(57)【要約】      （修正有）【課題】結核菌感染の治療、予防および／または診断にこれらを使用する方法の提供。【解決手段】少なくとも2種のマイコバクテリウム・エスピー(Mycobacterium sp.)抗原を含む組成物および融合タンパク質、ならびにこのような組成物および融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。【選択図】図６
2014058520.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫刺激剤、ならびに、2種以上の結核菌(Mycobacterium tuberculosis)抗原、またはその免疫原性断片の組合せを含む組成物であって、その際、上記抗原は、以下：Rv0164（配列番号1）、Rv0496（配列番号6）、Rv2608（配列番号26）、Rv3020（配列番号36）、Rv3478（配列番号41）、Rv3619（配列番号46）、Rv3620（配列番号51）、Rv1738（配列番号11）、Rv1813（配列番号16）、Rv3810（配列番号56）、Rv2389（配列番号21）、Rv2866（配列番号31）、Rv3876（配列番号61）、Rv0054（配列番号100）、Rv0410（配列番号106）、Rv0655（配列番号112）、Rv0831（配列番号115）、Rv1009（配列番号118）、Rv1099（配列番号121）、Rv1240（配列番号124）、Rv1288（配列番号127）、Rv1410（配列番号130）、Rv1569（配列番号133）、Rv1789（配列番号136）、Rv1818（配列番号139）、Rv1860（配列番号142）、Rv1886（配列番号145）、Rv1908（配列番号148）、Rv2220（配列番号154）、Rv2032（配列番号151）、Rv2623（配列番号160）、Rv2875（配列番号163）、Rv3044（配列番号166）、Rv3310（配列番号169）、Rv3881（配列番号178）、Rv0577（配列番号184）、Rv1626（配列番号187）、Rv0733（配列番号190）、Rv2520（配列番号193）、Rv1253（配列番号196）、Rv1980（配列番号199）、Rv3628（配列番号202）、Rv1884（配列番号205）、Rv3872（配列番号208）、Rv3873（配列番号211）、Rv1511（配列番号214）、およびRv3875（配列番号292）、ならびに上記配列のいずれかと少なくとも90％の同一性を有する抗原、からなる群より選択される、上記組成物。
【請求項２】
前記2種以上の抗原の組合せが、以下：
（a）Rv1813（配列番号16）、Rv3620（配列番号51）およびRv2608（配列番号26）を含む組合せ；
（b）Rv2608（配列番号26）およびRv3619（配列番号46）を含む組合せ；ならびに
（c）Rv3478（配列番号41）およびRv3619（配列番号46）を含む組合せ
からなる群より選択される、請求項1に記載の組成物。
【請求項３】
Rv2608（配列番号26）、Rv1813（配列番号16）およびRv3620（配列番号51）を含む前記組合せが、以下：Rv1886（配列番号145）、Rv2389（配列番号21）、Rv3478（配列番号41）、Rv2875（配列番号163）、Rv2220（配列番号154）、Rv0733（配列番号190）、Rv0577（配列番号184）、Rv3044（配列番号166）、Rv1626（配列番号187）、Rv3619（配列番号46）およびRv3020（配列番号36）からなる群より選択される1種以上の抗原をさらに含む、請求項2（a）に記載の組成物。
【請求項４】
前記組合せが、Rv1813（配列番号16）、Rv3620（配列番号51）、Rv2608（配列番号26）およびRv2389（配列番号21）を含む、請求項3に記載の組成物。
【請求項５】
前記組合せが、Rv2608（配列番号26）、Rv1813（配列番号16）、Rv3620（配列番号51）およびRv3619（配列番号46）を含む、請求項3に記載の組成物。
【請求項６】
Rv2608（配列番号26）およびRv3619（配列番号46）を含む前記組合せが、以下：Rv1886（配列番号145）、Rv2389（配列番号21）、Rv1813（配列番号16）、Rv2875（配列番号163）、Rv2220（配列番号154）、Rv0733（配列番号190）、Rv0577（配列番号184）、Rv3044（配列番号166）、Rv1626（配列番号187）、Rv3620（配列番号51）、Rv3478（配列番号41）およびRv3020（配列番号36）からなる群より選択される1種以上の抗原をさらに含む、請求項2（b）に記載の組成物。
【請求項７】
Rv3478（配列番号41）およびRv3619（配列番号46）を含む前記組合せが、以下：Rv1886（配列番号145）、Rv2389（配列番号21）、Rv1813（配列番号16）、Rv2875（配列番号163）、Rv2220（配列番号154）、Rv0733（配列番号190）、Rv0577（配列番号184）、Rv3044（配列番号166）、Rv1626（配列番号187）、Rv3620（配列番号51）、Rv2608（配列番号26）およびRv3020（配列番号36）からなる群より選択される1種以上の抗原をさらに含む、請求項2（c）に記載の組成物。
【請求項８】
2種以上の抗原、またはその免疫原性断片は、融合ポリペプチドの形態で共有結合している、請求項1に記載の組成物。
【請求項９】
前記融合ポリペプチドが、以下：ID83（配列番号91）、ID94（配列番号95）、ID93（配列番号226）、ID91（配列番号236）、ID71（配列番号245）、ID114（配列番号251）、ID125（配列番号257）、またはこれらと少なくとも90％の同一性を有する配列、からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項8に記載の組成物。
【請求項１０】
前記免疫刺激剤が、以下：GLA、AS-2、ENHANZYN（商標）、MPL（商標）、3D-MPL（商標）、IFA、QS21、CWS、TDM、AGP、CpG含有オリゴヌクレオチド、トール様受容体アゴニスト、LeIF、サポニン、サポニン模擬物、ならびに生体および合成のリピドA、イミキモド、ガルジキモド(gardiquimod)、レシキモド、polyI:C、フラジェリン、またはこれらの組合せからなる群より選択される、請求項1に記載の組成物。
【請求項１１】
2種以上の共有結合した結核菌(Mycobacterium tuberculosis)抗原、またはその免疫原性断片の組合せを含む、単離された融合ポリペプチドであって、その際、上記抗原は、以下：Rv0164（配列番号1）、Rv0496（配列番号6）、Rv2608（配列番号26）、Rv3020（配列番号36）、Rv3478（配列番号41）、Rv3619（配列番号46）、Rv3620（配列番号51）、Rv1738（配列番号11）、Rv1813（配列番号16）、Rv3810（配列番号56）、Rv2389（配列番号21）、Rv2866（配列番号31）、Rv3876（配列番号61）、Rv0054（配列番号100）、Rv0410（配列番号106）、Rv0655（配列番号112）、Rv0831（配列番号115）、Rv1009（配列番号118）、Rv1099（配列番号121）、Rv1240（配列番号124）、Rv1288（配列番号127）、Rv1410（配列番号130）、Rv1569（配列番号133）、Rv1789（配列番号136）、Rv1818（配列番号139）、Rv1860（配列番号142）、Rv1886（配列番号145）、Rv1908（配列番号148）、Rv2220（配列番号154）、Rv2032（配列番号151）、Rv2623（配列番号160）、Rv2875（配列番号163）、Rv3044（配列番号166）、Rv3310（配列番号169）、Rv3881（配列番号178）、Rv0577（配列番号184）、Rv1626（配列番号187）、Rv0733（配列番号190）、Rv2520（配列番号193）、Rv1253（配列番号196）、Rv1980（配列番号199）、Rv3628（配列番号202）、Rv1884（配列番号205）、Rv3872（配列番号208）、Rv3873（配列番号211）、Rv1511（配列番号214）、およびRv3875（配列番号292）、ならびに上記配列のいずれかと少なくとも90％の同一性を有する抗原、からなる群より選択される、上記単離された融合ポリペプチド。
【請求項１２】
前記2種以上の抗原の組合せが、以下：
（a）Rv1813（配列番号16）、Rv3620（配列番号51）およびRv2608（配列番号26）を含む組合せ；
（b）Rv2608（配列番号26）およびRv3619（配列番号46）を含む組合せ；ならびに
（c）Rv3478（配列番号41）およびRv3619（配列番号46）を含む組合せ
からなる群より選択される、請求項11に記載の単離された融合ポリペプチド。
【請求項１３】
Rv1813（配列番号16）、Rv3620（配列番号51）およびRv2608（配列番号26）を含む前記組合せが、以下：Rv1886（配列番号145）、Rv2389（配列番号21）、Rv1813（配列番号16）、Rv2875（配列番号163）、Rv2220（配列番号154）、Rv0733（配列番号190）、Rv0577（配列番号184）、Rv3044（配列番号166）、Rv1626（配列番号187）、Rv3619（配列番号46）、Rv3478（配列番号41）およびRv3020（配列番号36）からなる群より選択される1種以上の抗原をさらに含む、請求項12（a）に記載の単離された融合ポリペプチド。
【請求項１４】
前記組合せが、Rv1813（配列番号16）、Rv3620（配列番号51）、Rv2608（配列番号26）およびRv2389（配列番号21）を含む、請求項13に記載の単離された融合ポリペプチド。
【請求項１５】
前記組合せが、Rv2608（配列番号26）、Rv1813（配列番号16）、Rv3620（配列番号51）およびRv3619（配列番号46）を含む、請求項13に記載の単離された融合ポリペプチド。
【請求項１６】
Rv2608（配列番号26）およびRv3619（配列番号46）を含む前記組合せが、以下：Rv1886（配列番号145）、Rv2389（配列番号21）、Rv1813（配列番号16）、Rv2875（配列番号163）、Rv2220（配列番号154）、Rv0733（配列番号190）、Rv0577（配列番号184）、Rv3044（配列番号166）、Rv1626（配列番号187）、Rv3620（配列番号51）、Rv3478（配列番号41）およびRv3020（配列番号36）からなる群より選択される1種以上の抗原をさらに含む、請求項12（b）に記載の単離された融合ポリペプチド。
【請求項１７】
Rv3478（配列番号41）およびRv3619（配列番号46）を含む前記組合せが、以下：Rv1886（配列番号145）、Rv2389（配列番号21）、Rv1813（配列番号16）、Rv2875（配列番号163）、Rv2220（配列番号154）、Rv0733（配列番号190）、Rv0577（配列番号184）、Rv3044（配列番号166）、Rv1626（配列番号187）、Rv3620（配列番号51）、Rv2608（配列番号26）およびRv3020（配列番号36）からなる群より選択される1種以上の抗原をさらに含む、請求項12（c）に記載の単離された融合ポリペプチド。
【請求項１８】
請求項11〜17のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１９】
請求項1〜10のいずれか一項に記載の有効量の組成物を、それを必要とする被験体に投与することを含む、防御免疫応答を刺激する方法。
【請求項２０】
生体サンプルにおける結核菌(Mycobacterium tuberculosis)感染を検出するための方法であって、
（a）生体サンプルを以下：Rv0054（配列番号100）、Rv0164（配列番号103）、Rv0410（配列番号106）、Rv0496（配列番号109）、Rv0655（配列番号112）、Rv0831（配列番号115）、Rv1009（配列番号118）、Rv1099（配列番号118）、Rv1240（配列番号124）、Rv1288（配列番号127）、Rv1410（配列番号130）、Rv1569（配列番号133）、Rv1789（配列番号136）、Rv1818（配列番号139）、Rv1860（配列番号142）、Rv1886（配列番号145）、Rv1908（配列番号148）、Rv2220（配列番号154）、Rv2032（配列番号151）、Rv2608（配列番号157）、Rv2623（配列番号160）、Rv2875（配列番号163）、Rv3044（配列番号166）、Rv3310（配列番号169）、Rv3619（配列番号172）、Rv3810（配列番号175）、Rv3881（配列番号178）、Rv0577（配列番号184）、Rv1626（配列番号187）、Rv0733（配列番号190）、Rv2520（配列番号193）、Rv1253（配列番号196）、Rv1980（配列番号199）、Rv3628（配列番号202）、Rv1884（配列番号205）、Rv3872（配列番号208）、Rv3873（配列番号211）、Rv1511（配列番号214）、およびRv3875（配列番号292）、またはその免疫原性部分、またはその融合ポリペプチド、からなる群より選択される2種以上の抗原の組合せと接触させるステップと；
（b）生体サンプルにおいて、前記組合せに結合する抗体および／またはT細胞の存在を検出するステップ
を含む、上記方法。
【請求項２１】
生体サンプルにおける結核菌(Mycobacterium tuberculosis)感染を検出するための診断キットであって、
（a）以下：Rv0164（配列番号1）、Rv0496（配列番号6）、Rv2608（配列番号26）、Rv3020（配列番号36）、Rv3478（配列番号41）、Rv3619（配列番号46）、Rv3620（配列番号51）、Rv1738（配列番号11）、Rv1813（配列番号16）、Rv3810（配列番号56）、Rv2389（配列番号21）、Rv2866（配列番号31）、Rv3876（配列番号61）、Rv0054（配列番号100）、Rv0410（配列番号106）、Rv0655（配列番号112）、Rv0831（配列番号115）、Rv1009（配列番号118）、Rv1099（配列番号121）、Rv1240（配列番号124）、Rv1288（配列番号127）、Rv1410（配列番号130）、Rv1569（配列番号133）、Rv1789（配列番号136）、Rv1818（配列番号139）、Rv1860（配列番号142）、Rv1886（配列番号145）、Rv1908（配列番号148）、Rv2220（配列番号154）、Rv2032（配列番号151）、Rv2623（配列番号160）、Rv2875（配列番号163）、Rv3044（配列番号166）、Rv3310（配列番号169）、Rv3881（配列番号178）、Rv0577（配列番号184）、Rv1626（配列番号187）、Rv0733（配列番号190）、Rv2520（配列番号193）、Rv1253（配列番号196）、Rv1980（配列番号199）、Rv3628（配列番号202）、Rv1884（配列番号205）、Rv3872（配列番号208）、Rv3873（配列番号211）、Rv1511（配列番号214）、およびRv3875（配列番号292）、またはその免疫原性部分、もしくはその融合ポリペプチドからなる群より選択される2種以上の抗原の組合せと；
（b）検出試薬
とを含む、上記診断キット。
【請求項２２】
生体サンプルにおける結核菌(Mycobacterium tuberculosis)感染を検出するための方法であって、
（a）生体サンプルを以下：DID85（配列番号265）、DID92（配列番号273）、DID108（配列番号283）、およびDID93（配列番号291）からなる群より選択される融合ポリペプチドと接触させるステップと；
（b）生体サンプルにおいて、前記融合ポリペプチドに結合する抗体および／またはT細胞の存在を検出するステップ
を含む、上記方法。
【請求項２３】
生体サンプルにおける結核菌(Mycobacterium tuberculosis)感染を検出するための診断キットであって、
（a）以下：DID85（配列番号265）、DID92（配列番号273）、DID108（配列番号283）、およびDID93（配列番号291）からなる群より選択される融合ポリペプチドと；
（b）検出試薬
とを含む、上記診断キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列表に関する声明
本出願に付随する配列表は、紙のコピーの代わりに、テキスト形式で提供され、参照として本明細書に組み込むものとする。配列表を含むテキストファイルの名称は、480239_403PC_SEQUENCE_LISTING.txtである。テキストファイルは515KBであり、これは2007年4月4日に作成されたもので、本明細書の提出と同時に、EFS-Webから電子出願することになっている。
【０００２】
技術分野
本発明は、概して、結核菌(Mycobacterium tuberculosis)抗原の抗原および／または免疫原の組合せを含む組成物、ならびに、結核の診断、治療、および予防におけるそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
関連技術の説明
結核は、結核菌(Mycobacterium tuberculosis)およびその他のマイコバクテリウム種の感染により起こる慢性感染症である。これは、発展途上国における主要疾病であり、世界の先進地域でも問題は増加しており、毎年数百万の新たな症例が発生している。感染は、かなり長い間無症候性の可能性もあるが、最も一般的には、肺の急性炎症として発現し、これによって発熱および乾性咳嗽が生じる。治療しなければ、典型的には、深刻な合併症及び死を引き起こす。
【０００４】
結核は、一般に、長期にわたる抗生物質療法を用いて制御することができるが、そのような治療もこの疾患の拡大を予防するには不十分である。感染した個体は、しばらくの間、無症候ではあっても、伝染性であると考えられる。加えて、治療レジメンに対するコンプライアンスは極めて重要であるが、患者の行動を監視するのは困難である。患者の中には、治療コースを完了しない者もおり、そのような場合、治療は無効になり、薬剤耐性の発生を招く恐れがある。
【０００５】
結核の拡大を制御するためには、有効なワクチン接種および疾患の正確な早期診断が不可欠である。現在、生菌を用いたワクチン接種が、最も広範に用いられている防御免疫の誘導方法である。この目的で使用される最も一般的なマイコバクテリウム属は、カルメット−ゲラン桿菌（BCG）（ウシ型結核菌（Mycobacterium bovis）の無毒性菌株）である。しかし、BCGの安全性および効力は、論争の種となっており、米国など、いくつかの国では、この薬剤による一般大衆のワクチン接種を実施していない。
【０００６】
結核の診断は、一般に、皮膚試験を用いて達成されており、この試験は、ツベルクリンPPD（タンパク質精製誘導物）への皮内暴露を含む。抗原特異的T細胞応答によって、注射から48〜72時間後までに注射部位に、マイコバクテリア抗原に対する暴露を示す測定可能な硬化が生じる。しかし、感度と特異性には問題があり、BCG接種した個体は、感染個体と区別することができない。
【０００７】
従って、結核を診断、予防および治療するための改善された試薬および方法が必要である。本発明は、これらのニーズを満たすと共に、その他の関連する利点も提供する。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、一般に、少なくとも2種の異種抗原、これら抗原を含む融合ポリペプチド、及び該抗原をコードするポリヌクレオチド、を含む組成物に関する。上記抗原は、マイコバクテリウム種、具体的には結核菌(Mycobacterium tuberculosis)に由来する。本発明はまた、マイコバクテリウム感染の診断、治療および予防において本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドを用いる方法に関する。本発明の抗原は、本明細書に記載するような組合せおよび／または融合ポリペプチドもしくはポリヌクレオチドとして使用すると、改善されかつ予想外のレベルの免疫原性を提供し、これにより、肺細菌負荷を低減するため、ワクチン開発に関して特に有用である。
【０００９】
例えば、本発明の一態様において、免疫刺激剤、ならびに、2種以上の結核菌抗原、またはその免疫原性断片の組合せを含む組成物が提供され、その際、上記抗原は、以下：Rv0164（配列番号1）、Rv0496（配列番号6）、Rv2608（配列番号26）、Rv3020（配列番号36）、Rv3478（配列番号41）、Rv3619（配列番号46）、Rv3620（配列番号51）、Rv1738（配列番号11）、Rv1813（配列番号16）、Rv3810（配列番号56）、Rv2389（配列番号21）、Rv2866（配列番号31）、Rv3876（配列番号61）、Rv0054（配列番号100）、Rv0410（配列番号106）、Rv0655（配列番号112）、Rv0831（配列番号115）、Rv1009（配列番号118）、Rv1099（配列番号121）、Rv1240（配列番号124）、Rv1288（配列番号127）、Rv1410（配列番号130）、Rv1569（配列番号133）、Rv1789（配列番号136）、Rv1818（配列番号139）、Rv1860（配列番号142）、Rv1886（配列番号145）、Rv1908（配列番号148）、Rv2220（配列番号154）、Rv2032（配列番号151）、Rv2623（配列番号160）、Rv2875（配列番号163）、Rv3044（配列番号166）、Rv3310（配列番号169）、Rv3881（配列番号178）、Rv0577（配列番号184）、Rv1626（配列番号187）、Rv0733（配列番号190）、Rv2520（配列番号193）、Rv1253（配列番号196）、Rv1980（配列番号199）、Rv3628（配列番号202）、Rv1884（配列番号205）、Rv3872（配列番号208）、Rv3873（配列番号211）、Rv1511（配列番号214）、およびRv3875（配列番号292）、ならびに上記配列のいずれかと少なくとも80％、90％もしくは95％の同一性を有する抗原からなる群より選択される。
【００１０】
いくつかの実施形態において、前記2種以上の抗原の組合せは、以下：
（a）Rv1813（配列番号16）、Rv3620（配列番号51）およびRv2608（配列番号26）を含む組合せ；
（b）Rv2608（配列番号26）およびRv3619（配列番号46）を含む組合せ；ならびに
（c）Rv3478（配列番号41）およびRv3619（配列番号46）を含む組合せ
からなる群より選択される。
【００１１】
具体的な実施形態では、Rv2608（配列番号26）、Rv1813（配列番号16）およびRv3620（配列番号51）を含む前記（a）の組成物は、以下：Rv1886（配列番号145）、Rv2389（配列番号21）、Rv3478（配列番号41）、Rv2875（配列番号163）、Rv2220（配列番号154）、Rv0733（配列番号190）、Rv0577（配列番号184）、Rv3044（配列番号166）、Rv1626（配列番号187）、Rv3619（配列番号46）およびRv3020（配列番号36）からなる群より選択される1種以上の抗原をさらに含む。
【００１２】
さらに具体的な実施形態では、前記組成物は、Rv1813（配列番号16）、Rv3620（配列番号51）、Rv2608（配列番号26）およびRv2389（配列番号21）を含む。
【００１３】
関連する具体的な実施形態では、前記組成物は、Rv2608（配列番号26）、Rv1813（配列番号16）、Rv3620（配列番号51）およびRv3619（配列番号46）を含む。
【００１４】
本発明の別の実施形態において、Rv2608（配列番号26）およびRv3619（配列番号46）を含む前記（b）の組成物は、以下：Rv1886（配列番号145）、Rv2389（配列番号21）、Rv1813（配列番号16）、Rv2875（配列番号163）、Rv2220（配列番号154）、Rv0733（配列番号190）、Rv0577（配列番号184）、Rv3044（配列番号166）、Rv1626（配列番号187）、Rv3620（配列番号51）、Rv3478（配列番号41）およびRv3020（配列番号36）からなる群より選択される1種以上の抗原をさらに含む。
【００１５】
具体的な実施形態では、前記組成物は、Rv2608（配列番号26）、Rv3619（配列番号46）およびRv1886（配列番号145）を含む。
【００１６】
別の具体的な実施形態では、前記組成物は、以下：Rv2389（配列番号21）、Rv1813（配列番号16）、Rv2875（配列番号163）、Rv2220（配列番号154）、Rv0733（配列番号190）、Rv0577（配列番号184）、Rv3044（配列番号166）、Rv1626（配列番号187）、Rv3620（配列番号51）およびRv3020（配列番号36）からなる群より選択される1種以上の抗原をさらに含む。
【００１７】
さらに具体的な実施形態では、前記組成物は、Rv2608（配列番号26）、Rv3619（配列番号46）、Rv1813（配列番号16）およびRv3620（配列番号51）を含む。
【００１８】
本発明の別の実施形態において、Rv3478（配列番号41）およびRv3619（配列番号46）を含む前記（c）の組成物は、以下：Rv1886（配列番号145）、Rv2389（配列番号21）、Rv1813（配列番号16）、Rv2875（配列番号163）、Rv2220（配列番号154）、Rv0733（配列番号190）、Rv0577（配列番号184）、Rv3044（配列番号166）、Rv1626（配列番号187）、Rv3620（配列番号51）、Rv2608（配列番号26）およびRv3020（配列番号36）からなる群より選択される1種以上の抗原をさらに含む。
【００１９】
具体的な実施形態では、前記組成物は、Rv3478（配列番号41）、Rv3619（配列番号46）およびRv1886（配列番号145）を含む。
【００２０】
別の実施形態では、前記組合せは、以下：Rv2389（配列番号21）、Rv1813（配列番号16）、Rv2875（配列番号163）、Rv2220（配列番号154）、Rv0733（配列番号190）、Rv0577（配列番号184）、Rv3044（配列番号166）、Rv1626（配列番号187）およびRv3020（配列番号36）からなる群より選択される1種以上の抗原をさらに含む。
【００２１】
本明細書に記載する2種以上の抗原の組合せは、2種以上の個別の組換え抗原、またはその抗原／免疫原性断片の組合せを含んでもよい。これに代わり、2種以上の抗原、またはその抗原／免疫原性断片は、融合ポリペプチドの形態で共有結合していてもよい。
【００２２】
本発明の別の態様によれば、2種以上の共有結合した結核菌抗原、またはその免疫原性断片の組合せを含む、単離された融合ポリペプチドが提供され、その際、上記抗原は、以下：Rv0164（配列番号1）、Rv0496（配列番号6）、Rv2608（配列番号26）、Rv3020（配列番号36）、Rv3478（配列番号41）、Rv3619（配列番号46）、Rv3620（配列番号51）、Rv1738（配列番号11）、Rv1813（配列番号16）、Rv3810（配列番号56）、Rv2389（配列番号21）、Rv2866（配列番号31）、Rv3876（配列番号61）、Rv0054（配列番号100）、Rv0410（配列番号106）、Rv0655（配列番号112）、Rv0831（配列番号115）、Rv1009（配列番号118）、Rv1099（配列番号121）、Rv1240（配列番号124）、Rv1288（配列番号127）、Rv1410（配列番号130）、Rv1569（配列番号133）、Rv1789（配列番号136）、Rv1818（配列番号139）、Rv1860（配列番号142）、Rv1886（配列番号145）、Rv1908（配列番号148）、Rv2220（配列番号154）、Rv2032（配列番号151）、Rv2623（配列番号160）、Rv2875（配列番号163）、Rv3044（配列番号166）、Rv3310（配列番号169）、Rv3881（配列番号178）、Rv0577（配列番号184）、Rv1626（配列番号187）、Rv0733（配列番号190）、Rv2520（配列番号193）、Rv1253（配列番号196）、Rv1980（配列番号199）、Rv3628（配列番号202）、Rv1884（配列番号205）、Rv3872（配列番号208）、Rv3873（配列番号211）、Rv1511（配列番号214）、およびRv3875（配列番号292）、ならびに上記配列のいずれかと少なくとも80％、90％もしくは95％の同一性を有する抗原からなる群より選択される。
【００２３】
いくつかの実施形態において、前記融合ポリペプチドは、以下：
（a）Rv1813（配列番号16）、Rv3620（配列番号51）およびRv2608（配列番号26）を含む組合せ；
（b）Rv2608（配列番号26）およびRv3619（配列番号46）を含む組合せ；ならびに
（c）Rv3478（配列番号41）およびRv3619（配列番号46）を含む組合せ
からなる群より選択される共有結合抗原の組合せを含む。
【００２４】
具体的な実施形態では、Rv2608（配列番号26）、Rv1813（配列番号16）およびRv3620（配列番号51）を含む前記（a）の融合ポリペプチドは、以下：Rv1886（配列番号145）、Rv2389（配列番号21）、Rv1813（配列番号16）、Rv2875（配列番号163）、Rv2220（配列番号154）、Rv0733（配列番号190）、Rv0577（配列番号184）、Rv3044（配列番号166）、Rv1626（配列番号187）、Rv3619（配列番号46）、Rv3478（配列番号41）およびRv3020（配列番号36）からなる群より選択される1種以上の抗原をさらに含む。
【００２５】
さらに具体的な実施形態では、前記融合ポリペプチドは、Rv1813（配列番号16）、Rv3620（配列番号51）、Rv2608（配列番号26）およびRv2389（配列番号21）を含む。
【００２６】
関連する具体的な実施形態では、前記融合ポリペプチドは、Rv1813（配列番号16）、Rv3620（配列番号51）、Rv2608（配列番号26）およびRv3619（配列番号46）を含む。
【００２７】
本発明の別の実施形態において、Rv2608（配列番号26）およびRv3619（配列番号46）を含む前記（b）の融合ポリペプチドは、以下：Rv1886（配列番号145）、Rv2389（配列番号21）、Rv1813（配列番号16）、Rv2875（配列番号163）、Rv2220（配列番号154）、Rv0733（配列番号190）、Rv0577（配列番号184）、Rv3044（配列番号166）、Rv1626（配列番号187）、Rv3620（配列番号51）、Rv3478（配列番号41）およびRv3020（配列番号36）からなる群より選択される1種以上の抗原をさらに含む。
【００２８】
具体的な実施形態では、前記融合ポリペプチドは、Rv2608（配列番号26）、Rv1813（配列番号16）、Rv3619（配列番号46）およびRv1886（配列番号145）を含む。
【００２９】
別の具体的な実施形態では、前記融合ポリペプチドは、以下：Rv2389（配列番号21）、Rv1813（配列番号16）、Rv2875（配列番号163）、Rv2220（配列番号154）、Rv0733（配列番号190）、Rv0577（配列番号184）、Rv3044（配列番号166）、Rv1626（配列番号187）、Rv3620（配列番号51）およびRv3020（配列番号36）からなる群より選択される1種以上の抗原をさらに含む。
【００３０】
さらに具体的な実施形態では、前記融合ポリペプチドは、Rv2608（配列番号26）、Rv3619（配列番号46）、Rv1813（配列番号16）およびRv3620（配列番号51）を含む。
【００３１】
本発明の別の実施形態において、Rv3478（配列番号41）およびRv3619（配列番号46）を含む前記（c）の融合ポリペプチドは、以下：Rv1886（配列番号145）、Rv2389（配列番号21）、Rv1813（配列番号16）、Rv2875（配列番号163）、Rv2220（配列番号154）、Rv0733（配列番号190）、Rv0577（配列番号184）、Rv3044（配列番号166）、Rv1626（配列番号187）、Rv3620（配列番号51）、Rv2608（配列番号26）およびRv3020（配列番号36）からなる群より選択される1種以上の抗原をさらに含む。
