(57)【要約】      （修正有）【課題】改良された特性を呈するＣＨＩＰＳタンパク質の新規変異型に基づく医薬を提供する。【解決手段】、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus auras）の走化性阻害タンパク質（「ＣＨＩＰＳ」）の生物活性を有するポリペプチド、変異体。黄色ブドウ球菌の走化性阻害タンパク質（「ＣＨＩＰＳ」）の生物活性を有するポリペプチドであって、変異体を含み、以下のアミノ酸：Ｋ４０、Ｄ４２、Ｎ７７、Ｋ１００、Ｋ１０５、Ｎ１１１およびＧ１１２、が修飾されている、ポリペプチド。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
黄色ブドウ球菌の走化性阻害タンパク質（「ＣＨＩＰＳ」）の生物活性を有するポリペプチドであって、配列番号１のアミノ酸配列の変異体を含み、
以下のアミノ酸、
Ｋ４０、Ｄ４２、Ｎ７７、Ｋ１００、Ｋ１０５、Ｎ１１１およびＧ１１２
が修飾されている、ポリペプチド。
【請求項２】
配列番号１のアミノ酸１〜１１２を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
配列番号１に対して以下のアミノ酸突然変異、
Ｋ１００Ｒ、Ｎ１１１Ｉ、Ｎ１１１ＫまたはＧ１１２Ｖ
の１つ又は複数を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項４】
野生型ＣＨＩＰＳタンパク質よりもヒトにおいて免疫原性ではない、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項５】
前記ポリペプチドの生物活性が、野生型ＣＨＩＰＳタンパク質の生物活性より高い、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６】
好中球のＣ５ａ誘導性活性化の阻害能及び好中球のｆＭＬＰ誘導性活性化の阻害能を有する、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項７】
好中球のＣ５ａ誘導性活性化及び／又は好中球のｆＭＬＰ誘導性活性化が、少なくとも１０％まで阻害される、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項８】
８０〜５００アミノ酸長である、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項９】
１１０〜１２０アミノ酸長である、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
１１２アミノ酸長である、請求項９に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
配列番号１のアミノ酸配列の断片を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸３１〜１１３を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
配列番号１のアミノ酸配列のＮ末端又はＣ末端のいずれかに挿入される１つ又は複数の追加的なアミノ酸を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
少なくとも２個の追加的なアミノ酸を含む、請求項１３に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
６個の追加的なアミノ酸を含む、請求項１４に記載のポリペプチド。
【請求項１６】
前記追加的なアミノ酸が、配列番号１のアミノ酸配列のＣ末端に位置する、請求項１３に記載のポリペプチド。
【請求項１７】
前記アミノ酸が、以下の修飾
Ｋ４０Ｅ、Ｎ１１１Ｋ及びＧ１１２Ｖ
を含む配列番号１のアミノ酸１〜１１２から構成される、請求項１３に記載のポリペプチド。
【請求項１８】
野生型配列に対して以下のアミノ酸突然変異
Ｋ４０Ｅ、Ｋ４０Ｎ、Ｄ４２Ｖ、Ｎ７７Ｙ、Ｋ１００Ｒ、Ｋ１０５Ｒ、Ｎ１１１Ｋ、Ｎ１１１ＩまたはＧ１１２Ｖ
の１つ又は複数を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１９】
以下の修飾
Ｋ４０Ｅ、Ｄ４２Ｖ、Ｎ７７Ｙ、Ｋ１００Ｒ、Ｋ１０５Ｒ、Ｎ１１１ＫおよびＧ１１２Ｖ
を含む配列番号１のアミノ酸１〜１１２を含むポリペプチドである、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項２０】
アミノ酸Ｒ及びＳを、それぞれ１１３位及び１１４位に更に含む、請求項１９に記載のポリペプチド。
【請求項２１】
以下の修飾、
Ｋ４０Ｅ、Ｄ４２Ｖ、Ｎ７７Ｙ、Ｋ１００Ｒ、Ｋ１０５Ｒ、Ｎ１１１Ｋ及びＧ１１２Ｖ
を含む配列番号１のアミノ酸３１〜１１３を含むポリペプチドである、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項２２】
請求項１に記載のポリペプチドを含む薬理学的組成物。
【請求項２３】
以下のアミノ酸、
Ｋ４０、Ｄ４２、Ｎ７７、Ｋ１００、Ｋ１０５、Ｎ１１１およびＧ１１２
で配列番号１に対してアミノ酸置換を含む、配列番号１のアミノ酸１〜１１２からなる、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項２４】
配列番号１のアミノ酸１〜１１４、アミノ酸３１〜１１２またはアミノ酸３１〜１２１からなる群から選択される、配列番号１のアミノ酸配列の断片からなる、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項２５】
配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸３１〜１１３からなる、請求項１１に記載のポリペプチド。
【請求項２６】
配列番号１のアミノ酸配列のＮ末端又はＣ末端のいずれかに挿入される１つ又は複数の追加的なアミノ酸のみを含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項２７】
少なくとも２個の追加的なアミノ酸のみを含む、請求項２６に記載のポリペプチド。
【請求項２８】
６個の追加的なアミノ酸のみを含む、請求項２７に記載のポリペプチド。
【請求項２９】
以下の修飾
Ｋ４０Ｅ、Ｄ４２Ｖ、Ｎ７７Ｙ、Ｋ１００Ｒ、Ｋ１０５Ｒ、Ｎ１１１ＫおよびＧ１１２Ｖ
を含む配列番号１のアミノ酸１〜１１２からなるポリペプチドである、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３０】
以下の修飾
Ｋ４０Ｅ、Ｄ４２Ｖ、Ｎ７７Ｙ、Ｋ１００Ｒ、Ｋ１０５Ｒ、Ｎ１１１ＫおよびＧ１１２Ｖ
を含む配列番号１のアミノ酸３１〜１１３からなるポリペプチドである、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３１】
好中球のＣ５ａ誘導性活性化及び／又は好中球のｆＭＬＰ誘導性活性化が、少なくとも５０％まで阻害される、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３２】
８０〜１３０アミノ酸長である、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３３】
配列番号１のアミノ酸１〜１１４、アミノ酸３１〜１１２、アミノ酸３１〜１１３またはアミノ酸３１〜１２１からなる群から選択される、配列番号１のアミノ酸配列の断片を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３４】
配列番号１のアミノ酸１〜１１４、アミノ酸３１〜１１２、アミノ酸３１〜１１３またはアミノ酸３１〜１２１からなる群から選択される、配列番号１のアミノ酸配列の断片からなる、請求項１に記載のポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規ポリペプチドと、補体Ｃ５ａ受容体及び／又はホルミル化ペプチド受容体の活性化に関連する病態及び疾患の処置におけるその使用とに関する。特に本発明は、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）の走化性阻害タンパク質（「ＣＨＩＰＳ」）の変異型と、急性及び慢性炎症性障害の処置におけるその使用とを提供する。
【背景技術】
【０００２】
黄色ブドウ球菌は一般的なヒト病原体であり、様々な疾患を引き起こす。黄色ブドウ球菌が疾患を引き起こす機序は、複数の要因からなる。毒素性ショック症候群の原因である毒素性ショック症候群毒素（ＴＳＳＴ−１）又はエンテロトキシンのような特定の毒素により引き起こされる一部のブドウ球菌性疾患を除き、黄色ブドウ球菌感染症の病原性は単一因子に依存するものではない。黄色ブドウ球菌は多岐にわたる種々の「道具」を有して疾患を引き起こす。こうした種々の要因が全て複合し、一体となって作用することにより、宿主内でのコロニー形成、成長及び伝播が促進される。食細胞による食作用及びブドウ球菌の死滅は、最も重要な宿主防御機構である。食細胞は、侵入菌により放出されるサイトカイン及びケモカイン（ホルミル化ペプチドのような）によって、且つ補体系のような炎症カスケードが活性化すると、感染部位に誘引される。こうした化学誘引物質の放出により、食細胞を炎症部位に誘引する勾配が生じる。
【０００３】
成長している黄色ブドウ球菌の上清の食細胞との相互作用が、フェルトカンプ（Veldkamp）らにより研究された。彼らの発見によればブドウ球菌上清は食細胞を刺激できるが、モノクローナル抗体により検出すると、そこには補体Ｃ５ａ受容体（Ｃ５ａＲ）及びホルミル化ペプチド受容体（ＦＰＲ）の発現を特異的に下方制御し得る因子もまた存在した（フェルトカンプ（Veldkamp）ら、２０００年、Infect Immun ６８（１０）：５９０８−１３頁；フェルトカンプ（Veldkamp）ら、１９９７年、Inflammation ２１（５）：５４１−５１頁）。彼らは黄色ブドウ球菌の上清から、この作用を担う１４．１ｋＤａのタンパク質を単離した。このタンパク質はＣＨＩＰＳ、黄色ブドウ球菌の走化性阻害タンパク質と名付けられた。ＣＨＩＰＳはＣ５ａ及びｆＭＬＰによる好中球の走化性及び活性化を阻害できる。さらにＣＨＩＰＳは、好中球に存在する他の化学誘引物質受容体、例えば、ＦＰＲ様１、Ｃ３ａＲ、ＩＬ−８ＲＡ及びＩＬ−８ＲＢ、ＬＴＢ４受容体、及びＰＡＦ受容体を含め、広範に選択肢として存在する他の受容体に影響を及ぼさなかったため、非常に選択的であることが分かった。これは、ＣＨＩＰＳがＧタンパク質共役受容体ファミリーの２つのメンバーＣ５ａＲとＦＰＲとを特異的に阻害することを示す。ＣＨＩＰＳは細胞に対し毒性がなく、単球及びマスト細胞のような他の細胞上のＣ５ａＲもまた阻害する。
【０００４】
ポツマ（Postma）らは、ＣＨＩＰＳがエネルギー上依存しない方法でＣ５ａＲ及びＦＰＲの双方と直接結合することを示した。さらに、ＣＨＩＰＳはそれらの受容体と結合しても内部に取り込まれない。ＣＨＩＰＳは双方の受容体に結合し、その見かけのＫｄ値はＣ５ａＲ及びＦＰＲに対しそれぞれ１．１及び３５．４ｎＭである（ポツマ（Postma）ら、２００４年、J Immunol １７２（１１）：６９９４−７００１頁を参照）。これらのＫｄ値は、それらの天然リガンドについて記載されるものと同じ範囲である（バン・エプス（Van Epps）ら、１９９３年、J Immunol １５０（１）：２４６−２５２頁；フォーク（Falk）ら、１９８２年、Infect Immun ３６（２）：４５０−４５４頁；ヒューイ及びフークリ（Huey & Hugli）、１９８５年、Immunol. １３５（３）：２０６３−８頁；パイク（Pike）ら、１９８０年、J Exp Med １５２（１）：３１−４０頁を参照）。ＣＨＩＰＳ中のホルミル化ペプチド受容体及びＣ５ａ受容体に結合するための活性部位は、ＣＨＩＰＳ分子の異なる領域内に位置する。Ｎ末端とＣ末端との終端、及び特に第１アミノ酸と第３アミノ酸とが、ホルミル化ペプチド受容体に対するＣＨＩＰＳ活性に関与する（ハース（Haas）ら、２００４年、J Immunol １７３（９）：５７０４−１１頁を参照）。少なくとも最初の３０個のＮ末端アミノ酸は、ＣＨＩＰＳのＣ５ａＲに対する結合及びその遮断において役割を果たさない。従って、最初の３０個のアミノ酸を含まないＣＨＩＰＳタンパク質ＣＨＩＰＳ31-121は、Ｃ５ａＲ遮断活性の完全な保存を示すが、ＦＰＲに対する活性は完全に喪失している（ハース（Haas）ら、２００５年、J Mol Biol ３５３（４）：８５９−８７２頁を参照）。
【０００５】
ここ２〜３年の間に、ＦＰＲ及びＣ５ａＲのようなケモカイン受容体は、宿主防御の他にも様々な他の炎症過程に関与することが明らかとなってきた。近年、ＦＰＲに対する様々な新規及び宿主由来のアゴニストが同定され、疾患過程におけるＦＰＲの機能上の意義は広範となっている（レ（Le）ら、２００２年、Trends Immunol ２３（１１）：５４１−８頁を参照）。敗血症、虚血再灌流傷害、関節リウマチ、喘息及び免疫複合体病を含め、広範囲に及ぶ種々の疾患過程におけるＣ５ａＲの明らかな役割に関して多くの研究が行われている。動物モデルを用いた様々な実験研究により、こうした疾患過程においてＣ５ａＲを標的とすることが有利に影響することが実証された（グオ（Guo）ら、２００４年、Shock ２１（１）：１−７頁；フーバー−ラング（Huber-Lang）ら、２００１年、J Immunol １６６（２）：１１９３−１１９９頁；ヘラー（Heller）ら、１９９９年、J Immunol １６３（２）：９８５−９４頁を参照）。ＦＰＲ及びＣ５ａＲを特異的に阻害するＣＨＩＰＳ固有の特性から、このタンパク質は、ＦＰＲ又はＣ５ａＲ刺激が重要な役割を果たすこうした疾患における有望な候補抗炎症薬物となる。
【０００６】
単離されたヒト好中球及びマウス好中球による実験により、マウスＣ５ａＲに対するＣＨＩＰＳの活性はヒト受容体に対する活性より少なくとも３０倍低いことが示されている。マウス細胞と比較したときのヒト細胞に対する活性のこの３０倍の差によって示されるとおりのＣＨＩＰＳのヒト特異性は、マウス感染モデル又は他の動物モデルにおけるＣＨＩＰＳの試験を阻むものである。
【０００７】
黄色ブドウ球菌はヒト皮膚に通常みられる片利共生生物であり、黄色ブドウ球菌により引き起こされる軽度の皮膚感染又は創傷感染は通常、自己限定的である。黄色ブドウ球菌は体のどの組織にも感染する可能性があり、ときには一次感染部位から伝播して、骨髄炎、心内膜炎、肺炎、及び敗血症などの生命を脅かすような疾患を引き起こす。ＣＨＩＰＳ遺伝子は黄色ブドウ球菌臨床株及び健康保因者由来の株の大半に存在し、ＣＨＩＰＳはドハース（de Haas）らにより記載されるとおり、マウス感染モデルを使用してインビボで産生される（ハース（Haas）ら、２００４年、J Exp Med １９９（５）：６８７−９５頁を参照）。黄色ブドウ球菌は非常に一般的な細菌であるため、ほとんどの人が生涯のうち早期に黄色ブドウ球菌及びＣＨＩＰＳタンパク質に遭遇し、それにより抗ＣＨＩＰＳ抗体の産生がもたらされると考えられる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】フェルトカンプ（Veldkamp）ら、２０００年、Infect Immun ６８（１０）：５９０８−１３頁
【非特許文献２】フェルトカンプ（Veldkamp）ら、１９９７年、Inflammation ２１（５）：５４１−５１頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、改良された特性を呈するＣＨＩＰＳタンパク質の新規変異型に基づく医薬を提供しようとするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の第１の態様は、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus auras）の走化性阻害タンパク質（「ＣＨＩＰＳ」）の生物活性を有するポリペプチドを提供し、このポリペプチドは配列番号１のアミノ酸配列の変異体を含んでなる。
【００１１】
野生型ＣＨＩＰＳタンパク質のアミノ酸配列は以下に示される。
ＦＴＦＥＰＦＰＴＮＥＥＩＥＳＮＫＫＭＬＥＫＥＫＡＹＫＥＳＦＫＮＳＧＬＰＴＴＬＧＫＬＤＥＲＬＲＮＹＬＫＫＧＴＫＮＳＡＱＦＥＫＭＶＩＬＴＥＮＫＧＹＹＴＶＹＬＮＴＰＬＡＥＤＲＫＮＶＥＬＬＧＫＭＹＫＴＹＦＦＫＫＧＥＳＫＳＳＹＶＩＮＧＰＧＫＴＮＥＹＡＹ
配列番号１
野生型ＣＨＩＰＳタンパク質のアミノ酸配列は、データベース受託番号ＡＡＱ１４３３９、ＣＡＧ４１０２２及びＹＰ＿０４１４０９にも開示される。
【００１２】
「変異体」とは、そのポリペプチドが野生型ＣＨＩＰＳタンパク質と１００％のアミノ酸配列同一性を共有しないことを意味し、すなわち、野生型ＣＨＩＰＳタンパク質のアミノ酸は修飾されているはずである。例えばこのポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも６０％の同一性、より好ましくは前記配列と少なくとも７０％又は８０％又は８５％又は９０％の同一性、及び最も好ましくは前記アミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなり得る。
【００１３】
同一性パーセントは、当該技術分野において周知の方法により決定でき、例えばExpasyファシリティ・サイト（http://www.ch.embnet.org/software/LALIGN#form.html）におけるＬＡＬＩＧＮプログラム（ファン（Huang）及びミラー（Miller）、Adv. Appl. Math. （１９９１年）１２：３３７−３５７頁）を使用し、パラメータとして大域的アラインメント・オプション、スコアリング行列ＢＬＯＳＵＭ６２、開始ギャップ・ペナルティ−１４、伸長ギャップ・ペナルティ−４を用いる。
【００１４】
あるいは、２つのポリペプチド間の配列同一性パーセントは、好適なコンピュータ・プログラム、例えばウィスコンシン大学遺伝計算グループ（University of Wisconsin Genetic Computing Group）のＧＡＰプログラムを使用して決定されてもよく、同一性パーセントは配列が最適に整列されたポリペプチドに関して計算されることは理解されるであろう。
【００１５】
一実施形態において変異体は、ポリペプチド表面に露出している１つ又は複数のアミノ酸に修飾を含んでなる。表面に露出したアミノ酸は、当該技術分野において周知の技法を使用して決定され得る（実施例Ｅを参照）。しかしながら、露出していないアミノ酸の修飾もまた、結果として（野生型ＣＨＩＰＳタンパク質と比べて）変異ポリペプチドの表面に構造的な変化をもたらし得ることは理解されるであろう。
【００１６】
さらなる実施形態において、野生型ＣＨＩＰＳタンパク質内の以下のアミノ酸の１つ又は複数が修飾される。
Ｎ３１、Ｓ３２、Ｇ３３、Ｌ３４、Ｐ３５、Ｋ４０、Ｄ４２、Ｒ４６、Ｙ４８、Ｋ５０、Ｇ５２、Ｔ５３、Ｋ５４、Ｎ５５、Ｓ５６、Ａ５７、Ｑ５８、Ｋ６１、Ｅ６７、Ｋ６９、Ｌ７６、Ｎ７７、Ｐ７９、Ｄ８３、Ｌ９０、Ｋ９２、Ｋ１００、Ｋ１０１、Ｓ１０４、Ｋ１０５、Ｓ１０７、Ｙ１０８、Ｎ１１１及びＧ１１２。
【００１７】
「修飾された」とは、特定の位置におけるアミノ酸が野生型ＣＨＩＰＳタンパク質の天然アミノ酸と比較して改変されていることを意味する。例えば、特定の位置におけるアミノ酸が非天然であっても、欠失していても、若しくは置換されていてもよく、又は１つ若しくは複数のアミノ酸の挿入／付加部位であってもよい。アミノ酸分子はまた、他の方法、例えば化学修飾によっても修飾され得る。
【００１８】
このように、本発明のポリペプチドは、ペプチド結合又は修飾されたペプチド結合、例えばペプチドエステルにより互いに連結されるアミノ酸から構成され得るとともに、２０個の遺伝子をコードするアミノ酸以外のアミノ酸を含み得る。例えば本ポリペプチドは、Ｌ−アミノ酸及び／又はＤ−アミノ酸、並びに、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメート、Ｏ−ホスホセリン及びＯ−ホスホチロシンなどの修飾アミノ酸を含み得る。本ポリペプチドは、翻訳後修飾などの自然の過程か、又は当該技術分野において周知の化学修飾技法により修飾されてもよい。修飾は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖及びアミノ末端又はカルボキシ末端を含め、変異ＣＨＩＰＳポリペプチドのアミノ酸配列内のどこでも起こり得る。
【００１９】
しかしながら、一実施形態において本発明のポリペプチドは、天然Ｌ−アミノ酸を含んでなるか、又はそれらから構成される。
【００２０】
既知のポリペプチドの修飾型又は変異型は、当該技術分野において周知の技法を使用して産生できる（サムブルック及びラッセル（Sambrook & Russell）、２０００年、「Molecular Cloning, A Laboratory Manual」、第３版、コールド・スプリング・ハーバー（Cold Spring Harbor）、ニューヨーク（New York）を参照、この文献は参照により本明細書に援用される）。例えば、部位特異的突然変異誘発により特定のアミノ酸残基に点突然変異が導入されてもよい（サムブルック及びラッセル（Sambrook & Russell）、上記、第１３章を参照）。親ポリヌクレオチドの変異体を生成するためのさらなる方法は、以下に記載される。
【００２１】
本明細書で使用されるとき、「生物活性」は、野生型ＣＨＩＰＳタンパク質の生体、組織又は細胞に対する作用を指す。限定はされないが、その天然リガンドとの結合、並びに生体に直接的又は間接的な作用を引き起こすそれより下流のイベントが挙げられる。従って、ＣＨＩＰＳタンパク質の「生物活性」には、補体成分Ｃ５ａ及び／又はＮ−ホルミルペプチドｆＭＬＰにより誘導される好中球の走化性及び／又は活性化の阻害が含まれる。例えば保持する活性としては、Ｃ５ａ受容体（Ｃ５ａＲ）の拮抗作用及び／又はホルミル化ペプチド受容体（ＦＰＲ）の拮抗作用を含んでなり得る。
【００２２】
しかしながら、一実施形態において本発明の変異ＣＨＩＰＳポリペプチドはＦＰＲ結合部位を欠いている。
【００２３】
さらなる実施形態において、本発明のポリペプチドはインビボでＣＨＩＰＳタンパク質の１つ又は複数の生物活性を呈する。
【００２４】
野生型ＣＨＩＰＳタンパク質及びその変異体の生物活性及び結合特性を決定するためのアッセイは当該技術分野において周知である（実施例を参照）。
【００２５】
当然ながら当業者は、本発明の第１の態様のポリペプチドが呈する生物活性のレベルが野生型ＣＨＩＰＳタンパク質の呈するレベルより低いことも、それと同じであることも、又はそれより高いこともある点を理解するであろう。好ましくは、本発明のポリペプチドが呈する生物活性のレベルは、野生型ＣＨＩＰＳタンパク質が呈するレベルの少なくとも１０％、例えば少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又はそれ以上である。より好ましくは、本発明のポリペプチドが呈する生物活性のレベルは、野生型ＣＨＩＰＳタンパク質の呈する生物活性と比較して同じか、又はそれ以上である。最も好ましくは、本発明のポリペプチドが呈する生物活性のレベルは、野生型ＣＨＩＰＳタンパク質より高い（すなわち、活性がより大きい）。例えば、本発明のポリペプチドが呈する生物活性のレベルは、野生型ＣＨＩＰＳタンパク質が呈するレベルの少なくとも１１０％、例えば少なくとも１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２５０％、３００％、５００％又はそれ以上であり得る。
【００２６】
さらなる実施形態において、本発明のポリペプチドはＣ５ａＲ及び／又はＦＲＰに対して特異的な結合活性を有し、この活性は、野生型ＣＨＩＰＳタンパク質が呈する対応する活性と同等か、又はそれより大きい。
【００２７】
従って、本発明のポリペプチドはＣＨＩＰＳタンパク質の生物活性のみを呈し、すなわち本ポリペプチドの活性は選択的である。例えば、本発明のポリペプチドは補体成分Ｃ５ａ及び／又はＮ−ホルミルペプチドｆＭＬＰにより選択的に誘導される好中球の走化性及び／又は活性化を阻害し得る。「選択的である」とは、ポリペプチドの前記生物活性を阻害する程度が、細胞中の他のタンパク質の活性を調節する程度より大きいことを意味する。従って、このポリペプチドは好ましくは野生型ＣＨＩＰＳタンパク質の生物活性のみを阻害するが、細胞内の他のタンパク質の発現及び活性も選択的阻害による結果として下流で変化し得ることは理解されるであろう。従って本出願人らは、細胞過程に対し非特異的作用を有する作用物質は排除する。
【００２８】
本発明の第１の態様のさらに別の実施形態において、本ポリペプチドは、１つ又は複数の表面エピトープが修飾されている野生型ＣＨＩＰＳタンパク質の変異体である。かかる修飾は、直接的であるか（すなわちエピトープそれ自体のなかのアミノ酸の修飾）、又は間接的であるか（すなわちエピトープのアミノ酸の修飾ではないが、修飾されると、エピトープ内のアミノ酸又はかかるエピトープの構造の修飾がもたらされる）、いずれもあり得る。
【００２９】
「表面エピトープ」とは、ＣＨＩＰＳ抗原への曝露に応答して産生される抗ＣＨＩＰＳ抗体及び／又は黄色ブドウ球菌への曝露に応答して産生される抗体により認識される野生型ＣＨＩＰＳタンパク質の表面に露出したアミノ酸残基のコンホメーションを意味する。
【００３０】
例えば、表面エピトープは以下のエピトープ群から選択され得る。
【００３１】
【表１】
2014001212.tif 000002
【００３２】
【表２】
2014001212.tif 000003
【００３３】
誤解を避けるためにいえば、上記の例示的突然変異は非限定的である。
【００３４】
上記のエピトープのリストは必ずしも包括的なものではないことは理解されるであろう。野生型ＣＨＩＰＳタンパク質の表面上には他のエピトープが存在し得る。例えば、以下のアミノ酸、
Ｎ３１、Ｓ３２、Ｇ３３、Ｋ５０、Ｋ６１、Ｓ１０４、Ｎ１１１及びＧ１１２；
Ｎ５５、Ｋ１００、Ｓ１０７、Ｓ１０８；
Ｋ６９、Ｌ３４、Ｐ３５、Ｋ９２及びＥ６７；及び
Ｋ６９、Ｌ３４、Ｌ９０、Ｐ３５、Ｋ９２及びＥ６７
が１つ又は複数の追加的な表面エピトープの一部をなし得る。
【００３５】
さらに当業者は、上記の表面エピトープの１つ又は複数が変異している「親」ＣＨＩＰＳポリペプチドは、配列番号１の野生型ＣＨＩＰＳ配列、又はその断片若しくは変異体（例えば、配列番号１のアミノ酸１〜１１２、アミノ酸１〜１１４又はアミノ酸３１〜１１３）であり得ることを理解するであろう。
【００３６】
本発明の第１の態様の別の実施形態において、本ポリペプチドは配列番号１に対し以下のアミノ酸、
Ｎ３１、Ｓ３２、Ｇ３３、Ｌ３４、Ｐ３５、Ｋ４０、Ｄ４２、Ｒ４６、Ｙ４８、Ｋ５０、Ｇ５２、Ｔ５３、Ｋ５４、Ｎ５５、Ｓ５６、Ａ５７、Ｑ５８、Ｋ６１、Ｅ６７、Ｋ６９、Ｌ７６、Ｎ７７、Ｐ７９、Ｄ８３、Ｌ９０、Ｋ９２、Ｋ１００、Ｋ１０１、Ｓ１０４、Ｋ１０５、Ｓ１０７、Ｙ１０８、Ｎ１１１及びＧ１１２
の１つ又は複数においてアミノ酸置換を含んでなる。
【００３７】
当業者は、この置換が保存的であっても、又は非保存的であってもよいことを理解するであろう。「保存的置換」とは、Ｇｌｙ，Ａｌａ；Ｖａｌ，Ｉｌｅ，Ｌｅｕ；Ａｓｐ，Ｇｌｕ；Ａｓｎ，Ｇｌｎ；Ｓｅｒ，Ｔｈｒ；Ｌｙｓ，Ａｒｇ；及びＰｈｅ，Ｔｙｒなどの組み合わせを意図する。
【００３８】
例えば、本ポリペプチドは野生型配列に対し以下のアミノ酸突然変異、
Ｎ３１Ａ、Ｓ３２Ａ、Ｇ３３Ａ、Ｌ３４Ａ、Ｐ３５Ａ、Ｙ４８Ａ、Ｙ４８Ｈ、Ｋ５０Ｎ、Ｇ５２Ａ、Ｔ５３Ａ、Ｎ５５Ａ、Ｓ５６Ａ、Ｋ６１Ａ、Ｋ６９Ａ、Ｐ７９Ａ、Ｌ９０Ａ、Ｌ９０Ｐ、Ｋ９２Ｒ、Ｋ１００Ｒ、Ｓ１０４Ｙ、Ｓ１０７Ａ、Ｙ１０８、Ｎ１１１Ｉ、Ｎ１１１Ｋ及びＧ１１２Ｖ
の１つ又は複数を含んでなり得る。
【００３９】
本発明の第１の態様の特定の実施形態において、本ポリペプチドのヒトにおける免疫原性は野生型ＣＨＩＰＳタンパク質より低い。
【００４０】
「免疫原性」とは、宿主生物において免疫応答を誘発する（すなわち抗ポリペプチド抗体を産生する）ポリペプチドの能力を意味する。好ましくは本ポリペプチドのヒトにおける免疫原性は、野生型ＣＨＩＰＳタンパク質より低い。
【００４１】
免疫原性は当該技術分野において周知の方法により測定され得る。例えば、ウサギ又は他の動物種（マウス、ラット、モルモット、イヌ等）が本発明のポリペプチドで免疫され、免疫複合体の形成が測定されてもよい。理想的には、種特異的な効果を排除するため、免疫応答はいくつかの異なる種で試験される。ヒトにおいて考えられ得る免疫原性を評価するための好適な一方法は、ヒト抗ＣＨＩＰＳ ＩｇＧの精製、及び例えばＥＬＩＳＡを使用した、変異ポリペプチドのかかる抗体に対する親和性の測定を伴う（下記の実施例を参照）。
【００４２】
さらなる実施形態において、本発明のポリペプチドは好中球のＣ５ａ誘導性活性化の阻害能及び好中球のｆＭＬＰ誘導性活性化の阻害能を有する。かかる阻害は部分的であることも、又は完全なこともある。従って、好中球のＣ５ａ誘導性活性化及び／又は好中球のｆＭＬＰ誘導性活性化は本発明のポリペプチドに応答して、本ポリペプチドの不在下における活性化と比較して少なくとも１０％、例えば少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、及び好ましくは１００％阻害され得る。
【００４３】
野生型ＣＨＩＰＳタンパク質は１２１個のアミノ酸を含む（ｃｈｂ遺伝子産物からの２８アミノ酸シグナルペプチドの切断後）。しかしながら、当業者は本発明のポリペプチドが任意の長さであり得ることを理解するであろう。例えば、本ポリペプチドは１２１個より多い、又は少ないアミノ酸を含んでなってもよく、又はそれらから構成されてもよく、或いは１２１個ちょうどのアミノ酸を含んでなってもよく、又はそれらから構成されてもよい。好ましくは本ポリペプチドは５００アミノ酸長より短く、例えば４００、３００、２００、１５０、１４０、１３０、１２５、１２１、１２０、１１９、１１８、１１７、１１６、１１５、１１４、１１３、１１２、１１１、１１０、１０９、１０８、１０７、１０６、１０５、１０４、１０３、１０２、１０１、１００、９５、９０、８５、８０、７５、７０、６５、６０、５５、５０、４０、３０以下のアミノ酸長より短い。
