(57)【要約】      （修正有）【課題】改善された抗原性及び持続性の両方を有する新規リンカー分子の提供。【解決手段】次式中、式（ＩＶ）2014051498.tif 000073［式中、λは、１≦λ≦４の整数であり；μは、１≦μ≦４の整数であり；Ａは、ＣＯ2Ｈ、活性化ＣＯ2Ｈ、ＮＨ2、ＮＣＯ、ＣＨＯ、マレイミドまたはビニルスルホンのいずれかであり；Ｂは、ＣＨまたはＮのいずれかであり；Ｇは、（ＣＨ2）ν、ＣＯまたはＣＯＣＨ2ＯＣＨ2ＣＯのいずれかであり；Ｅは、ＮＨ2、ＮＨＢｏｃ、ＣＯ2Ｈ、ＣＨＯまたはマレイミドのいずれかであり；Ｘは、ＣＯ、結合またはＣＯＮＨのいずれかであり；Ｙは、ＣＯ、結合またはＮＨＣＯのいずれかであり；νは、２≦ν≦４の整数である］で示されるリンカー部分化合物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の構造：
【化５５】
2014051498.tif 000058
［式中、
αは、１≦α≦７の整数であり；
βは、１≦β≦７の整数であり；
δは、２≦δ≦５の整数であり；
Ａは、ＣＯ2Ｈ、活性化ＣＯ2Ｈ、ＮＨ2、ＮＣＯ、ＣＨＯ、マレイミドまたはビニルス
ルホンのいずれかであり；
Ｅは、ＮＨ2、ＣＯ2Ｈ、ＣＨＯ、マレイミドまたはＮＨＢｏｃのいずれかである］
を有するリンカー部分化合物。
【請求項２】
α＝β＝１または２であり；
δ＝３であり；
Ａが、ＣＯ2Ｈまたは活性化ＣＯ2Ｈのいずれかであり；
Ｅが、ＮＨＢｏｃである、請求項１に記載のリンカー部分化合物。
【請求項３】
以下の構造：
【化５６】
2014051498.tif 000059
［式中、
κは、０≦κ≦８の整数であり；
ρは、０≦ρ≦８の整数であり；
τは、２≦τ≦５の整数であり；
Ａは、ＮＨＲまたはＮＲＢｏｃのいずれかであり；
Ｒは、アルキルであり；
Ｅは、ＮＨ2、ＣＯ2Ｈ、活性化ＣＯ2Ｈ、ＣＨＯ、マレイミドまたはＮＲＢｏｃのいず
れかであり、ここで、Ｒは、Ｈまたはアルキルである］
を有するリンカー部分化合物。
【請求項４】
κ＝ρ＝０であり；
τ＝３であり；
Ａが、ＮＨＢｏｃであり；
Ｒが、ＣＨ3であり；
Ｅが、ＣＯ2ＨまたはＣＯＮＨＳである、請求項３に記載のリンカー部分化合物。
【請求項５】
以下の構造：
【化５７】
2014051498.tif 000060
［式中、
χは、１≦χ≦４の整数であり；
φは、１≦φ≦４の整数であり；
γは、２≦γ≦８の整数であり；
ηは、２≦η≦８の整数であり；
Ａは、ＣＯ2Ｈ、活性化ＣＯ2Ｈ、ＮＨ2、ＮＣＯ、ＣＨＯ、マレイミドまたはビニルス
ルホンのいずれかであり；
Ｂは、ＣＨまたはＮのいずれかであり；
Ｃは、ＣＯ（ＣＨ2）σＣＯまたは（ＣＨ2）σのいずれかであり；
Ｄは、ＣＨまたはＮのいずれかであり；
Ｅは、ＮＨ2、ＮＨＢｏｃ、ＣＯ2Ｈ、ＣＨＯまたはマレイミドのいずれかであり；
σは、２≦σ≦５の整数である］
を有するリンカー部分化合物。
【請求項６】
χ＝１であり；
φ＝１であり；
γが、２≦γ≦３の整数であり；
ηが、２≦η≦３の整数であり；
Ａが、ＣＯ2Ｈまたは活性化ＣＯ2Ｈのいずれかであり；
Ｂが、Ｎであり；
Ｃが、ＣＯ（ＣＨ2）σＣＯまたは（ＣＨ2）σであり；
Ｄが、Ｎであり；
Ｅが、ＮＨＢｏｃであり；
σが、２≦σ≦３の整数である、請求項５に記載のリンカー部分化合物。
【請求項７】
以下の構造：
【化５８】
2014051498.tif 000061
［式中、
λは、１≦λ≦４の整数であり；
μは、１≦μ≦４の整数であり；
Ａは、ＣＯ2Ｈ、活性化ＣＯ2Ｈ、ＮＨ2、ＮＣＯ、ＣＨＯ、マレイミドまたはビニルス
ルホンのいずれかであり；
Ｂは、ＣＨまたはＮのいずれかであり；
Ｇは、（ＣＨ2）ν、ＣＯまたはＣＯＣＨ2ＯＣＨ2ＣＯのいずれかであり；
Ｅは、ＮＨ2、ＮＨＢｏｃ、ＣＯ2Ｈ、ＣＨＯまたはマレイミドのいずれかであり；
Ｘは、ＣＯ、結合またはＣＯＮＨのいずれかであり；
Ｙは、ＣＯ、結合またはＮＨＣＯのいずれかであり；
νは、２≦ν≦４の整数である］
を有するリンカー部分化合物。
【請求項８】
λが、１≦λ≦３の整数であり；
μ＝２であり；
Ａが、ＣＯ2Ｈまたは活性化ＣＯ2Ｈのいずれかであり；
Ｂが、Ｎであり；
Ｇが、（ＣＨ2）ν、ＣＯまたはＣＯＣＨ2ＯＣＨ2ＣＯのいずれかであり；
Ｅが、ＮＨ2またはＮＨＢｏｃであり；
Ｘが、ＣＯまたは結合であり；
Ｙが、ＣＯまたは結合であり；
ν＝２である、請求項７に記載のリンカー部分化合物。
【請求項９】
ペプチド部分、リンカー部分および水溶性ポリマー部分を含む化合物であって、リンカ
ー部分が、ペプチド部分と水溶性ポリマー部分の間にあり、以下の構造：
【化５９】
2014051498.tif 000062
［式中、
αは、１≦α≦７の整数であり；
βは、１≦β≦７の整数であり；
δは、２≦δ≦５の整数であり；
Ａは、ＣＯ、ＮＨ、ＮＣＯ、ＳＯ2ＣＨ2ＣＨ2のいずれかであり；
Ｅは、ＮＨまたはＣＯのいずれかである］
を有する化合物。
【請求項１０】
α＝β＝１または２であり；
δ＝３であり；
Ａが、ＣＯであり；
Ｅが、ＮＨである、請求項９に記載の化合物。
【請求項１１】
（ａ）ペプチド部分、リンカー部分および水溶性ポリマー部分を含む化合物であって、
リンカー部分が、ペプチド部分と水溶性ポリマー部分の間にあり、以下の構造：
【化６０】
2014051498.tif 000063
［式中、
αは、１≦α≦７の整数であり；
βは、１≦β≦７の整数であり；
δは、２≦δ≦５の整数であり；
Ａは、ＣＯ、ＮＨ、ＮＣＯ、ＳＯ2ＣＨ2ＣＨ2のいずれかであり；
Ｅは、ＮＨまたはＣＯのいずれかである］
を有する化合物と、
（ｂ）１種または複数の製薬上許容される希釈剤、保存料、可溶化剤、乳化剤、アジュ
バントおよび／または担体と
を含む薬剤組成物。
【請求項１２】
α＝β＝１または２であり；
δ＝３であり；
Ａが、ＣＯであり；
Ｅが、ＮＨである、請求項１１に記載の化合物。
【請求項１３】
ペプチド部分、リンカー部分および水溶性ポリマー部分を含む化合物であって、リンカ
ー部分が、ペプチド部分と水溶性ポリマー部分の間にあり、以下の構造：
【化６１】
2014051498.tif 000064
［式中、
κは、０≦κ≦８の整数であり；
ρは、０≦ρ＜８の整数であり；
τは、２≦τ≦５の整数であり；
Ａは、ＮＨまたはＮＲであり；
Ｒは、アルキルであり；
Ｅは、ＮＨ、ＣＯまたはＮＲのいずれかであり、ここで、Ｒは、Ｈまたはアルキルであ
る］
を有する化合物。
【請求項１４】
κ＝ρ＝０であり；
τ＝３であり；
Ａが、ＮＨＲまたはＮＲのいずれかであり；
Ｒが、ＣＨ3であり；
Ｅが、ＣＯである、請求項１３に記載の化合物。
【請求項１５】
（ａ）ペプチド部分、リンカー部分および水溶性ポリマー部分を含む化合物であって、
リンカー部分が、ペプチド部分と水溶性ポリマー部分の間にあり、以下の構造：
【化６２】
2014051498.tif 000065
［式中、
κは、０≦κ≦８の整数であり；
ρは、０≦ρ＜８の整数であり；
τは、２≦τ≦５の整数であり；
Ａは、ＮＲであり；
Ｒは、アルキルであり；
Ｅは、ＮＨまたはＣＯ2のいずれかである］
を有する化合物と、
（ｂ）１種または複数の製薬上許容される希釈剤、保存料、可溶化剤、乳化剤、アジュ
バントおよび／または担体と
を含む薬剤組成物。
【請求項１６】
κ＝ρ＝０であり；
τ＝３であり；
Ａが、ＮＲであり；
Ｒが、ＣＨ3であり；
Ｅが、ＣＯである、請求項１５に記載の化合物。
【請求項１７】
ペプチド部分、リンカー部分および水溶性ポリマー部分を含む化合物であって、リンカ
ー部分が、ペプチド部分と水溶性ポリマー部分の間にあり、以下の構造：
【化６３】
2014051498.tif 000066
［式中、
χは、１≦χ≦４の整数であり；
φは、１≦φ≦４の整数であり；
γは、２≦γ≦８の整数であり；
ηは、２≦η≦８の整数であり；
Ａは、ＣＯ、ＮＨ、ＮＣＯまたはＳＯ2ＣＨ2ＣＨ2のいずれかであり；
Ｂは、ＣＨまたはＮのいずれかであり；
Ｃは、ＣＯ（ＣＨ2）σＣＯまたは（ＣＨ2）σであり；
Ｄは、ＣＨまたはＮのいずれかであり；
Ｅは、ＮＨまたはＣＯのいずれかであり；
σは、２≦σ≦５の整数である］
を有する化合物。
【請求項１８】
χ＝１であり；
φ＝１であり；
γが、２≦γ≦３の整数であり；
ηが、２≦η≦３の整数であり；
Ａが、ＣＯであり；
Ｂが、Ｎであり；
Ｃが、ＣＯ（ＣＨ2）σＣＯまたは（ＣＨ2）σであり；
Ｄが、Ｎであり；
Ｅが、ＮＨであり；
σが、２≦σ≦３の整数である、請求項１７に記載の化合物。
【請求項１９】
（ａ）ペプチド部分、リンカー部分および水溶性ポリマー部分を含む化合物であって、
リンカー部分が、ペプチド部分と水溶性ポリマー部分の間にあり、以下の構造：
【化６４】
2014051498.tif 000067
［式中、
χは、１≦χ≦４の整数であり；
φは、１≦φ≦４の整数であり；
γは、２≦γ≦８の整数であり；
ηは、２≦η≦８の整数であり；
Ａは、ＣＯ、ＮＨ、ＮＣＯまたはＳＯ2ＣＨ2ＣＨ2のいずれかであり；
Ｂは、ＣＨまたはＮのいずれかであり；
Ｃは、ＣＯ（ＣＨ2）σＣＯまたは（ＣＨ2）σであり；
Ｄは、ＣＨまたはＮのいずれかであり；
Ｅは、ＮＨまたはＣＯのいずれかであり；
σは、２≦σ≦５の整数である］
を有する化合物と、
（ｂ）１種または複数の製薬上許容される希釈剤、保存料、可溶化剤、乳化剤、アジュ
バントおよび／または担体と
を含む薬剤組成物。
【請求項２０】
χ＝１であり；
φ＝１であり；
γが、２≦γ≦３の整数であり；
ηが、２≦η≦３の整数であり；
Ａが、ＣＯであり；
Ｂが、Ｎであり；
Ｃが、ＣＯ（ＣＨ2）σＣＯまたは（ＣＨ2）σであり；
Ｄが、Ｎであり；
Ｅが、ＮＨであり；
σが、２≦σ≦３の整数である、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
ペプチド部分、リンカー部分および水溶性ポリマー部分を含む化合物であって、リンカ
ー部分が、ペプチド部分と水溶性ポリマー部分の間にあり、以下の構造：
【化６５】
2014051498.tif 000068
［式中、
λは、１≦λ≦４の整数であり；
μは、１≦μ≦４の整数であり；
Ａは、ＣＯ、ＮＨ、ＮＣＯまたはＳＯ2ＣＨ2ＣＨ2のいずれかであり；
Ｂは、ＣＨまたはＮのいずれかであり；
Ｇは、（ＣＨ2）ν、ＣＯまたはＣＯＣＨ2ＯＣＨ2ＣＯであり；
Ｅは、ＮＨまたはＣＯのいずれかであり；
Ｘは、ＣＯ、結合またはＣＯＮＨのいずれかであり；
Ｙは、ＣＯ、結合またはＮＨＣＯのいずれかであり；
νは、２≦ν≦４の整数である］
を有する化合物と、
（ｂ）１種または複数の製薬上許容される希釈剤、保存料、可溶化剤、乳化剤、アジュ
バントおよび／または担体。
【請求項２２】
λが、１≦λ≦３の整数であり；
μ＝２であり；
Ａが、ＣＯであり；
Ｂが、Ｎであり；
Ｇが、（ＣＨ2）ν、ＣＯまたはＣＯＣＨ2ＯＣＨ2ＣＯであり；
Ｅが、ＮＨであり；
Ｘが、ＣＯまたは結合であり；
Ｙが、ＣＯまたは結合であり；
ν＝２である、請求項２１に記載の化合物。
【請求項２３】
（ａ）ペプチド部分、リンカー部分および水溶性ポリマー部分を含む化合物であって、
リンカー部分が、ペプチド部分と水溶性ポリマー部分の間にあり、以下の構造：
【化６６】
2014051498.tif 000069
［式中、
λは、１≦λ≦４の整数であり；
μは、１≦μ≦４の整数であり；
Ａは、ＣＯ、ＮＨ、ＮＣＯまたはＳＯ2ＣＨ2ＣＨ2のいずれかであり；
Ｂは、ＣＨまたはＮのいずれかであり；
Ｇは、（ＣＨ2）ν、ＣＯまたはＣＯＣＨ2ＯＣＨ2ＣＯであり；
Ｅは、ＮＨまたはＣＯのいずれかであり；
Ｘは、ＣＯ、結合またはＣＯＮＨのいずれかであり；
Ｙは、ＣＯ、結合またはＮＨＣＯのいずれかであり；
νは、２≦ν≦４の整数である］
を有する化合物と、
（ｂ）１種または複数の製薬上許容される希釈剤、保存料、可溶化剤、乳化剤、アジュ
バントおよび／または担体と
を含む薬剤組成物。
【請求項２４】
λが、１≦λ≦３の整数であり；
μ＝２であり；
Ａが、ＣＯであり；
Ｂが、Ｎであり；
Ｇが、（ＣＨ2）ν、ＣＯまたはＣＯＣＨ2ＯＣＨ2ＣＯのいずれかであり；
Ｅが、ＮＨであり；
Ｘが、ＣＯまたは結合であり；
Ｙが、ＣＯまたは結合であり；
ν＝２である、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
水溶性ポリマー部分が、ポリ（エチレングリコール）部分である、請求項９から２４の
いずれか一項に記載の化合物。
【請求項２６】
ポリ（エチレングリコール）部分の各々の分子量が２０ｋＤａである、請求項２５に記
載の化合物。
【請求項２７】
ポリ（エチレングリコール）部分が直鎖である、請求項２５に記載の化合物。
【請求項２８】
ポリ（エチレングリコール）部分の各々が１０〜３０ｋＤａの分子量を有する、請求項
２５に記載の化合物。
【請求項２９】
ポリ（エチレングリコール）部分が、１．２０未満の多分散値（ＭW／Ｍn）を有する、
請求項２５に記載の化合物。
【請求項３０】
ペプチド部分が、単一のペプチドを含むペプチド単量体である、請求項９から２４のい
ずれか一項に記載の化合物。
【請求項３１】
ペプチド部分が、リンカー部分によって連結された２種のペプチドを含むペプチド二量
体である、請求項９から２４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項３２】
各ペプチドが、５０個以下のアミノ酸単量体を含む、請求項３０に記載の化合物。
【請求項３３】
各ペプチドが、５０個以下のアミノ酸単量体を含む、請求項３１に記載の化合物。
【請求項３４】
ポリ（エチレングリコール）部分が、少なくとも１つの直鎖ポリ（エチレングリコール
）鎖を含む、請求項２５に記載の化合物。
【請求項３５】
各ポリ（エチレングリコール）鎖が、１０〜３０ｋＤａの分子量を有する、請求項３４
に記載の化合物。
【請求項３６】
ペプチド部分が、エリスロポエチン受容体と結合する１種または複数のペプチドを含む
、請求項９から２４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項３７】
ペプチド部分が、配列番号：１〜２８のうちの１つである、請求項３６に記載の化合物
。
【請求項３８】
Ｎ末端リジン残基をさらに含み、リジン残基のεアミノ基がリンカー部分化合物と共有
結合している、請求項３６に記載の化合物。
【請求項３９】
エリスロポエチン受容体（ＥＰＯ−Ｒ）と結合し、これを活性化する化合物であって、
次式：
【化６７】
2014051498.tif 000070
［式中、
（ｉ）ペプチド二量体の各ペプチド単量体において、各アミノ酸は標準一文字略語で示
されており、ＡｃＧは、Ｎ−アセチルグリシンであり、１−Ｎａｌは、１−ナフチルアラ
ニンであり、ＭｅＧは、Ｎ−メチルグリシンであり；
（ｉｉ）ペプチド二量体の各ペプチド単量体は、各単量体の２つのシステイン（Ｃ）残
基間に分子内ジスルフィド結合を含み；
（ｉｉｉ）ＰＥＧは、合わせて約１０，０００〜約６０，０００ダルトンの分子量を有
する、２つの直鎖ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分を含む］
を有する、
ペプチド二量体（配列番号：５）を含む化合物。
【請求項４０】
エリスロポエチン受容体（ＥＰＯ−Ｒ）と結合し、これを活性化する化合物であって、
次式：
【化６８】
2014051498.tif 000071
を有する、
ペプチド二量体（配列番号：１６）を含む化合物。
【請求項４１】
エリスロポエチン受容体（ＥＰＯ−Ｒ）と結合し、これを活性化する化合物であって、
次式：
【化６９】
2014051498.tif 000072
を有する、
ペプチド二量体（配列番号：１６）を含む化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、２つの分子を共有結合によって連結でき、さらに、ポリ（エチレングリコー
ル）（ＰＥＧ）などの１個または複数の修飾基の共有結合を提供する新規リンカー分子に
関する。さらに、本発明は、このような化合物を含む新規治療用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、タンパク質に関する研究の発展によって、種々の作用を有する多数のペプチドが
見出されている。遺伝子組換え技術およびペプチドの有機合成法の進歩によって、これら
の生理学的に活性なペプチドおよびその構造的類似体化合物を多量に得ることが可能とな
った。特異的な活性を有するこれらのペプチドの多くは、医薬品として極めて有用である
。
【０００３】
このようなペプチドの例として、エリスロポエチン（ＥＰＯ）受容体（ＥＰＯ−Ｒ）と
結合するペプチドが挙げられる。ＥＰＯは、１６５個のアミノ酸、アミノ酸位置２４、３
８、８３および１２６の４つのグリコシル化部位ならびに約３４，０００の分子量を有す
る糖タンパク質ホルモンである。ＥＰＯは、赤血球前駆細胞の有糸分裂および分化を刺激
し、ひいては、赤血球の生成を確実にする。ＥＰＯは、赤血球形成の過程において必須で
あり、このホルモンは、少ない、または欠陥のある赤血球生成を特徴とする血液疾患の診
断および治療の両方において有用な適用を有する可能性がある。ＥＰＯ−Ｒと相互作用す
るいくつかのペプチドが発見されている。（例えば、Ｗｒｉｇｈｔｏｎらの米国特許第５
，７７３，５６９号；Ｗｒｉｇｈｔｏｎらの米国特許第５，８３０，８５１号；およびＳ
ｍｉｔｈ−ＳｗｉｎｔｏｓｋｙらのＷＯ０１／９１７８０参照のこと。）
【０００４】
しかし、特に、循環系に投与された場合のペプチドのクリアランスは、通常、極めて速
い。したがって、このようなペプチドの持続性を改善することが望まれる。さらに、ペプ
チドが、異なる種の動物から得られ、ペプチドタンパク質工学によって設計され、かつ／
または被験体のものとは異なる構造を有する場合は、抗体の生成による重大な症状を引き
起こす危険がある。したがって、また、このようなペプチドの抗原性を改善することも望
まれる。これらのペプチドを医薬品として使用するには、改善された抗原性および持続性
の両方を有することが必要である。
【０００５】
ポリ（エチレングリコール）などの高分子化合物でペプチドを化学修飾することは、種
々のペプチドの抗原性および持続性を改善するのに有効であることがわかっている。した
がって、ポリ（エチレングリコール）およびポリ（エチレングリコール）誘導体は、ペプ
チド修飾性高分子試薬として広く用いられている。
【０００６】
ポリ（エチレングリコール）は、その最も一般的な形では、以下の構造を有する。
ＨＯ−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）nＣＨ2ＣＨ2−ＯＨ
【０００７】
上記のポリマー、α−、ω−ジヒドロキシルポリ（エチレングリコール）は、ＨＯ−Ｐ
ＥＧ−ＯＨ（ここで、−ＰＥＧ−記号は、以下の構造単位を表すと理解される）として簡
潔な形で表すことができる。
−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）ｎ−ＣＨ2ＣＨ2−
【０００８】
いずれかの特定の理論または作用機序に制限されるものではないが、長い鎖様ＰＥＧ分
子または部分は、水性媒体中にあると、大量に水和され、高速運動中にあると考えられる
。この高速運動によって、ＰＥＧが大きな容積を一掃し、その他の分子の接近および干渉
を妨げると考えられる。結果として、ＰＥＧポリマー鎖は、別の化学物質（例えば、ペプ
チド）に結合されると、このような化学物質を免疫応答およびその他のクリアランス機構
から保護することができる。結果として、ＰＥＧ化は、薬物動態を最適化し、バイオアベ
イラビリティーを増大し、免疫原性および投与頻度を低減することによって、薬効および
安全性の改善につながる。
【０００９】
例えば、ＰＥＧのいくつかの活性な誘導体がペプチド、タンパク質および酵素に結合さ
れ、有益な結果となっている。ＰＥＧは、有機溶媒に可溶性である。酵素に結合されたＰ
ＥＧは、有機溶媒において可溶性であり、活性であるＰＥＧ−酵素コンジュゲートをもた
らし得る。タンパク質へのＰＥＧの結合は、非修飾タンパク質と比較して、ＰＥＧ−タン
パク質コンジュゲートの免疫原性および腎臓クリアランスの速度を低減することができ、
これは、コンジュゲートの血液循環寿命の著しい増大をもたらし得る。
【００１０】
例えば、インターロイキン（Ｋｎａｕｆ，Ｍ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９
８８年、２６３、１５，０６４頁；Ｔｓｕｔｓｕｍｉ，Ｙ．ら、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅ
ｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  １９９５年、３３、４４７頁）、インターフェロン（Ｋｉｔａ，Ｙ
．ら、Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ．Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  １９９０年、６、１５７頁）、カタラーゼ
（Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉ，Ａ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９７７年、２５２、３、
５８２頁）、スーパーオキシドジスムターゼ（Ｂｅａｕｃｈａｍｐ，Ｃ．Ｏ．ら、Ａｎａ
ｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８３年、１３１、２５頁）およびアデノシンデアミナーゼ（Ｃ
ｈｅｎ，Ｒ．ら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙ．Ａｃｔａ  １９８１年、６６０、２９
３頁）などの治療用タンパク質とＰＥＧの共有結合は、そのｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を延長
し、ならびに／またはその免疫原性および抗原性を低減すると報告されている。
【００１１】
さらに、表面に結合しているＰＥＧは、表面へのタンパク質および細胞吸着を低減し、
表面の電気的特性を変化させ得る。同様に、リポソームに結合しているＰＥＧは、これら
の粒子の血液循環寿命の大きな増大と、それによる、その薬物送達の有用性の増大の可能
