(57)【要約】【課題】新たな発毛促進物質または発毛抑制物質のスクリーニング方法の提供。【解決手段】Runxにより発現が制御される遺伝子を含有する細胞およびRunxを被験物質の存在下および非存在下に培養し、両条件下における該遺伝子の産生量を比較することを特徴とする、発毛促進物質または発毛抑制物質のスクリーニング方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Runxにより発現が制御される遺伝子を含有する細胞およびRunxを被験物質の存在下および非存在下に培養し、両条件下における該遺伝子の産生量を比較することを特徴とする、発毛促進物質または発毛抑制物質のスクリーニング方法。
【請求項２】
以下の工程を含む、請求項１に記載の発毛促進物質のスクリーニング方法：
（ａ）Runxにより発現が制御される遺伝子を含有する細胞およびRunxを、被験物質の存在下および非存在下に培養する工程、
（ｂ）両条件下、該遺伝子の産生量を測定する工程、および
（ｃ）被験物質の非存在下と比較して、該遺伝子の産生量を増加させる被験物質を選択する工程。
【請求項３】
以下の工程を含む、請求項１に記載の発毛抑制物質のスクリーニング方法：
（ａ）Runxにより発現が制御される遺伝子を含有する細胞およびRunxを、被験物質の存在下および非存在下に培養する工程、
（ｂ）両条件下、該遺伝子の産生量を測定する工程、および
（ｃ）被験物質の非存在下と比較して、該遺伝子の産生量を減少させる被験物質を選択する工程。
【請求項４】
Runxにより発現が制御される遺伝子が、Gli1、Ptch1およびTnfrsf19からなる群から選択される遺伝子である、請求項１−３のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
【請求項５】
Runxにより発現が制御される遺伝子が、Gli1、Ptch1またはTnfrsf19のプロモーターに機能的に連結された遺伝子である、請求項１−３のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
【請求項６】
Gli1、Ptch1またはTnfrsf19のプロモーターに機能的に連結された遺伝子が、レポーター遺伝子である、請求項５に記載のスクリーニング方法。
【請求項７】
Runxにより発現が制御される遺伝子を含有する細胞およびRunxを含む、請求項１に記載のスクリーニング方法に用いるためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、発毛を促進する物質または発毛を抑制する物質のスクリーニング方法などに関する。
【背景技術】
【０００２】
体毛は毛包の先端に位置する毛母細胞が増殖・分化し、変化することにより形成される。毛包は胎生期に形成され、その数は出生後に変化することがない。毛髪は成長・脱毛を繰り返しており(ヘアサイクル)、このサイクルが停滞又は短縮した状態は脱毛症と呼ばれる。
【０００３】
医療現場で日常的に見られる脱毛症は、加齢に伴う壮年性脱毛症や精神的ストレスに伴う円形脱毛症のほか、癌や内分泌異常などの疾病に伴うものや抗癌剤等の薬剤による脱毛などが知られている。脱毛は、患者の容姿に大きく影響を及ぼすものであることから、根本的な治療法や予防法の開発が望まれている。一方、特に女性の場合、美的外観上、手足、腋などにおける体毛や髭などのむだ毛の処理が行われており、例えばシェーバーなどを用いる機械的除毛方法、脱毛剤を用いてむだ毛を毛根から除去する化学的除毛方法などの体毛除去方法が利用されている。
【０００４】
脱毛症に対する治療又は予防に用いられる薬剤としてはフェナステリド(商品名：プロペシア)又はミノキシジル(商品名：リアップ(登録商標))が市販されているが、これらの薬剤の適用は壮年性の脱毛症に限定されており、完全にヘアサイクルが停滞した場合には有効性を期待できないという問題がある。また、上記の機械的、化学的除毛方法に用いられる機器、除毛剤を用いる場合、物理的または化学的刺激により皮膚や毛包が傷つきやすいという弊害がある。このような状況下、新しい発毛剤や脱毛剤の提供が望まれている。
【０００５】
ところで、ヘッジホッグ分子（Shh（Sonic hedgehog）、Ihh（Indian Hedgehog）、Dhh（Desert Hedgehog））は、脊椎動物の器官形成やパターニングに極めて重要な役割を持つことが知られ、Ptch1およびPtch2の2つの遺伝子にコードされる細胞膜受容体にヘッジホッグ分子が結合して、その下流で働く転写因子Gliファミリー（Gli1、Gli2およびGli3）に情報が伝達される（非特許文献１）。Shhは最もよく知られている毛包形成促進因子であり、Shh欠損マウスの皮膚では、毛包形成不全により毛が生えない表現型を呈したことから、Shhは毛包の増殖やサイズを調節していることが示唆されている（非特許文献２、３）。また、発明者は、Runx2標的遺伝子探索研究を2000年頃から手がけ、マイクロアレイ解析により骨代謝におけるRunx2下流シグナルに着目して研究し、IhhがRunxファミリー転写因子（Runx1、Runx2およびRunx3）により発現調節され、骨の長軸方向への成長に極めて重要であることを明らかにしてきた（非特許文献４）。Runxファミリーは代替的に機能することができ、特異的DNA配列に結合することで作用が発揮され、Ihh遺伝子のプロモーター領域には種間（ヒトとマウス）で保存された7つのRunx結合配列を有する（非特許文献４）。最近、Runx1コンディショナルノックアウトマウスが作成され、keratin14プロモーターCreマウスとの交配から、生後のRunx1の発毛における役割が明らかになった（非特許文献５）。また、毛包には、すべてのRunxファミリー分子の発現が認められ（非特許文献６−８）、Runxファミリーによる発毛制御機構の存在が示唆されていた。さらに、Tnfrsf19は、発毛に関わることが示され、その遺伝子欠損マウスに発毛異常が認められ、毛包形成過程、すなわち胎生15日のころに異常が生じることが明らかにされている（非特許文献９）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】C.A. Callahan, A.E. Oro Monstrous attempts at adnexogenesis: regulating hair follicle progenitors through Sonic Hedgehog signaling Current Opinion in Genetics & Development, 11 (2001):541-546.
