(57)【要約】【課題】食用植物由来の成分を含むとともに、小眼球症関連転写因子抑制作用を示し、従来よりもメラニン産生抑制作用に優れた小眼球症関連転写因子抑制剤、メラニン産生抑制剤、化粧品組成物及び抗ガン剤を提供する。【解決手段】各薬剤において、下記式（１Ａ）又は（１Ｂ）で示される脂環式化合物を含有するものとする。下記式（１Ａ）又は（１Ｂ）において、Ｒ１、Ｒ２は、それぞれ独立に、水素、ヒドロキシル基又は置換基を有していてもよい炭化水素基である。また、点線で示されている隣接する２つの化学結合のうち、一方が二重結合である。2014198683.tif 000036【選択図】図２
2014198683.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１Ａ）又は（１Ｂ）で示される脂環式化合物を含有する、小眼球症関連転写因子抑制剤。
【化１】
2014198683.tif 000024
（上記式（１Ａ）又は（１Ｂ）において、Ｒ１、Ｒ２は、それぞれ独立に、水素、ヒドロキシル基又は置換基を有していてもよい炭化水素基である。また、点線で示されている隣接する２つの化学結合のうち、一方が二重結合である。）
【請求項２】
前記脂環式化合物が、下記式（２Ａ）又は（２Ｂ）で示される化合物である、請求項１に記載の小眼球症関連転写因子抑制剤。
【化２】
2014198683.tif 000025
（上記式（２Ａ）又は（２Ｂ）において、Ｒ３は、水素又は置換基を有していてもよい炭化水素基である。また、点線で示されている隣接する２つの化学結合のうち、一方が二重結合である。）
【請求項３】
前記脂環式化合物が、下記式（３Ａ）で示される化合物である、請求項１に記載の小眼球症関連転写因子抑制剤。
【化３】
2014198683.tif 000026
（上記式（３Ａ）において、Ｒ４は、水素又は置換基を有していてもよい炭化水素基である。また、点線で示されている隣接する２つの化学結合のうち、一方が二重結合である。）
【請求項４】
前記脂環式化合物が、下記式（４Ａ）〜（６Ａ）から選ばれるいずれかの化合物である、請求項１に記載の小眼球症関連転写因子抑制剤。
【化４】
2014198683.tif 000027
【請求項５】
下記式（１Ａ）又は（１Ｂ）で示される脂環式化合物を含有する、メラニン産生抑制剤。
【化５】
2014198683.tif 000028
（上記式（１Ａ）又は（１Ｂ）において、Ｒ１、Ｒ２は、それぞれ独立に、水素、ヒドロキシル基又は置換基を有していてもよい炭化水素基である。また、点線で示されている隣接する２つの化学結合のうち、一方が二重結合である。）
【請求項６】
前記脂環式化合物が、下記式（２Ａ）又は（２Ｂ）で示される化合物である、請求項５に記載のメラニン産生抑制剤。
【化６】
2014198683.tif 000029
（上記式（２Ａ）又は（２Ｂ）において、Ｒ３は、水素又は置換基を有していてもよい炭化水素基である。また、点線で示されている隣接する２つの化学結合のうち、一方が二重結合である。）
【請求項７】
前記脂環式化合物が、下記式（３Ａ）で示される化合物である、請求項５に記載のメラニン産生抑制剤。
【化７】
2014198683.tif 000030
（上記式（３Ａ）において、Ｒ４は、水素又は置換基を有していてもよい炭化水素基である。また、点線で示されている隣接する２つの化学結合のうち、一方が二重結合である。）
【請求項８】
前記脂環式化合物が、下記式（４Ａ）〜（６Ａ）から選ばれるいずれかの化合物である、請求項５に記載のメラニン産生抑制剤。
【化８】
2014198683.tif 000031
【請求項９】
請求項５〜８のいずれかに記載のメラニン産生抑制剤を含む、化粧品組成物。
【請求項１０】
下記式（１Ａ）又は（１Ｂ）で示される脂環式化合物を含有する、抗ガン剤。
【化９】
2014198683.tif 000032
（上記式（１Ａ）又は（１Ｂ）において、Ｒ１、Ｒ２は、それぞれ独立に、水素、ヒドロキシル基又は置換基を有していてもよい炭化水素基である。また、点線で示されている隣接する２つの化学結合のうち、一方が二重結合である。）
【請求項１１】
前記脂環式化合物が、下記式（２Ａ）又は（２Ｂ）で示される化合物である、請求項１０に記載の抗ガン剤。
【化１０】
2014198683.tif 000033
（上記式（２Ａ）又は（２Ｂ）において、Ｒ３は、水素又は置換基を有していてもよい炭化水素基である。また、点線で示されている隣接する２つの化学結合のうち、一方が二重結合である。）
【請求項１２】
前記脂環式化合物が、下記式（３Ａ）で示される化合物である、請求項１０に記載の抗ガン剤。
【化１１】
2014198683.tif 000034
（上記式（３Ａ）において、Ｒ４は、水素又は置換基を有していてもよい炭化水素基である。また、点線で示されている隣接する２つの化学結合のうち、一方が二重結合である。）
【請求項１３】
前記脂環式化合物が、下記式（４Ａ）〜（６Ａ）から選ばれるいずれかの化合物である、請求項１０に記載の抗ガン剤。
【化１２】
2014198683.tif 000035
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エレモフィラン骨格を有するセスキテルペン類の一種であるペタシン又は類似構造を有する脂環式化合物を含有することを特徴とする新規小眼球症関連転写因子（ＭＩＴＦ）抑制剤、メラニン産生抑制剤、化粧品組成物及び抗ガン剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、健康・美容への関心が高まっており、例えば、肌の美白に関する研究が数多くなされている。肌の黒ずみの原因はメラニンの生成によるものである。通常、皮膚におけるメラニンの生成メカニズムは下記の通り説明される。すなわち、図１に示されるように、紫外線や体内のメラニン産生刺激ホルモンによる刺激を受けると、メラニン産生酵素であるチロシナーゼが発現され、皮膚のメラノサイトの中にあるチロシンをドーパクロムやインドール−５，６−キノンに変換し、次いで化学的な酸化重合反応により黒いメラニン色素が作り出される。
【０００３】
メラニン産生抑制剤として、上記のうちチロシナーゼの活性を阻害するものがある。例えば、ハイドロキノンにグルコースがひとつ結合した配糖体である「アルブチン」は、メラニン色素を生成するメラノサイト（色素生成細胞）の中にあるチロシナーゼの活性を阻害する作用を持っており、これによりメラニンの生成を抑制する。また、ヒト皮膚に紫外線を照射して誘導される色素沈着に対する抑制効果が二重盲検法により調べられ、アルブチン配合乳液の塗布が有効であることが示されている。このように、チロシナーゼの活性を阻害する物質は数多く見つかっているが、いくら阻害作用を有していようとも、ヒトに有害となる物質である場合は適用することができない。このような観点から、ヒトへの安全性の高い食用植物等にメラニン産生抑制成分を見出し、これを抽出して化粧品に用いる技術が数多くなされている（例えば、特許文献１〜５や非特許文献１等）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１１−８８８５６号公報
【特許文献２】特開２０１１−３７８５１号公報
【特許文献３】特開２０１０−１７３９６４号公報
【特許文献４】特開２０１０−１１１６４５号公報
