(57)【要約】      （修正有）【課題】単一の免疫グロブリン産生細胞から免疫グロブリン可変ドメインをコードする核酸を得る方法の提供。【解決手段】３〜６個の５’プライマー及び１個の３’プライマーを用いて第一ポリメラーゼ連鎖反応を行う工程と、１３〜１６個の５’プライマー及び１個の３’プライマーを用いて第一ポリメラーゼ連鎖反応の産物で第二ポリメラーゼ連鎖反応を行う工程を含み、第二ポリメラーゼ連鎖反応で用いられるプライマーの結合位置の距離が第一ポリメラーゼ連鎖反応と比較して減少している方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
単一細胞から免疫グロブリン可変ドメインをコードする核酸を得る方法であって、下記の工程：
−  ３〜６個の５’プライマー及び１個の３’プライマーを用いて第一ポリメラーゼ連鎖反応を行うこと、
−  １３〜１６個の５’プライマー及び１個の３’プライマーを用いて第一ポリメラーゼ連鎖反応の産物で第二ポリメラーゼ連鎖反応を行うことを含み、
第二ポリメラーゼ連鎖反応で用いられるプライマーの結合位置の距離が第一ポリメラーゼ連鎖反応での距離と比較して減少している、方法。
【請求項２】
単一細胞から免疫グロブリン可変ドメインをコードする核酸を得る方法であって、下記の工程：
−  ４〜６個の５’プライマー及び１個の３’プライマーを用いて第一ポリメラーゼ連鎖反応を行うこと、
−  １３〜１５個の５’プライマー及び１個の３’プライマーを用いて第一ポリメラーゼ連鎖反応の産物で第二ポリメラーゼ連鎖反応を行うことを含み、
第二ポリメラーゼ連鎖反応では、５’プライマーが第一ポリメラーゼ連鎖反応におけるのと同一であり、３’プライマーを変更するか、又は、３’プライマーが第一ポリメラーゼ連鎖反応におけるのと同一であり、少なくとも１個の５’プライマーを変更するかのいずれかであり、及び
増幅される核酸に結合するとき、第二ポリメラーゼ連鎖反応での各５’プライマーの５’末端と３’プライマーの３’末端間のヌクレオチドの数が、第一ポリメラーゼ連鎖反応での各５’プライマーの５’末端と３’プライマーの３’末端間のヌクレオチドの数と比較して減少している、方法。
【請求項３】
第一ポリメラーゼ連鎖反応で用いられる５’プライマーが免疫グロブリンのリーダーペプチドのコード領域に結合することを特徴とする、請求項１〜２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４】
第二ポリメラーゼ連鎖反応で用いられる５’プライマーが免疫グロブリンの第一フレームワーク領域のコード領域に結合することを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
第二ポリメラーゼ連鎖反応で用いられるプライマーが、５’プライマーに対する翻訳開始コドンＡＴＧ及び／又は３’プライマーに対する翻訳終始コドンＴＴＡをコードするオーバーハングを与えることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記方法が下記の第一工程：
−  単一細胞を準備すること及び前記細胞のｍＲＮＡを得ること、
を含むことを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記方法が下記の第二工程：
−  逆転写ポリメラーゼ連鎖反応により前記ｍＲＮＡからｃＤＮＡを得ること、
を含むことを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
６個の５’プライマー及び１個の３’プライマーを第一ポリメラーゼ連鎖反応で用いることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
４個の５’プライマー及び１個の３’プライマーを第一ポリメラーゼ連鎖反応で用いることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記免疫グロブリンがヒト免疫グロブリンであることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記免疫グロブリンがクラスＧ免疫グロブリン（ＩｇＧ）であることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記免疫グロブリン可変ドメインが免疫グロブリン重鎖可変ドメイン又は免疫グロブリンκ軽鎖可変ドメイン若しくは免疫グロブリンλ軽鎖可変ドメインであることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
ａ）免疫グロブリン重鎖可変ドメインをコードする核酸を得るために、第一ポリメラーゼ連鎖反応を配列番号：０５及び／又は０６、０７及び／又は０８、０９、１０及び／又は１１、１２、１３、及び１０４及び／又は１０５及び／又は１０６の核酸を含むプライマーを用いて行い、第二ポリメラーゼ連鎖反応を配列番号：１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、及び１０４及び／又は１０５及び／又は１０６、及び／又は１４２、及び／又は１４３の核酸を含むプライマーを用いて行い、
ｂ）免疫グロブリンκ軽鎖可変ドメインをコードする核酸を得るために、第一ポリメラーゼ連鎖反応を配列番号：１６、１７、１８、１９、及び１１５の核酸を含むプライマーを用いて行い、第二ポリメラーゼ連鎖反応を配列番号：５３及び／又は５４、５５及び／又は５６、５７及び／又は５８、５９、６０、６１及び／又は６２、６３及び／又は６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、及び／又は１１５、及び／又は１４４、及び／又は１４５の核酸を含むプライマーを用いて行い、
ｃ）免疫グロブリンλ軽鎖可変ドメインをコードする核酸を得るために、第一ポリメラーゼ連鎖反応を配列番号：２１、２２、２３及び／又は２４及び／又は２５及び／又は２６、及び１２０及び／又は１２１及び／又は１２２及び／又は１２３及び／又は１２４及び／又は１２５の核酸を含むプライマーを用いて行い、第二ポリメラーゼ連鎖反応を配列番号：７２、配列番号：７３及び／又は７４、配列番号：７５、配列番号：７６、配列番号：７７及び／又は７８、配列番号：７９、配列番号：８０、配列番号：８１、配列番号：８２及び／又は８３、配列番号：８４及び／又は８５、配列番号：８６、配列番号：８７及び／又は８８、配列番号：８９、配列番号：９０及び／又は９１、配列番号：９２、及び配列番号：１２０及び／又は１２１及び／又は１２２及び／又は１２３及び／又は１２４及び／又は１２５の核酸を含むプライマーを用いて行うことを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
免疫グロブリンＦａｂフラグメントを産生する方法であって、下記の工程：
−  単一の免疫グロブリン産生細胞を準備すること、
−  前記細胞から免疫グロブリン軽鎖及び重鎖可変ドメインをコードする核酸であって、場合により、また軽鎖定常ドメインの一部及び重鎖ＣＨ１ドメインの一部をコードする核酸を得ること、
−  前記核酸をin vitroで翻訳し、それによって免疫グロブリンＦａｂフラグメントを産生することを含む方法。
【請求項１５】
免疫グロブリンを産生する方法であって、下記の工程：
−  単一の免疫グロブリン産生細胞を準備すること、
−  前記細胞から免疫グロブリン軽鎖及び重鎖可変ドメインをコードする核酸を得ること、
−  軽鎖可変ドメインをコードする核酸と免疫グロブリン軽鎖定常ドメインをコードする核酸を組み合わせ、重鎖可変ドメインをコードする核酸と免疫グロブリン重鎖定常領域をコードする核酸を組み合わせること、
−  組み合わせた核酸で真核細胞をトランスフェクションすること、
−  前記トランスフェクション細胞を免疫グロブリンの発現に適した条件下で培養すること、
−  細胞又は培養培地から免疫グロブリンを回収することによって免疫グロブリンを産生することを含む方法。
【請求項１６】
核酸を得ることが請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法によって行われることを特徴とする、請求項１４又は１５のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、単一の免疫グロブリン産生細胞からマルチプレックスポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により免疫グロブリンをコードする核酸を得る方法及び手段に関し、また免疫グロブリンを産生する方法に関し、この方法では、in vitro翻訳と組み合わせて単一の免疫グロブリン産生細胞から免疫グロブリンをコードする核酸が得られる。また、本発明は組換え産生したヒトＦａｂフラグメントを特徴づけるための方法を包含する。
【背景技術】
【０００２】
ハイブリドーマ技術（Cole, S.P.C., et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); and Boerner, P., et al., J. Immunol. 147 (1991) 86-95）が確立されてから、モノクローナル免疫グロブリンが科学研究、ヒトの医療及び診断法において極めて重要な役割を果たしていることが明らかとなった。これにより、モノクローナル、特に治療免疫グロブリンの作製は盛んに研究が行われている分野である。この点に関して、特にハイブリドーマ技術及びファージディスプレイ技術（Hoogenboom, H.R., and Winter, G., J. Mol. Biol. 227 (1992) 381-388; Marks, J.D., et al., J. Mol. Biol. 222 (1991) 581-597）の２つの技術がモノクローナル免疫グロブリンの作製に一般的に使用されている。ハイブリドーマ技術では安定なクローンを得ることは困難であるため、抗体の多様性は減少し、限られた数のＢ細胞でのみ融合、増殖その後の特徴づけに成功している。同様に、ファージ又は酵母ディスプレイベースのコンビナトリアルライブラリーアプローチの欠点は、免疫グロブリン重鎖及び軽鎖のランダム対合である。本来の重鎖及び軽鎖対合の解離や本来あるべきでない対合が起こるため、高親和性の重鎖及び軽鎖対の同定のために、大量の免疫グロブリン産生細胞のスクリーニングを必要とする。さらに、このような本来あるべきでない対合はヒト抗原に対して望ましくない交差反応を示す可能性がある。最終的に、コンビナトリアルライブラリーの選択及びスクリーニングにより同定される標的特異的免疫グロブリンの遺伝的多様性は、一般的に、本来の選択バイアスにより制限される。
【０００３】
免疫グロブリン産生細胞から免疫グロブリンを生成することは当該技術分野で公知の方法に従って行うことができる。このような方法は、例えば、ハイブリドーマ技術である。別の方法には免疫グロブリンの核酸配列の同定に基づくものがある。通常、可変領域の又はＣＤＲ領域のみの又はＣＤＲ３領域のみの配列を同定することで十分である。例えば、ｍＲＮＡを免疫グロブリン産生細胞のプールから単離し、免疫グロブリンのＣＤＲ領域をコードするｃＤＮＡライブラリーを構築するために使用する。次に、ｃＤＮＡライブラリーをＮＳ０又はＣＨＯなどの適切な宿主細胞にトランスフェクションし、特異的な免疫グロブリン産生のためにスクリーニングする。
【０００４】
WO 2008/104184は同種抗体をクローニングする方法を報告している。単一のヒトＢ細胞からのモノクローナル抗体の効率的な生成がTiller等により報告されている（Tiller, T., et al., J. Immunol. Meth. 329 (2007) 112-124）。Braeuninger等はＴ細胞リッチＢ細胞リンパ腫から得られた単一Ｂ細胞の分子解析を報告している（Braeuninger, A., et al., Blood 93 (1999) 2679-2687）。ネステッド（ＲＴ−）ＰＣＲプライマーの系統的設計及び試験がRohatgi等により報告されている（Rohatgi, S., et al, J. Immunol. Meth. 339 (2008) 205-219）。WO 02/13862では、Ｂ細胞介在性の病変を変更させるための方法及び組成物が報告されている。Haurum等は１工程ＲＴ−マルチプレックスオーバーラッピング伸長ＰＣＲを報告している(Meijer, P.J. and Haurum, J.S., J. Mol. Biol. 358 (2006) 764-772）。Stollar等及びJunghans等は、単一細胞のＰＣＲ反応を用いた配列解析を報告している（Wang, X. and Stollar, B.D., J. Immunol. Meth. 244 (2000) 217-225; Coronella, J.A. and Junghans, R.P., Nucl. Acids Res. 28 (2000) E85）。Jiang, X.及びNakano, H.等は、in vitro転写及び翻訳のための直鎖発現エレメントの構築を報告している(Biotechnol. Prog. 22 (2006) 979-988）。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、一態様の特定の実施態様において、ヒト免疫グロブリンＧフラグメントをコードする核酸のin vitro翻訳を含むヒトモノクローナル抗体を提供する方法に関し、この方法では、前記核酸が単一の免疫グロブリン産生ヒトＢ細胞、形質芽球若しくは形質細胞又はヒト免疫グロブリン遺伝子座を含む動物のＢ細胞のｍＲＮＡから得られるｃＤＮＡフラグメントの特異的増幅により得られる。
【０００６】
この方法を用いることで、与えられた多数のＢ細胞の各々を産生免疫グロブリンの抗体結合特性に関し特徴づけることが可能である。従って、免疫グロブリン作製の多様性に損失が生じることはない。解析したＢ細胞はin vivoでの成熟過程後に得られる成熟Ｂ細胞であるため、その産生免疫グロブリンが他の抗原と交差反応を起こす可能性は極めて低い。
【０００７】
本発明は、単一Ｂ細胞又は形質芽球若しくは形質細胞から同種ＩｇＧ  ＨＣ及びＩｇＧ  ＬＣ鎖（ヒトＩｇＧアイソタイプ）を増幅するためのマルチプレックスセミネステッド（semi-nested）ＰＣＲ及びマルチプレックスワンチューブＲＴ−ＧＳＰ−ＰＣＲ（ＲＴ−遺伝子特異的プライマー−ＰＣＲ）方法を含む。その後、ＦａｂＰＣＲ産物をｍＲＮＡに転写し、E.coliライセートでin vitro翻訳する。発現はＥＬＩＳＡ及びウェスタンブロットを用いて調べた。
【０００８】
本発明は第一の態様として、単一細胞から免疫グロブリン可変ドメインをコードする核酸を得る方法であって、下記の工程：
−  ３〜６個の５’プライマー及び１個の３’プライマーを用いて第一ポリメラーゼ連鎖反応を行うことにより第一の核酸組成物を得ること、
−  １３〜１６個の５’プライマー及び１個の３’プライマーを用いて第一ポリメラーゼ連鎖反応で得られた組成物で第二ポリメラーゼ連鎖反応を行うことにより免疫グロブリン可変ドメインをコードする核酸を得ること、
ここで、増殖される核酸に結合するとき、第二ポリメラーゼ連鎖反応で用いられる５’プライマーの結合位置から３’プライマーの結合位置までの距離が第一ポリメラーゼ連鎖反応での距離と比較して減少している、を含む方法である。
【０００９】
本発明の第二の態様は、単一細胞から免疫グロブリン可変ドメインをコードする核酸を得る方法であって、下記の工程：
−  ４〜６個の５’プライマー及び１個の３’プライマーを用いて第一ポリメラーゼ連鎖反応を行うことにより核酸組成物を得ること、
−  １３〜１５個の５’プライマー及び１個の３’プライマーを用いて第一ポリメラーゼ連鎖反応で得られた組成物で第二ポリメラーゼ連鎖反応を行うことにより免疫グロブリン可変ドメインをコードする核酸を得ること、
