(57)【要約】【課題】十分な標的結合性を有する新規二重特異性抗体を提供する。【解決手段】EphA10に対する第一の特異性、及び、細胞障害活性を有する細胞で発現される表面抗原に対する第二の特異性、を有することを特徴とする。細胞障害活性を有する細胞は細胞障害性Ｔ細胞である。細胞障害性Ｔ細胞で発現される抗原はCD3である。二重特異性抗体の構造がタンデム型である。【選択図】図１
2014162739.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
EphA10に対する第一の特異性、及び、細胞障害活性を有する細胞で発現される表面抗原に対する第二の特異性、を有することを特徴とする二重特異性抗体。
【請求項２】
前記細胞障害活性を有する細胞が細胞障害性Ｔ細胞であることを特徴とする請求項１に記載の二重特異性抗体。
【請求項３】
前記細胞障害性Ｔ細胞で発現される抗原がCD3であることを特徴とする請求項２に記載の二重特異性抗体。
【請求項４】
二重特異性抗体の構造がタンデム型であることを特徴とする請求項１乃至３の何れか１項に記載の二重特異性抗体。
【請求項５】
配列番号47のDNA配列を含む組換えベクターを用いた哺乳類発現系により作製されたことを特徴とする請求項１乃至４の何れか１項に記載の二重特異性抗体。
【請求項６】
配列番号48のDNA配列を含む組換えベクターを用いた哺乳類発現系により作製されたことを特徴とする請求項１乃至４の何れか１項に記載の二重特異性抗体。
【請求項７】
配列番号49のDNA配列を含む組換えベクターを用いた哺乳類発現系により作製されたことを特徴とする請求項１乃至４の何れか１項に記載の二重特異性抗体。
【請求項８】
配列番号50のDNA配列を含む組換えベクターを用いた哺乳類発現系により作製されたことを特徴とする請求項１乃至４の何れか１項に記載の二重特異性抗体。
【請求項９】
請求項１乃至８の何れか１項に記載の二重特異性抗体を有効成分として含有することを特徴とする医薬組成物。
【請求項１０】
乳癌の治療に用いられることを特徴とする請求項９に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、所定のエフリン受容体に対する第一の特異性、及び、細胞障害活性を有する細胞で表面抗原に対する第二の特異性、を有する二重特異性抗体に関する。また、このような二重特異性抗体を有する医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
モノクローナル抗体(mAb)は、疾患特異的分子への結合性に加え、マクロファージやNK細胞による効率的な殺傷能を持つことから、癌治療薬として広く利用されている。近年、抗癌活性の増強を目的に天然型の構造が改変された人工抗体が開発され、治療効果の向上が検討されている。
【０００３】
特に、２種の抗原を標的可能な二重特異性抗体（Bispecific 抗body(BsAb)）は、２つの異なる抗原に対して特異的に結合することが可能であるため、この特性を生かして特異的な抗腫瘍効果を持った治療薬としての癌特異的免疫療法が可能であるとして、その研究が盛んに行われている（非特許文献１）。
【０００４】
癌特異的免疫療法は、癌細胞にのみ細胞傷害活性が働く治療法のことを指す。抗体と細胞傷害活性を示す薬物とを結合させ、薬物に標的指向性を持たせるもので、現在ではミサイル療法とも呼ばれる。現在、癌細胞において異常に発現している物質または細胞の癌化に伴い多少の変化が起こる物質を標的にして、副作用を最小限にして抗体の能力を発揮できる抗原を使用するといった方向で、二重特異性抗体の研究が進められている。
【０００５】
例えば、特許文献１には、癌関連抗原の一種であり腺細胞上に多く見られる糖蛋白質であるMUC1に対する抗体と抗CD3抗体に由来する二重特異性を有し、更に、細菌性エンテロトキシン等のスーパー抗原が抗体の可変領域と同一のポリペプチドに含まれている、融合タンパク質が記載されている。
【０００６】
また、特許文献２には、ヒトCD19に対する第一の特異性及びヒトCD16に対する第一の特異性を素なる二重特異性抗体が記載されている。
【０００７】
また、特許文献３には、VEGFR-2/KDRに対する中和抗体TTAC0001の重鎖または軽鎖のＮ−末端に水溶性リガンドが融合された二重標的抗体、及び、この二重標的抗体を含む癌治療のための薬学的組成物が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第０２／０６４８６号
