(57)【要約】    【課題】本発明は、必要な柔軟性及び強度を備え、移植部位に効率よく神経を再生させることができる神経移植用の移植片を提供することを課題とする。    【解決手段】本発明は、神経幹細胞又は神経幹細胞を所定の段階まで分化させた細胞を含むマイクロファイバが２本以上バンドル化された移植用神経束であって、前記マイクロファイバは、神経幹細胞又は神経幹細胞を所定の段階まで分化させた細胞を含むマイクロゲルファイバが高強度ハイドロゲルで被覆されたものであり、前記２本以上のマイクロゲルファイバは、生体適合性ゲルでコーティングすることによってバンドル化されている、移植用神経束を提供する。【選択図】    図１０
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経幹細胞又は神経幹細胞を所定の段階まで分化させた細胞を含むマイクロファイバが２本以上バンドル化された移植用神経束であって、
前記マイクロファイバは、神経幹細胞又は神経幹細胞を所定の段階まで分化させた細胞を含むマイクロゲルファイバが高強度ハイドロゲルで被覆されたものであり、
前記２本以上のマイクロゲルファイバは、生体適合性ゲル又はポリイオンコンプレックスでコーティングすることによってバンドル化されている、移植用神経束。
【請求項２】
前記コーティングが、ポリイオンコンプレックスを２層以上含む、請求項１に記載の移植用神経束。
【請求項３】
前記ポリイオンコンプレックスの各層が、アルギン酸又はその塩とキトサンとを含む、請求項２に記載の移植用神経束。
【請求項４】
神経幹細胞又は神経幹細胞を所定の段階まで分化させた細胞以外の少なくとも１種の細胞を含むマイクロファイバ、及び／又は細胞以外の物質を含むマイクロファイバをさらに含む、請求項１から３のいずれか１項に記載の移植用神経束。
【請求項５】
束の中心部のマイクロファイバが神経細胞を含み、周囲のマイクロファイバが神経細胞以外の細胞、及び／又は細胞以外の物質を含む、請求項１から４のいずれか１項に記載の移植用神経束。
【請求項６】
マイクロファイバを合計で３本から２００本含む、請求項１から５のいずれか１項に記載の移植用神経束。
【請求項７】
少なくとも１本の前記マイクロファイバの少なくとも一方の端部から、神経幹細胞又は神経幹細胞を所定の段階まで分化させた細胞が突出している、請求項１から６のいずれか１項に記載の移植用神経束。
【請求項８】
生体適合性ゲル又はポリイオンコンプレックスでコーティングされた、神経幹細胞又は神経幹細胞を所定の段階まで分化させた細胞を含むマイクロファイバであって、
前記マイクロファイバは、神経幹細胞又は神経幹細胞を所定の段階まで分化させた細胞を含むマイクロゲルファイバが高強度ハイドロゲルで被覆されたものである、マイクロファイバ。
【請求項９】
前記コーティングが、ポリイオンコンプレックスを２層以上含む、請求項８に記載のマイクロファイバ。
【請求項１０】
前記ポリイオンコンプレックスの各層が、アルギン酸又はその塩とキトサンとを含む、請求項９に記載のマイクロファイバ。
【請求項１１】
移植用神経束の製造方法であって、
神経幹細胞又は神経幹細胞を所定の段階まで分化させた細胞を含むマイクロゲルファイバが高強度ハイドロゲルで被覆されたマイクロファイバを、２本以上作製する工程と、
前記２本以上のマイクロファイバを束にして、生体適合性ゲル又はポリイオンコンプレックスでコーティングする工程と、
を含む方法。
【請求項１２】
前記マイクロファイバを２本以上作製する工程の後、マイクロファイバを束にする前に、
マイクロファイバ内の神経幹細胞を所定の段階まで分化させる工程をさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記神経幹細胞を分化させる工程において、少なくとも一部のマイクロファイバ内の神経幹細胞を神経細胞に分化させ、別の少なくとも一部のマイクロファイバ内の神経幹細胞をグリア細胞に分化させる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記２本以上のマイクロファイバを束にする工程において、神経細胞を含むマイクロファイバを束の中心部に配置し、グリア細胞を含むマイクロファイバをその周囲に配置する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記２本以上のマイクロファイバを束にする工程において、神経幹細胞又は神経幹細胞を所定の段階まで分化させた細胞以外の少なくとも１種の細胞を含むマイクロファイバ、及び／又は細胞以外の物質を含むマイクロファイバを作製し、神経幹細胞又は神経幹細胞を所定の段階まで分化させた細胞を含むマイクロファイバと共に束にする、請求項１１から１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記２本以上のマイクロファイバを束にする工程において、神経幹細胞又は神経幹細胞を所定の段階まで分化させた細胞を含むマイクロファイバを束の中心部に配置し、神経幹細胞又は神経幹細胞を所定の段階まで分化させた細胞以外の少なくとも１種の細胞を含むマイクロファイバ、及び／又は細胞以外の物質を含むマイクロファイバをその周囲に配置する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記マイクロファイバを束にして、生体適合性ゲル材料でコーティングする工程は、
前記束を、ポリイオンコンプレックスを形成するカチオン性ポリマー溶液とアニオン性ポリマー溶液で順次コーティングする工程を１回以上繰り返す工程を含む、請求項１１から１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
コーティングする工程の後、移植部位の長さに併せて切断する工程と、
切断後、マイクロファイバの端部から細胞が突出するまで培養する工程と、をさらに含む、請求項１１から１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
細胞を含むマイクロファイバが２本以上バンドル化された移植片であって、
前記マイクロファイバは、細胞を含むマイクロゲルファイバが高強度ハイドロゲルで被覆されたものであり、
前記２本以上のマイクロゲルファイバは、ポリイオンコンプレックスでコーティングすることによってバンドル化されている、移植片。
【請求項２０】
前記コーティングが、ポリイオンコンプレックスを２層以上含む、請求項１９に記載の移植片。
【請求項２１】
前記ポリイオンコンプレックスの各層が、アルギン酸又はその塩とキトサンとを含む、請求項２０に記載の移植片。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、２本以上の神経幹細胞等を含むマイクロゲルファイバを、生体適合性ゲル又はポリイオンコンプレックスでバンドル化した移植用神経束に関する。
【背景技術】
【０００２】
神経変性疾患や物理的な原因で損傷を受けた神経の機能を回復するために、神経を移植する方法が開発されている。神経移植の方法としては、神経幹細胞を注射で患部に注入する方法が広く用いられてきた。しかしながら、この方法では、注入した神経幹細胞が体内で移動しやすく、脳や脊髄、複雑な末梢神経などの神経組織の損傷部位を選択的に修復するのは困難であった。
