(57)【要約】【課題】  銀ナノ粒子を固体物質に固定化した抗生物性材料を提供する。【解決手段】  本発明は、脱アセチル化度が０％〜５０％のキチン誘導体と、キチン誘導体に結合した銀ナノ粒子とを有することを特徴とする固体状の抗微生物材料である。上記発明において、キチン誘導体の脱アセチル化度が５％〜４０％であることが好ましい。また、銀ナノ粒子は、平均粒径が１ｎｍ〜３０ｎｍであり、当該抗微生物材料に対する重量分率が１％〜３０％であることが好ましい。また、キチン誘導体は、分子量が１０，０００以上であることが好ましい。【選択図】    図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
脱アセチル化度が０％〜５０％のキチン誘導体と、
前記キチン誘導体に結合した銀ナノ粒子とを有することを特徴とする固体状の抗微生物材料。
【請求項２】
前記キチン誘導体の脱アセチル化度が５％〜４０％であることを特徴とする請求項１に記載の抗微生物材料。
【請求項３】
前記銀ナノ粒子は、平均粒径が１ｎｍ〜３０ｎｍであり、当該抗微生物材料に対する重量分率が１％〜３０％であることを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の抗微生物材料。
【請求項４】
前記キチン誘導体は、分子量が１０，０００〜３００，０００であることを特徴とする請求項１〜請求項３のいずれか１つの項に記載の抗微生物材料。
【請求項５】
請求項１〜請求項４に記載の抗微生物材料を含有する樹脂から構成された抗微生物性を有する物品。
【請求項６】
銀イオン含有ガラス粉末と還元糖とを含む水系懸濁液を加熱し、前記水系懸濁液に溶出した前記銀イオンを還元して銀ナノ粒子コロイド溶液を得る第１工程と、
前記銀ナノ粒子コロイド溶液に脱アセチル化度が０〜５０％のキチン誘導体を加え、前記銀ナノ粒子が前記キチン誘導体に結合したキチン／銀ナノ粒子複合体を得る第２工程と、
前記キチン／銀ナノ粒子複合体を前記水系懸濁液から分離し、乾燥することによって前記銀ナノ粒子が結合された固体状のキチン誘導体を含む固体材料を得る第３工程と
を有することを特徴とする抗微生物材料の製造方法。
【請求項７】
前記第１工程において、加熱によって前記還元糖をカラメル化させることを特徴とする請求項６に記載の抗微生物材料の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗微生物材料に係り、詳細には銀ナノ粒子を含む固体状の抗微生物材料に関する。また、抗微生物材料を含む物品と、抗微生物材料の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
単純なマクロな塊状の金属とは異なり、金属ナノ粒子は、そのサイズや形状に応じた光学的、電磁気的、化学的特性を生じることが知られている。このような金属ナノ粒子の製造方法として、ナノサイズレベルの銀ナノ粒子を含む金属コロイド溶液を、簡便な装置を用い、温和な条件で製造する方法が公知となっている（例えば、特許文献１、非特許文献１〜３）。特許文献１には、還元糖の種類及び濃度を変化させることによって金属ナノ粒子の粒径を制御する技術が開示されている。また、金属コロイドの製造方法として、金属イオン含有ガラス粉末と還元糖（グルコース）とを含む水系懸濁液を、一般的なオートクレーブ装置等を用いて加圧加熱する技術が公知となっている（例えば、特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２０１０−２６８６９４号公報
【特許文献２】特開２０１１−１５７６２３号公報
【非特許文献１】Y. Mori et al. Simple and environmentally friendly preparation and size control of silber nanoparticles using an inhomogeneous system with silver-containing glass powder. J Nanopart Res 13, 2799 (2011)
