(57)【要約】      （修正有）【課題】インシュリンを認識するインシュリン認識抗体、該インシュリン認識抗体の製造法、およびそれをリガンドに用いたインシュリン吸着剤を提供する。【解決手段】重鎖可変領域が特定のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が特定のアミノ酸配列を含み、かつ重鎖可変領域の３’末端と軽鎖可変領域の５’末端が配列番号５９のアミノ酸で連結されているインシュリン認識抗体。それを不溶性担体に固定化して抗体固定化担体。抗体固定化担体からなるインシュリン吸着剤。【選択図】図３
2014117255.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
重鎖相補性決定領域１，２および３として、それぞれ配列番号５０、５１、及び５２に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、
および／または、
軽鎖相補性決定領域１，２および３として、それぞれ配列番号５３、５４、及び５５に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
を含むことを特徴とする、インシュリン認識抗体。
【請求項２】
重鎖可変領域が、配列番号４７記載のアミノ酸配列を含む、請求項１記載のインシュリン認識抗体。
【請求項３】
軽鎖可変領域が、配列番号４９記載のアミノ酸配列を含む、請求項１記載のインシュリン認識抗体。
【請求項４】
重鎖可変領域が配列番号４７記載のアミノ酸配列を含み、かつ軽鎖可変領域が配列番号４９記載のアミノ酸配列を含む、請求項１〜３いずれかに記載のインシュリン認識抗体。
【請求項５】
重鎖可変領域が配列番号４７記載のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が配列番号４９記載のアミノ酸配列を含み、かつ重鎖可変領域のカルボキシル基末端と軽鎖可変領域のアミノ基末端が１以上のアミノ酸で連結されている、請求項１から４いずれかに記載のインシュリン認識抗体。
【請求項６】
請求項１から請求項５いずれかに記載のインシュリン認識抗体をコードすることを特徴とするポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求項６記載のポリヌクレオチドが挿入されていることを特徴とする発現ベクター。
【請求項８】
請求項７記載の発現ベクターにより形質転換されていることを特徴とする形質転換体。
【請求項９】
請求項８に記載の形質転換体を培養し、その培養上清又は形質転換体の破砕液からインシュリン認識抗体を回収することを特徴とする、インシュリン認識抗体の製造方法。
【請求項１０】
請求項１から５いずれかに記載のインシュリン認識抗体が不溶性担体に固定化されていることを特徴とする抗体固定化担体。
【請求項１１】
請求項１０に記載の抗体固定化担体からなるインシュリン吸着剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インシュリン認識抗体およびそれを用いたインシュリン吸着剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
インシュリンは膵臓のランゲルハンス島のβ細胞から分泌されるペプチドホルモンで、グルコースの消費促進、グリコーゲンへの転換促進させることによって血糖値を低下させる働きがあるため、糖尿病の治療薬に用いられている。インシュリンの構造はアミノ酸２１残基からなるＡ鎖とアミン酸３０残基からなるＢ鎖が２つのジスルフィド結合で結合し、亜鉛イオンが配位した６量体として存在する。
【０００３】
近年の遺伝子工学技術の発展により、インシュリンの生産技術は劇的に変化し、それまでのウシやブタ型の配列ではなくヒト型の配列を有するインシュリンが大腸菌や酵母によって生産されるようになった。また遺伝子工学技術の更なる進歩により、タンパク質の性質を変えることが可能となり、投与後の効果を持続させたり、あるいはさらに速効性にするといったインシュリン（インシュリンアナログ）が開発された。
【０００４】
遺伝子組み換え法によるヒトインシュリンおよびヒトインシュリンアナログの製造としては、例えば酵母ではミニプロインシュリンの遺伝子を組み換えた酵母を培養、増殖させることによりミニプロインシュリンを合成し、培養液中に分泌されたミニプロインシュリンを回収、イオン交換クロマトグラフィーにより分離精製した後、酵素処理によりヒトインシュリンへの変換を行なう。また大腸菌ではプロインシュリンの遺伝子を組み換えた大腸菌を培養、増殖させることによりプロインシュリンを合成し、回収した大腸菌の菌体を破砕、不溶性のプロインシュリンを回収、可溶化した後、イオン交換クロマトグラフィーにて精製し、酵素処理によりインシュリンに変換、いくつかのクロマトグラフィーを経て製造される。このように遺伝子組換えインシュリンの精製では、イオン交換や疎水性相互作用のクロマトグラフィーが使用されており、アフィニティクロマトグラフィーを利用することにより精製純度の向上、精製時間の短縮、回収率の向上が可能であると考えられる。
【０００５】
