(57)【要約】      （修正有）【課題】任意の接合型を有する酵母から、接合型変換の際の自己倍数化を回避して、所望の接合型を有する酵母を製造する方法を提供する。【解決手段】接合型の変換を望む酵母に、(１)ａ１遺伝子又はα２遺伝子等の接合型遺伝子を導入して形質転換体を得る工程、(２)ＨＯ遺伝子等の接合型変換遺伝子を導入して形質転換体を得る工程を含む、所望の接合型を有する酵母を製造する方法。得られた形質転換株を少なくとも片方の親株として用いることで、優良な形質を有する任意の酵母との交雑株を効率的に製造する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
任意の接合型を有する酵母から、所望の接合型を有する酵母を製造する方法であって、
（１）前記酵母の接合型を変換する工程、
（２）前記酵母の自己倍数化を抑制する工程、
を含む、方法。
【請求項２】
前記酵母が、醸造用酵母又はパン酵母である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記自己倍数化を抑制する工程が、プロモーターの下流に接合を制御する遺伝子を連結した構築物又はベクターを利用して、該遺伝子を前記酵母の細胞内で発現させる方法により構成される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記接合を制御する遺伝子が、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)属酵母由来のａ１遺伝子又はα２遺伝子である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記プロモーターが、ＰＧＫ１プロモーターである、請求項３又は４に記載の方法。
【請求項６】
前記所望の接合型がα型であるとき、前記プロモーターがａ型特異的に発現する遺伝子のプロモーターである、請求項３又は４に記載の方法。
【請求項７】
前記ａ型特異的に発現する遺伝子のプロモーターが、ＳＴＥ２プロモーターである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記接合型を変換する工程が、プロモーターの下流に接合変換遺伝子を連結した構築物又はベクターを利用して、該遺伝子を前記酵母の細胞内で発現させる方法により構成される、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記接合型変換遺伝子が、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)属酵母由来のＨＯ遺伝子である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記プロモーターが、酵母の接合型に依存した発現特性を示さないプロモーターである、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１１】
前記プロモーターが、ＧＡＬ１プロモーターである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれかに記載した方法により製造した酵母を、少なくとも片方の親株として、酵母の交雑株を製造する方法。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれかに記載した方法により製造した酵母。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵母の交雑を行なうための、酵母菌株を育種する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
酵母は古来より人類の日常生活と密接に関わり合ってきた。清酒，ワイン，ビール等の酒精飲料、及びパン、味噌，醤油等の発酵食品の製造に加えて、近年のバイオテクノロジーの発達により医薬品の製造にも関わるに至っている。(以降、「飲料・食品・医薬品等の製品の製造などの産業上有用な用途に用い得る酵母」を「実用酵母」とも表示する)。
【０００３】
酵母の有効利用に際しては、優秀な酵母を育種することが不可欠である。これまでに様々な育種法が用いて、実用酵母菌株の改良が行われてきた。とりわけ突然変異育種法は古くから広く用いられてきた方法であり、紫外線や放射線又は薬剤など種々の突然変異誘発源によって、人為的に突然変異を誘発することで形質を改変する方法である。しかしながら実用酵母は二倍体あるいは四倍体といった高次倍数体であることが多いため、所望の性質を有する突然変異体を得るには多大な労力を要する。
【０００４】
一方、他の育種法として、交雑育種法が知られている。交雑育種法は、異なる二つの菌株(親株)について人為的に交雑を行い、所望の形質を有する交雑株を選抜する方法であり、両親株の優良形質を併有する株を得るために有効な方法である。酵母の交雑には接合を利用するため、交雑の両親株として用いる二株は互いに接合する性質(以降「接合能」とも表示する)、すなわち、それぞれａ型とα型の接合型を持つことが必要である。ところが、実用酵母の多くは二倍体であり、通常は接合能を有さないａ／α型の接合型を持つ。そこで減数分裂を経て胞子を形成させることで、ａ型もしくはα型の接合型を持つ一倍体の減数分裂分離体(以降、「減数体」とも表示する)を取得することが必要となる。このとき生成したａ型もしくはα型の酵母細胞は親株の全ての形質を継承するとは限らないため、かかる減数体を用いて製造した交雑体の集団から所望の形質を有する酵母株を選別する作業に時間と労力を要する。
【０００５】
さらには、各々所望する形質を有する２つの優秀な一倍体酵母が存在したとしても、それらの接合型がａ型とａ型、又はα型とα型であった場合にはそれらを接合させることができない。その際には、どちらか一方の親株から、異なる接合型を持ち、尚かつ所望の形質を有する減数体を新たに取得しなければならないが、既存の減数体と同等の形質を有しつつ接合型のみ異なる減数体、すなわち接合型座位を除く全ての遺伝的背景が同一の酵母株を取得することはこれまで極めて困難であった。
【０００６】
ところが最近、酵母細胞内に接合型変換遺伝子ＨＯ(以降、「ＨＯ遺伝子」とも表示する)を発現させることによって、酵母の接合型をａ型又はα型へと変換する技術(特許文献１参照)が開発された。この技術により、親株の接合型座位を除く全ての遺伝的背景を継承したａ型又はα型の酵母を出現させることが可能となり、上記の「所望の形質を有する酵母株の選別作業」を軽減できることが期待されている。しかしながら、上記技術の課題も認識されている。特許文献２や特許文献３に示されるように、ＨＯ遺伝子による接合型の変換作用を利用しても、生成した所望の接合型を持つ酵母の近傍で、対となる接合型を持つ酵母(以降、「対型酵母」とも表示する)が残存あるいは新生することが不可避なため、増殖の過程で接合して自己倍数化(非特許文献１参照)を惹起してしまう。このような望まざる自己倍数化が起こってしまうと、ＨＯ遺伝子による接合型の変換作用を利用して作製した所望の接合型を持つ目的の酵母を分離することが困難となる。
【０００７】
以上のように、所望の形質を有する異なった実用酵母から、それぞれの形質を継承したａ型とα型の一倍体酵母の組み合わせを獲得するには依然甚大な労力が必要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開2010-220481号公報
【特許文献２】特開平7-67664号公報
【特許文献３】特開2009-171912号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】KentaroFurukawa，et．al.，2011，PLoS One，Vol.6，e26584
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の課題は、任意の接合型を持つ酵母から、接合型変換の際の自己倍数化を回避して、所望の接合型を持つ酵母を製造する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、接合型変換の際に不本意にも生成する対型酵母の接合能を人為的に抑制することで、自己倍数化を回避して所望する接合型の酵母が得られることを見出した。優秀な形質を有する酵母に対して、接合を制御する遺伝子、例えばａ型酵母の製造ではａ１遺伝子を、α型酵母の製造ではα２遺伝子を予め導入することにより、生成した対型酵母にａ／α型の遺伝的背景を一過的に創出することで、かかる酵母の接合を抑制することに成功し、本発明を完成するに到った。
【００１２】
すなわち、本発明は以下を包含する。
〔１〕  任意の接合型を有する酵母から、所望の接合型を有する酵母を製造する方法であって、
（１）前記酵母の接合型を変換する工程、
（２）前記酵母の自己倍数化を抑制する工程
を含む、方法。
〔２〕  前記酵母が、醸造用酵母又はパン酵母である前記〔１〕に記載の方法。
〔３〕  前記自己倍数化を抑制する工程が、プロモーターの下流に接合を制御する遺伝子を連結した構築物又はベクターを利用して、該遺伝子を前記酵母の細胞内で発現させる方法により構成される、前記〔１〕又は〔２〕に記載の方法。
〔４〕  前記接合を制御する遺伝子が、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)属酵母由来のａ１遺伝子又はα２遺伝子である、前記〔３〕に記載の方法。
〔５〕  前記プロモーターが、ＰＧＫ１プロモーターである、前記〔３〕又は〔４〕に記載の方法。
〔６〕  前記所望の接合型がα型であるとき、前記プロモーターがａ型特異的に発現する遺伝子のプロモーターである、前記〔３〕又は〔４〕に記載の方法。
〔７〕  前記ａ型特異的に発現する遺伝子のプロモーターが、ＳＴＥ２プロモーターである、前記〔６〕に記載の方法。
〔８〕  前記接合型を変換する工程が、プロモーターの下流に接合変換遺伝子を連結した構築物又はベクターを利用して、該遺伝子を前記酵母の細胞内で発現させる方法により構成される、前記〔１〕〜〔７〕のいずれかに記載の方法。
〔９〕  前記接合型変換遺伝子が、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)属酵母由来のＨＯ遺伝子である、前記〔８〕に記載の方法。
〔１０〕  前記プロモーターが、酵母の接合型に依存した発現特性を示さないプロモーターである、前記〔８〕又は〔９〕に記載の方法。
〔１１〕  前記プロモーターが、ＧＡＬ１プロモーターである、前記〔１０〕に記載の方法。
〔１２〕  前記〔１〕〜〔１１〕のいずれかに記載した方法により製造した酵母を、少なくとも片方の親株として、酵母の交雑株を製造する方法。
〔１３〕  前記〔１〕〜〔１２〕のいずれかに記載した方法により製造した酵母。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、自己倍数化を回避して効率よく接合型の変換を行うことができるので、優良な形質を有する酵母から所望する接合型を持つ酵母を容易に製造することができる。所望の接合型を持つ酵母を用いれば、交雑育種法に伴う上述の問題を回避することができるので、両親株の優良な形質を併有する交雑株を著しく効率的に育種することが可能となると考えられる。すなわち、本発明の製造方法は、従来法では交雑育種ができなかった、又は困難であった実用酵母の交雑育種の効率性を著しく高めることを可能とするものである。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】所望の接合型を持つ酵母を製造する方法の模式図：（Ａ）本発明の接合を抑制する方法の原理の概略を示す模式図、（Ｂ）従来の接合型変換技術において生じる自己倍数化を示す模式図、（Ｃ）本発明により所望の接合型を持つ酵母を製造する方法の概略を示す模式図。
