(57)【要約】【課題】ＲｈｏＣに基づく免疫療法の提供。【解決手段】本発明は、一般に、転移癌の予防および治療の分野に関する。詳細には、抗癌免疫応答を惹起することができるタンパク質；Ｒａｓ相同遺伝子ファミリー、メンバーＣ（ＲｈｏＣ）またはそのペプチドフラグメントを提供する。具体的には、本発明は、転移癌の処置のためのＲｈｏＣまたはそれに由来するペプチドまたはＲｈｏＣ特異的Ｔ細胞の使用に関する。従って、本発明は、１つの態様において、癌の処置としてワクチン接種によりインビボで養子的に移入または誘導されるＲｈｏＣ特異的Ｔ細胞に関する。癌の処置、診断および予後予測におけるＲｈｏＣおよびその免疫原性ペプチドフラグメントの使用も提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願明細書に記載された発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
出願、すなわち本出願に引用するすべての特許および非特許参考文献は、それら全体が参照により本明細書にも援用されている。
【０００２】
発明の分野
本発明は、一般に、転移癌の予防および治療の分野に関する。詳細には、抗癌免疫応答を惹起することができるタンパク質；Ｒａｓ相同遺伝子ファミリー、メンバーＣ（ＲｈｏＣ）またはそのペプチドフラグメントを提供する。具体的には、本発明は、転移癌の処置のためのＲｈｏＣまたはそれに由来するペプチドまたはＲｈｏＣ特異的Ｔ細胞の使用に関する。したがって、本発明は、１つの態様において、癌の処置としてワクチン接種によりインビボで養子的に移入または導入されるＲｈｏＣ特異的Ｔ細胞に関する。
【０００３】
癌の処置、診断および予後予測におけるＲｈｏＣおよびその免疫原性ペプチドフラグメントの使用も提供する。
【背景技術】
【０００４】
癌の転移の発生は、癌の処置の成功にとって大きな障害となる。大部分の癌死亡は、転移の発生に起因する。
【０００５】
転移の原因であるタンパク質についての研究は、Ｒａｓ相同遺伝子ファミリーＧＴＰアーゼＲｈｏＣに関与していた。ＲｈｏＣの過発現が転移の発生において、ある一定の役割を果たすことが示唆されている。ＲｈｏＣがその転移効果を発揮する方法についての正確な理解は未だ定かではないが、卵巣癌、肺癌および黒色腫をはじめとする多くの癌において過発現されることが判明した。
【０００６】
哺乳動物免疫系が異物または外来物質を認識し、反応するプロセスは、複合的なものである。この系の重要な一面は、Ｔ細胞応答である。この応答は、Ｔ細胞が、ヒト主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）を構成するヒト白血球抗原（ＨＬＡ）と呼ばれる細胞表面分子とペプチドとの複合体を認識し、それらと相互作用することを必要とする。前記ペプチドは、より大きな分子から誘導され、それらの分子が抗原提示細胞によってプロセッシングされ、その結果としてその抗原提示細胞がＨＬＡ／ＭＨＣ分子を提示する。Ｔ細胞とＨＬＡ／ペプチドの複合体との相互作用は、ＨＬＡ分子とペプチドの特定の組み合わせに特異的であるＴ細胞を必要とするので、制限される。特異的Ｔ細胞が存在しない場合、そのパートナー複合体がたとえ存在したとしてもＴ細胞応答はない。同様に、Ｔ細胞は存在するが、特異的複合体が存在しない場合、応答はない。
【０００７】
Ｔ細胞が細胞異常を認識するメカニズムも癌に関連付けられている。例えば、特許文献１には、ペプチドへとプロセッシングされ、その結果として細胞表面で発現され、特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ、ＣＤ８細胞）により腫瘍細胞の溶解をもたらすことができる遺伝子ファミリーが開示されている。これらの遺伝子は、ＭＡＧＥファミリーと呼ばれ、「腫瘍拒絶抗原前駆体」または「ＴＲＡＰ」分子をコードすると言われており、それらに由来するペプチドは、「腫瘍拒絶抗原」または「ＴＲＡ」と呼ばれる。
【０００８】
特許文献２には、ＨＬＡ−Ａ１分子に結合するノナペプチドが開示されている。この参考文献には、特定のＨＬＡ分子に対する特定のペプチドの既知特異性を考慮すれば、あるＨＬＡ分子に結合するが他のものには結合しない特定のペプチドが予想されるはずであると開示されている。これは、異なる個体は異なるＨＬＡ表現型を有するため、有意である。結果として、特定のペプチドが特定のＨＬＡ分子のパートナーであると同定されることは、診断的および治療的効果をもたらすが、これらは、特定のＨＬＡ表現型を有する個体についてしか該当しない。
【０００９】
このように、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に由来するペプチドエピトープが、ＭＨＣ分子に関連してＣＴＬによって抗原として認識され得ることは、十分立証されている。しかし、すべてではないにせよ大部分の腫瘍が抗原性であることは一般に認められているとはいえ、腫瘍進行が免疫系によって容易に制御されるという意味では、実際は、ほんの少数しか免疫原性でない。
【００１０】
この制限を克服するために、幾つかの免疫療法の研究、例えば、ＴＡＡ由来ペプチドでのワクチン接種が開始された。黒色腫、多数のＣＴＬ規定ＴＡＡが特性付けされている腫瘍については、抗原に対する強力なＣＴＬ応答がワクチン接種によって誘導され、一部の患者は、彼らの疾患の完全寛解を経験した。しかし、これらのワクチン接種の治験において使用されたペプチドエピトープの大部分は、メラニン形成細胞特異的であり、これらのペプチドをメラニン成細胞起源でない腫瘍に利用することはできない。さらに、これらのＴＡＡの発現は、異なる患者からの腫瘍間で不均一であり、１人の患者から得られる転移の間でさえ様々であり得る。しかし、ここ数年の間に、多数の異なる癌において発現される多数の腫瘍特異的ペプチド抗原、すなわちＨＥＲ−２、Ｍｕｃ−１およびテロメラーゼが同定された。
【００１１】
過去１０年の間に非常に多数の臨床試験が、癌患者において抗腫瘍Ｔ細胞応答を誘導するペプチド特異的ワクチン接種の実現の可能性を示した。しかし、これらの患者の臨床経過は、殆どの場合、改善されなかった。この矛盾は、非常に多数の症例において腫瘍細胞の免疫逃避メカニズムにより説明されている。
【００１２】
他のＲｈｏ  ＧＴＰアーゼと同様に、ＲｈｏＣは、成長制御についての幾つかの態様、および細胞外因子に応じての細胞骨格構成に影響を及ぼす。より最近のデータは、癌細胞の転移に重要な役割を果たすことが証明されているＲｈｏＣに関して、より特異的な役割を示唆している。例えば、幾つかの系統の証拠は、癌細胞におけるＲｈｏＣの高い発現、および癌細胞の転移の可能性がＲｈｏＣの発現に依存することを明示している。ＲｈｏＣの選択的増加発現が転移癌に関して記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】国際公開第９２／２０３５６号
【特許文献２】国際公開第９４／０５３０４号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は、ＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩ分子に結合することができるペプチドであるＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩ拘束ペプチドをＲｈｏＣから誘導することができるという驚くべき発見に基づく。驚くべきことに、本発明者らは、これらの自己抗原が、癌疾患、特に転移癌疾患に罹患している患者において自発的Ｔ細胞応答を惹起できることを発見した。これらの発見は、転移癌疾患の制御に一般に適用可能であり得る新規治療および診断アプローチへの道を開く。
【００１５】
特に転移に対するワクチンを設計するために適切なタンパク質標的を見つけることは非常に難しかった。本発明は、細胞傷害性（ＣＤ８）Ｔ細胞によって認識されるものもあり、ヘルパー（ＣＤ４）Ｔ細胞によって認識されるものもある、新規ＲｈｏＣペプチドを開示する。これらのエピトープは、クラスＩＩおよびクラスＩ  ＭＨＣタンパク質によってそれぞれ拘束される。
【００１６】
したがって、本発明の焦点は、腫瘍特異的Ｔ細胞免疫を惹起すること、すなわち、腫瘍が一般にはクラスＩＩ  ＭＨＣを発現しないという事実にもかかわらず、クラスＩおよびクラスＩＩ−ＭＨＣ拘束エピトープでワクチン接種することにある。これは、ＲｈｏＣに対するワクチン誘導抗腫瘍応答の誘導および効力が、腫瘍特異的ＣＤ４ポジティブＴｈ細胞の協同を必要とし得るという発見に基づく。
【００１７】
したがって、１つの態様において、ワクチンの開発に駆り立てる重要な要因は、例えば、注意深く選択されたＣＴＬおよびＴｈ細胞エピトープのコレクションを含むまたはコードするワクチンを設計することにより、多数の腫瘍抗原を標的にするという願望であり得る。マルチエピトープワクチンは、オンコプロテインなどの潜在的に有害なタンパク質（をコードする遺伝子）を導入する必要なく、幾つかの異なる抗原に由来するエピトープに対する免疫を生じさせる有効な方法となり得る。そのようなワクチンは、亜優占的で潜在的なＴ細胞エピトープに対する免疫を選択的に誘導することもでき、これは、正常組織に顕著に存在するエピトープに対する耐性が存在し得る腫瘍関連自己抗原の場合、特に重要であり得る。さらに、抗原提示細胞は、抗原提示細胞の免疫プロテアソームと大部分の腫瘍細胞に存在する「構成的」プロテアソームの間の機能的相違のため、腫瘍細胞上で発現する一定のエピトープを提示できない。
【００１８】
ペプチド系ワクチンの場合、抗原取り込みおよび宿主抗原提示細胞によるプロセッシングに関係なく外因性負荷により提示を可能にする「ＭＨＣ−ｒｅａｄｙ」形態で、エピトープを投与することができる。本発明のペプチドは、短い「ＭＨＣ−ｒｅａｄｙ」形態のペプチドと、プロテアソームによるプロセッシングを必要とする、より長い形態のペプチドの両方を含み、それゆえ、多数の腫瘍抗原を標的にすることができる、より複雑なワクチン組成物を提供する。ワクチンが標的にするＨＬＡ群が多様であるほど、異なる集団においてそのワクチンが機能する尤度が高くなる。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明は、ＲｈｏＣが、転移癌に対する免疫療法に適した標的のようであることを開示する。ＲｈｏＣの発現は転移を促進すると言われており、これは、ＲｈｏＣをワクチン接種の魅力的な標的にする可能性を秘めている。このタンパク質の発現のダウンレギュレーションまたは減少による免疫逃避が転移を損なわせるかもしれないからである。本発明者らは、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを用いて黒色腫患者においてＲｈｏＣ由来ペプチドについて研究し、驚くべきことに末梢血リンパ球（ＰＢＬ）においてＲｈｏＣ由来ペプチドに対する自発的Ｔ細胞活性を検出した。
【００２０】
したがって、本発明は、第１の態様において、医薬品として使用するための、
ａ）配列番号１のＲｈｏＣもしくは配列番号１と少なくとも７０％の同一性を有するその機能的相同体、または前記ＲｈｏＣもしくは前記その機能的相同体の連続配列を含む免疫原的に活性なペプチドフラグメント、または前記ＲｈｏＣもしくは前記ペプチドフラグメントをコードする核酸；と
ｂ）アジュバントと
を含むワクチン組成物に関する。
【００２１】
本発明の他の態様は、転移癌の予防または処置において医薬品として使用するためのＲｈｏＣまたはそのペプチドフラグメントに関する。
【００２２】
詳細には、本発明は、多くて３個のアミノ酸が置換されている、配列番号１のＲｈｏＣからの１８から２５個の連続するアミノ酸から成る単離された免疫原的に活性なペプチドフラグメントまたは前記ペプチドフラグメントの機能的相同体に関し、この場合のペプチドフラグメントは、配列番号１のＲｈｏＣのアミノ酸残基Ｉ４３、Ｑ１２３、Ｒ１４０、Ｓ１４１、Ｓ１５２、Ｌ１５７、Ｅ１６５、Ｇ１７８、Ｖ１８１、Ｋ１８３、Ｎ１８４、Ｒ１８６、Ｒ１８７、Ｒ１８８、Ｐ１９１またはＩ１９２のうちの少なくとも１個を含有する。
【００２３】
また、本発明は、多くて３個のアミノ酸が置換されている、配列番号１のＲｈｏＣからの８から１０の連続するアミノ酸から成る単離された免疫原的に活性なペプチドフラグメントまたは前記ペプチドフラグメントの機能的相同体に関し、この場合のペプチドフラグメントは、配列番号１のＲｈｏＣのアミノ酸残基Ｉ４３、Ｑ１２３、Ｒ１４０、Ｓ１４１、Ｓ１５２、Ｌ１５７、Ｅ１６５、Ｇ１７８、Ｖ１８１、Ｋ１８３、Ｎ１８４、Ｒ１８６、Ｒ１８７、Ｒ１８８、Ｐ１９１またはＩ１９２のうちの少なくとも１個を含有する。
【００２４】
さらに、本発明は、多くて２個のアミノ酸が置換されている、配列番号１のＲｈｏＣからの２６から７５の連続するアミノ酸から成る単離された免疫原的に活性なペプチドフラグメントまたはその機能的相同体に関し、この場合のペプチドフラグメントは、配列番号１のＲｈｏＣのアミノ酸残基Ｉ４３、Ｑ１２３、Ｒ１４０、Ｓ１４１、Ｓ１５２、Ｌ１５７、Ｅ１６５、Ｇ１７８、Ｖ１８１、Ｋ１８３、Ｎ１８４、Ｒ１８６、Ｒ１８７、Ｒ１８８、Ｐ１９１またはＩ１９２のうちの少なくとも１個を含有する。
【００２５】
したがって、本発明は、第２の態様において、転移癌の予防または処置において医薬品として使用するためのＲｈｏＣの免疫原的に活性なペプチドフラグメントに関する。詳細には、本発明は、転移癌の予防または処置において医薬品として使用するための、ＲｈｏＣに由来する単離された免疫原的に活性なペプチドフラグメントに関する。
【００２６】
さらなる態様において、本発明は、本発明の上記タンパク質および／またはペプチドフラグメントを含む、医薬組成物を提供する。
【００２７】
本発明の態様は、転移癌の予防または処置において医薬品として使用するための、ＲｈｏＣもしくはこの免疫原的に活性なペプチドフラグメントまたは前記タンパク質もしく前記ペプチドフラグメントをコードする核酸を含むワクチン組成物を提供することでもある。
【００２８】
なお、さらなる態様において、本発明は、癌患者におけるＲｈｏＣと反応性であるＰＢＬ中のもしくは腫瘍組織内のＴ細胞の存在のエクスビボもしくはインサイチュ診断のための診断キットに関し（このキットは、上で定義したとおりの本発明のペプチドフラグメント）；本発明のペプチドフラグメントとクラスＩもしくはクラスＩＩ  ＨＬＡ分子またはそのような分子のフラグメントとの複合体を含む。
【００２９】
本発明の目的は、転移癌患者においてＲｈｏＣ反応性Ｔ細胞の存在を検出する方法を提供することでもあり、この方法は、上で定義したとおりの本発明の複合体と腫瘍組織または血液サンプルとを接触させること、および前記複合体の前記組織または血液細胞への結合を検出することを含む。
【００３０】
加えて、本発明のペプチドフラグメントに特異的に結合することができる分子、およびそのような結合を阻止することができる分子を提供する。
【００３１】
もう１つの態様において、本発明は、転移癌疾患の処置方法に関し、この方法は、有効量の本発明の医薬組成物、本発明のペプチドフラグメントに特異的に結合することができる本発明の分子、および／またはそのような結合を遮断することができる本発明の分子を前記疾患に罹患している患者に投与することを含む。
【００３２】
さらにもう１つの態様において、本発明は、癌疾患の処置のための医薬品の製造における、本発明において定義するとおりのタンパク質またはペプチドフラグメントの使用を提供する。
【００３３】
加えて、転移癌の処置または予防において使用するための、配列番号１のＲｈｏＣもしくは配列番号１と少なくとも７０％の同一性を有するその機能的相同体または前記ＲｈｏＣもしくは前記その機能的相同体の連続配列を含む免疫原的に活性なペプチドフラグメントまたは前記ＲｈｏＣもしくは前記ペプチドフラグメントをコードする核酸を提供する。
【００３４】
さらに、転移癌の処置または予防において使用するための、本発明において定義するとおりのペプチドフラグメントまたは本発明において定義するとおりのワクチン組成物を提供する。
【００３５】
本発明のもう１つの態様は、免疫処置をモニターする方法に関し、前記方法は、
ｉ）個体からの血液サンプルを提供する工程；
ｉｉ）配列番号１のＲｈｏＣもしくは配列番号１と少なくとも７０％の同一性を有するその機能的相同体または前記ＲｈｏＣもしくは前記その機能的相同体の連続配列を含む免疫原的に活性なペプチドフラグメントまたは前記ＲｈｏＣもしくは前記ペプチドフラグメントをコードする核酸を提供する工程；
ｉｉｉ）前記血液サンプルが、前記タンパク質またはペプチドに特異的に結合する抗体またはＴ細胞受容体を含むＴ細胞を含むかどうかを決定する工程；
ｉｖ）それによって、前記タンパク質またはペプチドへの免疫応答が前記個体において生じたかどうかを決定する工程、
を含む。
【００３６】
本発明のもう１つの態様は、ＲｈｏＣまたはそのペプチドフラグメントと特異的に相互作用することができる単離されたＴ細胞、および前記Ｔ細胞を産生する方法に関する。
【００３７】
本発明のもう１つの態様は、単離されたＲｈｏＣ特異的Ｔ細胞クローンを含む医薬組成物、ならびに単離されたＲｈｏＣ特異的Ｔ細胞を含む組成物をその必要がある個体に投与することを含む転移癌の処置および／または予防方法を提供する。
本発明の好ましい実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
医薬品として使用するための、
ａ）配列番号１のＲｈｏＣもしくは配列番号１に対して少なくとも７０％の同一性を有するその機能的相同体、または該ＲｈｏＣもしくは該その機能的相同体の連続配列を含む免疫原的に活性なペプチドフラグメント、または該ＲｈｏＣもしくは該ペプチドフラグメントをコードする核酸；と
ｂ）アジュバントと
を含むワクチン組成物。
（項目２）
前記免疫原的に活性なペプチドフラグメントが、多くて２個のアミノ酸が置換されている、前記配列番号１のＲｈｏＣまたは前記その機能的相同体の８から５０個の範囲、好ましくは９から２５個の範囲のアミノ酸の連続配列から成る、項目１に記載のワクチン組成物。
（項目３）
ＲｈｏＣを発現する転移癌に罹患している個体に投与したとき、多くて２個のアミノ酸が置換されている配列番号１のＲｈｏＣまたはその機能的相同体を発現する転移癌に対する免疫応答を惹起することができる、項目１に記載のワクチン組成物。
（項目４）
多くて２個のアミノ酸が置換されている配列番号１のＲｈｏＣまたはその機能的相同体からの１８から２５個の連続するアミノ酸から成る、単離された免疫原的に活性なペプチドフラグメントであって、配列番号１のＲｈｏＣのアミノ酸残基Ｉ４３、Ｑ１２３、Ｒ１４０、Ｓ１４１、Ｓ１５２、Ｌ１５７、Ｅ１６５、Ｇ１７８、Ｖ１８１、Ｋ１８３、Ｎ１８４、Ｒ１８６、Ｒ１８７、Ｒ１８８、Ｐ１９１またはＩ１９２のうちの少なくとも１個を含有するペプチドフラグメント。
（項目５）
多くて２個のアミノ酸が置換されている配列番号１のＲｈｏＣまたはその機能的相同体からの８から１０個の連続するアミノ酸から成る、単離された免疫原的に活性なペプチドフラグメントであって、配列番号１のＲｈｏＣのアミノ酸残基Ｉ４３、Ｑ１２３、Ｒ１４０、Ｓ１４１、Ｓ１５２、Ｌ１５７、Ｅ１６５、Ｇ１７８、Ｖ１８１、Ｋ１８３、Ｎ１８４、Ｒ１８６、Ｒ１８７、Ｒ１８８、Ｐ１９１またはＩ１９２のうちの少なくとも１個を含有するペプチドフラグメント。
（項目６）
多くて２個のアミノ酸が置換されている配列番号１のＲｈｏＣまたはその機能的相同体からの２６から６０個の連続するアミノ酸から成る、単離された免疫原的に活性なペプチドフラグメントであって、配列番号１のＲｈｏＣのアミノ酸残基Ｉ４３、Ｑ１２３、Ｒ１４０、Ｓ１４１、Ｓ１５２、Ｌ１５７、Ｅ１６５、Ｇ１７８、Ｖ１８１、Ｋ１８３、Ｎ１８４、Ｒ１８６、Ｒ１８７、Ｒ１８８、Ｐ１９１またはＩ１９２のうちの少なくとも１個を含有するペプチドフラグメント。
（項目７）
配列ＲＸＧＬＱＶＲＫＮＫを含み、ここで、Ｘは、アラニンおよびロイシンからなる群より選択され、長くとも６０アミノ酸長である、項目４から６のいずれかに記載のペプチドフラグメント。
（項目８）
癌患者において細胞免疫応答を惹起することができる、項目４から７のいずれかに記載のペプチドフラグメント。
（項目９）
次の特徴：
（ｉ）ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって決定したとき、癌患者のＰＢＬ集団において１０４ＰＢＬあたり少なくとも１の頻度でＩＮＦ−γ産生細胞を惹起することができる、および／または
（ｉｉ）腫瘍組織においてエピトープペプチドと反応性であるＣＴＬをインサイチュで検出することができる、
（ｉｉｉ）ＲｈｏＣ特異的Ｔ細胞のインビトロでの成長を誘導することができる、
のうちの少なくとも１つを有する、ＭＨＣクラスＩ拘束ペプチドまたはＭＨＣクラスＩＩ拘束ペプチドである、項目４から８のいずれか１項に記載のペプチドフラグメント。
（項目１０）
ＭＨＣクラスＩ  ＨＬＡ−Ａ分子によって拘束される、項目９に記載のペプチドフラグメント。
（項目１１）
ＨＬＡ−Ａ１、ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ａ３、ＨＬＡ−Ａ１１およびＨＬＡ−Ａ２４からなる群より選択されるＭＨＣクラスＩ  ＨＬＡ種によって拘束される、項目１０に記載のペプチドフラグメント。
（項目１２）
ＨＬＡ−Ａ３によって拘束される、項目１１に記載のペプチドフラグメント。
（項目１３）
ＨＬＡ−Ａ２によって拘束される、項目１１に記載のペプチドフラグメント。
（項目１４）
ＭＨＣクラスＩ  ＨＬＡ−Ｂ分子によって拘束される、項目９に記載のペプチドフラグメント。
（項目１５）
ＨＬＡ−Ｂ７、ＨＬＡ−Ｂ３５、ＨＬＡ−Ｂ４４、ＨＬＡ−Ｂ８、ＨＬＡ−Ｂ１５、ＨＬＡ−Ｂ２７およびＨＬＡ−Ｂ５１からなる群より選択されるＭＨＣクラスＩ  ＨＬＡ−Ｂ種によって拘束される、項目１４に記載のペプチドフラグメント。
（項目１６）
ＭＨＣクラスＩＩ分子によって拘束される、項目９に記載のペプチドフラグメント。
（項目１７）
配列番号１のＲｈｏＣからの８から１０個または１８から２５個または２６から６０個の連続するアミノ酸から成る、項目４から１６のいずれかに記載のペプチドフラグメント。
（項目１８）
配列番号１のＲｈｏＣの少なくとも１個のアミノ酸が、少なくとも置換、欠失または付加されている、配列番号１のＲｈｏＣからの８から１０個または１８から２５個または２６から６０個の連続するアミノ酸から成る、項目４から１６のいずれかに記載のペプチドフラグメント。
（項目１９）
癌患者のＰＢＬ集団において１０４ＰＢＬあたり少なくとも１０の頻度でＩＮＦ−γ産生細胞を惹起することができる、項目４から１８のいずれかに記載のペプチドフラグメント。
（項目２０）
