(57)【要約】      （修正有）【課題】ＴＮＦスーパーファミリー受容体に対するスプライス切替オリゴマー（ＳＳＯ）及び同ＳＳＯを含む組成物の提供。【解決手段】少なくとも１０ヌクレオチドからなるＳＳＯは、特定配列で構成される群から選択される配列を含んでなり、かつヒトＴＮＦＲＳＦ１Ａ及びヒトＴＮＦＲＳＦ１Ｂから選択される受容体をコードする前駆体ｍＲＮＡのスプライシングを変更して、前記受容体の安定で分泌性でリガンド結合性の型を産生させることができるＳＳＯ。【選択図】図１４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１０ヌクレオチド〜少なくとも２０ヌクレオチドからなるスプライス切替オリゴマー（ＳＳＯ）において、
前記ＳＳＯは、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８、９、１４、１７〜２１、２４〜２９、３２、３３、３８〜４２、４４〜４６、５０〜５２、５５〜５７、６０、６８〜７１、７４、７５、７７、７８、８０、８２、８４、および８６〜８９で構成される群から選択される配列を含んでなり、かつヒトＴＮＦＲＳＦ１Ａ及びヒトＴＮＦＲＳＦ１Ｂから選択される受容体をコードする前駆体ｍＲＮＡのスプライシングを変更して、前記受容体の安定で分泌性でリガンド結合性の型を産生させることができることを特徴とするＳＳＯ。
【請求項２】
前記ＳＳＯは、２’−デオキシリボヌクレオチド、２’Ｏ−Ｍｅリボヌクレオチド、２’Ｏ−ＭＯＥリボヌクレオチド、ヘキシトール（ＨＮＡ）ヌクレオチドもしくはヌクレオシド、２’Ｏ−４’Ｃ−連結型二環式リボフラノシル（ＬＮＡ）ヌクレオチドもしくはヌクレオシド、前記のうちいずれかのホスホロチオエートアナログ、前記のうちいずれかのペプチド核酸（ＰＮＡ）アナログ、前記のうちいずれかのメチルホスホネートアナログ、前記のうちいずれかのペプチド核酸アナログ、前記のうちいずれかのＮ３’→Ｐ５’ホスホロアミデートアナログ、および前記のうちいずれかのホスホロジアミデートモルホリノヌクレオチドアナログ、ならびにこれらの組み合わせで構成される群から独立に選択される１または複数のヌクレオチドまたはヌクレオシドを含んでなる、請求項１に記載のＳＳＯ。
【請求項３】
前記２’Ｏ−４’Ｃ−連結型二環式リボフラノシル（ＬＮＡ）ヌクレオチドもしくはヌクレオシドは、それぞれ２’Ｏ−４’Ｃ−（メチレン）−リボフラノシルヌクレオチドもしくはヌクレオシド、またはそれぞれ２’Ｏ−４’Ｃ−（エチレン）−リボフラノシルヌクレオチドもしくはヌクレオシドである、請求項２に記載のＳＳＯ。
【請求項４】
前記ＳＳＯは、２’Ｏ−Ｍｅリボヌクレオチドおよび２’Ｏ−４’Ｃ−連結型二環式リボフラノシル（ＬＮＡ）ヌクレオチドもしくはヌクレオシドで構成される群から独立に選択される１または複数のヌクレオチドまたはヌクレオシドを含んでなる、請求項２に記載のＳＳＯ。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のＳＳＯと薬学的に許容可能な担体とを含んでなる医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、スプライス切替オリゴヌクレオチドまたはスプライス切替オリゴマー（ＳＳＯ）を用いて、前駆体ｍＲＮＡ分子のスプライシングを制御し、タンパク質発現を調節するための、組成物および方法に関する。ＳＳＯはヌクレオチドに限定されるものではなく、配列特異的に標的ＲＮＡとハイブリダイズすることが可能であってかつＲＮａｓｅＨを活性化しないかまたはそうでなければ標的ＲＮＡの分解をもたらさない、あらゆるポリマーまたは分子を含んでいる。具体的に述べる実施形態は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）スーパーファミリーの受容体に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
本願は、２００６年１０月２０日に出願された米国仮特許出願第６０／８６２，３５０号ならびに２００５年１１月１０日に出願された米国仮特許出願第６０／７３５，４２９号（これらは参照により全体が本願に組込まれる）の優先権を主張する。
【０００３】
真核細胞によるｍＲＮＡの産生は二段階プロセスである。最初に、長い連続的な転写物である前駆体メッセンジャーＲＮＡ（前駆体ｍＲＮＡ）が形成される。前駆体ｍＲＮＡは、タンパク質をコードする配列（エキソン）と、該配列内に散在するタンパク質をコードしない配列（イントロン）とを含んでいる。次に、スプライシングと呼ばれるプロセスによって、転写物のイントロンが削除されてエキソンが連結される。このプロセスは、成熟した機能的ｍＲＮＡの生成の重要なステップである。各イントロンの５’端はスプライス供与部位または５’スプライス部位を含み、各イントロンの３’端はスプライス受容部位または３’スプライス部位を含んでいる。前駆体ｍＲＮＡのプロセシングには、総称としてスプライセオソームと呼ばれる、タンパク質とＲＮＡ分子とを含んだ複合体が必要であり、スプライセオソームはスプライシングおよび核からのｍＲＮＡの輸送を行う。
【０００４】
選択的スプライス部位が存在する場合、スプライシングのステップにより単一の遺伝子から２以上の（関連した）タンパク質を合成することが可能となる（例えば、非特許文献１を参照）。生理的なメカニズムとして選択的スプライシングを用いる遺伝子の中には、炎症系および免疫系に影響を及ぼすタンパク質サイトカインの細胞表面受容体がある。これらのタンパク質は膜内在型として発現され、サイトカインリガンドの結合に応答してシグナルを伝達する。そのようなサイトカイン受容体は、サイトカインに結合してシグナル伝達を防止することのできる分泌型としても存在する。これら２つの型の受容体は選択的スプライシングによって産生され、分子の膜貫通ドメインをコードするために必要な１以上のエキソンの欠失という点で異なっている。一部の受容体については、膜内在型受容体から細胞外ドメインがタンパク質分解的に切断されることにより、該受容体の、分泌性のスプライスバリアントとは異なる可溶性フラグメントが生成される。
【０００５】
そのような受容体ファミリーの１つがＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーである。ＴＮＦＲスーパーファミリーは目下、現時点で同定されているＴＮＦスーパーファミリーの１９種のリガンドのうち１つ以上と結合し、その結果として細胞のシグナル伝達を仲介する、２９種の受容体で構成されている。ＴＮＦＲスーパーファミリーは、カルボキシ末端の細胞内ドメインと、共通のシステインリッチドメイン（ＣＲＤ）を特徴とするアミノ末端の細胞外ドメインとを備えた、タイプＩの膜貫通型タンパク質群である。ＴＮＦＲスーパーファミリーは、２つのサブグループ、すなわち細胞内デスドメイン（ＤＤ）を含む受容体と、ＤＤを欠く受容体とに分けることができる。ＤＤは、受容体の活性化に続くアポトーシス誘導を担う、８０アミノ酸のモチーフである。さらに、ＴＮＦ−α受容体タイプＩ（ＴＮＦＳＦＲ１Ａ、以降「ＴＮＦＲ１」、例えばヒトｍＲＮＡについてはＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｘ５５３１３）およびＴＮＦ−α受容体タイプＩＩ（ＴＮＦＳＦ１Ｂ、以降「ＴＮＦＲ２」、例えばヒトｍＲＮＡについてはＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿００１０６６）は、多数の受容体サブユニットのアセンブリとその後のＴＮＦ−αへの結合に必要な、プレリガンド結合アセンブリドメイン（ＰＬＡＤ）と呼ばれる共通の固有ドメインを有している。ＴＮＦＲスーパーファミリーのほとんどのメンバーは、ＴＮＦＲ関連因子（ＴＲＡＦ）と会合することによりシグナル伝達を活性化する。この会合は、ＴＮＦＲスーパーファミリーのメンバーの細胞内ドメインにある特定のモチーフによって仲介される（非特許文献２）。ＴＮＦＲスーパーファミリーの他のメンバーには、ＲＡＮＫ（ＴＮＦＲＳＦ１１Ａ）、ＣＤ４０（ＴＮＦＲＳＦ５）、ＣＤ３０（ＴＮＦＲＳＦ８）およびＬＴ−βＲ（ＴＮＦＲＳＦ３）が含まれる。
【０００６】
ＴＮＦ−αは、膜結合型のホモトリマーとして存在する炎症性サイトカインであり、プロテアーゼのＴＮＦ−α転換酵素（ＴＡＣＥ）によって循環血中に放出される。ＴＮＦ−αは、外傷および感染に対する炎症反応の仲介物質として循環血中に導入される。ＴＮＦ−α活性は、慢性関節リウマチ、クローン病、潰瘍性大腸炎、乾癬および乾癬性関節炎のような炎症性疾患の進行に密接に関連している（非特許文献２）。大量感染の際に経験されるような、高濃度のＴＮＦ−αへの急激な曝露は、敗血症をもたらし；敗血症の症状には、ショック、低酸素、多臓器不全および死亡が含まれる。慢性的な低量のＴＮＦ−αは、減量、脱水および体脂肪の減少を特徴とする疾病である悪液質の原因となる場合があり、また悪性腫瘍に関係している。
【０００７】
ＴＮＦ−α活性は主に、２つの異なる遺伝子によってコードされる２つの受容体、ＴＮＦＲ１およびＴＮＦＲ２を通して仲介される。ＴＮＦＲ１は、分子量およそ５５キロダルトン（ｋＤａｌ）の膜結合型タンパク質であり、ＴＮＦＲ２は分子量７５ｋＤａｌの膜結合型タンパク質である。いずれの受容体の可溶性細胞外ドメインも、メタロプロテアーゼの作用によって細胞膜からある程度脱落する。さらに、ＴＮＦＲ２の前駆体ｍＲＮＡは選択肢スプライシングを受け、完全長で活性型の膜結合型受容体（ｍＴＮＦＲ２）、または膜貫通のためのコード配列を包含するエキソン７および８を欠いた分泌性のデコイ受容体（ｓＴＮＦＲ２）のいずれかを生じる（非特許文献３）。ｓＴＮＦＲ２はＴＮＦ−αに結合するが生理反応を誘発せず、したがってＴＮＦ−α活性を低減する。ＴＮＦＲ１の内在の分泌性スプライスバリアントはまだ同定されていないが、上記２つの受容体の遺伝子構造の類似性は、このＴＮＦＲ１アイソフォームを生じる可能性を強く示唆している。
【０００８】
ＴＮＦシグナル伝達経路を標的とする薬物で処理された、ＴＮＦＲ１およびＴＮＦＲ２をいずれも欠くノックアウトマウスは、そのような薬物が脳卒中または外傷性脳損傷の治療に有益かもしれないことを示している（非特許文献４）。それぞれヒトの大脳マラリアおよび多発性硬化症のモデルである、実験的に誘発された大脳マラリア（非特許文献５）および自己免疫性脳脊髄炎（非特許文献６）におけるＴＮＦＲ２の役割を確立するために、ＴＮＦＲ２ノックアウトマウスも使用された。
【０００９】
