(57)【要約】【課題】優れた分散安定性及び保存安定性を持ち、かつ、不純物を含まない高純度の難溶性有機物質のナノ粒子コロイドを提供できる技術の構築。元の難溶性有機物質の構造を保持して当該有機物質の溶解液等よりも活性や反応性等の機能が向上したナノ粒子コロイドを提供できる技術の構築。含有ナノ粒子が、高い表面修飾能を有するナノ粒子コロイドを提供できる技術の構築。【解決手段】難溶性有機物質のナノ分散方法であって、液体又は固体の媒体中で前記難溶性有機物質に超短パルスレーザー光を照射してレーザーアブレーションすることにより前記難溶性有機物質をナノ粒子に微細化し、液体又は固体の媒体中に前記ナノ粒子を分散させる、難溶性有機物質のナノ分散方法、及び難溶性有機物質のナノ分散方法によって得られたナノ粒子コロイド。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
難溶性有機物質のナノ分散方法であって、
液体又は固体の媒体中で前記難溶性有機物質に超短パルスレーザー光を照射してレーザーアブレーションすることにより前記難溶性有機物質をナノ粒子に微細化し、前記液体又は固体の媒体中に前記ナノ粒子を分散させる、難溶性有機物質のナノ分散方法。
【請求項２】
前記超短パルスレーザー光が、パルス時間幅が１フェムト秒以上１ピコ秒未満のレーザー光である請求項１に記載の難溶性有機物質のナノ分散方法。
【請求項３】
前記媒体が、液体である請求項１又は２に記載の難溶性有機物質のナノ分散方法。
【請求項４】
前記難溶性有機物質が、抗酸化剤、抗炎症剤、及び抗悪性腫瘍剤から選択される請求項１〜３の何れか一項に記載の難溶性有機物質のナノ分散方法。
【請求項５】
前記抗炎症剤が、脂溶性ビタミン類である請求項４に記載の難溶性有機物質のナノ分散方法。
【請求項６】
前記脂溶性ビタミン類が、ビタミンＥである請求項５に記載の難溶性有機物質のナノ分散方法。
【請求項７】
請求項１〜６の何れか一項に記載の難溶性有機物質のナノ分散方法により得られた難溶性有機物質のナノ粒子コロイド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願発明は、難溶性有機物質のナノ分散方法、及び当該分散方法によって得られた難溶性有機物質のナノ粒子コロイドに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ナノ粒子とは、平均粒径が１マイクロメートル（μm）未満、一般には、粒子の直径が1〜100ナノメートル（nm）程度の超微粒子を指す。ナノ粒子は、通常の大きさの固体や当該固体を溶解させた溶液と比べて、その高表面積によって分散性及び拡散性等が増大し、更に活性や反応性等の機能を向上し得るとして、医療、農薬、化粧品、環境、電子デバイス、化学反応触媒等、幅広い技術分野への応用が期待されている。そのため、ナノ粒子の特性を利用すべく研究開発が進められている。また、ナノ粒子を水や有機溶媒等に分散させたナノ粒子コロイドは沈殿や相分離を起こさないとして、特に難溶性のためにその利用が制限されていた物質への適用が期待されている。
【０００３】
そして、ナノ粒子が他の物質の中に分散したナノ粒子コロイドを作製する方法が報告されており、例えば、逆ミセル法を用いて無機金属のナノ粒子コロイドを作製する方法が報告されている（例えば、特許文献１を参照のこと）。詳細には、特許文献１には、水、疎水性有機溶媒、界面活性剤、及び前記疎水性有機溶媒を基準にして溶解度パラメーターの差が0〜5の親水性有機溶媒を含み、前記親水性有機溶媒を全容積1リットル（L）当り2〜300ミリモル（mmol）を含む逆ミセル液、また、水、疎水性有機溶媒、界面活性剤、及び前記界面活性剤を基準にして無機性値／有機性値比の差が±1.5以内である親水性有機溶媒を含み、前記親水性有機溶媒は、全容積1リットル（L）当り2〜300ミリモル（mmol）含む逆ミセル液が開示されている。そして、当該逆ミセル液を使用して、金属、合金又はその酸化物の無機ナノ粒子を作製する方法が開示されている。また、高分子ミセル中に低分子抗酸化剤を内包する技術（例えば、特許文献２を参照のこと）が報告されている。詳細には、特許文献２には、高分子ミセル形態の高分子化環状ニトロキシドラジカル化合物中に、低分子抗酸化剤が内包された組成物が開示されている。そして、高分子ミセル内に封入される低分子抗酸化剤としてビタミンＥ、βカロテン、ユビキノン、ビリルビン等の難水溶性薬物が例示され、これらを水性媒体中で可溶化でき、難水溶性のために利用分野が限定されていた抗酸化剤の用途を拡張できることが開示されている。
【０００４】
ここで、難水溶性薬剤の生体への適用は、生体膜や細胞内部へ浸透し難く期待した薬効が得られないという問題があった。例えば、経口投与した場合には消化管粘膜からの吸収性が乏しくバイオアベイラビリティーの著しい低下をきたす。また非経口投与の場合にも、例えば、筋肉内や皮下注射により投与された薬剤は、体循環に到達するのに1以上の生体膜を通過する必要があるため、バイオアベイラビリティーの改善は限定的である。更に、標的細胞内部に輸送されず所望の薬効を奏することなく体外に排出されていた。そのため、難水溶性薬物の溶解性、吸収性、細胞内浸透性の改善は、製剤設計の上で重要な課題となっている。特に、近年、創薬戦略の変化により、コンビナトリアルケミストリーやハイスループットスクリーニング等の利用により、大量の医薬品候補化合物が大量に合成され評価されることとなった。そのため創薬現場では難水溶性化合物が増加しており、その製剤設計が大きな課題となっている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００９−８２８２８号公報