【図２】細胞特異的に緑色蛍光タンパク質ＧＦＰレポーターを発現させた場合における、各接合型の酵母細胞が発する蛍光強度を示すグラフ：（Ａ）酵母のａ型の場合、（Ｂ）酵母のα型の場合。
【図３】ａ型又はα型特異的にＧＦＰレポーターを発現する酵母細胞に、酵母の接合型に依存した発現特性を示さないＰＧＫ１プロモーターの制御下で、ａ１遺伝子又はα２遺伝子を構成発現させた場合における、各接合型の酵母細胞の挙動：（Ａ）各接合型の酵母細胞が発する蛍光強度を示すグラフ、（Ｂ）異なる栄養要求性を有する親株との接合により生成した二倍体酵母の生育を示す写真。
【図４】α型特異的にＧＦＰレポーターを発現する酵母細胞に、ａ型の接合型を有する酵母において特異的に発現する遺伝子のプロモーターの制御下でα２遺伝子を発現させた場合における、各接合型の酵母細胞の挙動：（Ａ）酵母細胞内での遺伝子発現の概略を示す模式図、（Ｂ）各接合型の酵母細胞が発する蛍光強度を示すグラフ、（Ｃ）異なる栄養要求性を有する親株との接合により生成した二倍体酵母の生育を示す写真。
【図５】α型からａ型への接合型変換の実施結果：（Ａ）α型からａ型へ変換した酵母の第三染色体の変化を示す模式図、（Ｂ）接合型変換において単離した酵母が発する蛍光強度を示すグラフ、（Ｃ）既存のＢＹ４７４１株、又は創製したａ型酵母ＨＲ４１−Ｋ株と、α型酵母ＨＲ４２−１１Ｔ株との接合により生成した二倍体酵母の生育を示す写真、(Ｄ)定量ＰＣＲにより酵母の倍数性を評価したグラフ。
【図６】ａ型からα型への接合型変換の実施結果：（Ａ）単離した酵母が発する蛍光強度を示すグラフ、（Ｂ）創製したα型酵母ＨＲ４２−Ｋ株又はＨＲ４２−Ｋ’株と、ａ型酵母ＭＣＦ４７４１株との接合により生成した二倍体酵母の生育を示す写真、（Ｃ）定量ＰＣＲにより酵母の倍数性を評価したグラフ。
【図７】ａ／α型からａ／ａ型又はα／α型への接合型変換の実施結果：（Ａ）プラスミドｐＨＹ−２ＧＡを導入したａ／α型又はａ／ａ型酵母が発する蛍光強度を示すグラフ、（Ｂ）プラスミドｐＬＹ−３ＧＣを導入したａ／α型又はα／α型酵母が発する蛍光強度を示すグラフ、（Ｃ）本技術により創製した酵母の接合効率を評価する方法及びその結果を示したグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
１．本発明における「酵母の接合型の変換」について
本発明は、任意の接合型を有する酵母の接合型を変換することにより、所望の接合型を有する酵母を製造する方法に関する。本発明の製造方法は、酵母の接合型を変換する工程、及び該酵母の自己倍数化を抑制する工程を含むことを特徴とし、これらの工程を含んでいる限り、当業者に公知のもののうち技術的に適用可能な全ての工程を包含することを排除しない。
【００１６】
本発明において、接合型の変換とは、任意の接合型を有する酵母を、該接合型以外のいずれかの接合型を有する酵母に変換することを指す。具体的には、一倍体のａ型酵母を一倍体のα型酵母に変換すること、一倍体のα型酵母を一倍体のａ型酵母に変換すること、二倍体のａ/α型酵母を二倍体のａ/ａ型酵母に変換すること、あるいは二倍体のａ/α型酵母を二倍体のα/α型酵母に変換することなどを指し、変換前の接合型あるいは変換後の接合型の種類が限定されることはない。また、変換前後の酵母の遺伝子型あるいは表現型は、接合型に関連する部分以外は不変であることが好適であるが、接合型の変換に伴い、接合型に関連する部分以外の遺伝子型あるいは表現型が変化することを除外しない。
【００１７】
２．本発明の適用可能な「酵母」について
上記の「酵母」としては、飲料、食品、医薬品等の製品の製造などの産業上有用な用途に用い得る酵母(実用酵母)、具体的には、サッカロミセス(Saccharomyces)属、ピキア(Pichia)属、クリベロマイセス(Kluyveromyces)属に属する酵母を好適に例示することができ、飲料や食品の製造に用い得る酵母をさらに好適に用いることができ、飲料や食品の製造に用いることができ、かつ、サッカロミセス(Saccharomyces)属に属する酵母を特に好適に用いることができる。上記の「飲料や食品の製造に用い得る酵母」としては、下面発酵酵母、上面発酵酵母、ワイン酵母、清酒酵母、焼酎酵母、ウイスキー酵母などの醸造用酵母や、パン酵母などを好適に例示することができる。また、上記の「酵母」には、親株だけでなく、かかる親株から胞子形成を経て得られる減数体も含む。なお、後記実施例で詳述するように、本発明の対象とする酵母は接合型座位(以下、ＭＡＴ座位とも表示する)に変異を有しないものが好ましい。ただし、ＭＡＴ座位に変異を有する酵母であっても、相同組み換え等の公知の技術を用いて、ＭＡＴ座位を修正することで本発明を適用することが可能である。
【００１８】
３．本発明における「自己倍数化を抑制する工程」について
本発明の製造方法における「自己倍数化を抑制する工程」としては、かかる酵母の接合型変換の際に生成する対型酵母の接合能を欠失し得る工程である限り特に制限されない。具体的にはａ１、α２、GPA1(GenBankアクセッション番号：NP_011868)、SST2(GenBankアクセッション番号：NP_013557)、DIG1(GenBankアクセッション番号：NP_015276；参考文献１参照)などの「接合を制御する遺伝子」を酵母細胞内で発現させる方法を好適に例示することができ、ａ１遺伝子又はα２遺伝子を酵母細胞内で発現させる方法をさらに好適に例示することができ、かつ、後記実施例で詳述するように、配列番号１に示されるアミノ酸配列(GenBankアクセッション番号：CAA24622)をコードするａ１遺伝子、又は配列番号２に示されるアミノ酸配列(GenBankアクセッション番号：DAA07518)をコードするα２遺伝子を酵母細胞内で発現させる方法を特に好適に例示することができる。なお、酵母の接合型変換の際に生成する対型酵母の接合能を欠失し得る限り、上記好適として例示した配列において１個若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入又は付加された配列を有する変異体、あるいは改変体を用いることもできる。なお、本発明において「１もしくは数個」とは、１〜５０個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個であり、全長のアミノ酸配列の８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の同一性を有する範囲内での変異があるか、または改変が施されていることを表す。
したがって、本発明における好ましい接合を制御する遺伝子は、例えば、酵母細胞内で発現させることによって、かかる酵母の接合型変換の際に生成する対型酵母の接合能を欠失し得る遺伝子であって、かつ下記の(１)〜(４)のいずれかから選択されるアミノ酸配列をコードする遺伝子であると表すことができる。
（１）配列番号１に示されるアミノ酸配列、
（２）配列番号１に示されるアミノ酸配列の１個若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列、
（３）配列番号２に示されるアミノ酸配列、
（４）配列番号２に示されるアミノ酸配列の１個若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列。
【００１９】
４．本発明における「接合型を変換する工程」について
本発明の製造方法における「接合型を変換する工程」としては、その酵母の接合型を変換し得る工程である限り特に制限されない。具体的には接合型変換遺伝子(ＨＯ遺伝子)を酵母細胞内で発現させる方法や、相同組み換えを用いてＭＡＴ座位を変換する方法、UV照射等を用いた変異誘発法などを好適に例示することができ、ＨＯ遺伝子を酵母細胞内で発現させる方法をさらに好適に例示することができる。ＨＯ遺伝子としては、例えば、先の特許文献１に記載のＨＯ遺伝子である、Saccharomyces sensu stricto、S．cerevisiae、S．cariocanus、S．kudriavzevii、S．mikatae、S．bayanus、S．pastorianus又は、S．uvarumに由来するＨＯ遺伝子などを用いることができる。中でもS．cerevisiaeに由来するＨＯ遺伝子が好ましく、特に、ワイン酵母サッカロミセス・セレビシエ  ＥＣ１１１８株に由来するＨＯ遺伝子を好適に用いることができ、後記実施例で詳述するように、配列番号３に示されるアミノ酸配列をコードするＨＯ遺伝子をさらに好適に用いることができる。なお、酵母の接合型を変換し得る限り、上記好適として例示した配列において１個若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有する変異体、あるいは改変体を用いることもできる。これらの変異体、あるいは改変体は、該タンパク質の２２３番目のアミノ酸残基がグリシンであることが好ましい。また、該タンパク質の４７５番目のアミノ酸残基は、ヒスチジンであることが好ましい。
したがって、本発明における好ましいＨＯ遺伝子は、例えば、酵母の接合型を変換し得る遺伝子であって、かつ下記の(１)又は(２)のアミノ酸配列をコードする遺伝子であると表すことができる。
（１）配列番号３に示されるアミノ酸配列、
（２）配列番号３に示されるアミノ酸配列の１個若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列であり、ただし、２２３位のグリシン及び４７５位のヒスチジンが保存されているアミノ酸配列。
【００２０】
５．本発明における所望の接合型を持つ酵母を製造する方法について
（５−１）方法の概略
本発明における所望の接合型を持つ酵母を製造する方法の概略を図１に示す。本発明の方法を、図１を参照して説明する。酵母の接合を誘起する遺伝子群(以降、ｈｓｇとも表示する)は、ａ型又はα型の一倍体細胞内で特異的に発現し、ａ／α型の二倍体細胞内ではかかる遺伝子群の発現が抑制されている。接合を制御する遺伝子として、ａ型細胞ではａ１遺伝子が、α型細胞ではα２遺伝子が発現しているが、これらがコードするタンパク質は、単独ではｈｓｇの発現に対し影響を与えることはほとんどない。一方、ａ／α型細胞は両遺伝子を発現し、これらがコードするタンパク質はａ１‐α２複合体を形成し、かかる複合体の作用によりｈｓｇの発現を抑制する(参考文献２参照)。そこで、図１Ａに示すように、ａ型細胞内でα２遺伝子を、又はα型細胞内でａ１遺伝子を強制的に発現させると、一倍体であるにもかかわらずａ１‐α２複合体を形成させることができるので、かかる酵母の接合能を抑制することが可能となる。
【００２１】
図１Ｂに示す従来の接合型変換では、ガラクトースの添加によりＨＯ遺伝子が発現して接合型が変換されるが(参考文献３参照)、この際、所望の接合型を持つ酵母の他に対型酵母が残存するため、かかる酵母との接合により自己倍数化が惹起されて、所望の接合型を持つ酵母が消失していく。一方、図１Ｃに示す本発明の方法では、生成した対型酵母の接合能をａ１‐α２複合体の形成により抑制できるため、自己倍数化の回避が可能となり、所望の接合型を持つ酵母の獲得が容易になる。ＧＦＰレポーターの蛍光を指標に酵母細胞を単離すれば、効率的に該酵母を製造することができる。
【００２２】
（５−２）酵母細胞内でａ１遺伝子又はα２遺伝子を発現させる方法
