(57)【要約】      （修正有）【課題】高病原性鳥インフルエンザウイルスの検出、サーベイランスを提供する。【解決手段】高病原性鳥インフルエンザウイルスに特徴的なヘマグルチニンの開裂部位中の連続性塩基性アミノ酸配列を含むヘマグルチニンに結合するアプタマーであって、特定の配列番号に示される塩基配列もしくはその部分配列又はその改変配列からなるRNA、又は化学修飾RNAを含むアプタマーを使用して、高病原性鳥インフルエンザウイルスの検出、サーベイランスを提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
高病原性鳥インフルエンザウイルスに特徴的なヘマグルチニンの開裂部位中の連続性塩基性アミノ酸配列を含むヘマグルチニンに結合するアプタマーであって、下記(１)または(２)に記載の塩基配列からなるRNA、又は化学修飾RNAを含むアプタマーを用いて、鳥インフルエンザウイルス含有被検試料に対する結合反応を観察することを特徴とする、鳥インフルエンザウイルスが高病原性であるか否かを判定する方法；
（１）配列番号１に示される塩基配列、又はそのうちの少なくとも配列番号２に示される塩基配列を含む部分配列、
（２）上記(１)に示される塩基配列中の１もしくは数個の塩基が欠失、置換、あるいは付加された塩基配列。
【請求項２】
高病原性鳥インフルエンザウイルスに特徴的なヘマグルチニンの開裂部位中の連続性塩基性アミノ酸配列を含むヘマグルチニンに結合するアプタマーであって、下記(１)または(２)に記載の塩基配列からなるRNA、又は化学修飾RNAを含むアプタマーを有効成分として用いることを特徴とする、高病原性鳥インフルエンザウイルス判定用試薬；
（１）配列番号１に示される塩基配列、又はそのうちの少なくとも配列番号２に示される塩基配列を含む部分配列、
（２）上記(１)に示される塩基配列中の１もしくは数個の塩基が欠失、置換、あるいは付加された塩基配列。
【請求項３】
高病原性鳥インフルエンザウイルスに特徴的なヘマグルチニンの開裂部位中の連続性塩基性アミノ酸配列を含むヘマグルチニンに結合するアプタマーであって、下記(１)または(２)に記載の塩基配列からなるRNA、又は化学修飾RNAを含むアプタマーを有効成分として用いることを特徴とする、高病原性鳥インフルエンザウイルスのサーベイランス用の検出試薬；
（１）配列番号１に示される塩基配列、又はそのうちの少なくとも配列番号２に示される塩基配列を含む部分配列、
（２）上記(１)に示される塩基配列中の１もしくは数個の塩基が欠失、置換、あるいは付加された塩基配列。
【請求項４】
高病原性鳥インフルエンザウイルスに特徴的なヘマグルチニンの開裂部位中の連続性塩基性アミノ酸配列を含むヘマグルチニンに結合するアプタマーであって、下記(１)または(２)に記載の塩基配列からなるRNA、又は化学修飾RNAを含むアプタマーを有効成分として用いることを特徴とする、高病原性鳥インフルエンザウイルスの予防又は治療用医薬組成物；
（１）配列番号１に示される塩基配列、又はそのうちの少なくとも配列番号２に示される塩基配列を含む部分配列、
（２）上記(１)に示される塩基配列中の１もしくは数個の塩基が欠失、置換、あるいは付加された塩基配列。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高病原性鳥インフルエンザウイルスのヘマグルチニンに結合能を有するアプタマーによる高病原性鳥インフルエンザウイルスの検出、サーベイランスに関する。
【背景技術】
【０００２】
高病原性鳥インフルエンザウイルスのヒトへの感染は、1997年に香港で発生して以来、世界各地で今なお増え続けている。WHOの発表によれば、H5N1亜型高病原性鳥インフルエンザは、2003年から2013年3月までの間に15か国で発生し、60％近くの高い致死率を示している(非特許文献１)。
【０００３】
幸い、鳥インフルエンザウイルス感染者の多くは家禽との直接的な接触が原因とされており、ヒトからヒトへの持続的な感染は確認されていないと言われている。しかしながら、患者と密接な接触をしていた場合に限り、ヒトからヒトへの感染が疑われる事例も数例報告されており、今後ヒトからヒトへの感染が可能となる変異が起こることも否定できない。
【０００４】
60％もの高い致死率を保ったまま効率的に伝播し、パンデミックを引き起こすことは考えにくいが、ある程度病原性が弱まった上でパンデミックが起こる可能性は十分に考えられる。これまでも新型インフルエンザは数十年に一度誕生し、大きな被害をひきおこしてきた。ある程度毒性が弱まっていたとしても、高病原性鳥インフルエンザがひとたび流行すれば、深刻な被害をもたらすことが予想される。
【０００５】
よって、インフルエンザの発生源となる家禽の調査・分析を行う体制を整えることは急務である。しかし、2010年の統計によると世界で飼育されている家禽の推定総数210億羽に対し、わずかに400個の鳥インフルエンザウイルスが単離され、1000個の遺伝子配列が決定されたにすぎず、インフルエンザのサーベイランスの不足と遅れが懸念されている(非特許文献２)。
【０００６】
本発明者らは、これまで、季節性のインフルエンザA(H3N2)およびB型のヘマグルチニンに結合するアプタマーを取得した他(非特許文献３，４、特許文献１)、鳥からヒトへの感染が確認されているH5N1及びH9N2亜型、さらに2009年にパンデミックを引き起こした豚インフルエンザのH1N1亜型のヘマグルチニンに結合するアプタマーを提供してきた(特許文献２)。また、最近、H5N1型などと同様にパンデミックの発生が強く懸念されている鳥インフルエンザのH7N7亜型に結合するアプタマーを提供することができ、特許出願している(特願２０１２−１４６６４９号)。これらのアプタマーはインフルエンザのウイルスの有無と共に特定の型、亜型の迅速な判定を可能とするものである。
【０００７】
しかしながら、インフルエンザウイルスは絶えず小規模な変異を繰り返しており、それまでのワクチンが効かないという事態が度々起こりうる。上述したアプタマーの幾つかも、亜型を識別できるほどの高い識別能を持つが、その特異性ゆえに、新たな変異が起きた場合に適用できなくなる恐れがある。