【００４４】
例えば本ポリペプチドは、１１０〜１３０アミノ酸長、例えば１１０〜１２０アミノ酸長、例えば１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８又は１１９アミノ酸長であり得る。一実施形態において、本ポリペプチドは１１２アミノ酸長である。
【００４５】
本発明の第１の態様のさらなる実施形態において、本ポリペプチドは配列番号１のアミノ酸配列の断片、又はその変異体を含んでなるか、又はそれらから構成される。
【００４６】
「断片」とは、配列番号１のアミノ酸配列の少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１０５、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９又は１２０個の連続したアミノ酸を含む。例えば本ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸１〜１１４、アミノ酸３１〜１１２、アミノ酸３１〜１１３又はアミノ酸３１〜１２１の変異配列を含んでなってもよく、又はそれらから構成されてもよい。
【００４７】
本発明の第１の態様の例示的実施形態において、本ポリペプチドは、以下の修飾、
（ａ）Ｋ４０Ｅ、Ｋ６９Ａ、Ｎ１１１Ｋ及びＧ１１２Ｖ；
（ｂ）Ｇ１１２Ｖ；
（ｃ）Ｋ５４Ｒ、Ｋ６９Ｒ、Ｋ１００Ｒ及びＫ１０５Ｒ；
（ｄ）Ｋ４０Ｎ及びＫ９２Ｒ；
（ｅ）Ｓ１０４Ｙ及びＮ１１１Ｉ；
（ｆ）Ｋ６９Ａ及びＧ１１２Ｖ；
（ｇ）Ｋ６９Ｔ；
（ｈ）Ｙ４８Ｈ、Ｄ８３Ｇ及びＬ９０Ｐ；
（ｉ）Ｋ５０Ｎ；
（ｊ）Ｋ６９Ａ、Ｋ１００Ｒ及びＫ１０１Ｒ；
（ｋ）Ｋ６９Ａ；
（ｌ）Ｎ３１Ａ；
（ｍ）Ｓ３２Ａ；
（ｎ）Ｇ３３Ａ；
（ｏ）Ｌ３４Ａ；
（ｐ）Ｐ３５Ａ；
（ｑ）Ｙ４８Ａ；
（ｒ）Ｇ５２Ａ；
（ｓ）Ｔ５３Ａ；
（ｔ）Ｎ５５Ａ；
（ｕ）Ｓ５６Ａ；
（ｖ）Ｅ６７Ａ；
（ｗ）Ｐ７９Ａ；
（ｘ）Ｌ９０Ａ；
（ｙ）Ｓ１０７Ａ；及び
（ｚ）Ｙ１０８Ａ
又は前記修飾の組み合わせを有する配列番号１のアミノ酸１〜１１２を含んでなるか、又はそれらから構成される。
【００４８】
さらなる実施形態において、本ポリペプチドは１つ又は複数の追加的なアミノ酸を含んでなるか、又はそれらから構成され、このアミノ酸は配列番号１のアミノ酸配列内のＮ末端若しくはＣ末端のいずれか、又はその内部に挿入される。例えば、本ポリペプチドは少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５又は２０個の追加的なアミノ酸を含んでなってもよく、又はそれらから構成されてもよい。有利には、追加的なアミノ酸は配列番号１のアミノ酸配列のＣ末端に位置する。
【００４９】
本発明のかかる実施形態の一例は、以下の修飾、
Ｋ４０Ｅ、Ｋ６９Ａ、Ｎ１１１Ｋ及びＧ１１２Ｖ
を有する配列番号１のアミノ酸１〜１１２を含んでなるか、又はそれらから構成されるポリペプチドである。
【００５０】
さらなる実施形態において、本発明のポリペプチドは野生型配列（すなわち配列番号１）に対し以下のアミノ酸突然変異、
Ｋ４０、Ｄ４２、Ｋ５０、Ｋ６９、Ｎ７７、Ｄ８３、Ｌ９０、Ｋ９２、Ｋ１００、Ｋ１０５、Ｎ１１１及びＧ１１２
の１つ又は複数を含んでなる。
【００５１】
例えば、本ポリペプチドは野生型配列に対し以下のアミノ酸突然変異、
Ｋ４０Ｅ、Ｋ４０Ｎ、Ｄ４２Ｖ、Ｋ５０Ｎ、Ｋ６９Ｒ、Ｎ７７Ｙ、Ｄ８３Ｇ、Ｌ９０Ｐ、Ｋ９２Ｒ、Ｋ１００Ｒ、Ｋ１０５Ｒ、Ｎ１１１Ｋ、Ｎ１１１Ｉ及びＧ１１２Ｖ
の１つ又は複数を含んでなってもよく、又はそれらから構成されてもよい。
【００５２】
従って本ポリペプチドは、以下の修飾、
（ａ）Ｋ５０Ｎ、Ｋ６９Ｒ、Ｎ７７Ｙ、Ｋ９２Ｒ、Ｎ１１１Ｋ及びＧ１１２Ｖ；
（ｂ）Ｋ４０Ｅ、Ｄ４２Ｖ、Ｎ７７Ｙ、Ｋ１００Ｒ、Ｋ１０５Ｒ、Ｎ１１１Ｋ及びＧ１１２Ｖ；
（ｃ）Ｋ５０Ｎ、Ｎ７７Ｙ、Ｋ９２Ｒ、Ｎ１１１Ｋ及びＧ１１２Ｖ；
（ｄ）Ｋ４０Ｅ、Ｄ４２Ｖ、Ｎ７７Ｙ、Ｎ１１１Ｋ及びＧ１１２Ｖ；
（ｅ）Ｋ４０Ｅ、Ｄ４２Ｖ、Ｎ７７Ｙ、Ｋ９２Ｒ、Ｎ１１１Ｋ及びＧ１１２Ｖ；
（ｆ）Ｋ５０Ｎ、Ｎ７７Ｙ、Ｎ１１１Ｋ及びＧ１１２Ｖ；
（ｇ）Ｋ４０Ｅ、Ｄ４２Ｖ、Ｋ５０Ｎ、Ｎ７７Ｙ、Ｋ９２Ｒ、Ｎ１１１Ｋ及びＧ１１２Ｖ；
（ｈ）Ｋ４０Ｎ、Ｋ５０Ｎ、Ｎ７７Ｙ、Ｋ９２Ｒ及びＮ１１１Ｉ；
（ｉ）Ｋ４０Ｎ、Ｎ７７Ｙ、Ｄ８３Ｇ、Ｌ９０Ｐ、Ｎ１１１Ｋ及びＧ１１２Ｖ；及び
（ｊ）Ｋ５０Ｎ、Ｎ７７Ｙ、Ｋ９２Ｒ、Ｋ１００Ｒ及びＮ１１１Ｉ
及びこれらの組み合わせを有する配列番号１のアミノ酸１〜１１２から構成されるポリペプチドからなる群から選択され得る。
【００５３】
代替的実施形態において、上記の（ａ）〜（ｊ）で定義されるポリペプチドはＣ末端に２つの追加的なアミノ酸、例えばアミノ酸１１３位に「Ｒ」とアミノ酸１１４位に「Ｓ」とを含んでなってもよい。
【００５４】
本発明のポリペプチドは、当業者に周知の方法により作成され得る（例えば、サムブルック及びラッセル（Sambrook & Russell）、２０００年、「Molecular Cloning, A Laboratory Manual」、第３版、コールド・スプリング・ハーバー（Cold Spring Harbor）、ニューヨーク（New York）を参照、この文献は参照により本明細書に援用される）。
【００５５】
簡潔には、核酸分子を含んでなる発現ベクターが構築され得、この核酸分子は然るべき宿主中でそれがコードするポリペプチドを発現させる能力を有する。
【００５６】
核酸分子、特にＤＮＡをベクターに対し、例えば相補的な粘着末端を介して機能的に連結するための様々な方法が開発されている。例えば、相補的ホモポリマートラクトを、ベクターＤＮＡ中に挿入されるＤＮＡセグメントに付加できる。次にベクターとＤＮＡセグメントとが相補的ホモポリマーの末端間の水素結合により繋ぎ合わされ、組換えＤＮＡ分子が形成される。
【００５７】
１つ又は複数の制限部位を含む合成リンカーが、ＤＮＡセグメントをベクターに繋ぎ合わせる代替的方法を提供する。例えば制限エンドヌクレアーゼ消化により生成されるＤＮＡセグメントはバクテリオファージＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ又は大腸菌（E. coli）ＤＮＡポリメラーゼＩで処理され、これらの酵素は、その３'−５'エキソヌクレアーゼ活性で一本鎖３'突出末端を除去するとともに、その重合活性で３'陥没末端を埋める。
【００５８】
従ってこれらの活性の組み合わせにより、平滑末端化されたＤＮＡセグメントが生じる。平滑末端化されたセグメントは次に、高モル過剰のリンカー分子と共に、平滑末端化されたＤＮＡ分子のライゲーションを触媒可能な酵素、例えばバクテリオファージＴ４ ＤＮＡリガーゼの存在下でインキュベートされる。従って、反応産物はポリマーリンカー配列を末端にもつＤＮＡセグメントである。こうしたＤＮＡセグメントは、次に然るべき制限酵素により切断され、ＤＮＡセグメントの末端と適合する末端を産生する酵素により切断された発現ベクターにライゲートされる。
【００５９】
様々な制限エンドヌクレアーゼ部位を含む合成リンカーが、インターナショナル・バイオテクノロジーズ社（International Biotechnologies Inc.）、米国コネチカット州ニュー・ヘブン（New Haven）を含む数多くの供給元から市販されている。
【００６０】
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの望ましい修飾方法は、ＰＣＲの使用である。この方法を用いて、例えば好適な制限部位で操作することによりＤＮＡを好適なベクターに導入してもよく、又はこの方法を用いて、当該技術分野において周知のの他の有用な手段によりＤＮＡを修飾してもよい。
【００６１】
この方法では、酵素的に増幅されるＤＮＡが２つの特異的プライマーに隣接して置かれ、これらのプライマーはそれ自身が増幅されたＤＮＡに組み込まれることになる。前記特異的プライマーは制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含んでもよく、これを用いることで当該技術分野において周知の方法を使用した発現ベクターへのクローニングが可能となる。
【００６２】
次にＤＮＡ（又はレトロウイルス・ベクターの場合にはＲＮＡ）を好適な宿主中で発現させて、本発明の化合物を含んでなるポリペプチドを産生する。従って、ポリペプチドをコードするＤＮＡは、本明細書に含まれる教示を考慮して適切に修正した公知の技法に従い使用することで発現ベクターを構築でき、次にこの発現ベクターを使用して然るべき宿主細胞を形質転換すると、本発明の化合物が発現及び産生される。かかる技法としては、１９８４年４月３日発行のラター（Rutter）らに対する米国特許第４，４４０，８５９号明細書、１９８５年７月２３日発行のワイスマン（Weissman）に対する米国特許第４，５３０，９０１号明細書、１９８６年４月１５日発行のクラウル（Crowl）に対する米国特許第４，５８２，８００号明細書、１９８７年６月３０日発行のマーク（Mark）らに対する米国特許第４，６７７，０６３号明細書、１９８７年７月７日発行のゲーデル（Goeddel）に対する米国特許第４，６７８，７５１号明細書、１９８７年１１月３日発行のイタクラ（Itakura）らに対する米国特許第４，７０４，３６２号明細書、１９８７年１２月１日発行のマレー（Murray）に対する米国特許第４，７１０，４６３号明細書、１９８８年７月１２日発行のトゥーレＪｒ．（Toole, Jr.）らに対する米国特許第４，７５７，００６号明細書、１９８８年８月２３日発行のゲーデル（Goeddel）らに対する米国特許第４，７６６，０７５号明細書及び１９８９年３月７日発行のストーカー（Stalker）に対する米国特許第４，８１０，６４８号明細書（これらは参照により本明細書に援用される）に記載されるものが挙げられる。
【００６３】
本発明の化合物を構成するポリペプチドをコードするＤＮＡ（又はレトロウイルス・ベクターの場合にはＲＮＡ）は、然るべき宿主に導入するために多種多様な他のＤＮＡ配列に繋ぎ合わせてもよい。相手となるＤＮＡは、宿主の性質、ＤＮＡの宿主への導入手法、及びエピソームの維持又は組込みが所望であるかどうかに依存するであろう。
【００６４】
一般にＤＮＡは、適切な方向性及び発現に妥当な読み枠で、プラスミドなどの発現ベクターに挿入される。必要であれば、ＤＮＡは所望の宿主により認識される然るべき転写及び翻訳調節性の制御ヌクレオチド配列と連結されてもよいが、かかる制御は一般に発現ベクターにおいて可能である。次にベクターは標準的な技法により宿主に導入される。一般には、宿主の全てがベクターにより形質転換されるわけではない。それゆえ、形質転換宿主細胞の選択が必要となるであろう。ある選択技法は、任意の必要な制御因子による、形質転換細胞中で抗生物質耐性などの選択可能な形質をコードするＤＮＡ配列の発現ベクターへの導入を伴うものである。あるいは、かかる選択可能な形質の遺伝子が別のベクター上にあって、これを使用して所望の宿主細胞を同時形質転換し得る。
【００６５】
本発明の発現ベクターにより形質転換された宿主細胞は次に、本明細書に開示される教示を考慮のうえ、十分な時間にわたり、且つ当業者に周知の然るべき条件下で培養されることによりポリペプチドの発現が可能となり、次にこれが回収され得る。
【００６６】
多くの発現系が知られており、細菌（例えば、大腸菌及び枯草菌（Bacillus subtilis））、酵母（例えば出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae））、糸状菌類（例えばアスペルギルス属（Aspergillus））、植物細胞、動物細胞及び昆虫細胞が挙げられる。
【００６７】
ベクターは典型的には、そのベクターが他の非原核生物の細胞型における発現のために使用されるものであったとしても、ＣｏｌＥ１ ｏｒｉなどの原核生物中で増殖するための原核生物レプリコンを含む。ベクターはまた、大腸菌などの、共に形質転換される細菌宿主細胞中において遺伝子の発現（転写及び翻訳）の誘導能を有する原核生物プロモーターなどの然るべきプロモーターを含み得る。
【００６８】
プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼの結合及び転写を生じさせることのできるＤＮＡ配列により形成される発現制御因子である。例示的細菌宿主と適合するプロモーター配列は、典型的には本発明のＤＮＡセグメントの挿入に好都合な制限部位を含むプラスミド・ベクター中に提供される。
【００６９】
典型的な原核生物ベクター・プラスミドは、バイオラド・ラボラトリーズ（Biorad Laboratories）、（米国カリフォルニア州リッチモンド（Richmond））から入手可能なｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２及びｐＢＲ３２９、及びファーマシア（Pharmacia）、米国ニュージャージー州ピスカタウェイ（Piscataway）から入手可能なｐＴｒｃ９９Ａ及びｐＫＫ２２３−３である。特に好ましい原核生物ベクター・プラスミドとしては、ｐＲＳＥＴ及びｐＨＩＰ（インビトロジェン（Invitrogen）、米国カリフォルニア州）が挙げられる。
【００７０】
典型的な哺乳動物細胞ベクター・プラスミドは、ファーマシア（Pharmacia）、米国ニュージャージー州ピスカタウェイ（Piscataway）から入手可能なｐＳＶＬである。このベクターはＳＶ４０後期プロモーターを使用してクローン化遺伝子の発現を駆動し、ＣＯＳ−１細胞などのＴ抗原産生細胞で最高レベルの発現が見られる。
【００７１】
誘導性の哺乳動物発現ベクターの例はｐＭＳＧであり、これもまたファーマシア（Pharmacia）から入手可能である。このベクターはマウス乳腺腫瘍ウイルス長鎖末端反復配列のグルココルチコイド誘導性プロモーターを使用してクローン化遺伝子の発現を駆動する。
【００７２】
有用な酵母プラスミド・ベクターはｐＲＳ４０３−４０６及びｐＲＳ４１３−４１６であり、一般にストラタジーン・クローニング・システムズ（Stratagene Cloning Systems）、米国カリフォルニア州ラ・ホーヤ（La Jolla）９２０３７から入手可能である。プラスミドｐＲＳ４０３、ｐＲＳ４０４、ｐＲＳ４０５及びｐＲＳ４０６は酵母組込みプラスミド（ＹＩｐｓ）であり、酵母選択可能マーカーＨＩＳ３、ＴＲＰ１、ＬＥＵ２及びＵＲＡ３を取り込む。プラスミドｐＲＳ４１３−４１６は酵母セントロメア・プラスミド（Ｙｃｐｓ）である。
【００７３】
他のベクター及び発現系が、様々な宿主細胞用として当該技術分野において周知である。
【００７４】
宿主細胞は原核生物か、又は真核生物であり得る。細菌細胞は好ましい原核生物宿主細胞であり、典型的には大腸菌の株、例えば、ベテスダ・リサーチ・ラボラトリーズ社（Bethesda Research Laboratories Inc.）、米国メリーランド州ベテスダ（Bethesda）から入手可能な大腸菌株ＤＨ５、及び米国メリーランド州ロックビル（Rockville）のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection）（ＡＴＣＣ）から入手可能なＲＲ１（ＡＴＣＣ番号３１３４３）である。好ましい真核生物宿主細胞としては、酵母、昆虫及び哺乳動物細胞、好ましくは脊椎動物細胞、例えばマウス、ラット、サル又はヒトの線維芽細胞系及び腎臓細胞系由来のものなどが挙げられる。酵母宿主細胞としては、ＹＰＨ４９９、ＹＰＨ５００及びＹＰＨ５０１が挙げられ、これらは一般に、ストラタジーン・クローニング・システムズ（Stratagene Cloning Systems）、米国カリフォルニア州ラ・ホーヤ（La Jolla）９２０３７から入手可能である。好ましい哺乳動物宿主細胞としては、ＣＲＬ１６５８としてＡＴＣＣから入手可能なチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胎児腎臓細胞である２９３細胞、及びＮＳ０細胞が挙げられる。好ましい昆虫細胞は、バキュロウイルス発現ベクターをトランスフェクトできるＳｆ９細胞である。
【００７５】
本発明のＤＮＡコンストラクトによる然るべき細胞宿主の形質転換は、典型的には使用されるベクターの種類に応じた周知の方法により達成される。原核生物宿主細胞の形質転換に関しては、例えば、コーエン（Cohen）ら（１９７２年）Proc. Natl. Acad. Sci. USA ６９、２１１０頁及びサムブルック（Sambrook）ら（１９８９年）「Molecular Cloning, A Laboratory Manual」、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory）、コールド・スプリング・ハーバー（Cold Spring Harbor）、ニューヨーク州を参照のこと。酵母細胞の形質転換は、シャーマン（Sherman）ら（１９８６年）「Methods In Yeast Genetics, A Laboratory Manual」、コールド・スプリング・ハーバー（Cold Spring Harbor）、ニューヨーク州に記載される。ベッグズ（Beggs）（１９７８年）Nature ２７５、１０４−１０９頁の方法もまた有用である。脊椎動物細胞に関しては、かかる細胞のトランスフェクションに有用な試薬、例えばリン酸カルシウム及びＤＥＡＥデキストラン又はリポソーム製剤が、ストラタジーン・クローニング・システムズ（Stratagene Cloning Systems）、又はライフ・テクノロジーズ社（Life Technologies Inc.）、米国メリーランド州ゲイサーズバーグ（Gaithersburg）２０８７７から入手可能である。
【００７６】
電気穿孔もまた、細胞の形質転換及び／又はトランスフェクションに有用であり、酵母細胞、細菌細胞、昆虫細胞及び脊椎動物細胞を形質転換するためのものとして当該技術分野において周知である。
【００７７】
例えば、多くの細菌種が、参照により本明細書に援用されるルシャンスキー（Luchansky）ら（１９８８年）Mol. Microbiol. ２、６３７−６４６頁に記載される方法により形質転換され得る。２．５ＰＥＢ中に懸濁されたＤＮＡ−細胞混合物を２５μＦＤで６２５０Ｖ／ｃｍを使用して電気穿孔した後は、常に最も多くの形質転換体が回収される。
【００７８】
電気穿孔による酵母の形質転換方法は、ベッカー及びグアレンテ（Becker & Guarente）（１９９０年）Methods Enzymol. １９４、１８２頁に開示される。
【００７９】
形質転換に成功した細胞、すなわち本発明のＤＮＡコンストラクトを含む細胞は、周知の技法により同定できる。例えば、本発明の発現コンストラクトを導入する結果生じる細胞は、成長すると本発明のポリペプチドを産生できる。細胞は回収及び溶解して、そのＤＮＡ含量をＤＮＡの存在について、サザン（Southern）（１９７５年）J. Mol. Biol. ９８、５０３頁又はベレント（Berent）ら（１９８５年）Biotech. ３、２０８頁により記載されるような方法を使用して調べることができる。あるいは、上清中のタンパク質の存在を以下に記載されるとおりの抗体を使用して検出できる。
【００８０】
組換えＤＮＡの存在について直接アッセイすることに加え、その組換えＤＮＡがタンパク質の発現の誘導能を有する場合には、形質転換の成功は周知の免疫学的方法により確認できる。例えば、発現ベクターによる形質転換が成功した細胞は、然るべき抗原性を提示するタンパク質を産生する。
【００８１】
形質転換されていると思われる細胞の試料が回収され、タンパク質について好適な抗体を使用してアッセイされる。
【００８２】
宿主細胞は、非ヒト動物体内の宿主細胞であり得る。従って、導入遺伝子の存在により本発明の第１の態様に係る化合物（又はその結合部分）を発現するトランスジェニック非ヒト動物が含まれる。好ましくは、トランスジェニック非ヒト動物は、マウスなどのげっ歯類である。トランスジェニック非ヒト動物は、当該技術分野において周知の方法を使用して作成できる。
【００８３】
宿主細胞の培養方法及び組換えタンパク質の単離方法は、当該技術分野において周知である。宿主細胞に応じて、産生される本発明の化合物（又はその結合部分）は異なり得ることは理解されるであろう。例えば、酵母又は細菌細胞などの特定の宿主細胞は、翻訳後修飾系を有しないか、又は異なる翻訳後修飾系を有し、その結果、翻訳後に異なる方法で修飾され得る形態の本発明の化合物（又はその結合部分）が産生される。
【００８４】
本発明の化合物（又はその結合部分）は哺乳動物細胞などの真核生物系で産生されることが好ましい。
【００８５】
次善として好ましい実施形態に従えば、本発明の化合物（又はその結合部分）は、市販のインビトロ翻訳系、例えば、ウサギ網状赤血球溶解液又は小麦胚芽溶解液（プロメガ（Promega）から入手可能）を使用してインビトロで産生できる。好ましくは、翻訳系はウサギ網状赤血球溶解液である。好都合には、翻訳系は転写系、例えばＴＮＴ転写−翻訳系（プロメガ（Promega））と結合させ得る。この系は、好適なｍＲＮＡ転写産物をコードＤＮＡポリヌクレオチドから翻訳と同じ反応で産生するという利点を有する。
【００８６】
従って、本発明の第２の態様は、本発明の第１の態様に係るポリペプチドをコードする核酸分子を提供する。一実施形態において、核酸分子はＤＮＡ分子である。有利には、核酸分子は、本発明のポリペプチドを発現させる宿主細胞により認識可能なシグナルペプチドをさらに含んでなる。
【００８７】
本発明の第３の態様は、本発明の第２の態様に係る核酸分子を含んでなるベクターを提供する。一実施形態において、ベクターは発現ベクター（ｐＲＳＥＴ及びｐＨＩＰなど）である。
【００８８】
本発明の第４の態様は、本発明の第２の態様に係る核酸分子又は本発明の第３の態様に係るベクターを含んでなる宿主細胞を提供する。
【００８９】
一実施形態において、宿主細胞は大腸菌細胞である。
【００９０】
本発明の第５の態様は、本発明の第１の態様に係るポリペプチドを産生するための方法を提供し、この方法は、本ポリペプチドが発現する条件下における本発明の第２の態様に係る核酸分子又は本発明の第３の態様に係るベクターを含んでなる宿主細胞集団の培養、及びそこからのポリペプチドの単離を含んでなる。発現したポリペプチドを「単離する」とは、培養培地から細胞残屑などの不純物の一部又は全部を除去することを含む。一実施形態において、本ポリペプチドは実質的に純粋である。
【００９１】
当業者は、本発明のポリペプチドが好ましくは化合物と薬学的に許容可能な担体とを含んでなる医薬組成物の形態で提供されることを理解するであろう。従って、本発明の第６の態様は、本発明の第１の態様に係るポリペプチドを含んでなる薬理組成物を提供する。
【００９２】
「薬学的に許容可能」とは、その製剤が無菌且つパイロジェンフリーであることを含む。好適な医薬担体は薬学分野において周知である。担体は、本発明の化合物と適合し、且つその被投与者にとって有害でないという意味で「許容可能」でなければならない。典型的には、担体は無菌且つパイロジェンフリーの水又は生理食塩水であり得るが、他の許容可能な担体が使用されてもよい。従って、「薬学的に許容可能な担体」及び「薬学的に許容可能な賦形剤」としては製剤の一部の形成に使用される任意の化合物が挙げられ、これは単に担体として作用することが意図され、すなわち、生物活性それ自体を有することは意図されない。薬学的に許容可能な担体又は賦形剤は一般に安全で非毒性、且つ生物学的にもその他の観点からも不都合のないものである。薬学的に許容可能な担体又は賦形剤は本明細書で使用されるとき、１つ及び２つ以上のいずれのかかる担体又は賦形剤も含む。
【００９３】
本発明のポリペプチドは、使用される化合物の効力／毒性に応じて様々な濃度で調合できる。好ましくは、製剤は本発明の薬剤を、０．１μＭ〜１ｍＭ、より好ましくは１μＭ〜１００μＭ、５μＭ〜５０μＭ、１０μＭ〜５０μＭ、２０μＭ〜４０μＭ、及び最も好ましくは約３０μＭの濃度で含んでなる。インビトロ適用では、製剤はより低濃度、例えば０．００２５μＭ〜１μＭの本発明の化合物を含んでなる。
【００９４】
当業者は、本医薬及び薬剤（すなわちポリペプチド）が一般的には、目的とする投与経路及び標準的な薬務に関して選択される好適な医薬賦形剤、希釈剤又は担体との混和物として投与されるであろうことを理解するであろう（例えば、「Remington: The Science and Practice of Pharmacy」、第１９版、１９９５年、アルフォンソ・ジェナーロ（Alfonso Gennaro）編、マック・パブリッシング・カンパニー（Mack Publishing Company）、米国ペンシルベニア州（Pennsylvania）を参照のこと。この文献は参照により本明細書に援用される）。
【００９５】
例えば、本医薬及び薬剤は、即時放出、遅延放出又は制御放出適用のため、香味剤又は着色剤を含有し得る錠剤、カプセル、オビュール（ovule）、エリキシル剤、溶液又は懸濁液の形態で、経口投与、経口腔粘膜投与、又は舌下投与できる。医薬及び薬剤はまた、海綿体内注射を介して投与されてもよい。
【００９６】
かかる錠剤は、微結晶性セルロース、ラクトース、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、二塩基性リン酸カルシウム及びグリシンなどの賦形剤、デンプン（好ましくはトウモロコシ、ジャガイモ又はタピオカデンプン）、デンプングリコール酸ナトリウム、クロスカルメロースナトリウム及びある種の複合ケイ酸塩などの崩壊剤、及びポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、スクロース、ゼラチン及びアカシアなどの顆粒結合剤を含有し得る。加えて、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、ベヘン酸グリセリル及びタルクなどの潤滑剤が含まれ得る。
【００９７】
同様の種類の固形組成物はまた、ゼラチンカプセル中の充填剤としても用られ得る。これに関連して好ましい賦形剤としては、ラクトース、デンプン、セルロース、乳糖又は高分子量ポリエチレングリコールが挙げられる。水性懸濁液及び／又はエリキシル剤については、本発明の化合物は様々な甘味剤又は香味剤、着色物質又は色素と、乳化剤及び／又は懸濁剤と、及び希釈剤、例えば、水、エタノール、プロピレングリコール及びグリセリンなどと、並びにこれらの組み合わせと混和されてもよい。
【００９８】
本発明の医薬及び薬剤はまた、非経口的に、例えば、静脈内、関節内、動脈内、腹腔内、髄腔内、脳室内、胸骨内、頭蓋内、筋肉内若しくは皮下にも投与でき、又は注入技法により投与されてもよい。本発明の医薬及び薬剤は滅菌水溶液の形態での使用に最も適しており、滅菌水溶液は他の物質、例えば、溶液を血液と等張にするのに十分な塩又はグルコースを含有し得る。必要であれば、水溶液は好適に（好ましくはｐＨ３〜９に）緩衝されなければならない。無菌条件下での好適な非経口製剤の調製は、当業者に周知の標準的な製薬技法により容易に達成される。
【００９９】
非経口投与に好適な製剤としては、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤及びその製剤を対象の被投与者の血液と等張にする溶質を含有し得る水性及び非水性の無菌注射溶液と、懸濁剤及び増粘剤を含み得る水性及び非水性の無菌懸濁液とが挙げられる。製剤は単位用量又は頻回用量容器、例えば密封されたアンプル及びバイアルに提供されてもよく、及び使用直前に無菌液体担体、例えば注射用水を添加すればよいだけのフリーズドライ（凍結乾燥）条件下で保存してもよい。即時使用できる注射溶液及び懸濁液は、既述の種類の無菌粉末、顆粒及び錠剤から調製され得る。
【０１００】
ヒト患者への経口及び非経口投与について、本医薬及び薬剤の１日投薬量レベルは、通常成人１人当たり１〜１０００ｍｇ（すなわち約０．０１５〜１５ｍｇ／ｋｇ）で、単回用量又は分割用量で投与され得る。
【０１０１】
本医薬及び薬剤はまた、鼻腔内投与又は吸入投与もでき、好都合には、乾燥粉末インヘラー又はエアロゾル噴霧調製剤の形態で、加圧容器、ポンプ、スプレー又はネブライザーから、好適な噴射剤、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、ヒドロフルオロアルカン、例えば１，１，１，２−テトラフルオロエタン（ＨＦＡ１３４Ａ３又は１，１，１，２，３，３，３−ヘプタフルオロプロパン（ＨＦＡ２２７ＥＡ３）、二酸化炭素又は他の好適な気体などを使用して送達される。加圧エアロゾルの場合、投薬量単位は定量を送達するためのバルブを提供することにより決定され得る。加圧容器、ポンプ、スプレー又はネブライザーは、例えばエタノールと噴射剤との混合物を溶媒として用いて活性化合物の溶液又は懸濁液を含むことができ、さらにこの混合物は潤滑剤、例えば三オレイン酸ソルビタンを含有してもよい。インヘラー又は吸入器用のカプセル及びカートリッジ（例えば、ゼラチンから作製される）は、本発明の化合物とラクトース又はデンプンなどの好適な粉末基剤との粉末混合物を含有するよう調合され得る。
【０１０２】
エアロゾル又は乾燥粉末製剤は好ましくは、各定量又は「一服」が、患者に送達するため少なくとも１ｍｇの本発明の化合物を含有するよう配合される。エアロゾルを含む総１日量は患者ごとに異なり得るとともに、単回用量で、又は多くの通例としては１日を通じた分割用量で投与され得ることは理解されるであろう。
【０１０３】
