(57)【要約】      （修正有）【課題】動脈硬化に起因する疾患などの虚血性疾患の予防および治療の用途に好適な試薬や医薬を開発する上で有用なポリペプチドを提供する。【解決手段】特定な配列のアミノ酸配列からなり、かつ血液の再灌流によって虚血性疾患の状態から脱した血管において発現レベルが増大するポリペプチド。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなり、かつ虚血性疾患の状態から脱した血管において発現レベルが増大する、ことを特徴とするポリペプチド。
【請求項２】
前記虚血性疾患が、動脈硬化である請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
配列番号：２０に記載のヌクレオチド配列の第７３９〜１６９５位のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドによってコードされる請求項１または２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
虚血性疾患の治療剤を製造するための請求項１乃至３のいずれかに記載のポリペプチドの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、虚血性疾患の発症メカニズムに関与し、特に、動脈硬化の予防および治療の用途に好適な試薬や医薬を開発する上で有用なポリペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
最近のわが国の原因別死亡者数において、血管障害による死亡者数が占める割合は依然として大きく、癌を原因とする死亡者数ともほぼ匹敵している。  これら血管障害の内でも、動脈硬化が直接的または間接的に関与している疾患が、その大勢を占めている。  動脈の硬化現象を伴う「動脈硬化症」と称されている疾患の内、一般的なものとして、血管障害、例えば、大動脈弁閉鎖不全症、腎性高血圧症、虚血性心疾患、脳卒中、閉塞性動脈硬化症、動脈瘤、動脈解離、急性動脈閉塞などがある。
【０００３】
この動脈硬化の症状が進行すると、最終的には、血管壁の崩壊や血管の閉塞に至る。  これまでの研究から、動脈硬化の病態は、内皮細胞の機能障害、血管壁内での脂質沈着、およびそれに伴う単球系炎症細胞の血管壁への集積、これら単球系炎症細胞の貪食細胞への分化および活性化、血管内脂質への酸化的または酵素的修飾とそれに起因する局所炎症の惹起、各種炎症反応の進展、そして、血管壁での平滑筋の増殖を伴う過剰修復または異常修復反応などによって、進行するものと考えられている。  すなわち、動脈硬化の病態は、特定の炎症や組織修復反応が関与するとも考えられている。  これら動脈硬化症の進行を抑える上で、従来から、高血圧、糖尿病、高脂血症、肥満、喫煙などの発症因子に対する治療や管理を行うことが重要であるとされていた。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
上述した動脈硬化の個別の発症因子への対処に止まらずに、当該技術分野では、動脈硬化の進行を積極的に阻害する根本的な予防方法や治療方法が依然として待望されている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本願発明者らは、上述した従来技術での問題点に鑑みて、鋭意研究を行った末に、動脈硬化の進行を効果的に阻害する手段を知見するに至ったものである。
【０００６】
すなわち、本願発明の要旨とするところは、少なくともその一部に配列番号：１に記載のアミノ酸配列を含み、かつ、血液の再灌流によって虚血状態を脱した哺乳動物の血管において、その発現レベルが亢進されるポリペプチドにある。  好ましくは、本願発明のポリペプチドは、配列番号：１に記載のアミノ酸配列から構成されている。
【発明の効果】
【０００７】
本願発明のこの構成により、虚血性疾患の発症メカニズムの解明に寄与し、また、動脈硬化の予防および治療の用途に好適な試薬や医薬の開発のために利用可能なポリペプチドが実現されることとなる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１(ａ)は、本願発明のポリペプチドのオープンリーディングフレームを示す図であり、図１(ｂ)は、本願発明のポリペプチドの塩基配列を決定するために使用したプライマーの名称と決定されたそれらの塩基配列を示す図である。
【図２】図２は、従来のコレクチンポリペプチドと本願発明のポリペプチドとのアミノ酸配列のアラインメントである。
【図３】図３は、ゲノミックサザン分析の結果を示す図である。
【図４】図４は、ポリペプチドの組織分布を示す図である。
【図５】図５は、ポリペプチドの哺乳動物種の間での保存性を示す図である。
【図６】図６は、コレクチンの遺伝的系統樹である。
【図７】図７は、プラスミドpNOW１-hCL-P１の構造を示す模式図である。
【図８】図８は、虚血/再灌流モデルでのmRNAレベルでのポリペプチド発現を示す図である。
【図９】図９は、低酸素暴露/再酸素化モデルでのポリペプチドの発現亢進を示す図である。
【図１０】図１０は、ポリペプチドの発現部位での細胞内部への取り込みを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本願発明のポリペプチドとは、一般的に、コレクチンファミリーに属するタンパク質である。  ところで、「コレクチン」とは、カルシウムイオン(Ca２＋)要求性の糖認識構造様領域(ＣＲＤ)とコラーゲン様領域とを有するタンパク質の総称であり、細菌、ウイルスをはじめとして様々な微生物に対する基礎免疫に関与していると考えられている。
【００１０】
これまでに報告されているコレクチンとして、マンナン結合タンパク質(ＭＢＰ)、サーファクタントタンパク質Ａ(ＳＰ-Ａ)、サーファクタントタンパク質Ｄ(ＳＰ-Ｄ)、それに、コングルチニンなどがある。  これらの内でも、コングルチニンなどのレクチンによる非特異的な免疫応答への関与も示唆されており、例えば、母親の移行抗体や特異的防御システムが充分に発達していない小児においても、種々の微生物の中和作用や排除に重要な役割を果たしているとの報告もなされている(Super et al., Lancet, vol.2, pp.1236-1239 (1989))。  さらに、ＭＢＰの遺伝子上の変異に起因したＭＢＰの血中濃度の低下によって、宿主が感染を受けやすくなる、という研究結果もある(Sumiya et al., Lancet, vol.337, pp.1569-1570 (1991))。
【００１１】
