(57)【要約】【課題】本発明の目的は、抗菌活性が強く、抗菌性繊維の製造に用いることができる抗菌性ペプチド（抗菌性を有するカブトムシディフェンシン由来の改変ペプチド）を安価に提供することである。【解決手段】本発明は、カブトムシディフェンシン由来の特定の改変ペプチド（Ｄ−ＲＬＬＬＲＩＧＲＲ−ＮＨ２D）のイソロイシン残基をロイシン残基またはバリン残基へアミノ酸置換することにより、元の改変ペプチドよりも顕著に高い活性を示し、安価に製造できるペプチドを提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記のアミノ酸配列：
Arg - Leu - Leu - Leu - Arg - Val - Gly - Arg - Arg-NH2（配列番号１）、または
Arg - Leu - Leu - Leu - Arg - Leu - Gly - Arg - Arg-NH2（配列番号２）
（ここで、Arg-NH2は、Argのカルボキシル末端がアミド化していることを示す）
で表される、Ｄ型アミノ酸からなる抗菌ペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載の抗菌ペプチドを有効成分とする抗菌剤。
【請求項３】
固相合成法又は液相合成法を用いて、化学合成された請求項１に記載の抗菌ペプチド。
【請求項４】
固相素材に固定化して固相素材に抗菌性を付与するための請求項１に記載の抗菌ペプチドの使用。
【請求項５】
前記固相素材が、繊維またはポリマーからなる請求項４に記載の抗菌ペプチドの使用。
【請求項６】
請求項１に記載の抗菌ペプチドが固定化された抗菌繊維又はポリマー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な抗菌ペプチドおよびその利用に関する。より詳しくは、昆虫抗微生物タンパク質であるカブトムシディフェンシン由来の改変ペプチド、およびその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年では、抗生物質に耐性を持った薬剤耐性菌が先進国を中心に蔓延しており、集団感染や院内感染を引き起こしている。特に、メチシリンに耐性を持つメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）による感染例は、国内で年間二万件以上報告されている。感染経路は、複雑であり特定は困難であるが病院内で使用するベッドシーツ、白衣なども感染リスク要因と考えられている。
【０００３】
これまで、石橋らによりＭＲＳＡに対して抗菌活性を示すカブトムシディフェンシン由来の改変ペプチドが報告されており（非特許文献１）、また、構成アミノ酸としてＤ型アミノ酸を用いた、カブトムシディフェンシン由来の改変ペプチドが報告されている（特許文献１）。
【０００４】
さらに発明者らは、上記問題を解決するため、石橋らにより発明されたカブトムシディフェンシン由来の改変ペプチドを固定化した抗菌繊維を開発した。綿にスペーサーと呼ばれる分子鎖を結合し、その末端のアミノ基を起点としてアミノ酸合成を行い、綿上で９残基の改変ペプチドを合成し、改変ペプチドを繊維に固定した。抗菌試験の結果、ＭＲＳＡに強い抗菌活性が認められ、繰り返し使用しても活性を維持していることが明らかになった（特許文献２、非特許文献２）。
【０００５】
しかしながら、抗菌剤として多くの用途にそして広く用いられるためには、強い抗菌活性を有しかつ材料が安価に提供できることが必要である。
上記の文献で報告されている抗菌ペプチドはカブトムシのディフェンシンを元にしているため、イソロイシン残基を含んでいる。イソロイシン残基は側鎖にも不斉炭素を持つために、ジアステレオマーが存在し、特にＤ型アミノ酸は他のアミノ酸と比べて極端に高価である。
【０００６】
そこで改変ペプチドの一つであるD-Peptide A（Ｄ−ＲＬＹＬＲＩＧＲＲ−ＮＨ2（配列番号４））のイソロイシン残基を、ロイシン残基またはバリン残基に置換した改変ペプチドが提案されている（非特許文献３）。そこでは、Ｖａｌ置換体およびＬｅｕ置換体は、元のＩｌｅ型の改変ペプチド（D-Peptide A）に同等の抗菌活性を示したことが報告されている（非特許文献３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００７−２８４４２１号公報