【特許文献５】特開２０１０−４３０４１号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Miyazawa et al. “Character Impact Odorants of Wild Edible Plant-Cacalia hastate L. var. orientalis-Used in Japanese Traditional Food”, Journal of Oleo Science 59, (10) 527-533 (2010)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
このように、メラニン産生抑制剤としては、チロシナーゼ等のメラニン色素産生酵素そのものに対する阻害作用を有するものが数多く知られている。或いは、抗酸化物質によって、メラニン産生時の酸化重合を抑えることもなされている。しかしながら、メラニン産生抑制はチロシナーゼの酵素反応を阻害することや、酸化重合を抑えることのみでは十分でない場合がある。
【０００７】
例えば、小眼球症関連転写因子（ＭＩＴＦ）は、メラニン色素産生酵素の遺伝子発現を促進することが知られており、ＭＩＴＦを抑制することができれば、メラニン産生を根元から抑えることができるものと考えられる。
【０００８】
そこで本発明は、ヒトへの安全性の高い食用植物由来の成分を含む、ＭＩＴＦ抑制剤、メラニン産生抑制剤、化粧品組成物、及び抗ガン剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、特願２０１２−０２５９６７において、食用植物由来の成分を含むとともに、ＭＩＴＦ抑制作用を示し、従来よりもメラニン産生抑制作用に優れた生理活性組成物及びその製造方法、ＭＩＴＦ抑制剤、並びにメラニン産生抑制剤、化粧品組成物、抗ガン剤を開示した。
【００１０】
より具体的には、先願において、本発明者は、天然に自生する山菜の一種であるヨブスマソウやイヌドウナのアルコール抽出物に、チロシナーゼ阻害成分、及び抗酸化成分とともに、ＭＩＴＦ抑制成分が含まれていることを開示した。ヨブスマソウやイヌドウナは、冷涼な地域に広く自生する山菜であり、食経験もありヒトへの安全性が高い。そして、上記各成分を含む抽出物によれば、ＭＩＴＦによるチロシナーゼ遺伝子発現を抑制し、チロシナーゼによる酵素反応を阻害し、且つ、酵素反応後の酸化重合反応を抑制することも可能であるため、メラニン産生に関して、根元から最終生成に至るまでの各段階において効果的に作用させることができる。
【００１１】
しかしながら、上記の先願においては、ＭＩＴＦ抑制物質の同定にまでは至っていなかった。このことに鑑み、本発明者らが共同でさらに鋭意研究を進めたところ、ヨブスマソウやイヌドウナに含まれるＭＩＴＦ抑制物質が、エレモフィラン骨格を有するセスキテルペン類の一種であるペタシン又は類似構造を有する脂環式化合物であることを突き止めた。これら脂環式化合物がＭＩＴＦ抑制作用を有することは従来において全く知られておらず、本発明は従来にない新規薬剤として極めて有用である。
【００１２】
すなわち、第１の本発明は、下記式（１Ａ）又は（１Ｂ）で示される脂環式化合物を含有する、小眼球症関連転写因子抑制剤である。
【００１３】
【化１】
2014198683.tif 000003
（上記式（１Ａ）又は（１Ｂ）において、Ｒ１、Ｒ２は、それぞれ独立に、水素、ヒドロキシル基又は置換基を有していてもよい炭化水素基である。また、点線で示されている隣接する２つの化学結合のうち、一方が二重結合である。）
【００１４】
尚、本発明において「式（１Ａ）又は（１Ｂ）で示される脂環式化合物を含有する」とは、式（１Ａ）で示される化合物を含有する形態、式（１Ｂ）で示される化合物を含有する形態、さらには、式（１Ａ）で示される化合物と式（１Ｂ）で示される化合物とを共に含有する形態のいずれをも含んだ概念である。また、「置換基を有していてもよい炭化水素基」とは、炭化水素が、ヘテロ原子（酸素原子や窒素原子等）を介してシクロヘキシル骨格に結合している形態を含む概念である。例えば以下に示すエーテルやエステルがこれに該当する。
【００１５】
すなわち、第１の本発明において、脂環式化合物が、下記式（２Ａ）又は（２Ｂ）で示される化合物であることが好ましい。
【００１６】
【化２】
2014198683.tif 000004
（上記式（２Ａ）又は（２Ｂ）において、Ｒ３は、水素又は置換基を有していてもよい炭化水素基である。また、点線で示されている隣接する２つの化学結合のうち、一方が二重結合である。）
【００１７】
また、第１の本発明において、脂環式化合物が、下記式（３Ａ）で示される化合物であることが好ましい。
【００１８】
【化３】
2014198683.tif 000005
（上記式（３Ａ）において、Ｒ４は、水素又は置換基を有していてもよい炭化水素基である。また、点線で示されている隣接する２つの化学結合のうち、一方が二重結合である。）
【００１９】
さらに、第１の本発明において、脂環式化合物が、下記式（４Ａ）〜（６Ａ）から選ばれるいずれかの化合物であることが好ましい。尚、下記式（４Ａ）〜（６Ａ）において、点線で示されている隣接する２つの化学結合のうち、一方が二重結合である。
【００２０】
【化４】
2014198683.tif 000006
【００２１】
第２の本発明は、下記式（１Ａ）又は（１Ｂ）で示される脂環式化合物を含有する、メラニン産生抑制剤である。
【００２２】
【化５】
2014198683.tif 000007
（上記式（１Ａ）又は（１Ｂ）において、Ｒ１、Ｒ２は、それぞれ独立に、水素、ヒドロキシル基又は置換基を有していてもよい炭化水素基である。また、点線で示されている隣接する２つの化学結合のうち、一方が二重結合である。）
【００２３】
第２の本発明において、脂環式化合物が、下記式（２Ａ）又は（２Ｂ）で示される化合物であることが好ましい。
【００２４】
【化６】
2014198683.tif 000008
（上記式（２Ａ）又は（２Ｂ）において、Ｒ３は、水素又は置換基を有していてもよい炭化水素基である。また、点線で示されている隣接する２つの化学結合のうち、一方が二重結合である。）
【００２５】
第２の本発明において、脂環式化合物が、下記式（３Ａ）で示される化合物であることが好ましい。
【００２６】
【化７】
2014198683.tif 000009
（上記式（３Ａ）において、Ｒ４は、水素又は置換基を有していてもよい炭化水素基である。また、点線で示されている隣接する２つの化学結合のうち、一方が二重結合である。）
【００２７】
第２の本発明において、脂環式化合物が、下記式（４Ａ）〜（６Ａ）から選ばれるいずれかの化合物であることが好ましい。尚、下記式（４Ａ）〜（６Ａ）において、点線で示されている隣接する２つの化学結合のうち、一方が二重結合である。
【００２８】
【化８】
2014198683.tif 000010
【００２９】
第３の本発明は、第２の本発明に係るメラニン産生抑制剤を含む、化粧品組成物である。
【００３０】
第４の本発明は、下記式（１Ａ）又は（１Ｂ）で示される脂環式化合物を含有する、抗ガン剤である。
【００３１】
【化９】
2014198683.tif 000011
（上記式（１Ａ）又は（１Ｂ）において、Ｒ１、Ｒ２は、それぞれ独立に、水素、ヒドロキシル基又は置換基を有していてもよい炭化水素基である。また、点線で示されている隣接する２つの化学結合のうち、一方が二重結合である。）
【００３２】
第４の本発明において、脂環式化合物が、下記式（２Ａ）又は（２Ｂ）で示される化合物であることが好ましい。
