(57)【要約】【課題】クロマトグラフ方法において、偽陽性を特異的に抑制でき、非常に高いノイズに対するシグナル比（Ｓ／Ｎ比）を実現できるクロマトグラフ方法、クロマトグラフキット及びクロマトグラフ用不溶性担体の製造方法を提供すること。【解決手段】  被検物質と、該被検物質と結合し得る第一の結合物質で修飾した標識物質との複合体を、不溶性担体上に展開する工程と、前記不溶性担体上の反応部位において、前記被検物質と標識物質との複合体を捕捉する工程と、洗浄液を用いて、前記不溶性担体上の反応部位を洗浄する工程と、増幅液で、前記標識物質のシグナルを増幅した後に、前記反応部位において捕捉された前記被検物質を検出する工程と、を含むクロマトグラフ方法であって、前記不溶性担体上の反応部位が、（ｉ）前記被検物質と結合し得る第二の結合物質、または前記被検物質と結合し得る第一の結合物質への結合性を有する物質と、（ii）分子量１５００以上１００００以下のポリエチレングリコールとを含む、クロマトグラフ方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検物質と、該被検物質と結合し得る第一の結合物質で修飾した標識物質との複合体を、不溶性担体上に展開する工程と、
前記不溶性担体上の反応部位において、前記被検物質と標識物質との複合体を捕捉する工程と、
洗浄液を用いて、前記不溶性担体上の反応部位を洗浄する工程と、
増幅液で、前記標識物質のシグナルを増幅した後に、前記反応部位において捕捉された前記被検物質を検出する工程と、
を含むクロマトグラフ方法であって、
前記不溶性担体上の反応部位が、
（ｉ）前記被検物質と結合し得る第二の結合物質、または前記被検物質と結合し得る第一の結合物質への結合性を有する物質と、
（ii）分子量１５００以上１００００以下のポリエチレングリコールと、
を含む、クロマトグラフ方法。
【請求項２】
前記ポリエチレングリコールの分子量が７０００以上９０００以下である、請求項１に記載のクロマトグラフ方法。
【請求項３】
前記ポリエチレングリコールと、前記被検物質と結合し得る第二の結合物質、または前記被検物質と結合し得る第一の結合物質への結合性を有する物質とのモル比が、６．３〜１５０である、請求項１又は２に記載のクロマトグラフ方法。
【請求項４】
（ｉ）前記被検物質と結合し得る第二の結合物質、または前記被検物質と結合し得る第一の結合物質への結合性を有する物質と、
（ii）前記ポリエチレングリコールと、
を含む混合液を前記不溶性担体上に塗布することによって、前記不溶性担体上の反応部位が設けられる、請求項１から３の何れか１項に記載のクロマトグラフ方法。
【請求項５】
前記増幅液が、銀を含む化合物を含む、請求項１から４の何れか１項に記載のクロマトグラフ方法。
【請求項６】
前記洗浄液が、銀イオンを還元し得る還元剤を含む、請求項１から５の何れか１項に記載のクロマトグラフ方法。
【請求項７】
前記銀イオンを還元し得る還元剤が２価の鉄イオンを含む、請求項１から６の何れか１項に記載のクロマトグラフ方法。
【請求項８】
前記標識物質が、金属コロイドである、請求項１から７の何れか１項に記載のクロマトグラフ方法。
【請求項９】
（ａ）被検物質と結合し得る第一の結合物質で修飾した標識物質、
（ｂ）（ｉ）前記被検物質と結合し得る第二の結合物質、または前記被検物質と結合し得る第一の結合物質への結合性を有する物質と、（ii）分子量１５００以上１００００以下のポリエチレングリコールとを含む反応部位を備えた不溶性担体、
（ｃ）洗浄液、及び
（ｄ）増幅液を含むクロマトグラフ用キット。
【請求項１０】
（ｉ）被検物質と結合し得る第二の結合物質、または前記被検物質と結合し得る第一の結合物質への結合性を有する物質と、
（ii）分子量１５００以上１００００以下のポリエチレングリコールと
を含む混合液を不溶性担体上に塗布する工程、
を含むクロマトグラフ用不溶性担体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分析対象物を高感度に検出することが可能であると同時に偽陽性を抑制したクロマトグラフ方法、クロマトグラフ用キット及びクロマトグラフ用不溶性担体の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫測定方法の中でもイムノクロマトグラフ方法は、操作が簡便であり短時間で測定可能であることから、一般的によく利用されている。イムノクロマトグラフ方法で用いられている免疫反応としては、競合的反応又はサンドイッチ型反応が広く使われている。その中でも、イムノクロマトグラフ法ではサンドイッチ型反応が主流であり、その典型例においては、試料中の分析対象物である抗原よりなる被検物質を検出するために、以下のような操作が行われる。まず、被検物質である抗原に対する抗体により感作させた微粒子を固相微粒子として不溶性担体に固定化することにより、あるいはこの抗体そのものを不溶性担体に直接固定化することにより、反応部位を有する不溶性担体を調製する。一方、被検物質と特異的に結合可能な抗体を標識微粒子に感作させて感作標識微粒子を調製する。この感作標識微粒子を、試料と共に不溶性担体上をクロマトグラフ的に移動させる。以上の操作により、不溶性担体に形成された反応部位において、固定化された抗体が固定化試薬となり、これに被検物質である抗原を介して感作標識微粒子と特異的に結合する。そして、感作標識微粒子が反応部位に捕捉されることにより生ずるシグナルの有無または程度を目視で判定することにより、試料中の被検物質の存在の有無または量を測定することができる。
【０００３】
イムノクロマトグラフ方法の中には、感度が低いために抗原が検出されない(偽陰性)問題を回避するために、検出シグナルを増幅させる方法が行われる場合がある。シグナル増幅の方法としては、標識としてアルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼなどの酵素を用いる方法がある。また、偽陰性の問題を回避する方法として、金属コロイド標識及び金属硫化物標識からなる群から選んだ標識微粒子に、銀を含む化合物及び銀イオンを還元し得る還元剤を作用させて増感すること(銀増幅)によって検出を行う方法も検討されてきた。そして、増感反応を用いたイムノクロマト系においては非特異吸着を抑制する検討も行われてきた。
【０００４】
非特異吸着を抑制する技術として、特許文献１には、二種類以上の被検物質を検出するための複数の判定領域を有するイムノクロマトグラフ用試験具において、第１判定領域で検出する被検物質が第２判定領域で検出されるのを防ぐために、ブロッキング剤として、グロブリン、アルブミン等を使用する技術が開示されている。また、特許文献２には、生化学反応チップなどで使用される固相担体において生理活性物質の非特異吸着を抑制するために、アルブミン、カゼイン、ポリエチレングリコールなどを使用する技術が開示されている。さらに、特許文献３には、イムノクロマトグラフ方法の非特異吸着の抑制のために断片化抗体を不溶性担体である多孔性担体上の結合物質として用いる技術が開示されており、検出部位を検出物質と非特異吸着防止剤とで形成すること、並びに非特異吸着防止剤の一例としてポリエチレングリコールを用いることができることが記載されている。
【０００５】
また、特許文献４には、抗体及び／又はその抗原結合性断片を結合させたラテックス粒子、並びに糖類及び多価アルコールから成る群より選ばれる少なくとも１種の凝集防止剤などを含む免疫測定用ラテックス組成物が記載されており、これを使用することで抗体を結合したラテックス粒子の自然凝集が防止され、高感度な免疫測定が可能となることが記載されている。さらに、特許文献５には、被検物質、被検物質に特異的に結合する捕捉抗体、被検物質に特異的に結合する捕捉抗原から選ばれる１種を固定化した判定部を有する支持体と、被検物質に特異的に結合する標識抗体とを用いた免疫分析法による被検物質の分析法であって、前記支持体の前記判定部に増感作用を有する標識物質を固定化しておくことを特徴とする分析方法が記載されており、標識物質の表面に、ポリエチレングリコール、アルキルチオール、ビオチン、アビジン、核酸等を吸着させて保護層を形成することによってその凝集を防止できることが記載されている。
【０００６】
一方、特許文献６から９には、非特異吸着した標識物質を取り除く方法として、洗浄液を用いて、不溶性担体の反応部位に非特異吸着した標識物質を洗い流してノイズを低く抑える技術が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００６−１８９３１７号公報