【特許文献２】特開２０１０−１８４０２２号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】石橋ら、Eur. J. Biochem, 1999 Dec; 266(2):616-23
【非特許文献２】中村ら、Biomacromolecules, 2011, 12(5):1540-1545
【非特許文献３】朝岡ら、日本蚕糸学会第65回東北支部・第62回関東支部・第77回関西支部・第67回九州支部合同大会  蚕糸・昆虫機能利用学術講演会講演要旨集2011  p52
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、抗菌活性が強く、抗菌性繊維の製造に用いることができる抗菌性ペプチド（抗菌性を有するカブトムシディフェンシン由来の改変ペプチド）を安価に提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、鋭意努力の結果、従来報告されている改変ペプチド（Ｄ−ＲＬＬＬＲＩＧＲＲ−ＮＨ2（配列番号３）：D-Peptide D）のイソロイシン残基をロイシン残基またはバリン残基へアミノ酸置換することにより、元の改変ペプチドよりも顕著に高い活性を示すことを見いだし、本発明を完成した。
本発明は、より具体的には、以下を提供するものである。
（１）下記のアミノ酸配列：
Arg - Leu - Leu - Leu - Arg - Val - Gly - Arg - Arg-NH2（配列番号１）、または
Arg - Leu - Leu - Leu - Arg - Leu - Gly - Arg - Arg-NH2（配列番号２）
（ここで、Arg-NH2は、Argのカルボキシル末端がアミド化していることを示す）
で表される、Ｄ型アミノ酸からなる抗菌ペプチド。
（２）前記（１）に記載の抗菌ペプチドを有効成分とする抗菌剤。
（３）固相合成法又は液相合成法を用いて、化学合成された前記（１）に記載の抗菌ペプチド。
（４）固相素材に固定化して固相素材に抗菌性を付与するための前記（１）に記載の抗菌ペプチドの使用。
（５）前記固相素材が、繊維またはポリマーからなる前記（４）に記載の抗菌ペプチドの使用。
（６）前記（１）に記載の抗菌ペプチドが固定化された抗菌繊維又はポリマー。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のペプチドを用いれば、安価でかつより活性の強い抗菌性ペプチドを提供することができる。より具体的には、本発明の抗菌ペプチドを用いることにより、低コストでより少ない使用量で抗菌活性を付与することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、実施例により、本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
本発明の抗菌ペプチドは、下記式：
Arg - Leu - Leu - Leu - Arg - Val - Gly - Arg - Arg-NH2（配列番号１）、または
Arg - Leu - Leu - Leu - Arg - Leu - Gly - Arg - Arg-NH2（配列番号２）
で表されるアミノ酸配列からなるペプチドであり、Ｄ型アミノ酸から構成される抗菌ペプチドである。上記式中、Arg-NH2は、Argのカルボキシル末端がアミド化していることを示す。
【００１３】
本発明の抗菌ペプチドは、石橋らにより報告されている様々なカブトムシディフェンシン由来の改変ペプチドの一つにさらに改変を加えたものであり、従来のペプチドには無い優れた抗菌活性を示す。
【００１４】