【特許文献２】特開２０１１−１８４４２９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、特許文献１の技術は、ナノ粒子コロイドを作製する技術であるが、かかるナノ粒子コロイドを元の固体と比したときの活性や反応性等の機能についての開示はなされていない。また、特許文献１の技術は、無機金属を一旦イオン化し、これを還元することによりナノ粒子に調製するものであり、調製に際して、疎水性及び親水性の有機溶媒や、界面活性剤等の様々な試薬を用いるものである。そのため、生体適用を目的とする医薬、化粧品、食品分野等への当該技術の応用は困難であるとの問題点があった。
【０００７】
特許文献２の技術も特許文献１の技術と同様にミセルを利用するものであり、高分子ミセルに薬剤を内包する手法である。そして、特許文献２に開示の組成物の生体適用として、アルツハイマー疾患への適用を検討した結果が開示されている。しかしながら、当該組成物の調製に際して、高分子化環状ニトロキシドラジカル化合物をはじめとして様々な試薬を用いることから、その応用範囲は制限されることが予想される。したがって、依然として特許文献１の問題点を解決するものではなかった。
【０００８】
そこで、本願発明は、かかる従来技術の問題を鑑みて、優れた分散安定性及び保存安定性を持ち、かつ、不純物を含まない高純度の難溶性有機物質のナノ粒子コロイドを提供できる技術の構築を目的とする。そして、元の難溶性有機物質の構造を保持して当該有機物質の溶解液等よりも活性や反応性等の機能が向上したナノ粒子コロイドを提供できる技術の構築を目的とする。また、含有ナノ粒子が、高い表面修飾能を有するナノ粒子コロイドを提供できる技術の構築を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本願発明者らは、上記課題を解決するべく鋭意研究した結果、難溶性有機物質にパルス幅がフェムト秒レベル等の超短パルスレーザー光を照射してレーザーアブレーションすることによって、優れた分散安定性及び保存安定性を持ち、かつ、不純物を含まない高純度のナノ粒子コロイドを提供できることを見出した。また、レーザーアブレーションは、非熱処理で行う物理的粉砕手法であるため、当該ナノ粒子が高い表面修飾能を有し、かつ、元の有機物質の構造を保持し、当該有機物質の懸濁液や溶解液等よりも活性や反応性等の機能が向上したナノ粒子コロイドを提供できることを見出し、これらの知見に基づいて本願発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、以下の〔１〕〜〔７〕に示す発明を提供する。
〔１〕難溶性有機物質のナノ分散方法であって、液体又は固体の媒体中で前記難溶性有機物質に超短パルスレーザー光を照射してレーザーアブレーションすることにより前記難溶性有機物質をナノ粒子に微細化し、前記液体又は固体の媒体中に前記ナノ粒子を分散させる、難溶性有機物質のナノ分散方法。
〔２〕前記超短パルスレーザー光が、パルス時間幅が１フェムト秒以上１ピコ秒未満のレーザー光である。
〔３〕前記媒体が、液体である。
〔４〕前記難溶性有機物質が、抗酸化剤、抗炎症剤、及び抗悪性腫瘍剤から選択される。
〔５〕前記難溶性有機物質が、脂溶性ビタミン類である。
〔６〕前記脂溶性ビタミン類が、ビタミンＥである。
〔７〕上記難溶性有機物質のナノ分散方法により得られた難溶性有機物質のナノ粒子コロイド。
【発明の効果】
【００１１】
上記〔１〕〜〔６〕の構成によれば、液体又は固体媒体中で難溶性有機物質に超短パルスレーザー光を照射してレーザーアブレーションすることによって、難溶性有機物質のナノ分散方法を提供することができる。当該方法は、難溶性有機物質をナノサイズに物理的粉砕することにより媒体中に均一に微細分散化するものである。したがって、非熱加工であるために、難溶性有機物質の化学構造を破壊することなくナノ分散可能である。また、親水基を付加する等の従来公知の化学的処理方法に比べて簡便に行うことができると共に、その表面にコーティング等の化学的修飾が施されていないため、高い表面修飾能を有するナノ粒子を得られるとの利点がある。さらに、分散剤といった反応試薬類等をはじめとする不純物がその作製過程で混入することなく、難溶性有機物質のナノ分散が可能であるとの利点をも有する。そして、当該方法により得られるナノ粒子コロイドは、粒子状であるため、粒子内部は光から保護される。その結果、溶液とは異なり有機物質の酸化が抑制され、保存安定性にも優れたナノ粒子コロイドを提供できるとの利点がある。そして、当該方法により得られるナノ粒子コロイドは、生体内に投与した場合に、元の難溶性有機物質を溶媒に溶解や懸濁させた溶解液や懸濁液の状態と比べて当該有機物質を細胞内に高濃度に輸送することができる。さらに、従来において、難溶性であるが故に、生体内への投与が困難であったり、投与形態が制限されていた難溶性有機物質の用途を大幅に拡張するために貢献できる技術を提供できるとの利点もある。
【００１２】
特に、上記〔２〕の構成によれば、レーザーアブレーションに際して、１フェムト秒以上１ピコ秒未満の超短パルスレーザー光を照射するフェムト秒レーザーを利用する。これにより、極めて短い時間内に極めて強いレーザー光を難溶性有機物質に照射でき、また小さな熱影響部の結果として、レーザーアブレーション効率を高めることができる。