性をもたらし得る（Ｊ．Ｍ．Ｈａｒｒｉｓ編、「Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏ
ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｇ
ｌｙｃｏｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、Ｐｌｅｎｕｍ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９２年）。
【００１２】
ＰＥＧおよび結合された高分子間にアミノ酸またはペプチドアーム（peptide arm）が
存在することが、適したアミノ酸またはペプチドを用いて導入され得る特性の変化による
いくつかの利点を実証してきた。これらのアミノ酸またはペプチドアームのうち、ノルロ
イシン（Ｎｌｅ）は、分析目的で用いられ、14Ｃまたはトリチウム標識されたＧｌｙは、
薬物動態研究のために用いられ、Ｌｙｓは、分枝のために用いられ、Ｍｅｔ−Ｎｌｅまた
はＭｅｔ−βＡｌａは、ＢｒＣＮ処理によるＰＥＧ除去のために用いられている（Ｖｅｒ
ｏｎｅｓｅ，Ｆ．Ｍ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、２００１年、２２、４０５頁）。
【００１３】
ＰＥＧおよび結合された高分子間にアミノ酸アームを含む、別の公知の種類のＰＥＧ誘
導体は、三官能性リンカーの２つの官能基によって一緒に連結している２つの直線ＰＥＧ
鎖を特徴とし、第３の官能基はタンパク質を結合するのに用いられる。リジン（Lysine）
は、三官能性アミノ酸リンカーであり、２つのＰＥＧ鎖は、そのαおよびεアミノ基と連
結しており、カルボン酸基は、タンパク質結合のためにヒドロキシスクシンイミジルエス
テルとして活性化される。このＰＥＧ誘導体は、コンジュゲーションの際に酵素の不活化
が少なく、その「傘様」構造は、タンパク質をタンパク質分解から保護するのに、抗体の
アプローチにおいて、また免疫原性を低減するのに有効であるという利点を有する（Ｖｅ
ｒｏｎｅｓｅ，Ｆ．Ｍ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、２００１年、２２、４０５頁）。
【００１４】
ＰＥＧ−リンカー−ペプチドまたはＰＥＧ−リンカー−リポソームは、活性化基の一部
が最終ＰＥＧ−ペプチドまたはＰＥＧ−リポソーム付加物中に組み込まれる時に、望まし
くない副生成物として形成されることがある。Ｆｒａｎｃｅｓら（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｈｅｍａ
ｔｏｌ．１９９８年、６８、１頁）は、このようなリンカーは、いくつかの種類の有害作
用を有し得ると開示している：（１）これらのリンカーは、必ずしも免疫学的に不活性で
はなく、このような基が、ＰＥＧタンパク質の免疫原性／抗原性の原因であるという実験
的証拠がある；（２）いくつかのリンカー部分は、酵素的にまたは化学的に切断され得る
不安定な結合を含む；（３）比較的毒性の高い活性化されたＰＥＧに由来するリンカー部
分は、規制問題につながり得ることが多い；（４）トリアジン環などの特定のリンカー基
は架橋を引き起こし得る。
【００１５】
ＰＥＧに加えて、その他の化合物でペプチドを化学修飾することは、種々のペプチドの
活性および持続性を改善するのに有効であることがわかっている。例として、脂肪酸（Ｗ
ａｎｇら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００５年、４８、３３２８頁）、能動輸送剤（例え
ば、コール酸）、密着結合修飾物質（tight junction modulators）（Ｊｏｈｎｓｏｎお
よびＱｕａｙ、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．２００５年、２、２８
１頁）、ペプチド（例えば、ポリアルギニン）、細胞傷害性薬剤（例えば、ドキソルビシ
ン）、ヒアルロン酸または炭水化物などのその他のポリマーなどの結合が挙げられる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
ＰＥＧまたは別の化学基の、例えばペプチドとの結合は、リンカー分子の使用によって
達成してもよい。これらのリンカー分子は、複数の官能基末端を提供することができ、そ
れによって、単一のリンカーの使用によっていくつかの分子の結合が可能となる。しかし
、例えば、ＰＥＧまたはその他のモディファイヤーペプチドベースのコンジュゲートの技
術分野においてなされた進展にもかかわらず、依然として、分子コンジュゲーションのさ
らなる方法を提供するための新規リンカー分子の必要性が残っている。
【００１７】
この節中の、この明細書を通じて、参照文献の引例および／または考察は、このような
参照文献が本発明の先行技術であるという承認と解釈されてはならない。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明のリンカーは、少なくとも１つの分子部分（molecular moiety）を別の分子部分
と結合できる。
【００１９】
一実施形態は、以下の構造を有するリンカー部分化合物（linker moiety compound）で
ある
【００２０】
【化１】
2014051498.tif 000002
［式中、
αは、１≦α≦７の整数であり；
βは、１≦β≦７の整数であり；
δは、２≦δ≦５の整数であり；
Ａは、ＣＯ2Ｈ、活性化ＣＯ2Ｈ、ＮＨ2、ＮＣＯ、ＣＨＯ、マレイミドまたはビニルス
ルホンのいずれかであり；
Ｅは、ＮＨ2、ＣＯ2Ｈ、ＣＨＯ、マレイミドまたはＮＨＢｏｃのいずれかである］。
【００２１】
さらなる実施形態は、
α＝β＝１または２であり；
δ＝３であり；
Ａが、ＣＯ2Ｈまたは活性化ＣＯ2Ｈのいずれかであり；
Ｅが、ＮＨＢｏｃである。
【００２２】
別のリンカー部分化合物実施形態は、以下の構造を有するリンカー部分化合物である
【００２３】
【化２】
2014051498.tif 000003
［式中、
κは、０≦κ≦８の整数であり；
ρは、０≦ρ≦８の整数であり；
τは、２≦τ≦５の整数であり；
Ａは、ＮＨＲまたはＮＲＢｏｃのいずれかであり；
Ｒは、アルキルであり；
Ｅは、ＮＨ2、ＣＯ2Ｈ、活性化ＣＯ2Ｈ、ＣＨＯ、マレイミドまたはＮＲＢｏｃのいず
れかであり、ここで、Ｒは、Ｈまたはアルキルである］。
【００２４】
さらなる実施形態は、
κ＝ρ＝０であり；
τ＝３であり；
Ａが、ＮＨＢｏｃであり；
Ｒが、ＣＨ3であり；
Ｅが、ＣＯ2ＨまたはＣＯＮＨＳである。
【００２５】
別のリンカー部分化合物実施形態は、リンカー部分化合物が、３個以上の分子を連結し
、リンカー部分化合物が、以下の構造を有する
【００２６】
【化３】
2014051498.tif 000004
［式中、
χは、１≦χ≦４の整数であり；
φは、１≦φ≦４の整数であり；
γは、２≦γ≦８の整数であり；
ηは、２≦η≦８の整数であり；
Ａは、ＣＯ2Ｈ、活性化ＣＯ2Ｈ、ＮＨ2、ＮＣＯ、ＣＨＯ、マレイミドまたはビニルス
ルホンのいずれかであり；
Ｂは、ＣＨまたはＮのいずれかであり；
Ｃは、ＣＯ（ＣＨ2）σＣＯまたは（ＣＨ2）σのいずれかであり；
Ｄは、ＣＨまたはＮのいずれかであり；
Ｅは、ＮＨ2、ＮＨＢｏｃ、ＣＯ2Ｈ、ＣＨＯまたはマレイミドのいずれかであり；
σは、２≦σ≦５の整数である］。
【００２７】
さらなる実施形態は、
χ＝１であり；
φ＝１であり；
γが、２≦γ≦３の整数であり；
ηが、２≦η≦３の整数であり；
Ａが、ＣＯ2Ｈまたは活性化ＣＯ2Ｈのいずれかであり；
Ｂが、Ｎであり；
Ｃが、ＣＯ（ＣＨ2）σＣＯまたは（ＣＨ2）σであり；
Ｄが、Ｎであり；
Ｅが、ＮＨＢｏｃであり；
σが、２≦σ≦３の整数である。
【００２８】
別の実施形態は、リンカー部分化合物が３個以上の分子を連結し、リンカー部分化合物
が以下の構造を有する
【００２９】
【化４】
2014051498.tif 000005
［式中、
λは、１≦λ≦４の整数であり；
μは、１≦μ≦４の整数であり；
Ａは、ＣＯ2Ｈ、活性化ＣＯ2Ｈ（活性化ＣＯ2Ｈ）、ＮＨ2、ＮＣＯ、ＣＨＯ、マレイミ
ドまたはビニルスルホンのいずれかであり；
Ｂは、ＣＨまたはＮのいずれかであり；
Ｇは、（ＣＨ2）ν、ＣＯまたはＣＯＣＨ2ＯＣＨ2ＣＯのいずれかであり；
Ｅは、ＮＨ2、ＮＨＢｏｃ、ＣＯ2Ｈ、ＣＨＯまたはマレイミドのいずれかであり；
Ｘは、ＣＯ、結合またはＣＯＮＨのいずれかであり；
Ｙは、ＣＯ、結合またはＮＨＣＯのいずれかであり；
νは、２≦ν≦４の整数である］。
【００３０】
さらなる実施形態は、
λが、１≦λ≦３の整数であり；
μ＝２であり；
Ａが、ＣＯ2Ｈまたは活性化ＣＯ2Ｈのいずれかであり；
Ｂが、Ｎであり；
Ｇが、（ＣＨ2）ν、ＣＯまたはＣＯＣＨ2ＯＣＨ2ＣＯのいずれかであり；
Ｅが、ＮＨ2またはＮＨＢｏｃであり；
Ｘが、ＣＯまたは結合であり；
Ｙが、ＣＯまたは結合であり；
ν＝２である。
【００３１】
上記のリンカー部分（linker moiety）のさらなる実施形態として、ペプチド部分（pep
tide moiety）、上記のリンカー部分、水溶性ポリマー部分（water-soluble polymer moi
ety）を含む化合物が挙げられる。特定の実施形態では、リンカー部分が、ペプチド部分
または水溶性ポリマー部分と共有結合するように、Ａは、ＣＯ、ＮＨ、ＮＣＯまたはＳＯ
2ＣＨ2ＣＨ2のいずれかであり、Ｅは、ＮＨまたはＣＯのいずれかである。
【００３２】
水溶性ポリマー部分が、ポリ（エチレングリコール）部分（moiety）であることが好ま
しい。ポリ（エチレングリコール）部分が、直線であり、約２ｋダルトン〜６０ｋダルト
ンの分子量を有することがより好ましい。ポリ（エチレングリコール）部分が、約２０〜
４０ｋダルトンの分子量を有することがさらにより好ましい。ポリ（エチレングリコール
）部分が、２０ｋダルトンの分子量を有することが最も好ましい。ポリ（エチレングリコ
ール）部分が、１．２０未満、より好ましくは１．１未満、最も好ましくは１．０５未満
の多分散性（ＭW／Ｍn）を有することが好ましい。特定の実施形態では、２種の水溶性部
分が、リンカー部分を介してペプチド部分と結合している。
【００３３】
本発明での一実施形態では、ペプチド部分は、二量体であり、リンカー部分によって連
結された２種の単量体ペプチドを含む。
【００３４】
一実施形態では、ペプチド部分は、エリスロポエチン受容体と結合するペプチドから選
択される。このようなＥＰＯ−Ｒ結合ペプチドの限定されない例として、公開国際出願Ｐ
ＣＴ／ＵＳ００／３２２２４（公開番号ＷＯ０１／３８３４２Ａ２、米国指定）、ＰＣＴ
／ＵＳ９６／０９８１０（公開番号ＷＯ９６／４０７４９、米国指定）およびＰＣＴ／Ｕ
Ｓ０１／１６６５４（公開番号ＷＯ０１／９１７８０Ａ１）；および米国特許第５，７６
７，０７８号、同第５，７７３，５６９号、同第５，８３０，８５１号、同第５，９８６
，０４７号および同第６，２２１，６０８号に開示されるものが挙げられる。このような
ＥＰＯ−Ｒ結合ペプチドのさらなる限定されない例は、ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１４８
８６（公開番号ＷＯ２００４／１０１６１１）およびＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１４８８
９（公開番号ＷＯ２００４／１０１６０６）に開示される。
【００３５】
本発明はまた、上記の化合物（複数の化合物）を含む薬剤組成物に関する。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】１０ｍｇ／ｋｇのＰＥＧ化ペプチドの単回ボーラスＩＶ注射後の雄のSprague-Dawley（スプラーグ−ドーリー）ラットにおけるヘモグロビン（Ｈｇｂ）における変化を示す図である。破線（△）：化合物Ｉ、実線（●）：化合物ＸＩＩＩ。
【図２】１０ｍｇ／ｋｇのＰＥＧ化ペプチドの単回ボーラスＩＶ注射後の雄のSprague-Dawleyラットにおけるヘモグロビン（Ｈｇｂ）における変化を示す図である。破線（△）：化合物Ｉ、実線（●）：化合物Ｖ。
【図３】１０ｍｇ／ｋｇのＰＥＧ化ペプチドの単回ボーラスＩＶ注射後の雄のSprague-Dawleyラットにおけるヘモグロビン（Ｈｇｂ）における変化を示す図である。破線（△）：化合物Ｉ、実線（●）：化合物ＩＶ。
【図４】１０ｍｇ／ｋｇのＰＥＧ化ペプチドの単回ボーラスＩＶ注射後の雄のSprague-Dawleyラットにおけるヘモグロビン（Ｈｇｂ）における変化を示す図である。破線（△）：化合物Ｉ、実線（●）：化合物ＩＩＩ。
【図５】実施例２５の方法に従って、雄のSprague-Dawleyラットにおいて観察された網状赤血球（reticulocyte）パーセント（Ｒｅｔ％）における変化を示す図である。破線（△）：化合物Ｉ、実線（●）：化合物ＩＩＩ。
【図６】実施例２５の方法に従って、雄のSprague-Dawleyラットにおいて観察された網状赤血球パーセント（Ｒｅｔ％）における変化を示す図である。破線（△）：化合物Ｉ、実線（●）：化合物Ｖ。
【図７】実施例２５の方法に従って、雄のSprague-Dawleyラットにおいて観察された網状赤血球パーセント（Ｒｅｔ％）における変化を示す図である。破線（△）：化合物Ｉ、実線（●）：化合物ＸＩＩＩ。
【図８】実施例２５の方法に従って、雄のSprague-Dawleyラットにおいて観察された網状赤血球パーセント（Ｒｅｔ％）における変化を示す図である。破線（△）：化合物Ｉ、実線（●）：化合物ＩＶ。
【図９】０．５ｍｇ／ｋｇの化合物ＸＶＩの単回ボーラス投与後の雄のSprague-Dawleyラットにおいて観察された網状赤血球パーセント（Ｒｅｔ％）における変化を示す図である。破線（△）：皮下注射（subcutaneous injection）（ＳＣ）；実線（●）：静脈注射（intravenous injection）（ＩＶ）。
【図１０】０．５ｍｇ／ｋｇの化合物ＸＶの単回ボーラス投与後の雄のSprague-Dawleyラットにおいて観察された網状赤血球パーセント（Ｒｅｔ％）における変化を示す図である。破線（△）：皮下注射（ＳＣ）；実線（●）：静脈注射（ＩＶ）。
【図１１】０．５ｍｇ／ｋｇの化合物ＸＶＩの単回ボーラス注射後の雄のSprague-Dawleyラットにおけるヘモグロビン（Ｈｇｂ）における変化を示す図である。破線（△）：皮下注射（ＳＣ）；実線（●）：静脈注射（ＩＶ）。
【図１２】０．５ｍｇ／ｋｇの化合物ＸＶの単回ボーラス注射後の雄のSprague-Dawleyラットにおけるヘモグロビン（Ｈｇｂ）における変化を示す図である。破線（△）：皮下注射（ＳＣ）；実線（●）：静脈注射（ＩＶ）。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
定義
ペプチド中のアミノ酸残基は以下のとおりに略記される：フェニルアラニンはＰｈｅま
たはＦであり；ロイシンはＬｅｕまたはＬであり；イソロイシンはＩｌｅまたはＩであり
；メチオニンはＭｅｔまたはＭであり；バリンはＶａｌまたはＶであり；セリンはＳｅｒ
またはＳであり；プロリンはＰｒｏまたはＰであり；トレオニンはＴｈｒまたはＴであり
；アラニンはＡｌａまたはＡであり；チロシンはＴｙｒまたはＹであり；ヒスチジンはＨ
ｉｓまたはＨであり；グルタミンはＧｌｎまたはＱであり；アスパラギンはＡｓｎまたは
Ｎであり；リジンはＬｙｓまたはＫであり；アスパラギン酸はＡｓｐまたはＤであり；グ
ルタミン酸はＧｌｕまたはＥであり；システインはＣｙｓまたはＣであり；トリプトファ
ンはＴｒｐまたはＷであり；アルギニンはＡｒｇまたはＲであり；グリシンはＧｌｙまた
はＧである。ペプチド中の非従来アミノ酸は以下のとおりに略記される：１−ナフチルア
ラニンは１−ＮａｌまたはＮｐであり；２−ナフチルアラニンは２−Ｎａｌであり；Ｎ−
メチルグリシン（サルコシンとしても知られている）はＭｅＧまたはＳcまたはＳａｒで
あり；アセチル化グリシン（Ｎ−アセチルグリシン）はＡｃＧである。
【００３８】
「ペプチド」または「ポリペプチド」とは、単量体が、アミド結合によって一緒になっ
て結合しているαアミノ酸であるポリマーを指す。ペプチドは、２個、または、多くは、
それより多いアミノ酸単量体の長さである。本発明のペプチドは、約５０個未満のアミノ
酸単量体の長さを含むことが好ましい。
【００３９】
本明細書において、語句「製薬上許容される」とは、「一般に安全と見なされる」、例
えば、生理学的に許容され、ヒトに投与された場合に、通常、アレルギー反応または同様
の有害反応、例えば、胃の不調、めまいなどを引き起こさない分子的実体および組成物を
指す。本明細書において、用語「製薬上許容される」は、連邦政府または州政府の監督官
庁によって承認される、または米国薬局方もしくは動物、さらに詳しくは、ヒトにおいて
使用するためのその他の一般に認識される薬局方に列挙されることを意味することが好ま
しい。用語「担体（carrier）」とは、それと一緒に化合物が投与される、希釈液（dilue
nt）、アジュバント（adjuvant）、賦形剤（excipient）またはビヒクル（vehicle）を指
す。このような薬剤担体は、水およびピーナッツオイル、ダイズオイル、鉱油、ゴマ油な
どの石油、動物、植物または合成由来のものを含めたオイルなどの滅菌液体であり得る。
水または水溶液生理食塩水および水性デキストロースおよびグリセロール溶液を、特に注
射用溶液のための、担体として用いることが好ましい。適した薬剤担体は、Ｅ．Ｗ．Ｍａ
ｒｔｉｎによる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎ
ｃｅｓ」に記載されている。
【００４０】
本明細書において、用語「アゴニスト」とは、それと相補的な生物学的に活性な受容体
と結合し、後者を活性化して、受容体において生物学的反応を引き起こすか、または受容
体の既存の生物学的反応を増強するのいずれかである生物学的に活性なリガンドを指す。
【００４１】
本明細書において、用語「活性化されたＣＯ2Ｈ（activated CO2H）」または「ＣＯＸ
」とは、カップリング反応に関与し、通常、アミンまたはヒドロキシ基での処理でアミド
またはエステル結合を形成し得るカルボン酸の活性エステルを指す。好ましい実施形態は
、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド活性化カルボキシル基（N-hydroxysuccinimide activat
ed carboxyl group）である。本発明の別の好ましい実施形態は、ジイソプロピルカルボ
ジイミド、ジシクロヘキシルカルボジイミド、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３
−エチルカルボジイミド（ＥＤＣ）などのカップリング剤の存在下で、カルボン酸および
アミンが反応することが可能となるｉｎ  ｓｉｔｕ活性化に依存する。
【００４２】
リンカー部分
本発明のリンカーは、水溶性ポリマー部分であり得る少なくとも２つの部分と、ペプチ
ドであり得る第３の部分と結合できる。
【００４３】
本発明の一実施形態では、以下の構造を有するリンカー部分化合物が示される
【００４４】
【化５】
2014051498.tif 000006
［式中、α、βおよびδは各々、値が独立して選択される整数である］。
【００４５】
好ましい実施形態では、
αは、１≦α≦７の整数であり；
βは、１≦β≦７の整数であり；
δは、２≦δ≦５の整数であり；
Ａは、ＣＯ2Ｈ、ＣＯＸ（活性化されたＣＯ2Ｈ、例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミ
ドによって活性化されたもの）、ＮＨ2、ＮＣＯ、ＣＨＯ、マレイミドまたはビニルスル
ホンのいずれかであり；
Ｅは、ＮＨ2、ＮＨＢｏｃ、ＣＯ2Ｈ、ＣＨＯまたはマレイミドのいずれかである。
【００４６】
特定の好ましい一実施形態では、
α＝β＝１または２であり；
δ＝３であり；
Ａは、ＣＯ2ＨまたはＣＯＸ（活性化されたＣＯ2Ｈ）のいずれかであり；
Ｅは、ＮＨＢｏｃである。
【００４７】
別の特定の好ましい実施形態では、
α＝β＝２であり；
δ＝３であり；
Ａは、ＣＯ2ＨまたはＣＯＸ（活性化されたＣＯ2Ｈ）のいずれかであり；
Ｅは、ＮＨＢｏｃである。
【００４８】
別のリンカー部分化合物実施形態は、以下の構造を有するリンカー部分化合物である
【００４９】
【化６】
2014051498.tif 000007
［式中、
κは、０≦κ≦８の整数であり；
ρは、０≦ρ≦８の整数であり；
τは、２≦τ≦５の整数であり；
Ａは、ＮＨＲまたはＮＲＢｏｃのいずれかであり；
Ｒは、アルキルであり；
Ｅは、ＮＨ2、ＣＯ2Ｈ、活性化されたＣＯ2Ｈ、ＣＨＯ、マレイミドまたはＮＲＢｏｃ
のいずれかであり、ここで、Ｒは、Ｈまたはアルキルである］。
【００５０】
さらなる実施形態は、
κ＝ρ＝０であり；
τ＝３であり；
Ａは、ＮＲＢｏｃであり；
Ｒは、ＣＨ3であり；
Ｅは、ＣＯ2ＨまたはＣＯＮＨＳである。
【００５１】
本発明のもう１つの実施形態では、リンカー部分は、以下の構造を有する四官能性リン
カーである
【００５２】
【化７】
2014051498.tif 000008
［式中、χ、φ、γおよびηは各々、値が独立に選択される整数である］。
【００５３】
好ましい実施形態では、
χは、１≦χ≦４の整数であり；
φは、１≦φ≦４の整数であり；
γは、２≦γ≦８の整数であり；
ηは、２≦η≦８の整数であり；
Ａは、ＣＯ2Ｈ、ＣＯＸ（活性化されたＣＯ2Ｈ、例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミ
ドによって活性化されたもの）、ＮＨ2、ＮＣＯ、ＣＨＯ、マレイミドまたはビニルスル
ホンのいずれかであり；
Ｂは、ＣＨまたはＮのいずれかであり；
Ｃは、ＣＯ（ＣＨ2）σＣＯまたは（ＣＨ2）σのいずれかであり；
Ｄは、ＣＨまたはＮのいずれかであり；
Ｅは、ＮＨ2、ＮＨＢｏｃ、ＣＯ2Ｈ、ＣＨＯまたはマレイミドのいずれかであり；
σは、２≦σ≦５の整数である。
【００５４】
特に好ましい実施形態では、
χ＝１であり；
φ＝１であり；
γは、２≦γ≦３の整数であり；
ηは、２≦η≦３の整数であり；
Ａは、ＣＯ2ＨまたはＣＯＸ（活性化されたＣＯ2Ｈ）のいずれかであり；