ＴＮＦＲ２はＴ細胞上に高密度で存在し、間質性肺疾患の肺の微小環境において肺胞炎をもたらす免疫反応に関与するようである（非特許文献７）。ＴＮＦＲ２はヒトの脂質代謝障害にも関与しており、肥満およびインスリン抵抗性（非特許文献８）、家族性複合型高脂血症（非特許文献９、非特許文献１０）、高血圧および高コレステロール血症（非特許文献１１）と関連付けられてきた。ＴＮＦＲ２は近年、ヒトのナルコレプシーと関連付けられた（非特許文献１２）。さらに、ＴＮＦＲ２の多型は、全身性エリテマトーデスへの罹病性につながるようである（非特許文献１３）。
【００１０】
ＣＤ４０のスプライスバリアント（非特許文献１４）（「Ｔｏｎｅ」）およびＣＤ９５（ＦＡＳ）のスプライスバリアント（非特許文献１５）が、悪性腫瘍において見出されている。これらのスプライスバリアントのいくつかは、エキソン７の読枠に影響する欠失または突然変異により、膜貫通領域を喪失している。これらが、悪性変換に起因する異常バリアントに相当するのか生理的な代替物に相当するのかについては、まだ不明である。
【００１１】
ＴＮＦスーパーファミリーのメンバーによる過剰な活性が関与しているので、分泌型の量が増大し膜内在型の量が減少するようにＴＮＦＲ受容体の選択的スプライシングを制御することは有用であろう。本発明は、この目的を達成するためのスプライス切替オリゴヌクレオチドまたはスプライス切替オリゴマー（ＳＳＯ）を提供する。ＳＳＯはアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯＮ）に似ている。しかしながら、ＡＳＯＮとは対照的に、ＳＳＯは、ＲＮａｓｅＨによる標的ＲＮＡの分解を引き起こすことなく標的ＲＮＡにハイブリダイズすることができる。
【００１２】
ＳＳＯは、ある種のサラセミアで見出された異常なスプライシングを修正するために使用されている（コール（Ｋｏｌｅ）の特許文献１、非特許文献１６）。ＩＬ−５受容体のα鎖（ＩＬ−５Ｒα）を用いた研究から、膜貫通型エキソンを対象とするＳＳＯが分泌型の合成を増大させ、膜内在型の合成を抑制することが実証された（ベネット（Ｂｅｎｎｅｔｔ）への特許文献２；非特許文献１７）。
【００１３】
ＩＬ−５受容体は、ヘテロダイマーとして生じるタイプの受容体のメンバーである。このインターロイキン５受容体（ＩＬ−５Ｒ）は、ＩＬ−３Ｒの受容体ファミリーのメンバーであり、このファミリーにはインターロイキン３受容体（ＩＬ−３Ｒ）およびＧＭ−ＣＳＦも含まれる。ＩＬ−３Ｒファミリーのメンバーは、共有される共通のβ鎖と、サイトカインリガンド特異性を伝える固有のα鎖とで構成される多重サブユニット受容体である。ＩＬ−３Ｒファミリーのメンバーは造血系において発現される。特に、ＩＬ−５はもっぱら好酸球、好塩基球およびＢ細胞において発現される（非特許文献１８）。これらの受容体および本発明のＴＮＦＲスーパーファミリーは配列相同性を持たず、別個のシグナル伝達経路において作用する。
【００１４】
ＳＳＯは、膜貫通領域の上流にあるエキソン６が欠失した結果としてタンパク質の読枠が変更された、Ｔｏｎｅの文献において検出された主要なＣＤ４０スプライスバリアントを生産するために使用された。このＳＳＯは予想どおりのｍＲＮＡスプライスバリアントをもたらしたが、分泌性の受容体は検出することができなかったので、該バリアントｍＲＮＡの翻訳産物は不安定のようであった（非特許文献１９）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】米国特許第５，９７６，８７９号明細書
【特許文献２】米国特許第６，２１０，８９２号明細書
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】Ｇｉｓｔ，Ａ．，２００５，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ，Ａｐｒｉｌ，ｐ．６０
【非特許文献２】Ｐａｌｌａｄｉｎｏ，Ｍ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．２：７３６−４６
【非特許文献３】Ｌａｉｎｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１６：１６９
【非特許文献４】Ｂｒｕｃｅ，ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２：７８８
【非特許文献５】Ｌｕｃａｓ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：１７１９
【非特許文献６】Ｓｕｖａｎｎａｖｅｊｈ，Ｇ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｃｅｌｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０５：２４
【非特許文献７】Ａｇｏｓｔｉｎｉ，Ｃ，ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ，１５３：１３５９
【非特許文献８】Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｒｅａｌ，ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ，２３：８３１
【非特許文献９】Ｇｅｕｒｔｓ，ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．９：２０６７
【非特許文献１０】ｖａｎ  Ｇｒｅｅｖｅｎｂｒｏｅｋ，ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，１５３：１
【非特許文献１１】Ｇｌｅｎｎ，ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ，９：１９４３
【非特許文献１２】Ｋｏｍａｔａ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ，５３：５２７
【非特許文献１３】Ｈｏｈｊｏｈ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ，５６：４４６
【非特許文献１４】Ｔｏｎｅ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９８：１７５１
【非特許文献１５】Ｓｈｅｎ，Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈ．１６１：２１２３
【非特許文献１６】Ｌａｃｅｒｒａ，Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９７：９５９１
【非特許文献１７】Ｋａｒｒａｓ，Ｊ．Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍ，５８：３８０
【非特許文献１８】Ａｄａｃｈｉａｎｄ，Ｔ．  ａｎｄ  Ａｌａｍ，Ｒ．，１９９８，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７５：Ｃ６２３−３３
【非特許文献１９】Ｓｉｗｋｏｗｓｋｉ，Ａ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３２；２６９５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
本発明の目的は、ＴＮＦスーパーファミリー受容体に対するスプライス切替オリゴマー（ＳＳＯ）及び同ＳＳＯを含む組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
上記した課題を解決するために、請求項１に記載の発明は、少なくとも１０ヌクレオチド〜少なくとも２０ヌクレオチドからなるスプライス切替オリゴマー（ＳＳＯ）において、同ＳＳＯは、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８、９、１４、１７〜２１、２４〜２９、３２、３３、３８〜４２、４４〜４６、５０〜５２、５５〜５７、６０、６８〜７１、７４、７５、７７、７８、８０、８２、８４、および８６〜８９で構成される群から選択される配列を含んでなり、かつヒトＴＮＦＲＳＦ１Ａ及びヒトＴＮＦＲＳＦ１Ｂから選択される受容体をコードする前駆体ｍＲＮＡのスプライシングを変更して、前記受容体の安定で分泌性でリガンド結合性の型を産生させることができることを特徴とするＳＳＯ、を提供する。
【００１９】
本発明は、ＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲ１およびＴＮＦＲ２）ならびにＴＮＦＲスーパーファミリーのその他のサイトカイン受容体をコードする前駆体ｍＲＮＡのスプライシングを制御することにより、前記受容体の発現を制御するための組成物ならびに方法を提供する。より具体的には、本発明は、分泌型の発現増大および膜内在型の発現低下をもたらす。更に、本発明は、過剰なサイトカイン活性に関連した疾病の治療に使用することができる。
【００２０】
膜内在型のｍＲＮＡ中には存在するが、分泌型のｍＲＮＡを生じる一次転写産物（「前駆体ｍＲＮＡ」）からは除去されるエキソンは、「膜貫通エキソン」と呼ばれる。本発明には、受容体の前駆体ｍＲＮＡの膜貫通エキソンおよび／または隣接するイントロンのどちらかに相補的な核酸および核酸アナログが用いられる。相補性は、スプライス部位にかかる前駆体ｍＲＮＡ配列中の配列に基づくものであってよく、限定するものではないが、エキソンイントロンジャンクションにまたがる配列に基づいた相補性を挙げることができる。あるいは相補性はイントロンの配列にのみ基づいてもよいし、または相補性はエキソンの配列にのみ基づいてもよい。
【００２１】
利用可能かつ当業者に周知の、いくつかの代替となる化学成分がある。１つの重要な特徴は、２’−デオキシオリゴヌクレオチド（「アンチセンスオリゴヌクレオチド」、以降「ＡＳＯＮ」）のようにＲＮａｓｅＨによる標的ＲＮＡの分解を引き起こすことなく、標的ＲＮＡにハイブリダイズする能力である。明確に述べれば、そのような化合物がスプライス切替オリゴマー（ＳＳＯ）と呼ばれることになる。当業者には明らかなように、ＳＳＯには、限定するものではないが、２’Ｏ−修飾オリゴヌクレオチドおよびリボヌクレオシドホスホロチオエート、ならびにペプチド核酸およびリボフラノシル系の結合を欠くその他のポリマーが挙げられる。
【００２２】
本発明の１つの実施形態は、患者または生体対象へのＳＳＯの投与により炎症性の疾病または状態を治療する方法である。投与されるＳＳＯは、安定で分泌性でリガンド結合性の型のＴＮＦＲスーパーファミリー受容体をコードするスプライスバリアントを生じるように、前駆体ｍＲＮＡのスプライシングを変更し、それによってその受容体のリガンドの活性を減少させる。別の実施形態では、本発明は、細胞へのＳＳＯの投与により、該細胞において安定で分泌性でリガンド結合性の型のＴＮＦＲスーパーファミリー受容体を産生させる方法である。