【非特許文献２】St-Jacques, H.R. Dassule, I. Karavanova, V.A. Botchkarev, J. Li, P.S. Danielian et al. Sonic Hedgehog signaling is essential for hair development Current Biology: CB, 8 (1998):1058-1068.
【非特許文献３】C. Chiang, R.Z. Swan, M. Grachtchouk, M. Bolinger, Y. Litingtung, E.K. Robertson et al. Essential role for Sonic Hedgehog during hair follicle morphogenesis. Developmental Biology, 205 (1999):1-9.
【非特許文献４】Yoshida CA, Yamamoto H, Fujita T, Furuichi T, Ito K, Inoue K, Yamana K, Zanma A, Takada K, Ito Y, Komori T. Runx2 and Runx3 are essential for chondrocyte maturation, and Runx2 regulates limb growth through induction of Indian hedgehog. Genes Dev. 2004 Apr 15;18(8):952-63.
【非特許文献５】Osorio KM, Lilja KC, Tumbar T. Runx1 modulates adult hair follicle stem cell emergence and maintenance from distinct embryonic skin compartments. J Cell Biol. 2011 Apr 4;193(1):235-50.
【非特許文献６】Osorio KM, Lee SE, McDermitt DJ, Waghmare SK, Zhang YV, Woo HN, Tumbar T. Runx1 modulates developmental, but not injury-driven, hair follicle stem cell activation. Development. 2008 Mar;135(6):1059-68.
【非特許文献７】Glotzer DJ, Zelzer E, Olsen BR. Impaired skin and hair follicle development in Runx2 deficient mice. Dev Biol. 2008 Mar 15;315(2):459-73.
【非特許文献８】Raveh E, Cohen S, Levanon D, Groner Y, Gat U. Runx3 is involved in hair shape determination. DevDyn. 2005 Aug;233(4):1478-87.
【非特許文献９】Pispa J, Pummila M, Barker PA, Thesleff I, Mikkola ML. Edar and Troy signalling pathways act redundantly to regulate initiation of hair follicle development. Hum Mol Genet. 2008 Nov 1;17(21):3380-91.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、Runxにより発現が制御される遺伝子を含有する細胞およびRunxを用いることを特徴とする、発毛促進物質または発毛抑制物質のスクリーニング方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明者は、Runx2およびすべてのRunxファミリー分子の機能を阻害するdominant-negative Runx（dnRunx）を用いたマイクロアレイ解析によって、Gli1、Ptch1およびTnfrsf19をRunxファミリーの標的遺伝子として初めて同定し、RunxファミリーがGli1、Ptch1またはTnfrsf19遺伝子の発現を調節する毛包形成の上流シグナルとなることを見出した。また、Gli1、Ptch1またはTnfrsf19プロモーターとルシフェラーゼ遺伝子と融合したコンストラクトを用いることで、毛包形成を刺激することにより発毛を促すエキスもしくは化合物を探索する方法を構築した。また、該方法によって、毛包形成において阻害効果を有する、発毛を抑制するエキスもしくは化合物も探索可能とした。
本発明者は、これらの知見に基づいてさらに研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、
［１］Runxにより発現が制御される遺伝子を含有する細胞およびRunxを被験物質の存在下および非存在下に培養し、両条件下における該遺伝子の産生量を比較することを特徴とする、発毛促進物質または発毛抑制物質のスクリーニング方法；
［２］以下の工程を含む、［１］に記載の発毛促進物質のスクリーニング方法：
（ａ）Runxにより発現が制御される遺伝子を含有する細胞およびRunxを、被験物質の存在下および非存在下に培養する工程、
（ｂ）両条件下、該遺伝子の産生量を測定する工程、および
（ｃ）被験物質の非存在下と比較して、該遺伝子の産生量を増加させる被験物質を選択する工程；
［３］以下の工程を含む、［１］に記載の発毛抑制物質のスクリーニング方法：
（ａ）Runxにより発現が制御される遺伝子を含有する細胞およびRunxを、被験物質の存在下および非存在下に培養する工程、
（ｂ）両条件下、該遺伝子の産生量を測定する工程、および
（ｃ）被験物質の非存在下と比較して、該遺伝子の産生量を減少させる被験物質を選択する工程；
［４］Runxにより発現が制御される遺伝子が、Gli1、Ptch1およびTnfrsf19からなる群から選択される遺伝子である、［１］−［３］のいずれか一つに記載のスクリーニング方法；
［５］Runxにより発現が制御される遺伝子が、Gli1、Ptch1またはTnfrsf19のプロモーターに機能的に連結された遺伝子である、［１］−［３］のいずれか一つに記載のスクリーニング方法；
［６］Gli1、Ptch1またはTnfrsf19のプロモーターに機能的に連結された遺伝子が、レポーター遺伝子である、［５］に記載のスクリーニング方法；