また、本発明の抗菌ペプチドは、ペプチドそのものを有効成分とする抗菌剤として用いることができ、さらには、本発明の抗菌ペプチドを、任意の他の素材に固定化して他の素材に抗菌活性を付与することができる。他の素材としては、本発明の抗菌ペプチドを固定できるものであれば特に限定されないが、例えば、繊維（天然繊維及び合成繊維）、膜（天然素材及び合成素材の膜）、ポリマー素材などをあげることができる。ポリマー素材は特に限定されず、一般に公知の任意のポリマー素材とともに用いることができる。例えば、セルロース、ナイロン、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、ポリウレタン、ポリカーボネート、ABS、ポリ塩化ビニル、アクリル樹脂などの高分子をあげることができる。
ここでいうポリマー素材は、合成繊維や合成膜の材料となり得る。すなわち、本明細書では、繊維または膜、とポリマー素材という用語を、互いに排他的に用いるものではない。
【００１５】
本発明の素材への固定化は、公知の方法を用いて行うことができるが、例えば、繊維に固定化する場合は、例えば、特許文献２に記載の方法を用いて行うこができる。さらには、本発明の抗菌ペプチドとポリマーからなる加工剤を作成して、それを繊維に塗布することにより、本発明のペプチドが固定化された抗菌性繊維を作成することができる。加工剤は、これには限定されないが、例えば、ポリマー及び／又はペプチドに反応性基を導入し、その後、溶媒に溶解したポリマー溶液に本発明の抗菌ペプチドを溶解した溶液を加えて、ペプチドをポリマーに化学的に結合することにより作製できる。より具体的な方法の例は、例えば、本出願において優先権を主張するＰＣＴ／ＪＰ２０１２／０７３５８７の記載を参照することができ、その全ての記載は、引用することにより本明細書の一部である。
【００１６】
本発明の抗菌ペプチドは、従来の配列とは異なり、その配列中にイソロイシン残基を含まないことを特徴とする。カブトムシディフェンシン由来改変ペプチドは、その配列中にイソロイシン残基を含んでいる。イソロイシン残基は側鎖にも不斉炭素を持つために、ジアステレオマーが存在し、特にＤ型アミノ酸は他のアミノ酸と比べて極端に高価であるという問題がある。一方、本発明の改変ペプチドは、イソロイシン残基の代わりに、ロイシンまたはバリン残基を有する。これにより、合成において、より安価に合成することができ、コストダウンが図れる。
【００１７】
さらに本発明の抗菌ペプチドは、従来のペプチドに比べて顕著な抗菌活性の増加を示す。イソロイシン残基をロイシン残基またはバリン残基に置換したＤ型改変ペプチドPeptide A、B およびC は、いずれも、元のイソロイシン型と同等の抗菌活性を示したのに対し、驚くべきことに、本発明の抗菌ペプチドは、アミノ酸置換により大幅な活性の上昇が見られた。
【００１８】
本発明の抗菌ペプチドは、公知のペプチド合成法を用いて製造することができ、固相合成法、液相合成法のいずれを用いることもできる。また、自動ペプチド合成方法、例えばＢｏｃ固相法、Ｆｍｏｃ固相法を用いて合成することも可能である。
本発明の抗菌ペプチドのＣ末端のアルギニンのカルボキシル基のアミド化も、公知の方法を用いて行うことができる。
【実施例】
【００１９】
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に制限されるものではない。
実施例１：改変ペプチドの合成
D-Peptide D（D-ＲＬＬＬＲＩＧＲＲ-NH2）の改変ペプチド、具体的には、イソロイシン残基をバリン残基に置換したもの（D-ＲＬＬＬＲＶＧＲＲ-NH2：）D-Peptide D(I6V)、および、イソロイシン残基をロイシン残基に置換したもの（D-ＲＬＬＬＲＬＧＲＲ-NH2：）D-Peptide D(I6V)を作製した。ペプチド合成は、常法に従い、Ｆ−ｍｏｃ法を用いて固相により合成した。
対象として、D-Peptide A（D-ＲＬＹＬＲＩＧＲＲ-NH2）、D-Peptide B（D-ＲＬＲＬＲＩＧＲＲ-NH2）、およびD-Peptide C（D-ＡＬＹＬＡＩＧＲＲ-NH2）の改変ペプチドとして、それぞれの、イソロイシン残基をバリン残基に置換したもの、および、イソロイシン残基をロイシン残基に置換したものを同様にして作製した。
