(57)【要約】      （修正有）【課題】ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）関連腫瘍及び他のサイクリン依存性キナーゼ阻害因子ｐ１６ＩＮＫ４ａ発現腫瘍の治療法及び予防法のための手段を提供する。【解決手段】Ｔ細胞のＩＦＮ−γ分泌を増大させるか、又はＴ細胞の増殖を誘導することが可能なサイクリン依存性キナーゼ阻害因子ｐ１６の特定のアミノ酸配列を有する断片、及びＨＰＶ関連癌、又は他のｐ１６ＩＮＫ４ａ発現癌、好ましくは進行癌に対する免疫性を個体に与えるための該断片の使用。前記断片をコードする核酸配列を含有するベクター。前記ベクターがプラスミド又はウイルスベクター。前記の断片、核酸、ベクターを含有する医薬組成物。新生物又は腫瘍を予防又は治療するためのワクチン生産のための前記ベクターの使用。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
サイクリン依存性キナーゼ阻害因子ｐ１６ＩＮＫ４の断片であって、ｐ１６ＩＮＫ４ａに対する免疫応答を誘導することが可能であり、
（ａ）以下のアミノ酸配列のいずれか１つ：
（ａ１）ＭＥＰＡＡＧＳＳＭＥＰＳＡＤＷＬＡＴＡＡＡＲＧＲＶ、
（ａ２）ＴＡＡＡＲＧＲＶＥＥＶＲＡＬＬＥＡＧＡＬＰＮＡＰＮＳＹ、
（ａ３）ＬＰＮＡＰＮＳＹＧＲＲＰＩＱＶＭＭＭＧＳＡＲＶＡＥＬＬ、
（ａ４）ＶＭＭＭＧＳＡＲＶＡＥＬＬＬＬＨＧＡＥＰＮＣＡＤＰＡＴＬＴＲ、
（ａ５）ＡＤＰＡＴＬＴＲＰＶＨＤＡＡＲＥＧＦＬＤＴＬＶＶＬＨＲＡＧＡＲＬ、
（ａ６）ＨＲＡＧＡＲＬＤＶＲＤＡＷＧＲＬＰＶＤＬＡＥＥＬＧＨＲＤＶＡＲ、
（ａ７）ＧＨＲＤＶＡＲＹＬＲＡＡＡＧＧＴＲＧＳＮＨＡＲＩＤＡＡＥＧＰＳＤＩＰＤ、
（ｂ）依然としてｐ１６ＩＮＫ４ａに対する免疫応答を誘導することが可能な、（ａ）の断片の機能的等価物、又は、
（ｃ）（ａ）及び／若しくは（ｂ）の断片の組合せ、
からなる、サイクリン依存性キナーゼ阻害因子ｐ１６ＩＮＫ４の断片。
【請求項２】
請求項１に記載の断片をコードする核酸配列、又は該核酸配列を含有するベクター。
【請求項３】
前記ベクターがプラスミド又はウイルスベクターである、請求項２に記載のベクター。
【請求項４】
前記ウイルスベクターがポックスウイルス、アデノウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、アルファウイルス由来のベクター、又はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、請求項３に記載のウイルスベクター。
【請求項５】
前記ポックスウイルスがワクシニアウイルス、ＮＹＶＡＣ、アビポックスウイルス、カナリア痘ウイルス、ＡＬＶＡＣ、ＡＬＶＡＣ（２）、鶏痘ウイルス又はＴＲＯＶＡＣである、請求項４に記載のポックスウイルス。
【請求項６】
請求項１に記載の断片、請求項２に記載の核酸、又は請求項２〜５のいずれか一項に記載のベクターを含有する医薬組成物。
【請求項７】
ｐ１６を発現する前がん状態、新生物又は腫瘍を予防又は治療するワクチンの生産のための請求項１に記載の断片、請求項２に記載の核酸、又は請求項２〜５のいずれか一項に記載のベクターの使用。
【請求項８】
ｐ１６を発現する前がん状態、新生物又は腫瘍を予防又は治療する方法に使用される、請求項１に記載の断片、請求項２に記載の核酸、又は請求項２〜５のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項９】
前記ｐ１６を発現する腫瘍が進行癌である、請求項７又は８に記載の使用。
【請求項１０】
前記ｐ１６を発現する腫瘍が進行肉腫である、請求項７又は８に記載の使用。
【請求項１１】
前記腫瘍が肛門性器腫瘍又は頭頸部腫瘍である、請求項７又は８に記載の使用。
【請求項１２】
前記腫瘍が、食道胃腸管若しくは肝膵胆管の腫瘍、皮膚腫瘍、又は気道の腫瘍である、請求項７又は８に記載の使用。
【請求項１３】
前記腫瘍が腎尿路、乳房、卵巣、子宮内膜又は前立腺の腫瘍である、請求項７又は８に記載の使用。
【請求項１４】
前記腫瘍が、脳腫瘍を含む神経系の腫瘍である、請求項７又は８に記載の使用。
【請求項１５】
前記腫瘍が、ＨＰＶ関連腫瘍である、請求項７又は８に記載の使用。
【請求項１６】
前記肛門性器癌が子宮頸癌である、請求項１１に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サイクリン依存性キナーゼ阻害因子ｐ１６ＩＮＫ４ａの特定の断片、及びｐ１６ＩＮＫ４ａ発現腫瘍に対する免疫性を個体に与えるための該断片の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
