(57)【要約】      （修正有）【課題】自己免疫疾患、特に、多発性硬化症に対する新規治療薬及び治療方法の提供。【解決手段】ＣＤ４＋ＣＤ２５−ＦｏｘＰ３−の静止状態の表現型を有するＴｒ１細胞を含む薬学的組成物。前記Ｔｒ１細胞は、多発性硬化症関連抗原であるミエリンオリゴデンドロサイトタンパク質（ＭＯＧ）ペプチド、又はそれらの断片、変異体若しくは混合物を含み、前記ＭＯＧペプチド配列としては、ＭＯＧ３５〜５５、ＭＯＧ２１〜４０、ＭＯＧ４１〜６０、ＭＯＧ７１〜９０、ＭＯＧ８１〜１００、ＭＯＧ１１１〜１３０、ＭＯＧ６３〜３７、ＭＯＧ９７〜１０８、ＭＯＧ１８１〜２００ペプチドが好ましく、特に、ＭＯＧ３５〜５５が好ましい。前記Ｔｒ１細胞はクローン細胞であることが好ましい。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミエリンオリゴデンドロサイトタンパク質（ＭＯＧ）ペプチド、またはそれらの断片、変異体若しくは混合物に方向付けられた少なくとも１つのＴｒ１細胞集団を、１つ以上の薬学的に許容可能なキャリアと共に含む薬学的組成物であって、前記Ｔｒ１細胞集団は、ＣＤ４＋ＣＤ２５−ＦｏｘＰ３−の静止状態の表現型を有する、薬学的組成物。
【請求項２】
ミエリンオリゴデンドロサイトタンパク質（ＭＯＧ）ペプチド、またはそれらの断片、変異体若しくは混合物に方向付けられた少なくとも１つのＴｒ１細胞集団を含む薬剤であって、前記Ｔｒ１細胞集団は、ＣＤ４＋ＣＤ２５−ＦｏｘＰ３−の静止状態の表現型を有する、薬剤。
【請求項３】
前記Ｔｒ１細胞集団はＴｒ１クローン集団である、請求項１に記載の薬学的組成物または請求項２に記載の薬剤。
【請求項４】
前記ミエリンオリゴデンドロサイトタンパク質（ＭＯＧ）ペプチド、またはそれらの断片、変異体若しくは混合物は、ＭＯＧ３５〜５５、ＭＯＧ２１〜４０、ＭＯＧ４１〜６０、ＭＯＧ７１〜９０、ＭＯＧ８１〜１００、ＭＯＧ１１１〜１３０、ＭＯＧ６３〜３７、ＭＯＧ９７〜１０８、ＭＯＧ１８１〜２００ペプチドを含む群から選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の薬学的組成物または薬剤。
【請求項５】
多発性硬化症の治療のための、請求項１〜４のうちいずれか１項に記載の薬学的組成物または薬剤。
【請求項６】
必要としている対象者に投与される前記薬剤または薬学的組成物は、前記対象者の細胞に対して自家のＴｒ１細胞を含む、請求項５に記載の多発性硬化症の治療のための薬学的組成物または薬剤。
【請求項７】
１０４／ｋｇ〜１０９／ｋｇのＴｒ１細胞が前記必要としている対象者に投与される、請求項５または６に記載の多発性硬化症の治療のための薬学的組成物または薬剤。
【請求項８】
有効量の本発明の薬剤または薬学的組成物の前記対象者への前記投与は、多発性硬化症の治療に用いられる１つ以上の治療薬と組み合わせて行われる、請求項５〜７のうちのいずれか１項に記載の多発性硬化症の治療のための薬学的組成物または薬剤。
【請求項９】
有効量の本発明の薬剤または薬学的組成物の前記対象者への前記投与は、インターフェロンベータ、グラチラマー酢酸塩、ミトキサントロン、シクロホスファミド、メトトレキサート、アジアトロピンまたはナタリズマブの群中の１つ以上の治療薬と組み合わせて行われる、請求項８に記載の多発性硬化症の治療のための薬学的組成物または薬剤。
【請求項１０】
前記対象者は、インターフェロンベータ、グラチラマー酢酸塩、ミトキサントロン、シクロホスファミド、メトトレキサート、アジアトロピンまたはナタリズマブの群中の１つ以上の治療薬に対して適切に応答しないかまたは適切に応答しない可能性がある、請求項５〜７のうちのいずれか１項に記載の多発性硬化症の治療のための薬学的組成物または薬剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、自己免疫性疾患、（例えば、多発性硬化症）の治療の分野に関する。より詳細には、本発明は、多発性硬化症関連抗原に方向付けられた（ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ａｇａｉｎｓｔ）Ｔｒ１細胞を含む薬剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
多発性硬化症は、中央神経系の脱髄性および慢性の炎症性疾患である。この疾患の病理組織学的特徴には、白質中の他の炎症細胞と共にＣＤ４＋細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞双方の限局性浸潤、および何らかの軸索障害を証拠とする脱髄が含まれる。多発性硬化症における免疫反応の標的と思われるミエリンタンパク質には、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、プロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）、ミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ）、およびミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）が含まれる。
【０００３】
今日、多発性硬化症治療のための多様な治療アプローチがヒトにおいて利用可能となっている。
【０００４】
しかし、多発性硬化症のための根治治療法は存在していない。コルチコステロイドおよび修飾βインターフェロンを含む多数の化合物については、多発性硬化症のいくつかの症状を軽減することはできるものの、深刻な副作用を起こすことが証明されているか、またはそうでなければ長期使用は望ましくないことが示されている。
【０００５】
多発性硬化症に対する１つの有望な治療について、ＷＯ０２／０７７０２５中に記載がある。同文献において、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）のペプチド類縁体が示されている。これらの類縁体を含む組成物は、過度の副作用無しにＭＳの症状を改善することができると報告されている。さらに、ミエリン構成タンパク質に対するペプチド類縁体の使用は、実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）の症状の治療において有効であることが示されている。実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）は、臓器特異的免疫疾患であり、ＭＳのモデルとしてマウスにおいて用いられることが多い。しかし、いくつかのフェーズＩＩ臨床試験では、試験投与量では改変ＭＢＰペプチドの耐性が低いため、試験を中断せざるを得なくなっている（Ｂｉｅｌｅｋｏｖａら、ｎａｔｕｒｅ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２０００、（６）１０：１１６７、ｅｔ  Ｋａｐｐｏｓら、ｎａｔｕｒｅ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２０００、（６）１０、１１７６）。
