(57)【要約】      （修正有）【課題】対象の食欲及び／又は体重を減少させる薬剤の提供。【解決手段】マクロファージ抑制性サイトカイン１（ＭＩＣ−１；macrophage inhibitory cytokine-1）の量を増加させる薬剤の使用。該ＭＩＣ−１増強薬剤は、対象における内因性のＭＩＣ−１の量を増加させる薬剤であり、ＭＩＣ−１と、ＭＩＣ−１遺伝子の転写又は翻訳を増強する薬剤と、ｐ５３の発現又は活性を増強する薬剤とからなる群から選択される。該ＭＩＣ−１増強薬剤はＭＩＣ−１であってもよい。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象の食欲及び／又は体重を減少させる薬剤の製造における、薬学的に許容される担体及び／又は賦形剤と混合されていてもよい、有効な量のＭＩＣ−１増強薬剤の使用。
【請求項２】
ＭＩＣ−１増強薬剤が、対象における内因性のＭＩＣ−１の量を増加させる薬剤である、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
対象における内因性のＭＩＣ−１の量を増加させる薬剤が、ＭＩＣ−１と、ＭＩＣ−１遺伝子の転写又は翻訳を増強する薬剤と、ｐ５３の発現又は活性を増強する薬剤とからなる群から選択される、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
ＭＩＣ−１増強薬剤が、ＭＩＣ−１である、請求項１に記載の使用。
【請求項５】
ＭＩＣ−１増強薬剤が、活性ＭＩＣ−１断片及びＭＩＣ−１ペプチドミメティックから選択される、請求項１に記載の使用。
【請求項６】
対象が肥満を患っている、請求項１〜５のいずれかに記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、個体の食欲及び／又は体重を調節する方法に関する。１つの特定の適用では、この方法は、後期段階の腫瘍（特に癌）に伴う食欲減退及び／又は体重減に苦しむ対象に、対象に存在するマクロファージ抑制性サイトカイン１（ＭＩＣ−１；macrophage inhibitory cytokine-1）の量を減少させるか、そうでなければ、対象におけるＭＩＣ−１の活性を抑制（inhibit）することができる薬剤を有効な量投与するものである。
【背景技術】
【０００２】
体重の制御は、現在のところ完全に理解されていない複雑な過程である。それは多因性であり、食欲、食物摂取及び排出、並びにエネルギー利用及び消費によって影響される。多数の可溶性介在物質がこの過程の様々な様相の調節に関与していることが知られており、それらには、レプチン、グレリン、メラノコルチン、アグーチ関連ペプチド、及びニューロペプチドＹ（ＮＰＹ）などのホルモンやサイトカインが含まれている。正常な体重の制御は健康に重要であり、特に、肥満は、個体の罹患率及び死亡率を大きく増大させる可能性がある。平均体重よりも少ないことも問題となりうる。先進諸国では、十分な食料が取得可能なので、これは、一部の慢性炎症性障害、神経性無食欲症などの摂食障害、及び癌を含めた疾患によることが多い。特に癌の後期段階では、悪液質（cachexia）となるのが一般的であり（最も末期症状の癌患者で起こる）、癌関連死亡全体のうち、その約４分の１の原因となっている。
【０００３】
数年前、本発明者は、ヒトＴＧＦ−βスーパーファミリーの新規なサイトカインをクローニングし、特徴付けを行い、それをマクロファージ抑制サイトカイン１（ＭＩＣ−１）と命名した（１〜７）。しかし、それ以降、それは、前立腺由来因子（ＰＤＦ）、胎盤骨形成タンパク質（ＰＬＡＢ）、及び成長／分化因子１５（ＧＤＦ−１５）としても知られるようになった（７）。安静状態では、胎盤が、ＭＩＣ−１を大量に発現する唯一の組織である（７）が、他の様々な臓器の上皮細胞も、少量のＭＩＣ−１ ｍＲＮＡを通常時に発現する。しかし、この低レベルの正常なＭＩＣ−１発現は、悪性腫瘍、炎症、及び傷害の際に劇的に上昇する（７、８〜１１）。この上昇は、様々な細胞ストレス及び活性化因子によって誘導され、特に転写因子ｐ５３及びＥＧＲ−１によって細胞内に伝達される（１２〜１５）。詳細には、ＭＩＣ−１発現の上昇は、乳癌、前立腺癌、膵癌、及び大腸癌と密接に関連しており（９〜１１、１７、１８）、大腸ポリープ又は大腸癌を有する１００人の患者に関する最近発表された研究（２０）で、本発明者は、ＭＩＣ−１の血清レベルの上昇が、正常から良性に、そして、異形成大腸ポリープを経て、最終的には大腸癌に至る、大腸癌の発病機序を反映して、進行性の段階的様式で起こることを示した。他の研究の結果（１５、１７、１９、２１）と併せて、この観察は、ＭＩＣ−１が、腫瘍環境を調節する重大なパラクリン作用を誘導することによって、腫瘍進行における重要な役割を果たしていることを示す。
【０００４】
本発明へと至る研究において、上述した上皮癌の１つの後期段階にある患者のＭＩＣ−１血清レベル（例えば１０〜５０ｎｇ／ｍｌ以上の血清レベル）が、ＭＩＣ−１を過剰発現し、著しい体重減を示したマウスの血清レベルと相関していることが観察された。従って、ＭＩＣ−１発現の上昇を伴う癌を有する患者で一般的に見られる悪液質は、ＭＩＣ−１の過剰発現によるものであること、そして、その発現の抑制（例えば抗ＭＩＣ−１抗体を用いる）によって、体重減の重篤度を逆転又は軽減させることが可能であろうということを提言した。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
従って、第１の態様では、本発明は、対象の食欲及び／又は体重を調節する方法を提供し、この方法は、有効な量のＭＩＣ−１調節薬剤（MIC-I -modulating agent）を前記対象に投与するステップを含み、前記薬剤は、前記対象に存在するＭＩＣ−１の量を増加又は減少させるか、或いは、前記対象に存在するＭＩＣ−１の生物活性を抑制又は増強する。
【０００６】
第２の態様では、本発明は、対象の食欲及び／又は体重を増加させる方法を提供し、この方法は、有効な量のＭＩＣ−１抑制薬剤（MIC-I -inhibiting agent）を前記対象に投与するステップを含み、その際、前記薬剤が、薬学的に許容される担体及び／又は賦形剤と混合されていてもよい。
【０００７】
第３の態様では、本発明は、対象の食欲及び／又は体重を減少させる方法を提供し、この方法は、有効な量のＭＩＣ−１増強薬剤を前記対象に投与するステップを含み、その際、前記薬剤が、薬学的に許容される担体及び／又は賦形剤と混合されていてもよい。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
