(57)【要約】      （修正有）【課題】エボラウイルス抗原に対する細胞傷害性Ｔリンパ球を効率よく誘導することができ、エボラウイルス感染及び該感染に起因する疾患に対する治療効果又は予防効果が期待できるペプチドやワクチンを提供する。【解決手段】特定の配列で表されるアミノ酸配列を含み、且つ９〜１１アミノ酸の長さを有する、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１に拘束された細胞傷害性Ｔリンパ球を誘導し得るペプチド。該ペプチドが結合したリポソームであって、該リポソームが、不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４のアシル基又は不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４の炭化水素基を有するリン脂質、及びリポソームの安定化剤を含有し；且つ該リポソームの表面に該ペプチドが結合している、ペプチド結合リポソーム。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１〜１４のいずれかで表されるアミノ酸配列を含み、且つ９〜１１アミノ酸の長さを有する、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１に拘束された細胞傷害性Ｔリンパ球を誘導し得るペプチド。
【請求項２】
請求項１記載のペプチドが結合したリポソームであって、
該リポソームが、不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４のアシル基又は不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４の炭化水素基を有するリン脂質、及びリポソームの安定化剤を含有し；且つ
該リポソームの表面に該ペプチドが結合している、
ペプチド結合リポソーム。
【請求項３】
リン脂質が、不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４のアシル基を有するリン脂質である、請求項２記載のペプチド結合リポソーム。
【請求項４】
アシル基がオレオイル基である、請求項２記載のペプチド結合リポソーム。
【請求項５】
リン脂質が、ジアシルホスファチジルセリン、ジアシルホスファチジルグリセロール、ジアシルホスファチジン酸、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、サクシンイミジル−ジアシルホスファチジルエタノールアミン、及びマレイミド−ジアシルホスファチジルエタノールアミンから選ばれる少なくとも１つである、請求項２記載のペプチド結合リポソーム。
【請求項６】
リポソームの安定化剤がコレステロールである、請求項２記載のペプチド結合リポソーム。
【請求項７】
ペプチドが、リポソームを構成するリン脂質膜に含まれる不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４のアシル基又は不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４の炭化水素基を有するリン脂質に結合している、請求項２記載のペプチド結合リポソーム。
【請求項８】
リポソームが以下の組成を有する、請求項２記載のペプチド結合リポソーム：
（Ａ）不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４のアシル基又は不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４の炭化水素基を有するリン脂質    １〜９９．８モル％；
（Ｂ）リポソームの安定化剤    ０．２〜７５モル％。
【請求項９】
リポソームが以下の組成を有する、請求項２記載のペプチド結合リポソーム：
（Ｉ）不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４のアシル基又は不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４の炭化水素基を有する酸性リン脂質    １〜８５モル％；
（ＩＩ）不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４のアシル基又は不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４の炭化水素基を有する中性リン脂質    ０．０１〜８０モル％；
（ＩＩＩ）ペプチドが結合した、不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４のアシル基又は不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４の炭化水素基を有するリン脂質    ０．２〜８０モル％；
（ＩＶ）リポソームの安定化剤    ０．２〜７５モル％。
【請求項１０】
請求項１記載のペプチド又は請求項２記載のペプチド結合リポソームを含む、細胞傷害性Ｔリンパ球活性化剤。
【請求項１１】
更にアジュバントを含有することを特徴とする、請求項１０記載の細胞傷害性Ｔリンパ球活性化剤。
【請求項１２】
請求項１記載のペプチド又は請求項２記載のペプチド結合リポソームを含む、エボラウイルスワクチン。
【請求項１３】
更にアジュバントを含有することを特徴とする、請求項１２記載のエボラウイルスワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エボラウイルスワクチンとして有用なペプチド結合リポソーム、ペプチド、及びそれらの用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
エボラウイルスは、フィロウイルス科のマイナス鎖ＲＮＡウイルスである。エボラウイルスはヒトを含む霊長類に重篤なエボラ出血熱を引き起こす。その致死率は極めて高く、時に９０％を超える。従って、研究を行う場合には、ＢＳＬ４の厳重な封じ込めが必要である。コウモリがエボラウイルスの自然宿主である可能性が報告されているが、不明な点も多い。エボラ出血熱は、１９７６年にスーダン及びザイールで大流行し、その後、中央・西アフリカで散発的に流行している。当初はアフリカにおける地域病と考えられていたが、１９８９年に米国のサル検疫室にて流行したことから、先進国におけるエボラウイルスの脅威が改めて認識されるに至った。近年においては、ペットのサルの輸入や、旅行者によるエボラウイルスの拡散、あるいはエボラウイルスを用いたバイオテロのリスクの増大が指摘されており、エボラ出血熱の効果的な予防又は治療法の開発が希求されているが、未だ効果的な予防又は治療法及びワクチンはない。
【０００３】
エボラウイルスに対する免疫反応について様々な研究成果が報告されている。エボラウイルスに感染しながら死亡には至らなかったヒトにおいて、エボラウイルス抗原に対するＣＴＬや抗体が存在することが報告されている（非特許文献１）。マウスを用いた感染試験において、エボラウイルス抗原に対する中和抗体やＣＴＬが有効であったことが報告されている（非特許文献２及び３）。また、サルを用いた感染試験において、ＤＮＡワクチンや組換えウイルスワクチンが細胞性免疫や液性免疫を誘導し、感染抑制に有効であったことが報告されている（非特許文献４〜７）。一方、エボラウイルス抗原に対する中和抗体は無効であったとの報告もあり（非特許文献８）、ヒトにおいては、エボラウイルスに対する抗体（液性免疫）はあまり有効ではないが、ＣＴＬ（細胞性免疫）は有効であろうと推測されている。
【０００４】
一方、生体の免疫応答を増強するための方法として、リポソーム製剤を用いる方法が知られている。
【０００５】
特許文献１には、抗原が結合したリポソームを用いた、病原体感染細胞又は癌細胞を殺傷するためのＣＴＬを効率よく特異的に増強することができ、感染症や癌の予防・治療に有用なＴ細胞活性化剤の調製法が開示されている。
【０００６】
また特許文献２には、鳥インフルエンザウイルスの、保存性の高い内部タンパク質配列中から、細胞傷害性Ｔリンパ球の調製に特に有効な抗原エピトープを見出したこと、該エピトープを含むペプチドを表面に結合したリポソームが、極めて強力に抗原特異的な細胞傷害性Ｔリンパ球を誘導し得ることが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開2008-37831号公報
【特許文献２】国際公開第2010/061924号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Nat. Immunol., 8: 1159, 2007
【非特許文献２】Science, 287: 1664, 2000
【非特許文献３】J Virol, 75: 2660, 2001
【非特許文献４】Nature, 408: 605, 2000
【非特許文献５】Nature, 424: 681, 2003
【非特許文献６】Nat Med, 11: 786, 2005
【非特許文献７】J Virol, 81: 6379, 2007
【非特許文献８】PLos Pathogens, 3: e9, 2007
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明が解決しようとする課題は、エボラウイルス抗原に対する細胞傷害性Ｔリンパ球を効率よく誘導することができ、エボラウイルス感染及び該感染に起因する疾患に対する治療効果又は予防効果が期待できるペプチドやワクチンを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題に鑑み、鋭意検討を行い、エボラウイルス抗原中に、細胞傷害性Ｔリンパ球の誘導に特に有効な抗原エピトープを探索した結果、幾つかの優れた抗原エピトープを見出した。更に、このエピトープを含むペプチドが結合したリポソームによりワクチン接種を行うと、極めて強力に抗原特異的な細胞傷害性Tリンパ球を誘導し、エボラウイルス感染や該感染に伴う疾患を治療又は予防し得ることを見出し、本発明を完成させた。
【００１１】
すなわち、本発明は以下を提供するものである。
［１］配列番号１〜１４のいずれかで表されるアミノ酸配列を含み、且つ９〜１１アミノ酸の長さを有する、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１に拘束された細胞傷害性Ｔリンパ球を誘導し得るペプチド。
［２］［１］のペプチドが結合したリポソームであって、