【０００６】
他の多発性硬化症の別の有望な治療については、ＥＰ０５８７７３５中にも記載がある。この治療は、自己反応性ＴＣＲ断片に酷似したペプチドに対する免疫学的露出によりＴｈ２細胞のプライミング／認識が高まるはずであり、従ってＴｈ１媒介炎症に対するサイトカイン調節管理の維持に有用であるという論理的根拠に基づいている。臨床試験によれば、この治療は患者において受容可能な安全性および耐性があることが分かっているが、この治療は、免疫された患者のうち５０％にしか有効ではない。
【０００７】
ＵＳ２００４／００８７０１８において、治療を必要としている患者において多発性硬化症を治療する方法が記載されている。この方法は、抗原特異的ＩＬ−１０産生細胞を、好適には同時に、可溶性抗原と共に前記患者に投与するステップを含む。
【０００８】
驚くべきことに、発明者らは、可溶性抗原の同時投与無く多発性硬化症関連抗原に方向付けられたＴｒ１細胞を投与した場合、免疫されたマウスにおけるＥＡＥの進行が顕著に抑制されることを発見した。
【０００９】
従って、出願人は、Ｔｒ１細胞の使用に基づいた多発性硬化症の別の種類の治療を提供することを目的とする。
【発明の概要】
【００１０】
本発明は、多発性硬化症関連抗原に方向付けられた少なくとも１つのＴｒ１細胞集団を含む組成物に向けられる。前記多発性硬化症関連抗原は好適には、ミエリン塩基性タンパク質、ミエリン関連糖タンパク質、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質、プロテオリピドタンパク質、オリゴデンドロサイトミエリンオリゴタンパク質、ミエリン関連オリゴデンドロサイト塩基性タンパク質、オリゴデンドロサイト特異的タンパク質、熱ショックタンパク質、オリゴデンドロサイト特異的タンパク質ＮＯＧＯ  Ａ、糖タンパク質Ｐｏ、末梢性ミエリンタンパク質２２、２’３’−環状ヌクレオチド３’−ホスホジエステラーゼを含む群から選択される。
【００１１】
本発明の別の目的は、本発明の組成物を含む薬剤または薬学的組成物を提供することである。
【００１２】
本発明はまた、治療を必要としている対象者において多発性硬化症を治療する方法にも関する。この方法は、本発明の薬剤または薬学的組成物の有効量を前記対象者に投与するステップを含む。好適な実施形態において、治療を必要としている対象者に投与される前記薬剤または前記薬学的組成物は、前記対象者の細胞に対して自家であるＴｒ１細胞を含む。
【００１３】
本発明の別の実施形態において、治療を必要としている対象者において多発性硬化症を治療するための前記方法は、本発明の薬剤または薬学的組成物の有効量を発性硬化症の治療において用いられる別の治療薬と共に前記対象者に投与するステップを含む。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】分化細胞のサイトカイン分泌プロファイル。  分化のレジメンに提示されたナイーブＣＤ４＋細胞を、抗ＣＤ３＋抗ＣＤ２８モノクローナル抗体によって４８時間で活性化させた。その後、ＩＬ−４、ＩＬ−１０およびＩＦＮガンマの存在について、培養上清をＥＬＩＳＡによって試験した。
【図２】ＥＡＥ易発性マウスにおける抗ＭＯＧ３５〜５５ＣＤ４＋Ｔ細胞の投与の効果
【発明を実施するための形態】
【００１５】
定義
【００１６】
本明細書中に用いられる「Ｔｒ１細胞」という用語は、静止状態のＣＤ４＋ＣＤ２５−ＦｏｘＰ３−において以下の表現型を有し、かつ活性化時に高レベルのＩＬ−１０および低レベル〜中レベルのＴＧＦ−βを分泌することが可能な細胞を指す。Ｔｒ１細胞は、そのユニークなサイトカインプロファイルにより、部分的に特徴付けられる。すなわち、Ｔｒ１細胞は、高レベルのＩＬ−１０、顕著なレベルのＴＧＦ−β、および中程度のレベルのＩＦＮ−γを産生するが、ＩＬ−４またはＩＬ−２はほとんど又は全く産生しない。サイトカイン産生は典型的には、Ｔリンパ球（例えば、抗ＣＤ３＋抗ＣＤ２８抗体またはインターロイキン−２、ＰＭＡ＋イオノマイシン）の多クローン性活性剤による活性化後の細胞培養において評価され、あるいは、サイトカイン産生は、抗原提示細胞によって提示された特異的Ｔ細胞抗原による活性化後の細胞培養において評価される。高レベルのＩＬ−１０は、少なくとも約５００ｐｇ／ｍｌに相当し、典型的には約１、２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、または２０、０００ｐｇ／ｍｌ以上よりも多い。顕著なレベルのＴＧＦ−βは、少なくとも約１００ｐｇ／ｍｌに相当し、典型的には、約２００、３００、４００、６００、８００、または１０００ｐｇ／ｍｌ以上よりも多い。中程度のレベルのＩＦＮ−γは、０ｐｇ／ｍｌ〜少なくとも４００ｐｇ／ｍｌの濃度に相当し、典型的には約６００、８００、１０００、１２００、１４００、１６００、１８００または２０００ｐｇ／ｍｌ以上よりも多い。ほとんどない又は全くないＩＬ−４またはＩＬ−２とは、約５００ｐｇ／ｍｌ未満、好適には約２５０、１００、７５未満、または５０ｐｇ／ｍｌ未満に相当する。
【００１７】
本明細書中に用いられる「抗原」という用語は、本発明の細胞が調節のために用いられるかまたは本発明の方法のうちいずれかにおいて用いられる特定の疾患と関連するタンパク質またはペプチドを指す。１つの実施形態において、「抗原」という用語は、合成的に誘導された分子または天然由来の分子を指し得、対象抗原と配列相同性を共有するかまたは対象抗原と構造的相同性を共有するか、またはその組み合わせを共有する。１つの実施形態において、前記抗原はミメトープであり得る。前記抗原の「断片」とは、より短いペプチドとしての前記抗原の任意のサブセットを指す。前記抗原の「変異体」とは、前記抗原全体またはその断片のいずれかに実質的に類似する分子を指す。変異体抗原は、当該分野において周知の方法を用いて前記変異体ペプチドの直接化学合成により簡便に調製され得る。
【００１８】
本明細書中に用いられる「対象者」という用語は、哺乳類（特にヒト）を指す。
【００１９】