【００３２】
具体的な実施形態では、前記融合ポリペプチドは、Rv3478（配列番号41）、Rv3619（配列番号46）およびRv1886（配列番号145）を含む。
【００３３】
別の実施形態では、前記融合ポリペプチドは、以下：Rv2389（配列番号21）、Rv1813（配列番号16）、Rv2875（配列番号163）、Rv2220（配列番号154）、Rv0733（配列番号190）、Rv0577（配列番号184）、Rv3044（配列番号166）、Rv1626（配列番号187）およびRv3020（配列番号36）からなる群より選択される1種以上の抗原をさらに含む。
【００３４】
いくつかの具体的な実施形態では、以下：ID83（配列番号91）、ID94（配列番号95）、ID93（配列番号226）、ID91（配列番号236）、ID71（配列番号245）、ID114（配列番号251）、ID125（配列番号257）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチドが提供される。
【００３５】
本発明の別の態様によれば、本明細書に記載の抗原および／または融合ポリペプチドのいずれかをコードする、単離ポリヌクレオチドが提供される。
【００３６】
多くの実施形態において、本明細書に記載の抗原により誘発される免疫応答を改善するために、好ましくは、1種以上の免疫刺激剤と組み合わせて、本発明の組成物、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドを製剤化することは理解されよう。多数の免疫刺激剤およびアジュバント系が当分野で周知かつ利用可能であり、本発明に関して用いることができるが、そのようなものの例として、AS-2、ENHANZYN（商標）、MPL（商標）、3D-MPL（商標）、IFA、QS21、CWS、TDM、AGP、CpG含有オリゴヌクレオチド、トール様受容体アゴニスト（例えば、TLR9アゴニスト、TLR7アゴニスト、TLR7/8アゴニスト、TLR5アゴニスト、TLR4アゴニスト、TLR2アゴニスト、TLR3アゴニストなど）、LeIF、サポニン、サポニン模擬物、ならびに生体および合成のリピドA、イミキモド、ガルジキモド(gardiquimod)、レシキモド、polyI:C、フラジェリン、またはこれらの組合せが挙げられる。
【００３７】
本発明の融合ポリヌクレオチド、融合ポリペプチド、または組成物は、高度に抗原性であることがわかっている。従って、本発明の別の態様によれば、本明細書に記載の有効量の組成物を投与することにより、被験体における防御免疫応答を刺激するワクチンおよびその関連方法が提供される。単離されたまたは精製されたポリヌクレオチドを用いて、組換え融合ポリペプチド抗原をin vitroで生産することができ、これをワクチンとして投与する。あるいは、DNAベースのワクチンとして、ポリペプチドを被験体に直接投与することにより、被験体において抗原発現を引き起こし、続いて、抗結核菌免疫応答の誘導を引き起こすことができる。
【００３８】
加えて、前記組成物、融合ポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、マイクロバクテリウムに感染した可能性のある患者における診断ツールとしても有用である。例えば、本発明の組成物、融合ポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、感染の診断、疾患進行のモニター、および／または治療効果評価のために、結核菌に対する体液性抗体または細胞性免疫を検出するin vitroおよびin vivoアッセイに用いることも可能である。
【００３９】
一実施形態では、生体サンプルにおいて結核菌感染を検出するための診断キットであって、（a）本明細書に記載する抗原または融合ポリペプチドの少なくとも免疫原性部分を含むポリペプチドと、（b）検出試薬を含んでなる、上記キットが提供される。
【００４０】
別の実施形態では、生体サンプルにおいて結核菌感染の存在を検出するための方法であって、（a）本明細書に記載の抗原または融合ポリペプチドに結合するモノクローナル抗体と、生体サンプルとを接触させるステップ；および（b）生体サンプルにおいて、上記モノクローナル抗体に結合する結核菌タンパク質の存在を検出するステップを含む、上記方法が提供される。
【００４１】
また別の実施形態では、生体サンプルにおいて結核菌感染を検出するための方法であって、（a）本明細書に記載する抗原の組合せまたは融合ポリペプチドと、生体サンプルとを接触させるステップ；および（b）生体サンプルにおいて、これに結合する抗体および／またはT細胞の存在を検出するステップを含む、上記方法が提供される。
【００４２】
具体的な実施形態では、生体サンプルにおいて結核菌感染を検出するための方法であって、（a）生体サンプルを以下：Rv0164（配列番号1）、Rv0496（配列番号6）、Rv2608（配列番号26）、Rv3020（配列番号36）、Rv3478（配列番号41）、Rv3619（配列番号46）、Rv3620（配列番号51）、Rv1738（配列番号11）、Rv1813（配列番号16）、Rv3810（配列番号56）、Rv2389（配列番号21）、Rv2866（配列番号31）、Rv3876（配列番号61）、Rv0054（配列番号100）、Rv0410（配列番号106）、Rv0655（配列番号112）、Rv0831（配列番号115）、Rv1009（配列番号118）、Rv1099（配列番号121）、Rv1240（配列番号124）、Rv1288（配列番号127）、Rv1410（配列番号130）、Rv1569（配列番号133）、Rv1789（配列番号136）、Rv1818（配列番号139）、Rv1860（配列番号142）、Rv1886（配列番号145）、Rv1908（配列番号148）、Rv2220（配列番号154）、Rv2032（配列番号151）、Rv2623（配列番号160）、Rv2875（配列番号163）、Rv3044（配列番号166）、Rv3310（配列番号169）、およびRv3881（配列番号178）、Rv0577（配列番号184）、Rv1626（配列番号187）、Rv0733（配列番号190）、Rv2520（配列番号193）、Rv1253（配列番号196）、Rv1980（配列番号199）、Rv3628（配列番号202）、Rv1884（配列番号205）、Rv3872（配列番号208）、Rv3873（配列番号211）、Rv1511（配列番号214）、およびRv3875（配列番号292）、またはその免疫原性部分からなる群より選択される2種以上の抗原の組合せと接触させるステップと；（b）生体サンプルにおいて、これらに結合する抗体および／またはT細胞の存在を検出するステップを含む、上記方法が提供される。
【００４３】
具体的な実施形態では、生体サンプルにおいて結核菌感染を検出するための方法は、生体サンプルを以下：DID85（配列番号265）、DID92（配列番号273）、DID108（配列番号283）、およびDID93（配列番号291）からなる群より選択される融合ポリペプチドと接触させるステップと；生体サンプルにおいて、これに結合する抗体および／またはT細胞の存在を検出するステップを含む。
【００４４】
別の具体的な実施形態では、本発明は、生体サンプルにおいて結核菌感染を検出するための診断キットを提供し、この診断キットは、（a）以下：Rv0164（配列番号1）、Rv0496（配列番号6）、Rv2608（配列番号26）、Rv3020（配列番号36）、Rv3478（配列番号41）、Rv3619（配列番号46）、Rv3620（配列番号51）、Rv1738（配列番号11）、Rv1813（配列番号16）、Rv3810（配列番号56）、Rv2389（配列番号21）、Rv2866（配列番号31）、Rv3876（配列番号61）、Rv0054（配列番号100）、Rv0410（配列番号106）、Rv0655（配列番号112）、Rv0831（配列番号115）、Rv1009（配列番号118）、Rv1099（配列番号121）、Rv1240（配列番号124）、Rv1288（配列番号127）、Rv1410（配列番号130）、Rv1569（配列番号133）、Rv1789（配列番号136）、Rv1818（配列番号139）、Rv1860（配列番号142）、Rv1886（配列番号145）、Rv1908（配列番号148）、Rv2220（配列番号154）、Rv2032（配列番号151）、Rv2623（配列番号160）、Rv2875（配列番号163）、Rv3044（配列番号166）、Rv3310（配列番号169）、およびRv3881（配列番号178）、Rv0577（配列番号184）、Rv1626（配列番号187）、Rv0733（配列番号190）、Rv2520（配列番号193）、Rv1253（配列番号196）、Rv1980（配列番号199）、Rv3628（配列番号202）、Rv1884（配列番号205）、Rv3872（配列番号208）、Rv3873（配列番号211）、Rv1511（配列番号214）、およびRv3875（配列番号292）、またはその免疫原性部分からなる群より選択される2種以上の抗原の組合せと；（b）検出試薬とを含む。
【００４５】
具体的な実施形態では、生体サンプルにおいて結核菌感染を検出するための本発明のキットは、以下：DID85（配列番号265）、DID92（配列番号273）、DID108（配列番号283）、およびDID93（配列番号291）からなる群より選択される融合ポリペプチドと、検出試薬とを含む。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】図１は、抗原刺激ヒトPBMCにより放出されるIFN-γのレベルを示す。PPD-およびPPD+PBMCを培地、10μg/ml PHA、10μg/ml Mtb溶解物、50μg/mlのMtb組換えタンパク質中で72時間インキュベートした。PPD+（n=18）およびPPD-（n=7）PBMCについての平均（平均Ag−平均Media）±SEMを示す。
【図２】図２は、様々なMtb組換えタンパク質によるin vitroでの抗原刺激時のTNF+脾細胞のレベルを示す。低用量の毒性結核菌H37Rvに感染させたマウスからの脾細胞を感染から4週間後および12週間後に採取し、ELISPOTにより抗原特異的TNFサイトカイン応答について試験した。培地、10μg/ml Mtb溶解物、または10μg/mlのMtb組換えタンパク質中で脾細胞を48時間インキュベートした。示したデータは代表的な実験における平均値±SD（n=2）である。
【図３】図3A〜Dは、結核菌感染に対する防御および抗原特異的免疫応答を示す。図3Aは、結核菌によるエアロゾルチャレンジ後の免疫マウスの肺におけるLog10 CFUを示す。CpG、3種のMtb Rv抗原、またはそれらの組合せで免疫したマウス（n=7）からの肺を50〜100Mtb桿菌によるエアロゾルチャレンジから4週間後に採取した。寒天プレート上のin vitro増殖から2週間後、CFUを計数した。示したデータは代表的な実験における平均±SEMである。図3Bは、血清IgG2抗体終点力価を示す。CpG、3種のMtb Rv抗原、またはそれらの組合せで免疫したマウス（n=3〜6）からの血清を、3回目の免疫から1週間後に採取し、ELISAにより抗原特異的IgG2c抗体について試験した。CpG群からの血清を全てのRv抗原に対して試験したが、他の血清は、免疫に用いたRv抗原に対して試験した。示したデータは代表的な実験における平均±SDである。図3Cは、抗原で刺激した脾細胞により放出されたIFN-γを示す。CpG、3種のMtb Rv抗原、またはそれらの組合せで免疫したマウスからの脾細胞を3回目の免疫から3週間後に採取し、抗原特異的IFN-γサイトカイン応答についてELISAにより試験した。培地、または免疫に用いた10μg/mlのRv抗原中で脾細胞を72時間インキュベートした。示したデータは代表的な実験における平均±SD（n=3）である。図3Dは、抗原特異的刺激に応答するTNF+脾細胞の相対頻度を示す。CpG、3種のMtb Rv抗原、またはそれらの組合せで免疫したマウスからの脾細胞を3回目の免疫から3週間後に採取し、ELISPOTにより抗原特異的TNFサイトカイン応答について試験した。培地、または免疫に用いた10μg/mlのRv抗原中で脾細胞を48時間インキュベートした。示したデータは代表的な実験における平均±SD（n=3）である。
【図４】図4A〜4Bは、C57BL/6マウスにおけるGLA-SE含有ID83およびID93融合タンパク質の免疫原性を示す。図4Aは、抗原特異的血清IgG1およびIgG2抗体終点力価を示す。生理食塩水、GLA-SEアジュバント製剤中のID83またはID93融合タンパク質で免疫したマウス（n=3〜6）からの血清を、3回目の免疫から1週間後に採取し、ID83およびID93特異的IgG1およびIgG2c抗体についてELISAにより試験した。示したデータは代表的な実験における平均±SDである。図4Bは、抗原で刺激した脾細胞により放出されたIFN-γのレベルを示す。GLA-SEアジュバント製剤中のID83またはID93で免疫したマウスからの脾細胞を3回目の免疫から3週間後に採取し、抗原特異的IFN-γサイトカイン応答についてELISAにより試験した。培地、3μg/mlのConA、または10μg/mlのID83またはID93融合タンパク質中で脾細胞を72時間インキュベートした。示したデータは代表的な実験における平均±SD（n=3）である。
【図５】図5A〜5Bは、C57BL/6マウスにおける様々なアジュバント製剤を含むID83の免疫原性を示す。図5Aは、抗原特異的血清IgG1およびIgG2c抗体終点力価を示す。生理食塩水、または様々なアジュバント製剤含有のID83融合タンパク質で免疫したマウス（n=3〜6）からの血清を、3回目の免疫から1週間後に採取し、ID83特異的IgG1およびIgG2c抗体についてELISAにより試験した。示したデータは代表的な実験における平均±SDである。図5Bは、抗原で刺激した脾細胞により放出されたIFN-γのレベルを示す。生理食塩水、または様々なアジュバント製剤含有のID83で免疫したマウスからの脾細胞を3回目の免疫から3週間後に採取し、抗原特異的IFN-γサイトカイン応答についてELISAにより試験した。培地、3μg/mlのConA、または10μg/mlのID83融合タンパク質中で脾細胞を72時間インキュベートした。示したデータは代表的な実験における平均±SD（n=3）である。
【図６】図6は、GLA/CpG-SE含有のID83融合タンパク質で免疫したモルモットの、Mtb感染後の生存率を示す。１用量のBCG、または3用量のGLA/CpG-SEアジュバント含有ID83でモルモットを免疫し、最後の追加免疫から4週間後に結核菌H37Rvの低用量エアロゾルでチャレンジした。プラセボ群（食塩水）のモルモットの3/4が死ぬまで200日間生存をモニターした。
【図７】図7A〜7Bは、結核菌チャレンジに対するAd5-ID83特異的免疫応答及び防御を示す。図7Aは、抗原特異的刺激に応答するIFN-γ+脾細胞の相対頻度を示す。生理食塩水、または5 x 109 Ad5-ID83ウイルス粒子で免疫したマウスからの脾細胞を3回目の免疫から3週間後に採取し、抗原特異的IFN-γサイトカイン応答についてELISPOTにより試験した。培地、または10μg/ml ID83融合タンパク質において脾細胞を48時間インキュベートした。示したデータは代表的な実験における平均±SD（n=3）である。図7Bは、結核菌によるエアロゾルチャレンジ後の免疫マウスの肺におけるLog10 CFUを示す。生理食塩水、または5 x 109 Ad5-ID83ウイルス粒子で免疫したマウス（n=7）からの肺を50〜100 Mtb桿菌のエアロゾルチャレンジから4週間後に採取した。寒天プレート上のin vitro増殖から2週間後にCFUを計数した。示したデータは代表的な実験における平均±SEMである。
【図８】図8は、抗生物質（Rx；リファンピン＋イソニアジドを60日間）＋免疫療法（GLA-SEと共にRv2608、Rv1813、およびRv3620を含む混合物を3回注射）の併用療法、抗生物質のみ（Rx；リファンピン＋イソニアジドを60日間）で処置した、または非処置のまま（生理食塩水）の、結核菌感染SWRマウス（n=8）の生存を示す。結果から、薬剤＋免疫療法の併用により、結核菌感染マウスの生存を延長することが明らかである。
【図９】図9は、喀痰陽性の、Tb確認血清サンプルのパネル（n=80〜92）と、Tb陰性の健康な対照血清のパネル（n=40〜46）を、選択したTb抗原との反応性について分析した、ELISA実験の結果を示す。これらの結果から、様々な抗原の組合せを使用することにより、100％陽性応答を取得できることが明らかである。
【発明を実施するための形態】
【００４７】
配列番号の簡単な説明
配列番号1は、Mtb Rv0164の推定アミノ酸配列を表す。
【００４８】
配列番号2は、Mtb Rv0164をコードするPCR増幅核酸配列の配列を表す。
【００４９】
配列番号3は、組換えMtb Rv0164（Hisタグを含む）のアミノ酸配列を表す。
【００５０】
配列番号4および5は、Mtb Rv0164を増幅するのに用いられるプライマーを表す。
【００５１】
配列番号6は、Mtb Rv0496の推定アミノ酸配列を表す。
【００５２】
配列番号7は、Mtb Rv0496をコードするPCR増幅核酸配列の配列を表す。
【００５３】
配列番号8は、組換えMtb Rv0496（Hisタグを含む）のアミノ酸配列を表す。
【００５４】
配列番号9および10は、Mtb Rv0496を増幅するのに用いられるプライマーを表す。
【００５５】
配列番号11は、Mtb Rv1738の推定アミノ酸配列を表す。
【００５６】
配列番号12は、Mtb Rv1738をコードするPCR増幅核酸配列の配列を表す。
【００５７】
配列番号13は、組換えMtb Rv1738（Hisタグを含む）のアミノ酸配列を表す。
【００５８】
配列番号14および15は、Mtb Rv1738を増幅するのに用いられるプライマーを表す。
【００５９】
配列番号16は、Mtb Rv1813の推定アミノ酸配列を表す。
【００６０】
配列番号17は、Mtb Rv1813をコードするPCR増幅核酸配列の配列を表す。
【００６１】
配列番号18は、組換えMtb Rv1813（Hisタグを含む）のアミノ酸配列を表す。
【００６２】
配列番号19および20は、Mtb Rv1813を増幅するのに用いられるプライマーを表す。
【００６３】
配列番号21は、Mtb Rv2389の推定アミノ酸配列を表す。
【００６４】
配列番号22は、Mtb Rv2389をコードするPCR増幅核酸配列の配列を表す。
【００６５】
配列番号23は、組換えMtb Rv2389（Hisタグを含む）のアミノ酸配列を表す。
【００６６】
配列番号24および25は、Mtb Rv2389を増幅するのに用いられるプライマーを表す。
【００６７】
配列番号26は、Mtb Rv2608の推定アミノ酸配列を表す。
【００６８】
配列番号27は、Mtb Rv2608をコードするPCR増幅核酸配列の配列を表す。
【００６９】
配列番号28は、組換えMtb Rv2608（Hisタグを含む）のアミノ酸配列を表す。
【００７０】
配列番号29および30は、Mtb Rv2608を増幅するのに用いられるプライマーを表す。
【００７１】
配列番号31は、Mtb Rv2866の推定アミノ酸配列を表す。
【００７２】
配列番号32および33は、Mtb Rv2866を増幅するのに用いられるプライマーを表す。
【００７３】
配列番号34は、Mtb Rv2866をコードするPCR増幅核酸配列の配列を表す。
【００７４】
配列番号35は、組換えMtb Rv2866（Hisタグを含む）のアミノ酸配列を表す。
【００７５】
配列番号36は、Mtb Rv3020の推定アミノ酸配列を表す。
【００７６】
配列番号37は、Mtb Rv3020をコードするPCR増幅核酸配列の配列を表す。
【００７７】
配列番号38は、組換えMtb Rv3020（Hisタグを含む）のアミノ酸配列を表す。
【００７８】
配列番号39および40は、Mtb Rv3020を増幅するのに用いられるプライマーを表す。
【００７９】
配列番号41は、Mtb Rv3478の推定アミノ酸配列を表す。
【００８０】
配列番号42は、Mtb Rv3478をコードするPCR増幅核酸配列の配列を表す。
【００８１】
配列番号43は、組換えMtb Rv3478（Hisタグを含む）のアミノ酸配列を表す。
【００８２】
配列番号44および45は、Mtb Rv3478を増幅するのに用いられるプライマーを表す。
【００８３】
配列番号46は、Mtb Rv3619の推定アミノ酸配列を表す。
【００８４】
配列番号47は、Mtb Rv3619をコードするPCR増幅核酸配列の配列を表す。
【００８５】
配列番号48は、組換えMtb Rv3619（Hisタグを含む）のアミノ酸配列を表す。
【００８６】
配列番号49および50は、Mtb Rv3619を増幅するのに用いられるプライマーを表す。
【００８７】
配列番号51は、Mtb Rv3620の推定アミノ酸配列を表す。
【００８８】
配列番号52は、Mtb Rv3620をコードするPCR増幅核酸配列の配列を表す。
【００８９】
配列番号53は、組換えMtb Rv3620（Hisタグを含む）のアミノ酸配列を表す。
【００９０】
配列番号54および55は、Mtb Rv3620を増幅するのに用いられるプライマーを表す。
【００９１】
配列番号56は、Mtb Rv3810の推定アミノ酸配列を表す。
【００９２】
配列番号57は、Mtb Rv3810をコードするPCR増幅核酸配列の配列を表す。
【００９３】
配列番号58は、組換えMtb Rv3810（Hisタグを含む）のアミノ酸配列を表す。
【００９４】
配列番号59および60は、Mtb Rv3810を増幅するのに用いられるプライマーを表す。
【００９５】
配列番号61は、Mtb Rv3876の推定アミノ酸配列を表す。
【００９６】
配列番号62は、Mtb Rv3876をコードするPCR増幅核酸配列の配列を表す。
【００９７】
配列番号63は、組換えMtb Rv3876（Hisタグを含む）のアミノ酸配列を表す。
【００９８】
配列番号64および65は、Mtb Rv3876を増幅するのに用いられるプライマーを表す。
【００９９】
配列番号66は、融合ポリペプチドMtb 36f.1をコードするポリヌクレオチド配列を表す。
【０１００】
配列番号67は、組換えMtb融合ポリペプチドMtb 36f.1（Hisタグを含む）のアミノ酸配列を表す。
【０１０１】
配列番号68〜71は、Mtb36f.1の増幅およびクローニングに用いられるプライマーを表す。
【０１０２】
配列番号72は、融合ポリペプチドID58をコードするポリヌクレオチド配列を表す。
【０１０３】
配列番号73〜78は、ID58の増幅およびクローニングに用いられるプライマーを表す。
【０１０４】
配列番号79は、組換えMtb融合ポリペプチドID58（Hisタグを含む）のアミノ酸配列を表す。
【０１０５】
配列番号80は、融合ポリペプチドID69をコードするポリヌクレオチド配列を表す。
【０１０６】
配列番号81〜82は、ID69の増幅およびクローニングに用いられるプライマーを表す。
【０１０７】
配列番号83は、組換えMtb融合ポリペプチドID69（Hisタグを含む）のアミノ酸配列を表す。
【０１０８】
配列番号84は、融合ポリペプチドID83をコードするポリヌクレオチド配列を表す。
【０１０９】
配列番号85〜90は、ID83の増幅およびクローニングに用いられるプライマーを表す。
【０１１０】
配列番号91は、組換えMtb融合ポリペプチドID83（Hisタグを含む）のアミノ酸配列を表す。
【０１１１】
配列番号92は、融合ポリペプチドID94をコードするポリヌクレオチド配列を表す。
【０１１２】
配列番号93〜94は、ID94の増幅およびクローニングに用いられるプライマーを表す。
【０１１３】
配列番号95は、組換えMtb融合ポリペプチドID94（Hisタグを含む）のアミノ酸配列を表す。
【０１１４】
配列番号96は、融合ポリペプチドID95をコードするポリヌクレオチド配列を表す。
【０１１５】
配列番号97は、組換えMtb融合ポリペプチドID95（Hisタグを含む）のアミノ酸配列を表す。
【０１１６】
配列番号98は、融合ポリペプチドID120をコードするポリヌクレオチド配列を表す。
【０１１７】
配列番号99は、組換えMtb融合ポリペプチドID120（Hisタグを含む）のアミノ酸配列を表す。
【０１１８】
配列番号100は、Rv0054の推定アミノ酸配列を表す。
【０１１９】
配列番号101は、Rv0054をコードするPCR増幅核酸配列の配列を表す。
【０１２０】
配列番号102は、組換えRv0054（Hisタグを含む）のアミノ酸配列を表す。
【０１２１】
配列番号103は、Rv0164の推定アミノ酸配列を表す。
【０１２２】
配列番号104は、Rv0164をコードするPCR増幅核酸配列の配列を表す。
【０１２３】
配列番号105は、組換えRv0164（Hisタグを含む）のアミノ酸配列を表す。
【０１２４】
配列番号106は、Rv0410の推定アミノ酸配列を表す。
【０１２５】
配列番号107は、Rv0410をコードするPCR増幅核酸配列の配列を表す。
【０１２６】
配列番号108は、組換えRv0410（Hisタグを含む）のアミノ酸配列を表す。
【０１２７】
配列番号109は、Rv0496の推定アミノ酸配列を表す。
【０１２８】
配列番号110は、Rv0496をコードするPCR増幅核酸配列の配列を表す。
【０１２９】
配列番号111は、組換えRv0496（Hisタグを含む）のアミノ酸配列を表す。
【０１３０】
配列番号112は、Rv0655の推定アミノ酸配列を表す。
【０１３１】
配列番号113は、Rv0655をコードするPCR増幅核酸配列の配列を表す。
【０１３２】
配列番号114は、組換えRv0655（Hisタグを含む）のアミノ酸配列を表す。
【０１３３】
配列番号115は、Rv0831の推定アミノ酸配列を表す。
【０１３４】
配列番号116は、Rv0831をコードするPCR増幅核酸配列の配列を表す。
【０１３５】
配列番号117は、組換えRv0831（Hisタグを含む）のアミノ酸配列を表す。
【０１３６】
配列番号118は、Rv1009の推定アミノ酸配列を表す。
【０１３７】
配列番号119は、Rv1009をコードするPCR増幅核酸配列の配列を表す。
【０１３８】
配列番号120は、組換えRv1009（Hisタグを含む）のアミノ酸配列を表す。
【０１３９】
配列番号121は、Rv1099の推定アミノ酸配列を表す。
【０１４０】
配列番号122は、Rv1099をコードするPCR増幅核酸配列の配列を表す。
【０１４１】
配列番号123は、組換えRv1099（Hisタグを含む）のアミノ酸配列を表す。
【０１４２】
配列番号124は、Rv1240の推定アミノ酸配列を表す。
【０１４３】
配列番号125は、Rv1240をコードするPCR増幅核酸配列の配列を表す。
【０１４４】
配列番号126は、組換えRv1240（Hisタグを含む）のアミノ酸配列を表す。
【０１４５】
配列番号127は、Rv1288の推定アミノ酸配列を表す。
【０１４６】
配列番号128は、Rv1288をコードするPCR増幅核酸配列の配列を表す。
【０１４７】
配列番号129は、組換えRv1288（Hisタグを含む）のアミノ酸配列を表す。
【０１４８】
配列番号130は、Rv1410の推定アミノ酸配列を表す。
【０１４９】
配列番号131は、Rv1410をコードするPCR増幅核酸配列の配列を表す。
【０１５０】
配列番号132は、組換えRv1410（Hisタグを含む）のアミノ酸配列を表す。
【０１５１】
配列番号133は、Rv1569の推定アミノ酸配列を表す。
【０１５２】
配列番号134は、Rv1569をコードするPCR増幅核酸配列の配列を表す。
【０１５３】
配列番号135は、組換えRv1569（Hisタグを含む）のアミノ酸配列を表す。
【０１５４】
配列番号136は、Rv1789の推定アミノ酸配列を表す。
【０１５５】
配列番号137は、Rv1789をコードするPCR増幅核酸配列の配列を表す。
【０１５６】
配列番号138は、組換えRv1789（Hisタグを含む）のアミノ酸配列を表す。
【０１５７】
配列番号139は、Rv1818の推定アミノ酸配列を表す。
【０１５８】
配列番号140は、Rv1818をコードするPCR増幅核酸配列の配列を表す。
【０１５９】
配列番号141は、組換えRv1818（Hisタグを含む）のアミノ酸配列を表す。
【０１６０】
配列番号142は、Rv1860の推定アミノ酸配列を表す。
【０１６１】
配列番号143は、Rv1860をコードするPCR増幅核酸配列の配列を表す。
【０１６２】
配列番号144は、組換えRv1860（Hisタグを含む）のアミノ酸配列を表す。
【０１６３】
配列番号145は、Rv1886の推定アミノ酸配列を表す。
【０１６４】
配列番号146は、Rv1886をコードするPCR増幅核酸配列の配列を表す。
【０１６５】
配列番号147は、組換えRv1886（Hisタグを含む）のアミノ酸配列を表す。
【０１６６】
配列番号148は、Rv1908の推定アミノ酸配列を表す。
【０１６７】
配列番号149は、Rv1908をコードするPCR増幅核酸配列の配列を表す。
【０１６８】
配列番号150は、組換えRv1908（Hisタグを含む）のアミノ酸配列を表す。
【０１６９】
配列番号151は、Rv2032の推定アミノ酸配列を表す。
【０１７０】
配列番号152は、Rv2032をコードするPCR増幅核酸配列の配列を表す。
【０１７１】
配列番号153は、組換えRv2032（Hisタグを含む）のアミノ酸配列を表す。
【０１７２】
配列番号154は、Rv2220の推定アミノ酸配列を表す。
【０１７３】
配列番号155は、Rv2220をコードするPCR増幅核酸配列の配列を表す。
【０１７４】
配列番号156は、組換えRv2220（Hisタグを含む）のアミノ酸配列を表す。
【０１７５】
配列番号157は、Rv2608の推定アミノ酸配列を表す。
【０１７６】
配列番号158は、Rv2608をコードするPCR増幅核酸配列の配列を表す。
【０１７７】
配列番号159は、組換えRv2608（Hisタグを含む）のアミノ酸配列を表す。
【０１７８】
配列番号160は、Rv2623の推定アミノ酸配列を表す。
【０１７９】
配列番号161は、Rv2623をコードするPCR増幅核酸配列の配列を表す。
【０１８０】
配列番号162は、組換えRv2623（Hisタグを含む）のアミノ酸配列を表す。
【０１８１】
配列番号163は、Rv2825の推定アミノ酸配列を表す。
【０１８２】
配列番号164は、Rv2825をコードするPCR増幅核酸配列の配列を表す。
【０１８３】
配列番号165は、組換えRv2825（Hisタグを含む）のアミノ酸配列を表す。
【０１８４】
配列番号166は、Rv3044の推定アミノ酸配列を表す。
【０１８５】
配列番号167は、Rv3044をコードするPCR増幅核酸配列の配列を表す。
【０１８６】
配列番号168は、組換えRv3004（Hisタグを含む）のアミノ酸配列を表す。
【０１８７】
配列番号169は、Rv3310の推定アミノ酸配列を表す。
【０１８８】
配列番号170は、Rv3310をコードするPCR増幅核酸配列の配列を表す。
【０１８９】
配列番号171は、組換えRv3310（Hisタグを含む）のアミノ酸配列を表す。
【０１９０】
配列番号172は、Rv3619の推定アミノ酸配列を表す。
【０１９１】
配列番号173は、Rv3619をコードするPCR増幅核酸配列の配列を表す。
【０１９２】
配列番号174は、組換えRv3619（Hisタグを含む）のアミノ酸配列を表す。
【０１９３】
配列番号175は、Rv3810の推定アミノ酸配列を表す。
【０１９４】
配列番号176は、Rv3810をコードするPCR増幅核酸配列の配列を表す。
【０１９５】
配列番号177は、組換えRv3810（Hisタグを含む）のアミノ酸配列を表す。
【０１９６】
配列番号178は、Rv3881の推定アミノ酸配列を表す。
【０１９７】
配列番号179は、Rv3881をコードするPCR増幅核酸配列の配列を表す。
【０１９８】
配列番号180は、組換えRv3881（Hisタグを含む）のアミノ酸配列を表す。
【０１９９】
配列番号181は、Rv0455の推定アミノ酸配列を表す。
【０２００】
配列番号182は、Rv0455をコードするPCR増幅核酸配列の配列を表す。
【０２０１】
配列番号183は、組換えRv0455（Hisタグを含む）のアミノ酸配列を表す。