【非特許文献２】T. Cunha et al. Biological and pharmacological activity of chitosan and derivatives. Chitosan-based systems for biopharmaceuticals: Delivery, targeting and polymer therapeutics, First edition. Edited by Bruno Sarmento and Jose das Neves. by John Wiley&Sons, Ltd. (2012)
【非特許文献３】J.L. Elechiguerra et al. Interaction of silver nanoparticles with HIV-1. J Nanobiotechnol 3, 6 (2005)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
銀ナノ粒子は、生体に対して影響を及ぼすことがいくつか報告されており、特に水生生物に対する生体毒性が危惧されている。哺乳類に対してもマウスの精子幹細胞の成長を阻害することが知られている。また、銀ナノ粒子は表面プラズモン共鳴により呈色するため、銀ナノ粒子を溶媒に分散させたコロイド溶液状態での抗微生物材料への適用は、生体への影響のみならず衣類や家財等の汚損が予期されるために困難であった。
【０００５】
そのため、銀ナノ粒子の抗微生物剤としての適用は、高分子やセラミック等の基質中に固定化させた状態に限られる。この場合、抗微生物性の発現は銀ナノ粒子部分の微生物に対する選択的な物理吸着よるものであるため、銀ナノ粒子と基質物質の立体構造の制御が特に重要で、簡便で有効な製造可能な技術は未到達であった。特に、銀ナノ粒子の粗大化を抑制しつつ、基質物質中に分散させることが困難であった。
【０００６】
本発明は、以上の背景を鑑みてなされたものであって、銀ナノ粒子を固体物質に固定化した抗生物性材料を提供することを課題とする。また、抗生物性材料を含む物品を提供することを課題とする。また、その製造方法を簡素にする（容易化する）ことを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題を解決するために、本発明は、脱アセチル化度が０％〜５０％のキチン誘導体と、前記キチン誘導体に結合した銀ナノ粒子とを有することを特徴とする固体状の抗微生物材料である。ここで、キチン誘導体は、複数のＮ−アセチルグルコサミン（Ｃ８Ｈ１３ＮＯ５）とグルコサミン（Ｃ６Ｈ１３ＮＯ５）とを直鎖状に含む分子量が数千〜数十万の多糖類である。Ｎ−アセチルグルコサミンは、そのアセチル基を脱アセチル化することによってグルコサミンとなる。キトサンは、キチンと同様に、複数のＮ−アセチルグルコサミンとグルコサミンとを直鎖状に含む分子量が数千〜数十万の多糖類であって、脱アセチル化度によってキチンと区別されている。脱アセチル化度は、キチン誘導体中に含まれるＮ−アセチルグルコサミン及びグルコサミンの総数に対するグルコサミンの数の割合と定義されている。キチン誘導体は、脱アセチル化度が０〜５０％のものをキチン、５１％〜１００％のものをキトサンと定義する。また、キチン誘導体は、含まれるＮ−アセチルグルコサミン及びグルコサミンが付加的な官能基を有していてもよい。キチン誘導体は、例えば、Ｎ−アセチルグルコサミン及びグルコサミンの水酸基のカルボキシ化合物やアルコキシ化合物、アルチレングリコールの付加物、アシルオキシ化合物、カルバメート化合物等の各種のものを含み、具体的には例えば、カルボキシメチルキチン（ＣＭＣＴ）を含む。
【０００８】
この構成によれば、脱アセチル化度が０％〜５０％のキチン誘導体は、常温（２０℃±１５℃）において、固体となるため、銀ナノ粒子が結合された固体状の抗微生物材料を得ることができる。キチンは正の電荷を有するため、表面に塩化物及び酸化物が形成されて負の電荷を有する銀ナノ粒子と結合することができる。特に、キチンは、銀ナノ粒子を含むコロイド溶液に添加することによって、銀ナノ粒子と結合することができるため、キチン／銀ナノ粒子複合体の形成が容易である。また、キチン／銀ナノ粒子複合体は、固体として形態が安定しているため、シート状、スポンジ状（多孔質状）等に形成することができ、銀ナノ粒子と微生物との接触面積を増大させることができる。
