(57)【要約】【課題】フラボノール構造を有する化合物を含む動物胚の低温保存用の保存剤、該保存剤を含む動物胚の低温保存用の保存液、及びフラボノール構造を有する化合物を用いた低温での動物胚の保存方法を提供する。【解決手段】式（Ｉ）：2014198673.tif 000013〔式中、R1〜R9は、同一又は異なって、-H、-OH又はアルコキシ基である〕で表されるフラボノイド化合物を含む動物胚の低温保存用の保存剤、該保存剤を含む動物胚の低温保存用の保存液、及び式（Ｉ）で表されるフラボノイド化合物を含む溶液に動物胚を浸漬し、該溶液を低温に保持することを特徴とする動物胚の保存方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）：
【化１】
2014198673.tif 000011
〔式中、R1〜R9は、同一又は異なって、-H、-OH又はアルコキシ基である〕で表されるフラボノイド化合物を含む動物胚の低温保存用の保存剤。
【請求項２】
前記フラボノイド化合物がミリセチン、クエルセチン、ケンペロール、ガランギン、イソラムネチン、フィセチン及びフラボノールからなる群から選ばれる少なくとも１種である、請求項１に記載の保存剤。
【請求項３】
前記動物胚が牛胚である、請求項１又は２に記載の保存剤。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の保存剤を含む動物胚の低温保存用の保存液。
【請求項５】
式（Ｉ）：
【化２】
2014198673.tif 000012
〔式中、R1〜R9は、同一又は異なって、-H、-OH又はアルコキシ基である〕で表されるフラボノイド化合物を含む溶液に動物胚を浸漬し、該溶液を低温に保持することを特徴とする動物胚の保存方法。
【請求項６】
前記フラボノイド化合物がミリセチン、クエルセチン、ケンペロール、ガランギン、イソラムネチン、フィセチン及びフラボノールからなる群から選ばれる少なくとも１種である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記動物胚が牛胚である、請求項５又は６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、動物胚の低温保存用の保存剤、及び該保存剤を含む動物胚の低温保存用の保存液に関する。さらに、本発明は、低温での動物胚の保存方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞は細胞膜を挟んで細胞内外でイオンの組成が異なっており、この電荷を持つイオンの分布の差が、電位差をもたらす。通常、細胞内は細胞外に対して負の電位にあり(膜電位)、この膜電位は生物共通の基本原理として動植物を問わず存在している。膜電位の調節機構は生命維持や細胞の機能を発揮するのに必須であり、その破綻は生命あるいは細胞の死に直結する。
【０００３】
このため、細胞内外の膜上には様々なイオンポンプやイオンチャンネルがあり、恒常的にイオンバランスの調節が行われている。その最も重要な調節機構として、動物細胞ではナトリウムポンプ(Na+-K+ATPase)が、植物細胞ではプロトンポンプ(H+-ATPase)が挙げられる。これらのイオンポンプはATPエネルギーを利用して特定のイオンを能動輸送する膜タンパク質である。何らかの原因によりATPが枯渇あるいは環境温度が至適範囲から逸脱するとイオンポンプの機能は低下あるいは停止することになる。
【０００４】
動物細胞では生理的条件下では主にナトリウムポンプの働きによって、1回毎に細胞内のナトリウムイオン3つが細胞外に汲み出され、逆にカリウムイオン2つが細胞外から細胞内に汲み入れられる。したがって、通常は細胞内はカリウム濃度が高く(ナトリウム濃度は低く)、細胞外はナトリウム濃度が高く(カリウム濃度は低く)維持されている。細胞は一定の温度以下の低温になるとナトリウムポンプの機能が低下し、ナトリウムを細胞外に汲み出すことができなくなり、細胞内のナトリウム濃度が上昇する。ナトリウム濃度の上昇に伴い細胞内浸透圧が上昇し、水分子の流入により細胞が膨潤、最終的に細胞破裂(細胞障害)に至る。
【０００５】
