(57)【要約】      （修正有）【課題】アルデヒドタグの取り込みによるタンパク質の部位特異的修飾のための組成物及び方法の提供。【解決手段】ポリペプチドを修飾するための方法であって、変換型スルファターゼモチーフを含むポリペプチドを、対象とする部分を含む反応パートナーと接触させることを含み、変換型スルファターゼモチーフがＸ１（ＦＧｌｙ）Ｘ２Ｚ２Ｘ３Ｒ（Ｉ）を含み、前記接触が、反応パートナーの対象とする部分をポリペプチドのＦＧｌｙと結合するのに十分な条件下で起こり、それによって修飾型ポリペプチドが生成される方法。【選択図】図１Ａ
2014221056.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリペプチドを修飾するための方法であって、
変換型スルファターゼモチーフを含むポリペプチドを、対象とする部分を含む反応パートナーと接触させること
を含み、変換型スルファターゼモチーフが
Ｘ１（ＦＧｌｙ）Ｘ２Ｚ２Ｘ３Ｒ          （Ｉ）
［上式で
ＦＧｌｙがホルミルグリシン残基であり、
Ｚ２がプロリンまたはアラニン残基であり、
Ｘ１が存在するかまたは存在せず、存在するときは任意のアミノ酸であり、ただし異種スルファターゼモチーフがポリペプチドのＮ末端に存在するとき、Ｘ１が存在し、
Ｘ２とＸ３がそれぞれ独立に任意のアミノ酸である］を含み、
前記接触が、反応パートナーの対象とする部分をポリペプチドのＦＧｌｙと結合するのに十分な条件下で起こり、それによって修飾型ポリペプチドが生成される方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００６年９月２１日に出願された米国仮出願第６０／８４６，６４４号の優先権を主張するものであり、この出願は参照によってその全容が本明細書に組み込まれている。
【０００２】
政府の権利
本発明は、国立衛生研究所によって授与された連邦補助金ｎｏ．Ｒ０１−ＡＩ０５１６２２で、政府の支援によってなされた。合衆国政府は、本発明において確かな権利を有するものとする。
【背景技術】
【０００３】
タンパク質の部位特異的標識は、生化学および細胞ネットワークを詳細に分析するためのツールとして重要である。この必要性に取り組むために様々な技術が開発されてきている。タンパク質の局在化および追跡に使用される１つのこのような技術は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などの蛍光タンパク質を用いた標識である。しかしながら、これらの蛍光タンパク質の大きさは、標的の輸送、局在化およびタンパク質−タンパク質相互作用に干渉する可能性がある（Ｌｉｓｅｎｂｅｅら、Ｔｒａｆｆｉｃ  ２００３、４、（７）、４９１〜５０１）。
【０００４】
その結果、多くのグループが、より小さな融合体を使用して特異的な二次標識試薬を誘導することに着目している。Ｒｏｇｅｒ  Ｔｓｉｅｎおよび共同研究者によって開発されたＦｌＡｓＨは、明確に配列したテトラシステインモチーフとバイアルセニル（ｂｉａｒｓｅｎｙｌ）−フルオロフォアの間の相互作用を利用する（Ｃｈｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９８、２８１、（５３７４）、２６９〜２７２）。最少８アミノ酸配列とバイ−アルセニカル（ｂｉ−ａｒｓｅｎｉｃａｌ）プローブの間のピコモルの親和性にもかかわらず（Ａｄａｍｓら、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００２、１２４、（２１）、６０６３〜６０７６）、天然システインモチーフによるバックグラウンドは依然として問題である（Ｓｔｒｏｆｆｅｋｏｖａら、Ｐｆｌｕｇｅｒｓ  Ａｒｃｈｉｖ−Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２００１、４４２、（６）、８５９〜８６６）。
【０００５】
特異性を増大させるために、酵素による二次標識に依存するペプチド標的モチーフが探索されてきている。１つのこのような戦略は、Ｏ６−アルキルグアニン−ＤＮＡトランスフェラーゼ（ｈＡＧＴ）との融合に依存し、これによって広く様々な小分子と内部システインを連結することが可能である。ｈＡＧＴの融合は広く様々な小分子プローブの非常に特異的な、共有結合を可能にするが、それは２０７のアミノ酸の融合を利用するものである（Ｇｅｏｒｇｅら、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００４、１２６、（２９）、８８９６〜８８９７；Ｇｕｉｇｎｅｔら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２００４、２２、（４）、４４０〜４４４）。別の手法では、約８０のアミノ酸アシル担体タンパク質とのタンパク質融合体を、酵素ホスホパンテテイントランスフェラーゼを使用してＣｏＡ由来のプローブで特異的に標識することができる。あるいは、ビオチンリガーゼを使用して、ビオチンまたはケトン含有ビオチンイソスターを１５アミノ酸受容体ペプチドに移動させている。ケトンイソスターの付加は、ヒドラゾンとオキシムの複合体の形成を可能にする。
【０００６】
タンパク質の部位特異的修飾のための新しい手法に関する必要性が存在する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
Ａｄａｍｓら、２００２  Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００２、１２４、（２１）、６０６３〜６０７６；Ｂａｎｇｈａｒｔら、２００４  Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．７（１２）：１３８１〜６．Ｅｐｕｂ  ２００４  Ｎｏｖ  ２１；Ｂｅｒｔｅａｕら、２００６  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２８１（３２）：２２４６４〜７０（Ｅｐｕｂ  ２００６  Ｊｕｎ  ９）；Ｃｈｅｎら、２００５  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２００５、２、（２）、９９〜１０４；Ｃｏｓｍａら、２００３  Ｃｅｌｌ  １１３、（４）、４４５〜５６；Ｄｉｅｒｋｓら、１９９７  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９４、（２２）、１１９６３〜８；Ｄｉｅｒｋｓら、２００３  Ｃｅｌｌ  １１３、（４）、４３５〜４４；Ｄｉｅｒｋｓら、２００５  Ｃｅｌｌ  １２１、（４）、５４１〜５２；Ｇｅｏｒｇｅら、２００４  Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２６、（２９）、８８９６〜８８９７；Ｇｒｉｆｆｉｎら、１９９８  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８１、（５３７４）、２６９〜２７２；Ｇｕｉｇｎｅｔら、２００４  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２、（４）、４４０〜４４４；Ｌａｎｄｇｒｅｂｅら、２００３  Ｇｅｎｅ  ３１６：４７〜５６；Ｌｅｍｉｅｕｘ（１９９８）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １６、５０６〜１３；Ｌｉｓｅｎｂｅｅら、２００３  Ｔｒａｆｆｉｃ  ４、（７）、４９１〜５０１；Ｍａｒｉａｐｐａｎら、２００５  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０（１５）：１５１７３〜９（Ｅｐｕｂ  ２００５  Ｆｅｂ  １１）；Ｍｏｕｇｏｕｓら、２００４  Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１１、７２１〜７２９；Ｐｒｅｕｓｓｅｒら、２００５  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０（１５）：１４９００〜１０（Ｅｐｕｂ  ２００５  Ｊａｎ  １８）；Ｒｏｅｓｅｒら、２００６  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０３（１）：８１〜６（Ｅｐｕｂ  ２００５  Ｄｅｃ  ２０）；Ｒｕｓｈら、（Ｊａｎ  ５  ２００６）Ｏｒｇ  Ｌｅｔｔ．８（１）：１３１〜４；Ｓａｒｄｉｅｌｌｏら、２００５  Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１４、３２０３〜３２１７；Ｓｃｈｉｒｍｅｒら、１９９８  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ５、Ｒ１８１〜Ｒ１８６；Ｓｃｈｍｉｄｔら、１９９５  Ｃｅｌｌ  ８２、（２）、２７１〜８；Ｓｔｒｏｆｆｅｋｏｖａら、２００１  Ａｒｃｈｉｖ−Ｅｕｒｏｐ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．４４２、（６）、８５９〜８６６；Ｓｚａｍｅｉｔら、１９９９  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７４、（２２）、１５３７５〜８１；Ｙｉｎ、Ｊら、２００５  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０２、１５８１５〜１５８２０（２００５）；ＵＳ２００５００２６２３４；ＵＳ２００３０１８６２２９；および米国特許第６，９００，３０４号。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、アルデヒドタグの取り込みによるタンパク質の部位特異的修飾のための組成物および方法を特徴とする。ホルミルグリシン生成酵素（ＦＧＥ）の作用によるアルデヒドタグのスルファターゼモチーフにおける酵素修飾は、ホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）残基を生成する。ＦＧｌｙ残基のアルデヒド部分は、対象とする部分とポリペプチドの部位特異的結合用の化学的ハンドルとして利用することができる。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
したがって、本開示は、
ポリペプチドを修飾するための方法であって、
変換型スルファターゼモチーフを含むポリペプチドを、対象とする部分を含む反応パートナーと接触させることを含み、変換型スルファターゼモチーフが
Ｘ１（ＦＧｌｙ）Ｘ２Ｚ２Ｘ３Ｒ          （Ｉ）
［上式で
ＦＧｌｙがホルミルグリシン残基であり、
Ｚ２がプロリンまたはアラニン残基であり、
Ｘ１が存在するかまたは存在せず、存在するときは任意のアミノ酸であり、ただし異種スルファターゼモチーフがポリペプチドのＮ末端に存在するとき、Ｘ１が存在し、
Ｘ２とＸ３がそれぞれ独立に任意のアミノ酸である］を含み、
前記接触が、反応パートナーの対象とする部分をポリペプチドのＦＧｌｙと結合するのに十分な条件下で起こり、それによって修飾型ポリペプチドが生成される方法を提供する。
【００１０】
スルファターゼモチーフは、異種スルファターゼモチーフでよい。さらに、ＦＧｌｙ残基はポリペプチドの内部配列に位置する、および／またはポリペプチドの末端ループ、Ｃ末端、またはＮ末端に位置する可能性がある。ＦＧｌｙ残基がフォールディング時にポリペプチドの溶媒接触可能領域に存在する状況を特に対象とする。ＦＧｌｙ残基がグリコシル化部位などのポリペプチドの翻訳後修飾部位に存在する状況をさらに対象とする。これらの翻訳後修飾部位は親ポリペプチドに固有のものでもよく、あるいは１つまたは複数の非天然翻訳後修飾部位を含むようにポリペプチドを工学的に作製することもでき、異種スルファターゼモチーフは前記１つまたは複数の非天然翻訳後修飾部位に位置する。
【００１１】
存在するときにはＸ１が、Ｌ、Ｍ、Ｖ、ＳまたはＴであるスルファターゼモチーフを特に対象とする。特に対象とするさらなるスルファターゼモチーフは、Ｘ２およびＸ３がそれぞれ独立に脂肪族アミノ酸、極性、非荷電アミノ酸、またはイオウ含有アミノ酸（すなわち、芳香族アミノ酸または荷電アミノ酸以外）であり、および特定の実施形態では、それぞれ独立にＳ、Ｔ、Ａ、Ｖ、ＧまたはＣであるスルファターゼモチーフである。
【００１２】
本開示は、ポリペプチド中でホルミルグリシンを生成するための方法であって、異種スルファターゼモチーフを含むポリペプチドをホルミルグリシン生成酵素（ＦＧＥ）と接触させることを含み、
異種スルファターゼモチーフが、式
Ｘ１Ｚ１Ｘ２Ｚ２Ｘ３Ｒ          （Ｉ）
［上式で
Ｚ１がシステインまたはセリンであり、
Ｚ２がプロリンまたはアラニン残基であり、
Ｘ１が存在するかまたは存在しない可能性があり、存在するときは任意のアミノ酸であり、ただし異種スルファターゼモチーフがポリペプチドのＮ末端に存在するとき、Ｘ１が存在し、
Ｘ２とＸ３が独立に任意のアミノ酸である］を含み、
前記接触が、ポリペプチド中でＺ１をホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）残基に変換するのに十分な条件下で起こり、変換型アルデヒドタグ化ポリペプチドを生成する方法も提供する。
【００１３】
この方法で使用するポリペプチドは、以下の：異種スルファターゼモチーフが１６アミノ酸残基長未満である、異種スルファターゼモチーフがポリペプチドのＮ末端に位置する、異種スルファターゼモチーフがポリペプチドに固有のアミノ酸配列の内部部位に位置する、異種スルファターゼモチーフがポリペプチドの末端ループに位置する、異種スルファターゼモチーフがポリペプチドの翻訳後修飾部位に位置する、ポリペプチドが完全長ポリペプチドである、ポリペプチドがプレプロラクチンポリペプチド、プロラクチンポリペプチド、またはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼポリペプチド以外であるという性質の少なくとも１つを有し得る。
【００１４】
異種スルファターゼモチーフは１６アミノ酸残基長未満でよく、ポリペプチドのＣ末端に位置してよい。異種スルファターゼモチーフはポリペプチドの末端ループ中の内部部位に存在してよく、かつ／または細胞外ループまたは細胞内ループ内の内部部位に存在してよい。異種スルファターゼモチーフは内部部位またはＮ末端に存在してよく、かつ／またはポリペプチドがフォールディングするときに溶媒接触可能であり得る。異種スルファターゼモチーフは、グリコシル化部位などの翻訳後修飾部位に存在してよい。これらの翻訳後修飾部位は親標的ポリペプチドに固有のものでよく、あるいは１つまたは複数の非天然翻訳後修飾部位を含むように標的ポリペプチドを工学的に作製することができ、異種スルファターゼモチーフは前記１つまたは複数の非天然翻訳後修飾部位に位置する。
【００１５】
存在するときにはＸ１が、脂肪族アミノ酸、イオウ含有アミノ酸、または極性、非荷電アミノ酸（すなわち、芳香族アミノ酸または荷電アミノ酸以外）であり、特定の実施形態ではＬ、Ｍ、Ｖ、ＳまたはＴであり得るスルファターゼモチーフを特に対象とする。特に対象とするさらなるスルファターゼモチーフは、Ｘ２およびＸ３がそれぞれ独立に脂肪族アミノ酸、極性、非荷電アミノ酸、またはイオウ含有アミノ酸（すなわち、芳香族アミノ酸または荷電アミノ酸以外）であり、特定の実施形態では、それぞれ独立にＳ、Ｔ、Ａ、Ｖ、ＧまたはＣであるスルファターゼモチーフである。対象とする一実施形態では、ＦＧＥを含有する細胞中でポリペプチドが発現される。
【００１６】
さらなる実施形態では、その方法は、変換型アルデヒドタグ化ポリペプチドを、対象とする部分を含む反応パートナーと接触させることをさらに含み、前記接触は、異種スルファターゼモチーフのＦＧｌｙ残基と共有結合した対象とする部分を有する修飾型アルデヒドタグ化ポリペプチドの反応生成物が生成するのに十分な条件下で起こる。対象とする部分は、例えば水溶性ポリマー、検出可能な標識、薬剤、または膜中もしくは表面上におけるポリペプチドの固定化用部分であり得る。
【００１７】
本開示は、本明細書に記載する方法によって生成される変換型アルデヒドタグ化ポリペプチド、および本明細書に記載する方法によって生成される修飾型アルデヒドタグ化ポリペプチドも提供する。
【００１８】
本開示は、ホルミルグリシン生成酵素（ＦＧＥ）を有する異種スルファターゼモチーフを含むポリペプチドであって、異種スルファターゼモチーフが、
Ｘ１（ＦＧｌｙ）Ｘ２Ｚ２Ｘ３Ｒ          （Ｉ）
［上式で
ＦＧｌｙがホルミルグリシン残基であり、
Ｚ２がプロリンまたはアラニン残基であり、
Ｘ１が存在するかまたは存在しない可能性があり、存在するときは任意のアミノ酸であり、ただし異種スルファターゼモチーフがアルデヒドタグ化ポリペプチドのＮ末端に存在するとき、Ｘ１が存在し、
Ｘ２が任意のアミノ酸である］を含むポリペプチドをさらに提供する。
【００１９】
この方法で使用するポリペプチドは、以下の：異種スルファターゼモチーフが１６アミノ酸残基長未満である、異種スルファターゼモチーフがポリペプチドのＮ末端に位置する、異種スルファターゼモチーフがポリペプチドに固有のアミノ酸配列の内部部位に位置する、異種スルファターゼモチーフがポリペプチドの末端ループに位置する、異種スルファターゼモチーフがポリペプチドの翻訳後修飾部位に位置する、ポリペプチドが完全長ポリペプチドである、またはポリペプチドがプレプロラクチンポリペプチド、プロラクチンポリペプチド、またはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼポリペプチド以外であるという性質の少なくとも１つを有する可能性がある。
【００２０】
このようなポリペプチドの異種スルファターゼモチーフは１６アミノ酸残基長未満でよく、ポリペプチドのＣ末端に位置してよい。異種スルファターゼモチーフは、ポリペプチドの末端ループ中に存在してよい。ポリペプチドは、細胞外ループまたは細胞内ループ内の内部部位に存在する異種スルファターゼモチーフを有する膜貫通型タンパク質でよい。ポリペプチドの異種スルファターゼモチーフは、ポリペプチドの内部部位またはＮ末端に存在してよく、ポリペプチドがフォールディングするときに溶媒接触可能である。さらに、異種スルファターゼモチーフは、グリコシル化部位などの翻訳後修飾部位に存在してよい。翻訳後修飾部位は親標的ポリペプチドに固有のものでよく、あるいは１つまたは複数の非天然翻訳後修飾部位を含むように標的ポリペプチドを工学的に作製することができ、異種スルファターゼモチーフは前記１つまたは複数の非天然翻訳後修飾部位に位置する。存在するときにはＸ１が、通常は脂肪族アミノ酸、イオウ含有アミノ酸、または極性、非荷電アミノ酸（すなわち、芳香族アミノ酸または荷電アミノ酸以外）であるが、特定の実施形態ではＬ、Ｍ、Ｖ、ＳまたはＴであるスルファターゼモチーフを特に対象とする。特に対象とするさらなるスルファターゼモチーフは、Ｘ２およびＸ３がそれぞれ独立に脂肪族アミノ酸、極性、非荷電アミノ酸、またはイオウ含有アミノ酸（すなわち、芳香族アミノ酸または荷電アミノ酸以外）であり、および特定の実施形態では、それぞれ独立にＳ、Ｔ、Ａ、Ｖ、ＧまたはＣであるスルファターゼモチーフである。
【００２１】
本開示は、このようなポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子、ならびにこのような核酸分子を含むベクターおよび組換え宿主細胞も企図する。
【００２２】
本開示は、対象とする部分と共有結合したホルミルグリシン残基を含む修飾型ポリペプチドであって、
式Ｘ１（ＦＧｌｙ’）Ｘ２Ｚ２Ｘ３Ｒ          （Ｉ）
［上式で
ＦＧｌｙ’が異種の共有結合部分を有するホルミルグリシン残基であり、
Ｚ２がプロリンまたはアラニン残基であり、
Ｘ１が存在するかまたは存在しない可能性があり、存在するときは任意のアミノ酸、通常は脂肪族アミノ酸、イオウ含有アミノ酸、または極性、非荷電アミノ酸（すなわち、芳香族アミノ酸または荷電アミノ酸以外）であり、ただし異種スルファターゼモチーフがポリペプチドのＮ末端に存在するとき、Ｘ１が存在し、
Ｘ２が任意のアミノ酸である］の修飾型スルファターゼモチーフを含む、修飾型ポリペプチドも提供する。
【００２３】
このような修飾型ポリペプチドの部分は、水溶性ポリマー、検出可能な標識、薬剤、または膜中もしくは表面上におけるポリペプチドの固定化用部分でよい。このような修飾型ポリペプチドの修飾型スルファターゼモチーフは、修飾型ポリペプチド中、修飾型ポリペプチドの親の翻訳後修飾部位に位置してよい。翻訳後修飾部位は、例えばグリコシル化部位でよい。翻訳後修飾部位は親標的ポリペプチドに固有のものでよく、あるいは１つまたは複数の非天然翻訳後修飾部位を含むように標的ポリペプチドを工学的に作製することができ、異種スルファターゼモチーフは前記１つまたは複数の非天然翻訳後修飾部位に位置する。
【００２４】
本開示は、アルデヒドタグコード配列を含む第１の核酸、およびアルデヒドタグコード配列の５’または３’に位置する制限部位であって、対象とするポリペプチドをコードする第２の核酸の挿入をもたらす制限部位を含む発現カセットと、発現カセットと作動可能に連結して、制限部位への対象とするポリペプチドをコードする第２の核酸の挿入によって生成するアルデヒドタグ化ポリペプチドの発現をもたらすプロモーターとを含む組換え核酸も提供する。
【００２５】
本開示は、ヒト型結核菌のホルミルグリシン生成酵素（ＦＧＥ）も同定し（ＭｔｂＦＧＥ）、したがってその使用法、ならびに単離ヒト型結核菌のホルミルグリシン生成酵素（ＦＧＥ）と、
式Ｘ１Ｚ１Ｘ２Ｚ２Ｘ３Ｒ          （Ｉ）
［上式で
Ｚ１がシステインまたはセリンであり、
Ｚ２がプロリンまたはアラニン残基であり、
Ｘ１が存在するかまたは存在せず、存在するときは任意のアミノ酸であり、ただし異種スルファターゼモチーフがポリペプチドのＮ末端に存在するとき、Ｘ１が存在し、
Ｘ２とＸ３がそれぞれ独立に任意のアミノ酸である］の異種スルファターゼモチーフを含むポリペプチドとを含む反応混合物を包含する。
【００２６】
本開示は、本明細書に記載する異種スルファターゼモチーフおよびＦＧＥを有するポリペプチドの反応混合物も提供し、この反応混合物は、ポリペプチドの異種スルファターゼモチーフがＦＧｌｙ残基を含有する変換型アルデヒドタグ化ポリペプチドをさらに含むことができる。本開示は、ＦＧＥ、およびポリペプチドの異種スルファターゼモチーフがＦＧｌｙ残基を含有する変換型アルデヒドタグ化ポリペプチドを含む組成物も提供する。関連の実施形態では、このような反応混合物は、対象とする部分とポリペプチドのＦＧｌｙ残基の結合を容易にするための試薬をさらに含むことができる。
【００２７】
本発明の他の特徴およびその関連する開示を以下に示し、それらは、本開示を読んだ後で当業者には容易に明らかとなるであろう。
【００２８】
添付の図面と併せて読むと、以下の詳細な説明から本発明は最もよく理解される。慣行に従い、図面の様々な特徴は正確な縮尺ではないことを強調する。反対に、様々な特徴の寸法は明確性のために任意に拡大または縮小する。図面中に含まれるのは、以下の図である。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１Ａ】本発明の方法および組成物の代表的概要を示している概略図である。この実施例では、代表的スルファターゼモチーフ（「ＬＣＴＰＳＲ」）は、対象とするタンパク質をコードする核酸を含有する構築体中に位置する。
【図１Ｂ】多様な生物において見られる様々なスルファターゼ由来の、スルファターゼモチーフの配列アラインメントを示している概略図である。そのコンセンサス配列は、この試験で使用した２つのアルデヒドタグの配列を含有する。保存残基は強調表示する。
【図２】１３残基のスルファターゼのコンセンサスモチーフ（ａｌｄ１３−Ｓｔｆ０）を有するマイコバクテリアのスルホトランスフェラーゼ由来のトリプシンペプチドにおけるＦＧｌｙの存在を確認する、質量スペクトル分析を示している一組のグラフである。ａｌｄ１３−Ｓｔｆ０由来のトリプシンペプチドにおけるＦＧｌｙの存在を確認する質量スペクトル。（パネルａ）ＦＧｌｙを取り込んだトリプシン断片の質量スペクトル（Ｍ＋２／２）。理論値：３７８．２０６６ｍ／ｚ  実測値：３７８．２０６５。（パネルｂ）メトキシルアミンを用いた処理後のＦＧｌｙを取り込んだトリプシン断片のＭ＋２／２ＦＴ−ＩＣＲスペクトル。理論値：３９２．７１９８ｍ／ｚ  実測値：３９２．７２０１．（パネルｃ）ＦＧｌｙを取り込んだトリプシン断片のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦによる配列決定。
【図３】ＦＧｌｙ生成の定量化およびアルデヒドタグ化構築体の選択的蛍光標識の結果を示す図である。（パネルａ）ａｌｄ６−Ｓｔｆ０トリプシン消化物への合成ＰＬ（ＦＧｌｙ）ＴＰＳＲの標準添加。（パネルｂ）ａｌｄ６−Ｓｔｆ０トリプシン消化物への合成ＰＬＣＴＰＳＲの標準添加。（パネルｃ）蛍光ゲルスキャナーで直接画像化したアミノオキシ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７を有するａｌｄ１３−Ｓｔｆ０、ａｌｄ６−Ｓｔｆ０およびａｌｄ６−ＭＢＰの選択的蛍光標識。（パネルｄ）タンパク質充填はＳｙｐｔｏ  Ｒｕｂｙ染色によって評価した。
【図４】アルデヒドタグ化タンパク質の選択的修飾を示している一組の画像である。（パネルａ）ａｌｄ６−ＭＢＰのスイッチアッセイ。レーン１：ビオチンヒドラジドとインキュベートしたタンパク質。レーン２：ビオチンヒドラジドとインキュベートし、かつ後にメトキシルアミンで修飾したタンパク質。レーン３：ビオチンヒドラジドとインキュベートし、かつ後にアミノオキシＦＬＡＧで修飾したタンパク質。タンパク質充填（底部ボックス）はポンソー染色によって評価した。（パネルｂ）５，０００ＤａのアミノオキシＰＥＧ（レーン１）、１０，０００ＤａのアミノオキシＰＥＧ（レーン２）および２０，０００ＤａのアミノオキシＰＥＧ（レーン３）を用いたａｌｄ６−Ｓｔｆ０のペグ化。ペグ鎖の電荷不足のため、ペグ化タンパク質は、同等分子量の非ペグ化タンパク質よりゆっくりと移動する。
【図５】ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）およびＨＥＫ（ヒト胎児腎臓）細胞における、アルデヒドタグ化合成光異性化可能なアゾベンゼン制御型Ｋ＋（ＳＰＡＲＫ）チャンネルタンパク質の生成を示している一組のゲル画像である。（パネルａ）ポンソーＳを使用してタンパク質に関して染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル。（パネルｂ）抗ｍｙｃ抗体の結合の検出。（パネルｃ）抗ＦＬＡＧ抗体の結合の検出。Ｖはサンプルがベクターのみの陰性対照であることを示し、Ｐ、Ｃ、およびＩは代表的な６残基アルデヒドタグを挿入するための３つの戦略、すなわち細胞外ループの１つの内部のアルデヒドタグの付加（Ｉ）、ループからの６残基の欠失およびアルデヒドタグとの置換（Ｃ）、またはループからの３残基の欠失および次いで６残基タグの付加（Ｐ）を表す。（＋）は陽性対照サンプルを指し、これは１７ｋＤａのｍｙｃタグタンパク質を含有するＣＨＯ細胞溶解物である。
【図６】ヒドラゾン、オキシムおよびセミカルバゾン結合の生成を示す図である。ＲおよびＲ’は、本明細書に開示するアルデヒドタグ化ポリペプチド中に現れる適切な置換基を指す。Ｒ”は、反応生成物中のアルデヒドタグ化ポリペプチドに移動する試薬の置換基を指す。
【図７】ホルミルグリシン生成酵素（ＦＧＥ）および提案したスルファターゼの機構によるスルファターゼの活性化を示す図である。（パネルａ）活性部位のシステインを２ホルミルグリシル残基（ＦＧｌｙ）に酸化することによって、ＦＧＥはスルファターゼを活性化する。以前に決定されたスルファターゼの結晶構造は、活性部位のＦＧｌｙは水和されることを示し、硫酸エステルの切断はトランスエステル化−脱離機構によって仲介されることを示唆する６。（パネルｂ）スルファターゼモチーフはスルファターゼのＮ末端の方に位置し、ＦＧＥによる修飾に適したシステイン（＊）を標的化する。枠で囲んだ残基は完全に一致した残基を示し、下線を引いた残基は保存残基を示し、ドット（・）を有する残基は類似の残基を示す。
【図８】ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでのＭｔｂＦＧＥ（Ｒｖ０７１２）の機能を示している結果を示す図である。（パネルａ）スルファターゼモチーフに似ている合成ペプチドを組換えＭｔｂＦＧＥで処理し、結果として生じたＦＧｌｙへのシステインの酸化は質量分析によってモニタリングした。Ｃｙｓ２６３５ｅｒＦＧＥ突然変異体はペプチド基質において不活性であった。ｍ／ｚ１４２７および１４４５におけるイオンは、それぞれ修飾および非修飾ペプチドのナトリウム付加物である。（パネルｂ）ビオチンヒドラジドを用いた処理によって、ＦＧｌｙ含有ペプチドはビオチンを有するヒドラゾン付加物を形成し、＋２４０Ｄａの質量シフトをもたらす。（パネルｃ）ＭｔｂＨ３７Ｒｖの野生型（ＷＴ）、Δｆｇｅ、および相補型（Δｆｇｅ＋ｆｇｅ）菌株由来の溶解物は、スルファターゼ／ホスファターゼ阻害剤がある状態およびない状態で蛍光発生基質４−メチルウンベリフェリル硫酸（４ＭＵＳ）を使用して、スルファターゼ活性に関して試験した。カサガイのスルファターゼを陽性対照として使用した。（パネルｄ）ＭｔｂＨ３７ＲｖのＷＴ、Δｆｇｅ、およびΔｆｇｅ＋ｆｇｅ菌株由来の溶解物は、スルファターゼ／ホスファターゼ阻害剤がある状態およびない状態で蛍光発生基質４−メチルウンベリフェリル硫酸を使用して、ホスファターゼ活性に関して試験した。組換えＭｔｂホスファターゼＰｔｐＡは、陽性対照として使用した。