【０００９】
上記発明において、前記キチン誘導体の脱アセチル化度が５％〜４０％であることが好ましい。
【００１０】
この構成によれば、キチン誘導体の固体形状が安定化する。
【００１１】
上記発明において、前記銀ナノ粒子は、平均粒径が１ｎｍ〜３０ｎｍであり、当該抗微生物材料に対する重量分率が１％〜３０％であることが好ましい。
【００１２】
この構成によれば、抗生物性材料の抗生物活性が高められる。
【００１３】
上記発明において、前記キチン誘導体は、分子量が１０，０００以上であることが好ましい。
【００１４】
この構成によれば、キチン誘導体の固体形状が安定化する。
【００１５】
上記発明における前記抗微生物材料を含有する樹脂から、抗微生物性を有する物品を構成してもよい。樹脂は、例えば、ポリエチレンテレフタラートやポリアセタール、ポリカーボネート、ポリアミド等の公知の樹脂であってよく、物品は自動車のインストルメントパネルやステアリングホイール、空調装置のフィルターやダクト等の公知のプラスチック成形部分であってよい。
【００１６】
この構成によれば、公知の様々な樹脂製物品に抗生物性を付与することができる。
【００１７】
また、本発明の他の側面は、抗微生物材料の製造方法であって、銀イオン含有ガラス粉末と還元糖とを含む水系懸濁液を加熱し、前記水系懸濁液に溶出した前記銀イオンを還元して銀ナノ粒子コロイド溶液を得る第１工程と、前記銀ナノ粒子コロイド溶液に脱アセチル化度が０〜５０％のキチン誘導体を加え、前記銀ナノ粒子が前記キチン誘導体に結合したキチン／銀ナノ粒子複合体を得る第２工程と、前記キチン／銀ナノ粒子複合体を前記水系懸濁液から分離し、乾燥することによって前記銀ナノ粒子が結合された固体状のキチン誘導体を含む固体材料を得る第３工程とを有することを特徴とする。
【００１８】
この構成によれば、キチン誘導体を使用したことによって、銀ナノ粒子コロイド溶液から銀ナノ粒子の粗大化を抑制しつつ、キチン／銀ナノ粒子複合体を形成することができる。特に、還元糖を使用した銀イオンの還元による銀ナノ粒子コロイド溶液では、銀ナノ粒子と還元糖との分離が困難であるが、キチン誘導体を使用したことによって還元糖の除去が容易になる。また、この製造方法よれば、銀ナノ粒子の粒径の制御が容易である。
【００１９】
上記発明において、前記第１工程において、加熱によって前記還元糖をカラメル化させることが好ましい。
【００２０】
この構成によれば、銀ナノ粒子コロイド溶液において、カラメル化した還元糖が銀ナノ粒子を保護し、銀ナノ粒子の粗大化が抑制される。
【発明の効果】
【００２１】
以上の構成によれば、銀ナノ粒子を固体物質に固定化した抗生物性材料を提供することができる。また、抗生物性材料を含む物品を提供することができる。また、その製造方法を簡素にする（容易化する）ことができる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】本実施形態に係るキチン／銀ナノ粒子複合体のＴＥＭ及びＳＥＭ観察像
【図２】キチン／銀ナノ粒子複合体のＰＢＳを用いた遠心分離洗浄の際に得られた上清のＵＶ−ｖｉｓスペクトル
【図３】キチンの重量濃度と吸着銀ナノ粒子の相関を示すグラフ
【図４】キチン／銀ナノ粒子複合体の抗ウィルス活性の評価結果を示すグラフ
【図５】キチン／銀ナノ粒子複合体又はキトサン／銀ナノ粒子複合体の抗菌活性の評価結果を示すグラフ
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本実施形態に係るキチン／銀ナノ粒子複合体からなる抗微生物材料は、アセチル化度が０〜５０％のキチン誘導体に、銀ナノ粒子が結合されたものである。キチン誘導体は、複数のＮ−アセチルグルコサミンとグルコサミンとを直鎖状に含む多糖類であり、Ｎ−アセチルグルコサミン及びグルコサミンは任意の官能基を付加的に有してもよい。キチン誘導体は、例えば、Ｎ−アセチルグルコサミン及びグルコサミンの水酸基のカルボキシ化合物やアルコキシ化合物、アルチレングリコールの付加物、アシルオキシ化合物、カルバメート化合物等の各種のものを含み、具体的には例えば、カルボキシメチルキチン（ＣＭＣＴ）を含む。