このようなアフィニティークロマトグラフィーの１つとして抗体をリガンドに用いてカラム基材に固定化したイムノアフィニティークロマトグラフィーがあり、研究用として広く活用されているほか、工業的にも血液凝固第ＶＩＩＩ因子製剤の製造の精製用として使用されている。またインシュリンのイムノアフィニティー精製については、ブタインシュリンをマウスに免疫して得たインシュリン抗体を用いたウシインシュリン、ブタインシュリンの調製例が報告されている（例えば特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開昭６０−１２３４２７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、インシュリンを認識するインシュリン認識抗体、該インシュリン認識抗体の製造法、およびそれをリガンドに用いたインシュリン吸着剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決するために鋭意研究した結果、インシュリン認識抗体を固定化した不溶性担体によりインシュリンを効率的に吸着・回収できることを見出した。即ち本発明は、以下の発明を包含する。
（１）重鎖相補性決定領域１，２および３として、それぞれ配列番号５０、５１、及び５２に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、
および／または、
軽鎖相補性決定領域１，２および３として、それぞれ配列番号５３、５４、及び５５に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
を含むことを特徴とする、インシュリン認識抗体。
（２）重鎖可変領域が、配列番号４７記載のアミノ酸配列を含む、（１）に記載のインシュリン認識抗体。
（３）軽鎖可変領域が、配列番号４９記載のアミノ酸配列を含む、（１）に記載のインシュリン認識抗体。
（４）重鎖可変領域が配列番号４７記載のアミノ酸配列を含み、かつ軽鎖可変領域が配列番号４９記載のアミノ酸配列を含む、（１）〜（３）いずれかに記載のインシュリン認識抗体。
（５）重鎖可変領域が配列番号４７記載のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が配列番号４９記載のアミノ酸配列を含み、かつ重鎖可変領域のカルボキシル基末端と軽鎖可変領域のアミノ基末端が１以上のアミノ酸で連結されている、（１）〜（４）いずれかに記載のインシュリン認識抗体。
（６）上述の（１）〜（５）いずれかに記載のインシュリン認識抗体をコードすることを特徴とするポリヌクレオチド。
（７）上述の（６）に記載のポリヌクレオチドが挿入されていることを特徴とする発現ベクター。
（８）上述の（７）に記載の発現ベクターにより形質転換されていることを特徴とする形質転換体。
（９）上述の（８）に記載の形質転換体を培養し、その培養上清又は形質転換体の破砕液からインシュリン認識抗体を回収することを特徴とする、インシュリン認識抗体の製造方法。
（１０）上述の（１）〜（５）いずれかに記載のインシュリン認識抗体が不溶性担体に固定化されていることを特徴とする抗体固定化担体。
（１１）上述の（１０）に記載の抗体固定化担体からなるインシュリン吸着剤。
【０００９】
以下、本発明を詳細に説明する。初めに本発明の抗体について説明する。
【００１０】
一般に、抗体分子中には二本の重鎖および二本の軽鎖があり、各軽鎖及び重鎖はそのアミノ基末端に可変領域を有する。また各可変領域は４つのフレームワーク領域（ＦＲ１から４）と３つの相補性決定領域（ＣＤＲ１から３）がそれぞれ交互に配置する構成になっている。
【００１１】
可変領域中の残基はＫａｂａｔらによって考えられた系（Ｋａｂａｔら、１９８７、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏf Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ,  ＵＳ  Ｄｅｐａｒｔｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ、ＵＳＡ）に従って慣用的に番号付けられている。
【００１２】
重鎖可変領域のＣＤＲはＫａｂａｔ番号付けに従って３１から３５番残基（ＣＤＲＨ１）、５０から６５番残基（ＣＤＲＨ２）、および９５から１０２番残基（ＣＤＲＨ３）に位置している。軽鎖可変領域のＣＤＲは、Ｋａｂａｔ番号付けに従って、２４から３４番残基（ＣＤＲＬ１）、５０から５６番残基（ＣＤＲＬ２）、および８９から９７番残基（ＣＤＲＬ３）に位置している。
【００１３】
本発明では、ＣＤＲＨ１，２，３として、それぞれ配列番号５０，５１，５２に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び／又はＣＤＲＬ１，２，３として、それぞれ配列番号５３，５４，５５に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含むインシュリン認識抗体である。このとき、少なくとも配列番号５０，５１，５２及び／又は配列番号５３，５４，５５のアミノ酸配列を有すればよく、それらの配列の前後にそれぞれ３つ以下のアミノ酸を有するものであってもよい。またインシュリン認識抗体としては、インタクト、フラグメント、一本鎖抗体、二本鎖抗体などのいずれでもよく、例えば免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）やＦａｂ、ＦＶ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｄｉａｂｏｄｙ、ＩｇＧの最小単位のＶＨ、ＶＬ、またラクダのＶＨＨやサメのＩｇＮＡＲなどがあげられる。また重鎖可変領域が配列番号４７に記載のアミノ酸配列を含む、及び／又は軽鎖可変領域が配列番号４９に記載のアミノ酸配列を含むインシュリン認識抗体であることが好ましい。またそのような重鎖可変領域のカルボキシル基末端と軽鎖可変領域のアミノ基末端が１以上のアミノ酸で連結されている抗体も好ましい。連結に用いられるアミノ酸としては特に限定はなく、リンカーとして用いられているものを適宜採用することができるが、一例として配列番号５９のアミノ酸配列をあげることができる。
