，０００，０００Ｕ；３，５００，０００Ｕ；４，０００，０００Ｕもしくはそれ以上である場合に投与される。
【０３１９】
通常、本明細書において考慮されるヒアルロニダーゼの注射剤または注入剤の容積は、０．５ｍｌ、１ｍｌ、２ｍｌ、３ｍｌ、４ｍｌ、５ｍｌ、６ｍｌ、７ｍｌ、８ｍｌ、９ｍｌ、１０ｍｌ、１５ｍｌ、２０ｍｌ、３０ｍｌ、４０ｍｌ、５０ｍｌもしくはそれ以上または約０．５ｍｌ、１ｍｌ、２ｍｌ、３ｍｌ、４ｍｌ、５ｍｌ、６ｍｌ、７ｍｌ、８ｍｌ、９ｍｌ、１０ｍｌ、１５ｍｌ、２０ｍｌ、３０ｍｌ、４０ｍｌ、５０ｍｌもしくはそれ以上である。ヒアルロニダーゼなどのヒアルロナン分解酵素は、５０Ｕ／ｍｌ、１００Ｕ／ｍｌ、１５０Ｕ／ｍｌ、２００Ｕ／ｍｌ、４００Ｕ／ｍｌもしくは５００Ｕ／ｍｌまたは約５０Ｕ／ｍｌ、１００Ｕ／ｍｌ、１５０Ｕ／ｍｌ、２００Ｕ／ｍｌ、４００Ｕ／ｍｌもしくは５００Ｕ／ｍｌ（または機能的に同等な量）で保存溶液として提供され得、または直接的に使用するため、もしくは使用前に有効な濃度に希釈するために、より濃縮された形態で、例えば、１０００Ｕ／ｍｌ、１５００ユニット／ｍｌ、２０００Ｕ／ｍｌ、４０００Ｕ／ｍｌもしくは５０００Ｕ／ｍｌまたは約１０００Ｕ／ｍｌ、１５００ユニット／ｍｌ、２０００Ｕ／ｍｌ、４０００Ｕ／ｍｌもしくは５０００Ｕ／ｍｌで提供され得る。投与される可溶性ヒアルロニダーゼなどのヒアルロナン分解酵素の容量は、必要とされる投与量の関数であるが、可溶性ヒアルロニダーゼなどのヒアルロナン分解酵素の濃度、利用可能な保存処方に応じて変わり得る。例えば、可溶性ヒアルロニダーゼなどのヒアルロナン分解酵素は、約５０ｍｌを超える用量では投与されず、通常、５〜３０ｍｌの容量、一般に、約１０ｍＬを超えない容量で投与されるということが本明細書において考慮される。高容量には、医師の裁量でシリンジポンプを使用できる。投与のタイミングもまた、治療医師によって調整できる。例えば、静脈内に投与される場合には、シリンジポンプを使用して、１分、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０またはそれ以上の分数の期間、一般に、１５または約１５分をかけて組成物を投与できる。可溶性ヒアルロニダーゼなどのヒアルロナン分解酵素は、液体または凍結乾燥処方として提供され得る。凍結乾燥処方が、大きなユニット用量のヒアルロナン分解酵素の保存にとって理想的である。
【０３２０】
一例では、疾患または状態を治療するためのヒアルロナン分解酵素および第２の薬剤または治療を投与することによって、可溶性ヒアルロニダーゼなどのヒアルロナン分解酵素が併用療法の一部として投与される。一例では、ヒアルロナン分解酵素および第２の薬剤または治療は、同時処方し、一緒に投与できる。別の例では、可溶性ヒアルロニダーゼなどのヒアルロナン分解酵素は、第２の薬剤または治療調製物に続いて、断続的にまたは同時に投与される。一般に、ヒアルロナン分解酵素は、第２の薬剤または治療調製物の投与に先立って投与され、ヒアルロナン分解酵素が、対象の細胞、組織または流体、例えば、間質空間、細胞外マトリックス、腫瘍組織、血液またはその他の組織中のヒアルロン酸を分解するのを可能にする。例えば、可溶性ヒアルロニダーゼなどのヒアルロナン分解酵素は、第２の薬剤調製物の投与に、０．５分、１分、２分、３分、４分、５分、６分、７分、８分、９分、１０分、２０分、３０分、１時間またはそれ以上先だって投与できる。いくつかの例では、ヒアルロナン分解酵素は、第２の薬剤調製物と一緒に投与される。当業者には当然であろうが、同時投与の所望の近接性は、かなりの部分、特定の組織環境における薬剤の効果半減期、治療されている特定の疾患に応じて変わり、適した動物モデルなど、適したモデルにおいてさまざまな時点で薬剤を投与することの効果を調べることによって容易に最適化できる。いくつかの状態では、ヒアルロニダーゼなどのヒアルロナン分解酵素の投与の最適なタイミングは、６０分を越える。
【０３２１】
１つまたは複数の第２の薬剤または治療の調製物は、１回で投与してもよく、時間間隔をおいて投与される、いくつかのより小さい用量に分割できる。選択された薬剤／治療調製物は、治療時間の過程にわたって、例えば、数時間、数日、数週間または数カ月にわたって、１または複数の用量で投与できる。いくつかの場合には、連続投与が有用である。正確な投与量および投与の経過は、適応症および患者の耐容性に応じて変わるということは理解される。一般に、本明細書における第２の薬剤／治療の投与計画は、当業者に知られている。
【０３２２】
３．併用療法
本明細書に記載される組成物または組合せのいずれも、ヒアルロナン関連癌を治療するための手順、例えば、薬剤または治療などの、その他の治療薬または薬理作用物質または治療と一緒に、それに先立って、それと断続的に、またはその後に、さらに同時処方または同時投与できる。このような薬剤として、それだけには限らないが、生物製剤、小分子化合物、分散剤、麻酔薬、血管収縮剤および手術ならびにそれらの組合せが挙げられる。本明細書において例示されるすべてのものを含め、疾患または状態の治療のために利用可能である、このようなその他の薬剤および治療は、当業者に公知であり、経験的に決定できる。別の例では、局所麻酔薬、例えば、リドカインを投与して、疼痛緩和を提供できる。いくつかの例では、麻酔は、麻酔効果の期間を増大するために血管収縮薬と組み合わせて提供され得る。
【０３２３】
したがって、一例では、本明細書において提供される組成物を、局所麻酔と同時処方または同時投与できる。麻酔として、短時間作用型および持続性局所麻酔薬処方が挙げられる。短時間作用型局所麻酔薬処方は、生理食塩水またはその他の適した注射用ビヒクルに溶解したリドカインまたは関連局所麻酔薬を含有する。通常、短時間作用型局所麻酔薬を用いる局所麻酔は、約２０〜３０分持続する。例示的麻酔薬として、例えば、アンブカイン（ａｍｂｕｃａｉｎｅｓ）；アモキセカイン（ａｍｏｘｅｃａｉｎｅｓ）；アミロカイン；アプトカイン（ａｐｔｏｃａｉｎｅｓ）；アルチカイン；ベノキシネート；ベンジルアルコール；ベンゾカイン；ベトキシカイン（ｂｅｔｏｘｙｃａｉｎｅｓ）；ビフェナミン；ブクリカイン（ｂｕｃｒｉｃａｉｎｅｓ）；ブメカイン（ｂｕｍｅｃａｉｎｅｓ）；ブピバカイン；ブタカイン；ブタムベン；ブタニリカイン；カルビゾカイン（ｃａｒｂｉｚｏｃａｉｎｅｓ）；クロロプロカイン；クリブカイン（ｃｌｉｂｕｃａｉｎｅｓ）；クロダカイン（ｃｌｏｄａｃａｉｎｅｓ）；コカイン；デキシバカイン（ｄｅｘｉｖａｃａｉｎｅｓ）；ジアモカイン（ｄｉａｍｏｃａｉｎｅｓ）；ジブカイン；ジクロニン；エルカイン（ｅｌｕｃａｉｎｅｓ）；エチドカイン；ユープロシン（ｅｕｐｒｏｃｉｎｓ）；フェキシカイン（ｆｅｘｉｃａｉｎｅｓ）；フォモカイン（ｆｏｍｏｃａｉｎｅｓ）；ヘプタカイン（ｈｅｐｔａｃａｉｎｅｓ）；ヘキシルカイン；ヒドロキシプロカイン；ヒドロキシテトラカイン；イソブタムベン；ケトカイン（ｋｅｔｏｃａｉｎｅｓ）；ロイシノカイン（ｌｅｕｃｉｎｏｃａｉｎｅｓ）；リドカイン；メピバカイン；メプリルカイン；オクトカイン（ｏｃｔｏｃａｉｎｅｓ）；オルトカイン（ｏｒｔｈｏｃａｉｎｅｓ）；オキセタキアン（ｏｘｅｔｈａｃａｉｎｅｓ）；オキシブプロカイン；フェナカイン（ｐｈｅｎａｃａｉｎｅｓ）；ピノールカイン（ｐｉｎｏｌｃａｉｎｅｓ）；ピペロカイン（ｐｉｐｅｒｏｃａｉｎｅｓ）；ピリドカイン（ｐｉｒｉｄｏｃａｉｎｅｓ）；ポリドカノール；プラモカイン；プリロカイン；プロカイン；プロパノカイン（ｐｒｏｐａｎｏｃａｉｎｅｓ）；プロピポカイン（ｐｒｏｐｉｐｏｃａｉｎｅｓ）；プロポキシカイン；プロキシメタカイン；ピロカイン（ｐｙｒｒｏｃａｉｎｅｓ）；クアタカイン（ｑｕａｔａｃａｉｎｅｓ）；キニソカイン；リソカイン（ｒｉｓｏｃａｉｎｅｓ）；ロドカイン（ｒｏｄｏｃａｉｎｅｓ）；ロピバカイン；サリチルアルコール；スイカイン（ｓｕｉｃａｉｎｅｓ）；テトラカイン；トラペンカイン（ｔｒａｐｅｎｃａｉｎｅ）；およびトリメカインなどの非吸入局所麻酔ならびにアルファキサロン；アモラノン（ａｍｏｌａｎｏｎｅｓ）；エトキサドロール（ｅｔｏｘａｄｒｏｌｓ）；フェンタニル；ケタミン；レボキサドロール（ｌｅｖｏｘａｄｒｏｌｓ）；メチツラル（ｍｅｔｈｉｔｕｒａｌｓ）；メトヘキシタール；ミダゾラム；ミナキソロン（ｍｉｎａｘｏｌｏｎｅｓ）；プロパニジド；プロポキサート（ｐｒｏｐｏｘａｔｅｓ）；プラモキシン；プロポフォール；レミフェンタニル；スフェンタニル；チレタミン；およびゾラミン（ｚｏｌａｍｉｎｅ）などの種々のその他の非吸入麻酔薬が挙げられる。処方中の有効量は、個々の患者、治療される疾患、投与経路およびその他の検討事項に応じて変わる。このような投与量は、経験的に決定できる。
【０３２４】
局所麻酔の短い半減期のために、このような麻酔薬を血管収縮薬と同時投与または同時処方することが望ましいことが多い。血管収縮剤の例として、カテコールアミンおよびカテコールアミン誘導体をはじめとするαアドレナリン受容体アゴニストが挙げられる。特定の例として、それだけには限らないが、レボノルデフリン（ｌｅｖｏｎｏｒｄｅｆｒｉｎ）、エピネフリンおよびノルエピネフリンが挙げられる。例えば、リドカインなどの局所麻酔薬処方は、低濃度のエピネフリンまたはレボノルデフリンなどの別のアドレナリン受容体アゴニストを含有するよう処方できる。局所麻酔薬を、アドレナリン受容体アゴニストと組み合わせることは、医薬品においてよく見られる（例えば、米国特許第７，２６１，８８９号および同５，９７６，５５６号参照）。麻酔薬の半減期を増大するために血管収縮薬が必要である。エピネフリンなどの血管収縮薬は、注射された組織中の血管上のα−アドレナリン受容体を刺激する。これは、組織中の血管を収縮させる効果を有する。血管収縮は、局所麻酔薬を組織中により長くとどまるようにさせ、その結果、麻酔効果期間が大きく増大する。
【０３２５】
通常、本明細書において血管収縮薬は、麻酔薬と組み合わせて使用される。麻酔薬および血管収縮薬は、単一の医薬組成物の一部として一緒に、または血管収縮薬が、麻酔薬が投与された場所の近くの血管を収縮するよう作用し、麻酔の延長をもたらす限り、別個の医薬組成物の一部として投与できる。一例では、麻酔薬および血管収縮薬は、溶液中で一緒に投与される。さらに、麻酔薬および血管収縮薬は、本明細書において提供される組成物と、一緒に処方してもよく、別個に処方してもよい。単一の処方が好ましい。麻酔薬および血管収縮薬は、注射によって、浸潤によって、または局所投与によって、例えば、ゲルもしくはペーストの一部として一緒に投与できる。通常、麻酔薬および血管収縮薬は、麻酔される部位に注射によって、例えば、皮下投与によって直接投与される。処方中の有効量は、個々の患者、治療される疾患、投与経路およびその他の検討事項に応じて変わる。このような投与量は経験的に決定できる。例えば、リドカインの例示的量は、１０ｍｇ〜１０００ｍｇ、１００ｍｇ〜５００ｍｇ、２００ｍｇ〜４００ｍｇ、２０ｍｇ〜６０ｍｇもしくは３０ｍｇ〜５０ｍｇまたは約１０ｍｇ〜１０００ｍｇ、１００ｍｇ〜５００ｍｇ、２００ｍｇ〜４００ｍｇ、２０ｍｇ〜６０ｍｇもしくは３０ｍｇ〜５０ｍｇである。投与されるリドカインの投与量は、個体および投与経路に応じて変わる。エピネフリンは、例えば、１０μｇ〜５ｍｇ、５０μｇ〜１ｍｇ、５０μｇ〜５００μｇ、５０μｇ〜２５０μｇ、１００μｇ〜５００μｇ、２００μｇ〜４００μｇ、１ｍｇ〜５ｍｇまたは２ｍｇ〜４ｍｇなどの量で投与できる。通常、エピネフリンは、１：１００，０００〜１：２００，０００希釈でリドカインと組み合わせることができ、これは、１００ｍｌの麻酔薬が０．５〜１ｍｇのエピネフリンを含有することを意味する。投与される容積は、治療される疾患および投与経路に応じて調整できる。容積の例示的なものとして、１〜１００ｍｌ、１〜５０ｍｌ、１０〜５０ｍｌ、１０〜３０ｍｌ、１〜２０ｍｌまたは１〜１０ｍｌ、通常、１０〜５０ｍｌの麻酔薬／血管収縮薬処方が挙げられる。投与は、可溶性ヒアルロニダーゼおよび本明細書において提供されるその他の薬剤の組成物の投与の後、それと同時に、またはそれと断続的にであり得る。
【０３２６】
４．パッケージングおよび製品
パッケージング材料、ヒアルロナン関連疾患または状態を治療するのに有効である医薬組成物、ならびに組成物および組合せが、ヒアルロナン関連疾患または状態を治療するために使用されるべきであることを示すラベルを含有する製品も提供される。一例では、医薬組成物は、ヒアルロナン分解酵素を含有し、第２の薬剤または治療を含有しない。別の例では、製品は、ヒアルロナン分解酵素および１つまたは複数の第２の薬剤または治療を含有する。この例では、第２の薬剤および可溶性ヒアルロニダーゼなどのヒアルロナン分解酵素の医薬組成物は、製品としてのパッケージングに、一緒に提供される場合も、別個に提供される場合もある。製品の例示的なものとして、単一チャンバーおよび二重チャンバー容器をはじめとする容器がある。容器として、それだけには限らないが、試験管、ビンおよびシリンジが挙げられる。容器は、皮下投与のためのニードルをさらに含み得る。
【０３２７】
本明細書において提供される製品は、パッケージング材料を含有する。医薬製品のパッケージングにおいて使用するためのパッケージング材料は、当業者に周知である。例えば、各々、その全文が本明細書に組み込まれる米国特許第５，３２３，９０７号、同５，０３３，２５２号および同５，０５２，５５８号参照。薬剤パッケージング材料の例として、それだけには限らないが、ブリスターパック、瓶、試験管、吸入器、ポンプ、バッグ、バイアル、容器、シリンジ、瓶および選択された処方および意図される投与様式および治療に適した任意のパッケージング材料が挙げられる。任意のヒアルロナン関連疾患または状態のために種々の治療が考慮されるように、本明細書において提供される化合物および組成物の幅広い処方が考慮される。
【０３２８】
ヒアルロナン関連疾患または状態を治療するのに有効な組成物（例えば、一緒にまたは別個に提供される、可溶性ヒアルロニダーゼなどのヒアルロナン分解酵素および／または第２の薬剤もしくは治療を含有する組成物（単数または複数））もキットとして提供され得る。キットは、本明細書に記載される医薬組成物および投与のための品目を含み得る。例えば、組成物は、シリンジ、吸入器、投与量カップ、点滴器またはアプリケーターなどの投与のための装置を供給され得る。キットは、投与量、投与計画をはじめとする適用のための使用説明書および投与様式の使用説明書を所望により含み得る。キットはまた、本明細書に記載される医薬組成物および診断のための品目を含み得る。例えば、このようなキットは、ヒアルロナンの濃度、量または活性を測定するための品目を含み得る。
【０３２９】
Ｇ．活性、バイオアベイラビリティおよび薬物動態を評価する方法
アッセイを使用して、対象が、ヒアルロナン関連疾患、状態または障害と関連しているマーカーを有し、したがって、本明細書において提供される方法を使用して治療可能であるかどうかを評価できる。このようなアッセイは、ヒアルロナンの量を測定すること、間質液圧、血管容積および水分含量を測定することを含み得る。また、アッセイを使用して、可溶性ヒアルロニダーゼをはじめとするヒアルロナン分解酵素のｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ活性ならびに例えば、化学療法薬などのその他の薬剤の可溶性修飾されたヒアルロニダーゼなどのヒアルロナン分解酵素の存在下および／または不在下でのｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ活性を評価できる。このようなアッセイの中に、ＰＥＧ化ヒアルロナン分解酵素などの修飾されたヒアルロナン分解酵素（例えば、ＰＥＧ化可溶性ヒアルロニダーゼ）と同時投与される薬剤の薬物動態特性、例えば、バイオアベイラビリティおよび耐容性を評価するものが含まれる。このようなアッセイを使用して、例えば、修飾されたヒアルロナン分解酵素、および所望により、化学療法薬などの同時投与される薬剤の、治療のための適当な投与量および投薬の頻度を決定できる。
【０３３０】
１．ヒアルロナン分解酵素の活性を評価するアッセイ
ヒアルロナン分解酵素の活性は、当技術分野で周知の方法を使用して評価できる。例えば、ヒアルロニダーゼのＵＳＰ  ＸＸＩＩアッセイは、酵素をＨＡと３７℃で３０分間反応させた後に残存する、分解されていないヒアルロン酸またはヒアルロナン、（ＨＡ）基質の量を測定することによって間接的に活性を決定する(USP XXII-NF XVII (1990) 644-645 United States Pharmacopeia Convention、Inc、Rockville、MD)。ヒアルロニダーゼ参照標準（ＵＳＰ）または国民医薬品集（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ）（ＮＦ）標準ヒアルロニダーゼ溶液を、任意のヒアルロニダーゼの、ユニットでの活性を確認するアッセイにおいて使用できる。一例では、活性は、マイクロ濁度（ｍｉｃｒｏｔｕｒｂｉｄｉｄｙ）アッセイを使用して測定される。これは、ヒアルロン酸が血清アルブミンと結合するときの不溶性沈殿の形成に基づく。活性は、ヒアルロニダーゼを、ヒアルロン酸ナトリウム（ヒアルロン酸）とともに一定期間（例えば、１０分）インキュベートすること、次いで、未消化のヒアルロン酸ナトリウムを酸性化血清アルブミンの添加によって沈殿させることによって測定される。得られたサンプルの濁度を、さらなる進行期間の後、６４０ｎｍで測定する。ヒアルロン酸ナトリウム基質に対するヒアルロニダーゼ活性に起因する濁度の減少が、ヒアルロニダーゼ酵素活性の尺度である。別の例では、ヒアルロニダーゼ活性は、ヒアルロニダーゼとともにインキュベートした後に残存するビオチン化ヒアルロン酸が測定されるマイクロタイターアッセイを使用して測定される（例えば Frost and Stern (1997) Anal. Biochem. 251:263-269,米国特許公報第２００５０２６０１８６号参照）。ヒアルロン酸のグルクロン酸残基上の遊離カルボキシル基をビオチン化し、ビオチン化されたヒアルロン酸基質を、マイクロタイタープレートに共有結合によってカップリングする。ヒアルロニダーゼとともにインキュベートした後、アビジン−ペルオキシダーゼ反応を使用して残存するビオチン化ヒアルロン酸基質を検出し、既知活性のヒアルロニダーゼ標準を用いる反応後に得られたものと比較する。ヒアルロニダーゼ活性を測定するためのその他のアッセイも当技術分野で公知であり、本明細書における方法において使用できる（例えば、Delpech et al., (1995) Anal. Biochem. 229:35-41; Takahashi et al., (2003) Anal. Biochem. 322:257-263参照）。
【０３３１】
修飾された可溶性ヒアルロニダーゼ（例えば、ＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０）などのヒアルロナン分解酵素の、展着剤または拡散剤として作用する能力も評価できる。例えば、トリパンブルー色素を、ヒアルロナン分解酵素とともに、または伴わずに、ヌードマウスの各側面の側面皮膚中に、皮下に、または皮内などで注射できる。次いで、色素領域をマイクロノギスなどを用いて測定し、ヒアルロナン分解酵素の、展着剤として作用する能力を決定する（例えば、米国公開特許番号第２００６０１０４９６８号参照）。ヒアルロニダーゼなどのヒアルロナン分解酵素の、化学療法薬などの別の薬剤との同時投与の、その薬剤の薬物動態および薬力学的特性に対する効果も、上記で論じられ、以下の実施例１において実証されるように、臨床試験の設定などにおいて、動物モデルおよび／またはヒト対象を使用してｉｎ  ｖｉｖｏで評価できる。ヒアルロニダーゼではないヒアルロナン分解酵素の機能活性は、これらのアッセイのいずれかを使用してヒアルロニダーゼと比較することができる。これを行って、ヒアルロナン分解酵素の機能的に同等な量がどのようなものであるかを決定することができる。例えば、ヒアルロナン分解酵素の、展着剤または拡散剤として作用する能力は、トリパンブルーとともにマウスの側面の皮膚中にそれを注射する（例えば、皮下にまたは皮内に）ことによって評価でき、例えば、１００ユニットのヒアルロニダーゼ参照標準と、同量の拡散を達成するのに必要な量を決定できる。したがって、必要なヒアルロナン分解酵素の量は、１００ヒアルロニダーゼ（ｈｙａｕｒｏｎｉｄａｓｅ）ユニットと機能的に同等である。修飾されたヒアルロニダーゼなどの修飾されたヒアルロナン分解酵素を用いた治療の前後での、腫瘍などにおける透水係数（Ｋ）を測定し、修飾されたヒアルロナン分解酵素調製物の活性を評価することもできる。
【０３３２】
ＰＥＧ化ヒアルロニダーゼをはじめとする修飾されたヒアルロニダーゼなどの修飾されたヒアルロナン分解酵素の、上記のヒアルロナン関連疾患および障害と関連している任意の１種もしくは複数のマーカーまたはその他の関連マーカーもしくは表現型に影響を及ぼす能力は、上記の任意の１種もしくは複数のアッセイを使用して評価できる。例えば、修飾されたヒアルロニダーゼなどの修飾されたヒアルロナン分解酵素の、ヒアルロナンレベルまたは含量、ハロー（ｈａｌｏｓ）形成または大きさ、間質液圧、水分含量および／または血管容積を低減する能力は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｖｏで上記のアッセイのうちいずれか１種または複数を使用して評価できる。一例では、修飾されたヒアルロニダーゼは、腫瘍を有する対象または適当な動物モデルに投与し、ヒアルロナンレベル、ハローの形成または大きさ、間質液圧、水分含量および／または血管容積に対する効果を評価し、修飾されたヒアルロニダーゼを投与されていない対象または動物モデルと比較することができる。いくつかの例では、修飾されたヒアルロニダーゼは、化学療法薬などの別の薬剤とともに投与できる。
【０３３３】
２．薬物動態および耐容性
薬物動態および耐容性研究は、動物モデルを使用して実施し、または患者を用いる臨床研究の際に実施し、化学療法薬などの薬剤の特性などに対する修飾されたヒアルロニダーゼなどの修飾されたヒアルロナン分解酵素との同時投与の効果を評価できる。動物モデルとして、それだけには限らないが、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、モルモットおよびカニクイザルまたはアカゲザルなどの非ヒト霊長類モデルが挙げられる。いくつかの例では、薬物動態および耐容性研究は、健常な動物を使用して実施される。その他の例では、研究は、ヒアルロナン関連疾患および障害を有するいずれかの動物モデルなどの、ヒアルロナンを用いる治療が考慮される疾患の動物モデルを使用して実施される。
【０３３４】
例えば、修飾されたヒアルロニダーゼなどの修飾されたヒアルロナン分解酵素と同時投与される化学療法薬の薬物動態特性は、投与後に、最大（ピーク）化学療法薬濃度（Ｃｍａｘ）、ピーク時間（すなわち、最大化学療法薬濃度が生じるとき；Ｔｍａｘ）、最小化学療法薬濃度（すなわち、化学療法薬の用量間の最小濃度；Ｃｍｉｎ）、消失半減期（Ｔ１／２）および曲線下面積（すなわち、時間対濃度をプロットすることによって作製した曲線下面積；ＡＵＣ）などのパラメータを測定することによって評価できる。化学療法薬が皮下に投与される場合には、薬剤の絶対バイオアベイラビリティは、皮下デリバリー後の化学療法薬の曲線下面積（ＡＵＣｓｃ）を、静脈内デリバリー後の化学療法薬のＡＵＣ（ＡＵＣｉｖ）と比較することによって決定する。絶対バイオアベイラビリティ（Ｆ）は、式：Ｆ＝（［ＡＵＣ］ｓｃ×用量ｓｃ）／（［ＡＵＣ］ｉｖ×用量ｉｖ）を使用して算出できる。皮下投与後の血漿中の化学療法薬の濃度は、血液のサンプル中の化学療法薬の濃度を評価するのに適した当技術分野で公知の任意の方法を使用して測定できる。
【０３３５】
薬物動態研究において、さまざまな用量および種々の投薬頻度の投薬を投与して、用量中の化学療法薬および／または修飾されたヒアルロナン分解酵素（例えば、ＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０）などの同時投与される薬剤の濃度を増大または減少させる効果を評価できる。バイオアベイラビリティなどの皮下投与された化学療法薬の薬物動態特性もまた、修飾されたヒアルロニダーゼの同時投与を用いて、または用いずに評価できる。例えば、ビーグルなどのイヌに、１種または複数の投与経路を使用して、化学療法薬を、修飾されたヒアルロニダーゼなどの修飾されたヒアルロナン分解酵素と組み合わせて、または単独で投与できる。このような研究を実施して、化学療法薬のバイオアベイラビリティなどの薬物動態特性に対する、ヒアルロニダーゼとの同時投与の効果を評価できる。
【０３３６】
安全性および耐容性を評価する研究も、当技術分野で公知であり、本明細書において使用できる。修飾されたヒアルロニダーゼなどの修飾されたヒアルロナン分解酵素の同時投与を伴う、または伴わない、化学療法薬などの同時投与される薬剤の投与後、任意の有害反応の発生をモニタリングできる。有害反応として、それだけには限らないが、浮腫または腫脹などの注射部位反応、頭痛、発熱、疲労、悪寒、潮紅、めまい、じんま疹、喘鳴音または胸部絞扼感、悪心、嘔吐、悪寒、背痛、胸痛、筋痙攣、てんかん発作または痙攣、血圧の変化およびアナフィキラシー性または重篤な過敏症反応を挙げることができる。通常、安全性および耐容性研究では、さまざまな用量および種々の投薬頻度を投与し、用量中の化学療法薬および／または修飾されたヒアルロナン分解酵素（例えば、修飾されたヒアルロニダーゼ）の濃度を増大または減少させる効果を評価できる。
【０３３７】
３．動物モデル
ヒアルロナン関連疾患、障害または状態の動物モデルを利用して、化学療法薬などの別の薬剤の同時投与を伴う、または伴わない、修飾されたヒアルロニダーゼなどの修飾されたヒアルロナン分解酵素の投与のｉｎ  ｖｉｖｏ効果を評価できる。適当な動物モデルが利用できる例示的ヒアルロナン関連疾患として、固形腫瘍、例えば、後期癌、転移性癌、未分化癌、卵巣癌、ｉｎ  ｓｉｔｕ癌腫（ＩＳＣ）、扁平上皮癌（ＳＣＣ）、前立腺癌、膵臓癌、非小細胞肺癌、乳癌、結腸癌およびその他の癌が挙げられる。また、ヒアルロナン関連疾患および障害の例示的なものとして、椎間板圧迫、癌および浮腫、例えば、臓器移植、卒中、脳外傷またはその他の傷害によって引き起こされる浮腫がある。
【０３３８】
動物モデルとして、それだけには限らないが、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、モルモットおよびカニクイザルまたはアカゲザルなどの非ヒト霊長類モデルを挙げることができる。いくつかの例では、ヒアルロナン関連癌に由来する腫瘍細胞株を用いて、ヌードマウスまたはＳＣＩＤマウスなどの免疫不全マウスに移植し、その癌の動物モデルを確立する。ヒアルロナン関連癌に由来する例示的細胞株として、それだけには限らないが、ＰＣ３前立腺癌腫細胞、ＢｘＰＣ−３膵臓腺癌細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞、ＭＣＦ−７乳腺腫瘍細胞、ＢＴ４７４乳腺腫瘍細胞、Ｔｒａｍｐ  Ｃ２前立腺腫瘍細胞およびＭａｔ−ＬｙＬｕ前立腺癌細胞およびヒアルロナン関連である、例えば、高レベルのヒアルロナンを含有する本明細書に記載されるその他の細胞株が挙げられる。次いで、マウスに修飾されたヒアルロニダーゼを投与し、例えば、ヒアルロナンレベルまたは含量、ｈａｌｏの形成または大きさ、間質液圧、水分含量および／または血管容積に対する効果を評価できる。いくつかの例では、化学療法薬を修飾された可溶性ヒアルロニダーゼなどの修飾されたヒアルロナン分解酵素と同時投与し、例えば、薬物動態、腫瘍の大きさまたは罹病率に対する効果を評価する。
【０３３９】
Ｈ．ヒアルロナン関連状態、疾患および障害の治療におけるヒアルロナン分解酵素の使用
本明細書に記載される方法は、ヒアルロナン分解酵素の治療的使用のための方法を含む。以下に記載される治療的使用は、例示的なものであって、本明細書に記載される方法の適用を制限するものではない。
【０３４０】
提供される方法は、それだけには限らないが、ヒアルロナンリッチな癌ならびに間質液圧の上昇と関連しているその他の疾患、例えば、椎間板圧迫および浮腫、例えば、臓器移植、卒中、脳外傷またはその他の傷害によって引き起こされる浮腫またはその他の浮腫と関連している疾患などのヒアルロナンと関連しているその他の疾患ならびにその他のヒアルロナン関連疾患および状態を含めた任意のヒアルロナン関連疾患または状態を治療するためにヒアルロナン分解酵素を使用する方法を含む。
【０３４１】
ヒアルロナンリッチな癌として、それだけには限らないが、卵巣癌、ｉｎ  ｓｉｔｕ癌腫（ＩＳＣ）、扁平上皮癌（ＳＣＣ）、前立腺癌、膵臓癌、非小細胞肺癌、乳癌、結腸癌、脳癌およびその他の癌などの、間質液圧の上昇と関連している癌、固形腫瘍、後期癌、転移性癌、未分化癌が挙げられる。
【０３４２】
治療的使用は、癌治療、腫瘍量の減少、化学療法またはその他の癌治療に対する感受性の増大、癌治療薬またはその他の治療薬のバイオアベイラビリティまたはデリバリーの増強、間質液圧の低下、血管容積の増大、対象中の組織における水分含量の減少およびその他の治療をはじめとするヒアルロナン関連疾患または状態の治療のための、組成物の、単独またはその他の治療または薬剤と組み合わせた投与を含む。
【０３４３】
方法はまた、対照組織、細胞、流体またはその他のサンプル、例えば、正常な対象（例えば、ヒアルロナン関連疾患を有さない対象）由来の組織、細胞、流体などの対照、低レベルのヒアルロナンを発現すると知られているサンプル（例えば、細胞株）、例えば、本明細書に記載される例示的腫瘍細胞株、例えば、ＨＣＴ１１６細胞株、ＨＴ２９細胞株、ＮＣＩ  Ｈ４６０細胞株、ＤＵ１４５細胞系統、Ｃａｐａｎ−１細胞株および、このような細胞株を使用して作製した腫瘍モデル由来の腫瘍（例えば、実施例１７Ａ参照）と比較してＨＡの発現を調べることなどの、例えば、以下の実施例３（ａ）に記載される方法を使用して、例えば、ヒアルロナンまたは関連分子の発現をアッセイする方法を使用することによって、例えば、対象が、ヒアルロナン関連疾患または状態を有するかどうかを調べるための、例えば、対象の治療に先立つ、治療のための対象の選択を含む。
【０３４４】
この例では、対象由来のサンプルにおける、１種または複数のマーカー、例えば、ヒアルロナンまたはＨＡＳ２の発現が測定され、所望により、別のサンプルまたは標準と比較される。測定後、疾患または状態が、ヒアルロナン関連疾患または状態であるかどうかが決定される。一例では、方法は、治療、例えば、可溶性ヒアルロニダーゼを含有する組成物の、単独または１種もしくは複数その他の治療と組み合わせた投与をさらに含む。方法は、対象の細胞、組織または流体中のヒアルロナンのレベルを測定することによる治療の評価をさらに含む。
【０３４５】
１．ヒアルロナン関連状態および疾患
ヒアルロニダーゼなどのヒアルロナン分解酵素を含有する組成物、例えば、可溶性ヒアルロニダーゼ、通常、ポリマーとのコンジュゲーションによって修飾されている可溶性ヒアルロニダーゼ（例えば、半減期を増大するために）の、単独で、または別の治療および／もしくは薬剤と組み合わせて、または別の治療および／もしくは薬剤に加えてのいずれかでの投与によって、ヒアルロナン関連疾患および状態を治療する方法が、本明細書において提供される。
【０３４６】
ヒアルロナン関連状態および疾患は、原因として、結果として、またはそれ以外に該疾患または状態において観察される、ヒアルロナンレベルが上昇している疾患および状態であり、ヒアルロニダーゼなどのヒアルロナン分解酵素、例えば、可溶性ヒアルロニダーゼを含有する組成物を、単独で、または別の治療および／もしくは薬剤と組み合わせた、または別の治療および／もしくは薬剤に加えてのいずれかで投与することによって治療できる。
【０３４７】
通常、ヒアルロナン関連疾患および状態は、組織、細胞または体液（例えば、腫瘍組織または腫瘍関連組織、血液または間質空間）における、対照、例えば、別の組織、細胞または体液と比較したヒアルロナン発現の上昇と関連している。上昇したヒアルロン発現は、正常な組織、細胞または体液、例えば、試験されているサンプルと類似しているが、正常である（すなわち、疾患または状態を有さない、または調べられている対象が有する疾患または状態の種類は有さない）対象、例えば、ヒアルロナン関連疾患または状態を有さない対象などの異なる対象から単離された組織、細胞または体液と比較して上昇したものであり得る。上昇したヒアルロナン発現は、同様の疾患または状態を有するが、その疾患が、それほど重篤ではない、および／または、ヒアルロナン関連ではない、もしくは比較的少ないヒアルロナンしか発現せず、したがって、より少ない程度にヒアルロナンに関連している別の対象由来の類似組織と比較して上昇したものであり得る。例えば、調べられている対象は、組織、細胞または流体中のＨＡ量が、初期ステージの、分化型のまたはその他の種類の癌など、あまり重篤ではない癌を有する対象と比較して相対的に上昇している、ヒアルロナン関連癌を有する対象であり得る。別の例では、細胞、組織または流体は、既知量の、または相対量のＨＡを有する、流体、組織、抽出物（例えば、細胞抽出物または核抽出物）、核酸またはペプチド調製物、細胞株、生検、標準またはその他のサンプルなどの対照サンプル、例えば、低レベルのＨＡを発現する本明細書に記載される例示的腫瘍細胞株、例えば、ＨＣＴ１１６細胞株、ＨＴ２９細胞株、ＮＣＩ  Ｈ４６０細胞株、ＤＵ１４５細胞株、Ｃａｐａｎ−１細胞株およびこのような細胞株を使用して作製した腫瘍モデル由来の腫瘍などの比較的低レベルのＨＡを発現することがわかっているヒト細胞株などのサンプルと比較して上昇したレベルのヒアルロナンを含有する（例えば、実施例１７Ａ参照）。
【０３４８】
いくつかの場合には、ヒアルロナン関連疾患および状態は、間質液圧の上昇、血管容積の減少、および／または腫瘍などの組織中の水分含量の増大と関連している。一例では、本明細書において提供される組成物および化合物を用いる治療は、これらの症状のうち１つもしくは複数または疾患または状態と関連しているその他の症状を回復させる、例えば、対象の生存または生活の質を経時的に改善し、または腫瘍成長を阻害する。
【０３４９】
提供された酵素、組成物および方法を使用して治療できる例示的ヒアルロナン関連疾患および状態として、それだけには限らないが、ヒアルロナンリッチな癌、例えば、後期癌、転移性癌、未分化癌、卵巣癌、ｉｎ  ｓｉｔｕ癌腫（ＩＳＣ）、扁平上皮癌（ＳＣＣ）、前立腺癌、膵臓癌、非小細胞肺癌、乳癌、結腸癌およびその他の癌などの固形腫瘍をはじめとする腫瘍が挙げられる。
【０３５０】
また、ヒアルロナン関連疾患および状態の例示的なものとして、椎間板圧迫および浮腫、例えば、臓器移植、卒中、脳外傷またはその他の傷害によって引き起こされる浮腫と関連している疾患などの間質液圧の上昇と関連している疾患がある。例示的ヒアルロナン関連疾患および状態として、癌、椎間板圧迫および浮腫をはじめとする、間質液圧の上昇、血管容積の減少、および／または組織中の水分含量の増大と関連している疾患および状態が挙げられる。一例では、ヒアルロナン関連状態、疾患または障害の治療は、間質液圧の上昇（ＩＦＰ）、血管容積の減少および組織中の水分含量の増大のうち１つまたは複数の寛解、低減またはその他の有益な効果を含む。
【０３５１】
通常、ヒアルロナン関連疾患または状態は、例えば、罹患組織、例えば、腫瘍におけるＨＡ発現の増大と関連している。一例では、対象の組織において、例えば、罹患組織において、ＨＡＬＯ（ヒアルロナンを含むプロテオグリカンが豊富な細胞周囲マトリックス領域）が生じる。別の例では、対象の組織、例えば、罹患組織由来の細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養においてＨＡＬＯの存在が検出される。
【０３５２】
一例では、ヒアルロナン関連状態、疾患または障害は、間質液圧の上昇、血管容積の減少または組織中の水分含量の増大と関連している。一例では、ヒアルロナン関連状態、疾患または障害の治療は、間質液圧の上昇（ＩＦＰ）、血管容積の減少および組織中の水分含量の増大のうち１つまたは複数の回復、低減またはその他の有益な効果を含む。
【０３５３】
ヒアルロナンリッチな癌をはじめとする癌
ヒアルロナンは、発達、再生、修復、胚発生、胎生発育、創傷治癒、脈管形成および腫瘍形成をはじめとする細胞運動性と関連する工程において役割を果たす(Toole 1991 Cell Biol. Extracell. Matrix, Hay (ed.), Plenum Press, New York, 1384-1386; Bertrand et al. 1992 Int. J. Cancer 52:1-6; Knudson et al, 1993 FASEB J. 7:1233-1241)。さらに、ヒアルロナンレベルは、腫瘍攻撃性と相関し(Ozello et al. 1960 Cancer Res. 20:600-604; Takeuchi et al. 1976, Cancer Res. 36:2133-2139; Kimata et al. 1983 Cancer Res. 43:1347-1354);ヒアルロナンは、それだけには限らないが、腫瘍成長、生存、転移および間質液圧をはじめとするいくつかの癌工程を促進する。可溶性ヒアルロニダーゼを含有する提供される組成物および方法を使用して治療できるヒアルロナン関連疾患および状態の例示的なものとして、癌、特に、ヒアルロナンリッチな癌、例えば、間質液圧の上昇と関連しているヒアルロナンリッチな癌がある。
【０３５４】
ヒアルロナン関連癌は、ヒアルロナン発現、通常、ヒアルロナン発現の上昇と関連している癌であり、これは、以下の節に記載されるように、例えば、治療に先立って決定できる。
【０３５５】
例えば、ヒアルロナンリッチな癌は、実施例６Ａに記載されるように、癌細胞が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ粒子排除アッセイにおいてＨＡＬＯを生じる癌、ヒアルロナンの発現が上昇している癌（腫瘍由来の切片の免疫染色、例えば、組織学的染色によって調べられる）、ＨＡＳ２（ヒアルロナンシンターゼ２）が上昇している癌、例えば、実施例２に記載される酵素アッセイを使用して決定されるようなｉｎ  ｖｉｔｒｏでヒアルロニダーゼ（ＨＹＡＬ１）を産生しない癌であり得る。ヒアルロナンリッチな癌は、ヒアルロナン発現を評価する任意の方法、例えば、以下の節３（ａ）に提供されるアッセイおよびタンパク質／ｍＲＮＡ発現をアッセイするためのその他の公知の方法によって同定できる。
【０３５６】
いくつかのヒアルロナンリッチな癌が同定されている。いくつかの場合には、ヒアルロナン発現は、予後不良、例えば、生存率および／または無再発生存率の低下、転移、脈管形成、その他の組織／領域への癌細胞浸潤およびその他の予後不良の指標と相関する。このような相関は、例えば、卵巣癌、ＳＣＣ、ＩＳＣ、前立腺癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を含む肺癌、乳癌、結腸癌および膵臓癌をはじめとするヒアルロナンリッチな腫瘍で観察されている（例えば、Maarit et al., Cancer Research, 60:150-155 (2000); Karvinen et al., British Journal of Dermatology, 148:86-94 (2003); Lipponen et al., Eur. Journal of Cancer, 849-856 (2001); Pirinen et al., Int. J. Cancer: 95: 12-17 (2001); Auvinen et al., American Journal of Pathology, 156(2):529-536 (2000); Ropponen et al., Cancer Research, 58: 342-347 (1998)）。したがって、ヒアルロナンリッチな癌は、癌の１種または複数の症状を治療するためのヒアルロニダーゼなどのヒアルロナン分解酵素の投与によって治療できる。ヒアルロナンリッチな腫瘍として、それだけには限らないが、前立腺、乳房、結腸、卵巣、胃、頭頸部およびその他の腫瘍および癌が挙げられる。
【０３５７】
例えば、ヒアルロニダーゼは、腫瘍に注射されると、直接抗腫瘍形成作用を有する。ヒアルロニダーゼは、マウスに移植された腫瘍の成長を妨げ(De Maeyer et al., (1992) Int. J. Cancer 51:657-660)、発癌物質に対する曝露の際に腫瘍形成を阻害する(Pawlowski et al. (1979) Int. J. Cancer23:105-109)。ヒアルロニダーゼは、脳癌（神経膠腫）の治療における唯一の治療薬として有効である（ＷＯ１９８８０２２６１）。
【０３５８】
したがって、癌、通常、ヒアルロナン関連癌を治療するための、修飾された可溶性ヒアルロニダーゼなどのヒアルロナン分解酵素を含有する酵素、組成物および組合せが提供される。
【０３５９】
２．ヒアルロナン関連疾患および状態の治療における使用
