(57)【要約】【課題】ｆＸａ阻害剤の抗凝血活性を実質的中和する点で、ならびに過量のｆＸａ阻害剤に関する事象の際に凝血プロセスを開始させる点で有効であり、効率のよい、改善された解毒剤を提供する。【解決手段】本発明は、第Ｘａ因子阻害剤での抗凝固療法を受けている被験体における出血を予防または低減するために、血液凝固剤と併用で第Ｘａ因子（ｆＸａ）誘導体を使用する方法に関する。本発明は、前記ｆＸａ誘導体と前記血液凝固剤とを含む組成物にも関する。前記ｆＸａ誘導体は、低減された内因性凝血促進活性を有し、または内因性凝血促進活性を有さず、ｆＸａ阻害剤を結合および／または中和することができ、ならびに集合してプロトロンビナーゼ複合体を構築しない。前記血液凝固剤は、凝血促進活性、抗血栓溶解活性、および／または抗線維素溶解活性を有する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書中に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
この出願は、２００８年１１月１４日に出願された米国仮特許出願第６１／１１４，９４８号（これは、その全体が参考として本明細書に援用される）の利益を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、第Ｘａ因子阻害剤での抗凝固療法を受けている被験体における出血を予防または低減するために、血液凝固剤と併用で第Ｘａ因子（ｆＸａ）誘導体を使用する方法に関する。本発明は、前記ｆＸａ誘導体と前記血液凝固剤とを含む組成物にも関する。前記ｆＸａ誘導体は、低減された内因性凝血促進活性を有し、または内因性凝血促進活性を有さず、ｆＸａ阻害剤を結合および／または中和することができ、ならびに集合してプロトロンビナーゼ複合体を構築しない。前記血液凝固剤は、凝血促進活性、抗血栓溶解活性、および／または抗線維素溶解活性を有する。
【背景技術】
【０００３】
抗凝血剤は、不動期間または医療手術を受けている期間に限った、例えば凝固障害を有する患者などの血餅を形成する傾向のある患者における望ましくない血栓症の処置または予防に関する市場における要求に役立つ。しかし、抗凝固療法の主な制限の１つは、その処置に随伴する出血の危険性であり、および過剰投与の際にまたは緊急外科手術手技が求められる場合にその抗凝血活性を急速に逆転する能力に制限があることである。それ故、すべての形態の抗凝固療法に対して特異的で有効な解毒剤は、非常に望ましい。安全性を考慮して、新たな抗凝血薬の開発の中で凝血剤と解毒剤のペアを得ることも有利である。
【０００４】
過剰凝血に現在利用できる抗凝血剤−解毒剤ペアは、ヘパリン−プロタミンおよびワルファリン−ビタミンＫである。大きな外傷または重篤な出血（ｈｅｍｏｒｒｈａｇｅ）で苦しんでいる、低分子量ヘパリン処置を受けている患者には、非特異的解毒剤として、新鮮凍結血漿および組換え型第ＶＩＩａ因子（ｒｆＶＩＩａ）も使用されている。（非特許文献１）。ヘパリンまたは低分子量ヘパリン解毒剤としてプロタミンフラグメント（特許文献１）および短鎖合成ペプチド（特許文献２）；およびトロンビン阻害剤に対する解毒剤としてトロンビンムテイン（特許文献３）も報告されている。プロトロンビン中間体および誘導体がヒルジンおよび合成トロンビン阻害剤に対する解毒剤として報告されている（特許文献４および特許文献５）。
【０００５】
１つの有望な形態の抗凝固療法は、第Ｘａ因子（ｆＸａ）をターゲットにするものであり、実際に幾つかの直接ｆＸａ阻害剤が、現在、抗凝固療法において使用するための様々な臨床開発段階にある。１つの直接ｆＸａ阻害剤Ｘａｒｅｌｔｏ（商標）（リバロキサバン）は、欧州連合およびカナダにおいて整形外科患者における静脈血栓塞栓症の予防のための臨床使用が認可されている。これらの多くが小分子である。これらの新たなｆＸａ阻害剤は、処置に有望であると証明されているが、特異的で有効な解毒剤が依然として必要とされている。これらのｆＸａ阻害剤で処置された患者において過剰凝血の際または外科手術が必要な際、投与したｆＸａ阻害剤（単数または複数）を実質的に中和するおよび正常な止血を回復させるための薬剤が必要とされるだろう。
【０００６】
現在利用できる薬剤、例えば組換え型第ＶＩＩａ因子（ｒｆＶＩＩａ）、は、機構的制限があり、ｆＸａ阻害剤の逆転に特異的ではないので、臨床家にとって改善された選択肢は非常に望ましい。ヒトを対象とした試験において、ｒｆＶＩＩａは、間接的抗トロンビンＩＩＩ依存性ｆＸａ阻害剤、例えばフォンダパリヌクス（ｆｏｎｄａｐａｒｉｎｕｘ）およびイドラパリヌクス（ｉｄｒａｐａｒｉｎｕｘ）、の効果を逆転するために使用された（Ｂｉｊｓｔｅｒｖｅｌｄ，ＮＲら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，２００２，１０６：２５５０−２５５４；Ｂｉｊｓｔｅｒｖｅｌｄ，ＮＲら，Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊ．ｏｆ  Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ，２００４（１２４）：６５３−６５８）。第ＶＩＩａ因子（ｆＶＩＩａ）の作用機構は、組織因子と共に作用して、血液循環中に存在する第Ｘ因子（ｆＸ）をｆＸａに変換して、患者における正常な止血を回復させるものである。この作用形態は、活性部位指向性ｆＸａ阻害剤を中和するために達成され得るｆＸａの最高潜在濃度がｆＸの循環血漿濃度によって制限されることを必然的に強いる。従って、直接ｆＸａ阻害剤の効果を低減させるためにｒｆＶＩＩａを使用する可能性は、機構的に制限される。ｆＸの循環血漿濃度は、１５０ナノモル（「ｎＭ」）であるので、この方式によって生成されるｆＸａの最大量は、１５０ｎＭであろう。リバロキサバンなどの小分子ｆＸａ阻害剤について報告されている治療濃度（おおよそ６００ｎＭ、Ｋｕｂｉｔｚａ  Ｄ，ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，２００５，６１：８７３−８８０）のほうが、ｒｆＶＩＩａによって生成されるｆＸａの可能量より高い。従って、ｆＸａ阻害剤による治療または超治療レベルの凝血を逆転するためのｒｆＶＩＩａの使用は、不適切なレベルの効力をもたらすであろう。図４に示すように、ｒｆＶＩＩａの使用は、第Ｘａ因子阻害剤ベトリキサバン（下で説明する）の抗凝血活性を中和する効果を制限した。組換え型ｆＶＩＩａは、５０ｎＭから１００ｎＭの用量応答性解毒剤活性を示したが、その効果は１００ｎＭから２００ｎＭの間ではレベル低下した。これは、その解毒剤作用が、その濃度以外の要因によって制限されることを示している。試験したｒｆＶＩＩａ濃度のすべてにおいて、ベトリキサバンは、２５０ｎＭの濃度で約７５％まで、ｆＸａに対する用量応答性阻害を尚、示した。この観察は、ｆＶＩＩａの提案されている作用機構と一致する。これは、ｒｆＶＩＩａ単独では、トロンビン生成およびプロトロンビン活性化のパラメータに対するフォンダパリヌクスの阻害効果を完全に逆転しなかったことを示す研究（Ｇｅｒｏｔｉａｆａｓ，ＧＴら、Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ＆  Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ  ２２０４（９１）：５３１−５３７）によっても裏付けられる。
【０００７】
外因性活性ｆＸａをｒｆＶＩＩａと同様の方法で被験体に直接投与することはできない。その補因子である組織因子がない状態では非常に低い凝血促進活性を有するｒｆＶＩＩａとは異なり、天然ｆＸａは、強力な酵素であり、および血栓症を引き起こす潜在的危険性を有する。このように、ｆＸａ抗凝固療法に対する解毒剤としてのｒｆＶＩＩａまたは活性ｆＸａのいずれかの使用には短所がある。
【０００８】
従って、望ましくない血栓症を引き起こさない、および過量のｆＸａ阻害剤に関する事象においてまたは出血を予防もしくは停止させるために正常な止血を回復させる必要がある事象においてｆＸａ阻害剤の抗凝血活性を実質的に中和する点で有効である、改善された解毒剤が必要とされている。
【０００９】
米国特許出願公開第２００９−００９８１１９号（これは、その全体が参照により本明細書に援用されている）は、低減された内因性凝血促進活性を有するまたは内因性凝血促進活性を有さない、ｆＸａ阻害剤を結合および／または中和できる、ならびに集合してプロトロンビナーゼ複合体を構築しない、ｆＸａタンパク質誘導体が、第Ｘａ因子阻害剤での抗凝固療法を受けている被験体における出血を予防もしくは低減するために有効な解毒剤であり得ることを教示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】米国特許第６，６２４，１４１号明細書
【特許文献２】米国特許第６，２００，９５５号明細書
【特許文献３】米国特許第６，０６０，３００号明細書
【特許文献４】米国特許第５，８１７，３０９号明細書
【特許文献５】米国特許第６，０８６，８７１号明細書
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｌａｕｒｉｔｚｅｎ，Ｂ．ら、Ｂｌｏｏｄ（２００５）６０７Ａ〜６０８Ａ
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
ｆＸａタンパク質誘導体は、低減された内因性凝血促進活性を有する、または内因性凝血促進活性を有さないので、ｆＸａタンパク質誘導体単独では、出血を有効に予防または停止するために抗凝血療法を受けている被験体において凝血プロセスを開始または増進するには、高い用量が必要とされるだろう。従って、ｆＸａ阻害剤の抗凝血活性を実質的中和する点で、ならびに過量のｆＸａ阻害剤に関する事象の際に凝血プロセスを開始させる点で有効であり、効率のよい、改善された解毒剤が必要とされている。
【００１３】
本明細書において言及する任意のおよびすべての出版物、特許、特許出願は、それら全体が参照により本明細書に援用されている。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
第Ｘａ因子（ｆＸａ）阻害剤に対する特異的解毒剤を別の血液凝固剤と一緒に投与することにより、一方もしくは両方の薬剤を治療量以下の用量で投与できること、またはそれらの低減された用量のためにいずれかの薬剤による任意の潜在的副作用を低減できることなどの、相乗または相加効果が生じると考えられる。ｆＸａ阻害剤に対する特異的解毒剤と血液凝固剤または別の解毒剤、例えばヘパリンに対する解毒剤、との併用は、結果として、１）前記特異的解毒剤の有効用量の低減；２）前記血液凝固剤単独で血友病者を処置するためにもしくは出血を緩和するために必要とされる量と比較して、前記血液凝固剤の量の低減；および／または３）前記特異的解毒剤と前記凝血剤の両方の潜在的副作用の低減、を生じさせることができると、さらに考えられる。
【００１５】
血液凝固剤または別の解毒剤、例えばヘパリンに対する解毒剤、の投与と併用でのｆＸａタンパク質の修飾誘導体の投与が、ｆＸａ抗凝血療法を受けている被験体における出血の予防または低減に役立つことを、今般、発見した。
【００１６】
一部の実施形態において、ｆＸａタンパク質の前記修飾誘導体は、集合してプロトロンビナーゼ複合体を構築する点でｆＸａと競合せず、その代り、ｆＸａ阻害剤などの抗凝血剤を結合する、および／または実質的に中和する。解毒剤として有用な前記誘導体は、前記阻害剤に結合する能力を維持しながら内因性凝血促進および抗凝血活性を低減または除去する修飾第Ｘａ因子タンパク質である。一部の実施形態において、前記修飾誘導体は、配列番号１２、１３もしくは１５のアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド、または配列番号１２、１３もしくは１５に対して少なくとも８０％の相同性を有するポリペプチドである。
【００１７】
１つの態様において、前記血液凝固剤は、凝血促進活性、抗血栓溶解活性および／または抗線維素溶解活性を有する。もう１つの態様において、前記血液凝固剤は、血液凝固を開始または増進することができる。もう１つの態様において、前記血液凝固剤は、線維素溶解または血栓溶解を阻害することができる。
【００１８】
凝固因子、該凝固因子に関連したポリペプチド、組換え型凝固因子、およびそれらの組み合わせからなる群より前記血液凝固剤を選択することができると考えられている。血漿由来第ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子、第ＩＸ／ＩＸａ因子、第Ｘ／Ｘａ因子、第ＩＩ／ＩＩａ因子、第ＶＩＩＩ／ＶＩＩＩａ因子、第Ｖ／Ｖａ因子およびそれらの組み合わせからなる群より前記凝固因子を選択することができると、さらに考えられる。組換え型第ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子、第ＩＸ／ＩＸａ因子、第Ｘ／Ｘａ因子、第ＩＩ／ＩＩａ因子、第ＶＩＩＩ／ＶＩＩＩａ因子、第Ｖ／Ｖａ因子およびそれらの組み合わせからなる群より前記組換え型凝固因子を選択することができると、さらに考えられる。
【００１９】
１つの態様において、前記血液凝固剤は、組換え型第ＶＩＩａ因子である場合がある。
【００２０】
前記血液凝固剤は、非特異的抗出血剤（ａｎｔｉ−ｂｌｅｅｄｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）である場合があることも考えられる。吸着性化学薬品（ａｄｓｏｒｂｅｎｔ  ｃｈｅｍｉｃａｌ）、止血剤、トロンビン、フィブリン糊、デスモプレシン、寒冷沈降物および新鮮凍結血漿、凝固因子濃縮物、活性化または非活性化プロトロンビン複合体濃縮物、Ｆｅｉｂａ  Ｖｈ、血小板濃縮物ならびにそれらの組み合わせからなる群より前記血液凝固剤を選択することができると、さらに考えられる。利用できる血液凝固因子のさらなる例は、引用文献Ｂｒｏｏｋｅｒ  Ｍ，Ｒｅｇｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｃｌｏｔｔｉｎｇ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｓ，第８版，Ｗｏｒｌｄ  Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ，２００８（これは、その全体が参照により本明細書に援用されている）において入手することができる。
【００２１】
トロンビン活性化線溶阻害因子（ｔｈｒｏｍｂｉｎ−ａｃｔｉｖａｔａｂｌｅ  ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）（ＴＡＦＩ）、プロテインＣインヒビター（ＰＣＩ）、プロテインＳインヒビター（ＰＳＩ）、アルファ−２抗プラスミン、トラネキサム酸、アミノカプロン酸、アプロチニンおよびそれらの組み合わせからなる群より前記血液凝固剤を選択することができることも考えられる。
【００２２】
前記ｆＸａ誘導体と併用で投与される他の解毒剤は、ヘパリンまたはヘパリン様薬物に対する解毒剤であり得ると、さらに考えられる。１つの実施形態において、前記他の解毒剤は、例えば、プロタミンまたは新規サリチルアミド（ｓｌｉｃｙｌａｍｉｄｅ）誘導体、例えばＰＭＸ６０１０２、ＰＭＸ６０１２６、ＰＭＸ６０１３８およびＰＭＸ６０１００であり得るが、これらに限定されない。
【００２３】
１つの態様では、前記ｆＸａ阻害剤を、フォンダパリヌクス、イドラパリヌクス、ビオチン化イドラパリヌクス、エノキサパリン（ｅｎｏｘａｐａｒｉｎ）、フラグミン（ｆｒａｇｍｉｎ）、ＮＡＰ−５、ｒＮＡＰｃ２、組織因子経路阻害剤、ヘパリン、低分子量ヘパリン、ＤＸ−９０６５ａ、ＹＭ−６０８２８、ＹＭ−１５０、アピキサバン（ａｐｉｘａｂａｎ）、リバロキサバン（ｒｉｖａｒｏｘａｂａｎ）、ベトリキサバン（ｂｅｔｒｉｘａｂａｎ）、ＰＤ−３４８２９２、オタミキサバン（ｏｔａｍｉｘａｂａｎ）、ＤＵ−１７６ｂ、ＬＹ５１７７１７、ＧＳＫ９１３８９３およびそれらの組み合わせからなる群より選択することができる。
【００２４】
本発明の１つの態様は、第Ｘａ因子阻害剤での過剰抗凝血療法を受けたまたは受けている患者を処置するための、前記第Ｘａ因子誘導体および前記血液凝固剤または他の解毒剤（ヘパリンおよびヘパリン様薬物に対する解毒剤を含む）ならびにそれらを含有する組成物の使用である。前記方法は、第Ｘａ因子阻害剤を以前に投与されたことがある、それ故、止血、例えば予定または緊急外科手術によって必要とされる止血、を必要とする、患者にも有用である。１つの態様において、前記修飾ｆＸａタンパク質は、それらが低減された内因性凝血促進活性を有し、またはそれらに内因性凝血活性がなく、止血の際に生理的ｆＸａ機能に干渉しないであろうが、ｆＸａ阻害剤を結合するおよび実質的に中和することが依然としてできるという点で、自然に存在するｆＸａとは区別される。
【００２５】
１つの態様において、前記ｆＸａタンパク質誘導体は前記血液凝固剤の投与の前に投与される。もう１つの態様において、前記ｆＸａタンパク質誘導体は、前記血液凝固剤の投与の後に投与される。さらにもう１つの態様において、前記ｆＸａタンパク質誘導体は、前記血液凝固剤と同時に投与される、すなわち併用投与される。
【００２６】
もう１つの態様において、前記修飾第Ｘａ因子タンパク質は、該第Ｘａ因子誘導体の血漿半減期（または循環半減期）を延長することができる薬剤と、併用投与される。さらにもう１つの態様では、前記解毒剤を、その血漿半減期を延長する部分と結合体化させる。
【００２７】
前記第Ｘａ因子誘導体と血液凝固剤または別の解毒剤、例えばヘパリン解毒剤、とを含有する薬学的組成物も提供する。一部の実施形態において、前記誘導体は、配列番号１２、１３もしくは１５のアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド、または配列番号１２、１３もしくは１５に対して少なくとも８０％の相同性を有するポリペプチドである。前記薬学的組成物は、薬学的に許容される担体を場合により含む。
【００２８】
１つの態様において、本発明は、ｆＸａ誘導体と血液凝固剤または別の解毒剤とを含むキットを提供する。もう１つの態様において、本発明は、抗凝血剤用のｆＸａ阻害剤と、前記ｆＸａ阻害剤の抗凝血活性の実質的中和が必要とされるときに使用するためのｆＸａ阻害剤解毒剤／血液凝固剤（または第Ｘａ因子誘導体／血液凝固剤）とを含むキットを提供する。
【００２９】
前記組成物または方法が、前記単離されたポリペプチドのペプチド結合体であって、直前に記載したポリペプチドに共有結合によりまたは非共有結合により連結されている担体を含むものであるペプチド結合体をさらに含むことがあることを、本明細書にさらに提供する。前記担体は、リポソーム、ミセル、薬学的に許容されるポリマー、または薬学的に許容される担体であり得る。
【００３０】
本明細書の残りの部分のいたるところで、本発明の追加の実施形態を見つけることができる。
したがって、本発明は、以下の項目を提供する：
（項目１）  第Ｘａ因子（ｆＸａ）阻害剤での抗凝固療法を受けている被験体における出血を予防または低減するための方法であって、該ｆＸａ阻害剤に結合するが集合してプロトロンビナーゼ複合体を構築しないｆＸａタンパク質誘導体と血液凝固剤またはヘパリン解毒剤とを該被験体に投与することを含む、方法。
（項目２）  ｆＸａ阻害剤での抗凝固療法を受けている被験体における出血を予防または低減するための方法であって、配列番号１２、１３もしくは１５のアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド、または配列番号１２、１３もしくは１５に対して少なくとも８０％の相同性を有するポリペプチドと、血液凝固剤またはヘパリン解毒剤とを該被験体に投与することを含む、方法。
（項目３）  上記誘導体が、ｆＸａ阻害剤に直接または間接的に結合する、項目１に記載の方法。
（項目４）  上記誘導体が、低減された凝血促進活性を有する、または凝血促進活性を有さない、項目３に記載の方法。
（項目５）  上記誘導体が、Ｇｌａ欠損ｆＸａタンパク質誘導体またはｄｅｓ−Ｇｌａ  ｆＸａタンパク質である、項目３に記載の方法。
（項目６）  上記誘導体が、修飾された活性部位を有する、項目３に記載の方法。
（項目７）  上記誘導体が、配列番号３の少なくともアミノ酸残基４６から４４８またはその等価物を含む、項目４に記載の方法。
（項目８）  上記誘導体が、配列番号３の少なくともアミノ酸残基４６から１３９および１９５から４４８またはその等価物を含む、項目３に記載の方法。
（項目９）  上記誘導体が、ｆＸａの軽鎖を欠き、かつ重鎖内に存在するセリンプロテアーゼ触媒ドメインを含有する、項目３に記載の方法。
（項目１０）  上記誘導体が、配列番号５のアミノ酸配列を含むポリペプチドである、項目３に記載の方法。
（項目１１）  上記誘導体が、タンパク質分解活性を欠くが結合に必要な構造的特徴を維持するように場合により化学修飾または組換え修飾された触媒ドメインを含み、該ドメインが、
ａ．血漿カリクレイン、トロンビンおよびトリプシンからなる群より選択される哺乳動物プロテアーゼ；または
ｂ．細菌プロテアーゼ・サブチリシン
、のいずれかに由来する、項目３に記載の方法。
（項目１２）  上記誘導体が、修飾された軽鎖を有する配列番号７のアミノ酸配列またはその等価物を含む、項目３に記載の方法。
（項目１３）  上記修飾された軽鎖が、野生型ヒト第Ｘａ因子タンパク質のＧｌａドメインと比較して、Ｇｌａドメイン内での少なくとも１つのアミノ酸置換、付加または欠失を含む、項目１２に記載の方法。
（項目１４）  上記誘導体が、未カルボキシル化（ｕｎｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅｄ）、低カルボキシル化（ｕｎｄｅｒｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅｄ）、および脱カルボキシル化（ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅｄ）第Ｘａ因子タンパク質からなる群より選択される、項目３に記載の方法。
（項目１５）  上記誘導体が、修飾されている配列番号７の重鎖またはその等価物を含む、項目３に記載の方法。
（項目１６）  上記誘導体が、Ｇｌｕ２１６、Ｇｌｕ２１８、Ａｒｇ３３２、Ａｒｇ３４７、Ｌｙｓ３７１およびＳｅｒ３７９からなる群より選択されるアミノ酸の少なくとも１つのアミノ酸置換によって修飾されている、項目１５に記載の方法。
（項目１７）  上記誘導体が、配列番号１０のアミノ酸配列またはその等価物を有するｄｅｓ−Ｇｌａ  ａｎｈｙｄｒｏ−ｆＸａである、項目３に記載の方法。
（項目１８）  上記誘導体が、配列番号１１のアミノ酸配列またはその等価物を有するｄｅｓ−Ｇｌａ  ｆＸａ−Ｓ３７９Ａである、項目３に記載の方法。
（項目１９）  上記誘導体が、ＡＴＩＩＩ、補因子ｆＶ／ｆＶａおよび／またはｆＶＩＩＩ／ｆＶＩＩＩａとの低減された相互作用を有し、ならびに配列番号７のアミノ酸配列またはその等価物を含む、項目１２に記載の方法。
（項目２０）  上記誘導体が、アミノ酸位置Ａｒｇ３０６、Ｇｌｕ３１０、Ａｒｇ３４７、Ｌｙｓ３５１、Ｌｙｓ４１４またはＡｒｇ４２４での少なくとも１つのアミノ酸置換を有する、項目１９に記載の方法。
（項目２１）  上記誘導体が、ＥＧＦドメイン内に修飾を有し、該修飾が、ＥＧＦ１ドメインの欠失、ＥＧＦ２ドメインの欠失、およびＥＧＦ１ドメインとＥＧＦ２ドメインの両方の欠失からなる群より選択される、項目３に記載の方法。
（項目２２）  上記血液凝固剤が、血液凝固を開始もしくは増進する、または線維素溶解もしくは血栓症を阻害する、項目１または項目２に記載の方法。
（項目２３）  上記血液凝固剤が、凝血促進活性、抗血栓溶解活性、および／または抗線維素溶解活性を有する、項目１または項目２に記載の方法。
（項目２４）  上記血液凝固剤が、凝固因子、該凝固因子に関連したポリペプチド、組換え型凝固因子、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、項目１または項目２に記載の方法。
（項目２５）  上記凝固因子が、血漿由来第ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子、第ＩＸ／ＩＸａ因子、第Ｘ／Ｘａ因子、第ＩＩ／ＩＩａ因子、第ＶＩＩＩ／ＶＩＩＩａ因子、第Ｖ／Ｖａ因子およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、項目２４に記載の方法。
（項目２６）  上記組換え型凝固因子が、組換え型第ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子、第ＩＸ／ＩＸａ因子、第Ｘ／Ｘａ因子、第ＩＩ／ＩＩａ因子、第ＶＩＩＩ／ＶＩＩＩａ因子、第Ｖ／Ｖａ因子およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、項目２４に記載の方法。
（項目２７）  上記組換え型凝固因子が、組換え型第ＶＩＩａ因子である、項目２６に記載の方法。
（項目２８）  上記血液凝固剤が、非特異的抗出血剤である、項目２３に記載の方法。
（項目２９）  上記非特異的抗出血剤が、吸着性化学薬品、止血剤、トロンビン、フィブリン糊、デスモプレシン、寒冷沈降物および新鮮凍結血漿、凝固因子濃縮物、活性化または非活性化プロトロンビン複合体濃縮物、Ｆｅｉｂａ  Ｖｈ、血小板濃縮物ならびにそれらの組み合わせからなる群より選択される、項目２８に記載の方法。
（項目３０）  上記血液凝固剤が、トロンビン活性化線溶阻害因子（ＴＡＦＩ）、プロテインＣインヒビター（ＰＣＩ）、プロテインＳインヒビター（ＰＳＩ）、アルファ−２抗プラスミン、トラネキサム酸、アミノカプロン酸、アプロチニンおよびそれらの組み合わせからなる群より選択される、項目１または項目２に記載の方法。
（項目３１）  上記ヘパリン解毒剤が、プロタミン（ｐｒｏｔａｍｉｅ）、ＰＭＸ  ６０１０２、ＰＭＸ  ６０１２６、ＰＭＸ  ６０１３８、ＰＭＸ  ６０１００、ＰＭＸ  ６００５６、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、項目１または項目２に記載の方法。
（項目３２）  上記ｆＸａタンパク質誘導体が、治療有効量でまたは治療有効量以下の量で投与される、項目１に記載の方法。
（項目３３）  上記単離されたポリペプチドが、治療有効量でまたは治療有効量以下の量で投与される、項目２に記載の方法。
（項目３４）  上記血液凝固剤またはヘパリン解毒剤が、治療有効量でまたは治療有効量以下の量で投与される、項目３２または項目３３に記載の方法。
（項目３５）  上記ｆＸａタンパク質誘導体に共有結合によりまたは非共有結合により連結された担体を含むペプチド結合体をさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目３６）  上記担体が、リポソーム、ミセル、薬学的に許容されるポリマーおよび薬学的に許容される担体からなる群より選択される、項目３４に記載の方法。
（項目３７）  上記ｆＸａ阻害剤が、フォンダパリヌクス、イドラパリヌクス、ビオチン化イドラパリヌクス、エノキサパリン、フラグミン、ＮＡＰ−５、ｒＮＡＰｃ２、組織因子経路阻害剤、ヘパリン、低分子量ヘパリン、ＤＸ−９０６５ａ、ＹＭ−６０８２８、ＹＭ−１５０、アピキサバン、リバロキサバン、ベトリキサバン、ＰＤ−３４８２９２、オタミキサバン、ＤＵ−１７６ｂ、ＬＹ５１７７１７、ＧＳＫ９１３８９３およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、項目１または項目２に記載の方法。
（項目３８）  上記被験体が、出血（ｈｅｍｏｒｒｈａｇｅ）、生命維持に必要不可欠な器官への出血、再手術または新たな治療手技を必要とする出血、および随伴顕性出血を伴う２．０以上の出血指数からなる群より選択される臨床的大出血事象を経験している、項目１または項目２に記載の方法。
（項目３９）  上記被験体が、持続性または再発性鼻出血、治療手技を必要としない直腸出血または尿路出血、実質的な注射部位血腫、非注射部位の特発性血腫、些細な外傷で発生する血腫、実質的血失、および予定外の輸血を必要とする出血からなる群より選択される出血事象を経験している、項目１または項目２に記載の方法。
（項目４０）  上記ｆＸａタンパク質誘導体が、外科手術前に投与される、項目１に記載の方法。
（項目４１）  上記ポリペプチドが、外科手術前に投与される、項目２に記載の方法。
（項目４２）  上記血液凝固剤またはヘパリン解毒剤が、外科手術前または外科手術中に投与される、項目１または項目２に記載の方法。
（項目４３）  上記ｆＸａタンパク質誘導体が、上記血液凝固剤またはヘパリン解毒剤の投与の前に、該投与の後に、または該投与と同時に投与される、項目１に記載の方法。
（項目４４）  上記ポリペプチドが、上記血液凝固剤の投与の前に、該投与の後に、または該投与と同時に投与される、項目２に記載の方法。
（項目４５）  上記被験体がヒトである、項目１または項目２に記載の方法。
（項目４６）  （ｉ）ｆＸａ阻害剤に結合するが集合してプロトロンビナーゼ複合体を構築しないｆＸａタンパク質誘導体と、（ｉｉ）凝血促進、抗血栓溶解もしくは抗線維素溶解活性を有する血液凝固剤、またはヘパリン解毒剤とを含む、薬学的組成物。
（項目４７）  （ｉ）配列番号１２、１３もしくは１５のアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド、または配列番号１２、１３もしくは１５に対して少なくとも８０％の相同性を有するポリペプチドと、（ｉｉ）血液凝固剤またはヘパリン解毒剤とを含む、薬学的組成物。
（項目４８）  （ｉ）配列番号１３のアミノ酸配列を含む単離された二つの鎖のポリペプチド、または配列番号１３に対して少なくとも８０％の相同性を有するポリペプチドと、（ｉｉ）凝血促進、抗血栓溶解もしくは抗線維素溶解活性を有する血液凝固剤、またはヘパリン解毒剤とを含む、薬学的組成物。
（項目４９）  上記血液凝固剤が、凝固因子、該凝固因子に関連したポリペプチド、組換え型凝固因子およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、項目４６から４８のいずれかに記載の組成物。
（項目５０）  上記凝固因子が、血漿由来第ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子、第ＩＸ／ＩＸａ因子、第Ｘ／Ｘａ因子、第ＩＩ／ＩＩａ因子、第ＶＩＩＩ／ＶＩＩＩａ因子、第Ｖ／Ｖａ因子およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、項目４９に記載の組成物。
（項目５１）  上記組換え型凝固因子が、組換え型第ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子、第ＩＸ／ＩＸａ因子、第Ｘ／Ｘａ因子、第ＩＩ／ＩＩａ因子、第ＶＩＩＩ／ＶＩＩＩａ因子、第Ｖ／Ｖａ因子およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、項目４８に記載の組成物。
（項目５２）  上記血液凝固剤が、非特異的抗出血剤である、項目４６から４８のいずれかに記載の組成物。
（項目５３）  上記非特異的抗出血剤が、吸着性化学薬品、止血剤、トロンビン、フィブリン糊、デスモプレシン、寒冷沈降物および新鮮凍結血漿、凝固因子濃縮物、活性化または非活性化プロトロンビン複合体濃縮物、Ｆｅｉｂａ  Ｖｈ、血小板濃縮物ならびにそれらの組み合わせからなる群より選択される、項目５２に記載の組成物。
（項目５４）  上記血液凝固剤が、ＴＡＦＩ、ＰＣＩ、ＰＳＩ、アルファ−２抗プラスミン、トラネキサム酸、アミノカプロン酸、アプロチニンおよびそれらの組み合わせからなる群より選択される、項目４６から４８のいずれかに記載の組成物。
（項目５５）  上記ヘパリン解毒剤が、プロタミン（ｐｒｏｔａｍｉｅ）、ＰＭＸ  ６０１０２、ＰＭＸ  ６０１２６、ＰＭＸ  ６０１３８、ＰＭＸ  ６０１００、ＰＭＸ  ６００５６、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、項目４６から４８のいずれかに記載の組成物。
（項目５６）  薬学的に許容される担体をさらに含む、項目４６から４８のいずれかに記載の組成物。
（項目５７）  ｆＸａ阻害剤での抗凝固療法を受けている被験体における出血を予防または低減するための方法であって、項目４６から４８のいずれかに記載の組成物の有効量を該被験体に投与することを含む、方法。
（項目５８）  ａ）ｆＸａ阻害剤に結合するが集合してプロトロンビナーゼ複合体を構築しないｆＸａタンパク質誘導体と、ｂ）血液凝固剤またはヘパリン解毒剤とを含む、キット。
（項目５９）  ａ）配列番号１２、１３もしくは１５のアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド、または配列番号１２、１３もしくは１５に対して少なくとも８０％の相同性を有するポリペプチドと、ｂ）血液凝固剤またはヘパリン解毒剤とを含む、キット。