【００２３】
本発明の前述およびその他の目的および態様は、本明細書中の図面ならびに後述の詳説において詳細に議論される。
【発明の効果】
【００２４】
本発明によれば、ＴＮＦスーパーファミリー受容体に対するスプライス切替オリゴマー（ＳＳＯ）及び同ＳＳＯを含む組成物が提供できた。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】腫瘍壊死因子受容体の前駆体ｍＲＮＡの一部の構造ならびにＴＮＦＲ１およびＴＮＦＲ２に関するスプライス生成物を示す図。これらの転写物は通常、受容体の膜貫通ドメインをコードするエキソン７およびエキソン８を含んでいる。これらのエキソンの一方または両方を標的とするＳＳＯ（バー）は選択的スプライシングを誘発し、その結果として完全な膜貫通ドメインを欠く転写物を生じる。
【図２】細胞培養物におけるマウスＴＮＦＲ１に対するＳＳＯのスプライシング生成物を示す図。ＮＩＨ−３Ｔ３細胞を、ｍｏｃｋトランスフェクション［Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）２０００（ＬＦＡ２０００のみ）］するか、あるいは記載の濃度の、第７エキソンをスキップするＴＮＦＲ１  ＳＳＯ（Ａ７−５もしくはＡ７−１０）単独、または第７エキソンをスキップするＳＳＯと第８エキソンをスキップするＳＳＯ（Ａ８−３）との組み合わせのいずれかを用いてトランスフェクションした。２４時間後に全ＲＮＡを単離してＲＴ−ＰＣＲを実施した。ＰＣＲプライマーを使用して第５エキソンから第９エキソンまでを増幅し、「完全長」のＴＮＦＲ１が４７５ｂｐのバンドによって表わされるようにした。第７エキソンを欠く転写物（Δエキソン７）、第７エキソンおよび第８エキソンの両方を欠く転写物（Δエキソン７／８）は、それぞれ３６１ｂｐおよび３３２ｂｐのバンドによって表わされる。
【図３】細胞培養物におけるマウスＴＮＦＲ２に対するＳＳＯのスプライシング生成物を示す図。ＮＩＨ−３Ｔ３細胞を、ｍｏｃｋトランスフェクション（ＬＦＡ２０００のみ）するか、あるいは記載の濃度の、第７エキソンをスキップするＴＮＦＲ２  ＳＳＯ（Ｂ７−６もしくはＢ７−１）単独、または第７エキソンをスキップするオリゴヌクレオチドと第８エキソンをスキップするオリゴヌクレオチド（Ｂ８−４）との組み合わせのいずれかを用いてトランスフェクションした。２４時間後に全ＲＮＡを単離してＲＴ−ＰＣＲを実施した。ＰＣＲプライマーを使用して第５エキソンから第９エキソンまでを増幅し、「完全長」のＴＮＦＲ２が４８６ｂｐのバンドによって表わされるようにした。第７エキソンを欠く転写物（Δエキソン７）、第７エキソンおよび第８エキソンの両方を欠く転写物（Δエキソン７／８）は、それぞれ４０８ｂｐおよび３７３ｂｐのバンドによって表わされる。
【図４Ａ】マウスＴＮＦＲ１の第７エキソンおよび隣接するイントロンの配列を示す図。さらに、スプライス切替活性についてアッセイした２’Ｏ−Ｍｅ−オリゴリボヌクレオシド−ホスホロチオエートＳＳＯの配列も示されている。
【図４Ｂ】マウスＴＮＦＲ１の第８エキソンおよび隣接するイントロンの配列を示す図。さらに、スプライス切替活性についてアッセイした２’Ｏ−Ｍｅ−オリゴリボヌクレオシド−ホスホロチオエートＳＳＯの配列も示されている。
【図５Ａ】マウスＴＮＦＲ２の第７エキソンおよび隣接するイントロンの配列を示す図。さらに、スプライス切替活性についてアッセイした２’Ｏ−Ｍｅ−オリゴリボヌクレオシド−ホスホロチオエートＳＳＯの配列も示されている。
【図５Ｂ】マウスＴＮＦＲ２の第８エキソンおよび隣接するイントロンの配列を示す図。さらに、スプライス切替活性についてアッセイした２’Ｏ−Ｍｅ−オリゴリボヌクレオシド−ホスホロチオエートＳＳＯの配列も示されている。
【図６】ヒトおよびマウスのＴＮＦ受容体遺伝子の膜貫通エキソンをコードする領域のアラインメントを示す図。マウスの配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１０７、１０８、１０９および１１０は、ヒトの配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１、２、３および４にそれぞれ相同である。
【図７】図２および図３で述べたように実施したアッセイにおける、マウス初代肝細胞培養物についてのＳＳＯによるスプライシング生成物を示す図。
【図８Ａ】表２および表３に記載の、マウスおよびヒトのＴＮＦＲ２（ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ）のＬＮＡ  ＳＳＯ配列を示す図。標的とするエキソンに対する各ＳＳＯの相対位置を概略的に示している。
【図８Ｂ】表２および表３に記載の、マウスおよびヒトのＴＮＦＲ２（ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ）のＬＮＡ  ＳＳＯ配列を示す図。前駆体ｍＲＮＡ配列（５’→３’）および該配列にハイブリダイズしたＳＳＯ（３’→５’）を示している。
【図８Ｃ】表２および表３に記載の、マウスおよびヒトのＴＮＦＲ１（ＴＮＦＲＳＦ１Ａ）のＬＮＡ  ＳＳＯ配列を示す図。標的とするエキソンに対する各ＳＳＯの相対位置を概略的に示している。
【図８Ｄ】表２および表３に記載の、マウスおよびヒトのＴＮＦＲ１（ＴＮＦＲＳＦ１Ａ）のＬＮＡ  ＳＳＯ配列を示す図。前駆体ｍＲＮＡ配列（５’→３’）および該配列にハイブリダイズしたＳＳＯ（３’→５’）を示している。
【図９】ＬＮＡ  ＳＳＯで処理されたマウスＬ９２９細胞のスプライシング生成物を示す図。細胞を、最終濃度５０ｎＭの記載のＬＮＡ  ＳＳＯでトランスフェクションした。２４時間後、細胞を溶解してＲＴ−ＰＣＲによりスプライス切替について分析した。上側パネルは第７エキソンを標的とするＳＳＯ；下側パネルは第８エキソンを標的とするＳＳＯである。ＦＬは完全長のＴＮＦＲ２アンプリコンであり；Δ７、Δ８、Δ７／８はそれぞれのＴＮＦＲ２スプライスバリアントのアンプリコンである。
【図１０】ＴＮＦＲ２を標的とするＬＮＡ  ＳＳＯの組み合わせを用いた、マウスＬ９２９細胞のスプライシング生成物を示す図。Ｌ９２９細胞を単一または複数の記載のＬＮＡ  ＳＳＯそれぞれ５０ｎＭで処理し、２４時間後に図９で述べたようにして分析した。
【図１１】ＴＮＦＲ１を標的とするＬＮＡ  ＳＳＯの組み合わせを用いた、マウスＬ９２９細胞のスプライシング生成物を示す図。Ｌ９２９細胞を単一または複数の記載のＬＮＡ  ＳＳＯそれぞれ５０ｎＭで処理し、２４時間後に図９で述べたようにして分析した。
【図１２】ＬＮＡ  ＳＳＯで処理されたマウス初代肝細胞のスプライシング生成物を示す図。マウス初代肝細胞を、それぞれ最終濃度３３ｎＭの単一または複数の記載のＬＮＡ  ＳＳＯでトランスフェクションし、図９で述べたようにして分析した。
【図１３】Ｌ９２９細胞（左）およびマウス初代肝細胞（右）由来の分泌型ＴＮＦＲ２スプライスバリアントの検出をグラフで示す図。細胞を記載のＬＮＡ  ＳＳＯでトランスフェクションした。７２時間後、細胞外の培地を取り出して、Ｒ  ＆  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（米国ミネソタ州ミネアポリス所在）のＱｕａｎｔｉｋｉｎｅ（登録商標）マウスｓＴＮＦ  ＲＩＩ  ＥＬＩＳＡキットの抗体を使用して、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）によって分析した。データは１ｍＬあたりの可溶性ＴＮＦＲ２（ｐｇ）として表されている。
【図１４】ＴＮＦＲ２を標的とするＬＮＡ  ＳＳＯで処理されたヒト初代肝細胞のスプライシング生成物を示す図。ヒト初代肝細胞を記載のＬＮＡ  ＳＳＯでトランスフェクションし、２４時間後に図９で述べたようにしてＲＴ−ＰＣＲによりスプライス切替について分析した。ＰＣＲプライマーを用いて第５エキソンから第９エキソンまでを増幅し、「完全長」（ＦＬ）のＴＮＦＲ２が４６３ｂｐのバンドで表わされるようにした。第７エキソンを欠く転写物（Δエキソン７）、第８エキソンを欠く転写物（Δエキソン８）、第７エキソンおよび第８エキソンの両方を欠く転写物（Δエキソン７／８）は、それぞれ３８５ｂｐ、４２８ｂｐおよび３５０ｂｐのバンドで表わされる。
【図１５】マウスへのＬＮＡ３２７４（上）および３３０５（下）の腹腔内（ｉ．ｐ．）注射に関するスプライシング生成物を示す図。ＬＮＡ３２７４は、１日あたり２５ｍｇ／ｋｇとして４日間（４／１および４／１０）または１０日間（１０／１）、ｉ．ｐ．注射した。最後の注射の１日後（４／１および１０／１）または１０日後（４／１０）にマウスを屠殺し、肝臓由来の全ＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲによってＴＮＦＲ２のスプライス切替について分析した。ＬＮＡ３３０５は、１日あたり記載の用量で４日間注射した。翌日にマウスを屠殺し、３２７４で処理した動物と同じようにして肝臓を分析した。
【図１６】ＳＳＯで処理した１０日後のマウス血清中の可溶性ＴＮＦＲ２の量をグラフで示す図（上側パネル）。マウスに、記載のＳＳＯまたは生理食塩水（１群当たりｎ＝５）を１日あたり２５ｍｇ／ｋｇとして１０日間ｉ．ｐ．注射した。注射を始める４日前および最後の注射の後記載の日数において血清を回収した。血清を図１３で述べたようにしてＥＬＩＳＡで分析した。１０日目にマウスを屠殺し、肝臓を図９で述べたようにしてＲＴ−ＰＣＲによりＴＮＦＲ２のスプライス切替について分析した（下側パネル）。
【図１７】ＴＮＦＲ２  ＳＳＯで処理した後の血清中の可溶性ＴＮＦＲ１の量をグラフで示す図。図１６由来のマウス血清を、Ｒ  ＆  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（米国ミネソタ州ミネアポリス所在）のＱｕａｎｔｉｋｉｎｅ（登録商標）マウスｓＴＮＦ  ＲＩ  ＥＬＩＳＡキットの抗体を使用して、ＥＬＩＳＡにより可溶性ＴＮＦＲ１について分析した。
【図１８】ＳＳＯで処理した２７日後のマウス血清中の可溶性ＴＮＦＲ２の量をグラフで示す図（上側パネル）。マウスを図１６と同じように処理し、ただし最後の注射の２７日後まで血清試料を回収した。ＬＮＡ３０８３および３２７２は、ＴＮＦＲ２スプライス切替能力のない対照のＳＳＯである。２７日目にマウスを屠殺し、肝臓を図９で述べたようにしてＲＴ−ＰＣＲによりＴＮＦＲ２のスプライス切替について分析した（下側パネル）。