あるいは、本医薬及び薬剤は坐薬又はペッサリーの形態で投与でき、又はローション、溶液、クリーム、軟膏若しくは散剤の形態で局所的に施用されてもよい。本発明の化合物はまた、例えば皮膚パッチの使用により、経皮的にも投与され得る。本発明の化合物はまた、眼内経路によって投与されてもよい。
【０１０４】
皮膚への局所的な施用について、本医薬及び薬剤は、例えば、鉱油、流動ワセリン、白色ワセリン、プロピレングリコール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン化合物、乳化ワックス及び水のうち１つ又は複数との混合物中に懸濁又は溶解された活性化合物を含有する好適な軟膏として調合できる。あるいは、本医薬及び薬剤は、例えば、鉱油、モノステアリン酸ソルビタン、ポリエチレングリコール、流動パラフィン、ポリソルベート６０、セチルエステルワックス、セテアリルアルコール、２−オクチルドデカノール、ベンジルアルコール及び水のうち１つ又は複数の混合物中に懸濁又は溶解された好適なローション又はクリームとして調合できる。
【０１０５】
口内の局所投与に好適な製剤としては、香味基剤、通常はスクロース及びアカシア又はトラガカント中に活性成分を含んでなるロゼンジ、ゼラチン及びグリセリン、又はスクロース及びアカシアなどの不活性基剤中に活性成分を含んでなるトローチ、及び好適な液体担体中に活性成分を含んでなる洗口剤が挙げられる。
【０１０６】
本医薬及び薬剤がポリペプチドの場合、マイクロスフェアなどの徐放性の薬物送達系を使用することが好ましくあり得る。こうした送達系は注射の頻度を低減するよう特別に設計される。かかる送達系の例はNutropin Depotであり、これは組換えヒト成長ホルモン（ｒｈＧＨ）を生分解性マイクロスフェア中に封入したもので、注射されるとｒｈＧＨをある持続時間にわたり徐々に放出する。
【０１０７】
徐放性免疫グロブリン組成物もまた、リポソームに捕捉された免疫グロブリンを含む。免疫グロブリンを含有するリポソームは、それ自体周知の方法により調製される。例えばエプステイン（Epstein）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８２：３６８８−９２頁（１９８５年）；ホワン（Hwang）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA ７７：４０３０−４頁（１９８０年）；米国特許第４，４８５，０４５号明細書；同第４，５４４、５４５号明細書；同第６，１３９，８６９号明細書；及び同第６，０２７，７２６号明細書を参照のこと。通常、リポソームは小さく（約２００〜約８００オングストローム）、単層タイプであり、そのなかの脂質含量は約３０モルパーセント（ｍｏｌ．％）コレステロールより多いが、その割合は最適な免疫グロブリン治療に対し調節して選択される。
【０１０８】
あるいは、ポリペプチド医薬及び薬剤は、外科的に植え込まれる器具により投与でき、器具が薬物を所要の部位に直接放出する。
【０１０９】
電気穿孔療法（ＥＰＴ）システムもまた、タンパク質及びポリペプチドの投与に用いることができる。パルス電界を細胞に印加する器具により、細胞膜の薬物に対する透過性が増加し、結果として細胞内薬物送達が大幅に亢進する。
【０１１０】
タンパク質及びポリペプチドはまた、エレクトロインコーポレーション（electroincorporation）（ＥＩ）により送達できる。ＥＩは皮膚の表面上の直径３０ミクロンまでの小さい粒子が、電気穿孔で使用されるものと同じか、又は類似した電気パルスを受けると生じる。ＥＩにおいては、こうした粒子は角質層を貫通して皮膚のより深い層へと送り込まれる。粒子は薬物又は遺伝子を取り込むか、若しくはそれでコーティングすることができ、又は単純に、薬物が侵入できる孔を皮膚に生じさせる「弾丸」として働くことができる。
【０１１１】
タンパク質及びポリペプチド送達の代替的方法は、注射用感熱性ReGelである。体温未満ではReGelは注射液だが、体温では直ちに、既知の安全な生分解性ポリマーを徐々に侵食してそのなかに溶解するゲル状貯留体を形成する。活性薬物は時間の経過に伴い生体高分子が溶解するに従い送達される。
【０１１２】
タンパク質及びポリペプチド医薬品は経口的にも送達できる。かかる送達系の１つは、ビタミンＢ１２を経口摂取したときの体内の自然の過程を用いてタンパク質及びポリペプチドを同時送達する。ビタミンＢ１２摂取系に乗ることにより、タンパク質又はポリペプチドは腸壁を通じて移動できる。ビタミンＢ１２類似体と薬物との間で複合体が生成され、これは複合体のビタミンＢ１２部分で内因子（ＩＦ）に対する著しい親和性を、及び複合体の薬物部分において著しい生物活性を、双方とも保持する。
【０１１３】
従って本発明の一態様は、医薬用の本発明の第１の態様に係るポリペプチドを提供する。
【０１１４】
本発明のさらなる態様は、本発明の第１の態様に係るポリペプチドの、補体５ａ（Ｃ５ａ）及び／又はＮ−ホルミルペプチドｆＭＬＰの生物活性を阻害するための医薬の調製における使用を提供する。
【０１１５】
アナフィラトキシンＣ５ａは多様な炎症反応を媒介する。Ｃ５ａはＣ５ａＲに作用することで食細胞の活性化及び動員において重要な役割を果たすとともに、侵入微生物の有効なクリアランスに不可欠である。近年、Ｃ５ａは組織傷害及び臓器不全につながる重篤な炎症症候群のような破壊的な炎症過程においても重要な役割を果たすことが明らかになってきた。加えて、Ｃ５ａはまた、正常な器官発生、様々な細胞系列の初期分化、及び細胞のアポトーシス死からの保護に影響を及ぼすいくつかの他の生物学的過程とも関連付けられている（表１を参照）。
【０１１６】
【表３】
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【０１１７】
トホルミルペプチド受容体（ＦＰＲ）及びその変異体ＦＰＲＬ−１（ＦＰＲ様１）及びＦＰＲＬ−２（ＦＰＲ様２）は、７つの膜貫通ドメインＧｉタンパク質共役受容体に属する。双方の受容体とも好中球及び単球に高レベルで存在する。ＦＰＲは高親和性ホルミルペプチド受容体として、及びＦＰＲＬ−１は高濃度のｆＭＬＰによってのみ活性化することに基づき、低親和性受容体として定義される。天然におけるホルミルペプチドの唯一の供給源は細菌及びミトコンドリアタンパク質合成であるため、これらの受容体は細菌侵入又は組織傷害の部位に食細胞を動員する媒介物として作用すると考えられる。これは、ＦＰＲノックアウトマウスがリステリア菌（Listeria monocytogenes）に感染しやすいという知見により支持される。また、機能不全のＦＰＲ対立遺伝子は局在化した若年性歯周炎とも関連付けられている。
【０１１８】
ここ数年間で、これらの受容体の多数の非ホルミル化ペプチドリガンドが同定されている（表２を参照）。これらのリガンドは、ランダム・ペプチド・ライブラリ、内因性の供給源及び病原体をはじめとする種々の供給源に由来する。そのなかには、アルツハイマー病、アミロイドーシス及びプリオン病を含むヒト疾患と関連付けられるものもある。従って、ホルミルペプチド受容体は種々の炎症過程の処置における標的である。
【０１１９】
【表４】
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【０１２０】
【表５】
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【０１２１】
従って、本ポリペプチドはＣ５ａＲ及び／又はＦＲＰでアンタゴニストとして作用する医薬の調製に使用するためのものである。好都合には、本ポリペプチドはこれらの受容体の一方又は双方との直接的な結合能を有する。
【０１２２】
一実施形態において、本医薬はＣ５ａ受容体の機能を全体的又は部分的に阻害するためのものである。
【０１２３】
代替的実施形態において、本医薬はホルミル化ペプチド受容体の機能を全体的又は部分的に阻害するためのものである。
【０１２４】
さらなる実施形態において、Ｃ５ａ受容体及び／又はホルミル化ペプチド受容体は、好中球、単球及び／又は内皮細胞上に位置する。
【０１２５】
従って、本医薬は補体５ａ（Ｃ５ａ）及び／又はＮ−ホルミルペプチドｆＭＬＰにより誘導される好中球の活性化を阻害するためのものであり得る。
【０１２６】
一実施形態において、本医薬は、炎症、例えば急性又は慢性炎症反応を処置するためのものである。
【０１２７】
本明細書においては用語「処置する」、及び「処置」などを使用することにより、一般に所望の薬理学的及び生理学的作用を得ることを意味する。さらに、この用語は任意の過程、行為、適用、治療などを指し、ここではヒトを含む哺乳動物が、直接的又は間接的に哺乳動物の病態を改善することを目的として医療救護の対象となる。従って、処置には治療的使用及び予防的使用の双方が含まれる。
【０１２８】
さらなる実施形態において、本医薬は、急性反応性関節炎、急性移植片拒絶反応、成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、アルコール性肝炎、同種移植、アルツハイマー病、動脈硬化、アルサス反応、喘息、アテローム性動脈硬化症、アトピー性皮膚炎、細菌性髄膜炎、気管支原性肺癌、水疱性類天疱瘡（bullos pemphigoid）、熱傷、心肺バイパス術、心血管疾患、慢性気管支炎、慢性リンパ性白血病、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、接触性皮膚炎、クローン病、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、嚢胞性線維症、皮膚病、中枢神経系疾患、子宮内膜症、実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）、実験的アレルギー性神経炎（ＥＡＮ）、凍傷、胃癌、胃腸疾患、泌尿生殖器疾患、痛風、ヘリコバクター・ピロリ菌胃炎（Heliobacter pylori gastritis）、血液透析、遺伝性血管浮腫、過敏性肺炎、特発性肺線維症、免疫複合体（ＩＣ）誘発性血管炎、虚血性ショック、虚血再灌流エピソード、虚血再灌流傷害、関節疾患、（大）血管手術、金属ヒューム熱、多発性硬化症、多系統臓器不全、重症筋無力症、心筋梗塞、膵炎、腹膜炎、胸気腫（pleural emphesema）、心肺バイパス術後（ＣＰＢ）炎症、乾癬、反復性緊張外傷（ＲＳＩ）、呼吸器疾患、関節リウマチ、敗血症、敗血症性ショック、副鼻腔炎、皮膚疾患、脳卒中、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、移植、（外傷性）脳損傷、潰瘍性大腸炎、尿路感染症、血液漏出症候群、血管炎及び異種移植からなる群から選択される疾患又は病態を処置するためのものである。
【０１２９】
一実施形態において、本医薬は再灌流傷害を処置するためのものである。例えば再灌流傷害は、急性心筋梗塞（ＡＭＩ）、冠動脈バイパス・グラフト（ＣＡＢＧ）、脳卒中及び／又は臓器移植に関連し得る。
【０１３０】
さらなる実施形態において、本医薬は、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）を処置するためのものである。
【０１３１】
従って、本発明はさらに、補体５ａ（Ｃ５ａ）及び／又はＮ−ホルミルペプチドｆＭＬＰの生物活性の阻害剤による処置を必要とする対象者の処置方法を提供し、本方法は、対象者に対し本発明の第１の態様に係るポリペプチド又は本発明の第６の態様に係る医薬組成物を投与するステップを含んでなる。
【０１３２】
当業者は、対象者がヒトであることを理解するであろう。
【０１３３】
本発明のポリペプチド又は医薬組成物は患者に対し有効量で投与される。「治療上の有効量」、又は「有効量」、又は「治療上有効である」は、本明細書で使用されるとき、補体５ａ（Ｃ５ａ）及び／又はＮ−ホルミルペプチドｆＭＬＰの生物活性の阻害を提供する量を指す。これは所望の治療効果を生み出すよう計算された活性物質の所定量である。さらにこれは、宿主の活性、機能及び応答における臨床的に重大な欠陥を低減し、及び最も好ましくは予防するうえで十分な量を意味することを意図している。あるいは、治療上の有効量は、宿主における臨床的に重大な病態を改善するうえで十分である。当業者は理解するであろうとおり、化合物の量はその比活性に応じて変動し得る。好適な投薬量は、所要の希釈剤を伴い所望の治療効果を生み出すよう計算された所定量の活性組成物を含有し得る。本発明の組成物を製造するための方法及び使用においては、治療上有効量の活性成分が提供される。治療上の有効量は医療又は獣医療従事者により、当該技術分野において周知のとおり、患者の特性、例えば、年齢、体重、性別、病態、合併症、他の疾患等に基づき決定され得る。
【０１３４】
従って一実施形態において、本方法は個人に対し、Ｃ５ａＲ及び／又はＦＰＲにおいてアンタゴニストとして作用するのに十分な量の化合物を投与するステップを含んでなる。
【０１３５】
当業者は、かかる有効量の化合物又はその製剤が、単回ボーラス用量として（すなわち急性投与）、又はより好ましくは、ある時間にわたる連続用量として（すなわち慢性投与）、送達され得ることを理解するであろう。
【０１３６】
本発明に係る変異ＣＨＩＰＳタンパク質は、定方向進化技法、例えば、アリゲーター・バイオサイエンスＡＢ（Alligator Bioscience AB）により開発されたFragment-Induced Nucleotide Diversity（「ＦＩＮＤ」）法により産生され得る。ＦＩＮＤ法は、国際公開第９８／５８０８０号パンフレット、同第０２／４８３５１号パンフレット及び同第０３／９７８３４号パンフレットに詳細に記載される。
【０１３７】
従って、本発明のさらなる態様は、本発明の第１の態様に係るポリペプチドを産生するための方法を提供し、本方法は以下のステップ、
（ａ）野生型ＣＨＩＰＳタンパク質又はその変異体をコードする１つ又は複数の親ポリヌクレオチド分子を提供するステップ、
（ｂ）１つ又は複数の親ポリヌクレオチド分子をヌクレアーゼ（例えばエキソヌクレアーゼ）で消化してポリヌクレオチド断片を生成するステップ、
（ｃ）ステップ（ｂ）で生成された前記ポリヌクレオチド断片を互いに接触させるステップ、及び
（ｄ）断片を互いにアニールして増幅することで、１つ又は複数の親ポリヌクレオチド分子によりコードされる配列と比較して改変されたアミノ酸配列を有する変異ＣＨＩＰＳポリペプチドをコードする少なくとも１本のポリヌクレオチド配列を生成するステップ、
を含んでなる。
【０１３８】
当業者は、ステップ（ａ）で提供される親ポリヌクレオチドは二本鎖であっても、又は一本鎖であってもよいことを理解するであろう。しかしながら、好ましくはステップ（ａ）の親ポリヌクレオチド分子は一本鎖である。
【０１３９】
一実施形態において、ステップ（ｄ）は、予め設定された変異性のオリゴヌクレオチドを付加することで親ポリヌクレオチドの規定領域に導入される変異性の程度を制御するステップを含んでなる。
【０１４０】
さらなる実施形態において、本方法はさらに、ステップ（ｄ）で産生された少なくとも１本のポリヌクレオチド配列を発現させるとともに、得られたポリペプチドを野生型ＣＨＩＰＳタンパク質の生物活性、例えば好中球のＣ５ａ誘導性活性化及び／又は好中球のｆＭＬＰ誘導性活性化を阻害する能力についてスクリーニングするステップ（ｅ）を含んでなる。
【０１４１】
ステップ（ｅ）はまた、得られたポリペプチドをＣ５ａＲ及び／又はＦＰＲに結合する能力について試験するステップも含んでなる。かかる結合特性は、当該技術分野において周知の技法、例えばアフィニティー・クロマトグラフィー及びファージ・ディスプレイを使用して評価され得る。
【０１４２】
より好ましくは、本方法はさらに、得られたポリペプチドを野生型ＣＨＩＰＳタンパク質に対する免疫原性の低減についてスクリーニングするステップ（ｆ）を含んでなる。
【０１４３】
例えば、ステップ（ｅ）は、以下のスクリーニング手順の１つ又は複数を含んでなり得る。
（ｉ）変異ＣＨＩＰＳポリペプチドのＣ５ａＲに対する結合能力ついてアッセイする。
【０１４４】
例えば、ファージ選択法を使用して、Ｃ５ａＲのＮ末端部分に対応するペプチドとの変異ポリペプチドの結合をスクリーニングし得る。第１のポジティブ選択後、溶出したファージを増幅して、続くポジティブ選択が行われてもよい。第２のポジティブ選択では、ヒト抗ＣＨＩＰＳ抗体を添加して、抗ＣＨＩＰＳ抗体との結合は保持しながら不要なＣＨＩＰＳ分子を吸収してもよく、これにより免疫原性のより低いクローンを同定できる可能性が高まり得る。
【０１４５】
第２のポジティブ選択の直後、溶出したファージは、磁気ビーズにコーティングされたヒト抗ＣＨＩＰＳ抗体と共にインキュベートされ得る。次に、以下のような溶出液のプールが回収される。（１）抗体を結合しなかったファージ、（２）洗浄ステップ後に溶出したファージ、（３）低濃度のＣＨＩＰＳで溶出したファージ、又は（４）高濃度のＣＨＩＰＳで溶出したファージ。プール（１）及び（２）からのクローンがさらなるスクリーニングのため選好的に選択され得る。
【０１４６】
突然変異体の選択されたプールからの遺伝子が、ｐＲＳＥＴベクターにクローニングされ、タンパク質がＨＴフォーマットで産生され得る。
（ｉｉ）各変異ＣＨＩＰＳポリペプチドの濃度について発現ＥＬＩＳＡによりアッセイする。
（ｉｉｉ）変異ＣＨＩＰＳポリペプチドの抗ＣＨＩＰＳ抗体に対する結合活性について、例えば阻害ＥＬＩＳＡ及び／又はヒト抗ＣＨＩＰＳ抗体ＥＬＩＳＡによりアッセイする。
（ｉｖ）選択された変異ＣＨＩＰＳポリペプチドはまた、再発現させて、発現ＥＬＩＳＡ及びペプチドＥＬＩＳＡで分析してもよい。
【０１４７】
例示的スクリーニング手順のさらなる詳細は、実施例に提供される（下記参照）。
【０１４８】
ハイスループット操作が可能なスクリーニングアッセイが特に好ましいことが理解されるであろう。例としては、細胞ベースアッセイ及びタンパク質−タンパク質結合アッセイを挙げることができる。ＳＰＡベースの（シンチレーション近接アッセイ；アマーシャム・インターナショナル（Amersham International））システムを使用してもよい。
【０１４９】
ポリペプチド／ポリペプチド相互作用の他の検出方法としては、イオンスプレー質量分析／ＨＰＬＣ法又は他の物理的及び分析的方法を伴う限外ろ過が挙げられる。例えば当業者に周知の蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）法を使用してもよく、ここでは２つの蛍光標識された物質の結合が、互いに近接しているときの蛍光標識の相互作用を計測することにより計測され得る。
【０１５０】
巨大分子、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質及びリン脂質に対するポリペプチドの結合を検出する代替的方法としては、例えばプラント（Plant）ら（１９９５年）Analyt Biochem ２２６（２）、３４２−３４８頁（参照により本明細書に援用される）に記載されるとおりの表面プラズモン共鳴アッセイが挙げられる。この方法は、例えば放射性標識又は蛍光標識で標識されたポリペプチドを利用し得る。
【０１５１】
標的巨大分子（Ｃ５ａＲ又はＦＰＲなど）との結合能を有するポリペプチドを同定する別の方法は、標的巨大分子をポリペプチドに曝露してポリペプチドの前記巨大分子に対する任意の結合を検出及び／又は計測するものである。ポリペプチドの巨大分子に対する結合性についての結合定数が決定され得る。ポリペプチドの巨大分子に対する結合を検出及び／又は計測（定量化）するための好適な方法は当業者に周知であり、例えば、ハイスループット操作が可能な方法、例えばチップベースの方法を使用して実施され得る。ＶＬＳＩＰＳ（商標）と呼ばれる新技術により、数十万個又はそれ以上の種々の分子プローブを含む極小チップの生産が可能となっている。こうしたバイオチップ又はアレイはアレイ状に配列されたプローブを有し、各プローブは特定の位置を割り当てられている。各位置が例えば１０ミクロンといったスケールを有するバイオチップが生産されている。このチップを使用して標的分子がチップ上のプローブのいずれかと相互作用するかどうかを判定できる。選択された試験条件下でアレイを標的分子に曝露した後、走査装置によりアレイの各位置を調べて、標的分子が当該位置のプローブと相互作用したかどうかを判定できる。
【０１５２】
バイオチップ又はアレイは、様々なスクリーニング技法においてプローブ又は標的分子のいずれの情報を得るためにも有用である。例えば、ペプチドのライブラリをプローブとして使用して薬物をスクリーニングできる。ペプチドは受容体に曝露でき、受容体に結合したプローブを同定できる。１９９９年２月２３日発行のラバ（Rava）らに対する米国特許第５，８７４，２１９号明細書を参照のこと。
【０１５３】
Ｃ５ａＲ及び／又はＦＰＲをインビボで遮断し得るポリペプチドの同定が望ましいことは理解されるであろう。従って、本方法で使用される試薬及び条件は、前記ポリペプチドと相互作用ポリペプチドとの間の相互作用が、前記天然に存在するポリペプチドと天然に存在する相互作用ポリペプチドとの間のインビボでの相互作用と実質的に同じであるよう選択され得ることは理解されるであろう。
【０１５４】
本発明の例示的実施形態が以下の非限定的な例において、以下の図面を参照して記載される。
【実施例】
【０１５５】
実施例Ａ−インビボでのＣＨＩＰＳ活性
材料及び方法
動物モデルにおけるＣＨＩＰＳ毒性の前臨床評価
種々の前臨床毒性試験を実施してＣＨＩＰＳの安全性を調べた。これらには、（ｉ）３匹の麻酔をかけられたビーグルイヌの一群におけるＣＨＩＰＳの様々な心血管及び呼吸パラメータに対する影響。イヌはＣＨＩＰＳを漸増用量０．２、２．０及び２０ｍｇ・ｋｇ-1で投与され、約３０分間隔で静脈内に１分間かけて注入された。（ｉｉ）マウスにおける行動（「アーウィン（Irwin）」）試験：ＣＨＩＰＳが単回静脈注射として雄ＩＣＲ ＣＤ−１マウス（１群当たり３匹）に対し７．５、２５及び７５ｍｇ・ｋｇ-1の用量で投与され、一般行動に対する影響が評価された。別の群には同等量（１０ｍＬ・ｋｇ-1）の媒体（０．９％ｗ／ｖ無菌生理食塩水）が与えられた。（ｉｉｉ）ラットにおける急性静脈内毒性試験：単回用量としての９６．１ｍｇ・ｋｇ-1（量的に考慮して実際に達成可能な最高用量）のＣＨＩＰＳの雄ラット５匹及び雌ラット５匹に対する静脈内投与。（ｉｖ）マウスにおける急性静脈内毒性：単回用量としての９６．１ｍｇ・ｋｇ-1のＣＨＩＰＳの雄マウス５匹及び雌マウス５匹に対する静脈内投与。（ｖ）ラットにおける７日間の予備的な静脈内ボーラス毒性試験（雄２４匹及び雌２４匹、最高用量１０ｍｇ・ｋｇ-1）。（ｖｉ）ラットにおける７日間の静脈内ボーラス毒性試験（雄７６匹及び雌７６匹、最高用量１０ｍｇ・ｋｇ-1）。（ｖｉｉ）イヌにおける７日間の静脈内ボーラス用量範囲設定試験（雄２匹及び雌２匹、最高用量２０ｍｇ・ｋｇ-1）。（ｖｉｉｉ）イヌにおける７日間の静脈内ボーラス毒性試験（雄１２匹及び雌１２匹、最高用量２０ｍｇ・ｋｇ-1）が含まれた。
【０１５６】
ヒトボランティアの組入れ
健常ボランティアの組入れ基準は次のとおりであった。（ｉ）対象者は男性とする。（ｉｉ）対象者は次のボディ・マス・インデックス（ＢＭＩ）範囲：１８〜３０（ｋｇ・ｍ2）及び年齢範囲：１８〜５０歳を、双方とも併せて満たすものとする。（ｉｉｉ）医学的スクリーニングは２つのパートに分けられた。対象者は抗ＣＨＩＰＳ抗体レベルについて予備スクリーニングされた。低い力価の対象者のみが投薬前３週間以内に第２のパートについてスクリーニングされ、これには、病歴、理学的検査、血圧測定、心拍数、呼吸及び体温、アルコール呼気検査、血液検査及び尿検査、心電図（ＥＣＧ）及び薬物スクリーニングが含まれた。
【０１５７】
入院及び経過観察
選ばれた６人の対象者（４人のＣＨＩＰＳ被投与者及び２人の対照者）を投薬１日前、臨床薬理ユニット（オランダ国ユトレヒトケンドール（Kendle, Utrecht））に入院させた。安全性に関する血液試料、検尿、暫定的な病歴、理学的検査、バイタルサイン及びＥＣＧを含むベースライン計測が行われた。投薬当日、野生型ＣＨＩＰＳ（ＣＨＩＰＳを５ｍｇ・ｍＬ-1の濃度で含む無菌凍結等張生理食塩水の単回用量として０．１ｍｇ・ｋｇ-1が投与された）又はプラセボ（０．９％のＮａＣｌ）が５分間にわたる静脈内注入により投与された。対象者は遠隔測定システムに接続され、投薬３０分前から投薬開始４時間後まで心臓がモニタされた。対象者の血圧が、Finapresを使用して投薬５分前から投薬開始３０分後まで、継続的に計測された。入院期間中のある時点でバイタルサインが計測され、ＥＣＧが行われた。安全のため、全対象者の臨床状態及び検査値（血液学、生化学、凝固及び検尿）がモニタされた。有害イベントがその重症度及びＣＨＩＰＳ又はプラセボとの関係性に従い記録され、特性決定された。対象者は投薬後２４時間で退院させた。投薬２週間後、対象者を来診のためユニットに戻し、バイタルサイン、ＥＣＧ、血液及び尿並びに抗ＣＨＩＰＳ抗体レベルを評価した。経過観察のための来診が投薬６週間後に予定された。
【０１５８】
ＣＨＩＰＳのクローニング及び発現
ハース（Haas）ら（２００４年）J. Immunol. １７３：５７０４−１１頁に記載されるとおり、ＣＨＩＰＳをクローニングして発現させた。簡潔にいえば、シグナル配列を含まない遺伝子をｐＲＳＥＴベクターに、エンテロキナーゼ切断部位のすぐ下流及びＥｃｏＲＩ制限部位の前でオーバーラップ伸長ＰＣＲによりクローニングした。細菌をCelLytic B細菌細胞溶解／抽出試薬（シグマ（Sigma））及びリゾチームにより製造者の説明に従い溶解した。ヒスチジン標識されたタンパク質をニッケル・カラム（HiTrap Chelating HP、５ｍＬ、アマーシャム・バイオサイエンシーズ（Amersham Biosciences）を使用して、製造者の指示に従い精製し、その後エンテロキナーゼ（インビトロジェン（Invitrogen））で切断した。試料は純度及びタンパク質の存在について、１５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動、Mini Protean 3 System、バイオ・ラッド（Bio-Rad））及びクマシー・ブリリアント・ブルー（メルク（Merck））染色を用いて確認した。
【０１５９】
静脈内注射用ＣＨＩＰＳの精製
８Ｌの発酵培地中、大豆ペプトン及び酵母抽出物から構成される成長培地において、ＣＨＩＰＳのコード配列を含む大腸菌株中、ＰｅｌＢコード配列のすぐ下流で完全長ＣＨＩＰＳを発現させた。ＣＨＩＰＳは、２段階陽イオン交換精製処理と、続く脱塩ステップにより成長培地及び細胞の双方から単離した。細菌細胞ペレットをＮａＣｌ（１０ｍＭ）、ＤＴＴ（１０ｍＭ）を含有するリン酸緩衝液（３０ｍＭ；ｐＨ７．０）中に再懸濁して凍結した。続いてこれを３７℃で解凍し、氷上でインキュベートして超音波処理した。１５，０００ｒｐｍでの遠心後、琥珀色の「細胞」上清を回収した。上清は３０ｍＭのリン酸緩衝液で４倍に希釈し、Source S-30カラムに通液した。材料をリン酸緩衝液の塩勾配で溶出して、ＣＨＩＰＳを含有する画分を混和したうえ、浅い塩勾配の仕上げカラムを使用してさらに精製した。純度が９７％超（ＨＰＬＣによる）のＣＨＩＰＳ含有画分を混和したうえ、Sephadex G25脱塩カラムに通液してリン酸塩及び過剰な塩化ナトリウムを除去した。アフィミックス（affimix）樹脂（バイオ・ラッド（Biorad））上で穏やかに振盪することによりエンドトキシンを除去し、限外ろ過により調製物を滅菌した。水−ＴＦＡからメタノール−ＴＦＡで構成される勾配移動相を伴うMicrobondapac CN-RPカラムにおいてＨＰＬＣ−ＭＳにより純度を確認した。ＣＨＩＰＳは約１３分でほぼ溶出した。産物を無菌生理食塩水で所要の濃度に希釈して、−２０℃で保管した。
【０１６０】
抗ＣＨＩＰＳ抗体
ウサギをフロイントの完全アジュバントを使用して組換えＣＨＩＰＳで免疫し、フロイントの不完全アジュバントで追加免疫した。放血液は、ＣＨＩＰＳとの反応性についてＥＬＩＳＡにより過去に記載されるとおり（ハース（Haas）ら、２００４年、J Immunol １７３（９）：５７０４−１１頁を参照）確認した。最終放血液から、標準的なProtein-G（ファーマシア（Pharmacia））アフィニティー・クロマトグラフィーにより製造者の指示に従いＩｇＧを精製した。ＣＨＩＰＳに特異的なマウスモノクローナル抗体を記載のとおり生成し、ＩｇＧをProtein-G Sepharoseカラムで精製した（ハース（Haas）ら、２００４年、J Immunol １７３（９）：５７０４−１１頁を参照）。
【０１６１】
アフィニティー精製ヒト−α−ＣＨＩＰＳ ＩｇＧの単離
ＣＨＩＰＳ1-121をＣＮＢＲ活性化Sepharose 4Bを使用して製造者の一般的な指示に従い（ファーマシア・ＧＥ（Pharmacia, GE））固体マトリクスに結合させた。約８ｍｇの精製ＣＨＩＰＳが１グラムのSepharose上に結合した。小型カラム（±１ｍＬ）に材料を充填し、ＰＢＳで平衡化したうえ、ＰＢＳで希釈した静脈内注射用ヒトＩｇＧ（ＩｇＧ−ＩＶ；サンキン（Sanquin）、オランダ国アムステルダム（Amsterdam））でゆっくりと灌流した。カラムをＰＢＳで広範囲にわたり洗浄し、続いてｐＨ３の０．１ＭのグリシンＨＣｌ緩衝液で溶出した。０．５ｍＬの画分を、５０μＬの１Ｍトリス／ＨＣｌ、ｐＨ８の入った試験管に回収して中和した。ＯＤ280が最高の画分をプールし、ＰＢＳに対し透析した。最終調製物をＩｇＧ含量についてＥＬＩＳＡで分析した。従ってプレートをＰＢＳ中２μｇ・ｍＬ-1のヒツジ抗ヒトＩｇＧ（ICN）でコーティングし、５％のＢＳＡでブロッキングしたうえ、標準的なＩｇＧ製剤（標準血清；ベーリンガー（Boehringer））の連続希釈液及び未知試料と共にインキュベートした。捕捉されたＩｇＧを、ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（サザン（Southern））により、ＴＭＢを基質として検出した。ＩｇＧ濃度を基準曲線から計算した。
【０１６２】
抗ＣＨＩＰＳ ＥＬＩＳＡ