（項目６０）  上記血液凝固剤が、凝固因子、該凝固因子に関連したポリペプチド、組換え型凝固因子およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、項目５８または５９のいずれかに記載のキット。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】図１は、Ｌｅｙｔｕｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９８６，２５，５０９８−５１０２に報告されているような表１に示すヒト第Ｘ因子（配列番号１）のドメイン構造を図示するものである。配列番号１は、先行技術分野において公知の表２に示すとおりのヒトｆＸのヌクレオチド配列（配列番号２）によってコードされたヒトｆＸのアミノ酸配列である。例えば、その翻訳アミノ酸配列は、Ｌｅｙｔｕｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９８６，２５，５０９８−５１０２に報告されており、および＜ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ／ｖｉｅｗｅｒ．ｆｃｇｉ？ｄｂ＝ｎｕｃｃｏｒｅ＆ｉｄ＝８９１４２７３１＞におけるＧｅｎＢａｎｋ、「ＮＭ＿０００５０４」において見つけることができる。この配列におけるアミノ酸ナンバリングは、ｆＸ配列に基づく。ヒトｆＸ前駆体（配列番号１）は、プレプロ−はしご配列（配列番号１のアミノ酸１から４０）、続いて、ｆＸ軽鎖（ＬＣ）に対応する配列（配列番号１のアミノ酸４１から１７９）、ｆＸ分泌中に除去されるＲＫＲトリプレット（配列番号１のアミノ酸１８０から１８２）、そして活性化ペプチド（ＡＰ）（配列番号１の１８３から２３４）と触媒ドメイン（配列番号１のアミノ酸２３５から４８８）とを含有するｆＸ重鎖（配列番号１のアミノ酸１８３から４８８）を含有する。
【図２】図２（配列番号３）は、成熟ヒト第Ｘ因子のアミノ酸配列を示すものである。この図におけるアミノ酸ナンバリングは、ｆＸ軽鎖のＮ末端から出発する成熟ｆＸ配列に基づく。第Ｘ因子は、ジスルフィド結合によって連結された二本鎖分子として血漿中で循環する。その軽鎖（ＬＣ）は、１３９アミノ酸（配列番号１のアミノ酸４１から１７９まで）を有し、および短い芳香族スタック（ＡＳ）（配列番号３のアミノ酸４０〜４５）を含む多γ−カルボキシグルタミン酸（Ｇｌａ）ドメイン（配列番号３のアミノ酸１〜４５）、続いて、２つの上皮増殖因子（ＥＧＦ）様ドメイン（ＥＧＦ１：配列番号３のアミノ酸４６〜８４、ＥＧＦ２：配列番号３のアミノ酸８５〜１２８）を含有する。その重鎖（ＨＣ）は、３０６アミノ酸を有し、および５２アミノ酸活性化ペプチド（ＡＰ：配列番号３のアミノ酸１４３〜１９４）、続いて、触媒ドメイン（配列番号３のアミノ酸１９５〜４４８）を含有する。キモトリプシンナンバリングの場合のＨ５７−Ｄ１０２−Ｓ１９５の触媒トライアド等価物が、ｆＸ配列内のＨｉｓ２３６、Ａｓｐ２８２およびＳｅｒ３７９に位置し、下線が引かれている（配列番号３のアミノ酸２３６、２８２および３７９）。
【図３】図３は、図２に示した成熟ヒト第Ｘ因子のドメイン構造を図示するものである。この図におけるアミノ酸ナンバリングは、成熟ｆＸ配列に基づく。Ｇｌａドメイン含有フラグメント（配列番号３のアミノ酸１〜４４）を除去するキモトリプシン消化についての切断部位、および活性化ペプチドを除去するｆＸ活性化についての切断部位が強調表示されている。ｆＸａのキモトリプシン消化は、この１〜４４アミノ酸残基を欠くＧｌａドメインなしｆＸａ（配列番号４）をもたらす。
【図４】図４は、（相対蛍光単位（ＲＦＵ）として表示する）トロンビン生成アッセイ（実施例２において説明するとおり）における、ｆＸａ阻害剤ベトリキサバン（下で説明する）の抗凝血活性に対する、組織因子の存在下での様々な濃度のｒｆＶＩＩａの効果を示すものである。データは、ｒｆＶＩＩａと組織因子の組み合わせが、２００ｎＭ以下のｒＶＩＩａの濃度で、ｆＸａ阻害剤、ベトリキサバン、の抗凝血活性を完全に中和できなかったことを示している。
【図５】図５は、そのＧｌａドメインが損なわれていないアンヒドロ−ｆＸａが、活性ｆＸａとベトリキサバンとを含有する精製された系でのベトリキサバンによってｆＸａ阻害を逆転する（白丸）一方で、単独でのアンヒドロ−ｆＸａが、活性ｆＸａと比較して極わずかな凝血促進活性しか有さない（白三角）ことを示すものである。ｆＸａ発色活性が一切の阻害剤不在下で活性ｆＸａに正規化された（白三角）。実施例４においてより詳細にこのことを説明する。データは、アンヒドロ−ｆＸａが、ｆＸａ基質に対して不活性であるが、ｆＸａ阻害剤結合能力を維持することを示している。
【図６】図６は、図５における損なわれていないＧｌａドメインを有するアンヒドロ−ｆＸａが、（相対蛍光単位（ＲＦＵ）として表示する）血漿トロンビン生成アッセイ（実施例２において説明するとおり）において強力な阻害剤であることを示すものである。それは、約１１５ｎＭでトロンビン生成を完全に阻害した。データは、Ｇｌａドメインの修飾を伴わないアンヒドロ−ｆＸａが、ｆＸａ阻害剤解毒剤としての使用に適さないことを示している。
【図７】図７は、キモトリプシン消化前ならびにキモトリプシン消化の１５分後および３０分後の９６ウエルプレート形式での活性ｆＸａの凝固活性についての比較を示すものである。この図に示されているように、凝固時間（ＯＤ４０５の変化）は、ｆＸａを１５分間キモトリプシンで消化した後、有意に遅延され、およびｆＸａを３０分間キモトリプシンで消化したときは２０分までの間、凝固は観察されなかった。この結果を、アンヒドロ−ｆＸａのキモトリプシン消化のための条件を確立するためにも用いた。それが、消化中にモニターすることができる活性を有さないからである。実施例３においてさらに詳細にこのことを説明する。
【図８】図８は、実施例４において説明するような第Ｘａ因子阻害剤ベトリキサバンに対するｄｅｓ−Ｇｌａ  ａｎｈｙｄｒｏ−ｆＸａの結合親和性を示すものである。データは、Ｇｌａドメイン含有フラグメント（残基１〜４４）を除去する、アンヒドロ−ｆＸａのキモトリプシン消化によって調製された、ｄｅｓ−Ｇｌａ  ａｎｈｙｄｒｏ−ｆＸａが、天然ｆＸａと同様の親和性でベトリキサバンに結合できることを示している（ｆＸａ：Ｋｉ＝０．１２ｎＭ、ｄｅｓ−Ｇｌａ  ａｎｈｙｄｒｏ−ｆＸａ：Ｋｄ＝０．３２ｎＭ）。
【図９】図９は、実施例２のトロンビン発生アッセイにおける６８０ｎＭの濃度の解毒剤（ｄｅｓ−Ｇｌａ  ａｎｈｙｄｒｏ−ｆＸａ）の添加による様々な濃度のベトリキサバンの抗凝血活性の逆転を示すものである。６８０ｎＭの濃度で、ｄｅｓ−Ｇｌａ  ａｎｈｙｄｒｏ−ｆＸａは、ｆＸａ活性の実質的に完全な回復を生じさせることができた。
【図１０】図１０は、（実施例３において説明するような）９６ウエルプレート形式でａＰＴＴ試薬を使用する凝固延長アッセイにおける様々な濃度の解毒剤（ｄｅｓ−Ｇｌａ  ａｎｈｙｄｒｏ−ｆＸａ）による２５０ｎＭのベトリキサバンの抗凝血活性の逆転を示すものである。データは、凝固時間が、約６０８ｎＭのこの解毒剤を使用して２５０ｎＭのｆＸａ阻害剤ベトリキサバンを中和したとき、対照乏血小板血漿のものに匹敵したことを示している。
【図１１】図１１は、正規化後の倍率変化として表示する、９６ウエルプレート形式でａＰＴＴ試薬を使用する凝固延長アッセイにおける５６３ｎＭの解毒剤（ｄｅｓ−Ｇｌａ  ａｎｈｙｄｒｏ−ｆＸａ）によるエノキサパリン（０．３１２５〜１．２５Ｕ／ｍＬ）の抗凝血活性に対する効果を示すものである。実施例３においてこのアッセイプロトコルを説明する。データは、５６３ｎＭの解毒剤の添加が、低分子量ヘパリンエノキサパリンの活性を有意に中和したことを示している。
【図１２】図１２は、発色アッセイにおける、トロンビン（５ｎＭ）の活性に対する解毒剤、ｄｅｓ−Ｇｌａ  ａｎｈｙｄｒｏ−ｆＸａ、の効果、および５０ｎＭのアルガトロバン、特異的トロンビン阻害剤、によるその阻害を示すものである。このｆＸａ阻害剤の解毒剤は、５３８ｎＭまでの濃度で、トロンビン活性にも、特異的阻害剤アルガトロバンによるその阻害にも、検出可能な効果を及ぼさない。実施例１４においてより詳細にこのことを説明する。
【図１３】図１３は、標準的な凝血時間測定器を使用するａＰＴＴアッセイにおける、様々な濃度の解毒剤、ｄｅｓ−Ｇｌａ  ａｎｈｙｄｒｏ−ｆＸａ、による４００ｎＭベトリキサバンの抗凝血活性に対する効果を示すものである。実施例３においてこのアッセイプロトコルを説明する。データは、ｆＸａ阻害剤の解毒剤が、４００ｎＭのベトリキサバンによるｆＸａの阻害を実質的に逆転することを示している。この解毒剤のＥＣ５０は、４００ｎＭベトリキサバンで約６５６ｎＭであると推定された。
【図１４】図１４は、ＣＨＯ細胞におけるｆＸａ三重変異体（配列番号１２）の発現についてのＤＮＡ構築物のマップを示すものである。プラスミドＤＮＡを線形化し、ＣＨＯ  ｄｈｆｒ（−）細胞にトランスフェクトした。テトラヒドロ葉酸塩（ＨＴ）欠失培地＋メトトレキサート（ＭＴＸ）を使用して、細胞を選択した。適するクローンをＥＬＩＳＡによって高タンパク質発現についてスクリーニングした。ｆＸａ三重変異体を無血清培地において生産し、イオン交換カラムとアフィニティーカラムの併用によって精製した。このマップにおけるナンバリングは、ヒトｆＸ配列番号１をコードするポリヌクレオチド配列に基づいた。例えば、活性部位Ｓ４１９（配列番号１）におけるアラニン変異は、本出願およびより詳細には実施例７を通して論ずる成熟ヒトｆＸのＳ３７９（配列番号３）での変異と等価である。ｒ−Ａｎｔｉｔｏｄｅ三重変異体をコードするポリヌクレオチドを構築するために使用したプライマーを表２１に列挙する。
【図１５】図１５Ａは、イオン交換およびアフィニティー精製により精製されたｒ−Ａｎｔｉｄｏｔｅのウエスタンブロットを示すものである。軽鎖と重鎖を接続するジスルフィド結合の還元に基づき、ｒ−Ａｎｔｉｄｏｔｅ重鎖は、血漿由来ｆＸａのものに類似した予想分子量で移動する。ｆＸａ変異体のＧｌａドメインにおける６〜３９ａａの欠失は、結果として、正常なＦＸａと比較して低い分子量のｒ−Ａｎｔｉｄｏｔｅ軽鎖バンドを生じさせる。図１５Ｂおよび１５Ｃは、イオン交換およびアフィニティー精製、その後のサイズ排除クロマトグラフィーによる、精製されたｒ−ＡｎｔｉｄｏｔｅのＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットを示すものである。
【図１６】図１６は、ベトリキサバン（１５ｍｇ／ｋｇ）の経口投与のみの後の、またはベトリキサバン（１５ｍｇ／ｋｇ）の経口投与、その後の実施例１に従って調製した血漿由来解毒剤（ｐｄ−Ａｎｔｉｄｏｔｅ）の静脈内注射（３００μｇ、ＩＶ）後の、マウス（１群につきｎ＝７〜１０）におけるベトリキサバン血漿レベルを示すものである。ｐｄ−Ａｎｔｉｄｏｔｅを１．５時間の時点より５分前に投与し、マウス血液サンプル（０．５ｍＬ）をベトリキサバンの経口投与後１．５、２．０および４．０時間の時点で採取した。全血ＩＮＲ、ベトリキサバンおよび解毒剤血漿レベルを分析した。マウス血漿中のベトリキサバンレベル（平均±標準偏差）を、１５ｍｇ／ｋｇ後のマウス（白四角）および１５ｍｇ／ｋｇ、続いての解毒剤注射の後のマウス（白丸）について時間の関数としてプロットした。１．５時間の時点（解毒剤注射の５分後）の解毒剤処置群のＰＫ−ＰＤ相関を表１３にまとめた。この解毒剤の単回注射は、結果として、ＩＮＲ測定値に基づき機能性ベトリキサバンの＞５０％の減少を生じさせた。実施例８においてより詳細にこのことを説明する。
【図１７】図１７Ａおよび１７Ｂは、精製されたｒ−Ａｎｔｉｄｏｔｅでのマウス実験（１群につきｎ＝４〜１０）の結果を示すものである。マウス血清中（図１７Ａ）および全血ＩＮＲ（図１７Ｂ）のベトリキサバン濃度を、ベトリキサバン（１５ｍｇ／ｋｇ）の経口投与のみの後、またはベトリキサバン（１５ｍｇ／ｋｇ）の経口投与、そのｇのｒ−解毒剤の静脈内注射（３００μｇ）の後で比較した。それぞれの処置群についての平均値を示した。表１４にまとめたように、ｒ−解毒剤の単回ＩＶ注射は、エクスビボ全血ＩＮＲの＞５０％の補正を結果としてもたらした。これは、単回もしくは多回注射または他のレジメ（ｒｅｇｉｍｅｓ）によるこの解毒剤でのｆＸａ阻害の有効な中和を是認する。これらの結果は、本発明のｆＸａ変異体が、出血しているまたは他の医学的緊急事態の患者においてｆＸａ阻害剤の抗凝血効果を逆転する万能解毒剤として作用する可能性があることを明示している。実施例８においてより詳細にこのことを説明する。
【図１８】図１８は、９６ウエル濁度変化凝固アッセイにおけるエノキサパリンの阻害効果のｒ−Ａｎｔｉｄｏｔｅ逆転を示すものである。結果は、ｐｄ−Ａｎｔｉｄｏｔｅ（図１１）と本質的に同様であり、これは、両方のｆＸａ誘導体が匹敵する機能的解毒剤活性を有することを示している。５０ｎＭ  ｒ−Ａｎｔｉｄｏｔｅは、１．２５Ｕ／ｍＬ  エノキサパリンの阻害効果を実質的に（＞７５％）補正した。このアッセイプロトコルを実施例１１に提示する。
【図１９】図１９は、ヒト血漿凝固アッセイにおいて試験したときの低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）の阻害効果のｒ−Ａｎｔｉｄｏｔｅ逆転を示すものである。図１８と１９の両方を実施例１１において論ずる。
【図２０】図２０は、リバロキサバンの抗凝血効果のｒ−Ａｎｔｉｄｏｔｅ逆転を示すものである。実施例１２においてより詳細にこのことを論ずる。
【図２１】図２１は、ｒ−Ａｎｔｉｄｏｔｅのポリヌクレオチド配列と翻訳ポリペプチド配列のアラインメントを示すものである。
【図２２】図２２Ａおよび２２Ｂは、ｒ−解毒剤の単回ＩＶ注射（１回注射）または二回注射（２回注射）でのマウス実験（１群につきｎ＝５、３１２ｕｇ／２００ｕｌ  ｒ−Ａｎｔｉｄｏｔｅ）の結果を示すものである。結晶中のベトリキサバン濃度（図２２Ａ）を、ベトリキサバン（１５ｍｇ／ｋｇ）の経口投与、続いてビヒクルまたはｒ−Ａｎｔｉｄｏｔｅの静脈内注射の後に比較した（詳細については、実施例８を参照のこと）。図２２Ａに示すように、ｒ−Ａｎｔｉｄｏｔｅを単回ＩＶ注射した場合の、血漿中ベトリキサバン濃度は、ビヒクル対照（対照＿１）の８倍以上であった。これは、インビボでベトリキサバンを有効に結合するこの解毒剤の能力を示している。この解毒剤の二回目の注射によるベトリキサバン濃度は、単回注射の２倍に満たなかった。これは、この解毒剤によるマウス血液中のベトリキサバンの量およびその抗凝血効果の制限を示している。図２２Ｂは、この解毒剤の単回および二重注射後、マウス血漿中の解毒剤／ベトリキサバン比が増加するにつれて、ＩＮＲが減少することを明示している。
【図２３】図２３は、トロンビン生成における２５０ｎＭ  ベトリキサバン、ｆＸａ阻害剤、の抗凝血活性に対するｒＶＩＩａとｒ−Ａｎｔｉｄｏｔｅの併用効果を示すものである。一切の添加阻害剤、ｒＶＩＩａまたはｒ−Ａｎｔｉｄｏｔｅ、を伴わない血漿中のＲＦＵの正規化後の相対トロンビン生成活性（活性％）として結果を表示した。データは、ｒ−Ａｎｔｉｄｏｔｅが、２５０ｎＭ  ベトリキサバンの抗凝血効果を独立して逆転させることを示している。１００ｎＭ  ｒＶＩＩａとｒ−Ａｎｔｉｄｏｔｅの併用は、それぞれのｒ−Ａｎｔｉｄｏｔｅ濃度でトロンビン生成活性をさらに増加させた一方で、ｒ−Ａｎｔｉｄｏｔｅ不在下での単独の１００ｎＭ  ｒＶＩＩａは、トロンビン生成活性をほんのわずかに増加させた。ｒＶＩＩａは、ベトリキサバンの不在下での対照血漿においてもトロンビン生成活性をわずかに増加させた。
【図２４】図２４Ａおよび２４Ｂは、ヒト血漿におけるプロトロンビン時間（ＰＴ）によって測定した、１μＭ  リバロキサバン、ｆＸａ阻害剤、の抗凝血活性に対するｒＶＩＩａおよびｒ−Ａｎｔｉｄｏｔｅ（図中で「ｒ−解毒剤」または「解毒剤」とも呼ぶ）の併用効果を示す。図２４Ａは、リバロキサバンの不在下で３８０ｎＭ  ｒ−Ａｎｔｉｄｏｔｅが、ＰＴをわずかに減少させた一方で、２．２ｎＭ  ｒＶＩＩａが、より多大な効果を及ぼしたことを示している。リバロキサバンの不在下で、ｒ−Ａｎｔｉｄｏｔｅ（３８０ｎＭ）の添加は、１４％補正（２１．５±０．２秒）を生じさせ、２．２ｎＭ  ｒＶＩＩａは、４６％補正を生じさせた。単一薬剤処置（ｒ−ＡｎｔｉｄｏｔｅまたはｒＶＩＩａ単独）は、抗凝血の完全逆転を生じさせなかった。３８０ｎＭ  ｒ−解毒剤と２．２ｎＭ  ｒＶＩＩａの併用は、リバロキサバン誘導抗凝血の（結果としてＰＴ＝１２秒になる）完全補正を生じさせた。図２４Ｂは、リバロキサバンの不在下で、ｒ−Ａｎｔｉｄｏｔｅ（７６０ｎＭ）の添加が２８％補正を生じさせたことを示している。７６０ｎＭ  ｒ−解毒剤と０．５５ｎＭ  ｒＶＩＩａの併用は、リバロキサバン誘導抗凝血の（結果としてＰＴ＝１２秒になる）完全に近い補正を生じさせた。
【図２５】図２５は、ヒト血漿における活性化部分プロトロンビン時間（ＡＰＰＴ）によって測定した、４００ｎＭ  ベトリキサバン、ｆＸａ阻害剤、の抗凝血活性に対するヒト血漿由来ｆＩＸとｒ−Ａｎｔｉｄｏｔｅ（図中で「解毒剤」とも呼ぶ）の併用効果を示すものである。ベトリキサバンの不在下、ｆＩＸは、ヒト血漿におけるａＰＴＴをわずかに短縮させた。ベースラインａＰＴＴ（２５．５±０．１秒）が４００ｎＭ  ベトリキサバンの添加によりおおよそ２倍延長された（５１．６±０．４秒）。ベトリキサバンの存在下、ｒ−解毒剤（１．１４μＭ）の添加は、４２％補正を生じさせたが、ヒト血漿由来ｆＩＸ（２５８ｎＭ）は、１５％補正しか生じさせなかった。従って、単独でのｆＩＸは、ベトリキサバン抗凝血に対する有効な逆転剤ではない。ｒ−Ａｎｔｉｄｏｔｅ（１．１４μＭ）とｆＩＸ（２５８ｎＭ）の併用は、ベースライン凝固パラメータ条件への抗凝血効果の完全インビトロ逆転を生じさせるために十分であった。
【図２６】図２６は、１２５ｎＭ  ベトリキサバンの抗凝血活性に対するｆＸと組換え型解毒剤（ｒ−Ａｎｔｉｄｏｔｅ）の併用効果を示すものである。一切の添加阻害剤、ｆＸまたはｒ−Ａｎｔｉｄｏｔｅ、を伴わない血漿（対照、ＦＸなし）における凝固時間の正規化後の倍率変化として結果を表示した。データは、１２５ｎＭ  ベトリキサバンが、凝固時間（０ｎＭ、ｒ−Ａｎｔｉｄｏｔｅ、ＦＸなし）を倍化したことを示している。１２５ｎＭ  ｒ−Ａｎｔｉｄｏｔｅの添加は、ベトリキサバンの抗凝血効果を実質的に逆転させた。１７０ｎＭ  ｆＸは、１２５ｎＭ  阻害剤を伴うまたは伴わない血漿中での凝固時間を独立して〜２０％減少させた。１７０ｎＭ  ｆＸと１２５ｎＭ  ｒ−Ａｎｔｉｄｏｔｅの併用は、１２５ｎＭ  ベトリキサバンの阻害効果をさらに補正した。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
Ｉ．定義
本発明の実施は、別の指示がない限り、当該技術分野の技術の範囲内である、従来の組織培養、免疫学、分子生物学、微生物学、細胞生物学および組換えＤＮＡの技術を利用するであろう。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ編（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第３版；ｔｈｅ  ｓｅｒｉｅｓ  Ａｕｓｕｂｅｌら編（２００７）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ；ｔｈｅ  ｓｅｒｉｅｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．）；ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎら（１９９１）ＰＣＲ  １：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ）；ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎら（１９９５）ＰＣＲ  ２：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ；Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ編（１９９９）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（２００５）Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ    Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ、第５版；Ｇａｉｔ編（１９８４）Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；米国特許第４，６８３，１９５号；Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ編（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ；Ａｎｄｅｒｓｏｎ（１９９９）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ；Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ編（１９８４）Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  （１９８６））；Ｐｅｒｂａｌ  （１９８４）Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｃａｌｏｓ編（１９８７）Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；Ｍａｋｒｉｄｅｓ編（２００３）Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ；  Ｍａｙｅｒ  ａｎｄ  Ｗａｌｋｅｒ編（１９８７）Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ）；Ｈｅｒｚｅｎｂｅｒｇら編（１９９６）Ｗｅｉｒ’ｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ；Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第３版（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（２００２））参照。
【００３３】
範囲を含めて、すべての数値指定、例えばｐＨ、温度、時間、濃度および分子量、は、０．１の増分で（＋）または（−）変動のある近似値である。常に明確に述べているとは限らないが、すべての数値指定の前に用語「約」があるものと解さねばならない。本明細書に記載する試薬が単に例示的なものであること、およびそのようなものの等価物が当該技術分野において公知であることも、常に明確に述べているとは限らないが、理解されるはずである。
【００３４】
本明細書および特許請求の範囲において用いる場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、その文脈が明確に別様に指示していない限り、複数の指示対象を含む。例えば、用語「１つの（ａ）薬学的に許容される担体」は、その混合物を含めて、複数の薬学的に許容される担体を含む。
【００３５】
本明細書において場合、用語「含むこと」は、組成物および方法が、列挙されている要素を含み、他のものを排除しないことを意味する。組成物および方法を定義するために用いるときの「から本質的に成ること」は、所期の使用のための組み合わせにとっていずれの本質的に有用もの以外の要素も含まないことを意味するものとする。従って、本明細書において定義するような要素から本質的に成る組成物は、単離および精製方法からの微量混在物ならびに薬学的に許容される担体、例えばリン酸緩衝食塩水、保存薬およびこれらに類するものを除外しないだろう。「から成ること」は、他の成分の微量元素および本発明の組成物を投与するための実質的方法段階以上のものを除外することを意味するものとする。これらの変転用語のそれぞれによって定義される実施形態は、本発明の範囲内である。
【００３６】
診断または処置の「被験体」は、細胞または哺乳動物（ヒトを含む）である。診断または処置に対する非ヒト動物被験体としては、例えば、ネズミ科の動物、例えばラット、マウス、イヌ科の動物、例えばイヌ、ウサギ科の動物、例えばウサギ、家畜、競技用動物、およびペットが挙げられる。
【００３７】
用語「タンパク質」および「ポリペプチド」は互換的に用いており、およびそれらの最も広い意味で、２つ以上のサブユニットアミノ酸の化合物、アミノ酸類似体またはペプチドミメティックを指す。前記サブユニットは、ペプチド結合によって連結されていることがある。もう１つの実施形態において、前記サブユニットは、他の結合、例えばエステル、エーテルなど、によって連結されていることがある。タンパク質またはペプチドは、少なくとも２つのアミノ酸を含有しなければならず、また、タンパク質配列含むこともありまたはペプチド配列を含むこともあるアミノ酸の最大数に対してかけられる制限はない。本明細書において用いる場合、用語「アミノ酸」は、天然および／または非天然もしくは合成いずれかのアミノ酸（グリシンおよびＤとＬ両方の光学異性体を含む）、アミノ酸類似体およびペプチドミメティックを指す。自然に存在するアミノ酸の１文字および３文字略語を下に列挙する。アミノ酸３個以上のペプチドは、そのペプチド鎖が短い場合、一般にオリゴペプチドと呼ばれる。ペプチド鎖が長い場合、そのペプチドは、一般にポリペプチドまたはタンパク質と呼ばれる。
【００３８】
【化１】
2014198719.tif 000002
「第Ｘａ因子」または「ｆＸａ」または「ｆＸａタンパク質」は、不活性第Ｘ因子（ｆＸ）から生産される、血液凝固経路におけるセリンプロテアーゼを指す。第Ｘ因子は、内因性Ｘａｓｅとして公知の複合体での第ＩＸａ因子とその補因子、第ＸＩＩＩａ因子、または外因性Ｘａｓｅとして公知の複合体での第ＶＩＩａとその補因子、組織因子、いずれかによって活性化される。ｆＸａは、第Ｖａ因子と共に膜結合プロトロンビナーゼ複合体を形成し、また、プロトロンビンのトロンビンへの転化を触媒するプロトロンビナーゼ複合体内の活性成分である。トロンビンは、最終的に血餅形成に至る、フィブリノゲンのフィブリンへの転化を触媒する酵素である。従って、ｆＸａの生物活性を本明細書では時として［凝血促進活性」と呼ぶ。
【００３９】
ヒト第Ｘ因子（「ｆＸ」）をコードするヌクレオチド配列を、＜ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ／ｖｉｅｗｅｒ．ｆｃｇｉ？ｄｂ＝ｎｕｃｃｏｒｅ＆ｉｄ＝８９１４２７３１＞におけるＧｅｎＢａｎｋ、「ＮＭ＿０００５０４」において見つけることができ、ならびに図１ｂおよび配列番号２に列挙する。ｆＸの対応するアミノ酸配列およびドメイン構造は、Ｌｅｙｔｕｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９８６，２５：５０９８−５１０２に記載されている。成熟ｆＸのドメイン構造がＶｅｎｋａｔｅｓｗａｒｌｕ，Ｄ．ら、Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ，２００２，８２：１１９０−１２０６にも記載されている。重鎖の最初の５２残基（配列番号３のアミノ酸１４３から１９４）の触媒による切断に基づき、ｆＸは、ｆＸａ（配列番号６）に活性化される。ＦＸａは、軽鎖（配列番号８）および重鎖（配列番号９）を含有する。軽鎖の最初の４５アミノ酸残基（配列番号６の残基１〜４５）は、１１の翻訳後修飾γ−カルボキシグルタミン酸残基（Ｇｌａ）を含有するため、Ｇｌａドメインと呼ばれる。それは、短い（６アミノ酸残基）芳香族スタック配列（配列番号６の残基４０〜４５）も含有する。キモトリプシン消化は、１〜４４残基を選択的に除去し、結果としてＧｌａドメインのないｆＸａ（配列番号４）を生じさせる。ｆＸａのセリンプロテアーゼ触媒ドメインは、重鎖Ｃ末端に位置する。ｆＸａの重鎖は、他のセリンプロテアーゼ、例えばトロンビン、トリプシンおよび活性化プロテインＣ、に高相同性である。
【００４０】
成熟第Ｘ因子のドメイン構造は、Ｖｅｎｋａｔｅｓｗａｒｌｕ  Ｄ．ら、Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｊ．，２００２，８２，１１９０−１２０６（その全体が参照により本明細書に援用されている）において見つけることができる。この図におけるアミノ酸ナンバリングは、図３と同じである。軽鎖を活性化ペプチドに接続するＡｒｇ１４０−Ｌｙｓ１４１−Ａｒｇ１４２のトリペプチド（図１に示すようなＲＫＲトリプレット）は、このトリペプチドを欠く形態が循環血漿において支配的であるため、示さない。個々のドメインを箱の中に示す。これは、図２（配列番号３）におけるアミノ酸１〜４５を含む。機能的に重要な触媒残基は丸で囲まれており、および「γ」はＧｌａ（γ−カルボキシグルタミン酸）残基を表す。
【００４１】
「天然ｆＸａ」または「野生型ｆＸａ」は、血漿中に自然に存在するまたはその原型、未修飾形態で単離されているｆＸａであって、プロトロンビンを活性化する、従って血餅の形成を促進する、生物活性を有するｆＸａを指す。この用語は、組織サンプルから単離された自然に存在するポリペプチド、ならびに組換生産されたｆＸａを含む。「活性ｆＸａ」は、プロトロンビンを活性化する生物活性を有するｆＸａを指す。「活性ｆＸａ」は、凝血促進活性を保持する、天然ｆＸａまたは修飾ｆＸａであり得る。
【００４２】
「ｆＸａ誘導体」または「修飾ｆＸａ」または「第Ｘａ因子タンパク質の誘導体」は、第Ｘａ因子阻害剤に直接的または間接的に結合するが集合してプロトロンビナーゼ複合体を構築しないように修飾されている、ｆＸａタンパク質を指す。構造的に、前記誘導体は、凝血促進活性をもたらさないように、または低減された凝血促進活性をもたらすように修飾される。「凝血促進活性」は、本明細書では、血液凝固または凝血塊形成を生じさせる薬剤の能力のことをいう。低減された凝血促進活性は、凝血促進活性が、同じ期間の間に野生型ｆＸａと比較して少なくとも約５０％、または約９０％より大きく、または約９５％より大きく低減されたことを意味する。例えば、組換え型ｆＸ−Ｓ３９５Ａは、ｆＸａ活性アッセイなどのインビトロアッセイによって測定された凝血促進活性を本質的に有さない。
【００４３】
前記誘導体は、修飾活性部位もしくは修飾Ｇｌａドメインまたは両方を有する。追加の修飾も考えられる。そのような修飾を次の方法の１つ以上で行うことができると考えられる：その配列からの１つ以上のアミノ酸の欠失、１つ以上のアミノ酸残基の１つ以上の異なるアミノ酸残基での置換、および／あるいは１つ以上のアミノ酸側鎖またはその「Ｃ」もしくは「Ｎ」末端の増幅。
【００４４】
用語「活性部位」は、化学反応が発生する酵素または抗体の部分を指す。「修飾活性部位」は、増加されたまたは減少された化学反応性または化学的特異性をその活性部位に備えさせるように構造的に修飾された活性部位である。活性部位の例としては、２３５〜４８８アミノ酸残基を含むヒト第Ｘ因子の触媒ドメイン（図１）、および１９５〜４４８アミノ酸残基を含むヒト第Ｘａ因子の触媒ドメイン（図２および３）が挙げられるが、それらに限定されない。修飾活性部位の例としては、位置Ａｒｇ３０６、Ｇｌｕ３１０、Ａｒｇ３４７、Ｌｙｓ３５１、Ｌｙｓ４１４またはＡｒｇ４２４での少なくとも１つのアミノ酸置換を有する、配列番号１０、１１、１２、１３または１５における１９５〜４４８アミノ酸残基を含む、ヒト第Ｘａ因子の触媒ドメインが挙げられるが、これに限定されない。
【００４５】
上で述べたように、本発明の誘導体は、修飾Ｇｌａドメインを有することがあり、または全Ｇｌａドメインが除去されていることがある。本発明の方法において解毒剤として適するｆＸａ誘導体の例は、本明細書において詳細に説明するような、ＧｌａドメインのないｆＸａ（配列番号４または５）、Ｇｌａ欠失ｆＸａ（本明細書に記載する修飾を有する配列番号７）、触媒部位での修飾を有するｆＸａ（配列番号１０または１１）、およびｆＶ／ｆＶａ相互作用またはｆＶＩＩＩ／ｆＶＩＩＩａ相互作用にとって重要であることが公知である部位での修飾を有するｆＸａ（位置Ａｒｇ３０６、Ｇｌｕ３１０、Ａｒｇ３４７、Ｌｙｓ３５１、Ｌｙｓ４１４またはＡｒｇ４２４での少なくとも１つのアミノ酸置換を有する、配列番号４、５、７、１０または１１）である。本発明によって考えられるｆＸａ誘導体のさらなる例を下に提供する。
【００４６】
「ＧｌａドメインのないｆＸａ」または「ｄｅｓ−Ｇｌａ  ｆＸａ」は、Ｇｌａドメインを有さないｆＸａを指し、およびＧｌａドメインの除去に加えて他の修飾（単数または複数）を有するｆＸａ誘導体を包含する。本発明におけるＧｌａドメインのないｆＸａの例としては、配列番号３の１〜３９アミノ酸残基を欠くｆＸａ誘導体；より詳細に下で説明するＣＨＯ細胞において発現されるｆＸａ変異体に対応する、配列番号３の６〜３９アミノ酸残基を欠くｆＸａ誘導体（配列番号１２、表１２）；ヒトｆＸａのキモトリプシン消化後のｄｅｓ−Ｇｌａ  ｆＸａに対応する、配列番号３の１〜４４アミノ酸アミノ酸残基を欠くｆＸａ誘導体（配列番号４、図３）；およびＰａｄｍａｎａｂｈａｎら、Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９３，２３２：９４７−９６６に記載されているような配列番号３の全１〜４５Ｇｌａドメイン残基を欠くｆＸａ誘導体（配列番号５）が挙げられるが、それらに限定されない。他の例としては、ｄｅｓ−Ｇｌａ  ａｎｈｙｄｒｏ−ｆＸａ（配列番号１０、表１０）およびｄｅｓ−Ｇｌａ  ｆＸａ−Ｓ３７９Ａ（配列番号１１、表１１）が挙げられる。
