(57)【要約】【課題】  ＭＭＰｓ活性阻害剤、皮膚のタルミ予防又は改善剤、シワ予防又は改善剤、皮膚老化予防又は改善剤等の提供。【解決手段】  Ｃｒａｎｅｓｂｉｌｌ及びＤｏｇｗｏｏｄ  Ｂａｒｋ  Ａｍｅｒｉｃａｎから選ばれる一種以上の植物又はその抽出物を有効成分とするマトリックスメタロプロテアーゼ活性阻害剤、皮膚のタルミ予防又は改善剤、シワ予防又は改善剤、皮膚老化予防又は改善剤、皮膚外用剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｃｒａｎｅｓｂｉｌｌ及びＤｏｇｗｏｏｄ  Ｂａｒｋ  Ａｍｅｒｉｃａｎから選ばれる一種以上の植物又はその抽出物を有効成分とするマトリックスメタロプロテアーゼ活性阻害剤。
【請求項２】
Ｃｒａｎｅｓｂｉｌｌ及びＤｏｇｗｏｏｄ  Ｂａｒｋ  Ａｍｅｒｉｃａｎから選ばれる一種以上の植物又はその抽出物を有効成分とする皮膚のタルミ予防又は改善剤。
【請求項３】
Ｃｒａｎｅｓｂｉｌｌ及びＤｏｇｗｏｏｄ  Ｂａｒｋ  Ａｍｅｒｉｃａｎから選ばれる一種以上の植物又はその抽出物を有効成分とするシワ予防又は改善剤。
【請求項４】
Ｃｒａｎｅｓｂｉｌｌ及びＤｏｇｗｏｏｄ  Ｂａｒｋ  Ａｍｅｒｉｃａｎから選ばれる一種以上の植物又はその抽出物を有効成分とする皮膚老化予防又は改善剤。
【請求項５】
Ｃｒａｎｅｓｂｉｌｌ及びＤｏｇｗｏｏｄ  Ｂａｒｋ  Ａｍｅｒｉｃａｎから選ばれる一種以上の植物又はその抽出物を含有する皮膚外用剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰｓ）活性阻害作用を有し、皮膚老化予防又は改善に有効なＭＭＰｓ活性阻害剤、皮膚老化予防又は改善剤等に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚は表皮、真皮、皮下組織の３層に主に分けられ、それらのうち真皮は皮膚の構造の維持に極めて重要であり、コラーゲンやエラスチン、プロテオグリカン、フィブロネクチンといった細胞外マトリックス（ＥＣＭ）が複雑に絡み合って構成され、強度や弾力性が制御されている。
【０００３】
加齢や紫外線の曝露により、細胞外マトリックスの減少や分解、変性が起こると、皮膚は弾力性が低下し、シワやタルミの形成、肌理の消失等の老化症状を呈するようになる。
近年、これら細胞外マトリックスの変化を誘導する因子として、線維芽細胞エラスターゼ（ＮＥＰ）やＭＭＰｓの関与が指摘されている。
【０００４】
ＭＭＰｓは、細胞外マトリックスタンパク質を主要な基質とする一群のプロテアーゼの総称名である。ＭＭＰｓには多くの種類が知られており、基質特異性とドメイン構造の違いから分類され、分泌型ＭＭＰｓとしてコラゲナーゼ群、ゼラチナーゼ群、ストロムライシン群及びその他、細胞膜貫通型ＭＭＰｓとして、ＭＭＰ−１４、ＭＭＰ−１５、ＭＭＰ−１６等が知られている。
【０００５】
コラゲナーゼ群には、ＭＭＰ−１（間質コラゲナーゼ）、ＭＭＰ−８、ＭＭＰ−１３等が含まれる。中でもＭＭＰ−１は、真皮マトリックスの主な構成成分であるＩ型、III型コラーゲンや、プロテオグリカン等を基質とすることが知られている。ＭＭＰ−８、ＭＭＰ−１３もI型コラーゲン等を基質とすることが知られている。
【０００６】
ゼラチナーゼ群には、ＭＭＰ−２（ゼラチナーゼＡ）、ＭＭＰ−９（ゼラチナーゼＢ）等が含まれる。これらＭＭＰ−２、−９は、IV型コラーゲンやラミニン、エラスチン等を基質とすることが知られている。