また、本発明者らのグループは、コングルチニンやマンナン結合タンパク質が、H1およびH3タイプのインフルエンザＡウイルスの感染や赤血球凝集活性を阻害することを見出している(Wakamiya et al., Glyconjugate J., vol.8, p.235 (1991)；Wakamiya et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., vol.187, pp.1270-1278 (1992))。  その後、コングルチニンをコードするcDNAクローンが取得されて、コングルチニンと種々のサーファクタントタンパク質Ｄ遺伝子との間の強い関連性も見出されている(Suzuki et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., vol.191, pp.335-342 (1993))。
【００１２】
前述したように、本願発明のポリペプチドとは、少なくともその一部に配列番号：１に記載のアミノ酸配列を含み、好ましくは、配列番号：１に記載のアミノ酸配列から構成されている。
【００１３】
また、本願発明のポリペプチドには、本質的にその生理学的作用を保持している以下の六つの変異体も包含している。
【００１４】
本願発明のポリペプチドを構成する配列番号：１に記載のアミノ酸配列のＮ末端にさらに３個のアミノ酸が結合してなるアミノ酸配列(配列番号：２)からなるポリペプチド変異体。
【００１５】
本願発明のポリペプチドを構成する配列番号：１に記載のアミノ酸配列のＮ末端にさらに１８個のアミノ酸が結合してなるアミノ酸配列(配列番号：３)からなるポリペプチド変異体。
【００１６】
本願発明のポリペプチドを構成する配列番号：１に記載のアミノ酸配列のＮ末端にさらに１２７個のアミノ酸が結合してなるアミノ酸配列(配列番号：４)からなるポリペプチド変異体。
【００１７】
本願発明のポリペプチドを構成する配列番号：１に記載のアミノ酸配列のＮ末端にさらに１３８個のアミノ酸が結合してなるアミノ酸配列(配列番号：５)からなるポリペプチド変異体。
【００１８】
本願発明のポリペプチドを構成する配列番号：１に記載のアミノ酸配列のＮ末端にさらに２２０個のアミノ酸が結合してなるアミノ酸配列(配列番号：６)からなるポリペプチド変異体。
【００１９】
本願発明のポリペプチドを構成する配列番号：１に記載のアミノ酸配列のＮ末端にさらに２２８個のアミノ酸が結合してなるアミノ酸配列(配列番号：７)からなるポリペプチド変異体。
【００２０】
なお、後述するように、本願発明のポリペプチドは、ヒト、特に、ヒトの胎盤組織に由来するものであるので、ヒトの体内において抗細菌活性やウイルス活性などを奏することも期待され、生理活性医薬物質としての用途での利用も期待される。
【実施例】
【００２１】
本願発明を、以下に、その実施例に沿って説明するが、これらの実施例の開示に基づいて、本願発明が限定的に解釈されるべきでないことは勿論である。
【００２２】
実施例１：ヒト胎盤由来ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング
まず、ＡＴＣＣ(American Type Culture Collection)より購入した胎児心臓由来のクローン(I.M.A.G.E. Consortium Clone ID 34472；GenBank/ESTデータベース内での登録番号Ｒ74387)でのインサートDNAの塩基配列を、Ｍ13ユニバーサルプライマー(Pharmacia、配列番号：８、５'-フルオレセイン-cgacgttgtaaaacgacggccagt-３')およびＭ13リバースプライマー(Pharmacia、配列番号：９、５'-フルオレセイン-caggaaacagctatgac-３')を用いて決定した。
【００２３】
ジゴキシゲニン(ＤＩＧ)ラベルｃＤＮＡプローブ用プライマー[逆プライマー、acaatctgatgagaaggtgatg(配列番号：10)、および、正プライマー、acgaggggctggatgggacat(配列番号：11)]を、392Ａ DNA/RNAシンセサイザー(アプライドバイオシステムズ)を用いて調製した。  DIGラベルは、PCR DIGプローブ合成キット(ベーリンガー・マンハイム)を用いて行った。  反応組成は、以下の表１に記載の通りであった。
【００２４】
【表１】
2014166999.tif 000002
【００２５】
PCR反応は、ザイモリアクター(アトー)を用いて、92℃で、１分間；55℃で、１分間；および、72℃で、２分間のサイクルを一サイクルとして、これを35回行った。
【００２６】
次に、ヒト胎盤由来ファージcDNAライブラリーのタイトレーションを行った。  すなわち、mLB培地(10mM MgSO４および0.2％マルトースを含むLB培地(１ｇトリプトン、0.5ｇ酵母抽出物、0.5ｇ NaCl/100ml)で、37℃にて、16時間培養を行った大腸菌 Ｙ1090ｒの0.2mlと、ＳＭ緩衝液(5.8ｇNaCl、２ｇ MgSO４・７H２O、２Ｍ Tris-HCl(pH 7.5) 25ml、５ml ２％ゼラチン/L)で段階希釈したcDNAライブラリーの0.1mlを、37℃で、15分間、インキュベーションした。  その後、2.5mlのLB-トップアガロース(0.75％アガロース/LB培地)に加えて均一とし、次いで、90mmφLB培地プレート(岩城硝子)(1.5％アガー/LB培地)に播いた。  15分間、室温で、固化させ、42℃で、５時間インキュベーションした。  各プレートのプラークを計数後、ファージのタイターを計算により求めた。  その結果、タイターは、2.1×10１０pfu/mlであった。
【００２７】
これらcDNAライブラリーに関して、前出のプローブを用いてスクリーニングを行った。
【００２８】
まず、mLB培地で、37℃で、16時間培養を行った大腸菌 Ｙ1090ｒの0.6mlとＳＭ緩衝液で希釈したcDNAライブラリーの１×10５pfuを、37℃で、15分間インキュベーションした。  その後、7.5ml LB-トップアガロース(0.75％アガロース)に加えて均一とした。  これを、140mm２のLB培地角プレート(日水製薬)に播いたものを10枚作製し、15分間、室温で固化させ、42℃にて、５時間インキュベーションした。  プラーク形成を確認した後に、ナイロンメンブレンへの転写を行った。  転写は、ナイトラン13Ｎ(Schleicher and Schuell Co.,)を用いて行った。  12.50cm×9.0cmのフィルターを蒸留水に浸けて、10分間湿らせた後、ワットマン３MM紙上において余分な水分を除去し、プラークを形成したプレート上にフィルターを置いた。  ２分間放置した後に、フィルターを剥がし、そして、10分間、風乾させた。  0.2M NaOH/1.5M NaClによって、ファージＤＮＡを、２分間かけて変性させ、次いで、0.4Ｍ Tris-HCl (pH 7.6)/２×SSCで、２分間中和し、そして、２×SSCで、２分間洗浄を行った。  その後、GS GENE LINKER(バイオラッド)で紫外線照射することによって、ファージＤＮＡを、メンブレンに固定した。
【００２９】
ハイブリダイゼーションおよびシグナルの検出は、以下のようにして行った。
【００３０】