【００２４】
銀ナノ粒子は、その表面に銀のハロゲン化物や酸化物が吸着して負電荷を有する。一方、キチン誘導体は、水溶液中では正電荷を有する。そのため、銀ナノ粒子とキチン誘導体とは、静電相互作用によって互いに結合している。
【００２５】
アセチル化度が０〜５０％のキチン誘導体は、常温（２０℃±１５℃）において固体である。そのため、キチン／銀ナノ粒子複合体は、常温において固体であり、所定の形状を維持する。アセチル化度が５０％より大きいキトサン誘導体は、一部が液体化（ゲル化）し、安定な形状を維持することができない。アセチル化度が０％〜５０％のキチン誘導体を含むキチン／銀ナノ粒子複合体は、粉体状、スポンジ状、シート状、膜状、ゲル状など種々の形態を取り得る。また、キチン／銀ナノ粒子複合体は、単体で又は他の樹脂材料と混合して射出成形用材料としても使用することができ、公知の様々なプラスチック物品に代替することができる。例えば、キチン／銀ナノ粒子複合体は、自動車のインストルメントパネルやステアリングホイール、電話機及びテレビ等の筐体、空調装置に組み込まれるフィルター材料やダクト等の公知の様々なプラスチック製品に使用することができる。また、カルボキシメチルキチン／銀ナノ粒子複合体とポリビニルアルコールとの混合物は、ハイドロゲルとして使用することができる。
【００２６】
キチン誘導体と銀ナノ粒子との結合は、キチン誘導体の脱アセチル化が低いほど、弱くなる傾向が確認されている。そのため、キチン誘導体は、銀ナノ粒子との結合性の観点について見れば、脱アセチル化度が高いほど好ましい。一方、キチンは、アセチル化度が低いほど固体形状の安定が良く、４０％以下において一層安定した形態を取り得る。以上より、キチン誘導体のアセチル化度は、固体形状の安定性の観点と、銀ナノ粒子との結合性の観点とから、０％〜５０％、より好ましくは５％〜４０％、更に好ましくは３０〜３５％であるとよい。
【００２７】
キトサン誘導体は、抗真菌活性、抗菌活性と共に創傷治癒促進活性を有することが知られている。これは、負の電荷を有する真菌や菌の細胞膜に正の電荷を有するキチン誘導体が強く相互作用し、細胞膜の変化、遊走の抑制、細胞質成分の溶出を引き起こすためと考えられている（非特許文献２参照）。以上の特性はキチン誘導体も同様に有するが、これらの抗真菌等の性質は、脱アセチル化度が増大するにつれて高くなることが知られている。これは、脱アセチル化度が増大するほど、キチン誘導体の正電荷が強くなることに起因すると考えられる。なお、キトサン誘導体及びキチン誘導体は、単独では抗ウイルス活性は確認されていない。
【００２８】
キチン誘導体は、銀ナノ粒子が結合されてキチン／銀ナノ粒子複合体となることによって、抗真菌、抗菌活性が大きく増強される。また、銀ナノ粒子が抗ウィルス活性を有することから、キチン／銀ナノ粒子複合体は抗ウィルス活性を有する。
【００２９】
キチン／銀ナノ粒子複合体に含まれる銀ナノ粒子のサイズ（球状に近似させた場合の直径）は、抗菌用途の材料を得る場合にはマイクロオーダーより小さいことが好ましく、抗ウィルス用途の材料を得る場合には、好ましくは５０ｎｍ以下、より好ましくは１〜３０ｎｍ、更に好ましくは、２〜２０ｎｍであるとよい。
【００３０】
キチン／銀ナノ粒子複合体に含まれるキチン誘導体は、分子量が好ましくは５，０００以上、より好ましく１０，０００〜３００，０００であるとよい。
【００３１】
実施形態に係るキチン／銀ナノ粒子複合体は、医療用あるいは産業用など各種用途に適用される。銀ナノ粒子はナノサイズにまで小さくすることにより、塊状金属とは異なる光学的、電磁気学的、化学的性質を呈する。例えば、１０ｎｍ以下の銀ナノ粒子はＨＩＶ−１ウィルスのエンベロープに選択的に吸着して該ウィルスを不活化させることが見出されている（非特許文献３）。キチン／銀ナノ粒子複合体は、良好な安定性と共に強い抗ウィルス活性を呈する。ウィルスとしては、例えば、Ａ（Ｈ１Ｎ１）インフルエンザウィルスが挙げられる。
【００３２】
以下に、キチン／銀ナノ粒子複合体の製造方法を説明する。キチン／銀ナノ粒子複合体は、調整した銀ナノ粒子コロイドに−キチン誘導体を加えることによって形成され、溶液を取り除くことによって固体状に精製される。