【特許文献２】特表２００５−５１７３９２号公報
【特許文献３】特表２０１２−５２７２３４号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Hollinger,et al., Proc. Natl. Acad.Sci. USA 90, 6444-6448, 1993
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかし、上述の文献に記載された二重特異性抗体を用いる医薬組成物では、期待された治療効果が十分でないケースがあり、抗癌活性を増強させた新規抗体医薬の開発が期待されている。
【００１１】
本発明はかかる問題点に鑑みてなされたものであって、十分な標的結合性を有する新規二重特異性抗体、及び、そのような二重特異性抗体を用い、抗癌活性を増強させた新規医薬組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明にかかる二重特異性抗体は、EphA10に対する第一の特異性、及び、細胞障害活性を有する細胞で発現される表面抗原に対する第二の特異性、を有することを特徴とする。
【００１３】
本発明にかかる医薬組成物は、本発明にかかる二重特異性抗体を有効成分として含有することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、十分な標的結合性を有する新規二重特異性抗体が得られる。また、そのような二重特異性抗体を用いた抗癌活性を増強させた新規医薬組成物が得られる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本実施形態にかかる二重特異性抗体の概要を示す図である。
【図２】pTOPO mOKT3 HC(No.1)の配列を説明する図である。
【図３】pTOPO mOKT3 LC(No.2)の配列を説明する図である。
【図４】pTOPO 38.1 HC(No.3)の配列を説明する図である。
【図５】pTOPO 38.1 LC(No.4)の配列を説明する図である。
【図６】pET20b EphA10 scFv(No.7)の配列を説明する図である。
【図７】pET20b EphA10 scFv(No.7)の概要を説明する図である。
【図８】pET20b mOKT3 scFv(No.8)の配列を説明する図である。
【図９】pET20b mOKT3 scFv(No.8)の概要を説明する図である。
【図１０】pET20b 38.1 scFv(No.9)の配列を説明する図である。
【図１１】pET20b 38.1 scFv(No.9)の概要を説明する図である。
【図１２】pET20b taFv(EphA10 x mOKT3)(No.10)の配列を説明する図である。
【図１３】pET20b taFv(EphA10 x mOKT3)(No.10)の概要を説明する図である。
【図１４】pET20b taFv(mOKT3 x EphA10)(No.11)の配列を説明する図である。
【図１５】pET20b taFv(mOKT3 x EphA10)(No.11)の概要を説明する図である。
【図１６】pET20b taFv(EphA10 x 38.1)(No.12)の配列を説明する図である。
【図１７】pET20b taFv(EphA10 x 38.1)(No.12)の概要を説明する図である。
【図１８】pET20b taFv(38.1 x EphA10)(No.13)の配列を説明する図である。
【図１９】pET20b taFv(38.1 x EphA10)(No.13)の概要を説明する図である。
【図２０】pET20b taFv(mOKT3 x EphA10)(No.11)の結合活性を確認する図であり、そのうち（ａ）はMDA-MB-435(p16発現乳癌細胞株)(-)であり、（ｂ）はMDA-MB-435(EphA10+)であり、（ｃ）はJurkatである。
【図２１】pcDNA3.1 taFv(EphA10 x mOKT3)(No.14)の配列を説明する図である。
【図２２】pcDNA3.1 taFv(EphA10 x mOKT3)(No.14)の概要を説明する図である。
【図２３】pcDNA3.1 taFv(mOKT3 x EphA10)(No.15)の配列を説明する図である。