ここで、第二ポリメラーゼ連鎖反応では、５’プライマーが第一ポリメラーゼ連鎖反応のそれと同一であり、３’プライマーを変更するか、又は、３’プライマーが第一ポリメラーゼ連鎖反応におけるのと同一であり、少なくとも１個の５’プライマーを変更するかのいずれであり、
ここで、増殖される核酸に結合するとき、第二ポリメラーゼ連鎖反応での各５’プライマーの５’末端と３’プライマーの３’末端間のヌクレオチドの数が、第一ポリメラーゼ連鎖反応での各５’プライマーの５’末端と３’プライマーの３’末端間のヌクレオチドの数と比較して減少している、を含む方法である。
【００１０】
本発明のさらなる態様は、単一細胞からマルチプレックスワンチューブＲＴ−ＧＳＰ−ＰＣＲにより免疫グロブリン可変ドメインをコードする核酸を得る方法であって、下記の工程：
−  １個の５’プライマー及び１個の３’プライマーを用いて逆転写及びポリメラーゼ連鎖反応を一工程で行うことを含む方法である。
【００１１】
一実施態様においては、本発明に記載の方法は、第一ポリメラーゼ連鎖反応で用いられる５’プライマーが免疫グロブリンのリーダーペプチドのコード領域に結合することを特徴とする。別の実施態様においては、本発明に記載の方法は、第二ポリメラーゼ連鎖反応で用いられる５’プライマー又はマルチプレックスワンチューブＲＴ−ＧＳＰ−ＰＣＲで用いられる５’プライマーが、免疫グロブリンの第一フレームワーク領域のコード領域に結合することを特徴とする。さらなる実施態様においては、本発明に記載の方法は、第二ポリメラーゼ連鎖反応で用いられるプライマーが、５’プライマーに対する翻訳開始コドンＡＴＧ及び／又は３’プライマーに対する翻訳終始コドンＴＴＡをコードするオーバーハングを与えることを特徴とする。なおさらなる実施態様においては、本発明に記載の方法は、下記の追加の工程：
−  単一細胞を準備し、この細胞のｍＲＮＡを得ることを含むことを特徴とする。
【００１２】
さらなる実施態様においては、先の実施態様に記載の方法は、下記の第２工程：
−  逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）により前記の得られたｍＲＮＡからｃＤＮＡを得ることを含むことを特徴とする。
【００１３】
別の実施態様においては、本発明に記載の方法は、６個の５’プライマー及び１個の３’プライマーを第一ポリメラーゼ連鎖反応で用いることを特徴とする。なおさらなる実施態様においては、本発明に記載の方法は、４個の５’プライマー及び１個の３’プライマーを第二ポリメラーゼ連鎖反応で用いることを特徴とする。本発明のさらなる実施態様においては、前記方法は、
ａ）免疫グロブリン重鎖可変ドメインをコードする核酸を得るために、第一ポリメラーゼ連鎖反応におけるプライマーが配列番号：０５及び／又は０６、０７及び／又は０８、０９、１０及び／又は１１、１２、１３、及び１０４及び／又は１０５及び／又は１０６の核酸を含み、第二ポリメラーゼ連鎖反応におけるプライマーが配列番号：１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、及び１０４及び／又は１０５及び／又は１０６、及び／又は１４２、及び／又は１４３の核酸を含み、
ｂ）免疫グロブリンκ軽鎖可変ドメインをコードする核酸を得るために、第一ポリメラーゼ連鎖反応におけるプライマーが配列番号：１６、１７、１８、１９及び１１５の核酸を含み、第二ポリメラーゼ連鎖反応におけるプライマーが配列番号：５３及び／又は５４、５５及び／又は５６、５７及び／又は５８、５９、６０、６１及び／又は６２、６３及び／又は６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、及び／又は１１５、及び／又は１４４、及び／又は１４５の核酸を含み、
ｃ）免疫グロブリンλ軽鎖可変ドメインをコードする核酸を得るために、第一ポリメラーゼ連鎖反応におけるプライマーが配列番号：２１、２２、２３及び／又は２４及び／又は２５及び／又は２６、及び１２０及び／又は１２１及び／又は１２２及び／又は１２３及び／又は１２４及び／又は１２５の核酸を含み、第二ポリメラーゼ連鎖反応におけるプライマーが配列番号：７２、７３及び／又は７４、７５、７６、７７及び／又は７８、７９、８０、８１、８２及び／又は８３、８４及び／又は８５、８６、８７及び／又は８８、８９、９０及び／又は９１、９２、及び１２０及び／又は１２１及び／又は１２２及び／又は１２３及び／又は１２４及び／又は１２５の核酸を含むことを特徴とする。
【００１４】
本発明に記載の方法の一実施態様においては、免疫グロブリン可変ドメインは免疫グロブリン重鎖可変ドメイン又は免疫グロブリンκ軽鎖可変ドメイン若しくは免疫グロブリンλ軽鎖可変ドメインである。
【００１５】
本発明のさらなる態様は、免疫グロブリンＦａｂフラグメントを産生する方法であって、下記の工程：
−  単一の免疫グロブリン産生細胞を準備すること、
−  前記細胞から、免疫グロブリン軽鎖及び重鎖可変ドメインをコードする核酸であって、場合により、また軽鎖定常ドメインの一部及び重鎖ＣＨ１ドメインの一部をコードする核酸を得ること、
−  得られた核酸を含む直鎖発現マトリックスを生成すること、
−  核酸をin vitroで翻訳することにより免疫グロブリンＦａｂフラグメントを産生することを含む方法である。
【００１６】
本発明の別の態様は、免疫グロブリンを産生する方法であって、下記の工程：
−  単一の免疫グロブリン産生細胞を準備すること、
−  前記細胞から、免疫グロブリン軽鎖及び重鎖可変ドメインをコードする核酸を得ること、
−  軽鎖可変ドメインをコードする核酸と免疫グロブリン軽鎖定常ドメインをコードする核酸を動作可能形態で連結し、重鎖可変ドメインをコードする核酸と免疫グロブリン重鎖定常領域をコードする核酸を動作可能形態で連結すること、
−  前工程で得られた核酸で真核細胞又は原核細胞をトランスフェクションすること、
−  一実施態様においては、免疫グロブリンの発現に適した条件下でトランスフェクション細胞を培養すること、
−  細胞又は培養培地から免疫グロブリンを回収することによって免疫グロブリンを産生することを含む方法である。
【００１７】
本発明に記載の全ての方法の一実施態様においては、免疫グロブリンはクラスＧ免疫グロブリン（ＩｇＧ）である。免疫グロブリンＦａｂフラグメント又は免疫グロブリンを産生する方法の一実施態様においては、核酸を得ることは本発明の態様に記載の方法により行われる。
【００１８】
発明の詳細な説明
本発明の一態様は、単一細胞から免疫グロブリン可変ドメインをコードする核酸を得る方法であって、下記の工程：
−  ３〜６個の５’プライマー及び１個の３’プライマーを用いて第一ポリメラーゼ連鎖反応を行うこと、
−  １３〜１６個の５’プライマー及び１個の３’プライマーを用いて、第一ポリメラーゼ連鎖反応の産物で第二ポリメラーゼ連鎖反応を行うことにより、免疫グロブリン可変ドメインをコードする核酸を得ることを含み、
ここで、第二ポリメラーゼ連鎖反応で用いられるプライマーの結合位置の距離が第一ポリメラーゼ連鎖反応と比較して減少している、方法である。
【００１９】
ヒトPanＢ細胞マーカーのＣＤ１９でコートした磁気マイクロビーズを用いて、末梢血からＢ細胞を単離した（例えば、Bertrand, F.E., III, et al., Blood 90 (1997) 736-744参照）。限界希釈法により、単一細胞を９６ウェルマイクロタイタープレートに入れた。これらの細胞のｍＲＮＡを抽出した。
【００２０】
単一細胞から免疫グロブリン可変ドメインをコードする核酸を得るために本発明に記載のＩｇＧ特異的ＰＣＲ増幅を行うことにより、その後の免疫グロブリン又はＦａｂフラグメントそれぞれの産生で、一実施態様においては、０．５〜２．０のＯＤ値が得られ、同時に、例えば、Ｆａｂフラグメントが１８０〜３１０ng/mlの収量で得られたことが明らかとなった。
【００２１】
本発明に記載の方法では、同じポリメラーゼ連鎖反応で重鎖及び軽鎖可変ドメインを同時に増幅させるために、マルチプレックスポリメラーゼ連鎖反応を使用する。別々の反応で重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを増幅させることとは対照的に、本発明のアプローチは高感度及び増幅配列の量の増加をもたらす。両方、即ち、全てのポリメラーゼ連鎖反応において遺伝子特異的プライマーを使用することにより本方法の特異性と精度が向上する。
【００２２】
ヒトＩｇＧの場合のより複雑な遺伝子構造では、必要な感度及び精度を得るためにプライマー設計、配置及びポリメラーゼ連鎖反応に関して異なる戦略が必要である。
【００２３】
従って、本明細書では、増幅する重鎖及び軽鎖領域の連結を有しない又は連結を有するマルチプレックスポリメラーゼ連鎖反応が用いられる。得られた核酸のin vitro翻訳のために、コードドメインが鎖間のジスルフィド結合形成に使用することができるシステイン残基を含むことが有利である。
【００２４】
本発明の実施に有用な当業者に公知の方法及び技術は、例えば、Ausubel, F.M., ed., Current Protocols in Molecular Biology, Volumes I to III (1997)、Wiley and Sons; Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)、Morrison, S.L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855；US 5,202,238、及びUS 5,204,244に記載されている。
【００２５】
用語「免疫グロブリン」は、免疫グロブリン遺伝子により実質的にコードされている一以上のポリペプチドから構成されるタンパク質を意味する。認識されている免疫グロブリン遺伝子には、様々な定常領域遺伝子並びに多数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。免疫グロブリンは多様な形態、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ）２並びに一本鎖（ｓｃＦｖ）又は二重特異性抗体で存在することができる（例えば、Huston, J.S., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988) 5879-5883; Bird, R.E., et al., Science 242 (1988) 423-426; Hood, L.E. et al., Immunology, Benjamin N.Y., 2nd edition (1984); Hunkapiller, T. and Hood, L., Nature 323 (1986) 15-16)。
【００２６】
通常、免疫グロブリンは２個のいわゆる軽鎖ポリペプチド（軽鎖）及び２個のいわゆる重鎖ポリペプチド（重鎖）を含む。各重鎖及び軽鎖ポリペプチドは、抗原と相互作用することができる結合領域を含む可変ドメイン（可変領域）（通常、ポリペプチド鎖のアミノ末端部分）を含有する。各重鎖及び軽鎖ポリペプチドは、定常領域（通常、カルボキシル末端部分）を含む。重鎖の定常領域は、抗体とｉ）食細胞などのＦｃγ受容体（ＦｃγＲ）を有する細胞、又はｉｉ）Ｂｒａｍｂｅｌｌ受容体としても知られている新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）を有する細胞との結合を媒介する。また、古典的補体系因子、例えば、成分（Ｃ１ｑ）などのいくつかの因子との結合も媒介する。免疫グロブリンの軽鎖又は重鎖の可変ドメインは順に、異なるセグメント、即ち、４個のフレームワーク領域（ＦＲ）及び３個の超可変領域（ＣＤＲ）を含む。
【００２７】
免疫グロブリンの遺伝子操作は、例えば、Morrison, S.L., et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 81 (1984) 6851-6855; US 5,202,238及びUS 5,204,244; Riechmann, L., et al., Nature 332 (1988) 323-327; Neuberger, M.S., et al., Nature 314 (1985) 268-270; Lonberg, N., Nat. Biotechnol. 23 (2005) 1117-1125に記載されている。
【００２８】
用語「キメラ免疫グロブリン」は、第一の非ヒト由来の可変ドメイン、即ち、結合領域及び少なくとも一部の第二の異なる起源又は種由来の定常領域を含む免疫グロブリン、好ましくは、モノクローナル免疫グロブリンを意味する。キメラ免疫グロブリンは、通常、組換えＤＮＡ技術により調製される。一実施態様においては、キメラ免疫グロブリンはマウス、ラット、ハムスター、ウサギ又はヒツジの可変ドメイン及びヒトの定常領域を含む。一実施態様においては、ヒト重鎖定常領域はヒトＩｇＧ定常領域である。別の実施態様においては、ヒト軽鎖定常領域はκ鎖又はλ鎖である。
【００２９】
本発明に包含されるキメラ免疫グロブリンの他の形態は、可変ドメインが由来する非ヒト免疫グロブリンのクラス又はサブクラスが変化したものである。このような免疫グロブリンは、また「クラススイッチ免疫グロブリン」と呼ばれる。また、本発明に包含される「クラススイッチ免疫グロブリン」の形態は、定常領域が、Ｃ１ｑ結合及び／又はＦｃ受容体（ＦｃＲ）結合などに関して異なる特性を有する免疫グロブリンを生じる野生型の定常領域配列と異なるものである。免疫グロブリンの「Ｆｃ部分」は抗原との結合に直接関与しないが、様々なエフェクター機能を示す。重鎖定常領域のアミノ酸配列により、免疫グロブリンはＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭのクラスに別けられる。これらのクラスには、さらにサブクラスに別けられ、ＩｇＧはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４に別けられ、ＩｇＡはＩｇＡ１及びＩｇＡ２に別けられる。免疫グロブリンが属する免疫グロブリンのクラスに従って、免疫グロブリンの重鎖定常領域は、α（ＩｇＡ）、δ（ＩｇＤ）、ε（ＩｇＥ）、γ（ＩｇＧ）及び、μ（ＩｇＭ）と呼ばれる。一実施態様においては、本発明に記載の免疫グロブリンはＩｇＧクラスに属する。「免疫グロブリンのＦｃ部分」は当業者に公知の用語であり、免疫グロブリンのパパイン切断に基づいて定義される。本発明の一実施態様においては、免疫グロブリンは、Ｆｃ部分として、ヒトＦｃ部分又はヒト由来のＦｃ部分を含有する。本発明のさらなる実施態様においては、Ｆｃ部分はサブクラスＩｇＧ４又はＩｇＧ１のヒト免疫グロブリンのＦｃ部分であるか、あるいは、以下に定義するように、Ｆｃγ受容体（例えば、ＦｃγＲＩＩＩａ）結合及び／又はＣ１ｑ結合が検出されないように改変したサブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ３のヒト抗体のＦｃ部分である。一実施態様においては、Ｆｃ部分はヒトＦｃ部分であり、別の実施態様においては、Ｆｃ部分はヒトＩｇＧ４若しくはＩｇＧ１サブクラスＦｃ部分又はヒトＩｇＧ１サブクラス由来の突然変異Ｆｃ部分である。さらなる実施態様においては、Ｆｃ部分は突然変異Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａを有するヒトＩｇＧ１サブクラスに由来する。ＩｇＧ４はＦｃγ受容体（ＦｃγＲＩＩＩａ）結合の低下を示すのに対し、他のＩｇＧサブクラスの免疫グロブリンは強い結合を示す。しかし、Ｐｒｏ２３８、Ａｓｐ２６５、Ａｓｐ２７０、Ａｓｎ２９７（Ｆｃ炭水化物の欠損）、Ｐｒｏ３２９、Ｌｅｕ２３４、Ｌｅｕ２３５、Ｇｌｙ２３６、Ｇｌｙ２３７、Ｉｌｅ２５３、Ｓｅｒ２５４、Ｌｙｓ２８８、Ｔｈｒ３０７、Ｇｌｎ３１１、Ａｓｎ４３４又は／及びＨｉｓ４３５は、改変された場合、Ｆｃγ受容体結合の低下をもたらす残基である（Shields, R.L., et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604;  Lund, J., et al., FASEB J. 9 (1995) 115-119; Morgan, A., et al., Immunology 86 (1995) 319-324; EP 0 307 434）。一実施態様においては、免疫グロブリンは、Ｌ２３４、Ｌ２３５及び／又はＤ２６５に突然変異を有するＩｇＧ４若しくはＩｇＧ１サブクラス又はＩｇＧ１若しくはＩｇＧ２サブクラスのＦｃγ受容体結合に関するものであり、及び／又はＰＶＡ２３６突然変異を含有する。別の実施態様においては、突然変異はＳ２２８Ｐ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５��、及び／又はＰＶＡ２３６（ＰＶＡ２３６はＩｇＧ１のアミノ酸２３３〜２３６位由来のアミノ酸配列ＥＬＬＧ（一文字アミノ酸コードによる）又はＩｇＧ４のＥＦＬＧがＰＶＡに置換されていることを意味する）である。さらなる実施態様においては、突然変異はＩｇＧ４のＳ２２８Ｐ並びにＩｇＧ１のＬ２３４Ａ及びＬ２３５Ａである。免疫グロブリンのＦｃ部分はＡＤＣＣ（抗体依存性細胞媒介性細胞傷害）及びＣＤＣ（補体依存性細胞傷害）に直接関与する。Ｆｃγ受容体及び／又は補体因子Ｃ１ｑに結合しない免疫グロブリンは、抗体依存性細胞性傷害（ＡＤＣＣ）及び／又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を引き起こさない。一実施態様においては、重鎖定常領域は、配列番号：０１又は配列番号：０２又は突然変異Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａを有する配列番号：０１又は突然変異Ｓ２２８Ｐを有する配列番号：０２のアミノ酸配列を有し、軽鎖定常領域は配列番号：０３又は配列番号：０４のアミノ酸配列を有する。