【特許文献２】特開２００９−２２９３２０号公報
【特許文献３】特開２００９−２１６６９４号公報
【特許文献４】特開２００７−３１５８８３号公報
【特許文献５】国際公開ＷＯ２００７／０６１０９８号公報
【特許文献６】特開２００９−１３９２５５号公報
【特許文献７】特開２００９−１３９２５６号公報
【特許文献８】特開２００９−２１６６９５号公報
【特許文献９】特開２００９−２８７９５２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上記したような、検出されるシグナルを増幅させる方法によれば高感度化を達成できるが、その一方で、不溶性担体に固定化した抗体に対して非特異吸着した標識物も増感されてしまうためにノイズが向上し、偽陽性リスクも高まるという問題があった。この問題を解決するために、免疫測定反応や生化学反応を利用した方法において、非特異吸着を抑制する方法が当業界において検討されてきたが、極微量の被検物質を高感度に検出するためにはいまだ十分ではなく、検出したい試料中の被検物質を更に高感度で検出するためによりいっそうノイズを低く抑える技術の開発が望まれていた。
【０００９】
本発明は、クロマトグラフ方法において、偽陽性を特異的に抑制でき、非常に高いノイズに対するシグナル比（Ｓ／Ｎ比）を実現できるクロマトグラフ方法、クロマトグラフ用キット及びクロマトグラフ用不溶性担体の製造方法を提供することを解決すべき課題とした。本発明は特に、増幅技術を用いた場合において、非特異吸着による偽陽性を抑制して微量な検体の検出を実現できるクロマトグラフ方法、クロマトグラフ用キット及びクロマトグラフ用不溶性担体の製造方法を提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、抗体を不溶性担体に固定化する際に、分子量１５００以上１００００以下のポリエチレングリコールを抗体と共に固定化することにより非特異吸着を効果的に抑制することが可能となることを見いだした。更に洗浄液を用いて非特異吸着物質を洗浄することにより、偽陽性の抑制を特異的に実現でき、特に、増幅反応を用いたクロマトグラフ方法において特に抑制することが期待されている偽陽性の抑制を実現し、非常に高いＳ／Ｎ比（ノイズに対するシグナル比）が実現できることを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。
【００１１】
即ち、本発明によれば、被検物質と、該被検物質と結合し得る第一の結合物質で修飾した標識物質との複合体を、不溶性担体上に展開する工程と、
前記不溶性担体上の反応部位において、前記被検物質と標識物質との複合体を捕捉する工程と、
洗浄液を用いて、前記不溶性担体上の反応部位を洗浄する工程と、
増幅液で、前記標識物質のシグナルを増幅した後に、前記反応部位において捕捉された前記被検物質を検出する工程と、を含むクロマトグラフ方法であって、
前記不溶性担体上の反応部位が、（ｉ）前記被検物質と結合し得る第二の結合物質、または前記被検物質と結合し得る第一の結合物質への結合性を有する物質と、（ii）分子量１５００以上１００００以下のポリエチレングリコールと、を含む、
クロマトグラフ方法が提供される。
【００１２】
好ましくは、前記ポリエチレングリコールの分子量は７０００以上９０００以下である。
好ましくは、前記ポリエチレングリコールと、前記被検物質と結合し得る第二の結合物質、または前記被検物質と結合し得る第一の結合物質への結合性を有する物質とのモル比は、６．３〜１５０である。
好ましくは、（ｉ）前記被検物質と結合し得る第二の結合物質、または前記被検物質と結合し得る第一の結合物質への結合性を有する物質と、（ii）前記ポリエチレングリコールと、を含む混合液を前記不溶性担体上に塗布することによって、前記不溶性担体上の反応部位が設けられる。
【００１３】
好ましくは、前記増幅液は、銀を含む化合物を含む。
好ましくは、前記洗浄液は、銀イオンを還元し得る還元剤を含む。
好ましくは、前記銀イオンを還元し得る還元剤は２価の鉄イオンを含む。
好ましくは、前記標識物質は、金属コロイドである。
【００１４】
さらに本発明によれば、（ａ）被検物質と結合し得る第一の結合物質で修飾した標識物質、
（ｂ）（ｉ）前記被検物質と結合し得る第二の結合物質、または前記被検物質と結合し得る第一の結合物質への結合性を有する物質と、（ii）分子量１５００以上１００００以下のポリエチレングリコールとを含む反応部位を備えた不溶性担体、
（ｃ）洗浄液、及び
（ｄ）増幅液を含むクロマトグラフ用キットが提供される。
【００１５】
さらに本発明によれば、（ｉ）被検物質と結合し得る第二の結合物質、または前記被検物質と結合し得る第一の結合物質への結合性を有する物質と、（ii）分子量１５００以上１００００以下のポリエチレングリコールとを含む混合液を不溶性担体上に塗布する工程、を含む、クロマトグラフ用不溶性担体の製造方法が提供される。
【発明の効果】
【００１６】
本発明のクロマトグラフ用キット及びクロマトグラフ方法によれば、不溶性担体に抗体を固定化する際に、分子量１５００〜１００００のポリエチレングリコールを同時に固定化するとともに、被検物質を不溶性担体に展開した後は洗浄液で洗浄し、次いで増幅液で増幅することによって、偽陽性を特異的に抑制でき、非常に高いノイズに対するシグナル比（Ｓ／Ｎ比）を実現できる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、本発明のアッセイ方法に使用することができるクロマトグラフ用キットの分解模式図を示す。
【図２】図２は、クロマトグラフ用不溶性担体と送液用不溶性担体および吸収用不溶性担体の接触状態を示す平面模式図を示す。
【図３】図３は、本発明のアッセイ方法の手順を示す平面模式図を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、本発明についてさらに詳細に説明する。
本発明は、被検物質と、該被検物質と結合し得る第一の結合物質で修飾した標識物質との複合体を、不溶性担体上に展開する工程と、前記不溶性担体上の反応部位において、前記被検物質と標識物質との複合体を捕捉する工程と、洗浄液を用いて、前記不溶性担体上の反応部位を洗浄する工程と、増幅液で、前記標識物質のシグナルを増幅した後に、前記反応部位において捕捉された前記被検物質を検出する工程と、を含むクロマトグラフ方法であって、前記不溶性担体上の反応部位が、（ｉ）前記被検物質と結合し得る第二の結合物質、または前記被検物質と結合し得る第一の結合物質への結合性を有する物質と、（ii）分子量１５００以上１００００以下のポリエチレングリコールとを含む、クロマトグラフ方法である。本発明の方法によれば、抗体などの結合物質を不溶性担体に固定化する際に、分子量１５００以上１００００以下のポリエチレングリコールを抗体と共に固定化することが好ましい態様である。これにより、非特異吸着を抑制できる。更に洗浄液を用いて非特異吸着物質を洗浄することにより、増幅反応を用いたクロマトグラフ方法において特に抑制することが期待されている偽陽性を特異的に抑制することができ、非常に高いノイズに対するシグナル比（Ｓ／Ｎ比）を実現することが可能となる。
【００１９】
本発明は、不溶性担体上の反応部位が、抗体などの結合物質と、分子量１５００以上１００００以下のポリエチレングリコールとを含むことを特徴とする。更には、抗体などの結合物質を不溶性担体に固定化する際に、分子量１５００以上１００００以下のポリエチレングリコール（本書中、ＰＥＧと略記する場合がある）を抗体と共に固定化することが好ましい態様である。ポリエチレングリコールの分子量が１５００未満であると、検体が存在しない被検試料を検査した場合に、被検物質と結合し得る第一の結合物質で修飾した標識物質の非特異吸着によるノイズ値が大きくなる場合がある。また分子量が１００００を超えるポリエチレングリコールを使用した場合には、標識物質のシグナルが低下する場合がある。
【００２０】
