(57)【要約】【課題】従来思考の多数のプロセスの全体的な設計変更を可能にし、精製物質の最大化及び工程数の減少を可能にするツールを提供する。【解決手段】キャップは、多孔性フリット及び段階的多孔度フィルターを含む陥凹部を有しており、したがって、液体は、キャップが接続されている容器から、フィルターを通過して、キャップの吐水口から流れ出る。フィルター多孔度は、容器内部の増殖培地中で増殖された細胞性生物から発現された産物を通過させるが、残屑はろ過して取り除くように選択されている。キャップ通気口は、容器アレージの陽圧によるろ過の促進を可能にし、容器内容物の撹拌を低減する。これは、単にフィルターを有するキャップではなく、実施可能なツールである。【選択図】図２
2014117281.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生細胞の外部に排出される産物を、前記産物が存在する容器内の液体、増殖培地、及び残屑から分離するために使用されるキャップ及びフィルターを含む工程数減少ツールアセンブリであって、前記容器が前記容器の開口部を画定する頚部を有し、前記産物が分子量により測定されるサイズを有し、
前記キャップ及びフィルターを含む工程数減少ツールアセンブリは、前記容器の前記開口部を覆うように構成された第１の部分、排出口、及び前記第１の部分と前記排出口との間に配置されたフィルターアセンブリを有するキャップを含み、
前記フィルターアセンブリは、
多孔質支持体を有するフィルター筐体であって、前記多孔質支持体の周囲が縁部で囲まれているフィルター筐体と、
フィルターであって、前記縁部内に嵌合し、前記産物が前記フィルターを通過するのに十分であるが前記残屑及び任意にある程度の増殖培地は保持される大きさの細孔径を有する段階的多孔度を有するフィルターと、
前記フィルターの周囲を前記フィルターの外側部に押し付ける締付リングと、
前記多孔質支持体とフリットとの間に前記フィルターを設置するために配置されるフリットであって、使用中に液体が前記フリットを通過して前記フィルターに流れるように前記筺体に封止されているフリットとを備える、
キャップ及びフィルターを含む工程数減少ツールアセンブリ。
【請求項２】
前記フィルターが、異なる多孔度の複数の平面状フィルター、複数のレンズ状フィルター、及び段階的多孔度フィルターを形成するビーズのうちの１つを含む、請求項１に記載のキャップ及びフィルターを含む工程数減少ツールアセンブリ。
【請求項３】
前記キャップを貫通して伸長する通気開口部を更に含み、前記キャップの前記通気開口部を画定する部分に通気管が接続されており、前記通気管が、前記容器を逆さまにした際に前記容器のアレージ内に伸長し、産物が前記容器から前記キャップ及びフィルターを含む工程数減少ツールを通過して流れるように選択された長さを有する、請求項１に記載のキャップ及びフィルターを含む工程数減少ツールアセンブリ。
【請求項４】
前記締付リングが、前記締付リングの周囲を囲み、使用中に前記フィルターの上流側の表面に当接するように配置された少なくとも１つの環状リブを有し、前記キャップが、前記キャップの周囲を囲み、使用中に前記フィルターの下流側の表面に当接するように配置された少なくとも１つの環状リブを有する、請求項１に記載のキャップ及びフィルターを含む工程数減少ツールアセンブリ。
【請求項５】
前記締付リングが、前記締付リングの周囲を囲み、使用中に前記フィルターの上流側の表面に当接するように配置された少なくとも１つの環状リブを有し、前記キャップが、前記キャップの周囲を囲み、使用中に前記フィルターの下流側の表面に当接するように配置された少なくとも１つの環状リブを有する、請求項２に記載のキャップ及びフィルターを含む工程数減少ツールアセンブリ。
【請求項６】
前記フィルターアセンブリが、前記キャップの円柱状側壁により形成された前記キャップの円柱状陥凹部に圧入されている、請求項１に記載のキャップ及びフィルターを含む工程数減少ツールアセンブリ。
【請求項７】
前記フィルターアセンブリが、前記キャップの円柱状側壁により形成された前記キャップの円柱状陥凹部に圧入されており、前記円柱状陥凹部が、前記容器と螺合するように構成されたねじ切りされた裾部の下流に配置されている、請求項１に記載のキャップ及びフィルターを含む工程数減少ツールアセンブリ。
【請求項８】
前記フィルターアセンブリが、前記キャップの円柱状側壁により形成された前記キャップの円柱状陥凹部に圧入されており、前記円柱状陥凹部が、前記容器と螺合するように構成されたねじ切りされた裾部の下流に配置されている、請求項２に記載のキャップ及びフィルターを含む工程数減少ツールアセンブリ。
【請求項９】
前記円柱状陥凹部が、平坦な環状外縁と内側部分とを有し、前記内側部分は、内部に排出口が形成された排出口フィッティングに向かって先細りになっている、請求項７に記載のキャップ及びフィルターを含む工程数減少ツールアセンブリ。
【請求項１０】
前記平坦な環状外縁の内側表面が、前記フィルター筐体に当接する、請求項８に記載のキャップ及びフィルターを含む工程数減少ツールアセンブリ。
【請求項１１】
前記通気開口部が、前記キャップの対向表面から伸長する管状フィッティングを備える、請求項２に記載のキャップ及びフィルターを含む工程数減少ツールアセンブリ。
【請求項１２】
前記キャップ及びフィルターを含む工程数減少ツールの使用中に、前記容器内部に陽圧を供給するように、前記通気開口部と連通している陽圧供給源を更に備える、請求項２に記載のキャップ及びフィルターを含む工程数減少ツールアセンブリ。
【請求項１３】
前記フィルターが、各々異なる多孔度を有する複数のフィルターを備える、請求項１に記載のキャップ及びフィルターを含む工程数減少ツールアセンブリ。
【請求項１４】
前記フィルターが、下流方向に減少する隙間細孔間隔を有する少なくとも１つの段階的多孔度フィルターを備える、請求項１に記載のキャップ及びフィルターを含む工程数減少ツールアセンブリ。
【請求項１５】
前記フリットが、下流方向に減少する隙間細孔間隔を有する段階的多孔度フィルターを備える、請求項１に記載のキャップ及びフィルターを含む工程数減少ツールアセンブリ。
【請求項１６】
前記キャップの前記排出口と連通する精製カラムを更に備える、請求項１に記載のキャップ及びフィルターを含む工程数減少ツールアセンブリ。
【請求項１７】
前記キャップの前記第１の部分が円柱状フランジであり、前記排出口フィッティングが、前記フィルターアセンブリの縦軸と一致するが、前記円柱状フランジの縦軸からずらされている縦軸を有するチューブである、請求項１に記載のキャップ及びフィルターを含む工程数減少ツールアセンブリ。
【請求項１８】
前記キャップ及びフィルターを含む工程数減少ツールアセンブリの使用中に前記容器中の液体に陰圧を付与するために、前記フィルターアセンブリの下流に減圧口を有し、前記キャップの前記排出口と連通する精製カラムを更に備える、請求項１に記載のキャップ及びフィルターを含む工程数減少ツールアセンブリ。
【請求項１９】
前記フィルターが、１０，０００〜３，０００，０００ＭＷの分子量を有する産物を通過させるように選択されている、請求項１に記載のキャップ及びフィルターを含む工程数減少ツールアセンブリ。
【請求項２０】
前記フィルターが、約１００〜１０，０００ＭＷの分子量を有する産物を通過させるように選択されている、請求項１に記載のキャップ及びフィルターを含む工程数減少ツールアセンブリ。
【請求項２１】
前記フィルターが、  の分子量を有する産物を通過させるように選択されている、請求項１に記載のキャップ及びフィルターを含む工程数減少ツールアセンブリ。
【請求項２２】
前記キャップ及びフィルターが、哺乳動物細胞及び増殖培地を含有する容器に締め付けられる、請求項２に記載のキャップ及びフィルターを含む工程数減少ツールアセンブリ。
【請求項２３】
前記キャップ及びフィルターが、昆虫細胞及び増殖培地を含有する容器に締め付けられる、請求項２に記載のキャップ及びフィルターを含む工程数減少ツールアセンブリ。
【請求項２４】
前記キャップ及びフィルターが、藻類又はシアノバクテリア細胞及び増殖培地を含有する容器に締め付けられる、請求項２に記載のキャップ及びフィルターを含む工程数減少ツールアセンブリ。
【請求項２５】
前記キャップ及びフィルターが、生細胞及び増殖培地を含有する容器に締め付けられる、請求項１に記載のキャップ及びフィルターを含む工程数減少ツールアセンブリ。
【請求項２６】
生細胞の外部に排出される産物を、前記産物が存在する容器内の液体、増殖培地、及び残屑から分離する方法であって、前記容器が前記容器の開口部を画定する頚部を有し、前記産物が分子量により測定されるサイズを有し、前記方法は、