【０２０２】
配列番号184は、Rv0577の推定アミノ酸配列を表す。
【０２０３】
配列番号185は、Rv0577をコードするPCR増幅核酸配列の配列を表す。
【０２０４】
配列番号186は、組換えRv0577（Hisタグを含む）のアミノ酸配列を表す。
【０２０５】
配列番号187は、Rv1626の推定アミノ酸配列を表す。
【０２０６】
配列番号188は、Rv1626をコードするPCR増幅核酸配列の配列を表す。
【０２０７】
配列番号189は、組換えRv1626（Hisタグを含む）のアミノ酸配列を表す。
【０２０８】
配列番号190は、Rv0733の推定アミノ酸配列を表す。
【０２０９】
配列番号191は、Rv0733をコードするPCR増幅核酸配列の配列を表す。
【０２１０】
配列番号192は、組換えRv0733（Hisタグを含む）のアミノ酸配列を表す。
【０２１１】
配列番号193は、Rv2520の推定アミノ酸配列を表す。
【０２１２】
配列番号194は、Rv2520をコードするPCR増幅核酸配列の配列を表す。
【０２１３】
配列番号195は、組換えRv2520（Hisタグを含む）のアミノ酸配列を表す。
【０２１４】
配列番号196は、Rv1253の推定アミノ酸配列を表す。
【０２１５】
配列番号197は、Rv1253をコードするPCR増幅核酸配列の配列を表す。
【０２１６】
配列番号198は、組換えRv1253（Hisタグを含む）のアミノ酸配列を表す。
【０２１７】
配列番号199は、Rv1980の推定アミノ酸配列を表す。
【０２１８】
配列番号200は、Rv1980をコードするPCR増幅核酸配列の配列を表す。
【０２１９】
配列番号201は、組換えRv1980（Hisタグを含む）のアミノ酸配列を表す。
【０２２０】
配列番号202は、Rv3628の推定アミノ酸配列を表す。
【０２２１】
配列番号203は、Rv3628をコードするPCR増幅核酸配列の配列を表す。
【０２２２】
配列番号204は、組換えRv3628（Hisタグを含む）のアミノ酸配列を表す。
【０２２３】
配列番号205は、Rv1884の推定アミノ酸配列を表す。
【０２２４】
配列番号206は、Rv1884をコードするPCR増幅核酸配列の配列を表す。
【０２２５】
配列番号207は、組換えRv1884（Hisタグを含む）のアミノ酸配列を表す。
【０２２６】
配列番号208は、Rv3872の推定アミノ酸配列を表す。
【０２２７】
配列番号209は、Rv3872をコードするPCR増幅核酸配列の配列を表す。
【０２２８】
配列番号210は、組換えRv3872（Hisタグを含む）のアミノ酸配列を表す。
【０２２９】
配列番号211は、Rv3873の推定アミノ酸配列を表す。
【０２３０】
配列番号212は、Rv3873をコードするPCR増幅核酸配列の配列を表す。
【０２３１】
配列番号213は、組換えRv3873（Hisタグを含む）のアミノ酸配列を表す。
【０２３２】
配列番号214は、Rv1511の推定アミノ酸配列を表す。
【０２３３】
配列番号215は、Rv1511をコードするPCR増幅核酸配列の配列を表す。
【０２３４】
配列番号216は、組換えRv1511（Hisタグを含む）のアミノ酸配列を表す。
【０２３５】
配列番号217は、融合ポリペプチドID93をコードするポリヌクレオチド配列を表す。
【０２３６】
配列番号218〜225は、ID93の増幅およびクローニングに用いられるプライマーを表す。
【０２３７】
配列番号226は、組換えMtb融合ポリペプチドID93（Hisタグを含む）のアミノ酸配列を表す。
【０２３８】
配列番号227は、融合ポリペプチドID91をコードするポリヌクレオチド配列を表す。
【０２３９】
配列番号228〜235は、ID91の増幅およびクローニングに用いられるプライマーを表す。
【０２４０】
配列番号236は、組換えMtb融合ポリペプチドID91（Hisタグを含む）のアミノ酸配列を表す。
【０２４１】
配列番号237は、融合ポリペプチドID71をコードするポリヌクレオチド配列を表す。
【０２４２】
配列番号238〜244は、ID71の増幅およびクローニングに用いられるプライマーを表す。
【０２４３】
配列番号245は、組換えMtb融合ポリペプチドID71（Hisタグを含む）のアミノ酸配列を表す。
【０２４４】
配列番号246は、融合ポリペプチドID114をコードするポリヌクレオチド配列を表す。
【０２４５】
配列番号247〜250は、ID114の増幅およびクローニングに用いられるプライマーを表す。
【０２４６】
配列番号251は、組換えMtb融合ポリペプチドID114（Hisタグを含む）のアミノ酸配列を表す。
【０２４７】
配列番号252は、融合ポリペプチドID125をコードするポリヌクレオチド配列を表す。
【０２４８】
配列番号253〜256は、ID125の増幅およびクローニングに用いられるプライマーを表す。
【０２４９】
配列番号257は、組換えMtb融合ポリペプチドID125（Hisタグを含む）のアミノ酸配列を表す。
【０２５０】
配列番号258は、融合ポリペプチドDID85をコードするポリヌクレオチド配列を表す。
【０２５１】
配列番号259〜264は、DID85の増幅およびクローニングに用いられるプライマーを表す。
【０２５２】
配列番号265は、組換えMtb融合ポリペプチドDID85（Hisタグを含む）のアミノ酸配列を表す。
【０２５３】
配列番号266は、融合ポリペプチドDID92をコードするポリヌクレオチド配列を表す。
【０２５４】
配列番号267〜272は、DID92の増幅およびクローニングに用いられるプライマーを表す。
【０２５５】
配列番号273は、組換えMtb融合ポリペプチドDID92（Hisタグを含む）のアミノ酸配列を表す。
【０２５６】
配列番号274は、融合ポリペプチドDID108をコードするポリヌクレオチド配列を表す。
【０２５７】
配列番号275〜282は、DID108の増幅およびクローニングに用いられるプライマーを表す。
【０２５８】
配列番号283は、組換えMtb融合ポリペプチドDID108（Hisタグを含む）のアミノ酸配列を表す。
【０２５９】
配列番号284は、融合ポリペプチドDID93をコードするポリヌクレオチド配列を表す。
【０２６０】
配列番号285〜290は、DID93の増幅およびクローニングに用いられるプライマーを表す。
【０２６１】
配列番号291は、組換えMtb融合ポリペプチドDID93（Hisタグを含む）のアミノ酸配列を表す。
【０２６２】
配列番号292は、Rv3875の推定アミノ酸配列を表す。
【０２６３】
配列番号293は、Rv3875をコードするPCR増幅核酸配列の配列を表す。
【０２６４】
配列番号294は、組換えRv3875（Hisタグを含む）のアミノ酸配列を表す。
【０２６５】
配列番号295〜296は、Rv0577の増幅およびクローニングに用いられるプライマーを表す。
【０２６６】
配列番号297〜298は、Rv1626の増幅およびクローニングに用いられるプライマーを表す。
【０２６７】
配列番号299〜300は、Rv0733の増幅およびクローニングに用いられるプライマーを表す。
【０２６８】
配列番号301〜302は、Rv2520の増幅およびクローニングに用いられるプライマーを表す。
【０２６９】
配列番号303〜304は、Rv1253の増幅およびクローニングに用いられるプライマーを表す。
【０２７０】
配列番号305〜306は、Rv1980の増幅およびクローニングに用いられるプライマーを表す。
【０２７１】
配列番号307〜308は、Rv3628の増幅およびクローニングに用いられるプライマーを表す。
【０２７２】
配列番号309〜310は、Rv1844の増幅およびクローニングに用いられるプライマーを表す。
【０２７３】
配列番号311〜312は、Rv3872の増幅およびクローニングに用いられるプライマーを表す。
【０２７４】
配列番号313〜314は、Rv3873の増幅およびクローニングに用いられるプライマーを表す。
【０２７５】
配列番号315〜316は、Rv1511の増幅およびクローニングに用いられるプライマーを表す。
【０２７６】
配列番号317〜318は、Rv3875の増幅およびクローニングに用いられるプライマーを表す。
【０２７７】
詳細な説明
本発明は、マイコバクテリウム抗原を含む、高度に抗原性／免疫原性の組成物に関する。本発明の組成物は、一般に、結核菌群のマイコバクテリウム種の少なくとも2つの異種ポリペプチドを含む。結核菌群のマイコバクテリウム種には、結核症を引き起こすと伝統的に考えられる種、ならびに、AIDS患者のような免疫低下患者に結核および肺疾患を引き起こすマイコバクテリウム環境種および日和見種、例えば、結核菌(Mycobacterium tuberculosis)（Mtb）、ウシ結核菌(Mycobacterium bovis)、またはマイコバクテリウム・アフリカナム(Mycobacterium africanum)、BCG、トリ結核菌(Mycobacterium avium)、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ(Mycobacterium intracellulare)、マイコバクテリウム・セラータム(Mycobacterium celatum)、マイコバクテリウム・ゲナベンズ(Mycobacterium genavense)、マイコバクテリウム・ヘモフィルム(Mycobacterium haemophilum)、カンサシ菌(Mycobacterium kansasii)、マイコバクテリウム・シミアエ(Mycobacterium simiae)、マイコバクテリウム・ワクカエ(Mycobacterium vaccae)、マイコバクテリウム・フォーチュイタム(Mycobacterium fortuitum)、およびマイコバクテリウム・スクロフラセム(Mycobacterium scrofulaceum)（例えば、Harrison's Principles of Internal Medicine、第1巻、pp.1004-1014および1019-1020を参照）。好ましい実施形態では、本発明に従い予防、治療または診断しようとするマイコバクテリウム種は、結核菌（Mtb）である。マイコバクテリウム種由来の抗原の配列は、容易に入手可能である。例えば、結核菌配列は、Coleら、Nature 393:537（1998）に見いだすことができ、また、Wellcome Trust Sanger InstituteおよびInstitut Pasteurにより維持されているようなウェブサイトでも見いだすことができる。
【０２７８】
A．マイコバクテリウム抗原およびその融合物
本発明は、一態様において、本明細書に記載するように、単離されたマイコバクテリウムポリペプチドを提供し、これには、融合ポリペプチド、およびそれを含有する組成物も含まれる。一般に、本発明のポリペプチドは、単離されたポリペプチドであるが、本明細書に開示するアミノ酸配列由来の断片（例えば、抗原性／免疫原性部分）であってもよいし、本明細書に開示する全アミノ酸配列を含んでもよい。本発明のポリペプチド、その抗原性／免疫原性断片、ならびに他の変異体は、従来の組換えおよび／または合成技術を用いて、作製することができる。
【０２７９】
特定の好ましい実施形態では、本発明のポリペプチドは抗原性／免疫原性である。すなわち、上記ポリペプチドは、イムノアッセイ（ELISAまたはT細胞刺激アッセイなど）において、感染被験体由来の抗血清および／またはT細胞と検出可能な程度で反応する。免疫原性のスクリーニングは、当業者には周知の技術を用いて実施することができる。例えば、このようなスクリーニングは、HarlowおよびLane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988に記載のような方法を用いて実施することができる。一例では、ポリペプチドを固体支持体上に固体化し、患者の血清と接触させることにより、血清内の抗体を固定化ポリペプチドに結合させることができる。次に、非結合血清を除去し、例えば、125I標識プロテインAを用いて、結合抗体を検出することができる。
【０２８０】
当業者には認識されるように、本明細書に開示するポリペプチドの免疫原性部分も本発明に含まれる。本明細書で用いる「免疫原性部分」とは、それ自体が、ポリペプチドを認識するB細胞および／またはT細胞表面抗原受容体と免疫学的に反応性である（すなわち、特異的に結合する）、本発明の免疫原性ポリペプチドの断片である。免疫原性部分は、一般に、周知の技術、例えば、Paul, Fundamental Immunology、第3版、243-247（Raven Press, 1993）ならびに該文献に引用されている参考文献に概説されたものなどを用いて、同定することができる。このような技術は、抗原特異的抗体、抗血清および／またはT細胞系もしくはクローンと反応する能力について、ポリペプチドをスクリーニングすることを含む。本明細書で用いる抗血清および抗体は、これらが抗原と特異的に結合する（すなわち、イムノアッセイにおいて当該タンパク質と反応するが、非関連タンパク質とは検出可能な程度に反応しない）ならば、「抗原特異的」である。このような抗血清および抗体は、本明細書に記載のように、また、周知の技術を用いて、調製することができる。
【０２８１】
具体的な実施形態では、本発明のポリペプチドの抗原性／免疫原性部分は、全長ポリペプチドの反応性に実質的に劣らないレベルで、抗血清および／またはT細胞と反応する（例えば、ELISAおよび／またはT細胞反応性アッセイにおいて）部分である。好ましくは、抗原性／免疫原性部分の免疫原性のレベルは、全長ポリペプチドの免疫原性の少なくとも約50％、好ましくは少なくとも約70％、また最も好ましくは、約90％以上である。いくつかの例では、好ましい免疫原性部分は、対応する全長ポリペプチドより高い免疫原性、例えば、約100％または150％もしくはそれ以上の免疫原性を有するものが同定される。
【０２８２】
本発明のポリペプチド組成物は、本発明のポリペプチド、特に、本明細書に開示するアミノ酸配列を有するポリペプチドに対して生じるT細胞および／または抗体と免疫学的に反応性である1以上のポリペプチド、またはその免疫原性断片もしくは変異体も含みうる。
【０２８３】
本発明の別の実施形態では、本明細書に記載の1以上のポリペプチドと免疫学的に反応性のT細胞および／または抗体を誘発することができる1以上のポリペプチド、または本明細書に開示のポリヌクレオチド配列に含まれる連続したポリヌクレオチド配列によりコードされる1以上のポリペプチド、またはその免疫原性断片もしくは変異体、または中度から高度ストリンジェンシーの条件下で、1以上の上記配列にハイブリダイズする1以上のポリヌクレオチド配列が提供される。
【０２８４】
本発明はまた、本明細書に記載するポリペプチド組成物の少なくとも約5、10、15、20、25、50、もしくは100個もしくはそれ以上（すべての中間長を包含する）の連続的アミノ酸を含むポリペプチド断片（抗原性／免疫原性断片を含む）、または本明細書に記載のポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド断片も提供する。
【０２８５】
別の態様では、本発明は、本明細書に記載のポリペプチド組成物の変異体を提供する。本発明に一般に含まれるポリペプチド変異体は、典型的には、本明細書に記載のポリペプチド配列に対し、その長さに沿って、少なくとも約70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％以上の同一性（以下に記載のように決定する）を呈示する。
【０２８６】
本明細書で用いる用語ポリペプチド「変異体」とは、典型的には、1以上の置換、欠失、付加および／または挿入において、本明細書に具体的に開示するポリペプチドと異なるポリペプチドである。このような変異体は、天然に存在するものでもよいし、あるいは、例えば、当業界で周知の多数の技術のいずれかを用いて、本発明の1以上の前記ポリペプチド配列を改変し、本明細書に記載する免疫原性を評価することによって、合成により作製することができる。
【０２８７】
例えば、本発明のポリペプチドの特定の例示的な変異体として、N末端リーダー配列または膜貫通ドメインなどの1以上の部分を除去したものが挙げられる。その他の例示的な変異体として、成熟タンパク質のNおよび／またはC末端から小部分（約1〜30アミノ酸）を除去した変異体が挙げられる。
【０２８８】
多くの例において、変異体は、保存的置換を含むものである。「保存的置換」とは、ペプチド化学の当業者によって、ポリペプチドの二次構造およびハイドロパシー性が実質的に不変であることが予想されるように、1アミノ酸を、類似の特性を有する別のアミノ酸で置換したものである。前述のように、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの構造に改変を加えてもよいし、さらには、望ましい特性、例えば、免疫原性を備えた変異型または誘導ポリペプチドをコードする機能性分子を取得することも可能である。ポリペプチドのアミノ酸配列を変更して、本発明のポリペプチドと同等の、または改善された免疫原性変異体もしくは部分を作製したい場合には、当業者は、典型的には、表1に従い、コードDNA配列の1以上のコドンを変更する。
【０２８９】
例えば、構造（例えば、抗体の抗原結合領域または基質分子上の結合部位）との相互結合能力の顕著な消失なしに、タンパク質構造内の特定のアミノ酸を別のアミノ酸に置換することができる。タンパク質の生体機能活性を決定するのはタンパク質の相互作用能力およびその性質であることから、特定のアミノ酸配列の置換は、タンパク質配列内、そして、もちろん、その基礎となるDNAコード配列で実施することができ、やはり、類似の性質を備えたタンパク質が得られる。従って、生物学的有用性または活性の顕著な消失なしに、開示する組成物のペプチド配列、または該ペプチドをコードする対応DNA配列に様々な変更を実施してもよいことが意図される。
【表１】
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【０２９０】
このような変更を実施する上で、アミノ酸のハイドロパシック・インデックス(hydropathic index)を考慮することもある。タンパク質に相互作用生物学的機能を賦与する上でアミノ酸のハイドロパシック・インデックスの重要性は、当分野において一般に理解されている（KyteおよびDoolittle、1982、参照として本明細書に組み込む）。アミノ酸の相対ハイドロパシー特性が、得られるタンパク質の二次構造に寄与し、次に、この二次構造が、他の分子、例えば、酵素、基質、受容体、DNA、抗体、抗原などと当該タンパク質の相互作用を規定することが認められている。各アミノ酸には、疎水性および電荷特性に基づいて、ハイドロパシック・インデックスが与えられている（KyteおよびDoolittle、1982）。これらの値は、以下の通りである：イソロイシン（+4.5）；バリン（+4.2）；ロイシン（+3.8）；フェニルアラニン（+2.8）；システイン／シスチン（+2.5）；メチオニン（+1.9）；アラニン（+1.8）；グリシン（-0.4）；トレオニン（-0.7）；セリン（-0.8）；トリプトファン（-0.9）；チロシン（-1.3）；プロリン（-1.6）；ヒスチジン（-3.2）；グルタミン酸（-3.5）；グルタミン（-3.5）；アスパラギン酸（-3.5）；アスパラギン（-3.5）；リシン（-3.9）；およびアルギニン（-4.5）。
【０２９１】
類似したハイドロパシック・インデックスまたはスコアを有する別のアミノ酸で、特定のアミノ酸を置換することができ、類似した生物活性を備えたタンパク質が依然として得られる、すなわち、生物学的な機能が同等のタンパク質が得られることは、当分野で公知である。このような変更を実施する上で、ハイドロパシック・インデックスが±2以内にあるアミノ酸の置換が好ましく、±1以内のアミノ酸が特に好ましく、さらには±0.5以内のアミノ酸がより好ましい。また、当分野では、類似アミノ酸の置換は、親水性に基づいて有効に実施できることもわっかっている。
【０２９２】
米国特許第4,554,101号に詳述されているように、以下の親水性値がアミノ酸残基に与えられている：アルギニン（+3.0）；リシン（+3.0）；アスパラギン酸（+3.0±1）；グルタミン酸（+3.0±1）；セリン（+3.0）；アスパラギン（+2.0）；グルタミン（+2.0）；グリシン（0）；トレオニン（-0.4）；プロリン（-0.5±1）；アラニン（-0.5）；ヒスチジン（-0.5）；システイン（-1.0）；メチオニン（-1.3）；バリン（-1.5）；ロイシン（-1.8）；イソロイシン（-1.8）；チロシン（-2.3）；フェニルアラニン（-2.5）；トリプトファン（-3.4）。類似した親水性値を有する別のアミノ酸でアミノ酸を置換することができ、生物学的に同等のタンパク質、特に、免疫学的に同等のタンパク質が依然として得られることが理解されている。このような変更に関して、親水性値が±2以内にあるアミノ酸の置換が好ましく、±1以内のアミノ酸が特に好ましく、さらには±0.5以内のアミノ酸がより好ましい。
【０２９３】
以上概説したように、アミノ酸置換は、一般に、アミノ酸側鎖置換基の相対類似性、例えば、それらの疎水性、親水性、電荷、サイズなどに基づいて行なう。以上の様々な特性を考慮に入れた置換例は当業者に周知であり、その例を以下に挙げる：アルギニンとリシン；グルタミン酸とアスパラギン酸；セリンとトレオニン；グルタミンとアスパラギン；ならびに、バリン、ロイシンおよびイソロイシン。
【０２９４】
加えて、任意のポリヌクレオチドをさらに改変することにより、in vivoでの安定性を高めることもできる。考えられる改変として、限定するものではないが、以下のものが挙げられる：5'および／または3'末端でのフランキング配列の付加；骨格における、ホスホジエステラーゼ結合ではなく、ホスホロチオエートまたは2'O-メチルの使用；および/またはイノシン、ケオシン(queosine)およびワイブトシンのような非伝統的塩基、ならびに、アデニン、シチジン、グアニン、チミンおよびウリジンのアセチル−、メチル−、チオ−およびその他の改変形態の含有。
【０２９５】
アミノ酸置換は、さらに、残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性、および／または両親媒性の類似性に基づいて行なってもよい。例えば、負荷電アミノ酸として、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられ；正荷電アミノ酸として、リシンおよびアルギンが挙げられ；類似した親水性値を有する非荷電極性頭部基を有するアミノ酸としては、ロイシン、イソロイシンおよびバリン；グリシンおよびアラニン；アスパラギンおよびグルタミン；ならびに、セリン、トレオニン、フェニルアラニンおよびチロシンが挙げられる。保存的改変を呈しうる別のアミノ酸群として、（1）ala、pro、gly、glu、asp、gln、asn、ser、thr；（2）cys、ser、tyr、thr；（3）val、ile、leu、met、ala、phe；（4）lys、arg、his；および（5）phe、tyr、trp、hisが挙げられる。変異体はまた（もしくは、これに代わり）、非保存的変更を含んでもよい。好ましい実施形態では、変異型ポリペプチドは、5個以下のアミノ酸の置換、欠失または付加により、天然の配列とは異なる。変異体はまた（もしくは、これに代わり）、例えば、当該ポリペプチドの免疫原性、二次構造およびハイドロパシー性に最小の影響しかもたらさないアミノ酸の欠失または付加により、改変してもよい。
【０２９６】
前記のように、ポリペプチドは、タンパク質のN末端にシグナル（またはリーダー）配列を含んでいてもよく、この配列は、翻訳と同時に、または翻訳後にタンパク質の輸送を指令する。このポリペプチドは、ポリペプチドの合成、精製または識別を容易にするため（例えば、poly-His）、または固体支持体へのポリペプチドの結合を増強するために、リンカーもしくはその他の配列とコンジュゲートさせてもよい。例えば、ポリペプチドは、免疫グロブリンFc領域とコンジュゲートさせることができる。
【０２９７】
ポリペプチド配列を比較する際、以下に記載するように、一致度が最大となるようにアラインメントしたとき、2つの配列におけるアミノ酸の配列が同じであれば、両配列は「同一」であるという。2つの配列の比較は、一般に、比較窓にわたって両配列を比較して、配列類似性の局所的領域を同定および比較することにより実施する。本明細書で用いる「比較窓」とは、少なくとも約20の連続した位置（通常、30〜約75、40〜約50）からなるセグメントであり、このセグメント内で、1配列と、同数の連続位置からなる参照配列を最適にアラインメントした後、両者を比較することができる。
【０２９８】
比較のための配列の最適なアラインメントは、Lansergeneのバイオインフォマテックスソフトウェアセット（DNASTAR, Inc.、ウィスコンシン州マディソン）中のMegalignプログラムをデフォルトパラメーターを用いて実施することができる。このプログラムは、以下の参考文献に記載されるいくつかのアラインメントスキームを実施する：Dayhoff, M.O. (1978) A model of evolutionary change in proteins - Matrices for detecting distant relationships. In Dayhoff, M.O. (版) Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, ワシントンDC、第5巻、Suppl. 3, pp. 345-358；Hein J. (1990) Unified Approach to Alignment and Phylogenes pp. 626-645 Methods in Enzymology、第183巻、 Academic Press, Inc., カリフォルニア州サンディエゴ；Higgins, D.G.およびSharp, P.M. (1989) CABIOS 5:151-153；Myers, E.W.およびMuller W. (1988) CABIOS 4:11-17；Robinson, E.D. (1971) Comb. Theor 11:105；Santou, N. Nes, M. (1987) Mol. Biol. Evol. 4:406-425；Sneath, P.H.A.およびSokal, R.R. (1973) Numerical Taxonomy - the Principles and Practice of Numerical Taxonomy, Freeman Press, カリフォルニア州サンフランシスコ；Wilbur, W.J.およびLipman, D.J. (1983) Proc. Nat’l Acad., Sci. USA 80:726-730。
【０２９９】
あるいは、比較のための最適な配列アラインメントは、以下：SmithおよびWaterman（1981）Add. APL. Math 2:482の局所同一性アルゴリズム、NeedlemanおよびWunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443の同一性アラインメントアルゴリズム、PearsonおよびLipman（1988）Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 85: 2444の類似性検索方法、これらアルゴリズムのコンピューターによる実施（Wisconsin Genetics Software PackageのGAP、BESTFIT、BLAST、FASTA、およびTFASTA；Genetics Computer Group (GCG)、575 Science Dr.、ウィスコンシン州マディソン）、または閲覧により実施することもできる。
【０３００】
配列同一性％および配列類似性％を決定するのに好適なアルゴリズムの好ましい例は、BLASTおよびBLAST 2.0アルゴリズム（それぞれ、Altschulら、(1977) Nucl. Acids Res. 25:3389-3402およびAltschulら、(1990) J. Mol. Biol. 215:403-410に記載されている）である。例えば、本明細書に記載のパラメーターと共に、BLASTおよびBLAST 2.0を用いて、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの配列同一性％を決定することができる。BLAST分析を実施するソフトウェアは、国立生物工学情報センター（National Center for Biotechnology Information）から一般に入手可能である。アミノ酸配列の場合、スコアリングマトリックスを用いて、累積スコアを計算することができる。各方向におけるワードヒットの伸長は以下の場合に停止する：累積アラインメントスコアが、その最大達成値からX量低下する；1以上のマイナススコア残基アラインメントの累積により、累積スコアが0以下になる；またはいずれか一方の配列の末端に達する。BLASTアルゴリズムパラメーターW、TおよびXは、アラインメントの感度および速度を決定する。
【０３０１】
1つの好ましい手法では、「配列同一性の割合（％）」は、少なくとも20位置からなる比較窓にわたって、2つの最適にアラインメントされた配列を比較することにより決定され、その際、比較窓内のポリペプチド配列の部分は、2配列の最適アラインメントのための参照配列（付加または欠失を含まない）と比較して、20％以下、通常5〜15％、もしくは10〜12％の付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含みうる。この割合は、両配列に同一アミノ酸残基が存在する位置の数を決定して、一致した位置の数を取得し、一致した位置の数を参照配列内の位置の総数（すなわち、窓のサイズ）で割った後、その商に100を掛けて、配列同一性％を得ることにより、計算する。
【０３０２】
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、結核菌融合ポリペプチド、および融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが提供される。融合ポリペプチドおよび融合タンパク質は、直接またはアミノ酸リンカーを介して共有結合した、少なくとも2種の異種マイコバクテリウム種ポリペプチド、例えば、結核菌ポリペプチドを有するポリペプチドを意味する。融合タンパク質を形成するポリペプチドは、一般に、C末端−N末端結合であるが、C末端−C末端、N末端−N末端、もしくはN末端−C末端結合であってもよい。融合タンパク質のポリペプチドはどの順序であってもよい。融合ポリペプチドまたは融合タンパク質はまた、融合タンパク質を構成する抗原の保存的に改変された変異体、多形変異体、対立遺伝子、突然変異体、部分配列、種間ホモログ、および免疫原性断片を含むことができる。結核菌抗原については、Coleら、Nature 393:537 (1998)に記載されており、そこには、全結核菌ゲノムが開示されている。結核菌抗原に対応する他のマイコバクテリウム種からの抗原は、例えば、本明細書に記載のような配列比較アルゴリズム、または当業者には公知の他の方法、例えば、ハイブリダイゼーションアッセイおよび抗体結合アッセイを用いて、同定することができる。
【０３０３】
本発明の融合ポリペプチドは、一般に、本明細書に記載のように、少なくとも2つの抗原ポリペプチドを含み、さらに、別の非関連配列、例えば、Tヘルパーエピトープ、好ましくはヒトにより認識されるTヘルパーエピトープの賦与を補助する配列（免疫学的融合パートナー）、または天然の組換えタンパク質より高い収率で、タンパク質の発現を助ける配列（発現エンハンサー）などを含んでもよい。いくつかの好ましい融合パートナーは、免疫学的および発現増強融合パートナーの両方である。タンパク質の溶解性を高めるために、またはタンパク質が所望の細胞内区画を標的化することができるように、その他の融合パートナーを選択してもよい。さらに別の融合パートナーとして、タンパク質の精製を容易にするアフィニティータグが挙げられる。
【０３０４】
融合タンパク質は、一般に、標準的技術を用いて作製することができる。好ましくは、組換えタンパク質として融合タンパク質を発現させる。例えば、所望の融合物のポリペプチド成分をコードするDNA配列を個別にアセンブルし、適切な発現ベクターに連結させてもよい。配列のリーディングフレームがフレーム内に存在するように、1つのポリペプチド成分をコードするDNA配列の3'末端を、ペプチドリンカーを用いて、または用いずに、第2のポリペプチド成分をコードするDNA配列の5'末端に連結する。これにより、両成分ポリペプチドの生物活性を保持する単一融合タンパク質への翻訳が可能になる。