世界中で毎年数百万人の人々が癌に罹患し、癌が原因で死亡している。集中治療法の研究にもかかわらず、これらの死亡率は何年も変化していない。従来、癌を患う患者は、癌を切除する外科手術、又は化学療法若しくは放射線療法を受けなければならないことが多い。しかしながら、これは、癌を患う患者の死亡率の一因となる非常に過度の副作用を伴う。興味深いことに、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）は、全てのがんの５％超の発生に関連する（非特許文献１）。予防的なＨＰＶワクチン接種が既に利用可能であるが、既に感染した人々においては治療効果は示されていない（非特許文献２）。このため、新規の治療選択が必要とされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Parkin and Bray, 2006
【非特許文献２】Hildesheim et al., 2007
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
したがって、本発明の目的は、ＨＰＶ関連腫瘍及び他のｐ１６ＩＮＫ４ａ発現腫瘍の治療法及び予防法のための手段を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明によると、この目的は、特許請求の範囲において規定される主題によって達成される。本発明につながる研究は、細胞が、ＨＰＶがん遺伝子産物Ｅ７による負のフィードバックループの破壊のために形質転換された、おそらくは悪性の表現型を獲得した場合に、細胞タンパク質ｐ１６ＩＮＫ４がＨＰＶ感染細胞において発現されるという観察によるものであった（Sano et al., 1998、Klaes et al., 2001）。このため、ｐ１６ＩＮＫ４ａは、子宮頸部、外陰部、膣、陰茎、肛門及び頭頸部の腫瘍を含む、ほぼ全てのＨＰＶ誘導癌及び高悪性度の前がん状態において強く発現される（Ishikawa et al., 2006、Samama et al., 2006、Missaoui et al., 2006、Santos et al., 2006、Roma et al., 2008、Hafkamp et al., 2003）。生理的条件下では、ｐ１６ＩＮＫ４は、その後の老化を受ける細胞においてのみ発現され、したがって正常組織において発現された状態で見られることはほとんどない（Beausejour et al., 2007）。ＨＰＶ関連腫瘍におけるＨＰＶがん遺伝子によって推進されるｐ１６ＩＮＫ４ａの発現に加えて、一部の黒色腫及び非黒色腫皮膚がん（Nindl et al., 2004、Busch et al., 2010）、肺がん（Leversha et al., 2003、Esposito et al., 2004）、食道がん、胃がん及び結腸直腸がん（Ding et al., 2010、Kim et al., 2005）、並びに腎臓がん、膀胱がん、卵巣がん、子宮内膜がん及び乳がん（Ikuerowo et al. 2007、Buza et al., 2010、Giordano et al., 2008、Giordano et al., 2007、di Vinci et al., 2005）を含む、ＨＰＶ感染と関連しない様々な腫瘍、又はＨＰＶが見られるが、ウイルスによる発がんが証明されていない腫瘍においても、ｐ１６ＩＮＫ４ａは過剰発現された状態で見られる。網膜芽細胞腫抑制遺伝子の突然変異がｐ１６ＩＮＫ４ａ発現の上方調節をもたらすことが知られている（Okamoto et al., 1994）。しかしながら、これらの例における強いｐ１６ＩＮＫ４ａ発現の基礎にある機序は、より不均一であり、最終的に理解されない可能性が最も高い。
【０００６】
がん細胞における内在性遺伝子産物の過剰発現は、腫瘍関連抗原の貴重な情報源であることが昔から認識されている。かかる抗原に対する免疫応答は様々ながん患者において観察されており、免疫療法試験が進んでいる（Jaeger et al., 2003、Finn, 2008、Rescigno et al., 2007）。
【０００７】
本発明につながる実験において、健常個体の末梢血サンプルから単離されたＴリンパ球が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでｐ１６ＩＮＫ４ａ由来ペプチドによって特異的に刺激され得ること、並びに子宮頸がん患者に由来するＣＤ４＋  Ｔ細胞及びＣＤ８＋  Ｔ細胞が、同じｐ１６ＩＮＫ４ａペプチドに対する自発的反応性を示し、共培養したＨＬＡ適合ｐ１６ＩＮＫ４ａ負荷細胞及び子宮頸がん細胞株を攻撃し、死滅させることが可能である細胞傷害性Ｔ細胞株を生じることを実証することができた。言い換えると、ｐ１６ＩＮＫ４の断片は高度に免疫原性であり、ｐ１６ＩＮＫ４に対する非常に強い免疫応答を誘導する。さらに、ｐ１６ＩＮＫ４ａに対する体液性免疫応答も検出可能であることが実証されている。
【０００８】