【００１３】
また、上記〔３〕の構成によれば、液体媒体中で難溶性有機物質を微細分散化することから、難溶性有機物質のナノ粒子コロイド液を提供することができる。かかるナノ粒子コロイド液は、溶解液や懸濁液の状態の場合よりも活性や反応性等の機能が向上しており、医薬や化学触媒等、様々な技術分野で利用することができる。
【００１４】
更に、上記〔４〕〜〔６〕の構成によれば、難溶性薬剤のナノ分散方法を提供することができ、難溶性薬剤のバイオアベイラビリティーを高めることができる。つまり、当該方法により得られるナノ粒子コロイドを生体内に投与した場合に、元の難溶性有機物質を溶媒に溶解や懸濁させた溶解液や懸濁液の状態と比べて当該有機物質を細胞内に高濃度に輸送することができ、その薬効を十分に発揮することができる。さらに、従来において、難溶性であるが故に、生体内への投与が困難であったり、投与形態が制限されていた難溶性有機物質の用途を大幅に拡張することができる。難溶性有機物質が増加している昨今、その利用価値は非常に高いといえる。
【００１５】
上記〔７〕の構成によれば、難溶性有機物質のナノ粒子コロイドを提供できる。当該ナノ粒子コロイドは、物理的粉砕により難溶性有機物質をナノサイズに微細分散化したコロイドである。そして、非熱加工で調製されるため、難溶性有機物質の化学構造を破壊することなくナノ分散したナノ粒子コロイドを提供できる。また、当該ナノ粒子コロイドは、化学的処理法で調製したものとは異なり、ナノ粒子の表面にコーティング等の化学的修飾が施されていないため、高い表面修飾能を有するナノ粒子を含んでいるとの利点がある。さらに、反応試薬等の不純物が混入せず、高純度な難溶性有機物質のナノ粒子コロイドである。また、当該ナノ粒子コロイドは、粒子状であるため、粒子内部は光から保護されるため、溶液とは異なり有機物質の酸化が抑制され、保存安定性にも優れるとの利点がある。そして、当該ナノ粒子コロイドは、生体内に投与した場合に、元の難溶性有機物質を溶媒に溶解や懸濁させた溶解液や懸濁液の状態と比べて当該有機物質を細胞内に高濃度に輸送することができる。さらに、従来において、難溶性であるが故に、生体内への投与が困難であったり、投与形態が制限されていた難溶性有機物質の用途を大幅に拡張することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本願発明のナノ分散方法の利用に適したレーザー系システムを概略的に示す図である。
【図２】ビタミンＥのナノ粒子コロイドを用いた抗酸化及び抗炎症能の検証を行った実施例１の結果を示すグラフであり、マクロファージ細胞に添加したVE量（μg）と蛍光強度の関係を示す。蛍光強度は活性酸素種の産生量と相関し、同濃度のVEのナノ粒子コロイドと溶液とを比較する。
【図３】ビタミンＥのナノ粒子コロイドを用いた抗酸化及び抗炎症能の検証を行った実施例２の結果を示すグラフであり、TNF-αmRNA量をβアクチンmRNA量との相対量比で表し、同濃度のVEのナノ粒子コロイドと溶液とを比較する。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００１８】
本願発明の難溶性有機物質の分散方法は、液体又は固体媒体中で前記難溶性有機物質に超短パルスレーザー光を照射してレーザーアブレーションすることにより、当該難溶性有機物質をナノ粒子に微細化すると共に、前記液体又は固体媒体中に前記ナノ粒子を分散させるものである。
【００１９】
ここで、分散とは、連続的な均一相の物質中に、他の物質が微粒子の状態となって散在している現象を意味するものとする。微粒子を散在させている物質を分散媒と称し、そして、散在している微粒子の方を分散質と称することができる。そしてナノ分散とは、分散媒中に、分散質がナノサイズの微粒子の状態、即ち、ナノ粒子となって散在している現象を意味するものとする。このとき、分散質は沈降することなく、分散媒中に安定的に分散されていることが好ましい。そして、このように、分散媒中に分散質がナノ分散した状態にあるものをナノ粒子コロイドと称する。
【００２０】
そして、ナノ粒子とは、平均粒径が１μm未満、一般には、粒子の直径が1〜100nm程度の超微粒子を指すが、ここでは、粒径は、20 〜 1000 nm であることが好ましく、 50 〜 300 nmであることがより好ましい。粒子径が 1000 nmよりも大きいと、ナノ粒子が数時間で沈降するようになり、分散性に問題が生じるため、安定した分散性を確保するため、粒径が 500 nm以下であること、そして調製された粒子の大きさがばらつかないことが好ましい。
【００２１】
本願発明のナノ分散方法の対象となる物質、所謂、分散質となり得る物質は、難溶性有機物質である。ここで、難溶性とは、水難溶性であり、BCSクラスIIまたはクラスIVに分類される薬物に相当する。水等の媒体に対して溶解し難い性質を意味する。好ましく、水難溶性である。本明細書においては、難溶性には、溶媒にほとんど若しくは全く溶解しない、所謂、不溶性をも含むものとする。また、分散目的とする溶媒に対して難溶性を示す場合には、他の溶媒に対して易溶性であっても、当該物質を本発明の分散方法の対象とすることができる。
【００２２】