【０００３】
一方、生体適合性材料で作られたスキャフォールドに神経幹細胞を包埋して移植片を作製するアプローチも報告されている（例えば、非特許文献１）。また、本発明者らは、内部に細胞等を封入できる高強度ハイドロゲルファイバの作製方法を開発し（特許文献１）、この技術を用いて神経幹細胞を封入した移植用ハイドロゲルファイバを作製した（非特許文献２）。このような移植片を神経の損傷部位に配置すると、神経幹細胞の増殖及び分化に伴って損傷神経が修復され、機能が回復することが期待される。
【０００４】
神経移植に用いられる移植片には、神経組織が効率的かつ機能的に再生するよう、断裂した神経組織の２点を直接的につなぐことができ、ピンセット等で運んでも細胞がダメージを受けないような十分な柔軟性と強度を有すること、また、移植片において細胞が好適に増殖・分化できる環境であること、既存の移植用スキャフォールドよりも内部の細胞密度を高く保持できることなどが必要とされる。
かかる観点で、これまでの移植片よりもさらに優れたものが求められていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開ＷＯ２０１１／０４６１０５号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Lu, P. et al., Cell 150, 1264-1273, September 14, 2012
【非特許文献２】Onoe, H. et al., Fifteenth International Conference on Miniaturized Systems for Chemistry and Life Science (microTAS), 2011, pp.1490-1492
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、必要な柔軟性及び強度を備え、移植部位に効率よく神経を再生させることができる神経移植用の移植片を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するために研究を重ねた結果、神経幹細胞等を含むマイクロゲルファイバが高強度ハイドロゲルで被覆されたマイクロファイバを２本以上作製し、これらを束ねて生体適合性ゲル又はポリイオンコンプレックスでコーティングすることによりバンドル化する移植用神経束の作製方法を見出した。
かかる方法で作製された移植用神経束は、十分な柔軟性及び強度を有し、内部の細胞に十分な栄養を供給できる構造であるとともに、高い細胞密度を維持できるので、移植時の取扱が容易で、患部において効率よく神経組織を再生することが可能である。
また、それぞれのマイクロファイバに異なる細胞を封入することや、異なる細胞を含むマイクロファイバを所望の位置に配置することも容易であることから、神経束の構造の自由度が高くなり、生体の神経束に近い構成を実現できる。
【０００９】
すなわち本発明は、
〔１〕神経幹細胞又は神経幹細胞を所定の段階まで分化させた細胞を含むマイクロファイバが２本以上バンドル化された移植用神経束であって、
前記マイクロファイバは、神経幹細胞又は神経幹細胞を所定の段階まで分化させた細胞を含むマイクロゲルファイバが高強度ハイドロゲルで被覆されたものであり、
前記２本以上のマイクロゲルファイバは、生体適合性ゲル又はポリイオンコンプレックスでコーティングすることによってバンドル化されている、移植用神経束；
〔２〕前記コーティングが、ポリイオンコンプレックスを２層以上含む、上記〔１〕に記載の移植用神経束；
〔３〕前記ポリイオンコンプレックスの各層が、アルギン酸又はその塩とキトサンとを含む、上記〔２〕に記載の移植用神経束；
〔４〕神経幹細胞又は神経幹細胞を所定の段階まで分化させた細胞以外の少なくとも１種の細胞を含むマイクロファイバ、及び／又は細胞以外の物質を含むマイクロファイバをさらに含む、上記〔１〕から〔３〕のいずれか１項に記載の移植用神経束；
〔５〕束の中心部のマイクロファイバが神経細胞を含み、周囲のマイクロファイバが神経細胞以外の細胞、及び／又は細胞以外の物質を含む、上記〔１〕から〔４〕のいずれか１項に記載の移植用神経束；
〔６〕マイクロファイバを合計で３本から２００本含む、上記〔１〕から〔５〕のいずれか１項に記載の移植用神経束；
〔７〕少なくとも１本の前記マイクロファイバの少なくとも一方の端部から、神経幹細胞又は神経幹細胞を所定の段階まで分化させた細胞が突出している、上記〔１〕から〔６〕のいずれか１項に記載の移植用神経束；
〔８〕生体適合性ゲル又はポリイオンコンプレックスでコーティングされた、神経幹細胞又は神経幹細胞を所定の段階まで分化させた細胞を含むマイクロファイバであって、
前記マイクロファイバは、神経幹細胞又は神経幹細胞を所定の段階まで分化させた細胞を含むマイクロゲルファイバが高強度ハイドロゲルで被覆されたものである、マイクロファイバ；
〔９〕前記コーティングが、ポリイオンコンプレックスを２層以上含む、上記〔８〕に記載の移植用神経束；
〔１０〕前記ポリイオンコンプレックスの各層が、アルギン酸又はその塩とキトサンとを含む、上記〔９〕に記載の移植用神経束；
〔１１〕移植用神経束の製造方法であって、
神経幹細胞又は神経幹細胞を所定の段階まで分化させた細胞を含むマイクロゲルファイバが高強度ハイドロゲルで被覆されたマイクロファイバを、２本以上作製する工程と、
前記２本以上のマイクロファイバを束にして、生体適合性ゲル又はポリイオンコンプレックスでコーティングする工程と、
を含む方法；
〔１２〕前記マイクロファイバを２本以上作製する工程の後、マイクロファイバを束にする前に、
マイクロファイバ内の神経幹細胞を所定の段階まで分化させる工程をさらに含む、上記〔１１〕に記載の方法；
〔１３〕前記神経幹細胞を分化させる工程において、少なくとも一部のマイクロファイバ内の神経幹細胞を神経細胞に分化させ、別の少なくとも一部のマイクロファイバ内の神経幹細胞をグリア細胞に分化させる、上記〔１２〕に記載の方法；
〔１４〕前記２本以上のマイクロファイバを束にする工程において、神経細胞を含むマイクロファイバを束の中心部に配置し、グリア細胞を含むマイクロファイバをその周囲に配置する、上記〔１３〕に記載の方法；
〔１５〕前記２本以上のマイクロファイバを束にする工程において、神経幹細胞又は神経幹細胞を所定の段階まで分化させた細胞以外の少なくとも１種の細胞を含むマイクロファイバ、及び／又は細胞以外の物質を含むマイクロファイバを作製し、神経幹細胞又は神経幹細胞を所定の段階まで分化させた細胞を含むマイクロファイバと共に束にする、上記〔１１〕から〔１４〕のいずれか１項に記載の方法；
〔１６〕前記２本以上のマイクロファイバを束にする工程において、神経幹細胞又は神経幹細胞を所定の段階まで分化させた細胞を含むマイクロファイバを束の中心部に配置し、神経幹細胞又は神経幹細胞を所定の段階まで分化させた細胞以外の少なくとも１種の細胞を含むマイクロファイバ、及び／又は細胞以外の物質を含むマイクロファイバをその周囲に配置する、上記〔１５〕に記載の方法；
〔１７〕前記マイクロファイバを束にして、生体適合性ゲル材料でコーティングする工程は、