【００４７】
一部の実施形態において、ｄｅｓ−Ｇｌａ  ｆＸａは、配列番号３のアミノ酸残基４０から４４８またはその等価物を少なくとも含む。一部の実施形態において、ｄｅｓ−Ｇｌａ  ｆＸａは、配列番号３のアミノ酸残基４５から４８８（配列番号４）もしくは４６から４８８（配列番号５）またはその等価物を少なくとも含む。
【００４８】
一部の実施形態において、ｄｅｓ−Ｇｌａ  ｆＸａは、配列番号３のアミノ酸残基４０から１３９および１９５から４４８またはその等価物を少なくとも含む。一部の実施形態において、ｄｅｓ−Ｇｌａ  ｆＸａは、配列番号３のアミノ酸残基４５から１３９および１９５から４４８またはその等価物を少なくとも含む。もう１つの実施形態において、ｄｅｓ−Ｇｌａ  ｆＸａは、配列番号３のアミノ酸残基４６から１３９および１９５から４４８またはその等価物を少なくとも含む。
【００４９】
「Ｇｌａ欠失ｆＸａ」は、そのＧｌａドメイン内の遊離側鎖γ−カルボキシル基数が低減されたｆＸａを指す。ＧｌａドメインのないｆＸａと同様に、Ｇｌａ欠失ｆＸａは、他の修飾も含む場合がある。Ｇｌａ欠失ｆＸａは、未カルボキシル化（ｕｎｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅｄ）、低カルボキシル化、および脱カルボキシル化（ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅｄ）ｆＸａを含む。「未カルボキシル化ｆＸａ」または「脱カルボキシル化ｆＸａ」は、Ｇｌａドメインのγ−カルボキシグルタミン酸残基のγ−カルボキシル基を有さないｆＸａ誘導体、例えば、そのＧｌａドメインγ−カルボキシグルタミン酸のすべてが別のアミノ酸によって置換されているｆＸａ、またはその側鎖γ−カルボキシルのすべてがアミノ化、エステル化などのような手段によって除去もしくはマスクされているｆＸａを指す。組換え発現されたタンパク質については、未カルボキシル化ｆＸａを、時として、非カルボキシル化（ｎｏｎ−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅｄ）ｆＸａ」とも呼ぶ。「低カルボキシル化ｆＸａ」は、Ｇｌａドメイン内のγ−カルボキシ基数が野生型ｆＸａと比較して低減されているｆＸａ誘導体、例えば、そのＧｌａドメインγ−カルボキシグルタミン酸のすべてではないが１つ以上が１つ以上の別のアミノ酸によって置換されているｆＸａ、またはその側鎖γ−カルボキシルのすべてではないが少なくとも１つがアミノ化およびエステル化などのような手段によって除去もしくはマスクされているｆＸａを指す。
【００５０】
ヒトＧｌａドメインのない第Ｘａ因子のドメイン構造は、Ｐａｄｍａｎａｂｈａｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９３，２３２，９４７−９６６（その全体が参照により本明細書に援用されている）において見つけることができる。そのアミノ酸のナンバリングは、キモトリプシンとのトポロジー的等価性に基づき、この場合、例えば、Ｓｅｒ１９５は、ヒト成熟ｆＸナンバリングを用いた場合の図２におけるＳｅｒ３７９に対応する。挿入を文字で示し、欠失を２つの連続するナンバリングによって示す。軽鎖ナンバリングに３００を加えて、重鎖ナンバリングと区別する。β３６３は、β−ヒドロキシアスパルタートである。スラッシュは、結晶材料において観察されたタンパク質分解性切断を示す。成熟ｆＸ（配列番号３）に基づき１〜４５アミノ酸残基を欠く、ＧｌａドメインのないｆＸａの配列を、配列番号５に列挙する。
【００５１】
１つの実施形態において、前記ｆＸａ誘導体は、重鎖内に存在するセリンプロテアーゼ触媒ドメインを依然として含有するが、ｆＸａの軽鎖を欠くことがある。加えて、他のセリンプロテアーゼ触媒ドメインとのキメラを用いて、重鎖内での置換を行うことができる。
【００５２】
「ｐｄ−Ａｎｔｉｄｏｔｅ」または「血漿由来解毒剤」は、ｄｅｓ−Ｇｌａ  ａｎｈｙｄｒｏ−ｆＸａ誘導体を指し、および配列番号１０のアミノ酸残基を有する。
【００５３】
「ｒ−Ａｎｔｉｄｏｔｅ」または「組換え型解毒剤」は、ＣＨＯ細胞において発現されるｆＸａ変異体に対応する、およびより詳細に下で説明するリンカーの除去後の、配列番号３の６〜３９アミノ酸残基を欠くｆＸａ誘導体（配列番号１３、表１２ａ）を指す。
【００５４】
「抗凝血性薬剤」または「抗凝血剤」は、血餅形成を阻害する薬剤である。抗凝血性薬剤の例としては、トロンビン、第ＩＸａ因子、第Ｘａ因子、第ＸＩａ因子、第ＸＩＩａ因子または第ＶＩＩａ因子の特異的阻害剤、ヘパリンおよび誘導体、ビタミンＫアンタゴニスト、ならびに抗組織因子抗体が挙げられるが、それらに限定されない。トロンビンの特異的阻害剤の例としては、ヒルジン、ビバリルジン（Ａｎｇｉｏｍａｘ（登録商標））、アルガトロバンおよびレピルジン（Ｒｅｆｌｕｄａｎ（登録商標））が挙げられる。ヘパリンおよび誘導体の例としては、未分画ヘパリン（ＵＦＨ）、低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）、例えばエノキサパリン（Ｌｏｖｅｎｏｘ（登録商標））、ダルテパリン（Ｆｒａｇｍｉｎ（登録商標））、およびダナパロイド（Ｏｒｇａｒａｎ（登録商標））；ならびに合成五糖類、例えばフォンダパリヌクス（Ａｒｉｘｔｒａ（登録商標））が挙げられる。ビタミンＫアンタゴニストの例としては、ワルファリン（Ｃｏｕｍａｄｉｎ（登録商標））、フェノクマロール、アセノクマロール（Ｓｉｎｔｒｏｕｍ（登録商標））、クロリンジオン、ジクマロール、ジフェナジオン、エチルビスクマアセタート、フェンプロクモン、フェニンジオン、およびチオクロマロールが挙げられる。１つの実施形態において、抗凝血剤は、第Ｘａ因子の阻害剤である。１つの実施形態において、抗凝血剤は、ベトリキサバンである。
【００５５】
「抗凝固療法」は、望ましくない血餅または血栓を予防するために患者に施与される治療レジメを指す。抗凝固療法は、２つ以上の抗凝血性薬剤または他の薬剤の１つまたは組み合わせを、患者における望ましくない血餅または血栓の処置または予防に適する投薬量およびスケジュールで投与することを含む。
【００５６】
用語「第Ｘａ因子阻害剤」または「第Ｘａ因子の阻害剤」は、インビトロおよび／またはインビボでのプロトロンビンのトロンビンへの転化を触媒する第Ｘａ因子の凝血活性を直接または間接的に阻害することができる化合物を指す。公知のｆＸａ阻害剤の例としては、限定ではないが、エドキサバン、フォンダパリヌクス、イドラパリヌクス、ビオチン化イドラパリヌクス、エノキサパリン、フラグミン、ＮＡＰ−５、ｒＮＡＰｃ２、組織因子経路阻害剤、ＤＸ−９０６５ａ（例えば、Ｈｅｒｂｅｒｔ，Ｊ．Ｍ．ら、Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ．１９９６  ２７６（３）：１０３０−８に記載されているようなもの）、ＹＭ−６０８２８（例えば、Ｔａｎｉｕｃｈｉ，Ｙ．ら、Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ．１９９８  ７９（３）：５４３−８に記載されているようなもの）、ＹＭ−１５０（例えば、Ｅｒｉｋｓｓｏｎ，Ｂ．Ｉ．ら、Ｂｌｏｏｄ  ２００５；１０６（１１），Ａｂｓｔｒａｃｔ  １８６５に記載されているようなもの）、アピキサバン、リバロキサバン、ＰＤ−３４８２９２（例えば、Ｐｉｐｅｌｉｎｅ  Ｉｎｓｉｇｈｔ：Ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃｓ−Ｒｅａｃｈｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｕｎｔｒｅａｔｅｄ  Ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ  Ｍａｒｋｅｔ，２００７に記載されているようなもの）、オタミキサバン、ラザキサバン（ＤＰＣ９０６）、ＢＡＹ  ５９−７９３９（例えば、Ｔｕｒｐｉｅ，Ａ．Ｇ．ら、Ｊ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．２００５，３（１１）：２４７９−８６に記載されているようなもの）、エドキサバン（例えば、Ｈｙｌｅｋ  ＥＭ，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｒｕｇｓ  ２００７  ８（９）：７７８−７８３に記載されているようなもの）、ＬＹ５１７７１７（例えば、Ａｇｎｅｌｌｉ，Ｇ．ら、Ｊ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．２００７  ５（４）：７４６−５３に記載されているようなもの）、ＧＳＫ９１３８９３、ベトリキサバン（下で説明するようなもの）およびそれらの誘導体が挙げられる。低分子量ヘパリン（「ＬＭＷＨ」）もまた、第Ｘａ因子阻害剤であると考えられる。
【００５７】
１つの実施形態において、第Ｘａ因子阻害剤は、ベトリキサバン、リバロキサバン、アピキサバン、エドキサバン、ＬＭＷＨ、およびそれらの組み合わせから選択される。
【００５８】
用語「ベトリキサバン」は、化合物「［２−（｛４−［（ジメチルアミノ）イミノメチル］フェニル｝カルボニルアミノ）−５−メトキシフェニル］−Ｎ−（５−クロロ（２−ピリジル））カルボキサミド」またはその薬学的に許容される塩を指す。「［２−（｛４−［（ジメチルアミノ）イミノメチル］フェニル｝カルボニルアミノ）−５−メトキシフェニル］−Ｎ−（５−クロロ（２−ピリジル））カルボキサミド」は、次の構造：
【００５９】
【化２】
2014198719.tif 000003
を有する化合物またはその互変異性体もしくは薬学的に許容される塩を指す。
【００６０】
ベトリキサバンは、米国特許第６，３７６，５１５号および同第６，８３５，７３９号ならびに２００６年１１月７日に出願された米国特許出願公開第２００７／０１１２０３９号に記載されており、これらの内容は、参照により本明細書に援用されている。ベトリキサバンが第Ｘａ因子の特異的阻害剤であることは公知である。
【００６１】
本明細書において用いる場合、用語「解毒剤」または「第Ｘａ因子阻害剤に対する解毒剤」は、活性ｆＸａと競合して利用可能なｆＸａ阻害剤と結合することによりｆＸａ阻害剤の凝血阻害活性を実質的に中和または逆転できる、ｆＸａの誘導体などの、分子を指す。本発明の解毒剤の例は、低減されたリン脂質膜結合を有するｆＸａ誘導体、例えばｄｅｓ−Ｇｌａ  ｆＸａまたはＧｌａ欠失ｆＸａ、および低減された触媒活性を有するｆＸａ、例えば活性部位修飾ｆＸａ誘導体、およびｆＶ／Ｖａ、もしくはｆＶＩＩＩ／ｆＶＩＩＩａとの低減された相互作用を有する誘導体である。低減された膜結合および低減された触媒活性を有する本発明の解毒剤の例としては、（実施例１に記載するような）アンヒドロ−ｆＸａのキモトリプシン消化によるｄｅｓ−Ｇｌａ  ａｎｈｙｄｒｏ−ｆＸａ；（実施例６に記載するよう）変異誘発によるｄｅｓ−Ｇｌａ  ｆＸａ−Ｓ３７９Ａ（キモトリプシンナンバリングの場合のＳ１９５Ａ）が挙げられるが、それらに限定されない。
【００６２】
本発明の解毒剤の他の例としては、ｆＸａ触媒ドメインへの十分な構造類似性を有し、従って小分子ｆＸａ阻害剤を結合することができる、セリンプロテアーゼ触媒ドメインを含有するタンパク質またはポリペプチドが挙げられる。例としては、ｆＸａ阻害剤ＧＳＫ９１３８９３に結合するトロンビン（Ｙｏｕｎｇ  Ｒ．ら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．２００７，１７（１０）：２９２７−２９３０）；ｆＸａ阻害剤アピキサバンに結合する血漿カリクレイン（Ｌｕｅｔｔｇｅｎ  Ｊ．ら、Ｂｌｏｏｄ，２００６，１０８（１１）ａｂｓｔｒａｃｔ  ４１３０）；およびサブモルの親和性（Ｋｄ＝５００ｐＭ）でｆＸａ阻害剤Ｃ９２１−７８を結合するトリプシン（またはその細菌ホモログ・サブチリシン）  （Ｂｅｔｚ  Ａ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９９，３８（４４）：１４５８２−１４５９１）が挙げられるが、それらに限定されない。
【００６３】
１つの実施形態において、本発明の誘導体は、第Ｘａ因子阻害剤に直接または間接的に結合する。本明細書において用いる場合の用語「結合すること」、「結合する」、「認識」、または「認識する」は、例えばハイブリダイゼーションアッセイを用いて検出することができる、分子間の相互作用を含むものとする。これらの用語は、分子間の「結合」相互作用も含むものとする。相互作用は、例えば、現実には、タンパク質−タンパク質、タンパク質−核酸、タンパク質−小分子または小分子−核酸であるだろう。結合は、「直接的」である場合もあり、または「間接的」である場合もある。「直接」結合は、分子間の直接的な物理的接触を含む。分子間の「間接」結合は、同時に１つ以上の中間分子と直接的な物理的接触を有する分子を含む。例えば、本発明の誘導体は、低分子量ヘパリンおよび第Ｘａ因子の他の間接的阻害剤を間接的に結合し、実質的に中和すると考えられる。この結合は、相互作用している分子を含む「複合体」の形成を生じさせる場合がある。「複合体」は、共有結合もしくは非共有結合、共有結合性もしくは非供給結合性相互作用または供給結合もしくは非共有結合力によって一緒に保持された２つ以上の分子の結合を指す。
【００６４】
ｆＸａの阻害剤の活性を「中和する」、「逆転する」、「補正する」もしくは「打ち消す」または同様のフレーズは、ｆＸａ阻害剤の第Ｘａ因子阻害または抗凝血機能を阻害するまたは阻止することを指す。そのようなフレーズは、前記機能の部分的阻害または阻止、ならびにインビトロおよび／またはインビボでの、ｆＸａ阻害剤の大部分のまたはすべての活性の阻害または阻止を指す。これらの用語は、薬力学的または代用マーカーに依存するｆＸａ阻害剤の少なくとも約２０％の補正も指す。マーカーの例としては、ＩＮＲ、ＰＴ、ａＰＴＴ、ＡＣＴ、抗ｆＸａ単位、トロンビン生成（Ｔｅｃｈｎｏｔｈｒｏｍｂｉｎ  ＴＧＡ、トロンボエラストグラフィー（ｔｈｒｏｍｂｏｅｌｓａｔｏｇｒａｐｈｙ）、ＣＡＴ（校正自動トロンボグラム（ｃａｌｉｂｒａｔｅｄ  ａｕｔｏｍａｔｅｒ  ｔｈｒｏｍｂｏｇｒａｍ））およびこれらに類するものが挙げられるが、それらに限定されない。
【００６５】
一定の実施形態において、第Ｘａ因子阻害剤は、実質的に中和される（または今まさに説明したように補正される）。これは、第Ｘａ因子を阻害するその能力が、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％低減されることを意味する。
【００６６】
用語「リン脂質膜結合」は、Ｃａ２＋イオンの存在下で、負の電荷を有するリン脂質膜または他の細胞膜、例えば血小板、に結合する活性ｆＸａの能力を指す。この結合は、ｆＸａのＧｌａドメイン内のγ−カルボキシグルタミン酸残基によって媒介される。
【００６７】
用語「低減された相互作用」は、野生型ｆＸａと通常結合または複合体化するイオンまたは他の補因子と結合するまたは複合体を形成するｆＸａ誘導体の減少された能力を指す。そのような相互作用の例としては、ｆＸａのＣａ２＋イオンおよびリン脂質膜との結合、ｆＶ／ｆＶａ、またはｆＶＩＩＩ／ｆＶＩＩＩａとの相互作用などが挙げられるが、それらに限定されない。ｆＸａ誘導体と前記イオンまたは他の補因子との相互作用が野生型ｆＸａのものの５０％に低減されることが好ましい。さらに好ましくは、前記相互作用は、野生型ｆＸａのものの１０％、１％、および０．１％に低減される。これは、「集合してプロトロンビナーゼ複合体を構築する」前記誘導体の能力を指す。
【００６８】
「ｆＸａ阻害剤結合活性」は、ｆＸａの阻害剤を結合する分子の能力を指す。本発明の解毒剤は、ｆＸａ阻害剤結合活性を、それが直接的であろうと、間接的であろうと、有する。
【００６９】
用語「循環半減期」または「血漿半減期」は、単回投与後にまたは注入の停止の後、血漿中を循環する解毒剤の血漿濃度がその初期濃度の半分に低減するために必要な時間を指す。
【００７０】
用語「結合体化される部分」は、そのｆＸａ誘導体の残基と供給結合を形成することによりｆＸａ誘導体に付加させることができる部分を指す。前記部分は、ｆＸａ融合体の残基に直接結合することがあり、またはリンカーと共有結合を形成することがあり、そしてまたそのリンカーが、ｆＸａ誘導体の残基と供給結合を形成する。
【００７１】
本明細書において用いる場合、「抗体」は、全抗体およびその任意の抗原結合フラグメントまたは一本鎖を含む。従って、用語「抗体」は、免疫グロブリン分子の少なくとも一部分を含む分子を含有する任意のタンパク質またはペプチドを指す。そのようなものの例としては、重鎖もしくは軽鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）またはそのリガンド結合部分、重鎖または軽鎖可変領域、重鎖または軽鎖定常領域、フレームワーク（ＦＲ）領域、またはそれらの任意の部分、または結合タンパク質の少なくとも一部分が挙げられるが、それらに限定されない。
【００７２】
抗体は、ポリクローナルである場合もありまたはモノクローナルである場合もあり、ならびに任意の適する生物源、例えばネズミ科の動物、ラット、ヒツジおよびイヌ科の動物、から抗体を単離することができる。
【００７３】
本明細書において用いる場合の用語「血液凝固剤」は、血液凝固を開始もしくは増進することができる、または線維素溶解もしくは血栓症を阻害ずることができる薬剤を指す。この活性を有することが公知のすべての薬剤が、本発明によって考えられる。一部の実施形態において、血液凝固剤は、凝血促進活性、抗血栓溶解活性および／または抗線維素溶解活性を有する。一部の実施形態において、血液凝固剤は、凝固因子、該凝固因子に関連したポリペプチド、組換え型凝固因子、またはそれらの組み合わせであり得る。一部の他の実施形態において、血液凝固剤は、非特異的抗出血剤であり得る。血液凝固剤の例としては、血漿由来第ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子、第ＩＸ／ＩＸａ因子、第Ｘ／Ｘａ因子、第ＩＩ／ＩＩａ因子、第ＶＩＩＩ／ＶＩＩＩａ因子、第Ｖ／Ｖａ因子、組換え型第ＶＩＩ／ＶＩＩａ（組換え型ヒト第ＶＩＩａ因子（ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ，ｅｐｔａｃｏｇ  ａｌｆａ（活性化），ＡＴＣ  ｃｏｄｅ  Ｂ０２ＢＤ０８））、ＩＸ／ＩＸａ、Ｘ／Ｘａ、ＩＩ／ＩＩａ、ＶＩＩＩ／ＶＩＩＩａ、Ｖ／Ｖａ因子およびそれらの組み合わせが挙げられるが、それらに限定されない。血液凝固剤の例としては、吸着性化学薬品、止血剤、トロンビン、フィブリン糊、デスモプレシン（商品名：ＤＤＡＶＰ、Ｓｔｉｍａｔｅ、Ｍｉｎｉｒｉｎ）、寒冷沈降物および新鮮凍結血漿、凝固因子濃縮物、活性化または非活性化プロトロンビン複合体濃縮物、Ｆｅｉｂａ  Ｖｈ、血小板濃縮物ならびにこれらの組み合わせも挙げられるが、それらに限定されない。血液凝固剤の追加の例としては、トロンビン活性化線溶阻害因子（ＴＡＦＩ）、プロテインＣインヒビター（ＰＣＩ）、プロテインＳインヒビター（ＰＳＩ）、アルファ−２抗プラスミン、トラネキサム酸（米国ではＣｙｋｌｏｋａｐｒｏｎ（登録商標）としておよびアジアではＴｒａｎｓａｍｉｎ（登録商標）として一般に市販されている）、アミノカプロン酸、アプロチニンおよびこれらの組み合わせが挙げられるが、それらに限定されない。利用可能な血液凝固因子のさらなる例は、引用文献Ｂｒｏｏｋｅｒ  Ｍ，Ｒｅｇｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｃｌｏｔｔｉｎｇ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｓ，第８版，Ｗｏｒｌｄ  Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ，２００８において入手することができる。
【００７４】
本発明の一定の態様において、前記ｆＸａ誘導体は、別の解毒剤と結合体化した状態で投与される。本発明によって考えられる追加の解毒剤は、当該技術分野において公知の解毒剤、例えば、ヘパリンまたはヘパリン様薬物に対する解毒剤などである。本発明の方法に有用であると考えられる１つの追加の薬剤は、プロタミン、例えば硫酸プロタミン、ならびに他の新規サリチルアミド誘導体、例えばＰＭＸ６０１０２、ＰＭＸ６０１２６、ＰＭＸ６０１３８およびＰＭＸ６０１００（ペンシルバニア州、ＲａｄｎｏｒのＰｏｌｙＭｅｄｉｘ  Ｃｏｐｒ．から入手可能）である。これらの薬剤を、本明細書に記載するｆＸａ誘導体解毒剤と併用すると相乗効果が観察されるであろうと考えられ、すなわち、いずれかの解毒剤を単独で使用した場合よりｆＸａ阻害剤が実質的に多く中和されるであろうと考えられる。ひとまとめにして、今まさに説明した他の解毒剤を「ヘパリン解毒剤」と呼ぶことにする。
【００７５】
「組成物」は、活性組成物と、不活性（例えば、検出可能な薬剤もしくは標識）な、またはアジュバントなどの活性な、別の化合物または組成物との組み合わせを意味することを意図したものである
「薬学的組成物」は、インビトロ、インビボまたはエクビボでの診断または治療使用に適する組成物を作るための、活性薬剤と不活性なまたは活性な担体との組み合わせを含むことを意図したものである。
【００７６】
「有効量」または「治療有効量」は、単独でまたは血液凝固剤と一緒に投与されたとき、所望の生物学的および／または治療的結果を誘導するために十分なｆＸａ誘導体の量を指す。それは、単独でまたはｆＸａ誘導体と一緒に投与されたとき、所望の生物学的および／または治療的結果を誘導するために十分な血液凝固剤の量を指すこともある。それは、所望の生物学的および／または治療的結果を誘導するために十分な、ｆＸａ誘導体および血液凝固剤を含む組成物の量を指すこともある。その結果は、疾病の徴候、症状もしくは原因の緩和である場合もあり、または生体系の所望の改変である場合もある。本発明において、その結果は、次のうちの１つ以上を概して含むであろう：患者に投与されたｆＸａ阻害剤の中和、ｆＸａ阻害剤の抗凝血活性の逆転、血漿からのｆＸａ阻害剤除去、止血の回復、および出血の低減または停止。有効量は、使用される具体的なｆＸａ誘導体または血液凝固剤、被験体が投与された具体的なｆＸａ阻害剤、ｆＸａ阻害剤の投薬レジメ、その解毒剤の投与のタイミング、処置される被験体および疾病状態、被験体の体重および年齢、疾病状態の重症度、投与の仕方ならびにこれらに類するもの（これらのすべてを当業者は容易に決定することができる）に依存して変わるであろう。「有効量以下の量（ｓｕｂ−ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ａｍｏｕｎｔ）」または「治療有効量以下の量（ｓｕｂ−ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ａｍｏｕｎｔ）」は、一方の薬剤（血液凝固剤またはｆＸａタンパク質誘導体のいずれか）を単独で投与したときに所望のレベルに達することができない生物学的および／または治療的結果を誘導するために十分な、単独投与または併用投与されるときのｆＸａ誘導体または血液凝固剤の量を指す。
【００７７】
本明細書に記載する解毒剤の有効単位用量は、２００９年７月１５日に出願された「Ｕｎｉｔ  Ｄｏｓｅ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｔｉｄｏｔｅｓ  ｆｏｒ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｘａ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｓａｍｅ」と題する米国特許仮出願第６１／２２５，８８７号に記載されており、前記仮出願は、その全体が参照により本明細書に援用されている。具体的には、薬学的に許容される担体と、配列番号１３のアミノ酸配列を含む二つの鎖のポリペプチド、または配列番号１３に対して少なくとも８０％の相同性を有するポリペプチドとを含む単位用量処方は、約１０ミリグラムから約２グラムまたは約１００ミリグラムから約１．５グラムまたは約２００ｍｇから約１グラムまたは約４００ミリグラムから約９００ミリグラムの量であると考えられる。血液凝固剤と併用で投与することにより、前記解毒剤の用量は、より少なくなるだろうと考えられる。あるいは、血液凝固剤の量を減少させることができ、そして今まさに説明した量に一致した解毒剤量を投与することとなる。前記血液凝固剤についての標準的用量は、十分に当該技術分野における技術の範囲内である。
【００７８】
前記生物学的または治療的結果が達成されたかどうかを決定する１つの方法は、患者におけるｆＸａ阻害剤依存性薬力学的または代用マーカーの測定である。このマーカーは、ＩＮＲ、ＰＴ、ａＰＴＴ、ＡＣＴ、抗ｆＸａ単位、およびトロンビン生成（Ｔｅｃｈｎｏｔｈｒｏｍｂｉｎ  ＴＧＡ、トロンボエラストグラフィー、ＣＡＴ（校正自動トロンボグラム））であり得るが、それらに限定されない。
【００７９】
本明細書において用いる場合、用語「処置すること」、「処置」およびこれらに類するものは、所望の薬理および／または生理効果を得ることを意味するために本明細書では用いる。この効果は、障害またはその兆候もしくは症状を完全にまたは一部予防するという点で予防的である場合もあり、ならびに／あるいは障害および／またはその障害に起因する有害作用についての一部または完全治癒という点で治療的である場合もある。
【００８０】
「処置すること」は、哺乳動物における障害のいかなる処置も包含し、および（ａ）障害の素因を有するだろうが、それを有するとまだ診断されていないことがある被験体における障害の発生の予防、例えば、抗凝血剤を過剰投与された患者における出血の予防；（ｂ）障害の抑制、すなわち、その発現の阻止、例えば出血の抑制；または（ｃ）障害の軽減または改善、例えば出血の低減、を含む。
【００８１】
本明細書において用いる場合、「処置する」ことは、その病態に随伴する症状の系統的改善および／または症状の発症の遅延をさらに含む。「処置」の臨床的および準臨床的証拠は、病態、個体および処置によって変わるであろう。
【００８２】
さらに、用語「予防する」は、「抑制すること」指す。
【００８３】
「投与」は、１回で行われる場合があり、処置過程全体にわたって連続的にまたは間欠的に行われる場合もある。投与の最も有効な手段および投薬量を決定するための方法は、当業者に公知であり、ならびに治療に用いられる組成物、治療の目的、処置されるターゲット細胞、および処置される被験体によって変わるであろう。処置する医師によって選択される投薬量およびパターンによって、単回投与が行われる場合もあり、または多回投与が行われる場合もある。適する投薬製剤およびそれらの薬剤を投与する方法は、当該技術分野において公知である。
【００８４】
本発明の薬剤および組成物を、医薬品の製造に使用することができ、ならびに薬学的組成物中の活性成分のような従来の手順に従って投与することによりヒトおよび他の動物の処置に使用することができる。
【００８５】
本発明の薬剤を、任意の適する経路により、特に、非経口投与（皮下、筋肉内、静脈内および経皮投与を含む）により、治療のために投与することができる。好ましい経路が、レシピエントの状態および年齢、ならびに処置される疾病によって変わるであろうということも理解されるだろう。
【００８６】
第Ｘａ因子阻害剤の方法、すなわち阻害または逆転、が達成されるかどうかを、多数のインビトロアッセイ、例えば、トロンビン生成アッセイおよび抗ｆＸａ単位、ならびに臨床的凝固アッセイ、例えばａＰＴＴ、ＰＴおよびＡＣＴ、によって決定することができる。
【００８７】
核酸、例えばＤＮＡまたはＲＮＡ、に関して本明細書において用いる場合の用語「単離された」は、その高分子の天然源に存在する他のＤＮＡまたはＲＮＡからそれぞれ分離された分子を指す。用語「単離された核酸」は、フラグメントとして自然に存在しないおよび自然な状態では見つけられないであろう核酸フラグメントを含むものとする。用語「単離された」は、他の細胞タンパク質から単離されているポリペプチドおよびタンパク質を指すためにも本明細書では用いており、精製されたポリペプチドと組換えポリペプチドの両方を包含するものとする。他の実施形態において、用語「単離された」は、細胞、組織、ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体またはそのフラグメント（単数もしくは複数）が自然界で通常会合している、細胞のまたは別の成分から分離されていることを意味する。例えば、単離された細胞は、異なる表現型または遺伝子型の組織または細胞から分離されている細胞である。当業者には明らかであるように、自然に存在しないポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体またはそのフラグメント（単数もしくは複数）は、それをその自然に存在する対応物と区別するために「単離」を必要としない。
【００８８】
本明細書において用いる場合、参照タンパク質、ポリペプチドまたは核酸を指すときの用語「その等価物」は、最小限の相同性を有し、その上、所望の官能性を依然として維持しているものを意味する。本明細書において述べる任意の修飾タンパク質が、その等価物も含むと考えられる。例えば、前記相同性は、参照ポリペプチドまたはタンパク質に対して少なくとも７５％の相同性および代替え的に少なくとも８０％、または代替的に少なくとも８５％、代替的に少なくとも９０％、または代替的に少なくとも９５％、または代替的に少なくとも９８％の相同性であり得、ならびに参照ポリペプチドまたはタンパク質と実質的に等価の生物活性を示すことができる。ポリヌクレオチドもしくはポリヌクレオチド領域（またはポリペプチドもしくはポリペプチド領域）が、別の配列との一定の百分率（例えば、８０％、８５％、９０％または９５％）の「配列同一性」を有するということは、配列させたしたとき、それら２つの配列を比較して塩基（またはアミノ酸）の百分率が同じであることを意味する。ｆＸａ（または関連セリンプロテアーゼ）の重鎖のみを使用すると、全相同性は、７５％より低い、例えば６５％または５０％などであるだろうが、所望の官能性はそのままであることに留意しなければならない。このアラインメントおよび同相または配列同一パーセントは、当該技術分野において公知のソフトウェアプログラム、例えば、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９８７）Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ３０、セクション７．７．１８、表７．７．１に記載されているもの、を使用して決定することができる。好ましくは、デフォルトパラメータをアラインメントに用いる。好ましいアラインメントプログラムは、デフォルトパラメータを使用するＢＬＡＳＴである。詳細には、好ましいプログラムは、次のデフォルトパラメータを用いる、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰである：遺伝子コード＝標準；フィルター＝なし；鎖＝両方；カットオフ＝６０；期待値＝１０；マトリクス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；記述＝５０配列；ソート手段＝ＨＩＧＨ  ＳＣＯＲＥ；データベース＝非冗長性、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ  ＣＤＳ翻訳＋ＳｗｉｓｓＰｒｏｔｅｉｎ＋ＳＰｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。これらのプログラムの詳細は、次のインターネットアドレス：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＢＬＡＳＴで見つけることができる。
【００８９】
用語「ポリヌクレオチド」および「オレゴヌクレオチド」は、互換的に用いており、ならびにデオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドまたはそれらの類似体のいずれかの、任意の長さのヌクレオチドの重合形態を指す。ポリヌクレオチドは、任意の三次元構造を有することがあり、および公知のまたは未知の任意の機能を果たすことがある。次のものは、ポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子または遺伝子フラグメント（例えば、プローブ、プライマー、ＥＳＴまたはＳＡＧＥタグ）、エキソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブおよびプライマー。ポリヌクレオチドは、修飾ヌクレオチド、例えばメチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体、を含むことができる。存在する場合、ヌクレオチド構造への修飾を、ポリヌクレオチドの組み立て前にまたは後にもたらすことができる。ヌクレオチドの配列に非ヌクレオチド成分を割り込ませることができる。重合後、例えば標識成分との結合体化によって、ポリヌクレオチドをさらに修飾することができる。この用語は、二本鎖分子と一本鎖分子の両方も指す。別様に指定または要求されていない限り、ポリヌクレオチドである本発明の任意の実施形態は、二本鎖形態と、二本鎖形態を構成することが公知のまたは二本鎖形態を構成すると予測される２本の相補的一本鎖形態の両方を包含する。