【００１４】
次に本発明の製法について説明する。
【００１５】
インシュリンを認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、ケーラーやミルスタインが開発した方法(ネイチャー  ２５６巻  ４９５項  １９７５年)に準じて調製することができる。また得られたハイブリドーマから、インシュリン認識抗体遺伝子のクローニングは、例えば以下の方法により行うことができる。すなわち、インシュリン認識抗体を産生するハイブリドーマ細胞より、市販キット（例えばキアゲン社、Ｒｎｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（製品名））を用いてトータルＲＮＡを抽出し、次いで市販キット（例えばタカラバイオ社、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｋｉｔ（製品名））を用いた逆転写反応により、抽出したトータルＲＮＡからｃＤＮＡを合成する。さらに合成したｃＤＮＡをＰＣＲにて増幅することで、該ハイブリドーマからインシュリン認識抗体遺伝子を取得することができる。抽出、増幅した抗体遺伝子は重鎖と軽鎖の定常領域と可変領域の全てをコードするものであってもよいが、重鎖と軽鎖の可変領域のみをコードするものであってもよい。またＰＣＲで用いるプライマーは既存のマウス抗体重鎖遺伝子、軽鎖遺伝子の可変領域において保存されている領域の配列を用いることにより増幅することができる。
【００１６】
また抗体遺伝子のクローニングのための公知の技術およびプロトコールは、抗体工学に関する書籍（Ａｎｉｔｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｖｏｌｕｍｅ１  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｏｎ（Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎら、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）などに記載されており、これらの方法を参考に作製することもできる。
【００１７】
該インシュリン認識抗体遺伝子の塩基配列は、塩基配列分析用に適当なプラスミドに組み込むなどして該プラスミドを増幅し、常法により塩基配列を解析することで決定することができる。また解析した塩基配列からアミノ酸に変換することもできる。
【００１８】
また本発明は、前述のインシュリン認識抗体をコードするポリヌクレオチド、それが挿入されている発現ベクター及び該発現ベクターにより形質転換されている形質転換細胞に関するものである。
【００１９】
形質転換細胞、即ち宿主としては酵母、細菌、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞など各種培養細胞が使用できるが、取扱いの容易さなどから大腸菌が好ましい。なお、各々のアミノ酸に対応するコドンの使用頻度は生物によってかなり偏りがあることが知られることから、使用する宿主におけるコドンの使用頻度を考慮して変換するのが好ましい。一例として、宿主が大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）の場合は、アルギニン（Ａｒｇ）ではＡＧＡ／ＡＧＧ／ＣＧＧ／ＣＧＡが、イソロイシン（Ｉｌｅ）ではＡＴＡが、ロイシン（Ｌｅｕ）ではＣＴＡが、グリシン（Ｇｌｙ）ではＧＧＡが、プロリン（Ｐｒｏ）ではＣＣＣが、それぞれ使用頻度が少ないため（いわゆるレアコドンであるため）、それらのコドンを避けるように変換すればよい。コドンの使用頻度の解析は公的データベース（例えば、かずさＤＮＡ研究所のホームページにあるＣｏｄｏｎ  Ｕｓａｇｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ等）を利用することによっても可能である。
【００２０】
本発明は遺伝子の５’末端側にシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドを付加してもよく、宿主が大腸菌の場合は、前記シグナルペプチドとしてｐｅｌＢ、ＤｓｂＡ、ＭａｌＥ（ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｎｏ．Ｐ０ＡＥＸ９に記載のアミノ酸配列のうち１番目から２６番目までの領域）、ＴｏｒＴといったペリプラズムにタンパク質を分泌させるシグナルペプチドをあげることができる。
【００２１】
また組換えた抗体遺伝子には精製のために有用な配列を付加してもよく、例えばカルボキシル基末端にヒスチジンヘキサマーを含んだタグ配列が付加されるように遺伝子を作製することができる。シグナルペプチドの種類やシグナルペプチドとの結合方法は上記方法に限定されることはなく、当業者が利用可能な任意のシグナルペプチドを利用することが出来る。
【００２２】