多くの癌、特に上皮由来の癌がＭＩＣ−１を過剰発現すること、そして、疾患の段階及び程度に比例して、これらの癌を有する患者の血清中ＭＩＣ−１レベルが上昇することが、以前に既に見出されている。特に癌の後期段階では、これらの血清レベルが１０〜５０ｎｇ／ｍｌ以上に達することがある。これは、マウスで著しい体重減を伴うレベルである。癌患者でＭＩＣ−１レベル又はＭＩＣ−１活性を低下させることによって、体重減並びにそれに続く、患者の生活状態及び尊厳への悪影響が逆転又は抑制されるであろうと予測される。続いて、これが、患者が癌の治療を受けて、その治療に前向きに反応する能力の助けとなり、それによって、罹患率及び死亡率を低下させる可能性がある。
【０００９】
従って、第１の態様では、本発明は、対象の食欲及び／又は体重を調節する方法を提供し、この方法は、有効な量のＭＩＣ−１調節薬剤を前記対象に投与するステップを含み、前記薬剤は、前記対象に存在するＭＩＣ−１の量を増加又は減少させるか、或いは、前記対象に存在するＭＩＣ−１の生物活性を抑制又は増強する。
【００１０】
対象に存在するＭＩＣ−１の量を減少させる（詳細にはＭＩＣ−１の血清レベルを低下させる）か、或いはＭＩＣ−１の活性を抑制するように上記の方法を実施する場合、この方法は、食欲を増強し、且つ／或いは、対象の体重の増加又は少なくとも何らかの体重減失の減少に導く可能性がある。その一方、ＭＩＣ−１の量を増加させる（詳細にはＭＩＣ−１の血清レベルを上昇させる）か、或いはＭＩＣ−１の活性を増強するように上記の方法を実施する場合、この方法は、食欲を減退させ、且つ／或いは、対象の体重の減少又は少なくとも何らかの体重増加の減少に導く可能性がある。
【００１１】
第２の態様では、本発明は、対象の食欲及び／又は体重を増加させる方法を提供し、この方法は、有効な量のＭＩＣ−１抑制薬剤を前記対象に投与するステップを含み、その際、前記薬剤が薬学的に許容される担体及び／又は賦形剤と混合されていてもよい。
【００１２】
第２の態様の方法は、ＭＩＣ−１を抑制する薬剤の投与を行うものである。そのような薬剤は、対象の内因性ＭＩＣ−１の量（詳細には内因性ＭＩＣ−１の血清レベル）を減少させるものでよく、抗ＭＩＣ−１抗体又はその断片（例えばＦａｂ断片化又は組換えｓｃＦｖ断片（２２））と、ＭＩＣ−１の遺伝子を標的とする触媒オリゴヌクレオチド及び抑制オリゴヌクレオチド（例えば、リボザイム、ＤＮＡザイム、アンチセンスＲＮＡ、及びｓｉＲＮＡ（small inhibitory RNA））と、ＭＩＣ−１の転写又は翻訳抑制物質とから選択されたものでありうる。別法では、ＭＩＣ−１抑制薬剤は、対象における内因性ＭＩＣ−１の活性阻害するものでもよく、抗ＭＩＣ−１抗体若しくはその断片（例えばＦａｂ断片又は組換えｓｃＦｖ断片）と、ＭＩＣ−１受容体の可溶性の細胞質外受容体ドメインと、ＭＩＣ−１に結合する他の可溶性の分子又はマトリックス結合タンパク質（例えばヘパリン、ヘパラン硫酸、及びフェチュイン）と、例えば、その受容体へのＭＩＣ−１の結合のペプチド、ペプチドミメティック又は有機小分子抑制物質とから選択されたものでありうる。加えて、ペプチド、ペプチドミメティック、又は有機小分子抑制物質は、ＭＩＣ−１受容体リン酸化、ＭＩＣ−１受容体から核へのシグナル伝達情報の伝達、又は細胞ゲノム上の適切な転写因子の作用を抑制することによって、内因性ＭＩＣ−１の活性を抑制するものでありうる。さらに、ＭＩＣ−１抑制薬剤は、成熟ＭＩＣ−１タンパク質ドメインからのプロペプチドの切断を行うプロコンバターゼ（proconvertase）酵素の抑制物質でもよい。下記の実施例１に示す通り、未成熟なＭＩＣ−１（すなわちｐｒｏＭＩＣ−１）は、細胞外マトリックスに結合しており、従って、ＭＩＣ−１のプロセシングを行うプロコンバターゼ酵素を抑制することによって、ＭＩＣ−１を細胞外マトリックス中に「閉じこめる」ことができる。プロコンバターゼ酵素は、例えば、（ａ）α−１−アンチトリプシン変異体であるα−１−アンチトリプシンポートランドを用いた、細胞の形質移入、（ｂ）ポリアルギニンペプチド、及び、（ｃ）標的タンパク質のプロペプチド配列とプロコンバターゼ配列とにまたがった、プロコンバターゼの標的タンパク質の配列に基づいたペプチドによって抑制できる。
【００１３】
ＭＩＣ−１を抑制する薬剤は、好ましくは、抗ＭＩＣ−１抗体又はその断片であり、より好ましくは、ヒト化されたモノクローナル抗ＭＩＣ−１抗体である。ヒト化された抗ＭＩＣ−１抗体は、米国特許第５２２５５３９号に記載の方法で産生できる（この開示全体を参照により本明細書に援用する）。
【００１４】
第２の態様の方法は、炎症性疾患（例えば慢性関節リウマチ）及び／又は癌（特に、乳癌、前立腺癌、大腸癌、直腸癌、膀胱癌、及び膵癌などの上皮癌）に伴う食欲減退及び／又は体重減に苦しむ対象の治療に有用である。しかし、この方法は、ＭＩＣ−１が過剰発現されるいかなる他の疾患、状態、又は治療（例えば傷害、炎症、ストレス、放射線療法、及び化学療法）に伴う食欲減退及び／又は体重減の治療にも有用でありうる。第２の態様の方法で治療するのに適した対象は、ＭＩＣ−１過剰発現を示すもの、又は、少なくともＭＩＣ−１の血清レベルが一貫して、正常血清レベルである２００〜１２００ｐｇ／ｍｌの上位にあるものに限定することができる。そのような対象は、ＭＩＣ−１のアッセイ（例えばＭＩＣ−１ ＥＬＩＳＡ（４））を用いて高血清レベルのＭＩＣ−１を検出する（例えば全血又は血清試料から）ことによって選択することができる。
【００１５】
第２の態様の方法は、進行癌に伴う食欲減退及び／又は体重減に苦しむ対象の治療に用いることが好ましい。進行癌では、総腫瘍量が多いことによって、ＭＩＣ−１の血清レベルが高くなることが多い。
【００１６】
第３の態様では、本発明は、対象の食欲及び／又は体重を減少させる方法を提供し、この方法は、有効な量のＭＩＣ−１増強薬剤を前記対象に投与するステップを含み、その際、前記薬剤が、薬学的に許容される担体及び／又は賦形剤と混合されていてもよい。
【００１７】
第３の態様の方法は、ＭＩＣ−１増強薬剤の投与を行うものである。そのような薬剤は、対象の内因性ＭＩＣ−１の量（詳細には内因性ＭＩＣ−１の血清レベル）を増加させるものでよく、ＭＩＣ−１、及びＭＩＣ−１遺伝子の転写又は翻訳を増強する薬剤（例えばｐ５３転写因子、又は、ヌトリン（ｎｕｔｌｉｎ）（２３）など、ｐ５３の発現又は活性を増強する薬剤であり、ｐ５３はＭＩＣ−１過剰発現を伴う疾患でしばしばレベルが上昇しているのが見られる）から選択されたものでありうる。別法では、ＭＩＣ−１増強薬剤は、対象における内因性ＭＩＣ−１の活性増強するものでもよい。本明細書で使用される場合、ＭＩＣ−１増強薬剤という用語には、ＭＩＣ−１の活性を模倣する薬剤が含まれるものとする（例えば、活性なＭＩＣ−１断片、ＭＩＣ−１の活性ドメインのペプチドミメティック、及びＭＩＣ−１活性を模倣する有機小分子）。
【００１８】
第３の態様の方法は、肥満を患う対象の治療、又は別の状況で生活状態の向上若しくは虚栄を理由として体重減を望むかもしれない対象への処置に有用である。
【００１９】