Ｂは、Ｎであり；
Ｃは、ＣＯ（ＣＨ2）σＣＯまたは（ＣＨ2）σのいずれかであり；
Ｄは、Ｎであり；
Ｅは、ＮＨＢｏｃであり；
σは、２≦σ≦３の整数である。
【００５５】
特定の一実施形態では、
χ＝１であり；
φ＝１であり；
γは、２≦γ≦３の整数であり；
ηは、２≦η≦３の整数であり；
Ａは、ＣＯ2ＨまたはＣＯＸ（活性化されたＣＯ2Ｈ）のいずれかであり；
Ｂは、Ｎであり；
Ｃは、ＣＯ（ＣＨ2）σＣＯであり；
Ｄは、Ｎであり；
Ｅは、ＮＨＢｏｃであり；
σは、２≦σ≦３の整数である。
【００５６】
本発明の別の一実施形態では、リンカー部分は、以下の構造を有する四官能性リンカー
である
【００５７】
【化８】
2014051498.tif 000009
［式中、λおよびμは各々、値が独立に選択される整数である］。
【００５８】
好ましい実施形態では、
λは、１≦λ≦４の整数であり；
μは、１≦μ≦４の整数であり；
Ａは、ＣＯ2Ｈ、ＣＯＸ（活性化されたＣＯ2Ｈ、例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミ
ドによって活性化されたもの）、ＮＨ2、ＮＣＯ、ＣＨＯ、マレイミドまたはビニルスル
ホンのいずれかであり；
Ｂは、ＣＨまたはＮのいずれかであり；
Ｇは、（ＣＨ2）ν、ＣＯまたはＣＯＣＨ2ＯＣＨ2ＣＯのいずれかであり；
Ｅは、ＮＨ2、ＮＨＢｏｃ、ＣＯ2Ｈ、ＣＨＯまたはマレイミドのいずれかであり；
Ｘは、ＣＯ、結合またはＣＯＮＨのいずれかであり；
Ｙは、ＣＯ、結合またはＮＨＣＯのいずれかであり；
νは、２≦ν≦４の整数である。
【００５９】
特に好ましい実施形態では、
λは、１≦λ≦３の整数であり；
μ＝２であり；
Ａは、ＣＯ2ＨまたはＣＯＸ（活性化されたＣＯ2Ｈ）のいずれかであり；
Ｂは、Ｎであり；
Ｇは、（ＣＨ2）ν、ＣＯまたはＣＯＣＨ2ＯＣＨ2ＣＯのいずれかであり；
Ｅは、ＮＨまたはＮＨＢｏｃであり；
Ｘは、ＣＯまたは結合であり；
Ｙは、ＣＯまたは結合であり；
ν＝２である。
【００６０】
本発明によれば、リンカーのＥ末端は、保護基を含む場合があり、これは、水溶性ポリ
マー部分（好ましくはＰＥＧ）が結合される前に、反応性官能基を遊離させるために除去
しなくてはならない。リンカーのＥ末端の保護基として、ＢｏｃおよびＡｌｌｏｃが挙げ
ることができるが、それらに限定されない。水溶性部分は、リンカーのＥ末端に直接的に
結合されてもよく、間接的に、例えば、アミドもしくはカルバメート結合を用いて結合さ
れてもよい。本発明のリンカーは、１つまたは複数の水溶性ポリマー部分の結合を可能に
する。
【００６１】
本発明によれば、ペプチド部分は、リンカーのＡ末端に結合されてもよい。リンカーは
、ペプチドのＣ末端またはＮ末端のいずれと結合させてもよい。したがって、リンカーが
ペプチドのＣ末端と結合している実施形態では、ＡはＮＨ2である。リンカーがペプチド
のＮ末端と結合している実施形態では、Ａは、ＣＯ2Ｈ、ＣＯＸ（活性化されたＣＯ2Ｈ）
またはＮＣＯである。代替実施形態では、ペプチドは、システイン中に見られるものなど
のチオール側鎖を含み、Ａはマレイミドである。その他の実施形態では、ペプチドは、還
元的アミノ化反応によって、ＡがＣＨＯであるリンカーと結合している遊離アミンを含む
。好ましい代替実施形態では、ＡがＣＯ2ＨまたはＣＯＸ（活性化されたＣＯ2Ｈ）である
本発明のリンカーは、アミド結合によってペプチド単量体のリジン残基のεアミノ基と結
合している。前記リジン残基は、ペプチド単量体中のいずれの位置にあってもよい。好ま
しい実施形態では、リジンはペプチドのＣ末端に位置する。
【００６２】
リンカー部分は、ペプチド合成の間にペプチド中に組み込んでもよい。例えば、リンカ
ーが、別の分子部分と結合可能な２種の遊離官能基（例えば、カルボキシル基またはアミ
ノ基）を含む場合は、リンカーを固相支持体にコンジュゲートさせてもよい。その後、標
準固相技術によってペプチドをリンカーの遊離官能基上に直接合成してもよい。
【００６３】
別の実施形態では、ペプチド合成後に、リンカー部分をペプチドにコンジュゲートさせ
てもよい。このようなコンジュゲーションは、当技術分野で十分に確立された方法によっ
て達成できる。一実施形態では、リンカーは、合成されたペプチドの標的官能基との結合
に適した少なくとも１個の官能基を含む。例えば、遊離アミン基を含むリンカーを、ペプ
チドのＣ末端カルボキシル基と反応させてもよい。
【００６４】
一実施形態では、リンカー部分を、まず、１つまたは２つのペプチドと結合し、後者の
場合には、ペプチド二量体を形成する。その後、リンカーの保護基を除去し、２つの反応
基を遊離させる。その後、２つの反応基を、２つの水溶性ポリマー部分（好ましくは、Ｐ
ＥＧ部分）と結合する。
【００６５】
あるいは、まず、水溶性部分（好ましくは、ＰＥＧ部分）を、リンカーとコンジュゲー
トし、続いて、リンカーの反応性官能基を遊離させてもよく、これが１つまたは２つのペ
プチドと反応でき、後者の場合はペプチド二量体を形成する。
【００６６】
特定の実施形態では、リンカーは、三官能性であり、Ａ末端が第２のリンカーと結合さ
れる。第２のリンカーは１つまたは２つのペプチドと結合でき、後者の場合にはペプチド
二量体を形成する。
【００６７】
水溶性ポリマー／ＰＥＧ部分（Moiety）
本発明の水溶性ポリマー部分として、それだけには限らないが、（ａ）ポリアルキレン
グリコールおよびその誘導体、例えば、ＰＥＧ、ｍＰＥＧ、ＰＥＧホモポリマー、ポリプ
ロピレングリコールホモポリマー、エチレングリコールのプロピレングリコールとの共重
合体（ここで、前記ホモポリマーおよび共重合体は、非置換であるか、または一方の末端
でアルキル基で置換されている）；（ｂ）セルロースおよびセルロース誘導体、例えば、
メチルセルロースおよびカルボキシメチルセルロース；（ｃ）デンプンおよびデキストリ
ンおよびその誘導体；（ｄ）デキストランおよびデキストラン誘導体、例えば、硫酸デキ
ストラン、架橋デキストリンおよびカルボキシメチルデキストリン；（ｅ）ヘパリンおよ
びヘパリンの断片；（ｆ）ポリビニルアルコールおよびポリビニルエチルエーテル；（ｇ
）ポリビニルピロリドン；（ｈ）ａ，ｂ−ポリ［（２−ヒドロキシエチル）−ＤＬ−アス
パルタミド；および（ｉ）ポリオキシエチレン化ポリオールが挙げられる。
【００６８】
これらのポリマーは、様々な分子量を有する、直鎖、分枝または星型であり得る。
【００６９】
水溶性ポリマー部分は、ＰＥＧであることが好ましい。本発明において使用するのに好
ましいＰＥＧとして、約２ｋダルトン（ｋＤａ）を超える分子量を有する直鎖ＰＥＧがあ
る。ＰＥＧは、約１０ｋＤａ〜約６０ｋＤａの分子量を有することが好ましい。ＰＥＧは
、約２０ｋＤａ〜約４０ｋＤａの分子量を有することが好ましい。ＰＥＧは、約４０ｋＤ
ａの分子量を有することが好ましい。２つのＰＥＧ部分の合計２０〜６０ｋダルトンにつ
いて、各ＰＥＧ部分が、１０〜３０ｋダルトンであることが好ましい。
【００７０】
水溶性ポリマー部分は、スペーサーまたはリンカー部分と共有結合している。一実施形
態では、ＰＥＧ部分は、スペーサーまたはリンカーのＮ末端に結合している。
【００７１】
本発明の化合物は、複数の水溶性ポリマー部分（好ましくは、ＰＥＧ部分）（例えば、
２、３、４またはそれ以上）を含むことができ、このような複数の水溶性ポリマー部分の
少なくとも１つは、リンカー部分を介して連結している。化合物が２つ以上の水溶性ポリ
マー部分を含む場合には、複数の水溶性ポリマー部分は同一の化学部分であってもよいし
、異なる化学部分（例えば、異なる分子量のＰＥＧ）であってもよい。本発明の一実施形
態では、水溶性ポリマー部分は、二量体であり、リンカー部分によって連結される２つの
単量体ＰＥＧを含む。いくつかの場合では、ペグ化度（ペプチドに結合されたＰＥＧ部分
の数および／またはＰＥＧが結合されているペプチドの総数）は、ＰＥＧ化反応における
ＰＥＧ分子対ペプチド分子の割合によって、ならびに反応混合物中の各々の総濃度によっ
て影響を受け得る。一般に、最適ＰＥＧ対ペプチド比（過剰の未反応ペプチドおよび／ま
たはＰＥＧを生じさせないための反応効率の点で）は、所望のペグ化度（例えば、モノ、
ジ−、トリ−等）、選択されたポリマーの分子量、ポリマーが分枝しているか未分枝であ
るかどうか、および特定の結合法のための反応条件などの因子によって決まる。
【００７２】
当業者に利用可能な、いくつかのＰＥＧ結合法がある［例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎら（１
９９０年）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ８：３４３（ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉ
ｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２  ａｔ  ｉｔｓ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｓｉｔｅ  ａ
ｆｔｅｒ  ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）；ＥＰ０４０１３８
４（ｃｏｕｐｌｉｎｇ  ＰＥＧ  ｔｏ  Ｇ−ＣＳＦ）；Ｍａｌｉｋら、（１９９２年）Ｅ
ｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２０：１０２８〜１０３５頁（ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇ
Ｍ−ＣＳＦ  ｕｓｉｎｇ  ｔｒｅｓｙｌ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）；ＰＣＴ公開番号ＷＯ９０
／１２８７４（ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ  ｃｏｎｔ
ａｉｎｉｎｇ  ａ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｌｙ  ｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ  ｃｙｓｔｅｉ
ｎｅ  ｒｅｓｉｄｕｅ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｃｙｓｔｅｉｎｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍＰＥ
Ｇ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）；米国特許第５，７６７，０７８号（ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ
ｏｆ  ＥＰＯ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ）；米国特許第５，６７２，６６２号（Ｐｏｌｙ（ｅ
ｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）ａｎｄ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ｍｏｎｏ
ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｐｒｏｐｉｏｎｉｃ  ｏｒ  ｂｕｔａｎｏｉｃ  ａ
ｃｉｄｓ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ｔｈｅｒｅｏｆ  
ｆｏｒ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）；米国特許第６，０７
７，９３９号（ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  α−ｃａｒ
ｂｏｎ  ｏｆ  ａ  ｐｅｐｔｉｄｅ）；Ｖｅｒｏｎｅｓｅら、（１９８５年）Ａｐｐｌ．
Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｅｃｈｎｏｌ１１：１４１〜１４２頁（ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ  
ｏｆ  ａｎ  Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  α−ｃａｒｂｏｎ  ｏｆ  ａ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｗ
ｉｔｈ  ＰＥＧ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌｃａｒｂｏｎａｔｅ（「ＰＥＧ−ＮＰＣ」）ｏ
ｒ  ＰＥＧ−ｔｒｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌｃａｒｂｏｎａｔｅ）；およびＶｅｒｏｎ
ｅｓｅ（２００１年）Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ２２：４０５〜４１７頁（Ｒｅｖｉｅｗ
ａｒｔｉｃｌｅ  ｏｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＰＥＧｙｌａｔｉ
ｏｎ）］。
【００７３】
例えば、ＰＥＧは、反応性基を介してアミノ酸残基と共有結合によって結合され得る。
反応性基は、活性化されたＰＥＧ分子が結合され得る（例えば、遊離アミノまたはカルボ
キシル基）。例えば、Ｎ末端アミノ酸残基およびリジン（Ｋ）残基は、遊離アミノ基を有
し、Ｃ末端アミノ酸残基は、遊離カルボキシル基を有する。スルフヒドリル基（例えば、
システイン残基上に見られるような）もまた、ＰＥＧを結合するための反応性基として使
用できる。さらに、活性化された基（例えば、ヒドラジド、アルデヒドおよび芳香族アミ
ノ基）を、ポリペプチドのＣ末端に特異的に導入するための酵素を使った方法（enzyme-a
ssisted methods）が記載されている［Ｓｃｈｗａｒｚら（１９９０年）Ｍｅｔｈｏｄｓ
Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８４：１６０頁；Ｒｏｓｅら（１９９１年）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａ
ｔｅ  Ｃｈｅｍ．２：１５４頁；Ｇａｅｒｔｎｅｒら（１９９４年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．２６９：７２２４頁］。
【００７４】
例えば、ＰＥＧ分子は、異なる反応性部分を有するメトキシル化ＰＥＧ（「ｍＰＥＧ」
）を用いてアミノ基と結合させてもよい。このような反応性部分の限定されない例として
、コハク酸スクシンイミジル（ＳＳ）、炭酸スクシンイミジル（ＳＣ）、ｍＰＥＧ−イミ
デート、パラニトロフェニルカルボナート（ＮＰＣ）、プロピオン酸スクシンイミジル（
ＳＰＡ）および塩化シアヌルが挙げられる。このようなｍＰＥＧの限定されない例として
、ｍＰＥＧ−コハク酸スクシンイミジル（ｍＰＥＧ−ＳＳ）、ｍＰＥＧ2−コハク酸スク
シンイミジル（ｍＰＥＧ2−ＳＳ）；ｍＰＥＧ−炭酸スクシンイミジル（ｍＰＥＧ−ＳＣ
）、ｍＰＥＧ2−炭酸スクシンイミジル（ｍＰＥＧ2−ＳＣ）；ｍＰＥＧ−イミデート、ｍ
ＰＥＧ−パラ−ニトロフェニルカルボナート（ｍＰＥＧ−ＮＰＣ）、ｍＰＥＧ−イミデー
ト；ｍＰＥＧ2−パラ−ニトロフェニルカルボナート（ｍＰＥＧ2−ＮＰＣ）；ｍＰＥＧ−
プロピオン酸スクシンイミジル（ｍＰＥＧ−ＳＰＡ）；ｍＰＥＧ2−プロピオン酸スクシ
ンイミジル（ｍＰＥＧ2−ＳＰＡ）；ｍＰＥＧ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ｍＰＥ
Ｇ−ＮＨＳ）；ｍＰＥＧ2−Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド（ｍＰＥＧ2−ＮＨＳ）；ｍ
ＰＥＧ−塩化シアヌル；およびｍＰＥＧ2−塩化シアヌルが挙げられる。
【００７５】
ＰＥＧの結合が、非特異的であり、特異的ＰＥＧ結合を含有するペプチドが望まれる場
合には、ＰＥＧ化化合物の混合物から所望のＰＥＧ化化合物を精製してもよい。例えば、
Ｎ末端がＰＥＧ化されたペプチドが望まれる場合には、ランダムにＰＥＧ化されたペプチ
ドの集団からＮ末端がＰＥＧ化された形を精製してもよい（すなわち、その他のモノＰＥ
Ｇ化部分からのこの部分の分離）。
【００７６】
いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、ペプチドまたはスペーサーに部位特異的に結合さ
れる。成長ホルモン放出因子の強力な類似体におけるＮ末端、側鎖およびＣ末端での部位
特異的ペグ化が、固相合成によって実施されている［Ｆｅｌｉｘら（１９９５年）Ｉｎｔ
．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．４６：２５３頁］。別の部位特異的法
は、Ｎ末端トレオニンの過ヨウ素酸ナトリウム酸化によって生じたＮ末端の反応性アルデ
ヒド基を介した部位特異的な方法での、リポソームの表面にグラフトされたＰＥＧ鎖の末
端とのペプチドの結合に関与する［Ｚａｌｉｐｓｋｙら（１９９５年）Ｂｉｏｃｏｎｊ．
Ｃｈｅｍ．６：７０５頁］。しかし、この方法は、Ｎ末端セリンまたはトレオニン残基を
含むポリペプチドに限定される。
【００７７】
一方法では、選択的Ｎ末端ペグ化は、特定のペプチドまたはリンカー部分における誘導
体化に利用可能な、異なる種類の第一級アミノ基（リジン対Ｎ末端）の反応性の差異を利
用する還元的アルキル化によって達成できる。カルボニル基を含有するＰＥＧは、適当な
反応条件下で、ペプチドまたはリンカーのＮ末端に選択的に結合される。例えば、ペプチ
ドまたはリンカーのリジン残基のεアミノ基と、Ｎ末端残基のαアミノ基の間のｐＫaの
差異を利用するｐＨで反応を実施することによって、選択的にタンパク質をＮ末端ＰＥＧ
化できる。このような選択的結合によって、ペグ化は、主に、タンパク質のＮ末端で起こ
り、その他の反応性基（例えば、リジン側鎖アミノ基）の著しい修飾はない。還元的アル
キル化を用いることで、ＰＥＧは、タンパク質とカップリングするための単一の反応性ア
ルデヒドを有するはずである（例えば、ＰＥＧプロプリオンアルデヒド（proprionaldehy
de）を使用してもよい）。
【００７８】
部位特異的突然変異誘発は、部位特異的ポリマー結合のためのペプチドを調製するため
に使用できるさらなるアプローチである。この方法によって、ペプチドのアミノ酸配列は
、ペプチド内の所望の位置に適当な反応性基を組み込むように設計される。例えば、ＷＯ
９０／１２８７４には、システイン残基の挿入またはその他の残基のシステイン残基との
置換によって修飾されたタンパク質の部位特異的ペグ化が記載されている。この刊行物に
はまた、システイン特異的ｍＰＥＧ誘導体を、ＥＰＯ上の組換えによって導入されたシス
テイン残基と反応させることによるｍＰＥＧ−エリスロポエチン（「ｍＰＥＧ−ＥＰＯ」
）の調製も記載されている。
【００７９】
ＰＥＧ部分が、スペーサー部分またはリンカー部分と結合している場合には、同様の結
合法を使用できる。この場合には、リンカーまたはスペーサーは、反応性基を含み、適当
な相補的な反応性基を含有する活性化されたＰＥＧ分子を用いて共有結合を達成する。好
ましい実施形態では、リンカーまたはスペーサー反応性基は、末端反応性基である（すな
わち、リンカーまたはスペーサーの末端に位置する）。
【００８０】
ペプチド、ペプチド二量体およびその他の本発明のペプチドベースの分子は、水溶性ポ
リマー（複数の水溶性ポリマー）と分子（例えば、ペプチド＋リンカー／スペーサー）の
受容体結合部分を連結するための種々の化学物質のいずれかを用いて水溶性ポリマー（例
えば、ＰＥＧ）と結合させてもよい。典型的な実施形態では、水溶性ポリマー（複数の水
溶性ポリマー）と受容体結合部分の共有結合について単一の結合接点を使用するが、代替
実施形態では、異なる種類の水溶性ポリマーが、別個の結合接点で受容体結合部分に結合
されるさらなる変形をはじめ、複数の結合接点を用いる場合もあり、リンカーおよび／ま
たはペプチド鎖の一方もしくは両方との共有結合接点（複数の共有結合接点）を含み得る
。いくつかの実施形態では、二量体またはより高次の多量体は、別個の種類のペプチド鎖
を含む（すなわち、ヘテロ二量体またはその他のヘテロ多量体）。例として、制限するも
のではないが、二量体が、ＰＥＧ結合接点を有する第１のペプチド鎖を含む場合もあり、
第２のペプチド鎖が、ＰＥＧ結合接点を欠くか、第１のペプチド鎖とは異なる連結化学物
質を利用する場合もあり、いくつかの変法では、リンカーが、ＰＥＧ結合接点を含む、ま
たは欠く場合もあり、前記リンカーが、ＰＥＧ化されている場合には、第１および／また
は第２のペプチド鎖のものとは異なる連結化学物質を利用する場合もある。代替実施形態
は、受容体結合部分のリンカー部分に結合されたＰＥＧと、分子のペプチド部分のアミノ
酸の１つの側鎖にコンジュゲートされた異なる水溶性ポリマー（例えば、炭水化物）を使
用する。
【００８１】
様々なポリエチレングリコール（ＰＥＧ）種を、受容体結合部分（ペプチド＋リンカー
／スペーサー）のペグ化に使用してよい。実質的に、任意の適した反応性ＰＥＧ試薬を使
用できる。好ましい実施形態では、反応性ＰＥＧ試薬は、受容体結合部分とのコンジュゲ
ーションでカルバメートまたはアミド結合の形成をもたらす。適した反応性ＰＥＧ種とし
て、それだけには限らないが、ＮＯＦ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（１５０−６０１９東京
都渋谷区恵比寿４丁目２０−３恵比寿ガーデンプレースタワー）のＤｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ
ｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓカタログ（２００３年）およびＮｅｋｔａｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕ
ｔｉｃｓ（４９０  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｄｒｉｖｅ、Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、Ａｌａｂ
ａｍａ  ３５８０６）のＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇカタログ（２００
３）において販売中であるものが挙げられる。例えば、限定するものではないが、種々の
実施形態において以下のＰＥＧ試薬が好ましいことが多い：ｍＰＥＧ２−ＮＨＳ、ｍＰＥ
Ｇ２−ＡＬＤ、ｍｕｌｔｉ−Ａｒｍ  ＰＥＧ、ｍＰＥＧ（ＭＡＬ）２、ｍＰＥＧ２（ＭＡ
Ｌ）、ｍＰＥＧ−ＮＨ２、ｍＰＥＧ−ＳＰＡ、ｍＰＥＧ−ＳＢＡ、ｍＰＥＧ−ＮＰＣ、ｍ
ＰＥＧ−チオエステル、ｍＰＥＧ−Ｄｏｕｂｌｅ  Ｅｓｔｅｒｓ、ｍＰＥＧ−ＢＴＣ、ｍ
ＰＥＧ−ＢｕｔｙｒＡＬＤ、ｍＰＥＧ−ＡＣＥＴ、ヘテロ官能性ＰＥＧ（ＮＨ２−ＰＥＧ
−ＣＯＯＨ、Ｂｏｃ−ＰＥＧ−ＮＨＳ、Ｆｍｏｃ−ＰＥＧ−ＮＨＳ、ＮＨＳ−ＰＥＧ−Ｖ
Ｓ、ＮＨＳ−ＰＥＧ−ＭＡＬ）、ＰＥＧアクリレート（ＡＣＲＬ−ＰＥＧ−ＮＨＳ）、Ｐ
ＥＧ−リン脂質（例えば、ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ）、ＳＵＮＢＲＩＴＥシリーズのマルチア
ームＰＥＧ、例えば、当業者によって選択された化学物質によって活性化されたグリセリ
ンベースのＰＥＧのＧＬシリーズ、任意のＳＵＮＢＲＩＴＥ活性化ＰＥＧ（例えば、それ
だけには限らないが、カルボキシル−ＰＥＧ、ｐ−ＮＰ−ＰＥＧ、トレシル−ＰＥＧ、ア
ルデヒドＰＥＧ、アセタール−ＰＥＧ、アミノ−ＰＥＧ、チオール−ＰＥＧ、マレイミド
−ＰＥＧ、ヒドロキシル−ＰＥＧ−アミン、アミノ−ＰＥＧ−ＣＯＯＨ、ヒドロキシル−
ＰＥＧ−アルデヒド、無水カルボン酸型ＰＥＧ、官能基を付与されたＰＥＧ−リン脂質お
よびそれらの特定の適用および使用のために当業者によって選択されるその他の同様の、
および／または適した反応性ＰＥＧ。
【００８２】
ペプチド部分
ヒトをはじめとする種々の動物、微生物または植物由来の任意のペプチドならびに遺伝
子操作によって、および合成によって作製したものを、ペプチド部分として使用してよい
。例として、ＥＰＯ−Ｒと結合するペプチド；ＴＰＯ−Ｒと結合するペプチド、種々のイ
ンターフェロン（例えば、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェ
ロン−γ）、インターロイキン−２およびインターロイキン−３などのサイトカイン、イ
ンスリン、成長ホルモン放出因子（ＧＲＦ）、カルシトニン、カルシトニン遺伝子関連ペ
プチド（ＣＧＲＰ）、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、バソプレシン、コルチ
コトロピン放出因子（ＣＲＦ）、血管作用性小腸ペプチド（ＶＩＰ）、セクレチン、α−
メラノサイト刺激ホルモン（α−ＭＳＨ）、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、コレシ
ストキニン（ＣＣＫ）、グルカゴン、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、ソマトスタチン、エ
ンドセリン、サブスタンスＰ、ダイノルフィン、オキシトシンおよび成長ホルモン放出ペ
プチド［ＧＨＲＰ、例えば、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、１１４、１５３７（１９８４
年）］などのホルモン、成長ホルモン（ＧＨ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ−Ｉ、Ｉ
ＧＦ−ＩＩ）、−神経成長因子（β−ＮＧＦ）、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）
、トランスフォーミング増殖因子、エリスロポエチン、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−Ｃ
ＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、血小板由来増殖因子
（ＰＤＧＦ）および上皮成長因子（ＥＧＦ）などの増殖因子、組織プラスミノーゲン活性
化因子（ｔ−ＰＡ）、エラスターゼ、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）ビリルビ
ンオキシダーゼ、カタラーゼ、ウリカーゼおよびアスパラギナーゼなどの酵素、ユビキチ
ン、インスリン分泌活性化タンパク質（ＩＡＰ）、血清胸腺因子（ＳＴＦ）、ペプチド−
Ｔおよびトリプシン阻害剤などのその他のタンパク質ならびにそれらの誘導体が挙げられ
る。
【００８３】
ペプチド部分は、１種または複数のペプチドを含み、各ペプチドの長さは、５０個未満
のアミノ酸であることが好ましく、約１０〜２５個の間のアミノ酸がより好ましく、約１
２〜１８個の間のアミノ酸が最も好ましい。
【００８４】
好ましい一実施形態では、ペプチド部分は、（例えば、Ｗｒｉｇｈｔｏｎらの米国特許
第５，７７３，５６９号；同第５，８３０，８５１号；および同第５，９８６，０４７号
；ＷｒｉｇｈｔｏｎらのＰＣＴ公開番号ＷＯ９６／４０７４９；ＪｏｈｎｓｏｎおよびＺ
ｉｖｉｎの米国特許第５，７６７，０７８号およびＰＣＴ公開番号９６／４０７７２；Ｂ
ａｌｕのＰＣＴ公開番号ＷＯ０１／３８３４２；およびＳｍｉｔｈ−Ｓｗｉｎｔｏｓｋｙ
らのＷＯ０１／９１７８０に開示されるもの）に開示されるものなどのＥＰＯ−Ｒと結合
するペプチドから選択される。本発明においてペプチド部分として使用できるさらにその
他の例示的ＥＰＯ−Ｒ結合性ペプチドは、ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１４８８６（公開番
号ＷＯ２００４／１０１６１１）およびＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１４８８９（公開番号
ＷＯ２００４／１０１６０６）に記載されており、そのすべてはその全文で参照により組
み込まれる。
【００８５】
別の好ましい実施形態では、ペプチド部分は、トロンボポエチン受容体（「ＴＰＯ−Ｒ
」）と結合するペプチドから選択される。このようなＴＰＯ−Ｒ結合性ペプチドの限定さ
れない例として、米国特許第６，８５８，６３０号、同第６，５５２，００８号、同第６
，５０６，３６２号、同第６，４９８，１５５号、同第６，４６５，４３０号、同第６，
３３３，０３１号、同第６，２５１，８６４号、同第６，１２１，２３８号、同第６，０
８３，９１３号、同第５，９３２，５４６号、同第５，８６９，４５１号、同第５，６８
３，９８３号、同第５，６７７，２８０号、同第５，６６８，１１０号および同第５，６
５４，２７６号；ならびに米国特許出願公開第２００３／０００９０１８号、同第２００
２／０１７７１６６号および同第２００２／０１６００１３号に開示されるものが挙げら
れる。
【００８６】
一実施形態では、ペプチド部分は、エリスロポエチン受容体（ＥＰＯ−Ｒ）と結合し、
これを活性化するか、またはそうでなければ、ＥＰＯアゴニストとして作用する、１０〜
４０個またはより多くのアミノ酸残基の長さであり、配列Ｘ3Ｘ4Ｘ5ＧＰＸ6ＴＷＸ7Ｘ8（
配列番号：１）（式中、各アミノ酸は、標準一文字略語によって示され；Ｘ3は、Ｃであ
り；Ｘ4は、Ｒ、Ｈ、ＬまたはＷであり；Ｘ5は、Ｍ、Ｆ、ＹまたはＩであり；Ｘ6は、２
０種の遺伝的にコードされるＬ−アミノ酸のいずれか１種から独立に選択され；Ｘ7は、
Ｄ、Ｅ、Ｉ、ＬまたはＶであり；Ｘ8は、Ｃである）を有する単量体ペプチドである。
【００８７】
別の実施形態では、ペプチド部分は、１７〜約４０個のアミノ酸の長さであり、コアア
ミノ酸配列ＬＹＡＣＨＭＧＰＩＴＸ1ＶＣＱＰＬＲ（配列番号：２）（式中、各アミノ酸
は、標準一文字略語によって示され；Ｘ1は、トリプトファン（Ｗ）、１−ナフチルアラ
ニン（１−Ｎａｌ）または２−ナフチルアラニン（２−Ｎａｌ）である）を含む、単量体
ペプチドである。
【００８８】
さらに別の実施形態では、ペプチド部分は、Ａｃ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−
Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｎａｌ（１）−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｓ
ａｒ（配列番号：３）またはＡｃ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−
Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｓａｒ（配列番号：４）な
どの配列を有する、１種または複数のＴＰＯ−Ｒ結合性ペプチドを含む。
【００８９】
好ましい一実施形態では、ペプチドは、以下から選択される：
【００９０】
【表１】
2014051498.tif 000010
【００９１】
別の実施形態では、ペプチドは、本発明のリンカーと共有結合し、ペプチドは、そのＣ
末端にリジンを有し、リジンのアミノ基がそのアミノ基を介してリンカーに共有結合して
いる。
【００９２】
一実施形態では、ＰＥＧ部分は、リンカー部分と直接結合される。
【００９３】
別の実施形態では、ペプチドＰＥＧ部分は、リンカーを介してスペーサー部分に結合さ
れる。
【００９４】
この発明のいくつかの実施形態によれば、２０種の遺伝的にコードされるＬ−アミノ酸
または立体異性Ｄ−アミノ酸のいずれかから独立に選択される、２個以上、好ましくは、
２〜６個の間のアミノ酸残基が、上記のコア配列のいずれかの末端または両端とカップリ
ングされる。例えば、ペプチドの合成において容易なようにコア配列のいずれかの末端ま
たは両端に配列ＧＧが付加されることが多い。本発明はまた、ＥＰＯ−Ｒ結合の特性を保
持する、これらのペプチドおよび誘導体およびペプチドのペプチドミメティクスのコンジ
ュゲートを提供する。
【００９５】
２０種の従来アミノ酸の立体異性体（例えば、Ｄ−アミノ酸）、ａ，ａ−二置換アミノ
酸、Ｎ−アルキルアミノ酸などの非天然アミノ酸、乳酸およびその他の非従来アミノ酸も
、本発明の化合物にとって適した成分であり得る。非従来アミノ酸の例として、それだけ
には限らないが、β−アラニン、３−ピリジルアラニン、４−ヒドロキシプロリン、０−
ホスホセリン、Ｎ−メチルグリシン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３
−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリシン、ノル−ロイシン、１−または２−ナフチル
アラリン（naphthylalaline）、サルコシンおよびその他の同様のアミノ酸およびイミノ
酸が挙げられる。
【００９６】
好ましい実施形態では、本発明のペプチド部分は、コア配列の２個のシステイン残基の
間に分子内ジスルフィド結合を含む。例えば：
【００９７】
【化９】
2014051498.tif 000011
【００９８】
二量体およびオリゴマーペプチド
好ましい実施形態、本発明の単量体ペプチド部分は、二量体化またはオリゴマー化され
て、二量体またはオリゴマーを形成する。さらに、このような二量体およびその他のマル
チマーはヘテロ二量体またはヘテロマルチマーであってもよい。
【００９９】
一実施形態では、本発明のペプチド単量体は、ビオチン／ストレプトアビジン系を用い
てオリゴマー化できる。ペプチド単量体のビオチン化類似体は、標準技術によって合成で
きる。例えば、ペプチド単量体は、Ｃ末端でビオチン化できる。次いで、ストレプトアビ
ジンと共にインキュベーションすることによって、これらのビオチン化単量体をオリゴマ
ー化する［例えば、４：１モル比、室温で、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）またはＨＥ
ＰＥＳ緩衝ＲＰＭＩ培地（Invitrogen）中、１時間］。この実施形態の変法では、いくつ
かの市販の抗ビオチン抗体の任意の１種［例えば、Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ  ＆  Ｐｅｒｒ
ｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ）製のヤギ抗ビ
オチンＩｇＧ］ととものインキュベーションによって、ビオチン化ペプチド単量体をオリ
ゴマー化できる。
【０１００】
概して、必ずしもそうではないが、分子間ジスルフィド結合の形成以外の技術によって
二量体化されたペプチド二量体はまた、ペプチド単量体のシステイン残基間に１つまたは
複数のジスルフィド結合を含む。例えば、２つの単量体を、１つまたは複数の分子間ジス
ルフィド結合によって架橋していてもよい。好ましくは、２つの単量体は、少なくとも１
つの分子内ジスルフィド結合を含む。ペプチド二量体の両単量体が、各単量体が環状基を
含むよう分子内ジスルフィド結合を含むことが最も好ましい。
【０１０１】
ペプチド修飾
本発明のペプチド化合物のアミノおよび／またはカルボキシ末端を修飾して、本発明の
その他の化合物を作製することもできる。アミノ末端修飾として、メチル化（すなわち、
−ＮＨＣＨ3または−Ｎ（ＣＨ3）2）、アセチル化（例えば、酢酸またはα−クロロ酢酸
、α−ブロモ酢酸またはα−ヨード酢酸などのそのハロゲン化誘導体）、ベンジルオキシ
カルボニル（Ｃｂｚ）基を付加することまたはＲＣＯＯ−によって規定されるカルボキシ
レート官能基またはＲ−ＳＯ2−（式中、Ｒは、アルキル、アリール、ヘテロアリール、
アルキルアリールなど、および同様の基からなる群から選択される）によって規定される
スルホニル官能基を含有する任意のブロッキング基でのアミノ末端のブロッキングが挙げ
られる。また、Ｎ末端にデスアミノ酸を組み込み（その結果、Ｎ末端アミノ基がない）、
プロテアーゼに対する感受性を低減し、またはペプチド化合物のコンホメーションを制限
することができる。好ましい実施形態では、Ｎ末端がアセチル化される。最も好ましい実
施形態では、Ｎ末端グリシンがアセチル化されて、Ｎ−アセチルグリシン（ＡｃＧ）が生
じる。
【０１０２】
カルボキシ末端修飾として、遊離酸をカルボキサミド基で置換することまたはカルボキ
シ末端で環状ラクタムを形成して構造制限を導入することが挙げられる。また、本発明の
ペプチドを、末端アミノまたはカルボキシル基がなくなるように、環化するか、またはペ
プチドの末端にデスアミノもしくはデスカルボキシ残基を組み込み、プロテアーゼに対す
る感受性を低減するか、またはペプチドのコンホメーションを制限することができる。本
発明の化合物のＣ末端官能基として、アミド、アミド低級アルキル、アミドジ（低級アル
キル）、低級アルコキシ、ヒドロキシおよびカルボキシならびにそれらの低級エステル誘
導体およびそれらの製薬上許容される塩が挙げられる。
【０１０３】
２０種の遺伝的にコードされるアミノ酸（または立体異性Ｄアミノ酸）の天然に存在す
る側鎖を、例えば、アルキル、低級アルキル、環状４員、５員、６員〜７員のアルキル、
アミド、アミド低級アルキル、アミドジ（低級アルキル）、低級アルコキシ、ヒドロキシ
、カルボキシならびにそれらの低級エステル誘導体などの基で、ならびに４員、５員、６
員〜７員の複素環式で置換してもよい。特に、プロリン残基の環の大きさが、５員から４
員、６員または７員に変化しているプロリン類似体を用いることができる。環状基は、飽
和であっても、不飽和であってもよく、不飽和である場合には、芳香族であっても、非芳
香族であってもよい。複素環式基は、１個または複数の窒素、酸素および／または硫黄へ
テロ原子を含むことが好ましい。このような基の例として、フラザニル、フリル、イミダ
ゾリジニル、イミダゾリル、イミダゾリニル、イソチアゾリル、イソキサゾリル、モルホ
リニル（例えば、モルホリノ）、オキサゾリル、ピペラジニル（例えば、１−ピペラジニ
ル）、ピペリジル（例えば、１−ピペリジル、ピペリジノ）、ピラニル、ピラジニル、ピ
ラゾリジニル、ピラゾリニル、ピラゾリル、ピリダジニル、ピリジル、ピリミジニル、ピ
ロリジニル（例えば、１−ピロリジニル）、ピロリニル、ピロリル、チアジアゾリル、チ
アゾリル、チエニル、チオモルホリニル（例えば、チオモルホリノ）およびトリアゾリル
が挙げられる。これらの複素環式基は、置換されていても、非置換であってもよい。基が
置換されている場合には、置換基は、アルキル、アルコキシ、ハロゲン、酸素または置換
もしくは非置換フェニルであり得る。
【０１０４】
また、リン酸化およびその他の方法［例えば、Ｈｒｕｂｙら（１９９０年）Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ  Ｊ．２６８：２４９〜２６２頁に記載されている］によってペプチド部分を容易に
修飾できる。
【０１０５】
本発明のペプチド部分はまた、同様の生物活性を有する非ペプチド化合物の構造モデル
として役立ち得る。当業者は、リードペプチド化合物として、同一または同様の所望の生
物活性を有するが、可溶性、安定性ならびに加水分解およびタンパク質分解に対する感受
性に関してリードよりも好都合な活性を有する化合物を構築するために種々の技術が利用
可能であるということは認識している［ＭｏｒｇａｎおよびＧａｉｎｏｒ（１９８９年）
Ａｎｎ．Ｒｅｐ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２４：２４３〜２５２頁を参照のこと］。これらの
技術として、ペプチド主鎖を、ホスホネート、アミデート、カルバメート、スルホンアミ
ド、第二級アミンおよびＮ−メチルアミノ酸から構成される主鎖で置換することが挙げら
れる。
【０１０６】
薬剤組成物
本発明の別の態様では、上記のＰＥＧ修飾ペプチドベースの化合物の薬剤組成物が提供
される。このような組成物の投与によって軽減されるか、または調節される状態として、
上記で示されるものが挙げられる。このような薬剤組成物は、経口、非経口（筋肉内の、
腹腔内、静脈内（ＩＶ）または皮下注射）、経皮（受動的に、またはイオン導入法もしく
はエレクトロポレーションを用いてのいずれかで）、経粘膜（鼻腔の、経膣、直腸または
舌下）経路の投与による投与または生体内分解性挿入物を用いる投与のためのものであり
得、各経路の投与に適当な剤形で製剤できる。概して、有効量の治療用ペプチド（例えば
、ＥＰＯ−Ｒと結合するペプチド）を、製薬上許容される希釈剤、保存料、可溶化剤、乳
化剤、アジュバントおよび／または担体とともに含む薬剤組成物が、本発明によって包含
される。このような組成物として、種々のバッファー内容物（例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
、酢酸塩、リン酸塩）、ｐＨおよびイオン強度の希釈剤；界面活性剤および可溶化剤など
の添加剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ８０、ポリソルベート８０）、抗酸化剤（例えば、アスコ
ルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム）、保存料（例えば、チメルソール（Thimersol）、
ベンジルアルコール）および増量物質（例えば、ラクトース、マンニトール）；材料を、
ポリ乳酸、ポリグリコール酸等といったポリマー化合物の微粒子調製物中に、またはリポ
ソームに組み込んだものが挙げられる。ヒラウロン酸（Hylauronic acid）もまた使用し
てよい。このような組成物は、本タンパク質および誘導体の物理的状態、安定性、ｉｎ  
ｖｉｖｏ放出速度およびｉｎ  ｖｉｖｏクリアランス速度に影響を及ぼし得る。例えば、
参照によって本明細書に組み込まれる、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ
ｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版（１９９０年、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ
Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ  １８０４２）１４３５〜１７１２頁を参照のこと。本組
成物は、液体の形で調製してもよいし、乾燥粉末（例えば、凍結乾燥した）形であっても
よい。
【０１０７】
経口デリバリー（Delivery、送達）
本明細書において使用するために考慮されるものとして、参照により本明細書に組み込
まれるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第
１８版、１９９０年（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．Ｅａｓｔｏｎ  ＰＡ  １
８０４２）中、第８９章に大まかに記載される経口固体剤形がある。固体剤形は、錠剤、
カプセル剤、丸剤、トローチ剤またはロゼンジ剤、カシェ剤、ペレット剤、散剤または顆
粒剤を含む。また、リポソームまたはプロテイノイド封入を用いて本組成物を製剤しても
よい（例えば、米国特許第４，９２５，６７３号において報告されるプロテイノイドミク
ロスフェアのように）。リポソーム封入を用いてもよく、リポソームを種々のポリマーで
誘導体化してもよい（例えば、米国特許第５，０１３，５５６号）。治療薬にとって、あ
り得る固体剤形の記載は、参照によって本明細書に組み込まれる、Ｍｏｄｅｒｎ  Ｐｈａ
ｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ  Ｇ．Ｓ．ＢａｎｋｅｒおよびＣ．Ｔ．Ｒｈｏｄｅｓ編、第１０章
、１９７９年中、Ｍａｒｓｈａｌｌ，Ｋ．によって行われている。通常、製剤は、ＥＰＯ
−Ｒアゴニストペプチド（またはその化学修飾された形）および胃環境に対する保護を可
能にする不活性成分を含み、生物学的に活性な材料を腸内で放出する。
【０１０８】
本明細書において使用するために考慮されるものとして、経口投与のための液体剤形、
例えば、製薬上許容される乳濁液、溶液、懸濁液およびシロップがあり、これらは不活性
希釈剤；湿潤剤などのアジュバント、乳化剤および懸濁剤ならびに甘味料、矯味剤および