【００３３】
【化１０】
2014198683.tif 000012
（上記式（２Ａ）又は（２Ｂ）において、Ｒ３は、水素又は置換基を有していてもよい炭化水素基である。また、点線で示されている隣接する２つの化学結合のうち、一方が二重結合である。）
【００３４】
第４の本発明において、脂環式化合物が、下記式（３Ａ）で示される化合物であることが好ましい。
【００３５】
【化１１】
2014198683.tif 000013
（上記式（３Ａ）において、Ｒ４は、水素又は置換基を有していてもよい炭化水素基である。また、点線で示されている隣接する２つの化学結合のうち、一方が二重結合である。）
【００３６】
第４の本発明において、脂環式化合物が、下記式（４Ａ）〜（６Ａ）から選ばれるいずれかの化合物であることが好ましい。尚、下記式（４Ａ）〜（６Ａ）において、点線で示されている隣接する２つの化学結合のうち、一方が二重結合である。
【００３７】
【化１２】
2014198683.tif 000014
【発明の効果】
【００３８】
本発明は、ヒトへの安全性が高い食用山菜の抽出成分であるエレモフィラン骨格を有するセスキテルペン類の一種であるペタシン又は類似構造の脂環式化合物を含んでなるもので、ＭＩＴＦ抑制作用によって、例えばチロシナーゼ遺伝子発現を抑制してメラニン産生を根元から効果的に抑えることが可能である。すなわち、本発明によれば、ヒトへの安全性の高い食用植物由来の成分を含む、ＭＩＴＦ抑制剤、メラニン産生抑制剤、化粧品組成物及び抗ガン剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】皮膚のメラニン生成メカニズムを説明するための図である。
【図２】本発明の効果を説明するための図である。
【図３】本発明の効果を説明するための図である。
【図４】ヨブスマソウ抽出物（分画１、２、３、４）のマッシュルームチロシナーゼ活性に及ぼす影響を示すデータである。
【図５】ヨブスマソウ抽出物（分画１、２、３、４）のメラニン産生に及ぼす影響を示すデータである。
【図６】ヨブスマソウ抽出物（分画１、２、３、４）の抗酸化能を示すデータである。
【図７】ヨブスマソウ抽出物（分画３）による細胞のｍＲＮＡ発現の定量に係るデータである。
【図８】ヨブスマソウ抽出物（分画３）のメラニン産生抑制作用に係るデータである。
【図９】ヨブスマソウ抽出物（分画３、４）と既存のメラニン抑制剤とについて、遺伝子発現に及ぼす影響を比較したデータである。
【図１０】ヨブスマソウ抽出物（分画３、４）と既存のメラニン抑制剤とについて、メラニン産生に及ぼす影響を比較したデータである。
【図１１】各種刺激剤の違いによる、ヨブスマソウ抽出物（分画３）の遺伝子発現に及ぼす影響を比較したデータである。
【図１２】各種刺激剤の違いによる、ヨブスマソウ抽出物（分画３）のメラニン産生に及ぼす影響を比較したデータである。
【図１３】ヨブスマソウ抽出物（分画３）の抗ガン作用を示すデータである。
【図１４】本発明の抗ガン作用について説明するための図である。
【図１５】ヨブスマソウ抽出物（分画３）について、細胞密度による抗ガン活性の相違を比較したデータである。
【図１６】ヨブスマソウ粗精製物（ＭＩ）に含まれる物質（（Ａ）ＭＩ-Ａ、（Ｂ）ＭＩ-Ｂ）についてさらにＨＰＬＣによって分析した結果を示す図である。
【図１７】ヨブスマソウ精製物（ＭＩ−Ａ）のＵＶスペクトルを示す図である。
【図１８】ヨブスマソウ精製物（ＭＩ−Ａ）の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図１９】ヨブスマソウ精製物（ＭＩ−Ａ）の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図２０】ヨブスマソウ精製物（ＭＩ−Ｂ）のＵＶスペクトルを示す図である。
【図２１】ヨブスマソウ精製物（ＭＩ−Ｂ）の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図２２】ヨブスマソウ粗精製物（ＭＩ）がメラニン産生に及ぼす影響を示すデータである。
【図２３】ヨブスマソウ粗精製物（ＭＩ）のＭＩＴＦ抑制作用、マッシュルームチロシナーゼ阻害作用に係る評価結果を示すデータである。
【図２４】ヨブスマソウ粗精製物（ＭＩ）に含まれていた２つの物質（ＭＩ−Ａ、ＭＩ−Ｂ）について、メラニン産生に及ぼす影響を評価したデータである。
【図２５】ヨブスマソウ粗精製物（ＭＩ）に含まれていた２つの物質（ＭＩ−Ａ、ＭＩ−Ｂ）について、ＭＩＴＦ抑制作用、マッシュルームチロシナーゼ阻害作用の評価結果を示すデータである。
【図２６】ヨブスマソウ粗精製物（ＭＩ）にＭＩＴＦ抑制成分として含まれていたペタシン（ＭＩ−Ａ）と類似構造を有するＳ−ペタシンとについて、メラニン産生に及ぼす影響を比較したデータである。
【図２７】ヨブスマソウ粗精製物（ＭＩ）にＭＩＴＦ抑制成分として含まれていたペタシン（ＭＩ−Ａ）と類似構造を有するＳ−ペタシンとについて、細胞のｍＲＮＡ発現に及ぼす影響を比較したデータである。
【図２８】ｃＡＭＰ産生に及ぼすヨブスマソウ抽出物（分画３）の影響を示すデータである。
【図２９】ＣＲＥＢのリン酸化に及ぼすヨブスマソウ精製物ＭＩ−Ａ、ＭＩ−Ｂ及びＳ−ペタシンの影響を説明するための図である。
【図３０】ヨブスマソウ抽出物及びモミジガサ抽出物のマッシュルームチロシナーゼ活性に及ぼす影響を示すデータである。
【図３１】ヨブスマソウ抽出物及びモミジガサ抽出物の抗酸化能を示すデータである。
【図３２】ヨブスマソウ抽出物及びモミジガサ抽出物のメラニン産生に及ぼす影響を示すデータである。
【図３３】ヨブスマソウ抽出物及びモミジガサ抽出物のＭＩＴＦ  ｍＲＮＡ発現に及ぼす影響を示すデータである。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
本発明に係る各種薬剤は、有効成分として、下記式（１Ａ）又は（１Ｂ）で示される脂環式化合物を含有することを特徴とする。
【００４１】
【化１３】
2014198683.tif 000015
（上記式（１Ａ）又は（１Ｂ）において、Ｒ１、Ｒ２は、それぞれ独立に、水素、ヒドロキシル基又は置換基を有していてもよい炭化水素基である。また、点線で示されている隣接する２つの化学結合のうち、一方が二重結合である。）
【００４２】
本発明において「置換基を有していてもよい炭化水素基」とは、炭化水素が、ヘテロ原子（酸素原子や窒素原子等）を介してシクロヘキシル骨格に結合している形態を含む概念である。例えば、上記の脂環式化合物は、下記式（２Ａ）又は（２Ｂ）で示される化合物であることが好ましく、下記式（３Ａ）で示される化合物であることがより好ましく、下記式（４Ａ）〜（６Ａ）から選ばれるいずれかの化合物であることがさらに好ましい。
【００４３】
【化１４】
2014198683.tif 000016
（上記式（２Ａ）又は（２Ｂ）において、Ｒ３は、水素又は置換基を有していてもよい炭化水素基である。また、点線で示されている隣接する２つの化学結合のうち、一方が二重結合である。）
【００４４】
【化１５】
2014198683.tif 000017
（上記式（３Ａ）において、Ｒ４は、水素又は置換基を有していてもよい炭化水素基である。また、点線で示されている隣接する２つの化学結合のうち、一方が二重結合である。）
【００４５】
【化１６】
2014198683.tif 000018
（上記式（４Ａ）〜（６Ａ）において、点線で示されている隣接する２つの化学結合のうち、一方が二重結合である。）