現在、特に恐れられているのは、高病原性鳥インフルエンザのヒトでの流行であることからも、H5及びH7亜型など高病原性鳥インフルエンザウイルスに幅広く用いることができるアプタマーであって、高病原性を保持したままでの新たな変異にも対応できるアプタマーが望まれる。
【０００８】
ところで、H5及びH7亜型の鳥インフルエンザウイルスは高病原性株が多数同定されているが、H5やH7亜型のすべてが高病原性というわけではなく、低病原性のものも存在する。鳥インフルエンザウイルスにおける高病原性と低病原性との最も大きな違いは、ヘマグルチニンの開裂部位における特異的なアミノ酸配列である。ヘマグルチニンは感染の始まる初期の段階において重要な役割を果たす。すなわち、ヘマグルチニンが宿主の細胞膜表面にある受容体に結合することで、ウイルスがエンドサイトーシスによって細胞内に取り込まれ、細胞内への侵入を果たす。次いで、細胞内へ侵入したウイルスの外皮膜が宿主細胞のエンドソームと膜融合することによって、ウイルスのRNAやタンパク質を宿主の細胞質へ送り込むことが可能となる。この膜融合を起こすには、ヘマグルチニンがタンパク質分解酵素により２つに開裂することが必須である(非特許文献５)。低病原性の鳥インフルエンザウイルスの場合、ヘマグルチニンは呼吸器と消化管に局在するタンパク質分解酵素によってのみ開裂され、局所的な症状にとどまる(非特許文献６)。一方、高病原性の鳥インフルエンザウイルスの場合は、ヘマグルチニンの開裂部位に複数のアルギニンやリシンのような塩基性アミノ酸残基が連続する特徴的なアミノ酸配列の領域が存在しており(非特許文献７)、これによって細胞内に普遍的に存在するフリンなどのタンパク質分解酵素での開裂が可能になり全身感染が起こる(非特許文献８)。このようなヘマグルチニン開裂部位にみられる特徴的なアミノ酸配列領域は、現在確認されているH5、H7亜型の高病原性鳥インフルエンザウイルス特異的に保存された領域であることから、他の亜型であってもこの配列を獲得することで高病原性になる可能性が高い。
したがって、当該高病原性の鳥インフルエンザウイルスで保存されたヘマグルチニン開裂部位の特徴的な領域に対して結合するアプタマーであれば、高病原性の鳥インフルエンザウイルスを特異的に認識できる可能性が高く、同時に、標的の高病原性ウイルスに変異が起こっても高病原性である限り認識可能なアプタマーとなると期待できる。
以上のように、H5及びH7亜型のいずれをも含む高病原性の鳥インフルエンザウイルスを認識できるアプタマーが望まれており、特に高病原性鳥インフルエンザウイルスのヘマグルチニン開裂部位領域に対して特異的に結合するアプタマーの開発が強く望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特許第４４４１６１８号公報
【特許文献２】特開２０１２−１００６３６号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】World Health Organization. 12 March(2013) World Health Organization，Geneva，Swizerland. http://www.who.int/influenza/human_animal_interface/H5N1_cumulative_table_archives/en/
【非特許文献２】Buller，D.(2012) Nature 483，520-522.
【非特許文献３】Gopinath，S.C.B. et al.,(2006) J. Gen. Virol.87，479-487.
【非特許文献４】Gopinath，S.C.B. et al.,(2006) J. Biochem. 139，837-846.
【非特許文献５】White，J. et al.,(1982) EMBO J. 1，217-222.
【非特許文献６】Rott,R. et al.,(1995) Am.J.Respir.Crit.Care Med.152,S16-S19.
【非特許文献７】Kaiyawet，N. et al.,(2013) International journal of quantum chemistry 113(4),569.
【非特許文献８】Kawaoka.Y. et al.,(1988) Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A. 85，324-328.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、パンデミックを起こす可能性のある高病原性鳥インフルエンザウイルスのヘマグルチニンに結合できるアプタマーを用いて、高病原性鳥インフルエンザウイルスの検出、サーベイランスを提供しようとするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上記課題を解決するために、まず本発明者らがこれまでインフルエンザウイルスの亜型の識別のために開発してきたアプタマーのうちでも特に高病原性である鳥インフルエンザウイルスH5及びH7亜型のヘマグルチニンに結合するアプタマーについて検証を行った。その結果、特許文献２に記載されたH5亜型に結合する「アプタマー8-3」が、高病原性鳥インフルエンザウイルスであるH5N1亜型のA/Vietnam/1194/2004((Accession no. AAT73273.1)なお、A/Vietnam/1203/2004(Accession no. AAW80717.1)に結合することは特許文献２で確認済)及びA/Indonesia/05/2005(Accession no. ABW06108.1)のヘマグルチニンのみならず、同様に高病原性のH7N7亜型のA/Netherlands/219/2003(Accession no. AAR02640.1)のヘマグルチニン(Sino Biological Inc.社製)に対しても高い結合能を示すことを見出した。その一方で、本発明者らが以前アプタマーの結合実験に用いたH7N7亜型ヘマグルチニン(Prospec社製)に対しては全く結合能を示さなかった。両者の配列上の差は、後者ではヘマグルチニンの開裂部位中の連続した塩基性アミノ酸配列領域の１部(例えば、「BBBBR/G(ただしBはR(アルギニン)又はK(リシン)である。/は切断位置を示す)」配列などと表現できる。)が人工的に変異及び除去されている点のみであり、当該「KRRRRG」配列は、鳥インフルエンザウイルスの「高病原性」の主たる原因となる連続的塩基性アミノ酸配列領域(非特許文献７、８)の１部であることからみて、「アプタマー8-3」及びその短鎖型アプタマーは、開裂部位中の当該「KRRRRG」配列を含む領域を特異的に認識することのできるアプタマーである可能性が高いと考えられた。