まず、フィルターを、２×SSCで湿らせ、余分な水分を、ワットマン３MM紙で除去した。  そして、このフィルターを、ハイブリダイゼーションバックに移し、ハイブリダイゼーション溶液(５×SSC、１％ブロッキング剤、0.1％ Ｎ-ラウロイルサルコシン、0.02％SDS)と共に、68℃にて、１時間プレハイブリダイゼーションを行った。  続いて、ハイブリダイゼーションバックからハイブリダイゼーション溶液を除き、DIGでラベルしたcDNAプローブを、10ng/mlになるように調製したハイブリダイゼーション溶液に加えて、55℃にて、16時間かけてハイブリダイゼーションした。  ハイブリダイゼーション終了後、フィルターは、室温にて、２×SSC/0.1％SDS溶液で、５分間かけて、２回洗浄し、55℃にて、0.5×SSC/0.1％SDS溶液で、15分間かけて、２回洗浄した。  次に、DIG緩衝液Ｉ(100mM Tris-HCl、150mM NaCl (pH 7.5))で、１分間かけて、SDSを除去し、DIG緩衝液II(１％ブロッキング剤、DIG緩衝液Ｉ)で、30分間かけて、フィルターのブロッキングを行った。  DIG緩衝液Ｉで１分間洗浄し、次いで、DIG緩衝液IIで抗DIGアルカリフォスファターゼ標識抗体(ベーリンガー・マンハイム)を、5,000倍希釈した溶液を加えて、30分間抗体反応を室温で行った後、室温で、DIG緩衝液Ｉで、15分間、２回洗浄した。  DIG緩衝液III(100mM Tris-HCl、100mM NaCl(pH 9.5)、50mM MgCl２)で３分間処理することで、マグネシウムイオン(Mg２＋)の濃度を高めて、NBT/BCIP(和光純薬)をDIG緩衝液IIIに加えた溶液で発色させたところ、10個の陽性クローンが得られた。  これらのクローンに相当するプラークを、プレートから切り出し、ＳＭ緩衝液１mlを入れたチューブに加え、10分間撹拌した後に、ＳＭ緩衝液で段階希釈した。  この希釈液0.1mlとmLB培地で、37℃で、16時間培養したEscherichia coli Ｙ1090ｒの0.2mlを混ぜて、37℃で、15分間インキュイベーションした。  その後、混合液を2.5ml LB-トップアガロースに加えて均一とし、90mmφLB培地プレートに播いたものを10枚作製し、15分間、室温で固化させ、42℃で、５時間インキュベーションした。  こうすることで、いくつかのプラークが得られたので、一次スクリーニングと同様にして、二次スクリーニングを行った。
【００３１】
実施例２：選抜クローンの塩基配列の決定
二次スクリーニングで得られた陽性クローンの内、適切と考えられるクローンのプラークをプレートから切り出した。  これらを、蒸留水200μlを入れたチューブに加えて、30分間、室温で、撹拌した後、15,000rpmで５分間遠心分離し、上清を得た。
【００３２】
得られた上清を鋳型とし、TaKaRa LA PCR Kit ver.２(宝酒造)を用いて、ＰＣＲによりインサートＤＮＡを増幅させた。  ＰＣＲの反応組成(水で全量を50μlにしたもの)は、以下の表２に記載の通りである。
【００３３】
【表２】
2014166999.tif 000003
【００３４】
PCR反応は、GeneAmp PCRシステム9600(アプライドバイオシステムズ)を用いて、98℃で、20秒間；そして、68℃で、５分間のサイクルを30回行った。  PCR産物は、１％アガロースゲル電気泳動にて確認後、ゲルからの切り出しにより精製した。  なお、この精製の際に、Sephaglas BandPrep Kit(ファルマシア)を用いた。
【００３５】
切り出したＤＮＡ断片は、ＴＡクローニングキット(インビトロジェン)のpCR2.1ベクターに組み込んだ。  組換えたベクターで、ＴＡクローニングキット(インビトロジェン)に含まれているTOP10F'細胞を形質転換した。  形質転換体を、LB培地(100μg/mlアンピシリン)で培養し、アルカリSDS法によって、各クローンについて３種類のプラスミドＤＮＡを抽出した。
【００３６】
得られたＤＮＡを適当と考えられる制限酵素で切断し、各ＤＮＡ断片をｐUC18ベクターに組込み、XL１-ブルー細胞に形質転換した。  形質転換体をLB培地(100μg/mlアンピシリン)で培養し、アルカリSDS法によって、以下のプラスミドを抽出した。
【００３７】
CL-P1-2-1からは、EcoRI-HindIII断片、HindIII-EcoRI断片を含むプラスミド。
【００３８】
CL-P1-3-4からは、EcoRI-BamHI断片、BamHI-SmaI断片、SmaI-HindIII断片、KpnI-Sau3AI断片、Sau3AI-EcoRI断片、EcoRI-KpnI断片、EcoRI-SmaI断片を含むプラスミド。
【００３９】
CL-P1-3-7からは、EcoRI-BamHI断片、BamHI-SmaI断片、SmaI-HindIII断片、KpnI-Sau3AI断片、Sau3AI-EcoRI断片、EcoRI-KpnI断片、KpnI-EcoRI断片を含むプラスミド。
【００４０】
プライマーは、オートリード・シークエンシング・キット(ファルマシア)に添付されていたＭ13ユニバーサルプライマー(配列番号：８）、Ｍ13リバースプライマー(配列番号：９)、および、ＦＩＴＣ(ファルマシアフルオロプライマー)でラベルした以下のプライマーを、DNA/RNAシンセサイザーを用いて作成した。  そしてこれらプライマーに関して、オートリード・シークエンシング・キット(ファルマシア)およびオートシーケンサー(A.L.F.)で、それらの全領域の塩基配列を決定した。
【００４１】
HPP １：５'-フルオレセイン-cgtgaaaatgaatggaagtgg-３’(配列番号：12）、
HPP ２：５'-フルオレセイン-ttttatccattgctgttcctc-３’(配列番号：13）、
HPP ３：５'-フルオレセイン-ctggcagtccccgaggtccag-３’（配列番号：14）、
HPP ５：５'-フルオレセイン-gctggtccccccggagagcgt-３’（配列番号：15）。
【００４２】
上記の塩基配列の決定の概略は、図１に示す通りである。
【００４３】
図１(ａ)には、得られた本願発明のポリペプチドのオープンリーディングフレーム(ＯＲＦ)が示されており、その中のＧ-Ｘ-Ｙは、コラーゲン様領域を表すものである。  また、図１(ｂ)には、上記した各プライマーの名称、決定された塩基配列(矢印で示した)を示している。  同時に、Ｍ13ユニバーサルプライマー(図中の「Ｕ」)とＭ13リバースプライマー(図中の「Ｒ」)も示している。
【００４４】
さらにCap部位のcDNAを用いて、この配列の転写開始点を含む５'末端領域の塩基配列を決定した。
【００４５】
Cap部位cDNA、ヒト肝臓(NIPPON GENE)に添付されていた1RC2プライマー(５'-caaggtacgccacagcgtatg-３’(配列番号：16)およびアプライドバイオシステムズ392Ａ DNA/RNAシンセサイザーにより合成したTGP１プライマー（５'-tcttcagtttccctaatccc-３'（配列番号：17)を用いて、第１回目のＰＣＲを行った。
【００４６】
反応混液(総液量50μl)は、以下の表３に記載の組成を含むものであった。
【００４７】