【０００７】
ストロムライシン群には、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−１０等が含まれる。これらＭＭＰ−３、−１０は、プロテオグリカンや、IV型コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン等を基質とすることが知られている。
【０００８】
近年、これらＭＭＰｓの発現は、紫外線の照射により大きく上昇して細胞外マトリックスの減少や変性を引き起こし、強いてはこれが光老化の大きな要因の１つになっていると考えられている（非特許文献１、２）。
また、ＭＭＰ−２、−９の阻害物質をヘアレスマウスの背部へ塗布し、ＵＶＢ照射した場合には、シワ形成が予防できることも報告されている（非特許文献３)。
したがって、ＭＭＰｓ活性の阻害は、種々の細胞外マトリックスを保護し、皮膚の老化を防ぐ上で重要であると考えられ、これまでにも、例えばトウキ（特許文献１）、イジュ、マツグミ等（特許文献２）の植物抽出物にＭＭＰｓ活性阻害作用があり、皮膚老化に対して有効であることが報告されている。
【０００９】
一方、フウロソウ科フウロソウ属植物であるＣｒａｎｅｓｂｉｌｌは、収斂、止血、除菌作用などがあることが知られている。また、ミズキ科ミズキ属植物であるＤｏｇｗｏｏｄ  Ｂａｒｋ  Ａｍｅｒｉｃａｎは、強心作用、鎮痛、鎮痙、強壮、収斂、解熱作用などがあることが知られている。
しかしながら、これらの植物に、ＭＭＰｓ活性の阻害作用や抗老化作用があることはこれまでに知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開２０００−３１９１５５号公報
【特許文献２】特開２００３−２０１２１２号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｇａｒｙ J.  Ｆｉｓｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  Ｖｏｌ．３７９，  Ｎｏ．６５６３，  ３３５−３３９  （１９９６）
【非特許文献２】Ｇａｒｙ J.  Ｆｉｓｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ＡＲＣＨ  ＤＥＲＭＡＴＯＬ，  Ｖｏｌ．１３８，  Ｎｏ．１１，  １４６２−１４７０（２００２）
【非特許文献３】Ｉｎｏｍａｔａ  ｅｔ  ａｌ，  ＴＨＥ  ＪＯＵＲＮＡＬ  ＯＦ  ＩＮＶＥＳＴＩＧＡＴＩＶＥ  ＤＥＲＭＡＴＯＬＯＧＹ，  Ｖｏｌ．１２０，  Ｎｏ．１，  １２８−１３４  （２００３）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、ＭＭＰｓ活性阻害剤、皮膚のタルミ予防又は改善剤、シワ予防又は改善剤、皮膚老化予防又は改善剤等を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、安全性の高い植物の中から、Ｃｒａｎｅｓｂｉｌｌの抽出物、Ｄｏｇｗｏｏｄ  Ｂａｒｋ  Ａｍｅｒｉｃａｎの抽出物が、ＭＭＰｓ活性を阻害する作用があること見出し、これが皮膚のタルミやハリの改善、シワの予防又は改善、皮膚老化の予防又は改善等のために有用であることを見出した。