【００１３】
そこで、ヘマグルチニンの開裂部位に存在する連続性塩基性アミノ酸残基がアプタマーの結合に関わるかどうかを調べるため、以下の実験を行った。
始めに、アプタマー8-3とH5N1亜型(A/Vietnam/1194/2004、A/Indonesia/05/2005)のヘマグルチニン(アミノ酸配列を図１及び配列番号３、７に示す)との相互作用解析を、表面プラズモン共鳴装置(BiacoreT100、GEヘルスケア)を用いて行ったところ、いずれも高い親和性を示し、A/Vietnam/1194/2004の解離定数(KD)は750pM、A/Indonesia/05/2005の解離定数(KD)は170pMであった(図２)。
【００１４】
また、アプタマー8-3とH7N7亜型であるA/Netherlands/219/2003のヘマグルチニン(アミノ酸配列を図１及び配列番号５に示す)との相互作用解析を行ったところ、H5亜型の場合と同等の高い親和性を示し(解離定数KD:420pM)、アプタマー8-3がH7亜型であっても高い結合能を持つことが示された(図３)。
【００１５】
なお、上述のように、先に発表した特許文献２においてもアプタマー8-3とH7N7亜型のヘマグルチニンとの相互作用解析を行っているが、特許文献２で用いたH7N7亜型のヘマグルチニン(PROSPEC社製のA/Netherlands/219/2003)は、高病原性鳥インフルエンザウイルスのヘマグルチニンの開裂部位に見られる、連続した塩基性アミノ酸配列「PKRRRR/G」を「PKGR/G」に変異及び除去した変異ヘマグルチニンであり(配列番号６)、アプタマー8-3との結合は確認できなかった。これに対し、図３で用いたヘマグルチニンは、開裂部位のアミノ酸配列を変異させていないヘマグルチニン、つまり連続性塩基性アミノ酸配列を含むヘマグルチニンを用いており(配列番号５)、こちらはアプタマー8-3と高い親和性を示した。
【００１６】
さらに、高病原性鳥インフルエンザウイルスのヘマグルチニンの開裂部位に存在する連続性塩基性アミノ酸残基がアプタマーの結合に関わるかどうかを調べるため、塩基性アミノ酸残基を変異及び除去したヘマグルチニンとの相互作用解析を行った。実験に用いたヘマグルチニンのアミノ酸残基配列を図４及び配列番号３、４(H5亜型)と図６及び配列番号５，６(H7亜型)に示す。
【００１７】
アプタマー8-3と開裂部位中の連続性の塩基性アミノ酸配列「RERRRKKR/G」を「TETR/G」に変異させたA/Vietnam/1194/2004(H5N1)のヘマグルチニン、すなわちcleaved site mutated HA(図４、配列番号４)との相互作用解析を行ったところ、アプタマー8-3はこのヘマグルチニンに対しては結合しなかった(図５)。
同様に、アプタマー8-3と開裂部位中の連続性の塩基性アミノ酸配列「PKRRRR/G」を「PKGR/G」に変異させたA/Netherlands/219/2003(H7N7)のヘマグルチニン、すなわちcleaved site mutated HA(図６)との相互作用解析を行ったところ、アプタマー8-3はこのヘマグルチニンに対しては結合しなかった(図７)。
【００１８】
以上のことからみて、「アプタマー8-3」及びその短鎖化アプタマーは、高病原性鳥インフルエンザウイルスに特徴的な開裂部位中の連続性の塩基性アミノ酸配列を含む領域を特異的に認識することのできるアプタマーである可能性が考えられる。
そして、このことは、H5及びH7亜型鳥インフルエンザウイルスが当該連続性の塩基性アミノ酸配列を保持している限り、他の配列が変異しても認識できる可能性があることを示すものであり、それと同時に、H5及びH7亜型のみならず、他の亜型が当該連続性の塩基性アミノ酸配列をアミノ酸配列中に有するように変異した場合においてもヘマグルチニン開裂部位に結合できる可能性があることを示している。当該アプタマーは、H5及びH7亜型などの高病原性鳥インフルエンザウイルスの検出、サーベイランスに有効であり、これら高病原性鳥インフルエンザウイルスに特異的な治療薬の有効成分として期待される。
以上の知見を得て本発明を完成した。
【００１９】
すなわち、本発明は以下の発明を含むものである。
〔１〕  高病原性鳥インフルエンザウイルスに特徴的なヘマグルチニンの開裂部位中の連続性塩基性アミノ酸配列を含むヘマグルチニンに結合するアプタマーであって、下記(１)または(２)に記載の塩基配列からなるRNA、又は化学修飾RNAを含むアプタマーを用いて、鳥インフルエンザウイルス含有被検試料に対する結合反応を観察することを特徴とする、鳥インフルエンザウイルスが高病原性であるか否かを判定する方法；
（１）配列番号１に示される塩基配列、又はそのうちの少なくとも配列番号２に示される塩基配列を含む部分配列、
（２）上記(１)に示される塩基配列中の１もしくは数個の塩基が欠失、置換、あるいは付加された塩基配列。
〔２〕  高病原性鳥インフルエンザウイルスに特徴的なヘマグルチニンの開裂部位中の連続性塩基性アミノ酸配列を含むヘマグルチニンに結合するアプタマーであって、下記(１)または(２)に記載の塩基配列からなるRNA、又は化学修飾RNAを含むアプタマーを有効成分として用いることを特徴とする、高病原性鳥インフルエンザウイルス判定用試薬；
（１）配列番号１に示される塩基配列、又はそのうちの少なくとも配列番号２に示される塩基配列を含む部分配列、