【表３】
2014166999.tif 000004
【００４８】
PCRは、熱変性を95℃にて20秒間、アニーリングを60℃にて20秒間、伸長反応を72℃にて20秒間を行うサイクルを35サイクル行った。  また、サイクル過程に入る以前に、熱変性を95℃にて５分間、最後に伸長反応を72℃にて10分間行うプログラムを実施した。  第１回目のPCRの終了後、nested PCRを行った。
【００４９】
第１回目のPCRのPCR産物の１μlを鋳型とし、プライマーは、添付されていた2RC2プライマー(５'-gtacgccacagcgtatgatgc-３'(配列番号：18))および合成TGP2プライマー(５'-cattcttgacaaacttcatag-３'(配列番号：19))(TGP1プライマーと同様にして合成したもの)を用いて、第１回目のPCRと同様の反応組成とプログラム(ただし、サイクル数は、25サイクル)に従って行った。
【００５０】
以上のPCR反応は、TaKaRa PCR THermal Cycler 480(宝酒造)により行った。  得られたPCR産物を、アガロースゲル電気泳動により確認した後に、バンドをゲルより切り出し、−80℃で、10分間凍結し、15,000rpmで、10分間遠心分離した後に、上清をエタノール沈澱することにより精製した。
【００５１】
精製したＤＮＡ断片を、Novagen pT７ブルーベクターに組み込み、このベクターを、コンピテントセルXL１-ブルー細胞に形質転換した。  形質転換体を、LB培地(100μg/mlアンピシリン)で培養し、アルカリSDS法によってプラスミドを抽出し、AutoRead Sequencing Kit(Pharmacia)およびDNA Sequencer(A.L.F.)で塩基配列の決定を行った。  プライマーとして、AutoRead Sequencing Kitに添付されているＭ13ユニバーサルプライマー(配列番号：８）およびＭ13リバースプライマー（配列番号：９）を用いた。
【００５２】
この結果、実施例１で取得されたcDNAクローンは、配列番号：20に記載の2,024塩基を含み、1,026塩基のオープンリーディングフレームを有していることが確認できた。  また、この塩基配列の一部に、配列番号：１に記載の３１９個のアミノ酸をコードしている領域(配列番号：20に記載の塩基配列の第739位〜第1695位のヌクレオチド)が含まれていたことが確認できた。
【００５３】
次いで、GenBankデータベースを用いて、DNAおよびアミノ酸についての相同性の検索を行った結果、得られたアミノ酸配列は、従来見出されているコレクチンのいずれとも異なる新規のタンパク質の配列であることが明らかとなった。
【００５４】
また、従来報告されている３種のコレクチンのアミノ酸配列と、本願発明のポリペプチドのアミノ酸配列を比較した。  そのアラインメントを図２に示す。  相同性を有するアミノ酸残基部分に黒囲みを付した。  このアラインメントにより、得られたポリペプチドは、既知のコレクチンと相同性を有し、コレクチンファミリーに属していることが示される。
【００５５】
本願発明において利用可能なベクター
本実施例で例示したベクター以外にも、本願発明のポリペプチドの発現をコードするポリヌクレオチドまたはその活性断片を、本願発明のポリペプチドの発現を許容するように組み込まれたベクターであれば、当然に利用可能である。
【００５６】
換言すれば、プラスミド、λファージ、コスミドなどのレプリコンに、前述したポリヌクレオチドを組み込んで、本願発明のポリペプチドが複製・発現されるようにしたベクターであれば、いずれのものでも利用可能である。  例えば、コスミドよりもさらに長鎖のＤＮＡ断片をクローニングできるベクターとして、Ｐ１ファージ、Ｆ因子および酵母の人工染色体YACなどがある。  また、λファージには、置換型ベクターおよび挿入型ベクターが含まれ、これらは、導入する遺伝子の長さに応じて適宜選択することができる。
【００５７】
また、例えば、動物細胞で発現可能なベクターとして、SV40系ベクター、ウシパピローマウイルスベクター、ヘルペスウィルスベクター、アデノウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、レトロウイルスベクターなどが公知である。  その一方で、pUC19、pTV118N(宝酒造）、pUEX2(アマシャム）、pGEX-4T、pKK233-2(ファルマシア)、pMAM-neo(クロンテック）、pGL2(プロメガ）、pDNA3.1+(インビトロジェン)などのベクターが市販されている。  これらベクターの構築方法は、特に限定されるものではなく、当該技術分野で周知の方法によって、制限酵素やリガーゼなどを利用して構築することができる。
【００５８】
前述したベクターを用いて形質転換またはトランスフェクトされる宿主細胞として、細菌、特に、大腸菌を使用する場合のベクターは、通常は、少なくともプロモーター領域(プロモーター、オペレーターおよびシャインダルガーノ配列を含む）、開始コドン、本願発明のポリペプチドをコードする塩基配列、終始コドン、ターミネーター領域などから構成される。  酵母または動物細胞を宿主として用いる場合のベクターは、少なくともプロモーター、開始コドン、シグナルペプチド、本願発明のポリペプチドをコードする塩基配列および終始コドンを含むことが好ましい。  また、エンハンサー配列、本願発明のポリペプチドの５'-および３'-非翻訳領域、スプライシング接合部、ポリアデニレーション部位、および選択マーカーをベクターに挿入することもできる。
【００５９】
本発明のベクターに組み込まれるプロモーターとしては、当該技術分野で周知のSV40(Similian Virus 40)、SRα、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター、アクチンプロモーター、ウイルス性LTR(Long Terminal Repeat)、例えば、HTLV-１ LTR、HIV-LTR、ラウス肉芽腫ウイルスLTR、単純ヘルペスチロシンキナーゼウイルスプロモーターなどを使用することができる。
【００６０】
また、真核細胞において、線維芽細胞、神経細胞、血液細胞および実質細胞などの正常細胞から、癌細胞に至る多くの細胞種に発現を期待する場合、一般的なプロモーターとしては、サイトメガロウィルス、チミジンキナーゼ(ＴＫ）、β-アクチンおよびSV40初期遺伝子プロモーターなどが挙げられる。  エンハンサーは、通常、プロモーター配列とセットになっているので、そのまま利用することができる。
【００６１】
あるいは、遺伝子を導入して発現させる細胞および組織が特定されている場合には、細胞に特異的なプロモーターを選択することができる。  さらに、これらプロモーターを、ホモあるいはヘテロに組合せることにより、高発現が期待でき、安定に本願発明のポリペプチドが得られるという効果が奏される場合がある。
【００６２】