本発明で用いられる発現ベクターとしては特に限定はない。例えば、大腸菌ベクターを用いて場合は大腸菌内で安定に発現可能なベクターであれば特に限定されないが、例えばｐＴｒｃ９９Ａ（ＧＥヘルスケア社）、ｐＵＣベクター（タカラバイオ社）、ｐＥＴベクター（ノバジェン社）などといったベクターなどが例示できる。また発現ベクターにおいて、遺伝子は、転写に必要な要素（例えば、プロモーター等）が機能的に連結される。プロモーターは宿主細胞において転写活性を示すＤＮＡ配列であり、ベクターの種類に応じて適宜選択することができ、大腸菌で使用できるプロモーターにはｌａｃ、ｔｒｐ、ｔｒｃ、Ｔ７もしくはｔａｃプロモーターなどが挙げられる。また使用する大腸菌株の種類としては、組換えた遺伝子が発現すれば特に限定はされないが、組換えた抗体の遺伝子が安定に保たれる菌株が好ましく、例えばＪＭ１０９、ＨＢ１０１，Ｗ３１１１０、ＢＬ２１、ＭＣ４１１０株などが例示できる。
【００２３】
発現ベクターにより形質転換された形質転換体は、導入された遺伝子の発現を可能にする条件下で適切な栄養培地中で培養することで、本発明の抗体の生産をすることができる。使用する培地としては形質転換した大腸菌が増殖し、本発明の抗体が生産されればいずれの培地を用いてもよく、例えばＬＢ培地、２×ＹＴ培地、ＳＯＢ培地などが例示できる。また炭素源、窒素源、無機塩、金属塩、ビタミン類などの栄養源を組み合わせた培地をも用いることができる。炭素源としては廃糖蜜、グルコース、フルクトース、マルトース、ショ糖、デンプン、乳糖、グリセロール、酢酸などが、窒素源にコーンスティープリカー、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、大豆粕等の天然成分や、酢酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム等のアンモニウム塩等やグルタミン酸、アスパラギン酸、グリシン等のアミノ酸類など、無機塩にはリン酸１ナトリウム、リン酸２ナトリウム、リン酸１カリウム、リン酸２カリウム等のリン酸塩や塩化ナトリウムなどが、金属塩には塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、硫酸第１鉄、硫酸第２鉄、塩化第１鉄、塩化第２鉄、クエン酸鉄、硫酸アンモニウム鉄、硫酸亜鉛、塩化亜鉛、硫酸銅、塩化銅、硫酸マンガン、塩化マンガンなど、ビタミン類として酵母エキスやビオチン、ニコチン酸、チアミン、リボフラビン、イノシトール、ピリドキシン等を用いた培地も使用することができる。また上記培地成分に用いる化合物は有水物、無水物を問わずに使用できる。
【００２４】
上記のような栄養培地を使用した好適な培養条件は、培養温度１５から４０℃、培地のｐＨを５から９、培養時間が１２時間以上であり、さらに好適には、培養温度２０から３７℃、ｐＨが約６から８、培養時間が１８時間から１８０時間である。また培養温度、培地のｐＨは培養中に適宜変えてもよい。
【００２５】
本発明の発現ベクターに誘導性のプロモーター配列が含まれている場合、本発明のタンパク質が良好に発現できるような条件下で誘導をかけると好ましい。誘導剤としてはＩＰＴＧ（イソプロピル−β−チオガラクトピラノシド）を例示することができる。宿主が大腸菌の場合、培養液の濁度（６００ｎｍにおける吸光度）を測定して添加する時間を決めることができる。添加の時間は細胞が活発に増殖している状態が好ましく、６００ｎｍの吸光度の値が約０．５から５．０の間で適当量のＩＰＴＧを添加後、引き続き培養することで目的のタンパク質を発現することができる。ＩＰＴＧの添加濃度は０．００５ｍＭから５ｍＭの範囲が好ましく、より好ましくは０．０１から１ｍＭの範囲である。また目的タンパク質の急激な発現による不溶性粒子（インクルージョンボディー）の生成を防ぐため、誘導剤を加える時に培養温度やｐＨを変更し、増殖速度を抑制することが好ましい。ＩＰＴＧ誘導に関する種々の条件は当該技術分野において周知の条件で行なえばよい。
【００２６】
本発明のインシュリン認識抗体を回収するには、培養物から何らかの方法で目的とする抗体を抽出すればよい。本発明の形質転換体の培養液から、本発明の抗体を抽出するには、当該抗体の発現の形態により適宜抽出方法を選択すればよい。培養上清に発現する場合は菌体を遠心分離操作によって分離し、得られる培養上清から本発明の抗体を抽出すればよい。一方、細胞内（原核生物においてはペリプラズムも含む）に発現する場合には、遠心分離操作により菌体を集めた後、酵素処理剤や界面活性剤等を添加することにより菌体を破砕し、本発明の抗体を抽出すればよい。抽出した本発明の抗体を含む溶液から本発明の抗体を分離精製するには、当該技術分野において公知の方法を用いればよく、一例として液体クロマトグラフィーを用いた分離精製があげられる。液体クロマトグラフィーには、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等があり、これらのクロマトグラフィーを組み合わせて精製操作を行なうことにより、本発明のインシュリン認識抗体を高純度に調製することができる。
【００２７】
本発明のインシュリン認識抗体を不溶性担体に固定化させて、抗体固定化担体が得られる。不溶性担体には特に限定はないが、アガロース、アルギネート（アルギン酸塩）、カラゲナン、キチン、セルロース、デキストリン、デキストラン、デンプンといった多糖質ゲル、またはポリビニルアルコール、ポリメタクレート、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリウレタンといった合成高分子ゲルが好ましい。前記好ましい担体の一例として、トヨパール（東ソー社製）等の水酸基を導入したポリメタクリレートゲル、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥヘルスケア社製）等のアガロースゲル、セルファイン（ＪＮＣ社製）等のセルロースゲルがあげられる。担体の形状については特に限定はなく、粒状物または非粒状物、多孔性または非多孔性、いずれであってもよい。本発明のインシュリン認識抗体を不溶性担体に固定化する方法には特に限定はなく、例えば活性基を介して固定化することができる。