本発明の製造方法における、「酵母細胞内でａ１遺伝子又はα２遺伝子を発現させる」方法としては、接合型変換の際に生成する対型酵母に、該酵母細胞内でａ１遺伝子又はα２遺伝子を発現させ得る方法である限り、特に制限されない。具体的にはＰＧＫ１プロモーター(参考文献４参照)、ＡＤＨ１プロモーター(参考文献４参照)、ＴＤＨ３プロモーター(参考文献４参照)、ＳＴＥ２プロモーター、ＳＴＥ６プロモーター(先の特許文献１参照)、ＭＦＡ１プロモーター(参考文献２参照)、又はＭＦＡ２プロモーター(参考文献２参照)などを、ａ１又はα２遺伝子と連結した構築物又はベクターを用いることが好ましく、後記実施例で詳述するように、ａ１遺伝子を発現させる場合においては、接合型に影響を受けないＰＧＫ１プロモーター(配列番号４)を、α２遺伝子を発現させる場合においては、ａ型特異的な発現特性を有するＳＴＥ２プロモーター(配列番号５)を連結した構築物又はベクターを用いることがさらに好ましい。なお、対型酵母にａ１遺伝子又はα２遺伝子を発現させ得る限り、上記好適として例示したプロモーター配列において１個若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列を有する改変型プロモーターを用いることもできる。
したがって、本発明における好ましいプロモーターは、例えば、下記の(１)〜(４)のいずれかから選択される塩基配列を有するものであると表すことができる。
（１）配列番号４に示される塩基配列、
（２）配列番号４に示される塩基配列の１個若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列。
（３）配列番号５に示される塩基配列、
（４）配列番号５に示される塩基配列の１個若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列。
【００２３】
（５−３）酵母細胞内でＨＯ遺伝子を発現させる方法
本発明の製造方法における、「酵母細胞内でＨＯ遺伝子を発現させる」方法としては、任意の酵母に、その酵母細胞内でＨＯ遺伝子を発現させ得る方法である限り、特に制限されない。具体的にはＧＡＬ１プロモーター(参考文献４参照)、ＣＵＰ１プロモーター(参考文献５参照)、ＰＧＫ１プロモーター、ＡＤＨ１プロモーター、又はＴＤＨ３プロモーターなどをＨＯ遺伝子と連結した構築物又はベクターを用いることが好ましく、ガラクトースの存在により遺伝子の発現が誘導されるＧＡＬ１遺伝子のプロモーターを連結した構築物又はベクターを用いることがさらに好ましい。また、かかるＧＡＬ１プロモーターとしては、ＨＯ遺伝子を発現させる酵母から取得するのが望ましいが、下面発酵酵母、上面発酵酵母、ワイン酵母、清酒酵母、焼酎酵母、ウイスキー酵母などのアルコール飲料醸造用酵母や、パン酵母などの産業上有用な酵母であれば、後記実施例で詳述するように、サッカロミセス・セレビシエに由来するＧＡＬ１プロモーター(配列番号６)を用いることができる。
なお、酵母細胞内にＨＯ遺伝子を発現させ得る限り、上記好適として例示したプロモーター配列において１個若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列を有する改変型プロモーターを用いることもできる。
したがって、本発明における好ましいプロモーターは、例えば、下記の(１)又は(２)のいずれかから選択される塩基配列を有するものであると表すことができる。
（１）配列番号６に示される塩基配列、
（２）配列番号６に示される塩基配列の１個若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列。
【００２４】
（５−４）酵母への導入方法
上記の構築物の酵母への導入方法としては、エレクトロポレーション法、金属処理法、プロトプラスト法等の技術的に適用可能な当業者に公知の全ての方法を用いることができる。上記構築物の酵母への導入は、上記構築物を酵母へ直接導入することであってもよいが、上記構築物をベクターに組み込んで、そのベクターを酵母へ導入することを好適に例示することができ、上記構築物を、酵母で自律複製可能なプラスミドに組み込んで、そのプラスミドを酵母へ導入することをさらに好適に例示することができる。かかるプラスミドを酵母へ導入した場合は、その酵母の染色体ＤＮＡにそのプラスミドの痕跡を残さずに、酵母からかかるプラスミドを容易に除去することができ、除去したその酵母は、現行の法規制で規定されるところの組換え体生物等には該当しないと解釈されるので、飲料や食品にも制限無く利用することができる点で好ましい。上記の「酵母で自律複製可能なプラスミド」としては、ＹＣｐタイプ、ＹＥｐタイプ、ＹＲｐタイプのプラスミドを好適に例示することができる。
【００２５】
（５−５）変換された接合型の選抜
前述のように、酵母細胞内にＨＯ遺伝子を発現させることにより、その酵母の接合型が変換し、ａ型からはα型の、あるいはα型からはａ型の接合型を持つ酵母細胞を製造することができる。ａ／α型の接合型を持つ二倍体酵母にＨＯ遺伝子を発現させた場合は、ａ／ａ型あるいはα／α型の遺伝子型を持つ細胞が得られる。ａ／ａ型あるいはα／α型の表現型はそれぞれａ型とα型と同一であることが知られている。
【００２６】
本発明の製造方法は、接合型の変換を望む酵母の細胞内で接合を制御する遺伝子を発現させる工程、及び該酵母の細胞内で接合型変換遺伝子を発現させる工程を含むことを特徴とするが、これらの工程の後に、所望の接合型を持つ酵母株を選抜する工程をさらに行っても良い。所望の接合型を持つ酵母株は、ＨＯ遺伝子を発現させた酵母細胞の集団から、シングルコロニーを単離し、その接合能を確認することによって、容易に選抜することができる。
【００２７】
（５−６）接合能の確認方法
上記の接合能を確認する方法としては、単離した酵母株とａ型の株やα型の株との接合を実際に試みることによって、接合能を調べる方法の他に、ａ型の酵母株に特異的に発現することが知られている遺伝子のプロモーター(以降、「ａ型特異的プロモーター」と表示する)又はα型の酵母株に特異的に発現することが知られている遺伝子のプロモーター(以降、「α型特異的プロモーター」と表示する)の制御下で、レポーター遺伝子の発現を可能とする構築物(好ましくは、該構築物を組み込んだベクター、より好ましくは、該構築物を組み込んだ、酵母で自律複製可能なプラスミド)を酵母に導入しておき、かかるレポーター遺伝子の発現を調べることによってその酵母がａ型であるかα型であるかを確認する方法を好適に例示することができる。
【００２８】
上記の「ａ型特異的プロモーター」としては、後記実施例で詳述するように、例えばサッカロミセス・セレビシエのＳＴＥ２遺伝子プロモーター(配列番号５)を好適に例示することができ、上記の「α型特異的プロモーター」としては、後記実施例で詳述するように、例えばサッカロミセス・セレビシエのＳＴＥ３遺伝子プロモーター(配列番号７)を好適に例示することができる。また、上記の「レポーター遺伝子」としては、例えば、蛍光レポーター遺伝子、発色レポーター遺伝子、発光レポーター遺伝子を好適に例示することができる。蛍光レポーター遺伝子としては、例えば、緑色蛍光タンパク質(ＧＦＰ)、赤色蛍光タンパク質(ＤｓＲｅｄ)、シアン色蛍光タンパク質(ＣＦＰ)などが挙げられる。発色レポーター遺伝子としては、例えば、βガラクトシダーゼ(ｌａｃＺ)などが挙げられる。発光レポーター遺伝子としては、例えば、ルシフェラーゼ(ｌｕｃ)などが挙げられる。
【００２９】
上記の「ａ型特異的プロモーター又はα型特異的プロモーターの制御下で、レポーター遺伝子の発現を可能とする構築物」と、前述の「酵母細胞内でａ１遺伝子又はα２遺伝子の発現を可能とする構築物」は、同一のベクター(好ましくは、酵母で自律複製可能なプラスミド)に組み込まれていてもよい。
【００３０】
（５−７）不要なプラスミドの脱落方法
本発明の製造方法は、「酵母細胞内でＨＯ遺伝子を発現させた後」、「所望の接合型を持つ酵母を選抜した後」、又は、「単離された酵母を他の酵母と接合させた後」に、不要となったプラスミド、すなわち、「酵母の接合型に影響を受けない遺伝子のプロモーターを用いて、ＨＯ遺伝子を発現させるための構築物を組み込んだプラスミド」や、「ａ型特異的プロモーター又はα型特異的プロモーターを用いて、レポーター遺伝子を発現させるための構築物を組み込んだプラスミド」、又は「酵母細胞内でａ１遺伝子又はα２遺伝子を発現させるための構築物を組み込んだプラスミド」を脱落させる工程をさらに含んでいることが好ましく、これらの構築物を全て脱落させる工程をさらに含んでいることがより好ましい。かくしてプラスミドを脱落させた株は、その酵母の染色体ＤＮＡに外来ＤＮＡ(前述のプラスミド)の痕跡を全く残さないため、かかる株は、現行の法規制で規定するところの組換え体生物等には該当しないと解釈される。したがって、接合前のかかる酵母は、飲料や食品にも制限無く利用することができる交雑株を得るための交雑育種の母本として好適に用いることができ、接合後のかかる酵母は、飲料や食品にも制限無く利用することができる点で好ましい。
【００３１】
上記のプラスミドを酵母から脱落させる方法としては、特に制限されないが、そのプラスミドを保持させる方向の選択圧をかけない条件でその酵母を培養した後、そのプラスミドに含まれる選択マーカー遺伝子を持たなくなった細胞を選択することにより、プラスミドを脱落した株を容易に得ることができる。
【００３２】
６．本発明の交雑株を製造する方法
本発明の交雑株を製造する方法としては、本発明の製造方法により製造された所望の接合型を持つ酵母(以降、「本発明による酵母」とも表示する)を、少なくとも片方の親株として交雑を行なう工程を含む。かかる酵母の交雑方法としては特に制限されず、両方の親株を混合して培養する等の公知の方法を用いることができる。なお、両方の親株のそれぞれに別個のマーカー遺伝子(好ましくは薬剤耐性遺伝子)を導入しておくと、それらの両方のマーカー遺伝子を併せ持つ株を選別することで、交雑株を容易に単離することが可能となる。上記のマーカー遺伝子としては、例えば、ブラストサイジン耐性遺伝子(ＢＳＲ遺伝子)や、Ｇ４１８耐性遺伝子(ｋａｎＭＸ４遺伝子)、又はヒスチジン合成遺伝子(ＨＩＳ３遺伝子)やロイシン合成遺伝子(ＬＥＵ２遺伝子)、ウラシル合成遺伝子(ＵＲＡ３遺伝子)を好適に例示することができる。上記の本発明の交雑株を製造する方法においては、本発明による酵母同士を両親株として交雑してもよいし、本発明による酵母でない方の親株として、元々ａ型もしくはα型の接合能を有している株を用いても良い。後記実施例では、同一の親株に別個のマーカー遺伝子を導入したのち、創製したａ／ａ型及びα／α型酵母を接合させて四倍体酵母を作成したが、当業者に公知の形態の内、技術的に適用可能ないかなる形態も排除しない。
【００３３】
上記の本発明の交雑株を製造する方法を用いると、従来法では実用的な交雑育種ができなかった、又は困難であった酵母(例えば実用酵母)について、両親株の優良な形質を併有する交雑株(以降、「本発明による交雑株」とも表示する)を著しく効率的に育種することが可能となる。上記の本発明による交雑株として、例えば、醸造用酵母として優良な形質を２つ以上併有する交雑株や、パン酵母として優良な形質を２つ以上併有する交雑株を例示することができる。醸造用酵母として優良な形質としては、高発酵性、硫化水素低生産性、高度凝集性、亜硫酸高生産性、アルコール高耐性を好適に例示することができる。
【００３４】
（参考文献）
参考文献１：Cook JG，et al.，1996，Genes Dev，Vol.10，2831-2848.
参考文献２：Botstein D，et．al.，2004，Genetics，Vol.166，653-660.
参考文献３：Kentaro Furukawa，et．al.，2011，PLoS One，Vol.6，e26584.
参考文献４：Siavash P et al.，2010，Yeast，Vol.27，955-964.
参考文献５：Etcheverry T，1990，Methods Enzymol，Vol.185,319-329.