【００３３】
銀ナノ粒子コロイドは、銀イオン含有ガラス粉末と還元糖（グルコース）とを含む水系懸濁液を、一般的なオートクレーブ装置等を用いて加圧加熱することによって生成される。この手法によって生成される銀ナノ粒子は粒径が一定しており、保存安定性も良好である。この手法における懸濁液の加熱において、グルコースは加熱され、分解し、不規則に結合する結果、褐色のあめ状物質に変化し、カラメル化する。
【００３４】
銀イオン含有ガラス粉末の粒径は、好ましくは２〜２０μｍである。銀イオン含有ガラス粉末の粒径が小さいほど、銀イオンの溶出速度が速くなり、目的とする金属コロイドを得易くなる。ガラス粉末の粒径の好適な下限値は、粉末の取り扱い易さやコスト等を根拠とするほか、銀イオンの流出速度が速くなり過ぎないという点も考慮するとよい。また、銀イオン含有ガラス粉末に含まれる銀イオンの割合は、特に限定は無く、好ましくは１〜３重量％である。この範囲内であれば、水系懸濁液中で好ましい速度で金属イオンが溶出する。また、一価の銀イオンの形態でガラス成分に含まれることが典型的であり、具体的には硝酸銀や酸化銀の形態でガラス粉末に含まれていてもよい。
【００３５】
還元糖は、塩基性溶液中でアルデヒド基とケトン基とを形成する糖である。還元糖としては例えばグルコース、フルクトース、グリセルアルデヒド等の全ての還元単糖類、ラクトース、アラビノース、マルトース等の還元二糖類・オリゴ糖等が挙げられる。溶出した銀イオンを還元するに足る還元力のある還元糖を特に限定無く用いることができ、入手の容易さ、水溶性等の観点から、単糖類であるグルコースを使用するとよい。懸濁液のオートクレーブにおいて還元糖としてのグルコースは、分解し、不規則に結合する結果、褐色のあめ状物質（カラメル）に変化し、カラメル化する。生成されたカラメルは、還元された銀ナノ粒子が粗大粒子へと成長することを阻害し、微小な銀ナノ粒子として安定化させる。
【００３６】
本実施形態では、金属の還元反応を水系溶媒中で行う。水系溶媒は少なくとも５０％以上が水であり、好ましくは水のみである。グルコースと銀イオンとの間の酸化還元反応によって銀イオンが還元されて銀ナノ粒子となり、銀ナノ粒子コロイド溶液が得られる。この酸化還元反応において、グルコースが大過剰であることが望ましい。具体的には、水系溶媒における還元糖の濃度は０．２〜８ｗｔ％とした。本発明者らの新知見によれば、得られる金属コロイド中の金属粒子のサイズは、反応系中の還元糖の量の平方根に概ね比例する。よって、還元糖の使用量は、金属コロイド中の金属粒子のサイズの制御要因になり得る。
【００３７】
本実施形態では、還元糖を水系溶媒に溶解させ、さらに、金属含有ガラス粉末を分散させて水系懸濁液（以下、単に懸濁液ともいう。）を得て、その懸濁液を加熱する。加熱の好適例として、閉鎖系にて懸濁液を加熱し続けることが挙げられる。これによれば、水蒸気が生成して系内圧力が上昇するため、加圧状態での加熱が可能となる。このような加圧加熱は、一般的なオートクレーブ装置などを用いて容易に実現できる。
【００３８】
懸濁液の加圧・加熱によって還元糖としてのグルコースは、分解し、不規則に結合する結果、褐色のあめ状物質に変化する（カラメル化する）。生成したカラメルは、還元され生成した銀ナノ粒子が粗大粒子へと成長するのを阻害し、微小な銀ナノ粒子として安定化させる。本実施形態では、従来法とは異なり、酸化還元反応において特段の添加剤が不要である。これは、還元糖に由来するカラメルが添加剤の代替になっているためである。
【００３９】
銀ナノ粒子コロイド溶液を生成するためのオートクレーブの好適な条件は、圧力が１８０〜２３０ｋＰａ、温度が１１０〜１３０℃、加圧・加熱時間が１０〜２５分間である。上記範囲内では、反応速度及びグルコースのカラメル化の速度が好適なバランスを保つ結果、銀ナノ粒子コロイドは粒径が一定し、保存安定性がより一層良好となる。本実施形態では、比較的に温和な反応条件で銀ナノ粒子コロイドを製造できる。
【００４０】
