(57)【要約】【課題】本発明は、カチオン性官能基及びアニオン性官能基を有する、ポリ（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート）由来のポリマーを、少ない工程で簡便に製造することを目的とする。【解決手段】２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）を含む混合物を調製する調製工程と、混合物に紫外線を照射する照射工程と、を含む、温度応答性ポリマーの製造方法であって、調製工程において、混合物は、重合禁止剤及び水を更に含み、照射工程において、紫外線は、不活性雰囲気下において、照射される、ことを特徴とする、温度応答性ポリマーの製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）を含む混合物を調製する調製工程と、
前記混合物に紫外線を照射する照射工程と、
を含む、温度応答性ポリマーの製造方法であって、
前記調製工程において、前記混合物は、重合禁止剤及び水を更に含み、
前記照射工程において、前記紫外線は、不活性雰囲気下において、照射される、
ことを特徴とする、温度応答性ポリマーの製造方法。
【請求項２】
請求項１に記載の製造方法により製造され、ここで、
式（Ｉ）で表される繰り返し単位（Ａ）
【化１】
2014162865.tif 000007
、及び式（ＩＩ）で表される繰り返し単位（Ｂ）
【化２】
2014162865.tif 000008
を含むことを特徴とする、温度応答性ポリマー。
【請求項３】
前記繰り返し単位（Ｂ）に対する前記繰り返し単位（Ａ）の割合が、０．５〜３２であることを特徴とする、請求項２に記載の温度応答性ポリマー。
【請求項４】
数平均分子量（Ｍｎ）が、１０ｋＤａ〜５００ｋＤａであり、
重量平均分子量（Ｍｗ）と前記数平均分子量（Ｍｎ）との比（Ｍｗ／Ｍｎ）が、１．１〜１０．０である
ことを特徴とする、請求項２又は３に記載の温度応答性ポリマー。
【請求項５】
請求項２〜４のいずれか一項に記載の温度応答性ポリマーを、その曇点以下の温度まで冷却する冷却工程と、
前記曇点以下の温度を有する前記温度応答性ポリマーを、細胞培養器の培養面に流延させる流延工程と、
前記温度応答性ポリマーが前記培養面に流延された前記細胞培養器を、前記曇点超の温度まで加熱する加熱工程と、
を含むことを特徴とする、細胞培養器の製造方法。
【請求項６】
請求項５に記載の製造方法により製造されたことを特徴とする、細胞培養器。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特に、カチオン性官能基及びアニオン性官能基を有する、ポリ（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート）由来のポリマーを、少ない工程で簡便に製造することが可能な温度応答性ポリマーの製造方法、該製造方法により製造された温度応答性ポリマー、該温度応答性ポリマーを用いた細胞培養器の製造方法、及び該製造方法により製造された細胞培養器に関する。
【背景技術】
【０００２】
温度応答性ポリマーは、所定の温度（下限臨界溶液温度：Lower Critical Solution Temperature、以下、「曇点」ともいう。）未満では水に溶解するが、所定の温度以上では不溶化して沈殿する、という物性を備えるポリマーである。
【０００３】
２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）の重合体である、ポリ（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート）（ＰＤＭＡＥＭＡ）は、約３２℃の曇点を有する温度応答性ポリマーとして知られている。
【０００４】
従来のＰＤＭＡＥＭＡの製造方法では、ＤＭＡＥＭＡを含む混合物を調製して（調製工程）、その後、この混合物に紫外線を照射する（照射工程）ことによってＤＭＡＥＭＡをラジカル重合させることによって、ＰＤＭＡＥＭＡを製造する（特許文献１参照）。
【０００５】
ここで、ＰＤＭＡＥＭＡの側鎖に結合する、カチオン性の２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエトキシ基を含むエステル基の一部を、加水分解によりアニオン性のカルボキシル基に変換することによって、物性を変化させたＰＤＭＡＥＭＡ由来のポリマーを製造する需要も存在していた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Wetering P et al, J Controlled Release 49, p59-69, 1997.