【図９】ＭｔｂΔｆｇｅ突然変異体のサザンブロット分析の結果を示す図である。ゲノムＤＮＡはＦｓｐＩまたはＮｃｏＩで消化し、アガロースゲル電気泳動によって分離し、ナイロンブロットに移した。ブロットは４７４ｂｐのジゴキシゲニン標識ＤＮＡ断片でプローブ処理し、野生型の４．８ｋｂのＦｓｐＩ断片および５．７ｋｂのＮｃｏＩ断片、ならびに突然変異体の５．５ｋｂのＦｓｐＩ断片および５．１ｋｂのＮｃｏＩ断片を同定した。
【図１０】組換えＲｖ２４０７、Ｒｖ３４０６およびＲｖ３７６２ｃは４ＭＵＳアッセイにおいて活性を示さないことを例示するデータを示す図である。カサガイのスルファターゼを陽性対照として使用した。
【図１１ＡＢ】ＳｔｒｅｐＦＧＥの構造を示している概略図である。（パネルａ）ＳｔｒｅｐＦＧＥおよびヒトＦＧＥの立体的な重ね合わせ。ＳｔｒｅｐＦＧＥの二次構造要素を示す。Ｃａ２＋イオンは球体として表す。全体の標準偏差は０．６５Åである。（パネルｂ）ＳｔｒｅｐＦＧＥの考えられるＣａ２＋結合部位とヒトＦＧＥの第２のＣａ２＋結合部位周辺の残基との比較。適切な配位構造は、ＳｔｒｅｐＦＧＥにおけるＧｌｕ６６Ａｌａの突然変異によって失われる。
【図１１Ｃ】（パネルｃ）ＳｔｒｅｐＦＧＥの推定外部位の表面表示。グレースケールで表した表面は、（アミノ酸配列アラインメントに基づいた）すべての既知のＦＧＥと推定ＦＧＥの間の残基の保存に従い着色し、白色は非保存残基を表し、ライトブルーはわずかに保存された残基を表し、ミディアムブルーは保存残基を表し、およびダークブルーは同一残基を表す。６残基のペプチド基質は、ヒトＦＧＥ−ペプチド複合体構造２４（ＰＤＢエントリー２ＡＩＫ）からモデル化する。仮想の拡大ペプチド基質をリボンとして表す。
【図１１ＤＥ】（パネルｄ、ｅ）活性部位のシステイン２７２および２７７は、一部分のジスルフィド結合中に存在するようである。Ｃｙｓ２７２は２つの代替の立体配座中に示される。Ｃｙｓ２７２とＳｅｒ２６９の間の電子密度は、水分子（ｄ）または部分占有されたヒドロペルオキシド（パネルｅ）としてモデル化することができる。モノマーＤを示す。除外電子密度は１σに合わせる。
【図１２】ＳｔｒｅｐＦＧＥおよびＭｔｂＦＧＥのＩＣＰ−ＡＥＳ分析を示している表である。
【図１３】ＭｔｂおよびＳｔｒｅｐＦＧＥの活性は分子酸素に依存するが、金属補因子とは無関係であることを示しているデータを示す図である。（ａ）スルファターゼモチーフに似ている合成ペプチド（質量＝１４２１．７Ｄａ）は、ＦＧＥの基質として使用した。ＦＧｌｙへのシステインの変換は１８Ｄａの消失をもたらし、これは質量分析によって検出した。（ｂ、ｇ）金属キレート剤ＥＤＴＡは活性に対してまったく影響がなかった。（ｃ、ｈ、ｉ）ＭｔｂおよびＳｔｒｅｐＦＧＥにおける活性部位のシステインの消失は活性を無効にした。（ｄ）ＭｔｂＦＧＥにおける活性部位のＳｅｒ２６０の消失は活性を著しく低下させた。（ｅ）ＭｔｂＦＧＥは分子酸素の不在下では不活性であった。（ｆ）ＷＴＳｔｒｅｐＦＧＥは合成ペプチドを酸化することができた。（ｊ）ＳｔｒｅｐＦＧＥにおける活性部位のＴｒｐ２３４は触媒活性に必要ではない。ｍ／ｚ１４２７におけるイオンは、ＦＧｌｙ含有生成ペプチドのナトリウム付加物である。
【図１４】ＳｔｒｅｐＦＧＥにおける活性部位のシステイン２７２および２７７が、一部分のジスルフィド結合に関与することを示しているデータを示す図である。（ａ）ＳｔｒｅｐＦＧＥはＮＢＤで標識し、付加物は質量分析によって検出した。ＮＢＤ修飾型ＳｔｒｅｐＦＧＥの２つの集団を観察した。１つの集団は、ジスルフィド結合したＣｙｓ２７２およびＣｙｓ２７７に対応する１つのＮＢＤ付加物を有していた（ｂ参照）。その他の集団は、Ｃｙｓ２７２およびＣｙｓ２７７チオールに対応する３つのＮＤＢ付加物を有していた（ｃ参照）。多数の荷電状態が両方の集団に関して示される。それぞれのイオンピークの上の数字は、それぞれの集団に帰属するＮＢＤ付加物の数を示す。（ｂ〜ｄ）トリプシン溶解後に質量分析を使用して、ＮＤＢ付加物をそれぞれの表面露出チオールにマッピングした。示すのは、ジスルフィド結合したＣｙｓ２７２およびＣｙｓ２７７（ｂ、計算質量＝１，４７１．５８；実測質量＝１，４７１．５８）、Ｃｙｓ２７２とＣｙｓ２７７の両方におけるＮＢＤ付加物（ｃ、計算質量＝１，７９９．５８；実測質量＝１，７９９．６１）、およびＣｙｓ３０ｌにおけるＮＢＤ付加物（ｄ、計算質量＝１４８６．５２；実測質量＝１，４８６．５４）に対応する＋２の荷電状態のイオンである。（ｅ）Ｃｙｓ３０１は遊離チオールとして観察されなかった（示した＋２の荷電状態のイオンの予想位置）。Ｃｙｓ３０１は、標識有効性を評価するための内部対照として働いた追加的な表面露出チオールであった。
【図１５】ＳｔｒｅｐＦＧＥのＣｙｓ２７７Ｓｅｒの亜集団が、還元型Ｃｙｓ２７２残基を含有しないことを示しているデータを示す図である。（ａ）ＳｔｒｅｐＦＧＥのＣｙｓ２７７ＳｅｒはＮＢＤで標識し、付加物は質量分析によって検出した。ＮＢＤ修飾型ＳｔｒｅｐＦＧＥのＣｙｓ２７７Ｓｅｒの２つの集団を観察した。１つの集団は、Ｃｙｓ３０１に１つのＮＢＤ付加物を有する遊離チオールとしてのＣｙｓ２７２に対応する（ｂおよびｄ参照）。その他の集団は、Ｃｙｓ２７２とＣｙｓ３０１の両方にＮＤＢ付加物を有していた（ｃおよびｄ参照）。多数の荷電状態が両方の集団に関して示される。それぞれのイオンピークの上の数字は、それぞれの集団に帰属するＮＢＤ付加物の数を示す。（ｂ〜ｄ）トリプシン溶解後に質量分析を使用して、ＮＤＢ付加物をそれぞれの表面露出チオールにマッピングした。示すのは、遊離チオールとしてのＣｙｓ２７２（ｂ、計算質量＝１，４５７．６１；実測質量＝１，４５７．６０）、ＮＢＤ付加物を有するＣｙｓ２７２（ｃ、計算質量＝１，６２０．６２；実測質量＝１，６２０．６０）、およびＮＢＤ付加物を有するＣｙｓ３０１（ｄ、計算質量＝１，４８６．５４；実測質量＝１４８６．５４）に対応する＋２の荷電状態のイオンである。（ｅ）Ｃｙｓ３０ｌは遊離チオールとして観察されなかった（示した＋２の荷電状態のイオンの予想位置）。Ｃｙｓ３０１は、標識有効性を評価するための内部対照として働いた追加的な表面露出チオールであった。
【図１６】ＳｔｒｅｐＦＧＥがＣｙｓ２７２の安定した、共有結合修飾を示唆する質量異常を示さないことを示しているデータを示す図である。ヒス６−タグはＳｔｒｅｐＦＧＥから切断し、酵素の質量は質量分析によって決定した。それぞれのイオンピークの上の数字は、荷電状態を表す。
【図１７】抗体の概略を含めた組換えＩｇＧＦｃの部位特異的標識の概略、および１３量体アルデヒドタグを用いたＮ末端タグ化状態（Ｎ−Ａｌｄ１３−Ｆｃ）またはＣ末端タグ化状態（Ｃ−Ａｌｄ１３−Ｆｃ）のいずれかである（ＬＣＴＰＳＲＡＡＬＬＴＧＲ）、あるいは対照タグでＮ末端またはＣ末端修飾した（ＬＡＴＰＳＲＡＡＬＬＴＧＲ）、Ｆｃ断片の修飾の結果を示す図である。
【図１８】６量体アルデヒドタグを使用したＩｇＧＦｃ断片の部位特異的標識の概略を示す図であり、６量体アルデヒドタグを用いたＮ末端タグ化状態（Ｎ−Ａｌｄ６−Ｆｃ）またはＣ末端タグ化状態（Ｃ−Ａｌｄ６−Ｆｃ）のいずれかである（ＬＣＴＰＳＲ）、あるいは対照タグでＮ末端またはＣ末端修飾した（ＬＡＴＰＳＲ）、Ｆｃ断片の修飾の結果を含む図である。
【図１９】Ｎ末端タグ化ＩｇＧＦｃ由来のホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）含有ペプチドの同定の結果を示す図であり、Ｎ末端タグ化ＩｇＧＦｃ断片のトリプシン断片におけるＦＧｌｙの存在を確認する、質量スペクトル分析を示す一組のグラフを含む図である。（パネルａ）ＦＧｌｙを取り込んだトリプシン断片の質量スペクトル。理論値：４２９．７２６８ｍ／ｚ；実測値：４２９．７３２１ｍ／ｚ。（パネルｂ）２−ヨードアセトアミドを用いた処理後の、ＦＧｌｙを取り込んだＮ末端タグ化ＩｇＧＦｃ断片のトリプシン断片の質量スペクトル。理論値：４６７．２３７５ｍ／ｚ  実測値：４６７．２４１０ｍ／ｚ。
【図２０】Ｃ末端タグ化ＩｇＧＦｃ由来のホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）含有ペプチドの同定の結果を示す図であり、Ｃ末端タグ化ＩｇＧＦｃ断片のトリプシン断片におけるＦＧｌｙの存在を確認する、質量スペクトル分析を示す一組のグラフを含む図である。（パネルａ）ＦＧｌｙを取り込んだトリプシン断片の質量スペクトル。理論値：５０８．７６１３ｍ／ｚ；実測値：５０８．７７５５ｍ／ｚ。（パネルｂ）２−ヨードアセトアミドを用いた処理後の、ＦＧｌｙを取り込んだＣ末端タグ化ＩｇＧＦｃ断片のトリプシン断片の質量スペクトル。理論値：５４６．２７２１；ｍ／ｚ  実測値：５４６．２８１１ｍ／ｚ。
【図２１】細胞表面タンパク質の部位特異的標識に関する図であり、（ＬＣＴＰＳＲＡＡＬＴＧＲの１３量体アルデヒドタグを使用して）アルデヒドタグ化細胞表面タンパク質を構築するために使用したｐＤｉｓｐｌａｙ（商標）ベクターの概略、および対照（ＬＡＴＰＳＲＡＡＬＬＴＧＲ；Ｃ−＞Ａ−ＴＭと呼ぶ）と比較した、１３量体を用いてタグ化した表面タンパク質（Ａｌｄ１３−ＴＭ）の増大した平均蛍光を示すグラフを与える図である。
【図２２】Ｈｉｓ６−Ａｌｄ１３−ＡｃＧＦＰによって例示されるサイトゾルタンパク質の部位特異的標識に関する図であり、ヒスタグおよび１３量体アルデヒドタグを含有する緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）融合タンパク質（Ｈｉｓ６−Ａｌｄ１３−ＡｃＧＦＰまたはＡｌｄ−ＡｃＧＦＰと呼ぶ）、または対照タグ（ＬＡＴＰＳＲＡＡＬＬＴＧＲ）を含有するＧＦＰ融合タンパク質（Ｃ−＞Ａ−ＡｃＧＦＰと呼ぶ）の修飾の結果を与える図である。
【図２３】アルデヒドタグ法を使用するインターフェロンβ（ＩＦＮ−β）の部位特異的グリコシル化を説明する概略を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
本発明を記載する前に、本発明は記載した特定の実施形態に限られず、当然ながら変わる可能性があることを理解されたい。本明細書で使用する術語は単に特定の実施形態を記載する目的であり、限定することを意図するものではないことも理解されたい、何故なら本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるからである。
【００３１】
ある範囲の値を与える場合、その範囲の上限と下限の間で、文脈が明らかに他のことを示さない限り、下限の単位の１０分の１までのそれぞれの介在値も、明確に開示されることを理解されたい。表示範囲内の任意の表示値または介在値とその表示範囲内の任意の他の表示値または介在値の間の、それぞれのさらに小さな範囲が本発明内に包含される。これらのさらに小さな範囲の上限と下限は、独立にその範囲に含める、あるいはその範囲から除外することができ、かつ小さな範囲に限界の一方が含まれ、両方とも含まれずまたは両方とも含まれるそれぞれの範囲も、表示範囲内の任意の明確に除外される限界に従い本発明内に包含される。表示範囲が限界の一方または両方を含む場合、これらの含まれる限界の一方または両方を除外した範囲も本発明内に含まれる。
【００３２】
他に定義しない限り、本明細書で使用するすべての技術および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されているのと同じ意味を有する。本明細書に記載するものと同様または均等である任意の方法および物質を、本発明を実施または試験する際に使用することができるが、いくつかの考えられる代表的な方法および物質をここで記載する。本明細書で述べるすべての刊行物は、それに関して刊行物が引用される方法および／または物質を開示および記載するように、参照によって本明細書に組み込まれる。本開示は矛盾が存在する程度で組み込んだ刊行物の任意の開示に優先することを理解されたい。
【００３３】
本明細書および添付の特許請求の範囲中で使用する単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他のことを示さない限り、複数形の指示語を含むことに留意しなければならない。したがって、例えば、「１つのアルデヒドタグ」に対する言及は複数のこのようなタグを含み、および「そのポリペプチド」に対する言及は、当業者に知られている１つまたは複数のポリペプチドおよびその均等物などに対する言及を含む。
【００３４】
任意選択である可能性がある任意の要素を除外するために、特許請求の範囲が作成され得ることにさらに留意されたい。このように、本記載は特許請求する要素の列挙、または「消極的」限定の使用に関して「単に」、「のみ」などの排他的術語を使用するための根拠として使用するものとする。
【００３５】
本明細書で論じる刊行物は、本出願の出願日前のそれらの開示のために示すにすぎない。本発明に先行発明によるこのような刊行物に先行する権利がないことを承認するとして解釈されるものは本明細書には存在しない。さらに、与えられる公開日は実際の公開日と異なる可能性があり、これらは独力で確認する必要があり得る。
【００３６】
定義
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は本明細書で互換的に使用され、任意の長さのポリマー形のアミノ酸を指す。他のことを明らかに示さない限り、「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、遺伝的にコードされたアミノ酸および非コードアミノ酸、化学的または生化学的に修飾または誘導体化されたアミノ酸、および修飾ペプチド骨格を有するポリペプチドを含むことができる。この用語は、異種アミノ酸配列を有する融合タンパク質、異種および相同リーダー配列を有する融合体、（例えば、組換え細菌宿主細胞における生成を容易にするために）少なくとも１つのＮ末端メチオニン残基を含むタンパク質、免疫学的タグ化タンパク質などだけには限られないが、これらを含めた融合タンパク質を含む。
【００３７】
「標的ポリペプチド」は、本明細書において、本明細書に記載するアルデヒドタグの使用によって修飾されるポリペプチドを指すのに使用される。
【００３８】
「天然アミノ酸配列」または「親アミノ酸配列」は、標的ポリペプチドの文脈で本明細書において互換的に使用され、異種アルデヒドタグを封入するための修飾前の標的ポリペプチドのアミノ酸配列を指す。
「アルデヒドタグ」または「ａｌｄ−タグ」とは、２−ホルミルグリシン残基（本明細書では「ＦＧｌｙ」と呼ぶ）を含有させるためのホルミルグリシン生成酵素（ＦＧＥ）の作用によって変換され得る、あるいは変換されている、スルファターゼモチーフ由来のアミノ酸配列を含有するアミノ酸配列を意味する。これは技術的には正しくないが、ＦＧＥによって生成するＦＧｌｙ残基は、文献中では「ホルミルグリシン」と呼ばれることが多い。別の言い方をすれば、用語「アルデヒドタグ」は、本明細書において、「非変換型」スルファターゼモチーフ（すなわち、システインまたはセリン残基がＦＧＥによってＦＧｌｙに変換されていないが、変換される可能性があるスルファターゼモチーフ）を含むアミノ酸配列、および「変換型」スルファターゼモチーフ（すなわち、システインまたはセリン残基がＦＧＥの作用によってＦＧｌｙに変換されているスルファターゼモチーフ）を含むアミノ酸配列を指すのに使用される。
【００３９】
スルファターゼモチーフに対するホルミルグリシン生成酵素（ＦＧＥ）の作用の文脈で使用する「変換」によって、ホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）残基に対する、スルファターゼモチーフにおけるシステインまたはセリン残基の生化学的修飾を指す（例えば、ＦＧｌｙへのＣｙｓ、またはＦＧｌｙへのＳｅｒ）。
【００４０】
「修飾」は、一部分の付加、除去、または改変を包含する。変換型スルファターゼモチーフを有するポリペプチドの文脈で使用するように、「修飾」は、ＦＧｌｙのアルデヒド部分と反応パートナーの反応による、ポリペプチドのアルデヒドタグのＦＧｌｙ残基の化学的または生化学的修飾を指すことを意味する。前に論じたように、用語「変換」は、ＦＧＥによって仲介されるアルデヒドタグのＦＧｌｙ残基の生化学的修飾の型を指す。
【００４１】
ポリペプチド、ペプチドまたはタンパク質のアミノ酸配列に関して使用する「遺伝的にコード可能な」によって、アミノ酸配列が、そのアミノ酸配列をコードする核酸の転写および翻訳による生成が可能であるアミノ酸残基から構成されることを意味し、この場合転写および／または翻訳は細胞で、または無細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写／翻訳系で起こる可能性がある。
【００４２】
用語「制御配列」は、個々の発現系、例えば哺乳動物細胞、細菌細胞、無細胞合成系などにおいて作動可能に連結したコード配列の発現を容易にするＤＮＡ配列を指す。原核生物系に適した制御配列は、例えばプロモーター、場合によってはオペレーター配列、およびリボソーム結合部位を含む。真核細胞系はプロモーター、ポリアデニル化シグナル、およびエンハンサーを利用することができる。
【００４３】
核酸は、それが他の核酸配列と機能的関係に置かれているとき「作動可能に連結している」。例えば、プレ配列または分泌リーダーのＤＮＡは、それがポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合、ポリペプチドのＤＮＡと作動可能に連結しており、プロモーターまたはエンハンサーは、それが配列の転写に影響を与える場合、コード配列と作動可能に連結しており、またはリボソーム結合部位は、それが翻訳の開始を容易にするように位置する場合、コード配列と作動可能に連結している。一般に、「作動可能に連結している」は、連結しているＤＮＡ配列は隣接しており、および分泌リーダーの場合、隣接しておりリーディングフレーム内に存在することを意味する。連結はライゲーションによって、または増幅反応によって実施される。合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーは、従来の習慣に従い配列を連結させるために使用することが可能である。
【００４４】
本明細書で使用する用語「発現カセット」は、（例えば、対象とする構築体へのライゲーションと適合性がある制限部位の使用によって、あるいは対象とする構築体または宿主細胞ゲノムへの相同的組換えによって）核酸に挿入することができる、核酸、通常ＤＮＡのセグメントを指す。一般に、核酸セグメントは、対象とするポリペプチド（例えば、対象とする標的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと作動可能に連結することができるアルデヒドタグ）をコードするポリヌクレオチドを含み、カセットおよび制限部位を設計して、転写および翻訳に適したリーディングフレーム中のカセットの挿入を容易にする。発現カセットは、宿主細胞中での対象とするポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現を容易にするエレメントも含むことができる。これらのエレメントは、プロモーター、最少プロモーター、エンハンサー、応答エレメント、ターミネーター配列、ポリアデニル化シグナルなどだけには限られないが、これらを含むことができる。
【００４５】
本明細書で使用する用語「単離した」は、その化合物が本来存在する環境と異なる環境に存在する、対象とする化合物を記載することを意味する。「単離した」は、対象とする化合物が実質的に増大したサンプルおよび／または対象とする化合物が部分的または実質的に精製されたサンプル内に存在する化合物を含むことを意味する。
【００４６】
本明細書で使用する用語「実質的に精製された」は、その本来の環境から除去され、それが本来結合している他の構成要素から少なくとも６０％遊離、通常７５％遊離、および最も通常は９０％遊離した化合物を指す。
【００４７】
用語「生理的条件」は、生存細胞と適合性がある条件、例えば生存細胞と適合性がある温度、ｐＨ、塩分などの主に水の条件を包含することを意味する。
【００４８】
「異種」とは、本来は通常見られない関係で第１の物体と第２の物体が与えられることを意味する。例えば、「異種」スルファターゼモチーフまたは「異種」ａｌｄ−タグを包含するタンパク質は、そのアミノ酸配列内のその位置にスルファターゼモチーフを通常含有しないタンパク質である（例えば、１つの天然スルファターゼモチーフを有するタンパク質は「異種」である第２のスルファターゼモチーフを含むことができ、スルファターゼモチーフを含むさらなるタンパク質を修飾してスルファターゼモチーフの位置を変え、位置を変えたスルファターゼモチーフをタンパク質と「異種」にすることができる）。いくつかの実施形態では、異種スルファターゼモチーフは、天然スルファターゼモチーフを含まないポリペプチド中に存在する。
【００４９】
「反応パートナー」とは、他の反応パートナーと特異的に反応して反応生成物を生成する、分子または分子部分を意味する。代表的な反応パートナーには、スルファターゼモチーフのシステインまたはセリンとホルミルグリシン生成酵素（ＦＧＥ）があり、これらは反応してモチーフ中にシステインまたはセリンの代わりにＦＧｌｙを含有する変換型アルデヒドタグの反応生成物を形成する。他の代表的な反応パートナーには、変換型アルデヒドタグのホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）残基のアルデヒドと対象とする部分を含む反応パートナー試薬があり、これらは反応してＦＧｌｙ残基においてアルデヒドタグ化ポリペプチドと結合した対象とする部分を有する修飾型アルデヒドタグ化ポリペプチドの反応生成物を形成する。
【００５０】
「Ｎ末端」は、遊離アミン基を有するポリペプチドの末端アミノ酸残基を指し、非Ｎ末端アミノ酸残基中のアミン基はポリペプチドの共有結合骨格の一部分を通常形成する。
【００５１】
「Ｃ末端」は、遊離カルボキシル基を有するポリペプチドの末端アミノ酸残基を指し、非Ｃ末端アミノ酸残基中のカルボキシル基はポリペプチドの共有結合骨格の一部分を通常形成する。
【００５２】
「Ｎ末端」とは、Ｃ末端よりＮ末端に近いポリペプチドの領域を意味する。
【００５３】
「Ｃ末端」とは、Ｎ末端よりＣ末端に近いポリペプチドの領域を意味する。
【００５４】
ポリペプチドまたはポリペプチドのアミノ酸配列に関して使用する「内部部位」によって、Ｎ末端またはＣ末端に存在しないポリペプチドの領域を意味し、かつポリペプチドのＮ末端とＣ末端領域の両方を含む。
【００５５】
序論
本発明は、本明細書で「アルデヒドタグ」または「ａｌｄ−タグ」と呼ぶペプチドタグとして使用するための、本来存在する、遺伝的にコード可能なスルファターゼモチーフを利用して、ポリペプチドの部位特異的修飾を誘導する。スルファターゼの活性部位に見られるモチーフに基づくアルデヒドタグのスルファターゼモチーフは、（例えば、細胞中でのアルデヒドタグ含有タンパク質の翻訳時に）ｉｎ  ｖｉｖｏまたは（例えば、無細胞系中でアルデヒドタグ含有タンパク質とＦＧＥを接触させることによって）ｉｎ  ｖｉｔｒｏのいずれかでのホルミルグリシン生成酵素（ＦＧＥ）の作用によって、ホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）に変換（酸化）される可能性があるセリンまたはシステイン残基を含有する。得られたＦＧｌｙ残基のアルデヒド部分を「化学的ハンドル」として使用して、タンパク質の部位特異的化学修飾を容易にすることができる。
【００５６】
図１Ａは、本発明の代表的な方法および組成物を示す概略図である。この実施例では、代表的スルファターゼモチーフ（「ＬＣＴＰＳＲ」）は、対象とするタンパク質をコードする核酸を含有する構築体中に位置する。この実施例では、スルファターゼモチーフは発現後にコードタンパク質のＮ末端に位置するが、しかしながら、以下により詳細に記載するように、スルファターゼモチーフはポリペプチドの１つまたは複数の望ましい部位に挿入することができる（例えば、コードポリペプチドのＮ末端、Ｃ末端および／または内部部位においてモチーフを与えるために）。図１Ａ中に例示するスルファターゼモチーフは、以下により詳細に記載するようにスルファターゼモチーフの属内に存在する。図１Ｂは、多様な生物において見られる様々なスルファターゼ由来の、スルファターゼモチーフの配列アラインメントの概略図である。そのコンセンサス配列は、この試験で使用した２つのアルデヒドタグの配列を含有する。保存残基は強調表示する。
【００５７】
細胞中での発現および／または適切な酵素（例えば、ＡｔｓＢ型またはＳＵＭＦ１型ＦＧＥ）への露出によって、スルファターゼモチーフのコードシステインはホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）に変換される。ＦＧｌｙ残基のアルデヒドを様々な適用例、例えば対象とする部分との共有結合用、タンパク質固定などの適用例に「化学的ハンドル」として使用することができる。図１Ａ中では、代表的な部分は、スルファターゼ部分の修飾システイン残基と結合した検出可能な標識である。
【００５８】
本明細書に開示する、修飾される標的タンパク質内のアルデヒドタグの配置とアルデヒドタグ仲介型修飾の両方を、広く様々なタンパク質に関して一般化することが可能である。スルファターゼモチーフの変換を容易にしてＦＧｌｙ残基を生成するＦＧＥの能力は、タンパク質内のモチーフの位置とは無関係である。ＦＧＥは配列状況非依存的と構造状況非依存的の両方の形式でスルファターゼモチーフのシステイン／セリンを変換することができるので、アルデヒドタグは修飾される標的ポリペプチド内の任意の望ましい部位に配置することが可能である、ただしスルファターゼモチーフは酵素変換時にＦＧＥに接触可能であるものとする。さらに、アルデヒドの特有の反応性は、組換えタンパク質のバイオオルソゴナル（ｂｉｏｏｒｔｈｏｎｇｏｎａｌ）および化学選択的な修飾を可能にし、したがって生理的条件下および高選択的方法で実施することができるタンパク質の化学修飾のための部位特異的手段をもたらす。
【００５９】
本開示から理解されるように、アルデヒドタグの適用例は多数存在し、いくつかの利点を与えることができる。例えば、アルデヒドタグは、タンパク質の共有結合修飾を可能にする従来のペプチドタグのすべてではないが大部分より小さく、したがって標的ポリペプチドのアミノ酸配列に対する最少の変化が必要とされる。第２に、アルデヒドタグは十分特徴付けられた第２の標識化学物質を利用する。第３に、アルデヒドタグは可逆性を示し、かつ異なる安定性の共有結合を介して一部分の結合をもたらす反応パートナーの選択によって、アルデヒドタグで結合した部分の連続的修飾および置換を可能にする。さらに、アルデヒドタグは大部分の細胞系に既に存在する生合成機構を使用して形成され、親アミノ酸配列内の標的または配置の性質とは無関係なので、アルデヒドタグを使用して、容易に利用可能な発現系を使用する多数のポリペプチドの修飾を容易にすることができる。
【００６０】
変換型アルデヒドタグのアルデヒド部分は、蛍光またはエピトープ標識を使用する可視化（例えば、アルデヒド反応基を備える金粒子を使用する電子顕微鏡法）、タンパク質固定（例えば、タンパク質マイクロアレイ生成）、タンパク質の動力学および局在性の試験および適用例、および対象とする部分（例えば、親タンパク質の治療指数を改善する部分（例えば、ＰＥＧ）、（例えば、作用部位に対する生物学的利用能を高めるための）標的部分、および生物活性部分（例えば、治療部分）とタンパク質の結合だけには限られないがこれらを含めた、様々な用途に使用することができる。
【００６１】
特に興味深いのは、ＰＥＧなどの水溶性ポリマーの部位特異的結合を容易にするためのアルデヒドタグの使用である。タンパク質結合化学における進展にもかかわらず、タンパク質の制御された、部位特異的修飾はいまだ課題である。多くの従来のペグ化法は、例えば標的残基としてのリシンまたはシステインとの反応によってＰＥＧ部分を結合させる。タンパク質中の多数の標的残基の存在が原因で、このような従来のシステムは多数の部位におけるペグ化をもたらし、異なる薬物動態を有する別個のタンパク質−ＰＥＧ複合体の集合を生成する可能性がある。対照的に、標的残基としてのアルデヒドタグのＦＧｌｙ残基の使用は、ポリマー共有結合に特有の部位を与え、したがって生成する修飾産物の特異性と均質性の両方を増大させる。これらおよび他の特徴および利点は、本開示を読むことによって当業者には容易に明らかである。
【００６２】
本発明を実施するための方法および組成物を、ここでより詳細に記載する。
【００６３】
アルデヒドタグ
一般に、アルデヒドタグは、ホルミルグリシン生成酵素（ＦＧＥ）の作用により変換されてホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）を含有し得る、（「スルファターゼドメイン」とも呼ばれる）スルファターゼモチーフ由来の任意のアミノ酸配列に基づくものであってよい。ＦＧＥの作用はＦＧＥがスルファターゼモチーフにおいて作用する点で配列特異的に誘導されるが、このスルファターゼモチーフは標的ポリペプチドの任意の領域内に位置する可能性がある。したがって、スルファターゼモチーフのＦＧＥ仲介型の変換は部位特異的であるが（すなわち、ＦＧＥがスルファターゼモチーフのアミノ酸配列において作用する点で）、スルファターゼモチーフに作用するＦＧＥの能力は配列状況非依存的である（すなわち、スルファターゼモチーフのシステイン／セリンを変換するＦＧＥの能力は、スルファターゼモチーフが標的ポリペプチド中に存在する配列の状況と無関係である）。
【００６４】
代表的なアルデヒドタグ
アルデヒドタグの最小スルファターゼモチーフは、通常約５または６アミノ酸残基長、通常せいぜい６アミノ酸残基長である。一般に、標的ポリペプチドの天然アミノ酸配列の修飾の程度を最小にして、（例えば、ＮまたはＣ末端に）挿入、欠失、置換（交換）、または付加されるアミノ酸残基の数を最小にすることが通常は望ましい。標的ポリペプチドのアミノ酸配列の修飾の程度を最小にすることは、このような修飾が標的ポリペプチドの機能および／または構造に対して有し得る修飾の影響を最小にするために通常望ましい。したがって、特に興味深いアルデヒドタグは、標的ポリペプチドのアミノ酸配列の１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、または７個未満のアミノ酸残基の修飾（挿入、付加、欠失、置換／交換）を必要とするアルデヒドタグを含む。