有機物質とは、その構造内に少なくとも炭素原子を構成元素として含む化合物を意味する。炭素原子の他に水素、窒素、酸素、硫黄、リン、ハロゲン原子等を含むことができる。また、非共有電子対を持つ有機物質が、金属若しくは金属イオンに配位結合した金属錯体や、構造内に炭素と金属原子の直接結合を含む有機金属化合物、構造内の酸素、窒素、リン原子が金属に結合したものや、有機酸の金属塩等も含むものとする。
【００２３】
難溶性有機物質は、固体であることが好ましく、特に好ましくは常温で固体である。また、その形状は、塊状、粒状、粉状等の何れであってもよい。
【００２４】
難溶性有機物質として、医療及び化粧用薬剤、農薬、染料、試薬等が例示される。好ましくは、医療用薬剤であり、抗酸化剤、抗炎症剤、抗悪性腫瘍剤、鎮痛薬、鎮咳剤、利尿剤、抗菌剤、抗ウイルス剤、筋弛緩剤、胃腸治療剤、精神神経治療剤、糖尿病治療剤及び心臓血管治療剤、栄養補助剤等を例示することができるが、これらに限定するものではない。好ましくは、抗酸化剤、抗炎症剤、抗悪性腫瘍剤である。具体的には、抗酸化、抗炎症剤としては、植物由来の成分が例示される。例えば、ビタミンＡ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＫ等の脂溶性ビタミン類が挙げられる。また、プロビタミンＡであるαカロテン、βカロテン、γカロテン及びδカロテン、そしてリコペン等のカロテン類、ルテイン、アスタキサンチン等のキサントフィル類等を含めたカロテノイド類、クルクミン等のクルクミノイド、イソフラボン、ケルセチン、ルチン等のフラボノイド類を含めたポリフェノール類が例示される。さらに、フロロブロフェン、インドメタシン、イブプロフェン、アセトアミノフェン等の抗炎症剤、グルココルチコイド、フルオロメトロン、ベタメザゾン等のステロイド系抗炎症剤、パクリタキセル、ドセタキセル、エトポシド、タモキシフェン、カンプトテシン等の抗悪性腫瘍剤、シクロスポリン等の免疫抑制剤、クラリスロマイシン、ミコナゾール等の抗菌剤、レバミピド等の胃腸治療剤、ニフェジピン等の心臓血管治療剤、フェニトイン等の精神神経治療用剤等も例示される。しかしながら、これらに限定されるものではなく、広く難溶性の薬剤を対象とすることができる。
【００２５】
好ましくは、難溶性有機物質は脂溶性ビタミン類である。脂溶性ビタミン類には、ビタミンＡ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＫ等が含まれる。そして、ビタミンＡとしては、レチノール、３−デヒドロレチノール及びその誘導体、ビタミンＤとしては、コレカルシフェロール、エルゴカルシフェロール及びその誘導体、ビタミンＥとして、α、β、γ−トコフェロール、α、β、γ−トコトリエノール及びその誘導体、ビタミンＫとしてフィロキノン、メトキノン、メナジオン及びその誘導体等が例示されるが、これらに限定するものではない。誘導体としては、例えば、コハク酸、酢酸や脂肪酸等のエステルが挙げられる。また、難溶性のプロビタミンも本願発明の分散の対象とすることができる。
【００２６】
なかでも、ビタミンＥが好ましく、特には、常温で固形状態であるビタミンＥのコハク酸エステルが好ましい。ビタミンＥは、抗酸化作用、抗炎症作用、抗老化作用を有し、細菌感染症、動脈硬化症、心臓血管疾患、褥瘡、凍傷、老化の予防や治療に有用であるとの報告がある優れた薬効を有する物質である。
【００２７】
つまり、本願発明のナノ分散方法の好適対象となる難溶性有機物質は優れた薬効を有するなど、優れた機能を持ちながらも難溶性であるために、その利用が制限されると共に、その機能を十分に発揮し得なかった物質である。本願発明の方法によって、これらの物質を微細分散化させることによって、その機能を十分に発揮及び増強することができる。
【００２８】
分散媒は、液体及び固体媒体の別は問わないが、好ましくは、流動性を有する状態である液体である。そして、分散媒が固体媒体である場合には、分散質が均一に分散可能なように粉末であることが好ましい。また、固体と液体が混合したゲル若しくはゾル状態であってもよい。分散媒としては、例えば、水、蒸留水、生理食塩水、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリム、硫酸カリウム、炭酸水素ナトリム、硝酸アンモニウム等の塩溶液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、トリス緩衝液、クエン酸、フマル酸緩衝液等の緩衝液等の水性媒体、エタノール、メタノール、イソプロピルアルコール、アリールアルコール、エチレングリコール、グリセリン等のアルコール類、ジエチルエーテル等のエーテル類、クロロホルム、ベンゼン、アセトン、ヘキサン、アセトニトリル等の有機性媒体、ヒマシ油、オリーブ油、ダイズ油、アマニ油、パーム油、ゴマ油、カルナバロウ等の植物油、ミツロウ、スクワラン、ラノリン等の動物油、パラフィン、ワセリン等の鉱物油等の油、炭酸カルシウム等の無機酸塩、乳糖、白糖、ブドウ糖、デンプン、セルロース、ゼラチン、カルボキシメチルセルロース、デキストラン等の糖類、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ポリプロピレン、シリコン等の合成高分子ポリマー等が例示されるが、これに限定されるものではなく、公知の分散媒として使用可能な液体又は固体媒体を利用することができる。そして、分散媒は、本願発明のナノ分散方法の産物であるナノ粒子コロイドの用途及び目的に応じて適宜選択される。ただし、分散質となる難溶解性有機物質が溶解してしまうことは望ましくないため、分散媒の選択に当たっては分散質となる難溶性有機物質の溶解性を考慮することが重要であり、難溶解性を示す媒体を分散媒として選択する。例えば、分散の対象が難水溶性有機物質である場合には、水や水性媒体を分散媒として使用することが好ましい。