【非特許文献２】Wetering P at al, Macromolecules 31, p8063-8068, 1998.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、上記従来のＰＤＭＡＥＭＡの製造方法を用いて、カチオン性の２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエトキシ基、及びアニオン性のカルボキシル基を有するＰＤＭＡＥＭＡ由来のポリマーを製造する場合、側鎖にエステル基を介してカチオン性の２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエトキシ基を有するＤＭＡＥＭＡを、紫外線を照射することによって、ラジカル重合させた後、エステル基の一部を加水分解することによって、アニオン性のカルボキシル基を生じさせる必要があり、製造に要する工程が多いという問題があった。
【０００８】
そこで、本発明は、カチオン性官能基及びアニオン性官能基を有する、ポリ（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート）由来のポリマーを、少ない工程で簡便に製造することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の要旨は以下の通りである。
本発明の温度応答性ポリマーの製造方法は、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）を含む混合物を調製する調製工程と、前記混合物に紫外線を照射する照射工程と、を含む、温度応答性ポリマーの製造方法であって、前記調製工程において、前記混合物は、重合禁止剤及び水を更に含み、前記照射工程において、前記紫外線は、不活性雰囲気下において、照射される、ことを特徴とする。
【００１０】
本発明の温度応答性ポリマーは、請求項１に記載の製造方法により製造されたものであり、ここで、
式（Ｉ）で表される繰り返し単位（Ａ）
【化１】
2014162865.tif 000002
、及び式（ＩＩ）で表される繰り返し単位（Ｂ）
【化２】
2014162865.tif 000003
を含む、ことを特徴とする。
【００１１】
また、本発明の温度応答性ポリマーは、前記繰り返し単位（Ｂ）に対する前記繰り返し単位（Ａ）の割合が、０．５〜３２であることが好ましい。
【００１２】
更に、本発明の温度応答性ポリマーは、数平均分子量（Ｍｎ）が、１０ｋＤａ〜５００ｋＤａであり、重量平均分子量（Ｍｗ）と前記数平均分子量（Ｍｎ）との比（Ｍｗ／Ｍｎ）が、１．１〜１０．０であることが好ましい。
【００１３】
本発明の細胞培養器の製造方法は、上記温度応答性ポリマーを、その曇点以下の温度まで冷却する冷却工程と、前記曇点以下の温度を有する前記温度応答性ポリマーを、細胞培養器の培養面に流延させる流延工程と、前記温度応答性ポリマーが前記培養面に流延された前記細胞培養器を、前記曇点超の温度まで加熱する加熱工程と、を含むことを特徴とする。
なお、本発明において、ポリマーの「曇点」とは、必ずしも厳密な意味で、「所定の温度未満では溶解するが、所定の温度以上では不溶化して沈殿する、その温度」を指すものではなく、「不溶化して沈殿したポリマーを所定の温度未満の条件下で溶解する際に、溶解に要する時間が１０分以上である、その温度」をも指す。
【００１４】
本発明の細胞培養器は、上記細胞培養器の製造方法により製造されたことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の温度応答性ポリマーの製造方法によれば、カチオン性官能基及びアニオン性官能基を有する、ポリ（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート）由来のポリマーを、少ない工程で簡便に製造することができる。本発明の温度応答性ポリマーによれば、曇点以上の温度で形成された温度応答性ポリマーの不溶化物が、室温（約２５℃）条件下で再溶解するまでの時間を顕著に遅延させることができる。本発明の細胞培養器の製造方法によれば、温度応答性ポリマーを被覆した細胞培養器を、簡便な方法で製造することができる。本発明の細胞培養器によれば、室温程度の条件下での細胞培養の操作を可能とすることができ、また、管腔状の構造を有する細胞構造体を、簡便に製造することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明の温度応答性ポリマーの製造方法、温度応答性ポリマー、細胞培養器の被覆方法、及び細胞培養器の実施形態について詳細に例示説明する。