【００６５】
特に興味深いアルデヒドタグは最小スルファターゼモチーフに基づくアルデヒドタグであることに留意すべきであるが、さらに長いアルデヒドタグが本開示によって企図されかつ包含され、本発明の組成物および方法において用途を見出すことができることは容易に理解される。したがってアルデヒドタグは５または６残基の最小スルファターゼモチーフを含むことができ、あるいはさらに長い可能性があり、かつモチーフのＮおよび／またはＣ末端側においてさらなるアミノ酸残基に隣接し得る最小スルファターゼモチーフを含むことができる。例えば５または６アミノ酸残基、および５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個を超える、あるいはそれを超えるアミノ酸残基のさらに長いアミノ酸配列の、アルデヒドタグが企図される。
【００６６】
一般に、本明細書に記載するアルデヒドタグにおいて有用なスルファターゼモチーフは、式：
Ｘ１Ｚ１Ｘ２Ｚ２Ｘ３Ｒ          （Ｉ）
［上式で
Ｚ１がシステインまたはセリンであり（これは（Ｃ／Ｓ）によって表すこともできる）、
Ｚ２がプロリンまたはアラニン残基のいずれかであり（これは（Ｐ／Ａ）によって表すこともできる）、
Ｘ１が存在するかまたは存在せず、存在するときは任意のアミノ酸であってよいが、通常は脂肪族アミノ酸、イオウ含有アミノ酸、または極性、非荷電アミノ酸（すなわち、芳香族アミノ酸または荷電アミノ酸以外）であり、通常はＬ、Ｍ、Ｖ、ＳまたはＴであり、さらに通常はＬ、Ｍ、ＳまたはＶであり、ただしスルファターゼモチーフが標的ポリペプチドのＮ末端に存在するとき、Ｘ１が存在し、
Ｘ２とＸ３が独立に任意のアミノ酸であってよいが、通常は脂肪族アミノ酸、極性、非荷電アミノ酸、またはイオウ含有アミノ酸（すなわち、芳香族アミノ酸または荷電アミノ酸以外）であり、通常はＳ、Ｔ、Ａ、Ｖ、ＧまたはＣであり、さらに通常はＳ、Ｔ、Ａ、ＶまたはＧである］のモチーフである。
【００６７】
スルファターゼモチーフに対するＦＧＥの作用後、Ｚ１が酸化されてホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）残基が生成することに留意すべきである。さらに、ＦＧＥ仲介の変換および対象とする部分を含む反応パートナーとの反応の両方の後、前式中のＺ１に位置するＦＧｌｙは対象とする部分（例えば検出可能な標識、水溶性ポリマーなど）と共有結合する。
【００６８】
アルデヒドタグが標的ポリペプチドのＮ末端以外の位置に存在するに存在する場合、前式のＸ１は標的ポリペプチドの天然アミノ酸配列のアミノ酸残基によって与えられ得る。したがって、いくつかの実施形態では、かつ標的ポリペプチドのＮ末端以外の位置に存在するとき、スルファターゼモチーフは、
式（Ｃ／Ｓ）Ｘ１（Ｐ／Ａ）Ｘ２Ｒ          （ＩＩ）
［上式でＸ１とＸ２が独立に任意のアミノ酸であってよいが、通常は脂肪族アミノ酸、極性、非荷電アミノ酸、またはイオウ含有アミノ酸（すなわち、芳香族アミノ酸または荷電アミノ酸以外）であり、通常はＳ、Ｔ、Ａ、Ｖ、ＧまたはＣであり、さらに通常はＳ、Ｔ、Ａ、またはＶである］のモチーフである。
【００６９】
前に示したように、スルファターゼモチーフは、例えばアルデヒドタグがスルファターゼモチーフと「補助モチーフ」の両方を含むように、配列のＮ末端とＣ末端の片方または両方に追加的な残基を含むことができる。一実施形態では、スルファターゼモチーフは、Ｃ末端に補助モチーフ（すなわち、前式中のアルギニン残基の後）、ＡＡＬＬＴＧＲ、ＳＱＬＬＴＧＲ、ＡＡＦＭＴＧＲ、ＡＡＦＬＴＧＲ、ＳＡＦＬＴＧＲ、ＡＳＩＬＴＧＫ、ＶＳＦＬＴＧＲ、ＡＳＬＬＴＧＬ、ＡＳＩＬＩＴＧ、ＶＳＦＬＴＧＲ、ＳＡＩＭＴＧＲ、ＳＡＩＶＴＧＲ、ＴＮＬＷＲＧ、ＴＮＬＷＲＧＱ、ＴＮＬＣＡＡＳ、ＶＳＬＷＴＧＫ、ＳＭＬＬＴＧ、ＳＭＬＬＴＧＮ、ＳＭＬＬＴＧＴ、ＡＳＦＭＡＧＱ、またはＡＳＬＬＴＧＬ、（例えば、Ｄｉｅｒｋｓら、（１９９９）ＥＭＢＯ  Ｊ  １８（８）：２０８４〜２０９１を参照）、またはＧＳＬＦＴＧＲのアミノ酸配列の隣接残基の１、２、３、４、５、６、もしくは全７個を含む。しかしながら、以下の実施例中で述べるように、本発明者は、このような追加的なＣ末端アミノ酸残基はアルデヒドタグのスルファターゼモチーフのＦＧＥ仲介の変換に必要とされず、したがって単なる任意選択であり、かつ本明細書に記載するアルデヒドタグから明確に除外することができることを発見している。いくつかの実施形態では、アルデヒドタグは、ホスホン酸モノエステル加水分解酵素における天然アミノ酸配列として存在し得る、アミノ酸配列ＣＧＰＳＲ（Ｍ／Ａ）ＳまたはＣＧＰＳＲ（Ｍ／Ａ）は含まない。
【００７０】
アルデヒドタグのスルファターゼモチーフは一般に、選択したＦＧＥ、例えばアルデヒドタグ化ポリペプチドが発現される宿主細胞中に存在するＦＧＥ、または無細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ法においてアルデヒドタグ化ポリペプチドと接触させるＦＧＥによる変換が可能であるように選択する。
【００７１】
アルデヒドタグ化標的ポリペプチドにおけるＦＧｌｙの生成を与えるのに適した反応パートナーを与えるアルデヒドタグおよびＦＧＥの選択は、当技術分野で入手可能な情報に照らして容易に実施することができる。一般に、真核生物のＦＧＥによる変換の影響を受けやすいスルファターゼモチーフは、システインおよびプロリン（すなわち、Ｚ１およびＺ２における、それぞれ前の式Ｉ（例えば、Ｘ１ＣＸ２ＰＸ３Ｒ）；前の式ＩＩ中のＣＸ１ＰＸ２Ｒ中のシステインおよびプロリン）を含み、「ＳＵＭＦ１型」ＦＧＥによって修飾される（Ｃｏｓｍａら、Ｃｅｌｌ  ２００３、１１３、（４）、４４５〜５６；Ｄｉｅｒｋｓら、Ｃｅｌｌ  ２００３、１１３、（４）、４３５〜４４）。原核生物のＦＧＥによる変換の影響を受けやすいスルファターゼモチーフは、システインまたはセリン、およびプロリンのいずれかをスルファターゼモチーフ中に含有し（すなわち、それぞれＺ１におけるシステインまたはセリン、およびＺ２におけるプロリン、前の式Ｉ中（例えば、Ｘ１（Ｃ／Ｓ）Ｘ２ＰＸ３Ｒ；（Ｃ／Ｓ）Ｘ１ＰＸ２Ｒ、前の式ＩＩ中）、それぞれ「ＳＵＭＦ１型」ＦＧＥまたは「ＡｔｓＢ型」ＦＧＥのいずれかによって修飾される（Ｓｚａｍｅｉｔら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９９９、２７４、（２２）、１５３７５〜８１）。原核生物のＦＧＥによる変換の影響を受けやすい他のスルファターゼモチーフは、システインまたはセリンのいずれか、およびプロリンまたはアラニンのいずれかをスルファターゼモチーフ中に含み（すなわち、それぞれＺ１におけるシステインまたはセリン、およびＺ２におけるプロリンまたはアラニン、前の式Ｉ中（例えば、Ｘ１ＣＸ２ＰＸ３Ｒ；Ｘ１ＳＸ２ＰＸ２Ｒ；Ｘ１ＣＸ２ＡＸ３Ｒ；Ｘ１ＳＸ２ＡＸ３Ｒ）；ＣＸ１ＰＸ２Ｒ；ＳＸ１ＰＸ２Ｒ；ＣＸ１ＡＸ２Ｒ；ＳＸ１ＡＸ２Ｒ、前の式ＩＩ中）、修飾の影響を受けやすく、例えばフィルミクテス網（例えば、クロストリジウムパーフリンジェンス）のＦＧＥによって修飾することができる（Ｂｅｒｔｅａｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．．２００６；２８１：２２４６４〜２２４７０を参照）。
【００７２】
したがって、例えば、ＦＧＥが真核生物のＦＧＥ（例えば、ヒトのＦＧＥを含めた哺乳動物のＦＧＥ）である場合、スルファターゼモチーフは通常、式
Ｘ１ＣＸ２ＰＸ３Ｒ
［上式で
Ｘ１が存在するかまたは存在しない可能性があり、存在するときは任意のアミノ酸であってよいが、通常は脂肪族アミノ酸、イオウ含有アミノ酸、または極性、非荷電アミノ酸（すなわち、芳香族アミノ酸または荷電アミノ酸以外）であり、通常はＬ、Ｍ、ＳまたはＶであり、ただしスルファターゼモチーフが標的ポリペプチドのＮ末端に存在するとき、Ｘ１が存在し、
Ｘ２とＸ３が独立に任意のアミノ酸であってよいが、通常は脂肪族アミノ酸、イオウ含有アミノ酸、または極性、非荷電アミノ酸、（すなわち、芳香族アミノ酸または荷電アミノ酸以外）であり、通常はＳ、Ｔ、Ａ、Ｖ、ＧまたはＣであり、さらに通常はＳ、Ｔ、Ａ、ＶまたはＧである］のモチーフである。
【００７３】
スルファターゼモチーフの具体例には、ＬＣＴＰＳＲ、ＭＣＴＰＳＲ、ＶＣＴＰＳＲ、ＬＣＳＰＳＲ、ＬＣＡＰＳＲ  ＬＣＶＰＳＲ、およびＬＣＧＰＳＲがある。他の具体的なスルファターゼモチーフは、本明細書で提供する開示から容易に明らかである。
【００７４】
以下により詳細に記載するように、変換型アルデヒドタグ化ポリペプチドは対象とする部分を含む反応パートナーと反応させて、対象とする部分と変換型アルデヒドタグ化ポリペプチドのＦＧｌｙ残基の結合、および修飾型ポリペプチドの生成をもたらす。修飾型アルデヒドタグを有する修飾型ポリペプチドは、式：
Ｘ１（ＦＧｌｙ’）Ｘ２Ｚ２Ｘ３Ｒ（Ｉ）
［上式で
ＦＧｌｙ’が共有結合部分を有するホルミルグリシン残基であり、
Ｚ２がプロリンまたはアラニン残基のいずれかであり（これは（Ｐ／Ａ）によって表すこともできる）、
Ｘ１が存在するかまたは存在しない可能性があり、存在するときは任意のアミノ酸であってよいが、通常は脂肪族アミノ酸、イオウ含有アミノ酸、または極性、非荷電アミノ酸（すなわち、芳香族アミノ酸または荷電アミノ酸以外）であり、通常はＬ、Ｍ、Ｖ、ＳまたはＴであり、さらに通常はＬ、Ｍ、ＳまたはＶであり、ただしスルファターゼモチーフが標的ポリペプチドのＮ末端に存在するとき、Ｘ１が存在し、
Ｘ２とＸ３が独立に任意のアミノ酸であってよいが、通常は脂肪族アミノ酸、イオウ含有アミノ酸、または極性、非荷電アミノ酸、（すなわち、芳香族アミノ酸または荷電アミノ酸以外）であり、通常はＳ、Ｔ、Ａ、Ｖ、ＧまたはＣであり、さらに通常はＳ、Ｔ、Ａ、ＶまたはＧである］の修飾型スルファターゼモチーフを含むことによって一般に記載される。
【００７５】
変換型スルファターゼモチーフの具体例には、Ｌ（ＦＧｌｙ）ＴＰＳＲ、Ｍ（ＦＧｌｙ）ＴＰＳＲ、Ｖ（ＦＧｌｙ）ＴＰＳＲ、Ｌ（ＦＧｌｙ）ＳＰＳＲ、Ｌ（ＦＧｌｙ）ＡＰＳＲ  Ｌ（ＦＧｌｙ）ＶＰＳＲ、およびＬ（ＦＧｌｙ）ＧＰＳＲがある。
【００７６】
以下により詳細に記載するように、対象とする部分は、水溶性ポリマー、検出可能な標識、薬剤、または膜中または表面上におけるポリペプチドの固定化用部分などの様々な部分のいずれかであってよい。アルデヒドタグ化ポリペプチドの前述の考察から明らかであるように、修飾型ポリペプチドの修飾型スルファターゼモチーフは、ポリペプチドの任意の望ましい部位に位置することができる。したがって、本開示は例えば、修飾型ポリペプチドの親の翻訳後修飾部位に位置する修飾型スルファターゼモチーフを有する修飾型ポリペプチドを与える（すなわち、標的ポリペプチドを修飾して翻訳後修飾部位にアルデヒドタグを与える場合、後に生成する修飾型ポリペプチドは、親ポリペプチド中のこの翻訳後修飾部位に対応する位置に一部分を含む）。例えば、したがって、親標的ポリペプチド中でグリコシル化が通常起こり得る部位に対応する部位に共有結合、水溶性ポリマーを有するように、修飾型ポリペプチドを生成することができる。したがって、糖残基は本来存在する親ポリペプチド中に位置し得るので、例えば、同じまたはほぼ同じ位置に位置するＰＥＧ部分を有するペグ化ポリペプチドを生成することができる。同様に、１つまたは複数の非天然翻訳後修飾部位を含むように親標的ポリペプチドを工学的に作製する場合、修飾型ポリペプチドは、親ポリペプチド中のこれらの非天然翻訳後修飾部位に対応する修飾型ポリペプチドの１つまたは複数の部位に、共有結合した水溶性ポリマーを含有することができる。
【００７７】
アルデヒドタグを含めるための標的ポリペプチドの修飾
アルデヒドタグは、アルデヒドタグの部位がＦＧＥによる変換およびＦＧｌｙにおける後の修飾に関して接触可能である、または（例えば、タンパク質の変性によって）接触可能になり得るという条件で、標的ポリペプチドの変換および／または修飾をもたらすことが望ましい標的ポリペプチド内の任意の位置に位置してよい。１つまたは複数のアルデヒドタグを含むように、標的ポリペプチドを修飾することができる。標的ポリペプチド中に存在することができるアルデヒドタグの数は、選択する標的ポリペプチドと共に変わり、１、２、３、４、５個、あるいはそれより多くのアルデヒドタグを含むことができる。
【００７８】
いくつかの実施形態では、（例えば、無細胞環境、通常は無細胞の生理的環境中の）フォールディングおよび／または（例えば、膜貫通タンパク質などのポリペプチドと結合した細胞膜に関して）細胞膜中または上に存在するときのその構造を考慮して、標的ポリペプチド中に（複数の）アルデヒドタグを配置することが望ましい。例えば、フォールディング状態の標的ポリペプチド中の溶媒接触可能部位にアルデヒドタグを配置することができる。フォールディング状態の非変換型アルデヒドタグ化ポリペプチド中の溶媒接触可能なアルデヒドタグは、したがってＦＧｌｙへのセリンまたはシステインの変換に関してＦＧＥと接触可能である。同様に、変換型アルデヒドタグ化ポリペプチドの溶媒接触可能なアルデヒドタグは、修飾型アルデヒドタグ化ポリペプチドを与えるための対象とする部分との結合に関して反応パートナー試薬と接触可能である。アルデヒドタグを溶媒接触可能部位に配置する場合、反応パートナーとの反応による対象とする部分を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＦＧＥ仲介型変換および修飾は、タンパク質の変性を必要とせずに実施することができる。溶媒接触可能部位は、（例えば、標的ポリペプチドの膜貫通領域以外の）宿主細胞中で発現されるとき細胞外または細胞内の細胞表面に露出する標的ポリペプチド領域も含むことができる。
【００７９】
したがって、例えば溶媒接触可能なＮ末端、溶媒接触可能なＮ末端領域、溶媒接触可能なＣ末端、溶媒接触可能なＣ末端領域、および／またはループ構造（例えば、細胞外ループ構造および／または細胞内ループ構造）から独立に選択される部位に、あるいはより多くのアルデヒドタグを与えることができる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドのＣ末端以外の部位にアルデヒドタグを配置する。他の実施形態では、アルデヒドタグを配置するポリペプチドは完全長ポリペプチドである。
【００８０】
他の実施形態では、アルデヒドタグ部位は、天然標的ポリペプチド中の翻訳後修飾された部位に位置する。例えば、天然標的ポリペプチド中のグリコシル化（例えば、Ｎ−グリコシル化、Ｏ−グリコシル化）、リン酸化、硫化、ユビキチン化、アシル化、メチル化、プレニル化、ヒドロキシル化、カルボキシル化状態などの部位にアルデヒドタグを導入することができる。様々な翻訳後修飾された部位のコンセンサス配列、およびポリペプチド中の翻訳後修飾された部位を同定するための方法は、当技術分野でよく知られている。翻訳後修飾部位は本来存在し得る、あるいはポリペプチドのこのような部位を（例えば、組換え技法により）（例えば、ＥＰＯの高度にグリコシル化した変異体のグリコシル化部位中と同様に）そのポリペプチドに固有でない翻訳後修飾部位を含むように工学的に作製できることは理解される。後者の実施形態では、非天然翻訳後修飾部位を有し対象とする生物活性を示すことが実証されているポリペプチドを特に対象とする。
【００８１】
本開示は本明細書において、アルデヒドタグを含めるための標的ポリペプチドの修飾に適した部位を同定するための方法も提供する。例えば、１つまたは複数のアルデヒドタグ化標的ポリペプチド構築体を生成することができ、構築体はＦＧＥを発現する細胞中で発現され、あるいは（以下により詳細に記載するように）細胞からの単離後にＦＧＥに曝される。次いでアルデヒドタグ化ポリペプチドは、アルデヒドタグが接触可能である場合検出可能な部分とアルデヒドタグのＦＧｌｙの結合をもたらす、反応パートナーと接触させることが可能である。検出可能な部分の存在または不在を次いで決定する。検出可能な部分が検出される場合、したがってポリペプチド中のアルデヒドタグの配置は成功である。このようにして、標的ポリペプチドのコード配列中の異なる部位に位置するアルデヒドタグを有する構築体のライブラリーを生成およびスクリーニングして、アルデヒドタグの最適位置の確認を容易にすることができる。追加的あるいは代替的に、アルデヒドタグ化ポリペプチドは、標的ポリペプチドと通常関係がある生物活性、および／または（例えば、天然標的ポリペプチド中の細胞外の細胞表面に通常存在するエピトープがアルデヒドタグ化ポリペプチド中にも存在するかどうか評価するために）評価するアルデヒドタグ化ポリペプチドの構造に関して試験することができる。
【００８２】
（例えば、天然アミノ酸配列内に５または６アミノ酸残基の挿入を与えるための）挿入によって、または（例えば、標的ポリペプチドのＮ−またはＣ−末端での）付加によって、アルデヒドタグを標的ポリペプチド中にもたらすことができる。アルデヒドタグの隣接アミノ酸配列と天然アミノ酸残基の完全または部分的置換によって、アルデヒドタグを与えることもできる。例えば、天然アミノ酸配列の１、２、３、４、または５（または１、２、３、４、５、または６）個のアミノ酸残基とアルデヒドタグの対応するアミノ酸残基の置換によって、５（または６）アミノ酸残基の異種アルデヒドタグを標的ポリペプチド中に与えることができる。一般に多くの適用例においてそれほど興味がないことかもしれないが、２つ以上のアルデヒドタグを有する標的ポリペプチドを修飾して、タグのＦＧｌｙにおいて同じ部分または異なる部分の結合をもたらすことができる。
【００８３】
１つまたは複数のアルデヒドタグを封入するための標的ポリペプチドの修飾は、組換え分子遺伝学的技法を使用して実施して、望ましいアルデヒドタグ化標的ポリペプチドをコードする核酸を生成することができる。このような方法は当技術分野でよく知られており、クローニング法、部位特異的突然変異誘発法などを含む（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」中（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  １９８９）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ａｕｓｕｂｅｌら編；Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．、およびＪｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．１９９０および増補）を参照）。あるいは、非組換え技法を使用して、例えば天然の化学的連結または非天然の化学的連結を使用してアルデヒドタグを付加して、例えば標的ポリペプチドのＣ末端にアルデヒドタグを付加することができる（例えば、米国特許第６，１８４，３４４号、米国特許第６，３０７，０１８号、米国特許第６，４５１，５４３号、米国特許第６，５７０，０４０号、ＵＳ２００６／０１７３１５９、ＵＳ２００６／０１４９０３９を参照）。Ｒｕｓｈら、（２００６年１月５日）Ｏｒｇ  Ｌｅｔｔ．８（１）：１３１〜４も参照。
【００８４】
標的ポリペプチド
任意の広く様々なポリペプチドを修飾して、ポリペプチドの修飾を容易にするためのアルデヒドタグを封入することができる。アルデヒドタグベースの修飾に適したポリペプチドは、天然に存在するアミノ酸配列、Ｎ末端メチオニンを有する天然アミノ酸配列、天然に存在するポリペプチドの断片、および非天然ポリペプチドおよびその断片を有する両方のタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、標的ポリペプチドは、スルファターゼまたはその断片以外、レポータータンパク質以外、あるいはプレプロラクチンまたはプロラクチン以外のポリペプチドである。
【００８５】
以下は、本明細書に記載するアルデヒドタグベースの方法を使用して修飾するのに興味深い、ポリペプチドの代表的なクラスおよび型である。
【００８６】
治療用ポリペプチド
一実施形態では、タンパク質修飾のアルデヒドタグベースの方法を、治療利点をもたらす可能性があるポリペプチド、特に一部分との結合が例えば血清中半減期の増大、不都合な免疫応答の低下、追加的または代替的な生物活性または機能など、あるいは他の利点または不都合な副作用の減少の１つまたは複数をもたらす可能性があるポリペプチドの修飾に施用する。治療用ポリペプチドがワクチンの抗原である場合、修飾はポリペプチドの高い免疫原性をもたらすことができる。
【００８７】
治療用タンパク質のクラスの例には、サイトカイン、ケモカイン、増殖因子、ホルモン、抗体、および抗原であるタンパク質がある。さらなる例には、エリスロポエチン（ＥＰＯ、例えば天然ＥＰＯ；合成ＥＰＯ（例えば、ＵＳ２００３／０１９１２９１を参照）、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、インターフェロン（例えば、ＩＦＮ−γ、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−ω、コンセンサスインターフェロンなど）、インシュリン、インシュリン様増殖因子（例えば、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ）、血液因子（例えば、因子ＶＩＩＩ、因子ＩＸ、因子Ｘ、組織プラスミノゲン活性化因子（ＴＰＡ）など）、コロニー刺激因子（例えば、顆粒球−ＣＳＦ（Ｇ−ＣＳＦ）、マクロファージ−ＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒球−マクロファージ−ＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）、など）、形質転換増殖因子（例えば、ＴＧＦ−β、ＴＧＦ−α）、インターロイキン（例えばＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１２など）、表皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ、例えばａＦＧＦ、ｂＦＧＦ）、グリア細胞系由来増殖因子（ＧＤＮＦ）、神経増殖因子（ＮＧＦ）、ＲＡＮＴＥＳなどがある。
【００８８】
さらなる例には、抗体、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、抗原結合断片（例えば、Ｆ（ａｂ）’、Ｆａｂ、Ｆｖ）、単鎖抗体などがある。腫瘍抗原、免疫細胞抗原（例えば、ＣＤ４、ＣＤ８など）、微生物、特に病原性微生物の抗原（例えば、細菌、ウイルス、真菌、または寄生虫抗原）などと特異的に結合する抗体を特に対象とする。
【００８９】
本明細書に記載する方法および組成物を施用して、天然または工学的に作製したグリコシル化部位において、例えばインターフェロン（例えば、ＩＦＮ−γ、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−ω；ＩＦＮ−τ）；インシュリン（例えば、ノボリン、ヒュームリン、ヒューマログ、ランタス、ウルトラレンテなど）；エリスロポエチン（例えば、ＰＲＯＣＲＩＴ（登録商標）、ＥＰＲＥＸ（登録商標）、またはＥＰＯＧＥＮ（登録商標）（エポエチン−α）；ＡＲＡＮＥＳＰ（登録商標）（ダルブエポエチン−α）；ＮＥＯＲＥＣＯＲＭＯＮ（登録商標）、ＥＰＯＧＩＮ（登録商標）（エポエチン−β）；など）；モノクローナル抗体の抗原結合断片を含めた、抗体（例えば、モノクローナル抗体）（例えば、ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標）（リツキシマブ）；ＲＥＭＩＣＡＤＥ（登録商標）（インフリキシマブ）；ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）（トラスツズマブ）；ＨＵＭＩＲＡ（商標）（アダリムマブ）；ＸＯＬＡＩＲ（登録商標）（オマリズマブ）；ＢＥＸＸＡＲ（登録商標）（トシツモマブ）；ＲＡＰＴＩＶＡＴ（商標）（エファリズマブ）；ＥＲＢＩＴＵＸ（商標）（セツキシマブ）；など）；血液因子（例えば、ＡＣＴＩＶＡＳＥ（登録商標）（アルテプラーゼ）組織プラスミノゲン活性化因子；ＮＯＶＯＳＥＶＥＮ（登録商標）（組換えヒト因子ＶＩＩａ）；因子ＶＩＩａ；因子ＶＩＩＩ（例えば、ＫＯＧＥＮＡＴＥ（登録商標））；因子ＩＸ；β−グロビン；ヘモグロビン；など）；コロニー刺激因子（例えば、ＮＥＵＰＯＧＥＮ（登録商標）（フィルグラスチム；Ｇ−ＣＳＦ）；ニューラスタ（ペグフィルグラスチム）；顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球−単球コロニー刺激因子、マクロファージコロニー刺激因子、巨核球コロニー刺激因子；など）；成長ホルモン（例えば、ソマトトロピン、例えば、ＧＥＮＯＴＲＯＰＩＮ（登録商標）、ＮＵＴＲＯＰＩＮ（登録商標）、ＮＯＲＤＩＴＲＯＰＩＮ（登録商標）、ＳＡＩＺＥＮ（登録商標）、ＳＥＲＯＳＴＩＭ（登録商標）、ＨＵＭＡＴＲＯＰＥ（登録商標）など；ヒト成長ホルモン；など）；インターロイキン（例えばＩＬ−１、ＩＬ−２、例えば、Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）；ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９などを含む）；増殖因子（例えば、ＲＥＧＲＡＮＥＸ（登録商標）（ベクラペルミン；ＰＤＧＦ）；ＦＩＢＬＡＳＴ（登録商標）（トラフェルミン；ｂＦＧＦ）；ＳＴＥＭＧＥＮ（登録商標）（アンセスチム；幹細胞因子）；ケラチノサイト増殖因子；および酸性線維芽細胞増殖因子、幹細胞因子、塩基性線維芽細胞増殖因子、肝細胞増殖因子；など）；可溶性受容体（例えば、ＥＮＢＲＥＬ（登録商標）（エタネルセプト）などのＴＮＦ−α−結合可溶性受容体；可溶性ＶＥＧＦ受容体；可溶性インターロイキン受容体、可溶性γ／δＴ細胞受容体など）；酵素（例えば、α−グルコシダーゼ；ＣＥＲＡＺＹＭＥ（登録商標）（イミグルカラーゼ、β−グルコセレブロシダーゼ、ＣＥＲＥＤＡＳＥ（登録商標）（アルグルセラーゼ；）；酵素活性化因子（例えば、組織プラスミノゲン活性化因子）；ケモカイン（例えば、ＩＰ−１０；Ｍｉｇ；Ｇｒｏα／ＩＬ−８、ＲＡＮＴＥＳ；ＭＩＰ−１α；ＭＩＰ−１β；ＭＣＰ−１；ＰＦ−４など）；血管形成剤（例えば、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）；血管形成阻害剤（例えば、可溶性ＶＥＧＦ受容体）；タンパク質ワクチン；例えばブラジキニン、コレシストキニン、ガスチン、セクレチン、オキシトシン、ゴナドトロピン放出ホルモン、β−エンドルフィン、エンケファリン、サブスタンスＰ、ソマトスタアチン、ガラニン、成長ホルモン放出ホルモン、ボンベシン、ワルファリン、ダイノルフィン、ニューロテンシン、モチリン、チロトロピン、ニューロペプチドＹ、黄体形成ホルモン、カルシトニン、インシュリン、グルカゴン、バソプレシン、アンギオテンシンＩＩ、チロトロピン放出ホルモン、血管作動性腸管ペプチド、睡眠誘発ペプチドなどの神経活性ペプチド；例えば血栓溶解剤、心房性ナトリウム利尿ペプチド、骨形態形成タンパク質、トロンボポイエチン、リラクシン、グリア細胞繊維性酸性タンパク質、卵胞刺激ホルモン、ヒトα１アンチトリプシン、白血病抑制因子、形質転換増殖因子、組織因子、インシュリン様増殖因子、黄体形成ホルモン、卵胞刺激ホルモン、マクロファージ活性化因子、腫瘍壊死因子、好中球走化因子、神経増殖因子、メタロプロテイナーゼの組織阻害剤；血管作動性腸管ペプチド、アンギオゲニン、アンギオトロピン、フィブリン；ヒルジン；白血病抑制因子；ＩＬ−１受容体アンタゴニスト（例えば、Ｋｉｎｅｒｅｔ（登録商標）（アナキンラ））などの他のタンパク質などの治療用タンパク質の過剰にグリコシル化された形などで見られる、一成分（例えば、水溶性ポリマー）を与えることができる。前述の治療用タンパク質の天然型も本発明における標的ポリペプチドとして興味深いことは、容易に理解される。
【００９０】