前記容器の前記開口部にキャップを締め付けて、液密結合を形成する工程、
前記容器の液体内容物を、前記キャップのフィルターアセンブリを通して通過させ、前記フィルターアセンブリが、前記産物がフィルターを通過するのに十分であるが前記残屑及び任意にある程度の増殖培地は保持される大きさの細孔径を有する段階的多孔度フィルターの上流にフリットを備え、前記産物に、前記フィルターアセンブリの下流に配置されているキャップ排出口を通過させる工程、及び
前記フィルターアセンブリの上に位置する前記容器のアレージと連通する通気管を通して気体を通過させる工程を含む方法。
【請求項２７】
前記通気管を通して気体を通過させる工程において、前記容器の前記アレージに陽圧を付与する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記産物を、前記キャップ及びフィルターを含む工程数減少ツールと連通する精製クロマトグラフィーカラムに通す工程を更に含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記フィルターアセンブリの下流に陰圧を付与して、前記フィルターアセンブリから産物を吸引する工程を更に含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
前記フィルターアセンブリに保持された前記細胞が回収され、増殖培地で再使用される、請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】
前記容器の前記液体内容物が、昆虫細胞断片又は哺乳動物細胞断片のうちの１つを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項３２】
容器の開口部を画定する頚部を有する前記容器から液体を移送させるためのキットであって、前記容器が、前記容器中の増殖培地に含まれていた生細胞の外部に排出された産物を収容し、前記容器が、それら細胞の断片を更に含有し、前記産物が、分子量により測定されるサイズを有し、
前記キットは、前記容器の前記開口部を覆うように構成された第１の部分、排出口、及び前記第１の部分と前記排出口との間に配置されたフィルターアセンブリを有するキャップを含み、
前記フィルターアセンブリが、
多孔質支持体を有するフィルター筐体であって、前記多孔質支持体の周囲が縁部で囲まれているフィルター筐体と、
フィルターであって、前記縁部内に嵌合し、前記産物が前記フィルターを通過するのに十分であるが残屑及び任意にある程度の増殖培地は保持される大きさの細孔径を有する段階的多孔度を有するフィルターと、
前記フィルターの周囲を前記フィルターの外側部に押し付ける締付リングと、
前記多孔質支持体とフリットとの間に前記フィルターを設置するために配置されるフリットであって、前記フリット及び締付リングが、使用中に液体が前記フリットを通過し、その後前記フィルターを通過して、前記キャップの排出口から流れ出るように、互いに及び前記フィルター筺体に封止されている前記フリットと、
前記キャップを貫通して伸長する通気開口部と、
通気管であって、前記キャップの前記通気開口部を画定する部分に接続されるように構成された第１の端部を有し、前記容器を逆さまにした際に前記容器のアレージ内に伸長し、産物が前記容器から前記キャップを通過して流れるように選択された長さを有する通気管とを含む、
キット。
【請求項３３】
連通アセンブリを更に含む請求項３２に記載のキットであって、前記連通アセンブリは、
前記キャップの前記排出口に連結するように構成された端部を有する第１の液体移送チューブ、
前記第１のチューブと直接的に又は流体接続を介在させて連通して配置されるように構成された液体流動調節バルブ、及び
前記バルブの下流側端部と直接的に又は流体接続を介在させて連通して配置されるように構成された第１の端部を有し、精製カラムのルアーロック又は入口のうちの１つに連結するように構成された第２の端部を有する第２のチューブを備える、
キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、キャップろ過ツール及び移送システムに関する。
【背景技術】
【０００２】
本方法及び装置は、細胞外及び細胞内増殖からの産物の抽出を向上させるために特に有用であり、時間に関して及び回収物質の量に関して抽出効率を向上させるために特に有用である。種々の細胞が増殖培地中で増殖され、細胞産物が抽出されて、各種の用途に使用される。図１を参照すると、細胞は、種々の形状の容器で増殖させることができ、一般的に、細胞は、増殖培地１２及び細胞物質３６を含有する増殖フラスコ又はバイオ反応器１０中で増殖される。１つの例示的な増殖フラスコ１０が、特許文献１に記載されている。細胞外増殖が使用される場合、培地１２は、細胞壁により増殖され細胞壁を通過して培地に排出される産物３８か、又は他の態様で細胞壁を通過して培地に抽出される産物３８を抽出するように選択される。抽出産物は、その後の工程で培地及び細胞から分離される。細胞内増殖が使用される場合、細胞壁を破裂させて、後工程で所望の産物を培地及び破裂細胞から分離するために、典型的には、増殖終了後に細胞溶解剤が培地に添加される。いずれの細胞増殖形態の場合も、プロセスは長期にわたり、その結果、産物が失われてしまう場合がある。
【０００３】
依然として図１を参照しているが、増殖が終了すると、増殖フラスコ１０中の液体は、典型的には保存容器１４にデカントされ、キャップ１５で密閉され、時間が許す場合は、処理に十分な量が収集されるまで保存してもよく、又は時間が重要である場合は、液体を直ちに処理してもよい。フラスコ１０の内容物を保存容器又は他の容器に移すための例示的な従来技術手段には、特許文献２及び特許文献３に開示されているキャップが含まれる。
【０００４】
増殖フラスコ１０から保存容器１４にデカントする際に、液体をろ過して移してもよく、又はろ過せずに移してもよい。ろ過は、増殖培地のより大きな粒子及び細胞を、サイズがより小さく、フィルターを通過する所望の産物及び溶解増殖培地から分離することを目的とする。しかし、ある産物は、フィルターに保持されるか、フィルターの上流側の表面に収集された残屑に保持されるため、産物は移送の際に失われる。典型的には、最大約２０％の産物が、このフィルターステップで失われる。
【０００５】
保存容器１４中の物質又は増殖フラスコ１０からの物質は、最終的に遠心分離容器１６に配置され、遠心機１８の遠心力を使用して、より重い細胞組織及び大型微粒子状増殖培地が、所望の産物及び溶解増殖培地から分離される。上清を遠心分離容器１６から取り出して、減圧ろ過移送用フラスコ２０に入れる。ある程度の産物が、遠心分離された細胞及び残屑に残留するため、典型的には、最大約２０％の産物が遠心機分離で失われる。減圧ろ過移送用フラスコ２０は開口部を備える頚部を有し、その開口部は、減圧容器２４と連通している減圧フィルターアセンブリ２２に連結する。フィルターアセンブリ２２の下流側に陰圧を付与して、産物をフィルターアセンブリ２２から減圧容器２４へと吸引する。フィルターアセンブリは、産物を通過させるが、産物よりもサイズの大きい細胞、細胞断片、及び増殖培地の通過を抑制するように選択される。フィルターが残屑により閉塞された場合、減圧ろ過移送用フラスコ２０中の液体物質の残りの容積は、産物の全てが１つ又は複数の減圧容器にろ過されるまで、次のフィルターアセンブリ２２を使用してろ過される。減圧フィルターアセンブリ２２が使用される度に、最大約１０％の産物が失われる。その後、増殖培地をカラムに結合させ、精製産物３８をそれから分離させるために、減圧容器のろ過液体を、レジン充填精製カラム２６等の精製カラムに通し、その結果生じた液体産物は、産物の性質に応じて種々の目的に使用される。精製カラム２６は、無菌カラムであってもよい。増殖培地１２及び細胞物質３６から分離された精製産物３８を、精製カートリッジ２６から得るために、最大約２０％の産物が精製カラム２６で失われる。
【０００６】
液体が処理される度に産物の一部が失われ、幾つかの処理ステップが産物の精製に使用されるため、失われる産物の総量は（絶対量又は割合量において）、甚大であり得る。更に、各処理ステップには、流失、取り扱い、異物混入による誤謬、及び各処理ステップに関する他の人為的的又は機械的誤謬が伴う。細胞及びその産物の増殖には多大の時間がかかる場合があり、抽出及び精製工程にも時間がかかるため、その結果、精製産物を得るコストは、時間、労力、及び金額の点で高コストである。したがって、残りの細胞、細胞断片、増殖培地等から細胞産物を分離する、より効率的な方法及び装置の必要性が存在する。
