(57)【要約】【課題】  これまで連続的な処理が困難であった、数十μｍから数百μｍのサイズにある生体試料を液体冷媒にて簡便、且つ迅速に凍結保存させる方法を提供する。【解決手段】  ２００Ｋ以下の温度で液体状態にある冷媒を対流または撹拌状態となし、前記冷媒に生物試料が懸濁された直径５００μｍ以下にある水溶液の液滴を連続的に滴下させる。これによって、滴下した生体試試料内の水溶液がアモルファス状態で凍結され、解凍後の生存率を高めることが可能となる。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
２００Ｋ以下の温度で液体状態にある冷媒を対流または撹拌状態となし、前記冷媒に生物試料が懸濁された直径５００μｍ以下にある水溶液の液滴を連続的に滴下することを特徴とする生物試料の凍結保存方法。
【請求項２】
前記冷媒が、液体窒素、液体酸素、液体空気、液体ヘリウム、フッ素系液体から選ばれる少なくとも１種を含むことを特徴とする、請求項１に記載の生物試料の凍結保存方法。
【請求項３】
前記液滴を連続的に滴下する為の送液ポンプが、シリンジポンプ、セラミックポンプ、バイモルポンプから選ばれる少なくとも１種含むことを特徴とする、請求項１または請求項２に記載の生物試料の凍結保存方法。
【請求項４】
内部に満たされた冷媒の温度を２００Ｋ以下に保持することが可能な冷却手段及び前記冷媒の撹拌手段を具備してなる容器と、生物試料が懸濁されてなる直径５００μｍ以下の水溶液の液滴を、前記冷媒に連続的に滴下することが可能な液体吐出手段とを有することを特徴とする生物試料の凍結装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は生物試料の凍結保存法及び凍結装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
現状、生物試料の凍結保存には冷却速度を制御しながら、最終的には液体窒素温度まで冷却するプログラム冷却法（非特許文献１）や生物試料を凍結保護物質水溶液に懸濁後、凍結保存用のストローに封入して液体窒素中に浸漬する方法（非特許文献２）、更には卵子を少量のガラス化液とともに樹脂フィルム上に付着させ、液体窒素中に浸漬するガラス化法（特許文献１）が実用されている。
【０００３】
しかしながら、第一の常法であるプログラム冷却法は、冷却速度のプログラムが可能な専用フリーザーが必要な点や、生体試料や凍結保護水溶液に応じて冷却プログラムの設定を変更する必要がある為に煩雑であり、商業的には殆ど利用されてはいない。
【０００４】
第二の常法である凍結保存用のストローによる凍結法は、生物試料を封入後に液体窒素に浸漬するのみで簡便であり、また１回に処理できる量が１ｍＬ程度と比較的多い為、一般的に広く実用されている。しかしながら、この方法は１〜１０μｍ未満の生物試料、例えば哺乳類の精子などに利用が限定されており、数十μｍから数百μｍのサイズにある哺乳類の受精卵では解凍後の生存率が極めて低く、利用されてはいない。
【０００５】
また、第三の常法は冷却速度を確保することが容易であり、解凍後の生存率も高い為、近年ではヒト受精卵で主に利用されてはいるが、１回の処理で保存できる受精卵は１〜４個程度と限定される。したがって、１回に数千個の処理が必要な生体試料、例えば膵島組織の凍結保存には本法を用いることは出来ない。
【０００６】
一方、液滴による急速凍結法（特許文献２）も開示されてはいるが、固体窒素の使用が前提である為、一般的な利用は困難である。また、固体窒素を維持する為に複雑な断熱容器内に試料凍結槽が収納されており、凍結処理後の試料回収操作なども煩雑である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特許第４３２４１８１号公報
【特許文献２】特開平４−２８２３０１号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】北村  惣一郎、「組織移植」、日本医学館、Ｐ．９３−１０２、２００１年
【非特許文献２】酒井  昭、「凍結保存」、朝倉書店、Ｐ．８４−９５、１９８７年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の課題は、これまで連続的な処理が困難であった、数十μｍから数百μｍのサイズにある生体試料を液体冷媒にて簡便、且つ迅速に凍結保存させる方法及び装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は上記課題を解決する為に鋭意検討した結果、常法では連続的に凍結保存処理を行うことが困難であった、数十μｍから数百μｍのサイズにある生体試料を、解凍後の生存率を低下させることなく、凍結保存が可能な方法を見出し、本発明をなすに至った。
【００１１】
即ち、本発明の第１は、２００Ｋ以下の温度で液体状態にある冷媒を対流または撹拌状態となし、前記冷媒に生物試料が懸濁された直径５００μｍ以下にある水溶液の液滴を連続的に滴下する方法であり、第二の発明は、使用する冷媒が液体窒素、液体酸素、液体空気、液体ヘリウム、フッ素系液体であることを特徴とする前記の方法であり、第三の発明は連続的に滴下または噴射する為の送液ポンプがシリンジポンプ、圧電ポンプ、セラミックポンプ、バイモルポンプであることを特徴とする前記の方法であり、第四の発明は内部に満たされた冷媒の温度を２００Ｋ以下に保持することが可能な冷却手段及び前記冷媒の撹拌手段を具備してなる容器と、生物試料が懸濁されてなる直径５００μｍ以下の水溶液の液滴を、前記冷媒に連続的に滴下することが可能な液体吐出手段とを有することを特徴とする生物試料の凍結装置である。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により数十μｍから数百μｍのサイズにある生体試料を簡便な操作で連続的に保存処理する事が可能となり、常法に比べ種々の生体試料を対象とした凍結保存を実現することが出来る。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の凍結保存方法を、図および実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明はこれにより何ら限定されるものではない。