【図２４】pcDNA3.1 taFv(mOKT3 x EphA10)(No.15)の概要を説明する図である。
【図２５】pcDNA3.1 taFv(EphA10 x 38.1)(No.16)の配列を説明する図である。
【図２６】pcDNA3.1 taFv(EphA10 x 38.1)(No.16)の概要を説明する図である。
【図２７】pcDNA3.1 taFv(38.1 x EphA10)(No.17)の配列を説明する図である。
【図２８】pcDNA3.1 taFv(38.1 x EphA10)(No.17)の概要を説明する図である。
【図２９】pcDNA3.1 taFv(EphA10 x mOKT3)(No.14)及びpcDNA3.1 taFv(mOKT3 x EphA10)(No.15)の結合活性を確認する図であり、そのうち（ａ）はMDA-MB-435(p16発現乳癌細胞株)(-)であり、（ｂ）はMDA-MB-435(EphA10+)であり、（ｃ）はJurkatである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、添付の図面を参照して本発明の実施形態について具体的に説明するが、当該実施形態は本発明の原理の理解を容易にするためのものであり、本発明の範囲は、下記の実施形態に限られるものではなく、当業者が以下の実施形態の構成を適宜置換した他の実施形態も、本発明の範囲に含まれる。
【００１７】
図１は、本実施形態にかかる二重特異性抗体の概要を示す。図１に示されるように、本実施形態にかかる二重特異性抗体は、EphA10に対する第一の特異性、及び、細胞障害活性を有する細胞で発現される表面抗原に対する第二の特異性、を有する。
【００１８】
二重特異性抗体の構造は、第一の抗体のＨ鎖の可変領域の抗原結合部位及び第一の抗体のＬ鎖の可変領域の抗原結合部位を同一のペプチド鎖上に有する第一のポリペプチドと、第二の抗体のＨ鎖の可変領域の抗原結合部位及び第二の抗体のＬ鎖の可変領域の抗原結合部位を同一のペプチド鎖上に有する第二のポリペプチドと、を連結させたタンデム型のscFvとすることが好適である。
【００１９】
なお、二重特異性抗体の構造は、第一の抗体のＨ鎖の可変領域の抗原結合部位及び第二の抗体のＬ鎖の可変領域の抗原結合部位を同一のペプチド鎖上に有する第一のポリペプチドと、第一の抗体のＬ鎖の可変領域の抗原結合部位及び第二の抗体のＨ鎖の可変領域の抗原結合部位を同一のペプチド鎖上に有する第二のポリペプチドと、を連結させたダイアボディ型とすることも可能である。
【００２０】
細胞障害活性を有する細胞は、特に限定されるものではないが、例えばNK細胞、マクロファージ等のＴ細胞である。このＴ細胞で発現される抗原は、特に限定されるものではないが、例えばCD3, CD2, CD4, CD5, CD6, CD8, CD16, CD28, CD44などが挙げられ、好ましくは細胞障害性Ｔ細胞で発現されるCD3である。
【００２１】
このような表面抗原に対するモノクローナル抗体としては、当業者に公知のOKT3, 38.1,T3, Leu4, T11, OKT11, NU-T1, T4, OKT4, Leu3a, NU-TH/I, T8, OKT8などが挙げられ、好ましくはOKT3, 38.1などが挙げられる。
【００２２】
EphA10はエフリン受容体の一種である。EphA10にはアイソフォームが３つあり、isoform 1は全長からなるタンパク質であり（GenBank AccessionNo. AJ872185）、isoform 2は、細胞外ドメインのみ（GenBank Accession No. AJ872185）、isoform 3はisoform 1において細胞内Ｃ末端のSAMドメインが欠失したもの（GenBank Accession No. AJ872185）である。
【００２３】
本発明者らがEphA10について解析を行った結果、EphA10は乳癌患者のほぼ半数（約４９％）でタンパク質の発現が認められ、Her-2陰性患者のほぼ半数（約４４％）でタンパク質発現が認められている。更には、トリプルネガティブ症例における約６７％においてタンパク質発現が認められている。また、EphA10は、胃癌、前立腺癌、及び大腸癌等においても発現が認められている。
【００２４】