【００３０】
非ヒト（例えば、齧歯類又はウサギ）免疫グロブリンの「ヒト化」又は「ＣＤＲ移植」形態は、非ヒト免疫グロブリン由来の部分配列及びヒト免疫グロブリン由来の部分配列を含有する免疫グロブリンである。主に、ヒト化免疫グロブリンはヒト免疫グロブリン（レシピエント又はアクセプター免疫グロブリン）由来であるが、この超可変領域からの残基が所望の特異性及び親和性を示すマウス、ラット、ハムスター、ウサギ又は非ヒト霊長類などの非ヒト（ドナー免疫グロブリン）の超可変領域からの残基により置換されている（例えば、Morrison, S.L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855; US 5,202,238; US 5,204,244参照）。場合によっては、アクセプター免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）残基が対応する非ヒト残基により置換されている。さらに、ヒト化免疫グロブリンはさらなる改変、例えば、アクセプター免疫グロブリン又はドナー免疫グロブリンに存在しないアミノ酸残基を含んでいてもよい。このような改変は、対応する親配列に相同であるが同一ではないこのようなレシピエント又はドナー免疫グロブリンの変異体を生じる。
【００３１】
非ヒト免疫グロブリンをヒト化する方法は当該技術分野において記載されている。一般的に、ヒト化免疫グロブリンは非ヒト由来の一以上の導入アミノ酸残基を含む。これらの非ヒトアミノ酸残基は「移入」残基と呼ばれることが多く、これは典型的には「移入」可変ドメインに由来する。ヒト化は基本的にWinter及び共同研究者の方法に従って、非ヒト免疫グロブリンの対応する配列に対して超可変領域配列を置換して実施することができる（例えば、Winter, G. and Harris, W.J., Immunol. Today 14 (1993) 243-246参照）。
【００３２】
本明細書で使用する用語「ヒト免疫グロブリン」は、ヒト生殖細胞系の免疫グロブリン配列由来の可変及び定常領域（ドメイン）を有し、且つ、これらの生殖細胞系配列と高い配列類似性又は同一性を有する免疫グロブリンを意味する。一実施態様においては、可変重鎖領域が生殖細胞系配列ＤＰ−５０（GenBank LO6618）に由来し、可変軽鎖領域が生殖細胞系配列Ｌ６（GenBank X01668）に由来するか、あるいは、可変重鎖領域がＤＰ−６１（GenBank M99682）に由来し、可変軽鎖領域が生殖細胞系配列Ｌ１５（GenBank K01323）に由来する。抗体の定常領域はヒトＩｇＧ１若しくはＩｇＧ４型又はその変異体の定常領域である。このような領域はアロタイプでありうるが、例えば、Johnson, G. and Wu, T.T., Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214-218に記載されており、そのデータベースは本明細書で参照される。
【００３３】
本明細書で使用する用語「組換え免疫グロブリン」は、組換え手段により調製、発現又は作製される免疫グロブリンを意味し、例えば、E.coli、ＮＳ０、ＢＨＫ若しくはＣＨＯ細胞などの宿主細胞又はヒト免疫グロブリン遺伝子に対してトランスジェニックである動物（例えば、マウス又はウサギ）から単離された免疫グロブリンである。一実施態様においては、本発明に記載の「組換えヒト免疫グロブリン」は、再配置した可変及び定常領域を有する。本発明に記載の組換えヒト免疫グロブリンはin vivoで体細胞超変異を受けている。従って、組換えヒト免疫グロブリンのＶＨ及びＶＬ領域のアミノ酸配列は、定義されたヒト生殖細胞系ＶＨ及びＶＬ配列とすることができる配列であるが、in vivoのヒト抗体生殖細胞系レパートリー内では天然には存在しない可能性がある。
【００３４】
本明細書で使用する用語「モノクローナル免疫グロブリン」は、実質的に同種（homogeneous）の免疫グロブリン（即ち、集団の個々の免疫グロブリンは、少ない量で存在しうる天然に生じる突然変異を除いて同一である）の集団から得られる免疫グロブリンを指す。モノクローナル免疫グロブリンは単一の抗原部位に対して向けられている、高特異的である。さらに、異なる抗原部位（決定基又はエピトープ）に対して向けられた異なる免疫グロブリンを含有するポリクローナル免疫グロブリン調製物とは対照的に、各モノクローナル免疫グロブリンは単一の抗原部位に対して向けられている。その特異性の他に、モノクローナル免疫グロブリンは他の免疫グロブリンを混入させずに合成することができる利点がある。修飾語「モノクローナル」は、実質的に同種の免疫グロブリンの集団から得られるような免疫グロブリンの特徴を示し、特定の方法により免疫グロブリンが産生される必要があると解釈されるべきではない。
【００３５】
免疫グロブリンの特性に影響又は変化を起さないアミノ酸配列改変である「保存的配列改変」を有する免疫グロブリンを、「変異免疫グロブリン」と称する。改変は当該技術分野で標準的な技術、例えば、部位特異的突然変異誘発及びＰＣＲ媒介突然変異誘発により導入することができる。保存的アミノ酸置換には、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されるものが含まれる。これらのファミリーには、塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非電荷極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸が挙げられる。従って、免疫グロブリンにおいて抗原結合に必須ではないと予測されるアミノ酸残基を同じ側鎖ファミリーの別のアミノ酸残基で置換することができる。
【００３６】
本明細書で使用する用語「可変ドメイン」（軽鎖の可変ドメイン（ＶＬ）、重鎖の可変ドメイン（ＶＨ））は、標的抗原との結合に直接関与する免疫グロブリンの一対の軽鎖及び重鎖の各ドメインのそれぞれを意味する。可変ドメインは、通常、軽鎖及び重鎖のＮ末端ドメインである。軽鎖及び重鎖の可変ドメインは同じ一般構造、即ち、「免疫グロブリンフレームワーク」を有し、各ドメインは、３個の「超可変領域」（又は「相補性決定領域」、ＣＤＲ）により結合された、配列が広範囲に保存されている４個の「フレームワーク領域」（ＦＲ）を含む。用語「相補性決定領域」（ＣＤＲ）又は「超可変領域」（ＨＶＲ）は、本願において互換的に使用され、抗原結合に主に関与する抗体のアミノ酸残基を意味する。「フレームワーク」領域（ＦＲ）は、超可変領域とは別の可変ドメイン領域である。従って、免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖可変ドメインはＮからＣ末端に領域ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３及びＦＲ４を含む。フレームワーク領域はβシート立体構造をとり、ＣＤＲはβシート構造に結合するループを形成する。各鎖のＣＤＲはフレームワーク領域によりその三次元構造内に保持され、他の鎖のＣＤＲと一緒になって抗原結合部位を形成する。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖のＣＤＲ３領域は、免疫グロブリンの結合特異性／親和性に特に重要な役割を果たす。ＣＤＲ及びＦＲ領域は、Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)の標準的な定義に従って決定される。
【００３７】
本願において使用する用語「アミノ酸」は、直接的に又は前駆体の形態で核酸にコードされうるカルボキシα−アミノ酸群を意味する。個々のアミノ酸は３個のヌクレオチドいわゆるコドン又は塩基トリプレットから構成される核酸によりコードされる。各アミノ酸は少なくとも１個のコドンによりコードされる。異なるコドンで同じアミノ酸をコード化することは「遺伝コードの縮重」として知られる。本願において使用する用語「アミノ酸」は天然に生じるカルボキシα−アミノ酸を意味し、アラニン（３文字表記：ａｌａ、１文字表記：Ａ）、アルギニン（ａｒｇ、Ｒ）、アスパラギン（ａｓｎ、Ｎ）、アスパラギン酸（ａｓｐ、Ｄ）、システイン（ｃｙｓ、Ｃ）、グルタミン（ｇｌｎ、Ｑ）、グルタミン酸（ｇｌｕ、Ｅ）、グリシン（ｇｌｙ、Ｇ）、ヒスチジン（ｈｉｓ、Ｈ）、イソロイシン（ｉｌｅ、Ｉ）、ロイシン（ｌｅｕ、Ｌ）、リシン（ｌｙｓ、Ｋ）、メチオニン（ｍｅｔ、Ｍ）、フェニルアラニン（ｐｈｅ、Ｆ）、プロリン（ｐｒｏ、Ｐ）、セリン（ｓｅｒ、Ｓ）、トレオニン（ｔｈｒ、Ｔ）、トリプトファン（ｔｒｐ、Ｗ）、チロシン（ｔｙｒ、Ｙ）及びバリン（ｖａｌ、Ｖ）を含む。
【００３８】
「核酸」又は「核酸配列」は、本願において互換的に使用される用語であり、個々のヌクレオチド（塩基とも呼ばれる）「ａ」、「ｃ」、「ｇ」及び「ｔ」（ＲＮＡでは「ｕ」）から構成される重合分子即ち、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はその改変体を指す。このポリヌクレオチド分子は、天然に生じるポリヌクレオチド分子、合成ポリヌクレオチド分子又は一以上の天然に生じるポリヌクレオチド分子と一以上の合成ポリヌクレオチド分子の組み合わせであってもよい。また、この定義には一以上のヌクレオチドが変化（例えば、突然変異により）、欠失又は付加された天然に生じるポリヌクレオチド分子も包含される。核酸は単離することができ、又は別の核酸、例えば、発現カセット、プラスミド又は宿主細胞の染色体に組み込むことができる。核酸は個々のヌクレオチドから構成されるその核酸配列により特徴づけられる。
【００３９】
当業者にとって、例えば、ポリペプチドのアミノ酸配列をこのアミノ酸配列をコードする対応する核酸配列に変換する手順及び方法は公知である。従って、核酸は個々のヌクレオチドから構成されるその核酸配列により特徴づけられ、同様にそれによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列により特徴づけられる。
【００４０】
ここで、モノクローナル免疫グロブリンをコードする核酸を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含む本発明に記載の方法を用いて単一細胞から得ることができることが明らかとなった。さらに、本発明に記載のＰＣＲ方法とin vitro翻訳方法の組み合わせを用いて、モノクローナル免疫グロブリンをコードする核酸を、単一細胞から得ることができ、コード免疫グロブリンを免疫グロブリンの結合特性を特徴づけるのに十分な量で提供できることが明らかとなった。単一細胞から得られる極めて少量のｍＲＮＡを増幅するために、各ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）は極めて高感度でなければならず、二以上のＰＣＲを組み合わせて実施する必要がある。
【００４１】
従って、単一細胞からのＩｇＧアイソタイプ免疫グロブリンの同種ＩｇＧ  ＨＣ（免疫グロブリンＧ重鎖）及びＩｇＧ  ＬＣ（免疫グロブリンＧ軽鎖）をコードする核酸の増幅、それに続く得られた増幅核酸のin vitro翻訳に基づき、Ｆａｂフラグメント又は完全免疫グロブリンを提供できることが明らかとなった。この方法を用いて、単一細胞から産生される免疫グロブリンについての情報を得る高感度な方法が提供される。これは単一細胞の微量なｍＲＮＡからでさえ可能である。本発明に記載の方法は、単一Ｂ細胞から発現される免疫グロブリンの結合特性の生化学的解析を可能にする。これにより、本方法を用いてハイブリドーマ技術とは対照的により高度な多様性特徴づけが可能となる。さらに、同種免疫グロブリン鎖が、抗原との接触後の成熟Ｂ細胞から得られるため、高特異的及び高精度に構築された免疫グロブリンをコードする核酸が選択的に得られる。
【００４２】
単一細胞から免疫グロブリンをコードする核酸を得る本発明に記載の方法は、単一Ｂ細胞から同種ＩｇＧ  ＨＣ及びＩｇＧ  ＬＣ（ヒトＩｇＧアイソタイプ）を増幅するためのマルチプレックスセミネステッドＰＣＲを含む。得られた核酸によりコードされる免疫グロブリンの結合特性の特徴づけのために、ＰＣＲ産物を対応するＦａｂフラグメントをコードする核酸に変形した。その後、ＦａｂフラグメントをE.coliライセート中、in vitroで翻訳した。発現をＥＬＩＳＡ及びウェスタンブロット法を用いて確認した。
【００４３】
一般的に、本発明の一態様は、下記の工程：ｉ）末梢血からヒトＣＤ１９でコートした磁気マイクロビーズを用いてＢ細胞を単離すること、ｉｉ）例えば、限界希釈又はＦＡＣＳにより単一細胞を沈着させること、ｉｉｉ）個々のＢ細胞のｍＲＮＡを抽出すること、ｉｖ）個々のＢ細胞から産生された免疫グロブリンの少なくとも可変ドメイン（ＶＨ及びＶＬ）をコードする一以上の核酸を得ること、ｖ）直鎖ＲＮＡテンプレートをin vitroで翻訳すること、場合により、ｖｉ）免疫グロブリン又は免疫グロブリンフラグメントの結合特性を特徴づけることを用いる方法である。
【００４４】
本発明に記載のＩｇＧ特異的ＰＣＲ増幅を最適化、改変して測定ＯＤ値の増加がもたらされ、in vitro翻訳後に免疫グロブリン又は免疫グロブリンフラグメントが得られた。
【００４５】
高感度であり、免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖又はそのフラグメントをコードする増幅核酸の回収率が高い３種の新規なＰＣＲベースのアプローチが確立された。また、本発明に記載のＰＣＲベースの方法を用いて、得られた核酸のin vitro翻訳後、機能的で安定なＦａｂフラグメントを発現させる方法を提供する。
