(57)【要約】【課題】抗癌剤を安定に担持した薬剤−キャリア複合体を提供する。【構成】キャリアとしてポリエチレングリコール−ｂ−ポリ（ビニルベンジルフォスフォナート）で表面を被覆した酸化鉄ナノ粒子に抗癌剤を担持させる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬剤を担持した酸化鉄ナノ粒子であって、薬剤が正荷電性基と疎水性部分を有する抗癌剤であり、酸化鉄ナノ粒子がポリエチレングリコール−ｂ−ポリ（ビニルベンジルフォスフォナート）で表面が被覆されており、かつ、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中で分散性を有する、前記酸化鉄ナノ粒子。
【請求項２】
薬剤を担持した酸化鉄ナノ粒子であって、薬剤が正荷電性基と疎水性部分を有する抗癌剤であり、酸化鉄ナノ粒子がポリエチレングリコール−ｂ−ポリ（ビニルベンジルフォスフォナート）で表面が被覆されており、かつ、当該ブロック共重合体が下記式（Ｉ）で表される前記酸化鉄ナノ粒子。
【化１】
2014001159.tif 000005
式中、
Ｒは、非置換または置換Ｃ１−Ｃ１２アルキル基を表し、置換されている場合の置換基は、ホルミル基または式Ｒ１Ｒ２ＣＨ−の基を表し、ここで、Ｒ１及びＲ２は独立して、Ｃ１−Ｃ４アルコキシまたはＲ１とＲ２は一緒になって−ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ−、−Ｏ（ＣＨ２）３Ｏ−もしくは−Ｏ（ＣＨ２）４Ｏ−を表し、
Ｌは、連結基を表し、
ｍは、１４〜５，０００の整数であり、
ｎは、２〜１，０００の整数であり、
但し、ポリ（ビニルベンジルフォスフォナート）セグメント中に、当該ビニルベンジルフォスフォナート反復単位に代わり、ビニルベンジルヒドロキシおよびビニルベンジルオキシＣ１−Ｃ４アルキルからなる群より選ばれる反復単位をランダムにまたはブロックとして３０％まで含むことができる。
【請求項３】
連結基が−（ＣＨ２）ｃＳ−、−ＣＯ（ＣＨ２）ｃＳ−、−ＣＯＯ（ＣＨ２）ｃＳ−、−ＣＯＣ（ＣＨ３）２−、からなる群より選ばれ、ここでｃは１ないし５の整数である、請求項２記載の酸化鉄ナノ粒子。
【請求項４】
薬剤が、アントラサイクリン系抗癌剤、キノリンアルカロイド系抗癌剤、ビンカアルカロイド系抗癌剤からなる群より選ばれる少なくとも１種の抗癌剤である、請求項１〜３のいずれかに記載の酸化鉄ナノ粒子。
【請求項５】
薬剤が、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ピラルビシンから選ばれるアントラサイクリン系抗癌剤であるか、またはトポテカン、イリノテカン、カンプトテシンから選ばれるキノリンアルカロイド系抗癌剤であるか、またはビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン、エリブリンから選ばれるビンカアルカロイド系抗癌剤である、請求項１〜３のいずれかに記載の酸化鉄ナノ粒子。
【請求項６】
リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中で分散性を有する、請求項２記載の薬剤を担持した酸化鉄ナノ粒子。
【請求項７】