該リポソームが、不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４のアシル基又は不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４の炭化水素基を有するリン脂質、及びリポソームの安定化剤を含有し；且つ
該リポソームの表面に該ペプチドが結合している、
ペプチド結合リポソーム。
［３］リン脂質が、不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４のアシル基を有するリン脂質である、［２］のペプチド結合リポソーム。
［４］アシル基がオレオイル基である、［２］のペプチド結合リポソーム。
［５］リン脂質が、ジアシルホスファチジルセリン、ジアシルホスファチジルグリセロール、ジアシルホスファチジン酸、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、サクシンイミジル−ジアシルホスファチジルエタノールアミン、及びマレイミド−ジアシルホスファチジルエタノールアミンから選ばれる少なくとも１つである、［２］のペプチド結合リポソーム。
［６］リポソームの安定化剤がコレステロールである、［２］のペプチド結合リポソーム。
［７］ペプチドが、リポソームを構成するリン脂質膜に含まれる不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４のアシル基又は不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４の炭化水素基を有するリン脂質に結合している、［２］のペプチド結合リポソーム。
［８］リポソームが以下の組成を有する、［２］のペプチド結合リポソーム：
（Ａ）不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４のアシル基又は不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４の炭化水素基を有するリン脂質    １〜９９．８モル％；
（Ｂ）リポソームの安定化剤    ０．２〜７５モル％。
［９］リポソームが以下の組成を有する、［２］のペプチド結合リポソーム：
（Ｉ）不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４のアシル基又は不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４の炭化水素基を有する酸性リン脂質    １〜８５モル％；
（ＩＩ）不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４のアシル基又は不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４の炭化水素基を有する中性リン脂質    ０．０１〜８０モル％；
（ＩＩＩ）ペプチドが結合した、不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４のアシル基又は不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４の炭化水素基を有するリン脂質    ０．２〜８０モル％；
（ＩＶ）リポソームの安定化剤    ０．２〜７５モル％。
［１０］［１］のペプチド又は［２］のペプチド結合リポソームを含む、細胞傷害性Ｔリンパ球活性化剤。
［１１］更にアジュバントを含有することを特徴とする、［１０］の細胞傷害性Ｔリンパ球活性化剤。
［１２］［１］のペプチド又は［２］のペプチド結合リポソームを含む、エボラウイルスワクチン。
［１３］更にアジュバントを含有することを特徴とする、［１２］のエボラウイルスワクチン。
【発明の効果】
【００１２】
本発明のペプチド又はペプチド結合リポソームを用いれば、エボラウイルス抗原に対する細胞傷害性Ｔリンパ球を効率よく誘導することができ、エボラウイルス感染や該感染に起因する疾患に対する優れた治療又は予防効果が期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】エボラウイルス抗原タンパク質に由来する種々のペプチドによるＣＤ８＋／ＩＦＮ−γ＋Ｔ細胞の誘導。縦軸はＩＦＮ−γ発現を、横軸はＣＤ８発現をそれぞれ示す。グラフ中の数値は、ゲートされたＣＤ８＋／ＩＦＮ−γ＋Ｔ細胞のパーセンテージを示す。
【図２】種々のペプチド結合リポソームによるＣＤ８＋／ＩＦＮ−γ＋Ｔ細胞の誘導。（×２）は２回免疫したことを示す。それ以外は全て１回免疫した。縦軸はＩＦＮ−γ発現を、横軸はＣＤ８発現をそれぞれ示す。グラフ中の数値は、ゲートされたＣＤ８＋／ＩＦＮ−γ＋Ｔ細胞のパーセンテージを示す。
【図３】種々のペプチド結合リポソームによるインビボにおけるＣＴＬ活性の誘導。免疫回数は１回である。縦軸は細胞数を、横軸はＣＦＳＥの発現をそれぞれ示す。グラフ中の数値は殺傷されたＭ２ゲート内の細胞のパーセンテージを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
１．ペプチド
本発明は、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１に拘束された細胞傷害性Ｔリンパ球を誘導し得るペプチドであって、
（１）配列番号１〜１４のいずれかで表されるアミノ酸配列、又は
（２）配列番号１〜１４のいずれかで表されるアミノ酸配列において、１又は２個のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列
を含み、且つ９〜１１アミノ酸の長さを有する、ペプチド（本発明のペプチド）を提供する。
【００１５】
本発明は、エボラウイルス抗原タンパク質中に以下の優れたエピトープ配列（本発明のエピトープ配列）を見出したことに基づき完成されたものである：
・配列番号１〜１４のいずれかで表されるアミノ酸配列
・配列番号１〜１４のいずれかで表されるアミノ酸配列において、１又は２個のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列（ここで、該アミノ酸配列からなるペプチドがＨＬＡ−Ａ＊０２０１に拘束された細胞傷害性Ｔリンパ球を誘導し得る）。
【００１６】
配列番号１〜１４で表されるアミノ酸配列は、エボラウイルスザイール株のタンパク質である
Ｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ（ＮＰ）（配列番号１〜２）、
ｖｉｒｉｏｎ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ４０（ＶＰ４０）（配列番号３）、
Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ（ＧＰ）（配列番号４〜７）、
ｖｉｒｉｏｎ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ３０（ＶＰ３０）（配列番号８）又は
ＲＮＡ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｌ）（配列番号９〜１４）
のアミノ酸配列中に含まれる連続する部分配列に相当する。
【００１７】
配列番号１で表されるアミノ酸配列は、エボラウイルスザイール株のＮＰのアミノ酸配列に含まれる第５６番目のイソロイシンから始まる連続する９アミノ酸長の部分配列に相当する（ＮＰ−５６）。
配列番号２で表されるアミノ酸配列は、エボラウイルスザイール株のＮＰのアミノ酸配列に含まれる第４０１番目のアルギニンから始まる連続する９アミノ酸長の部分配列に相当する（ＮＰ−４０１）。
配列番号３で表されるアミノ酸配列は、エボラウイルスザイール株のＶＰ４０のアミノ酸配列に含まれる第７３番目のフェニルアラニンから始まる連続する９アミノ酸長の部分配列に相当する（ＶＰ４０−７３）。
配列番号４で表されるアミノ酸配列は、エボラウイルスザイール株のＧＰのアミノ酸配列に含まれる第２５番目のイソロイシンから始まる連続する９アミノ酸長の部分配列に相当する（ＧＰ−２５）。
配列番号５で表されるアミノ酸配列は、エボラウイルスザイール株のＧＰのアミノ酸配列に含まれる第１６０番目のフェニルアラニンから始まる連続する９アミノ酸長の部分配列に相当する（ＧＰ−１６０）。
配列番号６で表されるアミノ酸配列は、エボラウイルスザイール株のＧＰのアミノ酸配列に含まれる第２５２番目のフェニルアラニンから始まる連続する９アミノ酸長の部分配列に相当する（ＧＰ−２５２）。
配列番号７で表されるアミノ酸配列は、エボラウイルスザイール株のＧＰのアミノ酸配列に含まれる第５４６番目のグリシンから始まる連続する９アミノ酸長の部分配列に相当する（ＧＰ−５４６）。
配列番号８で表されるアミノ酸配列は、エボラウイルスザイール株のＶＰ３０のアミノ酸配列に含まれる第９４番目のセリンから始まる連続する９アミノ酸長の部分配列に相当する（ＶＰ３０−９４）。
配列番号９で表されるアミノ酸配列は、エボラウイルスザイール株のＬのアミノ酸配列に含まれる第２０９番目のアラニンから始まる連続する９アミノ酸長の部分配列に相当する（Ｌ−２０９）。
配列番号１０で表されるアミノ酸配列は、エボラウイルスザイール株のＬのアミノ酸配列に含まれる第２９３番目のリジンから始まる連続する９アミノ酸長の部分配列に相当する（Ｌ−２９３）。
配列番号１１で表されるアミノ酸配列は、エボラウイルスザイール株のＬのアミノ酸配列に含まれる第７７１番目のアルギニンから始まる連続する９アミノ酸長の部分配列に相当する（Ｌ−７７１）。
配列番号１２で表されるアミノ酸配列は、エボラウイルスザイール株のＬのアミノ酸配列に含まれる第９３２番目のグリシンから始まる連続する９アミノ酸長の部分配列に相当する（Ｌ−９３２）。
配列番号１３で表されるアミノ酸配列は、エボラウイルスザイール株のＬのアミノ酸配列に含まれる第１０９９番目のアラニンから始まる連続する９アミノ酸長の部分配列に相当する（Ｌ−１０９９）。
配列番号１４で表されるアミノ酸配列は、エボラウイルスザイール株のＬのアミノ酸配列に含まれる第１９５５番目のバリンから始まる連続する９アミノ酸長の部分配列に相当する（Ｌ−１９５５）。
【００１８】
（２）における置換の態様は、該アミノ酸配列からなるペプチドがＨＬＡ−Ａ＊０２０１に拘束された細胞傷害性Ｔリンパ球を誘導し得る限り特に限定されないが、ザイール株とは異なるエボラウイルス株（型・亜型）（例、スーダン株、レストン株、コートジボアール株、ブンディブギョ株）の同一抗原における対応するエピトープ配列中に生じた既知のアミノ酸変異を反映したものが好適な態様として挙げられる。
【００１９】
本発明のエピトープ配列からなるペプチド（本発明のエピトープペプチド）は、以下の優れた特性を有する：