タンデム型の二重特異性抗体では、第一の抗体のＨ鎖の可変領域の抗原結合部位と第一の抗体のＬ鎖の可変領域の抗原結合部位とがリンカーにて連結されて第一のポリペプチドを形成しており、また、第二の抗体のＨ鎖の可変領域の抗原結合部位と第二の抗体のＬ鎖の可変領域の抗原結合部位とがリンカーにて連結されて第二のポリペプチドを形成しており、第一のポリペプチドと第二のポリペプチドとがリンカーにて連結されている。
【００２５】
ダイアボディ型の二重特異性抗体では、第一の抗体のＨ鎖の可変領域の抗原結合部位と第二の抗体のＬ鎖の可変領域の抗原結合部位とがリンカーにて連結されており、また、第一の抗体のＬ鎖の可変領域の抗原結合部位と第二の抗体のＨ鎖の可変領域の抗原結合部位とがリンカーにて連結されている。
【００２６】
リンカー(linker)は、Ｈ鎖の可変領域（ＶＨ）とＬ鎖の可変領域（ＶＬ）とを結合して一本鎖ポリペプチドを与える働きをするオリゴペプチド又はポリペプチドである。リンカーは、二つのポリペプチドを機能的に結合せしめて一つの一本鎖ポリペプチドを与えることのできるものであれば特に限定されず、公知のリンカーから選択して使用することが可能である。リンカーは、例えば１〜約50個のアミノ酸からなるペプチドであってよく、好ましくは約２〜20個のアミノ酸からなるペプチドである。
【００２７】
本実施形態にかかる二重特異性抗体を構成する一本鎖ポリペプチドは、例えば遺伝子工学的手法を用いて製造することができる。遺伝子工学的手法としては、例えばクローニングベクター又は発現ベクターを作製し、このベクターで宿主細胞を形質転換せしめ、該形質転換された宿主細胞を培養して宿主細胞中で該核酸を発現せしめ、それを回収し、精製することによって製造できる。ベクターは、プラスミド、ファージ粒子、あるいは単純にゲノムの挿入体(genomic insert)等の任意の形態が可能である。
【００２８】
宿主細胞としては当業者に公知の任意の細胞を使用することができ、例えば、大腸菌(E. coli)等の原核細胞、及び、チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO細胞)、ヒト由来細胞などの哺乳動物細胞等を挙げることができる。
【００２９】
精製操作は公知の方法を適宜組み合わせて行うことができる。例えば、遠心分離、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動等によって好適に精製される。
【００３０】
本実施形態にかかる医薬組成物は、本実施形態にかかる二重特異性抗体を有効成分として含有する。かかる有効成分は、以下の実施例に示されているように、EphA10を発現する（陽性）腫瘍細胞を有意に排除・傷害する作用を有している。そのため、本実施形態にかかる医薬組成物はこのような腫瘍細胞に対する抗腫瘍剤（抗癌剤）として使用することが可能である。
【００３１】
本実施形態にかかる医薬組成物は、例えば、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、乳化剤、シロップ、エアロゾールなど経口投与用の剤形、滅菌注射溶液、坐剤および経皮投与用製剤に調製して使用可能である。組成物に含まれ得る担体、賦形剤および希釈剤としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、澱粉、アカシアゴム、アルジネート、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウムおよび鉱物油が挙げられる。必要に応じて、充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤などの希釈剤または賦形剤を用いて調製する。
【００３２】
本実施形態にかかる医薬組成物は、任意の手段を用いて、ヒトをはじめとする動物に直接的に（例えば、注射、皮下注入または組織位置への局所的な投与など局所的に）または全身的に（例えば、非経口または経口的に）提供可能である。本発明にかかる医薬組成物が、非経口、例えば、静脈、皮下、眼、腹腔、筋肉内、口腔、直腸、膣、眼窩内、大脳内、脊髄内、心室内、鞘内、槽内、嚢内、鼻腔内、または噴霧投与によって提供される場合、組成物は、水性または生理適合性である流体懸濁液または溶液を含むことが好ましい。
【００３３】
本実施形態にかかる医薬組成物は、例えば、乳癌、胃癌、前立腺癌、及び大腸癌等の治療に利用されるが、これらに限定されることはない。本実施形態にかかる医薬組成物は、癌患者の腫瘍の進行、例えば、腫瘍の成長、浸潤、転移、再発を防止、抑制または減少させるのに十分な量で投与可能である。有効量は、疾病の重症度および患者自身の免疫系の全体的な状態に依存するものである。好ましい用量は、特に限定されるものではないが、例えば０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇである。
