(57)【要約】      （修正有）【課題】生物学的に活性なキチン様オリゴマーおよび精製されたその内毒素および部分的脱アセチル化キチンポリマー前駆体を含む組成物と、医薬組成物、生体材料組成物、医療デバイスでのその使用と、前記オリゴマーを生成するプロセスの提供。【解決手段】治療的に活性なキトオリゴマーを製造するための方法であって、キチンを３０〜６０％の脱アセチル化度まで脱アセチル化するステップと、該部分的脱アセチル化キチンを酸性条件下で溶解するステップと、特定のキナーゼで酵素加水分解するステップと、得られたオリゴマーを限外濾過に付して、保持物を集めるステップを含む方法。さらに本発明は、前記方法により得られる、乾燥状態にある組成物を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
高純度で完全溶解性の部分的脱アセチル化キチンポリマーを製造するための方法であっ
て、
脱アセチル化後に、部分的脱アセチル化キチンを中和するステップと、
酸性溶液中に、部分的脱アセチル化キチンを溶解するステップと、
逐次的濾過ステップを通じて、溶解していない粒子を除去するステップと、
当該溶液を、８よりも高いｐＨに調節するステップと、
高温および塩の添加を通じて、完全に溶解し精製された部分的脱アセチル化キチンを析
出物として析出させるステップと
を含み、
篩い分けを通じてまたは遠心分離によって、析出後に析出物が回収され洗浄され、洗浄
水および析出物の温度が５０℃よりも高い方法。
【請求項２】
部分的脱アセチル化キチンポリマーの脱アセチル化度（ＤＤ）が、２５から７０％であ
る、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
部分的脱アセチル化キチンポリマーの脱アセチル化度（ＤＤ）が、３０から５５％であ
る、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ＤＤが、前記部分的脱アセチル化キチンの可溶性画分の平均ＤＤを指す、請求項１〜３
のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
キトサンの分子量が１０ｋＤａよりも高い、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法
。
【請求項６】
前記部分的脱アセチル化キチン溶液の高温が、４０〜１００℃（範囲、沸騰）、４５〜
１００、３５〜１００に温度を上昇させることを含む、請求項１〜５のいずれか１項に記
載の方法。
【請求項７】
前記の部分的脱アセチル化キチン溶液の調節が、ｐＨ８〜１３にｐＨを上昇させること
を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
塩析が、塩の添加を通じて、または溶液の中和を通じて得られる、請求項１〜７のいず
れか１項に記載の方法。
【請求項９】
塩析に使用される塩が、塩化ナトリウムなどの高カオトロピック性の任意の塩、または
ポリマーを溶解するために使用される酸の任意の塩、好ましくは、クエン酸やリンゴ酸、
酢酸などのトリカルボンまたはジカルボンまたはモノカルボン有機酸の塩であり、または
硫酸アンモニウムや尿素、塩化グアニジニウムなどの任意の他の塩である、請求項１〜８
のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
塩濃度が、ポリマーの析出をもたらすことのできる任意の濃度を指す、請求項１〜９の
いずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
塩濃度が２％〜飽和状態である、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
脱アセチル化ステップの前に、キチンを無機または有機酸で処理する、請求項１〜１１
のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
部分的脱アセチル化キチンポリマーを、ファミリー１８エンドキチナーゼでさらに大規
模に処理する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
均質脱アセチル化の前に、アルカリ溶液中に前記キチン原材料を実質的に溶解すること
によって、エンドキチナーゼまたはファミリー１８キチナーゼによる処理中に形成される
治療的に活性なヘテロポリマー類およびヘテロオリゴマー類の相対収量を制御する、請求
項１から１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
最終的な複合体の物理化学的、機械的、および生物学的性質を調節するために、脱アセ
チル化度が３０〜１００％ＤＤである部分的脱アセチル化キチンおよび／またはキトサン
をリン酸カルシウム複合体と混合する、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１から１２のいずれか１項に記載の方法にしたがって生成される、部分的脱アセ
チル化キチンポリマー組成物。
【請求項１７】
Ｎ−アセチルグルコサミン（Ａ）とグルコサミン（Ｄ）との治療的に活性なキトオリゴ
マー類をさらに含み、ヘテロキトオリゴマー類であって、下記の基準、即ち
当該オリゴマー類が、５〜２０モノマー残基の範囲内の鎖長を有し、
各オリゴマー鎖が、オリゴマー鎖の一方または両方の端部に２個のＮ−アセチルグルコ
サミン残基（ＡＡ）を有することができ、
当該オリゴマーの残存する内部部分が、最大量のＡ残基を有し、
前記内部鎖の配列は、Ｎ−アセチルグルコサミン残基（Ａ）が別のＮ−アセチルグルコ
サミン残基に隣接（ＡＡなど）しないようになされている
基準を満たさなければならないヘテロキトオリゴマー類を含む、請求項１６に記載の組
成物。
【請求項１８】
部分的脱アセチル化キチンポリマーの脱アセチル化度（ＤＤ）が２５から６０％である
、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１９】
部分的脱アセチル化キチンポリマーの脱アセチル化度（ＤＤ）が３０から５５％である
、請求項１６に記載の組成物。
【請求項２０】
部分的脱アセチル化キチンポリマー組成物が、キチナーゼまたはファミリー１８キチナ
ーゼでさらに処理される、請求項１８または１９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２１】
薬剤として使用される、請求項１７から２０のいずれか１項に記載の組成物の使用。
【請求項２２】
請求項１５から２０のいずれか１項に記載の部分的脱アセチル化キチンポリマーを含む
、医薬組成物。
【請求項２３】
粉末、懸濁液、ゲル、ゾル、エアロゾル、ペースト、フィルム、フォーム、丸薬、およ
びカプセルからなる群から選択された形をとる、請求項２２に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
薬学的に許容される賦形剤を含む、請求項２２に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
生体材料／薬剤の製造のための、請求項１７から２０のいずれか１項に記載の組成物の
使用。
【請求項２６】
組織再生を強化する生体材料／薬剤を製造するための、請求項２５に記載の使用。
【請求項２７】
生体材料が、哺乳動物の骨折骨または切断された骨の治癒において骨再生および止血を
増強する、請求項２６に記載の使用。
【請求項２８】
生体材料が、下記のいずれか、即ちヒドロキシアパタイトを含めたリン酸カルシウム、
硫酸カルシウム、ナトリウムトリポリホスフェート、アルギネート、コラーゲン、および
ヒアルロン酸などのいずれかから選択される更なる成分を含む、請求項２６に記載の使用
。
【請求項２９】
医療デバイス中での使用中に、生体材料および／または組織に曝された表面を処置する
ための、請求項１７から２０のいずれか１項に記載の組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、溶液からポリマーキトサンを回収する新規な方法に関する。本発明はさらに
、生物学的に活性なキチン質ポリマーおよびオリゴマーを含む本発明の方法によって生成
された組成物と、医薬組成物、生体材料、医療デバイス、ならびに前記ポリマーおよびオ
リゴマーを生成するプロセスにおけるその使用とに関する。
【背景技術】
【０００２】
キトサンは、甲殻類の殻から得ることが可能であるがその他の無脊椎動物および菌類か
らも得ることができるキチンから得られた、天然由来のバイオポリマーである。キトサン
は、キチンポリマーのＮ−アセチルグルコサミン残基の脱アセチル化によって、典型的に
は濃アルカリによるＮ−アセチル結合の加水分解によって調製される。定義によれば、キ
トサンは一般に、Ｄ−グルコサミン（Ｄ）およびＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（Ａ）
のコポリマーと呼ばれ、これはｐＨが６．２よりも高い（遊離アミン基の等電点）水に不
溶であるが、約６．２よりも低いｐＨでは溶解する。典型的な場合、従来のキトサンコポ
リマー中のモノマー単位の７０〜１００％がＤ−グルコサミンであり、これを、脱アセチ
ル化度が７０〜１００％である７０〜１００％脱アセチル化キトサンと呼ぶことができる
。脱アセチル化度が約７０％よりも低い場合、キトサンポリマーは、異なる溶解特性、高
い生物活性、および全体的に高い生分解性を示す。
【０００３】
キトサンの化学的および生物学的性質は、脱アセチル化度（ＤＤ）および重合度（ＤＰ
）、即ちポリマーの鎖長の影響を直接受ける。ｐＨが６．２よりも低い溶液では、またＤ
−グルコサミン残基のアミン基がプロトン化される場合は、キトサンは正に帯電したポリ
マーである。アミンである場合、キトサンは弱塩基であり、カルボン酸や鉱酸などの酸と
共に塩を形成することができる。これらの塩のほとんどは水溶性である。その天然形態で
は、キチンは水に不溶である。しかし、アルカリ処理による部分的脱アセチル化によって
、水溶性にすることができる。ＤＤが３５〜５０％である部分的に脱アセチル化されたキ
チンは、広範囲にわたるｐＨで水に可溶である。部分的に脱アセチル化されたキチンのこ
の形は、生物医学や医薬品、化粧品などの様々な分野で可能性のある適用例で、生物活性
であることが示されている。
【０００４】
６０〜７０％超のＤＤのキトサン調製物の欠点の１つは、ｐＨが６．２よりも高いと析
出する傾向があることである。このため、中程度のｐＨから高いｐＨで溶解性が必要とさ
れる場合、その適用範囲が限定される。この点に関し、部分的脱アセチル化キチンは、そ
の溶解度プロファイルが広範なｐＨを包含するので、ＤＤがより高いキトサンにも優る大
きな利点を有する。このキチンは、キトサンの物理的−化学的性質のほとんどを受け継ぎ
、通常のキトサンに比べて高い保水力を有し、その結果、水に接触したときに素早く膨潤
し、ＤＤがより高い通常のキトサンに比べてバランスの取れた親水性／疎水性を有する。
これらの性質は、生物医学、医薬品、化粧品、およびその他の関連ある産業における様々
な適用例で、多大な可能性があることを表している。
【０００５】
キチンおよびキトサンの生物学的活性は、文献にふんだんに文書化されており、益々増
える証拠は、ＤＤがより低くなるにつれて生物活性が増大することを示している。これは
、生理的なｐＨで溶解度特性が改善されることと密接な関係がある。
【０００６】
キトサンの精製では、一般に、溶液から不溶物または不純物が除去されるように、溶解
プロセスが行われる。この後、溶液からのキトサンの析出による回収プロセスが続く。次
いで析出物の形でのキトサンの回収物を洗浄して、中性ｐＨにし、塩を除去することがで
きる。この回収は、溶液のｐＨを６．２よりも高く上昇させることによって容易に析出さ
せることができるので、一般に、５５％ＤＤおよびそれ以上のキトサンでは問題ではない
。しかしｐＨの調節は、部分的脱アセチル化キチンに有効ではなく、通常は、析出プロセ
スを補助するのに有機溶媒が必要とされる。特許番号ＣＮ１５５４２６７は、ポリマー洗
浄のためのエタノールの使用について報告しており、溶媒の使用に関するより多くの例が
、特許ＪＰ１００７２５０２、ＣＮ１３７１９２２などに見出すことができる。あるいは
、それほど適切ではない方法では、溶液を濾過し乾燥するだけであり、それによって塩が
生成物中に存在することになる（ＪＰ２０２２３０１）。
【０００７】
キトサンは、生体適合性であり生分解性であることが示されており、それが、生物工学
の適用例に向けた生体材料の成分として、魅力的な選択肢となっている。生体材料は、一
般に、生体系の一部と置き換えるために、または生体組織と密着させたときに機能させる
ために使用される合成材料と定義され、キトサンは一般に、生体材料配合物中の適切な不
活性成分またはその他の物質もしくは成分の母材と見なされている。キトサンは、大量の
生物活性物質を吸着によって、またはそのような物質を単純な化学反応を介して共有結合
することによって、固定化することができるので、薬物送達担体として提示されている。
【０００８】
ＷＯ２００４／０２８５７８は、キトサン、トリポリホスフェート、および骨形成タン
パク質（ＢＭＰ）を含む、骨延長における骨形成および骨硬化のための組成物を開示して
いる。さらにＵＳ２００３／０１２４１７２は、人工歯根または外傷状態での骨結合を強
化するために生分解性ポリマーおよびＢＭＰを含む、キトサンベースの被膜を製造するた
めの方法を開示している。
【０００９】
キチン由来材料の生物活性は、例えば、生物学的に活性であり、かつ結合組織の状態、
特に関節炎および変形性関節症を治療する薬剤の活性成分であることが示唆されている、
Ｎ−アセチル−グルコサミンおよびグルコサミンのヘテロオリゴマーを含むキトオリゴマ
ー組成物を開示する、ＥＰ１４３５９７６に示されている。
【００１０】
その他の特許出願では、ヒトおよびその他の脊椎動物のゲノムによって表されるキチナ
ーゼ様タンパク質（ＣＬＰ）が、これらのキトオリゴマーの生物活性に関与する標的受容
体であり、キトオリゴマーに結合したときにシグナル伝達応答を誘発することが示唆され
ている。これらのキチナーゼ用タンパク質は、ほとんどの形の生物におけるファミリー１
８キチナーゼを発現する遺伝子のファミリーから得られる。ファミリー１８キチナーゼの
活性側は、これらタンパク質のほとんどが活性側の重要な変異によってその触媒活性を失
っていること以外、ＣＬＰ内に十分に保護されている。しかしヒトにおいては、これらタ
ンパク質の少なくとも２種が、そのキチン分解活性を維持しており、即ち酸性哺乳類キチ
ナーゼ（ＡＭＣａｓｅ）およびキトトリシダーゼである。
【発明の開示】
【００１１】
発明の要旨
本発明の目的は、治療の適用例に向けた、高度に精製された部分的脱アセチル化キチン
の方法および組成物を提供することである。生体外または生体内でのファミリー１８キチ
ナーゼによる大規模な（extensive）加水分解により、部分的脱アセチル化ポリマー組成
物は、治療活性を有するキチン質ヘテロ多糖を生成することになる。したがって本発明は
、２つの形の組成物、即ちインプラントの適用例に向けた生体材料への活性成分として適
切な、菌体内毒素などの有機汚染物質から実質的に精製されたポリマー組成物と、全身投
与に適切なオリゴマー組成物とを提供する。本明細書では「キトバイオマー」と呼ぶこれ
らのポリマーおよびオリゴマー組成物は、従来のキトサンおよび従来技術のキチン由来材
料とは明らかに異なる、生物学的に関連ある特徴を含む。さらに、本発明により提供され