【００２８】
本発明の抗体固定化担体はインシュリン吸着剤として用いることができる。その使用方法に特に制限はないが、空カラムに本発明のインシュリン吸着剤を充填して得られるカラムを用いたクロマトグラフィーによる方法が好ましい。インシュリンを含む溶液としては、市販のインシュリン適当な緩衝液や大腸菌、酵母などのインシュリンを生産する細胞の培養液や、当該培養液を遠心分離等により細胞を除去した培養上清を例示でき、そこからインシュリンを吸着することができる。カラムの大きさ、即ち本発明のインシュリン吸着剤の充填量は精製原料の処理量を考慮の上、適宜決定すればよい。
【００２９】
本発明のインシュリン吸着剤を充填したカラムにインシュリンを含む溶液を添加する際は、送液量を考慮しポンプ等の送液手段を用いて添加すればよい。なお、本発明のインシュリン吸着剤を充填したカラムは、インシュリンを添加する前に、あらかじめ適切な緩衝液を用いて平衡化することが好ましい。緩衝液としてはリン酸緩衝液等の無機塩を成分とした緩衝液を例示することができる。なお、緩衝液のｐＨは、ｐＨ３から１０、好ましくはｐＨ５から８である。前記インシュリン吸着剤に吸着させたインシュリンを溶出させるには、前記インシュリン吸着剤とインシュリンとの相互作用を弱める緩衝液を用いればよく、具体的には、クエン酸緩衝液、グリシン塩酸緩衝液、酢酸緩衝液を例示することができる。緩衝液のｐＨは、抗体が有する機能を損なわない範囲で設定すればよく、好ましくはｐＨ２．０から６．０、より好ましくはｐＨ３．０から４．０である。本発明のインシュリン量の測定は、インシュリンが定量的に測定することができればいずれの方法でもよく、タンパク質の定量分析で一般的に用いられる方法が好ましく、紫外吸光法（例えば２８０ｎｍの吸収）、ブラッドフォード法、ローリー法、ＥＬＩＳＡ法などがあげられる。
【発明の効果】
【００３０】
本発明のインシュリン認識抗体を不溶性の担体に固定化させたインシュリン吸着剤は、インシュリンと特異的に結合し、その結合を弱めることでインシュリンを溶出させることができるため、インシュリンを効率よく精製することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】インシュリン認識単鎖抗体発現ベクターｐＥＴＩＮＳＡｂの概略構造を示す図である。
【図２】プラスミドｐＥＴＭａｌＥの概略構造を示す図である。
【図３】インシュリン認識抗体固定化カラムを用いて、インシュリンをアプライ、洗浄、溶出させた際の各フラクションのインシュリン濃度を示す図である。
【実施例】
【００３２】
以下、実施例を用いて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００３３】
実施例１  インシュリン認識抗体遺伝子のクローニングと塩基配列解析
インシュリン認識モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞からのＲＮＡの抽出は、Ｒｎｅａｓｙ Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（製品名、キアゲン社製）を用い、添付のプロトコールに従い抽出した（ＲＮＡ濃度１．２μｇ／μｌ）。ＲＮＡからｃＤＮＡへの逆転写反応はＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｋｉｔ（製品名、タカラバイオ社）を使いて以下の手順で行った。すなわち上記で調製したＲＮＡ約１μｇを鋳型に表１の試薬組成にて４２℃、３０分の反応を行った。必要なプライマーは添付のＯｌｉｇｏ  ｄＴ  ＰｒｉｍｅｒおよびＲａｎｄｏｍ  ６  ｍｅｒｓを用いた。
【００３４】
【表１】
2014117255.tif 000003
逆転写反応生成物の一部を鋳型に用いて、以下の手順でｃＤＮＡの増幅を行った。表２に示す試薬組成でＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応は９４℃、５分で熱処理後、９４℃、３０秒、６０℃の第一ステップ、３０秒、７２℃、１分３０秒間の３つサイクルを２５回繰り返した。ＰＣＲ反応の一部をアガロース電気泳動で分析し、目的のＤＮＡサイズに等しいバンドが増幅されていることを確認した。重鎖フォワードプライマーは制限酵素ＳｆｉＩ認識配列を含む配列番号１から１７に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを用い、重鎖リバースプライマーは制限酵素ＸｈｏＩ認識配列［ＣＴＣＧＡＧ］を含む配列番号１８から２１に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを用いた。また軽鎖フォワードプライマーは制限酵素ＮｃｏＩ認識配列［ＣＣＡＴＧＧ］を含む配列番号２２から４２に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを用い、軽鎖リバースプライマーは制限酵素ＡｓｃＩ認識配列［ＧＧＣＧＣＧＣＣ］を含む配列番号４３に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを用いた。
