(57)【要約】      （修正有）【課題】遺伝子工学の分野で有用な新規なヌクレアーゼ、当該ヌクレアーゼをコードする遺伝子及び当該ヌクレアーゼの製造方法を提供する。【解決手段】以下の（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｃ）のタンパク質；（Ａ）特定のアミノ酸配列を含むタンパク質、（Ｂ）特定のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつニッキング酵素活性を有するタンパク質、（Ｃ）特定のアミノ酸配列と相同性が８０％以上のアミノ酸配列からなり、かつニッキング酵素活性を有するタンパク質。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｃ）のタンパク質。
（Ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質
（Ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列を含む、タンパク質
（Ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列との相同性が８０％以上のアミノ酸配列からなるタンパク質
【請求項２】
以下の（Ｄ）、（Ｅ）又は（Ｆ）のタンパク質。
（Ｄ）配列番号４に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質
（Ｅ）配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列を含む、タンパク質
（Ｆ）配列番号４に示されるアミノ酸配列と相同性が８０％以上のアミノ酸配列からなるタンパク質
【請求項３】
以下の（ａ）から（ｄ）のいずれかのＤＮＡを含む遺伝子。
（ａ）配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ
（ｃ）配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡとの相同性が８０％以上の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ）配列番号１に示される塩基配列に１又は数個の塩基の置換、欠失又は付加されたＤＮＡ
【請求項４】
以下の（ｅ）から（ｈ）のいずれかのＤＮＡを含む遺伝子。
（ｅ）配列番号３に示される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｆ）配列番号３に示される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ
（ｇ）配列番号３に示される塩基配列からなるＤＮＡと相同性が８０％以上の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｈ）配列番号３に示される塩基配列に１又は数個の塩基の置換、欠失又は付加されたＤＮＡ
【請求項５】
請求項３又は４記載の遺伝子を含む組換ベクター。
【請求項６】
請求項５記載の組換ベクターを含む形質転換体。
【請求項７】
請求項６記載の形質転換体を培養し、得られる培養物からニッキング酵素活性を有するタンパク質を採取する工程を含む、タンパク質の製造方法。
【請求項８】
請求項１又は２記載のニッキング酵素活性を有するタンパク質を、無細胞タンパク質合成法を用いて合成し、反応液より当該ニッキング酵素活性を有するタンパク質を採取することを特徴とする、タンパク質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子工学試薬として有用な新規ヌクレアーゼ、当該酵素タンパク質をコードする遺伝子及び当該酵素の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヌクレアーゼ（Ｎｕｃｌｅａｓｅ）は核酸の糖とリン酸の間のホスホジエステル結合を加水分解してヌクレオチドとする酵素である。分解の型式により、エンドヌクレアーゼとエキソヌクレアーゼに分類できる。
【０００３】
エキソヌクレアーゼ（Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ）は、核酸配列の外側（ｅｘｏ−）から、すなわち核酸の５’端又は３’端から削るように分解する。一方、エンドヌクレアーゼ（Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ）は核酸配列の内部（ｅｎｄｏ−）で核酸を切断する。
【０００４】
エンドヌクレアーゼとしては、制限酵素とニッキング酵素の２種類の酵素が知られており、制限酵素は、現在遺伝子工学技術において幅広く用いられている有用な酵素である。
【０００５】
ニッキング酵素（Ｎｉｃｋｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅあるいはＮｉｃｋｉｎｇ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ）は、二本鎖ＤＮＡのうち一方の鎖だけホスホジエステル結合が切断されたニックを生じさせるエンドヌクレアーゼである。ニッキング酵素によって生じる通常のニック（３’−ヒドロキシ、５’−リン酸）は、様々な酵素反応の基点となるため、ニッキング酵素はＤＮＡの加工に用いられる。
【０００６】
例えば、ニッキング酵素を用いて二本鎖ＤＮＡの片方にニックを形成させ、生じたニックをプライミングサイトとして、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼにより１５塩基程度の短い核酸を等温増幅する方法が知られている（非特許文献１）。また、当該方法の改良技術として、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼとニッキング酵素を用いて、２１塩基以上の核酸を等温増幅する方法も開発されている（特許文献１）。
これまでにニッキング酵素は１０００種以上が報告されているが、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属に属する細菌においては１１例の報告があるのみで、これらは全て推定的（ｐｕｔａｔｉｖｅ）なものである（ｈｔｔｐ：／／ｒｅｂａｓｅ．ｎｅｂ．ｃｏｍ／）。
【０００７】
本発明者らは、これまでにロドコッカス  ロドクロウスＪ−１株から幾つかのヌクレアーゼを単離し、ミスマッチ配列を認識するニッキング酵素を見出している（特許文献２、特許文献３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００８−１３６４５１号公報
【特許文献２】特開２００７−２５９８５３号公報
【特許文献３】特開２０１３−００５７９１号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Jeffrey Van Ness,et al., (2003) “Isothermal reactions for the amplification of oligonucleotides” Proc.Natl.Acad.Sci.USA, Vol.100, No.8, 4504-4509
