(57)【要約】【課題】脳症を簡易かつ迅速に検出する方法を提供する。【解決手段】本発明の脳症の検出方法は、以下のステップ：（１）脳症が疑われる患者から採取した血液中のキノリン酸含有量及び／又はキヌレニン含有量を測定する、及び（２）前記キノリン酸含有量及び／又はキヌレニン含有量を、脳症非発症者又は脳症発症者の基準レベルと比較する、を含む【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
脳症の検出方法であって、以下のステップ：
（１）被験者から採取された血液中のキノリン酸含有量及び／又はキヌレニン含有量を測定する、及び
（２）前記キノリン酸含有量及び／又はキヌレニン含有量を、脳症非発症者又は脳症発症者の基準レベルと比較する、
を含む、前記脳症の検出方法。
【請求項２】
前記脳症が急性脳症である、請求項１に記載の脳症の検出方法。
【請求項３】
前記急性脳症が、ＨＨＶ−６脳症又はインフルエンザ脳症である、請求項２に記載の脳症の検出方法。
【請求項４】
ステップ（２）の脳症非発症者の基準レベルは、非脳症性急性期の患者から取得したものであり、また、脳症発症者の基準レベルは、脳症性急性期の患者から取得したものである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の脳症の検出方法。
【請求項５】
キノリン酸及び／又はキヌレニンからなる、脳症検出用バイオマーカー。
【請求項６】
前記脳症が急性脳症である、請求項５に記載の脳症検出用バイオマーカー。
【請求項７】
前記急性脳症が、ＨＨＶ−６脳症又はインフルエンザ脳症である、請求項６に記載の脳症検出用バイオマーカー。
【請求項８】
非脳症性急性期と脳症性急性期とを区別するための、請求項５〜７のいずれか一項に記載の脳症検出用バイオマーカー。
【請求項９】
（１）診断対象の被検者から採取された血液中のバイオマーカーの含有量を取得するステップ、
（２）前記取得された含有量に基づいて、前記被験者が脳症を発症しているか、あるいは、脳症を発症していないかのいずれかを判定するステップ、及び、
（３）得られた判定結果を出力するステップ
をコンピュータに実行させるためのプログラムであって、前記バイオマーカーが、キノリン酸及び／又はキヌレニンから選択されることを特徴とする、前記プログラム。
【請求項１０】
請求項９に記載のプログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脳症の検出方法に関し、より詳細には、新規なバイオマーカーを用いた脳症の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
脳症は、インフルエンザウイルス、ヒトヘルペスウイルス６型（ＨＨＶ−６）、ロタウイルス等のウイルス、腸管出血性大腸菌、サルモネラ菌等の細菌の感染等に伴って発症し、意識障害、痙攣、異常行動、幻覚等の症状を伴う疾患である。インフルエンザ脳症やＨＨＶ−６脳症では、主に小児に発症し、死亡率が比較的高く、死亡に至らなくても後遺症が残ることがある。インフルエンザ脳症の治療法は、抗インフルエンザ薬やステロイドの投与や対症療法による。ＨＨＶ−６脳症の治療法は、抗ウイルス薬、ステロイドの投与や対症療法による。
【０００３】
インフルエンザウイルスやＨＨＶ−６に感染して発熱、痙攣、意識障害等になった患者が、通常の外来や救急外来を受診する場合には、脳症が疑われる。しかし、インフルエンザやＨＨＶ−６罹患時には、高熱による熱性痙攣も起きやすい。したがって、痙攣等が熱性痙攣であるのかウイルス性の急性脳症であるのかを疾患の初期段階に判断することは非常に困難である。一方で、脳症は進行が早いため、脳症を早期に発見して適切な治療を施さないと、重篤な予後となる可能性が高まる。早期診断して、適切な治療を早く行なう必要がある状況にあって、簡便かつ迅速な診断法として脳症のバイオマーカーの応用が診療現場で望まれている。
【０００４】
バイオマーカーを用いてインフルエンザ脳症を迅速に診断しようとする試みがある。例えば、特許文献１は、髄液中に含まれる１４−３−３タンパク質をバイオマーカーとする方法を開示する。特許文献２は、髄液中に含まれるアミノ酸配列ＥＡＥＡＥＡＥＥを含む特定の断片ペプチドをバイオマーカーとする方法を開示する。これらの方法は、髄液を採取する浸襲的なものであるため、その実用化は難しい。ＨＨＶ−６脳症のバイオマーカーは、これまで報告されていない。
【特許文献１】特開２００５−２９２１０８
【特許文献２】特開２００９−２６４８４５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
そこで、本発明の課題は、より簡易かつ迅速に脳症を検出する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者等は、上記課題を鋭意検討した結果、トリプトファンの代謝経路で生成される特定の代謝物質の含有量が、脳症発症者と脳症非発症者との間で変動することを見出し、本発明を完成させた。すなわち、本発明は、脳症の検出方法であって、以下のステップ：
（１）被験者から採取された血液中のキノリン酸含有量及び／又はキヌレニン含有量を測定する、及び
（２）前記キノリン酸含有量及び／又はキヌレニン含有量を、脳症非発症者又は脳症発症者の基準レベルと比較する、
を含む、前記検出方法を提供する。
【０００７】
特開２００７−２４６５０７（疲労の予防・治療組成物及び予防・治療方法）には、感染症や炎症性疾患で急増したキノリン酸が脳内の神経細胞を傷害し、その結果、疲労感が起こされること記載されている。しかし、キノリン酸と脳症との関連性についての記載はない。