【００３５】
【表２】
2014117255.tif 000004
増幅した重鎖のＤＮＡはＳｆｉＩ、ＸｈｏＩの制限酵素で、軽鎖のＤＮＡはＮｃｏＩ、ＡｓｃＩの制限酵素でそれぞれ消化し、クローニング用ベクター（ｐＦＣＡＨ１０）に導入した。クローニングしたインシュリン認識抗体の可変領域について、その塩基配列をチェーンターミネータ法に基づくＢｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ  ｒｅａｄ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ＰＥアプライドバイオシステム社製）を用いてサイクルシークエンス反応に供し、全自動ＤＮＡシークエンサーＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３７００  ＤＮＡ  ａｎａｌｙｚｅｒ（ＰＥアプライドバイオシステム社製）にて解析した。なお、シークエンス用プライマーとして、重鎖は配列番号４４（５’−ＴＴＡＧＴＴＴＧＧＧＣＡＧＣＡＧＡＴＣＣ−３’）、軽鎖は配列番号４５（５’−ＣＣＡＴＴＡＡＴＡＡＧＡＧＣＴＡＴＣＣＣＧ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを用いた。重鎖可変領域の塩基配列を配列番号４６に、軽鎖可変領域の塩基配列を配列番号４８、それぞれの塩基配列をアミノ酸配列に変換した結果を配列番号４７および配列番号４９に記載した。
【００３６】
実施例２  インシュリン認識抗体遺伝子改変領域の配列設計
配列番号４６および４８に記載の塩基配列からなるインシュリン認識抗体重鎖可変領域および軽鎖可変領域（マウスコドン）から、大腸菌コドンを用いて変換した配列番号５６および配列番号５７に記載の塩基配列からなるインシュリン認識抗体重鎖可変領域および軽鎖可変領域（大腸菌コドン）を、ＤＮＡＷｏｒｋｓ法により設計した。インシュリン認識抗体重鎖可変領域および軽鎖可変領域（マウスコドン）の塩基配列（配列番号４６および配列番号４８）と、インシュリン認識抗体重鎖可変領域および軽鎖可変領域（大腸菌コドン）の塩基配列（配列番号５６および配列番号５７）とを比較した結果、塩基配列の相同性はそれぞれ７７％と７５％であった。
【００３７】
実施例３  インシュリン認識単鎖抗体遺伝子の作製
実施例２で設計した、配列番号５６のヌクレオチド配列（インシュリン認識抗体重鎖可変領域）の３’末端と、配列番号５７のヌクレオチド配列（インシュリン認識抗体軽鎖可変領域）の５’末端を、配列番号５８（５’−ＧＧＣＧＧＴＧＧＴＧＧＴＡＧＣＧＧＴＧＧＣＧＧＣＧＧＴＴＣＣＧＧＣＧＧＴＧＧＴＧＧＣＴＣＴ−３’）のヌクレオチド配列で連結させ、配列番号６０のヌクレオチドのインシュリン認識単鎖抗体遺伝子を作製した。なお、配列番号５９は、配列番号５８のヌクレオチド配列のアミノ酸配列に相当し、配列番号６１は、配列番号６０のヌクレオチド配列のアミノ酸配列に相当する。抗体遺伝子の作製については、具体的には、配列番号６２から配列番号９７に記載のヌクレオチド配列からなる３６種類のオリゴヌクレオチドを合成し、以下に示す二段階のＰＣＲ反応を行なった。
【００３８】
まず表３に示す組成の反応液を調製し、９６℃で５分間熱処理後、９６℃で３０秒間の第一ステップ、６０℃で３０秒間の第二ステップ、７２℃で１分３０秒間の第三ステップを２５サイクル行ない、最後に７２℃で１０分間反応させることで一段階目のＰＣＲを行なった。なお、表３のオリゴヌクレオチドミックスとは、配列番号６２から９７に記載の配列からなる３６種類のオリゴヌクレオチド溶液を１ｍＭの濃度になるよう等量ずつ採取し、混合した溶液である。
【００３９】
【表３】
2014117255.tif 000005
次に表４に示す組成の反応液を調製し、９６で５分間熱処理後、９６℃で３０秒間の第一ステップ、６２℃で３０秒間の第二ステップ、７２℃で１分３０秒間の第三ステップを２５サイクル行い、最後に７２℃で１０分間反応させることで二段階目のＰＣＲを行なった。なお、ＰＣＲプライマーとして配列番号６２（５’−ＣＡＴＧＣＣＡＴＧＧＧＣＣＡＧＧＴＴＣＡＧＣＴＣＣＡＡＣＡＧ ＴＣＴＧＧＴＧＣＧＧ−３’）および配列番号９７（５’−ＣＡＴＴＴＴＧＡＴＧＴＣＡＧＡＧＣＣＡＣＣＡ −３’）のオリゴヌクレオチドを用いた。
【００４０】
【表４】
2014117255.tif 000006
ＰＣＲ反応終了後、１．０％アガロース電気泳動により設計通りのサイズに相当するＤＮＡバンドを確認し、当該反応液を市販のＰＣＲ精製キットＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ：キアゲン社）を用いてＤＮＡを精製した。精製したＤＮＡを制限酵素ＮｃｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、同じ制限酵素で消化した発現ベクターｐＥＴＭａｌＥに挿入後、当該ベクターを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に形質転換した。調製したインシュリン認識単鎖抗体発現プラスミドベクターｐＥＴＩＮＳＡｂの概略図を図１に示した。
【００４１】
発現ベクターｐＥＴＭａｌＥは以下の方法により作製した。ＭａｌＥシグナルペプチド（ＵｎｉＰｒｏｔＮｏ．Ｐ０ＡＥＸ９）に記載のアミノ酸配列のうち１番目から２６番目までの領域）およびリンカーペプチドを含む配列番号９８のアミノ酸配列（ＭＫＩＫＴＧＡＲＩＬＡＬＳＡＬＴＴＭＭＦＳＡＳＡＬＡＫＩＥＥＭ）をコードするポリヌクレオチドを作製するために、下記に示す２段階のＰＣＲを行なった。