【００１４】
すなわち、本発明は以下の１）〜５）に係るものである。
１）Ｃｒａｎｅｓｂｉｌｌ及びＤｏｇｗｏｏｄ  Ｂａｒｋ  Ａｍｅｒｉｃａｎから選ばれる一種以上の植物又はその抽出物を有効成分とするマトリックスメタロプロテアーゼ活性阻害剤。
２）Ｃｒａｎｅｓｂｉｌｌ及びＤｏｇｗｏｏｄ  Ｂａｒｋ  Ａｍｅｒｉｃａｎから選ばれる一種以上の植物又はその抽出物を有効成分とする皮膚のタルミ予防又は改善剤。
３）Ｃｒａｎｅｓｂｉｌｌ及びＤｏｇｗｏｏｄ  Ｂａｒｋ  Ａｍｅｒｉｃａｎから選ばれる一種以上の植物又はその抽出物を有効成分とするシワ予防又は改善剤。
４）Ｃｒａｎｅｓｂｉｌｌ及びＤｏｇｗｏｏｄ  Ｂａｒｋ  Ａｍｅｒｉｃａｎから選ばれる一種以上の植物又はその抽出物を有効成分とする皮膚老化予防又は改善剤。
５）Ｃｒａｎｅｓｂｉｌｌ及びＤｏｇｗｏｏｄ  Ｂａｒｋ  Ａｍｅｒｉｃａｎから選ばれる一種以上の植物又はその抽出物を含有する皮膚外用剤。
【発明の効果】
【００１５】
本発明のマトリックスメタロプロテアーゼ活性阻害剤、皮膚のタルミ予防又は改善剤、シワ予防又は改善剤、皮膚老化予防又は改善剤、及び皮膚外用剤は、例えば皮膚に適用することにより、タルミの抑制又は回復、ハリの維持又は回復、シワの予防又は改善等の効果を発揮する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明植物抽出物のＭＭＰｓ活性阻害作用を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明の「Ｃｒａｎｅｓｂｉｌｌ」は、フウロソウ科フウロソウ属のＧｅｒａｎｉｕｍ  Ｍａｃｕｌａｔｕｍを意味する。
本発明の「Ｄｏｇｗｏｏｄ    Ｂａｒｋ  Ａｍｅｒｉｃａｎ」はミズキ科ミズキ属のＣｏｒｎｕｓ  ｆｌｏｒｉｄａ  Ｌ．ｒａｎｅｓｂｉｌｌを意味する。
【００１８】
本発明の上記植物は、全草、葉、茎、芽、花、蕾、根、根茎、種子等、又はこれらを組み合わせて使用することが可能であるが、Ｃｒａｎｅｓｂｉｌｌについては根茎を、Ｄｏｇｗｏｏｄ  Ｂａｒｋ  Ａｍｅｒｉｃａｎについては樹皮を、それぞれそのまま又は粉砕して用いるのが好ましい。斯かる植物は、そのまま若しくはそれを圧搾することにより得られる搾汁、植物体自身を乾燥した乾燥物若しくはその粉砕物、あるいはこれらから抽出した抽出物として用いることができるが、抽出物として用いるのが好ましい。
【００１９】
抽出物としては、植物を常温又は加温下にて抽出するか又はソックスレー抽出器等の抽出器具を用いて抽出すること等公知の抽出方法により得られる各種溶媒抽出液、その希釈液、その濃縮液又はその乾燥末が挙げられる。
公知の抽出方法としては、例えば、浸漬、煎出、浸出、還流抽出、超臨界抽出、超音波抽出及びマイクロ波抽出等が挙げられる。
【００２０】
当該抽出物を得るために用いられる抽出溶剤としては、極性溶剤、非極性溶剤のいずれをも使用することができる。