(57)【要約】      （修正有）【課題】ジゴサッカロミセス属酵母における産膜原因遺伝子を探索し、酵母や食品サンプルの産膜性を簡易に判断できる判定方法の提供。【解決手段】サンプル中における特定な配列からなる塩基配列のオリゴヌクレオチド、または特定な配列からなる塩基配列のオリゴヌクレオチドにおいて、１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの有無を検出することにより、ジゴサッカロミセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属酵母の産膜性を簡便かつ迅速に判定できる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ジゴサッカロミセス属酵母に由来し、下記（１）または（２）に記載されたオリゴヌクレオチド。
（１）配列表の配列番号１に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
（２）配列表の配列番号１において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
ジゴサッカロミセス属酵母がジゴサッカロミセス・ルキシである、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
サンプル中に存在するジゴサッカロミセス属酵母が産膜性を有するか否かを判定する方法であって、サンプル中の請求項１に記載のオリゴヌクレオチドまたは当該オリゴヌクレオチドの部分配列を含むオリゴヌクレオチドの存在を検出する工程を含む、ジゴサッカロミセス属酵母の産膜性を判定する方法。
【請求項４】
ＤＮＡの存在を検出する方法がＰＣＲ法である、請求項３記載の方法。
【請求項５】
請求項１記載のオリゴヌクレオチド由来の塩基配列または当該塩基配列の相補的配列を含むオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットを用いてＰＣＲを行う、請求項４記載の方法。
【請求項６】
プライマーセットが、配列表の配列番号１において第３３２７〜５９８２塩基を除いた部分の配列または当該塩基配列の相補的配列に由来して設計されたものである、請求項５記載の方法。
【請求項７】
プライマーセットが、配列表の配列番号１において第１〜３１６１塩基の範囲内の配列に由来して設計されたものである、請求項５記載の方法。
【請求項８】
サンプルが、ジゴサッカロミセス属酵母より抽出されたゲノムＤＮＡであることを特徴とする請求項３から７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
サンプルが食品に由来する、請求項３から７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
食品が醤油または味噌である、請求項９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サンプル中における、配列表の配列番号１に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、または配列表の配列番号１において１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの有無を検出することにより、ジゴサッカロミセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属酵母の産膜性を判定する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ジゴサッカロミセス・ルキシ（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｒｏｕｘｉｉ）は、醤油、味噌などの食品の生産等において欠くことのできない有用な微生物であり、アルコールをはじめとする各種の香気成分を生成することにより、当該食品に特徴的な香味を付与する役割を担っている。