ヒアルロナン関連疾患および状態を治療する方法が提供される。方法は、癌治療、腫瘍量の減少、化学療法またはその他の癌治療に対する感受性の増大、癌治療薬またはその他の治療薬のバイオアベイラビリティまたはデリバリーの増強、間質液圧の低下、血管容積の増大、対象中の組織における水分含量の減少およびその他の治療をはじめとするヒアルロナン関連疾患または状態の治療のための、組成物の、単独またはその他の治療または薬剤と組み合わせた投与を含む。
【０３６０】
方法はまた、例えば、以下の実施例ｂに記載される方法を使用して、例えば、ヒアルロナンまたは関連分子の発現をアッセイする方法を使用することによって、例えば、対象が、ヒアルロナン関連疾患または状態を有するかどうかを調べるための、例えば、対象の治療に先立つ、治療のための対象の選択を含む。この例では、対象由来のサンプルにおける、１種または複数のマーカー、例えば、ヒアルロナンまたはＨＡＳ２の発現が測定され、所望により別のサンプルまたは標準と比較される。測定後、疾患または状態が、ヒアルロナン関連疾患または状態であるかどうかが決定される。一例では、方法は、治療、例えば、可溶性ヒアルロニダーゼを含有する組成物の、単独または１種もしくは複数のその他の治療と組み合わせた投与をさらに含む。
【０３６１】
提供される方法の中には、可溶性ヒアルロニダーゼを含有する組成物の投与によって、ヒアルロナン関連疾患または障害、例えば、ヒアルロナン関連癌を有する対象の組織において間質液圧を低下させる方法がある。通常、ＩＦＰの低減は、例えば、２４、４８または７２時間持続される。また、通常、例えば、少なくとも２４、４８または７２時間以上の血管容積の持続した減少のために、組成物を投与することによって、対象の組織における血管容積を増大する方法も提供される。また、通常、効果が、例えば、少なくとも２４、４８または７２時間以上持続される、組成物を使用して対象の組織における水分含量を低減する方法も提供される。また、組成物を使用して対象におけるヒアルロナン発現を低減して、例えば、対象の組織における細胞周囲マトリックスＨＡＬＯを低減する方法も提供される。通常、低減が、投与後、少なくとも２４、４８、７２時間以上持続される。
【０３６２】
ａ．ヒアルロナン関連疾患マーカーの検出（治療および治療効果を評価するための対象の選択）
方法は、ヒアルロナン分解酵素を用いて治療するために、および治療の有効性などの治療効果を評価するために対象を選択する工程を含む。このような方法は、ヒアルロナン関連疾患マーカーを検出する方法を含み、これは、対象がヒアルロナン関連疾患を有するという、対象がヒアルロナン分解酵素による治療に応じる可能性が高いという、および／または組織、細胞または流体などの対象由来のサンプルが、ヒアルロナン発現の上昇を含むという任意の指標を含む。マーカーを検出するための例示的アッセイは、以下に記載されており、対象由来のサンプル中のＨＡ発現および／または関連ＨＡ発現を測定するアッセイ、対象由来のサンプルに対するヒアルロナン分解酵素の効果を分析するアッセイおよび通常、低いヒアルロニダーゼ発現または活性、高い間質液圧、血管容積および水分含量など、特定のヒアルロナン関連疾患／状態と関連している読み取り情報を測定するアッセイを含む。一般に、対象由来のサンプル中のタンパク質または核酸を検出するための、またｉｎ  ｖｉｔｒｏで細胞／組織に対する治療の効果を評価するための任意の既知アッセイを使用できる。
【０３６３】
本明細書において提供される方法における治療のために選択される対象として、疾患または状態を有さない対象と比較して、または上昇した、異常な、もしくは蓄積したＨＡの発現を有していない正常な組織もしくはサンプルと比較して、上昇した、異常な、もしくは蓄積したヒアルロナンの発現を有する対象が挙げられる。対象由来の任意のサンプルまたは組織を、試験し、正常なサンプルまたは組織と比較できる。ヒアルロナンレベルは、組織（例えば、生検によって）腫瘍、細胞から、または血液、血清、尿もしくはその他の体液からなど任意の供給源から測定できる。例えば、本明細書において別の場所で記載されるように、固形腫瘍におけるＨＡ沈着のプロフィールは、通常、細胞周囲または間質として分類されている。ＨＡの上昇した血漿レベルは、ウィルムス腫瘍、中皮腫および肝臓転移を有する患者において最も顕著に観察されている。したがって、疾患または状態に応じて、ヒアルロナンレベルについて種々のサンプルを測定できる。サンプルの選択は、当業者のレベルの範囲内である。
【０３６４】
ヒアルロニダーゼ基質レベルを測定するために使用されるアッセイは、疾患または状態の関数であり、特定の疾患または状態に基づいて選択できる。当業者は、ヒアルロナンを検出する方法に精通しており、これとして、それだけには限らないが、以下の節（ｉ）に記載される免疫組織化学法、ＥＬＩＳＡ法が挙げられる。
【０３６５】
一例では、マーカーを検出する工程は、対象が、ヒアルロナン分解酵素を用いる治療に適しているヒアルロナン関連状態または疾患を有するかどうかを調べるために、対象の治療に先立って実施する。この例では、マーカーが検出される場合には（例えば、患者由来の細胞、組織または流体が、上昇したヒアルロナン発現を含有する、またはヒアルロナン分解酵素に対して応答性であると決定される場合）、対象にヒアルロナン分解酵素が投与される治療工程が実施される。一例では、マーカーが検出されない場合には（例えば、患者由来の細胞、組織または流体が、正常な、もしくは上昇していないヒアルロナン発現を含有する、またはヒアルロナン分解酵素に対して応答性ではないと決定される場合）、別の治療選択肢を選択できる。
【０３６６】
別の例では、マーカーを検出する工程は、例えば、ヒアルロナン分解酵素を用いる治療が疾患または状態の治療に対して効果を有するかどうかを調べるために、対象を治療した後に、または対象の治療の過程の間に（例えば、ヒアルロナン分解酵素（例えば、可溶性の修飾されたヒアルロニダーゼ）を用いる治療（同時投与される薬剤を伴う、または伴わない））実施される。このような一例では、マーカーは検出されない、または治療前の量／レベルと比較して、または別のサンプルと比較して減少している量もしくは相対レベルで検出されるか、または治療が継続され、もう１ラウンド治療が実施され、または併用療法などの別の治療が開始される。別のこのような例では、マーカーが治療前または別のサンプルと同じレベルで検出される場合には、別の治療選択肢を選択してもよい。
【０３６７】
ｉ．ヒアルロナン関連疾患マーカーを検出するためのアッセイ
ヒアルロナン関連疾患および状態のマーカーを検出するアッセイは、対象の組織、細胞および／または体液、例えば、腫瘍におけるヒアルロナンおよび／またはヒアルロニダーゼ発現の量（例えば、相対量）を測定するアッセイを含む。このようなアッセイの中に、ＨＡ発現、ヒアルロナンシンターゼ２（ＨＡＳ２）発現、ＨＡＬＯ（ヒアルロナンをはじめとするプロテオグリカンの豊富な細胞周囲マトリックス領域）の存在および対象由来のサンプル中のヒアルロニダーゼなどのヒアルロナン分解酵素の存在を検出できるものが含まれる。
【０３６８】
タンパク質および核酸レベルを検出するアッセイは、当技術分野で周知であり、本明細書における方法において使用して、ヒアルロナン、ヒアルロナンシンターゼまたはその他のタンパク質および／または核酸発現を測定できる。このようなアッセイとして、それだけには限らないが、ＥＬＩＳＡ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウエスタンブロット、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、免疫組織化学、組織診断およびフローサイトメトリーが挙げられる。例えば、組織サンプル（例えば、患者または動物モデル由来の腫瘍の生検、間質サンプル）、流体（例えば、血液、尿、血漿、唾液もしくはその他のサンプル）、細胞または細胞性サンプルまたは抽出物またはその他のサンプルなどの対象由来のサンプルを、例えば、組織またはサンプル中のヒアルロナンの存在および程度を調べるための、固定または凍結された組織切片の免疫組織化学（ＩＨＣ）などの組織学的染色（例えば、実施例８．Ｂ．２．参照）、または免疫蛍光細胞染色、プルダウンアッセイおよびフローサイトメトリーを使用し、抗ＨＡ抗体を用いて染色することができる。別の例では、サンプル、例えば、生検をＲＴ−ＰＣＲによってアッセイし、ＨＡ  ｍＲＮＡの量を評価することができる。
【０３６９】
癌においてヒアルロナン発現を検出するための既知方法として、それだけには限らないが、膀胱癌を有する対象の尿または膀胱組織抽出物中のＨＡレベルを測定するための、Lokeshwar et al., Cancer Res. 57: 773-777 (1997)に記載されるＥＬＩＳＡ様アッセイが挙げられる。アッセイのために、尿または抽出物をマイクロウェルプレート上にコーティングし（標準として使用される臍帯ＨＡもコーティングされる）、続いて、本明細書に記載されるものなどの標識された（例えば、ビオチン化）ＨＡ結合タンパク質とともにインキュベートし（例えば、１６時間、室温）、洗浄し、アビジン−ビオチン検出物質基質を使用してウェルと結合しているＨＡ結合タンパク質を定量する。このような方法は、当技術分野で周知である。一例では、ＨＡ関連膀胱癌を有する対象由来の尿は、正常な患者（健常な対象またはその他の胃泌尿器疾患または状態を有する対象）由来の尿／抽出物と比較して、２〜９倍上昇しているＨＡレベルを含有していおり；従って、マーカーは、尿中のＨＡレベルが、正常な対象と比較して上昇している、例えば、２倍または約２倍から９倍または約９倍の間で上昇している、例えば、正常な対象と比較して２、３、４、５、６、７、８もしくは９倍または約２、３、４、５、６、７、８もしくは９倍の上昇の場合に検出される。
【０３７０】
さらなる例では、腫瘍細胞におけるヒアルロナン発現および産生を、上記の方法のいずれか１種を使用してｉｎ  ｖｉｔｒｏで評価できる。同様に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでの細胞によるヒアルロナンシンターゼ２（ＨＡＳ２）産生および／または発現もまた、例えば、ＥＬＩＳＡ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウエスタンブロット、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、免疫組織化学、組織診断またはフローサイトメトリーによってアッセイできる。
【０３７１】
別の例では、濁度アッセイを用いてなど、実施例２に記載されるように、血液または血漿中などの、対象由来のサンプル中のヒアルロニダーゼ活性の量が調べられる。
【０３７２】
別の例では、患者由来の細胞またはその他の組織は、単離された、例えば、腫瘍細胞であり、例えば、治療に応じた、腫瘍細胞などの細胞または組織の成長、増殖および／または生存を測定するためのクローン原性アッセイまたは任意のその他のアッセイを使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで細胞または組織が、ヒアルロナン分解酵素を用いる治療に対して応答性であるかどうかを調べるための研究において使用される。一例では、対象由来の癌細胞を、商標名Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）のもとで販売される混合物などの細胞外マトリックスまたはタンパク質混合物などの表面に播種することによる、下記実施例７Ｄに記載されるような研究がある。この例では、ヒアルロナン関連マーカーは、ヒアルロナン分解酵素の投与に対する細胞または組織の感受性である。この例では、ヒアルロナン分解酵素の添加によって細胞の増殖、成長または生存などの任意の特性が阻害または阻止される場合には、対象は、ヒアルロナン分解酵素を含有する組成物を用いる治療に適している可能性があると決定される。
【０３７３】
ヒアルロナン発現レベルを調べるアッセイに加えて、その他のアッセイを使用して、治療のための対象を選択できる、ならびに／または治療有効性および／もしくは期間を評価できる。間質液圧（ＩＦＰ）は、適当なプローブまたは機器を使用して測定できる。例えば、トランスデューサーが先端についたカテーテルを使用して、注目する癌組織またはその他の組織におけるＩＦＰを測定できる。カテーテルは、手術用針の内側の穴を通って通され、これが、次いで、腫瘍の中心に挿入される。ニードルが引き抜かれ、カテーテルは適切な位置に保持される。次いで、ＩＦＰ（ｍｍＨｇ）を、適当なデータ獲得ユニットを使用して測定できる（例えば、実施例６Ｂ、Ozerdem et al. (2005) Microvasc. Res. 70:116-120参照）。IFPを測定するためのその他の方法として、ウィック−イン−ニードル(wick-in-needle)法(Fadnes et al (1977) Microvasc. Res. 14:27-36)が挙げられる。
【０３７４】
血管容積は、例えば、以下の実施例１０に記載されるような超音波画像診断によって測定できる。この方法は、検出される強い超音波反射を提供するようハイパーエコーを示すマイクロバブルを用いる。マイクロバブルは、対象または動物モデルに静脈内になどで注入されると、その大きさのために血管内に捕捉されるようになる。腫瘍組織水分含量などの組織水分含量を評価するアッセイもまた、当技術分野で公知である。例えば、腫瘍からサンプルを採取し、吸い取り、秤量し、スナップ凍結し、その後、凍結乾燥できる。次いで、水重量は、組織湿潤重量対乾燥（すなわち、凍結乾燥）重量比として報告される。
【０３７５】
腫瘍細胞の、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで細胞周囲マトリックス（ｈａｌｏ）を形成する能力は、粒子排除アッセイ（例えば、実施例６参照）を使用して評価できる。小さい粒子（ホルマリン固定された赤血球）を、例えば、大きな凝集性コンドロイチン硫酸プロテオグリカンであるアグリカンの存在下で腫瘍細胞の低密度培養物に加えることができる。粒子が落ち着いた後、４００×の倍率で培養物を視察して、腫瘍細胞によって何らかのｈａｌｏが形成されたかどうかを決定することができる。これは、粒子が排除されている細胞周囲の領域として可視化され得る。
【０３７６】
ｉｉ．対照サンプルと比較したヒアルロナン関連マーカーの検出
いずれの検出方法についても、マーカー（例えば、ＨＡ発現、ヒアルロナン分解酵素に対する応答性、ＨＡシンターゼ発現またはヒアルロニダーゼ活性）は、通常、対照サンプルと比較され、その結果、マーカーの検出は、通常、読み取り情報が、対照サンプルと比較して上昇または低減していると決定することを含む。
【０３７７】
例えば、対照サンプルは、正常な組織、細胞または体液、例えば、調べられているサンプルと類似しているが、正常である（すなわち、疾患または状態を有さない、または調べられている対象が有する疾患または状態の種類は有さない）対象、例えば、ヒアルロナン関連疾患または状態を有さない対象などの異なる対象から単離された、組織、細胞または体液などの、別の組織、細胞または体液、あるいは、同様の疾患または状態を有するが、その疾患がそれほど重篤ではない、および／または、ヒアルロナン関連ではない、もしくは、比較的少ないヒアルロナンしか発現せず、したがって、より少ない程度にヒアルロナンに関連している別の対象由来の類似の組織であり得る。例えば、調べられている細胞、組織または流体が、癌を有する対象である場合には、初期ステージの、分化型のまたはその他の種類の癌など、あまり重篤ではない癌を有する対象由来の組織、細胞または流体と比較することができる。別の例では、対照サンプルは、既知量の、または相対量のＨＡを有する、流体、組織、抽出物（例えば、細胞抽出物または核抽出物）、核酸またはペプチド調製物、細胞株、生検、標準またはその他のサンプル、例えば、比較的低レベルのＨＡを発現すると知られているサンプル、例えば、腫瘍細胞株、例えば、低レベルのＨＡを発現する本明細書に記載される例示的腫瘍細胞株、例えば、ＨＣＴ  １１６細胞株、ＨＴ２９細胞株、ＮＣＩ  Ｈ４６０細胞株、ＤＵ１４５細胞株、Ｃａｐａｎ−１細胞株およびこのような細胞株を使用して作製した腫瘍モデル由来の腫瘍である（例えば、実施例１７Ａ参照）。
【０３７８】
特定の変化、例えば、ＨＡの増大または減少は、使用されるアッセイに応じて変わるということは理解される。例えば、ＥＬＩＳＡでは、特定の波長での吸光度の、またはタンパク質の量（例えば、標準曲線を使用することによって決定される）の増加または減少倍数は、対照に対して表すことができる。ＲＴ−ＰＣＲなどのＰＣＲアッセイでは、標準を使用するなど、当業者に公知の方法を使用して、対照発現レベルと比較する（例えば、変化倍数として表す）ことができる。
【０３７９】
例えば、対象由来のサンプル中のヒアルロナンの量が調べられている場合には、マーカーの検出は、対象由来のサンプル（例えば、癌性細胞、組織または流体）中のＨＡの量が、先の段落において記載された対照サンプルなどの対照サンプルと比較して上昇しているということを決定するものであり得る。一例では、癌は、組織、細胞または流体中のＨＡの量が、例えば、それだけには限らないが、既知量の、または相対量のＨＡを有する、流体、組織、抽出物（例えば、細胞抽出物または核抽出物）、核酸またはペプチド調製物、細胞株、生検、標準またはその他のサンプル、例えば、比較的低レベルのＨＡを発現すると知られているサンプル、例えば、腫瘍細胞株、例えば、低レベルのＨＡを発現すると本明細書に記載される例示的腫瘍細胞株、例えば、ＨＣＴ  １１６細胞株、ＨＴ２９細胞株、ＮＣＩ  Ｈ４６０細胞株、ＤＵ１４５細胞株、Ｃａｐａｎ−１細胞株およびこのような細胞株を使用して作製した腫瘍モデル由来の腫瘍（例えば、実施例１７Ａ参照）であり得る対照サンプルと比較して、０．５倍、１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、２０倍もしくはそれ以上、または約０．５倍、１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、２０倍もしくはそれ以上上昇している場合に、ヒアルロナンリッチな癌であると決定される。
【０３８０】
例えば、本明細書における目的上、ヒアルロナンリッチな腫瘍を有する患者を、ヒアルロニダーゼを、単独または第２の薬剤と組み合わせて用いる治療のために選択できる。このような例では、腫瘍は直接生検し、ＨＡの発現について染色することができる。その他の例では、血液または尿サンプルまたは特定の腫瘍と関連しているその他の体液サンプルなどのサンプルをＨＡについてアッセイできる。アッセイの種類は、腫瘍の種類に応じて変わるが、２種以上のアッセイを使用してＨＡを検出してもよいということが考慮される。特定の腫瘍のための本明細書におけるこのようなアッセイに対する言及は、単に例示のためのものである。例えば、膀胱癌については、標準ＥＬＩＳＡ手順によってヒアルロナンについて尿サンプルをアッセイできる。本明細書における目的上、正常な患者対照由来の尿と比較して１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍またはそれ以上のＨＡを示す対象（例えば、Ｌｏｋｅｓｈｗａｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｕｒｏｌ．，  １６３：３４８−５６参照）を選択できる。別の例では、腫瘍細胞を生検し、免疫組織化学などによってＨＡについて染色できる（例えば、Anttila et al. (2000) Cancer Research, 60:150-156; Karvinen et al. (2003) British J of Dermatology, 148:86-94; Lipponen et al. (2001) Euro J Can. 37: 849-856); Auvinen et al. (2000) American J of Pathology、156:529; 参照）。通常、このような例では、腫瘍サンプルまたは腫瘍細胞は、任意の癌細胞と結合しているＨＡシグナルが観察される場合に、ＨＡについて陽性と考えられる。バックグラウンド染色のための陰性対照として、細胞をヒアルロニダーゼで予備消化して、すべての細胞と結合しているＨＡを切断することができる。サンプルはまた、同一対象由来の正常な細胞または組織と比較することができる。さらに、このような方法では、細胞と結合しているヒアルロナンのレベルは、低、中または高としてスコア化することができる。例えば、ＨＡ発現は、３０％、３５％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％またはそれ以上の腫瘍領域が、持続性ＨＡシグナルを示した場合に、高または中と考えられる。通常、中から高ＨＡを有する対象の治療が本明細書において考慮される。
【０３８１】
ｂ．癌の治療における使用
上記で示されるように、ヒアルロナンは、癌と関連している過程において役割を果たし、ヒアルロナンレベルは、腫瘍攻撃性ならびに腫瘍攻撃性および予後不良の種々のマーカーと相関する。したがって、ヒアルロナン関連癌を、ヒアルロナン分解酵素ならびにヒアルロニダーゼをはじめとするヒアルロナン分解酵素を含有する組成物および組合せを用いて治療する方法が提供される。癌として、ヒアルロナンリッチな癌および間質液圧の上昇と関連している癌が挙げられる。
【０３８２】
ヒアルロナン関連癌とは、ヒアルロナン発現、通常、ヒアルロナン発現の上昇と関連している癌である。一例では、サンプル、例えば、細胞サンプル、組織、腫瘍間質、血漿、血液または癌を有する対象由来のその他のサンプルにおいて、ヒアルロナンの発現が上昇している、例えば、非罹患組織、細胞、間質、血漿、血液またはその他のサンプル由来の、またはあまり重篤ではない癌、例えば、初期ステージの、分化型のまたはその他の種類の癌由来のサンプルと比較して上昇した発現。ヒアルロナンのレベルは、組織学的方法またはポリペプチドまたはｍＲＮＡの発現を評価するためのその他の公知の方法によって、例えば、上記の節３（ａ）において、例えば、上記のように、対象の治療に先立って決定できる。
【０３８３】
一例では、ヒアルロナン分解酵素（例えば、ヒアルロニダーゼ）は、例えば、静脈内に（ＩＶ）、筋肉内に、または任意の別の全身経路によって全身投与される。別の例では、ヒアルロナン分解酵素組成物は、局所的に（ｌｏｃａｌｌｙ）、例えば、腫瘍内に投与される。
【０３８４】
治療方法として、ヒアルロナン分解酵素の反復投与、例えば、毎時間、数時間毎、１日に３回、１日に２回、１日に１回、１日おき、３日に１回、１週間に１回、２週間に１回、３週間に１回、月に１回の投与またはその他の反復投与が挙げられ、一定期間にわたって連続投与する方法も挙げられる。
【０３８５】
一例では、ヒアルロナン関連癌の治療は、ヒアルロナン依存的に間質液圧を低下させることを含む。例えば、ヒアルロニダーゼなどのヒアルロナン分解酵素の静脈内投与、特に、修飾された可溶性ヒアルロニダーゼ（例えば、ＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０）の投与は、ヒアルロナンリッチななヒト癌腫異種移殖片モデル（ＰＣ３）では、上昇した間質液圧を低下させるが、ヒアルロナン欠乏のヒト癌腫異種移殖片モデル（ＮＣＩ  Ｈ４６０）では低下させない（以下の実施例６および８〜９を参照）。以下の例において示されるように、間質液圧は、ヒアルロナンリッチな動物モデルにおいて腫瘍の大きさと相関する。したがって、可溶性ヒアルロニダーゼ、通常、ポリマーとコンジュゲートしているヒアルロニダーゼなどのヒアルロナン分解酵素を投与し（例えば、静脈内投与をはじめとする全身投与によって）、それによって、ヒアルロナン関連癌を有する対象において、上昇した間質液圧を低下させることによって癌を治療する方法が、本明細書において提供される。
【０３８６】
ヒアルロニダーゼなどのヒアルロナン分解酵素を用いる治療はまた、例えば、ヒアルロニダーゼを静脈内投与することによって、血管容積を増大させることおよび／または腫瘍中の水分含量を低減することを含み得る。
【０３８７】
ヒアルロニダーゼ単独などのヒアルロナン分解酵素単独での疾患の治療に加えて、ヒアルロナン分解酵素を、化学療法薬またはその他の抗癌剤または治療と組み合わせて、例えば、同時に、またはそれに先立って投与することによって、本明細書において提供される組成物および方法を使用してまた、ヒアルロナン関連癌を治療できる。この例では、ヒアルロニダーゼなどのヒアルロナン分解酵素は、通常、化学療法薬またはその他の抗癌剤の、固形腫瘍への浸透を増強し、それによって、疾患を治療する。ヒアルロニダーゼなどのヒアルロナン分解酵素は、抗癌剤とともに、腫瘍内に注射してもよく、または播種性癌または到達しづらい腫瘍には静脈内に注射してもよい。
【０３８８】
抗癌剤およびその他の治療
抗癌剤は、化学療法薬、抗体、ペプチドまたは遺伝子療法ベクター、ウイルスまたはＤＮＡであり得る。さらに、ヒアルロニダーゼなどのヒアルロナン分解酵素を使用して、多剤耐性を獲得しているこれまでは化学療法抵抗性であった腫瘍における感作のために、腫瘍細胞を循環プールに動員できる(St Croix et al., (1998) Cancer Lett September 131(1): 35-44)。例えば、ｒＨｕＰＨ２０などのヒアルロニダーゼをはじめとするヒアルロナン分解酵素はまた、モノクローナル抗体、サイトカインなどの生物製剤およびその他の薬剤の、グリコサミノグリカンを蓄積する腫瘍へのデリバリーを増強し得る。
【０３８９】
ヒアルロニダーゼなどのヒアルロナン分解酵素の投与の後に、それと一緒にまたはそれの前に投与できる例示的抗癌剤として、それだけには限らないが、アシビシン；アクラルビシン；アコダゾール；アクロニン；アドゼレシン；アルデスロイキン；アレムツズマブ；アリトレチノイン（９−Ｃｉｓ−レチノイン酸）；アロプリノール；アルトレタミン；アルボシジブ；アンバゾン；アンボマイシン；アメタントロン；アミホスチン；アミノグルテチミド；アムサクリン；アナストロゾール；アナキシロン；アンシタビン；アントラマイシン；アパジコン；アルギメスナ；ヒ素三酸化物；アスパラギナーゼ；アスペルリン；アトリムスチン；アザシチジン；アゼテパ；アゾトマイシン；バノキサントロン；バタブリン；バチマスタット；生ＢＣＧ；ベナキシビン；ベンダムスチン；ベンゾデパ；ベキサロテン；ベバシズマブ；ビカルタミド；ビエタセルピン；ビリコダル；ビサントレン；ビサントレン；ビスナフィドジメシレート；ビゼレシン；ブレオマイシン；ボルテゾミブ；ブレキナル；ブロピリミン；ブドチタン；ブスルファン；カクチノマイシン；カルステロン；カネルチニブ；カペシタビン；カラセミド；カルベチマー；カルボプラチン；カルボコン；カルモフール；ポリフェプロザンを伴うカルムスチン；カルムスチン；カルビシン；カルゼレシン；セデフィンゴール；セレコキシブ；セマドチン；クロラムブシル；シオテロネル；シロレマイシン；シスプラチン；クラドリビン；クランフェヌル；クロファラビン；クリスナトール；シクロホスファミド；リポソーム型シタラビン；シタラビン；ダカルバジン；ダクチノマイシン；ダルベポエチンα；リポソーム型ダウノルビシン；ダウノルビシン／ダウノマイシン；ダウノルビシン；デシタビン；デニロイキンジフチトクス；デクスニグルジピン；デキソナプラチン；デクスラゾキサン；デザグアニン；ジアジコン；ジブロスピジウム；ジエノゲスト；ジナリン；ジセルモリド；ドセタキセル；ドフェキダル；ドキシフルリジン；リポソーム型ドキソルビシン；ドキソルビシンＨＣＬ；ドコルビシンＨＣＬリポソーム注射剤；ドキソルビシン；ドロロキシフェン；プロピオン酸ドロモスタノロン；デュアゾマイシン；エコムスチン；エダトレキサート；エドテカリン；エフロールニチン；エラクリダル；エリナフィド；エリオットＢ溶液；エルサミトルシン；エミテフル；エンロプラチン；エンプロメート；エンザスタウリン；エピプロピジン；エピルビシン；エポエチンα；エプタロプロスト；エルブロゾール；エソルビシン；エストラムスチン；エタニダゾール；エトグルシド；リン酸エトポシド；エトポシドＶＰ−１６；エトポシド；エトプリン；エキセメスタン；エクシスリンド；ファドロゾール；ファザラビン；フェンレチニド；フィルグラスチム；フロクスウリジン；フルダラビン；フルオロウラシル；５−フルオロウラシル；フルオキシメステロン；フルロシタビン；ホスキドン；ホストリエシン；ホストリエシン；ホトレタミン；フルベストラント；ガラルビシン；ガロシタビン；ゲムシタビン；ゲムツズマブ／オゾガマイシン；ゲロキノール；ギマテカン；ギメラシル；グロキサゾン；グルホスファミド；酢酸ゴセレリン；ヒドロキシ尿素；イブリ��モマブ／チウキセタン；イダルビシン；イホスファミド；イルモホシン；イロマスタット；メシル酸イマチニブ；イメキソン；インプロスルファン；インジスラム；インプロコン；インターフェロンα２ａ；インターフェロンα２ｂ；インターフェロンα；インターフェロンβ；インターフェロンγ；インターフェロン；インターロイキン２および他のインターロイキン（組換えインターロイキンを含む）；イントプリシン；ヨーベングアン［１３１−Ｉ］；イプロプラチン；イリノテカン；イルソグラジン；イクサベピロン；ケトトレキサート；Ｌ−アラノシン；ランレオチド；ラパチニブ；レドキサントロン；レトロゾール；ロイコボリン；リュープロリド；リュープロレリン（リュープロレリド）；レバミソール；レキサカルシトール；リアロゾール；ロバプラチン；ロメトレキソール；ロムスチン／ＣＣＮＵ；ロムスチン；ロナファルニブ；ロソキサントロン；ルルトテカン；マホスファミド；マンノスルファン；マリマスタット；マソプロコール；メイタンシン；メクロレタミン；メクロレタミン／ナイトロジェンマスタード；酢酸メゲストロール；メゲストロール；メレンゲストロール；メルファラン；メルファランＩＬ−ＰＡＭ；メノガリル；メピチオスタン；メルカプトプリン；６−メルカプトプリン；メスナ；メテシンド；メトトレキサート；メトキサレン；メトミダート；メトプリン；メツレデパ；ミボプラチン；ミプロキシフェン；ミソニダゾール；ミチンドミド；ミトカルシン；ミトクロミン；ミトフラキソン；ミトギリン；ミトグアゾン；ミトマルシン；マイトマイシンＣ；マイトマイシン；ミトナフィド；ミトキドン；ミトスペル；ミトタン；ミトキサントロン；ミトゾロミド；ミボブリン；ミゾリビン；モファロテン；モピダモール；ムブリチニブ；ミコフェノール酸；フェンプロピオン酸ナンドロロン；ネダプラチン；ネルザラビン；ネモルビシン；ニトラクリン；ノコダゾール；ノフェツモバブ；ノガラマイシン；ノラトレキセド；ノルトピキサントロン；オクトレオチド；オプレルベキン；オルマプラチン；オルタタキセル；オテラシル；オキサリプラチン；オキシスラン；オキソフェナルシン；パクリタキセル；パミドロネート；パツビロン；ペガデマーゼ；ペガスパルガーゼ；ペグフィルグラスチム；ペルデシン；ペリオマイシン；ペリトレキソール；ペメトレキセド；ペンタムスチン；ペントスタチン；ペプロマイシン；ペルホスファミド；ペリホシン；ピコプラチン；ピナフィド；ピポブロマン；ピポスルファン；ピルフェニドン；ピロキサントロン；ピキサントロン；プレビトレキセド；プリカミシドミトラマイシン；プリカマイシン；プロメスタン；プロメスタン；ポルフィマーナトリウム；ポルフィマー；ポルフィロマイシン；プレドニムスチン；プロカルバジン；プロパミジン；プロスピジウム；プミテパ；ピューロマイシン；ピラゾフリン；キナクリン；ラニムスチン；ラスブリカーゼ；リボプリン；リトロスルファン；リツキシマブ；ログレチミド；ロキニメックス；ルホクロモマイシン；サバルビシン；サフィンゴール；サルグラモスチム；サトラプラチン；セブリプラチン；セムスチン；シムトラゼン；シゾフィラン；ソブゾキサン；ソラフェニブ；スパルホサート；ス���ルホス酸；スパルソマイシン；スピロゲルマニウム；スピロムスチン；スピロプラチン；スピロプラチン；スクアラミン；ストレプトニグリン；ストレプトバリシン；ストレプトゾシン；スホスファミド；スロフェヌル；リンゴ酸スニチニブ；６−チオグアニン（６−ＴＧ）；タセジナリン；タルク；タリソマイシン；タリムスチン；タモキシフェン；タリキダール；タウロムスチン；テコガラン；テガフール；テロキサントロン；テモポルフィン；テモゾロミド；テニポシド／ＶＭ−２６；テニポシド；テロキシロン；テストラクトン；チアミプリン；チオグアニン；チオテパ；チアミプリン；チアゾフリン；チロミソール；チロロン；チムコダル；チモナシック；チラパザミン；トピキサントロン；トポテカン；トレミフェン；トシツモマブ；トラベクテジン（エクチナサイジン７４３）；トラスツズマブ；トレストロン；トレチノイン／ＡＴＲＡ；トリシリビン；トリロスタン；トリメトレキセート；四硝酸トリプラチン；トリプトレリン；トロホスファミド；ツブロゾール；ウベニメクス；ウラシルマスタード；ウレデパ；バルルビシン；バルスポダル；バプレオチド；ベルテポルフィン；ビンブラスチン；ビンクリスチン；ビンデシン；ビネピジン；ビンフルニン；ビンホルミド；ビングリシネート；ビンロイシノール；ビンロイロシン；ビノレルビン；ビンロシジン；ビントリプトール；ビンゾリジン；ボロゾール；キサントマイシンＡ（グアメシクリン）；ゼニプラチン；ジラスコルブ［２−Ｈ］；ジノスタチン；ゾレドロネート；ゾルビシン；およびゾスキダル例えば、
アルデスロイキン（例えば、ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（登録商標））；アレムツズマブ（例えば、ＣＡＭＰＡＴＨ（登録商標））；アリトレチノイン（例えば、ＰＡＮＲＥＴＩＮ（登録商標））；アロプリノール（例えば、ＺＹＬＯＰＲＩＭ（登録商標））；アルトレタミン（例えば、ＨＥＸＡＬＥＮ（登録商標））；アミホスチン（例えば、ＥＴＨＹＯＬ（登録商標））；アナストロゾール（例えば、ＡＲＩＭＩＤＥＸ（登録商標））；三酸化ヒ素（例えば、ＴＲＩＳＥＮＯＸ（登録商標））；アスパラギナーゼ（例えば、ＥＬＳＰＡＲ（登録商標））；ＢＣＧ  Ｌｉｖｅ（例えば、ＴＩＣＥ（登録商標）ＢＣＧ）；ベキサロテン（例えば、ＴＡＲＧＲＥＴＩＮ（登録商標））；ベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標））；ブレオマイシン（例えば、ＢＬＥＮＯＸＡＮＥ（登録商標））；ブスルファン静脈内（例えば、ＢＵＳＵＬＦＥＸ（登録商標））；ブスルファン経口（例えば、ミレラン（登録商標））；カルステロン（例えば、ＭＥＴＨＯＳＡＲＢ（登録商標））；カペシタビン（例えば、ゼローダ（登録商標））；カルボプラチン（例えば、パラプラチン（登録商標））；カルムスチン（例えば、ＢＣＮＵ（登録商標）、ＢｉＣＮＵ（登録商標））；ポリフェプロサン（Ｐｏｌｉｆｅｐｒｏｓａｎｓ）を伴うカルムスチン（例えば、ＧＬＩＡＤＥＬ（登録商標）ウエハー）；セレコキシブ（例えば、ＣＥＬＥＢＲＥＸ（登録商標））；クロラムブシル（例えば、ＬＥＵＫＥＲＡＮ（登録商標））；シスプラチン（例えば、ＰＬＡＴＩＮＯＬ（登録商標））；クラドリビン（例えば、ＬＥＵＳＴＡＴＩＮ（登録商標）、２−ＣｄＡ（登録商標））；シクロホスファミド（例えば、ＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標）、ＮＥＯＳＡＲ（登録商標））；シタラビン（例えば、ＣＹＴＯＳＡＲ−Ｕ（登録商標））；シタラビンリポソーム（例えば、ＤｅｐｏＣｙｔ（登録商標））；ダカルバジン（例えば、ＤＴＩＣ−Ｄｏｍｅ）：ダクチノマイシン（例えば、ＣＯＳＭＥＧＥＮ（登録商標））；ダルベポエチンアルファ（例えば、ＡＲＡＮＥＳＰ（登録商標））；ダウノルビシンリポソーム（例えば、ＤＡＮＵＯＸＯＭＥ（登録商標））；ダウノルビシン／ダウノマイシン（例えば、ＣＥＲＵＢＩＤＩＮＥ（登録商標））；デニロイキンジフチトクス（例えば、ＯＮＴＡＫ（登録商標））；デクスラゾキサン（例えば、ＺＩＮＥＣＡＲＤ（登録商標））；ドセタキセル（例えば、タキソテール（登録商標））；ドキソルビシン（例えば、アドリアマイシン（登録商標）、ＲＵＢＥＸ（登録商標））；ドコルビシン（Ｄｏｃｏｒｕｂｉｃｉｎ）ＨＣＬリポソーム注射剤をはじめとするドキソルビシンリポソーム（例えば、ドキシル（登録商標））；プロピオン酸ドロモスタノロン（例えば、ＤＲＯＭＯＳＴＡＮＯＬＯＮＥ（登録商標）およびＭＡＳＴＥＲＯＮＥ（登録商標）注射剤）；エリオットＢ溶液（Ｅｌｌｉｏｔｔ’ｓ  Ｂ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（例えば、Ｅｌｌｉｏｔｔ’ｓ  Ｂ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（登録商標））；エピルビシン（例えば、ＥＬＬＥＮＣＥ（登録商標））；エポエチンアルファ（例えば、ＥＰＯＧＥＮ（登録商標））；エストラムスチン（例えば、ＥＭＣＹＴ（登録商標））；リン酸エトポシド（例えば、ＥＴＯＰＯ��ＨＯＳ（登録商標））；エトポシドＶＰ−１６（例えば、ベプシド（登録商標））；エキセメスタン（例えば、アロマシン（登録商標））；フィルグラスチム（例えば、ＮＥＵＰＯＧＥＮ（登録商標））；フロクスウリジン（例えば、ＦＵＤＲ（登録商標））；フルダラビン（例えば、フルダラ（登録商標））；フルオロウラシルを含む５−ＦＵ（例えば、ＡＤＲＵＣＩＬ（登録商標））；フルベストラント（例えば、ＦＡＳＬＯＤＥＸ（登録商標））；ゲムシタビン（例えば、ジェムザール（登録商標））；ゲムツズマブ／オゾガマイシン（例えば、ＭＹＬＯＴＡＲＧ（登録商標））；酢酸ゴセレリン（例えば、ＺＯＬＡＤＥＸ（登録商標））；ヒドロキシ尿素（例えば、ハイドレア（登録商標））；イブリツモマブ／チウキセタン（例えば、ＺＥＶＡＬＩＮ（登録商標））；イダルビシン（例えば、ＩＤＡＭＹＣＩＮ（登録商標））；イホスファミド（例えば、ＩＦＥＸ（登録商標））；メシル酸イマチニブ（例えば、ＧＬＥＥＶＥＣ（登録商標））；インターフェロンアルファ−２ａｓ（例えば、ＲＯＦＥＲＯＮ−Ａ（登録商標））；インターフェロンアルファ−２ｂｓ  （例えば、ＩＮＴＲＯＮ  Ａ（登録商標））；イリノテカン（例えば、ＣＡＭＰＴＯＳＡＲ（登録商標））；レトロゾール（例えば、ＦＥＭＡＲＡ（登録商標））；ロイコボリン（例えば、ＷＥＬＬＣＯＶＯＲＩＮ（登録商標）、ＬＥＵＣＯＶＯＲＩＮ（登録商標））；レバミソール（例えば、ＥＲＧＡＭＩＳＯＬ（登録商標））；ロムスチン／ＣＣＮＵ（例えば、ＣｅｅＢＵ（登録商標））；メクロレタミン／ナイトロジェンマスタード（例えば、ＭＵＳＴＡＲＧＥＮ（登録商標））；酢酸メゲストロール（例えば、ＭＥＧＡＣＥ（登録商標））；メルファラン／Ｌ−ＰＡＭ（例えば、ＡＬＫＥＲＡＮ（登録商標））；６−メルカプトプリン（６−ＭＰｓ；例えば、ＰＵＲＩＮＥＴＨＯＬ（登録商標））をはじめとするメルカプトプリン；メスナ（例えば  ＭＥＳＮＥＸ（登録商標））；メトトレキサート；メトキサレン（例えば、ＵＶＡＤＥＸ（登録商標））；マイトマイシン  Ｃ（例えば、ＭＵＴＡＭＹＣＩＮ（登録商標）、ＭＩＴＯＺＹＴＲＥＸ（登録商標））；ミトタン（例えば、ＬＹＳＯＤＲＥＮ（登録商標））；ミトキサントロン（例えば、ＮＯＶＡＮＴＲＯＮＥ（登録商標））；フェンプロピオン酸ナンドロロン（例えば、ＤＵＲＡＢＯＬＩＮ−５０（登録商標））；ノフェツモマブ（Ｎｏｆｅｔｕｍｏｍａｂｓ）（例えば、ＶＥＲＬＵＭＡ（登録商標））；オプレルベキン（例えば、ＮＥＵＭＥＧＡ（登録商標））；オキサリプラチン（例えば、エロキサチン（登録商標））；パクリタキセル（例えば、ＰＡＸＥＮＥ（登録商標）、ＴＡＸＯＬ（登録商標））；パミドロン酸（例えば、ＡＲＥＤＩＡ（登録商標））；ペガデマーゼ（例えば、ＡＤＡＧＥＮ（登録商標））；ペグアスパルガーゼ（例えば、ＯＮＣＡＳＰＡＲ（登録商標））；ペグフィルグラスチム（例えば、ＮＥＵＬＡＳＴＡ（登録商標））；ペントスタチン（例えば、ＮＩＰＥＮＴ（登録商標））；ピポブロマン（例えば、ＶＥＲＣＹＴＥ（登録商標））；プリカマイシン／ミトラマイシン（例えば、ＭＩＴＨＲＡＣＩＮ（登録商標））；ポルフィマーナトリウム（例えば、フォトフリン（登録商標））；プロカルバジン（例えば、ＭＡＴＵＬＡＮＥ（登録商標））；キナクリン（例えば、ＡＴＡＢＲＩＮＥ（登録商標））；ラスブリカーゼ（例えば、ＥＬＩＴＥＫ（登録商標））；リツキシマブ（例えば、ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標））；サルグラモスチム（例えば、ＰＲＯＫＩＮＥ（登録商標））；ストレプトゾシン（例えば、ＺＡＮＯＳＡＲ（登録商標））；リンゴ酸スニチニブ（例えば、ＳＵＴＥＮＴ（登録商標））；タルク（例えば、ＳＣＬＥＲＯＳＯＬ（登録商標））；タモキシフェン（例えば、ノルバデックス（登録商標））；テモゾロミド（例えば、ＴＥＭＯＤＡＲ（登録商標））；テニポシド／ＶＭ−２６（例えば、ＶＵＭＯＮ（登録商標））；テストラクトン（例えば、ＴＥＳＬＡＣ（登録商標））；６−チオグアニン（６−ＴＧ）をはじめとするチオグアニン；チオテパ（例えば、ＴＨＩＯＰＬＥＸ（登録商標））；トポテカン（例えば、ハイカムチン（登録商標））；トレミフェン（例えば、フェアストン（登録商標））；トシツモマブ（例えば、ＢＥＸＸＡＲ（登録商標））；トラスツズマブ（例えば、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標））；トレチノイン／ＡＴＲＡ（例えば、ＶＥＳＡＮＯＩＤ（登録商標））；ウラシルマスタード；バルルビシン（例えば、ＶＡＬＳＴＡＲ（登録商標））；ビンブラスチン（例えば、ＶＥＬＢＡＮ（登録商標））；ビンクリスチン（例えば、ＯＮＣＯＶＩＮ（登録商標））；ビノレルビン（例えば、ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（登録商標））；およびゾレドロネート（例えば、ＺＯＭＥＴＡ（登録商標））が挙げられる。