修飾型標的ポリペプチドの生物活性は、当技術分野で知られている方法に従いアッセイすることができる。対応する親タンパク質の少なくとも１つの望ましい薬理活性を保持する修飾型アルデヒドタグ化ポリペプチドを対象とする。個々の治療タンパク質に関する有用なアッセイの例には、ＧＭＣＳＦ（Ｅａｖｅｓ、Ａ．Ｃ．およびＥａｖｅｓ  Ｃ．Ｊ．、Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｓｉｓ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅ．Ｉｎ：Ｍｃｃｕｌｌｏｃｋ  Ｅ  Ａ（ｅｄｔ）Ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ−−Ｃｌｉｎｉｃｓ  ｉｎ  ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ。Ｗ  Ｂ  Ｓａｕｎｄｅｒｓ、Ｅａｓｔｂｏｕｒｎｅ、ｐｐ３７１〜９１（１９８４）；Ｍｅｔｃａｌｆ、Ｄ．、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  １０：１１６〜２５（１９９２）；Ｔｅｓｔａ、Ｎ．Ｇら、Ａｓｓａｙｓ  ｆｏｒ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒｓ．Ｉｎ：Ｂａｌｋｗｉｌｌ  Ｆ  Ｒ（ｅｄｔ）Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  Ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、ｐｐ２２９〜４４；ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  Ｏｘｆｏｒｄ  １９９１）ＥＰＯ（バイオアッセイ：Ｋｉｔａｍｕｒａら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１４０  ｐ３２３（１９８９））；Ｈｉｒｕｄｉｎ（血小板凝集アッセイ：Ｂｌｏｏｄ  Ｃｏａｇｕｌ  Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ  ７（２）：２５９〜６１（１９９６））；ＩＦＮα（抗ウイルスアッセイ：Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．３７（２）：７５５〜８（１９８１）；抗増殖アッセイ：Ｇａｏ  Ｙら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１９（１１）：７３０５〜１３（１９９９）；およびバイオアッセイ：Ｃｚａｒｎｉｅｃｋｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４９  ｐ４９０（１９８４））；ＧＣＳＦ（バイオアッセイ：Ｓｈｉｒａｆｕｊｉら、Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．１７  ｐ１１６（１９８９）；ネズミＮＦＳ−６０細胞の増殖（Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ８３：５０１０〜４（１９８６））；インシュリン（３Ｈ−グルコースの取り込みアッセイ：Ｓｔｅｐｐａｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ４０９（６８１８）：３０７〜１２（２００１））；ｈＧＨ（Ｂａ／Ｆ３−ｈＧＨＲ増殖アッセイ：Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ  ８５（１１）：４２７４〜９（２０００）；成長ホルモンの国際標準：Ｈｏｒｍ  Ｒｅｓ、５１  Ｓｕｐｐｌ  １：７〜１２（１９９９））；因子Ｘ（因子Ｘの活性アッセイ：Ｖａｎ  Ｗｉｊｋら、Ｔｈｒｏｍｂ  Ｒｅｓ  ２２：６８１〜６８６（１９８１））；因子ＶＩＩ（プロトロンビンの凝固時間を使用する凝固アッセイ：Ｂｅｌａａｏｕａｊら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：２７１２３〜８（２０００）；Ｄｉａｚ−Ｃｏｌｌｉｅｒら、Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ  ７１．３３９〜４６（１９９４））があるが、これらだけには限られない。
【００９１】
免疫原性組成物
本明細書に開示するアルデヒドタグベースの技術は、免疫原性組成物（例えば、治療用ワクチン）の構成要素の生成においても用途が見出される。例えば、アルデヒドタグを使用して、ポリペプチド抗原の血清中半減期を増大させる部分、ポリペプチドの免疫原性を増大させる部分、または非アミノ酸抗原とポリペプチド担体を連結させる部分の結合を容易にすることができる。この点において、アルデヒドタグを使用して、微生物抗原（例えば、細菌、ウイルス、真菌、または寄生虫抗原）、腫瘍抗原、および対象における免疫応答を誘導するための対象への投与に関して興味深い他の抗原の修飾を容易にすることができる。リサーチツールとして有用であり得る抗体を誘導する際に有用な抗原の修飾も興味深い。
【００９２】
（複数の）アルデヒドタグを使用した修飾に関するさらなる代表的な対象とするポリペプチドには、（例えば、薬剤スクリーニングアッセイなどにおけるリサーチツールとして）アッセイにおける検出または機能のモニタリングに関して興味深いポリペプチドがある。この型の代表的なポリペプチドには、受容体（例えば、Ｇタンパク質結合受容体（ＧＰＣＲ、オーファンＧＰＣＲ含む））、受容体リガンド（天然に存在するリガンドおよび合成リガンドを含む）、タンパク質チャンネル（例えば、イオンチャンネル（例えば、カリウムチャンネル、カルシウムチャンネル、ナトリウムチャンネルなど）、および他のポリペプチドがある。一実施形態では、特にポリペプチドが膜中に存在する間にこのような修飾が実施される場合、膜貫通ポリペプチド）などの細胞表面結合ポリペプチドの修飾を特に対象とする。生理的条件下でのアルデヒドタグ化ポリペプチドの修飾に関する方法は、以下でさらに記載する。
【００９３】
ホルミルグリシン生成酵素（ＦＧＥ）
スルファターゼモチーフ中のシステインまたはセリンをＦＧｌｙに酸化する酵素は、本明細書ではホルミルグリシン生成酵素（ＦＧＥ）と呼ぶ。前に論じたように、「ＦＧＥ」を本明細書で使用して、ＦＧｌｙへのスルファターゼモチーフのシステイン（Ｃ）の変換を仲介するＦＧｌｙ生成酵素、およびＦＧｌｙへのスルファターゼモチーフのセリン（Ｓ）の変換を仲介するＦＧｌｙ生成酵素を指す。一般に文献は、スルファターゼモチーフにおけるＣをＦＧｌｙに変換するＦＧｌｙ生成酵素をＦＧＥと呼び、かつスルファターゼモチーフにおけるＳをＦＧｌｙに変換する酵素をＡｔｓ−Ｂ様と呼ぶことに留意すべきである。しかしながら、本開示の目的のために、「ＦＧＥ」は一般的に使用して両方の型のＦＧｌｙ生成酵素を指し、適切なＦＧＥは適切なスルファターゼモチーフを含有する（すなわち、Ｃ含有またはＳ含有）標的反応パートナーにしたがって選択されることを理解されたい。
【００９４】
活性部位にＦＧｌｙを有するスルファターゼの偏在的存在によって明らかなように、真核生物と原核生物の両方を含めた広く様々な細胞型においてＦＧＥは見られる。少なくとも２つの形のＦＧＥが存在する。真核生物のスルファターゼはシステインをそれらのスルファターゼモチーフ中に含有し、「ＳＵＭＦ１型」ＦＧＥによって修飾される（Ｃｏｓｍａら、Ｃｅｌｌ  ２００３、１１３、（４）、４４５〜５６；Ｄｉｅｒｋｓら、Ｃｅｌｌ  ２００３、１１３、（４）、４３５〜４４）。ＦＧｌｙ生成酵素（ＦＧＥ）はＳＵＭＦ１遺伝子によってコードされている。原核生物のスルファターゼは、システインまたはセリンのいずれかをそれらのスルファターゼモチーフ中に含有することができ、「ＳＵＭＦ１型」ＦＧＥまたは「ＡｔｓＢ型」ＦＧＥのいずれかによってそれぞれ修飾される（Ｓｚａｍｅｉｔら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９９９、２７４、（２２）、１５３７５〜８１）。真核生物では、この修飾は小胞体（ＥＲ）において同時翻訳的または翻訳直後に起こると考えられる（Ｄｉｅｒｋｓら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９９７、９４（２２）：１１９６３〜８）。理論に縛られずに、原核生物ではＳＵＭＦ１型ＦＧＥはサイトゾル中で機能し、ＡｔｓＢ型ＦＧＥは細胞膜付近または細胞膜で機能すると考えられる。ＳＵＭＦ２ＦＧＥも脊椎動物および棘皮動物門を含めた新口動物において記載されている（例えば、Ｐｅｐｅら、（２００３）Ｃｅｌｌ  １１３、４４５〜４５６、Ｄｉｅｒｋｓら、（２００３）Ｃｅｌｌ  １１３、４３５〜４４４；Ｃｏｓｍａら、（２００４）Ｈｕｍ．Ｍｕｔａｔ．２３、５７６〜５８１を参照）。
【００９５】
一般に、標的ポリペプチドのアルデヒドタグのスルファターゼモチーフにおけるＦＧｌｙへのシステインまたはセリンの変換を容易にするために使用したＦＧＥは、アルデヒドタグ中に存在するスルファターゼモチーフにしたがって選択される。ＦＧＥはアルデヒドタグ化ポリペプチドが発現される宿主細胞に固有である可能性があり、あるいは宿主細胞を遺伝的に改変して適切なＦＧＥを発現させることが可能である。いくつかの実施形態では、ヒトＦＧＥと適合性があるスルファターゼモチーフを使用すること（例えばＳＵＭＦ１型ＦＧＥ、例えば、Ｃｏｓｍａら、Ｃｅｌｌ  １１３、４４５〜５６（２００３）；Ｄｉｅｒｋｓら、Ｃｅｌｌ  １１３、４３５〜４４（２００３）を参照）、およびＦＧＥを発現するヒト細胞中または宿主細胞、通常は哺乳動物細胞中でアルデヒドタグ化タンパク質を発現させること、遺伝的に改変してヒトＦＧＥを発現させることが望ましい可能性がある。
【００９６】
一般に、本明細書で開示する方法中で使用するためのＦＧＥは天然に存在する供給源から得ることができ、あるいは合成によって生成することができる。例えば、適切なＦＧＥは、ＦＧＥを本来生成する、あるいは遺伝的に改変されてＦＧＥをコードする組換え遺伝子を発現する生物学的供給源に由来してよい。いくつかのＦＧＥをコードする核酸は当技術分野で知られており、かつ容易に入手可能である（例えば、Ｐｒｅｕｓｓｅｒら、２００５  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０（１５）：１４９００〜１０（Ｅｐｕｂ  ２００５年１月１８日）；Ｆａｎｇら、２００４  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．７９（１５）：１４５７０〜８（Ｅｐｕｂ  ２００４年１月２８月）；Ｌａｎｄｇｒｅｂｅら、Ｇｅｎｅ．２００３年１０月１６日；３１６：４７〜５６；Ｄｉｅｒｋｓら、１９９８  ＦＥＥＳ  Ｌｅｔｔ．４２３（１）：６１〜５；Ｄｉｅｒｋｓら、Ｃｅｌｌ．２００３年５月１６日；１１３（４）：４３５〜４４；Ｃｏｓｍａら、（２００３年５月１６日）Ｃｅｌｌ  １１３（４）：４４５〜５６；Ｂａｅｎｚｉｇｅｒ（２００３年５月１６日）Ｃｅｌｌ  １１３（４）：４２１〜２（総説）；Ｄｉｅｒｋｓら、Ｃｅｌｌ．２００５年５月２０日；１２１（４）：５４１〜５２；Ｒｏｅｓｅｒら、（２００６年１月３日）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０３（１）：８１〜６；Ｓａｒｄｉｅｌｌｏら、（２００５年１１月１日）Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ．１４（２１）：３２０３〜１７；ＷＯ２００４／０７２２７５；およびＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿１８２７６０を参照。したがって本開示は、タグ化標的ポリペプチドのアルデヒドタグと共に使用するのに適したＦＧＥを発現するように遺伝的に改変した、組換え宿主細胞をここに提供する。
【００９７】
一実施形態では、ヒト型結核菌（Ｍｔｂ）から得たＦＧＥを本明細書で開示する方法中で使用する。代表的なＭｔｂＦＧＥは、以下の実施例中に詳細に記載する。代表的なＭｔｂＦＧＥは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿２１５２２６（ｇｉ：１５６０７８５２）で与えられるアミノ酸配列を有するＭｔｂＦＧＥである：
【化１】
2014221056.tif 000003
したがってＭｔｂＦＧＥ、およびＭｔｂＦＧＥをコードする核酸は、本発明の方法における使用が企図される。さらに、ＭｔｂＦＧＥを同定および特徴付けするために使用する方法は、本明細書に開示する方法において有用な他のＦＧＥの同定および特徴付けに適用可能である。
【００９８】
本明細書および当技術分野で与える広範囲のアミノ酸配列情報およびＦＧＥの特徴付けを与えると、ＦＧＥは、知られているＦＧＥ（例えば、本来存在するＦＧＥ）と配列同一性を共有し、およびスルファターゼモチーフのセリンまたはシステインの特異的修飾において機能を維持する、本来存在するＦＧＥ、および修飾型ＦＧＥを含むことは、当業者には容易に明らかであろう。
【００９９】
一般に、対象とするＦＧＥは、当技術分野で利用可能な配列比較アルゴリズムの使用または目視検査により測定して、親ＦＧＥのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列との最大対応性に関して比較しアラインメントをとるとき、少なくとも６０％、通常７５％、通常８０％、さらに通常は９０％〜９５％のヌクレオチドまたはアミノ酸残基の同一性を有するＦＧＥを含む。通常、列挙した配列同一性は、少なくとも約５０残基長である配列の領域、さらに通常は少なくとも約１００残基の領域、さらに通常は少なくとも約１５０残基から完全長までのコード領域またはタンパク質にわたって存在する、ただし比較の領域は酵素活性に必要とされるＦＧＥの活性部位を含むものとする。
【０１００】
配列比較用に、典型的には１つの配列が、試験配列と比較する参照配列として働く。配列比較アルゴリズムを使用するとき、試験配列および参照配列はコンピュータへのインプット情報であり、必要な場合、連続的一致を指定し、かつ配列アルゴリズムプログラムのパラメータを指定する。配列比較アルゴリズムは、指定したプログラムのパラメータに基づいて、参照配列と比較した（複数の）試験配列に関する配列同一性の割合を次いで計算する。
【０１０１】
比較用の配列の最適アラインメントは、例えばＳｍｉｔｈ  ＆  Ｗａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ＆  Ｗｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アラインメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ  ＆  Ｌｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４（１９８８）の類似性検索法によって、コンピュータによるこれらのアルゴリズムの実行（ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ中）によって、または目視検査によって（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．とＪｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．のジョイントベンチャー（１９９５年増補）（Ａｕｓｕｂｅｌ）を概略的に参照）実施することができる。
【０１０２】
配列同一性の割合および配列類似性を決定するのに適したアルゴリズムの例は、それぞれＡｌｔｓｃｈｕｌら、（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０およびＡｌｔｓｃｈｕｌら（１９７７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９〜３４０２中に記載されている、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを通じて公に入手可能である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）。このアルゴリズムは、データベース配列中の同じ長さのワードでアラインメントをとるとき、ある正の値の閾値スコアＴに適合するかあるいはそれを満たすかのいずれかである、検索配列中の長さＷの短いワードを同定することによって、高スコアの配列対（ＨＳＰ）を最初に同定することを含む。Ｔは近隣ワードのスコア閾値と呼ぶ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、上記）。
【０１０３】
これらの初期近隣ワードヒットは、それらを含有するさらに長いＨＳＰを発見するための検索を開始するためのシーズとして働く。次いで、累積アラインメントスコアを増大させることが可能である限り、ワードヒットを各配列に沿って両方向に延長させる。累積スコアは、ヌクレオチド配列に関して、パラメータＭ（一組の適合残基に関して報酬スコア；常に＞０）およびＮ（不適合残基に関してペナルティースコア；常に＜０）を使用して計算する。アミノ酸配列に関しては、スコアリングマトリクスを使用して累積スコアを計算する。累積アラインメントスコアがその最大獲得値から量Ｘまで低下するとき、１つまたは複数の負のスコアの残基アラインメントの蓄積が原因で累積スコアがゼロ以下になるとき、あるいはいずれかの配列の末端に達するとき、各方向におけるワードヒットの延長は止まる。ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメータＷ、Ｔ、およびＸは、アラインメントの感度およびスピードを決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラムは（ヌクレオチド配列に関して）、デフォルトとして１１のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝４、および両鎖の比較値を使用する。アミノ酸配列に関しては、ＢＬＡＳＴＮプログラムは、デフォルトとして３のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリクスを使用する（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ＆  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５（１９８９）を参照）。
【０１０４】
配列同一性の割合を計算すること以外に、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２配列間の類似性の統計分析も行う（例えば、Ｋａｒｌｉｎ  ＆  Ａｌｔｓｃｈｕｌ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３〜５７８７（１９９３）を参照）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって与えられる類似性の１つの測定値は最少合計確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の適合性が偶然生じ得る確率の指標を与える。例えば、試験核酸と参照核酸の比較における最少合計確率が約０．１未満、さらに通常は約０．０１未満、および最も通常は約０．００１未満である場合、核酸は参照配列と類似していると考えられる。
【０１０５】
同一ではない残基の位置は保存的アミノ酸置換によって異なる可能性があり、これは前に論じたアラインメントの分析から容易に明らかである。保存的アミノ酸置換は、類似の側鎖を有する残基の互換性を指す。例えば、群内の他の残基と交換可能である残基を定義し保存的アミノ酸置換を構成するアミノ酸群には、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、プロリン、およびイソロイシンである脂肪族側鎖を有するアミノ酸の群（「脂肪族アミノ酸」）、セリン、およびスレオニンである脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸の群（「脂肪族、ヒドロキシルアミノ酸」、これらは「極性、非荷電アミノ酸」の中にも包含される）、アスパラギンおよびグルタミンであるアミド含有側鎖を有するアミノ酸の群（「アミド含有アミノ酸」、これらは「極性、非荷電アミノ酸」の中にも包含される）、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンである芳香族側鎖を有するアミノ酸の群（「芳香族アミノ酸」）、（生理的ｐＨで）リシン、アルギニン、およびヒスチジンである塩基性側鎖を有するアミノ酸の群（「塩基性アミノ酸」）、システインおよびメチオニンであるイオウ含有側鎖を有するアミノ酸の群（「イオウ含有アミノ酸」）、セリン、スレオニン、アスパラギン、およびグルタミンを含む（生理的ｐＨで）極性かつ非荷電であるアミノ酸の群（「極性、非荷電アミノ酸」）、およびアスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、リシン、およびアルギニンである（生理的ｐＨで）荷電側鎖を有するアミノ酸の群（「荷電アミノ酸」）がある。保存的アミノ酸置換の群は、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リシン−アルギニン、アラニン−バリン、およびアスパラギン−グルタミンによって例示される。
【０１０６】
無細胞の方法を使用してスルファターゼモチーフ含有ポリペプチドを変換する場合、単離ＦＧＥを使用することができる。任意の好都合なタンパク質精製手順を使用してＦＧＥを単離することができる、例えば、Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、（Ｄｅｕｔｈｓｅｒ編）（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９９０）を参照。例えば、溶解物は望ましいＦＧＥを生成する細胞から調製することができ、ＨＰＬＣ、排除クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、親和性クロマトグラフィーなどを使用して精製することができる。
【０１０７】
アルデヒドタグ化ポリペプチドを生成するための発現ベクターおよび宿主細胞
本開示は、アルデヒドタグおよびアルデヒドタグ化ポリペプチドをコードする核酸、ならびに核酸を含有する構築体および宿主細胞を提供する。このような核酸は、アルデヒドタグおよびアルデヒドタグ化ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有するＤＮＡの配列を含み、および大部分の実施形態において、適切な条件下で発現させることが可能である。「核酸」はＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、およびこのような核酸を含むベクターを含有する。
【０１０８】
アルデヒドタグ、およびアルデヒドタグ化ポリペプチドをコードする核酸を本明細書で提供する。このような核酸は、アルデヒドタグコード配列およびアルデヒドタグ化ポリペプチドのｃＤＮＡの挿入によって修飾されるゲノムＤＮＡを含む。本明細書で使用する用語「ｃＤＮＡ」は、（スプライス変異体を含めた）天然成熟ｍＲＮＡ種において見られる配列エレメントの配置を共有するすべての核酸を含むものとし、この場合配列エレメントはエクソンおよび３’および５’非コード領域である。通常ｍＲＮＡ種は隣接エクソン、および存在するときは介在するイントロンを有し、これらは核ＲＮＡスプライシングによって除去して、本発明に従いタンパク質をコードする隣接オープンリーディングフレームを作成する。
【０１０９】
用語「遺伝子」は、ポリペプチド（例えば、アルデヒドタグ化ポリペプチド）、および場合によっては任意のイントロンをコードするオープンリーディングフレームを有する核酸を意図し、コード領域を越えて約２０ｋｂまでの、ただしおそらくさらに一方向に、発現の制御に関与する隣接５’および３’非コードヌクレオチド配列（例えば、転写および／または翻訳のレギュレーター、例えば、プロモーター、エンハンサー、翻訳制御シグナルなど）をさらに含むことができ、この隣接５’および３’非コードヌクレオチド配列はコード配列に対して内生的または異種である可能性がある。転写領域の５’末端または３’末端のいずれかに、約１ｋｂ、ただしおそらくそれより大きい隣接ゲノムＤＮＡを含めた、例えばプロモーター、エンハンサーなどの転写および翻訳制御配列が含まれる可能性がある。
【０１１０】
本明細書で企図する核酸は、（構築体とも呼ばれる）ベクターの一部分として提供することができ、広く様々なそれらは当技術分野で知られており、本明細書で詳しく述べる必要はない。代表的なベクターには、プラスミド、コスミド、ウイルスベクター（例えば、レトロウイルスベクター）、非ウイルスベクター、人口染色体（ＹＡＣ、ＢＡＣなど）、小染色体などがあるが、これらだけには限られない。
【０１１１】
ベクターの選択は、増殖が望ましい細胞の型、および増殖の目的などの様々な要因に依存するはずである。特定のベクターは、多量の望ましいＤＮＡ配列を増殖および作成するのに有用である。他のベクターは、培養中の細胞における発現に適している。さらに他のベクターは、全動物中の細胞における移動および発現に適している。適切なベクターの選択は十分当技術分野の技術内にある。多くのこのようなベクターは市販されている。
【０１１２】
構築体を調製するために、典型的にはベクター中の切断された制限酵素部位へのＤＮＡリガーゼ結合によって、ポリヌクレオチドをベクターに挿入する。あるいは、望ましいヌクレオチド配列は相同的組換えまたは部位特異的組換えによって挿入することができる。典型的には相同的組換えは、望ましいヌクレオチド配列の側面上のベクターと相同領域を結合させることによって実施されるが、一方で部位特異的組換えは、部位特異的組換えを容易にする配列（例えば、ｃｒｅ−ｌｏｘ、ａｔｔ部位など）の使用によって実施することができる。このような配列を含有する核酸は、例えばオリゴヌクレオチドの連結によって、または相同領域と望ましいヌクレオチド配列の一部分の両方を含むプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応によって付加することができる。
【０１１３】
ベクターは宿主細胞における染色体外の維持をもたらすことができ、あるいは宿主細胞ゲノム中への組込みをもたらすことができる。ベクターは、例えばＳｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、（１９９９）Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓを含めた、当業者によく知られている多くの刊行物中に十分記載されている。ベクターは対象とするポリペプチド（例えば、アルデヒドタグ化ポリペプチド、ＦＧＥなど）をコードする核酸の発現をもたらすことができ、対象の核酸の増幅をもたらすことができ、あるいは両方が可能である。
【０１１４】
使用することができる代表的なベクターには、組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡ由来のベクターがあるが、これらだけには限られない。例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９／１８、ｐＵＣ１１８、１１９およびＭ１３ｍｐ系のベクターなどのプラスミドベクターを使用することができる。バクテリオファージベクターは、λｇｔ１０、λｇｔ１１、λｇｔ１８−２３、λＺＡＰ／ＲおよびＥＭＢＬ系のバクテリオファージベクターを含むことができる。利用することができるコスミドベクターには、ｐＪＢ８、ｐＣＶ１０３、ｐＣＶ１０７、ｐＣＶ１０８、ｐＴＭ、ｐＭＣＳ、ｐＮＮＬ、ｐＨＳＧ２７４、ＣＯＳ２０２、ＣＯＳ２０３、ｐＷＥ１５、ｐＷＥ１６およびカロミド９系のベクターがあるが、これらだけには限られない。あるいは、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、またはウシパピローマウイルスなどのウイルス由来のベクターだけには限られないがこれらを含めた、組換えウイルスベクターを工学的に作製することができる。
【０１１５】
対象とするポリペプチドの発現用に、発現カセットを利用することができる。したがって本発明は、対象核酸を含む組換え発現ベクターを提供する。発現ベクターは転写および翻訳制御配列を与え、かつ誘導的または構成的発現をもたらすことができ、この場合コード領域は転写開始領域、および転写および翻訳停止領域の転写制御下で作動可能に連結している。これらの制御領域はポリペプチド（例えば、標的ポリペプチドまたはＦＧＥ）をコードする遺伝子に固有である可能性があり、あるいは外来供給源に由来する可能性がある。一般に、転写および翻訳制御配列は、プロモーター配列、リボソーム結合部位、転写開始および停止配列、翻訳開始および停止配列、およびエンハンサーまたはアクチベーター配列だけには限られないが、これらを含むことができる。構成的および誘導的プロモーター以外に、強力なプロモーター（例えば、Ｔ７、ＣＭＶなど）は、特に高い発現レベルがｉｎ  ｖｉｖｏ（細胞系）またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現系において望まれる場合、本明細書に記載する構築体において用途が見出される。さらなる代表的なプロモーターには、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、アデノウイルスプロモーター、ヒトＣＭＶの前初期遺伝子由来のプロモーター（Ｂｏｓｈａｒｔら、Ｃｅｌｌ  ４１：５２１〜５３０、１９８５）、およびＲＳＶの長末端反復配列（ＬＴＲ）由来のプロモーター（Ｇｏｒｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７９：６７７７〜６７８１、１９８２）がある。プロモーターは例えばレトロウイルスの５’ＵＴＲによって与えられる可能性もある。
【０１１６】
発現ベクターは一般に、対象とするタンパク質をコードする核酸配列の挿入をもたらすために、プロモーター配列の近くに位置する好都合な制限部位を有する。ベクターを含む細胞の選択を容易にするために、発現宿主中で作用し得る選択可能なマーカーが存在してよい。さらに、発現構築体は追加的なエレメントを含むことができる。例えば、発現ベクターは１つまたは２つの複製系を有することができ、したがって発現ベクターは生物中に、例えば発現用に哺乳動物または昆虫細胞中に、およびクローニングおよび増幅用に原核生物宿主中に維持することができる。さらに発現構築体は、形質転換宿主細胞の選択を可能にするための選択可能なマーカー遺伝子を含有することができる。選択遺伝子は当技術分野ではよく知られており、使用する宿主細胞と共に変化する。
【０１１７】
アルデヒドタグカセットも本明細書において提供し、これはアルデヒドタグをコードする核酸、および標的ポリペプチドをコードする核酸をインフレームで挿入するためのタグコード配列と隣接した適切な制限部位を含む。このような発現構築体は、標的ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端にアルデヒドタグの付加をもたらすことができる。アルデヒドタグカセットはプロモーター配列と作動可能に連結させて、生成するアルデヒドタグ化ポリペプチドの発現をもたらすことが可能であり、１つまたは複数の選択可能なマーカーをさらに含むことができる。