本発明の方法での使用に供するＭＩＣ−１調節薬剤は、いかなる適当な医薬／獣医学組成物又は剤形（例えば、経口、口腔、鼻腔、筋肉内、及び静脈内投与用の組成物）に処方してもよい。そのような組成物は、通常、食欲及び／又は体重を調節するのに効果的な量で対象に投与されるであろう。従って、そのような組成物は、１日あたり約０．０１〜約１００μｇ／ｋｇ体重のＭＩＣ−１調節薬剤、より好ましくは１日あたり０．０５〜２５μｇ／ｋｇ体重のＭＩＣ−１調節薬剤を提供するものでありうる。適当な組成物は、最も効果的な結果を実現するのに必要なように、１日１回投与用、１日複数回投与用、又は制御若しくは持続放出用に意図されたものでありうる。
【００２０】
上記に特定したＭＩＣ−１調節薬剤に加えて、対象に存在するＭＩＣ−１の量及び／又はＭＩＣ−１の活性に影響のあるものを求めて候補薬剤又は薬剤ライブラリーをスクリーニングすることよって、他のＭＩＣ−１調節薬剤を同定することもできる。同様に、様々な疾患又は状態の治療用薬剤を、食欲及び／又は体重への望ましくない副作用（例えば食欲の、望ましくない抑制又は促進）に関して評価することもできるであろう。
【００２１】
従って、さらに別の態様では、本発明は、対象の食欲及び／又は体重への薬剤の影響を評価する方法を提供し、この方法は、前記薬剤を前記対象又は適当なその動物モデル（例えばマウス）に投与するステップと、前記対象又は動物モデルにおけるＭＩＣ−１の量（特に血清ＭＩＣ−１レベル）のいかなる増加又は減少も検出するステップとを含む。
【００２２】
対象又は動物モデルにおけるＭＩＣ−１の量のいかなる増加又は減少も、前記薬剤の投与の前後にＭＩＣ−１試料（例えば全血又は血清試料）を採取し、前記試料のそれぞれにおけるＭＩＣ−１の量を測定する（例えばＭＩＣ−１ＥＬＩＳＡを用いて）ことによって同定できる。
【００２３】
同様の態様では、本発明は、対象の食欲及び／又は体重への薬剤の影響を評価する方法を提供し、この方法は、ＭＩＣ−１（又はその機能性断片若しくはミメティック）と、ＭＩＣ−１結合パートナー（好ましくはＭＩＣ−１受容体、又はその機能性断片若しくはミメティック）と、前記薬剤との間の混合物を形成するステップ、並びにＭＩＣ−１（又はその機能性断片若しくはミメティック）と、ＭＩＣ−１結合パートナーとの結合のいかなる増強又は減弱も検出するステップを含む。
【００２４】
結合の増強は、その薬剤が、対象の食欲及び／又は体重を減少させる可能性が高いことを示す。一方、結合の減弱は、その薬剤が、対象の食欲及び／又は体重を増加させる可能性が高いことを示す。
【００２５】
また、さらに別の同様の態様では、本発明は、対象の食欲及び／又は体重への薬剤の影響を評価する方法を提供し、この方法は、ＭＩＣ−１を発現する細胞を前記薬剤に曝露するステップと、前記ＭＩＣ−１発現のレベルのいかなる上昇又は低下も検出するステップとを含む。
【００２６】
ＭＩＣ−１の発現の上昇は、その薬剤が、対象の食欲及び／又は体重を減少させる可能性が高いことを示す。一方、ＭＩＣ−１の発現の低下は、その薬剤が、対象の食欲及び／又は体重を増加させる可能性が高いことを示す。
【００２７】
この方法は、マクロファージ、上皮細胞、内皮細胞、及びそれらの細胞系から選択された、ＭＩＣ−１を発現する細胞又は細胞系を用いてインビトロ（in vitro）で行うことが好ましい。
【００２８】
さらに別の態様では、本発明は、対象の食欲を評価する方法を提供し、この方法は、前記対象に存在するＭＩＣ−１の量（特に血清ＭＩＣ−１レベル）を測定するステップを含む。
【００２９】
そのような方法も、将来の体質量を予測するものでありうる。
【００３０】
ＭＩＣ−１の過剰発現が対象の食欲及び／又は体重を減少させているようだという新知見は、対象のＭＩＣ−１レベルを増強する遺伝子療法の方法によって、肥満の効果的な治療が提供されうることを示す。従って、本発明は、内因性ＭＩＣ−１発現の上昇を引き起こす組換えＭＩＣ−１遺伝子を含む、対象の食欲及び／又は体重を減少させる遺伝子療法の方法、及び遺伝子療法薬も企図する。ＭＩＣ−１遺伝子の導入に適したベクターには、組換えアデノウイルスベクター又はアデノウイルス関連ベクター、組換えレトロウイルスベクター、組換えレンチウイルスベクター、線状ＤＮＡ含有リポソーム、及び形質移入又は形質転換された幹細胞が含まれる。
【００３１】
本発明の本質がより明確に理解されるようにすることを目的として、その好ましい形態を、これより、以下の非限定的な実施例に関して記述する。
【実施例１】
【００３２】
（血清ＭＩＣ−１レベルの調節）
ＭＩＣ−１は、タンパク質におけるＴＧＦ−βスーパーファミリーの他のメンバーと同様に、Ｎ末端プロペプチドと、Ｃ末端の成熟ＭＩＣ−１ドメインとを含有する前駆体として合成される。この前駆体は、小胞体（ＥＲ）の中でジスルフィド結合による二量体化を行い、二量体化が完了すればゴルジ装置に向けてＥＲを離れ、ゴルジ装置で、フリン（ｆｕｒｉｎ）様のコンバターゼが、保存されたＲＸＸＲ部位（アミノ酸１９６）（配列番号１）でそれを切断する。この切断によってプロペプチドが成熟Ｃ末端側ドメインから分離され、それによって、ジスルフィド結合で連結された２４．５ｋＤの二量体として、ＭＩＣ−１が放出される（１）（図１）。
【００３３】
通常は、かなりの量のＭＩＣ−１が、プロセシングされていない形態で分泌されていることが以前に見出されている。例えば、栄養膜細胞系ＢｅＷｏ（４）、前立腺癌細胞系ＬｎＣＡＰ及びＰＣ３、膵細胞系Ｐａｎｃ１、並びに単球様細胞系Ｕ９３７を含めた様々な細胞から、プロセシングされていない内因性ｐｒｏＭＩＣ−１が分泌されることが判明している。前立腺腺癌細胞系ＬｎＣＡＰでは、プロセシングされていないｐｒｏＭＩＣ−１は細胞外マトリックス（ＥＣＭ）に結合しているが、成熟したＭＩＣ−１は培養上清中に局在することが判明している（２４）。ＭＤＣＫ形質移入体を用いた予備研究はまた、アミノ酸１４４〜１９５にある、プロペプチドのＣ末端領域によって、ＥＣＭ結合も媒介されることを実証した。さらに、精製された組換えプロペプチド及びｐｒｏＭＩＣ−１は、両方とも、プロペプチドにおける同一のＣ末端領域を介してヘパリンと相互作用する。
【００３４】
ＥＣＭとのｐｒｏＭＩＣ−１の結合は、ＥＣＭ結合が潜在性ＭＩＣ−１の局所的貯蔵を提供し、貯蔵されたｐｒｏＭＩＣ−１のプロセシングの結果、成熟したＭＩＣ−１（ＥＣＭへの親和性がほとんどない）が血流中に急速に放出されることを示唆する。この概念を試験するために、ヌードマウスの腫瘍異種移植モデル（１６）を開発した。
【００３５】
（材料及び方法）
ＤＵ１４５ヒト前立腺癌細胞系（１７）は、内因性ＭＩＣ−１を産生せず（主として、細胞が機能的なｐ５３を産生しないため）、従って、様々なヒトＭＩＣ−１コンストラクトを発現するための媒体として有用である。ＤＵ１４５細胞系を用いて、真核細胞発現ベクター（IRES II EGFPベクター、Clontech社製）で恒久的に形質移入されたサブクローニング済みのＤＵ１４５細胞系を作製した。これらの細胞系は、
（ｉ）完全長ヒトｐｒｏＭＩＣ−１（但し、天然のリーダーペプチドではなく、ＦＳＨリーダーペプチドを用いた）（１）、
（ii）成熟したヒトＭＩＣ−１（プロペプチドはもたないが、ＦＳＨリーダーを含有する）、