【００１７】
（温度応答性ポリマーの製造方法）
本発明の温度応答性ポリマーの製造方法では、まず、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）を含む混合物を調製する（調製工程）。ここで、混合物は、重合禁止剤及び水を更に含む。
【００１８】
２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）としては、市販品を用いることができる。重合禁止剤としては、メチルヒドロキノン（ＭＥＨＱ）、ヒドロキノン、ｐ−ベンゾキノリン、Ｎ，Ｎ−ジエチルヒドロキシルアミン、Ｎ−ｎｉｔｒｏｓｏ−Ｎ−ｐｈｅｎｙｌｈｙｄｒｏｘｙｌａｍｉｎｅ（Ｃｕｐｆｅｒｒｏｎ）、ｔ−ブチルハイドロキノン、等が挙げられる。また、市販のＤＭＡＥＭＡに含まれるＭＥＨＱ等をそのまま用いてもよい。水としては、超純水が挙げられる。
【００１９】
重合禁止剤の混合物に対する重量割合は、０．０１％〜１．５％であることが好ましく、０．１％〜０．５％であることが更に好ましい。上記範囲とすれば、ラジカル重合反応の暴走を抑制して、制御できない架橋を低減することができ、製造される温度応答性ポリマーの溶媒に対する溶解性を確保することができる。
水の混合物に対する重量割合は、１．０％〜５０％であることが好ましく、９．０％〜３３％であることが更に好ましい。上記範囲とすれば、側鎖の加水分解反応の反応速度と、重合するポリマー鎖の成長反応の反応速度とを、バランスよく調和させることができる。これにより、側鎖が加水分解されたＤＭＡＥＭＡに対する、側鎖が加水分解されていないＤＭＡＥＭＡの割合（共重合割合）が１．０〜２０程度の温度応答性ポリマーを得ることができる。
【００２０】
次いで、本発明の一例の温度応答性ポリマーの製造方法では、混合物に紫外線を照射する（照射工程）。ここで、紫外線は、不活性雰囲気下において、照射される。ＤＭＡＥＭＡは、紫外線の照射により、ラジカル重合して、ポリマーとなる。
この工程では、例えば、透明な密封バイアルに、上記混合物を加え、不活性ガスをバブリングすることによってバイアル内を不活性雰囲気とした後に、バイアルの外部から紫外線照射装置を用いて紫外線を照射する。
【００２１】
紫外線の波長としては、２１０ｎｍ〜６００ｎｍであることが好ましく、３６０ｎｍ〜３８０ｎｍであることが更に好ましい。上記範囲とすれば、効率よく重合反応を進行させることができ、所期の共重合割合を有する高分子材料を安定的に得ることができる。また、製造したポリマー材料が着色することを防ぐこともできる。
不活性ガスとしては、窒素、アルゴン、ヘリウム、ネオン等が挙げられる。
【００２２】
反応条件に関して、温度条件としては、１５℃〜５０℃であることが好ましく、２０℃〜３０℃であることが更に好ましい。上記範囲とすれば、熱による開始反応を抑制し、光照射による開始反応を優先的に進行させることができる。また、加水分解反応の反応速度をポリマー鎖の成長反応の反応速度に対してバランスのよいものにすることができる。
反応時間としては、７時間〜２４時間であることが好ましく、１７時間〜２１時間であることが更に好ましい。上記範囲とすれば、温度応答性ポリマーを高収率で得ることができ、また、光分解反応や不要な架橋反応を抑制しながらラジカル重合を行うことができる。
【００２３】
なお、調製工程において混合物が調製され終えてから、照射工程において紫外線の照射が開始されるまでの時間は、１０分〜１時間であることが好ましい。
【００２４】
混合物を加えたバイアルの内部の気体を置換して、バイアル内を不活性雰囲気とする際には、１０分程度の時間を要する。そのため、上記時間を１０分未満とすると、ラジカル重合に必要となる不活性雰囲気が得られない虞がある。また、混合物中では、ＤＭＡＥＭＡの加水分解反応が、紫外線の照射が開始される前に開始される。そのため、上記時間を１時間超とすると、ラジカル重合反応に不活性なメタクリル酸が混合物中に多数生じてしまう。
【００２５】