１段階目のＰＣＲ反応は、表５に示す反応液を用い、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を５サイクル行なうことで実施した。
【００４２】
【表５】
2014117255.tif 000007
なお表５に示す反応液の組成のうち、オリゴヌクレオチドミックスは、配列番号９９（５’−ＴＡＴＡ［ＣＡＴＡＴＧ］ＡＡＡＡＴＡＡＡＡＡＣＡＧＧＴＧＣＡＣＧＣＡＴＣＣ−３’；角かっこ内の塩基は制限酵素ＮｄｅＩサイト）、配列番号１００（５’−ＧＣＡＴＴＡＡＣＧＡＣＧＡＴＧＡＴＧＴＴＴＴＣＣＧＣＣＴＣＧＧＣＴＣＴＣＧＣＣ−３’）、配列番号１０１（５’−ＡＴＣＧＴＣＧＴＴＡＡＴＧＣＧＧＡＴＡＡＴＧＣＧＡＧＧＡＴＧＣＧＴＧＣＡＣＣＴＧ−３’）、または配列番号１０２（５’−ＴＴＧＴＣ［ＣＣＡＴＧＧ］ＣＴＴＣＴＴＣＧＡＴＴＴＴＧＧＣＧＡＧＡＧＣＣＧ−３’；角かっこ内の塩基は制限酵素ＮｃｏＩサイト）に記載の配列からなる５０μＭの濃度の各オリゴヌクレオチド溶液を、それぞれ等量ずつ採取し混合した溶液である。
【００４３】
２段階目のＰＣＲ反応は、表６に示す反応液を用い、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行なうことで実施し、ＭａｌＥシグナルペプチドおよびリンカーペプチドをコードするポリヌクレオチドを作製した。
【００４４】
【表６】
2014117255.tif 000008
なお、表６に示す反応液の組成のうち、鋳型は１段階目のＰＣＲ反応液を用い、ＰＣＲプライマーは配列番号９９および配列番号１０２に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを使用した。
【００４５】
上記で調製したＭａｌＥシグナルペプチドおよびリンカーペプチドをコードするポリヌクレオチドを、制限酵素ＮｄｅＩとＮｃｏＩで消化後、あらかじめ制限酵素ＮｄｅＩとＮｃｏＩで消化したｐＥＴ２６ｂ（＋）プラスミドベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）にライゲーションし、大腸菌ＪＭ１０９株（タカラバイオ社製）を２０μｇ／ｍＬのカナマイシン（タカラバイオ社製）を含むＬＢ寒天培地を用いて形質転換した。
【００４６】
得られた形質転換体を２０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ培地で培養し、形質転換体よりプラスミドＤＮＡを抽出することで、プラスミドｐＥＴＭａｌＥを調製した。ｐＥＴＭａｌＥの構造を図２に示す。
【００４７】
実施例４  塩基配列の解析
上述のインシュリン認識単鎖抗体発現プラスミドベクターｐＥＴＩＮＳＡｂに挿入されたポリヌクレオチドの塩基配列をチェーンターミネータ法に基づくＢｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ  ｒｅａｄ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ＰＥアプライドバイオシステム社製）を用いてサイクルシークエンス反応に供し、全自動ＤＮＡシークエンサーＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３７００  ＤＮＡ  ａｎａｌｙｚｅｒ（ＰＥアプライドバイオシステム社製）にて解析した。シークエンス用プライマーとして、配列番号１０３（５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ−３’）と配列番号１０４（５’−ＴＡＴＧＣＴＡＧＴＴＡＴＴＧＣＴＣＡＧ−３’）のオリゴヌクレオチドを用いた。解析の結果、ｐＥＴＩＮＳＡｂに挿入されたポリヌクレオチドの配列は設計通りであることを確認した。
【００４８】
実施例５  インシュリン認識単鎖抗体タンパク質の調製
実施例３で作製したベクターｐＥＴＩＮＳＡｂが導入された大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を２０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ液体培地１００ｍｌに接種し、５００ｍｌフラスコにて３７℃で一晩振とう培養し、前培養液を調製した。前培養液の６００ｎｍの濁度を測定した結果、５．７だった。
【００４９】
次いで、５Ｌおよび３Ｌの発酵槽を用いて本培養を行った。それぞれ３．５Ｌ、２．１Ｌの２０μｇ／ｍＬのカナマイシンおよび１０ｇ／Ｌグルコースを添加した２×ＴＹ培地（ｐＨ６．０）に上記培養液３５ｍｌ、２１ｍｌをそれぞれ接種し、温度３７℃、通気量１ＶＶＭ、撹拌速度４５０ｒｐｍおよび５００ｒｐｍの条件に設定し、培養を開始した。培養開始から約２．５時間後温度を２０℃に下げ、設定温度に到達したことを確認した後、終濃度０．１ｍＭになるようＩＰＴＧを添加し、引き続き２０℃で培養した。約２４時間培養後、培養液を７，０００ｒｐｍ、１０分間により遠心分離を行い、それぞれ１０４ｇ、７８ｇの湿菌体を回収した。
【００５０】
上記湿菌体を合わせ、２０ｍＭのトリス―塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）７００ｍｌで洗浄した後、同じ緩衝液７００ｍｌに再懸濁し、菌体を破砕した。菌体破砕は超音波発生装置（インソネーター２０１Ｍ（商品名）、久保田商事製）を用いて、４℃、約５分間、約１７０Ｗの出力で処理し、処理液を４℃、２０分間、１０，０００ｒｐｍの遠心分離にて、可溶性画分７００ｍｌを回収した。