【図１９】ＬＮＡオリゴヌクレオチドで処理したマウス由来の血清中の抗ＴＮＦ−α活性をグラフで示す図。Ｌ９２９細胞を、０．１ｎｇ／ｍＬのＴＮＦ−α（ＴＮＦ）、またはＴＮＦ−α＋記載のオリゴヌクレオチドで処理したマウス由来の血清１０％のいずれかで処理した（図１８も参照のこと）。細胞の生存率を２４時間後に測定し、未処理の細胞（未処理）に対して標準化した。
【図２０】図１９で述べた細胞生存アッセイを使用して、ＬＮＡオリゴヌクレオチドで処理したマウス由来の血清の抗ＴＮＦ−α活性を、組換え型可溶性ＴＮＦＲ２（ｒｓＴＮＦＲ２）およびＥｎｂｒｅｌ（登録商標）の活性と比較するグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本明細書で使用されるように、用語「腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー」または「ＴＮＦＲスーパーファミリー」または「ＴＮＦＲＳＦ」は、カルボキシ末端の細胞内ドメインと、共通のシステインリッチドメイン（ＣＲＤ）を特徴とするアミノ末端の細胞外ドメインとを備えた、タイプＩの膜貫通型タンパク質群を指す。ＴＮＦＲスーパーファミリーは受容体で構成され、該受容体はＴＮＦスーパーファミリーの１または複数のリガンドに結合する結果として細胞のシグナル伝達を仲介する。ＴＮＦＲスーパーファミリーは、２つのサブグループ、すなわち細胞内デスドメイン（ＤＤ）を含む受容体と、ＤＤを欠く受容体とに分けることができる。ＤＤは、受容体の活性化に続くアポトーシス誘導を担う８０アミノ酸のモチーフである。ＴＮＦＲスーパーファミリーのメンバーには、限定するものではないが、ＴＮＦＲ１（ＴＮＦＲＳＦ１Ａ）、ＴＮＦＲ２（ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ）、ＲＡＮＫ（ＴＮＦＲＳＦ１１Ａ）、ＣＤ４０（ＴＮＦＲＳＦ５）、ＣＤ３０（ＴＮＦＲＳＦ８）およびＬＴ−βＲ（ＴＮＦＲＳＦ３）が含まれる。
【００２７】
本明細書で使用されるように、用語「腫瘍壊死因子スーパーファミリー」または「ＴＮＦスーパーファミリー」は、ＴＮＦＲスーパーファミリーの１または複数の受容体に結合するリガンド群を指す。ＴＮＦファミリーのリガンドが対応する１または複数の受容体に結合すると、細胞のシグナル伝達が仲介される。ＴＮＦスーパーファミリーのメンバーには、限定するものではないが、ＴＮＦ−α、ＲＡＮＫＬ、ＣＤ４０Ｌ、ＬＴ−α、またはＬＴ−βが含まれる。
【００２８】
本明細書で使用されるように、用語「炎症性の疾病または状態」は、ＴＮＦスーパーファミリー由来のリガンドが対応する１または複数の受容体に結合することに少なくとも部分的に起因するか、または該結合によって悪化する、疾病、障害またはその他の医学的状態を指す。そのような疾病または状態には、限定するものではないが、ＴＮＦスーパーファミリーのリガンドのレベル上昇、ＴＮＦＲスーパーファミリー受容体レベルのレベル上昇、または対応するシグナル伝達経路の鋭敏化の増大を伴うものが挙げられる。炎症性の疾病または状態の例としては、限定するものではないが、慢性関節リウマチ、若年性慢性関節リウマチ、乾癬、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、炎症性腸疾患（クローン病または潰瘍性大腸炎を含む）、肝炎、敗血症、アルコール性肝疾患、および非アルコール性の脂肪症が挙げられる。
【００２９】
本明細書で使用されるように、用語「肝炎」は、少なくとも部分的には肝臓の炎症を特徴とする、消化器病学上の疾病、状態または障害を指す。肝炎の例としては、限定するものではないが、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、または虚血／再灌流に関連した肝臓の炎症、に関連した肝炎が挙げられる。
【００３０】
本明細書で使用されるように、用語「膜結合型」または「膜内在型」は、細胞膜を貫通するアミノ酸配列を有するタンパク質であって、細胞膜のいずれの側にもアミノ酸配列を備えているものを指す。
【００３１】
本明細書で使用されるように、用語「安定で分泌性でリガンド結合性の型」は、「安定で可溶性でリガンド結合性の型」として知られることもあるように（ここで、用語「分泌性」および「可溶性」は同意語であり、本明細書中では互換的である）、本来の膜結合型受容体の類縁タンパク質であって、該タンパク質が分泌性で安定であり、かつ対応するリガンドに結合する能力を維持しているものを指す。留意すべきことは、そのような分泌型が生理的なものであるかどうかによって上記の型が定義されるものではないこと、単にそのスプライスバリアントの生成物が、生成された場合に分泌性で、安定で、かつリガンド結合能力を維持しているであろうということである。
【００３２】
用語「分泌性」は、その型が可溶性であること、すなわち、細胞膜にはもはや結合しないことを意味する。この意味において、当業者に周知の従来のアッセイを用いて、ある型のうちのほとんどが膜と関係のないフラクション（例えば細胞上清中または血清中）に検出可能な場合、その型は可溶性ということになる。
【００３３】
用語「安定な」とは、その分泌型が、当業者により従来のアッセイを用いて検出可能であることを意味する。例えば、ウエスタンブロット法、ＥＬＩＳＡアッセイを用いて、患者から採取された細胞、細胞上清または血清からその型を検出することができる。
【００３４】
用語「リガンド結合性」は、その型が、対応する膜内在型の特異的リガンド結合活性を少なくともあるレベル（すべてである必要はない）で保持していることを意味する。
本明細書で使用されるように、用語「リガンドの活性を低減する」とは、受容体へのリガンドの結合またはリガンドと受容体との相互作用に起因する細胞内シグナル伝達の減少をもたらす任意の作用を指す。例えば、活性は、リガンドが該リガンドの受容体の可溶型に結合することにより、あるいはリガンドに結合可能な膜型受容体の量を減少させることにより、低減可能である。
【００３５】
本明細書で使用されるように、用語「前駆体ｍＲＮＡのスプライシングを変更する」とは、細胞の標的前駆体ｍＲＮＡのスプライシングを変更する結果としてスプライス生成物の比率を変更することを指す。そのようなスプライシングの変更は、当業者に周知の様々な技法によって検出可能である。例えば、細胞の全ＲＮＡについてのＲＴ−ＰＣＲを用いて、ＳＳＯ存在下および非存在下でのスプライス生成物の比率を検出することができる。
【００３６】
本明細書で使用されるように、用語「相補的」は、ＳＳＯと、標的配列を含んでいるＤＮＡまたはＲＮＡとの間に、安定かつ特異的な結合が生じるような、十分な程度の相補性または正確な対合を示すために使用される。当分野では当然のことであるが、ＳＳＯの配列はその標的の配列に１００％相補的である必要はない。スプライシングが可能な条件の下で、標的への結合が生じ、かつ非特異的な結合は回避される場合に、十分な程度の相補性が存在する。
【００３７】
本発明は、ＴＮＦＲスーパーファミリー由来の受容体の選択的スプライシングを制御して、可溶性で、安定で、分泌性で、リガンド結合性の型の量が増大し、膜内在型の量が減少するようにするために、スプライス切替オリゴヌクレオチドまたはスプライス切替オリゴマー（ＳＳＯ）を使用する。本発明の方法および組成物を、過剰なＴＮＦスーパーファミリー活性に関連した疾病の治療に使用することができる。
【００３８】
従って、本発明の１つの実施形態は、患者にＳＳＯを投与することにより炎症性の疾病または状態を治療する方法である。投与されたＳＳＯは、安定で、分泌性で、リガンド結合性の型のＴＮＦＲスーパーファミリー受容体をコードするスプライスバリアントを生成するように前駆体ｍＲＮＡのスプライシングを変更し、そうすることによって該受容体のリガンドの活性を減少させる。別の実施形態では、本発明は、細胞にＳＳＯを投与することにより、該細胞において安定で、分泌性で、リガンド結合性の型のＴＮＦＲスーパーファミリー受容体を生成する方法である。
【００３９】
以下に議論される本発明の次の態様は先述の実施形態に当てはまる。
ＳＳＯの長さはアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯＮ）に類似しており、典型的には約１０〜２４ヌクレオチドである。本発明は、ＲＮＡにハイブリダイズするが、従来のアンチセンス２’−デオキシオリゴヌクレオチドのようにＲＮａｓｅＨによる該ＲＮＡの破壊を活性化することはない、いくつかの化学成分でできたＳＳＯを用いて実行することができる。本発明は、２’Ｏ−メチルまたは２’Ｏ−メチルオキシエチル・ホスホロチオエートのような、２’Ｏ修飾された核酸オリゴマーを使用して実行することができる。核酸塩基は糖に連結される必要はなく、いわゆるペプチド核酸オリゴマーまたはモルホリン系オリゴマーを使用することができる。これらの様々な連結化学成分の比較については、サザニ、Ｐ．（Ｓａｚａｎｉ，Ｐ．）ら、２００１，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２９：３６９５に記載されている。スプライス切替オリゴヌクレオチドという用語は、上記の種のものを包含するように意図されている。当業者は、アンチセンスオリゴヌクレオチドギャップマーとＳＳＯとの関係を十分に理解するだろう。ギャップマー（ｇａｐｍｅｒ）は、ＲＮａｓｅＨを活性化する領域（典型的には２’−デオキシリボヌクレオシドホスホロチオエート）を含むＡＳＯＮであって、該領域には活性化作用のないヌクレアーゼ耐性オリゴマーが隣接している。一般に、ギャップマーＡＳＯＮの該隣接配列に適した任意の化学成分を、ＳＳＯに使用することができる。
【００４０】
本発明のＳＳＯは、よく知られた固相合成技法によって製造可能である。当分野で周知のそのような合成のための他の手段も、付随的に、または代替的に使用可能である。ホスホロチオエートおよびアルキル化誘導体のようなオリゴヌクレオチドを調製するために同様の技法を使用することはよく知られている。
【００４１】