【０００７】
従来技術では、非特許文献１（ｗｗｗ．ｐｈａｒｍａｔｅｃ．ｃｏｍにて入手可能）に記載されているように、接線流フィルター、精密ろ過フィルター、遠心分離、深層ろ過、及び滅菌ろ過を使用して、種々の処理ステップ間で液体の「清澄化」が支援される。しかし、種々のフィルター及び遠心分離を使用しても、多数の処理ステップ中で産物が失われることになる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第７，３８１，５５９号明細書
【特許文献２】米国特許第７，９９８，７３０号明細書
【特許文献３】米国特許第７，７０９，２５１号明細書
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｄ．Ｙａｖｏｒｓｋｙ、Ｒ．Ｂｌａｎｃｋ、Ｃ．Ｌａｍｂａｌｏｔ、及びＲ．Ｂｒｕｎｋｏｗ、Ｔｈｅ  Ｃｌａｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００３年３月、６２〜７６頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
したがって、残りの細胞、細胞断片、及び所望の産物以外の粒子から細胞産物を分離する、より効率的な方法及び装置及びシステムの必要性が存在する。更に、人間が介在するあらゆるステップには、誤謬がつきものであり、したがって、人間が取り扱うステップ及び人間が介在するステップの数を減らす改良された方法、装置、及びシステムの必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
細胞培養からの精製物質の最大化を可能にし、従来の精製プロセスにおけるステップ数の低減を可能にする実施可能なキャップ及びフィルターアセンブリツールが提供される。キャップ及びフィルターアセンブリツールは、産物、細胞、細胞断片、及び増殖培地が含有されている容器の頚部に配置されるキャップを含んでいてもよい。キャップは、多孔性フリット及び段階的多孔度フィルターを含む陥凹部を有し、したがって、容器の液体は、フリット及びフィルターを通過して、キャップの吐水口から流れ出ざるを得ない。フィルター多孔度は、容器内部の増殖培地中で増殖された細胞性生物から発現された産物を通過させるが、残屑はろ過して取り除くように選択され、用途又は細胞の種類に応じて様々であってもよい。容器アレージ内へと伸長する通気管に接続されたキャップ通気口は、容器アレージの陽圧によるろ過の促進を可能にし、かつ／又は容器内容物の撹拌を低減する。細胞、細胞断片、及び残屑から産物を分離するためのろ過の使用は、遠心分離を使用して分離を達成するのとは異なる分離原理（粒子のサイズ）に作用し、時間のかかる遠心分離ステップを完全に回避することができ、高価な遠心分離装置のコストを低減することができる。その結果生じた産物では、キャップの吐水口及びフィルターアセンブリツールと連通している精製カラムへとろ過液体を通過させることができるように、大きい微粒子の存在量が十分に少ないと考えられ、したがって精製カラムにより、高度に精製された産物を生産することができるであろう。
【００１２】
より詳細には、産物が存在する容器内の液体、増殖培地のより大きな粒子、及び残屑から、生細胞の外部に排出される産物を分離するのに使用されるキャップ及びフィルターを含む工程数減少ツールが有利に提供される。容器は、容器の開口部を画定する頚部を有する。産物は、細胞と比較して非常に小さく、産物は、分子量により測定されるサイズを有する。キャップは、容器の開口部を覆うように構成された第１の部分、排出口、及びその間に配置されたフィルターアセンブリを有する。フィルターアセンブリは、多孔質支持体を有するフィルター筐体を含み、多孔質支持体の周囲は縁部で囲まれている。段階的多孔度フィルターは、その縁部内に嵌合し、産物がフィルターを通過するのに十分であるが残屑及び増殖培地の任意のより大きな粒子は保持する大きさの細孔径を有し、フィルターの大きさ及び／又は流動方向の厚さは閉塞を防止するのに十分である。締付リングは、フィルターの周囲をフィルターの外側部に押し付ける。より粗い多孔度のフリットが、多孔質支持体とフリットとの間にフィルターを設置するために配置される。フリットは、筺体に封止されており、したがって液体は、使用中にフリットを通ってフィルターへと流れる。
【００１３】
更なるバリエーションでは、キャップは、キャップを貫通して伸長する通気開口部を有し、キャップの通気開口部を画定している部分に通気管が接続されている。通気管は、産物がキャップ及びフィルターを含む工程数減少ツールを通って容器から流れるように容器を逆さまにした際に、容器の空の空間（アレージ）内まで伸長するように選択された長さを有する。通気開口部は、キャップの対向表面から伸長する管状フィッティングの形態を取っていてもよい。通気管により泡の形成が回避され、したがって、ろ過中の内容物の撹拌を防止するだけでなく、液体の流動速度を上昇させる。泡の通過から生じ得る細胞損傷の可能性を軽視するべきではない。Ｙ．Ｃｈｉｓｔｉ、Ａｎｉｍａｌ−ｃｅｌｌ  ｄａｍａｇｅ  ｉｎ  ｓｐａｒｇｅｄ  ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒｓ、Ｔｉｂｔｅｃｈ、２０００年１０月、１８巻、４２０〜４３２頁を参照されたい。そこには、バイオリアクター内の泡散布から生じる細胞損傷の機序が記載されている。更に、キャップ及びフィルターを含む工程数減少ツールの使用中に容器内部に陽圧を供給し、それにより液体を所定の圧力でフィルターを通過させるように、陽圧の供給源を通気開口部と連通させて配置することができる。
【００１４】
締付リングは少なくとも１つの環状リブを有していてもよく、その環状リブは締付リングの周囲を囲み、使用中にフィルターの上流側の表面に当接するように配置される。キャップは、キャップの周囲を囲み、使用中にフィルターの下流側の表面に当接するように配置された少なくとも１つの環状リブを有していてもよい。これらのリブは、液体にフィルターを通過させ、液体がフィルターの外周を迂回して流れることを防止するのを支援する。有利には、フィルターアセンブリは、アセンブリの外周をキャップに密閉し、更に液体がアセンブリの周囲を迂回せず、フィルターを通過するのを強いるように、キャップの円柱状側壁により形成されたキャップの円柱状陥凹部に圧入される。円柱状陥凹部は好ましくはねじ切りされた裾部の下流に配置されており、ねじ切りされた裾部は容器に螺合し、したがってキャップが脱着可能に容器に締め付けられるように構成される。好ましくは、円柱状陥凹部は平坦な環状外縁と、内側部分とを有しており、内側部分は、ろ過産物を排出口フィッティングに流し込み、また排出口フィッティングから流し出すように、内部に排出口が形成された排出口フィッティングに向かって先細りになっている。有利には、平坦な環状外縁の内部表面は、フィルター筐体に当接して、フィルターアセンブリを位置決めし、その周囲を密閉するための台座を提供する。
【００１５】
フィルターは、各々が異なる別々の多孔度を有し、一緒に積層されて段階的多孔度フィルターを形成する複数のフィルターを備えていてもよい。更に、同じ多孔度を有するフィルターの積層を使用してもよく、第１の多孔度を有する複数の個別のフィルター及び第２の多孔度を有する複数の個別のフィルターを有するフィルターを使用してもよい。段階的多孔度フィルターが好ましいと考えられ、使用中の流体流動の下流方向に減少する隙間細孔間隔を有していてもよい。
【００１６】
キャップの排出口から流出するろ過産物は、有利には、精製カラムへ流れることができるように配置される。任意に、キャップ及びフィルターを含む工程数減少ツールの使用中に容器中の液体に陰圧を付与するために、フィルターアセンブリの下流の減圧口を使用してもよい。好ましくは、減圧口は、フィルターアセンブリの下流側のキャップに形成されるが、精製カラムとキャップとの間に、液体を通過させるように接続させて設置してもよい。
【００１７】
フィルターは、好ましくは１０，０００〜３，０００，０００ＭＷの分子量を有する産物を通過させるように、より好ましくは約１００〜１５０ＭＷの分子量を有する産物を通過させるように選択される。フィルター及びフリットは、所望のサイズ又は分子量の産物を通過させるように選択されるだけでなく、フィルターは、容器が空になってもフィルターが閉塞しない程度の十分な厚さを有するように選択される。したがって、限度容量のより大きい容器は、面積（例えば、直径）又は深さのいずれかがより大きいフィルター、又は高結合能のフィルターであってもよい。キャップ及びフィルターを含む工程数減少ツールは、哺乳動物細胞又は昆虫細胞を含む任意の生細胞に由来する産物を含む種々の産物をろ過するために使用することができる。