例えば、水；メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール等のアルコール類；プロピレングリコール、ブチレングリコール等の多価アルコール類；アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類；酢酸メチル、酢酸エチル等のエステル類；テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル等の鎖状及び環状エーテル類；ポリエチレングリコール等のポリエーテル類；ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素等のハロゲン化炭化水素類；ヘキサン、シクロヘキサン、石油エーテル等の炭化水素類；ベンゼン、トルエン等の芳香族炭化水素類；ピリジン類等が挙げられ、これらは単独又は混合物として用いることができる。このうち、特に水、アルコール系（アルコール類及び／又は多価アルコール類）溶剤、及び水−アルコール系混合溶剤を用いるのが好ましく、水−アルコール系混合溶剤がより好ましい。さらに、アルコール類としてはメタノール、エタノール、プロパノール、ブタノールがより好ましく、エタノールがさらに好ましい。また、多価アルコール類としてはブチレングリコールがより好ましい。
水−アルコール系混合溶剤を用いる場合、アルコールの濃度は、２０％（ｖ／ｖ）以上、５０％（ｖ／ｖ）以上又は９０％（ｖ／ｖ）以上、そして８０％（ｖ／ｖ）以下、９０％（ｖ／ｖ）以下又は９５％（ｖ／ｖ）以下である。例えば、２０〜９５％（ｖ／ｖ）エタノール水溶液、５０〜９５％（ｖ／ｖ）エタノール水溶液が挙げられる。
【００２１】
本発明の植物抽出物は、例えば、植物体１質量部に対して１〜５０質量部の抽出溶剤を用い、４〜１００℃にて０．５時間〜３０日間抽出することにより行うことができる。より具体的には、抽出溶剤として水を用いる場合には、植物体１質量部に対して５〜３０質量部、４０〜１００℃にて１時間〜１日間が好ましい。また、抽出溶剤として水−エタノール混合溶剤を用いる場合には、植物体１質量部に対して５〜３０質量部、室温〜還流下で１時間〜２０日間が好ましい。また、これらの作業を繰り返し行っても良い。
【００２２】
上記の抽出物は、そのまま用いることもできるが、当該抽出物を希釈、濃縮若しくは凍結乾燥した後、粉末又はペースト状に調製して用いることもできる。また、前記抽出処理物の他、市販品を用いても良い。
【００２３】
また、上記抽出物は、さらに液々分配、固液分配、濾過膜、活性炭、吸着樹脂、イオン交換樹脂等の公知の技術によって不活性な夾雑物を除去して用いることが好ましい。このとき用いる溶剤は、上記の抽出溶剤の例示のものを用いてもよい。また、これらは、必要により公知の方法により脱臭、脱色等の処理を施してから用いてもよい。また、抽出物をさらに精製する際には、当該公知の技術及び方法を用いてもよい。
【００２４】
後記実施例で示すとおり、本発明の植物抽出物は、線維芽細胞培養上清濃縮液と、複数のＭＭＰｓ（ＭＭＰ−１，−２，−７，−８，−９，−１１，−１２，−１３，−１４，−１６）により切断を受ける蛍光基質を含むＭＭＰｓ活性阻害評価系において、優れたＭＭＰｓ活性阻害作用を有する。前述したとおり、ＭＭＰｓ活性を阻害することができれば、コラーゲン、エラスチン、フィブロネクチンといった細胞外マトリックスの減少や変性を抑え、皮膚の老化を予防又は改善することができる。すなわち、ＭＭＰｓ活性の阻害は、皮膚のタルミの抑制又は回復、ハリの維持又は回復、シワの予防又は改善に有効であると云える。