【００４６】
上記のうち、式（１Ｂ）、（２Ｂ）に係る化合物としては、フキノン、２β−ヒドロキシフキノン、フキノサイドＡ等のフキノン類が挙げられる。
【００４７】
上記のうちペタシン（式（４Ａ）で示される化合物）は、セイヨウフキ（バターバー）の成分として知られている。バターバー抽出物は、「鼻づまり」「花粉症」「偏頭痛」「尿管の炎症」に効くとされ、ヒトでの有効性については、ドイツのコミッションＥモノグラフ（薬用植物評価委員会）が尿路の急性の痙攣痛に対する使用を承認している。また、特定の製剤では偏頭痛に対する有効性が示唆されている。或いは、国際公開ＷＯ２００８／０４９１９７号によれば、セイヨウフキに含まれるペタシンを用いることで、炎症を緩和することができる、とされている。しかしながら、上記した脂環式化合物がＭＩＴＦ抑制作用を有することについては、従来において全く知られていなかった。
【００４８】
本発明に係る各種薬剤において、上記した脂環式化合物の含有量（濃度）は特に限定されるものではない。ペタシンはこれまでアレルギー予防への有効性から、ケミカルメディエータであるロイコトリエン産生酵素阻害作用やカルシウムチャンネル阻害作用等が知られているが、いずれも本発明で知見したＭＩＴＦ抑制作用・メラニン産生抑制作用よりも、数十〜数百倍高い濃度が必要である。すなわち、本発明で知見したＭＩＴＦ抑制に係る生理作用のほうが従来公知の作用よりも優位性が高く、利用性も高いといえる。
【００４９】
本発明においては、薬剤中に上記した脂環式化合物を含ませることで、当該薬剤をＭＩＴＦ抑制剤として用いることもできるし、メラニン産生抑制剤（さらには当該メラニン産生抑制剤を含む化粧品組成物）或いは抗ガン剤として用いることも可能である。
【００５０】
例えば、上記した脂環式化合物を含むメラニン産生抑制剤は、図２に示すように、メラニン色素生成に必要な酵素・タンパク質のマスター転写因子であるＭＩＴＦを抑制するので、メラニン産生を根元から効果的に抑制することができる。
【００５１】
また、抗ガン剤の開発においては、ガン細胞に対する選択性が鍵となる。そのため特定の分子を標的とした物質が望ましく、近年承認された新薬としては肺ガン治療薬のイレッサをはじめ、グリベック、ハーセプチン、リツキサンなどがあり、細胞増殖因子受容体やその下流のシグナル分子の抑制を標的としている。一方、本発明による抗ガン剤は、ヒトへの安全性の高い食用植物由来の成分を含んでなるとともにＭＩＴＦを特異的に抑制するものであり、従来の細胞増殖シグナルを標的とした分子標的薬とは異なる作用点であることから、併用により悪性黒色腫の悪性化を防ぎ、高転位性や抗ガン耐性を抑制する独創性の高い薬剤を提供することができる（図１４参照）。
【００５２】
上記した脂環式化合物は公知の方法によって人工的に合成することもできるし（例えば、Matthias Christian Witshel et al. “Synthese der Pestwurzinhaltsstoffe (+)-Petasin und (+)-Isopetasin”, Tetrahedron Letters, Vol. 36, No. 19, pp.3325-3328, 1995, Pergamon 0040-4039(95)00475-0）、或いは、天然又は人工栽培された食用山菜であるヨブスマソウやイヌドウナをアルコール抽出することにより得ることもできる。
【００５３】
ここで、ヨブスマソウ及び／又はイヌドウナをアルコールと水の混液（以下、アルコール水と呼ぶ）で抽出して上記した脂環式化合物を得る場合、ヨブスマソウ及び／又はイヌドウナ由来のチロシナーゼ阻害成分、及び、抗酸化成分も併せて抽出することが可能なため、特にメラニン産生抑制剤や化粧品組成物として用いる場合に好ましい形態となる。すなわち、図３に示すように、上記した脂環式化合物によるＭＩＴＦ抑制作用によって、チロシナーゼの遺伝子発現を抑制してメラニン産生を根元から抑え（第１の効果）、発現を抑制しきれなかったチロシナーゼについては、チロシナーゼ阻害成分によって酵素反応を阻害してドーパクロムやインドール−５，６−キノンの生成を抑え（第２の効果）、さらに、これらが生成したとしても抗酸化成分によって酸化重合を抑えることができ（第３の効果）、複数の作用点でメラニン産生を相乗的に抑えることが可能となる。尚、チロシナーゼ阻害成分は、上記脂環式化合物よりも極性が高い成分であり、抗酸化成分は、チロシナーゼ阻害成分と同等又はチロシナーゼ阻害成分よりも極性が高い成分である。上記の各種有効成分の割合は、抽出操作によって変化し得る。
【００５４】
抽出操作については、極性の違いによって、ヨブスマソウ及び／又はイヌドウナに含まれる成分の一部をアルコール溶媒中に抽出可能な工程であればよく、公知の方法により実施可能である。尚、抽出の際は、刃物等を用いてヨブスマソウ及び／又はイヌドウナを細かく切断しておくと良い。これにより、含有成分を効率的に抽出することができる。
【００５５】
この際、抽出溶媒におけるアルコール水濃度を２５％（ｖ／ｖ）以上８０％（ｖ／ｖ）以下とすることが好ましい。より好ましくは、５０％以上８０％以下、特に好ましくは６０％以上８０％以下である。抽出溶媒として、水（熱水）や純粋なアルコールを用いるよりも、２５％以上８０％以下の濃度のアルコール水を用いるほうが、上記の各種有効成分を効率的に抽出することができる。アルコール水の温度は特に限定されるものではなく、例えば常温にて抽出可能である。アルコールの種類としては、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール等、特に限定されるものではないが、特にエタノールが好ましい。
【００５６】
アルコール水抽出により得られた抽出物については、保存性や取り扱い性を向上させる観点から、減圧乾固、或いは、凍結乾燥してもよい。
【００５７】
本発明に係る各種薬剤を製造する場合は、上記の脂環式化合物の他、公知のゲル化剤や防腐剤等を含ませることができる。例えば、化粧品組成物とする場合において、化粧液や化粧用クリームとすることも可能である。このような場合において、化粧液や化粧用クリームに含まれる、上記脂環式化合物の含有量（濃度）については特に限定されるものではない。例えば、上述したような食用山菜の抽出物を用いる場合は、化粧液や化粧用クリーム１ｍｌに対し、乾燥後の抽出物が０．１〜５ｍｇ、好ましくは１〜５ｍｇ含まれるようにすると、充分なＭＩＴＦ抑制効果、メラニン産生抑制効果を得ることができる。
【実施例】
【００５８】
以下、実施例により、本発明についてさらに詳述するが、本発明は以下の実施例に記載された具体的な形態に限定されるものではない。
【００５９】
１．ヨブスマソウ７０％（ｖ／ｖ）エタノール水抽出物からの有効成分の分画
ヨブスマソウ１３６２ｇを細断し、７０％（ｖ／ｖ）エタノール水を５．５Ｌ加えてワーリングブレンダーで粉砕した。これを２０００ｒｍｐで５分間遠心分離し、上層を濾紙で濾過して濾液を回収した。残渣に７０％（ｖ／ｖ）エタノール水を２．２Ｌ加え、同様に遠心分離し、上層を濾紙で濾過して回収した後、最初に回収したものに加えた。その後、ロータリーエバポレータによる減圧乾固を行い、エタノールを留去した後、凍結乾燥を行って溶媒を完全に除去した。固形抽出物の重量は４４．５ｇであった。
【００６０】