ポリエチレングリコールの分子量の下限は、好ましくは２０００以上、より好ましくは６０００以上、特に好ましくは７０００以上であり、ポリエチレングリコールの分子量の上限は、好ましくは９０００以下である。ポリエチレングリコールの分子量は、好ましくは２０００以上９０００以下であり、特に好ましくは７０００以上９０００以下である。また一例としては、ポリエチレングリコールの分子量は２０００以上８０００以下である。なお、ポリエチレングリコールの分子量の測定方法は特に限定されず、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー法（GPC法）、粘度法などに基づいて測定することができる。本明細書において、ポリエチレングリコールの分子量は、市販のポリエチレングリコールを用いる場合にはカタログに記載の値とし、実際に測定して求める場合には、ＧＰＣ（ゲルろ過クロマトグラフィー）法を用いて測定したポリスチレン換算値とする。ＧＰＣ法に用いるカラムに充填されているゲルは芳香族化合物を繰り返し単位に持つゲルが好ましく、例えばスチレン−ジビニルベンゼン共重合体からなるゲルが挙げられる。用いる溶媒は、テトラヒドロフラン等のエーテル系溶媒、Ｎ−メチルピロリドンのアミド系溶媒、クロロホルム等のハロゲン系溶媒、１，２−ジクロロベンゼン等の芳香族系溶媒が挙げられる。
【００２１】
本発明で使用するポリエチレングリコールとしては、市販品を使用することができ、例えば、以下のものを使用することができる。分子量約１５００のポリエチレングリコールとしては、和光純薬（株）社製（型番１６２−０９０９５）、分子量２０００のポリエチレングリコールとしては、和光純薬（株）社製（型番１６５−０９１０５）、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製（型番８１２２１）、日油（株）社製（型番ＰＥＧ−４０）、分子量６０００のポリエチレングリコールとしては、和光純薬（株）社製（型番１６９−０９１２５）、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製（型番８１２６０）、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社製（型番ｓｃ−３０２０１６）、日油（株）社製（型番ＰＥＧ−４０）、分子量８０００のポリエチレングリコールとしては、和光純薬（株）社（型番１９５４４５）、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製（型番Ｐ５４１３）、Ａｍｒｅｓｃｏ社製（型番０１５９）、分子量１００００のポリエチレングリコールとしては、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製（型番８１２８０−１ＫＧ）。これらのポリエチレングリコールは、単独で用いても２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００２２】
分子量１５００以上１００００以下のポリエチレングリコールと、被検物質と結合し得る第二の結合物質、または被検物質と結合し得る第一の結合物質への結合性を有する物質とのモル比（ＰＥＧ／被検物質と結合し得る第二の結合物質、または被検物質と結合し得る第一の結合物質への結合性を有する物質)は、好ましくは１．２５〜５００であり、より好ましくは６．３〜２５０である。さらに好ましくは６．３〜１５０であり、特に好ましくは１２．５〜５０．０であり、最も好ましくは１２．５〜２１．３である。
【００２３】
不溶性担体上の反応部位に含まれるポリエチレングリコールの量は特に限定されないが、０．００７２〜１．７μｇ／ｍｍ２が好ましく、０．０７２〜０．５７μｇ／ｍｍ２が更に好ましく、最も好ましくは、０．１０〜０．５０μｇ／ｍｍ２である。
【００２４】
不溶性担体上の反応部位にポリエチレングリコールを含ませる方法は、本発明の効果が得られる限り特に限定されないが、ポリエチレングリコールと、被検物質と結合し得る第二の結合物質、または被検物質と結合し得る第一の結合物質への結合性を有する物質とを含む混合液を不溶性担体上に塗布することによって、不溶性担体上の反応部位を設けることが好ましい。なお、被検物質と結合し得る第二の結合物質、または被検物質と結合し得る第一の結合物質への結合性を有する物質を固定化した後に、ポリエチレングリコールを塗布する態様は、本願発明の効果を達成するという観点から好ましくなく、本発明においては被検物質と結合し得る第二の結合物質、または被検物質と結合し得る第一の結合物質への結合性を有する物質とポリエチレングリコールとを同時に塗布する態様が好ましい。
【００２５】
１．クロマトグラフ
本発明は、検出シグナルを増幅させるクロマトグラフ方法において、上記の課題を達成するものである。一般には、クロマトグラフ方法とは以下のような手法で被検物質を簡便かつ迅速に、また特異的に、判定したり測定する手法である。すなわち、被検物質と結合可能な結合物質（被検物質と結合し得る第二の結合物質、又は下記の第一の結合物質への結合性を有する物質に相当する。具体的には抗体、抗原等）を有する反応部位を少なくとも１つ含む標識物質捕捉領域を備えたクロマトグラフ担体（不溶性担体の一部）を固定相として用いる。このクロマトグラフ担体上で、被検物質と結合し得る第一の結合物質によって修飾された標識物質を含む液を移動層として、クロマトグラフ的に移動させる。これにより、被検物質と標識物質とが特異的に結合しながら、反応部位を有する標識物質捕捉領域まで到達する。標識物質捕捉領域の反応部位において、被検物質と標識物質の複合体が、固定化された結合物質（第二の結合物質又は第一の結合物質への結合性を有する物質）に特異的に結合することにより、被検試料中に被検物質が存在する場合にのみ、結合物質（第二の結合物質又は第一の結合物質への結合性を有する物質）に標識物質が濃縮される。標識物質を目視または適当な機器を用いて標識量を測定することにより、被検試料中に被検物質が存在することを定性及び定量的に分析する。
【００２６】
本発明におけるクロマトグラフ方法においては、標識物質捕捉領域の反応部位において、被検物質と標識物質の複合体が、固定化された結合物質（第二の結合物質又は第一の結合物質への結合性を有する物質）に特異的に結合した後に、洗浄液を用いて反応部位を洗浄し、その後、増幅液を使用してシグナルを増幅する。標識物質のシグナルを増幅するために使用する増幅試薬（好ましくは２種の増幅試薬、例えば、好ましくは銀イオンを還元し得る還元剤及び銀を含む化合物）を使用し、標識物質捕捉領域上の固定化試薬に結合した、被検物質と標識物質との複合体を核として、増幅反応によってシグナルを増幅し、結果として高感度化を達成することができる。本発明によれば、迅速な高感度クロマトグラフを行うことができる。
【００２７】
２．被検試料
本発明のクロマトグラフ方法及びキットを用いて分析することのできる被検試料としては、被検物質を含む可能性のある試料である限り、特に限定されるものではなく、例えば、生物学的試料、特には動物（特にヒト）の体液（例えば、血液、血清、血漿、髄液、涙液、汗、尿、膿、鼻水、又は喀痰）若しくは排泄物（例えば、糞便）、臓器、組織、粘膜や皮膚、それらを含むと考えられる擦過検体（スワブ）、うがい液、又は動植物それ自体若しくはそれらの乾燥体を挙げることができる。被検物質としては、例えば、天然物、毒素、ホルモン、農薬等の生理活性物質、環境汚染物質、ウイルス、抗原、抗体などが挙げられる。 
【００２８】
３．被検試料の前処理
本発明のクロマトグラフ方法では、被検試料をそのままで、あるいは、被検試料を適当な抽出用溶媒を用いて抽出して得られる抽出液の形で、更には、抽出液を適当な希釈剤で希釈して得られる希釈液の形で、若しくは抽出液を適当な方法で濃縮した形で、用いることができる。本発明で用いられる抽出用溶媒としては、通常の免疫学的分析法で用いられる溶媒（例えば、水、生理食塩液、又は緩衝液等）、あるいは、かかる溶媒で希釈することにより直接抗原抗体反応を実施することができる水混和性有機溶媒を用いることもできる。
【００２９】
４．構成
本発明のクロマトグラフ方法を行うためのクロマトグラフ用キットにおいては、クロマトグラフ用ストリップを組み込んで使用することができる。使用することのできるクロマトグラフ用ストリップとしては、通常のクロマトグラフ法に用いることができるクロマトグラフ用ストリップである限り、特に限定されるものではない。
本発明において使用することができるクロマトグラフ用ストリップとしては、被検物質を含む被検試料の展開方向の上流方向から下流方向に向かって、標識物質保持領域、標識物質補足領域を有している。例えば、試料添加パッド、標識物質保持領域を有する標識物質保持パッド（例えば金コロイド抗体保持パッド）、不溶性担体である結合物質固定化メンブレン（例えば、標識物質捕捉領域を有するクロマトグラフ担体）、及び吸収パッドをこの順に、粘着シート上に配置する態様が好ましく用いられる。結合物質を固定化したクロマトグラフ担体（不溶性担体）としては、被検物質と特異的に結合する抗体又は抗原を固定化した反応部位（テストライン）を少なくとも１つ有する領域である標識物質捕捉領域を有し、所望により、コントロール用抗体又は抗原を固定化したコントロールラインを少なくとも１つ有する領域であるコントロール領域を更に有していてもよい。