ポリエチレングリコール−ｂ−ポリ（ビニルベンジルフォスフォナート）で表面が被覆された酸化鉄ナノ粒子含有溶液を、正荷電性基と疎水性部分を有する抗癌剤含有溶液を混合するステップ、および形成された抗癌剤を担持した酸化鉄ナノ粒子を回収するステップを含んでなる、抗癌剤を担持した酸化鉄ナノ粒子の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、低分子抗癌剤を担持した表面修飾酸化鉄ナノ粒子、より具体的には、正荷電性基と疎水性部分を有する抗癌剤と特定のブロック共重合体で表面修飾した酸化鉄ナノ粒子の複合体およびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
低分子薬剤を血中へ投与するとそのほとんどが肝臓による代謝や尿中への排泄を受け体内から消失する。そのため治療効果を発揮するためには大量の薬剤を投与する必要があるが、それに伴い正常組織に対する副作用が問題となる。この問題を解決するために薬剤を特定の脂質由来のリポソームやブロック共重合体由来の高分子ミセル等のキャリアに内包させる方策が検討されてきた。こうして、後者においては、例えば、ブロック共重合体の一方のブロックを親水性、非イオン性、かつ、生体適合性であるポリエチレングリコールで構成し、他方を疎水性や特有の性質を有するポリマーで構成し、しかも、薬剤の内包の仕方等を工夫することにより、臨床使用に供し得る薬剤−キャリアコンジュゲート（または複合体）が開発されている（例えば、特許文献１参照）。これらの研究をはじめとする当該技術分野の研究を通じ、コンジュゲートのサイズを数十ｎｍに制御することによって薬剤を血中に長期滞留させられることがわかっており、このようなコンジュゲートは固形がんや炎症部位に蓄積しやすいことも知られている（例えば、非特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特許第２５１７７６０号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｙ．Ｍａｔｓｕｍｕｒａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４６（１９８６）６３８７−６３９２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、従来技術では、一般的に、薬剤コンジュゲートを個体に投与した際、高塩濃度等の苛酷な生物学的環境にさらされることにより当該コンジュゲートが崩壊し糸球体から排泄されるとの課題や、血清タンパクの吸着が起こることで大きな凝集体を生じ肝臓のクッパー細胞などに貪食されるとの課題ある。また、薬物を上記のような高分子ミセル等に担持させる効率が必ずしも高くなく、さらに血中滞留中に漏れ出しが起こるため、十分な薬物送達ができないとの課題もある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記のような薬剤キャリアの開発とともに、上述したポリエチレングリコール（以下、“ＰＥＧ”ともいう）の特性を活用したバイオデバイスもしくは量子ドットの表面をポリエチレングリコールで修飾（または“ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ”）することを提案してきた。例えば、本発明者の一部は、酸化鉄ナノ粒子をＰＥＧｙｌａｔｉｏｎするに際し、ポリエチレングリコール−ｂ−ポリ（ビニルベンジルフォスフォナート）（以下、“ＰＥＧ−ｂ−ＰＶＢＰ”ともいう）を用いて、粒子表面を被覆したところ、ＰＥＧの極めて高い固定化安定性を示しかつ、相対的に高密度のＰＥＧで被覆した表面修飾酸化鉄ナノ粒子をもたらし、かような酸化鉄ナノ粒子が血中に長期滞留し、かつマウス腫瘍モデルにおいて標的化リガンド無しに腫瘍蓄積性を促進することも確認できることを報告した（Ｙ．Ｎａｇａｓａｋｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｌｏｉｄｓ  ａｎｄ  ｓｕｒｆａｃｅ