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
遺伝子工学の分野では様々な機能を有する酵素が求められており、これまで以上の多くの種類のニッキング活性を有する酵素が求められている。
【００１１】
本発明の主な目的は、遺伝子工学の分野で有用な新規なヌクレアーゼ及びその遺伝子を提供するとともに、当該ヌクレアーゼの製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、ロドコッカス属に属する細菌：ロドコッカス  ロドクロウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）Ｊ−１株より、新規なヌクレアーゼ（ＲｒｈＪ１ＩＩＩ）を単離した。
【００１３】
本発明は、下記の通りである。
以下の（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｃ）のタンパク質。
（Ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質
（Ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつニッキング酵素活性を有するタンパク質
（Ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と相同性が８０％以上のアミノ酸配列からなり、かつニッキング酵素活性を有するタンパク質
【発明の効果】
【００１４】
本発明により、遺伝子工学の分野で有用なニッキング酵素活性を有するエンドヌクレアーゼ及びこれをコードする遺伝子を提供することができる。本発明の新規ヌクレアーゼは、当該遺伝子を用いた組換え製造により、簡便かつ大量に生産することができる。
【００１５】
本発明の新規ヌクレアーゼは、ニッキング酵素活性を有するため、鎖置換型等温核酸増幅や、染色体ＤＮＡの蛍光標識による可視化、生体内遺伝子ターゲティングのための相同組換えを誘発するための一本鎖ＤＮＡ切断反応などに利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ロドコッカス属細菌の産生するエンドヌクレアーゼのホモロジー解析結果を示す図である。
【図２】ＲｒｈＪ１ＩＩＩ発現プラスミドｐＲＲ０３の構造を示す模式図である。
【図３】ＲｒｈＪ１ＩＩＩの酵素活性を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
（１）本発明の新規ヌクレアーゼ（ＲｒｈＪ１ＩＩＩヌクレアーゼ）
本発明に係る新規ヌクレアーゼは、ロドコッカス  ロドクロウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）Ｊ−１株から、本発明者らにより初めて単離された。ロドコッカス  ロドクロウスＪ−１株（以下、「Ｊ１菌」ともいう）は、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１４７８として独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に寄託されている。
【００１８】
本発明者らは、このＪ１菌由来の新規ヌクレアーゼを「ＲｒｈＪ１ＩＩＩ」と命名した。ＲｒｈＪ１ＩＩＩヌクレアーゼは、ｐＢＲ３２２のｃｌｏｓｅｄ  ｃｉｒｃｕｌａｒをｏｐｅｎ  ｃｉｒｃｕｌａｒにするニッキング酵素活性を有する。本明細書では、このＲｒｈＪ１ＩＩＩヌクレアーゼが有するニッキング酵素活性を「ＲｒｈＪ１ＩＩＩヌクレアーゼ活性」という。
【００１９】
本明細書において、「エンドヌクレアーゼ活性」とは、核酸配列の内部（ｅｎｄｏ−）で核酸を切断する酵素活性を意味し、「ニッキング酵素活性」とは、特定の配列を有する二本鎖ＤＮＡの片方の鎖のみを切断するエンドヌクレアーゼ活性を意味する。ＲｒｈＪ１ＩＩＩヌクレアーゼによる認識部位と切断部位とは、同一でも異なっていてもどちらでもよい。
【００２０】
本発明のＲｒｈＪ１ＩＩＩヌクレアーゼによって切断されるＤＮＡが二本鎖ＤＮＡの場合は、その一方の鎖のみにニックを入れる。また、切断されるＤＮＡは、認識部位と切断部位にミスマッチ構造（例えば、Ｃ／Ｔミスマッチ）を含んでいても含んでいなくてもよい。
【００２１】
ニッキング酵素活性は、ＲｒｈＪ１ＩＩＩヌクレアーゼをＤＮＡと接触させ、接触後のＤＮＡの分子量又はＤＮＡ断片数を測定することにより評価することができる。接触前のＤＮＡの分子量と接触後のＤＮＡの分子量を比較したり、接触前のＤＮＡの断片数と接触後のＤＮＡ断片数とを比較したりすることにより、ニッキング酵素活性を評価することができる。当業者であれば、基質となるＤＮＡ、接触時の酵素量、温度、溶液組成又は接触時間などの条件は適宜設定することができる。ＤＮＡの分子量は、例えばアガロース電気泳動によって測定することができる。
【００２２】
本発明者らは、Ｊ１菌由来のＲｒｈＪ１ＩＩＩヌクレアーゼが配列番号２又は４に示されるアミノ酸配列を有することを同定した。しかしながら、本発明のＲｒｈＪ１ＩＩＩヌクレアーゼは、これらの配列を有するものに限定されるものではなく、配列番号２又は４に示されるアミノ酸配列と約８０％以上、好ましくは約８５％以上、より好ましくは約９０％以上、特に好ましくは約９５％以上、最も好ましくは約９８％以上の相同性又は同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつニッキング酵素活性を有するタンパク質も、本発明のＲｒｈＪ１ＩＩＩヌクレアーゼに含まれる。
【００２３】
本発明のＲｒｈＪ１ＩＩＩヌクレアーゼは、当該酵素をコードする遺伝子が２つの開始コドンを有するため、Ｎ末端近傍の３アミノ酸残基の有無のみが異なる２種のヌクレアーゼ（ＲｒｈＪ１ＩＩＩヌクレアーゼ）が存在することが明らかになった。これら２種のヌクレアーゼはいずれも野生型ヌクレアーゼであるが、本明細書において両者を区別する場合は、最初の開始コドンから翻訳されたアミノ酸配列（配列番号２）からなるヌクレアーゼを「ＲｒｈＪ１ＩＩＩ（１ｓｔ）」、２番目の開始コドン（次に登場するメチオニン）から翻訳されたアミノ酸配列（配列番号４）からなるヌクレアーゼを「ＲｒｈＪ１ＩＩＩ（２ｎｄ）」とする。
【００２４】
また、本発明のＲｒｈＪ１ＩＩＩヌクレアーゼタンパク質には、配列番号２又は４に示されるアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつニッキング酵素活性を有するタンパク質も含まれる。
【００２５】