しかし、ジゴサッカロミセス・ルキシの中には産膜を形成し、不快臭成分を生成することで、当該食品の品質を著しく低下させる産膜性の株が存在する（非特許文献１）。従って、食品製造用に使用されるジゴサッカロミセス・ルキシは非産膜性の株でなければならないが、その識別は培養と目視による確認に頼るほかなく、絶対的な指標による産膜・非産膜性の株の識別方法が必要とされていた。また、蔵付きの産膜性ジゴサッカロミセス・ルキシにより、当該食品が汚染される場合も多く、これらの汚染部位を判定し、同部位を除染することができれば、蔵付き産膜性酵母による汚染を低減させることが可能であると考えられるが、これまで産膜性・非産膜性を識別する迅速かつ簡便な方法は提供されていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】ＷＯ２０１０／０６１９２３
【特許文献２】特表平７−５０９３７２
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】富田実、日本醸造協会誌、９２、７８３-８５９（１９９７）
【非特許文献２】Ｓｅｖｅｒｉｎｏ  Ｚａｒａ  ｅｔ  ａｌ．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，７１，２９３４―２９３９（２００５）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
そのため本発明者は、産膜原因遺伝子の存在を試験することにより産膜形成能を有する菌株を検出する方法を試みた。遺伝子の検出試験に関し、当業者において広く実施されており、最も広く行われている方法としてＰＣＲ法を利用できる。当該方法では、検出対象である遺伝子の塩基配列に基づいて設計された、該遺伝子に特異性のあるオリゴヌクレオチドＰＣＲプライマーを作製し、そのＰＣＲプライマーを用いて、検体から抽出した染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ反応を行い、反応生成物として増幅されたＤＮＡ断片を得ることにより、検体中の該遺伝子を検出する方法である。しかしながら、これまでに食品や環境中に生存するジゴサッカロミセス属酵母を始めとする微生物からの産膜原因遺伝子の検出に、当該ＰＣＲによる方法を用いた例は知られていなかった。
【０００６】
ＰＣＲ法により産膜原因遺伝子の検出試験を行うためには、まず産膜原因遺伝子の塩基配列を知る必要がある。ワイン醸造に使用される一部のサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）も産膜を形成することが知られており、この原因遺伝子がＦＬＯ１１であることが明らかにされている（非特許文献２）。また、この他にもサッカロミセス・セレビシエの凝集活性に関与する遺伝子、および当該遺伝子を用いてサッカロミセス・セレビシエに凝集性を付与することについてすでに知見が知られている（特許文献１、２）。しかしながら、当該知見において述べられているのは、凝集性には関与するものの産膜原因遺伝子ＦＬＯ１１とは異なった遺伝子であり、さらにまた、ジゴサッカロミセス・ルキシにおける産膜原因遺伝子や、当該産膜原因遺伝子の配列を用いてジゴサッカロミセス属酵母の産膜性を判定する方法については全く検討しておらず、記載、示唆ともしていない。
【０００７】
そこで、ジゴサッカロミセス・ルキシの産膜原因遺伝子を明らかにするために、発明者らはジゴサッカロミセス・ルキシの既知のゲノム配列情報を用いた遺伝子の探索を試みた。ジゴサッカロミセス・ルキシの全ゲノム配列が公共データベースGenolevures（http://www.genolevures.org/）等から利用可能であることから、公知の産膜原因遺伝子であるサッカロミセス・セレビシエのＦＬＯ１１遺伝子をクエリに相同配列検索を行った。その結果、３つの類似配列が見出されたが、実施例で記述する通り、これらの遺伝子は産膜形成には無関係であり、ジゴサッカロミセス属酵母の産膜形成は公知のＦＬＯ１１とは異なる、全く未知の遺伝子に依存していることが示唆された。
【０００８】
