(57)【要約】      （修正有）【課題】両生類卵母細胞を用いてリコンビナントタンパク質を大量に発現させることを可能にする、転写制御ポリヌクレオチドの提供。【解決手段】アフリカツメガエルの特定な配列からなる塩基配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有し、リコンビナントタンパク質を両生類卵母細胞に発現させるための転写制御ポリヌクレオチド。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号１に示す塩基配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有し、リコンビナントタンパク質を両生類卵母細胞に発現させるための転写制御ポリヌクレオチド。
【請求項２】
両生類が、カエルである請求項１に記載の転写制御ポリヌクレオチド。
【請求項３】
両生類が、アフリカツメガエルである請求項１又は請求項２に記載の転写制御ポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の転写制御ポリヌクレオチドが組み込まれた組換えベクター。
【請求項５】
請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の転写制御ポリヌクレオチドが組み込まれた組換えベクターを保有する形質転換体。
【請求項６】
請求項５に記載の形質転換体から生理活性物質を生産する方法。
【請求項７】
請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の転写制御ポリヌクレオチドが組み込まれたトランスジェニック生物。
【請求項８】
請求項７に記載のトランスジェニック生物から生理活性物質を生産する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、転写制御ポリヌクレオチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
有用なタンパク質を大量生産する方法としては、大腸菌及び酵母等の微生物を宿主として利用する方法が一般的である。
一方、抗体医薬、ワクチン等を生産する場合には、タンパク質の生理活性を保つために、大型哺乳類を宿主として利用する方法が試みられている。しかし、大型哺乳類を宿主として利用する場合には、遺伝子改変した大型哺乳類の管理、ヒトと共通する病原体の排除等の技術的な問題、及び、哺乳類を実験動物として使うことへの抵抗感等の倫理的な問題が存在する。
【０００３】
一方、両生類は多産であり、成体雌は極めて多数の卵を体内に保有する。また、飼育しやすいという利点も有する。
例えば、アフリカツメガエルは実験室内において高密度での飼育が可能である。また、アフリカツメガエルに外来遺伝子を導入して得られるトランスジェニックガエルの作製技術は１９９０年代には確立されている（非特許文献１）。その技術を用いて、アフリカツメガエルの卵母細胞中に、目的とするタンパク質を発現する方法も知られている（特許文献１）。
また、ネッタイツメガエルのゲノムＤＮＡの塩基配列は２０００年代に解明された（非特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００３−１３５０６５号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｋｒｏｌｌ  ａｎｄ  Ａｍａｙａ，  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．  １２２，  ３１７３−３１８３（１９９６）
【非特許文献２】Ｂｏｗｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．  ３６  （Ｄａｔａ  ｂａｓｅ  ｉｓｓｕｅ），  Ｄ７１６−７１７（２００８）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、両生類の卵母細胞にリコンビナントタンパク質を大量に発現させることを可能とする方法は、これまでのところ知られていない。
【０００７】
本発明は、両生類卵母細胞を用いてリコンビナントタンパク質を大量に発現させることを可能にする、転写制御ポリヌクレオチドを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は以下のとおりである。
＜１＞  配列表の配列番号１に示す塩基配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有し、リコンビナントタンパク質を両生類卵母細胞に発現させるための転写制御ポリヌクレオチド。
＜２＞  両生類が、カエルである＜１＞に記載の転写制御ポリヌクレオチド。
＜３＞  両生類が、アフリカツメガエルである＜１＞又は＜２＞に記載の転写制御ポリヌクレオチド。
＜４＞  ＜１＞〜＜３＞のいずれか１つに記載の転写制御ポリヌクレオチドが組み込まれた組換えベクター。