ｓ．Ｂ，Ｂｉｏｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ  ２０１１，８８，７７１−７７８、以下、Ｎａｇａｓａｋｉ，ｅｔ  ａｌ．という。この文献は、ここに引用することにより、その記載事項の全てが本明細書に組み入れられる。）。このような表面修飾酸化鉄ナノ粒子それ自体は、例えば、腫瘍の温熱療法（ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｉａ）等の技術分野で使用が期待されている。しかし、仮に、薬剤が、当該表面修飾酸化鉄ナノ粒子に効率よく導入でき、しかも、その特性、例えば、長期血中滞留性、腫瘍蓄積性に悪影響を及ぼさないのであれば、かような薬剤導入酸化鉄ナノ粒子の提供は、上述の課題を解決することに資するであろう。
【０００７】
今ここに、ＰＥＧ−ｂ−ＰＶＢＰで表面を被覆した酸化鉄ナノ粒子が効率よく、ドキソルビシンのような正荷電性基と疎水性部分を有する抗癌剤であれば、容易に前記酸化鉄ナノ粒子に担持することができ、しかも当該ナノ粒子が有していた特性がほぼ維持できることを見出した。
【０００８】
したがって、本発明は、薬剤を担持した酸化鉄ナノ粒子であって、薬剤が正荷電性基と疎水性部分を有する抗癌剤であり、酸化鉄ナノ粒子がポリエチレングリコール−ｂ−ポリ（ビニルベンジルフォスフォナート）で表面が被覆されており、かつ、リン酸緩衝化生理食塩水中（ＰＢＳ）で分散性を有する、前記酸化鉄ナノ粒子（以下、「ナノ複合体」ともいう）、ならびにその製造方法を提供する。
【０００９】
本発明のより具体的な態様のものは、次のとおりである：
薬剤を担持した酸化鉄ナノ粒子であって、薬剤が正荷電性基と疎水性部分を有する抗腫瘍剤であり、酸化鉄ナノ粒子がポリエチレングリコール−ｂ−ポリ（ビニルベンジルフォスフォナート）で表面が被覆されており、かつ、当該ブロック共重合体が下記式（Ｉ）で表される前記酸化鉄ナノ粒子。
【００１０】
【化１】
2014001159.tif 000002
【００１１】
式中、
Ｒは、非置換または置換Ｃ１−Ｃ１２アルキル基を表し、置換されている場合の置換基は、ホルミル基または式Ｒ１Ｒ２ＣＨ−の基を表し、ここで、Ｒ１及びＲ２は独立して、Ｃ１−Ｃ４アルコキシまたはＲ１とＲ２は一緒になって−ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ−、−Ｏ（ＣＨ２）３Ｏ−もしくは−Ｏ（ＣＨ２）４Ｏ−を表し、
Ｌは、連結基を表し、
ｍは、１４〜５，０００の整数であり、
ｎは、２〜１，０００の整数であり、
但し、ポリ（ビニルベンジルフォスフォナート）セグメント中に、当該ビニルベンジルフォスフォナート反復単位に代わり、ビニルベンジルヒドロキシおよびビニルベンジルオキシＣ１−Ｃ４アルキルからなる群より選ばれる反復単位をランダムにまたはブロックとし
て３０％まで含むことができる。
【００１２】
＜発明の詳細な説明＞
以下、本発明を規定するのに使用する用語、記述等について説明する。