【０３９０】
一例では、修飾されたヒアルロニダーゼ、例えば、ＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０などのヒアルロナン分解酵素が、ドセタキセル（例えば、タキソテール（登録商標））、ドキソルビシンリポソーム（例えば、ドキシル（登録商標））、リンゴ酸スニチニブ（例えば、ＳＵＴＥＮＴ（登録商標））またはベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標））のうち１種または複数の投与の後、投与と一致して、投与の前に対象に投与される。
【０３９１】
ヒアルロニダーゼをはじめとするヒアルロナン分解酵素を使用して、従来の化学療法に対して耐性である腫瘍の感受性を増大することができる。例えば、ｒＨｕＰＨ２０などのヒアルロニダーゼをはじめとするヒアルロナン分解酵素を、ＨＹＡＬ１欠乏と関連している腫瘍を有する患者に、腫瘍部位周囲の拡散を増大する（例えば、腫瘍部位中および腫瘍部位周囲の化学療法薬の循環および／または濃度を促進する）、ヒアルロン酸分解などによって腫瘍細胞運動性を阻害する、および／または腫瘍細胞アポトーシス閾値を低下させるのに有効な量で投与できる。これによって、腫瘍細胞（単数または複数）をアノイキスの状態に至らせることができ、これは腫瘍細胞を、化学療法薬の作用に対してより感受性にする。ヒアルロニダーゼなどのヒアルロナン分解酵素の投与は、これまでは化学療法耐性であった膵臓、胃、結腸、卵巣および乳房の腫瘍の応答性を誘導し得る(Baumgartner et al. (1988) Reg. Cancer Treat. 1:55-58; Zanker et al. (1986) Proc. Amer. Assoc. Cancer Res. 27:390)。
【０３９２】
一例では、ヒアルロナン分解酵素、特に、ヒアルロニダーゼは、非癌性細胞に対して内因性ヒアルロニダーゼ活性が低下しているものをはじめとする転移性癌および非転移性癌の治療において使用される。ヒアルロニダーゼなどのヒアルロナン分解酵素は、単独で、またはその他の化学療法薬と組み合わせて化学療法薬として使用できる。例示的癌として、それだけには限らないが、小肺細胞癌腫、肺扁平上皮癌および乳房、卵巣、頭頸部の癌またはヒアルロニダーゼ活性の低下したレベルまたはヒアルロン酸異化作用の低下と関連している任意のその他の癌が挙げられる。
【０３９３】
ｃ．間質液圧の上昇と関連しているその他の疾患の治療における使用
また、提供される組成物および方法を使用して、それだけには限らないが、椎間板圧迫および臓器移植、卒中、脳外傷または本明細書に記載されるその他の状態によって引き起こされる浮腫をはじめとする浮腫を含めた、高い間質液圧と関連しているその他のヒアルロナン関連疾患を治療できる。
【０３９４】
３．展着剤としての使用
一例では、本明細書に記載される方法を使用して製造されるヒアルロニダーゼ、例えば、ｒＨｕＰＨ２０などのヒアルロナン分解酵素は、ｉｎ  ｖｉｖｏで薬剤（単数または複数）および／または分子の、種々の哺乳類組織のいずれかへのデリバリーを促進または増強することによって、ヒアルロナン関連疾患または状態を治療するために投与される。ヒアルロニダーゼをはじめとするヒアルロナン分解酵素を使用して、拡散を促進し、従って、小分子薬理作用物質ならびにタンパク質、核酸およびリボ核酸などの、より大きな分子の薬理作用物質および、それだけには限らないが、核酸、タンパク質、炭水化物、脂質、脂質ベースの分子および薬物をはじめとする成分の組合せを含有し得る高分子の組成物のデリバリーを推進し得る。例えば、約１０ｎｍから約５００ｎｍの範囲の直径の分子および高分子複合体は、間質空間がそれまでにヒアルロニダーゼに曝露されていた、または同時に曝露される場合に、間質空間を通るデリバリーにおいて劇的な改善を示し得る。（例えば、米国特許出願第１０／７９５，０９５号、同１１／０６５，７１６号および同１１／２３８，１７１号参照）。
【０３９５】
可溶性ヒアルロニダーゼなどのヒアルロナン分解酵素の投与とともに、または投与後に投与できる、医薬品、治療薬、治療および化粧剤、分子および治療の例として、それだけには限らないが、麻酔薬；代謝拮抗薬、抗新生物薬、化学療法薬およびその他の抗癌剤および抗癌治療；抗ウイルス薬；抗菌薬およびその他の抗生物質、抗真菌薬およびその他の抗感染薬を含めた抗感染薬；免疫調節薬；ステロイド系および非ステロイド系抗胃炎症薬；β遮断薬；交感神経模倣薬；ドコサノイド（ｄｕｃｏｓａｎｏｉｄｓ）、プロスタグランジンおよびプロスタグランジン類似物；縮瞳薬、コリン作動薬および抗コリンエステラーゼ薬；抗アレルギー剤および鬱血除去薬；ホルモン剤；増殖因子；免疫抑制剤；ワクチンおよびトキソイド；抗血清；抗体；鎮痛薬、抗炎症薬、抗菌薬、殺アメーバ剤、殺トリコモナス剤、抗パーキンソン病薬、抗マラリア薬、抗痙攣薬、抗抑制薬、抗関節炎薬、抗真菌薬、抗高血圧薬、解熱薬、抗寄生虫薬、抗ヒスタミン薬、α−アドレナリン作動性アゴニスト剤、α遮断薬、麻酔薬、気管支拡張剤、殺生物剤、殺菌剤、静菌剤、βアドレナリン作動性の遮断薬、カルシウムチャネル遮断薬、心血管薬剤、避妊薬、化粧剤または審美剤、鬱血除去薬、利尿薬、抑制薬、診断薬、電解質物質、催眠薬、ホルモン剤、血糖上昇剤、筋弛緩薬、筋肉収縮剤、眼科用剤、副交感神経作動薬、精神賦活剤、鎮静薬、睡眠誘導物質、交感神経作用薬、トランキライザー物質、尿路剤、膣剤、抗ウイルス剤、ビタミン剤、非ステロイド系抗炎症薬およびアンジオテンシン変換酵素阻害剤ならびにそれらの組合せが挙げられる。
【０３９６】
４．皮下点滴療法における使用
皮下点滴療法、皮膚の皮下組織への流体および電解液の注入は、軽度から中程度の脱水状態の成人患者、特に、高齢者に適した、有用で簡単な水和技術である。安全および有効と考えられるが、ほとんどのよくある悪影響は、局所マッサージまたは全身性利尿薬によって治療できる軽度の皮下浮腫である。２箇所の別個の部位で２４時間で約３Ｌを与えることができる。一般的な注入部位として、胸部、腹部、大腿および上腕が挙げられる。皮下点滴療法において使用される溶液として、例えば、生理食塩水、２分の１生理食塩水、生理食塩水を含むグルコースおよび５％グルコースが挙げられる。塩化カリウムも溶液に加えることができる。溶液へのヒアルロニダーゼなどの１種または複数のヒアルロナン分解酵素の添加は、流体吸収を増強し、全体的な投与率を高めることができる。したがって、提供された組成物および方法を使用して、対象への投与による皮下点滴療法を処理できる。
【０３９７】
５．硝子体切除術および眼部障害および状態に対する適用
可溶性ヒアルロニダーゼなどのヒアルロナン分解酵素を含有する提供された組成物を使用して、硝子体切除術の際の網膜の剥離または断裂を最小にすることができる。このような断裂は、例えば、硝子体の除去に先立って、硝子体を網膜から分離されるまたは「挿入されていない」ようにできる。硝子体のこのような挿入されていないことまたは分離されていることは、硝子体が除去されるときに網膜のさらなる断裂または剥離が起こる可能性を最小にできる。
【０３９８】
提供される、ヒアルロニダーゼ組成物をはじめとするヒアルロナン分解酵素組成物および方法を、米国特許第５，２９２，５０９号に記載される硝子体切除術補助剤適用をはじめとする種々の眼部適用のために使用できる。本明細書に記載される方法によって製造および精製された、ヒアルロニダーゼ、例えば、ｒＨｕＰＨ２０などの高度に精製されたヒアルロナン分解酵素の使用が、眼球内手順にとって免疫原性および毒性を最小化するために望ましい。いくつかの例では、ＰＥＧ化ヒアルロニダーゼを使用して、硝子体液内での居留を延長し、局部的な取り込みを防ぐことができる。
【０３９９】
提供された、可溶性ヒアルロニダーゼを含有する組成物をはじめとするヒアルロニダーゼをはじめとするヒアルロナン分解酵素を使用して、例えば、新血管新生を妨げ、網膜に対して有毒な物質の硝子体液からのクリアランス速度を高めることによって眼部障害を治療および／または予防できる。ヒアルロニダーゼをはじめとするヒアルロナン分解酵素は、眼に対して中毒性障害を引き起こすことなく眼の硝子体液を液化するのに有効な量で投与できる。硝子体液の液化は、硝子体房（ｖｉｔｒｅａｌ  ｃｈａｍｂｅｒ）からの液体交換速度を高める。この交換時の増大によって、存在が眼科的損傷および網膜損傷を引き起こし得る汚染物質が除去される。
【０４００】
また、提供された、ヒアルロニダーゼ組成物をはじめとするヒアルロナン分解酵素組成物および方法を使用して、術後圧力を低下させることができる。ヒアルロン酸は、眼において主として白内障および眼球内レンズ外科手技の際のスペーサーとして使用されてきた。また、緑内障、硝子体および網膜手術などのその他の眼の外科手技において、また角膜移植においても使用される。術後白内障患者において起こるよくある副作用は、かなり早期の、時には長期の眼内圧の上昇である。このような状態は、特に、緑内障性視神経乳頭変化を有する患者では深刻であることもある。ヒアルロニダーゼなどのヒアルロナン分解酵素は、手術の前に眼にヒアルロン酸と同時投与し、眼において術後圧力を低下させることができる。例えば、ヒアルロニダーゼを、手術の際の有効性を低減することなく、患者において副作用を引き起こすことなくヒアルロン酸を分解することによって、眼内圧を術前レベルに低減するのに有効な量で投与できる（米国特許第６，７４５，７７６号）。
【０４０１】
ヒアルロニダーゼなどのヒアルロナン分解酵素はまた、緑内障の患者に投与して、輪状網目構造からグリコサミノグリカンを除去し、眼内圧を低下させることができ、硝子体に適用して、糖尿病性網膜症、網膜新血管新生、網膜静脈閉塞、後部硝子体剥離、網膜裂孔および眼外傷などの状態に関連して起こり得る硝子体出血（すなわち、硝子体への血液の血管外漏出）の回復を促進できる。通常、回復が遅い硝子体出血の存在は、それだけには限らないが、増殖性糖尿病性網膜症などの状態の主な治療であることが多いレーザー光凝固などの、診断のため、および／または治療手順のために、網膜が硝子体によって可視化されることを必要とする手順を遅延、複雑化し得る、または妨げ得る。
【０４０２】
６．遺伝子療法適用
ｉｎ  ｖｉｖｏでのほとんどの遺伝子デリバリービヒクルの有効性は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで見られ、観察される有効性と対応しない。グリコサミノグリカンは、ＤＮＡおよびウイルスベクターの、多数の細胞種への導入および拡散を妨げ得る。このような細胞外マトリックス物質のレベルは、このプロセスを相当に妨げ得る。ヒアルロニダーゼなどのヒアルロナン分解酵素の投与は、細胞外マトリックスのチャンネルを開け、したがって、遺伝子療法のデリバリーを増強することができる。例えば、ヒアルロニダーゼなどのヒアルロナン分解酵素を、コラゲナーゼとともに投与して、ｉｎ  ｖｉｖｏでＤＮＡの形質導入を促進できる(Dubinsky et al. (1984) Proc Natl Acad Sci USA 81(23):7529-33)。ヒアルロニダーゼをはじめとするヒアルロナン分解酵素は、アデノ随伴ウイルスを使用する遺伝子療法を増強できる(Favre et al、(2000) Gene Therapy 7(16):1417-20)。例えば、ヒアルロニダーゼの投与後に開かれるチャンネルは、通常、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスおよびＤＮＡ複合体（ならびに注目するその他の治療薬および薬剤）などの小分子の拡散を増強する大きさのものである。しかし、孔は、細胞の転位および運動を促進するほど大きくはない。
【０４０３】
いくつかの例では、ウイルスを、ヒアルロニダーゼなどの１種または複数のヒアルロナン分解酵素を発現するよう、その複製および標的組織内の蔓延を促進するよう操作することができる。標的組織は、例えば、ウイルスが腫瘍内で選択的複製できる癌性組織であり得る。ウイルスはまた、組織特異的プロモーターのもとでウイルスが選択的に複製する非溶菌性ウイルスであり得る。ウイルスが複製するので、ヒアルロニダーゼなどのヒアルロナン分解酵素の、ウイルス遺伝子との同時発現は、ｉｎ  ｖｉｖｏでのウイルスの蔓延を促進し得る。
【０４０４】
７．化粧適用
ヒアルロニダーゼをはじめとするヒアルロナン分解酵素を投与して、セルライトの蓄積に関与するグリコサミノグリカンを除去し、リンパ液の流れを促進できる。いくつかの例では、セルライトの治療のために、例えば、ｒＨｕＰＨ２０などのヒトヒアルロニダーゼをはじめとするヒアルロナン分解酵素が使用される。ヒアルロニダーゼなどのヒアルロナン分解酵素を、反復皮下注射によって軟膏もしくはクリームの形態の経皮デリバリーによって、または注射用持続放出処方の使用によって投与し、グリコサミノグリカンの連続分解を促進し、その再現を防止できる。
【０４０５】
また、ヒアルロニダーゼをはじめとするヒアルロナン分解酵素を使用して、「豚皮状」浮腫または「オレンジ皮状」浮腫などの状態を治療できる。ヒアルロニダーゼなどのヒアルロナン分解酵素は、結合水の保持および代謝廃棄物を排除する有機液体の拡散の毛細血管圧縮による遅延に関与する、真皮中に蓄積し得る長いムコ多糖鎖の脱重合を達成できる。脂質細胞の脂肪過負荷と関連しているこのような水および廃棄物の保持が、従来の「豚皮状」浮腫または「オレンジ皮状」浮腫をなす。脱重合は、ムコ多糖の長い鎖を短い鎖に切断し、結合水および廃棄物の排出ならびに静脈循環およびリンパ循環の回復をもたらし得、結果的に、局所浮腫の消失になる。
【０４０６】
８．臓器移植における使用
臓器中のヒアルロン酸の含量は、炎症で増大し得る。肺胞炎(Nettelbladt et al. (1991) Am. Rev. Resp. Dis. 139: 759-762)および心筋梗塞(Waldenstrom et al. (1991) J. Clin. Invest. 88(5): 1622-1628)などの炎症性−免疫学的傷害を特徴とする種々の臓器に由来する組織においてヒアルロン酸の濃度の増大が観察されている。その他の例として、腎移植(Haellgren et al. (1990) J. Exp. Med. 171: 2063-2076；Wells et al. (1990) Transplantation 50: 240-243)、小腸移植(Wallander et al. (1993) Transplant. Int.  6: 133-137)または心臓移植(Haellgren et al. (1990)  J Clin Invest 185:668-673)後の同種移植片拒絶;またはウイルス起源の心筋炎症 (Waldenstrom et al. (1993) Eur. J. Clin. Invest. 23: 277-282が挙げられる。臓器の移植に関連する間質性浮腫の出現は、移植手術の分野では重大な問題をなす。間質性浮腫を有する移植片は、機能が一時的に失われるような程度に膨潤し得る。いくつかの例では、膨潤は腎臓の破壊を引き起こし、広範囲の出血をもたらし得る。ヒアルロニダーゼをはじめとするヒアルロナン分解酵素を使用して、臓器移植片中の蓄積したグリコサミノグリカンを分解できる。このようなグリコサミノグリカンの除去が、移植片からの水の除去を促進し、臓器機能を増強する。
【０４０７】
９．脳におけるグリコサミノグリカン蓄積の治療における使用
いくつかの脳脊髄の病的状態では、ヒアルロン酸レベルが上昇している。脳脊髄のヒアルロン酸のレベルは、通常、成人において２００μｇ／Ｌ未満である(Laurent et al. (1996) Acta Neurol Scand September 94(3):194-206)が、髄膜炎、脊柱管狭窄、頭部外傷および大脳梗塞などの疾患では、８０００μｇ／Ｌを超えるレベルに上昇し得る。例えば、ｒＨｕＰＨ２０などのヒアルロニダーゼをはじめとするヒアルロナン分解酵素を利用して、非常に上昇したレベルの基質を分解できる。
【０４０８】
脳に有効なリンパ管がないことも、頭部外傷後の生死にかかわる浮腫につながり得る。ヒアルロン酸蓄積は、ヒアルロン酸シンターゼによる合成の増大および分解の減少の結果である。ヒアルロン酸の蓄積は、最初、損傷を受けた組織において水分含量の増大という有益な目的を果たし、白血球の血管外漏出を促進し得るが、蓄積の継続は致死的であり得る。頭部外傷を受けている患者への、くも膜下腔内または静脈内などへのヒアルロニダーゼなどのヒアルロナン分解酵素の投与は、組織ヒアルロン酸蓄積およびそれと関連している水の除去するよう働き得る。
【０４０９】
ヒアルロニダーゼなどのヒアルロナン分解酵素はまた、脳腫瘍と関連している浮腫、特に、多形神経膠芽腫と関連している浮腫の治療において使用できる。脳腫瘍と関連している浮腫は、腫瘍に隣接する脳の非癌性部分におけるヒアルロン酸の蓄積に起因する。ヒアルロン酸蓄積部位へのヒアルロニダーゼなどのヒアルロナン分解酵素の投与（例えば、静脈内注射による、またはシャントによる）は、これらの部位の過剰なヒアルロン酸を分解することによって、このような悪性腫瘍と関連している浮腫を軽減できる。
【０４１０】
１０．心血管疾患におけるグリコサミノグリカン蓄積の治療における使用
ヒアルロニダーゼをはじめとするヒアルロナン分解酵素は、一部の心血管疾患の治療において使用できる。実験的心筋梗塞後の、動物モデルにおけるヒアルロニダーゼなどのヒアルロナン分解酵素の投与は、梗塞の大きさを低減し得る(Maclean、et al (1976) Science 194(4261):199-200)。このことが起こり得る１つの提案される機序は、虚血再潅流後に生じるヒアルロン酸蓄積を低減することによってである。梗塞の大きさの低減は、リンパ排液の増大および組織酸素化の増大および心筋水分含量の低減から起こると考えられる。
【０４１１】
ヒアルロニダーゼをはじめとするヒアルロナン分解酵素を使用して、動脈硬化症からの冠動脈プラークを制限できる。このようなプラークは、グリコサミノグリカンを蓄積し、マクロファージを媒介し、細胞間接着を形成する（ｆｏａｍ）(Kolodgie et al. (2002) Arterioscler Thromb Vasc Biol. 22(10):1642-8)。
【０４１２】
１１．肺疾患における使用
正常な個体由来の気管支肺胞上皮洗浄液（ＢＡＬ）中のヒアルロン酸のレベルは、通常、１５ｎｇ／ｍｌ未満である。しかし、呼吸困難の状態では、ＢＡＬ中のヒアルロン酸レベルは劇的に上昇する(Bjermer et al.(1987) Br Med J (Clin Res Ed) 295(6602):803-6)。肺におけるヒアルロン酸の増大は、酸素拡散およびガス交換ならびに好中球およびマクロファージ応答の活性化を妨げ得る。例えば、ｒＨｕＰＨ２０などのヒアルロナン分解酵素の精製された調製物、例えば、本明細書において提供される方法を使用して製造されるものは、肺デリバリーまたは静脈内デリバリーのいずれかによって、このような状態を提示する患者にデリバリーされ、ヒアルロナンレベルを低減し得る。ヒアルロニダーゼをはじめとするヒアルロナン分解酵素はまた、グリコサミノグリカンの上昇と関連しているその他の肺の合併症を患う患者に投与でき、またはその他の肺に同時デリバリーされる分子のデリバリーを増強できる。
【０４１３】
１２．その他の使用
その治療的使用のさらなる例では、ヒアルロニダーゼなどのヒアルロナン分解酵素を、ビンカアルカロイドなどの壊死物質の静脈傍注射からの局所壊死に対する解毒薬、神経節嚢胞の治療(Paul et al. (1997) J Hand Surg. 22 (2): 219-21)および静脈不全による組織壊死の治療(Elder et al. (1980) Lancet 648-649)のような目的で使用できる(Few et al. (1987) Amer. J. Matern. Child Nurs. 12、23-26)。また、ヒアルロニダーゼをはじめとするヒアルロナン分解酵素を使用して、最もよく見られる手の軟組織塊であり、皮膚の下に障ることができる液体で満たされた嚢である、神経節嚢胞（手首嚢胞、聖書嚢胞、背側腱嚢胞としても知られる）を治療できる。
【０４１４】
ヒアルロニダーゼなどのヒアルロナン分解酵素を、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＣＳＰＧ）を分解することによって脊髄損傷の治療に使用できる。脊髄損傷後、星状細胞によってＣＳＰＧを含有する神経膠瘢痕が産生される。ＣＳＰＧは、軸策成長の阻害において重要な役割を果たす。さらに、ＣＳＰＧの発現は、中枢神経系（ＣＮＳ）の損傷後増大することがわかっている。また、ヒアルロナン分解酵素を化学的髄核融解術として知られる過程において椎間板ヘルニアの治療に利用できる。コンドロイチナーゼＡＢＣ、ヒアルロニダーゼと同様の基質を切断する酵素は、腰椎において椎間板内圧力の低減を誘導できる。３種の椎間板損傷がある。突出型椎間板は、無傷であるが、膨隆しているものである。脱出型椎間板では、線維包（ｆｉｂｒｏｕｓ  ｗｒａｐｐｅｒ）は、破れており、髄核（ＮＰ）がはみ出しているがまだ椎間板と結び付いている。遊離型椎間板では、ＮＰの断片が破壊されて椎間板から遊離しており、脊柱管中に遊離している。化学的髄核融解術は、通常、突出型および脱出型椎間板に対して有効であるが、遊離型椎間板損傷に対しては有効ではない。
【０４１５】
Ｉ．実施例
以下の例は、単に例示的目的のために含まれるのであって、本発明の範囲を制限しようとするものではない。
【実施例１】
【０４１６】
可溶性ｒＨｕＰＨ２０を発現する細胞株の作製
ＨＺ２４プラスミド（配列番号５２に示される）を使用して、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）をトランスフェクトした（例えば出願番号第１０，７９５，０９５号、同１１／０６５，７１６号および同１１／２３８，１７１号参照）。可溶性ｒＨｕＰＨ２０の発現のためのＨＺ２４プラスミドベクターは、ｐＣＩベクター骨格（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ヒトＰＨ２０ヒアルロニダーゼのアミノ酸１〜４８２をコードするＤＮＡ（配列番号４９）、ＥＣＭＶウイルス由来の内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）およびマウスジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子を含有する。ｐＣＩベクター骨格はまた、β−ラクタマーゼ耐性遺伝子をコードするＤＮＡ（ＡｍｐＲ）、ｆ１複製起点、サイトメガロウイルス最初期エンハンサー／プロモーター領域（ＣＭＶ）、キメライントロンおよびＳＶ４０後期ポリアデニル化シグナル（ＳＶ４０）も含む。可溶性ｒＨｕＰＨ２０構築物をコードするＤＮＡは、ヒトＰＨ２０の天然の３５アミノ酸シグナル配列のアミノ酸位置１のメチオニンをコードするＤＮＡの前にＮｈｅＩ部位およびＫｏｚａｋコンセンサス配列ならびに配列番号１に示されるヒトＰＨ２０ヒアルロニダーゼのアミノ酸位置４８２に対応するチロシンをコードするＤＮＡの後に停止コドン、続いて、ＢａｍＨＩ制限部位を含有する。したがって、構築物ｐＣＩ−ＰＨ２０−ＩＲＥＳ−ＤＨＦＲ−ＳＶ４０ｐａ（ＨＺ２４）は、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）によって分離されている、ヒトＰＨ２０のアミノ酸１〜４８２（配列番号３に示される）およびマウスジヒドロ葉酸レダクターゼのアミノ酸１〜１８６（配列番号５３に示される）をコードする、ＣＭＶプロモーターによって駆動される単一のｍＲＮＡ種をもたらす。
【０４１７】
４ｍＭグルタミンおよび１８ｍｌ／Ｌ  Ｐｌｕｒｉｏｎｉｃ  Ｆ６８／Ｌ（Ｇｉｂｃｏ）を補給したＤＨＦＲ（−）細胞のためのＧＩＢＣＯ改変ＣＤ−ＣＨＯ培地で増殖する非トランスフェクトＤＧ４４  ＣＨＯ細胞を、トランスフェクションのための調製物中、振盪フラスコ中に０．５×１０６個細胞／ｍｌで播種した。細胞を、１２０ｒｐｍで振盪しながら、加湿したインキュベーター中５％  ＣＯ２中、３７℃で増殖させた。対数増殖中の非トランスフェクトＤＧ４４  ＣＨＯ細胞を、トランスフェクションの前に生存力について試験した。
【０４１８】
非トランスフェクトＤＧ４４  ＣＨＯ細胞培養物のうち６００万個の生存細胞を、ペレットにし、０．７ｍＬの２×トランスフェクションバッファー（２×ＨｅＢＳ：４０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．０、２７４ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＫＣｌ、１．４ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１２ｍＭ  デキストロース）に、２×１０７個細胞の密度で再懸濁した。再懸濁された細胞の各アリコートに、０．０９ｍＬ（２５０μｇ）の直鎖ＨＺ２４プラスミド（ＣｌａＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）とともの一晩消化によって直線化された）を加え、室温で細胞／ＤＮＡ溶液を、０．４ｃｍ  ｇａｐ  ＢＴＸ（Ｇｅｎｔｒｏｎｉｃｓ）エレクトロポレーションキュベットに移した。陰性対照エレクトロポレーションは、細胞と混合されるプラスミドＤＮＡを用いずに実施した。細胞／プラスミド混合物に、３３０Ｖおよび９６０μＦまたは３５０Ｖおよび９６０μＦでのコンデンサ放電を用いてエレクトロポレーションを行った。
【０４１９】
エレクトロポレーション後、キュベットから細胞を回収し、５ｍＬの、４ｍＭグルタミンおよび１８ｍｌ／Ｌ  Ｐｌｕｒｉｏｎｉｃ  Ｆ６８／Ｌ（Ｇｉｂｃｏ）を補給したＤＨＦＲ（−）細胞のための改変ＣＤ−ＣＨＯ培地に移し、加湿したインキュベーター中、５％  ＣＯ２、３７℃で２日間、選択せずに、６ウェル組織培養プレートのウェル中で増殖させた。
【０４２０】
エレクトロポレーションの２日後、各ウェルから０．５ｍＬの組織培養培地を回収し、実施例２に記載されるマイクロ濁度アッセイを使用して、ヒアルロニダーゼ活性の存在について検査した。
【０４２１】
【表３】
2014041131.tif 000005
【０４２２】
トランスフェクション２（３５０Ｖ）から得た細胞を、組織培養ウェルから集め、カウントし、１ｍｌあたり１×１０４〜２×１０４個の生存細胞に希釈した。細胞懸濁液の０．１ｍＬのアリコートを、５枚の９６ウェル丸底組織培養プレートの各ウェルに移した。１００マイクロリットルの、４ｍＭのＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）−１サプリメント（ＧＩＢＣＯ（商標）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を含有し、ヒポキサンチンおよびチミジンサプリメントは含まないＣＤ−ＣＨＯ培地（ＧＩＢＣＯ）を、細胞を含有するウェルに加えた（最終容量０．２ｍＬ）。
【０４２３】
メトトレキサートを用いずに増殖させた５枚のプレートから１０個のクローンを同定した。
表４．同定されたクローンのヒアルロニダーゼ活性
【０４２４】
【表４】
2014041131.tif 000006
【０４２５】
６個のＨＺ２４クローンを培養で拡大し、単細胞懸濁液として振盪フラスコに移した。クローン３Ｄ３、３Ｅ５、２Ｇ８、２Ｄ９、１Ｅ１１および４Ｄ１０を、細胞を、左上隅のウェルで５０００個細胞で出発し、プレートを下に１：２希釈、プレートを横に１：３希釈した二次元無限希釈戦略を使用して９６ウェル丸底組織培養プレートにプレーティングした。希釈したクローンを、培養中最初の数日間に必要な増殖因子を提供するために、ウェルあたり５００個の非トランスフェクトＤＧ４４  ＣＨＯ細胞のバックグラウンド中で増殖させた。サブクローンあたり１０枚のプレートを作製し、５枚のプレートは５０ｎＭメトトレキサートを含有し、５枚のプレートはメトトレキサートを含有しなかった。
【０４２６】
クローン３Ｄ３から２４個の眼に見えるサブクローンが得られた（メトトレキサート処理なしから１３個、５０ｎＭメトトレキサート処理から１１個。２４個のサブクローンのうち８個から得た上清において、相当なヒアルロニダーゼ活性が測定され（＞５０ユニット／ｍＬ）、これら８個のサブクローンをＴ−２５組織培養フラスコに拡大した。メトトレキサート処理プロトコールから単離されたクローンを、５０ｎＭのメトトレキサートの存在下で拡大した。クローン３Ｄ３５Ｍを、５００ｎＭメトトレキサート中でさらに拡大し、振盪フラスコ中で１，０００ユニット／ｍｌを超えて産生するクローンを生じさせた（クローン３Ｄ３５Ｍ；またはＧｅｎ１  ３Ｄ３５Ｍ）。次いで、３Ｄ３５Ｍ細胞のマスター細胞バンク（ＭＣＢ）を調製した。
【実施例２】
【０４２７】
可溶性ｒＨｕＰＨ２０のヒアルロニダーゼ活性の決定
細胞培養物、精製画分および精製溶液などのサンプル中の可溶性ｒＨｕＰＨ２０のヒアルロニダーゼ活性を、ヒアルロン酸が血清アルブミンと結合するときの不溶性沈殿の形成に基づく比濁アッセイを使用して決定した。活性は、可溶性ｒＨｕＰＨ２０を、ヒアルロン酸ナトリウム（ヒアルロン酸）とともに一定期間（１０分）インキュベートすることおよび未消化のヒアルロン酸ナトリウムを酸性化血清アルブミンの添加によって沈殿させることによって測定される。得られたサンプルの濁度を、３０分の発生期間の後、６４０ｎｍで測定する。ヒアルロン酸ナトリウム基質の酵素活性に起因する濁度の低下が、可溶性ｒＨｕＰＨ２０ヒアルロニダーゼ活性の尺度である。方法は、可溶性ｒＨｕＰＨ２０アッセイ作業参照標準の希釈物を用いて作製した較正曲線を使用して実施され、サンプル活性測定は、この較正曲線に対して行われる。サンプルの希釈物は、酵素希釈溶液で調製した。酵素希釈溶液は、３３．０±０．０５ｍｇの加水分解ゼラチンを、２５．０ｍＬの５０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ反応バッファー（１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ、ｐＨ５．５）および２５．０ｍＬのＳＷＦＩに溶解すること、および０．２ｍＬの２５％  Ｂｕｍｉｎａｔｅ溶液を混合物に希釈することおよび３０秒間ボルテックス処理することによって調製した。これは、使用の２時間以内に実施し、必要になるまで氷上で保存した。サンプルを推定１〜２Ｕ／ｍＬに希釈した。通常、工程あたりの最大希釈は、１：１００を超えず、第１の希釈のための最初のサンプルサイズは、２０μＬ以上であった。アッセイを実施するために必要な最小サンプル容積は：インプロセスサンプル、ＦＰＬＣ画分：８０μＬ；組織培養上清：１ｍＬ；濃縮物質８０μＬ；精製または最終工程物質：８０μＬであった。希釈は、低タンパク質結合９６ウェルプレート中で３連で行い、３０μＬの各希釈物をＯｐｔｉｌｕｘ黒色／透明底プレート（ＢＤ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）に移した。
【０４２８】
２．５Ｕ／ｍＬの濃度を有する既知可溶性ｒＨｕＰＨ２０の希釈物を、酵素希釈溶液で調製して標準曲線を作成し、Ｏｐｔｉｌｕｘプレートに３連で加えた。希釈は、０Ｕ／ｍＬ、０．２５Ｕ／ｍＬ、０．５Ｕ／ｍＬ、１．０Ｕ／ｍＬ、１．５Ｕ／ｍＬ、２．０Ｕ／ｍＬおよび２．５Ｕ／ｍＬを含んでいた。６０μＬの酵素希釈溶液を含有していた「試薬ブランク」ウェルを、陰性対照としてプレートに含めた。次いで、プレートにカバーをし、ヒートブロック上、３７℃で５分間加温した。カバーを除去し、プレートを１０秒間振盪した。振盪後、プレートをヒートブロックのプレートに戻し、ＭＵＬＴＩＤＲＯＰ  ３８４  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｈａｎｄｌｉｎｇ装置に、加温０．２５ｍｇ／ｍＬヒアルロン酸ナトリウム溶液を入れた（１００ｍｇのヒアルロン酸ナトリウム（ＬｉｆｅＣｏｒｅ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）を２０．０ｍＬのＳＷＦＩに溶解することによって調製した。これを、完全に溶解するまで、２〜８℃で２〜４時間穏やかに回転および／または振動することによって混合した）。反応プレートをＭＵＬＴＩＤＲＯＰ３８４に移し、起動キーを押すことによって反応を開始し、３０μＬのヒアルロン酸ナトリウムを各ウェルに分配した。次いで、プレートをＭＵＬＴＩＤＲＯＰ  ３８４から回収し、１０秒間振盪し、その後、ヒートブロックに移し、プレートカバーを交換した。プレートを３７℃で１０分間インキュベートした。
【０４２９】
ＭＵＬＴＩＤＲＯＰ３８４は、機械に血清作業溶液を入れることおよび２４０μＬに溶液設定を変更することによって、反応を停止するよう準備した。（５００ｍＭ酢酸バッファー溶液７５ｍＬ中、２５ｍＬの血清保存溶液［１容量のウマ血清（Ｓｉｇｍａ）を、９容積の５００ｍＭ酢酸バッファー溶液で希釈し、ｐＨを塩酸を用いて３．１に調整した］）。プレートをヒートブロックから回収し、ＭＵＬＴＩＤＲＯＰ３８４におき、２４０μＬの血清作業溶液をウェルに分配した。プレートを回収し、プレートリーダー上で１０秒間振盪した。さらに１５分後、６４０ｎｍでサンプルの濁度を測定し、各サンプルのヒアルロニダーゼ活性（Ｕ／ｍＬで）を、標準曲線にフィッティングすることによって求めた。
【０４３０】
比活性（ユニット／ｍｇ）は、ヒアルロニダーゼ活性（Ｕ／ｍｌ）をタンパク質濃度（ｍｇ／ｍＬ）によって除することによって算出した。
【実施例３】
【０４３１】
Ｇｅｎ１ヒトｓＰＨ２０の製造および精製
Ａ．５Ｌバイオリアクター工程
３Ｄ３５Ｍのバイアルを解凍し、振盪フラスコから、１００ｎＭメトトレキサートおよびＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）−１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補給したＣＤ−ＣＨＯ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ  Ｃａｌｉｆ．）中で１Ｌのスピナーフラスコによって拡大した。細胞を、１ｍｌあたり４×１０５個の生存細胞の播種密度でスピナーフラスコから５Ｌのバイオリアクター（Ｂｒａｕｎ）に移した。パラメータは、溶存酸素設定値２５％および０〜１００ｃｃ／分のエアーオーバーレイを用いて、温度設定値３７℃、ｐＨ７．２（開始設定値）であった。１６８時間で、２５０ｍｌのフィード１培地（５０ｇ／Ｌグルコースを含むＣＤ  ＣＨＯ）を加えた。２１６時間で、２５０ｍｌのフィード２培地（５０ｇ／Ｌグルコースおよび１０ｍＭ酪酸ナトリウムを含むＣＤ  ＣＨＯ）を加え、２６４時間で、２５０ｍｌのフィード２培地を加えた。この工程の結果、１ｍｌあたり１６００ユニットの最終生産性および６×１０６個細胞／ｍｌの最大細胞密度が得られた。酪酸ナトリウムの添加は、製造の最終段階で可溶性ｒＨｕＰＨ２０の製造を著しく増強した。
【０４３２】
３Ｄ３５Ｍクローンから得たコンディショニング培地を、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．０への深層濾過および接線流ダイアフィルトレーションによって清澄化した。次いで、可溶性ｒＨｕＰＨ２０を、Ｑセファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）イオン交換、フェニルセファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）疎水性相互作用クロマトグラフィー、ボロン酸フェニル（Ｐｒｏｍｅｔｉｃｓ）およびヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー（Ｂｉｏｒａｄ，  Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，  ＣＡ）での連続クロマトグラフィーによって精製した。
【０４３３】
Ｑセファロースと結合している可溶性ｒＨｕＰＨ２０を、同一バッファー中、４００ｍＭ  ＮａＣｌで溶出した。溶出液を、２Ｍ硫酸アンモニウムを用いて、５００ｍＭ硫酸アンモニウムの最終濃度に希釈し、フェニルセファロース（ｌｏｗ  ｓｕｂ）カラムを通し、続いて、同一条件下でボロン酸フェニル樹脂と結合させた。可溶性ｒＨｕＰＨ２０を、硫酸アンモニウムを含まない５０ｍＭビシン中ｐＨ９．０で洗浄した後、フェニルセファロース樹脂からＨｅｐｅｓ  ｐＨ６．９中に溶出した。溶出液を、５ｍＭリン酸カリウムおよび１ｍＭ  ＣａＣｌ２中、ｐＨ６．９でセラミックヒドロキシアパタイト樹脂上にロードし、０．１ｍＭ  ＣａＣｌ２を含む８０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ７．４で溶出した。
【０４３４】
得られた精製可溶性ｒＨｕＰＨ２０は、ＵＳＰ参照標準を使用するマイクロ濁度アッセイ（実施例２）によって６５，０００ＵＳＰユニット／タンパク質１ｍｇを超える比活性を有していた。一実施例では、天然ｒＨｕＰＨ２０の比活性は、約１２０，０００ユニット／ｍｇであったのに対し、ＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０（以下の実施例７に記載される）は、約３０，０００ユニット／ｍｇの比活性を有する。精製ｓＰＨ２０は、０．１％  ＴＦＡ／Ｈ２Ｏから０．１％  ＴＦＡ／９０％アセトニトリル／１０％  Ｈ２０の間の勾配を用いて、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ５ＲＰＣスチレンジビニルベンゼンカラムから２４〜２６分から単一ピークとして溶出し、ＳＤＳ電気泳動によって単一のブロードな６１ｋＤａのバンドとして分離し、これは、ＰＮＧＡＳＥ−Ｆでの処理の際にシャープな５１ｋＤａのバンドに還元した。Ｎ末端アミノ酸配列決定によって、リーダーペプチドは効率よく除去されていることが示された。
【０４３５】
Ｂ．１００Ｌのバイオリアクター細胞培養への上流細胞培養拡大工程
スケールアップ工程を使用して、３Ｄ３５Ｍ細胞の４種の異なるバイアルから可溶性ｒＨｕＰＨ２０を別個に精製して、４種の別個のバッチのｓＨｕＰＨ２０；ＨＵＡ０４０６Ｃ、ＨＵＡ０４１０Ｃ、ＨＵＡ０４１５ＣおよびＨＵＡ０４２０Ｃを製造した。各バイアルを、１２５Ｌのバイオリアクターによって別個に拡大および培養し、次いで、カラムクロマトグラフィーを使用して精製した。工程を通じてサンプルをとり、酵素収率などのパラメータを評価した。以下に提供されるプロセスの説明は、バイオリアクター出発および供給培地容積、移行細胞密度ならびに洗浄容積および溶出容積などの事柄の代表的な明細を示す。正確な数は、各バッチでわずかに変わり、表１０〜１１に詳述されている。
【０４３６】
３Ｄ３５Ｍ細胞の４つのバイアルを３７℃の水浴中で解凍し、１００ｎＭメトトレキサートおよび４０ｍＬ／Ｌ  ＧｌｕｔａＭＡＸを含有するＣＤ  ＣＨＯを加え、細胞を遠心分離した。細胞を、２０ｍＬの新鮮培地を含む１２５ｍＬの振盪フラスコ中で再懸濁し、３７℃、７％  ＣＯ２インキュベーター中に入れた。細胞を１２５ｍＬの振盪フラスコ中で４０ｍＬにまで拡大した。細胞密度が、１．５〜２．５×１０６個細胞／ｍＬに達した時点で、培養物を、１００ｍＬの培養容積で１２５ｍＬのスピナーフラスコに拡大した。このフラスコを、３７℃、７％  ＣＯ２でインキュベートした。細胞密度が、１．５〜２．５×１０６個細胞／ｍＬに達した時点で、培養物を、２００ｍＬの培養容積で２５０ｍＬのスピナーフラスコに拡大し、フラスコを３７℃、７％  ＣＯ２でインキュベートした。細胞密度が、１．５〜２．５×１０６個細胞／ｍＬに達した時点で、培養物を、８００ｍＬの培養容積で１Ｌのスピナーフラスコに拡大し、３７℃、７％  ＣＯ２でインキュベートした。細胞密度が、１．５〜２．５×１０６個細胞／ｍＬに達した時点で、培養物を、５Ｌの培養容積で６Ｌのスピナーフラスコに拡大し３７℃、７％  ＣＯ２でインキュベートした。細胞密度が、１．５〜２．５×１０６個細胞／ｍＬに達した時点で、培養を、２０Ｌの培養容積で３６Ｌのスピナーフラスコに拡大し、３７℃、７％  ＣＯ２でインキュベートした。
【０４３７】