具体的には、（ｉ）配列番号２又は４に示されるアミノ酸配列において、数個、例えば１〜２０個（好ましくは１〜１０個、よろい好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜２個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、（ｉｉ）配列番号２又は４に示されるアミノ酸配列の数個、例えば１〜２０個（好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜２個）のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列、（ｉｉｉ）配列番号２又は４に示されるアミノ酸配列に数個、例えば、１〜２０個（好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜２個）のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列、（ｉｖ）配列番号２又は４に示されるアミノ酸配列に数個、例えば１〜２０個（好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜２個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、（ｖ）上記（ｉ）〜（ｉｖ）のいずれかを組み合わせたアミノ酸配列が挙げられる。
【００２６】
アミノ酸の置換は、類似するアミノ酸残基間の保存的置換が好ましい。アミノ酸は、その側鎖の性質に基づいて、疎水性アミノ酸（Ａ，Ｉ，Ｌ，Ｍ，Ｆ，Ｐ，Ｗ，Ｙ，Ｖ）、親水性アミノ酸（Ｒ，Ｄ，Ｎ，Ｃ，Ｅ，Ｑ，Ｇ，Ｈ，Ｋ，Ｓ，Ｔ）、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（Ｇ，Ａ，Ｖ，Ｌ，Ｉ，Ｐ）、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（Ｓ，Ｔ，Ｙ）、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（Ｃ，Ｍ），カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸（Ｄ，Ｎ，Ｅ，Ｑ），塩基含有側鎖を有するアミノ酸（Ｒ，Ｋ，Ｈ）、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（Ｈ，Ｆ，Ｙ，Ｗ）に分類される。各群に分類されたアミノ酸は、相互に置換したときに、当該ポリペプチドの活性が維持される可能性が高いことが知られており、そのようなアミノ酸相互の置換が好ましい。例えば、グリシンとプロリン、グリシンとアラニン又はバリン、ロイシンとイソロイシン、グルタミン酸とグルタミン、アスパラギン酸とアスパラギン、システインとスレオニン、スレオニンとセリン又はアラニン、リジンとアルギニン間での置換を挙げることができる。
【００２７】
（２）本発明の新規ヌクレアーゼ遺伝子（ＲｒｈＪ１ＩＩＩヌクレアーゼ遺伝子）
本発明のＲｒｈＪ１ＩＩＩヌクレアーゼ遺伝子は、上述したＲｒｈＪ１ＩＩＩヌクレアーゼタンパク質をコードする遺伝子である。本発明のＲｒｈＪ１ＩＩＩヌクレアーゼ遺伝子は、配列番号１又は３に示される塩基配列からなるＤＮＡを含む。配列番号１に示される塩基配列はＲｒｈＪ１ＩＩＩ（１ｓｔ）をコードする遺伝子であり、配列番号３に示される塩基配列はＲｒｈＪ１ＩＩＩ（２ｎｄ）をコードする遺伝子である。
【００２８】
本発明のＲｒｈＪ１ＩＩＩヌクレアーゼ遺伝子は上記配列に限定されるものではなく、配列番号１又は３に示される塩基配列と約８０％以上、好ましくは約８５％以上、より好ましくは約９０％以上、さらに好ましくは約９５％以上、最も好ましくは約９８％以上の相同性（同一性）を有する塩基配列を有するＤＮＡも、それがＲｒｈＪ１ＩＩＩヌクレアーゼとしての機能（ニッキング酵素活性）を有するタンパク質をコードする限り、本発明の遺伝子に含まれる。
【００２９】
また、前述したアミノ酸配列の欠失、置換又は付加に対応して、配列番号１又は３記載の塩基配列において、数個の塩基に欠失、置換又は付加等の変異が生じた塩基配列も、それが本発明のＲｒｈＪ１ＩＩＩヌクレアーゼとしての機能（ニッキング酵素活性）を有するタンパク質をコードする限り、本発明のＲｒｈＪ１ＩＩＩヌクレアーゼ遺伝子に含まれる。なお、欠失、置換又は付加される塩基の個数は、３０個以下、好ましくは１５個以下、特に好ましくは６個以下である。
【００３０】
さらに、配列番号１又は３に記載の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡも、これがニッキング酵素活性を有するタンパク質をコードする限り、本発明の遺伝子に含まれる。
【００３１】
ここで、ストリンジェントな条件としては、例えば、ＤＮＡを固定したナイロン膜を、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは、塩化ナトリウム８．７６ｇ、クエン酸ナトリウム４．４１ｇを１リットルの水に溶かしたもの）、１％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍＬサケ精子ＤＮＡ、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％フィコールを含む溶液（本明細書において、「％」は「ｗ／ｖ」を意味する。）中で６５℃にて２０時間プローブとともに保温してハイブリダイゼーションを行う条件を挙げることができる。しかし、この条件に限定されず、当業者であれば、このような緩衝液の塩濃度、温度等の条件に加えて、その他のプローブ濃度、プローブの長さ、反応時間等の諸条件を加味し、ハイブリダイゼーションの条件を設定することができる。
【００３２】
ハイブリダイゼーション法の詳細な手順については、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄ．（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  （１９８９））等を参照することができる。
【００３３】
以下に、ハイブリダイゼーションによりＲｒｈＪ１ＩＩＩヌクレアーゼ遺伝子を得る方法の一例を示すが、本発明はこれに限定されない。
【００３４】
まず、適当な遺伝子源から得たＤＮＡを定法に従ってプラスミドやファージベクターに接続してＤＮＡライブラリを作製する。このライブラリを適当な宿主に導入して得られる形質転換体をプレート上で培養し、生育したコロニー又はプラークをニトロセルロースやナイロンの膜にうつしとり、変性処理の後にＤＮＡを膜に固定する。この膜をあらかじめ３２Ｐ等で標識したプローブを含む上記の組成の溶液中、上記のストリンジェントな条件で保温し、ハイブリダイゼーションを行う。プローブとしては、配列番号１又は３に記載したアミノ酸配列の全部又は一部をコードするポリヌクレオチドを使用することができる。
【００３５】
ハイブリダイゼーションの終了後、非特異的に吸着したプローブを洗い流し、オートラジオグラフィ等によりプローブとハイブリッドを形成したクローンを同定する。この操作をハイブリッド形成クローンが単離できるまで繰り返す。最後に、得られたクローンの中から、目的の酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を選択する。遺伝子の単離は、アルカリ法等の公知のポリヌクレオチド抽出法により実施できる。