「酸化鉄ナノ粒子」にいう、酸化鉄には、いかなる製法により得られ、また、いかなる形態のものであっても、本発明の目的に沿うものであれば、すべて包含される。しかし、限定されるものではないが、好ましいものとしては、磁鉄鋼（Ｆｅ３Ｏ４等）、三酸化二鉄（Ｆｅ２Ｏ３）のα態、γ態、より好ましくはγ態の酸化鉄を挙げることができる。ナノ粒子とは、平均径が、ｎｍオーダーにある粒子を意味し、これらの径は、少なくとも１００粒子の各電子顕微鏡画像からの直径を測定することにより決定される径か、水性媒体中に存在する状態で動的光散乱（ＤＬＳ）測定による流体力学的な径（ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ  ｄｉａｍｅｔｅｒ）を基準とする。具体的には、酸化鉄それ自体の粒子にあっては、限定されるものでないが、数平均粒子径が３〜１００ｎｍであり、酸化鉄ナノ粒子がポリエチレングリコール−ｂ−ポリ（ビニルベンジルフォスフォナート）で表面が被覆された粒子（または「表面修飾酸化鉄ナノ粒子」ともいう）にあっては、流体力学的な径が、限定されるものでないが、１０〜２００ｎｍ、好ましくは、２０〜６０ｎｍである。
【００１３】
「酸化鉄ナノ粒子がポリエチレングリコール−ｂ−ポリ（ビニルベンジルフォスフォナート）（ＰＥＧ−ｂ−ＰＶＢＰ）で表面が被覆されており」とは、理論により本発明の技術的範囲の解釈が、拘束されるものでないが、Ｎａｇａｓａｋｉ，ｅｔ  ａｌ．に記載されているごとく、ＰＥＧ−ｂ−ＰＶＢＰの複数のＰＶＢＰセグメントにおけるフォスフォナート基の多点定着（ｍｕｌｔｉｐｏｉｎｔ  ａｎｃｈｏｒｉｎｇ）を介して酸化鉄表面にＰＥＧ−ｂ−ＰＶＢＰが結合した状態にあるものと理解している。また、当該技術分野では、フォスフォナート基が酸化鉄をはじめとする種々の酸化金属への結合能を有することが公知であるとおり、さらには、ポリスチレンからなるＰＶＢＰセグメントの主鎖構造が疎水性であることから、ＰＥＧ−ｂ−ＰＶＢＰの酸化鉄表面への結合はＰＥＧ鎖を強固かつ、稠密に当該表面に固定することを可能にするものと理解されている。本発明で薬剤のキャリアとして使用する、表面修飾酸化鉄ナノ粒子の表面ＰＥＧ鎖密度は、当該粒子製造時の、仕込み、ＰＥＧ−ｂ−ＰＶＢＰと酸化鉄の形成するための鉄塩の重量比を変動することにより、変動でき、ｚｅｔａ電位の測定等によると、１ｎｍ２当り、ほぼ０．８ＰＥＧ鎖の密度まで、例えば、０．４３〜０．８１ＰＥＧ鎖に調製したものとを使用することが好ましい。
【００１４】
このような表面修飾酸化鉄ナノ粒子は、脱イオン水または適当に緩衝化した水溶液の水性媒体中で薬剤たる正荷電性基と疎水性部分を有する抗癌剤と接触させることにより、容易に薬剤を担持した表面修飾酸化鉄ナノ粒子（ナノ複合体）を提供することができる。このことは、上記から理解できるように、表面修飾酸化鉄ナノ粒子は、表面にフォスフォナート基および疎水性ドメインを有するものと理解できるので、前記特性を有する薬剤は、当該表面と静電相互作用および／または疎水性結合を介して、表面修飾酸化鉄ナノ粒子に化学結合し、固定または担持されるものと理解されている。後述するが、こうして得られる本発明に従うナノ複合体は、薬剤が表面修飾酸化鉄ナノ粒子に担持さるにもかかわらず、薬剤を担持していない表面修飾酸化鉄ナノ粒子と同等の、安定な血中滞留性を示し、また、薬剤それ自体が有する細胞毒性に比べ有意に低下した細胞毒性を示す。
【００１５】
このような安定性は、薬剤を担持した表面修飾酸化鉄ナノ粒子の総重量当り、薬剤重量を、２２％としたときでさえ、維持される。したがって、本発明にしたがって提供できるナノ複合体は、限定されるものでないが、前記総重量当り、重量で５％〜４０％、好ましくは、１０％〜４０％薬剤を含み得る。
【００１６】
ＰＥＧ−ｂ−ＰＶＢＰは、酸化鉄ナノ粒子表面と上記のように相互作用し得るものであ