（Ａ）本発明のエピトープペプチドは、世界的に最もポピュラーなヒト主要組織適合性抗原（ＨＬＡ）の型であるＨＬＡ−Ａ＊０２０１への結合性に優れており、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１上に安定に提示される。
（Ｂ）本発明のエピトープペプチドは、上記（Ａ）の特性を有するため、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１に拘束された細胞傷害性Ｔリンパ球を強力に誘導することができる。「抗原がＨＬＡに拘束された細胞傷害性Ｔリンパ球を誘導する」とは、特定のＨＬＡ（例えばＨＬＡ−Ａ＊０２０１）を発現している哺乳動物（例えばヒト、トランスジェニックマウス等）を抗原で免疫した場合に、該哺乳動物の生体内において、当該ＨＬＡに拘束され、且つ当該抗原を特異的に認識する細胞傷害性Ｔリンパ球の数及び／又は活性（例えばＩＦＮ−γ産生や細胞傷害活性）が上昇することを意味する。上述のように、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１は世界的に最もポピュラーなＨＬＡであることから、本発明のエピトープペプチドは、人種差に関わらず、世界中の多くのヒト（特に、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１を発現するヒト）の細胞傷害性Ｔリンパ球を誘導し、細胞性免疫を活性化することができる。
【００２０】
本発明のペプチドは、上記本発明のエピトープペプチド自体であるか、或いは細胞（好ましくはヒト樹状細胞）内でプロテアソーム等の作用により切断され、上記本発明のエピトープペプチドを生じ得る。従って、本発明のペプチドは、本発明のエピトープペプチドと実質的に同一の優れた特性を有し、下記に記したような本発明の細胞傷害性Tリンパ球活性化剤及びエボラウイルスワクチンの製造に供した場合、エボラウイルスが感染した細胞の殺傷やエボラウイルスの感染防御に優れた効果を発揮することが期待できる。
【００２１】
本発明のペプチドの長さは、特に限定されないが通常９〜１１アミノ酸、好ましくは９〜１０アミノ酸、より好ましくは９アミノ酸である。該ペプチドの長さが１０アミノ酸以上である場合には、該ペプチドは、本発明のエピトープ配列のＮ末端側及び／又はＣ末端側に付加配列を有する。付加配列の長さやアミノ酸配列は、該ペプチドの上記特性を損なわない限り特に限定されない。例えば、該付加配列は、各エピトープ配列が由来するエボラウイルスザイール株のタンパク質のアミノ酸配列において、当該エピトープ配列に隣接して実際に存在するアミノ酸配列であり得る。例えば、本発明のペプチドが配列番号１で表されるアミノ酸配列を含む場合、該ペプチドに含まれ得る付加配列はエボラウイルスザイール株のＮｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ（ＮＰ）のアミノ酸配列中に含まれる、配列番号１からなる部分アミノ酸配列に隣接して実際に存在するアミノ酸配列であり得る。また該ペプチドが、細胞内で主要組織適合抗原複合体（MHC）上に提示される際に、MHCの個人差（多型性）による提示抗原の選別を克服できるような残基なども、付加配列として好ましい。
【００２２】
本発明のペプチドは、例えば、液相合成又は固相ペプチド合成等の公知のペプチド合成技術によって調製できる。或いは、該ペプチドを発現し得る発現ベクターを導入した形質変換体（大腸菌等）を培養し、その培養物からアフィニティカラム等の周知の精製技術により該ペプチドを単離することにより、該ペプチドを製造することができる。該ペプチドを発現し得る発現ベクターは、周知の遺伝子工学的技術を用いて、該ペプチドをコードするポリヌクレオチドを適切な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより構築することができる。
【００２３】
２．ペプチド結合リポソーム
本発明は、上記本発明のペプチドが結合したリポソームであって、
該リポソームが、不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４のアシル基又は不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４の炭化水素基を有するリン脂質、及びリポソームの安定化剤を含有し；且つ
該リポソームの表面に上記本発明のペプチドが結合している、
ペプチド結合リポソーム（本発明のペプチド結合リポソーム）を提供する。
【００２４】
本発明の課題の一つは、エボラウイルス感染細胞（好ましくは、エボラウイルス感染により本発明のペプチドをＨＬＡ−Ａ＊０２０１上に提示した細胞）を殺傷するための細胞傷害性Ｔリンパ細胞（ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＴＬ）を効率よく特異的に増強することである。この観点から、本発明のペプチド結合リポソームに用いられる本発明のペプチドは、好ましくは、配列番号１、２、３、５、６、８、９、１０、１１、１３又は１４で表されるアミノ酸配列を含むものである。
【００２５】
本発明のペプチド結合リポソームのリポソーム部分を構成するリン脂質膜は、両親媒性界面活性剤であるリン脂質が、極性基を水相側に向けて界面を形成し、疎水基が界面の反対側に向く構造を有する。ここで、リポソームとは閉鎖空間を有するリン脂質二重膜のことを指す。
【００２６】
本発明のペプチド結合リポソームに含まれるペプチドは、それが有する官能基を介してリポソームの表面に結合することができる。リポソーム表面への結合に用いられる該ペプチド中の官能基としては、アミノ基、チオール基、カルボキシル基、水酸基、ジスルフィド基又はメチレン鎖を有する炭化水素基（アルキル基等）からなる疎水基等が挙げられる。これらの内、アミノ基、チオール基、カルボキシル基、水酸基及びジスルフィド基は共有結合により、アミノ基及びカルボキシル基はイオン結合により、疎水基は疎水基同士で疎水結合により、該ペプチドをリポソームの表面に結合することができる。該ペプチドは、好ましくはアミノ基、カルボキシル基又はチオール基を介してリポソームの表面に結合する。
【００２７】
本発明のペプチド結合リポソームに含まれるペプチドが有する官能基を介して、該ペプチドが安定にリポソームに結合するため、リポソームを構成するリン脂質膜は、アミノ基、サクシンイミド基、マレイミド基、チオール基、カルボキシル基、水酸基、ジスルフィド基、メチレン鎖を有する炭化水素基（アルキル基等）からなる疎水基等の官能基を有することが望ましい。リポソームを構成するリン脂質膜が有する官能基は、好ましくは、アミノ基、サクシンイミド基又はマレイミド基である。該ペプチドのリポソームへの結合に関与する、該ペプチドの有する官能基とリポソームを構成するリン脂質膜が有する官能基の組み合わせは、本発明の効果に影響しない範囲において自由に選択することができるが、好ましい組み合わせとしては、それぞれ、アミノ基とアルデヒド基、アミノ基とアミノ基、アミノ基とサクシンイミド基、チオール基とマレイミド基等が挙げられる。イオン結合及び疎水結合は、リポソームへのペプチドの結合手順が簡便であり、ペプチド結合リポソームの調製容易性の点から好ましく、また、共有結合は、リポソーム表面のペプチドの結合安定性の点又はペプチド結合リポソームを実用する際の保存安定性の点から好ましい。本発明のペプチド結合リポソームは、その構成成分であるリポソームの表面に細胞傷害性Ｔリンパ球活性化効果を有するペプチドが結合していることを１つの特徴としている。従って、実用段階で、例えば注射行為によって生体内に投与された後にも、該ペプチドがリポソームの表面に安定に結合していることが、本発明の効果をより高める点で好ましい。このような観点から、該ペプチドとリポソームとの結合としては、共有結合が好ましい。
【００２８】
本発明のペプチド結合リポソームのリポソーム部分を構成するリン脂質膜は、不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４のアシル基又は不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４の炭化水素基を有するリン脂質、及びリポソームの安定化剤を含有してなる。
【００２９】
不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４のアシル基を有するリン脂質における、該アシル基の炭素数は、好ましくは１６〜２２であり、更に好ましくは１８〜２２であり、最も好ましくは１８である。該アシル基としては、具体的には、パルミトオレオイル基、オレオイル基、エルコイル基等が挙げられ、最も好ましくはオレオイル基である。
【００３０】
不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４の炭化水素基を有するリン脂質における、該炭化水素基の炭素数は、好ましくは１６〜２２であリ、更に好ましくは１８〜２２であり、最も好ましくは１８である。該炭化水素基としては、具体的には、テトラデセニル基、ヘキサデセニル基、オクタデセニル基、Ｃ２０モノエン基、Ｃ２２モノエン基、Ｃ２４モノエン基等が挙げられる。
【００３１】
リン脂質が有するグリセリン残基の１−位、及び２−位に結合する不飽和のアシル基又は不飽和炭化水素基は、同一でも異なっていてもよい。工業的な生産性の観点から、１−位及び２−位の基が同一であることが好ましい。
【００３２】
リン脂質としては、不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４のアシル基を有するリン脂質が好ましく用いられる。
【００３３】
本発明の課題の一つは、エボラウイルス感染細胞（好ましくは、エボラウイルス感染により本発明のペプチドをＨＬＡ−Ａ＊０２０１上に提示した細胞）を殺傷するための細胞傷害性Ｔリンパ細胞（ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＴＬ）を効率よく特異的に増強することである。実用上十分なレベルにＣＴＬ活性を増強させる点から、リン脂質は不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４のアシル基を有することが好ましい。アシル基の炭素数が１３未満であると、リポソームの安定性が悪くなったり、またＣＴＬ活性増強効果が不十分になる場合がある。また、アシル基の炭素数が２４を超えると、リポソームの安定性が悪くなる場合がある。
【００３４】