一方で、原核細胞において使用されるプロモーターとして、PBAD、PL、trc、T7、SP６、T3、lacなどがある。  これらの原核細胞由来の細胞内で本願発明のポリペプチドを高発現させることができるプロモーターは、宿主に適合する限り、本発明のプロモーターとして適宜選択して用いることができる。  また、遺伝子を導入して発現させる細胞および組織が特定されている場合には、細胞に特異的なプロモーターを選択することができる。
【００６３】
また、これらプロモーターを、ホモあるいはヘテロに組合せることにより、さらなる高発現が期待でき、安定に本願発明のポリペプチドが得られるという効果が奏される場合がある。
【００６４】
そして、酵母において使用されるプロモーターとしては、GAL１、AOX１、CUPI、PGKなどがある。
【００６５】
なお、これらベクターに組み込んで目的とするベクターのみを回収するための選択マーカーとしては、ジヒドロ葉酸還元酵素(以下、「DHFR」と称する)遺伝子(メトトレキサート耐性遺伝子）、neo遺伝子(Ｇ418耐性遺伝子)などがあり、例えば、DHFR遺伝子が欠損しているCHO細胞を用いて、DHFR遺伝子を選択マーカーとして使用する場合には、チミジンを含まない培地によっても選択できる。  また、メトトレキサートの濃度を上げて培養し、耐性細胞を選択することによって、遺伝子を細胞内で発現させ、さらに高発現の細胞株を得ることもできる。
【００６６】
実施例３：ゲノミックサザン分析
実施例２で取得されたポリペプチドの発現をコードする遺伝子が、シングルコピーまたはマルチコピーのいずれであるかを決定するために、ゲノミックサザン分析を行った。
【００６７】
ヒト血液由来のヒトゲノムＤＮＡ(プロメガ)の４μｇ相当量を、(１)EcoRI、(２)XbaI、(３)HindIII、(４)PstI、(５)BglIIまたは(６)BamHIの制限酵素で消化し、0.8％アガロースゲルにて、100mAで３時間電気泳動した。  泳動終了後、ナイロンメンブレン(ナイトラン13Ｎ)に転写して、分析用のメンブレンを作製した。  転写は、先ず、電気泳動後のゲルを100mlの0.25N HClに10分間浸し、蒸留水で３回洗浄した後、100mlの変性液(1.5Ｍ NaCl、0.5Ｍ NaOH)に15分間、２回浸し、100mlの中和液(0.5ＭTris-HCl、３Ｍ NaCl(pH 6.8))に30分間浸すことによって、脱プリン化、変性および中和の処理を施した。  そして、バキュームブロッティングシステム(東洋紡エンジニアリング、VB-30)を用いて、転写した。  この際、メンブレンは、２×SSCに５分間、次に、20×SSCに５分間浸漬して前処理したものを用い、パッドは、20×SSCを染み込ませておいたものを用いた。  転写終了後、紫外線照射により固定処理を施した。
【００６８】
サザン分析のためのハイブリダイゼーション用プローブとしては、実施例２で得られたcDNA配列のオープンリーディングフレームの一部分を、プライマー［５'-gaagacaagtcttcaactcttg-３'(配列番号：21)および５'-ctctgagtctgtgaggccgatc-３'（配列番号：22）］と、前記のPCR DIGプローブ合成キットを用いてDIGラベルしたDNAプローブ［gaagacaagt cttcacatct tgttttcata aacactagag aggaacagca atggataaaa aaacagatgg tagggagaga gagccactgg atcggcctca cagactcaga g(配列番号：23)］を用いた。  ハイブリダイゼーションの前に、プローブは10分間煮沸し、５分間、ドライアイス/エタノールで急速凍結処理しておいた。
【００６９】
まず、転写後のメンブレンを、２×SSCに５分間浸し、ExpressHybハイブリダイゼーション溶液(クローンテック)の10mlで、65℃にて、30分間プレハイブリダイゼーションを行った。  次いで、凍結処理したプローブを、ExpressHybハイブリダイゼーション溶液で10ng/mlとなるように希釈し、この溶液の２mlを用いて、65℃で、１時間ハイブリダイゼーションを行った。
【００７０】
ハイブリダイゼーション後のメンブレンの洗浄は、２×SSC、0.1％SDS溶液20mlで、室温にて、５分間ずつ２回振盪し、続いて、0.2×SSC、0.1％SDS溶液20mlで、65℃で、15分間ずつ２回振盪しながら行った。  SDSを除去するために、DIG緩衝液Ｉ(100mM Tris-HCl、150mM NaCl（pH 7.5))50mlで、室温にて、１分間、２回洗浄し、次に、DIG緩衝液II'(1.5％ブロッキング剤、DIG緩衝液Ｉ)50mlで、室温にて、１時間ブロッキングを行った。  次いで、0.2％Tween20を含むDIG緩衝液Ｉで5000倍に希釈しておいた抗DIGアルカリホスファターゼ標識抗体10mlで30分間処理し、0.2％Tween20を含むDIG緩衝液Ｉを50ml用いて、室温にて、20分間、振盪しながら洗浄を２回行った。  10mlのDIG緩衝液IIIに、室温にて、３分間、２回浸した後、メンブレンをハイブリバックに移し、DIG緩衝液IIIで100倍に希釈しておいたCSPD(登録商標、ベーリンガー・マンハイム、化学発光基質)を、全体にゆきわたるように延ばし、インスタントフィルムＴ612(ポラロイド)上で感光させた。
【００７１】
この結果、図３の各レーンに示されるように、各制限酵素で処理したゲノムＤＮＡより、それぞれ１〜２個のシグナルしか検出されなかったので、得られた本願発明のポリペプチドをコードする遺伝子が、シングルコピー遺伝子であることが推測された。
【００７２】
実施例４：ヒトの組織における発現分布解析
本願発明のポリペプチドのｍＲＮＡの生体組織での発現性を、RT-PCR法を用いて解析を行った。
【００７３】
まず、以下の表４に記載の種々の生体組織(臓器)を準備した。  なお、レーン10に記載の大腸の組織は、オリジーンテクノロジーズ社から購入したものである。  これら生体組織に由来するＲＮＡを鋳型とし、RNA LA PCRキット(AMV)Ver.1.1(宝酒造)を用いて、RT-PCR法を実施した。
【００７４】
【表４】
2014166999.tif 000005
【００７５】
まず、以下の表５に記載の反応組成(蒸留水で全量を20μlに調製したもの)で、逆転写反応を行った。
【００７６】
【表５】
2014166999.tif 000006
【００７７】
なお、逆転写酵素を含まない反応組成を、ネガティブコントロールとして調製した。
【００７８】
上記反応液を、0.2mlチューブに入れ、TaKaRa PCRサーマルサイクラーPERSONAL(宝酒造)で、42℃で、30分間；99℃で、５分間；５℃で、５分間の１サイクルでPCRを行った。  得られたPCR産物を用いて、続いて以下の表６に記載の反応組成で、LA PCRを行った。
【００７９】
【表６】
2014166999.tif 000007
【００８０】
得られたポリペプチドのcDNA配列のネック領域から糖認識構造様領域を増幅できるようなプライマー２種類(RT-PCRプライマーＵ：５'-gtgcccctggccctgcagaatg-３'(配列番号：24）、RT-PCRプライマーＲ：５'-gcatatcaccctggggaacattttag-３'（配列番号：25）を0.2μM加え、全量が80μlになるように滅菌蒸留水で調製した。