懸濁液の加圧・加熱による反応終了後は、遠心分離等の適宜の手法によって、ガラス粉末を除去し、銀ナノ粒子コロイド溶液を得る。銀ナノ粒子コロイド溶液に含まれる銀ナノ粒子は、生成したカラメルが保護剤として作用するため形状が一定した球状になり易く、そのサイズ（球状に近似させた場合の直径）は、２〜３０ｎｍである。銀ナノ粒子は、サイズが小さいほど、サイズのばらつきが小さく、安定性が高い。本実施形態では、従来法と異なり、金属コロイド溶液を貯蔵する際に、ポリ（Ｎ−ビニル−２−ピロリドン）等の安定剤を用いる必要が無い。
【００４１】
次に、銀ナノ粒子コロイド溶液にアセチル化度が０％〜５０％のキチン誘導体を添加し、攪拌する。キチン誘導体は、分子量が１０，０００以上であることが好ましい。これにより、銀ナノ粒子は、キチン誘導体と静電相互作用によって結合し、キチン／銀ナノ粒子複合体を形成し、カラメルから分離される。銀ナノ粒子とキチン誘導体との相互作用は、濃度及び脱アセチル化度に依存する。なお、他の実施形態では、銀ナノ粒子コロイド溶液からガラス粉末を除去する前に、キチン誘導体を加えてもよい。
【００４２】
キチン／銀ナノ粒子複合体を含む懸濁液は、遠心分離、透析、濾過等を行い、カラメルを除去する。その後、懸濁液を凍結乾燥することによって溶媒を除去し、キチン／銀ナノ粒子複合体を得る。なお、凍結乾燥に代えて懸濁液の濾過及び水洗によりキチン／銀ナノ粒子複合体を精製する場合には、水洗によりキチン誘導体の脱アセチル化度に応じて、１５〜８０％の銀ナノ粒子が流出する虞がある。
【００４３】
以上の製造方法によれば、キチン誘導体を懸濁液に加えることによって、カラメルによって保護された銀ナノ粒子から、カラメルを容易に取り除くことができる。また、キチン誘導体は銀ナノ粒子の粗大化を抑制する効果があり、生成した銀ナノ粒子を安定的に保存することができる。
【実施例】
【００４４】
以下、本発明による実施例を示す。ただし、本発明はこれらの実施例に記載された態様に限定されるわけではない。
【００４５】
［実施例１］
ＳｉＯ２（約２５％）−Ｂ２Ｏ３（約６０％）−Ｎａ２Ｏ（約１５％）−ＡｇＮＯ３（１．６％）なる組成の銀含有ガラス粉末（環境サイエンス社、型番ＢＳＰ２１、平均粒径１０μｍ）０．５０ｇを、１００ｍＬのガラスバイアル中で、所定濃度（０．２５重量％、１．０重量％、４．０重量％）のＤ−グルコース（＞９８％、和光純薬製）水溶液５０ｍＬに分散させた。得られた懸濁液をイケモト社製ＩＭＣ−３０Ｌのオートクレーブ装置にて、１２１℃、２００ｋＰａの加圧加熱処理に供した（約２０分）。その後、懸濁液を徐々に室温にまで冷却して、３０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離に供した。このとき、グルコースを含む溶媒部分（上清）は黄褐色になっていた。銀ナノ粒子コロイドを含む上清を銀ナノ粒子コロイド溶液として回収し、室温暗所に保存した。銀ナノ粒子コロイド溶液に、脱アセチル化度が３０％又は５％以下のキチン（焼津水産化学工業株式会社）を所定の重量加え、撹拌しながら１時間、室温で反応させた。ここで使用したキチンは、Ｎ−アセチルグルコサミン及びグルコサミンから構成されるものであり、付加的な官能基を有していない。反応後、溶液についてＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）を用いた遠心分離（３，０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ）を２度行い、生成したカラメルを除去すると共に、生成したキチン／銀ナノ粒子複合体を洗浄した。洗浄後のキチン／銀ナノ粒子複合体は、凍結乾燥し、形状が安定した固体のキチン／銀ナノ粒子複合体を得た。得られた固体のキチン／銀ナノ粒子複合体を実施例１とする。
【００４６】
上記の実施例において、Ｄ−グルコースの量は、０．２５重量％の場合において、銀イオンを還元する当量の２５倍以上に相当し、１．０重量％の場合に１００倍以上に相当し、４．０重量％の場合に４００倍以上に相当する。
【００４７】
［比較例１］
上記の実施例１において、製造工程において加えたキチンを、アセチル化度が８４％のキトサン（焼津水産化学工業株式会社）に変更し、生成したキトサン／銀ナノ粒子複合体を比較例１とする。
【００４８】
（外観観察）