【００５１】
可溶性画分に塩化ナトリウムおよびイミダゾールをそれぞれ５００ｍＭ、２０ｍＭの濃度になるように添加し、Ｈｉｓ・Ｂｉｎｄ  Ｒｅｓｉｎ（メルクミリポア社製）にアプライし、４５ｍＭのイミダゾールで洗浄後、２６０ｍＭのイミダゾールで溶出させ、精製を行った。
【００５２】
溶出液１１０ｍｌを分画分子量１２，０００〜１４，０００の透析セルロース膜に入れ４．５Ｌの１００ｍＭの塩化ナトリウム、１ｍＭのＥＤＴＡを含む２０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）にて、４℃で一晩透析した。透析後、４℃、１０,０００ｒｐｍ、１５分間の遠心分離により、上清を回収した。
【００５３】
遠心上清をトヨパールＣＭ−ギガキャップ（東ソー社製）にアプライし、透析液と同じ組成の緩衝液で洗浄以後、塩化ナトリウム濃度０．１Ｍから０．９Ｍの直線濃度勾配により溶出させた。溶出液をドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）およびクマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色し、インシュリン認識単鎖抗体タンパク質が均一である画分を回収した。  
回収した画分８０ｍｌの２８０ｎｍにける吸光度は２．３を示した。上記溶出液を分画分子量３，０００のアミコンウルトラ１５（メルクミリポア社製）で遠心ろ過を行い、２８０ｎｍの吸光度６．８を示すインシュリン認識単鎖抗体タンパク質４０ｍｌを調製した。インシュリン認識単鎖抗体のタンパク質の２８０ｎｍにおける１Ａｂｓを１．２ｍｇ／ｍｌとすると、作製したインシュリン認識単鎖抗体のタンパク質の濃度は約５．５ｍｇ／ｍｌであった。
【００５４】
実施例６  インシュリン認識単鎖抗体タンパク質固定ゲルの作製
インシュリン認識単鎖抗体タンパク質固定ゲルの作製は、Ｎ−ヒドロキシサクシイミドを活性基とするセファーロスゲルのＨｉｔｒａｐ  ＮＨＳ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＨＰカラム（ＧＥヘルスケア社製を用いた。まず１ｍｌゲル量の上記カラムを氷冷した５ｍｌの１ｍＭ  ＨＣｌで洗浄後、実施例５で作製したインシュリン認識単鎖抗体溶液と等量の２×カップリング緩衝液（組成：０．２Ｍ炭酸水素ナトリウム，０．５Ｍ  ＮａＣｌ，ｐＨ８．３）とを混合した液１１ｍｌ（１ｍｌゲルあたりのインシュリン認識単鎖抗体タンパク質使用量３０ｍｇ）をシリンジでアプライし、通過液を回収して再度カラムにアプライする操作を４回繰り返した。３ｍｌのカップリング緩衝液、６ｍｌのブロッキング緩衝液（組成：０．５Ｍモノエタノールアミン，０．５Ｍ  ＮａＣｌ，ｐＨ８．３）、６ｍｌ洗浄液で順次洗浄し、再度６ｍｌのブロッキング緩衝液を添加し、２５℃、３０分間静置した。さらに６ｍｌの洗浄液、６ｍｌのブロッキング緩衝液、６ｍｌの洗浄液で洗浄し、５００ｍＭの塩化ナトリウムを含む１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に置換し、４℃に保存した。
【００５５】
反応液に残存しているインシュリン認識単鎖抗体タンパク質量およびカップリング緩衝液中のインシュリン認識単鎖抗体タンパク質量は、実施例５で精製したインシュリン認識抗体の濃度を基準に、バイオラッドプロテインアッセイ（バイオラッド社製）にて求めた。インシュリン認識単鎖抗体固定化ゲルの固定化量については、反応に供した量から差し引いて計算した結果、１ｍｌゲルあたりインシュリン認識単鎖抗体タンパク質は１６．２ｍｇ固定化され、固定化率は５３．５％と求められた。  
実施例７  インシュリン結合量と有効固定化率の算出
実施例６で作製した１ｍｌゲル量のインシュリン認識単鎖抗体固定化カラムを、５００ｍＭの塩化ナトリウムを含む１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で置換し、同じ組成の緩衝液で調製した１ｍｇ／ｍｌのインシュリン溶液を、１ｍｌ／３分の流速で７．５ｍｌアプライした。同じ流速で５００ｍＭの塩化ナトリウムを含む１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）１３ｍｌで洗浄し、２８０ｎｍの吸光度が０．０６以下に低下し、かつ数値が安定していることを確認した後、５００ｍＭの塩化ナトリウムを含む１００ｍＭのグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）６ｍｌで溶出させた。溶出画分の２８０ｎｍの吸光度を求めた結果を図３のグラフに示す。インシュリンの２８０ｎｍにおける１Ａｂｓを１．１８ｍｇ／ｍｌ（既知濃度のインシュリンより決定）として求めたインシュリン結合量は、１ｍｌゲルあたり１．８４ｍｇだった。
【００５６】
インシュリンの分子量は５，７００、インシュリン認識単鎖抗体の分子量は２６，７００であり、インシュリンとその抗体とは１対１結合することを勘案し、ゲルに固定したインシュリン認識単鎖抗体が機能している割合（有効固定化率）を計算した。その結果、作製したインシュリン認識単鎖抗体固定化ゲルの有効固定化率は５３％であった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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