本明細書中に用いられる「有効量」という用語は、有益なまたは所望の臨床結果（例えば、臨床状態の改善）を発生させるのに十分な量を指す。
【００２０】
本明細書中に用いられる「クローン」または「クローン集団」という用語は、ユニークな分化細胞から派生した分化細胞の集団を指す。
【００２１】
本明細書中に用いられる「治療」または「治療中」という用語は一般的には、治療中の個人の自然経過を改変しようと試みるための臨床介入を指し、臨床病理学の治療単位において行われ得る。望ましい効果を非限定的に挙げると、症状の軽減、当該疾患の任意の直接的または間接的病理学的帰結の抑制、低減または抑止、疾患進行速度の遅延、疾患状態の改善または緩和、および寛解または予後改善の誘導がある。
【００２２】
本明細書中に用いられる「自己免疫性疾患」という用語は、自己抗原に対する免疫反応を指す。
【００２３】
多発性硬化症を有する患者は、臨床的に明確な多発性硬化症の診断を確立する基準により、特定され得る。簡単にいうと、臨床的に明確な多発性硬化症に罹患している個人は、２回の発病と２つの病変の臨床上の証拠、または１つの病変の臨床上の証拠と別の病変のパラクリニカルな証拠を有する。また、明確な多発性硬化症は、２回の発病および脳脊髄液中のＩｇＧのオリゴクローナルバンド、または発病、２つの病変の臨床上の証拠および脳脊髄液中のＩｇＧのオリゴクローナルバンドの組み合わせにより、診断され得る。ＭｃＤｏｎａｌｄ基準を用いて多発性硬化症を診断することも可能である。ＭｃＤｏｎａｌｄ基準は、複数の臨床的発病の非存在下において、多発性硬化症の診断において用いられる経時的ＣＮＳ障害のＭＲＩ証拠の使用を含む。多発性硬化症の有効な治療は、いくつかの異なる様式において、評価され得る。以下のパラメータを用いて、治療の有効性を測定することができる。２つの例示的基準を挙げると、ＥＤＳＳ（総合障害度評価尺度）およびＭＲｌ（磁気共鳴映像法）上での増悪の出現がある。ＥＤＳＳは、多発性硬化症に起因する臨床障害をグレード付けするための手段である。神経学的障害の種類および重症度について、８つの機能別障害度を評価する。簡単に言うと、治療を行う前に、以下のシステム（錐体路、小脳、脳幹、感覚、腸および膀胱、視覚、大脳など）に基づいて、障害について患者を評価する。規定の間隔でフォローアップを行う。基準は、０（正常）〜１０（多発性硬化症に起因する死亡）の範囲に及ぶ。１段階の低下は、治療が有効であることを示す。
【００２４】
増悪とは、多発性硬化症に起因しかつ妥当な新規の神経学的異常を伴う新規症状の出現として、定義される。さらに、増悪は少なくとも２４時間継続しなければならず、増悪前に少なくとも３０日間安定または改善がなければならない。簡潔に言うと、患者は、臨床医による標準的な神経学的検査を受ける。神経学的評価尺度の変化に基づいて、増悪を軽度、中程度または重度とする。年間の増悪率および増悪フリー患者の比率を決定する。
【００２５】
これらの測定のうちいずれかにおいて、処置群とプラセボ群との間で増悪フリー患者または再発フリー患者の比率または集団において統計的に有意な差異がみられた場合、治療が有効であるとみなすことができる。さらに、初回増悪発生までの時間および増悪持続期間および重症度を測定してもよい。この点についての治療としての有効性の尺度は、処置群を対照群と比較したときの初回増悪発生までの時間または持続期間および重症度における統計的に有意な差、である。増悪フリーまたは再発フリー期間が１年、１８ヶ月または２０ヶ月よりも長い場合、特に注目に値する。
【００２６】
臨床的測定を挙げると、１年および２年間隔での再発率、および６ヶ月継続するＥＤＳＳの基線値１．０単位からの進行時間を含むＥＤＳＳの変化がある。カプランマイヤー曲線上において、障害の持続した進行は、有効性を示す。他の基準を挙げると、ＭＲＩ上のＴ２画像の面積および体積の変化ならびにガドリニウム増強画像によって決定される病変部の数および体積がある。ＭＲＩは、ガドリニウムＤＴＰＡ増強画像生成を用いた活性病変部の測定、またはＴ２強調技術を用いた病変部の位置および範囲の測定に使用することができる。簡単に言うと、基線値ＭＲＩを入手する。同一の結像面および患者位置を、その後の各調査において用いる。病変検出を最大化しかつ病変追跡を容易化するように、位置決めおよび画像生成シーケンスを選択することができる。同一の位置決めおよび画像生成シーケンスを、その後の調査において用いることができる。多発性硬化症病変部の存在、位置および範囲を放射線科医が決定することができる。病変部の領域にアウトラインを付加し、病変領域全体についてスライスずつ合計することができる。３つの分析（新規病変の証拠、活性病変の出現率、病変領域の変化のパーセンテージ）を行うことができる。治療に起因する改善は、個人の患者を基線値と比較した場合または処置群とプラセボ群とを比較した場合に統計的に有意な改善が見られた場合に、確立される。
【００２７】
多発性硬化症の各事例は、いくつかの提示パターンおよびその後の経過の１つを示す。最も一般的には、多発性硬化症は先ず一連の発病として顕在化し、その後、症状が原因不明に低減するとともに完全または部分的に寛解し、その後、一定の安定期間後に症状が戻ることとなる。これは、再発−寛解型（ＲＲ）多発性硬化症と呼ばれる。
【００２８】
一次性進行型（ＰＰ）多発性硬化症は、明確な寛解の無い漸次的臨床的低下によって特徴付けられるが、一時的な停滞期または症状の少しの軽減があり得る。
【００２９】
二次性進行型（ＳＰ）多発性硬化症は、再発−寛解型で発生した後、一次性進行型の経過をたどる。患者がまれに進行−再発型（ＰＲ）の経過をたどる場合もあり、その場合、疾患が進行する間、急性の発病が断続的におこる。
【００３０】
ＰＰ、ＳＰ、およびＰＲをひとまとめにして慢性進行性多発性硬化症と呼ぶ場合もある。悪性多発性硬化症の患者は少数であるが、悪性多発性硬化症は、急速かつ絶え間ない低下の結果、顕著な障害または疾患発生後短期での死亡に至るものとして定義される。
本発明
【００３１】
本発明は、多発性硬化症関連抗原に方向付けられた少なくとも１つのＴｒ１細胞集団を含む組成物に関する。
【００３２】
本発明の１つの実施形態において、Ｔｒ１細胞は、以下のステップにより入手され得る。
ａ）対象者から前駆細胞集団を単離するステップ、
ｂ）ＩＬ−１０の存在下で前記前駆細胞集団を培養することにより、樹枝状細胞の集団を入手するステップ、
ｃ）多発性硬化症関連抗原の存在下でステップｂ）の細胞を前記対象者から単離されたＣＤ４＋Ｔリンパ球集団と接触させることで、前記抗原に方向付けられたＣＤ４＋Ｔ細胞を前記Ｔｒ１細胞集団に分化させるステップと、