るオリゴマー組成物は、生物学的利用能、生物安定性、および生物活性を含めた、キトバ
イオマー組成物全体の治療活性の最適化を示す。これらのオリゴマー組成物を、本明細書
では「治療用キトオリゴ多糖」（Ｔ−ＣｈＯＳ）と呼ぶ。ポリマー組成物は、特に局所マ
クロファージによって発現される内因性ファミリー１８キチナーゼがポリマー基質をその
場で徐々に分解し、瘢痕組織の形成を予防しかつ損傷軟骨および骨組織に組織再生を誘発
させることが可能な治療的に活性なＴ−ＣｈＯＳを生成するという、優れたｉｎ  ｓｉｔ
ｕ送達システムを提供する。これは、組織特異的な軟骨および骨前駆細胞の活性化と平行
して、Ｔ−ＣｈＯＳ組成物による損傷組織での線維芽細胞活性の低減または阻害が行われ
る。しかしオリゴマー組成物は、ファミリー１８キチナーゼによるポリマーキトバイオマ
ー組成物の大規模な加水分解によって、商業ベースで生体外で生成することもでき、経口
や筋肉内、皮下、静脈内投与などの任意の種類の全身送達用として、またはインプラント
組成物での局所送達用として、Ｔ−ＣｈＯＳを提供することができる。
【００１２】
本発明の第１の態様では、治療的に活性な部分的脱アセチル化キチンヘテロポリマー（
キトバイオマー）を生成するプロセスの、最適化がもたらされる。この最適化には、完全
に溶解した部分的脱アセチル化キチンポリマーを精製するための方法が含まれ、この方法
は、ａ）脱アセチル化後に部分的脱アセチル化キチンを中和するステップと、ｂ）酸性溶
液中に部分的脱アセチル化キチンを溶解するステップと、ｃ）逐次的濾過ステップを通じ
て、溶解していない粒子を除去するステップと、ｄ）溶液を、８よりも高いｐＨに調節す
るステップと、ｅ）高温および塩の添加によって、溶液のカオトロピック因子を増大させ
る溶解した部分的脱アセチル化キチンを析出させるステップとを含む。この方法は、篩い
分けによる析出後の析出物の回収、または遠心分離を特徴とし、この場合、析出物の温度
は５０℃よりも高くなっている。この最適化は特に、ファミリー１８キチナーゼによるポ
リマーキトバイオマーの大規模な加水分解によって生成された、加水分解生成物に焦点を
当てることによって得られる。基質は、全てのファミリー１８キチナーゼに対してかなり
の抵抗力を有するヘテロ−オリゴマーに分解することになる。提供されたプロセスで脱ア
セチル化ステップを慎重に制御することにより、均一性および脱アセチル化度の両方に関
して、加水分解ステップ中に生成されたＴ−ＣｈＯＳ組成物の相対的収量を制御すること
ができる。これは、キトバイオマー組成物の治療活性の最適化をもたらす。定義されたポ
リマーキトバイオマー組成物は、脱アセチル化度が３０〜７０％の範囲内に限定され、従
来のキトサンとは実質的に異なる溶解特性を示す。この定義により、全てのキトバイオマ
ー組成物は、生理的ｐＨで溶解性を示す。
【００１３】
本発明の第２の態様では、本発明の方法によって生成される、部分的脱アセチル化キチ
ンポリマー組成物が提供される。本発明の実施形態では、組成物は、Ｎ−アセチルグルコ
サミン（Ａ）とグルコサミン（Ｄ）との生物学的に活性なキトオリゴマーを含む。キトオ
リゴマーの組成物は、下記の基準（ａ〜ｄ）の全てを満たさなければならない：
ａ）前記オリゴマーは、５〜２０モノマー残基の範囲内の鎖長を有し、
ｂ）各オリゴマー鎖は、当該オリゴマー鎖の一端または両端に２個のＮ−アセチルグル
コサミン残基（ＡＡ）を有することができ、
ｃ）当該オリゴマーの残りの内部部分は、最大量のＡ残基を有し、
ｄ）前記内部鎖の配列は、Ｎ−アセチルグルコサミン残基（Ａ）が別のＮ−アセチルグ
ルコサミン残基に隣接（ＡＡなど）しないようなものである。
【００１４】
本発明の第３の態様では、生体材料／薬品の製造のための、本発明の組成物の使用が提
供される。
本発明の第４の態様では、本発明の方法によって生成されたキトバイオマーのオリゴマ
ー組成物を含む医薬組成物が提供される。
【００１５】
本発明の別の態様では、キトバイオマーのポリマー組成物を使用して、リン酸カルシウ
ム複合体中の水分活性を調節する。キトバイオマーのポリマー組成物は、マクロファージ
によって局所的に発現したファミリー１８キチナーゼによるキトバイオマーの分解と一緒
に、複合体の固化および硬化中に形成される結晶のサイズを限定することになり、これは
、複合体の生分解性を高め、遊走細胞が足場に浸透するのを助け、その骨伝導性を増大さ
せる。
【発明の詳しい説明】
【００１６】
下記の実施形態および定義は、本発明の方法および組成物および使用に関する。
本発明の実施形態では、部分的脱アセチル化キチンポリマーの脱アセチル化度（ＤＤ）
が２５から７０％であり、例えば３０から６５％、例えば３０から６０％、例えば３０か
ら５５％などであり、この場合ＤＤは、部分的脱アセチル化キチンの可溶性部分の平均Ｄ
Ｄを指し、このキトバイオマーの分子量は、約１０ｋＤａよりも高い。
【００１７】
本発明の文脈において、脱アセチル化後の部分的脱アセチル化キチン混合物に関する「
中和」という用語は、水を用いた洗浄による、または強酸の添加による脱アセチル化の過
程での、強アルカリ溶液のｐＨの低下を指す。
【００１８】
本発明の実施形態では、部分的脱アセチル化キチン溶液の加熱は、その温度を４５〜１
００℃または沸騰するまで、例えば５５〜９０℃、または例えば６０〜８０℃、または好
ましくは６０から７０℃に上昇させるステップを含む。
【００１９】
本発明の実施形態では、部分的脱アセチル化キチン溶液の調節は、そのｐＨを、ｐＨ８
〜１３、例えばｐＨ９〜１２、または１０〜１１に上昇させるステップを含む。
本発明の実施形態では、塩析は、塩の添加によってまたは溶液に溶解した酸の中和によ
って得られ、この塩析に使用される塩は、塩化ナトリウム、または酢酸などの部分的脱ア
セチル化キチンの溶解に使用される任意の有機酸の塩であり、あるいはリンゴ酸やクエン
酸などのジまたはトリカルボン酸が好ましい。これらの塩は、適切な塩基による溶液の中
和によって、形成することができる。さらに塩濃度は、ポリマーの析出をもたらすことが
できる任意の濃度を指し、即ちこの塩濃度は、２％〜飽和状態である。
【００２０】
本発明の実施形態では、キチンを脱アセチル化ステップの前に鉱酸で処理することによ
り、１から６０ＥＵ／ｇまたは３０ＥＵ／ｇより低い値など、非常に低い内毒素レベルを
有する生成物が得られる。酸はポリマーを開き、内毒素に曝し、内毒素を破壊する。キチ
ンポリマーの溶解をもたらす任意の高濃度酸、ＨＣｌ、リン酸、ギ酸、硝酸、硫酸を使用
することができる。内毒素の結果は、ＥＵ／ｍｌまたはＥＵ／ｇのようなＥＵ単位で表す
。
【００２１】
本発明の別の実施形態では、哺乳類の骨折または切断された骨の治癒において骨再生お
よび止血を増強するための、生体材料／薬品の製造に、このプロセスを使用する。そのよ
うな薬品は、組織特異的前駆細胞の活性化による軟骨内骨化を通じて、骨形成を増強する
。
【００２２】
本発明の実施形態では、生体材料は、ヒドロキシアパタイトを含めたリン酸カルシウム
、硫酸カルシウム、ナトリウムトリポリホスフェート、アルギネート、コラーゲン、およ
びヒアルロン酸からなる群から選択された別の成分を含む。
【００２３】
生物学的利用能、即ち所与の物質が生体膜を通過することのできる能力は、分子の疎水
性に関係する。全ての生体膜は多分に疎水性であるので、物質は疎水性であるほどそのよ
うな生体膜をより良好に浸透することができるという、一般的規則を適用する。Ｎ−アセ
チル−グルコサミンおよび完全アセチル化キチンオリゴマーは、対応するグルコサミンモ
ノマーまたは高度に脱アセチル化されたキトサンオリゴマーよりも疎水性であり、したが
ってキチン質ヘテロオリゴマーは、アセチル化が高まるほど、高い生物学的利用能を有す
ることになることを示唆している。このようにＴ−ＣｈＯＳ形成は、その生物安定性を危
うくすることなくその生物学的利用能を最大限にするために、その分子構造内に最大量の
Ｎ−アセチル−グルコサミンを含有するように最適化されてきた。本発明は、ヒトボラン
ティアにおけるＴ−ＣｈＯＳ組成物の、比較的高い生物学的利用能を示す独自のデータを
提供する。
【００２４】
有機化合物の生物安定性は、生体内の内因性酵素の感受性、およびその生物における半
減期（ｔ１／２）を指す。感受性が高いほど、化合物は生物安定性が低くなる。ヒトにお
いては、キチン分解酵素を２つのグループに分けることができ、即ち、ファミリー１８キ
チナーゼ（ＡＭＣａｓｅ、キトトリオシダーゼ）のような高レベルのキチン分解特異性を
有し、高い特異的活性を有する酵素、またはリゾチームや、キチンおよびキトサンの分解
を引き起こす一部のプロテアーゼなどの、キチン分解特異性が低いが特異的活性がより低
い酵素である。部分的脱アセチル化によって、Ｔ−ＣｈＯＳ組成物は、ファミリー１８キ
チナーゼによる加水分解に対する最大限の安定性を得るために最適化された。これらの酵
素は、切断の認識として２つ以上の連続Ｎ−アセチル−グルコサミン残基の配列を必要と
するので、Ｔ−ＣｈＯＳ組成物は、分子の内部部分のそのような配列が排除されるように
、特に最適化される。
【００２５】
有機物質またはリガンドの生物活性は、生体応答を引き起こす標的受容体へのリガンド
の親和性に、直接結び付けられる。人体におけるキチン質化合物の生物学的役割は、依然
としてほとんど知られていないが、キチンオリゴマーは、胚発生において生命に関わる役
割を演ずるという徴候がある。これは、キチンオリゴマーに結合するときに、ヒトゲノム
が、特異的に活性化された特定の受容体を発現することが可能であることを示唆している
。人体にいて唯一知られているキチン結合タンパク質は、ファミリー１８キチナーゼに遺
伝的に属しているがそのほとんどが自らの酵素活性を失っている、キチナーゼ様タンパク
質（ＣＬＰ）である。
【００２６】
これらのタンパク質におけるキチン結合ドメインは、高度に保存されており、ファミリ
ー１８キチナーゼの活性側とは、１個または数個のアミノ酸だけしか異なっていない。完
全アセチル化キチンオリゴ多糖とタンパク質の活性部位との結合は、一般に、タンパク質
構造において構造変化を誘発することになり、これは相互作用のシグナル伝達の役割を示
している。本発明は、完全アセチル化キチンオリゴ多糖に比べた場合、キチナーゼ様タン
パク質（ＹＫＬ−４０またはＨＣｇｐ−３９）の１つの結合部位が、部分的脱アセチル化
Ｔ−ＣｈＯＳ組成物に対してほとんど等しく強力な親和性（９０％）を有することを示す
データを提供する。ファミリー１８キチナーゼは、キチン質基質上で非常に活性であり、
加水分解の認識部位として隣接するＮ−アセチル基を必要とし、アセチル基の１つは、プ
ロトン供与体として加水分解反応に積極的に関与することになる。これは特に、キチン質
構造が、対応する内因性ファミリー１８キチナーゼの発現を誘発し易いので、完全にアセ
チル化したキチンオリゴマーが人体内で素早く分解する（不十分な生物安定性を有する）
ことを示唆している。しかし、特に部分的脱アセチル化によって、オリゴマー本体内に隣
接するアセチル基が存在しない配列が与えられる場合、キチンオリゴマーの部分的脱アセ
チル化は、生物安定性を増大させることになる。これは、ファミリー１８キチナーゼのよ
うな特定のキチン分解酵素によって切断されることはないが、キチンならびにキトサンを
切断することが可能であるが著しく低い特異的活性を有するそれほど特殊ではない酵素に
よって、ゆっくりと分解する分子を与えるだけである。これは、Ｔ−ＣｈＯＳ組成物が、
治療活性に必要とされる生物学的利用能、生物安定性、および生物活性を有することを示
唆している。
【００２７】
骨インプラントでは、ポリマーキトバイオマーが、マクロファージ由来のファミリー１
８キチナーゼによって徐々に加水分解され、大量のＴ−ＣｈＯＳ組成物を生成することに
なる。これらの非常に可溶性があるオリゴマーは、複合体および隣接する組織の全体に拡
散し、骨髄ならびに骨内膜および骨膜に局在化したマクロファージならびに軟骨および骨
前駆細胞の化学走化性因子または刺激物として、作用することになる。これは、骨インプ
ラント複合体に、骨伝導性を提供する。
【００２８】
治療用キトオリゴマーおよびそのポリマー前駆体（まとめてキトバイオマーと呼ぶ）を
含む本発明の組成物は、生成される材料の組成および性質、例えば溶解度や純度などに決
定的な影響を及ぼす、いくつかの重要な処理ステップを基にしたプロセスによって生成さ
れる。最大限の純度では、任意選択の前処理ステップが行われ、即ち、適切な供給源から
のキチンを、適切な酸溶液、好ましくは塩酸（ＨＣｌ）などの鉱酸であるが、カルボン酸
および／または硫酸やリン酸、硝酸などの鉱酸を含めたその他の酸を使用してもよい溶液
に、十分に溶解する。ＨＣｌを使用する場合、その濃度は、典型的には約１５〜３７％（
重量／重量）であり、例えば２５％以上であり、その他の酸の濃度は、同様の結果が得ら
れるように適切に調節される。一実施形態では、酸溶解キチンを酸化剤で、好ましくは過
酸化水素で処理するが、その他の酸化剤、例えばアルカリ金属過酸化物、アルカリ土類お
よびアルカリ金属過ホウ酸塩、過炭酸塩、ペルオキシ一硫酸塩、過硫酸塩、臭素酸塩、次
亜ハロゲン酸塩、およびジハロトラジントリオンも、同様に使用することができる。キチ
ンの酸性溶解は、その結晶構造を開き、材料内に埋め込まれた内毒素分子を露出させるこ
とになり、内毒素不純物の効率的な抽出および分解を可能にする。任意選択の酸化剤処理
は、内毒素分子の分解の補助を目的とし、それによって、最終生成物の内毒素含量がさら
に低下する。ポリマー鎖の一部の断片は、プロセスのこのステップで生ずることになる。
十分に溶解したキチンの溶液を、好ましくは素早く希釈し、十分純粋な水またはアルカリ
水溶液で十分に中和し、例えば、キチン材料のかなりの部分が非晶質コロイド状キチンと
して析出するように、十分溶解したキチンを含む溶液を大量の中和水溶液に流すことによ
って中和する。水は、典型的には高温であり、例えば４０〜１００℃の範囲内であり、例
えば５０〜１００℃の範囲内であり、例えば５０〜８０℃の範囲内である。温度は、コロ
イド状キチンの緻密度および凝固に影響を及ぼすことになる。十分純粋な水で洗浄した後
（好ましくは連続洗浄）、コロイド状キチンは、脱アセチル化の準備が整う。
【００２９】
本発明の実施形態では、最終的な複合体の物理化学的、機械的、および生物学的性質を
調節するために、脱アセチル化度が３０〜１００％ＤＤである部分的脱アセチル化キチン
および／またはキトサンを、リン酸カルシウム複合体と混合する。この方法は、異なる脱
アセチル化度のキトバイオマーまたはキトサンを複合体に混合することによって、リン酸
カルシウム複合体の機械的および生物学的性質を制御するために提供する。これは、固化
時間、硬化時間、硬さ、および強度、ならびに生分解性および細胞を宿主組織から移動さ
せるための到達性など、複合体の決定的な性質を調節するための強力なツールを提供する
。これらの基本的な性質を調節するこの可能性は、脱アセチル化度が３０から１００％Ｄ
Ｄに上昇したときの脱アセチル化キチン誘導体の保水能力の急峻な低下にあり、即ち、Ｄ
Ｄが低下するほど保水能力は高くなる。リン酸カルシウムの結晶化では、水と反応させる
ので、複合体内での水利用能が、結晶形成に影響を及ぼすことになる。部分的脱アセチル
化キチンによってより多くの水が保たれるほど、複合体中の結晶は小さくなる。これは、
複合体の機械的性質および生分解性に影響を及ぼすことになる。キトバイオマーの脱アセ
チル化度（ＤＤ）が低くなるほど、マクロファージなどの食細胞は複合体母材に侵入し易
くなり、軟骨および骨前駆細胞ならびに血管内皮細胞などのその他の遊走細胞様に新しい
孔を開ける。これは、健康な機能組織への複合体のリモデリングを増強するので、決定的