【００３０】
本発明で用いることができる標識物質保持領域を有する標識物質保持パッドは、標識物質を含む懸濁液を調製し、その懸濁液を適当な吸収パッド（例えば、グラスファイバーパット）に塗布した後、それを乾燥することにより調製することができる。
【００３１】
４−１．標識物質
本発明で用いる標識物質（被検物質（抗原）と特異的に結合する第一の結合物質を標識するのに用いる標識）として、金属を含む標識物質を用いるのが好ましい。本発明で用いることができる金属の種類としては、好ましくは、金、銀、白金の貴金属や、鉄、鉛、銅、カドミウム、ビスマス、アンチモン、錫、又は水銀を用いることができ、更に好ましくは金、銀、白金の貴金属を用いることができる。本発明において使用できる金属を含む標識物質の好ましい形態としては、金属コロイド標識又は金属硫化物標識を用いることができる。金属コロイド標識としては、好ましくは、白金コロイド、金コロイド、銀コロイド、鉄コロイド、又は水酸化アルミニウムコロイドなどを用いることができ、金属硫化物標識としては、好ましくは、鉄、銀、鉛、銅、カドミウム、ビスマス、アンチモン、錫、又は水銀の各硫化物を用いることができる。本発明においては更に好ましくは、白金コロイド、金コロイド、銀コロイド、最も好ましくは金コロイドを用いることができる。金属コロイド標識として金コロイド粒子を用いる場合には、市販のものを用いてもよい。あるいは、常法、例えば塩化金酸をクエン酸ナトリウムで還元する方法（Nature Physical Science，241(1973)20等）により金コロイド粒子を調製することができる。
【００３２】
金属コロイドの平均粒径としては、約１ｎｍ〜５００ｎｍが好ましく、３〜１００ｎｍがさらに好ましく、５〜６０ｎｍが特に好ましい。本発明に用いられる金属コロイドの平均粒径は、市販の粒度分布計等で計測することができる。粒度分布の測定法としては、光学顕微鏡法、共焦点レーザー顕微鏡法、電子顕微鏡法、原子間力顕微鏡法、静的光散乱法、レーザー回折法、動的光散乱法、遠心沈降法、電気パルス計測法、クロマトグラフィー法、超音波減衰法等が知られており、それぞれの原理に対応した装置が市販されている。
【００３３】
粒径範囲及び測定の容易さから、本発明においては動的光散乱法を好ましく用いることができる。動的光散乱を用いた市販の測定装置としては、ナノトラックＵＰＡ（日機装（株））、動的光散乱式粒径分布測定装置ＬＢ−５５０（（株）堀場製作所）、濃厚系粒径アナライザーＦＰＡＲ−１０００（大塚電子（株））等が挙げられ、本発明においては、２５℃の測定温度で測定したメジアン径（ｄ＝５０）の値として求める。
【００３４】
検出用の標識物質として金属コロイド標識又は金属硫化物標識、その他金属合金標識（以下、金属系標識と称することがある）、また金属を含むポリマ−粒子標識を用いるクロマトグラフでは、金属系標識の信号を増幅させることができる。具体的には、被検物質と標識物質の複合体の形成後に、無機銀塩や有機銀塩などの銀を含む化合物から供給される銀イオンと銀イオンを還元し得る還元剤とを接触させ、還元剤によって銀イオンを還元して銀粒子を生成させると、その銀粒子が金属系標識を核として金属系標識上に沈着するので、金属系標識が増幅され、被検物質の分析を高感度に実施することができる。従って、本発明のクロマトグラフ方法においては、還元剤による銀イオンの還元作用により生じた銀粒子を用いて、免疫複合体の標識に沈着させる反応を実施し、こうして増幅された信号を分析することを除けば、それ以外の点では従来公知のクロマトグラフ法をそのまま適用することができる。
【００３５】
４−２．結合物質
本発明では、標識物質は、被検物質と結合し得る第一の結合物質で修飾されている。第一の結合物質とは、例えば被検物質（抗原）に対する抗体、被検物質（抗体）に対する抗原、被検物質（たんぱく質、低分子化合物等）に対するアプタマーなど、被検物質に対して親和性を持つ化合物であれば特に制限はない。
【００３６】
本発明のクロマトグラフ用キットは、被検物質と結合し得る第二の結合物質、または第一の結合物質への結合性を有する結合物質を標識物質捕捉領域に有している。被検物質と結合し得る第二の結合物質とは、例えば被検物質（抗原）に対する抗体、被検物質（抗体）に対する抗原、被検物質（たんぱく質、低分子化合物等）に対するアプタマーなど、被検物質に対して親和性を持つ化合物であれば特に制限はない。また、第二の結合物質と第一の結合物質とは異なるものでもよいし、同一のものでもよい。第一の結合物質への結合性を有する物質とは、被検物質そのものでもよいし、第一の結合物質が認識する部位を持つ化合物でもよく、たとえば被検物質の誘導体とタンパク質（例えばＢＳＡなど）とを結合させたような化合物などが挙げられる。
【００３７】
好ましくは、第一の結合物質が抗体であり、及び／又は第二の結合物質が抗体である。
より好ましくは、第一の結合物質が抗体であり、第二の結合物質が第一の結合物質と結合する抗体である。
【００３８】
本発明のクロマトグラフ方法で用いる、被検物質に対して特異性を有する抗体として、特に限定されるものではないが、例えば、その被検物質によって免疫された動物の血清から調製する抗血清、抗血清から精製された免疫グロブリン画分、その被検物質によって免疫された動物の脾臓細胞を用いる細胞融合によって得られるモノクローナル抗体、あるいは、それらの断片（例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又はＦｖ）を用いることができる。これらの抗体の調製は、常法により行うことができる。
【００３９】
本発明において、第一の結合物質を用いて標識物質を修飾する方法のうち、例えば、金属コロイドと特異結合物質とを結合させる方法としては、以下に記載されている従来公知の方法（例えばThe Journal of Histochemistry and Cytochemistry，30,7 (1982)691-696）が挙げられる。具体例としては、金属コロイドと特異結合物質（例えば抗体）を適当な緩衝液中で室温で５分以上混合する。反応後、遠心分離により得た沈殿を、ポリエチレングリコ−ル等の分散剤を含む溶液中に分散させることにより、目的質を得ることができる。
【００４０】
４−３．不溶性担体
本発明で用いることができる不溶性担体としては、多孔性担体が好ましい。特に、ニトロセルロース膜、セルロース膜、アセチルセルロース膜、ポリスルホン膜、ポリエーテルスルホン膜、ナイロン膜、ガラス繊維、不織布、布、または糸等が好ましい。
【００４１】
本発明においては、クロマトグラフ用不溶性担体の標識物質捕捉領域に、被検物質と結合し得る第二の結合物質、又は第一の結合物質への結合性を有する物質と、分子量１５００以上１００００以下のポリエチレングリコールとを固定化させた反応部位を有する。被検物質と結合し得る第二の結合物質、又は第一の結合物質への結合性を有する物質は、不溶性担体の一部に物理的または化学的結合により、直接固定化させて反応部位を形成させてもよいし、あるいはラテックス粒子などの微粒子に物理的または化学的に結合させ、この微粒子を不溶性担体の一部にトラップさせて固定化させ、反応部位を形成してもよい。なお、不溶性担体は、第二の結合物質、又は第一の結合物質への結合性を有する物質を固定化した後、不活性蛋白による処理等により非特異的吸着防止処理を施して使用することが好ましい。本発明の不溶性担体は、反応部位を複数種有している態様も好ましく用いることができ、更には標識物質捕捉領域の一部として、所望により、上述のコントロール部位を有していてもよい。
【００４２】
４−４．標識物質保持パッド
本発明の不溶性担体（クロマトグラフ用不溶性担体）は、標識物質保持領域を有する標識物質保持パッドを組み込んで使用することが好ましい。標識物質保持パッドとしては、金コロイド保持パッドが挙げられる。標識物質保持パッドの素材としては、例えば、セルロース濾紙、グラスファイバー、及び不織布等を好ましく使用することができる。標識物質保持パッドは、前記素材に、前述のように調製した標識物質を一定量含浸させ、次いで乾燥させて作製できる。
【００４３】