よって、本発明の植物又はその抽出物は、ＭＭＰｓ活性阻害剤、皮膚のタルミ予防又は改善剤、シワ予防又は改善剤、皮膚老化予防又は改善剤、或いは皮膚外用剤（「ＭＭＰｓ活性阻害剤等」と称する）となり得、また、ＭＭＰｓ活性阻害剤等を製造するために使用することができる。すなわち、本発明のＭＭＰｓ活性阻害剤等は、皮膚の弾力性やハリが低下し、タルミやシワが気になるヒトに適用して、タルミの予防又は改善、シワの予防又は改善のために使用することができる。
【００２５】
当該ＭＭＰｓ活性阻害剤等は、それ自体、ＭＭＰｓ活性の阻害、タルミの予防又は改善、シワの予防又は改善、或いは皮膚老化予防又は改善のための、化粧品、医薬品部外品、医薬品であってもよく、又は当該化粧品、医薬部外品、医薬品等に配合して使用される素材又は製剤であってもよい。
【００２６】
本明細書において、「マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰｓ）」とは、コラーゲン、エラスチン、フィブロネクチンといった細胞外マトリックスタンパク質を主要な基質とする一群のプロテアーゼの総称を意味し、コラゲナーゼ群（ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−８、ＭＭＰ−１３等）、ゼラチナーゼ群（ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９）、ストロムライシン群（ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−１０）の何れのものでもよいが、線維芽細胞中に含まれるものが好ましく、コラゲナーゼ群（ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−８、ＭＭＰ−１３等）、ゼラチナーゼ群（ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９）が好ましい。
また、「ＭＭＰｓ活性阻害」とは、ＭＭＰｓ活性に対し拮抗作用を有することを意味する。
また「皮膚のタルミ予防又は改善」には、皮膚の弾性低下に伴って生じる皮膚のタルミの抑制や回復、ハリの回復や維持が包含される。
また、「シワ」とは、長期紫外線曝露、乾燥、加齢等により、皮膚に回復し難い深い溝が形成されたもの、すなわち「深いシワ」の他、保湿剤等を用いて改善できるような「小じわ」を含む概念である。
「皮膚老化」とは、加齢に伴う生理的老化と日光暴露（紫外線）による光老化の何れか或いは両方を包含し、主として皮膚にハリ、肌理が無くなりシワやタルミが生じることを意味する。
【００２７】
本発明のＭＭＰｓ活性阻害剤等を化粧品、医薬部外品又は医薬品等として使用する場合は、皮膚外用剤の形態で、具体的には、軟膏、乳化化粧料、クリーム、乳液、ローション、ジェル、エアゾール等の種々の形態で用いることができる。
斯かる上記製剤は、それぞれ一般的な製造法により、直接又は製剤上許容し得る担体、例えば、各種油剤、界面活性剤、ゲル化剤、防腐剤、酸化防止剤、溶剤、アルコール、水、キレート剤、増粘剤、紫外線吸収剤、乳化安定剤、ｐＨ調整剤、色素、香料等とともに混合、分散した後、所望の形態に加工することによって得ることができる。また、これらの化粧品、医薬部外品又は医薬品等には、それぞれの製剤に応じて、適宜、植物抽出物、殺菌剤、保湿剤、抗炎症剤、抗菌剤、清涼剤、抗脂漏剤等を本発明の効果を妨害しない範囲で適宜配合することができる。
【００２８】