合成吸着樹脂のＤｉａｉｏｎ  ＨＰ−２０（三菱化学社製）を用いて、ヨブスマソウ７０％（ｖ／ｖ）エタノール水抽出物を極性の違いにより分画した。４５ｇのＨＰ−２０をメタノールでカラムに充填した。これを３０％（ｖ／ｖ）メタノール水で平衡化後、２１ｇのヨブスマソウ７０％（ｖ／ｖ）エタノール水抽出物を２４５ｍｌの３０％（ｖ／ｖ）メタノール水に溶解したものをカラムに通塔した。ここで素通りしたものを「分画１」（３０％メタノール溶出物）とした。次に７５％（ｖ／ｖ）メタノール水３００ｍｌで溶出したものを「分画２」とした。さらにメタノール３００ｍｌで溶出したものを「分画３」（メタノール溶出物）とした。最後に、酢酸エチル３００ｍｌで溶出したものを「分画４」（酢酸エチル溶出物）とした。同様の操作を２回行い、合計４２ｇのヨブスマソウ７０％（ｖ／ｖ）エタノール水抽出物を分画した。それぞれの分画はロータリーエバポレータによる減圧乾固と凍結乾燥で溶媒を除去した。収率は下記表１に記載の通りである。
【００６１】
【表１】
2014198683.tif 000019
【００６２】
２．ヨブスマソウ分画の性状解析
各分画について、マッシュルームチロシナーゼ阻害作用及びメラニン色素抑制作用を評価した。
【００６３】
図４に、ヨブスマソウ７０％（ｖ／ｖ）エタノール水抽出物からのＨＰ−２０で処理した各分画のチロシナーゼ阻害作用を示す。分画２がチロシナーゼを５０％阻害する濃度は、ＩＣ５０＝５０μｇ／ｍｌであった。一方で、分画３、４は測定した濃度ではほとんどチロシナーゼ阻害作用を示さなかった。
【００６４】
図５（Ａ）、（Ｂ）に、１．５μｇ／ｍｌの濃度の各分画がＢ１６  ｍｅｌａｎｏｍａ  ４Ａ５細胞のＩＢＭＸ刺激（３日間）によるによるメラニン産生に及ぼす影響を示す。チロシナーゼ阻害作用の高い分画２のメラニン色素抑制効果は弱いものであった。一方で、ほとんどチロシナーゼ阻害作用を示さなかった分画３と４に強いメラニン色素抑制効果が観察された。
【００６５】
３．抗酸化能の測定
メラニン色素産生を抑制するには、図３に示したようにチロシナーゼを抑制する作用以外に、酸化重合反応を阻害する場合が考えられるため、各分画の抗酸化能を測定した。抗酸化能は、１，１−ジフェニル−２−ピクリルヒドラジル（ＤＰＰＨ）を用いてラジカル捕捉活性を測定することで評価した。１００μＭ  ＤＰＰＨ（エタノール溶液）を１ｍｌ試験管にとり、分画を各濃度に調整したものを２０μｌ加え、３０秒撹拌して室温、暗所で３０分間おいた。その後、分光光度計で５１７ｎｍの吸光度を測定することで、ラジカルの消失を測定した。結果を図６に示す。
【００６６】
図６のように、チロシナーゼ阻害作用の強かった分画２が最も抗酸化能が強く、次いで分画１が強い活性を示した。一方で、細胞のメラニン産生を抑制する効果の最も強かった分画３と４の抗酸化能は弱いものであった。以上より、分画３と４がメラニン産生を抑制するメカニズムは、チロシナーゼの阻害及び酸化重合反応の阻害とは別にあると考えられる。
【００６７】
４．ヨブスマソウ抽出物（分画３）によるＭＩＴＦ及びチロシナーゼ遺伝子発現の抑制
強いメラニン産生抑制効果を示したヨブスマソウ抽出物（分画３）は、チロシナーゼ阻害作用や抗酸化能以外の作用を持つと考えられたため、色素細胞特異的転写因子である小眼球症関連転写因子（ＭＩＴＦ）遺伝子のｍＲＮＡ発現に及ぼす影響を検討した。ＭＩＴＦとは、色素細胞（メラニン産生細胞）の分化・増殖を制御するマスター転写因子であり、標的遺伝子はメラニン合成酵素のチロシナーゼと、チロシナーゼのアミノ酸配列と４０％の類似性を持つチロシナーゼ関連タンパク−１（ＴＲＰ−１）やチロシナーゼ関連タンパク−２（ＴＲＰ−２）／ドーパクロムトートメラーゼ（ＤＣＴ）であり、これらに対して特異的に発現を促進する。近年では、ＭＩＴＦをコードする遺伝子が黒色腫細胞で大きく増幅されていることが発見され、黒色腫癌遺伝子として機能している可能性も示唆されるなど、癌治療の新たな戦略として注目されている。
【００６８】
φ６０ｍｍのディッシュで１２時間培養した細胞を、５ｍｌのＰＢＳで１回洗浄した後、１ｍｌのＴＲＩｚｏｌ（Ｇｉｂｃｏ）を加えて常法にしたがってＲＮＡを抽出した。これよりＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（タカラバイオ社製）を用いてｃＤＮＡを合成し、ＳＹＢＲ  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ  ＩＩ（タカラバイオ社製）を用いて、Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ法によりｍＲＮＡを定量した。実験に用いたＰｒｉｍｅｒの塩基配列は下記表２の通りである。
【００６９】
【表２】
2014198683.tif 000020
【００７０】
図７（Ａ）〜（Ｄ）に、細胞をＩＢＭＸで１２時間処理したときのＭＩＴＦ及びその下流のｍＲＮＡ発現に及ぼすヨブスマソウ抽出物（分画３）の影響を示す。図８（Ａ）のように、ヨブスマソウ抽出物（分画３）は１．５μｇ／ｍｌの濃度で、ＩＢＭＸによるＭＩＴＦ  ｍＲＮＡ発現の誘導を強く抑制した。また、図７（Ｂ）〜（Ｄ）に示すように、その下流のチロシナーゼ、ＴＲＰ−１及びＤＣＴの発現も抑制した。
【００７１】
図８に、分画３による細胞のメラニン産生抑制効果の検証結果を示す。図８に示すように、分画３は、１．５μｇ／ｍｌより低濃度の０．７５μｇ／ｍｌの濃度にて、十分なメラニン抑制効果が観察された。
【００７２】
５．ヨブスマソウ抽出物と既存のメラニン抑制剤との比較
２４時間培養して培地交換をして、ＩＢＭＸで処理した細胞に、分画３、４（Ｆｒ．３、４）を１．５μｇ／ｍｌ、アルブチン、コウジ酸を１５、３０μｇ／ｍｌの濃度で添加した後、１２時間培養して、ＲＮＡを抽出した。そして、リアルタイムＰＣＲ法を用いてＭＩＴＦ、チロシナーゼ、ＴＲＰ−１、ＤＣＴ遺伝子の発現を抑えるか調べた。結果を図９（Ａ）〜（Ｄ）に示す。
【００７３】
図９に示すように、分画３、４で全ての遺伝子の発現が抑えられていた。アルブチンは、３０μｇ／ｍｌでは１５μｇ／ｍｌの場合よりも発現が抑えられていたが、コウジ酸では発現が活性化されていた。このように分画３、４は既存のメラニン抑制剤にはないＭＩＴＦ抑制効果があり、同時にその下流の遺伝子発現も抑制していることが示された。
【００７４】
Ｂ１６  ｍｅｌａｎｏｍａ  ４Ａ５細胞のＩＢＭＸ刺激によるメラニン産生に及ぼす影響を比較した。結果を図１０（Ａ）、（Ｂ）に示す。図１１に示すように、分画３、４は、既存のメラニン抑制剤であるアルブチンやコウジ酸と比較して、１０分の１以下の濃度でメラニン産生を抑制した。
【００７５】
６．各種刺激剤の違いによるヨブスマソウ抽出物の効果の比較
Ｂ１６  ｍｅｌａｎｏｍａ  ４Ａ５細胞を２４時間培養して培地交換をして、ＩＢＭＸ、α−ＭＳＨ、Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎで処理した細胞に、分画３を１．５μｇ／ｍｌの濃度で添加した後、１２時間培養して、ＲＮＡを抽出した。そして、リアルタイムＰＣＲ法を用いてＭＩＴＦ、チロシナーゼ、ＴＲＰ−１、ＤＣＴ遺伝子の発現を抑えるか否かを調べた。結果を図１１（Ａ）〜（Ｄ）に示す。
【００７６】
図１１に示すように、いずれの刺激剤においても、分画３はＭＩＴＦの発現を最も強く抑制した。これらの結果より、分画３には強いＭＩＴＦ抑制効果があり、それに引き続いて、その下流の遺伝子であるチロシナーゼやＴＲＰ−１、ＤＣＴの発現を抑制していると考えられる。
【００７７】