【０００８】
本発明の方法は、特に急性脳症を検出する方法である。
【０００９】
前記急性脳症は、例えばＨＨＶ−６脳症又はインフルエンザ脳症である。
【００１０】
ステップ（２）の脳症非発症者の基準レベルは、非脳症性急性期の患者から取得したものであり、そして、脳症発症者の基準レベルは、脳症性急性期の患者から取得したものであることが好ましい。ここで、急性期とは、急激に悪化が進行していく時期を意味する。
【００１１】
本発明は、また、キノリン酸及び／又はキヌレニンからなる、脳症検出用バイオマーカーを提供する。
【００１２】
前記バイオマーカーが対象とする脳症は、特に急性脳症である。
【００１３】
前記急性脳症は、例えばＨＨＶ−６脳症又はインフルエンザ脳症である。
【００１４】
前記脳症検出用バイオマーカーは、特に、非脳症性急性期と脳症性急性期とを区別するためにある。
【００１５】
本発明は、また、
（１）診断対象の被検者から採取された血液中のバイオマーカーの含有量を取得するステップ、
（２）前記取得された含有量に基づいて、前記被験者が脳症を発症しているか、あるいは、脳症を発症していないかのいずれかを判定するステップ、及び、
（３）得られた判定結果を出力するステップ
をコンピュータに実行させるためのプログラムであって、前記バイオマーカーが、キノリン酸及び／又はキヌレニンから選択されることを特徴とするプログラムを提供する。
【００１６】
本発明は、また、上記プログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体を提供する。
【発明の効果】
【００１７】
脳症発症者の血液中のキノリン酸及びキヌレニンレベルは、非感染症患者と比較して有意に高い。そこで、本発明の脳症の検出方法は、脳症が疑われる被験者から採取された血液中のキノリン酸及び／又はキヌレニンレベルを測定することで、脳症非発症者と脳症発症者とを簡易かつ迅速に区別可能である。本発明の検出方法は、ＨＨＶ−６、インフルエンザ脳症等の急性脳症の有力な検知手段として期待される。
【００１８】
脳症性急性期の患者の血液中のキノリン酸及びキヌレニンレベルは、非脳症性急性期の患者と比較して有意に高い。そこで、本発明の検出方法は、ステップ（２）の脳症非発症者の基準レベルを非脳症性急性期の患者から取得したものとし、そして、脳症発症者の基準レベルは、脳症性急性期の患者から取得したものとすることで、非脳症性急性期と脳症性急性期とを簡易かつ迅速に区別可能である。すなわち、脳症を惹起する疾病の早期発症時に脳症の有無を判断できる。これは、脳症の有無に応じて的確な治療方針を立てるのに役立つ。
【００１９】
本発明の検出方法に使用するバイオマーカーは、血液中に存在するため、従来の髄液中のバイオマーカーを測定するよりも、患者の負担が少ない。測定作業も容易である。さらに、血液中の複数のバイオマーカーを例えばＴＯＦＭＳやＭＳで分析すれば、複数のバイオマーカーを一度に測定できるため、検出精度を向上させることが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１Ａ〜Ｅは、それぞれ、コントロール群（ＨＨＶ−６非感染患者、Ｉ）、非脳症急性期群（ＩＩ）又は脳症急性期群（ＩＩＩ）について、キノリン酸（実施例１）、キヌレニン（実施例２）、トリプトファン（比較例１）、インドール３−酢酸（比較例２）、及びセロトニン（比較例３）の血清中含量を示す。トリプトファンの代謝物質であるキノリン酸のレベルは、ＨＨＶ−６感染脳症患者群がコントロール群より２．６倍高く、そして、ＨＨＶ−６感染熱性痙攣群より１．５倍高い。また、キノリン酸と同じ代謝経路にあるキヌレニンのレベルは、ＨＨＶ−６感染脳症患者群がコントロール群より１．７倍高く、そして、ＨＨＶ−６感染熱性痙攣群より１．４倍高い。一方、キノリン酸やキヌレニンに代謝される前のトリプトファン、トリプトファンの別の代謝経路にあるインドール３−酢酸やセロトニンには、有意差が見られない。
【図２】図１Ａ及びＢの結果をもとに作成したＲＯＣ曲線を示す図である。図２Ａがキノリン酸、そして図２Ｂがキヌレニンである。
【図３】図３Ａ〜Ｅは、それぞれ、非脳症急性期群（Ｉ）及び脳症急性期群（ＩＩ）について、キノリン酸（実施例３）、キヌレニン（実施例４）、トリプトファン（比較例４）、インドール３−酢酸（比較例５）、及びセロトニン（比較例６）の血清中含量を示す。脳症急性期群のキノリン酸のレベルは、非脳症急性期群より１．２８倍高い。また、脳症急性期群のキヌレニンのレベルは、非脳症急性期群より１．５１倍高い。一方、トリプトファン及びセロトニンには、非脳症急性期群と脳症急性期群との間に有意差が見られない。インドール３−酢酸レベルは、脳症急性期群で減少した。
【図４】図３Ａ及びＢの結果をもとに作成したＲＯＣ曲線を示す図である。図４Ａがキノリン酸、そして図４Ｂがキヌレニンである。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下に、本発明の実施の形態をより詳細に説明する。本発明の脳症の検出方法は、
（１）被験者から採取された血液中のキノリン酸含有量及び／又はキヌレニン含有量を測定する、及び
（２）前記キノリン酸含有量及び／又はキヌレニン含有量を、脳症非発症者又は脳症発症者の基準レベルと比較する、
というステップを含む。
【００２２】
本発明の検出方法の対象となる脳症は、ウイルス感染、代謝異常等によって発症し、意識障害、痙攣、異常行動、幻覚等の症状を伴う疾患である。具体的には、インフルエンザ脳症、ＨＨＶ−６脳症、ロタウイルス関連脳症、敗血症性脳症、脂肪酸代謝異常症による脳症が例示される。本発明の方法は、特に、インフルエンザ脳症、ＨＨＶ−６脳症等の急性脳症の検出に有用である。なお、本発明のバイオマーカーは、患者が脳症を発症していることを確認する発症マーカー又は患者が脳症を発症していないことを確認する健常マーカーのいずれとしても機能する。