マイクロタイター・プレート（グライナー（Greiner））を、ＰＢＳ中１μｇ・ｍＬ-1で１ウェル当たり５０μＬのＣＨＩＰＳにより一晩４℃でコーティングした。全ての洗浄ステップは３度、ＰＢＳ−０．０５％Tween-20により実施し、続いてインキュベーションを３７℃で１時間行った。プレートをＰＢＳ−０．０５％Tween-20、４％ＢＳＡでブロッキングし、洗浄したうえ、ＰＢＳ−０．０５％Tween-20、１％ＢＳＡ中に希釈した血清又は抗体と共にインキュベートした。結合した抗体を、ペルオキシダーゼとコンジュゲートした種特異的ヤギ抗ＩｇＧにより（全て、サザン（Southern）、米国バーミングハム（Birmingham）から）、ＴＭＢを基質として検出した。反応をＨ２ＳＯ４で停止させ、BioRad ELISAリーダーにより４５０ｎｍの吸光度を計測した。
【０１６３】
捕捉ＥＬＩＳＡ
マイクロタイター・プレートを、ＰＢＳ中３μｇ・ｍＬ−１で５０μＬのＣＨＩＰＳ ｍＡｂ ２Ｇ８により一晩４℃でコーティングした。プレートを０．０５％のTween-20を含有するＰＢＳ中４％のＢＳＡでブロッキングし、洗浄したうえ、１％のＢＳＡを含有するＰＢＳ／Tween中の希釈試料及び標準として２倍希釈範囲のＣＨＩＰＳと共にインキュベートした。続いて、プレートを０．３３μｇ・ｍＬ-1のウサギα−ＣＨＩＰＳ ＩｇＧ及び１：５０００希釈ペルオキシダーゼ・コンジュゲート・ヤギ抗ウサギＩｇＧ（サザン（Southern））と共にインキュベートした。基質としてＴＭＢを用いて結合した抗体を定量化し、反応を１ＮのＨ2ＳＯ4で停止させたうえ、BioRad ELISAリーダーにおいて４５０ｎｍで計測した。
【０１６４】
ヒトＰＭＮの単離
健常ボランティアから得た血液は、ナトリウムヘパリン（グライナー・バイオ・ワン（Greiner Bio-One））を抗凝固剤として含む試験管に採取した。ヘパリン処理血液をＰＢＳで１／１（ｖ／ｖ）希釈したうえ、１０ｍＬのFicoll（アマーシャム・バイオサイエンシーズ（Amersham Biosciences）、スウェーデン国ウプサラ（Uppsala））及び１２ｍＬのHistopaque（密度１．１１９ｇ・ｍＬ-1；シグマ・アルドリッチ（Sigma-Aldrich）、ミズーリ州セントルイス（St. Louis））の勾配上に積層した。遠心後（３２０×ｇ、２２℃で２０分間）、好中球をHistopaque相から回収し、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液、Ｌ−グルタミン（インビトロジェン・ライフ・テクノロジーズ（Invitrogen Life Technologies））及び０．０５％のＨＳＡ（サンギン（Sanguin））を含有する冷温のＲＰＭＩ １６４０培地で洗浄した。残った赤血球は３０秒間氷冷水で溶解し、その後濃縮ＰＢＳ（１０×ＰＢＳ）を添加して等張性を回復した。洗浄後、細胞を計数し、ＲＰＭＩ−１６４０／０．０５％のＨＳＡ中に１０７好中球ｍＬ−１で再懸濁した。
【０１６５】
好中球抗原の発現
全血をＫ３−ＥＤＴＡ試験管中に採取し、氷上に置いた。最適希釈の蛍光標識ｍＡｂをファルコン管に分注し、５０μＬの血液と３０分間氷上で穏やかに攪拌しながら混合した。赤血球をＦＡＣＳ溶解溶液（BD）で溶解した後、緩衝液洗浄をして、細胞ペレットを０．１％のアジドを含むＰＢＳ中の０．５％パラホルムアルデヒド中に再懸濁した。好中球表面抗原の発現を、前方散乱及び側方散乱に基づきゲーティングするFACsCaliburで分析した。キャリブレーション・ビーズ（Calibrite；BD）及びアイソタイプの一致した対照を使用して然るべきバックグラウンド値及び電子補償を設定した。以下のｍＡｂ及びプローブを使用した：抗ＣＤ１１ｂ（ＣＲ３）ＡＰＣ標識（クローン４４；BD）；抗ＣＤ６２Ｌ（Ｌ−選択）ＰＥ標識（クローンＤｒｅｇ ５６；BD）；抗ＣＤ８８（Ｃ５ａＲ）ＦＩＴＣ標識（クローンＷ１７／１；セロテック（Serotec））；フルオレセイン標識ホルミル−Ｎｌｅ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｎｌｅ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（「ＦＩＴＣ−ｆＭＬＰ」；モレキュラー・プローブズ（Molecular Probes））；ウサギ抗ＣＨＩＰＳ ＩｇＧ（EWI）及びＦＩＴＣ標識Ｆ（ａｂ）'２ヤギ抗ウサギＩｇＧ（シグマ（Sigma））。
【０１６６】
全血の生体外刺激
Ｋ３−ＥＤＴＡ血の一部を室温で保管しておき、生体外での好中球刺激に使用した。従って、血液を１０倍濃縮刺激剤（緩衝液対照、１×１０-8個のＭｆＭＬＰ）と混合し、３７℃で３０分間、穏やかに振盪しながらインキュベートした。試験管を氷上に置いて反応を停止させたうえ、抗ＣＤ１１ｂに抗ＣＤ６２Ｌ ｍＡｂを加えたものと混合した。３０分後氷上で試料を上記のとおり処理した。
【０１６７】
ＣＨＩＰＳ／ＩｇＧ刺激好中球上でのＣＤ１１ｂ発現
種々の濃度のＣＨＩＰＳ（最終濃度０〜９μｇ・ｍＬ-1）を、アフィニティー精製ヒト−α−ＣＨＩＰＳ−ＩｇＧ（０〜４０μｇ・ｍＬ-1）と共に３７℃で３０分間インキュベートした。その後、５０μＬの単離したヒト好中球（１０７ｍＬ-1）をＣＨＩＰＳ／α−ＣＨＩＰＳの混合物に添加して、３７℃で３０分間、穏やかに振盪しながらインキュベートした。細胞を氷上に１０分間置いた後、３．５μＬの蛍光マウス−α−ヒト−ＣＤ１１ｂ（ＢＤバイオサイエンシーズ（BDbiosciences）、カリフォルニア州サン・ディエゴ（San Diego））を添加したうえ氷上で３０分間インキュベートした。細胞をＲＰＭＩ １６４０／０．０５％ＨＡＳで洗浄したうえ、２００μＬの０．５％パラホルムアルデヒドで固定した。
【０１６８】
全血中の細胞上でのＣＤ１１ｂ発現を、種々のα−ＣＨＩＰＳ力価について選択されたヒトボランティアから採取した血液を使用して実施した。ＩｇＧは全血中に既に存在するため、試料（５０μＬ）はＣＨＩＰＳ（０〜９μｇ・ｍＬ-1）と共に３７℃で３０分間インキュベートしたのみであった。試料を氷上に１０分間置いた後、３．５μＬの蛍光標識マウス抗ヒトＣＤ１１ｂを添加したうえ氷上で３０分間インキュベートした。赤血球を溶解し、細胞はＨ2Ｏで４分間、１：１０希釈した１ｍＬのＦＡＣＳ溶解溶液を添加することにより固定した。細胞を１０分間、１２００ｒｐｍで回転させ、ペレットを洗浄して氷冷ＲＰＭＩ １６４０／０．０５％ＨＡＳで洗浄した。最後に細胞を１７５μＬのＲＰＭＩ １６４０／０．０５％ＨＳＡ中に再懸濁した。細胞活性化を表す受容体発現をFACSCaliburフローサイトメーター（ＢＤバイオサイエンシーズ（BD Biosciences））で計測した。
【０１６９】
循環免疫複合体（ＣＩＣ）
カイデル（Quidel）（カリフォルニア州サン・ディエゴ（San Diego））からの２つの異なるＥＬＩＳＡによりＣＩＣを測定した。ＣＩＣ−Ｃ１ｑ酵素免疫測定法は、補体結合ＩＣが固定化されたヒトＣ１ｑ精製タンパク質に結合するという原理に基づく。ＣＩＣ−Ｒａｊｉ細胞置換酵素免疫測定法は、Ｃ３のｉＣ３ｂ、Ｃ３ｄｇ及びＣ３ｄ活性化断片に特異的に結合するｍＡｂを使用して、古典的Ｒａｊｉ細胞ＣＲ２結合反応と類似した方式でＩＣ含有Ｃ３活性化断片を計測する。双方のアッセイのデータは結合し、結果は時点０の相対値として表した。
【０１７０】
血清トリプターゼ濃度
血清由来トリプターゼ（α型及びβ型の双方）を、ファーマシア・ダイアグノスティックス（Pharmacia Diagnostics）（オランダ国ウールデン（Woerden））からのImmunoCAPTM技術を使用するUniCAP R-100で計測した。健常対照者の標準幾何平均は５．６μｇ・Ｌ−１である（ファーマシア（Pharmacia））。結果は時点０の相対値として表した。
【０１７１】
研究プロトコル及び任意の修正事項は独立倫理委員会により承認された。本研究は、欧州共同体（ＥＣ）規則の医薬品の臨床試験の実施に関する基準（Good Clinical Practice：ＧＣＰ）及び「ヘルシンキ宣言（Declaration of Helsinki）」（２０００年）を順守して実施された。
【０１７２】
結果
ＣＨＩＰＳは前臨床毒性試験において明らかな毒性は示さない
動物毒性試験のいずれにおいても、ＣＨＩＰＳの投与は、臨床所見、体重、摂食量、血液学、凝固、血液化学パラメータ、検眼鏡検査、心電図、肉眼的若しくは顕微鏡的病理学又は行動において、ＣＨＩＰＳに関連した毒性学的に有意ないかなる変化も引き起こさなかった。
【０１７３】
麻酔ビーグルイヌにおけるＣＨＩＰＳの様々な心血管及び呼吸パラメータに対する影響を調べた。低用量ＣＨＩＰＳ（０．０２及び２ｍｇ・ｋｇ-1）を与えられたイヌにおいては、媒体（等張生理食塩水）の注入と比較して、心血管及び呼吸に影響するという証拠はなかった。２０ｍｇ・ｋｇ-1のＣＨＩＰＳの静脈内投与後、平均動脈圧の過渡的な低下（約４０％）が投与開始約１分後に記録された。平均動脈圧レベルは投薬開始後約５分以内に投与前レベルに戻った。血圧に対する影響は、過渡的な一定しない心拍数の変化と同時に起こった。１匹のイヌにＣＨＩＰＳ（２０ｍｇ・ｋｇ-1）の反復静脈内投与用量を最初のＣＨＩＰＳ投与の約３０分後に投与した。最初の投与後に記録されたものと同様の心肺パラメータに対する過渡的な影響は、ＣＨＩＰＳの反復投与後には現れなかった。しかしながら、第２の投与により、第２の投与後約３０分で最大１８％に達する平均動脈圧の持続的な低減が生じた。この動物においてのみ、ＣＨＩＰＳの反復投与の１２分後、ある型の軽度アレルギー反応と一致する全身性の皮膚反応が現れた。
【０１７４】
この研究結果から、使用される用量範囲（０．１ｍｇ・ｋｇ-1）において心肺への影響がヒト対象者において認められる可能性は低いことが示唆される。さらに、起こり得るいかなる影響も、一過性で可逆的であるものと予想された。
【０１７５】
α−ＣＨＩＰＳ抗体力価の分布
黄色ブドウ球菌は一般的な細菌であり、ＣＨＩＰＳ遺伝子は大半の黄色ブドウ球菌株に存在するため、本出願人は、全ての人が循環α−ＣＨＩＰＳ抗体をもっていると仮定した。従って本出願人は、健常ボランティアの血清中のα−ＣＨＩＰＳ ＩｇＧの量を試験した。図１は、１６８人の健常ヒトボランティア集団におけるα−ＣＨＩＰＳ ＩｇＧ力価の分布を示す。計測された試料のこの集団には、使用したＥＬＩＳＡの検出限界を下回る力価はなかった。研究対象の母集団は、一般母集団を代表していると見なされる。このデータから結論をまとめれば、一般母集団の９９％を超える人が検出可能なα−ＣＨＩＰＳ ＩｇＧ血清レベルを有する。また、図１には試験に組み入れられた対象者の力価も示される。
【０１７６】
静脈内投与されたＣＨＩＰＳの薬物動態（Pharmokinetics）
ＣＨＩＰＳ投与後の４つの異なる時点において、ＥＬＩＳＡによりＣＨＩＰＳ血清力価を測定した（図２）。低いα−ＣＨＩＰＳ抗体力価を有したＣＨＩＰＳ被投与者においてのみ（対象者１０４及び１０５）、ＣＨＩＰＳ力価の増加が認められた。本出願人は、ヒト血清のＣＨＩＰＳ ＥＬＩＳＡに対する影響を測定した。ＣＨＩＰＳを様々な濃度のヒトプール血清中にスパイクし、捕捉ＥＬＩＳＡにより検出した。図３ａは血清が捕捉ＥＬＩＳＡを阻害することを示す。ＩｇＧなしにProtein G−セファロース・カラムを使用すると、阻害効果はなくなる（図３ｂ）。
【０１７７】
ＣＨＩＰＳはインビボでＦＰＲ及びＣ５ａＲに結合する
ＣＨＩＰＳは高親和性で好中球上のＦＰＲ及びＣ５ａＲに結合し、マウスｍＡｂ．１５８について先述したとおりα−ＣＨＩＰＳ抗体により検出できる。図４に示されるとおり、ＣＨＩＰＳ投与後様々な時点で好中球の表面上に存在するＣＨＩＰＳの量をウサギ−α−ＣＨＩＰＳ抗体を使用して測定した。α−ＣＨＩＰＳ抗体力価が低い対象者（対象者＃１０４及び＃１０５）においてのみ、好中球の表面上にＣＨＩＰＳが検出された。さらに、これらの２人の対象者においてＣＨＩＰＳの検出はα−ＣＨＩＰＳ抗体力価と負の相関を有した。血清中に存在するα−ＣＨＩＰＳ抗体はＣＨＩＰＳの直接的な検出を妨げるため、この直接検出のマイナスの結果は、受容体に結合するＣＨＩＰＳを排除できない。しかしながら、ＦＰＲ及びＣ５ａＲに結合するＣＨＩＰＳは、過去に記載されるとおりこれらの受容体のα−ＦＰＲ及びα−Ｃ５ａＲ抗体による検出を妨げる（フェルトカンプ（Veldkamp）ら、２０００年、Infect Immun ６８（１０）：５９０８−１３頁を参照）。図５は、ＦＩＴＣ−ｆＭＬＰ及びα−Ｃ５ａＲ抗体結合により測定されたＦＰＲ及びＣ５ａＲ受容体発現を示す。ＣＨＩＰＳ抗体力価が低い対象者はＦＰＲ及びＣ５ａＲの発現低下を示し、これはＣＨＩＰＳが受容体を占有したことを示す。α−ＣＨＩＰＳ抗体力価が高い対象者（１０３及び１０６）にはＦＰＲ及びＣ５ａＲの発現に変化はなく、これはα−ＣＨＩＰＳ抗体がＣＨＩＰＳの受容体との結合を妨げることを示す。
【０１７８】
ＣＨＩＰＳはα−ＣＨＩＰＳ抗体力価に応じて生体外でのｆＭＬＰ誘導性好中球活性化を阻害する
細胞が活性化すると、ＣＤ６２Ｌの発現が低下し、ＣＤ１１ｂの発現が上昇する。静脈内ＣＨＩＰＳの好中球阻害に対する影響を試験するため、本出願人は、生体外でのＣＤ６２Ｌ及びＣＤ１１ｂのｆＭＬＰ誘導性発現を計測した。好中球を全血アッセイにおいて生体外でｆＭＬＰにより活性化させた。図６に示されるとおり、静脈内投与されたＣＨＩＰＳは好中球のｆＭＬＰ誘導性活性化を生体外で阻害できる。この阻害は、検出可能なＣＨＩＰＳ血清濃度の対象者（対象者１０４及び１０５）においてのみ認められた。
【０１７９】
ＣＨＩＰＳ誘導性有害作用
ＣＨＩＰＳの投与直後に重篤な副作用が認められた。最も重篤な有害イベントは対象者１０６について認められ、これには、筋肉痛、呼吸困難、腹痛、嘔吐、筋攣縮、悪寒、発汗、眼窩浮腫及び眩暈が含まれた。こうした症状の確定診断はアナフィラキシー様反応である。対象者はクレマスチン、静脈内輸液、トラマドール及びプレドニゾロンで処置された。
【０１８０】
報告された他の有害イベントとしては、動悸、熱感、胸痛、紅潮、冷感、脚の疲労、起立性眩暈、発熱、頭痛、悪心、霧視が挙げられる。対象者１０６の重度の背痛の他、対象者１０３及び１０５は軽度の背痛を報告した。対象者１０４は筋痙攣を報告した。最高３８．６℃の発熱が対象者１０４及び１０５に認められ、これは投与の約４時間後に始まって１日目の夜に回復した。
【０１８１】
血圧に変化はなく、及びＥＣＧの異常はなかった。酸素飽和について、対象者１０６の上記の有害イベントの間における断続的な低い値を除き（８９％の酸素飽和）、異常は認められなかった。プラセボを与えられた対象者において有害イベントは報告されなかった。
【０１８２】
静脈内ＣＨＩＰＳは白血球減少症を誘発し、ＣＲＰレベルを上昇させる
本出願人は、図７に示されるとおり、白血球数（ＷＢＣ）及びＣ反応性タンパク質濃度（ＣＲＰ）を投与前及び投与後に計測した。ＣＨＩＰＳはＣＨＩＰＳを与えられた対象者に一過性の白血球減少症を誘発し、これは２日以内に消散した。さらには投与後１日目に始まるＣＲＰ濃度の上昇があり、これは対象者が１５日目の経過観察においてスクリーニングされたときには正常レベルに戻っていた（図７ｂ）。
【０１８３】
循環免疫複合体及び血清トリプターゼの上昇はアナフィラキシー様反応を示す
本出願人は、循環免疫複合体の量及び血清トリプターゼ濃度を計測した。ＣＨＩＰＳの静脈内投与はＣＨＩＰＳを与えられた対象者に免疫複合体の形成を誘発する（図８ａ）。本出願人はまたトリプターゼ血清濃度の上昇も認め、これは投与後約１０分で最高値に達した（図８ｂ）。
【０１８４】
ＣＨＩＰＳはインビボで細胞活性化を誘導する
ＣＨＩＰＳの細胞活性化に対する直接的な影響について調べるため、本出願人は、好中球上でのＣＤ６２Ｌ及びＣＤ１１ｂ受容体の発現を測定した。受容体発現は血液試料の採取直後に、さらなる細胞刺激は一切なしに計測した。対象者１０４、１０５及び１０６は、インビボ細胞活性化を示す好中球上での発現について、ＣＤ６２Ｌは低下、及びＣＤ１１ｂは上昇を示す（図９）。
【０１８５】
α−ＣＨＩＰＳ抗体力価はＣＨＩＰＳ投与後に上昇する
タンパク質の免疫原性が抗体の誘導能により特性決定された。本出願人は、ＣＨＩＰＳの免疫原性を健常ヒト対象者において測定した。静脈内ＣＨＩＰＳを与えられた対象者は、α−ＣＨＩＰＳ ＩｇＧ（図１０）の上昇を示す。
【０１８６】
インビトロでの好中球のＣＨＩＰＳ活性化は抗体濃度に依存する
本出願人は、インビトロでのＣＨＩＰＳ−ＩｇＧ複合体による好中球の活性化について調べた。図１１に示されるとおり、種々の濃度のＣＨＩＰＳを２０μｇ・ｍＬ-1のヒト・アフィニティー精製α−ＣＨＩＰＳ ＩｇＧと共にプレインキュベートし、これを使用して単離した好中球を刺激した。アフィニティー精製α−ＣＨＩＰＳ ＩｇＧはＣＨＩＰＳの不在下では好中球を活性化できなかった（データは示さず）。ＣＨＩＰＳ−ＩｇＧ複合体は用量依存的に好中球を刺激できた。図５．１１はまた、細胞を最大限に活性化させるために必要な最適ＣＨＩＰＳ濃度があることを示す。ＣＨＩＰＳ−ＩｇＧ誘導性細胞活性化は、ＦｃＲ遮断抗体により完全に阻害された。従って本出願人は、このアッセイにおけるＣＨＩＰＳ−ＩｇＧ誘導性細胞活性化がＦｃ受容体介在性であると結論付ける。
【０１８７】
ＣＨＩＰＳR46A（４６位のアルギニンがアラニンと置換されている）及びＣＨＩＰＳK69A（９６位のリジンがアラニンと置換されている）は単一アミノ酸置換を伴う２つのＣＨＩＰＳ突然変異体であり、過去に記載されている（ハース（Haas）ら、２００５年、J Mol Biol ３５３（４）：８５９−８７２頁を参照）。これらのＣＨＩＰＳ突然変異体は、ＥＬＩＳＡにより計測されるとき、精製α−ＣＨＩＰＳ ＩｇＧに対する親和性の低下を示す（データは示さず）。これらの突然変異体が全血細胞活性化アッセイにおいて使用されるとき、その細胞活性化の潜在能力は野生型ＣＨＩＰＳと比較して低い（図１２）。ＣＨＩＰＳR46A及びＣＨＩＰＳK69Aについて、野生型ＣＨＩＰＳと比較して、それと同じ細胞活性化を得るには１０倍高い濃度が必要とされる。これは、抗体力価の次に、抗原との反応性レベルが細胞活性化の大きさを決定することを示している。
【０１８８】
ＣＨＩＰＳによる好中球の生体外での活性化もまた、α−ＣＨＩＰＳ ＩｇＧ濃度に依存する
本出願人は、全血生体外アッセイにおけるＣＨＩＰＳの好中球活性化に対する影響を計測した。α−ＣＨＩＰＳ抗体は全血中に既に存在するため、本出願人は、ＣＨＩＰＳをアフィニティー精製α−ＣＨＩＰＳ ＩｇＧと共にプレインキュベートしなかった。種々の濃度のＣＨＩＰＳをヒトボランティア由来の血液に添加し、細胞活性化を表すＣＤ１１ｂ発現を計測した。図１３は、種々のα−ＣＨＩＰＳ ＩｇＧ力価をもつ８人の健常ボランティア由来の全血中でＣＤ１１ｂ発現により計測される好中球刺激を最大とするために必要なＣＨＩＰＳ濃度を示す。インビトロ実験において示されるとおり、最大好中球刺激は、ＣＨＩＰＳ／α−ＣＨＩＰＳの比に依存する。これはまた、この生体外アッセイにおいても認められる。より高いα−ＣＨＩＰＳ濃度が存在するとき、好中球の最大刺激にはより高濃度のＣＨＩＰＳが必要とされる。
【０１８９】
考察
黄色ブドウ球菌走化性阻害タンパク質は、ヒトＣ５ａ受容体及びホルミルペプチド受容体の非常に強力な阻害因子である。双方の受容体とも、但し特にＣ５ａＲが、様々な炎症性疾患の処置における重要な標的であると記載されている。ＣＨＩＰＳのＣ５ａＲ及びＦＰＲを阻害する強力な能力により、このタンパク質はこうした疾患の処置における候補治療剤となる。さらにはＣ５ａＲ及びＦＰＲに対する活性がＣＨＩＰＳ分子の異なる領域に位置するという事実から、特異的な受容体標的化が可能となる（ハース（Haas）ら、２００４年、J Immunol １７３（９）：５７０４−１１頁を参照）。ＣＨＩＰＳタンパク質のヒト特異性は、ヒト細胞に対する活性がマウス細胞と比較して３０倍の差があることから明らかなとおり、動物モデルにおけるインビボＣＨＩＰＳ活性の評価を妨げる（ドハース（de Haas）ら、２００４年、J Exp Med １９９（５）：６８７−９５頁を参照）。
【０１９０】
本出願人は、６人の健常ヒト対象者集団における黄色ブドウ球菌の走化性抑制タンパク質の活性、薬物動態（pharmokinetics）及び毒性について調べた。種々の動物モデルにおいて高濃度のＣＨＩＰＳを投与する前臨床毒性試験（マウスにおける最高９６．１ｍｇ・ｋｇ-1の単回静脈内投与）は、顕著な毒性の徴候は示さない。従って５分間にわたり静脈内投与される０．１ｍｇ・ｋｇ-1の開始用量が安全と考えられた。
【０１９１】
黄色ブドウ球菌は一般的な細菌であり、ＣＨＩＰＳタンパク質は大半の黄色ブドウ球菌株中で発現するため、本出願人は、全ての人にα−ＣＨＩＰＳ抗体が存在すると仮定した。これは、ヒトボランティア由来の１６８例の無作為に採取された血清のプールにおいて、α−ＣＨＩＰＳ ＩｇＧ力価をスクリーニングすることにより確認された。マウスモノクローナル抗体を用いた実験により、これらのモノクローナル抗体はＣＨＩＰＳ活性をインビトロで干渉し得ることが示された（ハース（Haas）ら、２００４年、J Immunol １７３（９）：５７０４−１１頁を参照）。従って、ＣＨＩＰＳタンパク質を与えられた健常対象者に存在するα−ＣＨＩＰＳ抗体もまた活性を干渉すると想定することは合理的である。
【０１９２】
ＣＨＩＰＳのヒト対象者に対する投与は、活性及び薬物動態（pharmokinetics）をインビボで研究するためのまたとない機会であった。０．１ｍｇ・ｋｇ-1のＣＨＩＰＳの静脈内投与後、本出願人はＣＨＩＰＳ血清濃度を計測した。図２は、投与後の種々の時点におけるＣＨＩＰＳ血清濃度を示す。ＣＨＩＰＳタンパク質を与えられた４人の対象者のうち２人においてのみ、本出願人はＣＨＩＰＳ血清濃度の上昇を計測した（対象者１０４及び１０５）。興味深いのは、これらの２人はまた、最も低いα−ＣＨＩＰＳ ＩｇＧ力価も示したという観察結果である。これは、α−ＣＨＩＰＳ抗体がＣＨＩＰＳの検出を干渉することを示している。結果的に、この干渉に起因して、対象者１０４及び１０５において計測されたＣＨＩＰＳ血清濃度は過小評価である。これらのデータに基づき、本出願人はインビボでのＣＨＩＰＳの予測半減期を少なくとも１．５時間と計算した。
【０１９３】
本出願人は好中球膜表面上に存在するＣＨＩＰＳの量を検出したとき、α−ＣＨＩＰＳ ＩｇＧ力価と同じ相関を認めた。ＣＨＩＰＳを好中球の表面上で検出できたのは、対象者１０４及び１０５からのみであった。さらに本出願人は、これらの人におけるα−ＦＰＲ及びα−Ｃ５ａＲ抗体による双方の受容体の検出には下方制御があることから、これらのＣＨＩＰＳ分子がＦＰＲ及びＣ５ａＲを占有することを示した。また、対象者１０４及び１０５由来の好中球のみが、ｆＭＬＰで刺激したとき活性化の低下を示した。残念なことに、Ｃ５ａ刺激による実験は技術的問題から失敗した。しかしながらこれらの実験は、静脈内投与されたＣＨＩＰＳが生体外での好中球活性化に対し阻害効果を有するとともに、この効果はα−ＣＨＩＰＳ抗体により阻害されることを明確に示している。
【０１９４】
前臨床動物毒性試験において関連有害作用は認められなかった。ヒト対象者における０．１ｍｇ・ｋｇ-1のＣＨＩＰＳの投与は、２人の対象者（対象者１０３及び１０４）により耐容され、対象者１０５においては中程度に耐容されたが、対象者１０６はＣＨＩＰＳ注入直後に重篤な症状を発症し、これはアナフィラキシー様反応と診断された。本出願人は全対象者において好中球ＣＤ１１ｂ表面発現を計測し、ＣＨＩＰＳ誘導性細胞活性化について調べた。細胞の活性化が対象者１０４、１０５及び１０６で認められた。ＣＨＩＰＳを与えられた対象者群には、対照と比較して投与後２日目にＣ反応性タンパク質の上昇があった。
【０１９５】
末梢組織に見られる白血球のマスト細胞は、炎症及び即時型アレルギー反応において中心的な役割を果たす。分泌顆粒からのトリプターゼの放出は、マスト細胞脱顆粒に特有の特徴である。血清マスト細胞トリプターゼ濃度はアナフィラキシー及び他のアレルギー病態において上昇する（ペイン及びカム（Payne & Kam）、２００４年、Anaesthesia ５９（７）：６９５−７０３頁を参照）。ＣＨＩＰＳ投与後に観察されるアナフィラキシー様反応が、マスト細胞活性化を表すトリプターゼレベルの上昇により確認された。トリプターゼレベルの上昇に先行して循環免疫複合体が増加した。免疫複合体はＦｃγＲ架橋結合により、並びに補体の活性化及びＣ５ａの生成を通じて、マスト細胞を活性化できる（ジャンカー及びクレスポ（Jancar & Crespo）、２００５年、Trends Immunol ２６（１）：４８−５５頁を参照）。
【０１９６】
インビトロ実験により、α−ＣＨＩＰＳ抗体の存在下におけるＣＨＩＰＳの細胞活性化特性が確認された。ＣＨＩＰＳ誘導性好中球活性化はＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩ遮断抗体を遮断することにより阻害された。これは、こうした細胞のＣＨＩＰＳ誘導性活性化がＣＨＩＰＳ／α−ＣＨＩＰＳ免疫複合体により引き起こされている可能性が最も高いことを示す。本出願人が試験対象者において循環免疫複合体を調べるとき、静脈内ＣＨＩＰＳを与えられた対象者については免疫複合体の増加も見る。α−ＣＨＩＰＳ抗体力価とＣＨＩＰＳ誘導性細胞活性化との間の関係もまた、インビトロ実験及び生体外実験から明らかである。これは、最も高いα−ＣＨＩＰＳ抗体力価を有する対象者１０３は軽い有害作用しか報告がないという観察結果と対照的である。当然ながら、研究対象の集団は４人の対象者のみに限られていたとともに、各個人のなかでも数多くの異なる要因が有害作用の発症及び知覚に影響を及ぼしている。さらには、インビトロ実験により、細胞活性化を誘導する最適抗体濃度があることが実証される。非常に高いα−ＣＨＩＰＳ抗体力価はアナフィラキシー様反応の発症を減少させる可能性がある。先行研究により、ＣＨＩＰＳはＣ５ａＲ及びＦＰＲを発現するもの以外の細胞を結合せず、ＣＨＩＰＳによる直接的な細胞活性化についての証拠はないことが示された。抗体は細胞活性化において明らかに役割を果たすが、観察数の少なさ及びインビボの複雑性がこうしたデータの解釈を阻む。
【０１９７】
本出願人は、α−ＣＨＩＰＳ ＩｇＧに対する親和性の低減した２つのＣＨＩＰＳ突然変異体（ＣＨＩＰＳR46A及びＣＨＩＰＳK69A）がインビトロでの潜在的な細胞活性化能力の低下を示すことを実証した。α−ＣＨＩＰＳ抗体の相殺作用にもかかわらず、本出願人は有意な血清濃度のＣＨＩＰＳタンパク質を検出できた。さらに、静脈内投与されたＣＨＩＰＳは、ＦＰＲ及びＣ５ａＲに結合して循環好中球上に検出され、ｆＭＬＰで生体外刺激すると好中球反応を阻害できた。これは、ＣＨＩＰＳタンパク質がその標的であるＦＰＲ及びＣ５ａＲをインビボで探し当てられることを示す。
【０１９８】
本出願人は、ＣＨＩＰＳタンパク質の血清中における半減期が約１．５時間であることを示した。さらに、同じ半減期が、細胞表面でその受容体に結合したＣＨＩＰＳにも認められたが、これは機能的な半減期が同程度の大きさであることを示す。これは、ＣＨＩＰＳタンパク質が血液から直ちには排除されないことを示す。急性心筋梗塞における血栓溶解に使用されるタンパク質性薬物であるストレプトキナーゼについて示されているとおり（ウー（Wu）ら、１９９８年、Appl Environ Microbiol ６４（３）：８２４−８２９頁を参照）、ＣＨＩＰＳタンパク質の半減期は点突然変異を導入することにより増加する可能性もあり得る。しかしながら、１．５時間という半減期は、投与を中止すればいかなる（免疫抑制）効果も急速に消失するであろうことを意味する。これは、インフリキシマブのような、感染症の発生率の上昇と関連付けられている長い半減期を伴う抗体薬（リスティング（Listing）ら、２００５年、Arthritis Rheum ５２（１１）：３４０３−３４１２頁；クラム（Crum）ら、２００５年、Medicine（Baltimore）８４（５）：２９１−３０２頁を参照）に優る利点であり得る。
【０１９９】
実施例Ｂ−ランダム・ペプチド・ファージ・ディスプレイ・ライブラリを使用した黄色ブドウ球菌走化性阻害タンパク質におけるヒトＩｇＧの立体構造依存性エピトープの同定
材料及び方法
組換えタンパク質のクローニング、発現及び精製
ＣＨＩＰＳ、ＣＨＩＰＳ31-121（最初の３０個のアミノ酸がないＣＨＩＰＳ）及びＣＨＩＰＳ31-113（最初の３０個及び最後の８個のアミノ酸がないＣＨＩＰＳ）を過去に記載されるとおり作成した（ドハース（de Haas）ら、２００４年、J Exp Med １９９（５）：６８７−９５頁； ハース（Haas）ら、２００４年、J Immunol １７３（９）：５７０４−１１頁を参照）。遺伝子はｐＲＳＥＴ−Ｂベクターに、エンテロキナーゼ切断部位のすぐ下流及びＥｃｏＲＩ制限部位の前にオーバーラップ伸長ＰＣＲによりクローニングした（ホー（Ho）ら、１９８９年、Gene ７７（１）：５１−５９頁を参照）。最初にＣＨＩＰＳ遺伝子を黄色ブドウ球菌染色体ＤＮＡから増幅した。この産物を鋳型として使用して、さらにクローニングした。Pfu Turbo DNAポリメラーゼ（ストラタジーン（Stratagene）、テキサス州シーダー・クリーク（Cedar Creek））を使用して増幅反応を行なった。製造者の指示に従い（インビトロジェン（Invitrogen））、最終ＰＣＲ産物をＰＣＲ精製キット（Qiaquick、キアゲン（Qiagen））を使用して精製し、ｐＲＳＥＴ−ＢベクターのＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩ部位にクローニングしたうえＴＯＰ１０Ｆ’大腸菌中で増殖させた。ABI Prism 377（アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems））を使用して妥当な配列を検証した後、組換えタンパク質を１ｍＭのＩＰＴＧ（イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトシド、インビトロジェン（Invitrogen））で誘導することによりRosetta-Gami大腸菌（ノバジェン、メルク・バイオサイエンシーズ（Novagen, MERCK Biosciences））内で発現させた。