れば、各ブロックの分子量、また、追加のマイナー（全分子量中５％まで占めるできる）な反復単位、置換基等を含み得る。しかし、ＰＥＧ−ｂ−ＰＶＢＰの典型的なものとしては、下記式（Ｉ）で表されるブロック共重合体を挙げることができる。
【００１７】
【化２】
2014001159.tif 000003
【００１８】
式中、
Ｒは、非置換または置換Ｃ１−Ｃ１２アルキル基を表し、置換されている場合の置換基は、ホルミル基または式Ｒ１Ｒ２ＣＨ−の基を表し、ここで、Ｒ１及びＲ２は独立して、Ｃ１−Ｃ４アルコキシまたはＲ１とＲ２は一緒になって−ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ−、−Ｏ（ＣＨ２）３Ｏ−もしくは−Ｏ（ＣＨ２）４Ｏ−を表し、
Ｌは、連結基を表し、
ｍは、１４〜５，０００、好ましくは９０〜１２００の整数であり、
ｎは、２〜１，０００、好ましくは１０〜１００の整数であり、
但し、ポリ（ビニルベンジルフォスフォナート）セグメント中に、当該ビニルベンジルフォスフォナート反復単位に代わり、ビニルベンジルヒドロキシおよびビニルベンジルオキシＣ１−Ｃ４アルキルからなる群より選ばれる反復単位をランダムにまたはブロックとして３０％まで、好ましくは、１０％まで、より好ましくは５％まで含むことができるが、特に好ましくは、０％である。
【００１９】
上記の但し書き中の反復単位は、通常、ＰＥＧ−ｂ−ＰＶＢＰの製造方法により、含むことができる。
Ｃ１−Ｃ１２アルキル基またはＣ１−Ｃ４アルキルにいうアルキル基は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓ−ブチル、ｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、イソヘキシル、ヘプチル、ドデシル等を包含する。
また、連結基Ｌは、上述したＰＥＧ−ｂ−ＰＶＢＰと酸化鉄ナノ粒子との相互作用に悪影響を及ぼさないかぎり、いかなる基であってもよいが、−（ＣＨ２）ｃＳ−、−ＣＯ（ＣＨ２）ｃＳ−、−ＣＯＯ（ＣＨ２）ｃＳ−、−ＣＯＣ（ＣＨ３）２−、からなる群より選ばれ、ここでｃは１ないし５の整数であることができる。なお、式（Ｉ）中のこれらの連結基の結合の方向性は記載した順であり、例えば、−（ＣＨ２）ｃＳ−のときは、Ｓを介してポリ（ビニルベンジルフォスフォナート）セグメントに結合することを意味する。
【００２０】
薬剤は、上記の作用機序により表面修飾酸化鉄ナノ粒子に担持されるものと理解できるので、正荷電性基と疎水性部分を有する、低分子抗癌剤であればいかなる薬剤をも包含できる。正荷電性基とは、アミノ基、イミノ基等の窒素原子含有基を意味し、また、疎水性部分とは、飽和もしくは部分的に窒素原子もしくは酸素原子を１もしくは２個含んでいてもより不飽和縮合炭化水素環を含有する部分を意味し、低分子抗癌剤とは、タンパク質、
ポリペプチ、核酸系の抗癌剤に対する概念のものとして用いている。このような薬剤には、限定されるものでないが、当該技術分野で通常用いられている概念である、アントラサイクリン系抗癌剤、キノリンアルカロイド系抗癌剤、ビンカアルカロイド系抗癌剤からなる群より選ばれる少なくとも１種の抗癌剤であることができる。本発明では、２種以上の抗癌剤であっても、同時に各ナノ粒子に担持できる。上記アントラサイクリン系抗癌剤としては、限定されるものでないが、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ピラルビシンを挙げることができる。また、キノリンアルカロイド系抗癌剤としては、限定されるものでないが、トポテカン、イリノテカン、カンプトテシンを挙げることができる。また、ビンカアルカロイド系抗癌剤としては、限定されるものではないが、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン、エリブリンを挙げることができる。