［７］Runxにより発現が制御される遺伝子を含有する細胞およびRunxを含む、［１］に記載のスクリーニング方法に用いるためのキット；
を提供する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明は、Runxにより発現が制御される遺伝子を含有する細胞およびRunxを用いることを特徴とする、発毛促進物質または発毛抑制物質のスクリーニング方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】Tnfrsf19のプロモーター領域の塩基配列（配列番号：７）を示す図である。実線部がRunx結合配列を示す。
【図２】Ptch1のプロモーター領域の塩基配列（配列番号：８）を示す図である。実線部はRunx結合配列を示す。破線部はRunx結合配列である可能性がある配列を示す。
【図３】Gli1のプロモーター領域の塩基配列（配列番号：９）を示す図である。実線部はRunx結合配列を示す。破線部はRunx結合配列である可能性がある配列を示す。
【図４】Runx2ノックアウトマウスのMEFにおけるRunxファミリー標的遺伝子の発現量を示す図である。MEFは４〜５例の個体から独立に調製した。Student T-testにより有意検定を行った。＊P＜0.001 vs wt
【図５】RunxファミリーまたはDN-Runxを安定強発現する皮膚線維芽細胞におけるRunxファミリー標的遺伝子の発現量を示す図である。細胞は独立して３回調製した。ここでは代表的結果を示す。ｎ＝３；Turkey-testにより有意検定を行った。＊P＜0.05, ＊＊P＜0.01 vs GFP
【図６】Tnfrsf19-lucコンストラクトの模式図を示す。
【図７】RunxファミリーまたはDN-Runxを安定強発現する皮膚線維芽細胞における各ルシフェラーゼレポーターベクターの発現量を示す図である。細胞は独立して３回調製した。ここでは代表的結果を示す。ｎ＝４；Turkey-testにより有意検定を行った。＊P＜0.05, ＊＊P＜0.01 vs GFP
【図８】Tnfrsf19-lucのレポーター活性を亢進させる植物性エキスのリストを示す図である。ベヒクルコントロールとしてはDMSOを用いた。ここでは代表的結果を示す。ｎ＝４
【図９】Tnfrsf19-lucのレポーター活性を抑制させる植物性エキスのリストを示す図である。ベヒクルコントロールとしてはDMSOを用いた。ここでは代表的結果を示す。ｎ＝４
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は、Runxにより発現が制御される遺伝子を含有する細胞およびRunxを被験物質の存在下および非存在下に培養し、両条件下における該遺伝子の産生量を比較することを特徴とする、発毛促進物質または発毛抑制物質のスクリーニング方法を提供する。
【００１３】
本発明のスクリーニング方法は、具体的には以下の工程を含む方法であってよい。
（ａ）Runxにより発現が制御される遺伝子を含有する細胞およびRunxを、被験物質の存在下および非存在下に培養する工程、
（ｂ）両条件下、該遺伝子の産生量を測定する工程、および
（ｃ）被験物質の非存在下と比較して、該遺伝子の産生量を増加させる被験物質を発毛促進物質として選択する工程
あるいは、
（ａ’）Runxにより発現が制御される遺伝子を含有する細胞およびRunxを、被験物質の存在下および非存在下に培養する工程、
（ｂ’）両条件下、該遺伝子の産生量を測定する工程、および
（ｃ’）被験物質の非存在下と比較して、該遺伝子の産生量を減少させる被験物質を発毛抑制物質として選択する工程。
【００１４】
「Runx」は、Runxファミリーを形成しており、ファミリーを形成するアイソフォームとしてRunx1、Runx2、Runx3が挙げられる。本発明においては、Runxは発毛調節に関わる下流遺伝子を調節しうるものであれば、上記のいずれのアイソフォームであってもよい。
【００１５】
本発明において、Runx1、Runx2、Runx3はそれぞれ、配列番号：２、４または６で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質であってよく、ヒトの細胞（例えば、毛包幹細胞など）もしくはそれらの細胞が存在するあらゆる組織、例えば、皮膚などに由来するタンパク質であってよく、また、化学合成もしくは無細胞翻訳系で合成されたタンパク質であってもよい。あるいは上記アミノ酸配列をコードする塩基配列(配列番号：１、３または５)を有するポリヌクレオチドを導入された形質転換体から産生された組換えタンパク質であってもよい。
【００１６】
配列番号：２、４または６で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号：２、４または６で表されるアミノ酸配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、さらに好ましくは約９０％以上、特に好ましくは約９５％以上、最も好ましくは約９８％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。
【００１７】
本明細書におけるアミノ酸配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムNCBI BLAST（National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool）を用い、以下の条件（期待値=10；ギャップを許す；マトリクス=BLOSUM62；フィルタリング=OFF）にて計算することができる。
【００１８】
配列番号：２、４または６で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質としては、例えば、前記の配列番号：２、４または６で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、配列番号：２、４または６で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好ましい。
【００１９】