【００１８】
また、産物が存在する容器内の液体、増殖培地のより大きな粒子、及び残屑から、生細胞の外部に排出される産物を分離する方法が提供される。産物は、分子量により測定することができるほどの小さなサイズを有し、容器は、通常は容器の開口部を画定する頚部を有する。本方法は、容器の開口部にキャップを締め付けて液密結合を形成するステップ、及び容器中の液体内容物をキャップ中のフィルターアセンブリを通して通過させるステップを含む。フィルターアセンブリは、産物がフィルターを通過するのに十分であるが残屑は保持されるように選択された大きさの細孔径を有する段階的多孔度フィルターの上流にフリットを備える。典型的には、増殖培地はフリットを通過できる程度に小さいが、より大きな粒子はフリットにより通過が制限される。したがって、産物は、フィルターアセンブリの下流に配置されたキャップ排出口を通過する。また本方法は、任意に、フィルターアセンブリ上部に配置された容器のアレージと連通する通気管を通して気体を通過させることを含んでいてもよい。
【００１９】
更なるバリエーションでは、通気管を通して気体を通過させるステップは、容器のアレージに陽圧を付与するか、又はフィルターアセンブリの下流に陰圧を付与して、産物をフィルターアセンブリから吸引することを含んでいてもよい。また本方法は、産物を精製クロマトグラフィーカラムに通すことを含んでいてもよい。
【００２０】
開口部を画定する頚部を有する容器であって、その容器内の増殖培地に含まれていた生細胞の外部に排出された産物を含有する容器から、液体を移送させるキットを提供することも有利である。容器は、それら細胞の断片を含有する。産物は小さく、分子量により測定されるサイズを有する。キットはキャップを含み、キャップは、容器の開口部を覆うように構成された第１の部分、排出口、及びそれらの間に配置されたフィルターアセンブリを有する。キャップは、キャップを貫通して伸長する通気開口部を有する。キャップの通気開口部を画定する部分に接続されるように構成された第１の端部を有する通気管が提供される。通気管は、産物がキャップを通って容器から流れるように容器を逆さまにした際に、容器のアレージ内へ伸長するように選択された長さを有する。キットに使用されるフィルターアセンブリは幾つかの部品を含む。例えば、周囲を縁部で囲まれ、その縁部内にフィルターフィッティングを有する多孔質支持体と、産物をフィルターに通すのに十分な大きさであるが、残屑及び任意にある程度の増殖培地は保持される大きさの細孔径とを有するフィルター筐体を含む。フィルターは、段階的多孔度フィルターであってもよい。また、フィルターアセンブリは、フィルターの周囲をフィルターの外側部分に押し付ける締付リング、及び多孔質支持体とフリットとの間にフィルターを配置するために設置されたフリットを含んでいてもよい。フリット及び締付リングは、液体が使用中にフリットを通り、その後フィルターを通ってキャップ排出口から流れ出るように、互いにかつフィルター筐体に密閉されている。
【００２１】
更なるバリエーションでは、キットは、キャップ及びフィルターアセンブリツールと共に使用して、産物を精製カラムへと移送させるための、本明細書に記載されている上記の特徴のいずれを含んでいてもよい。これらの特徴には、一方の端部がキャップの排出口に連結するように構成された第１の液体移送チューブ、及び、第１の液体移送チューブと直接的に又は流体接続を介在させて連通して配置されるように構成された液体流動調節バルブが含まれていてもよい。これらの特徴には、バルブの下流側端部と直接的に又は流体接続を介在させて連通して配置されるように構成された第１の端部を有し、精製カラムのルアーロック又は入口のうちの１つに連結するように構成された第２の端部を有する第２のチューブが更に含まれていてもよい。
【００２２】
本明細書に開示されている種々の実施形態のこれらの及び他の特徴及び利点は、以下の説明及び図面を参照すると更によく理解されるだろう。ここでは、全体にわたって、類似の部材が類似の番号により参照されている。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】従来技術の処理順序の流れ模式図である。
【図２】キャップ及びフィルターを含む工程数減少ツールの断面図である。
【図３】図２のキャップ及びフィルターを含む工程数減少ツールの分解組立透視図である。
【図４】精製カラムに連結されている図２及び図３のキャップ及びフィルターを含む工程数減少ツールの部分断面図である。
【図５】精製カラムに連結されており、キャップ上の減圧口及び液体移送チューブを有する図２及び図３のキャップ及びフィルターを含む工程数減少ツールの部分断面図である。
【図６】精製カラムに連結されており、通気フィッティングの内部に通気管を有する図２及び図３のキャップ及びフィルターを含む工程数減少ツールの部分断面図である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
図２〜４を参照すると、キャップ３０は、増殖培地１２が細胞増殖用に細胞３６と共に配置される増殖フラスコ１０等の容器３２用に提供される。細胞及び培地は、産物３８の細胞内増殖又は産物３８の細胞外増殖用に選択される。産物３８は、細胞３６よりも小さく、通常は増殖培地１２よりも小さい。細胞物質３６は、微生物細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、又は他の生細胞を含んでいてもよく、産物３８は、細胞内部で産生されてもよく又は細胞の外部に排出されてもよい。例示的な産物３８には、タンパク質、抗体、ペプチド、油類、脂質、及びアミノ酸が含まれる。容器３２は、典型的には、液体開口部を形成する頚部４０を有し、キャップ３０が頚部４０に締め付けられている。例示されている実施形態では、頚部の外側のねじ山４２ａは、キャップの円柱状フランジ４４の内側の相手側ねじ４２ｂと脱着可能に係合して、容器３２にキャップを脱着可能に締め付ける。
【００２５】
キャップ３０は第１の上面４５を有し、その上面４５の外周とつながったフランジ４４を有する。階段状ボス４８は、第１の上面４５から伸長するが、第１の上面４５から遠ざかるように伸長する。ボス４８は、第２の上面５０とともに側壁４６を有し、第２の上面５０は側壁４６により囲まれている。側壁４６は、好ましくは円柱状であるが、他の形状であってもよい。第２の上面５０は、種々の形態を有していてもよいが、第１の上面４５と平行な環状表面５０で示されている。そこから、傾斜した好ましくは円錐形の表面５２が伸長している。管状排出口フィッティング５４が円錐状表面５２から伸長しており、キャップ３０は、側壁４６により形成されるボスの内部に液体を導き、テーパ面５２は、その液体を管状排出口フィッティング５４に向けて及び管状排出口フィッティング５４を通るように導く。好ましくは、管状排出口フィッティング５４は、排出口フィッティング５４と平行であるがキャップ３０及びその裾部又はフランジ４４の中心を通る縦軸からずらされている。排出口フィッティング５４の外面は、Ｏリングシール、Ｄリングシール等の環状シールを受容する１つ又は複数の陥凹部５６（図２）を有していてもよい。
【００２６】
第２の上面５０は、好ましくは円柱状フランジ４４からずらされているボス４８上に形成されている。キャップ３０は、第１の上面４５を貫通して伸長する通気フィッティング５８を備え、具体的には、第１の上面４５の両面から管状通気フィッティング５８ａ、５８ｂが伸長している。有利には、管状通気フィッティング５８ａはキャップ３０の外側にあり、管状通気フィッティング５８ｂはキャップの内側にある。フィッティング５８ａ、５８ｂは、好ましくは、排出口フィッティング５４を通る縦軸６０（図１、６）と平行な軸に沿って配置されている。有利には、夾雑物の導入を回避するために、フィルター（図示略）が通気フィッティングに取り付けられている。
【００２７】
任意に、第１の上面４５の内面は、環状密閉リング６２を受容するように構成されている（図２）。図示されている密閉リング６２は、矩形断面を有するが、他の形態であってもよい。上面４５の内側面から環状突出部６４が伸長しており、密閉リング６２は、突出部６４と当接している。容器３２の頚部４０の縁部は、使用中にキャップ３０と容器３２との間の液密封止を提供するように密閉リング６２と当接し、突出部６４は、密閉リング６２の移動及び膨張を抑制して、その液密封止を向上させる。通気フィッティング５８ａ、５８ｂは、好ましくは、環状突出部６４及び密閉リング６２の内側に配置される。