【００２１】
これらの薬剤を担持したナノ複合体は、後述する、高濃度のＰＢＳ含有溶液中、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を加えたＰＢＳ溶液中で長期の安定性を示し、また、担持した薬剤の細胞毒性が薬剤それ自体のものに比べ有意に低下することを示すことから、水性媒体中では、稠密なＰＥＧ鎖のブラシが表面に形成されているものと理解できる。また、流体力学的粒径も、表面修飾酸化鉄ナノ粒子のそれを著しく変動させるものでなく、ほぼ５０ｎｍ以下に調製できるので、ＥＰＲ（ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ）効果を介して腫瘍または癌組織に蓄積できるものと思われ、また、かような組織が、一般に酸性側にあるｐＨを有することを考慮すると、上記のような機序で担持された正荷電性基を有する薬剤は、当該組織中で選択的に放出される蓋然性は高いものと考えられる。したがって、本発明にしたがうナノ複合体は、従来の薬剤−キャリアコンジュゲート（または複合体）を超えた有用性を有するものと理解できる。
【００２２】
このようなナノ複合体は、鉄塩およびＰＥＧ−ｂ−ＰＶＢＰを用いる共沈法、熱分解法、水熱処理法等のいずれの方法で製造されたものであっても上記特性を備えた表面修飾酸化鉄ナノ粒子と薬剤を水性媒体中で接触させることにより製造できる。したがって、本発明によれば、上記の課題を解決する手段として、ＰＥＧ−ｂ−ＰＶＢＰで表面が被覆された酸化鉄ナノ粒子含有溶液を、正荷電性基と疎水性部分を有する抗癌剤含有溶液を混合するステップ、および形成された抗癌剤を担持した酸化鉄ナノ粒子を回収するステップを含んでなる、抗癌剤を担持した酸化鉄ナノ粒子の製造方法も提供される。ＰＥＧ−ｂ−ＰＶＢＰで表面が被覆された酸化鉄ナノ粒子含有溶液は、必要により、適当な緩衝剤により、ｐＨを調節した水溶液として調製し、一方で、薬剤の種類に応じて、薬剤の適当塩酸塩から前記のようにｐＨを調節した水溶液を調製し、両水溶液を混合し、必要により遮光した室温下で撹拌することにより、薬剤を担持した表面修飾酸化鉄ナノ粒子を形成する。撹拌は、１２時間〜３２時間行えばよい。こうして形成されたナノ複合体は、それ自体公知の回収方法、例えば、遠心限外ろ過により担持されなかった薬剤等から分離することにより回収できる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】試験１の結果を示す、ＰＢＳおよび１０％ＦＢＳ溶液中でのＰＥＧ化酸化鉄ナノ粒子の安定性を示すグラフである。なお、縦軸は、流体力学的粒子径（ｎｍ）を表し、横軸は試験時間（日）を表す。
【図２】実施例１における、粒子―薬剤混合溶液をＳＥＣに通して分取し、各フラクションの吸光度測定を行った結果を表すグラフである。縦軸は薬剤に起因する吸光度（４８１ｎｍ）を示し、横軸は溶出フラクションを示す。黒塗り四角のデータは遊離薬剤溶液であり、黒塗り丸のデータは粒子―薬剤複合体溶液である。
【図３】試験２における薬剤濃度の変化に対する細胞生存率を測定した結果を表すグラフである。縦軸は細胞生存率を表し、横軸は薬剤濃度（μＭ）を表す。黒塗り四角のデータは遊離薬剤溶液であり、黒塗り丸のデータは粒子―薬剤複合体溶液である。
【実施例】
【００２４】