【０２００】
細菌をCelLytic B細菌細胞溶解／抽出試薬（シグマ（Sigma））及びリゾチームにより製造者の説明に従い溶解した。ヒスチジン標識タンパク質を、ニッケル・カラム（HiTrap Chelating HP、５ｍＬ、アマーシャム・バイオサイエンシーズ（Amersham Biosciences）を使用して製造者の指示に従い精製し、その後エンテロキナーゼ（インビトロジェン（Invitrogen））で切断した。試料は純度及びタンパク質の存在について、１５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動、Mini Protean R3 System、バイオ・ラッド（Bio-Rad））及びクマシー・ブリリアント・ブルー（メルク（Merck））染色を用いて確認した。タンパク質濃度を２８０ｎｍの吸光度により測定した。
【０２０１】
細胞培養
Ｃ５ａＲをトランスフェクトしたＵ９３７細胞（ヒト前単球細胞系）（Ｕ９３７／Ｃ５ａＲ）を、プロスニッツ（Prossnitz）博士（ニューメキシコ大学（University of New Mexico）、ニューメキシコ州アルバカーキ（Albuquerque））から供与して頂いた。あるいは、かかる細胞は当該技術分野において周知の技法を使用して産生してもよい。
【０２０２】
細胞を、３７℃の５％ＣＯ２インキュベーター内に置かれた２μＬのベントキャップ付き７５ｃｍ2細胞培養フラスコ（コーニング（Corning）、マサチューセッツ州アクトン（Acton））中で成長させた。細胞は、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（インビトロジェン・ライフ・テクノロジーズ（Invitrogen Life Technologies））、２．５ｍｇ・ｍＬ-1のグルコース（シグマ・アルドリッチ（Sigma-Aldrich））、１０％のＦＣＳ（インビトロジェン・ライフ・テクノロジーズ（Invitrogen Life Technologies））及び１０μｇ・ｍＬ-1のゲンタマイシン（インビトロジェン・ライフ・テクノロジーズ（Invitrogen Life Technologies））を含むＬグルタミン含有ＲＰＭＩ １６４０培地（インビトロジェン・ライフ・テクノロジーズ（Invitrogen Life Technologies））に維持した。細胞は週２回、１／１０（ｖ／ｖ）希釈した（ハース（Haas）ら、２００４年、J Immunol １７３（９）：５７０４−１１頁を参照）。
【０２０３】
ＣＨＩＰＳ活性アッセイ
化学誘引物質による活性化は細胞内遊離カルシウム濃度の急速な、且つ一過性の上昇を惹起する。Ｕ９３７／Ｃ５ａＲ細胞によるカルシウム動員を先行文献に記載のとおり計測した（ハース（Haas）ら、２００４年、J Immunol １７３（９）：５７０４−１１頁を参照）。簡潔にいえば、野生型ＣＨＩＰＳ及びトランケート型ＣＨＩＰＳ変異体（ＣＨＩＰＳ31-121及びＣＨＩＰＳ31-113）について、そのＣ５ａ誘導性カルシウム動員を阻害する能力を試験した。細胞（ＲＰＭＩ １６４０／０．０５％ＨＡＳ中５×１０6ｍＬ-1）を２×１０-6ＭのFluo-3-AM（モレキュラー・プローブズ（Molecular Probes）、オレゴン州ユージーン（Eugene））と共に室温で２０分間インキュベートし、２回洗浄したうえＲＰＭＩ １６４０／０．０５％ＨＳＡ中に懸濁した（１０6ｍＬ-1）。細胞は、緩衝液、又は１μｇ・ｍＬ-1のＣＨＩＰＳ又はＣＨＩＰＳ変異体と共に室温で３０分間プレインキュベートした。緩衝液とのインキュベーションをブランク対照として供した。Ｃ５ａ（シグマ・アルドリッチ（Sigma-Aldrich））により濃度を上昇させながら細胞を刺激した。細胞活性化を表す蛍光の上昇をFACSCaliburフローサイトメーターで計測した。
【０２０４】
抗ＣＨＩＰＳ ＥＬＩＳＡ
マイクロタイター・プレート（グライナー（Greiner））を４℃で一晩ＰＢＳ中１μｇ・ｍＬ-1で１ウェル当たり５０μＬのＣＨＩＰＳによりコーティングした。全ての洗浄ステップはＰＢＳ−０．０５％Tween-20で３度行い、続いて３７℃で１時間のインキュベーションを行った。プレートをＰＢＳ−０．０５％Tween-20、４％ＢＳＡでブロッキングし、洗浄したうえ、ＰＢＳ−０．０５％Tween-20、１％ＢＳＡに希釈した抗体と共にインキュベートした。結合した抗体を、ペルオキシダーゼをコンジュゲートした種特異的ヤギ抗ＩｇＧにより（全て、サザン（Southern）、米国バーミングハム（Birmingham）から）、ＴＭＢを基質として検出した。反応をＨ2ＳＯ4で停止させ、４５０ｎｍの吸光度をBioRad ELISAリーダーで計測した。ペプチド実験については、プレートを４℃で一晩ＰＢＳ中±１０μＭの２５ｍｅｒペプチドでコーティングし（製薬化学局（Department of Pharmaceutical Chemistry）、オランダ国ユトレヒト（Utrecht）；ハース（Haas）ら、２００４年、J Immunol １７３（９）：５７０４−１１頁を参照）、ＣＨＩＰＳについて記載されるとおり処理した。
【０２０５】
ヒト−α−ＣＨＩＰＳ−ＩｇＧのアフィニティー精製
ＣＨＩＰＳ又はトランケート型ＣＨＩＰＳ変異体をＣＮＢｒ活性化sepharose 4B（アマーシャム・バイオサイエンシーズ（Amersham Biosciences）、スウェーデン国ウプサラ（Uppsala））に結合させたうえ、Tricon 5/20カラム（アマーシャム・バイオサイエンシーズ（Amersham Biosciences）に製造者の指示に従い充填した。ヒトＩｇＧ（６０ ｍｇ・ｍＬ-1）（サンキン（Sanquin）、オランダ国アムステルダム（Amsterdam））をＰＢＳ中に３回希釈し、０．２μｍフィルターでろ過した。アフィニティー精製をAEKTA Primeシステムで５０ｍＬループ（アマーシャム・バイオサイエンシーズ（Amersham Biosciences））を使用して、製造者のプロトコルに従い実施した。簡潔にいえば、カラムを１０カラム容積のＰＢＳで洗浄した後、合計１ｇのヒトＩｇＧ（２０ｍｇ・ｍＬ-1）を流速０．５ｍＬ・分-1でカラムに流した。カラムを１０カラム容積のＰＢＳで洗浄し、結合したヒトＩｇＧを０．１Ｍのグリシン、ｐＨ３．０で溶出した。０．５ｍＬの画分を５０μＬの１Ｍトリス、ｐＨ８．０を含む試験管に回収した。タンパク質を含む溶出画分（ＯＤ280により計測したとき）をプールし、緩衝液をAmicon Ultra 15 5000 MWCOスピンカラムを使用してＰＢＳに変えた。ナトリウムアジドを最終濃度０．０２％まで添加したうえ、アフィニティー精製ヒト−α−ＣＨＩＰＳ−ＩｇＧを４℃で保管した。
【０２０６】
ＣＨＩＰＳ31-113タンパク質を発現するファージの調製
ＶＳＣＭ１３（ストラタジーン（Stratagene）、米国カリフォルニア州ラ・ホーヤ（La Jolla））をヘルパー・ファージとして使用して、ファージ・ストックを標準的なプロトコルに従い調製した。簡潔にいえば、ＣＨＩＰＳ31-113遺伝子をｐＦＡＢ７５ベクターのＰＩＩＩ遺伝子のすぐ上流にクローニングし（エングバーグ（Engberg）ら、１９９６年、Mol Biotechnol ６（３）：２８７−３１０頁を参照）、大腸菌ＴＯＰ１０Ｆ’（インビトロジェン（Invitrogen）、米国カリフォルニア州カールズバッド（Carlsbad））に形質転換した。細菌は対数期まで培養して、ヘルパー・ファージを感染させた（感染効率：約２０）。重感染させた細菌を３７℃で３０分間、振盪せずにインキュベートした。細菌細胞を遠心により回収し、それを使用してアンピシリン（５０μｇ・ｍＬ-1）、カナマイシン（１０μｇ・ｍＬ-1）、テトラサイクリン（１０μｇ・ｍＬ-1）及びイソプロピル−α−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）（１ｍＭ）を含有するＬＢ培地に接種した。培養物は３０℃で１５時間、激しく振盪しながらインキュベートした。上清を遠心により回収し、培養物容積の１／６の２５％ＰＥＧ６０００（フルカ（Fluka））、３ＭのＮａＣｌを添加することによりファージを沈殿させた。沈殿したファージをＰＢＳ、１％ＢＳＡ中に再懸濁し、０．４５μｍフィルターで無菌ろ過した。
【０２０７】
ヒト・アフィニティー精製α−ＣＨＩＰＳ31-113−ＩｇＧの抗ファージ反応性
２つのMaxisorb９６ウェル・プレート（ヌンク（Nunc）、米国ニューヨーク州ロチェスター（Rochester））をＰＢＳ中、１μｇ・ｍＬ−１のマウスＭ１３モノクローナル抗体（アマーシャム・ファーマシア・バイオテック社（Amersham Pharmacia Biotech Inc.）、米国ニュージャージー州ピスカタウェイ（Piscataway））と共に一晩４℃でインキュベートした。プレートをＰＢＳ−０．０５％Tween-20で３回洗浄し、２００μＬのＰＢＳ−０．０５％Tween-20、５％ＢＳＡにより３７℃で１時間ブロッキングした。プレートをＰＢＳ−０．０５％Tween-20及び１００μＬのＰＢＳで洗浄し、Ｍ１３ファージ又はＣＨＩＰＳ31-113タンパク質（２×１０11ｃｆｕ ｍＬ-1）を発現するＭ１３ファージを添加して３７℃で１時間インキュベートした。洗浄後、プレートを１００μＬのヒト・アフィニティー精製α−ＣＨＩＰＳ31-113−ＩｇＧ、又は種々の濃度のウサギ−α−ＣＨＩＰＳ−ＩｇＧと共に３７℃で１時間インキュベートした。次に、プレートを洗浄し、１００μＬのヤギ−α−ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ（ジャクソン・イムノリサーチ（Jackson ImmunoResearch）、米国ペンシルベニア州ウェスト・グローブ（West Grove））又は最適濃度のヤギ−α−ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ（サザン・バイオテック（Southern Biotech）、米国アラバマ州バーミングハム（Birmingham））を添加した。プレートを３回洗浄し、基質（０．６７ｍｇ・ｍＬ-1のｏ−フェニレンジアミン、３５ｍＭのクエン酸ナトリウム、６７ｍＭのＮａＰＯ３、ｐＨ５及び０．０１２％Ｈ2Ｏ2）を添加した。反応を１００μＬの１ＭのＨ2ＳＯ4で停止させたうえ４９０ｎｍで吸光度を計測した。
【０２０８】
ランダム・ペプチド・ファージ・ライブラリ及びファージ選択
ファージ・ライブラリをニュー・イングランド・バイオラブズ（New England Biolabs）（マサチューセッツ州イプスウィッチ（Ipswich））から購入した。Ｐｈ．Ｄ．−７（商標）ファージ・ディスプレイ・ペプチド・ライブラリは、リンカー配列（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）によりバクテリオファージＭ１３の主要なコート・タンパク質ｐＩＩＩのＮ末端に融合した７ｍｅｒのランダム・ペプチドからなる。このライブラリは約２．８×１０9の電気穿孔された配列（２０7＝１．２８×１０9の考えられ得る７残基配列と比較して）からなり、１０μＬのファージ・ストック中の各配列について約７０コピーを産生する。Ｐｈ．Ｄ．−Ｃ７Ｃ（商標）ライブラリのランダム化したセグメントは一対のシステイン残基に隣接し、これらはファージ構築中に酸化されてジスルフィド結合をなし、結果として提示されるペプチドが標的のループとして供される。Ｐｈ．Ｄ．−７（商標）及びＰｈ．Ｄ．−Ｃ７Ｃ（商標）ライブラリを使用してヒトＩｇＧのエピトープをＣＨＩＰＳタンパク質の表面にマッピングし、１００μＬのprotein-Gコーティング磁気ビーズ（ダイナル（Dynal））を１ｍＬのＰＢＳ−０．０５％Tween-20で３回洗浄した。洗浄したビーズを１ｍＬのＰＢＳ−０．０５％Tween-20、５％ＢＳＡにより２２℃で１時間ブロッキングした。ビーズを４回洗浄し、１ｍＬのＰＢＳ−０．０５％Tween-20中に再懸濁した。これらのブロッキングしたビーズの半分を使用してファージ・ストックを事前に選別した。従って、１０μＬのＰｈ．Ｄ．−７（商標）及び１０μＬのＰｈ．Ｄ．−Ｃ７Ｃ（商標）を、ブロッキングされたビーズを含有する１８０μＬのＰＢＳ−０．０５％Tween-20中に懸濁し、継続的に攪拌しながら２２℃で３０分間インキュベートした。
【０２０９】
１μＬのアフィニティー精製ヒト−α−ＣＨＩＰＳ31-113−ＩｇＧ（３００μｇ・ｍＬ-1、最終濃度は約１０ｎＭ）を事前に選別されたファージに添加し、２２℃で３０分間インキュベートした。ファージ／ＩｇＧ懸濁液をブロッキングしたビーズの残りに添加し、２２℃で３０分間インキュベートした。ビーズをＰＢＳ−０．０５％Tween-20で１０回洗浄して結合しなかったファージを洗い落とした。洗浄ステップにおけるTween濃度は連続するラウンドにおいて段階的に０．５％まで上昇させてストリンジェンシーを高くした。結合したファージを１２５μＬの０．２Ｍグリシン、ｐＨ２．２、０．１％ＢＳＡにより８分間で溶出し、その後溶出液のｐＨを１５μＬの１Ｍトリス−ＨＣＬ、ｐＨ８で直ちに中和した。
【０２１０】
溶出液を増幅し、増幅したファージの１０μＬを次の選択ラウンドの入力として使用した。ファージ選択の特異性をさらに高めるため、第４ラウンドで結合したファージをＣＨＩＰＳタンパク質による競合溶出を使用して溶出した。結合したファージを１．８ｍｇ・ｍＬ-1のＣＨＩＰＳと共に一晩インキュベーションすることにより溶出した。
【０２１１】
ファージの滴定及び増幅
ライブラリ・ファージはｌａｃＺα遺伝子を保因する通常のクローニング・ベクターＭ１３ｍｐ１９に由来するため、ファージ・プラークはＸｇａｌ及びＩＰＴＧを含有する培地にプレーティングされると青色に見える。環境中の繊維状ファージは典型的には、同じ培地にプレーティングされるとき、白色のプラークを生じる。
【０２１２】
１０ｍＬのＬＢ培地に単一コロニーＥＲ２７３８大腸菌を接種し、対数期中期（ＯＤ600約０．５）まで激しく振盪しながら３７℃でインキュベートした。トップ・アガー（５０％ＬＢ寒天、５０％ＬＢ培地）を融解して、約４５℃まで冷却した。３ｍＬの融解したトップ・アガーを２００μＬのＥＲ２７３８大腸菌に添加し、ＬＢ／ＩＰＴＧ／Ｘｇａｌプレート（０．５ｍＭのＩＰＴＧ、８０μｇ・ｍＬ-1のＸｇａｌを含有するＬＢ寒天プレート）の上層に流し込んだ。１μＬのファージ溶出液を使用して１０倍連続希釈液を作製した。ＬＢ培地中の各希釈液の１０μＬを調製済みの培養プレート上にスポッティングし、３７℃で一晩インキュベートした。翌日、プラークを計数することによりファージ力価を計算した。
【０２１３】
残りのファージ溶出液を対数期初期（ＯＤ600０．４〜０．５）に２０ｍＬのＥＲ２７３８大腸菌培養物に添加し、激しく振盪しながら３７℃で４．５時間インキュベートした。培養細胞を１００００ｒｐｍで１０分間、４℃で遠心した。上清を新しい試験管に流し込んで１／６容量の２５％ＰＥＧ６０００（フルカ（Fluka））、３ＭのＮａＣｌを添加し、ファージを４℃で一晩沈殿させた。沈殿したファージを１００００ｒｐｍ、４℃で１５分間遠心した。増幅したファージを含有するペレットを２００μＬのＰＢＳ中に再懸濁し、上記のとおり滴定した。４回目の選択ラウンド後はファージ増幅は行わず、ファージをＤＮＡ配列決定により直接特性決定した。
【０２１４】
結合ファージの特性決定
ＥＲ２７３８大腸菌の一晩培養物をＬＢ培地中に１：１００希釈した。滴定プレートから４８個の種々のプラークをピペットの先端で穿刺して１ｍＬの希釈培養物に移す。感染させた培養物を３７℃で４．５〜５時間インキュベートした。培養物を１３６００ｒｐｍで３０秒間遠心し、５００μＬの上清を新しい微量遠心管に移した。２００μＬのＰＥＧ６０００、３ＭのＮａＣｌを添加し、ファージを２２℃で１０分間沈殿させた。試料を１３６００ｒｐｍで１０分間遠心した。ペレットを１００μＬのヨウ化物緩衝液（４ＭのＮａＩ、１０ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８）中に再懸濁して２５０μＬの９５％ＥｔＯＨを添加し、２２℃で１０分間インキュベートすることにより一本鎖ファージＤＮＡを選好的に沈殿させた。試料を１３６００ｒｐｍで１０分間遠心し、ペレットを７０％ＥｔＯＨで洗浄して乾燥させ、'−９６ＰＩＩＩ配列決定用プライマー（５'−ＣＣＣＴＣＡＴＡＧＴＴＡＧＣＧＴＡＡＣＧ−３'［配列番号２］、ニュー・イングランド・バイオラブズ（New England Biolabs））を使用して配列決定に回した。
【０２１５】
エピトープ・マッピング
選択されたファージのアミノ酸配列をClustal-Wを使用して整列させた（アイヤール（Aiyar）、２０００年、Methods. Mol. Biol. １３２：２２１−４１頁を参照）。コンセンサス配列を、ＣＨＩＰＳ31-121 ＰＤＢファイル（ＰＤＢアクセスコード１ＸＥＥ）及びPyMol分子グラフィックス・プログラムを使用して、ＣＨＩＰＳタンパク質の表面上に手動でマッピングした（デラノ（DeLano）、２００２年、「The PyMol Molecular Graphics System」、デラノ・サイエンティフィック（Delano Scientific）、サン・カルロス（San Carlos）を参照）。
【０２１６】
選択されたファージの結合特異性
ファージＥＬＩＳＡを使用して選択されたファージのアフィニティー精製ヒト−α−ＣＨＩＰＳ31-113−ＩｇＧに対する結合特異性を試験した。９６ウェルのMaxisorbプレートを４℃のＰＢＳ中、１００μｇ・ｍＬ-1のアフィニティー精製ヒト−α−ＣＨＩＰＳ31-113ＩｇＧにより一晩コーティングした。プレートをＰＢＳ−０．０５％Tween-20で４回洗浄し、３００μＬのＰＢＳ−０．０５％Tween-20、５％ＢＳＡにより３７℃で１時間ブロッキングした。同時に、第２のMaxisorbプレートをＰＢＳ−０．０５％Tween-20、５％ＢＳＡによりブロッキングして、ＢＳＡコーティング・プラスチックとの結合性についての対照として供した。プレートを４回洗浄し、ＰＢＳ−０．０５％Tween-20、１％ＢＳＡ中の種々の希釈の精製ファージ・ストックと共に３７℃で１時間インキュベートした。プレートを４回洗浄し、３７℃で１時間、ＰＢＳ−０．０５％Tween-20、１％ＢＳＡ中の５０μＬのマウス−α−Ｍ１３−ｍＡｂ（１μｇ・ｍＬ−１）（アマーシャム（Amersham））と共にインキュベートした。プレートを洗浄し、５０μＬのウサギ−α−マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（ＰＢＳ−０．０５％Tween-20、１％ＢＳＡ中１：２０００）と共に３７℃で１時間インキュベートした。洗浄後、１００μＬの基質を添加し、反応を１５０μＬの１ＭのＨＣｌにより停止させた。４９２ｎｍの吸光度をＥＬＩＳＡプレート・リーダーで計測した。
【０２１７】
ｈｕ−α−ペプチドＩｇＧのアフィニティー精製
カップリングを効率的にするため、ファージ由来配列が損なわれている７アミノ酸のペプチドを、３個のグリシン及び１個のシステインの追加的なＣ末端スペーサーと合成した（イソジェン・ライフ・サイエンス（Isogen Life Science）；オランダ国アイセルスタイン（IJsselstein）及びバイオ−シンセシス（Bio-Synthesis）；テキサス州ルイスビル（Lewisville））。２つの対照ペプチドを組み入れ、１つはヒトＣ５ａ受容体に対し特異的なｍＡｂ（クローンＳ５／１）により認識される最小の７ｍｅｒ配列（カップリング用にＧＧＧＣ［配列番号３］が加わる）（バイオ−シンセシス（Bio-Synthesis））、及びＣＨＩＰＳのＮ末端部分が損なわれている３８ｍｅｒペプチド（最初の３７アミノ酸と、それに加え追加的なシステイン；ペプスキャン・システムズ（Pepscan Systems）；オランダ国レリスタッド（Lelystad））である。ペプチドをＨ２Ｏ中に溶解し、−２０℃で保管した。ＥＬＩＳＡのため、ペプチドをｐＨ８の０．１Ｍのトリス／ＨＣｌ中に２５μｇ・ｍＬ−１に希釈したうえ、１０ｍＭのＮ−サクシニミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）により３０分間処理して遊離アミノ基を組み込み、さらにＨ2Ｏで洗浄したNunc Covalink NHプレートに９０分間コーティングした。その後、他のＥＬＩＳＡと同じプロトコルに従いプレートを処理した。ペプチドを固体マトリクスに結合させるため、まず初めにペプチドをアガロース結合トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ、ピアス（Pierce））を使用して還元し、続いて５ｍＭのＥＤＴＡを含有するｐＨ８．３の５０ｍＭのトリス／ＨＣｌ緩衝液中のスルホ結合アガロースビーズ（ピアス（Pierce））と混合して室温で２時間インキュベートした。未反応基をＬ−システインでブロッキングし、ビーズを結合緩衝液及びＰＢＳで広範囲に洗浄した。小型１ｍｌカラムを使用して、ＣＨＩＰＳについて記載したとおり静脈内注射用のヒト免疫グロブリン製剤（サンキン（Sanquin））由来のＩｇＧをアフィニティー精製した。溶出したＩｇＧを１００μｇ・ｍＬ-1の純粋ヒトアルブミンと混合してＰＢＳに対し一晩透析し、実際のＩｇＧ含量をＥＬＩＳＡにより測定した。
【０２１８】
表面プラズモン共鳴を使用した選択されたペプチドに対する抗体結合性の分析
アフィニティー精製抗体及びプールされたヒトＩｇＧの合成ペプチド及びＣＨＩＰＳタンパク質に対する結合性についてBiacore 1000機器で調べた。Ｃ末端システイン残基を含有するペプチドを、Ｎ−エチル−Ｎ'（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）の化学物質をチオール・カップリング・キット（ファーマシア・バイオコア（Pharmacia Biacore））と共に使用して、カルボキシメチルデキストラン・センサー・チップＣＭ５にカップリングして、ＣＭ５デキストランを活性化した。活性化した後、２０μＬの２−（２−ピリジニルジチオ（pyrdinyldithio））エタンアミン（ＰＤＥＡ）を注入し、続いて０．１ＭのＮａＡｃ、１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ４中の３５μＬのシステイン含有ペプチド、１ｍｇ・ｍＬ-1を７分間で注入した。未反応基を２０μＬのＬ−システインを４分間注入してブロッキングした。ＣＨＩＰＳカップリングについては、２０μＬのＣＨＩＰＳ（１ｍｇ・ｍＬ-1）をＥＤＣ／ＮＨＳ活性化センサー・チップに直接注入した。センサー・チップ表面の残った反応性基を、５０μＬの１Ｍエタノールアミン−ＨＣＬ、ｐＨ８．５（ファーマシア（Pharmacia））を注入して飽和させた。
【０２１９】
５μＬ・分-1の一定流量で２５℃において結合アッセイを行った。アフィニティー精製抗体及びＩＶ−ＩｇＧをＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ及び０．００５％界面活性剤Ｐ２０を含有する１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４））中に希釈した。抗体を固定化したペプチドと２１０秒間にわたり相互作用させた後、２分間の解離工程を続けた。さらに競合について調べるため、抗体を１ｍｇ・ｍＬ-1のＣＨＩＰＳタンパク質と共にプレインキュベートした。アフィニティー精製α−ペプチド抗体を１０μｇ・ｍＬ-1の濃度で試験した。チップを１０ｍＭのグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ１．５）で３分間洗浄することにより残存する結合抗体をセンサー・チップ表面から除去した。
【０２２０】
結果
ＣＨＩＰＳ31-113の活性
本出願人は過去に、Ｃ５ａＲ遮断活性の完全な保存を示したＣＨＩＰＳ31-121タンパク質について記載した（ハース（Haas）ら、２００５年、J Mol Biol ３５３（４）：８５９−８７２頁を参照）。より小型の活性ＣＨＩＰＳ変異体を求めて本出願人はタンパク質の折り畳まれたコアの外部のＣ末端部分を欠失させた（ハース（Haas）ら、２００５年、J Mol Biol ３５３（４）：８５９−８７２頁を参照）。図１４は、種々のＣＨＩＰＳ変異体の活性を野生型ＣＨＩＰＳと比較して示す。全てのＣＨＩＰＳ変異体が、Ｃ５ａ誘導性活性化Ｕ９３７／Ｃ５ａＲ細胞を阻害することができた。
【０２２１】
アフィニティー精製α−ＣＨＩＰＳ抗体は立体構造依存性エピトープを認識する
固定化したＣＨＩＰＳ樹脂を装填したカラムを使用して、プールされたヒトＩｇＧをアフィニティー精製した。本出願人は、一組のＣＨＩＰＳ由来２５ｍｅｒペプチドに対するアフィニティー精製α−ＣＨＩＰＳ抗体の結合性を全ＣＨＩＰＳ配列にわたり試験した（ハース（Haas）ら、２００４年、J Immunol １７３（９）：５７０４−１１頁を参照）。図１５に示されるとおり、野生型ＣＨＩＰＳ及びＣＨＩＰＳのＮ末端に由来するペプチドのみがアフィニティー精製α−ＣＨＩＰＳ抗体により認識された。これは、こうしたα−ＣＨＩＰＳ抗体が残基３０〜１１３の線状エピトープを認識しないことを示唆する。
【０２２２】
ＣＨＩＰＳタンパク質における立体構造依存性エピトープの存在を確認するため、本出願人は、２つの異なるアフィニティー精製抗体調製物（α−ＣＨＩＰＳ1-121及びα−ＣＨＩＰＳ31-113）の野生型ＣＨＩＰＳ（ＣＨＩＰＳwt）、及び２つのトランケート型ＣＨＩＰＳタンパク質（ＣＨＩＰＳ31-121及びＣＨＩＰＳ31-113）に対する反応性を試験した。図１６は、全ての抗体がＣＨＩＰＳタンパク質と反応することを示す。アフィニティー精製α−ＣＨＩＰＳ1-121はＮ末端に対し特異的なエピトープを含有するが（図１５）、種々のＣＨＩＰＳ変異体に対する反応性について、調製物間に有意な差はない。これは、線状エピトープを上回る過剰な立体構造依存性エピトープを示している可能性がある。立体構造依存性エピトープに対し特異的なＣＨＩＰＳ特異的マウスモノクローナル抗体が対照として供された。
【０２２３】
アフィニティー精製α−ＣＨＩＰＳ ＩｇＧは野生型Ｍ１３ファージと反応しない
アフィニティー精製α−ＣＨＩＰＳ31-113ＩｇＧ調製物中に存在するヒト−α−ファージＩｇＧは、潜在的にファージ選択実験を妨害する可能性がある。従って本出願人は、空のＭ１３ファージ（野生型ｐＩＩＩ表面タンパク質を発現するＭ１３ファージ）に対するアフィニティー精製α−ＣＨＩＰＳ31-113ＩｇＧの結合性をＥＬＩＳＡにより試験した。図１７は、アフィニティー精製α−ＣＨＩＰＳ31-113ＩｇＧが野生型Ｍ１３ファージとは反応しないが、ＣＨＩＰＳタンパク質を発現するＭ１３ファージを完全に認識することを示す。１００μｇ・ｍＬ-1の濃度までのアフィニティー精製α−ＣＨＩＰＳ ＩｇＧを使用した。このような高濃度であっても、バックグラウンドと比較して空のファージに対する結合性に差はなかった。従って本出願人は、アフィニティー精製α−ＣＨＩＰＳ31-113ＩｇＧ調製物中に、選択実験を妨害し得る有意な量のα−ファージ抗体は存在しないと結論付ける。
【０２２４】
組換えファージのバイオパニング及び特性決定
アフィニティー精製α−ＣＨＩＰＳ31-113ＩｇＧを使用して２つのランダム・ペプチド・ファージ・ライブラリからファージを選択し、ヒトＩｇＧのエピトープをＣＨＩＰＳタンパク質表面上にマッピングした。４ラウンドのバイオパニング後、４８個の組換えファージ・クローンが無作為に選択され、ＤＮＡ配列決定により特性決定された。４７個のクローンの配列は表３に示される（クローン２７の配列決定は失敗した）。配列「ＭＮＫＴＷＹＰ」［配列番号４］がこの４７本の配列セットで１２回出現し、従ってこれが最も豊富であり、それに続くのは４回選択された「ＭＮＫＴＦＷＦ」［配列番号５］であった。興味深いことに、配列「ＦＮＫＳＹＹＧ」［配列番号６］は３回出現したが、これらの配列は遺伝的な配列が異なっており、従って単一の選択されたファージの単純な増幅ではない（データは示さず）。本出願人は２つの異なるライブラリ（Ｐｈ．Ｄ．−７（商標）及びＰｈ．Ｄ．−Ｃ７Ｃ（商標））を混合して着手したが、選択された配列は全て、Ｐｈ．Ｄ．−７（商標）ライブラリに由来した。
【０２２５】
【表６】
2014001212.tif 000007
表３：４ラウンドのパニング後の４７個の組換えファージ・クローンのペプチド配列。Ｐｈ．Ｄ．−７（商標）とＰｈ．Ｄ．−Ｃ７Ｃ（商標）とを組み合わせたランダム・ペプチド・ファージ・ライブラリをアフィニティー精製α−ＣＨＩＰＳ31-113ＩｇＧとの結合性について４回の連続的なパニング・ラウンドで選択した。最終ラウンドのファージを、高いＣＨＩＰＳ濃度（１．７ｍｇ・ｍＬ-1）による競合作用を使用して選択的に溶出した。４８個の単一ファージを増幅し、単離された一本鎖ＤＮＡを配列決定した（クローン２７の配列決定は失敗した）。データは、発現したランダム・ペプチドに相当する翻訳配列を示す。
【０２２６】
選択されたペプチドは、表４に示されるとおり、そのアミノ酸配列に基づき種々の群に分けることができた。さらに、各群内での配列の類似性に基づき、本出願人はコンセンサス配列を計算した。各群内において整列させた配列間で出現頻度の最も高かったアミノ酸をコンセンサス残基として分類した。各群のコンセンサス配列は表４に示される。
【０２２７】
選択された配列を、図１８に示されるとおり、PyMol分子グラフィックス・プログラム及びＣＨＩＰＳ３１−１２１ ｐｄｂファイル（ＰＤＢアクセスコード１ＸＥＥ）を使用してＣＨＩＰＳタンパク質の表面上に手動でマッピングした。選択された配列から第４のエピトープを同定した。ファージφ４５）により発現した配列「ＰＬＲＡＳＱ」［配列番号５５］は４７個の配列決定された組換えファージのなかで１回しか出現しなかったが、この配列はＣＨＩＰＳ分子の表面上に完全にマッピングできた。さらに、ファージφ１６により発現したペプチド配列（「ＡＬＱＡＳＲＨ」［配列番号５６］）がこの「エピトープ」に対し極めて高い類似性を示す。予測されたエピトープに対する類似性が最も高いペプチド配列を発現する８個の種々の組換えファージを、ＥＬＩＳＡによりさらに特性決定した（表５）。図１９ａは、これらのファージがアフィニティー精製α−ＣＨＩＰＳ31-113ＩｇＧと特異的に結合するものの、ＢＳＡとは結合しない（図１９ｂ）ことを示す。先に本出願人は、アフィニティー精製α−ＣＨＩＰＳ31-113ＩｇＧが空のファージとは反応しないことを示した（図１７）。従って本出願人は、選択されたファージのアフィニティー精製α−ＣＨＩＰＳ31-113ＩｇＧとの結合性が発現するペプチドに特異的であると結論付ける。