本発明の温度応答性ポリマーの製造方法では、混合物に水が含まれるため、ＤＭＡＥＭＡのラジカル重合反応と、ポリ２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＰＤＭＡＥＭＡ）の側鎖のエステル結合の加水分解反応とを、拮抗させることができる。
この拮抗により、得られる生成物は、式（Ｉ）で表される繰り返し単位（Ａ）
【化３】
2014162865.tif 000004
、及び式（ＩＩ）で表される繰り返し単位（Ｂ）
【化４】
2014162865.tif 000005
を含むポリマーとなる。
そのため、ポリマーが有するカチオン性官能基、すなわち、ジメチルアミノ基と、ポリマーが有するアニオン性官能基、すなわち、側鎖のエステル結合が加水分解されてできたカルボキシル基の両方を、バランスよく備えることができる。そして、本発明の温度応答性ポリマーの製造方法によれば、カチオン性官能基及びアニオン性官能基を有する、ポリ（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート）由来のポリマーを、少ない工程で簡便に製造することができる。
【００２６】
なお、本発明の温度応答性ポリマーの製造方法と同一の製造方法ではなくとも、ＤＭＡＥＭＡ、重合禁止剤、及び水が、紫外線照射時に反応系中に共存していれば、本発明の温度応答性ポリマーの製造方法の上記効果と同様の効果を得ることができる。
例えば、ＤＭＡＥＭＡ及び重合禁止剤を含む混合物と、水とを別々に準備し、次いで、混合物と水とに不活性ガスをバブリングし、その後、混合物と水とを不活性雰囲気下で混合すると同時に紫外線を照射するという、温度応答性ポリマーの製造方法も、本発明の温度応答性ポリマーに含めることができる。
【００２７】
（温度応答性ポリマー）
本発明の温度応答性ポリマーは、上記本発明の製造方法により製造される。
【００２８】
ここで、本発明の温度応答性ポリマーとしては、数平均分子量（Ｍｎ）が、１０ｋＤａ〜５００ｋＤａである分子が好ましい。また、重量平均分子量（Ｍｗ）と数平均分子量（Ｍｎ）との比（Ｍｗ／Ｍｎ）は、１．１〜１０．０である分子が好ましい。
温度応答性ポリマーの分子量は、紫外線の照射時間及び照射強度の条件により、適宜調整することができる。
【００２９】
本発明の温度応答性ポリマーによれば、曇点を、例えば室温（２５℃）以下に、低下させることができる。
【００３０】
上記温度応答性ポリマーでは、曇点以上の温度で形成された温度応答性ポリマーの不溶化物が、室温（約２５℃）条件下で再溶解するまでの時間が顕著に遅延する。これは、得られた温度応答性ポリマーは、分子内にカチオン性官能基とアニオン性官能基とが存在するため、高い自己凝集性を有するためであると推定される。
【００３１】
また、この本発明の温度応答性ポリマーを用いて、後述するように、培養面にこの温度応答性ポリマーを被覆してなる細胞培養器を調製することができる。
【００３２】
更に、本発明の一例の温度応答性ポリマーによれば、後述するように、細胞を適切な培養条件で培養することにより、管腔状（チューブ状）の構造を有する細胞構造体を形成させることができる。
【００３３】
本発明の温度応答性ポリマーが有する、カチオン性官能基（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ基）の官能基数と、アニオン性官能基（カルボキシル基）の官能基数との比（Ｃ／Ａ比）は、０．５〜３２であることが好ましく、４〜１６であることが更に好ましい。
【００３４】
Ｃ／Ａ比を上記範囲とすれば、曇点を低減させるという上記効果が得られやすい。上記Ｃ／Ａ比を有する温度応答性ポリマーでは、上記温度応答性ポリマー中でカチオン性官能基とアニオン性官能基とが、イオン結合的に分子間及び／又は分子内の凝集に作用して、温度応答性ポリマーの凝集力が強くなった結果であると推測される。
【００３５】
また、Ｃ／Ａ比を上記範囲とすれば、上記温度応答性ポリマー中の正電荷と負電荷とのバランスを特に好適にして、正電荷による細胞傷害性を抑制することができ、また、上記温度応答性ポリマーの親水性と疎水性とのバランスを特に好適にして、細胞の遊走や配向を生じやすくすることができるものと推定される。
【００３６】
（細胞培養器の製造方法）
本発明の細胞培養器の製造方法は、上記の温度応答性ポリマーを、その曇点以下の温度まで冷却する冷却工程と、曇点以下の温度を有する温度応答性ポリマーを、細胞培養器の培養面に流延させる流延工程と、温度応答性ポリマーが培養面に流延された細胞培養器を、曇点超の温度まで加熱する加熱工程と、を含む。