記載のｐ１６ＩＮＫ４の発現パターン、及びいかなる自己免疫疾患とも関連しないｐ１６ＩＮＫ４に対する自発的免疫応答の研究結果から、ｐ１６ＩＮＫ４はｐ１６ＩＮＫ４ａ発現がんを有する患者の免疫付与に有望な候補となる。ｐ１６ＩＮＫ４に対する積極的に誘導された強い免疫応答は、ＨＰＶ形質転換細胞及び他のｐ１６ＩＮＫ４ａ発現がん細胞を特異的に破壊することができた。これらのｐ１６ＩＮＫ４ペプチドによるドナーＴ細胞のワクチン接種を細胞培養実験において行った。ｐ１６ＩＮＫ４ペプチドを用いた更なる実験から、子宮頸がん患者における自発的Ｔ細胞応答が明らかとなり、特定のｐ１６ＩＮＫ４ペプチドがｉｎ  ｖｉｖｏでも免疫原性であることが確認された。このため、これらのペプチドを用いた免疫付与に基づくがんの予防法又は治療法は、患者に対して幾つかの利益を有するはずである。ｐ１６ＩＮＫ４は、ＨＰＶタイプにかかわらず全てのＨＰＶ関連がんにおいて、また様々な他のがんタイプにおいて強く発現される。ｐ１６ＩＮＫ４が正常組織ではほとんど発現されず、ｐ１６ＩＮＫ４に対する自発的免疫応答を有する個体において自己免疫現象が観察されていないため、ｐ１６ＩＮＫ４免疫付与の重度の副作用は予想されない。最後に、ｐ１６ＩＮＫ４発現は腫瘍細胞の悪性の表現型と複雑に関連するため、抗原欠損に起因する免疫回避の可能性は極めて低い。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】ｐ１６ＩＮＫ４ａペプチドによるドナーＴ細胞の刺激前（Ａ）及び刺激後（Ｂ）のＥＬＩＳｐｏｔ（インターフェロンγ）の結果を示す図である。スポット数を、ペプチドを含まないウェルにおけるバックグラウンドスポット検出を減算することによって正規化する。Ｂから、０日目と比較した、ペプチドｐ１６ＩＮＫ４ａ＿３７−６３、ｐ１６ＩＮＫ４ａ＿５１−８０及びｐ１６ＩＮＫ４ａ＿７３−１０４で刺激した細胞におけるスポット数の増加が明らかになる。ＣＥＦ＝ＣＭＶ、ＥＢＶ、インフルエンザ（ｆｌｕ）のペプチドミックス陽性対照。
【図２】陽性対照ウイルスミックス（ＣＥＦ）及び７つの３０ｍｅｒ  ｐ１６ＩＮＫ４ａペプチド（表１）に対する２３人の患者（Ｔｘ及びＦｘ）及び１５人の健常対照（ＢＣｘ）におけるＥＬＩＳｐｏｔ（インターフェロンγ）の結果を示す図である。結果をバックグラウンド補正し、カットオフ（陰性対照ウェルにおけるスポット数の２倍＋それぞれのｐ１６ＩＮＫ４ａペプチドに対する反応性の２標準偏差）を超えるスポットのみを検討する。２人の個体がＣＤ４＋応答を有し、残りの個体がＣＤ８＋応答を有していた。ｎａ＝分析せず。
【図３】クロム放出アッセイを示す図である。子宮頸がん患者（ＨＬＡ  Ａ２、Ａ３、Ｂ７、Ｂ１５、Ｃｗ３、Ｃｗ７）に由来するＣＤ８  Ｔ細胞は、ｐ１６ＩＮＫ４ａ＿３７−６３を負荷したＨＬＡ適合Ｂ細胞（黒四角）の溶解を誘導するが、ｐ１６ＩＮＫ４ａペプチドを含まない同じＢ細胞（白三角）の溶解は誘導しない。子宮頸がん細胞株ＨｅＬａ（ｐ１６ＩＮＫ４ａ＋、ＨＬＡ  Ａ６８、Ｂ１５、Ｂ９５、Ｃｗ７、Ｃｗ１２）及びＣａｓｋｉ（ｐ１６ＩＮＫ４ａ＋、ＨＬＡ  Ａ２、Ａ３、Ｂ７、Ｂ３７、Ｃｗ５、Ｃｗ７）は溶解されるが、ＭＥ１８０及びＫ５６２の溶解は検出されない。
【図４】７つのｐ１６ＩＮＫ４ａペプチド（表１）による刺激後の子宮頸部異形成を有する女性に由来する末梢血単核細胞の増殖を示す図である。ＰＢＭＣとｐ１６ＩＮＫ４ａペプチド、陽性対照（マイトジェンＰＨＡ及び破傷風トキソイド）及び陰性対照（抗原なし）とのインキュベーション後に行ったＢｒｄＵ増殖アッセイの光学密度を示す。点線は陽性応答のカットオフを示す。アスタリスクは増殖を誘導するｐ１６ＩＮＫ４ａペプチドを示す。３人の反応を示す患者及び１人の陰性患者からの結果を示す。
【図５】ウエスタンブロットにおける血清学的ｐ１６ＩＮＫ４ａ反応性を示す図である。（ａ）（１）精製Ｈｉｓタグ付きｐ１６ＩＮＫ４ａの銀染色。（２）モノクローナルｐ１６ＩＮＫ４ａ抗体Ｅ６Ｈ４を用いた精製Ｈｉｓタグ付きｐ１６ＩＮＫ４ａのウエスタンブロット。（ｂ）６つの代表的な陽性血清を示す。タンパク質サイズは、組換えタンパク質に対するモノクローナル抗体（Ｅ６Ｈ４）の反応に対応する。（ｃ）陰性血清の例（１及び２）。（ｄ）血清と組換えｐ１６ＩＮＫ４ａとのプレインキュベーションの前（１）及び後（２）のｐ１６ＩＮＫ４ａ血清の反応性。（３）子宮頸がん患者から得られた血清によって沈殿し、ＨＲＰ直接標識ｐ１６ＩＮＫ４ａモノクローナル抗体によって検出されるｐ１６ＩＮＫ４ａタンパク質の検出（Reuschenbach et al., 2008）。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
したがって、本発明は、ｐ１６ＩＮＫ４ａに対する免疫応答を誘導することが可能なサイクリン依存性キナーゼ阻害因子ｐ１６Ｉｎｋ４の特定の断片に関する。免疫応答は、以下の基準の少なくとも１つを満たす状態として定義される：１．ＥＬＩＳｐｏｔ、又は細胞内サイトカイン染色、又はサイトカインＥＬＩＳＡ、又は同等の方法によってバックグラウンドを超えるものとして（as above background）測定可能な、細胞傷害性アッセイ、若しくはＩＦＮ−γ分泌、若しくはパーフォリン発現、若しくはグランザイムＢ発現、若しくはＣＤ８陽性Ｔ細胞によって産生され得る他のサイトカインによって検出可能なＣＤ８陽性Ｔ細胞の誘導。２．ＥＬＩＳｐｏｔ、又は細胞内サイトカイン染色、又はサイトカインＥＬＩＳＡ、又は同等の方法によってバックグラウンドを超えるものとして測定可能な、サイトカイン分泌によって検出可能なＣＤ４陽性Ｔ細胞の誘導。サイトカインはＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、ＴＮＦ−α、ＴＧＦ−β、又はＣＤ４陽性Ｔ細胞によって産生され得る他のサイトカインを含み得る。３．ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、及び同等又は関連の方法によって検出可能な抗体の誘導。４．１及び２に記載のＣＤ８陽性Ｔ細胞又はＣＤ４陽性Ｔ細胞によって媒介されない、任意の種類の細胞性免疫応答の誘導。