実施例１に係るキチン／銀ナノ粒子複合体は、常温（２０℃±１５℃）において、安定した固体であることが目視によって観察された。一方、比較例１に係るキトサン／銀ナノ粒子複合体は、常温（２０℃±１５℃）において、液体（ゲル）であることが目視によって観察された。
【００４９】
（顕微鏡観察）
実施例１として得られたキチン／銀ナノ粒子複合体を凍結乾燥後、１ヶ月間室温保存したキチン／銀ナノ粒子複合体のＴＥＭ及びＳＥＭ像を観察した（ＪＥＯＬ  ＪＥＭ−１０１０、８０ｋＶ）（図１）。図１（Ａ）のＴＥＭ像に示されるように、複合体中の銀ナノ粒子は球形で均一に分散されていた。なお、ＴＥＭ観察像中のスケールバーは１００ｎｍであり、ＳＥＭ観察像中のスケールバーは１μｍである。銀ナノ粒子の粒径はＴＥＭ観察像写真から、粒径解析ソフトを用いて測定した。結果、製造工程においてＤ−グルコースの濃度を０．２５重量％としたものは、銀ナノ粒子の平均粒径（直径）が３．４８±１．８３ｎｍ、Ｄ−グルコースの濃度を１．００重量％としたものは、銀ナノ粒子の粒径が６．５３±１．７８ｎｍ、Ｄ−グルコースの濃度を４．００重量％としたものは、銀ナノ粒子の粒径が１２．９±２．５０ｎｍであった。
【００５０】
（ＵＶ−ｖｉｓスペクトル）
実施例１のキチン／銀ナノ粒子複合体コロイド溶液の遠心分離洗浄の際に得られた上清のＵＶ−ｖｉｓスペクトル（日立、Ｕ−３３００）を測定した結果を図２の（Ａ）〜（Ｃ）に示す。図２では、加えたＤ−グルコースの濃度が０．２５重量％、１．０重量％、４．０重量％のサンプルについて、脱アセチル化度が３０％であるキチンの添加量を変化させた結果を示している。図２に示すＵＶ−ｖｉｓスペクトルは、遠心分離洗浄直後の上清を測定したものである。図２の各図において、波長４００ｎｍ付近のピークは、銀ナノ粒子に起因するものである。銀ナノ粒子に起因するピークは、Ｄ−グルコースの濃度が高いほど、すなわち銀ナノ粒子の粒径が大きいほど増大することが確認された。また、各図において、キチンの添加量が増大するほど、ピークが減少することが確認された。これは、キチンの添加量が増大するに伴って、キチンと結合してキチン／銀ナノ粒子複合体を形成する銀ナノ粒子が増大することを示している。キチン／銀ナノ粒子複合体は遠心分離によって上清中から除去されるため、上清中の銀ナノ粒子濃度は減少する。
【００５１】
図３は、加えたＤ−グルコースの濃度が０．２５重量％、１．０重量％、４．０重量％のサンプルについて、脱アセチル化度が３０％であるキチンの添加量を変化させた際の波長４００ｎｍにおける吸光度を示している。この吸光度変化から１ｍｇ／ｍＬのキチン（脱アセチル化度：３０％）に対して結合（吸着）する銀ナノ粒子の重量を算出した。結果を以下の表１に示す。同様に、１ｍｇ／１ｍＬのキトサン（アセチル化度：８４％）及び１ｍｇ／１ｍＬのキチン（アセチル化度：５％以下）に対して結合する銀ナノ粒子の重量を算出し、表１に合わせて示す。表１から分かるように、脱アセチル化度が高いほど結合する銀ナノ粒子の重量は増大する。
【００５２】
【表１】
2014005241.tif 000003
【００５３】
［実施例２］
脱アセチル化度が３０％のキチン（焼津水産化学（株）、平均分子量：５４０００）１０ｍｇを１ｍＬの水に酸性下（ｐＨ２）で溶解させ、実施例１の操作に準拠して得た各銀ナノ粒子コロイド溶液（平均粒径が、１２．９±２．５０ｎｍ、６．５３±１．７８ｎｍ及び３．４８±１．８３ｎｍの３種類）を加えてよく攪拌した。その後、ＮａＯＨの添加により中和し、キチン／銀ナノ粒子複合体を沈殿物として調製した。この複合体を数回生食水で洗浄した。
【００５４】
（抗ウィルス活性評価）
Ａ／ＰＲ／８／３４株（Ｈ１Ｎ１型）のインフルエンザ液をキチン／銀ナノ粒子複合体に添加し、生じた懸濁液を１時間室温で攪拌し、遠心分離法でウィルスを吸着した複合体を除去し、上澄みの残存インフルエンザを被感染細胞（ＭＤＣＫ）を含む９６−ウエルプレートに段階希釈により加え、７日間培養した。プラーク形成したウエル数をカウントし、下記の数１によって表されるＴＣＩＤ５０法に基づいて評価をした。
【００５５】
【数１】