【００３７】
本発明の細胞培養器の製造方法では、まず、上記の温度応答性ポリマーを、その曇点以下の温度まで冷却する（冷却工程）。
この工程では、例えば、温度応答性ポリマーを約４℃の冷蔵庫に入れることによって、上記温度応答性ポリマーを曇点以下の温度まで冷却することができる。
【００３８】
次いで、本発明の細胞培養器の製造方法では、曇点以下の温度を有する温度応答性ポリマーを、細胞培養器の培養面に流延させる（流延工程）。
この工程では、例えば、曇点以下の温度を有する温度応答性ポリマーを、細胞培養器の培養面を傾けることによって、又はスパチュラを用いてポリマーを延ばすことによって、温度応答性ポリマーを流延させることができる。
【００３９】
細胞培養器としては、市販の細胞培養用のプレート、ディッシュ、フラスコ等が挙げられる。細胞培養器の材質としては、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリプロピレン、ポリブテン、ポリエチレン、ガラス等が挙げられる。
【００４０】
そして、本発明の細胞培養器の製造方法では、温度応答性ポリマーが培養面に流延された細胞培養器を、曇点超の温度まで加熱する（加熱工程）。
この工程は、例えば、流延工程後の細胞培養器を３７℃のインキュベーター中で静置することによって、上記温度応答性ポリマーを曇点超の温度まで加熱することができる。
【００４１】
本発明の細胞培養器の製造方法によれば、温度応答性ポリマーを細胞培養器の表面に被覆するための特別な処理、例えば、放射線グラフト重合などを施すことを要しない。すなわち、本発明の細胞培養器の調製は、該培養器を用いる研究者自身により、簡便な方法で（特殊な装置を要することなく）、低コストで行うことができる。
【００４２】
（細胞培養器）
本発明の細胞培養器は、上記の本発明の細胞培養器の製造方法により製造される。
【００４３】
この細胞培養器によれば、一般的な３７℃のインキュベーター中で細胞を培養して、組織を形成させた後、曇点以下の条件にすることにより、トリプシン処理等の細胞剥離操作を行うことなく、例えば、細胞シート状の構造を有する細胞を回収することができる。
そのため、この細胞培養器を用いて細胞を培養すれば、室温程度の条件下での細胞培養の操作が可能となる。
【００４４】
更に、本発明の一例の温度応答性ポリマーによれば、細胞を適切な培養条件で培養することにより、管腔状（チューブ状）の構造を有する細胞構造体を簡便に形成させることができる。
これは、上記温度応答性ポリマーが側鎖に有する疎水性基及びカチオン性基が、何らかの相互作用をしながら、細胞に刺激を与えていると推定される。また、カチオン性基とアニオン性基とを有する温度応答性ポリマーは、正電荷と負電荷とのバランスを好適にして、細胞傷害性を抑制し（哺乳類細胞の細胞膜の表面は負電荷を帯びているため、カチオン性物質は細胞傷害性を有することが多い）、且つ、上記温度応答性ポリマーの親水性と疎水性とのバランスを好適にして、細胞の遊走や配向を可能にしているものと推定される。
また、この細胞培養器によれば、細胞を適切な培養条件で培養することにより、管腔状（チューブ状）の構造を有する細胞構造体を形成させることができる。
【００４５】
本発明の細胞培養器では、該細胞培養器の培養面が、単位面積当たりに有する、本発明の温度応答性ポリマーの量が、５．０ｎｇ／ｍｍ２〜５０ｎｇ／ｍｍ２であることが好ましく、１５ｎｇ／ｍｍ２〜４０ｎｇ／ｍｍ２であることが更に好ましい。上記範囲とすれば、細胞構造体を形成させやすくするという効果が得られやすい。
【００４６】
（細胞培養方法）
以下に、本発明の温度応答性ポリマー、及び本発明の細胞培養器を用いた細胞培養方法について記載する。
上記細胞培養方法は、上記の本発明の細胞培養器に細胞を播種する播種工程と、播種された細胞を培養する培養工程とを含む。播種条件及び培養条件は、細胞種や実験目的に基づいて、当業者は適切に定めることができる。そして、この細胞培養方法は、細胞種に限定されることなく、血管細胞、脂肪幹細胞、肝細胞、軟骨細胞、線維芽細胞、心筋細胞、腎細胞、神経細胞、平滑筋細胞、軟骨細胞等の様々な細胞に適用することができる。
【００４７】
（管腔状（チューブ状）細胞の培養方法）