１２５Ｌリアクターを、１２１℃、２０ＰＳＩの蒸気で滅菌し、６５ＬのＣＤ  ＣＨＯ培地を加えた。使用前に、リアクターを汚染について調べた。３６Ｌのスピナーフラスコ中の細胞密度が１．８〜２．５×１０６個の細胞／ｍＬに達した時点で、２０Ｌの細胞培養物を３６Ｌスピナーフラスコから１２５Ｌバイオリアクター（Ｂｒａｕｎ）に移し、８５Ｌの最終容積および約４×１０５個細胞／ｍＬの播種密度が得られた。パラメータは温度設定値、３７℃；ｐＨ：７．２；溶存酸素：２５％±１０％；羽根車速度５０ｒｐｍ；容器圧３ｐｓｉ；エアースパージ１Ｌ／分；エアーオーバーレイ：１Ｌ／分であった。リアクターは、細胞数、ｐＨ確認、培地分析、タンパク質製造および保持について毎日サンプリングした。実施の間に栄養供給を加えた。６日目に、３．４Ｌの供給１培地（ＣＤ  ＣＨＯ＋５０ｇ／Ｌグルコース＋４０ｍＬ／Ｌ  ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）−１）を加え、培養温度を３６．５℃に変更した。９日目に、３．５Ｌの供給２（ＣＤ  ＣＨＯ＋５０ｇ／Ｌグルコース＋４０ｍＬ／Ｌ  ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）−１＋１．１ｇ／Ｌ酪酸ナトリウム）を加え、培養温度を３６℃に変更した。１１日目に、３．７Ｌの供給３（ＣＤ  ＣＨＯ＋５０ｇ／Ｌグルコース＋４０ｍＬ／Ｌ  ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）−１＋１．１ｇ／Ｌ酪酸ナトリウム）を加え、培養温度を３５．５℃に変更した。１４日目または細胞の生存力が５０％未満に低下した時点でリアクターを回収した。この工程は、８００万個細胞／ｍＬの最大細胞密度で、１６００ユニット／ｍｌの酵素活性を有する可溶性ｒＨｕＰＨ２０の製造をもたらした。回収時に、培養をｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでのマイコプラズマ、バイオバーデン、エンドトキシンおよびウイルス、ウイルス粒子の透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）および酵素活性のためにサンプリングした。
【０４３８】
１００リットルのバイオリアクター細胞培養回収を、ポリエーテルスルホン培地（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を有する一連のディスポーザブルカプセルフィルター：最初に、８．０μｍデプスカプセル、０．６５μｍデプスカプセル、０．２２μｍカプセルを通し、最後に、０．２２μｍ  Ｓａｒｔｏｐｏｒｅ  ２０００ｃｍ２フィルターを通して、１００Ｌ滅菌保存バッグに通して入れた。培養物を、らせん状ポリエーテルスルホン３０ｋＤａ  ＭＷＣＯフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いる２つのＴＦＦと、それに続く、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、２５ｍＭ  Ｎａ２ＳＯ４、ｐＨ７．０を用いる６×バッファー交換を使用して１０×濃縮し、０．２２μｍ最終フィルターへ入れ、２０Ｌ滅菌保存バッグ中に入れた。表５は、細胞培養、回収量、濃度およびバッファー交換工程に関するモニタリングデータを提供する。
【０４３９】
表５．細胞培養、回収量、濃度およびバッファー交換工程のモニタリングデータ
【表５】
2014041131.tif 000007
【０４４０】
Ｑセファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）イオン交換カラム（３Ｌ樹脂、高さ＝２０ｃｍ、直径＝１４ｃｍ）を調製した。洗浄サンプルをｐＨ、伝導率の決定およびエンドトキシン（ＬＡＬ）アッセイのために回収した。カラムを、５カラム容積の１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、２０ｍＭ  Ｎａ２ＳＯ４、ｐＨ７．５を用いて平衡化した。濃縮した、ダイフィルトレーションした回収物を、１００ｃｍ／時間の流速でＱカラムにロードした。カラムを、５カラム容積の１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、２０ｍＭ  Ｎａ２ＳＯ４、ｐＨ７．５および１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０を用いて洗浄した。１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、４００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０を用いてタンパク質を溶出し、０．２２μｍ最終フィルターを通して滅菌バッグ中に濾過した。
【０４４１】
フェニル−セファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）疎水性相互作用クロマトグラフィーを次に実施した。フェニル−セファロース（ＰＳ）カラム（９．１Ｌ樹脂、高さ＝２９ｃｍ、直径＝２０ｃｍ）を調製した。カラムを、５カラム容積の５ｍＭリン酸カリウム、０．５Ｍ硫酸アンモニウム、０．１ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ７．０を用いて平衡化した。上記から得たタンパク質溶出液に、２Ｍ硫酸アンモニウム、１Ｍリン酸カリウムおよび１Ｍ  ＣａＣｌ２保存溶液を、それぞれ、５ｍＭ、０．５Ｍおよび０．１ｍＭの最終濃度に補給した。タンパク質を、１００ｃｍ／時間の流速でＰＳカラムにロードした。５ｍＭ  リン酸カリウム、０．５Ｍ  硫酸アンモニウムおよび０．１ｍＭ  ＣａＣｌ２  ｐＨ７．０を１００ｃｍ／時間で加えた。フロースルーを０．２２μｍの最終フィルターに通し、滅菌バッグに入れた。
【０４４２】
ＰＳ精製したタンパク質を、５カラム容積の５ｍＭ  リン酸カリウム、０．５Ｍ  硫酸アンモニウムを用いて平衡化されている、アミノフェニルボロン酸カラム（ＰｒｏＭｅｄｉｃｓ）（６．３Ｌ樹脂、高さ＝２０ｃｍ、直径＝２０ｃｍ）にロードした。タンパク質を、１００ｃｍ／時間の流速でカラムに通し、カラムを、５ｍＭ  リン酸カリウム、０．５Ｍ  硫酸アンモニウム、ｐＨ７．０を用いて洗浄した。次いで、カラムを、２０ｍＭ  ビシン、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ９．０を用いて洗浄し、タンパク質を、５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ６．９を用い、滅菌フィルターを通して、２０Ｌ  滅菌バッグ中に溶出した。溶出液をバイオバーデン、タンパク質濃度および酵素活性について調べた。
【０４４３】
ヒドロキシアパタイト（ＨＡＰ）カラム（ＢｉｏＲａｄ）（１．６Ｌ樹脂、高さ＝１０ｃｍ、直径＝１４ｃｍ）を、５ｍＭ  リン酸カリウム、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１ｍＭ  ＣａＣｌ２  ｐＨ７．０を用いて平衡化した。洗浄サンプルを回収し、ｐＨ、伝導率およびエンドトキシンについて調べた（ＬＡＬアッセイ。アミノフェニルボロン酸精製されタンパク質に、リン酸カリウムおよびＣａＣｌ２を５ｍＭ  リン酸カリウムおよび０．１ｍＭ  ＣａＣｌ２の最終濃度を得るよう補給し、１００ｃｍ／時間の流速でＨＡＰカラムにロードした。カラムを、５ｍＭ  リン酸カリウム  ｐＨ７．０、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１ｍＭ  ＣａＣｌ２、次いで、１０ｍＭ  リン酸カリウム  ｐＨ７．０、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１ｍＭ  ＣａＣｌ２  ｐＨを用いて洗浄した。タンパク質を、７０ｍＭ  リン酸カリウム  ｐＨ７．０を用いて溶出し、０．２２μｍフィルターを通して濾過し、５Ｌの滅菌保存バッグに入れた。溶出液を、バイオバーデン、タンパク質濃度および酵素活性について調べた。
【０４４４】
次いで、ＨＡＰ精製したタンパク質を、圧力タンクによって２０ｎＭ  ウイルス除去フィルターを通して送った。タンパク質をＤＶ２０圧力タンクおよびフィルター（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）に加え、２０ｎｍの孔を有するＵｌｔｉｐｏｒ  ＤＶ２０フィルター（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を通して、滅菌２０Ｌ保存バッグに入れた。濾液を、タンパク質濃度、酵素活性、オリゴ糖、単糖およびシアル酸  プロファイリングおよび工程関連不純物について調べた。次いで、濾液中のタンパク質を、１０ｋＤ分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）Ｓａｒｔｏｃｏｎ  Ｓｌｉｃｅ  接線流濾過（ＴＦＦ）システム（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を使用して１ｍｇ／ｍＬに濃縮した。フィルターは、Ｈｅｐｅｓ／生理食塩水溶液（１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１３０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）を用いて洗浄することによってまず調製し、透過物を、ｐＨおよび伝導率のためにサンプリングした。濃縮後、濃縮されたタンパク質をサンプリングし、タンパク質濃度および酵素活性について調べた。濃縮されたタンパク質で６×バッファー交換を実施して、最終バッファー：１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１３０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０にした。濃縮されたタンパク質を、０．２２μｍフィルターに通し、２０Ｌ滅菌保存バッグに入れた。タンパク質をサンプリングし、タンパク質濃度、酵素活性、遊離スルフヒドリル基、オリゴ糖プロファイリングおよび浸透圧について調べた。
【０４４５】
表５〜１１は、各３Ｄ３５Ｍ細胞ロットの上記の各精製工程と関連するモニタリングデータを提供する。
【０４４６】
表６．Ｑセファロースカラムデータ
【表６】
2014041131.tif 000008
【０４４７】
表７．フェニルセファロースカラムデータ
【表７】
2014041131.tif 000009
【０４４８】
表８．アミノフェニルボロン酸カラムデータ
【表８】
2014041131.tif 000010
【０４４９】
表９．ヒドロキシアパタイトカラムデータ
【表９】
2014041131.tif 000011
【０４５０】
表１０．ＤＶ２０濾過データ
【表１０】
2014041131.tif 000012
【０４５１】
表１１．最終濃縮データ
【表１１】
2014041131.tif 000013
【０４５２】
表１２．最終処方データへのバッファー交換
【表１２】
2014041131.tif 000014
【０４５３】
精製され、濃縮された可溶性ｒＨｕＰＨ２０タンパク質を、５ｍＬおよび１ｍＬの充填容積を有する滅菌バイアルに無菌的に（ａｓｃｅｐｔｉｃａｌｌｙ）に詰めた。タンパク質を、オペレーターによって制御されるポンプに向けて０．２２μｍのフィルターに通し、これを使用し、重量測定読み出しを使用してバイアルに詰めた。バイアルを栓で閉め、圧着キャップで固定した。閉じたバイアルを、異質粒子について目視検査し、ラベルをつけた。ラベルをつけた後、バイアルを、液体窒素中にわずか１分沈めることによって急速冷凍し、≦−１５℃（−２０±５℃）で保存した。
【実施例４】
【０４５４】
可溶性ヒトＰＨ２０（ｒＨｕＰＨ２０）を含有するＧｅｎ２細胞の製造
実施例１に記載されるＧｅｎ１  ３Ｄ３５Ｍ細胞株を、高メトトレキサートレベルに適応させ、世代２（Ｇｅｎ２）クローンを作製した。３Ｄ３５Ｍ細胞は、確立されたメトトレキサート含有培養物から、４ｍＭ  ＧｌｕｔａＭＡＸ−１商標および１．０μＭメトトレキサートを含有するＣＤ  ＣＨＯ培地に播種した。細胞を、３７℃、７％  ＣＯ２、加湿したインキュベーター中で増殖させ、４６日間にわたって９回継代することによって高メトトレキサートレベルに適応させた。増殖した細胞集団を、２．０μＭメトトレキサートを含む培地を含有する９６ウェル組織培養プレートにおける制限希釈によってクローニングした。約４週間後、クローンを同定し、クローン３Ｅ１０Ｂを拡大のために選択した。３Ｅ１０Ｂ細胞を、４ｍＭ  ＧｌｕｔａＭＡＸ−１商標および２．０μＭメトトレキサートを含有するＣＤ  ＣＨＯ培地で２０継代の間、増殖させた。３Ｅ１０Ｂ細胞株のマスター細胞バンク（ＭＣＢ）を作製し、凍結し、その後の研究に使用した。
【０４５５】
細胞株の増幅は、３Ｅ１０Ｂ細胞を、４ｍＭ  ＧｌｕｔａＭＡＸ−１商標および４．０μＭメトトレキサートを含有するＣＤ  ＣＨＯ培地で培養することによって継続した。１２回目の継代後、細胞を研究細胞バンク（ＲＣＢ）としてバイアル中で凍結した。ＲＣＢの１つのバイアルを解凍し、８．０μＭメトトレキサートを含有する培地で培養した。５日後、培地中のメトトレキサート濃度を、１６．０μＭに、次いで、１８日後に２０．０μＭに増大させた。２０．０μＭメトトレキサートを含有する培地における８回目の継代から得た細胞を、４ｍＭ  ＧｌｕｔａＭＡＸ−１商標および２０．０μＭメトトレキサートを含有するＣＤ  ＣＨＯ培地を含有する９６ウェル組織培養プレートにおける制限希釈によってクローニングした。５〜６週間後にクローンを同定し、クローン２Ｂ２を、２０．０μＭメトトレキサートを含有する培地における拡大のために選択した。１１回目の継代の後、２Ｂ２細胞を研究細胞バンク（ＲＣＢ）としてバイアル中で凍結した。
【０４５６】
得られた２Ｂ２細胞は、可溶性組換えヒトＰＨ２０（ｒＨｕＰＨ２０）を発現するジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損（ｄｈｆｒ−）ＤＧ４４  ＣＨＯ細胞である。可溶性ＰＨ２０は、２Ｂ２細胞中に、約２０６コピー／細胞のコピー数で存在する。ｒＨｕＰＨ２０特異的プローブを使用する、Ｓｐｅ  Ｉ−、Ｘｂａ  Ｉ−およびＢａｍＨ  Ｉ／Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ消化ゲノム２Ｂ２細胞ＤＮＡのサザンブロット分析は、以下の制限消化プロフィールを示した：Ｓｐｅ  Ｉで消化されたＤＮＡを用いて、約７．７ｋｂの１つのメジャーなハイブリダイズバンドおよび４つのマイナーなハイブリダイズバンド（約１３．９、約６．６、約５．７および約４．６ｋｂ）；Ｘｂａ  Ｉで消化されたＤＮＡを用いて、約５．０ｋｂの１つの主要なハイブリダイズバンドおよび２つの微量のハイブリダイズバンド（約１３．９および約６．５ｋｂ）；ならびにＢａｍＨ  Ｉ／Ｈｉｎｄ  ＩＩＩで消化された２Ｂ２  ＤＮＡを使用して、約１．４ｋｂの１つの単一のハイブリダイズバンド。ｍＲＮＡ  転写物の配列分析は、導かれたｃＤＮＡ（配列番号５６）は予測されるシトシン（Ｃ）の代わりにチミジン（Ｔ）であると観察された、位置１１３１の１つの塩基対相違を除いて、参照配列（配列番号４７）と同一であるということを示した。これは、アミノ酸配列に対する効果がないサイレント突然変異である。
【実施例５】
【０４５７】
３００Ｌのバイオリアクター細胞培養におけるＧｅｎ２可溶性ｒＨｕＰＨ２０の製造
ＨＺ２４−２Ｂ２のバイアルを解凍し、２０μＭメトトレキサートおよびＧｌｕｔａＭＡＸ−１商標（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補給したＣＤ−ＣＨＯ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）中、３６Ｌスピナーフラスコによって振盪フラスコから拡大した。手短には、細胞のバイアルを３７℃の水浴中で解凍し、培地を加え、細胞を遠心分離した。細胞を、１２５ｍＬの振盪フラスコ中、２０ｍＬの新鮮培地を用いて再懸濁し、３７℃、７％  ＣＯ２インキュベーター中に入れた。細胞を、１２５ｍＬの振盪フラスコ中で４０ｍＬにまで拡大した。細胞密度が、１．５×１０６個／ｍＬ超に達した時点で、培養物を、１００ｍＬの培養容積で１２５ｍＬのスピナーフラスコ中に拡大した。このフラスコを、３７℃、７％  ＣＯ２でインキュベートした。細胞密度が、１．５×１０６個細胞／ｍＬ超に達した時点で、培養物を、２００ｍＬの培養容積で２５０ｍＬのスピナーフラスコに拡大し、このフラスコを３７℃、７％  ＣＯ２でインキュベートした。細胞密度が、１．５×１０６個細胞／ｍＬ超に達した時点で、培養物を、８００ｍＬの培養容積で１Ｌのスピナーフラスコに拡大し、３７℃、７％  ＣＯ２でインキュベートした。細胞密度が、１．５×１０６個細胞／ｍＬ超に達した時点で、培養物を、５０００ｍＬの培養容積で６Ｌのスピナーフラスコに拡大し、３７℃、７％  ＣＯ２でインキュベートした。細胞密度が、１．５×１０６個細胞／ｍＬ超に達した時点で、培養物を、３２Ｌの培養容積で３６Ｌのスピナーフラスコに拡大し、３７℃、７％  ＣＯ２でインキュベートした。
【０４５８】
４００Ｌのリアクターを滅菌し、２３０ｍＬのＣＤ−ＣＨＯ培地を加えた。使用前に、リアクターを汚染について調べた。約３０Ｌの細胞を、１ｍｌあたり４．０×１０５個の生存細胞の播種密度および２６０Ｌの総容積で、３６Ｌのスピナーフラスコから４００Ｌのバイオリアクター（Ｂｒａｕｎ）に移した。パラメータは、温度設定値、３７℃；羽根車速度４０〜５５ＲＰＭ；容器圧：３ｐｓｉ；エアースパージ０．５〜１．５Ｌ／分；エアーオーバーレイ：３Ｌ／分であった。リアクターは、細胞数、ｐＨ確認、培地分析、タンパク質製造および保持について毎日サンプリングした。また、実施の間に栄養供給を加えた。１２０時間（５日）で、１０．４Ｌの供給１培地（４×ＣＤ−ＣＨＯ＋３３ｇ／Ｌグルコース＋１６０ｍＬ／Ｌ  Ｇｌｕｔａｍａｘ−１商標＋８３ｍＬ／Ｌ  Ｙｅａｓｔｏｌａｔｅ＋３３ｍｇ／Ｌ  ｒＨｕインスリン）を加えた。１６８時間（７日）で、１０．８Ｌの供給２（２×ＣＤ−ＣＨＯ＋３３ｇ／Ｌグルコース＋８０ｍＬ／Ｌ  Ｇｌｕｔａｍａｘ−１商標＋１６７ｍＬ／Ｌ  Ｙｅａｓｔｏｌａｔｅ＋０．９２ｇ／Ｌ酪酸ナトリウム）を加え、培養温度を３６．５℃に変更した。２１６時間（９日）で、１０．８Ｌの供給３（１×ＣＤ−ＣＨＯ＋５０ｇ／Ｌグルコース＋５０ｍＬ／Ｌ  Ｇｌｕｔａｍａｘ−１商標＋２５０ｍＬ／Ｌ  Ｙｅａｓｔｏｌａｔｅ＋１．８０ｇ／Ｌ酪酸ナトリウム）を加え、培養温度を３６℃に変更した。２６４時間（１１日）に、１０．８Ｌの供給４（１×ＣＤ−ＣＨＯ＋３３ｇ／Ｌグルコース＋３３ｍＬ／Ｌ  Ｇｌｕｔａｍａｘ−１商標＋２５０ｍＬ／Ｌ  Ｙｅａｓｔｏｌａｔｅ＋０．９２ｇ／Ｌ酪酸ナトリウム）を加え、培養温度を３５．５℃に変更した。供給培地の添加は、製造の最終段階で可溶性ｒＨｕＰＨ２０の製造を著しく増強すると観察された。リアクターを、１４日または１５日で、または細胞の生存力が４０％未満に低下した時点で回収した。この工程は、１ｍｌあたり１７，０００ユニットの最終生産性および１２００万個細胞／ｍＬの最大細胞密度をもたらした。回収時に、培養をｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでのマイコプラズマ、バイオバーデン、エンドトキシンおよびウイルス、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）および酵素活性のためにサンプリングした。
【０４５９】
培養物を、各々、４〜８μｍに等級付けられた珪藻土の層および１．４〜１．１μｍに等級付けられた珪藻土の層を含有する、４つの平行なＭｉｌｌｉｓｔａｋ濾過システムモジュール（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）と、それに続く、セルロースメンブレンを通して、次いで、０．４〜０．１１μｍに等級付けられた珪藻土の層および＜０．１μｍに等級付けられた珪藻土の層を含有する、第２の単一のＭｉｌｌｉｓｔａｋ濾過システム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）と、それに続く、セルロースメンブレンを通して、次いで、０．２２μｍ最終フィルターを通して蠕動ポンプによって、３５０Ｌの容量を有する滅菌単回使用フレキシブルバッグに入れた。回収した細胞培養液に、１０ｍＭ  ＥＤＴＡおよび１０ｍＭ  Ｔｒｉｓを補給し、７．５のｐＨにした。培養物を、接線流濾過（ＴＦＦ）装置を用い、４種のＳａｒｔｏｓｌｉｃｅ  ＴＦＦ  ３０ｋＤａ分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）フィルター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）と、それに続く、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、２０ｍＭ  Ｎａ２ＳＯ４、ｐＨ７．５を用いる１０×バッファー交換を使用して１０×濃縮し、０．２２μｍの最終フィルターに入れ、５０Ｌの滅菌保存バッグに入れた。
【０４６０】
濃縮された、ダイアフィルトレーションされた回収物を、ウイルスについて不活化させた。ウイルス不活性化に先立って、１０％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、３％トリ（ｎ−ブチル）ホスフェート（ＴＮＢＰ）の溶液を調製した。濃縮された、ダイアフィルトレーションされた回収物を、３６Ｌのガラス反応容器中で、１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．３％  ＴＮＢＰに１時間曝露し、直後にＱカラムで精製した。
【０４６１】
Ｂ．Ｇｅｎ２可溶性ｒＨｕＰＨ２０の精製
Ｑセファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）イオン交換カラム（９Ｌ樹脂、Ｈ＝２９ｃｍ、Ｄ＝２０ｃｍ）を調製した。洗浄サンプルを、ｐＨ、伝導率の決定およびエンドトキシン（ＬＡＬ）アッセイのために回収した。カラムを、５カラム容積の１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、２０ｍＭ  Ｎａ２ＳＯ４、ｐＨ７．５を用いて平衡化した。ウイルス不活性化後、濃縮された、ダイアフィルトレーションされた回収物を、１００ｃｍ／時間の流速でＱカラムにロードした。カラムを５カラム容積の１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、２０ｍＭ  Ｎａ２ＳＯ４、ｐＨ７．５および１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０で洗浄した。１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、４００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０を用いて、タンパク質を、０．２２μｍ最終フィルターに溶出し、滅菌バッグに入れた。溶出液サンプルを、バイオバーデン、タンパク質濃度およびヒアルロニダーゼ活性について調べた。交換の始めおよび最後にＡ２８０吸光度読み取りをとった。
【０４６２】
フェニル−セファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）疎水性相互作用クロマトグラフィーを次に実施した。フェニル−セファロース（ＰＳ）カラム（１９〜２１Ｌ樹脂、Ｈ＝２９ｃｍ、Ｄ＝３０ｃｍ）を調製した。洗浄物を回収し、ｐＨ、伝導率およエンドトキシン（ＬＡＬアッセイ）のためにサンプリングした。カラムを、５カラム容積の５ｍＭ  リン酸カリウム、０．５Ｍ  硫酸アンモニウム、０．１ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ７．０を用いて平衡化した。Ｑセファロースカラムから得たタンパク質溶出液に、２Ｍ  硫酸アンモニウム、１Ｍ  リン酸カリウムおよび１Ｍ  ＣａＣｌ２保存溶液を、それぞれ、５ｍＭ、０．５Ｍおよび０．１ｍＭの最終濃度を得るよう補給した。タンパク質を、１００ｃｍ／時間の流速でＰＳカラムにロードし、カラムフロースルー（ｆｌｏｗ  ｔｈｒｕ）を回収した。カラムを、５ｍＭリン酸カリウム、０．５Ｍ硫酸アンモニウムおよび０．１ｍＭ  ＣａＣｌ２  ｐＨ７．０を、１００ｃｍ／時間で用いて洗浄し、回収されたフロースルーに洗浄液を加えた。カラム洗浄液と合わせ、フロースルーを、０．２２μｍ最終フィルターを通して、滅菌バッグに入れた。フロースルーを、バイオバーデン、タンパク質濃度および酵素活性のためにサンプリングした。
【０４６３】
アミノフェニルボロン酸カラム（ＰｒｏＭｅｄｉｃｓ）を調製した。洗浄液を回収し、ｐＨ、伝導率およびエンドトキシン（ＬＡＬアッセイ）のためにサンプリングした。カラムを、５カラム容積の５ｍＭ  リン酸カリウム、０．５Ｍ硫酸アンモニウムを用いて平衡化した。精製タンパク質を含有するＰＳフロースルーを、アミノフェニルボロン酸カラムに、１００ｃｍ／時間の流速でロードした。カラムを、５ｍＭリン酸カリウム、０．５Ｍ硫酸アンモニウム、ｐＨ７．０を用いて洗浄した。カラムを、２０ｍＭビシン、０．５Ｍ硫酸アンモニウム、ｐＨ９．０を用いて洗浄した。このカラムを、２０ｍＭビシン、１００ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ９．０を用いて洗浄した。５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．９を用いてタンパク質を溶出し、滅菌フィルターを通して、滅菌バッグに入れた。溶出したサンプルを、バイオバーデン、タンパク質濃度および酵素活性について調べた。
【０４６４】
ヒドロキシアパタイト（ＨＡＰ）カラム（Ｂｉｏｒａｄ）を調製した。洗浄液を回収し、ｐＨ、伝導率およびエンドトキシン（ＬＡＬアッセイ）について調べた。カラムを、５ｍＭリン酸カリウム、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ７．０を用いて用いて平衡化した。アミノフェニルボロン酸精製したタンパク質を、５ｍＭ  リン酸カリウムおよび０．１ｍＭ  ＣａＣｌ２の最終濃度に補給し、１００ｃｍ／時間の流速でＨＡＰカラムにロードした。カラムを、５ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ７、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１ｍＭ  ＣａＣｌ２を用いて洗浄した。次いで、カラムを１０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ７、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１ｍＭ  ＣａＣｌ２を用いて洗浄した。タンパク質を、７０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ７．０を用いて溶出し、０．２２μｍ滅菌フィルターを通して、滅菌バッグに入れた。溶出されたサンプルを、バイオバーデン、タンパク質濃度および酵素活性について調べた。
【０４６５】
次いで、ＨＡＰ精製されたタンパク質を、ウイルス除去フィルターに通した。まず、２Ｌの７０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ７．０を用いて洗浄することによって滅菌Ｖｉｏｓａｒｔフィルター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を調製した。使用前に、濾過されたバッファーをｐＨおよび伝導率のためにサンプリングした。ＨＡＰ精製されたタンパク質を、蠕動ポンプによって、２０ｎＭウイルス除去フィルターを通した。７０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ７．０中で濾過されたタンパク質を、０．２２μｍ最終フィルターを通して、滅菌バッグに入れた。ウイルスフィルター処理されたサンプルを、タンパク質濃度、酵素活性、オリゴ糖、単糖およびシアル酸プロファイリングについて調べた。また、サンプルを工程関連不純物について調べた。
【０４６６】
次いで、濾液中のタンパク質を、１０ｋＤ分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）Ｓａｒｔｏｃｏｎ  Ｓｌｉｃｅ接線流濾過（ＴＦＦ）システム（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を使用して１０ｍｇ／ｍＬに濃縮した。まず、１０ｍＭヒスチジン、１３０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．０を用いて洗浄することによってフィルターを調製し、ｐＨおよび伝導率について透過物をサンプリングした。濃縮後、濃縮されたタンパク質をサンプリングし、タンパク質濃度および酵素活性について調べた。濃縮されたタンパク質で、最終バッファー：１０ｍＭ  ヒスチジン、１３０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．０への６×バッファー交換を実施した。バッファー交換後、濃縮されたタンパク質を、０．２２μｍフィルターを通して、２０Ｌの滅菌保存バッグに入れた。タンパク質をサンプリングし、タンパク質濃度、酵素活性、遊離スルフヒドリル基、オリゴ糖プロファイリングおよび浸透圧について調べた。
【０４６７】
次いで、滅菌フィルター処理されたバルクタンパク質を、２０ｍＬで３０ｍＬの滅菌テフロンバイアル（Ｎａｌｇｅｎｅ）に無菌的に分配した。次いで、バイアルを急速冷凍し、−２０±５℃で保存した。
【０４６８】
Ｃ．Ｇｅｎ１可溶性ｒＨｕＰＨ２０およびＧｅｎ２可溶性ｒＨｕＰＨ２０の製造および精製の比較
３００Ｌのバイオリアクター細胞培養におけるＧｅｎ２可溶性ｒＨｕＰＨ２０の製造および精製は、１００Ｌのバイオリアクター細胞培養におけるＧｅｎ１可溶性ｒＨｕＰＨ２０の製造および精製（実施例３．Ｂに記載される）と比較して、プロトコールにおいていくつかの変化を含んでいた。表１３は、方法間の、簡単なスケールアップ変化に加え、例示的相違を示す。
【０４６９】
【表１３−１】
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【表１３−２】
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【表１３−３】
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【表１３−４】
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【実施例６】
【０４７０】
ヒアルロナンリッチな腫瘍において組換えヒアルロニダーゼ（ｒＨｕＰＨ２０）を用いたヒアルロナンのターゲッティング
Ａ．ヒアルロナンリッチな腫瘍細胞によるヒアルロナン特異的細胞周囲マトリックスＨａｌｏのＩｎ  ｖｉｔｒｏ形成
ヒアルロナンリッチな腫瘍細胞培養およびヒアルロナン欠損腫瘍細胞培養物を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで細胞周囲マトリックス（ｈａｌｏ）を形成する能力について、粒子排除アッセイおよび免疫組織化学を使用して評価した。この研究のために、ヒアルロナンリッチなヒト前立腺腫瘍癌腫（ＰＣ３）の低密度培養物およびヒアルロナン欠損ヒト肺癌腫（ＮＣＩ  Ｈ４６０）の低密度培養物を、細胞培地中、３７℃で６０分間処理し、続いて、０．５ｍｇ／ｍＬの、大きな凝集性コンドロイチン硫酸プロテオグリカンであるウシアグリカン（市販の）の存在下または不在下で、３７℃で６０分間インキュベートした。
【０４７１】
粒子排除によって、ｈａｌｏ形成を評価するために、培養物に小粒子（５×１０６個のホルマリン固定赤血球（ＲＢＣ））を加えた。粒子が落ち着いた後、培養物を４００×または１００×倍率で視察した。
【０４７２】
免疫組織化学によってヒアルロナン発現を評価するために、培養物のサブセットを、ビオチン標識したヒアルロナン結合タンパク質（ＨＡＢＰ−ｂｉｏ）（Ｓｅｉｋａｇａｋｕ、Ｊａｐａｎ）を用いて染色した。一次試薬を洗浄して除去した後、二次試薬としてＦＩＴＣ標識したストレプトアビジン（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ、Ｃａｎａｄａ）を使用した。核をＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）試薬を使用して対比染色した。Ｉｎｓｉｇｈｔ  ＦｉｒｅＷｉｒｅデジタルカメラ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｍｉｃｈｉｇａｎ）と連動した  Ｎｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＴＥ２０００Ｕ顕微鏡によって顕微鏡写真を撮った。
【０４７３】
細胞周囲マトリックスｈａｌｏを、ＨＡについて、免疫組織化学によって陽性に染色する領域および粒子排除アッセイにおいて粒子（ＲＢＣ）が排除される領域として同定した。結果は、アグリカンの存在下で前処理されているヒアルロナンリッチな腫瘍（ＰＣ３）培養物においてｈａｌｏ（代表的な実験では、およそ細胞の大きさ）を示した。対照的に、アグリカンの不在下では、また、ヒアルロナン欠損（ＮＣＩ  Ｈ４６０）腫瘍細胞の培養物においてもｈａｌｏは形成せず、このことは、細胞周囲マトリックスの形成は、ヒアルロナン発現に応じて変わるということを示唆した。
【０４７４】
ヒアルロナンをターゲッティングすることが、これらのｈａｌｏの形成を妨げ得るかどうかを調べるために、粒子排除研究および免疫組織化学を、（アグリカンの添加の前に）可溶性組換えヒトヒアルロニダーゼ組成物、指定されたｒＨｕＰＨ２０の存在下または不在下で、３７℃で６０分間処理されている細胞培養物で実施した。ｒＨｕＰＨ２０は、１ｍＬあたり１０００酵素ユニットで腫瘍細胞培養物中に含まれていると、上記の実施例２に記載される方法を使用して調べられた。抗ヒアルロナン抗体（市販の）を用いる免疫蛍光染色は、ｒＨｕＰＨ２０とともにインキュベーションした後にヒアルロナン染色がないことを示した。ｒＨｕＰＨ２０とともにインキュベーションした後、上記のように、粒子アッセイを実施した。顕微鏡写真は、ｒＨｕＰＨ２０を用いると、（ＰＣ３）腫瘍細胞培養物においてｈａｌｏは形成しなかったということを示した。ｒＨｕＰＨ２０は、ヒアルロナン欠損細胞（ＮＣＩ  Ｈ４６０）培養物に対しては効果がなく、これは、ｒＨｕＰＨ２０を用いても用いなくても細胞周囲マトリックスを形成しなかった。これらの結果は、腫瘍細胞培養物におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｈａｌｏ形成は、ヒアルロナン依存性であるという指摘を支持する。
【０４７５】
同じ粒子排除アッセイを、上記でこの実施例において記載されるように、さまざまな程度のＨＡ発現を有する７種の異なる種類のヒト腫瘍細胞株を用い、ｒＨｕＰＨ２０の存在下または不在下で実施した。使用した細胞株は、ＢｘＰＣ３（膵臓腫瘍株）ＰＣ３（前立腺腫瘍株）、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（乳房腫瘍株）、ＨＣＴ  １１６（結腸腫瘍株）、ＤＵ１４５（前立腺腫瘍株）、ＭｉａＰａＣａ２（膵臓腫瘍株）およびＨ４６０（ＮＳＣ肺癌株）であった。「細胞面積あたりのｈａｌｏ」値は、ピクセルまたはｍｍ２での平均細胞面積によって除した、培養皿中の平均ｈａｌｏ面積（ピクセルまたはｍｍ２で）を求めることによって決定した。種々の腫瘍種細胞培養物における細胞面積あたりのｈａｌｏを比較するために、ＢｘＰＣ３細胞の値を１００に設定し、ＨＡ欠損細胞株Ｈ４６０の値を０に設定し、比較によって各細胞種の「相対ｈａｌｏ割合」を求めた。結果は、以下の表１４に示されている。列挙される数字は、ｎ＝２５測定の平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）を表す。
【０４７６】
表１４．腫瘍細胞培養物における、相対Ｈａｌｏ割合およびｒＨｕＰＨ２０によるＨＡ低下
【表１４】
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【０４７７】
このアッセイを使用して、経時的研究も実施し、ｒＨｕＰＨ２０に対する細胞の一時的な曝露後のＰＣ３培養物におけるＨＡ除去の期間と、それに続く、細胞が酵素の不在下で細胞培地とともにインキュベートされる「追跡」期間を決定した。上記のように、ピクセルまたはｍｍ２での平均細胞面積で除した、ピクセルまたはｍｍ２での平均ｈａｌｏ面積を測定することによって「細胞面積あたりのｈａｌｏ」値を求めた。処理の前（時間ゼロ（０））に細胞面積あたりのｈａｌｏを算出し、１００％と設定した。６つの処理時点の各々について、１０００Ｕ／ｍＬ  ｒＨｕＰＨ２０の存在下で細胞を１時間インキュベートし、酵素を除去するための洗浄および追跡期間を続け、ここで、細胞を酵素を伴わずに、それぞれ合計２、４、８、１６、２４および４８時間インキュベートした。各時点について、細胞面積あたりのｈａｌｏを算出し、１００％のゼロ時間値と比較することによって相対的なｈａｌｏ割合を決定した。結果は、以下の表１５に示されている。列挙される数字は、ｎ＝４５測定の平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）を表す。
【０４７８】
表１５：ｒＨｕＰＨ２０によるＰＣ３細胞培養におけるＨＡ除去の期間
【表１５】
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【０４７９】
Ｂ．ヒアルロナンリッチな腫瘍モデル（脛骨周囲ＰＣ３前立腺癌腫異種移殖片モデル）における静脈内ｒＨｕＰＨ２０投与は、遠位腫瘍間質液圧（ＩＦＰ）を低下させる
ヒアルロナンリッチな腫瘍においてヒアルロナンをターゲッティングする効果を分析するために、脛骨周囲前立腺癌腫（ＰＣ３）異種移殖片モデルにおいてｒＨｕＰＨ２０を全身投与した。このモデルのために、胸腺欠損雄ヌードマウスに、ヒト前立腺癌細胞、ＰＣ３（０．０５ｍＬの総容量で１×１０６個細胞）を用いて、右脛骨骨膜に隣接して接種した。すべての動物研究は、ＩＡＣＵＣプロトコールに従って実施した。
【０４８０】
これらの動物における腫瘍間質液圧（ＩＦＰ）を評価するために、Ｍｉｌａｒ（登録商標）Ｍｉｋｒｏ−ｔｉｐカテーテル圧力トランスデューサー（ＳＰＲ−３２０ｓ）を、ＡＤＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（登録商標）ＰｏｗｅｒＬａｂ  ４／３０データ獲得ユニットおよび連続ＩＦＰ測定のためにポータブルラップトップコンピュータに接続した（単位＝水銀のミリメートル（ｍｍＨｇ））。システムを較正し、周囲圧力測定値が、１５〜２０分にわたって＋／−１．０ｍｍＨｇを超えて外れない場合に安定と考えた。プローブ留置のために、圧力カテーテルを、２１ゲージニードルの内部の穴に挿入し、ニードルを腫瘍の中心に導入した。ニードルをトランスデューサーの周囲に引き、一方で、圧力カテーテルは、同時に適切な位置に保持された。次いで、システムを使用して、腫瘍におけるＩＦＰを測定した（ｍｍＨｇ）。
【０４８１】
例示的な一実験では、この方法を用いる２６の異種移殖片モデル動物におけるベースライン遠位腫瘍ＩＦＰ測定値は、腫瘍量とＩＦＰの間の相関を示し（相関係数、ｒ＝０．５６５２）、このことは、腫瘍量の増大は、ＩＦＰの増大につながり得ることを示唆する。
【０４８２】
この異種移殖片モデルにおいて、全身ｒＨｕＰＨ２０治療が、腫瘍ＩＦＰを低下させ得るかどうかを調べるために、１０，０００ユニット（実施例２において決定されるような）のｒＨｕＰＨ２０を、１００μＬの用量で、３匹の動物の尾静脈における静脈内注射によって投与した。ｒＨｕＰＨ２０を用いる投薬（注射）の前に、ＩＦＰを約２０〜３０分間測定して、ベースラインＩＦＰ測定値を確立した。次いで、ＩＦＰを注射の間および注射後に測定した。ＩＦＰを、ｒＨｕＰＨ２０投与後１〜２時間測定した。静脈内ｒＨｕＰＨ２０投与は、遠位腫瘍ＩＦＰの低減を引き起こした。１０分内に、腫瘍ＩＦＰは、ベースラインと比較して平均３４％低下した。さらに、腫瘍ＩＦＰレベルは、１時間で３４．０６±１５．９ｍｍＨｇから１４．８６±１２．５５ｍｍＨｇの最大低減に下がった（ベースラインレベルの平均３８％；６１．３％の平均低減）。動物に投与された熱不活化ｒＨｕＰＨ２０は、間質液圧を低下させなかった。
【０４８３】