【実施例】
【００３４】
（１）抗CD3抗体(mOKT3, 38.1)の可変領域(VH, VL)のクローニング
抗CD3mAb(OKT3, 38.1)を産生する２種のハイブリドーマから可変領域(Fv)の配列をそれぞれ同定・単離した。ハイブリドーマmOKT3及び38.1から抽出したトータルRNAをもとに、5'-Full RACE Core Set(TKR6122)と下記のプライマーを用いてmOKT3及び38.1の重鎖(HC)、軽鎖(LC)のクローニングを行った。
【００３５】
表１は、マウスOKT3（IgG2b）由来VH, VLのクローニングに用いたプライマーを示す。表２は、38.1（IgM）由来VH, VLのクローニングに用いたプライマーを示す。表３は、mOKT3 & 38.1, κのクローニングに用いたプライマーを示す。
【００３６】
【表１】
2014162739.tif 000003
【００３７】
【表２】
2014162739.tif 000004
【００３８】
【表３】
2014162739.tif 000005
【００３９】
PCRにより増幅した重鎖ならびに軽鎖をTAクローニング法にてクローニングし、下記ベクターを構築した後、配列解析を実施した。
【００４０】
・No.1：pTOPO mOKT3 HC（配列番号16）
・No.2：pTOPO mOKT3 LC（配列番号17）
・No.3：pTOPO 38.1 HC（配列番号18）
・No.4：pTOPO 38.1 LC（配列番号19）
なお、No.1：pTOPO mOKT3 HCの配列を図２に、No.2：pTOPO mOKT3 LCの配列を図３に、No.3：pTOPO 38.1 HCの配列を図４に、No.4：pTOPO 38.1 LCの配列を図５に示す。
【００４１】
（２）抗EphA10一本鎖抗体(scFv)ならびに抗CD3 scFv(mOKT3, 38.1)発現用ベクターの構築
（２−１）抗EphA10抗体の重鎖、軽鎖の配列
クローニングした抗EphA10抗体の重鎖ならびに軽鎖の配列を鋳型としてPCR反応を行った。その配列情報を以下に示す。
【００４２】
・No.5：pTOPO EphA10 IgGHC（配列番号20）
・No.6：pTOPO EphA10 IgGLC（配列番号21）
下記表４は抗EphA10 scFv(VL-G4S-VH)発現ベクターのクローニングに用いたプライマーである。
【００４３】
【表４】
2014162739.tif 000006
【００４４】
鋳型にNo.6のプラスミドを用いて、上記プライマーPとQにてPCRを行った。また同様に、R+S(鋳型：No.5)の組合せでPCR(1stPCR) を行った。
【００４５】
増幅した両DNA断片を混合しPCRの鋳型とした。その後、PおよびSプライマーを用いて2ndPCRを行い、各遺伝子断片をリンカー部位を介して結合させた。
【００４６】
得られたPCR産物を制限酵素NcoI, NotIによって消化後、pET20bベクター(Novagen, 69739-3)に挿入し、抗EphA10scFv(VL-G4S-VH)発現ベクター(No.7:pET20b EphA10 scFv（配列番号26）)を構築した。なお、No.7:pET20bEphA10 scFvの配列を図６に、その概要を図７に示す。
【００４７】
(２−２)抗CD3 scFv(mOKT3, 38.1)発現用ベクターの構築
表５は、抗CD3 scFv(VL-G4S-VH)発現ベクターのクローニングに用いたプライマーである。
【００４８】
【表５】
2014162739.tif 000007
【００４９】
T+U(鋳型：No.2)、V+W(鋳型：No.1)の組合せでPCR(1stPCR)を行った。増幅したDNA断片を鋳型に、TおよびWのプライマーを用いて2ndPCRを行った。制限酵素NcoI, NotIによるdigest後、pET20bベクターに挿入し、抗CD3 scFv(VL-G4S-VH)発現ベクター（No.8：pET20b mOKT3 scFv（配列番号32））を構築した。なお、No.8：pET20bmOKT3 scFvの配列を図８に、その概要を図９に示す。
【００５０】