すなわち本発明の課題は、ジゴサッカロミセス属酵母における産膜原因遺伝子を探索し、酵母や食品サンプルの産膜性を簡易に判断できる判定方法を確立することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、従来全く知られていなかったジゴサッカロミセス・ルキシの産膜原因遺伝子を同定した。この遺伝子は、すでに全ゲノム解析が行われているジゴサッカロミセス・ルキシＣＢＳ７３２株のゲノム中には存在しない、新規のＦＬＯ１１様遺伝子であった。また、当該新規ＦＬＯ１１様遺伝子を全く持たないジゴサッカロミセス・ルキシＣＢＳ７３２株は、確かに産膜性を有さないことが確認された。
【００１０】
更に、本発明者は本発明の産膜原因遺伝子の塩基配列に基づいて設計及び作製したＰＣＲプライマーを用いたＰＣＲ法により、目的とするジゴサッカロミセス属酵母ゲノム中の産膜原因遺伝子をコードするポリヌクレオチドを検出することで、当該酵母の産膜形成活性の有無を判定できることを明らかにし、本発明を完成させた。
【００１１】
すなわち、本発明は、下記に示すようなものである。
（１）ジゴサッカロミセス属酵母に由来し、下記１）または２）に記載されたオリゴヌクレオチド。
１）配列表の配列番号１に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
２）配列表の配列番号１において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
（２）ジゴサッカロミセス属酵母がジゴサッカロミセス・ルキシである、（１）に記載のオリゴヌクレオチド。
（３）サンプル中に存在するジゴサッカロミセス属酵母が産膜性を有するか否かを判定する方法であって、サンプル中の（１）に記載のオリゴヌクレオチドまたは当該オリゴヌクレオチドの部分配列を含むオリゴヌクレオチドの存在を検出する工程を含む、ジゴサッカロミセス属酵母の産膜性を判定する方法。
（４）ＤＮＡの存在を検出する方法がＰＣＲ法である、（３）記載の方法。
（５）請求項１記載のオリゴヌクレオチド由来の塩基配列または当該塩基配列の相補的配列を含むオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットを用いてＰＣＲを行う、（４）記載の方法。
（６）プライマーセットが、配列表の配列番号１において第３３２７〜５９８２塩基を除いた部分の配列または当該塩基配列の相補的配列に由来して設計されたものである、（５）記載の方法。
（７）プライマーセットが、配列表の配列番号１において第１〜３１６１塩基の範囲内の配列に由来して設計されたものである、（５）記載の方法。
（８）サンプルが、ジゴサッカロミセス属酵母より抽出されたゲノムＤＮＡであることを特徴とする（３）から（７）のいずれか１項に記載の方法。
（９）サンプルが食品に由来する、（３）から（７）のいずれか１項に記載の方法。
（１０）食品が醤油または味噌である、（９）に記載の方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の方法によれば、従来の培養と目視による確認方法と比較して、簡便且つ高い信頼性を持って、ジゴサッカロミセス属酵母の産膜性を判定することが可能である。そして、産膜原因遺伝子を保有しない酵母を選抜することによって、産業利用する上で不都合な形質を示さない酵母の有用菌株を得ることができる。また、食品サンプルや製造工程等における産膜の発生リスクを事前に判定することが可能になり、食品製造上さまざまな形での応用が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、ＦＬＯ１１Ｄ遺伝子の構造を表した模式図および遺伝子構造模式図の下にプライマーセットを作成した遺伝子上の位置を示す。
【図２】図２はＦＬＯ１１Ａ、Ｂ及びＣ破壊ベクターの構築方法の模式図を示す。
【図３】図３はＦＬＯ１１Ａ、ＦＬＯ１１Ｂ、ＦＬＯ１１Ｃ、ＦＬＯ１１ＡＢ、ＦＬＯ１１ＡＢＣ破壊株の産膜形成を示す。
【図４】図４はショットガンクローニングにより取得されたプラスミドによる、非産膜性のジゴサッカロミセス・ルキシＮＢＲＣ１８７７株に対する産膜活性付与を示す。