医療現場での臓器移植に際し、移植用臓器を低温保存した場合の細胞障害は、上記のメカニズムが主要な原因の一つと考えられ、電解質の基本組成を細胞内型の低ナトリウム、高カリウムとした臓器保存液が開発された。その代表例がユーロコリンズ(EC)液やUW (University of Wisconsin)液である。これらは、それまでのリンゲル液を中心とした細胞外型(高ナトリウム、低カリウム)の保存液と比べ、大幅な臓器保存期間の延長を可能とし、国内外において主要な臓器保存液として臨床応用されている。しかしながら、これら細胞内型保存液は保存温度が上昇した場合には一転して細胞障害性を起こす危険性を持っている。また、これらが全ての組織、臓器に適用できるわけではなく、更なる保存期間の延長も含め、より一層の性能向上が待望されている。
【０００６】
牛の受精卵(胚)移植技術は、供卵牛へのホルモン剤による過剰排卵処置、人工授精、胚回収及び受卵牛への移植等のプロセスからなり、当該胚移植技術を用いることにより、優良な繁殖雌牛や遺伝的価値の高い種雄牛を効率よく生産することが可能となる。そのため、世界中で牛胚の凍結保存に関する研究が行われ、多くの急速凍結法(ガラス化凍結法)や緩慢凍結法が開発されており、比較的安定した受胎率が得られるようになっている。
【０００７】
しかし、従来の牛胚の凍結保存に関する技術では50%前後の平均受胎率しか得ることができず、受胎率向上への大きな改善策は10年以上報告されていない。当該事実は、哺乳類胚の凍結保存法がある程度の技術的限界に達していることを意味すると考えられる。従来の凍結保存法では、凍結と解凍の過程で受ける物理的損傷によって胚の生命力が必然的に損なわれるという問題が生じている。また、従来の凍結保存の方法では、液体窒素を使用するため、飛行機に乗せて運ぶことができないという問題もある。
【０００８】
したがって、供卵牛から回収された牛胚を非凍結状態で発育を抑制しながら生かし続けることのできる方法があれば、凍結及び解凍に伴う損傷を受けていない胚を効率よく子牛生産に利用することが可能となる。このような方法を利用することにより、供卵牛と受卵牛の発情周期が数日ずれた場合、受卵牛の発情周期に合わせて移植時期を調整することも可能となる。
【０００９】
このような問題に対応するための方法として、非特許文献１では、FBSとHEPESを一定の割合で含有するMedium 199を培地として使用することで、4℃で7日間まで牛胚を維持することが可能となることが報告されている。また、特許文献１では、牛胚の非凍結低温保存において、血清とNfe11ペプチドを添加した培地が、低温環境下において牛胚に対して強い延命効果を発揮することが報告されている。
【００１０】
さらに、細胞や臓器を保存する技術としては、例えば、次の特許文献２〜５に開示がある。
【００１１】
特許文献２には、一以上のポリフェノールを含む保存溶液を生物学的材料に添加し、冷却することによる生物学的材料の保存方法が開示され、実施例においてはポリフェノールとしてはカテキン類が開示されているのみである。
【００１２】
特許文献３には、細胞培養液中にエンケファリン誘導体を添加することによる、水が結晶化しない温度、例えば4℃前後の温度で細胞を冷蔵保存する方法が開示されている。
【００１３】
特許文献４には、ポリフェノールと0.0001〜0.05重量%のアスコルビン酸又はアスコルビン酸金属塩とを含有する、細胞保存剤、組織保存剤等として使用するための医用ポリフェノール溶液、当該医用ポリフェノール溶液によりポリフェノールの分解が抑制され、過酸化水素の発生が抑制されることが開示されている。そして、実施例においてはポリフェノールとしてはエピガロカテキンガレート(EGCg)が開示されているのみである。
【００１４】
特許文献５には、有効成分としてエピガロカテキンガレートを90質量%以上含有する保存剤用組成物が開示され、エピガロカテキンガレートを高純度に精製して用いることで細胞の保存効果をより一定にできることが記載されている。
【００１５】
また、特許文献６では、水溶液の過冷却能力を促進する能力があるフラボノイド配糖体について開示され、この過冷却促進物質を用いることにより水が約-15℃程度で利用できる不凍性液体となるので当該不凍性液体中で生物材料等を保存できることが記載されている。特許文献６で開示されている過冷却促進物質のフラボノイド配糖体の使用方法としては、次の特許文献７〜９にも報告がある。
【００１６】
特許文献７には、上記フラボノイド配糖体を含んだ過冷却状態を維持できる飲料が開示されている。また、特許文献８には、ガラス化溶液に上記フラボノイド配糖体を含んだ凍結保存液が開示され、従来のガラス化溶液よりも毒性が低く、保存による細胞等の生存性を上昇させることができることが記載されている。