【００２３】
本発明の検出方法の被験者は、脳症が疑われる者であり、脳症非発症者及び脳症発症者を含む。脳症非発症者は、健常者、脳症と関連しない疾病の患者、及び脳症を引き起こす疾病（例えばインフルエンザ感染、ＨＨＶ−６感染）の非脳症急性期患者のいずれかであり得る。
【００２４】
本発明の検出方法は、被験者が、脳症を引き起こす疾病の急性期における、非脳症性急性期と脳症性急性期の患者を含む場合に有用である。非脳症性急性期には、例えば、インフルエンザ脳症の場合の非脳症急性期や、ＨＨＶ−６脳症の場合のＨＨＶ−６熱性痙攣が挙げられる。一方、脳症性急性期には、インフルエンザ脳症の場合の脳症急性期や、ＨＨＶ−６脳症の場合の脳症急性期が挙げられる。本発明の検出方法は、脳症性急性期と脳症性急性期との区別が可能である。これは、急性期の治療方針の決定に非常に役立つ。
【００２５】
ステップ（１）で採取される血液は、血液自体、血液から分離された血清及び血漿であり得る。好ましくは血清又は血漿である。血液から血清又は血漿を分離する方法は、特に限定されず、例えば静置法、遠心分離法等である。
【００２６】
ステップ（１）は、キノリン酸及び／又はキヌレニンをバイオマーカーとして使用する。キノリン酸は、トリプトファンの代謝経路であるキヌレニン経路における代謝物の一種である。以下、キノリン酸及び／又はキヌレニンを、本発明のバイオマーカーということがある。
【００２７】
本発明のバイオマーカーは、キノリン酸又はキヌレニンの一種単独でもよく、あるいはキノリン酸及びキヌレニンの併用でもよい。両者を併用すると、検出の精度が高まる。また、本発明のバイオマーカーのほかに、脳症との関連が報告されている公知のバイオマーカーを組み合わせて、検出の精度を高めことができる。
【００２８】
上記バイオマーカーの含有量を、公知の汎用方法で測定する。例えば、キャピラリー電気泳動-質量分析計（ＣＥ−ＭＳ）法、高速液体クロマトグラフィー−質量分析計（ＬＣ−ＭＳ）法、ガスクロマトグラフィー−質量分析計（ＧＣ−ＭＳ）法、ＮＭＲ分析、酸アルカリ中和滴定、アミノ酸分析、酵素法、核酸アプタマー／ペプチドアプタマーもしくは抗体を利用する方法、比色定量法、高速液体クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー、質量分析法等が挙げられる。血液中のバイオマーカーが微量であることから、高い測定精度の得られるＣＥ−ＭＳ法、ＬＣ−ＭＳ法、ＧＣ−ＭＳ法、高速液体クロマトグラフィー、酵素法及び抗体法が好ましい。
【００２９】
血液中のバイオマーカー含有量は、バイオマーカーの絶対濃度、バイオマーカーの絶対濃度と相関して各個体の絶対濃度の比較できる値のいずれでもよい。そのような値の例には、相対濃度、単位体積辺りの重量、絶対濃度を知るために測定した生データ（例えば、ＣＥ−ＭＳ法を用いた測定で得られるグラフのピーク面積を標準化した値）等が挙げられる。好ましくは、絶対濃度である。
【００３０】
以下に、ＣＥ−ＭＳ法によるバイオマーカー含有量の測定方法を詳細に説明する。ＣＥ−ＭＳを用いて測定する場合、定法により血液から得られる血清又は血漿を、さらに以下の前処理をすることが好ましい。
【００３１】
まず、血清又は血漿をアルコール溶媒と混合し、血清中又は血漿中に含まれる酵素の反応を停止させる。アルコール溶媒は、特に限定されないが、メタノールが好ましい。
【００３２】
酵素反応を停止させた血清又は血漿に水及び水と相分離できる有機溶媒を加えて混合して相分離することによって、リン脂質等の脂溶性物質を含む有機相を除去する。有機溶媒は、ジクロロメタン、クロロホルム及びジクロロエタンが好ましく、クロロホルムが特に好ましい。
【００３３】
得られた水相からタンパク質を除去することが好ましい。タンパク質を除去する方法は、特に限定されないが、限外ろ過が好ましい。
【００３４】
タンパク質を除去した後、水相中に含まれるアルコール溶媒を留去することが好ましい。溶媒を留去する方法は、自然乾燥、減圧乾燥、減圧遠心乾燥等が挙げられる。減圧遠心乾燥は、短時間で簡便に行える点で好ましい。
【００３５】
ＣＥ−ＭＳ法に用いるサンプルは、バイオマーカーである化合物の電気泳動時間や含有量の測定基準となる内部標準物質を含み得る。内部標準物質の例には、メチオニンスルホン、１０−カンファースルホン酸（１０−ｃａｍｐｈｏｒｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ、ＣＳＡ）が挙げられる。
【００３６】
キャピラリー電気泳動のためのキャピラリーとしては、ヒューズドシリカキャピラリーが好ましい。キャピラリーの内径は、分離能の向上の点で、好ましくは１００μｍ以下であり、特に好ましくは５０μｍである。キャピラリーの全長は、好ましくは５０ｃｍ〜１５０ｃｍである。
【００３７】
上記キャピラリー電気泳動後の画分から目的のバイオマーカーを含む画分を特定する方法は、特に限定されない。例えば、予め目的化合物の標品を用いて当該化合物の電気泳動時間を測定しておく、又は内部標準物質の電気泳動時間との相対時間を利用することにより、目的の画分を特定する。
【００３８】
バイオマーカー物質が含まれる特定画分中の、目的化合物のｍ／ｚを有する化合物の含有量を、ピーク面積として測定する。測定されたピーク面積は、内部標準物質のピーク面積との比を取ることで標準化する。具体的には、血清中に含まれるバイオマーカーの含有量をＣＥ−ＭＳによって測定して得られたグラフ中のバイオマーカーのピーク面積を、１０μＭ  メチオニンスルホンのピーク面積（カチオンモードで測定した場合）、又は１０μＭ  １０−カンファースルホン酸のピーク面積（アニオンモードで測定した場合）で除算して得られる値である。