（２）上記(１)に示される塩基配列中の１もしくは数個の塩基が欠失、置換、あるいは付加された塩基配列。
〔３〕  高病原性鳥インフルエンザウイルスに特徴的なヘマグルチニンの開裂部位中の連続性塩基性アミノ酸配列を含むヘマグルチニンに結合するアプタマーであって、下記(１)または(２)に記載の塩基配列からなるRNA、又は化学修飾RNAを含むアプタマーを有効成分として用いることを特徴とする、高病原性鳥インフルエンザウイルスのサーベイランス用の検出試薬；
（１）配列番号１に示される塩基配列、又はそのうちの少なくとも配列番号２に示される塩基配列を含む部分配列、
（２）上記(１)に示される塩基配列中の１もしくは数個の塩基が欠失、置換、あるいは付加された塩基配列。
〔４〕  高病原性鳥インフルエンザウイルスに特徴的なヘマグルチニンの開裂部位中の連続性塩基性アミノ酸配列を含むヘマグルチニンに結合するアプタマーであって、下記(１)または(２)に記載の塩基配列からなるRNA、又は化学修飾RNAを含むアプタマーを有効成分として用いることを特徴とする、高病原性鳥インフルエンザウイルスの予防又は治療用医薬組成物；
（１）配列番号１に示される塩基配列、又はそのうちの少なくとも配列番号２に示される塩基配列を含む部分配列、
（２）上記(１)に示される塩基配列中の１もしくは数個の塩基が欠失、置換、あるいは付加された塩基配列。
【発明の効果】
【００２０】
本発明により、ヘマグルチニン開裂部位中に連続性塩基性アミノ酸配列を特徴的に有する高病原性鳥インフルエンザウイルスのヘマグルチニンに結合するアプタマーを検出用に用いることで高病原性鳥インフルエンザウイルスの検出、サーベイランスが可能になった。また、本発明に用いるアプタマーは、高病原性鳥インフルエンザウイルスのヘマグルチニンの開裂を妨げる作用をもつ可能性が考えられ、宿主細胞内へ侵入したウイルスの外皮膜が宿主細胞のエンドソームと膜融合することを阻害し、ウイルスが遺伝子を宿主の細胞質に放出することを防ぐことが期待できる。つまり、ウイルスの全身の臓器への拡散、宿主外への感染防止が期待できる。すなわち、本発明のアプタマーは、高病原性鳥インフルエンザウイルスの伝播を阻害する可能性があり、高病原性鳥インフルエンザウイルスの治療薬、抗ウイルス薬剤としての応用も期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】高病原性鳥インフルエンザウイルス、A/Vietnam/1194/2004(H5N1)、A/Indonesia/05/2005(H5N1)、A/Netherlands/219/2003(H7N7)のヘマグルチニンのアミノ酸配列である。
【図２】表面プラズモン共鳴法(シングルサイクルカイネティクス法)によって測定したアプタマー8-3とH5N1亜型(A/Vietnam/1194/2004、及びA/Indonesia/05/2005)のヘマグルチニンとの相互作用の解析図である。
【図３】表面プラズモン共鳴法(シングルサイクルカイネティクス法)によって測定したアプタマー8-3とH7N7亜型(A/Netherlands/219/2003)のヘマグルチニンとの相互作用の解析図である。
【図４】A/Vietnam/1194/2004(H5N1)のヘマグルチニンと、このヘマグルチニンから開裂部位の塩基性アミノ酸残基を変異及び除去したもの(cleaved site mutated HA)のアミノ酸配列である。
【図５】表面プラズモン共鳴法(シングルサイクルカイネティクス法)によって測定したアプタマー8-3とA/Vietnam/1194/2004(H5N1)のヘマグルチニンおよびアプタマー8-3とcleaved site mutated HAとの相互作用の解析図である。
【図６】A/Netherlands/219/2003(H7N7)のヘマグルチニンと、このヘマグルチニンから開裂部位の塩基性アミノ酸残基を変異および除去したもの(cleaved site mutated HA)のアミノ酸配列である。
【図７】表面プラズモン共鳴法(シングルサイクルカイネティクス法)によって測定したアプタマー8-3とA/Netherlands/219/2003(H7N7)のヘマグルチニンおよびアプタマー8-3とcleaved site mutated HAとの相互作用の解析図である。
【図８】本発明で用いられるアプタマーの二次構造モデル(アプタマー8-3及びその短鎖型アプタマー)である。
【図９】タンパク質分解酵素(フリン)で開裂後のA/Vietnam/1194/2004(H5N1)のヘマグルチニンの電気泳動図である。番号１がタンパク質分解酵素処理後、番号２がタンパク質分解酵素処理前のヘマグルチニンである。
【図１０】表面プラズモン共鳴法(シングルサイクルカイネティクス法)によって測定したアプタマー8-3とA/Vietnam/1194/2004(H5N1)のヘマグルチニン(タンパク質分解酵素処理後及び処理前)との相互作用の解析図である。番号１がタンパク質分解酵素処理後、番号２がタンパク質分解酵素処理前のヘマグルチニンである。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
１．高病原性鳥インフルエンザについて
（１）インフルエンザの亜型
インフルエンザウイルスのうち、パンデミックを起こす可能性があるのはA型であるが、A型インフルエンザウイルスは様々な動物に感染し、多くの亜型を持つ。亜型は、ウイルス表面に突出した２つのタンパク質、ノイラミニダーゼとヘマグルチニンの組み合わせによって決まり、これまでに分離された高病原性鳥インフルエンザウイルスはH5N1やH7N7など、H5及び、H7亜型に限られている。
【００２３】
（２）低病原性と高病原性鳥インフルエンザについて