【００１４】
本発明による生物試料とは別段限定されるものではなく、例えば膵島組織など、特に一度に多数の凍結処理が必要となる細胞・組織には特に有効である。
【００１５】
本発明による連続的に滴下または噴射する為の送液ポンプとは、送液時において生物試料に機械的な損傷を与えないポンプであればよく、望ましくはシリンジポンプ、圧電ポンプ、セラミックポンプ、バイモルポンプが挙げられる。
【００１６】
本発明で液滴を排出するノズルとは通常、医療用注射針として市販されているものや、バイオ用インクジェットヘッドなどが利用可能であるが、ノズル先端から直径５００μｍ以下の液滴を生じることが可能であれば、別段限定されるものでは無い。
【００１７】
本発明では攪拌操作により冷媒を攪拌させる必要がある。この操作には理化学実験等で汎用されるマグネットスターラーと攪拌子（回転子）、攪拌モーターと攪拌羽などが利用可能であるが、冷媒を攪拌させる事が可能であれば、別段限定されるものでは無い。
【００１８】
本発明で液体冷媒を保持する容器とはデュワー瓶、デュワーフラスコ、真空断熱容器、発泡スチロール容器など断熱容器として汎用的な容器を用いる事ができる。
【００１９】
本発明で液体冷媒とは２００Ｋ以下の温度で液体状態であれば別段限定されるものでは無いが、気化温度が高い液体であると、液滴表面に冷媒の気化により生じた蒸気膜が形成され、これが伝熱抵抗となる為、フッ素系液体などが望ましい。
【実施例】
【００２０】
生体試料には雄のＬｅｗｉｓ
ｒａｔｓ より分離した膵島を用いた。分離した膵島は凍結保護物質水溶液として市販されている、ＣＰ−１水溶液（極東製薬工業製）に１ｍＬあたり１００個程度となる様に懸濁させ、これを滴下水溶液とした。
【００２１】
膵島が懸濁された水溶液１ｍＬを医療用シリンジ（テルモ社製、１０ｍＬ）に入れ、これをマイクロシリンジポンプ（ＫＤ
Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、ＫＤＳ-１２０）に装着した。また、液滴を排出するノズルとしては医療用注射針（テルモ社製、針規格２４〜３１Ｇ）を用い、排出ノズルとシリンジ間はシリコンホースにより繋いだ。尚、液滴のサイズは注射針の規格により変更した。
【００２２】
浅型デュワーフラスコ（ＩＳＯＴＨＥＲＭ
製）に冷媒を入れ、これを攪拌させる為、フロート攪拌子（アズワン製）をデュワーフラスコ内に設置した。冷媒には、液体窒素、液体ヘリウム、フッ素系液体、パーフルオロカーボン（住友３Ｍ社製、フロリナートＦＣ−７７０）およびジメチルシリコンオイル（モメンティブ社製、ＴＳＦ４５１-５）を使用した。
【００２３】
液体冷媒がフッ素系液体およびシリコンオイルの場合については、これらをステンレス製の別容器に入れ、この容器を液体窒素の入った浅型デュワーフラスコに入れることで各冷媒の融点温度付近まで十分に冷却した。また、これらの冷媒もフロート攪拌子を設置して攪拌操作を行った。
【００２４】
冷媒への滴下により調製した固体粒子は液体冷媒内にてクライオチューブに移し替え、液体窒素中にて１日保存後、３７℃に維持したＣＰ−１水溶液に直接投入し、解凍処理を行った。その後、遠心操作により膵島のみを分離し、生理食塩水（ダルベッコ社製）による洗浄後、生死判別を目的とした蛍光染色を行った。染色後の膵島は蛍光顕微鏡（Ｃａｒｌ
Ｚｅｉｓｓ社製）にて、４９０および５４５ｎｍのフィルターにより生死識別を行った。尚、生存率は全細胞数に対する生細胞数の比から求めた。
【００２５】
得られた生存率を８０％以上は◎、７０％以上は○、６０％以上は△、５０％未満は×として表１に纏めた。
【００２６】
【表１】
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【００２７】
表１の結果から液滴直径が５００μｍより小さい場合は何れの冷媒であっても生存率は高いが、８００μｍ以上であると極端に生存率は低くなることが分かる。通常、凍結保存した生体試料が解凍後にも生存する為には、冷却時に生体試料内の溶液がアモルファス状態（ガラス状態）となる必要がある。また、一般的に水溶液が結晶状態を取らずアモルファス状態となる為には溶液の種類にも因るが、−１００００℃／分程度の冷却速度が必要である。従って、本発明の冷却条件では冷媒の種類を問わず５００μｍ未満であればアモルファス状態を取りえた為、生存率は良好であったと考えられる。また、液滴直径が５００μｍの結果に着目すると液体ヘリウムとフッ素系液体の結果が良好である。これは液体ヘリウムであればその温度自体が４Ｋと低く、冷却速度が早かった為と考えられる。一方、フッ素系液体の場合、温度は液体窒素温度に比べ高いが気化温度が他の冷媒に比べ極めて高く、液滴表面に蒸気膜が形成されなかった為、冷却効率が高かった結果、生存率も良好であったと考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】本発明に係る凍結装置の一例を示す図。
【符号の説明】
【００２９】
１ ・・・ 医療用シリンジ
２ ・・・ プランジャ
３ ・・・医療用注射針
４ ・・・ マイクロシリンジポンプ
５ ・・・ シリンジ用クランプ
６ ・・・ 輸液チューブ
７ ・・・ 輸液チューブ用クランプ
８ ・・・ デュワーフラスコ
９ ・・・ ノズル
１０ ・・・ 冷媒
１１ ・・・ マグネットスターラー
１２ ・・・ フロート撹拌子
１３ａ，１３ｂ 
・・・ ジャッキ
【図１】
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