【実施例】
【００３５】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例にその技術的範囲が限定されるものではない。
本発明におけるその他の用語や概念は、当該分野において慣用的に使用される用語の意味に基づくものであり、本発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。また、各種の分析などは、使用した分析機器又は試薬、キットの取り扱い説明書、カタログなどに記載の方法を準用して行った。
なお、本明細書中に引用した技術文献、特許公報及び特許出願明細書中の記載内容は、本発明の記載内容として参照されるものとする。
【００３６】
（実験方法）
（１）培地の調製
１％(w/v)酵母エキストラクト、２％(w/v)ペプトンおよび２％(w/v)グルコースを含むＹＰＤ培地、１％(w/v)酵母エキストラクト、２％(w/v)ペプトンおよび２％(w/v)ガラクトースを含むＹＰＧａｌ培地、０.６７％(w/v)アミノ酸不含酵母ニトロゲンベース(Becton Dickinson社製)及び２％(w/v)グルコースを含むＳＤ培地、又は０.６７％(w/v)アミノ酸不含酵母ニトロゲンベース及び２％(w/v)ガラクトースを含むＳＧａｌ培地で酵母を培養した。ＳＤ培地及びＳＧａｌ培地には選択マーカーに対応するアミノ酸および核酸を適宜添加した。２％(w/v)寒天をこれらの培地に添加してＹＰＤおよびＳＤの固体培地を調製した。
【００３７】
（２）酵母の調製
酵母サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)のメチオニン要求性ａ型一倍体株ＢＹ４７４１(参考文献６参照)、リジン要求性α型一倍体株ＢＹ４７４２(参考文献６参照)、及び以下の実施例で作製した酵母株、並びに酵母株に導入したプラスミドの情報を表１に示す。ａ型のＭＹ４７４１の接合型座位(以下、ＭＡＴ座位とも表示する)は、１塩基変異により接合型変換酵素ＨＯに認識されないため、接合型を変換することができない。またα型のＢＹ４７４２のＭＡＴ座位は、ＨＯの認識配列を有しており、接合型の変換が可能であるが、その際に鋳型として利用される染色体ＤＮＡ上のサイレント型のａ型遺伝子(以下、ＨＭＲａ遺伝子とも表示する)は上述の変異を有する。すなわち、ＢＹ４７４２の接合型変換により創製したａ型細胞では再び接合型を変換することができなくなる。そこでＢＹ４７４２のＨＭＲａ遺伝子を、遺伝子組換えによりＨＯの認識配列を含むものと置換した形質転換株ＨＲ４２−Ｋ株を作製し、接合型変換実験に用いた。
【００３８】
（３）蛍光測定
図１Ｂ及び図１Ｃに示すように、緑色蛍光タンパク質をコードするＧＦＰ遺伝子(配列番号８)を酵母の接合型を示すためのレポーター遺伝子として用いた。酵母形質転換体を、ＳＤ培地を用いて３０℃で１８時間培養したのち、集菌および洗浄して滅菌水で再懸濁した。菌体濃度ＯＤ600＝５.０となるように調整した酵母懸濁液１００μＬの蛍光強度をマイクロプレートリーダーInfinite200(Tecan Japan社製)を用いて測定した。励起フィルタセンター波長を４８５ｎｍ(フィルタ帯域幅２０ｎｍ)に、蛍光フィルタセンター波長を５３５ｎｍ(フィルタ帯域幅２５ｎｍ)に設定し、ゲインを５０に固定して測定を行った。
【００３９】
（４）増殖アッセイ
酵母の接合能を評価するため、a型およびα型の酵母の栄養要求性の違いを利用して、接合体のみが生育可能となるよう作成した寒天培地を用いて増殖アッセイを実施した。ａ型及びα型酵母株をそれぞれ初期菌体濃度ＯＤ600＝０.１で１ｍＬのＹＰＤ培地に播種し、３０℃にて１.５時間共培養した。菌体を回収して洗浄したのち、滅菌蒸留水に再懸濁した。ＯＤ600＝１.０、０.１および０.００１の酵母懸濁液を調製し、接合体のみが生育することができる寒天培地上に１０μＬずつスポットして、３０℃で２日間培養したのち、コロニー形成の有無を調べた。
【００４０】
(５)定量PCR
定量ＰＣＲを用いて以下のように、酵母株の染色体ＤＮＡのセット数(以下、「倍数性」とも示す)を測定した。染色体ＤＮＡ上に１コピーのｋａｎＭＸ４遺伝子(配列番号８)を遺伝子組換えにより導入した一倍体酵母株、ＨＲ４２−１１Ｔ及びＭＣＦ４７４１(表１)を後述のように作製した。両株の染色体ＤＮＡ上には１コピーのｋａｎＭＸ４遺伝子１コピーのＰＧＫ１遺伝子(内在遺伝子；配列番号９)が存在する。かかる酵母のうちいずれかを接合の親株として、倍数性を測定したい酵母株と掛け合わせて接合体を作成した。例えば作成した接合体が二倍体であった場合、２セットの染色体ＤＮＡ上には１コピーのｋａｎＭＸ４遺伝子と２コピーのＰＧＫ１遺伝子が存在することになる。すなわち、ｋａｎＭＸ４遺伝子のコピー数を基準に相対定量したＰＧＫ遺伝子のコピー数が、酵母接合体の倍数性を示すことになる。定量ＰＣＲの試薬としてはThunderbird SYBR qPCR Mix(Toyobo社製)を用い、ABI PRISM 7900HT Sequence Detection System(Applied Biosystems社製)を用いて測定を行った。ｋａｎＭＸ４遺伝子のコピー数の定量にはプライマー１(配列番号１０)及びプライマー２(配列番号１１)を用いた。またＰＧＫ１遺伝子のコピー数の定量にはプライマー３(配列番号１２)及びプライマー４(配列番号１３)を用いた。酵母接合体の倍数性から１を減じた値を、対象とする酵母株の倍数性として算出した。
【００４１】
【表１】
2014143957.tif 000002
【００４２】
（実施例１）接合型識別のためのレポーターの発現例
（１−１）ａ型細胞特異的ＧＦＰ発現プラスミドの構築
ａ型特異的プロモーターであるＳＴＥ２プロモーターをプライマー５(配列番号１４)及びプライマー６(配列番号１５)を用いて、ＰＣＲによりＢＹ４７４１株の染色体ＤＮＡを鋳型として増幅した。続いてＧＦＰ遺伝子(配列番号１６)をプライマー７(配列番号１７)及びプライマー８(配列番号１８)を用いて、ＰＣＲによりｐＮＨＫ１２(文部科学省ＮＢＲＰ「酵母」より提供された)を鋳型として増幅した。さらにＡＤＨ１遺伝子のターミネーター(配列番号１９)をプライマー９(配列番号２０)及びプライマー１０(配列番号２１)を用いて、ＰＣＲによりＢＹ４７４１株の染色体ＤＮＡを鋳型として増幅した。オーバーラップＰＣＲを用いて、ＳＴＥ２プロモーター、ＧＦＰ遺伝子、ＡＤＨ１ターミネーターを連結して、プラスミドｐＹＯ３２３(文部科学省ＮＢＲＰ「酵母」より提供された)のＳａｃＩＩ−ＸｈｏＩ部位間に挿入し、プラスミドｐＨＹ−２ＧＡとした。
【００４３】
（１−２）α型細胞特異的ＧＦＰ発現プラスミドの構築
α型特異的プロモーターであるＳＴＥ３プロモーターをプライマー１１(配列番号２２)及びプライマー１２(配列番号２３)を用いて、ＰＣＲによりＢＹ４７４１株の染色体ＤＮＡを鋳型として増幅した。続いてＧＦＰ遺伝子をプライマー７及びプライマー８を用いて、ＰＣＲによりｐＮＨＫ１２を鋳型として増幅した。さらにＣＹＣ１遺伝子のターミネーター(配列番号２４)をプライマー１３(配列番号２５)及びプライマー１４(配列番号２６)を用いて、ＰＣＲによりＢＹ４７４１株の染色体ＤＮＡを鋳型として増幅した。オーバーラップＰＣＲを用いて、ＳＴＥ３プロモーター、ＧＦＰ遺伝子、ＣＹＣ１ターミネーターを連結して、プラスミドｐＹＯ３２５(文部科学省ＮＢＲＰ「酵母」より提供された)のＳａｃＩＩ−ＸｈｏＩ部位間に挿入し、プラスミドｐＬＹ−３ＧＣとした。
【００４４】
（１−３）接合型特異的ＧＦＰ発現プラスミドを有する各接合型の酵母細胞が発する蛍光強度の測定
ａ型細胞としてＢＹ４７４１を、α型細胞としてＢＹ４７４２を、ａ／α型細胞としてＢＹ４７４３を選択し、それぞれｐＨＹ−２ＧＡあるいはｐＬＹ−３ＧＣを酢酸リチウム法(参考文献７参照)により導入した形質転換体を創製した。またそれぞれの接合型の酵母細胞にｐＹＯ３２３あるいはｐＹＯ３２６(文部科学省ＮＢＲＰ「酵母」より提供された)を導入した形質転換体を創製してＭＯＣＫ細胞とした。各形質転換体の蛍光強度の測定結果を図２に示す(図２中のエラーバーは、３度の独立した実験結果における標準偏差を示す。
【００４５】
この結果、ｐＨＹ−２ＧＡを導入した場合、ａ型細胞のみがＧＦＰを発現して蛍光を示した(図２Ａ)。一方で、ｐＬＹ−３ＧＣを導入した場合、α型細胞のみがＧＦＰを発現して蛍光を示した(図２Ｂ)。以上のように、ａ型特異的プロモーターあるいはα型特異的プロモーターをＧＦＰ遺伝子と連結したプラスミドを酵母細胞に導入することで、緑色蛍光を指標に、ａ型細胞あるいはα型細胞の識別が可能であることが確認された。
【００４６】
（実施例２）接合制御遺伝子の導入による接合抑制例
（２−１）ａ１構成発現プラスミドの構築
ａ１遺伝子(配列番号２７)をプライマー１５(配列番号２８)及びプライマー１６(配列番号２９)を用いて、ＰＣＲによりＢＹ４７４１株の染色体ＤＮＡを鋳型として増幅し、プラスミドｐＨＹ−２ＧＡのＳａｌＩ−ＢａｍＨＩ部位間に挿入して、プラスミドｐＨ２Ｙ−ａ１とした。続いて接合型に影響を受けないＰＧＫ１プロモーターをプライマー１７(配列番号３０)及びプライマー１８(配列番号３１)を用いて、ＰＣＲによりＢＹ４７４１株の染色体ＤＮＡを鋳型として増幅し、ｐＨ２Ｙ−ａ１のＳａｃＩＩ−ＮｏｔＩ部位間に挿入し、プラスミドｐＨＰＹ−ａ１とした。さらにＰＧＫ１プロモーター−ａ１−ＡＤＨ１ターミネーターをプライマー１７(配列番号３０)及びプライマー１９(配列番号３２)を用いて、ＰＣＲによりｐＨＰＹ−ａ１を鋳型として増幅し、ｐＨＹ−２ＧＡ及びｐＬＹ−３ＧＣのＳａｃＩ−ＳａｃＩＩ部位間に挿入して、それぞれプラスミドｐＨ２Ｇ−Ｐａ１、ｐＬ３Ｇ−Ｐａ１とした。
【００４７】
（２−２）α２構成発現プラスミドの構築