【０３０５】
所望であれば、ペプチドリンカー配列を用いて、各ポリペプチドがその二次および三次構造に確実にフォールディングするのに十分な間隔で、第1および第2ポリペプチド成分を隔てることもできる。当分野で周知の標準的技術を用いて、上記のようなペプチドリンカー配列を融合タンパク質に組み込む。いくつかのペプチドリンカー配列は、以下の要素に基づき選択してもよい：（1）フレキシブルな伸長コンホメーションを採る能力；（2）第1および第2ポリペプチド上の機能性エピトープと相互作用が可能な二次構造を採る能力；および（3）ポリペプチド機能性エピトープと反応しうる疎水性または荷電残基の欠如。好ましいペプチドリンカー配列は、Gly、AsnおよびSer残基を含む。また、他の中性に近いアミノ酸、例えば、ThrおよびAlaをリンカー配列に用いてもよい。リンカーとして有用に用いることができるアミノ酸配列として、以下の文献に開示されたものが挙げられる：Marateaら、Gene 40:39 46 (1985); Murphyら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:8258 8262 (1986)；米国特許第4,935,233号および米国特許第4,751,180号。リンカー配列は、一般に、長さ1〜約50アミノ酸でよい。第1および第2ポリペプチドが、機能性ドメインの分離および立体干渉の防止に用いることができる非必須N末端アミノ酸領域を有する場合には、リンカー配列は必要とされない。
【０３０６】
連結DNA配列は、好適な転写または翻訳調節エレメントに機能的に連結される。DNAの発現に関与する調節エレメントは、第1ポリペプチドをコードするDNA配列の5'側にのみ位置する。同様に、翻訳を停止するのに必要な停止コドン、および転写終結シグナルは、第2ポリペプチドをコードするDNA配列の3'側にのみ存在する。
【０３０７】
好ましい実施形態では、本発明の融合ポリペプチドで用いるための免疫学的融合パートナーは、プロテインD、すなわち、グラム陰性細菌B型インフルエンザ菌の表面タンパク質（WO 91/18926）に由来する。好ましくは、プロテインD誘導体は、該タンパク質の約1/3（例えば、最初のN末端100〜110アミノ酸）を含み、プロテインD誘導体に脂質化してもよい。いくつかの好ましい実施形態では、リポプロテインD融合パートナーの最初の109残基をN末端に含有させることにより、別の外来T細胞エピトープを有するポリペプチドが提供され、また、大腸菌における発現レベルが増大する（従って、発現エンハンサーとして機能する）。脂質テイルにより、抗原提示細胞への抗原の最適な提示が確実になる。他の融合パートナーとして、インフルエンザウイルス、NS1（血球凝集素）が挙げられる。典型的には、N末端81アミノ酸を用いるが、Tヘルパーエピトープを含む別のフラグメントを用いてもよい。
【０３０８】
別の実施形態において、免疫学的融合パートナーは、LYTAとして知られるタンパク質由来のアミノ酸配列、またはその一部（好ましくは、C末端部分）を含む。LYTAは、肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）に由来し、これは、アミダーゼLYTA（LytA遺伝子によりコードされる；Gene 43:265〜292（1986））として知られるN-アセチル-L-アラニンアミダーゼを合成する。LYTAは、ペプチドグリカン骨格における特定の結合を特異的に分解する自己消化酵素である。LYTAタンパク質のC末端ドメインは、コリンまたはいくつかのコリン類似体（例えば、DEAE）に対する親和性に関与している。この特性は、融合タンパク質の発現に有用な大腸菌C-LYTA発現プラスミドの開発に利用されている。アミノ酸末端にC-LYTA断片を含むハイブリッドタンパク質の精製が記載されている（Biotechnolody 10: 795-798（1992）参照）。好ましい実施形態では、LYTAの反復部分を融合タンパク質に組み込んでもよい。反復部分は残基178から出発するC末端領域に存在する。特に好ましい反復部分は、残基188〜305を含む。
【０３０９】
一般に、ポリペプチドおよび融合ポリペプチド（さらには、そのコードポリヌクレオチド）を単離する。「単離された」ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、その本来の環境から取り出されたものである。例えば、天然に存在するタンパク質は、天然系における共存在物質の一部または全部から分離されていれば、単離されたことになる。好ましくは、このようなポリペプチドは、少なくとも純度約90％、さらに好ましくは少なくとも純度約95％、さらに好ましくは少なくとも純度約99％である。ポリヌクレオチドは、例えば、自然環境に属さないベクターにクローニングされた場合、単離されたとみなす。
【０３１０】
B．ポリヌクレオチド組成物
本発明はまた、単離されたポリヌクレオチド、特に、本発明の融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならびにこのようなポリヌクレオチドを含む組成物も提供する。本明細書で用いる用語「DNA」および「ポリヌクレオチド」および「核酸」とは、特定の種の全ゲノムDNAから単離されたDNA分子を意味する。従って、ポリペプチドをコードするDNAセグメントは、1以上のコーディング配列を含み、しかも、該DNAセグメントが由来する種の全ゲノムDNAから実質的に単離された、または該DNAから精製されたDNAセグメントを指す。用語「DNAセグメント」および「ポリヌクレオチド」には、DNAセグメント、およびこのようなセグメントのさらに小さい断片、ならびに、組換えベクター、例えば、プラスミド、コスミド、ファージミド、ファージ、ウイルスなども含まれる。
【０３１１】
当業者には理解されるように、本発明のポリヌクレオチド配列は、タンパク質、ポリペプチド、ペプチドなどを発現する、または発現するように適合することができるゲノム配列、ゲノム外配列およびプラスミドコード化配列、ならびに、より小さな操作遺伝子セグメントなどを含むことができる。このようなセグメントは、自然に単離されたものでもよいし、合成により人為的に改変されたものでもよい。
【０３１２】
当業者には認識されるように、ポリヌクレオチドは、一本鎖（コーディングもしくはアンチセンス）または二本鎖のいずれでもよく、DNA（ゲノム、cDNAもしくは合成）またはRNA分子のいずれでもよい。さらに別のコーディングまたは非コーディング配列が本発明のポリヌクレオチド内に存在してもよいが、その必要があるわけではない。また、ポリヌクレオチドを他の分子および／または支持材料に連結させてもよいが、その必要があるわけではない。
【０３１３】
ポリヌクレオチドは、天然の配列（すなわち、マイコバクテリウム抗原をコードする内因性配列、またはその一部）を含んでもよいし、このような配列の変異体、または生物学的もしくは抗原機能的同等物を含んでもよい。ポリヌクレオチド変異体は、以下にさらに詳述するように、好ましくは、天然のタンパク質と比較して、コードポリペプチドの免疫原性が低減しないような1以上の置換、付加、欠失および／または挿入を含んでもよい。コードポリペプチドの免疫原性への影響は、一般に、本明細書に記載のように評価することができる。用語「変異体」はまた、異種起源の相同遺伝子も包含する。
【０３１４】
別の実施形態では、本発明は、本明細書に開示した1以上の配列と同一の、またはこれに相補的な配列の様々な長さの連続したストレッチを含む、単離されたポリヌクレオチドを提供する。例えば、本発明により、本明細書に開示した1以上の配列の少なくとも約15、20、30、40、50、75、100、150、200、300、400、500、または1,000もしくはそれ以上、ならびにこれらの間のあらゆる中間長、の連続したヌクレオチドを含むポリヌクレオチドが提供される。この関連で、「中間長」とは、記載した値の間の任意の長さ、例えば、16、17、18、19など；21、22、23など；30、31、32など；50、51、52、53など；100、101、102、103など；150、151、152、153などを意味し、200、500；500、1,000などまでの全ての整数を含むものと容易に理解されよう。
【０３１５】
本発明のポリヌクレオチド、またはその断片は、コーディング配列自体の長さとは関係なく、他のDNA配列、例えば、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、追加の制限酵素部位、マルチプルクローニングサイト、他のコーディングセグメントなどと組み合わせて、その長さ全体をかなり変化させることができる。従って、ほぼあらゆる長さのポリヌクレオチド断片を使用しうると考えられ、その合計長さは、調製のしやすさ、および意図する組換えDNAプロトコルでの使用に応じて制限するのが好ましい。
【０３１６】
さらに、遺伝子コードの縮重により、本明細書に記載のポリペプチドをコードする多数のヌクレオチド配列が存在することは、当業者には理解されよう。これらのポリヌクレオチドのいくつかは、あらゆる天然遺伝子のヌクレオチド配列に対して最小の相同性を有している。それでも、コドン使用頻度の相違により変動するポリヌクレオチド、例えば、ヒトおよび／または霊長類コドン選択のために最適化されたポリヌクレオチドが本発明により特に考慮される。さらに、本明細書に記載するポリヌクレオチド配列を含む遺伝子の対立遺伝子も本発明の範囲に含まれる。対立遺伝子は、1以上の突然変異、例えば、ヌクレオチドの欠失、付加、および／または置換の結果、改変された内在性遺伝子である。こうして得られたmRNAおよびタンパク質は、改変された構造または機能を有してもよいが、その必要があるわけではない。対立遺伝子は、標準的技術（例えば、ハイブリダイゼーション、増幅、および／またはデータベース配列比較）を用いて、同定することができる。
【０３１７】
マイコバクテリウムポリヌクレオチドおよびその融合物は、当分野で公知の十分に確立され、かつ利用可能な技術のいずれかを用いて、作製し、操作しおよび／または発現させることができる。
【０３１８】
例えば、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列もしくはその断片、またはその融合タンパク質もしくは機能的同等物を、組換えDNA分子中で用いて、適切な宿主細胞におけるポリペプチドの発現を指令することも可能である。遺伝子コードの固有の縮重により、実質的に同じ、または機能的に同等のアミノ酸配列をコードする他のDNA配列が生産されることがあるが、これらの配列を用いて、所与のポリペプチドをクローニングし、発現させてもよい。
【０３１９】
当業者には理解されるように、いくつかの例では、非天然のコドンを有するポリペプチドコードヌクレオチド配列を生産するのが有利な場合もある。例えば、特定の原核または真核宿主が指向するコドンを選択して、タンパク質発現の速度を高める、または所望の特性（例えば、天然に存在する配列から生じた転写産物より、半減期が長いなど）を有する組換えRNA転写産物を生産することができる。
【０３２０】
さらに、様々な理由でポリペプチドコード配列を改変するために、当分野で公知の方法を用いて、本発明のポリヌクレオチド配列を操作することができ、このようなものとして、限定するものではないが、遺伝子産物のクローニング、プロセシング、発現および／または免疫原性を改変する変更が挙げられる。
【０３２１】
所望のポリペプチドを発現させるために、該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、またはその機能的同等物を、適切な発現ベクター、すなわち、挿入されたコーディング配列の転写および翻訳に必要なエレメントを含むベクターに挿入してもよい。当業者には周知の方法を用いて、目的のポリペプチドをコードする配列と、適切な転写および翻訳制御エレメントとを含む発現ベクターを構築することができる。このような方法として、in vitro組換えDNA技術、合成技術、およびin vivo遺伝子組換えなどが挙げられる。このような技術は、Sambrookら、Molecular Cloning, A Laboratory Manual (1989)、およびAusubelら、Current Protocols in Molecular Biology (1989)に記載されている。
【０３２２】
様々な発現ベクター／宿主系が知られており、これらを用いて、ポリヌクレオチド配列を含有および発現させてもよい。そのような系として、限定するものではないが、微生物、例えば、組換えバクテリオファージ、プラスミド、もしくはコスミドDNA発現ベクターで形質転換した細菌；酵母発現ベクターで形質転換した酵母；ウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染させた昆虫細胞系；ウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、CaMV；タバコモザイクウイルス、TMV）または細菌発現ベクター（例えば、TiもしくはpBR322プラスミド）で形質転換した植物細胞系；または動物細胞系が挙げられる。
【０３２３】
発現ベクターに存在する「制御エレメント」または「調節配列」は、宿主細胞タンパク質と相互作用して、転写および翻訳を実施するために宿主細胞タンパク質と相互作用するベクターの非翻訳領域（エンハンサー、プロモーター、5'および3'非翻訳領域）である。このようなエレメントは、その強度および特異性が変わることがある。使用するベクター系および宿主に応じて、好適な転写および翻訳エレメント（構成性および誘導性プロモーターなど）をいくつ用いてもよい。例えば、細菌系にクローニングする場合には、PBLUESCRIPTファージミド（Stratagene、カリフォルニア州ラホーヤ）またはPSPORT1プラスミド（Gibco BRL、メリーランド州ゲイザーズバーグ）などのハイブリッドlacZプロモーターのような誘導性プロモーターを用いることができる。哺乳動物細胞系においては、哺乳動物遺伝子または哺乳動物ウイルス由来のプロモーターが一般に好ましい。ポリペプチドをコードする配列の多コピーを含む細胞系を作製する必要がある場合には、SV40またはEBVをベースとするベクターを適切な選択マーカーと一緒に用いるのが有利でありうる。
【０３２４】
細菌系においては、発現させるポリペプチドについて意図する用途に応じて、多数の発現ベクターを選択することができる。例えば、大量に必要であれば、精製が容易な融合タンパク質の高レベルの発現を指令するベクターを用いればよい。このようなベクターとして、限定するものではないが、以下のものが挙げられる：多機能性大腸菌クローニングおよび発現ベクター、例えば、BLUESCRIPT（Stratagene）、この場合、ハイブリッドタンパク質が生産されるように、-ガラクトシダーゼのアミノ末端Met、およびこれに続く７残基の配列とインフレームで、目的のポリペプチドをコードする配列を該ベクターと連結することができる；pINベクター（Van Heeke & Schuster, J. Biol. Chem. 264:5503 5509 (1989)）など。また、pGEXベクター（Promega,ウィスコンシン州マディソン）を用いて、グルタチオンS-トランスフェラーゼ（GST）との融合タンパク質として外来ポリペプチドを発現させることもできる。一般に、このような融合タンパク質は可溶性であり、グルタチオン−アガロースビーズに吸着させた後、遊離グルタチオンの存在下で溶離することにより、溶解細胞から容易に精製することができる。このような系で作製したタンパク質は、随意に目的のクローニングポリペプチドをGST部分から放出することができるように、ヘパリン、トロンビン、またはXA因子プロテアーゼ切断部位を含むように設計してもよい。
【０３２５】
酵母、すなわち、ビール酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)の場合、α因子、アルコールオキシダーゼ、およびPGHのような構成性または誘導性プロモーターを含む多数のベクターを用いることができる。概要については、Ausubelら、（前掲）およびGrantら、Methods Enzymol. 153:516-544 (1987)を参照。
【０３２６】
植物発現ベクターを用いる場合には、ポリペプチドをコードする配列の発現は、多数のプロモーターのいずれかにより駆動することができる。例えば、CaMVの35Sおよび19Sプロモーターのようなウイルスプロモーターを単独で、またはTMV由来のオメガリーダー配列と組み合わせて用いてもよい（Takamatsu, EMBO J. 6:307-311 (1987)）。あるいは、RUBISCOの小サブユニットまたは熱ショックプロモーターなどの植物プロモーターを用いてもよい（Coruzziら、EMBO J. 3:1671-1680 (1984)；Broglieら、Science 224:838-843 (1984)；およびWinterら、Results Probl. Cell Differ. 17:85-105 (1991)）。これらの構築物は、直接DNA形質転換または病原体媒介トランスフェクションにより、植物細胞に導入することができる。このような技術は、一般に公開されている多数の論文に記載されている（例えば、Hobbs in McGraw Hill, Yearbook of Science and Technology, pp. 191-196 (1992)参照）。
【０３２７】
また、昆虫系を用いて、目的のポリペプチドを発現することも可能である。例えば、このような系の1つでは、オートグラファ・カリフォルニカ(Autographa californica)核多角体病ウイルス（AcNPV）をベクターとして用いて、ヨトウガ(Spodoptera frugiperda)細胞またはイラクサギンウワバ(Trichoplusia)幼虫において外来遺伝子を発現させる。ポリペプチドをコードする配列をウイルスの非必須領域（例えば、ポリヘドリン遺伝子）にクローニングして、ポリヘドリンプロモーターの制御下に置くこともできる。ポリペプチドコード配列をうまく挿入できれば、ポリヘドリン遺伝子を不活性にし、被覆タンパク質が欠失した組換えウイルスを作製することができる。次に、組換えウイルスを用いて、例えば、ヨトウガ細胞またはイラクサギンウワバ幼虫を感染させ、そこで、目的のポリペプチドを発現させることができる（Engelhardら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91:3224-3227 (1994)）。
【０３２８】
哺乳動物宿主細胞では、多数のウイルスベースの発現系が一般に利用可能である。例えば、発現ベクターとしてアデノウイルスを用いる場合には、目的のポリペプチドをコードする配列を、後期プロモーターと三分節リーダー配列とからなるアデノウイルス転写／翻訳複合体に連結させてもよい。ウイルスゲノムの非必須E1またはE3領域への挿入を用いて、感染宿主細胞にポリペプチドを発現させることができる生存ウイルスを取得することができる（LoganおよびShenk, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81:3655-3659 (1984)）。加えて、転写エンハンサー、例えば、ラウス肉腫ウイルス（RSV）エンハンサーを用いて、哺乳動物宿主細胞における発現を増大させることも可能である。
【０３２９】
また、特定の開始シグナルを用いて、目的のポリペプチドをコードする配列のさらに効率的な翻訳を達成することもできる。このようなシグナルとして、ATG開始コドンおよび隣接配列が挙げられる。ポリペプチドをコードする配列、その開始コドン、ならびに上流配列を適切な発現ベクターに導入する場合には、追加の転写または翻訳制御シグナルは必要ないであろう。しかし、コーディング配列、またはその一部のみを挿入する場合には、ATG開始コドンを含む外来の翻訳制御シグナルを供給しなければならない。さらに、開始コドンは、全挿入断片の翻訳を確実にするように、正しいリーディングフレーム内に存在しなければならない。外来の翻訳エレメントおよび開始コドンは、天然および合成の多様な供給源に由来するものでよい。用いた具体的細胞系に適切なエンハンサーを含有させることにより、発現の効率を増強することも可能であり、このようなエンハンサーは、文献に記載されている（Scharf.ら、Results Probl. Cell Differ. 20:125-162 (1994)）。
【０３３０】
加えて、挿入した配列の発現をモジュレートする能力、または発現したタンパク質を所望の様式でプロセシングする能力について、宿主細胞株を選択してもよい。ポリペプチドのこのような改変として、限定するものではないが、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化、およびアシル化が挙げられる。また、タンパク質の「プレプロ」形態を切断する翻訳後プロセシングを用いて、正しい挿入、フォールディングおよび／または機能を促進することもできる。このような翻訳後活性のための特定の細胞分子機械的および特徴的メカニズムを有する様々な宿主細胞（例えば、CHO、HeLa、MDCK、HEK293、およびW138など）を選択して、外来タンパク質の正しい改変およびプロセシングを確実にすることも可能である。
【０３３１】
組換えタンパク質の長期かつ高収率生産のためには、一般に、安定した発現が好ましい。例えば、目的のポリペプチドを安定して発現する細胞系を、発現ベクターを用いて形質転換することができるが、その際、上記発現ベクターは、ウイルスの複製起原および／または内在性発現エレメントおよび選択マーカー遺伝子を同じまたは別のベクターに含有してもよい。ベクターの導入に続き、富化培地において細胞を1〜2日増殖させた後、細胞を選択培地に移すことができる。選択マーカーの目的は、選択に対する耐性を賦与することであり、その存在により、導入された配列をうまく発現する細胞の増殖および回収が可能になる。安定に形質転換された細胞の耐性クローンは、細胞型に適した組織培養技術を用いて増殖することができる。
【０３３２】
形質転換細胞系を回収するために、選択系をいくつ用いてもよい。このような選択系として、限定するものではないが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Wiglerら、Cell 11: 223-232 (1977)）およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Lowyら、Cell 22: 817-823 (1990)）遺伝子が挙げられ、これらは、それぞれtk-またはaprt-細胞で使用することができる。また、以下の代謝拮抗物質、抗生物質もしくは除草剤耐性を選択の基準として用いることもできる：例えば、メトトレキセートに対する耐性を賦与するdhfr（Wiglerら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77:3567-70 (1980)）; アミノグリコシド、ネオマイシンおよびG-418に対する耐性を賦与するnpt（Colbere-Garapinら、J. Mol. Biol. 150:1-14 (1981)）；ならびに、クロルスルフロンおよびホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼに対する耐性をそれぞれ賦与するalsまたはpat（Murry、前掲）。これ以外の選択遺伝子も記載されており、例えば、細胞がトリプトファンの代わりにインドールを使用できるようにするtrpB、または細胞がヒスチジンの変わりにヒスチノールを使用できるようにするhisDがある（HartmanおよびMulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:8047-51 (1988)）。可視マーカーの使用が人気を得ており、例えば、アントシアニン、βグルクロニダーゼおよびその基質GUS、ならびに、ルシフェラーゼおよびその基質ルシフェリンなどが、形質転換体の同定だけではなく、特定のベクター系に起因しうる一過性または安定タンパク質発現の量を定量する目的で、広く用いられている（Rhodesら、Methods Mol. Biol. 55:121-131 (1995)）。
【０３３３】
ポリヌクレオチドによりコードされた産物の発現を、該産物に特異的なポリクローナルまたはモノクローナル抗体のいずれかを用いて検出および測定する様々なプロトコルが当分野で知られている。そのような例として、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ELISA）、放射免疫アッセイ（RIA）、および蛍光活性化セルソーティング（FACS）が挙げられる。上記およびその他のアッセイは、特に、Hamptonら、Serological Methods, a Laboratory Manual (1990)およびMaddoxら、J. Exp. Med. 158:1211-1216 (1983)に記載されている。
【０３３４】
当業者には、多種多様な標識およびコンジュゲーション技術が知られており、これらを様々な核酸およびアミノ酸アッセイで用いることができる。ポリヌクレオチドに関連する配列を検出するための標識化ハイブリダイゼーションまたはPCRプローブを生産する手段として、オリゴ標識、ニック翻訳、末端標識、または標識ヌクレオチドを用いたPCR増幅が挙げられる。あるいは、配列もしくはその任意の部分をmRNAプローブ生産用のベクターにクローニングしてもよい。このようなベクターは当分野において周知であり、市販されているが、これらを用いて、適切なRNAポリメラーゼ（例えば、T7、T3、もしくはSP6）および標識ヌクレオチドの添加により、in vitroでRNAプローブを合成することができる。これらの手順は、様々な市販のキットを用いて実施してもよい。用いることができる好適なリポーター分子または標識として、放射性核種、酵素、蛍光、化学発光もしくは色原体物質、ならびに、基質、補因子、阻害剤、磁気粒子などが挙げられる。
【０３３５】
細胞培養物からのタンパク質の発現および回収に好適な条件下で、目的のポリヌクレオチド配列で形質転換した宿主細胞を培養することができる。組換え細胞が産生するタンパク質は、用いた配列および／またはベクターに応じて分泌されるか、細胞内に含有されうる。当業者には理解されるように、本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、原核または真核細胞膜を介したコードポリペプチドの分泌を指示するシグナル配列を含有するように設計してもよい。別の組換え構築物を用いて、目的のポリペプチドをコードする配列を、可溶性タンパク質の精製を容易にするポリペプチドドメインをコードするヌクレオチド配列と結合させることもできる。
【０３３６】
組換え生産方法に加えて、固相技術を用いた直接ペプチド合成（(Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154 (1963))）により、本発明のポリペプチド、およびその断片を生産してもよい。手動の技術を用いて、または自動化により、タンパク質合成を実施することもできる。自動化合成は、例えば、Applied Biosystems 431A Peptide Synthesizer（Perkin Elmer）を用いて、達成することができる。これに代わり、様々な断片を化学的に個別に合成し、化学的方法を用いて、これらを結合させることにより、全長分子を生産することも可能である。
【０３３７】
C．医薬およびワクチン組成物
別の態様では、本発明は、細胞または動物に対して、単独で、または1以上の他の治療法と組み合わせて投与するための、製薬上に許容される、または生理学的に許容される溶液中の、本明細書に開示した1種以上のポリヌクレオチド、ポリペプチドもしくはその他の組成物からなる製剤に関する。このような医薬組成物は、好適な免疫刺激剤／アジュバント系と一緒に製剤化すれば、ワクチンとして使用するのに特に好ましい。本組成物はまた、診断に関する用途にも好適である。
【０３３８】
また、所望であれば、他の薬剤、例えば、他のタンパク質もしくはポリペプチドまたは様々な薬学的に活性な薬剤と組み合わせて、本発明の組成物を投与してもよいことは理解されよう。追加の薬剤が、本発明の目的に顕著な悪影響を引き起こすものではない限り、含有させてもよい他の成分について、実質的に制限はない。
【０３３９】
いくつかの好ましい実施形態において、本発明の組成物をワクチンとして使用し、1以上の免疫刺激剤と組み合わせて製剤化する。免疫刺激剤は、外来抗原に対する免疫応答（抗体および／または細胞性）を増強または強化する任意の物質でよい。免疫刺激剤の例として、アジュバント、生分解性ミクロスフィア（例えば、ポリ乳酸ガラクチド）およびリポソーム（これに、化合物を組み込む；例えば、Fullerton、米国特許第4,235,877号参照）が挙げられる。ワクチン製剤は、一般に、例えば、PowellおよびNewman編、Vaccine Design（the subunit and adjubant approach）（1995）に記載されている。
【０３４０】
様々な免疫刺激剤のいずれを本発明のワクチンに用いてもよい。例えば、アジュバントを含有させてもよい。多くのアジュバントは、急速な異化から抗原を保護するように設計された物質であり、例として、水酸化アルミニウムまたは鉱油、ならびに、免疫応答の刺激剤、例えば、リピドA（天然または合成）、百日咳菌(Bortadella pertussis)、またはマイコバクテリウム種、もしくはマイコバクテリウム由来のタンパク質などが挙げられる。好適なアジュバントは、市販されており、例えば、以下のものが挙げられる：フロイント不完全アジュバントおよび完全アジュバント（Difco Laboratories、ミシガン州デトロイト）；Merck Adjuvant 65（Merck and Company, Inc.、ニュージャージー州ラーウェイ）；AS-2およびその誘導体（SmithKline Beecham、ペンシルバニア州）；CWS、TDM、Leif、アルミニウム塩、例えば、水酸化アルミニウム（alum）またはリン酸アルミニウム；カルシウム、鉄もしくは亜鉛の塩；アシル化チロシンの不溶性懸濁液；アシル化糖；カチオンまたはアニオンにより誘導体化した多糖；ポリホスファゼン；生分解性ミクロスフィア；モノホスホリルリピドAおよびクイルA。また、サイトカイン、例えば、GM-CSFまたはインターロイキン-2、-7、もしくは-12もアジュバントとして用いることができる。
【０３４１】
いくつかの好ましい実施形態では、本発明で用いるアジュバントは、米国特許出願番号11/862,122（その開示内容はすべて、参照として本明細書に組み込む）に記載のように、グルコピラノシルリピドA（GLA）アジュバントである。例えば、いくつかの興味深いGLA化合物は、以下の式により表される：
【化１】
2014058520.tif 000004
【０３４２】
（式中、R1、R3、R5、およびR6は、C11-C20アルキルであり;R2およびR4は、C12-C20アルキルである）。さらに具体的な実施形態では、R1、R2、R3、R4、R5およびR6はC14である。
【０３４３】
本発明に関して有用なその他のアジュバント例として、トール様受容体アゴニスト、例えば、TLR7アゴニスト、TLR7/8アゴニストなどが挙げられる。さらに別のアジュバント例として、イミキモド（IMQ）、ガルジキモド（GDQ）、レシキモド（RSG）、およびその関連化合物が挙げられる。
【０３４４】
特定の好ましいワクチンは、主としてTh1型の免疫応答を誘導するように設計されたアジュバント系を用いる。高レベルのTh1型サイトカイン（例えば、IFN-γ、TNF、IL-2およびIL-12）は、投与された抗原に対する細胞性免疫応答の誘導を優先する傾向がある。これとは対照的に、高レベルのTh2型サイトカイン（例えば、IL-4、IL-5、IL-6およびIL-10）は、体液性免疫応答の誘導を優先する傾向がある。本明細書に記載のようなワクチンの投与後、患者は、Th1およびTh2型応答を含む免疫応答を支持するであろう。応答が主としてTh1型である好ましい実施形態では、Th1型サイトカインのレベルが、Th2型サイトカインのレベルより大幅に上昇することになる。これらサイトカインのレベルは、標準的アッセイを用いて容易に評価することができる。サイトカインのファミリーについて詳しくは、MossmanおよびCoffman, Ann. Rev. Immunol. 7:145-173 (1989)を参照されたい。