（iii）フリン様プロコンバターゼ部位（太字で示す）を含有するアミノ酸配列RGRRRAR（配列番号２）を欠失したヒトｐｒｏＭＩＣ−１（ＦＳＨリーダーを含有する）であって、欠失により、プロセシングと、それに続く、成熟したＭＩＣ−１の、プロペプチドからの遊離が阻止されているヒトｐｒｏＭＩＣ−１、並びに、
（iv）ベクターの陰性対照のみ（５）のいずれかをコードする配列を含有する。
【００３６】
ＥＧＦＰ発現に基づいて、発現の高いサブクローンを選択した。これらの細胞を免疫不全ＢＡＬＢ／ｃ ｎｕ／ｎｕヌードマウスの側腹部に皮下注射した。マウスを定期的にモニターし、２〜３日おきにそれらの体重を測定した。マウスは、注射の約２カ月後、又は腫瘍直径が１．１ｃｍに達したときに屠殺した。ＥＬＩＳＡによってヒトＭＩＣ−１レベルを推定するために、屠殺の直前にこれらのマウスから血清を取得した（４、１６、１８）。このヒトＭＩＣ−１についてのＥＬＩＳＡは、マウスのＭＩＣ−１と交差反応を起こさず、また、以前に、マウスにおけるヒト腫瘍ＭＩＣ−１レベルの良好且つ排他的な測定に用いられている（１６）。
【００３７】
（結果）
結果を図２及び３に示す。成熟したＭＩＣ−１を発現する腫瘍マウスのみが血清ＭＩＣ−１レベルの劇的な上昇を示した。ＭＩＣ−１のＦＵＲＩＮ ＤＥＬ変異体を発現するマウス腫瘍は、プロセシングを正常に行うことができず、従って、プロペプチドを含有するが、これらは、著しく低い血清ＭＩＣ−１レベルを有していた。インビトロデータから推定すると、この結果は、ＦＵＲＩＮ ＤＥＬ変異体がＥＣＭと強固に結合しているためと思われる。
【００３８】
（考察）
この実施例で得られた結果は、組織と血液との間のＭＩＣ−１分布を調節するのに、ＭＩＣ−１プロペプチドが重要であることを示す。従って、ＭＩＣ−１プロペプチドに結合する物質（例えばヘパリン及びヘパラン硫酸）、又は、他の方法で、プロペプチド上のマトリックス結合部位と競合する物質（例えば精製された組換えプロペプチドそれ自体）のいかなるものも、血流中のＭＩＣ−１レベルを上昇させると予測されよう。その結果、食欲を含めた、血清ＭＩＣ−１によって媒介される機能が調節されるであろう。
【実施例２】
【００３９】
（ＭＩＣ−１による食欲の調節）
実施例１に記載した調査の過程で、異種移植モデルマウスのうち、ＭＩＣ−１を過剰発現している腫瘍を有するものは、体重が減少したか、或いは対照マウスほど体重を増加させなかったことに気づいた。そのため、観察された、マウスの体重への影響の程度及び理由を決定するための研究を行った。
【００４０】
（材料及び方法）
屠殺の直前にマウスの体重を測定し、体重／％体重減を血清ＭＩＣ−１レベル（例えば、実施例１に記載のＥＬＩＳＡによって測定したもの）と比較した。
【００４１】
血清ＭＩＣ−１レベルが、観察された体重減の原因であるかどうかを査定するために、第２の研究を行った。この研究では、成熟したヒトＭＩＣ−１を過剰発現している（且つ、以前に発明者らによって最も高い血清ＭＩＣ−１レベルと関連付けられている）ＤＵ１４５クローンをヌードマウスに皮下注射し、マウスの体重がかなり減少した後、２７日目に、１ｍｇ若しくは１０ｍｇの、精製された対照ヒツジＩｇＧ、又は組換えヒトＭＩＣ−１で免疫処置され、且つヒトＭＩＣ−１に対する高力価の抗体を有するヒツジの血清から精製されたＩｇＧをマウスに腹腔内注射した。このヒツジ抗ヒトＭＩＣ−１ ＩｇＧは、ヒトＭＩＣ−１に高い親和性で反応し、以前に、ＭＩＣ−１ ＥＬＩＳＡに使用されている。
【００４２】
観察された体重減が、別の腫瘍由来の産物ではなく、ＭＩＣ−１によって媒介されたものであることをさらに実証するため、マクロファージに特異的なｃ−ｆｍｓプロモーターの制御下にマウスＭＩＣ−１を過剰発現する２つのトランスジェニックマウス系統（ｍｉｎ ２８及びｍｉｎ ７５；共にＣ５７Ｂｌ６マウスで作製）について、体重減の評価を行った。
【００４３】
（結果）
ヒツジ抗ヒトＭＩＣ−１ ＩｇＧを用いて行われた研究において、１ｍｇのヒツジ抗ヒトＭＩＣ−１ ＩｇＧは、マウスの体重に相違をもたらさなかった（データは示されていない）が、１０ｍｇの抗ＭＩＣ−１ ＩｇＧ（図４Ａを参照）は、それぞれの腫瘍保有ヌードマウスで、急速な体重増加を誘導した（図４Ｂに示す、１０ｍｇの対照ＩｇＧでの結果を参照のこと）ことが判明した。この体重増加は、抗体を投与した５から６日後にピークに達し、その後、それに続く７から１０日間にわたって、マウスの体重が徐々に減少した。
トランスジェニックマウス系統ｍｉｎ ２８及びｍｉｎ ７５の体重減評価の結果を図５から７に示す。これらの結果は、これらのマウスが、それらの野生型コンジェニック同腹仔より実質的に小さいことも示す。これらのマウスは、出生時体重が等しく、体重の相違は出生して最初の数週間の後に現れ始める。
【００４４】
（考察）
観察された体重減は、一部のマウスでは極めて劇的であった。そして、それは、腫瘍由来のヒトＭＩＣ−１の血清レベルと関連していることが判明した。成熟したヒトＭＩＣ−１を過剰発現しているＤＵ１４５クローンで形質移入されたマウスは、圧倒的に最も高いレベルの血清ＭＩＣ−１を有し、これらのマウスは劇的な速度で体重を減少させた。動物行動の観察によって、このことの主原因が、これらのマウスによる飼料摂取の劇的な減少にあることが示された。ヒツジ抗ＭＩＣ−１ ＩｇＧの投与によって（対照ＩｇＧでは効果がないが）、体重減を逆転できるであろうという新知見は、この体重減がＭＩＣ−１によることを実証するものである。これはトランスジェニックマウス系統ｍｉｎ ２８及びｍｉｎ ７５を用いた体重減評価によって実証された。これらのマウスでは、ＭＩＣ−１発現がマクロファージ特異的であるにもかかわらず、血清ＭＩＣ−１レベルが著しく上昇しており、野生型コンジェニックマウスと比較して、体重の有意な相違が観察された。トランスジェニックマウス系統及びそれらの野生型コンジェニック同腹仔は、両方とも出生時体重（すなわち、出生の２４時間後に測定されたもの）が同じであったので、この体重減効果は出生後に起こったものである。
【実施例３】
【００４５】
（抗ＭＩＣ−１モノクローナル抗体の投与によって、ＭＩＣ−１を分泌する腫瘍に関連した体重減が逆転される）
（結果及び考察）
異種移植モデルをヌードマウスで確立した（上述の通り）。その際、ヌードマウスの側腹部に、成熟ＭＩＣ−１を過剰発現するように遺伝子操作されたいずれかのＤＵ１４５細胞を注射した。ＭＩＣ−１を過剰発現しているＤＵ１４５細胞を注射されたマウスは、急速に体重減を開始した。ＭＩＣ−１に対するモノクローナル抗体（ＭＡｂ２６）を、１１日目に０．１〜１ｍｇの用量で単回投与したところ、それによって、体重の増加が引き起こされ、その程度、及びその期間は、ＭＡｂ２６の量を増加させるに従って、増大した（図８Ａ〜Ｃ）。最も高い用量である約１ｍｇでは、体重が異種移植前のレベルにまで上昇し、それから、抗体が最初に投与されたときと同じ体重にまで再び減少するのに約１７日かかった。ＭＡｂ２６は、腫瘍の成長に影響を与えなかった（図８Ｄ〜Ｆ）。また、未処置のマウス（図８Ｇ）、及びリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）のみで処置されたマウス（図８Ｈ）は、実験期間中、急速且つ継続的に体重を減少させた。