【図５】図５はジゴサッカロミセス・ルキシＺ３株およびＺ３のＦＬＯ１１Ｄ遺伝子欠損株において、ＦＬＯ１１Ｄ遺伝子の検出をＰＣＲ解析した結果を示す。
【図６】図６はＦＬＯ１１Ｄがジゴサッカロミセス・ルキシＺ３株において、産膜形成に必須であることを示す。
【図７】図７はＦＬＯ１１Ｄ特異的なプライマーによるＰＣＲ解析により、産膜性と非産膜性のジゴサッカロミセス・ルキシが識別可能であることを示す。図中「ＮＢＲＣ１８７６」、「ＮＢＲＣ１８７７」は味噌由来のジゴサッカロミセス・ルキシ株、「ＡＴＣＣ２６２３」はグレープ果汁由来のジゴサッカロミセス・ルキシ株、「ＡＴＣＣ４６２５１」は由来が不明なジゴサッカロミセス・ルキシ株、その他は醤油由来の株を示している。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の方法により判定の対象とする酵母は、産膜性を示し、ジゴサッカロミセス属に属する酵母が好ましい。中でも、食品産業でよく用いられるジゴサッカロミセス・ルキシがとくに好ましいが、これに限定されるものではない。
【００１５】
また本発明の方法では、単独の酵母に対する産膜性・非産膜性の識別だけではなく、各種サンプルの産膜性酵母による汚染度を判定することが可能である。対象とするサンプルとしては、食品製造設備、食品、天然サンプル等を用いることが可能である。
【００１６】
食品をサンプルとして用いる場合、当該食品としては、醤油、味噌などの酵母を用いて製造される発酵食品を使用することができる。また、発酵食品でなくても、酵母の混入によって産膜が生じる可能性がある任意の食品を使用してもよい。さらに当該食品は、最終製品でなく、製造工程の途中段階である中間製品であっても構わない。
【００１７】
本発明の方法では、サンプル中における、下記（１）または（２）に記載したオリゴヌクレオチドまたは当該オリゴヌクレオチドの部分配列を含むオリゴヌクレオチドの存在を検出することにより、酵母の産膜性の産膜性を判定する。
（１）配列番号１に示したポリヌクレオチド、または
（２）配列表の配列番号１において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
【００１８】
当該オリゴヌクレオチドの存在を検出する方法としては、ＰＣＲ法やサザンハイブリダイゼーションなどを用いることができるが、とくにＰＣＲ法を用いるのが簡易である。いずれの場合でも、上記（１）または（２）に記載したようなオリゴヌクレオチドの存在が検出された場合には、当該サンプルに産膜性酵母が含まれると判定することができる。
【００１９】
以下、本発明の方法をさらに詳細に説明する。
ＰＣＲによって検出を行う場合は、まず、産膜原因遺伝子に特異的な配列に対するオリゴヌクレオチドプライマーを設計する。ターゲットとする配列は、
（１）配列番号１に示したポリヌクレオチド、または、
（２）配列表の配列番号１において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、
であればいかなる領域でもよい。
【００２０】
より詳細には、ターゲットとする配列は以下のように決定することができる。
すなわち、本発明のＦＬＯ１１Ｄ遺伝子は、図１に模式的に示したような遺伝子構造を有しているところ、プライマーセットを設計するに当たっては、図１に示した部位１（プロモーター領域および５’側ＯＲＦから成り、配列番号１の第１−２８２６番目までの塩基に相当）、部位２（ＦＬＯ１１ドメインから成り、配列番号１の第２８２７〜３１６１番目の塩基に相当）、部位３（３’側ＯＲＦから成り、配列番号１の第３１６２〜６９５９番目の塩基に相当）部位４（ターミネーター領域から成り、配列番号１の第６９６０番目以降の塩基に相当）内の任意の領域を増幅するように設計することが可能である。また、プライマーは部位１〜４のいずれかの領域の内部に設計してもよいし、部位１〜４の２つ以上の連続した領域にまたがった領域を増幅するように設計してもよい。ただし、部位３の内部には反復配列が存在する（配列番号１の第３３２７−５９８４番目の塩基）ため、当該反復配列に該当する領域は避けて増幅するようにプライマーセットを設計するのが望ましい。