４−５．試料添加パッド
本発明の不溶性担体（クロマトグラフ用不溶性担体）は更に、試料添加パッドを組み込み使用することが好ましい。試料添加パッドは、添加された被検物質を含む試料（被検試料）を受入れるだけでなく、試料中の不溶物粒子等を濾過する機能をも兼ねる態様が好ましい。試料添加パッドの材質としては、セルロース濾紙、ガラス繊維、ポリウレタン、ポリアセテート、酢酸セルロース、ナイロン、及び綿布等の均一な特性を有するものが挙げられる。また、分析の際、試料中の被検物質が試料添加パッドの材質に非特異的に吸着し、分析の精度を低下させることを防止するため、試料添加部を構成する材質は、予め非特異的吸着防止処理して用いることもできる。本発明においては、試料添加パッドは、４−４で述べた標識物質保持領域を有する標識物質保持パットを兼ねていてもよい。
【００４４】
４−６．吸収パッド
本発明においては、吸収パッドを不溶性担体（クロマトグラフ用ストリップ）に好ましく組み込んで用いることができる。吸収パッドは、クロマト移動した、添加された被検試料を物理的に吸収すると共に、クロマトグラフ担体の反応部位に捕捉されない標識物質等を吸収除去する部位であり、セルロース濾紙、不織布、布、セルロースアセテート等吸水性材料が用いられる。添加された被検試料がクロマト移動して吸収パッドに届いてからのクロマト移動の速度は、吸収パッドの材質、大きさなどにより異なるので、その選定により被検物質の測定に合った速度を設定することができる。
【００４５】
５．洗浄液
本発明では、洗浄液は、特異的な結合反応以外で不溶性担体中に残存している（つまり非特異的に残存している）標識物質を洗浄する機能を有する液であれば特に制限はなく、洗浄効果を上げるためにそのｐＨを調整したり、界面活性剤成分やＢＳＡなどのタンパク質などの高分子化合物を加えた洗浄液を用いてもよい。本発明においては、洗浄液として、以下に説明する銀イオンを還元し得る還元剤を含有する液を用いることが好ましい。その場合、使用される２種類の増幅液（後述する）のうちの一方の増幅液は、洗浄液としての役割をも担うことになる。
【００４６】
洗浄液は、展開途中に非特異的に残存した標識物質を洗浄しながら展開するので標識化物質を含みながら展開されることになるが、展開される前の洗浄液は洗浄効果を高めるために、標識物質を含んでいない液を用いることが好ましい。
【００４７】
洗浄液は、被検試料（検体液）を展開した後に、不溶性担体に添加されるものであり、不溶性担体中に残存する、特異的な結合反応で結合した標識物以外の標識物を洗浄する。洗浄液の送液方法としては、検体液を展開した後にそのまま試料滴下部に添加する方法や、予め不溶性担体に洗浄液送液の為の送液用不溶性担体（洗浄液添加パット）、吸収用不溶性担体（吸水パット）を付着させておき、その送液用不溶性担体に添加し吸収用不溶性担体方向へ送液する方法、予め不溶性担体に洗浄液の添加部位を備えておき、検体液の展開後にその洗浄液の添加部位に洗浄液を添加する方法、または、検体液を不溶性担体に展開した後に洗浄液送液の為の送液用不溶性担体、吸収用不溶性担体を不溶性担体に付着させても良い。
【００４８】
本発明においては、被検試料（検体液）の展開方向と洗浄液の展開方向との成す角は特に限定されず、０度から１８０度で行うことができるが、好ましくは、９０度で行うことが好ましい。送液用不溶性担体は、洗浄液を添加できれば特に制限はなく、グラスファイバーパッドやセルロースメンブレン、ニトロセルロースメンブレンなどを用いることができる。
吸収用不溶性担体は、吸水することが可能な物質であれば特に制限はなく、セルロース、ニトロセルロース、グラスファイバー、それらの混合体などを用いることができる。
【００４９】
６．免疫検査の方法
以下、本発明のクロマトグラフ方法について、その具体的な実施態様であるサンドイッチ法について説明する。
サンドイッチ法では、特に限定されるものではないが、例えば、以下の手順により被検物質の分析を実施することができる。まず、被検物質（抗原）に対して特異性を有する第一の結合物質（例えば、第１抗体）及び第二の結合物質（例えば、第２抗体）を、先に述べた方法により予め調製しておく。また、第一の結合物質で、予め標識物質を修飾しておく。第二の結合物質を、適当なクロマトグラフ用担体（不溶性担体）（例えば、ニトロセルロ−ス膜、ガラス繊維膜、ナイロン膜、又はセルロ−ス膜等）上に固定して標識物質捕捉領域とし、被検物質（抗原）を含む可能性のある被検試料（又はその抽出液）と接触させると、その被検試料中に被検物質が存在する場合には、第二の結合物質との結合（例えば、第二抗体との抗原抗体反応）が起こる。被検物質と第二の結合物質との結合と同時又は結合後に、更に第一の結合物質で修飾した標識物質を過剰量接触させると、被検試料中に被検物質が存在する場合には、固定化された第二の結合物質と被検物質（抗原）と第一の結合物質で修飾した標識物質とからなる複合体が形成される。
【００５０】
サンドイッチ法では、固定化された第二の結合物質と被検物質（抗原）、及び被検物質と標識物質を修飾した第一の結合物質との反応が終了した後、免疫複合体を形成しなかった標識物質を除去し、続いて、例えば、不溶性担体の標識物質捕捉領域をそのまま観察しその標識物質を検出、または定量し、被検試料中の被検物質の有無判定または量を測定することができる。本発明においては、例えば、還元剤及び銀イオン含有化合物を供給することにより、かかる複合体を形成した標識物質からの信号を増幅し検出する。
【００５１】
７．増幅液
本発明で使用する増幅液は、増幅試薬を含有する液である。増幅試薬は、標識物質や被検物質の作用により、触媒的に反応することで、着色した化合物や発光などを生じ、シグナルの増幅を起こすことができる試薬であり、試薬を含有する溶液の状態、即ち増幅液として使用することができる。例えば、金属標識上で、物理現像により金属銀の析出を起こす銀イオン溶液や、ペルオキシダーゼ標識と過酸化水素の作用により色素となる、フェニレンジアミン化合物とナフトール化合物の溶液などが挙げられる。
【００５２】
詳細には、写真化学の分野での一般書物（例えば、「改訂写真工学の基礎-銀塩写真編-」（日本写真学会編、コロナ社）、「写真の化学」（笹井明、写真工業出版社）、「最新処方ハンドブック」（菊池真一他、アミコ出版社））に記載されているような、いわゆる現像液を、増幅試薬を含有する増幅液として用いることができる。すなわち、液中に銀イオンを含み、液中の銀イオンが現像の核となるような金属コロイド等を中心に還元される、いわゆる物理現像液であれば、特に限定されることなく増幅液として用いることができる。
【００５３】
本発明では、２種の増幅試薬を用いることができる。標識物質捕捉領域に捕捉された標識物質のシグナルを増幅するために使用する２種の増幅試薬のうち、第１の増幅試薬を第１の増幅液に、第２の増幅試薬を第２の増幅液に含有させておき、第１の増幅液および第２の増幅液を順次、添加することにより増幅を行うことが好ましい。
【００５４】
増幅液の具体例としては、銀イオンを還元し得る還元剤を含む第１の増幅液、及び、銀を含む化合物を含む第２の増幅液の組み合わせを用いることができる。
以下、第１の増幅液に含まれる銀イオンを還元し得る還元剤と第２の増幅液に含まれる銀を含む化合物等について説明する。
【００５５】
７−１．銀を含む化合物
銀を含む化合物としては、銀イオン含有化合物、例えば、有機銀塩、無機銀塩、もしくは銀錯体を用いることができる。好ましくは、水などの溶媒に対して溶解度の高い銀イオン含有化合物であり、硝酸銀、酢酸銀、乳酸銀、酪酸銀、チオ硫酸銀などが挙げられる。特に好ましくは硝酸銀である。銀錯体としては、水酸基やスルホン基など水溶性基を有する配位子に配位された銀錯体が好ましく、ヒドロキシチオエーテル銀等が挙げられる。
【００５６】
無機銀塩、もしくは銀錯体は、銀として一般に０．００１モル／ｍ２〜０．２モル／ｍ２、好ましくは０．０１モル／ｍ２〜０．０５モル／ｍ２含有されることが好ましい。
【００５７】
７−２．銀イオンを還元し得る還元剤
銀イオンを還元し得る還元剤は、銀イオンを銀に還元することができれば、無機・有機のいかなる材料、またはその混合物でも用いることができる。
無機還元剤としては、Fe2+、V2+、Ti3+、などの金属イオンで原子価の変化し得る還元性金属塩、還元性金属錯塩を好ましく挙げることができる。無機還元剤を用いる際には、酸化されたイオンを錯形成するか還元して、除去するか無害化する必要がある。例えば、Fe2+を還元剤として用いる系では、クエン酸やEDTAを用いて酸化物であるFe3+の錯体を形成し、無害化することができる。本系ではこのような無機還元剤を用いることが好ましく、より好ましくはFe2+の金属塩が好ましい。