【０２２８】
【表７】
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表４：ペプチド配列の分類。Ｐｈ．Ｄ．−７（商標）ファージ・ライブラリから選択されたペプチド配列を、アミノ酸配列に基づき種々の群に分けた。括弧内の数字は、２回以上見られた配列の数を示す。３つの異なる群を区別できる。また、各群のコンセンサス配列も示される。各群内において整列させた配列間で出現頻度の最も高かったアミノ酸を、コンセンサス残基として分類した。
【０２２９】
合成ペプチドはマッピングされたエピトープを模倣する
ファージ選択及びエピトープ・マッピングで得られた結果に基づき、４つの異なるペプチドを合成した（挿入図２０）。全てのペプチドがＣ末端システイン残基を含み、チオール・カップリング化学反応による固定化が可能であった。ＣＨＩＰＳタンパク質のＮ末端はヒトＩｇＧのエピトープを含むことが分かった（図１５）ため、Ｎ末端の３７ＣＨＩＰＳ残基及び追加的なシステインを含んでなる合成ペプチド（ｐｅｐ１−３８）を陽性対照として使用した。このペプチドをチオール活性化セファロースとカップリングして種々のアフィニティー・カラムを作成した。これらのカラムを使用してヒトＩｇＧをアフィニティー精製した。アフィニティー精製α−ペプチド抗体の種々のペプチド及びＣＨＩＰＳ分子に対する結合性をＥＬＩＳＡにより検証し（データは示さず）、Biacore 1000機器で調べた（図２０）。
【０２３０】
アフィニティー精製α−ペプチド抗体は、ＩＶＩｇＧと比較したとき、それらの特異的ペプチドとの結合性について増加を示す。アフィニティー精製抗体を１ｍｇ・ｍＬ-1のＣＨＩＰＳと共にプレインキュベートしても、この相互作用は低下しない。α−５５２及びα−５５４抗体はペプチド５５２及び５５４と交差反応する。これらのペプチドは配列の類似性が高いため（挿入図２０）、これは意外なことではない。
【０２３１】
アフィニティー精製α−ペプチド抗体はＩＶＩｇＧと比較してＣＨＩＰＳタンパク質との結合性について増加を示す。この相互作用は、アフィニティー精製α−ペプチド抗体を１ｍｇ・ｍＬ−１のＣＨＩＰＳと共にプレインキュベートすると妨げられる。
【０２３２】
【表８】
2014001212.tif 000009
表５：さらなる特性決定のために選択された配列。ＥＬＩＳＡによるさらなる特性決定のため、本出願人はマッピングされたエピトープに基づき種々のペプチドを発現する８個のファージを選択した。
【０２３３】
考察
抗体エピトープは多くの場合に、タンパク質の一次配列中で互いに離間しているアミノ酸によって形成されるが、折り畳まれた分子の表面上の反応部位としては一つにまとまっている。本出願人は、アフィニティー精製α−ＣＨＩＰＳ抗体がＣＨＩＰＳタンパク質の残基３１と１１３との間の直鎖部分を認識できないことから、これはＣＨＩＰＳの場合に特に当てはまることを示す。結果的に、小さい欠失及び置換であっても分子の構造に相当な影響を及ぼし得るため、エピトープ・マッピングにおけるトランケートされた分子の有用性は限られている。ランダム・ペプチド・ライブラリの使用は、エピトープ・マッピングのトランケート分子による制約を克服する。
【０２３４】
先行研究は、モノクローナル抗体の線状エピトープの同定（ヤング（Yang）ら、２００５年、J Immunol Methods ３０４（１−２）：１５−２９頁）及び立体構造依存性エピトープの同定（クック（Cook）ら、１９９８年、J Autoimmun １１（３）：２０５−２１１頁；マイヤー（Myers）ら、２０００年、J Immunol １６５（７）：３８３０−３８３８頁；シャウ（Shaw）ら、２００２年、Biochem J ３６３（第１部）：１３７−１４５頁）におけるランダム・ペプチド・ファージ・ディスプレイ・ライブラリの使用可能性を示している。これらの研究により、ファージ・ディスプレイにより発現するペプチドは立体構造依存性エピトープを模倣してアフィニティー精製を可能にするコンホメーションをとる能力を有することが示されている。この研究では、ＣＨＩＰＳ上のエピトープはランダム・ペプチド・ファージ・ディスプレイ・ライブラリを使用してマッピングされた。本出願人の知る限りでは、ポリクローナル抗体調製物における立体構造依存性エピトープのマッピングを報告するのは本研究が最初である。
【０２３５】
本出願人は、アフィニティー精製α−ＣＨＩＰＳ31-113ＩｇＧとの結合性についてファージを選択した。シュルデルベルグ（Schluederberg）ら（１９８０年、Nature ２８３（５７４９）：７９２−４頁）は、Ｍ１３と区別のつかないファージをヒト便から単離できることを示した。Ｍ１３ファージは環境中に多量にあるにもかかわらず、本出願人の示したところによれば、本出願人のアフィニティー精製抗体調製物はいかなる検出可能なレベルのα−Ｍ１３ファージ抗体も含まない。しかしながら、選択されたファージのα−ＣＨＩＰＳ抗体との結合性についての特異性を高めるため、本出願人は高濃度のＣＨＩＰＳによる競合溶出法を用いた。
【０２３６】
４回の選択ラウンド後、４７個のクローンを配列決定した。ファージ選択は多種多様な要因に依存する。例えば、提示されたペプチド配列中のアルギニンはｐＩＩＩの分泌を妨げる。結果的に、Ａｒｇを含有するペプチドのクローンは、積極的に選択不可とされる（ピータース（Peters）ら、１９９４年、J Bacteriol １７６（１４）：４２９６−４３０５頁を参照）。また、洗浄ステップのストリンジェンシー及び性質も、特定のファージを好み得る（スミス及びペトレンコ（Smith & Petrenko）、１９９７年、Chem Rev ９７（２）：３９１−４１０頁を参照）。従って、配列「ＭＮＫＴＷＭＰ」［配列番号８６］は単離される頻度が最も高かったが、これ以上の結論はこの観察からは推測できない。Ｐｈ．Ｄ．−７（商標）及びＰｈ．Ｄ．−Ｃ７Ｃ（商標）の双方のライブラリとも約２．８×１０9の電気穿孔された配列からなり（２０7＝１．２８×１０9の考えられ得る７残基配列と比較して）、位置に明らかな偏りのない多様な配列を含む。この大型ライブラリから、本出願人はＣＨＩＰＳ分子の表面にマッピングできた４本の配列を選択した。これらの類似性は偶然の一致によって説明できるものではなく、従って本出願人は、これらの配列が立体構造依存性エピトープに相当するものと結論付ける。
【０２３７】
各々予測エピトープとの類似性が最も高い異なるペプチド配列を発現する８個のファージについてのさらなる特性決定をＥＬＩＳＡにより行った。これらのファージはアフィニティー精製α−ＣＨＩＰＳ ＩｇＧとの結合性を示す。先に本出願人は、アフィニティー精製α−ＣＨＩＰＳ ＩｇＧがいかなる検出可能な量の抗Ｍ１３ファージ抗体も含まないことを示した。従って本出願人は、この相互作用が発現したペプチドに特異的であると結論付ける。
【０２３８】
発現したペプチドがＣＨＩＰＳタンパク質上の立体構造依存性エピトープを模倣できたことを確認するため、追加的な実験を行った。ファージ・ライブラリから選択されたペプチドと類似した合成ペプチドを使用して、本出願人はＣＨＩＰＳタンパク質を特異的に認識したＩｇＧのプールからの抗体をアフィニティー精製した。これらのアフィニティー精製抗体はそれらの特異的ペプチドと相互作用させた。この相互作用はＣＨＩＰＳタンパク質とは競合しなかった。こうした観察から本出願人は、種々のコンホメーションの合成ペプチドを認識するＩＶ−ＩｇＧプール中にα−ペプチド抗体が存在すると結論付ける。これらのコンホメーションのほとんどはＣＨＩＰＳ立体構造依存性エピトープとは異なり、従ってＣＨＩＰＳタンパク質と競合しない。合成ペプチドはスペーサー（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ［配列番号８７］）を含むため、精製された抗体調製物はα−スペーサー又はα−スペーサー−ペプチド抗体を含む可能性がある。
【０２３９】
アフィニティー精製α−ペプチド抗体のＣＨＩＰＳタンパク質との結合研究から、ＣＨＩＰＳタンパク質を特異的に認識するサブセットが明らかとなる。これらの抗体により認識されるＣＨＩＰＳタンパク質表面上のエピトープのコンホメーションは限られており、従って異なるペプチドのコンホメーションを認識する他のα−ペプチド抗体との競合はない。
【０２４０】
ＣＨＩＰＳは小さくコンパクトに折り畳まれたタンパク質であるが、存在するエピトープの総量を推定するのは困難である。本出願人の使用したＰｈ．Ｄ．−７（商標）及びＰｈ．Ｄ．−Ｃ７Ｃ（商標）ライブラリは、発現するペプチドのサイズが７残基に限定されており、従って模倣されるエピトープのサイズが限られる。本出願人は４つのエピトープをＣＨＩＰＳ分子の表面上にマッピングした。より大型のペプチドを発現するライブラリを使用したさらなる選択を用いて、さらなるエピトープを同定し得る。
【０２４１】
本出願人は、ＣＨＩＰＳのＣ５ａＲの遮断を担う部分であるＣＨＩＰＳ31-113分子に焦点を置く。興味深いことに、本出願人は線状エピトープを模倣するペプチド・ファージは単離しなかった。これはアフィニティー精製α−ＣＨＩＰＳ抗体とＣＨＩＰＳ由来ペプチドとの間に相互作用が観察されなかったペプスキャン（pepscan）ＥＬＩＳＡの結果と一致する。
【０２４２】
α−ＣＨＩＰＳ ＩｇＧのアフィニティー精製について、本出願人は大規模なドナー群から得られたＩｇＧのプールから開始した。様々な人がエピトープのサブセットを認識する可能性が最も高い。今後の研究において記載された選択技法を使用することにより、異なる人々の間でのエピトープ認識の分布についてより多くの洞察を得ることができる。
【０２４３】
実施例Ｃ−例示的変異ＣＨＩＰＳポリペプチドＩ
ＣＨＩＰＳペプチドＥＬＩＳＡ：ライブラリの一点計測
目標：粗細胞溶解液中におけるＣＨＩＰＳ突然変異体に対するペプチド結合能力を測定すること
概要：タンデム・サンドイッチＥＬＩＳＡを、ストレプトアビジンをコーティングとして最適化した後、ＣＨＩＰＳが結合するビオチン化Ｃ５ａＲペプチドをモノクローナル抗体ｍＡｂ ２Ｈ７により、続いて二次ＨＲＰコンジュゲートポリクローナル抗体及び基質により検出した。精製した組換えＣＨＩＰＳwtによる標準曲線を各ＥＬＩＳＡプレートについて準備した。４９２ｎｍの吸光度を計測して標準の濃度に対しプロットしたうえ、４パラメータ曲線適合モデルで分析し、そこから突然変異体のペプチド結合を計算して比活性として発現した濃度と相関させた。
【０２４４】
材料及び方法
１０×ＰＢＳ（バイオウィタッカー（BioWhittaker）＃ＢＥ１７−５１７Ｑ、ロット４ＭＢ０１０２）
ＰＢＳ Tween 20（０．０５％）（メディカゴ（Medicago）＃０９−８４１０−１００、ロット１１３３０３）
ＢＳＡ（メルク（Merck）＃１．１２０１８．０１００、ロットＫ５４５９３３１８５２７）
CellyticB（シグマ（Sigma）＃Ｂ−３５５３、ロット１１４Ｋ６５１５６）
Sigma fast OPD（シグマ（Sigma）＃Ｐ９１８６、ロット０５５Ｋ８２０４）
F96 Maxisorp（ヌンク（Nunc）＃４４２４０４、ロット０７９０２７）
９６ウェルＵ字型ＰＰプレート
ストレプトアビジン１ｍｇ／ｍｌ（シグマ（Sigma）、ロット１２０Ｋ１２４９）
ＣＤ８８−Ｎ末端ペプチド：ＡＢＣＦ−１、６．３ ｍｇ／ｍｌ（ロット０５０８０５ＫａＢ）
ｍＡｂ ２Ｈ７モノクローナル抗体、１ｍｇ／ｍｌ（ユトレヒト（Utrecht）、ロット２００４−１２）
ウサギ抗マウスＩｇ−ＨＲＰ（ダコ（Dako）＃Ｐ０２６０、ロット００００６９８３）
ｒＣＨＩＰＳwt、１．８ｍｇ／ｍｌ（ユトレヒト（Utrecht）、ロット２００４−１２−０２）
ＣＨＩＰＳ対照（溶解液）：ＣＨＩＰＳｗｔ、Ｋ６９Ａ、２ｍｕｔ
ＣＨＩＰＳライブラリ：
器具：
ＥＬＩＳＡ洗浄器ＥＬｘ４０５（バイオテック・インスツルメント（BioTek Instruments））
振盪台Titramax 1000（ハイドルフ・インスツルメント（Heidolph Instruments））
FLUOstar Optima（BMG）ソフトウェア
Excel
GraphPad、シグマ（Sigma）
緩衝液：
コーティング緩衝液：１×ＰＢＳ：１００ｍｌの１０×ＰＢＳを９００ｍｌの脱イオン水に添加する。
洗浄緩衝液（buffert）：ＰＢＳ＋０．０５％Tween 20（ＰＢＳＴ）：錠剤を１個、１０００ｍｌの脱イオン水に添加する。
アッセイ緩衝液Ａ：ＰＢＳＴ＋１％ＢＳＡ（ｗ／ｖ）＋１％Cellytic（ｖ／ｖ）
アッセイ緩衝液Ｂ：ＰＢＳＴ＋１％ＢＳＡ（ｗ／ｖ）
ブロッキング液：ＰＢＳＴ＋４％ＢＳＡ（ｗ／ｖ）
プロトコル（３プレート）
１．コーティング：ストレプトアビジン５．０μｇ／ｍｌをコーティング緩衝液（ＰＢＳ）中に調製する。９６ウェルMaxisorpプレートに１００μｌ／ウェルをピペットで移す。一晩４℃でインキュベートする。
２．ブロッキング：ブロッキング液２００μｌ／ウェルを添加する。室温（ＲＴ）で１時間（ｈ）、６００ｒｐｍの振盪台（Ｓ）でインキュベートする。
３．ビオチン化ペプチド：ＣＤ８８−Ｎ末端ペプチドＡＢＣＦ−１：アッセイ緩衝液Ｂ（ＰＢＳＴ＋１％ＢＳＡ）中０．３μｇ／ｍｌ。希釈原液１：１０＝０．６３ｍｇ／ｍｌ。
【０２４５】
３２ｍｌの緩衝液＋１５．２μｌのペプチド（０．６３ｍｇ／ｍｌ）。
【０２４６】
１００μｌ／ウェルを添加する。室温で１時間、６００ｒｐｍの振盪台でインキュベートする。
４．ｒＣＨＩＰＳwt標準曲線：１５ｍｌの試験管において：アッセイ緩衝液Ａ中に３倍連続希釈液を調製する、１０００〜０．４２ｎｇ／ｍｌ。
【０２４７】
アッセイ緩衝液Ａ中ｒＣＨＩＰＳwt（原液１．８ｍｇ／ｍｌ）の１：１００希釈液：５μＬのＣＨＩＰＳ＋４９５μＬの緩衝液＝１８μｇ／ｍｌ
１０００ｎｇ／ｍｌ：８５μｌのＣＨＩＰＳ＋１４４５μｌの緩衝液
３３３ｎｇ／ｍｌ：５００μｌのＣＨＩＰＳ（１０００ｎｇ／ｍｌ）＋１０００μｌの緩衝液（buffert）
↓
合計８通りの濃度
対照及びライブラリ：３倍連続希釈液１：３００、１：９００及び１：２７００を９６ウェルＵ字型ＰＰプレートに調製する（ロボットか、又は手動で）。
【０２４８】
１：５希釈液：１５０μｌの溶解液＋６００μｌのアッセイ緩衝液Ｂ（ＰＢＳＴ＋１％ＢＳＡ）
１：１００希釈液：２５μｌ（１：５希釈液）＋４７５μｌのアッセイ緩衝液Ａ（ＰＢＳＴ＋１％ＢＳＡ＋１％ＣＬ）
１：３００希釈液：１５０μｌ（１：１００希釈液）＋３００μｌのアッセイ緩衝液Ａ
↓
１：９００及び１：２７００。
１００μｌ／ウェルを標準曲線用及び対照用に２つ、ライブラリ用に一点をピペットで移す。ブランク：１００μｌのアッセイ緩衝液Ａを４つのウェルにピペットで移す。
【０２４９】
室温で１時間、６００ｒｐｍの振盪台でインキュベートする。
５．抗体の検出：アッセイ緩衝液Ｂ（ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ）中、Ｍａｂ ２Ｈ７、１μｇ／ｍｌ
３２μｌの抗体＋３２ｍｌの緩衝液
１００μｌ／ウェルをピペットで移す。室温で１時間、６００ｒｐｍの振盪台でインキュベートする。
６．二次抗体：ウサギ抗マウスＩｇ−ＨＲＰ。アッセイ緩衝液Ｂ中に１：２０００希釈液を調製する。
【０２５０】
１６μｌの抗体＋３２ｍｌの緩衝液。
【０２５１】
１００μｌ／ウェルを添加する。室温で１時間、６００ｒｐｍの振盪台でインキュベートする。
７．拡張洗浄：洗浄緩衝液２００ｍｌ／ウェルを添加する。室温で５分間、６００ｒｐｍの振盪台でインキュベートする。
８．基質：基質：Sigma fast OPD。（指示に従う）。２つの緩衝液−及び２つの基質錠剤を４０ｍｌの脱イオン水中に溶解する。１００μｌ／ウェルを添加する。暗所において室温で約３〜６分間、６００ｒｐｍの振盪台でインキュベートする。
【０２５２】
１ＭのＨＣｌ、１５０μｌ／ウェルを添加することにより反応を停止させる。
【０２５３】
抗体を４９２ｎｍで計測する。
＊＊＊＊＊全てのステップ間：＃３×９６GreinerをＥＬ４０５においてＰＢＳＴで３回洗浄する＊＊＊＊＊＊
【０２５４】
【表９】
2014001212.tif 000010
計算
標準曲線をＢＭＧリーダー・ソフトウェア、Excel及び／又はSigma GraphPadを使用して分析した（図２１を参照）。
【０２５５】
Excel：標準曲線、対照及びブランクの平均値を計算する。ブランクのＣＶ（％）を計算する。
【０２５６】
全てのデータ点についてブランクの減算を行う。
【０２５７】
GraphPadにおいて：標準曲線：標準のＬｏｇ濃度に対する吸光度をプロットする。モデルにおいて曲線のフィッティングを行う：変数のシグモイド曲線適合。ＥＣ５０値及びＲ２値を記録する。対照及びライブラリにおけるペプチド結合を分析する。（抗体４９２をＹとして、未知数をｘとすると、結合性がＬｏｇ濃度として求まる。再計算：１０＾（ｌｏｇ濃度）＝濃度。
【０２５８】
【表１０】
2014001212.tif 000011
ＣＨＩＰＳ１００４抗ＣＨＩＰＳ ＥＬＩＳＡ。二次スクリーニングにおける１：１０００希釈液中のライブラリの一点計測
目標：一点計測において、ヒトポリクローナル抗ＣＨＩＰＳとの結合性が低下したクローンの選択を可能にすること。
【０２５９】
概要：一次スクリーニング（ファージ・ディスプレイ）から選択されたＫ６９Ａに基づく変異クローンをタンデム・サンドイッチＥＬＩＳＡでヒト抗ＣＨＩＰＳ結合性について試験した。ＥＬＩＳＡは、ＣＨＩＰＳの最初の３０アミノ酸（Ｎ末端）に対し結合するモノクローナル抗体をコーティング抗体として、及びポリクローナルヒト抗ＣＨＩＰＳ ＩｇＧに対し結合するモノクローナル抗体を検出抗体として最適化した。ＨＲＰをコンジュゲートしたポリクローナル抗体を第２の抗体として、その後ＨＲＰ基質を使用した。精製された組換えＣＨＩＰＳwtによる標準曲線を各ＥＬＩＳＡプレートについてプレート間対照として準備し、Ｋ６９Ａ溶解液の連続希釈液を使用してライブラリを計算及び比較した。４９２ｎｍの吸光度を計測し、濃度に対してプロットして、傾きが可変のシグモイド曲線適合モデルで分析した。予測結合性（抗体）を突然変異体についてＫ６９Ａのように計算した。期待値からの偏差：計測値−予測値を計算して記録した。
【０２６０】
材料及び方法：
１０×ＰＢＳ（バイオウィタッカー（BioWhittaker）＃ＢＥ１７−５１７Ｑ、ロット４ＭＢ０１０２）
ＰＢＳ Tween 20（０．０５％）（メディカゴ（Medicago）＃０９−８４１０−１００、ロット１１３３０３）
脱脂粉乳（センパー（Semper）、ロット０４１２０３）
CellyticB（シグマ（Sigma）＃Ｂ−３５５３、ロット１１４Ｋ６５１５６）
Sigma fast OPD（シグマ（Sigma）＃Ｐ９１８６、ロット０５５Ｋ８２０４）
F96 Maxisorp（ヌンク（Nunc）＃４４２４０４、ロット０７９０２７）
９６ウェルＵ字型ＰＰプレート（ヌンク（Nunc）＃２６７２４５、ロット０７５８６０）
ｍＡｂ ２Ｈ７モノクローナル抗体、１ｍｇ／ｍｌ（ユトレヒト（Utrecht）、ロット２００４−１２）
ヒト抗ＣＨＩＰＳ（３１−１１３）ＩｇＧ（ＨａＣＨＩＰＳ）、２．５４ ｍｇ／ｍｌ（アリゲーター・バイオサイエンス（Alligator Bioscience）、０５０２２３ＫａＢ）
ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃγ）−ＨＲＰ（ジャクソン・イムノテック・リサーチ（Jackson Immunotech Research）、＃、ロット６４０６７）
ｒＣＨＩＰＳwt、１．８ｍｇ／ｍｌ（ユトレヒト（Utrecht）、ロット２００４−１２−０２）
ＣＨＩＰＳ突然変異体：
器具：
ＥＬＩＳＡ洗浄器ＥＬｘ４０５（バイオテック・インスツルメント（BioTek Instruments））
振盪台Titramax 1000（ハイドルフ・インスツルメント（Heidolph Instruments））
Multiscan Ascent（ラブシステムズ（Labsystems））
GraphPad、シグマ（Sigma）
Excel
緩衝液：
コーティング緩衝液：１×ＰＢＳ：１００ｍＬの１０×ＰＢＳを９００ｍＬの脱イオン水に添加する。
洗浄緩衝液（buffert）：ＰＢＳ＋０．０５％Tween 20（ＰＢＳＴ）：錠剤を１つ、１０００ｍＬの脱イオン水に添加する。
アッセイ緩衝液Ａ：ＰＢＳＴ＋１％脱脂粉乳（ＭＰ）（ｗ／ｖ）＋１％Cellytic（ｖ／ｖ）
アッセイ緩衝液Ｂ：ＰＢＳＴ＋１％ＭＰ（ｗ／ｖ）
ブロッキング液：ＰＢＳＴ＋３％ＭＰ（ｗ／ｖ）
希釈緩衝液：１．２５×ＰＢＳ（１２．５ｍｌの１０×ＰＢＳを８７．５ｍｌの脱イオン水に添加する。
【０２６１】
プロトコル（３プレート）
１．コーティング：モノクローナル抗体ｍＡｂ ２Ｈ７、３．０μｇ／ｍｌをコーティング緩衝液（ＰＢＳ）中に調製する。
【０２６２】
９６ウェルMaxisorpプレートに１００μｌ／ウェルをピペットで移す。
【０２６３】
一晩４℃でインキュベートする。
２．ブロッキング：ブロッキング液２００μｌ／ウェルを添加する。室温（ＲＴ）で１時間（ｈ）、６００ｒｐｍの振盪台（Ｓ）でインキュベートする。
３．試料：ｒＣＨＩＰＳｗｔ標準曲線１０００〜０．０６ｎｇ／ｍｌ。エッペンドルフ管において：アッセイ緩衝液Ａ（ＰＢＳＴ＋１％ＭＰ＋１％Callytic）中に４倍連続希釈液を調製する。
【０２６４】
ｒＣＨＩＰＳwt（原液１．８ｍｇ／ｍｌ）のアッセイ緩衝液Ａ中１：１００希釈液：
５μＬのＣＨＩＰＳ＋４９５μＬの緩衝液＝１８μｇ／ｍｌ
連続希釈：
１０００ｎｇ／ｍｌ：３３μｌのＣＨＩＰＳwt（１８μｇ／ｍｌ）＋６５１μｌの緩衝液
２５０ｎｇ／ｍｌ：１５０μｌのＣＨＩＰＳ（１０００ｎｇ／ｍｌ）＋４５０μｌの緩衝液
↓
合計８通りの濃度
対照Ｋ６９Ａ（溶解液）：４倍連続希釈液１：１００〜１：１０２４００を２つのクローンから調製する。
【０２６５】
９６ウェルＵ字型ＰＰプレートにおいて：１．２５×ＰＢＳ中の１：５希釈液：６０μｌの溶解液＋２４０μｌの１．２５×ＰＢＳ
エッペンドルフ管において：
１：１００ ３０ｍｌの溶解液＋５７０μｌのアッセイ緩衝液Ｂ
１：４００ １５０μｌ（１：１００希釈液）＋４５０μｌのアッセイ緩衝液Ａ
↓
合計６通りの濃度
対照ｗｔ、２ｍｕｔ（溶解液）及びライブラリ：９６ウェルＵ字型ＰＰプレートにおいてアッセイ緩衝液Ａ中の１：１０００希釈液を調製する。
【０２６６】
１．２５×ＰＢＳ中の１：５希釈液：６０μｌの溶解液＋２４０μｌの１．２５×ＰＢＳ
アッセイ緩衝液Ａ（ＰＢＳＴ＋１％ＭＰ＋１％cellytic）中の１：１００希釈液
対照ｗｔ及び２ｍｕｔ（溶解液）：７５μｌ（１：５希釈液）＋１４２５μｌの緩衝液
ライブラリ：１５μｌ（１：５希釈液）＋２８５μｌの緩衝液
ＥＬＩＳＡプレートに対し（プレートレイアウトに従い）：
ｒＣＨＩＰＳｗｔ標準曲線及び対照Ｋ６９Ａ：１００ｍｌ／ウェルをピペットで移す。
【０２６７】
対照ｗｔ及び２ｍｕｔ（溶解液）及びライブラリ：９０μｌのアッセイ緩衝液Ａ＋１０μｌの試料（１：１００希釈液）をピペットで移す。
【０２６８】
ブランク：アッセイ緩衝液Ａ、１００μｌ／ウェルを３つのウェルに移す。
室温で１時間、６００ｒｐｍの振盪台でインキュベートする。
４．抗体の検出：アッセイ緩衝液Ｂ中のヒト抗ＣＨＩＰＳ（３１−１１３）０．１μｇ／ｍｌ。
【０２６９】
原液の１：１０希釈液：５μｌ＋２９５μｌのアッセイ緩衝液Ｂ＝２５４μｇ／ｍｌ
１３．４μｌのＨａＣＨＩＰ（２５４μｇ／ｍｌ）＋３４ｍｌのアッセイ緩衝液Ｂ
１００μｌ／ウェルをピペットで移す。室温で１時間、６００ｒｐｍの振盪台でインキュベートする。
５．二次抗体：アッセイ緩衝液Ｂ中１：１２０００希釈のヤギ抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ。
【０２７０】
３μｌの抗体＋３５ｍｌのアッセイ緩衝液Ｂ
１００μｌ／ウェルを添加する。室温で１時間、６００ｒｐｍの振盪台でインキュベートする。
６．拡張洗浄：２００μｌの洗浄緩衝液を添加する。室温で５分間、６００ｒｐｍの振盪台でインキュベートする。
７．基質：Sigma fast OPD。（指示に従う）。２つの緩衝液及び２つの基質錠剤を４０ｍｌの脱イオン水中に溶解する。１００μｌ／ウェルを添加する。
【０２７１】
暗所において室温で約３〜６分間、６００ｒｐｍの振盪台でインキュベートする。
【０２７２】
１ＭのＨＣｌを１５０μｌ／ウェルで添加することにより反応を停止させる。
【０２７３】
抗体を４９２ｎｍで計測する。
＊＊＊＊＊全てのステップ間：＃３×９６GreinerをＥＬ４０５においてＰＢＳＴで３回洗浄する＊＊＊＊＊＊
【０２７４】
【表１１】
2014001212.tif 000012
計算：
ＣＨＩＰＳwt標準曲線をExcel及びSigma GraphPadを使用して分析した。
ブランクの平均値及びＣＶ（％）を計算する（Excel）
全てのデータ点についてブランクの減算を行う（Excel）
ＣＨＩＰＳwt標準曲線：抗体４９２ｎｍを標準のＬｏｇ濃度に対しプロットする。
モデル「傾きが可変のシグモイド曲線適合」（GraphPad）で曲線のフィッティングを行う。
ＥＣ５０値及びＲ２値を記録する。
Ｋ６９Ａ溶解液（２つの試料）について同じ計算を行う。ＥＣ５０、Ｒ２及び最高値（抗体）を計測する。
最高値を１００％の結合性として用いてＫ６９Ａについて結合％として値を再計算する。（Excel）
クローンについて結合％を計算する＝結合性の計測値（Excel）
Ｋ６９Ａ標準曲線：結合％をＫ６９Ａのｌｏｇ濃度に対しプロットする。
モデル「傾きが可変のシグモイド曲線適合」（GraphPad）で曲線のフィッティングを行う。
発現ＥＬＩＳＡで計測された濃度を用いて、曲線適合モデルをクローンに対するヒト抗ＣＨＩＰＳの結合性の計算に使用する＝結合性の計算値
クローンの結合性の計測値と結合性の計算値との間の偏差を計算する。
導入された突然変異がヒト抗ＣＨＩＰＳへの結合に影響しない場合、突然変異体の結合性の計算値はＫ６９Ａの結合性の計測値と等しいはずである。導入された突然変異が結合性に影響する場合、結合性の計測値と計算値とは一致しないことになる。弱い結合物の示す阻害能力はＫ６９Ａより低くなり、偏差は負値となる。
偏差（差異）＝計測値−計算値。
【０２７５】
【表１２】
2014001212.tif 000013
ＣＨＩＰＳ１００４発現ＥＬＩＳＡ。１：１００及び１：５００希釈液中のライブラリの一点計測
目標：ｐＲＳＥＴベクターにおける発現後の粗細胞溶解液中のＣＨＩＰＳ突然変異体の濃度を測定すること。
【０２７６】
概要：タンデム・サンドイッチＥＬＩＳＡを、ＣＨＩＰＳの最初の３０アミノ酸（Ｎ末端）と結合する２つのモノクローナル抗体をコーティング抗体及び検出抗体として最適化した。ＨＲＰをコンジュゲートさせたポリクローナル抗体を第２の抗体として、続いてＨＲＰ発光基質を使用した。精製した組換えＣＨＩＰＳｗｔによる標準曲線を各ＥＬＩＳＡプレートについて準備した。相対発光量（ＲＬＵ）を計測して標準の濃度に対しプロットし、４パラメータ曲線適合モデルで分析することにより突然変異体の濃度を計算した。
【０２７７】
材料及び方法：
１０×ＰＢＳ（バイオウィタッカー（BioWhittaker）＃ＢＥ１７−５１７Ｑ、ロット４ＭＢ０１０２）
ＰＢＳ Tween 20（０．０５％）（メディカゴ（Medicago）＃０９−８４１０−１００、ロット１１３３０３）
ＢＳＡ（メルク（Merck）＃１．１２０１８．０１００、ロットＫ５４５９３３１８５２７）
CellyticB（シグマ（Sigma）＃Ｂ−３５５３、ロット１１４Ｋ６５１５６）
Super Signal ELISA Pico化学発光基質（ピアス（Pierce）＃３７０６９、ロットＦＫ９７６５５）
９６ウェル平底高結合白色ＬＩＡ−プレート（グライナー（Greiner）＃６５５０７４、ロット０４４１０１２９）
９６ウェルＵ字型ＰＰプレート
ｍＡｂ ２Ｈ７モノクローナル抗体、１ｍｇ／ｍｌ（ユトレヒト（Utrecht）、ロット２００４−１２）
ウサギ抗ＣＨＩＰＳ−Ｎ−Ｐｅｐ ＩｇＧ、６ｍｇ／ｍｌ（ユトレヒト（Utrecht）、ロット２０００−１２−０６）
ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−ＨＲＰ（サザン・バイオテクノロジーズ（Southern Biotechnologies）＃４０−５０−０５、ロットＣ４１０３−Ｓ１９４Ｄ）
ｒＣＨＩＰＳｗｔ、１．８ｍｇ／ｍｌ（ユトレヒト（Utrecht）、ロット２００４−１２−０２）
ＣＨＩＰＳ突然変異体：
器具：
ＥＬＩＳＡ洗浄器ＥＬｘ４０５（バイオテック・インスツルメント（BioTek Instruments））
振盪台Titramax 1000（ハイドルフ・インスツルメント（Heidolph Instruments））
FLUOstar Optima（ＢＭＧ）ソフトウェア
Excel
GraphPad、シグマ（Sigma）
緩衝液：
コーティング緩衝液：１×ＰＢＳ：１００ｍＬの１０×ＰＢＳを９００ｍＬの脱イオン水に添加する。
洗浄緩衝液（buffert）：ＰＢＳ＋０．０５％Tween 20（ＰＢＳＴ）：錠剤１つを１０００ｍＬの脱イオン水に添加する。
アッセイ緩衝液Ａ：ＰＢＳＴ＋１％ＢＳＡ（ｗ／ｖ）＋１％Cellytic（ｖ／ｖ）
アッセイ緩衝液Ｂ：ＰＢＳＴ＋１％ＢＳＡ（ｗ／ｖ）
ブロッキング液：ＰＢＳＴ＋４％ＢＳＡ（ｗ／ｖ）
プロトコル（６プレート）
１．コーティング：モノクローナル抗体ｍＡｂ ２Ｈ７、３．０μｇ／ｍｌをコーティング緩衝液（ＰＢＳ）中に調製する。９６ウェル白色高結合平底ＬＩＡプレートに１００μｌ／ウェルをピペットで移す。
【０２７８】
一晩４℃でインキュベートする。