【００４６】
用語「ポリメラーゼ連鎖反応」及び「ＰＣＲ」は本願で互換的に使用され、例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡの核酸領域を特異的に増幅させる方法を意味する。この方法は、K. Mullisにより開発された（例えば、Winkler, M.E., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79 (1982) 2181-2185参照）。その領域は単一遺伝子、遺伝子の一部、コード又は非コード配列であってもよい。多くのＰＣＲ方法は、典型的には、数百塩基対（ｂｐ）のＤＮＡフラグメントを増幅させるが、いくつかの技術には４０キロ塩基対（ｋｂ）サイズまでフラグメントを増幅させることができるものがある。基本的なＰＣＲの開始には、いくつかの構成成分及び試薬が必要である。これらの構成成分には、増幅される領域を含む核酸テンプレート、増幅される領域の５’及び３’末端に相補的な２種のプライマー、ポリメラーゼ、例えば、Ｔａｑポリメラーゼ又は他の耐熱性ポリメラーゼ、ポリメラーゼが新しい鎖を合成するためのデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）、ポリメラーゼの最適な活性及び安定性のための適切な化学環境を提供する緩衝液、二価陽イオン、通常はＭｇ２＋、最後にカリウムイオンのような一価陽イオンが含まれる。
【００４７】
用語「セミネステッドＰＣＲ」は、各々少なくとも一対のＰＣＲプライマーを用いる２つの連続したポリメラーゼ連鎖反応を意味し、第一ポリメラーゼ連鎖反応で第一プライマー対が用いられ、第二ポリメラーゼ連鎖反応で第二プライマー対が用いられる。第一及び第二プライマー対において、プライマーの一つは同一であり、他のプライマーが変更されている。この方法では、距離、即ち、第一プライマーの３’末端及び第二プライマーの５’末端間のヌクレオチドの数が、第一ポリメラーゼ連鎖反応で用いられるプライマー対と比較して第二ポリメラーゼ連鎖反応で用いられるプライマー対では減少している。変更プライマーはセンスプライマー又はアンチセンスプライマーのいずれかである。第一ＰＣＲは任意のＰＣＲ実験のように配列を増幅する。第二ＰＣＲに対する、第二プライマー対の一方のプライマー、即ち、ネステッドプライマーは第一ＰＣＲ産物内に結合し、第一産物よりも短い第二ＰＣＲ産物を生成する。この技術は２つよりむしろ４つの特異的なプライマーを使用するため、標準的なＰＣＲよりも特異性が高い。また、単純なＰＣＲで検出できないような場合でも検出可能な生成物を得ることができる。
【００４８】
用語「マルチプレックスポリメラーゼ連鎖反応）又は「マルチプレックスＰＣＲ」は、本願において互換的に使用され、これは、１回のＰＣＲ反応／混合物で、複数のユニークなプライマーを用いて、異なるＤＮＡ配列に特異的な様々なサイズの単位複製配列を生成するポリメラーゼ連鎖反応を意味する。一度に複数の遺伝子を標的とすることにより、１回の試験の実施でさらなる情報を得ることができるが、そのようにしない場合は、実施するのに数回試薬を用いる必要があり、さらなる時間が必要であろう。各プライマーセットのアニーリング温度は、１回の反応で正確に行うために最適化する必要がある。また、ゲル電気泳動で観察した際、別々のバンドで得るために、単位複製配列のサイズは十分に異なっている必要がある。
【００４９】
ヒトゲノムでは免疫グロブリンをコードする遺伝子を含有する染色体遺伝子座は染色体２、１４及び２２上に位置している（図１参照）。ヒト免疫グロブリンＧ重鎖遺伝子座は、染色体における遺伝子座の配向：テロメア−５’末端−ＶＨ−Ｄ−ＪＨ−ＣＨ−３’末端−セントロメアと共に染色体１４（１４ｑ３２．２）上に見出すことができる。染色体上のＶＨセグメントを以下の表１に示すように分類する。
【００５０】
【表１】
2014221069.tif 000002
【００５１】
ヒト免疫グロブリンＧ重鎖遺伝子座は、全体で１２３−１２９個のＶＨ遺伝子を含み、７種のファミリーに分類され、その５１個が機能的であり、２３個が機能Ｄ遺伝子（Ｄ＝多様性）であり、６個が機能ＪＨ遺伝子（Ｊ＝連結）であり、最も多いハプロタイプでは９個が機能ＣＨ遺伝子（Ｃ＝定常）である。
【００５２】
カッパ（κ）及びラムダ（λ）型のヒト免疫グロブリンＧ軽鎖のための遺伝子座は２つの異なる染色体の染色体２及び２２上に位置する。κ軽鎖遺伝子座は、染色体２（２ｐ１１．２）の短腕に見出すことができ、４０個の機能Ｖκ遺伝子セグメントを含む。これらは７種のファミリーに分類される。遺伝子座は、また、５個のＪκ遺伝子及び単一のＣκ遺伝子を含む（Schable, K.F. and Zachau, H.G., Biol. Chem. Hoppe Seyler 374 (1993) 1001-1022; Lefranc, M.P., Exp. Clin. Immunogenet. 18 (2001) 161-174）。
【００５３】
【表２】
2014221069.tif 000003
【００５４】
λ軽鎖遺伝子座は染色体２２（２２ｐ１１．２）の長腕に見出すことができ、７３〜７４個のＶλ遺伝子を含み、その３０個が機能的である。これらは１０種のファミリーに分類され、さらに３種のクラスターに分類される。遺伝子座は、また、７個のＪλ遺伝子を含み、その５個が機能的である。
【００５５】
【表３】
2014221069.tif 000004
【００５６】
単一の免疫グロブリン産生細胞、例えば、単一Ｂ細胞からの、ＩｇＧ  ＨＣ及びＬＣ又は少なくともその可変ドメインをコードする核酸のＰＣＲベースの増幅は、Ｂリンパ球の単一細胞の沈着、その後の重鎖及び軽鎖の可変ドメインに対する特異的プライマーを用いたＰＣＲベースの核酸増幅に基づいている。ＰＣＲの結果は、本質的に、用いるＰＣＲプライマーに依存している。用いるプライマーで最良のものは全てのＶ遺伝子を網羅する必要があり、二量体形成を起こし難く、免疫グロブリンをコードするｃＤＮＡに特異的に結合する必要がある。従って、一実施態様においては、免疫グロブリン可変ドメインをコードする核酸はｃＤＮＡから得られる。
【００５７】
ヒト免疫グロブリンＧ遺伝子座上に多数の機能遺伝子があることから、できるだけ多くの公知の遺伝子を網羅するためにＰＣＲ反応では異なるプライマーを用いる必要がある。従って、縮重プライマーセットを確立した。これは本発明の態様でもある。一実施態様においては、重鎖及び軽鎖をコードする核酸の増幅は１回のポリメラーゼ連鎖反応により実施される。この実施態様においては、プライマーは同じＰＣＲ条件を可能にするため、ほぼ同じ長さの核酸を増幅させる目的で選択される。この実施態様においては、１つが重鎖ＣＨ１領域に結合する、重鎖をコードする核酸に対するプライマーを用いるため、対応する軽鎖をコードする核酸と同程度のサイズの核酸フラグメントが得られる。
【００５８】
本発明の一態様は、単一細胞から少なくとも免疫グロブリン可変ドメインをコードする核酸を得る方法であって、下記の工程：
−  ３〜６個の５’プライマー及び１個の３’プライマーを用いて第一ポリメラーゼ連鎖反応を行うことにより第一の核酸組成物を得ること、
−  １３〜１６個の５’プライマー及び１個の３’プライマーを用いて、第一ポリメラーゼ連鎖反応で得られた組成物で第二ポリメラーゼ連鎖反応を行うことにより免疫グロブリン可変ドメインをコードする核酸を得ることを含み、
第二ポリメラーゼ連鎖反応で用いられるプライマーの結合位置の距離が第一ポリメラーゼ連鎖反応と比較して減少している、方法である。
【００５９】
本発明の一実施態様においては、第一ポリメラーゼ連鎖反応で用いられる５’プライマーは、免疫グロブリンのリーダーペプチドのコード領域に結合する。別の実施態様においては、第二ポリメラーゼ連鎖反応で用いられる５’プライマーは免疫グロブリンの第一フレームワーク領域のコード領域に結合する。別の実施態様においては、第二ポリメラーゼ連鎖反応で用いられるプライマーは、５’プライマーに対する翻訳開始コドンＡＴＧ及び／又は３’プライマーに対する翻訳終始コドンＴＴＡをコードするオーバーハングを与える。このオーバーハングは、in vitro翻訳に用いる核酸を生成するための任意の後続のオーバーラッピングポリメラーゼ連鎖反応に有用である。一実施態様においては、免疫グロブリン可変ドメインは、免疫グロブリン重鎖可変ドメイン又は免疫グロブリンκ軽鎖可変ドメイン若しくは免疫グロブリンλ軽鎖可変ドメインである。
【００６０】
本発明に記載の方法の一実施態様においては、免疫グロブリン重鎖可変ドメインをコードする核酸を得るための第一ポリメラーゼ連鎖反応で用いられるプライマーは、配列番号：０５及び／又は０６、及び配列番号：０７及び／又は０８、及び配列番号：０９、及び配列番号：１０及び／又は１１、及び配列番号：１２、及び配列番号：１３、及び配列番号：１４及び／又は１５の核酸配列を有する。
【００６１】
【表４】
2014221069.tif 000005
【００６２】
本発明に記載の方法の一実施態様においては、免疫グロブリンκ軽鎖可変ドメインをコードする核酸を得るための第一ポリメラーゼ連鎖反応で用いられるプライマーは、配列番号：１６〜２０の核酸配列を有する。
【００６３】
【表５】
2014221069.tif 000006
【００６４】
本発明に記載の方法の一実施態様においては、免疫グロブリンλ軽鎖可変ドメインをコードする核酸を得るための第一ポリメラーゼ連鎖反応で用いられるプライマーは、配列番号：２１、及び配列番号：２２、及び配列番号：２３及び／又は２４及び／又は２５及び／又は２６、及び配列番号：２７及び／又は２８の核酸配列を有する。
【００６５】
【表６】
2014221069.tif 000007
【００６６】
本発明に記載の方法の一実施態様においては、免疫グロブリン重鎖可変ドメインをコードする核酸を得るための第二ポリメラーゼ連鎖反応で用いられるプライマーは、配列番号：２９及び／又は３０、及び配列番号：３１、及び配列番号：３２及び／又は３３、及び配列番号：３４及び／又は３５、及び配列番号：３６、及び配列番号：３７及び／又は３８、及び配列番号：３９及び／又は４０、及び配列番号：４１、及び配列番号：４２、及び配列番号：４３及び／又は４４、及び配列番号：４５、及び配列番号：４６及び／又は４７、及び配列番号：４８、及び配列番号：４９及び／又は５０、及び配列番号：５１及び／又は５２の核酸配列を有する。
【００６７】
【表７】
2014221069.tif 000008
【００６８】
本発明に記載の方法の一実施態様においては、免疫グロブリンκ軽鎖可変ドメインをコードする核酸を得るための第二ポリメラーゼ連鎖反応で用いられるプライマーは、配列番号：５３及び／又は５４、及び配列番号：５５及び／又は５６、及び配列番号：５７及び／又は５８、及び配列番号：５９、及び配列番号：６０、及び配列番号：６１及び／又は６２、及び配列番号：６３及び／又は６４、及び配列番号：６５、及び配列番号：６６、及び配列番号：６７、及び配列番号：６８、及び配列番号：６９、及び配列番号：７０、及び配列番号：７１の核酸配列を有する。
【００６９】
【表８】
2014221069.tif 000009
【００７０】
本発明に記載の方法の一実施態様においては、免疫グロブリンλ軽鎖可変ドメインをコードする核酸を得るための第二ポリメラーゼ連鎖反応で用いられるプライマーは、配列番号：７２、及び配列番号：７３及び／又は７４、及び配列番号：７５、及び配列番号：７６、及び配列番号：７７及び／又は７８、及び配列番号：７９、及び配列番号：８０、及び配列番号：８１、及び配列番号：８２及び／又は８３、及び配列番号：８４及び／又は８５、及び配列番号：８６、及び配列番号：８７及び／又は８８、及び配列番号：８９、及び配列番号：９０及び／又は９１、及び配列番号：９２、及び配列番号：９３の核酸配列を有する。
【００７１】
【表９】
2014221069.tif 000010
【００７２】
本発明のさらなる態様は、単一細胞から少なくとも免疫グロブリン可変ドメインをコードする核酸を得る方法であって、下記の工程：
−  ３〜４個の５’プライマー及び１個の３’プライマーを用いて第一ポリメラーゼ連鎖反応を行うことにより第一の核酸組成物を得ること、
−  １個の５’プライマー及び１個の３’プライマーを用いて、第一ポリメラーゼ連鎖反応で得られた組成物で第二ポリメラーゼ連鎖反応を行うことにより少なくとも免疫グロブリン可変ドメインをコードする核酸を得ることを含み、
第一及び第二ポリメラーゼ連鎖反応で用いられるプライマーが同一であり得る方法である。
【００７３】
一実施態様においては、ポリメラーゼ連鎖反応で用いられるプライマーが、５’プライマーに対する翻訳開始コドンＡＴＧ及び／又は３’プライマーに対する翻訳終始コドンＴＴＡをコードするオーバーハングを与える。このオーバーハングは、in vitro翻訳に用いる核酸を生成するための任意の後続のオーバーラッピングポリメラーゼ連鎖反応に有用である。一実施態様においては、免疫グロブリン可変ドメインは、免疫グロブリン重鎖可変ドメイン又は免疫グロブリンκ軽鎖可変ドメイン若しくは免疫グロブリンλ軽鎖可変ドメインである。
【００７４】
本方法の一実施態様においては、免疫グロブリン重鎖可変ドメインをコードする核酸を得るための第一の２工程ポリメラーゼ連鎖反応で用いられるプライマーは、配列番号：９４、及び配列番号：９５、及び配列番号：９６及び／又は９７及び／又は９８及び／又は９９、及び配列番号：１００及び／又は１０１及び／又は１０２及び／又は１０３、及び配列番号：１０４及び／又は１０５及び／又は１０６の核酸配列を有する。
【００７５】
【表１０】
2014221069.tif 000011
【００７６】
本方法の一実施態様においては、免疫グロブリンκ軽鎖可変ドメインをコードする核酸を得るための第一の２工程ポリメラーゼ連鎖反応で用いられるプライマーは、配列番号：１０７及び／又は１０８及び／又は１０９及び／又は１１０、及び配列番号：１１１及び／又は１１２、及び配列番号：１１３、及び配列番号：１１４、及び配列番号：１１５の核酸配列を有する。
【００７７】
【表１１】
2014221069.tif 000012
【００７８】
本方法の一実施態様においては、免疫グロブリンλ軽鎖可変ドメインをコードする核酸を得るための第一の２工程ポリメラーゼ連鎖反応で用いられるプライマーは、配列番号：１１６、及び配列番号：１１７、及び配列番号：１１８及び／又は１１９、及び配列番号：１２０及び／又は１２１及び／又は１２２及び／又は１２３及び／又は１２４及び／又は１２５の核酸配列を有する。
【００７９】
【表１２】
2014221069.tif 000013
【００８０】
本方法の一実施態様においては、第二の２工程ポリメラーゼ連鎖反応で用いられるプライマーは配列番号：１２６及び配列番号：１２７の核酸配列を有する。
【００８１】
【表１３】
2014221069.tif 000014
【００８２】
本発明の別の態様は、単一細胞から少なくとも免疫グロブリン可変ドメインをコードする核酸を得る方法であって、下記の工程：
−  ４〜６個の５’プライマー及び１個の３’プライマーを用いて第一ポリメラーゼ連鎖反応を行うことにより第一の核酸組成物を得ること、
−  １３〜１５個の５’プライマー及び１個の３’プライマーを用いて、第一ポリメラーゼ連鎖反応で得られた組成物で第二ポリメラーゼ連鎖反応を行うことにより少なくとも免疫グロブリン可変ドメインをコードする核酸を得ることを含み、
第二ポリメラーゼ連鎖反応では、５’プライマーが第一ポリメラーゼ連鎖反応と同一であり、３’プライマーが異なるか、又は３’プライマーが第一ポリメラーゼ連鎖反応と同一であり、少なくとも１個の５’プライマーが異なる、及び
第二ポリメラーゼ連鎖反応での各５’プライマーの５’末端と３’プライマーの３’末端間のヌクレオチドの数が、第一ポリメラーゼ連鎖反応での各５’プライマーの５’末端と３’プライマーの３’末端間のヌクレオチドの数と比較して少ない方法である。