当該化粧品、医薬部外品又は医薬品等中の本発明の植物又はその抽出物の含有量は、一般的に固形分濃度として０．０００１〜３０質量％とするのが好ましく、０．００１〜１０質量％とするのがより好ましい。
【００２９】
上記化粧品、医薬部外品又は医薬品の投与量は、効果が得られる量であれば特に限定されず、対象者の状態、体重、性別、年齢又はその他の要因に従って変動し得るが、成人（６０ｋｇ）１人当たり１日、本発明の植物又はその抽出物（乾燥物換算）として、例えば０．１ｍｇ〜３．０ｇとするのが好ましく、更に１．０ｍｇ〜１．０ｇとするのが好ましい。また、当該製剤は、任意の摂取・投与計画に従って摂取・投与され得るが、１日１回〜数回に分け、数週間〜数カ月間継続して投与することが好ましい。
また、上記化粧品、医薬品又は医薬部外品の適用対象者としては、それを必要としていれば特に限定されないが、皮膚のタルミやハリの予防又は改善、シワの予防又は改善等の皮膚老化の予防又は改善を望むヒトが好ましい。
上述した実施形態に関し、本発明はさらに以下の用途を開示する。
【００３０】
＜１＞Ｃｒａｎｅｓｂｉｌｌ及びＤｏｇｗｏｏｄ  Ｂａｒｋ  Ａｍｅｒｉｃａｎから選ばれる一種以上の植物又はその抽出物を有効成分とするマトリックスメタロプロテアーゼ活性阻害剤。
＜２＞Ｃｒａｎｅｓｂｉｌｌ及びＤｏｇｗｏｏｄ  Ｂａｒｋ  Ａｍｅｒｉｃａｎから選ばれる一種以上の植物又はその抽出物を有効成分とする皮膚のタルミ予防又は改善剤。
＜３＞Ｃｒａｎｅｓｂｉｌｌ及びＤｏｇｗｏｏｄ  Ｂａｒｋ  Ａｍｅｒｉｃａｎから選ばれる一種以上の植物又はその抽出物を有効成分とするシワ予防又は改善剤。
＜４＞Ｃｒａｎｅｓｂｉｌｌ及びＤｏｇｗｏｏｄ  Ｂａｒｋ  Ａｍｅｒｉｃａｎから選ばれる一種以上の植物又はその抽出物を有効成分とする皮膚老化予防又は改善剤。
＜５＞Ｃｒａｎｅｓｂｉｌｌ及びＤｏｇｗｏｏｄ  Ｂａｒｋ  Ａｍｅｒｉｃａｎから選ばれる一種以上の植物又はその抽出物を含有する皮膚外用剤。
【００３１】
＜６＞マトリックスメタロプロテアーゼ活性阻害剤を製造するための、Ｃｒａｎｅｓｂｉｌｌ及びＤｏｇｗｏｏｄ  Ｂａｒｋ  Ａｍｅｒｉｃａｎから選ばれる一種以上の植物又はその抽出物の使用。
＜７＞皮膚のタルミ予防又は改善剤を製造するための、Ｃｒａｎｅｓｂｉｌｌ及びＤｏｇｗｏｏｄ  Ｂａｒｋ  Ａｍｅｒｉｃａｎから選ばれる一種以上の植物又はその抽出物の使用。
＜８＞シワ予防又は改善剤を製造するための、Ｃｒａｎｅｓｂｉｌｌ及びＤｏｇｗｏｏｄ  Ｂａｒｋ  Ａｍｅｒｉｃａｎから選ばれる一種以上の植物又はその抽出物の使用。
＜９＞皮膚老化予防又は改善剤を製造するための、Ｃｒａｎｅｓｂｉｌｌ及びＤｏｇｗｏｏｄ  Ｂａｒｋ  Ａｍｅｒｉｃａｎから選ばれる一種以上の植物又はその抽出物の使用。
＜１０＞皮膚外用剤を製造するための、Ｃｒａｎｅｓｂｉｌｌ及びＤｏｇｗｏｏｄ  Ｂａｒｋ  Ａｍｅｒｉｃａｎから選ばれる一種以上の植物又はその抽出物の使用。
＜１１＞マトリックスメタロプロテアーゼ活性阻害に使用するためのＣｒａｎｅｓｂｉｌｌ及びＤｏｇｗｏｏｄ  Ｂａｒｋ  Ａｍｅｒｉｃａｎから選ばれる一種以上の植物又はその抽出物。
＜１２＞皮膚のタルミ予防又は改善に使用するためのＣｒａｎｅｓｂｉｌｌ及びＤｏｇｗｏｏｄ  Ｂａｒｋ  Ａｍｅｒｉｃａｎから選ばれる一種以上の植物又はその抽出物。