【０１１８】
本開示は、（例えば、Ｎ末端、Ｃ末端に位置するアルデヒドタグを有する）アルデヒドタグ化ポリペプチドを生成するための発現カセットも提供する。このような発現カセットは、アルデヒドタグコード配列を含む第１の核酸、および対象とするポリペプチドをコードする第２の核酸を挿入するための少なくとも１つの制限部位を一般に含む。制限部位は、アルデヒドタグコード配列の５’および／または３’に位置してよい。アルデヒドタグコード配列とインフレームでポリペプチドコード配列を挿入することによって、本明細書に記載するアルデヒドタグ化ポリペプチドである融合タンパク質をコードする組換え核酸の生成をもたらす。このような発現カセットを含む構築体は、生成するアルデヒドタグ化ポリペプチドの発現をもたらすための、発現カセットと作動可能に連結したプロモーターも一般に含む。発現構築体の他の構成要素は、選択可能なマーカーおよび他の適切なエレメントを含むことができる。
【０１１９】
アルデヒドタグ化ポリペプチドをコードする発現構築体は、増幅法（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ））を使用して作成することも可能であり、この場合少なくとも１つの増幅プライマー（すなわち、少なくとも１つの順方向または逆方向プライマー）はアルデヒドタグをコードする核酸配列を含む。例えば、アルデヒドタグコード配列を有する増幅プライマーを、対象とする標的ポリペプチドをコードする核酸の増幅をもたらすように設計する。アルデヒドタグ含有順方向プライマーからのポリメラーゼ仲介型合成から生じる伸長産物は、アルデヒドタグ化標的ポリペプチドから構成される融合タンパク質をコードする核酸増幅産物を生成する。次いで増幅産物を選択した発現構築体中に挿入して、アルデヒドタグ化ポリペプチド発現構築体を与える。
【０１２０】
宿主細胞
任意のいくつかの適切な宿主細胞を、アルデヒドタグ化ポリペプチドの生成において使用することができる。アルデヒドタグ化ポリペプチドの生成に使用する宿主細胞はＦＧＥ仲介の変換を場合によってはもたらすことができ、したがって生成したポリペプチドは、発現およびＦＧＥによる翻訳後修飾後にＦＧｌｙ含有アルデヒドタグを含有する。あるいは宿主細胞は、（例えば、アルデヒドタグの変換を容易にするＦＧＥの発現の欠如のため）非変換型アルデヒドタグ化ポリペプチドの生成をもたらす可能性がある。
【０１２１】
一般に、本明細書に記載するポリペプチドは、発現の目的に応じて、従来の方法に従い原核生物または真核生物中で発現させることが可能である。したがって、本発明は宿主細胞、例えばアルデヒドタグ化ポリペプチドをコードする核酸を含む、遺伝的に改変された宿主細胞をさらに提供する。宿主細胞は、宿主細胞に対して内因性または異種であってよい組換えＦＧＥを、場合によってはさらに含むことができる。
【０１２２】
非変換または（宿主細胞が適切なＦＧＥを発現する場合）変換アルデヒドタグ化ポリペプチドを生成するため（大量生産含む）、あるいは（例えば、無細胞の方法中で使用するための）ＦＧＥを生成するための宿主細胞は、任意の様々な利用可能な宿主細胞から選択することができる。代表的な宿主細胞には、細菌（例えば、大腸菌菌株、バシラス種（例えば、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）など）酵母または真菌（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、ピキア種など）などの、原核または真核単細胞生物の宿主細胞があり、かつ他のこのような宿主細胞を使用することができる。昆虫、脊椎動物、特に哺乳動物などの高等生物に本来由来する代表的な宿主細胞（例えば、ＣＨＯ、ＨＥＫなど）を、発現宿主細胞として使用することができる。
【０１２３】
対象とする具体的な発現系には細菌、酵母、昆虫細胞および哺乳動物細胞由来の発現系がある。これらのカテゴリーの各々由来の代表的な系を以下に示す。
【０１２４】
細菌。細菌における発現系には、Ｃｈａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ（１９７８）２７５：６１５；Ｇｏｅｄｄｅｌら、Ｎａｔｕｒｅ（１９７９）２８１：５４４；Ｇｏｅｄｄｅｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９８０）８：４０５７；ＥＰ００３６，７７６；米国特許第４，５５１，４３３号；ＤｅＢｏｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）（１９８３）８０：２１〜２５；およびＳｉｅｂｅｎｌｉｓｔら、Ｃｅｌｌ（１９８０）２０：２６９中に記載された発現系がある。
【０１２５】
酵母。酵母における発現系には、Ｈｉｎｎｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）（１９７８）７５：１９２９；Ｉｔｏら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９８３）１５３：１６３；Ｋｕｒｔｚら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８６）６：１４２；Ｋｕｎｚｅら、Ｊ．Ｂａｓｉｃ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．（１９８５）．２５：１４１；Ｇｌｅｅｓｏｎら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９８６）１３２：３４５９；Ｒｏｇｇｅｎｋａｍｐら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．（１９８６）２０２：３０２；Ｄａｓら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９８４）１５８：１１６５；Ｄｅ  Ｌｏｕｖｅｎｃｏｕｒｔら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９８３）１５４：７３７；Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９０）８：１３５；Ｋｕｎｚｅら、Ｊ．Ｂａｓｉｃ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９８５）２５：１４１；Ｃｒｅｇｇら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８５）５：３３７６；米国特許第４，８３７，１４８号および同４，９２９，５５５号；Ｂｅａｃｈ  ａｎｄ  Ｎｕｒｓｅ、Ｎａｔｕｒｅ（１９８１）３００：７０６；Ｄａｖｉｄｏｗら、Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．（１９８５）１０：３８０；Ｇａｉｌｌａｒｄｉｎら、Ｃｕｒｔ．Ｇｅｎｅｔ．（１９８５）１０：４９；Ｂａｌｌａｎｃｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．（１９８３）１１２：２８４〜２８９；Ｔｉｌｂｕｒｎら、Ｇｅｎｅ（１９８３）２６：２０５〜２２１；Ｙｅｌｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）（１９８４）８１：１４７０〜１４７４；Ｋｅｌｌｙ  ａｎｄ  Ｈｙｎｅｓ、ＥＭＢＯ  Ｊ．（１９８５）４：４７５４７９；ＥＰ０２４４，２３４；およびＷＯ９１／００３５７中に記載された発現系がある。
【０１２６】
昆虫細胞。昆虫における異種遺伝子の発現は、米国特許第４，７４５，０５１号；Ｆｒｉｅｓｅｎら、「Ｔｈｅ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」、ｉｎ：Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｏｆ  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓｅｓ（１９８６）（Ｗ．Ｄｏｅｒｆｌｅｒ編）；ＥＰ０１２７，８３９；ＥＰ０１５５，４７６；およびＶｌａｋら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８８）６９：７６５〜７７６；Ｍｉｌｌｅｒら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９８８）４２：１７７；Ｃａｒｂｏｎｅｌｌら、Ｇｅｎｅ（１９８８）７３：４０９；Ｍａｅｄａら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８５）３１５：５９２〜５９４；Ｌｅｂａｃｑ−Ｖｅｒｈｅｙｄｅｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８８）８：３１２９；Ｓｍｉｔｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）（１９８５）８２：８８４４；Ｍｉｙａｊｉｍａら、Ｇｅｎｅ（１９８７）５８：２７３；およびＭａｒｔｉｎら、ＤＮＡ（１９８８）７：９９中に記載されたのと同様に実施される。多数のバキュロウイルス菌株および変異体、および宿主由来の対応する許容昆虫宿主細胞は、Ｌｕｃｋｏｗら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９８８）６：４７〜５５、Ｍｉｌｌｅｒら、Ｇｅｎｅｒｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（１９８６）８：２７７〜２７９、およびＭａｅｄａら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８５）３１５：５９２〜５９４中に記載されている。
【０１２７】
哺乳動物細胞。哺乳動物の発現は、Ｄｉｊｋｅｍａら、ＥＭＢＯ  Ｊ．（１９８５）４：７６１、Ｇｏｒｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）（１９８２）７９：６７７７、Ｂｏｓｈａｒｔら、Ｃｅｌｌ（１９８５）４１：５２１および米国特許第４，３９９，２１６号中に記載されたのと同様に実施される。哺乳動物の発現の他の特徴は、Ｈａｍ  ａｎｄ  Ｗａｌｌａｃｅ、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．（１９７９）５８：４４、Ｂａｒｎｅｓ  ａｎｄ  Ｓａｔｏ、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８０）１０２：２５５、米国特許第４，７６７，７０４号、同４，６５７，８６６号、同４，９２７，７６２号、同４，５６０，６５５号、ＷＯ９０／１０３４３０、ＷＯ８７／００１９５、およびＵ．Ｓ．ＲＥ３０，９８５中に記載されたのと同様に助長される。
【０１２８】
任意の前述の宿主細胞、または他の適切な宿主細胞または生物を使用して、本発明のポリヌクレオチドまたは核酸を複製および／または発現するとき、得られる複製核酸、ＲＮＡ、発現タンパク質またはポリペプチドは、宿主細胞または生物の生成物として本発明の範囲内にある。
【０１２９】
当技術分野で知られている任意の適切な手段によって生成物を回収することができる。さらに、任意の好都合なタンパク質精製手順を利用することができ、適切なタンパク質精製法はＧｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、（Ｄｅｕｔｈｓｅｒ編）（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９９０）中に記載されている。例えば、溶解物は対象とするポリペプチドを発現する発現ベクターを含む細胞から調製することができ、およびＨＰＬＣ、排除クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、親和性クロマトグラフィーなどを使用して精製することができる。
【０１３０】
ポリペプチドの修飾用部分
アルデヒドタグ化ＦＧｌｙ含有ポリペプチドに修飾を施して、広く様々な部分の結合を与えることができる。代表的な対象とする分子には、検出可能な標識、小分子、ペプチドなどがあるが、必ずしもこれらに限られない。
【０１３１】
対象とする部分は、タグ化ポリペプチドの変換型アルデヒドタグのＦＧｌｙ残基のアルデヒドとの反応用の、反応パートナーの構成要素として与えられる。タグ化ポリペプチドの修飾の方法は従来の化学プロセスと適合性があるので、本発明の方法は広範囲の市販の試薬を利用して、アルデヒドタグ化ポリペプチドのＦＧｌｙ残基と対象とする部分の結合を実施することができる。例えば、いくつかの対象とする部分のアミノオキシ、ヒドラジド、ヒドラジン、またはチオセミカルバジド誘導体は適切な反応パートナーであり、かつ容易に入手可能であり、あるいは標準的な化学法を使用して生成することができる。
【０１３２】
例えば、アミノオキシ−ＰＥＧは標準的なプロトコルを使用してモノアミノ−ＰＥＧおよびアミノオキシグリシンから生成することができる。アミノオキシ−ＰＥＧは次いで変換型アルデヒドタグ化ポリペプチドと反応させて、ＰＥＧ部分の結合を与えることができる。変換型アルデヒドタグ化ポリペプチドへのビオチン部分の送達は、アミノオキシビオチン、ビオチンヒドラジドまたは２，４ジニトロフェニルヒドラジンを使用して実施することができる。
【０１３３】
本開示を与えることにより、当業者は任意の様々な部分を容易に適合させて、本明細書で企図するアルデヒドタグ化ポリペプチドとの結合用の反応パートナーを与えることが可能である。当業者は、ｐＨおよび立体障害（すなわち、対象とする反応パートナーとの反応に対するアルデヒドタグの接触可能性）などの要因が重要であることを理解している。最適な結合条件を与えるための修飾反応条件は十分に当業者の技術範囲内にあり、かつ当技術分野では通常のことである。一般に、７未満のｐＨ、約５．５、約６、約６．５のｐＨで結合反応を実施することが通常は望ましく、通常約５．５が最適である。生存細胞内または生存細胞上に存在するアルデヒドタグ化ポリペプチドを用いて結合を実施する場合、生理的に適合性があるように条件を選択する。例えば、反応を引き起こすのに十分な時間、ただしアルデヒドタグを有する細胞によって許容される期間内で（例えば、約３０分〜１時間）、ｐＨを一時的に低下させることが可能である。細胞表面上のアルデヒドタグ化ポリペプチドの修飾を実施するための生理的条件は、細胞表面アジドを有する細胞の修飾におけるケトン−アジド反応中で使用される条件と同様である可能性がある（例えば、米国特許第６，５７０，０４０号を参照）。
【０１３４】
一般に、１つまたは複数の部分は１つまたは複数の広く様々な機能または特徴を与えることができる。代表的な部分には、検出可能な標識（例えば、色素標識（例えば、発色団、フルオロフォア）、生物物理的プローブ（スピン標識、ＮＭＲプローブ）、ＦＲＥＴ型標識（例えば、フルオロフォア／消光剤対の少なくとも１つのメンバーを含めた、ＦＲＥＴ対の少なくとも１つのメンバー）、ＢＲＥＴ型標識（例えば、ＢＲＥＴ対の少なくとも１つのメンバー）、免疫検出可能なタグ（例えば、ＦＬＡＧ、Ｈｉｓ（６）など）、位置特定タグ（例えば、組織または分子細胞レベルでタグ化ポリペプチドの結合（例えば、組織型、または個々の細胞膜との結合）を同定するため）など）；光活性型動的部分（例えば、アゾベンゼン仲介型気孔閉鎖、アゾベンゼン仲介型構造変化、光崩壊性認識モチーフ）；水溶性ポリマー（例えば、ペグ化）；精製タグ（例えば、親和性クロマトグラフィーによる単離を容易にするため（例えば、ＦＬＡＧエピトープの結合））；膜局在ドメイン（例えば、脂質またはＧＰＩ型アンカー）；固定化タグ（例えば、選択的結合を含めた、表面へのポリペプチドの結合を容易にするため）；、薬剤（例えば、例えば抗体と薬剤の結合による薬剤標的化を容易にするため）；標的送達部分、（例えば、標的受容体との結合用リガンド（例えば、ウイルス結合、リポソーム上に存在する標的タンパク質の結合などを容易にするため））などがある。
【０１３５】
具体的な、非限定的実施例を以下に示す。
【０１３６】
検出可能な標識
本発明の組成物および方法を使用して、検出可能な標識をアルデヒドタグ化ポリペプチドに送達することができる。代表的な検出可能な標識には、蛍光性分子（例えば、自己蛍光性分子、試薬などとの接触によって蛍光を発する分子）、放射性標識（例えば、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、２１２Ｂ、９０Ｙ、１８６Ｒｈなど）；ビオチン（例えば、ビオチンとアビジンの反応によって検出される）；蛍光タグ；造影試薬などがあるが、必ずしもこれらに限られない。検出可能な標識は、抗体結合によって、例えば検出可能に標識した抗体の結合によって、またはサンドウィッチ型アッセイによる結合抗体の検出によって検出することができるペプチドまたはポリペプチドも含む。
【０１３７】
支持体と標的分子の結合
本発明の方法は、アルデヒドタグ化ポリペプチドと、（例えば、アッセイを容易にするための）固体基質とポリペプチドの結合を容易にするための部分、または簡単な分離を容易にするための部分（例えば、磁気ビーズと結合した抗体によって認識されるハプテン）の結合をもたらすことができる。一実施形態では、本発明の方法を使用して、明確な配向でタンパク質とアレイ（例えば、チップ）の結合をもたらす。例えば、選択部位に（例えば、Ｎ末端またはその近辺に）アルデヒドタグを有するポリペプチドを作成することができ、本発明の方法および組成物を使用して一部分を変換型アルデヒドタグに送達する。したがってこの部分は、ポリペプチドを支持体（例えば、固形または半固形支持体、特に高スループットアッセイにおけるマイクロチップとして使用するのに適した支持体）に加えるための結合部位として使用することができる。
【０１３８】
標的部位に送達するための分子の結合
アルデヒドタグ化ポリペプチドの反応パートナーは、小分子薬剤、毒素、または細胞に送達するための他の分子を含むことができ、薬理活性をもたらすことができ、あるいは他の分子の送達用の標的として働くことができる。
【０１３９】
結合パートナーの対の１つ（例えば、リガンド、受容体のリガンド結合部分、リガンドの受容体結合部分など）を含む反応パートナーの使用も企図する。例えば反応パートナーは、ウイルス受容体として働き、かつウイルスエンベロープタンパク質またはウイルスカプシドタンパク質との結合によって、修飾型アルデヒドタグ化タンパク質が発現される細胞表面とウイルスの結合を容易にするポリペプチドを含むことができる。あるいは反応パートナーは、修飾型アルデヒドタグ化ポリペプチドを発現する宿主細胞の検出および／または分離を容易にするための、抗体（例えば、モノクローナル抗体）と特異的に結合する抗原を含む。
【０１４０】
水溶性ポリマー
特に興味深い部分は水溶性ポリマーである。「水溶性ポリマー」は、水溶性であり通常は実質的に非免疫原性であり、かつ通常は約１，０００ダルトンを超える原子分子量を有するポリマーを指す。本明細書に記載する方法および組成物を使用して、１つまたは複数の水溶性ポリマーとアルデヒドタグ化ポリペプチドを結合させることが可能である。ポリペプチド、特に薬剤として活性がある（治療用）ポリペプチドの水溶性ポリマー（例えば、ＰＥＧ）の結合は望ましい可能性がある、何故ならこのような修飾は、タンパク質分解安定性の増大および／または腎クリアランスの低下の結果として血清中半減期を増大させることによって、治療指数を増大させる可能性があるからである。さらに、１つまたは複数のポリマーの結合（例えば、ペグ化）はタンパク質製剤の免疫原性を低下させる可能性がある。
【０１４１】
いくつかの実施形態では、水溶性ポリマーは、約１０，０００Ｄａを超える、約２０，０００〜５００，０００Ｄａを超える、約４０，０００Ｄａ〜３００，０００Ｄａ、約５０，０００Ｄａ〜７０，０００Ｄａを超える、通常は約６０，０００Ｄａを超える有効な流体力学的分子量を有する。「有効な流体力学的分子量」によって、水性サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって決定したポリマー鎖の有効な水溶媒和したサイズを意図する。水溶性ポリマーがエチレンオキシド反復単位などのポリアルキレンオキシド反復単位を有するポリマー鎖を含有するとき、それぞれの鎖は約２００Ｄａと約８０，０００Ｄａの間、または約１，５００Ｄａと約４２，０００Ｄａの間の原子分子量を有する可能性があり、２，０００〜約２０，０００Ｄａが特に興味深い。具体的に言及しない限り、分子量は原子分子量を指すものとする。線状、分岐状、および末端荷電水溶性ポリマー（例えば、ＰＥＧ）が特に興味深い。
【０１４２】
アルデヒドタグ化ポリペプチドと結合する部分として有用なポリマーは、広範囲の分子量、およびポリマーサブユニットを有することができる。これらのサブユニットは、生物学的ポリマー、合成ポリマー、またはこれらの組合せを含むことができる。このような水溶性ポリマーの例には、硫酸デキストラン、Ｐ−アミノ架橋デキストリン、およびカルボキシメチルデキストリンを含めたデキストランおよびデキストラン誘導体、メチルセルロースおよびカルボキシメチルセルロースを含めたセルロースおよびセルロース誘導体、デンプンおよびデキストリン、およびデンプンの誘導体およびヒドロイルアクト（ｈｙｄｒｏｙｌａｃｔｅｓ）、ポリエチレングリコール、メトキシポリエチレングリコール、ポリエチレングリコールホモポリマー、ポリプロピレングリコールホモポリマー、エチレングリコールとプロピレングリコールのコポリマーを含めたポリアルキレングリコールおよびその誘導体があり、前記ホモポリマーおよびコポリマーは非置換状態である、またはアルキル基、ヘパリンおよびヘパリンの断片、ポリビニルアルコールおよびポリビニルエチルエーテル、ポリビニルピロリドン、アスパルトアミド、およびポリオキシエチル化ポリオール、およびデキストランおよびデキストラン誘導体、デキストリンおよびデキストリン誘導体で一末端において置換されている。具体的に列挙した水溶性ポリマーの様々な誘導体も企図されることは理解される。
【０１４３】
前に記載したポリマーなどの水溶性ポリマー、特にポリエチレングリコール「ＰＥＧ」などのポリアルキレンオキシドベースのポリマーはよく知られている（例えば、「Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ｊ．Ｍ．Ｈａｒｒｉｓ編、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、Ｎ．Ｙ．（１９９２）；および「Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ｊ．Ｍ．Ｈａｒｒｉｓ  ａｎｄ  Ｓ．Ｚａｌｉｐｓｋｙ編、ＡＣＳ（１９９７）；および国際特許出願：ＷＯ９０／１３５４０、ＷＯ９２／００７４８、ＷＯ９２／１６５５５、ＷＯ９４／０４１９３、ＷＯ９４／１４７５８、ＷＯ９４／１７０３９、ＷＯ９４／１８２４７、ＷＯ９４／２８９３７、ＷＯ９５／１１９２４、ＷＯ９６／０００８０、ＷＯ９６／２３７９４、ＷＯ９８／０７７１３、ＷＯ９８／４１５６２、ＷＯ９８／４８８３７、ＷＯ９９／３０７２７、ＷＯ９９／３２１３４、ＷＯ９９／３３４８３、ＷＯ９９／５３９５１、ＷＯ０１／２６６９２、ＷＯ９５／１３３１２、ＷＯ９６／２１４６９、ＷＯ９７／０３１０６、ＷＯ９９／４５９６４、および米国特許第４，１７９，３３７号、同５，０７５，０４６号、同５，０８９，２６１号、同５，１００，９９２号、同５，１３４，１９２号、同５，１６６，３０９号、同５，１７１，２６４号、同５，２１３，８９１号、同５，２１９，５６４号、同５，２７５，８３８号、同５，２８１，６９８号、同５，２９８，６４３号、同５，３１２，８０８号、同５，３２１，０９５号、同５，３２４，８４４号、同５，３４９，００１号、同５，３５２，７５６号、同５，４０５，８７７号、同５，４５５，０２７号、同５，４４６，０９０号、同５，４７０，８２９号、同５，４７８，８０５号、同５，５６７，４２２号、同５，６０５，９７６号、同５，６１２，４６０号、同５，６１４，５４９号、同５，６１８，５２８号、同５，６７２，６６２号、同５，６３７，７４９号、同５，６４３，５７５号、同５，６５０，３８８号、同５，６８１，５６７号、同５，６８６，１１０号、同５，７３０，９９０号、同５，７３９，２０８号、同５，７５６，５９３号、同５，８０８，０９６号、同５，８２４，７７８号、同５，８２４，７８４号、同５，８４０，９００号、同５，８７４，５００号、同５，８８０，１３１号、同５，９００，４６１号、同５，９０２，５８８号、同５，９１９，４４２号、同５，９１９，４５５号、同５，９３２，４６２号、同５，９６５，１１９号、同５，９６５，５６６号、同５，９８５，２６３号、同５，９９０，２３７号、同６，０１１，０４２号、同６，０１３，２８３号、同６，０７７，９３９号、同６，１１３，９０６号、同６，１２７，３５５号、同６，１７７，０８７号、同６，１８０，０９５号、同６，１９４，５８０号、同６，２１４，９６６号を参照）。
【０１４４】
代表的な対象とするポリマーには、式−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）−のエチレンオキシド反復単位を含むポリアルキレンオキシドおよびポリアミドアルキレンオキシドを含めた、ポリアルキレンオキシド、ポリアミドアルキレンオキシド、またはその誘導体を含有するポリマーがある。さらなる代表的な対象とするポリマーには、式−［Ｃ（Ｏ）−Ｘ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｙ−ＮＨ］ｎ−または−［ＮＨ−Ｙ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｘ−Ｃ（Ｏ）］ｎ−の約１，０００ダルトンを超える分子量を有するポリアミドがあり、前式でＸおよびＹは、同じであるか異なってよい、かつ分岐状または線状であってよい二価ラジカルであり、ｎは２〜１００、通常２〜５０の個別の整数であり、ＸおよびＹの片方または両方は、線状または分岐状であってよい、生体適合性の実質的に非抗原性の水溶性反復単位を含む。さらなる代表的な水溶性反復単位は、式−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）−または−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）−のエチレンオキシドを含む。このような水溶性反復単位の数は著しく変わる可能性があり、このような単位の通常の数は２〜５００、２〜４００、２〜３００、２〜２００、２〜１００、および最も通常は２〜５０である。代表的な実施形態は、ＸおよびＹの片方または両方が、ｎ１が１〜６、１〜５、１〜４および最も通常は１〜３であり、かつｎ２が２〜５０、２〜２５、２〜１５、２〜１０、２〜８、および最も通常は２〜５である、−（（ＣＨ２）ｎ１−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ２−（ＣＨ２）−または−（（ＣＨ２）ｎ１−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｎ２−（ＣＨ２）ｎ−１−）から選択される実施形態である。さらなる代表的な実施形態は、Ｘが−（ＣＨ２−ＣＨ２）−であり、かつＹが−（ＣＨ２−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）３−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２）−または−（ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）３−ＣＨ２）−である実施形態である。
【０１４５】
ポリマーは、１つまたは複数のスペーサーまたはリンカーを含むことができる。代表的なスペーサーまたはリンカーには、水溶性ポリマーにおいて利用される１つまたは複数の反復単位、ジアミノおよびまたは二酸単位を含む線状または分岐状部分、天然または非天然アミノ酸またはその誘導体、ならびに例えば１８個までの炭素原子またはさらに追加的なポリマー鎖を含有し得る、アルキル、アリール、ヘテロアルキル、ヘテロアリール、アルコキシなどを含めた脂肪族部分がある。
【０１４６】
ポリマー部分、または存在するときポリマー部分の１つまたは複数のスペーサーまたはリンカーは、生体安定性または生分解性であるポリマー鎖または単位を含むことができる。例えば、反復結合を有するポリマーは、結合の不安定性に応じて生理的条件下で様々な程度の安定性を有する。このような結合を有するポリマーは、低分子量類似体の既知の加水分解率、例えば低安定性〜高安定性、例えばポリウレタン（−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−）＞ポリオルトエステル（−Ｏ−Ｃ（（ＯＲ）（Ｒ’））−Ｏ−）＞ポリアミド（−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−）に基づいた、生理的条件下でのそれらの相対的な加水分解率によって分類することができる。同様に、水溶性ポリマーと標的分子を結合させる結合系は、例えば低安定性〜高安定性、カーボネート（−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−）＞エステル（−Ｃ（Ｏ）−Ｏ）＞ウレタン（−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−）＞オルトエステル（−Ｏ−Ｃ（（ＯＲ）（Ｒ’））−Ｏ−）＞アミド（−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−）で、生体安定性または生分解性である可能性がある。一般に、硫酸基の不安定性に応じて、硫化多糖の使用を避けることが望ましい可能性がある。さらに、ポリカーボネートおよびポリエステルを使用することは、それほど望ましくない可能性がある。これらの結合は例証として与えられ、本明細書で開示する修飾型アルデヒドタグ化ポリペプチド中で有用な水溶性ポリマーのポリマー鎖または結合系において利用可能な、結合の型を限定することを意図するものではない。