T+U(鋳型：No.4)、V+X(鋳型：No.3)の組合せでPCR(1stPCR) を行った。増幅したDNA断片を鋳型に、TおよびXのプライマーを用いて2ndPCRを行った。制限酵素NcoI, NotIによるdigest後、pET20bベクターに挿入し、抗CD3 scFv(VL-G4S-VH)発現ベクター（No.9： pET20b 38.1 scFvの（配列番号33））を構築した。なお、No.9： pET20b38.1 scFvの配列を図１０に、その概要を図１１に示す。
【００５１】
ここで、図７、図９、図１１において記号は下記である。
T7 Pro：T7 プロモーター
ATG：開始コドン
TGA：終止コドン
signal peptide：pelB
3L：(G4S)3Linker
His：(His)6
FLAG：DYKDDDDKA
主要制限酵素サイト：NcoI, NotI,XhoI
抗EphA10 mAb：IgG2b, κ
OKT3 mAb：IgG1a, κ
38.1 mAb:IgM,κ
（３）抗EphA10抗体と抗CD3抗体(mOKT3, 38.1)から成るtandem scFv(taFv)型Bispecific抗体の作製(大腸菌発現系)
（３−１）taFv(EphA10 x mOKT3), taFv(mOKT3 x EphA10)発現ベクターの構築
表６は、taFv(EphA10 x mOKT3), taFv(mOKT3 x EphA10)発現ベクターのクローニングに用いたプライマーである。
【００５２】
鋳型にNo.7のプラスミドを用いて、下記プライマーPとYにてPCRを行った。また同様に、W+Z(鋳型：No.8)の組合せでPCR(1stPCR)を行った。
【００５３】
増幅した両DNA断片を混合しPCRの鋳型とした。その後、PおよびWプライマーを用いて2ndPCRを行った。
【００５４】
制限酵素NcoI, NotIによるdigest後、pET20bベクターに挿入し、taFv(EphA10 x mOKT3)発現ベクター（No.10： pET20b taFv(EphA10 x mOKT3)（配列番号38））を構築した。なお、No.10： pET20btaFv(EphA10 x mOKT3)の配列を図１２に、その概要を図１３に示す。
【００５５】
次に、鋳型にNo.8のプラスミドを用いて、下記プライマーTとAAにてPCRを行った。また同様に、S+AB(鋳型：No.7)の組合せでPCR(1stPCR) を行った。
【００５６】
増幅した各DNA断片を鋳型に、T+Sのプライマーを用いて2ndPCRを行った。
【００５７】
制限酵素NcoI, NotIによるdigest後、pET20bベクターに挿入し、taFv(mOKT3 x EphA10)発現ベクター（No.11: pET20b taFv(mOKT3 x EphA10)(配列番号39)）を構築した。なお、No.11: pET20b taFv(mOKT3 x EphA10の配列を図１４に、その概要を図１５に示す。
【００５８】
【表６】
2014162739.tif 000008
【００５９】
（３−２）taFv(EphA10 x 38.1), taFv(38.1 x EphA10)発現ベクターの構築
表７は、taFv(EphA10 x 38.1), taFv(38.1 x EphA10)発現ベクターのクローニングに用いたプライマーである。
【００６０】
鋳型にNo.7のプラスミドを用いて、下記プライマーPとYにてPCRを行った。また同様に、X+Z(鋳型：No.9)の組合せでPCR(1stPCR) を行った。
【００６１】
増幅した各DNA断片を鋳型に、P+Xのプライマーを用いて2ndPCRを行った。
【００６２】
制限酵素NcoI, NotIによるdigest後、pET20bベクターに挿入し、taFv(EphA10 x 38.1)発現ベクター(No.12: pET20b taFv(EphA10 x 38.1)(配列番号41)を構築した。なお、No.12: pET20b taFv(EphA10 x 38.1)の配列を図１６に、その概要を図１７に示す。
【００６３】
次に、鋳型にNo.9のプラスミドを用いて、下記プライマーTとACにてPCRを行った。また同様に、S+AB(鋳型：No.7)の組合せでPCR(1stPCR) を行った。
【００６４】
増幅した各DNA断片を鋳型に、T+Sのプライマーを用いて2ndPCRを行った。
【００６５】