【００９０】
ポリヌクレオチドは、４つのヌクレオチド塩基：アデニン（Ａ）；シトシン（Ｃ）；グアニン（Ｇ）；チミン（Ｔ）；およびポリヌクレオチドがＲＮＡであるときにはチミンの代わりにウラシル（Ｕ）、の特異的配列から成る。従って、用語「ポリヌクレオチド配列」は、ポリヌクレオチド分子のアルファベット表示である。このアルファベット表示を、中央処理装置を有するコンピュータのデータベースにインプットし、そして機能性ゲノム解析および相同性検索などのバイオインフォマティクスアプリケーションに使用することができる。
【００９１】
「相同性」または「同一性」または「類似性」は、２ペプチド間または２核酸分子間の配列類似性を指す。相同性は、比較を目的としてアラインすることができるそれぞれの配列内の位置を比較することによって決定することができる。比較配列内の位置を同じ塩基またはアミノ酸が占めているときには、それらの分子はその位置で相同である。配列間の相同度は、それらの配列が共有するマッチング位置または相同位置の数の関数である。「無関係の」または「非相同」配列は、本発明の配列の１つと４０％未満の同一性、または代替的に２５％未満の同一性を共有する。
【００９２】
ポリヌクレオチドもしくはポリヌクレオチド領域（またはポリペプチドもしくはポリペプチド領域）が、別の配列との一定の百分率（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％）の「配列同一性」を有するということは、アラインしたとき、それら２つの配列を比較して塩基（またはアミノ酸）の百分率が同じであることを意味する。このアラインメントおよび同相または配列同一パーセントは、当該技術分野において公知のソフトウェアプログラム、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編（２００７）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙに記載されているもの、を使用して決定することができる。好ましくは、デフォルトパラメータをアラインメントに用いる。１つのアラインメントプログラムは、デフォルトパラメータを使用するＢＬＡＳＴである。詳細には、プログラムは、次のデフォルトパラメータを用いる、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰである：遺伝子コード＝標準；フィルター＝なし；鎖＝両方；カットオフ＝６０；期待値＝１０；マトリクス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；記述＝５０配列；ソート手段＝ＨＩＧＨ  ＳＣＯＲＥ；データベース＝非冗長性、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ  ＣＤＳ翻訳＋ＳｗｉｓｓＰｒｏｔｅｉｎ＋ＳＰｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。これらのプログラムの詳細は、次のインターネットアドレス：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ（２００７年１１月２６日に最終アクセス）で見つけることができる。生物学的に等価のポリヌクレオチドは、指定の相同パーセントを有するもの、および同じまたは異なる生物活性を有するポリペプチドをコードするものである。
【００９３】
用語「核酸の相同体」は、その核酸のヌクレオチド配列またはその補体との一定の相同度を有するヌクレオチド配列を有する核酸を指す。二本鎖核酸の相同体は、その補体との一定の同相度を有するヌクレオチド配列を有するまたはその補体を有する核酸を含むと解釈される。１つの態様において、核酸の相同体は、核酸またはその補体にハイブリダイズすることができる。
【００９４】
「遺伝子」は、転写または翻訳された後、特定のポリペプチドまたはタンパク質をコードすることができる少なくとも１つのオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）を含有するポリヌクレオチドを指す。本明細書に記載するポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列のいずれかを使用して、それらが関係づけられる遺伝子のより大きなフラグメントまたは完全長コーディング配列を同定することができる。より大きなフラグメント配列を単離する方法は、当業者に公知である。
【００９５】
用語「発現する」は、遺伝子産物の産生を指す。
【００９６】
本明細書において用いる場合、「発現」は、ポリヌクレオチドがｍＲＮＡに転写されるプロセス、および／または転写されたｍＲＮＡが、その後、ペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質に翻訳されるプロセスを指す。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する場合、発現は、真核細胞におけるｍＲＮＡのスプライシングを含むことがある。
【００９７】
ポリヌクレオチドに適用される場合の用語「コードする」は、その本来の状態で、または当業者に周知の方法によって操作されたとき、ポリペプチドを、該ポリペプチドおよび／またはそのフラグメントのためのｍＲＮＡを生産するように転写および／または翻訳することができる場合、ポリペプチドを「コードする」と言われるポリヌクレオチドを指す。アンチセンス鎖は、そのような核酸の補体であり、およびコードする配列をそれらから導出することができる。
【００９８】
「ペプチド結合体」は、１つ以上のポリペプチドと別の化合的または生物学的化合物との共有結合または非共有結合による会合を指す。非限定的な例では、ポリペプチドと化学的化合物の「結合体化」は、結果として、その所期の目的のためにそのポリペプチドの安定性または効力改善をもたらす。１つの実施形態では、リポソーム、ミセルまたは薬学的に許容されるポリマーである担体とペプチドを結合体化させる。
【００９９】
「リポソーム」は、同心脂質二重層から成る微視的小胞である。構造的に、リポソームは、サイズおよび形状の点で、数百オングストロームからミリメートルの何分の幾つかの寸法を有する長管から球形にわたる。小胞を形成する脂質は、外層の脂質組成をもたらす最終複合体の指定流動度または剛性度を達成するように選択される。これらは、中性（コレステロール）または二極性であり、ならびにリン脂質、例えばホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）およびスフィンゴミエリン（ＳＭ）、ならびに１４〜２２の範囲の炭化水素鎖長を有し、および飽和されているか１つ以上の二重Ｃ＝Ｃ結合を有する、ジオレイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）をはじめとする（しかし、これらに限定されない）他のタイプの二極性脂質を含む。単独で、または他の脂質成分と併用で、安定なリポソームを生成することができる脂質の例は、リン脂質、例えば、水素添加大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）、レシチン、ホスファチジルエタノールアミン、リゾレシチン、リゾホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、セファリン、カルジオリピン、ホスファチジン酸、セレブロシド、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）およびジオレオイルホスファチジルエタノールアミン４−（Ｎ−マレイミド−メチル）シクロヘキサン−１−カルボキシラート（ＤＯＰＥ−ｍａｌ）である。リポソームに組み込まれた状態になることができる脂質を含有する追加の非リン含有脂質（ｎｏｎ−ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｕｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｌｉｐｉｄｓ）としては、ステアリルアミン、ドデシルアミン、ヘキサデシルアミン、イソプロピルミリスタート、トリエタノールアミン−ラウリルスルファート、アルキル−アリールスルファート、アセチルパルミタート、グリセロールリシノレアート、ヘキサデシルステアラート、両性アクリルポリマー、ポリエチルオキシル化脂肪酸アミド、および上述のカチオン性脂質（ＤＤＡＢ、ＤＯＤＡＣ、ＤＭＲＩＥ、ＤＭＴＡＰ、ＤＯＧＳ、ＤＯＴＡＰ（ＤＯＴＭＡ）、ＤＯＳＰＡ、ＤＰＴＡＰ、ＤＳＴＡＰ、ＤＣ−Ｃｈｏｌ）が挙げられる。負の電荷を有する脂質としては、小胞を形成することができる、ホスファチジン酸（ＰＡ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）およびジセチルホスファートが挙げられる。概して、リポソームを、それらの全体的なサイズおよび層状構造の性質に基づいて、３つのカテゴリーに分けることができる。ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ａｃａｄｅｍｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｍｅｅｔｉｎｇ、「Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｕｓｅ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ」、Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  １９７７によって詳しく説明されているようなこの３つの分類は、多重ラメラ小胞（ＭＬＶｓ）、小型単ラメラ小胞（ＳＵＶｓ）および大型単ラメラ小胞（ＬＵＶｓ）である。
【０１００】
「ミセル」は、脂質コロイド中に分散された界面活性剤分子の凝集体である。水溶液中で典型的なミセルは凝集体を形成し、親水性「ヘッド」領域が周囲の溶媒と接触しており、疎水性テール領域がミセル中心部に隔離されている。このタイプのミセルは、順相ミセル（水中油型ミセル）として公知である。逆ミセルは、中心にヘッド基を有し、テールが外に伸びている（油中水型ミセル）。ミセルを使用して、本明細書に記載するポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体または組成物を付着させて、ターゲット細胞または組織への効率的送達を助長することができる。
【０１０１】
「薬学的に許容されるポリマー」というフレーズは、本明細書に記載する１つ以上のポリペプチドに結合体化させることができる化合物の群を指す。ポリマーのポリペプチドへの結合体化は、インビボおよびインビトロでのそのポリペプチドの半減期を延長することができると考えられる。非限定的な例としては、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、セルロース誘導体、ポリアクリラート、ポリメタクリラート、糖、ポリオールおよびそれらの混合物が挙げられる。
【０１０２】
「遺伝子送達ビヒクル」は、挿入されたポリヌクレオチドを宿主細胞に運ぶことができる任意の分子と定義する。遺伝子送達ビヒクルの例は、リポソーム、ミセル生体適合性ポリマー（天然ポリマーおよび合成ポリマーを含む）；リポタンパク質；ポリペプチド；多糖類；リポ多糖類；人工ウイルスエンベロープ；金属粒子；ならびに細菌またはウイルス、例えばバキュロウイルス、アデノウイルスおよびレトロウイルス、バクテリオファージ、コスミド、プラスミド、真菌ベクター、ならびに当該技術分野において一般に使用されている他の組換えビヒクル（これらは、様々な真核および原核生物宿主における発現について記載されており、単純なタンパク質発現にばかりでなく遺伝子療法にも用いることができる）である。
【０１０３】
本発明のポリヌクレオチドは、遺伝子送達ビヒクルを使用して細胞または組織に送達することができる。本明細書において用いる場合の「遺伝子送達」、「遺伝子導入」、「形質導入」およびこれらに類するものは、外因性ポリヌクレオチド（時として「トランスジーン」と呼ぶ）の宿主細胞への導入を、その導入に用いられる方法に関係なく、指す用語である。そのような方法としては、様々な周知の技術、例えば、ベクター媒介遺伝子導入（例えば、ウイルス感染／トランスフェクション、または様々な他のタンパク質に基づくもしくは脂質に基づく遺伝子送達複合体によるもの）、ならびに「裸の」ポリヌクレオチドの送達を助長する技術（例えば、エレクトロポレーション、「遺伝子銃」送達、およびポリヌクレオチドの導入に用いられる様々な他の技術）が挙げられる。導入されたポリヌクレオチドを宿主細胞内で安定的に維持することができ、または一時的に維持することができる。安定した維持には、概して、導入されたポリヌクレオチドが、宿主細胞と適合性の複製起点を含有すること、あるいは宿主細胞のレプリコン、例えば染色体外レプリコン（例えば、プラスミド）または核もしくはミトコンドリア染色体と一体化することが必要とされる。当該技術分野において公知であるように、および本明細書に記載するように、哺乳動物細胞への遺伝子の導入を媒介することができる多数のベクターが公知である。
【０１０４】
「ウイルスベクター」は、インビボ、エクスビボまたはインビトロのいずれかで宿主細胞に送達されるポリヌクレオチドを含む、組換え生産ウイルスまたはウイルス粒子と定義する。ウイルスベクターの例としては、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、アルファウイルスベクターおよびこれらに類するものが挙げられる。アルファウイルスベクター、例えばセムリキ森林ウイルス系ベクターおよびシンドビスウイルス系ベクター、は、遺伝子療法および免疫療法において使用するためにも開発されている。Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｄｕｂｅｎｓｋｙ（１９９９）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５：４３４−４３９およびＹｉｎｇら（１９９９）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．５（７）：８２３−８２７参照。遺伝子導入がレトロウイルスベクターによって媒介される態様において、ベクター構築物は、レトロウイルスゲノムまたはその一部と治療用遺伝子とを含むポリヌクレオチドを指す。本明細書において用いる場合、「レトロウイルス媒介遺伝子導入」または「レトロウイルス形質導入」は、同じ意味を有するものであり、ならびに遺伝子または核酸配列が、宿主細胞に、該細胞に進入してそのゲノムをその宿主細胞ゲノムに組み込むウイルスによって、安定的に導入されるプロセスを指す。前記ウイルスは、その通常の感染機構によって宿主細胞に入ることができ、または前記ウイルスを、異なる宿主細胞表面受容体またはリガンドに結合して細胞に入るように修飾することができる。本明細書において用いる場合、レトロウイルスベクターは、ウイルスまたはウイルス様進入機構によって外因性核酸を細胞に導入することができるウイルス粒子を指す。
【０１０５】
レトロウイルスは、ＲＮＡの形態でそれらの遺伝情報を運ぶが、このウイルスが細胞を感染させると、そのＲＮＡは、逆転写されてＤＮＡ形態になり、それがその感染細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれる。この組み込まれたＤＮＡ形態をプロウイルスと呼ぶ。
【０１０６】
遺伝子導入がＤＮＡウイルスベクター、例えばアデノウイルス（Ａｄ）またはアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）、によって媒介される態様において、ベクター構築物は、ウイルスゲノムまたはその一部とトランスジーンとを含むポリヌクレオチドを指す。アデノウイルス（Ａｄ）は、５０を超えるサブタイプを含む、比較的よく特性づけされている同種のウイルス群である。例えば、国際ＰＣＴ出願番号ＷＯ  ９５／２７０７１参照。Ａｄは、宿主細胞ゲノムへの組み込みを必要としない。組換えＡｄ由来のベクター、特に、野生型ウイルスの組換えおよび産生の可能性を低下させるもの、も構築されている。国際ＰＣＴ出願番号ＷＯ  ９５／００６５５およびＷＯ  ９５／１１９８４参照。野生型ＡＡＶは、宿主細胞のゲノムに組み込まれる点で高い感染性および特異性を有する。Ｈｅｒｍｏｎａｔ  ａｎｄ  Ｍｕｚｙｃｚｋａ（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：６４６６−６４７０およびＬｅｂｋｏｗｓｋｉら（１９８８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：３９８８−３９９６参照。
【０１０７】
プロモーターとポリヌクレオチドを作動可能に連結させることができるクローニング部位とを両方とも含有するベクターは、当該技術分野において周知である。そのようなベクターは、インビトロまたはインビボでＲＮＡを転写することができ、ならびにＳｔｒａｔａｇｅｎｅ（カリフォルニア州、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ）およびＰｒｏｍｅｇａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（ウィスコンシン州、Ｍａｄｉｓｏｎ）などの供給業者から市販されている。発現および／またはインビトロ転写を最適化するために、クローンの５’および／または３’非翻訳部分を除去、付加または改変して、余分な、潜在的に不適切な選択的翻訳開始コドン、または転写もしくは翻訳レベルいずれかで発現に干渉するまたは発現を低減することがある他の配列を排除することが必要である場合がある。あるいは、コンセンサスリボソーム結合部位を開始コドンのすぐ５’側に挿入して発現を増進させることができる。
【０１０８】
遺伝子送達ビヒクルは、ＤＮＡ／リポソーム複合体、ミセルおよびターゲッティングされたウイルスタンパク質−ＤＮＡ複合体も含む。ターゲッティング抗体またはそのフラグメントも含むリポソームを本発明の方法に使用することができる。細胞への送達を増進するために、細胞表面抗原、例えば幹細胞または心筋細胞上で見つけることができる細胞表面マーカー、を結合する抗体またその結合フラグメントに本発明の核酸またはタンパク質を結合体化させることができる。細胞または細胞集団へのポリヌクレオチドの送達に加えて、非限定的なタンパク質トランスフェクション技術によって、本明細書に記載するタンパク質の細胞または細胞集団への直接導入を行うことができ、あるいは、本発明のタンパク質の発現を増進するおよび／または活性を促進することができる培養条件が、他の非限定的技術である。
【０１０９】
「固体支持体」というフレーズは、非水性表面、例えば「培養プレート」、「遺伝子チップ」または「マイクロアレイ」を指す。そのような遺伝子チップまたはマイクロアレイを、当業者に公知の多数の技術により診断および治療目的で使用することができる。１つの技術では、米国特許第６，０２５，１３６号および同第６，０１８，０４１号に概説されているものなどのハイブリダイゼーションアプローチによってＤＮＡ配列を決定するためにオレゴヌクレオチドを遺伝子チップ上に整列させる。本発明のポリヌクレオチドを修飾してプローブにすることができ、そしてまたそのプローブを遺伝子配列の検出に使用することができる。そのような技術は、例えば米国特許第５，９６８，７４０号および同第５，８５８，６５９号に記載されている。Ｋａｙｅｍらの米国特許第５，９５２，１７２号によりおよびＫｅｌｌｅｙら（１９９９）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２７：４８３０−４８３７により説明されているものなどの核酸配列の電気化学的検出のために、プローブを電極表面に取り付けることができる。
【０１１０】
様々な「遺伝子チップ」または「マイクロアレイ」および類似した技術が当該技術分野において公知である。そのようなものの例としては、ＬａｂＣａｒｄ（ＡＣＬＡＲＡ  Ｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．）；ＧｅｎｅＣｈｉｐ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｉｎｃ）；ＬａｂＣｈｉｐ（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐ）；電気化学的探査を用いる低密度アレイ（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏ  Ｓｅｎｓｏｒｓ）；ＬａｂＣＤ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｇａｍｅｒａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃｏｒｐ．）；Ｏｍｎｉ  Ｇｒｉｄ  （Ｇｅｎｅ  Ｍａｃｈｉｎｅｓ）；Ｑ  Ａｒｒａｙ（Ｇｅｎｅｔｉｘ  Ｌｔｄ．）；液相発現技術を用いるハイスループット自動質量分析システム（Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｃｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｉｎｃ．）；サーマル・ジェット・スポッティング・システム（Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ）；Ｈｙｓｅｑ  ＨｙＣｈｉｐ（Ｈｙｓｅｑ，Ｉｎｃ．）；ＢｅａｄＡｒｒａｙ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．）；ＧＥＭ（Ｉｎｃｙｔｅ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）；多数スライドガラス上に１２から６４のスポットを計量分配することができるハイ・スループット・マイクロアレイイング（ｍｉｃｒｏａｒｒｙｉｎｇ）システム（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ  Ｂｉｏ−Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ＷｏｒｋｓｔａｔｉｏｎおよびＮａｎｏＣｈｉｐ（Ｎａｎｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．）；ミクロ流体ガラスチップ（Ｏｒｃｈｉｄ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）；４つのＰｉｅｚｏＴｉｐ圧電ドロップ・オン・デマンド型チップを用いるＢｉｏＣｈｉｐ  Ａｒｒａｙｅｒ（Ｐａｃｋａｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．）；ＦｌｅｘＪｅｔ（Ｒｏｓｅｔｔａ  Ｉｎｐｈａｒｍａｔｉｃ，Ｉｎｃ．）；ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計（Ｓｅｑｕｎｏｍｅ）；ＣｈｉｐＭａｋｅｒ  ２およびＣｈｉｐＭａｋｅｒ  ３（ＴｅｌｅＣｈｅｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）；ならびにＨｅｌｌｅｒ（２００２）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．４：１２９−１５３において確認されるおよび説明されているようなＧｅｎｏＳｅｎｓｏｒ（Ｖｙｓｉｓ，Ｉｎｃ．）が挙げられるが、それらに限定されない。「遺伝子チップ」または「マクロアレイ」の例は、米国特許公開第２００７−０１１１３２２号、同第２００７−００９９１９８号、同第２００７−００８４９９７号、同第２００７−００５９７６９号および同第２００７−００５９７６５号ならびに米国特許第７，１３８，５０６号、同第７，０７０，７４０号および同第６，９８９，２６７号にも記載されている。
【０１１１】
１つの態様では、本明細書に記載するポリヌクレオチド、ポリペプチドまたは抗体に相同なプローブまたはプライマーを含有する「遺伝子チップ」または「マイクロアレイ」を作製する。適するサンプルを患者から得、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質またはそれらの任意の組み合わせの抽出を行い、必要な場合には増幅する。そのサンプルを、遺伝子チップまたはマイクロアレイに、該遺伝子チップまたはマイクロアレイ上に含めたプローブ（単数もしくは複数）またはプライマー（単数もしくは複数）への関心のある遺伝子（単数もしくは複数）または遺伝子産物（単数もしくは複数）のハイブリダイゼーションに適する条件下で接触させる。プローブまたはプライマーを検出可能に標識することができ、それによって関心のある遺伝子（単数または複数）を同定することができる。あるいは、関心のある遺伝子（単数または複数）のＤＮＡまたはＲＮＡとハイブリダイズさせたプローブまたはプライマーを同定するするために化学反応または生物学的反応を用いることができる。その後、その患者の遺伝子型または表現型を、上述の装置および方法を利用して決定する。
【０１１２】
固相支持体の他の非限定的例としては、硝子、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然および改質セルロース、ポリアクリルアミド、斑糲岩、および磁鉄鉱が挙げられる。前記担体の性質は、ある程度可溶性である場合もあり、または不溶性である場合もある。前記支持体材料は、カップリングしている分子が、ポリヌクレオチド、ポリペプチドまたは抗体に結合できるのであれば、事実上、いずれの可能な構造形態であってもよい。従って、前記支持体の形態は、ビーズの場合のように球形である場合もあり、または試験管の内面もしくは棒材の外面の場合にように円筒形である場合もある。あるいは、前記表面は、シート、試験ストリップなどのように平坦である場合もあり、または代替的にポリスチレンビーズである場合もある。当業者は、抗体もしくは抗原を結合するための他の適する抗体を知っているであろう、または常例的実験を用いることによりそれらを突き止めることができるであろう。
【０１１３】
「真核細胞」は、モネラを除く生物界のすべてを含む。それらは、膜に包まれた核によって容易に区別することができる。動物、植物、真菌および原生生物は、真核生物であり、または細胞が内膜および細胞骨格によって複合構造に構成されている生物である。最も特徴的な包膜構造は、その核である。例えば酵母、高等植物、昆虫および哺乳動物細胞をはじめとする真核生物宿主、または代替的に上で説明したような原核生物からのもの。非限定的な例としては、類人猿、ウシ属の動物、豚、ネズミ科の動物、ラット、鳥、爬行動物およびヒトが挙げられる。
【０１１４】
「原核細胞」には、通常、核または一切の他の包膜細胞小器官がなく、２つのドメイン、細菌および古細菌、に分けられる。加えて、染色体ＤＮＡを有する代わりに、これらの細胞の遺伝情報は、プラスミドと呼ばれる環状ループ内にある。細菌細胞は、非常に小さく、おおよそ動物のミトコンドリアのサイズ（直径約１〜２μｍおよび長さ１０μｍ）である。原核細胞は、３つの主要形状を特徴とする：棒形状、球形、およびらせん形。真核生物のような精巧な複製プロセスによって広がるのではなく、細菌細胞は、２分裂より分裂する。例としては、ｂａｃｃｉｌｕｓ菌、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、サルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）が挙げられるが、それらに限定されない。
【０１１５】
本明細書において用いる場合の用語「ヒト抗体」は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する可変および定常領域を有する抗体を含むことを意図したものである。本発明のヒト抗体は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、インビトロでのランダムもしくは部位特異的変異誘発によりまたはインビボでの体細胞変異により導入された変異）を含むことがある。しかし、本明細書において用いる場合の用語「ヒト抗体」は、マウスなどの別の哺乳動物種の生殖細胞系に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列にグラフトされた抗体を含むことを意図したものであはない。従って、本明細書において用いる場合、用語「ヒト抗体」は、そのタンパク質の実質的にあらゆる部分（例えば、ＣＤＲ、フレームワーク、ＣＬ、ＣＨドメイン（例えば、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３）、ヒンジ、（ＶＬ、ＶＨ））が、ヒトにおいて実質的に非免疫原性であり、ほんの小さな配列変化または変異しか伴わない抗体を指す。同様に、霊長類（サル、ヒヒ、チンパンジーなど）、齧歯動物（マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ハムスター、およびこれらに類するもの）ならびに他の哺乳動物に指定されている抗体は、そのような種、亜属、属、亜科、科特異的抗体を意味する。さらに、キメラ抗体は、上のものの任意の組み合わせを含む。そのような変化または変異は、非修飾抗体を基準にしてヒトまたは他の種における免疫原性を、場合によりおよび好ましくは維持または低減する。従って、ヒト抗体は、キメラ抗体またはヒト化抗体とは異なる。機能的に再配列されたヒト免疫グロブリン（例えば、重鎖および／または軽鎖）遺伝子を発現することができる非ヒト動物または原核もしくは真核細胞によってヒト抗体を生産できることが指摘される。さらに、ヒト抗体が一本鎖抗体であるとき、それは、天然ヒト抗体では見つけられないリンカーペプチドを含む場合がある。例えば、Ｆｖは、重鎖の可変領域と軽鎖の可変領域を接続するリンカーペプチド、２から約８のグリシンまたは他のアミノ酸残基、を含む場合がある。そのようなリンカーペプチドは、ヒト起源のものであると考えられる。
【０１１６】
本明細書において用いる場合、ヒト抗体は、その抗体が、ヒト免疫グロブリン配列を用いて、例えば、ヒト免疫グロブリン遺伝子を有するトランスジェニックマウスを免疫することによって、またはヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリーをスクリーニングすることによって、系から得られる場合、特定の生殖細胞系配列「に由来する」。ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列「に由来する」ヒト抗体は、ヒト抗体のアミノ酸配列とヒト生殖細胞系免疫グロブリンのアミノ酸配列とを比較することなどによって、同定することができる。選択されるヒト抗体は、概して、アミノ酸配列の点でヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子によってコードされたアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であり、および他の種の生殖細胞系免疫グロブリンアミノ酸配列（例えば、ネズミ科の動物の生殖細胞系配列）と比較したときにヒト抗体をヒトであると同定するアミノ酸残基を含有する。ある場合には、ヒト抗体は、アミノ酸配列の点で、生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子によってコードされたアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であることがあり、または少なくとも９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であることさえある。概して、特定のヒト生殖細胞系配列に由来するヒト抗体は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子によってコードされたアミノ酸配列によるアミノ酸の変異をわずか１０しか表示しないであろう。ある場合には、ヒト抗体は、生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子によってコードされたアミノ酸配列によるアミノ酸の変異がわずか５しか表示されないこともあれば、４、３、２または１しか表示されないことさえある。
【０１１７】
「ヒトモノクローナル抗体」は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する可変および定常領域を有する単一結合特異性を表示する抗体を指す。この用語は、組換えヒト抗体も指す。これらの抗体を作る方法を本明細書において説明する。