H5やH7亜型であっても低病原性のものは存在するが、鳥インフルエンザウイルスにおける高病原性と低病原性との最も大きな違いは、ヘマグルチニンの開裂部位における特異的なアミノ酸配列である。ヘマグルチニンは感染の始まる初期の段階において重要な役割を果たす。すなわち、ヘマグルチニンが宿主の細胞膜表面にある受容体に結合することで、ウイルスがエンドサイトーシスによって細胞内に取り込まれ、細胞内への侵入を果たす。次いで、細胞内に侵入したウイルスの外皮膜が宿主細胞のエンドソームと膜融合することによって、宿主の細胞質へウイルスのRNAやタンパク質を送り込むことが可能となる。この膜融合を起こすには、ヘマグルチニンがタンパク質分解酵素により２つに開裂することが必須である(非特許文献５)。低病原性の鳥インフルエンザウイルスの場合、ヘマグルチニンは呼吸器と消化管に局在するタンパク質分解酵素によってのみ開裂され、局所的な症状にとどまる(非特許文献６)。一方、高病原性の鳥インフルエンザウイルスの場合は、ヘマグルチニンの開裂部位に複数のアルギニンやリシンのような塩基性アミノ酸残基が連続する特徴的なアミノ酸配列の領域が存在しており(非特許文献７)、これによって細胞内に普遍的に存在するフリンなどのタンパク質分解酵素での開裂が可能になり全身感染が起こる(非特許文献８)。
【００２４】
２．本発明で用いるアプタマーについて
（１）本発明のアプタマー
本発明の検出に使用するアプタマーは、高病原性の鳥インフルエンザウイルスに特徴的なヘマグルチニン開裂部位中の連続性塩基性アミノ酸配列を含むヘマグルチニンを特異的に認識する一本鎖RNAであり、RNAを構成するリボース基が化学的に修飾されている場合も含む。
具体的には、本発明者らの発明に係る特許文献２に記載された、配列番号１に示される「アプタマー8-3」もしくはその部分配列又はその修飾体からなるアプタマーである。
【００２５】
本発明のアプタマーの２次構造モデルは、図８に示されるように、先端のループ構造とステム構造とループ構造の繰り返しが続いたステム・ループ構造となっている。実際に高病原性インフルエンザウイルスのHAタンパク質の開裂部位と結合する部位は、このうちの先端ループを含むステム領域であると考えられるため、当該先端部領域の構造を壊さない範囲でRNA鎖を短鎖化することもでき、安定化のための化学修飾を行うこともできる。
【００２６】
本発明において用いるアプタマーは、典型的には配列番号１に示される塩基配列もしくはその部分配列からなる一本鎖RNAであるが、当該RNAと相補の塩基配列を有するRNA、これらRNAと対応する配列を有するDNA及び相補のDNA、あるいはこれら相補のDNA鎖同士が２本鎖を構成したdsDNAの場合を包含する。これらはそれ自体慣用の遺伝子操作手段により、たやすく本発明のアプタマーRNAに変換可能であり、本発明のアプタマー製造用中間体である。また、本発明において用いるアプタマーは、上記配列番号１に示される塩基配列中のヌクレオチド残基を１若しくは数個欠失、置換、あるいは付加させた改変アプタマーであっても、高病原性鳥インフルエンザウイルスのHAタンパク質の開裂部位と結合するものであればこれを包含する。また、後述のように、RNAを構成するリボース基を化学修飾させた修飾アプタマーも包含される。
【００２７】
すなわち、本発明において用いることのできるアプタマーは、
高病原性の鳥インフルエンザウイルスに特徴的なヘマグルチニン開裂部位中の連続性塩基性アミノ酸配列を含むヘマグルチニンに結合するアプタマーであって、
下記(１)または(２)に記載の塩基配列からなるRNA、又は化学修飾RNAを含むアプタマー；
（１）配列番号１に示される塩基配列、又はそのうちの少なくとも配列番号２に示される塩基配列を含む部分配列、
（２）上記(１)に示される塩基配列中の１もしくは数個の塩基が欠失、置換、あるいは付加された塩基配列、
と表現することができる。
ここで、数個とは、1〜5個、好ましくは1〜3個、さらに好ましくは1〜2個をいう。
【００２８】
（２）本発明に用いるアプタマーのヘマグルチニン認識部位
本発明に使用するアプタマーには高病原性鳥インフルエンザウイルスのヘマグルチニンに結合する能力がある。アプタマーが認識する部位は、高病原性鳥インフルエンザウイルスのヘマグルチニン開裂部位中の連続性塩基性アミノ酸配列である可能性が考えられ、例えば、「BBBBR/G(ただしBはR又はKである。/は切断位置を示す)」配列などと表現できる。具体的な配列としてはH5N1亜型のA/Vietnam/1194/2004株由来の「RERRRKKR/G」(配列番号３の339-347番目)、H5N1亜型のIndonesia/05/2005株由来の「RESRRKKR/G」(配列番号７の339-347番目)、H7N7亜型のA/Netherlands/219/2003株由来の「PKRRRR/G」(配列番号５の343-349番目)などが例示できる。
【００２９】
（３）本発明のアプタマーのヘマグルチニン認識部位への親和性
また、本発明のアプタマーの親和性を、表面プラズモン共鳴装置(GEヘルスケア社製BiacoreT100)を用いて測定したところ、高病原性インフルエンザヘマグルチニン開裂部位に対する親和性は高く、且つ特異的であることが確認できた。(図５、７)。
すなわち、鳥インフルエンザウイルスを含有する被検試料もしくは含有する可能性が疑われる被検試料に対して、本発明のアプタマーを反応させて、その親和性を観察することで、被検試料中の鳥インフルエンザウイルスが高病原性か否かを判定することができ、また被検試料中に高病原性トリインフルエンザウイルスが含まれていることを検出することができるため、高病原性サーベイランス用の検出試薬の有効成分としての有用性がある。
【００３０】
３．本発明のアプタマーRNAの製造方法
（１）アプタマーRNAの製造方法
本発明のアプタマーは、特許文献２に記載されたとおり、中央の塩基部分をランダム化したRNAライブラリーに周知のSELEX法を適用して、H5亜型ヘマグルチニンに対して特異性及び結合性の高いRNAを選択し、配列番号１に示されるアプタマー(アプタマー8-3)を得たものである。さらに当該RNAを短鎖化した配列番号２に示される短鎖化アプタマー(アプタマー8-3S)についても同等の結合能を保持していることを確認している。
したがって、少なくとも配列番号１中の配列番号２に示される塩基配列を含む部分配列からなるRNAであれば、アプタマー8-3と同等の結合活性が期待できる。
【００３１】