ｄ）前記Ｔｒ１細胞集団をステップｃ）から回復させるステップ。
【００３３】
ステップｂ）において、培地中にＩＬ−１０は５０〜２５０Ｕ／ｍｌ（好適には１００Ｕ／ｍｌ）で存在する。前記Ｔｒ１細胞を入手する方法について、Ｗａｋｋａｃｈら（Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、２００３年５月、１８（５）：６０５−１７）において記載がある。
【００３４】
前記方法はまた、ステップｂ）のＤＣの代わりにデキサメタゾンおよびビタミンＤ３、または免疫寛容原性（ｔｏｌｅｒｏｇｅｎｉｓｅｄ）または未成熟のＤＣを用いて行うこともできる。
【００３５】
本発明の別の実施形態において、Ｔｒ１細胞は、以下のステップにより入手され得る。
ａ）多発性硬化症関連抗原に方向付けられたＣＤ４＋Ｔ細胞集団を培養するステップであって、前記ＣＤ４＋Ｔ細胞集団は、適切な量のＩＦＮ−αを含む培地において対象者から単離される、ステップ、および
ｂ）前記Ｔｒ１細胞集団を回復させるステップ。
【００３６】
ＩＦＮ−αは好適には、前記培地中に５ｎｇ／ｍｌで存在する。ステップａ）において、前記培地は、適切な量のＩＬ−１０（好適には１００Ｕ／ｍｌ）をさらに含み得る。
【００３７】
ステップｂ）において、前記Ｔｒ１細胞集団は、ＩＬ−１５を含む培地において培養され、これにより増殖させる。ＩＬ−１５は好適には、前記培地中で５ｎｇ／ｍｌである。前記Ｔｒ１細胞を入手する方法について、前記特許ＵＳ６７４６６７０に記載がある。
【００３８】
本発明のさらに別の実施形態において、Ｔｒ１細胞は、以下のステップによって入手され得る。
ａ）多発性硬化症関連抗原の存在下においてＣＤ４＋Ｔ細胞集団をインビトロ活性化させるステップであって、前記多発性硬化症関連抗原は人工抗原提示細胞によって提示される、ステップ、および、
ｂ）少なくとも１０％のＴｒ１細胞を含む活性化されたＣＤ４＋Ｔ細胞を回復させるステップ。好適には、前記人工抗原提示細胞は、ＨＬＡ  ＩＩ系分子およびヒトＬＦＡ−３分子を発現し、副刺激分子Ｂ７−１、Ｂ７−２、Ｂ７−Ｈ１、ＣＤ４０、ＣＤ２３およびＩＣＡＭ−１を発現しない。
【００３９】
Ｔｒ１細胞を入手するプロセスについて、特許出願ＷＯ０２／０９２７９３において記載がある。
【００４０】
本発明のさらに別の実施形態において、Ｔｒ１細胞は、以下のステップにより入手され得る。
ａ）多発性硬化症関連抗原および適切な量のＩＬ−１０の存在下において、ＣＤ４＋Ｔ細胞集団をインビトロ活性化させるステップ、および
ｂ）前記Ｔｒ１細胞集団を回復させるステップ。
【００４１】
好適には、ＩＬ−１０は前記培地中に１００Ｕ／ｍｌで存在する。前記方法について、Ｇｒｏｕｘら（Ｎａｔｕｒｅ、１９９７年、３８９（６６５２）、７３７〜４２）に記載がある。
【００４２】
本発明のさらに別の実施形態において、抗原特異的Ｔｒ１細胞は、以下のステップにより入手され得る。
ａ）多発性硬化症関連抗原によって白血球集団または末梢血単核球（ＰＢＭＣ）集団を刺激するステップと、
ｂ）前記刺激された集団から前記抗原特異的Ｔｒ１細胞集団を回復させるステップと、
ｃ）任意に前記抗原特異的Ｔｒ１細胞集団を拡大（ｅｘｐａｎｄ）させるステップ。
【００４３】
白血球は、いくつかの種類の細胞を包含する。これらのいくつかの種類の細胞は、その重要性、その分布、その数、その寿命およびその可能性により、特徴付けられる。これらの種類の細胞は、以下のもの、すなわち、多核白血球または顆粒白血球である。多核白血球または顆粒白血球のうち、好酸性白血球、好中性白血球および好塩基性白血球、および単核細胞または末梢血単核球（ＰＢＭＣ）がある。これらは、大型の白血球細胞であり、免疫系（リンパ球および単球）の細胞型からなる。前記白血球またはＰＢＭＣは、当業者にとって公知の任意の方法により、前記末梢血から分離することができる。有利なことに、前記ＰＢＭＣの分離において、遠心分離法（好適には、密度勾配遠心分離法、好適には、不連続密度勾配遠心分離法）を用いることができる。代替例として、特異的モノクローナル抗体の使用がある。特定の実施形態において、ＰＢＭＣは典型的には、フィコールハイパックの手段により標準的な手順を用いて、血液製剤全体から単離される。他の実施形態において、前記ＰＢＭＣは、白血球除去法により、回復される。前記方法について、前記特許出願ＷＯ２００７／０１０４０６に記載がある。
【００４４】
さらに別の実施形態において、Ｔｒ１細胞は、以下のステップにより入手され得る。
ａ）多発性硬化症関連抗原の存在下で白血球集団または末梢血単核球（ＰＢＭＣ）集団を間充織幹細胞と共に培養するステップ、および
ｂ）前記Ｔｒ１細胞集団を回復させるステップ。
【００４５】
前記方法は、ＰＢＭＣまたは白血球の代わりにナイーブまたは記憶Ｔ細胞を用いて行ってもよい。
【００４６】
このようにして入手されたＴｒ１細胞集団は、サイトカイン（例えば、インターロイキン２およびインターロイキン４）の存在下で培養によりさらに拡大され得る。あるいは、Ｔｒ１細胞拡大培養において、インターロイキン１５およびインターロイキン１３を用いてもよい。
【００４７】
上述した方法において、Ｔｒ１細胞は、ＷＯ２００５／０００３４４中に記載の識別の方法により、特徴付けることができる。前記Ｔｒ１細胞の識別方法は、ＣＤ４分子並びにＣＤ１８および／またはＣＤ１１ａおよびＣＤ４９ｂを含む群からの分子をコードする遺伝子の発現産物が同時に存在することを検出することに基づく。Ｔｒ１細胞は、前記マーカーに対する抗体と共にＥｌｉｓａ、フローサイトメトリーまたは免疫親和性方法により、特定および／または精製することができる。
【００４８】
Ｔｒ１細胞はまた、フローサイトメトリーまたは磁気ビーズを用いた正の選択または負の選択により濃縮することもできる。このような方法については、ＷＯ２００５／０００３４４中にも記載がある。
【００４９】
本発明の別の実施形態において、多発性硬化症関連抗原に方向付けられた前記Ｔｒ１細胞は、ＷＯ２００６／１０８８８２中に記載のインビトロ方法により、拡大され得る。前記方法は、以下のステップを含む。
ａ）３５℃よりも低い温度Ｔ１で培地Ｍｆにおいて、支持細胞（例えば、昆虫支持細胞）を培養するステップであって、前記温度Ｔ１により、支持細胞の増殖を可能にし、前記支持細胞は、以下の細胞表面タンパク質と相互作用する要素を発現する、ステップ、
−ＣＤ３／ＴＣＲ複合体、
−ＣＤ２８タンパク質、
−ＩＬ−２受容体、
−ＣＤ２タンパク質、
−ＩＬ−４受容体