【００３６】
本発明のＲｒｈＪ１ＩＩＩヌクレアーゼ遺伝子は、当該酵素を発現する微生物から単離することもできる。例えば、ロドコッカス  ロドクロウスＪ−１株由来のゲノムＤＮＡを鋳型として、既知のアミノ酸配列情報から遺伝子の縮重を考慮して設計したプライマーもしくはプローブ又は既知の塩基配列情報に基づいて設計したプライマー又はプローブを用いたＰＣＲ又はハイブリダイゼーション法により、前記微生物のゲノムから目的の遺伝子を単離することができる。
【００３７】
このように種々のＤＮＡが本発明のＲｒｈＪ１ＩＩＩヌクレアーゼ遺伝子の範囲内に含まれるのは、コドンの縮重に由来する。すなわち、遺伝子上でアミノ酸を指定するコドン（３つの塩基の組み合わせ）は、アミノ酸の種類ごとに１〜６種類存在することが知られている。従って、あるアミノ酸配列をコードする遺伝子は多数存在しうる。
【００３８】
遺伝子は自然界において安定に存在しているものではなく、その塩基配列に変異が起こることは稀ではない。遺伝子上に起こった変異によっては、コードされるアミノ酸配列に変化を与えない変異（サイレント変異と呼ばれる）もあり、この場合には同じアミノ酸配列をコードする、異なる遺伝子が生じたと言える。従って、ある特定のアミノ酸配列をコードする遺伝子が単離されても、それを含有する生物が継代されていくうちに同じアミノ酸配列をコードする多種類の遺伝子ができて行く可能性は否定できない。
【００３９】
さらに、同じアミノ酸配列をコードする多種類の遺伝子を人為的に作製することは、種々の遺伝子工学的手法を用いれば困難なことではない。例えば、遺伝子工学的なタンパク質の生産において、目的のタンパク質をコードする本来の遺伝子上で使用されているコドンが宿主中では使用頻度の低いものであった場合には、タンパク質の発現量が低いことがある。このような場合にはコードされているアミノ酸配列に変化を与えることなく、コドンを宿主で繁用されているものに人為的に変換することにより、目的タンパク質の高発現を図ることが行われている。
【００４０】
このように、特定のアミノ酸配列をコードする多種類の遺伝子は人為的に作製可能なことは言うまでもなく、自然界においても生成されうるものである。従って、本発明中に開示された塩基配列と同一の遺伝子ではなくても、ＲｒｈＪ１ＩＩＩと同等の活性を示すタンパク質をコードするＤＮＡである限り、本発明のＲｒｈＪ１ＩＩＩヌクレアーゼ遺伝子に含まれる。
【００４１】
遺伝子に変異を導入し、人為的にアミノ酸配列を改変する方法としては、Ｋｕｎｋｅｌ法やＧａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ法等の公知の手法や、部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入キット、例えば、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅＴＭ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ストラタジーン社）、ＧｅｎｅＴａｉｌｏｒＴＭ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（インビトロジェン社）、ＴａＫａＲａ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｕｔａｎ−Ｋ，Ｍｕｔａｎ−Ｓｕｐｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｋｍ等：タカラバイオ社）等を用いることができる。
【００４２】
ＤＮＡの塩基配列の確認は、慣用の方法により配列決定することにより行うことができる。例えば、ジデオキシヌクレオチドチェーンターミネーション法（Ｓａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９７７）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７４：５４６３）等により行うことができる。また、適当なＤＮＡシークエンサーを利用して配列を解析することも可能である。
【００４３】
塩基配列の決定は、プラスミドベクターを用いて作製された形質転換体の場合、宿主がエシェリヒア  コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）であれば試験管等で培養を行い、定法に従ってプラスミドを調製する。得られたプラスミドをそのまま鋳型とするか、あるいは挿入断片を取り出してＭ１３ファージベクター等にサブクローニングした後に、ジデオキシ法により塩基配列を決定する。ファージベクターで作製された形質転換体の場合も基本的に同様な操作により塩基配列を決定することができる。これら培養から塩基配列決定までの基本的な実験法については、例えば前述のＴ．ＭａｎｉａｔｉｓらのＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ等に記載されている。
【００４４】
得られた遺伝子が目的のＲｒｈＪ１ＩＩＩヌクレアーゼをコードする遺伝子であるかどうかの確認は、決定された塩基配列を配列番号１又は３に記載の塩基配列と比較して行うことができる。あるいは決定された塩基配列より推定されるアミノ酸配列を配列番号２又は４に記載のアミノ酸配列と比較して行うことができる。
【００４５】
（３）本発明の新規ヌクレアーゼ遺伝子を含む組換えベクター
本発明は、ＲｒｈＪ１ＩＩＩヌクレアーゼ遺伝子を含む組換えベクターも提供する。本発明の組換えベクターは、上記酵素をコードする遺伝子の上流に転写プロモーター、場合によっては下流にターミネーターを挿入して発現カセットを構築し、このカセットを発現ベクターに挿入することにより作製することができる。あるいは、発現ベクターに転写プロモーター及び／又はターミネーターがすでに存在する場合には、発現カセットを構築することなく、ベクター中のプロモーター及び／又はターミネーターを利用して、その間に当該酵素をコードする遺伝子を挿入すればよい。
【００４６】
本明細書において、プロモーターは、例えば、ｔｒｃプロモーター、ｌａｃプロモーターなどをあげることができるが、これに限定されるわけではない。本明細書において、ターミネーターは、例えば、ｔｒｐオペロンターミネータを挙げることができるが、これに限定されるわけではない。
【００４７】
ベクターに本発明の遺伝子を挿入するには、制限酵素を用いる方法、トポイソメラーゼを用いる方法等を利用することができる。また、挿入の際に必要であれば、適当なリンカーを付加してもよい。また、アミノ酸への翻訳にとって重要な塩基配列として、ＳＤ配列やＫｏｚａｋ配列などのリボソーム結合配列が知られており、これらの配列を遺伝子の上流に挿入することもできる。挿入にともない、遺伝子がコードするアミノ酸配列の一部を置換してもよい。