不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４のアシル基又は不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４の炭化水素基を有するリン脂質としては、酸性リン脂質、中性リン脂質、ペプチドを結合することのできる官能基を有する反応性リン脂質等の種類が挙げられる。これらは、種々の要求に応じて、その種類、割合を適宜選択することができる。
【００３５】
酸性リン脂質としては、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、ホスファチジルイノシトール等を用いることができる。ＣＴＬ活性を実用上十分なレベルに増強する点、及び工業的な供給性、医薬品として用いるための品質等の点から、不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４のアシル基を有するジアシルホスファチジルセリン、ジアシルホスファチジルグリセロール、ジアシルホスファチジン酸、及びジアシルホスファチジルイノシトールが好ましく用いられる。酸性リン脂質は、リポソームの表面にアニオン性電離基を与えるので、リポソーム表面にマイナスのゼータ電位を付与する。このためリポソームは、電荷的な反発力を得、水性溶媒中で安定な製剤として存在できる。このように、酸性リン脂質は、本発明のペプチド結合リポソームが水性溶媒中にある際のリポソームの安定性を確保する点で重要である。
【００３６】
中性リン脂質としては、例えば、ホスファチジルコリン等を用いることができる。本発明で用いることができる中性リン脂質は、本発明が課題として取り組むＣＴＬ活性増強を達成する範囲において、その種類・量を適宜選択して用いることができる。中性リン脂質は、酸性リン脂質及び本発明のペプチドを結合したリン脂質に比べ、リポソームを安定化する機能が高く、膜の安定性を向上させ得る。かかる観点から、本発明のペプチド結合リポソームのリポソーム部分を構成するリン脂質膜は、中性リン脂質を含有することが好ましい。ＣＴＬ活性増強効果を達成するために用いる酸性リン脂質、ペプチド結合のための反応性リン脂質及びリポソームの安定化剤の含有量を確保した上で、中性リン脂質の使用量を決定できる。
【００３７】
本発明のペプチド結合リポソームにおいては、本発明のペプチドがリポソームを構成するリン脂質膜に含まれる不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４のアシル基又は不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４の炭化水素基を有するリン脂質に結合することにより、リポソームの表面に結合する。
【００３８】
このペプチド結合のためのリン脂質として、本発明のペプチドが結合することのできる官能基を有する反応性リン脂質が用いられる。不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４のアシル基又は不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４の炭化水素基を有する反応性リン脂質は、種々の要求に応じて、その種類、割合が適宜選択される。前記リン脂質と同様に、反応性リン脂質においても、リン脂質に含まれる不飽和アシル基又は不飽和炭化水素基の炭素数が２４を超えるか、１４未満である場合は好ましくない。
【００３９】
反応性リン脂質としては、ホスファチジルエタノールアミン又はその末端変性体が挙げられる。また、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、ホスファチジルイノシトール及びこれらの末端変性体も反応性リン脂質として用いることができる。工業的な入手性、本発明のペプチドとの結合工程の簡便性、収率等の点から、ホスファチジルエタノールアミン又はその末端変性体が好ましく用いられる。ホスファチジルエタノールアミンはその末端に本発明のペプチドを結合することのできるアミノ基を有する。更に、ＣＴＬ活性を実用上十分なレベルに増強する点、リポソームでの安定性、及び工業的な供給性、医薬品として用いるための品質等の点から、不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４のアシル基を有するジアシルホスファチジルエタノールアミン又はその末端変性体が最も好ましく用いられる。
【００４０】
ジアシルホスファチジルエタノールアミンは、例えば、ジアシルホスファチジルコリンを原料に、ホスホリパーゼＤを用いてコリンとエタノールアミンを塩基交換反応させることで得ることができる。具体的には、ジアシルホスファチジルコリンを溶解したクロロホルム溶液と、ホスホリパーゼＤ及びエタノールアミンを溶解した水を適宜比率において混合し粗反応物を得ることができる。粗反応物を、クロロホルム／メタノール／水系溶媒を用いてシリカゲルカラムで精製し目的のジアシルホスファチジルエタノールアミンを得ることができる。当業者であれば、溶媒組成比等のカラム精製条件を適宜選択して実施することが可能である。
【００４１】
末端変性体としては、ジアシルホスファチジルエタノールアミンのアミノ基に２価反応性化合物の一方の末端を結合させたジアシルホスファチジルエタノールアミン末端変性体が挙げられる。２価反応性化合物としては、ジアシルホスファチジルエタノールアミンのアミノ基と反応することができるアルデヒド基又はコハク酸イミド基を少なくとも片方の末端に有する化合物が利用できる。アルデヒド基を有する２価反応性化合物として、グリオキサール、グルタルアルデヒド、サクシンジアルデヒド、テレフタルアルデヒド等が挙げられる。好ましくは、グルタルアルデヒドが挙げられる。コハク酸イミド基を有する２価反応性化合物として、ジチオビス（サクシンイミジルプロピオネート）、エチレングリコール−ビス（サクシンイミジルサクシネート）、ジサクシンイミジルサクシネート、ジサクシンイミジルスベレート、又はジサクシンイミジルグルタレートが等挙げられる。
【００４２】
また、一方の末端にサクシンイミド基、他方の片末端にマレイミド基を有する２価反応性化合物として、Ｎ−サクシンイミジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート、スルホサクシンイミジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート、Ｎ−サクシンイミジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）アセテート、Ｎ−サクシンイミジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）プロピオネート、サクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドエチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート、スルホサクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドエチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート、Ｎ−（γ−マレイミドブチリルオキシ）サクシンイミド、Ｎ−（ε−マレイミドカプロイルオキシ）サクシンイミド等が挙げられる。このような２価反応性化合物を用いると、官能基としてマレイミド基を有するジアシルホスファチジルエタノールアミン末端変性体が得られる。以上のような２価反応性化合物の一方の末端の官能基をジアシルホスファチジルエタノールアミンのアミノ基に結合し、ジアシルホスファチジルエタノールアミン末端変性体を得ることができる。
【００４３】
リポソームの表面にペプチドを結合する方法としては、例えば、上記の反応性リン脂質を含有するリポソームを調製し、次にペプチドを加えてリポソームの反応性リン脂質にペプチドを結合する方法を挙げることができる。また、予めペプチドを反応性リン脂質に結合しておき、次に、得られたペプチドが結合した反応性リン脂質を、反応性リン脂質以外のリン脂質及びリポソームの安定化剤と混合することによっても、ペプチドを表面に結合したリポソームを得ることができる。反応性リン脂質へのペプチドの結合方法は、当該技術分野において周知である。
【００４４】
本発明のペプチド結合リポソームのリポソーム部分を構成するリン脂質膜は、不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４のアシル基又は不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４の炭化水素基を有するリン脂質を少なくとも１種、例えば２種以上、好ましくは３種以上含有する。
【００４５】
例えば、本発明のペプチド結合リポソームのリポソーム部分を構成するリン脂質膜は、ジアシルホスファチジルセリン、ジアシルホスファチジルグリセロール、ジアシルホスファチジン酸、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、サクシンイミジル−ジアシルホスファチジルエタノールアミン、及びマレイミド−ジアシルホスファチジルエタノールアミンから選ばれる少なくとも１種、例えば２種以上、好ましくは３種以上の、不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４のアシル基又は不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４の炭化水素基を有するリン脂質を含有する。
【００４６】
また、本発明のペプチド結合リポソームのリポソーム部分を構成するリン脂質膜は、
不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４のアシル基又は不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４の炭化水素基を有する酸性リン脂質、
不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４のアシル基又は不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４の炭化水素基を有する中性リン脂質、及び
不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４のアシル基又は不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４の炭化水素基を有する反応性リン脂質
を、それぞれ、少なくとも１種含有することが好ましい。
【００４７】