【実施例４】
【００４６】
（マウス異種移植モデルにおける飼料摂取への影響）
（材料及び方法）
異種移植モデルをヌードマウスで確立した（上述の通り）。その際、ヌードマウスの側腹部に、成熟ＭＩＣ−１を過剰発現するように遺伝子操作されたＤＵ１４５細胞、又は対照プラスミドを有するＤＵ１４５細胞のいずれかを注射した。ＭＩＣ−１を過剰発現しているＤＵ１４５細胞を注射した後の８日目に、飼料摂取を、３回の連続した２４時間の測定時間について測定した。８日目の平均腫瘍量は５６ｍｍ３、平均体重減は７％であった。マウスは、１ケージあたり５匹のグループで飼育した。タイムポイント０に、ホッパーに入れた飼料の重さ及び同腹仔の体重を計測した。ホッパーに入れた飼料から残余及びこぼれた量を引くことによって、２４時間後に、消費された飼料を推定した。対照マウスの飼料摂取も同様に測定したが、測定は、平均腫瘍容積が７０ｍｍ３に達したときである腫瘍注射後２１日目に行った。
【００４７】
（結果）
ＭＩＣ−１を過剰発現しているＤＵ１４５が注入されたマウスの飼料摂取は、対照マウスより、１、２、及び３日目（ｐ＝０．０１、０．０００１、及び０．０２）に有意に少なかった（約３０％）（図９）。これらのマウスの脂肪量を直接測定したところ、精巣上体、鼠径部、及び後腹膜の領域で、脂肪量の著しい減少がＭＩＣ−１過剰発現に伴った（図１０）。その際、２種類の代表的な筋肉の量は減少しなかった。
【実施例５】
【００４８】
（マウス異種移植モデルにおける血清代謝マーカーの測定）
（材料及び方法）
異種移植モデルをヌードマウスで確立した（上述の通り）。その際、ヌードマウスの側腹部に、ＭＩＣ−１を過剰発現するように遺伝子操作されたＤＵ１４５細胞、又は対照ＤＵ１４５細胞のいずれかを注射した。腫瘍容積が１００〜２００ｍｍ３に達したか、或いはマウスの体重が約１８％低下したとき、すなわち、ＭＩＣ−１を過剰発現しているＤＵ１４５腫瘍細胞を注射した１１〜１６日後、そして、対照腫瘍を注射した２１〜３０日後に、マウスを屠殺した。以前の実験から、腫瘍に由来するヒトＭＩＣ−１の血清レベルは１５〜５８ｎｇ／ｍｌであることが知られている。心臓穿刺によって血清を採集し、市販のイムノアッセイを用いて代謝マーカーをアッセイした。統計的比較は、スチューデントのＴ検定を用いて行った。
【００４９】
（結果及び考察）
マウスにおける様々な代謝マーカーの測定によって、ＭＩＣ−１を過剰発現する腫瘍マウスにおける、トリグリセリド及び遊離脂肪酸、そしてグルカゴン及びＩＧＦ−１の統計的に有意な減少が実証された（データは示されていない）。脂肪量の減少と一致した、レプチン濃度の減少もあった。これは、ＭＩＣ−１によって減少した飼料摂取が、ＭＩＣ−１によるレプチンの刺激によって媒介された可能性が非常に小さいことを示すものである。グルコースに関する相違は、ｐ＝０．０５３であり、僅差で統計的有意性を満たさなかった。これらの新知見は、飢餓及び脂肪の減失と概ね一致したものである。
【実施例６】
【００５０】
（マウス異種移植モデルにおける脂肪パッド及び筋肉の重さの測定）
（材料及び方法）
異種移植モデルをヌードマウスで確立した（上述の通り）。ＭＩＣ−１を過剰発現するように遺伝子操作されたＤＵ１４５細胞を２０匹のマウスの側腹部に注射し、対照プラスミドで形質移入されたＤＵ１４５細胞を２０匹のマウスに注射した。腫瘍容積が１００〜２００ｍｍ３に達したか、或いはマウスの体重が約１８％低下したとき、すなわち、ＭＩＣ−１を過剰発現しているＤＵ１４５腫瘍細胞を注射した１１〜１６日後、そして、対照腫瘍を注射した２１〜３０日後にマウスを屠殺した。肩甲骨間褐色脂肪組織、鼠径部、精巣上体、及び後腹膜の脂肪、並びに脛骨筋及び腓腹筋を慎重に解剖し、摘出して重さを量り、その重さを体重に関して補正した。
【００５１】
（結果及び考察）
褐色脂肪は減少しなかったが、鼠径部脂肪、精巣上体脂肪、及び後腹膜脂肪における体脂肪の重さに顕著な減少があった（図１０）。これら２つのグループの間では、マウスの筋肉の重さに有意な相違がなかった（図１０)。しかし、ＰＩＸＩｍｕｓイメージャー（GE Lunar社製）を使用した、より感度の高い総除脂肪体重分析を用いたところ、除脂肪体重の全体的な減少があったことが示された。また、それは、総脂肪質量及び腹部脂肪質量がはるかに大きく減少していることを確認した。
【実施例７】
【００５２】
（ＭＩＣ−１トランスジェニックマウス）
（結果及び考察）
ｃ−ｆｍｓプロモーターの制御下に、ＭＩＣ−１を単球様細胞から過剰発現するように遺伝子操作して、トランスジェニックマウスを作製した。これらのマウスは、全身的にＭＩＣ−１レベルが上昇しており、健康な外見を有し、正常に繁殖した。それらは、野生型マウスから識別できないが、生後約３週間に始まり、成人期にまで至る有意な成長遅延を示す（図５〜７）。この効果は、ｍｉｎ ７５及びｍｉｎ ２８と呼ばれる２つの独立したトランスジェニック系統で観察された。
【００５３】
腫瘍異種移植マウスと同様に、ＭＩＣ−１を過剰発現するトランスジェニックマウスの飼料摂取は、それらの野生型対応物より有意に少なかったが、この相違は、飼料摂取量をマウスの体重に関して補正することによって消失した（図１１）。出生時からＭＩＣ−１レベルが上昇していれば、その結果、飼料摂取が減少し、その結果としてサイズが減少し、それらのサイズが、減少した飼料摂取に適したものとなる平衡に達すると考えられている。これらのトランスジェニック動物で、腫瘍を異種移植されたマウスと同じ代謝マーカーの測定を行ったところ、ＩＧＦ−１レベルのみが有意な相違を示した。ＭＩＣ−１トランスジェニックマウスでは、ＩＧＦ−１レベルが低下している。
【００５４】
過剰発現性のトランスジェニックマウスは、鼠径部、精巣上体／子宮、及び後腹膜の領域で脂肪量の減少を示し、これは、オスマウスと比較して、メスの方がより顕著である（図１２）。比較的に、脾臓が小さいことと、胸腺が大きいことを除いて、分析された３種類の脂肪パッドすべてのサイズが減少していた。絶対的な意味では、野生型（ＷＴ）対トランスジェニック（ＴＧ）で胸腺の重さに相違はなかった。
【実施例８】
【００５５】
（フェチュインによる血清ＭＩＣ−１レベルの制御）
血清ＭＩＣ−１が、すべての個体で平均濃度４５０ｐｇ／ｍｌで存在することは、ＴＧＦ−βスーパーファミリーに属する他の一部のサイトカインと同様に、ＭＩＣ−１が１つ又は複数の血中調節因子に結合している可能性があることを示唆する。糖タンパク質であるフェチュインは、広範な細胞及び組織で発現され、血清中に存在する。ＭＩＣ−１がこの糖タンパクと相互作用しているかどうかを決定するために以下の調査を行った。
【００５６】
（材料及び方法）