α２遺伝子(配列番号３３)をプライマー２０(配列番号３４)及びプライマー２１(配列番号３５)を用いて、ＰＣＲによりＢＹ４７４１株の染色体ＤＮＡを鋳型として増幅し、プラスミドｐＬＹ−３ＧＣのＳａｌＩ−ＢａｍＨＩ部位間に挿入して、プラスミドｐＬ３Ｙ−α２とした。続いて接合型に影響を受けないＰＧＫ１プロモーターをプライマー１７(配列番号３０)及びプライマー１８(配列番号３１)を用いて、ＰＣＲによりＢＹ４７４１株の染色体ＤＮＡを鋳型として増幅し、ｐＬ３Ｙ−α２のＳａｃＩＩ−ＮｏｔＩ部位間に挿入し、プラスミドｐＬＰＹ−α２とした。さらにＰＧＫ１プロモーター−α２−ＣＹＣ１ターミネーターをプライマー１７(配列番号３０)及びプライマー２２(配列番号３６)を用いて、ＰＣＲによりｐＨＰＹ−ａ１を鋳型として増幅し、ｐＨＹ−２ＧＡ及びｐＬＹ−３ＧＣのＳａｃＩ−ＳａｃＩＩ部位間に挿入して、それぞれプラスミドｐＨ２Ｇ−Ｐα２、ｐＬ３Ｇ−Ｐα２とした。
【００４８】
（２−３）ａ１あるいはα２構成発現によるａ型及びα型酵母のＧＦＰレポーター発現量及び接合能の評価
ａ型細胞としてＢＹ４７４１を選択し、酢酸リチウム法によりｐＨ２Ｇ−Ｐａ１あるいはｐＨ２Ｇ−Ｐα２を導入した形質転換体を創製した。またα型細胞としてＢＹ４７４２を選択し、酢酸リチウム法によりｐＬ３Ｇ−Ｐａ１あるいはｐＬ３Ｇ−Ｐα２を導入した形質転換体を創製した。各形質転換体の蛍光強度の測定結果を図３Ａに示す。図３Ａ中のエラーバーは、３度の独立した実験結果における標準偏差を示す。
【００４９】
ａ型特異的プロモーター及びα型特異的プロモーターによる遺伝子発現は、ａ１−α２複合体を有するａ／α型細胞内において抑制されることが知られている(参考文献８参照)。ａ型細胞にα２を発現させた場合、及びα型細胞にａ１を発現させた場合は、ａ１−α２複合体が形成されることにより、疑似的にａ／α型細胞内環境が創出されることになる。図３Ａに示されるように、ＢＹ４７４１(ＭＡＴａ)にｐＨ２Ｇ−Ｐα２を導入した場合にはα２の強制発現により、図２Ａと比較してＧＦＰレポーターの発現量が著しく低下することが確認された。またＢＹ４７４２(ＭＡＴα)にｐＬ３Ｇ−Ｐα２を導入した場合にはａ１の強制発現により、図２Ｂと比較してＧＦＰレポーターの発現量が著しく低下することが確認された。以上の結果は両細胞においてａ１−α２複合体が想定通りに形成されたことを示唆している。一方、ａ型細胞にａ１を過剰発現させた場合、及びα型細胞にα２を過剰発現させた場合は、それぞれａ型特異的プロモーター及びα型特異的プロモーターによる遺伝子発現は抑制されないと予想される。実際に、ａ１型細胞の場合は、図３Ａに示されるように、ｐＨ２Ｇ−Ｐａ１を導入したＢＹ４７４１では図２Ａと同等の蛍光が観察され、ａ１過剰発現の影響を受けなかった。しかしながらα２型細胞の場合は、ｐＬ３Ｇ−Ｐα２を導入したＢＹ４７４２では、ｐＨ２Ｇ−Ｐａ１導入の場合と比較すれば、ＧＦＰレポーターの発現量は数倍高いものの、図２Ｂと比較してみると、α２過剰発現の影響によりＧＦＰレポーターの発現量が著しく低下することが確認された。
【００５０】
上記の形質転換体の接合能を野生型のＢＹ４７４１及びＢＹ４７４２と比較して評価した(図３Ｂ)。左の写真ではメチオニン及びリジンを含まず、２０ｍｇ／Ｌのヒスチジン、３０ｍｇ／Ｌのロイシンおよび２０ｍｇ／Ｌウラシルを含む二倍体選択用ＳＤ固体培地(ＳＤ−Ｍｅｔ、Ｌｙｓプレート)を用いた。野生型のａ型及びα型酵母株をそれぞれ初期菌体濃度ＯＤ600＝０.１で１ｍＬのＹＰＤ培地に播種し、３０℃にて１.５時間共培養した。菌体を回収して洗浄したのち、滅菌蒸留水に再懸濁した。ＯＤ600＝１.０、０.１および０.００１の酵母懸濁液を調製し、寒天培地上に１０μＬずつスポットして、３０℃で２日間培養した。野生型のａ型およびα型細胞では通常の接合が生じるため、二倍体のコロニーが形成された。
【００５１】
図３Ｂの中央の写真では二倍体選別に加え、導入したプラスミドの脱落を抑制するため、メチオニン、リジン及びヒスチジンを含まず、３０ｍｇ／Ｌのロイシンおよび２０ｍｇ／Ｌウラシルを含むＳＤ固体培地(ＳＤ−Ｍｅｔ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓプレート)を用いた。上述のように、酵母懸濁液を寒天培地上にスポットして培養した結果、α２を発現させることでａ型細胞の接合抑制が可能であることが確認された。一方、右の写真では二倍体選別に加え、導入したプラスミドの脱落を抑制するため、メチオニン、リジン及びロイシンを含まず、２０ｍｇ／Ｌのヒスチジンおよび２０ｍｇ／Ｌウラシルを含むＳＤ固体培地(ＳＤ−Ｍｅｔ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓプレート)を用いた。上述のように、酵母懸濁液を寒天培地上にスポットして培養した結果、ａ１を発現させることでα型細胞の接合抑制が可能であることが確認されたが、α２を過剰発現させることでもα型細胞の接合能が若干低下することが明らかとなった。以上のように、構成的にａ１あるいはα２発現する手法は共にα型あるいはａ型細胞の接合抑制に有効であることが確認された。一方、α型細胞におけるα２の過剰発現は、接合型識別のためのレポーター発現を阻害してしまうことから、所望の接合型を持つ酵母の単離に労力を要すると予想される。なおα型特異的プロモーター制御下でのレポーター発現量の低下については、ａ１−α２複合体が結合するＤＮＡ配列に対して、α２が単独でも低い親和性を有している(参考文献９参照)ことから、過剰発現したα２がかかる配列に集積してプロモーター活性を低下させたと推察される。そこでレポーター発現の阻害を回避するために、以下の発現様式を試験した。
【００５２】
（２−４）ａ型細胞特異的α２発現プラスミドの構築
α２遺伝子をプライマー２０(配列番号３４)及びプライマー２１(配列番号３５)を用いて、ＰＣＲによりｐＬ３Ｙ−α２を鋳型として増幅し、プラスミドｐＨＹ−２ＧＡのＳａｌＩ−ＢａｍＨＩ部位間に挿入して、プラスミドｐＨ２Ｙ−α２とした。さらにＳＴＥ２プロモーター−α２−ＡＤＨ１ターミネーターをプライマー５(配列番号１４)及びプライマー１９(配列番号３２)を用いて、ＰＣＲによりｐＨ２Ｙ−α２を鋳型として増幅し、ｐＬＹ−３ＧＣのＳａｃＩ−ＳａｃＩＩ部位間に挿入して、プラスミドｐＬ３Ｇ−２αとした。
【００５３】
（２−５）ａ型細胞特異的α２発現によるａ型及びα型酵母のＧＦＰレポーター発現量及び接合能の評価
ａ型細胞としてＢＹ４７４１を、α型細胞としてＢＹ４７４２を選択し、酢酸リチウム法によりｐＬ３Ｇ−２αを導入した形質転換体を創製した。各形質転換体の細胞内におけるＧＦＰ、α２、及び接合を誘導するｈｓｇの発現の概略を図４Ａに示す。導入したｐＬ３Ｇ−２α上でコードされるＧＦＰ遺伝子はα型細胞特異的に、α２遺伝子はａ型細胞特異的に発現する。すなわちａ型細胞ではＧＦＰは発現せず、α２の発現によりａ１−α２複合体が形成されることで、ｈｓｇの発現を抑制して接合能を欠失させる。一方、α型細胞ではα２が過剰発現しないためにＧＦＰの発現が阻害されず、またａ１−α２複合体を形成しないため接合能が保持されることになる。
【００５４】
各形質転換体の蛍光強度の測定結果を図４Ｂに示す。図４Ｂ中のエラーバーは、３度の独立した実験結果における標準偏差を示す。この結果、α型細胞におけるレポーター発現は阻害されないことが確認された。また各形質転換体の接合能を評価した結果を図４Ｃに示す。この結果、ａ型細胞特異的α２発現によってａ型細胞の接合を抑制可能であることが確認された。また当発現様式において、α型細胞の接合能は低減されないことが確認された。したがって、図１Ｃに示すように、ａ型細胞の接合を抑制するにはａ型細胞特異的にα２を発現する方法を、α型細胞の接合を抑制するには構成的にａ１を発現する方法を用いることが効果的である。
【００５５】
（実施例３）接合型変換遺伝子の導入による酵母の接合型変換例(α型→ａ型)
（３−１）ＨＯ発現プラスミドの構築
ガラクトースの存在下で誘導が可能なＧＡＬ１プロモーターをプライマー２３(配列番号３７)及びプライマー２４(配列番号３８)を用いて、ＰＣＲによりＢＹ４７４１株の染色体ＤＮＡを鋳型として増幅し、ｐＨＹ−２ＧＡのＳａｃＩＩ−ＮｏｔＩ部位間に挿入し、プラスミドｐＨＹ−ＧＧＡとした。次にＧＡＬ１プロモーター−ＧＦＰ−ＡＤＨ１ターミネーターをプライマー２３及びプライマー１９を用いて、ＰＣＲによりｐＨＹ−ＧＧＡを鋳型として増幅し、ｐＹＯ３２６のＳａｃＩＩ−ＸｈｏＩ部位間に挿入して、それぞれプラスミドｐＵＹ−ＧＧＡとした。続いてＨＯ遺伝子(配列番号３９)をプライマー２５(配列番号４０)及びプライマー２６(配列番号４１)を用いて、ＰＣＲによりＢＹＰ５１６６(文部科学省ＮＢＲＰ「酵母」より提供された)を鋳型として増幅し、ｐＵＹ−ＧＧＡのＮｏｔＩ−ＳａｌＩ部位間に挿入して、プラスミドｐＵＹＧ−ＨＯ−ｇとした。さらにＡＤＨ１ターミネーターをプライマー２７(配列番号４２)及びプライマー２８(配列番号４３)を用いて、ＰＣＲによりｐＨＹ−ＧＧＡを鋳型として増幅し、ｐＵＹＧ−ＨＯ−ｇのＳａｌＩ−ＫｐｎＩ部位間に挿入し、プラスミドｐＵＹＧ−ＨＯとした。
【００５６】
（３−２）ＨＯ認識配列を含むＨＭＲａを有するＨＲ４２−Ｋ株の創製
（３−２−１）ＨＭＲａ置換のためのプラスミドの構築
本発明の上記各実施例でａ型細胞として用いてきたＢＹ４７４１株は、ＨＯ認識配列に変異を有しており、ＨＯ認識能を失っていたため、本実施例では、まず、ＨＯ認識配列を含む領域の変異を取り除き、本来のＨＯ認識能を回復させる。
ＨＭＲａはＸ(配列番号４４)、Ｙａ(配列番号４５)、Ｚ１(配列番号４６)領域から構成され、ＨＯの認識部位はＺ１領域に存在する。配列番号４７に示すＨＭＲａ上流配列(以降、「ＨＭＲ５’」とも表示する)、及び配列番号４８に示すＨＭＲａ下流配列(以降、「ＨＭＲ３’」とも表示する)を相同領域として用いて、染色体ＤＮＡの相同組換えを行うために以下のプラスミドを作製した。