芳香剤をはじめとするその他の成分を含み得る。
【０１０９】
ペプチドは、誘導体の経口デリバリーが効果的であるように化学修飾され得る。概して
、考慮される化学修飾として、成分分子自体との少なくとも１つの部分の結合があり、こ
こで、前記部分によって、（ａ）タンパク質分解の阻害；（ｂ）胃または腸から血流への
取り込みが可能になる。また、成分または複数の成分の全体的な安定性の増大および身体
における循環時間の増大も望まれる。上記で論じたように、ペグ化は、薬剤使用にとって
好ましい化学修飾である。使用できるその他の部分として、以下が挙げられる：プロピレ
ングリコール、エチレングリコールおよびプロピレングリコールの共重合体、カルボキシ
メチルセルロース、デキストラン、脂肪酸（例えば、ミリスチン酸）、ペプチド［Ｄｅｎ
ｎｉｓ，Ｍ．Ｓ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００２年、２７７、３５０３５頁参照
のこと］、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリプロリン、ポリ−１，３
−ジオキソランおよびポリ−１，３，６−チオキソカン［例えば、Ｅｎｚｙｍｅｓ  ａｓ
Ｄｒｕｇｓ．ＨｏｃｅｎｂｅｒｇおよびＲｏｂｅｒｔｓ編（Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓ
ｃｉｅｎｃｅ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ）３６７〜３８３頁中、Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉお
よびＤａｖｉｓ（１９８１年）「Ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒ−Ｅｎｚｙｍｅ  Ａｄ
ｄｕｃｔｓ」；およびＮｅｗｍａｒｋら（１９８２年）Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．
４：１８５〜１８９頁参照のこと］。
【０１１０】
経口製剤については、放出の位置は、胃、小腸（十二指腸、空腸もしくは回腸）または
大腸であり得る。当業者は、胃で溶解しないが、十二指腸または腸中のどこかで材料を放
出する利用可能な製剤を有する。放出は、ペプチド（または誘導体）の保護によって、ま
たは、腸中などの胃環境を過ぎてのペプチド（または誘導体）の放出のいずれかによって
、胃環境の有害な効果を避けることが好ましい。
【０１１１】
完全な胃での耐性を確実にするためには、少なくともｐＨ５．０に対して不浸透性のコ
ーティングが不可欠である。腸溶コーティングとして使用される、より一般的な不活性成
分例として、トリメリット酸酢酸セルロース（ＣＡＴ）、ヒドロキシプロピルメチルセル
ロースフタレート（ＨＰＭＣＰ）、ＨＰＭＣＰ５０、ＨＰＭＣＰ５５、ポリビニルアセテ
ートフタレート（ＰＶＡＰ）、Ｅｕｄｒａｇｉｔ  Ｌ３０Ｄ、Ａｑｕａｔｅｒｉｃ、酢酸
フタル酸セルロース（ＣＡＰ）、Ｅｕｄｒａｇｉｔ  Ｌ、Ｅｕｄｒａｇｉｔ  Ｓおよびセ
ラックがある。これらのコーティングは、混合フィルムとして用いてもよい。
【０１１２】
胃に対する保護のために意図されるものではない、コーティングまたはコーティングの
混合物もまた、錠剤上に用いてもよい。これとして、糖コーティングまたは錠剤を飲み込
みやすくするコーティングが挙げられる。カプセル剤は、乾燥治療薬（すなわち、粉末）
のデリバリーのためには、ハードシェル（ゼラチンなど）からなる場合もあり、液体形の
ためには、ソフトゼラチンシェルを用いてもよい。カシェ剤（cachets）のシェル材料は
厚いデンプンまたはその他の食用紙であり得る。丸剤、ロゼンジ剤、成形錠剤または錠剤
トリチュレートのために、湿潤集結技術を用いることができる。
【０１１３】
ペプチド（または誘導体）は、粒径約１ｍｍの顆粒またはペレットの形で微細な多粒子
物として製剤中に含まれ得る。カプセル剤投与のための材料の製剤は、粉末、軽く圧縮さ
れたプラグとして、またはさらに錠剤としてであってもよい。これらの治療薬は圧縮によ
って調製できる。
【０１１４】
着色剤および／または矯味剤も含めることができる。例えば、ペプチド（または誘導体
）を、製剤し（リポソームまたはミクロスフェア封入などによって）、次いで、着色剤お
よび矯味剤を含有する冷蔵飲料などの食用製品内にさらに含めてもよい。
【０１１５】
ペプチド（または誘導体）の容積を、不活性材料で希釈または増量してもよい。これら
の希釈剤として、炭水化物、特に、マンニトール、α−ラクトース、無水ラクトース、セ
ルロース、スクロース、修飾デキストランおよびデンプンを挙げることができる。三リン
酸カルシウム、炭酸マグネシウムおよび塩化ナトリウムをはじめとする特定の無機塩も、
増量剤として使用できる。いくつかの市販の希釈剤として、Ｆａｓｔ−Ｆｌｏ、Ｅｍｄｅ
ｘ、ＳＴＡ−Ｒｘ  １５００、ＥｍｃｏｍｐｒｅｓｓおよびＡｖｉｃｅｌｌがある。
【０１１６】
崩壊剤（disintegrants）を、固体剤形への治療薬の製剤において含めることができる
。崩壊剤として使用される材料として、それだけには限らないが、デンプン、例えば、デ
ンプンをベースとする市販の崩壊剤、Ｅｘｐｌｏｔａｂが挙げられる。グリコール酸ナト
リウムデンプン、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ウルト
ラミロペクチン（ultramylopectin）、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、オレンジピー
ル、酸性カルボキシメチルセルロース、天然のスポンジおよびベントナイトもすべて使用
してよい。崩壊剤はまた、不溶性陽イオン交換樹脂であってもよい。粉末ゴムを、崩壊剤
として、また結合剤として用いてもよく、寒天、Ｋａｒａｙａまたはトラガカントなどの
粉末ゴムを挙げることができる。アルギン酸およびそのナトリウム塩も、崩壊剤として有
用である。
【０１１７】
結合剤（binders）を用いて、ペプチド（または誘導体）物質をまとめ、硬い錠剤を形
成することができ、これとして、天然物由来の材料、例えば、アラビアガム、トラガカン
ト、デンプンおよびゼラチンが挙げられる。その他のものとして、メチルセルロース（Ｍ
Ｃ）、エチルセルロース（ＥＣ）およびカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）が挙げら
れる。ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）およびヒドロキシプロピルメチルセルロース（Ｈ
ＰＭＣ）は両方とも、アルコール性溶液中で使用して、ペプチド（または誘導体）を造粒
することができる。
【０１１８】
抗摩擦剤（antifrictional agent）を、ペプチド（または誘導体）の製剤に含め、製剤
過程の間に固着するのを防ぐことができる。滑沢剤（lubricants）を、ペプチド（または
誘導体）と金型壁（die wall）の間の層として用いることができ、これらとして、それだ
けには限らないが、ステアリン酸、例えば、そのマグネシウムおよびカルシウム塩、ポリ
テトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、流動パラフィン、植物油およびワックスが挙げら
れる。ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウム、種々の分子量のポリエチレ
ングリコール、Ｃａｒｂｏｗａｘ  ４０００および６０００などの可溶性滑沢剤も使用し
てよい。
【０１１９】
製剤の間に薬剤の流動特性を改善し得る流動促進剤（Glidant）を、圧縮の間の転位を
補助するために加えてもよい。流動促進剤として、デンプン、タルク、発熱性シリカおよ
び水和されたケイアルミン酸を挙げることができる。
【０１２０】
ペプチド（または誘導体）の、水性環境中への溶解を補助するために、界面活性剤（su
rfactant）を、湿潤剤（wetting agent）として加えてもよい。界面活性剤として、ラウ
リル硫酸ナトリウム、スルホコハク酸ジオクチルナトリウムおよびスルホン酸ジオクチル
ナトリウムなどのアニオン性界面活性剤を挙げることができる。カチオン性界面活性剤を
使用してもよく、これとして、塩化ベンザルコニウムまたはベンゾエトミウムクロリド（
benzethomium chloride）を挙げることができる。界面活性剤として製剤中に含めること
ができる可能性ある非イオン性界面活性剤の一覧として、ラウロマクロゴール４００、ス
テアリン酸ポリオキシル４０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油１０、５０および６０、
モノステアリン酸グリセロール、ポリソルベート４０、６０、６５および８０、スクロー
ス脂肪酸エステル、メチルセルロースおよびカルボキシメチルセルロースがある。これら
の界面活性剤は、タンパク質または誘導体の製剤中に、単独または種々の比で混合物とし
てのいずれかで存在し得る。
【０１２１】
ペプチド（または誘導体）の取り込みを増強する可能性がある添加剤として、例えば、
脂肪酸オレイン酸、リノール酸およびリノレン酸がある。
【０１２２】
制御放出経口製剤が望ましいものであり得る。ペプチド（または誘導体）を、拡散また
は浸出機構のいずれかによる放出を可能にする不活性マトリックス、例えば、ゴム中に組
み込むことができる。遅変性マトリックスを、製剤中に組み込んでもよい。いくつかの腸
溶コーティングもまた、遅延放出効果を有する。別の形の制御放出として、Ｏｒｏｓ治療
システム（Ａｌｚａ  Ｃｏｒｐ．）に基づく方法によるものがあり、すなわち、薬物が、
単一の小さな開口部を通って、水が入り、薬物を浸透作用によって押し出すことを可能に
する半透膜に包まれている。
【０１２３】
その他のコーティングを、製剤に用いてもよい。これらとして、コーティングパン（co
ating pan）中に適用できる種々の糖類が挙げられる。ペプチド（または誘導体）はまた
、フィルムで被覆された錠剤で提供することもでき、この場合に用いられる材料は、２群
に分けられる。第１のものは、非腸溶材料であり、これとして、メチルセルロース、エチ
ルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、メチルヒドロキシ−エチルセルロース、ヒ
ドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピル−メチルセルロース、ナトリウムカル
ボキシ−メチルセルロース、プロビドン（providone）およびポリエチレングリコールが
挙げられる。第２の群は、腸溶材料からなり、これは、一般に、フタル酸のエステルであ
る。
【０１２４】
材料の混合物を用いて、最適フィルムコーティングを提供してもよい。フィルムコーテ
ィングは、パンコーティング機（pan coater）中または流動床（fluidized bed）中また
は圧縮コーティングによって実施できる。
【０１２５】
非経口デリバリー
非経口投与のための本発明に従う調製物は、滅菌水性または非水性溶液、懸濁液または
乳濁液を含む。非水性溶媒またはビヒクルの例として、プロピレングリコール、ポリエチ
レングリコール、オリーブオイルおよびコーンオイルなどの植物油、ゼラチンおよびオレ
イン酸エチルなどの注射用有機エステルがある。このような剤形はまた、保存料、湿潤剤
、乳化剤および分散剤などのアジュバントを含み得る。それらは、例えば、細菌保持フィ
ルターを通す濾過によって、組成物中に滅菌剤を組み込むことによって、組成物を照射す
ることによって、または組成物を加熱することによって滅菌してもよい。それらはまた、
滅菌水またはいくつかのその他の滅菌注射用媒体を用いて、使用の直前に製造してもよい
。
【０１２６】
直腸または膣デリバリー
直腸投与または膣投与のための組成物は、坐剤であることが好ましく、これは活性物質
に加え、ココアバターまたは坐剤ワックスなどの賦形剤を含み得る。鼻腔のまたは舌下投
与のための組成物はまた、当技術分野でよく知られる標準賦形剤を用いて調製される。
【０１２７】
肺デリバリー
本明細書において、ＥＰＯ−Ｒアゴニストペプチド（またはその誘導体）の肺デリバリ
ーも考慮される。ペプチド（または誘導体）は、吸入の間に哺乳類の肺にデリバリーされ
、肺上皮層を越えて血流に入る［例えば、Ａｄｊｅｉら（１９９０年）Ｐｈａｒｍａｃｅ
ｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ７：５６５〜５６９頁；Ａｄｊｅｉら（１９９０年）Ｉ
ｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ６３：１３５〜１４４頁（酢酸ロイプロリド）；
Ｂｒａｑｕｅｔら（１９８９年）Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏ
ｌｏｇｙ１３（付録５）：１４３〜１４６頁（エンドセリン−１）；Ｈｕｂｂａｒｄら（
１９８９年）Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、第ＩＩＩ巻２
０６〜２１２頁（α１−アンチトリプシン）；Ｓｍｉｔｈら（１９８９年）Ｊ．Ｃｌｉｎ
．Ｉｎｖｅｓｔ．８４：１１４５〜１１４６頁（α−１−プロテイナーゼ）；Ｏｓｗｅｉ
ｎら（１９９０年）「Ａｅｒｏｓｏｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、Ｐｒ
ｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  ｏｎ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｄｒ
ｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ＩＩ  Ｋｅｙｓｔｏｎｅ、Ｃｏｌｏｒａｄｏ（組換えヒト成長
ホルモン）；Ｄｅｂｓら（１９８８年）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４０：３４８２〜３４８
８頁（インターフェロン−γおよび腫瘍壊死因子α）；およびＰｌａｔｚらの米国特許第
５，２８４，６５６号（顆粒球コロニー刺激因子）参照のこと。全身作用のための薬物の
肺デリバリーのための方法および組成物は、Ｗｏｎｇらの米国特許第５，４５１，５６９
号に記載されている。
【０１２８】
本発明の実施において使用するために考慮されるものとして、治療用製品の肺デリバリ
ーのために設計された様々な機械装置、例えば、それだけには限らないが、噴霧器（nebu
lizers）、定量吸入器（metered dose inhalers）および粉末吸入器（powder inhalers）
があり、そのすべてが当業者にはよく知られている。本発明の実施に適している市販の装
置のいくつかの具体的な例として、Ｕｌｔｒａｖｅｎｔ噴霧器（Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄ
ｔ  Ｉｎｃ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）；Ａｃｏｒｎ  ＩＩ噴霧器（Ｍａｒｑｕｅｓｔ
Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｅｎｇｌｅｗｏｏｄ、ＣＯ）；Ｖｅｎｔｏｌｉｎ
定量吸入器（Ｇｌａｘｏ  Ｉｎｃ．、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｔｒｉａｎｇｌｅ  Ｐａｒｋ、
ＮＣ）；およびＳｐｉｎｈａｌｅｒ粉末吸入器（Ｆｉｓｏｎｓ  Ｃｏｒｐ．、Ｂｅｄｆｏ
ｒｄ、ＭＡ）がある。
【０１２９】
すべてのこのような装置には、ペプチド（または誘導体）の分散に適した製剤の使用が
必要である。通常、各製剤は、用いられる装置の種類に特異的であり、治療において有用
な、通常の希釈剤、アジュバントおよび／または担体に加え、適当な噴射剤材料の使用を
含み得る。また、リポソーム、マイクロカプセル剤またはミクロスフェア、封入複合体ま
たはその他の種類の担体の使用も考慮される。化学修飾されたペプチドもまた、化学修飾
の種類または使用される装置の種類に応じて種々の製剤で調製できる。
【０１３０】
ジェットまたは超音波いずれかの噴霧器（nebulizer）を用いて使用するのに適した製
剤は、通常、溶液１ｍＬあたり約０．１〜２５ｍｇの生物活性タンパク質の濃度で水に溶
解されたペプチド（または誘導体）を含む。製剤はまた、バッファーおよび単糖を含み得
る（例えば、タンパク質安定化および浸透圧の調節のために）。噴霧器製剤はまた、エア
ゾールを形成する際の溶液の噴霧によって引き起こされるペプチド（または誘導体）の表
面誘起凝集（surface induced aggregation）を低減または防止するために界面活性剤を
含み得る。
【０１３１】
定量吸入器装置を用いて使用するための製剤は、通常、界面活性剤を用いて噴射剤（pr
opellant）に懸濁した、ペプチド（または誘導体）を含有する微粉を含む。噴射剤は、こ
の目的のために使用される任意の従来材料、例えば、クロロフルオロカーボン、ヒドロク
ロロフルオロカーボン、ヒドロフルオロカーボンまたはトリクロロフルオロメタン、ジク
ロロジフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタノールおよび１，１，１，２−テト
ラフルオロエタンまたはそれらの組合せを含めた炭化水素であり得る。適した界面活性剤
として、トリオレイン酸ソルビタンおよびダイズレシチンが挙げられる。オレイン酸はま
た、界面活性剤としても有用である。
【０１３２】
粉末吸入器装置から分散されるための製剤は、ペプチド（または誘導体）を含有する微
粉化乾燥粉末を含み、これとして、増量剤、例えば、粉末の装置からの分散を促進する量
、例えば、製剤の５０〜９０重量％のラクトース、ソルビトール、スクロースまたはマン
ニトールを挙げることができる。ペプチド（または誘導体）は、遠位肺への最も効果的な
デリバリーのためには、１０ｍｍ（またはミクロン）未満、最も好ましくは、０．５〜５
ｍｍの平均粒径を有する微粒子の形で調製されることが最も有利であるはずである。
【０１３３】
鼻腔デリバリー
ＥＰＯ−Ｒアゴニストペプチド（または誘導体）の鼻腔デリバリーもまた考慮される。
鼻腔デリバリーによって、鼻に治療製剤を投与した後に、ペプチドが血流へ直接通過する
ことが可能となり、肺に製剤が沈着する必要がない。鼻腔デリバリーのための製剤として
、デキストランまたはシクロデキストランを含むものが挙げられる。
【０１３４】
鼻腔デリバリーを促進するために用いられるその他の浸透促進剤も、本発明のペプチド
とともに使用するために考慮される（参照によりその全文が本明細書に組み込まれる、２
００３年１２月１７日出願された、国際特許公報番号ＷＯ２００４０５６３１４に記載さ
れるものなど）。
【０１３５】
投与量
すべてのペプチド化合物について、さらなる研究が実施されるので、種々の患者におけ
る種々の状態の治療にとって適当な投与量レベルに関する情報が現れ、当業者は、治療状
況、年齢およびレシピエントの全体的な健康を考慮し、適正な投与を確定することができ
るであろう。選択される投与量は、所望の治療効果、投与経路および所望の治療期間に応
じて変わる。通常、１日に、０．００１〜１０ｍｇ／体重１ｋｇの間の投与量レベルが哺
乳類に投与される。通常、静脈注射または注入には、投与量はより低いものであり得る。
投与スケジュールは、循環半減期および用いられる製剤に応じて変わり得る。
【０１３６】
本発明のペプチド（またはその誘導体）は、１種または複数のさらなる有効成分または
薬剤組成物とともに投与してよい。
【実施例】
【０１３７】
以下の実施例は、本発明を例示するが、制限するものではない。
【０１３８】
［実施例１］
三官能性リンカーの一般的合成
以下の構造を有する分枝三官能性分子：
【０１３９】
【化１０】
2014051498.tif 000012
［式中、
【０１４０】
【化１１】
2014051498.tif 000013
は、以下の反応スキームに従って合成した：
【０１４１】
【化１２】
2014051498.tif 000014
【０１４２】
ジシクロヘキシル−カルボジイミド（ＤＣＣ）などのカルボジイミド試薬を用いて、Ｂ
ｏｃ−β−アラニン（Ｂｏｃ＝ｔ−ブトキシカルボニル）などのＮ末端が保護されたアミ
ノ酸を、ジエチルイミノジアセテートなどのイミノジエステルとカップリングする。抽出
物を後処理し、単離した後、エステル基をけん化して所望の三官能性リンカーを作製する
。アセトニトリル（ＡＣＮ）中、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）およびジシク
ロヘキシル−カルボジイミドで処理することによって、酸性基をＮＨＳエステルとして活
性化する。沈殿した尿素を濾過し、抽出物を後処理すると、ＮＨＳ活性化リンカーが得ら
れる。ジクロロメタン／ヘキサンからトリチュレートする（trituration）と、リンカー
が白色固体として得られ、これは、−２０℃で数カ月間安定であるとわかった。
【０１４３】
リンカーの、限定されない、詳細な合成については、実施例２および２２参照のこと。
【０１４４】
［実施例２］
三官能性リンカーの合成
以下の構造を有する第１の三官能性分子
【０１４５】
【化１３】
2014051498.tif 000015
を以下に従って作製した：
（ステップＩ）
【０１４６】
【化１４】
2014051498.tif 000016
０℃で、２００ｍＬのＤＣＭ中、Ｂｏｃ−β−Ａｌａ−ＯＨ（１０．０ｇ、５２．８ｍ
ｍｏｌ）およびジエチルイミノジアセテート（１０．０ｇ、５２．８ｍｍｏｌ）の溶液に
、ＤＣＣ（１０．５ｇ、５０．９ｍｍｏｌ）を５分かけて加えた。白色の沈殿が２分以内
に形成された。反応混合物を室温に加温させ、２４時間攪拌した。尿素を、焼結フィルタ
ー（中程度の空隙率）を用いて濾去し、溶媒を減圧下で除去した。残渣を５００ｍＬのＥ
ｔＯＡｃ（ＥｔＯＡｃ＝酢酸エチル）に溶かし、上記のように濾過し、分液漏斗に移した
。有機相を洗浄し（飽和ＮａＨＣＯ3、ブライン、１Ｎ  ＨＣｌ、ブライン）、乾燥させ