【００２９】
分散媒の量は、分散質となる難溶性有機物質をナノ粒子として分散させることができれば特に制限はない。
【００３０】
次に、レーザーアブレーションとは、物質の表面に短時間に極めて強いレーザー光を照射することにより、物質表面から粒子を爆発的に剥離、放出させる現象である。本願発明のナノ分散方法では、そのパルス幅がフェムト秒レベルで発振するフェムト秒レーザーアブレーションを利用することが好ましい。例えば、本発明者らの特開２０１２−１３６６８号公報が参照される。
【００３１】
図１は、本願発明のナノ分散方法の利用に好適なレーザー系システム一部の概略的に示した図である。ここでは、塊状の難溶性有機物質（ターゲット）を、液状の分散媒（液体）中に微細分散する場合を例示する。レーザービーム１は、超短パルス源（図示せず）から受光され、レンズ２によって焦束され、ターゲット４にビームの急速移動用機構、例えば振動ミラー３により誘導される。ターゲット４は、容器６に含まれる液体５の表面の下に数ミリメートル浸水され、好ましくは１cm未満浸水される。容器６は、運動ステージ７、例えば移動ステージ上に配置される。ナノ粒子８が押し流されて他の場所で回収されるように、液体の流れが容器に導入される。また、液体の流れは、レーザー焦点体積をも冷却する。前記液体は、好ましくは１Ｍオーム・cm超の比抵抗を有する脱イオン水であることが好ましいが、上述の通り使用目的及び用途に応じて適宜選択することができる。制御装置（図示せず）は、パルス線源、運動システム及び／又は循環システムに動作可能なように連結される。制御装置は、ビームの発出、液体の流れ及び運動を調整する。また、制御装置は、システムコンピュータ、ユーザーインターフェース、電気通信機器及び／又は他の標準装置に連結され、遠隔地からプログラムされるように構成される。
【００３２】
ナノ粒子製造用レーザーは、約1.03μmの波長（数ミリメートルの液体の層は、この波長で無視し得る吸光度を有する）、約1〜20マイクロジュールの範囲、好ましくは約１０マイクロジュール未満のパルスエネルギーを有してよい。約500fs、最高約10psのパルス幅が、ナノ粒子の形成に著しい影響を及ぼすことなく用いられ得る。パルス繰返し率は、約100kHz〜5MHzの範囲であってよい。好ましいレーザーシステムは、更に後述される。液体の流れ、ビーム移動、又はその両方が、高繰返し率での蓄熱を回避するために用いられ得る。
【００３３】
例えば、振動ミラー３は、ターゲット表面上へのレーザービームの急速なラスター又は他の移動のために構成される。ミラー振動数は10Hzより大きいことが好ましく、角度振幅は1mradより大きいことが好ましい。0.01m/s超のターゲット表面上のラスター速度が提供され得る。かかるミラーは、圧電駆動ミラー（piezo-driven mirror）、ガルバノメーターミラー、又はビーム移動のための他の適切な装置であり得る。
【００３４】
液体の流れは、循環システムにより容器に導入することが可能であり、流速は10mL/s超であることが好ましい。循環システムが利用可能でない場合は、横振動移動を導入することによってアブレーションスポット全体に亘る液体の流れを局所的に引き起こすこともできる。例えば、運動ステージ７は、図１に示すようにレーザービームに対して垂直な方向に移動させることができる。振動ステージは、数Hzの振動数と数ミリメートルの振幅とを有することが好ましい。
【００３５】
安定で且つ化学的に純粋なナノ粒子は、レーザーパラメータ及び液流量の両方を制御することによって製造される。レーザーパラメータとしては、パルス幅、パルスエネルギー、パルス繰返し率、ビーム移動量が挙げられる。
【００３６】
本願発明においては、超短パルス幅の採用が好ましい。多くのレーザー加工用途において、例えば、フェムト秒範囲の超短パルス幅は、非常に高い最大出力及び小さな熱影響部の結果としてアブレーション効率を高める。したがって、パルス幅が１フェムト秒以上１ピコ秒未満であることが好ましい。
【００３７】
ナノ粒子生成における適用のための研究（文献１：B. Liu, Z. D. Hu, Y. Che, Y. B. Chen, X. Q. Pan, "Nanoparticle generation in ultrafast pulsed laser ablation of nickel", Applied Physics Letters, Vol. 90, 044103 (2007), 文献２：B. Liu, Z. D. Hu, Y. Che, "Ultrafast sources: ultrafast lasers produce nanoparticles", Laser Focus World, Vol. 43, 74 (2007)）において、アブレーション閾値に近い低パルスエネルギー（より正確には低フルエンス）がナノ粒子生成に好ましいことが分かった。アブレート材料は、主に粒度分布が狭いナノ粒子の形態で存在する。また、米国公開特許第２００８／０００６５２４号は、これらの研究に基づく真空中及び雰囲気ガス中におけるコロイド用粒子の生成方法をも教示する。
【００３８】