前記束を、ポリイオンコンプレックスを形成するカチオン性ポリマー溶液とアニオン性ポリマー溶液で順次コーティングする工程を１回以上繰り返す工程を含む、上記〔１１〕から〔１６〕のいずれか１項に記載の方法；
〔１８〕コーティングする工程の後、移植部位の長さに併せて切断する工程と、
切断後、マイクロファイバの端部から細胞が突出するまで培養する工程と、をさらに含む、上記〔１１〕から〔１７〕のいずれか１項に記載の方法；
〔１９〕  細胞を含むマイクロファイバが２本以上バンドル化された移植片であって、
前記マイクロファイバは、細胞を含むマイクロゲルファイバが高強度ハイドロゲルで被覆されたものであり、
前記２本以上のマイクロゲルファイバは、ポリイオンコンプレックスでコーティングすることによってバンドル化されている、移植片；
〔２０〕前記コーティングが、ポリイオンコンプレックスを２層以上含む、上記〔１９〕に記載の移植片；及び
〔２１〕前記ポリイオンコンプレックスの各層が、アルギン酸又はその塩とキトサンとを含む、上記〔２１〕に記載の移植片、
に関する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明に係る移植用神経束は、十分な柔軟性及び強度を有し、内部の細胞に十分な栄養を供給できるとともに、細胞を高密度に保持できる構造であるため、移植時の取扱が容易で、患部において効率よく神経組織を再生することが可能である。
また、本発明に係る移植用神経束は、各マイクロファイバに封入する細胞を自由に選択し、所望の位置に配置することができるので、神経束の構造の自由度が高く、神経組織の再生に好適な構造を実現することができる。
さらに、本発明に係る移植用神経束は、その側面から細胞が漏出することがなく、端部のみから細胞が外に延びていくため、断裂した神経と効率よく相互作用し、神経の損傷部を再生させることが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、本発明に係る移植用神経束の構造の一態様を示す。
【図２】図２は、マイクロファイバの束を作製する方法の一例を示す。
【図３】図３は、２種類のマイクロファイバを異なる配置でバンドル化した例を示す。
【図４】図４は、マイクロファイバ中で神経幹細胞が増殖した様子を示す。
【図５】図５は、マイクロファイバ中で神経幹細胞が分化した様子を示す。
【図６】図６は、神経細胞を含むマイクロファイバを中心に、グリア細胞を含むマイクロファイバを周囲に配置した移植用神経束を観察した結果を示す。
【図７】図７は、１２本のマイクロファイバを３層コートしたものを４本作製し、これを束ねて３層コートした移植用神経束の観察結果、及び強度の試験結果を示す。
【図８】図８は、１２本のマイクロファイバを６層コートしたものを４本作製し、これを束ねて６層コートした移植用神経束の観察結果、及び強度の試験結果を示す。
【図９】図９は、１２本のマイクロファイバを９層コートしたものを４本作製し、これを束ねて９層コートした移植用神経束の観察結果、及び強度の試験結果を示す。
【図１０】図１０は、バンドル化後の培養で、内部の神経幹細胞が増殖し、端部から細胞が突出した様子を示す。
【図１１】図１１は、二重同軸マイクロ流体装置を用いたマイクロファイバの作製方法の概略を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
（移植用神経束）
本発明に係る移植用神経束は、神経幹細胞又は神経幹細胞を所定の段階まで分化させた細胞を含むマイクロファイバを２本以上含む。マイクロファイバは、神経幹細胞又は神経幹細胞を所定の段階まで分化させた細胞を含むマイクロゲルファイバが高強度ハイドロゲルで被覆されたものであり、２本以上のマイクロゲルファイバは、生体適合性ゲル又はポリイオンコンプレックスでコーティングすることによってバンドル化されている。
【００１３】
本明細書において、「神経幹細胞」とは、増殖することができ、継代を繰り返すことができる自己複製能を有し、かつ、神経細胞、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、シュワン細胞などの中枢神経および末梢神経系を構成する細胞に分化する能力を有する細胞をいう。
神経幹細胞は、まず神経前駆細胞またはグリア前駆細胞に分化し、神経前駆細胞が神経細胞（ニューロン）に、グリア前駆細胞がグリア細胞（神経系を構成する神経細胞以外の細胞の総称。アストロサイト、オリゴデンドロサイト、及びシュワン細胞を含む。）に分化する。
【００１４】
本明細書において、「神経幹細胞を所定の段階まで分化させた細胞」とは、神経幹細胞から神経細胞、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、シュワン細胞までのいずれかの分化段階の細胞を意味し、神経細胞、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、シュワン細胞、神経前駆細胞、グリア前駆細胞を含むがこれらに限定されない。
以下、「神経幹細胞」と、「神経幹細胞を所定の段階まで分化させた細胞」とを、併せて「神経幹細胞等」という。
【００１５】
本発明に用いられる神経幹細胞等は、生体から神経幹細胞を単離して調製したものでもよいし、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞などの多能性幹細胞その他の細胞から分化・誘導したものであってもよい。また、神経幹細胞等は、移植対象の個体に由来する自家細胞であってもよいし、移植対象以外の個体に由来する他家細胞であってもよい。
【００１６】
本明細書において、「神経幹細胞等を含むマイクロファイバ」は、神経幹細胞等を含むマイクロゲルファイバが、高強度ハイドロゲルで被覆されたものを意味し、後述する生体適合性ゲルやポリイオンコンプレックスによってバンドル化でき、生体に悪影響を及ぼすものでない限り、その材料や構造は特に限定されない。
【００１７】
マイクロファイバとしては、例えば、特許文献１に記載されたコア・シェル構造のファイバを用いることができる。簡単に説明すると、マイクロファイバは、細胞を内包するマイクロゲルファイバと、マイクロゲルファイバを被覆する高強度ハイドロゲル層からなる。
マイクロゲルファイバは、ハイドロゲル層に比較して強度の弱いゲルで形成される。マイクロゲルファイバに用いられるゲルは、内包する細胞の増殖や分化に悪影響を与えない限り特に限定されないが、例えば、キトサンゲル、コラーゲンゲル、ゼラチン、ペプチドゲル、フィブリン、またはこれらの２種以上含む混合物を用いることができる。市販のゲル（例えば、マトリゲル（日本ベクトン・ディッキンソン株式会社））を用いてもよい。
その他、ポリビニルアルコール、ポリエチレンオキサイド、ポリビニルピロリドンなどの水溶性ポリマーに紫外線等を照射して形成したハイドロゲル；
親水−疎水性ドメインを有する両親媒性ポリマー、例えばポリエチレンオキサイド−ポリプロピレンオキサイド共重合体、両親媒性ポリアミノ酸、架橋ポリ（N−イソプロピルアクリルアミド）、ポリオキシエチレンビニルエーテル系共重合体などを相転移温度以上にして形成したハイドロゲル；