【００３９】
別法として、目的化合物の標品を用いて検量線を作成することによって、測定されたピーク面積から、採血された血液に含まれるバイオマーカーの絶対濃度を求めてもよい。
【００４０】
ステップ（２）では、前記キノリン酸含有量及び／又はキヌレニン含有量を、脳症非発症者又は脳症発症者の基準レベルと比較する。比較のため、予め、脳症非発症者又は脳症発症者の血液中のバイオマーカーレベルを、本検出方法と同一の条件で計測して、基準レベルを求めておく。
【００４１】
ステップ（２）の脳症非発症者の基準レベルとして、好ましくは、非脳症性急性期の患者から取得し、そして、脳症発症者の基準レベルとして、脳症性急性期の患者から取得する。これらの基準値を採用することにより、非脳症性急性期と脳症性急性期とを区別可能となる。
【００４２】
基準レベルは、複数回の測定値の平均値に標準偏差を減じた値から平均値に標準偏差を加えた値までの範囲、平均値の下限値から上限値までの範囲等、特に限定されない。バイオマーカーによって、疾患を診断する際に最も好ましい値又は範囲を選択する。
【００４３】
測定血液中のバイオマーカー含有量が、脳症非発症者の基準レベルを超える場合は、脳症の発症が疑われる。非脳症急性期患者の基準レベルを超える場合は、脳症の発症が強く疑われる。また、前記バイオマーカー含有量が、脳症発症者の基準レベルの下限よりも高ければ、脳症が強く疑われる。
【００４４】
本発明の検出方法により得られた結果は、さらに、臨床検査、臨床診断、頭部画像検査、生理検査（脳波）等の従来の脳症診断方法へ提供される。
【００４５】
本発明は、また、脳症を発症しているかを判別するためのキノリン酸及び／又はキヌレニンの含有量の閾値の決定方法であって、以下のステップ：
（１）脳症を発症していないと診断された複数の患者から採取された血液中のキノリン酸及び／又はキヌレニン含有量を測定する、及び、
（２）脳症を発症していると診断された複数の患者から採取された血液中のキノリン酸及び／又はキヌレニン含有量を測定する、
を含む、前記決定方法を提供する。
【００４６】
ステップ（１）及び（２）において、複数の脳症非発症者及び複数の脳症発症者の血液中のバイオマーカー量をそれぞれ計測する。バイオマーカー量は、上記ピーク面積の生データ、相対濃度、絶対濃度等であり得る。計測値に基づいて閾値を決定する方法は、当業者の定法に従えばよく、特に限定されない。例えば、脳症発症者が閾値以上に所定の割合で含まれ、そして、脳症非発症者が閾値未満に所定の割合で含まれるような閾値を決定する。市販の統計解析ソフトウエア（例えば製品名ＪＭＰ、ＳＡＳ社製）を用いて、判別のカイ二乗値が最良となるような値を求めてもよい。ヒューマン・メタボローム・テクノロジー社製の統計解析ソフトウエアやフリー統計解析ソフトウエアのＲを用いてもよい。
【００４７】
閾値の設定により、バイオマーカーの感度及び特異度が求まる。感度とは、脳症を正しく検出する正確さを意味する。感度が低いと、実際に脳症である患者を正常と判定し、脳症を見逃すリスクが高まる。特異度は、非脳症を脳症であると誤判定しない能力を意味する。特異度が低いと、脳症非発症者を脳症（偽陽性）と判定するリスクが高まる。
【００４８】
閾値、感度及び偽陽性率から、受診者動作特性（ＲＯＣ）曲線を求めてもよい。ＲＯＣ曲線とは、横軸に偽陽性率、縦軸に感度をプロットし、閾値を媒介変数として大から小へ変化させるときに描かれる曲線である。はじめは陽性者も陰性者も捕捉しにくいので、どちらも小さな値をとるが、次第に感度が上がり、遅れて偽陽性度が上がる。最終的には、感度も偽陽性度も１００％になる。バイオマーカーが有能であれば、ＲＯＣ曲線は４５度の傾斜から左上に離れる。すなわち、ＲＯＣ曲線の曲線下面積（ＲＯＣ−ＡＵＣ）は、バイオマーカーの性能を表す。さらに、ＲＯＣ−ＡＵＣのｐ値をｚ−検定により求めてもよい。
【００４９】
脳症が疑われる患者の測定値が、本発明のバイオマーカーを閾値よりも高ければ、脳症を発症している可能性が高い。
【００５０】
脳症を有する実験動物（脳症モデル動物という）を用いて、脳症の治療に効果がある候補物質（例えば、化合物等）を同定することができる。脳症のモデル動物に脳症の治療薬の候補である化合物を投与し、投与前後で採血し、その血液に含まれるバイオマーカーの含有量を測定して、その化合物を投与する前後の血液におけるバイオマーカーの含有量を比較する。化合物投与後に、そのバイオマーカーの含有量が健常の範囲に近づけば、投与した化合物は脳症の治療に効果があると判定できる。このように、本発明のバイオマーカーを用いることにより、疾患の治療に効果がある化合物を容易にスクリーニングすることも可能である。
【００５１】
したがって、本発明は、脳症に対する治療薬の効果の判定方法であって、以下のステップ：
（１）脳症モデル動物に前記治療薬が投与される前に採取された血液に含まれる、キノリン酸及び／又はキヌレニンの含有量を測定する、
（２）前記患者に前記治療薬が投与された後に採取された血液に含まれる、前記化合物の含有量を測定する、
（３）前記治療薬が投与される前後の血液間で、前記測定された化合物の含有量を比較する、
を含む、前記判定方法を提供する。
【００５２】