特に好ましい化学成分は、ロックされた核酸（ＬＮＡ）によって提供される（コシキン、Ａ．Ａ．（Ｋｏｓｈｋｉｎ，Ａ．Ａ．）ら、１９９８，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ５４：３６０７；オビカ、Ｓ．（Ｏｂｉｋａ，Ｓ．）ら、１９９８，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．３９：５４０１）。ＬＮＡは、リボフラノシル部分が２’Ｏと４’Ｃとの間の架橋によって二環となっていること以外の点では、従来のホスホジエステル結合したリボヌクレオチドである。この架橋により、リボフラノシル環の立体配座は、オリゴヌクレオチドが相補的ＲＮＡにハイブリダイズするときに採る立体配座（３’ｅｎｄｏ配座）内に制約される。ＬＮＡの合成における最近の進歩については国際公開公報第０３／０９５４６７号パンフレットに記載されている。架橋は、最も典型的にはメチレンまたはエチレンである。２’Ｏ，４’Ｃ−エチレン架橋型の核酸（ＥＮＡ）、ならびにその他のＬＮＡの合成については、モリタ（Ｍｏｒｉｔａ）ら、２００３，Ｂｉｏｏｒｇ．  ＆  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１１：２２１１に記載されている。しかしながら、別の化学成分を使用することも可能であり、２’Ｏが２’Ｎで置き換えられてもよい。ＬＮＡおよび従来のヌクレオチドが混合されてキメラ状のＳＳＯが形成されてもよい。例えば、ＬＮＡと２’デオキシヌクレオチドとが交互になっている、またはＬＮＡと２’Ｏ−Ｍｅもしくは２’Ｏ−ＭＯＥとが交互になっているキメラ状ＳＳＯを使用することができる。２’−デオキシヌクレオチドに限らず、これらの化学成分のうち任意のものの別例は、ホスホジエステルに代わるホスホロチオエートジエステル結合である。インビボでの使用については、ホスホロチオエート結合が好ましい。
【００４２】
ＬＮＡヌクレオチドがＳＳＯにおいて使用される場合、非ＬＮＡヌクレオチドも存在することが好ましい。ＬＮＡヌクレオチドは、かなりの非特異的結合を存在させうる高いハイブリダイゼーション親和性を有し、このことは遊離ＳＳＯの有効濃度を低減する可能性がある。ＬＮＡヌクレオチドが使用される場合、ＬＮＡヌクレオチドは２’−デオキシヌクレオチドとともに好都合なように交互になされるとよい。交互になされるパターンには重要な意味はない。ヌクレオチドが交互になっているもの、ジヌクレオチドが交互になっているもの、または混合型のパターン、例えば、ＬＤＬＤＬＤまたはＬＬＤＬＬＤまたはＬＤＤＬＤＤを使用することができる。２’−デオキシヌクレオチドまたは２’−デオキシヌクレオシドホスホロチオエートがＬＮＡヌクレオチドと混合される場合は、ＲＮａｓｅＨの活性化の回避が重要である。ＳＳＯのＬＮＡヌクレオチドが約３分の１〜３分の２であることが適切であろうと予想される。例えば、ＳＳＯが１２量体ならば、少なくとも４つのＬＮＡヌクレオチドおよび４つの従来型ヌクレオチドが存在することになる。
【００４３】
ＳＳＯの塩基は、従来のシトシン、グアニン、アデニン、およびウラシルまたはチミジンであってよい。別例として、修飾塩基も使用することができる。特に興味深いのは、結合親和性を増大させる修飾塩基である。好ましい修飾塩基の非限定的な一例は、いわゆるＧ形クランプまたは９−（アミノエトキシ）フェノキサジンヌクレオチド、グアノシンとともに４つの水素結合を形成するシトシンアナログである。（フラナガン、Ｗ．Ｍ．（Ｆｌａｎａｇａｎ，Ｗ．Ｍ．）ら、１９９９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９６：３５１３；ホルメス、Ｓ．Ｃ．（Ｈｏｌｍｅｓ，Ｓ．Ｃ．）、２００３，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１：２７５９）。
【００４４】
ＲＮａｓｅＨを活性化しない、多数の代替化学成分を利用可能である。例えば、適切なＳＳＯは、ヌクレオチド間を架橋するリン酸残基のうち少なくとも１つまたはすべてが修飾リン酸であるオリゴヌクレオチドであってもよく、修飾リン酸は例えばメチルホスホネート、メチルホスホノチオエート、ホスホロモルホリデート、ホスホロピペラジデートおよびホスホロアミデートなどである。例えば、ヌクレオチド間を架橋するリン酸残基が１つおきに記載のように修飾されてもよい。別の非限定的な例では、そのようなＳＳＯは、ヌクレオチドのうち少なくとも１つまたはすべてが２’低級アルキル部分（例えば、Ｃ１〜Ｃ４の、直線状または分岐状の、飽和または不飽和のアルキル、例えばメチル、エチル、エテニル、プロピル、１−プロペニル、２−プロペニル、およびイソプロピル）を含んでいるオリゴヌクレオチドである。例えば、ヌクレオチドが１つおきに記載のように修飾されてもよい。［米国特許第５，９７６，８７９号明細書の第４カラムの参考文献を参照のこと］。
【００４５】
ＳＳＯの長さ（すなわちオリゴマー中のモノマーの数）は、約１０〜約３０塩基長となろう。１つの実施形態では、２０塩基の２’Ｏ−Ｍｅ−リボヌクレオシドホスホロチオエートが有効である。当業者には当然のことであるが、親和性を増大させる化学修飾が使用される場合は、ＳＳＯはより短くかつ特異性を保持したものとなりうる。さらに当業者には当然のことであるが、ＳＳＯのサイズの上限は、標的配列の特異的認識を維持するため、かつ二次構造を形成するＳＳＯの分子内ハイブリダイゼーションを回避するための必要性によって、ならびに細胞に侵入可能な限度によって決まる。これらの制限は、ＳＳＯの長さが増大すると（ＳＳＯの親和性によって変わる特定の長さを超えると）、特異性の低下、不活性化、または不十分な活性が見出されることが多くなるであろうことを示唆している。
【００４６】
本発明のＳＳＯには、限定するものではないが、ＳＳＯの活性、細胞内分布もしくは細胞への取り込みを増強する１以上の部分またはコンジュゲートがＳＳＯに化学的に結合しているＳＳＯ修飾体が挙げられる。そのような部分には、限定するものではないが、脂質部分、例えばコレステロール部分、コール酸、チオエーテル、例えばヘキシル−Ｓ−トリチルチオール、チオコレステロール、脂肪鎖、例えばドデカンジオールまたはウンデシル残基、リン脂質、例えばジヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールまたはトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖、アダマンタン酢酸、パルミチル部分、オクタデシルアミンまたはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分が挙げられる。
【００４７】
所与のＳＳＯ中のすべての部位について一様に修飾されている必要はなく、実際、前述の修飾のうち２以上が単一の化合物に、あるいはＳＳＯ内の単一のヌクレオシドに組み込まれてもよい。
【００４８】
ＳＳＯは、取り込み、分布及び吸収のうちの少なくとも一つを助けるために、例えばリポソーム、受容体を標的とする分子、経口用、直腸用、局所用もしくはその他の処方物のような、他の分子、分子構造体、または化合物の混合物とともに、混合、カプセル化、コンジュゲート化、またはそうでなければ会合されうる。
【００４９】
当業者には当然のことであるが、細胞の分化には、限定するものではないが、スプライセオソームの分化が含まれる。従って、本発明の任意の特定のＳＳＯの活性は、該ＳＳＯが導入される細胞種によって変わりうる。例えば、細胞種において有効なＳＳＯは別の細胞種では効果がないかもしれない。
【００５０】
本発明の方法、オリゴヌクレオチドおよび製剤は、ヒトまたは動物の遺伝子におけるスプライシングを調べるためのインビトロまたはインビボのツールとしても有用である。そのような方法を、本明細書に記載の手順により、あるいは当業者には明白なその改良法により、実行することができる。
【００５１】
本発明は、医師がＴＮＦスーパーファミリー・リガンドの影響またはそのようなリガンドによって活性化されるシグナル伝達経路を制限しようとする任意の状態を治療するために使用することができる。特に、本発明は炎症性疾患を治療するために使用することができる。１つの実施形態では、上記の状態は炎症性の全身性疾患（例えば慢性関節リウマチまたは乾癬性関節炎）である。別の実施形態では、その疾患は炎症性の肝臓病である。炎症性の肝臓病の例には、限定するものではないが、Ａ型、Ｂ型またはＣ型肝炎ウイルスに関連した肝炎、アルコール性肝疾患、および非アルコール性の脂肪症が含まれる。さらに別の実施形態では、炎症性疾患は乾癬のような皮膚状態である。
【００５２】
本発明の用途には、限定するものではないが、既知のＴＮＦアンタゴニストが有用であることが示されている疾患の治療が挙げられる。３つの特定のＴＮＦアンタゴニストが現在ＦＤＡに承認されている。その薬物は、エタネルセプト（Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標））、インフリキシマブ（Ｒｅｍｉｃａｄｅ（登録商標））およびアダリムマブ（Ｈｕｍｉｒａ（登録商標））である。これらの薬物のうち１つ以上が、慢性関節リウマチ、若年性慢性関節リウマチ、乾癬、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、および炎症性腸疾患（クローン病または潰瘍性大腸炎）の治療について承認されている。
【００５３】
好ましい実施形態では、受容体はＴＮＦＲ１またはＴＮＦＲ２受容体である。他の実施形態では、受容体は、ＴＮＦＲ１およびＴＮＦＲ２に十分に相同なＴＮＦＲスーパーファミリーのメンバー（例えば、ＴＮＦＲＳＦ３、ＴＮＦＲＳＦ５、もしくはＴＮＦＲＳＦ１１Ａ）であって、エキソン７および８に相同なエキソンのいずれかまたは両方の欠失により分泌型が生じるものである。当業者には当然のことであるが、本発明の実施可能性は、そのような分泌型が生理的なものかどうかによって決まるのではなく、単に、そのようなスプライスバリアントの生成物が、分泌性で、安定で、リガンド結合能力を有していることによって決まる。
【００５４】
対象へのＳＳＯの投与は、ＡＳＯＮのために開発された手法を使用して行うことができる。ＡＳＯＮは、生理食塩水中に含めて６ｍｇ／ｋｇの用量で１週間に３回の静脈内投与により、実験動物およびヒト対象に投与され成功している（ヤシシン、Ｂ．Ｒ．（Ｙａｃｙｓｙｈｎ，Ｂ．Ｒ．）ら、２００２，Ｇｕｔ  ５１：３０（クローン病治療用の抗ＩＣＡＭ−１  ＡＳＯＮ）；スティーヴンソン、Ｊ．（Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ，Ｊ．）ら、１９９９，Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  １７：２２２７（ＰＢＭＣに標的設定された抗ＲＡＦ−１  ＡＳＯＮ））。ＴＮＦ−αを標的とする２’Ｏ−ＭＯＥホスホロチオエートＡＳＯＮの薬物動態が報告されている（ギアリー、Ｒ．Ｓ．（Ｇｅａｒｙ，Ｒ．Ｓ．）ら、２００３，Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ａｎｄ  Ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ  ３１：１４１９）。混合ＬＮＡ／ＤＮＡ分子の全身的な効能も報告されている（フルーター、Ｋ．（Ｆｌｕｉｔｅｒ，Ｋ．）ら、２００３，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１：９５３）。