以下、具体例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するがこれらに本発明を限定することを意図するものではない。
ＰＥＧ−ｂ−ＰＶＢＰで表面が被覆された酸化鉄ナノ粒子は、上記のＮａｇａｓａｋｉ，ｅｔ  ａｌ．に記載された方法により、種々の共重合体被覆率のナノ粒子を製造できるが、典型例について下記に示す。以下の製造例および試験において温度について記載していない場合は、室温（２５℃）で、処理を行った。
【００２５】
＜参考例製造例１＞  ポリエチレングリコール−ｂ−ポリクロロメチルスチレン（ＰＥＧ−ｂ−ＰＣＭＳ）ブロック共重合体の合成
ＰＥＧ−ｂ−ＰＣＭＳは、次の合成スキーム１に従い合成した：
【００２６】
【化３】
2014001159.tif 000004
【００２７】
α末端にメトキシ基、ω末端にチオール基を有しているポリエチレングリコール（ＰＥＧ−ＳＨ）（Ｍｎ＝５，０００ｇ／ｍｏｌ；０．２ｍｍｏｌ，１．０ｇ）とアゾビスイソブチロニトリル（０．１ｍｍｏｌ，１６．５ｍｇ）を反応容器に加えた。次に、反応容器中を真空にした後、窒素ガスを吹き込む操作を３回繰り返すことにより、反応容器内を窒素雰囲気にした。反応容器に１０ｍＬのトルエンとクロロメチルスチレン（１０ｍｍｏｌ，１．３８ｍＬ）を加え、６０℃まで加熱し、２４時間撹拌した。反応混合物をポリクロロメチルスチレンホモポリマーに対して良溶媒であるジエチルエーテルを用いて３回洗浄操作を行った後、ベンゼン凍結乾燥を行い、白い粉体を得た。収量は１．４ｇであり収率は９６％であった。目的のＰＥＧ−ｂ−ＰＣＭＳブロック共重合体が取得できたことは、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）測定と１Ｈ  ＮＭＲ測定によるスペクトルを検討した結果確認できた。
【００２８】
＜参考製造例２＞  亜リン酸基とベンゼン骨格を複数有するＰＥＧブロックコポリマー（ＰＥＧ−ｂ−ＰＶＢＰ）の合成
窒素雰囲気下でＮａＨ（５．２５ｍｍｏｌ，１２６ｍｇ）とＮａＩ（ｃａ．４０ｍｇ）、反応溶媒としてＴＨＦを５ｍＬ加えた後、氷浴中で亜リン酸ジエチル（２．５５ｍｍｏｌ，０．３３ｍＬ）を加えた。また、別の窒素雰囲気下反応容器中でＰＥＧ−ｂ−ＰＣＭＳ（５００ｍｇ）をＴＨＦ  ５ｍＬに溶解した。後者をシリンジで前者にゆっくりと滴下し、室温で一晩反応させることによりＣＭＳに亜リン酸ジエチル基を導入した（ＰＥＧ−ｂ−ＰＤＥＶＢＰ）。生成物の溶媒をエバポレート後、メタノール透析（ＭＷＣＯ  ３５００）を行い、ベンゼンに溶解させ凍結乾燥後、粉末を回収した。構造解析は、１Ｈ，３１Ｐ−ＮＭＲ測定により行った。１Ｈ  ＮＭＲからは亜リン酸ジエチルに由来したピークの出現およびベンジル位由来のピークの高磁場シフトが確認され、亜リン酸ジエチル基の導入が確認できた。また、３１Ｐ−ＮＭＲからも亜リン酸ジエチル由来と思われる単一のピークが確認され（２６．９１ｐｐｍ）、目的の反応が進行したことが確認できた。収量は５３２ｍｇであり収率は８８％であった。
【００２９】
続いて窒素雰囲気下でＰＥＧ−ｂ−ＰＤＥＶＢＰ（４３０ｍｇ）、反応溶媒としてジクロロメタン５ｍＬを加えた後、ブロモトリメチルシラン（０．４７ｍＬ，３．５５ｍｍｏｌ）を加え、オイルバス中で４５℃，２時間リフラックスした。反応後は溶媒をエバポレートし、メタノールを加え、室温で１５時間撹拌した後、メタノール透析（ＭＷＣＯ  ３５００）を行い、ベンゼンに溶解させ凍結乾燥後、粉末を回収した。構造解析は、１Ｈ，３１Ｐ−ＮＭＲ測定により行った。１Ｈ  ＮＭＲからは加メタノール分解の進行による亜リン酸ジエチル基由来のピークの消失が観察できた。更にＰＥＧ−ｂ−ＰＤＥＶＢＰと比較し３１Ｐ  ＮＭＲのピークが高磁場シフトしていることから（２６．９１→２４．１７ｐｐｍ）、ＰＥＧ−ｂ−ＰＶＢＰの合成が確認できた。収量は３８４ｍｇであり収率は８５％であった。