配列番号１のＲｈｏＣまたは配列番号１に対して少なくとも７０％の同一性を有するその機能的相同体が発現される癌疾患を有する患者のＰＢＬ集団においてＩＮＦ−γ産生細胞を惹起することができる、項目４から１９のいずれかに記載のペプチドフラグメント。
（項目２１）
前記癌疾患が、転移癌である、項目２０に記載のペプチドフラグメント。
（項目２２）
前記ペプチドフラグメントが、少なくとも１個のアミノ酸だけ配列番号２のＲｈｏＡまたは配列番号３のＲｈｏＢの配列から異なる、８から６０個の範囲のアミノ酸の配列、好ましくは９から２５個の範囲のアミノ酸の配列の、配列番号１のＲｈｏＣの連続配列から成る、項目１から３のいずれかに記載のワクチン組成物。
（項目２２）
前記ペプチドフラグメントが、少なくとも１個のアミノ酸だけ配列番号３のＲｈｏＢの配列から異なる、８から６０個の範囲のアミノ酸、好ましくは９から２５個の範囲のアミノ酸の配列番号１のＲｈｏＣの連続配列から成る、項目１から３のいずれかに記載のワクチン組成物。
（項目２３）
前記ペプチドフラグメントが、配列番号１のＲｈｏＣの６０個の最もＣ末端側のアミノ酸または配列番号１に対して少なくとも７０％の同一性を有するその機能的相同体から選択される配列から成る、項目１から３のいずれかに記載のワクチン組成物。
（項目２４）
前記ペプチドフラグメントが、多くて６０個のアミノ酸残基、例えば５０個のアミノ酸残基、例えば多くて４５個のアミノ酸残基、例えば多くて４０個のアミノ酸残基、例えば多くて３５個のアミノ酸残基、例えば多くて３０個のアミノ酸残基、例えば多くて２５個のアミノ酸残基、例えば１５から２０個のアミノ酸残基から成る、項目１から３のいずれかに記載のワクチン組成物。
（項目２５）
前記ペプチドフラグメントが、多くて２０個のアミノ酸残基、例えば多くて１９個のアミノ酸残基、例えば多くて１８個のアミノ酸残基、例えば多くて１７個のアミノ酸残基、例えば多くて１６個のアミノ酸残基、例えば多くて１５個のアミノ酸残基、例えば多くて１４個のアミノ酸残基、例えば多くて１３個のアミノ酸残基、例えば多くて１２個のアミノ酸残基、例えば多くて１１個のアミノ酸残基、例えば８から１０個のアミノ酸残基から成る、項目１から３のいずれかに記載のワクチン組成物。
（項目２６）
前記ペプチドフラグメントが、多くて１個のアミノ酸が置換されており、好ましくは該置換が保存的である、８から６０個の範囲のアミノ酸、好ましくは８から２０個の範囲のアミノ酸の配列番号１のＲｈｏＣの連続配列から成る、項目１から３のいずれかに記載のワクチン組成物。
（項目２７）
前記ペプチドフラグメントが、多くて２個のアミノ酸が置換されており、好ましくは該置換が保存的である、８から６０個の範囲のアミノ酸、好ましくは８から２０個の範囲のアミノ酸の配列番号１のＲｈｏＣの連続配列から成る、項目１から３のいずれかに記載のワクチン組成物。
（項目２８）
前記ペプチドフラグメントが、多くて３個のアミノ酸が置換されており、好ましくは該置換が保存的である、８から６０個の範囲のアミノ酸、好ましくは８から２０個の範囲のアミノ酸の配列番号１のＲｈｏＣの連続配列から成る、項目１から３のいずれかに記載のワクチン組成物。
（項目２９）
項目４から２１のいずれかに記載のペプチドフラグメントを含む、項目１から３のいずれかに記載のワクチン組成物。
（項目３０）
前記ワクチンが、ワクチン接種した患者において癌細胞に対して細胞傷害効果を有するエフェクターＴ細胞の産生を惹起する、項目１から３および２２から２９のいずれかに記載のワクチン組成物。
（項目３１）
被験者において腫瘍間質における抗原特異的Ｔ細胞の浸潤を誘導することができる、項目１から３および２２から３０のいずれかに記載のワクチン組成物。
（項目３２）
被験者において臨床応答を惹起することができ、該臨床応答が、安定した疾患、部分応答または完全寛解を特徴とする、項目１から３および２２から３１のいずれかに記載のワ
クチン組成物。
（項目３３）
被験者において臨床応答を惹起することができ、該臨床応答が、最大の標的病変の最大直径の合計の減少を特徴とする、項目１から３および２２から３２のいずれかに記載のワクチン組成物。
（項目３４）
被験者において臨床応答を惹起することができ、該臨床応答が、完全寛解である、項目１から３および２３から３３のいずれかに記載のワクチン組成物。
（項目３５）
ＲｈｏＣではないタンパク質またはペプチドフラグメントから選択される、免疫原性タンパク質またはペプチドフラグメントをさらに含む、項目１から３および２２から３４のいずれかに記載のワクチン組成物。
（項目３６）
前記アジュバントが、細菌ＤＮＡ系アジュバント、油／界面活性剤系アジュバント、ウイルスｄｓＲＮＡ系アジュバントおよびイミダゾキニリン（ｉｍｉｄａｚｏｃｈｉｎｉｌｉｎｅｓ）からなる群より選択される、項目１から３および２２から３５のいずれかに記載のワクチン組成物。
（項目３７）
前記アジュバントが、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡアジュバントである、項目１から３および２２から３６のいずれかに記載のワクチン組成物。
（項目３８）
前記アジュバントが、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ５１またはＭｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ  ７２０である、項目３７に記載のワクチン組成物。
（項目３９）
前記アジュバントが、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ５１である、項目３８に記載のワクチン組成物。
（項目４０）
前記アジュバントが、ＧＭ−ＣＳＦである、項目１から３および２２から３６のいずれかに記載のワクチン組成物。
（項目４１）
免疫原的に活性なペプチドフラグメントまたは該免疫原的に活性なペプチドフラグメントをコードする核酸を含む抗原提示細胞を含む、項目１から３および２２から４０のいずれかに記載のワクチン組成物。
（項目４２）
前記抗原提示細胞が、樹状細胞である、項目４１に記載のワクチン組成物。
（項目４３）
前記核酸が、項目４から２１のいずれかに記載のペプチドをコードする、項目１に記載のワクチン組成物。
（項目４４）
前記核酸が、ベクター内に含まれる、項目１から４３のいずれかに記載のワクチン組成物。
（項目４５）
前記ベクターが、ウイルスベクターおよび細菌ベクターからなる群より選択される、項目４４に記載のワクチン組成物。
（項目４６）
前記ベクターが、Ｔ細胞刺激ポリペプチドをコードする核酸をさらに含む、項目４４から４５のいずれかに記載のワクチン組成物。
（項目４７）
項目１から３および２２から４６のいずれかに記載のワクチン組成物とさらなる抗癌剤とを含むパーツキット（ｋｉｔ−ｏｆ−ｐａｒｔｓ）。
（項目４８）
前記抗癌剤が、抗体である、項目４７に記載のパーツキット。
（項目４９）
前記抗癌剤が、サイトカインである、項目４７に記載のパーツキット。
（項目５０）
ＲｈｏＣと反応性であるＰＢＬ中のまたは腫瘍組織内のＴ細胞の癌患者における存在についてのエクスビボまたはインサイチュ診断のための組成物であって、項目４から２１のいずれかに記載のペプチドフラグメントを含む組成物。
（項目５１）
ＲｈｏＣと反応性であるＰＢＬ中のまたは腫瘍組織内のＴ細胞の癌患者における存在についてのエクスビボまたはインサイチュ診断のための診断キットであって、項目４から２１のいずれかに記載のペプチドフラグメントを含むキット。
（項目５２）
項目４から２１のいずれかに記載のペプチドフラグメントとクラスＩ  ＨＬＡもしくはクラスＩＩ  ＨＬＡ分子またはそのような分子のフラグメントとの複合体。
（項目５３）
単量体である、項目５３に記載の複合体。
（項目５４）
多量体である、項目５３に記載の複合体。
（項目５５）
腫瘍組織または血液サンプルと項目５３に記載の複合体とを接触させること、および該複合体の該組織または血液細胞への結合を検出することを含む、癌患者においてＲｈｏＣ反応性Ｔ細胞の存在を検出する方法。
（項目５６）
項目４から２１のいずれかに記載のペプチドフラグメントに特異的に結合することができる分子。
（項目５７）
抗体またはそのフラグメントである、項目５７に記載の分子。
（項目５８）
Ｔ細胞受容体である、項目５８に記載の分子。
（項目５９）
項目５６または５８に記載の分子の結合を阻止することができる分子。
（項目６０）
転移癌疾患の処置方法であって、有効量の、項目１から３および２２から４６のいずれかに記載の組成物、項目５６に記載の分子、項目５９に記載の分子または項目４７から４９のいずれかに記載のパーツキットを前記疾患に罹患している患者に投与することを含む方法。
（項目６１）
処置される前記疾患が、ＲｈｏＣが発現される癌疾患である、項目６０に記載の方法。
（項目６２）
さらなる癌処置と併用される、項目６１に記載の方法。
（項目６３）
前記さらなる処置が、化学療法、放射線療法、免疫刺激物質での処置、遺伝子療法、抗体での処置および樹状細胞を使用する処置からなる群より選択される、項目６２に記載の方法。
（項目６４）
癌疾患の処置または予防用の医薬品の製造における、項目４から２１のいずれかに記載のペプチドフラグメントまたは項目１から３および２２から４６のいずれかに記載のワクチン組成物の使用。
（項目６５）
処置される前記疾患が、ＲｈｏＣが発現される癌疾患である、項目６４に記載の使用。
（項目６６）
前記癌疾患が、転移癌である、項目６４から６５のいずれかに記載の使用。
（項目６７）
さらなる癌処置と併用される、項目６４から６６のいずれかに記載の使用。
（項目６８）
前記さらなる処置が、化学療法、放射線療法、免疫刺激物質での処置、遺伝子療法、抗体での処置および樹状細胞を使用する処置からなる群より選択される、項目６７に記載の使用。
（項目６９）
免疫処置をモニターする方法であって、該方法は：
ｉ）個体からの血液サンプルを提供する工程；
ｉｉ）配列番号１のＲｈｏＣもしくは配列番号１に対して少なくとも７０％の同一性を有するその機能的相同体または該ＲｈｏＣもしくは該その機能的相同体の連続配列を含む免疫原的に活性なペプチドフラグメントまたは該ＲｈｏＣもしくは該ペプチドフラグメントをコードする核酸を提供する工程；
ｉｉｉ）該血液サンプルが、該タンパク質またはペプチドを特異的に結合する抗体またはＴ細胞受容体を含むＴ細胞を含むかどうかを決定する工程；
ｉｖ）それによって、該タンパク質またはペプチドへの免疫応答が該個体において生じたかどうかを決定する工程、
を含む、免疫処置をモニターする方法。
（項目７０）
前記ペプチドフラグメントが、いずれかの項目に記載のペプチドフラグメントである、項目６９に記載の方法。
（項目７１）
転移癌の処置または予防において使用するための、配列番号１のＲｈｏＣもしくは配列番号１に対して少なくとも７０％の同一性を有するその機能的相同体または該ＲｈｏＣもしくは該その機能的相同体の連続配列を含む免疫原的に活性なペプチドフラグメントまたは該ＲｈｏＣもしくは該ペプチドフラグメントをコードする核酸。
（項目７２）
転移癌の処置または予防において使用するための、項目４から２１のいずれかに記載のペプチドフラグメントまたは項目１から３および２２から４６のいずれかに記載のワクチン組成物。
（項目７３）
項目５８に記載のＴ細胞受容体を含む単離されたＴ細胞。
（項目７４）
配列番号１のＲｈｏＣもしくは配列番号１に対して少なくとも７０％の同一性を有するその機能的相同体または該ＲｈｏＣもしくはそのフラグメントの連続配列を含む免疫原的に活性なペプチドフラグメントと特異的に相互作用することができる単離されたＴ細胞。
（項目７５）
項目４から２１に記載のＲｈｏＣペプチドのいずれかと特異的に相互作用することができる、項目７４に記載のＴ細胞。
（項目７６）
ＣＤ８  Ｔ細胞である、項目７４から７５に記載のＴ細胞。
（項目７７）
ＣＤ４  Ｔ細胞である、項目７４から７５に記載のＴ細胞。
（項目７８）
項目５７に記載のＴ細胞受容体をコードする第１のヌクレオチド配列とＴ細胞における該第１のヌクレオチド配列の発現を指示する第２のヌクレオチド配列とを含む異種ＤＮＡ構築物を含む、項目７４から７７のいずれかに記載のＴ細胞。
（項目７９）
配列番号１のＲｈｏＣもしくは配列番号１に対して少なくとも７０％の同一性を有するその機能的相同体または該ＲｈｏＣもしくはそのフラグメントの連続配列を含む免疫原的に活性なペプチドフラグメントの存在下でＴ細胞を増殖させることを含む、項目７８に記載のＴ細胞クローンの調製方法。
（項目８０）
項目４から２１に記載のＲｈｏＣペプチドのいずれかの存在下でＴ細胞を増殖させることを含む、項目７９に記載の方法。
（項目８１）
項目７３から８０のいずれかに記載の単離されたＴ細胞クローンを含む医薬組成物。
（項目８２）
転移癌の治療において使用するためのものである、項目８１に記載の医薬組成物。
（項目８３）
項目７４に記載の単離されたＴ細胞を含む組成物をその必要がある個体に投与することを含む、転移癌の処置および／または予防方法。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】図１は、ＲｈｏＣ、ＲｈｏＡおよびＲｈｏＢのアラインメント。ヒトＲｈｏＣ、ヒトＲｈｏＡおよびヒトＲｈｏＢの配列アラインメント
【図２】図２は、Ｒｈｏ１およびＲｈｏ１Ｌ２の結合親和性。Ｒｈｏ１およびＲｈｏ１Ｌ２の安定化をアセンブリーアッセイによって分析した。クラスＩ  ＭＨＣ重鎖バンドをＰｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒで定量した。安定化ＨＬＡ−Ａ３重鎖の量は、添加したペプチドの結合親和性と正比例する。ＨＬＡ−Ａ３拘束ポジティブ対照インフルエンザＮＰ２６５−２７３の結合を、ペプチドＲｈｏ１Ｌ２および天然ペプチドＲｈｏ１と比較した。
【図３】図３は、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴによって測定したときのＲｈｏ１Ｌ２に対するＨＬＡ−Ａ３拘束Ｔ細胞応答。５×１０５のインビトロで刺激した、５人のＨＬＡ−Ａ３＋健常ドナー（ＨＤ）からのＰＢＭＣ、１０人の腎細胞癌患者（ＲＣＣ）および１０人の黒色腫患者（ＭＭ）からのＰＢＬの間のＲｈｏ１Ｌ２に応答して形成されたペプチド特異的ＩＦＮγスポットの平均数。三重反復で測定を行った。抗原特異的スポットの数は、ポジティブウエルにおける平均スポット数から対照ウエルの平均スポット数を引くことによって計算した；高い標準偏差を有する反復測定値がポジティブな結果と受け取られることを防ぐために、すべての反復測定値を、対応のないサンプルのためのスチューデントｔ検定によって分析し、ｐ値＜０．０５を有する結果をポジティブとみなした。
【図４】図４は、Ｔ細胞抗原特異性および交差反応性。Ｒｈｏ１Ｌ２を負荷した自己ＤＣ／自己ＰＢＬで刺激したバルク培養物の５１Ｃｒ放出アッセイによる細胞傷害性。ペプチドを伴わないまたはＲｈｏ１Ｌ２もしくはＲｈｏ１でパルスしたＴ２−Ａ３細胞の特異的溶解。Ｅ：Ｔ比＝６０：１、二重反復で測定を行った。ａ）５１Ｃｒ放出アッセイによってアッセイしたＴ細胞クローン（クローン９）の特異性。ペプチドを伴わないＴ２−Ａ３細胞、Ｒｈｏ１Ｌ２、Ｒｈｏ１でまたはＨＬＡ−クラスＩ特異的抗体Ｗ６／３２もしくはＨＬＡ−Ａ３特異的抗体ＧＡＰ  Ａ３で、異なるＥ：Ｔ比（９：１；３：１；１：１；０．３：１）でパルスしたＴ２−Ａ３細胞の溶解。
【図５】図５は、ＲｈｏＣ特異的Ｔ細胞の機能的能力。ａ）Ｒｈｏ１Ｌ２を負荷した自己ＤＣ／自己ＰＢＬで刺激したバルク培養物の細胞傷害性。ＨＬＡ−クラスＩ特異的抗体Ｗ６／３２を添加していないおよび添加したＨＬＡ−Ａ３＋黒色腫細胞系ＦＭ３の特異的溶解。ｂ）ＨＬＡ−Ａ３＋黒色腫細胞系ＦＭ３のＲｈｏ１Ｌ２特異的クローンによる溶解、Ｒｈｏ１Ｌ２でパルスしたまたはペプチドでパルスしていない非標識Ｔ２−Ａ３細胞の添加での細胞溶解（阻害剤対標的比＝２０：１）、ならびにＨＬＡ−Ａ３＋黒色腫細胞系ＦＭ９およびＨＬＡ−Ａ３−黒色腫細胞系ＦＭ８２の細胞溶解。すべてのＥ：Ｔ比について二重反復で測定を行った。ｃ）ＨＬＡ−Ａ３＋乳癌細胞系ＢＴ−２０、大腸癌細胞系ＨＴ−２９および頭頚部癌細胞系ＣＲＬ−２０９５のＲｈｏ１Ｌ２特異的クローンによる溶解。すべてのＥ：Ｔ比について二重反復で測定を行った。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
本発明の主目的は、癌の予防または処置において医薬品として使用するための、ＲｈｏＣまたはその免疫原的に活性なペプチドフラグメントを提供することである。
【００４０】
Ｒｈｏ  ＧＴＰアーゼ
３個のヒトＲｈｏファミリーメンバーＲｈｏＡ、ＢおよびＣは、非常に相同であり、ＲｈｏＡとＲｈｏＣは、最も相同である。ＲｈｏＡおよびＲｈｏＣは、両方とも１９３アミノ酸長であるが、ＲｈｏＣは、１９１のアミノ酸から成る。ＲｈｏＡとＲｈｏＣは非常に相同であるにもかかわらず、ＲｈｏＡとＲｈｏＣ間にはその配列のＣ末端において、甚だしい非相同性が存在する。図１は、ＲｈｏＡ、ＲｈｏＢおよびＲｈｏＣのアラインメントを示すものであり、ここで、同一残基（「＊」）、保存的置換を有する残基（「：」）および半保存的置換を有する残基（「．」）に印が付いている。
【００４１】
Ｒｈｏ  ＧＴＰアーゼのＮ末端半分は、ＧＴＰ結合および加水分解に関与する大多数のアミノ酸を、ＧＴＰ結合状態とＧＤＰ結合状態の間で配座を変えるＳｗｉｔｃｈ  １および２領域と共に含有する（Ｂｉｓｈｏｐ，Ａ．Ｌ．、Ｈａｌｌ，Ａ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２０００、３４８（Ｐｔ．２）：２４１）。
【００４２】
ＲｈｏファミリーＧＴＰアーゼのＣ末端は、これらのタンパク質の正確な局在定位に必要不可欠である。それは、保存Ｃ末端システインのプレニル化、続いての最後の３個のアミノ酸のメチル化およびタンパク質分解性除去により、翻訳後修飾される（Ｓｈａｏ，Ｆ．、Ｄｉｘｏｎ，Ｊ．Ｅ．、Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２００３、５２９：７９）。プレニル基がＧＴＰアーゼを膜に係留する、この修飾は、細胞成長、形質転換、およびＲｈｏタンパク質の細胞骨格構成機能に必要不可欠である（Ａｌｌａｌ，Ｃ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２０００、２７５：３１００１）。Ｒｈｏタンパク質のプレニル化は、それらの安定性にとって重要であるようであり、プレニル基を合成する酵素の阻害剤は、Ｒｈｏタンパク質レベルおよびそれらの機能の低下を誘導する（Ｓｔａｍａｔａｋｉｓ，Ｋ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ  ２００２、２７７：４９３８９）。
【００４３】
ＲｈｏＡ
ＲｈｏＡは、幾つかのヒト癌において過発現され、ＲｈｏＡ過発現は、不良な予後と相関するようである。幾つかの報告は、充実性腫瘍の成長および転移を助長する血管新生へのＲｈｏＡの関与も明示している（Ａｂｅｃａｓｓｉｓら、２００３）。細胞骨格組立ての活性化は、細胞の成長および拡大を生じさせる結果となることが最も多く、ニューロンにおいては、Ｒｈｏファミリータンパク質が神経突起退縮を誘導し、細胞を丸くさせることが証明されている。
【００４４】
本発明の一部の実施形態において、本発明のペプチドフラグメントは、配列番号２のＲｈｏＡと配列番号１のＲｈｏＣの両方に共通である。しかし、好ましい実施形態において、本発明のペプチドフラグメントは、配列番号１のヒトＲｈｏＣのみに特異的である。
【００４５】
ＲｈｏＣ
最近のデータは、ＲｈｏＣが癌細胞の転移に重要な役割を果たすことを示している。Ｒｈｏタンパク質依存性細胞シグナル伝達が悪性形質転換にとって重要であり得ることが研究によって示された。ＲｈｏＣが黒色腫、炎症性乳癌（Ｃｌａｒｋら、２０００；Ｋｌｅｅｒら、２００２）および卵巣癌（Ｈｏｒｉｕｃｈｉら、２００３）における癌浸潤に関与することが証明されている。
【００４６】
一般に、免疫系は「自己」タンパク質に対する応答をめったに惹起しないので、自己抗原に対する癌ワクチンを設計することは難しかった。驚くべきことに、本発明のＲｈｏＣペプチドは、癌疾患、特に転移癌疾患に罹患している患者において自発的Ｔ細胞応答を惹起することができた。
【００４７】
本発明は、ＲｈｏＣが、転移癌に対する免疫療法に適した標的のようであることを開示する。ＲｈｏＣの発現は転移を促進すると言われており、これは、ＲｈｏＣをワクチン接種の魅力的な標的にする可能性を秘めている。このタンパク質の発現のダウンレギュレーションまたは減少による免疫逃避が転移を損なわせるかもしれないからである。驚くべきことに、本発明者らは、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを用いて黒色腫患者における末梢血リンパ球（ＰＢＬ）においてＲｈｏＣ由来ペプチドに対する自発的Ｔ細胞反応性を検出した。これは、ＲｈｏＣペプチドフラグメントが、実際に有用なＴ細胞エピトープであり得ることを明示している。
【００４８】
本発明の好ましい実施形態において、ＲｈｏＣは、ヒトＲｈｏＣであり、さらに好ましくは、配列番号１のヒトＲｈｏＣである。
【００４９】
本発明の好ましい実施形態において、前記ＲｈｏＣペプチドは、ＲｈｏＢの配列とは異なるアミノ酸残基から選択される。さらに好ましい実施形態において、前記ＲｈｏＣペプチドは、ＲｈｏＡとＲｈｏＢのどちらの配列とも異なるアミノ酸残基を含むペプチドである。したがって、非常に好ましい実施形態において、本発明のペプチドフラグメントは、配列番号１のＲｈｏＣのアミノ酸残基Ｉ４３、Ｑ１２３、Ｒ１４０、Ｓ１４１、Ｓ１５２、Ｌ１５７、Ｅ１６５、Ｇ１７８、Ｖ１８１、Ｋ１８３、Ｎ１８４、Ｒ１８６、Ｒ１８７、Ｒ１８８、Ｐ１９１またはＩ１９２のうちの少なくとも１個を含有する。
【００５０】
あまり好ましくない実施形態において、ＲｈｏＣペプチドは、ＲｈｏＢの配列とは異なるがＲｈｏＡの配列と同一であるアミノ酸残基を含むペプチドである。したがって、あまり好ましくない実施形態において、本発明のペプチドフラグメントは、アミノ酸残基
【００５１】
【化１】
2014139185.tif 000002
のうちの少なくとも１個を含有する。
【００５２】