【００１７】
さらには、特許文献９には、上記フラボノイド配糖体を含む臓器保存液を用いることにより、凍結が起こらない状態で0℃以下の温度で動物の臓器を保存することが可能となることが開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１８】
【特許文献１】特開2012-176940号公報
【特許文献２】特表2007-519712号公報
【特許文献３】特開2002-335954号公報
【特許文献４】特開2006-188436号公報
【特許文献５】特開2003-267801号公報
【特許文献６】国際公開第2008/007684号
【特許文献７】特開2009-219394号公報
【特許文献８】特開2009-219395号公報
【特許文献９】特開2009-221128号公報
【非特許文献】
【００１９】
【非特許文献１】Scientific Reports 3: 1173 doi: 10.1038/srep01173
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
非特許文献１及び特許文献１〜５には細胞や臓器を保存する溶液にフラボノール構造を有する化合物を使用することは実質的には開示されていない。特許文献６、９には、フラボノイド配糖体を用いることにより、凍結することなく、氷点下の温度にまで過冷却できるため、凍結による傷害を伴うことなく0℃以下で細胞などを保存できることが開示されているが、通常の低温条件での低温障害の軽減については開示されていない。また、糖を含まないフラボノール化合物について、このような開示はない。
【００２１】
細胞や臓器、生体組織などを低温下で簡便に保存することは、一般に実施されている方法である。しかしながら、対象物の凍結を伴わない場合でも、その低温条件に起因する障害が発生することも知られている。
【００２２】
本発明では、これらの低温障害を軽減すべく、糖を有しないフラボノール化合物を使用することによる、動物胚の低温保存用の保存剤、該保存剤を含む動物胚の低温保存用の保存液、及びフラボノール化合物を用いた低温での動物胚の保存方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
本発明者らは、糖を有していないフラボノール構造を有する特定の化合物を使用して凍結を伴わない氷点下前後の低温から通常の冷蔵温度までの低温で牛胚を保存することにより、牛胚の生存率及び胚孵化率が高められ低温障害保護効果が得られるという知見を得た。本発明は、これら知見に基づき完成されたものであり、次の保存剤、保存液、及び保存方法を提供するものである。
【００２４】
(I) 保存剤
(I-1) 式（Ｉ）：
【００２５】
【化１】
2014198673.tif 000002
【００２６】
〔式中、R1〜R9は、同一又は異なって、-H、-OH又はアルコキシ基である〕で表されるフラボノイド化合物を含む動物胚の低温保存用の保存剤。
(I-2) 前記フラボノイド化合物がミリセチン、クエルセチン、ケンペロール、ガランギン、イソラムネチン、フィセチン及びフラボノールからなる群から選ばれる少なくとも１種である、(I-1)に記載の保存剤。
(I-3) 前記動物胚が牛胚である、(I-1)又は(I-2)に記載の保存剤。
(I-4) 前記低温は前記動物胚が完全な凍結をしない温度、すなわち、-5℃〜20℃の温度である、(I-1)〜(I-3)のいずれか一項に記載の保存剤。
【００２７】
(II) 保存液
(II-1) (I-1)〜(I-4)のいずれか一項に記載の保存剤を含む動物胚の低温保存用の保存液。
【００２８】
(III)保存方法
(III-1) 式（Ｉ）：
【００２９】
【化２】
2014198673.tif 000003
【００３０】
〔式中、R1〜R9は、同一又は異なって、-H、-OH又はアルコキシ基である〕で表されるフラボノイド化合物を含む溶液に動物胚を浸漬し、該溶液を低温に保持することを特徴とする動物胚の保存方法。
(III-2) 前記フラボノイド化合物がミリセチン、クエルセチン、ケンペロール、ガランギン、イソラムネチン、フィセチン及びフラボノールからなる群から選ばれる少なくとも１種である、(III-1)に記載の方法。
(III-3) 前記動物胚が牛胚である、(III-1)又は(III-2)に記載の方法。