アンピシリン耐性遺伝子及び大腸菌の複製起点配列を含む配列番号４９に示すＤＮＡを、ＰＣＲによりｐＮＨＫ１２を鋳型として、それぞれプライマー２９(配列番号５０)及びプライマー３０(配列番号５１)、プライマー３１(配列番号５２)及びプライマー３２(配列番号５３)、プライマー３３(配列番号５４)及びプライマー３４(配列番号５５)、プライマー３５(配列番号５６)及びプライマー３６(配列番号５７)、プライマー３７(配列番号５８)及びプライマー３８(配列番号５９)を用いて、５つの断片に分割して増幅した。続いてｌｏｘＰ(配列番号６０)とｋａｎＭＸ４遺伝子から成るｌｏｘＰ−ｋａｎＭＸ４−ｌｏｘＰをプライマー３９(配列番号６１)及びプライマー４０(配列番号６２)を用いて、ＰＣＲによりｐＵＣ５７−ＬＫＬ(Genescript社製)を鋳型として増幅した。上述の５つのＤＮＡ断片とｌｏｘＰ−ｋａｎＭＸ４−ｌｏｘＰをIn-Fusion HD Cloning Kit(タカラバイオ社製)を用いて連結し、プラスミドｐＵＧ-ＬＫＬとした。
さらにｌｏｘＰ−ｋａｎＭＸ４−ｌｏｘＰをプライマー４１(配列番号６３)及びプライマー４２(配列番号６４)を用いて、ＰＣＲによりｐＵＧ-ＬＫＬを鋳型として増幅し、ｐＵＧ００６のＰｖｕＩＩ−ＳｐｅＩ部位間に挿入して、プラスミドｐＫ６とした。次にＨＭＲ５’−Ｘ−Ｙａをプライマー４３(配列番号６５)及びプライマー４４(配列番号６６)を用いて、ＰＣＲによりＢＹ４７４２株の染色体ＤＮＡを鋳型として増幅した。続いてＺ１をプライマー４５(配列番号６７)及びプライマー４６(配列番号６８)を用いて、ＰＣＲによりＢＹ４７４２株の染色体ＤＮＡを鋳型として増幅した。オーバーラップＰＣＲを用いて、ＨＭＲ５’−Ｘ−Ｙａ、及びＺ１を連結して、プラスミドｐＫ６のＢａｍＨＩ−ＳｐｅＩ部位間に挿入し、プラスミドｐＫ−Ｒ５’とした。さらにＨＭＲ３’をプライマー４７(配列番号６９)及びプライマー４８(配列番号７０)を用いて、ＰＣＲによりＢＹ４７４２株の染色体ＤＮＡを鋳型として増幅し、プラスミドｐＫ−Ｒ５’のＳｐｅＩ−ＳａｃＩＩ部位間に挿入し、ＨＯ認識能が回復したＨＭＲａを含むプラスミドｐＫ−Ｒ１１Ｔとした。
Ｃｒｅリコンビナーゼ遺伝子(配列番号７１)をプライマー４９(配列番号７２)及びプライマー５０(配列番号７３)を用いて、ＰＣＲによりpUC57-Cre(Genescript社製)を鋳型として増幅し、In-Fusion HD Cloning Kit(タカラバイオ社製)を用いて、プラスミドｐＵＹ−ＧＧＡをＮｏｔＩ及びＢａｍＨＩで消化したＤＮＡ断片と連結してプラスミドｐＵＹＧ−Ｃｒｅとした。
【００５７】
（３−２−２）ＨＲ４２−Ｋ株の創製
図５Ａに示すＢＹ４７４２株からＨＲ４２−Ｋ株の創製は以下の手順で行った。ｐＫ−Ｒ１１ＴをＳｐｅＩで消化して作成したＤＮＡ断片を用いて、ＢＹ４７４２株を酢酸リチウム法により形質転換した。形質転換体は、０.２ｍｇ／ｍＬのジェネティシン(Ｇ４１８)を含むＹＰＤ培地で選択し、ＨＲ４２−１１Ｔ株(表１)を得た。ＨＲ４２−１１Ｔの染色体ＤＮＡ内のｌｏｘＰ−ｋａｎＭＸ４−ｌｏｘＰからｋａｎＭＸ４を脱落させるために、酢酸リチウム法を用いてＣｒｅリコンビナーゼ遺伝子を含むプラスミドｐＵＹＧ−ＣｒｅをＨＲ４２−１１Ｔ株に導入した形質転換体を創製した。ＳＧａｌ培地で形質転換体を一晩培養して、Ｃｒｅリコンビナーゼを発現させることでｋａｎＭＸ４を脱落させた後、選択圧のないＹＰＤ培地でさらに一晩培養してプラスミドｐＵＹＧ−Ｃｒｅを脱落させ、ＨＲ４２−Ｋ株(表１)を得た。プライマー５１(配列番号７４)及びプライマー５２(配列番号７５)を用いて、ＨＲ４２−Ｋ株の染色体ＤＮＡを鋳型としてＨＭＲａをＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲ産物の配列を３１３０ジェネティックアナライザ(Applied Biosystems社製)により、プライマー５３(配列番号７６)を用いて解読し、図５Ａに示すようにＺ１領域がＨＯに認識される配列へと置換されていることを確認した。
以下、ＨＯ認識能が回復したＨＲ４２−Ｋ株を、「ａ型酵母」創製のための親株として用いる。
【００５８】
（３−３）ＨＲ４２−Ｋ株の接合型変換
次いで、ＨＲ４２−Ｋ株にＨＯ遺伝子を作用させて接合型変換を行った。ＨＲ４２−Ｋの接合型変換(図５Ａ)は以下の手順で行った。酢酸リチウム法を用いてｐＨ２Ｇ−Ｐａ１及びｐＵＹＧ−ＨＯをＨＲ４２−Ｋに導入した形質転換体を創製した。形質転換体を初期菌体濃度ＯＤ600＝０.３でＳＧａｌ培地に播種し、１８時間培養した後に培養液の希釈液を２０ｍｇ／Ｌのリジン、２０ｍｇ／Ｌのウラシルおよび３０ｍｇ／Ｌのロイシンを含むＳＤ固体培地(ＳＤ−Ｈｉｓプレート)に塗布して、３０℃で２日間培養することでコロニーを形成させた。
【００５９】
各コロニーをＳＤ−Ｈｉｓ培地で一晩培養した後、蛍光強度の測定を行った結果を図５Ｂに示す。表１に示すようにｐＨ２Ｇ−Ｐａ１にコードされるＧＦＰ遺伝子はａ型細胞で特異的に発現される。図５Ｂに示すように、α型のＨＲ４２−Ｋに上述の接合型変換操作を施すことで、緑色蛍光を発するａ型細胞が出現した。このうち最も蛍光強度の高いコロニーを選択して、ＹＰＤ培地で一晩培養したのち、酵母を回収し、洗浄後、蒸留水に再懸濁した。ＹＰＤ固体培地上に希釈した酵母懸濁液を塗布して、３０℃で２日間培養することにより形成したコロニーの中から、プラスミドｐＨ２Ｇ−Ｐａ１及びｐＵＹＧ−ＨＯが脱落したものを選択してＨＲ４１−Ｋ株(表１)とした。具体的には、ヒスチジンを含まない培地及びウラシルを含まない培地のどちらにおいても生育できないものを、両プラスミドが脱落したコロニーであると判別した。
【００６０】
創製したＨＲ４１−Ｋ株の接合能を評価した結果を図５Ｃに示す。比較対象として、既存のａ型酵母ＢＹ４７４１株を利用した。酢酸リチウム法により、ａ型のＢＹ４７４１又はＨＲ４１−Ｋ株にプラスミドｐＹＯ３２３を導入した形質転換体を創製した。また同様にして、α型のＨＲ４２−１１Ｔ株にプラスミドｐＹＯ３２５を導入した形質転換体を創製した。ａ型の形質転換体と、α型の形質転換体とをそれぞれ混合培養したのち、ヒスチジン及びロイシンを含まず、２０ｍｇ／Ｌのウラシル、２０ｍｇ／Ｌのリジンを含む二倍体選択用ＳＤ固体培地(ＳＤ−Ｈｉｓ、Ｌｅｕプレート)に塗布して３０℃で２日間培養した。この結果、既知創製したＨＲ４１−Ｋ株が、既知ａ型のＢＹ４７４１株と同様に、α型酵母と接合して二倍体酵母を形成することが確認され、ＨＲ４１−Ｋ株が確かにａ型の接合能を獲得したことが示された。
【００６１】
定量ＰＣＲにより、ＨＲ４３−ｋａｎ株の倍数性を測定した結果を図５Ｄに示す。一倍体のＨＲ４２−１１Ｔ株の染色体ＤＮＡ上には１コピーのｋａｎＭＸ４遺伝子(遺伝子組換えにより導入)と１コピーのＰＧＫ１遺伝子(内在遺伝子；配列番号５３)が存在する。また二倍体酵母ＢＹ４３−ｋａｎ株の２セットの染色体ＤＮＡ上には１コピーのｋａｎＭＸ４遺伝子(ＨＲ４２−１１Ｔ株由来)と２コピーのＰＧＫ１遺伝子が存在する。すなわち、ＨＲ４２−１１Ｔ株を創製したａ型酵母と接合させた酵母接合体の染色体ＤＮＡにおいて、ｋａｎＭＸ４遺伝子のコピー数を１として相対定量したＰＧＫ遺伝子のコピー数が、対象酵母の倍数性を示すことになる。図５Ｄより、ＨＲ４３−ｋａｎ株におけるＰＧＫ遺伝子のコピー数が２であると推定されることから、ＨＲ４３−ｋａｎ株は二倍体であると判別できる。したがって創製したＨＲ４１−Ｋ株が一倍体であることが示され、接合型変換の際の自己倍数化を回避していることが確認された。
【００６２】
（実施例４）接合型変換遺伝子の導入による酵母の接合型変換例(ａ型→α型)
（４−１）ＨＲ４１−Ｋ株の接合型変換
図６に示すａ型のＨＲ４１−Ｋ株の接合型変換は以下の手順で行った。酢酸リチウム法を用いてｐＬ３Ｇ−２α及びｐＵＹＧ−ＨＯをＨＲ４１−Ｋに導入した形質転換体を創製した。形質転換体を初期菌体濃度ＯＤ600＝０.３でＳＧａｌ培地に播種し、１８時間培養した後に培養液の希釈液を２０ｍｇ／Ｌのヒスチジン、２０ｍｇ／Ｌのウラシルおよび３０ｍｇ／Ｌのロイシンを含むＳＤ固体培地(ＳＤ−Ｌｅｕプレート)に塗布して、３０℃で２日間培養することでコロニーを形成させた。
【００６３】
各コロニーをＳＤ−Ｌｅｕ培地で一晩培養した後、蛍光強度の測定を行った結果を図６Ａに示す。表１に示すようにｐＬ３Ｇ−２αにコードされるＧＦＰ遺伝子はα型細胞で特異的に発現される。図６Ａに示すように、ａ型のＨＲ４１−Ｋに上述の接合型変換操作を施すことで、緑色蛍光を発するα型細胞が出現した。このうち最も蛍光強度の高いコロニーを選択して、ＹＰＤ培地で一晩培養したのち、酵母を回収し、洗浄後、蒸留水に再懸濁した。ＹＰＤ固体培地上に希釈した酵母懸濁液を塗布して、３０℃で２日間培養することにより形成したコロニーの中から、プラスミドｐＬ３Ｇ−２α及びｐＵＹＧ−ＨＯが脱落したものを選択してＨＲ４２−Ｋ’株とした。ＨＲ４２−Ｋ’株は図５Ａおよび図６Ａが示すように、ＨＲ４２−Ｋ株(表１)に２度の接合型変換を施して作製された株であるため、自己倍数化を回避できた場合は、ＨＲ４２−Ｋ株と一致することになる。以下の手順により、ＨＲ４２−Ｋ’株がＨＲ４２−Ｋ株と同一のものであることを確認した。
【００６４】
（４−２）ｋａｎＭＸ４配列を染色体ＤＮＡ上に有するＭＣＦ４７４１株の創製
（４−２−１）ｋａｎＭＸ４導入のためのプラスミドの構築