【００８３】
本方法の一実施態様においては、第一ポリメラーゼ連鎖反応で用いられる５’プライマーは免疫グロブリンのリーダーペプチドのコード領域に結合する。別の実施態様においては、第二ポリメラーゼ連鎖反応で用いられる５’プライマーは免疫グロブリンの第一フレームワーク領域のコード領域に結合する。別の実施態様においては、第二ポリメラーゼ連鎖反応で用いられるプライマーは、５’プライマーに対する翻訳開始コドンＡＴＧ及び／又は３’プライマーに対する翻訳終始コドンＴＴＡをコードするオーバーハングを与える。このオーバーハングは、in vitro翻訳に用いる核酸を生成するための任意の後続のオーバーラッピングポリメラーゼ連鎖反応に有用である。免疫グロブリン可変ドメインをコードする核酸を得るための本方法の一実施態様においては、６個の５’プライマー及び１個の３’プライマーが第一ポリメラーゼ連鎖反応で用いられる。別の実施態様においては、４個の５’プライマー及び１個の３’プライマーが第二ポリメラーゼ連鎖反応で用いられる。一実施態様においては、免疫グロブリン可変ドメインは、免疫グロブリン重鎖可変ドメイン又は免疫グロブリンκ軽鎖可変ドメイン若しくは免疫グロブリンλ軽鎖可変ドメインである。
【００８４】
本発明に記載の方法の一実施態様においては、免疫グロブリン重鎖可変ドメインをコードする核酸を得るための第一ポリメラーゼ連鎖反応で用いられるプライマーは、配列番号：０５及び／又は０６、及び配列番号：０７及び／又は０８、及び配列番号：０９、及び配列番号：１０及び／又は１１、及び配列番号：１２、及び配列番号：１３、及び配列番号：１０４及び／又は１０５及び／又は１０６の核酸配列を有する。
【００８５】
【表１４】
2014221069.tif 000015
【００８６】
本発明に記載の方法の一実施態様においては、免疫グロブリンκ軽鎖可変ドメインをコードする核酸を得るための第一ポリメラーゼ連鎖反応で用いられるプライマーは、配列番号：１６、及び配列番号：１７、及び配列番号：１８、及び配列番号：１９、及び配列番号：１１５の核酸配列を有する。
【００８７】
【表１５】
2014221069.tif 000016
【００８８】
本発明に記載の方法の一実施態様においては、免疫グロブリンλ軽鎖可変ドメインをコードする核酸を得るための第一ポリメラーゼ連鎖反応で用いられるプライマーは、配列番号：２１、及び配列番号：２２、及び配列番号：２３及び／又は２４及び／又は２５及び／又は２６、及び配列番号：１２０及び／又は１２１及び／又は１２２及び／又は１２３及び／又は１２４及び／又は１２５の核酸配列を有する。
【００８９】
【表１６】
2014221069.tif 000017
【００９０】
本発明に記載の方法の一実施態様においては、免疫グロブリン重鎖可変ドメインをコードする核酸を得るための第二ポリメラーゼ連鎖反応で用いられるプライマーは、配列番号：１２８、及び配列番号：１２９、及び配列番号：１３０、及び配列番号：１３１、及び配列番号：１３２、及び配列番号：１３３、及び配列番号：１３４、及び配列番号：１３５、及び配列番号：１３６、及び配列番号：１３７、及び配列番号：１３８、及び配列番号：１３９、及び配列番号：１４０、及び配列番号：１４１、及び配列番号：１０４及び／又は１０５及び／又は１０６の核酸配列を有する。
【００９１】
【表１７】
2014221069.tif 000018
【００９２】
本発明に記載の方法の一実施態様においては、免疫グロブリンκ軽鎖可変ドメインをコードする核酸を得るための第二ポリメラーゼ連鎖反応で用いられるプライマーは、配列番号：５３及び／又は５４、及び配列番号：５５及び／又は５６、及び配列番号：５７及び／又は５８、及び配列番号：５９、及び配列番号：６０、及び配列番号：６１及び／又は６２、及び配列番号：６３及び／又は６４、及び配列番号：６５、及び配列番号：６６、及び配列番号：６７、及び配列番号：６８、及び配列番号：６９、及び配列番号：７０、及び配列番号：１１５の核酸配列を有する。
【００９３】
【表１８】
2014221069.tif 000019
【００９４】
本発明に記載の方法の一実施態様においては、免疫グロブリンλ軽鎖可変ドメインをコードする核酸を得るための第二ポリメラーゼ連鎖反応で用いられるプライマーは、配列番号：７２、及び配列番号：７３及び／又は７４、及び配列番号：７５、及び配列番号：７６、及び配列番号：７７及び／又は７８、及び配列番号：７９、及び配列番号：８０、及び配列番号：８１、及び配列番号：８２及び／又は８３、及び配列番号：８４及び／又は８５、及び配列番号：８６、及び配列番号：８７及び／又は８８、及び配列番号：８９、及び配列番号：９０及び／又は９１、及び配列番号：９２、及び配列番号：１２０又は１２１又は１２２又は１２３又は１２４又は１２５の核酸配列を有する。
【００９５】
【表１９】
2014221069.tif 000020
【００９６】
本発明に記載の方法の一実施態様においては、軽鎖可変ドメインをコードする核酸及び重鎖可変ドメインをコードする核酸は、１回のマルチプレックスポリメラーゼ連鎖反応で異なる５’及び３’プライマーを組み合わせることにより１回のポリメラーゼ連鎖反応において得られる。
【００９７】
本発明の別の態様は、単一細胞から少なくとも免疫グロブリン可変ドメインをコードする核酸を得る方法であって、下記の工程：
−  １個の５’プライマー及び１個の３’プライマーを含むプライマーセット用いて逆転写及びポリメラーゼ連鎖反応を一工程で行うことを含む方法である。
【００９８】
本方法の一実施態様においては、マルチプレックスワンチューブ逆転写遺伝子特異的プライマーポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＧＳＰ−ＰＣＲ）で用いられる５’プライマーは、免疫グロブリンの第一フレームワーク領域のコード領域に結合する。別の実施態様においては、ＲＴ−ＧＳＰ−ＰＣＲ反応で用いられるプライマーは、５’プライマーに対する翻訳開始コドンＡＴＧ及び／又は３’プライマーに対する翻訳終始コドンＴＴＡをコードするオーバーハングを与える。このオーバーハングは、in vitro翻訳に用いる核酸を生成するための任意の後続のオーバーラッピングポリメラーゼ連鎖反応に有用である。一実施態様においては、本方法は、ＲＴ−ＧＳＰ−ＰＣＲ反応を用いて免疫グロブリン重鎖可変ドメインを得るための方法である。一実施態様においては、免疫グロブリン可変ドメインは免疫グロブリン重鎖可変ドメイン又は免疫グロブリンκ軽鎖可変ドメイン若しくは免疫グロブリンλ軽鎖可変ドメインである。
【００９９】
一実施態様においては、免疫グロブリン重鎖可変ドメインをコードする核酸を得るためのマルチプレックスワンチューブＲＴ−ＧＳＰ−ＰＣＲで用いられるプライマーは、配列番号：１４２及び１４３の核酸配列を有する。
【０１００】
【表２０】
2014221069.tif 000021
【０１０１】
本発明に記載の方法の一実施態様においては、免疫グロブリンκ軽鎖可変ドメインをコードする核酸を得るためのマルチプレックスワンチューブＲＴ−ＧＳＰ−ＰＣＲで用いられるプライマーは、配列番号：１４４及び１４５の核酸配列を有する。
【０１０２】
【表２１】
2014221069.tif 000022
【０１０３】
さらに、本発明に記載のＰＣＲ方法と無細胞in vitro翻訳システムの組み合わせを用いて、同種免疫グロブリンＶＨ及びＶＬドメインをコードする核酸を単一細胞から得ることができ、これにより、コード免疫グロブリン可変ドメインが、免疫グロブリンの結合特性を特徴づけるのに十分な量でＦａｂフラグメントとして得られることが明らかとなった。単一細胞から得られるごく少量のｍＲＮＡを増幅させるために、個々のＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）は極めて高感度でなければならず、二以上のＰＣＲを組み合わせて実施する必要がある。
【０１０４】
本発明に記載の「無細胞in vitro翻訳システム」はリボソーム、ｔＲＮＡ、ＡＴＰ、ＣＧＴＰ、ヌクレオチド及びアミノ酸を含有する原核細胞又は真核細胞、好ましくは原核細胞の無細胞ライセートを意味する。一実施態様においては、原核生物はE.coliである。
【０１０５】
無細胞in vitro翻訳は長年最高水準にある公知の方法である。Spirin等は１９８８年に、比較的多量にタンパク質合成が行われる連続フロー無細胞（ＣＦＣＦ）翻訳及び結合した転写／翻訳システムを開発した（Spirin, A.S., et al., Science 242 (1988) 1162-1164）。このような無細胞in vitro翻訳のために、リボソームを含有する細胞ライセートを翻訳又は転写／翻訳に用いた。E.coliから得られるこのような無細胞抽出物は、例えば、Zubay（Zubay, G., et al., Ann. Rev. Genetics 7 (1973) 267-287）によって開発され、Pratt（Pratt, J.M., et al., Nucleic Acids Research 9 (1981) 4459-4474; and Pratt, J.M., et al., Transcription and Translation: A Practical Approach, Hames and Higgins (eds.), 179-209, IRL Press, 1984）により用いられた。さらに、無細胞タンパク質合成の開発は、US 5,478,730、US 5,571,690、EP 0 932664、WO 99/50436、WO 00/58493及びWO 00/55353に報告されている。真核生物無細胞発現系は、例えば、Skup, D. and Millward, S., Nucleic AcidsResearch 4 (1977) 3581-3587; Fresno, M., et al., Eur. J. Biochem. 68 (1976) 355-364; Pelham, H.R. and Jackson, R.J., Eur. J. Biochem. 67 (1976) 247-256及びWO 98/31827に報告されている。
【０１０６】
単一細胞からのＩｇＧアイソタイプ免疫グロブリンの同種ＩｇＧ  ＨＣ（免疫グロブリンＧ重鎖）及びＩｇＧ  ＬＣ（免疫グロブリンＧ軽鎖）をコードする核酸の増幅、それに続く得られた核酸のin vitro翻訳により、免疫グロブリンのＦａｂフラグメントを得ることに基づき、得られる微量のｍＲＮＡから単一細胞により産生される免疫グロブリンについての情報を得る高感度な方法が提供される。本発明に記載の方法により単一Ｂ細胞から発現される免疫グロブリンの研究が可能となり、従って、ハイブリドーマ技術とは対照的により多くの多様性が提供される。さらに、同種免疫グロブリン可変ドメイン又は免疫グロブリン鎖が、抗原接触後の成熟Ｂ細胞から得られるので、高特異的及び高精度に構築された免疫グロブリンをコードする核酸を選択的に得ることができる。
【０１０７】
従って、本発明の一態様は、免疫グロブリンＦａｂフラグメントを産生する方法であって、下記の工程：
−  単一の免疫グロブリン産生細胞を準備すること、
−  前記細胞から免疫グロブリン軽鎖及び重鎖可変ドメインをコードする核酸であって、場合により、また軽鎖定常ドメインの一部及び重鎖ＣＨ１ドメインの一部をコードする核酸を得ること、
−  場合により、得られた核酸を含む直鎖発現マトリックスを生成すること、
−  核酸をin vitroで翻訳することにより免疫グロブリンＦａｂフラグメントを産生することを含む方法である。
【０１０８】
一実施態様においては、免疫グロブリン可変ドメインをコードする核酸は、本発明の前の態様に記載の方法を用いて得られる。本発明に記載の方法の一実施態様においては、単一細胞から免疫グロブリン軽鎖及び重鎖可変ドメインをコードする核酸を得ることは、単一Ｂ細胞から同種ＩｇＧ  ＨＣ及びＩｇＧ  ＬＣ（ヒトＩｇＧアイソタイプ）を増幅させるために本発明に記載のマルチプレックスポリメラーゼ連鎖反応を含む。得られた核酸によりコードされる免疫グロブリンの結合特性を特徴づけるため、その後核酸をE.coliライセートでin vitro翻訳して、免疫グロブリンＦａｂフラグメントにする。
【０１０９】
一般的に、本発明の一態様は、下記の工程：ｉ）末梢血からヒトＣＤ１９でコートした磁気マイクロビーズを用いてＢ細胞を単離すること、ｉｉ）限界希釈又はＦＡＣＳにより単一細胞を沈着させること、ｉｉｉ）個々のＢ細胞のｍＲＮＡを抽出すること、ｉｖ）個々のＢ細胞から産生される免疫グロブリンの少なくとも可変ドメインをコードする核酸を得ること、ｖ）直鎖ｍＲＮＡテンプレートをin vitroで翻訳すること、場合により、ｖｉ）免疫グロブリン又は免疫グロブリンフラグメントの結合特性を特徴づけることを用いる方法である。
【０１１０】
本発明に記載の方法を用いて、単一細胞から得られる可変ドメインを含む免疫グロブリンの組換え産生のために、得られた軽鎖及び重鎖免疫グロブリンの可変ドメインをコードする核酸をさらに改変する。まず、可変ドメインをコードする核酸を、免疫グロブリン定常領域をコードする核酸と結合させる。一実施態様においては、軽鎖可変ドメインをコードする核酸を、配列番号：０３のヒトκ軽鎖定常ドメインをコードする核酸又は配列番号：０４のヒトλ軽鎖可変ドメインをコードする核酸と結合させる。別の実施態様においては、重鎖可変ドメインをコードする核酸を、配列番号：０１のヒト免疫グロブリンＧ１（ＩｇＧ１）定常領域をコードする核酸又は配列番号：０２のヒト免疫グロブリンＧ４（ＩｇＧ４）定常領域をコードする核酸と結合させる。別の実施態様においては、重鎖可変ドメインをコードする核酸を、ヒト免疫グロブリンＧ１（ＩｇＧ１）定常領域１（ＣＨ１）をコードする核酸と結合させる。
【０１１１】
完全免疫グロブリン重鎖及び軽鎖又はそのフラグメントをコードする核酸分子は以下構造遺伝子として言及する。これらは同じ発現プラスミド上に位置することができ、又は代わりに異なる発現プラスミド上に位置することができる。免疫グロブリンが培養培地へ分泌される前に、従って、発現細胞内で免疫グロブリン又はＦａｂフラグメントの構築が起こる。従って、一実施態様においては、免疫グロブリン鎖をコードする核酸分子は同じ宿主細胞で発現される。組換え発現後、免疫グロブリンの混合物が得られる場合、この混合物は当業者に公知の方法により分離し精製することができる。これらの方法は、免疫グロブリン精製で十分に確立され広く使用されており、単独で又は組み合わせて用いられている。このような方法は、例えば、微生物由来のタンパク質を用いた親和性クロマトグラフィー（例えば、タンパク質Ａ又はタンパク質Ｇ親和性クロマトグラフィー）、イオン交換クロマトグラフィー（例えば、カチオン交換（カルボキシメチル樹脂）、アニオン交換（アミノエチル樹脂）及び混合型交換クロマトグラフィー）、チオール基吸着（例えば、β−メルカプトエタノール及び他のＳＨリガンドによる）、疎水性相互作用又は芳香族吸着クロマトグラフィー（例えば、フェニルセファロース、アザアレノフィリック（aza-arenophilic）樹脂又はｍ−アミノフェニルボロン酸による）、金属キレート親和性クロマトグラフィー（例えば、Ｎｉ（ＩＩ）及びＣｕ（ＩＩ）親和性物質による）、サイズ排除クロマトグラフィー及び分取電気泳動（ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動など）である（Vijayalakshmi, M.A., Appl. Biochem. Biotech. 75 (1998) 93-102）。
【０１１２】