【００２１】
より精度よくＦＬＯ１１Ｄ遺伝子を検出するためには、配列の保存性が高いと考えられる活性ドメインから成る部位２の内部にプライマーを設計することが最も好ましい。また、上記反復配列を除けば、部位１、３または４に設計した場合でも、ほぼ全ての株において産膜性を正確に判定することが可能である。
【００２２】
プライマーの長さ、増幅領域の長さは、いずれも、ＰＣＲ法を行う際の常法にしたがって任意に設定すればよい。プライマーの長さは１５〜５０ベースに設定するのが好ましく、さらに１５〜３０ベースとするのがとくに好ましい。具体的には、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０ベースのいずれかであってもよい。また、ＰＣＲで増幅するＤＮＡ断片の長さは任意に設定することができるが、簡便に識別するため長さ０．２から５キロベースの領域を設定することが好ましく、さらに０．３〜２キロベースとするのがとくに好ましい。具体的には３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００ベースのいずれかであってもよく、それらの値の範囲内であってもよい。
【００２３】
次に、任意の酵母から採取したゲノムＤＮＡ、または各種サンプルを鋳型として、当該産膜原因遺伝子に特異的な配列を有するオリゴヌクレオチドを、ＰＣＲ法で増幅する。ＰＣＲによる増幅は常法に従えばよく、例えばＴＯＹＯＢＯ製のＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼなどを利用することができる。
【００２４】
増幅したＤＮＡ断片を適当な方法で分離した後、目的のＤＮＡ断片の増幅を確認する。ＤＮＡ断片の分離に用いる方法はいかなる方法でも良く、例えばアガロースゲルやアクリルアミドゲル電気泳動が好ましい。また、増幅したＤＮＡ断片の可視化に用いる方法にも、特に限定はないが、通常のエチジウムブロマイドによる染色が好ましい。
【００２５】
以上の操作を行った結果として、サンプル酵母より採取したゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＰＣＲで増幅されると予想される長さのＤＮＡ断片が増幅された場合には、当該酵母は産膜性であると判定でき、ＤＮＡ断片が増幅されなかった場合は、当該酵母は非産膜性であり、産業上有用であると判定できる。
【００２６】
また、食品やその中間産物等に由来する各種サンプルを鋳型とし、ＰＣＲで増幅されると予想される長さのＤＮＡ断片が増幅された場合には、当該サンプルは産膜性酵母に汚染されていると判定でき、ＤＮＡ断片が増幅されなかった場合は、当該サンプルは産膜性酵母には汚染されていないと判定することが可能である。
【実施例】
【００２７】
以下、実施例によって本発明をさらに具体的に説明するが、これらの実施例は本発明を限定するものではない。
【００２８】
（実施例１）ジゴサッカロミセス・ルキシにおける産膜原因遺伝子の同定
既に、ワイン醸造に用いられるサッカロミセス・セレビシエにおいてＦＬＯ１１遺伝子が産膜形成に関ることが知られていたため、ＦＬＯ１１遺伝子に特徴的なＦｌｏ１１ドメインをコードする領域をクエリとし、ジゴサッカロミセス・ルキシのゲノムデータベースに対する相同性検索を行った。その結果、ジゴサッカロミセス・ルキシは３つのＦＬＯ１１様遺伝子、ＺＹＲＯ０Ｆ０２７２８ｇ、ＺＹＲＯ０Ｆ０２７５０ｇ、及びＺＹＲＯ０Ａ０１３６６２ｇ（以下、それぞれの遺伝子を「ＦＬＯ１１Ａ」、「ＦＬＯ１１Ｂ」、「ＦＬＯ１１Ｃ」とする）を持つことが明らかとなった。
【００２９】
そこで、これらのＦＬＯ１１様遺伝子が産膜形成に寄与するかどうかを確認するため、遺伝子置換破壊法による機能解析を実施した。図２に示すとおり、ＦＬＯ１１様遺伝子破壊に使用するベクターを構築した。すなわち、まず、下記表１に示した配列番号３〜８の各ＦＬＯ１１様遺伝子に特異的なプライマーを用い、ＰＣＲによって各ＦＬＯ１１様遺伝子のコード領域を増幅した後、増幅産物をｐＥＮＴＲ（インビトロジェン）にクローニングした。
【００３０】
【表１】
2014014338.tif 000002