迅速なヒアルロナンターンオーバーと一致して、腫瘍ＩＦＰは、すべてのマウスにおいて２４時間以内にベースラインに戻った。最初の用量の４８時間後に与えられた、１０，０００ユニットｒＨｕＰＨ２０の反復静脈内投与は、同様のＩＦＰの低下を示した（平均、ベースラインの２８．６％）。腫瘍を保持しない肢におけるｒＨｕＰＨ２０投与の前後にとられた測定値は、これらの組織における間質液圧において変化を示さなかった。これらのデータは、ヒアルロニダーゼの全身の、静脈内投与を使用して、遠位腫瘍において間質液圧を低下させることができるということを示した。
【０４８４】
間質液圧はまた、ヒアルロナン欠損肺癌腫細胞（Ｈ４６０）の注射によって同様に作製した異種移殖片モデルにおいても測定した。このモデルにおける腫瘍は、高間質液圧を示したが、ｒＨｕＰＨ２０の静脈内投与の効果は、ヒアルロナンリッチな腫瘍モデルと比較してこのモデルではそれほど明白ではなく、このことは、腫瘍間質性圧力に対するｒＨｕＰＨ２０の効果がヒアルロナン依存性であるという指摘を支持した。
【実施例７】
【０４８５】
ｒＨｕＰＨ２０のペグ化
Ａ．ｍＰＥＧ−ＳＢＡ−３０ＫのｒＨｕＰＨ２０とのコンジュゲーション
ＰＥＧ化可溶性ヒトヒアルロニダーゼを作製するために、ｒＨｕＰＨ２０（約６０ＫＤａの大きさである）を３０ｋＤａのおよその分子量を有する、メトキシポリ（エチレングリコール）ブタン酸の直鎖Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル（ｍＰＥＧ−ＳＢＡ−３０Ｋ）と共有結合によってコンジュゲートした。ｍＰＥＧ−ＳＢＡの構造は、以下のスキーム２に示されている。
スキーム２
【０４８６】
【化２】
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【０４８７】
ｒＨｕＰＨ２０をＰＥＧ化するために使用された、ｍＰＥＧ−ＳＢＡ−３０Ｋを調製するために使用される方法は、例えば、米国特許５，６７２，６６２号に記載されている）。手短には、ｍＰＥＧ−ＳＢＡ−３０Ｋは、以下の手順に従って製造される：
【０４８８】
窒素雰囲気下、水素化ナトリウム（２当量）およびトルエンに、ジオキサンに溶解したマロン酸エチル（２当量）の溶液を１滴ずつ滴加する。トルエンにｍＰＥＧスルホン酸メタン（１当量、ＭＷ３０ｋＤａ、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ）を溶解し、上記の混合物に加える。得られた混合物を、約１８時間還流する。反応混合物をその最初の容量の半量に濃縮し、１０％ＮａＣｌ水溶液を用いて抽出し、１％塩酸水溶液を用いて抽出し、水性抽出物を合わせる。集めた水層を、ジクロロメタン（３×）で抽出し、有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、蒸発乾固する。得られた残渣を、塩化ナトリウムを含有する１Ｎ水酸化ナトリウムに溶解し、混合物を１時間撹拌する。混合物のｐＨを、６Ｎ塩酸の添加によって約３に調整する。混合物をジクロロメタン（２×）を用いて抽出する。
【０４８９】
有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、濃縮し、冷ジエチルエーテルに注ぎ入れる。濾過によって沈殿を回収し、真空下で乾燥させる。得られた化合物をジオキサンに溶解し、８時間還流し、次いで、濃縮乾固する。得られた残渣を水に溶解し、ジクロロメタン（２×）を用いて抽出し、硫酸マグネシウムで乾燥させ、溶液をロータリーエバポレーションによって濃縮し、次いで、冷ジエチルエーテルに注ぎ入れる。濾過によって沈殿を回収し、真空下で乾燥させる。得られた化合物（１当量）をジクロロメタンに溶解し、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（２．１当量）を加える。溶液を０℃に冷却し、ジクロロメタン中、ジシクロヘキシルカルボジイミド（２．１当量）の溶液を滴加する。溶液を室温で約１８時間撹拌する。反応混合物を濾過し、濃縮し、ジエチルエーテル中で沈殿させる。濾過によって沈殿を回収し、真空下で乾燥させると、ｍＰＥＧ−ＳＢＡ−３０Ｋが得られる。
【０４９０】
ＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０を製造するために、スキーム３に示されるように、ｍＰＥＧ−ＳＢＡ−３０Ｋを、共有結合コンジュゲーションによってｒＨｕＰＨ２０のアミノ基（単数または複数）とカップリングし、ｒＨｕＰＨ２０およびｍＰＥＧ間に安定なアミド結合を提供した。
スキーム３：
【０４９１】
【化３】
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【０４９２】
コンジュゲーションのために、ｍＰＥＧ−ＳＢＡ−３０Ｋを粉末形態でｒＨｕＰＨ２０に加えた（１３０ｍＭ  ＮａＣｌ／１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ；ｐＨ７中、１０ｍｇ／ｍＬの濃度で）。ＰＥＧ：ｒＨｕＰＨ２０比は、１０：１（モル比）であった。ＰＥＧがバッファーに溶解された後、溶液を滅菌濾過した（Ｃｏｒｎｉｎｇ  ５０ｍＬ試験管トップフィルター、ポリスチレン、酢酸セルロース０．２２μｍメンブレン）。コンジュゲーションを、低温室中、４℃で撹拌しながら一晩実施した。
【０４９３】
コンジュゲーション後、溶液を１００，０００ＭＷＣＯ  ＴＦＦメンブレンを使用して濃縮し、ｐＨ６．８の１３０ｍＭ  ＮａＣｌ／１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳに対してバッファー交換した。上記の実施例２に記載されるように、酵素活性について調べられた得られた物質を、ｐＨ６．８の１３０ｍＭ  ＮａＣｌ／１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳを使用して希釈すると、１００，０００Ｕ／ｍＬの最終酵素活性（約２．５ｍｇペプチド／ｍＬに対応する）が得られた。このＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０物質を濾過して１ｍＬの容積にし、ブロムブチル（ｂｒｏｍｂｕｔｙｌ）シールを備えた１３−ｍｍ１型ガラスバイアルに入れ、凍結保存した（８０℃のフリーザー中で一晩凍結し、次いで、長期保存には−２０℃のフリーザー中に入れる）。
【０４９４】
Ｂ．ＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０の分析
ＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０物質を、ゲル電気泳動によってアッセイした。上記の実施例７Ａにおいてと同様に製造したＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０の３バッチは、未反応のＰＥＧおよび異なる距離に移動した複数の種のｍＰＥＧ−ｒＨｕＰＨ２０コンジュゲートに相当する、同一パターンの複数のバンドを示した。分子量マーカーの移動との比較に基づいて、種に相当するバンドは、約９０ＫＤａ〜３００ＫＤａの範囲であり、３つの濃いバンドは２４０ＫＤａマーカーを超えて移動する。これらのデータは、ｍＰＥＧ−ＳＢＡ−３０Ｋの共有結合コンジュゲーションによって作製したＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０は、おそらくは、モノ−、ジ−およびトリ−ＰＥＧ化タンパク質含む、ＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０種の不均一な混合物を含んでいるということを示した。６０ＫＤａに眼に見えるバンドがないことは、すべてのタンパク質がＰＥＧと反応してしまったこと、および混合物には検出可能な天然ｒＨｕＰＨ２０が存在しないということを示唆した。
【０４９５】
Ｃ．ＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０による、ヒアルロナンリッチな腫瘍細胞におけるヒアルロナン特異的細胞周囲マトリックスＨａｌｏの用量依存性低減
実施例６Ａに記載されるものと同様のアッセイを用いて、ヒアルロナンリッチなヒト前立腺腫瘍癌腫（ＰＣ３）細胞における細胞周囲マトリックス（ｈａｌｏ）の形成に対する種々の用量のＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０の効果を評価した。このアッセイのために、ＰＣ３細胞の種々の低密度培養物を、細胞培地単独（対照；０）またはＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０（上記の実施例２において記載される方法を使用して決定される、３、３０、３００、１０００または３０００のｍＬあたりの酵素ユニット（Ｕ／ｍＬ）で）を用いて、３７℃で６０分処理した。次いで、培養物を０．５ｍｇ／ｍＬウシアグリカン（市販の；大きな凝集性コンドロイチン硫酸プロテオグリカン）とともに３７℃で６０分間インキュベートした。
【０４９６】
ＨＡ（ヒアルロナン）タンパク質免疫組織化学（ＩＨＣ）を使用して、培養物中のＨＡの量を可視化するために、細胞を、ビオチン標識ビオチン標識ヒアルロナン結合性タンパク質（ＨＡＢＰ−ｂｉｏ）（Ｓｅｉｋａｇａｋｕ、Ｊａｐａｎ）を用いて染色した。洗浄して、一次試薬を除去した後、ＦＩＴＣ標識ストレプトアビジン（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ、Ｃａｎａｄａ）を二次試薬として使用した。核を、ＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）試薬を使用して対比染色した。Ｉｎｓｉｇｈｔ  ＦｉｒｅＷｉｒｅデジタルカメラ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｍｉｃｈｉｇａｎ）と連動したＮｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＴＥ２０００Ｕ顕微鏡によって顕微鏡写真を撮った。
【０４９７】
赤血球（ＲＢＣ）粒子排除アッセイのために、各培養物に５×１０６個のホルマリン固定赤血球）を加えた。粒子が落ち着いた後、培養物を１００×倍率で視察した。細胞周囲マトリックスｈａｌｏは、ＨＡについてＩＨＣによって陽性に染まる領域および粒子排除アッセイにおいて粒子（ＲＢＣ）が排除される領域として同定した。
【０４９８】
「ｈａｌｏ領域」は、ＨＡについて陽性に染まるピクセル（免疫組織化学）またはＲＢＣが排除される領域のｍｍ２（粒子排除アッセイ）を測定することによって決定した。平均細胞面積を、各アッセイについて、それぞれ、ピクセルまたはｍｍ２で同様に決定した。次いで、各サンプルの視野についてｈａｌｏ面積を平均細胞面積で除することによって「細胞面積あたりのｈａｌｏ面積」を導いた。次いで、ハロ対照サンプル（培地単独）の細胞あたりのｈａｌｏ面積を１００％とし、１０００Ｕ−ＰＨ２０処理したヒアルロナンによって分解されたＨ４６０細胞の細胞あたりのｈａｌｏ面積（上記の実施例６Ａに由来する）をゼロとして設定することによって「ｈａｌｏパーセント」を決定した。結果は、以下の表１６に示されている。この表は、各研究条件（ＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０の用量）の平均「ｈａｌｏパーセント」を列挙し；各条件は、３連のウェル、ウェルあたりカウントされた２５細胞で実施した（合計ｎ＝カウントされた７５細胞）；平均の標準誤差（ＳＥＭ）が示されている。データは、この研究におけるＨａｌｏの低減におけるＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０の最大半量有効濃度（ＥＣ５０）は、３．１Ｕ／ｍＬ（０．０９μｇ／ｍＬ）であると示した。７５％最大有効濃度（ＥＣ７５）は、１４．１Ｕ／ｍＬ（０．４μｇ／ｍＬ）であった。
【０４９９】
表１６：ＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０で処理したヒアルロナンリッチな腫瘍細胞培養物におけるＨａｌｏ形成における用量依存性低減
【表１６】
2014041131.tif 000023
【０５００】
Ｄ．ＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＰＣ３細胞のコロニー増殖を阻害する
ＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでヒアルロナンリッチな前立腺腫瘍細胞（ＰＣ３）の足場非依存性成長および増殖を阻害できるかどうかを調べるために、細胞で三次元クローン原性アッセイを実施した。約８０％コンフルエンシーのＰＣ３細胞をトリプシン処理し、回収し、完全培地で１回洗浄した。細胞密度を８×１０４個／ｍＬに調整し、氷上でＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）に懸濁した。この細胞／Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）混合物の０．０２５ｍＬを、ウェルあたり０．１ｍＬで  Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）を用いてプレコーティングされ、３７℃で１時間固化されている４８ウェル細胞培養プレートに播種した。連続曝露のために、１７日間にわたって、ＡＰＩバッファーおよび種々の濃度のＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０を制御するために、０．６ｍＬ／ウェルの、ＡＰＩバッファー、１、３、１０および１００Ｕ／ｍＬのＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０を含有する完全培地を適当なウェルの上部に加えた。ウェルを３７℃、空気中、５％  ＣＯ２を含む加湿雰囲気中で１７日間インキュベートし、必要に応じて、適当な濃度の酵素を含む新鮮処理培地を、１７日の期間の間、３〜４日毎に交換した。
【０５０１】
１７日目に、Ｉｎｓｉｇｈｔ  ＦｉｒｅＷｉｒｅデジタルカメラ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｍｉｃｈｉｇａｎ）と連動したＮｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＴＥ２０００Ｕ倒立顕微鏡を用いて像を得ることによってコロニーの成長を評価した。コロニー数およびμｍでの各コロニーの直径は、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（像のディスプレイおよび解析のための、面積およびピクセル値を算出するための、オープンソースソフトウェア、公的に入手可能なプログラム）および連動する較正機能を使用して測定した（コロニー容積は、コロニー直径を使用して、および式：４／３πｒ３を使用して算出した。
【０５０２】
各条件についてウェルの平均コロニー容積を求め、対照サンプル（酵素を含まないＡＰＩ（活性な薬剤成分）バッファー（１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓおよび１３０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０））対ＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０の存在下でインキュベートされたサンプルにおける平均コロニー容積を比較することによって、ＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０の、コロニー容積に対する効果を評価した。次式：
（対照の平均容積−処理の平均容積）／（対照の平均容積）＊１００
を使用して阻害割合を算出した。
【０５０３】
ＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０は、対照と比較して小さいコロニー容積によって明らかな、成長の用量依存性阻害を誘導した。上記の式を使用して算出した阻害割合に基づいて、１、３、１０および１００Ｕ／ｍＬのＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０の存在下でインキュベートした培養物は、対照バッファーとともにインキュベートされた培養物と比較して、それぞれ、３９％、６７％、７３％および７５％のコロニー容積の平均低減を示した（３Ｕおよび１０Ｕサンプルについてｐ＜０．０１；１００Ｕサンプルについてｐ＜０．００１；ｎ＝６）。統計的差異は、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定を使用して分析した。
【０５０４】
Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ（登録商標）４プログラム（ＧｒａｐｈＰａｄ  ソフトウェア、Ｉｎｃ．、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を使用して求めた、コロニー容積の低減におけるＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０のＩＣ５０は、約１．６７Ｕ／ｍＬであった。ビヒクル処理（対照）培養物では、コロニーの平均数は、ウェルあたり１０．１７±１．５６であり、ＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０  １００Ｕ／ｍＬで処理した培養物では、ウェルあたり１１．５０±０．８９であった。コロニー数の相違は、対照と１００Ｕ／ｍＬ培養物の間で有意ではなかった（ｎ＝６、ｐ＞０．０５）。これらの結果は、ＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０は、ヒアルロナンの豊富な癌細胞の増殖および／または生存を阻害できるということを示す。
【実施例８】
【０５０５】
ＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０：天然ｒＨｕＰＨ２０と比較したｉｎ  ｖｉｖｏ作用期間の増大
Ａ．天然ｒＨｕＰＨ２０およびＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０の薬動力学の評価  
１．天然ｒＨｕＰＨ２０の薬動力学の評価
Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから９０匹の雄のＣＤ−１マウスを入手した。動物は、無作為化の当日に、約３〜５週齢のものであり、約１７〜２３グラムの重量であった。０．３９８ｍｇ／ｋｇ  ＨＵＡ（ロット番号ＨＵＡ０７０３ＭＡ；実施例３に記載されるＧｅｎ１製造を使用して作製した）または０．４３３ｍｇ／ｋｇ  ＨＵＢ（ロット番号ＨＵＢ０７０２ＣＡ；実施例４に記載されるＧｅｎ２製造を使用して作製した）ｒＨｕＰＨ２０のいずれかの尾静脈注射（静脈内の）によって動物に投薬した。静脈内注射は、約３０秒かかる緩やかな圧力によって行った。ＰＨ２０（ＨＵＡまたはＨＵＢ）を用いて投薬した６匹の動物を、血液採取のために、投与前に、投与後１、５、１０、３０分にならびに１、２および３時間に麻酔／安楽死させた。血漿サンプルを採取し、ｒＨｕＰＨ２０濃度測定まで凍結保存した。
【０５０６】
９６ウェルプレートベースの酵素アッセイを使用してｒＨｕＰＨ２０の血漿濃度を調べた。酵素アッセイは、血漿試料または組織ホモジネート中のｒＨｕＰＨ２０含量の尺度を提供する、Frost et al. (1997)によって記載される方法(A Microtiter-Based Assay for Hyaluronidase Activity Not Requiring Specialized Reagents. Analytical Biochemistry (1997) 251:263-269)の改変である。最初に、ビオチン化ＨＡ（ｂＨＡ）基質をプラスチック製マイクロタイタープレートと結合させた。標準および試料中に存在するｒＨｕＰＨ２０を、これらのｂＨＡコーティングされたプレート中、最適条件下、３７℃で約９０分間インキュベートした。酵素反応を停止した後、残存する結合しているｂＨＡを、ストレプトアビジン−ＨＲＰコンジュゲートを６０分間最初に加えること、次いで、続いて、ＴＭＢ基質を使用して反応を可視化することによって検出した。標準またはサンプル中にｒＨｕＰＨ２０が多いほど、より少ないＳＡ−ＨＲＰと結合するのに利用可能なｂＨＡにつながるので、光学濃度（４５０ｎｍ）値は、各検体中のヒアルロニダーゼ活性の濃度と反比例していた。アッセイ範囲は、約０．０１３〜１Ｕ／ｍＬであった。５０倍サンプル希釈係数について、ＬＬＯＱは、約０．６２５Ｕ／ｍＬであった。したがって、サンプルの１：１００希釈を用いる、アッセイの定量化の下限（ＬＬＯＱ）は、０．６２５Ｕ／ｍＬの酵素であった。薬物動態（ＰＫ）分析は、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ  Ｐｒｏバージョン５．１（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ  Ｃｏｒｐ．、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ．）を使用して実施した。ＰＫパラメータは、非区画化法を使用して導いた。要約統計量は、ＥＸＣＥＬ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｃｏｒｐ．、Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）またはＪＭＰ  ｖ．５．０．１（ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｃａｒｙ、ＮＣ．）を使用してコンピュータで計算した。ＡＮＯＶＡは、ＪＭＰ  ｖ．５．０．１を使用して実施した。
【０５０７】
ｒＨＵＰＨ２０（ＨＵＡおよびＨＵＢ）のピーク血漿濃度は、ＩＶ注入の開始の際、直ちに得た（１分の採取時間で）。ＨＵＡおよびＨＵＢの平均ピーク濃度（Ｃｍａｘ）は、それぞれ、１１４８および１１７６ｎｇ／ｍＬであった。ピーク濃度の減少は、ＨＵＡおよびＨＵＢの両方について迅速であり、二相性であった。投薬後１から５分の間の初期分布相に、わずかに遅い排出相が続いた。血漿濃度は、投薬後３０分までに、アッセイ定量化限界（０．６２５Ｕ／ｍＬ）より低く低下した。ＩＶ注射からの終末期半減期（ｔ1/2λｚ）は、ＨＵＡについて０．０４５時間（２．６分）であり、ＨＵＢについて０．０３８時間（２．３分）であった。短い半減期は、雄のＣＤ−１マウスにおけるｒＨｕＰＨ２０の迅速な排出を表した。
【０５０８】
２．ＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０の薬動力学の評価
雄のＩＲＣマウス（Ｈａｒｌａｎ）において単回用量ＰＫ研究を実施して、２ロットのＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０（ＰＥＧＰＨ２０）；ロット２００５−９−１４（比活性３８，０００Ｕ／ｍｇ）およびロット２２１−０９２（比活性３２，０００Ｕ／ｍｇ）について血漿濃度対時間プロフィールを特性決定し、比較した。さらに、反復Ｍｏｎｄａｙ−Ｔｈｕｒｓｄａｙ  ＢＩＷ（１週間に２回）ＩＶ注射後のＰＫ濃度を、１研究群の動物で調べた。
【０５０９】
ＰＥＧＰＨ２０（実施例７Ａに記載のとおり製造された）を、２５ｇを超える重量の雄のＩＲＣマウスに静脈内投与した；ＩＶ用量は、１２５，０００の体重１キログラムあたりのヒアルロニダーゼ活性ユニット（Ｕ／ｋｇ）とした。投薬前および投薬後所定の時間で血液サンプルを採取した。マウスの制限された血液容積のために、連続血液採取のために低密度サンプリングスキームを使用した。研究動物の無作為化および低密度血液採取時間は、表１６Ａに示されている。
【０５１０】
【表１７】
2014041131.tif 000024
【０５１１】
採取した血液サンプルから血漿を調製し、−７０℃で分析まで凍結保存した。実施例２に記載されるマイクロ濁度マイクロタイタープレートベースのアッセイによって各血漿サンプル中のヒアルロニダーゼ活性を調べた。アッセイの定量化の下限は、２．９０Ｕ／ｍＬであった。血漿濃度対時間データを、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ  Ｐｒｏバージョン５．１（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ  Ｃｏｒｐ．、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）を使用して非コンパートメントおよびコンパートメント法によって分析した。導かれたＰＫパラメータは、ＡＵＣ、ＣｍａｘおよびＴｍａｘを含んでいた。これらのパラメータを、２ロットのＰＥＧＰＨ２０間で比較して、ＰＫ比較性を評価した。Ｕ／ｍＬからμｇ／ｍＬの変換のために３５，０００Ｕ／ｍｇの一般的な比活性を使用した。３５，０００Ｕ／ｍｇは、２ロットのＰＥＧＰＨ２０（ロット２２１−０９２および２００５−９−１４）の比活性の平均であった。
【０５１２】
ＡＵＣおよびＣｍａｘによって定義される全身曝露は、マウスに静脈内に投与された場合に２ロットのＰＥＧＰＨ２０間で同様であった。２ロットから得た一般的なＰＫプロフィールも、同様であり、約１０〜１１時間の長期の消失半減期および１０ｍＬ／ｈ−ｋｇ未満の遅い全身クリアランスを有していた。血液採取時間による平均および中央値血漿濃度の統計的比較は、２ロットのＰＥＧＰＨ２０間で有意な相違を示さなかった。合計３用量のＰＥＧＰＨ２０の反復ＢＩＷ（月曜−木曜）ＩＶ投与によって、第１の用量の薬物動態学によって予測できる予想される血漿濃度が得られた。これらの結果は、ＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０は、静脈内注射による投与後に、持続されたｉｎ  ｖｉｖｏ酵素活性を有し、半減期の約２５０倍を超える増大を有するということを示唆した。
【０５１３】
Ｂ．ヒアルロナンリッチな腫瘍モデルにおける（脛骨周囲ＰＣ３前立腺癌腫異種移殖片モデル）におけるＩｎ  Ｖｉｖｏ活性
静脈内投与後のＰＥＧ化および天然ｒＨｕＰＨ２０の効果を比較するために、実施例６に記載される脛骨周囲ＰＣ３前立腺癌腫異種移殖片モデル動物を、天然およびＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０を用いて治療した。
【０５１４】
１．ＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０の投与後の血漿におけるヒアルロニダーゼ酵素活性の期間の増大
２群の脛骨周囲ＰＣ３前立腺癌腫異種移殖片モデル動物（ＰＣ３ヒト前立腺癌異種移植片を有する胸腺欠損雄；上記の実施例６参照）に、それぞれ、１０，０００ユニットのＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０（実施例７Ａに記載されるとおりに製造した）および天然ｒＨｕＰＨ２０を用いて静脈内注射した。
【０５１５】
１０，０００ユニットの天然ｒＨｕＰＨ２０／ＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０の投与に先立って、投与後の種々の時点で、動物から血液を採取した。血漿を調製し、上記の実施例２に記載される酵素活性測定法を使用して、これらの時点での１ｍＬの血漿あたりのｒＨｕＰＨ２０活性の単位を調べた。結果は、天然ｒＨｕＰＨ２０の投与後の血漿における酵素活性の半減期は、１分未満である（この実験では、血漿半減期は、０．５９分であった）ということを示した。天然ｒＨｕＰＨ２０の投与後１０分までに、血漿１ｍＬあたり５未満の酵素ユニットしか観察されなかった。
【０５１６】
対照的に、ＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０は、２４時間を超える血漿酵素半減期を示した。１０，０００酵素ユニットのＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０の投与後６０分で、血漿１ｍＬあたり１０００を超える酵素活性ユニット（注射されたものの１０％を超える）が観察された。これらの結果は、ＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０は、静脈内注射による投与後、持続したｉｎ  ｖｉｖｏ酵素活性を有し、半減期の２０００倍を超える増大を有するということを示唆した。
【０５１７】
２．ＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０を用いる、遠位腫瘍におけるヒアルロナン低減期間の増大
天然／ＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０投与の前、投与後４５分、２時間、２４時間、４８時間および７２時間に、上記の実施例８Ｂ．１に記載されるマウスから脛骨周囲腫瘍を採取し、規定濃度の緩衝ホルマリン（ＮＢＦ）中で固定した。腫瘍中のヒアルロナン（ＨＡ）のレベルを、免疫組織化学（ＩＨＣ）によって評価した。ＩＨＣのために、５μｍの腫瘍切片をビオチン標識ヒアルロナン結合タンパク質（ＨＡＢＰ−ｂｉｏ）（Ｓｅｉｋａｇａｋｕ、Ｊａｐａｎ）を使用して染色した。洗浄して一次試薬を除去した後、ＦＩＴＣ標識したストレプトアビジン（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ、Ｃａｎａｄａ）を、二次試薬として使用した。核を、ＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）試薬を使用して対比染色した。Ｉｎｓｉｇｈｔ  ＦｉｒｅＷｉｒｅデジタルカメラ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｍｉｃｈｉｇａｎ）と連動したＮｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＴＥ２０００Ｕ顕微鏡によって顕微鏡写真を撮った。
【０５１８】
ｒＨｕＰＨ２０投与の前の、強い緑色の染色は、腫瘍中のＨＡの存在を示した。１０，０００ユニットの天然ｒＨｕＰＨ２０の静脈内投与の４５（４５）分後、腫瘍は、眼に見えるＨＡ染色を示さなかった。しかし、２４時間内に、腫瘍中のＨＡレベルは、投与前に観察されたものへ回復したと思われ、迅速なヒアルロナンターンオーバーおよび天然ｒＨｕＰＨ２０の短い半減期と一致する。しかし、ＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０の投与後、ＨＡ染色は、投与後２時間、４８時間で、７２時間でも観察されなかった。これらの結果は、ＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０の静脈内投与は、腫瘍部位で持続した酵素活性を投与後少なくとも７２時間もたらすということを示唆した。
【０５１９】
３．ＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０による遠位腫瘍におけるＨＡ分解の用量反応
別の研究では、脛骨周囲ＰＣ３前立腺癌腫異種移殖片モデル動物のさらなる群中の動物を、ビヒクルおよび種々の量濃度（マウスあたり１０、１００、５００、１０００および１０，０００酵素ユニット（Ｕ））のＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０を用いて治療した。この治療の３日（７２時間）後、マウスから脛骨周囲腫瘍を採取し、規定濃度の緩衝ホルマリン（ＮＢＦ）中で固定した。上記の実施例８Ｂ．２に記載されるとおり、腫瘍中のヒアルロナン（ＨＡ）のレベルを、免疫組織化学（ＩＨＣ）によって評価した。腫瘍切片でヘマトキシリン／エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色も行った。結果は、１００、５００、１０００および１０，０００ＵのＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０を用いて治療した動物から得た腫瘍切片におけるＨＡ染色の用量依存性低減を示した。１０００および１０，０００ＵのＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０を投与されている動物から得た切片では、眼に見える染色はほとんど観察されなかった。５００ＵのＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０を投与された動物の切片では、弧発性染色が観察され、このことは、この例示的研究では、ＨＡ染色は、５００Ｕを超える（この場合には、１０００Ｕ）用量を用いる場合にのみ完全に除去されるということを示す。これらの結果は、ＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０の単回全身投与は、遠位腫瘍においてヒアルロナンを少なくとも３日間低減し得るということを示した。この研究では、ＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０のＥＤ５０（ＨＡ染色の５０％低減を誘発する用量）は、キログラムあたり１３，０００の酵素ユニット（Ｕ／Ｋｇ）であり、これは、約３００μｇ／Ｋｇに相当する。
【０５２０】
４．遠位ＰＣ３腫瘍からのＨＡのＰＥＧ化ＰＨ２０除去の作用期間
さらなる研究では、ＰＣ３前立腺腫瘍モデル動物を、ビヒクルを用いて１０日間、またはマウスあたり１０，０００Ｕ（約１５ｍｇ／Ｋｇ）のＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０を用いて１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０日間治療した。治療後、上記の実施例８Ｂ．２に記載されるように、マウスから脛骨周囲腫瘍を採取し、規定濃度の緩衝ホルマリン（ＮＢＦ）中で固定し、免疫組織化学によってヒアルロナン（ＨＡ）発現について評価した。ＨＡ染色は、すべての時点で減少し、５日目からＨＡ染色の可視的検出はなかった。
【実施例９】
【０５２１】
ＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０を用いる持続したＩＦＰ抑制
Ａ．ＰＥＧ・ｒＨｕＰＨ２０投与は、腫瘍ＩＦＰにおいて迅速な、持続した用量依存性低減をもたらす。
遠位腫瘍ＩＦＰに対する、ＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０（ＰＥＧｒＨｕＰＨ２０）および天然ｒＨｕＰＨ２０の全身投与の効果を比較するために、上記の実施例６Ｂに記載される方法を使用して、ＰＣ３異種移殖片モデル動物における種々の量の各酵素の静脈内注射後の腫瘍ＩＦＰを測定した。
【０５２２】
第１に、群あたり、各々、ＰＥＧｒＨｕＰＨ２０または天然ｒＨｕＰＨ２０いずれかの１０，０００ユニット用量を投与されている３匹のマウスを使用して、腫瘍ＩＦＰの低下を比較した。上記の実施例６Ｂに記載されるように、天然ｒＨｕＰＨ２０の投与を用いると、腫瘍ＩＦＰは、投与後１０分で平均３４％まで低下し、１時間で６１．３％まで低下した。１０，０００ユニットのＰＥＧ  ｒＨｕＰＨ２０の投与は、注射後最初の１０分で同様の（２２．４％）低減をもたらした。しかし、投与後１時間までに、ＰＥＧ  ｒＨｕＰＨ２０は、遠位腫瘍ＩＦＰを、ベースラインと比較して平均８８．６％まで低減し、このことは、ＰＥＧ化可溶性ヒアルロニダーゼは、天然酵素と比較して、ＩＦＰに対して増大した、および／または持続した効果を有することを示す。
【０５２３】
次いで、間質液圧に対するｒＨｕＰＨ２０の効果が用量依存性であったかどうかを調べるために、１０群のＰＣ３異種移殖片マウス（群あたり７匹のマウス）を使用して上記の実施例６Ｂに記載される方法を実施し、各群は、１００、１０００、３０００、７０００（ＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０のみ）または１０，０００ユニットのＰＥＧ化もしくは天然ｒＨｕＰＨ２０を用いて、上記のように治療され、または対照担体バッファーを尾静脈注射によって静脈内に投与した。ＩＦＰを、投与前、投与の間および投与後連続して測定した。ＩＦＰは、投与後１２０分まで測定した。
【０５２４】
結果は、天然およびＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０両方の静脈内投与は、遠位腫瘍ＩＦＰを用量依存的に低減させるということを示した。ＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０の数回の用量は、投与後１および２時間までにＩＦＰのより大きな低減をもたらした。例えば、この例示的実験では、１０００ユニットの天然ｒＨｕＰＨ２０の投与は、１２０分後、腫瘍ＩＦＰの約３０％の低減をもたらした（対照と比較しておよそ７０％）が、同用量（１０００ユニット）のＰＥＧ  ｒＨｕＰＨ２０の投与は、腫瘍ＩＦＰを５０％超まで低減させた（対照のおよそ４８％）。最高用量（３，０００〜１０，０００Ｕ／マウス）のＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０でのＩＦＰ低減は、１２０分で８０％を超えていた。ＩＣ５０（ＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０治療後１２０分でのＩＦＰ阻害％の）は、８０７．６Ｕ／マウスであった。３種の最高用量（３０００、７０００および１０，０００ＵのＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０／マウス）効果は、この時点で横ばい状態になると思われた。
【０５２５】
Ｂ．ＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０の静脈内投与は、長期の腫瘍ＩＦＰ抑制をもたらす
実施例８において観察される、ＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０によるｉｎ  ｖｉｖｏ活性期間の増大が腫瘍ＩＦＰの長期の抑制に変換されるかどうかを調べるために、ＰＣ３異種移殖片モデル動物（群あたり４匹の動物）の群に、上記のように、担体バッファーまたは１０，０００ユニットのＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０を静脈内注射し、実施例６Ｂに記載されるように、投与後８時間、２４時間、４８時間および７２時間でＩＦＰを測定した。
【０５２６】
同様の実験は、遠位腫瘍ＩＦＰは、天然ｒＨｕＰＨ２０の投与後２４時間までに対照レベルに戻ったことを示した。対照的に、この実験では、ＩＦＰは、１０，０００ユニットＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０の単回用量の静脈内投与後、８時間、２４時間および４８時間で少なくとも約５０％低下した。この実験では、平均腫瘍ＩＦＰは、７２時間までに対照レベルに近づいた。これらの結果は、ＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０を、静脈内に投与して、遠位腫瘍部位で長期の間質液圧低下を達成できるということを示す。
【０５２７】
Ｃ．ＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０投与による腫瘍ＩＦＰの低下は、ＨＡ依存性である
ＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０による腫瘍ＩＦＰの低下が、腫瘍中のヒアルロン酸（ＨＡ）の存在に依存していたことを実証するために、５種の異なる腫瘍モデルにおいてＩＦＰに対する効果を評価した。この研究のために、雄胸腺欠損ヌード（ｎｕ／ｎｕ）マウスに、適当な細胞株：ＰＣ３（上記、例えば、実施例６に記載される）；ＢｘＰＣ３（ヒト膵臓癌腫細胞株）；Ｍａｔ  ＬｙＬｕ（Ｄｕｎｎｉｎｇシリーズのラット前立腺癌腫に由来するラット前立腺癌腫）；Ｄｕ１４５（ヒトホルモン不応性前立腺癌腫細胞株）；およびＮＣＩ  Ｈ４６０（ヒト大細胞肺癌腫細胞株）を用いて、ＰＣ３モデルについて記載されるように、後肢において、脛骨周囲に接種することによって、各腫瘍モデルの動物の群を作製した（上記の実施例６参照）。
【０５２８】