な性質である。脱アセチル化プロセスでのキトバイオマーの最適化によって、複合体の再
構築中に生成されるＴ−ＣｈＯＳの収量を上昇させることが可能になり、骨欠損の軟骨性
骨再生の効果的な刺激が行われる。
【００３０】
したがって、複合体に使用される部分的脱アセチル化キチンの脱アセチル化度を慎重に
制御することにより、複合体の骨伝導性ならびに骨誘導性を最適化することが可能である
と結論付けられる。
【００３１】
脱アセチル化は、典型的には、アルカリ塩基反応媒体に溶解したキチン原材料を用いて
実施される。このアルカリ塩基は、典型的には水酸化ナトリウムであるが、ＫＯＨ、Ｌｉ
ＯＨ、Ｃａ（ＯＨ）２、Ｎａ３ＰＯ４、およびＮＨ４ＯＨを含めたその他の塩基も適切で
ある。乾燥物質とアルカリとの比は、いくつかの実施形態では１：５から１：１００に及
ぶ。塩基溶液は、好ましくは混合前に冷却する。アルカリキチン混合物を凍結し、その後
、脱アセチル化のために解凍しインキュベートすることによって、脱アセチル化の均一性
が十分に高めらることがわかった。しかし、脱アセチル化プロセスのためのインキュベー
ション温度は、０〜１００℃という比較的広い範囲内で調節することができ、インキュベ
ーション時間もそれに応じて調節される（より低い脱アセチル化温度では、より長いイン
キュベーション時間が必要であり、またその逆も同様である）。いくつかの実施形態では
、脱アセチル化は、５〜５０℃の範囲内の温度、より好ましくは１０〜４０℃の範囲また
は２０〜５０℃の範囲、例えば１０から３０℃の範囲または１０〜２５℃の範囲、より好
ましくは１２〜２５℃の範囲、例えば１５〜２５℃の範囲で実施される。部分的脱アセチ
ル化キチンを、十分に純粋な水中で、好ましくは高温の水、例えば約３５から６５℃の範
囲を含めた約３０〜８０℃の範囲、例えば約４５〜６０℃または４０〜５０℃の範囲の水
中に析出させ、その後、十分に純粋な水で洗浄する。前述のように、析出物中のポリマー
の回収をさらに補助するために、塩を溶液に添加することができる。材料は、引き続き洗
浄することができ、意図される別の用途に応じて凍結乾燥または噴霧乾燥してもよい。
【００３２】
記述されるプロセスは、著しく均質な脱アセチル化をもたらし、即ち、ポリマー中のＮ
−アセチル−Ｄ−グルコサミン残基（Ａ）およびグルコサミン残基（Ｄ）が実質的に均等
に分布され、その後のポリマーから治療用キトオリゴマーへの加水分解に影響を及ぼすこ
とを意味する。これは、部分的脱アセチル化キチンにおける平均脱アセチル化度を慎重に
調節することによって、ファミリー１８キチナーゼによる加水分解中にＴ−ＣｈＯＳの収
量を最適化する機会をもたらす。そのような加水分解は、使用前に（即ち、例えば以下に
述べるように生体外で）、または医薬品、生体材料、もしくは医療デバイスの構成要素と
して得られたポリマー前駆体（キトバイオマー）を使用することによって生体内で、引き
起こすことができる。キトバイオマーは、その場で治療用キトオリゴマーを製造するため
に、例えばキトトリオシダーゼなどの内因性酵素によって、ゆっくりと加水分化される。
【００３３】
本明細書で使用される「カオトロピック剤」という用語は、分子構造を崩壊させる薬剤
であり、特に、水素結合やファンデルワールス相互作用、疎水作用などの非結合力によっ
て形成される薬剤である。しばしば、円偏光２色性などの手段によって検出される構造的
特徴は、カオトロープ濃度依存的な手法で調整することができる。最も一般的に使用され
るカオトロープは、６〜８Ｍ尿素および６Ｍ塩化グアニジニウムであり、尿素は非荷電分
子であり、塩化グアニジニウムは塩酸塩である。非常に一般的な塩は、電荷を遮蔽し塩橋
の安定化を防ぐことによって、カオトロピック特性を有することができる。水素結合は無
極性媒体の場合より強力であり、したがって溶媒の双極子モーメントを増大させる塩は、
水素結合を不安定化させることもできる。
【００３４】
本発明の文脈において、「塩などのカオトロピック剤の添加」という用語は、限定する
ものではないがＮａＯＨ、硫酸アンモニウム、尿素、塩化グアニジニウム、酸の任意の塩
、好ましくはトリカルボン有機酸（例えばクエン酸）の塩、次いでジカルボン酸（リンゴ
酸）の塩、次いでモノカルボン酸の塩、高カオトロピック性の塩から選択された塩の添加
を指す。
【００３５】
得られた部分的脱アセチル化キトバイオマーは、明らかな特徴を有する。キチンの事前
溶解、コロイド状キチンの形成、およびその後の、脱アセチル化前のアルカリ塩基への溶
解は、キチン結晶構造を著しく開き、キチン質材料中の菌体内毒素を効率的に低下させ、
ポリマーの純度を、生体材料の配合および／またはインプラント適用を目的とした医療デ
バイスでの使用に許容可能なものにする。
【００３６】
治療用キトオリゴマーの連続パターンは、その生物学的活性に直接影響を及ぼし、即ち
、生体膜上にどのように輸送されるのか（生物学的利用能）、生体系内でどの程度速く崩
壊するのか（生物安定性）、キチナーゼ様タンパク質およびキチン質配列を結合するその
他の特異的受容体とどのように相互作用するのか（生物活性）に影響を及ぼす。
【００３７】
ファミリー１８キチナーゼの活性メカニズムを考えると、基質分子の切断部位の認識に
は、２つ以上の隣接するＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン部分（−ＡＡ−）の配列が必要
である。切断によって、得られた生成物の還元末端に２個のアセチル基が残されるが、こ
れは、酵素加水分解が終了に至った場合、オリゴマーの大部分が還元末端に２個のＮ−ア
セチル−Ｄ−グルコサミン部分を有することを意味する。これは、最適な生物学的利用能
、生物安定性、および生物活性を有する本発明の治療用キトオリゴマーが、分子の内部領
域に２個の隣接するアセチル基を有することなく最大限アセチル化された部分アセチル化
キトオリゴマーになることを示唆している。したがって単純計算では、内部領域において
その分子配列内に２個のモノマーが交互に配された（即ち、−ＤＡＤＡＤＡＤＡ−）、約
５０％のアセチル化が示唆される。この構造とファミリー１８キチナーゼ、ＹＫＬ−４０
、またはそのＣＬＰ類縁体の結合ドメインのいずれかとが相互に作用する場合、−ＤＡＤ
ＡＤＡＤＡ−構造は、圧倒的に多いＤ配列（即ち、−ＤＤＤＤＤＡ−）に比べて結合部位
に対する親和性が強力である。アセチル化が増すと分子の疎水性も同様に増すので、治療
用キトオリゴマーの生物学的利用能についても同じことが言える。本発明は、ＣＬＰ結合
ドメインに対する結合親和性が、Ａ残基（ＦＡ）の相対数と共に増大することを示すデー
タを提供する。しかし本発明者等のデータは、Ｔ−ＣｈＯＳ組成物が、完全アセチル化キ
チンヘキサマー（Ａ６）に関して測定された結合親和性の少なくとも９０％を有すること
も確かめている。
【００３８】
菌体内毒素の汚染に関し、インプラントの適用例を目的としたキチンおよびキトサン由
来の材料は、外骨格由来のキチンならびにヤリイカおよびコウイカ由来のキチンが典型的
にはかなりのレベルの菌体内毒素を含有するので、特殊な注意を必要とする。さらにキト
サンは、脱アセチル化の間および後に、菌体内毒素に対してかなりの親和性を得ることに
なる。したがって、インプラントの適用例に向けた、十分純粋なキトサンの生成を目的と
する任意のプロセスは、原材料基質から菌体内毒素を十分に抽出し低下させる特定のステ
ップを組み込む必要がある。
【００３９】
本明細書に記述される医薬組成物は、本発明の治療用キトオリゴマー（Ｔ−ＣｈＯＳ）
を含む。この組成物は、全身に投与することができ、内因性ＣＬＰに結合することができ
、その多くは、いくつかの疾患および状態で役割を果たすことが示されておりまたは示唆
されている。ＣＬＰの高い発現に関連する疾患および状態の中には、関節炎（例えばリウ
マチ様関節炎および変形性関節症）を含めた変形性関節疾患などの変性疾患がある。Ｔ−
ＣｈＯＳ組成物は、これらの疾患、ならびに骨組織形成に関連した状態、および外科的介
入または外傷後の骨再生などの状態を治療しかつ／または改善するのに有用であることが
わかっている。
【００４０】
組成物はさらに、薬学的に許容される賦形剤、例えば加工助剤、または安定剤、希釈剤
、香料、栄養剤、または着色剤、または適切な追加の生物学的に活性なまたは非活性の成
分などを含んでもよい。
【００４１】
医薬組成物は、好ましくは、例えば１杯の水に容易に溶解することのできる乾燥形態な
ど、経口投与に適した形をとるべきである。そのような形態には、乾燥粉末、懸濁液、ゲ
ル、被膜、フォーム、ゾル、エアロゾル、顆粒、薄片、繊維、およびペースト形態が含ま
れる。しかし組成物は、丸薬またはカプセルに含めることもできる。医薬組成物はさらに
、薬学的に許容される賦形剤を含むことができる。
【００４２】
その他の有用な実施形態では、本発明の組成物が、筋肉内、皮下、または静脈内投与な
ど、全身投与のその他の形に適した形をとる。そのような適切な形は、標準的な薬務に従
い薬学的に許容される担体または賦形剤を有する溶液形態である。前記溶液形態は無菌で
あり、ｐＨは適切に調節され緩衝される。静脈内使用では、調剤物が等張性になるように
、溶質の合計濃度を制御すべきである。
【００４３】
本発明のＴ−ＣｈＯＳは、カプセルもしくは錠剤で送達することができまたは摂取用の
水溶液中に溶解しもしくは懸濁することができる、粉末、薄片、または繊維状材料を含む
、本質的に乾燥した形で都合良く提供することができる。そのような組成物は、実質的に
前述の治療用キトオリゴマーのみから、即ちキトオリゴマーの約８０〜１００重量％の範
囲内のキトオリゴマーのみからなってもよい。有用な実施形態では、組成物は、前記Ｔ−
ＣｈＯＳを２０〜１００重量％の範囲内で含み、この範囲には約２５〜９５重量％が含ま
れ、例えば約５０から９０重量％などである。
【００４４】
本発明のＴ−ＣｈＯＳの経口投与は、Ｔ−ＣｈＯＳの分子構造がいくつかの要件を満た
すことが必要であり；十分な生物学的利用能を有すること、即ち胃腸管の生体膜の端から
端まで定量的に輸送する能力を有すること；ＧＩ管内で初期分解を生き抜くために、十分
な生物安定性を有すること、および分解して系から排除される前に、体液中に効率的に分
布されること、最後に、標的受容体との結合を通じて、適切な生物活性を保有しなければ
ならないことが必要である。これらの要件を全て満たすには妥協が必要であり、一部また
は全ての基準は、最適には及ばないレベルでしか満たされない。これは、Ｔ−ＣｈＯＳを
確実に標的受容体に到達させ相互に作用させながら、吸収および生分解のハードルを克服
することが可能な最良の可能性ある組成物を得るために、生成物最適化の概念に関して包
括的な視点を必要とする。
【００４５】
本発明の文脈において、「医療デバイス」という用語は一般に、ヒトまたはその他の動
物の、疾患またはその他の状態の診断での使用、または疾患の治癒、緩和、治療、または
予防での使用を目的とし、あるいはヒトまたはその他の動物の身体の構造または任意の機
能に影響を及ぼすことを目的とした、器具、装置、道具、機械、仕掛け、インプラント、
生体外試薬、またはその他同様のまたは関連する物品であって、構成部品を含めたもの、
または付属品を指す。本明細書の文脈において、「生体材料生成物」という用語は、「医
療デバイス」という用語と同義に使用される。
【００４６】
本発明のキトバイオマー（ポリマーおよびオリゴマー）は、様々な目的の生体材料にお
いて特に有用である。従来のキトサンの有利な特徴（生体適合性、その他の成分と混合し
て、機械式インプラントや薬物送達装置などの医療デバイスに適した混合物を生成する能
力）全てを示す他に、上述のように、体内でのＣＬＰに対する高親和性が原因で、かなり
高い溶解性と生物学的または治療活性を有している。
【００４７】
生体材料の配合物は、様々なバイオポリマー（アルギネートおよびその他の多糖など）
、コラーゲン、ヒドロキシアパタイトを含めたリン酸カルシウム、硫酸カルシウム、ナト
リウムトリポリホスフェート、リン酸２水素ナトリウム、リン酸グリセロールナトリウム
、酸化カルシウム、水酸化カルシウム、および様々な有機またはカルボン酸などの、その
他の有機および無機成分を適切に含むことができる。
【００４８】
本発明の生体材料は、生体材料組成物に含まれるキトバイオマーの性質から利益を得る
、様々な医療デバイスで有用である。
骨およびその他の組織の再生では、２つの主なタイプの骨、骨梁骨および皮質骨がある
。骨梁骨はスポンジ状であり、椎骨を含めたほとんどの骨の内部のバルクを構成し、一方
、皮質骨は稠密で、骨の表面を形成する。小柱網は、骨内の血液形成要素を支える。
【００４９】
「結合組織性骨化」という用語は、適正な誘発シグナルによって新しい骨に直接分化す
る、骨前駆細胞から生ずる新しい骨形成のプロセスを指す。骨化のこの経路は、特に頭蓋
骨などの扁平骨の成長の際、胚性段階で生じる。
【００５０】
「軟骨内骨化」という用語は、軟骨が最初に生じて最終な骨の枠組をもたらす、骨形成
プロセスを指す。軟骨組織は、成熟骨組織に比べてその発達および維持には局所酸素濃度
をそれほど必要とせず、したがって、血液供給系がその最終的な発達段階に到達しない場
合であっても、軟骨が骨に取って代わることになる。軟骨は、血管新生がその進行段階に
到達した後、新しい骨によって置き換えられるだけであり、発達した組織に対する酸素の
必要不可欠な供給が保証される。骨形成のこのプロセスも、特に椎骨、長骨、胸骨などで
の胚性段階中に典型的なものである。
【実施例１】
【００５１】
高純度の部分的脱アセチル化キチンポリマー（キトバイオマー）の生成
１．１  脱アセチル化中に、キトバイオマー組成物の収量を増大させ、実質的に菌体内
毒素のレベルを低下させるための、均質な脱アセチル化条件の使用
キチン粉末（１）を、１５℃で５０％ＮａＯＨ（３）に添加し（２）（キチン／ＮａＯ
Ｈの比、１：１５、ｗ／ｗ）、３６ｒｐｍという一定速度（４）で１時間（５）混合した
。引き続き、微粉砕した３〜１０ｍｍの氷（アルカリ／氷の比、１：３、ｗ／ｗ）（６）
をアルカリスラリーに添加して、キチンを溶解した。キチンが溶解し、菌体内毒素がアル
カリ溶液に完全に曝された２時間後、温度（７）を上昇させ、脱アセチル化反応を１６℃
で４０時間実施した。脱アセチル化プロセスが終了し、内毒素が劇的に減少した後（＜３
０ＥＵ／ｇ）、ｐＨをさらに３．８に調節した（８）。この後、一連の濾過ステップ（９
）を行って、異物および溶解していないポリマーを除去した。ポリマーを、塩析法を介し
て析出することにより回収した。回収後、ポリマーを洗浄し、均質化した。最後に懸濁液
を噴霧乾燥して（１０）、精製されたポリマーを得た。このプロセスは、商業的に実現可
能であり、完全に可溶性のキトバイオマー組成物の収率を、不均一脱アセチル化プロセス
に比べて６０％上昇させることになる。内毒素レベルは、このプロセス中に劇的に低下す
ることになるが、その理由はおそらく、プロセス全体を通してキチン原材料がその結晶構
造を維持する不均一脱アセチル化プロセスでの状況に比べて、内毒素分子がより多く苛性
ソーダ溶液に曝され、かつ固体キチン構造内に固定され得る内毒素分子が、おそらくは反
応媒体中の苛性ソーダから保護されるからである。
【００５２】
括弧内の注釈番号は、下記のリストに従って変えることのできる方法ステップを表す
（１）粉末の粒度は２ｍｍ以下でもよい。エビ、カニ、コウイカ、ヤリイカ、オキアミ
などを含めたキチンの供給源が適切である。
【００５３】
（２）衛生要件を満たす反応器。
（３）アルカリの最終濃度は５から９０％（ｗ／ｗ）に及んでもよい。最も好ましいア
ルカリは水酸化ナトリウムである。その他のアルカリも同様に適切であり、濃ＫＯＨ、Ｌ