本発明において、リポソームの安定化剤としては、ステロール類やトコフェロール類を用いることができる。前記のステロール類としては、一般にステロール類として知られるものであればよく、例えば、コレステロール、シトステロール、カンペステロール、スチグマステロール、ブラシカステロール等が挙げられ、入手性等の点から、特に好ましくは、コレステロールが用いられる。前記のトコフェロール類としては、一般にトコフェロールとして知られるものであればよく、例えば、入手性等の点から、市販のα-トコフェロールが好ましく挙げられる。
【００４８】
さらに、本発明の効果を損なわない限り、本発明のペプチド結合リポソームのリポソーム部分を構成するリン脂質膜は、リポソームを構成することのできる、公知の構成成分を含んでいてもよい。
【００４９】
本発明のペプチド結合リポソームのリポソーム部分を構成するリン脂質膜の組成としては、例えば以下を挙げることができる：
（Ａ）不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４のアシル基又は不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４の炭化水素基を有するリン脂質    １〜９９．８モル％；
（Ｂ）リポソームの安定化剤    ０．２〜７５モル％
尚、各成分の含有量は、ペプチド結合リポソームのリポソーム部分を構成するリン脂質膜の全構成成分に対するモル％として表示する。
上記成分（Ａ）の含有量は、リポソームの安定性の観点から、好ましくは１０〜９０モル％、より好ましくは３０〜８０モル％、更に好ましくは５０〜７０モル％である。
上記成分（Ｂ）の含有量は、リポソームの安定性の観点から、好ましくは５〜７０モル％、より好ましくは１０〜６０モル％、更に好ましくは２０〜５０モル％である。安定化剤の含有量が７５モル％を超えるとリポソームの安定性が損なわれ好ましくない。
【００５０】
上記成分（Ａ）には、以下が含まれる：
（ａ）ペプチドが結合していない、不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４のアシル基又は不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４の炭化水素基を有するリン脂質、及び
（ｂ）ペプチドが結合した、不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４のアシル基又は不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４の炭化水素基を有するリン脂質。
上記成分（ａ）の含有量は、通常０．０１〜８５モル％、好ましくは０．１〜８０モル％、より好ましくは０．１〜６０モル％、更に好ましくは０．１〜５０モル％である。
上記成分（ｂ）の含有量は、通常０．２〜８０モル％、好ましくは０．３〜６０モル％、より好ましくは０．４〜５０モル％、更に好ましくは０．５〜２５モル％である。含有量が０．２モル％未満であると、本発明のペプチドの量が低下するため、実用上十分なレベルに細胞傷害性Ｔリンパ球を活性化することが困難となり、８０モル％を超えると、リポソームの安定性が低下する。
【００５１】
上記成分（ａ）のリン脂質には、通常、上述の酸性リン脂質及び中性リン脂質が含まれる。また、上記成分（ｂ）のリン脂質には、上述の反応性リン脂質が含まれる。
【００５２】
酸性リン脂質の含有量は、通常１〜８５モル％、好ましくは２〜８０モル％、より好ましくは４〜６０モル％、更に好ましくは５〜４０モル％である。含有量が１モル％未満であると、ゼータ電位が小さくなりリポソームの安定性が低くなり、また、実用上十分なレベルに細胞傷害性Ｔリンパ球を活性化することが困難となる。一方、含有量が８５モル％を超えると、結果として、リポソームのペプチドが結合したリン脂質の含有量が低下し、実用上十分なレベルに細胞傷害性Ｔリンパ球を活性化することが困難となる。
【００５３】
中性リン脂質の含有量は、通常０．０１〜８０モル％、好ましくは０．１〜７０モル％、より好ましくは０．１〜６０モル％、更に好ましくは０．１〜５０モル％である。含有量が８０モル％を超えると、リポソームに含まれる酸性リン脂質、ペプチドが結合したリン脂質及びリポソームの安定化剤の含有量が低下し、実用上十分なレベルに細胞傷害性Ｔリンパ球を活性化することが困難となる。
【００５４】
ペプチドが結合したリン脂質は、前記の反応性リン脂質にペプチドが結合して得られるもので、反応性リン脂質がペプチドと結合する割合は、本発明の効果を妨げない範囲において、結合に用いる官能基の種類、結合処理条件等を適宜実施して選択することができる。
【００５５】
例えば、ジアシルホスファチジルエタノールアミンの末端アミノ基に２価反応性化合物であるジサクシンイミジルサクシネートの片末端を結合して得たジアシルホスファチジルエタノールアミンの末端変性体を反応性リン脂質として用いる場合、結合処理諸条件の選択によって反応性リン脂質の１０〜９９％をペプチドと結合することができる。この場合、ペプチドと結合していない反応性リン脂質は、酸性リン脂質となってリポソームに含有される。
【００５６】
本発明のペプチド結合リポソームのリポソーム部分を構成するリン脂質膜の好ましい態様としては、以下の組成を挙げることができる：
（Ｉ）  不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４のアシル基又は不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４の炭化水素基を有する酸性リン脂質１〜８５モル％；
（ＩＩ）  不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４のアシル基又は不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４の炭化水素基を有する中性リン脂質０．０１〜８０モル％；
（ＩＩＩ）  ペプチドが結合した、不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４のアシル基又は不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４の炭化水素基を有するリン脂質０．２〜８０モル％；
（ＩＶ）  リポソームの安定化剤０．２〜７５モル％。
（合計１００モル%）
【００５７】
本発明のペプチド結合リポソームのリポソーム部分を構成するリン脂質膜のより好ましい態様としては、以下の組成を挙げることができる：
上記成分（Ｉ）      ２〜８０モル％
上記成分（ＩＩ）    ０．１〜７０モル％
上記成分（ＩＩＩ）  ０．３〜６０モル％
上記成分（ＩＶ）    １０〜７０モル％
（合計１００モル%）
【００５８】
本発明のペプチド結合リポソームのリポソーム部分を構成するリン脂質膜の更に好ましい態様としては、以下の組成を挙げることができる：
上記成分（Ｉ）      ４〜６０モル％
上記成分（ＩＩ）    ０．１〜６０モル％
上記成分（ＩＩＩ）  ０．４〜５０モル％
上記成分（ＩＶ）    ２０〜６０モル％
（合計１００モル%）
【００５９】
本発明のペプチド結合リポソームのリポソーム部分を構成するリン脂質膜のとりわけ好ましい態様としては、以下の組成を挙げることができる：
上記成分（Ｉ）      ５〜４０モル％
上記成分（ＩＩ）    ０．１〜５０モル％
上記成分（ＩＩＩ）  ０．５〜２５モル％
上記成分（ＩＶ）    ２５〜５５モル％
（合計１００モル%）
【００６０】
本発明のペプチド結合リポソームは、リポソーム部分を構成するリン脂質膜中のリン脂質に含まれる不飽和アシル基又は不飽和炭化水素基の炭素数が１４〜２４であることを特徴とするが、本発明の効果を妨げない範囲で、炭素数が１４未満又は２４を超える不飽和アシル基又は不飽和炭化水素基を含むリン脂質を含んでいても差支えない。本発明のペプチド結合リポソームのリポソーム部分を構成するリン脂質膜中のリン脂質に含まれる全ての不飽和アシル基又は不飽和炭化水素基の合計数に対して、炭素数が１４〜２４である不飽和アシル基又は不飽和炭化水素基の数の割合は、例えば５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７５％以上、更に好ましくは９０％以上、最も好ましくは９７％以上（例えば実質的に１００％）である。
【００６１】
本発明のペプチド結合リポソームのリポソーム部分を構成するリン脂質膜は、本発明の効果を妨げない限り、炭素数が１４〜２４の範囲のアシル基又は炭化水素基を有する、リン脂質以外の脂質を含んでもよい。該脂質の含有量は、通常は４０モル％以下であり、好ましくは２０モル％以下、より好ましくは１０モル％以下、更に好ましくは５モル％以下（例えば実質的に０モル％）である。
【００６２】
本発明のペプチド結合リポソームのリポソーム部分は、構成成分であるリン脂質、反応性リン脂質、リポソームの安定化剤、ペプチド等を用い、適宜配合や加工を行い、これを適当な溶媒に添加する等の方法で得ることができる。
【００６３】
例えば、エクスツルージョン法、ボルテックスミキサー法、超音波法、界面活性剤除去法、逆相蒸発法、エタノール注入法、プレベシクル法、フレンチプレス法、W/O/Wエマルジョン法、アニーリング法、凍結融解法等の製造方法が挙げられる。リポソームの形態は、特に限定されず、前記のリポソーム製造方法を適宜選択することにより、多重層リポソーム、小さな一枚膜リポソーム、大きな一枚膜リポソーム等、種々の大きさや形態を有するリポソームを製造することができる。
【００６４】
リポソームの粒径は特に限定されるものではないが、保存安定性等の点から、粒径は２０〜６００ｎｍが挙げられ、好ましくは３０〜５００ｎｍ、次に好ましくは４０〜４００ｎｍであり、更に好ましくは、５０〜３００ｎｍであり、最も好ましくは７０〜２３０ｎｍである。
【００６５】
なお、本発明においては、リポソームの物理化学的安定性を向上させるために、リポソーム調製過程又は調製後に、リポソームの内水相及び/又は外水相に、糖類又は多価アルコール類を添加しても良い。特に、長期保存或いは製剤化途上での保管が必要な場合には、リポソームの保護剤として、糖類或いは多価アルコール類を添加・溶解し、凍結乾燥により水分を除いてリン脂質組成物の凍結乾燥物とすることが好ましい。
【００６６】
糖類としては、例えばグルコース、ガラクトース、マンノース、フルクトース、イノシトール、リボース、キシロース等の単糖類；サッカロース、ラクトース、セロビオース、トレハロース、マルトース等の二糖類；ラフィノース、メレジトース等の三糖類；シクロデキストリン等のオリゴ糖；デキストリン等の多糖類；キシリトール、ソルビトール、マンニトール、マルチトール等の糖アルコール等が挙げられる。これらの糖類の中では単糖類又は二糖類が好ましく、中でもグルコース又はサッカロースが入手性等の点からより好ましく挙げられる。