【００２８】
細長い通気管が、通気フィッティング５８により形成された通路と接続しており、好ましくは内部通気フィッティング５８ｂの内側（図６）又は内部通気フィッティング５８ｂの外側（図４〜５）に適合させることにより接続されている。通気管６６は、キャップ３０及び排出口フィッティング５４を通して頚部４０から培地を注ぐために、容器３２を傾けて頚部４０を下方に配置した際に、管の自由端を増殖培地の液位よりも上に配置するのに十分な長さまで伸長している。通気管６６及びフィッティング５８ｂにより形成された通路は、液体を容器３２から別の容器に移す際に、容器３２の底部と液体培地１２との間のアレージに空気が進入することを可能にする。空気は、液体がキャップ３０及び排出口フィッティング５４内をより迅速に及びより滑らかに流れることを可能にし、空気の通気が可能でなければ生じるであろう泡の除去に役立つ。泡は、培地１２、細胞３６、及び産物３８を撹拌し、細胞３６を損傷する場合があるため、泡の低減又は除去はそれらに利点を提供する。
【００２９】
図２〜４を再び参照すると、ボス４８の内部は、締付リング７２により筺体に保持された１つ又は複数のフィルター７４を有するフィルター筐体７０を含むフィルターアセンブリ、及びフィルターアセンブリの上流にあるフリット７６を受容するように構成される。本明細書で使用される場合、相対的な用語である上流及び下流は、フィルター装置及び方法の使用中に、容器３２から精製カラム２６へと流れる液体の流れに対する方向を指す。フィルター筐体７０は、多孔質支持体８０の周囲を囲むように配置されている短い円柱状側壁７８を有する。支持体８０は、好ましくは平面状であるが、図２の中で示されているように、排出口フィッティング５４に向かって下流方向にわずかに傾いていてもよい。多孔質支持体８０は、容器３２からのろ過液体が通り抜ける複数の開口部８２を有する。多孔質支持体８０の上流端は、好ましくは、フィルターが擦過、断裂、又は破損しないように、フィルター７４と接触する部分では、丸みを帯びている。好ましくは、１つ又は複数の環状密閉リブ８４が、支持体８０におけるフランジ７８に隣接する部分に形成されており、突出部はフィルター７４に向かって伸長している。密閉リブ８４は、液体が、リブ８４を横切り径方向外側に向かってフィルター７４の周端部と筺体７０との間を通過するのを防止するために、フィルター７４に対する封止を行う突出部を形成する。フリットは、産物３８が使用中にフリット７６を通ってフィルター７４に向かって流れることを強制し、産物が、フリットと側壁７８との間及び側壁７８と締付リング７２との間を流れることを抑制するように、側壁７８又は締付リング７２の周囲の縁部の一方又は両方と密閉接触している。密閉接触は、フィルター筐体７８及びフリット７６を、キャップ３０の側壁４６により形成される陥凹部に圧入することにより得ることが有利であるが、部品間に挿入される密閉リングの接着、溶解を含む他の密閉手段を使用してもよい。更に、締付リング７２及びフリット７６は、リング７２がフリット７６と当接して、フリットの周囲を囲む液密封止を形成するように、互いに大きさが決められることが有利である。
【００３０】
フィルター７４が平面状フィルター又はシートである場合、フィルター７４は、環状保持リング７２の形態である保持部により筺体に保持されている。フィルター７４がばらばらの顆粒で形成されている場合、保持部は支持体８０と同様の、ろ過物質を保持する大きさの開口部を有する多孔質支持体を含むことになる。保持締付リング７２という用語は、別様の記載がない限り、環状構造物又は多孔質支持体構造物のいずれかを指すために使用される。
【００３１】
保持リング７２は、側壁７８とのスナップ式結合を形成するように構成された周縁を有する。有利には、側壁７８は、その表面が保持リング７２を保持し、スナップ式結合を形成するように傾斜している、リング７２に面する表面を有するように形作られていてもよい。約５度の傾斜が好適であると考えられる。或いは、側壁７８の端部のわずかな突出部を使用して、組立及び使用中に部品を一緒に保持するために、側壁７８と保持リング７２との間のスナップ式結合を形成してもよい。互いに螺合するねじ山を、脱着可能な結合に使用することもできる。部品の超音波溶接、接着、ステーキング、塑性変形、又は締まり嵌め等の恒久的締付デバイスを使用して、より恒久的な接続を形成することもできる。保持リング７２は、フィルター７４を多孔質支持体８０の適所に保持する。
【００３２】
図３を参照すると、保持リング７２は、矩形断面を有する環状リングとして示されている。好ましくは、１つ又は複数の環状密閉リブ８４が保持リング７２上に形成され、使用中にフランジ７８に隣接し、リブは、フィルター７４に向かって伸長している。密閉リブ８４は、液体が、リブ８４を横切って径方向外側に向かってフィルター７４の周端部と筺体７０との間を通過するのを防止するために、フィルター７４に対する密閉を行う突出部を形成する。有利には、締付リング７２は、多孔質支持体８０に配置された２つのリブ８４の反対側及びそれらの間でフィルター７４と当接するように配置された１つのリブ８４を有する。しかしながら、異なる配置を使用してもよい。
【００３３】
フリット７６は、こうした用途に一般的に用いられるポリマー製又はガラス製フリットであってもよい。厚さ約１．６〜１３ｍｍ（約１／１６〜１／２インチ）のフリットが好適であると考えられるが、厚さは、具体的な用途に応じて様々であろう。フリット７６は、好ましくは、フィルター筐体７０が歪んで側壁４６の内部及び／又は環状表面５０の内部との密閉が不完全になることを防止するのに十分な硬さが選択される。筺体７０、フィルター７４、保持部材又はリング７８、及びフリット７６は、フィルターアセンブリ８８（図３）を形成し、フィルターアセンブリ８８は、好ましくは、側壁４６により形成される円柱状陥凹部に圧入されることによりキャップ３０に保持される。フィルターアセンブリ８８は、スナップリング、ねじ山、部材の変形等の、他の機構により保持されていてもよい。フィルターアセンブリ８８は、キャップ３０に脱着可能に保持されていてもよく、又はフリット７６又は筺体７０の一方と、隣接する側壁４６との間の密閉締まり嵌めのように恒久的にキャップ３０に締め付けられていてもよい。
【００３４】
フィルター７０は、１つ又は複数の個別のフィルターを備えていてもよいが、好ましくは約１０個未満のフィルターを有する。ポリプロピレン、ニトロセルロース材料、ＰＶＤＦ、ポリテトラフルオロエチレン、ナイロン、ガラス、又はガラス繊維のフィルター７４が好適であると考えられる。好ましくは、複数のフィルターが使用され、各フィルターは、異なる多孔度であり、細孔径又はフィルター部品間の隙間間隔が流れの方向に減少する段階的多孔度フィルターを提供するために、より大きな多孔度フィルターが上流に配置され、より小さな多孔度フィルターは下流に配置されている。図２には、２つのフィルター７４ａ、７４ｂが示されており、フィルター７４ａは、上流フィルター７４ｂよりも多孔度が小さい下流フィルターであり、図３には、３つのフィルター７４ａ、７４ｂ、７４ｃが示されている。したがって、細孔径が流れの方向に減少するデプスフィルターが提供されるが、細孔径が流れの方向に増加していてもよい。特定の多孔度及び細孔変化の組み合わせは、具体的な用途に応じて様々であろう。フィルター７４のより小さな細孔径は、産物３８が通過するのに十分大きく、細胞３６、細胞断片、及び増殖培地１２のより大きな粒子を保持するのに十分小さい。単一の段階的多孔度フィルター７４を使用してもよく、又は固定されているが異なる多孔度の複数のフィルター７４を一緒に積層してもよく、異なる多孔度（大細孔径対小細孔径）を有する可変多孔度フィルターを一緒に積層してもよい。
【００３５】
フィルター７４の多孔度は、用途に応じて様々であろう。細孔径は、好ましくは容器３２の全内容物を１回の使用でろ過できるように、好ましくは数回の使用で、理想的にはわずか２〜３回の使用で（ただし、毎回新しいキャップ３０及び／又はフィルター７４を用いる）ろ過できるように選択される。
【００３６】