【００１１】
サイクリン依存性キナーゼ阻害因子ｐ１６ＩＮＫ４ａの断片は、
（ａ）以下のアミノ酸配列のいずれか１つ：
（ａ１）ＭＥＰＡＡＧＳＳＭＥＰＳＡＤＷＬＡＴＡＡＡＲＧＲＶ、
（ａ２）ＴＡＡＡＲＧＲＶＥＥＶＲＡＬＬＥＡＧＡＬＰＮＡＰＮＳＹ、
（ａ３）ＬＰＮＡＰＮＳＹＧＲＲＰＩＱＶＭＭＭＧＳＡＲＶＡＥＬＬ、
（ａ４）ＶＭＭＭＧＳＡＲＶＡＥＬＬＬＬＨＧＡＥＰＮＣＡＤＰＡＴＬＴＲ、
（ａ５）ＡＤＰＡＴＬＴＲＰＶＨＤＡＡＲＥＧＦＬＤＴＬＶＶＬＨＲＡＧＡＲＬ、
（ａ６）ＨＲＡＧＡＲＬＤＶＲＤＡＷＧＲＬＰＶＤＬＡＥＥＬＧＨＲＤＶＡＲ、
（ａ７）ＧＨＲＤＶＡＲＹＬＲＡＡＡＧＧＴＲＧＳＮＨＡＲＩＤＡＡＥＧＰＳＤＩＰＤ、
（ｂ）依然としてｐ１６ＩＮＫ４ａに対する免疫応答を誘導することが可能な、（ａ）の断片の機能的等価物、又は、
（ｃ）（ａ）及び／若しくは（ｂ）の断片の組合せ、
からなる。
【００１２】
「機能的等価物」という用語は、本明細書中で使用される場合、例えば、依然としてｐ１６ＩＮＫ４ａに対する免疫応答を誘導することが可能であり、したがって依然として有効なワクチンとして有用である（ａ）の変異体又は断片に関する。変異体はアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を特徴とする。好ましくは、アミノ酸差異は１つ又は複数の保存的なアミノ酸置換に起因するものである。「保存的なアミノ酸置換」という用語は、脂肪族又は疎水性のアミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ及びＩｌｅの置き換え、ヒドロキシル残基Ｓｅｒ及びＴｈｒの置き換え、酸性残基Ａｓｐ及びＧｌｕの置き換え、アミド残基Ａｓｎ及びＧｌｎの置き換え、塩基性残基Ｌｙｓ、Ａｒｇ及びＨｉｓの置き換え、芳香族残基Ｐｈｅ、Ｔｙｒ及びＴｒｐの置き換え、並びに小型アミノ酸Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ及びＧｌｙの置き換えを包含する。
【００１３】
特定の程度の同一性を示すペプチドの生成については、ペプチド機能に重要な領域を同定するために、例えば遺伝子操作を用いてクローン化ＤＮＡ配列の特定の位置にアミノ酸変化を導入することができる。例えば、部位特異的突然変異誘発又はアラニンスキャニング突然変異誘発（分子内の残基毎の単一のアラニン突然変異の導入）を用いることができる（Cunningham and Wells, 1989）。次いで、得られる突然変異分子を、実施例のアッセイを用いて免疫原性について試験することができる。
【００１４】
好ましくは、変異体は８個以下のａａ、より好ましくは６個以下のａａ、更により好ましくは４個以下のａａの置換、欠失及び／又は付加を特徴とする。
【００１５】
元のｐ１６Ｉｎｋ４ａ断片の断片において、特定のアミノ酸配列の少なくとも５個の連続したａａ、好ましくは少なくとも１０個の連続したａａ、より好ましくは少なくとも１５個の連続したａａ、更により好ましくは少なくとも２０個の連続したａａが残存する。かかる断片は、依然としてｐ１６ＩＮＫ４ａに対する免疫応答を誘導することが可能であり、したがって依然として有効なワクチンとして有用である。
【００１６】
本発明は、本発明の断片をコードする核酸、又はかかる核酸を含有するベクターも提供する。生きた宿主への遺伝物質の直接注射によって、その細胞の少量が導入遺伝子産物を産生する。宿主内でのこの不適切な遺伝子発現は、重大な免疫学的重要性を有し、遺伝子送達抗原に対する宿主の特異的な免疫活性化をもたらす。裸のプラスミドＤＮＡの直接注射は、その遺伝子ワクチンによってコードされる抗原に対する強い免疫応答を誘導する。プラスミドＤＮＡ構築物を注射すると、宿主細胞は外来ＤＮＡを取り込み、ウイルス遺伝子を発現し、ｐ１６ＩＮＫ４ａが細胞内で産生される。このような形の抗原提示及びプロセシングは、ＭＨＣクラスＩ及びＭＨＣクラスＩＩの両方によって制限される細胞性及び体液性の免疫応答を誘導する。ＤＮＡワクチンは、通常は２つの単位（プロモーター／エンハンサー配列、それに続く抗原（ＦＳＰ）コード配列及びポリアデニル化配列から構成される抗原発現単位、並びにベクターの増幅及び選択に必要とされる配列から構成される産生単位）を含有するベクターから構成される。