ここで、一例の細胞培養方法では、播種される細胞の密度が１．０×１０３個／ｍｍ２未満（培養面の面積が２００ｍｍ２である２４ウェル細胞培養プレートに１．０ｍＬの細胞浮遊液を加えることにより播種する場合、２０×１０４個／ｍＬ未満）であることが好ましい。なお、播種される細胞は、生きた細胞とする。
上記細胞密度とすれば、管腔状（チューブ状）の構造を有する細胞構造体を形成させることができる。
【００４８】
上記一例の細胞培養方法は、血管内皮細胞、脂肪細胞、脂肪幹細胞、線維芽細胞など間葉系の細胞に対して、特に好適に適用することができる。初代細胞の場合は、コロニーを形成する接着性細胞を選択すれば良く、当業者によって適宜選択可能である。
【実施例】
【００４９】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明は下記の実施例に何ら限定されるものではない。
【００５０】
下記の試験において、市販の試薬は、特に断りのない限り更に精製することなく用いた。
【００５１】
（試験１）ポリマーの製造
分子内イオン複合体型温度応答性ポリマーの製造（実施例製法１）
容量５０ｍＬの軟質ガラス製の透明なバイアル瓶に、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）１０．０ｇ、及び水５００μＬを加えて、磁気撹拌器を用いて撹拌した。そして、この混合物（液体）に対してＧ１グレードの高純度（純度：９９．９９９９５％）の窒素ガスを１０分間パージ（流速：２．０Ｌ／分）することにより、この混合物を脱酸素した。なお、用いたＤＭＡＥＭＡには、重合禁止剤であるメチルヒドロキノン（ＭＥＨＱ）が０．５重量％含まれていた。
その後、この反応物に対して、丸型ブラック蛍光灯（ＮＥＣ社製、型番：ＦＣＬ２０ＢＬ、１８Ｗ）を用いて、２２時間紫外線照射することにより、上記反応物を重合させた。反応物は、５時間後に粘性を帯び１５時間後に固化して、重合体が反応生成物として得られた。この反応生成物を２−プロパノールに溶解させ、溶液を透析チューブに移した。そして、透析を７２時間行い、反応生成物を精製した。
反応生成物を含む溶液を、セルロース混合エステル製の０．２μｍフィルター（東洋濾紙社製、型番：２５ＡＳ０２０）で濾過し、得られた濾液を凍結乾燥させることにより、温度応答性（ホモ）ポリマーが得られた（収量：６．８ｇ、転化率：６８％）。このポリマーの数平均分子量（Ｍｎ）を、ＧＰＣ（島津社製、型番：ＬＣ−１０ｖｐシリーズ）を用いて、ポリエチレングリコール（Ｓｈｏｄｅｘ社製、ＴＳＫシリーズ）を標準物質として測定し、Ｍｎ＝１６０，０００（Ｍｗ／Ｍｎ＝３．０）と決定した（実施例ポリマー１）。
【００５２】
分子内イオン複合体型温度応答性ポリマーの製造（実施例製法２）
水を１０００μＬとした以外は、実施例製法１と同様に、分子内イオン複合体型温度応答性ポリマーを合成した。このポリマーの数平均分子量（Ｍｎ）を、Ｍｎ＝１０３，０００（Ｍｗ／Ｍｎ＝４．３）と決定した（実施例ポリマー２）。
【００５３】
分子内イオン複合体型温度応答性ポリマーの製造（実施例製法３）
水を５０００μＬとした以外は、実施例製法１と同様に、分子内イオン複合体型温度応答性ポリマーを合成した。このポリマーの数平均分子量（Ｍｎ）をＭｎ＝６０，０００と決定した（Ｍｗ／Ｍｎ＝７．４）（実施例ポリマー３）。なお、実施例ポリマー１、２及び３のいずれにおいてもＧＰＣピークの変形が認められた。また、重合反応において加えられる水の量に依存してピークに広がりが見られた。これは、ポリマー分子がカチオン性ポリマー用に調整されたカラム中を移動する際に、ポリマー分子に導入されたアニオン性部分のイオン排除効果に起因して、ポリマー分子がカラム中を滑る現象によるものと考えられる。
【００５４】
実施例ポリマー１〜実施例ポリマー３の核磁気共鳴スペクトル（ＮＭＲ）を、核磁気共鳴装置（Ｖａｒｉａｎ社製、型番：Ｇｅｍｉｎｉ３００）を用いて、重水（Ｄ２Ｏ）を標準物質として測定した。下記には、実施例ポリマー１〜実施例ポリマー３に共通する代表的なピークを示す。
1H-NMR (in D2O) δ 0.8-1.2 (br, -CH2-C(CH3)-), 1.6-2.0 (br, -CH2-C(CH3)-), 2.2-2.4 (br, -N(CH3)2), 2.5-2.7 (br, -CH2-N(CH3)2), 4.0-4.2 (br, -O-CH2-).