【０１４７】
アルデヒドタグを変換および修飾するための方法
細胞系（ｉｎ  ｖｉｖｏ）または無細胞の方法（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）によって実施されるアルデヒドタグ化ポリペプチド中に存在するアルデヒドタグの変換。同様に、アルデヒドタグ化ポリペプチドの変換型アルデヒドタグの修飾は、細胞系（ｉｎ  ｖｉｖｏ）または無細胞の方法（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）によって実施することができる。これらは以下により詳細に記載する。
【０１４８】
「Ｉｎ  ｖｉｖｏ」の宿主細胞の変換および修飾
アルデヒドタグ化ポリペプチドのアルデヒドタグの変換は、適切なＦＧＥを含む細胞中でのアルデヒドタグ化ポリペプチドの発現によって実施することができる。この実施形態では、アルデヒドタグのシステインまたはセリンの変換は、宿主細胞中での翻訳中または翻訳後に起こる。この実施形態では、宿主細胞のＦＧＥは宿主細胞に対して内因性であってよく、あるいは宿主細胞は、宿主細胞に対して異種である適切なＦＧＥの組換え体であってよい。ＦＧＥの発現はＦＧＥ遺伝子に対して内因性である発現系によってもたらすことができ（例えば、宿主細胞の天然ＦＧＥ遺伝子中に存在するプロモーターおよび他の制御エレメントによって発現がもたらされる）、あるいはＦＧＥコード配列が異種プロモーターと作動可能に連結して構成的または誘導的発現をもたらす組換え発現系からもたらすことができる。高レベルのＦＧＥ発現をもたらすための強力なプロモーターの使用は、いくつかの実施形態において特に興味深い可能性がある。
【０１４９】
アルデヒドタグを含有する標的ポリペプチドの性質に応じて、変換後に、変換型アルデヒドタグ化ポリペプチドは宿主細胞中の細胞内に保たれるか、分泌されるか、または宿主細胞の細胞外膜と結合する。アルデヒドタグ化ポリペプチドのアルデヒドタグが細胞表面に存在する場合、変換型アルデヒドタグの修飾は、反応パートナーを使用して、生理的条件下で反応パートナーの一部分と表面接触可能なアルデヒドタグのＦＧｌｙ残基を結合させることによって実施することができる。反応パートナーの一部分とアルデヒドタグ化ポリペプチドの結合を実施するために使用するのに適した条件は、Ｍａｈａｌら、（１９９７年５月１６日）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７６（５３１５）：１１２５〜８中に記載された条件と同様である。
【０１５０】
「Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」（無細胞）の変換および修飾
アルデヒドタグ化ポリペプチドのアルデヒドタグのｉｎ  ｖｉｔｒｏ（無細胞）の変換は、アルデヒドタグのスルファターゼモチーフのシステインまたはセリンをＦＧｌｙに転換するのに適した条件下で、アルデヒドタグ化ポリペプチドとＦＧＥを接触させることによって実施することができる。例えば、アルデヒドタグ化ポリペプチドをコードする核酸は、適切なＦＧＥの存在下でｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写／翻訳系において発現させて、変換型アルデヒドタグ化ポリペプチドの生成をもたらすことが可能である。
【０１５１】
あるいは、単離非変換型アルデヒドタグ化ポリペプチドは、適切なＦＧＥを欠く宿主細胞における組換え生成後に、または合成生成によって単離することができる。したがって単離アルデヒドタグ化ポリペプチドは、アルデヒドタグ変換をもたらすための条件下で適切なＦＧＥと接触させる。この実施形態では、単離ポリペプチドにおけるアルデヒドタグが容易に溶媒接触可能でない可能性がある場合、当技術分野で知られている方法によって（例えば、熱、ｐＨの調整、カオトロピック剤（例えば、尿素など）、有機溶媒（例えば、炭化水素：オクタン、ベンゼン、クロロホルム）などを使用して）、アルデヒドタグ化ポリペプチドをアンフォールディング状態にすることが可能であり、変性したタンパク質は適切なＦＧＥと接触させる。次いで変換型アルデヒドタグ化ポリペプチドを、適切な条件下でリフォールディング状態にすることが可能である。
【０１５２】
変換型アルデヒドタグの修飾に関して、修飾は通常ｉｎ  ｖｉｔｒｏで実施する。変換型アルデヒドタグ化ポリペプチドは、生成源（例えば、組換え宿主細胞生成、合成生成）から単離し、反応パートナーの一部分とアルデヒドタグのＦＧｌｙの結合をもたらすのに適した条件下で反応パートナーと接触させる。アルデヒドタグが溶媒接触可能でない場合、アルデヒドタグ化ポリペプチドは、反応パートナーとの反応前に、当技術分野で知られている方法によってアンフォールディング状態にすることが可能である。
【０１５３】
アルデヒドタグと結合した変更可能な部分
いくつかの実施形態では、アルデヒドタグのＦＧｌｙ残基における結合部分の除去および異なる部分との置換を容易にするような形式で、アルデヒドタグ化ポリペプチドを修飾することができる。本発明のこの態様は、異なる反応パートナーと形成される結合体の相対的な熱力学的安定性を利用する。
【０１５４】
例えば、図６中に示すように、アルデヒドはヒドラジドおよびアミノオキシ部分と容易に反応して、それぞれヒドラゾンおよびオキシムを生成する。これらの結合体の両方は生理的条件下で強固であるが、オキシムはより熱力学的に安定している。さらに、チオセミカルバジドもアルデヒドと容易に反応してチオセミカルバゾン結合体を形成し、これらはオキシムより熱力学的安定性が低い。これらの熱力学的安定性の違いは、低安定性のヒドラゾン結合体をより安定したオキシム結合体に変更するため、および低安定性のオキシム結合体をより安定したセミカルバゾン結合体に変更するために利用することができる。以下の実施例中に示すように、アルデヒドタグのこの特徴は、順々に（すなわち連続的に）２つの試薬を用いて標的タンパク質を修飾することを可能にする。
【０１５５】
修飾型アルデヒドタグ化ポリペプチド
アルデヒドタグ化ポリペプチドと対象とする部分を含む反応パートナーの反応によって生成する反応生成物は、一般に部位特異的な形式で（すなわち、ＦＧｌｙ残基で）修飾され、実質的に均質な集団の修飾型アルデヒドタグ化ポリペプチドが得られる。異種集団のこのような反応生成物は、望ましい場合、異なる部分を含む２つ以上の反応パートナーを使用することによって生成することができる。
【０１５６】
例えば、標的ポリペプチドをペグ化によって修飾する場合、方法を適合させて、ペグ化ポリペプチドの均質な集団（その中でポリペプチドは同じＰＥＧ部分で修飾されている）またはペグ化ポリペプチドの異種集団（その中で組成物中のポリペプチドは異なる型のＰＥＧ分子で修飾されている）の生成をもたらすことが可能である。
【０１５７】
キットおよびシステム
本発明の組成物を容易にする、および望ましい場合は標準化するキットおよびシステム、およびその使用を提供する。本明細書で企図するキットは、標的ポリペプチドに挿入するためのアルデヒドタグをコードする１つまたは複数の構築体、（例えば、アルデヒドタグとのＮ末端またはＣ末端融合体として標的ポリペプチドのコード配列の挿入をもたらすための発現カセットとして）宿主細胞中での発現用のアルデヒドタグ化ポリペプチドをコードする構築体、キットのアルデヒドタグと適合性がある内因性、組換え、または異種であってよいＦＧＥを生成する宿主細胞、対象とするアルデヒドタグ化ポリペプチドを発現するように遺伝的に改変されており、タグ化ポリペプチドのアルデヒドタグの変換と適合性がある内因性、組換え、または異種であってよいＦＧＥをさらに発現することができる宿主細胞、およびタグ化ポリペプチドの変換型アルデヒドタグの化学修飾用の反応パートナーを含むことができる。
【０１５８】
さらにキットは、キットの構成要素、特にキット中に含まれる本発明の組成物を使用するための説明書を含むことができる。
【実施例】
【０１５９】
以下の実施例は、本発明の作成および使用の仕方の完全な開示および記載を当業者に提供するために示すものであり、本発明者がその発明とみなすものの範囲を限定することを目的とするものでもなく、以下の実験がすべてまたは唯一の実施した実験であることを表すことを目的とするものではない。使用する数値（例えば量、温度など）に関する精度を確実にするための努力を施してきているが、ある程度の実験誤差および偏差は考慮すべきである。他に示さない限り、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏温度であり、かつ圧力は大気圧またはほぼ大気圧である。
【０１６０】
方法および材料：
以下の材料および方法を、以下に述べる実施例１〜６中で使用した。
【０１６１】
プラスミド構築。以下のオリゴヌクレオチドを以下の実施例中で使用した：
【０１６２】
【化２】
2014221056.tif 000004
ａアルデヒドコード塩基に下線を引く。ｂ部位特異的突然変異誘発プライマー。適切な場合、それぞれのタンパク質の開始コドンの最初から番号処理する。一対の相補的プライマーをそれぞれの突然変異体に使用した。逆相補配列は示さない。
【０１６３】
構築体のスルファターゼモチーフは以下に与える：
ａｌｄ１３−Ｓｔｆ０：          ＬＣＴＰＳＲＧＳＬＦＴＧＲ−（マイコバクテリアスルホトランスフェラーゼ）
ａｌｄ１３−Ｓｔｆ０（Ｃ５Ａ）：ＬＡＴＰＳＲＧＳＬＦＴＧＲ−（マイコバクテリアスルホトランスフェラーゼ）
ａｌｄ６−Ｓｔｆ０：            ＬＣＴＰＳＲ−（マイコバクテリアスルホトランスフェラーゼ）
ａｌｄ６−ＭＢＰ：              ＬＣＴＰＳＲ−（マルトース結合タンパク質）
ａｌｄ６−ｈＧＨ：              ＬＣＴＰＳＲ−（ヒト成長ホルモン）
【０１６４】
ａｌｄ１３−Ｓｔｆ０をコードする核酸を、アニーリングしたオリゴヌクレオチドをＮｃｏＩとＮｄｅＩ制限部位の間の前に構築したｐＥＴ２８−Ｓｔｆ０ベクター１９に連結させることによって構築した。ｓｔｆ０停止コドンをＱｕｉｋｃｈａｎｇｅ（商標）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）突然変異誘発法によって除去してＣ末端Ｈｉｓ６タグを得た。ａｌｄ６Ｓｔｆ０をＱＵＩＣＫＣＨＡＮＧＥ（商標）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用して構築して、１３アミノ酸のアルデヒドタグの最後の７残基をコードするヌクレオチドを排除した。ａｌｄ６−ＭＢＰをコードする遺伝子は、アニーリングしたオリゴヌクレオチドをＸｈｏＩとＨｉｎｄＩＩＩ制限部位の間のｐＭＡＬｃ−Ｈベクター１９に連結させることによって構築した。ｈＧＨ（ヒト成長ホルモン１転写産物変異体１、残基２９〜２１７をコードする）をコードする遺伝子は、６アミノ酸のアルデヒドタグをコードしＮｃｏＩとＮｏｔＩ制限部位の間のｐＥＴ２８ｂに連結した５’プライマーを使用して、ｐＣＭＶ−ＳＰＯＲＴ６．ｌ．ｃｃｄｂ（Ｏｐｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）から増幅した。ヒト型結核菌のＦＧＥ（Ｒｖ０７１２、残基２〜２９９をコードする）をコードする遺伝子は、ＦＧＥ１４を含有する前に調製したｐＥＴ１４ｂプラスミドから増幅し、ＮｃｏＩとＮｏｔＩ制限部位の間のｐＢＡＤ／ｍｙｃ−ｈｉｓＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に連結させた。ＦＧＥ遺伝子はＱｕｉｋＣｈａｎｇｅＰＣＲ突然変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用して開始コドンとインフレームで配置した。ａｌｄ−Ｓｔｆ０、ａｌｄ−ＭＢＰ、およびａｌｄ−ｈＧＨのＣｙｓ→Ａｌａ突然変異体は、Ｑｕｉｋｃｈａｎｇｅ（商標）突然変異誘発法を使用して生成した。ＤＮＡの塩基配列決定を実施して、それぞれの遺伝子産物の忠実性を確認した。タンパク質コードプラスミドはＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換した。
【０１６５】
タンパク質の発現および精製。アルデヒドタグ化タンパク質コードプラスミドのみを有するＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌細胞のクローン集団を、ＯＤ６００＝０．５まで３７℃で振とうしながらカナマイシンと共にＬＢ培地中でインキュベートし、その時点で温度は１８℃まで低下させ１００μＭのＩＰＴＧを加えた。アルデヒドタグ化タンパク質コードプラスミドおよびＦＧＥコードプラスミドを有するＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌細胞は、ＯＤ６００＝０．５まで３７℃で振とうしながらカナマイシンおよびアンピシリンと共にＬＢ培地中でインキュベートし、その時点でＦＧＥの発現を０．０２％アラビノースで誘導した。３０分後、温度は１８℃まで低下させ、１００μＭのＩＰＴＧを加えてアルデヒドタグ化タンパク質の発現を誘導した。１２〜１６時間後、細胞を採取し、培養物１リットル当たり２０ｍｌの溶解バッファー（５０ｍＭのトリス、５００ｍＭのＮａＣｌ、１０％のグリセロール、２０ｍＭのイミダゾール、１ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭのＴＣＥＰ、１ｍＭのメチオニン、ｐＨ７．５、ａｌｄ６−ｈＧＨ用、または５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのイミダゾール、ｐＨ７．４、ａｌｄ−Ｓｔｆ０およびａｌｄ６−ＭＢＰ用）に再懸濁させ、超音波処理によって溶かした。
【０１６６】
細胞溶解物はＤＮａｓｅ（１０μｇ／ｍｌ）で処理し、遠心分離によって除去し、１ｍｌのＨｉｓＴｒａｐカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にかけた。カラムは３５ｍＭのイミダゾールを含む溶解バッファーで洗浄し、Ｈｉｓ６タグ化タンパク質は２５０ｍＭのイミダゾールを含む溶解バッファーを使用して溶出させた。ａｌｄ６−ｈＧＨはＳｅｐｈａｄｅｘ１６／６０Ｓ３００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でさらに精製した。
【０１６７】
トリプシンによる消化および標準添加アッセイ。１０μｇのタンパク質を、５０ｍＭのＮＨ４ＨＣＯ３ｐＨ８中において１６時間３７℃で０．４μｇのトリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて消化した。欠損切断部位を含有するペプチドは、同一条件下で消化の３時間後にＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によって検出されなかったので、このプロトコルは完全な消化に十分であると考えた。標準添加アッセイは、１回分当たり約０．６μｇのタンパク質消化産物を用いて水中で実施した。システインまたはアルデヒド（ＦＧｌｙ）のいずれかを含有する合成ペプチドを等モル量加え、次に１００ｍＭのＤＴＴを加えた。この溶液は、質量分析による分析（Ａｇｉｌｅｎｔ  ＭＳＤ）の前に１時間室温でインキュベートした。対照の１回分はランダムに選択した１回分の間で加え、残留シグナルは検出しなかった。システインの酸化は観察しなかった。
【０１６８】
小分子の標識。蛍光標識反応を、２時間３７℃において標識バッファー（１００ｍＭのＭＥＳ  ｐＨ５．５、１％のＳＤＳ）中で１０μｇの標的タンパク質および３００μＭのアミノオキシ色素（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７  Ｃ５−アミノオキシアセトアミド、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて実施した。１６６ｍＭのメトキシルアミンを対照反応に加えた。反応混合物はＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、蛍光はＴｙｐｈｏｏｎ９４１０スキャナー（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して検出した。タンパク質充填はＳｙｐｒｏ  Ｒｕｂｙ（Ｓｉｇｍａ）染色によって決定した。３７℃において２時間標識バッファー中で、３０μＭのビオチンヒドラジド（Ｓｉｇｍａ）と共に１０μｇの標的タンパク質をインキュベートすることによってビオチン化をもたらした。ビオチンヒドラジドの後の置換は、２時間３７℃において１６６ｍＭのメトキシルアミンまたは１ｍＭのアミノオキシＦＬＡＧのいずれかを加えることによってもたらした。α−ビオチンのウェスタンブロットは標準プロトコルを使用して実施した。α−ＦＬＡＧブロットは、膜を剥離しα−ＦＬＡＧＭ２（Ｓｉｇｍａ）で再度プローブ処理することによって得た。アミノオキシ−ＦＬＡＧは、標準的なＦＭＯＣベースの固相ペプチド合成プロトコルを使用して合成した。Ｃ末端に加えた最終残基は（ｔ−Ｂｏｃ−アミノオキシ）酢酸であり、次に標準条件下で切断した。
【０１６９】
ペグ化。アミノオキシ−ＰＥＧは、標準プロトコルを使用してモノアミノ−ＰＥＧおよびアミノオキシグリシンから作成した。より具体的には、標準ペプチド結合条件を使用してアミノＰＥＧ（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ）を活性化（ｔ−Ｂｏｃ−アミノオキシ）酢酸に加えることによって、アミノオキシＰＥＧを生成した。簡単に言うと、アミド結合の形成は、アセトニトリル中で（ｔ−Ｂｏｃ−アミノオキシ）酢酸（５当量）の予め形成させた８−ヒドロキシベンゾトリアゾールエステルにアミノＰＥＧを加えることによって実施した。エーテルからの沈殿、次に粉砕によって産物の精製をもたらした。脱保護は室温で３時間トリフルオロ酢酸水溶液（９５％ＴＦＡ、５％Ｈ２Ｏ）を用いた処理によって実施した。エーテルへの沈殿および粉砕は、１ＨＮＭＲによって判断して純産物をもたらした。カップリング溶液（４９．９５％のＣＨ３ＣＮ、４９．９５％のＨ２Ｏ、０．１％のＴＦＡ）中での１０μｇの標的タンパク質と１０ｍＭのアミノオキシＰＥＧの１時間のインキュベーション、次に凍結乾燥によって、アルデヒドタグ化タンパク質との結合をもたらした。
【０１７０】
カップリング溶液（４９．９５％のＣＨ３ＣＮ、４９．９５％のＨ２Ｏ、０．１％のＴＦＡ）中での１０μｇの標的タンパク質と１０ｍＭのアミノオキシＰＥＧの１時間のインキュベーション、次に凍結乾燥によって、アルデヒドタグ化タンパク質との結合をもたらした。反応混合物は水に再懸濁させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、Ｓｙｐｒｏ  Ｏｒａｎｇｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色し、およびＴｙｐｈｏｏｎ９４１０スキャナー（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して検出した。
【０１７１】
実施例１：大腸菌において発現されるタンパク質中のスルファターゼモチーフの部位特異的修飾
Ｎ末端またはＣ末端いずれかのアルデヒドタグを有するタンパク質構築体を、大腸菌において発現させた。３つのタンパク質標的、Ｃ末端タグ化マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、Ｎ末端タグ化ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）；およびＮ末端タグ化マイコバクテリアスルホトランスフェラーゼ（Ｓｔｆ０）を調査した。さらに、アルデヒドタグの２つの変異体、スルファターゼのコンセンサスモチーフ全体を含んでいた１３残基のタグ（ａｌｄ１３−Ｓｔｆ０）、およびスルファターゼのコンセンサスモチーフを含有するさらに短い配列を含んでいた６残基のタグ（ａｌｄ６−Ｓｔｆ０）を試験した：
ＬＣＴＰＳＲＧＳＬＦＴＧＲ−Ｓｔｆ０      （ａｌｄ１３−Ｓｔｆ０）
ＬＣＴＰＳＲ−Ｓｔｆ０                    （ａｌｄ６−Ｓｔｆ０）
【０１７２】
ＦＧｌｙの効率のよい形成を確実にするために、タグ化タンパク質はヒト型結核菌（Ｍｔｂ）由来の原核生物のＦＧＥと同時に発現させた（以下の実施例中に記載する）。
【０１７３】
１３残基のスルファターゼのコンセンサスモチーフを含有するペプチド（ａｌｄ１３−Ｓｔｆ０）のトリプシンによる消化は、ＦＧｌｙの直接的な質量スペクトルによる同定を可能にした（図２）。ＦＧｌｙ含有ペプチドは容易に同定することができたが、システイン含有ペプチドは観察されず、アルデヒドタグの効率のよい酸化が示された。
【０１７４】
実施例２：６残基のスルファターゼのコンセンサスモチーフを含有するペプチドは高い変換率を示す
ＣｙｓからＦＧｌｙへの変換の程度を定量化するために、標準添加アッセイを実施した。標的タンパク質由来のトリプシン誘導型ペプチド内のシステインとＦＧｌｙの相対レベルを、合成ペプチドを様々な濃度でトリプシン消化産物に入れることによって作成した標準添加曲線と比較した（図３、パネルａ）。
【０１７５】
予想外に、６残基のスルファターゼのコンセンサスモチーフを含有するＳｔｆ０ペプチド（ａｌｄ６−Ｓｔｆ０）は、保存型１３アミノ酸配列を含有するＳｔｆ０ペプチド（ａｌｄ１３−Ｓｔｆ０）の変換よりわずかに高い変換を示し、それぞれ９２±３％および８６±５％の変換レベルであった。この結果は、遠位スレオニン−グリシン−アルギニン（ＴＧＲ）配列は効率のよいシステイン酸化に重要であることを示した以前のスルファターゼ試験（Ｄｉｅｒｋｓら、（１９９９）ＥＭＢＯ  Ｊ．１８（８）；２０８４〜９１）と対照的である。６残基のスルファターゼのコンセンサスモチーフを含むｈＧＨペプチド（ａｌｄ６−Ｓｔｆ０）は、９９±５％で有意に高い変換を示した。
【０１７６】
実施例３：ＦＧＥによるスルファターゼモチーフの変換は主要配列の状況と無関係であり、したがってポリペプチド内のＮ末端またはＣ末端のいずれかの位置におけるアルデヒドタグの配置を可能にする
以前のスルファターゼ試験は、（以下で下線を引いた）１３残基のスルファターゼのコンセンサスモチーフにおける遠位スレオニン−グリシン−アルギニン（ＴＧＲ）配列は、高レベルのシステイン酸化に重要であることを示している：
ＬＣＴＰＳＲＧＳＬＦＴＧＲ
【０１７７】
ＦＧｌｙの形成は共翻訳によって起こると考えられるので（Ｄｉｅｒｋｓら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１９９７  Ｏｃｔ  ２８；９４（２２）：１１９６３〜８）、Ｃ末端構築体はアルデヒドタグの接触不能性により低度のＦＧｌｙ形成を経る可能性があると考えた。マルトース結合タンパク質および６残基のスルファターゼのコンセンサスモチーフを含有するＣ末端タグ化ポリペプチド（ａｌｄ６−ＭＢＰ）を作成することによって、これを試験した：
ＬＣＴＰＳＲ−（マルトース結合タンパク質）
【０１７８】
驚くことに、Ｃ末端タグ化ａｌｄ６−ＭＢＰも９９±２％でほぼ定量的な変換を示した。このスルファターゼモチーフはスルファターゼの内部中に本来見られることを考慮すると、これらの結果は、アルデヒドの形成はタグの主要配列の位置に関して制限されないことを示す。
【０１７９】
実施例４：アルデヒドタグ化タンパク質の選択的蛍光標識
ＦＧｌｙ導入によってもたらされる特異性を示すために、一団のアルデヒドタグタンパク質を、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）６４７アミノオキシアセトアミド色素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で標識した：
ａｌｄＥ３−ＳｔｆＯ（Ｃ５Ａ）：ＬＡＴＰＳＲＧＳＬＦＴＧＲ−（マイコバクテリアスルホトランスフェラーゼ）
ａｉｄ１３−ＳｔｆＯ：          ＬＣＴＰＳＲＧＳＬＦＴＧＲ−（マイコバクテリアスルホトランスフェラーゼ）
ａｌｄ６−ＳｔｆＯ：            ＬＣＴＰＳＲ−（マイコバクテリアスルホトランスフェラーゼ）
ａｌｄ６−ＭＢＰ：              ＬＣＴＰＳＲ−（マルトース結合タンパク質）
【０１８０】
アルデヒドタグタンパク質は確かな蛍光標識を示した（図３、パネルｂ）：ａｌｄ１３−Ｓｔｆ０（−）、ａｌｄ６−Ｓｔｆ０（−）、およびａｌｄ６−ＭＢＰ（−））。対照的に、アルデヒドタグモチーフ中の重要なシステインがアラニンに突然変異した対照タンパク質は、少量のバックグラウンド標識のみを示した（図３、パネルｃおよびｄ：ａｌｄ１３−Ｓｔｆ０（Ｃ５Ａ）（−））。過剰のメトキシルアミン、競合求核剤と共にインキュベートしたアルデヒドタグ化タンパク質は、標識を示さなかった（図３、パネルｃおよびｄ：ａｌｄ１３−Ｓｔｆ０（Ｃ５Ａ）（＋）、ａｌｄ１３−Ｓｔｆ０（＋）、ａｌｄ６−Ｓｔｆ０（＋）、およびａｌｄ６−ＭＢＰ（＋））。興味深いことに、大腸菌のゲノムは注釈のＦＧＥを含まないが、外来性ＦＧＥを含まない発現されたアルデヒドタグ化タンパク質は、低い強度ではあったが蛍光標識を依然として示した。これは大腸菌が、スルファターゼモチーフを酸化することができる１つまたは複数の酵素を本来発現するに違いないことを示す。
【０１８１】
実施例５：アルデヒドタグタンパク質の修飾は「変更可能な」部分を与えることができる
アルデヒドはヒドラジドおよびアミノオキシ部分と容易に反応して、それぞれヒドラゾンおよびオキシムを生成する。これらの結合体の両方は生理的条件下で強固であるが、オキシムはより熱力学的に安定している。この違いは、低安定性のヒドラゾン結合体をより安定したオキシム結合体に変更するために利用することができる。精製タグの結合、次に結合フロオロフォアを与えるための結合した精製タグの置換によって例示されるように、アルデヒドタグのこの特徴は、順々に（すなわち連続的に）２つの試薬を用いて標的タンパク質を修飾することを可能にする。
【０１８２】
この技法の実現可能性を評価するために、マルトース結合タンパク質および６残基のスルファターゼのコンセンサスモチーフを含有するポリペプチド（ａｌｄ６−ＭＢＰ）を、ビオチンヒドラジドを用いて最初に標識し、その後メトキシルアミンまたはアミノオキシエピトープタグ（アミノオキシ−ＦＬＡＧ）と共にインキュベートした。ビオチンヒドラジドを用いた標識は、ウェスタンブロットにおいてα−ビオチンによる確かなシグナルをもたらした（図４、パネルａ、レーン１）。メトキシルアミンまたはアミノオキシ−ＦＬＡＧとの後のインキュベーションは、α−ビオチンシグナルの完全な消失（図４、パネルａ、レーン２）または確かなα−ＦＬＡＧシグナル（図４、パネルａ、レーン３）をそれぞれもたらした。
【０１８３】
アミノオキシ−ＦＬＡＧ標識タンパク質をその後メトキシルアミンに曝すと、おそらく結合体の同等の安定性による、シグナルのごく一部分の消失を観察した（データ示さず）。これらの結果は、アルデヒドタグ化タンパク質への連続的な結合は、結合化学の安定性に基づいてプログラムされている可能性があることを示す。
【０１８４】
実施例６：治療標的タンパク質においてＰＥＧ−タンパク質結合体を生成するための部位特異的ペグ化の作成
部位特異的ペグ化を仲介する際のアルデヒドタグの使用を例示するために、アルデヒドタグを使用して、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖と組換えによって発現したａｌｄ６−Ｓｔｆ０を部位特異的に結合させた。ａｌｄ６−Ｓｔｆ０は組換えによって発現させ、様々な鎖の長さを有する一連のアミノオキシ−ＰＥＧを用いてそれを修飾した。Ｓｔｆ０−ＰＥＧ結合体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、添付のＰＥＧ分子の分子量および帯電と一致する明確な質量シフトを示した（図４，パネルｂ）。これらの結果は、元のシステインまたはリシンの数とは無関係に、部位特異的ＰＥＧ−タンパク質結合体を得ることの容易さを示す。
【０１８５】
前述の事項は、例えば治療用タンパク質の部位特異的ペグ化を仲介するための、アルデヒドタグの適用例に関する原理の証拠を与える。医薬品タンパク質のペグ化は望ましい、何故ならそれは、タンパク質分解安定性の増大および腎クリアランスの低下によって、治療指数を増大させる可能性があるからである。さらに、ペグ化を利用してタンパク質製剤の免疫原性を低下させることができる。タンパク質結合化学の進展にもかかわらず、タンパク質の部位特異的修飾は依然として問題がある。システインまたはリシン残基の誘導体化は、タンパク質をペグ化するための現在最も利用されている方法であるが、この非特異的な標識法は多数の部位のペグ化をもたらし、異なる薬物動態を有する別個のタンパク質−ＰＥＧ結合体の望ましくない集合を作成する。本明細書に記載するアルデヒドタグ技術を使用して、これらなどの必要性に対処することができる。
【０１８６】
実施例７：哺乳動物細胞において発現されるポリペプチドの細胞表面接触可能な残基を修飾するためのアルデヒドタグの使用
細胞膜に不可欠なタンパク質へのＦＧｌｙの導入を示すために、アルデヒドタグ合成光異性化可能なアゾベンゼン制御型Ｋ＋（ＳＰＡＲＫ）チャンネルタンパク質を生成した。光活性化Ｋ＋イオンチャンネルであるＳＰＡＲＫチャンネルタンパク質は、ニューロン活動の非侵襲性制御のために開発された（Ｂａｎｇｈａｒｔら、Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２００４）。