【０３４５】
主としてTh1型応答を誘発するのに用いる特定のアジュバントとして、例えば、モノホスホリルリピドA、好ましくは、3-O-脱アシル化モノホスホリルリピドA（3D-MPL（商標））と、アルミニウム塩との組み合わせ（米国特許第4,436,727号；第4,877,611号；第4,866,034号；および第4,912,094号）が挙げられる。また、CpG含有オリゴヌクレオチド（ここで、CpGジヌクレオチドはメチル化されていない）も、主にTh1型応答を誘導する。このようなオリゴヌクレオチドは周知であり、例えば、以下の文献に記載されている：WO 96/02555、WO 99/33488および米国特許第6,008,200号および第5,856,462号。さらに、免疫刺激性DNA配列も、例えば、Satoら、Science 273:352 (1996)により記載されている。別のアジュバント例として、サポニン、例えば、クイルA、またはその誘導体（QS21およびQS7など）（Aquila Biopharmaceuticals Inc.、マサチューセッツ州フラミンガム）；エスシン（Escin）；ジギトニン（Digitonin）；またはカスミソウ（Gypsophila）もしくはキヌア（Chenopojium quinoa）サポニンが挙げられる。その他の製剤例として、本発明のアジュバント組合せに2種以上のサポニンを含有させたもの、例えば、以下：QS21、QS7、クイルA、エスシン、もしくはジギトニンを含む群からの少なくとも2種の組合せが挙げられる。
【０３４６】
好ましい実施形態において、アジュバント系は、WO 94/00153に記載のように、モノホスホリルリピドAとサポニン誘導体の組合せ、例えば、QS21と3D-MPL（商標）アジュバントの組合せ、またはWO 96/33739に記載のように、QS21をコレステロールと一緒にクエンチした低反応生成性組成物を含む。他の製剤は、水中油型エマルションおよびトコフェノールを含む。水中油型エマルション中にQS21、3D-MPL（商標）アジュバントおよびトコフェノールを用いた別のアジュバント製剤が、WO 95/17210に記載されている。
【０３４７】
別の増強アジュバント系は、WO 00/09159に開示のように、CpG含有オリゴヌクレオチドとサポニン誘導体の組合せを含む。
【０３４８】
他のアジュバント例として、以下のものが挙げられる：Montanide ISA 720（Seppic、フランス）、SAF（Novartis、米国、カリフォルニア州）、ISCOMS（CSL）、MF-59（Chiron）、SBASシリーズのアジュバント（例えば、GlaxoSmithKline（ベルギー、リクセンサール）から入手可能なSBAS-2、AS2'、AS2、'' SBAS-4、もしくはSBAS6）、Detox、RC-529（GlaxoSmithKline、モンタナ州ハミルトン）、ならびにその他のアミノアルキルグルコサミニド4-ホスフェート（AGP）、例えば、係属中の米国特許出願番号08/853,826および09/074,720（これらの開示物は、参照として本明細書に全文を組み込む）に記載のもの、およびWO 99/52549A1に記載のようなポリオキシエチレンエーテルアジュバント。
【０３４９】
本発明の組成物はさらに、または上記に代わり、マイコバクテリウム抗原に特異的なT細胞を含んでもよい。このような細胞は、一般に、標準的方法を用いて、in vitroまたはex vivoで調製することができる。例えば、患者の骨髄、末梢血液、または骨髄もしくは末梢血液の画分からT細胞を単離することができる。あるいは、近縁または非近縁のヒト、非ヒト哺乳動物、細胞系または培養物からT細胞を誘導してもよい。
【０３５０】
本発明のポリペプチド、このようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および／またはこのようなポリペプチドを発現する抗原提示細胞（APC）でT細胞を刺激してもよい。このような刺激は、ポリペプチドに特異的なT細胞の産生を可能にするのに十分な条件下で、かつ十分な時間にわたり実施する。好ましくは、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを送達ビヒクル（例えば、ミクロスフィア）内に存在させることにより、特異的T細胞の産生を促進する。
【０３５１】
T細胞が特異的に増殖し、サイトカインを分泌するか、または、ポリペプチドでコーティングされたもしくは該ポリペプチドをコードする遺伝子を発現する標的細胞を死滅させれば、このT細胞は、本発明のポリペプチドに特異的であると考えられる。T細胞の特異性は、様々な標準的技術のいずれを用いて評価してもよい。例えば、クロム放出アッセイまたは増殖アッセイにおいて、負の対照と比較して、刺激指数が、溶解および／または増殖において三倍以上増加すれば、T細胞特異性を示している。このようなアッセイは、例えば、Chenら、Cancer Res. 54:1065-1070（1994）に記載されているように、実施することができる。あるいは、公知の様々な技術により、T細胞増殖の検出を達成することもできる。例えば、T細胞増殖は、DNA合成速度の増加を測定する（例えば、トリチウム化チミジンでT細胞の培養物をパルス標識した後、DNAに取込まれたトリチウム化チミジンの量を測定する）ことにより検出することができる。本発明のポリペプチド（100 ng/ml〜100μg/ml、好ましくは200 ng/ml〜25μg/ml）と3〜7日接触させると、T細胞の増殖が少なくとも二倍増加するはずである。前記のように2〜3時間接触させると、標準的サイトカインアッセイを用いて測定されるT細胞の活性化が起こるはずであり、このアッセイにおいて、サイトカイン（例えば、TNFまたはIFN-γ）放出レベルが二倍増加していれば、T細胞の活性化を示している（Coliganら、Current Protocols in Immunology、第1巻（1998）参照）。ポリペプチド、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド発現性APCに応答して活性化されているT細胞は、CD4+および／またはCD8+でありうる。標準的技術を用いて、タンパク質特異的T細胞を増殖させることができる。好ましい実施形態では、T細胞は、患者、近縁ドナーまたは非近縁ドナーに由来するものであり、刺激および増殖させた後、患者に投与する。
【０３５２】
本発明の医薬組成物において、製薬上許容される賦形剤および担体溶液の製剤化は当業者には周知である。様々な治療レジメンにおいて本明細書に記載の具体的な組成物を用いるのに好適な投薬および治療レジメンの開発も同様に周知であり、そのようなものとして、例えば、経口、非経口、静脈内、鼻内、皮内、表皮、および筋肉内投与および製剤化が挙げられる。
【０３５３】
特定の用途では、本明細書に開示する医薬組成物は、経口投与により被験体に送達することができる。このように、これらの組成物は、不活性希釈剤、または同化性食用担体と一緒に製剤化してもよいし、硬質または軟質シェルゼラチンカプセルに封入する、錠剤に圧縮する、あるいは、食事用の食品に直接組込んでもよい。
【０３５４】
特定の状況では、米国特許第5,543,158号；米国特許第5,641,515号および米国特許第5,399,363号（各々、その全文を参照として本明細書に具体的に組み込む）に記載のように、本明細書に開示する医薬組成物を非経口、静脈内、筋内、または腹腔内送達するのが望ましいこともある。ヒドロキシプロピルセルロースのような界面活性剤と好適に混合した水で、遊離塩基としての活性化合物または薬理学的に許容される塩の溶液を調製してもよい。また、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、その混合物、ならびに油中で、分散液を調製してもよい。通常の貯蔵および使用条件下で、これらの調製物は、微生物の増殖を防止するための防腐剤を含有する。
【０３５５】
注射用途に好適な医薬形態として、無菌水溶液または分散液、および無菌注射溶液または分散液の即時調製のための無菌粉末などが挙げられる（米国特許第5,466,468号；その全文を参照として本明細書に具体的に組み込む）。いずれの場合にも、医薬形態は、無菌であり、尚かつ、容易に注射できる程度まで液体でなければならない。また、この形態は、製造および貯蔵条件下で安定でなければならず、しかも、細菌および真菌のような微生物の汚染作用に対して保護しなければならない。担体は、溶媒または分散媒であり、例えば、水、エタノール、ポリオール（例：グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、それらの好適な混合物、および／または植物油を含む。例えば、レシチンのようなコーティング剤、分散液の場合には必要粒度の維持、ならびに、界面活性剤の使用などにより、適正な流動性を維持することができる。微生物の作用の阻止は、各種抗菌および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどにより促進することができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを含有させるのが好ましい。注射組成物の持続的吸収は、吸収を遅らせる物質、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物に用いることにより達成することができる。
【０３５６】
水溶液による非経口投与の場合には、例えば、必要に応じて溶液を好適に緩衝する必要があり、最初に、液体希釈剤を十分な生理食塩水またはグルコースで等張にする。これらの特定の水溶液は、静脈内、筋内、皮下および腹腔内投与に適している。これに関して、用いることができる無菌水性媒質は、本発明の開示内容に照らして当業者には公知であろう。例えば、1用量を1mlの等張NaCl溶液に溶解した後、1,000 mlの皮下注入液に添加するか、または意図する注入部位に注射することができる（例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy、第20版、メリーランド州バルチモア：Lippincott Williams & Wilkins, 2000を参照）。治療を受ける被験体の状態に応じて、ある程度の用量変動は必然的に生じる。投与に関与する者は、あらゆる事象において、個々の被験体に適切な用量を決定する。さらに、ヒトへの投与の場合、製剤は、FDA Office of Biologics基準により要求される無菌状態、発熱原性、および安全性全般および純度基準を満たす必要がある。
【０３５７】
無菌注射液は、前述の様々な他の成分を含む適切な溶媒中に必要量の活性化合物を添加した後、必要に応じて、ろ過滅菌を実施することにより調製する。一般に、分散液は、基本的分散液と、前記のものから選択した必要な他の成分を含む無菌ビヒクルに、滅菌した様々な活性成分を組込むことにより調製する。滅菌注射液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、真空乾燥および凍結乾燥技術であり、これにより、活性成分の粉末、ならびに、事前に滅菌ろ過した溶液から得た別の所望の成分を取得する。
【０３５８】
本明細書に開示する組成物は、中性または塩形態で製剤化してもよい。製薬上許容される塩として、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基で形成したもの）、ならびに、例えば、塩酸もしくはリン酸のような無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸のような有機酸で形成した酸付加塩が挙げられる。また、遊離カルボキシル基で形成した塩は、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、もしくは水酸化鉄のような無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基から誘導することもできる。製剤化の際、投与製剤と適合する様式で、かつ、治療に有効な量の溶液を投与する。注射液、薬剤放出カプセルなどの様々な剤形で製剤を容易に投与する。
【０３５９】
本明細書で用いる「担体」は、あらゆる溶媒、分散媒、ビヒクル、コーティング剤、希釈剤、抗菌および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤、バッファー、担体溶液、懸濁液、コロイドなどを包含する。医薬活性物質用のこのような媒質および薬剤の使用は、当分野において周知である。任意の慣用の媒質または薬剤が活性成分と不適合性である場合を除いて、治療組成物におけるその使用が考慮される。また、追加の活性成分を組成物に組込んでもよい。
【０３６０】
「製薬上許容される」という表現は、ヒトに投与したとき、アレルギーまたは類似の不都合な反応を発生しない分子実体および組成物を意味する。活性成分としてタンパク質を含む水性組成物の調製は、当分野において十分に理解されている。典型的には、このような組成物は、溶液または懸濁液のいずれかの注射液として調製する。また、注射前に、液体に溶解または懸濁させるのに適した固体形態を調製することもできる。さらにまた、調製物を乳化することもできる。
【０３６１】
いくつかの実施形態では、鼻内噴霧、吸入、および／またはエアロゾル送達ビヒクルにより医薬組成物を送達してもよい。鼻内エアロゾル噴霧により遺伝子、ポリヌクレオチド、およびペプチド組成物を肺に直接送達する方法は、例えば、米国特許第5,756,353号および米国特許第5,804,212号（各々、参照としてその全文を本明細書に具体的に組み込む）に記載されている。同様に、鼻内微粒子樹脂（Takenagaら、1998）およびリソホスファチジル−グリセロール化合物（米国特許第5,725,871号；参照としてその全文を本明細書に具体的に組み込む）を用いた薬剤の送達も製薬分野において周知である。同様に、ポリテトラフルオロエチレン支持マトリックスの形態での経粘膜薬剤送達が、米国特許第5,780,045号（参照としてその全文を本明細書に具体的に組み込む）に記載されている。
【０３６２】
いくつかの実施形態において、送達は、本発明の組成物を好適な宿主細胞に導入するためのリポソーム、ナノカプセル、マイクロカプセル、ミクロスフィア、液体粒子、ベシクルなどを用いて実施してもよい。具体的には、本発明の組成物は、脂質粒子、リポソーム、ベシクル、ナノスフィア、ナノ粒子などのいずれかに封入して送達するように製剤化することもできる。このような送達ビヒクルの製剤化および使用は、公知の従来の技術を用いて実施することができる。
【０３６３】
D．診断方法およびキット
前述したように、上記の組成物、融合ポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、患者において結核菌感染を検出および／またはモニターするための診断試薬としても有用である。例えば、本発明の組成物、融合ポリペプチド、およびポリヌクレオチドは、感染の診断、疾患の進行のモニタリング、または治療効果評価のために、結核菌に対する液体性抗体または細胞性免疫を検出するためにin vitroおよびin vivoアッセイで用いることができる。
【０３６４】
従って、いくつかの実施形態では、本発明は、血清学検査に基づき、結核菌感染を示差的に診断するための改善された診断用抗原を提供し、その際、該診断に用いる結核菌抗原は、以下のものからなる群より選択される：Rv0164（配列番号1）、Rv0496（配列番号6）、Rv2608（配列番号26）、Rv3020（配列番号36）、Rv3478（配列番号41）、Rv3619（配列番号46）、Rv3620（配列番号51）、Rv1738（配列番号11）、Rv1813（配列番号16）、Rv3810（配列番号56）、Rv2389（配列番号21）、Rv2866（配列番号31）、Rv3876（配列番号61）、Rv0054（配列番号100）、Rv0410（配列番号106）、Rv0655（配列番号112）、Rv0831（配列番号115）、Rv1009（配列番号118）、Rv1099（配列番号: 121）、Rv1240（配列番号124）、Rv1288（配列番号127）、Rv1410（配列番号130）、Rv1569（配列番号133）、Rv1789（配列番号136）、Rv1818（配列番号139）、Rv1860（配列番号142）、Rv1886（配列番号145）、Rv1908（配列番号148）、Rv2220（配列番号154）、Rv2032（配列番号151）、Rv2623（配列番号160）、Rv2875（配列番号163）、Rv3044（配列番号166）、Rv3310（配列番号169）、Rv3881（配列番号178）、Rv0577（配列番号184）、Rv1626（配列番号187）、Rv0733（配列番号190）、Rv2520（配列番号193）、Rv1253（配列番号196）、Rv1980（配列番号199）、Rv3628（配列番号202）、Rv1884（配列番号205）、Rv3872（配列番号208）、Rv3873（配列番号211）、Rv1511（配列番号214）、およびRv3875（配列番号292）、またはその免疫原性部分もしくは変異体、個別の抗原として混合したこれらの任意の組合せ、または融合遺伝子構築物中のもの。本明細書で実証するように、開示した診断用抗原の組合せは、血清学診断試験において感度の改善をもたらす。
【０３６５】
診断方法およびキットは、本明細書に記載のように2種以上の抗原の組合せを用いるのが好ましい。いくつかの実施形態においては、本明細書に記載の複数（例えば、3以上、4以上、5以上、6以上など）の抗原を本発明の診断方法に用いるのが好ましい。抗原は、例えば、個別にアッセイする個々の抗原として、同時にアッセイする複数の抗原として、アレイなどの固体支持体に固定化した抗原として、所望する実質的にすべてのアッセイ形式で用いることができる。
【０３６６】
具体的な実施形態では、本方法に用いる診断用抗原は、以下のものからなる群より選択される：Rv0164（配列番号1）、Rv0496（配列番号6）、Rv2608（配列番号26）、Rv3020（配列番号36）、Rv3478（配列番号41）、Rv3619（配列番号46）、Rv3620（配列番号51）、Rv1738（配列番号11）、Rv1813（配列番号16）、Rv3810（配列番号56）、Rv2389（配列番号21）、Rv2866（配列番号31）、Rv3876（配列番号61）、Rv0054（配列番号100）、Rv0410（配列番号106）、Rv0655（配列番号112）、Rv0831（配列番号115）、Rv1009（配列番号118）、Rv1099（配列番号121）、Rv1240（配列番号124）、Rv1288（配列番号127）、Rv1410（配列番号130）、Rv1569（配列番号133）、Rv1789（配列番号136）、Rv1818（配列番号139）、Rv1860（配列番号142）、Rv1886（配列番号145）、Rv1908（配列番号148）、Rv2220（配列番号154）、Rv2032（配列番号151）、Rv2623（配列番号160）、Rv2875（配列番号163）、Rv3044（配列番号166）、Rv3310（配列番号169）、およびRv3881（配列番号178）、Rv0577（配列番号184）、Rv1626（配列番号187）、Rv0733（配列番号190）、Rv2520（配列番号193）、Rv1253（配列番号196）、Rv1980（配列番号199）、Rv3628（配列番号202）、Rv1884（配列番号205）、Rv3872（配列番号208）、Rv3873（配列番号211）、Rv1511（配列番号214）、およびRv3875（配列番号292）、またはその免疫原性部分もしくは変異体、個別の抗原として混合したこれらの任意の組合せ、または融合遺伝子構築物中のもの。
【０３６７】
一実施形態において、生体サンプルにおいて結核菌感染を検出するための診断キットであって、（a）本明細書に記載の抗原の少なくとも免疫原性部分を含むポリペプチド、または融合ポリペプチドと、（b）検出試薬とを含む、上記診断キットが提供される。
【０３６８】
別の実施形態では、生体サンプルにおいて結核菌感染を検出するための診断キットであって、（a）本明細書に記載の抗原の少なくとも免疫原性部分を含むポリペプチド、または融合ポリペプチドに特異的な抗体もしくはその抗原結合断片と、（b）検出試薬とを含む、上記診断キットが提供される。
【０３６９】
別の実施形態では、生体サンプルにおいて結核菌感染の存在を検出するための方法であって、（a）本明細書に記載の抗原または融合ポリペプチドに結合するモノクローナル抗体と生体サンプルとを接触させるステップと；（b）該生体サンプルにおいて、モノクローナル抗体に結合する結核菌タンパク質の存在を検出するステップを含む、上記方法を提供する。
【０３７０】
さらに別の実施形態では、生体サンプルにおいて結核菌感染を検出するための方法であって、（a）本明細書に記載の抗原の組合せまたは融合ポリペプチドと生体サンプルとを接触させるステップと；（b）該生体サンプルにおいて、これに結合する抗体および／またはT細胞の存在を検出するステップを含む、上記方法を提供する。
【０３７１】
精製抗原または融合ポリペプチドを用いて、サンプル中の抗体を検出する様々なアッセイ形式があり、これらは当業者には公知である。例えば、HarlowおよびLane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988を参照されたい。一実施形態では、アッセイは、固体支持体上に固定化したポリペプチドを使用して抗体に結合させ、これをサンプルから回収することを含む。次に、抗体／ペプチド複合体に結合し、検出可能なレポーター基を含む検出試薬を用いて、結合した抗体を検出することができる。好適な検出試薬として、抗体／ポリペプチド複合体に結合する抗体、ならびにレポーター基で標識された遊離ポリペプチド（例えば、半競合アッセイの場合）などが挙げられる。あるいは、競合アッセイを用いてもよく、その際、ポリペプチドに結合する抗体をレポーター基で標識してから、サンプルと一緒に抗原をインキュベートした後、固定化抗原に結合させる。サンプルの成分が標識抗体とポリペプチドの結合を阻害する程度が、固定化ポリペプチドとサンプルの反応性を示している。
【０３７２】
固体支持体は、抗原が結合することができるものであれば、当業者に公知のいずれの固体材料でもよい。例えば、固体支持体は、マイクロタイタープレート中の試験ウェルまたはニトロセルロースもしくはその他の好適な膜でよい。あるいは、上記支持体は、ビーズまたはディスク、例えば、ガラス、繊維ガラス、ラテックス、またはポリスチレンもしくはポリ塩化ビニルのようなプラスチック材料でもよい。本支持体はまた、磁気粒子または光ファイバーセンサー、例えば、米国特許第5,359,681号に開示されているものであってもよい。
【０３７３】
ポリペプチドは、当分野において公知で、利用可能な様々な技術のいずれを用いて固体支持体に結合させてもよい。用語「結合（した）」とは、非共有会合（例えば、吸着）、および共有結合（支持体上で抗原と官能基同士の直接結合、または架橋剤による結合のいずれでもよい）の両方を含む。マイクロタイタープレート中のウェルまたは膜への吸着による結合が好ましい。このような場合、吸着は、好適なバッファー中で、固体支持体とポリペプチドとを適切な時間接触させることにより達成することができる。
【０３７４】
いくつかの実施形態では、使用する診断アッセイは、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ELISA）である。このアッセイは、まず、固体支持体（一般にマイクロタイタープレートのウェル）に固定化させておいたポリペプチド抗原をサンプルと接触させて、サンプル内のポリペプチドに対する抗体が、固定化ポリペプチドに結合するようにすることにより、行うことができる。非結合サンプルを固定化ポリペプチドから除去し、固定化抗体−ポリペプチド複合体に結合することができる検出試薬を添加する。次に、固体支持体に結合したままの検出試薬の量を、特定の検出試薬に適した方法により決定する。
【０３７５】
ポリペプチドを支持体に固定化したら、一般に、支持体上に残っているタンパク質結合部位を遮断する。当業者には公知の好適な遮断剤、例えば、ウシ血清アルブミンまたはTween 20（商標）（Sigma Chemical Co.、ミズリー州セントルイス）。次に、固定化ポリペプチドをサンプルと共にインキュベートし、抗体（もしサンプルに存在すれば）を抗原に結合させる。インキュベーションの前に、サンプルを好適な希釈剤、例えば、リン酸緩衝化生理食塩水（PBS）で希釈してもよい。一般に、適切な接触時間（すなわち、インキュベーション時間）は、感染サンプル内の結核菌に対する抗体の存在を検出するのに十分な時間である。好ましくは、接触時間は、結合および非結合抗体同士の平衡を達成する結合レベルの少なくとも95％の結合レベルを達成するのに十分なものである。当業者であれば、平衡を達成するのに必要な時間は、一定時間にわたって起こる結合レベルをアッセイすることにより容易に決定できることを認識するだろう。室温では、一般に、インキュベーション時間は約30分で十分である。
【０３７６】
次に、適切なバッファー、例えば、0.1％Tween 20（商標）を含むPBSで、固体支持体を洗浄することにより、非結合サンプルを除去する。次に、検出試薬を固体支持体に添加する。適切な検出試薬は、固定化抗体−ポリペプチド複合体に結合し、当分野で公知の各種手段のいずれかにより検出することができる化合物のいずれでもよい。検出試薬は、一般に、レポーター基にコンジュゲートする結合剤（例えば、プロテインA、プロテインG、免疫グロブリン、レクチンもしくは遊離抗原）を含む。レポーター基の例として、酵素（西洋ワサビペルオキシダーゼなど）、基質、補因子、阻害剤、色素、放射性核種、発光基、蛍光基およびビオチンが挙げられる。結合剤とレポーター基とのコンジュゲーションは、当業者には公知の標準的方法を用いて、達成することができる。
【０３７７】
次に、結合抗体を検出するのに十分な時間にわたって、検出試薬を固定化抗体−ポリペプチド複合体と一緒にインキュベートする。好適な時間は、一般に、製造者の説明書から決定するか、一定時間にわたって起こる結合レベルをアッセイすることにより、決定することができる。次に、非結合検出試薬を除去した後、レポーター基を用いて結合検出試薬を検出する。レポーター基を検出するのに使用する方法は、レポーター基の性質により変わってくる。放射性基の場合には、シンチレーションカウントまたはオートラジオグラフィー法が一般に適している。分光法は、色素、発光基および蛍光基を検出するために用いることができる。ビオチンは、別のレポーター基（一般に放射性もしくは蛍光基または酵素）に結合させたアビジンを用いて検出することができる。酵素レポーター基は、一般に、基質を添加（一般に特定の時間にわたり）後、反応生成物の分光またはその他の分析により検出することができる。
【０３７８】
サンプル中の結核菌抗体の存在または非存在を決定するために、一般に、固体支持体に結合したままのレポーター基から検出されたシグナルを、予め定めたカットオフ値に対応するシグナルと比較する。このカットオフ値は、好ましくは、非感染患者からのサンプルと一緒に固定化抗原をインキュベートしたときに得られる平均シグナルである。一般に、平均値より3標準偏差高いシグナルを生成するサンプルは結核菌抗体および結核菌感染について陽性とみなされる。別の実施形態では、Sackettら、Clinical Epidemiology: A Basic Science for Clinical Medicine, p.106-7（Little Brown and Co., 1985）に従い、Receiver Operator Curveを用いて、カットオフ値を決定する。手短に言うと、この実施形態では、診断試験結果について考えられる各カットオフ値に対応する真陽性率（すなわち、感度）と偽陽性率（100％−特異性）のペアのプロットからカットオフ値を決定する。左上の角に最も近いプロットのカットオフ値（すなわち、最大面積を囲む値）が最も正確なカットオフ値であり、この方法により決定されるカットオフ値より高いシグナルを生成するサンプルが陽性とみなされる。あるいは、カットオフ値をプロットに沿って左側にシフトすることにより、偽陽性率を最小にしてもよいし、または右側にシフトすることにより、偽陰性率を最小にしてもよい。一般に、この方法により決定されたカットオフ値より高いシグナルを生成するサンプルが結核菌感染について陽性と考えられる。
【０３７９】
別の実施形態では、診断アッセイをフロースルーまたはストリップ試験方式で実施してもよく、その際、抗原または融合ポリペプチドをニトロセルロースのような膜上に固定化する。フロースルー試験では、サンプルが膜を通過するとき、サンプル内の抗体は固定化ポリペプチドに結合する。その後、検出試薬を含む溶液が膜を通過して流れる際、検出試薬（例えば、プロテインA−金コロイド）は抗体ペプチド複合体に結合する。その後、結合検出試薬の検出は、前記のように実施することができる。ストリップ試験方式では、ポリペプチドが結合した膜の一端を、サンプルを含む溶液に浸漬する。サンプルは、検出試薬を含む領域から膜に沿って、固定化ポリペプチドの領域まで移動する。ポリペプチドにおける検出試薬の濃度が、サンプル中の結核菌抗体の存在を示している。このような試験は、一般に、非常に少量（例えば、1滴）の患者血清または血液で実施することができる。
【０３８０】
さらに別の実施形態では、1以上の抗原に特異的な本発明の抗体（ポリクローナルまたはモノクローナルのいずれでもよい）および／またはT細胞、融合ポリペプチドおよび／または免疫原性部分を用いて、生体サンプルにおいて結核菌を検出する方法が提供される。
【０３８１】
本明細書に記載する刊行物および特許出願はすべて、それぞれの刊行物または特許出願が、具体的および個別に、参照として組み込む旨を明示していたかの如く、参照として本明細書に組み込むものとする。
【０３８２】
以上、明瞭な理解のために、説明および例示により本発明をある程度詳細に説明してきたが、本発明の教示内容を読めば、添付する特許請求の範囲の精神または範囲を逸脱することなく、いくつかの変更および改変を行いうることは当業者には明らかであろう。以下の実施例は例示として記載するにすぎず、限定を意図するものではない。当業者であれば、ほぼ同様の結果を得るために変更または改変することができる様々な重要でないパラメーターを容易に認識するだろう。
【０３８３】
前述した様々な実施形態を組み合わせることにより、さらに別の実施形態を提供することができる。本明細書で参照した、および／または出願データシートに記載した米国特許、米国特許出願公報、米国特許出願、外国特許、外国特許出願、および非特許文献は、参照としてその全文を本明細書に組み込むものとする。必要に応じて様々な特許、出願及び刊行物のコンセプトを採用して、これら実施形態の態様を改変することにより、さらに別の実施形態を提供することもできる。
【実施例】
【０３８４】
実施例１
組換えRv0164のクローニングおよび発現
H37RvゲノムDNAを鋳型として使用し、以下の配列番号4および5に記載のプライマーセットを用いてRv0164をPCR増幅した：
【化２】
2014058520.tif 000005
【０３８５】
以下の増幅条件：94℃で0.5分、55℃で0.5分、68℃で1分、30サイクルを用いて、配列番号2に記載の産物を得た。このPCR産物をNdeI/HindIIIで消化し、pET 28aにクローニングした。Rv0164遺伝子を含むプラスミドを発現宿主およびRosetta2 pLysSに形質転換した。34 mg/Lのクロラムフェニコール、35 mg/Lのカナマイシンを補充した2 x YT培地において37℃で、振盪フラスコ内で培養物をOD600＝0.5〜0.6まで増殖させ、1mM IPTGで3〜4時間誘導した。細胞ペーストを10,000 x gでペレット化し、−20℃で保存した。超音波処理により1L誘導物を溶解し、上清を透明にした後、Rv0164タンパク質が不溶性画分中に残った。次に、この画分を1％CHAPS 界面活性剤、20 mM Tris HCl pH8.0で2回洗浄した後、8M尿素で可溶化した。変性条件下で、2ラウンドのNi-NTAアフィニティークロマトグラフィー（Qiagen）を用いて、精製を実施した後、300 mMイミダゾールを用いて、Rv0164タンパク質を溶出した。SDS-PAGE分析後、10 mM Tris pH8.0に対して精製タンパク質を含む画分を透析した。Bradfordアッセイによりタンパク質濃度を決定し、Llimulus Amoebcyteアッセイにより残留外毒素レベルを決定した。組換えタンパク質のアミノ酸配列を配列番号3に記載する。
【０３８６】