【００５８】
なお、湿式のハロゲン化銀写真感光材料に用いられる現像主薬（例えばメチル没食子酸塩、ヒドロキノン、置換ヒドロキノン、３−ピラゾリドン類、ｐ−アミノフェノール類、ｐ−フェニレンジアミン類、ヒンダードフェノール類、アミドキシム類、アジン類、カテコール類、ピロガロール類、アスコルビン酸（またはその誘導体）、およびロイコ色素類）、および本分野の当業者にとって明らかなその他の材料、例えば米国特許第6,020,117号に記載されている材料も用いることができる。
【００５９】
還元剤としては、アスコルビン酸還元剤も好ましい。有用なアスコルビン酸還元剤は、アスコルビン酸と類似物、異性体とその誘導体を含み、例えば、Ｄ−またはＬ−アスコルビン酸とその糖誘導体（例えばγ−ラクトアスコルビン酸、グルコアスコルビン酸、フコアスコルビン酸、グルコヘプトアスコルビン酸、マルトアスコルビン酸）、アスコルビン酸のナトリウム塩、アスコルビン酸のカリウム塩、イソアスコルビン酸（又はＬ−エリスロアスコルビン酸）、その塩（例えばアルカリ金属塩、アンモニウム塩又は当技術分野において知られている塩）、エンジオールタイプのアスコルビン酸、エナミノールタイプのアスコルビン酸、チオエノ−ルタイプのアスコルビン酸等を好ましく挙げることができ、特にはＤ、ＬまたはＤ，Ｌ−アスコルビン酸（そして、そのアルカリ金属塩）若しくはイソアスコルビン酸（またはそのアルカリ金属塩）が好ましく、ナトリウム塩が好ましい塩である。必要に応じてこれらの還元剤の混合物を用いることができる。
【００６０】
８．その他の助剤
増幅液のその他の助剤としては、緩衝剤、防腐剤（例えば酸化防止剤または有機安定剤）、速度調節剤を含む場合がある。緩衝剤としては、例えば、酢酸、クエン酸、水酸化ナトリウムまたはこれらのどれかの塩、又はトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを用いた緩衝剤、その他一般的化学実験に用いられる緩衝剤を用いることができる。これら緩衝剤を適宜用いて、その増幅液に最適なｐＨに調整することができる。また、カブリ防止剤としてアルキルアミンを添加剤として用いることができ、特に好ましくはドデシルアミンである。またこれら添加剤の溶解性向上のため、界面活性剤を用いることができ、特に好ましくはＣ9Ｈ19-Ｃ6Ｈ4-Ｏ-（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）50Ｈである。
【００６１】
増幅試薬をクロマトグラフ用キットに点着する方法としては、還元剤溶液を送液するためのパッドに、第１の増幅液としての還元剤溶液を点着し、標識物質捕捉領域を含む領域に、第２の増幅液としての銀イオン溶液を上から点着して、銀イオン溶液を不溶性担体の厚み方向に浸潤させる方法が好ましい。
２種の増幅試薬をクロマトグラフ用キットに内蔵する方法としては、各増幅試薬を含む溶液を含むポットを、各増幅試薬を点着する部位の上部に配置する方法が挙げられる。還元剤溶液(第１の増幅液)を、還元剤溶液を送液するためのパッドの上部に置き、銀イオン溶液（第２の増幅液）を含むポットを銀イオン溶液充填孔のすぐ上部に設置することが好ましい。このように配置することにより、それぞれのポットを押すことで液が流れ、所定の部位に点着することができる。
【００６２】
９．クロマトグラフ用キット
本発明のクロマトグラフ方法は、被検物質と結合し得る第一の結合物質で修飾した標識物質と、被検物質と結合し得る第二の結合物質、又は被検物質と結合し得る第一の結合物質への結合性を有する物質を含んだ不溶性担体とを具えたクロマトグラフ用キットを用いて実施することができる。その場合、クロマトグラフ用キットは、被検物質と結合し得る第一の結合物質で修飾した標識物質を予め不溶性担体上に具えているものでもよい。あるいは、被検物質と結合し得る第一の結合物質で修飾した標識物質を不溶性担体とは別に具えているものでもよい。この場合、不溶性担体とは別に具えられた標識物質を被検試料と混合した後に不溶性担体上を展開するなどの方法で測定を行うことができる。本発明のクロマトグラフ用キットは、洗浄液、および増幅液を備えるものであり、好ましくは、銀を含む化合物と銀イオンを還元し得る還元剤とを含む増幅液を具えることができる。クロマトグラフ用キットを構成する各素材の例、好ましい範囲は、クロマトグラフ方法等で記載した例、範囲を好ましく用いることができる。
【００６３】
特に本発明によれば、
（ａ）被検物質と結合し得る第一の結合物質で修飾した標識物質と、
（ｂ）（ｉ）被検物質と結合し得る第二の結合物質、または被検物質と結合し得る第一の結合物質への結合性を有する物質と、（ii）分子量１５００以上１００００以下のポリエチレングリコールとを含む反応部位を備えた不溶性担体、
（ｃ）洗浄液、及び
（ｄ）増幅液を含むクロマトグラフ用キットが提供される。
被検物質と結合し得る第一の結合物質で修飾した金属を含む標識物質は、標識物質保持パッドの上に配置されていてもよいし、標識物質保持パッドとは別に具えていてもよい。
【００６４】
更に本発明によれば、（ｉ）被検物質と結合し得る第二の結合物質、または被検物質と結合し得る第一の結合物質への結合性を有する物質と、（ii）分子量１５００以上１００００以下のポリエチレングリコールとを含む混合液を不溶性担体上に塗布することを含む、クロマトグラフ用不溶性担体の製造方法が提供される。上記方法で製造されるクロマトグラフ用不溶性担体は、本発明によるクロマトグラフ方法及びクロマトグラフ用キットにおいて使用することができる。
【００６５】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【００６６】
（１）インフルエンザウイルス抗原検出イムノクロマトグラフ用キットの作成
(１−１)抗インフルエンザＡ型抗体修飾金コロイドの作成
(１−１−１)Ｆ（ａｂ’）2断片化抗インフルエンザＡ型ウイルス抗体の作製
抗インフルエンザＡ型ウイルス抗体（品番７３０７、メディックスバイオケミカ社製）を使用し、ImmunoPureIgG1 Fab and F(ab')2 Preparation Kit（品番 ４４８８０、ピアース社製）を用いて、１６０μg／ｍＬのＦ（ａｂ’）2断片化抗インフルエンザＡ型ウイルス抗体溶液を作製した。
【００６７】
(１−１−２)抗インフルエンザＡ型断片化抗体修飾金コロイドの作成
直径５０ｎｍ金コロイド溶液（EM.GC50、BBInternational社製）９ｍＬに５０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４バッファー（ｐＨ７．５）１ｍＬを加えることでｐＨを調整した金コロイド溶液に、(１−１−１)で作製したＦ（ａｂ’）2断片化抗インフルエンザＡ型ウイルス抗体溶液１ｍＬを加え攪拌した。１０分間静置した後、１質量％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ  分子量２００００、品番１６８−１１２８５、和光純薬社製）水溶液を５５０μL加え攪拌し、続いて１０質量％牛血清アルブミン（ＢＳＡ FractionV、品番Ａ−７９０６、SIGMA社製）水溶液を１．１ｍＬ加え攪拌した。この溶液を８０００×ｇ、４ ℃下、３０分遠心（himacCF16RX、日立社製）した後、１ｍＬ程度を残して上清を取り除き、超音波洗浄機により金コロイドを再分散した。この後、２０ｍＬの金コロイド保存液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー(ｐＨ８．２)、０．０５質量％ＰＥＧ（分子量２００００）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１質量％ＢＳＡ）に分散し、再び８０００×ｇ、４℃、３０分間遠心した後、１ｍＬ程度を残して上清を取り除き、超音波洗浄機により金コロイドを再分散し、抗体修飾金コロイド（５０ｎｍ）溶液を得た。
【００６８】
(１−２)抗インフルエンザＢ型抗体修飾金コロイドの作成
(１−２−１) Ｆ（ａｂ’）2断片化抗インフルエンザＢ型ウイルス抗体の作製
抗インフルエンザＢ型ウイルス抗体（品番Ｍ２１１０１７１、Fitzgerald社製）を使用し、Ｖ８−プロテアーゼ（品番１６４−１３９８２、和光純薬社製）を用いて、６０μｇ／ｍＬのＦ（ａｂ’）2断片化抗インフルエンザＢ型抗体溶液を作製した。