好ましくは、例えば少なくとも約10kHz、より好ましくは少なくとも約100KHzの高パルス繰返し率が、少なくとも３つの理由のために用いられる。第１は、高繰返し率パルスレーザーアブレーションにおけるマルチパルス効果である。10マイクロ秒未満のパルス間隔（即ち、100kHz超の高繰返し率）により、アブレート材料は、レーザー焦点体積から離れる前に、多数のレーザー発射を受け、高く帯電する。安定なコロイド用粒子が、更なる化学的安定剤を添加することなくかかる高繰返し率で作製され得る。第２の理由は、マルチパルスによるアブレーションの際、大粒子の断片化が起きる可能性があり、それによってコロイド用粒子の粒度分布が生じる結果となる。第３の理由は、高繰返し率から恩恵を受ける高生成率である。
【００３９】
また、アブレーションの間のレーザービームの急速なラスターが、高繰返し率の操作と共に有益である。例えば、レーザービームのかかる急速なラスターなしでは、先行するレーザーパルスにより生成したコロイド用粒子の流れが、散乱及び吸収によってその後のレーザーパルスを最終的には遮断することになる。更に重要なことに、高繰返し率による水に対する蓄積した加熱はまた、コロイド用粒子の凝集を誘発する可能性もある。
【００４０】
以上の通り、本願発明のナノ分散方法によれば、液体又は固体媒体中で難溶性有機物質に超短パルスレーザー光を照射してレーザーアブレーションすることによる、難溶性有機物質のナノ分散方法を提供することができる。当該方法は、難溶性有機物質をナノサイズに物理的粉砕することにより媒体中に均一に微細分散化するものである。そして、フェムト秒レーザー光等の超短パルスレーザー光を利用する非熱加工であるため、分散対象の難溶性有機物質の化学構造を破壊することなくナノ分散可能である。
【００４１】
また、当該方法によれば、親水基を付加する等の従来公知の化学的処理方法に比べて簡便に行うことができると共に、その表面にコーティング等の化学的修飾が施されていないため、高い表面修飾能を有するナノ粒子を得られるとの利点がある。さらに、当該方法によれば、分散剤といった反応試薬類等をはじめとする不純物がその作製過程で混入することなく、難溶性有機物質のみのナノ分散が可能であるとの利点をも有する。そして、当該方法により得られるナノ粒子コロイドは、粒子状であることから、粒子内部は光から保護される。その結果、溶液とは異なり有機物質の酸化が抑制され、保存安定性にも優れたナノ粒子コロイドを提供できる。そして、当該方法により得られるナノ粒子コロイドは、生体内に投与した場合に、元の難溶性有機物質を溶媒に溶解や懸濁させた溶解液や懸濁液の状態と比べて薬剤を細胞内に高濃度に輸送することができる。さらに、従来において、難溶性であるが故に、生体内への投与が困難であったり、投与形態が制限されていた難溶性有機物質の用途を大幅に拡張することに貢献することができる。
【００４２】
本願発明のナノ分散方法によって得られる分散系であるナノ粒子コロイドも本願発明に含まれ、本願発明の一部を構成する。本願発明のナノ粒子コロイドは、難溶性有機物質がナノ粒子として均一かつ安定的に分散しているものである。
【００４３】
さらに、本発明のナノ粒子コロイドは、そのまま実用に供することができるが、その目的及び用途に応じて製剤化することができる。製剤の形態は、液体及び固体の別は問わないが、好ましくは、液体である。製剤化に際しては、適当な担体を含ませることができ、固体、液体の別を問わず、微細分散化された難溶性有機物質の活性等の性質が安定して維持可能なものであれば、特に制限はない。
【００４４】
液体形態として製剤化する場合には、例えば、水、適当な塩溶液や緩衝液、有機性溶媒、油等の液体に、本願発明のナノ粒子コロイドを希釈又は置換して調製することができる。このような液体としては、分散媒として例示されたものを利用することができるが、これらに限定されるものではない。また、用途等に応じて、水素イオン濃度（pH）を適宜設定してもよい。さらに、防腐剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、安定化剤、溶解補助剤のような補助剤を含んでもよい。
【００４５】
固体形態として製剤化する場合には、ナノ粒子コロイドの分散媒が固体である場合の他、ナノ粒子コロイドの分散媒が液体である場合には、例えば、当該ナノ粒子コロイド液を凍結乾燥や真空乾燥等に供して固形物のナノ粒子とすることにより調製することもできる。そして、適当な担体を含ませることができ、賦形剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤等と混合し、常法により錠剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤、丸剤等の形態に調製することもできる。ここで、固形担体としては、上述の分散媒として例示されたものを利用することもでき、使用目的及び用途に応じて適宜選択することができる。例えば、賦形剤としては、デンプン、乳糖、白糖、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム等、結合剤としては、デンプン、アラビアゴム、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、結晶セルロース等、滑沢剤としては、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム等、崩壊剤としては、カルボキシメチルセルロース、タルク等が挙げられる。しかしながら、これらに限定されるものではなく、公知の材料を適宜選択して使用することができる。