【００５５】
マウスのモデル系におけるＳＳＯの全身作用が、２’Ｏ−ＭＯＥホスホロチオエートおよびＰＮＡ化学成分を使用して調査された。重要な活性は、脳、胃および真皮を除き調査されたすべての組織で観察された（サザニ、Ｐ．（Ｓａｚａｎｉ，Ｐ．）ら、２００２，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０，１２２８）。
【００５６】
一般に、従来のアンチセンス療法に有用な任意の投与方法を、本発明のＳＳＯを投与するために使用することができる。培養細胞におけるＳＳＯの試験については、ＡＳＯＮまたはＳＳＯを試験するために開発された任意の技術を使用可能である。
【００５７】
本発明の製剤は、水性担体のような生理学的または薬学的に許容可能な担体中にＳＳＯを含んでなる。したがって、本発明で使用される製剤には、限定するものではないが、非経口投与、例えば、腹腔内、静脈内、動脈内、皮下、もしくは筋肉内への注射もしくは注入に適した製剤、ならびに、局所投与（例えば、眼科的投与および経腟送達などの経粘膜投与）、経口投与、直腸投与、経肺投与（噴霧器、気管内送達、鼻腔内送達などによる散剤もしくはエアロゾル剤の吸入あるいは注入）に適した製剤が挙げられる。該製剤は、単位投与形態として便利なように提供されてもよいし、また当分野において周知の任意の方法によって調製可能である。いかなる場合にも最適な投与経路は、被投与者、治療される病状の性質および重症度、ならびに使用される特定の活性化合物によって変化しうる。
【００５８】
本発明の医薬品組成物には、限定するものではないが、その生理学的かつ薬学的に許容可能な塩、すなわち親化合物の所望の生物活性を保持し、かつ望ましくない毒物学的作用をもたらさない塩が含まれる。そのような塩の例には、（ａ）陽イオン、例えばナトリウム、カリウム、ＮＨ４＋、マグネシウム、カルシウム、スペルミンおよびスペルミジンのようなポリアミンなどとともに形成された塩；（ｂ）無機酸、例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、硝酸などとともに形成された酸付加塩；（ｃ）有機酸、例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、グルコン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、安息香酸、タンニン酸、パルミチン酸、アルギン酸、ポリグルタミン酸、ナフタレンスルホン酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ナフタレンジスルホン酸、ポリガラクツロン酸などとともに形成された塩；ならびに（ｄ）元素陰イオン、例えば、塩素、臭素およびヨウ素などから形成された塩；が挙げられる。
【００５９】
本発明は、上記に議論したように、ＴＮＦ−αなどのサイトカインの過剰な活性を伴う炎症性障害に罹患した患者において、ＴＮＦＲスーパーファミリーのメンバーの可溶型と対応する膜結合型との比率を増大させるための医薬を調製するための、上述のような特徴を有するＳＳＯの用途を提供する。本発明による医薬の製造においては、ＳＳＯは一般に、特に許容可能な担体と混合される。該担体は、当然ながら、該製剤中で他の成分と混合可能であるという意味において許容可能でなければならず、また患者に有害であってはならない。担体は固体でも液体でもよい。ＳＳＯは本発明の製剤に組み込まれ、該製剤は、任意選択で１以上の付属的治療成分を含む構成成分を混合することから本質的に構成される、周知の任意の調剤技術によって調製可能である。
【００６０】
本発明の製剤は、活性化合物の無菌の水性および非水性の注射用溶液を含むものでよく、その調製物は、意図した被投与者の血液と等張であり、かつ本質的に発熱性物質を含まないことが好ましい。これらの調製物は、酸化防止剤、緩衝剤、静菌薬、および製剤を意図した被投与者の血液と等張にする溶質を含有しうる。水性および非水性の無菌懸濁物は、限定するものではないが、懸濁化剤および粘稠化剤を含みうる。製剤は、単位用量または複数回用量の容器（例えば密封したアンプルおよびバイアル）中に提供されてもよく、また、使用直前に無菌の液体担体（例えば生理食塩水または注射用水）を添加するだけでよい冷凍乾燥（凍結乾燥）状態で保存されてもよい。
【００６１】
製剤中では、ＳＳＯは、非経口投与に適している可能性のある、リポソームまたは微結晶のような脂質粒子または小胞内に含まれていてもよい。粒子は、その中にＳＳＯが含まれる限りは、任意の適切な構造、例えば単層または多層であってよい。正に荷電した脂質、例えばＮ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル−アンモニウムメチルサルフェート、または「ＤＯＴＡＰ」は、そのような粒子および小胞に特に好適である。そのような脂質粒子の調製物はよく知られている。［米国特許第５，９７６，８７９号明細書の第６カラムの参考文献を参照されたい］。
【００６２】
ＳＳＯは、スプライシングを調節する任意の要素または要素の組み合わせを標的とすることが可能であり、該要素は例えば、３’スプライス部位、５’スプライス部位、ブランチ部位、ポリピリミジントラクト、エキソン内スプライシングエンハンサ、エキソン内スプライシングサイレンサ、イントロン内スプライシングエンハンサ、およびイントロン内スプライシングサイレンサである。ＳＳＯの配列の決定には、以降の表を指標とすることが可能であり、その表は、配列および位置が図４、５、および８に示すとおりであるＳＳＯの活性を示している。当業者であれば：１）エキソンに相補的なＳＳＯは、スプライス受容部位またはスプライス供与部位のいずれにも相補的である必要はないこと（注：表１のＳＳＯ  Ａ７−１０、Ｂ７−７およびＢ７−９）；２）イントロンの配列およびエキソンのわずか１ヌクレオチドに相補的なＳＳＯは有効な可能性があること（注：表１のＡ８−５およびＢ７−６）；３）エキソンに直接隣接しているイントロンに相補的なＳＳＯも有効な可能性があること（注：表２の３３１２）；ならびに、４）通常は、オリゴヌクレオチド単独の有効性から、他のＳＳＯと組み合わせたＳＳＯの有効性が予測されること、に気付くであろう。
【００６３】
当業者には当然のことであるが、ヒトＴＮＦ−α受容体を標的とした本発明は、ＴＮＦＲ１またはＴＮＦＲ２遺伝子のエキソン７または８および該エキソンに隣接するイントロンを含んでなる部分の少なくとも１０ヌクレオチド、好ましくは１５〜２０ヌクレオチドに相補的な配列を有するＳＳＯを用いて、実行することができる。エキソン自体の少なくとも１ヌクレオチドが該相補配列内に含まれることがさらに好ましい。ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．（配列番号）１〜４は、ＴＮＦＲ１（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１及び２）ならびにＴＮＦＲ２（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３及び４）の、エキソン７および８とその隣にあるイントロンの隣接する５０ヌクレオチドとの配列を含んでいる。親和性を増強する修飾（例えば、限定するものではないがＬＮＡまたはＧ形クランプヌクレオチド）が使用される場合、当業者であればわかるようにＳＳＯの長さを相応に短縮することができる。従来のヌクレオチドとＬＮＡヌクレオチドとが交互になっているものを使用する場合、長さ１６ヌクレオチドが有効である。ＬＮＡおよび従来のヌクレオチドが交互になるパターンは重要ではない。
【００６４】
当業者であれば同様に分かるように、ＳＳＯ配列の選択は、部分的な「ヘアピン状」二重鎖構造の形成をもたらす可能性のある自己相補的ＳＳＯを回避するように注意して行わなければならない。加えて、非特異的な塩基対合の可能性を最小限にするために、高いＧＣ含量を避けるべきである。更に、例えばＢＬＡＳＴによって明らかとなる、標的外遺伝子に一致するＳＳＯも、回避すべきである。
【００６５】
状況によっては、ヒトおよび他の少なくとも１生物種を標的とすることができるＳＳＯ配列を選択することが好ましいかもしれない。これらのＳＳＯは、ヒトで使用する前に前記の他の生物種において本発明を試験し最適化することにより、規制当局の承認を受け、かつ薬剤を開発する目的に役立てるために使用することができる。例えば、ヒトのＴＮＦＲ２を標的とするＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７４、７５、７７、７８、８０および８９は、対応するアカゲザル（Ｍａｃａｃａ  Ｍｕｌｌａｔａ）の配列とも１００％相補的である。その結果、これらの配列は、ヒトで使用する前にサルでの治療を試験するために使用することができる。
【００６６】
当業者には当然のことであるが、本発明の範囲から逸脱することなく、上述の本発明に様々な省略、追加および修飾をなすことが可能であり、すべてのそのような修飾および変更は、添付の特許請求の範囲によって定義されるように、本発明の範囲内にあるものと意図される。引用された参照文献、特許文献、特許出願または他の文書はすべて、参照によって本願に組み込まれる。
【実施例１】
【００６７】
材料と方法
［オリゴヌクレオチド］  すべて一様に修飾された２’−Ｏ−メチル−リボヌクレオシド−ホスホロチオエート（２’−ＯＭｅ）２０量体は、米国カリフォルニア州サンディエゴのＴｒｉｌｉｎｋ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓにより合成された。これらの配列を表１に列挙する。表２および表３は、２’デオキシ−および２’Ｏ−４’−（メチレン）−二環式−リボヌクレオシド−ホスホロチオエートが交互になっているキメラ状のＬＮＡ  ＳＳＯの配列を示している。これらはデンマークのＳａｎｔａｒｉｓ  Ｐｈａｒｍａにより合成された。各ＬＮＡオリゴヌクレオチドについて、５’末端ヌクレオシドは２’Ｏ−４’−メチレン−リボヌクレオシドであり、３’末端リボヌクレオシドは２’デオキシ−リボヌクレオシドであった。
【００６８】