ｉＯＨ、Ｃａ（ＯＨ）２、Ｎａ３ＰＯ４、およびＮＨ４ＯＨが含まれる。乾燥物質とアル
カリとの比は、１：３から１：１００に及んでもよい。アルカリの温度は２から３５℃に
及んでもよい。
【００５４】
（４）混合速度は０から８０ｒｐｍまで様々に変えてもよい。このプロセスに関して最
も好ましい範囲は２０〜４０ｒｐｍである。
（５）脱アセチル化時間は、主にアルカリの温度および濃度に応じて０．５から１００
０時間に及んでもよい。
【００５５】
（６）粉砕した氷のサイズは、０．５から５０ｍｍに及んでもよい。アルカリと氷との
比は、１：１から１：３０に及んでもよい。
（７）加えられる温度および時間の組合せに応じて、脱アセチル化温度は１０から１０
０℃に及んでもよく、最適な場合は５〜３０℃であり、脱アセチル化時間は０．１から１
０００時間に及んでもよい。
【００５６】
（８）この酸性化プロセスでは様々な酸を使用してもよく、高濃度のカルボン酸および
高濃度の鉱酸が含まれる。塩酸が最も好ましい。ＨＣｌの濃度は、０．０１から３７％（
ｗ／ｗ）に及んでもよい。
【００５７】
（９）限外濾過およびナノ濾過を含めた様々な濾過技術が適用可能である。
（１０）乾燥は、凍結乾燥または噴霧乾燥器によって、あるいは任意のその他の適切な
乾燥技術によって行ってもよい。
【００５８】
１．２  菌体内毒素の低減をさらに増強するための、塩酸によるキチン原材料の前処理
この実施例は、キチン原材料の前処理の追加のステップを提供し、強塩酸（ＨＣｌ）媒
体にキチン粉末を溶解するステップと、溶解したキチン構造から菌体内毒素を効率的に抽
出するステップと、その後、ＨＣｌおよび任意選択の酸化剤（例えば過酸化水素）と接触
させた、曝された内毒素を破壊するステップとを含む。さらに、その後の液体状態の脱ア
セチル化プロセス中、アルカリに溶解したキチンによって、ＨＣｌ処理を生き抜いた内毒
素のさらなる抽出および破壊が可能になる。この方法は、収集、保存、または輸送中に、
その新鮮さを失いかつ細菌増殖に曝された原材料を処理する際に、特に有用である。
【００５９】
詳細な製造プロセスの実施例
粉末状キチン（＜１５０μｍ）（１）を、室温で３０％塩酸（２）に溶解した（キチン
／ＨＣｌの比１：２０、ｗ／ｗ）。１０分後、過酸化水素を添加し（Ｈ２Ｏ２の最終濃度
、２％、ｗ／ｗ）（３）、１５（４）分間反応させ、次いでこの溶液を、７５％ＩＰＡに
流し込み（キチン溶液：５０％ＩＰＡ溶液は１：４０であった）（５）、洗浄して中性ｐ
Ｈにした。次いで析出物を、内毒素を含まない水で、７０℃でさらに洗浄した（６）。過
剰な水を除去した後、濃アルカリ溶液（アルカリの最終濃度は２５％ｗ／ｗであった）（
７）をコロイド状キチンに添加した。次いで混合物を−２５℃にした（８）。この後、コ
ロイド状キチンを解凍し、溶解し、６０℃で６時間脱アセチル化した（９）。脱アセチル
化後、部分的脱アセチル化キチンを温水（７０℃）に注ぐことによって回収し（１０）、
洗浄して中性ｐＨにした。最後に、中和された懸濁液を、凍結乾燥器／噴霧乾燥器に移す
ことにより、乾燥物質が得られた。
【００６０】
得られたキトバイオマー生成物の内毒素レベルは、一般に、ＬＡＬ分析法によれば３０
ＥＵ／ｇ部分的脱アセチル化キチンよりも十分低い。
１．３  部分的脱アセチル化キチン溶液の精製および塩析法によるポリマーの回収
本発明の組成物は、エビの殻などのキチン質原材料から適切に得ることができる。キチ
ンは、部分的脱アセチル化キチンポリマーが得られるように、強塩基で脱アセチル化され
ることが有利である。または引き続き、材料は、可溶性キトバイオマーの収量を増加させ
るために、かつ精製前の菌体内毒素（ＥＵ）レベルを低下させるために、この実施例の１
．１または１．２による生成物にすることができる。反応の時間およびキチンの濃度は、
所望の脱アセチル化度に応じて変えてもよく、任意の特定の加工ユニットおよび特定の所
望の脱アセチル化度に合わせて容易に最適化することができる。脱アセチル化反応は、得
られた部分的脱アセチル化キチンを温水で洗浄することにより、または適切な酸を添加す
ることにより、ｐＨを中和することによって停止させる。次いで得られたポリマーを酸性
溶液に溶解し、異物または不溶性物質を除去するためにこの溶液を濾過することにより、
精製を行ってもよい。
【００６１】
部分的脱アセチル化キチンポリマーを回収するには、濾過された溶液の温度を、最初に
５５℃よりも高く上昇させる。次いでｐＨを８よりも高く、好ましくはｐＨ１０〜１１に
調節し、最後に適切な塩を添加して、析出プロセスを開始させる。次いで温水を使用して
、中性であり塩を含まない材料が得られるまで析出物を洗浄する。洗浄プロセスの後、適
切な従来の乾燥方法を行って、材料を乾燥してもよい。
【００６２】
この実施例は、高溶解性の部分的脱アセチル化キチン（平均脱アセチル化度が３０から
５５％）を、そのような濾過済みポリマー溶液から有機溶媒を使用することなくどのよう
に回収できるのかを教示している。任意選択の塩（ＮａＣｌ）の添加は、商業的プロセス
でのより容易な回収のために、析出物の緻密度を高めることにある。
【００６３】
選択された実施例
１．３．１  ４３％ＤＤ部分的脱アセチル化キチン（Ｌｏｔ  Ｇ０６０３０７Ｐ）１ｇ
を、水１００ｇに分散させた。クエン酸（２ｇ）を、ポリマーを溶解するために添加した
。温度を６０℃まで上昇させ、ＮａＯＨ（３５％溶液）を１滴ずつ添加して、ｐＨを１１
に調節した。この結果、ポリマーが析出し、これを温水で洗浄してほぼ中性にすることが
できた。
【００６４】
１．３．２  キチン１ｋｇを用いるパイロット規模（Ｌｏｔ  Ｇ０６０３０７Ｐ）では
、キチンを最初に脱アセチル化し、洗浄し、１％クエン酸溶液に溶解した。この後、多段
階濾過を行って、透明な溶液を得た。６５℃に加熱した後、ＮａＯＨ  ３５０ｇを投入し
てｐＨを１０．５に調節した。引き続き、ＮａＣｌ  ４．５ｋｇを添加し、析出物の白色
の塊を形成させた。析出物を、中性ｐＨが得られるまで７０℃の水で集中的に洗浄した。
次いで析出物を均質化し、噴霧乾燥して、白色粉末状の部分的脱アセチル化キチンを生成
した。析出を、下記の通り分析した：
乾燥粉末の平均粒度は５μｍ（分布は３〜１０μｍ）であり、脱アセチル化度は４３％
であり、見掛け粘度は５４０ｃｐｓ（１％酢酸に溶かした１％の生成物）であり、濁度（
１％生成物）＜１５ＮＴＵであった。
【００６５】
図１は、７０％脱アセチル化および９４％脱アセチル化キトサンと比較した、この生成
物（４３％ＤＤ）の溶解度を示す。４３％ＤＤポリマーは、生理学的ｐＨ７．４で完全に
可溶性であった（濁度に変化なし）。７０％ＤＤポリマーはｐＨ７．４で一部溶解したが
、９４％ＤＤキトサンポリマーは析出した（濁度＞１０００ＮＴＵ）。
【００６６】
結果は、キチンポリマーをアルカリおよび氷に溶解することによって、残りのＮ−アセ
チル−グルコサミンの分布を制御することができるように、均質な脱アセチル化を行うこ
とができることを示す。この実験は、工業的に実現可能な規模で行うことができ、かつキ
チナーゼを加えることによって得られたキトオリゴマー調製物中のＴ−ＣｈＯＳの収量が
増加するように、この脱アセチル化法を使用できることも示す。
【実施例２】
【００６７】
Ｔ−ＣｈＯＳの生成および特徴付け
２．１  ロットＧ０２０４１８の生成；不均一ＣｈＯＳ試験ロット；同族体の定量およ
び配列決定
生成
水酸化ナトリウム２５ｋｇを、８０Ｌブレンダーに入れた水２５ｋｇに溶解し、６０℃
に加熱した。Ｐ．ｂｏｒｅａｌｉｓ（Ｇｅｎｉｓ  ｅｈｆ．）から得たエビの殻２．５ｋ
ｇを添加し、４０分間撹拌した（１５ｒｐｍ）。次いでスラリーを水で冷却し、チーズク
ロスバッグ（２００×４０ｃｍ）に入れて１０〜１５分間洗浄した。キチンゲルを２００
Ｌブレンダーに移し、３０％ＨＣｌを添加することによってｐＨを４．０に調節し、１０
０Ｌの体積が得られるように水を添加した。ファミリー１８エンドキチナーゼを添加し（
１００００単位／ｋｇ基質）、ゲルを３０℃で２２時間撹拌した。ｐＨを５．４に調節し
、溶液を１０分間８０℃に加熱することによって、酵素を変性させた。冷却後、オリゴマ
ー溶液（ＣｈＯＳ）を、２８０μｍメッシュサイズの篩に通して注いだ。５００Ｄａのカ
ットオフ膜０．７２ｃｍ２を備えたＤＳＳ  ＬａｂＳｔａｋ  Ｍ２０ナノ濾過ユニットを
使用して、ｐＨ４．８で溶液を脱塩した。次いで入口空気温度が１９０℃であり出口空気
温度が８０℃であるロータリーアトマイジング噴霧乾燥ユニットを使用して、溶液を噴霧
乾燥にかけた。微細な白色ＣｈＯＳ粉末２．０ｋｇ（８０％）を収集し、室温で維持した
。脱アセチル化度は、直接滴定によって判断した場合に３７％（またはＦＡ  ０．６３）
であった。
【００６８】
分析方法
ＢｌｏＧｅｌ  Ｐ４ゲル透過クロマトグラフィー分析（ＧＰＣ）
ＣｈＯＳ粉末の２．１６ｇ量を、ｐＨ４．２の０．０５酢酸アンモニウム緩衝液１８０
ｍＬに溶解した。得られた溶液を、０．８μｍおよび０．２μｍの酢酸セルロース膜（Ｓ
ｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌｌ）に通して順次濾過し、３０００Ｄａカットオ
フ膜（Ａｍｉｃｏｎ）に通して限外濾過した。濾液を凍結乾燥した。収量は０．７４ｇ（
３４％）であった。次いで得られた粉末（３５０ｍｇのロット）を、Ｂｉｏｇｅｌ  Ｐ４
、ｆｉｎｅ  ｇｒａｄｅ（ＢｉｏＲａｄ、ミュンヘン、ドイツ）上でのゲル透過クロマト
グラフィー（ＧＰＣ）によって分離した。カラム寸法：５×２００ｃｍ；移動相０．０５
Ｍ酢酸アンモニム緩衝液、０．２３Ｍ酢酸でｐＨ４．２に調節；流量６０ｍＬ／時；屈折
率検出器Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ＲＩＤ  ６Ａ。２０ｍｌの画分を収集し、適切に組み合わせ
、小体積にまで濃縮し、最後に凍結乾燥した。
【００６９】
同族体の調製−イオン交換クロマトグラフィー
ＧＰＣから得た凍結乾燥した画分４ｍｇを、ｐＨ３．０の塩酸塩水溶液２００μＬに溶
解した。溶液を、ナイロン膜（Ｎａｌｇｅｎｅ）を備えた０．４５μｍシリンジフィルタ
に通して濾過した。同族体を、Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａ
ｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、スウェーデン）上での高性能イオン交換クロマトグラフィー（
ＨＰ−ＩＥＣ）によって分離した。床体積：１ｍｌ；移動相：ｐＨ３．０の塩酸塩水溶液
（Ａ）、ｐＨ３．０４の１Ｍ塩化ナトリウム水溶液（Ｂ）；溶離プロファイル：０〜５分
１００％Ａ、５〜４５分  １００％〜５０％Ａ、４５〜４６分  ５０％〜０％Ａ、４６
〜５５分  ０％Ａ、５５〜５６分  ０％〜１００％Ａ、５６〜８０分  １００％Ａ；流量
６０ｍＬ×ｈ−１；ＵＶ検出器Ｊａｓｃｏ  ＵＶ−ＭＤ−９１０。５００μＬの画分を収
集し、適切に組み合わせ、ｆｌｏａｔａｌｙｚｅｒｓ（商標）（ＳｐｅｃｔｒａＰｏｒ）
で水に対して透析し（２Ｌ、４日間）、小体積に濃縮し、最後に凍結乾燥した。サンプル
を、４ｍｇのバッチでＨＰ−ＩＥＣにかけた。収量に関しては、結果および考察を参照さ
れたい。
【００７０】
２−アミノアクリドン（ＡＭＡＣ）によるＣｈＯＳの還元的アミノ化
純粋なＣｈＯＳ  ３０ｎｍｏｌまたはＣｈＯＳ混合物６０〜８０ｎｍｏｌを、２−アミ
ノアクリドンの０．１Ｍ酢酸／ＤＭＳＯ（ｖ／ｖ  ３：１７）溶液２０μＬに溶解し、手
動で３０秒間撹拌し、その後、シアノホウ水素化ナトリウムの１Ｍ水溶液２０μＬを添加
し、さらに３０秒間撹拌した。混合物を、９０℃で３０分間、暗所で加熱した。反応容器
を−２０℃に冷却し、反応混合物を凍結乾燥した。残留物を水１ｍｌに溶解し、水１Ｌに
対して４８時間透析し、最後に凍結乾燥することによって、薄黄色の粉末が得られた。サ
ンプルを直ぐに分析し、または−２０℃で暗所に保存した。
【００７１】
質量分析
凍結乾燥したＡＭＡＣ−オリゴ糖誘導体を、メタノール／水（ｖ／ｖ  ５０：５０）２
００〜５００μＬに再溶解した。この溶液のアリコート（０．５μＬ）を、３０％エタノ
ール水溶液に溶かした母材としてのＤＨＢ（１５ｍｇ×ｍＬ−１）の溶液２μＬと、標的
上で混合し、穏やかな空気流中で液滴を乾燥した。母材の結晶化は、普通に自然に生じた
。場合によっては、結晶化は、当初のサンプル溶液をメタノール／水（ｖ／ｖ  ５０：５
０）で約５倍に希釈した後にだけ、観察された。
【００７２】
ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ質量スペクトルを、陽イオンモードのＢｒｕｋｅｒ  Ｒｅｆｌｅｘ
ＩＩ（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｋ、ブレーメン、ドイツ）で記録した。イオン化
では、窒素レーザ（３３７ｎｍ、３ナノ秒パルス幅、３Ｈｚ）を使用した。質量スペクト
ルの最適化では、レーザを、サンプルの中央領域または結晶縁の最も外側の端部に向けた
。全てのスペクトルは、外部較正を使用して反射器モードで測定した（アンギオテンシン
ＩＩ）。
【００７３】
ＣｈＯＳ同族体−同重体（isobar）の配列決定
ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ質量スペクトルで適切なシグナルを示す、ＤＰ８に対するＤＰ３の
全ての同族体について、他の箇所１に記述されている手順に従って配列決定をした。簡単
に言うと、凍結乾燥したＧＰＣ画分Ｆ３〜Ｆ１０それぞれの６０〜８０ｎｍｏｌを、２−
アミノアクリドンで還元的にアミノ化することにより、還元末端にタグが付された同族体
が得られた２（ＧＰＣ画分Ｆ７−ＡＭＡＣのＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ質量スペクトルについて
は以下を参照のこと、その他については図示していない）。画分を、ＭＡＬＤＩタンデム
質量分析によって分析した。問題となっている同族体の一ナトリウム化擬似分子イオンを
、質量分析器の４極子で選択し、衝突セル内で断片化することによって、非還元末端から
形成されるＡ、Ｂ、およびＣタイプのイオンと、還元末端からのＸ、Ｙ、およびＺタイプ
のイオンが得られた。還元末端のタグにより、Ｙタイプのイオンは、１９４Ｄａの質量増
加によって同定することができ、オリゴ糖配列は、配列系統樹を使用して還元末端から読
み取ることができた。
【００７４】
結果
表１は、各画分の各ＣｈＯＳおよび同族体のＤＰ、ならびに画分Ｆ１〜Ｆ１０の質量分
布を示す。表２は、ＣｈＯＳの同族体の配列の配列分析によって見出された、同重体の配
列を示す。
【００７５】
ＤＰ５とＤＰ７との間のＣｈＯＳの主な化合物では、これらの結果を定量することがで
きた（Ｄ２Ａ３、Ｄ３Ａ３、Ｄ２Ａ４、Ｄ３Ａ４）。
同重体の混合物に関する定量的情報を得るには、擬似ＭＳを用いなければならなかった
：サンプルを供給源内で断片化し（イオンの予備選択なしで）、断片イオンを質量分析器
の４極子で選択し、衝撃セル内で断片化し、最後の断片化の質量スペクトルを記録する。
【００７６】
最初の断片化は、イオンのいかなる予備選択もなしに実施されるので、サンプルは、純
粋な同族体でなければならない。特に、分析物よりも低い質量を有するイオンは、ＭＡＬ
ＤＩ  ＴＯＦ質力スペクトル内に存在すべきではない。
【００７７】
そのような理由で、定量的配列分析の前に、ＧＰＣ画分を精製する必要があった。ＧＰ
Ｃ画分Ｆ６からＦ９の同族体を、陽イオン交換ＨＰＬＣカラムでの電荷数によって分離し
た結果、純粋なＤ２Ａ３（Ｆ６）、Ｄ３Ａ３（Ｆ７）、Ｄ２Ａ４（Ｆ８）、およびＤ３Ａ
４（Ｆ９）が得られた。表３は、ＧＰＣ画分Ｆ６からＦ９のＨＰ−ＩＥＣ分離の結果をま