＜５＞  ＜１＞〜＜３＞のいずれか１つに記載の転写制御ポリヌクレオチドが組み込まれた組換えベクターを保有する形質転換体。
＜６＞  ＜５＞に記載の形質転換体から生理活性物質を生産する方法。
＜７＞  ＜１＞〜＜３＞のいずれか１つに記載の転写制御ポリヌクレオチドが組み込まれたトランスジェニック生物。
＜８＞  ＜７＞に記載のトランスジェニック生物から生理活性物質を生産する方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、両生類卵母細胞を用いてリコンビナントタンパク質を大量に発現させることを可能にする、転写制御ポリヌクレオチドを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】実施例１にかかるプライマーの模式図である。
【図２】実施例１にかかる蛍光顕微鏡観察結果を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明にかかる転写制御ポリヌクレオチドは、配列表の配列番号１に示す塩基配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有し、リコンビナントタンパク質を両生類卵母細胞に発現させるためのポリヌクレオチドである。
【００１２】
本発明における配列表の配列番号１に示す塩基配列は、ネッタイツメガエルゲノム中のリンカーヒストンＢ４遺伝子のフランキング領域中に含まれる塩基配列であり、ＪＧＩ  Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ  ｇｅｎｏｍｅ  ｄａｔａｂａｓｅ  （ｖｅｒ．  ４．１，  ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｊｇｉ−ｐｓｆ．ｏｒｇ／Ｘｅｎｔｒ４／Ｘｅｎｔｒ４．ｈｏｍｅ．ｈｔｍｌ）のＳｃａｆｆｏｌｄ  １９６：  １６４２１０４〜１６４５１８３の配列であり、１６４２１０４を塩基番号１とした塩基番号１〜３０８０で構成される塩基配列である。
【００１３】
ネッタイツメガエルゲノム中のリンカーヒストンＢ４遺伝子のフランキング領域中に含まれるポリヌクレオチドが、ネッタイツメガエル以外の両生類において、リコンビナントタンパク質を両生類卵母細胞に発現させるためのエンハンサー配列として機能し、リコンビナントタンパク質を両生類卵母細胞に大量に発現させ得る。
このメカニズムは明らかではないが、リンカーヒストンＢ４は卵母細胞のみに大量に蓄積されるタンパク質であるため、サイズの大きなカエル卵に大量に産生する必要があり、それを保証するための発現制御システムがリンカーヒストンＢ４遺伝子中には存在していると推測される。
【００１４】
本明細書において「〜」を用いて示された数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を示す。
また、本発明において、組成物中の各成分の量は、組成物中に各成分に該当する物質が複数存在する場合には、特に断らない限り、組成物中に存在する当該複数の物質の合計量を意味する。
以下、本発明について説明する。
【００１５】
＜転写制御ポリヌクレオチド＞
本発明にかかる転写制御ポリヌクレオチドは、配列表の配列番号１に示す塩基配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有し、リコンビナントタンパク質を両生類卵母細胞に発現させるためのポリヌクレオチドである。
【００１６】
転写制御ポリヌクレオチドは、リコンビナントタンパク質を両生類卵母細胞に発現させるためのエンハンサー配列として機能し得るポリヌクレオチドである。そのため、転写制御ポリヌクレオチドを利用しないときに比べて、転写制御ポリヌクレオチドを利用することにより、両生類卵母細胞に大量のリコンビナントタンパク質を発現させることができる。
【００１７】
転写制御ポリヌクレオチドは、両生類卵母細胞におけるリコンビナントタンパク質の発現効率の観点より、配列表の配列番号１に示す塩基配列に対して８５％以上の同一性、９０％以上の同一性、９５％以上の同一性、９６％以上の同一性、９７％以上の同一性、９８％以上の同一性又は９９％以上の同一性を示してもよい。
転写制御ポリヌクレオチドと、配列表の配列番号１における塩基配列とを比較した際の同一性が８０％未満である場合には、両生類卵母細胞におけるリコンビナントタンパク質の発現効率が低くなる。
【００１８】
また、転写制御ポリヌクレオチドは、配列表の配列番号１に示す塩基配列と同一の塩基を有する塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする転写制御ポリヌクレオチドも包含される。
【００１９】
ハイブリダイゼーションは、公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ３ｒｄ（Ｊ．  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．  Ｐｒｅｓｓ，  ２００１）  に記載の方法等に従って行うことができる。この文献は、参照により本明細書に組み入れられるものとする。
ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。典型的なストリンジェントな条件とは、例えば、カリウム濃度は約２５ｍＭ〜約５０ｍＭ、及びマグネシウム濃度は約１．０ｍＭ〜約５．０ｍＭ中において、ハイブリダイゼーションを行う条件があげられる。本発明の条件の１例としてＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）、２５ｍＭのＫＣｌ、及び１．５ｍＭのＭｇＣｌ２中においてハイブリダイゼーションを行う条件が、挙げられるが、これに限定されるものではない。その他、ストリンジェントな条件としては、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ３ｒｄ（Ｊ．  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．  Ｐｒｅｓｓ，  ２００１）に記載されている。この文献は、参照により本明細書に組み入れられるものとする。当業者は、ハイブリダイゼーション反応や、ハイブリダイゼーション反応液の塩濃度等を変化させることによって、このような条件を容易に選択することができる。
【００２０】
さらに、転写制御ポリヌクレオチドには、配列表の配列番号１に示す塩基配列に塩基が挿入、欠失又は置換した転写制御ポリヌクレオチドも包含される。
塩基が挿入、欠失又は置換した転写制御ポリヌクレオチドは、本発明にかかる転写制御ポリヌクレオチドと同等程度の作用を示せばよく、塩基が挿入、欠失又は置換されている場合、その挿入、欠失又は置換の位置は、特に限定されない。
挿入、欠失又は置換した塩基の数としては１塩基又は２塩基以上が挙げられ、転写制御ポリヌクレオチド全体の長さによって異なるが、例えば１塩基〜１０塩基又は１塩基〜５塩基が挙げられる。
【００２１】
転写制御ポリヌクレオチドは、制御可能な位置に配置されたタンパク質をコードする遺伝子を両生類卵母細胞に発現させるためのエンハンサー配列として機能し得るポリヌクレオチドである。
制御可能な位置とは、転写制御ポリヌクレオチドの３’末端あるいは５’末端が挙げられる。また、転写制御ポリヌクレオチドの３’末端にタンパク質をコードする遺伝子が結合された態様がより好ましい。これにより、転写制御ポリヌクレオチドがより機能的に作用し得ると推測される。
タンパク質をコードする遺伝子としては、特に制限されるものではない。例えば、アルブミン、血液凝固因子、ウイルス外被タンパク質等のタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。
なお、本明細書においてリコンビナントタンパク質とは、遺伝子組み換え技術によって人工的に作製されたタンパク質を意味する。
【００２２】
転写制御ポリヌクレオチドの３’末端に、タンパク質をコードする遺伝子を結合する方法は特に制限されるものではない。例えば、転写制御ポリヌクレオチドと、タンパク質をコードする遺伝子とを制限酵素で消化し、その後結合させる方法が挙げられる。
【００２３】
両生類としては、カエル、イモリ、サンショウウオ等が挙げられる。中でも、アフリカツメガエルは繁殖及び飼育が容易な点で好ましく、遺伝子改変個体の管理においても、いわゆる家畜動物に比して問題が少ない。両生類の特徴として挙げられる卵のサイズについてはカエルの中では最大級とは言えないが、繁殖期が年１回に決まっている日本在来種と比べると、季節に関わらず卵生産を行うアフリカツメガエルは、多数の卵を効率よく集めることができるため好ましい。
【００２４】
両生類は、脊椎動物であるため、例えば、ヒトと同じタンパク質合成制御機構を有している。そのため、両生類卵母細胞で発現したヒトタンパク質は、ヒトに投与する場合にも、何の改変を行う必要もなく、ヒトにおいても機能し得る生理活性を有すると推測される。
また、両生類には、哺乳類に特有の病原体が存在する可能性も極めて低い。
【００２５】
＜組換えベクター＞
本発明における組換えベクターは、配列表の配列番号１に示す塩基配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有し、リコンビナントタンパク質を両生類卵母細胞に発現させるための転写制御ポリヌクレオチドが組み込まれたベクターである。
【００２６】
また、本発明における組換えベクターは、転写制御ポリヌクレオチドと、タンパク質をコードする遺伝子とが組み込まれていることが好ましい。
ベクターは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）のような原核細胞において発現可能なベクター（例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１１９又はこれらの派生物）であっても、真核生物において発現可能なベクターであってもよいが、真核生物において発現可能なベクターであることが好ましい。ベクターとしては、脊椎動物で発現可能なベクターであることが好ましく、両生類で発現可能なベクターであることがより好ましい。また、両生類卵母細胞を形質転換することができるベクターを用いることが好ましい。