（ＭｇＳＯ4）、濾過し、乾燥させると、無色のオイルが得られた。このオイルを固体化
させると、１０分以内に白色の結晶固体が得られた。
【０１４７】
（ステップＩＩ）
【０１４８】
【化１５】
2014051498.tif 000017
粗ジエステルを、７５ｍｌのＴＨＦ（ＴＨＦ＝テトラヒドロフラン）および７５ｍＬの
ＭｅＯＨ（ＭｅＯＨ＝メタノール）に溶かし、５０ｍＬの水を加えた。この溶液に、２５
ｍＬの水中、ＫＯＨ（ＫＯＨ＝水酸化カリウム）（８．６ｇ、１５３ｍｍｏｌ）の溶液を
加えた。反応混合物の色が淡黄色に変わった。１２時間攪拌した後（ｐＨは依然として約
１２であった）、有機溶媒をロータリーエバポレーターで除去し、得られたスラリーを、
Ｅｔ2Ｏ（Ｅｔ2Ｏ＝ジエチルエーテル）および飽和ＮａＨＣＯ3の間に分配した。合わせ
た水相をｐＨ１に酸性化し、ＮａＣｌで飽和し、ＥｔＯＡｃで抽出した。ＥｔＯＡｃ相を
洗浄し（ブライン）、乾燥させ（ＭｇＳＯ4）、濃縮すると、１３．９７ｇの生成物が白
色固体として得られた（２段階について９０．２％）。
【０１４９】
注記：ＤＣＣ反応をＡＣＮ中で実施した場合には、収率は７３％に低下した。ジイソプ
ロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）を用いる場合には、クロマトグラフィーなしでは目的生
成物から尿素副生成物を除去することができなかった；ＤＣＣ尿素は、クロマトグラフィ
ーなしで定量的に除去できた。反応はまた、水溶性カルボジイミドを用いても良好に進行
した。
【０１５０】
（ステップＩＩＩ）
【０１５１】
【化１６】
2014051498.tif 000018
５０ｍＬのＡＣＮ中、二酸（１．００ｇ、３．２９ｍｍｏｌ）およびヒドロキシスクシ
ンイミド（０．９４５ｇ、８．２１ｍｍｏｌ）の溶液に、ＤＣＣ（１．３６ｇ、６．５９
ｍｍｏｌ）を５分かけて加えた。白色沈殿が直ちに形成された。反応混合物を２２時間攪
拌し、ＤＣＣ尿素を濾過して除去した。溶媒を減圧下で除去し、残渣をＥｔＯＡｃ（２５
０ｍＬ）に溶かし、分液漏斗に移した。有機相を洗浄し（飽和ＮａＨＣＯ3、ブライン、
１Ｎ  ＨＣｌ、ブライン）、乾燥させ（ＭｇＳＯ4）、濃縮すると、白色固体が得られた
。この固体を７５ｍＬのＡＣＮに溶かし、濾過し、濃縮すると、１．２８ｇの生成物が白
色固体として得られた（収率７８．２％）。
【０１５２】
注記：収率は、ＴＨＦ中で３１％に、ＤＮＦ中で６８％に（ＤＣＣの代わりにＤＩＣを
用いた）、ＤＣＭ／ＤＭＦ中で５７％に低下した。出発二酸は、ＡＣＮに可溶性であるの
で、ＤＣＣが加えられる前に溶解していなかった材料がある場合には、それを濾去し、廃
棄してもよい。
【０１５３】
［実施例３］
三官能性アミンリンカーを用いるＣ末端二量体化とそれに続くＰＥＧ化
【０１５４】
【化１７】
2014051498.tif 000019
ペプチド合成：
単量体ペプチド（配列番号：５を用いて）を、標準Ｆｍｏｃ−アミノ酸（ＴＦＡ−不安
定側鎖保護基）およびＡＣＴ９０ペプチドシンセサイザー（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｈｅｍ
Ｔｅｃｈ、Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ、Ｋｅｎｔｕｃｋｙ製）でのジイソプロピルカルボジミ
ド（diisopropylcarbodimide）（ＤＩＣ）／ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）
カップリングを用いて、３０ｇのＴｅｎｔａＧｅｌ  Ｒｉｎｋ  Ａｍｉｄｅ樹脂上で合成
した。この樹脂を、８５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、１０％トリイソプロピルシラン
（ＴＩＰＳ）、２．５％チオアニソール、２．５％Ｈ2Ｏの溶液で３回処理し、各回に、
２００ｍＬの切断カクテルを用い（初回は２時間、次の２回については１時間攪拌した）
、次いで、１００ｍＬのＴＦＡですすいだ。ペプチドを含有する切断カクテルを減圧下で
約５０ｍＬに濃縮し、５倍過剰の冷エーテルに加え、ペプチドを沈殿させた。沈殿をエー
テルで２回洗浄し、凍結乾燥機で凍結乾燥させると、１１．４ｇの粗単量体が得られた。
この単量体を、３００ｍＬのトリフルオロエタノール（ＴＦＥ）に溶解した。この溶液の
５０ｍＬアリコートを、６００ｍＬのＭｅＯＨおよび４００ｍＬのＴＦＥの溶液に加えた
。酢酸中、飽和Ｉ2を、黄色が持続するまで攪拌しながら滴下した。ＭｅＯＨ／ＴＦＥ溶
液に、ＴＦＥ中、５０ｍＬのペプチド溶液を加え、続いて、Ｉ2／ＡｃＯＨの添加をさら
に５回反復して酸化を完了した。反応混合物を、ＲＰ−ＨＰＬＣおよびＬＣ／ＭＳ技術に
よって分析して反応をモニターした。完了した時点で、固体アスコルビン酸を、溶液が透
明になるまで加えた。溶媒混合物を、減圧下で約５０ｍＬに濃縮し、５倍過剰の冷エーテ
ルに加え、ペプチドを沈殿させた。この沈殿を、エーテルで２回洗浄し、続いて、ＲＰ−
ＨＰＬＣ（Ｋｒｏｍａｓｉｌ  Ｃ１８、１０ｍＭ、１００Å  Ｃ１８支持体、７．５×２
０．５ｃｍ  軸圧縮カラム、移動相Ａ：０．１２％ＴＦＡを含有する水、移動相Ｂ：０．
１％ＴＦＡを含有するアセトニトリル（ＡＣＮ）、１０分間の１０％Ｂ、２分かけて２５
％Ｂへの、次いで、６０分かけて３５％Ｂへの変化の勾配、流速１２５ｍＬ／分）で精製
した。生成物を含有する画分を、凍結乾燥機で凍結乾燥させた。９５％を超える純度の画
分をＡＣＮ／水に溶解し、合わせ、凍結乾燥機で凍結乾燥させると、ペプチドが白色固体
として得られた。
【０１５５】
二量体化反応：
上記から得られた単量体（３ｇ、１．２７ｍｍｏｌ）を、３０ｍＬの無水ジメチルスル
ホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解した。ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）（６．３ｍ
ｍｏｌ、５当量）を加え、混合物を均質まで攪拌した。３０ｍｇ／ｍＬのＤＭＳＯ中、四
官能性活性化リンカーの保存溶液を調製し、この一部（０．５５当量）を、攪拌しながら
ペプチド溶液に加えた。２時間後、反応混合物をＨＰＬＣ／ＬＣＭＳによって分析した。
反応が完了した後、反応混合物に水（２００マイクロリットル）を加え、この溶液を凍結
乾燥機で凍結乾燥させた。乾燥粉末を精製すると（Ｃ１８支持体での逆相ＨＰＬＣ、アセ
トニトリル／水／０．１％ＴＦＡ  １０％ＡＣＮ〜３５％ＡＣＮへの６０分かけた勾配を
用いて溶出する）、純粋なＢｏｃ保護二量体が得られた。Ｂｏｃ保護二量体を、１０ｍＬ
の９５％ＴＦＡ／Ｈ2０で１５分間処理し、続いて、５倍過剰の冷エーテル中で沈殿させ
た。沈殿を冷エーテルで２回洗浄すると、粗二量体が得られ、これを、上記と同じ逆相Ｈ
ＰＬＣ法を用いて精製すると、１．８ｇの純粋な二量体ペプチドが得られた。
【０１５６】
ペグ化反応：
上記から得られたペプチド（１００ｍｇ、０．０２０ｍｍｏｌ）を、２ｍｌのＤＭＳＯ
：アセトニトリルの８０：２０混合物に溶解した。活性化された４０ｋＤａの（ｍＰＥＧ
）2−Ｌｙｓ−ＮＨＳ（１．２３ｇ、０．０３０ｍｍｏｌ、Ｎｅｋｔａｒ  Ｔｈｅｒａｐ
ｅｕｔｉｃｓ、Ｓａｎ  Ｃａｒｌｏｓ、ＣＡ製）を加え、反応混合物を、均質になるまで
激しく攪拌した。ＤＩＥＡ（６９μＬ、０．４ｍｍｏｌ）を加え、２時間後に反応混合物
をＨＰＬＣによって分析すると、完全な反応を示した。２０ｍＬの冷無水ジエチルエーテ
ルを加えることによってペプチドを沈殿させた。得られた沈殿を冷エーテルで２回洗浄し
、ＰＥＧ化ペプチドを強力な陽イオン交換クロマトグラフィー（Ｓｏｕｒｃｅ  １５Ｓ  
１５μｍ支持体、移動相Ａ：０．２％ＨＯＡｃを含有する、３５％ＡＣＮ／水にペプチド
を溶解し、ロードし、移動相Ｂ：０．２％ＨＯＡｃを含有する３５％ＡＣＮ／水中、１０
０ｍＭ  ＮＨ4ＯＡｃを用いる勾配溶出、１２５ｍｍ×３５ｍｍカラム寸法、勾配：１０
分かけて２％Ｂ〜２０％Ｂ、６５分かけて１００％Ｂへ）によって精製した。遊離ＰＥＧ
が、ボイド（void）容量の間に溶出された。生成物を含有する画分を凍結乾燥機で凍結乾
燥すると、１．２ｇのＰＥＧ化ペプチドが、白色粉末として得られた。
【０１５７】
［実施例４］
三官能性アミンリンカーの一般的合成
以下の構造を有する三官能性、活性化アミンリンカー：
【０１５８】
【化１８】
2014051498.tif 000020
［式中、αは、１≦α≦７の整数であり；βは、１≦β≦７の整数であり；δは、２≦δ
≦５の整数である］
を、以下の反応スキームに従って合成した：
【０１５９】
【化１９】
2014051498.tif 000021
【０１６０】
市販のトリアミノ化合物１を、触媒量のトリエチルアミン（Ｃａｔ  ＴＥＡ）の存在下
で、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中、ｔ−ブチルフェニルカーボネートで２４時間処
理して、ジ−ｔ−ブチルカルバメート中間体２を生じさせた。２の、塩化メチレン中、グ
ルタル酸無水物およびジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）での処理によって、ジア
ミノ遊離酸３が生じる。アセトニトリル（ＡＣＮ）中、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（
ＮＨＳ）およびジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）での処理によって、酸性基を
、ＮＨＳエステルとして活性化する。沈殿した尿素を濾過し、抽出物を後処理することに
よって、ＮＨＳ活性化リンカーが得られた。ＤＣＭ／ヘキサンからのトリチュレーション
（trituration）によって、リンカーが白色固体として得られ、これは−２０℃で数カ月
安定であるとわかった。
【０１６１】
このリンカーの限定されない、詳細な合成については、実施例５を参照のこと。
【０１６２】
［実施例５］
三官能性アミンリンカーの合成およびそのＮＨＳエステルとしての活性化
以下の構造を有する三官能性、活性化アミンリンカー
【０１６３】
【化２０】
2014051498.tif 000022
を以下の手順に従って作製した：
（ステップＩ）
【０１６４】
【化２１】
2014051498.tif 000023
無水ＤＭＦ（５０ｍＬ）中、Ｎ−（３−アミノプロピル）−１，３−プロパンジアミン
（０．０５モル）の溶液に、ｔ−ブチルフェニルカーボネート（２０ｍＬ、０．１１モル
）を滴下した。この溶液に、Ｅｔ3Ｎ（５ｍＬ）を加えた。得られた混合物を室温で一晩
攪拌した。混合物を、リン酸バッファー（２Ｌ、０．０２５Ｍ  Ｋ2ＨＰＯ4および０．０
２５Ｍ  ＮａＨ2ＰＯ4）中に注ぎ入れ、得られた溶液を、２Ｍ  Ｈ2ＳＯ4を用い、激しく
攪拌しながらｐＨ約３に調整した。混合物を、ＤＣＭ（２×２５０ｍＬ）で抽出し、有機
抽出物を廃棄した。水層を、９Ｎ  ＮａＯＨ水溶液で塩基性化し、次いで、ＤＣＭ（３×
２５０ｍＬ）で抽出した。有機抽出物を、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥させ、減圧下で濃縮し、次い
で、真空下で一晩乾燥させると、目的生成物（１５ｇ、収率９０％）が得られた。
【０１６５】
（ステップＩＩ）
【０１６６】
【化２２】
2014051498.tif 000024
無水ＤＣＭ（５０ｍＬ）中、ジ−Ｂｏｃ保護アミン（５ｇ、１５ｍｍｏｌ）、グルタミ
ン酸無水物（１．６４ｇ、１４．２５ｍｍｏｌ）およびＥｔ3Ｎ（３ｍＬ、２２．５ｍｍ
ｏｌ）の混合物を、室温で一晩攪拌した。溶媒を減圧下で除去し、残渣を水に溶解した。
水溶液を、４〜１０℃で１Ｎ  ＨＣｌを用いてｐＨ約３に酸性化し、ＤＣＭ（３×１５０
ｍＬ）で抽出した。合わせた抽出物を、飽和ＮａＣｌで洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥させ、
次いで、減圧下で濃縮すると、目的生成物（６ｇ、９０％）が得られた。
【０１６７】
（ステップＩＩＩ）
【０１６８】
【化２３】
2014051498.tif 000025
無水ＤＣＭ（５０ｍＬ）中、上記のステップＩＩの一酸生成物（２ｇ、５．７８ｍｍｏ
ｌ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（７３１ｍｇ、６．３６ｍｍｏｌ）の混合物を
、氷浴中で４℃に冷却した。反応混合物に、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’
−エチルカルボジイミドヒドロクロリド（ＥＤＣＩ）（１．４ｇ、８．７ｍｍｏｌ）を少
量ずつ加えた。次いで、得られた混合物を、室温に加温し、２時間攪拌した。溶媒を減圧
下で除去した後、残渣を、酢酸エチルおよび水の間に分配した。水層を、ＥｔＯＡｃ（２
×１００ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層を、１Ｍ  ＮａＨＣＯ3（１×１００ｍＬ）
、続いて、水（５×１００ｍＬ）および飽和ＮａＣｌ（１×１００ｍＬ）で洗浄した。抽
出物をＮａ2ＳＯ4で乾燥させ、濃縮し、真空下で乾燥させると、最終活性化三官能性リン
カーが半固体として得られた（４．９ｇ、８５％）。
【０１６９】
［実施例６］
三官能性リンカーのペプチドとのコンジュゲーションと、その後のＰＥＧ化
【０１７０】
【化２４】
2014051498.tif 000026
実施例３から得られた（配列番号：５を用いて）二量体ペプチドを、この実施例の出発
材料として用い、化合物ＩＩを合成した。Ｂｏｃ基の除去は、９５％ＴＦＡ／水を用いて
行った。冷エーテルからペプチドを沈殿させ、ＴＦＡ／ＡＣＮ／０．１％ＴＦＡ勾配を用
いるＣ１８カラムでのＨＰＬＣによって精製した。生成物を含有する画分を、凍結乾燥機
で凍結乾燥させると、遊離アミン−ペプチドが白色固体として得られた。０．５ｍＬのＤ
ＭＦ中、ペプチド（２０ｍｇ、１当量）およびＤＩＥＡ（１０マイクロリットル、１０当
量）の溶液を、実施例５から得た三官能性活性化リンカー（４．５ｍｇ、２当量）で処理
した。一晩攪拌した後のＨＰＬＣ分析によって、ほぼ完全な反応が明らかにされた。反応
混合物を、冷エーテルに加えてペプチドを沈殿させた。ビス−Ｂｏｃ保護リンカー−ペプ
チドコンジュゲートを減圧下で乾燥させた。
【０１７１】
ペプチドを、１．９ｍＬのＴＦＡおよび０．１ｍＬの水の溶液中に溶解し、１時間攪拌
することによって、２つのＢｏｃ基を除去した。ＴＦＡを、減圧下で除去し、残渣を冷エ
ーテルから沈殿させた。ビス−アミンペプチドを、ＴＦＡ／ＡＣＮ／０．１％ＴＦＡ勾配
を用いるＣ１８カラムでのＨＰＬＣによって精製した。所望のペプチドを含有する画分を
、凍結乾燥機で凍結乾燥させた。
【０１７２】
ペグ化反応：
０．５ｍＬのＤＭＦ中、ビス−アミンペプチド（１０ｍｇ、１当量）の溶液に、ＤＩＥ
Ａ（７マイクロリットル、２０当量）、続いて、ｍＰＥＧ−ＮＰＣ  ２０ｋＤａ（ＮＯＦ
Ｃｏｒｐ．、１２０ｍｇ、３当量）を加えた。６時間後、ｍＰＥＧ−ＮＰＣ（４０ｍｇ
）およびＡＣＮ（約５０〜１００マイクロリットル）のさらなるアリコートを加えた。イ
オン交換クロマトグラフィーによる１４時間後の分析によって、完全な反応が明らかにさ
れた。反応混合物を、０．２％ＨＯＡｃを含有する２０％ＡＣＮ／水で希釈し、強力な陽
イオン交換クロマトグラフィー（Ｓｏｕｒｃｅ  １５Ｓ  １５μｍ支持体、０．２％ＨＯ
Ａｃを含有する、２０％ＡＣＮ／水中、１００ｍＭ  ＮＨ4ＯＡｃを用いる勾配溶出）に
よって精製した。遊離ＰＥＧが、ボイド容量の間に溶出された。生成物を含有する画分を
凍結乾燥機で凍結乾燥すると、５１ｍｇのＰＥＧ化ペプチドが、白色粉末として得られた
。
【０１７３】
［実施例７］
四官能性リンカーの合成および、そのＮＨＳエステルとしての活性化
以下の構造を有する四官能性、活性化リンカー
【０１７４】
【化２５】
2014051498.tif 000027
を、以下のスキームに従って合成した
【０１７５】
【化２６】
2014051498.tif 000028
【０１７６】
ジ−ｔ−ブチルオキシトリアミン（ＩＩＩ）：
ＤＭＦ（５０ｍＬ）中、トリアミン（ＩＩ）（０．０５モル）の溶液に、ｔ−ブチルフ
ェニルカーボネート（２．３当量）を加えた。反応混合物を室温で一晩攪拌し、リン酸バ
ッファー（１Ｌの０．０５Ｍ  Ｋ2ＨＰＯ4および０．０５Ｍ  ＮａＨ2ＰＯ4）中に注ぎ入
れた。ｐＨを、２Ｍ  Ｈ2ＳＯ4で３に調整し、ジエチルエーテル（３×２５０ｍＬ）で抽
出した。水相を１０Ｎ  ＮａＯＨを用いて強アルカリ性にし、ＤＣＭ（４×２５０ｍＬ）
で抽出した。有機相をブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧下で濃縮する
と、ビス保護されたトリアミン（ＩＩＩ）が白色固体として得られた（収率約６０％）。
【０１７７】
ジＢｏｃアミノ酸（ＩＶ）：
無水ＤＣＭ（２５ｍＬ）中、ジＢｏｃトリアミン（ＩＩＩ）（０．０１モル）およびグ
ルタル酸無水物（０．０１モル）の混合物を、５℃に冷却した（氷−水浴）。無水ＴＥＡ
（０．０１５モル、１．５当量）を加え、混合物を室温で６時間攪拌した。混合物をさら
なるＤＣＭで希釈し、１Ｎ  ＮａＨＣＯ3（２回）で洗浄した。有機層を廃棄した。水層
を、２Ｎ  ＨＣを用いｐＨ３に酸性化し、酢酸エチル（３回）で抽出した。酢酸エチル層
を水およびブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧下で濃縮すると、（ＩＶ
）が白色の粘着性固体として得られた（収率約９０％）。
【０１７８】
ジエチルエステルリンカー（Ｖ）：
ジＢｏｃアミノ酸（ＩＶ）（０．０１モル）およびジエチルイミノジアセテート（０．
０１モル）を、無水ジクロロメタンに溶解した。これに、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロ
ピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミドヒドロクロリド（ＥＤＣＩ）（０．０１２モル）を
加え、反応混合物を室温で一晩攪拌した。混合物を、さらなるＤＣＭで希釈し、０．１Ｎ
ＨＣＬ、氷冷１Ｎ  ＮａＨＣＯ3、水（３回）およびブラインで洗浄した。ＤＣＭ層を
硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧下で濃縮すると、ジエチルエステルリンカー（Ｖ）が、
粘着性半固体として得られた。
【０１７９】
二酸エステルリンカー（Diacid ester linker）（ＶＩ）：
先のステップから得たジエチルエステルリンカー（Ｖ）を、１Ｎ  ＮａＯＨおよびＭｅ
ＯＨの１：１混合物に溶解し、室温で６時間攪拌した。ＭｅＯＨを減圧下で除去し、残渣
を水で希釈した。溶液をＤＣＭ（２回）で洗浄した。水層を冷１Ｎ  ＨＣＬを用いて中性
化し、酢酸エチル（３回）で抽出した。有機層をブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾
燥させ、減圧下で濃縮すると、四官能性リンカー（ＶＩ）が白色固体として得られた（収
率約６５％、２段階）。
【０１８０】
活性化四官能性リンカー（Ｉ）：
上記から得た二酸リンカー（ＶＩ）（０．００５モル）およびＮ−ヒドロキシスクシン
イミド（０．０１５モル、３当量）を、無水アセトニトリルに溶解した。これに、Ｎ−（
３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミドヒドロクロリド（ＥＤＣＩ
）（０．０１２５ｍｏｌ、２．５当量）を加え、反応混合物を室温で一晩攪拌した。混合
物をＤＣＭで希釈し、氷冷水（５回）およびブラインで洗浄した。ＤＣＭ相を硫酸ナトリ
ウムで乾燥させ、減圧下濃縮すると、活性化四官能性リンカー（Ｉ）が、白色固体として
得られた（収率約８５％）。リンカーの構造を1Ｈ−ＮＭＲによって確認した。
【０１８１】
［実施例８］
四官能性リンカーを用いるペプチド二量体化およびその後のＰＥＧ化
【０１８２】
【化２７】
2014051498.tif 000029
ペプチド単量体を、実施例３と同様に調製し（配列番号：５を用いて）、化合物ＩＩＩ
の合成において初期分子として用いる。０．４ｍＬのＤＭＦ中、ペプチド（１５０ｍｇ、
２当量）およびＤＩＥＡ（５６マイクロリットル、１０当量）の溶液に、実施例７から得
た四官能性活性化リンカー（２３ｍｇ、１当量）を加えた。一晩攪拌した後のＨＰＬＣ分
析によって、完全な反応が明らかにされた。ペプチドを冷エーテルから沈殿させ、減圧下
で乾燥させた。１．９ｍＬのＴＦＡおよび０．１ｍＬの水の溶液にペプチドを溶解し、１
時間攪拌することによって、２個のＢｏｃ基を除去した。ＴＦＡを減圧下で除去し、残渣
を冷エーテルから沈殿させた。ビス−アミンペプチドを、ＴＦＡ／ＡＣＮ／０．１％ＴＦ
Ａ勾配を用いるＣ１８カラムでのＨＰＬＣによって精製した。所望のペプチドを含有する
画分を凍結乾燥機で凍結乾燥させた。
【０１８３】
ペグ化反応：
ｍＰＥＧ−ＮＰＣ  ２０ｋＤａ（ＮＯＦ  Ｃｏｒｐ．、５９６ｍｇ、３当量）を、最小
の、ＤＭＳＯ：ＡＣＮの７０：３０混合物に溶解した。この溶液に、ビス−アミンペプチ
ド（５０ｍｇ、１当量）およびＤＩＥＡ  １７マイクロリットル、１０当量）を加えた。
５時間後、イオン交換クロマトグラフィーによる分析によって完全な反応が明らかにされ
た。反応混合物を、冷エーテルに加えて、ＰＥＧ化ペプチドを沈殿させた。０．２％ＨＯ
Ａｃを含有する３５％ＡＣＮ／水にＰＥＧ化ペプチドを溶解し、強力な陽イオン交換クロ
マトグラフィー（Ｓｏｕｒｃｅ  １５Ｓ  １５μｍ支持体、０．２％ＨＯＡｃを含有する
３５％ＡＣＮ／水中、１００ｍＭ  ＮＨ4ＯＡｃを用いる勾配溶出）によって精製した。
遊離ＰＥＧが、ボイド容量の間に溶出された。生成物を含有する画分を凍結乾燥機で凍結
乾燥すると、３６０ｍｇのＰＥＧ化ペプチドが白色粉末として得られた。
【０１８４】
［実施例９］
四官能性リンカーの合成およびそのＮＨＳエステルとしての活性化
以下の構造を有する四官能性、活性化リンカー：
【０１８５】
【化２８】
2014051498.tif 000030
を以下のステップに従って合成した：
（ステップＩ）
【０１８６】
【化２９】