（メタ）アクリル基や桂皮酸などを修飾した光硬化性基を有する水溶性ポリマーに紫外線を照射して形成したハイドロゲル；
チオール基を有する水溶性ポリマーを混合し、分子内及び分子間ジスルフィド結合を形成することにより形成されるハイドロゲル；
２液混合により結合を形成する官能基を有する水溶性ポリマーを混合することにより形成されるハイドロゲル、例えばＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルとアミン、チオールとエン、アルキンとアジドおよびこれらの複合体からなるハイドロゲル、
などを用いてもよい。
また、モノマー分子が自己集合した非共有結合性の超分子ハイドロゲル（例えば、Dojin News, 118, pp.1-17, 2006）を用いることもできる。
マイクロファイバの材料は、生体に悪影響を及ぼさない限り、生体分解性・生体吸収性であっても非分解性・非吸収性であってもよい。
【００１８】
高強度ハイドロゲルも、生体適合性ゲル又はポリイオンコンプレックスでコーティングするために必要な性質を有する限り特に限定されず、マイクロゲルファイバより強度の高いものであればよい。ゲルの機械的強度は、当業者に周知の方法、例えば、引っ張り試験機を水中で用いて引っ張り強度や荷重強度を測定する方法で評価できる。高強度ハイドロゲルとしては、例えば、アガロースゲル、ＵＶ照射により硬化する光硬化性ゲルが挙げられる。
その他、ポリビニルアルコール、ポリエチレンオキサイド、ポリビニルピロリドンなどの水溶性ポリマーに紫外線等を照射して形成したハイドロゲル；
親水−疎水性ドメインを有する両親媒性ポリマー、例えばポリエチレンオキサイド−ポリプロピレンオキサイド共重合体、両親媒性ポリアミノ酸、架橋ポリ（N−イソプロピルアクリルアミド）、ポリオキシエチレンビニルエーテル系共重合体などを相転移温度以上にして形成したハイドロゲル；
（メタ）アクリル基や桂皮酸などを修飾した光硬化性基を有する水溶性ポリマーに紫外線を照射して形成したハイドロゲル；
チオール基を有する水溶性ポリマーを混合し、分子内及び分子間ジスルフィド結合を形成することにより形成されるハイドロゲル；
２液混合により結合を形成する官能基を有する水溶性ポリマーを混合することにより形成されるハイドロゲル、例えばＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルとアミン、チオールとエン、アルキンとアジドおよびこれらの複合体からなるハイドロゲル；
カルシウムイオンなどの金属イオン存在下でゲル化する性質を有するアルギン酸ゲル、カラギーナンゲル、ジェランガムゲル、ペクチンゲル、
などであって、マイクロゲルファイバに用いるものより高強度としたものを用いてもよい。
また、高強度ハイドロゲルは、生体に悪影響を及ぼさない限り、生体分解性・生体吸収性であっても非分解性・非吸収性であってもよい。
【００１９】
マイクロファイバは、例えば図３に示すような二重同軸マイクロ流体装置（double coaxial microfluidic device）によって作製することができる。この装置は、マイクロゲルファイバの材料と高強度ハイドロゲルとを、マイクロゲルファイバ材料がコア部、高強度ハイドロゲルがシェル部となるように同軸方向に射出して、マイクロファイバを形成することができる。二重同軸マイクロ流体装置は、例えば、Lab Chip, 4, pp.576-580, 2004のFig. 1に説明されている。
【００２０】
マイクロファイバの内部において細胞が存在する領域の径は、特に限定されないが、例えば内径を５０μｍ〜２００μｍ以下、特に約１００μｍ程度とすると、細胞の増殖に好ましい環境となる。
マイクロファイバの外径も特に限定されないが、例えば１０μｍ〜１ｍｍとすることができる。内径（細胞が存在する領域）が１００μｍ程度の場合、外径が２００μｍ程度であるとよい。
マイクロファイバの長さは最終的な移植用神経束のサイズや、細胞への栄養の供給を考慮して、任意に決定することができる。
【００２１】
神経幹細胞等を含むマイクロファイバは、神経幹細胞等以外の成分を含んでいてもよい。かかる成分として、神経細胞の生存・増殖・分化を誘導もしくは保持する細胞（例えば、平滑筋細胞、骨格筋細胞など）、成長因子（例えば、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）や上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ））、栄養因子、成長ホルモンなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２２】
本発明に係る移植用神経束は、マイクロファイバを２本以上含む。マイクロファイバの数は、移植用神経束のサイズ、マイクロファイバの径、生体適合性ゲルの種類等によって、適宜決定することができ、例えば、３本以上、５本以上、１０本以上、２００本以下、１５０本以下等とすることができる。
【００２３】
本発明に係る移植用神経束の複数のマイクロファイバは、生体適合性ゲル又はポリイオンコンプレックスでコーティングすることによってバンドル化される。
本明細書において、「バンドル化」とは、複数本のマイクロファイバを束ね、移植片として十分な柔軟性と強度を有する１本の移植用神経束を形成することを意味する。また、本明細書において「コーティング」とは、マイクロファイバがバンドル化されるように、マイクロファイバの束の少なくとも一部を生体適合性ゲル又はポリイオンコンプレックスで覆うことを意味する。
【００２４】
本明細書において、生体適合性ゲルは、好適な柔軟性と強度を有するようにマイクロファイバをバンドル化できるものであれば特に限定されず、生体に問題となるような毒性を与えない限り、生体分解性・生体吸収性であっても非分解性・非吸収性であってもよい。
生体適合性ゲルとしては、例えば、コラーゲン、アガロース、ヒアルロン酸、キトサン、キチン、ゼラチン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸−ポリグリコール酸共重合体、ポリエチレングリコール、ポリジオキサン、アルブミン、フィブリン、フィブロネクチン、ラミニン、デキストリン、デキストラン、アルギン酸、セルロース、ヘパリン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、ポリアミノ酸、デンプン、及びこれらの誘導体又は塩からなる群より選択される少なくとも１つとすることができる。上述したマイクロゲルファイバ又は高強度ハイドロゲルに用いられる各種のゲルを使用してもよい。異なる種類の生体適合性ゲルを、層状に重ねてコーティングしてもよい。
誘導体としては、例えば、水酸基を酢酸、硝酸、硫酸、リン酸などと反応させたものや、カルボキシル基の一部をエチレングリコールやプロピレングリコールでエステル化したものなどが挙げられ、塩としては、ナトリウム塩などのアルカリ金属塩が挙げられる）。
それぞれの材料は、当業者が周知技術を用いて適当な柔軟性及び強度を有するゲルとすることが可能である。
【００２５】