当業者に公知の組換え技術を用いて、コンジュゲートを核酸／遺伝子レベルでオーダーメードすることができる。免疫グロブリン軽鎖及び重鎖をコードする核酸配列は公知であり、例えば、ゲノムデーターベースから入手することができる。本発明に記載の方法を用いて得られる免疫グロブリンの発現のための発現プラスミド構築に必要なエレメントは、例えば、免疫グロブリン軽鎖用発現カセット、免疫グロブリン重鎖用発現カセット（あるいは、軽鎖及び重鎖構造遺伝子を同じ発現カセットに、例えば、バイシストロン性発現エレメントとして含むことができる）、選択マーカー及びE.coli複製並びに選択ユニットである。発現カセットは通常、プロモーター、分泌シグナル配列をコードするＤＮＡセグメント、構造遺伝子及びターミネータ／ポリアデニル化シグナルを含む。エレメントは免疫グロブリンの全鎖をコードする１個のプラスミド又は各々が免疫グロブリンの一個の鎖をコードする２個のプラスミドのいずれかに動作可能に連結した形態で集められている。構造遺伝子の発現のために、プラスミドを適切な宿主細胞に導入する。タンパク質がＣＨＯ細胞、ＮＳ０細胞、Ｓｐ２／０細胞、ＣＯＳ細胞、ＨＥＫ細胞、Ｋ５６２細胞、ＢＨＫ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞などの哺乳類細胞で産生される。一実施態様においては、コンジュゲートはＣＨＯ細胞、又はＢＨＫ細胞、又はＨＥＫ細胞、又はＮＳ０細胞で発現される。プラスミドの調節エレメントはこれらが選択した宿主細胞で機能するようにして選択する必要がある。発現のために、宿主細胞を当業者に公知の免疫グロブリンの発現に適した条件下で培養する。発現した免疫グロブリン鎖は機能的に構築されて、完全にプロセシングされた免疫グロブリンは培地中に分泌される。
【０１１３】
「発現プラスミド」は宿主細胞に含まれる構造遺伝子の発現に必要な全てのエレメントを提供する核酸である。典型的には、発現プラスミドは、プロモーター、構造遺伝子及びポリアデニル化シグナルを含む転写ターミネータをそれぞれ含む対象の構造遺伝子の発現のために、原核生物プラスミド増殖ユニット（例えば、E.coliの場合には複製起点及び選択マーカーを含む）、真核生物選択マーカー、及び一以上の発現カセットを含む。遺伝子発現は通常、プロモーターの制御下に置かれ、このような構造遺伝子はプロモーターに「動作可能に連結される」と言われる。同様に、調節エレメントがコアプロモーターの活性をモジュレーションする場合、調節エレメント及びコアプロモーターは動作可能に連結される。
【０１１４】
「動作可能に連結される」は２以上の構成成分の並置を指し、ここで、そのように記載の構成成分は、これらを意図する様式で機能させることが可能な関係にある。用語「動作可能な形態で連結」は、個々の核酸が最後の核酸に動作可能に連結されるように２以上の個々の核酸を組み合わせることを意味する。例えば、プロモーター及び／又はエンハンサーは、連結配列の転写を制御又はモジュレーションするためにｃｉｓで作用する場合コード配列に動作可能に連結される。一般的に、必ずしも必要ではないが、「動作可能に連結」しているＤＮＡ配列は連続的であり、第一ドメイン及び第二ドメイン、例えば、免疫グロブリン可変ドメイン及び免疫グロブリン定常ドメイン又は定常領域などの２個のタンパク質コード領域に連結する必要がある場合は、連続的でイン（リーディング）フレームである。ポリアデニル化部位が、転写がコード配列を経由してポリアデニル化配列まで進行するようにコード配列の下流末端に位置している場合、コード配列に動作可能に連結される。翻訳終始コドンが、翻訳がコード配列を経由して終始コドンまで進行し、そこで終結するようにコード配列の下流末端（３’末端）に位置している場合、エキソン核酸配列に動作可能に連結される。連結は当該技術分野で公知の組換え方法、例えば、ＰＣＲ方法を用いて及び／又は便利な制限酵素認識部位でのライゲーションにより達成される。便利な制限酵素認識部位が存在しない場合、次に、合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーが従来の慣習に習って使用される。
【０１１５】
従って、本発明の一態様は、免疫グロブリンを産生する方法であって、下記の工程：
−  単一の免疫グロブリン産生細胞を準備すること、
−  この細胞から免疫グロブリン軽鎖及び重鎖可変ドメインをコードする核酸を得ること、
−  軽鎖可変ドメインをコードする核酸と配列番号：０３又は配列番号：０４の免疫グロブリン軽鎖定常ドメインをコードする核酸を動作可能形態で連結し、重鎖可変ドメインをコードする核酸と配列番号：０１又は配列番号：０２の免疫グロブリン重鎖定常領域をコードする核酸を動作可能形態で連結すること、
−  前工程の核酸で真核又は原核細胞をトランスフェクションすること、
−  トランスフェクション細胞を免疫グロブリンの発現に適した条件下で培養すること、
−  細胞又は培養培地から免疫グロブリンを回収することによって免疫グロブリンを産生することを含む方法である。
【０１１６】
用語「の発現に適した条件下」は、異種ポリペプチドを発現することができる細胞の培養に使用される条件であり、且つ、当業者に公知であるか又は容易に確定することができる条件を意味する。これらの条件を培養する細胞の種類及び発現するポリペプチドの種類に従って変更することができることは当業者に公知である。通常、細胞は、例えば、２０℃〜４０℃の温度で、コンジュゲートを効果的に産生するのに十分な期間、例えば４日〜２８日、０．０１リッター〜１０７リッターの容量で培養する。
【０１１７】
下記の実施例、配列表及び図は本発明の理解を容易にするために提供し、その真の範囲を添付の特許請求の範囲に記載する。本発明の精神から逸脱することなく記載の手順を変更することが可能であることを理解されたい。
【０１１８】
配列表の説明
配列番号：０１    ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域
配列番号：０２    ヒトＩｇＧ４重鎖定常領域
配列番号：０３    ヒトＩｇＧκ軽鎖定常ドメイン
配列番号：０４    ヒトＩｇＧλ軽鎖定常ドメイン
配列番号：０５    プライマーＶＨＬ−１変異体１
配列番号：０６    プライマーＶＨＬ−１変異体２
配列番号：０７    プライマーＶＨＬ−２変異体１
配列番号：０８    プライマーＶＨＬ−２変異体２
配列番号：０９    プライマーＶＨＬ−３
配列番号：１０    プライマーＶＨＬ−４変異体１
配列番号：１１    プライマーＶＨＬ−４変異体２
配列番号：１２    プライマーＶＨＬ−５
配列番号：１３    プライマーＶＨＬ−６
配列番号：１４    プライマーｈｕＣＨ−ＩＩ変異体１
配列番号：１５    プライマーｈｕＣＨ−ＩＩ変異体２
配列番号：１６    プライマーＶｋＬ−１
配列番号：１７    プライマーＶｋＬ−２
配列番号：１８    プライマーＶｋＬ−３
配列番号：１９    プライマーＶｋＬ−４
配列番号：２０    プライマーｈｕＣｋ−ＩＩ
配列番号：２１    プライマーＶｌＬ−１
配列番号：２２    プライマーＶｌＬ−２
配列番号：２３    プライマーＶｌＬ−３変異体１
配列番号：２４    プライマーＶｌＬ−３変異体２
配列番号：２５    プライマーＶｌＬ−３変異体３
配列番号：２６    プライマーＶｌＬ−３変異体４
配列番号：２７    プライマーｈｕＣｌ−ＩＩ変異体１
配列番号：２８    プライマーｈｕＣｌ−ＩＩ変異体２
配列番号：２９    プライマーＶＨＬ−１ａ変異体１
配列番号：３０    プライマーＶＨＬ−１ａ変異体２
配列番号：３１    プライマーＶＨＬ−１ｂ
配列番号：３２    プライマーＶＨＬ−１ｃ変異体１
配列番号：３３    プライマーＶＨＬ−１ｃ変異体２
配列番号：３４    プライマーＶＨＬ−１ｄ変異体１
配列番号：３５    プライマーＶＨＬ−１ｄ変異体２
配列番号：３６    プライマーＶＨＬ−２ａ
配列番号：３７    プライマーＶＨＬ−２ｂ変異体１
配列番号：３８    プライマーＶＨＬ−２ｂ変異体２
配列番号：３９    プライマーＶＨＬ−３ａ変異体１
配列番号：４０    プライマーＶＨＬ−３ａ変異体２
配列番号：４１    プライマーＶＨＬ−３ｂ
配列番号：４２    プライマーＶＨＬ−３ｃ
配列番号：４３    プライマーＶＨＬ−４ａ変異体１
配列番号：４４    プライマーＶＨＬ−４ａ変異体２
配列番号：４５    プライマーＶＨＬ−４ｂ
配列番号：４６    プライマーＶＨＬ−５ａ変異体１
配列番号：４７    プライマーＶＨＬ−５ａ変異体２
配列番号：４８    プライマーＶＨＬ−６ａ
配列番号：４９    プライマーＶＨＬ−７ａ変異体１
配列番号：５０    プライマーＶＨＬ−７ａ変異体２
配列番号：５１    プライマーｈｕＣＨ−ＩＩＩ変異体１
配列番号：５２    プライマーｈｕＣＨ−ＩＩＩ変異体２
配列番号：５３    プライマーＶｋＬ−１ａ変異体１
配列番号：５４    プライマーＶｋＬ−１ａ変異体２
配列番号：５５    プライマーＶｋＬ−１ｂ変異体１
配列番号：５６    プライマーＶｋＬ−１ｂ変異体２
配列番号：５７    プライマーＶｋＬ−１ｃ変異体１
配列番号：５８    プライマーＶｋＬ−１ｃ変異体２
配列番号：５９    プライマーＶｋＬ−１ｄ
配列番号：６０    プライマーＶｋＬ−２ａ
配列番号：６１    プライマーＶｋＬ−２ｂ変異体１
配列番号：６２    プライマーＶｋＬ−２ｂ変異体２
配列番号：６３    プライマーＶｋＬ−３ａ変異体１
配列番号：６４    プライマーＶｋＬ−３ａ変異体２
配列番号：６５    プライマーＶｋＬ−３ｂ
配列番号：６６    プライマーＶｋＬ−３ｃ
配列番号：６７    プライマーＶｋＬ−４ａ
配列番号：６８    プライマーＶｋＬ−５ａ
配列番号：６９    プライマーＶｋＬ−６ａ
配列番号：７０    プライマーＶｋＬ−６ｂ
配列番号：７１    プライマーｈｕＣｋ−ＩＩＩ
配列番号：７２    プライマーＶｌＬ−１ａ
配列番号：７３    プライマーＶｌＬ−１ｂ変異体１
配列番号：７４    プライマーＶｌＬ−１ｂ変異体２
配列番号：７５    プライマーＶｌＬ−１ｃ
配列番号：７６    プライマーＶｌＬ−２ａ
配列番号：７７    プライマーＶｌＬ−３ａ変異体１
配列番号：７８    プライマーＶｌＬ−３ａ変異体２
配列番号：７９    プライマーＶｌＬ−３ｂ
配列番号：８０    プライマーＶｌＬ−３ｃ
配列番号：８１    プライマーＶｌＬ−３ｄ
配列番号：８２    プライマーＶｌＬ−４変異体１
配列番号：８３    プライマーＶｌＬ−４変異体２
配列番号：８４    プライマーＶｌＬ−５変異体１
配列番号：８５    プライマーＶｌＬ−５変異体２
配列番号：８６    プライマーＶｌＬ−６
配列番号：８７    プライマーＶｌＬ−７変異体１
配列番号：８８    プライマーＶｌＬ−７変異体２
配列番号：８９    プライマーＶｌＬ−８
配列番号：９０    プライマーＶｌＬ−４／９変異体１
配列番号：９１    プライマーＶｌＬ−４／９変異体２
配列番号：９２    プライマーＶｌＬ−１０
配列番号：９３    プライマーｈｕＣｌ−ＩＩＩ
配列番号：９４    プライマーｈｕＶＨ−１
配列番号：９５    プライマーｈｕＶＨ−２
配列番号：９６    プライマーｈｕＶＨ−３変異体１
配列番号：９７    プライマーｈｕＶＨ−３変異体２
配列番号：９８    プライマーｈｕＶＨ−３変異体３
配列番号：９９    プライマーｈｕＶＨ−３変異体４
配列番号：１００    プライマーｈｕＶＨ−４変異体１
配列番号：１０１    プライマーｈｕＶＨ−４変異体２
配列番号：１０２    プライマーｈｕＶＨ−４変異体３
配列番号：１０３    プライマーｈｕＶＨ−４変異体４
配列番号：１０４    プライマーｈｕＣＨ−２変異体１
配列番号：１０５    プライマーｈｕＣＨ−２変異体２
配列番号：１０６    プライマーｈｕＣＨ−２変異体３
配列番号：１０７    プライマーｈｕＶｋ−１変異体１
配列番号：１０８    プライマーｈｕＶｋ−１変異体２
配列番号：１０９    プライマーｈｕＶｋ−１変異体３
配列番号：１１０    プライマーｈｕＶｋ−１変異体４
配列番号：１１１    プライマーｈｕＶｋ−２変異体１
配列番号：１１２    プライマーｈｕＶｋ−２変異体２
配列番号：１１３    プライマーｈｕＶｋ−３
配列番号：１１４    プライマーｈｕＶｋ−４
配列番号：１１５    プライマーｈｕＣｋ−２
配列番号：１１６    プライマーｈｕＶｌ−１
配列番号：１１７    プライマーｈｕＶｌ−２
配列番号：１１８    プライマーｈｕＶｌ−３変異体１
配列番号：１１９    プライマーｈｕＶｌ−３変異体２
配列番号：１２０    プライマーｈｕＣｌ−２変異体１
配列番号：１２１    プライマーｈｕＣｌ−２変異体２
配列番号：１２２    プライマーｈｕＣｌ−２変異体３
配列番号：１２３    プライマーｈｕＣｌ−２変異体４
配列番号：１２４    プライマーｈｕＣｌ−２変異体５
配列番号：１２５    プライマーｈｕＣｌ−２変異体６
配列番号：１２６    プライマーＬＴＧＳ−ｌｆｐ
配列番号：１２７    プライマーＬＴＧＳ−ｒｆｐ
配列番号：１２８    プライマーＶＨ−１ａ
配列番号：１２９    プライマーＶＨ−１ｂ
配列番号：１３０    プライマーＶＨ−１ｃ
配列番号：１３１    プライマーＶＨ−１ｄ
配列番号：１３２    プライマーＶＨ−２ａ
配列番号：１３３    プライマーＶＨ−２ｂ
配列番号：１３４    プライマーＶＨ−３ａ
配列番号：１３５    プライマーＶＨ−３ｂ
配列番号：１３６    プライマーＶＨ−３ｃ
配列番号：１３７    プライマーＶＨ−４ａ
配列番号：１３８    プライマーＶＨ−４ｂ
配列番号：１３９    プライマーＶＨ−５ａ
配列番号：１４０    プライマーＶＨ−６ａ
配列番号：１４１    プライマーＶＨ−７ａ
配列番号：１４２    プライマーＶＨ−ｌｆｐ
配列番号：１４３    プライマーＶＨ−ｒｆｐ
配列番号：１４４    プライマーＶＬ（ｋ）−ｌｆｐ
配列番号：１４５    プライマーＶＬ（ｋ）−ｒｆｐ
【図面の簡単な説明】
【０１１９】
【図１】ヒト免疫グロブリンＧ重鎖遺伝子座（Ａ）、ヒト免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座（Ｂ）及びヒト免疫グロブリンλ軽鎖遺伝子座（Ｃ）の染色体局在。
【図２】第一及び第二プライマーセットを用いた免疫グロブリン軽鎖のポリメラーゼ連鎖反応のスキーム。
【図３】異なるプライマーセットを用いた第一（Ａ）及び第二（Ｂ）ポリメラーゼ連鎖反応後の増幅核酸のアガロースゲル解析；（Ａ）１−ＩｇＧ  ＨＣ及びＩｇＧ  ＬＣ（κ）、５５℃；２−ＩｇＧ  ＬＣ（κ）、５５℃；３−ＩｇＧ  ＨＣ、５５℃；４−ＩｇＧ  ＨＣ及びＩｇＧ  ＬＣ（κ）、５０℃；５−ＩｇＧ  ＬＣ（κ）、５０℃；６−ＩｇＧ  ＨＣ、５０℃；７−Ｈ２Ｏ  ＰＣＲＩ；（Ｂ）１−ＩｇＧ  ＬＣ（κ）、５５℃；２−ＩｇＧ  ＨＣ及びＩｇＧ  ＬＣ（κ）、５５℃；３−ＩｇＧ  ＨＣ、５５℃；４−ＩｇＧ  ＨＣ及びＩｇＧ  ＬＣ（κ）、５０℃；５−ＩｇＧ  ＬＣ（κ）、５０℃；６−ＩｇＧ  ＨＣ、５０℃；７−Ｈ２Ｏ  ＰＣＲＩＩ；８−Ｈ２Ｏ  ＰＣＲＩ。
【図４】２回のポリメラーゼ連鎖反応における異なる第二プライマーセットを用いた免疫グロブリン重鎖のポリメラーゼ連鎖反応のスキーム。
【図５】異なるプライマーセットを用いた第一（Ａ）及び第二（Ｂ）ポリメラーゼ連鎖反応後の増幅核酸のアガロースゲル解析；（Ａ）１−ＩｇＧ  ＨＣ及びＩｇＧ  ＬＣ（κ）、５５℃；２−ＩｇＧ  ＬＣ（κ）、５５℃；３−ＩｇＧ  ＨＣ、５５℃；４−ＩｇＧ  ＨＣ及びＩｇＧ  ＬＣ（κ）、５０℃；５−ＩｇＧ  ＬＣ（κ）、５０℃；６−ＩｇＧ  ＨＣ、５０℃；７−Ｈ２Ｏ  ＰＣＲＩ；（Ｂ）１−ＩｇＧ  ＨＣ及びＩｇＧ  ＬＣ（κ）、５５℃；２−ＩｇＧ  ＬＣ（κ）、５５℃；３−ＩｇＧ  ＨＣ、５５℃；４−ＩｇＧ  ＨＣ及びＩｇＧ  ＬＣ（κ）、５０℃；５−ＩｇＧ  ＬＣ（κ）、５０℃；６−ＩｇＧ  ＨＣ、５０℃；７−Ｈ２Ｏ  ＰＣＲＩＩ；８−Ｈ２Ｏ  ＰＣＲＩ。
