(57)【要約】【課題】細胞の増殖面積を低下させることなく、マイクロキャリアへの接着工程を短縮することができる細胞培養方法を提供することを目的とする。【解決手段】収容部を有する培養容器を準備する工程と、前記収容部に、細胞、培養液、及び前記細胞と略同じ大きさのマイクロキャリアを導入する工程と、前記細胞と前記マイクロキャリアとを接触させ、前記マイクロキャリアの表面に前記細胞を接着させる工程と、前記マイクロキャリアの表面積を増加させ、前記マイクロキャリアの表面に接着した前記細胞を増殖させる工程と、を含むことを特徴とする。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
収容部を有する培養容器を準備する工程と、
前記収容部に、細胞、培養液、及び前記細胞と略同じ大きさのマイクロキャリアを導入する工程と、
前記細胞と前記マイクロキャリアとを接触させ、前記マイクロキャリアの表面に前記細胞を接着させる工程と、
前記マイクロキャリアの表面積を増加させ、前記マイクロキャリアの表面に接着した前記細胞を増殖させる工程と、
を含む細胞培養方法。
【請求項２】
マイクロキャリアの表面積の増加が、前記マイクロキャリアに刺激を加えることにより、前記マイクロキャリアの水膨潤度を変化させ、前記マイクロキャリア自体の径を大きくすることで行われる請求項１に記載の細胞培養方法。
【請求項３】
マイクロキャリアの表面積の増加が、前記マイクロキャリアに刺激を加えることにより、前記マイクロキャリアの水膨潤度を部分的に変化させ、前記マイクロキャリア自体の形状が非球形となるように径を大きくすることで行われる請求項１に記載の細胞培養方法。
【請求項４】
マイクロキャリアの表面積の増加が、前記マイクロキャリアに刺激を加えることにより、前記マイクロキャリアを親水性から疎水性へと変化させ、複数の前記マイクロキャリア同士を凝集させることで行われる請求項１に記載の細胞培養方法。
【請求項５】
前記マイクロキャリアが電荷を有し、前記マイクロキャリアの表面積の増加が、前記電荷とは逆の電荷を有するイオン又は粒子を前記マイクロキャリアに作用させ、複数の前記マイクロキャリア同士を凝集させることで行われる請求項１に記載の細胞培養方法。
【請求項６】
請求項１に記載の細胞培養方法に用いるマイクロキャリアであって、刺激応答性高分子と、水膨潤性粘土鉱物とを複合化した三次元網目の中に水が包含されている有機無機複合ゲルからなる前記マイクロキャリア。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞培養方法及びそれに用いるマイクロキャリアに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、医薬品の生産や、遺伝子治療、再生医療、免疫療法等の分野において、細胞や組織、微生物等を人工的な環境下で効率良く大量に培養することが求められている。このような要求に対して、合成樹脂からなる培養容器を用いて、細胞を自動的に大量培養することが行われている。
【０００３】
上記の細胞の大量培養技術として、マイクロキャリア培養法が知られている。マイクロキャリア培養法は、培養容器内に、細胞、培養液、及び細胞の接着足場となるマイクロキャリアを導入し、培養液を間欠的に攪拌して細胞とマイクロキャリアを浮遊させ、浮遊した細胞が下降しながらマイクロキャリアに接触することにより、マイクロキャリアの表面に接着して増殖する方法である（例えば、特許文献１）。マイクロキャリアは、体積比に対し、非常に大きい接着及び増殖表面積を提供することが可能であり、細胞の大量培養には有利である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第２０１０／１３８７０２号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、通常マイクロキャリアの大きさは細胞に比して数倍〜数十倍大きいものが用いられ、マイクロキャリアの質量は細胞に比べて極めて大きい。