ｂ）ステップａ）において入手された、除去されたがその培地Ｍｆは除去されていない前記支持細胞と、前記培地Ｍｐ中に含まれる前記Ｔｒ１細胞集団とを接触させるステップであって、前記培地Ｍｐは、初期にはステップａ）において引用された前記要素を含まず、これにより、前記Ｔｒ１細胞集団、前記支持細胞および前記培地Ｍｐを含む混合物を入手する、ステップ、
ｃ）ステップｂ）において入手された、前記混合物を温度Ｔ２で培養するステップであって、温度Ｔ２は少なくとも３５℃であり、前記温度は、前記Ｔｒ１細胞集団が増殖しかつ前記支持細胞が増殖しないように選択される、ステップ、および
ｄ）このように拡大した前記Ｔｒ１細胞集団を回復させるステップ。
【００５０】
前記の細胞表面タンパク質と相互作用する要素の例には、
−ＣＤ３重鎖の抗ＣＤ３細胞質内ドメインが膜貫通領域と交換された変性抗ＣＤ３抗体、
−ＣＤ８０またはＣＤ８６タンパク質、
−前記支持細胞によって分泌されるＩＬ−２、
−ＣＤ５８タンパク質、
−ＩＬ−４およびＩＬ−１３を含む群から選択されるインターロイキン、
が含まれる。
【００５１】
本発明の好適な実施形態において、多発性硬化症関連抗原に方向付けられた前記Ｔｒ１細胞は、Ｔ細胞をクローニングするための従来の方法を用いることにより、クローン化され得る。
【００５２】
本発明の好適な実施形態において、多発性硬化症関連抗原に方向付けられた少なくとも１つのＴｒ１細胞集団または多発性硬化症関連抗原に向けられたＴｒ１細胞の少なくとも１つのクローンを含む前記組成物が、保存できるように凍結され得る。
【００５３】
本発明の好適な実施形態において、前記多発性硬化症関連抗原は、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、ミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ）、ミエリンオリゴデンドロサイトタンパク質（ＭＯＧ）、プロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）、オリゴデンドロサイトミエリンオリゴタンパク質（ＯＭＧＰ）、ミエリン関連オリゴデンドロサイト塩基性タンパク質（ＭＯＢＰ）、オリゴデンドロサイト特異的タンパク質（ＯＳＰ／クローディン１１）、熱ショックタンパク質、オリゴデンドロサイト特異的タンパク質（ＯＳＰ）、ＮＯＧＯ  Ａ、糖タンパク質Ｐｏ、末梢性ミエリンタンパク質２２（ＰＭＰ２２）、２’３’環状ヌクレオチド３’ホスホジエステラーゼ（ＣＮＰａｓｅ）、並びにそれらの断片、変異体および混合物を含む群から選択される。
【００５４】
好適には、前記多発性硬化症関連抗原は、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、プロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）およびミエリンオリゴデンドロサイトタンパク質（ＭＯＧ）ペプチド並びにそれらの断片、変異体および混合物を含む群から選択される。
【００５５】
より好適には、前記多発性硬化症関連抗原は、ＨＬＡ−ＤＲ２が陽性の対象者のためにＭＢＰ８２−９８、ＭＢＰ８３−９９およびＭＢＰ１５１−１７０を含む群から選択される。
【００５６】
より好適には、前記多発性硬化症関連抗原は、ＨＬＡ−ＤＲ２が陽性の対象者のためにＭＯＧ３５〜５５、ＭＯＧ２１−４０、ＭＯＧ４１−６０、ＭＯＧ７１−９０、ＭＯＧ８１−１００、ＭＯＧ１１１−１３０およびＭＯＧ６３−３７を含む群から選択される。
【００５７】
より好適には、前記多発性硬化症関連抗原は、ＨＬＡ−ＤＲ４が陽性の対象者のためにＭＢＰ１１１−１２９およびＭＢＰ１１６−１２３を含む群から選択される。
【００５８】
より好適には、前記多発性硬化症関連抗原は、ＨＬＡ−ＤＲ４が陽性の対象者のためにＭＯＧ２１−４０、ＭＯＧ９７−１０８、ＭＯＧ７１−９０、ＭＯＧ１８１−２００を含む群から選択される。
【００５９】
本発明の別の目的は、上述したような組成物を含む薬剤を提供することである。
【００６０】
本発明はまた、上述したような組成物を含む薬学的組成物を、１つ以上の薬学的に許容可能なキャリアと組み合わせて提供することも意図する。
【００６１】
本明細書において有用な薬学的に許容可能なキャリアは、従来のものである。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｅｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１６版、Ｏｓｏｌ、Ａ．Ｅｄ（１９８０）において、本発明の組成物の薬剤送達に適した組成物および製剤についての記載がある。一般的に、キャリアの性質は、用いられている投与モードに依存する。例えば、非経口製剤は通常、薬学的かつ生理的に受容可能な流体（例えば、水、生理食塩水、平衡塩類溶液、水性デキストロース、ごま油、グリセロール、エタノール、その組み合わせなど）を送達媒体として含む注射用流体を含む。前記キャリアおよび組成物は無菌にすることができ、前記製剤は前記投与モードに適している。生物学的な中性キャリアに加えて、投与される薬学的組成物は、少量の無毒性補助物質（例えば、湿潤剤または乳化剤、防腐剤、およびｐＨ緩衝剤など（例えば、酢酸ナトリウムまたはソルビタンラウリン酸モノエステル）を含み得る。前記組成物は、液体溶液、懸濁液、エマルションであり得る。
【００６２】
本発明の１つの実施形態において、上述したような薬剤または薬学的組成物は、多発性硬化症関連抗原に方向付けられた本質的に少なくとも１つのＴｒ１細胞集団からなる。
【００６３】
本発明の別の実施形態において、上述したような薬剤または薬学的組成物は、多発性硬化症関連抗原に方向付けられた本質的にＴｒ１細胞集団の少なくとも１つのクローンからなる。
【００６４】
本明細書中に用いられる「本質的に〜からなる」とは、薬剤または薬学的組成物中に存在する細胞のうち少なくとも７０％（好適には７５％、８０％、８５％または９０％）が多発性硬化症関連抗原に方向付けられたＴｒ１細胞である薬剤または薬学的組成物を指す。
【００６５】
本発明の別の実施形態において、上述したような薬剤または薬学的組成物は、多発性硬化症関連抗原に方向付けられた少なくとも１つのＴｒ１細胞集団、または多発性硬化症関連抗原に方向付けられたＴｒ１細胞集団の少なくとも１つのクローンからなる。
【００６６】
本発明は、多発性硬化症の治療のための薬剤または薬学的組成物の調製のための上述したような組成物の使用に関する。
【００６７】
本発明の目的は、治療を必要としている対象者において多発性硬化症を治療する方法である。前記方法は、ここで上述したような薬剤または上述したような薬学的組成物の有効量を前記対象者に投与するステップを含む。