最も一般に用いられている細胞３６のサイズは、約１０マイクロメートルから０．２マイクロメートルまで様々であり得るが、細胞壁が、処理中に意図的に又は偶然に破砕され、小さな細胞壁断片が生成され、それらは産物３８から除去されなければならない。産物３８は、有利には、分子量により選別又はろ過することができる。したがって、例えば、タンパク質を含む産物３８を分離するのに好適なフィルター７４は、約１００，０００〜３，０００，０００ＭＷの分子の通過を提供することになり、ペプチド又はアミノ酸を含む産物３８を分離するのに好適なフィルター７４は、約１００〜１０，０００ＭＷの分子の通過を提供することになり、脂質を含む産物３８を分離するのに好適なフィルター７４は、約１００万ＭＷ〜１０００万ＭＷの分子の通過を提供することになる。油類は、分子量が更に大きく変動する場合がある。それらの範囲内で、特定のフィルター７４は、特定の産物３８、及びその関連する分子量、又はその特定の産物３８に関連する分子のサイズに応じて様々であろう。
【００３７】
閉塞により流れが許容できない程度に低減されるまでにフィルター７４及びフリット７６を通過することができる液体及び産物３８の限度容量を増加させるために、広面積のフィルター及びフリットを有することが望ましく、デプスフィルターの場合は、閉塞を防止するために厚さが十分なフィルター及びフリット（流れ方向で測定される）を有することが望ましい。正確な面積及び厚さは、関与する産物３８及び細胞３６の種類、及びフィルター及びフリットを通過する産物の体積を決定する容器３２の容積に応じて様々であろう。同様に、ある残屑は、その残屑サイズに比べて十分に大きい細孔のフリット７６又はフィルター７４を通過することができるため、多孔度は、ろ過産物３８の純度に影響を及ぼす場合がある。更に、フィルター及びフリットは、生産中にある程度のばらつきが生じるため、特定の大きさの細孔又は通路で製作されていない。
【００３８】
より大きなフィルター面積を達成するために、容器３２の頚部４０及び開口部を増大させ、より大きなキャップ及びキャップ３０内のフィルターを含む工程数減少ツール８８を可能にしてもよい。しかし、通気管５８があるため、フィルター及びフリットがキャップの裾部４４内の面積全体を占めることはできない。そのため、排出口５４の軸６０は、キャップ３０及びその裾部又はフランジ４４の縦軸からずらされる。縦軸６０は、好ましくは、ボス４８の陥凹部、フィルター７４、及びフィルターアセンブリ８８の縦軸である。更に、通気フィッティング５８は、通気管５８と、フィルターアセンブリ８８が配置される陥凹部の側壁４６との間にわずかな空間が残されるように、通気管６６又は管の外側に接続された陽圧管（図示略）を有していてもよい。
【００３９】
使用中、細胞３６及び増殖培地１２は、増殖容器３２に配置され、細胞増殖及び細胞３６による所望の産物３８の産生を引き起こすのに好適な温度及び他の関連環境条件下で維持される。細胞外増殖の場合、産物３８は、細胞３６から周囲の液体培地１２に排出されるか、又は周囲液体培地１２中の化学薬品により抽出される。細胞内増殖の場合、産物３８は、回収するまで細胞内に残り、回収時に、細胞壁を、例えば溶解により破砕する。その後、キャップ３０及びフィルターアセンブリは、好ましくは、容器の開口部を形成するねじ切りされた頚部４０にキャップを螺合させることにより、容器３２に締め付けられる。
【００４０】
その後、容器３２及びキャップ３０を傾けて、容器内容物をキャップ及びそのフィルターアセンブリ８８を通して注ぐ。フリット７６は、より大きな粒子を阻止し、フィルター７４は、より小さな粒子を阻止するが、産物３８は通過させる。フリット７６及びフィルター７４は、培地１２のより大きな粒子、細胞３６、及び細胞断片を分離して除去するために、産物３８の通過を可能にするが、より大きな粒子を阻止するように構成されている。多孔質支持体８０は、産物３８の通過を可能にする開口部８２を有し、使用中にフィルター７４を支持する。産物３８は、傾斜壁面５２により排出口フィッティング５４に向かって導かれる。有利には、フィルターアセンブリ８８は、容器３２の全内容物を１つのフィルターアセンブリにより、フリット７６又はフィルター７４を閉塞させずにろ過することができ、細胞壁断片又は培地１２のより大きな粒子を含有する残屑等の不要な物質が少ないか又は含まない、高度に純粋な産物３８を含有する流出液を依然として生成するように構成される。
【００４１】
有利には、キャップ３０は、液体がキャップ３０を流れる際に容器のアレージに達するのに十分な長さを有するように選択された通気管６６を有する。容器３２には、典型的には、液体が２０〜６０％満たされており、容器３２を傾けて容器の底部をキャップ３０より上にすると、液体はキャップ３０に向かって流れ、空気は、以前は容器の底部だったところに向かって移動する。容器３２を傾けると、通気管６６の端部は空気で満たされた空間に進入し、容器内容物と、今ではキャップ３０より上にある容器底部との間のアレージに空気が進入することが可能になる。空気が通気管６６を通過可能になることにより、幾つかの利点がもたらされる。液体の容積が空気等の気体と置換されなければ、液体は、壁が硬質な容器からほとんど流れ出てこないであろう。空気が通気管６６を通過可能であることにより、液体培地を通過して培地及び細胞を撹拌し得るだけでなく、更に細胞断片を生成し得る泡が除去される。また、液体が、キャップ３０及び排出口フィッティング５４内をより滑らかに流れることが可能になり、それにより細胞断片及び残屑の生成がより少ないろ過が可能になる。更に、残屑のろ過及び産物３８の分離が一段階で可能になり、それにより、時間が著しく短縮されるだけでなく、従来技術で使用される幾つかの処理ステップを排除することにより収率が向上する。好ましくは、通気管６６を通過する空気又は他の気体はろ過されており、容器３２に進入する前にあらゆる夾雑物が除去されていることが保証されたものであるか、又は夾雑物が含まれていないことが知られている供給源から提供された気体でもよい。
【００４２】
通気フィッティング５８ａは大気に開放されているため、容器３２を傾けて液体をキャップ３０及びその排出口フィッティング５４から注ぐと、ある程度の液体が通気管６６に進入する場合があり、容器を傾けると共に更なる液体が通気管６６の自由端に進入するため、その液体は、通気フィッティング５８から流れ出る場合がある。したがって、脱着可能な蓋９０（図２）を外部通気フィッティング５８ａに設けて通気管のその端部を密閉し、通気管６６の開放自由端に進入する液体の体積を低減させることができる。いったん容器３２を傾けて、通気管６６の自由端が、容器底部と容器中の液体との間の何もない空間にあれば、蓋９０を取り外すことができる。蓋９０は任意選択である。
【００４３】
更に、図４〜６を参照すると、通気フィッティング５８に陽圧を付与することにより、容器内容物を、キャップ３０、フィルターアセンブリ８８、及び排出口フィッティング５４を通して強制的に通過させるために、容器と容器内の液体との間の空気空間に陽圧を提供することができる。有利には、夾雑物が容器に進入するのを防止するために、陽圧の供給源と容器３２のアレージとの間にフィルター（図示略）を設けるか、又は夾雑物を含んでいないことが知られている気体供給源を使用してもよい。手動で陽圧を付与する場合、注射器フィルターを使用して、除菌空気を通気口５８から容器３２に供給することができる。フィルターアセンブリ８８の上流側の陽圧により、キャップ３０及びフィルターアセンブリ８８から液体がより迅速に押し出され、それにより容器３２の内容物を処理し、産物３８を分離する時間が更に低減される。球体又はひだ付きのアコーディオン型ふいご等のふいごを手で圧搾することにより、手動で陽圧を提供してもよい。実際、任意の手動で生成される圧力源を使用することができる。同様に、空気ポンプ、缶入りガス（空気、不活性ガス、又は他のガス）、窒素発生器、及び他の気体供給源を含む、陽圧の他の供給源を使用することができる。
【００４４】
圧力がフィルターアセンブリ８８を通過する液体を高速に通過させ過ぎて、更なる許容できない残屑を生成させるか、又は産物３８の純度の許容できない低減を引き起こすか、又は精製カラム等の下流部品の結合容量を超過させることのないように、陽圧の程度を制御可能にすることは、任意はであるが好ましい。したがって、圧力調節器、圧力計、又は圧力リミッタ９２を、陽圧の供給源及び通気入口フィッティング５８ａと連通するように設けることは、任意ではあるが有利であり得る。
【００４５】
図５を参照すると、任意に、減圧口９４を有するキャップ３０を使用して、フィルターアセンブリ８８の下流側に陰圧又は吸引を適用することができ、これにより、フィルターアセンブリ８８を通して液体がより迅速に吸引される。ろ過液体及び産物３８が減圧口９４に吸引されるのを防止するために、バッフル９６を、ポート９４と、液体がフィルター７４から排出口フィッティング５４に向かって流出する流動経路との間に介在させる。陰圧は、ろ過液体にかかる重力が、減圧口から受ける力を超過するように選択され、ろ過液体が排出口フィッティング５４から流れ出ることを可能にする。