実質的に同質の活性としては、例えば、Ihh、Gli1、Ptch1、Tnfrsf19、オステオカルシン、IL-11、p21、MMP-13等の転写促進活性などが挙げられる。実質的に同質とは、それらの性質が性質的に（例、生理学的に、または薬理学的に）同質であることを示す。したがって、転写促進活性が同等（例、約０．０１〜１００倍、好ましくは約０．１〜１０倍、より好ましくは０．５〜２倍）であることが好ましいが、これらの活性の程度、タンパク質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
転写促進活性の測定は、公知の方法、例えば、標的遺伝子についてのノーザン解析やRT-PCR解析等を用いて行うことができる。
【００２０】
また、本発明の「Runx」としては、例えば、(i)配列番号：２、４または６で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、(ii)配列番号：２、４または６で表されるアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、(iii)配列番号：２、４または６で表されるアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、(iv)配列番号：２、４または６で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、または(v)それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有するタンパク質などのいわゆるムテインも含まれる。
上記のようにアミノ酸配列が挿入、欠失または置換されている場合、その挿入、欠失または置換の位置は、タンパク質の活性が保持される限り特に限定されない。
本発明の「Runx」は、好ましくは、配列番号：２、４または６で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質、すなわちヒトRunxまたは他の哺乳動物におけるそのホモログである。
【００２１】
「Runxにより発現が制御される遺伝子」とは、Runxが関わる発毛調節シグナル伝達経路の下流に存在し、その発現がRunxによって直接的に制御される遺伝子を指す。そのような遺伝子は、例えばIhh、Gli1、Ptch1、Tnfrsf19等が挙げられるが、好ましくは、Gli1、Ptch1、Tnfrsf19である。あるいは、「Runxにより発現が制御される遺伝子」とは、Runxが関わる発毛調節シグナル伝達経路の下流に存在し、その発現がRunxによって直接的に制御される遺伝子のプロモーターを含むキメラＤＮＡであってもよく、この場合は当該プロモーターの下流に各種のレポータータンパク質をコードするＤＮＡを機能的に連結してもよい。ここで、該遺伝子のプロモーターとしては、例えば、Gli1、Ptch1、Tnfrsf19のプロモーターが挙げられる。
「Runxにより発現が制御される遺伝子を含有する細胞」としては、例えば、毛包幹細胞などが挙げられる。あるいは、「Runxにより発現が制御される遺伝子」が、Runxによって直接的に制御される遺伝子のプロモーターの下流に機能的に連結されたレポーター遺伝子である場合は、該細胞は、該遺伝子を導入された細胞であってもよい。
【００２２】
Runxにより発現が制御される遺伝子を導入された細胞は、Runxにより発現が制御される遺伝子を含む核酸を細胞に遺伝子導入することによって作成することができる。
【００２３】
Runxにより発現が制御される遺伝子を含む核酸としては、DNAであってもRNAであってもよく、あるいはDNA/RNAキメラであってもよいが、好ましくはDNAが挙げられる。また、該核酸は二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。二本鎖の場合は、二本鎖DNA、二本鎖RNAまたはDNA:RNAのハイブリッドでもよい。
【００２４】
Runxにより発現が制御される遺伝子を含むＤＮＡとしては、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、細胞・組織由来のｃＤＮＡ、細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。ライブラリーに使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。また、上記の細胞・組織よりｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて直接ＲＴ-ＰＣＲ法によって増幅することもできる。
【００２５】
本発明におけるRunxにより発現が制御される遺伝子を含むＤＮＡとしては、前記の通り、Gli1、Ptch1、Tnfrsf19を含むＤＮＡが挙げられ、例えば、GenBank Accession No. NG_029564、NG_007664、NG_018924に各遺伝子のプロモーターを含む塩基配列情報がそれぞれ開示されている。 
【００２６】
また、本発明におけるRunxにより発現が制御される遺伝子を含むＤＮＡが、Runxによって直接的に制御される遺伝子のプロモーターの下流に機能的に連結されたレポーター遺伝子である場合は、Runxによって直接的に制御される遺伝子のプロモーターとして、Tnfrsf19、Ptch1またはGli1のプロモーターが挙げられ、それぞれ配列番号：７、８または９として表される。また、該プロモーターに機能的に連結されたレポータータンパク質をコードするＤＮＡとしては、例えばβ−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）、可溶性アルカリフォスファターゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子などが挙げられる。これらレポーター遺伝子の塩基配列は、市販されているＤＮＡなどから取得することができる。
【００２７】
クローン化された前記ＤＮＡは、目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化するか、リンカーを付加した後に、使用することができる。該ＤＮＡはその５’末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３’末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することができる。
【００２８】
発現ベクターとしては、上記の他に、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン（以下、ＳＶ４０ｏｒｉと略称する場合がある）などを含有しているものを用いることができる。