精製された組換えＭＩＣ−１及び成熟ＭＩＣ−１（０．１％ＢＳＡ中）を、フェチュインでコーティングされたアガロースビーズと共にインキュベートした。その後ビーズを洗浄し、結合した物質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと、それに続く、抗ＭＩＣ−１抗体を用いたウェスタンブロット法とによって分析した。その際、レーン１は、精製された組換えＭＩＣ−１、レーン２は、フェチュインビーズに結合したＭＩＣ−１、レーン３は、フェチュインビーズのみ、レーン４は、アガロースビーズのみと共にインキュベートされたＭＩＣ−１とした。
【００５７】
（結果）
結果は、図１３に示されており、これは、成熟したＭＩＣ−１がフェチュインと相互作用及び結合することを明確に示している。
【００５８】
（考察）
ＭＩＣ−１はフェチュインに結合するので、血清ＭＩＣ−１によって媒介される機能を調節するために、ＭＩＣ−１抗体の投与の代替手段を、フェチュインが提供する可能性がある。例えば、血清ＭＩＣ−１が食欲に及ぼす抑制効果を調節するのに、「遊離」ＭＩＣ−１のレベルが低下するように、フェチュインを適当な経路（例えば静脈内投与）で対象（例えば進行癌を患う対象）に投与することができよう。
【実施例９】
【００５９】
（正常なマウス脳におけるＭＩＣ−１発現の分析）
（結果及び考察）
飼料摂取及び食欲は、一連の複雑な機構によって制御されており、その多くは中枢神経系の内部に局在する。神経系において、食欲や体温など、多数の基本的身体機能を制御する領域は、視床下部の領域の中に局在する。食欲の場合、この過程を調節する多数の複雑な因子は、視床下部の弓状核に局在し、ニューロペプチドＹなどの介在因子及び介在因子の受容体の多くがこの領域に局在する。この領域の血液脳関門は、漏出が起こりやすい領域でもあり、これは、全身性分子が血液脳関門を通過して、脳に直接作用する可能性のある非常に限られた脳領域の１つである。この作用機序によって、ＭＩＣ−１は、弓状核及び視床下部に直接的に作用を及ぼすことができると考えられている。しかし、ＭＩＣ−１は、正常マウス脳のこの領域内部でも発現される（図１４）。これは、インサイチュ（in situ）ハイブリダイゼーションの研究によって示した通り、血流中ＭＩＣ−１の拡散を表すものではなく、インサイチュハイブリダイゼーションの研究は、ＭＩＣ−１ ｍＲＮＡと、弓状核、脳室周囲領域、及び室傍視床下部の領域のタンパク質との共局在を実証する。正常脳における、食欲制御などの機能と強く関連した領域にＭＩＣ−１が局在することは、この重要な機能を制御するのに、末梢循環からのＭＩＣ−１と、脳内で内因的に産生されたＭＩＣ−１との両方が、役割を果たしていることの強力な論拠を提供する。
【００６０】
この明細全体を通して、「含む」という用語、又は「含んでいる」若しくは「含むこと」などのその変形は、何らかの他の要素、実体、若しくはステップ、又は一群の要素、実体、若しくはステップを除外することを意味するのではなく、言及された要素、実体、若しくはステップ又は一群の要素、実体、若しくはステップの含有を意味することが理解されよう。
【００６１】
この明細書の中で参照されたすべての出版物を、参照により本明細書に援用する。本明細書に含まれている書類、文書、物質、装置、記事又は同様のものにおけるいかなる論述も、本発明の前後関係を提供することのみを目的としたものである。それは、これらの要素の一部又は全部が、先行技術基盤の一部を形成すること、又は、この出願の各請求項の優先日以前に豪州若しくは他の何らかの場所で存在した、本発明に関連した分野における通常の一般知識であることを是認するものではないと理解するべきである。
【００６２】
特定の実施形態で示した通り、大まかに記載された本発明の趣旨及び範囲から逸脱せずに、多数の変更及び／又は改良を本発明に加えられることを、当業者ならば理解するであろう。従って、これらの実施形態は、あらゆる点に関して限定的なものではなく、例示的なものである。
【００６３】
REFERENCES 
1. Bootcov MR, Bauskin A, Valenzuela SM, Moore AG, Bansal M, He C, Zhang HP, Donnellan M, Mahler S, Pryor K, Walsh B, Nicholson R, Fairlie DF, Por SB, Robbins JM, Breit SN. MIC-I, a novel macrophage inhibitory cytokine, is a divergent member of the TGF-β superfamily cluster. Proc Natl Acad Sci USA 1997: 94:11514-11519.
2. Breit SN, Bootcov MR. "Novel TGF-beta like cytokine", International Patent Application No PCT/AU96/00386 (WO 97/00958).
3. Fairlie WD, Zhang H-P, Brown PK, Russell PK, Bauskin AR, Breit SN. Expression of a TGF-β superfamily protein, Macrophage Inhibitory Cytokine-1, in the yeast Pichia pastoris. Gene 2000: 254:67-76.
4. Moore AG, Brown DA, Fairlie WD, Bauskin AR, Brown PK, Munier MLC, Russell PK, Salamonsen LA, Wallace EM, Breit SN.TGF-β superfamily cytokine MIC-I is present in high concentrations in the serum of pregnant women. J Clin Endocrinol Metab 2000: 85:4781-88.
5. Fairlie WD, Russell PK, Moore AG, Zhang H-P, Brown PK, Breit SN. Epitope mapping of the Transforming Growth Factor- Q superfamily protein, MIC-I: Identification of at least five distinct epitope specificities. Biochemistry 2001: 40:65- 73
6. Breit SN et al. "Diagnostic assay and method of treatment involving macrophage inhibitory cytokine-1 (MIC-I)", International Patent Application No PCT/AUOl/00456 (WO 01/81928).