とめている。
【００７８】
純粋な同族体Ｄ２Ａ３、Ｄ３Ａ３、Ｄ２Ａ４、およびＤ３Ａ４を、２−アミノアクリド
ンで還元的にアミノ化して、還元末端にタグが付された誘導体を得た（Ｄ３Ａ３−ＡＭＡ
ＣのＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ質量スペクトルについては下記参照のこと、その他については図
示していない）。誘導同族体について、擬似ＭＡＬＤＩ  ＭＳにより、上述のように配列
決定した。
【００７９】
同族体断片イオンの相対強度［％］を、評価ソフトウェアによって割り当てた。相対ピ
ーク強度の再現性は、繰り返される断片化によって証明した。平均標準偏差は１％である
ことがわかった。図２は、異なる配列の断片イオンによって引き起こされたピークの強度
を定量する、Ｄ３Ａ３に関する配列系統樹を示す。Ｙ２タイプのイオンでは、ＤＡ（７．
５％）およびＡＡ（９２．５％）の相対量を、Ｄ１Ａ１−ＡＭＡＣおよびＡ２−ＡＭＡＣ
の相対ピーク強度から直接読み取ることができた。
【００８０】
Ｙ３タイプのイオンでは、ＤＤＡ（５．９％）およびＡＡＡ（６．５％）の相対量を、
Ｄ２Ａ１−ＡＭＡＣおよびＡ３−ＡＭＡＣの相対ピーク強度から直接読み取ることができ
た。ＡＤＡの相対量（１．６％）は、方程式［ＤＤＡ］＋［ＡＤＡ］＝７．５％から結論
付けることができ、ＤＡＡの１つ（８６．０％）は、方程式［ＤＡＡ］＋［ＡＡＡ］＝９
２．５％から得ることができた。
【００８１】
Ｙ４タイプのイオンでは、ＤＤＤＡ（０．９％）の相対量を、Ｄ３Ａ１−ＡＭＡＣの相
対ピーク強度から直接読み取ることができた。ＡＤＤＡの相対量（５．０％）は、方程式
［ＤＤＤＡ］＋［ＡＤＤＡ］＝５．９％から結論付けることができた。ＤＡＡＡの相対量
は、ＤＡＡＡ−ＡＭＡＣのみがＡ３−ＡＭＡＣを与えるので、６．５％であり、これに、
６．５％の相対ピーク強度を割り当てた。
【００８２】
【表１】
2014221905.tif 000002
【００８３】
【表２】
2014221905.tif 000003
【００８４】
【表３】
2014221905.tif 000004
【００８５】
Ｄ１Ａ３−ＡＭＡＣの擬似ＭＳ３では、Ｄ１Ａ１−ＡＭＡＣおよびＡ２−ＡＭＡＣの相
対ピーク強度が、１．０％および９９．０％である。Ｄ３Ａ３−ＡＭＡＣのＭＡＬＤＩタ
ンデム質量スペクトルでは、Ｄ１Ａ３−ＡＭＡＣの相対ピーク強度が２２．１％である。
ＡＡＤＡは、断片Ｄ１Ａ１−ＡＭＡＣを与えるＤ１Ａ３（ＡＡＤＡ、ＡＤＡＡ、ＤＡＡＡ
）の唯一の配列である。その理由で、ＡＡＤＡの相対量が２２．１％の１％＝０．２％で
ある。ＤＡＤＡの相対量（１．４％）は、方程式［ＡＡＤＡ］＋［ＤＡＤＡ］＝１．６％
から計算することができた。ＡＤＡＡの相対量（１５．４％）は、方程式［ＡＡＤＡ］＋
［ＡＤＡＡ］＋［ＤＡＡＡ］＝２２．１％から計算することができた。最後に、ＤＤＡＡ
の相対量（７０．６）は、方程式［ＡＤＡＡ］＋［ＤＤＡＡ］＝８６．０％から計算する
ことができた。Ｙ５タイプのイオンの場合、ＡＤＤＤＡの相対量は、ＡＤＤＤＡ−ＡＭＡ
ＣのみがＤＤＤＡ−ＡＭＡＣを与えるので０．９％であり、これに相対ピーク強度０．９
％を割り当てた。同じような考察により、ＤＡＡＤＡ（０．２％）、ＤＡＤＡＡ（１５．
４％）、およびＤＤＡＡＡ（６．５％）の割り当てが可能になる。
【００８６】
Ｄ２Ａ３−ＡＭＡＣの擬似ＭＳ３では、Ｄ２Ａ１−ＡＭＡＣ、Ｄ１Ａ２−ＡＭＡＣ、お
よびＡ３−ＡＭＡＣの相対ピーク強度が、２．６％、８８．０％、および９．４％である
。Ｄ３Ａ３−ＡＭＡＣのＭＡＬＤＩタンデム質量スペクトルでは、Ｄ２Ａ３−ＡＭＡＣの
相対ピーク強度が８２．０％である。ＡＡＤＤＡは、断片Ｄ２Ａ１−ＡＭＡＣを与えるＤ
２Ａ３（ＡＡＤＤＡ、ＡＤＡＤＡ、ＤＡＡＤＡ、ＡＤＤＡＡ、ＤＡＤＡＡ、ＤＤＡＡＡ）
の最適な配列である。その理由で、ＡＡＤＤＡの相対量は、８２．０％の２．６％＝２．
１％である。ＤＡＤＤＡの相対量（２．９％）は、方程式［ＤＡＤＤＡ］＋［ＡＡＤＤＡ
］＝５．０％から計算することができる。Ｄ２Ａ３−ＡＭＡＣの擬似ＭＳ３では、Ｄ１Ａ
１−ＡＭＡＣおよびＡ２−ＡＭＡＣの相対ピーク強度が３．９％および９６．１％である
。ＡＤＤＡＡ、ＤＡＤＡＡ、およびＤＤＡＡＡは、Ａ２−ＡＭＡＣを与えるＤ２Ａ３の最
適な配列である。その理由で、ＡＤＤＡＡ＋ＤＡＤＡＡ＋ＤＤＡＡＡの相対量は、８２．
０％の９６．１％＝７８．８％である。この方程式から、ＡＤＤＡＡの相対量（５６．９
％）を計算することができる。ＤＤＤＡＡの相対量（１３．７％）は、方程式［ＤＤＤＡ
Ａ］＋［ＡＤＤＡＡ］＝７０．６％から計算することができる。ＤＤＡＤＡの相対量（０
．５％）は、方程式［ＤＤＡＤＡ］＋［ＡＤＤＤＡ］＋［ＤＡＤＤＡ］＋［ＤＤＤＡＡ］
＝１８．０％から計算することができ、ＡＤＡＤＡの相対量（０．９％）は、方程式［Ｄ
ＤＡＤＡ］＋［ＡＤＡＤＡ］＝１．４％から計算することができる。
【００８７】
図３ａ〜３ｄは、同族体Ｄ２Ａ３、Ｄ３Ａ３、Ｄ２Ａ４、およびＤ３Ａ４の同重体の相
対量を示す。この方法の再現性により、１％の未満の相対ピーク強度を決定することがで
きないので、同重体は、計算量が１％未満の場合に図に含まれなかった。
【００８８】
２．２  ロットＧ０５０４２１の生成；均質脱アセチル化プロセスによる改善されたＴ
−ＣｈＯＳの収量
均質キトオリゴ糖Ｇ０５０４２１の生成
脱アセチル化を、実施例１で述べたように行った。脱アセチル化プロセスの終了後、塩
酸を使用してｐＨをさらに３．８に調節し、温度を３５℃に調節した。ファミリー１８エ
ンドキチナーゼ（１００００単位／ｋｇ基質）を溶液に添加し、加水分解反応を２２時間
続けて、加水分解を終了させた。この後、一連の濾過ステップを行って固体粒子を除去し
、限外濾過ステップを行って、酵素タンパク質およびその他のポリマーの残遺物を除去し
た。最後に、溶液を噴霧乾燥することにより、粉末状の治療用キトオリゴ糖（Ｔ−ＣｈＯ
Ｓ）（Ｇ０５０４２１）が得られた。
【００８９】
分析方法
Ｂｉｏｇｅｌ  Ｐ４のＧＰＣ分画を、前述のように行った。ＧＰＣ画分のＭＡＬＤＩ−
ＴＯＦ質量分析を、前述のように行った。
【００９０】
結果
直接滴定による判定では、不均一脱アセチル化ＣｈＯＳの脱アセチル化度が３９％であ
り、均質脱アセチル化オリゴマー（Ｇ０５０４２１）では４０％であった。
【００９１】
不均一脱アセチル化オリゴマー（Ｇ０２０４１８）に関するオリゴマーピーク分布およ
び同族体分析を、図４に示し、均質脱アセチル化オリゴマー（Ｇ０５０４２１）に関する
ものを図５に示す。ピーク分布における最も著しい差は、より長いオリゴマーで観察され
る。不均一脱アセチル化オリゴマーの場合、ＤＰ１１から２２（図４のピーク領域０）は
、全材料の３５．５％であり、その量は、ＤＰ１１から２２の増加と共に増加する。一方
、均質脱アセチル化オリゴマーの場合、ＤＰ１１から２２（図５のピーク領域０から−３
）は、全材料のわずか１２．９％であり、その量は、ＤＰ１１から２２の増加と共に減少
し、文献上はＤＰ１８またはそれ以上を残さない。これは、非常に活性なオリゴマー（Ｄ
Ｐ５〜１０）の値にも反映されている。均質オリゴマーは４１％のＤＰ５〜１０を有する
が、不均一オリゴマーは、わずか２８％のＤＰ５〜１０を有する。
【００９２】
これら２つの脱アセチル化方法による、オリゴマーに関する同族体分布を図６に示す。
不均一オリゴマーの場合、均質オリゴマーの場合よりも非常に少ないＤＰ４（Ａ２Ｄ２お
よびＡ３Ｄ）およびＤＰ５（Ａ３Ｄ２）ならびにＤＰ７（Ａ３Ｄ４）およびＤＰ８（Ａ４
Ｄ４）が存在する（図６）。
【００９３】
まとめると、均質脱アセチル化は、不均一脱アセチル化よりも生物活性が高いＣｈＯＳ
を与える可能性が高い。望ましくないより高いＤＰ＞１５オリゴマーの生成の著しい減少
は、この方法によって観察される。
【００９４】
２．３  限外濾過によるＴ−ＣｈＯＳの相対量の増強（ロットＧ０５１１２８）
Ｔ−ＣｈＯＳ（ＤＰ５〜１５）の相対量を改善するために、追加の限外濾過ステップを行って、１ｋＤａのＵＦ膜（Ｈｅｌｉｃｏｎ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）Ｔ−ＣｈＯＳ溶液を濾過し、濃縮し、小キトオリゴマー（ＤＰ２〜５）を大幅に減少させ、モノマーを排除した。浸透液を廃棄し、保持物（retentate）を収集して噴霧乾燥した。
【００９５】
試験材料の分析では、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｇｏｌｄシステムを使用してＨＰＬＣを実施し
た。分子量によってＣｈＯＳを分離する（ＤＰ１、ＤＰ２など）ＴＳＫ−オリゴカラム（
ＴｏｓｏＨａａｓ、日本）を使用した。溶媒は５ｍＭ水酸化アンモニウム、ｐＨ１０．０
であり、流量は０．５ｍｌ／分、吸光度は２０５ｎｍ、注入体積は２０μｌであり、Ｃｈ
ＯＳ濃度は１０ｍｇ／ｍｌであった。
【００９６】
図７は、限外濾過ステップ前後の各ＤＰの相対量を示す。モノマーは除去され、より小
さいオリゴマー（ＤＰ２〜５）が著しく低下している。
【実施例３】
【００９７】
人体での治療用キトオリゴ糖の吸収
方法
キトオリゴマー
Ｎ−アセチルグルコサミンおよびグルコサミンからなるキトオリゴマーは、Ｇｅｎｉｓ
、レイキャビク、アイスランドによって調製された。簡単に言うと、キチンをアルカリ中
で部分的に脱アセチル化し、洗浄し、キチナーゼによりオリゴマーに加水分解した。オリ
ゴマーを限外濾過し、脱塩し、噴霧乾燥して、微細な白色粉末にした。平均脱アセチル化
度は４７％（ＦＡ０．５３）であった。オリゴマーおよび同族体の分析および定量を、血
液の場合と同じ方法を使用して行った。このデータを使用して、血液中の種々の同族体の
吸収度を比較した。
【００９８】
全体的な血液サンプル処理
ボランティアの被験者に、４週間にわたって毎日、ＣｈＯＳ（Ｇｅｎｉｓ  ｅｈｆ；Ｓ
０４１１２４−１Ｋ）１．８ｇを消費させた。血液サンプルを６週間以内に収集した。最
初のサンプルは、ＣｈＯＳの消費前に採取した。続いて４つのサンプルを、最初の消費か
ら１週間後に開始して毎週採取した。サンプル６は、ＣｈＯＳの消費を停止させてから２
週間後に採取した。各サンプルの体積は、７．０ｍｌであった。血液サンプルを、３００
０ｒｐｍで３０分間遠心分離した。血清を収集した。メタノールおよび塩化ナトリウムを
添加して、最終濃度をメタノール３０％および塩化ナトリウム０．１ｍｇ／ｍｌにし、そ
の後、別の遠心ステップを行った。サンプル５００μｌを、３ｋＤａのカットオフ膜に通
して濾過した（限外濾過）。上澄みを３倍に満たした。適切な濾液を貯留し、メタノール
を真空除去し、サンプルを最後に凍結乾燥した。
【００９９】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ
凍結乾燥したサンプル（約１００μｇ）を、メタノール／水（ｖ／ｖ  ５０：５０）１
００μｌに再度溶解した。溶液のアリコートを、ターゲット上で、３０％のエタノール水
溶液（１５ｍｇ＊ｍｇ−１）に溶かしたＤＨＢの溶液２μｌと混合した。液滴を、穏やか
な空気流中で乾燥した。質量スペクトルを、陽イオンモードのＢｒｕｋｅｒ  Ｒｅｆｌｅ
ｘ  ＩＩ（Ｄａｌｔｏｎｉｋ、ブレーメン、ドイツ）で記録した。イオン化では、窒素レ
ーザ（３３７ｎｍ、３ナノ秒のパルス幅、３Ｈｚ）を使用した。全てのスペクトルを、外
部較正を使用してリフレクタモードで測定した。モノアイソトピックピークを、全ての質
量スペクトルにおいて標識した。
【０１００】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによる同族体決定
凍結乾燥したサンプル（約１００μｇ）を、メタノール／重水（ｖ／ｖ  ５０：５０）
１００μｌ中に再度溶解した。１０倍モル過剰なヘキサ重水素無水酢酸を添加し、それと
共に氷状テトラ重水素酢酸を３滴添加した。溶液を、３０℃で１２時間撹拌した。等モル
量のアンモニアを添加することによって、反応を停止させた。溶液を凍結乾燥し、アンモ
ニア１００μｌ中に再度溶解した。アンモニアの濃度は、Ｎ−アセチルグルコサミン単位
（ＧｌｃＮＡｃまたはＡ）のモル数に対して１０倍モル過剰に設定した。溶液を、２２℃
で一晩撹拌した。アンモニアを真空中で除去した後、サンプルを凍結乾燥した。ＭＡＬＤ
Ｉ−ＴＯＦ  ＭＳがＯ−アセチル基を依然として示す場合、凍結乾燥物を、水酸化ナトリ
ウム水溶液（１００μｌ）中に再度溶解した。水酸化カリウムの濃度は、ＧｌｃＮＡｃ単
位のモル数に対して２倍モル量過剰に設定した。溶液を室温で１０時間撹拌し、陽イオン
交換樹脂（Ｈ＋形）を添加することによって中和した後、濾過し、濾液を凍結乾燥した。
【０１０１】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルを、実施例４で述べるように採取した。相対シグナ
ル強度の定量によって、混合物中の同族体の組成が得られる。
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによるＣｈＯＳの定量法
サンプルを、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによる同族体決定で述べたように調製する。そ
の後、標準物質を各サンプルに添加した。標準物質であるキチンオリゴマー（Ａｎ）は、
分析物と同じＤＰ±１でなければならない。この標準物質の連続希釈物を使用した。分析
物と標準物質との信号強度を比較することにより、分析物の濃度が得られる。
【０１０２】
ゲル透過クロマトグラフィー（ＧＰＣ）
オリゴマーを、実施例２で述べたＢｉｏｇｅｌ  Ｐ４上でのＧＰＣを用いて分離した。
適切な画分を組み合わせた；体積を真空中で減じた後、一定質量まで凍結乾燥して、酢酸
アンモニウムを除去した。
【０１０３】
高性能イオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＩＥＣ）
ＧＰＣ分離から得られた同族体（およびオリゴマー）の混合物を、ＨＰＩＥＣによって
分析した。条件：固定相：Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｓ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ウプサラ、スウ
ェーデン）、床体積１ｍｌ；移動相：塩酸ｐＨ３．５、塩化ナトリウム勾配０〜１Ｍ、５
〜６０分、流量１ｍｌ／分；装置：ＵＶ検出器（検出波長２１０ｎｍ）を備えたＨＰＬＣ
機器（Ｊａｓｃｏ、Ｇｒｏｓｓ−Ｕｍｓｔａｄｔ、ドイツ）。ＨＰＬＣ画分を凍結乾燥し
た。時折り、画分を透析（Ｆｌｏａｔａｌｙｚｅｒ（登録商標）、ＳｐｅｋｔｒａＰｏｒ
、ドイツ）によって脱塩した。
【０１０４】
ＨＰＩＥＣを用いた同族体の定量法
実験は本質的に、高速イオン交換クロマトグラフィーで述べたように行った。標準物質
を各サンプルに添加した。標準物質は、分析物と同じ濃度範囲内になければならない。分
析物の濃度は、標準物質と分析物とのピーク面積の比較から計算する。ピーク面積は、分
析物分子中のアセチル基の数に対して線形相関を示す。
【０１０５】
結果
ＣｈＯＳの消費前に収集された血液サンプルのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦは、ＣｈＯＳのいか
なるシグナルも示さなかった。
【０１０６】
１週間後
ＣｈＯＳ消費の１週間後の血液サンプルでは、オリゴマーのごく微量のＤＰ２（Ａ２同
族体）およびＤＰ３（Ｄ１Ａ２同族体）が観察された（データは図示せず）。
【０１０７】
２週間後