(III-4) 前記低温は前記動物胚が完全な凍結をしない温度、すなわち、-5℃〜20℃の温度である、(III-1)〜(III-3)のいずれか一項に記載の方法。
【発明の効果】
【００３１】
本発明の保存剤及び方法により、完全に凍結をしない-5℃から20℃の通常の冷蔵保管の低温で動物胚を保存することで、牛胚等の動物胚の生存率を高めることができ低温障害保護効果が得られる。したがって、動物胚の保存に適した低温下で且つそれに起因する低温障害を抑制することができる条件で、動物胚を保存することが可能となるので、動物胚の更なる生存率の向上が期待できる。そのため、本発明は、家畜育種などの分野における応用が期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】試験例３における化合物(1)〜(7)の添加量と生存細胞数の関係を示すグラフである(添加化合物最終濃度10μg/ml、1μg/ml、0.1μg/ml、0.01μg/ml)。
【図２】試験例３におけるカテキン類及び没食子酸の添加量と生存細胞数の関係を示すグラフである(添加化合物最終濃度100μg/ml、10μg/ml、1μg/ml)。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００３４】
本発明の動物胚の低温保存用の保存剤は、式（Ｉ）：
【００３５】
【化３】
2014198673.tif 000004
【００３６】
〔式中、R1〜R9は、同一又は異なって、-H、-OH又はアルコキシ基である〕で表されるフラボノイド化合物を含むことを特徴とする。
【００３７】
また、本発明の動物胚の保存方法は、上記フラボノイド化合物を含む溶液に動物胚を浸漬し、該溶液を低温に保持することを特徴とする。
【００３８】
R1〜R4は、好ましくは、同一又は異なって、-H又は-OHである。
【００３９】
上記アルコキシ基は、好ましくは炭素数１〜６のアルコキシ基、より好ましくは炭素数１〜３のアルコキシ基、特に好ましくは-OCH3である。当該アルコキシ基のアルキル部分は、直鎖状又は分枝状のいずれであってもよい。炭素数１〜６のアルコキシ基としては、例えば、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、イソブトキシ、tert−ブトキシ、ペンチルオキシ、イソペンチルオキシ、ヘキシルオキシなどが挙げられる。
【００４０】
式（Ｉ）で表されるフラボノイド化合物としては、例えば、ミリセチン(Myricetin)、クエルセチン(Quercetin)、ケンペロール(Kaempferol)、ガランギン(Galangin)、イソラムネチン(Isorhamnetin)、フィセチン(Fisetin)、フラボノール(Flavonol)などが挙げられる。
【００４１】
上記のフラボノイド化合物は、公知の方法により化学的に合成することができるし、植物等の生物に含まれているので、これらから公知の方法により抽出することで入手することもできる。また、市販品により入手することも可能である。
【００４２】
本発明において低温とは、前記動物胚が完全な凍結をしない温度、すなわち、-5℃以上、好ましくは-3℃以上、より好ましくは0℃より高い且つ20℃以下、好ましくは15℃以下、より好ましくは10℃以下の温度である。
【００４３】
本明細書で使用する低温障害とは、低温により引き起こされる細胞障害を意味し、低温障害保護効果とは、該低温障害から動物胚を保護する効果を意味する。したがって、この意味を勘案すると、本発明の保存剤は低温障害保護剤と称することもできる。
【００４４】
本発明で使用する動物胚としては、本発明の効果が得られる限り、どのような動物由来のものであっても制限されないが、好ましくは哺乳動物(ヒト、サル、ウシ、ブタ、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギ、マウス、ラットなど)の胚であり、より好ましくは牛胚である。
【００４５】
牛胚は、公知の方法により適宜調製することができ、体外受精又は体内受精のいずれの方法で作製したものでも使用することができる。牛胚の作製方法としては、例えば次の方法が挙げられる。牛の卵巣より吸引採取した卵胞卵子を体外培養し、牛の精子と共培養(媒精)した後、形態的に桑実期から胚盤胞期の胚を牛胚として使用する。
【００４６】