上に記載したように、ＲｈｏＣは、主として、その配列のＣ末端部分がＲｈｏＡおよびＲｈｏＢと異なる。ＲｈｏＣだけが、腫瘍の転移の可能性に対して影響を及ぼすようであるため、好ましい実施形態は、配列番号１のＲｈｏＣの１２０個の最もＣ末端側の残基、例えば、ＲｈｏＣの１００個の最もＣ末端側の残基、例えばＲｈｏＣの７５個の最もＣ末端側の残基、例えばＲｈｏＣの５２個の最もＣ末端側の残基、例えばＲｈｏＣの４０個の最もＣ末端側の残基、例えばＲｈｏＣの３０個の最もＣ末端側の残基、例えばＲｈｏＣの２５個の最もＣ末端側の残基、例えばＲｈｏＣの２４個の最もＣ末端側の残基、例えばＲｈｏＣの２３個の最もＣ末端側の残基、例えばＲｈｏＣの２２個の最もＣ末端側の残基、例えばＲｈｏＣの２１個の最もＣ末端側の残基、例えばＲｈｏＣの２０個の最もＣ末端側の残基、例えばＲｈｏＣの１９個の最もＣ末端側の残基、例えばＲｈｏＣの１８個の最もＣ末端側の残基、例えばＲｈｏＣの１７個の最もＣ末端側の残基、例えばＲｈｏＣの１６個の最もＣ末端側の残基、例えばＲｈｏＣの１５個の最もＣ末端側の残基、例えばＲｈｏＣの１４個の最もＣ末端側の残基に由来するＲｈｏＣのペプチドに関する。配列番号１のＲｈｏＣの２０個の最もＣ末端側の残基から成るペプチドが、最も好ましい。
【００５３】
したがって、非常に好ましい実施形態において、本発明のペプチドフラグメントは、配列番号１のＲｈｏＣの２０個の最Ｃ末端ＲｈｏＣ特異的アミノ酸残基Ｇ１７８、Ｖ１８１、Ｋ１８３、Ｎ１８４、Ｒ１８６、Ｒ１８７、Ｒ１８８、Ｐ１９１またはＩ１９２のうちの少なくとも１個を含有する。
【００５４】
本発明の特定の実施形態において、本発明のペプチドフラグメントは、配列番号１のＲｈｏＣの２０個の最もＣ末端側のアミノ酸残基から成る。したがって、この特定の実施形態におけるペプチドは、ＡＴＲＡＧＬＱＶＲＫＮＫＲＲＲＧＣＰＩＬ（配列番号４）である。
【００５５】
本発明の他の特定の実施形態において、本発明のペプチドフラグメントは、配列ＲＸＧＬＱＶＲＫＮＫを含み、この場合、Ｘは、アラニンおよびロイシンからなる群より選択され、ならびに前記ペプチドフラグメントは、多くて６０アミノ酸長である。
【００５６】
機能的相同体
野生型ヒトＲｈｏＣ、すなわちこのタンパク質の自然に存在する非突然変異バージョン、を配列番号１として同定する。本発明は、ＲｈｏＣの免疫学的に活性なペプチドフラグメントを包含する。本発明は、ＲｈｏＣ、多くて２個のアミノ酸が置換されているＲｈｏＣのペプチドフラグメント、または配列番号１と少なくとも７０％の配列同一性を含むＲｈｏＣの機能的相同体を含む、ワクチン組成物を包含する。
【００５７】
機能的相同体は、野生型ヒトＲｈｏＣなどの野生型ＲｈｏＣと配列の点で異なるが、野生型ＲｈｏＣを発現する癌に対する免疫応答を依然として誘導することができるＲｈｏＣと定義することができる。機能的相同体は、突然変異バージョンである場合もあり、または野生型ＲｈｏＣの選択的スプライス変異体である場合もある。もう１つの態様では、ＲｈｏＣの機能的相同体を、本明細書において下で説明するように定義する。機能的相同体は、１つ以上の突然変異ならびに／またはエクスビボで導入された１つ以上の配列欠失および／もしくは付加を有するＲｈｏＣの組換えバージョンであり得るが、これらに限定されない。
【００５８】
ＲｈｏＣの機能的相同体は、配列番号７との少なくとも多少の配列同一性を示す、および野生型ＲｈｏＣを発現する癌に対する免疫応答を誘導することができる、任意のタンパク質であり得る。
【００５９】
したがって、本発明の１つの実施形態において、ＲｈｏＣの機能的相同体は、図１に「太字」で示されているＲｈｏＣ特異的残基Ｑ１２３、Ｒ１４０、Ｓ１４１、Ｓ１５２、Ｌ１５７、Ｅ１６５、Ｇ１７８、Ｖ１８１、Ｋ１８３、Ｎ１８４、Ｒ１８６、Ｒ１８７、Ｒ１８８、Ｐ１９１またはＰ１９２がいずれも置換されていない、配列番号１に対して高い配列同一性を有する配列を含むことが好ましい。
【００６０】
さらに、本発明のあまり好ましくない実施形態において、ＲｈｏＣの機能的相同体は、図１において「＊」の印が付いている、ＲｈｏＡおよびＲｈｏＣ特異的であるアミノ酸残基Ｌ８１、Ｍ８２、Ｃ８３、Ｆ８４、Ｓ８５、Ｉ８６、Ｄ８７、Ｓ８８、Ｐ８９、Ｄ９０、Ｓ９１、Ｌ９２、Ｅ９３、Ｎ９４、Ｉ９５、Ｋ９８、Ｗ９９、Ｔ１００、Ｐ１０１、Ｅ１０２、Ｖ１０３、Ｋ１０４、Ｈ１０５、Ｆ１０６、Ｃ１０７、Ｐ１０８、Ｎ１０９、Ｐ１１１、Ｉ１１２、Ｉ１１３、Ｖ１１５、Ｇ１１６、Ｎ１１７、Ｋ１１８、Ｋ１１９、Ｔ１２７、Ｒ１２９、Ｅ１４２、Ｅ１４３、Ｄ１４６、Ｎ１４９、Ｆ１５４、Ｄ１５５、Ｇ１６６、Ｖ１６７、Ｒ１６８、Ｅ１６９、Ｖ１７０、Ｆ１７１、Ｅ１７２、Ｍ１７３、Ａ１７４、Ｔ１７５、Ｒ１７６、Ａ１７７、Ｌ１７９、Ｑ１８０、Ｒ１８２、Ｋ１８５、Ｇ１８９、Ｃ１９０がいずれも置換されていない、配列番号１に対して高い配列同一性を有する配列を含むことが好ましい。
【００６１】
したがって、１つの実施形態において、ＲｈｏＣの機能的相同体は、ＲｈｏＣ特異的アミノ酸残基Ｑ１２３、Ｒ１４０、Ｓ１４１、Ｓ１５２、Ｌ１５７、Ｅ１６５、Ｇ１７８、Ｖ１８１、Ｋ１８３、Ｎ１８４、Ｒ１８６、Ｒ１８７、Ｒ１８８、Ｐ１９１またはＰ１９２が、置換されていない、または保存的置換によってしか置換されていない、さらに好ましくは、本明細書において下で定義するような高い類似性レベルを有するアミノ酸によってしか置換されていない、配列番号１に対して高い配列同一性を有する配列を有することが好ましい。さらにより好ましくは、これらの残基は、全く置換されていない。
【００６２】
さらに、本発明のあまり好ましくない実施形態において、ＲｈｏＣの機能的相同体は、図１において「＊」の印が付いている、ＲｈｏＡおよびＲｈｏＣ特異的アミノ酸残基Ｌ８１、Ｍ８２、Ｃ８３、Ｆ８４、Ｓ８５、Ｉ８６、Ｄ８７、Ｓ８８、Ｐ８９、Ｄ９０、Ｓ９１、Ｌ９２、Ｅ９３、Ｎ９４、Ｉ９５、Ｋ９８、Ｗ９９、Ｔ１００、Ｐ１０１、Ｅ１０２、Ｖ１０３、Ｋ１０４、Ｈ１０５、Ｆ１０６、Ｃ１０７、Ｐ１０８、Ｎ１０９、Ｐ１１１、Ｉ１１２、Ｉ１１３、Ｖ１１５、Ｇ１１６、Ｎ１１７、Ｋ１１８、Ｋ１１９、Ｔ１２７、Ｒ１２９、Ｅ１４２、Ｅ１４３、Ｄ１４６、Ｎ１４９、Ｆ１５４、Ｄ１５５、Ｇ１６６、Ｖ１６７、Ｒ１６８、Ｅ１６９、Ｖ１７０、Ｆ１７１、Ｅ１７２、Ｍ１７３、Ａ１７４、Ｔ１７５、Ｒ１７６、Ａ１７７、Ｌ１７９、Ｑ１８０、Ｒ１８２、Ｋ１８５、Ｇ１８９、Ｃ１９０がいずれも置換されていない、または保存的置換によってしか置換されていない、さらに好ましくは、本明細書において下で定義するような高い類似性レベルを有するアミノ酸によってしか置換されていない、配列番号１に対して高い配列同一性を有する配列を含むことが好ましい。さらにより好ましくは、これらの残基は、全く置換されていない。
【００６３】
当業者は、あるアミノ酸で１つ以上の化学的および／または物理的特性を共有する別のアミンが置換される「保存的」アミノ酸置換をするおよび評定する方法を知っていることであろう。保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能に影響する可能性が低い。アミノ酸は、共有する特性によって分類することができる。保存的アミノ酸置換は、所定のアミノ酸群内のあるアミノ酸での、同じ群内の別のアミノ酸の置換であり、この場合、所定の群内のアミノ酸は、類似した、または実質的に類似した特性を示す。
【００６４】
保存的アミノ酸置換は、類似した側鎖を有する残基の互換性を指す。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸群は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシンであり；脂肪族−ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸群は、セリンおよびトレオニンであり、アミド含有側鎖を有するアミノ酸群は、アスパラギンおよびグルタミンであり；芳香族側鎖を有するアミノ酸群は、フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンであり；塩基性側鎖を有するアミノ酸群は、リシン、アルギニンおよびヒスチジンであり；ならびに硫黄含有側鎖を有するアミノ酸群は、システインおよびメチオニンである。好ましい保存的アミノ酸置換群は、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リシン−アルギニン、アラニン−バリン、およびアスパラギン−グルタミンである。
【００６５】
本明細書において適用する場合の用語「保存的アミノ酸置換」の意味の中では、本明細書において下に示すアミノ酸群内で、あるアミノ酸で別のアミノ酸を置換することができる：
より低い類似性レベル：
極性：
ｉ）極性側鎖を有するアミノ酸（Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、およびＣｙｓ）、
ｉｉ）非極性側鎖を有するアミノ酸（Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｐｒｏ、およびＭｅｔ）
親水性または疎水性：
ｉｉｉ）疎水性アミノ酸（Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｖａｌ）
ｉｖ）親水性アミノ酸（Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ）
電荷：
ｖ）中性アミノ酸（Ａｌａ、Ａｓｎ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｖａｌ）
ｖｉ）塩基性アミノ酸（Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ）
ｖｉｉ）酸性アミノ酸（（ａｓｐ、Ｇｌｕ）
高い類似性レベル：
ｖｉｉｉ）酸性アミノ酸およびそれらのアミド（Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ）
ｉｘ）脂肪族側鎖を有するアミノ酸（Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ）
ｘ）芳香族側鎖を有するアミノ酸（Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ）
ｘｉ）塩基性側鎖を有するアミノ酸（Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ）
ｘｉｉ）ヒドロキシ側鎖を有するアミノ酸（Ｓｅｒ、Ｔｈｒ）
ｘｉｉｉ）硫黄含有側鎖を有するアミノ酸（Ｃｙｓ、Ｍｅｔ）、
好ましい保存的アミノ酸置換群は、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リシン−アルギニン、アラニン−バリン、およびアスパラギン−グルタミンである。
【００６６】
したがって、本発明の変異体またはそのフラグメントは、同じ配列変異体もしくはそのフラグメントの中での、または異なる配列変異体もしくはそのフラグメント間での、互いに独立して導入される少なくとも１個の置換、例えば複数の置換を含むことがある。
【００６７】
同じ変異体またはそのフラグメントが、本明細書において上で定義したような保存的アミノ酸の１つより多い群からの１つより多い保存的アミノ酸置換を含む場合があることは、上の概説から明らかである。
【００６８】
２０の標準アミノ酸および２個の特別なアミノ酸、セレノシステインおよびピロリシンのほかに、インビボでタンパク質に取り込まれない非常に多数の「非標準アミノ酸」がある。非標準アミノ酸の例としては、硫黄含有タウリンならびに神経伝達物質ＧＡＢＡおよびドーパミンが挙げられる。他の例は、ランチオニン、２−アミノイソ酪酸、およびデヒドロアラニンである。さらなる非標準アミノ酸は、オルニチンおよびシトルリンである。
【００６９】
非標準アミノ酸は、通常は、標準アミノ酸への修飾によって形成される。例えば、タウリンは、システインの脱カルボキシル化によって形成することができる一方で、ドーパミンは、チロシンから合成され、およびヒドロキシプロリンは、（コラーゲン中によくある）プロリンの翻訳後修飾によって作られる。非天然アミノ酸の例は、例えば、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．ｓｅｃｔｉｏｎ  １．８２２（ｂ）（４）に挙げられており、それらのすべてが参照により本明細書に援用されている。
【００７０】
本明細書に記載する標準および非標準アミノ酸残基は両方とも、「Ｄ」異性体形である場合もあり、または「Ｌ」異性体形である場合もある。
【００７１】
本発明の機能的等価物は、非標準アミノ酸を含む任意のアミノ酸を含むことがあると考えられる。好ましい実施形態において、機能的等価物は、標準アミノ酸しか含まない。
【００７２】
標準および／または非標準アミノ酸は、ペプチド結合によって連結されることもあり、または非ペプチド結合によって連結されることもあるが、一般には、ペプチド結合によってしか連結されない。用語ペプチドは、当該技術分野において公知であるような化学または酵素触媒反応によって導入される翻訳後修飾も包含する。そのような翻訳後修飾は、所望される場合には分配前に導入することができる。本明細書に明記するようなアミノ酸は、好適にはＬ立体異性体形であろう。２０の自然に存在するアミノ酸の代わりにアミノ酸類似体を用いることができる。フルオロフェニルアラニン、ノルロイシン、アゼチジン−２−カルボン酸、Ｓ−アミノエチルシステイン、４−メチルトリプトファンおよびこれらに類するものをはじめとする幾つかのそのような類似体が公知である。
【００７３】
適する変異体は、少なくとも７０％であろう、したがって、変異体は、好ましくは、ヒトＲｈｏＣの所定の配列との少なくとも７５％の配列同一性、例えば少なくとも８０％の配列同一性、例えば少なくとも８５％の配列同一性、例えば少なくとも９０％の配列同一性、例えば少なくとも９１％の配列同一性、例えば少なくとも９１％の配列同一性、例えば少なくとも９２％の配列同一性、例えば少なくとも９３％の配列同一性、例えば少なくとも９４％の配列同一性、例えば少なくとも９５％の配列同一性、例えば少なくとも９６％の配列同一性、例えば少なくとも９７％の配列同一性、例えば少なくとも９８％の配列同一性、例えば少なくとも９９％の配列同一性を有する。
【００７４】
配列同一性は、多数の周知アルゴリズムを用いて、および多数の異なるギャップペナルティーを適用して、計算することができる。配列同一性は、完全長配列番号１を基準にして計算される。任意の配列アラインメントツール、例えばＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴまたはＬＡＬＩＧＮ（しかし、これらに限定されない）を相同体の検索および配列同一性の計算に用いることができる。さらに、適する場合には、任意の一般に公知の置換行列、例えばＰＡＭ、ＢＬＯＳＳＵＭまたはＰＳＳＭ行列（しかし、これらに限定されない）を前記検索アルゴリズムと共に利用することができる。例えば、ＰＳＳＭ（位置特異的スコア行列）は、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴプログラムによって利用することができる。さらに、ある範囲のギャップ開始および伸長ペナルティーを用いて配列アラインメントを行うことができる。例えば、ＢＬＡＳＴアルゴリズムを５−１２の範囲のギャップ開始ペナルティーと１−２の範囲のギャップ伸長ペナルティーで用いることができる。
【００７５】
機能的等価物は、化学的修飾、例えば、ユビキチン化、（例えば、放射性核種、様々な酵素などでの）標識、ＰＥＧ化（ポリエチレングリコールでの誘導体化）、またはアミノ酸（ヒトタンパク質中には通常存在しないアミノ酸、例えばオルニチン）の挿入（または化学合成による置換）による修飾をさらに含むことがあるが、機能的等価物は化学的修飾を含まないほうが好ましい。
【００７６】
本明細書に記載するペプチジル化合物に加えて、立体的に類似した化合物をペプチド構造の重要な部分によく似るように調合することができ、そのような化合物も本発明のペプチドと同じ方法で用いることができる。これは、当業者に公知のモデリングおよび化学的設計技術によって達成することができる。例えば、エステル化および他のアルキル化を用いて、例えばジ−アルギニンペプチド骨格の、アミノ末端をテトラペプチド構造とよく似るように修飾することができる。すべてのそのような立体的に類似した構築物が本発明の範囲に入ることは理解されるであろう。
【００７７】
Ｎ末端アルキル化およびＣ末端エステル化を有するペプチドも本発明の範囲内に包含される。機能的等価物は、グリコシル化コンジュゲート、および二量体または非関連化学的部分をはじめとする同じ分子とで形成された二重結合性または凝集性コンジュゲートも包含する。そのような機能的等価物は、当該技術分野において公知の手段による、フラグメントの中で見つけられる基への官能基の連結（Ｎ末端およびＣ末端のいずれか一方または両方でのものを含む）によって、調製される。
【００７８】
機能的相同体は、少なくとも７０％の配列番号１の共有によって同定されるようなＲｈｏＣの欠失突然変異体であり得、したがって、機能的相同体は、好ましくは、少なくとも７５％配列同一性、例えば、少なくとも８０％配列同一性、例えば、少なくとも８５％配列同一性、例えば、少なくとも９０％配列同一性、例えば、少なくとも９１％配列同一性、例えば、少なくとも９１％配列同一性、例えば、少なくとも９２％配列同一性、例えば、少なくとも９３％配列同一性、例えば、少なくとも９４％配列同一性、例えば、少なくとも９５％配列同一性、例えば、少なくとも９６％配列同一性、例えば、少なくとも９７％配列同一性、例えば、少なくとも９８％配列同一性、例えば、少なくとも９９％配列同一性を有する。
【００７９】
ＭＨＣ
２つのタイプのＭＨＣ分子；ＭＨＣクラスＩ分子およびＭＨＣクラスＩＩ分子がある。ＭＨＣクラスＩ分子は、適応免疫応答の主エフェクター細胞であるＣＤ８  Ｔ細胞によって認識される。ＭＨＣクラスＩＩ分子は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）（これらのうち最も重要なものは樹状細胞であるようである）の表面に主として発現される。ＡＰＣは、ナイーブＴ細胞、ならびに免疫系における他の細胞を刺激する。それらは、ＣＤ８  Ｔ細胞とＣＤ４  Ｔ細胞の両方を刺激する。
【００８０】
１つの実施形態において、配列番号１の多くて２個のアミノ酸が置換されている、配列番号１のＲｈｏＣまたはその機能的相同体からの８−１０個のアミノ酸から成る新規ＭＨＣクラスＩ拘束ペプチドフラグメントを提供し、これらは、幾つかの特徴のうちの少なくとも１つを有することを特徴とし、それらの１つは、本明細書おいて説明するようなアセンブリー結合アッセイによって決定したとき多くて５０μＭであるクラスＩ  ＨＬＡ分子の半最大回収が可能であるペプチドの量（Ｃ５０値）によって測定されるような親和性で、それが拘束されるクラスＩ  ＨＬＡ分子に結合する能力である。このアセンブリーアッセイは、以前に記載されているように行うことができ（ＷＯ２００５／０４９０７３、実施例１．２）、ならびにそれは、ペプチド輸送体欠失細胞系Ｔ２へのペプチドの負荷後のＨＬＡ分子の安定化に基づく。その後、正しくフォールディングされた安定なＨＬＡ重鎖を、配座依存性抗体を使用して免疫沈降させ、そのペプチド結合を定量する。この実施形態のペプチドは、配列番号１の多くて２個のアミノ酸が置換されている、配列番号１のＲｈｏＣまたはその機能的相同体の多くて２００個、好ましくは多くて１００個、さらに好ましくは多くて５０個、さらにより好ましくは多くて２５個、さらにより好ましくは多くて２０個、さらに尚より好ましくは多くて１５個、例えば多くて１０個、例えば８から１０個の範囲の連続するアミノ酸を含む（またはさらに好ましくは、から成る）。
【００８１】
このアッセイは、上記親和性で所与のＨＬＡ対立遺伝子分子に結合するそれらの能力について候補ペプチドをスクリーニングする簡単な手段をもたらす。好ましい実施形態において、本発明のペプチドフラグメントは、多くて３０μＭであるＣ５０値、例えば、多くて２０μＭであるＣ５０値（多くて１０μＭ、多くて５μＭおよび多くて２μＭのＣ５０値を含む）を有するものである。
【００８２】
もう１つの好ましい実施形態において、配列番号１の多くて２個のアミノ酸が置換されている、配列番号１のＲｈｏＣまたはその機能的相同体の新規ＭＨＣクラスＩＩ拘束ペプチドフラグメント（本明細書では「ペプチド」とも呼ばれる）を提供し、これらは本明細書において下で説明する幾つかの特徴のうちの少なくとも１つを有することを特徴とする。この実施形態のペプチドは、配列番号１の多くて２個のアミノ酸が置換されている、配列番号１の配列番号１のＲｈｏＣまたはその機能的相同体の、４個と１２０個の間、好ましくは８個と１００個の間、さらに好ましくは１０個と７５個の間、さらにより好ましくは１２個と６０個の間、さらにより好ましくは１５個と４０個の間、例えば、１８個と２５個の間の連続するアミノ酸を含む（またはさらに好ましくは、から成る）。
【００８３】
したがって、配列番号１の多くて２個のアミノ酸が置換されている、配列番号１のＲｈｏＣまたはその機能的相同体の、８−１０個のアミノ酸の新規ＭＨＣクラスＩ拘束ペプチドフラグメントまたは１８−２５個のアミノ酸の新規ＭＨＣクラスＩＩ拘束ペプチドフラグメント、（共に、本明細書では「ペプチド」と呼ばれる）、を提供し、これらは、本明細書において下で説明する幾つかの特徴のうちの少なくとも１つを有することを特徴とし、そのうちの１つは、それが拘束されるクラスＩまたはクラスＩＩ  ＨＬＡ分子に結合する能力である。
【００８４】
特定の実施形態において、以下の特徴のうちの少なくとも１つを有するＭＨＣクラスＩ拘束ペプチドまたはＭＨＣクラスＩＩ拘束ペプチドであるペプチドフラグメントを提供する：
（ｉ）ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって決定したとき、癌患者のＰＢＬ集団において１０４ＰＢＬ当り少なくとも１の頻度でＩＮＦ−γ産生細胞を惹起することができる、および／または
（ｉｉ）腫瘍組織においてエピトープペプチドと反応性であるＣＴＬをインサイチュで検出することができる、
（ｉｉｉ）ＲｈｏＣ特異的Ｔ細胞のインビトロでの成長を誘導することができる。
【００８５】
本発明のさらに好ましいペプチドは、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ、例えば、本明細書において下の実施例１で説明するおよびＷＯ２００５／０４９０７３の実施例１．４に詳細に記載されているＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって決定したとき、特異的Ｔ細胞応答を惹起することができるペプチドである。一部のペプチドは、ＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩに高い親和性で結合しないにもかかわらず、ＥＬＩＳＰＯＴによって判定するとＴ細胞応答を生じさせることがある。ＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩに高い親和性で結合することができる他のペプチドも、ＥＬＩＳＰＯＴによって判定するとＴ細胞応答を生じさせる。両方の種類のペプチドが、本発明の好ましいペプチドである。