2014051498.tif 000031
４００ｍＬのメタノールを入れたフラスコに、塩化アセチル（８ｍＬ、１１２ｍｍｏｌ
）を加えた。この溶液を１０分間攪拌し、ＴＣＩ  Ａｍｅｒｉｃａ（Ｐｏｒｔｌａｎｄ、
Ｏｒｅｇｏｎ）製のエチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジプロピオン酸ジヒドロクロリド（２
５．０ｇ、９０．２ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を２４時間還流した。この溶液を室温
に冷却し、次いで、冷凍庫に１４時間入れた。濾過によって白色結晶を回収し、減圧下で
乾燥させると、２７．１２ｇのジアミン二塩酸塩生成物が得られた。
【０１８７】
（ステップＩＩ）
【０１８８】
【化３０】
2014051498.tif 000032
ジアミン二塩酸塩（５．０ｇ、１６．４ｍｍｏｌ）を、５０ｍｌの水に溶解することに
よって遊離塩基にし、分液漏斗に移し、１００ｍＬの飽和ＮａＨＣＯ3および２５ｍＬの
飽和ＮａＣｌを加え（水相のｐＨは、約１０であった）、クロロホルムで４回抽出し、Ｎ
ａ2ＳＯ4で乾燥させた。溶媒を除去すると、１．１２ｇの無色のオイルが得られた。上記
から得た水相を、ＮａＯＨ水溶液を用いてｐＨ１２にさらに塩基性にし、クロロホルムで
４回抽出した。Ｎａ2ＳＯ4で乾燥させ、溶媒を除去すると、さらなる２．３３ｇの無色の
オイルが得られた。
【０１８９】
合わせた遊離塩基（３．４５ｇ、１４．８ｍｍｏｌ）を、１２５ｍＬのアセトニトリル
に溶解し、Ｂｏｃ−β−アラニン−ＯＨ（４．３６ｇ、２３．０ｍｍｏｌ）を加え、氷水
浴をフラスコの下に置き、続いて、このフラスコにジシクロヘキシルカルボジイミド（４
．７４ｇ、２２．９７ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を、室温に加温させ、２４時間攪
拌し、次いで、濾過して沈殿した尿素を除去した。溶媒を減圧下で除去し、残渣を、２５
０ｍＬの酢酸エチルに溶かし、飽和ＮａＨＣＯ3、飽和ＮａＣｌ、１Ｎ  ＨＣｌおよび飽
和ＮａＣｌを用いて逐次洗浄した。有機相をＭｇＳＯ4で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃
縮すると、６．０３ｇ（収率９１％）の白色固体が得られた。
【０１９０】
（ステップＩＩＩ）
【０１９１】
【化３１】
2014051498.tif 000033
上記から得た粗ジメチルエステル（６．０３ｇ、１０．５ｍｍｏｌ）を、７５ｍＬのメ
タノールおよび５０ｍＬのテトラヒドロフランおよび３０ｍｌの水の混合物に溶解した。
２０ｍＬの水中、ＫＯＨ（１．８９ｇ、３３．７ｍｍｏｌ）の溶液を、室温で加えた。２
時間後、ＨＰＬＣ分析によって、生成物への完全変換が明らかにされた。３．５時間後、
有機溶媒を減圧下で除去した。溶液を、１００ｍＬの水で希釈し、ジエチルエーテルで抽
出し、６Ｎ  ＨＣｌを用いてｐＨ２より低く酸性化し、固体ＮａＣｌを用いて飽和させ、
酢酸エチルで抽出した。有機相を、ＭｇＳＯ4で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮すると
、白色の半固体が得られた。生成物を、少量のＨＣｌを含有する１０％メタノール／水か
ら再結晶化させると、３．４２ｇの二酸が、白色固体として得られた（収率６０％）。
【０１９２】
（ステップＩＶ）
【０１９３】
【化３２】
2014051498.tif 000034
３５ｍＬのＤＭＦ中、上記から得た二酸（０．５５１ｇ、１．０１ｍｍｏｌ）およびＮ
−ヒドロキシスクシンイミド（０．２８ｇ、２．４２ｍｍｏｌ）の溶液に、１−（３−ジ
メチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミドヒドロクロリド（０．４０８ｇ、２
．１３ｍｍｏｌ）を加えた。２６時間攪拌した後、溶媒を減圧下で除去し、残渣を酢酸エ
チルおよび飽和ＮａＨＣＯ3間に分配した。有機相を洗浄し（飽和ＮａＣｌ、２×１０％
ＫＨＳＯ4、飽和ＮａＣｌ）、乾燥させ（ＭｇＳＯ4）、濾過し、濃縮すると、０．３８５
ｇ（収率５１．５％）のジ−ＮＨＳ活性化エステル生成物が白色固体として得られた。
【０１９４】
［実施例１０］
四官能性リンカーを用いるペプチドのＣ末端二量体化およびその後のＰＥＧ化
【０１９５】
【化３３】
2014051498.tif 000035
ペプチド合成：
単量体ペプチド（配列番号：５で示されたペプチドを用いて）を、標準Ｆｍｏｃ−アミ
ノ酸（ＴＦＡ−不安定側鎖保護基）およびＡＣＴ９０ペプチドシンセサイザー（Ａｄｖａ
ｎｃｅｄ  ＣｈｅｍＴｅｃｈ、Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ、Ｋｅｎｔｕｃｋｙ製）でのジイソ
プロピルカルボジミド（diisopropylcarbodimide）（ＤＩＣ）／ヒドロキシベンゾトリア
ゾール（ＨＯＢｔ）カップリング（０．２５Ｍ、４当量、２時間カップリング）を用いて
、３０ｇのＴｅｎｔａＧｅｌ  Ｒｉｎｋ  Ａｍｉｄｅ樹脂上で合成した。この樹脂を、８
５／１０／２．５／２．５ＴＦＡ／ＴＩＰＳ／チオアニソール／水を用いて切断した。切
断カクテルの容積を１／２に減らし、エーテルを用いて沈殿させた。沈殿をＴＦＥに溶か
し、ＭｅＯＨで２ｍｇ／ｍｌに希釈した。この攪拌溶液に、ＡｃＯＨ中、Ｉ2の飽和溶液
を、淡黄色が残るまで加えた。この溶液を１５分間攪拌し、次いで、少量のアスコルビン
酸でクエンチした（quenched）。この溶液は、最小容積を残して取り除き、エーテルで沈
殿させた。沈殿物を、ＡＣＮ／水／０．１％ＴＦＡ勾配を用いるＣ１８カラムでの逆相Ｈ
ＰＬＣによって精製した。
【０１９６】
二量体化反応：
純粋な酸化単量体（８０ｍｇ、３４マイクロモル）を、１ｍＬのＤＭＦに溶解した。こ
れに、１０当量のＤＩＥＡ（５９マイクロリットル）、続いて、５ｍｇアリコート中、０
．５当量の実施例９の活性化四官能性リンカー（１２．６ｍｇ、１７マイクロモル）を２
時間かけて加えた。二量体化は、ＨＰＬＣによって追跡した。反応が完了した時点で、溶
液を８０／２０  水／ＡＣＮで希釈し、逆相ＨＰＬＣによって精製した。純粋な画分を、
ＴＦＡで処理して、Ｂｏｃ保護を除去した（反応はＨＰＬＣによってモニターした）。遊
離ジアミンを、ＡＣＮ／水／０．１％ＴＦＡ勾配を用いるＣ１８カラムでの逆相ＨＰＬＣ
によって精製した。
【０１９７】
ペグ化反応：
二量体ペプチド（２０ｍｇ、４マイクロモル）を、１７５ｍｇ（２．２当量、８．８マ
イクロモル）ＮＯＦ  Ｃｏｒｐ．製ｍＰＥＧ−ＮＰＣ  ２０ｋＤａとともに、０．５ｍＬ
の７０／３０  ＤＭＳＯ／ＡＣＮに溶解した。この粘稠性溶液に、７マイクロリットルの
ＤＩＥＡ（１０当量、４０マイクロモル）を加えた。反応は、ＨＰＬＣによって追跡した
。１６時間後、反応混合物に、さらなる０．５ｍＬの７０／３０  ＤＭＳＯ／ＡＣＮを加
えた。反応は２２時間で完了した。この溶液を、０．２％ＡｃＯＨを含有する、８０／２
０  水／ＡＣＮで希釈した。溶液の１／３を、強力な陽イオン交換Ｓｏｕｒｃｅ  １５Ｓ
（ＧＥ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製）を含有するカラムにロードし、複数のカラム容積の
溶媒Ａ（０．２％ＡｃＯＨを含有する、３５％ＡＣＮ／水）をカラムに通した。溶媒Ａ中
、１００ｍＭ  ＮＨ4ＯＡｃを用いて、ＰＥＧ化材料をカラムから溶出した。目的生成物
を含有する画分を、凍結乾燥機で凍結乾燥させた。純度＞９５％の画分を、８０／２０  
ＡＣＮ／水に溶解し、合わせ、凍結乾燥機で凍結乾燥させると、４２ｍｇのＰＥＧ化ペプ
チドが白色固体として得られた。
【０１９８】
［実施例１１］
四官能性リンカーを用いるペプチドのＣ末端二量体化およびその後のＰＥＧ化
以下のコンジュゲート（化合物Ｖ）を、異なるペプチド単量体を用いた（配列Ａｃ−Ｇ
ＧＬＹＡＣＨＹＧＰＩＴ（Ｎａｌ）ＶＣＱＰＬＲ（ＭｅＧ）Ｋ、配列番号：２４を用いて
）点を除いて、実施例１０の手順に従って調製した。
【０１９９】
【化３４】
2014051498.tif 000036
【０２００】
［実施例１２］
四官能性リンカーを用いるペプチドのＣ末端二量体化
【０２０１】
【化３５】
2014051498.tif 000037
実施例１０のペプチド合成および二量体化手順をたどって、上記のコンジュゲート（化
合物ＶＩ、配列番号：１７を出発材料として用いて）を、６．０ｍｇの白色固体として調
製した。
【０２０２】
［実施例１３］
四官能性リンカーを用いるペプチドのＣ末端二量体化
【０２０３】
【化３６】
2014051498.tif 000038
実施例１０のペプチド合成および二量体化手順をたどって、化合物ＶＩＩ（配列番号：
１７のペプチドを出発材料として用いて）を、４．５ｍｇの白色固体として調製した。
【０２０４】
［実施例１４］
三官能性リンカーを用いるペプチドのＣ末端二量体化
【０２０５】
【化３７】
2014051498.tif 000039
実施例１０のペプチド合成および二量体化手順をたどって、化合物ＶＩＩＩ（配列番号
：１７のペプチドを出発材料として用いて）を、５ｍｇの白色固体として調製した。
【０２０６】
［実施例１５］
四三官能性リンカーを用いるペプチドのＣ末端二量体化
【０２０７】
【化３８】
2014051498.tif 000040
実施例１０のペプチド合成および二量体化手順をたどって、化合物ＩＸ（配列番号：２
５のペプチドを出発材料として用いて）を、９５ｍｇの白色固体として調製した。
【０２０８】
［実施例１６］
三官能性アミンリンカーを用いるペプチドのＮ末端二量体化およびその後の５ｋＤａ  Ｐ
ＥＧを用いるＰＥＧ化
【０２０９】
【化３９】
2014051498.tif 000041
ペプチド合成：
直鎖ペプチドＡｃ−Ｋ−Ｇ−Ｇ−Ｌ−Ｙ−Ａ−Ｃ−Ｈ−Ｍ−Ｇ−Ｐ−Ｉ−Ｔ−１Ｎａｌ
−Ｖ−Ｃ−Ｑ−Ｐ−Ｌ−Ｒ−Ｓａｒ−アミド（７−１５ジスルフィド、配列番号：２６）
を、実施例３と同様、標準Ｆｍｏｃアミノ酸を用いて調製した。ＴＦＡ／トリイソプロピ
ルシラン／チオアニソール／水の８５／１０／２．５／２．５混合物を用いて、樹脂から
のペプチドの切断を実施し、得られたペプチドを、冷エーテルから沈殿させた。ＡＣＮ／
水／ＴＦＡ勾配を用いるＣ１８での精製によって、純粋な単量体ペプチドが得られた。
【０２１０】
二量体化反応：
二量体化は、１０ｍＬのＤＭＦ中、５０７ｍｇの単量体、６０ｍｇの実施例２の三官能
性リンカーおよび１７０マイクロリットルのＤＩＥＡを用い、実施例３と同様に実施した
。１ｍＬのＤＭＦ中、実施例２から得たさらなる６ｍｇのリンカーを３時間後に加えた。
さらに１時間後、２００マイクロリットルの水を加え、反応混合物を凍結乾燥機で凍結乾
燥させた。粗ペプチドを、ＡＣＮ／水／ＴＦＡ勾配を用いるＣ１８カラムでの逆相ＨＰＬ
Ｃによって精製すると、２３６ｍｇの二量体のペプチドが白色固体として得られた。乾燥
固体を、４ｍＬの９５％ＴＦＡ／水に溶かし、１５分間攪拌し、次いで、冷エーテルに加
えて、ペプチドを沈殿させた。固体を、５０％ＡＣＮ／水に溶解し、凍結乾燥機で凍結乾
燥させると、１９７ｍｇの二量体のペプチドが白色固体として得られた。
【０２１１】
ペグ化反応：
上記から得た二量体のペプチド（１０２ｍｇ）を、３．５ｍＬのＤＭＳＯに溶かし、Ｄ
ＩＥＡ（３４マイクロリットル）、続いて、１．５ｍＬのＡＣＮ中、ｍＰＥＧ−ＮＰＣ  
５ｋＤａ（Ｓｕｎ  Ｂｉｏ  ＵＳＡ、Ｏｒｉｎｄａ、ＣＡ製、カタログ番号ＰＩＮＰＣ−
００５、ｗｗｗ．ｓｕｎｂｉｏ．ｃｏｍ）の溶液を加えた。２時間攪拌した後、ＨＯＡｃ
を、溶液が透明になるまで滴下した（約１０滴）。溶液を、０．２％ＡｃＯＨを含有する
３５％ＡＣＮ／水を用いて１０ｍＬに希釈し、実施例３と同様、Ｓｏｕｒｃｅ  １５Ｓ支
持体での陽イオン交換クロマトグラフィーによって精製すると、９３ｍｇの白色固体が得
られた。粉末（化合物Ｘ）をＨＰＬＣ（Ｚｏｒｂａｘ  ３００  ＳＢ−Ｃ８、ＡＣＮ／水
／ＴＦＡ勾配）によって分析すると、純度９８．８％であることが明らかになった。ペプ
チド含量（９４％）は、燃焼分析によって、窒素値の実測値７．８３％と、予測値８．３
３％との比較に基づいて決定した。
【０２１２】
［実施例１７］
四官能性リンカーを用いるペプチドのＣ末端二量体化およびその後のＰＥＧ化
【０２１３】
【化４０】
2014051498.tif 000042
実施例１０のペプチド合成、二量体化およびＰＥＧ化手順をたどって、上記のコンジュ
ゲート（化合物ＸＩ、配列番号：２７を出発材料として用いて）を調製することができる
。位置１のグリシンは、アリルオキシカルボニル（Ａｌｌｏｃ）などの直交（orthogonal
）Ｎ末端保護基を用いる。切断および二量体化後、Ａｌｌｏｃ基を、（Ｐｈ3）4Ｐｄを、
ＨＯＡｃおよびＮ−メチルモルホリンとともに用いて除去する。
【０２１４】
［実施例１８］
四官能性リンカーを用いるペプチドのＣ末端二量体化およびその後のＰＥＧ化
【０２１５】
【化４１】
2014051498.tif 000043
実施例１０の手順をたどって、上記のコンジュゲート（化合物ＸＩＩ、配列番号：２８
を出発材料として用いて）を調製することができる。位置１６のリジンは、アリルオキシ
カルボニル（Ａｌｌｏｃ）などの直交側鎖保護基を用い、位置１のグリジンは、Ａｌｌｏ
ｃ−Ｇｌｙ−ＯＨを用いる。切断および二量体化後、２つのＡｌｌｏｃ基を、（Ｐｈ3）4
Ｐｄを、ＨＯＡｃおよびＮ−メチルモルホリンとともに用いて除去する。
【０２１６】
［実施例１９］
四官能性リンカーを用いるペプチドのＣ末端二量体化およびその後のＰＥＧ化
以下のコンジュゲート（化合物ＸＩＩＩ）を、ｍＰＥＧ−ＮＰＣ  ３０ｋＤａ（ＮＯＦ
Ｃｏｒｐ、Ｊａｐａｎ製）を、ｍＰＥＧ−ＮＰＣ  ２０ｋＤａの代わりに用いた点を除
いて、実施例１０に従って（配列番号：５を用いて）調製した。
【０２１７】
【化４２】
2014051498.tif 000044
【０２１８】
［実施例２０］
四官能性リンカーの合成およびビス−ＮＨＳエステルとしての活性化
以下の構造を有する四官能性活性化リンカー：
【０２１９】
【化４３】
2014051498.tif 000045
を、以下の反応スキームに従って合成した：
【０２２０】
【化４４】
2014051498.tif 000046
【０２２１】
２．２当量のｔ−ブチルフェニルカーボネートを含有するＤＭＦ中、テトラ−アミンの
溶液に、触媒トリエチルアミンを加えた。反応混合物を一晩攪拌した。反応混合物をリン
酸バッファー（２Ｌ、０．０２５Ｍ  Ｋ2ＨＰＯ4および０．０２５Ｍ  ＮａＨ2ＰＯ4）に
注ぎ入れ、得られた溶液を、激しく攪拌しながら２Ｍ  Ｈ2ＳＯ4を用いてｐＨ約３に調整
した。混合物を、エーテルで洗浄し（洗浄液は廃棄した）、水層を、９Ｎ  ＮａＯＨを用
いてｐＨ１０に塩基性にし、次いで、ＤＣＭで抽出した。有機抽出物を、Ｎａ2ＳＯ4で乾
燥させ、減圧下で濃縮し、次いで、真空下で一晩乾燥させると、目的生成物が得られた。
【０２２２】
無水ＤＣＭ（２５ｍＬ）中、ジＢｏｃテトラ−アミン（１当量）およびグルタル酸無水
物（２当量）の混合物を、５℃に冷却した（氷−水浴）。無水ＴＥＡ（１．３当量）を加
え、混合物を室温で６時間攪拌した。混合物をさらなるＤＣＭで希釈し、１Ｎ  ＮａＨＣ
Ｏ3で洗浄した。有機層を廃棄した。水層を、２Ｎ  ＨＣを用いてｐＨ３．０に酸性化し
、酢酸エチルで抽出した。酢酸エチル層を、水およびブラインで洗浄し、硫酸ナトリウム
で乾燥させ、減圧下で濃縮すると、四官能性リンカーが得られた。
【０２２３】
無水ＤＭＦ中、四官能性リンカー（１当量）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（２
．２当量）の混合物を、氷浴中で４℃に冷却した。反応混合物にＮ−（３−ジメチルアミ
ノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミドヒドロクロリド（ＥＤＣＩ）（１．１当量）
を、少量ずつ加えた。次いで、得られた混合物を室温に加温させ、２時間攪拌した。減圧
下で溶媒を除去した後、残渣を、ＤＣＭおよび水の間に分配した。抽出物を、Ｎａ2ＳＯ4
で乾燥させ、濃縮し、真空下で乾燥させると、最終活性化四官能性リンカーが灰白色固体
として得られた。
【０２２４】
［実施例２１］
四官能性リンカーの合成
以下の構造を有する四官能性リンカー：
【０２２５】
【化４５】
2014051498.tif 000047
を、以下の反応スキームに従って合成した：
【０２２６】
【化４６】
2014051498.tif 000048
【０２２７】
［実施例２２］
三官能性リンカーの合成およびペプチドの二量体化およびペグ化
以下の構造を有する三官能性リンカー：
【０２２８】
【化４７】
2014051498.tif 000049
を、以下のプロトコールに従って作製した。
【０２２９】
（ステップＩ）
【０２３０】
【化４８】
2014051498.tif 000050
ＭｅＯＨ（５０ｍＬ）および３当量のＥｔ3Ｎ（５ｍＬ）中、４−（メチルアミノ）酪
酸ヒドロクロリド（５ｇ、３２．５ミリモル）の混合物に、ジ−ｔ−ブチルジカルボナー
ト（７ｇ、３２．１ｍｍｏｌ）を１０分間かけて滴下した。反応混合物を室温で１時間攪
拌し、次いで、減圧下で濃縮した。残渣をＥｔＯＡｃ（１５０ｍＬ）に溶解し、氷冷０．
１Ｎ  ＨＣｌ水溶液（２×７０ｍＬ）で洗浄した。次いで、有機層を、水（２×１００ｍ
Ｌ）で中性ｐＨに洗浄し、次いで、飽和ＮａＣｌ（１×１００ｍＬ）で洗浄した。ＥｔＯ
Ａｃ層をＮａ2ＳＯ4で乾燥させ、濃縮すると、Ｂｏｃ保護生成物（６．８ｇ、収率９６％
）が得られた。
【０２３１】
（ステップＩＩ）
【０２３２】
【化４９】
2014051498.tif 000051
無水ＤＣＭ（８０ｍＬ）中、Ｂｏｃ保護４−（メチルアミノ）酪酸（６．８ｇ、３１．
３ｍｍｏｌ）およびジ−エチルイミノジアセテート（５．９２ｇ、２９．７ｍｍｏｌ）の
混合物を、氷浴中で４℃に冷却した。反応混合物に、ＥＤＣＩ（７．１ｇ、３７．３ｍｍ
ｏｌ）を少量ずつ加えた。次いで、得られた混合物を室温に加温させ、４時間攪拌した。
溶媒を減圧下で除去した後、残渣を、酢酸エチル（２００ｍＬ）および水（１００ｍＬ）
の間に分配した。続いて、有機層をＨ2Ｏ（４×１００ｍＬ）、氷冷０．１Ｎ  ＨＣｌ（
２×１００ｍＬ）、Ｈ2Ｏ（２×１００ｍＬ）、飽和ＮａＨＣＯ3（１×１００ｍＬ）、Ｈ
2Ｏ（２×１００ｍＬ）、最後に、続いて、飽和ＮａＣｌ（１×１００ｍＬ）で洗浄した
。有機層を、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥させ、次いで、濃縮すると、目的生成物が得られた（１０
ｇ、収率８６．７％）。
【０２３３】
（ステップＩＩＩ）
【０２３４】
【化５０】
2014051498.tif 000052
ジエチルエステル生成物（１０ｇ、２５．７ｍｍｏｌ）を、ＴＨＥ中、２Ｎ  ＬｉＯＨ
水溶液（容量で１：１）を用いて、１８時間加水分解した。溶媒を除去した後、水層をＥ
ｔＯＡｃ（２×１００ｍＬ）で洗浄し、有機層を廃棄した。溶液中に氷を加えて０℃で、
水層を、６Ｎ  ＨＣｌを用いてｐＨ約１に酸性化し、次いで、後に固体ＮａＣｌを用いて
飽和させた。飽和溶液をＥｔＯＡｃ（５×１００ｍＬ）で抽出した。合わせた抽出物を、
飽和ＮａＣｌ（３×１００ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥させ、次いで、濃縮すると
、二酸リンカー（５．８ｇ、６８％）が、白色固体として得られた。
【０２３５】
（ステップＩＶ）
【０２３６】
【化５１】
2014051498.tif 000053
無水ＤＣＭ（２０ｍＬ）中、上記二酸リンカー（１ｇ、３．０ｍｍｏｌ）およびＮ−ヒ
ドロキシスクシンイミド（７６０ｍｇ、６．６ｍｍｏｌ）の混合物を、氷浴中で４℃に冷
却した。反応混合物に、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイ
ミドヒドロクロリド（ＥＤＣＩ）（１．７２ｇ、９．０ミリモル）を少量ずつ加えた。次
いで、得られた混合物を室温に加温させ、３〜４時間攪拌した。溶媒を除去した後、残渣
を、酢酸エチルおよび水の間に分配した。水層を、ＥｔＯＡｃ（２×５０ｍＬ）で抽出し
た。合わせた有機層を、水（５×５０ｍＬ）および飽和ＮａＣｌ（１×５０ｍＬ）で洗浄
した。抽出物を、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥させ、濃縮し、真空下で乾燥させると、最終活性化リ
ンカーが白色固体として得られた（１．３５ｇ、８５％）。
【０２３７】
活性化リンカーを用いるペプチド二量体化：
実施例３に記載されるペプチド単量体（配列番号：５、１９３ｍｇ、０．０７５ｍｍｏ
ｌ）を、無水ＤＭＳＯ（２ｍＬ）に溶解し、攪拌しながらＤＩＥＡを加えた（７０μＬ、
０．３８ｍｍｏｌ）。活性化リンカー（２１．７ｍｇ、０．０４１ｍｍｏｌ）を０．５ｍ
Ｌの無水ＤＭＳＯに溶解し、次いで、ピペットによって加えた。得られた混合物を室温で
１時間攪拌し、次いで、ＨＰＬＣ［分析用ＨＰＬＣカラム：Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｚｏｒｂａ
ｘ  ３００ＳＢ−Ｃ８、５ミクロン、３００Å、２．１×１５０ｍｍ（１０分かけて、２
０％Ｂ〜７０％Ｂ；移動相として、ＡＣＮ＆Ｈ2Ｏ中、０．１％ＴＦＡ；ＵＶ検出器：２
１０ｎｍ；流速：０．５ｍＬ／分）］およびＬＣ−ＭＳによって分析した。反応が完了し
た時点で、混合物を２０μＬのＨ2Ｏを用いてクエンチし、および凍結乾燥して溶媒を除
去した。
【０２３８】
乾燥残渣を、ＴＦＡ−ＤＣＭ（１：１）（１ｍＬ）で１０分間で処理して、Ｂｏｃ−保
護基を除去し、Ｎ2ガスを溶液上に穏やかに吹き込むことによって、溶媒を乾燥させた。
混合物の１／２を、分取ＨＰＬＣ（７０分かけて２５％Ｂ〜５０％Ｂ；移動相として、Ａ
ＣＮ＆Ｈ2Ｏ中、０．１％ＴＦＡ；ＵＶ検出器：２１０ｎｍ；流速：３０ｍＬ／分）によ
って精製した。画分を乾燥させた後、二量体のペプチドが、９５％の純度の白色粉末（４
２ｍｇ、収率４３％）として単離された。
【０２３９】
４０ｋＤａ  ＰＥＧを用いる二量体のペプチドのペグ化：
二量体のペプチド（４２ｍｇ、０．００８ｍｍｏｌ）を、無水ＤＭＳＯ−ＡＣＮ（容量