【００６９】
(１−２−２)抗インフルエンザＢ型断片化抗体修飾金コロイドの作成
直径５０ｎｍ金コロイド溶液（EM.GC50、BBInternational社製）９ｍＬに２０ｍＭ  Ｂｏｒａｘバッファー（ｐＨ９．０）１ｍＬを加えることでｐＨを調整した金コロイド溶液に、(１−２−１)で作製したＦ（ａｂ’）2断片化抗インフルエンザＢ型抗体溶液１ｍＬを加え攪拌した。１０分間静置した後、１質量％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ  分子量２００００、品番１６８−１１２８５、和光純薬社製）水溶液を５５０μＬ加え攪拌し、続いて１０質量％牛血清アルブミン（BSA FractionV、品番Ａ−７９０６、SIGMA社製）水溶液を１．１ｍＬ加え攪拌した。この溶液を８０００×ｇ、４ ℃下、３０分遠心（himacCF16RX、日立社製）した後、１ｍＬ程度を残して上清を取り除き、超音波洗浄機により金コロイドを再分散した。この後、２０ｍＬの金コロイド保存液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー(ｐＨ８．２), ０．０５質量％ＰＥＧ（分子量２００００）, １５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１質量％ＢＳＡ）に分散し、再び８０００×ｇ、４℃下、３０分間遠心した後、１ｍＬ程度を残して上清を取り除き、超音波洗浄機により金コロイドを再分散し、抗体修飾金コロイド（５０ｎｍ）溶液を得た。
【００７０】
(１−３)抗インフルエンザＡ型抗体修飾金コロイド保持パッドの作成
(１−１−２)で作成した抗インフルエンザＡ型断片化抗体修飾金コロイドを、金コロイド塗布液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー(ｐＨ８．２)、０．０５質量％ＰＥＧ（分子量２００００）、 ５質量％スクロース）及び水を用いて、５２０ｎｍのAbsorbanceが１．５となるように希釈した。この溶液を、８ｍｍ×２００ｍｍに切ったグラスファイバーパッド（Glass Fiber Conjugate Pad、ミリポア社製）１枚あたり１．１ｍＬずつ均一に塗布し、１２時間減圧乾燥し、金コロイド抗体保持パッドを得た。金コロイド抗体を保持する部分が、標識物質保持領域に相当する。
【００７１】
(１−４)抗インフルエンザＢ型抗体修飾金コロイド保持パッドの作成
(１−２−２)で作成した抗インフルエンザＢ型断片化抗体修飾金コロイドを、金コロイド塗布液（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー(ｐＨ８．２)、０．０５質量％ＰＥＧ（分子量２００００）、５質量％スクロース）及び水を用いて、５２０ｎｍのAbsorbanceが１．５となるように希釈した。この溶液を、８ｍｍ×２００ｍｍに切ったグラスファイバーパッド（Glass Fiber Conjugate Pad、ミリポア社製）１枚あたり１．１ｍＬずつ均一に塗布し、１２時間減圧乾燥し、金コロイド抗体保持パッドを得た。金コロイド抗体を保持する部分が、標識物質保持領域に相当する。
【００７２】
(１−５) 抗インフルエンザＡ型抗体固定化メンブレン（クロマトグラフ担体）の作成
(１−５−１)実施例１
２５ｍｍ×２００ｍｍに切断したニトロセルロースメンブレン（プラスチックの裏打ちあり、HiFlow Plus HF120、ミリポア社製）に関し以下のような方法により抗体を固定し抗体固定化メンブレンを作成した。メンブレンの長辺を下側（手前側）にし、下側から７ｍｍの位置に、１．５ｍｇ／ｍＬとなるように調製した固定化用抗インフルエンザＡ型モノクローナル抗体（Anti-Influenza A SPTN-5 7307、Medix Biochemica社製）溶液に分子量２０００のポリエチレングリコールを０．１質量％となるように混合した溶液をインクジェット方式の塗布機（ＢｉｏＤｏｔ社製）を用いて幅０．７ｍｍ程度のライン状に塗布した。このラインをテストラインと呼ぶ。同様に、下側から１３ｍｍの位置に、０．５ｍｇ／ｍＬとなるように調製したコントロール用抗マウスＩｇＧ抗体（抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、ウサギＦ（ａｂ'）２、 品番５６６−７０６２１、和光純薬社製）溶液をライン状に塗布した。このラインをコントロールラインと呼ぶ。塗布したメンブレンは、温風式乾燥機で５０℃、３０分間乾燥した。ブロッキング液（０．５質量％カゼイン（乳由来、品番０３０−０１５０５、和光純薬社製）含有５０ｍＭホウ酸バッファー(ｐＨ８．５)）５００ｍＬをバットに入れ、その中に、乾燥したメンブレンを浸漬し、そのまま３０分間静置した。その後、別のバットに入れた洗浄・安定化液（０．５質量％スクロースおよび０．０５質量％コール酸ナトリウムを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）バッファー）５００ｍＬ中に、ブロッキング液中から取り出したメンブレンを浸し、そのまま３０分間静置した。メンブレンを液から取り出し、室温で１２時間乾燥し、抗体固定化メンブレンとした。
【００７３】
（１−５−２） 実施例２
分子量２０００のポリエチレングリコールに代えて、分子量６０００のポリエチレングリコール(０．１質量％)を用いた以外は（１−５−１）と同じ方法で、抗体固定化メンブレンを作製した。
（１−５−３） 実施例３
分子量２０００のポリエチレングリコールに代えて、分子量８０００のポリエチレングリコール(０．１質量％)を用いた以外は（１−５−１）と同じ方法で、抗体固定化メンブレンを作製した。
【００７４】
（１−５−４） 比較例１
固定化用抗インフルエンザＡ型モノクローナル抗体を、分子量２０００のポリエチレングリコールと混合することなく塗布する以外は（１−５−１）と同じ方法で、抗体固定化メンブレンを作製した。
（１−５−５） 比較例２
分子量２０００のポリエチレングリコールに代えて、分子量１０００のポリエチレングリコール(０．１質量％)を用いた以外は（１−５−１）と同じ方法で、抗体固定化メンブレンを作製した。
（１−５−６） 比較例３
分子量２０００のポリエチレングリコールに代えて、分子量２００００のポリエチレングリコール(０．１質量％)を用いた以外は（１−５−１）と同じ方法で、抗体固定化メンブレンを作製した。
（１−５−７） 比較例４
分子量２０００のポリエチレングリコールに代えて、分子量７２５００のポリビニルアルコール（ＰＶＡ）(０．１質量％)を用いた以外は（１−５−１）と同じ方法で、抗体固定化メンブレンを作製した。
（１−５−８） 比較例５
分子量２０００のポリエチレングリコールに代えて、分子量６６０００のＢＳＡ(０．１質量％)を用いた以外は（１−５−１）と同じ方法で、抗体固定化メンブレンを作製した。
（１−５−９） 比較例６
分子量２０００のポリエチレングリコールに代えて、分子量４００００のデキストラン(０．１質量％)を用いた以外は（１−５−１）と同じ方法で、抗体固定化メンブレンを作製した。
（１−５−１０） 比較例７
分子量２０００のポリエチレングリコールに代えて、分子量５０００のデキストラン硫酸(０．１質量％)を用いた以外は（１−５−１）と同じ方法で、抗体固定化メンブレンを作製した。
【００７５】
実施例１〜３及び比較例１〜７では、抗体の塗布量は０．２１μｇ／ｍｍ２であり、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ＢＳＡ、デキストラン及びデキストラン硫酸の塗布量はそれぞれ０．１４μｇ／ｍｍ２である。また、実施例１〜３及び比較例１〜７におけるＰＥＧ／抗体（モル比）を表１に示す。
【００７６】
（１−６）抗インフルエンザＢ型抗体固定化メンブレン（クロマトグラフ担体）の作成
(１−６−１)実施例４