制限酵素NcoI, NotIによるdigest後、pET20bベクターに挿入し、taFv(38.1 x EphA10)発現ベクター（No.13: pET20b taFv(38.1 x EphA10)(配列番号42)）を構築した。なお、No.13: pET20btaFv(38.1 x EphA10)の配列を図１８に、その概要を図１９に示す。
【００６６】
【表７】
2014162739.tif 000009
【００６７】
ここで、図１３、図１５、図１７、図１９において記号は下記である。
T7 Pro：T7 プロモーター
ATG：開始コドン
TGA：終止コドン
signal peptide：pelB
L：(G4S)3Linker
3L：(G4S)3Linker
His：(His)6
主要制限酵素サイト：NcoI, NotI, XhoI
（３−３）taFv型BsAb（No.11）の結合性確認
フローサイトメトリーにより、上述のtaFv(mOKT3 x EphA10)発現ベクター（No.11: pET20b taFv(mOKT3 x EphA10)）の結合活性を評価した。フローサイトメトリーのプロトコルは下記であった。
1. 細胞の調製(106 cell/sample)
2. 1次抗体反応(1 hr)  
IMAC溶出サンプル(taFv, OKT3 scFv:4 mL, EphA10 scFv：1 mL)
EphA10 IgG:2μg, OKT3 IgG:0.25 μg
3. Wash(PBS+2％FCS) × 2
4. 2次抗体反応(1 hr)  Surelight P3(anti mIgG, anti His)
5. Wash(PBS+2％FCS) × 2
6. 検出(FACS Canto)
結果を図２０に示す。ここで図２０（ａ）はMDA-MB-435(p16発現乳癌細胞株)(-)であり、図２０（ｂ）はMDA-MB-435(EphA10+)であり、図２０（ｃ）はJurkatである。図２０に示されるように、EphA10並びにCD3に対するtaFvの結合活性は存在するものの、やや弱いものであった。
【００６８】
（４）抗EphA10抗体と抗CD3抗体(mOKT3, 38.1)から成るtandem scFv(taFv)型Bispecific抗体の作製(哺乳類発現系)
（４−１）taFv(EphA10 x mOKT3), taFv(mOKT3 x EphA10)発現用ベクターの構築
表８は、taFv(EphA10 x mOKT3), taFv(mOKT3 x EphA10)発現用ベクターのクローニングに用いたプライマーである。
【００６９】
鋳型にNo.10のプラスミドを用いて、下記プライマーADとAEにてPCRを行った。
【００７０】
増幅したDNA断片を制限酵素HindIII,NotIによりdigest後、pcDNA3.1(+)ベクター(Invitrogen, V790-20)に挿入し、哺乳類発現用taFvベクター(No.14: pcDNA3.1 taFv(EphA10 x mOKT3)(配列番号47))を構築した。なお、No.14: pcDNA3.1taFv(EphA10 x mOKT3)の配列を図２１に、その概要を図２２に示す。
【００７１】
次に、鋳型にNo.11のプラスミドを用いて、下記プライマーAFとAGにてPCRを行った。
【００７２】
増幅したDNA断片を制限酵素HindIII,NotIによりdigest後、pcDNA3.1(+)ベクター(Invitrogen, V790-20)に挿入し、哺乳類発現用taFvベクター(No.15:pcDNA3.1 taFv(mOKT3 x EphA10)(配列番号48))を構築した。なお、No.15: pcDNA3.1taFv(mOKT3 x EphA10)の配列を図２３に、その概要を図２４に示す。
【００７３】
次に、鋳型にNo.12のプラスミドを用いて、下記プライマーADとAGにてPCRを行った。
【００７４】
増幅したDNA断片を制限酵素HindIII,NotIによりdigest後、pcDNA3.1(+)ベクター(Invitrogen, V790-20)に挿入し、哺乳類発現用taFvベクター（No.16: pcDNA3.1 taFv(EphA10 x 38.1)(配列番号49)）を構築した。なお、No.16: pcDNA3.1taFv(EphA10 x 38.1)の配列を図２５に、その概要を図２６に示す。
【００７５】
次に、鋳型にNo.13のプラスミドを用いて、下記プライマーAFとAGにてPCRを行った。
【００７６】