【００２９】
「Runxにより発現が制御される遺伝子を導入された細胞」は、公知の方法に従い、該ＤＮＡを含有する発現ベクターで、細胞に遺伝子導入することによって製造することができる。
細胞としては、例えば、サル細胞ＣＯＳ−７，Ｖｅｒｏ，チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ，ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ，マウスＬ細胞，マウスＡｔＴ−２０，マウスミエローマ細胞，ラットＧＨ３，ヒトＦＬ, ＨＥＫ２９３，ＨｅｐＧ２，ＨｅＬａ細胞などが用いられる。
【００３０】
遺伝子導入は、例えば、細胞工学別冊８  新細胞工学実験プロトコール．２６３−２６７（１９９５）（秀潤社発行）、ヴィロロジー（Virology），５２巻，４５６(１９７３)に記載の方法に従って遺伝子導入することができる。
【００３１】
スクリーニング系へのRunxの供給は、「Runxにより発現が制御される遺伝子を含有する細胞」が、Runxを産生する能力をさらに有することによっても行うことができる。あるいは、Runxを産生する能力をさらに有する細胞は、前記したRunxをコードするＤＮＡを含有する細胞であってもよい。その場合、RunxをコードするＤＮＡは、該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクター（例えば、レトロウイルス，ワクシニアウイルス，バキュロウイルス、アデノウイルスなどの動物ウイルス；ｐＡ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏなど）中のプロモーター（例えば、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター、ＨＳＶ-ＴＫプロモーターなど）の下流に連結して、細胞に導入することができる。
【００３２】
被験物質としては、例えばペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、低分子化合物、siRNA、アンチセンスオリゴヌクレオチド、抗体、アプタマーなどが挙げられる。
【００３３】
本発明のスクリーニング方法における細胞の培養は、公知の方法に従って実施することができる。例えば、約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地，ＤＭＥＭ培地，ＲＰＭＩ１６４０培地，１９９培地などが用いられる。培地のｐＨは、好ましくは約６〜８である。培養は、通常約３０℃〜４０℃で、約１５〜６０時間行なわれる。必要に応じて通気や撹拌を行ってもよい。
【００３４】
Runxにより発現が制御される遺伝子の産生量は、公知の方法に従って測定することができる。
【００３５】
例えば、Runxにより発現が制御される遺伝子によってコードされるタンパク質に対する抗体を用いて、ウェスタン解析、ＥＬＩＳＡ法などの方法またはそれに準じる方法に従って、遺伝子の産生量を定量することができる。
ここで使用される抗体は、Runxにより発現が制御される遺伝子によってコードされるタンパク質（例えば、Gli1、Ptch1、Tnfrsf19遺伝子によってコードされるタンパク質）を認識し得る抗体であれば、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体の何れであってもよい。また、該抗体は、抗体分子そのものであってもよいし、抗体分子のＦ(ａｂ')２ 、Ｆａｂ'、あるいはＦａｂ画分であってもよい。また、抗体は標識されていてもよい。
抗体の標識に用いられる標識剤としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素としては、例えば、〔３５Ｓ〕〔１２５Ｉ〕、〔１３１Ｉ〕、〔３Ｈ〕、〔１４Ｃ〕などが用いられる。酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えば、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。蛍光物質としては、例えば、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネートなどが用いられる。発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどが用いられる。さらに、抗体あるいは抗原と標識剤との結合にビオチン−（ストレプト）アビジン系を用いることもできる。
【００３６】
または、該遺伝子から産生されるｍＲＮＡの塩基配列をもとに適当なプライマーを作成し、ＲＴ−ＰＣＲを行って該遺伝子の転写産物量を測定することにより、該遺伝子の産生量を測定できる。また、上記転写産物量の測定は、公知の方法またはそれに準じる方法に従って、該遺伝子から産生されるｍＲＮＡの塩基配列の全部または一部を含むポリヌクレオチドを標識して作成したプローブを用いたノザンブロッティング法により測定できる。
例えば、Runxにより発現が制御される遺伝子を含有する細胞の培養物から常法に従って全ＲＮＡまたはポリＡ（＋）ＲＮＡを抽出し、例えば、Gli1、Ptch1、Tnfrsf19の塩基配列の全部または一部を含有するポリヌクレオチドをプローブとしてノーザンハイブリダイゼーションを行うか、あるいはGli1、Ptch1、Tnfrsf19の塩基配列の一部を含有する一対のオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＲＴ−ＰＣＲ法を行うことによって定量することができる。
【００３７】
あるいは、「Runxにより発現が制御される遺伝子」が、Runxによって直接的に制御される遺伝子のプロモーターの下流に機能的に連結されたレポーター遺伝子である場合は、レポーター遺伝子がコードするタンパク質の発現を確認することによっても測定できる。