【０１８７】
前に記載した６残基のアルデヒドタグ（ａｌｄ６（ＬＣＴＰＳＲ））を、ＳＰＡＲＫチャンネルタンパク質をコードする構築体中に導入した。３つの戦略：１）タンパク質の細胞外ループの１つの内部のアルデヒドタグの６残基のスルファターゼのコンセンサスモチーフの付加（図５中では「Ｉ」と呼ぶ）、２）ループからの６残基の欠失および次いで６残基タグのアルデヒドタグとこれらの残基の置換（図５中では「Ｃ」と呼ぶ）、および３）ループからの３残基の欠失および次いで６残基のアルデヒドタグの付加（図５中では「Ｐ」と呼ぶ）を使用した。ベクターのみの陰性対照も実施した（図５中で「Ｖ」）。
【０１８８】
組換え、アルデヒドタグ化ＳＰＡＲＫチャンネルの３つの変異体のそれぞれをコードするプラスミドを、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞およびヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）細胞にトランスフェクトした。ＣＨＯ細胞とＨＥＫ細胞の両方が内因性ＦＧＥを発現する。しかしながら、アルデヒドタグのＣｙｓの変換を増大させるために、アルデヒドタグ化ＳＰＡＲＫをコードするプラスミドを、ヒトＦＧＥをコードするｐｃＤＮＡ３．１構築体とコトランスフェクトした。使用したヒトＦＧＥは以下のアミノ酸配列を有する：
【化３】
2014221056.tif 000005
【０１８９】
１日後、細胞を溶かし、ウェスタンブロットによって（ＳＰＡＲＫチャンネルタンパク質中に存在し、したがって成功したトランスフェクションおよび翻訳を示す）ｍｙｃエピトープの存在に関して、およびアミノオキシ−ＦＬＡＧを使用する反応によってアルデヒドの存在に関して、溶解物をプローブ処理し、次に抗ＦＬＡＧ抗体を用いてプローブ処理した。ポンソーブロットは、ブロット上での同じ細胞型由来のサンプルの等しい充填を示した。
【０１９０】
図５中に示すように、ＳＰＡＲＫ細胞外ループの６残基の欠失および６残基のアルデヒドタグとの置換に関する戦略は成功した（図５、パネルｃ中の抗ＦＬＡＧブロット上の矢印を参照）。この結果は、哺乳動物細胞中でのアルデヒドタグ化タンパク質の細胞表面残基を修飾する能力を示す。
【０１９１】
細胞の表面上のアルデヒドタグ化ＳＰＡＲＫのＦＬＡＧの存在は、フローサイトメトリーを使用して確認することができる。
【０１９２】
実施例８：Ｆｃ抗体断片を修飾するためのアルデヒドタグの使用
アルデヒドタグの適用例をさらに示すために、Ｎ末端またはＣ末端のいずれかにアルデヒドタグを含むように可溶性ＩｇＧＦｃ断片を修飾した。簡単に言うと、１３残基のアルデヒドタグ（ａｌｄ１３）（ＬＣＴＰＳＲＡＡＬＬＴＧＲ）を導入して、市販のｐＦｕｓｅ−Ｆｃベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にコードされる可溶性ＩｇＧＦｃ断片のＮ末端またはＣ末端のいずれかにアルデヒドタグを配置した。アルデヒドタグのＣｙｓの変換を増大させるために、Ｆｃコード構築体およびヒトＦＧＥをコードするｐｃＤＮＡ３．１構築体とＣＨＯ細胞をコトランスフェクトした。
【０１９３】
Ｆｃ断片は細胞上清から単離し、その中でＣｙｓがＦＧｌｙに変換されたアルデヒドタグ化ＩｇＧＦｃ断片の検出は、単離したタンパク質とアミノオキシ−ＦＬＡＧ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）プローブ（ＦＬＡＧ−ＯＮＨ２）を反応させ、次にＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット分析によって実施した。ＦＬＡＧ−ＯＮＨ２プローブと反応しなかったタンパク質は、追加的な対照として働いた。
【０１９４】
アルデヒドタグ１２量体を含有するＦｃ融合体は、Ｎ末端（Ｎ−Ｆｃ−Ａｌｄ１３）またはＣ末端（Ｃ−Ｆｃ−Ａｌｄ１３）のいずれかに存在したとき確かな標識を与えたが、重要なシステインがアラニンに突然変異している（ＣからＡに突然変異している）対照タンパク質は、検出可能なシグナルは与えなかった（図１７）。
【０１９５】
６量体アルデヒドタグはタンパク質の修飾を仲介するのに十分であるかどうか評価するために、Ｃ末端に６量体アルデヒドタグ（Ｆｃ−Ａｌｄ）または対照タグ（Ｆｃ−Ｃ−＞Ａ）を有するＩｇＧＦｃ断片を、ｐＦｕｓｅ−Ｆｃベクターを使用して作成した。アルデヒドタグ化ＩｇＧＦｃ断片は、単離したタンパク質とアミノオキシ−ＦＬＡＧプローブ（ＦＬＡＧ−ＯＮＨ２）を反応させ、次にＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット分析によって検出した。ＦＬＡＧ−ＯＮＨ２プローブと反応しなかったタンパク質は、追加的な対照として働いた。図１８中に示すように、６量体アルデヒドタグはＦｃ−Ａｌｄの確かな標識を容易にしたが、一方修飾して対照タグを封入したＦｃ断片では、検出可能な標識は観察されなかった。Ｎ末端に６量体アルデヒドタグ配置を有するＩｇＧＦｃ断片をコードする構築体は、同様の結果をもたらした（データ示さず）。
【０１９６】
Ｆｃ断片のホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）による修飾を確認するために、Ｎ末端またはＣ末端タグ化ａｌｄ１３−Ｆｃ断片にトリプシンによる消化を施して、ＦＧｌｙの直接的な質量スペクトルによる同定を可能にした。図１９および２０中に示すように、ＦＧｌｙ含有ペプチドおよびシステイン含有ペプチドは、Ｎ末端とＣ末端の両方が修飾されたＦｃ断片から容易に同定することができた。
【０１９７】
アルデヒドタグ化Ｆｃの特異的標識は、アミノオキシ−ＦＬＡＧプローブを無血清培地に直接さらすことによっても認められた（データ示さず）。
【０１９８】
実施例９：アルデヒドタグ化タンパク質におけるＦＧｌｙへのＣｙｓの変換の効率
ＣｙｓからＦＧｌｙへの変換の程度を定量化するために、トリプシンにより消化された標的タンパク質の変換効率を分析するためのアッセイを開発した。システインを含有する非修飾ペプチドの量は、合成ペプチドを様々な濃度でトリプシン消化産物に入れることによって作成した標準曲線から決定した。ＦＧｌｙ含有ペプチドの量は、全タンパク質の量からシステイン含有ペプチドの量を引くことによって計算し、ＢＣＡタンパク質アッセイを使用して決定した。
【０１９９】
このアッセイを前の実施例中に記載したＮ末端およびＣ末端タグＦｃ断片に施すと、外因性ヒトＦＧＥ（ｈＦＧＥ）の存在下では、ＣｙｓからＦＧｌｙへの変換の効率はＮ末端タグａｌｄ１３−Ｆｃに関して８６±１％、およびＣ末端タグａｌｄ１３−Ｆｃに関して５８±２％であったことが分かった。対照的に、外因性ｈＦＧＥの不在下では、変換の効率は、Ｎ末端およびＣ末端タグＦｃ断片に関してそれぞれわずか約２５％と約２３％であった。６量体アルデヒドタグを含むＣ末端修飾Ｆｃ断片は、外因性ｈＦＧＥの存在下で約９２％の変換効率を示した。
【０２００】
実施例１０：細胞表面タンパク質のアルデヒドタグ仲介型修飾
この実施例は、アルデヒドタグを使用して、同じ手法を使用した生存ＨＥＫ細胞における、細胞表面タンパク質、血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦＲ）膜貫通ドメイン（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのｐＤｉｓｐｌａｙベクターによってコードされる）の部位特異的修飾を容易にすることができることを示す。
【０２０１】
１３量体アルデヒドタグ（ＬＣＴＰＳＲＡＡＬＬＴＧＲ）または対照タグ（ＬＡＴＰＳＲＡＡＬＬＴＧＲ）を、ＢｇｌＩＩ部位とＳａｌＩ部位の間のｐＤｉｓｐｌａｙ（商標）発現構築体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；図２１）中に導入した。生成した融合タンパク質は、ここではＡｌｄｌ３−ＴＭ（１３量体アルデヒドタグを含む）およびＣ−＞Ａ−ＴＭ（対照タグを含む）と呼ぶ。この発現構築体およびヒトＦＧＥ（ｈＦＧＥ）を発現する構築体を、ＨＥＫ２９３−Ｔ細胞に一時的にトランスフェクトして発現をもたらした。
【０２０２】
細胞の標識はオキシアミノビオチンと反応させることによって実施し、ストレプトアビジンＡｌｅｘｆｌｕｒｏ４８８結合体によってプローブ処理した。次いで細胞はフローサイトメトリーによる分析に施した。
【０２０３】
図２１中に示すように、Ａｌｄ１３−ＴＭ表面タンパク質を発現する細胞の平均蛍光は、Ｃ−＞Ａ−ＴＭ対照を発現する細胞（平均蛍光約３．３１）より有意に高かった（平均蛍光約２４．４２）。
【０２０４】
実施例１１：サイトゾルタンパク質を標識するためのアルデヒドタグ修飾
サイトゾルタンパク質の特異的標識におけるアルデヒドタグの使用を示すために、アルデヒドタグ化または対照タグ化したオワンクラゲ由来の緑色蛍光タンパク質（ＡｃＧＦＰ）をコードする構築体を作製した。市販のｐＡｃＧＦＰ１−Ｎ１ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用して、ヒスタグ（Ｈｉｓ６によって表される６個のヒスチジン残基）次にＡｃＧＦＰのＮ末端に位置する１３量体アルデヒドタグ（ＬＣＴＰＳＲＡＡＬＬＴＧＲ）または対照タグ（ＬＡＴＰＳＲＡＡＬＬＴＧＲ）から構成されるＡｃＧＦＰ融合タンパク質をコードする発現構築体を、ＫｐｎＩ制限部位とＸｍａＩ制限部位の間にヒスタグおよび１３量体アルデヒドタグコード配列を挿入することによって作成した。
【０２０５】
ストレプトミセスコエリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）由来の細菌のＦＧＥ相同体（ＳｔｒｅｐＦＧＥ）は、アルデヒドタグ化ＧＦＰ（Ａｌｄ−ＡｃＧＦＰ）または対照タグ化ＧＦＰ（Ｃ−＞Ａ−ＡｃＧＦＰ）をコードするプラスミドとＨＥＫ細胞のコトランスフェクション用に、哺乳動物発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３．１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。ＳｔｒｅｐＦＧＥの発現を欠く細胞は、さらなる対照として使用した。
【０２０６】
ＦＧｌｙを含有していたアルデヒドタグ化ＡｃＧＦＰの検出は、単離したタンパク質とアミノオキシ−ＦＬＡＧ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）プローブ（ＦＬＡＧ−ＯＮＨ２）を反応させ、次にＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット分析によって実施した。ＦＬＡＧ−ＯＮＨ２プローブと反応しなかったタンパク質は、追加的な対照として働いた。
【０２０７】
サイトゾルＦＧＥ相同体の存在下では、コンセンサス配列内のシステイン残基はホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）に効率よく変換され（図２２）、一方対照タグ化ＡｃＧＦＰは検出可能な標識を示さず、検出可能なＦＧｌｙを示さなかった。さらに、ＳｔｒｅｐＦＧＥを発現しなかったＨＥＫ細胞において生成されたＡｌｄ−ＧＦＰも、強いシグナルを生成した（図２２）。これは、ＨＥＫ細胞を溶かし、したがってこれらの細胞のＥＲからｈＦＧＥを遊離させることが可能であり、したがってｈＦＧＥとアルデヒドタグの間の接触が可能であり、アルデヒドへのシステイン変換をもたらす、使用するタンパク質単離の方法が原因である可能性がある。
【０２０８】
実施例１２：ＩＦＮ−βのアルデヒドタグ修飾
アルデヒドタグを使用して、様々なタンパク質の修飾を容易にすることができる。修飾に関する代表的な対象とするタンパク質はインターフェロンβ（ＩＦＮ−β）を含む。ＩＦＮ−βは、５つのα−二重らせん構造（Ａ〜Ｅ）および残基Ａｓｎ−８０に存在する１つのグリコシル化部位から構成される。ＩＦＮ−βを修飾して、タンパク質のグリコシル化部位および／または他の溶媒接触可能部位における修飾をもたらすことができる。例えば、グリコシル化を容易にするＩＦＮ−βのアミノ酸配列を修飾して、アルデヒドタグを与えることができる。例えば、組換え技法を使用して、ＩＦＮ−βのループ中に存在するＩＦＮ−βの配列ＤＳＳＳＴＧＷＮＥは、アルデヒドタグ含有配列ＧＳＬＣＴＰＳＲＧと置換することができる。したがってアルデヒドタグを利用して、図２３中に例示するように、対象とする部分を結合させることが可能である。
【０２０９】
実施例１３〜１４：ヒト型結核菌由来のＦＧＥの同定および特徴付け
以下の実施例では、ヒト型結核菌（Ｍｔｂ）において原核生物のＦＧＥを機能的に同定する。前に論じたように、スルファターゼは、新規の同時翻訳または翻訳後誘導型補因子を利用して触媒作用を容易にし、活性部位ＦＧｌｙ残基を含有する酵素の広範囲のファミリーのメンバーである。ＦＧｌｙ残基はゲム−ジオールへの水和を経ると考えられ、その後ヒドロキシル基の１つが触媒的求核剤として作用して、硫酸エステルの切断を開始する（図７、パネルａ）。ＦＧｌｙ残基はスルファターゼコンセンサス配列内に位置し、これはスルファターゼファミリーの酵素を定義し、ライフサイクルのすべてのドメインを通じて高度に保存される（図７、パネルｂ）。ＦＧｌｙは真核生物スルファターゼではシステイン残基から形成されるが、原核生物スルファターゼでは、システイン（コアモチーフＣＸＰＸＲ内）またはセリン（ＳＸＰＸＲ）のいずれかがＦＧｌｙに酸化され得る。Ｍｔｂなどのいくつかの原核生物はシステイン型スルファターゼのみをコードし、一方他の種は、セリン型スルファターゼのみまたは両方の組合せを有する。
【０２１０】
実施例８〜９は、Ｍｔｂ由来の原核生物のＦＧＥの特徴付けを記載し、Ｓｔｒｅｐ由来のオルソログの構造を解明した。我々の試験は、ＦＧＥ活性化スルファターゼはＭｔｂ溶解物における全スルファターゼ活性の約半分を占めることを示し、この生物がいまだ同定されていないＦＧＥ非依存性スルファターゼを有することを示唆する。Ｍｔｂ（および他の原核生物）由来のスルファターゼの完全なレパートリーを定義することは重大な将来の目標であり、この生物のライフサイクルおよび発病におけるこれらの酵素の役割を定義するための基盤を与える。
【０２１１】
方法および材料
以下の方法および材料を、ヒト型結核菌（Ｍｔｂ）におけるＦＧＥの同定、およびＦＧＥ欠損Ｍｔｂ菌株の生成に関する実施例中で使用した。
【０２１２】
タンパク質発現ベクターの調製。以下の表は、以下の実施例中で使用したオリゴヌクレオチドを列挙する。ＭｔｂＦＧＥをコードする遺伝子（Ｒｖ０７１２、残基２〜２９９をコードする）はＭｔｂＨ３７ＲｖゲノムＤＮＡから増幅し、ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩ制限部位を使用したｐＥＴ１４ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ）にクローニングした。ＳｔｒｅｐＦＧＥをコードする遺伝子（ＳＣＯ７５４８、残基２〜３１４をコードする）はＳｔｒｅｐＡ３（２）ゲノムＤＮＡから増幅し、ｐＥＴ１５１／Ｄ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。オープンリーディングフレームＲｖ２４０７（残基２〜２７３をコードする）、Ｒｖ３４０６（残基２〜２９５をコードする）、およびＲｖ３７６２ｃ（残基２〜６２６をコードする）は、ＭｔｂＨ３７ＲｖゲノムＤＮＡから増幅した。Ｒｖ２４０７はＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩ制限部位を使用してｐＭＡＬ−Ｃ２Ｘ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）と連結させ、Ｒｖ３４０６とＲｖ３７６２ｃの両方は、ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩ制限部位を使用してｐＥＴ２８ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ）と連結させた。ＤＮＡの塩基配列決定を実施して、それぞれの遺伝子産物の忠実性を確認した。タンパク質コードプラスミドはＢＬ２１（ＤＥ３）細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換した。
【０２１３】
【表１】
2014221056.tif 000006
ａそれぞれのＦＧＥの開始コドンの最初から番号処理する。一対の相補的プライマーをそれぞれの突然変異体に使用した。逆相補配列は示さず、配列に対する変化に下線を引く。
【０２１４】
部位特異的突然変異誘発。ＭｔｂＦＧＥおよびＳｔｒｅｐＦＧＥにおける部位特異的突然変異を、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅＰＣＲ突然変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用してもたらした。ｐＥＴ１４ｂＭｔｂＦＧＥおよびｐＥＴ１５１ＳｔｒｅｐＦＧＥプラスミドおよび前の表からの適切なオリゴヌクレオチドを、突然変異誘発反応において使用した。突然変異はＤＮＡの塩基配列決定によって確認し、プラスミドは以下に記載するようにタンパク質発現用にＢＬ２１（ＤＥ３）細胞に形質転換した。
【０２１５】
タンパク質の発現および精製。Ｈｉｓ６タグ化タンパク質コードプラスミドを有するＢＬ２１（ＤＥ３）細胞のクローン集団を、ＯＤ６００＝０．５まで３７℃で振とうしながらアンピシリンまたはカナマイシンと共にＬＢ培地中でインキュベートし、その時点で温度は１８℃まで低下させ２５０μＭのＩＰＴＧを加えた。１２〜１６時間後、細胞を採取し、培養物１リットル当たり２０ｍｌの溶解バッファー（５０ｍＭのトリス、５００ｍＭのＮａＣｌ、１０％のグリセロール、２０ｍＭのイミダゾール、１ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭのＴＣＥＰ、１ｍＭのメチオニン、ｐＨ７．５）に再懸濁させ、超音波処理によって溶かした。細胞溶解物はＤＮａｓｅ（１０μｇ／ｍｌ）で処理し、遠心分離によって除去し、１ｍｌのＨｉｓＴｒａｐカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に施した。カラムは３５ｍＭのイミダゾールを含む溶解バッファーで洗浄し、Ｈｉｓ６タグタンパク質は２５０ｍＭのイミダゾールを含む溶解バッファーを使用して溶出させた。溶出体積は必要な場合２ｍｌ未満に濃縮し、Ｓｅｐｈａｄｅｘ１６／６０Ｓ３００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でさらに精製した。精製した組換えタンパク質は後に約２０ｍｇ／ｍｌに濃縮した。
【０２１６】
ＭｔｂおよびＳｔｒｅｐＦＧＥの同一性および純度は、エレクトロスプレーイオン化質量分析（Ｂｒｕｋｅｒ／Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｅｓｑｕｉｒｅ）によって評価した。Ｒｖ２４０７はＨｉｓ６タグ化形で溶けず、代わりにマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）と融合した。ＭＢＰ−Ｒｖ２４０７生成細胞に関する増殖および溶解条件は、溶解バッファー中のイミダゾールの不在以外は前と同じであった。除去した溶解物は溶解バッファー中でアミロース樹脂（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）に施し、さらなる溶解バッファー中で洗浄し、ＭＢＰ−Ｒｖ２４０７は１０ｍＭのマルトースを含む溶解バッファー中で溶出させ、およびその後濃縮した。それぞれ因子Ｘａ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）およびアミロース樹脂を使用して、Ｒｖ２４０７からＭＢＰを切断および除去した。
【０２１７】
ＳｔｒｅｐＦＧＥの結晶化。Ｍｔｂ、マイコバクテリウムスメグマティス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）およびトリ型結核菌由来のＦＧＥ相同体を結晶化するための試みは、タンパク質の不安定性のため成功しなかった。ＳｔｒｅｐＦＧＥは１０ｍＭのトリスｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、および１ｍＭのＴＣＥＰに透析した。Ｈｉｓ６タグ化ＳｔｒｅｐＦＧＥの結晶は、室温（ＲＴ）で１μｌの透析タンパク質と１μｌの結晶化溶液（１００ｍＭのトリスｐＨ８．０、２．４Ｍのギ酸アンモニウム、０．３％のβ−オクチルグルコシド、３．２％の２−ブタノール）を混合することによって蒸気拡散を使用して得た。結晶は２週間の間増大し、その後２０％グリセロールを含む結晶化溶液からなる抗凍結剤に移した。
【０２１８】
ＳｔｒｅｐＦＧＥ構造の決定。ＡＤＳＣ  Ｑｕａｎｔｕｍ−Ｑ３１５ＣＣＤ検出器を使用してＡｄｖａｎｃｅｄ  Ｌｉｇｈｔ  Ｓｏｕｒｃｅにおいて、ビームライン８．２．２でデータを収集した。回折データはＨＫＬ２０００（Ｏｔｗｉｎｏｗｓｋｉら、（１９９７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ：Ｍａｃｒｏｍｏｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  Ｐａｒｔ  Ａ  ２７６、３０７〜３２６）を使用して処理した。ＰＨＡＳＥＲ（Ｓｔｏｒｏｎｉら、（２００４）Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  Ｄ  Ｂｉｏｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  ６０、４３２〜８）において検索モデルとしてヒトＦＧＥ（ＰＤＢエントリー１Ｙ１Ｅ）を使用して、分子置換によって初期段階を決定した。非対称ユニットは、スペース群Ｐ３１２１中に５つのＳｔｒｅｐＦＧＥモノマーを含んでいた。モデル改善の初期段階は、ねじれ角動力学を用いたシミュレーテッドアニーリングおよびＣＮＳを使用した拘束Ｂ因子の改善（Ｂｒｕｎｇｅｒら、（１９９８）Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  Ｄ  Ｂｉｏｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  ５４、９０５〜２１）、次にＯ（Ｊｏｎｅｓら、（１９９１）Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  Ａ  ４７（Ｐｔ２）、１１０〜９）を使用した手作業によるモデルの改築のサイクルを含んでいた。改善の最終サイクルは、５ＴＬＳ群（非対称ユニット中の各ＦＧＥモノマーに対応する）を使用してＲＥＦＭＡＣ５（Ｍｕｒｓｈｕｄｏｖ（１９９７）Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  Ｄ  Ｂｉｏｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  ５３、２４０〜５５）で実施されたのと同様に、ＴＬＳ（Ｗｉｎｎら、（２００１）Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  Ｄ  Ｂｉｏｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  ５７、１２２〜３３）拘束によって実施した。水分子にＡＲＰ／ＷＡＲＰ（Ｌａｍｚｉｎら、（１９９３）Ａｃｔｓ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  Ｄ  Ｂｉｏｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  ４９、１２９〜４７）を加えた。最終モデルは、モノマーＡ中に残基１８〜３０５、モノマーＢ中に残基１９〜３０６、モノマーＣ中に残基２０〜３０６、モノマーＤ中に残基１９〜３０５、およびモノマーＥ中に残基１９〜３０７を含んでいた。最終ＲｗｏｒｋおよびＲｆｒｅｅ値は、それぞれ１９．５％および２３．３％であった。データ収集および処理の統計値は、以下の表中に要約する。すべての数字はＰｙＭＯＬ（ｗｗｗ．ｐｙｍｏｌ．ｏｒｇ）で得た。
【０２１９】
【表２】
2014221056.tif 000007
ａ括弧内の値は最高分解能範囲に対応する。
ｂＲｓｙｍ＝１００＊ΣｈΣ｜ｌｉ（ｈ）−＜ｌ（ｈ）＞｜／、ΣｈΣｉΣｌｉ（ｈ）、前式でｌｉ（ｈ）は反射ｈのｉ番目の測定値であり、＜ｌ（ｈ）＞は反射強度の平均値である。
ｃＲｗｏｒｋ＝１００＊Σ｜｜Ｆｏｂｓ｜−｜Ｆｃａｌｃ｜｜／｜Ｆｏｂｓ｜、前式でＦｏｂｓおよびＦｃａｌｃは、それぞれデータおよびモデルからの構造増幅係数である。Ｒｆｒｅｅは改善を通じて得たＲｗｏｒｋおよび５％の反射率である。
ｄ数字は、それぞれ好ましい、許容される、大いに許容されるおよび許容されない領域中のアミノ酸残基の割合に対応する。ＰＲＯＣＨＥＣＫ３９を使用して計算した。
ｅ結晶充填接触（モノマーＡおよびＣ中のＴｙｒ２１９）または水素結合相互作用（モノマーＡ〜Ｅ中のＡｓｎ２３２）により立体化学的に制約された立体配座において７個の残基を観察した。
【０２２０】
ＦＧＥ活性アッセイ。ＭｔｂおよびＳｔｒｅｐ由来の野生型および突然変異ＦＧＥを、前に記載したように精製した。ペプチド基質は標準的なＦｍｏｃ固相合成法によって合成し、これは１３残基の配列ＬＣＳＰＳＲＧＳＬＦＴＧＲ、スルファターゼコンセンサスモチーフからなっていた。Ｎ末端をアセチル化し、Ｃ末端はアミド化し、配列は質量分析法によって確認した。アッセイ条件は、Ｄｉｅｒｋｓら、ｉｎ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ＦＧＥ（Ｄｉｅｒｋｓら、（２００３）Ｃｅｌｌ  １１３、４３５〜４）によって以前に報告された条件と同様であった。嫌気性実験は、酸素捕捉ガスマニホルドを使用して溶液を嫌気性にし、嫌気性グローブボックス中で基質と酵素を混合することにより反応を開始したこと以外、同じ形式で実施した。ＥＤＴＡは１００ｍＭの濃度で適切な反応に加えた。ＦＧｌｙ形成の確認は、室温で３０分間１μｌの脱塩生成物および１μｌの５ｍＭのビオチンヒドラジド（Ｓｉｇｍａ）をインキュベートすることによって実施した。サンプルはマトリクス溶液（１０ｍｇ／ｍｌのα−シアノ−４−ヒドロキシ−桂皮酸および２ｍＭのクエン酸アンモニウム）と１：１（ｖ／ｖ）で混合し、マトリクス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型質量分析（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｖｏｙａｇｅｒ  ＤＥ  Ｐｒｏ）によって分析した。
【０２２１】
金属の検出。多元素の標準溶液をＣａ、Ｃｕ、Ｆｅ、Ｍｎ、Ｍｇ、およびＺｎのＩＣＰ標準（Ｓｉｇｍａ）の適切な希釈によって調製した。ＭｔｂおよびＳｔｒｅｐＦＧＥの金属含有量は、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｏｐｔｉｍａ  ３０００ＤＶを使用してＩＣＰ−ＡＥＳによって分析した。ＳｔｒｅｐＦＧＥ中のＦｅ、ＣｕおよびＺｎの不在を、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｌｉｇｈｔ  Ｓｏｕｒｃｅでビームライン８．３．１において確認した。これらの金属の吸収端は、二結晶モノクロメーターおよびビームラインのｘ線蛍光検出器を使用して調べた。
【０２２２】
ＭｔｂＦＧＥ欠損菌株の生成。ＦＧＥコードオープンリーディングフレームＲｖ０７１２の無印の、インフレーム遺伝子欠失を、対立遺伝子の置換（Ｐａｒｉｓｈら、（２０００）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４６（Ｐｔ８）、１９６９〜７５）を使用してＭｔｂＨ３７Ｒｖにおいて作成した。Ｒｖ０７１２の２ｋｂ領域上流を増幅し、ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位とＸｂａＩ制限部位の間のマイコバクテリア送達ベクターｐ２ＮＩＬＸ中に挿入した。ｐ２ＮＩＬＸはｐＮＩＬ（Ｐａｒｉｓｈら、（２０００）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４６（Ｐｔ８）、１９６９〜７５）に由来し、ＫｐｎＩ制限部位とＮｏｔＩ制限部位の間にＸｂａＩ制限部位を加えることによって修飾する。Ｒｖ０７１２の２ｋｂ領域下流を増幅し、ＸｂａＩ制限部位とＰａｃＩ制限部位の間のｐ２ＮＩＬＸ中に挿入した。選択マーカーｌａｃＺおよびｓａｃＢはｐＧＯＡＬ１７から消化し、ＰａｃＩ制限部位を使用してｐ２ＮＩＬＸに連結させた。以前に記載されたように（Ｈａｔｆｕｌｌ、Ｇ．Ｆ．＆  Ｊａｃｏｂｓ、Ｗ．Ｒ．Ｊ．（編）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ（ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ、ワシントンＤ．Ｃ．、２０００））、完全送達ベクターはＵＶ光で処理し（１２０ｍＪ  ｃｍ−２）、エレクトロコンピテントＭｔｂＨ３７Ｒｖにエレクトロポレーションした。突然変異体の選択は以前に記載されたように実施し（Ｐａｒｉｓｈら、（２０００）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４６（Ｐｔ８）、１９６９〜７５）、遺伝子型はサザン分析によって確認した（図９）。グルタミンシンターゼプロモーターの制御下において、完全Ｒｖ０７１２オープンリーディングフレームを含む組込みベクターｐＭＶ３０６．ｋａｎでΔｆｇｅ菌株を形質転換することによって、相補型菌株を生成した。