本発明のアプタマーは、その他に、アプタマー8-3の塩基配列から、それ自体周知の各種方法を用いて本発明のアプタマーを合成することができる。
例えば、合成目的のアプタマーRNAに対応する上記DNAを化学合成し、これをPCR増幅し、増幅されたDNAからRNAポリメラーゼによる転写反応によりアプタマーRNAを合成する「インビトロ転写法」を用いることができる。具体的には、T7プロモーターの下流側に上記DNAを連結してPCR増幅し２本鎖DNAを得て、該２本鎖DNAを鋳型として、T7RNAポリメラーゼ、およびATP、GTP、CTP及びUTPからなる該RNAポリメラーゼ基質を含む反応溶液中で、RNA伸長反応を行うことにより、アプタマーRNAを得ることができる。
この方法においては、T7プロモーター配列を含むプラスミドに上記dsDNAを連結したもの、あるいは化学合成したDNAも鋳型として用いることができる。また、上記DNAの合成においては従来公知の種々の方法で合成することが可能である。例えば、DNA合成機を用いて、dNTPを材料として、末端塩基から化学合成することができる。
【００３２】
また、「化学合成法」により、アプタマーRNAを直接合成することができる。RNAの合成の際には、リボース部位の2’水酸基の保護が必要であり、保護基として例えば2-cyanoethoxymethyl (CEM)基を用いるとRNA合成時の鎖長伸長反応の効率が高くなる。
このほか、上記アプタマーRNAと相補のRNAからは、RNA依存RNAポリメラーゼを使用することにより本発明のアプタマーRNAを得ることも可能である。
【００３３】
（２）アプタマーRNAの短鎖化
アプタマーの短鎖化の主な目的は、アプタマーRNAの製造コストを削減することである。本発明のアプタマーは、HAタンパク質との結合に関与するコア領域となるステム・ループ構造を残して、HAタンパク質との結合活性を保持したまま短鎖化することができる。その際には、一般的なアプタマーの短鎖化方法であるマッピング法(非特許文献２、特許文献１)に従って行うことができるが、本発明で用いたアプタマー8-3は、比較的単純な２次構造をとっており、先端部のHA結合領域の予測がつきやすいため、マッピング法実験を省略することができる。典型的な本発明の短鎖型アプタマーとして、アプタマー8-3S(配列番号２)があげられる。
【００３４】
（３）アプタマーRNAの化学修飾
本発明のアプタマーRNAにおいては、リボヌクレアーゼ耐性を付加するために、その配列中に化学修飾(modified)したヌクレオチドを有していても良い。このようなアプタマーRNAは、例えば、アプタマーRNA中のヌクレオチドのリボース部位の2’-OH基を、常法によりフロオロ基(2’-F)にまたはメトキシ基(2’-OMe)に、あるいは同リボース部位の2’位を水素に置換(2’-deoxy)することにより得られる。この化学修飾は、ピリミジンヌクレオチド部位がリボヌクレアーゼにより分解されやすいので、ピリミジンヌクレオチドに対してより有効である。
このような化学修飾は、ヘマグルチニンとの結合に関与する部位のヌクレオチドに対しては行わない。それ以外のヌクレオチドであれば全て修飾することも可能であるが、一般的にはループ領域のピリミジンヌクレオチドのリボース基について行う。
【００３５】
本発明においては、さらにアプタマーRNAの3’及び／又は5’末端をインバーストデオキシチミジン(idT)あるいはポリエチレングリコール(PEG)により修飾することもでき、これらにより、アプタマーRNAのリボヌクレアーゼ耐性はさらに向上し、生体中での分解による活性の低下を抑制することができ、生体内で有効な抗ウイルス作用を発揮させることが可能となる。
【００３６】
４．本発明のアプタマーを用いた高病原性鳥インフルエンザウイルスの検出法、判定法
（１）表面プラズモン共鳴法(SPR)
本発明のアプタマーは、蛍光色素などの標識を行わずに、高病原性鳥インフルエンザウイルスを検出することが可能である。例えば、表面プラズモン共鳴法(SPR)などを用いた検出法が適用できる。SPRは分子間の相互作用を、センサー表面でおこる分子間の結合時の微細な質量変化を表面プラズモン共鳴とよばれる光学現象を採用することで測定可能とするものであり、GEヘルスケア社製のBiacore等を用いることができる。測定の際は、センサーチップの金薄膜表面に本発明のアプタマーあるいは被験試料のいずれかを周知の方法で固定化し、これに被験試料あるいはアプタマーを添加することで相互作用解析を行う。この方法によれば、結合反応をリアルタイムでモニタリングすることができる。本手法において精度を高く検出するためのヘマグルチニンの最小量は、A/Vietnam/1194/2004(H5N1)およびA/Netherlands/219/2003(H7N7)では約2.5nM、A/Indonesia/05/2005(H5N1)では約630pMである。
【００３７】
（２）標識化されたアプタマーを用いる方法
本発明のアプタマーは標識物質を用いて、高病原性鳥インフルエンザウイルスを検出、定量することができる。例えば、フルオロセイン、ローダミン、テキサスレッド等の蛍光色素でアプタマー及び被験試料のいずれかを標識して、被験試料と接触・結合反応を行う。結合しなかったものを除去した後、蛍光の有無あるいはその強度を検出・測定することにより、高病原性鳥インフルエンザウイルスを検出、または定量化することができる。この際、アプタマーあるいは被験試料のいずれかを固定化した基板を用いて行うことも可能である。 
【００３８】
５．本発明のアプタマーを用いた検出剤、診断剤、診断用キット及びサーベイランス用キット
本発明のアプタマーを、鳥インフルエンザウイルスを含有する被検試料もしくは含有する可能性が疑われる被検試料に対して反応させる、その親和性を観察することで、被検試料中の鳥インフルエンザウイルスが高病原性か否かを判定することができ、また被検試料中に高病原性トリインフルエンザウイルスが含まれていることを検出することができる。