＜１３＞シワ予防又は改善に使用するためのＣｒａｎｅｓｂｉｌｌ及びＤｏｇｗｏｏｄ  Ｂａｒｋ  Ａｍｅｒｉｃａｎから選ばれる一種以上の植物又はその抽出物。
＜１４＞皮膚老化予防又は改善に使用するためのＣｒａｎｅｓｂｉｌｌ及びＤｏｇｗｏｏｄ  Ｂａｒｋ  Ａｍｅｒｉｃａｎから選ばれる一種以上の植物又はその抽出物。
＜１５＞皮膚外用に使用するためのＣｒａｎｅｓｂｉｌｌ及びＤｏｇｗｏｏｄ  Ｂａｒｋ  Ａｍｅｒｉｃａｎから選ばれる一種以上の植物又はその抽出物。
＜１６＞Ｃｒａｎｅｓｂｉｌｌ及びＤｏｇｗｏｏｄ  Ｂａｒｋ  Ａｍｅｒｉｃａｎから選ばれる一種以上の植物又はその抽出物を、それらを必要とする対象に有効量で投与又は摂取するマトリックスメタロプロテアーゼ活性阻害方法。
＜１７＞Ｃｒａｎｅｓｂｉｌｌ及びＤｏｇｗｏｏｄ  Ｂａｒｋ  Ａｍｅｒｉｃａｎから選ばれる一種以上の植物又はその抽出物を、それらを必要とする対象に有効量で投与又は摂取する皮膚のタルミ予防又は改善方法。
＜１８＞Ｃｒａｎｅｓｂｉｌｌ及びＤｏｇｗｏｏｄ  Ｂａｒｋ  Ａｍｅｒｉｃａｎから選ばれる一種以上の植物又はその抽出物を、それらを必要とする対象に有効量で投与又は摂取するシワ予防又は改善方法。
＜１９＞Ｃｒａｎｅｓｂｉｌｌ及びＤｏｇｗｏｏｄ  Ｂａｒｋ  Ａｍｅｒｉｃａｎから選ばれる一種以上の植物又はその抽出物を、それらを必要とする対象に有効量で投与又は摂取する皮膚老化予防又は改善方法。
＜２０＞非治療的な方法である前記＜１６＞〜＜１９＞の方法。
＜２１＞前記＜１＞、＜６＞、＜１１＞、＜１６＞において、マトリックスメタロプロテアーゼは、好適には、コラゲナーゼ群、及びゼラチナーゼ群から選ばれる１種以上である。
＜２２＞前記＜１＞〜＜２１＞において、植物の使用部位は、好適には、Ｃｒａｎｅｓｂｉｌｌは根茎、Ｄｏｇｗｏｏｄ  Ｂａｒｋ  Ａｍｅｒｉｃａｎは樹皮根である。
＜２３＞前記＜１＞〜＜２１＞において、植物抽出物を得るための抽出溶剤は、好適には、水、アルコール系（アルコール類及び／又は多価アルコール類）溶剤、又は水−アルコール系混合溶剤である。ここで、アルコール類としてはメタノール、エタノール、プロパノール、ブタノールがより好ましく、エタノールがさらに好ましく、また、多価アルコール類としてはブチレングリコールがより好ましい。
＜２４＞  前記＜１＞〜＜２１＞において、植物抽出物を得るための抽出溶剤は、好適には水−アルコール系混合溶剤であり、更に好適には、アルコールの濃度が２０％（ｖ／ｖ）以上、５０％（ｖ／ｖ）以上又は９０％（ｖ／ｖ）以上、そして８０％（ｖ／ｖ）以下、９０％（ｖ／ｖ）以下又は９５％（ｖ／ｖ）以下である。
＜２５＞  前記＜１＞〜＜２１＞において、植物抽出物は、好適には、植物体１質量部に対して１質量部以上５０質量部以下の抽出溶剤を用い、４℃以上１００℃以下にて０．５時間以上３０日間以下抽出されるものである。また、植物抽出物は、好適には、抽出溶剤として水を用いる場合には、植物体１質量部に対して５質量部以上３０質量部以下の抽出溶剤を用い、４０℃以上１００℃以下にて１時間以上１日以下抽出されるものであり、抽出溶剤として水−エタノール混合溶剤を用いる場合には、植物体１質量部に対して５質量部以上３０質量部以下の抽出溶剤を用い、室温以上還流下で１時間以上２０日間以下抽出されるものである。
【実施例】
【００３２】
以下、実施例を示し、本発明をより具体的に説明する。
実施例１  Ｃｒａｎｅｓｂｉｌｌ抽出物の製造