以下の実施例１７に記載されるように、これらのマウスから単離された腫瘍を、ＨＡ発現の程度の相違について免疫組織化学（ＩＨＣ）によって評価した。ＩＨＣを、腫瘍から得た切片で実施し、「＋＋＋」スコアが、視野の８０％超における強い染色を示し、「＋／−」が、薄い染色を示し、「−」が眼に見える染色がないことを示す採点システムを使用した。以下の実施例１７に、および表１７に記載されるように、この研究は、＋＋＋から＋／−の範囲の腫瘍中のＨＡレベルの範囲を示した。
【０５２９】
４００から８００ｍｍ３の間に達した腫瘍を有する、ＰＣ３前立腺腫瘍モデル、ＢｘＰＣ３膵臓癌腫腫瘍モデル、Ｍａｔ  ＬｙＬｕ前立腺腫瘍モデル、Ｄｕ１４５ヒト前立腺腫瘍モデルおよびＮＣＩ  Ｈ４６０肺癌腫モデルからの動物に、１５ｍｇ／Ｋｇ（マウスあたり１０，０００Ｕ）ＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０または対照バッファー（酵素を含まないＡＰＩ（活性な薬剤成分）バッファー（１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓおよび１３０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０））を用いて静脈内注射した。以下の実施例１７Ａに記載されるように決定される、これらのモデルの各々における腫瘍ＨＡの相対量が、以下の表１７に示されている。
【０５３０】
ＩＦＰを、上記の実施例６Ｂに記載のとおりに、投与前、投与の間および投与後連続して測定した。ＩＦＰは、投与後１２０分まで測定した。以下の表１７は、各腫瘍モデルの、１２０分でのＩＦＰのおよその相対的低減（対照バッファーを用いる治療と比較して）を示す。これらの数字について、ＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０を投与された動物におけるＩＦＰを、対照バッファーを投与されている動物におけるものと比較した。結果は、ＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０静脈内投与は、遠位腫瘍においてＩＦＰをＨＡ依存的に低下させるということを示す。
【０５３１】
表１７：ＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０による腫瘍ＩＦＰの低下は、腫瘍中のＨＡ量に応じて変わる
【表１８】
2014041131.tif 000025
【実施例１０】
【０５３２】
ｒＨｕＰＨ２０の静脈内投与は、遠位腫瘍における血管容積の増大をもたらす（ＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０を用いる持続した効果）
横断二次元超音波画像診断を使用して、上記の実施例６に記載される異種移殖片モデルにおける脛骨周囲腫瘍におけるｒＨｕＰＨ２０投与の前後で血管容積を測定した。
【０５３３】
ＶｉｓｕａｌＳｏｎｉｃｓ  Ｖｅｖｏ  ７７０（登録商標）高解像度超音波（Ｕ／Ｓ）（ＶｉｓｕａｌＳｏｎｉｃｓ、Ｉｎｃ．、Ｔｏｒｏｎｔｏ、Ｏｎｔａｒｉｏ、Ｃａｎａｄａ）をコントランスモードで使用し、腫瘍中の血管容積の相対的測定値を得た。コントランスモード画像獲得の際、血管腔に捕捉されていないが、その大きさによって捕捉されるようになる、非標的化窒素／ペルフルオロブタン充填ＭｉｃｒｏＭａｒｋｅｒ（登録商標）マイクロバブル（ＭＢ）（ＶｉｓｕａｌＳｏｎｉｃｓ、Ｉｎｃ．）を尾静脈注射によって静脈内に投与した。ＭＢは、ハイパーエコーを示し、従って、強い超音波反射を提供し、また２．３〜２．９ｍｍの中央径を有する。したがって、ＭＢは、注射後、血管区画に閉じ込められる。相対血管容積は、以下の方程式を使用して、注目する腫瘍領域（ＲＯＩ）あたりの、ＭＢ注射後の超音波シグナル強度（Ｂ）−ＭＢ注射前の超音波シグナル強度（Ａ）として算出した：
血管容積（τ１）＝［（Ｂ−Ａ）／ＲＯＩ］
【０５３４】
相対血管容積の変化は、以下の方程式のように、２時点（例えば、ｒＨｕＰＨ２０の投与の前後）での血管容積の相違（上記の方程式を用いて算出される）であった：
血管容積の変化＝血管容積（τ２）−血管容積（τ１）
【０５３５】
これらの方法を使用して、脛骨周囲腫瘍中の血管容積を、上記の実施例６および９に記載されるように可溶性ヒトヒアルロニダーゼ（天然またはＰＥＧ化）の異種移殖片モデル動物への静脈内投与後８時間、２４時間、４８時間および７２時で測定した。天然ｒＨｕＰＨ２０の投与後８および２４時間で、遠位腫瘍血管容積は、担体バッファー単独の注射後よりも２から２．５倍の間、高かった。しかし、ＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０の投与後８および２４時間で、血管容積は、バッファー単独の注射後よりも３から４倍の間、高かった。ＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０の投与後４８時間までに、腫瘍血管容積は、バッファー単独を用いる注射後に観察された血管容積と比較して依然として３倍増大していた。これらの結果は、ＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０の全身投与は、腫瘍血管の持続した「酵素的減圧」を達成でき、これが血管容積の増大をもたらすということを示す。
【０５３６】
腫瘍血管の酵素的減圧はまた、血管の可視化のために免疫組織化学（ＩＨＣ）によっても評価した。担体バッファーまた１０，０００ユニットのＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０で治療された群から得た（３匹のＰＣ３異種移殖片モデル動物各々の）脛骨周囲腫瘍を、採取し、ホルマリンで固定し、パラフィンに包埋した。血管の検出のために、腫瘍から得た切片を、ラット抗マウスＣＤ３１抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）を使用して染色した。一次抗体を洗浄した後、ＨＲＰがコンジュゲートしているウサギ抗ラットＩｇＧ（ベクターＬａｂｓ、Ｃａｎａｄａ）を用いて切片を染色した。二次抗体を洗浄した後、ＤＡＢ基質を使用して、ＣＤ３１染色を可視化した。ヘマトキシリンを用いて核を対比染色した。ＩｍａｇｅＪオープンソースソフトウェア、像のディスプレイおよび解析のための、面積およびピクセル値を算出するための、公的に入手可能なプログラムを使用して微小血管面積を定量化した。この場合には、プログラムを使用して、ＣＤ３１陽性微小血管の内側の面積を測定した。結果は、対照治療動物から得た腫瘍切片において約２００平方マイクロメートル（μｍ２）の平均ＣＤ３１＋微小血管面積、および４８時間前にＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０の静脈内用量を投与されたマウスから得た腫瘍切片において約７００μｍ２の平均ＣＤ３１＋微小血管面積を示した。この３倍を超える増大は、ＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０の投与は、腫瘍血管の持続した酵素的減圧達成するという知見を支持した。
【実施例１１】
【０５３７】
ＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０の静脈内投与は、腫瘍水分含量の持続した低減をもたらす
１０，０００ユニットのＰＥＧ・ｒＨｕＰＨ２０または担体バッファー単独の、上記の実施例において記載されるような、静脈内投与後、種々の時点で、ＰＣ３異種移殖片動物の群（群あたり９匹のマウス）で腫瘍水分含量を測定した。水分含量を投与後２、８、２４、４８、７２、９６および１２０時間に測定した。
【０５３８】
水分含量を測定するために、ＰＣ３腫瘍片を採取し、吸い取り、秤量し、スナップ凍結した。続いて、サンプルを凍結乾燥機に入れ、４８時間にわたって乾燥させ、秤量した。水分重量は、組織湿重対乾重比として報告された。結果は、測定されたすべての時点で、ＰＥＧ  ｒＨｕＰＨ２０を投与されたマウスでは、担体バッファー注射を投与されている動物と比較して、湿重／乾重比は有意に低下する（ｐ＜０．０５）ということを示した。
【０５３９】
相対Ｈ２Ｏ拡散率（ＡＤＣ）−動物に、天然ｒＨｕＰＨ２０、ＰＥＧ・ｒＨｕＰＨ２０または担体バッファーを投与し、拡散加重ＭＲＩを経時的に測定し、見かけの拡散係数（ＡＤＣ）を決定した（例えば、Park MJ et. al, Korean J Radiol. 2007 (5):390-6、The role of diffusion-weighted imagimg and the apparent diffusion coefficient(ADC) values for breast tumors参照）。ADC値は、腫瘍水分含量を反映していた。投与後４８および７２時間の両方で、ＰＥＧ・ｒＨｕＰＨ２０治療後の平均Ｈ２０見かけ拡散係数（ＡＤＣ）は、担体バッファー単独での治療と統計的に異なっていた。水ＡＤＣの低下は、ＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０によって静脈内に治療された動物中の腫瘍における水拡散／並進運動の低減を反映していた。したがって、水拡散は、対照と比較して、４８および７２時間の両方でこれらの動物中の腫瘍において有意に低減した。この結果は、ＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０の静脈内投与後、少なくとも７２時間、間質容積割合が低減したこと、および／または間質液の蛇行が減少したことを示す。
【実施例１２】
【０５４０】
シアル酸および単糖含量の決定
可溶性ｒＨｕＰＨ２０のシアル酸および単糖含量を、トリフルオロ酢酸を用いる加水分解後の逆相液体クロマトグラフィー（ＲＰＬＣ）によって評価できる。一実施例では、精製されたヒアルロニダーゼロット番号ＨＵＢ０７０１Ｅ（１．２ｍｇ／ｍＬ；本質的に実施例５に記載のとおり製造および精製された）のシアル酸および単糖含量を決定した。手短には、１００μｇサンプルは、２連で１００℃で４時間４０％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸を用いて加水分解した。加水分解後、サンプルを乾燥させ、３００μＬの水に再懸濁した。再懸濁したサンプルの各々から４５μＬのアリコートを、新しい試験管に移し、乾燥させ、各々に１０ｍｇ／ｍＬ酢酸ナトリウム溶液１０μＬを加えた。放出された単糖を、メタノール中、３０ｍｇ／ｍＬの２−アミノ安息香酸、２０ｍｇ／ｍＬ水素化シアノホウ素ナトリウム、約４０ｍｇ／ｍＬ酢酸ナトリウムおよび２０ｍｇ／ｍＬホウ酸を含有する溶液５０μＬを添加することによって蛍光標識した。混合物を、８０℃暗所で３０分間インキュベートした。移動相Ａ（０．２％（ｖ／ｖ）ｎ−ブチルアミン、０．５％（ｖ／ｖ）リン酸、１％（ｖ／ｖ）テトラヒドロフラン）４４０μＬの添加によって、誘導体化反応をクエンチした。陰性対照として水のマトリックスブランクも、ヒアルロニダーゼサンプルについて記載されるように加水分解し、誘導体化した。放出された単糖を、オクタデシル（Ｃ１８）逆相カラム（４．６×２５０ｍｍ、５μｍ粒径；Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ）を使用するＲＰＬＣによって分離し、蛍光検出（３６０ｎｍ励起、４２５ｎｍ発光）によってモニタリングした。単糖含量の定量化は、ヒアルロニダーゼサンプルから得たクロマトグラムを、Ｎ−Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮ）、Ｎ−Ｄ−ガラクトサミン（ＧａｌＮ）、ガラクトース、フコースおよびマンノースを含めた単糖標準のクロマトグラムと比較することによって行った。表１８は、ヒアルロニダーゼ分子あたりの各単糖のモル比を示す。
【０５４１】
表１８．可溶性ｒＨｕＰＨ２０の単糖含量
【表１９】
2014041131.tif 000026
＊ＧａｌＮ結果は、検出限界より低かった
【実施例１３】
【０５４２】
３Ｄ３５Ｍおよび２Ｂ２細胞から得た可溶性ｒＨｕＰＨ２０のＣ末端不均一性
Ｃ末端配列決定を、１００Ｌのバイオリアクター容量中の３Ｄ３５Ｍ細胞（ロットＨＵＡ０５０５ＭＡ）および３００Ｌのバイオリアクター容量中の２Ｂ２細胞（ロットＨＵＢ０７０１ＥＢ）から製造し、精製した２ロットのｓＨｕＰＨ２０で実施した。これらのロットを、Ｎ末端でアスパラギン酸およびシステイン酸でペプチド結合を特異的に切断する、エンドプロテアーゼＡｓｐ−Ｎを用いて別個に消化した。これによって、配列番号４の位置４３１のアスパラギン酸で可溶性ｒＨｕＰＨ２０のＣ末端部分が放出される。Ｃ末端断片を分離し、特性決定して、ロットＨＵＡ０５０５ＭＡおよびロットＨＵＢ０７０１ＥＢ中の各集団の配列および存在量を決定した。
【０５４３】
３Ｄ３５Ｍ細胞および２Ｂ２細胞から得た可溶性ｒＨｕＰＨ２０調製物は、不均一性を示し、そのＣ末端配列において互いに異なっているポリペプチドを含むということが観察された（表１９および２０）。この不均一性は、製造および精製工程の間の、細胞培養培地またはその他の溶液中に存在するペプチダーゼによる、発現された４４７個のアミノ酸のポリペプチド（配列番号４）のＣ末端切断の結果である可能性が高い。可溶性ｒＨｕＰＨ２０調製物中のポリペプチドは、配列番号４に示される可溶性ｒＨｕＰＨ２０配列のアミノ酸１〜４４７、１〜４４６、１〜４４５、１〜４４４および１〜４４３に対応するアミノ酸配列を有する。これらのポリペプチド各々の全長アミノ酸配列は、それぞれ、配列番号４〜８に示されている。表１９および２０に記載されるように、３Ｄ３５Ｍ細胞および２Ｂ２細胞から得た可溶性ｒＨｕＰＨ２０調製物中の各ポリペプチドの存在量は異なる。
【０５４４】
【表２０】
2014041131.tif 000027
【０５４５】
【表２１】
2014041131.tif 000028
【実施例１４】
【０５４６】
前立腺癌モデルにおける静脈内投与後のＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０および細胞傷害性薬剤の抗腫瘍効果
ＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０ならびに細胞傷害性薬剤ドセタキセル（タキソテール（登録商標）；Ｓａｎｏｆｉ  Ａｖｅｎｔｉｓ）およびリポソームドキソルビシン（ドキシル（登録商標）；Ｏｒｔｈｏ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）の同時投与の抗腫瘍効果を、ホルモン不応性前立腺癌異種移殖片モデルおよび骨転移モデルを使用して評価した
Ａ．前立腺癌異種移殖片モデル
ＰＣ３脛骨周囲ホルモン不応性前立腺癌異種移殖片モデルを確立するために、胸腺欠損雄ヌードマウスに、ヒトＰＣ３前立腺癌細胞（総容量０．０５ｍＬ中、マウスあたり１×１０６個細胞）を用い、右脛骨骨膜に隣接して筋肉内に接種し、３４±１６ｍｍＨｇの間質液圧（ｉｎｓｔｅｒｓｔｉａｌ  ｆｌｕｉｄ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ）を有する腫瘍を作製した。腫瘍を４００〜５００ｍｍ３の平均腫瘍量に増殖させ、その後、細胞傷害性薬剤／ＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０、細胞傷害性薬剤単独またはＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０単独のいずれかを用いる治療を開始した。腫瘍成長は、ＶｉｓｕａｌＳｏｎｉｃｓ  イメージングマイクロ超音波システムを使用してモニタリングした。
【０５４７】
１つの群中のマウスには、０日目および７日目に、１０ｍｇ／ｋｇタキソテール（登録商標）（ドセタキセル）および１０，０００Ｕ／マウスＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０を静脈内に投与した。これは、まず、シリンジ中に、０．１ｍＬのタキソテール（登録商標）（ドセタキセル）、続いて、０．１ｍＬのＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０を引き上げること、次いで、０．２ｍＬの溶液をマウスの尾静脈中に直ちに注射することによって実施した。これらのマウスにはまた、０．２ｍＬ中、１０，０００Ｕ／マウスのＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０のさらなる用量を、３日目および１０日目に静脈内に投与した。対照群のマウス（Ｇ２）には、１０ｍｇ／ｋｇのドセタキセルＱ７Ｄｘ２を０日目および７日目に静脈内に投与した。別の対照群のマウスには、３０ｍｇ／ｋｇのドセタキセルＱ７Ｄｘ２を、０日目および７日目に静脈内に投与した。さらなる対照群のマウスには、１０，０００Ｕ／マウスのＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０を０、３、７および１０日目に静脈内に投与した。ＡＰＩバッファーのみを投与された最後の対照群も、研究（Ｇ１）に含めた。種々の時点で腫瘍量を測定し（図１および表２１）、１５００ｍｍ３腫瘍量までの生存パーセンテージも観察した（図２）。表２２は、生存に対するタキソテール（登録商標）（ドセタキセル）およびＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０の同時投与の効果の分析を示す。生存期間中央値（ＭＳＴ）（日での）を、各群中の個々の動物に基づいて１５００ｍｍ３腫瘍量までの平均期間によって算出した。Ｔ／Ｃ％は、Ｔ／Ｃ％＝（Ｔ／Ｃ）×１００（式中、Ｔは、治療群における１５００ｍｍ３腫瘍量までの生存期間中央値であり、Ｃは、ＡＰＩバッファー対照群における１５００ｍｍ３腫瘍量までの生存期間中央値である）によって算出される。米国国立癌研究所（ＮＣＩ）判定基準によれば、１２５％を超えるＴ／Ｃ％を有する処方が活性であると考えられる。寿命の増大（ＩＬＳ）は、［（Ｔ−Ｃ）／Ｃ］×１００として算出される抗腫瘍活性の尺度である［式中、（Ｔ−Ｃ）は、治療（Ｔ）および対照（Ｃ）群間の、１５００ｍｍ３腫瘍量までの平均日数における相違である］。ＮＣＩ判定基準によれば、２５％を超えるＩＬＳ％を有する処方が有効と考えられる。
【０５４８】
タキソテール（登録商標）（ドセタキセル）およびＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０の同時投与は、Ｑ７Ｄｘ２によって投与される１０ｍｇ／ｋｇのドセタキセル単独またはＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０単独のものよりも大幅に優れていた、７３日間にわたる相乗的な腫瘍成長阻害、および生存時間の増大（１５００ｍｍ３の腫瘍量に達する時間として定義される）をもたらした。
【０５４９】
【表２２】
2014041131.tif 000029
【０５５０】
【表２３】
2014041131.tif 000030
【０５５１】
ＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０およびリポソームドキソルビシンの同時投与の抗腫瘍効果を評価するために、ＰＣ３腫瘍を有するマウスに、６ｍｇ／ｋｇドキシル（登録商標）リポソームドキソルビシンおよび１０，０００Ｕ／マウスのＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０を０、７および１４日目に静脈内投与した。これは、まず、シリンジ中に、０．１ｍＬのドキシル（登録商標）リポソームドキソルビシン、続いて、０．１ｍＬのＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０を引き上げること、次いで、０．２ｍＬの溶液をマウスの尾静脈中に直ちに注射することによって実施した。これらのマウスにはまた、０．２ｍＬ中、１０，０００Ｕ／マウスのＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０のさらなる用量を、３、５、１０、１２日目に投与した。対照群のマウスには、６ｍｇ／ｋｇのドキシル（登録商標）リポソームドキソルビシンを、０、７および１４日目に静脈内に投与した。別の対照群のマウスには、０．２ｍＬ中、１０，０００Ｕ／マウスのＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０の用量を、０、３、５、７、１０、１２および１４日目に投与した。ＡＰＩバッファーのみを投与された最後の対照群も、この研究に含めた。腫瘍量を種々の時点で観察した（図３および表２３）。同時投与されたＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０およびリポソームドキソルビシンの抗腫瘍効果は、リポソームドキソルビシン単独のものよりも統計上有意に優れていることが観察された。
【０５５２】
【表２４】
2014041131.tif 000031
【０５５３】
Ｂ．ＰＣ−３Ｍ−ｌｕｃ−Ｃ６骨転移モデル
ＰＣ−３Ｍ−ｌｕｃ−Ｃ６骨転移モデルを、Ｊｅｎｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｍｅｔａｓｔ  （２００３）２０：７４５−７５６）によって記載されるようにヌードマウスで確立した。マウスの生存をモニタリングすることに加え、ＰＣ−３Ｍ−ｌｕｃ−Ｃ６細胞の生物発光によって、マウスを画像にして、ＰＣ−３Ｍ−ｌｕｃ−Ｃ６転移を可視化した。手短には、０日目に、７〜１０週齢ｎｕ／ｎｕ雄マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を麻酔し、５０μＬの滅菌ＤＰＢＳに懸濁した３×１０６個のＰＣ−３Ｍ−ｌｕｃ−Ｃ６細胞（生物発光ヒト前立腺癌腫細胞株）を用い、心臓内注射によって注射した。マウスに、非外科的手段によって心臓の左心室に注射して、ＰＣ−３Ｍ−ｌｕｃ−Ｃ６細胞からの転移の可能性を増大した。腫瘍細胞の心臓内注射は、肺をバイパスし、細胞を全身循環に分散して、動物内の複数の組織における転移の播種を可能にする方法として働く。左心室への十分な注射は、生物発光イメージング（ＢＬＩ）によって数分内に検出可能であり、マウスの完全ブルーシグナルＢＬＩによって示されるような、直ちにではあるが一時的な、動物全体にわたる全身の生物発光によって同定された。不首尾の移植は、通常、動物の胸部領域内のみに隔離され、経時的に持続されるより局在したシグナルをもたらした。０および１１日目に胸部において高生物発光シグナルを示した動物を研究から除外した。０日目にＰＣ−３Ｍｌｕｃ−Ｃ６細胞の成功した心臓内注射を施したマウス（ｎ＝１０〜１３匹のマウス／Ｇｒｐ）を、最大４週間の間１週間に２回画像にし、続いて、４９日目まで、およびその時点を越えて生存について追跡調査した。すべてのマウスにおいて、種々の組織への転移の初期兆候は、細胞の注射後１４日内に観察された。観察された転移のパターンは、マウスの胸部、顎および／または肢において発生する病変を示した。
【０５５４】
１４日目に、マウスをいくつかの治療計画のうちの１つに付した。対照マウスのセットには、１４、１６、１８、２１、２３、２５、２８、３０および３２日目にＡＰＩバッファー（１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓおよび１３０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）のみを投与した。２つのその他のセットのマウスには、１４および２１日目に３０ｍｇ／ｋｇタキソテール（登録商標）（ドセタキセル）Ｑ７Ｄｘ２、または１４、２１および２８日目に１０ｍｇ／ｋｇタキソテール（登録商標）（ドセタキセル）Ｑ７Ｄｘ３をそれぞれ投与した。別の群のマウスには、１４、１６、１８、２１、２３、２５、２８、３０、３２および３５日目に１０，０００Ｕ／マウスのＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０を静脈内に投与した。２つのその他の群のマウスには、混合されたＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０／タキソテール（登録商標）（ドセタキセル）または逐次投与されるＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０、次いでタキソテール（登録商標）（ドセタキセル）を投与した。これらの群の最初のものには、注射後１４、２１および２８日目に１０ｍｇ／ｋｇのタキソテール（登録商標）（ドセタキセル）および１０，０００Ｕ／マウスのＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０を静脈内に投与した。これは、まず、シリンジ中に、０．１ｍＬのタキソテール（登録商標）（ドセタキセル）を、続いて、０．１ｍＬのＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０を引き上げること、次いで、０．２ｍＬの溶液をマウスの尾静脈中に直ちに注射することによって実施した。これらのマウスにはまた、０．２ｍＬ中、１０，０００Ｕ／マウスのＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０のさらなる用量を、１６、１８、２３、２５、３０および３２日目に静脈内に投与した。同じ投薬を受けたこれらの群の２つ目には、１０ｍｇ／ｋｇタキソテール（登録商標）（ドセタキセル）／１０，０００ＵのＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０の混合物の代わりに、１０ｍｇ／ｋｇタキソテール（登録商標）（ドセタキセル）用量の投与の２時間前に１０，０００ユニットのＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０用量を投与した。
【０５５５】
マウスを、０、１１、１５、１８、２２、２５および２９日目に、ＩＶＩＳ（登録商標）イメージングシステム（Ｘｅｎｏｇｅｎ）を使用して先に記載されたように（Ｊｅｎｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｍｅｔａｓｔ  ２０：７４５−７５６）画像にし、Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅ（登録商標）ソフトウェア（Ｘｅｎｏｇｅｎ）を使用して分析して、生物発光ＰＣ−３Ｍ−ｌｕｃ−Ｃ６転移を可視化した。０および１１日目の初期シグナルは、２９日目までのその後の画像によって確認され、ほぼすべての転移性部位が、生物発光の漸増を経時的に示した。マウスの顎領域からのｉｎ  ｖｉｖｏ生物発光シグナルは、歯髄、下顎骨または頸部リンパ節における微小転移に相当する。下肢ｉｎ  ｖｉｖｏシグナルは、脛骨または大腿下肢骨中に同定される転移病巣に相当していた。ｉｎ  ｖｉｖｏで観察される胸部シグナルは、心臓、肺または胸腔の胸腔表面に接種された残存腫瘍細胞と関連している。０日目に成功した全身注射を示し、２９日目までに転移のｉｎ  ｖｉｖｏ証拠を示す像を有するマウスを、治療群の分析に含めた。
【０５５６】
１４およ２１日目に３０ｍｇ／ｋｇで静脈内に投与されたタキソテール（登録商標）（ドセタキセル）は、ＭＴＤ（最大耐容量）で最高用量レベルに相当する。１１日目から２９日目にとられた像は、薬物は、治療されたマウスにおいてすべての転移部位で相当な阻害効果を有することを示す。１１日目の像は、２９日目に生存して残っている１１匹のマウスのうち１０匹で２９日目に検出可能な生物発光強度の低下によって示されるように時間とともに徐々に消失する、代表的な転移パターンを有するマウスを示す。１０ｍｇ／ｋｇタキソテール（登録商標）（ドセタキセル）治療マウスの像において、発光減少の、より少ない程度であるが同様の傾向が観察され、腫瘍細胞注射の２９日後に１２匹のうち９匹の生存動物を含んでいた。対照的に、対照ＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０治療動物は、６匹の生存マウスの像からわかるような２９日目のリバウンドシグナルによって示される、動物全体の生物発光においてその後の再発の証拠を示した。混合ＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０／タキソテール（登録商標）（ドセタキセル）を投与されたマウスおよび逐次投与されるＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０およびタキソテール（登録商標）（ドセタキセル）を投与されたマウスの２９日目の像は、変化なしから減少したレベルのＢＬＩシグナルの量および強度を示し、このことは、骨部位への腫瘍播種の安定化を示す。特に、逐次用量のＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０およびタキソテール（登録商標）（ドセタキセル）を投与された４匹のマウスは、２９日目に完全にシグナルがなくなったと思われ、このことは、治癒の可能性または長期の生存者効果を示す。
【０５５７】
ＰＣ−３Ｍ−ｌｕｃ−Ｃ６の心臓内注射の４９日後の各群のマウスの生存率が、表２４に示されている。１０，０００ユニットのＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０および１０ｍｇ／ｋｇのタキソテール（登録商標）（ドセタキセル）の同時投与は、１０ｍｇ／ｋｇタキソテール（登録商標）（ドセタキセル）単独を用いる治療よりも大きな抗腫瘍活性をもたらしたことが観察された。
【０５５８】
【表２５】
2014041131.tif 000032
【実施例１５】
【０５５９】
毒性研究−単独およびドセタキセルと組み合わせたＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０
単独およびタキソテール（登録商標）（ドセタキセル）と組み合わせたＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０の毒性研究のために、ヌードマウスに、種々の用量のＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０および１０ｍｇ／ｋｇタキソテール（登録商標）（ドセタキセル）を投与した。ＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０単独、タキソテール（登録商標）（ドセタキセル）単独またはＡＰＩバッファー単独を投与されている対照群も研究に含めた。表２５は、マウスの各群の治療計画を示す。毒性研究のために、最大２６日間研究の過程にわたって体重および生存中の観察をモニタリングした。外部医薬品開発業務受託機関、ＢｉｏＱｕａｎｔ  Ｉｎｃ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）によって、全血および血清サンプルで、差次的および血清臨床化学を用いて完全血液化学を評価した。
【０５６０】
表２６および２７および図４および５は、ＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０単独、ＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０／タキソテール（登録商標）（ドセタキセル）およびタキソテール（登録商標）（ドセタキセル）単独の投与後の体重の変化を示す。表２７および図６は、ＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０単独、ＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０／タキソテール（登録商標）（ドセタキセル）およびタキソテール（登録商標）（ドセタキセル）単独を投与されたマウスの血液中の顆粒球の数を示し、表２８および図７は、ＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０単独、ＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０／タキソテール（登録商標）（ドセタキセル）およびタキソテール（登録商標）（ドセタキセル）単独を投与されたマウスにおける血清アルブミンレベルを示す。健常なマウスの血液中の顆粒球の数の正常範囲は、１．２〜６．８×１０３  個細胞／μＬであり、正常血清アルブミン範囲は、２．５〜４．８ｇ／ｄＬである。ドセタキセルおよびＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０の同時投与は耐容性良好であり、好中球減少症の大幅な増加はなく（顆粒球の大幅な低減がないことによって示されるように）、３０ｍｇ／ｋｇの最大耐容量（ＭＴＤ）でドセタキセル治療単独と比較して耐容性が良好であることが観察された。最大３０，０００Ｕ／マウスの用量でのＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０単独の投与も耐容性良好であった。
【０５６１】
【表２６】
2014041131.tif 000033
【０５６２】
【表２７】
2014041131.tif 000034
【０５６３】
【表２８】
2014041131.tif 000035
【０５６４】
【表２９】
2014041131.tif 000036
【０５６５】
【表３０】
2014041131.tif 000037
【実施例１６】
【０５６６】
ＰＣ３異種移殖片モデルにおけるＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０単独の抗腫瘍活性
ＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０単独の抗腫瘍活性を調べるために、上記の実施例に記載されるＰＣ３異種移殖片モデルを使用して、反復された、持続した投与後の腫瘍成長を測定した。
【０５６７】
Ａ．ＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０の反復された静脈内投与は、ＰＣ３ヒト前立腺癌モデルにおいて抗腫瘍効果をもたらす。
ＰＣ３ヒト前立腺モデルを上記のように作製した。胸腺欠損雄ヌードマウスに、ヒトＰＣ３前立腺癌細胞（総容量０．０５ｍＬ中、マウスあたり１×１０６個細胞）を用い、右脛骨骨膜に隣接して筋肉内に（ＩＭ）接種し、高間質液圧を有する腫瘍を作製した。腫瘍を４００〜５００ｍｍ３の平均腫瘍量に増殖させ、その後、対照ビヒクルおよびさまざまな酵素ユニット（Ｕ）量のＰＥＧＰＨ２０を用いて以下のとおりに静脈内治療を開始した。５群のマウスを使用した。群１（１１匹の動物）に対照ビヒクルを投与し；群２中の各動物（８匹の動物）に１０００ＵのＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０を投与し；群３中の各動物（８匹の動物）に３，０００ＵのＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０を投与し；群４中の各動物（８匹の動物）に１０，０００ＵのＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０を投与し；群５中の各動物（１１匹の動物）に３０，０００ＵのＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０を投与した。各動物にＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０または対照ビヒクルを、週３回（Ｑ３Ｗ）、１日おき（ＥＯＤ）、月曜、水曜および金曜に、０日目、次いで、３、５、７、１０、１２、１４および１７日目の合計８用量投与した。
【０５６８】
Ｖｉｓｕａｌ  Ｓｏｎｉｃｓ超音波システムを使用し、超音波画像診断ソフトウェアプログラムを使用して像を得ることによって、２、４、７、１１、１４および１８日目に各群の動物において、研究の過程にわたって、腫瘍量（ｍｍ３）を測定した。データは、以下の図８に、および表３０に示されている。図８中のエラーバーは、表３０にも列挙されている標準誤差を表す。結果は、反復された静脈内ＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０の各用量は、各治療後時点で、対照群と比較して、より小さい腫瘍量によって証明されるように、腫瘍成長の低減を引き起こすということを示す。
【０５６９】
【表３１】
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【０５７０】
治療された動物の腫瘍中のＨＡの除去を実証するために、各群の動物から得た腫瘍も、上記の実施例８Ｂ．２に記載されるように単離し、固定し、切片にした。その実施例に記載のとおり、５μｍの切片を染色した。免疫組織化学のために、ビオチン標識ヒアルロナン結合タンパク質（ＨＡＢＰ−ｂｉｏ）（Ｓｅｉｋａｇａｋｕ、Ｊａｐａｎ）を使用して５μｍの腫瘍切片を染色した。洗浄して一次試薬を除去した後ＦＩＴＣ標識ストレプトアビジン（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ、Ｃａｎａｄａ）を二次試薬として使用した。核を、ＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）試薬を使用して対比染色した。Ｉｎｓｉｇｈｔ  ＦｉｒｅＷｉｒｅデジタルカメラ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｍｉｃｈｉｇａｎ）と連動したＮｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＴＥ２０００Ｕ顕微鏡によって顕微鏡写真を撮った。結果は、治療された動物各々の腫瘍中に眼に見える染色がないことを示し、これは、１，０００、３，０００、１０，０００および３０，０００ＵのＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０の全身投与は、このヒト前立腺癌動物モデル中の遠位腫瘍においてすべての検出可能なヒアルロナンを除去したということを実証する。
【０５７１】
Ｂ．ＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０に対する持続した、全身曝露は、腫瘍量を低減する
１０匹のＰＣ−３脛骨周囲腫瘍を有するマウスを、上記のように、ヒトＰＣ３前立腺癌細胞（マウスたり１×１０６個細胞、総容量０．０５ｍＬ）を用い、右脛骨骨膜に隣接して胸腺欠損ヌードマウスに筋肉内に（ＩＭ）接種することによる脛骨周囲移植によって作製した。約３００ｍｍ３腫瘍量を有するＰＣ−３脛骨周囲腫瘍を有するマウスに、対照バッファー（ＡＰＩバッファー）（５動物−対照群）または０．２ｍｌの容量あたり約２０，０００酵素ユニット（Ｕ）（１２日にわたって各マウスに投与される０．７ｍｇ／マウス（３５ｍｇ／Ｋｇ））のＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０（５動物）を含有するＡｌｚａ  ｐｕｍｐｓ（Ａｌｚｅｔ（登録商標）ミニ浸透圧ポンプ、モデル番号２００２、Ｄｕｒｅｃｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃｕｐｅｒｔｉｎｏ、ＣＡ）を用いて皮下に（ＳＣ）移植した。各群について、ポンプは、１４日にわたって、時間あたり０．５マイクロリットルをデリバリーし、これは、ＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０を用いて治療される群にとっては、時間あたり５０Ｕ；１日あたり１，２００Ｕに匹敵した。
【０５７２】
腫瘍量（ｍｍ３）を、Ｖｉｓｕａｌ  Ｓｏｎｉｃ超音波システムを使用し、超音波画像診断ソフトウェアプログラムを使用して像を得ることによって、治療前、−１日目に、および研究の終了時の１２日目に測定した。結果は、以下の表３１に示されている。表に示されるように、対照群中の１匹のマウスが、研究の結論の前に死亡していることがわかった。
【０５７３】
【表３２】
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【０５７４】
表３１に示されるように、ＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０の持続した静脈内曝露（合計２０，０００Ｕ、１２日間にわたって）は、対照動物と比較して腫瘍成長を低減した。対照群およびＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０で治療された群における腫瘍量間で、１２日目に有意差（ｐ＜０．００１５）が観察された。したがって、ＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０の連続投与は、ヒト前立腺腫瘍異種移殖片モデルにおいて抗腫瘍効果を有する。