【００３０】
＜参考製造例３＞  ＰＥＧ化酸化鉄ナノ粒子の合成
反応容器に０．０５ＭのＦｅＣｌ２水溶液と０．１ＭのＦｅＣｌ３水溶液をそれぞれ７５μＬずつ加えたところに２７ｍｇ／ｍＬのＰＥＧ−ｂ−ＰＶＢＰ水溶液を１００μＬ加えて５分間撹拌した。その後反応容器を超音波の発生している水槽に浸しながら２８％  ＮＨ４ＯＨ溶液を５０４μＬ加え、２時間撹拌を行った。反応後の溶液は水透析（ＭＷＣＯ  １２−１４，０００）を行い、過剰なＮＨ４ＯＨを除去した。得られた溶液を用いて動的光散乱（ＤＬＳ）測定を行ったところ、平均粒径が２５−３０ｎｍの単峰性の分布を有する粒子が合成できていることが確認された。
【００３１】
＜試験１＞  ＰＥＧ化酸化鉄ナノ粒子の分散安定性
合成した粒子溶液に１０倍濃い濃度のＰＢＳ溶液、またはウシ胎児血清（ＦＢＳ）を加え、ＰＢＳ溶液中または１０％  ＦＢＳ含有ＰＢＳ溶液中における粒子の平均粒径の変化を動的光散乱（ＤＬＳ）測定により記録した。いずれの場合においても粒子の平均粒径は長期間変化せず、生体内における安定性が高いことが示唆された（図１）。
【００３２】
＜実施例１＞  ＰＥＧ化酸化鉄ナノ粒子―ドキソルビシン複合体の合成
ＰＥＧ化酸化鉄ナノ粒子溶液を１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳバッファ中で透析することによりｐＨ７．４に調整した。そこへドキソルビシン（以下、“ＤＯＸ”ともいう）塩酸塩のＨＥＰＥＳ溶液（ｐＨ７．４）を最終濃度が１ｍｇ／ｍＬまたは２ｍｇ／ｍＬになるように加え、遮光した環境下（２５℃）で１日間撹拌した。遠心限外濾過装置（ＭＷＣＯ  ３０，０００）を用いて粒子―薬剤混合溶液における担持されていない薬剤を分離し、分離溶液の吸光度を測定することにより、薬剤担持効率と担持量を算出したところ、ＤＯＸ最終濃度が１ｍｇ／ｍＬのサンプルはそれぞれ９８．３±０．９％、１２．０±０．１％であり、ＤＯＸ最終濃度が２ｍｇ／ｍＬのサンプルはそれぞれ９９．０±０．７％、２１．５±０．１％であった。またＤＬＳ測定による平均粒径はそれぞれ３３．７±６ｎｍ、４４．０±９ｎｍであった。さらに粒子―薬剤混合溶液をＳＥＣに通して分取し、各フラクションの吸光度測定を行ったところ未反応のＤＯＸ由来の吸光度が検出されなかったため、ほとんどのＤＯＸが粒子に担持されたことが確認された（図２参照）。
【００３３】
＜試験２＞  粒子―ＤＯＸ混合溶液を用いた細胞毒性試験
ＤＯＸ溶液または粒子―ＤＯＸ混合溶液をＰＣ３細胞に４８時間接触させ、ＭＴＴアッセイにより細胞生存率を測定した。結果を図３に示す。細胞培地中のＤＯＸ濃度で比較した場合、ＤＯＸ溶液に比べ粒子―ＤＯＸ混合溶液の細胞毒性が小さかったことから、薬剤が粒子に担持されていることが示唆される。また、当該細胞培養条件下で、少なくとも４８時間粒子―ＤＯＸからＤＯＸは放出されないことも示唆される。
【産業上の利用可能性】
【００３４】
本発明は、特定の抗癌剤を安定に担持した表面修飾酸化鉄ナノ粒子を提供するので、例
えば、医薬製造業で利用できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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