【図６】２回のポリメラーゼ連鎖反応における同一のプライマーセットを用いた免疫グロブリン重鎖のポリメラーゼ連鎖反応のスキーム。
【図７】異なるプライマーセットを用いた第一（Ａ）及び第二（Ｂ）ポリメラーゼ連鎖反応後の増幅核酸のアガロースゲル解析；（Ａ）１−ＩｇＧ  ＨＣ及びＩｇＧ  ＬＣ（κ）、５５℃；２−ＩｇＧ  ＬＣ（κ）、５５℃；３−ＩｇＧ  ＨＣ、５５℃；４−ＩｇＧ  ＨＣ及びＩｇＧ  ＬＣ（κ）、５０℃；５−ＩｇＧ  ＬＣ（κ）、５０℃；６−ＩｇＧ  ＨＣ、５０℃；７−Ｈ２Ｏ  ＰＣＲＩ；（Ｂ）１−ＩｇＧ  ＬＣ（κ）、５５℃；２−ＩｇＧ  ＨＣ及びＩｇＧ  ＬＣ（κ）、５５℃；３−ＩｇＧ  ＨＣ、５５℃；４−ＩｇＧ  ＨＣ及びＩｇＧ  ＬＣ（κ）、５０℃；５−ＩｇＧ  ＬＣ（κ）、５０℃；６−ＩｇＧ  ＨＣ、５０℃；７−Ｈ２Ｏ  ＰＣＲＩＩ；８−Ｈ２Ｏ  ＰＣＲＩ。
【図８】Ｃ末端ＨＡ−ｔａｇで例示されるオーバーラッピング伸長ＰＣＲのスキーム。
【図９】実施例１〜３に示す３回の異なるポリメラーゼ連鎖反応の直鎖発現構築物のアガロースゲル解析。
【図１０】in vitro翻訳後の本発明に記載の３回のポリメラーゼ連鎖反応の結果の比較（４５０nmで測定、基準波長６２０nm、バックグラウンドの減算）。
【図１１】２個の同一のプライマーセットを用いた第一及び第二ポリメラーゼ連鎖反応後の増幅核酸のアガロースゲル解析；１−ＲＴなし、２〜３７−単一細胞、３８−Ｈ２Ｏ  ｃＤＮＡ、３９−コントロールｍＲＮＡ、４０−Ｈ２Ｏ  コントロールｍＲＮＡ、４１−Ｈ２Ｏ  ＰＣＲＩＩ、４２−ＩｇＧ  ＨＣ／ＩｇＧ  ＬＣ（κ）、４３−ＩｇＧ  ＨＣ、４４−ＩｇＧ  ＬＣ（κ）、４５−Ｈ２Ｏ  ＰＣＲＩ、４６−ＧＦＰ、４６−Ｈ２Ｏ  ＧＦＰ。
【図１２】１個の可変及び１個の固定プライマーセットを用いた第二ポリメラーゼ連鎖反応後の増幅核酸のアガロースゲル解析。
【図１３】１個の可変及び１個の固定プライマーセットを用いた第二ポリメラーゼ連鎖反応後の核酸から得られた直鎖発現構築物のアガロースゲル解析。
【図１４】１個の固定プライマーセット及び１個の可変プライマーセットを用いた単一細胞のＩｇＧ特異的２工程ポリメラーゼ連鎖反応のin vitro翻訳の結果。
【図１５】単一細胞のポリメラーゼ連鎖反応及びin vitro翻訳後のヒトＦａｂ免疫グロブリンフラグメント；１〜８は単一細胞から得られたＩｇＧ  ＨＣ及びＩｇＧ  ＬＣ（κ）のin vitro翻訳後及びＩｇＧ  ＨＣコントロール試料添加後のヒトＦａｂフラグメント、９〜１１は単一細胞から得られたＩｇＧ  ＨＣ及びＩｇＧ  ＬＣ（κ）のin vitro翻訳後のヒトＦａｂフラグメント、１２は単一細胞から得られたＩｇＧ  ＨＣ及びＩｇＧ  ＬＣ（λ）のin vitro翻訳後のヒトＦａｂフラグメント。
【図１６】１個の固定プライマーセット及び１個の可変プライマーセットを用いた２工程ポリメラーゼ連鎖反応及びin vitro翻訳後のウェスタンブロット解析；（Ａ）１はＩｇＧ  ＨＣと組み合わせた単一細胞から得られたＩｇＧ  ＨＣ／ＩｇＧ  ＬＣ、２〜４は単一細胞から得られたＩｇＧ  ＨＣ／ＩｇＧ  ＬＣ、５〜７はＩｇＧ  ＨＣ／ＩｇＧ  ＬＣ（κ）コントロール、８はＩｇＧ  ＨＣ及びＩｇＧ  ＬＣ（κ）コントロール、９はネガティブコントロール、１０は標準Ｆａｂ０．５ng/ml、１１は標準Ｆａｂ５０ng/ml、１２は標準Ｆａｂ５μg/ml；（Ｂ）１は標準Ｆａｂ５μg/ml、２は標準Ｆａｂ５０ng/ml、３は標準Ｆａｂ０．５ng/ml、３はネガティブコントロール、５〜１２はＩｇＧ  ＨＣと組み合わせた単一細胞から得られたＩｇＧ  ＨＣ／ＩｇＧ  ＬＣ。
【０１２０】
実施例
材料及び方法
Ｂ細胞及び形質細胞
このアプローチに使用する試料は、健康なドナーの末梢血及びヒトＩｇＧトランスジェニックマウスの組織（脾臓、骨髄）から単離したＢ細胞及び形質細胞である。まず、別々のチューブのＤＭＥＭ中に固体組織を手動で細かく破砕させる。この後の工程では、低温で優しく扱って細胞の溶解を最小限に抑える。これはその後の目的細胞の陽性単離とｍＲＮＡ源をインタクトに維持するために重要である。細かく破砕した組織に細胞分離媒体を注意深く添加して懸濁し、異なる細胞型の勾配を作る（Leucosepチューブ（Greiner Bio-One）中、Ficollを用いた密度勾配）。形質細胞（ＰＢＭＣ）及びリンパ球を濃縮するために、遠心分離機中、２２℃、８００×ｇで２０分間冷分離媒体を用いて懸濁細胞をブレーキなしで遠心分離して精製する。細胞を冷バッファー（ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）、０．１％（w/v）ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、２mMＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸））で洗浄し、上清を注意深く除去してリンパ球だけを得る。次に、リンパ球をＰＢＳに再懸濁し、注意深くピペッティングして混合する。遠心分離を２２℃、８００×ｇで５分間行って、細胞をペレットにする。Ｂ細胞及び形質細胞をマウス及びヒトＦＣブロッカーで前処理して、細胞表面への抗体の非特異的結合をブロックする。細胞をバッファー（ＰＢＳ、０．１％（w/v）ＢＳＡ、2mMＥＤＴＡ）で一度洗浄し、遠心分離した後ＰＢＳに再懸濁する。ＣＤ１９＋Ｂ細胞及びＣＤ１３８＋形質細胞のみを使用した。ｍＲＮＡの分解を防ぐためにＲＮＡｓｅ阻害剤を添加する。製造業者の説明書に従って、マウスの脾臓からＣＤ１９＋Ｂ細胞の陽性単離を行った（Dynal Biotech Dynabeads CD19 Pan B）。ＣＤ１３８＋形質細胞の選択を製造業者の説明書に従って行った（StemCell Technologies EasySep Human CD138 Selection Kit）。
【０１２１】
限界希釈培養又はＦＡＣＳソーティング法よる単一細胞への分離：
細胞をカウントし、限界希釈培養法により９６ウェルＰＣＲプレート又は３８４ウェルプレートのウェルに単一細胞で沈着させる。プレートをＰＣＲフィルムで密閉した後、直ちに氷上に置く。ソーティング細胞はすぐさまＲＴ−ＰＣＲ（逆転写ポリメラーゼ連鎖反応）に使用することができる。あるいは短期使用に−２０℃又は長期使用に−８０℃で保存してもよい。FACSAria細胞ソーティングシステム（Becton Dickinson）で単一細胞ソーティングを行った。ＣＤ１９陽性に染色された細胞、ＣＤ３８陽性に強く染色された細胞及びすぐさまＣＤ４５陽性に染色された細胞を選取して形質細胞（ＰＣ）と指定した。前方散乱／側方散乱及び側方散乱幅／側方散乱高に関してさらなるゲーティングを行い、生リンパ球及びシングレットをそれぞれ選択した。逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、バッファー及びｄＮＴＰ以外の必要な全てのＰＣＲ試薬（容量１０μl）を含有した９６ウェルＰＣＲプレート（Eppendorf）に単一細胞を直接分注し、今後の処理用に−８０℃で凍結した。
【０１２２】
細胞溶解及び逆転写：
ポリメラーゼ連鎖反応でｍＲＮＡを増幅させるために、Ｂ細胞及び形質細胞を逆転写反応の前に溶解する必要がある。
【０１２３】
【表２２】
2014221069.tif 000023
【０１２４】
【表２３】
2014221069.tif 000024
【０１２５】
溶解した細胞を含むプレートを遠心分離機で３０秒間簡単にスピンして、液体及びウェルの底の細胞を回収する。ＲＴ（逆転写酵素）反応及び全てのＰＣＲ反応を９６ウェルプレートで行った。テンプレート５μlを含有する各ウェルに、水２．５μl、冷ＲＴ反応バッファー１μl、ｄＮＴＰ１μl、ＲＮＡｓｅ阻害剤（４０U/μl）０．２５μl、逆転写酵素（２０U/μl）０．２５μl（これらは全て、First Strand cDNA Synthesis Kit（Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany）に含まれる）を添加し、総容量１０μlにする。ＲＴプレートを簡単に遠心し、氷上からBlock cycler（LightCycler 480, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany）に移し、加熱した蓋で５５℃にして６０分間、８５℃に加熱して２分間放置する（逆転写酵素を不活化する）。ｃＤＮＡの分解を防ぐために逆転写反応の直後の一本鎖ｃＤＮＡを−２０℃で保存した。並行して、細胞を含まないコントロール合成反応を行ってコンタミネーションを試験した。
【０１２６】
【表２４】
2014221069.tif 000025
【０１２７】
細胞溶解及び逆転写：
ポリメラーゼ連鎖反応でｍＲＮＡを増幅させるために、Ｂ細胞及び形質細胞を逆転写反応の前に溶解する必要がある。
【０１２８】
第一ＰＣＲ：
【表２５】
2014221069.tif 000026
【０１２９】
【表２６】
2014221069.tif 000027
【０１３０】
第二ＰＣＲ：
次に、κ及びλ軽鎖並びに重鎖を、下記のプロトコールに従って、二回目のＰＣＲで増幅させた。セミネステッドプライマーを用いて第二ＰＣＲを行い、ｃＤＮＡコピーの量を増やし、そして軽鎖（ＬＣ）及び重鎖（ＨＣ）の可変部分からＣＨ１領域までだけを増幅させた。ＨＣ増幅は１６プライマーを用いて、κＬＣは１７プライマーを用いて、そしてλＬＣは１４プライマーを用いて行った。遺伝子を第一ＰＣＲ産物２μl、ハイフィディリティＰＣＲマスター１０μl（各ｄＮＴＰ０．４μM、２倍濃縮反応バッファー（３mMＭｇＣｌ２を有する）、各プライマー０．０２μM含有）（これらは全て、ハイフィディリティＰＣＲマスターキット（Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany）に含まれる）を用いて総容量２０μlで、第二ＰＣＲプログラムに従って増幅させた：９５℃で２分間、９４℃で１５秒間を４５サイクル、５５℃で３０秒間、７２℃で１分間、その後７２℃で１０分間。
【０１３１】
【表２７】
2014221069.tif 000028
【０１３２】
【表２８】
2014221069.tif 000029
【０１３３】
【表２９】
2014221069.tif 000030
【０１３４】
１工程マルチプレックスＲＴ−ＧＳＰ（遺伝子特異的プライマー）−ＰＣＲ反応：
ポリメラーゼ連鎖反応でｍＲＮＡを増幅させるために、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、バッファー及びｄＮＴＰ以外の必要な全てのＰＣＲ試薬（容量１０μl）を含有した９６ウェルＰＣＲプレート（Eppendorf）のウェルにＢ細胞及び形質細胞を直接分注し、その後の処理のために−８０℃で凍結する必要がある。
【０１３５】
ＲＴ工程：
逆転写及びＰＣＲを１工程（１工程マルチプレックスＲＴ−ＰＣＲ）で実施した。単離、ソーティングし保存した細胞を逆転写又はＲＴ−ＰＣＲの原料として用いた。全ての必要な試薬を室温で融解させた。全てのプライマーをMOLBIOL TIB GmbH研究所で合成した。プレート及びその他の全ての試薬は全ての作業中氷上に保持した。ｃＤＮＡ合成のために、伸長した遺伝子特異的プライマーを直接使用した。酵素コンプレックスは２個のSensiscript逆転写酵素及び１個のOmniscriptポリメラーゼ（Qiagen OneStep RT PCR）から構成される。ｃＤＮＡへのｍＲＮＡの書き換えをSensiscriptコンプレックス（Qiagen OneStep RT PCR）により行い、ｃＤＮＡの増幅はHotStarTaqＤＮＡポリメラーゼ（Qiagen OneStep RT PCR）を用いて行った。このHotStarTaqＤＮＡポリメラーゼは、サーマス・アクアチクス（Thermus aquaticus）から最初に単離され、E.coliで発現させた、化学的に組換えた９４ｋＤａのＤＮＡポリメラーゼ（デオキシヌクレオシド三リン酸：ＤＮＡデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ、EC 2.7.7.7）の形態である。細胞を９６ウェルＰＣＲプレートにソーティングし、ＰＣＲグレードのＨ２Ｏ５μl、ＶＨ及びＶＬ用の０．１μMプライマー１μl、ＲＮＡｓｅ阻害剤（２０Ｕ／反応）１μl及び１．５mMのトリス３μlを加えた１０μlの容量で保存した。ＰＣＲ反応を行うため別の１０μlを添加する前に、−６０℃で保存した細胞を簡単に遠心し（１４００ｒｐｍで２０秒間）、液体及びウェルの底の細胞を回収した。
【０１３６】
【表３０】
2014221069.tif 000031
【０１３７】
【表３１】
2014221069.tif 000032
【０１３８】
１０μl／ウェルのマスターミックス２を細胞に添加した。マスターミックス２にはＨ２Ｏ（ＰＣＲグレード）２．２μl、１×バッファー４μl、各４００μＭのｄＮＴＰ０．８μl、０．２５×Ｑ溶液１μl、酵素コンプレックス１．２μl及びＲＮＡｓｅ阻害剤（２０Ｕ）１μlを含めた。
【０１３９】
【表３２】
2014221069.tif 000033
【０１４０】
【表３３】
2014221069.tif 000034
【０１４１】
ＰＣＲ産物の精製：
次のオーバーラッピングＰＣＲ（第三ＰＣＲ）でin vitro翻訳のための直鎖テンプレート生成の効率を改善するために、下流アプリケーションでの干渉を避けるために、ＰＣＲ増幅に使用した未取込みのプライマー、ｄＮＴＰ、ＤＮＡポリメラーゼ及び塩を除去することにより先の増幅ＰＣＲ産物の精製を行った。Agencourt AMPureを使用した。バッファーを最適化し、１００ｂｐ以上のＰＣＲ単位複製配列を常磁性ビーズに選択的に結合させる。過剰のオリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、塩及び酵素は簡単な洗浄操作で除去することができる。得られた精製ＰＣＲ産物は基本的に不純物を含まず、下記のアプリケーションに使用することができる：蛍光ＤＮＡ配列決定（キャピラリー電気泳動など）、マイクロアレイスポッティング、クローニング及びプライマー伸長遺伝子型決定法。９６ウェルフォーマットのためのワークフローをバッファー中に保存のビーズを穏やかに振とうさせて開始し、沈殿した可能性のある任意の磁気粒子を再懸濁した。正確な容量のビーズ溶液３６μlを試料２０μlに添加し、混合物を浮き沈みさせながら１０回ピペッティングした。この後の工程は１０分間のインキュベーションであり、その後反応プレートを磁気プレート上に１０分間置いてビーズを溶液から分離させた。透明な溶液（上清）を反応プレートから吸引し廃棄した。ビーズ−ｃＤＮＡ洗浄のために、７０％エタノール２００μlを各ウェルに分注し、室温で少なくとも３０秒間インキュベーションした。エタノールを吸引し廃棄した。洗浄工程を２回行い、次に反応プレートを室温で２０分間風乾させた。その後、溶離バッファー４０μlを添加し、再度混合物を浮き沈みさせながら１０回ピペッティングした。ｃＤＮＡを磁気ビーズから解離させた後、精製ＤＮＡを新たなプレートに移した。
【０１４２】
第三ＰＣＲ：