【００６８】
本発明によれば、ここで上述したような薬学的組成物または薬剤は、多発性硬化症を治療するためのものである。
【００６９】
本発明によれば、ここで上述したような薬学的組成物または薬剤は、多発性硬化症の治療において用いられる。
【００７０】
本発明によれば、前記薬学的組成物または薬剤は、可溶性の多発性硬化症関連抗原と組み合わせて用いられない。
【００７１】
本発明によれば、前記薬学的組成物または薬剤は、前記可溶性の多発性硬化症関連抗原と共にまたは前記可溶性の多発性硬化症関連抗原と組み合わせて前記対象者に投与されない。
【００７２】
本発明によれば、前記Ｔｒ１細胞が方向付けられた可溶性の多発性硬化症関連抗原との共処理は不要である。
【００７３】
前記組成物は、非経口、筋肉内、静脈内、腹腔内、注入、鼻腔内、肺吸入、皮内、関節内、髄腔内または消化管経由に合わせて製剤化され得る。
【００７４】
好適には、前記本発明の薬剤または薬学的組成物の投与は、筋肉内、腹腔内または静脈内注入によって行われるか、あるいは、好適には静脈内注入による患者のリンパ節内への直接注入によって行われ得る。
【００７５】
多発性硬化症の治療において有効な多発性硬化症関連抗原に方向付けられたＴｒ１細胞の量は、多発性硬化症の性質よって異なり、標準的な臨床技術によって決定することができる。製剤において用いられるべき正確な投与量も投与経路および当該疾患または疾患の深刻度によって異なるため、施術者および個々の状況に従って決定すべである。有効な投与量は、インビトロまたは動物モデル試験システムから得られた投与量−反応曲線から推定ことができる。
【００７６】
本発明の１つの実施形態において、１０４／ｋｇ〜１０９／ｋｇの細胞が前記対象者に投与される。好適には、１０５／ｋｇ〜１０７／ｋｇの細胞およびより好適には約１０６／ｋｇの細胞が前記対象者に投与される。
【００７７】
本発明の１つの実施形態において、前記対象者の臨床状態の低下によって再発が起こった場合、または例えば中枢神経系内のＭＲＩによて炎症病変が視認できた場合、前記対象者に前記薬剤を投与する。
【００７８】
本発明の１つの実施形態において、前記対象者に、本発明の薬剤または薬学的組成物を１回投与する。
【００７９】
本発明の第２の実施形態において、前記対象者に、本発明の薬剤または薬学的組成物を月に１回投与する。
【００８０】
本発明の第３の実施形態において、前記対象者に対し、本発明の薬剤または薬学的組成物を四半期毎に投与する。
【００８１】
本発明の第４の実施形態において、前記対象者に対し、本発明の薬剤または薬学的組成物を1年に１回から２回に投与する。
【００８２】
本発明の別の実施形態において、治療を必要としている対象者に投与されるべき薬剤または薬学的組成物は、前記対象者の細胞に対して自家であるＴｒ１細胞を含む。
【００８３】
すなわち、Ｔｒ１細胞の入手元である対象者に当該Ｔｒ１細胞が投与されるか、または、対象者から得られたＴｒ１細胞の産生に用いられた前駆体が投与される。
【００８４】
本発明の別の実施形態において、治療を必要としている対象者において多発性硬化症を治療するための前記方法は、有効量の本発明の薬剤または薬学的組成物を多発性硬化症の治療に用いられる１つ以上の治療薬と組み合わせて前記対象者に投与するステップを含む。
【００８５】
本発明は、本発明の薬学的組成物または薬剤の使用に関し、有効量の本発明の薬剤または薬学的組成物の前記対象者への投与は、多発性硬化症の治療に用いられる１つ以上の治療薬と組み合わせて行われる。
【００８６】
多発性硬化症の治療において一般的に用いられる治療薬の例を以下に挙げる。
−インターフェロン（例えば、ヒトインターフェロンベータ−１ａ（例えば、ＡＶＯＮＥＸ（Ｒ）またはＲｅｂｉｆ（Ｒ））、インターフェロンベータ−１ｂ（ＢＥＴＡＳＥＲＯＮ（ＴＭ）、位置１７において置換されたヒトインターフェロンベータ、Ｂｅｒｌｅｘ／Ｃｈｉｒｏｎ））、
−グラチラマー酢酸塩（コポリマー１、Ｃｏｐ−１、ＣＯＰＡＸＯＮＥ（ＴＭ）とも呼ばれる、Ｔｅｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）および誘導体、
−フマル酸エステル（例えば、フマル酸ジメチル（例えば、Ｆｕｍａｄｅｒｍ（Ｒ））、
−リツキサン（Ｒ）（リツキシマブ）または別の抗ＣＤ２０抗体（例えば、リツキシマブと共に重複エピトープと競合するかまたは重複エピトープに結合するもの）、
−ミトキサントロン（ＮＯＶＡＮＴＲＯＮＥ（Ｒ）、Ｌｅｄｅｒｌｅ）、
−化学療法薬（例えば、ｃｌａｂｒｉｂｉｎｅ（ＬＥＵＳＴＡＴＩＮ（Ｒ））、アザチオプリン（ＩＭＵＲＡＮ（Ｒ））、シクロホスファミド（ＣＹＴＯＸＡＮ（Ｒ））、シクロスポリン−Ａ、メトトレキサート、４−アミノピリジン、およびチザニジン）
−コルチコステロイド（例えば、メチルプレドニゾロン（ＭＥＤＲＯＮＥ（Ｒ）、Ｐｆｉｚｅｒ）、プレドニゾン）、
−免疫グロブリン（例えば、リツキサン（Ｒ）（リツキシマブ）、ＣＴＬＡ４  Ｉｇ、アレムツズマブ（ＭａｂＣＡＭＰＡＴＨ（Ｒ））またはダクリズマブ（ＣＤ２５に結合する抗体）、
−スタチン
−免疫グロブリンＧ静脈内（ＩｇＧＩＶ）、
−ナタリズマブ（タイサブリ）抗インテグリンアルファ−４抗体、
−経口ＣＣケモカイン受容体１拮抗薬ＢＸ４７１（ＺＫ８１１７５２）、
−ＦＴＹ７２０（フィンゴリモド）、
−ヒトサイトカインまたは成長因子の抗体または拮抗薬（例えば、ＴＮＦ、ＬＴ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２３、ＥＭＡＰ−Ｉ１、ＧＭ−ＣＳＦ、ＦＧＦ、およびＰＤＧＦ）、
−細胞表面分子に対する抗体（例えば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤ６９、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ９０またはそのリガンド）、
−ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸モフェチル、レフルノミド、非ステロイド性抗炎症薬剤（ＮＳＡＩＤ）（例えば、ホスホジエステラーゼ阻害剤、アデノシン作動薬、抗血栓剤、補体阻害剤、アドレナリン作動薬、本明細書中に記載のような炎症性サイトカインによるシグナル伝達を阻害する薬剤、ＩＬ−１［ベータ］変換酵素阻害剤（例えば、Ｖｘ７４０）、抗Ｐ７、ＰＳＧＬ、ＴＡＣＥ阻害剤、Ｔ細胞シグナル伝達阻害剤（例えば、キナーゼ阻害剤、メタロプロテアーゼ阻害剤、スルファサラジン、アザチオプリン、６−メルカプトプリン、アンジオテンシン変換酵素阻害剤、