【００４６】
排出口フィッティング５４は、液体容器又は他の処理装置を含む種々のデバイスと連通していてもよい。図４〜６を参照すると、キャップ３０の排出口フィッティング５４は、陥凹部５６と密閉係合するか又は陥凹部５６内に密閉されている脱着可能なコネクタ１００に接続され、液密結合を提供する。コネクタ１００は、好ましくは、コールダー（Ｃｏｕｌｄｅｒ）コネクタ又は他のタイプの締付コネクタを含む。コネクタ１００は、第１の管状コネクタ１０４ａのバルブ１０２に密閉接続されている先細かつフランジ付き端部を備える遠位端を有する。バルブ１０２は、手動で、電気的に、又は気体を使って作動可能な任意のタイプのバルブでよい。バルブ１０２は、バルブレバー１０６により手動で作動する回転式ボールバルブとして示されている。図５に示されているように、液体及び産物３８がフィルターアセンブリ８８を通過するのを促進するために、減圧口９４をキャップ３０及び精製カラム２６との間に設けてもよい。図５には、バルブ１０２の下流側端部にある減圧口９４が示されているが、他の部品に配置されていてもよく、又はそれ自体の接続部を有していてもよい。必要に応じて、バッフル９６（図５には表示されていない）が設けられる。
【００４７】
任意のステップダウンコネクタ１０８が、第２の管状コネクタ１０４ｂによりバルブ１０２の下流側端部に接続されている。ルアーロックフィッティングを有する更なる任意のステップダウンコネクタ１１０が、第３の管状コネクタ１０４ｃによりコネクタ１０８の下流側端部に接続されていてもよい。ルアーロックフィッティング１１０は、クロマトグラフィーカラム又は精製カラム２６等の更なる精製デバイスの入口フィッティング１１２に接続している。培地１１４を含有する管状体及び精製産物３８が流れる排出口１１６を有する精製カラム２６が示されている。カラム２６は、フラッシュクロマトグラフィーカラムであってもよい。
【００４８】
使用中、容器３２を上下逆さまにして保持すると（手で又は好適な支持枠により）、容器３２の内容物は、重力により及び／又はキャップ３０のフィルターアセンブリ８８を貫通するチューブ６６からの圧力により、排出口フィッティング５４から強制的に流れ出る。バルブ１０２は流れを制御し、好ましくは流速が変わるように調整可能である。必要に応じて、１つ又は複数のステップダウンコネクタ１０８、１１０は、精製カラム２６の入口フィッティング１１２へのキャップ排出口５４の流体結合に適合する。フィルターアセンブリ８８は、単一ろ過ユニットにて不要な細胞３６及び培地１２のより大きな粒子を除去し、ろ過産物３８を１つ又は複数の連通チューブを通して精製カラム２６に提供する。カラム２６は、増殖培地及び不要な粒子を除去するか又はそれらと結合して、精製カラム２６の排出口１１６から高度に精製された産物３８を提供する。カラム２６からの精製産物３８は、容器３２内で生成されている産物３８の性質に応じて様々である更なる使用のために収集される。
【００４９】
粗フィルター又はフリット７６及び下流の段階的多孔度フィルター７４を有するろ過アセンブリ８８を使用することにより、産物を、容器３２内の不要な残屑から、単一ろ過ステップでより効率的に分離することができる。産物３８のみを通過させるようにフィルター７４の多孔度を選択することにより、及び密度勾配ろ過を使用することにより、フィルターアセンブリ８８の閉塞を回避することができる。単一ステップろ過は、各ステップで最大約２０％の産物を失う複数のろ過及び移送ステップよりもはるかに効率的である。
【００５０】
ろ過時間は、産物３８及び増殖培地１２の性質に応じて様々であろう。しかし、約１リットルの増殖培地（大腸菌）及び産物（プラスミド＋）を保持する２〜５リットルの容器３２の場合、直径６．３ｃｍ（２．５インチ）及び厚さ０．３ｃｍ（１／８インチ）のフィルター７４を使用して、約３時間のろ過時間が達成される（管６６から陽圧をかけずに）。
【００５１】
このろ過プロセス及び方法は、種々の大きさの容器３２に適用可能であると考えられる。現行の増殖容器は、約１ミリリットルから２００リットルの範囲であり、典型的には、容器容積の２０〜６０％が増殖培地で満たされる。しかし、フィルターアセンブリ８８及びキャップ３０は、必要に応じて、種々の大きさ及び形状の容器に適合し、通気管６６を通して大気圧又は陽圧（大気圧を超える）を提供するように構成されていてもよい。フィルターアセンブリ８８を保持するようにキャップ３０を構成することにより、ろ過法に使用される、キャップを使用する単純化された装置が提供される。従来技術の方法では、容器３２内の培地１２中で産物３８を増殖させ、液体をデカントし、それをバルク処理のために貯蔵し（時間が許す場合）、遠心分離し、１回又は複数回減圧ろ過し、その後精製カラム２６に流すことが求められていた。本方法は、増殖容器３２から精製カラム２６へと直結しており、多数のステップを排除し、典型的には、従来技術の方法における各移送ステップに伴う産物３８の喪失を排除する。したがって、より単純な方法、より迅速な方法、より効率的な方法、及びより安価な方法が提供される。
【００５２】
更に、遠心分離による従来の分離は、遠心速度及び半径に応じて様々である力で細胞残留物を互いに押し付け、それらを圧縮する。重力による流れを用いるフィルターアセンブリは穏やかな分離であり、陽圧又は陰圧をかけてフィルターを通過する流量を増加させる場合でさえ、分離された細胞にかかる力は、遠心分離により加えられる力よりも小さいと考えられる。細胞は、フィルター及びフリットから擦り取って除去することができ、所望の場合には、フィルター及びフリットを通して液体又は気体を逆流させることにより除去することができる。これにより、フィルターアセンブリ８８から除去された細胞を回収することができる。回収された細胞は、例えば、細胞断片を使用するプロセスで使用される異なる容器中の増殖培地に置くことにより、再使用することができる。したがって、フリット、フィルター、又はフィルターアセンブリ上の細胞及び細胞断片を収集し、それらを取り出し、所望の場合にはフリット、フィルター、又はフィルターアセンブリを逆洗することにより細胞断片を回収し、細胞及び細胞断片を別のアプリケータでの再使用のために提供する方法及び装置、及びそのような細胞及び細胞断片を再利用するための方法及び装置が提供される。
【００５３】
フィルター７４及びろ過ユニット８８は、単一筺体（キャップ３０）に設けられており、好ましくは単回使用の使い捨てのユニットを形成するように設計される。同様に、キャップ３０を精製カラム２６と連通するように配置させる部品は、好ましくは単一ユニットとして又は別々の部品からなるキットとして、好ましくはキャップ３０（及びろ過７４及びアセンブリ８８）と共に提供されるか、又はキャップの排出口５４に予め結合した状態で提供される。
【００５４】
本開示及び引用文献を参考にすれば、当業者は、種々の方法に好適なフィルター７４及びフィルターアセンブリ８８を、過度の実験をせずに考案することができるであろう。その幾つかを以下で考察する。例えば、実質的に平面状のディスク積層型、又はレンズ状積層ディスクカートリッジ型の複数のフィルターは、デプスフィルターアセンブリ８８に好適であると考えられる。異なる等級のセルロース系繊維を有するフィルターが好適であると考えられ、任意に、フィルター７４又はフィルターアセンブリ８８のいずれかの上に膜プレフィルター層を設けてもよい。Ｙａｖｏｒｓｋｙ、Ｂｌａｎｃｋ、Ｌａｍｂａｌｏｔ、及びＢｒｕｎｋｏｗによる上記で特定されている文献、表題Ｔｈｅ  Ｃｌａｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２００３年３月、６２〜７６頁には、種々の圧力及び流速を適用する従来技術の用途でのデプスフィルターを選択するための種々の要因が記載されており（この文献の内容は、参照により本明細書に援用される）、これらの要因は、フィルター７４及びフィルターアセンブリ８８に適用可能な場合がある。米国特許第７，１２５，４３４号にはデプス勾配密度フィルターが記載されており、そのフィルターは、約１００ｃｍ／時以上の流速及び約１．４５ｃｍ／時／ｋＰａ（約１０ｃｍ／時／ｐｓｉ）を超える初期透水率でさえ、約２５μｍ〜約１μｍの粒子を保持する前ろ過領域及び約０．３〜１μｍの範囲の粒子を保持する一次ろ過領域を備える。そのようなフィルターは、本明細書に記載の使用に好適であると考えられる。またこの特許には、各々が異なる粒径分布領域（約２５μｍ〜０．２μｍの全範囲）の粒子を保持するように構成された３つの領域を有するデプスフィルターが記載されているが、この特許には前濃縮領域デバイスが記載されており、そのようなデバイスは、ろ過液体中の残屑のかなり部分を保持するために、フィルターを繰り返し通過するように液体を再循環させる必要がある。同じフィルター（複数の場合を含む）を繰り返し通過させるこの手法とは対照的に、本明細書に記載の方法、システム、及び装置は、好ましくは単回流動デバイスであり、前濃縮領域はなく、細胞３６及び残屑が細胞３６及び残屑から完全に分離される領域を有し、さらに精製カラム２６により方法及びシステムの終わりで精製産物３８が生成される。したがって、本方法、装置、及びシステムは、好ましくは前濃縮工程を使用しない。その代わり、培地１２、細胞３６、及び産物３８は、キャップ３０及びそのフィルター７４を単回通過して十分に清澄化され、その結果生じた液体を、精製チューブ２６を通して通過させ、そこで高度に精製された産物３８が生成される。