２．ブロッキング：ブロッキング液２００μｌ／ウェルを添加する。室温（ＲＴ）で１時間（ｈ）、６００ｒｐｍの振盪台（Ｓ）でインキュベートする。
３．試料：ｒＣＨＩＰＳｗｔ標準曲線８００〜１．６ｎｇ／ｍｌ。１５ｍｌの試験管において：２倍連続希釈液（アッセイ緩衝液Ａ中）を１０段階で調製し、そのうち８つの濃度を標準曲線に使用した（表１０を参照）。
【０２７９】
ｒＣＨＩＰＳｗｔ（原液１．８ｍｇ／ｍｌ）のアッセイ緩衝液Ａ中１：１００希釈液：
５μＬのＣＨＩＰＳ＋４９５μＬの緩衝液＝１８μｇ／ｍｌ
【０２８０】
【表１３】
2014001212.tif 000014
【０２８１】
プロトコルに従い１００μＬ／ウェルを２つに添加する。
対照（溶解液）：アッセイ緩衝液Ｂ（ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ）中に１：１００希釈液を調製する。
【０２８２】
１：１００希釈液について：１００μｌ／ウェルを２つに添加する。
【０２８３】
１：５００希釈液について：２０μｌ＋８０μｌのアッセイ緩衝液Ａ／ウェルを２つに添加する。
ＣＨＩＰＳ突然変異体（溶解液）：９６ウェルＵ字型ＰＰプレートにおいてアッセイ緩衝液Ｂ（ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ）中に１：１００希釈液を調製する。
【０２８４】
１：１００希釈液について：ＥＬＩＳＡプレートに１００μｌ／ウェルを添加する。
【０２８５】
１：５００希釈液について：２０μｌ／ウェル＋８０μｌのアッセイ緩衝液Ａ（ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ＋１％Cellytic）／ウェルを添加する。一点。
ブランク：１００μｌのアッセイ緩衝液Ａを少なくとも２つのウェルに添加する。
室温で２時間、６００ｒｐｍの振盪台でインキュベートする。
４．抗体の検出：アッセイ緩衝液Ｂ（ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ）中のウサギ抗ＣＨＩＰＳ−Ｎ−ｐｅｐ、３μｇ／ｍｌ
３１μｌの抗体＋６２ｍｌの緩衝液
１００ｍｌ／ウェルをピペットで移す。室温で１時間、６００ｒｐｍの振盪台でインキュベートする。
５．二次抗体：ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−ＨＲＰ。アッセイ緩衝液Ｂ中に１：２００００希釈液を調製する。
【０２８６】
３．１μｌの抗体＋６２ｍｌの緩衝液。
【０２８７】
１００μｌ／ウェルを添加する。室温で１時間、６００ｒｐｍの振盪台でインキュベートする。
６ 拡張洗浄：洗浄緩衝液２００ｍｌ／ウェルを添加する。室温で５分間、６００ｒｐｍの振盪台でインキュベートする。
７．基質：Suiper Signal pico：同量の溶液ＡとＢとを混合する（暗所）。１００μ／ウェルを添加する。１分間６００ｒｐｍで振盪する（暗所）。発光を計測する。標準曲線で最高濃度の８０％の設定にする。（約３０００）。
＊＊＊＊＊全てのステップ間：＃３×９６GreinerをＥＬ４０５においてＰＢＳＴで３回洗浄する＊＊＊＊＊＊
【０２８８】
【表１４】
2014001212.tif 000015
計算：
ＢＭＧリーダー・ソフトウェア、Excel及び／又はSigma GraphPadを使用して標準曲線を分析した（図２５を参照）。
ブランクのＣＶ（％）を計算する。
全てのデータ点についてブランクの減算を行う。
標準曲線：ＲＬＵの平均値を標準のＬｏｇ濃度に対しプロットする。
モデル「４パラメータ適合」（ソフトウェア）又は「傾きが可変のシグモイド曲線適合」（GraphPad）で曲線のフィッティングを行う。ＥＣ５０値及びＲ２値を記録する。
曲線適合モデルを使用して試料の濃度を計算する。
【０２８９】
抗ＣＨＩＰＳ抗体ＥＬＩＳＡ及びペプチドＥＬＩＳＡで分析した例示的クローンから得られた結果の概要が、表１２に示される。
【０２９０】
【表１５】
2014001212.tif 000016
【０２９１】
実施例Ｄ−例示的変異ＣＨＩＰＳポリペプチドＩＩ
材料及び方法
さらなる例示的変異ＣＨＩＰＳポリペプチドの特性を調べた。
【０２９２】
発現ＥＬＩＳＡ、特異的結合試験及び抗ＣＨＩＰＳ ＥＬＩＳＡを上記のとおり行った。
【０２９３】
結果
結果は表１３に示される。
【０２９４】
【表１６】
2014001212.tif 000017
【０２９５】
実施例Ｅ−例示的変異ＣＨＩＰＳポリペプチドＩＩＩ
材料及び方法
ランダム突然変異誘発
ＣＨＩＰＳ変異体の多様なライブラリを作成するため、ランダム突然変異誘発の種々の方法を使用した。GeneMorph II（ストラタジーン（Stratagene））を製造者の推奨するとおりに実行した。簡潔にいえば、１ｎｇ又は１０ｐｇのＤＮＡ（突然変異Ｋ６１Ａ、Ｋ６９Ａ又はＫ１００Ａを有するＣＨＩＰＳ遺伝子）を、２５０ｎｇの各プライマー（フォワード：５'−ＴＣＧＣＧＧＣＣ ＣＡＧＣＣＧＧＣＣＡＴＧＧＣＣＴＴＴＡＣＴＴＴＴＧＡＡＣＣＧ−３'［配列番号８８］及びリバース：５'−ＧＣＣＴＧＣＧＧ ＣＣＧＣＡＧＡＴＣＴＡＣＣＡＴＴＡＡＴＴＡ ＣＡＴＡＡＧ−３'）［配列番号８９］、０．８ｍＭのｄＮＴＰ、１×Mutazyme緩衝液、２．５ＵのMutazymeＤＮＡポリメラーゼ、総容量５０μｌから構成されるＰＣＲ反応液に添加した。ＰＣＲプログラムは、９５℃で２分間の変性ステップ、９５℃で１分間、６０℃で１分間及び７２℃で１分間を４０サイクル、及び最後に７２℃で１０分間の伸長で構成された。突然変異が高頻度のライブラリと突然変異頻度が低いライブラリとを得るため、１ｎｇのライブラリをもう１ラウンドのGenemorph II突然変異誘発に供した。このときには、ＰＣＲ反応液中のＤＮＡ量は１０ｎｇであった。
【０２９６】
エラー・プローンＰＣＲを過去に記載されるとおり実行した（レオン（Leung）ら、１９８９年、Technique １：１１−１５頁）。突然変異頻度の高いライブラリを１つと、突然変異頻度の低いライブラリを１つとを作成した。簡潔にいえば、１０ｎｇのＤＮＡを、２０μＭの各プライマー（上記）、０．８ｍＭのｄＮＴＰ（ニュー・イングランド・バイオラブズ（New England Biolabs）、米国マサチューセッツ州）、１×AmpliTaq反応緩衝液、それぞれ３．２ｍＭの追加ｄＧＴＰ又はｄＴＴＰ、７．５ｍＭのＭｇＣｌ2、０．６４ｍＭのＭｎＣｌ2、２．５ＵのAmpliTaq熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ（アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）、米国カリフォルニア州）、総容量５０μｌから構成されるＰＣＲ反応液に添加した。ＰＣＲプログラムは、９４℃で５分間の変性ステップ、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間及び７２℃で４０秒間を２０サイクル、及び最後に７２℃で１０分間の伸長で構成された。ＰＣＲ産物をｐＧＥＭ−Ｔベクター（プロメガ（Promega））に、製造者の推奨に従いサブクローニングし、配列を検証して塩基交換を評価した。
【０２９７】
ＦＩＮＤ（登録商標）技法を使用した変異体ＣＨＩＰＳライブラリの生成
特定の一実施形態において、アリゲーター・バイオサイエンスＡＢ（Alligator Bioscience AB））のＦＩＮＤ（登録商標）（Fragment Induced Diversity）技法を使用して、参照により本明細書に援用される国際公開第２００２／４８３５１号パンフレット、国際公開第０３／０９７８３４号パンフレット及びＰＣＴ／ＧＢ第２００６／００４２９４号明細書に記載のとおり、変異体を生成した。
【０２９８】
ファージ・ディスプレイ
変異ＣＨＩＰＳポリペプチドのライブラリは、ファージミドｐＦＡＢ７５（エングバーグ（Engberg））ＳｆｉＩ及びＮｏｔＩ部位にクローニングして大腸菌ＴＯＰ１０Ｆ’（インビトロジェン（Invitrogen）、米国カリフォルニア州カールズバッド（Carlsbad））に形質転換することにより、ファージ粒子上で発現させた。ＶＳＣＭ１３（ストラタジーン（Stratagene）、米国カリフォルニア州ラ・ホーヤ（La Jolla））をヘルパー・ファージとして使用して、ファージ・ストックを標準プロトコルに従い調製した。対数増殖期の培養物にヘルパー・ファージを感染させて（感染効率：約２０）、振盪なしに３７℃で３０分間、インキュベートした。重感染した大腸菌を遠沈させたうえ、これを使用してアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）、カナマイシン（１０μｇ／ｍｌ）、テトラサイクリン（１０μｇ／ｍｌ）及びイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）（１ｍＭ）を補充したＬＢに接種した。培養物を３０℃で振盪しながら約１５時間成長させ、その後遠心によりペレット状にしてポリエチレングリコール／ＮａＣｌ沈殿に供した。１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（シグマ・アルドリッチ（Sigma-Aldrich）、米国ミズーリ州セントルイス（St. Louis））を含有するＰＢＳ中にファージを再び溶解し、０．４５μｍフィルターでろ過した。
【０２９９】
Ｃ５ａＲペプチド親和性についてのポジティブ選択
アミノ酸７−２８（アナスペック（AnaSpec）、米国）及びストレプトアビジン・コーティング磁気Dynabeads（ダイナル（Dynal）、ノルウェー国）から構成されるビオチン化Ｃ５ａＲペプチドに対し選択を行なった。磁気スタンド上で２分間の分離を行なった。選択に先立ち、ストレプトアビジン・ビーズ（５０μｌ）を１ｍｌの選択用緩衝液（３％ＢＳＡ及び０．０５％Tween-20を含有するＰＢＳ）中で３回洗浄した。５００μｌのファージ・ストック（約１０11個のファージ粒子を含有）を洗浄したビーズと共に室温で３０分間、回転させながらプレインキュベートすることで、可能性のあるストレプトアビジン結合物の一切を除去した。ペプチドを事前に選別されたファージに１０-7Ｍの最終濃度で添加し、混合物を１時間、室温で回転させながらインキュベートした。同時に、５０μｌのストレプトアビジン・ビーズを選択用緩衝液中で１時間、室温で回転させながらブロッキングした。ペプチド／ファージ混合物をビーズに添加したうえ、さらに１５分間、室温で回転させながらインキュベートした。次にビーズを１ｍｌの選択用緩衝液中で５回、続いて１ｍｌのＰＢＳ中で３回洗浄した。ペプチド結合物を溶出させるため、４５０μｌの０．１Ｍグリシン、０．１％ＢＳＡ、ｐＨ２．２を洗浄したビーズに添加した。室温で１０分間インキュベートした後、５０μｌの１Ｍトリス、ｐＨ９．０を添加して溶出液を中和した。数マイクロリットルの溶出ファージを確保して得られたファージの滴定に使用し、一方残りの溶出ファージは対数増殖期の大腸菌ＴＯＰ１０Ｆ’（インビトロジェン（Invitrogen）、米国カリフォルニア州カールズバッド（Carlsbad））を感染させて新しいファージ・ストックを調製するために使用した。次にこの選択プロトコルを再度、上記のとおり繰り返した。
【０３００】
ヒト抗ＣＨＩＰＳ ＩｇＧ親和性についてのネガティブ選択
ポジティブ選択の第２ラウンドの直後、ＣＨＩＰＳファージ・ストックをヒト抗ＣＨＩＰＳ31-113ＩｇＧ親和性についてのネガティブ選択のラウンドに供した。ヒト抗ＣＨＩＰＳ31-113ＩｇＧでコーティングされた磁気ビーズを１ｍｌの選択用緩衝液で３回洗浄し、次に１ｍｌの選択用緩衝液で１時間、室温で回転させながらブロッキングした。ポジティブ選択の溶出液をビーズに添加して、室温で１５分間インキュベートした。磁性体上で分離した後、上清を溶出液１として確保した。４ラウンドの溶出を行なった；１００μｌのＰＢＳをビーズに添加した後、５分間室温でインキュベートした。磁性体上で分離した後、このＰＢＳを溶出液２として確保した。これを２回繰り返した（溶出液３及び４）。溶出液１と溶出液２〜４のプールとを用いて、対数増殖期の大腸菌ＴＯＰ１０Ｆ’（インビトロジェン（Invitrogen）、米国カリフォルニア州カールズバッド（Carlsbad））を感染させ、次に大腸菌からファージミドを精製した。
【０３０１】
大腸菌におけるライブラリのクローニング及び発現
ファージ選択の後、選択されたＣＨＩＰＳ変異体のプールをｐＦＡＢ７５ベクターから切り離し、ｐＲＳＥＴベクター（インビトロジェン（Invitrogen））ＢｂｓＩ及びＢｇｌＩＩ部位にクローニングすることにより、大腸菌溶解液中で発現させた。ライブラリを大腸菌ＢＬ２１ ｓｔａｒ ＤＥ３ ｐＬｙｓＳ（インビトロジェン（Invitrogen））に形質転換し、５０μｇ／ｍｌのアンピシリン及び３４／ｍｌのクロラムフェニコールを補充したＬＢ寒天を入れた２０ｃｍのQtrayプレートにプレーティングし、３７℃で一晩インキュベートした。翌日、大腸菌コロニーを採取し、Qpixロボットを使用して、５０μｇ／ｍｌのアンピシリン及び３４μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを補充した１５０μｌのＬＢを含む９６ウェルGreiner丸底プレートに接種した。培養物を３７℃、７８％の湿度でMultitronプレート振盪機により７００ｒｐｍで振盪しながら一晩インキュベートした。５μｌの一晩培養物を１４５μｌのＬＢ／アンピシリン／クロラムフェニコールに３７℃で上記のとおり接種することにより、一晩培養物から一日培養物を調製した。タンパク質発現を誘導するため、３時間後に０．５ｍＭのＩＰＴＧ（イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトシド）を培養物に添加し、次に培養物をさらに３時間培養した。ＰＢＳ−０．０５％Tween-20、完全ＥＤＴＡ非含有プロテアーゼ阻害剤（ロシュ（Roche））、２５Ｕ／ｍｌのベンゾナーゼ（Benzonase）（シグマ（Sigma））及び１ＫＵ／ｍｌのrLysozyme（ノバジェン（Novagen））から構成される９０μｌの緩衝液中に大腸菌ペレットを凍結融解することにより、タンパク質を大腸菌溶解液中で発現させた。溶解液を室温で１０分間、振盪しながらインキュベートした。この溶解液の画分２０μｌを１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ−０．０５％Tween-20中に１０倍希釈した。希釈溶解液及び未希釈溶解液は全て、ＥＬＩＳＡによる分析まで−２０℃に保った。
【０３０２】
抗ＣＨＩＰＳ ＥＬＩＳＡ
ＣＨＩＰＳ変異体のアフィニティー精製ヒト抗ＣＨＩＰＳ31-113との結合を計測するため、Maxisorb９６又は３８４ウェル・プレート（ヌンク（Nunc）、米国ニューヨーク州ロチェスター（Rochester））に、一晩４℃でＰＢＳ中の１μｇ／ｍｌのマウス抗ＣＨＩＰＳ Ｎ末端ｍＡｂ ２Ｈ７（ハースＪＩ（Haas JI）、２００４）をコーティングした。プレートを洗浄緩衝液（０．０５％Tween 20含有ＰＢＳ）で３回洗浄し、ブロッキング緩衝液（ＰＢＳ−０．０５％Tween-20、３％粉乳含有）中、室温で１時間ブロッキングした。プレートを上記のとおり洗浄し、続いてＣＨＩＰＳクローンからの溶解液（上記のとおり希釈したもの）を添加して室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄した後、さらに希釈緩衝液（ＰＢＳ−０．０５％Tween-20、１％粉乳含有）中０．１μｇ／ｍｌのアフィニティー精製ヒト抗ＣＨＩＰＳ31-113ポリクローナルＩｇＧと共に室温で１時間インキュベートした。プレートを再び洗浄し、希釈緩衝液中に１／１００００希釈されたヤギ−抗ヒトＩｇＧ ＨＲＰ（ジャクソン・イムノリサーチ（Jackson ImmunoResearch）、米国ペンシルベニア州ウェスト・グローブ（West Grove））と共に室温で１時間インキュベートした。プレートをさらに３回洗浄し、Super Signal ELISA Pico化学発光基質（ピアス（Pierce））を添加して発光を計測した。
【０３０３】
発現ＥＬＩＳＡ
大腸菌溶解液中のＣＨＩＰＳ変異体の発現レベルを計測するため、上記のとおりＥＬＩＳＡを実施したが、但しコーティングには３μｇ／ｍｌのｍＡｂ ２Ｈ７を使用し、且つブロッキング緩衝液はＰＢＳ−０．０５％Tween-20、４％ＢＳＡ含有で構成され、希釈緩衝液はＰＢＳ−０．０５％Tween-20、１％ＢＳＡ含有で構成された。さらに、検出には１／２００００希釈の３μｇ／ｍｌのポリクローナルウサギ抗ＣＨＩＰＳ Ｎ末端ＩｇＧ及びヤギ抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ（サザン・バイオテック（Southern Biotech））を使用した。
【０３０４】
阻害ＥＬＩＳＡ
ＣＨＩＰＳ変異体のアフィニティー精製ヒト抗ＣＨＩＰＳ31-113との結合を野生型ＣＨＩＰＳタンパク質との競合で計測するため、阻害ＥＬＩＳＡを実施した。洗浄ステップ、ブロッキング及び希釈は、発現ＥＬＩＳＡと同様に行った。コーティングには５０ｎｇ／ｍｌの精製野生型ＣＨＩＰＳを使用した。次に、ＣＨＩＰＳ変異体の５倍連続希釈液（０．１６〜２５００ｎｇ／ｍｌ）をNuncポリプロピレン・プレートにおいて６０ｎｇ／ｍｌのアフィニティー精製ヒト抗ＣＨＩＰＳ31-113ポリクローナルＩｇＧと混合し、室温で２時間インキュベートした。次に、混合物のうち１００μｌをＥＬＩＳＡプレートに添加し、さらに室温で２時間インキュベートした。１／１２０００希釈のヤギ−抗ヒトＩｇＧ ＨＲＰにより検出を行った。上記のとおりＯＰＤ基質を使用した。
【０３０５】
ペプチドＥＬＩＳＡ
上記のＣ５ａＲ７−２８ペプチドに対するＣＨＩＰＳ変異体の結合性を計測するため、発現ＥＬＩＳＡについて記載されたとおりＥＬＩＳＡを実施したが、但しコーティングには５μｇ／ｍｌのストレプトアビジン（シグマ（Sigma））を使用した。さらに、プレートを洗浄及びブロッキングした後、Ｃ５ａＲペプチドを最終濃度が０．３μｇ／ｍｌになるまで添加した。ＣＨＩＰＳ溶解液をｘｘｘ希釈液中に添加した。１μｇ／ｍｌのｍＡｂ ２Ｈ７及びウサギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（ダコ（Dako））、１／２０００希釈により検出を行った。ＯＰＤ基質（３５ｍｌ；３４．７ｍＭのクエン酸Ｎａ、６６．７ｍＭのＮａＰＯ4、０．０１％Ｈ2Ｏ2中Ｏ−フェニレンジアミン錠剤１錠）を添加して検出した。１ＭのＨＣｌを添加して反応を停止させたうえ、４９２ｎｍで吸光度を記録した。
【０３０６】
上述の発現ＥＬＩＳＡも参照のこと。
【０３０７】
組み合わせＥＬＩＳＡ
組み合わせＥＬＩＳＡは、抗ＣＨＩＰＳ ＥＬＩＳＡとペプチドＥＬＩＳＡとの組み合わせである。このＥＬＩＳＡをペプチドＥＬＩＳＡについて記載されるものと同様に実施したが、次の点は修正した。ブロッキングにはＰＢＳ−０．０５％Tween-20、２％ＢＳＡ含有を使用し、検出には０．１μｇ／ｍｌのアフィニティー精製ヒト抗ＣＨＩＰＳ31-113ポリクローナルＩｇＧ／ヤギ−抗ヒトＩｇＧ ＨＲＰ、１／６０００希釈を使用した。Super Signal ELISA Pico化学発光基質（ピアス（Pierce））をＨＲＰ基質として使用して発光を計測した。
【０３０８】
選択方針
突然変異体の結合は、常に野生型ＣＨＩＰＳの抗ＣＨＩＰＳ抗体又はペプチドとの結合結果と比較した（結合％を計算した）。一次スクリーニングからの最良の突然変異体を、以下の基準に基づき選択した。
１．ペプチドとの結合が少なくとも８０％
２．組み合わせＥＬＩＳＡにおいて抗ＣＨＩＰＳ抗体との結合が７０％未満。二重ＥＬＩＳＡにおける野生型結合の３％／ペプチドＥＬＩＳＡにおける結合％が、０．０５〜０．６でなければならない。
【０３０９】
選択されたクローンは、二次スクリーニングにおいて上記のとおりの発現ＥＬＩＳＡ及び抗ＣＨＩＰＳ ＥＬＩＳＡにより分析した。
【０３１０】
好ましいクローン（抗ＣＨＩＰＳ抗体との結合が４０％未満を呈する）を抗ＣＨＩＰＳ ＥＬＩＳＡ及び阻害ＥＬＩＳＡでさらに分析した。上記の基準に基づく最良の４２個のクローンを発現させたうえ、インビトロ／インビボ細胞実験において結合性について分析した。高濃度のＣＨＩＰＳ変異体を発現させるため、無細胞発現系であるExpressway無細胞大腸菌発現キット（インビトロジェン（Invitrogen））を使用した。製造者の記載するとおり発現を実施した。簡潔にいえば、マイクロタイター・プレートにおいて０．５μｇのプラスミドＤＮＡを、大腸菌抽出物、反応緩衝液、アミノ酸及びＴ７酵素混合物と混合し、３０℃で３０分間、振盪しながらインキュベートした。アミノ酸を含む栄養供給緩衝液を試料に添加して、３０℃で５．５時間、さらにインキュベートした。プレートを遠心し、タンパク質を含む上清を、Ｕ９３７／Ｃ５ａＲ細胞上でのＣ５ａＲに対する結合アッセイ、及び好中球（天然でＣ５ａＲ及びｆＭＰＬを発現する）上でのＣ５ａＲ及びｆＭＰＬ結合についての結合アッセイで分析されるまで−２０℃で保管した。こうしたアッセイはインビトロで発現させた材料により２回実行し、別個にＣ５ａＲ結合性について分析してクローンを順位付けした。１０個の最良な成績のクローンをさらなる分析用に選択した。
【０３１１】
Ｕ９３７／Ｃ５ａＲ細胞に対する結合性
２５μｌのＲＰＭＩ／ＨＡＳ中７．５×１０4個のＵ９３７／Ｃ５ａＲ細胞を２５μｌのＣＨＩＰＳ溶解液と共に氷上で３０分間インキュベートした。細胞をＲＰＭＩ／ＨＡＳにより１回洗浄し、再懸濁して５０μｌの５μｇ／ｍｌ ２Ｈ７抗体と共に氷上で３０分間インキュベートした。１回洗浄して再懸濁し、５０μｌの１／５０希釈ヤギ−抗マウス−ＲＰＥ抗体と共に氷上で３０分間インキュベートした。ＲＰＭＩ／ＨＡＳにより１回洗浄して２５０μｌの０．５％パラホルムアルデヒド／ＲＰＭＩ／ＨＡＳ中に再懸濁し、ボルテックスした。４℃の暗所に保管した。ＦＡＣＳにより分析して平均値を計測した。
【０３１２】
ＣＨＩＰＳ活性バイオアッセイ・デュアルｆＭＬＰ−Ｆ／ａ−Ｃ５ａＲ−ＰＥ（マイクロタイター・プレート）
ＣＨＩＰＳ（希釈液）の複数の試料を生物活性についてヒト好中球によりｆＭＬＰ及びＣ５ａの双方について同時に試験するための手順。ＣＨＩＰＳ含有試料は、ＦＩＴＣ−ｆＭＬＰ及び抗Ｃ５ａＲ ｍＡｂが細胞と結合するのを妨げ得る。第２のインキュベーション・ステップは、ｍＡｂをＰＥで染色して、試料をフロー・サイトメトリーにより分析する。
【０３１３】
上記の細胞ベースのアッセイで示される結合性が最高位に順位付けされる１０個のクローンを選択した（下記「結果」を参照）。
【０３１４】
結果
ＦＩＮＤ（登録商標）技法を使用して生成された例示的変異ＣＨＩＰＳポリペプチドが、以下の表１４に開示される（上記の細胞ベースのアッセイで示される結合性が最高位に順位付けされる１０個のクローンに相当する）。
【０３１５】
【表１７】
2014001212.tif 000018
【０３１６】
従って、クローンＦ３．０３は以下のアミノ酸配列からなる。
ＦＴＦＥＰＦＰＴＮＥＥＩＥＳＮＫＫＭＬＥＫＥＫＡＹＫＥＳＦＫＮＳＧＬＰＴＴＬＧＫＬＤＥＲＬＲＮＹＬＮＫＧＴＫＮＳＡＱＦＥＫＭＶＩＬＴＥＮＲＧＹＹＴＶＹＬＹＴＰＬＡＥＤＲＫＮＶＥＬＬＧＲＭＹＫＴＹＦＦＫＫＧＥＳＫＳＳＹＶＩＫＶＲＳ
配列番号９０
【０３１７】
特定の実験において、「Ｓ３．２３」と指定されるさらなる１つの突然変異ＣＨＩＰＳポリペプチドを使用し、これは１１３位及び１１４位のアミノ酸ＲＳを伴う配列番号１のアミノ酸１〜１１２に相当し、以下の突然変異を含む。
Ｋ４０Ｎ、Ｄ４２Ｖ、Ｎ７７Ｙ、Ｄ８３Ｇ、Ｌ９０Ｐ、Ｎ１１１Ｋ及びＧ１１２Ｖ。
【０３１８】
上記の選択されたインビトロ発現クローンについてのさらなる結合データが表１５に示される。
【０３１９】
【表１８】
2014001212.tif 000019
【０３２０】
抗ＣＨＩＰＳ ＥＬＩＳＡ試験及び阻害ＥＬＩＳＡ試験の結果が、それぞれ図２６及び２７に詳細に示される。これらの知見から、スクリーニング過程のデータが示すところによれば、抗ＣＨＩＰＳ抗体のＣＨＩＰＳ突然変異体に対する結合性は野生型と比較して低下することが確認される。
【０３２１】
一連のさらなる実験において、上記に示されるものからの例示的突然変異体を修飾して、Ｎ末端の３０アミノ酸と、Ｃ末端の最後の１つのアミノ酸とを欠失させた。従ってこの修飾突然変異体は、表１４に示される突然変異が組み込まれる配列番号１のアミノ酸３１〜１１３に相当する。
【０３２２】
Ｃ５ａＲの修飾３１−１１３突然変異体による阻害が図２８に示される。いずれも安定にトランスフェクトされたタンパク質としてＵ９３７細胞中で発現するか、又は好中球で自然に発現するＦ３．０８、Ｆ３．３９及びＦ３．５０突然変異体の発現及び精製と、それに続くこれらのＣ５ａＲに対する結合の分析から、スクリーニング・データが結合特性の保持を実証していることが確認された。
【０３２３】
実施例Ｆ−ＣＨＩＰＳアミノ酸の表面可触性及び近接性
材料及び方法
アミタイ（Amitai）ら、２００４年、J. Mol. Biol. ３４４：１１３５−１１４６頁に記載されるとおり、ＮＡＣＣＥＳＳプログラムを使用してＲＳＡ値を測定した（ハバード（Hubbard）、１９９６年、ＮＡＣＣＥＳＳ，２．１．１編、「Biomolecular Structure and Modelling Unit」、英国ロンドン、ユニバーシティ・カレッジ（University College）もまた参照）。
【０３２４】
簡潔には、ＮＡＣＣＥＳＳプログラムは、ファンデルワールス表面の周囲に所与のサイズのプローブを回転させることにより画定される原子が接触可能な表面を計算する。このプログラムは、リー及びリチャーズ（Lee & Richards）（１９７１年）J. Mol. Biol. ５５、３７９−４００頁の方法を実行するものである。プログラムは最大２００００個の原子の寸法を決定し、ユーザはプローブ・サイズ及び原子半径を変化させることができる。プログラムは３つのファイルを出力する。
（１）原子可触性ファイル（．ａｓａファイル）、各原子についての接触可能な表面の計算値をＰＤＢファイルとして、並びに割り当てられたファンデルワールス半径を含む。
（２）残基可触性（．ｒｓａ）ファイル、各タンパク質又は核酸残基上の原子が接触可能な表面積の合計、並びに伸長したＡＬＡ−ｘ−ＡＬＡトリペプチドにおける（アミノ酸についての）当該残基タイプの可触性と比較した可触性％として計算される各残基の相対可触性を含む。ハバード、キャンベル及びソーントン（Hubbard, Campbell & Thornton）（１９９１年）J. Mol. Biol. ２２０、５０７−５３０頁を参照のこと。
（３）ログファイル（．ｌｏｇ）、計算に関する情報を含む。
【０３２５】
相対表面可触性（ＲＳＡ）
野生型ＣＨＩＰＳタンパク質内のアミノ酸の相対表面可触性（ＲＳＡ）が表１５に示される。ＲＳＡ＞３０％は、露出した残基を示すものと見なされる。
【０３２６】
【表１９】
2014001212.tif 000020
【０３２７】
【表２０】
2014001212.tif 000021
【０３２８】
予測機能性残基
野生型ＣＨＩＰＳタンパク質内の予測された機能性アミノ酸残基が表１６に示される。
（注記：タンパク質コアの残基はタンパク質表面の残基より近接性の値が高い。しかしながら、活性部位残基はタンパク質表面にあるが、近接性の値はコア残基よりさらに高い）
閾値：
近接性Ｚスコア≧１
３≦相対表面積≦２００
【０３２９】
【表２１】
2014001212.tif 000022
【図面の簡単な説明】
【０３３０】
【図１】健常ヒトドナー（ｎ＝１６８）におけるＩｇＧ抗ＣＨＩＰＳ力価の度数分布。力価は、バックグラウンド値を減じた後の０．３００の吸光度を与える対数希釈として定義した。平均力価は３．６２であり、ＳＤは０．７２であった。挿入されている記号は６人の対象者の研究に参加する前の抗ＣＨＩＰＳ力価を表す（ＥＬＩＳＡごとに参照としてヒトプール血清に対し補正された３つの値の平均値）。
【図２】ボランティアの血清中に検出されたＣＨＩＰＳの薬力学。ＣＨＩＰＳは特異的捕捉ＥＬＩＳＡによりＣＨＩＰＳの静脈注射後の様々な時点で計測した。塗りつぶされていない記号はプラセボを、及び塗りつぶされている記号はＣＨＩＰＳ被投与者を表す。
【図３Ａ】ヒト抗ＣＨＩＰＳ ＩｇＧはＣＨＩＰＳの捕捉ＥＬＩＳＡによる検出を妨げる。様々な濃度のヒトプール血清中にスパイクされ、捕捉ＥＬＩＳＡにより計測された２．５ｎｇ・ｍＬ-1のＣＨＩＰＳの回収。
【図３Ｂ】ヒト抗ＣＨＩＰＳ ＩｇＧはＣＨＩＰＳの捕捉ＥＬＩＳＡによる検出を妨げる。Protein-G Sepharoseに通液してヒト血清由来のＩｇＧを欠乏させることにより、ＣＨＩＰＳ捕捉ＥＬＩＳＡに対する阻害効果はなくなる。様々な濃度のＣＨＩＰＳを、緩衝液（●）、１％ヒト血清（１人のドナー由来；▲）、又はProtein-G-Sepharose通液後の１％血清（▼）と共にインキュベートした。データはある代表的な実験を示す。
【図４−１】ＣＨＩＰＳは末梢血好中球の表面上で回収される。ＣＨＩＰＳの静脈注射後の様々な時点で、好中球の表面に結合したＣＨＩＰＳの存在をウサギ−抗ＣＨＩＰＳ抗体により検出した。個々の対象者が示される；白いバーはプラセボを、及び黒いバーはＣＨＩＰＳ被投与者を表す。値は、様々な時点におけるＥＤＴＡ全血試料中のゲートにかけられた好中球の平均蛍光（ＭＦＬ）として表される（Ｔ＝０、１５、６０、２４０分及び２４時間後）。二次的なＦＩＴＣ標識されたコンジュゲートについてのバックグラウンドＭＦＬ値は６であった。
【図４−２】ＣＨＩＰＳは末梢血好中球の表面上で回収される。ＣＨＩＰＳの静脈注射後の様々な時点で、好中球の表面に結合したＣＨＩＰＳの存在をウサギ−抗ＣＨＩＰＳ抗体により検出した。個々の対象者が示される；白いバーはプラセボを、及び黒いバーはＣＨＩＰＳ被投与者を表す。値は、様々な時点におけるＥＤＴＡ全血試料中のゲートにかけられた好中球の平均蛍光（ＭＦＬ）として表される（Ｔ＝０、１５、６０、２４０分及び２４時間後）。二次的なＦＩＴＣ標識されたコンジュゲートについてのバックグラウンドＭＦＬ値は６であった。