実施例２
組換えRv0496のクローニングおよび発現
鋳型としてH37RvゲノムDNAを使用し、以下のプライマーを用いてRv0496をPCR増幅した：
【化３】
2014058520.tif 000006
【０３８７】
以下の条件を用いて増幅を実施した：94℃で0.5分、55℃で0.5分、68℃で2分を30サイクル実施して、配列番号7に記載の産物を得る。このPCR産物をNdeI/HindIIIで消化し、pET 28aにクローニングした。Rv0496を発現宿主およびRosetta2 pLysSに形質転換した。1L誘導物を溶解後、これは封入体になった。変性条件下でNi-NTAを2回実施した後、10 mM Tris pH 10に対して透析した。組換えタンパク質のアミノ酸配列を配列番号8に記載する。
【０３８８】
実施例３
組換えRv1738のクローニングおよび発現
鋳型としてH37RvゲノムDNAを使用し、以下のプライマーを用いてRv1738をPCR増幅した：
【化４】
2014058520.tif 000007
【化５】
2014058520.tif 000008
【０３８９】
以下の条件：95℃で1分、58℃で1分、72℃で1分、35サイクルを用いて増幅を実施することにより、配列番号12に記載の産物を得た。このPCR産物をNdeI/ EcoRIで消化し、pET 17bにクローニングした。Rv1738を発現宿主BL-21pLysEおよびplysSに形質転換した。1L誘導物を溶解後、タンパク質は可溶性上清中に残った。変性条件下でNi-NTAを実施した後、10 mM Tris pH 8.0に対して透析した。組換えタンパク質のアミノ酸配列を配列番号13に記載する。
【０３９０】
実施例４
組換えRv1813のクローニングおよび発現
鋳型としてH37RvゲノムDNAを使用し、以下のプライマーを用いてRv1813をPCR増幅した：
【化６】
2014058520.tif 000009
【０３９１】
以下の条件：95℃で1分、58℃で1分、72℃で1分、35サイクルを用いて増幅を実施することにより、配列番号17に記載の産物を得た。このPCR産物をNdeI/ EcoRIで消化し、pET 17bにクローニングした。Rv1813を発現宿主BL-21pLysEおよびRosetta plysSに形質転換した。1L誘導物を溶解後、タンパク質は封入体になった。変性条件下でNi-NTAを実施した後、10 mM Tris pH 8.0に対して透析した。組換えタンパク質のアミノ酸配列は配列番号18に記載する。
【０３９２】
実施例５
組換えRv2389（RPF-D）のクローニングおよび発現
鋳型としてH37RvゲノムDNAを使用し、以下のプライマーを用いてRv2389をPCR増幅した：
【化７】
2014058520.tif 000010
【０３９３】
以下の条件：95℃で1分、58℃で1分、72℃で1分、35サイクルを用いて増幅を実施することにより、配列番号22に記載の産物を得た。このPCR産物をNdeI/ EcoRIで消化し、pET 17b（pET構築物はaa49で開始する）にクローニングした。Rv2389を発現宿主BL-21pLysEおよびRosetta plysSに形質転換した。1L誘導物を溶解後、タンパク質は可溶性画分に残った。変性条件下でNi-NTAを実施した後、10 mM Tris pH 8.0に対して透析した。組換えタンパク質のアミノ酸配列は配列番号23に記載する。
【０３９４】
実施例６
組換えRv2608のクローニングおよび発現
鋳型としてH37RvゲノムDNAを使用し、以下のプライマーを用いてRv2608をPCR増幅した：
【化８】
2014058520.tif 000011
【０３９５】
以下の条件：94℃で0.5分、55℃で0.5分、68℃で2分、30サイクルを用いて増幅を実施することにより、配列番号27に記載の産物を得た。ゲル精製したPCR産物をNdeI/HindIIIで消化し、pET 28a（Clonetech）（pET構築物はアミノ酸1で開始する）にクローニングした。Rv2608を発現宿主およびRosetta2 pLysSに形質転換した。34 mg/Lのクロラムフェニコール、35 mg/Lのカナマイシンを補充した2 x YT培地において37℃で、振盪フラスコ内で培養物をOD600＝0.5〜0.6まで増殖させ、1mM IPTGで3〜4時間誘導した。細胞ペーストを10,000 x gでペレット化し、−20℃で保存した。超音波処理により1L誘導物を溶解し、上清を透明にした後、Rv2608タンパク質が不溶性画分中に残った。次に、この画分を1％CHAPS界面活性剤、10 mM Tris HCl pH8.0で2回洗浄した後、8M尿素で可溶化した。変性条件下で、2回のNi-NTAアフィニティークロマトグラフィー（Qiagen）を用いて、精製を実施した後、300 mMイミダゾールを用いて、Rv2608タンパク質を溶出した。SDS-PAGE分析後、10 mM Tris pH8.0に対して精製タンパク質を含む画分を透析した。BCAアッセイによりタンパク質濃度を決定し、Llimulus Amoebcyteアッセイにより残留外毒素レベルを決定した。組換えタンパク質のアミノ酸配列を配列番号28に記載する。
【０３９６】
実施例７
組換えRv2866のクローニングおよび発現
以下のプライマーを用いて、PCRによりゲノム鋳型からRv2866を増幅した：
【化９】
2014058520.tif 000012
【０３９７】
以下の増幅条件：94℃で0.5分、66℃で0.50分、68℃で1.50分、35サイクルを用いて、配列番号34に記載の産物を得た。この産物をNdeI/HindIIIで消化し、pET28.aにクローニングした。Rv2866を宿主株BL-21pLysSにより発現させた。変性条件下でペレットおよび上清をNi樹脂と結合させた。20 mM Tris pH 6において透析を実施した。組換えタンパク質のアミノ酸配列を配列番号35に記載する。
【０３９８】
実施例８
組換えRv3020のクローニングおよび発現
鋳型としてH37ゲノムDNAを使用し、以下のプライマーを用いてRv3020をPCR増幅した：
【化１０】
2014058520.tif 000013
【０３９９】
以下の増幅条件：94℃で0.5分、55℃で0.5分、68℃で1分、30サイクルを用いて、配列番号37に記載の産物を得た。このPCR産物をNdeI/HindIIIで消化し、pET 28aにクローニングした。Rv3020遺伝子を含むプラスミドを発現宿主およびRosetta2 pLysSに形質転換した。34 mg/Lのクロラムフェニコール、35 mg/Lのカナマイシンを補充した2 x YT培地において37℃で、振盪フラスコ内で培養物をOD600＝0.5〜0.6まで増殖させ、1mM IPTGで3〜4時間誘導した。細胞ペーストを10,000 x gでペレット化し、−20℃で保存した。超音波処理により1L誘導物を溶解し、上清を透明にした後、Rv3020タンパク質は不溶性画分中に残った。次に、この画分を1％CHAPS界面活性剤、20 mM Tris HCl pH8.0で2回洗浄した後、8M尿素で可溶化した。変性条件下で、Ni-NTAアフィニティークロマトグラフィー（Qiagen）を用いて、精製を実施した後、250 mMイミダゾールを用いて、Rv3020タンパク質を溶出した。SDS-PAGE分析後、10 mM Tris pH8.0に対して精製タンパク質を含む画分を透析した。Bradfordアッセイによりタンパク質濃度を決定し、Llimulus Amoebcyteアッセイにより残留外毒素レベルを決定した。組換えタンパク質のアミノ酸配列を配列番号38に記載する。
【０４００】
実施例９
組換えRv3478のクローニングおよび発現
鋳型としてHv37RvゲノムDNAを使用し、以下のプライマーを用いてRv3478を増幅した：
【化１１】
2014058520.tif 000014
【０４０１】
以下の条件：94℃で0.5分、55℃で0.5分、68℃で2分、30サイクルで、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を用いて、Rv3478を増幅した。ゲル精製したPCR産物（配列番号42）をNdeI/HindIIIで消化し、pET 28a（Clonetech）にクローニングした。Rv3478を発現宿主およびRosetta2 pLysSに形質転換した。37℃の振盪フラスコ内で、34 mg/Lのクロラムフェニコール、35 mg/Lのカナマイシンを補充した2 x YT培地において培養物をOD600＝0.5〜0.6まで増殖させ、1mM IPTGで3〜4時間誘導した。細胞ペーストを10,000 x gでペレット化し、−20℃で保存した。超音波処理により1L誘導物を溶解し、上清を透明にした後、Rv3478タンパク質は不溶性画分中に残った。次に、この画分を1％CHAPS界面活性剤、10 mM Tris HCl pH8.0で2回洗浄した後、8M尿素で可溶化した。変性条件下で、2回のNi-NTAアフィニティークロマトグラフィー（Qiagen）を用いて、精製を実施した後、300 mMイミダゾールを用いて、Rv3478タンパク質を溶出した。SDS-PAGE分析後、10 mM Tris pH8.0に対して精製タンパク質を含む画分を透析した。BCAアッセイによりタンパク質濃度を決定し、Llimulus Amoebcyteアッセイにより残留外毒素レベルを決定した。組換えタンパク質のアミノ酸配列を配列番号43に記載する。
【０４０２】
実施例１０
組換えRv3619のクローニングおよび発現
H37RvゲノムDNAを鋳型として使用し、以下のプライマーを用いてRv3619を増幅した：
【化１２】
2014058520.tif 000015
【０４０３】
以下の条件：94℃で0.5分、55℃で0.5分、68℃で1分、30サイクルで、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を用いて、Rv3619を増幅した。ゲル精製したPCR産物（配列番号47）をNdeI/HindIIIで消化し、発現ベクターpET 28a（Clonetech）にクローニングした。
【０４０４】
Rv3619を発現宿主およびRosetta2 pLysSに形質転換した。37℃の振盪フラスコ内で、34 mg/Lのクロラムフェニコール、35 mg/Lのカナマイシンを補充した2 x YT培地において培養物をOD600＝0.5〜0.6まで増殖させ、1mM IPTGで3〜4時間誘導した。細胞ペーストを10,000 x gでペレット化し、−20℃で保存した。超音波処理により1L誘導物を溶解し、上清を透明にした後、Rv3619タンパク質は不溶性画分中に残った。次に、この画分を1％CHAPS界面活性剤、10 mM Tris HCl pH8.0で2回洗浄した後、8M尿素で可溶化した。変性条件下で、Ni-NTAアフィニティークロマトグラフィー（Qiagen）を用いて、精製を実施し、300 mMイミダゾールを用いて、Rv3619タンパク質を溶出した。SDS-PAGE分析後、10 mM Tris pH8.0に対して精製タンパク質を含む画分を透析した。Bradfordアッセイによりタンパク質濃度を決定し、Llimulus Amoebcyteアッセイにより残留外毒素レベルを決定した。組換えタンパク質のアミノ酸配列を配列番号48に記載する。
【０４０５】
実施例１１
組換えRv3620のクローニングおよび発現
H37RvゲノムDNAを鋳型として使用し、以下のプライマーを用いて、Rv3620をPCR増幅した：
【化１３】
2014058520.tif 000016
【０４０６】
94℃で0.5分、55℃で0.5分、68℃で1分を30サイクルの条件で、Rv3620をPCR増幅した。PCR産物（配列番号52）をNdeI/HindIIIで消化し、pET 28aにクローニングした。Rv3620を発現宿主Rosetta2 plysSに形質転換した。1L誘導物を溶解後、タンパク質は封入体になった。変性条件下でNi-NTAを実施した後、精製した抗原を20 mM Tris pH 8.0、50 mM NaClに対して透析した。組換えタンパク質のアミノ酸配列を配列番号53に記載する。
【０４０７】
実施例１２
組換えRv3810のクローニングおよび発現
H37RvゲノムDNAを鋳型として使用し、以下のプライマーを用いてRv3810をPCR増幅した：
【化１４】
2014058520.tif 000017
【０４０８】
95℃で1分、58℃で1分、72℃で1.5分を35サイクルの条件で、Rv3810をPCR増幅した。PCR産物（配列番号57）をNdel/XhoIで消化し、pET 17b（pET構築物はアミノ酸23で開始する）にクローニングした。Rv3810を発現宿主BL-21plysEおよびRosetta plysSに形質転換した。1L誘導物を溶解後、タンパク質は封入体になった。変性条件下でNi-NTAを実施した後、10 mM Tris pH 8.0に対して透析した。組換えタンパク質のアミノ酸配列を配列番号58に記載する。
【０４０９】
実施例１３
組換えRv3876のクローニングおよび発現
以下の増幅プライマーを用いて、Rv3876をゲノムDNAからPCR増幅した：
【化１５】
2014058520.tif 000018
【０４１０】
以下の条件：94℃で30秒、55℃で30秒、72℃で2分を30サイクルの条件で、増幅を実施した。PCR産物をシャトルベクターpGemTに連結した。LB寒天-x-galプレート上で陽性クローンを青／白セレクションにより同定した。Rv3876遺伝子産物をNdeI/EcoRIで消化し、pET 28aにクローニングした。Rv3876cを発現宿主BL-21(DE3)plysSに形質転換した。1L誘導物を溶解後、タンパク質は不溶性画分に残った。変性条件下でNi-NTAを実施した後、20 mM Tris pH 8.0に対して透析した。組換えタンパク質のアミノ酸配列を配列番号63に記載する。
【０４１１】
実施例１４
組換え融合タンパク質MTB36F.1のクローニングおよび発現
以下のプライマーを融合構築物Mtb36f.1の構築に用いた：
【化１６】
2014058520.tif 000019
【化１７】
2014058520.tif 000020
【０４１２】
事前にクローニングしたRv2389およびRv3810のプラスミドDNAを使用し、以下の条件：94℃で30秒、58℃で30秒、68℃で1分、35サイクルを用いて、Mtb36f.1成分をPCR増幅した。5'Rv2389PCR産物をNdeI/SacIで消化し、pET 28aにクローニングした。3'Rv3810 PCR産物をSacI/HindIIIで消化し、pET 28a構築物を含むRv2389にクローニングした。Mtb36f.1（配列番号66）を発現宿主BL-21(DE3)plysSに形質転換した。1L誘導物を溶解後、タンパク質は不溶性画分に残った。天然の条件下でNi-NTAを実施した後、20 mM Tris pH 8.0に対して透析した。組換え融合タンパク質のアミノ酸配列を配列番号67に記載する。
【０４１３】
実施例１５
組換え融合タンパク質ID58のクローニングおよび発現
Mtb Rv1813、Rv3620およびRv0496に由来する融合パートナーを含む融合構築物ID58のクローニングのために、以下のプライマーを用いた：
【化１８】
2014058520.tif 000021
【化１９】
2014058520.tif 000022
【０４１４】
Rv1813およびRv3620をゲノム鋳型DNAからPCR増幅した（94℃で1.5分、58℃で0.5分、58℃で1.5分、35サイクル）。Rv1813をNdeI/SacIで消化し、pET28.aベクターにクローニングした。Rv3620をSacI/SaIIで消化し、Rv1813pET構築物に連結した。Rv0496をPCR（94℃で0:30、60℃で0:30、68℃で1分30秒、35サイクル）によりプラスミド鋳型から増幅した。産物をSaII/HindIIIで消化し、pET28.a-Rv1813-3620ベクターにクローニングした。ID58-pET28.aにはいくつかの点突然変異が存在したため、部位指定突然変異誘発を用いて、正しい核酸を挿入した。ID58融合構築物は、配列番号72に記載のポリヌクレオチド配列を有し、この配列は、配列番号79に記載の融合タンパク質をコードする。ID58を宿主BL-21plysSに発現させた（1L、2XYT増殖培地、37℃）。OD 0.471で、1mM IPTGを用いて誘導を実施し、OD 1.36で細胞を回収した。細胞ペレットを溶解バッファー（20mM Tris pH8、100mM NaCl、2mM PMSF）中に懸濁させてから、凍結させた。ID58は、封入体を形成し、ID83と同様に処理した。フロースルー結合からの画分を20 mM Tris pH 8.5において透析した。
【０４１５】
実施例１６
組換え融合タンパク質ID69のクローニングおよび発現
Rv2389、Rv1813、Rv3620およびRv0496に由来する融合パートナーを含む融合構築物ID69のクローニングのために、以下のプライマーを用いた：
【化２０】
2014058520.tif 000023
【０４１６】
Rv2389をゲノム鋳型からPCR増幅して（94℃で0.5分、58℃で0.5分、68℃で1.5分；35サイクル）、NdeI/HindIIIで消化し、pET28.aに連結した。ID58-pET28.aベクターをKpnI/HindIIIで消化し、挿入断片を除去した。ID58をRv2389-pET28.aベクターに連結した（また、KpnI/HindIIIで消化した）。融合構築物は、配列番号80に記載のポリヌクレオチド配列を有し、この配列は、配列番号83に記載の融合タンパク質をコードする。ID69を宿主BL-21plysSに発現させた（1L、2XYT増殖培地、37℃）。細胞ペレットを溶解バッファー（20mM Tris pH8、100mM NaCl、2mM PMSF）中に懸濁させてから、凍結させた。ID69は封入体を形成し、ID83と同様に精製した。
【０４１７】
実施例１７
組換え融合タンパク質ID83のクローニングおよび発現
Rv1813、Rv3620およびRv2608に由来する融合パートナーを含む融合構築物ID83のクローニングのために、以下のプライマーを用いた：
【化２１】
2014058520.tif 000024
【化２２】
2014058520.tif 000025
【０４１８】
Rv1813およびRv3620をゲノム鋳型DNAからPCR増幅した（94℃で0.5分、58℃で0.5分、58℃で1.5分、35サイクル）。Rv1813をNdeI/SacIで消化した後、pET28.aベクターにクローニングした。Rv3620をSacI/SaIIで消化し、Rv1813pET構築物に連結した。PCR（94℃で0.5分、58℃で0.5分、68℃で1.5分、35サイクル）によりプラスミド鋳型からRv2608を増幅した。産物をSaII/HindIIIで消化し、pET28.a-Rv1813-3620ベクターにクローニングした。融合構築物は、配列番号84に記載のポリヌクレオチド配列を有し、この配列は、配列番号91に記載の融合タンパク質をコードする。
【０４１９】
ID83を宿主BL-21plysSに発現させた（2L、2XYT増殖培地、37℃）。OD 0.77で、1mM IPTGを用いて誘導を実施し、OD 1.93で回収した。細胞ペレットを溶解バッファー（20mM Tris pH8、100mM NaCl、2mM PMSF）中に懸濁させてから、凍結させた。細胞ペレットを解凍し、超音波処理による溶解後、7,000 rcfで20分スピンさせた。ID83は、封入体タンパク質である。ペレットを1％Chapsで2回洗浄した。ペレットを結合バッファー（8M尿素、20mM Tris pH8、100mM NaCl）中に60 mL溶解させ、室温で1時間16 mL Ni-NTA樹脂に結合させた。樹脂を洗浄（50 mLの0.5％DOCで20分；80 mLの60％IPAで30分、50 mLの0.5％DOCですすぎ）した後、300 mMイミダゾールを含む結合バッファーで溶出した。最初の結合物からの上清を追加した8 mL樹脂に結合させ、前記と同様に処理した。前記の精製により、分解産物を除去した。32 mL樹脂を含む160 mL（50 mM NaClを含む結合バッファー）において、もう一度Ni-NTA結合を4℃で一晩実施した。樹脂を洗浄し、前記と同様に溶出した。この結合物からの画分を20 mM Tris pH 8.0において透析した。
【０４２０】
実施例１８
組換え融合タンパク質ID94のクローニングおよび発現
Rv2389、Rv1813、Rv3620およびRv2608に由来する融合パートナーを含む融合構築物ID94のクローニングのために、以下のプライマーを用いた：
【化２３】
2014058520.tif 000026
【０４２１】
Rv2389をゲノム鋳型からPCR増幅し（94℃で0.5分、58℃で0.5分、68℃で1.5分、35サイクル）、NdeI/HindIIIで消化し、pET28.aに連結した。ID83-pET28.aベクターをKpnI/HindIIIで消化し、挿入断片を除去した。ID83をRv2389-pET28.aベクターに連結した（また、KpnI/HindIIIで消化した）。融合構築物は、配列番号92に記載のポリヌクレオチド配列を有し、この配列は、配列番号95に記載の融合タンパク質をコードする。ID94を宿主BL-21plysSに発現させた（1L、2XYT増殖培地、37℃）。OD 0.50にて、1 mM IPTGで発現を誘導し、OD 1.41で回収した。細胞ペレットを溶解バッファー（20mM Tris pH8、100mM NaCl、2mM PMSF）中に懸濁させ、凍結させた。ID94は封入体を形成し、これをID83と同様に処理した。ID94は、一晩でよく結合しなかったため、容量を8M尿素で2倍にし、BMEを10 mMまで添加した。室温で2時間、次に4℃で一晩、より低濃度の溶液をNi-NTA樹脂に結合させた。樹脂を洗浄し、前述のように溶出した。この精製物からの画分を20 mM Tris pH 8.0において透析した。
【０４２２】
実施例１９
組換え融合タンパク質ID95のクローニングおよび発現
ID95は、Rv2389、Rv3810、Rv1813、Rv3620およびRv0496に由来する融合パートナーを含む融合構築物である。ID58-pET28.aベクターをKpnI/HindIIIで消化し、挿入断片を除去した。事前に作製しておいた36f.1-pET28.aベクターにID58挿入断片を連結した（また、KpnI/HindIIIで消化した）。融合構築物は、配列番号96に記載のポリヌクレオチド配列を有し、この配列は、配列番号97に記載の融合タンパク質をコードする。ID95を宿主BL-21plysSに発現させた（1L、2XYT増殖培地、37℃）。細胞ペレットを溶解バッファー（20mM Tris pH8、100mM NaCl、2mM PMSF）中に懸濁し、凍結させた。ID95は封入体を形成し、ID83と同様に精製した。
【０４２３】
実施例２０
組換え融合タンパク質ID120のクローニングおよび発現
ID120は、Rv2389、Rv3810、Rv1813、Rv3620およびRv2608に由来する融合パートナーを含む融合構築物である。ID83-pET28.aベクターをKpnI/HindIIIで消化し、挿入断片を除去した。事前に作製しておいた36f.1-pET28.aベクターにID83挿入断片を連結した（また、KpnI/HindIIIで消化した）。融合構築物は、配列番号98に記載のポリヌクレオチド配列を有し、この配列は、配列番号99に記載の融合タンパク質をコードする。ID120を宿主BL-21plysSに発現させた（1L、2XYT増殖培地、37℃）。OD 0.50にて、1 mM IPTGで発現を誘導し、OD 1.41で細胞を回収した。細胞ペレットを溶解バッファー（20mM Tris pH8、100mM NaCl、2mM PMSF）中に懸濁し、凍結させた。ID120は封入体を形成し、ID83と同様に処理した。ID120は、一晩では十分に結合しなかったため、容量を8M尿素で2倍にし、BMEを10 mMまで添加した。室温で2時間、次に4℃で一晩、より低濃度の溶液をNi-NTA樹脂に結合させた。樹脂を洗浄し、前述のように溶出した。この精製物からの画分を20 mM Tris pH 8において透析した。
【０４２４】
実施例２１
PPD+ヒトPBMCおよびMTB感染マウスからの脾細胞によるMTB抗原の認識
この実施例により、本発明のMtb抗原が、PPD+健康体ドナーからのヒトPBMC、および結核菌に感染したマウスから単離した脾細胞において記憶再生応答(memory recall response)を誘導することを実証する。
【０４２５】
材料および方法：
ヒトPBMCのin vitroでの刺激およびサイトカインELISA
PBMCは、アフェレーシスにより取得するか、7PPD-、および15PPD+健康体ドナー由来のヘパリン添加血液から精製した。PBMCを2〜2.5 x 105細胞／ウェルで96ウェル組織培養プレートに3重に塗布し、培地、PHA（10μg/ml）、結核菌（Mtb）溶解物（10μg/ml）、または各組換えタンパク質（50μg/ml）と一緒に72時間培養した。上清を回収し、特異的mAb（eBioscience）を製造者のプロトコルに従って用いた二重サンドイッチELISAによりIFN-γについて分析した。
【０４２６】
マウスサイトカインELISPOT
結核菌に感染したマウスからの脾臓を、感染後の様々な時点で採取し、従来の方法により単一の脾細胞懸濁液を取得した。ELISPOTアッセイを用いて、IFN-γまたはTNF発現脾細胞の相対数を決定した。MultiScreen 96ウェルろ過プレート（Millopore、マサチューセッツ州ベッドフォード）に10μg/mlのラット抗マウスIFN-γ、またはTNF、捕獲Ab（eBioscience）をコーティングし、4℃で一晩インキュベートした。プレートをPBSで洗浄し、RPMI 1640および10％FBSを用いて室温で少なくとも1時間遮断してから、再度洗浄した。2 x 105細胞／ウェルで脾細胞を2重に塗布し、特異的rAg（10μg/ml）を用いて37℃で48時間刺激した。次いで、プレートをPBSおよび0.1％Tweenで洗浄し、PBS、0.5％BSA、および0.1％ Tween中5μg/mlのビオチンコンジュゲート型ラット抗マウスIFN-γ、またはTNF、二次Ab（eBioscience）と一緒に、4℃で一晩インキュベートした。製造者のプロトコルに従って、Vectastain ABCアビジンペルオキシダーゼコンジュゲートおよびVectastain AEC基質キット（Vector Laboratories、カリフォルニア州バーリンゲーム）を用いて、フィルターを展開した。脱イオン水でプレートを洗浄することにより反応を停止し、プレートを暗所で乾燥させ、スポットを計数した。
【０４２７】
結果：
ヒトPPD+ PBMCによるMtb組換えタンパク質の認識
Mtb Rv0164、Rv0455、Rv0496、Rv2608、Rv3020、Rv3478、Rv3619、Rv3620、Rv1738、Rv1813、Rv3810、Rv2389、Rv2866、Rv3876、Rv0054、Rv0410、Rv0655、Rv0831、Rv1009、Rv1099、Rv1240、Rv1288、Rv1410、Rv1569、Rv1789、Rv1818、Rv1860、Rv1886、Rv1908、Rv2220、Rv2032、Rv2623、Rv2875、Rv3044、Rv3310、Rv3881、Rv0577、Rv1626、Rv0733、Rv2520、Rv1253、Rv1980、Rv3628、Rv1884、およびRv1511組換えタンパク質と一緒に、PPD+およびPPD-ドナーからのPBMCを72時間培養した。これら組合せ抗原の生産についての説明は本明細書の他所に記載されている。細胞培養上清中のIFN-γの濃度をさらに分析した。
【０４２８】
Rv1908を除き、試験した組換えタンパク質は全て、PPD+ドナー由来のT細胞に提示され、これを活性化して、IFN-γを生産した（図1）。PPD-対照からのPBMCを用いたこれら抗原に対する応答して、バックグラウンドレベルのIFN-γのみが検出された。PPD-対照と比較してPPD+ドナー由来のPBMC培養物には、5〜70倍のIFN-γ濃度の増加が測定されたが、これは、事前に結核菌(Mycobacterium tuberculosis)またはウシ型結核菌(Mycobacterium bovis)に暴露された（BCGでのワクチン接種）ドナー由来のこれら組換えタンパク質の抗原特異的認識を示すものである。
【０４２９】
結核菌感染マウスからの脾細胞によるMtb組換えタンパク質の認識
結核菌H37Rv株での低用量エアロゾル暴露によりマウスを感染させ、感染後の様々な時点で脾臓を採取した。ELISPOTアッセイを用いて、48時間のin vitro培養の間の、Mtb組換えRv0164、Rv0455、Rv0496、Rv2608、Rv3020、Rv3478、Rv3619、Rv3620、Rv1738、Rv1813、Rv3810、Rv2389、Rv2866、Rv0054、Rv0655、Rv0831、Rv1009、Rv1240、Rv1288、Rv1410、Rv1569、Rv1789、Rv1818、Rv1860、Rv1886、Rv1908、Rv2220、Rv2032、Rv2875、Rv3044、Rv3310、Rv3881、Rv0577、Rv1626、Rv0733、Rv1253、Rv1980、Rv3628、Rv1884、Rv3875、Rv1511およびID83タンパク質に応答する、TNF発現脾細胞の相対数を決定した。
【０４３０】
試験した組換えおよび融合タンパク質は全て、感染から28日目（図2、上のパネル）、60日目（データは示していない）、および90日目（図2、下のパネル）で、結核菌感染マウスからのTNF+脾細胞数の増加を誘導した。
【０４３１】
全体として、これらのデータから、マウスの結核菌感染により、Rv0164、Rv0455、Rv0496、Rv2608、Rv3020、Rv3478、Rv3619、Rv3620、Rv1738、Rv1813、Rv3810、Rv2389、Rv2866、Rv0054、Rv0655、Rv0831、Rv1009、Rv1240、Rv1288、Rv1410、Rv1569、Rv1789、Rv1818、Rv1860、Rv1886、Rv1908、Rv2220、Rv2032、Rv2875、Rv3044、Rv3310、Rv3881、Rv0577、Rv1626、Rv0733、Rv1253、Rv1980、Rv3628、Rv1884、Rv1511およびID83タンパク質を含む、Mtbタンパク質に対する免疫応答が誘導されたことがわかる。
【０４３２】
従って、毒性結核菌に自然に暴露されたヒト、ならびに、該結核菌のエアロゾルチャレンジにより感染したマウスは、Mtb溶解物およびPPDに対する再生応答により証明されたように、細菌タンパク質に対する免疫応答を増大した。加えて、in vitro刺激時のRv0164、Rv0455、Rv0496、Rv2608、Rv3020、Rv3478、Rv3619、Rv3620、Rv1738、Rv1813、Rv3810、Rv2389、Rv2866、Rv3876、Rv0054、Rv0410、Rv0655、Rv0831、Rv1009、Rv1099、Rv1240、Rv1288、Rv1410、Rv1569、Rv1789、Rv1818、Rv1860、Rv1886、Rv1908、Rv2220、Rv2032、Rv2623、Rv2875、Rv3044、Rv3310、Rv3881、Rv0577、Rv1626、Rv0733、Rv2520、Rv1253、Rv1980、Rv3628、Rv1884、Rv1511およびID83タンパク質に対するIFN-γおよびTNFサイトカイン応答の増大は、これらの抗原が、（1）事前に暴露された個体（記憶T細胞の存在）により認識される、（2）免疫治療薬として用いることができる、または（3）診断薬として使用できる、ことを示している。
【０４３３】
実施例２２
C57BL/6マウスにおけるMtb抗原に対する免疫応答、ならびにMtbのエアロゾルチャレンジに対する防御
この実施例では、本発明のMtb抗原によるマウスの免疫化が、免疫原性であり、エアロゾル結核菌チャレンジに対する防御を提供できることを実証する。
【０４３４】
材料および方法：
組換え抗原およびアジュバント製剤
上記のように組換えタンパク質を生産した。CpG 1826は、Coley Pharmaceuticals（マサチューセッツ州ウェルズリー）から取得した。
【０４３５】
免疫化