２５ｍｍ×２００ｍｍに切断したニトロセルロースメンブレン（プラスチックの裏打ちあり、HiFlow Plus HF120、ミリポア社製）に関し以下のような方法により抗体を固定し抗体固定化メンブレンを作成した。メンブレンの長辺を下側（手前側）にし、下側から１０ｍｍの位置に、１．５ｍｇ／ｍＬとなるように調製した固定化用抗インフルエンザＢ型モノクローナル抗体（Anti-Influenza B M2110171、Fitzgerald社製）溶液に分子量８０００のポリエチレングリコールを０．１７質量％となるように混合した溶液をインクジェット方式の塗布機（BioDot社製）を用いて幅０．７ｍｍ程度のライン状に塗布した。このラインをテストラインと呼ぶ。同様に、下側から１３ｍｍの位置に、０．５ｍｇ／ｍＬとなるように調製したコントロール用抗マウスＩｇＧ抗体（抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、ウサギＦ（ａｂ'）２、 品番５６６−７０２６１、和光純薬社製）溶液をライン状に塗布した。このラインをコントロールラインと呼ぶ。塗布したメンブレンは、温風式乾燥機で５０℃、３０分間乾燥した。ブロッキング液（０．５質量％カゼイン（乳由来、品番０３０−０１５０５、和光純薬社製）含有５０ｍＭホウ酸バッファー(ｐＨ８．５)）５００ｍＬをバットに入れ、その中に、乾燥したメンブレンを浸漬し、そのまま３０分間静置した。その後、別のバットに入れた洗浄・安定化液（０．５質量％スクロースおよび０．０５質量％コール酸ナトリウムを含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）バッファー）５００ｍＬ中に、ブロッキング液中から取り出したメンブレンを浸し、そのまま３０分間静置した。メンブレンを液から取り出し、室温で１２時間乾燥し、抗体固定化メンブレンとした。
【００７７】
(１−６−２) 比較例８
固定化用抗インフルエンザＢ型モノクローナル抗体を、分子量８０００のポリエチレングリコールと混合することなく塗布する以外は(１−６−１)と同じ方法で行った。
(１−６−３) 比較例９
分子量８０００のポリエチレングリコールに代えて、分子量１０００のポリエチレングリコール(０．１７質量％)を用いた以外は(１−６−１)と同じ方法で、抗体固定化メンブレンを作製した。
(１−６−４) 比較例１０
分子量８０００のポリエチレングリコールに代えて、分子量２００００のポリエチレングリコール(０．１７質量％)を用いた以外は(１−６−１)と同じ方法で、抗体固定化メンブレンを作製した。
(１−６−５) 比較例１１
分子量８０００のポリエチレングリコールに代えて、分子量６６０００の牛血清アルブミン（ＢＳＡ、０．１７質量％)を用いた以外は(１−６−１)と同じ方法で、抗体固定化メンブレンを作製した。
【００７８】
実施例４及び比較例８〜１１では、抗体の塗布量は０．２１μｇ／ｍｍ２であり、ポリエチレングリコール及びＢＳＡの塗布量はそれぞれ０．２４μｇ／ｍｍ２である。また、実施例４及び比較例８〜１１におけるＰＥＧ／抗体（モル比）を表２に示す。
【００７９】
(１−７)クロマトグラフ用不溶性担体の作製
バック粘着シート（ARcare9020、ニップンテクノクラスタ社製）に、(１−５)あるいは(１−６)で作成した抗体固定化メンブレンをそれぞれ貼り付けた。このバック粘着シート付着抗体固定化メンブレンを、テストライン側が下側（手前側）となるようメンブレンを横長に設定し、抗体固定化メンブレンの下側に約２ｍｍ重なるように（１−３）及び（１−４）で作成した金コロイド抗体保持パッドを貼り付けた。更に、金コロイド抗体保持パッド下側に約４ｍｍ重なるようにして試料添加パッド（１８ｍｍ×２００ｍｍに切ったグラスファイバーパッド（Glass Fiber Conjugate Pad、ミリポア社製））を重ねて貼り付けた。さらに、抗体固定化メンブレンの上側には約５ｍｍ重なるように吸収パッド（８０ｍｍ×２００ｍｍに切ったセルロース・グラス膜（CF6、ワットマン社製））を重ねて貼り付けた。このように作製したクロマトグラフ用シートを、幅７ｍｍずつに裁断し、クロマトグラフ用不溶性担体を作製した。
【００８０】
(１−８)洗浄液の作製
水２９０ｇに、硝酸鉄(III)九水和物（品番０９５−００９９５、和光純薬社製）を水に溶解して作製した１ｍｏｌ/Ｌの硝酸鉄水溶液２３．６ｍＬ及びクエン酸（品番０３８−０６９２５、和光純薬社製）１３．１ｇを溶解させた。全て溶解したら、スターラーで攪拌しながら硝酸（１０重量％）を３６ｍＬ加え、さらに硫酸アンモニウム鉄（II）六水和物（品番０９１−００８５５、和光純薬社製）を６０．８ｇ加えこれを洗浄液とした。なお、この洗浄液は、銀イオンの還元剤を含む液であり、増幅液の一部の役割をも担うものである。
【００８１】
(１−９)増幅液の作製
水６６ｇに、硝酸銀溶液８ｍＬ（１０ｇの硝酸銀を含む）と１ｍｏｌ/Ｌの硝酸鉄水溶液２４ｍＬを加えた。さらに、この溶液と、硝酸（１０重量％）５．９ｍＬ、ドデシルアミン（品番１２３−００２４６、和光純薬社製）０．１ｇ、界面活性剤Ｃ12Ｈ25-Ｃ6Ｈ4-Ｏ-（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）50Ｈ  ０．１ｇをあらかじめ４７．６ｇの水に溶解した溶液とを混合し、これを増幅液とした。
【００８２】
(１−１０)アッセイ用デバイスの作製
図１に示す第１のデバイス部品（射出成形によるポリプロピレン製）１１に、(１−７)で作製したクロマトグラフ用不溶性担体を装填した。次に、図２に示すように送液用不溶性担体２および吸収用不溶性担体３として、グラスファイバーパッド（Glass Fiber Conjugate Pad、ミリポア社製）を装填した。
【００８３】
(２−１)評価
(２−１−１)検体（被検試料）液の点着・展開
Ａ型模擬陽性検体(BD FluエグザマンコントロールA+B-(ベクトン・ディッキンソン社製))又はB型模擬陽性検体(BD FluエグザマンコントロールA-B+(ベクトン・ディッキンソン社製))を、１質量％ＢＳＡ−ＰＢＳ（Phosphate Buffered Saline）で希釈し、(１−７)で作成したクロマトグラフ用不溶性担体の試料添加パットに、各抽出液で希釈した検体液を検体注入孔から１４０μＬ点着し、１０分間静置して検体液を拡散、展開させた。
【００８４】
(２−１−２)洗浄
検体液を１０分間展開した後、図１に示した第１のデバイス部品１１の液体貯蔵ポッド１３に(１−８)で作製した洗浄液２００μＬを入れた。第１のデバイス部品１１を第２のデバイス部品１２に向かい合わせて閉じた。こうして洗浄液をクロマトグラフ用不溶性担体に展開させ２分間送液した。この工程によりクロマトグラフ用不溶性担体が洗浄液に浸され、さらに特異的に吸着していない材料が洗浄された。
【００８５】
(２−１−３)銀増幅
第２のデバイス部品１２に設けられた点着孔１５から(１−９)で作製した増幅液を滴下し、銀増幅反応を１分間行った。増幅後、クロマトグラフ用不溶性担体を取り出し、３分間水洗した。
【００８６】
(２−１−４)テストライン濃度値の算出
水洗したクロマトグラフ用不溶性担体をLAS4000(富士フイルム社製）で撮影し、テストラインΔＯＤ (テストラインの光学濃度（ＯＤ）−非テストライン部の光学濃度（ＯＤ）)を算出した。抗原（被検物質）を含む場合のテストラインのΔＯＤをシグナル(Ｓ)、抗原を含まない場合のテストラインのΔＯＤをシグナル(Ｎ)と定義した。表１及び表２において、各実施例及び各比較例の欄の上段に抗原を含まない場合のテストラインのΔＯＤであるシグナル(Ｎ)を示し、各実施例及び各比較例の欄の下段に抗原を含む場合のテストラインのΔＯＤであるシグナル(Ｓ)を示した。また、表１及び表２においては、各実施例及び各比較例についてのＳ／Ｎ比を算出して記載した。
【００８７】
（３）結果表１及び表２から明らかなように、分子量１５００〜１００００のＰＥＧを抗体と混合して固定化することによって偽陽性を特異的に抑制できることがわかる。また、ＢＳＡ、ＰＶＡ又は多糖を使用する場合よりも、分子量１５００〜１００００のＰＥＧを使用する場合の方が偽陽性抑制効果は高かった。さらに、抗原がある場合のテストラインの濃度(感度)も高く維持されていた。
【００８８】
【表１】
2014194407.tif 000002
【００８９】
【表２】
2014194407.tif 000003
【符号の説明】
【００９０】
１：不溶性担体(クロマトグラフ用不溶性担体)、２：送液用不溶性担体、３：吸収用不溶性担体、４：試料添加パッド、５：標識物質保持パッド、６：クロマトグラフ担体、６ａ：テストライン（反応部位）、６ｂ：コントロールライン、７：吸収パッド、１０：クロマトグラフ用キット、１１：第１のデバイス部品、１２：第２のデバイス部品、１３：液体貯蔵ポッド、１４：位置決め部材、１５：点着孔
【図１】
2014194407.tif 000004
【図２】
2014194407.tif 000005
【図３】
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