【００８１】
PCRは、94℃で、２分間の１サイクルに続いて、94℃で、30秒間；60℃で、30秒間；72℃で、１分30秒間からなるサイクルを50サイクル行った。  反応生成物を、１％アガロースゲル電気泳動により分離し、エチジウムブロマイド溶液(0.1μg/ml)で染色を行い、トランスイルミネーターで泳動パターンを確認し、発現組織を同定した。
【００８２】
また、各組織での発現量を比較するために、各組織でβ-アクチン遺伝子の一部分を増幅させるRT-PCRを行い、RNAの補正を行った。  この方法は、上記した手法と同様に、逆転写反応、PCR反応を行い、上記した手法と同様にして、１％アガロースゲル電気泳動を用いて判定を行った。  逆転写反応の組成(蒸留水で全量を60μlに調製したもの)は、以下の表７に記載の通りであった。
【００８３】
【表７】
2014166999.tif 000008
【００８４】
PCRは、30℃で、10分間；42℃で、15分間；99℃で、５分間；５℃で、５分間の１サイクルを行った。
【００８５】
得られたPCR産物を用いて、続いて、以下の表８に記載の反応組成(蒸留水で全量を40μlに調製したもの)でPCR反応を行った。
【００８６】
【表８】
2014166999.tif 000009
【００８７】
PCRは、94℃で、15秒間；68℃で、30秒間からなるサイクルを、30サイクル行った。
【００８８】
この結果を、図４に示すが、本願発明のポリペプチドのmRNAが、胎盤(レーン９)、脾臓(レーン４)、腎臓(レーン３)で発現しており、特に、胎盤での発現が高いことが明らかとなった。
【００８９】
実施例５：ゲノミックサザン分析
本願発明のポリペプチドの発現をコードする遺伝子が、ヒト以外の動物種において保存されているか否かを明らかにするために、ゲノミックサザン分析を実施した。
【００９０】
ハイブリダイゼーション用プローブとしては、前述したオープンリーディングフレームに相当する部分を、PCR DIGプローブ合成キット(ベーリンガー・マンハイム)を用いてDIGラベルしたDNAプローブを用いた。  また、メンブレンには、以下の表９に記載の動物に由来するゲノムＤＮＡの各５μｇを、制限酵素EcoRIで処理し、アガロースゲルで電気泳動した後に、ナイトラン13Ｎメンブレンに転写し、紫外線照射により固定処理を施したものを用いた。
【００９１】
【表９】
2014166999.tif 000010
【００９２】
以上のプローブとメンブレンを用いて、ハイブリダイゼーションを行った。
【００９３】
まず、２×SSCにメンブレンを５分間浸し、10mlのExpressHybハイブリダイゼーション溶液中で、65℃で、30分間プレハイブリダイゼーションを行った。  次いで、同様に凍結処理されたプローブを、ExpressHybハイブリダイゼーション溶液で10ng/mlとなるように希釈し、この溶液２mlを用いて、65℃にて１時間ハイブリダイゼーションを行った。
【００９４】
ハイブリダイゼーション後のメンブレンの洗浄は、２×SSC、0.1％SDS溶液20mlで、室温で、５分間、２回振盪し、続いて、0.2×SSC、0.1％SDS溶液20mlで、68℃で、15分間ずつ、２回振盪しながら行った。  SDSを除去するために、DIG緩衝液Ｉで、室温で、１分間、２回洗浄し、次に、50mlのDIG緩衝液II'で、室温で、１時間、ブロッキングを行った。
【００９５】
次いで、0.2％Tween20を含むDIG緩衝液Ｉで5,000倍に希釈しておいた抗DIGアルカリホスファターゼ標識抗体を10ml用いて、30分間処理し、0.2％Tween20を含むDIG緩衝液Ｉを50ml用いて、室温で、20分間、振盪しながら洗浄を２回行った。  10mlのDIG緩衝液IIIに、室温で、３分間、２回浸した後に、メンブレンをハイブリバックに移し、DIG緩衝液IIIで100倍に希釈しておいたCSPDを、全体にゆきわたるように延ばし、インスタントフィルムＴ612上で感光させた。
【００９６】
この結果を、図５に示す。  図５において、ニワトリ(レーン８)を除くすべての動物種において明瞭なシグナルが認められることから、本願発明のポリペプチド遺伝子は、哺乳類において保存されていることが明らかとなった。
【００９７】
実施例６：遺伝学的解析
本願発明のポリペプチドの発現をコードする遺伝子の構成ＤＮＡ配列に基づいて、既知のコレクチンとの遺伝的位置付けを明らかにするために解析を行い、遺伝的系統樹(図６)を作成した。
【００９８】
解析の対象としたコレクチンは、図６に示す各種コレクチンファミリーのタンパク質である。  なお、図６に記載の「ＣＬ-Ｌ１」とは、本発明者らが単離したヒト肝臓由来のコレクチンである(特開平11−206377号公報を参照されたい）。
【００９９】
具体的には、GenBankデータベースから各アミノ酸配列を検索して得られたデータをもとにして、レクチンドメインを含む領域を用いてclustalw法でマルチプル・アラインメントを作成した。  そして、それらをもとにして、Ｎ-Ｊ法(ネイバー-ジョイニング法)を用い、フィリップバージョン３.５７ｃパッケージプログラムを用いて遺伝的系統樹を作成した。
【０１００】
ＳＰ-Ｄ、ウシＣＬ-４３およびウシコングルチニンで独立したクラスターが形成されており、さらに、ＭＢＰおよびＳＰ-Ａで、それぞれ別々にクラスターを形成していたが、本願発明のポリペプチドの発現をコードする遺伝子は、ＣＬ-Ｌ１と同様に、これらのいずれのクラスターにも属していないことが示された。  また、本願発明のポリペプチドはＣＬ-Ｌ１とも異なる、従来報告されているコレクチンとは遺伝的に別のクラスターを形成するものと推測された。
【０１０１】
実施例７：発現ベクターの構築
まず、配列番号：20に記載の塩基配列で表現される遺伝子の開始コドンから終止コドンまでを、aaggaaaaaa gcggccgcat gcaacaagat ttgatgaggの塩基配列(配列番号：26)からなるプライマーと、gctctagatt ataatgcaga tgacagtacの塩基配列(配列番号：27)からなるプライマーを用いて、ザイモリアクター(アトー)で増幅させる。
【０１０２】
得られたポリペプチドのcDNAを、制限酵素NotIとXbaIで消化して、本願発明のポリペプチドのcDNAでの対応する部分(配列番号：20に記載の塩基配列での第670位〜第1698位のヌクレオチド)を取得して、これを挿入体とする。
【０１０３】
次に、特開平10−179169号公報に記載の発現ベクターpNOW/CMV-Aを、制限酵素NotIとXbaIで消化して、サイトメガロウイルスプロモーター(pCMV)の下流、すなわち、PCMV(サイトメガロウイルス初期主要抗原プロモーター)とBGPポリＡ(ウシ成長ホルモンポリアデニレーションシグナル)との間に、前述した挿入体を、ＤＮＡライゲーションキット(宝酒造)を用いて挿入する。  このようにして得られた発現ベクターを、プラスミドpNOW１-hCL-P1と命名し、その構造の模式図を図７に示す。