［細胞培養およびトランスフェクション］  ＮＩＨ−３Ｔ３細胞は、１０％のコロラド・ウシ胎仔血清および抗生物質を補足したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で維持した（３７℃、５％ＣＯ２）。Ｌ９２９細胞は、１０％のウシ胎児血清および抗生物質を補足した最少必須培地中で維持した（３７℃、５％ＣＯ２）。トランスフェクションについては、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞またはＬ９２９細胞のいずれかを２４ウェルプレートに１ウェルあたり細胞１０５個として播種し、２４時間後にトランスフェクションした。オリゴヌクレオチドは、２μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）２０００トランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、製造業者の指示に従って表示の濃度で複合体化した。その後、このヌクレオチド／脂質複合体を細胞に付与し、何時間もインキュベーションした。その後、培地を吸引し、ＴＲＩ−Ｒｅａｇｅｎｔ（登録商標）（米国オハイオ州シンシナティのＭＲＣ）を用いて細胞をハーベストした。
【００６９】
［ＲＴ−ＰＣＲ］  ＴＲＩ−Ｒｅａｇｅｎｔ（登録商標）（米国オハイオ州シンシナティのＭＲＣ）を用いて全ＲＮＡを単離し、ＴＮＦＲ１またはＴＮＦＲ２のｍＲＮＡを、ｒＴｔｈポリメラーゼ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて供給業者の指示に従ってＲＴ−ＰＣＲにより増幅させた。マウスのＴＮＦＲ１  ｍＲＮＡは、順方向プライマーＰＳ００９（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１１１）（５’−ＧＡＡ  ＡＧＴ  ＧＡＧ  ＴＧＣ  ＧＴＣ  ＣＣＴ  ＴＧＣ−３’）および逆方向プライマーＰＳ０１０（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１１２）（５’−ＧＣＡ  ＣＧＧ  ＡＧＣ  ＡＧＡ  ＧＴＧ  ＡＴＴ  ＣＧ−３’）を使用して増幅させた。マウスのＴＮＦＲ２  ｍＲＮＡは、順方向プライマーＰＳ００３（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１１３）（５’−ＧＡＧ  ＣＣＣ  ＣＡＡ  ＡＴＧ  ＧＡＡ  ＡＴＧ  ＴＧＣ−３’）および逆方向プライマーＰＳ００４（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１１４）（５’−ＧＣＴ  ＣＡＡ  ＧＧＣ  ＣＴＡ  ＣＴＧ  ＣＣ−３’）を使用して増幅させた。ヒトのＴＮＦＲ２  ｍＲＮＡは、順方向プライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１１５）（５’−ＡＣＴ  ＧＡＡ  ＡＣＡ  ＴＣＡ  ＧＡＣ  ＧＴＧ  ＧＴＧ  ＴＧＣ−３’）および逆方向プライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１１６）（５’−ＣＣＴ  ＴＡＴ  ＣＧＧ  ＣＡＧ  ＧＣＡ  ＡＧＴ  ＧＡＧ−３’）を使用して増幅させた。Ｃｙ５標識されたｄＣＴＰ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を、視認化のためにＰＣＲステップに含めた（５０μＬのＰＣＲ反応物あたり０．１μＬ）。ＰＣＲのサイクルは、９５℃で６０秒；５６℃で３０秒；７２℃で６０秒として全体で２２サイクル実施した。ＰＣＲ生成物を１０％の非変性ポリアクリルアミドゲルで分離し、Ｃｙ５標識されたバンドをＴｙｐｈｏｏｎ（登録商標）９４００スキャナ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で視認化した。スキャン結果をＩｍａｇｅＱｕａｎｔ（登録商標）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）ソフトウェアで定量した。
【００７０】
［マウス肝細胞培養物］  肝細胞の採取については、マウスの肝臓を、０．５３ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ製、タイプ１（コードＣＬＳ））を含むＲＰＭＩ培地で灌流した。灌流後、細胞懸濁液を回収し、１０％（体積比）ＦＢＳおよび０．５％ペニシリン・ストレプトマイシンと１ｎＭのインスリンおよび１３ｎＭのデキサメタゾンを含んだＲＰＭＩの停止液中に播種した。細胞およそ３×１０５個を、コラーゲンコーティングされた６ウェルプレートに播種した。播種用培地を、１時間後に、１０％（体積比）ＦＢＳを含まない播種用培地で構成される維持用培地に交換した。様々な量のオリゴヌクレオチド−脂質複合体を２４時間後に付与した。細胞を、トランスフェクションの２４時間後にＴＲＩ−Ｒｅａｇｅｎｔ（登録商標）を用いて溶解した。
【００７１】
［ヒト肝細胞培養物］  ヒトの肝細胞は、ＡＤＭＥＴ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、またはノースカロライナ大学チャペルヒル校のＴｈｅ  ＵＮＣ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  Ｃｏｒｅのいずれかから、懸濁物として入手した。細胞を洗浄し、１０％のＦＢＳ、１μｇ／ｍＬのヒトインスリン、および１３ｎＭのデキサメタゾンを補足したＲＰＭＩ１６４０中に懸濁した。肝細胞を、培地３ｍＬ中にプレート１枚当たり細胞０．５×１０６個として６ウェルプレートに播種した。１〜１．５時間後、付着していない細胞を取り除き、培地を、１μｇ／ｍＬのヒトインスリンおよび１３０ｎＭのデキサメタゾンを補足したＦＢＳ非含有ＲＰＭＩ１６４０に交換した。
【００７２】
６ウェルプレート中の肝細胞へのＬＮＡ  ＳＳＯの送達については、５μＭのＬＮＡストック１０μＬを１００μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）中に希釈し、４μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）２０００を１００μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）中に希釈した。その後、この２００μＬの複合体溶液を、２８００μＬの培地を含んだ６ウェルプレート中の細胞に添加して合計３０００μＬとした。最終的なＬＮＡ濃度は１７ｎＭであった。２４時間後、細胞をＴＲＩ−Ｒｅａｇｅｎｔ（登録商標）中にハーベストした。全ＲＮＡを製造業者の指示に従って単離した。およそ２００ｎｇの全ＲＮＡを、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）に供した。
【００７３】
［ＥＬＩＳＡ］  細胞培養培地中またはマウス血清中の可溶性ＴＮＦＲ２のレベルを決定するために、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（米国ミネソタ州ミネアポリス）のＱｕａｎｔｉｋｉｎｅ（登録商標）マウスｓＴＮＦ  ＲＩＩ  ＥＬＩＳＡキットを使用した。細胞培養培地中またはマウス血清中の可溶性ＴＮＦＲ１のレベルを決定するために、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（米国ミネソタ州ミネアポリス）のＱｕａｎｔｉｋｉｎｅ（登録商標）マウスｓＴＮＦ  ＲＩ  ＥＬＩＳＡキットを使用した。検出に使用した抗体は受容体のプロテアーゼ切断型も検出することに注意が必要である。
【００７４】
細胞培養実験については、細胞外の培地をトランスフェクションの７２時間後に回収した。アッセイは、希釈していない培地５０μＬを使用して、製造業者の手引きに従って実施した。アッセイ値の読み取りは、波長補正を５７０ｎｍとし、４５０ｎｍに設定したマイクロプレートリーダを使用して実施した。
【００７５】
マウスのインビボ実験については、マウスからの血液を３７℃で１時間凝固させ、１４，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した（Ｊｏｕａｎ社製ＢＲＡ４ｉ遠心機）。血清を回収し、１：１０に希釈したマウス血清５０μＬを使用して、製造業者の手引きに従ってアッセイした。アッセイ値の読み取りは、波長補正を５７０ｎｍとし、４５０ｎｍに設定したマイクロプレートリーダを使用して実施した。
【００７６】
［Ｌ９２９細胞毒性アッセイ］  ９６ウェルプレートにプレート１枚当たり１０４個として播種したＬ９２９細胞を、合計１００μＬの細胞培養培地中に、記載のオリゴヌクレオチドで処理したマウス由来の血清１０％の存在下、０．１ｎｇ／ｍＬのＴＮＦ−α（ＴＮＦ）およびアクチノマイシンＤ（ＡｃｔＤ）で処理した。対照のレーンには、未処理のマウス由来の血清１０％として播種した。２４時間後、２０μＬのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６（登録商標）水溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ）を加えてマイクロプレートリーダで４９０ｎｍでの吸光度を計測することにより、細胞の生存率を測定した。細胞生存率を、ＴＮＦ／ＡｃｔＤで処理していない細胞に対して標準化した。
【実施例２】
【００７７】
ＳＳＯのスプライス切替活性に関する試験
ＳＳＯを合成し、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞またはＬ９２９細胞のいずれかへトランスフェクションした。ＳＳＯのスプライス切替能力を評価するために、該細胞由来の全ＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲで分析した。表１には、２０ヌクレオチドの２’Ｏ−Ｍｅ−リボヌクレオシド−ホスホロチオエート型のマウスＳＳＯの、配列およびスプライス切替活性が記載されている。表２には、１６ヌクレオチドのキメラ状ＬＮＡ型のマウスＳＳＯの、配列およびスプライス切替活性が記載されている。表３には、１６ヌクレオチドのキメラ状ＬＮＡ型のヒトＳＳＯの、配列およびスプライス切替活性が記載されている。各表はまた、相補領域およびヌクレオチド数によって各ＳＳＯの標的部位を列挙しており；例えば、Ｉ６：Ｅ７（８：８）は、第６イントロン（イントロン６）の最も３’側の８ヌクレオチドおよび第７エキソン（エキソン７）の最も５’側の８ヌクレオチドに相補的であることを意味し；Ｅ７（１６）は、第７エキソン内の１６ヌクレオチドに相補的であることを意味し；Ｅ８：Ｉ８（７：９）は、第８エキソン（エキソン８）の最も３’側の７ヌクレオチドおよび第８イントロン（イントロン８）の最も５’側の９ヌクレオチドに相補的であることを意味している。
【００７８】
【表１】
2014221039.tif 000003
【００７９】
【表２】
2014221039.tif 000004