そのため、培養液中でのマイクロキャリアの沈降速度は細胞に比べて極端に速く、細胞とマイクロキャリアの接触確率が極めて低くなる。したがって、多くのマイクロキャリアは細胞と接触せずに培養容器の底に沈降してしまう。一方、細胞をマイクロキャリアに十分に接着させるには攪拌操作を多数回繰り返す必要があり、接着工程に長時間を要することになる。また、接着工程を長時間行うと、細胞へのダメージが懸念される。そこで、マイクロキャリアの大きさを小さくすることが考えられるが、そうするとマイクロキャリアの表面積が減少して細胞の増殖面積を低下させることにつながり、量産性が低下するといった問題がある。
【０００６】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、細胞の増殖面積を低下させることなく、マイクロキャリアへの接着工程を短縮することができる細胞培養方法と、それに用いるマイクロキャリアを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の一実施形態に係る細胞培養方法は、収容部を有する培養容器を準備する工程と、前記収容部に、細胞、培養液、及び前記細胞と略同じ大きさのマイクロキャリアを導入する工程と、前記細胞と前記マイクロキャリアとを接触させ、前記マイクロキャリアの表面に前記細胞を接着させる工程と、前記マイクロキャリアの表面積を増加させ、前記マイクロキャリアの表面に接着した前記細胞を増殖させる工程と、を含むことを特徴とする。
【０００８】
他の態様として、マイクロキャリアの表面積の増加が、前記マイクロキャリアに刺激を加えることにより、前記マイクロキャリアの水膨潤度を変化させ、前記マイクロキャリア自体の径を大きくすることで行われてもよい。
【０００９】
他の態様として、マイクロキャリアの表面積の増加が、前記マイクロキャリアに刺激を加えることにより、前記マイクロキャリアの水膨潤度を部分的に変化させ、前記マイクロキャリア自体の形状が非球形となるように径を大きくすることで行われてもよい。
【００１０】
他の態様として、マイクロキャリアの表面積の増加が、前記マイクロキャリアに刺激を加えることにより、前記マイクロキャリアを親水性から疎水性へと変化させ、複数の前記マイクロキャリア同士を凝集させることで行われてもよい。
【００１１】
他の態様として、前記マイクロキャリアが電荷を有し、前記マイクロキャリアの表面積の増加が、前記電荷とは逆の電荷を有するイオン又は粒子を前記マイクロキャリアに作用させ、複数の前記マイクロキャリア同士を凝集させることで行われてもよい。
【００１２】
本発明の一実施形態に係るマイクロキャリアは、上記の細胞培養方法に用いるマイクロキャリアであって、刺激応答性高分子と、水膨潤性粘土鉱物とを含む三次元網目の中に水が包含されている有機無機複合ゲルからなることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、細胞の増殖面積を低下させることなく、マイクロキャリアへの接着工程を短縮することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明に係る細胞培養方法を説明する図である。
【図２】本発明に係る細胞培養方法の一実施形態を説明する図である。
【図３】本発明に係る細胞培養方法の一実施形態を説明する図である。
【図４】本発明に係る細胞培養方法の一実施形態を説明する図である。
【図５】本発明に係る細胞培養方法の一実施形態を説明する図である。
【図６】本発明に係る細胞培養方法の一実施形態を説明する図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明を詳細に説明する。ただし、本発明は種々の態様で実施することが可能であり、以下に示す実施の形態の記載内容に限定して解釈されるものではない。便宜上、実際に比べて縮尺等を変更して説明していることに留意されたい。
【００１６】