7. Fairlie WD, Moore AG, Bauskin AR, Russell PK, Zhang H-P, Breit SN. MIC-I is a novel TGF-β superfamily cytokine associated with macrophage activation. J Leukocyte Biol 1999; 65:2-5.
8. Koniaris LG. Induction of MIC-1/growth differentiation factor-15 following bile duct injury. J Gastrointest Surg 2003 Nov 7(7):901-5.
9. Welsh JB, Hampton GM. Analysis of Gene Expression Identifies Candidate Markers and Pharmacological Targets in Prostate Cancer. Cancer Res 2001: 61:5974-5978.
10. Buckhaults P. Vogelstein B, Kinzler KW. Secreted and cell surface genes expressed in benign and malignant colorectal tumors. Cancer Res 2001: 61:6996-7001.
11. Welsh JB, Sapinoso LM, Kern SG, Brown DA, Liu T, Bauskin AR, Ward RL, Hawkins NJ, Quinn DI, Russell PJ, Sutherland RL, Breit SN, Moskaluk CA, Frierson, HA Jr. and Hampton GM. Large-Scale Delineation of Secreted Protein Biomarkers Overexpressed in Cancer Tissue and Serum. Proc Natl Acad Sci USA 2003: 100:3410-3415.
12. Kannan K, Amariglio N, Rechavi G, Givol D. 2000 Profile of gene expression regulated by induced p53: connection to the TGF-beta family. I7EBS Lett 470:77-82.
13. Pei-Xiang Li, et al. Placental Transforming Growth Factor-b Is a Downstream Mediator of the Growth Arrest and Apoptotic Response of Tumour Cells to DNA Damage and p53 Overexpression. J Biol Chem 2000: 275:20127-20135.
14. Yang H, Filipovic Z, Brown D, Breit SN, Vassilev LT. Macrophage inhibitory cytokine- 1: a novel biomarker for p53 pathway activation. MoI Cancer Ther 2003: Oct 2(10): 1023-1029.
15. Albertoni M, Shaw PH, Nozaki M, Godard S, Tenan M, Hamou M-F, Fairlie DW, Breit SN, Paralkar VM, de Tribolet N, Van Meir EG, Hegi ME. Anoxia induces macrophage inhibitory cytokine-1 (MIC-I) in glioblastoma cells independently of p53 and HtF-I. Oncogene 2002: 27:4212-4219.
16. Brown DA, Bauskin AR, Fairlie WD, Smith MD, Liu T, Xu N and Breit SN. An antibody based approach to high volume genotyping for MIC-I polymorphism. Biotechniques 2002: 33(l):118-20, 122, 124 passim.
17. Liu T, Bauskin AR, Zaunders J, Brown DA, Pankurst S, Russell PJ, Breit SN. MIC-I reduces cell adhesion and induces apoptosis in prostate cancer cells. Cancer Res 2003: 63: 5034-5040.
18. Koopmann J, Buckhaults P, Brown DA, Zahurak ML, Sato N, Sokoll L, Chan DW, Yeo CJ, Hruban RH, Breit SN, Kinzler KW, Vogelstein B, Goggins M. Serum MIC- 1 as a Marker of Pancreatic and other Periampullary Cancers. Clin Cancer Res (in press).
19. Baek SJ et al. Cyclooxygenase inhibitors regulate the expression of a TGF-beta superfamily member that has proapoptotic and antitumorigenic activities. MoI Pharmacol 2001: 59:901-908.
20. Brown DA, Ward RL, Buckhaults P, Liu T, Romans KE, Hawkins NJ, Bauskin AR, Kinzler KW, Vogelstein B, Breit SN. MIC-I serum level and genotype: Associations with progress and prognosis of colorectal carcinoma. Clinical Cancer Research 2003: 9:2642-2650.
21. Lee DH, Yang Y, Lee SJ, Kim KY, Koo TH, Shin SM, Song KS, Lee YH et al. Macrophage inhibitory cytokine- 1 induces the invasiveness of gastric cancer cells by up-regulating the urokinase-type plasminogen activator system. Cancer Res 2003: Aug l; 63(15):4648-4655.
22. Pluckthun A, Antibody engineering: advances from the use of Escherichia coli expression systems. Bio/Technology 1991: 9: 545-551.
23. Vassilev LT, Vu BT, Graves B, Carvajal D, Podlaski F, Filipovic Z, Kong N, Kammlott U, Lukacs C, Klein C, Fotouhi N, Liu EA. In vivo activation of the p53 pathway by small-molecule antagonists of MDM2. Science 2004: Feb 6; 303(5659):844-848.
24. Bauskin AR, Brown DA, Junankar S, Rasiah KK, Eggleton S, Hunter M, Liu T, Smith D, Kuffner T, Pankhurst, GJ, Johnen, H, Russell PJ, Barret W, Strieker PD, Grygiel JJ, Kench JG, Henshall SM, Sutherland RL, Breit SN. The propeptide mediates formation of stromal stores of PROMIC-I: role in determining prostate cancer outcome. Cancer Res 2005: March 15; 65(6):2330-2336. 