【００６７】
前記多価アルコール類としては、例えば、グリセリン、ジグリセリン、トリグリセリン、テトラグリセリン、ペンタグリセリン、ヘキサグリセリン、ヘプタグリセリン、オクタグリセリン、ノナグリセリン、デカグリセリン、ポリグリセリン等のグリセリン系化合物；ソルビトール、マンニトール等の糖アルコール系化合物；エチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、テトラエチレングリコール、ペンタエチレングリコール、ヘキサエチレングリコール、ヘプタエチレングリコール、オクタエチレングリコール、ノナエチレングリコール等が挙げられる。このうち、グリセリン、ジグリセリン、トリグリセリン、ソルビトール、マンニトール、分子量４００〜１０，０００のポリエチレングリコールが入手性の点から好ましく挙げられる。
【００６８】
リポソームの内水相及び／又は外水相に含ませる、糖類或いは多価アルコール類の濃度は、リポソーム液に対する重量濃度で、例えば１〜２０重量％が挙げられ、好ましくは２〜１０重量％が挙げられる。
【００６９】
本発明のペプチド結合リポソームを製造する場合、ペプチドを結合させる前のリポソームを作製した後、ペプチドを結合させることにより簡便に本発明のペプチド結合リポソームを得ることができる。
【００７０】
例えば、リン脂質、リポソームの安定化剤及び膜表面にペプチドを結合するための反応性リン脂質を含有したリポソームの懸濁液を調製し、その外水相に前記の糖類の一つであるスクロースを２〜１０重量％程度加えて溶解する。この糖添加製剤を１０ｍｌガラス製バイヤルに移して棚段式凍結乾燥機内に置き、−４０℃等に冷却して試料を凍結した後、常法により凍結乾燥物を得る。
【００７１】
ここで得たリポソームの凍結乾燥物は、水分が取り除かれているため長期の保存が可能であり、必要時に特定のペプチドを加えて後の工程を実施することにより、本発明の最終的なペプチド結合リポソームを簡便に迅速に得ることができる。ペプチドとリポソームとの相互作用が強く不安定性が高い場合等は、このようにリポソームの凍結乾燥物の段階で保存し、必要な際にペプチドを結合して用いると非常に簡便である。
【００７２】
本発明のペプチド結合リポソームのリポソーム部分を構成するリン脂質膜は、ペプチドが結合したリン脂質を有し得る。ペプチドが結合したリン脂質を含有するリポソームを得る方法としては、次の（Ａ）及び（Ｂ）による方法が挙げられる。
（Ａ）リン脂質、反応性リン脂質、リポソームの安定化剤を含有するリポソームを調製し、これにペプチド及び２価反応性化合物を添加し、リポソーム中に含有される反応性リン脂質の官能基と、該ペプチドの官能基とを、２価反応性化合物を介して連結する方法。ここで用いることができる２価反応性化合物は、反応性リン脂質の末端変性体調製において用いたものを同様に用いることができる。具体的には、アルデヒド基を有する２価反応性化合物として、グリオキサール、グルタルアルデヒド、サクシンジアルデヒド、テレフタルアルデヒド等が挙げられる。好ましくは、グルタルアルデヒドが挙げられる。更に、コハク酸イミド基を有する２価反応性化合物として、ジチオビス（サクシンイミジルプロピオネート）、エチレングリコール−ビス（サクシンイミジルサクシネート）、ジサクシンイミジルサクシネート、ジサクシンイミジルスベレート、又はジサクシンイミジルグルタレート等が挙げられる。また、片末端にサクシンイミド基、もう一方の片末端にマレイミド基を有する２価反応性化合物として、Ｎ−サクシンイミジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート、スルホサクシンイミジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート、Ｎ−サクシンイミジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）アセテート、Ｎ−サクシンイミジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）プロピオネート、サクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドエチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート、スルホサクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドエチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート、Ｎ−（γ−マレイミドブチリルオキシ）サクシンイミド、Ｎ−（ε−マレイミドカプロイルオキシ）サクシンイミド等を使用することができる。かかる２価反応性化合物を使用すると、官能基としてマレイミド基を有する反応性リン脂質（例えばホスファチジルエタノールアミン）の末端変性体が得られる。
（Ｂ）リン脂質、反応性リン脂質、リポソームの安定化剤を含有するリポソームを調製し、これにペプチドを添加し、リポソームに含まれる反応性リン脂質の官能基と、該ペプチドの官能基を連結して結合させる方法。
【００７３】
前記（Ａ）及び（Ｂ）における結合の種類としては、例えば、イオン結合、疎水結合、共有結合等が挙げられるが、好ましくは共有結合である。更に共有結合の具体例としては、シッフ塩基結合、アミド結合、チオエーテル結合、エステル結合等が挙げられる。
【００７４】
以上の２つの方法いずれとも、リポソームを構成するリン脂質膜に含まれる反応性リン脂質にペプチドを結合することができ、リポソームにおいてペプチドを結合したリン脂質が形成される。
【００７５】
前記の（Ａ）の方法において、原料となるリポソームとペプチドとを２価反応性化合物を介して結合させる方法の具体例としては、例えば、シッフ塩基結合を利用する方法が挙げられる。シッフ塩基結合を介してリポソームとペプチドとを結合する方法としては、アミノ基を表面に有するリポソームを調製し、ペプチドを該リポソームの懸濁液に添加し、次に、２価反応性化合物としてジアルデヒドを加え、リポソーム表面のアミノ基と該ペプチド中のアミノ基とをシッフ塩基を介して結合する方法を挙げることができる。
【００７６】
この結合手順の具体例としては、例えば、次の方法が挙げられる。
（Ａ−１）アミノ基を表面に有するリポソームを得るために、不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４のアシル基又は不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４の炭化水素基を有する反応性リン脂質（例  ホスファチジルエタノールアミン）をリポソーム原料脂質（リン脂質、リポソームの安定化剤等）中に混合して、アミノ基がリポソーム表面に所定量存在するリポソームを作成する。
（Ａ−２）前記リポソーム懸濁液に、ペプチドを添加する。
（Ａ−３）次に、２価反応性化合物としてグルタルアルデヒドを加えて、所定の時間反応させてリポソームとペプチドとの間にシッフ塩基結合を形成する。
（Ａ−４）その後、余剰のグルタルアルデヒドの反応性を失活させるため、アミノ基含有水溶性化合物としてグリシンをリポソーム懸濁液に加えて反応させる。
（Ａ−５）ゲルろ過、透析、限外ろ過、遠心分離等の方法により、リポソームに未結合のペプチド、グルタルアルデヒドとグリシンとの反応産物、及び余剰のグリシンを除去して、本発明のペプチド結合リポソーム懸濁液を得る。
【００７７】
前記の（Ｂ）の方法の具体例としては、アミド結合、チオエーテル結合、シッフ塩基結合、エステル結合等を形成することのできる官能基を有する反応性リン脂質を、リポソームを構成するリン脂質膜に導入する方法が挙げられる。このような官能基の具体例としては、サクシンイミド基、マレイミド基、アミノ基、イミノ基、カルボキシル基、水酸基、チオール基等が挙げられる。
【００７８】
リポソームを構成するリン脂質膜に導入する反応性リン脂質の例としては、前記の不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４のアシル基又は不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４の炭化水素基を有する反応性リン脂質（例  ホスファチジルエタノールアミン）のアミノ基末端の末端変性物を用いることができる。
【００７９】
この結合手順の具体例として、ジアシルホスファチジルエタノールアミンを用いた場合を例にとって、以下説明する。
（Ｂ−１）不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４のアシル基を有するジアシルホスファチジルエタノールアミンとジサクシンイミジルサクシネートを公知の方法で片末端のみ反応させて、官能基としてサクシンイミド基を末端に有するジサクシンイミジルサクシネート結合ジアシルホスファチジルエタノールアミンを得る。
（Ｂ−２）前記ジサクシンイミジルサクシネート結合ジアシルホスファチジルエタノールアミンと他のリポソーム構成成分（リン脂質、リポソームの安定化剤等）とを公知の方法で混合し、表面に官能基としてサクシンイミド基を有するリポソームを作成する。
（Ｂ−３）前記リポソーム懸濁液に、ペプチドを加え、該ペプチド中のアミノ基と、リポソーム表面のサクシンイミド基とを反応させる。
（Ｂ−４）未反応のペプチド、反応副生物等を、ゲルろ過、透析、限外ろ過、遠心分離等の方法により除去して、本発明のペプチド結合リポソームの懸濁液を得る。
【００８０】
リポソームとペプチドとを結合する場合、官能基として含有されることが多いアミノ基又はチオール基を対象とすることが実用上好ましい。アミノ基を対象とする場合には、サクシンイミド基と反応させることによりシッフ塩基結合を形成させることができる。チオール基を対象とする場合には、マレイミド基と反応させることによりチオエーテル結合を形成させることができる。
【００８１】
３．本発明のペプチド及びペプチド結合リポソームの用途