さらに、Ｂ１６−ｍｅｌａｎｏｍａ  ４Ａ５細胞の各種刺激剤によるメラニン産生に及ぼす影響を比較した。結果を図１２（Ａ）、（Ｂ）に示す。図１２に示すように、ＩＢＭＸ、α−ＭＳＨ、Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎのいずれの刺激で産生されるメラニンであっても、分画３は強く抑制した。
【００７８】
以上のように、ヨブスマソウのアルコール抽出物には、抗酸化成分（分画１〜３）、チロシナーゼ阻害成分（分画１、２）及びＭＩＴＦ抑制成分（分画３、４）が含まれており、従来の美白剤に含まれるコウジ酸やアルブチンよりも、低濃度にてメラニン産生を抑制可能なことが分かった。これら分画１〜４は、極性の違いによって各種溶媒で抽出可能であり、例えば、抽出して分画３、４を得ることで、ＭＩＴＦ抑制剤としても用いることができる。
【００７９】
７．ヨブスマソウ抽出物（分画３）の細胞増殖抑制作用（抗ガン作用）
分画３を添加し培養した細胞を用いて各種癌細胞株の増殖を測定した。結果を図１３に示す。図１３に示すように、分画３は悪性黒色腫であるＢ１６  ｍｅｌａｎｏｍａ  ４Ａ５及びヒト肺癌細胞株Ａ５４９に対して、強い細胞増殖抑制が確認された。一方で、マウス由来間葉系幹細胞Ｃ３Ｈ／１０Ｔ１／２、ヒト肝臓癌細胞株ＨｅｐＧ２、ヒト白血病細胞株Ｕ９３７、マウス由来脂肪前駆細胞３Ｔ３−Ｌ１の細胞増殖には、同じ濃度の範囲ではほとんど影響を及ぼさなかった。以上のように、分画３は悪性黒色腫や肺癌に選択的に抗ガン作用を示すことが分かった。
【００８０】
例えば、Nature. 480(7375), 94-98 (2011)、A SUMOylation-defective MITF germline mutation predisposes to melanoma and renal carcinomaや、Nature. 480(7375), 99-103 (2011)、A novel recurrent mutation in MITF predisposes to familial and sporadic melanomaに開示されている通り、最近になってＭＩＴＦは悪性黒色種の原因遺伝子であることを示す知見が得られており、分画３は、このＭＩＴＦを抑制することによって、抗ガン作用を示したものと考えられる（図１４参照）。ＭＩＴＦをターゲットとした抗ガン剤は従来において得られておらず、本発明は新規抗がん剤としても極めて有効と考えられる。
【００８１】
細胞密度による抗ガン活性の相違を比較した結果を図１５に示す。図１５から明らかなように、分画３は、高密度で細胞を培養した場合に、より強い抗ガン作用があることが分かった。
【００８２】
８．薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）による分画３の分析・活性評価
薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣガラスプレート  シリカゲル６０  Ｆ２５４、メルク社製）により、ヨブスマソウ抽出物の分画３を極性によりさらに分画し、メラニン産生抑制効果を検討した。分画３のメタノール溶液（０．２ｍｇ／ｍｌ）１０μｌを５ｃｍ×１０ｃｍの大きさのＴＬＣプレート３枚にそれぞれ線状にスポットして、クロロホルム、クロロホルム：メタノール混液（２０：１）、クロロホルム：メタノール混液（１０：１）でそれぞれ展開した。充分に乾かしてから３枚のＴＬＣプレートを２９の画分に分け、シリカゲルを掻きとってシリカゲルに吸着している物質をメタノールで溶出させ回収した。メタノールを除いてからそれぞれの画分のメラニン産生に及ぼす影響を調べた。予備実験により、ＴＬＣ分画１５〜２９には抑制効果がみられなかったため、ＴＬＣ分画１〜１４について効果を調べることとした。
【００８３】
各ＴＬＣ分画について、上記と同様の方法にて、メラニン産生に及ぼす影響を調べた。その結果、細胞、培地ともにＴＬＣ分画１、３、７が抑制することがわかった。また、各ＴＬＣ分画について、上記と同様の方法にて、Ｂ１６ｍｅｌａｎｏｍａ４Ａ５細胞のＭＩＴＦ抑制作用、マッシュルームチロシナーゼ抑制作用について評価した。その結果、ＭＩＴＦ  ｍＲＮＡ発現、チロシナーゼｍＲＮＡ発現は、ＩＢＭＸ刺激で最も増加し、ＭＩＴＦ  ｍＲＮＡの発現は、ＴＬＣ分画３による処理で約６４％、チロシナーゼｍＲＮＡの発現は、ＴＬＣ分画３による処理で約５１％抑制された。なお、ＴＬＣ分画１、３、７には、ＨＰＬＣ分析の結果、共通する２つの物質が含まれていたことから、各種抑制効果を有するのはこの２つの物質であると判断した。この２つの物質を量が多い順にＭＩ−Ａ、ＭＩ−Ｂと名付けた。カラム：Ｓｈｉｍ−ｐａｃｋ  ＶＰ−ＯＤＳ（４．６ｍｍφ×１５０ｍｍ、島津社製)、カラム温度：４０℃、流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ、移動相：メタノール：水（７０：３０）、検出：２３０ｎｍ、試料量：５．０μｌの条件のＨＰＬＣ分析で、ＭＩ−ＡとＭＩ−Ｂの保持時間は、図１６（Ａ）、（Ｂ）に示すようにそれぞれ１８．４０分、１７．２４分であった。
【００８４】
９．ヨブスマソウ抽出物（分画３）からのＭＩＴＦ抑制物質ＭＩ−Ａ、ＭＩ−Ｂの単離精製
ヨブスマソウ抽出物（分画３）０．６３５ｇを少量のクロロホルムに溶かして、あらかじめクロロホルムで充填したシリカゲルカラム（ワコーゲルＣ−３００、和光純薬（株）製、２ｃｍφ×２０ｃｍ）に吸着させ、クロロホルムで溶出して５ｍｌずつ溶出液を分取した。分取したフラクションを、カラム：Ｓｈｉｍ−ｐａｃｋ  ＶＰ−ＯＤＳ（４．６ｍｍφ×１５０ｍｍ、島津社製)、カラム温度：４０℃、流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ、移動相：メタノール：水（７０：３０）、検出：２３０ｎｍ、試料量：５．０μｌのＨＰＬＣ分析してＭＩ−ＡとＭＩ−Ｂを含むフラクションを合わせた。合わせた画分をエバポレーターで減圧下に濃縮乾固して固形物５３ｍｇを得た。この乾固物を７０％（ｖ／ｖ）メタノール水２０ｍｌに溶かし、カラムＩｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−３（２０ｍｍφ×２５０ｍｍ、ジーエル・サイエンス社製）、流速５．０ｍｌ／ｍｉｎ、移動相メタノール：水（７０：３０）、検出ＵＶ２３０ｎｍ、試料量：５．０ｍｌの条件で分取ＨＰＬＣを数回行いＭＩ−ＡとＭＩ−Ｂの分取を行った。分取した画分を先の条件のＨＰＬＣで分析して純度が９５％以上の画分を合わせ、エバポレーターで減圧下に移動相を留去して純品としてＭＩ−ＡとＭＩ−Ｂをそれぞれ５ｍｇ、２ｍｇ得た。
【００８５】
１０．ＭＩ−ＡとＭＩ−Ｂの構造決定
ＭＩ−Ａの各種スペクトル測定を行った。結果は以下の通りである。
【００８６】
ＭＩ−Ａのマススペクトル（ｍ／ｚ）：３１７．２１４（Ｍ＋Ｈ）＋（実測値）
【００８７】
ＭＩ−Ａの紫外線吸収スペクトルは図１７に示す通りである（メタノール中で測定）。
【００８８】
ＭＩ−Ａの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルは図１８に示す通りである（重クロロホルム中で測定）。