本発明の保存剤は、フラボノイド化合物（Ｉ）以外にも、公知の添加剤が適宜配合されていてもよい。
【００４７】
本発明の動物胚の低温保存用の保存液は、上記保存剤を含むことを特徴とする。本発明において動物胚を低温保存する際には、フラボノイド化合物（Ｉ）は、通常、溶液として使用する。フラボノイド化合物（Ｉ）を溶解する溶剤としては、特に限定されないが、例えば、生理食塩水、輸液類(電解質輸液、栄養輸液、糖質輸液、アミノ酸輸液、ブドウ糖液、リンゲル液、酢酸リンゲル液、乳酸リンゲル液等)、緩衝液(PBS、トリス緩衝液、Hepes緩衝液、MOPS緩衝液、PIPES緩衝液等)、細胞培養液(Medium199、RPMI1640、DMEM等)、臓器保存液(EC液、UW液等)、モデナ液などが挙げられる。牛胚を低温保存する場合には、溶剤としては血清(好ましくはウシ血清)及び細胞培養液(好ましくはMedium199)を含むものが望ましく、更にHepes緩衝液を含むものがより望ましい。ウシ血清としては、ウシ胎児血清、仔ウシ血清、又は成ウシ血清を挙げることができるが、ウシ胎児血清が望ましい。
【００４８】
本発明の保存液におけるフラボノイド化合物（Ｉ）の濃度としては、通常、0.001〜1000μg/ml、好ましくは0.01〜100μg/ml、より好ましくは0.1〜10μg/mlである。なお、本発明の保存液には従来の他の成分、例えば、緩衝剤、抗生物質、抗菌剤、抗酸化剤、血清、糖類、脂質、ビタミン、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、pH指示薬、キレート剤、浸透圧調節剤などを含むこともできる。
【００４９】
本発明において、動物胚の保存は、フラボノイド化合物（Ｉ）を含む溶液に動物胚を浸漬することにより行うことができる。その際、該溶液は動物胚を浸漬する前に低温に冷却されてもよいし、また動物胚を浸漬した後に低温に冷却されてもよい。動物胚を含む溶液が一旦低温まで冷却された後は、低温に保持されるが、常に一定の温度に維持される必要はなく、短時間なら低温の範囲外の温度になってもよい。
【００５０】
上記フラボノイド化合物を含む溶液に動物胚を浸漬するための容器は、動物胚に毒性を示さないものであれば特に限定されないが、例えば、精液凍結用ストロー、クライオチューブ、サンプリングチューブ、受精卵移植用ストロー、細胞培養プレート、細胞培養シャーレ、各種バイアル等が挙げられる。
【００５１】
本発明のフラボノイド化合物（Ｉ）を含む溶液を使用することにより、低温で動物胚を保存することで、動物胚の生存率を有意に高めることができ低温障害保護効果が得られる。本発明は、動物胚の保存に適した低温下で且つそれに起因する低温障害を抑制できるので、動物胚を適切な状態で保存することが可能となる。
【００５２】
上記のような特徴を有する本発明の保存液は、家畜育種の分野における受精胚の保存液などとしての応用が期待される。
【００５３】
本発明の保存液により非凍結低温下で保存した動物胚は、凍結保存法における凍結及び融解時の物理的な損傷を受けることが無いため、受胎率の向上を期待できる。さらに、従来の液体窒素を用いた凍結保存法では飛行機での輸送ができなかったが、本発明によれば飛行機による高速輸送が可能となる。
【実施例】
【００５４】
以下、本発明を更に詳しく説明するため実施例を挙げる。しかし、本発明はこれら実施例等になんら限定されるものではない。
【００５５】
試験例１
本発明化合物について細胞の低温障害に対する保護作用を以下の方法により評価した。
【００５６】
5%炭酸ガス、37℃のインキュベーター(三洋電機社製、MCO-17AIC)内において10%ウシ胎仔血清(Thermo社、No.SH3D396.03)を含有したRPMI-1640(SIGMA社、No.R8758)(10％FBS-RPMI)培養液中で培養したヒト前骨髄性白血病細胞株HL-60を回収し、4℃、1,000rpm、5分間遠心(TOMY社製、EIX-135)後、上清を除去し2×106個/mlとなるよう生理食塩水にて再懸濁した。この細胞懸濁液0.25 mlと供試化合物0.25 mlを2 ml滅菌済マイクロチューブ内にて混合した。なお、供試化合物は試験前にジメチルスルフォキサイド(ナカライテスク社、No.13407-45)(DMSO)にて100 mg/mlに溶解後、生理食塩水(大塚製薬、大塚生食注)にて500倍希釈し、0.2 mg/ml生理食塩水溶液として調製したものを使用した。