例えば、Runxにより発現が制御される遺伝子が、Runxによって転写活性が制御されるプロモーター（例、Ihh、Gli1、Ptch1、Tnfrsf19等のプロモーター）の下流にβ−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）が機能的に連結された遺伝子である場合、Runxにより発現が制御される遺伝子の代わりにβ−ガラクトシダーゼが発現する。したがって、例えば、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ）のようなβ−ガラクトシダーゼの基質となる試薬を用いる染色により、簡便にβ−ガラクトシダーゼの発現状態を確認することができる。具体的には、細胞あるいは組織切片をグルタルアルデヒドなどで固定し、リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）で洗浄後、Ｘ−ｇａｌを含む染色液で、室温または３７℃付近で、約３０分ないし１時間反応させた後、組織標本を１ｍＭ ＥＤＴＡ／ＰＢＳ溶液で洗浄することによって、β−ガラクトシダーゼ反応を停止させ、呈色を観察することにより、細胞におけるβ−ガラクトシダーゼの発現状態を確認することができる。また、常法に従い、ｌａｃＺをコードするｍＲＮＡを検出してもよい。
【００３８】
本発明のスクリーニング方法によって、発毛促進物質または発毛抑制物質をスクリーニングすることができる。
例えば、被検物質の非存在下に比べて、Runxにより発現が制御される遺伝子の産生量を約２００％以上、好ましくは５００％以上、より好ましくは約１０００％以上増加させる被験物質を発毛促進物質として、選択することができる。
また、例えば、被検物質の非存在下に比べて、Runxにより発現が制御される遺伝子の産生量を約２０％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは約８０％以上減少させる被験物質を発毛抑制物質として、選択することができる。
【００３９】
本発明はまた、本発明のスクリーニング法に用いることができるスクリーニング用キットを提供する。例えば、 (a) Runxにより発現が制御される遺伝子を含有する細胞、(b) Runxおよび(c)該遺伝子の発現を検出することができる試薬、例えば、該遺伝子とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るポリヌクレオチド、該遺伝子によってコードされるタンパク質に対する抗体、またはRunxにより発現が制御される遺伝子がレポーター遺伝子である場合、その検出用の試薬、好ましくはすべてをその構成として含むものが挙げられる。尚、(b)のRunxは、(a)の細胞により産生されるものであってもよい。
これらのキットは、所望により本発明のスクリーニング方法を実施するのに必要もしくは好ましい他の試薬類、器具類をさらに構成として含むことができる。
【実施例】
【００４０】
以下において、実施例により本発明をより具体的に説明するが、この発明はこれらに限定されるものではない。
【００４１】
１．細胞
（１）plat-E
（２）293
２．細胞培養とウイルス
10%fetal bovine serum (FBS) (Thermo Fisher Scientific Inc., Yokohama, Japan)、抗生物質溶液(64μg/ml penicillin G (NACALAI TESQUE,INC., Kyoto, Japan)、100μg/ml streptomycin (NACALAI TESQUE,INC.))を含むDulbecco’s modified eagle medium (DMEM) (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japan) で培養を行った。
細胞の播種は、0.25%トリプシンを用いて培養中のディッシュから細胞を剥がし、遠心分離機LC-200 (TOMY, Tokyo, Japan)で回収した細胞を新しいディッシュに播種した。
細胞の凍結にはバンバンカー（LYMPHOTEC Inc, Tokyo, Japan）を用い-85℃超低温冷蔵庫に、長期保存には液体窒素タンクに保存した。
Runxファミリー分子およびdnRunxを発現するレトロウイルスベクターは、PCRクローニングにより作成した。Runxファミリー分子およびdnRunxを発現するアデノウイルスベクターは組み換え操作により作成し、293細胞にpJM17と共導入することによりアデノウイルスを作成し、増幅したアデノウイルスは、-85℃超低温冷蔵庫に保存した。
３．高密度培養
マウスの胎児(E12.5)から四肢を摘出し、0.1%トリプシン0.1%コラゲナーゼに37℃で30分間温浸した。細胞をピペッティングにより懸濁し、10%FBS、抗生物質溶液(64μg/ml penicillin G (NACALAI TESQUE,INC.)、100μg/ml streptomycin (NACALAI TESQUE,INC.))を含むDMEMで反応を停止した。細胞を懸濁後、2×107cells/mlの濃度で20μLずつ12穴プレートに播種した。1時間後、細胞が接着してから10％FCSを含むDMEMを2mL添加した。3日間培養後、アルシアンブルー染色により、軟骨基質産物を染色した。
４．レトロウイルスを用いた安定発現細胞の樹立
Transfection
35mmディッシュにplat-Eを播種し、翌日にFuGENE6 transfection reagent (Roche Diagnostics, Tokyo, Japan)を用いて遺伝子導入を行った。遺伝子導入時には、green fluorescent protein (GFP)とネオマイシン耐性遺伝子を含むpMXs-neo (IG/pMXs-neo)を対照実験として導入した。plat-Eから得られる培養上清をレトロウイルス液として調製した。Flag-Runx2/pMXs-neoおよびFlag-Runx3/pMXs-neoは、それぞれddYマウス骨格組織より調製したcDNAプールを鋳型にして、PCRによってFlagタグ化したcDNAインサートを調製し、クローン化した。
Infection
レトロウイルス液を0.2μmフィルター(NIPPON Genetics Co., Ltd, Tokyo, Japan)によって濾過し、8ng/ml polybreneを含むウイルス液で目的の細胞を培養した。細胞は400μg/ml G418(NACALAI TESQUE, INC.)を含む培地で1週間、薬剤耐性の選別を行った。
５．アデノウイルスの作成
pAC-CMVにIRES-EGFP(pAC-CMV-IG)を組み込み、ネガティブコントロールとして使用した。Runx2およびdnRunxを発現するアデノウイルスベクターは、pAC-CMV-IGにサブクローニングした。アデノウイルスベクターは、pJM17と共に293細胞にトランスフェクションし、作成したウイルスはGFPの蛍光を確認した。