疾患の治療薬は、一般に、個体によってその効果がばらつくことがある。ある治療薬の効果は、実際に治療薬投与が必要な個体において調べることが非常に有益である。本発明のバイオマーカーを用いれば、容易にその効果を調べることができる。例えば、脳症に対する治療薬を投薬する前後で、発症者から血液を採血し、その採血した血液に含まれるバイオマーカーの含有量を測定して、治療薬を投薬する前後の血液におけるバイオマーカーの含有量を比較する。治療薬の投与後に、そのバイオマーカーの含有量が健常の範囲に近づけば、治療薬は効果があると判定できる。このように、本発明のバイオマーカーを用いることにより、治療薬の効果があるかどうかについて容易に判定することができる。
【００５３】
したがって、本発明は、脳症に対する治療薬の効果の判定方法であって、以下のステップ：
（１）前記脳症を発症している患者に前記治療薬が投与された後に採取された血液に含まれる、キノリン酸及び／又はキヌレニンの含有量を測定する、及び、
（２）前記脳症を発症しているかを判別するために、血液中の前記化合物の含有量の閾値と、前記測定された化合物の含有量とを比較する、
を含む、前記判定方法を提供する。
【００５４】
本発明は、また、脳症モデル動物のスクリーニング方法であって、以下のステップ：
（１）候補動物から血液を採取する、及び、
（２）前記血液中のキノリン酸及び／又はキヌレニン含有量を測定する、
を含む、前記方法を提供する。
【００５５】
本発明は、また、脳症治療薬のスクリーニング方法であって、以下のステップ：
（１）血液を採取する、
（２）脳症モデル動物から前記血液が採取されたモデル動物に前記治療薬の候補物質を投与する、
（３）前記候補物質が投与されたモデル動物から血液を採取する、
（４）前記候補物質が投与される前後で採取された血液中のキノリン酸及び／又はキヌレニン含有量を測定する、及び、
（５）前記測定された化合物の含有量を、前記候補物質が投与される前後で比較する、
を含む、前記スクリーニング方法を提供する。
【００５６】
本発明は、また、脳症の診断方法であって、以下のステップ：
（１）診断対象の被検者の血液中のキノリン酸及び／又はキヌレニン含有量を測定する、
を含む、前記診断方法を提供する。
【００５７】
本発明は、また、（１）診断対象の被検者から採取された血液中のバイオマーカーの含有量を取得するステップ、
（２）前記取得された含有量に基づいて、前記被験者が脳症を発症しているか、あるいは、脳症を発症していないかのいずれかを判定するステップ、及び、
（３）得られた判定結果を出力するステップ
をコンピュータに実行させるためのプログラムであって、
前記バイオマーカーがキノリン酸及び／又はキヌレニンから選択されることを特徴とする、前記プログラムを提供する。
【００５８】
脳症が疑われる患者から採取された血液中に含まれるバイオマーカーの含有量が測定され、その結果が、コンピュータに送信され、上述の方法に従って、コンピュータが、その結果を利用する。例えば、医師等が患者から血液を採取し、適宜処理したサンプルをバイオマーカー測定装置にセットする。コンピュータは、バイオマーカー測定装置に、サンプル中のバイオマーカーの含有量を測定させ、測定結果を取得する。そして、コンピュータは、取得した血液中のバイオマーカーの含有量に基づいて、脳症の発症を検出する。また、コンピュータは、脳症に対する治療薬の薬効を判定することもできる。コンピュータが出力した結果は、医師による診断に供される。
【００５９】
本発明のプログラムは、コンピュータに、取得した血液中のバイオマーカーの含有量を利用する方法を実行させるものである。また、コンピュータに、バイオマーカー測定装置にサンプル中のバイオマーカーの含有量を測定させるステップを実行させてもよい。したがって、上記プログラムは、さらに、バイオマーカー測定装置に、前記採取された血液中の前記バイオマーカーの含有量を測定させるステップを含んでもよい。
【００６０】
本発明は、また、上記プログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体を提供する。記録媒体は、ハードディスク、ＣＤ、ＤＶＤ、ＵＳＢメモリ、フロッピーディスク（登録商標）等、特に限定されない。
【実施例】
【００６１】
以下に、本発明に従う実施例及び本発明に従わない比較例を示すことにより、本発明をより詳細に説明する。
〔実施例１及び２〕ＨＨＶ−６脳症の検出試験
本発明のバイオマーカーが、ＨＨＶ−６感染症に基づく脳症を検出できることを、以下の実験により検証した。
【００６２】
１．血液の採取
表１に示す３種類の被験者群から血液を採取した。
【表１】
2014194396.tif 000003
ＡＥＳＤ：遅発性拡散低下を伴う急性脳症
【００６３】
上記各群の患者もしくは保護者からインフォームドコンセントを得た上で、５ｍＬ採血し、血清を単離した。測定まで−８０℃〜液体窒素中の低温下で保管した。
【００６４】
２．代謝物質の血清中濃度の測定
バイオマーカーとなる代謝物質であるキノリン酸（実施例１）及びキヌレニン（実施例２）を、上記血清からそれぞれ抽出ための前処理を行なった。キノリン酸及びキヌレニンは、トリプトファンからの同一の代謝経路上の代謝中間体である。比較のため、トリプトファンからの別の代謝経路上の中間体であるトリプトファン（比較例１）、インドール３−酢酸（比較例２）及びセロトニン（比較例３）もまた、上記血清からそれぞれ抽出した。
【００６５】