【００４８】
本発明において使用されるベクターは、本発明の遺伝子を保持するものであれば特に限定されず、それぞれの宿主に適したベクターを用いることができる。ベクターとしては、例えば、プラスミドＤＮＡ、バクテリオファージＤＮＡ、レトロトランスポゾンＤＮＡ、人工染色体ＤＮＡなどが挙げられる。例えば、大腸菌を宿主とする場合には、ｐＴｒｃ９９Ａ（ＧＥヘルスケア  バイオサイエンス）、ｐＡＣＹＣ１８４（ニッポンジーン）、ｐＭＷ１１８（ニッポンジーン）などを挙げることができる。また、必要に応じて、これらのベクターを改変したものを用いることもできる。
【００４９】
（４）本発明のベクターを導入した形質転換体
本発明の組換えベクターを宿主に導入することで、本発明の形質転換体を作製することができる。
【００５０】
形質転換体に使用する宿主は、上記組換えベクターが導入された後、目的の制限酵素又は修飾酵素を発現することができる限り、特に限定されるものではない。宿主としては、例えば、大腸菌（エシェリヒア  コリ）、枯草菌（バチルス  ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ））、ロドコッカス菌（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、放線菌などの細菌、酵母（サッカロミセス  セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））、カビ、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞などが挙げられる。本発明において、宿主は好ましくは大腸菌である。
【００５１】
本発明において、大腸菌は、例えば、大腸菌Ｋ１２株やＢ株、あるいはそれらの野生株由来の派生株であるＪＭ１０９株、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ株（例えば、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’）、Ｋ８０２株、Ｃ６００株などを挙げることができる。
【００５２】
宿主への組換えベクターの導入方法としては、宿主に適した方法であれば特に限定されるものではなく、当業者であれば公知技術から適宜選択することができる。このような方法としては、例えば、エレクトロポレーション法、カルシウムイオンを用いる方法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が挙げられる。
【００５３】
（５）本発明のＲｒｈＪ１ＩＩＩヌクレアーゼの製造方法
（５−１）細胞系による製造
本発明のＲｒｈＪ１ＩＩＩヌクレアーゼは、形質転換体を培養して、培養物中よりＲｒｈＪ１ＩＩＩヌクレアーゼの特徴（例えば、ニッキング酵素活性）を有する活性を有するタンパク質を採取することにより、ＲｒｈＪ１ＩＩＩヌクレアーゼを製造することができる。
【００５４】
本発明において「培養物」とは、菌体、培養液、無細胞抽出液、細胞膜などの培養により得られるものを意味する。無細胞抽出液は、培養後の菌体を、例えばリン酸ナトリウム緩衝液を加えてホモジナイザーなどで物理的に破砕した後、遠心（１５，０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ、４℃）し、破砕できない菌体（細胞）が存在しないように上清を回収して得ることができる。細胞膜は、上記遠心で得られたペレットとして得ることができ、また、ペレットを溶解バッファで懸濁することにより得ることもできる。
【００５５】
本発明のＲｒｈＪ１ＩＩＩヌクレアーゼは、培養物をそのまま用いてもよいし、透析や硫安沈殿などの公知の方法、あるいは公知の方法を単独又は適宜組み合わせることによって、培養物から濃縮、精製したものを用いてもよい。この場合、酵素活性、分子量、等電点などを指標に濃縮、精製することができる。
【００５６】
たとえば、形質転換体の培養物からＲｒｈＪ１ＩＩＩヌクレアーゼ及びその修飾酵素を採取するにあたっては、培養物より菌体を集菌後、超音波破砕、超遠心分離等により酵素を抽出し、ついで除核酸法、塩析法、アフィニティクロマトグラフィ法、ゲル濾過法、イオン交換クロマトグラフィ法等を組み合わせて精製すればよい。この方法により、ＲｒｈＪ１ＩＩＩヌクレアーゼを大量に得ることができる。
【００５７】
用いる発現系によっては、形質転換体中で発現された酵素タンパク質が不溶物［封入体（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎｂｏｄｙ）］として蓄積される場合がある。この場合にはこの不溶物を回収し、穏和な変性条件、たとえば尿素等の変性剤存在下で可溶化した後に変性剤を除くことによって活性型のタンパク質を得ることができる。さらに上記のようなクロマトグラフィ操作を行って目的とする酵素タンパク質を精製することができる。
【００５８】
（５−２）無細胞タンパク質合成系による製造
本発明においては、無細胞タンパク質合成系を用いて、本発明のＲｒｈＪ１ＩＩＩヌクレアーゼ遺伝子又は本発明のベクターから、ＲｒｈＪ１ＩＩＩヌクレアーゼを製造することも可能である。
【００５９】
無細胞タンパク質合成系とは、細胞抽出液を用いて試験管等の人工容器内でタンパク質を合成する系である。すなわち、無細胞タンパク質合成系は、生物を用いた組換えタンパク質発現とは異なり、細胞を使用せずに試験管内で転写・翻訳という一連のタンパク質合成の流れを行う合成系であるため、細胞にとって毒性となるタンパク質を生産できるという利点がある。なお、本発明において使用される無細胞タンパク質合成系にはＤＮＡを鋳型としてＲＮＡを合成する無細胞転写系も含まれる。
【００６０】
無細胞タンパク質合成系の細胞抽出液としては、真核細胞由来又は原核細胞由来の抽出液、例えば小麦胚芽、大腸菌等の抽出液を使用することができる。これらの細胞抽出液は濃縮されたものであっても濃縮されていないものであってもよい。
【００６１】
細胞抽出液は、例えば限外濾過、透析、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈殿等によって得ることができる。さらに本発明において、無細胞タンパク質合成は、市販のキットを用いて行うこともできる。そのようなキットとしては、例えば試薬キットＰＲＯＴＥＩＯＳＴＭ（東洋紡）、ＴＮＴＴＭ  Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ）、合成装置のＰＧ−ＭａｔｅＴＭ（東洋紡）、ＲＴＳ（ロシュ  ダイアグノスティクス）等が挙げられる。
【００６２】
こうした細胞抽出液に代えて、タンパク質合成に関与するすべての因子を精製し、それらをリボソーム、ＡＴＰ、ｔＲＮＡ、アミノ酸などとともに再構成して作成された「再構成された無細胞タンパク質合成系」を用いることもできる。
【００６３】
通常の無細胞タンパク質合成系に用いられる細胞抽出液には、ＡＴＰを加水分解する酵素などの混在によりタンパク質合成以外に無駄に消費されるエネルギー量が多く、エネルギー効率が低く、また細胞抽出液中に存在するプロテアーゼやヌクレアーゼなどの阻害因子によりンパク質合成の効率が低下する場合がある。