Ｃｒａｎｅｓｂｉｌｌの根茎（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｔａｎｉｃａｌｓ社より入手）４０ｇに５０重量％エタノール水溶液を４００ｍｌ加え、室温で１７日間浸漬後、ろ過し、濃縮してＣｒａｎｅｓｂｉｌｌ抽出物８．８９ｇを得た。
【００３３】
実施例２  Ｄｏｇｗｏｏｄ  Ｂａｒｋ  Ａｍｅｒｉｃａｎ抽出物の製造
Ｄｏｇｗｏｏｄ  Ｂａｒｋ  Ａｍｅｒｉｃａｎの樹皮（Ｍｏｎｔｅａｇｌｅ  Ｈｅｒｂｓ社より入手）５０ｇに５０重量％エタノール水溶液を５００ｍｌ加え、室温で２０日間浸漬後、ろ過し、濃縮してＤｏｇｗｏｏｄ  Ｂａｒｋ  Ａｍｅｒｉｃａｎ抽出物４．９９ｇを得た。
【００３４】
試験例1  植物抽出物のＭＭＰｓ活性阻害作用
（１）細胞の培養と培養上清濃縮液の調製
ＭＭＰｓの酵素源として線維芽細胞の培養上清を用いた。すなわち、ヒト新生児包皮由来正常線維芽細胞（クラボウ）を８−１５継代程度まで５％ ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ（Invitrogen）を用いてＴ−１７５フラスコにて培養し、数日間培養後の培養上清を回収した。セントリプレップ  ＹＭ−１０（Millipore）を用いた限外ろ過法により、培養上清を約３０倍に濃縮してタンパク質量を定量した。培養上清濃縮液のタンパク質量は、BCA Protein Assay Kit（Pierce）を用いて、マニュアルに従い測定した。
【００３５】
（２）蛍光基質の切断活性（ＭＭＰｓ活性）の測定
９６  穴プレートに、５０μＬの線維芽細胞培養上清濃縮液（４００μｇ／ｗｅｌｌ）と、複数のＭＭＰｓ（ＭＭＰ−１，−２，−７，−８，−９，−１１，−１２，-１３，−１４，−１６）により切断を受ける蛍光基質としての５０μＬのFluorescence Substrate XI (R&D systems：終濃度 10μM)を混合し、実施例１及び２で調製した植物抽出物（５０％ＥｔＯＨ抽出物、固形残分濃度１．０ｗ／ｖ％）を終濃度で０．０１ｗ／ｖ％となるよう添加した。コントロールとして、同量の５０％ＥｔＯＨを添加した。また、主にＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−８などを阻害する合成化合物であるＧＭ６００１（Calbiochem)を、ＭＭＰｓ阻害剤として反応系の陽性対照に用いた（終濃度１０μＭ）。なお、培養上清濃縮液の濃度調製および反応系のバッファーにはＴＣＮＢバッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１０ｍＭ  ＣａＣｌ2、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％  Ｂｒｉｊ−３５：ｐＨ７．５）を用いた。混合物を３７℃で３０分間インキュベートした後、蛍光プレートリーダーにて蛍光量をカウントした（Ｅｘ：３５５ｎｍ、Ｅｍ：４３０ｎｍ）。コントロールの基質切断活性を１００とし、植物抽出物添加時のそれをコントロールに対する相対値（％）で求めた。結果を図１示す。
【００３６】
図１より、本発明の植物抽出物には優れたＭＭＰｓ活性阻害作用が認められた。
【図１】
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