血清５０μＬを遠心チューブに入れ、内部標準溶液として１０μＭのメチオニンスルホンと１０μＭの１０−カンファースルホン酸（Ｈ３３０４−１００２、販売製造元：ヒューマン・メタボローム・テクノロジーズ株式会社）を含有するメタノール（和光純薬、ＬＣ／ＭＳ用）０．４５ｍＬを加え、クロロホルム（和光純薬、試薬特級）０．５ｍＬ及びＭｉｌｌｉ−Ｑ水２００μＬを加えた。ボルテックスで３０秒間よく混合し、遠心分離（４℃、２，３００×ｇ、５分）した。水相を限外ろ過フィルター（ミリポア社製Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ−ＭＣＰＢＣＣ遠心式フィルターユニット５ｋＤａ）に移し、フィルターカップ内の溶液が、ほぼなくなるまで遠心ろ過（４℃、９，１００×ｇ、２−４時間）した。フィルターカップを取り除き、ろ液を減圧下で遠心乾燥した。乾燥物を、内部標準物質を添加した５０μＬのＭｉｌｌｉ−Ｑ水に再溶解することによって、ＣＥ−ＭＳ測定用サンプルを調製した。
【００６６】
ＣＥ−ＭＳの測定とデータ解析は、慶應義塾大学先端生命科学研究所が開発したＭａｓｔｅｒＨａｎｄｓＴＭを用いて行った。ＣＥ−ＭＳを測定する際のキャピラリーには、Ｆｕｓｅｄ  ｓｉｌｉｃａ  ｃａｐｉｌｌａｒｙを用いた。
【００６７】
前記代謝物質を、市販の標品と比較することによって同定した。具体的には、調製したＣＥ−ＭＳ測定用サンプルのみをＣＥ−ＭＳ測定した結果と、市販の標品のみをＣＥ−ＭＳ測定した結果とを比較し、ＣＥ−ＭＳ測定用サンプルに含まれるバイオマーカーである各化合物の保持時間及び分子量と、市販の標品の保持時間及び分子量とが一致することを確認した。さらに、ＣＥ−ＭＳ測定用サンプルと市販の標品との混合物をＣＥ−ＭＳ測定し、ＣＥ−ＭＳ測定用サンプルに含まれるバイオマーカーである各化合物のピークと、市販の標品とのピークとが分離せずに重なることを確認した。
【００６８】
コントロール群（Ｉ）、非脳症急性期群（ＩＩ）及び脳症急性期群（ＩＩＩ）から採血し調製された血清由来の測定用サンプルについて、カチオンモード及びアニオンモードでのＣＥ−ＭＳ測定を行った。ＣＥ−ＭＳの測定の測定条件を以下に示す。
（Ｉ）カチオンモード
Ｒｕｎ  ｂｕｆｆｅｒ：  Ｃａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  （ｐ／ｎ：  Ｈ３３０１−１００１）
Ｒｉｎｓｅ  ｂｕｆｆｅｒ：  Ｃａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  （ｐ／ｎ：  Ｈ３３０１−１００１）
Ｓａｍｐｌｅ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ：  Ｐｒｅｓｓｕｒｅ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ５０  ｍｂａｒ，  １０  ｓｅｃ
ＣＥ  ｖｏｌｔａｇｅ：  Ｐｏｓｉｔｉｖｅ，  ２７  ｋＶ
ＭＳ  ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ：  ＥＳＩ  Ｐｏｓｉｔｉｖｅ
ＭＳ  ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｖｏｌｔａｇｅ：  ４，０００  Ｖ
ＭＳ  ｓｃａｎ  ｒａｎｇｅ：  ｍ／ｚ  ５０−１，０００
Ｓｈｅａｔｈ  ｌｉｑｕｉｄ：  ＨＭＴ  Ｓｈｅａｔｈ  Ｌｉｑｕｉｄ  （ｐ／ｎ：  Ｈ３３０１−１０２０）
（ＩＩ）アニオンモード
Ｒｕｎ  ｂｕｆｆｅｒ：  Ａｎｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  （ｐ／ｎ：  Ｈ３３０２−１０２１）
Ｒｉｎｓｅ  ｂｕｆｆｅｒ：  Ａｎｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  （ｐ／ｎ：  Ｈ３３０２−１０２２）
Ｓａｍｐｌｅ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ：  Ｐｒｅｓｓｕｒｅ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ５０  ｍｂａｒ，  ２５  ｓｅｃ
ＣＥ  ｖｏｌｔａｇｅ：  Ｐｏｓｉｔｉｖｅ，  ３０  ｋＶ
ＭＳ  ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ：  ＥＳＩ  Ｎｅｇａｔｉｖｅ
ＭＳ  ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｖｏｌｔａｇｅ：  ３，５００  Ｖ
ＭＳ  ｓｃａｎ  ｒａｎｇｅ：  ｍ／ｚ  ５０−１，０００
Ｓｈｅａｔｈ  ｌｉｑｕｉｄ：  ＨＭＴ  Ｓｈｅａｔｈ  Ｌｉｑｕｉｄ  （ｐ／ｎ：  Ｈ３３０１−１０２０）
【００６９】
ＣＥ−ＭＳで検出されたピークは、ピーク情報としてｍ／ｚ、泳動時間（Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ｔｉｍｅ：  ＭＴ）及び面積値を得た。得られたピーク面積値は下式を用いて相対面積値に変換した。
（１）カチオンモードで測定した場合：
【数１】
2014194396.tif 000004
（２）アニオンモードで測定した場合：
【数２】
2014194396.tif 000005
【００７０】
上記の標準化されたＣＥ−ＭＳピーク面積で表される血清中の各代謝物質の含有量の平均値と標準偏差を、コントロール群（Ｉ）、ＨＨＶ−６熱性痙攣群（ＩＩ）、及びＨＨＶ−６脳症群（ＩＩＩ）について求めた。結果を表２に示す。表中の（ｘ１０−４）との記載は、表の中の値を１０−４倍した値であることを示す。したがって、表中の数値の１０−４倍が真値である。
【００７１】
さらに、コントロール群（Ｉ）又はＨＨＶ−６熱性痙攣群（ＩＩ）に対するＨＨＶ−６脳症群（ＩＩＩ）の値の比率（Ｒａｔｉｏ）を求めた。さらに、Ｗｅｌｃｈのｔ−検定によって比率の有意性（ｐ値）を計算した。結果を表２Ａに示す。図１Ａ〜Ｅには、Ｉ〜ＩＩＩ群について各代謝物質の平均レベル（相対値）をグラフ化する。