δTMS (ppm)：0.98(3H, d, J=6.72 Hz), 1.25(3H, s), 1.51(1H, m), 1.67(1H, m), 1.75(3H, s), 1.89(3H, m), 1.94(1H, m), 1.99(3H, m), 2.05(1H, dd, J=4.70, 13.1Hz), 2.25(1H, m), 2.37(1H, m), 2.53(1H, m), 3.13(1H, dd, J=4.64, 14.4Hz), 4.83(1H, m), 4.95(1H, dd, J=4.38, 11,1Hz), 4.99(1H, m), 5.80(1H, d, J=1.72Hz), 6.08(1H, m)
【００８９】
ＭＩ−Ａの１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルは図１９に示す通りである（重クロロホルム中で測定）。
δTMS (ppm)：10.5, 15.8, 17.2, 20.0, 20.6, 30.6, 31.6, 40.0, 41.7, 47.3, 50.3, 73.0, 114.4, 124.6, 127.9, 138.1, 143.3, 166.8, 167.6, 198.5
【００９０】
ＭＩ−Ｂの各種スペクトル測定を行った。結果は以下の通りである。
【００９１】
ＭＩ−Ｂのマススペクトル（ｍ／ｚ）：３１７．２１０（Ｍ＋Ｈ）＋（実測値）
【００９２】
ＭＩ−Ｂの紫外線吸収スペクトルは図２０に示す通りである（メタノール中で測定）。
【００９３】
ＭＩ−Ｂの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルは図２１に示す通りである（重クロロホルム中で測定）。
δTMS (ppm)：0.95(3H, d, J=6.76Hz), 1.24(3H, s), 1.47(1H, m), 1.59(1H, m), 1.75(3H, s), 1.90(1H, m), 1.91(3H, d, J=1.16Hz), 2.03(1H, dd, J=4.68, 13.1Hz), 2.18(3H, d, J=1.12Hz), 2.20(1H, m), 2.35(1H, m), 2.52(1H, m), 3.12(1H, dd, J=4.58, 14.3Hz), 4.83(1H, s), 4.91(1H, m), 4.99(1H, m), 5.68(1H, m), 5.79(1H, d, J=1.68Hz)
【００９４】
以上のように、ＭＩ−ＡとＭＩ−Ｂの各種スペクトルデータを詳細に検討した結果、ＭＩ−ＡとＭＩ−Ｂはそれぞれ下記式（４Ａ）および下記式（５Ａ）で表される化学構造であることが決定された。すなわち、ＭＩ−Ａはペタシンであり、ＭＩ−Ｂはその異性体である。
【００９５】
【化１７】
2014198683.tif 000021
【００９６】
【化１８】
2014198683.tif 000022
【００９７】
１１．ＭＩがメラニン産生に及ぼす影響
得られたＭＩが、メラニン産生に及ぼす影響を調べるために、ＩＢＭＸで処理した細胞にＭＩを０．０５μｇ／ｍｌ、０．１μｇ／ｍｌ、０．２μｇ／ｍｌ添加した後、３日間培養し、メラニン産生に及ぼす影響を評価した。結果を図２２に示す。
【００９８】
図２２（Ａ）に示すように、細胞でのメラニン産生は、コントロール、ＩＢＭＸ処理と比べてＭＩで処理することによって０．２μｇ／ｍｌで約５５％抑制され、濃度に依存してメラニン産生を抑制した。また、図２２（Ｂ）に示すように、培地に放出されたメラニンは、ＩＢＭＸ刺激で発現が増加し、ＭＩで処理することによって０．１μｇ／ｍｌで約６７％、０．２μｇ／ｍｌで約９７％抑制され、細胞と同様に濃度に依存してメラニン産生を抑制した。
【００９９】
１２．ＭＩによるＭＩＴＦ及びチロシナーゼ遺伝子発現の抑制
得られたＭＩが、ＭＩＴＦ  ｍＲＮＡ発現、チロシナーゼｍＲＮＡ発現に及ぼす影響を調べた。評価法は上記と同様とした。結果を図２３に示す。
【０１００】
図２３（Ａ）に示すように、ＭＩＴＦ  ｍＲＮＡ発現は、コントロール、ＩＢＭＸ処理と比べて、ＭＩで処理することによって０．４μｇ／ｍｌで約３９％抑制された。また、図２３（Ｂ）に示すように、チロシナーゼｍＲＮＡ発現は、ＭＩで処理することによって、０．４μｇ／ｍｌで約４２％抑制された。これらの結果から、ＭＩの中にＭＩＴＦ抑制物質が含まれていることがわかった。
【０１０１】
１３．ＭＩ−Ａ、ＭＩ−Ｂのメラニン産生に及ぼす影響
得られたＭＩ−Ａ、ＭＩ−Ｂのメラニン産生に及ぼす影響を調べた。評価法は上記と同様とした。結果を図２４に示す。
【０１０２】
図２４（Ａ）、（Ｂ）に示すように、ＭＩ−Ａ、ＭＩ−Ｂともに、メラニン産生抑制効果が確認され、ＭＩ−Ａのほうが若干効果が高いこともわかった。
【０１０３】
１４．ＭＩ−Ａ、ＭＩ−ＢによるＭＩＴＦ及びチロシナーゼ遺伝子発現の抑制
得られたＭＩ−Ａ、ＭＩ−Ｂが、ＭＩＴＦ  ｍＲＮＡ発現、チロシナーゼｍＲＮＡ発現に及ぼす影響を調べた。評価法は上記と同様とした。結果を図２５に示す。
【０１０４】
図２５（Ａ）、（Ｂ）に示すように、ＭＩ−Ａ、ＭＩ−Ｂともに抑制効果があり、ヨブスマソウに含まれるＭＩＴＦ抑制成分が、これら２つの物質であることが示された。そこで、ＭＩ−Ａ、ＭＩ−Ｂについて構造解析を行った。
【０１０５】
構造解析結果から、少なくとも、エステル結合が異なっていても、ＭＩＴＦ抑制効果がある可能性が示唆されたため、ペタシンと類似構造を有するＳ−ペタシン（下記一般式（６Ａ））を入手し、ＭＩＴＦ抑制効果があるか調べた。
【０１０６】
【化１９】
2014198683.tif 000023
【０１０７】
１５．ペタシン、Ｓ−ペタシンのメラニン産生に及ぼす影響
ペタシンとＳ−ペタシンとをそれぞれ用いて、エステル結合の違いがメラニン産生に影響を及ぼすかどうか調べた。評価法は上記と同様とした。結果を図２６に示す。
【０１０８】
図２６（Ａ）に示すように、細胞でのメラニン産生は、コントロール、ＩＢＭＸ処理と比較して、ペタシンで処理することによって０．２μｇ／ｍｌで約６５％、Ｓ−ペタシンで処理することによって０．２μｇ／ｍｌで約６６％抑制され、いずれも濃度に依存してメラニン産生を抑制した。また、図２６（Ｂ）に示すように、培地に放出されたメラニンは、ＩＢＭＸ刺激で発現が増加し、ペタシンで処理することによって０．２μｇ／ｍｌで約８９％、Ｓ−ペタシンで処理することによって０．２μｇ／ｍｌで約８８％抑制され、細胞と同様に濃度に依存して抑制した。
【０１０９】
１６．ペタシン、Ｓ−ペタシンによるＭＩＴＦ及びチロシナーゼ遺伝子発現の抑制
ペタシン、Ｓ−ペタシンが、ＭＩＴＦ  ｍＲＮＡ発現、チロシナーゼｍＲＮＡ発現に及ぼす影響を調べた。評価法は上記と同様とした。結果を図２７に示す。
【０１１０】
図２７（Ａ）に示すように、ＭＩＴＦ  ｍＲＮＡ発現は、コントロール、ＩＢＭＸ処理と比べて、ペタシンで処理することによって０．４μｇ／ｍｌで約４８％、Ｓ−ペタシンで処理することによって０．４μｇ／ｍｌで約５５％抑制された。また、図２７（Ｂ）に示すように、チロシナーゼｍＲＮＡ発現は、ペタシンで処理することによって０．４μｇ／ｍｌで約６６％、Ｓ−ペタシンで処理することによって０．４μｇ／ｍｌで約７１％抑制された。
【０１１１】
以上の結果から、ペタシンと類似構造を有するＳ−ペタシンもＭＩＴＦ抑制効果を有することが示された。すなわち、少なくとも、エステル結合が異なっていても、ＭＩＴＦ抑制効果を有することがわかった。
【０１１２】
１７．補足実験１：ｃＡＭＰ産生に及ぼすヨブスマソウ抽出物（分画３）の影響