【０１０４】
実施例８：生産クローンの選択
(１) 宿主細胞へのプラスミドpNOW１-hCL-P１の導入
ウシ胎児血清(FCS、GIBCO社)を10％添加したIscove's Modified Dulbecco's Medium(IMDM)と、ヒポキサンチンとチミジンを含まない培地(GIBCO)を調製し、これにDHFR遺伝子が欠損した(dhfr−)DG44チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞株を、１×10５細胞／mlになるように混合し、このものを直径60mmのディッシュに播種し、37℃で、５％炭酸ガス(CO２)の条件下で、24時間培養する。
【０１０５】
培養上清を廃棄し、その代わりに別途予め、５μｇのＤＮＡ(プラスミドpNOW１-hCL-P１)を、リポフェクチン溶液(DOTAPリポソーム型トランスフェクション試薬；ベーリンガーマンハイム)に混合して得た溶液100μlを含む10％FCS添加IMDMを加えて６mlとし、さらに、ヒポキサンチン(終濃度10nM)(GIBCO)とチミジン(終濃度100nM)(GIBCO)を加え、16時間培養し、dhfr−の宿主CHO細胞へのプラスミドpNOW１-hCL-P１の導入を行う。  その後、培養上清を廃棄し、10％FCS、ヒポキサンチン、チミジン添加IMDMの６mlを加えてから、さらに24時間培養を行う。
【０１０６】
(２) ネオマイシン(Ｇ418)耐性ＣＨＯ細胞の取得
プラスミドpNOW１-hCL-P１が導入された細胞を24時間培養した後、これをトリプシン処理してディッシュから回収し、細胞数を計測した後、１×10５細胞／mlになるように400μg/mlの濃度のネオマイシン(Ｇ418)を含む10％FCS添加IMDMで細胞を懸濁したものを、0.1ml/ウェルの量で96ウェルのマイクロプレート10枚に播種(分注)する。  37℃で、５％炭酸ガス(CO２)の条件下で培養し、２週間後の生存細胞をＧ418耐性細胞(クローン)として取得する。
【０１０７】
これらＧ418耐性クローンを、本願発明のポリペプチドの産生性について確認する。
【０１０８】
本願発明のポリペプチドの産生が確認されたクローンの内から幾つかを選択し、各クローンを、25cm２のカルチャーフラスコに播種する。  細胞が密集するまで(約３×10６細胞/25cm２カルチャーフラスコになるまで)培養を行う。  それぞれのカルチャーフラスコの培養上清を廃棄し、前出のものと同じ組成の10％FCS添加IMDMを２ml加え、４日間培養し、その培養上清を回収する。  回収した培養上清に含まれている本願発明のポリペプチド(rhCL-P１：組換えヒトポリペプチド)の産生量を測定する。
【０１０９】
なお、本願発明のポリペプチドの産生量は、Y. Suzuki, et al., "Characterization of Recombinant Bovine Conglutinin Expressed in a Mammalian Cell", Biochem. Biophys. Res. Commun., vol.238, pp.856-863 (1997) に記載の方法に準じて定量する。  具体的には、本願発明のポリペプチドの産生量は、この文献に記載の方法に従って大腸菌で発現させた本願発明のポリペプチド、コレクチンの糖認識領域(ＣＲＤ)とネック領域(同様の方法を用いて大腸菌で発現させたもの)に対する抗ウサギポリクローナル抗体、それに、本願発明のポリペプチド(定量対象)を用いて、同文献に記載の手順に従って定量を行う。
【０１１０】
(３) メトトレキセート耐性のＣＨＯ細胞の取得
実施例８(２)で得られた本願発明のポリペプチドを産生するクローンをさらに継代培養して安定化させた後、低濃度のメトトレキセート(ＭＴＸ)を培地に加えて、遺伝子増幅を行う。
【０１１１】
まず、５nM MTX、400μg/mlのＧ418を加えた10％透析済FCS(JRHバイオサイエンス)を添加したIMDMに、選択した各細胞クローンを混合し、0.1ml/ウェルの量を96ウェルのマイクロプレート10枚に播種(分注)する。  37℃で、５％炭酸ガス(CO２)の条件下で培養を行い、２週間後の生存細胞を、５nM MTX耐性細胞(クローン)として取得する。
【０１１２】
これら５nM MTX耐性のクローンを、本願発明のポリペプチド産生性について確認する。
【０１１３】
本願発明のポリペプチドの産生が確認されたクローンから幾つかのクローンを任意に選択し、その各々を、25cm２のカルチャーフラスコに播種し、細胞が密集するまで２週間培養する。  培養上清を廃棄し、前述したものと同じ組成の10％FCS添加IMDM(５nM MTX、400μg/ml Ｇ418を加えたもの)を２ml加え、４日間培養し、その培養上清を回収し、本願発明のポリペプチドの産生レベルを確認する。
【０１１４】
(４) 本願発明のポリペプチドの産生量の定量
本願発明のポリペプチド100μｇをPBS(-)(カルシウムイオンおよびマグネシウムイオンを含まないPBS)100μlに溶解したものと、完全フロイントアジュバンド100μlとを混合して、エマルジョンを調製し、２匹のBALB/cマウス(雌性、８週齢)の腹腔内に注射する。
【０１１５】
３週間後、同様にして２回目の免疫を行う。  ただし、完全フロイントアジュバンドの代わりに、不完全フロイントアジュバンドを用いる。
【０１１６】
さらに２週間後に、血清を採取して、その抗体価を測定する。  抗体価が最高のマウスを選び、一週間後に、２回目と同様にして最終免疫を行う。  最終免疫の５日後に、脾臓を採取して、細胞浮遊液を調製する。  細胞融合は、２×10７個の骨髄腫細胞ＮＳ-１細胞と１×10８個の調製した脾細胞とを混合して行う。  混液を、1,600rpmで、６分間、室温で遠心分離した後に、上清を除去し、残った細胞をほぐしたところに、ポリエチレングリコニル(PEG)を１ml、１分間かけて添加し、室温で、１分間攪拌する。  その後、予め37℃で保温しておいた基本培地(イスコフ培地、15％FCS、２mM Ｌ-グルタミン溶液、0.05mM ２-メルカプトエタノール)１mlを、１分間かけて滴下しながら軽く混ぜる。  この操作をもう一度繰り返した後に、今度は、その８mlを３分間かけて同様の操作を行う。  その後、1,000rpmで、５分間、室温で遠心分離することによって、PEGを除去する。
【０１１７】
ペレットをほぐし、そこへ５×10６個/mlの胸腺細胞浮遊液(ＨＡＴを含むハイブリドーマ増殖培地に浮遊させたもので、ハイブリドーマ形成率を高めるフィーダー細胞として使用する液)の100mlを加えて浮遊液を調製した。  この浮遊液を、96穴プレートに0.1mlずつ播き、炭酸ガス(CO２)インキュベーターにて、37℃、５％炭酸ガスで培養を行う。
【０１１８】
ハイブリドーマの選択は、以下のようにして行う。
【０１１９】