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】１１２アミノ酸形態の成熟型ＭＩＣ−１に至る、前駆体のプロセッシングの概念図である。成熟型ドメインからのプロペプチドの切断はＡｒｇ１９６で起こる。
【図２】最も大きいマウス腫瘍が直径約１ｃｍに達したときの、ヌードマウスの体重と、採取された血液中のヒトＭＩＣ−１血清レベルとの関係を示すグラフである。ヌードマウスには、 （ｉ）完全長ヒトＭＩＣ−１（プロペプチドを含有する）（第３シリーズ）、 （ii）成熟したヒトＭＩＣ−１（プロペプチドを含有しない）（第１シリーズ）、 （iii）プロペプチドを含有するが、フリン様プロコンバターゼ部位の欠失を有するヒトＭＩＣ−１（ＦＵＲＩＮ ＤＥＬ）（第２シリーズ）、又は、 （iv）ベクターのみの陰性対照（第４シリーズ）を過剰発現するように遺伝子操作されたヒトＤＵ１４５細胞を異種移植した。
【図３】最も大きいマウス腫瘍が直径約１ｃｍに達したときの、ヌードマウスのパーセント体重減（実験開示時の体重と比較した）と、採取された血液中のヒトＭＩＣ−１血清レベルとの関係を示すグラフである。ヌードマウスには、 （ｉ）完全長ヒトＭＩＣ−１（プロペプチドを含有する）（第３シリーズ）、 （ii）成熟したヒトＭＩＣ−１（プロペプチドを含有しない）（第１シリーズ）、 （iii）プロペプチドを含有するが、フリン様プロコンバターゼ部位の欠失を有するヒトＭＩＣ−１（ＦＵＲＩＮ ＤＥＬ）（第２シリーズ）、又は、 （iv）ベクターのみの陰性対照（第４シリーズ）を過剰発現するように遺伝子操作されたヒトＤＵ１４５細胞を異種移植した。
【図４】マウスの体重（ｇ）へのヒツジ抗ヒトＭＩＣ−１抗体の影響の結果を示すグラフである。（Ａ）２７日目に、ヒトＭＩＣ−１に対する高力価抗体が産生されるように、高純度に精製された組換えＭＩＣ−１で免疫処置されたヒツジから精製されたＩｇＧ １０ｍｇを２匹のマウスに（腹腔内）投与した。（Ｂ）２７日目に、正常なヒツジ血清から精製された対照ＩｇＧ １０ｍｇを２匹のマウスに（腹腔内）投与した。Ａ及びＢのグラフは、２つのグループのマウスからそれぞれ１匹の代表的なデータを示す。
【図５】ＭＩＣ−１を過剰発現するトランスジェニック（ＴＧ）マウス系統ｍｉｎ ２８を用いた体重減評価の結果を示すグラフである。オス及びメスのｍｉｎ ２８マウス両方で、野生型のコンジェニック同腹仔と比較して有意に体重が減少した（Ｐ＜０．００１）（３グループの同腹仔、５９から６１日齢）。
【図６】ＭＩＣ−１を過剰発現するトランスジェニック（ＴＧ）マウス系統ｍｉｎ ７５を用いた体重減評価の結果を示すグラフである。オス及びメスのｍｉｎ ７５マウス両方で、野生型（ＷＴ）のコンジェニック同腹仔と比較して有意に体重が減少した（Ｐ＜０．００１）（３グループの同腹仔、５９から６１日齢）。
【図７】野生型マウス（黒塗りの印、ＷＴ）、及び７グループのヘテロ接合トランスジェニック同腹仔マウス（ＴＧ、中空の印）の体重（ｇ）の比較を示す。数字は、ヘテロ接合マウスの平均体重を、各同腹仔グループにおけるそれらの野生型同腹仔と比較して示す。新生仔のＷＴマウス及びＴＧマウス（４８時齢未満のマウス）では、体重に有意な相違がない。
【図８】成熟したヒトＭＩＣ−１（プロペプチドを含有しない）のコンストラクトを用いて、ＭＩＣ−１を過剰発現するように形質移入されたヒトＤＵ１４５細胞を異種移植されたヌードマウスにおいて、ヒトＭＩＣ−１に対するモノクローナル抗体（ＭＡｂ２６）の投与によって、体重減が逆転されうることを示す図である。ＭＩＣ−１を過剰発現するＤＵ１４５細胞を注射されたマウスでは、体重減が速やかに始まった。１１日目に、０．１〜１ｍｇの量のＭＡｂ２６を単回注射で投与したところ、体重増加、その程度、及びその期間の増大が引き起こされ、それらは、Ｍａｂ２６の量が増加するのに従って増大した（Ａ〜Ｃ）。ＭＡｂ２６は、腫瘍の成長には影響を与えなかった（Ｄ〜Ｆ）。未処置のマウス（Ｇ）、及びＰＢＳ緩衝のみで処置されたマウス（Ｈ）は、実験の過程全体を通して急速且つ継続的に体重を減少させた。縦軸は体重（ｇ）である。
【図９】成熟ヒトＭＩＣ−１（プロペプチドを含有しない）のコンストラクトを用いて、ＭＩＣ−１を過剰発現するように形質移入されたヒトＤＵ１４５細胞を異種移植されたヌードマウス、及び対照コンストラクトで形質移入されたＤＵ１４５細胞を受容した対照マウスにおける、連続した３日間にわたる毎日の飼料摂取を比較したグラフである。
【図１０】成熟ヒトＭＩＣ−１（プロペプチドを含有しない）のコンストラクトを用いて、ＭＩＣ−１を過剰発現するように形質移入されたヒトＤＵ１４５細胞を異種移植されたヌードマウス、及び対照コンストラクトで形質移入されたＤＵ１４５細胞を受容した対照マウスにおける、脂肪パッド及び筋肉の重さを比較したグラフである。ＭＩＣ−１を保持するＤＵ１４５発現腫瘍は、黒塗りの棒グラフで表されており、中空の棒グラフは、対照腫瘍を有するマウスを表す。Ｔ検定を用いて統計的な比較を行った。星印の数は、ｐ＝０．００３からｐ＜０．０００１まで増大する統計的有意性を示す。鼠径部脂肪、精巣上体脂肪、及び後腹膜脂肪の体脂の重さに顕著な減少があった。２つのグループの間では、マウスの筋肉の重さに有意な相違がなかった。ＮＳ＝有意ではない、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図１１】野生型の対照と比較した、ＭＩＣ−１トランスジェニックマウスの飼料摂取を示すグラフである。５匹の野生型（ＷＴ）マウスと、６匹のトランスジェニック（ＴＧ）マウスとをケージに１匹ずつ収容し、単独の状態に適応させるために４８時間放置した。タイムポイント０に、ホッパーに入っている飼料の重さを計測した。２４時間毎に、ホッパーに入れられた食物の重さから、残余及びこぼれた量を引くことによって、消費された飼料の量を推定した。飼料摂取の測定は、相互に離れた、２４時間ずつの時間で４回行った。マウスあたりの１日の飼料摂取は、ＷＴ動物の方が有意に多かった（ｐ＜０．０３）（Ａ）。しかし、この相違は、飼料摂取量をマウスの体重に関して補正することによって消失した（Ｂ）。
【図１２】ＭＩＣ−１トランスジェニック（ＴＧ）マウス及び野生型（ＷＴ）のマウスの臓器の重さを示すグラフである。略語：ｍ＝オス、ｆ＝メス、ｅｐｉｄ＝鼠径部、ｕｔ＝子宮、ｒｅｔｒｏｐｅｒｉｔ＝後腹膜。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図１３】ＭＩＣ−１のフェチュイン結合アッセイの結果を示す図である。精製された組換えＭＩＣ−１（０．１％ＢＳＡ中）を、フェチュインでコーティングされたアガロースビーズと共にインキュベートした。その後、ビーズを洗浄し、結合した物質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと、それに続く、抗ＭＩＣ−１抗体を用いたウェスタンブロット法とで分析した。レーン１、精製された組換えＭＩＣ−１；レーン２、フェチュインに結合したＭＩＣ−１；レーン３、フェチュインビーズのみ；レーン４、アガロースビーズのみと共にインキュベートされたＭＩＣ−１。矢印はＭＩＣ−１バンドを示す。
【図１４】（Ａ）３５Ｓで標識されたＲＮＡプローブを用いたＭＩＣ−１のインサイチュハイブリダイゼーション及びオートラジオグラフィー、並びに（Ｂ）自家親和性精製された組換えマウスＭＩＣ−１に対するポリクロナール抗体を用いた免疫組織化学で処置された、視床下部及び第３脳室（Ｖ３）の領域における正常成体マウス脳の切片を示す図である。切片は、弓状核（ＡＮ）及び室傍領域の領域におけるＭＩＣ−１ ｍＲＮＡ及びタンパク質の発現を示す。
【図１】
2014051511.tif 000002
【図２】
2014051511.tif 000003
【図３】
2014051511.tif 000004
【図４Ａ】
2014051511.tif 000005
【図４Ｂ】
2014051511.tif 000006
【図５】
2014051511.tif 000007
【図６】
2014051511.tif 000008
【図７】
2014051511.tif 000009
【図８Ａ】
2014051511.tif 000010
【図８Ｂ】
2014051511.tif 000011
【図８Ｃ】
2014051511.tif 000012
【図８Ｄ】
2014051511.tif 000013
【図８Ｅ】
2014051511.tif 000014
【図８Ｆ】
2014051511.tif 000015
【図８Ｇ】
2014051511.tif 000016
【図８Ｈ】
2014051511.tif 000017
【図９】
2014051511.tif 000018
【図１０】
2014051511.tif 000019
【図１１】
2014051511.tif 000020
【図１２】
2014051511.tif 000021
【図１３】
2014051511.tif 000022
【図１４Ａ】
2014051511.tif 000023
【図１４Ｂ】
2014051511.tif 000024
【配列表】
2014051511000001.app