増幅したDNA断片を制限酵素HindIII,NotIによりdigest後、pcDNA3.1(+)ベクター(Invitrogen, V790-20)に挿入し、哺乳類発現用taFvベクター（No.17: pcDNA3.1 taFv(38.1 x EphA10)(配列番号50)）を構築した。なお、No.17: pcDNA3.1taFv(38.1 x EphA10)の配列を図２７に、その概要を図２８に示す。
【００７７】
【表８】
2014162739.tif 000010
【００７８】
（４−２）哺乳類発現用taFvベクター(No.14: pcDNA3.1taFv(EphA10 x mOKT3))及び哺乳類発現用taFvベクター(No.15:pcDNA3.1taFv(mOKT3 x EphA10))の結合性の確認
哺乳類発現用taFvベクター(No.14:pcDNA3.1 taFv(EphA10 x mOKT3))及び哺乳類発現用taFvベクター(No.15:pcDNA3.1 taFv(mOKT3 x EphA10))の結合活性を評価した。フローサイトメトリーのプロトコルは下記であった。
1. 細胞の調製(106 cell/sample)
2. 1次抗体反応(1 hr)
→  IMAC溶出画分：1 mL, EphA10 mAb：2 μg, OKT3 mAb：0.25 μg
3. Wash(PBS+2％FCS) × 2
4. 2次抗体反応(1 hr)
→  Surelight P3標識化抗体(anti mIgG, anti His, anti FLAG)
5. Wash(PBS+2％FCS) × 2
6. 検出(FACS Canto)
結果を図２９に示す。ここで図２９（ａ）はMDA-MB-435(p16発現乳癌細胞株)(-)であり、図２９（ｂ）はMDA-MB-435(EphA10+)であり、図２９（ｃ）はJurkatである。図２９に示されるように、taFv EO(taFv(EphA10 x mOKT3))も、taFvOE(taFv(mOKT3 x EphA10))も、大腸菌発現系のタンデム型scFvと比較して高い結合活性を有することが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００７９】
乳癌の治療薬として利用できる。
【配列表フリーテキスト】
【００８０】
配列番号１〜１５，２３〜２５，２７〜３１,３４〜３７,４０，４３〜４６：プライマー
配列番号１６〜１９,２６,３２，３３，３８，３９，４１，４２，４７〜５０：ベクター
配列番号２０，２１：プラスミド
【図２】
2014162739.tif 000011
【図３】
2014162739.tif 000012
【図４】
2014162739.tif 000013
【図５】
2014162739.tif 000014
【図６】
2014162739.tif 000015
【図８】
2014162739.tif 000016
【図１０】
2014162739.tif 000017
【図１２】
2014162739.tif 000018
【図１４】
2014162739.tif 000019
【図１６】
2014162739.tif 000020
【図１８】
2014162739.tif 000021
【図２０】
2014162739.tif 000022
【図２１】
2014162739.tif 000023
【図２３】
2014162739.tif 000024
【図２５】
2014162739.tif 000025
【図２７】
2014162739.tif 000026
【図２９】
2014162739.tif 000027
【図１】
2014162739.tif 000028
【図７】
2014162739.tif 000029
【図９】
2014162739.tif 000030
【図１１】
2014162739.tif 000031
【図１３】
2014162739.tif 000032
【図１５】
2014162739.tif 000033
【図１７】
2014162739.tif 000034
【図１９】
2014162739.tif 000035
【図２２】
2014162739.tif 000036
【図２４】
2014162739.tif 000037
【図２６】
2014162739.tif 000038
【図２８】
2014162739.tif 000039
【配列表】
2014162739000001.app