本明細書において、ポリイオンコンプレックスは、ポリカチオン類とポリアニオン類を水の存在下で接触させると静電相互作用によって形成される。生体適合性に優れ、医薬品や医療機器等に広く利用されている。
ポリカチオン類及びポリアニオン類は、水の存在下で混合することによってポリイオンコンプレックスを形成するものであれば特に限定されず、当業者が適宜選択することができる。
ポリカチオン類としては、例えば、キトサン、アミノ化多糖類（セルロース、デキストラン、プルラン、カードラン、グルコマンナンなどの中性多糖類をアミノ化したもの）、ポリビニルアミン、ポリアリルアミン、ポリエチレンイミン、ポリアミン、ポリリジン、ポリアルギニン、リジン−アルギニン共重合体、及びこれらの誘導体又は塩からなる群より選択される１種以上を用いることができる。誘導体としては、アセチル化物など、塩としては、塩酸塩、酢酸塩などが挙げられる。
ポリアニオン類としては、例えば、アルギン酸、ペクチン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デキストラン硫酸、カルボキシメチル化又はサクシニル化した多糖類（セルロース、デキストラン、デンプン、キトサンなどをカルボキシメチル化又はサクシニル化したもの）、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、ポリ（メタ）アクリル酸、ポリマレイン酸、無機ポリリン酸、ポリホスマー、ポリスルフェート、及びこれらの誘導体又は塩からなる群より選択される１種以上を用いることができる。誘導体としては、例えば、水酸基を酢酸、硝酸、硫酸、リン酸などと反応させたものや、カルボキシル基の一部をエチレングリコールやプロピレングリコールでエステル化したものなどが挙げられ、塩としては、ナトリウム塩などのアルカリ金属塩が挙げられる）。
【００２６】
ポリイオンコンプレックスでコーティングする場合は、ポリイオンコンプレックスの層を２層以上重ねてもよい。ポリイオンコンプレックスの層は、例えば、束ねたマイクロファイバをポリカチオン類溶液とポリアニオン類溶液に交互に浸漬することによって形成することができる。例えば、アルギン酸とキトサンの層としてもよい。アルギン酸とキトサンの層は、生体内で徐々に解離するため特に好適である。
層の数は、移植用神経束に必要とされる柔軟性、強度や径に応じて、適宜決定すればよく、例えば、２層〜１５層、３層〜９層とすることができる。
また、ポリイオンコンプレックスによるコーティングと生体適合性ゲルによるコーティングを重ねてもよいし、その逆であってもよい。
【００２７】
本発明に係る移植用神経束は、複数のマイクロファイバを一度に生体適合性ゲル又はポリイオンコンプレックスでコーティングしたものであってもよいし、少ない数のマイクロファイバを束ねて生体適合性ゲル又はポリイオンコンプレックスでコーティングしたものを２以上作製し、これらをさらに生体適合性ゲル又はポリイオンコンプレックスでコーティングしてバンドル化したものであってもよい。この場合、最初にマイクロファイバをコーティングする生体適合性ゲル又はポリイオンコンプレックスと、一度コーティングされたマイクロファイバをさらに束ねる際に用いる生体適合性ゲル又はポリイオンコンプレックスは、同じ種類であっても異なる種類であってもよい。
最初のコーティングに生体適合性ゲルを用い、次のコーティングにポリイオンコンプレックスを用いてもよいし、その逆であってもよい。
【００２８】
本発明に係る移植用神経束は、神経幹細胞等を含むマイクロファイバを少なくとも２本含んでいる限り、他の種類の細胞や細胞以外の物質を含むマイクロファイバを含んでいてもよい。他の細胞や細胞以外の物質は、神経の再生に悪影響を及ぼさない限り特に限定されず、各種幹細胞、分化した各種の細胞（筋細胞、線維芽細胞、上皮細胞、神経細胞の生存・増殖・分化を誘導もしくは保持する細胞（例えば、平滑筋細胞、骨格筋細胞など）等）、タンパク質、脂質、糖類、核酸類、細胞外マトリクス等、成長因子、栄養因子、成長ホルモンなどが挙げられる。
【００２９】
神経幹細胞等を含むマイクロファイバと種類の異なる細胞や物質を含むマイクロファイバは、任意の位置に配置することができる。
具体例として、以下が挙げられるがこれらに限定されるものではない。
中心部に神経幹細胞等を含むマイクロファイバを配置し、その周囲に神経幹細胞等を機械的にサポートする細胞・物質を含むマイクロファイバを配置したもの；
中心部に神経幹細胞等を含むマイクロファイバを配置し、その周囲に神経幹細胞等に栄養を供給するための細胞・物質を含むマイクロファイバを配置したもの；
中心部に神経細胞を含むマイクロファイバを配置し、その周囲にグリア細胞（アストロサイト、オリゴデンドロサイト、又はシュワン細胞）を含むマイクロファイバを配置したもの。
このように、複数種類のマイクロファイバを用いることにより、天然の神経束（図１右上参照）に似た構造を実現することが可能である。
【００３０】
本発明に係る移植用神経束は、その長さを適宜切断して調節し、ピンセットなどで把持して患部に配置することができる。
なお、本発明に係る移植用神経束は、当然のことながら、移植のみならずin vitroの研究に使用されることもある。
【００３１】
（コーティングされたマイクロファイバ）
本発明は、生体適合性ゲル又はポリイオンコンプレックスでコーティングされた、神経幹細胞又は神経幹細胞を所定の段階まで分化させた細胞を含むマイクロファイバであって、
前記マイクロファイバは、神経幹細胞又は神経幹細胞を所定の段階まで分化させた細胞を含むマイクロゲルファイバが高強度ハイドロゲルで被覆されたものである、マイクロファイバも包含する。
１本のマイクロファイバであっても、生体適合性ゲル又はポリイオンコンプレックスでコーティングすることによって、柔軟性及び強度が向上し、移植用又は研究用に好適に用いることができる。
コーティングされたマイクロファイバを説明するために用いられる用語のうち、上述した本発明に係る移植用神経束にも用いられた用語は、ここでも同義で用いられる。
【００３２】
（移植用神経束の製造方法）
本発明に係る移植用神経束の製造方法は、神経幹細胞等を含むマイクロゲルファイバが高強度ハイドロゲルで被覆されたマイクロファイバを、２本以上作製する工程と、前記２本以上のマイクロファイバを束にして、生体適合性ゲル又はポリイオンコンプレックスでコーティングする工程と、を含む。
【００３３】
神経幹細胞等を内包するマイクロファイバを作製する工程は、上述のとおり、例えば、Lab Chip, 4, pp.576-580, 2004のFig. 1や特許文献１に記載された装置を用いて行うことができる。
マイクロファイバを作製する際、内部には神経幹細胞を入れてもよいし、所定の段階まで分化した神経幹細胞を入れてもよい。神経幹細胞を用いれば、マイクロファイバ内で効率よく増殖させることができ、細胞密度の高いマイクロファイバを作製することができる。神経幹細胞の増殖させる工程は、マイクロファイバごと公知の増殖培地やそれに順ずる培地（例えば、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）や上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）などの増殖因子を含む培地）に浸し、神経幹細胞が増殖できる条件で培養することによって行うことができる。