以下にそれぞれの元のペプチド（original）および改変ペプチド（バリン置換ペプチド：I6V、及びロイシン置換ペプチド：I6L）の配列を示す。
【００２０】
D-Peptide D (original)：Arg Leu Leu Leu Arg Ile Gly Arg Arg-NH2 （配列番号３）
D-Peptide D (I6V)：Arg Leu Leu Leu Arg Val Gly Arg Arg-NH2 （配列番号１）
D-Peptide D (I6L)：Arg Leu Leu Leu Arg Leu Gly Arg Arg-NH2 （配列番号２）
【００２１】
D-Peptide A (original)：Arg Leu Tyr Leu Arg Ile Gly Arg Arg-NH2 （配列番号４）
D-Peptide A (I6V)：Arg Leu Tyr Leu Arg Val Gly Arg Arg-NH2 （配列番号５）
D-Peptide A (I6L)：Arg Leu Tyr Leu Arg Leu Gly Arg Arg-NH2 （配列番号６）
D-Peptide B (original)：Arg Leu Arg Leu Arg Ile Gly Arg Arg-NH2（配列番号７）
D-Peptide B (I6V)：Arg Leu Arg Leu Arg Val Gly Arg Arg-NH2 （配列番号８）
D-Peptide B (I6L)：Arg Leu Arg Leu Arg Leu Gly Arg Arg-NH2 （配列番号９）
D-Peptide C (original)：Ala Leu Tyr Leu Ala Ile Gly Arg Arg-NH2 （配列番号１０）
D-Peptide C (I6V)：Ala Leu Tyr Leu Ala Val Gly Arg Arg-NH2 （配列番号１１）
D-Peptide C (I6L)：Ala Leu Tyr Leu Ala Leu Gly Arg Arg-NH2 （配列番号１２）
【００２２】
実施例２：抗菌活性
それぞれのペプチドについて、抗菌活性を測定した。抗菌活性は、液体希釈法で行い、寒天平板培養法で生菌数を測定し、黄色ブドウ球菌に対する最少阻止濃度（ＭＩＣ）を求めた。結果を以下の表１に示す。
【００２３】
【表１】
2014058498.tif 000002
表より、イソロイシン残基をロイシン残基またはバリン残基に置換したＤ型改変ペプチド、D-Peptide A、B およびC は、いずれも、元のイソロイシン型と同等の抗菌活性を示したのに対し、本発明の抗菌ペプチドは、アミノ酸置換により大幅な活性の上昇が見られた。具体的には、ロイシン置換のD-Peptide D（I6L）は元のペプチドの４倍、バリン置換のD-Peptide D（I6V）は元のペプチドの８倍という、強い抗菌活性を示した。
【００２４】
このことより、本発明の抗菌ペプチドが、従来型の９残基のカブトムシディフェンシン由来改変ペプチドに比べ、アミノ酸置換をすることにより、格段に強い抗菌活性を示すことが判った。また、本発明の抗菌ペプチドは、イソロイシンを有していないので、従来のペプチドの比べて安価に製造でき、アミノ酸原料のコストを大幅に下げることができる。
【００２５】
実施例３：抗菌繊維の製造
本発明の抗菌ペプチドである、D-Peptide D(I6V)を用いて抗菌性繊維を、以下のようにして作製した。
（１）抗菌ペプチドとポリマーからなる繊維加工剤
メタクリル酸 2-(3-ブロモプロポキシカルボニルアミノ)エチルエステル(305mg, 1.04mmol)とポリ(エチレングリコール)メチルエーテルメタクリラートMn300(15.6g, 52mmol)をエタノール50mLに溶解させ、開始剤のAIBN(174mg, 1.06mmol)を添加した。容器内を窒素置換した後、6時間還流攪拌を行った。透析チューブ（分画分子量3500）で、48時間透析し、未反応のモノマーを除去し、ポリマーＡを得た。