ＣｈＯＳ消費の２週間後に採取した血液サンプルは、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクト
ルによって判定したときに、ヘテロキトオリゴマーの明らかな徴候を示した。図８は、Ｄ
Ｐ２〜ＤＰ５の同族体を示す；ＤＰ２（同族体Ａ２）からＤＰ１２（同族体Ｄ７Ａ５）ま
での同族体は、質量スペクトル内に明らかに認められた。様々な方法（方法の章を参照）
による同族体の定量法は、消費から２週間後の全ＣｈＯＳ濃度が０．１６ｍｇ／ｍｌ血清
であることを明らかにした。全血液体積が５Ｌと仮定すると、吸収されたＣｈＯＳの総量
は、０．８０ｇまたは日用量の４４％である。
【０１０８】
３週間後
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳは、ＤＰ２からＤＰ１２までのオリゴマーについて明らかに
した（図９）。図１０は、消費された天然サンプルと３週間後の血液サンプルとの、オリ
ゴマーと同族体の相対質量分光分析シグナル強度を比較する。当初の混合物と比べると、
血液サンプル中において、より高いアセチル化同族体（より高いＦＡ値）への明らかなシ
フトが観察される。３週間後の血液サンプルでは、ＤＰ１５までの微量の同族体が見出さ
れた。様々な方法（表４および方法の章を参照）による同族体の定量法は、消費から３週
間後の全ＣｈＯＳ濃度が０．１９ｍｇ／ｍｌ血清であることを明らかにした。
【０１０９】
【表４】
2014221905.tif 000005
【０１１０】
結論
毎日１．８ｇのＣｈＯＳを消費することによって、血流中へのこれらの糖の吸収がもた
らされる。微量のＤＰ２およびＤＰ３オリゴマーは、消費から１週間で明らかである。最
大８４％の摂取は、消費開始から２週間で達せられ、ＣｈＯＳの最高水平域（１００％）
は、消費開始後３週間で達せられる。全体的な最大濃度は、血液ｍｌ当たり約１９０μｇ
であり、毎日の投与の５３％最大吸収率を示している（５Ｌ血液体積）。ＤＰ２〜７のオ
リゴマーは、血液ｍｌ当たり１４〜４０μｇの濃度（むしろ等しい）であることがわかる
。ＤＰ８〜９のオリゴマーは、３〜１０μｇ／ｍｌのより低い濃度であることがわかる。
ＤＰ１５までのオリゴマーは血液中に見出された。消費された天然サンプル中および血液
中に見出された同族体の比較によって、より高いアセチル化度の同族体が、血流中に好ま
しく浸透していることが明らかにされる。
【０１１１】
消費停止から２週間後、もはや血流中にはキトオリゴマーが検出されない。
Ｔ−ＣｈＯＳ組成物は、ＦＡ値など、異なる組成を含むヘテロオリゴマー組成物に比べ
て、生物学的利用能がより高い傾向があると結論付けられる。これは、Ｔ−ＣｈＯＳ組成
物が、その他のヘテロオリゴマー組成物に比べてより高い治療活性を含むという結論を裏
付けている。
【実施例４】
【０１１２】
キチナーゼＡ活性の遮断薬としてのＴ−ＣｈＯＳ同族体；Ｔ−ＣｈＯＳ組成物の生物安
定性に関するモデル
材料および方法
キトオリゴ糖（ＣｈＯＳ）（ロットＮｏ．Ｇ０２０４１８およびＧ０２０２１８）を、
陽イオン交換クロマトグラフィーまたはゲル透過クロマトグラフィーによって、あるいは
両方の方法の組合せによって、同族体画分に分画した。生成物を凍結乾燥し、ＭＡＬＤＩ
−ＴＯＦ質量分光分析によって構造および配列を分析した。Ｇｅｎｉｓから得た３つのそ
の他の未分画ＣｈＯＳロットについても、同じＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ法によって分析した（
ロットＮｏ．Ｇ０４０８２３、Ｇ０５０４２１、およびＧ０５０４２１ＵＦ；ＵＦは、Ｄ
Ｐ≦５の含量を減少させるための、１ｋＤａ膜を通した限外濾過を表す）。
【０１１３】
限外濾過は、均質に脱アセチル化された部分的脱アセチル化キチンロットの加水分解によって調製された、バッチＧ０５０４２１に関して実施した。簡単に言うと、ＣｈＯＳ  １６ｇを１８０ｍｌの蒸留水に溶解し、Ａｍｉｃｏｎセルを使用して、１ｋＤａ再生セルロース膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＵＳＡ）でダイアフィルトレーションを行った。保持された溶液の最終体積は６５ｍｌであり、０．５８２ｇのＣｈＯＳが得られた（収率＝３３％）。全透過液体積は９７０ｍｌであった。全透過液と最終の保持物（retentate）との
両方を、実施例４に記述されるようにＰ４ＢｉｏｇｅｌクロマトグラフィーおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分光分析によって分析した。最終的な保持物（retentate）を凍結乾燥
し、これをＧ０５０４２１ＵＦと呼ぶ。
【０１１４】
霊菌（Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）から精製されたキチナーゼＡ調製物を、標準的なフ
ァミリー１８キチナーゼとして使用し、４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−Ｎ，Ｎ’
−トリアセチルキトトリオシド（４−ＭＵ−Ａ３）、キチンテトラマー（Ａ４）類似体を
、標準的なキチナーゼ基質として使用した。
【０１１５】
標準的なキチナーゼＡ溶液は、０．１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ中に０．５ｎＭ（５００ｐＭ
）であり、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）（Ｃｈｉｔ−Ａ  ｓｏｌ．）および基質
溶液は、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に溶かした４０μＭの４−ＭＵ−Ａ３であ
った。
【０１１６】
純粋な各ＣｈＯＳ同族体の種々の濃度（通常、０、２５、５０、１００、２００、４０
０、および８００μＭ）を、基質緩衝液中に作製した。アッセイでは、Ｃｈｉｔ−Ａ溶液
２５μｌを基質／遮断溶液２５μｌと混合し、３７℃で１０分間インキュベートした。反
応を、１．９５ｍｌの０．２Ｍ重炭酸ナトリウム緩衝液（Ｎａ２ＣＯ３）で停止させた。
生成物、４−メチルウンベリフェロン（４−ＭＵ）の形成を、Ｐｅｒｋｅｎ−Ｅｌｍｅｒ
ＬＳ  ５０Ｂ蛍光高度計で各反応ごとに読み取った。励起波長は３８０ｎｍであり（５
ｎｍ調節スリット）、発光波長は４６０ｎｍ（４ｎｍ調節スリット）であった。各反応を
、３回読み取った。遮断を評価するために、非線形当てはめ、ｆ＝ｙ０＋ａ＊ｅｘｐ（−
ｂ＊ｘ）を使用して（式中、ｘはキチナーゼの特異的活性に等しく、ｆはオリゴ糖濃度（
μＭ）に等しい）、５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を各ＣｈＯＳ同族体ごとに計算した。各
同族体の親和性を、ＩＣ５０の逆数として計算した。使用した式は、１／ＩＣ５０×１０
００であった。
【０１１７】
結果および結論
キナーゼＡは、ｐＨ５．５で最適の活性を有するにも関わらず、遮断実験に関するｐＨ
は、ｐＨ７．４に調節された。これは、ｐＨ５．５で行われたより早期のパイロット実験
で、ＣｈＯＳ同族体の低遮断活性が示されたので、ＣｈＯＳのアミン基をプロトンから解
放するために行った。またこのｐＨは、血液およびその他の生理学的流体の生理学的ｐＨ
により良く似ており、人体でのオリゴ糖の振舞いをより良く反映している。
【０１１８】
図１１は、キチナーゼ活性の典型的なＣｈＯＳ遮断を示す。得られるＩＣ５０は、Ａ４
Ｄ２同族体に関して１７μＭと計算された。表５に、ＤＰ、同族体、ＩＣ５０、試験がな
された全ての同族体に関して計算された親和性および配列をまとめる。図１２は、試験が
なされた各同族体の計算された親和性を示す。図１３は、図１２と同じ内容を示し、それ
と共に各同族体を含む全ての配列（同重体）も示す。異なる同族体の遮断活性を考慮する
と、２つの主な規則を導き出すことができる。遮断は、ＤＰが増加するほど強力になり、
それと同時に、より多くのアセチル化同族体（分子当たり、より多くのＡ単位）がより高
い親和性を示す。したがって、Ｄ６、Ｄ９、およびＤ１２は全て、不十分な遮断薬である
。Ａ４Ｄ２、Ａ４Ｄ３、Ａ５Ｄ７、およびＡ６Ｄ９（ＤＰ６〜１２）は、最も強い遮断性
を示した。したがってこれらの同族体は、キチナーゼ活性側に対する見掛けの親和性によ
り、最も高い生物活性を有すると見なすことができる。ＤＰ１２（Ａ５Ｄ７）は、最も高
い親和性を示し、ＤＰ１５（Ａ５Ｄ７）では、親和性がそれほど著しく上昇しない（図１
２および１３）。ホモオリゴマーＡ６は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによって判定されるように
、キチナーゼＡによってＡ３、Ａ２、およびＡ１に切断した。
【０１１９】
しかしキチナーゼＡは、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分光分析によって判定されるように、
アッセイ条件下（ｐＨ５．５およびｐＨ７．４）で試験されたヘテロオリゴマーのいずれ
も切断せず、同族体が良好な生物安定性を有することが示された。この高い生物安定性の
理由は、ＣｈＯＳ生成中のファミリー１８キチナーゼによる、基質の完全な加水分解であ
る。
【０１２０】
未分画ＣｈＯＳ調製物を同じ酵素系で試験した場合、ＩＣ５０は、Ｇ０４０８２３に関
しては７０μｇ／ｍｌであり（図１４）、Ｇ０５０４２１に関しては１０５μｇ／ｍｌで
あり、限外濾過したＧ０５０４２１ＵＦの関しては６７μｇ／ｍｌであった。これは、Ｃ
ｈＯＳ混合物中での同族体の遮断活性および生物安定性を評価するのに、この方法を使用
できること、およびこの方法では、分析前に同族体に分画する必要がないことを実証して
いる。したがってこの方法は、ヘテロキトオリゴ糖の種々の同族体の混合物を含むＣｈＯ
Ｓ調製物の、平均遮断活性を評価するのに使用することができる。そのような評価は、酵
素の活性部位に対する平均結合親和性、および含まれる同族体の平均生物安定性の指標を
与えることが可能である。
【０１２１】
【表５】
2014221905.tif 000006
【実施例５】
【０１２２】
ヘテロオリゴ糖と３９ｋＤａヒト軟骨糖タンパク質（ＨＣ  ｇｐ−３９）との結合
ＨＣ  ｇｐ−３９はキチナーゼ由来のタンパク質であるので、キチンオリゴマー（ポリ
マーキチンの他に）は、このタンパク質に対して最も強い親和性を示す。一方、キチンオ
リゴマーは、人体にも見出される活性ファミリー１８キチナーゼによって素早く切断され
る。Ｔ−ＣｈＯＳ組成物などのヘテロキトオリゴ糖（ＡおよびＤ単位からなる）は、キチ
ンオリゴマー（Ａ単位またはホモオリゴ糖のみ）よりも著しく高い生物安定性性を有する
。したがって本実施例の目的は、ＨＣ  ｇｐ−３９に対するＣｈＯＳの親和性が、ＦＡに
よって、さらにはヘテロオリゴ糖のＤＰによってどの程度の影響を受けるか調査すること
であった。
【０１２３】
材料および方法
ヘテロキトオリゴ糖の定性的および定量的配列分析は、前述のように（実施例４）行っ
た。
【０１２４】
親和性の研究
ＣｈＯＳとＨＣ  ｇｐ−３９との非共有複合体の親和性を、結合条件下で、タンパク質
の内因性トリプトファン蛍光の変化を利用して分析した。蛍光強度の変化は、リガンドで
誘発されたトリプトファン残基の溶媒カバーの変化によって引き起こされ、糖濃度と正に
相関する。
【０１２５】
ＨＣ  ｇｐ−３９を、１ｍＭジチオトレイトールを含有する２５ｍＭトリスＨＣｌ緩衝
液ｐＨ７．４に溶解して、最終濃度１．００μＭ（タンパク質溶液）にした。異なる濃度
の同族体を、１ｍＭジチオトレイトールを含有する２５ｍＭトリスＨＣｌ緩衝液ｐＨ７．
４中に溶かして調製した（糖溶液）。各同族体ごとに、４つの異なる濃度を調製した：溶
液Ｉ  １．３〜２．０μＭ、溶液ＩＩ  ６．５〜１６．０μＭ、溶液ＩＩＩ  ５２．０〜
８０．０μＭ、および溶液ＩＶ  １３０．０〜２００．０μＭ（濃度は、同族体間で異な
った）。アッセイでは、タンパク質溶液５０μｌおよび各糖溶液（溶液Ｉ〜ＩＶ）５０μ
ｌを、サーモシェーカーで１５分間、２５℃で別々にプレインキュベートした。その後、
サーモスタットで調節したタンパク質溶液５０μＬを、糖溶液５０μＬと（溶液Ｉ〜ＩＶ
を続けて）混合した。混合物を、サーモシェーカーで、２５℃で７分間インキュベートし
た。蛍光を、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  ＬＳ  ５０Ｂ蛍光分光計（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌ
ｍｅｒ、Ｕｂｅｒｌｉｎｇｅｎ、ドイツ）で各反応ごとに読み取った。励起波長は２９５
ｎｍ（５ｎｍの調節スリット）、発光波長は３４０ｎｍ（１０ｎｍの調節スリット）であ
り、カットオフは２９０ｎｍであった。各反応について、３回測定した。
【０１２６】
解離定数の計算
生の蛍光データから、ブランクの蛍光を差し引いた。Ｆ−Ｆ０を、同族体の濃度に対し
てプロットし、データを、非線形回帰により、ＳｉｇｍａＰｌｏｔ（登録商標）ソフトウ
ェアを用いてワンサイト飽和モデルに当てはめて、結合等温式を得た。
【０１２７】
ｙ＝Ｂｍａｘ×ｘ／（Ｋｄ＋ｘ）
Ｂｍａｘ：ＨＣ  ｇｐ−３９の飽和結合ドメインに関する蛍光強度
Ｋｄ：解離定数。
【０１２８】
ＫｄとＦＡとの間の相関
Ａ単位の数に基づく一連のＤＰ６同族体（Ｄ６、Ｄ３Ａ３、Ｄ２Ａ４、およびＡ６）に
関する解離定数のデータを、非線形回帰（ＳｉｇｍａＰｌｏｔ（登録商標）ソフトウェア
）により２パラメータ双曲線形減衰に当てはめた。
【０１２９】
ｙ＝ａ×ｂ／（ｂ＋ｘ）
相対親和性とＦＡの間の相関
解離定数のデータを相対親和性に変換し、Ａ６に関しては１００％の相対親和性であり
、Ｄ６に関しては０％の相対親和性であった。Ｄ３Ａ３およびＤ２Ａ４の相対親和性を、
この仮想スケールに従って計算し、Ａ単位の数に対してプロットした。データを、非線形
回帰により（ＳｉｇｍａＰｌｏｔ（登録商標）ソフトウェア）２パラメータ単一矩形双曲
線関数に当てはめた。
【０１３０】
ｙ＝ａ×ｘ／（ｂ＋ｘ）
結果
親和性研究の前に、本実施例で使用した全てのＣｈＯＳを、その純度および配列組成に
関して分析した。キチンオリゴマーＡ６（生化学工業（株）、日本）を精製し、分析した
後に親和性の研究を行った。全てのオリゴマーについて、その純度をチェックした。表６
は、試験がなされたＣｈＯＳの配列組成を示す。
【０１３１】
ＣｈＯＳとＨＣ  ｇｐ−３９との複合体の親和性を、タンパク質の内因性トリプトファ
ン蛍光を使用して分析した。蛍光強度の変化は糖濃度に依存しており、非結合条件下での
、トリプトファンの表面を覆う溶媒分子の再配列によって説明される。２４濃度依存性蛍
光データを、非線形回帰によりワンサイト飽和モデルに当てはめた（ＳｉｇｍａＰｌｏｔ
（登録商標）プログラム、図１５参照）。Ｄ６、Ｄ３Ａ３、Ｄ２Ａ４、Ａ６、およびＤ５
Ａ６に関して見出された解離定数は、全て、マイクロモル範囲内にある（図１６）。
【０１３２】
予測されるように、解離定数に関する値は、ＣｈＯＳのＦＡの上昇と共に低下する。一
連のＤＰ６同族体（Ｄ６、Ｄ３Ａ３、Ｄ２Ａ４、およびＡ６）に関する、ＦＡの上昇に伴
う解離定数の低下は、線形関数ではない。データは、双曲線型減衰関数に最も良く当ては
まる（ｙ＝ａ×ｂ／（ｂ＋ｘ）；ａ：４１９．９３２；ｂ：０．３８３９；Ｒ２：０．９
９８６；図１７）。図１７の差し込み図は、相対親和性［％］（Ｄ６＝０％およびＡ６＝
１００％）を示し、Ｄ３Ａ３に関する最大親和性は９０．８％のままである。
【０１３３】
また解離定数の値は、Ｄ３Ａ３（ＦＡ  ０．５；Ｋｄ  ５１．１μＭ）およびＤ５Ａ６