培養は、例えば、１日から１５日とすることができる。
【００３４】
神経幹細胞を入れた場合、マイクロファイバを束にする前に、マイクロファイバ内で神経幹細胞を所定の段階まで分化させてもよい。神経幹細胞を分化させる工程は、例えば、分化用培地にマイクロファイバごと浸漬させることによって行うことができる。分化用の培地は、当業者が適宜調製することができる。
例えば、神経幹細胞を増殖させる間は、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）や上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）などの増殖因子を含む培地を用い、これらの増殖因子を培地から除いて、ウシ胎児血清を加えることによって、神経幹細胞を分化させることが可能である。
【００３５】
神経幹細胞が、神経細胞、アストロサイト、又はオリゴデンドロサイト、シュワン細胞に選択的に分化するように制御することもできる。分化の制御は公知の方法等に従って当業者が適宜行うことができるが、例えば、培地に白血病抑制因子（ＬＩＦ）やＢＭＰ２を加えることによりアストロサイトへの分化が誘導される一方、骨形成タンパク質２（ＢＭＰ２）は神経細胞への分化を抑制すること、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤（ＶＰＡ）は神経細胞への分化を促進することなどが知られている。市販の分化用培地を使用してもよい。
２以上のマイクロファイバのうち、少なくとも一部のマイクロファイバ内の神経幹細胞を他のマイクロファイバ内の細胞とは異なる細胞に分化させてもよい。例えば一部を神経細胞に、一部をグリア細胞に分化させることができる。
【００３６】
２本以上のマイクロファイバを束にする工程では、神経幹細胞等を含むマイクロファイバに加えて、神経幹細胞等以外の細胞を含むマイクロファイバや、細胞以外の物質を含むマイクロファイバを、共に束ねてもよい。神経幹細胞等以外の細胞や、細胞以外の物質を含むマイクロファイバも、神経幹細胞等を含むマイクロファイバと同様の方法で作製することができるが、別の方法で作製してもよい。
神経幹細胞以外の幹細胞を含むマイクロファイバを用いる場合、同様に公知の方法に従って所定の細胞に分化させることができる。
【００３７】
２本以上のマイクロファイバを束にする工程は、どのように行ってもよいが、例えば実施例に示すように、長いマイクロファイバを作製し、２本のピラー（杭）に巻きつけていく方法や、長いマイクロファイバを溶液中に浸し、その一点をガラス管等で持ち上げて２本に折り畳み、さらに一点を持ち上げて４本に折り畳み…という作業を繰り返して、折りたたんでいく方法を用いることが可能である。
【００３８】
種類の異なるマイクロファイバを束にする場合、各マイクロファイバの配置は自由に決定することができる。例えば、神経幹細胞等を含むマイクロファイバを中心に配置し、その周囲に他の細胞や細胞以外の物質を含むマイクロファイバを配置してもよいし、神経幹細胞等を含むマイクロファイバと他の細胞や細胞以外の物質を含むマイクロファイバが交じり合うように配置してもよい。
【００３９】
例えば、神経細胞を含むマイクロファイバを中心に配置し、グリア細胞を含むマイクロファイバをその周囲に配置して束ねてもよい。このようなバンドルを作製する方法の一例を説明する。
まず、神経幹細胞を含む２本の長いマイクロファイバを作製し、１本の神経幹細胞を神経細胞に、もう１本の神経幹細胞をグリア細胞に分化させる。
その後上記のとおりそれぞれのマイクロファイバから適当な束を作り、神経細胞を含むマイクロファイバの束の周りを、グリア細胞を含むマイクロファイバの束が囲むように配置する。
このように、本発明に係る移植用神経束の製造方法によれば、神経細胞等に加え、任意の種類の細胞や細胞以外の物質を含むマイクロファイバを、任意の位置に配して束にすることが可能である。
【００４０】
束にしたマイクロファイバを生体適合性ゲル又はポリイオンコンプレックスでコーティングする工程は、当業者が公知の方法に従って行うことができる。例えば、アテロコラーゲンゲルは温度によって流動性が変化するので、流動性の高い低温のアテロコラーゲン溶液にマイクロファイバの束を浸漬し、温度を上昇させてインキュベートすることでコラーゲンをゲル化し、マイクロファイバをコーティングすることができる。
【００４１】
束にしたマイクロファイバを、１層以上のポリイオンコンプレックスでコーティングする場合、ポリカチオン溶液とポリアニオン溶液を用意する。まずいずれかの溶液にマイクロファイバの束を浸漬し、必要に応じて生理食塩水等で洗浄後、もう一方の溶液にマイクロファイバを浸漬する方法によって１層のポリイオンコンプレックスが形成される。必要に応じて洗浄工程を入れながら、これらの工程を繰り返すことによって複数層のポリイオンコンプレックスでコーティングすることができる。
マイクロファイバの束をポリカチオン溶液又はポリアニオン溶液に浸漬するのではなく、マイクロファイバの束の両端を保持して、ピペットなどで溶液を上から注いでコーティングしてもよい。
【００４２】
生体適合性ゲル又はポリイオンコンプレックスでバンドル化された移植用神経束は、培養液中で保存することが可能である。移植時に、移植部位にあわせて適当な長さに切断して用いることができる。実施例に示されるとおり、本発明に係る移植用神経束は、内部で細胞が増殖してもその側面から細胞が漏出することがなく、端部のみから細胞が外に延びていくため、断裂した神経と効率よく相互作用し、神経の損傷部を再生させることが可能である。従って、適当な長さに切断した後、一定期間培養し、移植用神経束のマイクロファイバの端部から増殖した細胞が突出するようになってから移植してもよい。このように、マイクロファイバの端部から増殖した神経細胞等が突出した移植用神経束も、本発明に包含される。
【００４３】
本発明に係る移植用神経束の製造方法の一例の概略を図１に示す。
神経幹細胞（NCSs）を含むマイクロファイバを作製し、マイクロファイバ内の神経幹細胞をグリア細胞に分化させたものと、神経細胞に分化させたものと用意する。
神経細胞を含むマイクロファイバを中心に、グリア細胞を含むマイクロファイバを周囲に配置することにより、右上に示されるような生体内の神経束と同様の構成の神経束を得ることができる。
【００４４】
（移植片）
本発明は、細胞を含むマイクロファイバが２本以上バンドル化された移植片も包含する。ここで、マイクロファイバは、細胞を含むマイクロゲルファイバが高強度ハイドロゲルで被覆されたものを意味し、２本以上のマイクロゲルファイバは、ポリイオンコンプレックスでコーティングすることによってバンドル化されている。
本発明に係る移植片を説明するために用いられる用語のうち、上述した本発明に係る移植用神経束にも用いられた用語は、ここでも同義で用いられる。
本発明に移植片に含まれる細胞はあらゆる細胞とすることができる。例えば、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、肝幹細胞、生殖幹細胞等の各種幹細胞や、骨格筋細胞、心筋細胞などの筋細胞、大脳皮質細胞などの神経細胞、線維芽細胞、上皮細胞、肝細胞、膵β細胞、皮膚細胞等の各種の分化した細胞が挙げられるが、これらに限定されない。１種以上の細胞を組み合わせてもよい。