【０１１８】
本明細書において用いる場合、用語「組換えヒト抗体」は、組換え手段によって調製、発現、産生または単離されるすべてのヒト抗体、例えば、ヒト免疫グロブリン遺伝子に関してトランスジェニックもしくは染色体導入性（ｔｒａｎｓｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ）である動物（例えばマウス）から単離された抗体またはそれらから調製されたハイブリドーマ；その抗体を例えばトランスフェクトーマから発現するように形質転換された宿主細胞から単離された抗体；組換え型、コンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離された抗体；ならびにヒト免疫グロブリン遺伝子配列の他のＤＮＡ配列へのスプライシングを含む任意の他の手段によって調製、発現、産生または単離された抗体を含む。そのような組換えヒト抗体は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する可変および定常領域を有する。しかし、一定の実施形態において、そのような組換えヒト抗体をインビトロ変異誘発（または、ヒトＩｇ配列に関してトランスジェニックな動物を用いるときには、インビボ体細胞変異誘発）に付すことができ、従って、その組換え抗体のＶＨおよびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系ＶＨおよびＶＬ配列に由来するおよび関連しているが、インビボでヒト抗体生殖細胞系レパートリーの中に自然には存在し得ない配列である。これらの抗体を作る方法を本明細書において説明する。
【０１１９】
本明細書において用いる場合、「アイソタイプ」は、重鎖定常領域遺伝子によってコードされる抗体クラス（例えば、ＩｇＭまたはＩｇＧ１）を指す。
【０１２０】
本明細書において用いる場合の用語「ポリクローナル抗体」または「ポリクローナル抗体組成物」は、異なるＢ細胞系に由来する抗体の製剤を指す。それらは、それぞれが異なるエピトープを認識する、特異的抗原に対して分泌された免疫グロブリン分子の混合物である。
【０１２１】
本明細書において用いる場合の用語「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」は、単一分子組成の抗体分子の製剤を指す。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対して単一の結合特異性および親和性を表示する。
【０１２２】
本明細書において用いる場合、用語「標識」は、「標識された」組成物を生成するために、検出すべき組成物、例えば、ポリヌクレオチドまたはタンパク質、例えば抗体、に直接または間接的に結合体化させる、直接または間接的に検出可能な化合物または組成物を意味する。この用語は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）およびこれらに類するものなどの挿入された配列の発現に基づいてシグナルを生じさせるであろう、ポリヌクレオチドに結合体化させた配列も含む。標識は、それ自体が検出可能であることがあり（例えば、放射性同位体標識もしくは蛍光標識）、または、酵素的標識の場合には、検出可能である基質化合物もしくは組成物の化学的改変を触媒することができる。標識は、小規模検出に適する場合もあり、またはハイ・スループット・スクリーニングに、より適する場合もある。従って、適する標識としては、放射性同位体、蛍光色素、化学発光化合物、色素、およびタンパク質（酵素を含む）が挙げられるが、それらに限定されない。標識を簡単に検出することができ、またはそれを定量することができる。簡単に検出される応答は、その存在が確認されるだけの応答を一般に含み、これに対して定量される応答は、強度、分極および／または他の特性などの定量可能な（例えば、数値報告可能な）値を有する応答を一般に含む。発光または蛍光アッセイの場合、結合に実際に関与するアッセイ成分と会合している発色団もしくは蛍光団を使用して検出可能な応答を直接生じさせることができ、または別の（例えば、レポーターもしくは指示薬）成分と会合している発光団もしくは蛍光団を使用して検出可能な応答を間接的に生じさせることができる。
【０１２３】
シグナルを生成する発光標識の例としては、生物発光および化学発光が挙げられるが、それらに限定されない。検出可能な発光応答は、発光シグナルの変化または発生を一般に含む。アッセイ成分に発光標識するための適する方法および発光団は、当該技術分野において公知であり、例えば、Ｈａｕｇｌａｎｄ，Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｐ．（１９９６）Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（第６版）に記載されている。発光プローブの例としては、エクオリンおよびルシフェラーゼが挙げられるが、それらに限定されない。
【０１２４】
適する蛍光標識の例としては、フルオレセイン、ローダミン、テトラメチルローダミン、エオシン、エリスロシン、クマリン、メチル−クマリン、ピレン、マラサイトグリーン、スチルベン、ルシファーイエロー、Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｌｕｅ（商標）、およびテキサスレッドが挙げられるが、それらに限定されない。他の適する光学色素は、Ｈａｕｇｌａｎｄ，Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｐ．（１９９６）Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（第６版）に記載されている。
【０１２５】
もう１つの態様では、細胞または組織内またはそれらの表面上に存在する細胞成分、例えば細胞表面マーカー、への共有結合性付着を助長するように蛍光標識を官能化する。イソチオシアナート基、アミノ基、ハロアセチル基、マレイミド、スクシンイミジルエステルおよびハロゲン化スルホニルをはじめとする（しかし、これらに限定されない）適する官能基、これらのすべてを、蛍光標識を第二の分子に付けるために使用することができる。蛍光標識の官能基の選択は、リンカー、薬剤、マーカーまたは第二の標識剤のいずれかに対するその付着部位に依存するであろう。
【０１２６】
ＩＩ．本発明の方法
本発明の１つの態様は、抗凝固療法を受けている被験体における出血を予防または低減する方法であって、有効量の第Ｘａ因子タンパク質誘導体および有効量の血液凝固剤またはヘパリン解毒剤を該被験体に投与することによるものである方法に関する。前記血液凝固剤は、血餅形成を開始または増進する。１つの実施形態において、前記凝血性薬剤は、凝血促進活性、抗血栓溶解活性および／または抗線維素溶解活性を有する。１つの実施形態において、前記誘導体は、修飾活性部位および／または修飾Ｇｌａドメインを有し、その結果、低減された凝血促進活性を有する、または凝血促進活性を有さない。前記誘導体は、解毒剤として作用し、前記阻害剤の抗凝血活性を実質的に中和する。１つの実施形態において、前記誘導体は、Ｇｌａ欠失性であるか、Ｇｌａドメインがない。１つの実施形態において、前記血液凝固剤は、凝固因子、該凝固因子に関連したポリペプチド、組換え型凝固因子、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。もう１つの実施形態において、前記血液凝固剤は、非特異的抗出血剤である場合がある。もう１つの実施形態では、吸着性化学薬品、止血剤、トロンビン、フィブリン糊、デスモプレシン、寒冷沈降物および新鮮凍結血漿、凝固因子濃縮物、活性化または非活性化プロトロンビン複合体濃縮物、Ｆｅｉｂａ  Ｖｈ、血小板濃縮物ならびにそれらの組み合わせからなる群より前記血液凝固剤を選択することができる。利用可能な血液凝固因子のさらなる例は、引用文献Ｂｒｏｏｋｅｒ  Ｍ，Ｒｅｇｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｃｌｏｔｔｉｎｇ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｓ，第８版，Ｗｏｒｌｄ  Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ，２００８において入手することができる。前記被験体は、哺乳動物、またはより詳細にはヒトである場合がある。
【０１２７】
この療法に適する患者は、以前に抗凝固療法を受けたことがあり、例えば、彼らは、第Ｘａ因子の阻害剤などの１つ以上の抗凝血剤を投与されたことがある。第Ｘａ因子阻害剤である抗凝血剤の例としては、フォンダパリヌクス、イドラパリヌクス、ビオチン化イドラパリヌクス、エノキサパリン、フラグミン、ＮＡＰ−５、ｒＮＡＰｃ２、組織因子経路阻害剤、ＤＸ−９０６５ａ、ＹＭ−６０８２８、ＹＭ−１５０、アピキサバン、リバロキサバン、ＰＤ−３４８２９２、オタミキサバン、ＤＵ−１７６ｂ、ＬＹ５１７７１７、ＧＳＫ９１３８９３、低分子量ヘパリン、およびベトリキサバン、またはこれらの任意の組み合わせが挙げられるが、それらに限定されない。様々な抗凝血剤の供給源が本明細書のいたるところで見つけられる。
【０１２８】
１つの態様において、前記誘導体は、修飾された活性部位および／または修飾されたもしくは除去されたＧｌａドメインを有する。１つの態様において、前記第Ｘａ因子誘導体は、凝血促進活性を有さず、示さない。この態様において、前記誘導体は、配列番号３のアミノ酸残基４０から４４８、４５から４４８、もしくは４６から４４８またはそれらの等価物を少なくとも含む。もう１つの態様において、前記誘導体は、配列番号３のアミノ酸残基４５から１３９および１９５から４４８もしくは４６から１３９および１９５〜４４８またはそれらの等価物を少なくとも含む。
【０１２９】
本発明のもう１つの態様において、前記ｆＸａ誘導体は、ｆＸａタンパク質の活性部位の三次元構造を保持する。ｄｅｓ−Ｇｌａ  ｆＸａの三次元構造に関する情報は、Ｂｒａｎｄｓｔｅｔｔｅｒ，Ｈら、Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．，１９９６，２７１：２９９８８−２９９９２において見つけることができる。
【０１３０】
本発明のもう１つの態様において、前記ｆＸａ誘導体は、Ｇｌａドメインを欠くことがあり、ならびに２つのＥＧＦドメインのいずれか一方を欠くことがある。本発明のもう１つの態様において、前記ｆＸａ誘導体は、軽鎖を完全に欠く。重鎖の他の修飾は、阻害剤を結合することができる関連セリンプロテアーゼの触媒ドメインを含むことがある。前記関連セリンプロテアーゼは、ｆＸａ触媒ドメインとの十分な構造類似性を有する、従って、小分子ｆＸａ阻害剤を結合することができる、触媒ドメインを有する。関連セリンプロテアーゼの例としては、哺乳動物プロテアーゼ、例えば血漿カリクレイン、トロンビンおよびトリプシン、または細菌プロテアーゼ・サブチリシンが挙げられるが、それらに限定されない。これらの誘導体は、本明細書に記載する活性部位セリン（ＳＥＲ３７９）またはアスパラギン酸（ＡＳＰ２８２）と等価のアミノ酸残基に対する修飾をさらに含む。
【０１３１】
一部の実施形態において、低減された凝血促進活性を有する第Ｘａ因子タンパク質は、修飾された軽鎖を含み、この修飾は、ｆＸａのリン脂質膜結合を低減するためのＧｌａドメインの置換、付加または欠失である。一部の実施形態において、ｆＸａの主なアミノ酸配列は、変わらないが、一定のアミノ酸の側鎖は、変更されている。ｆＸａのリン脂質膜結合を低減する修飾Ｇｌａドメインの例は、野生型ヒト第Ｘａ因子タンパク質のＧｌａドメインと比較して少なくとも１つのアミノ酸置換、付加または欠失を伴う、配列番号３の一次アミノ酸配列を有するポリペプチドもしくはタンパク質またはそれらの等価物を含む。一部の実施形態において、置換または欠失されている少なくとも１つのアミノ酸は、γ−カルボキシグルタミン酸（Ｇｌａ）である。Ｇｌａ残基は、配列番号３におけるアミノ酸位置６、７、１４、１６、１９、２０、２５、２６、２９、３２、および３９に示されている。一部の実施形態において、前記解毒剤の一次アミノ酸配列は、配列番号３またはその等価物と同一であるが、未カルボキシル化、低カルボキシル化または脱カルボキシル化された第Ｘａ因子タンパク質である。一部の実施形態において、前記解毒剤は、ｄｅｓ−Ｇｌａ  ａｎｈｙｄｒｏ−ｆＸａまたはｄｅｓ−Ｇｌａ  ｆＸ−Ｓ３７９Ａである。一部の実施形態において、低減されたリン脂質膜結合を有する第Ｘａ因子タンパク質は、ＥＧＦ１および／もしくはＥＧＦ２（図３においてそれぞれアミノ酸４６から８４および８５から１２８として示す）、またはＥＧＦ１および／もしくはＥＧＦ２ドメインの一部、すなわちフラグメント、の修飾または欠失をさらに含む。一部の実施形態において、全軽鎖または実質的に全重鎖が修飾または除去される。例えば、低減されたリン脂質膜結合を有する修飾ｆＸａタンパク質は、重鎖しか含有しないことがあり、または前記修飾ｆＸａは、重鎖と、Ｃｙｓ１３２（配列番号３における重鎖のＣｙｓ３０２と共に単一のジスルフィド結合を形成する残基）を含有する軽鎖のフラグメントとを含有することがある。一部の実施形態において、前記誘導体は、配列番号１２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、前記誘導体は、配列番号１３を含む二つの鎖のポリペプチドである。他の実施形態において、前記誘導体は、配列番号１５のポリペプチドである。
【０１３２】
一部の実施形態において、第Ｘａ因子タンパク質誘導体は、該第Ｘａ因子タンパク質の触媒ドメインを含有する修飾された重鎖を含む。一部の実施形態において、配列番号３および７におけるＧｌｕ２１６、Ｇｌｕ２１８、Ａｒｇ３３２、Ａｒｇ３４７、Ｌｙｓ３５１、およびＳｅｒ３７９（キモトリプシンナンバリングの場合はそれぞれＧｌｕ３７、Ｇｌｕ３９、Ａｒｇ１５０、Ａｒｇ１６５、Ｌｙｓ１６９、およびＳｅｒ１９５）からなる群より選択されるｆＸａの１つ以上のアミノ酸位置に、少なくとも１つのアミノ酸置換が存在する。一部の実施形態において、前記解毒剤は、活性部位セリン（配列番号３および７におけるＳｅｒ３７９、キモトリプシンナンバリングの場合はＳｅｒ１９５）残基が修飾されてデヒドロ−アラニンまたはアラニンになった第Ｘａ因子タンパク質である。そのような修飾を野生型ｆＸａタンパク質に対して、または上で説明した修飾ｆＸａタンパク質もしくはフラグメントのいずれかに対して行うことができる。例えば、実施例１において説明する、活性部位セリン残基がデヒドロ−アラニンによって置換されたｄｅｓ−Ｇｌａ  ａｎｈｙｄｒｏ−ｆＸａは、解毒剤活性を示した。
【０１３３】
他の実施形態において、前記誘導体は、野生型または自然に存在する第Ｘａ因子と比較して、ＡＴＩＩＩ、補因子ｆＶ／ｆＶａおよびｆＶＩＩＩ／ｆＶＩＩＩａとの低減された相互作用を有する。一部の実施形態において、少なくとも１つのアミノ酸置換が、配列番号３および７におけるアミノ酸位置Ａｒｇ３０６、Ｇｌｕ３１０、Ａｒｇ３４７、Ｌｙｓ３５１、Ｌｙｓ４１４またはＡｒｇ４２４（キモトリプシンナンバリングの場合には、それぞれ、Ａｒｇ１２５、Ｇｌｕ１２９、Ａｒｇ１６５、Ｌｙｓ１６９、Ｌｙｓ２３０またはＡｒｇ２４０）に存在する。そのような修飾を、野生型ｆＸａタンパク質に対して、または上で説明した修飾ｆＸａタンパク質もしくはフラグメントのいずれに対しても行うことができる。
【０１３４】
他の実施形態において、前記ｆＸａ誘導体は、ｆＸａ重鎖の阻害剤結合能力を模倣することができるセリンプロテアーゼドメインのアミノ酸配列を含むタンパク質である。そのようなタンパク質としては、タンパク質基質を切断することができるセリンプロテアーゼ活性を欠くように組換え修飾されているが、活性部位クレフトを特徴とする構造を依然として有する、哺乳動物プロテアーゼ、例えば血漿カリクレイン、トロンビン、トリプシン（またはその細菌相同体・サブチリシン）を挙げることができる。
【０１３５】
本発明は、前記修飾第Ｘａ因子誘導体の１つ以上と、前記血液凝固剤またはヘパリン解毒剤の１つ以上と、薬学的に許容される担体とを含有する薬学的組成物も提供する。前記組成物は、それを必要とする患者に、所望の恩恵、出血の低減または停止、をもたらすであろう量で投与される。前記組成物を、第Ｘａ因子誘導体の活性を補足または強化する任意の適する薬剤または療法と共に併用投与することができる。そのようなものの一例は、ｆＸａ誘導体の血漿半減期を延長することができる安定剤である。適する安定剤の例としては、ｆＸａ重鎖のエキソサイトを認識する抗ｆＸａ抗体またはアルファ−２−マクログロブリン結合ｆＸａ誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。ｆＸａ誘導体と安定剤（エキソサイト抗体またはアルファ−２−マクログロブリン）との複合体の形成は、高分子相互作用を阻止するであろうが、活性部位依存性阻害剤結合能力を維持する。併用投与に適する抗ｆＸａ抗体の例としては、Ｙａｎｇ  Ｙ．Ｈ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００６，１；１７７（１１）：８２１９−２５、Ｗｉｌｋｅｎｓ，Ｍ  ａｎｄ  Ｋｒｉｓｈｎａｓｗａｍｙ，Ｓ．，Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．，２００２，２７７（１１），９３６６−９３７４、およびＣｈｕｒｃｈ  ＷＲら、Ｂｌｏｏｄ，１９８８，７２（６），１９１１−１９２１に記載されているものが挙げられるが、それらに限定されない。
【０１３６】
一部の実施形態では、第Ｘａ因子タンパク質は、化学的、酵素的または組換え手段によって修飾される。例えば、活性部位Ｓｅｒ３７９を化学修飾してデヒドロアラニンにすることができ、および実施例１において説明するようなキモトリプシン消化によってＧｌａドメインを酵素的に除去することができる。組換え型解毒剤（ｒ−Ａｎｔｉｄｏｔｅ）の直接発現について実施例７でより詳細に説明する、野生型ｆＸをコードするｃＤＮＡ（配列番号２）の配列を修飾することによる組換え手段によって、本明細書に記載する修飾ｆＸａを生産することもでき、または代替的に、組換え手段、その後の活性化剤（例えば、ヘビ毒、例えばラッセルクサリヘビ毒）およびｆＶＩＩａ／組織因子またはｆＩＸａ／ｆＶＩＩＩａ複合体による修飾ｆＸａへの活性化によって、所望の修飾を有するｆＸタンパク質を生産することができる。
【０１３７】
一部の実施形態では、凝固因子、該凝固因子に関連したポリペプチド、組換え型凝固因子、およびそれらの組み合わせからなる群より前記血液凝固剤を選択することができる。一部の実施形態では、血漿由来第ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子、第ＩＸ／ＩＸａ因子、第Ｘ／Ｘａ因子、第ＩＩ／ＩＩａ因子、第ＶＩＩＩ／ＶＩＩＩａ因子、第Ｖ／Ｖａ因子およびそれらの組み合わせからなる群より前記凝固因子を選択することができる。一部の実施形態では、組換え型第ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子、第ＩＸ／ＩＸａ因子、第Ｘ／Ｘａ因子、第ＩＩ／ＩＩａ因子、第ＶＩＩＩ／ＶＩＩＩａ因子、第Ｖ／Ｖａ因子およびそれらの組み合わせからなる群より前記組換え型凝固因子を選択することができる。
【０１３８】
１つの態様において、前記血液凝固剤は、組換え型第ＶＩＩａ因子である場合がある。
【０１３９】
一部の実施形態において、前記血液凝固剤は、非特異的抗出血剤である場合がある。一部の実施形態では、吸着性化学薬品、止血剤、トロンビン、フィブリン糊、デスモプレシン、寒冷沈降物および新鮮凍結血漿、凝固因子濃縮物、活性化または非活性化プロトロンビン複合体濃縮物、Ｆｅｉｂａ  Ｖｈ、血小板濃縮物ならびにそれらの組み合わせからなる群より前記血液凝固剤を選択することができる。利用可能な血液凝固因子のさらなる例は、引用文献Ｂｒｏｏｋｅｒ  Ｍ，Ｒｅｇｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｃｌｏｔｔｉｎｇ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｓ，第８版，Ｗｏｒｌｄ  Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ、２００８において入手できる。
【０１４０】
一部の実施形態では、トロンビン活性化線溶阻害因子（ＴＡＦＩ）、プロテインＣインヒビター（ＰＣＩ）、プロテインＳインヒビター（ＰＳＩ）、アルファ−２抗プラスミン、トラネキサム酸、アミノカプロン酸およびそれらの組み合わせからなる群より前記血液凝固剤を選択することができる。
【０１４１】
一部の実施形態において、前記血液凝固剤は、凝血促進、抗血栓溶解および／もしくは抗線維素溶解活性を有する１つの薬剤である場合があり、あるいは本出願に開示する、または引用特許、特許出願もしくは他の参考文献に開示されている、または当該技術分野において公知であるような、凝血促進、抗血栓溶解および／もしくは抗線維素溶解活性を有する１つ以上の異なる薬剤を含む場合がある。
【０１４２】
本明細書に記載する組成物の投与および付随する方法からの恩恵を受けるであろう被験体としては、臨床的大出血事象もしくは臨床的に有意な非大出血事象を経験している、または前記事象の素因を有する被験体が挙げられる。臨床的大出血事象の例は、出血（ｈｅｍｏｒｒｈａｇｅ）、生命維持に必要不可欠な器官への出血、再手術または新たな治療手技を必要とする出血、および随伴顕性出血（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｏｖｅｒｔ  ｂｌｅｅｄ）を伴う≧２．０の出血指数（ｂｌｅｅｄｉｎｇ  ｉｎｄｅｘ）からなる群より選択される。（Ｔｕｒｐｉｅ  ＡＧＧら、ＮＥＪＭ，２００１，３４４：６１９−６２５）。加えて、前記被験体は、持続性または再発性である、および実質的な量である、または介入なしでは停止しないであろう鼻出血、治療手技を必要とするレベルまで至らない直腸出血または尿路出血；特発的であるまたは些細な外傷で発生する、注射部位または他の箇所での実質的血腫；ドレナージを必要としない外科手術手技に通常伴うものより多い実質的失血（ｂｌｏｏｄ  ｌｏｓｓ）；ならびに予定外の輸血を必要とする出血からなる群より選択される、非大出血事象を経験しているまたは前記事象の素因を有する場合がある。
【０１４３】
一部の実施形態において、前記解毒剤は、過量のｆＸａ阻害剤の投与後、または被験体を出血（ｈｅｍｏｒｒｈａｇｅ）の危険にさらすことがある外科手術の前に投与される。
【０１４４】
本明細書に記載する方法のいずれにおいても、たとえ常に明確に述べていなかったとしても、有効量の前記誘導体および／または血液凝固剤が被験体に投与されることは理解されるはずである。処置する医師は、この量を経験的に決定することができ、ならびにこの量は、被験体の年齢、性別、体重および健康状態によって変わるであろう。処置する医師が考慮すべき追加の要因としては、投与されただろう第Ｘａ因子阻害剤の素性および／または量、解毒剤を被験体に投与することとなる方法または方式、解毒剤の処方、ならびにその患者についての治療のエンドポイントが挙げられるが、それらに限定されない。これらの可変要素を念頭において、当量者は、治療すべき被験体に治療有効量を投与することとなる。被験体における抗凝血剤を打ち消すまたは実質的に中和するために十分な治療有効量の本明細書に記載する解毒剤は、被験体の体重１キログラムにつき約０．０１ミリグラムのｆＸａ誘導体から被験体の体重１キログラムにつき１グラムの解毒剤を含有し得ると考えられる。ｆＸａ誘導体を被験体に約１０ナノモルから約１００マイクロモル、または約１０ナノモルから約５マイクロモル、または約１００ナノモルから約２．５マイクロモルの範囲の濃度で提供することができると、さらに考えられる。血液凝固剤を、熟練臨床家が容易に突き止められる量で、投与することができる。この量は、体重１キログラムにつき０．０１μｇから体重１キログラムにつき１ｇにわたることがある。例えば、前記因子または組換え型因子、例えばｒＶＩＩａ、の投与は、体重１キログラムにつき約１μｇから２００μｇにわたるだろう。１被験体あたり約１μｇから５００μｇのデスモプレシンを投与することができる。Ｆｅｉｂａ  Ｖｈの有効量は、体重１キログラムにつき約１μｇから２００μｇであるだろうと考えられる。体重１キログラムにつき約１ｍｇと１００ｍｇの間のトラネキサム酸を被験体に投与することができる。
【０１４５】
１つの態様において、前記ｆＸａタンパク質誘導体は、前記血液凝固剤の投与の前に投与される。もう１つの態様において、前記ｆＸａタンパク質誘導体は、前記血液凝固剤の投与の後に投与される。さらにもう１つの態様において、前記ｆＸａタンパク質誘導体は、前記血液凝固剤と同時に投与される。さらにもう１つの態様において、前記ｆＸａタンパク質誘導体は、前記血液凝固剤と一緒に投与される。
【０１４６】
さらにもう１つの態様において、本発明は、ａ）ｆＸａ阻害剤に結合するが集合してプロトロンビナーゼ複合体を構成しないｆＸａタンパク質誘導体と；ｂ）凝血促進、抗血栓溶解または抗線維素溶解活性を有する血液凝固剤とを含むキットに関する。もう１つの態様において、本発明は、ａ）単離されたポリペプチドとｂ）凝血促進、抗血栓溶解または抗線維素溶解活性を有する血液凝固剤とを含むキットに関する。１つの態様において、前記単離されたポリペプチドは、配列番号１２のアミノ酸配列、または配列番号１２に対して少なくとも８０％の相同性を有するポリペプチドを含む。もう１つの態様において、前記単離されたポリペプチドは、配列番号１３のアミノ酸配列を含む単離された二つの鎖のポリペプチド、または配列番号１３に対して少なくとも８０％の相同性を有するポリペプチドである。さらにもう１つの態様において、前記単離されたポリペプチドは、配列番号１５のアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド、または配列番号１５に対して少なくとも８０％の相同性を有するポリペプチドである。
【０１４７】
さらにもう１つの態様において、本発明は、有効量のｆＸａ誘導体と、有効量の血液凝固剤と、薬学的に許容される担体とを投与することを含む（但し、前記ｆＸａ誘導体が、血漿由来因第ＶＩＩａ因子、組換え型第ＶＩＩａ因子、新鮮凍結血漿、活性化または非活性化プロトロンビン複合体濃縮物および全血でないことを条件とする）被験体に投与された第Ｘａ因子阻害剤の抗凝血活性の逆転または中和のための、薬学的組成物に関する。
【０１４８】
一部の実施形態において、前記解毒剤は、上で説明した解毒剤のうちのいずれか１つである。一部の実施形態では、前記解毒剤を、その解毒剤の循環半減期を延長することができる部分と結合体化させる。一部の実施形態において、前記部分は、ポリエチレングリコール、アシル基、リポソーム、担体タンパク質、人工リン脂質膜、およびナノ粒子からなる群より選択される。例えば、本明細書に記載するｆＸａ誘導体の非活性部位リシンまたはシステイン残基を化学的に修飾して、ポリエチレングリコール分子に付けることができる。Ｗｅｒｌｅ，Ｍ．＆  Ｂｅｒｎｋｏｐ−Ｓｃｈｎｕｒｃｈ，Ａ．Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｔｏ  Ｉｍｐｒｏｖｅ  Ｐｌａｓｍａ  Ｈａｌｆ  Ｌｉｆｅ  Ｔｉｍｅ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｒｕｇｓ，Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  ２００６，３０（４）：３５１−３６７に提供されている他の方法を用いて、本発明の解毒剤の血漿半減期を延長することができる。
【０１４９】
本発明の他の実施形態では、前記解毒剤をＦｃ担体ドメインにカップリングさせることによってｆＸａ誘導体の半減期を改善する。１つの実施形態では、前記解毒剤を、Ｆｃフラグメント、例えば免疫グロブリンペプチド部分またはＩｇＧ１フラグメントに、カップリングさせる。１つの実施形態では、ｆＸａ誘導体と免疫グロブリンペプチド部分とを含むキメラタンパク質が考えられる。さらにもう１つの実施形態では、ｆＸａ誘導体と免疫グロブリンペプチドを化学反応によってカップリングさせる、例えば、ヒトＩｇＧ重鎖定常領域とカッパ軽鎖定常領域の場合のジスルフィド結合など。
【０１５０】
一部の実施形態において、前記薬学的組成物は、前記解毒剤の血漿半減期を延長することができる薬剤をさらに含む。もう１つの態様では、前記解毒剤の血漿半減期を延長することができる薬剤と前記薬学的組成物を併用処方した。一部の実施形態において、前記併用投与または併用処方される薬剤は、ｆＸａのエキソサイトを認識する抗ｆＸａ抗体またはアルファ−２−マクログロブリン結合ｆＸａ誘導体である。
【０１５１】
ＩＩＩ．抗体および血液凝固剤第Ｘａ因子誘導体
本発明の１つの態様において、ｆＸａ誘導体は、Ｇｌａドメイン欠失ｆＸａまたはｄｅｓ−Ｇｌａ  ｆＸａである。
【０１５２】
ｆＸａ誘導体は、低減された凝固促進活性を有するまたは凝固促進活性を有さないが、ｆＸａ阻害剤と結合することができると考えられる。そのような限定された活性が、循環野生型ｆＸａより高い濃度での解毒剤の投薬を可能にすると考えられる。一定のｆＸａ誘導体、例えばｄｅｓ−Ｇｌａ  ｆＸａおよびＧｌａ欠失ｆＸａ、は本発明の適する解毒剤である。低減または減少された凝血促進活性を有することに加えて、本発明の解毒剤は、被験体に対して実質的に非免疫原性であるはずである。ｆＸａ誘導体は、２つ以上の上記変異および／または修飾の組み合わせを含有することがある。加えて、上記ｆＸａ誘導体を単独で投与することができ、または互いに併用して投与することができる。
【０１５３】
第Ｘａ因子は、プロトロンビンをトロンビンに変換させる原因となる、血液凝固経路におけるセリンプロテアーゼである。それは、内因性Ｘａｓｅ（第ＩＸａ因子とその補体、第ＶＩＩＩａ因子、によって形成される複合体）または外因性Ｘａｓｅ（第ＶＩＩａ因子とその補因子、組織因子、によって形成される複合体）のいずれかによる活性化に基づいて不活性第Ｘ因子から生成される。活性化されたｆＸ（ｆＸａ）は、さらに、その重鎖のＣ末端においてｆＸａαをサブフォームｆＸａβに変換させる自己触媒切断を受けるだろう（Ｊｅｓｔｙ，Ｊら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９７５，２５０（１２）：４４９７−４５０４）。ｆＸａαとｆＸａβの両方が本発明の適する材料である。ｆＸａそれ自体は、凝血を支持するには十分でない遅い速度でプロトロンビナーゼに変換する。補因子Ｃａ２＋、リン脂質および第Ｖａ因子、と共にプロトロンビン複合体を形成したときのみ、ｆＸａは、凝血を支持するために十分速い速度でプロトロンビンを活性化することができる（Ｓｋｏｇｅｎ，Ｗ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９８４，２５９（４）：２３０６−１０）。前記複合体は、負の電荷を有するリン脂質とｆＸａのＧｌａドメイン内のγ−カルボキシグルタミン酸残基の間のＣａ２＋架橋による結合を必要とする。
【０１５４】
従って、Ｇｌａドメインは、ｆＸａの活性部位を含有しないが、γ−カルボキシグルタミン酸残基によりｆＸａがプロトロンビナーゼ複合体を形成できるようにする。これは、キモトリプシン消化によるｆＸａ  Ｇｌａドメインの選択的除去によって証明される（図７および実施例１参照）。キモトリプシン消化によるＧｌａドメインの切断の時間経過の間にｆＸａに関する凝固アッセイを行った。ＧｌａドメインのないｆＸａ、ｆＶａ、リン脂質およびカルシウムイオンを含む再構成されたプロトロンビナーゼが、有意に低減された率でトロンビンを生成する（天然ｆＸａを含有する対照複合体と比較して生ずる生成物０．５％）と報告されている（Ｓｋｏｇｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９８４，２５９（４）：２３０６−１０）。図７に示すように、凝血塊形成に関するｆＸａの活性は、そのｆＸａをキモトリプシンによって１５分間消化した後、ある程度低減され、３０分の消化の後、その活性は完全に失われた。従って、カルシウムイオン依存性膜結合に必要とされる適切なガンマ−カルボキシグルタミン酸残基を欠く低カルボキシル化または脱カルボキシル化ｆＸａは、集合して膜依存性凝血複合体を構築できない、および血液凝固を支持しないことが判明した（Ｍａｎｎ，ＫＧら、Ｂｌｏｏｄ，１９９０，７６：１−１６）。
【０１５５】
Ｇｌａドメイン欠失ｆＸａが、ｆＸａの活性部位指向性阻害剤を結合できないことも確証されている。（Ｂｒａｎｄｓｔｅｔｔｅｒ，Ｈら、Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．，１９９６，２７１：２９９８８−２９９９２）。活性部位クレフトの構造の説明を提供する、ｄｅｓ−ＧｌａヒトｆＸａに結合した小分子ｆＸａ阻害剤の結晶学についての報告があった（Ｂｒａｎｄｓｔｅｔｔｅｒ，Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．，１９９６，２７１：２９９８８−２９９９２およびＲｏｅｈｒｉｇ，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００５，４８（１９）：５９００−８）。図８は、ｄｅｓ−Ｇｌａ  ａｎｈｙｄｒｏ−ｆＸａが、天然ｆＸａのものに匹敵する、ｆＸａ阻害剤ベトリキサバンとの０．３１９ｎＭの結合親和性を呈示したことを示している。