【図４−３】ＣＨＩＰＳは末梢血好中球の表面上で回収される。ＣＨＩＰＳの静脈注射後の様々な時点で、好中球の表面に結合したＣＨＩＰＳの存在をウサギ−抗ＣＨＩＰＳ抗体により検出した。個々の対象者が示される；白いバーはプラセボを、及び黒いバーはＣＨＩＰＳ被投与者を表す。値は、様々な時点におけるＥＤＴＡ全血試料中のゲートにかけられた好中球の平均蛍光（ＭＦＬ）として表される（Ｔ＝０、１５、６０、２４０分及び２４時間後）。二次的なＦＩＴＣ標識されたコンジュゲートについてのバックグラウンドＭＦＬ値は６であった。
【図４−４】ＣＨＩＰＳは末梢血好中球の表面上で回収される。ＣＨＩＰＳの静脈注射後の様々な時点で、好中球の表面に結合したＣＨＩＰＳの存在をウサギ−抗ＣＨＩＰＳ抗体により検出した。個々の対象者が示される；白いバーはプラセボを、及び黒いバーはＣＨＩＰＳ被投与者を表す。値は、様々な時点におけるＥＤＴＡ全血試料中のゲートにかけられた好中球の平均蛍光（ＭＦＬ）として表される（Ｔ＝０、１５、６０、２４０分及び２４時間後）。二次的なＦＩＴＣ標識されたコンジュゲートについてのバックグラウンドＭＦＬ値は６であった。
【図４−５】ＣＨＩＰＳは末梢血好中球の表面上で回収される。ＣＨＩＰＳの静脈注射後の様々な時点で、好中球の表面に結合したＣＨＩＰＳの存在をウサギ−抗ＣＨＩＰＳ抗体により検出した。個々の対象者が示される；白いバーはプラセボを、及び黒いバーはＣＨＩＰＳ被投与者を表す。値は、様々な時点におけるＥＤＴＡ全血試料中のゲートにかけられた好中球の平均蛍光（ＭＦＬ）として表される（Ｔ＝０、１５、６０、２４０分及び２４時間後）。二次的なＦＩＴＣ標識されたコンジュゲートについてのバックグラウンドＭＦＬ値は６であった。
【図４−６】ＣＨＩＰＳは末梢血好中球の表面上で回収される。ＣＨＩＰＳの静脈注射後の様々な時点で、好中球の表面に結合したＣＨＩＰＳの存在をウサギ−抗ＣＨＩＰＳ抗体により検出した。個々の対象者が示される；白いバーはプラセボを、及び黒いバーはＣＨＩＰＳ被投与者を表す。値は、様々な時点におけるＥＤＴＡ全血試料中のゲートにかけられた好中球の平均蛍光（ＭＦＬ）として表される（Ｔ＝０、１５、６０、２４０分及び２４時間後）。二次的なＦＩＴＣ標識されたコンジュゲートについてのバックグラウンドＭＦＬ値は６であった。
【図５Ａ−１】ヒト末梢血好中球におけるＦＰＲの発現。ＣＨＩＰＳの静脈注射後の様々な時点で、好中球の表面上のＦＰＲの存在をＦＩＴＣ標識されたｆＭＬＰにより検出した。白いバーはプラセボを、及び黒いバーはＣＨＩＰＳ被投与者を表す。値はゲートにかけられた好中球の平均蛍光（ＭＦＬ）として表される。
【図５Ａ−２】ヒト末梢血好中球におけるＦＰＲの発現。ＣＨＩＰＳの静脈注射後の様々な時点で、好中球の表面上のＦＰＲの存在をＦＩＴＣ標識されたｆＭＬＰにより検出した。白いバーはプラセボを、及び黒いバーはＣＨＩＰＳ被投与者を表す。値はゲートにかけられた好中球の平均蛍光（ＭＦＬ）として表される。
【図５Ａ−３】ヒト末梢血好中球におけるＦＰＲの発現。ＣＨＩＰＳの静脈注射後の様々な時点で、好中球の表面上のＦＰＲの存在をＦＩＴＣ標識されたｆＭＬＰにより検出した。白いバーはプラセボを、及び黒いバーはＣＨＩＰＳ被投与者を表す。値はゲートにかけられた好中球の平均蛍光（ＭＦＬ）として表される。
【図５Ａ−４】ヒト末梢血好中球におけるＦＰＲの発現。ＣＨＩＰＳの静脈注射後の様々な時点で、好中球の表面上のＦＰＲの存在をＦＩＴＣ標識されたｆＭＬＰにより検出した。白いバーはプラセボを、及び黒いバーはＣＨＩＰＳ被投与者を表す。値はゲートにかけられた好中球の平均蛍光（ＭＦＬ）として表される。
【図５Ａ−５】ヒト末梢血好中球におけるＦＰＲの発現。ＣＨＩＰＳの静脈注射後の様々な時点で、好中球の表面上のＦＰＲの存在をＦＩＴＣ標識されたｆＭＬＰにより検出した。白いバーはプラセボを、及び黒いバーはＣＨＩＰＳ被投与者を表す。値はゲートにかけられた好中球の平均蛍光（ＭＦＬ）として表される。
【図５Ａ−６】ヒト末梢血好中球におけるＦＰＲの発現。ＣＨＩＰＳの静脈注射後の様々な時点で、好中球の表面上のＦＰＲの存在をＦＩＴＣ標識されたｆＭＬＰにより検出した。白いバーはプラセボを、及び黒いバーはＣＨＩＰＳ被投与者を表す。値はゲートにかけられた好中球の平均蛍光（ＭＦＬ）として表される。
【図５Ｂ−１】ヒト末梢血好中球におけるＣ５ａＲの発現。ＣＨＩＰＳの静脈注射後の様々な時点で、好中球の表面上のＣ５ａＲの存在をＦＩＴＣ標識された抗ＣＤ８８ｍＡｂにより検出した。白いバーはプラセボを、及び黒いバーはＣＨＩＰＳ被投与者を表す。値はゲートにかけられた好中球の平均蛍光（ＭＦＬ）として表される。
【図５Ｂ−２】ヒト末梢血好中球におけるＣ５ａＲの発現。ＣＨＩＰＳの静脈注射後の様々な時点で、好中球の表面上のＣ５ａＲの存在をＦＩＴＣ標識された抗ＣＤ８８ｍＡｂにより検出した。白いバーはプラセボを、及び黒いバーはＣＨＩＰＳ被投与者を表す。値はゲートにかけられた好中球の平均蛍光（ＭＦＬ）として表される。
【図５Ｂ−３】ヒト末梢血好中球におけるＣ５ａＲの発現。ＣＨＩＰＳの静脈注射後の様々な時点で、好中球の表面上のＣ５ａＲの存在をＦＩＴＣ標識された抗ＣＤ８８ｍＡｂにより検出した。白いバーはプラセボを、及び黒いバーはＣＨＩＰＳ被投与者を表す。値はゲートにかけられた好中球の平均蛍光（ＭＦＬ）として表される。
【図５Ｂ−４】ヒト末梢血好中球におけるＣ５ａＲの発現。ＣＨＩＰＳの静脈注射後の様々な時点で、好中球の表面上のＣ５ａＲの存在をＦＩＴＣ標識された抗ＣＤ８８ｍＡｂにより検出した。白いバーはプラセボを、及び黒いバーはＣＨＩＰＳ被投与者を表す。値はゲートにかけられた好中球の平均蛍光（ＭＦＬ）として表される。
【図５Ｂ−５】ヒト末梢血好中球におけるＣ５ａＲの発現。ＣＨＩＰＳの静脈注射後の様々な時点で、好中球の表面上のＣ５ａＲの存在をＦＩＴＣ標識された抗ＣＤ８８ｍＡｂにより検出した。白いバーはプラセボを、及び黒いバーはＣＨＩＰＳ被投与者を表す。値はゲートにかけられた好中球の平均蛍光（ＭＦＬ）として表される。
【図５Ｂ−６】ヒト末梢血好中球におけるＣ５ａＲの発現。ＣＨＩＰＳの静脈注射後の様々な時点で、好中球の表面上のＣ５ａＲの存在をＦＩＴＣ標識された抗ＣＤ８８ｍＡｂにより検出した。白いバーはプラセボを、及び黒いバーはＣＨＩＰＳ被投与者を表す。値はゲートにかけられた好中球の平均蛍光（ＭＦＬ）として表される。
【図６】生体外での全血ｆＭＬＰ刺激後の末梢血好中球の阻害指数。ＣＨＩＰＳの静脈注射後の様々な時点で、ＥＤＴＡ抗凝固処理血液を緩衝液及びｆＭＬＰと共に３０分間３７℃でインキュベートし、ＣＤ１１ｂ及びＣＤ６２Ｌの双方の発現を分析した。すべての時点について、ＣＤ１１ｂ及びＣＤ６２Ｌの発現は緩衝液で処理された対照試料の相対値として表された（ＣＤ１１ｂ発現については相対的上昇及びＣＤ６２Ｌ発現については相対的低下）。これらの値を使用して各対象者についての時点毎の活性化指標を計算した（ＣＤ６２Ｌについての相対値／ＣＤ１１ｂについての相対値）。データは、プラセボ（○）、血清及び好中球ＣＨＩＰＳ陰性（−）対象者（●）及びＣＨＩＰＳ陽性（＋）対象者（■）の平均値±ＳＤとして表される。
【図７Ａ】循環末梢白血球のレベル。ＣＨＩＰＳの静脈注射後の様々な時点で、ＷＢＣ計数を実施した。（１．１及び１．６は、それぞれ１日と１時間又は６時間を示す）。ＷＢＣについてのデータはＴ＝０の値の相対値として表される。値はプラセボ（●）及びＣＨＩＰＳ被投与者（▲）についての平均値±ＳＤである。
【図７Ｂ】循環血清炎症マーカーＣＲＰのレベル。ＣＨＩＰＳの静脈注射後の様々な時点で、ＣＲＰ計測を実施した。（１．１及び１．６は、それぞれ１日と１時間又は６時間を示す）。ＣＲＰについてのデータはｍｇ・Ｌ-1として表される。値はプラセボ（●）及びＣＨＩＰＳ被投与者（▲）についての平均値±ＳＤである。
【図８Ａ】循環免疫複合体（ＣＩＣ）のレベルにより計測したときのＣＨＩＰＳの有害作用。ＣＨＩＰＳの静脈注射後の様々な時点で、このマーカーについて特異的アッセイを実施した。データはＴ＝０の値の相対値として表され、プラセボ（●）及びＣＨＩＰＳ被投与者（▲）についての平均値±ＳＤとして示される。
【図８Ｂ】循環マスト細胞マーカー・トリプターゼのレベルにより計測したときのＣＨＩＰＳの有害作用。ＣＨＩＰＳの静脈注射後の様々な時点で、このマーカーについて特異的アッセイを実施した。データはＴ＝０の値の相対値として表され、プラセボ（●）及びＣＨＩＰＳ被投与者（▲）についての平均値±ＳＤとして示される。
【図９Ａ−１】ＣＨＩＰＳの静脈注射後の様々な時点における循環末梢血好中球上のＣＤ１１ｂ及びＣＤ６２Ｌの発現指標。各対象者について、ＣＤ１１ｂ及びＣＤ６２Ｌの発現をＴ＝０における最初の発現レベルに対し時点毎に正規化した。これらの値を使用して各対象者についての時点毎の活性化指標を計算した（ＣＤ１１ｂについての相対値／ＣＤ６２Ｌについての相対値）。
【図９Ａ−２】ＣＨＩＰＳの静脈注射後の様々な時点における循環末梢血好中球上のＣＤ１１ｂ及びＣＤ６２Ｌの発現指標。各対象者について、ＣＤ１１ｂ及びＣＤ６２Ｌの発現をＴ＝０における最初の発現レベルに対し時点毎に正規化した。これらの値を使用して各対象者についての時点毎の活性化指標を計算した（ＣＤ１１ｂについての相対値／ＣＤ６２Ｌについての相対値）。
【図９Ａ−３】ＣＨＩＰＳの静脈注射後の様々な時点における循環末梢血好中球上のＣＤ１１ｂ及びＣＤ６２Ｌの発現指標。各対象者について、ＣＤ１１ｂ及びＣＤ６２Ｌの発現をＴ＝０における最初の発現レベルに対し時点毎に正規化した。これらの値を使用して各対象者についての時点毎の活性化指標を計算した（ＣＤ１１ｂについての相対値／ＣＤ６２Ｌについての相対値）。
【図９Ａ−４】ＣＨＩＰＳの静脈注射後の様々な時点における循環末梢血好中球上のＣＤ１１ｂ及びＣＤ６２Ｌの発現指標。各対象者について、ＣＤ１１ｂ及びＣＤ６２Ｌの発現をＴ＝０における最初の発現レベルに対し時点毎に正規化した。これらの値を使用して各対象者についての時点毎の活性化指標を計算した（ＣＤ１１ｂについての相対値／ＣＤ６２Ｌについての相対値）。
【図９Ａ−５】ＣＨＩＰＳの静脈注射後の様々な時点における循環末梢血好中球上のＣＤ１１ｂ及びＣＤ６２Ｌの発現指標。各対象者について、ＣＤ１１ｂ及びＣＤ６２Ｌの発現をＴ＝０における最初の発現レベルに対し時点毎に正規化した。これらの値を使用して各対象者についての時点毎の活性化指標を計算した（ＣＤ１１ｂについての相対値／ＣＤ６２Ｌについての相対値）。
【図９Ａ−６】ＣＨＩＰＳの静脈注射後の様々な時点における循環末梢血好中球上のＣＤ１１ｂ及びＣＤ６２Ｌの発現指標。各対象者について、ＣＤ１１ｂ及びＣＤ６２Ｌの発現をＴ＝０における最初の発現レベルに対し時点毎に正規化した。これらの値を使用して各対象者についての時点毎の活性化指標を計算した（ＣＤ１１ｂについての相対値／ＣＤ６２Ｌについての相対値）。
【図９Ｂ−１】ＣＨＩＰＳの静脈注射後の様々な時点における循環末梢血好中球上のＣＤ１１ｂ及びＣＤ６２Ｌの発現指標。各対象者について、ＣＤ１１ｂ及びＣＤ６２Ｌの発現をＴ＝０における最初の発現レベルに対し時点毎に正規化した。これらの値を使用して各対象者についての時点毎の活性化指標を計算した（ＣＤ１１ｂについての相対値／ＣＤ６２Ｌについての相対値）。
【図９Ｂ−２】ＣＨＩＰＳの静脈注射後の様々な時点における循環末梢血好中球上のＣＤ１１ｂ及びＣＤ６２Ｌの発現指標。各対象者について、ＣＤ１１ｂ及びＣＤ６２Ｌの発現をＴ＝０における最初の発現レベルに対し時点毎に正規化した。これらの値を使用して各対象者についての時点毎の活性化指標を計算した（ＣＤ１１ｂについての相対値／ＣＤ６２Ｌについての相対値）。
【図９Ｂ−３】ＣＨＩＰＳの静脈注射後の様々な時点における循環末梢血好中球上のＣＤ１１ｂ及びＣＤ６２Ｌの発現指標。各対象者について、ＣＤ１１ｂ及びＣＤ６２Ｌの発現をＴ＝０における最初の発現レベルに対し時点毎に正規化した。これらの値を使用して各対象者についての時点毎の活性化指標を計算した（ＣＤ１１ｂについての相対値／ＣＤ６２Ｌについての相対値）。
【図９Ｂ−４】ＣＨＩＰＳの静脈注射後の様々な時点における循環末梢血好中球上のＣＤ１１ｂ及びＣＤ６２Ｌの発現指標。各対象者について、ＣＤ１１ｂ及びＣＤ６２Ｌの発現をＴ＝０における最初の発現レベルに対し時点毎に正規化した。これらの値を使用して各対象者についての時点毎の活性化指標を計算した（ＣＤ１１ｂについての相対値／ＣＤ６２Ｌについての相対値）。
【図９Ｂ−５】ＣＨＩＰＳの静脈注射後の様々な時点における循環末梢血好中球上のＣＤ１１ｂ及びＣＤ６２Ｌの発現指標。各対象者について、ＣＤ１１ｂ及びＣＤ６２Ｌの発現をＴ＝０における最初の発現レベルに対し時点毎に正規化した。これらの値を使用して各対象者についての時点毎の活性化指標を計算した（ＣＤ１１ｂについての相対値／ＣＤ６２Ｌについての相対値）。
【図９Ｂ−６】ＣＨＩＰＳの静脈注射後の様々な時点における循環末梢血好中球上のＣＤ１１ｂ及びＣＤ６２Ｌの発現指標。各対象者について、ＣＤ１１ｂ及びＣＤ６２Ｌの発現をＴ＝０における最初の発現レベルに対し時点毎に正規化した。これらの値を使用して各対象者についての時点毎の活性化指標を計算した（ＣＤ１１ｂについての相対値／ＣＤ６２Ｌについての相対値）。
【図１０】ＣＨＩＰＳの健常ヒト対象者における免疫原性。ＣＨＩＰＳに対する特異的ＩｇＧ力価を全対象者において試験開始前及び試験終了７日後及び４２日後に測定した。値は、プラセボ（●）及びＣＨＩＰＳ被投与者（■）についての平均値±ＳＤである。
【図１１】ＣＨＩＰＳ−ＩｇＧ複合体によりインビトロで誘導された好中球上での相対的ＣＤ１１ｂ発現。健常ボランティアから単離された好中球を、２０μｇ・ｍＬ-1のアフィニティー精製ヒトα−ＣＨＩＰＳ ＩｇＧを伴い（■）、又は伴わず（●）、高濃度のＣＨＩＰＳに曝露した。ＦｃγＲの役割について取り組むため、細胞をｍＡｂ抗ＦｃＲＩＩ（ＩＶ−３）及びＦ（ａｂ’）２抗ＦｃＲＩＩＩ（３Ｇ８）の遮断により前処理し、洗浄したうえ、これを使用して緩衝液（□）又は抗ＣＨＩＰＳ ＩｇＧ（○）中においてＣＨＩＰＳで刺激した。曝露後、細胞を蛍光標識された抗ＣＤ１１ｂ ｍＡｂと共に氷上でインキュベートし、細胞の活性化レベルを測定した。データは緩衝液のみ（ＣＨＩＰＳ又はＩｇＧなし）のなかの細胞のＣＤ１１ｂ発現の相対値として表され、平均値±ＳＥＭ（ｎ≧３）として示される。
【図１２】ＣＨＩＰＳ及びアラニン置換突然変異体により生体外で誘導された全血好中球上での相対的なＣＤ１１ｂ発現。健常ボランティア由来のＥＤＴＡ血を野生型ＣＨＩＰＳ（ＣＨＩＰＳwt）、４６位のアルギニンをアラニンに置換した突然変異体（ＣＨＩＰＳR46A）及び６９位のリジンをアラニンに置換した突然変異体（ＣＨＩＰＳK69A）に濃度を増加させながら曝露した。ＣＤ１１ｂ発現を氷上での特異的ｍＡｂにより測定し、データは緩衝液のみの細胞の相対値として平均値±ＳＥＭ（ｎ≧３）で表された。
【図１３】特異的抗ＣＨＩＰＳ ＩｇＧ力価と生体外での全血好中球の最大刺激に必要なＣＨＩＰＳの量との間の相関。健常ボランティア由来のＥＤＴＡ血を、濃度を増加させながらＣＨＩＰＳに曝露し、ＣＤ１１ｂ発現を細胞活性化の指標として計測した。ＩｇＧ抗ＣＨＩＰＳ力価をＥＬＩＳＡにより測定し、０．３００の吸光度を与える対数血清希釈として定義した。式ｙ＝切片＋傾き×ｌｎ（ｘ）を用いて回帰分析を行った。
【図１４】ＣＨＩＰＳ31-113はＣ５ａ誘導性細胞活性化を阻害する。Fluo-3標識Ｕ９３７／Ｃ５ａＲ細胞を緩衝液又は１μｇ・ｍＬ-1のＣＨＩＰＳ（ＣＨＩＰＳwt）又はトランケート型ＣＨＩＰＳ（ＣＨＩＰＳ31-121及びＣＨＩＰＳ31-113）と共にインキュベートした。細胞は種々の濃度のＣ５ａで刺激し、細胞活性化を表す蛍光の増加をフローサイトメーターで計測した。
【図１５】アフィニティー精製α−ＣＨＩＰＳ抗体をＣＨＩＰＳ由来ペプチドを結合するその能力について試験した。５０μＬのＣＨＩＰＳ（１μｇ・ｍＬ-1）又はＣＨＩＰＳ由来ペプチド（１０μＭ）を９６ウェル・マイクロタイター・プレートにコーティングした。プレートを５％ＢＳＡでブロッキングし、アフィニティー精製α−ＣＨＩＰＳ抗体と共にインキュベートした。結合した抗体を、ペルオキシダーゼ・コンジュゲート・ヤギ−α−ヒト−ＩｇＧによりＴＭＢを基質として検出した。
【図１６Ａ】種々のアフィニティー精製α−ＣＨＩＰＳ抗体を、ＣＨＩＰＳ又はトランケート型ＣＨＩＰＳ変異体と相互作用するその能力についてＥＬＩＳＡにより試験した。１μｇ・ｍＬ-1のＣＨＩＰＳ又はトランケート型ＣＨＩＰＳを９６ウェル・マイクロタイター・プレートにコーティングした。ウェルを洗浄し、種々の濃度のアフィニティー精製抗体と共にインキュベートした。種特異的ペルオキシダーゼ・コンジュゲート・ヤギＩｇＧ及びＴＭＢを使用して結合した抗体を検出した。ＣＨＩＰＳ特異的マウスモノクローナル抗体（２Ｇ８）を対照として使用した。
【図１６Ｂ】種々のアフィニティー精製α−ＣＨＩＰＳ抗体を、ＣＨＩＰＳ又はトランケート型ＣＨＩＰＳ変異体と相互作用するその能力についてＥＬＩＳＡにより試験した。１μｇ・ｍＬ-1のＣＨＩＰＳ又はトランケート型ＣＨＩＰＳを９６ウェル・マイクロタイター・プレートにコーティングした。ウェルを洗浄し、種々の濃度のアフィニティー精製抗体と共にインキュベートした。種特異的ペルオキシダーゼ・コンジュゲート・ヤギＩｇＧ及びＴＭＢを使用して結合した抗体を検出した。ＣＨＩＰＳ特異的マウスモノクローナル抗体（２Ｇ８）を対照として使用した。
【図１６Ｃ】種々のアフィニティー精製α−ＣＨＩＰＳ抗体を、ＣＨＩＰＳ又はトランケート型ＣＨＩＰＳ変異体と相互作用するその能力についてＥＬＩＳＡにより試験した。１μｇ・ｍＬ-1のＣＨＩＰＳ又はトランケート型ＣＨＩＰＳを９６ウェル・マイクロタイター・プレートにコーティングした。ウェルを洗浄し、種々の濃度のアフィニティー精製抗体と共にインキュベートした。種特異的ペルオキシダーゼ・コンジュゲート・ヤギＩｇＧ及びＴＭＢを使用して結合した抗体を検出した。ＣＨＩＰＳ特異的マウスモノクローナル抗体（２Ｇ８）を対照として使用した。
【図１７】ヒト・アフィニティー精製α−ＣＨＩＰＳ31-113−ＩｇＧの抗ファージ反応性。maxisorb９６ウェル・プレートを、ＣＨＩＰＳを発現するＭ１３ファージ、野生型ファージ又は緩衝液でコーティングすることにより、ヒト・アフィニティー精製α−ＣＨＩＰＳ31-113−ＩｇＧの反応性について試験した。データは、抗体調製物が発現したＣＨＩＰＳタンパク質のみと反応し、野生型ファージとは反応しないことを示す。
【図１８Ａ】ＣＨＩＰＳ分子の表面上にマッピングされた立体構造依存性エピトープ。
【図１８Ｂ】ＣＨＩＰＳ分子の表面上にマッピングされた立体構造依存性エピトープ。
【図１８Ｃ】ＣＨＩＰＳ分子の表面上にマッピングされた立体構造依存性エピトープ。
【図１８Ｄ】ＣＨＩＰＳ分子の表面上にマッピングされた立体構造依存性エピトープ。
【図１９Ａ】選択されたファージの特性決定。８個の種々のファージをアフィニティー精製α−ＣＨＩＰＳ31-113ＩｇＧを結合するその能力について試験した。１００μｇ・ｍＬ-1のアフィニティー精製α−ＣＨＩＰＳ31-113ＩｇＧを９６ウェルＥＬＩＳＡプレートにコーティングした。種々の希釈の増幅されたファージ・ストックをコーティングしたプレートと共にインキュベートした。結合したファージをα−Ｍ１３ｍＡｂを使用して検出した。選択されたファージはアフィニティー精製α−ＣＨＩＰＳ31-113ＩｇＧと結合できた。
【図１９Ｂ】選択されたファージの特性決定。８個の種々のファージをアフィニティー精製α−ＣＨＩＰＳ31-113ＩｇＧを結合するその能力について試験した。１００μｇ・ｍＬ-1のＢＳＡを９６ウェルＥＬＩＳＡプレートにコーティングした。種々の希釈の増幅されたファージ・ストックをコーティングしたプレートと共にインキュベートした。結合したファージをα−Ｍ１３ｍＡｂを使用して検出した。選択されたファージはＢＳＡとは結合できなかった。
【図２０Ａ】アフィニティー精製抗体及びＩＶＩｇＧのＣＨＩＰＳタンパク質及び合成ペプチドに対する結合性。マッピングされたエピトープ配列を含んでなるとともに追加的なＧＧＧＣ［配列番号３］スペーサー及びＣＨＩＰＳのＮ末端（ｐｅｐ１−３８）に由来する合成ペプチドを含む７ｍｅｒのペプチドを使用してヒトＩｇＧをアフィニティー精製した。アフィニティー精製α−ペプチド抗体調製物（１０μｇ・ｍＬ-1）を、ＣＭ５センサー・チップの表面に共有結合した個々のペプチド及び野生型ＣＨＩＰＳに結合するその能力について試験した。ＳＰＲ応答を固定化リガンドの量及びサイズについて補正した。黒いバーは種々のアフィニティー精製抗体の結合を表す。白いバーは１ｍｇ・ｍＬ-1のＣＨＩＰＳと共にプレインキュベートした抗体の結合を示す。
【図２０Ｂ】アフィニティー精製抗体及びＩＶＩｇＧのＣＨＩＰＳタンパク質及び合成ペプチドに対する結合性。マッピングされたエピトープ配列を含んでなるとともに追加的なＧＧＧＣ［配列番号３］スペーサー及びＣＨＩＰＳのＮ末端（ｐｅｐ１−３８）に由来する合成ペプチドを含む７ｍｅｒのペプチドを使用してヒトＩｇＧをアフィニティー精製した。アフィニティー精製α−ペプチド抗体調製物（１０μｇ・ｍＬ-1）を、ＣＭ５センサー・チップの表面に共有結合した個々のペプチド及び野生型ＣＨＩＰＳに結合するその能力について試験した。ＳＰＲ応答を固定化リガンドの量及びサイズについて補正した。黒いバーは種々のアフィニティー精製抗体の結合を表す。白いバーは１ｍｇ・ｍＬ-1のＣＨＩＰＳと共にプレインキュベートした抗体の結合を示す。
【図２０Ｃ】アフィニティー精製抗体及びＩＶＩｇＧのＣＨＩＰＳタンパク質及び合成ペプチドに対する結合性。マッピングされたエピトープ配列を含んでなるとともに追加的なＧＧＧＣ［配列番号３］スペーサー及びＣＨＩＰＳのＮ末端（ｐｅｐ１−３８）に由来する合成ペプチドを含む７ｍｅｒのペプチドを使用してヒトＩｇＧをアフィニティー精製した。アフィニティー精製α−ペプチド抗体調製物（１０μｇ・ｍＬ-1）を、ＣＭ５センサー・チップの表面に共有結合した個々のペプチド及び野生型ＣＨＩＰＳに結合するその能力について試験した。ＳＰＲ応答を固定化リガンドの量及びサイズについて補正した。黒いバーは種々のアフィニティー精製抗体の結合を表す。白いバーは１ｍｇ・ｍＬ-1のＣＨＩＰＳと共にプレインキュベートした抗体の結合を示す。
【図２０Ｄ】アフィニティー精製抗体及びＩＶＩｇＧのＣＨＩＰＳタンパク質及び合成ペプチドに対する結合性。マッピングされたエピトープ配列を含んでなるとともに追加的なＧＧＧＣ［配列番号３］スペーサー及びＣＨＩＰＳのＮ末端（ｐｅｐ１−３８）に由来する合成ペプチドを含む７ｍｅｒのペプチドを使用してヒトＩｇＧをアフィニティー精製した。アフィニティー精製α−ペプチド抗体調製物（１０μｇ・ｍＬ-1）を、ＣＭ５センサー・チップの表面に共有結合した個々のペプチド及び野生型ＣＨＩＰＳに結合するその能力について試験した。ＳＰＲ応答を固定化リガンドの量及びサイズについて補正した。黒いバーは種々のアフィニティー精製抗体の結合を表す。白いバーは１ｍｇ・ｍＬ-1のＣＨＩＰＳと共にプレインキュベートした抗体の結合を示す。
【図２０Ｅ】アフィニティー精製抗体及びＩＶＩｇＧのＣＨＩＰＳタンパク質及び合成ペプチドに対する結合性。マッピングされたエピトープ配列を含んでなるとともに追加的なＧＧＧＣ［配列番号３］スペーサー及びＣＨＩＰＳのＮ末端（ｐｅｐ１−３８）に由来する合成ペプチドを含む７ｍｅｒのペプチドを使用してヒトＩｇＧをアフィニティー精製した。アフィニティー精製α−ペプチド抗体調製物（１０μｇ・ｍＬ-1）を、ＣＭ５センサー・チップの表面に共有結合した個々のペプチド及び野生型ＣＨＩＰＳに結合するその能力について試験した。ＳＰＲ応答を固定化リガンドの量及びサイズについて補正した。黒いバーは種々のアフィニティー精製抗体の結合を表す。白いバーは１ｍｇ・ｍＬ-1のＣＨＩＰＳと共にプレインキュベートした抗体の結合を示す。
【図２０Ｆ】アフィニティー精製抗体及びＩＶＩｇＧのＣＨＩＰＳタンパク質及び合成ペプチドに対する結合性。マッピングされたエピトープ配列を含んでなるとともに追加的なＧＧＧＣ［配列番号３］スペーサー及びＣＨＩＰＳのＮ末端（ｐｅｐ１−３８）に由来する合成ペプチドを含む７ｍｅｒのペプチドを使用してヒトＩｇＧをアフィニティー精製した。アフィニティー精製α−ペプチド抗体調製物（１０μｇ・ｍＬ-1）を、ＣＭ５センサー・チップの表面に共有結合した個々のペプチド及び野生型ＣＨＩＰＳに結合するその能力について試験した。ＳＰＲ応答を固定化リガンドの量及びサイズについて補正した。黒いバーは種々のアフィニティー精製抗体の結合を表す。白いバーは１ｍｇ・ｍＬ-1のＣＨＩＰＳと共にプレインキュベートした抗体の結合を示す。
【図２１】ＣＨＩＰＳペプチドＥＬＩＳＡ：標準曲線
【図２２】抗ＣＨＩＰＳ ＥＬＩＳＡ：ＣＨＩＰＳwt標準曲線
【図２３】抗ＣＨＩＰＳ ＥＬＩＳＡ：ＣＨＩＰＳK69A吸光度
【図２４】抗ＣＨＩＰＳ ＥＬＩＳＡ：ＣＨＩＰＳK69A結合
【図２５】発現ＥＬＩＳＡ：ＣＨＩＰＳwt標準曲線
【図２６】抗ＣＨＩＰＳ ＥＬＩＳＡにより計測したときの例示的ＣＨＩＰＳ突然変異体のヒト抗ＣＨＩＰＳ抗体との結合（配列の詳細については実施例Ｅを参照）。
【図２７】阻害ＥＬＩＳＡにより計測したときの野生型ＣＨＩＰＳタンパク質との競合における例示的ＣＨＩＰＳ突然変異体のヒト抗ＣＨＩＰＳ抗体との結合（配列の詳細については実施例Ｅを参照）。
【図２８Ａ】配列番号１のアミノ酸３１〜１１３に基づく例示的ＣＨＩＰＳ突然変異体によるＵ９３７細胞のＣ５ａＲの阻害。
【図２８Ｂ】配列番号１のアミノ酸３１〜１１３に基づく例示的ＣＨＩＰＳ突然変異体による好中球のＣ５ａＲの阻害。
【０３３１】
【表２２】
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【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図４−４】
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【図４−５】
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【図４−６】
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【図５Ａ−１】
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【図５Ａ−２】
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【図５Ａ−３】
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【図５Ａ−４】
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【図５Ａ−５】
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【図５Ａ−６】
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【図５Ｂ−１】
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【図５Ｂ−２】
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【図５Ｂ−３】
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【図５Ｂ−４】
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【図５Ｂ−５】
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【図５Ｂ−６】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ−１】
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【図９Ａ−２】
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【図９Ａ−３】
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【図９Ａ−４】
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【図９Ａ−５】
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【図９Ａ−６】
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【図９Ｂ−１】
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【図９Ｂ−２】
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【図９Ｂ−３】
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【図９Ｂ−４】
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【図９Ｂ−５】
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【図９Ｂ−６】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１８Ｄ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２０Ｄ】
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【図２０Ｅ】
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【図２０Ｆ】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【配列表】
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