まず、本発明に係る細胞培養方法の一実施形態について図面を参照して説明する。本発明の細胞培養方法は、典型的には医薬品等の主原料となる物質を生産する細胞の培養に適用することができるが、これに限定されるものではない。生産する物質としては、例えば抗体や酵素等のタンパク質、低分子化合物、高分子化合物等の生理活性物質及びウイルスを挙げることができる。
【００１７】
（１）細胞等導入工程
図１は、本発明の細胞培養方法に用いる培養容器を示している。培養容器１０は、容器本体１１と攪拌手段とにより主に構成されている。この実施形態において、容器本体１１は、合成樹脂からなる透明な軟包材で形成した袋である。容器本体１１として軟包材を用いることで、培養容器１０に可撓性や柔軟性を付与することができる。培養容器１０は、さらに細胞の培養に必要とされる、ガス導入機構、温度調整機構、センサー機構等の種々の構成を備えるものであってもよい。
【００１８】
容器本体１１の内側には袋状の収容部１２が形成される。収容部１２内には、容器本体１１の上端と下端との間に延びる回転軸１３と、回転軸１３に接続された攪拌翼１４と、回転軸１３の上端及び下端をそれぞれ支持する上方軸受部１５及び下方軸受部１６とが配置される。回転軸１３は、駆動装置（図示せず）による動力が伝達されることにより回転し、回転軸１３が回転することにより回転軸１３に接続された攪拌翼１４を動作させる。攪拌翼１４は、回転軸１３の下方に接続されている。
【００１９】
医薬品等の主原料となる物質を生産する細胞を大量に培養する場合には、例えば、収容部１２の内径が１０ｃｍ〜１００ｃｍ、高さが１０ｃｍ〜１００ｃｍの筒状の容器本体１１を準備し、その中に回転直径が１０ｍｍ〜１０００ｍｍの攪拌翼１４を配置するとよい。また、攪拌翼１４は収容部１２の底部に触れない程度の高さに配置するとよい。
【００２０】
培養容器１０を使用して細胞培養を行うに当たり、まず、収容部１２に細胞１、細胞１を培養するための培養液２、及び細胞１の接着足場となるマイクロキャリア３が導入される。導入の仕方は任意であり、細胞１、培養液２及びマイクロキャリアの混合物を収容部１２に導入してもよいし、予め細胞１を懸濁した培養液２を導入した後、マイクロキャリア３を導入してもよい。培養する細胞１としては、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞等を挙げることができる。特に、接着依存性を有する動物細胞を用いることが好ましい。培養液２は、培養する細胞１の種類に合わせて適宜選択することができる。培養液２の量は適宜設定できるが、培養液２が収容部１２の容積の８０〜１００％を占める程度の量とするとよい。
【００２１】
マイクロキャリア３は、細胞１の接着足場であり、かつ細胞１がその表面に接着した後に伸展して増殖するための微小な担体である。マイクロキャリア３の大きさは、培養する細胞１の大きさと略同じである。マイクロキャリア３の大きさが「培養する細胞の大きさと略同じ」であるとは、マイクロキャリア３の大きさと培養する細胞１の大きさとの差が１００μｍ以下であることをいう。これにより、細胞１とマイクロキャリア３の培養液２中での沈降速度の差を小さくすることができ、細胞１とマイクロキャリア３の接触確率が高まる。より好ましくは、マイクロキャリア３の大きさと培養する細胞１の大きさとの差を５０μｍ以下とするとよい。
【００２２】
マイクロキャリア３の形状は、特に制限はないが、例えば、球状や楕円状等の粒子状、平板状、管状のもの等を挙げることができる。この場合、マイクロキャリア３の大きさは、マイクロキャリア３の外形の最も大きい部分の幅を指し、例えば、球状であれば直径、楕円形であれば長径、矩形板状であれば対角線の長さを指す。
【００２３】
（２）細胞接着工程
回転軸１３の下方に配置された攪拌翼１４を回転させると、攪拌翼１４によって培養液２が攪拌されて流動し、収容部１２の下方から上方に向けた上昇流が発生する。この上昇流により細胞１及びマイクロキャリア３が上方に舞い上げられ、ともに浮遊した状態となる。攪拌速度は、培養液２の粘性等を考慮し、細胞１とマイクロキャリア３を上昇させるのに十分な速度に設定すればよく、例えば、１０ｒｐｍ〜２０００ｒｐｍの範囲とすることができる。なお、攪拌手段は上記の態様に限られることはなく、電磁スターラー等の回転子により収容部１２内の培養液２を攪拌するように構成してもよい。