ワクチンインサート（inserts）を含むベクターの構築は、組換えＤＮＡ技術を用いて達成され、このアプローチに使用することのできるベクターは当業者に既知である。ＤＮＡ免疫付与の効率は、ＤＮＡを分解に対して安定化すること、及び抗原提示細胞へのＤＮＡ送達の効率を増大させることによって改善することができる。これは、生分解可能なカチオン性微粒子（例えば、臭化セチルトリメチルアンモニウムを配合したポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド））にＤＮＡをコーティングすることによって実証されている。かかるＤＮＡコーティング微粒子は、とりわけアラム（alum）と混合した場合に、ＣＴＬを惹起する点で組換えワクシニアウイルスと同程度に効果的である。直径３００ｎｍの粒子が、抗原提示細胞による取り込みに最も有効なようである。
【００１７】
様々な発現ベクター、例えばプラスミド又はウイルスベクターを利用して、本発明の断片をコードする核酸配列を含有させ、発現させることができる。
【００１８】
好ましいウイルスベクターがポックスウイルス、アデノウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、又はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。特に好ましいポックスウイルスがワクシニアウイルス、ＮＹＶＡＣ、アビポックスウイルス、カナリア痘ウイルス、ＡＬＶＡＣ、ＡＬＶＡＣ（２）、鶏痘ウイルス又はＴＲＯＶＡＣである。
【００１９】
アルファウイルス由来の組換えベクターも、ＤＮＡワクチン接種の効率を改善するために使用されている。本発明の断片をコードする遺伝子をアルファウイルスレプリコンに挿入して、構造遺伝子を置き換えるが、非構造性レプリカーゼ遺伝子は無傷のままにする。シンドビスウイルス及びセムリキ森林熱ウイルスが、組換えアルファウイルスレプリコンを構築するために使用されている。しかしながら、従来のＤＮＡワクチン接種とは異なり、アルファウイルスベクターは一時的にしか発現されない。アルファウイルスレプリコンは、このベクターによって発現される高レベルのタンパク質に起因した免疫応答、レプリコン誘導性サイトカイン応答、又はレプリコン誘導性アポトーシスを惹起し、樹状細胞による抗原取り込みの向上がもたらされる。
【００２０】
本発明は、本発明の断片、核酸配列又はベクターを、好ましくは１つ又は複数の一般的な助剤とともに、個体の免疫付与に好適な量で含有する医薬組成物も提供する。かかる断片、核酸配列又はベクターは、単独で、又は担体と組み合わせて存在し得る。担体が個体中で免疫原性を示さないことが好都合である。かかる担体は、個体自身のタンパク質若しくは外来タンパク質、又はそれらの断片であり得る。血清アルブミン、フィブリノーゲン若しくはトランスフェリン、又はそれらの断片等の担体が好ましい。断片は、細胞傷害性Ｔ細胞、例えばＣＤ８＋  Ｔ細胞又はＣＤ４  Ｔ細胞によって認識され、免疫応答を誘導し得るエピトープを含有する。細胞周期調節タンパク質のかかるエピトープは、当業者が精通している方法によって決定することができる。様々な断片が同時に存在することも有益であり得る。上記の断片の組換え生産については、例えばSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor N.Y. (1989)を参照する。
【００２１】
本発明は、ｐ１６ＩＮＫ４ａを発現する前がん状態、新生物又は癌（進行癌を含む）を予防又は治療するワクチンの生産のための本発明の断片、核酸配列又はベクターの使用にも関する。
【００２２】
これらは例えば、ＨＰＶ誘導性のｐ１６ＩＮＫ４ａを発現する肛門性器癌、特に子宮頸癌又は頭頸部がん、及び非ＨＰＶ誘導性のｐ１６ＩＮＫ４ａ発現腫瘍であり得る。同様に、乳頭腫、腺腫、過形成等の良性の形態（modifications）、又は上皮、間葉若しくは造血細胞の増殖等の同様の増殖も、これらの一つに数えられる。
【００２３】
用いられる「個体」という用語は、癌に罹患し得る任意の種類の個体を含む。かかる個体の例はヒト及び動物、並びにそれらの細胞である。
【００２４】
用いられる「個体の免疫付与に好適な量」という用語は、上記の説明が適用され、個体に免疫性を与えることのできる、本発明の断片の任意の量を含む。その量は例えば、免疫付与が予防的処置を目的とするか、又は治療的処置を目的とするかに応じて異なる。加えて、個体の年齢、性別及び体重も量の決定に影響を与える。個体に１００μｇ〜１ｇのｐ１６断片を注射によって与えることが好都合である。注射は個体の様々な部位で筋肉内、皮下、皮内に、又は任意の他の適用形態で行うことができる。ほぼ等量の１回又は複数回の「ブースター注射」を行うことも好都合であり得る。この場合、それぞれの細胞周期調節タンパク質の種々の断片を個々の注射に使用することが特に好都合であり得る。
【００２５】
用いられる「一般的な助剤」という用語は、個体に免疫性を与える医薬組成物に好適な任意の助剤を含む。かかる助剤は例えば、ＧＭ−ＣＳＦ又はフロイントアジュバント等の免疫アジュバント（immunization adjuvants）、緩衝食塩溶液、水、油／水エマルション等のエマルション、湿潤剤、滅菌溶液等である。