【００６４】
「再構成された無細胞タンパク質合成系」は、こうした阻害的要因の問題がなく、また構成成分を自由に操作することができるため、目的や標的タンパク質に応じた自由なシステム設計が可能である。また系の自由度が高く、反応系を微小化したり、自動化装置と組み合わせてハイスループットにすることも可能である。
【００６５】
「再構成された無細胞タンパク質合成系」の一例としてＰＵＲＥＳＹＳＴＥＭ（登録商標）を挙げることができる。ＰＵＲＥＳＹＳＴＥＭ（登録商標）は大腸菌から再構成されているが、無細胞タンパク質合成系で用いられる他の公知の細胞、昆虫細胞、小麦胚芽、ウサギ網状赤血球のいずれを用いても、同様の系は構成可能である。
【００６６】
上記のように無細胞タンパク質合成系によって得られる本発明のヌクレアーゼは前述のように適宜クロマトグラフィを選択して、濃縮、精製することができる。
【００６７】
（６）ＲｒｈＪ１ＩＩＩヌクレアーゼ活性の解析
ＲｒｈＪ１ＩＩＩヌクレアーゼ酵素活性を調べるために、まずＪ１菌を培養し、培養した菌体を集めて超音波処理にて破砕した後、超遠心分離を行って上清を集め、これを活性測定用の試料とする。また、上述したように細胞系による製造又は無細胞系タンパク質合成系により得られたものも試料とすることができる。
【００６８】
この試料の適当量を、基質であるｃｌｏｓｅｄ  ｃｉｒｃｕｌａｒ  ｐＢＲ３２２  ＤＮＡ（ｐＢＲ３２２）とともに３７℃でインキュベートした後、基質ＤＮＡの分解をアガロースゲル電気泳動により確認する。
【００６９】
当該方法を用いてＪ１菌のＲｒｈＪ１ＩＩＩヌクレアーゼ酵素活性を調べると、当該酵素活性は、ｐＢＲ３２２を切断してｏｐｅｎ  ｃｉｒｃｕｌａｒにする活性として検出される。種々のプラスミドを基質ＤＮＡとして使用してＲｒｈＪ１ＩＩＩヌクレアーゼによる切断パターンを解析すると、ＲｒｈＪ１ＩＩＩヌクレアーゼの認識配列を決定することができる。
【実施例】
【００７０】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明する。本明細書において「％」とは「ｗ／ｖ」を意味するものとする。
【００７１】
［実施例１］
Ｊ１菌染色体ＤＮＡの調製
ロドコッカス  ロドクロウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）Ｊ−１株を１００ｍＬのＭＹＫＧ培地中、３０℃にて７２時間振盪培養した。
【００７２】
培養後、集菌し、集菌された菌体をＳａｌｉｎｅ−ＥＤＴＡ溶液（０．１Ｍ  ＥＤＴＡ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ（ｐＨ８．０））４ｍＬに懸濁した。懸濁液にリゾチーム４０ｍｇを加えて３７℃で１〜２時間振盪した後、−２０℃で凍結した。
【００７３】
次に、１０ｍＬのＴｒｉｓ−ＳＤＳ液（１％ＳＤＳ、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０））を穏やかに振盪しながら加え、さらにプロテイナーゼＫ（メルク社）（１０ｍｇ／ｍＬ）を１０μＬ加えて３７℃で１時間振盪した。
【００７４】
次に、等量のＴＥ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０））飽和フェノールを加え、攪拌後、遠心した。上層を採取し、２倍量のエタノールを加えた後、ガラス棒でＤＮＡを巻き取り、９０％、８０％、７０％のエタノールで順次フェノールを取り除いた。
【００７５】
次に、ＤＮＡを３ｍＬのＴＥ緩衝液に溶解させ、リボヌクレアーゼＡ溶液（１００℃、１５分間の加熱処理済）を１０μｇ／ｍＬになるように加え、３７℃で３０分間振盪した。さらに、プロテイナーゼＫを加え３７℃で３０分間振盪した後、等量のＴＥ飽和フェノールを加えて遠心し、上層と下層に分離させた。
【００７６】
上層についてこの操作を２回繰り返した後、同量のクロロホルム（４％イソアミルアルコール含有）を加え、同様の抽出操作を繰り返した。その後、上層に２倍量のエタノールを加え、ガラス棒でＤＮＡを巻き取り回収し、染色体ＤＮＡ標品を得た。
【００７７】
［実施例２］
ＲｒｈＪ１ＩＩＩヌクレアーゼ遺伝子のＰＣＲ
ＲｒｈＪ１ＩＩＩヌクレアーゼ遺伝子をＰＣＲで増幅するためのプライマーを以下の方法で設計した。
【００７８】
図１はロドコッカス属細菌の産生する推定ヌクレアーゼのアミノ酸ホモロジー解析結果を示す。図１中でホモロジー解析を行ったヌクレアーゼとその由来は以下のとおりである。
【００７９】
Ａ：HNH endonuclease family protein（Rhodococcus sp.JVH1）
Ｂ：hypothetical protein W59_10709（Rhodococcus imtechensis RKJ300）
Ｃ：hypothetical protein RHA1_ro03393（Rhodococcus jostii RHA1）
Ｄ：hypothetical protein AK37_14191（Rhodococcus pyridinivorans AK37）
図１中、特に保存されている２つの領域を選んで配列番号５及び配列番号６のデジェネレイトプライマーを設計し、実施例１で調製したＪ１菌ゲノムＤＮＡを鋳型としてデジェネレイトＰＣＲを以下の条件で実施した。その結果、約２８０ｂのバンドの増幅が確認された。
反応液組成                                              
鋳型ＤＮＡ（Ｊ１菌染色体ＤＮＡ，実施例１）         １μＬ
１０×Ｅｘ  Ｂｕｆｆｅｒ（タカラバイオ社）       １０μＬ
１５０μＭプライマーＤＧ−０１（配列番号５）       １μＬ
１５０μＭプライマーＤＧ−０２（配列番号６）       １μＬ
２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ                               ８μＬ
ＤＭＳＯ                                  １０μＬ
滅菌水                                    １８μＬ
ＥｘＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社）  １μＬ    
総量                                      ５０μＬ
温度サイクル：９４℃：３０秒、６５℃：３０秒及び７２℃：１分の反応を３０サイクル
プライマー
ＤＧ−０１：５’−ＧＧＩＡＧ（Ａ／Ｇ）ＴＧＣＴＴ（Ａ／Ｇ）ＴＧＧＴＧ（Ｃ／Ｔ）ＧＧＩＡＧＧ−３’（配列番号５）
ＤＧ−０２：５’−ＣＣＴ（Ｔ／Ｃ）ＡＡＣＴＧＩＣＣＧＣＴ（Ｔ／Ｃ）ＡＡＧＴＡ−３’（配列番号６）。
【００８０】
次に、増幅された配列のダイレクトシークエンシングをＰＣＲで使用したプライマーを用いて実施した。その結果、配列番号７に示す配列が得られ、ホモロジー検索の結果、前述のエンドヌクレアーゼとの相同性が認められた。