本発明に係る移植片は、本発明に係る移植用神経束のうち、ポリイオンコンプレックスでコーティングしたものと同様の方法で作製することができる。
【００４５】
本明細書において引用されるすべての特許文献及び非特許文献の開示は、全体として本明細書に参照により組み込まれる。
【実施例】
【００４６】
以下、本発明を実施例に基づいて具体的に説明するが、本発明は何らこれに限定されるものではない。当業者は、本発明の意義を逸脱することなく様々な態様に本発明を変更することができ、かかる変更も本発明の範囲に含まれる。
【００４７】
材料と方法
［材料］
塩化カルシウム、DMSO、塩化カリウム、及びグルコースはKanto Chemicals社から、水酸化ナトリウム、HEPES、塩化ナトリウム、及びアルギン酸ナトリウム（Na−alginate、80−120cP）はWako Pure Chemical Industries社から、スクロースはNacalai tesque社から、ポリエチレンイミン及びDulbeccoのリン酸緩衝生理食塩水（PBS（−）、D1408）はSigma-Aldrich Japan社から、それぞれ購入し、精製せずに使用した。水はミリポア精製システムにより、18MΩまで脱イオン化した。
細胞培養実験に用いた市販の材料は以下のとおりである。Neurobasal-A（10888、GIBCO）、B27 neuronal supplement（12587010、GIBCO）、及びTrypLE Select（12563）はInvitrogen社から、ウシ胎児血清（FBS、S1650）と、ペニシリン−ストレプトマイシン溶液（antibiotics, AB, P4333又はP4458）は、それぞれJapan Bioserum社とSigma-Aldrich Japan社から購入した。塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF、AF-100-18B）とヒト上皮細胞増殖因子（hEGF）は、Peprotech社から購入した。
【００４８】
［二重同軸マイクロ流体装置によるマイクロファイバの作製］
二重同軸マイクロ流体装置（図１１参照）によるマイクロファイバの作製は、Onoeらの方法（22nd IEEE International Conference on Micro Electro Mechanical Systems (MEMS), 2010, pp.248-251.；Fourteenth International Conference on Miniaturized Systems for Chemistry and Life Science (microTAS), 2010, pp.629-631.）に従った。
内側のマイクロチャネル用に、ガラスキャピラリチューブ（外径1mm、内径0.6mm、G-1、Narishige社）を、puller（PC-10、Narishige社）で引き伸ばし、直径約230μmとして用いた。外側の流路用に、長方形のガラスチューブ（外径1.4mm、内径1mm、Vitrocom社）を使用した。これらのガラスキャピラリチューブは、ステレオリソグラフィー法で作製されたコネクター（Perfactory、envisionTEC、Marl社）で取り付けた。注入口と流出口は、テフロン(登録商標)チューブ（内径0.5mm）を用いてガスタイトシリンジに接続した。
【００４９】
［マウス神経幹細胞の培養］
解剖顕微鏡下で、ICRマウス（Sankyo Labo Service Corporation社）の脳から線条体組織を切り出した（胎生期14.5日目）。Raynoldsらの方法（J. Neurosci., vol. 12, pp.4565-4574, 1992）に従って、線条体組織から、神経幹細胞のシングルセルの懸濁液を調製した。血球計とトリパンブルーを使用して、全細胞数と生存率を測定した。細胞懸濁液は、増殖培地（Neurobasal-A/B27/bFGF/hEGF）で適当な濃度に調節し、37℃の水蒸気飽和5％CO2環境で培養した。実験には、第二〜三代の継代培養の神経幹細胞を用いた。
【００５０】
［神経幹細胞を含むマイクロファイバの作製］
コア・シェル構造のマイクロファイバを作製するために、以下の3種類の溶液を調製した（図１１参照）。
(1)  アテロコラーゲンに神経幹細胞を1-2×108 cells/ml懸濁した溶液（core stream用）
(2)  アルギン酸ナトリウム溶液（shell stream用）
(3)  塩化カルシウム溶液（sheath stream用）
(1)のアテロコラーゲンは、0.2％のウシ皮膚ペプシン可溶化I型アテロコラーゲン（AtelCell（商標）、DME-02、アテロコラーゲン、KOKEN社）を用いた。
組み立てた二重同軸マイクロ流体装置は、流速を精確に制御するためにシリンジポンプ（KDS210、KD Scientific社）に接続した。作られたマイクロファイバが絡まるのを防ぐため、装置を垂直な壁に取り付け、流れの方向が重力方向となるように設定した。装置は、汚染を防ぐためクリーンフード内に置いた。殺菌のため、装置に溶液をローディングする前に、装置とすべてのチューブを70％エタノールで満たした。
作られたコア・シェル構造のマイクロファイバは、直ちに培養液で満たした培養ディッシュに移した。37℃で15分以上インキュベートし、アテロコラーゲンゾルをゲル化した。得られたマイクロファイバ（以下、「NSCマイクロファイバ」と呼ぶ）は、37℃の水蒸気飽和5％CO2環境で培養した。
神経幹細胞が増殖し、マイクロファイバ中の空間が満たされるまで、3−10日培養した。
【００５１】
［NSCマイクロファイバの分化］
神経幹細胞が十分に増殖した後、NSCマイクロファイバを、bFGF、hEGF及びB27を含まない増殖培地に15分浸してリンスした。
続いて、NSCマイクロファイバを、分化培地に浸漬し、37℃の水蒸気飽和5％CO2環境で培養して、神経幹細胞を神経細胞とグリア細胞に分化させた。神経細胞への分化には（Neurobasal A/B27（+）、1％FBS（+）、bFGF（-）、及びhEGF（-））培地を、グリア細胞への分化には（Neurobasal A/10％FBS（+）、bFGF（-）、及びhEGF（-））培地を用いた。
【００５２】
［免疫組織化学染色］
NSCマイクロファイバを、4％のパラホルムアルデヒド（Muto Pure Chemicals社）で1時間固定し、PBS（-）中の0.1%のTriton-X（A16046、Alfa Aesar社）で細胞膜を透過性にした後、非特異的結合を除くために、PBS（-）中の1％のウシ血清アルブミン（BSA、A7906、Sigma-Aldrich社）で90分ブロッキングした。この段階では、NSCマイクロファイバのアルギン酸シェルは、アルギン酸カルシウムとPBS（-）間のイオン交換により完全に溶解した。