【００２６】
本発明を用いて、個体、特にヒト及び動物に免疫性を与えることが可能である。免疫付与は、抗体の誘導及びＴ細胞の刺激の両方によって行われる。これにより、前がん状態、新生物及び癌に対する予防的及び治療的な措置を講じることが可能である。
【００２７】
本発明を下記の実施例によって説明する。
【実施例】
【００２８】
実施例１
ＨＰＶ関連新生物を有する患者におけるｐ１６ＩＮＫ４ａペプチドに対するＴ細胞反応性
ＨＰＶ関連腫瘍を有する患者が、強く過剰発現したｐ１６ＩＮＫ４ａに対してＴ細胞応答を惹起するか否か、及びその程度を評価するために、ｐ１６ＩＮＫ４ａ抗原に対する免疫応答の詳細な特性化を可能にする種々の方法を適用した。子宮頸がん患者におけるｐ１６ＩＮＫ４ａに対する自発的免疫応答の研究結果は、一般的な抗原及び特定のｐ１６ＩＮＫ４ａ断片の免疫原性を証明し、ｐ１６ＩＮＫ４ａ断片を用いてｐ１６ＩＮＫ４ａ発現腫瘍を有する患者に免疫性を与えることの根拠を提供する。
【００２９】
ｐ１６ＩＮＫ４ａを発現する高悪性度の子宮頸部異形成（ＣＩＮ２／３）を有する１３人の女性に由来する末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、ｐ１６ＩＮＫ４ａペプチド（表１）とともにインキュベートし、ｐ１６ＩＮＫ４ａペプチドによるチャレンジ後のリンパ球増殖能の包括的尺度としてＢｒｄＵアッセイを適用することによって、免疫細胞の増殖能を決定した。ＢｒｄＵアッセイは、ＤＮＡ合成時のチミジン類似体５−ブロモ−２’−デオキシウリジンの取り込みの測定に基づく、細胞増殖の定量化に適用される比色イムノアッセイである。１０％ヒト血清を添加したＩＭＤＭ培地中のＰＢＭＣを、９６ウェルマイクロタイタープレート（平底）に、１５００００細胞／５０μｌ／ウェルの密度で播種した。各々の４連（4 replicate）ウェル内の細胞を、７つのｐ１６ＩＮＫ４ａペプチド（表１）、陽性対照として破傷風トキソイド（２０ｎｇ／ｍｌ、Calbiochem（La Jolla，CA））及びマイトジェンＰＨＡ−Ｌ（５μｇ／ｍｌ、Roche（Mannheim，Germany））の存在下（陰性対照では抗原の非存在下）で、３７℃、５％ＣＯ２で６日間インキュベートした。６日目に、ＩＭＤＭ培地＋１０％ヒト血清で１：１００に希釈した、１０μｌ／ウェルのＢｒｄＵ標識溶液（全てのＢｒｄＵアッセイ試薬は、Roche（Mannheim，Germany）によるＣｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ＥＬＩＳＡ、ＢｒｄＵ（ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ）のものを使用した）を各々のウェルに添加し、更に１８時間にわたって３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。７日目に、プレートを１２００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、５０μｌの上清を取り出し、新たなＶ字底プレートに移し、最終的にサイトカイン分析のために−８０℃で貯蔵した。残りの細胞を、ヘアドライヤーを用いて約１５分間乾燥させ、１５０μｌ／ウェルのＦｉｘＤｅｎａｔ溶液を細胞に添加し、３０分間室温でインキュベートした後、ＦｉｘＤｅｎａｔをはじき飛ばし、慎重にタッピングすることによって除去した。１００μｌ／ウェルの抗ＢｒｄＵ−ＰＯＤ希釈標準溶液を添加し、室温で９０分間インキュベートした後、除去して１００μｌのＴＭＢ基質に置き換え、これを室温で３０分間インキュベートした。２５μｌ／ウェルの１Ｎ  Ｈ２ＳＯ４を添加することによって酵素反応を停止させ、光学密度（ＯＤ）を４５０ｎｍ（参照波長６２０ｎｍ）で測定した。陽性反応のカットオフを、抗原を含まない陰性対照ウェルにおけるＯＤの３倍の標準偏差として設定した。試験した１３人の女性のうち３人に由来するＰＢＭＣが、ｐ１６ＩＮＫ４ａペプチドに応答した増殖を示し、ペプチドとのインキュベーションが増殖性記憶Ｔ細胞の応答を活性化したことが示された。全体として、応答を誘導するペプチドのパターンは、不均一であり、ｐ１６抗原における様々なＴ細胞エピトープを示した。１人の患者がペプチドｐ１６ＩＮＫ４ａ＿１８−４４、ｐ１６ＩＮＫ４ａ＿３７−６３、ｐ１６ＩＮＫ４ａ＿７３−１０７及びｐ１６ＩＮＫ４ａ＿１２３−１５６に対する応答、１人の患者がペプチドｐ１６ＩＮＫ４ａ＿５１−８０及びｐ１６ＩＮＫ４ａ＿９８−１２８に対する応答、１人の患者がペプチドｐ１６ＩＮＫ４ａ＿１−２５及びｐ１６ＩＮＫ４ａ＿３７−６３に対する応答を示した（図４）。
【００３０】