【００８６】
したがって、本発明の好ましいペプチドは、１０８細胞当り、さらに好ましくは１０７当り、さらにより好ましくは１０６当り、さらにより好ましくは１０５細胞当り、例えば１０４細胞当り、５０より多くのペプチド特異的スポットが測定される、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって測定して、特異的系Ｔ細胞応答を惹起することができるペプチドである。
【００８７】
本発明の最も好ましいペプチドは、癌患者において細胞免疫応答を惹起することができるペプチドである。
【００８８】
上述のように、ＨＬＡ系は、ヒト主要組織適合（ＭＨＣ）系の代表である。一般に、ＭＨＣ系は、ある範囲の特性を制御する：移植抗原、胸腺依存性免疫応答、一定の補体因子および一定の疾患についての素因。より具体的には、ＭＨＣは、ＭＨＣのより一般的な特性を決定する３個の異なるタイプの分子、すなわちクラスＩ、ＩＩおよびＩＩ分子をコードする。これらの分子のうち、クラスＩ分子は、殆どの有核細胞および血小板の表面に提示される、いわゆるＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＢおよびＨＬＡ−Ｃ分子である。
【００８９】
本発明のペプチドは、特定のＭＨＣクラスＩ  ＨＬＡ分子に結合する（によって拘束される）それらの能力を特徴とする。したがって、１つの実施形態において、前記ペプチドは、ＨＬＡ−Ａ１、ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ａ３、ＨＬＡ−Ａ９、ＨＬＡ−Ａ１０、ＨＬＡ−Ａ１１、ＨＬＡ−Ａｗ１９、ＨＬＡ−Ａ２３（９）、ＨＬＡ−Ａ２４（９）、ＨＬＡ−Ａ２５（１０）、ＨＬＡ−Ａ２６（１０）、ＨＬＡ−Ａ２８、ＨＬＡ−Ａ２９（ｗ１９）、ＨＬＡ−Ａ３０（ｗ１９）、ＨＬＡ−Ａ３１（ｗ１９）、ＨＬＡ−Ａ３２（ｗ１９）、ＨＬＡ−Ａｗ３３（ｗ１９）、ＨＬＡ−Ａｗ３４（１０）、ＨＬＡ−Ａｗ３６、ＨＬＡ−Ａｗ４３、ＨＬＡ−Ａｗ６６（１０）、ＨＬＡ−Ａｗ６８（２８）、ＨＬＡ−Ａ６９（２８）をはじめとする、ＭＨＣクラスＩ  ＨＬＡ−Ａ分子によって拘束されるものである。主要な数値記号だけを用いる、例えば、ＨＬＡ−Ａｗ１９およびＨＬＡ−Ａ２４（４９）の代わりにそれぞれＨＬＡ−Ａ１９またはＨＬＡ−Ａ２４を用いる、より単純な記号も本文献を通して用いている。特定の実施形態において、本発明のポリペプチドは、ＨＬＡ−Ａ１、ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ａ３、ＨＬＡ−Ａ１１およびＨＬＡ−Ａ２４からなる群より選択される、ＭＨＣクラスＩ  ＨＬＡ種によって拘束される。特定の実施形態において、本発明のペプチドは、ＭＨＣクラスＩＨＬＡ種ＨＬＡ−Ａ２またはＨＬＡ−Ａ３によって拘束される。
【００９０】
さらに有用な実施形態において、本発明のペプチドは、次のうちのいずれかを含む、ＭＨＣクラスＩ  ＨＬＡ−Ｂ分子によって拘束されるペプチドである：ＨＬＡ−Ｂ５、ＨＬＡ−Ｂ７、ＨＬＡ−Ｂ８、ＨＬＡ−Ｂ１２、ＨＬＡ−Ｂ１３、ＨＬＡ−Ｂ１４、ＨＬＡ−Ｂ１５、ＨＬＡ−Ｂ１６、ＨＬＡ−Ｂ１７、ＨＬＡ−Ｂ１８、ＨＬＡ−Ｂ２１、ＨＬＡ−Ｂｗ２２、ＨＬＡ−Ｂ２７、ＨＬＡ−Ｂ３５、ＨＬＡ−Ｂ３７、ＨＬＡ−Ｂ３８、ＨＬＡ−Ｂ３９、ＨＬＡ−Ｂ４０、ＨＬＡ−Ｂｗ４１、ＨＬＡ−Ｂｗ４２、ＨＬＡ−Ｂ４４、ＨＬＡ−Ｂ４５、ＨＬＡ−Ｂｗ４６およびＨＬＡ−Ｂｗ４７。本発明の特定の実施形態において、本発明のペプチドが結合することができるＭＨＣクラスＩ  ＨＬＡ−Ｂ種は、ＨＬＡ−Ｂ７、ＨＬＡ−Ｂ３５、ＨＬＡ−Ｂ４４、ＨＬＡ−Ｂ８、ＨＬＡ−Ｂ１５、ＨＬＡ−Ｂ２７およびＨＬＡ−Ｂ５１から選択される。
【００９１】
さらに有用な実施形態において、本発明のペプチドは、次のうちのいずれかを含む（しかし、これらに限定されない）、ＭＨＣクラスＩ  ＨＬＡ−Ｃ分子によって拘束されるペプチドである：ＨＬＡ−Ｃｗ１、ＨＬＡ−Ｃｗ２、ＨＬＡ−Ｃｗ３、ＨＬＡ−Ｃｗ４、ＨＬＡ−Ｃｗ５、ＨＬＡ−Ｃｗ６、ＨＬＡ−Ｃｗ７およびＨＬＡ−Ｃｗ１。
【００９２】
さらに有用な実施形態において、本発明のペプチドは、次のうちのいずれかを含む（しかし、これらに限定されない）、ＭＨＣクラスＩＩ  ＨＬＡ分子によって拘束されるペプチドである：ＨＬＡ−ＤＰＡ−１、ＨＬＡ−ＤＰＢ−１、ＨＬＡ−ＤＱＡ１、ＨＬＡ−ＤＱＢ１、ＨＬＡ−ＤＲＡ、ＨＬＡ−ＤＲＢおよびこれらの群におけるすべての対立遺伝子ならびにＨＬＡ−ＤＭ、ＨＬＡ−ＤＯ。
【００９３】
特定のＨＬＡ分子に結合する能力を有する可能性を秘めているペプチドの選択は、所与の特定のＨＬＡ分子に結合する既知配列をアラインメントして、それにより、それらのペプチドにおける特定の位置での少数の関連アミノ酸の支配を明らかにすることによって行うことができる。そのような支配的アミノ酸残基を、本明細書では「アンカー残基」または「アンカー残基モチーフ」とも呼ぶ。利用可能なデータベースにおいて見つけることができる公知の配列データに基づくそのような比較的単純な手順に従うことにより、特定のＨＬＡ分子に結合する可能性が高いペプチドをＲｈｏＣから誘導することができる。ある範囲のＨＬＡ分子についてのそのような分析の代表例を下の表に与える：
【００９４】
【表１】
2014139185.tif 000003
【００９５】
【表２】
2014139185.tif 000004
【００９６】
【表３】
2014139185.tif 000005
【００９７】
【表４】
2014139185.tif 000006
したがって、一例として、ＨＬＡ−Ａ３に結合する能力を有する可能性を秘めているノナペプチドは、次の配列のうちの１つを有するであろう：Ｘａａ−Ｌ−Ｙ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｋ、Ｘａａ−Ｌ−Ｙ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｙ；Ｘａａ−Ｌ−Ｙ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−ＦまたはＸａａ−Ｖ−Ｙ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｋ（Ｘａａは、任意のアミノ酸残基を示す）。同様の方法で、任意の他のＨＬＡ分子に結合する能力を有する可能性を秘めている配列を設計することができる。
【００９８】
通常の当業者が所与のＨＬＡ分子についてのさらなる「アンカー残基モチーフ」を同定することができるであろうことは、理解されるであろう。
【００９９】
前記免疫原的に活性なペプチドフラグメントは、前記配列番号１のＲｈｏＣまたは前記配列番号１と少なくとも７０％の同一性を有するその機能的相同体の、２から１００個、例えば５から７５個、例えば８から５０個の範囲、好ましくは９から２５の範囲のアミノ酸の連続配列から成り得る。
【０１００】
本発明のペプチドは、配列番号１の多くて３個のアミノ酸が置換されている、配列番号１のＲｈｏＣまたはその機能的相同体の、多くて２００個、好ましくは多くて１００個、さらに好ましくは多くて６０個、さらにより好ましくは多くて２５個、さらにより好ましくは多くて２０個、さらにより好ましくは多くて１５個、例えば多くて１０個、例えば、８から１０個の範囲の連続するアミノ酸を含む（またはさらに好ましくは、から成る）。
【０１０１】
一部の実施形態において、本発明のペプチドは、配列ＲＸＧＬＱＶＲＫＮＫを含み、この場合、Ｘは、アラニンおよびロイシンからなる群より選択され、ならびに前記ペプチドフラグメントは、配列番号１の多くて３個のアミノ酸が置換されている、配列番号１のＲｈｏＣまたはその機能的相同体の、多くて２００個、好ましくは多くて１００個、さらに好ましくは多くて６０個、さらにより好ましくは多くて２５個、さらにより好ましくは多くて２０個、さらにより好ましくは多くて１５個、例えば多くて１０個、例えば、８から１０個の範囲の連続するアミノ酸である。
【０１０２】
本発明の他のペプチドは、配列番号１の配列番号１のＲｈｏＣまたは配列番号１に対して少なくとも７０％の同一性を有するその機能的相同体の、４個と１２０個の間、好ましくは８個と１００個の間、さらに好ましくは１０個と７５個の間、さらにより好ましくは１２個と６０個の間、さらにより好ましくは１５個と４０個の間、例えば１８個と２５個の間の連続するアミノ酸を含む（またはさらに好ましくは、から成る）。
【０１０３】
一部の実施形態において、本発明のペプチドは、配列ＲＸＧＬＱＶＲＫＮＫを含み、この場合、Ｘは、アラニンおよびロイシンからなる群より選択され、ならびに前記ペプチドフラグメントは、配列番号１の配列番号１のＲｈｏＣまたは配列番号１に対して少なくとも７０％の同一性を有するその機能的相同体の、４個と１２０個の間、好ましくは８個と１００個の間、さらに好ましくは１０個と７５個の間、さらにより好ましくは１２個と６０個の間、さらにより好ましくは１５個と４０個の間、例えば１８個と２５個の間の連続するアミノ酸である。
【０１０４】
本発明の他のペプチドは、配列番号１の配列番号１のＲｈｏＣまたは配列番号１に対して少なくとも７０％の同一性を有するその機能的相同体の、１０個と１５０個の間、好ましくは１２個と１２０個の間、さらに好ましくは１５個と７５個の間、さらにより好ましくは２０個と７０個の間、さらにより好ましくは２２個と６５個の間、例えば２６個と６０個の間の連続するアミノ酸を含む（またはさらに好ましくは、から成る）。
【０１０５】
一部の実施形態において、本発明のペプチドは、配列ＲＸＧＬＱＶＲＫＮＫを含み、この場合、Ｘは、アラニンおよびロイシンからなる群より選択され、ならびに前記ペプチドフラグメントは、配列番号１の配列番号１のＲｈｏＣまたは配列番号１に対して少なくとも７０％の同一性を有するその機能的相同体の、１０個と１５０個の間、好ましくは１２個と１２０個の間、さらに好ましくは１５個と７５個の間、さらにより好ましくは２０個と７０個の間、さらにより好ましくは２２個と６５個の間、例えば２６個と６０個の間の連続するアミノ酸である。
【０１０６】
本発明の特定の実施形態において、本発明のペプチドは、配列ＲＸＧＬＱＶＲＫＮＫを含み、この場合、Ｘは、アラニンおよびロイシンからなる群より選択され、ならびに前記ペプチドフラグメント前記ペプチドフラグメントは、長さが多くて２００、好ましくは多くて１００、さらに好ましくは多くて６０アミノ酸である。
【０１０７】
本発明の一部の態様において、８から１０アミノ酸より長いＲｈｏＣ由来のペプチドを提供する。８から１０アミノ酸より長いペプチドは、ＨＬＡ分子への結合のために、より短い長さへとプロテアソームによってプロセッシングされる。したがって、８から１０アミノ酸より長いペプチドを投与したとき、そのより長いペプチドは、サイトゾル中でプロテアソームによって一連のより小さなペプチドへとプロセッシングされる。１つの特定の実施形態において、前記より長いペプチドは、ＲｈｏＣの２０個の最Ｃ末端ペプチドＡＴＲＡＧＬＱＶＲＫＮＫＲＲＲＧＣＰＩＬ（配列番号４）を含むことがある。例えば、前記Ｃ末端ＲｈｏＣペプチドは、プロテアソームによってノナ−および／またはデカペプチドへとプロセッシングされ得る。
【０１０８】
プロテアソームによって様々な異なる、より短いペプチドへとプロセッシングされ得る、より長いペプチドを使用することの利点は、特定のＨＬＡクラスに拘束される８から１０アミノ酸ペプチドより１個のペプチドで多くのＨＬＡクラスを標的にすることができることである。
【０１０９】
本発明の他の実施形態では、ＲｈｏＣのＣ末端ペプチドに由来するプロセッシングされる可能性のあるペプチドを提供する。
【０１１０】
特定の実施形態において、本発明のノナペプチドは、多くて２個のアミノ酸が置換されている、例えば、多くて１個のアミノ酸が置換されている、次のものから選択される配列を有するＲｈｏＣ  Ｃ末端由来ペプチドである：ＡＴＲＡＧＬＱＶＲ（配列番号１１）、ＴＲＡＧＬＱＶＲＫ（配列番号１２）、ＲＡＧＬＱＶＲＫＮ（配列番号１３）、ＡＧＬＱＶＲＫＮＫ（配列番号１４）、ＧＬＱＶＲＫＮＫＲ（配列番号１５）、ＬＱＶＲＫＮＫＲＲ（配列番号１６）、ＱＶＲＫＮＫＲＲＲ（配列番号１７）、ＶＲＫＮＫＲＲＲＧ（配列番号１８）、ＲＫＮＫＲＲＲＧＣ（配列番号１９）、ＫＮＫＲＲＲＧＣＰ（配列番号２０）、ＮＫＲＲＲＧＣＰＩ（配列番号２１）、およびＫＲＲＲＧＣＰＩＬ（配列番号２２）。好ましくは、いずれのアミノ酸も置換されていない。
【０１１１】
特定の実施形態において、本発明のデカペプチドは、多くて２個のアミノ酸が置換されている、例えば、多くて１個のアミノ酸が置換されている、次のものから選択される配列を有するＲｈｏＣ  Ｃ末端由来ペプチドである：ＡＴＲＡＧＬＱＶＲＫ（配列番号２３）、ＴＲＡＧＬＱＶＲＫＮ（配列番号２４）、ＲＡＧＬＱＶＲＫＮＫ（配列番号２５）、ＡＧＬＱＶＲＫＮＫＲ（配列番号２６）、ＧＬＱＶＲＫＮＫＲＲ（配列番号２７）、ＬＱＶＲＫＮＫＲＲＲ（配列番号２８）、ＱＶＲＫＮＫＲＲＲＧ（配列番号２９）、ＶＲＫＮＫＲＲＲＧＣ（配列番号３０）、ＲＫＮＫＲＲＲＧＣＰ（配列番号３１）、ＫＮＫＲＲＲＧＣＰＩ（配列番号３２）およびＮＫＲＲＲＧＣＰＩＬ（配列番号３３）。好ましくは、いずれのアミノ酸も置換されていない。
【０１１２】
好ましい実施形態において、本発明の免疫原的に活性なペプチドフラグメントは、配列番号２のＲｈｏＡおよび配列番号３のＲｈｏＢの配列とは異なる、多くて２個のアミノ酸が置換されている、配列番号１のＲｈｏＣまたはその機能的相同体の配列から選択される。
【０１１３】
したがって、１つの実施形態では、ＲｈｏＢとは異なるＲｈｏＣ配列が好ましい。ＲｈｏＡとＲｈｏＢの両方と異なるＣ末端ＲｈｏＣ配列が最も好ましい。好適には、前記ペプチドは、７個のアミノ酸が、例えば６個のアミノ酸が、例えば５個のアミノ酸が、例えば４個のアミノ酸が、例えば３個のアミノ酸が、例えば２個のアミノ酸が、例えば少なくとも１個のアミノ酸が配列番号２のＲｈｏＡおよび配列番号３のＲｈｏＢの配列と異なるであろう。
【０１１４】
好ましくは、本発明の免疫原的に活性なペプチドフラグメントは、少なくとも１個のアミノ酸が配列番号２のＲｈｏＡおよび配列番号３のＲｈｏＢの配列と異なる。したがって、本発明の好ましいペプチドは、配列番号１のＲｈｏＣのアミノ酸残基Ｉ４３、Ｑ１２３、Ｒ１４０、Ｓ１４１、Ｓ１５２、Ｌ１５７、Ｅ１６５、Ｇ１７８、Ｖ１８１、Ｋ１８３、Ｎ１８４、Ｒ１８６、Ｒ１８７、Ｒ１８８、Ｐ１９１またはＩ１９２のうちの少なくとも１個を含有し得る。
【０１１５】
あまり好ましくはないが、前記ペプチドは、７個のアミノ酸が、例えば６個のアミノ酸が、例えば５個のアミノ酸が、例えば４個のアミノ酸が、例えば３個のアミノ酸が、例えば２個のアミノ酸が、例えば少なくとも１個のアミノ酸が配列番号３のＲｈｏＢと異なるであろう。したがって、本発明の免疫原的に活性なペプチドフラグメントは、アミノ酸残基
【０１１６】
【化２】
2014139185.tif 000007
のうちの少なくとも１個を含有する。
【０１１７】
したがって、特定の実施形態において、本発明の免疫原的に活性なペプチドフラグメントは、配列番号１のＲｈｏＣまたはその機能的相同体からの、５０個のアミノ酸残基、例えば、多くて４５個のアミノ酸残基、例えば多くて４０個のアミノ酸残基、例えば多くて３５個のアミノ酸残基、例えば多くて３０個のアミノ酸残基、例えば多くて２５個のアミノ酸残基、例えば１８から２５個の連続するアミノ酸から成り、この場合、多くて３個のアミノ酸が置換されており、および前記ペプチドフラグメントは、配列番号１のＲｈｏＣのＲｈｏＣ特異的アミノ酸残基Ｉ４３、Ｑ１２３、Ｒ１４０、Ｓ１４１、Ｓ１５２、Ｌ１５７、Ｅ１６５、Ｇ１７８、Ｖ１８１、Ｋ１８３、Ｎ１８４、Ｒ１８６、Ｒ１８７、Ｒ１８８、Ｐ１９１またはＩ１９２のうちの少なくとも１個を含有する。
【０１１８】
したがって、もう１つの特定の態様において、本発明の免疫原的に活性なペプチドフラグメントは、配列番号１のＲｈｏＣまたはその機能的相同体からの、最大２０個のアミノ酸残基、例えば多くて１９個のアミノ酸残基、例えば多くて１８個のアミノ酸残基、例えば多くて１７個のアミノ酸残基、例えば多くて１６個のアミノ酸残基、例えば多くて１５個のアミノ酸残基、例えば多くて１４個のアミノ酸残基、例えば多くて１３個のアミノ酸残基、例えば多くて１２個のアミノ酸残基、例えば多くて１１個のアミノ酸残基、例えば８から１０個の連続するアミノ酸から成り、この場合、多くて２個のアミノ酸が置換されており、および前記ペプチドフラグメントは、配列番号１のＲｈｏＣのＲｈｏＣ特異的アミノ酸残基Ｉ４３、Ｑ１２３、Ｒ１４０、Ｓ１４１、Ｓ１５２、Ｌ１５７、Ｅ１６５、Ｇ１７８、Ｖ１８１、Ｋ１８３、Ｎ１８４、Ｒ１８６、Ｒ１８７、Ｒ１８８、Ｐ１９１またはＩ１９２のうちの少なくとも１個を含有する。
【０１１９】
したがって、もう１つの特定の実施形態において、本発明の免疫原的に活性なペプチドフラグメントは、配列番号１のＲｈｏＣまたはその機能的相同体からの、１００個のアミノ酸残基、例えば多くて９０個のアミノ酸残基、例えば多くて８０個のアミノ酸残基、例えば多くて７０個のアミノ酸残基、例えば多くて６５個のアミノ酸残基、例えば２６から６０の連続するアミノ酸から成り、この場合、多くて３個のアミノ酸が置換されており、および前記ペプチドフラグメントは、配列番号１のＲｈｏＣのＲｈｏＣ特異的アミノ酸残基Ｉ４３、Ｑ１２３、Ｒ１４０、Ｓ１４１、Ｓ１５２、Ｌ１５７、Ｅ１６５、Ｇ１７８、Ｖ１８１、Ｋ１８３、Ｎ１８４、Ｒ１８６、Ｒ１８７、Ｒ１８８、Ｐ１９１またはＩ１９２のうちの少なくとも１個を含有する。
【０１２０】
したがって、一部の実施形態において、本発明のペプチドは、多くて２個のアミノ酸が置換されている、次のものを含む群から選択されるデカペプチドである：ＹＶＰＴＶＦＥＮＹＩ（配列番号３４）、ＶＰＴＶＦＥＮＹＩＡ（配列番号３５）、ＰＴＶＦＥＮＹＩＡＤ（配列番号３６）、ＴＶＦＥＮＹＩＡＤＩ（配列番号３７）、ＶＦＥＮＹＩＡＤＩＥ（配列番号３８）、ＦＥＮＹＩＡＤＩＥＶ（配列番号３９）、ＥＮＹＩＡＤＩＥＶＤ（配列番号４０）、ＮＹＩＡＤＩＥＶＤＧ（配列番号４１）、ＹＩＡＤＩＥＶＤＧＫ（配列番号４２）、ＩＡＤＩＥＶＤＧＫＱ（配列番号４３）、ＬＶＧＮＫＫＤＬＲＱ（配列番号４４）、ＶＧＮＫＫＤＬＲＱＤ（配列番号４５）、ＧＮＫＫＤＬＲＱＤＥ（配列番号４６）、ＮＫＫＤＬＲＱＤＥＨ（配列番号４７）、ＫＫＤＬＲＱＤＥＨＴ（配列番号４８）、ＤＫＬＲＱＤＥＨＴＲ（配列番号１７０）、ＫＬＲＱＤＥＨＴＲＲ（配列番号５０）、ＬＲＱＤＥＨＴＲＲＥ（配列番号５１）、ＲＱＤＥＨＴＲＲＥＬ（配列番号１７１）、ＱＤＥＨＴＲＲＥＬＡ（配列番号１７２）、ＬＡＫＭＫＱＥＰＶＲ（配列番号５４）、ＡＫＭＫＱＥＰＶＲＳ（配列番号５５）、ＫＭＫＱＥＰＶＲＳＥ（配列番号５６）、ＭＫＱＥＰＶＲＳＥＥ（配列番号５７）、ＫＱＥＰＶＲＳＥＥＧ（配列番号５８）、ＱＥＰＶＲＳＥＥＧＲ（配列番号５９）、ＥＰＶＲＳＥＥＧＲＤ（配列番号６０）、ＰＶＲＳＥＥＧＲＤＭ（配列番号６１）、ＶＲＳＥＥＧＲＤＭＡ（配列番号６２）、ＲＳＥＥＧＲＤＭＡＮ（配列番号６３）、ＳＥＥＧＲＤＭＡＮＲ（配列番号６４）、ＥＧＲＤＭＡＮＲＩＳ（配列番号６５）、ＧＲＤＭＡＮＲＩＳＡ（配列番号６６）、ＲＤＭＡＮＲＩＳＡＦ（配列番号６７）、ＤＭＡＮＲＩＳＡＦＧ（配列番号６８）、ＭＡＮＲＩＳＡＦＧＹ（配列番号６９）、ＡＮＲＩＳＡＦＧＹＬ（配列番号１７３）、ＮＲＩＳＡＦＧＹＬＥ（配列番号７１）、ＲＩＳＡＦＧＹＬＥＣ（配列番号１７４）、ＩＳＡＦＧＹＬＥＣＳ（配列番号７３）、ＳＡＦＧＹＬＥＣＳＡ（配列番号１７５）、ＡＦＧＹＬＥＣＳＡＫ（配列番号７５）、ＦＧＹＬＥＣＳＡＫＴ（配列番号７６）、ＧＹＬＥＣＳＡＫＴＫ（配列番号７７）、ＹＬＥＣＳＡＫＴＫＥ（配列番号７８）、ＬＥＣＳＡＫＴＫＥＧ（配列番号７９）、ＥＣＳＡＫＴＫＥＧＶ（配列番号８０）、ＣＳＡＫＴＫＥＧＶＲ（配列番号８１）、ＳＡＫＴＫＥＧＶＲＥ（配列番号８２）、ＡＫＴＫＥＧＶＲＥＶ（配列番号１７６）、ＫＴＫＥＧＶＲＥＶＦ（配列番号１５７）、ＴＫＥＧＶＲＥＶＦＥ（配列番号８９）、ＫＥＧＶＲＥＶＦＥＭ（配列番号８６）、ＥＧＶＲＥＶＦＥＭＡ（配列番号１７７）、ＥＶＦＥＭＡＴＲＡＧ配列番号８８）、ＶＦＥＭＡＴＲＡＧＬ（配列番号８９）、ＦＥＭＡＴＲＡＧＬＱ（配列番号９０）、ＥＭＡＴＲＡＧＬＱＶ（配列番号９１）、ＭＡＴＲＡＧＬＱＶＲ（配列番号９２）、ＡＴＲＡＧＬＱＶＲＫ（配列番号９３）、ＴＲＡＧＬＱＶＲＫＮ（配列番号９４）、ＲＡＧＬＱＶＲＫＮＫ（配列番号１０）、ＡＧＬＱＶＲＫＮＫＲ（配列番号９６）、ＧＬＱＶＲＫＮＫＲＲ（配列番号９７）、ＬＱＶＲＫＮＫＲＲＲ（配列番号９８）、ＱＶＲＫＮＫＲＲＲＧ（配列番号９９）、ＶＲＫＮＫＲＲＲＧＣ（配列番号１００）、ＲＫＮＫＲＲＲＧＣＰ（配列番号１０１）、ＫＮＫＲＲＲＧＣＰＩ（配列番号１０２）、ＮＫＲＲＲＧＣＰＩＬ（配列番号１０３）またはこれらの機能的相同体。好ましくは、いずれのアミノ酸も置換されていない。
【０１２１】
したがって、一部の実施形態において、本発明のペプチドは、多くて２個のアミノ酸が置換されている、次のものを含む群から選択されるノナペプチドである：ＶＰＴＶＦＥＮＹＩ（配列番号１０４）、ＰＴＶＦＥＮＹＩＡ（配列番号１０５）、ＴＶＦＥＮＹＩＡＤ（配列番号１０６）、ＶＦＥＮＹＩＡＤＩ（配列番号１０７）、ＦＥＮＹＩＡＤＩＥ（配列番号１０８）、ＥＮＹＩＡＤＩＥＶ（配列番号１０９）、ＮＹＩＡＤＩＥＶＤ（配列番号１１０）、ＹＩＡＤＩＥＶＤＧ（配列番号１１１）、ＩＡＤＩＥＶＤＧＫ（配列番号１１２）、ＶＧＮＫＫＤＬＲＱ（配列番号１１３）、ＧＮＫＫＤＬＲＱＤ（配列番号１１４）、ＮＫＫＤＬＲＱＤＥ（配列番号１１５）、ＫＫＤＬＲＱＤＥＨ（配列番号１１６）、ＫＤＬＲＱＤＥＨＴ（配列番号１１７）、ＫＬＲＱＤＥＨＴＲ（配列番号１１８）、ＬＲＱＤＥＨＴＲＲ（配列番号１１９）、ＲＱＤＥＨＴＲＲＥ（配列番号１２０）、ＱＤＥＨＴＲＲＥＬ（配列番号１２１）、ＡＫＭＫＱＥＰＶＲ（配列番号１２２）、ＫＭＫＱＥＰＶＲＳ（配列番号１２３）、ＭＫＱＥＰＶＲＳＥ（配列番号１２４）、ＫＱＥＰＶＲＳＥＥ（配列番号１２５）、ＱＥＰＶＲＳＥＥＧ（配列番号１２６）、ＥＰＶＲＳＥＥＧＲ（配列番号１２７）、ＰＶＲＳＥＥＧＲＤ（配列番号１２８）、ＶＲＳＥＥＧＲＤＭ（配列番号１２９）、ＲＳＥＥＧＲＤＭＡ（配列番号１３０）、ＳＥＥＧＲＤＭＡＮ（配列番号１３１）、ＧＲＤＭＡＮＲＩＳ（配列番号１３２）、ＲＤＭＡＮＲＩＳＡ（配列番号１３３）、ＤＭＡＮＲＩＳＡＦ（配列番号１３４）、ＭＡＮＲＩＳＡＦＧ（配列番号１３５）、ＡＮＲＩＳＡＦＧＹ（配列番号１３６）、ＮＲＩＳＡＦＧＹＬ（配列番号１３７）、ＲＩＳＡＦＧＹＬＥ（配列番号１３８）、ＩＳＡＦＧＹＬＥＣ（配列番号１３９）、ＳＡＦＧＹＬＥＣＳ（配列番号１４０）、ＡＦＧＹＬＥＣＳＡ（配列番号１４１）、ＦＧＹＬＥＣＳＡＫ（配列番号１４２）、ＧＹＬＥＣＳＡＫＴ（配列番号１４４）、ＹＬＥＣＳＡＫＴＫＥ（配列番号１４５）、ＬＥＣＳＡＫＴＫＥＧ（配列番号１４６）、ＥＣＳＡＫＴＫＥＧＶ（配列番号１４７）、ＣＳＡＫＴＫＥＧＶＲ（配列番号１４８）、ＳＡＫＴＫＥＧＶＲＥ（配列番号１４９）、ＫＴＫＥＧＶＲＥＶ（配列番号１５０）、ＫＥＧＶＲＥＶＦＥ（配列番号１５２）、ＥＧＶＲＥＶＦＥＭ（配列番号１５３）、ＶＦＥＭＡＴＲＡＧ（配列番号１５４）、ＦＥＭＡＴＲＡＧＬ（配列番号１５５）、ＭＡＴＲＡＧＬＱＶ（配列番号１５７）、ＡＴＲＡＧＬＱＶＲ（配列番号１５８）、ＴＲＡＧＬＱＶＲＫ（配列番号１５９）、ＲＡＧＬＱＶＲＫＮ（配列番号１６０）、ＡＧＬＱＶＲＫＮＫ（配列番号１６１）、ＧＬＱＶＲＫＮＫＲ（配列番号１６２）、ＬＱＶＲＫＮＫＲＲ（配列番号１６３）、ＱＶＲＫＮＫＲＲＲ（配列番号１６４）、ＶＲＫＮＫＲＲＲＧ（配列番号１６５）、ＲＫＮＫＲＲＲＧＣ（配列番号１６６）、ＫＮＫＲＲＲＧＣＰ（配列番号１６７）、ＮＫＲＲＲＧＣＰＩ（配列番号１６８）、ＫＲＲＲＧＣＰＩＬ（配列番号１６９）またはこれらの機能的相同体。好ましくは、いずれのアミノ酸も置換されていない。