ポリマーＡ(2.04g,Br換算0.13mmol)とCysリンカー付きペプチド（D-Peptide D(I6V)：CRLLLRVGRR）(235.4mg,0.13mmol)をDMF10mlに溶解させ、ターシャリーブトキシカリウム(87.5mg,0.78mmol)を添加した。40℃で7時間加熱撹拌した。TLCで原料ペプチドが消失したことを確認した。DCM50mlで希釈し、析出した塩をセライトろ過し取り除いた。ろ液をエバポレータで濃縮し、真空乾燥し、ポリマーＡにペプチドが結合したポリマーであるポリマーＢを得た。次いで、ポリマーＢ(2.08g)に水を加え全量を500gとした。一晩攪拌し完全に分散させ、加工剤Ａを調整した
対照としてペプチドを含有しない繊維加工剤Ｃを以下のようにして調整した。ポリマーＡ(346mg)に水を加え全量を17.3gとし、一晩攪拌し完全に分散させ、加工剤Ｃ（ペプチド非含有ポリマー加工剤）を得た。これを参照実験用として用いた。
【００２６】
実施例４：加工布Ａ、Ｃの作製
綿のJIS添付白布に対し、1.5〜2.0倍の質量の加工剤Ａを生地全体に浸透するように加え、マングルで余分な加工剤を除去し、室温で乾燥させ、加工布Ａを作製した。ペプチドの存在量は、1cm2あたり0.006μmolであった。加工剤は生地に対して0.8％であった。
綿のJIS添付白布に対し、1.5〜2.0倍の質量の加工剤Ｃ（参照例）を生地全体に浸透するように加え、マングルで余分な加工剤を除去し、室温で乾燥させ、加工布Ｃ（参照例）を作製した。加工剤は生地に対して6.8％であった。
【００２７】
実施例５：抗菌活性試験（黄色ブドウ球菌）
上記のようにして作製した加工布Ａについて、抗微生物活性試験を行った。加工布（1 cm×1 cm）および標準布をそれぞれ黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus NBRC 12732）を含む培養液（0.8% NB培地で一昼夜培養した菌液を、新たな培養液に１％容量で加え、37℃で3時間培養した後、波長600nmにおける吸光度が0.01となるように希釈した培養液200μl）中に入れ、37℃で１８時間培養した後、生菌数を測定し、18時間培養後の標準布の生菌数を18時間培養後の加工布の生菌数で除した対数値として示した。抗菌試験を実施した後、布を40ml超純水でボルテックス洗浄（最大スピード１０秒間振とう×３回）及びオートクレーブによる滅菌操作（121℃、20分）を行い、同じ加工布を用いて抗菌試験を行った。更に、この洗浄−滅菌操作−抗菌試験を繰り返し行った。結果を以下の表２に示す。
【００２８】
【表２】
2014058498.tif 000003
【００２９】
実施例６：抗菌活性試験（ＭＲＳＡ等）
上記のようにして作製した加工布Ａ及びＣについて、抗微生物活性試験を行った。JIS L 1902 の定量試験方法に準拠して行った。培養後の生菌数測定法には、混釈平板培養法（コロニー法）を用いた。また、耐久性評価のための繰り返し洗濯試験は、JIS L 0217の洗い方103に規定する方法（40℃で5分間洗い、30℃で2回すすぎ洗いを2分間行う。脱水後、直射日光の当たらない場所でスクリーン乾燥）で、10回、20回、50回の繰り返し試験を行った。洗濯時には、ポリオキシエチレンアルキルエーテルを洗剤として用いた。ただし、静菌活性値は、（18時間培養後の標準布の生菌数の常用対数値−試験菌接種直後の標準布の生菌数の常用対数値）−（18時間培養後の加工布の生菌数の常用対数値−試験菌接種直後の加工布の生菌数の常用対数値）として示した。結果を以下の表３に示す。
【００３０】
【表３】
2014058498.tif 000004
【００３１】
上記の記載は、本発明の目的及び対象を単に説明するものであり、添付の特許請求の範囲を限定するものではない。添付の特許請求の範囲から離れることなしに、記載された実施態様に対しての、種々の変更及び置換は、本明細書に記載された教示より当業者にとって明らかである。
【産業上の利用可能性】
【００３２】
本発明の抗菌ペプチドは、従来にない強い抗菌活性をもつとともに安価に製造できるので、抗菌剤として、また抗菌性素材を作製するための抗菌成分として有用である。
【配列表】
2014058498000001.app