【００３１】
次に、取得したベクターを制限酵素ＮｄｅＩおよびＳｐｅＩで処理し、同制限酵素で処理したｐＵＧ６とライゲーションした。ただし、ＦＬＯ１１Ｃ破壊ベクターにおいては、インバースＰＣＲによりＮｄｅＩとＳｐｅＩサイトを付加した後、同制限酵素で処理したｐＵＧ６及びｐＵＺ６とライゲーションした。このプラスミドをＮｏｔＩ処理し、ジゴサッカロミセス・ルキシの形質転換に使用した。ジゴサッカロミセス・ルキシの形質転換は公知の方法（Ｗａｔａｎａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，７４，１０９２―１０９４，２０１０）に従った。この操作により、ジゴサッカロミセス・ルキシＺ３株の遺伝子破壊株ＦＬＯ１１ＡΔ株（ＦＬＯ１１Ａ遺伝子のみ欠損）、ＦＬＯ１１ＢΔ株（ＦＬＯ１１Ｂ遺伝子のみ欠損）、ＦＬＯ１１ＣΔ株（ＦＬＯ１１Ｃ遺伝子のみ欠損）、ＦＬＯ１１ＡΔ/ＢΔ株（ＦＬＯ１１Ａ遺伝子およびＦＬＯ１１Ｂ遺伝子を欠損）、ＦＬＯ１１ＡΔ/ＢΔ/ＣΔ株（ＦＬＯ１１Ａ、Ｂ、Ｃの全ての遺伝子を欠損）を取得した。
【００３２】
次にこれらの遺伝子が、ジゴサッカロミセス・ルキシの産膜形成に寄与しているかどうかを確認するため、取得された遺伝子破壊株を産膜形成培地（イーストエクストラクト１％、ペプトン２％、グルコース２％、食塩１０％）で７日間、３０度で静置培養し産膜が形成されるかどうかを確認した。その結果、非常に興味深いことに、これらの遺伝子破壊株はすべて親株と同等の産膜形成活性を示した（図３）。以上のことから、ジゴサッカロミセス・ルキシの産膜形成は、ゲノム解析で明らかになったＦＬＯ１１遺伝子群によるものではなく、未知の遺伝子に依存していることが示唆された。
【００３３】
そこで、ジゴサッカロミセス・ルキシの産膜原因遺伝子を同定するため、ショットガンクローニングを行った。まず、産膜形成能が高いジゴサッカロミセス・ルキシＺ３株のゲノミックＤＮＡを制限酵素Ｓａｕ３ＡＩで処理した。制限酵素処理産物をアガロースゲル電気泳動により分離し、５〜８キロベースペアの断片を回収した。回収したＤＮＡ断片を、事前にＢａｍＨ１処理しておいたｐＺＥＵｎｅｏとライゲーションし、Ｚ３株のゲノミックＤＮＡライブラリーを構築した。構築したゲノミックライブラリーで大腸菌ＤＨ５α株を形質転換した。大腸菌からプラスミドを回収し、ライブラリーの品質を確認した結果、平均インサート長６．８キロベース、インサート保持率８０％以上の約２０，０００の独立したクローンから構成されるライブラリーが構築できた。
【００３４】
当該ライブラリーからプラスミドＤＮＡを大量調整し、非産膜性のジゴサッカロミセス・ルキシＮＢＲＣ１８７７株を形質転換し、産膜形成能が付与された株をスクリーニングした。その結果、弱い産膜形成能が付与された株が取得された（図４）。そこで、この株が保持するプラスミドＤＮＡを回収し、一旦大腸菌で増幅した後、シーケンス解析に供した。シーケンスの結果、新規のＦＬＯ１１様遺伝子（ＦＬＯ１１Ｄとする）をコードしていた。ＦＬＯ１１Ｄ遺伝子塩基を配列番号１、ＦＬＯ１１Ｄのアミノ酸配列を配列番号２に示す。ＦＬＯ１１Ｄの遺伝子構造を解析した結果、ＯＲＦ中に活性ドメインであるＦＬＯ１１ドメイン、および機能不明の繰り返し配列を含む構造であることが明らかになった（図１）。
【００３５】
ＦＬＯ１１Ａ、ＦＬＯ１１Ｂ、ＦＬＯ１１Ｃおよびサッカロミセス・セレビシエのＦＬＯ１１遺伝子（ＳｃＦＬＯ１１）にコードされるＦｌｏ１１ドメインのアミノ酸配列をＦＬＯ１１ＤのＦｌｏ１１ドメインのアミノ酸配列と比較した結果、表２に示すとおり、相同性はそれぞれ６４．３%、４７．８%、２８．９%、及び２２．８%ときわめて低い値を示し、ＦＬＯ１１Ｄはゲノムシーケンスでは明らかとなっていなかった、未発見の遺伝子であることが明らかとなった。
【００３６】
【表２】
2014014338.tif 000003
【００３７】