本発明は、上記本発明のペプチド又は本発明のペプチド結合リポソームを含む細胞傷害性Ｔリンパ球活性化剤及びエボラウイルスワクチンを提供する。本発明のペプチドやペプチド結合リポソームを用いれば、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１拘束的に、本発明のペプチド又はエピトープペプチドを認識する細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を強力に誘導することが可能となる。本発明のペプチドやペプチド結合リポソームにより誘導される細胞傷害性Ｔリンパ球は、エボラウイルス感染等の結果、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１上に本発明のペプチド又はエピトープペプチドを提示した細胞を殺傷し、これらの細胞を除去することができる。従って、本発明のペプチドやペプチド結合リポソームは、細胞傷害性Ｔリンパ球活性化剤やエボラウイルスワクチンとして、エボラウイルス感染や該感染により引き起こされる疾患（エボラ出血熱等）の治療や予防に有用である。
【００８２】
本発明のエボラウイルスワクチンが標的とするエボラウイルスの株の種類は、該エボラウイルス感染に対して予防又は治療効果が発揮される限り特に限定されない。エボラウイルスの株としては、ザイール株、スーダン株、レストン株、コートジボアール株、ブンディブギョ株等が挙げられる。配列番号１〜１４で表されるエピトープ配列は、ザイール株の対応するタンパク質（ＮＰ、ＶＰ４０、ＧＰ、Ｌ又はＶＰ３０）のアミノ酸配列に含まれるので、本発明のエボラウイルスワクチンは、ザイール株に対して特に効果が期待される。また、本発明のエピトープ配列が保存されたザイール株以外のエボラウイルスの株に対しても、ザイール株と同様に、本発明のエボラウイルスワクチンは、優れた効果を発揮することが期待される。各本発明のエピトープ配列が保存されたエボラウイルスの株を以下に列挙する。
配列番号１：ザイール株、スーダン株、コートジボアール株、ブンディブギョ株
配列番号２：ザイール株、スーダン株、レストン株、コートジボアール株、ブンディブギョ株
配列番号３：ザイール株、コートジボアール株、ブンディブギョ株
配列番号４：ザイール株
配列番号５：ザイール株、スーダン株、レストン株、コートジボアール株、ブンディブギョ株
配列番号６：ザイール株
配列番号７：ザイール株
配列番号８：ザイール株、スーダン株、コートジボアール株、ブンディブギョ株
配列番号９：ザイール株
配列番号１０：ザイール株
配列番号１１：ザイール株、スーダン株、レストン株、コートジボアール株、ブンディブギョ株
配列番号１２：ザイール株、コートジボアール株
配列番号１３：ザイール株、コートジボアール株
配列番号１４：ザイール株
【００８３】
上に列挙された株以外であっても、当業者であれば、評価対象のエボラウイルス株において、目的とするエピトープ配列が保存されているか否かを、ＲＴ−ＰＣＲやダイレクトシークエンシング等の周知のヌクレオチド配列解析方法により、容易に決定することが出来る。
【００８４】
本発明のペプチドやペプチド結合リポソームを細胞傷害性Ｔリンパ球活性化剤やエボラウイルスワクチンとして使用する場合は、常套手段に従って製剤化することができる。本発明のペプチドやペプチド結合リポソームは低毒性であり、そのまま液剤として、又は適当な剤形の医薬組成物として、ヒト、非ヒト哺乳動物（例、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サル等）、鳥類（ニワトリ、ガチョウ、アヒル、ダチョウ、ウズラ等）等に対して経口的又は非経口的（例、血管内投与、皮下投与等）に投与することができる。本発明のペプチドやペプチド結合リポソームの投与対象は、通常、標的とするエボラウイルスが感染し得る哺乳動物（例、ヒト）であり、好ましくはＨＬＡ−Ａ＊０２０１を発現するヒト又はトランスジェニック哺乳動物（例：ＨＨＤマウス（Pascolo S, Bervas N, Ure JM, Smith AG, Lemonnier FA, Perarnau B. The Journal of Experimental Medicine 1997; 185(12):2043-2051）等のトランスジェニックマウス）であり、最も好ましくはＨＬＡ−Ａ＊０２０１を発現するヒトである。本発明のペプチドやペプチド結合リポソームは、通常、非経口的に投与される。
【００８５】
本発明の細胞傷害性Ｔリンパ球活性化剤及びエボラウイルスワクチンは、その有効成分であるペプチド又はペプチド結合リポソーム自体を投与しても良いし、又は適当な医薬組成物として投与しても良い。投与に用いられる医薬組成物としては、上記ペプチド又はペプチド結合リポソームと薬理学的に許容され得る担体、希釈剤又は賦形剤とを含むものであっても良い。このような医薬組成物は、経口又は非経口投与に適する剤形として提供される。
【００８６】
非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、坐剤等が用いられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤等の剤形を包含しても良い。このような注射剤は、公知の方法に従って調製できる。注射剤の調製方法としては、例えば、上記ペプチド又はペプチド結合リポソームを通常注射剤に用いられる無菌の水性溶媒に溶解又は懸濁することによって調製できる。注射用の水性溶媒としては、例えば、蒸留水；生理的食塩水；リン酸緩衝液、炭酸緩衝液、トリス緩衝液、酢酸緩衝液等の緩衝液等が使用できる。このような水系溶媒のｐＨは５〜１０が挙げられ、好ましくは６〜８である。調製された注射液は、適当なアンプルに充填されることが好ましい。
【００８７】
また、本発明のペプチドの溶解液又は本発明のペプチド結合リポソームの懸濁液を、真空乾燥、凍結乾燥等の処理に付すことにより、本発明のペプチド又は本発明のペプチド結合リポソームの粉末製剤を調製することもできる。本発明のペプチド又は本発明のペプチド結合リポソームを粉末状態で保存し、使用時に該粉末を注射用の水系溶媒で分散することにより、使用に供することができる。
【００８８】
本発明の細胞傷害性Ｔリンパ球活性化剤及びエボラウイルスワクチンは、その効果を増強するため、アジュバントをさらに含有してもよい。アジュバントとしては、水酸化アルミニウムゲル、完全フロイントアジュバント、不完全フロイントアジュバント、百日咳菌アジュバント、ポリ（Ｉ，Ｃ）、ＣｐＧ−ＤＮＡ等が挙げられるが、ＣｐＧ−ＤＮＡがとりわけ好ましい。ＣｐＧ−ＤＮＡは細菌の非メチル化ＣｐＧモチーフを含むＤＮＡであり、特定の受容体（Toll-like receptor 9）のリガンドとしてはたらくことが知られている（詳細はBiochim. Biophys. Acta 1489, 107-116 (1999)及びCurr. Opin. Microbiol. 6, 472-477 (2003)参照）。ＣｐＧ−ＤＮＡは樹状細胞（ＤＣ）を活性化することにより、本発明のペプチド又はペプチド結合リポソームによる細胞傷害性Ｔリンパ球の誘導を増強することができる。
【００８９】
医薬組成物中の有効成分（本発明のペプチド又はペプチド結合リポソーム）の含有量は、通常、医薬組成物全体の約０．１〜１００重量％、好ましくは約１〜９９重量％、さらに好ましくは約１０〜９０重量％程度である。
【００９０】
本発明の細胞傷害性Ｔリンパ球活性化剤又はエボラウイルスワクチンがアジュバントを含む場合、該アジュバント（例えばＣｐＧ−ＤＮＡ）の含有量は、細胞傷害性Ｔリンパ球の誘導を増強し得る範囲で適宜設定することができるが、通常、医薬組成物全体の約０．０１〜１０重量％、好ましくは約０．１〜５重量％程度である。
【００９１】
本発明のペプチド又は本発明のペプチド結合リポソームの投与量は、投与する対象、投与方法、投与形態等によって異なるが、例えば、皮下投与或いは経鼻投与により生体内の細胞傷害性Ｔリンパ球を活性化する場合には、通常成人１人（体重６０ｋｇ）あたり本発明のペプチドとして一回当たり１μｇ〜１０００μｇの範囲、好ましくは２０μｇ〜１００μｇの範囲で、通常４週間から１８ヶ月に亘って、２回から３回投与する。また、皮下投与によりエボラウイルス感染を予防する場合には、本発明のペプチドとして一回当たり１μｇ〜１０００μｇの範囲、好ましくは２０μｇ〜１００μｇの範囲で、通常４週間から１８ヶ月に亘って、２回から３回投与する。更に、皮下投与によりエボラウイルス感染に起因する疾患（例、エボラ出血熱）を治療する場合には、本発明のペプチドとして一回当たり１μｇ〜１０００μｇの範囲、好ましくは２０μｇ〜１００μｇの範囲で、通常４週間から１８ヶ月に亘って、２回から３回投与する。
【００９２】
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。
【実施例】
【００９３】
［参考例１］
リポソームの調製
１）脂質混合粉末の調製
末端変性ホスファチジルエタノールアミンからなる反応性リン脂質（サクシンイミジル基-ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン）の合成
ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン2g及びトリエチルアミン180μlをクロロホルム50mlに溶解及び添加し、300ml容の4つ口フラスコに入れた。このフラスコをマグネットスタラーで室温で攪拌しつつ、別に調製した2価反応性化合物であるジサクシンイミジルスベレート3gをクロロホルム80mlに溶解した溶液を、常法に従って4時間に亘って滴下し、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンのアミノ基にジサクシンイミジルスベレートの片末端を反応させた。この粗反応溶液をナス型フラスコに移し、エバポレータによって溶媒を留去した。次に、このフラスコに粗反応物を溶解できるだけのクロロホルムを少量加えて高濃度粗反応物溶液を得、クロロホルム/メタノール/水（65/25/1、体積比）で平衡化したシリカゲルを用いて常法に従ってカラムクロマトグラフィーを行い、目的のジオレオイルホスファチジルエタノールアミンのアミノ基にジサクシンイミジルスベレートの片末端が結合した画分のみを回収し、溶媒を留去して目的の反応性リン脂質であるサクシンイミド基−ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンを得た。
２）脂質混合粉末の調製
ジオレオイルホスファチジルコリン1.3354g（1.6987mmol）、前項で調製したサクシンイミド基-ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン0.2886g（0.2831mmol）、コレステロール0.7663g（1.9818mmol）及びジオレオイルホスファチジルグリセロールNa塩0.4513g（0.5662mmol）をナス型フラスコに取り、クロロホルム/メタノール/水（65/25/4、容量比）混合溶剤50mlを入れ、40℃にて溶解した。次にロータリーエバポレーターを使用して減圧下で溶剤を留去し、脂質の薄膜を作った。更に注射用蒸留水を30ml添加し、攪拌して均一のスラリーを得た。このスラリーを凍結させ、凍結乾燥機にて24時間乾燥させ脂質混合粉末を得た。