【０１２２】
特定の実施形態において、本発明のペプチドは、多くて３個のアミノ酸が置換されている、例えば、多くて２個のアミノ酸が置換されている、例えば多くて１個のアミノ酸が置換されている、次のものから選択される：ＶＹＶＰＴＶＦＥＮＹＩＡＤＩＥＶＤＧＫＱＶ（配列番号５）、ＩＬＶＧＮＫＫＬＲＱＤＥＨＴＲＲＬＡＫ（配列番号６）およびＥＬＡＫＭＫＱＥＰＶＲＳＥＥＧＲＤＭＡＮＲ（配列番号７）またはこれらの機能的相同体。好ましくは、いずれのアミノ酸も置換されていない。
【０１２３】
配列番号１のＲｈｏＣの配列のＣ末端部分が、配列番号２のＲｈｏＡおよび配列番号３のＲｈｏＢの配列と最も異なる。本発明の好ましい実施形態において、前記ペプチドは、配列番号１のＲｈｏＣのＣ末端部分から選択され得る。
【０１２４】
本発明の他のペプチドは、配列番号１のＲｈｏＣの多くて２個のアミノ酸が置換、欠失または付加されている、配列番号１のＲｈｏＣまたは配列番号１と少なくとも７０％の同一性を有するその機能的相同体の、４個と１２０個の間、好ましくは８個と１００個の間、さらに好ましくは１０個と７５個の間、さらにより好ましくは１２個と６０個の間、さらにより好ましくは１５個と４０個の間、例えば１８個と２５個の間の連続するアミノ酸を含む（またはさらに好ましくは、から成る）。
【０１２５】
本発明の好ましい実施形態において、前記ペプチドは、多くて３個のアミノ酸が置換、欠失または付加されている、配列番号１のＲｈｏＣまたはその機能的相同体の、４個と１２０個の間、好ましくは８個と１００個の間、さらに好ましくは１０個と７５個の間、さらにより好ましくは１２個と６０個の間、さらにより好ましくは１５個と４０個の間、例えば１８個と２５個の間の連続するアミノ酸を含む（またはさらに好ましくは、から成る）。
【０１２６】
本発明の他のペプチドは、配列番号１のＲｈｏＣの多くて２個のアミノ酸が置換、欠失または付加されている、配列番号１のＲｈｏＣまたは配列番号１と少なくとも７０％の同一性を有するその機能的相同体の、１０個と１５０個の間、好ましくは１２個と１２０個の間、さらに好ましくは１５個と７５個の間、さらにより好ましくは２０個と７０個の間、さらにより好ましくは２２個と６５個の間、例えば２６個と６０個の間の連続するアミノ酸を含む（またはさらに好ましくは、から成る）。
【０１２７】
本発明の好ましい実施形態において、前記ペプチドは、多くて３個のアミノ酸が置換、欠失または付加されている、配列番号１のＲｈｏＣまたはその機能的相同体の、１０個と１５０個の間、好ましくは１２個と１２０個の間、さらに好ましくは１５個と７５個の間、さらにより好ましくは２０個と７０個の間、さらにより好ましくは２２個と６５個の間、例えば２６個と６０個の間の連続するアミノ酸を含む（またはさらに好ましくは、から成る）。
【０１２８】
本発明の好ましい実施形態において、前記ペプチドは、配列ＲＸＧＬＱＶＲＫＮＫを含み、この場合、Ｘは、アラニンおよびロイシンから成る群から選択され、ならびに前記ペプチドフラグメントは、多くて６０アミノ酸長である。
【０１２９】
特定の実施形態において、本発明のペプチドは、ＲｈｏＣのＣ末端から選択され、したがって、次のＥＥＧＲＤＭＡＮＲＩＳＡＦＧＹＫＥＣＳＡＫＴＫＥＧＶＲＥＶＦＥＭＡＴＲＡＧＬＱＶＲＫＮＫＲＲＲＧＣＰＩＬ（配列番号８）またはＡＴＲＡＧＬＱＶＲＫＮＫＲＲＲＧＣＰＩＬ（配列番号４）またはＲＡＧＬＱＶＲＫＮＫ（配列番号１０）から選択される。もう１つの実施形態において、前記ペプチドは、ＲＡＧＬＱＶＲＫＮＫ（配列番号１０）のアラニンがロイシンで置換されている、人工ペプチドであるＲＬＧＬＱＶＲＫＮＫ（配列番号９）である。
【０１３０】
本発明の１つの実施形態において、ＲｈｏＣペプチドは、変異体ペプチドを含む。本明細書において用いる場合、「変異体」という表現は、好適にはヒトＲｈｏＣである基本タンパク質と相同であるが、その配列内の１個以上のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されている点でそれらが由来する基本配列と異なる、ペプチドを指す。好適には、変異体は、多くて６個のアミノ酸置換、例えば、多くて５個のアミノ酸置換、例えば多くて４個のアミノ酸置換、例えば多くて３個のアミノ酸置換、例えば多くて２個のアミノ酸置換、例えば多くて１個のアミノ酸置換を有する。
【０１３１】
したがって、有用な実施形態において、本発明のペプチドは、それらの配列が、表に列挙した特定のＨＬＡ対立遺伝子のそれぞれについて、表に示したようなアミノ酸のいずれかを含むペプチドを含む。
【０１３２】
したがって、本発明のペプチドは、１から１０個の範囲の、好ましくは１から５個の範囲の、さらに好ましくは１から３個の範囲の、さらにより好ましくは１から２個の範囲の、さらにより好ましくは１個のアミノ酸が、好ましくは、そのペプチドが、上の表に示したような所与のＨＬＡ−Ａ特異的ペプチドの１個以上、好ましくはすべてのアンカー残基を含むような様式で、別のアミノ酸と交換されている、ＲｈｏＣからの連続配列を含む上述のペプチドのいずれかであり得る。
【０１３３】
所与のＨＬＡ−Ａ特異的ペプチドのアンカー残基を含むＲｈｏＣのペプチドを調製する方法の非限定的な例は、実施例１におけるセクション「ＲｈｏＣからのＨＬＡ−Ａ３結合ペプチド」において説明する。したがって、本発明の１つの実施形態において、前記ペプチド前記ペプチドは、多くて２００個、好ましくは多くて１００個、さらに好ましくは多くて５０個、さらにより好ましくは多くて２５個、さらにより好ましくは多くて２０個、さらにより好ましくは多くて１５個、さらにより好ましくは多くて１０個のアミノ酸を含み、ＲＡＧＬＱＶＲＫＮＫ（配列番号１０）またはＲＬＧＬＱＶＲＫＮＫ（配列番号１１）からなる群より選択される配列を含む、任意のペプチドであり得る。
【０１３４】
したがって、本発明の短いペプチドを同定するためのアプローチは、次の段階を含む：特定のＨＬＡ分子、例えば所与の集団において高い率で発生するもの、を選択する段階、上で説明したようなアラインメント分析を行って、Ｒｈｏ遺伝子タンパク質中の「アンカー残基モチーフ」を同定する段階、同定されたアンカー残基のうちの１個以上を含む、適するサイズのペプチドを単離または構築する段階、ならびに結果として得られたペプチドを、本明細書において実施例１で説明するおよびＷＯ２００５／０４９０７３に詳細に記載されているようなＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって決定したとき癌患者のＰＢＬ集団において１０４ＰＢＬ当り少なくとも１の頻度でＩＮＦ−γ産生細胞を惹起する該ペプチドの能力、および／または（ｉｉｉ）試験するエピトープペプチドと反応性であるＣＴＬを腫瘍組織においてインサイチュで検出する該ペプチドの能力について試験する段階。
【０１３５】
本発明のペプチドは、上述のように、配列番号１のＲｈｏＣまたはそのフラグメントから誘導される。前記ペプチドを誘導することができるタンパク質は、そのタンパク質が発現される任意の動物種からの任意のＲｈｏＣであり得る。好ましい実施形態において、出発タンパク質は、齧歯動物種、ウサギおよび霊長類種、例えばヒトを含む、哺乳動物種からのものである。選択するタンパク質の配列に基づき、上に示したような、適するサイズのペプチドを結果として生じさせるタンパク質出発原料の任意の適切な化学的もしくは酵素的処理によって本発明のペプチドを誘導し、または通常の当業者によく知られている任意の従来のペプチド合成手順によってそれを合成することができる。
【０１３６】
本発明のペプチドは、それが由来するＲｈｏＣの天然配列である配列を有することがある。しかし、任意の所与のＨＬＡ分子に対する、より高い親和性を有するペプチドを、例えば、所与のＨＬＡ分子についてのアンカー残基モチーフを同定する、上で説明した手順に基づいて、少なくとも１個のアミノ酸残基の置換、欠失または付加により配列を修飾することによって、そのような天然配列から誘導することができる。
【０１３７】
本発明のペプチドの有意な特徴は、ＩＮＦ−γ産生性リスポンダーＴ細胞、すなわち、癌患者のＰＢＬ集団または腫瘍細胞（標的細胞）中の特定のペプチドを特異的に認識する細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＬＴ）、を認識または惹起するその能力である。この活性は、実施例１において説明するおよびＷＯ２００５／０４９０７３および実施例１に詳細に記載されているＥＬＩＳＰＯＴアッセイに患者からのＰＢＬまたは腫瘍細胞を付すことによって容易に判定される。このアッセイの前に、アッセイするＰＢＬ集団または腫瘍細胞を、試験するペプチドと細胞を接触させることによって、刺激することが有利である場合もある。好ましくは、前記ペプチドは、本明細書において用いるようなＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって決定したとき１０４ＰＢＬ当り少なくとも１の頻度でＩＮＦ−γ産生性Ｔ細胞を惹起または認識することができる。さらに好ましくは、前記頻度は、１０４ＰＢＬ当り少なくとも５、最も好ましくは１０４ＰＢＬ当り少なくとも１０、例えば、１０４ＰＢＬ当り少なくとも５０または１００である。
【０１３８】
ＥＬＩＳＰＯＴアッセイは、ＲｈｏＣペプチド特異的Ｔ細胞応答をモニターするための強力なツールの代表である。本明細書における発見の重要な含意は、本発明のペプチドを癌細胞上で発現させてＨＬＡ分子と複合させることができることである。これは、これらの細胞をＣＴＬによる分解を受け易くし、および転移の発達を制御するＲｈｏＣ免疫処置の潜在的有用性を強調する。実施例１において説明するような黒色腫患者からのＰＢＬにおけるＨＬＡ拘束ＲｈｏＣ由来ペプチドエピトープへの自発的ＣＴＬ応答の存在は、ＲｈｏＣ免疫原性ペプチドの免疫療法の可能性を示す。
【０１３９】
１つの実施形態において、本発明のペプチドは、配列番号１のＲｈｏＣまたは配列番号１と少なくとも７０％の同一性を有するその機能的相同体が発現される癌疾患を有する患者のＰＢＬ集団におけるＩＮＦ−γ産生細胞を惹起することができる。
【０１４０】
本発明の好ましい実施形態において、臨床状態は、癌である。本明細書において用いる場合の用語「癌」は、任意の癌、新生物性および前新生物性疾患を包含する意味を持つ。前記癌は、例えば、大腸癌、乳癌、膵臓癌、卵巣癌、前立腺癌、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、扁平上皮癌腫、規定細胞癌腫、腺癌腫、汗腺癌腫、脂腺癌腫、乳頭癌腫、乳頭腺癌腫、嚢胞腺癌腫、髄様癌腫、気管支原性癌腫、腎細胞癌腫、ヘパトーム、胆管癌腫、絨毛上皮癌腫、精上皮腫、胎児性癌腫、ウィルムス腫瘍、子宮頚癌、精巣腫瘍、肺癌腫、小細胞肺癌腫、膀胱癌腫、上皮癌腫、膠芽腫、ニューロノーマ、頭蓋咽頭腫、神経鞘腫、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽腫、網膜芽細胞腫、白血病およびリンパ腫、急性リンパ性白血病および急性骨髄性真性多血症、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレーム・マクログロブリン血症、および重鎖病、急性非リンパ球性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、直腸癌、泌尿器の癌、子宮癌、口腔癌、皮膚癌、胃癌、脳腫瘍、肝臓癌、喉頭癌、食道癌、乳房腫瘍、小児−ｎｕｌｌ急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、胸腺ＡＬＬ、Ｂ細胞ＡＬＬ、急性骨髄性白血病、骨髄単球様白血病、急性巨核球様白血病、バーキットリンパ腫、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、およびＴ細胞白血病、小および大非小細胞肺癌、急性顆粒球性白血病、生殖細胞腫瘍、子宮内膜癌、胃癌、頭頚部癌、慢性リンパ性白血病、ヘアリー細胞白血病ならびに甲状腺癌からなる群より選択することができる。
【０１４１】
好ましい実施形態において、本発明のワクチン組成物は、黒色腫、卵巣癌または肺癌の群から選択される癌の処置用である。
【０１４２】
非常に好ましい実施形態において、前記癌疾患は、転移癌であり、したがって好ましくは、前記臨床状態は、転移癌である上述の癌のいずれかであり、さらにより好ましくは、前記臨床状態は、転移性黒色腫、転移性卵巣癌または転移性肺癌の群から選択される。
【０１４３】
ＰＢＬ集団において免疫応答を惹起するそれらの能力に加えて、本発明のペプチドは、インサイチュで、すなわち充実性腫瘍組織において、細胞溶解性免疫応答を惹起することができることも考えられる。これは、例えば、ＨＬＡ−ペプチド複合体を生じさせること、例えば、多量体化されることおよび検出可能なラベルを付与されること、ならびにそのような複合体を免疫組織化学染色に用いて、本発明のエピトープペプチドと反応性であるＣＴＬを腫瘍組織において検出することによって、実証することができる。したがって、本発明のペプチドのさらなる有意な特徴は、前記エピトープペプチドと反応性であるＣＬＴの腫瘍組織におけるインサイチュ検出ができることである。
【０１４４】
本発明のペプチドは、ＨＬＡ分子に結合するそれらの能力（その結果、細胞表面にＨＬＡとペプチドの複合体を提示し、そしてまたその複合体がエピトープとして作用する、または細胞溶解性Ｔ細胞を標的にする）ことに加えて、前記複合体に対する抗体の産生および／または遅延型過敏（ＤＴＨ）反応を生じさせるＢ細胞応答などの他のタイプの免疫応答を惹起することがある。後のタイプの免疫応答は、本発明のペプチドの注射部位での発赤および触知可能な硬結と定義する。
【０１４５】
本発明のワクチン組成物は、上述のペプチドのいずれかを含み得る。本発明のワクチン組成物は、前記配列番号１のＲｈｏＣまたは前記配列番号１と少なくとも７０％の同一性を有するその機能的相同体の、２から１００個の範囲、例えば５から７５個、例えば８から５０個、好ましくは９から２５個の範囲のアミノ酸の連続配列から成る。好ましい実施形態において、前記ワクチン組成物は、少なくとも１個のアミノ酸が配列番号３のＲｈｏＢの配列と異なる、配列番号１のＲｈｏＣの配列を含む。さらにより好ましい実施形態において、前記ワクチン組成物は、少なくとも１個のアミノ酸が配列番号２のＲｈｏＡまたは配列番号３のＲｈｏＢの配列と異なる、配列番号１のＲｈｏＣの配列を含む。
【０１４６】
１つの実施形態において、本発明のワクチン組成物は、多くて５０個のアミノ酸残基、例えば多くて４５個のアミノ酸残基、例えば多くて４０個のアミノ酸残基、例えば多くて３５個のアミノ酸残基、例えば多くて３０個のアミノ酸残基、例えば多くて２５個のアミノ酸残基、例えば１５から２０個のアミノ酸残基から成るペプチドフラグメントを含むことがある。
【０１４７】
もう１つの実施形態において、本発明のワクチン組成物は、多くて２０個のアミノ酸残基、例えば多くて１９個のアミノ酸残基、例えば多くて１８個のアミノ酸残基、例えば多くて１７個のアミノ酸残基、例えば多くて１６個のアミノ酸残基、例えば多くて１５個のアミノ酸残基、例えば多くて１４個のアミノ酸残基、例えば多くて１３個のアミノ酸残基、例えば多くて１２個のアミノ酸残基、例えば多くて１１個のアミノ酸残基、例えば８から１０個のアミノ酸残基から成るペプチドフラグメントを含むことがある。
【０１４８】
もう１つの実施形態において、本発明のワクチン組成物は、多くて１００個のアミノ酸残基、例えば多くて９０個のアミノ酸残基、例えば多くて８０個のアミノ酸残基、例えば多くて７０個のアミノ酸残基、例えば多くて６５個のアミノ酸残基、例えば２６から６０個のアミノ酸残基から成るペプチドフラグメントを含むことがある。
【０１４９】
一部の実施形態において、前記ワクチン組成物は、多くて３個、例えば多くて２個のアミノ酸、例えば多くて１個のアミノ酸が置換されている、８から６０個の範囲のアミノ酸、好ましくは８から２０個の範囲のアミノ酸のペプチドフラグメントを含むことがある。前記置換は、半保存的であるこがあり、または好ましくは、前記置換は保存的である。
【０１５０】
ＲｈｏＡとＲｈｏＢとＲｈｏＣにはそれらのタンパク質のＣ末端に関して大きな配列の違いがあるので、好ましい実施形態において、本発明のワクチン組成物は、配列番号１のＲｈｏＣまたは配列番号１と少なくとも７０％の同一性を有するその機能的相同体の１００個の最もＣ末端側のアミノ酸、例えば７５個の最もＣ末端側のアミノ酸、例えば６０個の最もＣ末端側のアミノ酸から選択される配列から成る。
【０１５１】
特定の実施形態において、前記ワクチン組成物は、多くて２個のアミノ酸が置換されている、例えば、多くて１個のアミノ酸が置換されている、次のものから選択される配列を有するＲｈｏＣ  Ｃ末端由来ペプチドを含むことがある：ＡＴＲＡＧＬＱＶＲ（配列番号１１）、ＴＲＡＧＬＱＶＲＫ（配列番号１２）、ＲＡＧＬＱＶＲＫＮ（配列番号１３）、ＡＧＬＱＶＲＫＮＫ（配列番号１４）、ＧＬＱＶＲＫＮＫＲ（配列番号１５）、ＬＱＶＲＫＮＫＲＲ（配列番号１６）、ＱＶＲＫＮＫＲＲＲ（配列番号１７）、ＶＲＫＮＫＲＲＲＧ（配列番号１８）、ＲＫＮＫＲＲＲＧＣ（配列番号１９）、ＫＮＫＲＲＲＧＣＰ（配列番号２０）、ＮＫＲＲＲＧＣＰＩ（配列番号２１）、およびＫＲＲＲＧＣＰＩＬ（配列番号２２）。好ましくは、いずれのアミノ酸も置換されていない。
【０１５２】
特定の実施形態において、前記ワクチン組成物は、多くて２個のアミノ酸が置換されている、例えば、多くて１個のアミノ酸が置換されている、次のものから選択される配列を有するＲｈｏＣ  Ｃ末端由来ペプチドを含むことがある：ＡＴＲＡＧＬＱＶＲＫ（配列番号２３）、ＴＲＡＧＬＱＶＲＫＮ（配列番号２４）、ＲＡＧＬＱＶＲＫＮＫ（配列番号２５）、ＡＧＬＱＶＲＫＮＫＲ（配列番号２６）、ＧＬＱＶＲＫＮＫＲＲ（配列番号２７）、ＬＱＶＲＫＮＫＲＲＲ（配列番号２８）、ＱＶＲＫＮＫＲＲＲＧ（配列番号２９）、ＶＲＫＮＫＲＲＲＧＣ（配列番号３０）、ＲＫＮＫＲＲＲＧＣＰ（配列番号３１）、ＫＮＫＲＲＲＧＣＰＩ（配列番号３２）およびＮＫＲＲＲＧＣＰＩＬ（配列番号３３）。好ましくは、いずれのアミノ酸も置換されていない。
【０１５３】
他の特定の実施形態において、前記ワクチン組成物は、多くて２個のアミノ酸が置換されている、次のものを含む群から選択されるペプチドを含むことがある：ＹＶＰＴＶＦＥＮＹＩ（配列番号３４）、ＶＰＴＶＦＥＮＹＩＡ（配列番号３５）、ＰＴＶＦＥＮＹＩＡＤ（配列番号３６）、ＴＶＦＥＮＹＩＡＤＩ（配列番号３７）、ＶＦＥＮＹＩＡＤＩＥ（配列番号３８）、ＦＥＮＹＩＡＤＩＥＶ（配列番号３９）、ＥＮＹＩＡＤＩＥＶＤ（配列番号４０）、ＮＹＩＡＤＩＥＶＤＧ（配列番号４１）、ＹＩＡＤＩＥＶＤＧＫ（配列番号４２）、ＩＡＤＩＥＶＤＧＫＱ（配列番号４３）、ＬＶＧＮＫＫＤＬＲＱ（配列番号４４）、ＶＧＮＫＫＤＬＲＱＤ（配列番号４５）、ＧＮＫＫＤＬＲＱＤＥ（配列番号４６）、ＮＫＫＤＬＲＱＤＥＨ（配列番号４７）、ＫＫＤＬＲＱＤＥＨＴ（配列番号４８）、ＤＫＬＲＱＤＥＨＴＲ（配列番号１７０）、ＫＬＲＱＤＥＨＴＲＲ（配列番号５０）、ＬＲＱＤＥＨＴＲＲＥ（配列番号５１）、ＲＱＤＥＨＴＲＲＥＬ（配列番号１７１）、ＱＤＥＨＴＲＲＥＬＡ（配列番号１７２）、ＬＡＫＭＫＱＥＰＶＲ（配列番号５４）、ＡＫＭＫＱＥＰＶＲＳ（配列番号５５）、ＫＭＫＱＥＰＶＲＳＥ（配列番号５６）、ＭＫＱＥＰＶＲＳＥＥ（配列番号５７）、ＫＱＥＰＶＲＳＥＥＧ（配列番号５８）、ＱＥＰＶＲＳＥＥＧＲ（配列番号５９）、ＥＰＶＲＳＥＥＧＲＤ（配列番号６０）、ＰＶＲＳＥＥＧＲＤＭ（配列番号６１）、ＶＲＳＥＥＧＲＤＭＡ（配列番号６２）、ＲＳＥＥＧＲＤＭＡＮ（配列番号６３）、ＳＥＥＧＲＤＭＡＮＲ（配列番号６４）、ＥＧＲＤＭＡＮＲＩＳ（配列番号６５）、ＧＲＤＭＡＮＲＩＳＡ（配列番号６６）、ＲＤＭＡＮＲＩＳＡＦ（配列番号６７）、ＤＭＡＮＲＩＳＡＦＧ（配列番号６８）、ＭＡＮＲＩＳＡＦＧＹ（配列番号６９）、ＡＮＲＩＳＡＦＧＹＬ（配列番号１７３）、ＮＲＩＳＡＦＧＹＬＥ（配列番号７１）、ＲＩＳＡＦＧＹＬＥＣ（配列番号１７４）、ＩＳＡＦＧＹＬＥＣＳ（配列番号７３）、ＳＡＦＧＹＬＥＣＳＡ（配列番号１７５）、ＡＦＧＹＬＥＣＳＡＫ（配列番号７５）、ＦＧＹＬＥＣＳＡＫＴ（配列番号７６）、ＧＹＬＥＣＳＡＫＴＫ（配列番号７７）、ＹＬＥＣＳＡＫＴＫＥ（配列番号７８）、ＬＥＣＳＡＫＴＫＥＧ（配列番号７９）、ＥＣＳＡＫＴＫＥＧＶ（配列番号８０）、ＣＳＡＫＴＫＥＧＶＲ（配列番号８１）、ＳＡＫＴＫＥＧＶＲＥ（配列番号８２）、ＡＫＴＫＥＧＶＲＥＶ（配列番号１７６）、ＫＴＫＥＧＶＲＥＶＦ（配列番号１５７）、ＴＫＥＧＶＲＥＶＦＥ（配列番号８９）、ＫＥＧＶＲＥＶＦＥＭ（配列番号８６）、ＥＧＶＲＥＶＦＥＭＡ（配列番号１７７）、ＥＶＦＥＭＡＴＲＡＧ配列番号８８）、ＶＦＥＭＡＴＲＡＧＬ（配列番号８９）、ＦＥＭＡＴＲＡＧＬＱ（配列番号９０）、ＥＭＡＴＲＡＧＬＱＶ（配列番号９１）、ＭＡＴＲＡＧＬＱＶＲ（配列番号９２）、ＡＴＲＡＧＬＱＶＲＫ（配列番号９３）、ＴＲＡＧＬＱＶＲＫＮ（配列番号９４）、ＲＡＧＬＱＶＲＫＮＫ（配列番号１０）、ＡＧＬＱＶＲＫＮＫＲ（配列番号９６）、ＧＬＱＶＲＫＮＫＲＲ（配列番号９７）、ＬＱＶＲＫＮＫＲＲＲ（配列番号９８）、ＱＶＲＫＮＫＲＲＲＧ（配列番号９９）、ＶＲＫＮＫＲＲＲＧＣ（配列番号１００）、ＲＫＮＫＲＲＲＧＣＰ（配列番号１０１）、ＫＮＫＲＲＲＧＣＰＩ（配列番号１０２）、ＮＫＲＲＲＧＣＰＩＬ（配列番号１０３）またはこれらの機能的相同体。好ましくは、いずれのアミノ酸も置換されていない。