【００２４】
攪拌翼１４により生じた上昇流によって収容部１２の上方に移動した、細胞１とマイクロキャリア３は培養液２中を浮遊しながら次第に下降する。この下降中に細胞１とマイクロキャリア３とが接触することにより、マイクロキャリア３の表面に細胞１が接着する。本発明の細胞培養方法においては、上記のように細胞１とマイクロキャリア３の大きさが略同程度であるため、両者の沈降速度が近接する。したがって、細胞１とマイクロキャリア３が接触する確率が従来に比べて上がり、所望の接着レベルに達する時間を短縮することが可能となる。また、従来はマイクロキャリアの沈降速度が極めて大きいものであるため、攪拌されてもなお下方近傍に存在するマイクロキャリアには細胞が接着することができず、上方寄りに存在するマイクロキャリアにしか細胞が接着しなかった。本発明の細胞培養方法によれば、マイクロキャリアの沈降速度を低下させることで細胞１とマイクロキャリア３とが接触する機会を増やし、より多くのマイクロキャリア３に細胞１を接着させることができる。このとき、細胞１とマイクロキャリア３とが効率的に接触するように、攪拌手段による培養液２の攪拌を停止したり、攪拌速度を低下させたりしてもよい。
【００２５】
（３）細胞増殖工程
続いて、マイクロキャリア３の表面積を増加させ、マイクロキャリア３の表面に接着した細胞１を増殖させる。ここで、「マイクロキャリアの表面積を増加させる」とは、各々のマイクロキャリアそれ自体の径が大きくなり表面積が増加する場合や、複数のマイクロキャリア同士が凝集し、その凝集体としての表面積が増加する場合を包含する趣旨である。
【００２６】
マイクロキャリア３の表面積を増加させる手段は、マイクロキャリアに刺激を加える等したときに、その応答として表面に細胞１を接着させたまま表面積を増加させ得る手段であればよく、特に限定はされない。好適な例として、以下の実施形態（３−ａ）〜（３−ｄ）の方法を挙げることができる。すなわち、マイクロキャリア３の水膨潤度が刺激により変化する場合（３−ａ及び３−ｂ）であれば、温度、光、ｐＨ等の刺激のうち所定の刺激を印加して表面積を増加させる。マイクロキャリア３が疎水性相互作用により凝集する場合（３−ｃ）であれば、水に対する親和性を低下させて疎水性相互作用によるマイクロキャリア同士の凝集体を形成し表面積を増加させる。マイクロキャリア３が静電相互作用により凝集するもの（３−ｄ）であれば、マイクロキャリア３の電荷の反対の電荷を有するイオンや粒子を導入して静電相互作用によるマイクロキャリア同士の凝集体を形成し表面積を増加させる。以下、それぞれの実施形態（３−ａ）〜（３−ｄ）について詳述する。
【００２７】
（３−ａ）刺激により水膨潤度が変化するマイクロキャリア（１）
この実施形態では、図２に示すように、浮遊しながら次第に下降する細胞１とマイクロキャリア３とを互いに接着させた後、マイクロキャリア３に刺激を加えることにより、マイクロキャリアの水膨潤度を変化させ、マイクロキャリア３自体の径を大きくして表面積を増加させる。そして、その表面積が増加したマイクロキャリア３の表面上で細胞１を増殖させ、細胞培養を行う。刺激により水膨潤度が変化するマイクロキャリアとしては、水膨潤性を有し、温度、光、ｐＨ等の刺激によって水膨潤度が変化するものを用いることができる。このような材料としては、特開２０１０−２４１８５９号公報に記載されたものを用いることができる。特に、水膨潤性の粘土鉱物（クレイ）と、その粘土鉱物と水素結合、イオン結合、配位結合、共有結合等を形成できる官能基を有する刺激応答性高分子とを複合化して形成された三次元網目の中に水が包含されている有機無機複合ゲルは好ましく用いられる。この有機無機複合ゲルを構成する水膨潤性粘土鉱物は、好ましくは水中で層状に剥離して均一分散する層状の粘土鉱物であり、具体的には水膨潤性スメクタイト、ナトリウムを層間イオンとして含む水膨潤性ヘクトライト、水膨潤性モンモリロナイト、水膨潤性サポナイト、水膨潤性雲母等が挙げられる。