その後、第二ＰＣＲの増幅ＤＮＡをオーバーラッピング伸長ＰＣＲ方法により転写／翻訳工程に必要な下記の成分と結合させた：リボソーム結合部位（ＲＢＳ）、Ｔ７プロモーター及びＴ７ターミネータ配列。このＰＣＲのために、第二ＰＣＲ２μlを、下記を含有する最終容量２０μlにした：水１０．７μl、ＭｇＣｌ２（１０mM）を含む１０×反応バッファー２μl、ＤＭＳＯ０．８μl、ｄＮＴＰ（各１０mM）０．５μl、Ｔ７プロモーター及びターミネータプライマー（各６μM）１．６μl、Ｃ末端ＨＡ−Ｔａｇプライマー０．４μl及び酵素ブレンド０．４μl（これらは全て、RTS E.coli Linear Template Generation Set, HA-Tag（Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany）に含まれる）。最後に、オーバーラッピングＰＣＲ産物をテンプレートとして使用して、Escherichia coliライセートを用いてin vitro転写を行い、得られた機能的Ｆａｂを酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によりＦ（ａｂ’）２ＩｇＧに対してスクリーニングした。
【０１４３】
【表３４】
2014221069.tif 000035
【０１４４】
【表３５】
2014221069.tif 000036
【０１４５】
ゲル電気泳動：
ゲル電気泳動解析（１％アガロースゲル、Invitrogen Corp., USA）を行って、適切なコントロールを用いてｃＤＮＡテンプレートの増幅及び特異性を評価した。
【０１４６】
【表３６】
2014221069.tif 000037
【０１４７】
in vitro転写及び翻訳：
in vitroでの転写及び翻訳の組み合わせを、記載の構成成分（表１２参照）を用いて、RTS 100 E.coliDisulfide Kit（Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany）を使用し製造業者のプロトコールに従って実施した。各オーバーラッピングＰＣＲ産物４μlを、RTS Proteo Master Instrument（Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany）で、総容量５０μl、３７℃で２０時間かけて転写し翻訳した。コントロール反応を同条件下、ｃＤＮＡテンプレート不含で実施した。ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）ベクターをポジティブコントロールとしてオートラジオグラフィー反応システムに添加した。in vitro転写／翻訳後、タンパク質を正確にフォールディング、成熟させるために、反応混合物５０μlをＰＢＳ（１：２．５希釈）７５μlに移し、４℃で一晩インキュベーションした。
【０１４８】
【表３７】
2014221069.tif 000038
【０１４９】
ＥＬＩＳＡ：
３８４ウェルプレート（Nunc GmbH & Co. KG, Thermo Fisher Scientific, Langenselbold, Germany）をヤギ抗ヒトＩｇＧＦａｂフラグメント（Bethyl Laboratories Inc.が製造、Biomol GmbH, Hamburg, Germanyから得た、１mg/1ml）５０μl（ＰＢＳ中、１：１０００）でコートし、４℃で一晩インキュベーションした。プレートを洗浄液（１００μlのＰＢＳＴ（リン酸緩衝生理食塩水−ツイーン２０））で３回洗浄し、６０μlのブロッキング溶液（０．２５％CroteinC（w/v）／０．５％ツイーン（w/v）／ＰＢＳ）を添加し、室温で１時間インキュベーションした。別の洗浄工程（３×１００μlのＰＢＳＴ）を行い、３７．５μlの試料を移し、同様に、３７．５mlのネガティブコントロール（in vitro転写／翻訳からのネガティブコントロール）及び０．７５μlのヒト組換えＦａｂフラグメント（Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany）を含有する３７．５μlのポジティブコントロールを移した。試料を１：３希釈に滴定した。プレートを室温で１．５時間インキュベーションした。洗浄工程（３×１００μlのＰＢＳＴ）後、２５μlのヤギ抗ヒトＩｇＧＦ（ａｂ’）２（Dianova, Hamburg, Germany；０．８mg/ml（ブロッキング溶液で１：２０００希釈））を添加し、室温で１時間インキュベーションした。最後の洗浄工程（３×１００μlのＰＢＳＴ）を行い、２５μlのＴＭＢ（ＰＯＤ基質、Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany, Art-No: 1 484 281）を各ウェルにピペットで入れた。２〜３分後、４０５nm及び４９５nmで吸収シグナルを検出した（Tecan, Safire 2; Tecan Deutschland GmbH, Crailsheim, Germany）。
【０１５０】
フローサイトメトリー解析及び細胞ソーティング：
ＦＡＣＳ解析及び細胞ソーティングのために、下記の抗原に対してビオチン化モノクローナル抗体又はＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）、ＰＥ（フィコエリトリン）若しくはＡＰＣ（アロフィコシアニン）コンジュゲートモノクローナル抗体を使用した：ＣＤ３（ＵＣＨＴ１）、ＣＤ４（１３Ｂ８．２）、ＣＤ８（Ｂ９．１１）、ＣＤ４０（ＭＡＢ８９）、ＣＤ８０（ＭＡＢ１０４）、ＣＤ８３（ＨＢ１５ａ）、ＣＤ８６（ＨＡ５．２Ｂ７）（全てImunotech/Beckman Coulter、Marseille, Franceから入手可能）、ＣＤ１９（ＨＩＢ１９）、ＣＤ２０（２Ｈ７）、ＣＤ３４（５８１）、ＩＬ−３Ｒａ／ＣＤ１２３（９Ｆ５）、ＣＤ１１ｃ（Ｂ−ｌｙ６）、ＣＤ１４（Ｍ５Ｅ２）、ＣＤ２４、ＣＤ２２ａ、ＣＤ３８、ＣＤ１３８（全てBD Pharmingen, San Diego, CA, USAから入手可能）、ＣＤ４５（ＨＩ３０）、ＣＤ４５ＲＡ（ＭＥＭ５６）、ＨＬＡ−ＤＲ（ＴＵ３６）（全てCaltag, Burlingame, CA, USAから入手可能）、ＴＬＲ２（ＴＬ２．１）、ＴＬＲＲ４（ＨＴＡ１２５）、ＴＣＲａｂ（ＩＰ２６）、（全てBioscience, San Diego, CAから入手可能）、ＢＤＣＡ−１、ＢＤＣＡ−２、ＢＤＣＡ−４、ＣＤ２５（４Ｅ３）（全てMiltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germanyから入手可能）、ＩｇＭ（Jackson Immunoresearch, West Grove, PA, USA）、ＣＣＲ７（３Ｄ１２、M. Lipp, Berlin, Germanyより提供）。IOTest Beta MarkをＶｂ解析に使用した（Imunotech/Beckman Coulter）。ストレプトアビジンコンジュゲートＦＩＴＣ、ＰＥ又はＡＰＣ（全てBD Pharmingen）をビオチン化抗体の可視化に使用した。死細胞をヨウ化プロピジウム染色により除外した。適切なアイソタイプ適合の無関係のコントロールｍＡｂを使用してバックグラウンド染色のレベルを決定した。細胞をFACS Caliburを用いて解析し、FACSAria（Becton Dickinson Immunocytometry Systems, Mountain View, CA, USA）でソーティングした。
【０１５１】
実施例１
１個の固定プライマーセット及び１個の変更プライマーセットを用いたポリメラーゼ連鎖反応によるヒト化免疫化マウスの単一Ｂ細胞からのＩｇＧ遺伝子の増幅
【０１５２】
ヒト免疫グロブリン遺伝子座を有するマウスの単一Ｂ細胞を上記で概説したようにして得た。ポリメラーゼ連鎖反応で用いた第一及び第二プライマーセットの３’プライマーは同一であった。第一及び第二プライマーセットの５’プライマーは、第一の５’プライマーセットのプライマーがリーダーペプチドをコードする領域に結合し、第二の５’プライマーセットのプライマーがＦＲ１領域に結合する限りにおいて異なっている。このポリメラーゼ連鎖反応のスキームを図２に示す。
【０１５３】
第一ポリメラーゼ連鎖反応で用いるプライマーセットを下記のリストで示す：
【０１５４】
【表３８】
2014221069.tif 000039
【０１５５】
第二ポリメラーゼ連鎖反応で用いるプライマーセットを下記のリストで示す：
【０１５６】
【表３９】
2014221069.tif 000040
【０１５７】
図３では、このポリメラーゼ連鎖反応で得られた増幅核酸フラグメントのアガロースゲルを示す。試料をそれぞれ５０℃及び５５℃のアニーリング温度で４０増幅サイクルした後解析した。ブランク（水）はネガティブであり、フラグメントのサイズは第一ポリメラーゼ連鎖反応後の予想されるサイズの７５０ｂｐ（ＩｇＧ  ＨＣ）及び６６５ｂｐ（ＩｇＧ  ＬＣ）並びに第二ポリメラーゼ連鎖反応後の予想されるサイズの７１１ｂｐ及び６８８ｂｐによく相関した。
【０１５８】
実施例２
２個の変更プライマーセットを用いたポリメラーゼ連鎖反応によるヒト化免疫化マウスの単一Ｂ細胞からのＩｇＧ遺伝子の増幅
【０１５９】
ヒト免疫グロブリン遺伝子座を有するマウスの単一Ｂ細胞を上記で概説したようにして得た。第一及び第二プライマーセットの５’プライマー及び３’プライマーは第二プライマーセットの各プライマーが核酸のより内部領域に結合する限りにおいて互いに異なっていた。このポリメラーゼ連鎖反応のスキームを図４に示す。
【０１６０】
第一ポリメラーゼ連鎖反応で用いるプライマーセットを下記のリストで示す：
【０１６１】
【表４０】
2014221069.tif 000041
【０１６２】
第二ポリメラーゼ連鎖反応で用いるプライマーセットを下記のリストで示す：
【０１６３】
【表４１】
2014221069.tif 000042
【０１６４】
図５では、このポリメラーゼ連鎖反応で得られた増幅核酸フラグメントのアガロースゲルを示す。試料をそれぞれ５０℃及び５５℃のアニーリング温度で４０増幅サイクルした後解析した。ブランク（水）はネガティブであり、フラグメントのサイズは第一ポリメラーゼ連鎖反応後の予想されるサイズの４７１ｂｐ（ＩｇＧ  ＨＣ）及び４１３ｂｐ（ＩｇＧ  ＬＣ）並びに第二ポリメラーゼ連鎖反応後の予想されるサイズの４４２ｂｐ及び３９９ｂｐによく相関した。
【０１６５】
実施例３
２個の同一のプライマーセットを用いたポリメラーゼ連鎖反応によるヒト化免疫化マウスの単一Ｂ細胞からのＩｇＧ遺伝子の増幅
【０１６６】
ヒト免疫グロブリン遺伝子座を有するマウスの単一Ｂ細胞を上記で概説したようにして得た。第一及び第二プライマーセットの５’プライマー及び３’プライマーは同一であった。このポリメラーゼ連鎖反応のスキームを図６に示す。
【０１６７】
第一及び第二ポリメラーゼ連鎖反応で用いるプライマーセットを下記のリストで示す：
【０１６８】
【表４２】
2014221069.tif 000043
【０１６９】
図７では、このポリメラーゼ連鎖反応で得られた増幅核酸フラグメントのアガロースゲルを示す。試料をそれぞれ５０℃及び５５℃のアニーリング温度で４０増幅サイクルした後解析した。ブランク（水）はネガティブであり、フラグメントのサイズは第一及び第二ポリメラーゼ連鎖反応後の予想されるサイズ７１１ｂｐ（ＩｇＧ  ＨＣ）及び６８８ｂｐ（ＩｇＧ  ＬＣ）によく相関した。
【０１７０】
実施例４
in vitro翻訳のための直鎖テンプレートの生成
第一ポリメラーゼ連鎖反応のために、遺伝子特異的プライマーをＴ７ファージの調節ＤＮＡ領域に必要なオーバーラッピング配列を含むように設計した。第二ポリメラーゼ連鎖反応のために、第一ＰＣＲ産物を、調節配列を含みｔａｇ配列をコードする核酸フラグメントと組み合わせた。３’末端伸張は調節エレメントを含む核酸フラグメントとハイブリダイゼーションさせて達成した。この直鎖発現構築物は２個の末端プライマーによりさらに増幅させる。これらのプライマーは下記の配列を含む：５’−ＣＴＴＴＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＣ＋ＡＴＧ＋１５〜２０ｂｐの遺伝子特異的配列（５’プライマー、配列番号：１２６）又は５’−ＡＴＣＧＴＡＴＧＧＧＴＡＧＣＴＧＧＴＣＣＣ＋ＴＴＡ＋１５〜２０ｂｐの遺伝子特異的配列（３’プライマー、配列番号：１２７）。
【０１７１】
図９では、レーン１、５及び９はブランクの水コントロールを示す。重鎖核酸はレーン４、８及び１２に含まれ、κ軽鎖はレーン３、７及び１１に含まれる。レーン２、６及び１０は両方の鎖を組み合わせた試料を示す。全ての核酸が期待するサイズを有している（表３８参照）。
【０１７２】
【表４３】
2014221069.tif 000044
【０１７３】
実施例５
in vitro翻訳及びｈｕＦａｂ特異的ＥＬＩＳＡ
in vitro翻訳は上記に概説したように実施する。
【０１７４】
図１０から明らかなように、２個の可変プライマーセットを用いた２工程ポリメラーゼ連鎖反応により得られた核酸からは、コードＦａｂ免疫グロブリンフラグメントのin vitro産生を可能にする直鎖発現構築物が得られない。対照的に、別々の連続したポリメラーゼ連鎖反応で用いた１個の固定及び１個の可変プライマーセットでの２工程ポリメラーゼ連鎖反応は、その後の直鎖発現構築物の提供及び免疫グロブリンＦａｂフラグメントを含むＩｇＧ  ＨＣ及びＩｇＧ  ＬＣのin vitro翻訳を可能にする。
【０１７５】
これとは対照的に、マルチプレックスフォーマットでは、２個の固定プライマーセットを用いるポリメラーゼ連鎖反応よりも１個の固定プライマーセットを含む２工程ポリメラーゼ連鎖反応がより効率的である。わずか１個の固定プライマーセットを用いることで、最高５倍高い光学密度を達成することができる。
【０１７６】
実施例６
単一細胞から得られる核酸を用いたin vitro翻訳及びｈｕＦａｂ特異的ＥＬＩＳＡ
【０１７７】
同一のプライマーセットを用いた２工程ポリメラーゼ連鎖反応
図１１から明らかなように、コントロール試料はアガロースゲルでシグナルを生成しなかった。沈着した単一Ｂ細胞もまたシグナルを生成しなかった。ＩｇＧ  ＨＣ及びＩｇＧ  ＬＣ（κ）はコントロール試料から増幅することができた。
【０１７８】
１個の固定プライマーセット及び１個の可変プライマーセットを用いた２工程ポリメラーゼ連鎖反応
図１３から明らかなように、１個の固定プライマーセット及び１個の可変プライマーセットを用いた２工程ポリメラーゼ連鎖反応から得られた試料２を除いた全ての核酸は、ＩｇＧ  ＨＣ及びＩｇＧ  ＬＣの産生のための直鎖発現構築物を提供することができた。従って、これらのマルチプレックスポリメラーゼ連鎖反応は非常に優れている。
【０１７９】
得られたヒトκＦａｂ免疫グロブリンフラグメントの濃度は１００〜５５０ng/mlである。図１６のレーン９〜１１はＩｇＧ  ＨＣポジティブコントロールを添加せず単一細胞から得られたＩｇＧ  ＨＣ及びＩｇＧ  ＬＣ（κ）を示す。ここで、得られたヒトＦａｂ免疫グロブリンフラグメントの量は１８０〜３３０ng/mlであった。
【図１】
2014221069.tif 000045
【図２】
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【図３】
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【図４】
2014221069.tif 000048
【図５】
2014221069.tif 000049
【図６】
2014221069.tif 000050
【図７】
2014221069.tif 000051
【図８】
2014221069.tif 000052
【図９】
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【図１０】
2014221069.tif 000054
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
2014221069.tif 000058
【図１５】
2014221069.tif 000059
【図１６】
2014221069.tif 000060
【配列表】
2014221069000001.app
【外国語明細書】
2014221069000001.pdf