【０５７５】
マウスの体重も、−１、０、４、６、８および１１日目に測定した。これらの結果は、以下の表３２に示されている。
【０５７６】
【表３３】
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＊  Ａｖｇ＝平均；ＢＷ（ｇ）＝グラムでの体重；％Ｃｈ＝０日目からの変化パーセント；ｆｄ＝死亡と見られた
【実施例１７】
【０５７７】
複数のＨＡ発現性腫瘍におけるＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０のＩｎ  ｖｉｖｏ  ＨＡ低減活性および抗腫瘍活性
Ａ．ＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０の全身投与は、複数のＨＡ発現性腫瘍においてＨＡを除去する
ビヒクルまたはＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０（１０，０００Ｕ／マウス＝１５ｍｇ／Ｋｇ）の静脈内投与の２時間後、ヒアルロナン（ＨＡ）の発現を、腫瘍の動物モデル中の種々の腫瘍（以下の表３３に列挙される）において、上記の実施例８Ｂ．２に記載のとおりに評価した。モデルは、種々の癌性細胞株から以下に記載されるとおりに作製した。
【０５７８】
（ｉ）細胞株
動物腫瘍モデルを作製するために使用された癌性細胞株は、以下の表３３に列挙されている。ヒトホルモン不応性前立腺癌細胞株（ＰＣ３、ＤＵ１４５）；ヒト膵臓癌細胞株（ＭＩＡＰＡＣＡ  ＩＩ、ＢＸＰＣ３）；ヒト乳癌細胞株（ＭＤＡ  ＭＢ  ２３１）；ヒト結腸癌細胞株（ＨＣＴ１１６、ＨＴ２９）およびヒト非小細胞肺癌細胞株（ＮＣＩ  Ｈ４６０）は、ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から購入した。Ｄｕｎｎｉｎｇラット前立腺癌細胞株（Ｍａｔ  ＬｙＬｕ）は、ＭｃＧｉｌｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｃｅｎｔｒｅ、Ｍｏｎｔｒｅａｌ、Ｑｕｅｂｅｃ、Ｈ３Ａ  １Ａ１  Ｃａｎａｄａの医薬、生理学および腫瘍学科から親切に寄付された。マウス胸部細胞株（４Ｔ１−ＧＦＰ）は、Ｓｉｄｎｅｙ  Ｋｉｍｍｅｌ癌センター（ＳＫＣＣ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から寄付された。ヒト膵臓癌細胞株、Ｃａｐａｎ−１  Ｈ２Ｂは、Ｓｉｄｎｅｙ  Ｋｉｍｍｅｌ癌センター（ＳＫＣＣ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から寄付された。
【０５７９】
ＰＣ３細胞は、２ｍＭ  Ｌ−グルタミンを含み、１．５ｇ／Ｌの炭酸水素ナトリウムを含むよう調整され１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＨａｍ’ｓ  Ｆ１２Ｋ培地（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．）で維持した。ＭＩＡ  ＰＡＣＡ  ＩＩ細胞は、１０％  ＦＢＳ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．）を含むダルベッコ改変イーグル培地で維持した。Ｍａｔ  ＬｙＬｕ細胞は、１０％  ＦＢＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミンおよび２５０ｎＭデキサメタゾンを含むＲＰＭＩ  １６４０で維持した。その他の細胞は、１０％  ＦＢＳを含むＲＰＭＩ  １６４０培地で維持した。ＰＣ３ヒト前立腺癌動物モデルは、上記の実施例８に記載のとおりに作製した。約４００〜８００ｍ３に達した腫瘍量を有する動物を選択し、次いで、ビヒクルまたはＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０（１０，０００Ｕ／マウス＝１５  ｍｇ／Ｋｇ）の静脈内注射によって治療した。
【０５８０】
（ｉｉ）動物腫瘍モデル
ＰＣ３およびＤｕ１４５ヒト前立腺異種移殖片モデル
ＰＣ３およびＤｕ１４５異種移殖片腫瘍モデルを、それぞれ、ＰＣ３およびＤｕ１４５細胞を使用して以下のとおりに作製した。腫瘍細胞を、約８０％コンフルエンシーでトリプシン処理し、回収し、ＨＢＳＳ（Ｈａｎｋ’ｓ平衡塩溶液、Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．）で１回洗浄し、氷上で、ＨＢＳＳ中、５０％  Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）に、２×１０７個細胞／ｍＬで再懸濁し、その後、動物に接種した。胸腺欠損雄ヌードマウスに、この細胞懸濁液０．０５ｍＬを用い、左下肢中、脛骨周囲に（脛骨骨膜に隣接して）筋肉内に（ＩＭ）接種した。動物中の腫瘍の容積が、４００〜５００ｍｍ３に達したと思われる時点で、Ｖｉｓｕａｌ  Ｓｏｎｉｃｓ超音波を使用し、２つの直交軸寸法を使用して実際の腫瘍量を決定した。
【０５８１】
動物を、各々３〜４匹の動物の２つの群に無作為にグループ化し、それぞれ、ビヒクル（ＡＰＩバッファー）およびＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０（１０，０００Ｕ／マウス＝約１５ｍｇ／Ｋｇ）の静脈内注射によって治療した。治療の２時間後に腫瘍組織を回収し、さらなる組織学的評価のために１０％中性緩衝ホルマリン溶液（ＮＢＦ）中で固定した。
【０５８２】
ＭＩＡＰＡＣＡ  ＩＩ、ＢＸＰＣ３（ヒト膵臓癌モデル）、ＨＣＴ１１６、ＨＴ２９（ヒト結腸癌モデル）およびＮＣＩ  Ｈ４６０（ヒト非小肺癌モデル）
ＭＩＡＰＡＣＡ  ＩＩ、ＢＸＰＣ３、ＨＣＴ１１６、ＨＴ２９およびＮＣＩ  Ｈ４６０異種移殖片腫瘍モデルを、それぞれ、ＭＩＡＰＡＣＡ  ＩＩ、ＢＸＰＣ３、ＨＣＴ１１６、ＨＴ２９およびＮＣＩ  Ｈ４６０細胞を使用して以下のとおりに作製した。腫瘍細胞を、約８０％コンフルエンシーでトリプシン処理し、回収し、ＨＢＳＳ（Ｈａｎｋ’ｓ平衡塩溶液、Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．）で１回洗浄し、氷上で、ＨＢＳＳに２×１０７個細胞／ｍＬで再懸濁し、その後、動物に接種した。胸腺欠損雌ヌードマウスに、この細胞懸濁液０．０５ｍＬを用い、左下肢中、脛骨周囲に（脛骨骨膜に隣接して）筋肉内に（ＩＭ）接種した。動物中の腫瘍の容積が、４００〜５００ｍｍ３に達したと思われる時点で、Ｖｉｓｕａｌ  Ｓｏｎｉｃｓ超音波を使用して実際の腫瘍量を決定した。動物を、各々３〜４匹の動物の２つの群に無作為にグループ化し、それぞれ、ビヒクル（ＡＰＩバッファー）およびＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０（１０，０００Ｕ／マウス＝約１５ｍｇ／Ｋｇ）の静脈内注射によって治療した。治療の２時間後に腫瘍組織を回収し、さらなる組織学的評価のために１０％中性緩衝ホルマリン溶液（ＮＢＦ）中で固定した。
【０５８３】
ＭＤＡ  ＭＢ２３１ヒト乳癌異種移殖片モデル
ＭＤＡ  ＭＢ２３１ヒト乳房腫瘍異種移殖片モデルを、ＭＤＡ  ＭＢ  ２３１細胞株を使用して以下のとおりに作製した。腫瘍細胞を、約８０％コンフルエンシーでトリプシン処理し、回収し、ＨＢＳＳ（Ｈａｎｋ’ｓ平衡塩溶液、Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．）で１回洗浄し、氷上で、ＨＢＳＳ中、５０％  Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）に、４×１０７個細胞／ｍＬで再懸濁し、その後、接種した。胸腺欠損雌ヌードマウスに、細胞−Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）懸濁液０．０５ｍＬを用い、乳房脂肪体中に同所的に接種した。不十分な腫瘍獲得のために、腫瘍組織移植を実施して、研究のためにより多くの腫瘍を有する動物を作製した。５００ｍｍ３を超える腫瘍量を有する動物を選択し、これらの動物から腫瘍を摘出し、滅菌培地ですすぎ、ブレードで１ｍｍ角に刻んだ。次いで、これらの腫瘍組織を外套針を使用して雌のヌードマウスの乳房脂肪体中に移植した。固形腫瘍塊の長さ（Ｌ）および幅（Ｗ）を、ノギスで週に２回測定し、腫瘍量（ＴＶ）を、（Ｌ×Ｗ２）／２として算出した。それらの腫瘍の容積が約１０００ｍｍ３に達した時点で、各々５匹のマウスの２つの群に動物を無作為に分け、２群の動物を、それぞれ、ビヒクルまたはＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０（３０００Ｕ／マウス＝約４．５ｍｇ／Ｋｇ）の静脈内注射によって治療した。治療の３日後に腫瘍組織を回収し、さらなる組織学的評価のために１０％中性緩衝ホルマリン溶液（ＮＢＦ）中で固定した。
【０５８４】
Ｃａｐａｎ−１ヒト膵臓腫瘍異種移殖片モデル
Ｃａｐａｎ−１ヒト膵臓異種移殖片腫瘍モデルを、Ｃａｐａｎ−１  ＨＢ２細胞株を使用して以下のとおりに作製した。腫瘍細胞を、約８０％コンフルエンシーでトリプシン処理し、回収し、ＨＢＳＳ（Ｈａｎｋ’ｓ平衡塩溶液、Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．）で１回洗浄し、氷上で、ＨＢＳＳ溶液に５×１０７個細胞／ｍＬで再懸濁し、その後、接種した。胸腺欠損雌ヌードマウスに、細胞懸濁液０．１ｍＬを用い、皮下に接種した。固形腫瘍塊の長さ（Ｌ）および幅（Ｗ）を、ノギスで週に２回測定し、腫瘍量（ＴＶ）を、（Ｌ×Ｗ２）／２として算出した。それらの腫瘍の容積が、およそ約５００〜７００ｍｍ３に達した時点で、動物を、各々３〜４匹のマウスの２つの群に無作為に分けた。これらの群の動物を、それぞれ、ビヒクル（ＡＰＩバッファー）およびＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０（５０００Ｕ／マウス＝約７．５ｍｇ／Ｋｇ）の静脈内注射によって治療した。治療の３日後に腫瘍組織を回収し、さらなる組織学的評価のために１０％中性緩衝ホルマリン溶液（ＮＢＦ）中で固定した。
【０５８５】
４Ｔ１−ＧＦＰ乳癌腫瘍モデル
４Ｔ１−ＧＦＰ乳癌モデルを、４Ｔ１−ＧＦＰ細胞株を使用して以下のとおりに作製した。４Ｔ１−ＧＦＰ腫瘍細胞を、約８０％コンフルエンシーでトリプシン処理し、回収し、ＨＢＳＳ（Ｈａｎｋ’ｓ平衡塩溶液、Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．）で１回洗浄し、氷上で、ＨＢＳＳに、２×１０６個細胞／ｍＬで再懸濁し、その後、接種した。雌Ｂａｌｂ／ｃマウスに、細胞懸濁液０．０５ｍＬを用い、乳房脂肪体中に同所的に接種した。固形腫瘍塊の長さ（Ｌ）および幅（Ｗ）を、ノギスで週に２回測定し、腫瘍量（ＴＶ）を、（Ｌ×Ｗ２）／２として算出した。それらの腫瘍の容積が約５００〜７００ｍｍ３に達した時点で、動物を、各々３〜４匹のマウスの２つの群に無作為に分け、これらの群をそれぞれ、ビヒクルおよびＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０（１０，０００Ｕ／マウス＝約１５ｍｇ／Ｋｇ）の静脈内注射によって治療した。治療の２時間後に腫瘍組織を回収し、さらなる組織学的評価のために１０％中性緩衝ホルマリン溶液（ＮＢＦ）中で固定した。
【０５８６】
Ｍａｔ  ＬｙＬｕラット前立腺腫瘍モデル
Ｍａｔ  ＬｙＬｕ腫瘍モデルを、Ｍａｔ  ＬｙＬｕ細胞株を使用して以下のとおりに作製した。腫瘍細胞を、約８０％コンフルエンシーでトリプシン処理し、回収し、ＨＢＳＳ（Ｈａｎｋ’ｓ平衡塩溶液、Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．）で１回洗浄し、氷上で、ＨＢＳＳに、１×１０６個細胞／ｍＬで再懸濁し、その後、接種した。胸腺欠損雄ヌードマウスに、ラットＭａｔ  ＬｙＬｕ前立腺癌細胞（総容量０．０４ｍＬ中、マウスあたり２×１０５個細胞）を用い、右脛骨骨膜に隣接して筋肉内に接種した。腫瘍量が４００〜５００ｍｍ３に達したと思われる時点で、ＶｉｓｕａｌＳｏｎｉｃｓ超音波を使用して実際の容積を決定した。動物を、各々３〜４匹の２群に無作為に入れ、これを、それぞれ、ビヒクルおよびＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０の静脈内注射によって治療した。治療の２時間後に腫瘍組織を回収し、さらなる組織学的評価のために１０％中性緩衝ホルマリン溶液（ＮＢＦ）中で固定した。
【０５８７】
（ｉｉｉ）免疫組織化学
各動物モデル（実施例１７Ａ（ｉｉ）、上記）から得た固定された腫瘍を、５μｍの切片に切断した。回収された腫瘍中のヒアルロナン（ＨＡ）の量を評価するために、ビオチン標識ヒアルロナン結合タンパク質（ＨＡＢＰ−ｂｉｏ）（Ｓｅｉｋａｇａｋｕ、Ｊａｐａｎ）を使用して切片を染色した。洗浄して一次試薬を除去した後、ＦＩＴＣ標識ストレプトアビジン（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ、Ｃａｎａｄａ）またはテキサスレッド標識ストレプトアビジン（４Ｔ１−ＧＦＰ腫瘍切片のための；Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ、Ｃａｎａｄａ）を、二次試薬として使用した。核を、ＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）試薬を使用して対比染色した。Ｉｎｓｉｇｈｔ  ＦｉｒｅＷｉｒｅデジタルカメラ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｍｉｃｈｉｇａｎ）と連動した  Ｎｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＴＥ２０００Ｕ顕微鏡によって顕微鏡写真を撮った。
【０５８８】
切片中のＨＡ発現を、＋＋＋（視野の８０％超における強い染色）から＋／−（薄い染色）、−（眼に見える染色なし）の範囲の採点システムを使用し、切片中（腫瘍領域および関連間質領域）の蛍光強度のレベルによって段階付けした。結果は、以下の表３３に示されている。表は、マウス異種移殖片モデルを作製するために使用された各細胞株の名称、腫瘍の種類および細胞株が単離された種を示す。ビヒクルおよびＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０を用いる治療後の各腫瘍種モデルのＨＡ発現の程度が示されている。結果は、すべてのＨＡ発現性腫瘍において、ＨＡ発現が、ＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０を用いる治療によって低下することを示す。表に示されるように、ＨＴ２９腫瘍切片およびＣａｐａｎ−１腫瘍切片（ビヒクルを用いて注射された動物から得た）は、ＰＥＧ化の前に、細胞周囲領域において陰性染色および間質において陽性染色を示した。
【０５８９】
【表３４】
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＊細胞周囲領域における陰性染色；間質における陽性染色
【０５９０】
Ｂ．例示的なＨＡが豊富な腫瘍におけるＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０による腫瘍ＨＡの用量依存性除去
１種の例示的なＨＡが豊富な（＋＋）腫瘍モデル、４Ｔ１−ＧＦＰ中の動物を、上記のように作製し、ビヒクルおよび種々の量（マウスあたり１０、１００、１，０００、３，０００および１０，０００酵素ユニット（Ｕ））のＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０を用いて治療した。この治療の投与の３日（７２時間）後、マウスから得た脛骨周囲腫瘍を回収し、中性緩衝ホルマリン中で固定した。腫瘍中のヒアルロナン（ＨＡ）のレベルを、上記の実施例１７Ａに記載のとおり免疫組織化学（ＩＨＣ）によって、二次としてアビジン−テキサスレッドを使用して評価した。腫瘍切片でヘマトキシリン／エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色も行った。結果は、１００、１，０００、３，０００および１０，０００ＵのＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０を用いて治療された動物から得た腫瘍切片におけるＨＡ染色の用量依存性低減を示した。１，０００、３，０００および１０，０００ＵのＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０を投与されている動物から得た切片では、眼に見える染色は観察されなかった。これらの結果は、ＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０の単回の全身投与は、乳房遠位腫瘍モデルにおいてヒアルロナンを少なくとも３日間低減させ得るということを示した。
【０５９１】
Ｃ．ＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０投与は、腫瘍成長を阻害し、ＨＡが豊富な腫瘍モデルにおいて生存を増大する
ＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０単独の反復投与が、複数の腫瘍モデル系において抗腫瘍効果をもたらすことを実証するために、先の実施例において列挙される細胞株を使用して作製した３種の異なるマウス腫瘍モデルにおいて腫瘍成長および生存を評価した。これらの研究では、２種の異なる前立腺癌モデル（ＰＣ３（上記の実施例１７Ａにおいて決定される、ＨＡ＋＋＋）およびＭａｔ  ＬｙＬｕ（上記の実施例１７Ａにおいて決定される、ＨＡ＋））および１種の乳癌モデル（４Ｔ１−ＧＦＰ（上記の実施例１７Ａにおいて決定される、ＨＡ＋＋）をＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０を用いて治療した。
【０５９２】
これらの研究のために、合計６群のマウス（それぞれ、１つの対照および各腫瘍モデルの実験群（群あたりｎ＝６〜８匹の動物）に、ＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０を用い、以下に記載されるように投薬し、腫瘍量および生存について評価した。各群について、治療前に腫瘍成長を測定し、次いで、ＶｉｓｕａｌＳｏｎｉｃｓイメージングマイクロ超音波システムを使用して治療の過程にわたってモニタリングした。以下に記載されるように、１５００ｍｍ３エンドポイント腫瘍量を瀕死状態と同等とみなすことによって、動物生存に対するＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０治療の効果を評価した。
【０５９３】
ＰＣ３ヒト前立腺癌モデルを、上記のように作製した。胸腺欠損雄ヌードマウスに、ヒトＰＣ３前立腺癌細胞（総容量０．０５ｍＬ中、マウスあたり１×１０６個細胞）を用い、右脛骨骨膜に隣接して筋肉内に播種して、高間質液圧を有する腫瘍を作製した。腫瘍を４００〜５００ｍｍ３の平均腫瘍量に増殖させ、その後、マウスあたり３，０００酵素ユニット（Ｕ）のＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０を用い、または対照ビヒクル（ＡＰＩ−バッファー）を用い静脈内治療を開始した。群あたりｎ＝７マウス。動物は、Ｑ３ｄｘ９スケジュール（３日毎に１回、合計９用量）で、０、３、６、９、１２、１５、１８、２１および２４日目に３日毎に治療した。
【０５９４】
上記のように、４Ｔ１−ＧＦＰ乳房腫瘍モデルは、ＢＡＬＢ／ｃ雌マウスに、４Ｔ１−ＧＦＰ乳癌細胞（総容量０．０５ｍＬ中、マウスあたり５×１０５個細胞）を用い、乳房脂肪体中に同所的に接種することによって作製した。腫瘍を１００ｍｍ３の平均腫瘍量に増殖させ、その後、静脈内治療を開始した。治療のために、ＡＰＩ−バッファー（対照群）を用い、またはマウスあたり３，０００酵素ユニット（Ｕ）のＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０を用い、１日おき（ＥＯＤ）に、合計６用量の間（Ｑ２ｄｘ６投薬計画）、０、２、４、７、９および１１日目に、マウスに注射した。群あたりｎ＝６〜８匹マウス。
【０５９５】
Ｍａｔ  ＬｙＬｕ前立腺腫瘍モデルのために、胸腺欠損雄ヌードマウスに、Ｍａｔ  ＬｙＬｕ前立腺癌細胞（総容量０．０４ｍＬ中、マウスあたり２×１０５個細胞）を用い、右脛骨骨膜に隣接して筋肉内に接種して、高間質液圧を有する腫瘍を作製した。腫瘍を１００ｍｍ３の平均腫瘍量に増殖させ、その後、治療を開始した。治療のために、ＡＰＩ−バッファー（対照群）を用い、または３０００ＵのＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０を用い、動物に静脈内に投薬した。群あたり、ｎ＝６〜８匹の動物。投薬は、１日おきに、週に３回、月曜、水曜および金曜に（Ｑ２ｄｘ６）、０、２、４、７、９および１１日目に投与した。しかし、対照群では、Ｍａｔ  ＬｙＬｕ腫瘍が、１１日目までに危機的容量または２，０００ｍｍ３超に達し、従って、人道的理由のために屠殺した。
【０５９６】
ＰＣ３腫瘍を有する動物の各群について、ＶｉｓｕａｌＳｏｎｉｃｓ（ＶＳ）イメージングマイクロ超音波システムを使用して腫瘍成長をモニタリングした。４Ｔ−１およびＭａｔ  ＬｙＬｕ−腫瘍を有する動物における腫瘍成長は、ノギスを用いて測定した。ノギスを用いる二次元直径測定によって、式０．４（ａ×ｂ２）（式中「ａ」は、大きな腫瘍直径であり、「ｂ」は、小さな垂直直径である）を使用して連続腫瘍量を得た。
【０５９７】
腫瘍量および生存を経時的に評価したこの研究の結果は、以下の節に論じられている。腫瘍量データは、以下の節（ｉ）に記載されており、表３３〜３６に、および図９の一番上のパネルに示されている。生存データは、節（ｉｉ）に記載されており、表３８に、および図９の一番下のパネルに示されている。
【０５９８】
（ｉ）腫瘍量効果
ＶＳ−超音波およびノギス腫瘍量は、ｍｍ３で表した。２群のＰＣ３腫瘍を有する動物（対照および３０００ＵのＰＥＧ−ｒＨｕＰＨ２０）について、−１、３、６、１０、１３、１７、２０、２４、２７、３１、３４、３８、４１および４５日目に測定値をとった。結果は、表３４に示されている。１５００ｍｍ３を超えて到達している腫瘍を有する動物は、以下に記載されるように人道的理由のために屠殺した。したがって、ＰＣ３モデルについて、１００％の動物がこの腫瘍重量に達したため、２７日目以後は測定を行わなかった。４Ｔ１−ＧＦＰを有する腫瘍の２群については、ノギス測定値は、０、２、４、７、９、１１、１４、１６、１８および２１日目にとった。結果は表３５に示されている。Ｍａｔ  Ｌｙ  Ｌｕを有する腫瘍の２群については、０、２、４、７および９日目にノギス測定値をとった。結果は表３６に示されている。
【０５９９】
【表３５】
2014041131.tif 000042
＊ＮＡ＝該当なし−すべての動物が、１５００ｍｍ３超の腫瘍量のために屠殺された
【０６００】
【表３６】
2014041131.tif 000043
【０６０１】
【表３７】
2014041131.tif 000044
【０６０２】
腫瘍量測定値によって示されるように、ＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０の反復された静脈内投与は、各モデルにおいて腫瘍成長を低減させ、上記の実施例１７Ａにおいて決定される腫瘍中のＨＡの量と相関を有する。例えば、各腫瘍モデルにおけるＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０治療された群および対照群間の腫瘍量における有意差（ＰＣ３前立腺癌モデルにおいて２７日目でｐ＝０．００１；４Ｔ１乳癌モデルにおいて１４日目でｐ＝０．０４；およびＭａｔ  ＬｙＬｕ前立腺癌モデルにおいて９日目でｐ＝０．０２）。
【０６０３】
それぞれの腫瘍モデル各々の腫瘍成長阻害（ＴＧＩ）パーセントを、以下の方程式を使用して算出した：
ＴＧＩ％＝［１−（Ｔｎ−Ｔ０）÷（Ｃｎ−Ｃ０）］×１００％
（式中、「Ｔｎ」は、ＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０の最終用量後の、「ｎ」日目（ここでは、それぞれＰＣ３、４Ｔ１およびＭａｔ  ＬｙＬｕモデルについて、２７日目、１４日目および９日目）の治療群の（ＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０を投与されている動物）の平均腫瘍量である；「Ｔ０」は、治療前の０日目のその治療群における平均腫瘍量である；「Ｃｎ」は、「ｎ」日目（ここでは、それぞれＰＣ３、４Ｔ１およびＭａｔ  ＬｙＬｕモデルについて、２７日目、１４日目および９日目）の対応する対照群の平均腫瘍量である；ビヒクルの最終用量後しばらく；および「Ｃ０」は、治療前の０日目の対照群における平均腫瘍量である）。それぞれの腫瘍モデルの腫瘍量までの時間（ＴＴＶ）は、１，５００ｍｍ３の腫瘍量に達する平均時間として算出した。
【０６０４】
【表３８】
2014041131.tif 000045
【０６０５】
表３７に示されるように、この研究の結果は、それぞれ、ＰＣ３前立腺、４Ｔ１乳房およびＭａｔ  ＬｙＬｕ前立腺腫瘍モデルにおいて全身ＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０投与による、７０％、６０％および３４％の腫瘍成長阻害（ＴＧＩ）を示した（それぞれ、投与後２７日目、１４日目および９日目）。
【０６０６】
図９に、および表３４〜３７に示されるように、腫瘍量に対する効果は、上記の実施例１７Ａにおいて決定された腫瘍ＨＡ発現のレベルと相関していた。例えば、ＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０によって、腫瘍中に最高の相対ＨＡ発現を有するモデル（ＰＣ３（ＨＡ＋＋＋）において腫瘍量は最も低減され（ＴＧＩ＝７０％）、腫瘍中に最低の相対ＨＡ発現を有するモデル（Ｍａｔ  ＬｙＬｕ（ＨＡ  ＋）において最小（ＴＧＩ＝３４％）であった。腫瘍量の低減は、上記の実施例１７Ａにおいて＋＋の相対ＨＡレベルを示した４Ｔ１−ＧＦＰモデルにおいて中間（ＴＧＩ＝６０％）であった。
【０６０７】
（ｉｉ）生存効果
全身の、反復されたＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０投与の、生存に対する効果を、各群において各時点で「生存している」動物のパーセンテージを決定することによって各モデルにおいて評価した。この研究のために、１５００ｍｍ３以上の腫瘍量を、瀕死（生存していない）状態と似ていると考えられるエンドポイントとして選択した。したがって、１５００ｍｍ３未満の腫瘍量を有する動物を、生存していると考え、一方で、１５００ｍｍ３以上の腫瘍重量を有する動物は、病的と考えた。
【０６０８】
種々のモデルでのＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０の反復投与による生存の効果は、図９（下のパネル）に示されている。図９（下のパネル）に示されるように、ＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０を用いる治療は、それぞれ、ＰＣ３、４Ｔ１−ＧＦＰおよびＭａｔ  ＬｙＬｕ腫瘍モデルにおいて、対照治療と比較して、指定された瀕死状態への到達において２倍、１．７倍および１．５倍の遅延をもたらした。したがって、生存に対する効果も、上記の実施例１７Ａにおいて測定される腫瘍中のＨＡの相対発現と相関していた。
【０６０９】
各群においてマウスが、指定された１５００ｍｍ３腫瘍量エンドポイントに達する前の平均期間として、各動物群の日数での生存期間中央値（ＭＳＴ）を決定した。ＩＬＳ（寿命の増大）パーセント、対照と比較したＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０による抗腫瘍活性の尺度を、以下の方程式を使用して算出した
ＩＬＳ％＝［（Ｔ−Ｃ）／Ｃ］×１００
（式中、「Ｔ」は、ＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０を用いて治療された群のＭＳＴであり、「Ｃ」は、対照群のＭＳＴである）。米国国立癌研究所（ＮＣＩ）判定基準によれば、２５％を超えるＩＬＳ％を有する治療が有効と考えられる。結果は、以下の表３８に要約されている。
【０６１０】
【表３９】
2014041131.tif 000046
ＮＡ＝該当なし
【０６１１】
上記の表３８に示されるように、ＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０を用いる全身治療は、それぞれ、ＰＣ３前立腺、４Ｔ１乳房およびＭａｔ  ＬｙＬｕ前立腺腫瘍モデルにおいて９７％、７３％および５６％の寿命の増大（ＩＬＳ）を引き起こし、やはり、上記の実施例１７Ａに記載される、測定された腫瘍中の相対ＨＡレベル（それぞれ、＋＋＋、＋＋および＋）と相関する。
【０６１２】
これらの結果は、反復された、ＰＥＧ化可溶性ヒアルロニダーゼ単独の全身投与は、いくつかのＨＡの豊富な腫瘍モデルにおいて抗癌治療として有効であるということ、および抗腫瘍効果の程度は、腫瘍中のＨＡの発現と相関することを示す。
【０６１３】
（ｉｉｉ）腫瘍中のＨＡの低減
さらに、腫瘍組織ヒアルロナンの免疫組織化学的検出のために最後のＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０または対照治療の後に腫瘍を採取した。この研究のために、ＰＣ−３腫瘍を、最後の治療の７２時間後（２０日目）に採取し、４Ｔ１−ＧＦＰ腫瘍を、最後の治療の７２時間後（１４日目）に採取し、Ｍａｔ  ＬｙＬｕ腫瘍を、最後の治療の２４時間後（１２日目）に採取した。採取した腫瘍は、中性緩衝ホルマリン（ＮＢＦ）中で固定し、５μｍの切片を切断し、ビオチン標識ヒアルロナン結合性タンパク質（ＨＡＢＰ−ｂｉｏ）（Ｓｅｉｋａｇａｋｕ、Ｊａｐａｎ）を使用して染色した。洗浄して一次試薬を除去した後、ＰＣ−３およびＭａｔ  ＬｙＬｕ腫瘍についてはＦＩＴＣ標識ストレプトアビジン（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ、Ｃａｎａｄａ）、またはテキサスレッド標識ストレプトアビジンを二次試薬として使用した。核を、ＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）試薬を使用して対比染色した。Ｉｎｓｉｇｈｔ  ＦｉｒｅＷｉｒｅデジタルカメラ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｍｉｃｈｉｇａｎ）と連動したＮｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＴＥ２０００Ｕ倒立蛍光顕微鏡または同一イメージングシステムを有するＺＥＩＳＳオーバーヘッド顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ，Ｉｎｃ．）によって顕微鏡写真を撮った。結果は、対照腫瘍において強いＨＡ染色を示したが、ＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０を用いて治療された動物から得た腫瘍では検出可能なヒアルロナン染色はなく、このことは、治療によって引き起こされる腫瘍ヒアルロナンの持続した低減を示す。
【実施例１８】
【０６１４】
ＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０の血液脳関門透過性および脳腫瘍モデルの治療
この研究は、ＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０は、動物モデルにおける脳腫瘍においてヒアルロン酸（ＨＡ）を低減し得、放射線療法と組み合わせて生存を増大し得ることを実証するために実施した。
【０６１５】
Ａ．脳腫瘍モデル
脳腫瘍モデルを作製するために、以下のように、種々の群で各マウスの定位固定フレームを用い、２μｌのＨａｎｋｓ培地中、４×１０４個のＰＣ３細胞を右大脳半球に注射した。
【０６１６】
Ｂ．静脈内に投与されたＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０による脳ＨＡの血液脳関門透過性および分解
この研究は、静脈内に投与されたＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０が、脳腫瘍においてＨＡを分解し得るということを実証するために実施した。上記の実施例１８Ａに記載される種々の群の脳腫瘍モデル動物に、３，０００酵素ユニット（Ｕ）ＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０および対照バッファー（ＡＰＩ）を静脈内に投与した。動物は、４時間後に屠殺した。続いて、脳を採取し、分析のために切片を作製した。
【０６１７】
腫瘍モデル動物における損なわれた血液脳関門（ＢＢＢ）の評価のために、動物のサブセットでＢＢＢ透過性アッセイを実施した。このアッセイのために、２％エバンスブルー色素０．１ｍＬを、これらのマウスの尾静脈中に静脈内注射し、１時間後屠殺した。脳切片を作製し、以下に記載されるように可視化した。脳切片中の青色色素は、エバンスブルーと複合体化しているアルブミン、大きな血清タンパク質（６７ｋＤａ）の存在を示し、このことは、ＢＢＢ透過性（ＢＢＢの相対的な「漏出しやすさ」）の増大を示す。
【０６１８】
治療後の脳腫瘍中のＨＡの量の評価のために、脳切片をビオチン標識ヒアルロナン結合性タンパク質（ＨＡＢＰ−ｂｉｏ）（Ｓｅｉｋａｇａｋｕ、Ｊａｐａｎ）とともにインキュベートした。洗浄して一次試薬を除去した後、二次試薬としてＦＩＴＣ標識ストレプトアビジン（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ、Ｃａｎａｄａ）を使用した。核を、ＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）試薬を使用して対比染色した。ヘマトキシリン／エオシン染色も行い、脳中の腫瘍を同定した。Ｉｎｓｉｇｈｔ  ＦｉｒｅＷｉｒｅデジタルカメラ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｍｉｃｈｉｇａｎ）と連動したＮｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＴＥ２０００Ｕ顕微鏡または同じ画像取得システムを有するＬｅｉｔｚオーバーヘッド顕微鏡によって顕微鏡写真を撮った。
【０６１９】
結果は、対照動物（ＡＰＩバッファー）における強いＨＡ染色を示したが、ＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０を用いて注射された動物では検出可能なＨＡ染色は示さず、これは、この酵素を使用して、静脈内に投与された場合に脳腫瘍中のＨＡを低減できるということを示した。
【０６２０】
Ｃ．ＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０治療後の動物の生存
ＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０単独を用いる治療後の脳腫瘍モデル動物の生存を評価するために、２０匹のＰＣ３脳腫瘍モデルマウス（上記の実施例１８Ａに記載される）を注射後１２日目に留めた。マウスに、５０００酵素ユニット（Ｕ）のＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０（１０匹のマウス）またはＡＰＩバッファー（１０匹の対照マウス）のいずれかを用い、１週間に２回４週間の間、尾静脈に注射した。
【０６２１】
動物の生存率を、動物の死亡をモニタリングすることによって経時的にモニタリングした。図１０に示される結果は、ＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０処理された動物および対照動物間の生存において有意な変化を示さなかった。
【０６２２】
Ｄ．放射線療法を組み合わせたＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０の生存に対する効果
放射線と組み合わせたＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０を用いる治療後の脳腫瘍モデル動物の生存を評価するために、３群のＰＣ３脳腫瘍モデルマウス（上記の実施例１８Ａに記載される）を使用した。
【０６２３】
この研究のために、２７匹の腫瘍を有するマウスを、接種後１３日目の体重に基づいて３群（Ａ、ＢおよびＣ）に段階分けした。各群のために、ＰＣ３細胞の接種後１３日目に投薬を開始した。各治療／対照は、ｑ３ｄ×４投与計画（３日毎、合計４回）を使用して投与した。各投与で、群Ａ，対照群は、１００μＬのＡＰＩバッファー単独の静脈内注射を投与された。群Ｂは、全脳照射（５Ｇｙ）を用いて治療された。群Ｃ、併用療法群は、５０００酵素ユニットのＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０（１００μＬのＡＰＩバッファー中）と、それに続く４時間後の全脳照射（３Ｇｙ）を用いて治療された。この投与計画は、以下の表３９に示されている。
【０６２４】
【表４０】
2014041131.tif 000047
＊放射線の４時間前に投与されるＰＥＧＰＨ２０
＊＊ＷＢＲ、全脳照射
【０６２５】
各群における動物の生存を、動物の死亡をモニタリングすることによって経時的にモニタリングした。図１１に、および表４０に示される結果は、併用療法（放射線およびＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０；群Ｃ）を用いて、対照（治療なし）を上回る生存の改善（最大４５％延長した生存）を示し、併用療法（放射線およびＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０；群Ｃ）を用いて、放射線単独（群Ｂ）を上回る生存の改善（最大１０％延長した生存）を示した。
【０６２６】
【表４１】
2014041131.tif 000048
【実施例１９】
【０６２７】
動物におけるＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０の薬物動態特性
薬剤の静脈内投与後いくつかの時点で血液サンプル中の血漿ヒアルロニダーゼを測定することによって、Ｈａｒｌａｎ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、Ｉｎｄｉａｎａ）から得たＩＣＲマウス、ラットおよびカニクイザルにおいて、ＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０（上記の実施例７に記載のとおりｍＰＥＧ−ＳＢＡ−３０Ｋを用いて製造された）の薬物動態特性を評価した。
【０６２８】
マウスでは、７０時間の期間にわたって研究を実施した。この研究の「時間０」で、各々１９〜２５グラムの体重のＨａｒｌａｎから得た雌のＩＣＲマウスに、０．５ｍｇ／ｍｌに希釈された約３０００Ｕの精製ＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０を用い、片側尾静脈を介して注射した。ほとんどの場合には、後の評価のために、治療の５分後、ガラス毛細血管によって後眼窩神経叢から血液を採取した。次いで、動物をそのケージに戻した。ＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０の投与後、種々の時点で、５％イソフランを用いて短時間麻酔されている動物から、ガラス毛細血管によって後眼窩神経叢から血液サンプルを採取した。各サンプルから得た血液を、凝固を防ぐために紫色のキャップのＭｉｃｒｏｔａｉｎｅｒ採血管中でＥＤＴＡと混合した。この管を、卓上遠心機で５０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、血漿を、新しいエッペンドルフ管に移した。血漿を−２０℃で凍結し、その後、アッセイしてヒアルロニダーゼ活性を決定した。
【０６２９】