【００５５】
更に、その特許では、高速流動デプスろ過デバイス又は接線流デバイスも使用されている。精製カラム２６と連通している場合、本ろ過装置、システム、及び方法における流量は、より制限されることになり、典型的には、最大流は、ろ過カラムの結合係数により、約２０〜２５ｃｍ／時に制限される。
【００５６】
米国特許出願公開第２００５／０１４８８４６号には、離間デプスフィルター積層体が記載されており、このフィルターは、端板により保持され、好ましくは熱可塑性枠に埋包された使い捨てフィルターを形成している。端板により、液体がフィルターアセンブリを出ていく前に１つ又は複数の板を実質的に同時に（つまり、並行して）通過することが引き起こされる。この構造も本明細書に記載の使用に好適であると考えられるが、離間積層フィルターを収容するために長さを増加させると、キャップ３０のサイズを、より顕著に増大させることが必要となる場合がある。特許第７，１２５，４３４号及び出願公開第２００５／０２７９６９５号の内容は、参照により本明細書に援用される。これらの開示及び本記載を考慮すると、本明細書に開示されている装置及び方法に好適なフィルター及びフィルターアセンブリは、過度の実験をせずに利用可能であると考えられる。
【００５７】
本明細書に記載の装置を使用するのに好適であると考えられる例示的な方法には、キャップ３０のフィルターアセンブリ８８を使用して精製されるタンパク質を含有する産物３８を生成するために増殖培地１２を使用することが含まれる。哺乳動物細胞３６（例えば、ＣＨＯ、ＨＥＫ、ＨｅＬａ等）を使用して、種々の抗体を含む産物３８を産生することができる。ＣＨＯ細胞３６は、タンパク質３８を含む産物を細胞から分泌し、得られる産物３８に由来する抗生物質には、Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）及びＡｒａｎｓｅｐという商標で市販されている抗生物質製品が含まれる。ＣＨＯ細胞は、バイオテクノロジー製造業において現在最も広く使用されている哺乳動物細胞であると考えられており、Ａｒａｎｅｓｐという商標で市販されているアムジェン社（Ａｍｇｅｎ  Ｉｎｃ．）の貧血治療薬及びＡｖａｓｔｉｎ（登録商標）という商標で販売されているロシュ・ホールディング社（Ｒｏｃｈｅ  Ｈｏｌｄｉｎｇ  ＡＧ）の抗がん剤等のよく売れている医薬品を製造するために使用されている。
【００５８】
したがって、本明細書に記載の方法及び装置は、バチルス、アスペルギルス、及びトリコデルマ等の真菌を含む細胞３６を使用するのに好適であると考えられる。真菌は、種々の酵素を含む産物３８を生産する際の使用に好適であると考えられる。１つの望ましい酵素は、デンプン及びグリコーゲン等の大型のα結合性多糖のα結合を加水分解してグルコース及びマルトースを生成する酵素ＥＣ３．２．１．１のα−アミラーゼである。α−アミラーゼは、ヒト及び他の哺乳動物に見出される主要な形態のアミラーゼである。α−アミラーゼは、貯蔵栄養分としてデンプンを含有する種子中にも存在し、また、多数の真菌によっても分泌される。α−アミラーゼは、エタノール生産にも使用され、穀物中のデンプンを発酵性糖に分解する。高果糖コーンシロップ生産の第一段階は、α−アミラーゼでコーンスターチを処理して、オリゴ糖と呼ばれるより短鎖の糖を生成することである。したがって、本開示の方法及び装置は、他の酵素の中でもα−アミラーゼの生産に使用するために、及び真菌を使用して種々の産物３８を生産するために好適であると考えられる。
【００５９】
真菌から作られた酵素は、洗濯用洗剤、パルプ及び紙加工、生体高分子、化学合成、動物飼料、糖還元、ならびに油、ガス及びエタノールの生産にも使用される。したがって、本開示の方法及び装置は、真菌を使用して、これら及び他の消費者製品に使用するのに好適な酵素産物３８を生産するのに好適であると考えられる。
【００６０】
昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９、ＨｉＦｉｖｅ等）を含む細胞３６を使用して、タンパク質、ペプチド、及び種々のワクチンを分泌させることができる。例示的な使用には、米国特許第４，８７９，２３６号に記載のように、産物３８を生産するために培養昆虫細胞を組換えバキュロウイルスに感染させることが含まれる。この文献の全内容は、参照により本明細書に援用される。同様に、米国特許第４，７４５，０５１号に記載のように、昆虫細胞を使用して、宿主昆虫細胞中で目的遺伝子を発現させることが可能な組換えバキュロウイルスを産生することができる。この文献の全内容は、参照により本明細書に援用される。同様に、組換えバキュロウイルスに感染したＳＦ９細胞は、ヒトトランスフェリンタンパク質を発現するのに好適であると考えられる。また、昆虫細胞を使用して、インターロイキン２を生産することができる。バキュロウイルスからの発現を使用して、インフルエンザワクチン（季節性及び汎発性）、ヒトパピローマウイルス、病原体、腫瘍（前立腺がん及び乳がん）及び糖尿病の治療用ワクチン、及びリポタンパク質リパーゼ欠損の遺伝子治療用産物が生産されている。細胞から分泌される他のタンパク質には、本開示の方法及び装置を使用して回収可能であると考えられる産物３８として、アミノ酸成分、及びヒトパピローマウイルスワクチンを含むワクチンが含まれる。
【００６１】
藻類を含む細胞３６を使用して、様々な産物を生産することができる。例えば、種々の油類、炭化水素系産物、脂質、糖、及び乳酸を発現するためにシアノバクテリアを使用することが知られている。組換えアシル−ＡＣＰレダクターゼ酵素及び組換えアルカナール脱炭酸モノオキシゲナーゼ酵素を含む組換えシアノバクテリア（これら２つの酵素のうち少なくとも一方は組換えシアノバクテリアに関して異種性である）を、米国特許第８，０４３，８４０号により詳しく記載されているように、光及び二酸化炭素の存在下で培養して、ｎ−ペンタデカン等のｎ−アルカンを生産することができる。この文献の全内容は、参照により本明細書に援用される。これらの藻類を含む細胞３６は、本開示の方法及び装置を用いて、なかでも上記で特定されている産物を生産するのに好適であると考えられる。
【００６２】
上記の記載は例として示されており、限定のために示されているのではない。上記の開示を考慮すると、当業者は、種々の多孔度のフィルター７４及び／又はフリット７６を使用して様々な産物３８を提供することを含む、本明細書に開示されている本発明の範囲及び趣旨内に含まれる変更例を考案することができる。上記の装置及び方法は、生物の細胞で発現され、細胞、細胞断片、及び通常は細胞が増殖する増殖培地よりも小さいサイズを有する産物の分離に使用するために記載されている。好ましくは、産物は、産物３８が生産される容器３２中の残屑の小粒子の大部分よりもその最大寸法が少なくとも１０倍小さい。しかし、キャップ及びフィルター機構及び関連する使用方法は、同様に、周囲の残屑から他の望ましい小さい産物を分離することに適用可能である。したがって、本方法は、好ましい細胞産物に限定されない。更に、本明細書に開示されている実施形態の種々の特徴は、単独で又は互いの様々な組み合わせで使用することができ、本明細書に記載の特定の組み合わせに限定されることは意図されていない。したがって、特許請求の範囲は、例示されている実施形態により限定されない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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