６．RNA抽出
Total RNAをセパゾールRNA ＩSuper G (NacalaiTesque)を用いてマニュアルに従い、抽出した。
７．逆転写反応
1μgのTotal RNAをReverTra Ace（登録商標）cDNA synthesis kit (TOYOBO)を用いて逆転写した。サーマルサイクラ−(PC320) (ASTEC, Fukuoka, Japan)にセットし、逆転写反応条件は以下に従って行った。
【００４２】
【表１】
2014166164.tif 000002
【００４３】
８．Real-time PCR
KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix(2X) 5μL、0.5μMプライマー、dH2O 3.6μL、cDNA 1μLを混合し、PikoReal PCR system (Thermo Fisher Scientific Inc.)を用いて定量した。PCR産物は、ハウスキーピング遺伝子であるGAPDHの発現量で補正し、各サンプル間のサイクル数を比較した。目的とする遺伝子をgene bankから検索し、プライマーを設計した。プライマーの合成はinvitrogenに委託した。
[List of PCR primers]
Target mRNA            Primer Sequences (5’------------------3’)
GAPDH (forward)                            TGCACCACCAACTGCTTAG    配列番号：１０
GAPDH (reverse)                            GGATGCAGGGATGATGTTC    配列番号：１１
Ihh (forward)                              TTCAAGGACGAGGAGAACACG  配列番号：１２
Ihh (reverse)                              TTCAGACGGTCCTTGCAGC    配列番号：１３
Tnfrsf19 (forward)                         CTGCGTTCTCCCACTACCCT   配列番号：１４
Tnfrsf19 (reverse)                         ATCGTGTCCCCCACAGAAGC   配列番号：１５
Gli1 (forward)                             GCTGTCGGAAGTCCTATT     配列番号：１６
Gli1 (reverse)                             ACTGGCATTGCTAAAGG      配列番号：１７
Gli2 (forward)                             CTGACCCGCAACGCCTACT    配列番号：１８
Gli2 (reverse)                             CCGAATGCCGTCATCCAAG    配列番号：１９
Gli3 (forward)                             AACCCTATTCTACCCTCCAAA  配列番号：２０
Gli3 (reverse)                             GCTGATAGTGCTGGTATTGCT  配列番号：２１
Ptch1 (forward)                            AAAGAACTGCGGCAAGTTTTTG 配列番号：２２
Ptch1 (reverse)                            CTTCTCCTATCTTCTGACGGGT 配列番号：２３
Ptch2 (forward)                            GGTCCTCCGCACCTCATATC   配列番号：２４
Ptch2 (reverse)                            GCGCAGTCTGAATCAACATC   配列番号：２５
９．ルシフェラーゼアッセイ
Dual luciferase assay system (Promega)を用いて各レポーターベクター（p6OSE2-luc、p8Gli-luc、Tnfrsf19-luc）300μg、pRL-CMV (Promega, Madison, Wl) 10μgをエレクトロポレーション法により一過性導入した。ルシフェラーゼ活性は、20/20n luminometer (Turner BioSystems, Sunnyvale, CA)もしくは、発光マイクロプレートリーダー（Berthold Tech., Tokyo, Japan）を使って、renilla luciferaseのシグナルに対する比活性を測定した。
１０．プロモータークローニング
Tnfrsf19-lucは、以下のプライマーを用いて、ヒト健常人ボランティアより得たゲノムDNAを鋳型として、KOD-FX neo（TOYOBO）により増幅した。
XhoI-hTnfrsf19 promoter-F GCCTCGAGCTAGTGACATTTCTATACCT     配列番号：２６
XhoI-hTnfrsf19 promoter-R GCCTCGAGCAGATCCCATGACATCATTC     配列番号：２７
得られたPCRプロダクトは、PGL4.10（Promega）にサブクローン化した。同様に、得られたクローンの塩基配列は、シークエンス解析によりデータベース:Official Symbol:TNFRSF19 (Gene ID: 55504)のmRNA(AN: NM_018647.3)の転写調節領域と推定された上流2.5kbと同一の配列であることを認めた（図１）。Human PTCH1、Human GLI１はそれぞれ、転写開始点の異なるバリアントを有し、すべての活性をGli反応性レポーターベクターp8Gli-lucにより計測することとした。なお、PTCH1、GLI1のプロモーター領域において、Runxファミリー反応性の結合配列は、in silico解析により認めた。
１１．TF Search解析
ヒトTnfrsf19プロモーター領域におけるRunxファミリーの結合をTF Search program（http://www.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html）より検索し、Runx binding siteを抽出した（図１）。同様に、ヒトPTCH1プロモーター領域およびヒトGLI1プロモーター領域についてもRunx binding site解析を行った（図２、３）。