続いて、NSCマイクロファイバを、β−tubulin（神経細胞マーカー、1：500、T8578、Sigma-Aldrich社）、又はnestin（神経幹細胞マーカー、1：200、mab353、Millipore社）に対するマウスモノクローナル抗体と、グリア細胞繊維性酸性タンパク質（GFAP、グリア細胞マーカー）に対するウサギモノクローナル抗体と、4℃で一晩反応させた。
PBS（-）で2回リンスした後、NSCマイクロファイバを、抗マウスIgG−AlexaFluor488（A11001、Invitrogen社）と、抗ウサギIgG−AlexaFluor568（A11011、Invitrogen社）と共に4℃で一晩処理した。
続いて、DPBS（-）で2回リンスし、Hoechst 33342（1：1000、H3570、Invitrogen社）で処理して核を染色した。その後、NSCマイクロファイバを蛍光顕微鏡（Axio Observer、Zeiss社）と共焦点レーザ走査顕微鏡（LSM710、Zeiss社）で観察した。
【００５３】
［マイクロファイバのバンドル化（１）］
マイクロファイバを、図２（ａ）に示すようにターンテーブル上に2本のピラー（杭）を立てたディッシュを置き、ターンテーブルを回転させて２本のピラー（杭）に巻きつけるようにして束にした。
種類の違うマイクロファイバを、ピラー上の異なる位置に巻きつけることにより、束におけるそれぞれのマイクロファイバの位置を任意に制御することができる（図２（ｂ））。
得られた束をコラーゲンでコーティングしてバンドル化した。バンドル化の方法は、束にしたマイクロファイバをシャーレ上に移動し、アテロコラーゲン（0.2％のウシ皮膚ペプシン可溶化I型アテロコラーゲン（AtelCell（商標）、DME-02、アテロコラーゲン、KOKEN社））で、ピペットなどを用いて束全体を覆うように滴下した。37度CO2インキュベータで3〜5分ほど保温し、その後培地を加え培養した。
【００５４】
［マイクロファイバのバンドル化（２）］
ポリカチオン溶液として、2％酢酸0.3%キトサンを、ポリアニオン溶液として、生理食塩水中の0.3%アルギン酸を用意した。
マイクロファイバを培地中に浸し、ガラス管を用いて一点をすくい上げて2本の束にし、2本の束の一点をすくいあげて4本の束にし…という作業を繰り返し、2〜48本程度の束を作った。
得られたマイクロファイバの束の両端をガラス管2本で保持し、ピペットマンでファイバ上にポリカチオン溶液→生理食塩水→ポリアニオン溶液→生理食塩水を注いで1ターン（1層）とし、3〜9層のコーティングを行ってバンドル化した。
また、12本程度の束を作製してバンドル化した後、バンドル化された神経束を複数本含む束をさらに作製し、キトサンとアルギン酸でコーティングし、より本数の多いバンドルも作製した。
【００５５】
結果
［マイクロファイバのバンドル化］
ピラーに巻きつける方法で、2種類のマイクロファイバの配置を変えて束にし、コラーゲンゲルでバンドル化した移植用神経束を図２（ｃ）に示す。
図２（ｃ）上段の例では、それぞれ複数本の第1のファイバと第2のファイバを、平行に隣接するように配置した。得られた神経束の蛍光画像の結果を図３左に示す。2種類のマイクロファイバを示す蛍光強度から、それぞれ複数本の第1のファイバと第2のファイバが、隣接するようにバンドル化されたことが確認された。
図２（ｃ）中段の例では、複数本の第1のファイバの周囲を、より数の多い第2のファイバが囲むように配置した。得られた神経束の蛍光画像の結果を図３右に示す。2種類のマイクロファイバを示す蛍光強度から、第1のファイバが中心に配置され、第2のファイバがその周囲を囲むように配置されていることが確認された。
【００５６】
［マイクロファイバ内での神経幹細胞の増殖］
神経幹細胞を含むマイクロファイバを、bFGF及びhEGFを含む増殖培地で培養した結果を図４に示す。
図４（ａ）及び（ｂ）に示されるとおり、6日間の培養で、生きた神経幹細胞によってファイバ内が満たされた。図４（ｃ）に、このようなマイクロファイバで作製した神経束を示す。細胞密度が十分に高いこと確認された。
図４（ｄ）右には、左に示すＡ−Ｂ線に沿った断面における蛍光強度の変化を示す。
【００５７】
［マイクロファイバ内での神経幹細胞の分化］
マイクロファイバ内で、神経幹細胞を神経細胞又はグリア細胞に分化させた8日目の共焦点レーザ走査顕微鏡による位相差像を図５（ａ）、（ｂ）に、免疫細胞化学染色像を（ｃ）、（ｄ）に示す。
それぞれ神経細胞とグリア細胞細胞に分化していることが確認された。
【００５８】
［マイクロファイバのバンドル化］ 
マイクロファイバ内の神経幹細胞を、神経細胞とグリア細胞に分化させ、神経細胞を含むマイクロファイバを中心に配置し、グリア細胞を含むマイクロファイバをその周囲に配置してバンドル化した例を図６に示す。
図６（ａ）、（ｂ）は顕微鏡による位相差画像、（ｃ）はCell Tracker（商標）による、解析結果を示す。神経細胞を含むマイクロファイバが、表面を、グリア細胞を含むマイクロファイバに覆われているのが確認された。
【００５９】
［コーティングの層の数の検討］
図７〜９に、コーティング方法を変えて作製した移植用神経束を観察した結果を示す。
図７左は、12本のマイクロファイバを、アルギン酸とキトサンの層3層でコーティングしたもの、右は、左のバンドルを4本束ねてさらにアルギン酸とキトサンの層3層でコーティングしたものである（計48本のマイクロファイバ）。
図８左は、12本のマイクロファイバを、アルギン酸とキトサンの層6層でコーティングしたもの、右は、左のバンドルを4本束ねてさらにアルギン酸とキトサンの層6層でコーティングしたものである（計48本のマイクロファイバ）。
図９左は、12本のマイクロファイバを、アルギン酸とキトサンの層9層でコーティングしたもの、右は、左のバンドルを4本束ねてさらにアルギン酸とキトサンの層9層でコーティングしたものである（計48本のマイクロファイバ）。
いずれも移植に適した柔軟性と強度を有するバンドルが得られた。
各図の下2つは、コーティング後3日目に観察した様子である。いずれもマイクロファイバが平行に並んでバンドル化されており、好適な柔軟性と強度を有していた。このうち上段は、コーティング後0日にバンドルの一部をピンセットで把持したものである。ピンセットで把持したときに内部の細胞に若干のダメージを受けるものも見られたが、特に12本のマイクロファイバを9層コーティングしたものはほとんど細胞へのダメージがなかった。
【００６０】
［バンドル化後の培養］
図１０に、バンドル化後の培養による細胞増殖を示す。
12本のNSCマイクロファイバをアルギン酸とキトサンの層3層でコーティングし、さらにこのバンドルを4本まとめてアルギン酸とキトサンの層3層でコーティングし、計48本のマイクロファイバをバンドル化した（上段）。
バンドル化後、培地にEGFとFGFを添加して培養した。1日後の様子を下段に示す。増殖した神経幹細胞が増殖し、マイクロファイバの端部から出てきているのが観察された。神経幹細胞がバンドル側面から漏出せず、端部からのみ延びていくことで、移植部の断裂した神経と効率よく相互作用し、神経の再生を促すものと考えられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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