【０１５６】
ｄｅｓ−Ｇｌａ  ｆＸａ、および低減された凝血促進活性を有するがｆＸａ阻害剤に結合できる他のｆＸａ誘導体を、ｆＸａ阻害剤に対する解毒剤として使用できることを今般発見した。図９に示すように、ｄｅｓ−Ｇｌａ  ａｎｈｙｄｒｏ−ｆＸａは、６８０ｎＭの濃度でベトリキサバンの抗凝血活性の完全な逆転を示した。実施例２において詳述するように、トロンビン生成は、ＴＦ含有試薬（Ｉｎｎｏｖｉｎ）の添加によって開始され、従って、外因性凝血経路における凝固因子機能を示した。前記組換え型解毒剤が多種多様な抗凝血剤を逆転させるために有用であることも、実施例９〜１３において確証された。
活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）を用いた凝固延長アッセイにより、内因性凝血経路における凝固因子の機能を決定する試薬（Ａｃｔｉｎ  ＦＳ）も、ｄｅｓ−Ｇｌａ  ａｎｈｙｄｒｏ−ｆＸａが解毒剤活性を有することを示す。図１０は、６００ｎＭで完全に逆転する、２５０ｎＭのベトリキサバンに対するｄｅｓ−Ｇｌａ  ａｎｈｙｄｒｏ−ｆＸａの用量応答解毒剤効果を示している。図１１は、ｄｅｓ−Ｇｌａ  ａｎｈｙｄｒｏ−ｆＸａが、別のｆＸａ阻害剤、エノキサパリン、の抗凝血活性も逆転できたことを示している。図１２は、ｄｅｓ−Ｇｌａ  ａｎｈｙｄｒｏ−ｆＸａが、直接トロンビン阻害剤アルガトロバンに対して有意な解毒剤活性を呈示しなかったことを示している。従って、ｄｅｓ−Ｇｌａ  ａｎｈｙｄｒｏ−ｆＸａは、ｆＸａ阻害剤の選択的解毒剤であり、および外因性経路または内因性経路のいずれかよって開始されるｆＸａ凝血促進活性も回復させることができる。
【０１５７】
さらに、ｄｅｓ−Ｇｌａ  ａｎｈｙｄｒｏ−ｆＸａの解毒剤活性が、従来の凝血測定器で測定したａＰＴＴ延長アッセイによって確証された。図１３に示すように、ｄｅｓ−Ｇｌａ  ａｎｈｙｄｒｏ−ｆＸａそれ自体は、試験した最高濃度（２５７６ｎＭ）で対照血漿のａＰＴＴに対して効果がない。４００ｎＭのベトリキサバンは、ａＰＴＴを２倍以上に延長した。ベトリキサバンに対するこの抗凝血効果は、ｄｅｓ−Ｇｌａ  ａｎｈｙｄｒｏ−ｆＸａによって用量応答的に逆転され、１６１０ｎＭより高い解毒剤濃度でａＰＴＴは対照血漿の正常レベル付近に戻る。
【０１５８】
ｆＸａ軽鎖でのさらなる末端切断、例えば、ＥＧＦ１ドメイン、ＥＧＦ１＋ＥＧＦ２ドメイン、またはそれらのフラグメントの追加の欠失、および重鎖しか有さない不活性ｆＸａは、本発明の有用な解毒剤であると考えられる。
【０１５９】
Ｇｌａドメイン欠失ｆＸａは、生理的に適切な濃度より下では正常な凝血を支持しない。しかし、前記タンパク質は、多くの基質を切断するおよびより高い濃度で凝固を生じさせる能力を有する。例えば、Ｓｋｏｇｅｎら（Ｓｋｏｇｅｎ，Ｗ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９８４，２５９（４）：２３０６−１０）は、ウシｄｅｓ−Ｇｌａ  ｆＸａが、野生型ｆＸａを基準にして約０．５〜１．０％のプロトロンビナーゼ複合体活性を有することを明らかにした。従って、ｆＸａ誘導体の凝血促進活性をさらに低減するまたは完全に排除する修飾が本発明の方法によって考えられる。そのような修飾は、例えば、ｆＸａの触媒ドメインにおけるものであり得る。
【０１６０】
ｆＸａ重鎖内の触媒ドメインをその凝血促進活性を低減するように修飾する幾つかの方法が考えられる。例えば、（配列番号７に示すような）ｆＸａの活性部位残基Ｓ３７９をデヒドロ−アラニン（実施例１参照）またはアラニン（実施例６参照）によって選択的に置換して、凝血促進活性を低減または排除することができる。ｆＸａとｆＸａのエキソサイトをターゲットにする試薬との複合体形成により、ｆＸａの高分子結合能力を阻止することができ、従って、活性部位での小分子結合能力を維持しながらその抗凝血活性を低減できることも公知である。このエキソサイトをターゲットにする試薬としては、限定ではないが、活性部位から除去される領域をターゲットにするモノクローナル抗体（Ｗｉｌｋｅｎｓ，Ｍ  ａｎｄ  Ｋｒｉｓｈｎａｓｗａｍｙ，Ｓ，Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．，２００２，２７７（１１），９３６６−９３７４）、またはα−２−マクログロブリンが挙げられる。α−２−マクログロブリン−セリンプロテアーゼ複合体、例えばトリプシン、トロンビンまたはｆＸａとのもの、が小分子基質を結合できることは、公知になっている（Ｋｕｒｏｌｗａ，Ｋ．ら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．１９８９，３５（１１），２１６９−２１７２）。
【０１６１】
その軽鎖を不変に保ちながら重鎖にのみ修飾を有する不活性ｆＸａは、図６に示すように正常なｆＸａの凝血促進活性に干渉するので、プロトロンビナーゼ阻害剤として作用するであろうということも公知である（Ｈｏｌｌｅｎｂａｃｈ，Ｓ．ら、Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．，１９９４，７１（３），３５７−６２）。従って、１つの実施形態において、ｆＸａ誘導体は、軽鎖と重鎖の両方に修飾を有する。これらの修飾が、ｆＸａ誘導体の阻害剤結合活性を維持しながら凝血促進活性と抗凝血活性の両方を低減または排除することを発見した。
【０１６２】
Ｇｌａドメイン欠失ｆＸａ誘導体または本明細書に記載する他のｆＸａ誘導体を生成するために幾つかの方法を用いることができる。例えば、Ｇｌａドメインをキモトリプシンによる切断によって完全に除去して、ＧｌａドメインのないｆＸａを生成することができる。あるいは、ＧｌａドメインのないｆＸを天然ｆＸのキモトリプシンによる切断によって生成することができる。その後、ｆＸ活性化剤によってそのＧｌａのないｆＸをＧｌａドメインのないｆＸａに変換させることができる。ｆＸは、治療すべき被験体と同じまたは種の血漿から単離される場合もあり、または異なる種の血漿から単離される場合もある。例えば、ウシｆＸはヒト血漿アッセイにおいて機能性であることが証明されている。ｆＸ活性化剤の例としては、限定ではないが、ヘビ毒、例えばラッセルクサリヘビ毒、およびｆＶＩＩａ／組織因子もしくはｆＩＸａ／ｆＶＩＩＩａの複合体が挙げられる。そのような手段は当業者に公知である。例えば、Ｒｕｄｏｌｐｈ  Ａ．Ｅ．らは、グルタミンによるＡｒｇ３４７の単一置換を有する組換え型第Ｘ因子（ｆＸ）（ｆＸＲ３４７Ｎ）から生成された組換え型ｆＸａを報告している（Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０００，３９（１１）：２８６１−２８６７）。１つの実施形態において、非ヒト源から生産されるｆＸａ誘導体は、非免疫原性または実質的に非免疫原性である。実施例７も、配列番号１２および配列番号１３のアミノ酸配列を有する組換え型解毒剤の生産方法を提供するものである。
【０１６３】
ｆＸａ誘導体をヒト血漿から精製することもでき、またはｆＸａ誘導体のために適切な遺伝子が適する宿主生物において発現される組換えＤＮＡ法によって生産することもできる。組換え型ｆＸａの発現および精製が幾つかのグループによって報告されている。例えば、組換え型ｆＸの生産については、Ｌａｒｓｏｎ，Ｐ．Ｊ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９８，３７：５０２９−５０３８、およびＣａｍｉｒｅ，Ｒ．Ｍ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２０００，３９，１４３２２−１４３２９；組換え型ｆＸａの生産についてはＷｏｌｆ，Ｄ．Ｌ．ら、Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．，１９９１，２６６（２１）：１３７２６−１３７３０を参照のこと。所望のｆＸａ変異体をコードするヌクレオチド配列を有する遺伝子修飾ｃＤＮＡを使用してこれらの手順に従って修飾ｆＸａを調製することができる。実施例６は、解毒剤としての機能活性を有する、ＧｌａドメインのないｆＸａ−Ｓ３７９変異体の直接発現についてのさらなる詳説を与えるものである。
【０１６４】
Ｇｌａドメインが欠失した活性部位変異または修飾ｆＸａ、例えば低カルボキシル化ｆＸａ、もｆＸａ阻害剤解毒剤として有用であるだろうと考えられる。低カルボキシル化ｆＸａは、タンパク質発現中にビタミンＫ誘導体を使わせない組換え手段により（ビタミンＫ誘導体は、Ｇｌａ残基を形成するための翻訳後修飾に必要とされる）、または組織培養中にワルファリンなどのビタミンＫアンタゴニストを添加することにより、調製することができる。脱カルボキシル化ｆＸａは、加熱により（Ｂａｊａｊ  Ｐ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９８２，２５７（７）：３７２６−３７３１）、またはキモトリプシンにより（ＭｏｒｉｔａＴ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９８６，２６１（９）：４０１５−４０２３）、調製することができる。原核生物系において解毒剤を産生させ、その後、ｆＸａ阻害剤結合部位のインビトロリフォールディングまたは構築を行うこともできる。
【０１６５】
Ｇｌａ残基を化学的に修飾して、カルシウムイオン依存性膜結合の原因となるカルボキシル基を除去することもできる。例えば、Ｇｌａ残基上のカルボキシル基を、脱カルボキシル化条件下で選択的に除去することができ、または例えばエステル化もしくはアミノ化によって、キャッピングすることができる。そのようなエステル化またはアミノ化は、修飾されたｆＸａが、血栓を生じさせることがある活性ｆＸａに容易に変換されないように、インビボ加水分解に対して耐性であることが望ましい。
【０１６６】
ｆＸａの他の変異体または誘導体も本発明の有用な解毒剤である。１つの実施形態において、本発明は、Ｐｅｔｅｒ  Ｊ．Ｌａｒｓｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９８，３７：５０２９−５０３８に記載されている変異体のｆＸａ阻害剤解毒剤としての使用を包含する。
【０１６７】
もう１つの実施形態において、本発明は、ｆＸａ阻害剤解毒剤を調製するための触媒不活性ｆＸａ変異体の使用を包含する。例えば、Ｓｉｎｈａ，Ｕ．ら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆ．，１９９２，３：５１８−５２４に記載されている変異体、ｒＸａｉ；Ｎｏｇａｍｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９９，２７４（４３）：３１０００−７に記載されているような、化学修飾を有する変異体、例えばデヒドロ−アラニン（アンヒドロｆＸａ）。凝血促進活性が排除された、活性部位セリン（配列番号７に示すようなｆＸナンバリングの場合はＳｒ３７９、およびキモトリプシンナンバリングの場合はＳｅｒ１９５）がアラニンで置換されたｆＸａ（ｆＸナンバリングの場合はｆＸａ−Ｓ３７９Ａ、またはキモトリプシンナンバリングの場合はｆＸａ−Ｓ１９５Ａ）もｆＸａ阻害剤解毒剤として使用することができる。本発明は、小分子阻害剤を依然として結合することができる不可逆的にアシル化された活性部位セリン残基を有するｆＸａ誘導体も構想している。可逆的にアシル化された活性部位セリンを有するｆＸａは、Ｗｏｌｆら、Ｂｌｏｏｄ，１９９５，８６（１１）：４１５３−７によって報告されている。しかし、そのような可逆的アシル化は、活性ｆＸａの時間依存性生産が可能であり、時が経つにつれて過剰な活性ｆＸａをもたらすことがある。この脱アシル化率は、Ｌｉｎ  Ｐ．Ｈ．ら、Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  Ｒｅｓ．，１９９７，８８（４），３６５−３７２に記載されているものに類似した戦略によって低下させることができる。例えば、４−メトキシベンジルおよび３−ブロモ−４−メトキシベンジル基によってアシル化されたＳｅｒ３７９（キモトリプシンナンバリングの場合はＳｅｒ１９５）を有するｆＸａ分子は、ｐＨ７．５を有する緩衝液中、３７℃で４時間インキュベートすると、それらの本来の活性の５０％未満を回復する。
【０１６８】
１つの実施形態は、補因子ｆＶ／ｆＶａとのｆＸａ相互作用にとって重要であることが公知であるｆＸａ残基での変異を有するｆＸａ誘導体の使用に関する。そのような残基としては、限定ではないが、Ａｒｇ３０６、Ｇｌｕ３１０、Ａｒｇ３４７、Ｌｙｓ３５１、またはＬｙｓ４１４（配列番号３および７、これらのアミノ酸は、キモトリプシンナンバリングの場合のＡｒｇ１２５、Ｇｌｕ１２９、Ａｒｇ１６５、Ｌｙｓ１６９、Ｌｙｓ２３０に対応する）が挙げられる。そのような変異体の例は、Ｒｕｄｏｌｐｈ，Ａ．Ｅ．ら、Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．，２００１，２７６：５１２３−５１２８に報告されている。加えて、ｆＶＩＩＩ／ｆＶＩＩＩａ相互作用にとって重要であることが公知であるｆＸａ残基、例えば、配列番号３および７におけるＡｒｇ４２４（キモトリプシンナンバリングの場合はＡｒｇ２４０）での変異も、ｆＸａ阻害剤解毒剤として使用することができる。そのような変異体の例は、Ｎｏｇａｍｉ，Ｋ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００４，２７９（３２）：３３１０４-３３１１３に記載されている。
【０１６９】
ｆＸａの活性残基またはセリンプロテアーゼ相互作用にとって重要であることが公知である残基の他の修飾、例えば、配列番号３および７におけるＧｌｕ２１６、Ｇｌｕ２１８およびＡｒｇ３３２（キモトリプシンナンバリングの場合は、それぞれ、Ｇｌｕ３７、Ｇｌｕ３９、およびＡｒｇ１５０）の他のアミノ酸残基での置換も、本発明の有用な解毒剤をもたらすことができる。
【０１７０】
１つの実施形態において、アミド分解性基質切断アッセイによって評定したとき、解毒剤の残留凝血促進活性は、ヒト血漿由来天然ｆＸａの＜１％、好ましくは＜０．１％、さらに好ましくは＜０．０５％である。例えば、活性部位Ｓｅｒ３７９（キモトリプシンナンバリングの場合のＳ１９５）をアラニン残基によって置換すると、凝固アッセイによって測定したとき、組換え型ｆＸａ−Ｓ３７９Ａについて測定可能な凝血促進活性はない。
【０１７１】
本発明は、上で説明したｆＸａ誘導体をコードする核酸配列、特にＤＮＡ配列、にさらに関する。これらは、ポリペプチド配列を遺伝子コードに従って対応するＤＮＡ配列に戻すように翻訳することにより、容易に決定することができる。好ましく用いられるコドンは、必要な宿主生物における良好な発現をもたらすものである。天然ｆＸａ遺伝子配列から出発する部位特異的変異誘発によって、でなければ完全ＤＮＡ合成によって、前記核酸配列を調製することができる。
【０１７２】
本発明のポリペプチド
一定の態様において、本発明は、配列番号１２、１３または１５のアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチドに関する。本発明は、配列番号１２、１３または１５に対して少なくとも８０％の相同性を有するポリペプチドも包含する。
【０１７３】
本発明のアミノ酸配列を含むポリペプチドは、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを適切な宿主細胞において発現させることによって調製することができる。これは、当業者に公知の組換えＤＮＡ技術の方法によって遂行することができる。従って、本発明は、真核または原核宿主細胞において本発明のポリペプチドを組換え生産するための方法も提供する。本発明のタンパク質およびポリペプチドは、市販の自動ペプチド合成装置、例えば、米国、カリフォルニア州、Ｆｏｓｔｅｒ  ＣｉｔｙのＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ／Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ、Ｍｏｄｅｌ  ４３０Ａまたは４３１Ａ、によって製造されているものを使用して化学合成によって得ることもできる。合成されたタンパク質またはポリペプチドを沈殿させ、例えば高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって、さらに精製することができる。従って、本発明は、タンパク質および試薬、例えばアミノ酸および酵素、の配列を提供すること、および前記アミノ酸を適正な配向および線形配列で互いに連結させることによる、本発明のタンパク質の化学合成プロセスも提供する。
【０１７４】
任意のペプチドを、それに改変された特性を備えさせるように修飾できることは、当業者に公知である。本発明のポリペプチドを、非天然アミノ酸を含むように修飾することができる。例えば、それらのペプチドは、Ｄ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸とＬ−アミノ酸の組み合わせ、およびペプチドに特別な特性を伝える様々な「デザイナー」アミノ酸（例えば、β−メチルアミノ酸、Ｃ−α−メチルアミノ酸、およびＮ−α−メチルアミノ酸など）を含むことがある。加えて、特定のカップリング段階に特定のアミノ酸を指定することにより、α−ヘリックス、βターン、βシート、α−ターンを有するペプチド、および環状ペプチドを生じさせることができる。一般に、α−ヘリックス二次構造またはランダム二次構造が好ましいと考えられている。
【０１７５】
さらなる実施形態において、有用な化学的および構造的特性を付与するポリペプチドのサブユニットを選択することとなる。例えば、Ｄ−アミノ酸を含むペプチドは、インビボでＬ−アミノ酸特異的プロテアーゼに対して耐性であるだろう。逆の順序で並べたアミノ酸を用いてＤ−アミノ酸を有する修飾化合物を合成して、ｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏ型ペプチドとして本発明のペプチドを生成することができる。加えて、本発明は、よりよく定義された構造特性を有するペプチドの調製、ならびに新規特性を有するペプチドを調製するためのペプチドミメティック、およびペプチドミメティック結合、例えばエステル結合、の使用を構想している。もう１つの実施形態では、還元ペプチド結合、すなわち、Ｒ１−ＣＨ２ＮＨ−Ｒ２（この式中のＲ１およびＲ２は、アミノ酸残基または配列である）が組み込まれているペプチドを生じさせることができる。還元ペプチド結合をジペプチドサブユニットとして導入することができる。そのような分子は、ペプチド結合加水分解、例えばプロテアーゼ活性、に対して耐性であろう。そのような分子は、ユニークな機能および活性、例えば代謝分解またはプロテアーゼ活性に対する耐性のために延長されたインビボ半減期、を有するリガンドをもたらすであろう。さらに、一定の系において、拘束ペプチドが強化された機能活性を示すことは周知であり（Ｈｒｕｂｙ（１９８２）Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ３１：１８９−１９９およびＨｒｕｂｙら、（１９９０）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．２６８：２４９−２６２）；本発明は、すべての他の位置にランダム配列が組み込まれている拘束ペプチドを生成する方法を提供する。
【０１７６】
特定の配座モチーフを導入するために、次の非古典的アミノ酸を本発明のペプチドに組み込むことができる：１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボキシラート（Ｋａｚｒｎｉｅｒｓｋｉら（１９９１）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１３：２２７５−２２８３）；（２Ｓ，３Ｓ）−メチル−フェニルアラニン、（２Ｓ，３Ｒ）−メチル−フェニルアラニン、（２Ｒ，３Ｓ）−メチル−フェニルアラニンおよび（２Ｒ，３Ｒ）−メチル−フェニルアラニン（Ｋａｚｍｉｅｒｓｋｉ  ａｎｄ  Ｈｒｕｂｙ（１９９１）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．３２（４１）：５７６９−５７７２）；２−アミノテトラヒドロナフタレン−２−カルボン酸（Ｌａｎｄｉｓ（１９８９）Ｐｈ．Ｄ．Ｔｈｅｓｉｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ａｒｉｚｏｎａ）；ヒドロキシ−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボキシラート（Ｍｉｙａｋｅら（１９８９）Ｊ．Ｔａｋｅｄａ  Ｒｅｓ．Ｌａｂｓ．４３：５３−７６）ヒスチジンイソキノリンカルボン酸（Ｚｅｃｈｅｌら（１９９１）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．３８（２）：１３１−１３８）；ならびにＨＩＣ（ヒスチジン環状尿素）、（Ｄｈａｒａｎｉｐｒａｇａｄａら（１９９３）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．４２（１）：６８−７７）および（Ｄｈａｒａｎｉｐｒａｇａｄａら（１９９２）Ａｃｔａ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｃ．４８：１２３９−１２４１）。
【０１７７】
特定の二次構造を誘導するために、または特定の二次構造に有利であるように、次のアミノ酸類似体およびペプチドミメティックをペプチドに組み込むことができる：ＬＬ−Ａｃｐ（ＬＬ−３−アミノ−２−プロペニドン−６−カルボン酸）、β−ターン誘導性ジペプチド類似体（Ｋｅｍｐら（１９８５）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５０：５８３４−５８３８）；β−シート誘導性類似体（Ｋｅｍｐら（１９８８）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．２９：５０８１−５０８２）；β−ターン誘導性類似体（Ｋｅｍｐら（１９８８）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．２９：５０５７−５０６０）；α−ヘリックス誘導性類似体（Ｋｅｍｐら（１９８８）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．２９：４９３５−４９３８）；α−ターン誘導性類似体（Ｋｅｍｐら（１９８９）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５４：１０９：１１５）；次の参考文献によって提供されている類似体：Ｎａｇａｉ  ａｎｄ  Ｓａｔｏ（１９８５）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．２６：６４７−６５０；およびＤｉＭａｉｏら（１９８９）Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ．ｐ．１６８７；Ｇｌｙ−Ａｌａターン類似体（Ｋａｈｎら（１９８９）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．３０：２３１７）；アミド結合同配体（Ｃｌｏｎｅｓら（１９８８）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．２９：３８５３−３８５６）；テトラゾール（Ｚａｂｒｏｃｋｉら（１９８８）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１０：５８７５−５８８０）；ＤＴＣ（Ｓａｍａｎｅｎら（１９９０）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｅｐ．Ｒｅｓ．３５：５０１：５０９）；ならびにＯｌｓｏｎら（１９９０）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１１２：３２３−３３３およびＧａｒｖｅｙら（１９９０）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５６：４３６に教示されている類似体。ベータターンおよびベータバルジの配座制限ミメティック、ならびにそれらを含有するペプチドは、１９９５年８月８日にＫａｈｎに発行された米国特許第５，４４０，０１３号記載にされている。
【０１７８】
任意のペプチドを、そのペプチドの生物学的機能を改変しない１つ以上の機能的に等価のアミノ酸で１つ以上のアミノ酸を置換することにより、修飾できることは、当業者に公知である。１つの態様では、アミノ酸を、類似した固有特性（疎水性、サイズまたは電荷を含むが、これらに限定されない）を有するアミノ酸によって置換する。置換される適切なアミノ酸を決定するために用いる方法およびそのためのアミノ酸は、当業者に公知である。非限定的な例としては、Ｄａｙｈｏｆｆら（１９７８）Ｉｎ  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｖｏｌ．５  ｓｕｐｐｌ．２（編者Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ）、３４５−３５２頁、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＤＣによって説明されているような実験置換モデル；Ｄａｙｈｏｆｆ行列（Ｄａｈｏｆｆら（１９７８）、上記）、またはＪｏｎｅｓら（１９９２）Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．８：２７５−２８２およびＧｏｎｎｅｔら（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：１４４３−１１４５によって説明されているようなＪＴＴ行列をはじめとする、ＰＡＭ行列；Ａｄａｃｈ  ａｎｄ  Ｈａｓｅｇａｗａ（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．４２：４５９−４６８によって説明されているような実験モデル；Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５−１０９１９によって説明されているようなブロック置換行列（ＢＬＯＳＵＭ）；Ｎｅｉ（１９８７）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．Ｃｏｌｕｍｂｉａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．によって説明されているようなポアソンモデル；ならびにＭｕｌｌｅｒら（２００２）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．１９：８−１３によって記載されているような最尤（ＭＬ）法が挙げられる。
【０１７９】
血液凝固剤
一部の実施形態において、前記血液凝固剤は、血液凝固を開始もしくは増進することができ、または線維素溶解もしくは血栓症を阻害することができる。一部の実施形態において、前記血液凝固剤は、凝血促進活性、抗血栓溶解活性および／または抗線維素溶解活性を有する。
【０１８０】
凝固因子、該凝固因子に関連したポリペプチド、組換え型凝固因子、およびそれらの組み合わせからなる群より前記血液凝固剤は選択することができる。因子または組換え型因子ＶＩＩ／ＶＩＩａ（例えば、Ｂｉｊｓｔｅｒｖｅｌｄ，ＮＲら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，２００２（１０６）：２５５０−２５５４；Ｂｉｊｓｔｅｒｖｅｌｄ，ＮＲら、Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ，２００４（１２４）：６５３−６５８に記載されているようなもの）、ＩＸ／ＩＸａ（例えば、米国特許出願公開番号ＵＳ  ２００８／００７５７１１参照）、Ｘ／Ｘａ（例えば、米国特許第７，２２０，５６９号参照）、ＩＩ／ＩＩａ  （例えば、Ｇａｌｌｉｓｔｌ  Ｓ．ら、Ｂｌｏｏｄ  Ｃｏａｇｕｌ  Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ．２００２  １３（７）：６５３−５に記載されているようなもの）、ＶＩＩＩ／ＶＩＩＩａ（例えば、米国特許出願公開番号：ＵＳ  ２００８／００７６７０２参照）、Ｖ／Ｖａ（例えば米国特許第７，１２５，８４６号参照）およびそれらの組み合わせからなる群より前記血液凝固剤を選択することができると、さらに考えられる。
【０１８１】
前記血液凝固剤が非特異的抗出血剤であり得ることも考えられる。吸着性化学薬品、止血剤、トロンビン、フィブリン糊、デスモプレシン、寒冷沈降物および新鮮凍結血漿、凝固因子濃縮物、活性化または非活性化プロトロンビン複合体濃縮物、Ｆｅｉｂａ  Ｖｈ、血小板濃縮物ならびにそれらの組み合わせからなる群より前記血液凝固剤を選択することができると、さらに考えられる。利用可能な血液凝固因子のさらなる例は、引用文献Ｂｒｏｏｋｅｒ  Ｍ，Ｒｅｇｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｃｌｏｔｔｉｎｇ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｓ，第８版，Ｗｏｒｌｄ  Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ，２００８において入手できる。
【０１８２】
トロンビン活性化線溶阻害因子（ＴＡＦＩ）（例えば、米国特許番号ＵＳ  ７，２９１，５８７参照）、プロテインＣインヒビター（ＰＣＩ）（例えば、米国特許出願公開番号ＵＳ  ２００８／０１０２０６４参照）、プロテインＳインヒビター（ＰＳＩ）（米国特許出願公開番号ＵＳ  ２００８／００５７０５９）、アルファ−２抗プラスミン（例えば米国特許番号ＵＳ  ７，０７８，４７９参照）、トラネキサム酸（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐａｔｉｅｎｔ．ｃｏ．ｕｋ／ｓｈｏｗｄｏｃ／３０００２１１７／に記載されているようなもの）、アミノカプロン酸（例えば、Ｅａｔｏｎ，Ｍ．Ｐ．Ａｎｅｓｔｈ  Ａｎａｌｇ．２００８  １０６（４）：１０８７−１００に記載されているようなもの）、アプロチニン（例えば、Ｌｉｕ  Ｃ．Ｍ．ら、Ｗｏｒｌｄ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．２００８  １４（９）：１４２５−９に記載されているようなもの）およびそれらの組み合わせからなる群より前記血液凝固剤を選択することができることも考えられる。
【０１８３】
１つの態様において、前記ｆＸａタンパク質誘導体は、前記血液凝固剤の投与の前に投与される。もう１つの態様において、前記ｆＸａタンパク質誘導体は、前記血液凝固剤の投与の後に投与される。さらにもう１つの態様において、前記ｆＸａタンパク質誘導体は、前記血液凝固剤と同時に投与される。さらにもう１つの態様において、前記ｆＸａタンパク質誘導体は、前記血液凝固剤と一緒に投与される。
【０１８４】
ＩＶ．ポリペプチド結合体
本発明のポリペプチドおよびポリペプチド複合体を、所期の使用に依存して変わるだろう様々な調合物で使用することができる。例えば、１つ以上のものを、他の分子（その性質は、個々の目的に依存して変わるだろう）と共有結合によりまたは非共有結合により連結させる（複合体化する）ことができる。例えば、天然および合成ポリマー、タンパク質、多糖類、ポリペプチド（アミノ酸）、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドンおよび脂質をはじめとする（しかし、これらに限定されない）高分子担体と本発明のペプチドを共有結合によりまたは非供給結合により複合体化することができる。リポソームに導入するためにポリペプチドを脂肪酸に結合体化させることができる、例えば、米国特許第５，８３７，２４９号参照。本発明のペプチドを固体支持体と共有結合によりまたは非共有結合により複合体化することができ、様々な固体支持体が当該技術分野において公知であり、本明細書に記載されている。本発明の抗原性ペプチドエピトープを、共刺激分子を伴うまたは伴わないＭＨＣ複合体などの抗原提示マトリックスと会合させることができる。
【０１８５】
タンパク質担体の例としては、超抗原、血清アルブミン、破傷風トキソイド、オボアルブミン、サイログロブリン、ミオグロブリン、および免疫グロブリンが挙げられるが、それらに限定されない。
【０１８６】