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数１において、ｃは１段目のウィルス濃度であり、ｐはプラーク形成したウエル数であり、ｗは１濃度あたりのウエル数であり、ｖは１ウエルあたりのウィルス液体積である。
【００５６】
図４は抗ウィルス活性の評価結果である。図４の縦軸はインフルエンザの感染の程度を表している。銀ナノ粒子を含まぬキチンのみの場合におけるインフルエンザの感染の程度を、縦軸における１００％として規格化した。ここで脱アセチル化が３０％のキチンには銀ナノ粒子の含有なくして抗インフルエンザ活性は観察できなかった。よって、縦軸の値が１００％より小さければ、キチンのみの場合よりも、抗インフルエンザ活性が高いといる。また、縦軸の値が小さければ小さいほど、抗インフルエンザ活性が高いと言える。横軸は１ｍｇのキチンに対する銀粒子の含有量を示す。図４にプロットされるように、銀ナノ粒子を含有する複合体は、例外なく、キチンのみの場合よりも抗インフルエンザ活性が向上した。銀ナノ粒子の平均粒径が小さいほど、少ない含有量で高い抗インフルエンザ活性を呈することが判明した。
【００５７】
［実施例３及び比較例３］
実施例１の工程に従って生成した銀ナノ粒子コロイド溶液（平均粒径が１２．９±２．５０ｎｍ、６．５３±１．７８ｎｍ及び３．４８±１．８３ｎｍの３種類）に、脱アセチル化度が３０％又は５％以下のキチンのスポンジ断片(直径５ｍｍ×厚さ１ｍｍ)を加え、攪拌した。各スポンジ断片はＰＢＳを用いた遠心分離法で３度洗浄した後、凍結乾燥させた。これらを実施例３とする。また、比較対象として、実施例３のスポンジ断片に代えて、脱アセチル化度が８４％の光硬化キトサンからなるスポンジ断片(直径５ｍｍ×厚さ１ｍｍ)を使用したものを比較例３とした。
【００５８】
（抗真菌活性試験）
実施例３及び比較例３の各スポンジ断片にE. coli（strain B, ATCC no.11303）懸濁液(3x1010 colony forming units(CFU) / mL in PBS)を５０ｍＬ滴下し、１５分間室温で放置した。それらE. coliを滴下した各スポンジ断片は、１ｍＬの菌体培養液(NB：Nutrient Broth)内で、振動下３７℃で２４時間培養した。各スポンジ断片の入った菌体培養液をボルテックスミキサーによって１分間攪拌した後、各スポンジ断片を除去した菌体培養液の波長６５０ｎｍでの吸光度（ＯＤ６５０）を測定した。結果を図５に示す。
【００５９】
図５の各図には、最も右側の部分に菌体培養液のみの吸光度（バックグラウンド、菌なし）、その左側に実施例２及び比較例２のスポンジを含まず、同様の条件で培養されたE. coliを含む菌体培養液の吸光度（菌のみ）、その左側に銀ナノ粒子を含まない実施例２及び比較例２に係るスポンジを使用した際のE. coliを含む菌体培養液の吸光度（１ｍｇキチン又はキトサン）を示している。図５から、脱アセチル化度が５％以下及び３０％のキチンからなるスポンジと、脱アセチル化度が８４％のキトサンからなるスポンジとは、いずれも銀ナノ粒子を含まなくても、抗真菌活性を有することが分かる。そして、これらのスポンジに銀ナノ粒子を結合させた実施例２及び比較例２に係るスポンジは、更に抗真菌活性が増大することが確認された。これらの実施例２及び比較例２に係るスポンジは、スポンジを構成するキチン又はキトサンの脱アセチル化度が高いほど抗真菌活性が高いことが分かる。また、図５から、銀ナノ粒子は、その平均粒径が小さいほど抗真菌活性が高く、濃度が高いほど抗真菌活性が高いことが確認された。
【００６０】
図５の結果から、キチンのスポンジはキトサンのスポンジに比較して抗真菌活性が低いことが確認されたが、銀ナノ粒子を結合することによって抗真菌活性が増大することが確認された。キチンのスポンジは、常温において安定して形態を維持することができるため、光硬化性の処理が必要なキトサンに比較して汎用性が高いと言える。
【００６１】
以上で具体的実施形態の説明を終えるが、本発明は上記実施形態に限定されることなく幅広く変形実施することができる。
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図１】
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