【００５７】
この細胞懸濁液と供試化合物との混合液を4℃に設定した冷却容器(TWINBIRD社製、No.SC-DF25)内にて約24時間静置した。その後10%FBS-RPMI培養液2.5 mlを添加して4℃、1,000rpm、5分間遠心した。上清除去後、2.5 mlの10％FBS-RPMI培養液にて懸濁し、96穴マイクロプレート(IWAKI社、No.3860-096)に0.1 ml/ウェル添加し、5%炭酸ガス、37℃のインキュベーター内で約24時間培養した。続いてWST-8液(ナカライテスク社、Cell Count Reagent SF、No.07553-44)10μl/ウェルを添加し、更にインキュベーター内にて3時間培養した後、450 nmの波長にて吸光度を測定した(WAKO社、SPECTRA MAX250)。この吸光度の値から、前もって作成した細胞数と吸光度との標準線(生存細胞数＝56375×吸光度、R2＝0.9995)により生存細胞数を算定した。
【００５８】
その結果、表１に示すように無添加の場合には、細胞を4℃にて24時間静置したこと(低温障害)によって、生存細胞数は初期細胞数20,000個/ウェルから500個/ウェルまで減少した。一方、低温保存時に化合物(1)〜(7)をそれぞれ100μg/mlの濃度で細胞に添加処理することによって低温障害保護効果が認められた。この時の生存細胞数は、生理食塩水のみの化合物無添加と比べ、21.0〜50.6倍高い値であった。
【００５９】
【表１】
2014198673.tif 000005
【００６０】
試験例２
供試化合物(3) (最終濃度：100μg/ml、10μg/ml、1μg/ml又は0.1μg/ml)について、低温保存時の温度を-5℃、0℃、4℃又は10℃に設定した以外は、試験例１と同様の試験方法に従い実施した。その結果、表２に示されているように、実施した全ての保存温度において低温障害保護効果が確認された。
【００６１】
【表２】
2014198673.tif 000006
【００６２】
試験例３
低温保存時に表１に(1)〜(7)で示す各検討化合物を各10μg/ml、1μg/ml、0.1μg/ml、又は0.01μg/ml (最終濃度)添加した以外は試験例１と同様の試験を行った。また、低温保存時にカテキン類(カテキン、エピカテキン、没食子酸エピカテキン、エピガロカテキン、没食子酸エピガロカテキン)及び没食子酸(gallic acid)を各100μg/ml、10μg/ml、又は1μg/ml (最終濃度)添加した以外は試験例１と同様の試験を行った。
【００６３】
結果を図１及び２に示す。これらの結果から、カテキン類及び没食子酸は1μg/ml以下では低温障害保護効果が得られないのに対して、本発明の化合物は1μg/mlであっても低温障害保護効果が得られることが分かる。
【００６４】
また、以下の表３に示されているようにポリフェノール類には一般的に抗酸化能があることが知られているが、抗酸化能の高い化合物が必ずしも低温障害保護効果が高いというわけではない。抗酸化能と低温障害保護効果との間に明確な相関関係がみられないことから、本発明の化合物の低温障害保護効果は単にポリフェノール類の抗酸化能によるものではないことが分かる。
【００６５】
【表３】
2014198673.tif 000007
【００６６】
試験例４
低温保存時に検討化合物を添加する溶媒を生理食塩水から、リン酸緩衝生理食塩水(PBS、SIGMA社No.D 8537)、EC液(組成K2HPO4; 7.4 g/L、KH2PO4; 2.05 g/L、KCl; 1.12 g/L、NaHCO3; 0.84 g/L、グルコース; 35 g/L)、UW液(ビアスパン；アステラス製薬製)、RPMI1640培養液(RPMI)、又は10%FBS-RPMI培養液に変更して試験例１と同様の試験を行った。その結果、表４に示されているように、使用した全ての溶媒において低温障害保護効果が確認された。即ち、本発明化合物の溶媒としては生理食塩水だけに限定されず、生理緩衝液、臓器保存液、細胞培養液などの広く一般的に使用される溶媒中でも低温障害保護効果を発揮することが確認された。
【００６７】
【表４】
2014198673.tif 000008
【００６８】
試験例５(牛胚の低温保存１)
体外受精胚の低温障害に対する本発明化合物の保護効果の測定を以下の方法により評価した。
【００６９】
(保存液の調製)