特定のｐ１６断片が、Ｔｈ１応答の１つの兆候であるインターフェロンγの分泌を誘導することが可能であると証明するために、侵襲性子宮頸がん、及び強いｐ１６ＩＮＫ４ａ過剰発現を有する高悪性度の前がん病変（ＣＩＮ２／３）を有する２３人の患者に由来するＴ細胞を、インターフェロンγ  ＥＬＩＳｐｏｔアッセイにおいて７つのｐ１６ＩＮＫ４ａペプチド（表１）に対して試験した。Ｔ細胞を、ヘパリン添加血からＦｉｃｏｌｌ遠心分離、プラスチック接着法及び抗体結合磁気ビーズ（ＣＤ１１、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ３６、ＣＤ５６、汎Ｔ細胞単離キット（Milteny（Bergisch Gladbach，Germany））を用いて分離した。樹状細胞を、プラスチック接着細胞をＩＬ４及びＧＭ−ＳＣＦ（各々１０００Ｕ／ｍｌ）とともに７日間培養することによって生成し、ＥＬＩｓｐｏｔにおいて抗原提示細胞として使用した。各々１０５個のＴ細胞を、２×１０４個の樹状細胞によって提示されたそれぞれのペプチドによる短期間（２日間〜５日間）のｉｎ  ｖｉｔｒｏ前感作後に試験した。
【００３１】
７人の子宮頸がん患者におけるバックグラウンド（陰性対照ウェルにおけるスポットの２倍＋それぞれのｐ１６ＩＮＫ４ａペプチドに対する反応性の２標準偏差）を減算すると、ｐ１６ＩＮＫ４ａ＿３７−６３ペプチドに対して反応するＴ細胞（ＣＤ４又はＣＤ８）を同定することができた（図２）。
【００３２】
実施例２
ｐ１６ＩＮＫ４ａペプチドによる健常ドナーＴ細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏプライミング
各々が７個〜１３個のアミノ酸オーバーラップを有する、ｐ１６ＩＮＫ４ａアミノ酸配列の全体をカバーする７つの長鎖２５ｍｅｒ〜３５ｍｅｒペプチドを試験して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで健常ドナーからインターフェロンγ分泌Ｔ細胞を誘導することが可能なｐ１６ＩＮＫ４ａ断片を規定した（表１）。
【００３３】
【表１】
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【００３４】
ｐ１６ＩＮＫ４ａ断片が健常ドナーＴ細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで刺激して、インターフェロンγを分泌させ、最も免疫原性の高いｐ１６ＩＮＫ４ａ由来エピトープを同定することができることを示すために、健常ドナーの末梢血から単離されたＴ細胞が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでこれらのｐ１６ＩＮＫ４ａペプチドによって刺激され得るか否かを調査した。ｐ１６ＩＮＫ４ａペプチドが細胞培養実験において特異的なＴ細胞応答を誘導することが可能である場合、いわゆるＥＬＩＳｐｏｔ実験において、Ｔ細胞は、それぞれのｐ１６ＩＮＫ４ａペプチドでチャレンジするとサイトカインを分泌する。ＥＬＩＳｐｏｔアッセイでは、その後の呈色反応を用いて、サイトカイン（インターフェロンγ）を特異的な抗体によって検出することができる。
【００３５】
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、１人の健常ドナーのヘパリン添加血（１００ｍｌ）からＦｉｃｏｌｌ  Ｐｌａｑｕｅ密度勾配遠心分離によって単離した。５×１０７〜１０×１０７個のＰＢＭＣを、プラスチック接着法及び抗体結合磁気ビーズ（ＣＤ１１、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ３６、ＣＤ５６、汎Ｔ細胞単離キット、Milteny（Bergisch Gladbach，Germany））によって単球及びＴ細胞に分離した。単球を７日間にわたってＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４（各々１０００Ｕ／ｍｌ）とともに培養し、抗原提示樹状細胞を生成した。
【００３６】
２×１０７個のＴ細胞を、ｐ１６ＩＮＫ４ａペプチド（１０μｇ／ｍｌ）で事前にパルスした２×１０６個の樹状細胞とともに４時間インキュベートして、抗原の提示を達成した。７つのｐ１６ＩＮＫ４ａペプチドの各々について、別個の刺激アプローチを行った。
【００３７】
５週間にわたって７日毎に、Ｔ細胞をｐ１６ＩＮＫ４ａペプチドでパルスした樹状細胞によって再刺激し、ＩＬ−２及びＩＬ−７（１０Ｕ／ｍｌ）で処理した。
【００３８】
ｐ１６ＩＮＫ４ａペプチドに特異的なＴ細胞応答を、インターフェロンγ  ＥＬＩＳｐｏｔアッセイにおいて刺激前（０日目）及び最後の刺激後（３５日目）に測定した。ＥＬＩＳｐｏｔアッセイについては、９６ウェルニトロセルロースプレート（MilliporeのＭＡＨＡ  Ｎ４５５０）を、０．７５ｕｇ／ウェルの濃度の抗インターフェロンγ抗体１−Ｄ１Ｋ（Mabtech（Nacka Strand，Sweden））でコーティングした。各々１０５個のＴ細胞を、２×１０４個の樹状細胞によって提示されたそれぞれのペプチドを用いて試験した。３７℃で１２時間のインキュベーションの後、分泌されたインターフェロンγの検出を、ビオチン化二次抗インターフェロンγ抗体７ＢＧ−１（Mabtech）、ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼコンジュゲート及びＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質溶液（Sigma Aldrich（St. Louis，USA））を用いた検出によって達成した。