また、刺激応答性高分子としては、Ｎ−アルキルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジアルキルアクリルアミド、アクリルアミド等のアクリルアミド類、又はＮ−アルキルメタクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジアルキルメタクリルアミド、メタクリルアミド等のメタクリルアミド類の中から選択される一種又は複数種を重合して得られる水溶性有機高分子が挙げられる。有機無機複合ゲルは、上述の刺激応答性高分子の重合原料であるモノマーと粘土鉱物と水とを含む均一な溶液又は分散液を調製した後、ラジカル重合開始剤を加え、必要に応じて触媒を添加し、加熱（５℃〜９０℃）するによりモノマーを重合させる方法によって得ることができる。
【００２８】
マイクロキャリアの水膨潤度は、膨潤したマイクロキャリアの質量（ＷＧ）を測定した後、マイクロキャリアを乾燥させてマイクロキャリアの乾燥質量（ＷＤ）を得ることにより、Ｒ＝（ＷＧ−ＷＤ）／ＷＤとして得ることができる。刺激を加えることによる水膨潤度の変化の割合は、最大膨潤度（Ｒｍａｘ）と最小膨潤度（Ｒｍｉｎ）の比（Ｒｍａｘ／Ｒｍｉｎ）が３以上、好ましくは５以上であることが好ましい。これにより、細胞の増殖面積を増加させることができる。なお、刺激により水膨潤度が変化するマイクロキャリアを用いる場合、導入する細胞の数をマイクロキャリアの数の５倍〜１０倍程度とすることが好ましい。
【００２９】
（３−ｂ）刺激により水膨潤度が変化するマイクロキャリア（２）
この実施形態を図３に基づき説明する。なお、図３〜６では、便宜上、マイクロキャリア３に接着している細胞は図示を省略し、マイクロキャリア３の表面積を増加させる過程のみを示している。図３の例では、マイクロキャリア３に刺激を加えることにより、マイクロキャリア３の水膨潤度を部分的に変化させている。具体的には、マイクロキャリア３の下部３ｂの水膨潤度の変化量よりも、マイクロキャリア３の上部３ａの水膨潤度の変化量を大きくしている。これにより、マイクロキャリア３自体の径を大きくしつつ、形状が非球形（図３では、傘状）となるようにしている。なお、水膨潤度の部分的な変化は、例えば、浮遊しているマイクロキャリアに対し、容器本体の一方の面から光照射等を行い、光が照射される面と照射されない面とで水膨潤度が異なるようにすることで達成することができる。図３のようにマイクロキャリア３を非球形に膨潤させることによって、細胞の増殖面積を増加させるとともに、培養液中におけるマイクロキャリア３の流動抵抗を大きくして、下降する速度を細胞１と近接させ、細胞１とマイクロキャリア３が接触する確率を上げることができる。
【００３０】
（３−ｃ）疎水性相互作用により凝集するマイクロキャリア
この実施形態では、図４に示すように、細胞が接着したマイクロキャリア３に刺激を加えることにより、マイクロキャリアを親水性から疎水性へと変化させ、複数のマイクロキャリア３同士を疎水性相互作用により凝集させることで表面積を増加させる。そして、その表面積が増加したマイクロキャリア３の凝集体の表面上で細胞を増殖させ、細胞培養を行う。疎水性相互作用により凝集するマイクロキャリアとしては、温度、光、ｐＨ等の刺激によって、周囲の水分子に対する親和性が変化するものを用いることができる。具体的には、マイクロキャリア自体が刺激応答性を有するものや、ビーズ表面に刺激応答性高分子が固定化されたものを挙げることができる。マイクロキャリア自体が刺激応答性を有する例としては、特開２００６−２８０２０６号公報に記載される、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド等の水溶性有機モノマーの重合体と、水膨潤性粘土鉱物（クレイ）とを含んで構成される三次元網目構造を有し、温度により親水性と疎水性が可逆的に変化する高分子ヒドロゲルを挙げることができる。