【００２７】
真核生物において発現可能なベクターとしては、例えば、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）、ｐｃＤＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）のようなプラスミドベクター、ｐＤＯＮ−５（Ｔａｋａｒａ社）などのウイルスベクターを挙げることができる。
【００２８】
組換えベクターは、必要に応じて、プロモーター、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）、ＮＯＳなどのターミネーター等を有していてもよい。
プロモーターとしては、転写制御ポリヌクレオチドが機能し得るものであれば特に制限はされない。例えばアクチンプロモーター、サイトケラチンプロモーター、グロビンプロモーター等が挙げられる。プロモーターの由来は特に限定されないが、ＳＶ４０などのウイルスプロモータを使うと、組織特異的な発現が失われ、卵巣以外の器官、組織での非特異的な発現が見られる可能性がある。そのため、本発明においては、本発明の転写制御ポリヌクレオチドの働きを効率よく確認するため、ミニマムなエレメントのみからなるニワトリアクチンプロモーターを用いることがより好ましい。
選択マーカーとしては、例えば、カナマイシン、アンピシリン、テトラサイクリン等が挙げられる。
また組換えベクターには、目的とする遺伝子の導入を確認するためのレポーター遺伝子を含んでいてもよい。このようなレポーター遺伝子としては、ＧＵＳ（β−グルクロニダーゼ）遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）遺伝子等を挙げることができる。
【００２９】
転写制御ポリヌクレオチドと、タンパク質をコードする遺伝子とをベクターに組み込む方法としては、公知の方法を用いることができる。例えば、転写制御ポリヌクレオチドと、タンパク質をコードする遺伝子とを含むＤＮＡ断片を適当な制限酵素で切断し、ベクター中の過剰発現プロモーター下流の適当な制限酵素部位にイン・フレームとなるように挿入する方法等が挙げられる。
【００３０】
＜形質転換体＞
本発明における形質転換体は、配列表の配列番号１に示す塩基配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有し、リコンビナントタンパク質を両生類卵母細胞に発現させるための転写制御ポリヌクレオチドが組み込まれた組換えベクターを保有するものである。
【００３１】
また、本発明における形質転換体は、転写制御ポリヌクレオチドと、タンパク質をコードする遺伝子とが組み込まれた組換えベクターを、宿主中に保有するものであることが好ましい。
【００３２】
宿主としては、特に制限されるものではないが、両生類の卵母細胞を用いることが好ましい。なお、体細胞（卵以外の細胞）を用いた場合には、本発明の転写制御ポリヌクレオチドが機能しない場合もあると推定される。そのため、本発明においては、成体雌の卵巣から得られるステージＸＩ（最大径のもの）を外科的に取り出し、卵胞細胞をコラゲナーゼ処理によって取り除いた卵母細胞を使用することがより好ましい。また、中でも、アフリカツメガエルの卵母細胞を用いることが好ましい。
【００３３】
形質転換体は、組換えベクター中に組み込まれた転写制御ポリヌクレオチドが機能し得るように、組換えベクターを宿主中に導入することにより得ることができる。
宿主への組換えベクターの導入方法は、特に限定されるものではない。一般的には、両生類の卵１個当たり、１．０ｎｇ〜５．０ｎｇの組換えベクターを、マイクロインジェクターにより注入する方法が挙げられる。
【００３４】
組換えベクターが、宿主に組み込まれたか否かの確認は、組換えベクターの項で述べたレポーター遺伝子の発現の有無等によって確認することができる。
【００３５】
＜トランスジェニック生物＞
トランスジェニック生物は、配列表の配列番号１に示す塩基配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有し、リコンビナントタンパク質を両生類卵母細胞に発現させるための転写制御ポリヌクレオチドが組み込まれたものである。
【００３６】
本発明におけるトランスジェニック生物とは、転写制御ポリヌクレオチドと、タンパク質をコードする遺伝子とが染色体中に挿入された生物であることが好ましい。
トランスジェニック生物としては、転写制御ポリヌクレオチドと、タンパク質をコードする遺伝子とが染色体中に挿入された両生類であることがより好ましく、転写制御ポリヌクレオチドと、タンパク質をコードする遺伝子とが染色体中に挿入されたカエルであることがより好ましく、転写制御ポリヌクレオチドと、タンパク質をコードする遺伝子とが染色体中に挿入されたアフリカツメガエルであることがさらに好ましい。
【００３７】