すなわち、本発明のアプタマーは、高病原性鳥インフルエンザウイルスを特異的に識別し、判定することができるから、診断剤、診断用キットとして用いることができる。さらに、ヒトへの感染やパンデミックが発生する前に、豚や鳥類において実際に流行しているインフルエンザウイルスのヘマグルチニンをモニタリングし、将来のヒトへの感染やパンデミック予測のためのサーベイランス用キットとすることができる。
診断剤、診断用キット及びサーベイランス用キットを製造するに際しては、適宜、周知の薬学的に許容可能な希釈剤、安定化剤、その他の担体などと組み合わせて用いる。
本発明の診断剤、診断用キット及びサーベイランス用キットの対象となる被検試料としては、例えば、被験者の咽頭拭い液、鼻汁等の採取検体等や、それら検体を培養細胞やニワトリ受精卵に与えて感染・増殖の工程によって得た溶液等が挙げられる。
【００３９】
６．高病原性鳥インフルエンザウイルスの予防もしくは治療用組成物
本発明に使用するアプタマーは、高病原性鳥インフルエンザウイルスのヘマグルチニンの開裂部位に結合する可能性が考えられる。この結合によってタンパク質分解酵素によるヘマグルチニンの開裂が妨げられ、ウイルスの伝播を食い止めることが期待できる。特に化学修飾されたアプタマーはヌクレアーゼ抵抗性で、血中半減期も長いばかりか、生体内での抗原性も無視できるので、高病原性鳥インフルエンザの予防用または治療用の医薬組成物として、また抗ウイルス剤として利用できる可能性が考えられる。投与対象としては、ヒトのみならず鳥や豚などの哺乳動物に適用できる。
抗ウイルス製剤、または医薬組成物とする場合には、経口、非経口のいずれでもよく、適宜、周知の薬学的に許容可能な無毒性の担体、希釈剤と組み合わせて用いる。非経口投与としては、典型的には注射剤であるが、噴霧剤などと共に吸入による投与も可能である。１日あたり単回の投与でも分割投与でも良い。その際の有効な投与量は対象の状態、体重、性別及び年齢によって変化しうる。
また、直接ヒトなどに投与せずに、抗ウイルス剤として、マスクや看護用の衣服などに含浸させて用いることもできる。
【実施例】
【００４０】
以下に本発明の一実施形態として、高病原性鳥インフルエンザウイルスのA/Vietnam/1194/2004(H5N1)、A/Indonesia/05/2005(H5N1)およびA/Netherlands/219/2003(H7N7)のヘマグルチニンとアプタマー8-3との相互作用解析例を挙げ、下記実施例において具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
なお、本発明で使用されている技術的用語は、別途定義されていない限り、当業者により普通に理解されている意味を持つ。本発明で用いた遺伝子組換え技術、PCR法、その他の手法などの具体的な手順や条件は、特に断らない限り、Sambrook and Russell,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3rd Edition.Cold Spring Harbor Laboratory Press,Plainview,NY (2001)、Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York (1989); D. M. Glover et al. ed.，"DNA Cloning"，2nd ed.，Vol.1 to 4，(The Practical Approach Series)，IRL Press，Oxford University Press (1995); Ausubel，F. M. et al.，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，New York，N.Y，1995；日本生化学会編、「続生化学実験講座１、遺伝子研究法II」、東京化学同人(1986)；日本生化学会編、「新生化学実験講座２、核酸 III(組換えDNA技術)」、東京化学同人(1992)；R. Wu ed.,"Methods in Enzymology"，Vol.68 (Recombinant DNA)，Academic Press，New York (1980); R. Wu et al. ed.，"Methods in Enzymology"，Vol.100 (Recombinant DNA，PartB) & 101 (Recombinant DNA，Part C)，Academic Press，New York (1983); R. Wu et al. ed.，"Methods in Enzymology"，Vol.153 (Recombinant DNA，Part D)，154 (Recombinant DNA，Part E) & 155 (Recombinant DNA，Part F)，Academic Press，New York (1987)などに記載の方法あるいはそこで引用された文献記載の方法またはそれらと実質的に同様な方法により行うことができる。
また、本発明で引用した先行文献又は特許出願明細書の記載内容は、参照して本明細書の記載として組み入れるものとする。
【００４１】
（実施例１）高病原性鳥インフルエンザウイルスのヘマグルチニンとアプタマー8-3との相互作用解析
（１−１）高病原性A/Vietnam/1194/2004(H5N1)のヘマグルチニン
高病原性鳥インフルエンザウイルスであるA/Vietnam/1194/2004(H5N1)のヘマグルチニンとアプタマー8-3との親和性をBiacoreT100(GEヘルスケア)によって測定した。 
解析には、Sensor Chip SA(SAチップ)(GEヘルスケア)を利用した。当該SAチップには、ビオチン化分子を固定化するためにストレプトアビジンが予め固定化されている。HBS-P+緩衝液(0.01M HEPES，0.15M NaCl，0.05％ v/v Surfactant P20，pH7.4)に溶解した5μMのビオチン化チミンヌクレオチド鎖[5'-(dT)24-3']を、当該SAチップに対して流速10μl/minで、2分間添加し、固定化を行った。