【０２２３】
スルファターゼ／ホスファターゼアッセイ。ＯＤ６００＝１．０まで３７℃で、ＡＤＣ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を補充した７Ｈ９培地中でＭｔｂＨ３７Ｒｖ菌株を増殖させた。細胞は０．１ｍｍのジルコニアビーズ（ＦａｓｔＰｒｅｐ、ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）を使用した機械的破壊によって溶解し、粗製溶解物は遠心分離によって除去し、０．２２μｍの膜を介して濾過した。除去した溶解物サンプルは全体のタンパク質濃度に関して標準化し（Ｂｉｏｒａｄ  ＡＣ／ＤＣタンパク質アッセイキット）、５０μｇの溶解タンパク質を、バッファー（５０ｍＭのトリスｐＨ７．５、５００ｍＭのＮａＣｌ、１００μＭのＭｇＣｌ２、１００μＭのＭｎＣｌ２、１００μＭのＣａＣｌ２）、プロテアーゼ阻害剤（プロテアーゼ阻害剤カクテルセットＩＩＩ、ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、および８ｍＭの４−メチルウンベリフェリル硫酸（４ＭＵＳ）に加えた。カサガイのスルファターゼ（Ｓｉｇｍａ）は、１μｇ／ｍｌの最終濃度で陽性対照として使用した。反応は３７℃で３時間インキュベートし、４体積の０．５ＭのＮａ２ＣＯ３／ＮａＨＣＯ３ｐＨ１０．５を加えることによって停止した。それぞれ３６０ｎｍおよび４６０ｎｍの励起波長および発光波長を使用して、蛍光光度計（Ｇｅｍｉｎｉ  ＸＬ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用してスルファターゼ活性を測定した。スルファターゼ／ホスファターゼ阻害剤は製造者の説明書に従い使用し、マイクロシスチン、カンタリジン、ｐ−ブロモテトラミゾール、バナジウム酸ナトリウム、モリブデン酸ナトリウム、酒石酸ナトリウム、およびイミダゾール（ホスファターゼ阻害剤カクテル１および２、Ｓｉｇｍａ）を含んでいた。組換えＲｖ２４０７、Ｒｖ３４０６およびＲｖ３７６２ｃのスルファターゼ活性は、１ｍＭのα−ケトグルタレート、２００μＭのアスコルベートおよび１００μＭのＦｅＣｌ２をバッファーに加えることによって、前に述べたのと同じ条件を使用して測定した。ホスファターゼ活性は、４−メチルウンベリフェリルリン酸を４ＭＵＳに置き換えたこと以外は、前に記載したのと同様にモニタリングした。
【０２２４】
ＮＢＤ標識。Ｈｉｓ６タグ化ＳｔｒｅｐＦＧＥを１：５０（ｗ／ｗ）ＴＥＶプロテアーゼで処理し、ＮＢＤ標識および質量分光分析前にＮ末端Ｈｉｓ６タグを除去した。ＳｔｒｅｐＦＧＥ（４５μＭ）は、室温で３０分間、バッファー（２５ｍＭのリン酸カリウムｐＨ７．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ）および１ｍＭの４−クロロ−７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール（ＮＢＤ−Ｃｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中でインキュベートした（Ｅｌｌｉｓら、（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３６、１５０１３〜８）。サンプルはＣ１８逆相クロマトグラフィーによって脱塩し、タンパク質−ＮＢＤ付加物は、質量分析法（Ｂｒｕｋｅｒ／Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｅｓｑｕｉｒｅ）によって検出した。ＮＢＤ付加物のマッピングは、ＮＢＤ反応ＳｔｒｅｐＦＧＥを１：５０（ｗ／ｗ）トリプシンで消化し、Ｃ１８逆相クロマトグラフィーによって脱塩し、およびエレクトロスプレーイオン化フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析法（Ｂｒｕｋｅｒ９．４Ｔ  ＡｐｅｘＩＩＩ）を使用して生成したペプチド断片を分析することによって実施した。
【０２２５】
実施例１３：ヒト型結核菌のＦＧＥの同定およびクローニング
ヒト型結核菌（Ｍｔｂ）Ｈ３７ＲｖオープンリーディングフレームＲｖ０７１２は、ＢＬＡＳＴ分析（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２５、３３８９〜４０２）によって、ヒトＦＧＥＳＵＭＦ１（Ｃｏｓｍａら、（２００３）Ｃｅｌｌ  １１３、４４５〜５６（２００３）；Ｄｉｅｒｋｓら、（２００３）Ｃｅｌｌ  １１３、４３５〜４４）と３０％を超えて同一であることが確認された。質量分析によって決定したように、組換えＲｖ０７１２はスルファターゼモチーフを含む合成ペプチドを修飾することができた（図８、パネルａ）。基質内のＦＧｌｙの存在は、ビオチンヒドラジドで修飾ペプチドを処理することによって確認し、これはヒドラゾン形成によってペプチドと共有結合付加物を形成した（図８、パネルｂ）。これらのデータを一緒にして、ＭｔｂのＦＧＥとしてＲｖ０７１２を示す。
【０２２６】
ヒトゲノムと同様に、ＭｔｂゲノムはＦＧＥのただ１つの機能的コピーをコードしているようである。したがって、ＭｔｂにおけるＲｖ０７１２の破壊はスルファターゼ欠損菌株をもたらすと予想した。Ｒｖ０７１２は相同的組換えを使用してＭｔｂＨ３７Ｒｖにおいて破壊し、サザン分析によって確認した（図９）。ΔｆｇｅＭｔｂは生命力があり、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで明らかな増殖欠陥は示さなかった。
【０２２７】
Δｆｇｅ菌株のスルファターゼ活性を、野生型（ＷＴ）Ｈ３７Ｒｖの活性、およびＦＧＥ発現が相補性によって修復されたΔｆｇｅ突然変異体の活性と比較した。粗製溶解物をこの３つのＭｔｂ菌株から生成し、全体的なスルファターゼ活性は、一般的基質４−メチルウンベリフェリル硫酸（４ＭＵＳ）を使用して決定した。Δｆｇｅ菌株は、相当な、ただし驚くほど不完全なスルファターゼ活性の消失を示した（図８、パネルｃ）。残留スルファターゼ活性は４ＭＵＳに作用するホスファターゼから生じたと考えることは可能であったかもしれないが、広範囲のスルファターゼ／ホスファターゼ阻害剤のカクテルの存在下でスルファターゼ活性をモニタリングしたとき、Δｆｇｅは影響を受けなかった。実際、野生型および相補型Δｆｇｅ由来の溶解物における活性は、阻害剤カクテルの存在下で約４０％低下し、阻害剤の不在下でのΔｆｇｅのスルファターゼ活性と一致した（図８、パネルｃ）。これらの施用した阻害剤はＦＧＥ活性化スルファターゼを阻害することが知られているので、（Ｓｔａｎｋｉｅｗｉｃｚら、（１９８８）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７、２０６〜１２）、これらのデータはＭｔｂがＦＧＥ非依存性スルファターゼを有することを示唆する。
【０２２８】
雑多のホスファターゼが残留スルファターゼ活性を担っていたわけではないことをさらに検証するために、それぞれの菌株由来の粗製溶解物のホスファターゼ活性を、４−メチルウンベリフェリルリン酸を使用してモニタリングした。全３個の菌株が阻害剤の不在下で同じレベルのホスファターゼ活性を示したが、阻害剤の存在下ではすべての菌株において活性は無効であった（図８、パネルｄ）。これらのデータは、ホスファターゼはΔｆｇｅ菌株において観察した残留４ＭＵＳの加水分解活性の原因ではないこと、およびＦＧＥ活性化スルファターゼはＭｔｂ溶解物における全スルファターゼ活性の約４０％を担うことをさらに示す。
【０２２９】
ＭｔｂゲノムをＦＧＥ非依存性スルファターゼ活性の考えられる供給源に関して検索した。大部分の既知または推定の原核生物スルファターゼは、真核生物スルファターゼと相同であり、スルファターゼモチーフを含む。しかしながら、いくつかの原核生物は、ＦＧｌｙを必要とせずおそらく異なる機構によって作用するＦＧＥ非依存性スルファターゼも有する。これらの酵素は広範囲のスルファターゼ／ホスファターゼ阻害剤に感受性がない可能性がある。ＦＧＥ非依存性スルファターゼはＦＧＥ活性化スルファターゼと相同ではなく、２つの酵素ファミリー、メタロ−β−ラクタマーゼおよびＦｅ（ＩＩ）α−ケトグルタレート依存性ジオキシゲナーゼ１８〜２０の１つに分類されている。他の原核生物由来の既知のＦＧＥ非依存性スルファターゼとの配列類似性に基づくと、ＭｔｂはオープンリーディングフレームＲｖ２４０７、Ｒｖ３４０６およびＲｖ３７６２ｃによってコードされる少なくとも３つの推定ＦＧＥ非依存性スルファターゼを有する。組換え型のＲｖ２４０７、Ｒｖ３４０６およびＲｖ３７６２ｃは大腸菌において発現されたが、精製タンパク質は４ＭＵＳアッセイにおいて活性を示さず、これらの推定スルファターゼはおそらくΔｆｇｅＭｔｂにおける残留スルファターゼ活性を担っていないことが示される（図１０）。ＦＧＥ非依存性スルファターゼ間の配列類似性の欠如を考慮すると、ＭｔｂはＢＬＡＳＴ分析によって検出不能な他のスルファターゼを有する可能性がある。
【０２３０】
実施例１４：ＭＴＢＦＧＥの構造
原核生物ＦＧＥの特有の酵素機構および基質結合特性をさらに理解するために、ストレプトミセスコエリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）（Ｓｔｒｅｐ）由来のＭｔｂＦＧＥオルソログの構造を、２．１Åの分解能まで決定した。細菌ＦＧＥの全体的なトポロジーは、近年決定されたヒトＦＧＥの構造と著しく類似している（Ｄｉｅｒｋｓら、（２００５）Ｃｅｌｌ  １２１、５４１〜５２）。（図１１Ａ）。ヒトＦＧＥと同様に、ＳｔｒｅｐＦＧＥは低い二次構造含有率を有し、１６％のα−らせんおよび１２％のβ−シートを含む。いずれも新規の「ＦＧＥフォールディング」を共有するが、配位構造および融合結合プラズマ原子発光分析（ＩＣＰ−ＡＥＳ）により決定したように、ＳｔｒｅｐＦＧＥ変異体はただ１つのＣａ２＋イオンを含む（図１２）。ヒト変異体は２つのＣａ２＋イオンによって安定化し、この違いは明らかに適切な配位環境を破壊するＳｔｒｅｐＦＧＥにおけるＧｌｕ６６Ａｌａ置換によるものである（図３、パネルｂ）。ＩＣＰ−ＡＥＳデータはＭｔｂＦＧＥが２つのＣａ２＋イオンを欠くことを示し（図１２）、ＦＧＥフォールディングは二価カチオンによる安定化を必要としないことを示唆する。
【０２３１】
原核生物ＦＧＥとヒトＦＧＥの活性部位は著しく類似している。いずれも長さ約２０Å、幅１２Å、および深さ１０Åであり、スルファターゼモチーフを画定する１３個のアミノ酸のわずか６個を収容し得る。スルファターゼモチーフがコアコンセンサス配列（ＣＸＰＸＲ）を越えて他の８残基のペプチド基質のＣ末端に延長することを考慮すると（図７、パネルｂ）、トロンビンおよびボツリヌス神経毒素などの他のタンパク質と同様に、ＦＧＥは基質認識に役立つ二次結合領域が発達していると考えられる（Ｈａｇｅｍａｎら、（１９７４）Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  １６４：７０７〜１５；Ｂｒｅｉｄｅｎｂａｃｈら、（２００４）Ｎａｔｕｒｅ  ４３２：９２５〜９）。実際、Ｓｔｒｅｐ、Ｍｔｂ、ヒトおよび他の推定ＦＧＥの間の保存残基をＳｔｒｅｐＦＧＥ分子の表面にマッピングすると、スルファターゼモチーフのＣ末端部分がおそらく結合し得る高保存領域を観察する（図１１Ｃ）。
【０２３２】
ＦＧＥは、その活性部位内の２つの保存システイン残基を使用して、アルデヒドへのチオールの酸化を触媒すると考えられている（Ｄｉｅｒｋｓら、（２００５）Ｃｅｌｌ  １２１、５４１〜５２；Ｒｏｅｓｅｒら、（２００６）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０３、８１〜６）。Ｍｔｂ（Ｃｙｓ２６３およびＣｙｓ２６８）およびＳｔｒｅｐＦＧＥ（Ｃｙｓ２７２およびＣｙｓ２７７）におけるこれらのシステインは基質の代謝回転に必要とされる、何故ならセリン突然変異体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＦＧｌｙを生成することができなかったからである（図８、パネルａ、図１３、パネルｃ、ｈ、ｉ）。興味深いことに、これらの残基の酸化状態は非対称ユニット内の５個のモノマー間で異なる。省略マップは、Ｃｙｓ２７２およびＣｙｓ２７７が、非対称ユニット内の５個のＳｔｒｅｐＦＧＥモノマーの３個中の一部分のジスルフィドに関与していたことを示した（図１１Ｄおよび１１Ｅ、およびデータ示さず）。これらの一部分のジスルフィドの生化学的確認は、チオール標識試薬４−クロロ−７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール（ＮＢＤ）で天然ＳｔｒｅｐＦＧＥの３個の溶媒露出システインを処理することによって得た。１個または３個のＮＢＤ付加物を伴うＳｔｒｅｐＦＧＥに対応する２つの別個の集団は、完全タンパク質の質量分析によって検出し（図１４）、この２つの隣接システインの約三分の一がジスルフィド結合で連結していることを確認した。
【０２３３】
２つの活性部位のシステイン以外に、ＳｔｒｅｐおよびＭｔｂＦＧＥは触媒作用のための分子酸素も必要とする、何故なら嫌気環境で実施した反応においてＦＧｌｙ形成は観察されなかったからである（図１３、パネルｅ、およびデータ示さず）。オキシゲナーゼファミリーのメンバーとして、ＦＧＥはＦｅまたはＣｕなどの遷移金属、あるいは分子酸素の活性化用のＦＡＤＨなどの有機補因子を含有すると予想することができる。しかしながら、ＩＣＰ−ＡＥＳおよびｘ線吸収端スキャニングによる分析は、活性ＭｔｂおよびＳｔｒｅｐＦＧＥはすべての酸化還元活性金属を欠くことを示した（図１２およびデータ示さず）。さらに、これらのＦＧＥはｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイで機能するために金属の添加を必要とせず、ＥＤＴＡの存在下で機能することができる（図１３、パネルｂ、ｇ）。同様に、ＵＶ可視吸収分光法は、色素体の有機補因子の存在を明らかにしなかった（データ示さず）。ＳｔｒｅｐＦＧＥに関する電子密度情報と一緒にして、これらのデータは、ヒトＦＧＥと同様に原核生物ＦＧＥは、触媒作用のために外因性補因子を使用しないことを示す。
【０２３４】
分子酸素を活性化する代替手段として、ＦＧＥは他の補因子のないオキシゲナーゼと同様に機能することができ、従来の残基を独自に利用することができる２５。ＳｔｒｅｐＦＧＥの触媒システイン対からの反応距離内の絶対的に保存された残基には、Ｔｒｐ２３４およびＳｅｒ２６９がある。Ｒｏｅｓｅｒらは、触媒抗体によるＯ２還元の提案された機構２６と同様に、Ｔｒｐ２３４が機能して分子酸素を活性化することができると理論立てしている（Ｒｏｅｓｅｒら、（２００６）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０３：８１〜６）。しかしながら、ＰｈｅへのＴｒｐ２３４の突然変異は活性を無効にせず（図１３、パネルｊ）、分子酸素の活性化は他の経路によって達成されるに違いないことが示された。ＭｔｂＦＧＥにおけるＳｅｒ２６９Ａｌａの同等の突然変異（Ｓｅｒ２６０Ａｌａ）によって活性は大幅に低下したが（図１３、パネルｄ）、この残基がＦＧＥの触媒サイクルにおいてどのように役割を果たしているかは現在知られていない。
【０２３５】
興味深いことに、Ｃｙｓ２７２自体が分子酸素の活性化と関係がある可能性がある。ＳｔｒｅｐＦＧＥの非対称ユニット内の全５個のモデル化Ｃｙｓ２７２残基は、その代替的な、非ジスルフィド結合立体配座から広がる余剰の電子密度を有する。省略マップは、この余剰の密度は部分占有がある１つの水分子またはヒドロペルオキシド部分としてモデル化することができたことを示す（図１３、パネルｄ、ｅ）。Ｃｙｓ２７７ＳｅｒＳｔｒｅｐＦＧＥ突然変異体を使用したＮＢＤ標識実験は、Ｃｙｓ２７２は酵素分子の亜集団における反応チオールではないことを示し（図１５）、余剰の密度はヒドロペルオキシドなどのＣｙｓ２７２と共有結合した部分に対応することを示唆する。ヒトＦＧＥの以前に公開された構造も、この余剰の密度は結合水分子と組合せたヒドロペルオキシドまたはシステインスルフェン酸であり得ることを示唆している２１。しかしながら、後者はＳｔｒｅｐＦＧＥにおいて観察した電子密度とあまり適合しない。さらに、ＳｔｒｅｐＦＧＥをＮＢＤ−塩化物で処理したとき、スルフェン酸は検出されなかった（図１５および図１４）。部分占有でモデル化したヒドロペルオキシドの存在を、ＳｔｒｅｐＦＧＥの観察した電子密度に基づいて除外することはできない。しかしながら、完全ＳｔｒｅｐおよびＭｔｂＦＧＥの質量スペクトル分析は質量異常を明らかにせず（図１６およびデータ示さず）、Ｃｙｓ２７２が修飾される場合、その修飾は一時的または酸不安定であることを示唆した。
【０２３６】
実施形態
１．  ポリペプチドを修飾するための方法であって、
変換型スルファターゼモチーフを含むポリペプチドを、対象とする部分を含む反応パートナーと接触させること
を含み、変換型スルファターゼモチーフが
Ｘ１（ＦＧｌｙ）Ｘ２Ｚ２Ｘ３Ｒ          （Ｉ）
［上式で
ＦＧｌｙがホルミルグリシン残基であり、
Ｚ２がプロリンまたはアラニン残基であり、
Ｘ１が存在するかまたは存在せず、存在するときは任意のアミノ酸であり、ただし異種スルファターゼモチーフがポリペプチドのＮ末端に存在するとき、Ｘ１が存在し、
Ｘ２とＸ３がそれぞれ独立に任意のアミノ酸である］を含み、
前記接触が、反応パートナーの対象とする部分をポリペプチドのＦＧｌｙと結合するのに十分な条件下で起こり、それによって修飾型ポリペプチドが生成される方法。
２．  スルファターゼモチーフが異種スルファターゼモチーフである、実施形態１に記載の方法。
３．  ＦＧｌｙ残基がポリペプチドの内部配列に位置する、実施形態１に記載の方法。
４．  ＦＧｌｙ残基がポリペプチドの末端ループ、Ｃ末端、またはＮ末端に位置する、実施形態１に記載の方法。
５．  ＦＧｌｙ残基がフォールディング時にポリペプチドの溶媒接触可能領域に存在する、実施形態１に記載の方法。
６．  ＦＧｌｙ残基がポリペプチドの翻訳後修飾部位に存在する、実施形態１に記載の方法。
７．  翻訳後修飾部位がグリコシル化部位である、実施形態６に記載の方法。
８．  １つまたは複数の非天然翻訳後修飾部位を含むように標的ポリペプチドを工学的に作製し、異種スルファターゼモチーフが前記１つまたは複数の非天然翻訳後修飾部位に位置する、実施形態７に記載の方法。
９．  存在するときにはＸ１、Ｘ２、およびＸ３がそれぞれ独立に脂肪族アミノ酸、イオウ含有アミノ酸、または極性、非荷電アミノ酸である、実施形態１に記載の方法。
１０．  存在するときにはＸ１が、Ｌ、Ｍ、Ｖ、ＳまたはＴである、実施形態１に記載の方法。
１１．  Ｘ２およびＸ３がそれぞれ独立にＳ、Ｔ、Ａ、Ｖ、ＧまたはＣである、実施形態１に記載の方法。
１２．  ポリペプチド中でホルミルグリシンを生成するための方法であって、
異種スルファターゼモチーフを含むポリペプチドをホルミルグリシン生成酵素（ＦＧＥ）と接触させることを含み、異種スルファターゼモチーフが、式：
Ｘ１Ｚ１Ｘ２Ｚ２Ｘ３Ｒ          （Ｉ）
［上式で
Ｚ１がシステインまたはセリンであり、
Ｚ２がプロリンまたはアラニン残基であり、
Ｘ１が存在するかまたは存在せず、かつ存在するときは任意のアミノ酸であり、ただし異種スルファターゼモチーフがポリペプチドのＮ末端に存在するとき、Ｘ１が存在し、
Ｘ２とＸ３がそれぞれ独立に任意のアミノ酸である］を含み、かつ
ポリペプチドが以下の性質：
異種スルファターゼモチーフが１６アミノ酸残基長未満である、
異種スルファターゼモチーフがポリペプチドのＮ末端に位置する、
異種スルファターゼモチーフがポリペプチドに固有のアミノ酸配列の内部部位に位置する、
異種スルファターゼモチーフがポリペプチドの末端ループに位置する、
異種スルファターゼモチーフがポリペプチドの翻訳後修飾部位に位置する、
ポリペプチドが完全長ポリペプチドである、
ポリペプチドがプレプロラクチンポリペプチド、プロラクチンポリペプチド、またはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼポリペプチド以外である
の少なくとも１つを有し、
前記接触が、ポリペプチド中でＺ１をホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）残基に変換するのに十分な条件下で起こり、変換型アルデヒドタグ化ポリペプチドを生成する方法。
１３．  異種スルファターゼモチーフが１６アミノ酸残基長未満であり、ポリペプチドのＣ末端に位置する、実施形態１２に記載の方法。
１４．  異種スルファターゼモチーフがポリペプチドの末端ループ中の内部部位に存在する、実施形態１２に記載の方法。
１５．  ポリペプチドが膜貫通型タンパク質であり、異種スルファターゼモチーフが細胞外ループまたは細胞内ループ内の内部部位に存在する、実施形態１２に記載の方法。
１６．  異種スルファターゼモチーフが内部部位またはＮ末端に存在し、ポリペプチドがフォールディングするときに溶媒接触可能である、実施形態１２に記載の方法。
１７．  異種スルファターゼモチーフが、グリコシル化部位である翻訳後修飾部位に存在する、実施形態１２に記載の方法。
１８．  １つまたは複数の非天然翻訳後修飾部位を含むように標的ポリペプチドを工学的に作製し、異種スルファターゼモチーフが前記１つまたは複数の非天然翻訳後修飾部位に位置する、実施形態１７に記載の方法。
１９．  存在するときにはＸ１、Ｘ２、およびＸ３がそれぞれ独立に脂肪族アミノ酸、イオウ含有アミノ酸、または極性、非荷電アミノ酸である、実施形態１に記載の方法。
２０．  存在するときにはＸ１が、Ｌ、Ｍ、Ｖ、ＳまたはＴである、実施形態１２に記載の方法。
２１．  Ｘ２およびＸ３がそれぞれ独立にＳ、Ｔ、Ａ、Ｖ、ＧまたはＣである、実施形態１２に記載の方法。
２２．  ＦＧＥを含有する細胞中でポリペプチドが発現される、実施形態１２に記載の方法。
２３．  変換型アルデヒドタグ化ポリペプチドを、対象とする部分を含む反応パートナーと接触させることをさらに含み、
前記接触が、異種スルファターゼモチーフのＦＧｌｙ残基と共有結合した対象とする部分を有する修飾型アルデヒドタグ化ポリペプチドの反応生成物が生成するのに十分な条件下で起こる、実施形態１２に記載の方法。
２４．  対象とする部分が水溶性ポリマー、検出可能な標識、薬剤、または膜中もしくは表面上におけるポリペプチドの固定化用部分である、実施形態２３に記載の方法。
２５．  実施形態１２に記載の方法によって生成される変換型アルデヒドタグ化ポリペプチド。
２６．  実施形態１に記載の方法によって生成される修飾型アルデヒドタグ化ポリペプチド。
２７．ホルミルグリシン生成酵素（ＦＧＥ）を有する異種スルファターゼモチーフを含むポリペプチドであって、異種スルファターゼモチーフが、式：
Ｘ１（ＦＧｌｙ）Ｘ２Ｚ２Ｘ３Ｒ          （Ｉ）
［上式で
ＦＧｌｙがホルミルグリシン残基であり、
Ｚ２がプロリンまたはアラニン残基であり、
Ｘ１が存在するかまたは存在せず、存在するときは任意のアミノ酸であり、ただし異種スルファターゼモチーフがアルデヒドタグ化ポリペプチドのＮ末端に存在するとき、Ｘ１が存在し、
Ｘ２とＸ３がそれぞれ独立に任意のアミノ酸である］を含み、
以下の性質：
異種スルファターゼモチーフが１６アミノ酸残基長未満である、
異種スルファターゼモチーフがポリペプチドのＮ末端に位置する、
異種スルファターゼモチーフがポリペプチドに固有のアミノ酸配列の内部部位に位置する、
異種スルファターゼモチーフがポリペプチドの末端ループに位置する、
異種スルファターゼモチーフがポリペプチドの翻訳後修飾部位に位置する、
ポリペプチドが完全長ポリペプチドである、または
ポリペプチドがプレプロラクチンポリペプチド、プロラクチンポリペプチド、またはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼポリペプチド以外である
の少なくとも１つを有するポリペプチド。
２８．  異種スルファターゼモチーフが１６アミノ酸残基長未満であり、ポリペプチドのＣ末端に位置する、実施形態２７に記載のポリペプチド。
２９．  異種スルファターゼモチーフがポリペプチドの末端ループ中に存在する、実施形態２７に記載のポリペプチド。
３０．  ポリペプチドが膜貫通型タンパク質であり、異種スルファターゼモチーフが細胞外ループまたは細胞内ループ内の内部部位に存在する、実施形態２７に記載のポリペプチド。
３１．  異種スルファターゼモチーフがポリペプチドの内部部位またはＮ末端に存在し、ポリペプチドがフォールディングするときに溶媒接触可能である、実施形態２７に記載のポリペプチド。
３２．  異種スルファターゼモチーフが、グリコシル化部位である翻訳後修飾部位に存在する、実施形態２７に記載のポリペプチド。
３３  ポリペプチドを工学処理して１つまたは複数の非天然翻訳後修飾部位を封入し、かつ異種スルファターゼモチーフが前記１つまたは複数の非天然翻訳後修飾部位に位置する、実施形態３２に記載のポリペプチド。
３４．  存在するときにはＸ１が、Ｌ、Ｍ、Ｖ、ＳまたはＴである、実施形態２７に記載のポリペプチド。
３５．  Ｘ２およびＸ３がそれぞれ独立にＳ、Ｔ、Ａ、Ｖ、ＧまたはＣであるが、
通常は脂肪族アミノ酸、イオウ含有アミノ酸、または極性、非荷電アミノ酸（すなわち、芳香族アミノ酸または荷電アミノ酸以外）である、実施形態２７に記載のポリペプチド。
３６．  実施形態２７に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子。
３７．  実施形態３６に記載の核酸分子を含有するベクター。
３８．  実施形態３６に記載の核酸分子を含有する組換え宿主細胞。
３９．  対象とする部分と共有結合したホルミルグリシン残基を含む修飾型ポリペプチドであって、式Ｘ１（ＦＧｌｙ’）Ｘ２Ｚ２Ｘ３Ｒ（Ｉ）の修飾型スルファターゼモチーフ
［上式で
ＦＧｌｙ’が異種の共有結合部分を有するホルミルグリシン残基であり、
Ｚ２がプロリンまたはアラニン残基であり、
Ｘ１が存在するかまたは存在せず、存在するときは任意のアミノ酸であり、ただし異種スルファターゼモチーフがポリペプチドのＮ末端に存在するとき、Ｘ１が存在し、
Ｘ２とＸ３がそれぞれ独立に任意のアミノ酸である］を含む、修飾型ポリペプチド。
４０．  前記部分が水溶性ポリマー、検出可能な標識、薬剤、または膜中もしくは表面上におけるポリペプチドの固定化用部分である、実施形態３９に記載の修飾型ポリペプチド。
４１．  修飾型スルファターゼモチーフが修飾型ポリペプチド中、修飾型ポリペプチドの親の翻訳後修飾部位に位置する、実施形態３９に記載の修飾型ポリペプチド。
４２．  翻訳後修飾部位がグリコシル化部位である、実施形態３９に記載の修飾型ポリペプチド。
４３．  親ポリペプチドを工学処理して１つまたは複数の非天然翻訳後修飾部位を封入し、かつ修飾型スルファターゼモチーフが前記１つまたは複数の非天然翻訳後修飾部位に位置する、実施形態４２に記載の修飾型ポリペプチド。
４４．  アルデヒドタグコード配列を含む第１の核酸、および
アルデヒドタグコード配列の５’または３’に位置する制限部位であって、対象とするポリペプチドをコードする第２の核酸の挿入をもたらす制限部位
を含む発現カセットと、
発現カセットと作動可能に連結して、制限部位への対象とするポリペプチドをコードする第２の核酸の挿入によって生成するアルデヒドタグ化ポリペプチドの発現をもたらすプロモーターとを含む組換え核酸。
４５．  単離ヒト型結核菌のホルミルグリシン生成酵素（ＦＧＥ）と、式：
Ｘ１Ｚ１Ｘ２Ｚ２Ｘ３Ｒ          （Ｉ）
［上式で
Ｚ１がシステインまたはセリンであり、
Ｚ２がプロリンまたはアラニン残基であり、
Ｘ１が存在するかまたは存在せず、存在するときは任意のアミノ酸であり、ただし異種スルファターゼモチーフがポリペプチドのＮ末端に存在するとき、Ｘ１が存在し、
Ｘ２とＸ３がそれぞれ独立に任意のアミノ酸である］の異種スルファターゼモチーフを含むポリペプチドとを含む反応混合物。
【図１Ａ】
2014221056.tif 000008
【図１Ｂ】
2014221056.tif 000009
【図２】
2014221056.tif 000010
【図３】
2014221056.tif 000011
【図４】
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【図５】
2014221056.tif 000013
【図６】
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【図７】
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【図８】
2014221056.tif 000016
【図９】
2014221056.tif 000017
【図１０】
2014221056.tif 000018
【図１１ＡＢ】
2014221056.tif 000019
【図１１Ｃ】
2014221056.tif 000020
【図１１ＤＥ】
2014221056.tif 000021
【図１２】
2014221056.tif 000022
【図１３】
2014221056.tif 000023
【図１４】
2014221056.tif 000024
【図１５】
2014221056.tif 000025
【図１６】
2014221056.tif 000026
【図１７】
2014221056.tif 000027
【図１８】
2014221056.tif 000028
【図１９】
2014221056.tif 000029
【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
2014221056.tif 000032
【図２３】
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【配列表】
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