また、マイクロキャリア表面に刺激応答性高分子が固定化された例としては、ビーズ表面に温度により親水性と疎水性が可逆的に変化するポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、メチルセルロース等の温度応答性高分子が固定化されたもの等を挙げることができる。なお、疎水性相互作用により凝集するマイクロキャリアを用いる場合、導入する細胞とマイクロキャリアの質量比は、細胞及びマイクロキャリアの種類や攪拌条件等によっても異なるが、例えば細胞：マイクロキャリア＝１：１〜１：２００（質量比）とすることが好ましい。
【００３１】
（３−ｄ）静電相互作用により凝集するマイクロキャリア
この実施形態では、図５及び６に示すように、細胞が接着したマイクロキャリア３が電荷（図５及び６では正電荷）を有しており、そのマイクロキャリア３に対して逆の電荷を有するイオン（図５）又は逆の電荷を有する粒子４（図６）を作用させ、複数のマイクロキャリア３同士を静電相互作用により凝集させることで表面積を増加させる。そして、その表面積が増加したマイクロキャリア３の凝集体の表面上で細胞を増殖させ、細胞培養を行う。静電相互作用により凝集するマイクロキャリアとしては、正又は負の電荷を有するものを用いることができる。具体的には、正の電荷を有するものとしてコラーゲン等を挙げることができ、負の電荷を有するものとしてはヒアルロン酸、ゼラチン、ＯＨ基で表面修飾したキャリア等を挙げることができる。なお、静電相互作用により凝集するマイクロキャリアを用いる場合、導入する細胞とマイクロキャリアの質量比は、細胞及びマイクロキャリアの種類や攪拌条件等によっても異なるが、例えば細胞：マイクロキャリア＝１：１〜１：２００（質量比）とすることが好ましい。
【００３２】
上記のようにして、マイクロキャリア３の表面積を増加させた後、培養する細胞１の増殖に適した条件に温度、ＣＯ２濃度等を制御し、所定の時間培養を行って細胞を増殖させる。マイクロキャリア３の表面積が増加することにより、細胞１の増殖面積が増えるため、大量の細胞を得ることができる。特に、マイクロキャリア３が球状、楕円状等である場合には、表面積が増加するとともに曲率が小さくなるため、細胞の伸展が起こりやすくなり、細胞の増殖効果がより高くなる。
【００３３】
（４）細胞回収工程
次に、マイクロキャリア３の表面で増殖した細胞１を回収する。細胞１の回収は、培養容器外で行なってもよいし、培養容器内で行なってもよい。マイクロキャリア３の表面が刺激応答性を有する場合には、所定の刺激を加えて細胞１をマイクロキャリア３の表面から脱離させることができる。マイクロキャリア３の表面が刺激応答性を有しない場合には、トリプシン等を加えて細胞１をマイクロキャリア３の表面から脱離させる。脱離した細胞１とマイクロキャリア３との分離は公知の方法により行なわれるが、典型的には遠心分離法や、フィルタによるろ過を利用して行なわれる。その際、フィルタは培養容器１０の外部に設置することもできるし、培養容器１０の内部に設置することもできる。
【符号の説明】
【００３４】
１    細胞
２    培養液
３    マイクロキャリア
３ａ  マイクロキャリアの上部
３ｂ  マイクロキャリアの下部
４    逆の電荷を有する粒子
１０  培養容器
１１  容器本体
１２  収容部
１３  回転軸
１４  攪拌翼
１５  上方軸受部
１６  下方軸受部
【図１】
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【図２】
2014233245.tif 000004
【図３】
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【図４】
2014233245.tif 000006
【図５】
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【図６】
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