１２．統計処理
有意差の検定はstudent’s unpaird t-testを用いて行い、p<0.05の場合は有意に異なるものと判定した。多検体比較には、Turkeyテストを行った。
【００４４】
実施例１  Runxファミリーの標的遺伝子探索
アデノウイルスを用いてRunx2およびdominant-negative Runx（DN）をマウス四肢高密度培養細胞に強制発現させ、24時間後に細胞からRNAを調製した。外部委託したAgilentマイクロアレイ解析からRunxファミリー標的候補遺伝子を抽出し、リアルタイムPCR解析により標的遺伝子を抽出した。まず、マイクロアレイデータからデータマイニングにより、Runx2により2倍以上発現が亢進し、DNによって0.5倍以下に発現低下した遺伝子に着目し、かつ興味が持たれる遺伝子、100遺伝子に絞込んだ。野生型マウスとRunx2ノックアウトマウスのMEFにおけるマイクロアレイデータと更にデータマイニングを行い、28遺伝子に絞り込んだ。その結果、既知Runxファミリー標的遺伝子Ihhに加え、新たにPtch1、Gli1およびTnfrsf19を同定した（表２）。Runxファミリー分子について、ヒトとマウスの毛包形成過程における発現は、時空間において極めて酷似し、マウスにおいてヘッジホッグシグナルに関わる分子群（Ptch1、Gli1）およびTnfrsf19が発毛制御に関わるとの先の知見から、毛包形成過程においてRunxファミリー分子は発毛情報の上流に位置すると推定された。そこで、これら遺伝子の発現制御について、それぞれのヒト遺伝子プロモーター領域におけるRunx binding siteを検索した（図１〜３）。それぞれの遺伝子発現において、Runxファミリーが制御していることを調べるために、胎生14.5日齢頭蓋骨形成予定領域より調製した野生型（wt）もしくはRunx2遺伝子欠損マウス由来MEF（mouse embryonic fibroblasts:Runx2-/-）細胞を用いてリアルタイムPCR解析により調べた結果、Runx2-/- MEFにおけるそれぞれの遺伝子発現量はwtに比べ低下していることを認めた（図４）。
【００４５】
【表２】
2014166164.tif 000003
【００４６】
これらの遺伝子群が、すべてのRunxファミリー分子によって調節されていることを調べた（図５）。胎生15.5日齢のマウス皮膚から調製した野生型皮膚線維芽細胞を用いて、GFPを発現するレトロウイルスを対照実験に、Runx1、Runx2、Runx3もしくはdominant-negative Runx（DN）を発現するレトロウイルスを感染させ、400μg/mLのG418により薬剤選別を行った細胞を樹立し、これら細胞における遺伝子発現について、リアルタイムPCR解析により調べた。Runx1、Runx2、Runx3を発現させた細胞では、GFP導入細胞に比べてIhh、Tnfrsf19の発現が亢進し、DN-Runxにより発現が低下した。同様の結果は、Gli1の発現においても観察されたが、TF Search解析でGli1同様にRunxファミリーの結合が予想された他のGliファミリー分子（Gli2、Gli3）においては発現変動を認めなかった。つまり、Runxファミリーの結合領域を全てのGliファミリーが持つにも関わらず、Runxの影響を受けたのはGli1のみであった。ただし、Gli2はRunx1により有意な発現亢進が観察されたが、Cq値はいずれも高く、内在する遺伝子発現のコピー数は相当低いところ（GapdhのCq値が15程度に対し、Gli2のCq値が38程度）での有意差であった。Ptch1もまた、Runx1、Runx2、Runx3により発現亢進し、DN-Runxにより発現が低下した。一方、TF Search解析でPtch1同様にRunxファミリーの結合が予想されたPtch2は、Runxのいずれの遺伝子によっても影響を受けなかった。
【００４７】
実施例２  Tnfrsf19プロモーター応答性
レポーター解析によるRunxファミリー活性、Gliファミリー活性およびTnfrsf19活性化を調べるために、それぞれp6OSE2-luc、p8Gli-lucもしくはTnfrsf19-lucをGFP、RunxファミリーもしくはDN-Runx導入細胞に一過性に強発現させ、ルシフェラーゼ活性を調べた（図６、７）。検討の結果、リアルタイムPCR解析と相関して、すべてのRunxファミリー分子により有意にそれぞれのレポーター活性を亢進効果が観察され、逆にDN-Runxによって抑制効果が観察された。
【００４８】
実施例３  プロモーター応答性を指標としたハイスループットスクリーニング系の構築
大量のサンプルを用いて、効率的に発毛シグナルを誘導、もしくは抑制する化合物やエキスをスクリーニングするために、レポーター解析系において、96穴フォーマットのハイスループットスクリーニング系の構築を試みた。遺伝子導入はエレクトロポレーション法により行い、96穴のプレートに胎生15.5日齢ddYマウス皮膚より調製した培養皮膚線維芽細胞を播種し、24時間後のルシフェラーゼ活性を指標に、Tnfrsf19-luc活性を調べた（図８、９）。Tnfrsf19-luc活性に応答性を示したエキスは非常に多く得られた。また、リアルタイムPCR解析とレポーター活性のRunxファミリーによる応答性は極めて相関が高かった。
【産業上の利用可能性】
【００４９】
新たな発毛促進物質または発毛抑制物質のスクリーニング方法を提供することができる。Runxファミリーを直接活性化する物質を見いだすことができれば、毛包幹細胞のステム機能活性を調節する発毛調節が可能となり、画期的なプロダクトとなることが期待される。
【図１】
2014166164.tif 000004
【図２】
2014166164.tif 000005
【図３】
2014166164.tif 000006
【図４】
2014166164.tif 000007
【図５】
2014166164.tif 000008
【図６】
2014166164.tif 000009
【図７】
2014166164.tif 000010
【図８】
2014166164.tif 000011
【図９】
2014166164.tif 000012
【配列表】
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