【００３９】
０日目では、７つのｐ１６ＩＮＫ４ａペプチドのいずれに対する反応性も検出可能でなく、陽性対照として使用したウイルスペプチドミックス（ＣＥＦ＝ＣＭＶ及びＥＢＶ及びｆｌｕ）に対してのみ反応性が検出可能であったが、３５日目では、ペプチドｐ１６ＩＮＫ４ａ＿３７−６３、ｐ１６ＩＮＫ４ａ＿５１−８０及びｐ１６ＩＮＫ４ａ＿７３−１０４で刺激したＴ細胞が、それぞれのｐ１６ＩＮＫ４ａペプチドでパルスした標的細胞に対して試験した場合に、ＥＬＩＳｐｏｔにおいてインターフェロンγ分泌の増大を示し、残りのｐ１６ＩＮＫ４ａペプチドでパルスした細胞に対して試験した場合にはこれは示されなかった（図１）。
【００４０】
実施例３
ｐ１６ＩＮＫ４ａ反応性Ｔ細胞による子宮頸がん細胞株の溶解
ｐ１６ＩＮＫ４ａを発現する子宮頸がん細胞を溶解する活性化Ｔ細胞の能力を、種々の子宮頸がん細胞株、及び標的としてｐ１６ＩＮＫ４ａペプチドを負荷したＨＬＡ適合Ｂ細胞を用いたクロム放出アッセイによって試験した。１０×６個の標的細胞（ペプチドを負荷したＨＬＡ適合Ｂ細胞、ペプチドを含まないＢ細胞）を、５１Ｃｒ（１００μＣｉ）とともに、その後、ＥＬＩｓｐｏｔアッセイにおいてペプチドｐ１６ＩＮＫ４ａ＿３７−６３を負荷した標的細胞に対して反応した１人の代表的な子宮頸がん患者に由来する種々の比率のＴ細胞とともに１時間インキュベートした。Ｔ細胞による標的細胞の特異的な溶解は、放出された放射能の検出によって測定することができる。
【００４１】
ＥＬＩｓｐｏｔアッセイにおいてペプチドｐ１６ＩＮＫ４ａ＿３７−６３を負荷した標的細胞に対して反応した子宮頸がん患者のＣＤ８＋  Ｔ細胞が、ｐ１６ＩＮＫ４ａ＿３７−６３ペプチドを負荷したＨＬＡ適合Ｂ細胞、並びに子宮頸がん細胞株ＨｅＬａ及びＣａｓｋｉ（どちらもＨＰＶ及びｐ１６ＩＮＫ４ａに陽性）を溶解することが可能であるが、ｐ１６ＩＮＫ４ａ＿３７−６３ペプチドを含まない同じＨＬＡ適合Ｂ細胞、並びに他のＨＰＶ及びｐ１６ＩＮＫ４ａに陰性の細胞株では溶解を検出することができないことを示すことができた（図３）。これらの結果は、ｐ１６ＩＮＫ４ａペプチド特異的Ｔ細胞の細胞傷害活性を実証し、ｐ１６ＩＮＫ４ａエピトープが子宮頸がん細胞上に提示され、患者のｐ１６ＩＮＫ４ａ反応性Ｔ細胞クローンによって認識されることを実証する。
【００４２】
実施例４
ｐ１６ＩＮＫ４ａに対する体液性免疫応答
９００個を超える血清の分析から、一部の個体が、ｐ１６ＩＮＫ４ａ由来エピトープに特異的に結合する抗体を生じ（図４）（Reuschenbach et al., 2008）、体液性免疫応答を誘導するｐ１６ＩＮＫ４ａの能力を示すことが更に実証された。
【００４３】
さらに、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＴ細胞による最も強いインターフェロンγ分泌を誘導するようであったペプチドｐ１６ＩＮＫ４ａ＿３７−６３に対しても、抗体を血清中で検出することができることが実証された。子宮頸がん、小細胞肺がん、頭頸部がんを有する患者及び健常個体に由来する合計で３７４個の血清を、ペプチドＥＬＩＳＡにおいて試験した。ペプチド（２０ｕｇ／ｍｌ）を、９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ、Nunc（Roskilde，Denmark））に４℃で一晩コーティングし、非特異的結合部位を０．５％カゼインでブロッキングし、血清をペプチドに対する抗体について１：１００で試験した。結合した血清抗体を、ＨＲＰ結合抗ヒトＩｇＧ抗体（Jackson Immuno（West Grove，USA））及びＴＭＢ基質（Sigma Aldrich（St. Louis，USA））によって検出した。バックグラウンドによって正規化した光学密度のカットオフ（０．０３）で、試験した血清の１５％（５６／３７４）がｐ１６ＩＮＫ４ａ＿３７−６３に対する抗体を有していた。
【００４４】
まとめると、これらの観察から、ＨＲ−ＨＰＶによって誘導される異形成又は新生物を患う患者が、抗ｐ１６ＩＮＫ４ａ免疫応答を生じることが可能であると実証される。この免疫応答によってＨＲ−ＨＰＶ形質転換細胞を排除することが可能であれば、ｐ１６ＩＮＫ４ａ抗原が、ｐ１６ＩＮＫ４ａ発現新生物（前がん状態）、特にＨＲ−ＨＰＶ誘導腫瘍を予防及び／又は治療する今後のワクチンにとって非常に魅力的な候補となり得る。
【００４５】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【外国語明細書】
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