培養開始１日後、各ウェルにHAT培地(HATを含むハイブリドーマ増殖培地)150μｌを添加した後、引き続き、２日間培養する。  ２日後に、培地の150μlを除去し、そこへHAT培地150μlを添加して培地交換を行い、さらに３日および７日間の培養後も、同様に培地交換を行う。  その４日後、培養上清100μlを採取し、本願発明のポリペプチドに対する抗体価を測定してスクリーニングを行う。  次に、抗体陽性細胞を、パスツールピペットを用いて、96穴プレートから24穴マルチプレートに移す。  この時、各ウェルに予め0.5mlのHT培地(ヒポキサンチンおよびチミジンを含むハイブリドーマ増殖用培地)を添加しておく。
【０１２０】
３日間培養した後に、培地を一部採取し、抗体価を再測定した結果、抗体陽性と判断できる細胞を、クローニングおよび凍結保存する。  クローニングは、陽性細胞を胸腺細胞浮遊液で限界希釈して１個/mlに調製し、96穴マルチプレートに0.2mlずつ播く。  10日間培養した後に、１ウェルに１個だけコロニーを形成しているクローンの抗体価を測定し、高い抗体価が示されたもの２個を選択する。
【０１２１】
この２つのコロニーについて、再クローニングを行う。  方法は、１回目のクローニングと同様の方法で行う。  抗体陽性細胞は、続いて培養拡大を行う。  まず、24穴マルチプレートに移した後、３日間かけて培養を行った後、25cm２のフラスコに移し、さらに３日後、225cm２のフラスコに移して培養をさらに３日間続け、培養上清を回収することによって、モノクローナル抗体を調製する。
【０１２２】
また、腹水からのモノクローナル抗体の製造は、クローニングを行ったハイブリドーマを、１×10７個/mlに調製し、マウス１匹当たりに１mlを腹腔内に注射して行う。  １週間後、腹部の肥大したマウスを、エーテルで麻酔し、腹水を採取する。  血清分離剤の入った凝固促進型遠心管に腹水を移し、室温で、30分間放置した後に、3,000rpmで、５分間遠心する。  上部の腹水を回収し、さらに、硫安塩析で精製して抗体を得る。
【０１２３】
こうして得られた抗体(抗マウス抗ヒトポリペプチド抗体)を、コーティングバッファー(50mM炭酸-炭酸水素バッファー、pH 9.6)で10μg/mlに希釈し、この抗体液を、96穴ELISAプレートに100μlずつ分注する。  その後、４℃で、一晩インキュベーションする。  洗浄液(TBS/T液(25mM Tris-HCl、0.14M NaCl、５mM KCl、0.05％Tween20, pH 7.4))300μlで、３回洗浄する。  その後の洗浄も、同様にして行う。  ５％スキムミルク/TBS/T液の300μlを分注し、37℃で、１時間静置する。  洗浄後、被験試料および本願発明のポリペプチド標準品の各々の100μlを分注し、37℃で、１時間静置する。  この際に、被験試料を適当に希釈し、標準品は、0.02μg/mlを最高濃度として、２倍連続希釈列を用いる。  洗浄後、１μg/mlのビオチン化抗ウサギ抗ヒトポリペプチド抗体100μlを分注し、37℃で、１時間静置する。  洗浄後、ビオチンストレプトアビジン液100μlを分注し、37℃で、30分間静置する。  さらに洗浄後、3, 3', 5, 5'-テトラメチルベンチジン溶液100μlを分注し、30分間、室温にて放置した後、１Ｎリン酸100μlを添加することにより、反応を停止し、波長450nmで吸光度の測定を行う。
【０１２４】
この方法を用いて標準品により検量線を作成し、本願発明のポリペプチドの産生量を定量する。
【０１２５】
実施例９：虚血性疾患の発症メカニズムに対するポリペプチドの関連性
心筋梗塞などの血管虚血性疾患の後に血液を再灌流することで、好中球などの炎症性細胞の活性化や活性酸素の発生などの様々な障害が、局所的に起こる。  この状況を再現した動物モデルとして、ラットやマウスを用いた虚血／再灌流モデルがあり、これら障害のメカニズムを明らかにするための研究において、このモデルは、よく利用されている。
【０１２６】
そこで、ラットの頸動脈に関する虚血／再灌流モデルを用いて、血液を再灌流後の本願発明のポリペプチドの動態について検討を行った。
【０１２７】
まず、ラット(雌性、８週齢)の頸動脈を、30分間虚血状態にした後に、血液を再灌流した時の経時的な本願発明のポリペプチドの発現に関与するmRNAの発現およびそのタンパク質の発現について検討を行った。  その結果、図８に示したように、頸動脈内皮の本願発明のポリペプチドの発現は、mRNAレベルで48時間から亢進し、72時間後に頂点に至り、そして、120時間後には通常の発現レベルに戻っていた。  免疫組織染色によって、血管内皮細胞に発現する本願発明のポリペプチドをタンパク質レベルで観察したところ、３日後から発現が亢進し、７日目をピークに、以後14日後においても、その発現性が維持されていることが明らかになった。  同一個体で虚血／再灌流を行わなかった反体側の頸動脈(コントロール)では、その発現の亢進は認められなかった。
【０１２８】
また、頸動脈に関するin vitroの虚血／再灌流モデルである血管内皮細胞HUVECsを用いた低酸素暴露／再酸素化のモデルにおいても、同様の結果が認められた。  すなわち、図９に示した結果からも明らかなように、30分間の低酸素暴露を行った後に再酸素化して72時間後にあっても、発現の亢進が認められていた。
【０１２９】
虚血後の再灌流などの血管刺激によって、その発現が亢進するなど、本願発明のポリペプチドの機能が出現することが示唆された。  それ故に、図10に示した結果からも実証されているように、発現亢進時に、そのリガンドである変性低比重リポタンパク(変性LDL)や酸化低比重リポタンパク(酸化LDL)を添加し、その動態を観察したところ、本願発明のポリペプチドの発現部位において結合し、さらに、細胞内部へ取り込まれることが明らかとなった。
【０１３０】
このことから、本願発明のポリペプチドは、恒常的な発現レベルではその機能を示さないが、刺激により局所で発現誘導がおこり、その発現が亢進することで、その機能を発揮するものと考えられる。  例えば、本願発明のポリペプチドは、動脈硬化を引き起こす酸化LDLを取り込み、そして、動脈硬化発症へ導く可能性が考えられる。  このような場合に、本願発明のポリペプチドの細胞外領域やそのリガンドとの結合ドメインのポリペプチドなどを投与することで、その取り込み作用を抑え、動脈硬化をはじめ種々の血管障害を阻害することが可能であると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【０１３１】
本願発明のポリペプチドは、虚血性疾患、特に、動脈硬化に起因する疾患の発症メカニズムの解明に寄与し、また、それら疾患の予防および治療の用途に好適な試薬や医薬の開発のために有効に利用できる。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図６】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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