トランスジェニック生物は、転写制御ポリヌクレオチドと、タンパク質をコードする遺伝子とが染色体中に挿入されているため、転写制御ポリヌクレオチドの下流に結合されたタンパク質をコードする遺伝子を、卵巣のみに発現することができる。
【００３８】
トランスジェニック生物は、公知の方法で作製することができる。例えば、メガヌクレアーゼとともにベクターＤＮＡを卵に注入する方法、またはベクターＤＮＡを付加した精子核を卵に注入する方法等により作製することができる。具体的には、Ｐａｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２００６）  Ｉ−ＳｃｅＩ  ｍｅｇａｎｕｃｌｅａｓｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  Ｘｅｎｏｐｕｓ．  Ｄｅｖ．  Ｄｙｎ．  ２３５，  ２４７−２５２．に記載の方法等が挙げられる。
【００３９】
＜生理活性物質の生産方法＞
本発明の生産方法は、形質転換体又はトランスジェニック生物から生理活性物質を生産する方法である。
生理活性物質の生産方法は、培養された形質転換体、又は飼育されたトランスジェニック生物から生理活性物質を含む成分を抽出することを含んでいればよい。さらに、生理活性物質の生産方法は、抽出された成分から目的とする生理活性物質を精製することを含むことが好ましい。
【００４０】
形質転換体の培養方法又は培養条件は、宿主の種類に応じて、適宜設定することができる。
培地としては、宿主の種類に応じて適宜選択することができるが、ＭＭＲ培地、ＭＢＳ培地を用いることが好ましい。
培養温度は、宿主の種類に応じて適宜設定することができるが、１８℃〜２３℃が好ましい。
培養時間は、宿主の種類に応じて適宜設定することができるが、１２時間〜７２時間が好ましい。
宿主として、アフリカツメガエル卵母細胞を用いた場合には、ＭＭＲ培地、又はＭＢＳ培地を用いて、１８℃〜２３℃、１２時間〜７２時間培養することができる。
【００４１】
トランスジェニック生物の飼育方法又は飼育条件は、トランスジェニック生物の種類に応じて、適宜設定することができる。
飼育温度は、対象となる生物の種類に応じて適宜設定することができるが、１８℃〜２３℃が好ましく、２０℃〜２３℃が更に好ましい。
対象生物として、アフリカツメガエルを用いた場合には、餌として魚類養殖用固形えさあるいは凍結豚肝臓を与え、１８℃〜２３℃で飼育することができる。また、幼生の飼育には、グリーンピース裏ごし、カボチャ裏ごしなど植物性の餌を与え、エアーポンプによる水循環下で飼育することができる。
【００４２】
生理活性物質を含む成分を抽出する方法としては、特に制限されるものではなく、当業者にとって公知の方法により行うことができる。例えば、形質転換の宿主として卵母細胞を用いた場合には、Ｅｖａｎｓ  ａｎｄ  Ｋａｙ  （１９９４）  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｏｃｙｔｅｓ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ３６，  １３３−１４８．に記載の方法等に従って抽出すればよい。
【００４３】
抽出された成分から目的とする生理活性物質を精製する方法としては、特に制限されるものではなく、当業者にとって公知の方法により行うことができる。例えば、溶剤抽出法、イオン交換樹脂法、吸着又は分配カラムクロマトグラフィー法、ゲル濾過法、透析法、沈殿法、結晶化法等を単独で、又は適宜組み合わせて、目的とする生理活性物質を精製することができる。
【００４４】
本明細書において、生理活性物質とは、具体的には、転写制御ポリヌクレオチドの３’末端に結合されたタンパク質をコードする遺伝子由来のタンパク質を意味する。
タンパク質としては、転写制御ポリヌクレオチドの項で述べた事項を適用する。
【実施例】
【００４５】
以下、本発明を実施例にて詳細に説明する。しかしながら、本発明はそれらに何ら限定されるものではない。
【００４６】
［実施例１］
配列表の配列番号２及び配列番号３に記載のプライマーを用いて、ネッタイツメガエルゲノム中のＢ４遺伝子のフランキング領域（ＪＧＩ  Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ  ｇｅｎｏｍｅ  ｄａｔａｂａｓｅ  （ｖｅｒ．  ４．１，  ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｊｇｉ−ｐｓｆ．ｏｒｇ／Ｘｅｎｔｒ４／Ｘｅｎｔｒ４．ｈｏｍｅ．ｈｔｍｌ）のＳｃａｆｆｏｌｄ  １９６：  １６４２１０４−１６４５１８３の配列）から、ＰＣＲ法により、配列表の配列番号１に記載の塩基配列を得た。
ＰＣＲ法は、以下に記載のＰＣＲ反応液（５０μｌのＰＣＲ反応液の組成）を用いて、高熱ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｋｓ  Ｇｆｌｅｘ（登録商標）  ＤＮＡ  ｐｌｙｍｅｒａｓｅ、Ｔａｋａｒａ社）によるＤＮＡ増幅をサーマルサイクラー（ＧｅｎｅＡｔｌａｓ４８２、アステック社）により行った。