【０１５４】
他の特定の実施形態において、前記ワクチン組成物は、多くて２個のアミノ酸が置換されている、次のものを含む群から選択されるペプチドを含むことがある：ＶＰＴＶＦＥＮＹＩ（配列番号１０４）、ＰＴＶＦＥＮＹＩＡ（配列番号１０５）、ＴＶＦＥＮＹＩＡＤ（配列番号１０６）、ＶＦＥＮＹＩＡＤＩ（配列番号１０７）、ＦＥＮＹＩＡＤＩＥ（配列番号１０８）、ＥＮＹＩＡＤＩＥＶ（配列番号１０９）、ＮＹＩＡＤＩＥＶＤ（配列番号１１０）、ＹＩＡＤＩＥＶＤＧ（配列番号１１１）、ＩＡＤＩＥＶＤＧＫ（配列番号１１２）、ＶＧＮＫＫＤＬＲＱ（配列番号１１３）、ＧＮＫＫＤＬＲＱＤ（配列番号１１４）、ＮＫＫＤＬＲＱＤＥ（配列番号１１５）、ＫＫＤＬＲＱＤＥＨ（配列番号１１６）、ＫＤＬＲＱＤＥＨＴ（配列番号１１７）、ＫＬＲＱＤＥＨＴＲ（配列番号１１８）、ＬＲＱＤＥＨＴＲＲ（配列番号１１９）、ＲＱＤＥＨＴＲＲＥ（配列番号１２０）、ＱＤＥＨＴＲＲＥＬ（配列番号１２１）、ＡＫＭＫＱＥＰＶＲ（配列番号１２２）、ＫＭＫＱＥＰＶＲＳ（配列番号１２３）、ＭＫＱＥＰＶＲＳＥ（配列番号１２４）、ＫＱＥＰＶＲＳＥＥ（配列番号１２５）、ＱＥＰＶＲＳＥＥＧ（配列番号１２６）、ＥＰＶＲＳＥＥＧＲ（配列番号１２７）、ＰＶＲＳＥＥＧＲＤ（配列番号１２８）、ＶＲＳＥＥＧＲＤＭ（配列番号１２９）、ＲＳＥＥＧＲＤＭＡ（配列番号１３０）、ＳＥＥＧＲＤＭＡＮ（配列番号１３１）、ＧＲＤＭＡＮＲＩＳ（配列番号１３２）、ＲＤＭＡＮＲＩＳＡ（配列番号１３３）、ＤＭＡＮＲＩＳＡＦ（配列番号１３４）、ＭＡＮＲＩＳＡＦＧ（配列番号１３５）、ＡＮＲＩＳＡＦＧＹ（配列番号１３６）、ＮＲＩＳＡＦＧＹＬ（配列番号１３７）、ＲＩＳＡＦＧＹＬＥ（配列番号１３８）、ＩＳＡＦＧＹＬＥＣ（配列番号１３９）、ＳＡＦＧＹＬＥＣＳ（配列番号１４０）、ＡＦＧＹＬＥＣＳＡ（配列番号１４１）、ＦＧＹＬＥＣＳＡＫ（配列番号１４２）、ＧＹＬＥＣＳＡＫＴ（配列番号１４４）、ＹＬＥＣＳＡＫＴＫＥ（配列番号１４５）、ＬＥＣＳＡＫＴＫＥＧ（配列番号１４６）、ＥＣＳＡＫＴＫＥＧＶ（配列番号１４７）、ＣＳＡＫＴＫＥＧＶＲ（配列番号１４８）、ＳＡＫＴＫＥＧＶＲＥ（配列番号１４９）、ＫＴＫＥＧＶＲＥＶ（配列番号１５０）、ＫＥＧＶＲＥＶＦＥ（配列番号１５２）、ＥＧＶＲＥＶＦＥＭ（配列番号１５３）、ＶＦＥＭＡＴＲＡＧ（配列番号１５４）、ＦＥＭＡＴＲＡＧＬ（配列番号１５５）、ＭＡＴＲＡＧＬＱＶ（配列番号１５７）、ＡＴＲＡＧＬＱＶＲ（配列番号１５８）、ＴＲＡＧＬＱＶＲＫ（配列番号１５９）、ＲＡＧＬＱＶＲＫＮ（配列番号１６０）、ＡＧＬＱＶＲＫＮＫ（配列番号１６１）、ＧＬＱＶＲＫＮＫＲ（配列番号１６２）、ＬＱＶＲＫＮＫＲＲ（配列番号１６３）、ＱＶＲＫＮＫＲＲＲ（配列番号１６４）、ＶＲＫＮＫＲＲＲＧ（配列番号１６５）、ＲＫＮＫＲＲＲＧＣ（配列番号１６６）、ＫＮＫＲＲＲＧＣＰ（配列番号１６７）、ＮＫＲＲＲＧＣＰＩ（配列番号１６８）、ＫＲＲＲＧＣＰＩＬ（配列番号１６９）またはこれらの機能的相同体。好ましくは、いずれのアミノ酸も置換されていない。
【０１５５】
特定の実施形態において、前記ワクチン組成物は、配列ＲＸＧＬＱＶＲＫＮＫを含むペプチドを含むことがあり、この場合、Ｘは、アラニンおよびロイシンからなる群より選択され、ならびに前記ペプチドフラグメントは、配列番号１のＲｈｏＣのまたは配列番号１と少なくとも７０％の同一性を有するその機能的相同体の、１０個と１５０個の間、好ましくは１２個と１２０個の間、さらに好ましくは１５個と７５個の間、さらにより好ましくは２０個と７０個の間、さらにより好ましくは２２個と６５個の間、例えば２６個と６０個の間の連続するアミノ酸である。
【０１５６】
特定の実施形態において、前記ワクチン組成物は、配列ＲＸＧＬＱＶＲＫＮＫを含むペプチドを含むことがあり、この場合、Ｘは、アラニンおよびロイシンからなる群より選択され、ならびに前記ペプチドフラグメントは、長くとも２００、好ましくは長くとも１００、さらに好ましくは長くとも６０アミノ酸長である。
【０１５７】
他の特定の実施形態において、前記ワクチン組成物は、配列ＲＸＧＬＱＶＲＫＮＫを含むペプチドを含むことがあり、この場合、Ｘは、アラニンおよびロイシンからなる群より選択され、ならびに前記ペプチドフラグメント前記ペプチドフラグメントは、配列番号１のＲｈｏＣのまたは配列番号１と少なくとも７０％の同一性を有するその機能的相同体の、４個と１２０個の間、好ましくは８個と１００個の間、さらに好ましくは１０個と７５個の間、さらにより好ましくは１２個と６０個の間、さらにより好ましくは１５個と４０個の間、例えば１８個と２５個の間の連続するアミノ酸である。
【０１５８】
他の特定の実施形態において、前記ワクチン組成物は、配列ＲＸＧＬＱＶＲＫＮＫを含むペプチドを含むことがあり、この場合、Ｘは、アラニンおよびロイシンからなる群より選択され、ならびに前記ペプチドフラグメント前記ペプチドフラグメントは、配列番号１の多くて３個のアミノ酸が置換されている、配列番号１のＲｈｏＣまたはその機能的相同体の、多くて２００個、好ましくは多くて１００個、さらに好ましくは多くて６０個、さらにより好ましくは多くて２５個、さらにいっそう好ましくは多くて２０個、さらに尚より好ましくは多くて１５個、例えば多くて１０個、例えば８から１０個の範囲の連続するアミノ酸である。
【０１５９】
非常に特定の実施形態において、前記ワクチン組成物は、多くて３個のアミノ酸が置換されている、例えば、多くて２個のアミノ酸が置換されている、例えば、多くて１個のアミノ酸が置換されている、次のものを含む群から選択されるペプチドを含むことがある：ＶＹＶＰＴＶＦＥＮＹＩＡＤＩＥＶＤＧＫＱＶ（配列番号５）、ＩＬＶＧＮＫＫＬＲＱＤＥＨＴＲＲＬＡＫ（配列番号６）およびＥＬＡＫＭＫＱＥＰＶＲＳＥＥＧＲＤＭＡＮＲ（配列番号７）またはこれらの機能的相同体。好ましくは、いずれのアミノ酸も置換されていない。
【０１６０】
他の非常に特定の実施形態において、前記ワクチン組成物は、ＲｈｏＣのＣ末端からのペプチド、したがって、次のものから選択されるペプチドを含むことがある：ＥＥＧＲＤＭＡＮＲＩＳＡＦＧＹＫＥＣＳＡＫＴＫＥＧＶＲＥＶＦＥＭＡＴＲＡＧＬＱＶＲＫＮＫＲＲＲＧＣＰＩＬ（配列番号８）またはＡＴＲＡＧＬＱＶＲＫＮＫＲＲＲＧＣＰＩＬ（配列番号４）またはＲＡＧＬＱＶＲＫＮＫ（配列番号１０）。もう１つの好ましい実施形態において、前記ペプチドは、ＲＡＧＬＱＶＲＫＮＫ（配列番号１０）のアラニンがロイシンで置換されている、人工ペプチドであるＲＬＧＬＱＶＲＫＮＫ（配列番号９）である。
【０１６１】
本発明のワクチン組成物は、ＲｈｏＣを発現する癌に罹患している個体に投与したとき、配列番号１のＲｈｏＣまたは配列番号１と少なくとも７０％の同一性を有するその機能的相同体を発現する癌に対する免疫応答を惹起することができる。好ましい実施形態において、前記癌は、転移癌である。本発明のワクチン組成物は、ワクチン接種した患者において癌細胞に対する細胞傷害効果を有するエフェクターＴ細胞の産生を惹起することができ、および／または被験者における腫瘍間質への抗原特異的Ｔ細胞の浸潤を誘導することができる。
【０１６２】
本発明のワクチン組成物は、ＲｈｏＣに属するタンパク質またはその免疫学的に活性なペプチドフラグメントをコードする核酸を含むことがある。したがって、前記核酸は、任意の上述のタンパク質およびペプチドフラグメントのいずれかをコードすることがある。前記核酸は、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＬＮＡ、ＨＮＡ、ＰＮＡであり得、好ましくは、前記核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡである。
【０１６３】
本発明の核酸は、発現ベクターなどの任意の適するベクターの中に含まれていることがある。非常に多数のベクターを利用することができ、当業者は、特定の目的のために有用なベクターを選択することができるだろう。前記ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス粒子または人工染色体の形態であり得る。適切な核酸配列を様々な手技によって前記ベクターに挿入することができ、例えば、当該技術分野において周知の技術を用いてＤＮＡを適切な制限エンドヌクレアーゼ部位（単数または複数）に挿入することができる。本発明の核酸配列の他に、前記ベクターは、シグナル配列、複製起点、１つ以上のマーカー遺伝子、エンハンサー要素、プロモーター、および転写終結配列のうちの１つ以上をさらに含むことがある。前記ベクターは、追加の配列も含むことがある。これらの成分の１つ以上を含有する、適するベクターの構築には、当業者に公知である標準的なライゲーション技術が利用される。前記ベクターは、好ましくは、適する細胞においてその核酸の発現を指示する核酸調節配列に作動可能に連結された核酸を含む、発現ベクターである。本発明の範囲内の前記核酸調節配列は、一般に、哺乳動物細胞、好ましくはヒト細胞、さらに好ましくは抗原提示細胞における発現を指示することができるはずである。
【０１６４】
１つの好ましい実施形態において、前記ベクターは、ウイルスベクターである。
【０１６５】
前記ベクターは、細菌ベクター、例えば弱毒化細菌ベクターである場合もある。弱毒化細菌ベクターは、感染および残存部位での継続的粘膜免疫応答を誘導するために使用することができる。異なる組換え細菌をベクターとして使用することができ、例えば、それらの細菌ベクターは、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ］、およびＬｉｓｔｅｒｉａからなる群より選択することができる。一般に、異種抗原ＨＰＶ１６  Ｌ１またはＥ７に対する免疫の誘導は、マウスにおける強いＣＴＬ誘導および腫瘍退縮で、証明することができる。
【０１６６】
前記ベクターは、Ｔ細胞刺激ポリペプチドをコードする核酸もさらに含むことがある。
【０１６７】
本発明は、
ｉ）本明細書に記載するワクチン組成物のいずれか、および／または
ｉｉ）本明細書に記載するｒｈｏ遺伝子ファミリーに属するタンパク質のいずれか、および／または
ｉｉｉ）本明細書に記載するｉｉ）のタンパク質のペプチドフラグメント、および／または
ｉｖ）ｉｉ）のタンパク質もしくはｉｉｉ）のペプチドをコードする核酸のいずれか、
およびさらなる抗癌剤
を含む、パーツキットにも関する。
【０１６８】
前記パーツキットの成分は、好ましくは個々の組成物に含まれるが、パーツキットの成分すべてが同じ組成物の中に含まれることは、本発明の範囲内に含まれる。したがって、前記パーツキットの成分は、同時にまたは逐次的に任意の順序で投与することができる。
【０１６９】
前記抗癌剤は、化学療法もしくは遺伝子療法において使用される薬剤、免疫刺激物質または抗体であり得る。前記免疫刺激物質は、サイトカイン、例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｉ型ＩＦＮ、インターロイキン１２およびインターロイキン１５からなる群より選択されるサイトカインであり得る。前記抗体は、好ましくは、免疫賦活性抗体、例えば抗ＣＤ４０または抗ＣＴＬＡ−４抗体である。前記免疫刺激物質は、免疫抑制細胞（例えば、調節Ｔ細胞）または因子を枯渇させることができる物質である場合もあり、前記物質は、例えば、Ｅ３ユビキチンリガーゼである。Ｅ３ユビキチンリガーゼ（ＨＥＣＴ、ＲＩＮＧおよびＵ−ｂｏｘタンパク質）は、免疫細胞機能の重要な分子調節剤として登場したものであり、それぞれが、特定の抑制分子をタンパク質分解破壊のための標的にすることにより、感染中の免疫応答の調節に関与することができる。幾つかのＨＥＣＴおよびＲＩＮＧ  Ｅ３タンパク質は、今では自己免疫寛容の誘導および維持にも結び付けられている：ｃ−Ｃｂｌ、Ｃｂｌ−ｂ、ＧＲＡＩＬ、ＩｔｃｈおよびＮｅｄｄ４は、それぞれ、Ｔ細胞成長因子産生および増殖を負に調節する。
【０１７０】
本発明の発見が、本発明のタンパク質またはペプチドフラグメントの診断的用途ばかりでなく治療のための基礎をもたらすことは、明らかである。
【０１７１】
本発明の重要な態様は、ＲｈｏＣ特異的Ｔ細胞のインビトロでの培養および患者へのこれらの養子的移入に関する。養子的移入は、特定の免疫応答を既に生じさせることができる免疫系の実際の成分を医師が患者に直接移入することを意味する。
【０１７２】
例えば養子的移入に有用であり得るＲｈｏＣ特異的Ｔ細胞を提供することが、本発明の１つの目的である。ＲｈｏＣペプチド／ＭＨＣクラスＩまたはＲｈｏＣペプチド／ＭＨＣクラスＩＩ複合体に特異的に結合することができるＴ細胞受容体を含む単離されたＴ細胞を患者に養子的に移入することができ、前記Ｔ細胞は、好ましくは、インビトロで増殖させたＴ細胞であり、この場合のＲｈｏＣペプチドは、本明細書において上述したＲｈｏＣペプチドのいずれかであり得る。インビトロでのＴ細胞の増殖方法は、当業者に周知である。本発明は、ＭＨＣ拘束ＲｈｏＣペプチド複合体に特異的に結合することができるＴ細胞受容体を含むＴ細胞を個体、例えば癌疾患に罹患しているヒト、に投与することを含む処置方法にも関し、この場合のＲｈｏＣ由来ペプチドは、本明細書において上述したＲｈｏＣペプチドのいずれかであり得る。本発明は、癌疾患の処置用の医薬品を調製するための、ＲｈｏＣまたはそのペプチドフラグメントに特異的に結合することができるＴ細胞受容体を含むＴ細胞の使用にさらに関する。自己由来Ｔ細胞移入は、本質的にはＷａｌｔｅｒら（１９９５）に記載されているように、行うことができる。
【０１７３】
さらにもう１つの実施形態において、そのようなＴ細胞を養子的移入前に照射して、患者における増殖を制御することができる。ＴＣＲ遺伝子移入によってＴ細胞の特異性を遺伝子操作することができる。これにより、ＲｈｏＣペプチド特異性を有するＴ細胞を患者に移入することができる。一般に、養子免疫療法のためのＴ細胞の使用は、腫瘍またはウイルスのない環境でＴ細胞を増殖させることができるため、および注入前にＴ細胞機能を分析できるため、魅力的である。養子的移入におけるＴＣＲ遺伝子修飾Ｔ細胞（例えば、異種ＴＣＲお発現を指示する発現構築物で形質転換されたＴ細胞）の利用は、Ｔ細胞系の移入と比較して幾つかの利点を有する。（ｉ）指示し直されたＴ細胞の世代を一般に利用できる。（ｉｉ）高親和性または超高親和性ＴＣＲを選択または作製して使用してＴ細胞を遺伝子操作することができる。（ｉｉｉ）安定化ＴＣＲのより良好な表面発現を可能にするコドン最適化またはマウス化ＴＣＲを使用して高結合活性Ｔ細胞を産生することができる。Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）遺伝子移入によるＴ細胞特異性の遺伝子操作は、本質的にはＭｏｒｇａｎら（２００６）に記載されているように、行うことができる。
【０１７４】
したがって、さらなる態様において、本発明は、本発明のタンパク質またはペプチドフラグメントを含むワクチン組成物、詳細には、転移癌を有する患者に投与したとき、そのワクチン接種した患者において癌細胞に対する細胞傷害効果を有するエフェクターＴ細胞の産生を惹起することを含めて癌疾患に対する免疫応答を惹起することができる医薬組成物を提供する。
【０１７５】
ＨＬＡ細胞が異なれば、大きなヒト集団におけるそれらの有病率も異なることは周知であるので、本発明の方法によって処置することができる患者コホートを拡大するために幾つかのＨＬＡクラスＩ分子に拘束されるペプチドエピトープを同定する必要がある。異なるＨＬＡ拘束要素を有する多数のＲｈｏＣエピトープの特性付けは、２つの重要な点でこの標的抗原の臨床的可能性を広げる：（ｉ）それは、ＲｈｏＣ由来ペプチドに基づく免疫療法に適格な患者の数を増加させる。ＨＬＡ−Ａ２抗原は、白人およびアジア人人口の約５０％によって発現され、ＨＬＡ−Ａ１およびＨＬＡ−Ａ３抗原は、両方とも、白人の約２５％およびアジア人の５％で発現されるのに対して、ＨＬＡ−Ａ１１抗原は、白人の約１５％およびアジア人の３０％によって発現される。共発現のため、これらの数の計算が合わないことがあるにもかかわらず、これらの多重度により限定されるペプチドの組み合わせは、大部分の癌患者を確かに包含する、（ｉｉ）それぞれの患者における幾つかの拘束要素の一括標的化は、ＨＬＡ対立遺伝子喪失による免疫逃避のリスクを低下させる可能性が高い。単一のＨＬＡ対立遺伝子の喪失は、癌細胞について説明されているＭＨＣ変性の有意な要素であるが、クラスＩ発現の完全喪失は、相当珍しい事象である。したがって、異なるＨＬＡ対立遺伝子に拘束されるＲｈｏＣエピトープを同定すれば、対立遺伝子が重複している患者において１つより多くのＨＬＡ分子を同時に標的にすることができるだろう。また、プロテアソームによるより長いＣ末端ＲｈｏＣペプチドの細胞プロセッシングがあれば、対立遺伝子が重複している患者において１つより多くのＨＬＡ分子を同時に標的にすることができるだろう。
【０１７６】
本発明は、高免疫原性マルチ・エピトープ・ワクチンにも関する。好ましくは、そのようなワクチンは、他の適するペプチドおよび／または本明細書において後で説明するようなアジュバントとの場合によっては組み合わせでの最適なＲｈｏＣ由来ペプチドの同時送達を助長するように設計すべきである。本発明は、ＲｈｏＣに属さないまたは由来しないさらなるタンパク質もしくはペプチドおよび／または本明細書において後で説明するようなアジュバントとの場合によっては組み合わせでＲｈｏＣ由来ペプチドを含むそのようなマルチエピトープワクチンを包含する。より複雑な組成物を有するワクチンの開発に駆り立てる重要な要因は、例えば、注意深く選択されたＣＴＬおよびＴｈ細胞エピトープのコレクションを含むまたはコードするワクチンを設計することにより、多数の腫瘍抗原を標的にするという願望である。したがって、１つの態様において、本発明は、クラスＩ拘束ＲｈｏＣエピトープとクラスＩＩ拘束ＲｈｏＣエピトープの両方を含むワクチン組成物に関する。
【０１７７】
したがって、本発明のペプチドは、短い「ＭＨＣ−ｒｅａｄｙ」形態の（クラスＩ拘束）ペプチドと、プロテアソームによるプロセッシングを必要とするより長い形態の（クラスＩＩ拘束）ペプチドの両方を含む。
【０１７８】
本発明のペプチドは、比較的小さい分子であるので、そのような組成物では、ワクチン、免疫原性組成物などを産生するために、それらのペプチドをアジュバントなどの様々な材料と併せることを必要とすることがある。アジュバントは、広く定義すると、免疫応答を促進する物質である。アジュバントの一般的論考は、Ｇｏｄｉｎｇ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ＆  Ｐｒａｃｔｉｃｅ（第２版、１９８６）の６１−６３頁に提供されている。しかし、Ｇｏｄｉｎｇは、対象となる抗原が低分子量のものであるとき、またはあまり免疫原性でないものであるとき、免疫原性担体とのカップリングを推奨すると述べている。そのような担体分子の例としては、キーホールリンペットヘモシアニン、ウシ血清アルブミン、オボアルブミンおよび家禽免疫グロブリンが挙げられる。様々なサポニン抽出物も免疫原性組成物におけるアジュバントとして有用であることが示唆されている。顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、周知のサイトカイン、をアジュバントとして使用することも提案されている（ＷＯ９７／２８８１６）。
【０１７９】
本発明のワクチン組成物は、好ましくは、アジュバントおよび／または担体を含む。有用なアジュバントおよび担体の例は、本明細書において下で与える。したがって、前記組成物中に存在するＲｈｏ遺伝子タンパク質ファミリーに属するタンパク質またはそのペプチドフラグメントを、例えば、Ｒｈｏ遺伝子タンパク質ファミリーまたはそのペプチドフラグメントをＴ細胞に提示することができる例えば樹状細胞（ＤＣ）などのタンパク質または抗原提示細胞のような担体と、会合させることができる。
【０１８０】
アジュバントは、前記ワクチン組成物への混合がＲｈｏＣまたはそのペプチドフラグメントへの免疫応答を増加させるまたは別様に修飾する任意の物質である。担体は、ＲｈｏＣまたはそのペプチドフラグメントを会合させることができる足場構造、例えばポリペプチドまたは多糖類である。
【０１８１】
アジュバントは、例えば、ＡｌＫ（ＳＯ４）２、ＡｌＮａ（ＳＯ４）２、ＡｌＮＨ４（ＳＯ４）、シリカ、ミョウバン、Ａｌ（ＯＨ）３、Ｃａ３（ＰＯ４）２、カオリン、炭素、水酸化アルミニウム、ムラミルジペプチド、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＤＭＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ＣＧＰ  １１６８７；ｎｏｒ−ＭＤＰとも呼ばれる）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミル−Ｌ−アラニン−２−（１’２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＣＧＰ  １９８３５Ａ；ＭＴＰ−ＰＥとも呼ばれる）、２％スクアレン／Ｔｗｅｅｎ−８０．ＲＴＭ．エマルジョンでのＲＩＢＩ（ＭＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳ）、リポ多糖類およびその様々な誘導体（脂質Ａを含む）、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）、フロイント不完全アジュバント、Ｍｅｒｃｋアジュバント６５、ポリヌクレオチド（例えば、ポリＩＣおよびポリＡＵ酸）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓからのワックスＤ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、およびＢｒｕｃｅｌｌａ属のメンバーにおいて見出される物質、Ｔｉｔｅｒｍａｘ、ＩＳＣＯＭＳ、Ｑｕｉｌ  Ａ、ＡＬＵＮ（ＵＳ  ５８７６７および５，５５４，３７２参照）、脂質Ａ誘導体、コレラ毒素誘導体、ＨＳＰ誘導体、ＬＰＳ誘導体、合成ペプチドマトリックスまたはＧＭＤＰ、インターロイキン１、インターロイキン２、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ−５１ならびにＱＳ−２１からなる群より選択することができる。本発明に伴って使用するために好ましいアジュバントとしては、油／界面活性剤系アジュバント、例えばＭｏｎｔａｎｉｄｅアジュバント（ベルギーのＳｅｐｐｉｃから入手可能）、好ましくはＭｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ−５１が挙げられる。他の好ましいアジュバントは、細菌ＤＮＡ系アジュバント、例えば。ＣｐＧオリゴヌクレオチド配列を含むアジュバントである。さらに他の好ましいアジュバントは、ウイルスｄｓＲＮＡ系アジュバント、例えばポリＩ：Ｃである。イミダゾキニリンは、好ましいアジュバントのさらにもう１つの例である。最も好ましいアジュバントは、ヒトでの使用に適するアジュバントである。リポソームは、一般に、本発明にとって有用なアジュバントではなく、したがって、好ましくは、本発明のワクチン組成物は、リポソームを含まない。