ここで、主鎖のメチル基（δ 0.8-1.2）のプロトン数（ＤＭＡＥＭＡのホモポリマーの場合はモノマー１分子につき３個）Ａと、側鎖のジメチルアミノ基（δ 2.2-2.4）のメチルプロトン数（ＤＭＡＥＭＡのホモポリマーの場合はモノマー１分子につき６個で）Ｂとから、側鎖が有するアミノ基の官能基数と、重合反応と同時に進行する側鎖のエステル結合の加水分解反応により生じた側鎖のカルボキシル基の官能基数との比を算出した。
その結果、実施例ポリマー１の場合は９４：６、実施例ポリマー２の場合は９２：８、実施例ポリマー３の場合は５０：５０となった。これは、カチオン性ポリマーとアニオン性ポリマーとを含む２成分混合系におけるイオン複合体で言うＣ／Ａ比に換算すると、それぞれ、Ｃ／Ａ比＝１５．６、１１．５、１．０となる。上記の結果から、混合物中の水の量が増加するほど、紫外線照射により生成する温度応答性ポリマーが有するアニオン性官能基の数が増加することが確認された。
詳細な条件及び結果を表１に示す。
【００５５】
２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレートホモポリマーの合成、水を含まない場合（比較例製法１）
水を０μＬとした以外は、実施例製法１と同様に重合反応を行い、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレートのホモポリマーを得た。このポリマーの数平均分子量（Ｍｎ）を、Ｍｎ＝１３４，０００（Ｍｗ／Ｍｎ＝３．４）と決定した（比較例ポリマー１）。
【００５６】
分子内イオン複合体型温度応答性ポリマーの合成、重合禁止剤を含まない場合（比較例製法２）
２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレートを減圧蒸留により精製し、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート中に含まれるＭＥＨＱ（重合禁止剤）を除去した以外は、実施例製法１と同様に、分子内イオン複合体型温度応答性ポリマーの合成を試みた。反応物は、約２時間後に粘性を帯び３時間後に完全に固化した。反応生成物は、２−プロパノール、水、クロロホルム、及びメタノールのいずれの溶媒にも溶解しなかった。実施例のポリマーのように水溶液にして用いることが可能なポリマーは得られなかった（比較例ポリマー２）。
【００５７】
分子内イオン複合体型温度応答性ポリマーの合成、不活性雰囲気下でない場合（比較例製法３）
混合物に対して乾燥空気をパージした以外は、実施例製法１と同様に、分子内イオン複合体型温度応答性ポリマーの合成を試みた。反応物は、約２時間後に粘性を帯びて褐色に着色し、約５時間後に固化した。反応生成物に、２−プロパノール、水、クロロホルム、又はメタノールを加えたところ、この反応生成物は、いずれの溶媒の場合にも、膨潤するか、又は高粘度を有するゲル状体となった。その後に、溶媒を追加してもポリマーは溶解することはなく、溶媒を含んだポリマーと追加した溶媒とが相分離するだけであった。因みに、ゲル状体は高い曳糸性を有し、被験物質を垂直方向に曳く曳糸性評価試験において１ｍ以上の高さにまで糸が切れずに繋がった。実施例のポリマーのように水溶液にして用いることが可能なポリマーは得られなかった（比較例ポリマー３）。
【００５８】
分子内イオン複合体型温度応答性ポリマーの合成、カチオン性官能基を有するモノマーとアニオン性官能基を有するモノマーとを共重合させた場合（比較例製法４）
カチオン性官能基を有する２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）と、アニオン性官能基を有する４−ビニル安息香酸又はそのＮａ塩とを用いて、比較例製法１と同様に、ポリマーの製造を試みた。しかしながら、両モノマー分子間が、イオン結合の形成により、凝固層を形成して、反応系全体が白濁した。実施例製法１〜３のようなポリマーの製造は困難であった。
詳細な条件及び結果を表１に示す。
【００５９】
（試験２）ポリマーの曇点の測定
実施例ポリマー１〜実施例ポリマー３の３％水溶液を調製し、この水溶液の６６０ｎｍにおける吸光度を、２０℃〜４０℃の間で測定した。
その結果、２０℃〜３０℃では、水溶液は透明であり、吸光度がほぼ０であったが、３１℃付近から水溶液中に白濁が見られるようになり、３２℃で吸光度が急激に上昇した。これにより、上記ポリマーは、約３２℃の曇点を有することを確認した。
なお、実施例ポリマーを３７℃まで昇温させると、ポリマー水溶液は、良好な応答性で、懸濁し、その後、水溶液全体が固化した。この固化物を室温（２５℃）で維持したところ、数十時間の間、固化した状態のままであった。その後、固化物が徐々に溶解して、均質な水溶液に変化した。固化したポリマーは４℃まで冷却すると、速やかに溶解した。そして、上記昇温及び降温の操作を繰り返し行なっても、応答性に変化は生じなかったことから、ポリマーが可逆的に相転移を生じさせることが確認された。