カルボジイミドなどの従来の架橋剤を使用して、ペプチド−タンパク質担体ポリマーを形成することができる。カルボジイミドの例は、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−（４−エチル）カルボジイミド（ＣＭＣ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）および１−エチル−３−（４−アゾニア−４４−ジメチルペンチル）カルボジイミドである。
【０１８７】
他の適する架橋剤の例は、臭化シアン、グルタルアルデヒドおよび無水コハク酸である。一般に、ホモ二官能性アルデヒド、ホモ二官能性エポキシド、ホモ二官能性イミド−エステル、ホモ二官能性Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ホモ二官能性マレイミド、ホモ二官能性アルキルハリド、ホモ二官能性ピリジルジスルフィド、ホモ二官能性アリールハリド、ホモ二官能性ヒドラジド、ホモ二官能性ジアゾニウム誘導体およびホモ二官能性光反応性化合物をはじめとする、多数のホモ二官能性薬剤のいずれを使用してもよい。ヘテロ二官能性化合物、例えば、アミン反応性およびスルフヒドリル反応性の基を有する化合物、アミン反応性および光反応性の基を有する化合物、ならびにカルボニル反応性およびスルフヒドリル反応性の基を有する化合物も含む。
【０１８８】
そのようなホモ二官能性架橋剤の具体的な例としては、二官能性Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル：ジチオビス（スクシンイミジルプロピオナート）、ジスクシンイミジルスベラート、およびジスクシンイミジルタータラート；二官能性イミド−エステル：ジメチルアジピミダート、ジメチルピメリミダート、およびジメチルスベリミダート；二官能性スルフヒドリル反応性架橋剤：１，４−ジ−［３’−（２’−ピリジルジチオ）プロピオンアミド］ブタン、ビスマレイミドヘキサン、およびビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタン；二官能性アリールハリド：１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼンおよび４，４’−ジフルオロ−３，３’−ジニトロフェニルスルホン；二官能性光反応性薬剤、例えばビス−［ｂ−（４−アゾジサリチルアミド）エチル］ジスルフィド；二官能性アルデヒド：ホルムアルデヒド、マロンジアルデヒド、スクシンアルデヒド、グルタルアルデヒドおよびアジポアルデヒド；二官能性エポキシド、例えば１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル；二官能性ヒドラジド：アジピン酸ジヒドラジド、カルボヒドラジドおよびコハク酸ジヒドラジド；二官能性ジアゾニウム：ｏ−トリジン、ジアゾ化およびビスジアゾ化ベンジジン；二官能性アルキルハリド：Ｎ１Ｎ’−エチレン−ビス（ヨードアセトアミド）、Ｎ１Ｎ’−ヘキサメチレン−ビス（ヨードアセトアミド）、Ｎ１Ｎ’−ウンデカメチレン−ビス（ヨードアセトアミド）、ならびにベンジルハリドおよびハロマスタード、例えば、それぞれ、ａ１ａ’−ジヨード−ｐ−キシレンスルホン酸およびトリ（２−クロロエチル）アミンが挙げられる。
【０１８９】
タンパク質とペプチドの結合体化を果たすために使用することができる一般的なヘテロ二官能性架橋剤の例としては、ＳＭＣＣ（スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシラート）、ＭＢＳ（ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）、ＳＩＡＢ（Ｎ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾアート）、ＳＭＰＢ（スクシンイミジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチラート）、ＧＭＢＳ（Ｎ−（γ−マレイミドブチリルオキシ）スクシンイミドエステル）、ＭＰＢＨ（４−（４−Ｎ−マレイミドフェニル（ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｏｈｅｎｙｌ））酪酸ヒドラジド）、Ｍ２Ｃ２Ｈ（４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシル−ヒドラジド）、ＳＭＰＴ（スクシンイミジルオキシカルボニル−α−メチル−α−（２−ピリジルジチオ）トルエン）、およびＳＰＤＰ（Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオナート）が挙げられるが、それらに限定されない。
【０１９０】
還元アミノ化によってカルボニル基をアミン基にまたはヒドラジン基にカップリングさせることにより、架橋を果たすことができる。
【０１９１】
本発明のポリペプチドを、イオン性、吸着性または生体特異的相互作用によりモノマーの非供給結合性付着物として調合することもできる。ペプチドと高い正または負電荷を有する分子との複合体化を、低イオン強度環境下での、例えば脱イオン水中での、塩架橋形成によって行うことができる。非常に多くの負および正電荷をそれぞれ含有するポリ−（Ｌ−グルタミン酸）またはポリ−（Ｌ−リシン）などの荷電ポリマーを使用して、大きな複合体を作ることができる。微粒子ラテックスビーズなどの表面への、または他の疎水性ポリマーへのペプチドの吸着を行って、架橋されたまたは化学的に重合されたタンパク質を有効に模倣する非共有結合により会合しているペプチド−超抗原複合体を形成することができる。最後に、ペプチドを、他の分子間の生体特異的相互作用の使用によって、非共有結合により連結させることができる。例えば、アビジンもしくはストラプタビジンなどのタンパク質またはそれらの誘導体に対するビオチンの強い親和性の利用を、ペプチド複合体を形成するために用いることができよう。これらのビオチン結合タンパク質は、溶解状態でビオチンと相互作用することができる、または別の分子に共有結合により付けることができる、４つの結合部位を含有する。（Ｗｉｌｃｈｅｋ（１９８８）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７１：１−３２参照）。タンパク質上の利用可能なアミン基と反応する一般的なビオチン化試薬、例えばＤ−ビオチンのＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル（ＮＨＳ−ビオチン）、を使用して、ビオチン基を有するようにペプチドを修飾することができる。その後、ビオチン化ペプチドをアビジンまたはストレプタビジンと共にインキュベートして、大きな複合体を作ることができる。ビオチン化ペプチドのアビジンまたはストレプタビジンに対するモル比の注意深い制御によって、そのようなポリマーの分子量を調節することができる。
【０１９２】
本出願は、診断法において使用するために、標識、例えば蛍光または生物発光標識、に結合体化させた本明細書に記載するペプチドおよびポリペプチドも提供する。例えば、直接標識したペプチドおよびポリペプチドをカラムに結合させ、抗体の検出または精製のために使用することができる。適する蛍光標識としては、フルオレセイン、ローダミン、テトラメチルローダミン、エオシン、エリスロシン、クマリン、メチル−クマリン、ピレン、Ｍａｌｅｃｉｔｅグリーン、スチルベン、ルシファーイエロー、Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｌｕｅ（商標）、およびテキサスレッドが挙げられるが、それらに限定されない。他の適する光学色素は、Ｈａｕｇｌａｎｄ，Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｐ．（１９９６）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋに記載されている。
【０１９３】
本発明のポリペプチドを様々な液相担体、例えば滅菌溶液または水溶液、薬学的に許容される担体、懸濁液およびエマルジョン、と併用することもできる。非水性溶媒の例としては、プロピルエチレングリコール、ポリエチレングリコールおよび植物油が挙げられる。抗体の調製に用いるとき、担体は、特異的免疫応答を非特異的に増加させるために有用であるアジュバントを含む場合もある。当業者は、アジュバントが必要であるかどうかを容易に決めることができ、アジュバントを選択することができる。しかし、例証のみを目的として、適するアジュバントとしては、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、および無機塩が挙げられるが、それらに限定されない。
【０１９４】
Ｖ．療法
本発明は、抗凝固療法を受けている被験体における出血を予防または低減する治療法に関する。本発明の解毒剤は、有害な血液動態副作用または傷害に対する増殖性血管応答の憎悪を生じさせることなく、ｆＸａ阻害剤の従来の抗凝血特性を安全におよび特異的に中和することができる、選択的状況または緊急事態に使用することができる短期の薬であり得ると考えられる。
【０１９５】
１つの実施形態において、治療有効量の解毒剤は、高い治療指数を呈示する。治療指数は、ＬＤ５０とＥＤ５０の間の比として表示することができる毒性効果と治療効果の間の用量比である。ＬＤ５０は、集団の５０％に対して致死的な用量であり、ＥＤ５０は、集団の５０％において治療的に有効な用量である。ＬＤ５０およびＥＤ５０は、標準的な薬学的手順により動物細胞培養または実験動物において決定される。被験体の血漿中に存在するｆＸａ阻害剤の効果を中和するために必要とされるときに、本発明の解毒剤または誘導体を１回または数回投与することができる。好ましくは、本発明の解毒剤は、単回用量で投与したとき十分なものである。
【０１９６】
本発明の代表的な解毒剤投薬量は、実際の臨床設定および血漿中の阻害剤濃度に依存するであろう。インビトロアッセイ、例えばトロンビン生成、臨床的凝固アッセイ、例えばａＰＴＴ、ＰＴおよびＡＣＴ、において、治療有効量の解毒剤は、エクスビボ凝固活性の１０％より大きな補正を生じさせると予想される。インビトロアッセイは、解毒剤／阻害剤比＞０．５が逆転効果を示すはずであることを示す。解毒剤についての最大血漿濃度は、マイクロモル範囲である、おそらく１０マイクロモル以下であると予想される。
【０１９７】
臨床設定で、解毒剤の有効性を決定する基準の１つは、出血の実際の測定値の何らかの変化をそれが生じさせることである。臨床試験において、大出血のカテゴリーは、致命的出血（ｈｅｍｏｒｒｈａｇｅ）、生命維持に必要不可欠な器官への（頭蓋内、眼内、後腹膜、脊髄、心嚢内）出血、再手術または新たな治療手技（例えば、手術した膝関節の吸引、血胸のための開胸チューブ挿入、内視鏡的電気凝固術など）を必要とする任意の出血、または顕性出血を伴う場合には≧２．０の出血指数を含む。前記出血指数は、出血エピソード前のヘモグロビン値を加え、出血が安定した後のヘモグロビン値を引いた、（デシリットルあたりのグラム数での）輸血した濃縮赤血球または全血の単位数と定義される。
【０１９８】
臨床設定での解毒剤効力についてのもう１つの基準は、それが臨床的に有意な非大出血を低減することである。出血（ｈｅｍｏｒｒｈａｇｅ）のこのカテゴリーは、持続性または再発性である、および実質的な量である、または介入なしでは停止しないであろう鼻出血；治療手技（例えば、Ｆｏｌｅｙカテーテルの新たな挿入または膀胱鏡検査）を必要とするレベルまで行かない直腸出血または尿路出血、特発的であるまたは些細な外傷で発生する、注射部位または他の箇所での実質的血腫；実質的血失；ならびに予定外の輸血を必要とする出血をはじめとする、大きくないが通常よりは多いおよび臨床的注意を是認する出血を含む。本明細書において用いる場合、「実質的失血」は、外科手術手順に通常付随する量より多い失血量を指す。実質的失血は、腫脹をもたらし、これは、ドレナージを必要とするほどではないので、保存的に管理される。
【０１９９】
１つの実施形態において、本発明の誘導体は、血漿中に存在するｆＸａ阻害剤を実質的に中和するための十分な血漿循環半減期を有する。活性化されたｆＸａは、ＡＴＩＩＩ、ＴＦＰＩおよび他の血漿阻害剤によって有効に阻害されるので、ヒトにおける循環半減期を本質的に有さない（Ｆｕｃｈｓ，Ｈ．Ｅ．ａｎｄ  Ｐｉｚｚｏ，Ｓ．Ｖ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１９８３，７２：２０４１−２０４９）。ヒヒモデルにおいて、ＤＥＧＲ（［５−（ジメチルアミノ）１−ナフタレンスルホニル］−グルタミルグリシルアルギニルクロロメチルケトン）によって活性部位において阻止されるｆＸａの半減期は、同位体または酵素結合イムノソルベントアッセイによりって決定したとき、それぞれ、おおよそ１０時間または２時間であった（Ｔａｙｌｏｒ，Ｆ．Ｂ．ら、Ｂｌｏｏｄ，１９９１，７８（２）：３６４−３６８）。
【０２００】
解毒剤ｆＸａ誘導体の半減期を２４〜４８時間に延長することが、望ましいことがある。以下の部分のうちの１つ以上の結合体化または付加は解毒剤の血漿半減期を増加させるであろうと考えられる：
ａ）ポリエチレングリコール；
ｂ）アシル基；
ｃ）リポソームおよびカプセル化剤；
ｄ）担体タンパク質；
ｅ）人工リン脂質膜；
ｆ）免疫グロブリン；および
ｇ）ナノ粒子。
【０２０１】
結合体化部位は、結合体化が解毒剤の阻害剤結合部位（単数または複数）をマスクしない限り、特定の鎖または残基に限定されないだろう。本明細書に記載する解毒剤は、上で説明した化合物のうちのいずれか１つまたは１つより多くと併用で投与することができる。
【０２０２】
一般に、投与される抗体は、循環血液凝固タンパク質よりはるかに長い半減期を有する。Ｇｌａドメイン欠失ｆＸａとｆＸａのエキソサイトに結合した抗体とから成る複合体を、延長された循環半減期を有する解毒剤として使用することができる。ｆＸａとそのエキソサイトをターゲットにする抗体との複合体の形成は、該複合体が解毒剤として作用して小分子阻害剤に対する活性部位を結合するために、活性部位クレフトを乱さないままでＧｌａドメイン欠失ｆＸａと高分子基質および阻害剤、例えばプロトロンビンおよびアンチトロンビンＩＩＩ、との相互作用を低減することができる。α−２−マクログロブリン−ｆＸａ複合体の形成も、ｆＸａ小分子阻害剤に対する解毒剤として有用である場合がある。
【０２０３】
当業者は、ｆＸａ阻害剤の抗凝血活性の逆転における前記解毒剤の効力ならびにその凝血促進活性を、インビトロアッセイおよび動物モデルによって決定することができる。インビトロアッセイの例は、トロンビン生成、抗第Ｘａ因子単位、臨床的凝固アッセイ、例えばａＰＴＴ、ＰＴおよびＡＣＴである。本発明の解毒剤は、エクスビボ凝固活性の１０％以上の補正を生じさせることができると考えられる。例えばマウスなどの齧歯動物、イヌ、およびサルなどの霊長類における出血時間および／または失血の幾つかの動物モデルを使用して、効力を測定することができる。
【０２０４】
ＶＩ．薬学的組成物
本発明は、ｆＸａ誘導体および血液凝固剤を含み、薬学的に許容される担体を場合により含む組成物をさらに提供する。配列番号１２、１３もしくは１５のアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド、または配列番号１２、１３もしくは１５に対して少なくとも８０％の相同性を有するポリペプチドと、血液凝固剤とを含み、薬学的に許容される担体を場合により含む組成物も提供する。
【０２０５】
「薬学的に許容される担体」は、本発明の組成物において使用することができる任意の希釈剤、賦形剤または担体を指す。薬学的に許容される担体としては、イオン交換樹脂、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清タンパク質、例えばヒト血清アルブミン、緩衝物質、例えばリン酸塩、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸ナトリウム、飽和植物性脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、塩または電解質、例えば硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイド状シリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース系物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリラート、ワックス、ポリエチレン−ポリオキシプロピレン−ブロックポリマー、ポリエチレングリコールおよび羊毛脂が挙げられる。適する薬学的に許容される担体は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、この分野の標準参照テキスト、に記載されている。好ましくは、それらは、所期の投与形態、例えば経口錠剤、カプセル、エリキシル、シロップおよびこれらに類するもの、を基準にして、ならびに従来の薬学的実施と矛盾なく、選択される。
【０２０６】
本発明の薬学的組成物は、当該技術分野において周知の方法、例えば、数ある中でも、従来の造粒、混合、溶解、カプセル化、凍結乾燥または乳化プロセス、によって製造することができる。顆粒、沈殿物もしくは微粒子、粉末（フリーズドライド、回転乾燥もしくは噴霧乾燥粉末を含む）、非晶質粉末、注射剤、エマルジョン、エリキシル、懸濁液または溶液をはじめとする様々な形態で組成物を製造することができる。調合物は、安定剤、ｐＨ調節剤、界面活性剤、バイオアベイラビリティー調節剤およびこれらの組み合わせを場合により含むことがある。
【０２０７】
滅菌液、例えば油、水、アルコールおよびそれらの組み合わせを、使用して、懸濁液または溶液として医薬調合物を調製することができる。薬学的に適する界面活性剤、懸濁化剤または乳化剤を経口または非経口投与のために添加することがある。懸濁液は、油、例えば落花生油、ごま油、綿実油、トウモロコシ油およびオリーブ油、を含むことがある。懸濁製剤は、脂肪酸のエステル、例えばオレイン酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル、脂肪酸グリセリドおよびアセチル化脂肪酸グリセリド、も含有することがある。懸濁調合物は、アルコール、例えばエタノール、イソプロピルアルコール、ヘキサデシルアルコール、グリセロールおよびプロピレングリコールを含むことがある。エーテル、例えばポリ（エチレングリコール）、石油炭化水素、例えば鉱油およびワセリン、ならびに水も懸濁調合物において使用することができる。
【０２０８】
本発明の組成物は、哺乳動物、好ましくは人間、への薬学的投与用に調合される。本発明のそのような薬学的組成物を様々な方法で投与、好ましくは非経口投与、することができる。
【０２０９】
緊急事態の際に患者の血漿中に存在するｆＸａ阻害剤の抗凝血活性を迅速に逆転するために、本発明の解毒剤を非経口投与によって全身循環に投与することができまたは投与してもよいと考えられる。前記ｆＸａ誘導体および前記血液凝固剤を別々に投与してもよく、または一緒に投与してもよい。本明細書において用いる場合の用語「非経口の」は、皮下、静脈内、筋肉内、関節内、滑液包内、胸骨内、髄腔内、肝臓内、病変内および頭蓋内注射または注入技術を含む。しかし、中和することとなるｆＸａ阻害剤が長い血漿半減期を有する場合、ｆＸａ阻害剤に結合し、そして身体からのｆＸａ阻害剤のクリアランス前にそれが活性ｆＸａを解放するために持続注入または持続放出調合物が必要とされることがある。
【０２１０】
本発明の組成物の滅菌注射用形態は、水性懸濁液である場合もあり、または油性懸濁液である場合もある。これらの懸濁液は、適する分散または湿潤剤および懸濁化剤を使用して当該技術分野において公知の技術に従って調合することができる。滅菌注射用製剤は、例えば１，３−ブタンジオール中の溶液のような非毒性で非経口的に許容される希釈剤または溶媒中の滅菌注射用溶液または懸濁液である場合もある。利用することができる許容されるビヒクルおよび溶媒には、リンガー溶液および等張塩化ナトリウム溶液などがある。加えて、滅菌固定油が溶媒または懸濁媒体として従来利用されている。このために、合成モノまたはジグリセリドをはじめとする任意の無菌固定油を利用することができる。脂肪酸、例えばオレイン酸およびそのグリセリド誘導体は、注射剤調製に有用であり、薬学的に許容される天然油、例えばオリーブ油またはヒマシ油、とりわけそれらのポリオキシエチル化バージョンのものも有用である。これらの油溶液または懸濁液は、長鎖アルコール希釈剤または分散剤、例えば、カルボキシメチルセルロース、またはエマルジョンおよび懸濁液をはじめとする薬学的に許容される剤形の調合に一般に使用される同様の分散剤を含有することもある。他の一般に使用される界面活性剤、例えばＴｗｅｅｎｓ、Ｓｐａｎおよび他の乳化剤、または薬学的に許容される固体、液体もしくは他の剤形の製造に一般に使用されるバイオアベイラビリティー向上剤も調合のために用いることがある。注射による、例えばボーラス注射または持続注入による、非経口投与用に化合物を調合することができる。注射用の単位剤形がアンプル内にある場合もあり、または多回投与用容器内にある場合もある。
【０２１１】
上で説明した剤形に加えて、薬学的に許容される賦形剤および担体および剤形は、当業者に一般に公知であり、本発明に含まれる。任意の個々の患者についての具体的な投薬および処置レジメが、利用する具体的な解毒剤の活性、患者の年齢、体重、全身の健康状態、性別および食事、腎および肝機能、ならびに投与の回数、排泄率、薬物併用、処置する医師または獣医の判断、ならびに処置する個々の疾病の重症度をはじめとする様々な要因に依存するであろうことは、理解されるはずである。
【０２１２】
ＶＩＩ．キット
本発明は、キットまたはパッケージをさらに提供する。一部の実施形態において、本発明のキットは、（ａ）ｆＸａ誘導体、あるいは配列番号１２、１３もしくは１５のアミノ酸配列を含むまたは配列番号１２、１３もしくは１５に対して少なくとも８０％の相同性を有する単離ポリペプチドを含有する、第一の容器、（ｂ）血液凝固剤を含有する第二の容器を含む。他の実施形態において、前記キットは、血栓の処置のための規則的投与のためのｆＸａ阻害剤をさらに含む。他の実施形態において、前記キットは、これらの薬剤をいつ使用すべきかを説明するラベルを含む。
【０２１３】
前記第一および第二の容器は、ボトル、ジャー、バイアル、フラスコ、注射器、チューブ、バッグ、または医薬品の製造、保管もしくは流通に用いられる他の容器であり得る。添付文書は、そのキットの薬学的組成物に関係がある情報を列挙するラベル、タグ、マーカーまたはこれらに類するものであり得る。列挙される情報は、その薬学的組成物を販売することとなる地域を管理する監督機関、例えば米国食品医薬品局（Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）、によって、通常、決定されるであろう。好ましくは、添付文書には、その薬学的組成物が認可されている適応症が具体的に列挙される。添付文書は、その中のまたはその上の情報を人が読むことができるいずれの材料で作られていてもよい。好ましくは、添付文書は、所望の情報が印刷されたまたは塗布された印刷可能な材料、例えば、紙、裏紙に接着剤の付いた厚紙、ホイルまたはプラスチックおよびこれらに類するものである。
【実施例】
【０２１４】
本発明は、本発明を単に例示するためのものである以下の実施例を参照することによってさらに理解される。本発明は、単に本発明の単一の態様の例証と解釈されるこれらの例示する実施形態によって範囲を限定されない。機能的に等価であるいずれの方法も本発明の範囲内である。本明細書に記載するものに加えて、本発明の様々な変形が、上述の説明および添付の図から当業者には明らかになるであろう。そのような変形は、添付の特許請求の範囲の範囲内に入る。
【０２１５】
別様に述べていない限り、すべての温度は、摂氏度でのものである。また、これらの実施例および他の箇所における略語は、以下の意味を有する：
【０２１６】
【化３】
2014198719.tif 000004
実施例１．キモトリプシン消化によるｄｅｓ−Ｇｌａ  ａｎｈｙｄｒｏ−ｆＸａの調製
デヒドロアラニンが活性部位セリンを置換しているアンヒドロ−ｆＸａとキモトリプシンとをｐＨ７．５の０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１Ｍ  ＮａＣｌ中、２２℃で６０分間インキュベートすることにより、Ｍｏｒｉｔａ，Ｔ．ら、Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．，１９８６，２６１（９）：４０１５−４０２３の手順に従って、ｄｅｓ−Ｇｌａ  ａｎｈｙｄｒｏ−ｆＸａを調製した。代表的な実験設定では、０．５ミリグラム／ミリリットル（ｍｇ／ｍＬ）アンヒドロ−ｆＸａを５単位／ミリリットル（Ｕ／ｍＬ）α−キモトリプシン−アガロースビーズと共に穏やかに攪拌しながらインキュベートした。反応終了時、α−キモトリプシン−アガロースビーズを遠心分離または濾過によって除去した。この後、過剰量の阻害剤４−アミジノ−フェニル−メタン−スルホニルクロリド（ＡＰＭＳＦ）、トシル−Ｌ−リシンクロロメチルケトン（ＴＬＣＫ）、およびトシル−Ｌ−フェニルアラニンクロロメチルケトン（ＴＰＣＫ）と共にインキュベートして、残留ｆＸａ活性、またはビーズから浸出したと思われるキモトリプシンの一切の活性を失活させた。Ｇｌａドメインフラグメントおよび阻害剤を、最終生成物、ｄｅｓ−Ｇｌａ  ａｎｈｙｄｒｏ−ｆＸａ、から、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  ｆｉｌｔｅｒ  ｄｅｖｉｃｅ（ＹＭ１０膜）により、または従来の透析により除去した。必要な場合には、濃縮または緩衝液交換も同時に実行した。
【０２１７】
Ｎｏｇａｍｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９９，２７４（４３）：３１０００−７によって報告された手順に従ってＧｌａ含有アンヒドロ−ｆＸａを調製した。図５に示すように、Ｇｌａ含有アンヒドロ−ｆＸａは、減少された酵素活性を有するが、ベトリキサバンなどのｆＸａ阻害剤を結合することができる。このことを実施例４において詳細に説明する。
【０２１８】
α−キモトリプシン−アガロースビーズは、Ｓｉｇｍａから購入したものであり、比活性（Ｕ／ｍＬ）は、用いた特定のロット番号についての製造業者のデータに準拠した。
【０２１９】
ＡＰＭＳＦを使用せずに上の手順に従って活性ｆＸａのキモトリプシン消化を行うことができる。下の実施例３において説明する手順に従って、活性ｆＸａの凝固活性を、キモトリプシン消化前、ならびに１５、３０および６０分のキモトリプシン消化の後に決定した。図７は、３０分のキモトリプシン消化後、凝固活性の完全喪失を示している。Ｇｌａドメインの完全除去を確保にするためにインキュベーション時間を６０分に延長した。
【０２２０】
実施例２．乏血小板血漿（ＰＰＰ）または多血小板血漿（ＰＲＰ）におけるトロンビン生成アッセイ
この実施例では、ヒト乏血小板または多血小板血漿サンプルを、０．３２％クエン酸塩の中に取った健常ドナーの血液から調製した。抗凝血剤処理した血液を室温でそれぞれ重力〜１００Ｘまたは重量１０００Ｘで２０分間回転させることによって、ＰＲＰおよびＰＰＰを調製した。７５〜１００マイクロリットル（ｕＬ）血漿をＣａＣｌ２およびＺ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−アミノメチルクマリン（Ｚ−ＧＧＲ−ＡＭＣ、トロンビン蛍光原基質）と混合した。組織因子（Ｉｎｎｏｖｉｎ、Ｄａｄｅ  Ｂｅｈｒｉｎｇ）を添加して、トロンビンの生成を開始させた。代表的な実験についての反応混合物は、１５ミリモル（ｍＭ）Ｃａ２＋、１００マイクロモル（μＭ）Ｚ−ＧＧＲ−ＡＭＣ、および０．１ナノモル（ｎＭ）組織因子（ＴＦ）（Ｉｎｎｏｖｉｎ）を含有した。蛍光プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）により相対蛍光単位（ＲＦＵ）を測定しながら３７℃で継続的にトロンビン形成をモニターした。存在する場合には阻害剤および解毒剤を血漿と共に２０分間、室温でインキュベートし、その後、トロンビン生成を開始させた。
【０２２１】
このアッセイを用いる様々な実験の結果を図４、６および９において見つけることができる。
【０２２２】
実施例３．凝固延長アッセイ
２つの凝固アッセイ形式を用いて、第Ｘａ因子阻害剤および解毒剤の凝固延長に対する効果を検査した。第一の形式では、９６ウエルプレートを使用して多数のサンプルを同時に測定した。第二のアッセイ形式では、ａＰＴＴを従来の凝血計測器（ＭＬＡ  Ｅｌｅｃｔｒａ  ８００自動凝血時間測定器）で測定した。
【０２２３】
９６ウエルプレート形式の方法では、実施例２における手順と同様にヒト乏血小板血漿または多血小板血漿を調製した。７５〜１００μＬ血漿にＣａＣｌ２でカルシウム再加を施し、それを３７℃で３分間インキュベートし、組織因子（Ｉｎｎｏｖｉｎ、Ｄａｄｅ  Ｂｅｈｒｉｎｇ）またはａＰＴＴ試薬（Ａｃｔｉｎ  ＦＳ、Ｄａｄｅ  Ｂｅｈｒｉｎｇ）の添加により凝血塊形成を開始させた。ＯＤ４０５の変化をプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）によって継続的にモニターした。凝固時間を、吸光度（ＯＤ４０５ｎｍ）変化の半最大値に達したときの時間（秒）と定義した。存在する場合には第Ｘａ因子阻害剤および解毒剤を血漿と共に室温で２０分間プレインキュベートし、その後、反応を開始させた。
【０２２４】
図７に示すように活性ｆＸａをその凝固活性について試験したとき、７５〜１００ｕＬ  ｆＸ欠失血漿（Ｇｅｏｒｇｅ  Ｋｉｎｇ  Ｂｉｏ−Ｍｅｄｉｃａｌ，Ｉｎｃ．）にＣａＣｌ２でカルシウム再加を施し、それを３７℃で３分間インキュベートし、キモトリプシン消化後のｆＸａ産物をその血漿に添加して凝血塊形成を開始させた。前に説明したようにプレートリーダーによってＯＤ４０５の変化を継続的にモニターした。
【０２２５】
図１３では、健常ヒト血漿のａＰＴＴ延長に対する４００ｎＭ  ベトリキサバンの効果および解毒剤ｄｅｓ−Ｇｌａ  ａｎｈｙｄｒｏ−ｆＸａによるベトリキサバン阻害効果の逆転を、ＭＬＡ  Ｅｌｅｃｔｒａ  ８００  Ａｕｔｏｍａｔｉｃ凝血時間測定器で測定した。１００μＬのプールされたヒト血漿を４００ｎＭ  ベトリキサバンおよび異なる濃度の解毒剤と混合した。凝固時間の測定についての製造業者の説示に従ってａＰＴＴ試薬（Ａｃｔｉｎ  ＦＳ、Ｄａｄｅ  Ｂｅｈｒｉｎｇ）およびＣａＣｌ２を添加した。
【０２２６】
このアッセイを用いる追加の実験の結果を図１０および１１において見つけることができる。
【０２２７】
実施例４．ベトリキサバンによるｆＸａの阻害のアンヒドロ−ｆＸａまたはｄｅｓ−Ｇｌａ  ａｎｈｙｄｒｏ−ｆＸａによる逆転
ベトリキサバンによるｆＸａ活性の阻害およびその阻害効果の逆転を測定するために、精製された活性ｆＸａ、異なる濃度のベトリキサバンおよびアンヒドロ−ｆＸａまたはｄｅｓ−Ｇｌａ  ａｎｈｙｄｒｏ−ｆＸａを、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  Ｃａ２＋および０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に添加した。室温で２０分間のインキュベーションの後、１００μＭ  Ｓｐｅｃｔｒｏｚｙｍｅ−ｆＸａ（第Ｘａ因子発色基質、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ）をその混合物に添加し、基質切断速度をプレートリーダーにより４０５ナノメートル（ｎｍ）で５分間、継続的にモニターした。図５において、発色活性は、一切の阻害剤がない場合の活性ｆＸａに正規化された。阻害剤および解毒剤濃度の関数として生成物形成の初期速度を線形回帰により解析して、解毒剤に対するベトリキサバンの親和性を推定した（図８）。
【０２２８】
発色基質Ｓ２２８８（２００μＭ）に向けてのトロンビン活性に対する解毒剤ｄｅｓ−Ｇｌａ  ａｎｈｙｄｒｏ−ｆＸａの効果を、Ａｒｇａｔｒｏｂａｎ、特異的小分子ＩＩａ阻害剤、を用いてまたは用いずに、前と同様に測定した。予想通り、解毒剤（５３８ｎＭ）は、ＩＩａ（５ｎＭ）のアミド分解活性または５０ｎＭ  Ａｒｇａｔｒｏｂａｎによるその阻害に対して影響を及ぼさない。
【０２２９】
実施例５．脱カルボキシル化γ−カルボキシグルタミン酸残基を有するｆＸａの調製
例えば、Ｂａｊａｊら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９８２，２５７（７）：３７２６−３７３１によって報告された手順に基づいて、ｆＸａタンパク質を処理することにより、脱カルボキシル化γ−カルボキシグルタミン酸残基を有するｆＸａ誘導体を調製することができる。ｐＨ８．０で２ｍＬの０．１モル重炭酸アンモニウム中の２から５ｍｇの精製されたまたは組換え型ｆＸａを凍結乾燥させる。得られた粉末を２０μｍ未満の真空下で密封し、様々な期間にわたって１１０℃で加熱して脱カルボキシル化ｆＸａを得る。
【０２３０】
実施例６．組換え型ｄｅｓ−Ｇｌａ  ｆＸａ−Ｓ３７９Ａの調製