雌のC57BL/6マウスをCharles Riverから取得し、各実験において生齢を合わせた（5〜7週）。25μgのアジュバントCpGと一緒に製剤化した8μgの以下：組換えRv0164（配列番号1）、Rv0496（配列番号6）、Rv2608（配列番号26）、Rv3020（配列番号36）、Rv3478（配列番号41）、Rv3619（配列番号46）、Rv3620（配列番号51）、Rv1738（配列番号11）、Rv1813（配列番号16）、Rv3810（配列番号56）、Rv2389（配列番号21）、Rv2866（配列番号31）、Rv0831（配列番号115）、Rv1288（配列番号127）、Rv1569（配列番号133）、Rv1789（配列番号136）、Rv1818（配列番号139）、Rv1860（配列番号142）、Rv1886（配列番号145）、Rv2220（配列番号154）、Rv2032（配列番号151）、Rv2623（配列番号160）、Rv2875（配列番号163）、Rv3044（配列番号166）、Rv0577（配列番号184）、Rv1626（配列番号187）、Rv0733（配列番号190）、Rv3628（配列番号202）、およびRv1884（配列番号205）タンパク質で3回（3週間置きに）免疫した。生理食塩水、アジュバントのみ、およびBCG対照群のマウスには、それぞれ、3用量のPBS、3用量のアジュバントのみ、または1用量の5 x 104 BCG CFUを受けた。1匹当たり総用量100μlをマウスに皮下注射した。
【０４３６】
サイトカインELISA
最後の追加免疫から3週間後、免疫原性試験用の動物からの脾臓を採取し、従来の方法により脾細胞を取得した。サイトカイン分析のために、2.5 x 105細胞／ウェルで96ウェル組織培養プレートに脾細胞を二重に塗布し、培地、Con A 3μg/ml、PPD（10μg/ml）、Mtb溶解物（10μg/ml）、または各組換えタンパク質（10μg/ml）と一緒に72時間培養した。上清を回収し、特異的mAb（eBioscience）を製造者のプロトコルに従って用いた二重サンドイッチELISAによりIFN-γについて分析した。
【０４３７】
サイトカインELISPOT
MultiScreen 96ウェルろ過プレート（Millopore、マサチューセッツ州ベッドフォード）を10μg/mlのラット抗マウスIFN-γまたはTNF捕獲Ab（eBioscience）でコーティングし、4℃で一晩インキュベートした。プレートをPBSで洗浄し、RPMI 1640および10％FBSを用いて室温で少なくとも1時間遮断し、再度洗浄した。2 x 105細胞／ウェルで脾細胞を二重に塗布し、培地、Con A（3μg/ml）、PPD（10μg/ml）、または各組換えタンパク質（10μg/ml）を用いて37℃で48時間刺激した。次いで、プレートをPBSおよび0.1％Tween-20で洗浄した後、PBS、0.5％BSA、および0.1％Tween-20中5μg/mlのビオチンコンジュゲート型ラット抗マウスIFN-γまたはTNF二次Ab（eBioscience）と一緒に、2時間インキュベートした。製造者のプロトコルに従って、Vectastain ABCアビジンペルオキシダーゼコンジュゲートおよびVectastain AEC基質キット（Vector Laboratories、カリフォルニア州バーリンゲーム）を用いて、フィルターを展開した。脱イオン水でプレートを洗浄することにより反応を停止し、プレートを暗所で乾燥させ、自動化ELISPOTリーダー（C.T.L. Serie3A Analyzer、Cellular Technology Ltd、オハイオ州クリーブランド）でスポットを計数した後、Immunospot（登録商標）（CTL Analyzer LLC）で分析した。
【０４３８】
IgGアイソタイプELISA
最後の免疫化から1週間後、マウスから採血し、血清IgG1およびIgG2c抗体力価を決定した。0.1 M重炭酸塩バッファー中の2μg/mlの組換えタンパク質でNunc-Immuno Polysorbプレートを室温で4時間コーティングし、PBS Tween-20 0.05％ BSA 1％を用いて4℃で一晩遮断し、PBS Tween-20 0.05％で洗浄した後、1:50希釈、次に5倍連続希釈の血清と共に室温で2時間インキュベートし、洗浄し、PBS Tween-20 0.05％ BSA 0.1％中1:2,000の抗IgG1-HRPまたは抗IgG2c-HRPと共に1時間インキュベートした。プレートを洗浄し、SureBlue TMB基質（KPL Inc.、メリーランド州ゲイザーズバーグ）を用いて展開した。酵素反応を1N H2SO4で停止し、マイクロプレートELISAリーダー（Molecular Devices、カリフォルニア州サニーベール）およびSoftMax Pro5を用いて、650 nmの参照フィルター設定で、30分以内に450 nmでプレートを読み取った。カットオフ0.1のGraphPad Prism 4（GraphPad Software Inc., カリフォルニア州サンディエゴ）で終点力価を決定した。
【０４３９】
防御実験
アジュバントCpGを混合したMtb抗原のサブセット由来の各組換えタンパク質8 gでマウスを3週間置きに3回皮下経路で免疫した。正の対照マウスは尾の付け根にBCG（5 x 104 CFU）で免疫し（1回）、負の対照マウスは食塩水、またはアジュバントのみを注射した。最後の免疫から30日後、50〜100の細菌を肺に送達するように調整したUW-Madisonエアロゾル暴露チャンバ（ウィスコンシン州マディソン）を用いて、結核菌H37Rv株（ATCC 35718；American Type Culture Collection、バージニア州マナッサス）の低用量エアロゾル暴露により、マウスをチャレンジした。4週間後、マウスを安楽死させ、PBS/Tween 80（0.05％）中に肺および脾臓ホモジネートを調製した。ニュートリエントMiddlebrook 7H11 Bacto Agar（BD Bioscences、メリーランド州コッキーズビル）上で個々の全器官の段階希釈物を平板培養し、加湿空気および5％CO2下での14日間のインキュベーション後の細菌コロニー形成を計数することにより、細菌数を決定した。データは、回収細菌の平均数±SDのLog10として表し、Log10 CFUの減少＝ワクチン接種群のLog10 CFU−生理食塩水処置群のLog10 CFUである。
【０４４０】
結果：
CpGをアジュバントとして添加した組換えMtb抗原に対する免疫応答
25μgのアジュバントCpGと一緒に製剤化した以下：組換えMtb Rv0164、Rv0455、Rv0496、Rv2608、Rv3020、Rv3478、Rv3619、Rv3620、Rv1738、Rv1813、Rv3810、Rv2389、Rv2866、Rv0831、Rv1818、Rv1886、Rv2032、Rv2623、Rv2875、Rv3044、Rv0577、Rv1626、Rv3628、およびRv1884タンパク質でC57BL/6マウスを3週間置きに3回免疫した。最後の免疫から1週間および3週間後、抗原特異的抗体、および記憶Tリンパ球の存在をそれぞれ評価した。
【０４４１】
各組換えタンパク質をプレートにコーティングし、各血清を段階的に希釈することにより、通常のELISAを用いて、特異的血清IgGアイソタイプAb応答を測定した。IgG2c:IgG1終点力価比を各ワクチン群について決定した（表1）。生理食塩水、CpGアジュバントのみ、またはBCGによる免疫化は、試験したMtb組換えタンパク質のいずれに対しても特異的なIgG1またはIgG2c抗体応答を誘導しなかった（データは示していない）。アジュバントCpG を含むMtb組換えタンパク質の各々による免疫化は、抗原特異的IgG1およびIgG2cを誘導した。
【表２】
2014058520.tif 000027
【０４４２】
最後の免疫から3週間後に、脾細胞を調製し、ELISPOTによりアッセイして、培地のみ、マイトジェンConA、PPD、Mtb溶解物、ならびに各組換えMtbタンパク質に応答するIFN-γまたはTNF発現脾細胞の相対数を決定した。
【０４４３】
生理食塩水、またはCpGアジュバントのみを注射した場合には、組換えタンパク質のいずれかに特異的なIFN-γまたはTNF応答も誘導しなかった（データは示していない）。
【０４４４】
アジュバントCpGと一緒に各組換えMtbタンパク質で免疫すると、活性化脾細胞による抗原特異的IFN-γおよび／またはTNF再生応答を誘導した（表1）。また、Mtb溶解物およびPPDに対するより低いレベルのIFN-γが観察された（データは示していない）が、このことは、これらのタンパク質が微生物溶解物に天然に存在するものであり、部分的に精製された誘導体であることを示している。
【０４４５】
全体として、これらの結果から、CpG中の様々な組換えMtb抗原で免疫することにより、IgG2c、IFN-γおよびTNFが優勢なTh1型記憶応答を誘導したことがわかる。
【０４４６】
Mtb H37Rvでのエアロゾルチャレンジに対して、CpGをアジュバントとして添加した様々なMtb組換えタンパク質によりもたらされる防御
CpGをアジュバントとして含む、以下：Mtb組換えタンパク質Rv0496、Rv2608、Rv3020、Rv3478、Rv3619、Rv3620、Rv1813、Rv1569、Rv1789、Rv1860、Rv1886、Rv2220、Rv2875、Rv3044、Rv0577、Rv1626、およびRv0733でワクチン接種したマウスの肺および脾臓における生存桿菌の数（平均Log10 CFUとして表す）を、約50 CFUの毒性結核菌H37Rvによるエアロゾルチャレンジから4週間後に決定した。様々な組換えタンパク質で免疫したマウスの肺における平均Log10 CFUをプラセボ（生理食塩水）、またはTBに対する現在唯一のワクチンであるBCGを投与したマウスから得た平均Log10 CFUと比較した。生理食塩水群とワクチン接種群における平均Log10 CFUの差をLog10 CFUの減少として表す。
【０４４７】
3用量のRv3478 + CpGまたはRv2608 + CpGでマウスを免疫すると、肺における生存Mtb桿菌の減少が起こり（それぞれ、0.66および0.58）、これは、BCGワクチン接種がもたらしたもの（0.78）に近かった（表2）。また、CpGをアジュバントとして添加した以下：Rv0496、Rv3020、Rv3619、Rv3620、Rv1813、Rv1569、Rv1789、Rv1860、Rv1886、Rv2220、Rv2875、Rv3044、Rv0577、Rv1626、およびRv0733の各々による免疫でも、Mtb感染に対するある程度の防御がもたらされた。CpGアジュバントのみでは、肺の細菌負荷は減少しなかった（−0.09）。
【表３】
2014058520.tif 000028
【０４４８】
これらの結果は、Mtb感染に対する防御レベルがCpGアジュバントを添加した3用量の単一組換えタンパク質で達成された点で驚くべきものであった。
【０４４９】
実施例２３
C57BL/6マウスにおけるMtb抗原の混合物に対する免疫応答、ならびにMtbによるエアロゾルチャレンジに対する防御
この実施例では、本発明のMtb抗原の混合物によるマウスの免疫化が免疫原性であり、エアロゾル結核菌チャレンジに対する防御を提供できることを実証する。
【０４５０】
材料および方法：
組換え抗原およびアジュバント製剤
前記のように組換えタンパク質を作製した。CpG1826はColey Pharmaceuticals（マサチューセッツ州ウェルズリー）から入手した。
【０４５１】
免疫化
雌のC57BL/6マウスをCharles Riverから取得し、各実験において生齢を合わせた（5〜7週）。25μgのアジュバントCpGと一緒に製剤化した6または8μgの組換えRv2608、Rv3620、およびRv1813タンパク質で3回（3週間置きに）マウスを免疫した。アジュバントのみ、およびBCG対照群のマウスには、それぞれ、3用量のアジュバントのみ、または1用量の5 x 104 BCG CFUを投与した。1匹当たり総用量100μlをマウスに皮下経路で注射した。
【０４５２】
サイトカインELISA
最後の追加免疫から3週間後、免疫原性試験用に指定された動物からの脾臓を採取し、従来の方法により脾細胞を取得した。サイトカイン分析のために、2.5 x 105細胞／ウェルで96ウェル組織培養プレートに脾細胞を二重に塗布し、培地、Con A 3μg/ml、PPD（10μg/ml）、Mtb溶解物（10μg/ml）、または各組換えタンパク質（10μg/ml）と一緒に72時間培養した。上清を回収し、特異的mAb（eBioscience）を用いた二重サンドイッチELISA及び製造者のプロトコルによりIFN-γについて分析した。
【０４５３】
サイトカインELISPOT
MultiScreen 96ウェルろ過プレート（Millopore、マサチューセッツ州ベッドフォード）を10μg/mlのラット抗マウスIFN-γまたはTNF捕獲Ab（eBioscience）でコーティングし、4℃で一晩インキュベートした。プレートをPBSで洗浄し、RPMI 1640および10％FBSを用いて室温で少なくとも1時間遮断し、再度洗浄した。2 x 105細胞／ウェルで脾細胞を二重に塗布し、培地、Con A（3μg/ml）、PPD（10μg/ml）、または各組換えタンパク質（10μg/ml）を用いて37℃で48時間刺激した。次いで、プレートをPBSおよび0.1％Tween-20で洗浄し、PBS、0.5％BSA、および0.1％ Tween-20中5μg/mlのビオチンコンジュゲート型ラット抗マウスIFN-γまたはTNF二次Ab（eBioscience）と一緒に、2時間インキュベートした。製造者のプロトコルに従って、Vectastain ABCアビジンペルオキシダーゼコンジュゲートおよびVectastain AEC基質キット（Vector Laboratories、カリフォルニア州バーリンゲーム）を用いて、フィルターを展開した。脱イオン水でプレートを洗浄することにより反応を停止し、プレートを暗所で乾燥させ、自動化ELISPOTリーダー（C.T.L. Serie3A Analyzer、Cellular Technology Ltd、オハイオ州クリーブランド）でスポットを計数し、Immunospot（登録商標）（CTL Analyzer LLC）で分析した。
【０４５４】
IgGアイソタイプELISA
最後の免疫から1週間後、マウスから採血し、血清IgG1およびIgG2c抗体力価を決定した。0.1 M重炭酸塩バッファー中の2μg/mlの組換えタンパク質でNunc-Immuno Polysorbプレートを室温で4時間コーティングし、PBS Tween-20 0.05％ BSA 1％を用いて4℃で一晩遮断し、PBS Tween-20 0.05％で洗浄し、1:50希釈、次に5倍段階希釈の血清と共に室温で2時間インキュベートし、洗浄し、PBS Tween-20 0.05％ BSA 0．1％中1:2,000の抗IgG1-HRPまたは抗IgG2c-HRPと共に1時間インキュベートした。プレートを洗浄し、SureBlue TMB基質（KPL Inc.、メリーランド州ゲイザーズバーグ）を用いて展開した。酵素反応を1N H2SO4で停止し、マイクロプレートELISAリーダー（Molecular Devices、カリフォルニア州サニーベール）およびSoftMax Pro5を用いて、650 nmの参照フィルター設定で、30分以内に450 nmでプレートを読み取った。カットオフ0.1のGraphPad Prism 4（GraphPad Software Inc., カリフォルニア州サンディエゴ）で終点力価を決定した。
【０４５５】
防御実験
アジュバントCpGを混合したMtb抗原のサブセット由来の各組換えタンパク質6または8μgでマウスを3週間置きに3回皮下注射により免疫した。正の対照マウスは尾の付け根にBCG（5 x 104 CFU）で免疫し（1回）、負の対照マウスはアジュバントのみを注射した。最後の免疫から30日後、50〜100の細菌を肺に送達するように調整したUW-Madisonエアロゾル暴露チャンバ（ウィスコンシン州マディソン）を用いて、結核菌H37Rv株（ATCC 35718；American Type Culture Collection、バージニア州マナッサス）の低用量エアロゾル暴露により、マウスをチャレンジした。4週間後、マウスを安楽死させ、PBS/Tween 80（0.05％）中に肺および脾臓ホモジネートを調製した。ニュートリエントMiddlebrook 7H11 Bacto Agar（BD Bioscences、メリーランド州コッキーズビル）上で個々の全器官の連続希釈物を平板培養し、加湿空気および5％CO2下での14日間のインキュベーション後、細菌コロニー形成を計数することにより、細菌数を決定した。データは、回収細菌の平均数±SDのLog10として表し、Log10 CFU減少＝ワクチン接種群のLog10 CFU−生理食塩水処置群のLog10 CFUである。
【０４５６】
結果：
CpGをアジュバントとして添加した組換えMtb抗原の混合物に対する免疫応答
25μgのアジュバントCpGと一緒に製剤化した各組換えMtb Rv2608、Rv3620、Rv1813タンパク質を個別に（8μg）、または混合物（各6μg）として用いて、C57BL/6マウスを3週間置きに3回免疫した。最後の免疫から1週間、3週間後、抗原特異的抗体の存在、ならびに記憶Tリンパ球をそれぞれ評価した。
【０４５７】
各々の組換えタンパク質をプレートに塗布し、各血清を連続的に希釈することにより、通常のELISAを用いて、特異的血清IgGアイソタイプAb応答を測定した。IgG2c終点力価を各ワクチン群について決定した。CpGアジュバントのみ、またはBCG免疫は、試験したMtb組換えタンパク質のいずれかに特異的なIgG1またはIgG2c抗体応答を誘導しなかった（図3B、データは示していない）。アジュバントCpG を含む各Mtb組換えタンパク質で免疫した場合、抗原特異的IgG1（データは示していない）およびIgG2c（図3B）を誘導した。
【０４５８】
最後の免疫から3週間後に、脾細胞を調製し、ELISAまたはELISPOTによりアッセイして、培地のみ、マイトジェンConA、PPD、Mtb溶解物、ならびに組換えMtbタンパク質の各々に応答するIFN-γの相対レベルまたはTNF発現脾細胞の数を決定した。
【０４５９】
CpGアジュバントのみを注射した場合には、組換えタンパク質のいずれかに特異的なIFN-γまたはTNF応答を誘導しなかった（図3C〜D）。
【０４６０】
アジュバントCpGと一緒に各Mtb組換えタンパク質で免疫すると、活性化脾細胞による抗原特異的IFN-γおよびTNF再生応答を誘導した（図3C〜D）。3種の抗原を混合物として用いた場合には、より低いレベルのサイトカイン応答が観察された。
【０４６１】
全体として、これらの結果から、CpG中の、個別に、または混合物としての様々な組換えMtb抗原で免疫することにより、IgG2c、IFN-γおよびTNFが優勢なTh1型記憶応答を誘導したことがわかる。
【０４６２】
Mtb H37Rvのエアロゾルチャレンジに対して、CpGをアジュバントとして添加した様々なMtb組換えタンパク質の混合物によりもたらされる防御
アジュバントとしてCpGを添加したMtb組換えタンパク質Rv2608、Rv3620、およびRv1813を個別に（8μg）、または混合物（各々6μg）としてワクチン接種したマウスの肺において、約50 CFUの毒性結核菌H37Rvによるエアロゾルチャレンジから4週間後に、生存桿菌の数（平均Log 10 CFUとして表す）を決定した。様々な組換えタンパク質で免疫したマウスの肺における平均Log 10 CFUを、アジュバントのみまたはBCG（現在TBに対する唯一のワクチン）を投与したマウスにおいて得られた平均Log 10 CFUと比較した。アジュバント群とワクチン接種群における平均Log10 CFUの差をCFUのLog 10減少として表す。
【０４６３】
3用量のRv2608 + Rv3680 + Rv1813 + CpGでマウスを免疫すると、肺における生存Mtb桿菌の減少が起こり（0.67のCFU減少）、これは、BCGワクチン接種がもたらしたもの（0.71）に近かった（表3A）。また、CpGをアジュバントとして添加したRv2608またはRv1813による免疫でも、Mtb感染に対するある程度の防御がもたらされた（それぞれ、0.24および0.30）。Rv3680 + CpGまたはCpGアジュバント単独の免疫では、肺細菌負荷は減少しなかった。3種のMtb抗原の混合物を注射することにより達成されたCFUの減少は、個々の効果を相加したものより高かった。
【０４６４】
これらの結果は、CpGをアジュバントとして添加した3用量の混合物または3種の組換えタンパク質により、CpGを加えた3用量の個々のタンパク質と比較して、Mtb感染に対する防御レベルが増大したという点で驚くべきものである。
【０４６５】
実施例２４
C57BL/6マウスにおけるID83およびID93融合タンパク質に対する免疫応答、ならびにMtbのエアロゾルチャレンジに対する防御
この実施例では、本発明の融合タンパク質による免疫が免疫原性であり、エアロゾル結核菌チャレンジに対する防御を提供できることを実証する。
【０４６６】
材料および方法：
融合タンパク質およびアジュバント製剤
前記のように組換えタンパク質を作製した。CpG1826はColey Pharmaceuticals（マサチューセッツ州ウェルズリー）から入手した。グルコピラノシルリピドA（GLA）はAvanti（アラバマ州アラバスター）から、またガルジキモド（GDQ）はInvivogen（カリフォルニア州サンディエゴ）から取得した。標準的技術により、安定な水中油型エマルジョン（-SE）を調製した。
【０４６７】
免疫化
雌のC57BL/6マウスをCharles Riverから取得し、各実験において生齢を合わせた（5〜7週）。20μgのアジュバントGLA-SEと一緒に製剤化した8μgのID83およびID93融合タンパク質で、または20〜25μgのアジュバントGLA-SE、GDQ-SE、CpG-SE、GLA/GDQ-SE、GLA/CｐG-SE、CpG/GDQ-SEと一緒に製剤化した8μgのID83融合タンパク質で3回（3週間置きに）マウスを免疫した。生理食塩水、アジュバント単独、およびBCG対照群のマウスには、それぞれ、3用量のPBS、3用量のアジュバント単独、または1用量の5 x 104 BCG CFUを受けた。1匹当たり総用量100μlをマウスに皮下経路で注射した。
【０４６８】
サイトカインELISA
最後の追加免疫から3週間後、免疫原性試験用の動物からの脾臓を採取し、従来の方法により脾細胞を取得した。サイトカイン分析のために、2.5 x 105細胞／ウェルで96ウェル組織培養プレートに脾細胞を二重に塗布し、培地、Con A 3μg/ml、PPD（10μg/ml）、Mtb溶解物（10μg/ml）、または各融合タンパク質（10μg/ml）と一緒に72時間培養した。上清を回収し、特異的mAb（eBioscience）を用い、製造者のプロトコルに従って、二重サンドイッチELISAによりIFN-γについて分析した。
【０４６９】
IgGアイソタイプELISA
最後の免疫から1週間後、マウスから採血し、血清IgG1およびIgG2c抗体力価を決定した。0.1 M重炭酸塩バッファー中の2μg/mlの組換えタンパク質でNunc-Immuno Polysorbプレートを室温で4時間コーティングし、PBS Tween-20 0.05％ BSA 1％を用いて4℃で一晩遮断し、PBS Tween-20 0.05％で洗浄し、1:50希釈、次に5倍段階希釈の血清と共に室温で2時間インキュベートし、洗浄し、PBS Tween-20 0.05％ BSA 0．1％中1:2,000の抗IgG1-HRPまたは抗IgG2c-HRPと共に1時間インキュベートした。プレートを洗浄し、SureBlue TMB基質（KPL Inc.、メリーランド州ゲイザーズバーグ）を用いて展開した。酵素反応を1N H2SO4で停止し、マイクロプレートELISAリーダー（Molecular Devices、カリフォルニア州サニーベール）およびSoftMax Pro5を用いて、650 nmの参照フィルター設定で、30分以内に450 nmでプレートを読み取った。カットオフ0.1のGraphPad Prism 4（GraphPad Software Inc., カリフォルニア州サンディエゴ）で終点力価を決定した。
【０４７０】
防御実験
前記アジュバント中で製剤化した8μgの融合タンパク質で、マウスを3週間置きに3回皮下注射で免疫した。正の対照マウスには尾の付け根にBCG（5 x 104 CFU）で免疫し（1回）、負の対照マウスには生理食塩水、またはアジュバントのみを注射した。最後の免疫から30日後、50〜100の細菌を肺に送達するように調整したUW-Madisonエアロゾル暴露チャンバ（ウィスコンシン州マディソン）を用いて、結核菌H37Rv株（ATCC 35718；American Type Culture Collection、バージニア州マナッサス）の低用量エアロゾル暴露により、マウスをチャレンジした。4週間後、マウスを安楽死させ、PBS/Tween 80（0.05％）中に肺および脾臓ホモジネートを調製した。ニュートリエントMiddlebrook 7H11 Bacto Agar（BD Bioscences、メリーランド州コッキーズビル）上で個々の全器官の段階希釈物を平板培養し、加湿空気および5％CO2下、37℃で14日間のインキュベーション後、細菌コロニー形成を計数することにより、細菌数を決定した。データは、回収細菌の平均数±SDのLog10として表し、Log10 CFUの減少CFU＝ワクチン接種群のLog10 CFU−生理食塩水処置群のLog10 CFUである。
【０４７１】
結果：
GLA-SEをアジュバントとして添加したID83およびID93に対する免疫応答
20μgのアジュバントGLA-SEと一緒に製剤化したID83またはID93融合タンパク質で、C57BL/6マウスを3週間置きに3回免疫した。最後の免疫から1週間、および3週間後、抗原特異的抗体、ぷおび記憶Tリンパ球の存在をそれぞれ評価した。
【０４７２】
各々の組換えタンパク質をプレートにコーティングし、各血清を段階的に希釈することにより、通常のELISAを用いて、特異的血清IgGアイソタイプAb応答を測定した。終点力価を各ワクチン群について決定した。生理食塩水の場合には、ID83またはID93融合タンパク質に特異的なIgG1またはIgG2c抗体応答を誘導せず（図4A）、またGLA-SEアジュバント単独でも誘導しなかった（データは示していない）。アジュバントGLA-SEを含むID83またはID93融合タンパク質で免疫した場合には、抗原特異的IgG1およびIgG2cを誘導した。
【０４７３】
最後の免疫から3週間後に、脾細胞を調製し、ELISAによりアッセイして、培地のみ、マイトジェンConA、および各融合タンパク質に応答して脾細胞により生産されたIFN-γの相対レベルを決定した。
【０４７４】
生理食塩水またはGLA-SEアジュバントのみを注射した場合には、ID83またはID93融合タンパク質に特異的なIFN-γ応答を誘導しなかった（データは示していない）。
【０４７５】
アジュバントGLA-SEと一緒にID83またはID93融合タンパク質で免疫すると、活性化脾細胞による抗原特異的IFN-γ再生応答を誘導した（図4B）。
【０４７６】
全体として、これらの結果は、GLA-SE中の様々な融合タンパク質での免疫が、BおよびT細胞免疫応答を誘導したことを示している。
【０４７７】
様々なアジュバントと一緒に製剤化したID83の免疫原性
20〜25μgのアジュバントGLA-SE、GDQ-SE、CpG-SE、GLA/GDQ-SE、GLA/CpG-SE、CpG/GDQ-SEと一緒に製剤化したID83融合タンパク質で、C57BL/6マウスを3週間置きに3回免疫した。最後の免疫から1週間および3週間後、抗原特異的抗体、および記憶Tリンパ球の存在をそれぞれ評価した。
【０４７８】
各組換えタンパク質をプレートにコーティングし、各血清を段階的に希釈することにより、通常のELISAを用いて、特異的血清IgGアイソタイプAb応答を測定した。終点力価を各ワクチン群について決定した。生理食塩水の場合には、ID83融合タンパク質に特異的なIgG1またはIgG2c抗体応答を誘導しなかった。各アジュバントを含むID83で免疫した場合、抗原特異的IgG1およびIgG2cを誘導した（図5A）。
【０４７９】
最後の免疫から3週間後に、脾細胞を調製し、ELISAによりアッセイして、培地のみ、マイトジェンConA、およびID83融合タンパク質に応答して脾細胞により生産されたIFN-γの相対レベルを決定した。
【０４８０】
生理食塩水を注射した場合には、ID83融合タンパク質に特異的なIFN-γ応答を誘導しなかった。様々なアジュバントと一緒にID83融合タンパク質で免疫すると、活性化脾細胞による抗原特異的IFN-γ再生応答を誘導した（図5B）。
【０４８１】
全体として、これらの結果は、様々なアジュバント中のID83融合タンパク質での免疫が、BおよびT細胞免疫応答を誘導したことを示している。
【０４８２】
Mtb H37Rvのエアロゾルチャレンジに対して、アジュバントGLA-SEと一緒に製剤化したID83およびID93融合タンパク質によりもたらされる防御
GLA-SEをアジュバントとして添加したID83またはID93融合タンパク質をワクチン接種したマウスの肺において、約50 CFUの毒性結核菌H37Rvのエアロゾルチャレンジから4週間後に、生存桿菌の数（平均Log 10 CFUとして表す）を決定した。
【０４８３】
様々な融合タンパク質で免疫したマウスの肺における平均Log 10 CFUを、プラセボ（生理食塩水）またはBCG投与マウスにおいて得られた平均Log 10 CFUと比較した。生理食塩水群とワクチン接種群における平均Log10 CFUの差をCFUのLog 10減少として表す。
【０４８４】
3用量のID83 + GLA-SEまたはID93 + GLA-SEでマウスを免疫すると、Mtb感染マウスの肺における生存Mtb桿菌の減少が起こった（それぞれ0.34、0.48 Log10）（表3）。これらの結果は、GLA-SEをアジュバントとして添加した3用量の2種の異なる融合タンパク質により、Mtb感染に対する防御が達成されたことを実証するものである。
【表４】
2014058520.tif 000029
【０４８５】
Mtb H37Rvのエアロゾルチャレンジに対して、様々なアジュバントと一緒に製剤化したID83によりC57BL/6マウスにもたらされる防御
20〜25μgのアジュバントGLA-SE、CpG-SE、またはGLA/CpG-SEと一緒に製剤化したID83融合タンパク質をワクチン接種したマウスの肺において、約50 CFUの毒性結核菌H37Rvを用いたエアロゾルチャレンジから4週間後に、生存桿菌の数（平均Log 10 CFUとして表す）を決定した。
【０４８６】
様々なアジュバント中のID83で免疫したマウスの肺における平均Log 10 CFUを、プラセボ（生理食塩水）またはBCG投与マウスにおいて得られた平均Log 10 CFUと比較した。生理食塩水群とワクチン接種群における平均Log10 CFUの差をCFUのLog10減少として表す。
【０４８７】
様々なアジュバントを含む3用量のID83でマウスを免疫すると、Mtb感染マウスの肺における生存Mtb桿菌の減少が起こった（表4）。これらの結果は、GLA-SE をアジュバントとして含む3用量の2種の異なる融合タンパク質により、Mtb感染に対する防御が達成された点で有望である。
【表５】
2014058520.tif 000030
【０４８８】
全体として、これらの結果から、アジュバントとしてCpG-SE、GLA-SE、またはCpG/GLA-SEを加えたID83融合タンパク質による免疫化により、細菌負荷を低減し、マウスを結核菌感染から部分的に防御したことがわかる。Mtb感染マウスの肺における生存桿菌の数の減少には、ID83 + CpG/GLA-SEが最も有効な製剤であった。
【０４８９】
Mtb H37Rvのエアロゾルチャレンジに対して、GLA/CpG-SEと一緒に製剤化したID83によりモルモットにもたらされる防御
20／25μgのアジュバントGLA/CpG-SEと一緒に製剤化したID83融合タンパク質をワクチン接種したモルモットの生存を、約50 CFUの毒性結核菌H37Rvを用いたエアロゾルチャレンジから200日間追跡した。
【０４９０】
GLA/CpG-SEアジュバント中のID83で免疫したモルモットの生存率を、プラセボ（生理食塩水）またはBCG投与モルモットの生存率と比較した。
【０４９１】
様々なアジュバントを含む3用量のID83でモルモットを免疫すると、Mtb感染モルモットの生存率が増加した（表6）。感染から200日後、ID83 + GLA/CpG-SEでワクチン接種したモルモットの75％がまだ生存していたのに対し、プラセボ群の生存は25％であった。BCGで免疫したモルモットの62％がMtb感染から200日後に生存していた。