次いで、3'-末端に24塩基のアデニンヌクレオチド(rA)を付加したアプタマー8-3(50-100nM)を流速2μl/minで10分間添加し、チミンヌクレオチド鎖にハイブリダイズさせた。
【００４２】
上記のSAチップへSino Biological Inc.社製のA/Vietnam/1194/2004(H5N1)のヘマグルチニン溶液を、2.5-40 nMの濃度範囲で、流速30μl/minで2分間添加し、固定化されたアプタマー8-3との相互作用解析を行った。
その結果、アプタマー8-3とA/Vietnam/1194/2004(H5N1)のヘマグルチニンは高い親和性を示し、その解離定数(KD)は750pMであった(図２)。
【００４３】
解析後、10mM NaOHを流速60μl/minで5秒間添加し、チミンヌクレオチド鎖とアプタマーのアデニンヌクレオチド鎖とのハイブリダイゼーションを解離させることによって、チップの再生を行った。再生後のチップにはチミンヌクレオチド鎖が残っており、再びアデニンヌクレオチド鎖を付加したアプタマーを添加することによって次の解析へと利用することができる。
【００４４】
（１−２）高病原性A/Indonesia/05/2005(H5N1)のヘマグルチニン
前記(１−１)と同様に調製したアデニンヌクレオチド鎖を付加したアプタマー8-3(50-100nM)をチミンヌクレオチド鎖がビオチンアビジン結合をしているSAチップにハイブリダイゼーションにより固定化した後、A/Indonesia/05/2005(H5N1)のヘマグルチニン(Sino Biological Inc.社製)に対して同様の相互作用解析を行った。
その結果、アプタマー8-3とA/Indonesia/05/2005(H5N1)のヘマグルチニンも高い親和性を示し、その解離定数(KD)は170pMであった(図２)。
【００４５】
（１−３）高病原性A/Netherlands/219/2003(H7N7) のヘマグルチニン
前記(１−１)と同様に調製したアプタマー8-3(50-100nM)をSAチップに固定化後、A/Netherlands/219/2003(H7N7)のヘマグルチニン(Sino Biological Inc.社製)に対して同様の相互作用解析を行った。
その結果、アプタマー8-3とA/Netherlands/219/2003(H7N7)のヘマグルチニンも高い親和性を示し、解離定数(KD)は420pMであった(図３)。
【００４６】
（実施例２）高病原性鳥インフルエンザウイルスのヘマグルチニンにおけるアプタマー8-3の結合領域の特定
（２−１）開裂部位のアミノ酸を変異及び除去したA/Vietnam/1194/2004(H5N1)のヘマグルチニンとの相互作用解析
高病原性鳥インフルエンザウイルスのヘマグルチニンの開裂部位に存在する連続性塩基性アミノ酸残基がアプタマーの結合に関わるかどうかを調べるため、実施例１(１−１)で用いたA/Vietnam/1194/2004(H5N1)のヘマグルチニン(Sino Biological Inc.社製)のアミノ酸配列(配列番号３)において、ヘマグルチニン開裂部位中の塩基性アミノ酸「RERRRKKR/G」を「TETR/G」に変異及び除去した変異ヘマグルチニン(配列番号４)を利用した。実施例１と同様の方法で、当該塩基性アミノ酸配列変異ヘマグルチニンとアプタマー8-3との相互作用解析を行った。
その結果、アプタマー8-3はこの変異ヘマグルチニンに対して結合を示さなかった(図５)。
【００４７】
（２−２）開裂部位のアミノ酸を変異及び除去したA/Netherlands/219/2003(H7N7)のヘマグルチニンとの相互作用解析
前記(２-１)と同様に、実施例１(１−３)で用いたA/Netherlands/219/2003(H7N7)のヘマグルチニンのアミノ酸配列(配列番号５)において、ヘマグルチニン開裂部位中の塩基性アミノ酸「PKRRRR/G」を「PKGR/G」に変異及び除去した変異ヘマグルチニンを利用した(配列番号６)。実施例１と同様の方法で、当該塩基性アミノ酸配列変異ヘマグルチニンとアプタマー8-3との相互作用解析を行った。
その結果、アプタマー8-3はこの変異ヘマグルチニンに対して結合を示さなかった(図７)。
【００４８】
（実施例３）開裂後のA/Vietnam/1194/2004(H5N1)のヘマグルチニンとアプタマー8-3の相互作用解析
実施例１(図２及び図３)の解析に用いたヘマグルチニンは、開裂していないヘマグルチニン(HA0)と一部が開裂したヘマグルチニン(HA1及びHA2)との混合試料である。これに対し、タンパク質分解酵素による開裂が起こった場合は、ヘマグルチニンが開裂し、HA1とHA2のみが試料中に存在すると考えられる。このような開裂が起こった後でもアプタマー8-3がヘマグルチニンに結合できるかどうかを調べるため、以下の実験を行った。
【００４９】
A/Vietnam/1194/2004(H5N1)のヘマグルチニンをHA1とHA2に開裂させるため、タンパク質分解酵素フリンをヘマグルチニンに添加し、室温で1時間反応させた。反応後、SDS-PAGEにて開裂前(２)と開裂後(１)のヘマグルチニンの電気泳動を実施し、フリンによってヘマグルチニンが開裂したことを確認した(図９)。
【００５０】
アプタマー8-3が開裂後のヘマグルチニン(HA1及びHA2)にも結合するかどうかを調べるため、タンパク質分解酵素処理後のヘマグルチニン(HA1及びHA2)及び処理前のヘマグルチニン(HA0、一部HA1とHA2を含む)とのアプタマー8-3の相互作用解析を行った(図１０)。解析は実施例１と同様の方法で行った。
その結果、アプタマー8-3は開裂後のヘマグルチニンにも結合を示し、開裂前、開裂後のいずれのヘマグルチニンにも結合することが明らかとなった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
2014233276.tif 000010
【図１０】
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【配列表】
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