【００８１】
［実施例３］
ＲｒｈＪ１ＩＩＩヌクレアーゼ遺伝子のクローニング
（１）ゲノミックサザンハイブリダイゼーション
ＡｐａＬＩ、ＢａｍＨＩ、ＣｌａＩ、Ｅｃｏ５２Ｉ、ＥｃｏＴ１４Ｉ、ＫｐｎＩ、ＭｌｕＩ、ＮｃｏＩ、ＮｏｔＩ、ＰｖｕＩＩ、ＳａｌＩ、ＸｂａＩそれぞれで消化したＪ１菌ゲノムＤＮＡに対し、後述の方法で調製したＲｒｈＪ１ＩＩＩのプローブを用いてサザンハイブリダイゼーションを行ったところ、ＢａｍＨＩで消化した断片から、約１．６ｋｂの単一シグナルが得られた。
【００８２】
なお、ＲｒｈＪ１ＩＩＩのプローブは以下のようにして調製した。
【００８３】
実施例２で調製したＰＣＲ産物をＧＦＸ  ＰＣＲ  ＤＮＡ  ｂａｎｄ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  Ｂａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ＧＥヘルスケア  バイオサイエンス社）を用いて精製した。精製したＰＣＲ産物に対してＡｌｋＰｈｏｓ    Ｄｉｒｅｃｔ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｋｉｔ（ＧＥヘルスケア  バイオサイエンス社）を用い、添付のマニュアルにしたがってラベリングを行い、ＲｒｈＪ１ＩＩＩのプローブとした。
【００８４】
（２）コロニーハイブリダイゼーション
Ｊ１菌ゲノムＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩで分解して０．７％アガロースゲル電気泳動で分離し、ゲルからＧＦＸ  ＰＣＲ  ＤＮＡ  ｂａｎｄ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  Ｂａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ＧＥヘルスケア  バイオサイエンス社）を使用して約１．６ｋｂの断片を回収した。得られた断片は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（＋）ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）にＤＮＡ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ＜Ｍｉｇｈｔｙ  ｍｉｘ＞（タカラバイオ社製）を用いて連結した。反応条件は以下の通りである。
反応液組成：                                                                
ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｍｉｇｈｔｙ  ｍｉｘ（タカラバイオ社製）     ５μＬ
Ｊ１菌ゲノムＤＮＡ／ＢａｍＨＩ切断断片                  ４μＬ
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（＋）／ＢａｍＨＩ切断断片     １μＬ    
総量                                                  １０μＬ
反応：１６℃、１時間。
【００８５】
上記ライゲーション産物の全量を、後述の方法で調製した大腸菌ＪＭ１０９株コンピテントセル２００μＬに加え、０℃で３０分放置した。続いて、前述コンピテントセルに４２℃で４５秒間ヒートショックを与え、０℃で２分間冷却した。その後、ＳＯＣ培地（２０ ｍＭグルコース、２％バクトトリプトン、０．５％バクトイーストエキス、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、２．５ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２）を１ｍＬ添加し、３７℃にて１時間振盪培養した。
【００８６】
培養後の培養液を２００μＬずつ、ＬＢ  ＡＩＸプレート（１００μｇ／Ｌアンピシリン、１００μＭ  ＩＰＴＧ、５０μｇ／Ｌ  Ｘ−ｇａｌを含むＬＢ寒天培地）に塗布し、３７℃で一晩放置した。
【００８７】
プレート上に生育した白色の組換コロニーを新しいＬＢ  ＡＩＸプレートに、プレート１枚に付き９４個、プレート１０枚分単離した。各プレートにはインサートを含まないｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（＋）で形質転換したＪＭ１０９株を２コロニー／プレート植菌した。
【００８８】
コロニー単離したプレートを３７℃で一晩放置した後、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋（ＧＥヘルスケア  バイオサイエンス社）膜にコロニーを写し取り、実施例３（１）で調製したＲｒｈＪ１ＩＩＩのプローブを用いてコロニーハイブリダイゼーションを行った。
【００８９】
検出されたコロニーを培養して得られた培養液を集菌後、QIAprep miniprep kit（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて組換えプラスミドを回収した。キャピラリーＤＮＡシーケンサーＣＥＱ２０００（ベックマン・コールター社製）を用いて、添付のマニュアルに従って、プラスミド中にクローニングされているゲノムＤＮＡ断片の塩基配列を解析した。
【００９０】
その結果、配列番号８に示される塩基配列が得られた。配列番号８に示される塩基配列中に、配列番号１に示す３９３ｂｐのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ１）、及び配列番号３に示す３８４ｂｐのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ２）を見出した。このＯＲＦ１及びＯＲＦ２のコードするアミノ酸配列は、図１中に示したＡ〜Ｄのロドコッカス属細菌由来エンドヌクレアーゼに対して６８％〜９４％の相同性を持っていることから、ＯＲＦ１及びＯＲＦ２はエンドヌクレアーゼをコードしていることが推定されたため、ＯＲＦ１及びＯＲＦ２のコードするエンドヌクレアーゼをそれぞれＲｒｈＪ１ＩＩＩヌクレアーゼ（１ｓｔ）及びＲｒｈＪ１ＩＩＩヌクレアーゼ（２ｎｄ）と命名した。また、本実施例３（２）で得られたＯＲＦ１及びＯＲＦ２を含むプラスミドをｐＢＲｒｈＪ１ＩＩＩと命名した。
【００９１】
なお、大腸菌ＪＭ１０９株のコンピテントセルは以下の方法で調製した。
【００９２】