（ＦＡ  ０．５５；Ｋｄ  ６．９μＭ）の比較が示すように、ＤＰおよび定数ＦＡの上昇
と共に低下する。興味深いことにＫｄ値は、Ａ６（６Ａ単位；Ｋｄ  １３．６μＭ）およ
びＤ５Ａ６（６Ａ単位；Ｋｄ  ６．９μＭ）の比較が示すように（Ｄ５Ａ６のＫｄは、Ｄ
３Ａ３に関するＫｄの１４％である）、Ａ単位の数は一定の状態でＤ単位の数が増加する
と共にさらに低下する。
【０１３４】
【表６】
2014221905.tif 000007
【０１３５】
結論
ＣｈＯＳは、マイクロモル範囲内の親和性（解離定数）でＨＣ  ｇｐ−３９と結合する
。親和性は、ＦＡおよびＤＰの増加と共に、さらにＡ単位数が一定の状態でのＤ単位数の
増加と共に、増大する。一連のＤＰ６同族体の場合、ＦＡの５０％低下（Ａ６□Ｄ３Ａ３
）によって、わずか９．２％の低下を親和性に引き起こす。したがって、ＦＡが０．５か
ら０．７５のＣｈＯＳは、人体におけるＨＣ  ｇｐ−３９の最適な結合パートナーである
。これらは最大結合能力の９０＋％を回復し、十分なＤ単位を含有して（したがってＤ−
Ｄ、Ｄ−Ａ、Ａ−Ｄ結合）、人体において著しく増大した生物安定性を示す。これらの化
合物は最適な治療活性をもたらし、したがって本明細書では、治療用キトオリゴ糖（Ｔ−
ＣｈＯＳ）と呼ぶ。
【実施例６】
【０１３６】
キトバイオマー成分の脱アセチル化度が、リン酸カルシウム−キトバイオマー複合体の
性質に及ぼす影響
キトバイオマー／リン酸カルシウム複合体は、固体画分（５％のキトバイオマーまたは
キトサン（８０％ＤＤ）、リン酸カルシウム、およびミネラルを含有する）と、これに対
応する量の酸性媒体とを混合することによって調製した。表７に、この実施例で試験をし
た組成物をまとめる。混合後のペーストの特徴は、スポンジ状で弾性があり、硬化時間は
、ＤＤが増大すると共に著しく短縮された。機械的強度も、ＤＤの増大と共に（４０％Ｄ
Ｄ＜＜７０％ＤＤ＜８０％ＤＤ）著しく増大した。
【０１３７】
図１８に示すように、破砕表面は多孔質であり、複合体にはマクロ細孔（直径が５０μ
ｍよりも大きい細孔）が豊富に見られる。
種々のタイプ（またはサイズ）の結晶が、種々の脱アセチル化度のポリマーによって調
製された複合体内に観察された（図１９）。部分的脱アセチル化キチン（４０％ＤＤ）を
有する複合体は、棒状結晶または粒子で占有されており（図２０（ａ））、一方、８０％
ＤＤキトサンを有する複合体（図２０（ｃ））は、プレート状の結晶が稠密に充填されて
いた。７０％ＤＤキトバイオマーを含む調製物では（図２０（ｂ））、その結晶は、４０
％ＤＤキトバイオマーと８０％ＤＤキトサン複合体との中間体であり、棒状およびプレー
ト状の両方の結晶を含有している。これは、キトサンの脱アセチル化度が、複合体におけ
る結晶形成に影響を及ぼし、７０％ＤＤで、棒状からプレート状の構造に明らかにシフト
することを実証している。この差は、キトサン（８０％ＤＤ）と比較したときに、４０〜
７０％ＤＤキトバイオマーが有するより高い水結合能力に関係している可能性がある。こ
れは、水の利用可能性に影響を及ぼし、したがって複合体における結晶の発達に影響を及
ぼす。
【０１３８】
複合体における結晶形成の差は、複合体の強度およびその生分解性に影響を及ぼす可能
性があるので、特に重要である。
この実施例は、キトバイオマーまたはキトサンの脱アセチル化度によって、複合体の強
度をどのように操作できるかを示している。これは、複合体の足場の生分解性を制御する
のに使用することができ、即ち複合体に侵入するための、マクロファージのような遊走細
胞および破骨細胞の進入が制御され、即ち骨発達に必要な血管新生を生成する軟骨および
骨前駆細胞ならびに上皮細胞が侵入するための細孔が形成される。
【０１３９】
【表７】
2014221905.tif 000008
【実施例７】
【０１４０】
ラット大腿骨における軟骨内軟化による骨治癒
８０匹のメスラットを使用して、リン酸カルシウム（ＣＡＰ）を有する５％キトバイオ
マーの複合体の影響をチェックした。動物の全グループを３つのサブグループに分けた：
Ｉ．対照（未処理）；ＩＩ．リン酸カルシウムで処理；ＩＩＩ．５％キトバイオマーを含
有するＣＡＰで処理。キトバイオマーおよびＣＡＰを、手術室で一緒に混合し、パン生地
状のコンシステンシーにした。
【０１４１】
全ての動物に麻酔をかけ、その大腿骨の中央骨幹で露出させた。単皮質的ドリルホール
を実現するために、圧縮空気を介して２ｍｍドリルを使用した。ドリルを骨髄腔内に侵入
させ、新しいホールにＣＡＰのみを充填し、または５％キトバイオマーを有するＣＡＰを
充填した。ラットの１つのグループでは、ホールをそのままにし、その一方で全ての動物
において、局所出血を制御した。筋肉およびその上の皮膚を層ごとに縫合し、その動物を
、個々のケージ内で自由に動くままにした。一部の動物では、皮質に侵入させること（完
全に）および侵入部位の当初の直径を５ｍｍまで広げることの両方によって、局所損傷を
意図的に拡大させた。これらのケースでは、骨ホールが十分に確定されておりかつ損傷部
位で対向する皮質骨に損傷を与えることのないその他の動物群に比べ、大きな骨欠損が生
ずると考えられた。
【０１４２】
上述の３つのサブグループをさらに分け、術後２、３、４、および５週間で犠牲にした
。犠牲後、全ての標本を巨視的に検査し、その後、顕微鏡検査用に処理した。
結果
グループＩ：対照  未処理動物（単一ホール）
２週間で、骨ホールの開口は新しい骨の不規則粒子の島を含有したが、それでもホール
は、骨の外側の隣接組織に対して十分に封止されなかった。また、新しい骨髄組織が、損
傷領域内で明らかになった。３週間で、骨の薄層が骨ホールの橋かけをしていることが観
察された。損傷部位では、新しい骨梁骨がほとんど明らかにされなかった。４週間で、上
記にて観察されたパターンがさらにより明らかになった。新しい骨橋は脆弱のようであり
、それと同時に新しい骨梁骨がその下にあった（図２１）。かなりの亀裂が、手術部位の
当初の大腿骨皮質に見られた。５週間で、骨ホールを封止する新しい骨橋は、依然として
脆弱な組織のままに見え、骨髄は明らかではないが、その一方で、皮質骨は、骨細胞の損
傷および死を表す多数の空の裂孔明らかにした。
【０１４３】
グループＩＩ：ＣＡＰ処理動物（単一ホール）
２週間で、組織応答は骨損傷部位に限定され、ＣＡＰの埋込みペーストの下にある骨髄
腔内での、多数の新しい骨小柱で表された。大きな塊のＣＡＰが、骨ホール内のその埋込
み部位に見られた。皮質縁の外側、即ち骨膜に沿って、細胞応答は見られなかった。３週
間で、応答パターンは上述のパターンと同様であったが、より多くの骨組織が、ホールの
「橋かけ」に関与した。４週間で、新しい骨橋が、損傷骨髄を外部環境から切り離し、よ
り組織化されるように見え、連続層および健康な骨として見える（図２２）。さらに、当
初のホール部位の下に、新たに発生した骨髄組織が、散乱した骨梁に沿って明らかになっ
た。その時間間隔では、埋め込まれたＣＡＰの残遺物をもはや確認することはできなかっ
た。５週間で、概して、先の２週間で見られた発生パターンが続けて生じた。新しい骨橋
の再確立が終了したようであり、それによって、回復した骨髄組織が周囲組織から切り離
された。そのときまでに、新しい骨髄組織は明らかであるのに対し、骨髄腔内の骨梁は、
その内部の多数の亀裂を示した。
【０１４４】
グループＩＩＩ：キトバイオマーＣＡＰ処理動物（単一ホール）
２週間で、損傷部位は、新しい骨髄組織と一緒に新しい軟骨および骨形成の形をとる、
組織反応の明らかな徴候を示した（図２３）。侵入部位は、既に完全に閉じられた。その
時間間隔で見られる独自の特徴は、十分に発達した新しい骨梁の網状構造によって占有さ
れる、当初の骨髄組織の著しい応答であった。後者を、単核細胞、脂肪細胞、および毛細
血管からなる骨髄の豊富な組織内に埋込み；追加の独自の特徴は、当初の皮質組織内の細
胞応答に関係していた。これは、皮質そのものの内部の多数の細胞−骨細胞、結合組織細
胞、および毛管の外観によって明らかにされた。３週間で、骨橋が終了した。この橋は、
ドリルホールの両側にある、当初の皮質骨に接続される、新しい骨梁網状構造からなって
いた。骨髄腔内では、新しい骨梁骨が、当初の皮質の内面に接続された。十分発達した骨
髄組織が明らかであった。５週間で、骨梁骨の固い橋が侵入部位を完全に封止しており、
骨梁骨の新しい「ガードル」が、当初の皮質を取り囲んでいた。キトバイオマーの残遺物
は、当初の埋込み部位に依然として見られた。図２４は、術後４週間での、新しく健康な
骨組織の組織像を示す。
【０１４５】
大きな骨欠損
２週間で、１つの皮質に誘発されかつＣＰ＋キトバイオマーで処理した、より大きい欠
陥（５〜６ｍｍ）について、検査をした。そのときまでに、全骨髄腔は、侵入ホールを介
して連続している大きな塊の新しい骨梁骨と、皮質の外面にある骨梁骨の新しい塊を明ら
かにした。当初の皮質のほとんどは、皮質の外面に直接連絡している新しい骨梁骨層に包
まれた。ＣＡＰのみで処理された同様の場合に見られる線維性骨とは対照的に、骨髄腔内
の新しい骨梁は、より組織化されかつより稠密であるように見えた。その領域における大
腿骨の当初の皮質層は、骨細胞を阻害する多数の裂孔を明らかにした。赤血球を含む毛管
も、皮質内に見られた。同じ実験グループ（２週間、キトバイオマー、大きな欠損）の別
の動物は、大腿骨の輪郭の外側に、大きな塊の軟骨を示した。この特徴は、骨膜内の前駆
細胞に対するキトバイオマーの誘導性刺激の結果と考えられた。新しく形成された軟骨は
、その後、鉱質化され、軟骨内骨化の活性座位に変換された。大腿骨の外側の新しい骨の
形成は、当初の大腿骨に接続される外骨の発生で終わる、非常に広い領域で行われた。
【０１４６】
３週間で、本発明者等は、ドリルが両方の皮質を通り抜ける場合について検査した。無
傷の皮質の比較的大きい小片が、当初の骨からはるかに離れた別個の部分として見出され
た。疑う余地なく、観察される最も顕著な特徴の１つは、皮質および当初の大腿骨皮質の
両方の、切り離された小片の骨膜に由来しかつそこに結合されたままの、大きく新しい塊
の軟骨であった。新しく形成された軟骨は、骨髄腔内で、その新しい軟骨状組織との連続
性を保っている。新しい軟骨は、この組織に特徴的な組織分化の全ての段階を明らかにし
た。軟骨前駆細胞から始まって、若い軟骨芽細胞、次いで成熟軟骨細胞、次いで肥大性軟
骨細胞、次いで基質の鉱質化が行われ、その後、軟骨内タイプの骨化に非常に特徴的な骨
化プロセスが行われる。
【０１４７】
上述のプロセス全体は、わずか３週間続くが、これは、骨膜および骨髄組織の両方にお
いて前駆細胞から新しい軟骨を誘発させるという、キトバイオマー（５％）の限りない可
能性を示している。これは、あたかもキトバイオマーが、特により広くかつ複雑な損傷の
場合に強力な骨誘導的可能性を有するようであり；自然のプロセスでは、当初の組織、即
ち骨の、本来の再生をもたらすプロセスを介して危険な損傷を克服することができず；し
かしむしろ、癒着不能に終わる治癒プロセスのみ可能になる。
【０１４８】
さらに、キトバイオマーの担体として働くＣＡＰは、独自に、キトバイオマーで処理さ
れた標本に見られる現象を実現することもできなかった。ＣＡＰは良好な骨誘導性材料で
あるが、最初に軟骨形成で、さらにこれに続く後者の骨化で示されるキトバイオマーが有
する誘導能力に欠けている。
【０１４９】
まとめると、成体メスをモデルとして使用する生体内実験では、キトバイオマーが、Ｂ
ＭＰの場合に非常に良く似ている骨誘導的性質を有することが見出された。その目標は、
適切なトリガーによって最終的には骨化する軟骨細胞に分化する、骨膜、骨内膜、および
骨髄組織内で遺伝的に決定された細胞である。本発明の研究で使用された濃度：５％は非
常に潜在性が高いようであり、上記知見を得るのに必要とされるキトバイオマーの最適な
パーセンテージを決定するために、用量依存的な研究が必要不可欠である。
【０１５０】
骨切片の顕微鏡観察中に偏光を使用することにより、コラーゲン線維（Ｉ型コラーゲン
）の向きを分析した。無傷の骨では、これらの線維が規則的な向きを有しており、それに
対してより「原始的な」胚型の骨では、この向きが不十分である。図は、線維が規則的な
向きを有することを示しており、これは、生ずる骨形成が、軟骨内骨化経路を辿ることを
示している。マクロファージは、ＣＡＰ−キトバイオマー複合体を侵襲し、その結果、新
しい軟骨および骨組織に置き換えられるので、キトバイオマーが徐々に分解されることが
示される。
【０１５１】
結論
まとめると、成体メスラットをモデルとして使用する生体内実験では、キトバイオマー
が、ＢＭＰの場合に非常に良く似ている骨誘導的性質を有することが見出された。骨形成
は、組織を表す図によって実証されるように、軟骨内骨化経路を辿る。軟骨内骨化のプロ
セスは、骨形成前の軟骨形成を特徴とする。軟骨形成は、骨形成段階とは対照的に酸素を
必要とせず、したがって、軟骨から骨への変換を引き起こすことができる前に、新しい血
管を形成することが必要である。
【０１５２】
キトバイオマーとの反応は、キトバイオマーインプラント内での新しい軟骨組織の形成
と、新しい軟骨内での新しい血管組織の豊富な形成とを特徴とし、その結果、キトバイオ
マーが新しい組織に代わり、キトバイオマーの残遺物だけがインプラント内に検出される
。さらに、軟骨細胞は、キトバイオマーの残遺物付近に形成され、鉱質化した軟骨が、新
たに形成された骨組織に隣接して検出されるが、これは、新しい骨形成が軟骨内骨化経路
を辿ることを裏付けている。キトバイオマーは、骨髄組織内ならびに骨膜内の両方で、骨
形成原細胞に対して誘導的性質を有する。軟骨細胞は、骨形成が生ずる前に軟骨を形成し
、この軟骨細胞は、骨芽細胞−軟骨細胞の境界で、ＩＩ型コラーゲンを発現する肥大性軟
骨細胞に最終分化し、血管原性因子を分泌し、それによって、石灰化した軟骨を鉱質化す
る。
【実施例８】
【０１５３】
ＩＩ型コラーゲン誘導性関節炎のラットモデルを使用した、リウマチ様関節炎における
Ｔ−ＣｈＯＳの影響
材料および方法
Ｔ−ＣｈＯＳ組成物の６０％以上を構成するキトオリゴマーの調製物を、実施例２に従
ってＧｅｎｉｓにより生成した（ロットＧ０５１１２８）。図２５は組成を示す。この研
究の被験動物は、研究の０日時点で体重が１５９〜１７９ｇ（平均１７１ｇ）の、メスの
ルイスラットであった。動物を、尾の基部に異なる番号を付して識別し、グループおよび
動物番号を明らかにした。無作為化後、全てのケージに、プロトコル番号、グループおよ
び動物番号を、適切なカラーコードと共に付した。
【０１５４】
動物（関節炎の１０／グループ、正常な４／グループ）を、４〜５／ケージで収容し、
イソフルランで麻酔をかけ、２ｍｇ／ｍｌのウシＩＩ型コラーゲンを含有するフロイント
不完全アジュバント３００μｌを、第０日および６日目に尾の基部および背部の２カ所に
注射した。水中でのＴ−ＣｈＯＳ処理を、研究の第０日に開始し、第０、６、９〜１７日
（体重計量日）に濃度調節を行いながら、１７日間にわたって継続した。
【０１５５】
実験グループを、表８に示す。
【０１５６】
【表８】
2014221905.tif 000009
【０１５７】
試験がなされた主なパラメータは、ラットの後足の左右の足関節の直径であり、炎症期
間中は毎日測定した。問題とされるその他のパラメータは、第１７日目に動物で測定され
た組織学的スコアであった。組織学的評価は、足関節および膝関節で行った。これらの関
節を、半分長手方向に（足関節）または前額面（膝）で切断した。サンプルを保存し、石
灰質を抜き（５％ギ酸）、等級付けされたアルコールおよび清浄剤で処理し、パラフィン
を染み込ませ、埋込み、切断し、トルイジンブルーで染色した。全ての動物から得た全て