種々の時点で血漿ヒアルロニダーゼ活性を決定するために、上記の実施例２に記載されるような標準マイクロ濁度プレートアッセイを血漿で実施し、血漿中のヒアルロニダーゼ活性の量を測定した。マウスでは少ない総血液容積のために、研究の過程にわたって、動物あたり２または３回の採血しか実施しなかった。したがって、全経時的推移にわたって複数の動物に薬物動態曲線をフィッティングさせた。ＰＫ曲線フィッティングは、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（登録商標）（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｉｎｃ．、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）ソフトウェアまたはＷｉｎＮｏｎＬｉｎソフトウェア（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ（登録商標）Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）のいずれかを使用して行った。
【０６３０】
同様の研究を、ラットおよびカニクイザルで実施した。ラットでは、９６時間の期間にわたって研究を実施した。マウスについて上記で記載されたものと同様の研究では、ラットに１２５，０００Ｕ／ｋｇ（約４ｍｇ／ｋｇ）のＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０を投与した。種々の時点で、上記の実施例２に記載されるような標準マイクロ濁度プレートアッセイを使用して血漿ヒアルロニダーゼ活性をモニタリングした。時点あたり、３匹のラットを評価した。カニクイザルでは、ＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０が、０．５、２．０および６．０ｍｇ／ｋｇの段階的に増大する用量で２匹の雌ザルに投与されるＭＰＩ２８日静脈内用量研究を実施した。サルすべてのＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０を排除させ、その後、その後の投薬を行った。上記の実施例２に記載されるような標準マイクロ濁度プレートアッセイを使用して、９６時間にわたって種々の時点で血漿ヒアルロニダーゼ活性をモニタリングした。マウス、ラットおよびカニクイザルのＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０の静脈内用量比較が、表４１に示されている。
【０６３１】
【表４２】
2014041131.tif 000049
【０６３２】
薬物動態回帰曲線を、導かれたデータにフィッティングし、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（登録商標）（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｉｎｃ．、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡで、以下の方程式を使用して血漿半減期（Ｔ１／２）を決定した。
【０６３３】
血漿半減期は、非線形回帰のためのＰｒｉｓｍソフトウェアを使用して決定した。静脈内注射後の半減期曲線フィッティングのための標準化した式は以下のとおりである：
Ｃｐ  ＝  Ｃ０  ｅｘｐ（−ｋｅｌ）ｔ
（式中、ｋｅｌ  ＝０．６９３／Ｔ１／２
ｔ＝被験物質投与後の時間
Ｃ０  は、理論上の出発値であり、
Ｃｐ  は、時間ｔでの測定値である）。
【０６３４】
以下の方程式を使用した：
一成分指数関数的減衰：
Ｙ＝スパン１＊ｅｘｐ（−ｋｅｌＸ）＋プラトー；
（式中、ｋｅｌは、０．６９３／Ｔ１／２  に相当する崩壊率定数であり、プラトーは、崩壊が無限に近づくときの漸近値である）。
二成分指数関数的減衰：
Ｙ＝スパン１＊ｅｘｐ（−ｋ１ｅｌＸ）＋スパン２＊ｅｘｐ（−ｋ２ｅｌＸ）＋プラトー；
（式中、ｋ１ｅｌおよびｋ２ｅｌは、スパン１およびスパン２それぞれの崩壊率定数であり、プラトーは、崩壊が無限に近づくときの漸近値である）。
【０６３５】
濃度−時間データの２コンパートメントモデリングによって導かれた上記の研究の結果が、以下の表４２に示されており、ここで、ＰＫパラメータの説明は、表４３に示されており、Ｔ１／２αは、分布相半減期であり、Ｔ１／２βは、排出相半減期であり、ＭＲＴは、平均滞留時間である。マウスでは、血漿中の酵素のα相（分布相）半減期およびβ相（排出相）半減期は、それぞれ、０．６９６時間および１９．２３時間であった。マウスにおける結果は、図１２に示されており、ここで、血漿ヒアルロニダーゼの初期の迅速な分解（分布相）、続いて、経時的な遅い段階的な減衰（排出相）が観察された。ラットでは、血漿中の酵素のα相（分布相）半減期およびβ相（排出相）半減期は、それぞれ、１．１３時間および７．４８時間であった。カニクイザルでは、血漿中の酵素のα相（分布相）半減期およびβ相（排出相）半減期は、それぞれ、１．１３時間および２１．７５時間であった。
【０６３６】
【表４３】
2014041131.tif 000050
【０６３７】
【表４４】
2014041131.tif 000051
【実施例２０】
【０６３８】
ＰＥＧＰＨ２０の単回用量静脈内投与後の血漿ヒアルロニダーゼレベルの薬物動態分析
ＰＥＧＰＨ２０の単回用量投与後に、Ｈａｒｌａｎ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、Ｉｎｄｉａｎａ）から得たＩＣＲマウスで、またスプラーグ−ドーリーラット（Ｈａｒｌａｎ）で、薬物動態（ＰＫ）研究を実施した。以下に記載されるようにＰＥＧＰＨ２０の注射後、実施例２記載されるような改変した比濁（ｔｕｒｂｉｄｏｍｅｔｒｉｃ）アッセイを使用して、ヒアルロニダーゼ活性を測定することによってＰＥＧＰＨ２０の血漿レベルを決定した。手短には、ヒアルロニダーゼを含有する血漿サンプルをヒアルロネート（ＨＡ）とともに６０分間インキュベートした。酸性化血清の添加で、未消化のＨＡを沈殿させた。３０分の発生期間の後、得られたサンプルの濁度を６４０ｎｍで測定し、得られた濁度は、存在するヒアルロニダーゼ活性の尺度であった。アッセイは、血漿中の、通常、酸性ｐＨで活性を示す内因性リソソームヒアルロニダーゼ活性を抑制するｐＨ条件下で実施した。ＰＥＧＰＨ２０濃度は、較正曲線から補間されるようなヒアルロニダーゼ活性のユニット（Ｕ）／ｍＬとして、またはＰＥＧＰＨ２０ロットの比活性（Ｕ／ｍｇで）を使用して算出されたμｇ／ｍＬとして表した。通常、ラットについては、低レベルの定量化は、１０Ｕ／ｍＬであり、アッセイは、最大１００Ｕ／ｍＬのヒアルロニダーゼ活性を測定することに適用できる。
【０６３９】
Ａ．マウス
雄のＩＣＲマウス（３匹／群）に、ＰＥＧＰＨ２０の単回ＩＶ用量（１２５，０００Ｕ／ｋｇ；３．３ｍｇ／ｋｇ）を投与し、用量後、５分から２４時間の選択された間隔で血漿サンプルを採取した。上記のように、血漿サンプルを、ヒアルロニダーゼ活性について分析した。結果は、ＩＶ注射後、ＰＥＧＰＨ２０の血漿濃度は、二相性に低下することを示す。初期の迅速な減少は、全身循環からの分布を表し、排出相を表す遅い減少が続いた。経時的なヒアルロニダーゼ活性の非コンパートメント解析から導かれた薬物動態パラメータは、表４４に示されている。値は、非コンパートメント解析を使用して３匹のマウスから得た平均データである。このデータは、ＰＥＧＰＨ２０の消失半減期（ｔ1/2λｚ）は、約１０時間であったことを示す。平均分布容積（Ｖｚ）は、約１２２ｍＬ／ｋｇであり、これは、マウスにおいて予想された血漿容量（すなわち、５０ｍＬ／ｋｇ；Ｄａｖｉｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｒｒｉｓ  １９９３）の約２倍であり、このことは、ＰＥＧＰＨ２０は、末梢組織まで広くは分布されなかったということを示唆する。
【０６４０】
【表４５】
2014041131.tif 000052
ＰＫ＝薬物動態；Ｕ＝酵素活性の単位；ＩＶ＝静脈内に；Ｃ０＝時間０に逆推定された血漿濃度；Ｃｍａｘ＝最大の観察された血漿濃度；ｔ１／２  λｚ＝終末相半減期；ＡＵＣ０−∞＝時間０から推定される無限への血漿濃度対時間曲線下の面積；Ｖｚ＝分布容積；Ｖｓｓ＝定常状態での分布容積；ＣＬ＝完全クリアランス；ＭＲＴ＝平均滞留時間
【０６４１】
Ｂ．ラット
雄のスプラーグ−ドーリーラット（３匹／群）に、ＰＥＧＰＨ２０の単回ＩＶ用量（１２５，０００Ｕ／ｋｇ；３ｍｇ／ｋｇ）を投与し、用量後５分〜９６時間の選択した間隔で血漿サンプルを採取した。上記のように、ヒアルロニダーゼ活性について、血漿サンプルを分析した。結果は、ＩＶ注射後、ＰＥＧＰＨ２０の血漿濃度は二相性に低下したことを示す。初期の迅速な低下は、全身循環からの分布を表し、排出相を表す遅い減少が続いた。経時的なヒアルロニダーゼ活性の非コンパートメント解析から導かれた薬物動態パラメータは、表４５に示されている。値は、非コンパートメント解析を使用して３匹のラットから得た平均データである。このデータは、ＰＥＧＰＨ２０の消失半減期（ｔ1/2λｚ）は、約８時間であり、マウスにおいて見られたものよりも迅速であったことを示す。これはまた、マウスにおいて観察されたものよりも短い平均滞留時間（ＭＲＴ）および速い完全クリアランス（ＣＬ）にも反映された。平均分布容積（Ｖｚ）は、約２９６ｍＬ／ｋｇであり、これは、ラットにおいて予想された血漿容量（すなわち、３１ｍＬ／ｋｇ；Ｄａｖｉｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｒｒｉｓ  １９９３）よりも多く、ラットにおいて予想された細胞外液容量に近似する（すなわち、２９７  ｍＬ／ｋｇ；Ｄａｖｉｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｒｒｉｓ  １９９３）。
【０６４２】
【表４６】
2014041131.tif 000053
ＰＫ＝薬物動態；Ｕ＝酵素活性の単位；ＩＶ＝静脈内に；Ｃ０＝時間０に逆推定された血漿濃度；Ｃｍａｘ＝最大の観察された血漿濃度；ｔ１／２  λｚ＝終末相半減期；ＡＵＣ０−∞＝時間０から推定される無限への血漿濃度対時間曲線下の面積；Ｖｚ＝分布容積；Ｖｓｓ＝定常状態での分布容積；ＣＬ＝完全クリアランス；ＭＲＴ＝平均滞留時間
【０６４３】
Ｃ．概要
マウスおよびラットにおける単回静脈内用量研究では、血漿ヒアルロニダーゼ活性は二相性に低下し、迅速な初期分布相および遅い排出相を有していた。平均排出半減期（ｔ1/2）は、マウスでは約１０時間であり、ラットでは、８時間であった。平均分布容積（Ｖｚ）は、マウスについては１２２ｍＬ／ｋｇであり、このことは、ＰＥＧＰＨ２０は、マウスでは末梢組織まで広くは分布されなかったということを示唆する。ラットでは、平均Ｖｚは、２９６ｍＬ／ｋｇで高かった。
【実施例２１】
【０６４４】
カニクイザルにおける単回静脈内用量投与後のＰＥＧＰＨ２０の用量範囲および薬物動態研究
カニクイザルにおいて、種々の用量範囲で単回用量投与後の薬物動態（ＰＫ）研究を実施した。以下に記載されるように、ＰＥＧＰＨ２０の注射後、実施例２０記載されるような改変した比濁アッセイを使用して、ヒアルロニダーゼ活性を測定することによってＰＥＧＰＨ２０の血漿レベルを決定した。ラットと同様に、低レベルの定量化は、１０Ｕ／ｍＬであり、アッセイは、最大１００Ｕ／ｍＬのヒアルロニダーゼ活性を測定することに適用できる。
【０６４５】
雄のカニクイザル（１〜５匹／群）に、１ｍｇ／ｋｇ（３８，０００Ｕ／ｋｇ）、３ｍｇ／ｋｇ（１１４，０００Ｕ／ｋｇ）、６ｍｇ／ｋｇ（２２８，０００Ｕ／ｋｇ）、１２．５ｍｇ／ｋｇ（４１２，５００Ｕ／ｋｇ）および３３ｍｇ／ｋｇ（１，０８９，０００Ｕ／ｋｇ）の範囲の濃度でＰＥＧＰＨ２０の単回ＩＶ用量を投与し、用量後０．５〜７２時間の選択された間隔で血漿サンプルを採取した。血漿サンプルを、ヒアルロニダーゼ活性について上記のように分析した。結果は、血漿濃度の低下は、用量後０．５時間の最初のＰＫ血液採取時間について迅速な分布相が獲得されなかったので単相性であったということを示す。経時的なヒアルロニダーゼ活性の非コンパートメント解析から導かれた薬物動態パラメータが、表４６に示されている。値は、表に示されるような非コンパートメント解析を使用して１〜５匹のサルから得た平均データである。
【０６４６】
このデータは、ＰＥＧＰＨ２０の消失半減期（ｔ1/2λｚ）が、３９〜５３時間（１．６〜２．２日）の範囲であったことを示す。長い半減期は、約１．０ｍＬ／ｈ  ｋｇの遅い全身クリアランスに起因した。ＩＶ注射の直後の時間への逆推定によって決定されるような最大血漿濃度［Ｃ０］、終末相排出速度ｋλｚおよび完全クリアランス（ＣＬ）は、分布容積の推定（Ｖｚ）を提供した。平均Ｖｚの範囲は、７０〜９３ｍＬ／ｋｇであり、これは、サルにおいて予想された血漿容量（すなわち、４５ｍＬ／ｋｇ；Ｄａｖｉｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｒｒｉｓ  １９９３）の約２倍あり、これは、ＰＥＧＰＨ２０は末梢組織まで広くは分布されなかったということを示唆した。
【０６４７】
血漿濃度−時間曲線下の面積、推定された最大濃度［Ｃ０］および観察されたＣｍａｘを使用して用量線形性を調べた。対数変換したＰＫパラメータの、対数変換したＩＶ用量との相関は、１．０に等しい傾きを有する直線関係を示し、このことは、サルにおけるＰＥＧＰＨ２０のＰＫは、用量に対して直線であるということを示唆した。全身曝露および観察された最大血漿濃度は、用量の増大とともに比例的に増大した。
【０６４８】
【表４７】
2014041131.tif 000054
ＰＫ＝薬物動態；Ｕ＝酵素活性の単位；ＩＶ＝静脈内に；Ｃ０＝時間０に逆推定された血漿濃度；Ｃｍａｘ＝最大の観察された血漿濃度；ｔ１／２  λｚ＝終末相半減期；ＡＵＣ０−∞＝時間０から推定される無限への血漿濃度対時間曲線下の面積；Ｖｚ＝分布容積；Ｖｓｓ＝定常状態での分布容積；ＣＬ＝完全クリアランス；ＭＲＴ＝平均滞留時間
【０６４９】
概要
サルにおける単回静脈内用量研究では、血漿ヒアルロニダーゼ活性は、二相性に低下し、迅速な初期分布相および遅い排出相を有していた。平均排出半減期（ｔ1/2）は、サルでは約４０〜５３時間であった。平均分布容積（Ｖｚ）は、サルについては７０〜９３ｍＬ／ｋｇであり、このことは、ＰＥＧＰＨ２０は、末梢組織まで広くは分布されなかったということを示唆する。ＰＥＧＰＨ２０のいくつかの用量レベルを評価するサル研究では、最大の観察された血漿濃度（Ｃｍａｘ）および血漿濃度対時間の曲線下面積（ＡＵＣ）は、ＰＥＧＰＨ２０用量の増大につれて直線的に増大した。
【実施例２２】
【０６５０】
反復された用量
ＰＥＧＰＨ２０の反復用量投与後に、スプラーグ−ドーリーラット（Ｈａｒｌａｎ）およびカニクイザルにおいて、薬物動態（ＰＫ）および／または毒性学（ＴＫ）研究を実施した。実施例２０に記載のとおりに血漿ヒアルロニダーゼレベルを決定した。
【０６５１】
Ａ．ラット
ＰＥＧＰＨ２０のＩＶ投与後に、スプラーグ−ドーリーラットにおいて４週間の反復用量毒性研究を実施した。３ラット／性別／群の４群に、ビヒクル（１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．０＋１３０ｍＭ  ＮａＣｌ）または０．５、５もしくは２５ｍｇ／ｋｇのＰＥＧＰＨ２０の週に２回の用量をそれぞれ、４連続週間、静脈内に投与した。１日目および２５日目に、投与後所定の時間で各動物から血液サンプルを採取した。血漿サンプルを、実施例２０に記載されるようにヒアルロニダーゼ活性について分析した。各ＩＶ用量の毒物動態学パラメータは、血漿濃度対時間データの非コンパートメントモデリングを使用して導いた。導かれたＴＫパラメータは、表４７に示されている。ＰＥＧＰＨ２０の週に２回のＩＶ用量投与後の血漿濃度対時間の分析によって、曝露（ＣｍａｘおよびＡＵＣ）は、ＰＥＧＰＨ２０用量の増大につれて増大するということが示された。薬物動態学は、評価された用量の範囲にわたってほぼ直線であった。消失半減期（ｔ1/2）は、ＰＥＧＰＨ２０用量の増大につれて増大した。曝露は、概して、任意の所与の用量レベルおよび投薬日について性別間で同様であった。ＰＥＧＰＨ２０の反復されたＩＶ投薬後、５ｍｇ／ｋｇおよび２５ｍｇ／ｋｇ用量群において、１日目と比較して、２５日目にＡＵＣの増大に向かう傾向があった。しかし、２５日目ＡＵＣ曝露は、任意の所与の用量群内で、１日目に観察された曝露の＜２倍のままであった。Ｃｍａｘによって決定される曝露は、概して、任意の所与の用量群内で１日目から２５日目まで一貫したままであった。
【０６５２】
【表４８】
2014041131.tif 000055
ＴＫ＝毒物動態学；ＩＶ＝静脈内に；Ｕ＝酵素活性の単位；Ｃｍａｘ＝最大の観察された血漿濃度；ｔ１／２＝消失半減期；ＡＵＣ０−ｔ＝時間０から最後に測定した時点の血漿濃度対時間曲線下面積
【０６５３】
週に２回のＩＶ投与は、ラットにおいて耐容性良好であった。体重の一時的な減少があり、これは、投薬期間（ｐｅｒｉｏ）の最後までに研究前の値に向かって戻った。この効果は、細胞外ヒアルロナンおよびその結合している水の減少のようなＰＥＧＰＨ２０薬理学に起因する。プロトロンビン時間は変更されなかったが、活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）の中程度の延長があった。調べられた任意の組織において、剖検で、または顕微鏡によって、激しく行われた出血は観察されなかった。したがって、ＡＰＴＴ延長は、ラットにおける有害事象であったという評価のために、最大無毒性量（ＮＯＡＥＬ）は、ラットでは５ｍｇ／ｋｇ／用量として規定された。摂餌量または挙動に変化は観察されなかった。その他の被験物質関連知見が観察されなかったので、観察された延長されたＡＰＴＴを除いて、２５ｍｇ／ｋｇ／用量が、指定されたＮＯＡＥＬであるだろう。
【０６５４】
Ｂ．サル
１．反復用量毒性研究
雌のカニクイザル（Ｎ＝３）に、研究日１、３、８、１１、１５、２２、２５および２９に６ｍｇ／ｋｇ（１９８，０００〜２２２，０００Ｕ／ｋｇ）のＩＶ用量のＰＥＧＰＨ２０を投与した。血漿サンプルを、用量後０．０８３〜９６時間の選択された間隔で、１、３、８、１１および２５日目に採取した。血漿サンプルを、実施例２０に記載されるようなマイクロ濁度プレートアッセイを使用してヒアルロニダーゼ活性について分析した。各ＩＶ用量の毒物動態学パラメータは、血漿濃度対時間データの非コンパートメントモデリングを使用して導いた。各用量は、それまでの連続用量とは独立にモデリングした。結果は、表４８に示されている。雌のサルへのＰＥＧＰＨ２０の反復ＩＶ用量投与後の血漿濃度対時間データのＴＫ分析は、６ｍｇ／ｋｇ（約２１０，０００Ｕ／ｋｇ）の用量のＰＥＧＰＨ２０のＩＶ注射後の血漿濃度の低下が二相性であることを示した。時間とともに、濃度の迅速な初期低下と、それに続く、濃度の遅い低下があった。分布容積（Ｖｚ）の推定は、ＰＥＧＰＨ２０は、末梢組織まで広くは分布されなかったということを示唆した。ＰＥＧＰＨ２０の全身クリアランスは、遅く、研究日１、３、８および１１に決定されたような０．９〜１．６ｍＬ／ｈ−ｋｇの範囲の平均速度を有していた。遅いクリアランスは、長い消失半減期（ｔ1/2λｚ）の一因であった。ＰＥＧＰＨ２０の観察された平均消失半減期（ｔ1/2λｚ）は、２８〜６４時間（１．２〜２．７日）の範囲であった。研究日２５日に、３匹のうち２匹の動物において、ＰＥＧＰＨ２０の加速されたクリアランスが観察された。研究日２５に採取された血漿サンプルを、再アッセイして、ＰＥＧＰＨ２０濃度を確認し、平均濃度を報告した。
【０６５５】
【表４９−１】
2014041131.tif 000056
【表４９−２】
2014041131.tif 000057
ＴＫ＝毒物動態学；ＩＶ＝静脈内に；Ｕ＝酵素活性の単位；Ｃ０＝時間０に逆推定された血漿濃度；ＮＤ＝決定されず；Ｃｍａｘ＝最大の観察された血漿濃度；ｔ１／２  λｚ＝終末相半減期；ＡＵＣ０−∞＝時間０から推定される無限への血漿濃度対時間曲線下の面積；Ｖｚ＝分布容積；Ｖｓｓ＝定常状態での分布容積；ＣＬ＝完全クリアランス；ＭＲＴ＝平均滞留時間
【０６５６】
２．４週間の反復静脈内用量毒性研究
ＰＥＧＰＨ２０のＩＶ投与後、カニクイザルにおいて、４週間の反復用量毒性研究を実施した。４群のサル（性別あたり４匹であった０．２  ｍｇ／ｋｇ／用量のＰＥＧＰＨ２０を投与された群を除いて、性別あたり６匹の動物）に、それぞれ、ビヒクル、０．２、２．０または１０．５ｍｇ／ｋｇ／用量のＰＥＧＰＨ２０の用量を１週間に２回、４連続週間ＩＶ投与した。用量前、および用量後０．５、１、２、４、８、１２、２４、４８および７２時間で、１日目および２５日目に各動物から血液サンプルを採取した。用量前、および用量後２分で、４、８、１１、１５、１８および２２日目に、さらなる血液サンプルを採取した。血漿サンプルを、実施例２０に記載される比濁アッセイを使用してヒアルロニダーゼ活性について分析した。毒物動態学パラメータは、血漿濃度対時間データの非コンパートメントモデリングを使用して各ＩＶ用量について導いた。結果は、表４９に示されている。４連続週間のサルへのＰＥＧＰＨ２０の週に２回のＩＶ用量投与後の血漿濃度対時間データのＴＫ分析によって、曝露（ＣｍａｘおよびＡＵＣ）は、ＰＥＧＰＨ２０用量の増大につれて増大するということが示された。薬物動態学は、評価された用量の範囲にわたってほぼ直線であった。消失半減期（ｔ1/2）は、ＰＥＧＰＨ２０用量の増大につれて増大した。反復投与時に、ｔ1/2は、低用量および中用量の雄において低下した。低用量の曝露データも、反復投与で曝露が失われた動物を示した。曝露は、概して、任意の所与の用量レベルおよび投薬日について性別間で同様であった。ＰＥＧＰＨ２０の反復されたＩＶ投薬後、２ｍｇ／ｋｇおよび１０．５ｍｇ／ｋｇ用量群において、１日目と比較して２５日目にＣｍａｘおよびＡＵＣの増大に向かう傾向があった。しかし、２５日目ＡＵＣ曝露は、任意の所与の用量群内で、１日目に観察された曝露の＜２倍のままであった。ＰＥＧＰＨ２０の曝露の喪失は、０．２ｍｇ／ｋｇ群において、研究日２５の８匹の動物のうち３匹で観察された。
【０６５７】
【表５０】
2014041131.tif 000058
ＴＫ＝毒物動態学；ＩＶ＝静脈内に；Ｕ＝酵素活性の単位；Ｃｍａｘ＝最大の観察された血漿濃度；ｔ１／２＝消失半減期；ＡＵＣ０−ｔ＝時間０から最後に測定した時点の血漿濃度対時間曲線下の面積
【０６５８】
週に２回のＩＶ投与は、サルにおいて耐容性良好であった。ラット同様、体重の一時的な減少があり、これは、投薬期間の最後までに研究前の値に向かって戻った。ラットとは異なり、ＡＰＴＴの延長はなく、血液凝固パラメータの唯一の変化は、血漿フィブリノゲンの一時的な、用量依存的な増大に限定され、これは、ＰＥＧＰＨ２０投与に対する一時的な急性期応答と一致する。サルでは肢関節における変化が観察され、膝および肘において可動域が用量に関連して低下し、これは、投薬の休止後、部分的から完全な回復を示した。また、放射線検査によって観察される、単回高用量動物における軟組織量（骨格筋）の中程度の減少があった。これは、組織からヒアルロナンおよびその結合している細胞外水を除去する、ＰＥＧＰＨ２０の薬理学的効果と一致する。膝関節また骨格筋の関連する病理組織学的変化も、膝関節自体の異常なＸ線撮影知見もなかった。摂餌量または挙動の変化も観察されなかった。被験物質関連知見が観察されなかったので、１０．５ｍｇ／ｋｇ／用量の高用量が、指定されたＮＯＡＥＬサルであった。
【０６５９】
Ｃ．概要
６ｍｇ／ｋｇ（約２１０，０００Ｕ／ｋｇ）用量のＰＥＧＰＨ２０が、２９日の期間にわたって８回投与される、サルにおける反復ＩＶ用量では、曝露（平均ＣｍａｘおよびＡＵＣ値によって評価されるような）は、研究期間にわたって同様であった。ＰＥＧＰＨ２０の全身クリアランス（ＣＬ）は遅く、０．９〜１．６ｍＬ／ｈ  ｋｇの平均速度を有していた。遅いクリアランスは、長い消失半減期の一因であり、これは、２８〜６４時間（１．２〜２．７日）の範囲であった。
【０６６０】
動物にＰＥＧＰＨ２０をさまざまな用量で週に２回、４連続週間の間投与したラットおよびサルにおける毒性学研究は、曝露（ＣｍａｘおよびＡＵＣ値）は、用量の増大につれて直線的に増大し、消失半減期は用量の増大につれて増大することを示した。ラットにおける消失半減期の平均値は、約３時間（０．５ｍｇ／ｋｇ用量）〜２４時間（２５ｍｇ／ｋｇ用量）の範囲であり、サルでは、１７時間（０．２ｍｇ／ｋｇ用量）〜７８時間（１０．５ｍｇ／ｋｇ用量）の範囲であった。両種において、曝露は、概して、任意の所与の用量レベルおよび投薬日について性別間で同様であった。しかし、曝露の喪失が、０．２ｍｇ／ｋｇ群において、２５日目の８匹の動物のうち３匹で観察された。ラットでは、５ｍｇ／ｋｇおよび２５ｍｇ／ｋｇ用量群において、１日目と比較して２５日目に、ＡＵＣの増大に向かう傾向があったが、それにもかかわらず、２５日目ＡＵＣ曝露は、任意の所与の用量群内で、１日目に観察された曝露の＜２倍のままであった。ラットでは、Ｃｍａｘによって決定される曝露は、概して、任意の所与の用量群内で１日目から２５日目まで一貫したままであった。サルでは、２ｍｇ／ｋｇおよび１０．５ｍｇ／ｋｇ用量群において、１日目と比較して２５日目にＣｍａｘおよびＡＵＣの増大に向かう傾向があった。ラットと同様に、サルにおける２５日目ＡＵＣ曝露は、任意の所与の用量群内で、１日目に観察された曝露の＜２倍のままであった。
【実施例２３】
【０６６１】
非比例的スケーリングモデル
実施例２０に記載される、マウス、ラットおよびサルにおける単回用量静脈内薬物動態研究は、主として血管系内に保持される巨大分子に適用できる非比例的スケーリングモデルの基礎を築き、これを使用して、ヒトにおけるＰＥＧＰＨ２０の薬理学的に活性な用量（ＰＡＤ）および投薬頻度を推定した。ＰＥＧＰＨ２０の巨大分子の大きさのために（分子量は、１００から２７０ｋＤａの間であると推定される）、小分子に使用される従来の種間スケーリング係数技術は、血管内コンパートメントに限定される分子には適用できない。
【０６６２】
マウス、ラットおよびサルにおいて観察されたＰＫパラメータから、パラメータを動物の体表面積に対して、また動物の体重に対して非比例的に拡大することによって非比例的モデリングを実施した。導かれた種間非比例的関係を使用して、ヒトの主要ＰＫパラメータを算出／予測した。算出されたパラメータは、全身クリアランス（ＣＬ）、末梢クリアランス（ＣＬ２）、中枢コンパートメントの容量（Ｖ１）、末梢コンパートメントの容量（Ｖ２）、中枢コンパートメントからの排出速度定数（ｋ１０）および中枢および末梢コンパートメント間の分布速度定数（ｋ１２およびｋ２１）であった。ＩＶ用量の増大に伴う全身曝露の比例的増大を仮定して、ヒトにおけるＰＥＧＰＨ２０の濃度−時間プロフィールを、１５００、３，０００、６，０００、１２，０００、２４，０００および４８，０００Ｕ／ｋｇのＩＶ用量レベルについて２コンパートメントモデルを用いてシミュレートした。月曜−木曜または月曜−金曜スケジュールの週に２回（ＢＩＷ）の用量投与を調べ、≧１，５００Ｕ／ｋｇ（５０μｇ／ｋｇ）の臨床用量および月曜−木曜ＢＩＷ用量スケジュールは、≧１０Ｕ／ｍＬの薬理学的に有効な濃度を上回る閾値血漿濃度（Ｃｔｒｏｕｇｈ）を維持すると予測されるということを実証した。
【０６６３】
０．０５  ｍｇ／ｋｇのヒト用量は、ラットにおいて５ｍｇ／ｋｇ用量レベルがＮＯＡＥＬとして定義された場合のげっ歯類の従来の１／１０安全係数と一致する。サル研究における最低用量は、０．２ｍｇ／ｋｇであり、最高用量は、１０．５ｍｇ／ｋｇであった。これら２種の用量レベルをそれぞれとり、有害事象と関連していることに注目して、０．０５ｍｇ／ｋｇのヒト用量は、霊長類に投与される用量に対して４倍および２１０倍安全係数に相当する。
【０６６４】
改変は、当業者には明らかであるので、本発明は、添付の特許請求の範囲によってのみ制限されると意図される。
【図１】
2014041131.tif 000059
【図２】
2014041131.tif 000060
【図３】
2014041131.tif 000061
【図４】
2014041131.tif 000062
【図５】
2014041131.tif 000063
【図６】
2014041131.tif 000064
【図７】
2014041131.tif 000065
【図８】
2014041131.tif 000066
【図９Ａ】
2014041131.tif 000067
【図９Ｂ】
2014041131.tif 000068
【図９Ｃ】
2014041131.tif 000069
【図９Ｄ】
2014041131.tif 000070
【図９Ｅ】
2014041131.tif 000071
【図９Ｆ】
2014041131.tif 000072
【図１０】
2014041131.tif 000073
【図１１】
2014041131.tif 000074
【図１２】
2014041131.tif 000075
【配列表】
2014041131000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成25年9月6日(2013.9.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
修飾されたヒアルロニダーゼでヒアルロナン関連疾患または状態を治療するための対象を同定する方法であって、
ａ）対象から事前に得られたサンプル中のマーカーの発現またはレベルを測定し、ここに、該マーカーはヒアルロナン関連疾患または状態に関連し、
ｂ）該マーカーの発現またはレベルを、対照サンプルまたは標準中の発現またはレベルと比較し、
ｃ）該マーカーが対照サンプルまたは標準と比べて変化している場合、該サンプルが得られた対象を該修飾されたヒアルロニダーゼでの治療の対象として同定する、ここに、該ヒアルロニダーゼの修飾は、ポリマーとのコンジュゲーションである、
ことを含む方法。
【請求項２】
対象におけるヒアルロナン関連疾患または状態の治療において使用するためのポリマーとのコンジュゲーションによって修飾された可溶性ヒアルロニダーゼを含む医薬組成物であって、該対象が、
（ａ）該対象由来のサンプル中のヒアルロナン発現またはヒアルロナンを測定する工程と、
（ｂ）該対象由来のサンプル中のヒアルロナン発現またはヒアルロナンが上昇しているか、または該疾患もしくは状態を示すレベルである場合には、該可溶性ヒアルロニダーゼを含有する組成物を該対象に投与する工程と
を含む方法によって治療されるところの、医薬組成物。
【請求項３】
ヒアルロナン関連疾患または状態に関連するマーカーの改変された発現またはレベルによって同定された対象においてヒアルロナン関連疾患または状態を治療するための医薬の製造における可溶性ヒアルロニダーゼ組成物の使用であって、ここに、
該対象由来のサンプル中で、該マーカーの発現またはレベルを測定し、
該可溶性ヒアルロニダーゼがポリマーに対するコンジュゲーションによって修飾されるところの、使用。
【請求項４】
対象由来のサンプルが組織または体液である、請求項１記載の方法、請求項２記載の医薬組成物、または請求項３記載の使用。
【請求項５】
組織が腫瘍である、請求項４記載の方法、医薬組成物、または使用。
【請求項６】
サンプルが腫瘍生検である、請求項４または５記載の方法、医薬組成物、または使用。
【請求項７】
対象由来のサンプルが体液であり、該体液が血液サンプル、脳脊髄液、尿、汗、精液または唾液サンプルである、請求項４記載の方法、医薬組成物、または使用。
【請求項８】
サンプル中のヒアルロナンが免疫組織化学またはＥＬＩＳＡによって測定される、請求項１〜７のいずれか１項記載の方法、医薬組成物、または使用。
【請求項９】
ポリマーがシアル化またはペグ化部分である、請求項１〜８のいずれか１項記載の方法、医薬組成物、または使用。
【請求項１０】
マーカーがヒアルロナンである、請求項１〜９のいずれか１項記載の方法、医薬組成物、または使用。
【請求項１１】
対象由来のサンプル中のマーカーのレベルが対照サンプルまたは標準中の発現と比べて上昇している、請求項１〜１０のいずれか１項記載の方法、医薬組成物、または使用。
【請求項１２】
対照サンプルが正常な対象または腫瘍細胞株である別の対象から事前に得られた類似サンプルのなかから選択される、請求項１１記載の方法、医薬組成物、または使用。
【請求項１３】
疾患または状態が椎間板圧迫、癌および浮腫の中から選択される、請求項１〜１２のいずれか１項記載の方法、医薬組成物、または使用。
【請求項１４】
疾患または状態が癌であり、癌が腫瘍である、請求項１３記載の方法、医薬組成物、または使用。
【請求項１５】
疾患または状態が固形腫瘍である、請求項１４記載の方法、医薬組成物、または使用。
【請求項１６】
疾患または状態が、卵巣癌、ｉｎ  ｓｉｔｕ癌腫（ＩＳＣ）、扁平上皮癌（ＳＣＣ）、前立腺癌、膵臓癌、非小細胞肺癌、乳癌、脳癌および結腸癌のうちいずれか１以上の中から選択される、請求項１〜１５のいずれか１項記載の方法、医薬組成物、または使用。
【請求項１７】
疾患または状態が癌であり、サンプル中のヒアルロナンのレベルが対照サンプルと比べて０．５倍以上上昇している、請求項１〜１６のいずれか１項記載の方法、医薬組成物、または使用。
【請求項１８】
サンプルが腫瘍であり、対象において、中ないし高いヒアルロナンが測定される、請求項１〜１７のいずれか１項記載の方法、医薬組成物、または使用。
【請求項１９】
腫瘍領域の少なくとも３０％がヒアルロナンを示す場合、中ないし高いヒアルロナンが存在する、請求項１８記載の方法、医薬組成物、または使用。
【請求項２０】
疾患または状態が浮腫であり、浮腫が臓器移植、卒中または脳外傷によって引き起こされる、請求項１３記載の方法、医薬組成物、または使用。
【請求項２１】
可溶性ヒアルロニダーゼが可溶性ＰＨ２０である、請求項１〜２０のいずれか１項記載の方法、医薬組成物、または使用。
【請求項２２】
ＰＨ２０がヒツジ、マウス、サル、ウシ、細菌およびヒトＰＨ２０の中から選択される、請求項２１記載の方法、医薬組成物、または使用。
【請求項２３】
ＰＨ２０の可溶性型が、Ｃ末端ＧＰＩアンカー付着配列を欠く末端切断されたＰＨ２０である、請求項２１または請求項２２記載の方法、医薬組成物、または使用。
【請求項２４】
可溶性ヒアルロニダーゼが、配列番号１のアミノ酸３６〜４６７、３６〜４６８、３６〜４６９、３６〜４７０、３６〜４７１、３６〜４７２、３６〜４７３、３６〜４７４、３６〜４７５、３６〜４７６、３６〜４７７、３６〜４７８、３６〜４７９、３６〜４８０、３６〜４８１、３６〜４８２もしくは３６〜４８３として示されるアミノ酸の配列を有するか、または配列番号１のアミノ酸３６〜４６７、３６〜４６８、３６〜４６９、３６〜４７０、３６〜４７１、３６〜４７２、３６〜４７３、３６〜４７４、３６〜４７５、３６〜４７６、３６〜４７７、３６〜４７８、３６〜４７９、３６〜４８０、３６〜４８１、３６〜４８２もしくは３６〜４８３として示されるアミノ酸の配列と少なくとも約９１％のアミノ酸配列同一性を有する、請求項１〜２３のいずれか１項記載の方法、医薬組成物、または使用。
【請求項２５】
可溶性ヒアルロニダーゼが、配列番号４〜９および４６〜４８のいずれかに示されるアミノ酸の配列を含有するポリペプチドならびにその対立遺伝子変異体、種変異体およびその他の変異体の中から選択される、請求項１〜２４のいずれか１項記載の方法、医薬組成物、または使用。
【請求項２６】
可溶性ヒアルロニダーゼとコンジュゲートしているポリマーがペグ化部分（ＰＥＧ）を含む、請求項１〜２５のいずれか１項記載の方法、医薬組成物、または使用。
【請求項２７】
ＰＥＧがメトキシ−ＰＥＧ（ｍＰＥＧ）である、請求項２６記載の方法、医薬組成物、または方法。
【請求項２８】
ＰＥＧがメトキシポリ（エチレングリコール）ブタン酸の直鎖Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルである、請求項２７に記載の方法、医薬組成物、または使用。
【請求項２９】
ポリマーが、メトキシ−ポリ（エチレングリコール）−スクシンイミジルブタノエート（ｍＰＥＧ−ＳＢＡ）（５ｋＤａ）；メトキシ−ポリ（エチレングリコール）−スクシンイミジルブタノエート（ｍＰＥＧ−ＳＢＡ）（２０ｋＤａ）；メトキシ−ポリ（エチレングリコール）−スクシンイミジルブタノエート（ｍＰＥＧ−ＳＢＡ）（３０ｋＤａ）；メトキシ−ポリ（エチレングリコール）−スクシンイミジルα−メチルブタノエート（ｍＰＥＧ−ＳＭＢ）（２０ｋＤａ）；メトキシ−ポリ（エチレングリコール）−スクシンイミジルα−メチルブタノエート（ｍＰＥＧ−ＳＭＢ）（３０ｋＤａ）；メトキシ−ポリ（エチレングリコール）−ブチルアルデヒド（ｍＰＥＧ−ブチルアルデヒド）（３０ｋＤａ）、メトキシ−ポリ（エチレングリコール）−スクシンイミジルプロピオネート（ｍＰＥＧ−ＳＰＡ）（２０ｋＤａ）；メトキシ−ポリ（エチレングリコール）−スクシンイミジルプロピオネート（ｍＰＥＧ−ＳＰＡ）（３０ｋＤａ）；（メトキシ−ポリ（エチレングリコール））２−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ｍＰＥＧ２−ＮＨＳ）（１０ｋＤａ、分岐）；（メトキシ−ポリ（エチレングリコール））２−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ｍＰＥＧ２−ＮＨＳ）（２０ｋＤａ、分岐）；（メトキシ−ポリ（エチレングリコール））２−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ｍＰＥＧ２−ＮＨＳ）（４０ｋＤａ、分岐）；（メトキシ−ポリ（エチレングリコール））２−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ｍＰＥＧ２−ＮＨＳ）（６０ｋＤａ、分岐）；ビオチン−ポリ（エチレングリコール）−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ビオチン−ＰＥＧ−ＮＨＳ）（５ｋＤａ、ビオチン化）；ポリ（エチレングリコール）−ｐ−ニトロフェニルカルボネート（ＰＥＧ−ｐ−ニトロフェニル−カルボネート）（３０ｋＤａ）；およびポリ（エチレングリコール）−プリオピオンアルデヒド（ＰＥＧ−プロピオンアルデヒド）（３０ｋＤａ）の中から選択される、請求項２７に記載の方法、医薬組成物、または使用。
【外国語明細書】
【０００１】
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【０００２】
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【０００３】
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【０００４】
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【０００５】
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【０００７】
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【０００８】
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【０００９】
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【００１０】
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【００１１】
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【００１２】
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【００１３】
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【００１４】
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【００１５】
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【００１７】
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【００２０】
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【００２２】
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【００２４】
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【００２５】
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【配列表】
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