20%(V/V)ウシ胎子血清及び25 mM Hepes (DOJINDO)を含有するMedium199培地(GIBCO)に供試化合物を最終濃度1μg/mlとなるように添加した。
【００７０】
(体外受精と受精胚選抜)
牛卵巣より卵胞卵子を吸引採取し、5%(V/V)ウシ胎子血清を含むmedium199培地中、5%CO2及び38.5℃の条件下で体外成熟培養を20時間行った。一方、凍結融解した牛の精子を媒精液IVF-100 (機能性ペプチド研究所)中に懸濁し、2000rpm、10分の遠心分離を行うことで精子洗浄を行った。最終精子濃度が500万精子/mlになるように調整した精子と上記卵子とを100μlのスポット中で共培養し、媒精を6時間行った。媒精後、1日目に受精卵に付着した卵丘細胞を1〜2層程度までピペッティングにより除去し、2%(V/V)ウシ胎子血清を含むCR1aa培地中で体外発生培養を行い、5日目に5%(V/V)ウシ胎子血清含有USU培地に交換した。7日目に国際受精卵移植研究会の指標に従い、胚盤胞期まで形態的に正常に発育したグレード1〜2の受精胚を選抜し下記の低温保存試験に供した。
【００７１】
(低温保存試験)
以下に示す方法で低温保存試験を実施した。
【００７２】
保存液を直径400μm(容量0.25ml)のストロー(1/4cc clear straw、SPI)内に吸引し、続いて空気の層を挟んで牛胚を含む保存液を吸引した。さらに空気の層を挟んで再び保存液のみを吸引した後、ストローの両端を封じ、冷蔵庫内(4±1℃)で保存した。120時間(5日間)の低温保存後、5%(V/V)ウシ胎子血清を含むダルベッコリン酸緩衝液(D-PBS、GIBCO)にて3回浸漬し洗浄した牛胚を5%CO2及び38.5℃の条件下、5%(V/V)ウシ胎子血清を含むCR1aa培地中で48時間培養した。実体顕微鏡下で形態観察を行い、培養による卵割進行が確認できた場合に胚が生存していると判断した。生存胚については、透明体からの脱出(孵化)が観察されるか否かを確認した。
【００７３】
(試験結果)
牛胚を4℃で120時間(5日間)低温保存後の生存率と孵化率を以下の表５に示す。
【００７４】
【表５】
2014198673.tif 000009
【００７５】
表５に示すように20%(V/V)ウシ胎子血清を含むmedium199培地中において無添加群は生存率が44.0%、胚孵化率は20.0%であった。一方、化合物(3)処理群では生存率が76.0%、孵化率が40%となり、本発明化合物の牛胚に対する低温障害保護効果が確認された。
【００７６】
試験例６(牛胚の低温保存２)
体内受精胚の低温障害に対する本発明化合物の保護効果の測定を以下の方法により評価した。
【００７７】
(保存液の調製)
20%(V/V)ウシ胎子血清及び25 mM Hepes (DOJINDO)を含有するMedium199培地(GIBCO)に供試化合物を最終濃度1μg/mlとなるように添加した。
【００７８】
(人工受精と受精胚選抜)
発情周期の黄体期に卵胞刺激ホルモンを漸減的に3〜4日間投与し、最終日にPGF2αを投与して発情誘起した。発情観察後は凍結精液にて人工授精を行った。7日齢胚(発情日を0日として)を非外科的に回収し、5%(V/V)ウシ胎子血清含有USU培地で1日培養した。国際受精卵移植研究会の指標に従い、胚盤胞期まで形態的に正常に発育したグレード1〜2の受精胚を選抜し下記の低温保存試験に供した。
【００７９】
(低温保存試験)
低温保存期間を120時間(5日間)に換えて240時間(10日間)とした以外は、体外受精胚と同様の試験方法及び評価方法により生存率及び孵化胚数を評価した。
【００８０】
(試験結果)
牛胚を4℃で240時間(10日間)低温保存後の生存率と胚孵化率を以下の表６に示す。
【００８１】
【表６】
2014198673.tif 000010
【００８２】
表６に示すように20%(V/V)ウシ胎子血清を含むmedium199培地中において無添加群は生存率が10.0%、胚孵化率は0%であった。一方、化合物(3)処理群では生存率が27.6%、孵化率は10.3%となり、本発明化合物の牛胚に対する低温障害保護効果が確認された。
【図１】
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【図２】
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