配列番号７７に示すＦＩＧ１上流配列(以降、「ＦＩＧ５’」とも表示する)、及び配列番号７８に示すＦＩＧ１下流配列(以降、「ＦＩＧ３’」とも表示する)を相同領域として用いて、染色体ＤＮＡのＦＩＧ１(配列番号７９)座位にｋａｎＭＸ４を導入するために、以下のプラスミドを作製した。ＦＩＧ３’をプライマー５４(配列番号８０)及びプライマー５５(配列番号８１)を用いて、ＰＣＲによりＢＹ４７４１株の染色体ＤＮＡを鋳型として増幅し、ｐＵＧ-ＬＫＬのＳｐｅＩ−ＳａｃＩＩ部位間に挿入して、プラスミドｐＵＧ−Ｆ１ｔとした。次にＦＩＧ５’−ＦＩＧ１をプライマー５６(配列番号８２)及びプライマー５７(配列番号８３)を用いて、ＰＣＲによりＢＹ４７４１株の染色体ＤＮＡを鋳型として増幅し、ＰｖｕＩＩ及びＢａｍＨＩで消化した。続いてＧＦＰ遺伝子をプライマー５８(配列番号８４)及びプライマー５９(配列番号８５)を用いて、ＰＣＲによりｐＮＨＫ１２を鋳型として増幅し、ＢａｍＨＩ及びＳａｌＩで消化した。ＦＩＧ５’−ＦＩＧ１及びＧＦＰ遺伝子をｐＵＧ−Ｆ１ｔのＰｖｕＩＩ−ＳａｌＩ部位間に挿入して、プラスミドｐＵＧ−ｐＦ１ｔとした。
【００６５】
（４−２−２）ＭＣＦ４７４１株の創製
ｐＵＧ−ｐＦ１ｔをＰｖｕＩＩおよびＳａｃＩＩで消化して、ＦＩＧ５’−ＦＩＧ１−ＧＦＰ−ｌｏｘＰ−ｋａｎＭＸ４−ｌｏｘＰ−ＦＩＧ３’から成るＤＮＡ断片を作製し、ＢＹ４７４１株を酢酸リチウム法により形質転換した。形質転換体は、０.２ｍｇ／ｍＬのジェネティシン(Ｇ４１８)を含むＹＰＤ培地で選択し、ＭＣＦ４７４１株(表１)を得た。
【００６６】
（４−３）ＨＲ４２−Ｋ’株の接合能及び倍数性の評価
創製したＨＲ４２−Ｋ’株の接合能を評価した結果を図６Ｂに示す。比較対象として、既存のα型酵母ＨＲ４２−Ｋ株を利用した。ａ型のＭＣＦ４７４１株と、創製したＨＲ４２−Ｋ’株又は既知α型酵母を混合培養したのち、メチオニン及びリジンを含まず、２０ｍｇ／Ｌのウラシル、２０ｍｇ／Ｌのヒスチジン、及び３０ｍｇ／Ｌのロイシンを含む二倍体選択用ＳＤ固体培地(ＳＤ−Ｍｅｔ、Ｌｙｓプレート)に塗布して３０℃で２日間培養した。この結果、二倍体酵母ＭＣＦ４３−ｋａｎ株(表１)、及びＭＣＦ４３−ｋａｎ’(ＭＣＦ４７４１／ＨＲ４２−Ｋ’)株が共に形成されることが確認され、ＨＲ４２−Ｋ’株がα型の接合能を有することが示された。
【００６７】
定量ＰＣＲにより、ＭＣＦ４３−ｋａｎ’株の倍数性を測定した結果を図６Ｃに示す。一倍体のＭＣＦ４７４１株の染色体ＤＮＡ上には１コピーのｋａｎＭＸ４遺伝子(遺伝子組換えにより導入)と１コピーのＰＧＫ１遺伝子(内在遺伝子)が存在する。また二倍体酵母ＭＣＦ４３−ｋａｎ株の２セットの染色体ＤＮＡ上には１コピーのｋａｎＭＸ４遺伝子(ＭＣＦ４７４１株由来)と２コピーのＰＧＫ１遺伝子が存在する。すなわち、ＭＣＦ４７４１株を創製したα型酵母と接合させた酵母接合体の染色体ＤＮＡにおいて、ｋａｎＭＸ４遺伝子のコピー数を１として相対定量したＰＧＫ遺伝子のコピー数が、対象酵母の倍数性を示すことになる。図６Ｃより、ＭＣＦ４３−ｋａｎ’株におけるＰＧＫ遺伝子のコピー数が２であると推定されることから、ＭＣＦ４３−ｋａｎ’株は二倍体であると判別できる。したがって創製したＨＲ４２−Ｋ’株が一倍体であることが示され、ＨＲ４２−Ｋ株と同一の株がａ型からα型への接合型変換により得られることが確認された。すなわちａ型からα型への接合型変換においても自己倍数化を回避していることが確認された。
【００６８】
（実施例５）二倍体酵母の接合型変換例(ａ／α型→ａ／ａ型、及びａ／α型→α／α型)
（５−１）ＨＲ４３−Ｋ株の創製
酢酸リチウム法により、ａ型のＨＲ４１−Ｋ株にプラスミドｐＹＯ３２５を導入した形質転換体を創製した。また同様にして、α型のＨＲ４２−Ｋ株にプラスミドｐＹＯ３２６を導入した形質転換体を創製した。ａ型の形質転換体と、α型の形質転換体とをそれぞれ混合培養したのち、ロイシン及びウラシルを含まず、２０ｍｇ／Ｌのヒスチジン、２０ｍｇ／Ｌのリジンを含む二倍体選択用ＳＤ固体培地(ＳＤ−Ｕｒａ、Ｌｅｕプレート)に塗布して３０℃で２日間培養した。この結果、創製した二倍体酵母をＹＰＤ培地で一晩培養したのち、酵母を回収し、洗浄後、蒸留水に再懸濁した。ＹＰＤ固体培地上に希釈した酵母懸濁液を塗布して、３０℃で２日間培養することにより形成したコロニーの中から、プラスミドｐＹＯ３２５及びｐＹＯ３２６が脱落したものを選択してＨＲ４３−Ｋ株とした。具体的には、ロイシンを含まない培地及びウラシルを含まない培地のどちらにおいても生育できないものを、両プラスミドが脱落したコロニーであると判別した。
【００６９】
（５−２）ＨＲ４３−Ｋ株の接合型変換(ａ／α型→ａ／ａ型)
酢酸リチウム法を用いて、ＨＲ４３−Ｋ株にプラスミドｐＵＹＧ−ＨＯ及びプラスミドｐＨ２Ｇ−Ｐａ１を導入した形質転換体を創製した。形質転換体を初期菌体濃度ＯＤ600＝０.３でＳＧａｌ培地に播種し、１８時間培養した後に培養液の希釈液を２０ｍｇ／Ｌのリジン、２０ｍｇ／Ｌのウラシルおよび３０ｍｇ／Ｌのロイシンを含むＳＤ固体培地(ＳＤ−Ｈｉｓプレート)に塗布して、３０℃で２日間培養することでコロニーを形成させた。
【００７０】
各コロニーをＳＤ−Ｈｉｓ培地で一晩培養した後、蛍光強度の測定を行った。このうち最も蛍光強度の高いコロニーを選択して、ＹＰＤ培地で一晩培養したのち、酵母を回収し、洗浄後、蒸留水に再懸濁した。ＹＰＤ固体培地上に希釈した酵母懸濁液を塗布して、３０℃で２日間培養することにより形成したコロニーの中から、プラスミドｐＨ２Ｇ−Ｐａ１及びｐＵＹＧ−ＨＯが脱落したものを選択してＨＲ４３Ｋ−Ａ株とした。具体的には、ヒスチジンを含まない培地及びウラシルを含まない培地のどちらにおいても生育できないものを、両プラスミドが脱落したコロニーであると判別した。
【００７１】
酢酸リチウム法を用いて、ＨＲ４３−Ｋ株、及びＨＲ４３Ｋ−Ａ株にプラスミドｐＨＹ−２ＧＡを導入した形質転換体を創製した。形質転換体をＳＤ−Ｈｉｓ培地で一晩培養した後、蛍光強度の測定を行った結果を図７Ａに示す。表１に示すようにｐＨＹ−２ＧＡにコードされるＧＦＰ遺伝子はａ型細胞で特異的に発現される。図７Ａに示すように、ａ／α型のＨＲ４３−Ｋに上述の接合型変換操作を施すことで、緑色蛍光を発するａ／ａ型細胞が創製されたことを確認した。
【００７２】
（５−３）ＨＲ４３−Ｋ株の接合型変換(ａ／α型→α／α型)
酢酸リチウム法を用いて、ＨＲ４３−Ｋ株にプラスミドｐＵＹＧ−ＨＯ及びプラスミドｐＬ３Ｇ−２αを導入した形質転換体を創製した。形質転換体を初期菌体濃度ＯＤ600＝０.３でＳＧａｌ培地に播種し、１８時間培養した後に培養液の希釈液を２０ｍｇ／Ｌのリジン、２０ｍｇ／Ｌのウラシルおよび２０ｍｇ／Ｌのヒスチジンを含むＳＤ固体培地(ＳＤ−Ｌｅｕプレート)に塗布して、３０℃で２日間培養することでコロニーを形成させた。
【００７３】
各コロニーをＳＤ−Ｌｅｕ培地で一晩培養した後、蛍光強度の測定を行った。このうち最も蛍光強度の高いコロニーを選択して、ＹＰＤ培地で一晩培養したのち、酵母を回収し、洗浄後、蒸留水に再懸濁した。ＹＰＤ固体培地上に希釈した酵母懸濁液を塗布して、３０℃で２日間培養することにより形成したコロニーの中から、プラスミドｐＬ３Ｇ−２α及びｐＵＹＧ−ＨＯが脱落したものを選択してＨＲ４３Ｋ−ＡＬ株とした。具体的には、ロイシンを含まない培地及びウラシルを含まない培地のどちらにおいても生育できないものを、両プラスミドが脱落したコロニーであると判別した。
【００７４】
酢酸リチウム法を用いて、ＨＲ４３−Ｋ株、及びＨＲ４３Ｋ−ＡＬ株にプラスミドｐＬＹ−３ＧＣを導入した形質転換体を創製した。形質転換体をＳＤ−Ｌｅｕ培地で一晩培養した後、蛍光強度の測定を行った結果を図７Ｂに示す。表１に示すようにｐＬＹ−３ＧＣにコードされるＧＦＰ遺伝子はα型細胞で特異的に発現される。図７Ａに示すように、ａ／α型のＨＲ４３−Ｋに上述の接合型変換操作を施すことで、緑色蛍光を発するα／α型細胞が創製されたことを確認した。
【００７５】
（５−４）接合効率の評価
本技術により創製した酵母株の接合効率を図７Ｃに示すように評価した。自己倍数化を抑制する工程を含まない従来技術では、接合型変換により生成したａ／ａ型又はα／α型酵母を単離することは困難であるため、先の特許文献１に記されるように、同一の培養液内で接合型変換と接合を行って接合体を形成させる。一方、本技術では創製及び単離したａ／ａ型及びα／α型酵母を混合培養して接合体を形成させる。
【００７６】
従来技術の接合効率を以下のように測定した。酢酸リチウム法を用いて、ＨＲ４３−Ｋ株にプラスミドｐＨＹ−２ＧＡ及びプラスミドｐＵＹＧ−ＨＯを導入した形質転換体を創製した。同様にして、ＨＲ４３−Ｋ株にプラスミドｐＬＹ−３ＧＣ及びプラスミドｐＵＹＧ−ＨＯを導入した形質転換体を創製した。両形質転換体をＹＰＧａｌ培地で混合培養したのち、ヒスチジン及びロイシンを含まず、２０ｍｇ／Ｌのウラシル、２０ｍｇ／Ｌのリジンを含む二倍体選択用ＳＤ固体培地(ＳＤ−Ｈｉｓ、Ｌｅｕプレート)に酵母懸濁液を塗布して３０℃で２日間培養した。形成したコロニー数を計測し、菌体濃度ＯＤ600＝１.０の酵母懸濁液１ｍＬ中に生成した接合体数を定量した結果を図７Ｃに示す。
【００７７】
本技術の接合効率を以下のように測定した。上述のＨＲ４３Ｋ−Ａ株にプラスミドｐＨＹ−２ＧＡを導入した形質転換体と、ＨＲ４３Ｋ−ＡＬ株にプラスミドｐＬＹ−３ＧＣを導入した形質転換体とを、ＹＰＤ培地で混合培養したのち、ヒスチジン及びロイシンを含まず、２０ｍｇ／Ｌのウラシル、２０ｍｇ／Ｌのリジンを含む二倍体選択用ＳＤ固体培地(ＳＤ−Ｈｉｓ、Ｌｅｕプレート)に酵母懸濁液を塗布して３０℃で２日間培養した。形成したコロニー数を計測し、菌体濃度ＯＤ600＝１.０の酵母懸濁液１ｍＬ中に生成した接合体数を定量した結果を図７Ｃに示す。この結果、本技術を用いることで、従来技術に比べて約１０,０００倍の効率で接合体を生成可能であることを確認した。
【００７８】
（参考文献）
参考文献６：Brachmann CB，et．al.，1998，Yeast．Vol14: 115-132.