【００７２】
【表２Ａ】
2014194396.tif 000006
＊＊＊：ｐ  ｖａｌｕｅ＜０．００１
＊＊：ｐ  ｖａｌｕｅ＜０．０１
＊：ｐ  ｖａｌｕｅ＜０．０５
【００７３】
表２Ａのキノリン酸及びキヌレニンの相対値を絶対濃度に換算した。また、ヒューマン・メタボローム・テクノロジー社製の統計解析ソフトウエアを用いて、閾値、感度及び特異度を求めた。これらの結果を表２Ｂに示す。さらに、図２に示すＲＯＣ曲線から求めたＲＯＣ−ＡＵＣを表２Ｂに示す。
【００７４】
【表２Ｂ】
2014194396.tif 000007
【００７５】
表２Ａ及びＢ、並びに図１Ａに示すとおり、トリプトファンの代謝物質であるキノリン酸（実施例１）レベルは、ＨＨＶ−６感染脳症患者群がコントロール（HHV-6非感染患者）に比べて２．６倍高く、そして、ＨＨＶ−６感染熱性痙攣群に比べて１．５倍高かった。また、表２及び図１Ｂに示すとおり、キノリン酸と同じの代謝経路にあるキヌレニン（実施例２）レベルは、ＨＨＶ−６感染脳症患者群がコントロール（HHV-6非感染患者）に比べて１．７倍高く、そして、ＨＨＶ−６感染熱性痙攣群に比べて１．４倍高かった。一方、表２及び図１Ｃ〜Ｅに示すとおり、キノリン酸やキヌレニンの源であるトリプトファン（比較例１）、並びにキノリン酸及びキヌレニンとは別の代謝経路にあるインドール３−酢酸（比較例２）やセロトニン（比較例３）には、差が見られなかった。すなわち、ＨＨＶ−６感染脳症患者群のキノリン酸及びキヌレニンのレベルが、脳症を発症していないＨＨＶ−６非感染患者群及びＨＨＶ−６感染熱性痙攣群と比べて有意に高いことは、キノリン酸及びキヌレニンを脳症発症のバイオマーカーとして使用できることを示唆する。しかも、ＨＨＶ−６感染脳症患者群がＨＨＶ−６感染熱性痙攣群と比べても有意に高いことは、ＨＨＶ−６感染の早期に痙攣等の症状が認められた場合、単なる熱性痙攣であるか、脳症を発症したかを検出できることを示唆する。これは、ＨＨＶ−６感染から早期の治療方針を立てる上で、非常に有益な情報となる。
【００７６】
表２ＢのＲＯＣ−ＡＵＣが０．７を超えたこと、そして最適な閾値での感度及び特異度が高いことは、本発明のバイオマーカーの診断性能が高いことを示している。
【００７７】
本実験結果から、ＨＨＶ−６脳症の閾値は、キノリン酸について、１．０６〜１．８２が好ましく、特に１．１５〜１．７９μＭが好ましいといえる。また、キヌレニンについて、２．３７〜３．７２が好ましく、特に２．４４〜２．９３μＭが好ましいといえる。
【００７８】
〔実施例３及び４〕インフルエンザ脳症の検出試験
本発明のバイオマーカーが、インフルエンザに基づく脳症を検出できることを、以下の実験により検証した。具体的には、以下に示す二種類の患者群から取得した血清中の代謝物質であるキノリン酸（実施例３）及びキヌレニン（実施例４）レベルを、実施例１と同様の手順でＣＥ−ＭＳ法により測定した。また、比較のため、トリプトファン（比較例４）、インドール３−酢酸（比較例５）及びセロトニン（比較例６）の血清中濃度も測定した。
【００７９】
１．バイオマーカー測定用サンプルの調製
表３に示す３種類の被験者群から血液を採取した。
【表３】
2014194396.tif 000008
【００８０】
各群の診断は、厚生労働省インフルエンザ脳症研究班によるインフルエンザ脳症ガイドライン改訂版（平成２１年９月）に従った。具体的には、インフルエンザの診断を、迅速診断キットを用いたインフルエンザ抗原検査、インフルエンザウイルスの分離、インフルエンザウイルスのＲＮＡ遺伝子検査、及び、ペア血清による抗インフルエンザ抗体価測定の、いずれか一つ以上を用いて行った。インフルエンザ脳症については、インフルエンザに罹患していると診断された患者が、さらに、Ｊａｐａｎ  Ｃｏｍａ  Ｓｃａｌｅ（ＪＣＳ）２０以上の意識障害がある、ＪＣＳ１０以上の意識障害が24時間以上続く、及び、頭部ＣＴ検査にて急性脳症が強く疑われる異常所見があるの、いずれか一つ以上である場合にインフルエンザ脳症を発症していると診断した。
【００８１】
実施例１と同様の手順で、標準化されたＣＥ−ＭＳピーク面積の平均値と標準偏差を、非脳症急性期群（Ｉ）及び脳症急性期群（ＩＩＩ）について求めた。結果を表４Ａに示す。表中の（ｘ１０−４）との記載は、表の中の値を１０−４倍した値であることを示す。したがって、表中の数値の１０−４倍が真値である。さらに、非脳症急性期群（Ｉ）に対する脳症急性期群（ＩＩ）の値の比（Ｒａｔｉｏ）を求めた。Ｗｅｌｃｈのｔ−検定によって、比率の有意性（ｐ値）を計算した。結果を表４Ａに示す。Ｉ〜ＩＩＩ群の各代謝物質の平均レベル（相対値）を、図３Ａ〜Ｅにグラフ化する。
【００８２】
【表４Ａ】
2014194396.tif 000009
【００８３】
表４Ａのキノリン酸及びキヌレニンの相対値を絶対濃度に換算した。また、ヒューマン・メタボローム・テクノロジー社製の統計解析ソフトウエアを用いて、閾値、感度及び特異度を求めた。これらの結果を表４Ｂに示す。さらに、図４に示すＲＯＣ曲線から求めたＲＯＣ−ＡＵＣを表４Ｂに示す。
【００８４】
【表４Ｂ】
2014194396.tif 000010
【００８５】
表４Ａ及びＢ並びに図３Ａに示すとおり、脳症急性期群のキノリン酸レベルは、非脳症急性期群に比べて１．２８倍高かった。また、表４及び図３Ｂに示すとおり、脳症急性期群のキヌレニンレベルは、非脳症急性期群に比べて１．５１倍高かった。一方、図３Ｃ〜Ｅに示すとおり、トリプトファン及びセロトニンには、有意差が見られなかった。インドール３−酢酸レベルは、逆に減少した。インフルエンザ罹患者の脳症急性期群のキノリン酸及びキヌレニンのレベルが非脳症急性期群と比べて有意に高いことは、キノリン酸及びキヌレニンを脳症発症のバイオマーカーとして使用できることを示唆する。特に、インフルエンザの感染初期に、患者の脳症発症の有無を検出することが期待できる。これは、インフルエンザ感染で、脳症発症が疑われる時に、早期の治療方針を立てる上で、非常に有益な情報となる。