次に、ＦＬＯ１１Ｄ遺伝子がジゴサッカロミセス・ルキシの産膜形成に寄与するかどうかを確認するため、ＦＬＯ１１Ｄ遺伝子破壊実験を行った。ＦＬＯ１１Ｄ遺伝子破壊コンストラクトは、下記表３に示すＦＬＯ１１Ｄ特異的なプライマーで、ｐＵＧ６（Ｇｕｌｄｅｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２４，２５１９−２５２４，１９９６）の薬剤耐性遺伝子を含む領域を増幅することで作成した。遺伝子破壊実験の結果、Ｚ３株においてＦＬＯ１１Ｄ遺伝子は複数個存在することが明らかとなった。
【００３８】
【表３】
2014014338.tif 000004
【００３９】
そこで、再度ＦＬＯ１１Ｄ特異的なプライマーでｐＵＺ６、ｐＵＮ６の薬剤耐性遺伝子を含む領域を増幅することにより得られた遺伝子破壊コンストラクトを元に、ＦＬＯ１１Ｄ２重破壊株、ＦＬＯ１１Ｄ３重破壊株を作成した。遺伝子破壊の確認は、下記表４に記載のプライマーを用いたＰＣＲ解析により実施した。その結果、ＦＬＯ１１Ｄ３重遺伝子破壊株において、ＦＬＯ１１Ｄ由来のシグナルが非検出となったことから、Ｚ３株には３コピーのＦＬＯ１１Ｄ遺伝子がコードされていたことが明らかとなった（図５）。なお、これら３コピーのＦＬＯ１１Ｄ遺伝子の塩基配列を比較したところ、ＯＲＦ中の反復配列の繰り返し回数に違いがあるほかの配列の相同性は９９％以上ときわめて高いものであり、１セットのプライマーを用いたＰＣＲによって、当該ＦＬＯ１１Ｄ３コピーの遺伝子すべてを同時に検出可能であることが十分に示唆された。
【００４０】
【表４】
2014014338.tif 000005
【００４１】
次に、ＦＬＯ１１Ｄ遺伝子が産膜形成の原因遺伝子であるかどうかを確認するため、取得された遺伝子破壊株を産膜形成培地で７日間、３０℃で静置培養し、産膜が形成されるかどうかを確認した。その結果、非常に興味深いことに、ＦＬＯ１１Ｄ単独破壊株、ＦＬＯ１１Ｄ２重破壊株では産膜形成が認められたものの、ＦＬＯ１１Ｄ３重破壊株では、産膜形成が完全に消失しており、ＦＬＯ１１Ｄがジゴサッカロミセス・ルキシの産膜形成に必須の遺伝子であることが確認された（図６）。
【００４２】
さらに、産膜形成能を有する株を簡便に識別するため、下記表５に示したようなＦＬＯ１１Ｄ遺伝子特異的なＰＣＲプライマーを設計した。当該プライマーは、ＦＬＯ１１Ｄ遺伝子内の活性ドメイン（図１中、部位２に相当）内に設計した。当該プライマーを用いたＰＣＲによって産膜形成能の有無を判別可能かどうか調査するため、醤油・味噌等に由来するさまざまなジゴサッカロミセス・ルキシの株をＰＣＲ解析に供した。その結果、ＦＬＯ１１Ｄ遺伝子の有無と産膜形成能は完全に一致しており、１株の例外も存在しなかった（図７）。以上の結果から、ジゴサッカロミセス・ルキシの産膜形成能の有無をＰＣＲ法により、簡便かつ迅速に評価可能であることが判明した。
【００４３】
【表５】
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【００４４】
また、図１模式図中の部位２のほか、部位１、３、４内に設計したプライマーセットを用いても産膜性の評価ができることを確認するため、表６に示すプライマーを作成し、同様にジゴサッカロミセス・ルキシの株をＰＣＲ解析に供した。結果、ＦＬＯ１１Ｄ＿ｆｗｄ４およびｒｅｖ４の組み合わせから成るプライマーセットを用いた場合では、ＦＬＯ１１Ｄ遺伝子の有無と産膜形成能は完全に一致していた。また、ＦＬＯ１１Ｄ＿ｆｗｄ５およびｒｅｖ５の組み合わせ、またＦＬＯ１１Ｄ＿ｆｗｄ５およびｒｅｖ５の組み合わせから成るプライマーセットを用いた場合では、いずれも同一の１株に対してのみ擬陽性を示したものの、他の株では完全に産膜形成能を有する株においてのみＦＬＯ１１Ｄが検出され、ほぼ確実に産膜形成酵母菌株を判別することが可能であることが判明した。
【００４５】
【表６】
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【産業上の利用可能性】
【００４６】
本発明により、食品産業において利用する上で不都合な形質を示さない有用な酵母の簡便かつ迅速な識別方法が供給される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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