大腸菌 ＪＭ１０９株をＬＢ培地１ｍＬに接種し、３７℃で５時間好気的に前培養した。次に、前培養液０．４ｍＬをＳＯＢ培地４０ｍＬ（２％バクトトリプトン、０．５％バクトイーストエキス、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、２．５ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２）に加え、１８℃で２０時間培養した。得られた培養物を遠心分離（３，７００×ｇ、１０分間、４℃）により集菌した後、冷ＴＦ溶液（２０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ６．０）、２００ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＣａＣｌ２、４０ｍＭ  ＭｎＣｌ２）を１３ｍＬ加え、０℃で１０分間放置し、再度遠心分離（３，７００×ｇ、１０分間、４℃）して上清を除いた。得られた大腸菌菌体を冷ＴＦ溶液３．２ｍＬに懸濁し、０．２２ｍＬのジメチルスルホキシドを加え、０℃で１０分間放置した後、液体窒素を用いて凍結したものをコンピテントセルとした。
【００９３】
［実施例４］
大腸菌組換体によるＲｒｈＪ１ＩＩＩヌクレアーゼの生産
（１）ＲｒｈＪ１ＩＩＩヌクレアーゼ発現プラスミドの構築
ＲｒｈＪ１ＩＩＩヌクレアーゼを得るために、実施例１で得られたＪ１菌染色体ＤＮＡを鋳型として使用し、以下に示す反応液組成及びプライマーを用いてＰＣＲを行った。この際、ＲｒｈＪ１ＩＩＩヌクレアーゼをＨｉｓ−ｔａｇ融合タンパクとして発現させるため、ＲｒｈＪ１ＩＩＩヌクレアーゼ遺伝子上流にＳＤ配列とＨｉｓ−ｔａｇ配列を付加した。
反応液組成                                                                      
鋳型ＤＮＡ（Ｊ１菌染色体ＤＮＡ）                               ３μＬ
２×ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＭａｘＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社）２５μＬ
１０μＭプライマーＮ（配列番号９）                                    ２μＬ
１０μＭプライマーＣ（配列番号１０）                                  ２μＬ    
総量                                                           ５０μＬ
温度サイクル：９８℃：１０秒、５５℃：５秒及び７２℃：５秒の反応を３０サイクル
プライマー
Ｎ：５’−ＧＣＧＡＡＴＴＣＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＧＡＴＡＴＧＣＧＴＣＡＣＧＡＴＣＧＧＡＧＧＡＴＧ−３’（配列番号９）
Ｃ：５’−ＧＴＡＡＧＣＴＴＴＣＡＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＡＴＧＴＣＣＣＣＡＣＧＡＣＧＧＴＣＧＣＣＧＣＡＡＣＣＧＣＣ−３’（配列番号１０）。
【００９４】
反応終了後、反応液５μＬを１％アガロースゲルにおける電気泳動に供し、約０．４ｋｂのＰＣＲ産物の検出を行った。ＰＣＲ産物を確認した後、反応液からＰＣＲ産物をＤＮＡ／ＲＮＡ  ｅｘｔａｃｔｉｏｎＫｉｔ（ＶＩＯＧＥＮＥ社）で精製した。
【００９５】
得られたＰＣＲ産物を、制限酵素ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断した。制限酵素処理を行ったＰＣＲ産物を１％アガロースゲルにおける電気泳動に供し、約０．５ｋｂ付近のバンドを回収した。回収したＰＣＲ産物をベクターｐＵＣ１８のＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ部位に連結し、プラスミドを作製した。得られたプラスミドをｐＲＲ０３と名づけた。図２はプラスミドｐＲＲ０３の構造を示す模式図である。
【００９６】
このプラスミドで大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、１００μｇ／ｍＬアンピシリン、１ｍＭ  ＩＰＴＧ、５０μｇ／ｍＬ  Ｘ−ｇａｌを含むＬＢ寒天培地上でコロニーを形成させた。得られた白色のコロニーを１００μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ液体培地に植菌し、３７℃で一晩培養した後Ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｓｙｓｔｅ（Ｖｉｏｇｅｎｅ社）を使用してプラスミドを回収し、シークエンス解析を行って目的のＤＮＡ断片が挿入されていることを確認した。
【００９７】
（２）ヌクレアーゼ活性の確認
（１）で作製したＲｒｈＪ１ＩＩＩヌクレアーゼ発現ベクターを含む大腸菌組換体（ＪＭ１０９／ｐＲＲ０３）を、１００μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ液体培地１０ｍＬで３７℃、５時間培養した後、１ｍＬを１００μｇ／ｍＬアンピシリン、１ｍＭ  ＩＰＴＧを含むＬＢ液体培地２００ｍＬ×１本に植菌し、２５℃、１５０ｒｐｍ、２０時間培養した。
【００９８】
培養液を遠心分離によって回収し、回収した菌体を破砕用緩衝液（組成：２０  ｍＭ  Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ｐＨ７．４）、５００  ｍＭ  ＮａＣｌ）に懸濁した後４℃で３０分間超音波による破砕（Ｉｎｓｏｎａｔｏｒ（ＫＵＢＯＴＡ社）２００Ｗ）を行った。破砕液を遠心分離し、得られた上清を無細胞抽出液とした。
【００９９】
無細胞抽出液からＨｉｓＴｒａｐ  カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて目的タンパク質を部分精製し、０．５μｇ  の基質ＤＮＡ  を含む２０μｌ  の反応液中、３７℃で酵素反応を行った。酵素処理したプラスミドＤＮＡをアガロースゲル電気泳動で分離した結果、閉環状ｐＢＲ３２２  が開環状へ変化していることが示された（図３）。
【産業上の利用可能性】
【０１００】
本発明の新規ヌクレアーゼ及びその遺伝子は、遺伝子工学の分野で有用であり、鎖置換型恒温核酸増幅や、染色体ＤＮＡの蛍光標識による可視化、生体内遺伝子ターゲティングのための相同組換えを誘発するための一本鎖ＤＮＡ切断反応などに利用できる。
【配列表フリーテキスト】
【０１０１】
配列番号５：プライマーＤＧ−０１
配列番号６：プライマーＤＧ−０２
配列番号７：Ｈｉｓ−ｔａｇプライマーＨＩＳ
配列番号８：Ｓｔｒｅｐｔ−ｔａｇプライマーＳＴＲＥＰ
配列番号９：転写開始シグナルプライマー（フォワード）ＮＨ
配列番号１０：転写開始シグナルプライマー（リバース）ＣＳ
【図２】
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【図１】
2014221015.tif 000003
【図３】
2014221015.tif 000004
【配列表】
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