−アマンタジン、バクロフェン、パパベリン、メクリジン、ヒドロキシジン、スルファメトキサゾール、シプロフロキサシン、ドキュセート、ペモリン、ダントロレン、デスモプレシン、デキサメタゾン、トルテロジン、フェニトイン、オキシブチニン、ビサコジル、ベンラファクシン、アミトリプチリン、メテナミン、クロナゼパム、イソニアジド、バルデナフィル、ニトロフラントイン、車前子親水性粘漿薬、アルプロスタジル、ガバペンチン、ノルトリプチリン、パロキセチン、臭化プロパンテリン、モダフィニル、フルオキセチン、フェナゾピリジン、メチルプレドニゾロン、カルバマゼピン、イミプラミン、ジアゼパム、シルデナフィル、ブプロピオンおよびセルトラリン。
【００８７】
現在用いられている組み合わせ治療の例を以下に示す。
−グラチラマー酢酸塩およびアルブテロール、
−グラチラマー酢酸塩およびミノサイクリン、
−インターフェロンベータ１ａおよびミコフェノール酸モフェチル、
−ＢＨＴ−３００９およびアトルバスタチン
【００８８】
本発明の好適な実施形態において、治療を必要としている対象者において多発性硬化症を治療するための前記方法は、有効量の本発明の薬剤または薬学的組成物をインターフェロンベータ、グラチラマー酢酸塩、ミトキサントロン、シクロホスファミド、メトトレキサート、アジアトロピン（ａｚｉａｔｈｒｏｐｉｎｅ）またはナタリズマブの群中の１つ以上の治療薬と組み合わせて前記対象者に投与するステップを含む。
【００８９】
本発明は、本発明の薬学的組成物または薬剤の使用に関する。前記使用において、有効量の本発明の薬剤または薬学的組成物を前記対象者に投与するステップは、インターフェロンベータ、グラチラマー酢酸塩、ミトキサントロン、シクロホスファミド、メトトレキサート、アジアトロピンまたはナタリズマブの群中の１つ以上の治療薬と組み合わせて行われる。
【００９０】
別の実施形態において、本発明はまた、多発性硬化症の治療の方法に関する。前記方法において、本発明の薬剤または薬学的組成物は、治療を必要としている対象者に投与され、前記対象者は、インターフェロンベータ、グラチラマー酢酸塩、ミトキサントロン、シクロホスファミド、メトトレキサート、アジアトロピンまたはナタリズマブの群中の１つ以上の治療薬に適切に応答しないかまたは適切に応答しない可能性がある。
【００９１】
本発明は、本発明の薬学的組成物または薬剤の使用に関する。前記使用において、前記対象者は、インターフェロンベータ、グラチラマー酢酸塩、ミトキサントロン、シクロホスファミド、メトトレキサート、アジアトロピンまたはナタリズマブの群中の１つ以上の治療薬に適切に応答しないかまたは適切に応答しない可能性がある。
【００９２】
「不適切な反応」および「適切に応答しない」または「適切に応答しない可能性がある」とは、実際のまたは推定される対象者からの反応を指し、当該対象者に関する限り、当該治療が有効ではないか、毒性があるかまたは免疫寛容性が低いかあるいはそのような可能性があることを示している。
【００９３】
従来の多発性硬化症の治療（例えば、インターフェロンベータ、グラチラマー酢酸塩、ミトキサントロン、シクロホスファミド、メトトレキサート、アジアトロピンまたはナタリズマブの群中の１つ以上の治療薬による治療）に対して適切に応答しないかまたは適切に応答しない可能性がある対象者は、当業者に従来から公知のようなＥＤＳＳスコア（総合障害度評価尺度）を用いて特定することができる。
実施例
【００９４】
以下の記載において、詳細なプロトコルの無い全ての実験を、標準的なプロトコルに基づいて行う。
【００９５】
以下の実施例は、本発明の好適な実施形態を示すために記載する。当業者であれば、以下の実施例中に開示される技術は、本発明者によって発見された、本発明の実施において良好に機能するように技術を示し、よって、好適な実施様式を構成するものとしてみなすことができることを理解するであろう。しかし、当業者であれば、本開示を鑑みれば、開示される特定の実施形態において多くの変更が可能であり、本発明の精神および範囲から逸脱することなく同様のまたは類似の結果を得ることができることを理解するであろう。
実験手順
【００９６】
マウス
Ｊａｎｖｉｅｒ（Ｌｅ  Ｇｅｎｅｓｔ−Ｓｔ−Ｉｓｌｅ、フランス）からＣ５７Ｂｌ／６マウスを入手した。Ｃ５７Ｂ１／６バックグラウンドのＭＯＧ３５〜５５特異的ＴＣＲトランスジェニックマウスをＰｒ．Ｌｉｂｌａｕ（ＩｎｓｅｒｍＵ５６３、Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｐｕｒｐａｎ、Ｔｏｕｌｏｕｓｅ）の研究所に収容した。全てのマウスは、７〜８週齢のメスであった。
抗体および試薬
【００９７】
マウス細胞精製およびキャラクタリゼーションのために、以下の抗体を用いた：抗ＣＤ４（Ｈ１２９−１９）抗ＣＤ６２Ｌ（Ｍｅｌ−１４）、（ＢＤ−Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｌｅ  Ｐｏｎｔ  ｄｅ  Ｃｌａｉｘ、フランス）。ＭＯＧ３５〜５５ペプチドは、Ｂａｃｈｅｍ（Ｖｏｉｓｉｎ−ｌｅ−Ｂｒｅｔｏｎｎｅｕｘ、フランス）からのものであった。ＩＬ−２は、Ｃｈｉｒｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｅｍｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、ＣＡ、米国）から入手した。ＩＬ−４、ＩＬ−１２および抗ＩＬ１２は、Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓ（ミネアポリス、米国）から購入した。
Ｔ細胞の精製および培養
【００９８】