で３：１）（２ｍＬ）に溶解し、ＤＩＥＡ（１０μＬ、７当量）を加えた。無水アセトニ
トリル（１ｍＬ）に溶解した活性化４０ｋＤａ（ｍＰＥＧ）2−Ｌｙｓ−ＮＨＳ（４８０
ｍｇ、０．０１２ｍｍｏｌ、Ｎｅｋｔａｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、Ｓａｎ  Ｃａｒ
ｌｏｓ、ＣＡ製）を加え、得られた混合物を室温で一晩攪拌した。ＨＰＬＣによる分析に
よって、ペプチド二量体の１／３が出発材料として残存していることが示された。無水ア
セトニトリル（１ｍＬ）に溶解した活性化ＰＥＧ試薬（４８０ｍｇ、０．０１２ｍｍｏｌ
）のさらなる部分を加え、反応混合物を再度、一晩攪拌した。分析用ＨＰＬＣによって、
形成された大部分の生成物と少量の出発材料が示された。溶媒を凍結乾燥した後、実施例
３と同様に、混合物を、強力な陽イオンイオン交換カラムに通して、過剰の加水分解され
たＰＥＧを除去した。イオン交換精製から回収されたＵＶによる第１のピークは、８０ｋ
Ｄａ−ＰＥＧ化生成物であると同定され、ＳＥＣ分析によって確認された。イオン交換精
製から回収されたＵＶによる第２のピークは、所望の４０ｋＤａ−ＰＥＧ化生成物（８５
％純度の）および幾分かの出発物質および不純物であると同定された。分取ＨＰＬＣ（Ｃ
１８、ＡＣＮ／Ｈ2Ｏ／０．１％ＴＦＡ勾配）によって、不純物混合物を再精製すると、
４０ｋＤａ−ＰＥＧ化コンジュゲート（化合物ＸＩＶ、３２ｍｇ）が９５％純度で得られ
た。
【０２４０】
【化５２】
2014051498.tif 000054
【０２４１】
［実施例２３］
四官能性リンカーを用いるペプチドのＣ末端二量体化およびその後のＰＥＧ化
化合物ＸＶは以下のとおりに調製した。
【０２４２】
ペプチド合成：
配列番号：１６として示される単量体ペプチドを、標準Ｆｍｏｃ−アミノ酸（ＴＦＡ−
不安定側鎖保護基）およびＡＣＴ９０ペプチドシンセサイザー（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｈ
ｅｍＴｅｃｈ、Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ、Ｋｅｎｔｕｃｋｙ製）でのジイソプロピルカルボ
ジミド（diisopropylcarbodimide）（ＤＩＣ）／ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢ
ｔ）カップリング（０．２５Ｍ、４当量、２時間カップリング）を用いて、３０ｇのＴｅ
ｎｔａＧｅｌ  Ｒｉｎｋ  Ａｍｉｄｅ樹脂上で合成した。この樹脂を、８５／１０／２．
５／２．５  ＴＦＡ／ＴＩＰＳ／チオアニソール／水で切断した。ジエチルエーテルを加
えることによって、ペプチドを溶液から沈殿させた。沈殿を回収し、減圧下で乾燥させ、
トリフルオロエタノール（ＴＦＥ）に溶かし、ＭｅＯＨで２ｍｇ／ｍｌに希釈した（最終
比ＴＦＥ：ＭｅＯＨ  １：４）。この攪拌溶液に、ＡｃＯＨ中、Ｉ2の飽和溶液を、淡黄
色が持続するまで加えた。この溶液を１５分間攪拌し、次いで、少量のアスコルビン酸で
クエンチした。溶液を取り除いて最小容量とし、エーテルを用いて沈殿させた。沈殿を、
以下のような水／０．１２％ＴＦＡ（溶媒Ａ）およびＡＣＮ／０．１０％ＴＦＡ（溶媒Ｂ
）勾配：５分間の５％Ｂから、１分かけて２０％Ｂへ、５５分かけて４０％Ｂへ、１分か
けて９５％Ｂへ、を用いるＣ１８カラムでの逆相ＨＰＬＣによって精製した。所望のペプ
チドを含有する画分を合わせ、凍結乾固すると、純粋な単量体ペプチドが得られた。
【０２４３】
二量体化反応：
純粋な酸化された単量体（１１５６ｍｇ、４９８マイクロモル）を、１１ｍＬのＤＭＦ
に溶解した。これに、１０当量のＤＩＥＡ（８５２マイクロリットル）、続いて、アリコ
ートの実施例９の０．５当量の活性化四官能性リンカー（１８４．６ｍｇ、２４９マイク
ロモル）を１時間かけて加えた。二量体化はＨＰＬＣによって追跡した。反応が完了した
時点で、溶液を、８０／２０  水／ＡＣＮで希釈し、逆相ＨＰＬＣによって精製した。純
粋な画分を、ＴＦＡで処理して、Ｂｏｃ保護を除去した（反応は、ＨＰＬＣによってモニ
ターした）。遊離ジアミンを、以下のような水／０．１２％ＴＦＡ（溶媒Ａ）およびＡＣ
Ｎ／０．１０％ＴＦＡ（溶媒Ｂ）勾配：９分間の１０％Ｂから、１分かけて２０％Ｂへ、
７０分かけて３５％Ｂへ、次いで、１分かけて８０％Ｂへ、を用いるＣ１８カラムでの逆
相ＨＰＬＣによって精製した。所望のペプチドを含有する画分を合わせ、凍結乾固すると
、６１９ｍｇの純粋な二量体ペプチドが得られた。
【０２４４】
ペグ化反応：
二量体ペプチド（２１９ｍｇ、４４．２マイクロモル）および２９１７ｍｇ（２．２当
量、９７．２マイクロモル）のＮＯＦ  Ｃｏｒｐ製ｍＰＥＧ−ＮＰＣ  ３０ｋＤａ（ロッ
ト番号Ｍ３５５２５）を、２０ｍＬの７０／３０  ＤＭＳＯ／ＡＣＮに溶解した。この粘
稠性溶液に、７６マイクロリットルのＤＩＥＡ（１０当量、４４２マイクロモル）を加え
た。反応はＨＰＬＣによって追跡した。反応は５．５時間で完了した。反応混合物に冷エ
ーテルを加えて、ペプチドを沈殿させ、沈殿を冷エーテルで３回洗浄した。ペプチドを、
０．２％ＡｃＯＨを含有する８０／２０  水／ＡＣＮに溶解した。溶液の１／３を、強力
な陽イオン交換Ｓｏｕｒｃｅ  １５Ｓ（ＧＥ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製）を含有するカ
ラムにロードし、複数のカラム容積の溶媒Ａ（０．２％ＡｃＯＨ  を含有する、３５％Ａ
ＣＮ／水）をカラムに通した。溶媒Ａ中、１００ｍＭ  ＮＨ4ＯＡｃを用いて、ＰＥＧ化
材料をカラムから溶出した。この過程を、残りのペプチド溶液を用いてさらに２回反復し
た。目的生成物を含有する画分を凍結乾固した。純度＞９５％の画分を、さらに３回、８
０／２０  ＡＣＮ／水に溶解し、合わせ、凍結乾燥させ、続いて、以下のような水／０．
２％ＨＯＡｃ（溶媒Ａ）およびＡＣＮ／０．２％ＨＯＡｃ（溶媒Ｂ）勾配：２２％Ｂで開
始、１０分かけて２４％Ｂへ、１分かけて３０％Ｂへ、６０分かけて４０％Ｂへ、次いで
、１分かけて９５％Ｂへ、を用いるＣ１８カラムでの逆相ＨＰＬＣによって精製した。所
望のペプチドを含有する画分を合わせ、凍結乾固すると、５１４ｍｇの純粋なＰＥＧ化二
量体が白色固体として得られた。
【０２４５】
化合物ＸＶの合成を以下に示す。
【０２４６】
【化５３】
2014051498.tif 000055
【０２４７】
［実施例２４］
２０ｋＤａ  ＰＥＧを用いるＰＥＧ化
化合物ＸＶＩ、２つの２０ｋＤａ  ＰＥＧ部分とのコンジュゲートの合成を以下に示す
。
【０２４８】
【化５４】
2014051498.tif 000056
【０２４９】
上記の実施例２３から得た二量体ペプチド（７９ｍｇ、１５．９マイクロモル）を、７
００ｍｇ（２．２当量、３４．９マイクロモル）のＮＯＦ  Ｃｏｒｐ製のｍＰＥＧ−ＮＰ
Ｃ  ２０ｋＤａ（ＭＥＭＰ−２０Ｔ、ロット番号Ｍ４Ｄ５５８）と共に、２．５ｍＬの７
０／３０  ＤＭＳＯ／ＡＣＮに溶解した。この粘稠性溶液に、２８マイクロリットルのＤ
ＩＥＡ（１０当量、１５９マイクロモル）を加えた。反応物を完了のために一晩静置した
。反応混合物に冷エーテルを加えて、ペプチドを沈殿させ、沈殿を冷ジエチルエーテルで
３回洗浄した。ペプチドを０．２％ＡｃＯＨを含有する８０／２０  水／ＡＣＮに溶解し
た。溶液の半量を、強力な陽イオン交換Ｓｏｕｒｃｅ  １５Ｓ（ＧＥ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎ
ｃｅｓ製）を含有するカラムにロードし、２〜３カラム容積の溶媒Ａ（０．２％ＡｃＯＨ
を含有する３５％ＡＣＮ／水）をカラムに通した。ＰＥＧ化材料を、溶媒Ａ中、１００ｍ
Ｍ  ＮＨ4ＯＡｃでカラムから溶出した。精製過程をペプチド溶液の残りの部分を用いて
反復した。目的生成物を含有する画分を、凍結乾燥機で凍結乾燥させた。純度＞９５％を
有する目的生成物の画分を、さらに３回、８０／２０  ＡＣＮ／水に溶解し、合わせ、凍
結乾燥させ、続いて、以下のような水／０．２％ＨＯＡｃ（溶媒Ａ）およびＡＣＮ／０．
２％ＨＯＡｃ（溶媒Ｂ）勾配：２２％Ｂから１０分かけて２４％Ｂへ、１分かけて３０％
Ｂへ、６０分かけて３０％〜４０％Ｂへ、１分かけて９５％Ｂへ、を用いるＣ１８カラム
での逆相ＨＰＬＣによって精製した。純粋なＰＥＧ−ペプチドコンジュゲートが、４７０
ｍｇの白色固体として単離された。
【０２５０】
［実施例２５］
ペプチドの生物学的試験
１．レポーターアッセイ
このアッセイは、ヒトＥＰＯ−Ｒを発現するようにトランスフェクトされ、ｆｏｓプロ
モーター駆動性ルシフェラーゼリポーター遺伝子構築物をさらにトランスフェクトされた
マウスプレＢ細胞株に基づいたものであった。このような細胞は、ＥＰＯまたは別のＥＰ
Ｏ−Ｒアゴニストに曝露されると、ルシフェラーゼを合成することによって応答する。ル
シフェラーゼは、基質ルシフェリンを添加すると光の発光を引き起こす。したがって、こ
のような細胞におけるＥＰＯ−Ｒ活性化のレベルは、ルシフェラーゼ活性の測定によって
定量することができる。
【０２５１】
試験ペプチドの活性は、細胞に、試験ペプチドの段階希釈物を加え、次いで、これを４
時間インキュベートすることによって測定した。インキュベーション後、細胞にルシフェ
リン基質を加え、光の発光を測定した。ＥＰＯを用いて観察されたものと比較して、最大
値の半分発光をもたらす試験ペプチドの濃度を、ＥＣ５０と記録した。
【０２５２】
２．増殖アッセイ
このアッセイは、ヒトＥＰＯ−Ｒを発現するようにトランスフェクトされたマウスプレ
Ｂ細胞株に基づくものであった。この細胞株の増殖は、ＥＰＯ−Ｒ活性化に応じて変わる
。細胞増殖度は、ＭＴＴを用いて定量し、ここで、ＭＴＴアッセイにおけるシグナルは、
生存細胞数に比例する。試験ペプチドの活性は、細胞に試験ペプチドの段階希釈物を加え
、次いで、これを４８時間インキュベートすることによって測定した。インキュベーショ
ン後、細胞にＭＴＴを加え、吸光度を測定した。ＥＰＯを用いて観察されたものと比較し
て最大値の半分の吸光度をもたらす試験ペプチドの濃度をＥＣ５０として記録した。
【０２５３】
３．競合結合実験（Competitive Binding Assay）
競合結合算出は、２つのビーズ：ＥＰＯがコンジュゲートされたビーズおよびＥＰＯ−
Ｒがコンジュゲートされたビーズの近接の関数として光シグナルが生じるアッセイを用い
て行う。ビーズ近接は、ＥＰＯのＥＰＯ−Ｒとの結合によって生じる。ＥＰＯ−Ｒとの結
合についてＥＰＯと競合する試験ペプチドは、この結合を妨げ、光発光の減少を引き起こ
す。試験ペプチドなしで観察されるものと比較して、光発光の５０％減少をもたらす試験
ペプチドの濃度はＩＣ５０と記録される。
【０２５４】
４．Ｃ／ＢＦＵ−ｅアッセイ
ＥＰＯ−Ｒシグナル伝達は、骨髄幹細胞の増殖性赤血球前駆体への分化を刺激する。こ
のアッセイでは、試験ペプチドの、初代ヒト骨髄多能性幹細胞からの赤血球前駆体の増殖
および分化を刺激する能力を測定した。ヒト骨髄細胞の培養物に試験ペプチドを加え、細
胞を１６日間インキュベートする。その後、赤血球コロニーの数をカウントした。形成さ
れたコロニーの数が、ＥＰＯを用いて観察されたものと比較して最大の９０％である試験
ペプチドの濃度をＥＣ９０と記録した。
【０２５５】
【表２】
2014051498.tif 000057
【０２５６】
５．赤血球増加症のエクスハイポキシック（exhypoxic）マウスバイオアッセイ
試験ペプチドを、ＣｏｔｅｓおよびＢａｎｇｈａｍ（１９６１年）、Ｎａｔｕｒｅ  １
９１：１０６５〜１０６７頁によって記載された方法から適応させた、赤血球増加症のエ
クスハイポキシックマウスバイオアッセイにおいてｉｎ  ｖｉｖｏ活性についてアッセイ
する。このアッセイでは、試験ペプチドの、ＥＰＯミメティックとして機能する、すなわ
ち、ＥＰＯ−Ｒを活性化し、新規赤血球合成を誘導する能力を調べる。赤血球合成は、放
射標識された鉄の、合成された赤血球のヘモグロビンへの組み込みに基づいて定量する。
【０２５７】
ＢＤＦ１マウスには、７〜１０日間周囲条件に順応することを許す。すべての動物につ
いて体重を調べ、低体重の動物（＜１５グラム）は使用しない。マウスを、減圧チャンバ
ー中で合計１４日間連続的コンディショニングサイクルに付す。各２４時間のサイクルは
、０．４０±０．０２％大気圧で１８時間および周囲圧力で６時間からなる。コンディシ
ョニング後、マウスを周囲圧力でさらに７２時間維持し、その後、投与する。
【０２５８】
試験ペプチド、または組換えヒトＥＰＯ標準を、ＰＢＳ＋０．１％ＢＳＡビヒクル（Ｐ
ＢＳ／ＢＳＡ）で希釈する。まず、ペプチド単量体保存溶液をジメチルスルホキシド（Ｄ
ＭＳＯ）中で可溶化する。陰性対照群は、ＰＢＳ／ＢＳＡを単独で注射された１つの群の
マウス、１％ＤＭＳＯを注射された１つの群を含む。各投与群は、１０匹のマウスを含む
。マウスには、０．５ｍＬの適当なサンプルを用いて皮下注射（首筋）する。
【０２５９】
サンプル注射の４８時間後、約０．７５μキュリー／マウスの用量のために、０．２ｍ
ｌのＦｅ59（Ｄｕｐｏｎｔ、ＮＥＮ）の腹膜内注射をマウスに投与する。マウス体重は、
Ｆｅ59の投与の２４時間後に調べ、マウスをＦｅ59の投与の４８時間後に屠殺する。心臓
穿刺によって、各動物から血液を採取し、ヘマトクリットを調べる（ヘパリンを抗凝固剤
として用いた）。各血液サンプル（０．２ｍｌ）を、Ｐａｃｋａｒｄガンマカウンターを
用いてＦｅ59取り込みについて分析する。ノンレスポンダーマウス（すなわち、陰性対照
群よりも少ない放射性取り込みを有するマウス）は、適切なデータセットから排除する。
陰性対照群の５３％よりも低いヘマトクリット値を有するマウスも排除する。
【０２６０】
６．ヘモグロビンおよび網状赤血球（reticulocyte）アッセイ
正常赤血球の（Normocythemic）雄のSprague-Dawleyラットに、リン酸バッファー中、
ｐＨ６．０で製剤された試験ペプチドを用い、１０ｍｇ／ｋｇ（静脈内に注射された、１
０ｍｇ／ｍＬ溶液の１ｍＬ／ｋｇ注射）で投与した。５、９、１４、１９、２３、２８、
３４、４３および５７日で、血液サンプルを採取し、ヘモグロビンレベルを測定した。図
１〜４は、実施例３のペプチドと比較した、選択された実施例のペプチドについての、経
時的なヘモグロビンの上昇を示す。
【０２６１】
また、各血液サンプルの網状赤血球パーセント（％）を、チアゾールオレンジ染色およ
びフローサイトメーター分析（ｒｅｔｉｃ−ｃｏｕｎｔプログラム）によって調べた。図
５〜８は、実施例３のペプチドと比較して、選択された実施例のペプチドについて、経時
的に観察される網状赤血球パーセントの上昇を示す。
【０２６２】
雄のSprague-Dawleyラットにおける観察される網状赤血球パーセント（Ｒｅｔ％）およ
びヘモグロビン（Ｈｇｂ）の変化は、化合物ＸＶおよびＸＶＩについて測定した。正常赤
血球の雄のSprague-Dawleyラットに、リン酸バッファー中、ｐＨ６．０で製剤された試験
ペプチドを用い、１０ｍｇ／ｋｇ（静脈内にまたは皮下に注射された、１０ｍｇ／ｍＬ溶
液の１ｍＬ／ｋｇ注射）で投与した。５、９、１４、１９、２３、２８、３４、４３およ
び５７日目に、血液サンプルを採取した。各血液サンプルの網状赤血球パーセント（％）
は、チアゾールオレンジ染色およびフローサイトメーター分析（ｒｅｔｉｃ−ｃｏｕｎｔ
プログラム）によって調べた。これらの結果は、化合物ＸＶＩについては図９に、化合物
ＸＶについては図１０に示されている。ヘモグロビンレベルは、これらの時点で測定し、
化合物ＸＶＩについては図１１に、化合物ＸＶについては図１２に示されている。
【０２６３】
本発明は、本明細書に記載される具体的な実施形態による範囲に制限されない。実際、
本明細書に記載されるものに加え、本発明の種々の修飾は、以上の説明および付随する図
から当業者に明らかになろう。このような修飾は、添付の特許請求の範囲内に入るものと
する。
【０２６４】
特許、特許出願、プロトコールおよび種々の刊行物をはじめ、多数の参照文献が列挙さ
れ、本発明の説明に論じられている。このような参照文献の引用および／または議論は、
単に、本発明の説明を明確にするために提供されるのであって、このような参照文献のい
ずれも、本明細書に記載される本発明の「先行技術」であるということの承認ではない。
この明細書に列挙され、論じられるすべての参照文献は、参照によってその全文が、また
、各参照文献が参照により個別に組み込まれる場合には同程度に本明細書に組み込まれる
。
【図１】
2014051498.tif 000074
【図２】
2014051498.tif 000075
【図３】
2014051498.tif 000076
【図４】
2014051498.tif 000077
【図５】
2014051498.tif 000078
【図６】
2014051498.tif 000079
【図７】
2014051498.tif 000080
【図８】
2014051498.tif 000081
【図９】
2014051498.tif 000082
【図１０】
2014051498.tif 000083
【図１１】
2014051498.tif 000084
【図１２】
2014051498.tif 000085
【配列表】
2014051498000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成25年10月25日(2013.10.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の構造：
【化１】
2014051498.tif 000086
［式中、
λは、１≦λ≦４の整数であり；
μは、１≦μ≦４の整数であり；
Ａは、ＣＯ2Ｈ、活性化ＣＯ2Ｈ、ＮＨ2、ＮＣＯ、ＣＨＯ、マレイミドまたはビニルス
ルホンのいずれかであり；
Ｂは、ＣＨまたはＮのいずれかであり；
Ｇは、（ＣＨ2）ν、ＣＯまたはＣＯＣＨ2ＯＣＨ2ＣＯのいずれかであり；
Ｅは、ＮＨ2、ＮＨＢｏｃ、ＣＯ2Ｈ、ＣＨＯまたはマレイミドのいずれかであり；
Ｘは、ＣＯ、結合またはＣＯＮＨのいずれかであり；
Ｙは、ＣＯ、結合またはＮＨＣＯのいずれかであり；
νは、２≦ν≦４の整数である］
を有するリンカー部分化合物。
【請求項２】
λが、１≦λ≦３の整数であり；
μ＝２であり；
Ａが、ＣＯ2Ｈまたは活性化ＣＯ2Ｈのいずれかであり；
Ｂが、Ｎであり；
Ｇが、（ＣＨ2）ν、ＣＯまたはＣＯＣＨ2ＯＣＨ2ＣＯのいずれかであり；
Ｅが、ＮＨ2またはＮＨＢｏｃであり；
Ｘが、ＣＯまたは結合であり；
Ｙが、ＣＯまたは結合であり；
ν＝２である、請求項１に記載のリンカー部分化合物。
【請求項３】
ペプチド部分、リンカー部分および水溶性ポリマー部分を含む化合物であって、リンカ
ー部分が、ペプチド部分と水溶性ポリマー部分の間にあり、以下の構造：
【化２】
2014051498.tif 000087
［式中、
λは、１≦λ≦４の整数であり；
μは、１≦μ≦４の整数であり；
Ａは、ＣＯ、ＮＨ、ＮＣＯまたはＳＯ2ＣＨ2ＣＨ2のいずれかであり；
Ｂは、ＣＨまたはＮのいずれかであり；
Ｇは、（ＣＨ2）ν、ＣＯまたはＣＯＣＨ2ＯＣＨ2ＣＯであり；
Ｅは、ＮＨまたはＣＯのいずれかであり；
Ｘは、ＣＯ、結合またはＣＯＮＨのいずれかであり；
Ｙは、ＣＯ、結合またはＮＨＣＯのいずれかであり；
νは、２≦ν≦４の整数である］
を有する化合物と、
（ｂ）１種または複数の製薬上許容される希釈剤、保存料、可溶化剤、乳化剤、アジュ
バントおよび／または担体。
【請求項４】
λが、１≦λ≦３の整数であり；
μ＝２であり；
Ａが、ＣＯであり；
Ｂが、Ｎであり；
Ｇが、（ＣＨ2）ν、ＣＯまたはＣＯＣＨ2ＯＣＨ2ＣＯであり；
Ｅが、ＮＨであり；
Ｘが、ＣＯまたは結合であり；
Ｙが、ＣＯまたは結合であり；
ν＝２である、請求項３に記載の化合物。
【請求項５】
水溶性ポリマー部分が、少なくとも1つのポリ（エチレングリコール）鎖を含むポリ（エチレングリコール）部分である、請求項３または４に記載の化合物。
【請求項６】
ポリ（エチレングリコール）鎖の分子量が１０〜３０ｋＤａである、請求項５に記載の化合物。
【請求項７】
ポリ（エチレングリコール）鎖の各々が直鎖である、請求項５に記載の化合物。
【請求項８】
ポリ（エチレングリコール）鎖の各々が２０ｋＤａの分子量を有する、請求項５に記載の化合物。
【請求項９】
ポリ（エチレングリコール）部分が、１．２０未満の多分散値（ＭW／Ｍn）を有する、請求項５に記載の化合物。
【請求項１０】
ペプチド部分が、単一のペプチドを含むペプチド単量体である、請求項３〜９のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１１】
ペプチド部分が、２種のペプチドを含むペプチド二量体である、請求項３〜９のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１２】
各ペプチドが、５０個以下のアミノ酸単量体を含む、請求項１０または１１に記載の化合物。
【請求項１３】
ペプチド部分が、エリスロポエチン受容体と結合する１種または複数のペプチドを含む、請求項３〜１２のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１４】
ペプチド部分が、配列番号：１〜２７のうちの１つである、請求項３〜１３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１５】
ペプチド部分が、Ｎ末端リジン残基を含み、さらにリジン残基のεアミノ基がリンカー部分と共有結合している、請求項３〜１４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１６】
ペプチド二量体（配列番号：１６）を含み、かつ
次式：
【化３】
2014051498.tif 000088
を有する、化合物。
【請求項１７】
ペプチド二量体（配列番号：１６）を含み、かつ
次式：
【化４】
2014051498.tif 000089
を有する、化合物。
【請求項１８】
以下の（ａ）および（ｂ）を含有する薬剤組成物。
（ａ）請求項３〜１７のいずれか一項に記載の化合物：および
（ｂ）１または複数種類の製薬上許容される希釈剤、保存料、可溶化剤、乳化剤および／または担体
【外国語明細書】
2014051498000001.pdf