の組織を、顕微鏡で検査し、その観察内容をコンピュータ支援データ検索システムに入力
した。
【０１５８】
炎症に対するＴ−ＣｈＯＳの影響を、足関節の直径のデータに関するＡＮＯＶＡおよび
ｔ検定（パラメータまたは非パラメータ検定）を利用して分析した。
結果
図２６は、炎症（関節炎スコア）をモニタする主な方法を示す。左右の足関節に関する
足関節直径を、第９日目から毎日測定した。図２７は、コラーゲンが注入されたがその他
の処理を全く行わないラットの、ＲＡスコアを示す。炎症は、１０日目に検出され、第１
５〜１７日までに徐々に増大する。
【０１５９】
図２８は、初期の足関節炎症率に対する、種々の用量のＴ−ＣｈＯＳの影響を示す（第
１０〜１２日）。ＡＷグループ（０用量）からＡ０．２５グループまで、明らかな用量依
存的な影響があり、炎症率の減少は５８％であり、非常に有意であった（ｐ＜０．０１）
。次に高い用量では、その影響が徐々に消失した。
【０１６０】
図２９は、後期関節炎症率（第１２〜１７日）に対する、種々の用量のＴ−ＣｈＯＳの
影響を示す。初期に見られた用量依存的な影響は、消失した。
足関節炎症の全線形相の分析（第９〜１５日）も行った。その期間の炎症率の有意な低
下を示した唯一のグループは、Ａ０．２５グループであり、その影響は２８％であった（
ｔ検定；ｐ＜０．０５、表９参照）。
【０１６１】
第１７日目の組織学的炎症および損傷スコアでは、最も活発なグループに関する主な結
果を表９にまとめる。これらはＡ０．２５であった。骨吸収（骨組織の崩壊）は４８％減
少するが、これは、全ての組織学的パラメータに対して最も強い影響を及ぼした。図３０
は、明らかな用量効果を示すが、Ａ０．５グループは、相から外れているようである。こ
れらは、炎症において２８％の有意な減少を示し、炎症組織での瘢痕組織形成（パンヌス
）では４０％の減少を示した。Ｔ−ＣｈＯＳにより、軟骨損傷は２９％減少したが、この
影響は統計的に有意ではなかった。最後に、組織病理学的スコアには有意な減少（３３％
）があったが、この因子は、各ラットごとの、炎症、パンヌス、軟骨損傷、および骨吸収
スコアの合計であった。
【０１６２】
【表９】
2014221905.tif 000010
【０１６３】
結論
ラットのＩＩ型コラーゲン誘発性関節炎の初期段階では、Ｔ−ＣｈＯＳによる強力な著
しい影響があった。足関節の炎症率の低下は、初期段階で最良の５８％であった。この影
響は、用量に関係しており、Ａ０．２５グループで最大の影響が示され、これはヒトの日
用量０．５ｇに等しい。しかしより高い用量では、その影響が徐々に消失した。しかし、
全ての組織学的スコアは、１つを除き、実験の終わりの最適なＴ−ＣｈＯＳ用量に対する
応答として、関節炎状態の有意な減少を示した。最も強力な効果は、骨再生の減少（４８
％）およびパンヌスの予防（４０％）で観察された。
【０１６４】
経口投与されたＴ−ＣｈＯＳ調製物は、組織変性を著しく減少させ、炎症状態の関節で
の瘢痕組織形成を減少させることが結論付けられた。これは、Ｔ−ＣｈＯＳの組織再生活
性（実施例７）および組織培養における線維芽細胞増殖の低下を示す（実施例９）、その
他の結果を裏付けている。
【実施例９】
【０１６５】
固定化Ｔ−ＣｈＯＳによる線維芽細胞増殖の阻害
材料および方法
マイクロプレートコーティング：
マイクロプレート用のコーティング溶液を、３７℃のハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ
）にゼラチン（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、ＵＳＡ）を溶解して０．１％の濃度にすることによって
調製した。この溶液の半分に、Ｔ−ＣｈＯＳを補って、最終濃度を１０００μｇ／ｍｌに
し、あとの半分を対照として役立てた。全ての溶液を、限外濾過（０．２２μｍ  Ｎａｌ
ｇｅｎｅフィルタ）によって滅菌した。マイクロプレート（９６ウェル、Ｎｕｎｃ、デン
マーク）を、各ウェルにゼラチン溶液１００μｌを添加し、４℃で一晩インキュベートす
ることによってコーティングした。過剰な溶液を廃棄し、プレートを、４℃でＨＢＳＳと
共に保存した。
【０１６６】
線維芽細胞のプレーティングおよび計数
ヒト線維芽細胞を、集密Ｔ−２５培養フラスコからトリプシン処理によって収集し、１
０％血清を含むＲＰＭＩ  １６４０培地の１×１０５細胞／ｍｌで、コーティングされた
マイクロプレートウェルに播種した。細胞を、３７℃および５％ＣＯ２で３日間維持し、
その後、光学顕微鏡下で計数することによって細胞数を決定した。各実験条件を、８個の
ウェルごとに繰り返した。
【０１６７】
細胞数は、８個のウェルのそれぞれにおいて、画定視野内で計数した（線維芽細胞密度
）。計数は、培養物中で１、２、および３日後に行った。データを統計的に分析した（Ａ
ＮＯＶＡ）。
【０１６８】
結果
統計分析では、データの非正規分布が明らかにされた。したがって、順位二環するＡＮ
ＯＶＡ試験、その後のクルスカル・ウォリスの順位の一元配置分散分析を行った。ゼラチ
ン中に固定化されたこのＴ−ＣｈＯＳは、図３１および３２に示されるように、線維芽細
胞の増殖を大幅に停止させた。
【０１６９】
結論
この実験では、本発明者等は、Ｔ−ＣｈＯＳを培養プレートのゼラチンコーティング内
に埋め込んだ場合に、ゼラチン表面の線維芽細胞の増殖を著しく低下させることができる
ことを、実証することができた。
【０１７０】
創傷治癒に対するキトサンの影響の科学的報告、キトバイオマー、オリゴマーおよびポ
リマーの両方による本発明者等の経験、および本発明の結果と一緒に、本発明者等は、Ｔ
−ＣｈＯＳが、線維芽細胞による線維状組織の形成を抑制することができ、それと共に骨
や軟骨、その他の硬質および軟質組織などの基本的な組織の再生を促進することができる
と結論付けた。創傷治癒のこのメカニズムは、瘢痕組織の形成をもたらさずかつ当初の組
織の完全性および機能性を保存するので、非常に有利である。
【図面の簡単な説明】
【０１７１】
【図１】図１は、７０％脱アセチル化および９４％脱アセチル化キトサンと比較した、この生成物（４３％ＤＤ）の溶解度を示す。
【図２】図２は、異なる配列の断片イオンによって引き起こされたピークの強度を定量する、Ｄ３Ａ３に関する配列系統樹を示す。
【図３】図３のＡ〜Ｄは、同族体Ｄ２Ａ３、Ｄ３Ａ３、Ｄ２Ａ４、およびＤ３Ａ４の同重体の相対量を示す。
【図４】図４は、不均一脱アセチル化オリゴマー（Ｇ０２０４１８）に関するオリゴマーピーク分布および同族体分析を示す。ものを図５に示す。
【図５】図５は、均質脱アセチル化オリゴマー（Ｇ０５０４２１）に関するオリゴマーピーク分布および同族体分析をしめす。
【図６】図６は、２つの脱アセチル化方法による、オリゴマーに関する同族体分布を示す。
【図７】図７は、限外濾過ステップ前後の各ＤＰの相対量を示す。
【図８】図８は、ＤＰ２〜ＤＰ５の同族体を示すＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳである。
【図９】図９は、ＤＰ２からＤＰ１２までのオリゴマーについて明らかにするＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳである。
【図１０】図１０は、消費された天然サンプルと３週間後の血液サンプルとの、オリゴマーと同族体の相対質量分光分析シグナル強度を比較する。
【図１１】キチナーゼＡに対する同族体Ａ４Ｄ２の遮断効果を示す図である。非線形当てはめ、ｆ＝ｙ０＋ａ×ｅｘｐ（−ｂ×ｘ）が示されている。Ａ４Ｄ２に関する５０％阻害濃度（ＩＣ５０）は、１７μＭとして計算された。
【図１２】同族体の、計算された親和性を示す図である。図は、試験がなされた各同族体の親和性を示す（表５のデータに基づく）。
【図１３】図１２に示すようなＣＨＯＳ同族体の生物活性および生物安定性を、配列と共に示す図であり、詳細は表５を参照されたい。
【図１４】キチナーゼＡに対するＣｈＯＳロットＧ０４０８２３の遮断効果を示す図である。ＩＣ５０は、７０μｇ／ｍｌとして計算された。
【図１５】Ｂｍａｘを備えた、ＨＣ  ｇｐ−３９に結合するＤ６、Ｄ３Ａ３、Ｄ２Ａ２、Ａ６、およびＤ５Ａ６に関する結合等温線であって、結合部位飽和に関する相対蛍光強度を示す図である。
【図１６】同族体／オリゴマーのＦＡを基にした、ＨＣ  ｇｐ−３０に結合するＣｈＯＳの解離定数（Ｋｄに関しては対数目盛りである）を示す図である。破線は、ＤＰ同族体のデータポイントを接続する。
【図１７】ＦＡ（Ａ単位の数）の関数として、ＤＰ６同族体の解離定数を示す図である。データを、非線形回帰によって双曲線型減衰に当てはめた。差し込み図は、Ａ単位に対するＤＰ６同族体の相対親和性のプロットを示す。
【図１８】５％キトバイオマーを含有するキトサン／リン酸カルシウム複合体（４０％ＤＤ）の破砕表面を示す図である。ＳＥＭ写真を、３７℃で７日間インキュベートした後に撮った。倍率１０００×。
【図１９】ＤＤが結晶形成に及ぼす影響を示す図である。ＳＥＭ写真は、３７℃で７日間インキュベートした後に撮った。（ａ）キトバイオマー（４０％ＤＤ）、倍率１０Ｋ×、および（ｂ）８０％ＤＤキトサン、倍率９．４３Ｋ×。
【図２０】３７℃で７日間インキュベートした複合体のＳＥＭ分析を示す図である。（ａ）キトバイオマー４０％ＤＤ、（ｂ）キトバイオマー７０％ＤＤ、および（ｃ）キトサン８０％ＤＤ、倍率１００Ｋ×。
【図２１】術後４週間の、未処理の動物を示す図である。この画像は、インプラントの側面を示し、脆弱な組織が骨の隙間を橋かけしており、この治癒状態を、癒着不能と特徴付けた。
【図２２】術後４週間の、リン酸カルシウムで処理した動物を示す図である。この画像はインプラントの側面を示しており、リン酸カルシウム結晶の残遺物が、骨の隙間を橋かけする脆弱な組織内に埋め込まれている。この治癒状態を、癒着不能と特徴付けた。
【図２３】術後２週間の、リン酸カルシウム−キトバイオマー複合体で処理した動物を示す図である。この画像はインプラントの側面を示し、皮質骨が、新しい皮質の下にある稠密な骨梁骨で、骨の隙間を覆っている。この治癒状態を、完全な癒合と特徴付けた。
【図２４】術後４週間の、リン酸カルシウム−キトバイオマー複合体で処理した動物を示す図である。この画像は、健康な新しい骨梁骨を示す。
【図２５】試験がなされたＴ−ＣｈＯＳ材料（ロットＧ０５１１２８）のＨＰＬＣ分析を示す図である。図は、ＤＰ２から約１５までの、種々の分子量の糖の相対量を示す。
【図２６】炎症（関節炎スコア）の指標としての、足関節の直径の測定を示す図である。
【図２７】ＡＤ（足関節直径）関節炎スコアを示す図である。第０日にコラーゲンが注入された１０匹の個々のラットの足関節直径（左＋右の足関節）（グループ２；関節炎＋水）。
【図２８】初期の足関節炎症率における、Ｔ−ＣｈＯＳ（全ての用量）の影響を示す図である（第１０、１１、および１２日から得た左右の足関節直径の、平均増加としての初期炎症率）。平均および標準誤差が示されている。
【図２９】後期足関節炎症率における、Ｔ−ＣｈＯＳ（全ての用量）の影響を示す図である（第１２〜１７日から得た左右の足関節直径の、平均増加としての初期炎症率）。平均および標準誤差が示されている。
【図３０】組織学的検査によって判定された、骨吸収におけるＴ−ＣｈＯＳ（全ての用量）の影響。平均および標準誤差が示されている。
【図３１】１００μｇ／ｍｌの固定化Ｔ−ＣｈＯＳを含み、また含まない、ゼラチン層での線維芽細胞の増殖（密度対時間）を示す図である。平均（ｎ＝７〜８）、＋／−標準誤差
【図３２】３日間（ｄ１〜３）のインキュベーション中の線維芽細胞増殖にＴ−ＣｈＯＳが及ぼす影響の、統計的評価を示す図である。Ｃは未処理の、またＯは処理した細胞を表す。
【図１】
2014221905.tif 000011
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図２５】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
2014221905.tif 000041
【図２６】
2014221905.tif 000042
【手続補正書】
【提出日】平成26年7月16日(2014.7.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療的に活性なキトオリゴマーを製造するための方法であって、
キチンを、不均一脱アセチル化に有利な条件下で、３０〜６０％の脱アセチル化度まで脱アセチル化するステップと、
当該部分的脱アセチル化キチンを酸性条件下で溶解するステップと、
当該部分的脱アセチル化キチンを、ファミリー１８キチナーゼで大規模に酵素加水分解するステップと、
得られたオリゴマーを、限外濾過に付して、モノマー及びより小さいオリゴマーが分離された保持物を集めるステップと、
を含む方法。
【請求項２】
前記脱アセチル化が、２０〜５０℃の範囲の温度で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記限外濾過工程が、１ｋＤａの限外濾過膜を用いた限外濾過を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
さらに、前記の得られたキトオリゴマーを乾燥して、粉末、薄片、または繊維状材料から選択される乾燥形態にあるキトオリゴマーを得ることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
５〜２０の鎖長を有する、Ｎ−アセチルグルコサミンとグルコサミンとの治療上活性なキトオリゴマーを含む組成物であって、当該キトオリゴマーは、不均一条件下で脱アセチル化された３０〜６０％の脱アセチル化度を有する部分的脱アセチル化キチンポリマー組成物を、ファミリー１８キチナーゼ酵素により大規模に酵素加水分解し、限外濾過し、モノマー及びより小さいオリゴマーがそのようにして分離された保持物を、当該組成物中に保持することにより得られ得るものである、組成物。
【請求項６】
前記オリゴマーが、粉末、薄片、または繊維状材料から選択される、乾燥形態にある、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記部分脱アセチル化キチンポリマー組成物が、２０〜５０℃の範囲の温度で脱アセチル化されたものである、請求項５又は６に記載の組成物。
【請求項８】
前記限外濾過が、１ｋＤａの限外濾過膜を用いた限外濾過を含む、請求項５〜７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
部分的脱アセチル化キチンポリマー組成物の析出物を含む組成物であって、当該析出物が、以下の工程：
キチンを、アルカリ処理で、３０〜６０％の脱アセチル化度まで部分的脱アセチル化するステップと、
部分的脱アセチル化キチンを中和するステップと、
酸性溶液中に、部分的脱アセチル化キチンを溶解するステップと、
逐次的濾過ステップを通じて、溶解していない粒子を除去するステップと、
当該溶液を、８よりも高いｐＨに調節するステップと、
完全に溶解し精製された部分的脱アセチル化キチンを、高温および塩の添加を通じて、又は高温および溶液の中和を通じて、塩析により析出させるステップであって、当該高温が４０℃よりも高いステップと
を含み、
篩い分けを通じてまたは遠心分離によって、析出後に析出物が回収され洗浄され、洗浄水および析出物の温度が４０℃よりも高い
方法で製造されたものである、前記組成物。
【請求項１０】
骨折骨または切断された骨の治癒において骨再生および止血を増強するための、生体材料組成物であって、請求項９に記載の組成物と、リン酸カルシウムとを含む組成物。
【外国語明細書】
2014221905000001.pdf