変異誘発および分子生物学の一般的な手順に従って適する宿主生物においてｆＸ（配列番号１、３）またはｆＸａ誘導体（配列番号４、５、９および１１）を発現させるためにｆＸ  ｃＤＮＡ（配列番号２）に基づく以下の手順のうちの１つを用いて組換えＤＮＡ法によりｆＸａ誘導体を生成することができる。
【０２３１】
組換え型ｆＸおよびｆＸ誘導体を、Ｌａｒｓｏｎ，Ｐ．Ｊ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９８，３７：５０２９−５０３８、およびＣａｍｉｒｅ，Ｒ．Ｍ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２０００，３９，１４３２２−１４３２９に記載されている手順に基づいて、例えばヒト胚性腎細胞ＨＥＫ２９３において発現させることができる。組換え型ｆＸを第Ｘ因子活性化剤ラッセルクサリヘビ毒（Ｒｕｓｓｅｌｌ’ｓ  Ｖｉｐｅｒ  Ｖｅｎｏｍ：ＲＶＶ）によってｒｆＸａに活性化することができる。実施例１において説明した手順に基づいてｒｆＸａをさらに処理してｄｅｓ−Ｇｌａ  ａｎｈｙｄｒｏ−ｆＸａにすることができる。
【０２３２】
活性部位セリン残基がアラニンにより置換されている組換え型ｆＸ−Ｓ３７９Ａ（キモトリプシンナンバリングの場合はＳ１９５Ａ）、および好ましくは活性化ｆＸａ変異体、ｒｆＸａ−Ｓ３７９Ａ、を、Ｓｉｎｈａら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆ．１９９２，３：５１８−５２４；Ｗｏｌｆ，Ｄ．Ｌ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９１，２６６（２１）：１３７２６−１３７３０によって記載された手順に基づいて、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞において発現させることができる。
【０２３３】
実施例１において説明した手順に従ってｆＸａ−Ｓ３７９Ａのキモトリプシン消化によりｄｅｓ−Ｇｌａ  ｆＸａ−Ｓ３７９Ａを調製することができる。
【０２３４】
さらに好ましくは、ｄｅｓ−Ｇｌａ  ｆＸａ−Ｓ３７９Ａを、変異誘発手順によるＧｌａドメインフラグメントの欠失を伴う以前の手順に従って、直接発現させることができる。例えば、組換えタンパク質発現を用いて、配列番号３のＧｌａドメインフラグメント１〜３９の除去後にｄｅｓ−Ｇｌａ（１〜３９）−ｆＸａ−Ｓ３７９Ａを；デヒドロ−アラニンがアラニンによって置換されている配列番号１０と等価のｄｅｓ−Ｇｌａ（１〜４４）−ｆＸａ−Ｓ３７９Ａを；および全Ｇｌａドメインが除去されているｄｅｓ−Ｇｌａ（１〜４５）−ｆＸａ−Ｓ３７９Ａ（配列番号１１）を、発現させることができる。
【０２３５】
ＥＧＦ１またはＥＧＦ１＋ＥＧＦ２ドメインでのさらなる末端切断（図２）を行って、ｄｅｓ（１〜８４）−ｆＸａ−Ｓ３７９Ａまたはｄｅｓ（１〜１２８）−ｆＸａ−Ｓ３７９Ａ誘導体を発現させることもできる。
【０２３６】
実施例７．ＣＨＯ細胞における組換え型ｆＸａ変異体の発現
この実施例は、ＧｌａドメインのないｆＸａ−Ｓ３７９Ａ（キモトリプシンナンバリングの場合はＳ１９５Ａ）変異体の組換えタンパク質発現構築物および直接発現のための細胞系を説明するものである。この組換え型解毒剤は、ｐｄ−Ａｎｔｉｄｏｔｅを生成するために必要な活性化または化学修飾段階を必要とせず、ならびに本明細書において論じるインビトロアッセイにおいて血漿由来タンパク質に匹敵する親和性を有する。
【０２３７】
この実施例において、ｆＸａ変異体（配列番号１３、表１２ａ）をＣＨＯ細胞において直接発現させ（発現ベクターについては図１４を参照のこと）、下で説明するような条件培地から機能性タンパク質を精製した。組換え型解毒剤（ｒ−Ａｎｔｉｄｏｔｅ）機能活性をインビトロでおよび動物モデルにおいて試験した（図８）。
【０２３８】
ＰＣＲを用いて、ｆＸのｃＤＮＡ配列（配列番号２）を３領域で変異させた。第一の変異は、ＦＸのＧｌａドメインにおける６〜３９ａａの欠失であった（配列番号３、図３）。第二の変異は、活性化ペプチド配列１４３〜１９４ａａの−ＲＫＲ−での置換であった。これは、軽鎖と重鎖を接続する−ＲＫＲＲＫＲ−リンカーを生成した。分泌により、ＣＨＯにおいてこのリンカーが除去されて、二本鎖ｆＸａ分子を生じさせる。第三の変異は、活性部位残基Ｓ３７９のＡｌａ残基への変異である。
【０２３９】
今まさに説明したｃＤＮＡ（配列番号１６）によって生成されたポリペプチドを表１２（配列番号１２）に記載する。前記ｃＤＮＡと前記ポリペプチドのアラインメントを図２１に示す。分泌後に生成された二本鎖ｆＸａ分子は、表１２ｂに記載する軽鎖フラグメント（配列番号１４）および表１２ｃに記載する重鎖フラグメント（配列番号１５）である。
【０２４０】
ｆＸ配列内の最初の１〜５ａａを保存し、ｆＸａ変異体のポリペプチドとｆＸのプレプロペプチド（配列番号１、図１）を接続するために使用して、ｆＸａ変異体におけるプロプロペプチドの適正なプロセッシングを確保した。
【０２４１】
上に記載したｆＸａ変異体のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列をシークエンシングし、図１４に示す発現ベクターに挿入した。この発現ベクターのポリヌクレオチドを配列番号１８に示す。プラスミドＤＮＡを線形化し、ＣＨＯ  ｄｈｆｒ（−）細胞にトランスフェクトした。テトラヒドロ葉酸塩（ＨＴ）欠失培地＋メトトレキサート（ＭＴＸ）を使用して細胞を選択した。ｆＸ  ＥＬＩＳＡキット（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログ番号ＦＸ−ＥＩＡ）を使用して高タンパク質発現について安定なクローンをスクリーニングした。ＦＸａ変異タンパク質を無血清培地において発現させ、条件培地を回収し、精製のために処理した。
【０２４２】
条件培地中のターゲットタンパク質をイオン交換クロマトグラフィーによって単離し、その後、一段階アフィニティークロマトグラフィー（例えば、マトリックスにカップリングさせた抗ｆＸａ抗体）によってまたは幾つかのクロマトグラフィー段階の組み合わせ、例えば疎水性およびサイズ排除マトリックス、によって精製することができる。前記アフィニティー精製は、ｆＸａ活性部位クレフトに選択的に結合するクロマトグラフ材料、例えばベンズアミジン−セファロースまたは大豆トリプシン阻害剤−アガロース（ＳＴＩ−Ａｇａｒｏｓｅ）を含むことがある。
【０２４３】
図１５Ａは、ｆＸ重鎖およびｆＸ軽鎖をそれぞれ認識するモノクローナル抗体（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＦＸ−ＥＩＡ）を使用するアフィニティー（ＳＴＩ−Ａｇａｒｏｓｅ、Ｓｉｇｍａ  Ｃａｔａｌｏｇ  ＃  Ｔ０６３７）精製ｆＸａ変異体のウエスタンブロットを示すものである。軽鎖と重鎖を接続するジスルフィド結合の還元により、ｒ−Ａｎｔｉｄｏｔｅは、このウエスタンブロットにおいて（血漿由来ｆＸａに類似した）予想された移動の重鎖バンドを示す。ｆＸａ変異体のＧｌａドメインにおけるアミノ酸残基（６から３９の番号が付いているもの）の欠失は、ｒ−Ａｎｔｉｄｏｔｅの軽鎖についての、血漿由来ｆＸａと比較して低い分子量のバンドを生じさせる結果となる。このブロット上で分子量マーカーの位置も見ることができる。
【０２４４】
図１５Ｂおよび１５Ｃは、イオン交換およびアフィニティー精製、続いてＳｕｐｅｒｄｅｘ  ７５  １０／３００  ＧＬカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｃａｔ＃  １７−５１７４−０１）を使用するサイズ排除クロマトグラフィーによる、精製されたｒ−ＡｎｔｉｄｏｔｅのＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットを示す図である。
【０２４５】
実施例８．インビボ・マウス・モデル
解毒剤の投与を伴うまたは伴わないオスＣ５７Ｂｌ／６マウスにおけるベトリキサバンの薬物動態および薬力学的（ＰＫ−ＰＤ）プロフィールを検査した。ベトリキサバンの単回経口投与を対照群に対して０、１５、２５および７５ｍｇ／ｋｇで施した。解毒剤処置群には１５ｍｇ／ｋｇを使用した。１．５時間の時点の５分前に、解毒剤（３００ｕｇ／２００μＬ）またはビヒクル（規定食塩水、２００μＬ）の単回静脈内（ＩＶ）注射を施した。
【０２４６】
ベトリキサバンの経口投与後１．５、２．０および４．０時間の時点で、マウスをケタミンカクテル（ＳＣ）で麻酔し、心臓穿刺により瀉血した。５０μＬクエン酸三ナトリウム中から血液サンプル（０．５ｍＬ）を得た。Ｈｅｍｏｃｈｒｏｎ  Ｊｒ．カートリッジ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｄｙｎｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）をその製造業者の説示に従って使用して、全血ＩＮＲを測定した。ベトリキサバンおよび解毒剤（ＥＬＩＳＡ）血漿濃度決定のために遠心分離によってマウス乏血小板血漿を調製した。
【０２４７】
組換え型解毒剤（ｒ−Ａｎｔｉｄｏｔｅ）について、対照群にはベトリキサバンを０、１５、２５および７５ｍｇ／ｋｇでマウスに経口投与した。解毒剤（３００μｇ／２００μＬ）処置群には１５ｍｇ／ｋｇを使用した。ベトリキサバンの経口投与後１．５時間（解毒剤注射後５分）の時点でサンプルを採取した。
【０２４８】
図１６および１７ならびに表１３および１４に示すように、ベトリキサバンの投与（１５ｍｇ／ｋｇ、ＰＯ）後のマウスへの血漿由来解毒剤（ｐｄ−Ａｎｔｉｄｏｔｅ）または組換え型ｆＸａ変異体（ｒ−Ａｎｔｉｄｏｔｅ）の単回注射（３００μｇ、ＩＶ）は、インビボで該阻害剤を有効に捕捉した。全血ＩＮＲおよび解毒剤血漿濃度のＰＫ−ＰＤ補正（表１３〜１４）は、ＩＮＲ測定に基づき機能性ベトリキサバンの＞５０％低減を示し、多回注射または他のレジメによる解毒剤でのｆＸａ阻害剤の有効な中和を是認した。これらの結果は、本発明のｆＸａ誘導体が、出血しているまたは他の医学的緊急事態の患者においてｆＸａ阻害剤の抗凝血効果を逆転する万能解毒剤として作用する可能性を有することを明示していると考えられる。
【０２４９】
図２２は、ベトリキサバン（１５ｍｇ／ｋｇ）の経口投与後のｒ−解毒剤（１群あたりｎ＝５、３１２ｕｇ／２００ｕｌ  ｒ−Ａｎｔｉｄｏｔｅ）の単回ＩＶ注射（１回注射）または二回注射（２回注射）でのマウス実験を示すものである。単回注射群については、マウス血液サンプルを、ベトリキサバンの経口投与後１時間の時点で採取した。ビヒクル（対照＿１）またはｒ−Ａｎｔｉｄｏｔｅ（１回注射）を１時間の時点の５分前に投与した。二重注射群については、ビヒクルまたはｒ−Ａｎｔｉｄｏｔｅを、ベトリキサバンの経口投与後５５分の時点で注射し、１１５分の時点で繰り返した。ビヒクル（対照＿２）およびｒ−Ａｎｔｉｄｏｔｅ（２回注射）処置マウスについては、２時間の時点でマウス血液サンプルを採取した。測定したＩＮＲを、解毒剤の単回または二重注射後のマウス血漿中の解毒剤／ベトリキサバン比の関数として、図２２Ｂに示した。
【０２５０】
実施例９．解毒剤によるリバロキサバンおよびアピキサバンのインビトロ逆転
予想通り、本発明により考えられる解毒剤は、ｆＸａ阻害剤に対する他の活性部位も結合し、中和することができた。表１５および１６は、ｐｄ−Ａｎｔｉｄｏｔｅおよびｒ−Ａｎｔｉｄｏｔｅによるベトリキサバン、リバロキサバンおよびアピキサバンによる阻害のインビトロ補正を示すものである。精製されたｆＸａ（３．０ｎＭ）、阻害剤（７．５ｎＭ）、および異なる濃度の解毒剤を、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％ＢＳＡ、ｐＨ７．４を有する緩衝液中で１０分間、２２℃でインキュベートした。実施例４と同様にｆＸａ活性をアッセイした。
【０２５１】
表１５に示すように、２０４ｎＭ  ｐｄ−Ａｎｔｉｄｏｔｅは、試験した阻害剤の阻害効果の少なくとも６０％補正を生じさせた一方で、表１６では、ｒ−Ａｎｔｉｄｏｔｅ（１８６ｎＭ）によりベトリキサバンおよびリバロキサバンについて阻害の＞９５％補正、およびアピキサバンの＞７０％逆転を達成した。
【０２５２】
実施例１０．ｒ−Ａｎｔｉｄｏｔｅによるベトリキサバンのインビトロ逆転
表１７では、ベトリキサバンによる抗凝血の逆転に対する組換え型解毒剤の効果をヒト血漿凝固アッセイで試験した。血漿のａＰＴＴ延長に対する３００ｎＭおよび４００ｎＭ  ベトリキサバンの効果、ならびに阻害効果の逆転を、ＭＬＡ  Ｅｌｅｃｔｒａ  ８００  Ａｕｔｏｍａｔｉｃ凝血時間測定器によって測定した。１００μＬのプールされたクエン酸塩凝血剤処理ヒト血漿を３００ｎＭまたは４００ｎＭ  ベトリキサバンおよび異なる濃度の解毒剤と混合した。製造業者の説示に従ってａＰＴＴ試薬（Ａｃｔｉｎ  ＦＳ、Ｄａｄｅ  Ｂｅｈｒｉｎｇ）およびＣａＣｌ２を添加した。
【０２５３】
実施例１１．ｒ−Ａｎｔｉｄｏｔｅによる低分子量ヘパリン（「ＬＭＷＨ」）のインビトロ逆転
図１８では、ＬＭＷＨエノキサパリン（Ｓａｎｏｆｉ−Ａｖｅｎｔｉｓ）の阻害効果を逆転させるｒ−Ａｎｔｉｄｏｔｅの効果を、ヒト血漿中の濁度変化によって試験した。エノキサパリン（０〜１．２５Ｕ／ｍＬ）を２２℃で２０分間、５０８ｎＭ  ｒ−Ａｎｔｉｄｏｔｅと共にまたは伴わずにインキュベートした。濁度変化は、実施例３において説明した手順に従って測定した。５０８ｎＭ  ｒ−Ａｎｔｉｄｏｔｅは、０．３１２５〜１．２５Ｕ／ｍＬ  エノキサパリンの阻害効果を実質的に（＞７５％）補正した。
【０２５４】
図１９では、低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨエノキサパリン、Ｓａｎｏｆｉ−Ａｖｅｎｔｉｓ）による抗凝血の逆転に対するｒ−Ａｎｔｉｄｏｔｅの効果をヒト血漿凝固アッセイにおいて試験した。血漿のａＰＴＴ延長に対する１抗Ｘａ単位／ｍＬ  ＬＭＷＨの効果および阻害効果の逆転を、ＭＬＡ  Ｅｌｅｃｔｒａ  ８００  Ａｕｔｏｍａｔｉｃ凝血時間測定器によって測定した。１００μＬのプールされたクエン酸塩凝血剤処理ヒト血漿をエノキサパリンおよび異なる濃度の解毒剤と混合した。凝固時間の測定前に、製造業者の説示に従ってａＰＴＴ試薬（Ａｃｔｉｎ  ＦＳ、Ｄａｄｅ  Ｂｅｈｒｉｎｇ）およびＣａＣｌ２を添加した。１．１４μＭ  組換え型解毒剤の添加は、１単位／ｍＬエノキサパリンによって生じた抗凝血の５２％補正を生じさせた。
【０２５５】
実施例１２．ｒ−Ａｎｔｉｄｏｔｅによるリバロキサバンのインビトロ逆転
図２０では、小分子第Ｘａ因子阻害剤（リバロキサバン、Ｂａｙ  ５９−７９３９）による抗凝血の逆転に対する組換え型解毒剤タンパク質の効果をヒト血漿凝固アッセイにおいて試験した。Ｐｅｒｚｂｏｒｎら、Ｊ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．３：５１４−５２１，２００５によって報告されているように、プロトロンビン時間測定は、リバロキサバンの抗凝血効果を評価するための的確な方法である。プールされたヒト血漿のプロトロンビン時間（ＰＴ）延長に対する１μＭ  リバロキサバンの効果および阻害剤効果の逆転を、ＭＬＡ  Ｅｌｅｃｔｒａ  ８００  Ａｕｔｏｍａｔｉｃ凝血時間測定器によって測定した。１００μＬのプールされたクエン酸塩凝血剤処理ヒト血漿をリバロキサバンおよび異なる濃度の解毒剤と混合した。凝固時間の測定前に、製造業者の説示に従ってウサギ脳Ｔｈｒｏｍｂｏｐｌａｓｔｉｎ  Ｃ  Ｐｌｕｓ試薬（Ｄａｄｅ  Ｂｅｈｒｉｎｇ）を血漿サンプルに添加した。１．９μＭ  組換え型解毒剤の添加は、１μＭ  リバロキサバンによって生じた抗凝血の１００％補正を生じさせた。
【０２５６】
実施例１３．ｒ−Ａｎｔｉｄｏｔｅによるアピキサバンのインビトロ逆転
図１８では、アピキサバンによる抗凝血の逆転に対する組換え型解毒剤タンパク質の効果をヒト血漿凝固アッセイにおいて試験した。Ｐｉｎｔｏら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．５５（２２）：５３３９−５３５６，２００７によって報告されているように、プロトロンビン時間（ＰＴ）測定は、アピキサバンのエクスビボ抗凝血効果を評価するための的確な方法である。プールされたヒト血漿のプロトロンビン時間（ＰＴ）延長に対する１μＭおよび１．５μＭ  アピキサバンの効果ならびに阻害剤効果の逆転を、ＭＬＡ  Ｅｌｅｃｔｒａ  ８００  Ａｕｔｏｍａｔｉｃ凝血時間測定器によって測定した。１００μＬのプールされたクエン酸塩凝血剤処理ヒト血漿をアピキサバンおよび異なる濃度の解毒剤と混合した。凝固時間の測定前に、製造業者の説示に従ってウサギ脳Ｔｈｒｏｍｂｏｐｌａｓｔｉｎ  Ｃ  Ｐｌｕｓ試薬（Ｄａｄｅ  Ｂｅｈｒｉｎｇ）を血漿サンプルに添加した。１．９μＭ  組換え型解毒剤の添加は、１．５μＭ  アピキサバンによって生じた抗凝血の９７％補正を生じさせた。
【０２５７】
実施例１４．ｄｅｓ−Ｇｌａ  ａｎｈｙｄｒｏ−ｆＸａによるアルガトロバンのインビトロ阻害
アルガトロバンによるトロンビン活性の阻害およびその阻害効果の逆転を測定するために、精製されたヒトトロンビン（５ｎＭ）、アルガトロバン（５０ｎＭ）および異なる濃度の解毒剤ｄｅｓ−Ｇｌａ  ａｎｈｙｄｒｏ−ｆＸａを、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  塩化ナトリウム、０．１％ウシ血清アルブミン、ｐＨ７．４を含有する緩衝液に添加した。室温での２０分間のインキュベーションの後、アミド分解性基質Ｓ２２８８（２００ｕＭ）をその混合物に添加し、ｐ−ニトロアニリド基質切断速度を４０５ｎｍの吸光度によってモニターした。結果を図１２に提示する。
【０２５８】
実施例１５．乏血小板血漿（ＰＰＰ）または多血小板血漿（ＰＲＰ）におけるトロンビン生成アッセイ
この実施例では、ヒト乏血小板または多血小板血漿サンプルを０．３２％クエン酸塩の中に取った健常ドナーの血液から調製した。抗凝血剤処理した血液を室温でそれぞれ重力〜１００Ｘまたは重量１０００Ｘで２０分間回転させることによって、ＰＲＰおよびＰＰＰを調製した。７５〜１００マイクロリットル（μＬ）の血漿をＺ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−アミノメチルクマリン（Ｚ−ＧＧＲ−ＡＭＣ、トロンビン蛍光原基質、Ｂａｃｈｅｍ  Ｃａｔ＃  Ｉ−１１４０）と混合した。組織因子（Ｉｎｎｏｖｉｎ、Ｄａｄｅ  Ｂｅｈｒｉｎｇ）およびＣａＣｌ２を添加して、トロンビンの生成を開始させた。代表的な実験についての反応混合物は、１５ミリモル（ｍＭ）Ｃａ２＋、１００マイクロモル（μＭ）Ｚ−ＧＧＲ−ＡＭＣ、および０．１ナノモル（ｎＭ）組織因子（ＴＦ）（Ｉｎｎｏｖｉｎ）を含有した。蛍光プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）により相対蛍光単位（ＲＦＵ）を測定しながら３７℃で継続的にトロンビン形成をモニターした。存在する場合には阻害剤および解毒剤を血漿と共に１５分間、室温でプレインキュベートし、その後、トロンビン生成を開始させた。存在する場合には組換え型ＶＩＩａ（ｒＶＩＩａ、Ｎｏｖｏｓｅｖｅｎ）を添加し、その後、ＴＦを添加して反応を開始させた。
【０２５９】
図２３は、トロンビン生成における２５０ｎＭ  ベトリキサバン、ｆＸａ阻害剤、の抗凝血活性に対するｒＶＩＩａと組換え型ｆＸａタンパク質誘導体解毒剤（ｒ−Ａｎｔｉｄｏｔｅ）の相乗効果を示すものである。一切の添加阻害剤、ｒＶＩＩａまたはｒ−Ａｎｔｉｄｏｔｅ、を伴わない血漿におけるＲＦＵの正規化後の相対トロンビン生成活性（活性％）として結果を表示した。データは、ｒ−Ａｎｔｉｄｏｔｅが、２５０ｎＭ  ベトリキサバンの抗凝血効果を用量とは無関係に逆転させることを示している。１００ｎＭ  ｒＶＩＩａとｒ−Ａｎｔｉｄｏｔｅの併用は、それぞれのｒ−Ａｎｔｉｄｏｔｅ濃度でトロンビン生成活性をさらに増加させた一方で、ｒ−Ａｎｔｉｄｏｔｅ不在下での単独の１００ｎＭ  ｒＶＩＩａは、トロンビン生成活性をわずかに増加させたに過ぎなかった。ｒＶＩＩａは、ベトリキサバンの不在下の対照血漿においてもトロンビン生成活性をわずかに増加させた。
【０２６０】
実施例１６．ｒ−ＡｎｔｉｄｏｔｅおよびｒＶＩＩａの併用によるリバロキサバン抗凝血活性の逆転
リバロキサバン（Ｘａｒｅｌｔｏ（商標）、Ｂａｙ  ５９−７９３９）は、整形外科手術を受けている患者における静脈血栓塞栓の予防に指示される小分子第Ｘａ因子阻害剤である。Ｐｅｒｚｂｏｒｎら、Ｊ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．３：５１４−５２１，２００５によって報告されているように、プロトロンビン時間（ＰＴ）測定は、リバロキサバンの抗凝血効果を評価するための的確な方法である。臨床的に有効な用量のリバロキサバンは、３１８ｎｇ／ｍＬ（７３０ｎＭ、Ｋｕｂｉｔｚａら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．６１：８７３−８８０，２００５）ほどもの高いピーク血漿濃度を生じさせる。臨床的に有意な出血シナリオに関与する可能性が高いレベルでの、超治療濃度の抗凝血効果を模倣するために、７３０ｎＭより高い濃度のリバロキサバンを逆転する可能性を調査した。
【０２６１】
プールされたヒト血漿（８人の健常ボランティアドナーからのクエン酸塩抗凝血剤処理血漿の組み合わせ）のプロトロンビン時間（ＰＴ）延長に対する１μＭ  リバロキサバンの効果を、ＭＬＡ  Ｅｌｅｃｔｒａ  ８００  Ａｕｔｏｍａｔｉｃ凝血時間測定器によって測定した。凝固時間を測定するために、製造業者の説示に従ってウサギ脳Ｔｈｒｏｍｂｏｐｌａｓｔｉｎ  Ｃ  Ｐｌｕｓ試薬（Ｄａｄｅ  Ｂｅｈｒｉｎｇ）を血漿サンプル（１００ｕＬ）に添加した。リバロキサバンの添加に基づき、ベースラインＰＴ（１２．２±０．１秒）が２倍延長された（２５±０．４秒）。抗凝血効果のインビトロ逆転を、組換え型解毒剤タンパク質（ｒ−Ａｎｔｉｄｏｔｅ）または組換え型第ＶＩＩａ因子（ｒＶＩＩａ、ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（商標）、Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ）の添加によって試験した。ｒ−Ａｎｔｉｄｏｔｅ単独での添加は、ＰＴの一部補正を生じさせた：それぞれ、ｒ−Ａｎｔｉｄｏｔｅ（３８０ｎＭ）の添加は、１４％補正（２１．５±０．２秒）を生じさせ、より高い濃度（７６０ｎＭ）は、２８％補正を生じさせた。比較実験において、リバロキサバン抗凝血剤処理血漿をｒＶＩＩａ（２．２ｎＭ）で処理した場合、結果として生ずるＰＴの一部補正は、４６％であった。しかし、ヒト被験体におけるｒＶＩＩａは、短い循環半減期（Ｔ１／２＝２．３時間、ＮｏｖｏＳｅｖｅｎについての処方情報）を有し、そのためこのインビトロ実験において観察された逆転レベルが臨床設定で確認される可能性は低い。リバロキサバン効果のより高い逆転レベルを達成するために、ｒ解毒剤とｒＶＩＩａの様々な組み合わせをヒト血漿に添加し、結果として生ずるＰＴを測定した（図２４にまとめたとおり）。３８０ｎＭ  ｒ−解毒剤と２．２Ｍ  ｒＶＩＩａの併用は、リバロキサバン誘導抗凝血の完全補正（結果として生ずるＰＴ＝１２秒）を生じさせた。類似して、７６０ｎＭ  ｒ−Ａｎｔｉｄｏｔｅと０．５５ｎＭ  ｒＶＩＩａの併用は、リバロキサバンの抗凝血効果の大きな逆転を呈示した。
【０２６２】
実施例１７．ｒ−Ａｎｔｉｄｏｔｅと凝血第ＩＸ因子の併用によるベトリキサバン抗凝血活性の逆転
血液凝固第ＩＸ因子は、血友病Ｂを有する患者における出血エピソードの管理にのために指示される。血漿由来タンパク質（Ｂｒｏｏｋｅｒ  Ｍ，Ｒｅｇｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｃｌｏｔｔｉｎｇ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｓ，Ｗｏｒｌｄ  Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ，第８版，２００８に列挙されているような第ＩＸ因子複合体濃縮物）および組換え型ｆＩＸ（例えば、ＢｅｎｅＦＩＸ、Ｗｙｅｔｈ）は、両方とも、この指示に用いられる。加えて、第ＩＸ因子の使用は、抗凝血剤関連脳内出血の逆転の臨床的適用に関して報告されている（Ｓｉｄｄｉｑ  Ｆら、Ｎｅｕｒｏｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ，８（１）：３６−４１，２００８）。
【０２６３】
臨床的に有意な出血シナリオに関与する可能性が高い、超治療抗凝血濃度の効果を模倣するために、高濃度のベトリキサバンを逆転する可能性を試験した。正常ヒト血漿のａＰＴＴ延長に対する４００ｎＭ  ベトリキサバン（深在静脈血栓症の予防のための治療濃度の８倍以上）の効果およびｒ−Ａｎｔｉｄｏｔｅまたはヒト血漿由来ｆＩＸ（バーモント州、Ｅｓｓｅｘ  ＪｕｎｃｔｉｏｎのＨａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によるベトリキサバン阻害剤効果の逆転を、ＭＬＡ  Ｅｌｅｃｔｒａ  ８００  Ａｕｔｏｍａｔｉｃ凝血時間測定器によって測定した。１００μＬのプールされたヒト血漿を、４００ｎＭ  ベトリキサバンおよび様々な濃度のｒ−Ａｎｔｉｄｏｔｅ、精製された血漿ｆＩＸ、またはｒ−ＡｎｔｉｄｏｔｅとｆＩＸの組み合わせと混合した。凝固時間の測定のために製造業者の説示に従ってａＰＴＴ試薬（Ａｃｔｉｎ  ＦＳ，Ｄａｄｅ  Ｂｅｈｒｉｎｇ）およびＣａＣｌ２を添加した。
【０２６４】
ベトリキサバンの添加に基づき、ベースラインａＰＴＴ（２５．５±０．１秒）がおおよそ２倍延長された（５１．６±０．４秒）。ｒ−Ａｎｔｉｄｏｔｅ単独での添加は、ａＰＴＴの一部補正を生じさせた：ｒ−解毒剤（３８０ｎＭ）の添加は、２５％補正（３８．６秒）を生じさせ、より高い濃度（７６０ｎＭおよび１．１４μＭ）は、それぞれ４０％および４２％補正を生じさせた。比較実験において、ベトリキサバン抗凝血剤処理血漿をヒト血漿由来ｆＩＸ（２５８ｎＭまたは３８７ｎＭ）で処理した場合、結果として生ずるａＰＴＴの一部補正は、両方とも、わずか１５％であった。従って、単独でのｆＩＸは、ベトリキサバン抗凝血に対する有効な逆転剤ではない。ベトリキサバン媒介抗凝血に対するより高い逆転レベルを達成するために、様々な濃度のｒ−ＡｎｔｉｄｏｔｅおよびｆＩＸをヒト血漿に添加し、結果として生ずるａＰＴＴを測定した（図２５にまとめたとおり）。ｒ−Ａｎｔｉｄｏｔｅ（３８０ｎＭ）とｆＩＸ（２５８ｎＭ）の併用は、単一の薬剤のみによって達成されるもの（それぞれ、３８．６秒および４３．８秒）より補正の向上（結果として生ずるａＰＴＴ＝３３秒）を生じさせた。類似して、ｒ−Ａｎｔｉｄｏｔｅ（７６０ｎＭ）とｆＩＸ（２５８ｎＭ）の併用は、単一の薬剤のみによって達成されるもの（それぞれ、３１．２秒および４３．８秒）より補正の向上（結果として生ずるａＰＴＴ＝２６．９秒）を生じさせた。図２５に示すように、ｒ−Ａｎｔｉｄｏｔｅ（１．１４μＭ）およびｆＩＸ（２５８ｎＭ）の併用は、ベースライン凝固パラメータ条件への抗凝血効果の完全インビトロ逆転を生じさせるために十分なものであった。
【０２６５】
実施例１８．ｒ−Ａｎｔｉｄｏｔｅと抗凝血第Ｘ因子の併用によるベトリキサバン抗凝血活性の逆転
この実施例では、ベトリキサバン阻害の逆転についてのヒト第Ｘ因子（ｆＸ）とｒ−Ａｎｔｉｄｏｔｅの併用効果を９６ウエルプレート形式凝固アッセイで試験した。ａＰＴＴ試薬（Ａｃｔｉｎ  ＦＳ）でのヒト乏血小板血漿（ＰＰＰ）の濁度変化を、実施例３において説明した手順に従ってモニターした。存在する場合には１２５ｎＭ  ベトリキサバン、１２５ｎＭ  ｒ−Ａｎｔｉｄｏｔｅ、または１７０ｎＭ  ＦＸ（Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を室温で１５分間、血漿と共にプレインキュベートし、その後、Ｃａ２＋を添加して反応を開始させた。
【０２６６】
図２６は、１２５ｎＭ  ベトリキサバンの抗凝血活性に対するｆＸと組換え型解毒剤（ｒ−Ａｎｔｉｄｏｔｅ）の併用効果を示すものである。一切の添加阻害剤、ｆＸまたはｒ−Ａｎｔｉｄｏｔｅ、を伴わない血漿（対照、ＦＸなし）における凝固時間の正規化後、倍率変化として結果を表示した。データは、１２５ｎＭ  ベトリキサバンが、凝固時間（０ｎＭ、ｒ−Ａｎｔｉｄｏｔｅ、ＦＸなし）を倍化したことを示している。１２５ｎＭ  ｒ−Ａｎｔｉｄｏｔｅの添加は、ベトリキサバンの抗凝血効果を実質的に逆転させた。１７０ｎＭ  ｆＸは、１２５ｎＭ  阻害剤を伴うまたは伴わない血漿における凝固時間を独立して〜２０％減少させた。１７０ｎＭ  ｆＸと１２５ｎＭ  ｒ−Ａｎｔｉｄｏｔｅの併用は、１２５ｎＭ  ベトリキサバンの阻害効果をさらに補正した。
【０２６７】
上の実施形態に関連して本発明を説明したが、上述説明および実施例は、例証のためのものであり、本発明の範囲を限定するためのものでないことは理解されるはずである。本発明の範囲内の他の態様、利点および変形は、本発明が属する技術分野の技術者には明らかであろう。
【０２６８】
【表１】
2014198719.tif 000005
【０２６９】
【表２】
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【０２７０】
【表３】
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【０２７１】
【表４】
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【０２７２】
【表５】
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【０２７３】
【表６】
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【０２７４】
【表７】
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【０２７５】
【表８】
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【０２７６】
【表９】
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【０２７７】
【表１０】
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【０２７８】
【表１１】
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【０２７９】
【表１２】
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【０２８０】
【表１３】
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【０２８１】
【表１４】
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【０２８２】
【表１５】
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【０２８３】
【表１６】
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【０２８４】
【表１７】
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【０２８５】
【表１８】
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【０２８６】
【表１９】
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【０２８７】
【表２０−１】
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【０２８８】
【表２０−２】
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【０２８９】
【表２１】
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【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２６】
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【図２】
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【図１５】
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【図１６】
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【図２４】
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【図２５】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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