【００４７】
ＰＣＲ反応液の組成；
Ｔｓｋ  Ｇｆｌｅｘ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ    １μｌ
２ｘ  ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ                        ２５μｌ
Ｘ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ  ゲノムＤＮＡ      １μｌ（３００ｎｇ）
Ｐｒｉｍｅｒ  １（配列番号２）              １μｌ（２０  ｐｍｏｌ）
Ｐｒｉｍｅｒ  ２（配列番号３）              １μｌ（２０  ｐｍｏｌ）
Ｈ２Ｏ                        ２１μｌ
【００４８】
ＰＣＲは、９４℃で６０秒処理した後、９８℃で１０秒、６０℃で１５秒、６８℃で９０秒を１サイクルとして、３０サイクル繰り返した。
【００４９】
得られた配列番号１に記載の塩基配列、ニワトリアクチンプロモーター（アクセションＮｏ．ＤＩ０７５０３６を含む配列、Ｍａｔｓｕｏ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９１）  Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｆａｃｔｏｒ  ｔｏ  ａｎ  ｅｎｈａｎｃｅｒ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｉｓｓｕｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｈｉｃｋｅｎ  ａｌｐｈａ−ａ−ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎ  ｇｅｎｅ．    Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，  １１３，  ５３９−５５０に記載）及びＧＦＰ遺伝子（商品名ｐＥＧＦＰ  ｖｅｃｔｏｒ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて、まず、比較用のプラスミド（ｐｒｏｍｏｔｅｒ／ＧＦＰ／ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）を作製した。続いて、プロモーターの上流にある制限酵素ＳｍａＩサイトを用いて、プラスミドを直線化し、ＰＣＲにより増幅したＢ４−３ｋ配列を挿入した（Ｂ４−３ｋ／ｐｒｏｍｏｔｅｒ／ＧＦＰ／ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）。作製したプラスミドコンストラクト（Ｂ４−３ｋ／ｐｒｏｍｏｔｅｒ／ＧＦＰ／ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）の模式図を図１に示す。
Ｂ４−３ｋ／ｐｒｏｍｏｔｅｒ／ＧＦＰと、ｐｒｏｍｏｔｅｒ／ＧＦＰとを各１ｎｇ、アフリカツメガエル卵母細胞（ワタナベ養殖社）の核内に常法に従い注入し、２４時間、ＭＭＲ培地を用いて培養した。
その後、蛍光顕微鏡（Ｍ２０５ＦＡ、ライカ社）下で観察した。
結果を図２に示す。図２から明らかである通り、Ｂ４−３ｋ／ｐｒｏｍｏｔｅｒ／ＧＦＰを注入した卵母細胞では、ＧＦＰタンパク質の強い発現が確認できた。なお、図２の右側上段は、多数の卵母細胞が発色している様子を示し、右側下段は、１つの卵母細胞の拡大写真を示したものである。
以上より、転写制御ポリヌクレオチドは、３’末端に結合されたタンパク質をコードする遺伝子を両生類卵母細胞に発現させるためのエンハンサー配列として機能し得ることが明らかになった。
【００５０】
［実施例２］
実施例１で用いたＧＦＰの代わりに、タンパク質Ａをコードする遺伝子を用いて、実施例１に記載の方法と同様に両生類卵母細胞に挿入する。その結果、両生類卵母細胞にタンパク質Ａを発現させることができる。
【００５１】
［実施例３］
配列番号１に記載の転写制御ポリヌクレオチドと、タンパク質Ａをコードする遺伝子とを染色体中に挿入したトランスジェニックカエルを、Ｐａｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２００６）  Ｉ−ＳｃｅＩ  ｍｅｇａｎｕｃｌｅａｓｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  Ｘｅｎｏｐｕｓ．  Ｄｅｖ．  Ｄｙｎ．  ２３５，  ２４７−２５２．に記載の方法に従い作製する。その結果、トランスジェニックカエルの卵巣中にタンパク質Ａを発現する雌個体を作製することができる。また、その雌個体の子孫も同様に、卵巣中にタンパク質Ａを発現し得る。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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