【００８６】
本実験結果から、インフルエンザ脳症の閾値は、キノリン酸について、０．８７〜０．９１μＭが好ましいといえる。また、キヌレニンについて、１．５２〜２．５１μＭが好ましく、特に１．７１〜１．９３μＭが好ましいといえる。
【００８７】
上記実施例は、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができることは、当業者にとって明らかである。本発明の実施態様を列挙すれば、以下である。
【００８８】
１．  脳症の検出方法であって、以下のステップ：
（１）被験者から採取された血液中のキノリン酸含有量及び／又はキヌレニン含有量を測定する、及び
（２）前記キノリン酸含有量及び／又はキヌレニン含有量を、脳症非発症者又は脳症発症者の基準レベルと比較する、
を含む、前記脳症の検出方法。
２．前記脳症が急性脳症である、上記１項に記載の脳症の検出方法。
３．前記脳症が、ＨＨＶ−６脳症又はインフルエンザ脳症である、上記２項に記載の脳症の検出方法。
４．  ステップ（２）の脳症非発症者の基準レベルは、非脳症性急性期の患者から取得したものであり、そして、脳症発症者の基準レベルは、脳症性急性期の患者から取得したものである、上記１〜３項のいずれかに記載の脳症の検出方法。
５．  キノリン酸及び／又はキヌレニンからなる、脳症検出用バイオマーカー。
６．  前記脳症が急性脳症である、上記５項に記載の脳症検出用バイオマーカー。
７．  前記急性脳症が、ＨＨＶ−６脳症又はインフルエンザ脳症である、上記６項に記載の脳症検出用バイオマーカー
８．  非脳症性急性期と脳症性急性期とを区別するための、上記５〜７項のいずれか一項に記載の脳症検出用バイオマーカー
９．  脳症を発症しているかを判別するためのキノリン酸及び／又はキヌレニンの含有量の閾値の決定方法であって、以下のステップ：
（１）脳症を発症していないと診断された複数の患者から採取された血液中のキノリン酸及び／又はキヌレニン含有量を測定する、
（２）脳症を発症していると診断された複数の患者から採取された血液中のキノリン酸及び／又はキヌレニン含有量を測定する、
を含む、前記決定方法。
１０．  脳症に対する治療薬効果の判定方法であって、以下のステップ：
（１）脳症モデル動物に前記治療薬が投与される前に採取された血液に含まれる、キノリン酸及び／又はキヌレニンの含有量を測定する、
（２）前記患者に前記治療薬が投与された後に採取された血液に含まれる、前記化合物の含有量を測定する、
（３）前記治療薬が投与される前後の血液間で、前記測定された化合物の含有量を比較する、
を含む、前記判定方法。
１１．  脳症に対する治療薬の効果の判定方法であって、以下のステップ：
（１）前記脳症を発症している患者に前記治療薬が投与された後に採取された血液に含まれる、キノリン酸及び／又はキヌレニンの含有量を測定する、
（２）前記脳症を発症しているかを判別するための、血液中の前記化合物の含有量の閾値と、前記測定された化合物の含有量とを比較する、
を含む、前記判定方法。
１２．  脳症モデル動物のスクリーニング方法であって、以下のステップ：
（１）候補動物から血液を採取する、及び、
（２）前記血液中のキノリン酸及び／又はキヌレニン含有量を測定する、
を含む、前記方法。
１３．  脳症治療薬のスクリーニング方法であって、以下のステップ：
（１）脳症モデル動物から血液を採取する、
（２）前記血液が採取されたモデル動物に前記治療薬の候補物質を投与する、
（３）前記候補物質が投与されたモデル動物から血液を採取する、
（４）前記候補物質が投与される前後で採取された血液中のキノリン酸及び／又はキヌレニン含有量を測定する、及び、
（５）前記測定された化合物の含有量を、前記候補物質が投与される前後で比較する、
を含む、前記スクリーニング方法。
１４．  脳症の診断方法であって、以下のステップ：
（１）診断対象の被検者の血液中のキノリン酸及び／又はキヌレニン含有量を測定する
を含む、前記診断方法。
１５．  （１）診断対象の被検者から採取された血液中のバイオマーカーの含有量を取得するステップ、
（２）前記取得された含有量に基づいて、前記被験者が脳症を発症しているか、あるいは、脳症を発症していないかのいずれかを判定するステップ、及び、
（３）得られた判定結果を出力するステップ
をコンピュータに実行させるためのプログラムであって、前記バイオマーカーが、キノリン酸及び／又はキヌレニンから選択されることを特徴とする、前記プログラム。
１６．  さらに、バイオマーカー測定装置に、前記採取された血液中の前記バイオマーカーの含有量を測定させるステップを含む、上記１５項に記載のプログラム。
１７．上記１５又は１６項に記載のプログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体。
【図１】
2014194396.tif 000011
【図２】
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【図３】
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【図４】
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