【００４６】
以上の通り、本願発明のナノ粒子コロイドは、難溶性有機物質をナノサイズに物理的粉砕により微細分散化したコロイドである。非熱加工で調製されるため、難溶性有機物質の化学構造を破壊することなくナノ分散したナノ粒子コロイドを提供できる。また、当該ナノ粒子コロイドは化学的処理方法で調製したものとは異なり、ナノ粒子の表面にコーティング等の化学的修飾が施されていないため、高い表面修飾能を有するナノ粒子を含んでいるとの利点がある。したがって、使用目的や用途に応じて様々な物質で修飾することができ、例えば、所望の標識物質やコーティング等を施すことができる。さらに、反応試薬等の不純物が混入せず、高純度な難溶性有機物質のナノ粒子コロイドを提供することができる。そのため、生体内適用に際しても、望ましくない副反応等を誘発することなく安全である。また、当該ナノ粒子コロイドは、粒子状であるため、粒子内部は光から保護されるため、溶液とは異なり有機物質の酸化が抑制され、保存安定性にも優れるとの利点がある。
【００４７】
そして、当該ナノ粒子コロイドは、生体内に投与した場合に、元の難溶性有機物質を溶媒に溶解や懸濁させた溶解液や懸濁液の状態と比べて薬剤を細胞内に高濃度に輸送することができる。さらに、従来において、難溶性であるが故に、生体内への投与が困難であったり、投与形態が制限されていた難溶性有機物質の用途を大幅に拡張することができる。
【００４８】
つまり、本願発明のナノ粒子コロイドは、様々な製品の製造に利用することができ、また当該製品の性能向上等に貢献することができる。例えば、医薬品、農薬、化粧品、染料、標識や反応触媒等の試薬類、ディスプレイや記録媒体等の電子材料等に利用することができる。
【００４９】
特に、医薬品分野においてその有用性を発揮でき、不溶性薬剤をナノサイズの粒子として均一分散できることから、薬剤の浸透性や吸収性を向上させることができる。つまり、薬剤を細胞内に高濃度に輸送でき、かつ、器官、組織、細胞の深部にまで浸透できることから、また、その薬効を十分に発揮することが可能となる。元の難溶性有機物質を溶媒に溶解や懸濁させた溶解液や懸濁液の状態と比較した場合にも、非常に高い薬効を発揮することができる。また、薬剤の口腔粘膜、消化管粘膜等の粘膜や皮膚からの吸収性が向上することができる。そうして、従来において、難溶性性質により生体内への投与が困難であったり、投与形態が制限されていた難溶性有機物質の用途を大幅に拡張することができる。したがって、経口投与、非経口投与の何れの投与形態にも適用が可能となる。したがって、筋肉内投与、皮下投与、経皮投与、鼻腔内投与、経直腸投与等の公知の何れの投与形態でもよく、そして、高い分散安定性を実現できたことから静脈投与にも途が開かれる。
【００５０】
ナノ粒子は、肝臓、脾臓や骨髄等の細網内皮系に多く存在するマクロファージ等の食細胞内に貯留する性質を有することが知られている。また、腫瘍細胞は、正常組織に比べて血管透過性が著しく亢進していることからナノ粒子が血管より流出しやすく、一方で、リンパ系が発達していないため腫瘍組織に到達したナノ粒子は腫瘍細胞内に貯留する。一般的に、脂溶性薬剤を経口投与した場合、腸で吸収された薬剤は肝臓で代謝を受け、酵素等の作用により親水性物質に化学変化を受け尿中に排泄され、腸で吸収されなかった薬剤はそのまま糞便として排出される。したがって、脂溶性薬剤を、本願発明のナノ粒子コロイドとして投与した場合に、マクロファージや腫瘍細胞に貯留されることから、腎臓等からの排出が低減される。したがって、本願発明のナノ粒子コロイドは、特にマクロファージが関連する炎症疾患や癌に対する治療剤への利用に適している。
【００５１】
また、本願発明のナノ粒子コロイドを構成するナノ粒子は高い表面修飾活性を有するため、使用目的及び用途に応じて様々な物質で修飾することができる。例えば、標的部位に特異的親和性の高い物質で修飾し標的部位に効果的に薬剤を送達するドラックデリバリーシステムの構築や、外部から検出可能な適当な標識物質で修飾し薬剤の体内動態を観察する等が挙げられるが、これらに限定されるものでない。したがって、本願発明のナノ粒子コロイドはその優れた物性により新たな用途の開拓が期待される。
【実施例】
【００５２】
以下、本願発明を実施例によって更に詳細に説明する。しかしながら、本願発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００５３】
実施例１．ビタミンＥのナノ粒子コロイドを用いた抗酸化及び抗炎症能の検証−１
本実施例では、ビタミンＥの抗酸化能を、溶液状態のビタミンＥと比較検証した。抗酸化能の検証は、炎症誘導したマクロファージ細胞の産生する活性酸素種を検出することにより行った。
【００５４】
（試薬）
ビタミンＥ（以下、「VE」と称する場合がある）は常温では油状であるため、常温で粉末であるVEの誘導体、VEのコハク酸エステルを使用して、以下の検討を行った。
VEのナノ粒子コロイドは、IMRAレーザー（フェムト秒ファイバーレーザー）を用いてVEのコハク酸エステルを微細分散化することにより調製した（IMRA AMERICA製 D−１０００、照射エネルギー：1W、分散媒：イオン交換水）。そして、ここで調製されたナノ粒子コロイドは、平均粒径189 nmのVEナノ粒子を含んでいた。
そして、VEのナノ粒子コロイドは、0、1.25、2.5、5、10、20μg/well となるように細胞培地溶液で希釈し、マクロファージ細胞に接触するように調製した。
【００５５】