３）リポソームの調製
次に、別途作製した緩衝液（1.0mM Na2HPO4/KH2PO4、0.25Ｍサッカロース、pH7.4、以後緩衝液と略す）60mlを上記脂質混合粉末の入ったナス型フラスコ内に入れ、40℃にて攪拌しながら脂質を水和させ、リポソームを得た。次にエクストルーダーを用いてリポソームの粒径を調整した。まず8μmのポリカーボネートフィルターを通過させ、続いて5μm、3μm、1μm、0.65μm、0.4μm及び0.2μmの順にフィルターを通過させた。リポソーム粒子の平均粒径206nm（動的光散乱法による測定）が得られた。
【００９４】
［実施例１］
ＣＴＬエピトープの検索
エボラウイルス（ザイール株）polyproteinのアミノ酸配列から、モチーフ配列等に基づき、ＨＬＡ−Ａ*０２０１拘束性ＣＴＬのエピトープの候補を９４種類選択した。これらのエピトープからなるペプチド（９アミノ酸長）について、以下の方法によりＨＬＡ−Ａ*０２０１に対する結合性を評価した。
【００９５】
ＲＭＡ−Ｓ−ＨＨＤ細胞を２６℃にて終夜インキュベートした。その後、ＲＭＡ−Ｓ−ＨＨＤ細胞を、種々の濃度の評価対象のペプチドと供に、３７℃で３時間インキュベートした。細胞を回収し、コンフォメーション感受性の抗ＨＬＡ−Ａ*０２０１モノクローナル抗体（ＢＢ７．２）（１次抗体）にて処理し、引き続きＦＩＴＣ標識した２次抗体で染色した後、フローサイトメトリーによりＨＬＡ−Ａ*０２０１の発現を解析した。ＲＭＡ−Ｓ−ＨＨＤ細胞は、ＴＡＰを欠損しているため、２６℃において、自己ペプチドが結合していない空の（empty）ＨＬＡ−Ａ*０２０１を安定に発現する。一方、３７℃では、ペプチドが結合していない空の（empty）ＨＬＡ−Ａ*０２０１は不安定であり、ＢＢ７．２はこれを認識できないため、評価対象のペプチド存在下で３７℃にてインキュベートした後のＨＬＡ−Ａ*０２０１の発現をＢＢ７．２にて解析することにより、評価対象のペプチドのＨＬＡ−Ａ*０２０１への結合性を評価することができる。
【００９６】
各ペプチドについてＢＬ５０（μＭ）を算出した。ＢＬ５０は、２６℃にて１４〜１６時間インキュベートしたＲＭＡ−Ｓ−ＨＨＤ細胞の半最大ＭＦＩ（half-maximal MFI）を与える各ペプチドの濃度を意味する。結果を表１に示す。
【００９７】
【表１】
2014005205.tif 000002
【００９８】
［実施例２］
エボラウイルス特異的ＣＤ８＋／ＩＦＮ−γ＋Ｔ細胞誘導能の評価
実施例１に記載した９４種類のエピトープペプチドについて、エボラウイルス特異的ＣＤ８＋／ＩＦＮ−γ＋Ｔ細胞誘導能を評価した。
評価対象のペプチド（１０μＭ）でパルスした２×１０７個の同種同系脾臓細胞で、ＨＨＤマウスを免疫した。ＨＨＤマウスにおいては、マウス固有のMHCクラスI遺伝子であるH-2D、及びマウスβ2-microglobulin遺伝子がノックアウトされ、ヒトのHLA-A*0201及びヒトβ2-microglobulin遺伝子が導入され発現している（Pascolo S, Bervas N, Ure JM, Smith AG, Lemonnier FA, Perarnau B. The Journal of Experimental Medicine 1997; 185(12):2043-2051）。１週間後、免疫したマウスからの脾臓細胞を、１０μＭの対応する評価対象のペプチドと供に、ブレフェルディンＡの存在下、５時間、ＣＯ２インキュベーター中でインキュベートした。
細胞を回収し、細胞上のＦｃレセプターをブロックするために抗マウスＣＤ１６／ＣＤ３２モノクローナル抗体を加え、ＦＩＴＣ標識抗マウスＣＤ８αモノクローナル抗体で染色した。細胞を固定し、透過処理し、ＰＥ標識抗マウスＩＦＮ−γモノクローナル抗体でさらに染色した後、フローサイトメトリーにより解析した。ＣＤ８＋／ＩＦＮ−γ＋Ｔ細胞の割合の増加により、ＣＴＬ誘導能を評価した。
【００９９】
評価した９４種類のエピトープペプチドのうち、図１に示す２４種類のエピトープペプチドが各エピトープに特異的なＣＴＬを誘導した。
【０１００】
［実施例３］
ペプチド結合リポソームのエボラウイルス特異的ＣＤ８＋／ＩＦＮ−γ＋Ｔ細胞誘導能の評価
１）ペプチド結合リポソーム製剤の調製
実施例２においてＣＴＬ誘導活性を示した２４種類のエピトープペプチドを用いて、ペプチド結合リポソームを以下の方法により調製した。
参考例１（リポソームの調製）のリポソーム１．５ｍｌを試験管に採取し、別に調製した３ｍｌの各ペプチドプール溶液を加えた後、５℃で４８時間穏やかに攪拌し反応させた。この反応液を、緩衝液で平衡化したSepharoseCL-4Bを用いて常法に従ってゲル濾過した。尚、リポソーム画分は白濁しているので、目的画分は容易に確認できるが、ＵＶ検出器等で確認しても良い。
得られたリポソーム懸濁液中のリン濃度を測定し（リン脂質テストＷａｋｏ）、リン脂質由来のリン濃度を２ｍＭになるように濃度を緩衝液で希釈調整し、各ペプチド結合リポソームの懸濁液を得た。
【０１０１】
２）エボラウイルス特異的ＣＤ８＋／ＩＦＮ−γ＋Ｔ細胞誘導能の評価
ＣｐＧと供に、評価対象のペプチド結合リポソームでＨＨＤマウスを免疫した。１週間後、免疫したマウスからの脾臓細胞を、１０μＭの対応する評価対象のペプチドと供に、ブレフェルディンＡの存在下、５時間、ＣＯ２インキュベーター中でインキュベートした。
細胞を回収し、細胞上のＦｃレセプターをブロックするために抗マウスＣＤ１６／ＣＤ３２モノクローナル抗体を加え、ＦＩＴＣ標識抗マウスＣＤ８αモノクローナル抗体で染色した。細胞を固定し、透過処理し、ＰＥ標識抗マウスＩＦＮ−γモノクローナル抗体でさらに染色した後、フローサイトメトリーにより解析した。ＣＤ８＋／ＩＦＮ−γ＋Ｔ細胞の割合の増加により、ＣＴＬ誘導能を評価した。
【０１０２】
評価した２４種類のエピトープペプチドのうち、以下の１４種類のエピトープペプチドを用いて調製したペプチド結合リポソームが、有意にＣＴＬを誘導した。
ＮＰ−５６：配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド。
ＮＰ−４０１：配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるペプチド。
ＶＰ４０−７３：配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるペプチド。
ＧＰ−２５：配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるペプチド。
ＧＰ−１６０：配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるペプチド。
ＧＰ−２５２：配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるペプチド。
ＧＰ−５４６：配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるペプチド。
ＶＰ３０−９４：配列番号８で表されるアミノ酸配列からなるペプチド。
Ｌ−２０９：配列番号９で表されるアミノ酸配列からなるペプチド。
Ｌ−２９３：配列番号１０で表されるアミノ酸配列からなるペプチド。
Ｌ−７７１：配列番号１１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド。
Ｌ−９３２：配列番号１２で表されるアミノ酸配列からなるペプチド。
Ｌ−１０９９：配列番号１３で表されるアミノ酸配列からなるペプチド。
Ｌ−１９５５：配列番号１４で表されるアミノ酸配列からなるペプチド。
【０１０３】
これら１４種類のエピトープペプチドに関する結果を図２に示す。特に、ＮＰ５６、Ｌ２９３及びＬ２０９のＣＴＬ誘導能が強力であった。ＶＰ４０−７３、ＧＰ１６０及びＧＰ２５２は、２回免疫した場合に、強力にＣＴＬを誘導した。
【０１０４】
［実施例４］
インビボにおけるＣＴＬ活性誘導能の評価
HHDマウスを、リポソームに結合したそれぞれの評価対象のペプチド（0.5μg/μlを100μl/匹）及びCpG5002（Vaccine 25, 4914-4921 (2007)参照）（5μｇ/匹）で1回免疫した。免疫7日後に、別のナイーブなHHDマウスから脾細胞を調製した。２×１０８個の脾細胞を２ｍｌのＲＰＭＩ１６４０にサスペンドし、そのサスペンジョンを１ｍｌずつ２本のチューブに分けた。片方のチューブに免疫に使用したペプチド（10μM）を加え、３７℃で１時間インキュベートすることにより、脾細胞を該ペプチドでパルスした。脾細胞を遠心分離し、上清を除いた。脾細胞を１０ｍｌのＴ１０により１回洗浄し、遠心分離し、上清を除いた。脾細胞のペレットに２０ｍｌのＰＢＳ／０．１％ＢＳＡを加え、素早くボルテックスすることにより脾細胞を再分散した。脾細胞の分散液に５ｍＭのＣＦＳＥを１０μｌ加え（最終濃度：２．５μＭ）、素早くボルテックスし、３７℃で１０分間インキュベートすることにより、ペプチドでパルスした脾細胞を濃い蛍光色素（ＣＦＳＥ）で標識した。もう片方のチューブにはペプチドを加えないで、薄い蛍光色素（ＣＦＳＥ）（最終濃度：０．２５μＭ）で標識した。双方の脾細胞を遠心分離し、上清を除いた。洗浄した脾細胞に１０ｍｌのＲ１０を加え、遠心分離し、上清を除いた。双方の脾細胞をそれぞれＨＢＳＳ（又は血清不含ＲＰＭＩ）に再懸濁し、５×１０７個／ｍｌの濃度に調整した。この２グループの細胞懸濁液を同体積混ぜて、免疫したマウスの静脈内に注射することにより、脾細胞を移入（１×１０７個／匹）した。翌日（移入から４〜１２時間後）、マウスを安楽殺した後に脾臓を回収して、その中の濃い蛍光色素（ＣＦＳＥ）2.5μM）で標識した標的細胞の減少率をフローサイトメーターにより解析した。
【０１０５】
図３に示されるように、いずれのペプチド結合リポソームも、インビボにおいて各エピトープに特異的なＣＴＬ活性を誘導した。特に、ＮＰ５６、ＮＰ４０１、ＶＰ４０−７３、ＧＰ１６０、ＧＰ２５２、Ｌ１９５５、Ｌ２９３、Ｌ２０９、Ｌ１０９９、Ｌ７７１及びＶＰ３０−９４の誘導能が強力であった。
【産業上の利用可能性】
【０１０６】
本発明のペプチド又はペプチド結合リポソームを用いれば、エボラウイルスに対する細胞傷害性Ｔリンパ球を効率よく誘導することができ、エボラウイルス感染に対する優れた治療又は予防効果が期待できる。
【図３】
2014005205.tif 000003
【図１】
2014005205.tif 000004
【図２】
2014005205.tif 000005
【配列表】
2014005205000001.app