参考文献７：Gietz D，et．al.，1992，Nucleic Acids Res．Vol20: 1425.
参考文献８：Gelfand B et．al.，2011，Mol Biol Cell．Vol31: 1701-1709.
参考文献９：Li T et．al.，1998，Nucleic Acids Res．Vol26: 5707-5718.
【産業上の利用可能性】
【００７９】
本発明は、従来法では実用的な交雑育種ができなかった又は困難であった酵母の交雑育種の効率性を著しく高めることを可能とするものであり、飲料・食品等の製品の製造などの産業上有用な用途に用い得る酵母(実用酵母)の交雑育種の分野において非常に有効に利用することができる。
［配列表フリーテキスト］
配列番号１：ａ１タンパク質(Saccharomyces cerevisiae)
配列番号２：α２タンパク質(Saccharomyces cerevisiae)
配列番号３：ＨＯタンパク質(Saccharomyces cerevisiae)
配列番号４：ＰＧＫ１プロモーター
配列番号５：ＳＴＥ２プロモーター
配列番号６：ＧＡＬ１プロモーター
配列番号７：ＳＴＥ３プロモーター
配列番号８：ｋａｎＭＸ４マーカー遺伝子
配列番号９：ＰＧＫ１遺伝子(内在性遺伝子)
配列番号１０：プライマー１(Ｆ)ＫａｎＭＸ４遺伝子コピー数定量
配列番号１１：プライマー２(Ｒ)ＫａｎＭＸ４遺伝子コピー数定量
配列番号１２：プライマー３(Ｆ)ＰＧＫ１遺伝子コピー数定量
配列番号１３：プライマー４(Ｒ)ＰＧＫ１遺伝子コピー数定量
配列番号１４：プライマー５(Ｆ)ＳＴＥ２プロモーター増幅
配列番号１５：プライマー６(Ｒ)ＳＴＥ２プロモーター増幅
配列番号１６：ＧＦＰ遺伝子
配列番号１７：プライマー７(Ｆ)ＧＦＰ遺伝子増幅
配列番号１８：プライマー８(Ｒ)ＧＦＰ遺伝子増幅
配列番号１９：ＡＤＨ１ターミネーター
配列番号２０：プライマー９(Ｆ)ＡＤＨ１ターミネーター増幅
配列番号２１：プライマー１０(Ｒ)ＡＤＨ１ターミネーター増幅
配列番号２２：プライマー１１(Ｆ)ＳＴＥ３プロモーター増幅
配列番号２３：プライマー１２(Ｒ)ＳＴＥ３プロモーター増幅
配列番号２４：ＣＹＣ１ターミネーター
配列番号２５：プライマー１３(Ｆ)ＣＹＣ１ターミネーター増幅
配列番号２６：プライマー１４(Ｒ)ＣＹＣ１ターミネーター増幅
配列番号２７：ａ１遺伝子(Saccharomyces cerevisiae)
配列番号２８：プライマー１５(Ｆ)ａ１遺伝子増幅
配列番号２９：プライマー１６(Ｒ)ａ１遺伝子増幅
配列番号３０：プライマー１７(Ｆ)ＰＧＫ１プロモーター増幅
配列番号３１：プライマー１８(Ｒ)ＰＧＫ１プロモーター増幅
配列番号３２：プライマー１９(Ｒ)ＰＧＫ１−ａ１−ＡＤＨ１ターミネーター増幅
配列番号３３：α２遺伝子
配列番号３４：プライマー２０(Ｆ)α２遺伝子の増幅
配列番号３５：プライマー２１(Ｒ)α２遺伝子の増幅
配列番号３６：プライマー２２(Ｒ)ＰＧＫ１−α２−ＣＹＣ１ターミネーター増幅
配列番号３７：プライマー２３(Ｆ)ＧＡＬ１プロモーター増幅
配列番号３８：プライマー２４(Ｒ)ＧＡＬ１プロモーター増幅
配列番号３９：ＨＯ遺伝子
配列番号４０：プライマー２５(Ｆ)ＨＯ遺伝子増幅
配列番号４１：プライマー２６(Ｒ)ＨＯ遺伝子増幅
配列番号４２：プライマー２７(Ｆ)ＡＤＨ１ターミネーター増幅
配列番号４３：プライマー２８(Ｒ)ＡＤＨ１ターミネーター増幅
配列番号４４：Ｘ領域(ＨＭＲａ)
配列番号４５：Ｙａ領域(ＨＭＲａ)
配列番号４６：Ｚ１領域(ＨＭＲａ)
配列番号４７：ＨＭＲ５’(ＨＭＲａ上流配列)
配列番号４８：ＨＭＲ３’(ＨＭＲａ下流配列)
配列番号４９：アンピシリン耐性遺伝子及び複製起点からなるＤＮＡ配列
配列番号５０：プライマー２９(Ｆ)配列４９の第一断片増幅
配列番号５１：プライマー３０(Ｒ)配列４９の第一断片増幅
配列番号５２：プライマー３１(Ｆ)配列４９の第二断片増幅
配列番号５３：プライマー３２(Ｒ)配列４９の第二断片増幅
配列番号５４：プライマー３３(Ｆ)配列４９の第三断片増幅
配列番号５５：プライマー３４(Ｒ)配列４９の第三断片増幅
配列番号５６：プライマー３５(Ｆ)配列４９の第四断片増幅
配列番号５７：プライマー３６(Ｒ)配列４９の第四断片増幅
配列番号５８：プライマー３７(Ｆ)配列４９の第五断片増幅
配列番号５９：プライマー３８(Ｒ)配列４９の第五断片増幅
配列番号６０：ｌｏｘＰ遺伝子
配列番号６１：プライマー３９(Ｆ)ｌｏｘＰ−ｋａｎＭＸ４−ｌｏｘＰ増幅配列番号６２：プライマー４０(Ｒ)ｌｏｘＰ−ｋａｎＭＸ４−ｌｏｘＰ増幅
配列番号６３：プライマー４１(Ｆ)ｌｏｘＰ−ｋａｎＭＸ４−ｌｏｘＰ増幅
配列番号６４：プライマー４２(Ｒ)ｌｏｘＰ−ｋａｎＭＸ４−ｌｏｘＰ増幅
配列番号６５：プライマー４３(Ｆ)ＨＭＲ５’−Ｘ−Ｙａ増幅
配列番号６６：プライマー４４(Ｒ)ＨＭＲ５’−Ｘ−Ｙａ増幅
配列番号６７：プライマー４５(Ｆ)Ｚ１増幅
配列番号６８：プライマー４６(Ｒ)Ｚ１増幅
配列番号６９：プライマー４７(Ｆ)ＨＭＲ３’増幅
配列番号７０：プライマー４８(Ｒ)ＨＭＲ３’増幅
配列番号７１：Ｃｒｅリコンビナーゼ遺伝子
配列番号７２：プライマー４９(Ｆ)Ｃｒｅ増幅
配列番号７３：プライマー５０(Ｒ)Ｃｒｅ増幅
配列番号７４：プライマー５１(Ｆ)ＨＭＲａ増幅
配列番号７５：プライマー５２(Ｒ)ＨＭＲａ増幅
配列番号７６：プライマー５３(Ｆ)Ｚ１領域(ＨＭＲａ)のシーケンシング
配列番号７７：ＦＩＧ５’(ＦＩＧ１上流配列)
配列番号７８：ＦＩＧ３’(ＦＩＧ１下流配列)
配列番号７９：ＦＩＧ１遺伝子
配列番号８０：プライマー５４(Ｆ)ＦＩＧ３’増幅
配列番号８１：プライマー５５(Ｒ)ＦＩＧ３’増幅
配列番号８２：プライマー５６(Ｆ)ＦＩＧ５’−ＦＩＧ１増幅
配列番号８３：プライマー５７(Ｒ)ＦＩＧ５’−ＦＩＧ１増幅
配列番号８４：プライマー５８(Ｆ)ＧＦＰ増幅
配列番号８５：プライマー５９(Ｒ)ＧＦＰ増幅
【図１】
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【図２】
2014143957.tif 000004
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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