【０４９２】
これらの結果は、GLA/CpG-SE と一緒に製剤化したID83融合タンパク質3用量で、Mtb感染に対する防御が達成されたことを実証するものである。さらに、ID83 + GLA/CpG-SEを用いたワクチン接種は、BCGより長くMtb感染モルモットを防御した。
【０４９３】
全体として、これらの結果から、アジュバントとしてCpG-SE、GLA-SE、またはCpG/GLA-SEを含むID83融合タンパク質によるワクチン接種は、Mtb感染マウスの肺における細菌負荷を低減し、モルモットを結核菌感染から部分的に防御したことがわかる。Mtb感染マウスの肺における生存桿菌の数を減少させて、Mtb感染モルモットの生存を延長させる上で、ID83 + CpG/GLA-SEが最も有効な製剤であった。
【０４９４】
GLA-SEをアジュバントとして加えた3用量のID83またはID93融合タンパク質によるマウスのワクチン接種は、結核菌感染マウスの肺における生存桿菌数の減少に応じて、抗体およびTh1 T細胞記憶応答を誘導した。さらに、CpGとGLA-SEの組合せは、最も免疫原性が高いことが観察され、結核菌チャレンジに対する防御の増大をもたらした。
【０４９５】
実施例２５
C57BL/6マウスにおけるAD5-ID83に対する免疫応答、ならびにエアロゾル結核菌チャレンジに対する防御
この実施例は、本発明のID83融合タンパク質を発現すべく操作されたアデノウイルスベクターによるマウスの免疫が、C57BL/6マウスにおいて免疫原性であることを実証するものである。
【０４９６】
材料および方法：
ウイルス構築および精製
AdEasy（商標）XL AdenoviralVector System（Stratagene #240010）を用いて、Ad5-ID83を構築した。手短には、PCRを用いて、プラスミドDNAからID83を増幅し、HinDIIIおよびEcoRVで消化し、pShuttle-CMVに連結して、ID83-pShuttleCMVを作製した。PmeIで消化することにより、ID83-pShuttleCMVを線状にし、大腸菌BJ5183-AD-1エレクトロコンピテントセル（Stratagene #200157）にエレクトロポレートした（2.4kV、186Ω、0.2cm ギャップキュベット）。PacIで消化することにより、組換えAd5-ID83プラスミドを同定した。Polyfect試薬（Invitrogen #301107）を用いて、60mmプレート中で、AD-239細胞にPacIで消化したAd5-ID83プラスミド（4μg）をトランスフェクトした。4日後、3mL媒地中に細胞を回収し、3サイクルの凍結／解凍により細胞を溶解させた。溶解物上清を、CsCl勾配遠心分離による精製用のウイルスを増幅するために用いた。
【０４９７】
免疫化
雌のC57BL/6マウスをCharles Riverから取得し、各実験において生齢を合わせた（5〜7週）。5 x 108  Ad5-ID83ウイルス粒子で2回（3週間置きに）マウスを免疫した。生理食塩水、およびBCG対照群のマウスには、PBS、または1用量の5 x 104 BCG CFUをそれぞれ投与した。1匹当たり総用量100μlをマウスに筋内経路で注射した。
【０４９８】
サイトカインELISPOT
MultiScreen 96ウェルろ過プレート（Millopore、マサチューセッツ州ベッドフォード）を10μg/mlのラット抗マウスIFN-γまたはTNF捕獲Ab（eBioscience）でコーティングしてから、4℃で一晩インキュベートした。プレートをPBSで洗浄し、RPMI 1640および10％FBSを用いて室温で少なくとも1時間遮断し、再度洗浄した。2 x 105細胞／ウェルで脾細胞を二重に塗布し、培地、Con A（3μg/ml）、PPD（10μg/ml）、または各組換えタンパク質（10μg/ml）を用いて37℃で48時間刺激した。次いで、プレートをPBSおよび0.1％Tween-20で洗浄し、PBS、0.5％BSA、および0.1％ Tween-20中5μg/mlのビオチンコンジュゲート型ラット抗マウスIFN-γまたはTNF二次Ab（eBioscience）と一緒に、2時間インキュベートした。製造者のプロトコルに従って、Vectastain ABCアビジンペルオキシダーゼコンジュゲートおよびVectastain AEC基質キット（Vector Laboratories、カリフォルニア州バーリンゲーム）を用いて、フィルターを展開した。脱イオン水でプレートを洗浄することにより反応を停止し、プレートを暗所で乾燥させ、自動化ELISPOTリーダー（C.T.L. Serie3A Analyzer、Cellular Technology Ltd、オハイオ州クリーブランド）でスポットを計数した後、Immunospot（登録商標）（CTL Analyzer LLC）で分析した。
【０４９９】
防御実験
前記アジュバント中で製剤化した8μgの融合タンパク質でマウスを3週間置きに3回皮下注射で免疫した。正の対照マウスは尾の付け根にBCG（5 x 104 CFU）で免疫し（1回）、負の対照マウスには生理食塩水、またはアジュバントのみを注射した。最後の免疫から30日後、50〜100の細菌を肺に送達するように調整したUW-Madisonエアロゾル暴露チャンバ（ウィスコンシン州マディソン）を用いて、結核菌H37Rv株（ATCC 35718；American Type Culture Collection、バージニア州マナッサス）の低用量エアロゾル暴露により、マウスをチャレンジした。4週間後、マウスを安楽死させ、PBS/Tween 80（0.05％）中に肺および脾臓ホモジネートを調製した。ニュートリエントMiddlebrook 7H11 Bacto Agar（BD Bioscences、メリーランド州コッキーズビル）上で個々の全器官の段階希釈物を平板培養し、加湿空気および5％CO2下、37℃で14日間のインキュベーション後、細菌コロニー形成を計数することにより、細菌数を決定した。データは、回収細菌の平均数±SDのLog10として表し、Log10 CFUの減少＝ワクチン接種群のLog10 CFU−生理食塩水処置群のLog10 CFUである。
【０５００】
結果：
Ad5-ID83に対する免疫応答
C57BL/6マウスをAd5-ID83で3週間置きに2回免疫した。
【０５０１】
最後の免疫から3週間後に、脾細胞を調製し、ELISPOTによりアッセイして、媒地のみ、マイトジェンConA、および融合タンパク質の各々に応答するIFN-γ発現脾細胞の相対数を決定した。
【０５０２】
Ad5-ID83で免疫すると、活性化脾細胞による抗原特異的IFN-γ再生応答を誘導した（図7A）。生理食塩水を注射した場合には、ID83に特異的なIFN-γ応答を誘導しなかった。
【０５０３】
Mtb H37Rvのエアロゾルチャレンジに対して、Ad5-ID83によりもたらされる防御
5 x 108個のAd5-ID83ウイルス粒子をワクチン接種したマウスの肺において、約50 CFUの毒性結核菌H37Rvを用いたエアロゾルチャレンジから4週間後に、生存桿菌の数（平均Log 10 CFUとして表す）を決定した。
【０５０４】
Ad5-ID83で免疫したマウスの肺における平均Log 10 CFUを、プラセボ（生理食塩水）を投与したマウスにおいて得られた平均Log 10 CFUと比較した。生理食塩水群とワクチン接種群との平均Log10 CFUの差をLog 10 CFUの減少として表す。
【０５０５】
2用量のAd5-ID83でマウスを免疫すると、Mtb感染マウスの肺における生存Mtb桿菌の0.27の減少が起こった（表7B）。これらの結果は、わずか2用量のAd5-ID83でMtb感染に対する防御が達成されたという点で有望である。
【０５０６】
全体として、これらの結果から、Ad5-ID83による免疫が、T細胞免疫応答を誘導し、結核菌エアロゾルチャレンジからマウスを部分的に防御したことがわかる。
【０５０７】
実施例２６
アジュバントGLA-SEを含むMtb Rv1813、Rv2608、およびRv3620組換えタンパク質による免疫療法
この実施例では、標準的抗生物質療法と併用した本発明の組換えタンパク質の混合物によるマウスの免疫化により、結核菌感染マウスの寿命を延長できることを実証する。
【０５０８】
材料および方法：
組換えタンパク質およびアジュバント製剤
前記のように組換えタンパク質を作製した。グルコピラノシルリピドA（GLA）はAvanti（アラバマ州アラバスター）から取得した。安定な水中油型エマルション（-SE）を調製した。
【０５０９】
結核菌によるエアロゾルチャレンジ
雌のSWR/JマウスをJackson Laboratoriesから取得し、各実験において生齢を合わせた（5〜7週）。50〜100の細菌を肺に送達するように調整したUW-Madisonエアロゾル暴露チャンバ（ウィスコンシン州マディソン）を用いて、結核菌H37Rv株（ATCC 35718；American Type Culture Collection、バージニア州マナッサス）の低用量エアロゾル暴露により、マウスをチャレンジした。感染から225日間、マウスの生存をモニターした。
【０５１０】
治療
結核菌によるエアロゾルチャレンジから2週間後、標準的抗生物質療法を開始した。飲用水に50 mg/lのリファンピンと85 mg/lのイソニアジドを添加して、これらをマウスに60日間与えた。いくつかのマウスにはさらに免疫療法を施し、感染から76日、97日、および118日後、20μgのアジュバントGLA-SEと一緒に製剤化したRv1813、Rv2608、およびRv3620組換えタンパク質各々6μgでこれらのマウスを免疫した。1匹当たり総量100μlをマウスに皮下経路で注射した。マウスの生存を225日間モニターした。
【０５１１】
結果：
結核菌感染マウスにおける、抗生物質と、GLA-SE含有Rv1813、Rv2608、およびRv3620免疫療法との併用によりもたらされる防御
リファンピン＋イソイアジド抗生物質の標準的レジメン（Rx）、またはRxと、20μgのアジュバントGLA-SEと一緒に製剤化したRv1813、Rv2608、およびRv3620組換えタンパク質による免疫（免疫療法）との併用療法、を用いて治療したMtb感染マウスの生存を、約50 CFUの毒性結核菌H37Rvによるエアロゾルチャレンジから225日間追跡した。
【０５１２】
Rx＋免疫療法で治療したマウスの生存をRxのみまたはプラセボ（生理食塩水）を受けたマウスの生存と比較した。
【０５１３】
Rxに加えて、GLA-SEを含む3用量のRv1813、Rv2608、およびRv3620組換えタンパク質を用いたマウスの治療により、Mtb感染マウスの生存率が増加した（表8）。感染から225日後、抗生物質（Rx）単独療法群のマウス0％、およびプラセボ群のマウス0％と比較して、GLA-SEを含むRv1813、Rv2608、およびRv3620をワクチン接種したマウスの75％がまだ生存していた。
【０５１４】
これらの結果は、抗生物質と、GLA-SEを含む3用量のRv1813、Rv2608、およびRv3620とにより、Mtb感染に対する防御が達成されたことを実証するものである。加えて、抗生物質と、GLA-SE含有Rv1813、Rv2608、およびRv3620とを用いた治療では、抗生物質単独の場合より長くMtb感染マウスを防御した。
【０５１５】
全体として、これらの結果は、抗生物質と併用したGLA-SE含有Rv1813、Rv2608、およびRv3620による免疫療法が免疫応答を誘導し、この免疫応答が、マウスが樹立した結核菌感染を制御するのを手助けしたことを示す。
【０５１６】
実施例２７
結核の血清学的診断
この実施例では、結核菌感染の血清学的診断のための感度および特異性が増大した結核菌抗原および抗原融合物を同定する。
【０５１７】
重炭酸塩バッファー中の2μg/mlの組換え抗原をPolysorb 96ウェルプレート（Nunc、ニューヨーク州ロチェスター）に4℃で一晩コーティングし、プレート振盪機上で、1％（w/v）BSA含有PBSTを用いて室温で2時間遮断した。0.1％BSAを含むPBSTに血清を約1/200まで希釈し、各ウェルに加えて、プレートを振盪しながら、室温で2時間インキュベートした。0.1％BSAを含むPBSTでプレートを洗浄後、HRPコンジュゲート型IgG免疫グロブリン（Sigma、ミズリー州セントルイス）をPBSTおよび0.1％BSA中に1:10000希釈してから各ウェルに添加し、振盪しながら室温で60分インキュベートした。プレートを洗浄してから、ペルオキシダーゼ用発色基質（KPL、メリーランド州バルチモア）で展開し、10分後、1N H2SO4の添加により反応をクエンチした。VERSAmax（登録商標）マイクロプレートリーダー（Molecular Devices、カリフォルニア州サニーベール）を用いて、450〜570 nmで各ウェルの補正光学密度を読み取った。
【０５１８】
これら実験の結果を図9にまとめる。喀痰陽性で、結核が確認された血清サンプル（TB、N＝80〜92）のパネルと、結核陰性の健康な対照血清（NEC、N＝40〜46）のパネルを選択結核抗原との反応性について分析した。事前に特性決定した抗原TBF10を陽性対照として用いて、92の結核陽性血清サンプルのうち53に血清陽性応答をもたらすことがわかった。個々の抗原の反応性を図9に示すが、記載した抗原の全てが結核血清サンプルの11〜82に対する反応性を呈示し、健康な対照に対して反応性は低いか、皆無であった。血清パネルに対する所与の抗原の反応性は異なっていたため、適切な抗原の組合せの選択により100％陽性応答が得られた。
【０５１９】
実施例２８
組換えRv0577のクローニングおよび発現
H37RvゲノムDNAを鋳型として使用し、以下のプライマーを用いて、Rv0577をPCR増幅した：
【化２４】
2014058520.tif 000031
【０５２０】
94℃で0.5分、55℃で0.5分、68℃で2分を30サイクルの条件で増幅を実施することにより、配列番号185に記載する産物を取得した。PCR産物をNdeI/HindIIIで消化し、pET 28.aベクターにクローニングした。Rv0733を宿主株BL-21plysSにより発現させた。変性条件下で、上清をNi樹脂と結合させた。Ni-NTA精製後、アニオン交換精製を実施した。20 mM Tris pH 8.0で透析した。組換えタンパク質のアミノ酸配列を配列番号186に記載する。
【０５２１】
実施例２９
組換えRv1626のクローニングおよび発現
H37RvゲノムDNAを鋳型として使用し、以下のプライマーを用いてRv1626をPCR増幅した：
【化２５】
2014058520.tif 000032
【化２６】
2014058520.tif 000033
【０５２２】
94℃で0.5分、55℃で0.5分、68℃で2分を30サイクルの条件で、増幅を実施することにより、配列番号188に記載する産物を取得した。PCR産物をNdeI/HindIIIで消化し、pET 28.aベクターにクローニングした。Rv1626を宿主株BL-21plysSにより発現させた。変性条件下で、上清をNi樹脂と結合させた。Ni-NTA精製後、アニオン交換精製を実施した。20 mM Tris pH 8で透析した。組換えタンパク質のアミノ酸配列を配列番号189に記載する。
【０５２３】
実施例３０
組換えRv0733のクローニングおよび発現
H37RvゲノムDNAを鋳型として使用し、以下のプライマーを用いてRv0733をPCR増幅した：
【化２７】
2014058520.tif 000034
【０５２４】
94℃で0.5分、55℃で0.5分、68℃で2分を30サイクルの条件で、増幅を実施することにより、配列番号191に記載する産物を取得した。PCR産物をNdeI/HindIIIで消化し、pET 28.aベクターにクローニングした。Rv0733を宿主株BL-21plysSにより発現させた。変性条件下で、上清をNi樹脂と結合させた。Ni-NTA精製後、アニオン交換精製を実施した。20 mM Tris pH 8で透析した。組換えタンパク質のアミノ酸配列を配列番号192に記載する。
【０５２５】
実施例３１
組換えRv2520のクローニングおよび発現
H37RvゲノムDNAを鋳型として使用し、以下のプライマーを用いてRv2520をPCR増幅した：
【化２８】
2014058520.tif 000035
【０５２６】
94℃で0.5分、55℃で0.5分、68℃で2分を30サイクルの条件で、増幅を実施することにより、配列番号194に記載する産物を取得した。PCR産物をNdeI/EcoRIで消化し、上流6位のヒスチジンおよび5'リンカー配列を欠失した改変pET 28aにクローニングした。Rv2520を発現宿主BL-21plysSおよびRosetta pLysSに形質転換した。両者は同等に発現したが、BL-21plysS細胞株で続行した。細胞溶解後、変性条件下で、上清画分をNi-NTA樹脂と結合させた。Ni-NTA精製後、アニオン交換精製を実施した。精製画分を20 mM Tris pH 8で透析した。組換えタンパク質のアミノ酸配列を配列番号195に記載する。
【０５２７】
実施例３２
組換えRv1253のクローニングおよび発現
H37RvゲノムDNAを鋳型として使用し、以下のプライマーを用いてRv1253をPCR増幅した：
【化２９】
2014058520.tif 000036
【化３０】
2014058520.tif 000037
【０５２８】
94℃で0.5分、55℃で0.5分、68℃で2分を30サイクルの条件で、増幅を実施することにより、配列番号197に記載する産物を取得した。PCR産物をNdeI/EcoRIIで消化し、pET 28.aベクターにクローニングした。Rv1511を発現宿主Rosetta pLysSに形質転換した。1L誘導物の溶解後、組換えタンパク質を封入体ペレットにおいて発現させた。変性条件下でNi-NTAアフィニティー精製を実施してから、20 mM Tris pH 8.0に対して透析した。組換えタンパク質のアミノ酸配列を配列番号198に記載する。
【０５２９】
実施例３３
組換えRv1980のクローニングおよび発現
H37RvゲノムDNAを鋳型として使用し、以下のプライマーを用いてRv1980をPCR増幅した：
【化３１】
2014058520.tif 000038
【０５３０】
94℃で0.5分、55℃で0.5分、68℃で2分を30サイクルの条件で、増幅を実施することにより、配列番号200に記載する産物を取得した。PCR産物をNdeI/HindIIIで消化し、pET 28.aベクターにクローニングした。Rv1980を発現宿主Rosetta pLysSに形質転換した。1L誘導物の溶解後、組換えタンパク質を封入体ペレットにおいて発現させた。変性条件下でNi-NTAアフィニティー精製を実施してから、20 mM Tris pH 8.0に対して透析した。組換えタンパク質のアミノ酸配列を配列番号201に記載する。
【０５３１】
実施例３４
組換えRv3628のクローニングおよび発現
H37RvゲノムDNAを鋳型として使用し、以下のプライマーを用いてRv3628をPCR増幅した：
【化３２】
2014058520.tif 000039
【０５３２】
94℃で0.5分、55℃で0.5分、68℃で2分を30サイクルの条件下で、増幅を実施することにより、配列番号203に記載する産物を取得した。H37RvゲノムDNAを鋳型として使用し、95℃で1分、58℃で1分、72℃で1.5分を35サイクルの条件で、Rv3628をPCR増幅した。PCR産物をNdeI/EcoRIで消化し、pET 17bにクローニングした。Rv3628を発現宿主BL-21plysEおよびRosetta plysSに形質転換した。両者は同等に発現したが、plysE構築物で続行した。1L誘導物の溶解後、これは封入体になった。変性条件下で、Ni-NTAを実施した後、10 mM Tris pH 8.0に対して透析した。組換えタンパク質のアミノ酸配列を配列番号204に記載する。
【０５３３】
実施例３５
組換えRv1844のクローニングおよび発現
H37RvゲノムDNAを鋳型として使用し、以下のプライマーを用いてRv1844をPCR増幅した：
【化３３】
2014058520.tif 000040
【化３４】
2014058520.tif 000041
【０５３４】
94℃で0.5分、55℃で0.5分、68℃で2分を30サイクルの条件下で、増幅を実施することにより、配列番号206に記載する産物を取得した。PCR産物をNdeI/EcoRIで消化し、pET 17bにクローニングした。Rv1884遺伝子を含むプラスミドを発現宿主BL-21plysEおよびpLysSに形質転換した。両者は同等に発現したが、plysEで続行した。1L誘導物の溶解後、これは不溶性封入体画分中に残った。変性条件下で、Ni-NTAを実施した後、10 mM Tris pH 8.0に対して透析した。組換えタンパク質のアミノ酸配列を配列番号207に記載する。
【０５３５】
実施例３６
組換えRv3872のクローニングおよび発現
H37RvゲノムDNAを鋳型として使用し、以下のプライマーを用いてRv3872をPCR増幅した：
【化３５】
2014058520.tif 000042
【０５３６】
94℃で0.5分、55℃で0.5分、68℃で2分を30サイクルの条件下で、増幅を実施することにより、配列番号209に記載する産物を取得した。PCR産物をNdeI/HindIIIで消化し、pET28.aベクターにクローニングした。Rv3872を発現宿主Rosetta pLysSに形質転換した。1L誘導物の溶解後、組換えタンパク質を可溶性上清画分において発現させた。天然の条件下でNi-NTAアフィニティー精製を2回実施してから、20 mM Tris pH 8.0に対して透析した。組換えタンパク質のアミノ酸配列を配列番号210に記載する。
【０５３７】
実施例３７
組換えRv3873のクローニングおよび発現
H37RvゲノムDNAを鋳型として使用し、以下のプライマーを用いてRv3873をPCR増幅した：
【化３６】
2014058520.tif 000043
【０５３８】
94℃で0.5分、55℃で0.5分、68℃で2分を30サイクルの条件下で、増幅を実施することにより、配列番号212に記載する産物を取得した。PCR産物をNdeI/HindIIIで消化し、pET28aベクターにクローニングした。Rv3873遺伝子を含むプラスミドを、発現宿主Rosetta pLysSに形質転換した。1L誘導物の溶解後、組換えタンパク質を可溶性上清画分において発現させた。天然の条件下でNi-NTAアフィニティー精製を2回実施してから、20 mM Tris pH 8.0に対して透析した。組換えタンパク質のアミノ酸配列を配列番号213に記載する。
【０５３９】
実施例３８
組換えRv1511のクローニングおよび発現
H37RvゲノムDNAを鋳型として使用し、以下のプライマーを用いてRv1511をPCR増幅した：
【化３７】
2014058520.tif 000044
【０５４０】
94℃で0.5分、55℃で0.5分、68℃で2分を30サイクルの条件下で、増幅を実施することにより、配列番号214に記載する産物を取得した。PCR産物をNdeI/EcoRIで消化し、5'リンカーのないpET28aにクローニングした。Rv1511を発現宿主BL-21plysSおよびRosetta pLysSに形質転換した。両者は同等に発現したが、BL-21細胞で続行した。1L誘導物の溶解後、組換えタンパク質を封入体ペレットに発現させた。変性条件下で、Ni-NTAアフィニティー精製を実施した後、10 mM Tris pH 9.5に対して透析した。組換えタンパク質のアミノ酸配列を配列番号215に記載する。
【０５４１】
実施例３９
組換え融合タンパク質ID93のクローニングおよび発現
Rv3619、Rv1813、Rv3620およびRv2608由来の融合パートナーを含む融合構築物ID93のクローニングのために、以下のプライマーを用いた：
【化３８】
2014058520.tif 000045
【化３９】
2014058520.tif 000046
【０５４２】
Rv1813およびRv3620をH37Rvゲノム鋳型DNAからPCR増幅した（94℃で0:30；58℃で0:30、58℃で1:30、35サイクル）。Rv1813をNdeI/SacIで消化した後、pET28.aベクターにクローニングした。Rv3620をSacI/SaIIで消化し、Rv1813pET構築物に連結した。融合構築物は、配列番号217に記載のポリヌクレオチド配列を有し、この配列は、配列番号226に記載の融合タンパク質をコードする。PCR（94℃で0:30；58℃で0:30、68℃で1:30、35サイクル）によりプラスミド鋳型からRv2608を増幅した。産物をSaII/HindIIIで消化し、pET28.a-Rv1813-3620ベクターにクローニングした。Rv3619を上記と同様に増幅し、NdeI/KpnIで消化した後、ID83ベクターに連結した。ID93を宿主BL-21plysSに発現させた（2L、2XYT増殖培地、37℃）。OD 0.77で、1mM IPTGを用いて誘導し、OD 1.93で回収した。細胞ペレットを溶解バッファー（20mM Tris pH8、100mM NaCl、2mM PMSF）中に懸濁し、凍結させた。次に細胞ペレットを解凍し、超音波処理により溶解し、7,000 rcfで20分スピンさせた。ID83は封入体タンパク質である。ペレットを1％Chapsで2回洗浄した。ペレットを結合バッファー（8M尿素、20mM Tris pH8、100mM NaCl）中に60 mL溶解させ、室温で1時間16 mL Ni-NTA樹脂に結合させた。樹脂を洗浄（50 mL 0.5％DOCで20分、80 mL 60％IPAで30分、50 mL 0.5％DOCですすぎ）した後、300 mMイミダゾールを含む結合バッファーで溶出した。最初の結合物からの上清を追加の8 mL樹脂に結合させ、前記と同様に処理した。前記の精製により、分解産物を除去した。32 mL樹脂を含む160 mL（50 mM NaClを含む結合バッファー）において、もう一度Ni-NTA結合を4℃で一晩実施した。樹脂を洗浄し、前記と同様に溶出した。この結合物からの画分を20 mM Tris pH 8.0において透析した。
【０５４３】
実施例４０
組換え融合タンパク質ID91のクローニングおよび発現
Rv3619、Rv2389、Rv3478およびRv1886由来の融合パートナーを含む融合構築物ID91のクローニングのために、以下のプライマーを用いた：
【化４０】
2014058520.tif 000047
【０５４４】
融合構築物は、配列番号227に記載のポリヌクレオチド配列を有し、この配列は、配列番号236に記載の融合タンパク質をコードする。
【０５４５】
実施例４１
組換え融合タンパク質ID71のクローニングおよび発現
Rv3619、Rv2389、Rv3478（N180）およびRv1886由来の融合パートナーを含む融合構築物ID71のクローニングのために、以下のプライマーを用いた：
【化４１】
2014058520.tif 000048
【０５４６】
融合構築物は、配列番号237に記載のポリヌクレオチド配列を有し、この配列は、配列番号245に記載の融合タンパク質をコードする。
【０５４７】
実施例４２
組換え融合タンパク質ID114のクローニングおよび発現
Rv1813、Rv3620、Rv2608およびRv1886由来の融合パートナーを含む融合構築物ID114のクローニングのために、以下のプライマーを用いた：
【化４２】
2014058520.tif 000049
【０５４８】
Rv1813およびRv3620をH37Rvゲノム鋳型DNAからPCR増幅した（94℃で0:30、58℃で0:30、58℃で1:30、35サイクル）。融合構築物は、配列番号246に記載のポリヌクレオチド配列を有し、この配列は、配列番号251に記載の融合タンパク質をコードする。
【０５４９】
実施例４３
組換え融合タンパク質ID125のクローニングおよび発現
Rv3619、Rv1813、Rv3620、Rv2608およびRv1886由来の融合パートナーを含む融合構築物ID125のクローニングのために、以下のプライマーを用いた：
【化４３】
2014058520.tif 000050
【化４４】
2014058520.tif 000051
【０５５０】
融合構築物は、配列番号252に記載のポリヌクレオチド配列を有し、この配列は、配列番号257に記載の融合タンパク質をコードする。
【０５５１】
実施例４４
組換え融合タンパク質DID85のクローニングおよび発現
Rv2032、Rv2875、およびRv0831由来の融合パートナーを含む融合構築物DID85のクローニングのために、以下のプライマーを用いた：
【化４５】
2014058520.tif 000052
【化４６】
2014058520.tif 000053
【０５５２】
上記プライマー配列を用いて、Rv2032、Rv2875、およびRv0831の遺伝子を既存のプラスミドDNAからPCR増幅した（94℃で0:30、58℃で0:30、58℃で1:30、30サイクル）。3つの増幅PCR産物を第2ラウンドのPCRに用いて、5'-Rv2032-NdeI-6hisおよび3'-Rv0831R-HindIIIプライマーを用いて、全長融合遺伝子産物を増幅した。得られたPCR産物をNdeI/ HindIIIで消化し、pET29aベクターにクローニングした。DID85を宿主株BL-21plysSにより発現した。融合構築物は、配列番号258に記載のポリヌクレオチド配列を有し、この配列は、配列番号265に記載の融合タンパク質をコードする。1L誘導物の溶解後、これは封入体ペレットになった。変性条件下で、Ni-NTAを実施した後、アニオン交換クロマトグラフィーを実施した。精製画分を10 mM Tris pH 8.0に対して透析した。
【０５５３】
実施例４５
組換え融合タンパク質DID92のクローニングおよび発現
Rv3044、Rv1009、およびRv0614由来の融合パートナーを含む融合構築物DID92のクローニングのために、以下のプライマーを用いた：
【化４７】
2014058520.tif 000054
【化４８】
2014058520.tif 000055
【０５５４】
融合構築物は、配列番号266に記載のポリヌクレオチド配列を有し、この配列は、配列番号273に記載の融合タンパク質をコードする。
【０５５５】
実施例４６
組換え融合タンパク質DID108のクローニングおよび発現
Rv3872、Rv3873、Rv3875およびRv3881由来の融合パートナーを含む融合構築物DID108のクローニングのために、以下のプライマーを用いた：
【化４９】
2014058520.tif 000056
【化５０】
2014058520.tif 000057
【０５５６】
融合構築物は、配列番号274に記載のポリヌクレオチド配列を有し、この配列は、配列番号283に記載の融合タンパク質をコードする。
【０５５７】
実施例４７
組換え融合タンパク質DID93のクローニングおよび発現
Rv1099、Rv0655、およびRv0054由来の融合パートナーを含む融合構築物DID93のクローニングのために、以下のプライマーを用いた：
【化５１】
2014058520.tif 000058
【化５２】
2014058520.tif 000059
【０５５８】
融合構築物は、配列番号284に記載のポリヌクレオチド配列を有し、この配列は、配列番号291に記載の融合タンパク質をコードする。
【０５５９】
実施例４８
組換え融合タンパク質Rv3875のクローニングおよび発現
H37RvゲノムDNAを鋳型として使用し、以下のプライマーを用いてRv3875をPCR増幅した：
【化５３】
2014058520.tif 000060
【０５６０】
組換えタンパク質のアミノ酸配列は配列番号294に記載のものである。
【０５６１】
以上の詳細な説明に照らして、前記およびその他の変更を実施形態に施すことができる。一般に、以下に示す特許請求の範囲において、用いた用語は、本明細書および特許請求の範囲に開示した具体的な実施形態に特許請求の範囲を限定すると解釈すべきではなく、権利が与えられた特許請求の範囲に対する同等物の範囲全体に加えて、あらゆる可能な実施形態を包含すると解釈すべきである。従って、特許請求の範囲が本開示内容によって制限されることはない。
【図１】
2014058520.tif 000061
【図２】
2014058520.tif 000062
【図３】
2014058520.tif 000063
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2014058520.tif 000067
【図８】
2014058520.tif 000068
【図９】
2014058520.tif 000069
【配列表】
2014058520000001.app
【外国語明細書】
2014058520000001.pdf