Ｔ細胞培養のために用いた培地は、Ｉｓｃｏｖｅ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にＦＣＳ、Ｙｓｓｅｌ培地およびβ２−メルカプトエタノール（シグマ）を添加したものとした。ＭＯＧ３５〜５５特異的ＴＣＲトランスジェニックマウスからの脾細胞を先ずＦＩＴＣコンジュゲート抗ＣＤ６２ＬおよびＰＥコンジュゲート抗ＣＤ４でラベルした。次に、ＣＤ４＋ＣＤ６２Ｌ＋Ｔ細胞をＦＡＣＳｔａｒ  ＳＥ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、フランス）上でソートした。全集団の再分析における純度は＞９８％であった。ＭＯＧ３５〜５５に方向付けられたマウスＴｈ１、Ｔｈ２およびＴｒ１細胞を、以下のようにしてインビトロ分化後に入手した。２．５ｘ１０５個のソートされたＣＤ４＋ＣＤ６２Ｌ＋Ｔ細胞を、２４ウェルプレート中の４．１０６個の照射された同系脾細胞の存在下およびＭＯＧ３５〜５５個のペプチド（ｌ０μｇ／ｍｌ）の存在下で培養した。ＩＬ−１２（２０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−４（４０ｎｇ／ｍｌ）＋抗ＩＬ−１２（５μｇ／ｍｌ）またはＩＬ−１０（５０ｎｇ／ｍｌ）をＴ細胞分化のためにＴｈ１細胞、Ｔｈ２細胞およびＴｒ１細胞中にそれぞれ付加した。細胞を３７℃で５％のＣＯ２において培養し、Ｔｈ１についてＩＬ−２（１００ＵＩ／ｍｌ）が添加され、Ｔｈ２およびＴｒ１細胞についてＩＬ−２＋ＩＬ−４（２０ｎｇ／ｍｌ）が添加された培地において、必要なときに分割した。あるいは、Ｔｒ１細胞は、ＩＬ−１０（５ｎｇ／ｍｌ）が添加された培地中にも分割した。２〜３週間の間て、Ｔ細胞集団は週に１回再度刺激した。
サイトカインアッセイ
【００９９】
抗ＣＤ３（１０μｇ／ｍｌ）＋抗ＣＤ２８（ｌμｇ／ｍｌ）刺激されたＴ細胞集団の上清に対し、サンドイッチＥＬＩＳＡを４８時間行った。簡単に言うと、５．１０５個の細胞を、９６ウェル平底プレート中のコーティングされた抗ＣＤ３および可溶性抗ＣＤ２８モノクローナル抗体で活性化し、３７℃で５％のＣＯ２において４８時間培養した。抗ＩＬ−４（１１Ｂ１１）、抗ＩＬ−ｌ０（２Ａ５）、抗ＩＦＮ−γ（ＸＧＭ１．２）、ビオチン抗ＩＬ−４（２４Ｇ２）、抗ＩＬ−１０（ＳＸＣｌ）、抗ＩＦＮ−γ（Ｒ４−６Ａ２）（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ  Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて、ＥＬＩＳＡを行った。
実験的自己免疫脳脊髄炎
【０１００】
Ｃｕａらによって記載されたプロトコル（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ、１９９９年）に従って、実験的自己免疫脳脊髄炎を行った。簡単にいうと、完全フロイントアジュバントで調製した２．５ｍｇのマウス脊髄ホモジネートをＣ５７ＢＬ／６マウスに皮内注入した。二日後、２００ｎｇの百日咳毒素を腹腔内投与によってマウスに注入した。同一の免疫付与レジメンをＪ８およびＪ９において脊髄および百日咳毒素のためにそれぞれ繰り返した。以下の臨床スコアを１０日目から毎日評価した。０＝疾患無し、１＝尾の麻痺、２＝後肢の衰弱、３＝後肢の麻痺、４＝後肢＋前肢麻痺、５＝瀕死。９日目において、Ｔ細胞集団（３．１０５個の細胞／マウス）を静注経路で注入した。
結果
抗ＭＯＧ３５〜５５Ｔリンパ球の分化
【０１０１】
先ず、抗ＭＯＧ３５〜５５ＴＣＲトランスジェニックマウスから単離されたナイーブＣＤ４＋Ｔリンパ球から、抗ＭＯＧ３５〜５５ＣＤ４＋Ｔリンパ球集団を分化する。これらのマウスからの全てのリンパ球は、Ｈ−２ｂ分子の状況において提示されたペプチドＭＯＧ３５〜５５を特異的に認識する特異的ＴＣＲを有する。ナイーブ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ６２Ｌ＋）をソートし、照射された同系脾細胞およびＭＯＧ３５〜５５ペプチドと共にインビトロ活性化した。ＩＬ−１２を添加してＴｈ１細胞を分化させ、ＩＬ−４および抗ＩＬ−１２モノクローナル抗体を添加してＴｈ２細胞を分化させ、ＩＬ−１０を添加して、Ｔｒ１細胞を分化させた。２週間または３週間の刺激後、細胞を採取し、抗ＣＤ３＋抗ＣＤ２８刺激の下でそのサイトカイン産生について試験した。結果を図１に示す。
【０１０２】
ＩＬ−１０の存在下において分化させた細胞は、高ＩＬ−１０および低ＩＬ−４産生によるＴｒ１細胞サイトカイン産生の典型的パターンを得たことが観察された。分化細胞のＩＬ−４刺激は、Ｔｈ２細胞がＩＬ−４およびＩＬ−１０を等しく産生し、ＩＦＮ−γを産生しないということを生じさせる。顕著なＩＬ−１０産生にも関わらず、分化細胞のＩＬ−１２刺激は、高くＩＦＮ−γを産生し、ＩＬ−４を産生しないというＴｈ１サイトカイン産生プロファイルを生じさせる。
抗ＭＯＧ３５〜５５ＴＲｌ細胞のインビボ抑制機能
【０１０３】
次に、マウスにおける実験的自己免疫脳脊髄炎に対する分化抗ＭＯＧＴ細胞集団の効果を評価した。この目的のため、全フロイントアジュバント中のマウス脊髄ホモジネート（ｍｓｃｈ）によってＣ５７Ｂｌ／６マウスに免疫付与した後１日経過した後、百日咳毒素の腹腔内投与を行った。同一レジメンをｍｓｃｈおよび百日咳毒素それぞれについて８日目および９日目に繰り返した。９日目に、免疫されたマウスに対して抗ＭＯＧＴｈ１、Ｔｈ２およびＴｒ１細胞集団を静脈内注入し、臨床スコアを１日１回評価した。図２は、実験的脳脊髄炎の進化に対する抗ＭＯＧＣＤ４陽性Ｔ細胞の影響を示す。前記ＭＯＧ３５〜５５ペプチドに方向付けられたＴｈ１細胞およびＴｈ２細胞は、ｍｓｃｈ免疫付与によって誘発されたＥＡＥに対して有意な効果を持たなかったことを観察した。それとは対照的に、抗ＭＯＧ３５〜５５Ｔｒ１細胞を投与した場合、免疫されたマウスにおけるＥＡＥの進行が顕著に抑制された。実際、対照マウスは、後肢の運動機能の減少を発生したのに対して、ミエリン抗原に方向付けられたＴｒ１細胞で治療したマウスには、軽微な尾の麻痺が発生した。重要なことに、Ｔｒ１投与により、疾患の進行が抑制されただけでなく、非Ｔ細胞で治療された動物において発生する再発も抑えられる。以前の研究（Ｂａｒｒａｔら、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ、２００２）によれば、抗オボアルブミンＴｒ１細胞はマウスにおいてＥＡＥを抑えることができることが分かっている。これらの抑制効果は、オボアルブミンの頭蓋内注入後のみに達成された。これは、脳中のＴｒ１細胞の特異的抗原活性化がそのエフェクター機能に欠かせないことを示す。従って、自己抗原が中枢神経系の本質的要素としてこのようなサプレッサー細胞活性剤の機能を果たすことができるか否かを評価することが望まれた。実験によれば、この質問に対する答えは肯定的であり、これは、ミエリン抗原に方向付けられたＴｒ１細胞は脳脊髄炎をインビボで抑制することができることを示す。前記ＭＯＧタンパク質は、この脳炎症のマウスモデルにおける炎症性細胞の標的の１つである。同一抗原に方向付けられたＴｒ１細胞が炎症を抑制するという事実は、炎症性疾患のＴｒ１治療が、免疫寛容が破壊された抗原を直接標的にできることを示唆している。
【図１】
2014221819.tif 000002
【図２】
2014221819.tif 000003