【００８０】
【表３】
2014221039.tif 000005
【実施例３】
【００８１】
マウスＬ９２９細胞に対するＳＳＯの作用
単一のＬＮＡ  ＳＳＯをマウスＬ９２９細胞にトランスフェクションし、ＴＮＦＲ２のスプライス切替について分析した。図９（上）は、マウスの第７エキソンを標的とするＬＮＡのスプライス切替効果を示す。試験したＬＮＡのうち、少なくとも９つが何らかの活性を示した。特に、ＬＮＡ３３１２、３２７４および３３０５は、第７エキソンを５０％以上スキップ（読み飛ばし）させ；ＬＮＡ３３０５による処理ではほとんど完全にスキップされた。図９（下）は、マウスの第８エキソンを標的とするＳＳＯの活性を示す。このデータは、ＬＮＡ３３１５および３３１６が、第８エキソンをおよそ２０％スキップさせる能力について同等であることを示している。第８エキソンが小さく（３５ヌクレオチド）、したがって、第８エキソンを含むＰＣＲフラグメントと第８エキソンを欠くＰＣＲフラグメントとの差も小さいことに留意されたい。
【実施例４】
【００８２】
マウスＬ９２９細胞に対する複数のＳＳＯの作用
第７および第８エキソンを標的とするＬＮＡ  ＳＳＯを組み合わせてＬ９２９細胞にトランスフェクションし、そのような処理の結果ＴＮＦＲ２Δ７／８ｍＲＮＡが生成されるかどうかを測定した。図１０のデータは、第８エキソンを標的とする３３１５または３３１６と、第７エキソンを標的とするＬＮＡ３３０５、３３０９、３３１２、または３２７４のうちの１つとの組み合わせにより、同時に両方のエキソンがスキップされたことを示している。特に、ＬＮＡ３３０５および３３１５を組み合わせた結果、６０％以上がΔ７／８ｍＲＮＡへと変化し、その残りはほとんど全てがΔ７ｍＲＮＡであった。その他の組み合わせも有効であり；３２７４と３３１５とでは５０％がΔ７／８ｍＲＮＡへと変化した。これらのデータは、ＬＮＡ  ＳＳＯが、選択的にスプライシングされたＴＮＦＲ２  ｍＲＮＡを生じさせるのに非常に有効であることを示している。同様に、ＴＮＦＲ１の第７および第８エキソンを標的とするＬＮＡ  ＳＳＯの組み合わせも、Ｌ９２９細胞において該ＳＳＯそれぞれに対応するエキソンの変化をもたらした（図１１）。
【実施例５】
【００８３】
マウス初代肝細胞に対するＬＮＡ  ＳＳＯの作用
ＴＮＦＲ２  ＬＮＡ  ＳＳＯをマウス初代肝細胞にトランスフェクションし、これらの細胞において該ＳＳＯがスプライス切替に同程度に有効であることがわかった。特に、ＬＮＡ３２７４または３３０５とＬＮＡ３３１５との組み合わせを用いた処理により、Ｌ９２９細胞で見出されたのと非常によく似たスプライス切替プロファイルが示された（図１２）。これらのデータは、スプライシングの変化が意図したインビボ細胞標的において起きることを確認するものである。
【実施例６】
【００８４】
マウス細胞からのＴＮＦＲ２スプライスバリアントの分泌
ＬＮＡ  ＳＳＯが可溶性ＴＮＦＲ２タンパク質の産生と細胞外の培地への分泌を引き起こす能力について試験した。Ｌ９２９細胞を上述のようにＬＮＡ  ＳＳＯで処理し、細胞外の培地試料をトランスフェクションの４８時間後に回収した。該試料を、可溶性ＴＮＦＲ２（Δ７およびΔ７／８タンパク質アイソフォームのうちいずれか）に特異的なＥＬＩＳＡによって定量した。図１３の左側パネルは、ＲＮＡスプライシングの変化を最も良く引き起こしたＬＮＡが、最も多くのタンパク質を細胞外の培地へ分泌したことを示している。特に、ＬＮＡ３３０５、３３１２および３２７４は、最高の、バックグラウンドの少なくとも３．５倍の可溶性ＴＮＦＲ２の増加をもたらし、また２５０ｐｇ／ｍＬの可溶性スプライスバリアントを生成させた。同様に処理したマウス初代肝細胞においても増加が見られた（図１３、右側パネル）。これらの初代細胞では、ＬＮＡ３２７４または３３０５単独での処理により、細胞外の培地中の可溶性ＴＮＦＲ２がおよそ２．５倍に増加し、該可溶性スプライスバリアントが〜２００ｐｇ／ｍＬ生成され、また３２７４または３３０５と３３１５との組み合わせによってもタンパク質産生が増大した。従って、スプライスバリアントｍＲＮＡの誘導は可溶性ＴＮＦＲ２の産生および分泌と相関している。
【実施例７】
【００８５】
ヒト初代肝細胞に対するＬＮＡ  ＳＳＯの作用
ヒトＴＮＦＲ２前駆体ｍＲＮＡに対するＬＮＡ  ＳＳＯを、培養されたヒト初代肝細胞にトランスフェクションした。図１４は、第７エキソンを標的とする１０種のＳＳＯのうち７種がある程度のスプライス切替活性を示したことを表している。特に、ＬＮＡ３３７８、３３８４および３４７９は、第７エキソンを少なくとも７５％スキップさせた。同様に、第８エキソンを標的とする５種のＳＳＯのうち４種が活性を示した。興味深いことに、ＬＮＡ３４６４、３４６５、または３４６６は単独でΔ７／８のスプライス除去に十分であり、これはマウス細胞では見られない観察結果であった。従って、第７エキソンおよび第８エキソンを両方スキップさせるために必要とされるのは１種類のＳＳＯだけでよい。これらのデータは、スプライシングの変化が意図されたヒト治療標的において起きることを確認するものである。
【実施例８】
【００８６】
マウスにおけるＬＮＡ  ＳＳＯのインビボ注射
ＬＮＡ３３０５を、生理食塩水のみで希釈して３ｍｇ／ｋｇ〜２５ｍｇ／ｋｇの用量として、１日に１回、４日間マウスに腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。５日目にマウスを屠殺し、肝臓からの全ＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲによって分析した。このデータは、細胞培養物において見られたのと同様のスプライス切替効果を示す。最大容量の２５ｍｇ／ｋｇでは、ＬＮＡ３３０５はほとんど完全なΔ７ｍＲＮＡへの変換をもたらした（図１５、下側パネル）。
【００８７】
ＬＮＡ３２７４を用いた同様の手法により、Δ７ｍＲＮＡへの約２０％の変換が引き起こされた。Δ７ｍＲＮＡの誘導を最適化するために、ＬＮＡ３２７４の投与計画および最後の注射と動物の屠殺との間の時間の両方を変化させた。生理食塩水のみで希釈した２５ｍｇ／ｋｇのＬＮＡ３２７４を、１日に１回、４日間マウスに注射（ｉ．ｐ．）した。１５日目に分析したマウスでは、一方、第５日に分析したマウスでは、わずか２０％しかΔ７ｍＲＮＡに変化しないことが実証された（図１５、上側パネル）。更に、１０日間注射され、１１日目に屠殺されたマウスでは、５０％のΔ７ｍＲＮＡの誘導が示された（図１５、上側パネル）。これらのインビボデータは、ＴＮＦＲ２  ＬＮＡ  ＳＳＯが肝臓内で存続し、投与後少なくとも１０日間はスプライス切替を誘導することができることを示唆している。
【実施例９】
【００８８】
循環血中のＴＮＦＲスプライスバリアント
肝臓においてΔ７ｍＲＮＡが誘導されると、分泌され循環血中に蓄積しうる可溶性ＴＮＦＲが産生されるはずである。従って、ＬＮＡ３２７４、３３０５、または対照の３０８３を単独で用いて１日あたり２５ｍｇ／ｋｇのｉ．ｐ．として１０日間マウスを処理した。注射の前にマウスから採血し、また最後の注射の１、５および１０日後にも採血した。血清を、可溶性ＴＮＦＲ２の濃度について定量した。図１６は、ＬＮＡ処理により６０００〜８０００ｐｇ／ｍＬの可溶性ＴＮＦＲ２（Δ７）が誘導されたことを示しており、この可溶性ＴＮＦＲ２濃度は少なくとも１０日間バックグラウンドより有意に高かった。
【００８９】
同じ試料を可溶性ＴＮＦＲ１の産生について分析した。可溶性ＴＮＦＲ１の増加は観察されなかった（図１７）。
より長期の時点における効果を試験するために、同じ実験を実行し、マウスを、最後の注射の２７日後まで血清中の可溶性ＴＮＦＲ２について分析した。結果は、最後のＬＮＡ
ＳＳＯ注射の２７日後には可溶性ＴＮＦＲ２レベルがごくわずかに減少することを示している（図１８）。このデータは、ＬＮＡの作用が少なくとも２７日間続くことを示唆している。
【実施例１０】
【００９０】
ＬＮＡ  ＳＳＯで処理されたマウスの抗ＴＮＦ−α活性の測定
ＬＮＡ３２７４で処理されたマウス由来の血清の抗ＴＮＦ−α活性を、Ｌ９２９細胞毒性アッセイで試験した。このアッセイでは、血清が、一定濃度のＴＮＦ−αの細胞毒性から培養Ｌ９２９細胞を保護する能力に関して試験する。Ｌ９２９細胞を、９６ウェルプレートに１ウェルあたり細胞２×１０４個として、１００μＬの完全ＭＥＭ培地（１０％の通常のＦＢＳを含有）中に播種し、３７℃で２４時間増殖させた。図１９に示すように、ＬＮＡ３２７４で処理したマウス由来の血清により、０．１ｎｇ／ｍＬのＴＮＦ−αに曝露されたＬ９２９細胞の生存率が上昇したが、対照ＬＮＡ（３０８３または３２７２）では上昇しなかった。従って、ＬＮＡ３２７４血清は、ＴＮＦ−αに結合して不活性化し、その結果としてＴＮＦ−αの細胞毒性から細胞を保護するのに十分なΔ７  ＴＮＦＲ２  ＴＮＦ−αアンタゴニストを含んでいた。この抗ＴＮＦ−α活性は３２７４ＬＮＡの最後の注射の５日後および２７日後の動物の血清中に存在していた。
【実施例１１】
【００９１】
ＬＮＡ  ＳＳＯと他の抗ＴＮＦ−α剤との比較
Ｌ９２９細胞を、実施例１０のようにして播種した。９０μＬの無血清ＭＥＭ、０．１ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−α（ＴＮＦ）および１μｇ／ｍｌのアクチノマイシンＤ（ＡｃｔＤ）を含み、（ｉ）ｒｓＴＮＦＲ２（組換え型で可溶性）（０．０１〜３μｇ／ｍＬ）、（ｉｉ）ＬＮＡ３２７４で処理したマウス由来の血清（未処理マウス由来の血清で希釈して１．２５〜１０％）、または（ｉｉｉ）Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標）（０．４５〜１５０ｐｇ／ｍｌ）のいずれかを含んで、最終的なマウス血清濃度が１０％で最終体積１００μｌとした試料を調製した。該試料を室温で３０分間インキュベーションした。続いて、試料を播種した細胞に適用し、５％ＣＯ２の加湿環境下で３７℃にて〜２４時間インキュベーションした。２０μＬのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６（登録商標）水溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ）を添加してマイクロプレートリーダで４９０ｎｍでの吸光度を計測することにより、細胞の生存率を測定した。細胞の生存率を、図２０に示すように、ＴＮＦ／ＡｃｔＤで処理していない細胞に対して標準化した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【配列表】
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