【０１８２】
Ｍｏｎｔａｎｉｄｅアジュバント（すべて、ベルギーのＳｅｐｐｉｃから入手可能）は、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ−５１、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ−５０、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ−７０、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ−２０６、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ−２５、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ−７２０、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ−７０８、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ−７６３Ａ、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ−２０７、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ−２６４、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ−２７、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ−３５、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ  ５１Ｆ、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ  ０１６ＤおよびＭｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＭＳから成る群より、好ましくは、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ−５１、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＭＳおよびＭｏｎｔａｎｉｄｅ
ＩＳＡ−７２０から成る群より、さらに好ましくは、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ−５１からなる群より選択することができる。Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ−５１（Ｓｅｐｐｉｃ，Ｉｎｃ．）は、異なる界面活性剤を非代謝性鉱油、代謝性油、またはこれら２個の混合物のいずれかと併用している、油／界面活性剤系アジュバントである。それらを、エマルジョンとして、ＲｈｏＣまたはそのペプチドフラグメントを含む水溶液と共に使用するために調製する。前記界面活性剤は、オレイン酸マンニドである。ＱＳ−２１（Ａｎｔｉｇｅｎｉｃｓ；マサチューセッツ州、フレーミングハムのＡｑｕｉｌａ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）は、水溶液として取り扱う高純度水溶性サポニンである。ＱＳ−２１およびＭｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ−５１アジュバントは、滅菌単回使用バイアルで供給され得る。
【０１８３】
周知のサイトカインＧＭ−ＣＳＦは、本発明のもう１つの好ましいアジュバントである。ＧＭ−ＣＳＦは、１０年にわたってアジュバントとして使用されており、好ましくは、ＷＯ９７／２８８１６に記載されているようなＧＭ−ＣＳＦであり得る。
【０１８４】
アジュバントの一般的な論考は、Ｇｏｄｉｎｇ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ＆  Ｐｒａｃｔｉｃｅ（第２版、１９８６）の６１−６３頁に提供されている。しかし、Ｇｏｄｉｎｇは、対象となる抗原が低分子量のものであるとき、またはあまり免疫原性でないものであるとき、免疫原性担体とのカップリングを推奨すると述べている。そのような担体分子の例としては、キーホールリンペットヘモシアニン、ウシ血清アルブミン、オボアルブミンおよび家禽免疫グロブリンが挙げられる。様々なサポニン抽出物も免疫原性組成物におけるアジュバントとして有用であることが示唆されている。最近、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、周知のサイトカイン、をアジュバントとして使用することも提案された（ＷＯ９７／２８８１６）。
【０１８５】
本発明に従って使用することができるアジュバントの望ましい機能性を下の表に列挙する。
【０１８６】
【表５】
2014139185.tif 000008
本発明のワクチン組成物は、１つより多くの異なるアジュバントを含むことがある。さらに、本発明は、上のもののいずれか、またはそれらの組み合わせをはじめとする任意のアジュバント物質をさらに含む治療用組成物を包含する。ＲＨｏＣまたはそのペプチドフラグメントとアジュバントを別々に任意の適する順序で投与することができることも考えられる。
【０１８７】
担体は、アジュバントとは無関係に存在し得る。担体の機能は、例えば、特にペプチドフラグメントの分子量を増加させてそれらの活性もしくは免疫原性を増加させること、安定性を付与すること、生物活性を増加させること、または血清半減期を増加させることであり得る。さらに、担体は、ｒｈｏ遺伝子ファミリーに属するタンパク質またはそのペプチドフラグメントのＴ細胞への提示を助長し得る。担体は、当業者に公知の任意の適する担体、例えば、タンパク質または抗原提示細胞であり得る。担体タンパク質は、キーホールリンペットヘモシアニン、血清タンパク質、例えばトランスフェリン、ウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミン、サイログロブリンもしくはオボアルブミン、免疫グロブリン、またはホルモン、例えばインスリンもしくはパルミチン酸であり得るが、これらに限定されない。ヒトの免疫処置のための担体は、ヒトに生理的に許容される担体でなければならず、安全でなければならない。しかし、破傷風毒素および／またはジフテリア毒素は、本発明の１つの実施形態では、適する担体である。あるいは、担体は、デキストラン、例えばセファロースであり得る。
【０１８８】
したがって、本発明は、上のもののうちのいずれかまたはそれらの任意の組み合わせをはじめとするアジュバント物質をさらに含む治療用組成物を包含する。抗原、すなわち本発明のペプチド、およびアジュバントを同時にまたは逐次的に任意の適する順序で投与できることも考えられる。
【０１８９】
本発明のワクチン組成物における抗原の選択は、当業者が決めることができるパラメータに依存するであろう。既に述べたように、本発明の異なるペプチドのそれぞれが特定のＨＬＡ分子によって細胞上に提示される。したがって、治療する被験者をＨＬＡ表現型に関して分類すれば、その特定のＨＬＡ分子に結合することがわかっているペプチド（単数／複数）が選択される。
【０１９０】
あるいは、対象となる抗原を、所与の集団における様々な表現型の普及率に基づいて選択する。例えば、ＨＬＡ−Ａ２は、白人人口において最も優勢な表現型であり、したがって、ＨＬＡ−Ａ２に結合するペプチドを含有する組成物は、この人口の大部分において活性であろう。
【０１９１】
しかし、本発明の組成物は、標的集団の大部分を対象に含めるために、それぞれが異なるＨＬＡ分子と特異的に相互作用する１つ以上のＲｈｏＣ由来ペプチドを含有することもある。したがって、例として、前記医薬組成物は、例えば、標的集団におけるＨＬＡ表現型の普及率に対応するＨＬＡ−Ａ分子とＨＬＡ−Ｂ分子、例えばＨＬＡ−Ａ２とＨＬＡ−Ｂ３５など、をはじめとする、ＨＬＡ−Ａ分子によって拘束されるペプチドとＨＬＡ−Ｂ分子によって拘束されるペプチドの組み合わせを含有することがある。加えて、前記組成物は、ＨＬＡ−Ｃ分子によって拘束されるペプチドを含むこともある。
【０１９２】
前記医薬組成物中の本発明の免疫原性ペプチドの量は、個々の用途に依存して変わり得る。しかし、前記ペプチド組成物の単回用量は、好ましくは、概して約１０μｇから約５０００μｇ、さらに好ましくは、約５０μｇから約２５００μｇ、例えば約１００μｇから約１０００μｇである。投与方式としては、経皮、皮下および静脈内投与、徐放性調合物の形態での移植などが挙げられる。当該技術分野において公知の任意のおよびすべての投与形態がここに包含される。また、必要な場合には従来の医薬的に許容される担体、希釈剤、保存薬、アジュバント、緩衝成分などを含有する、注射用免疫原性ペプチド組成物の調合に適することが当該技術分野において公知である任意のおよびすべての従来的剤形、例えば、凍結乾燥形態および溶液、懸濁液またはエマルジョン形態が包含される。
【０１９３】
前記医薬組成物は、当業者に公知の任意の従来のプロトコルを用いて調製および投与することができる。実施例２において、本発明のワクチン組成物の調製の非限定的な例、ならびにそのようなワクチンの投与の非限定的な例を与える。そのプロトコルを本明細書に記載するワクチン組成物のいずれにも容易に適応させることができることは当業者には理解されるであろう。
【０１９４】
本発明のさらなる実施形態において、本発明の医薬組成物は、癌患者の処置にとって、その患者において癌進行中に癌細胞が化学療法活性抗癌薬および／または放射線療法に対する感受性低下を顕示した場合、有用である。
【０１９５】
加えて、本発明の組成物は、本明細書において前に定義したようなクラスＩ拘束エピトープおよびクラスＩＩ拘束エピトープを含むマルチエピトープワクチンとして提供することができる。
【０１９６】
本発明の組成物の免疫保護効果は、例えば上記ＷＯ９７／２８８１６に記載されているような、幾つかのアプローチを用いて判定することができる。好結果の免疫応答は、免疫処置後のＤＴＨ反応の出現および／または前記ワクチン組成物のペプチド（単数もしくは複数）を特異的に認識する抗体の検出によっても判定することができる。
【０１９７】
好ましい実施形態において、本発明の医薬組成物は、ワクチン組成物である。したがって、前記医薬組成物は、癌疾患に対する免疫応答を惹起することができる免疫原性組成物またはワクチンであり得る。本明細書において用いる場合、「免疫原性組成物またはワクチン」という表現は、癌細胞に対する少なくとも１つのタイプの免疫応答を惹起する組成物を指す。したがって、そのような免疫応答は、上述のタイプのいずれか：細胞溶解を生じさせる結果となる細胞表面に提示されたＨＬＡ／ペプチド複合体を認識することができるＣＴＬが産生される、すなわち、ワクチンがワクチン接種した患者において癌細胞に対する細胞傷害効果を有するエフェクターＴ細胞の産生を惹起する、ＣＴＬ応答；抗癌抗体の産生を生じさせるＢ細胞応答；および／またはＤＴＨタイプの免疫応答、であり得る。
【０１９８】
有用な実施形態では、患者からの抗原提示細胞（ＡＰＣ）上にＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ分子を負荷すること、患者からＰＢＬを単離し、それらの細胞と前記ペプチドをインキュベートした後、それらの細胞を患者に注射して戻すこと、または患者から前駆ＡＰＣを単離し、サイトカインおよび抗原を使用してそれらの細胞をプロフェッショナルＡＰＣに分化させた後、それらの細胞を患者に注射して戻すこと、のいずれかによって本発明のペプチドを投与することにより、癌疾患に対する免疫応答を惹起する。
【０１９９】
したがって、本発明のある態様は、ＲｈｏＣもしくはその免疫学的に活性なペプチドフラグメントまたは前記タンパク質もしくは前記免疫学的に活性なペプチドフラグメントをコードする核酸を含む、抗原提示細胞を含むワクチン組成物を提供することである。前記抗原提示細胞は、抗原をＴ細胞に提示することができる任意の細胞であり得る。好ましい抗原提示細胞は、樹状細胞である。樹状細胞（ＤＣ）は、例えば本明細書において下で説明するような、任意の適するプトロコルによる治療手順で調製して使用することができる。そのプロトコルを異なるＨＬＡタイプおよび異なる疾患を有する患者での使用に適応させることができることは、当業者には理解されるであろう。
【０２００】
樹状細胞（ＤＣ）を１時間、３７℃で、５０μｇ／ｍｌのＨＬＡ拘束ペプチド（ＧＭＰ品質で合成されたもの）でパルスし、ペプチドおよび５×１０６細胞を第１日および第１４に、その後は４週間ごとに皮下投与し、５回のワクチン接種後に白血球搬出を施す。臨床的使用のためのＤＣの産生および品質管理は、本質的にはＮｉｃｏｌｅｔｔｅら（２００７）に記載されているように、行うことができる。
【０２０１】
したがって、本発明の１つの実施形態において、癌患者を処置するための方法は、エクスビボで患者の抗原提示細胞（ＡＰＣ）に前記ペプチドを提示させること、その後、このように処理したＡＰＣを患者に注射して戻すことによって前記ペプチドを投与する方法である。これを実施する代替方法が少なくとも２つある。１つの代替は、癌患者からＡＰＣを単離し、ＭＨＣクラスＩ分子をそのペプチドと共にインキュベート（負荷）することである。ＭＨＣクラスＩ分子の負荷は、そのペプチドに特異的なＭＨＣクラスＩ分子を有するＡＰＣがそのペプチドに結合する、したがって、それをＴ細胞に提示することができるように、ＡＰＣをそのペプチドと共にインキュベートすることを意味する。その後、それらのＡＰＣを患者に再び注射する。もう１つの代替方法は、樹状細胞生物学の分野においてなされた最近の発見に依存する。この場合、単球（樹状細胞前駆体である）を患者から単離し、サイトカインおよび抗原の使用によりそれらをプロフェッショナルＡＰＣ（または樹状細胞）にインビトロで分化させる。その後、それらのインビトロ産生ＤＣを前記ペプチドでパルスし、患者に注射する。
【０２０２】
上の説明から、当業者には、本発明のタンパク質および／またはペプチドが癌診断ツールとして有用であることが、容易にわかることであろう。したがって、本発明のペプチドは、癌疾患に関して幅広く応用できる診断および予後予測手順の開発の基礎をもたらす。それゆえ、他の有用な実施形態において、本発明の組成物は、例えばＰＢＬ中または腫瘍組織内のＲｈｏＣ反応性Ｔ細胞の検出に基づく、癌患者におけるその存在のエクスビボまたはインサイチュ診断用の組成物である。
【０２０３】
したがって、尚、さらなる態様において、本発明の１つ以上のペプチドを含むＰＢＬ中または腫瘍組織内のＲｈｏＣ反応性Ｔ細胞の癌患者における存在のエクスビボまたはインサイチュ診断用の診断キット、およびそのような反応性Ｔ細胞の存在を癌患者において検出する方法を提供し、この方法は、腫瘍組織または血液サンプルを、本発明のペプチドとクラスＩもしくはクラスＩＩ  ＨＬＡ分子またはそのような分子のフラグメントとの複合体と接触させること、および前記組織または血液細胞への前記複合体の結合を検出することを含む。
【０２０４】
もう１つの有用な診断または予後予測アプローチは、異種動物種における抗体、例えば、本発明のヒトＲｈｏＣ由来ペプチドに対するマウス抗体、を産生させ、その後、それを使用して、例えば、そのペプチドを提示する癌細胞の存在について診断することに基づく。そのような免疫処置のためのペプチドの量は、上述したものなどの、インビボ療法の過程で使用されるものより少ない場合がある。一般に、好ましい用量は、ペプチド約１μｇから約７５０μｇにわたり得る。本発明のペプチドでの免疫処置に基づいてモノクローナル抗体を産生することもできる。したがって、本発明は、本発明のペプチドに特異的に結合することができる分子、特にモノクローナルまたはポリクローナル抗体（それらのフラグメントを含む）、およびそのような結合を阻止することができる分子、例えば、本発明のペプチドに対するモノクローナルまたはポリクローナル抗体に対して産生させた抗体にも関する。さらに、本発明は、本発明のペプチドまたはタンパク質に特異的に結合することができる単離されたＴ細胞受容体、ならびにそれらをコードする単離された核酸に関する。そのようなＴ細胞受容体は、例えば、当業者に周知の標準的な技術を用いてタンパク質またはペプチド特異的Ｔ細胞からクローニングすることができる。
【０２０５】
１つの態様において、本発明は、本明細書に記載するＲｈｏＣおよび／またはそのペプチドフラグメントに特異的に結合することができるＴ細胞受容体を含む単離されたＴ細胞にも関する。前記単離されたＴ細胞は、ＣＤ８  Ｔ細胞またはＣＤ４  Ｔ細胞であり得る。前記単離されたＴ細胞は、好ましくは、インビトロで増殖させたＴ細胞である。インビトロでＴ細胞を増殖させる方法は、当業者に周知である。そのようなＴ細胞は、特に、養子的移入または自己細胞移入による癌の処置に有用であり得る。したがって、本発明は、Ｔ細胞を含む医薬組成物、ならびに転移癌に罹患しているヒトなどのその必要がある個体にＲｈｏＣまたはそのペプチドフラグメントに特異的に結合することができるＴ細胞受容体を含むＴ細胞を投与することを含む処置方法にも関する。さらに、本発明は、転移癌の処置用の医薬品の調製のための、ＲｈｏＣまたはそのペプチドフラグメントに特異的に結合することができるＴ細胞受容体を含むＴ細胞の使用に関する。自己細胞移入は、本質的にはＷａｌｔｅｒら（１９９５）に記載されているように、行うことができる。
【０２０６】
１つの態様において、本発明は、上で説明しているものなどの診断用試薬として有用である、本発明のペプチドとクラスＩもしくはクラスＩＩ  ＨＬＡ分子またはそのような分子のフラグメントとの複合体を提供する。そのような複合体は、単量体であることもあり、または多量体であることもある。
【０２０７】
本発明は、細胞の異常増殖を特徴とする臨床状態、好ましくは癌、さらに好ましくは転移癌疾患、を処置、予防、緩和または治癒するための手段を提供し、この手段は、有効量の本明細書において定義するとおりの組成物、ペプチドフラグメントに特異的に結合することができる分子（例えば、抗体もしくはＴ細胞であり得る）または本明細書に記載するパーツキットを前記疾患に罹患している患者に投与することを含む。したがって、本発明のさらなる態様は、配列番号１のＲｈｏＣの発現を随伴する転移癌疾患を処置する方法を提供することである。
【０２０８】
本発明の１つの態様において、前記ワクチン組成物は、被験者における臨床応答を惹起することができる。１つの実施形態において、前記臨床応答は、安定した疾患を特徴とすることがあり、好ましい実施形態において、前記臨床応答は、部分的応答を特徴とすることがあり、または好ましくは、前記臨床応答は、癌疾患の完全寛解を特徴とすることがある。前記臨床応答は、本明細書において下で説明するように判定することができる。
【０２０９】
本発明の疾患は、例えば、大腸癌、乳癌、膵臓癌、卵巣癌、前立腺癌、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、扁平上皮癌腫、規定細胞癌腫、腺癌腫、汗腺癌腫、脂腺癌腫、乳頭癌腫、乳頭腺癌腫、嚢胞腺癌腫、髄様癌腫、気管支原性癌腫、腎細胞癌腫、ヘパトーム、胆管癌精上皮腫、絨毛上皮癌精上皮腫、精上皮腫、胎児性癌腫、ウィルムス腫瘍、子宮頚癌、精巣腫瘍、肺癌腫、小細胞肺癌腫、膀胱癌腫、上皮癌腫、膠芽腫、ニューロノーマ、頭蓋咽頭腫、神経鞘腫、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽腫、網膜芽細胞腫、白血病およびリンパ腫、急性リンパ性白血病および急性骨髄性真性多血症、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレーム・マクログロブリン血症、および重鎖病、急性非リンパ球性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、直腸癌、泌尿器の癌、子宮癌、口腔癌、皮膚癌、胃癌、脳腫瘍、肝臓癌、喉頭癌、食道癌、乳房腫瘍、小児−ｎｕｌｌ急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、胸腺ＡＬＬ、Ｂ細胞ＡＬＬ、急性骨髄性白血病、骨髄単球様白血病、急性巨核球様白血病、バーキットリンパ腫、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、およびＴ細胞白血病、小および大非小細胞肺癌、急性顆粒球性白血病、生殖細胞腫瘍、子宮内膜癌、胃癌、頭頚部癌、慢性リンパ性白血病、ヘアリー細胞白血病ならびに甲状腺癌からなる群より選択される癌疾患であり得、この場合、前記癌疾患は、好ましくは、転移性である。
【０２１０】
好ましい実施形態において、本発明のワクチン組成物は、被験者における臨床応答を惹起することができ、この場合、前記臨床応答は、安定した疾患を特徴とすることがあり、好ましい実施形態において、前記臨床応答は、部分的応答を特徴とすることがあり、または好ましくは、前記臨床応答は、黒色腫、卵巣癌または肺癌、さらに好ましくは転移性黒色腫、卵巣癌または肺癌、の群から選択される癌の完全寛解を特徴とすることがある。
【０２１１】
本発明のもう１つの実施形態において、前記ワクチン組成物は、被験者における臨床応答を惹起することができ、この場合、前記臨床応答は、最大標的病変の最大直径の合計の減少を特徴とする。この減少は、本明細書において下で説明するように判定することができる。
【０２１２】
すべての関係器官を代表する、１器官につき最大５個の病変および合計で１０個の病変までのすべての測定可能な病変を標的病変として同定し、記録し、ベースラインで測定することとする。
【０２１３】
●標的病変は、それらのサイズ（最大直径を有する病変）および正確な反復測定についてのそれらの適性に基づいて（画像形成技術により、または臨床的に）選択することとする。
【０２１４】
●すべての標的病変についての最大直径（ＬＤ）の合計を計算し、ベースライン合計ＬＤとして報告することとなる。目標腫瘍を特性付けするために基準としてそのベースライン合計ＬＤを用いることとなる。
【０２１５】