競合ＥＩＡ法によって測定し、ｃＡＭＰの定量をした。結果を図２８に示す。図２８に示すように、それぞれα−ＭＳＨ、ＩＢＭＸ，Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎのみで刺激した細胞では１０〜３０分後にピークを迎え、その後減少した。一方、刺激剤とヨブスマソウ抽出物（分画３）１．５μｇ／ｍｌとによる処理では、ｃＡＭＰ産生が増加した。ヨブスマソウ抽出物（分画３）で処理したとしても、ｃＡＭＰは減少しなかった。
【０１１３】
１８．補足実験２：ＣＲＥＢのリン酸化に及ぼすＭＩ−Ａ、ＭＩ−Ｂ、Ｓ−ペタシンの影響
ウェスタンブロット法によって、ペタシン（ＭＩ−Ａ）、ペタシン異性体（ＭＩ−Ｂ）、Ｓ−ペタシンがＣＲＥＢのリン酸化に与える影響を調べた。結果を図２９に示す。図２９に示すように、これら物質は、ＣＲＥＢのリン酸化レベルには影響しなかった。
【０１１４】
１９．補足実験３：他のＣａｃａｌｉａ植物との比較
ヨブスマソウから得られる抽出物が、同じＣａｃａｌｉａ植物の一種であるモミジガサから得られる組成物よりも極めて優れたＭＩＴＦ抑制効果、メラニン産生抑制効果を有することについて示す。
【０１１５】
１９．１．マッシュルームチロシナーゼ阻害作用
抽出物として、ヨブスマソウ８８ｇに溶媒（（１）熱水、（２）７０％  エタノール、（３）１００％メタノール）を加え、ミキサーで細かく粉砕した。（１）の場合はその後１００℃、１０分加熱した。３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上層を濾紙で濾過し回収した。その後、（１）は凍結乾燥機、（２）と（３）はロータリーエバポレータによる減圧乾固を行って溶媒を除去した。固形抽出物の重量を測定後、それぞれ０．１ｇ／ｍｌに調製した。一方、モミジガサについても同様にして、それぞれ０．１ｇ／ｍｌに調製した。
【０１１６】
９６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅにＬ−チロシン含有溶液（２ｍＭ  Ｌ−チロシン、溶媒：５０ｍＭ燐酸緩衝液ｐＨ６．８）を１００μｌ採り、５０ｍＭ燐酸緩衝液ｐＨ６．８を６０μｌ入れ、１ｍｇ／ｍｌに調製した抽出物を２０μｌ入れた。そして、マッシュルームチロシナーゼ（３００Ｕ）を２０μｌ加え攪拌し、２５℃に設定したハイブリオーブンに入れて、６０分インキュベート後、４９０ｎｍの吸光度を測定した。結果を図３０に示す。
【０１１７】
図３０から、ヨブスマソウ抽出物は、７０％エタノール水抽出物で最も強くチロシナーゼを阻害したが、モミジガサ抽出物は、どの溶媒で抽出したとしても、全く阻害作用を示さなかった。
【０１１８】
１９．２．抗酸化能の測定
上記と同様に、抗酸化能は、１，１−ジフェニル−２−ピクリルヒドラジル（ＤＰＰＨ）を用いてラジカル捕捉活性を測定することで評価した。１００μＭ  ＤＰＰＨ（エタノール溶液）を１ｍｌ試験管にとり、上記の抽出物を１０ｍｇ／ｍｌ濃度に調整したものを２０μｌ加え、３０秒撹拌して室温、暗所で３０分間おいた。その後、分光光度計で５１７ｎｍの吸光度を測定することで、ラジカルの消失を測定した。結果を図３１に示す。
【０１１９】
図３１のように、どの溶媒で作成した抽出物でもヨブスマソウ抽出物はモミジガサ抽出物よりも強い抗酸化能を示した。特に、ヨブスマソウ７０％エタノール抽出物は強い抗酸化能を示した。
【０１２０】
１９．３．メラニン産生抑制作用
Ｂ１６  ｍｅｌａｎｏｍａ  ４Ａ５細胞を用いて、ＤＭＥＭを基礎培地として、１０％ウシ胎児血清、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、１００μｇ／ｍｌペニシリンを添加し、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で３〜４日間培養した。メラニン産生を測定するにあたって、細胞を２４時間培養し、培地交換をして１００μＭ  ＩＢＭＸと抽出物及び精製物を添加した後、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で３日間培養した後、メラニン産生量を測定した。
【０１２１】
メラニン測定では、細胞を培養した後、ＰＢＳを加え、細胞を２回かきとり、３０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清をとり、１Ｎ  ＮａＯＨを加えて６０℃で６０分間処理した。処理した後、合成メラミンを標準物質として、マイクロプレートリーダーで細胞は４５０／６５５ｎｍ、培地は４５０ｎｍで測定した。結果を図３２（Ａ）、（Ｂ）に示す。
【０１２２】
図３２から、Ｂ１６  ｍｅｌａｎｏｍａ  ４Ａ５細胞におけるＩＢＭＸ刺激によるメラニン産生に対して、ヨブスマソウ抽出物はモミジガサ抽出物よりも強い抑制作用を示した。特に、ヨブスマソウ７０％エタノール抽出物は強いメラニン産生抑制作用を示した。
【０１２３】
１９．４．ＭＩＴＦ  ｍＲＮＡ発現に及ぼす影響
φ６０ｍｍのディッシュで１２時間培養した細胞を、５ｍｌのＰＢＳで１回洗浄した後、１ｍｌのＴＲＩｚｏｌ（Ｇｉｂｃｏ）を加えて常法にしたがってＲＮＡを抽出した。これよりＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（タカラバイオ社製）を用いてｃＤＮＡを合成し、ＳＹＢＲ  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ  ＩＩ（タカラバイオ社製）を用いて、Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ法によりｍＲＮＡを定量した。
【０１２４】
図３３に、細胞をＩＢＭＸで１２時間処理したときのＭＩＴＦ及びその下流のｍＲＮＡ発現に及ぼす抽出物の影響を示す。図３３に示すように、Ｂ１６メラノーマ細胞におけるＩＢＭＸ刺激によるＭＩＴＦ  ｍＲＮＡの発現上昇に対して、ヨブスマソウ７０％エタノール抽出物は強い抑制作用を示したが、モミジガサ７０％エタノール抽出物には抑制作用はなかった。この差が、メラニン産生抑制の差になっていると考えられる。
【０１２５】
以上、現時点において、最も実践的であり、且つ、好ましいと思われる実施形態に関連して本発明を説明したが、本発明は、本願明細書中に開示された実施形態に限定されるものではなく、請求の範囲及び明細書全体から読み取れる発明の要旨あるいは思想に反しない範囲で適宜変更可能であり、そのような変更を伴う小眼球症関連転写因子抑制剤、メラニン産生抑制剤、化粧品組成物及び抗ガン剤もまた本発明の技術範囲に包含されるものとして理解されなければならない。
【産業上の利用可能性】
【０１２６】
本発明は、エレモフィラン骨格を有するセスキテルペン類の一種であるペタシン又は類似構造を有する脂環式化合物を、ＭＩＴＦ抑制成分として含むことを特徴とする。これら脂環式化合物がＭＩＴＦ抑制作用を有することは従来において全く知られておらず、本発明は従来にない新規薬剤として極めて有用であり、ＭＩＴＦ抑制剤、メラニン産生抑制剤や美白用の化粧品、或いは、抗ガン剤として利用することができる。
【配列表フリーテキスト】
【０１２７】
実験に用いたＰｒｉｍｅｒの塩基配列である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２９】
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【配列表】
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