（方法）
マクロファージ細胞株（Raw 264.7）をシャーレに播種した後、10μg／mlのリポ多糖（Lipopolysaccharide：以下、「LPS」と称する）を添加し炎症誘導した。誘導後、シャーレに、各量のVEのナノ粒子コロイドを添加した。続いて、2'7'−ジクロロフルオレセインジアセタート（2'7'-dichlorofluorescein diacetate）を添加した後に、蛍光を測定し抗酸化能を測定した。ここで、2'7'−ジクロロフルオレセインジアセタートは、活性酸素種によって酸化されると蛍光を発するジクロロフルオレセインになることから、細胞内の活性酸素種の指標として用いられる。なお、実験はｎ＝３で行った。
【００５６】
また、比較例として、VEのナノ粒子コロイドに代えて同量の溶液状のVE（溶媒：細胞培地溶液）を別シャーレに添加し、蛍光を測定し抗酸化能を測定した（比較例１）。コントロールとして、無処置のマクロファージ細胞（コントロール、無処置）、及びLPSによる炎症誘導を行っただけのマクロファージ細胞（コントロール、LPS炎症誘導のみ）についても同様にしてジクロロフルオレセイン由来の蛍光を測定した。
【００５７】
（結果）
結果を図２に示す。図２は、マクロファージ細胞に添加したVE量（μg）と蛍光強度の関係を示すグラフであり、蛍光強度は活性酸素種の産生量と相関する。そして、同量のVEのナノ粒子コロイドと溶液での活性酸素種の産生量を比較するグラフである。この結果、VEのナノ粒子コロイドが活性酸素種のマクロファージが産生する活性酸素種の産生を抑制する（実施例１）。そして、VE溶液よりも活性酸素種の産生抑制効果は高いことが確認された（比較例１との比較）。このように、VEのナノ粒子コロイドは、炎症の増悪の要因となり得る活性酸素種の産生を効果的に抑制できることが理解できる。
【００５８】
実施例２．ビタミンＥのナノ粒子コロイドを用いた抗酸化及び抗炎症能の検証−２
本実施例では、ビタミンＥの抗炎症能を、溶液状態のビタミンＥと比較検証した。抗炎症能の検証は、炎症の指標となるTNF-αのmRNA量をリアルタイムRT-PCRにより測定することにより行った。
【００５９】
（試薬）
VEナノ粒子コロイドは実施例１と同様にして調製した。そして、VEのナノ粒子コロイドは、そして、VEのナノ粒子コロイドは、実施例１と同様に5μg/well となるように細胞培地溶液で希釈し、マクロファージ細胞に接触するように調製した。
【００６０】
（方法）
実施例１と同様に、LPSにより炎症誘導されたマクロファージ細胞にVEのナノ粒子コロイドを添加して培養を行った。培養後、細胞からRNeasy mini kit(Quiagen社製)を用いてトータルRNAを抽出し、続いてReverse transcriptase（Invitorogen社製）を用いてcDNAを合成した。そして、PCR primer and probes（Universal Probe Library：Roche社製のプライマーデザインツールにより設計）をプライマーとして用いて、TNF-αの遺伝子発現量をリアルタイムPCR（Applied & Biosystem社製）によって測定した。なお、実験はｎ＝３で行った。
【００６１】
また、比較例として、VEのナノ粒子コロイドに代えて同量の溶液（細胞培地溶液）状のVEを別シャーレに添加したものについてもRT-PCRに供してTNF-αの遺伝子発現量を測定した（比較例２）。コントロールとして、無処置のマクロファージ細胞（コントロール、無処置）、及びLPSによる炎症誘導を行っただけのマクロファージ細胞（コントロール、LPS炎症誘導のみ）についても同様にしてTNF-αの遺伝子発現量を測定した。
【００６２】
（結果）
結果を図３に示す。図３は、TNF-αmRNA量をβ-アクチンmRNA量との相対量比で表したグラフであり、同濃度のVEのナノ粒子コロイドと溶液添加でのmRNA量を比較するグラフである。この結果、VEのナノ粒子コロイドが、LPSによって誘導されるTNF-αの産生を半分程度にまで抑制していることが確認された（実施例２）。そして、溶液状のVEに比べてTNF-αの産生を効果的に抑制していることが確認された（比較例２との比較）。つまり、当該VEのナノ粒子コロイドは、炎症性サイトカインの産生を効果的に抑制し、高い抗炎症効果を示すことが理解できる。
【００６３】
実施例１及び実施例２の結果より、VEのナノ粒子コロイドの方が溶液よりも高い抗酸化、抗炎症作用を示すことが確認された。そして、ナノ粒子コロイドは、マクロファージ認識され、薬効の向上に寄与することができる。特にマクロファージ関連疾患に対する治療剤としての利用が期待される。
【産業上の利用可能性】
【００６４】
本願発明は、難溶性有機物質の利用を要求する全ての技術分野に利用することができる。例えば、医薬品、農薬、化粧品、染料、標識や反応触媒等の試薬類、ディスプレイや記録媒体等の電子材料等に利用することができる。
【符号の説明】
【００６５】
１  レーザービーム
２  レンズ
３  振動ミラー
４  ターゲット
５  液体
６  運動ステージ
７  ナノ粒子
【図１】
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【図２】
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【図３】
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