●すべての他の病変（または疾患部位）を非標的病変として同定することとし、同様にベースラインで記録することとする。これらの病変の測定は、必要でないが、追跡調査を通してそれぞれの存在または不在を書き留めることとする。
【０２１６】
標的病変の評価
●完全応答（ＣＲ）：すべての標的病変の消失
●部分応答（ＰＲ）：ベースライン合計ＬＤを基準として考えて、標的病変のＬＤの合計の少なくとも３０％減少
●進行性疾患（ＰＤ）：処置を開始してから記録した最少合計ＬＤを基準として考えて、標的病変のＬＤの合計の少なくとも２０％増加または１つ以上の新たな病変の出現
●安定した疾患（ＳＤ）：処置を開始してからの最少合計ＬＤを基準として考えて、ＰＲと定性するには不十分な収縮またはＰＤと定性するには不十分な増加
非標的病変の評価
●完全応答（ＣＲ）：すべての非標的病変の消失および腫瘍マーカーレベルの正規化
●不完全応答／安定した疾患（ＳＤ）：１つ以上の非標的病変の残存および／または正常レベルより上での腫瘍マーカーレベルの維持
●進行性疾患（ＰＤ）：１つ異常の新たな病変の出現および／または既存の非標的病変の明確な進行
場合によっては、本発明の処置方法とさらなる従来の癌処置、例えば化学療法、放射線療法、免疫刺激物質での処置、遺伝子療法、抗体での処置および樹状細胞を使用する処置とを併用することが適切であろう。腫瘍細胞におけるＲｈｏＣの発現上昇は、薬物耐性と相関するので、本発明が開示するようなＲｈｏＣ系免疫療法と細胞傷害性化学療法の併用は、癌を処置する有効なアプローチであろう。
【０２１７】
１つの態様において、本発明は、免疫処置のモニター方法に関し、この方法は、
ｉ）個体からの血液サンプルを提供する工程
ｉｉ）ＲｈｏＣまたはそのペプチドフラグメントを提供する工程（この場合、前記タンパク質またはペプチドは、本明細書に記載するタンパク質またはペプチドのいずれかであり得る）
ｉｉｉ）前記血液サンプルが、前記タンパク質またはペプチドを特異的に結合する抗体またはＴ細胞受容体を含むＴ細胞を含むかどうかを決定する工程
ｉｖ）それによって、前記タンパク質またはペプチドへの免疫応答が前記個体において生じたかどうかを決定する工程
を含む。
【０２１８】
前記個体は、好ましくは、ヒト、例えばＲｈｏＣもしくはそのペプチドフラグメントまたは前記タンパク質もしくはペプチドをコードする核酸で免疫処置されたヒトである。
【実施例】
【０２１９】
実施例１：ＲｈｏＣに対する免疫応答
１．患者
ＨＬＡ−Ａ３＋癌患者からの末梢血リンパ球（ＰＢＬ）または健常対照からの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をデンマークのＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｈｅｒｌｅｖから入手した。細胞は、１０％ＤＭＳＯを伴うＦＣＳ中で冷凍保存されていた。組織の分類は、デンマーク、コペンハーゲン、Ｔｈｅ  Ｓｔａｔｅ  Ｈｏｓｐｉｔａｌのｔｈｅ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙで行った。これらの測定のいずれを始める前にも、患者からインフォームドコンセントを得た。
【０２２０】
２．ＭＨＣクラスＩ分子に結合するペプチドについてのアセンブリーアッセイ
ＨＬＡ−Ａ３分子に対する合成ペプチド（米国、スコッチプレーンズのＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）の結合親和性を、記載されているようなアセンブリーアッセイ（１３）によって測定した。このアッセイは、ＴＡＰ欠失細胞系Ｔ２−Ａ３に異なる濃度のペプチドを負荷した後のクラスＩ分子の安定化に基づく。簡単に言うと、Ｔ２−Ａ３細胞を、１０％透析ＦＣＳを伴うメチオニン不含ＲＰＭＩ  １６４０（英国、ペーズリーのＧｉｂｃｏ  ＢＲＬ）中でインキュベートした。その後、細胞を５０μＣｉの３５Ｓ−メチオニン（デンマーク、ＢｉｒｋｅｒｏｅｄのＡｍｅｒｓｈａｍ）で代謝標識した。インキュベーション後、溶解バッファー中、プロテアーゼ阻害剤（１００μｇ／ｍＬ  ヨードアセトアミド、２００μｇ／ｍＬ  ＰＥＦＡブロックおよび２μｇ  ペプスタチン（デンマーク、ＨｖｉｄｏｖｒｅのＲｏｃｈｅ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ））の存在下で、および様々な濃度（４−０．０４μＭ）のペプチドを用いて、細胞を溶解した。超遠心分離によって細胞核を除去した。Ｔ２−Ａ３の上清を５分間、４５℃で加熱して、空ＨＬＡ−Ａ３を優先的に不安定化することによってバックグラウンドシグナルを除去した。Ｐａｎｓｏｒｂｉｎ（ドイツ、ダルムシュタットのＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ）の添加によってそれらのサンプルを事前に清澄化し、回転させながら一晩、放置した。安定してフォールディングされたＨＬＡ分子を、ＨＬＡクラスＩ特異的、配座依存性ｍＡｂ  Ｗ６／３２を使用して免疫沈降させた。Ａ−セファロースビーズを添加して、それらのフォールディングされたＭＨＣ複合体を回収し、等電点電気泳動によって分離した。ＩｍａｇｅＧａｕｇｅ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒプログラム（富士フィルム株式会社）を用いて、ＭＨＣ重鎖を定量した。バンドの強度は、アッセイ中に回収されたペプチド結合クラスＩ  ＭＨＣ複合体の量に正比例する。その後、ＨＬＡ−Ａ３の安定化度は、添加したペプチドの結合親和性に正比例する。半最大安定化のために十分なペプチド濃度として、それぞれのペプチドについてのＣ５０値を計算した。
【０２２１】
３．ＰＢＬのＡｇ刺激
ＥＬＩＳＰＯＴアッセイの感受性を拡大するために、ＰＢＬを分析前に１回刺激した。第０日にＰＢＬを解凍し、１０μＭ  ペプチド（米国、スコッチプレーンズのＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）の存在下、５％熱不活化ヒト血清を伴うＸ−ビボ培地（デンマーク、Ｖａｌｌｅｎｓｂａｅｋ  ＳｔｒａｎｄのＣａｍｂｒｅｘ  Ｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ）中で２４ウエルプレート（デンマーク、ＲｏｓｋｉｌｄｅのＮｕｎｃ）にプレーティングした。翌日、２０Ｕ／ｍｌ  ＩＬ−２（英国、ロンドンのＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）をそれらの培養物に添加した。培養した細胞を、第８日に、ＥＬＩＳＰＯＴにおいて反応性について試験した。
【０２２２】
４．インタフェロン−γ（ＩＮＦ−γＥＬＩＳＰＯＴアッセイ）
ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを用いて、以前に記載されたようにペプチドエピトープ特異的ＩＮＦ−γ放出エフェクターを定量した（ＷＯ２００５／０４９０７３、実施例１．２）。簡単に言うと、ニトロセルロース底の９６ウエルプレート（ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ  ＭＡＩＰ  Ｎ４５、デンマーク、ＨｅｄｅｈｕｓｅｎｅのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ）を抗ＩＦＮ−γ抗体（１−Ｄ１Ｋ、スウェーデン、ＮａｃｋａのＭａｂｔｅｃｈ）で被覆した。それらのウエルを洗浄し、Ｘ−ビボ培地でブロックした後、１０４刺激物質Ｔ２−Ａ３細胞（１０μＭのペプチド；Ｒｈｏ１Ｌ２：ＲＬＧＬＱＶＲＫＮＫ；Ｒｈｏ１：ＲＡＧＬＱＶＲＫＮＫ（ＵＳ、スコッチプレーンズのＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）を伴うまたは伴わない）およびエフェクター細胞を異なる濃度で添加した。それらのプレートを一晩、インキュベートした。翌日、培地を廃棄し、ウエルを洗浄した後、ビオチン化二次抗体（７−Ｂ６−１、スウェーデン、ＮａｃｋａのＭａｂｔｅｃｈ）を添加した。それらのプレートを２時間インキュベートし、洗浄し、アビジン−酵素コンジュゲート（ＡＰ−アビジン、デンマーク、ＲｏｓｋｉｌｄｅのＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）をそれぞれのウエルに添加した。プレートを室温で１時間インキュベートした後、酵素基質ＮＢＴ／ＢＣＩＰ（デンマーク、ＴａａｓｔｒｕｐのＧｉｂｃｏ  Ｌｉｆｅ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）をそれぞれのウエルに添加し、室温で５−１０分間インキュベートした。暗い紫色のスポットが現れたら水道水で反応を停止させた。ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ（登録商標）Ｓｅｒｉｅｓ  ２．０  Ａｎａｌｙｚｅｒ（米国、クリーブランドのＣＴＬ  Ａｎａｌｙｚｅｒｓ，ＬＬＣ）を使用してスポットを計数し、ペプチド特異的ＣＴＬ頻度は、スポット形成細胞の数から計算することができた。ポジティブウエルにおける平均スポット数から対照ウエルの平均スポット数を引くことによって、抗原特異的スポットの数を計算した；ｐ値＜０．０５（対応のないサンプルのためのスチューデントｔ検定）を有する応答をポジティブとみなした。この定義は、ｔｈｅ  ＣＩＭＴ  Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  Ｐａｎｅｌ  ｉｎｔｅｒ−ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｔｅｓｔｉｎｇ  ｐｒｏｊｅｃｔ（ｗｗｗ．ｃ−ｉｍｔ．ｏｒｇ）との関連でのものである。
【０２２３】
５．樹状細胞（ＤＣ）
ＤＣは、１０％ヒトＡＢ血清を富化したＲＰＭＩ−１６４０倍地中、６０分間、３７℃での培養皿への付着により、ＰＢＭＣから産生させた。１０％ヒトＡＢ血清を補足したＲＰＭＩ−１６４０中、ＩＬ−４（１０００Ｕ／ｍｌ）およびＧＭ−ＣＳＦ（８００Ｕ／ｍｌ）の存在下で６日間、付着単球を培養した。ＩＬ−１β（２ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−６（１０００Ｕ／ｍｌ）、ＴＮＦ−α（１０ｎｇ／ｍｌ）およびＰＧＥ２（１μｇ／ｍｌ）の添加によって、ＤＣを成熟させた。翌日、結果として生じた成熟ＤＣを１０μＭ  ペプチドで２時間、３７℃でパルスし、照射し（２０Ｇｙ）、４０Ｕ／ｍｌ  ＩＬ−２の存在下での１×１０６ＰＢＬ／ｍｌの刺激のために、１×１０５ＤＣ／ｍｌを使用した。ＩＬ−２は、３−４日ごとに添加した。
【０２２４】
６．抗原特異的Ｔ細胞培養物およびクローンの樹立
黒色腫（ＭＭ）患者からのＰＢＬを、照射（２０Ｇｙ）自己Ｒｈｏ１Ｌ２負荷ＤＣで刺激した（ＰＢＬ：ＤＣ比＝３×１０６：３×１０５）。翌日、１２０Ｕ／ｍｌ  ＩＬ−２（英国、ロンドンのＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）を添加した。培養物の刺激は、１０日ごとにＲｈｏ１Ｌ２負荷照射自己ＤＣ（２×）、続いてＲｈｏ１Ｌ２負荷照射自己ＰＢＬ（３×）で行った。それぞれの刺激後に１２０Ｕ／ｍｌ  ＩＬ−２（英国、ロンドンのＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）を添加した。１ヶ月後、成長培養物をＲｈｏ１Ｌ２に対する特異性について試験した。
【０２２５】
３人の健常ドナーからの１０６／ｍｌ  照射（２０Ｇｙ）リンパ球を含有するクローニングミックスの存在下、５％熱不活化ヒト血清、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳバッファー（英国、ペーズリーのＧｉｂｃｏＢＲＬ）および１２０Ｕ／ｍｌ  ＩＬ−２（ＵＫ、ロンドンのＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）を伴うＸ−ビボ中での限界希釈によって、特定の培養物からＰＢＬをクローニングした。それらのプレートを３７℃／５％ＣＯ２でインキュベートした。３−４日ごとに、ＩＬ−２を含有する５０μＬの新鮮な培地を１２０Ｕ／ｍｌの最終濃度まで添加した。クローニングミックス細胞（５×１０４細胞／ウエル）およびＩＬ−２を使用して、成長クローンを増殖させた。増殖後、標準的５１Ｃｒ放出アッセイで特異性および細胞傷害の可能性についてそれらのクローンを試験した。
【０２２６】
７．細胞傷害性アッセイ
ＣＴＬ媒介細胞傷害性についての従来の５１Ｃｒ放出アッセイは、他の場所に記載されている（Ａｎｄｅｒｓｅｎら、（１９９９）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６３：３８１２−３８１８）ように行った。標的細胞は、ＨＬＡ特異的ｍＡｂ  Ｗ６／３２（Ｂａｒｎｓｔａｂｌｅら、（１９７８）Ｃｅｌｌ  １４：９−２０）（２μｇ／１００μｌ）（Ｓｃｈｍｉｄｔら、（２００３）Ｂｌｏｏｄ  １０２：５７１−５７６）またはＨＬＡ−Ａ３特異的抗体ＧＡＰＡ３（Ｓｉｒｅら、（１９８８）１４０：２４２２−２４３０）を添加したまたはしていない、Ｔ２−Ａ３細胞、ＨＬＡ−Ａ３＋乳癌細胞系ＢＴ−２０、ＨＬＡ−Ａ３＋大腸癌細胞系ＨＴ−２９、ＨＬＡ−Ａ３＋頭頚部癌細胞系ＣＲＬ−２０９５（すべて、米国微生物系統保存機関（ＡＴＣＣ）から入手可能）、ＨＬＡ−Ａ３＋黒色腫細胞系ＦＭ９、ＨＬＡ−Ａ３−黒色腫細胞系ＦＭ８２、およびＨＬＡ−Ａ３＋黒色腫細胞系ＦＭ３（Ｋｉｒｋｉｎら、（１９９５）Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ
４１：７１−８１）であった。
【０２２７】
結果
ＲｈｏＣからのＨＬＡ−Ａ３結合ペプチド
ＲｈｏＣは、主として、その配列のＣ末端部分がＲｈｏＡおよびＲｈｏＢと異なる。それゆえ、この２０アミノ酸領域を、本明細書において上で説明したような主ＨＬＡ特異的アンカー残基を使用して推定ＨＬＡエピトープについて綿密に調査した。本発明者らは、可能性のあるＨＬＡ−Ａ３拘束ペプチドＲｈｏ１（ＲＡＧＬＱＶＲＫＮＫ）を同定した。しかし、アラニンは不良なアンカーアミノ酸であるので、位置２においてこのエピトープは、低い親和性でしかＨＬＡ−Ａ３に結合しないと予想された。黒色腫抗原ｇｐ１００およびＭＡＲＴ−１などの癌細胞によって提示される樹立Ｔ細胞エピトープの多くが、それぞれのＨＬＡクラスＩ分子に対して比較的低い結合親和性を有するので、ＨＬＡ分子へのペプチドの結合に必要不可欠である特定の位置、すなわちアンカー位置、でのアミノ酸の置換によって、そのような低親和性エピトープからヘテロクリティックペプチドを産生させることが通例になっている（Ｐａｒｄｏｌｌ  ＤＭ（１９９８）Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ４：５２５−５３１；Ｓｃｈｅｉｂｅｎｂｏｇｅｎ  Ｃ．ら、（２００２）Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ９８：４０９−４１４）。その結果として、本発明者らは、位置２をアラニンからロイチンに変更した、修飾対応物Ｒｈｏ１Ｌ２（ＲＬＧＬＱＶＲＫＮＫ）を本発明者らの研究に含めた。２個のペプチドを合成し、アセンブリーアッセイによってインフルエンザＮＰ２６５−２７３からのＨＬＡ−Ａ３高親和性ポジティブ対照エピトープ（ＩＬＲＧＳＶＡＨＫ）と比較することによりＨＬＡ−Ａ３への結合を検査した（図２）。クラスＩ  ＭＨＣ分子の半最大回収に必要なペプチド濃度（Ｃ５０値）は、インフルエンザＮＰ２６５−２７３については０．３μＭであった（図２）。修飾Ｒｈｏ１Ｌ２ペプチドは、中等度の親和性で結合した（Ｃ５０＝４）が、天然ペプチドＲｈｏ１は、非常に弱くしかＨＬＡ−Ａ３に結合しなかった（Ｃ５０＞４０）。
【０２２８】
ＲｈｏＣへの自発的Ｔ細胞応答
本発明者らは、ＥＬＩＳＰＯＴ  ＩＦＮ−γ分泌アッセイによって修飾Ｒｈｏ１Ｌ２（ＲＬＧＬＱＶＲＫＮＫ）ペプチドに対する特異的Ｔ細胞応答の存在について、ＨＬＡ−Ａ３＋ＭＭおよび腎細胞癌（ＲＣＣ）患者からのＰＢＬを綿密に調査した。図３に記載するように、ＭＭ患者１０人のうち３人のＰＢＬ中に特異的Ｔ細胞応答が存在した。ＲＣＣ患者および健常対照（ＨＤ）のいずれにおいても、Ｒｈｏ１Ｌ２およびＲｈｏ１に対する応答は検出されなかった。
【０２２９】
Ｔ細胞抗原特異性およびＲｈｏ１／Ｒｈｏ１Ｌ２交差反応性
Ｒｈｏ１Ｌ２ペプチドに対する応答を宿す患者が特定されると、本発明者らは、これらの癌患者からのＰＢＬを使用して、このペプチドに対するＣＴＬバルク培養物をインビトロで産生させた。その後、本発明者らは、そのような患者からのＰＢＬを、Ｒｈｏ１Ｌ２をパルスした自己ＤＣで、インビトロで刺激した。４回のインビトロ刺激の後、ペプチドなしのまたはＲｈｏ１もしくはＲｈｏ１Ｌ２を負荷したＴ２−Ａ３細胞を標的細胞として使用して、標準的な５１Ｃｒ放出アッセイで、ペプチド特異性を試験した（図４ａ）。このアッセイにより、バルク培養物は、Ｒｈｏ１Ｌ２およびＲｈｏ１で効率的にパルスした両方のＴ２−Ａ３細胞を溶解するが、パルスしていないＴ２−Ａ３細胞に対する細胞傷害性は観察されないことが明らかになった。
【０２３０】
次に、限界希釈法により、これらの特異的Ｔ細胞培養物からＣＴＬクローンを樹立した。短い増殖段階の後、成長クローンの特異性を標準的な５１Ｃｒ放出アッセイで分析した。提示するデータは、１個の成長クローン（クローン９（＊））について得られた結果を記載するものである。このクローンは、修飾Ｒｈｏ１Ｌ２と天然Ｒｈｏ１ペプチドの両方でパルスしたＴ２−Ａ３細胞を有効に溶解した。これは、Ｒｈｏ１Ｌ２特異的Ｔ細胞が天然類似体ペプチドと交差反応することを強調する（図４ｂ）。クローン９のＨＬＡ拘束を検査するために、本発明者らは、ＨＬＡ特異的ｍＡｂ  Ｗ６／３２およびＨＬＡ−Ａ３特異的ｍＡｂ  ＧＡＰ  Ａ３の添加によりＨＬＡクラスＩを阻止する効果を試験した。両方の抗体と標的細胞のインキュベーションによって、溶解を完全に阻止することができた（図４ｂ）。
【０２３１】
腫瘍細胞を死滅させるＲｈｏＣ特異的Ｔ細胞の能力
まず第一に、本発明者らは、黒色腫細胞を死滅させるＲｈｏ１Ｌ２／Ｒｈｏ１特異的バルク培養物の能力を検査した。このために、ＨＬＡ−Ａ３＋  ＦＭ３黒色腫細胞をＨＬＡ拘束物質中において高効率で死滅させた、ＦＭ３標的細胞とＷ６／３２のインキュベーションにより溶解を完全に阻止できたからである（図５ａ）。
【０２３２】
同様に、特定のバルク培養物から産生させたクローン９は、ＦＭ３黒色腫細胞を死滅させることができた（図５ｂ）。Ｒｈｏ１Ｌ２ペプチドでパルスした冷（非標識）Ｔ２−Ａ３細胞の添加は、ＦＭ３黒色腫細胞を死滅させるのを完全に無効にした（図５ｂ）。さらに、ＲｈｏＣ特異的ＣＴＬクローンは、ＨＬＡ−Ａ３＋黒色腫癌細胞系ＦＭ９を溶解することができた。追加の対照として、本発明者らは、ＨＬＡ−Ａ３−黒色腫癌細胞系ＦＭ８２を標的細胞として使用した。この細胞系に対しては何の細胞傷害性も観察されなかった。転移癌におけるＲｈｏＣの発現が、異なる起源の癌に関して記載されているので、本発明者らは、黒色腫以外の癌細胞を死滅させるＲｈｏＣ特異的ＣＴＬクローンの能力をさらに検査した。その後、ＨＬＡ−Ａ３＋乳癌細胞系ＢＴ−２０、ＨＬＡ−Ａ３＋頭頚部癌細胞系ＣＲＬ−２０９５およびＨＬＡ−Ａ３＋クローン細胞系ＨＴ−２９を標的細胞として使用した。ＲｈｏＣ特異的ＣＴＬクローンは、すべてのＨＬＡ−Ａ３＋細胞系を溶解したが、クローン細胞系ＨＴ−２９についは限られた程度でしかなかった。
【０２３３】
実施例２
ワクチン組成物の調製についての非限定的実施例およびワクチンの投与についての非限定的実施例
ペプチドワクチン
例えば、遊離アミドＮＨ２末端および遊離酸ＣＯＯＨ末端を有するＲｈｏＣペプチドを、例えばＵＶＡ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｏｒｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙで合成することができる。それぞれは、凍結ペプチドとして供給されるので、それを滅菌水で再構成し、乳酸加リンガー溶液（ＬＲ、イリノイ州、ディアフィールドのＢａｘｔｅｒ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）をバッファーとして用いて水中６７−８０％の乳酸加リンガー溶液の最終濃度に希釈する。その後、これらの溶液を滅菌濾過し、ホウケイ酸ガラスバイアルの中に入れ、ＩＮＤ  ６４５３に記載されているように、ＦＤＡガイドラインに従って、素性、無菌性、一般的安全性および純度の確認を含む一連の品質保証調査に付す。
【０２３４】
実際の環境では、患者は、約１００μｇのクラスＩ  ＨＬＡ拘束ペプチドもしくはクラスＩＩ  ＨＬＡ拘束ペプチドまたは両方の組み合わせを含むワクチンを受けることとなる。例えばアジュバント中の約１００μｇのクラスＩ  ＨＬＡペプチドのみで患者にワクチン接種し、またはアジュバント中の１００μｇのクラスＩＩ  ＨＬＡペプチドのみでワクチン接種し、または例えば約１００μｇのＨＬＡクラスＩ拘束ペプチドと１９０μｇのクラスＩＩ拘束ペプチドでワクチン接種する。併用の際のクラスＩＩペプチドのより高い用量は、等モル量のヘルパーエピトープと細胞傷害性エピトープを与えるために算出される。加えて、両方のペプチドのアミノ酸配列を含む、より長いペプチドで、患者にワクチン接種することができる。
【０２３５】
１ｍｌ水溶液での上記ペプチドを、約１００μｇのＱＳ−２１を伴う溶液／懸濁液として、または約１ｍｌのＭｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ−５１アジュバントを伴うエマルジョンとして投与することができる。
【０２３６】
例えば、合計７回の免疫処置のために、第０日ならびに第１月、第２月、第３月、第６月、第９月および第１２月に、ペプチドとアジュバントで患者に免疫処置する。稀な例外で、それぞれのワクチンでのワクチン接種を同じ腕に投与する。好ましくは、前記ペプチドを皮下投与する。
【数１】
2014139185.tif 000009
【数２】
2014139185.tif 000010
【数３】
2014139185.tif 000011
【図１】
2014139185.tif 000012
【図２】
2014139185.tif 000013
【図３】
2014139185.tif 000014
【図４】
2014139185.tif 000015
【図５】
2014139185.tif 000016
【配列表】
2014139185000001.app