詳細な条件及び結果を表１に示す。
【００６０】
（試験３）ポリマーの凝集体の粒子径測定
比較例ポリマー１を２０℃の液体とし、静的光散乱装置（シスメックス社製、型番：ゼーターセイザー・ナノ）を用いて、光散乱により、ポリマー分子の凝集体の粒子径を測定したところ、１５．７ｎｍであった（ナローフランクションモードで分解したところ、７．０ｎｍのピークも出現した）。ＧＰＣ測定による、ポリマー、及びポリマーの分解物の分子量を示す複数のピーク値から判断すれば、曇点未満の温度である２０℃においても、２〜３分子が会合したクラスターが形成されているものと考えられるが、この温度では１５ｎｍ程度の微粒子が長時間安定して存在した。比較例ポリマー１を曇点超の温度である３７℃としたところ、ポリマーは速やかに凝集して、光散乱によるシグナルは消失した。
【００６１】
実施例ポリマー１〜実施例ポリマー３について、比較例ポリマー１と同様に、その凝集体の粒子径を測定したところ、１１５ｎｍ、１３６ｎｍ、１８２ｎｍであった。曇点未満の温度である２０℃においても、比較例ポリマー１と比較して、粒子径の大きい凝集体、すなわち、沈殿しやすく、沈殿後に拡散しにくい凝集体を形成していることが示唆された。実施例ポリマーは、比較例ポリマーと比較して、細胞培養器に容易に被覆することができる可能性が示唆された。
詳細な条件及び結果を表１に示す。
【００６２】
（試験４）細胞培養器の製造
実施例ポリマー１の水溶液を調製し（最終濃度、ポリマー：１．１２５〜６μｇ／２００μＬ）、この水溶液を４℃まで冷却した。この水溶液を、ポリスチレン製の２４ウェル細胞培養プレート（イワキ社製、マイクロプレート、型番：３８１５−０２４、１ウェル当たりの底面積：２００ｍｍ２）の各ウェルに、この溶液を２００μＬずつ、室温下で加えて、素早く穴の底面の全面に流延させた。そして、この細胞培養皿を、細胞培養インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）中で６時間インキュベートした。こうして、培養面であるウェルに実施例ポリマー１を被覆してなる２４ウェル細胞培養プレート（細胞培養器）が得られた。
【００６３】
（試験５）細胞培養
実施例ポリマー１を用いて製造した上記の２４ウェル細胞培養プレートの各ウェルに、室温条件下において、ラット皮下脂肪由来の脂肪幹細胞（初代培養細胞）を、完全培地（ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）＋１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）溶液、ＤＭＥＭ：ギブコ社製、型番１１９６５、ＦＣＳ：インビトロゲン社製、ロット番号８５２５４６）中に浮遊させ、細胞密度を３．７５〜１５×１０４個／ｍＬに調整した培養液を１ｍＬずつ加えた（１．８７×１０３個／ｍｍ２〜７．５０×１０３個／ｍｍ２）。この細胞を３７℃の細胞培養インキュベーター中で７日間培養した。
７０時間後に、細胞はコンフルエントの状態となった。更に培養を続けたところ、一部の細胞がプレート上を移動し、細胞が互いに集まる現象が生じて、プレート表面の露出が確認されるようになった。５日目に、上記露出する領域は、肉眼で確認できるようになり、一方、互いに集まった細胞は、二次元平面で見て網目状の構造を形成した。この網目状の構造を、更に詳細に観察したところ、細胞の集合体は、管腔状（チューブ状）の構造を形成していることが確認され、これらの細胞が、あたかも血管を形成するかのように自発的に集合していることを示した。
【００６４】
【表１】
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【産業上の利用可能性】
【００６５】
本発明の温度応答性ポリマーの製造方法によれば、カチオン性官能基及びアニオン性官能基を有する、ポリ（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート）由来のポリマーを、少ない工程で簡便に製造することができる。本発明の温度応答性ポリマーによれば、曇点以上の温度で形成された温度応答性ポリマーの不溶化物が、室温（約２５℃）条件下で再溶解するまでの時間を顕著に遅延させることができる。本発明の細胞培養器の製造方法によれば、温度応答性ポリマーを被覆した細胞培養器を、簡便な方法で製造することができる。本発明の細胞培養器によれば、室温程度の条件下での細胞培養の操作を可能とすることができ、また、管腔状の構造を有する細胞構造体を、簡便に製造することができる。