(57)【要約】【課題】特定の細胞内のみで機能する、オリゴヌクレオチド構造体および遺伝子発現抑制方法を提供することである。【解決手段】トリガー鎖とエフェクター鎖とサポート鎖の３本のオリゴヌクレオチド鎖で構成されるオリゴヌクレオチド構造体であって、前記３本のオリゴヌクレオチド鎖は、それぞれの鎖の一部が他の２本の鎖の一部と塩基対合して、全体でＹ字構造を形成し、トリガー鎖の一部およびサポート鎖の一部は、ステムループ構造を形成し、エフェクター鎖は、標的遺伝子転写産物の少なくとも一部と相補性を有し、トリガー鎖の一部は、ＲＮＡである崩壊誘導鎖の少なくとも一部と相補性を有し、トリガー鎖および前記サポート鎖は、ＤＮＡであり、Ｙ字構造は、崩壊誘導鎖の少なくとも一部がトリガー鎖の一部と塩基対合することが引き金となって崩壊する、オリゴヌクレオチド構造体を提供する。【選択図】図１
2014147365.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
トリガー鎖（１）とエフェクター鎖（２）とサポート鎖（３）の３本のオリゴヌクレオチド鎖で構成されるオリゴヌクレオチド構造体であって、
前記３本のオリゴヌクレオチド鎖は、それぞれの鎖の一部が他の２本の鎖の一部と塩基対合して、全体でＹ字構造を形成し、
前記トリガー鎖（１）は、ｔ１−２部位とｔ１−１部位とｔ２部位とｔ３部位でこの順に構成され、
前記エフェクター鎖（２）は、ｅ１部位とｅ２部位で構成され、
前記サポート鎖（３）は、ｓ１部位とｓ２部位とｓ３部位でこの順に構成され、
前記ｔ２部位と前記ｅ２部位は塩基対合し、
前記ｅ１部位と前記ｓ２部位は塩基対合し、
前記ｓ１部位と前記ｔ１−１部位は塩基対合し、
前記ｔ３部位および前記ｓ３部位は、ステムループ構造を形成し、
前記エフェクター鎖（２）は、標的遺伝子転写産物の少なくとも一部と相補性を有し、
前記ｔ１−１部位と前記ｔ１−２部位からなるｔ１部位は、ＲＮＡである崩壊誘導鎖の少なくとも一部と相補性を有し、
前記トリガー鎖（１）および前記サポート鎖（３）は、ＤＮＡであり、
前記Ｙ字構造は、前記崩壊誘導鎖の少なくとも一部が前記ｔ１−２部位と塩基対合することが引き金となって崩壊する、
オリゴヌクレオチド構造体。
【請求項２】
前記エフェクター鎖（２）は、ＲＮＡである、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド構造体。
【請求項３】
前記エフェクター鎖（２）は、相補性を有するオリゴヌクレオチドであるパッセンジャー鎖と二本鎖を形成する、請求項１または２に記載のオリゴヌクレオチド構造体。
【請求項４】
請求項３に記載のオリゴヌクレオチド構造体と、前記パッセンジャー鎖とを含む、遺伝子発現抑制剤。
【請求項５】
前記パッセンジャー鎖は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＤＮＡとＲＮＡのキメラである、請求項４に記載の遺伝子発現抑制剤。
【請求項６】
前記パッセンジャー鎖は、エフェクター鎖（２）と形成する二本鎖において、該パッセンジャー鎖の５’側がエフェクター鎖（２）より長い、請求項４または５に記載の遺伝子発現抑制剤。
【請求項７】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド構造体または請求項４〜６のいずれか一項に記載の遺伝子発現抑制剤を有効成分として含有する医薬組成物。
【請求項８】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド構造体または請求項４〜６のいずれか一項に記載の遺伝子発現抑制剤を細胞または組織に導入し、
前記崩壊誘導鎖が存在する細胞または組織においてのみ、前記Ｙ字構造の崩壊を生じさせ、エフェクター鎖（２）が機能する、
遺伝子発現抑制方法。
【請求項９】
前記エフェクター鎖（２）が、ＲＮＡｉによって標的遺伝子発現を抑制する、請求項８に記載の遺伝子発現抑制方法。
【請求項１０】
トリガー鎖（１）が配列番号１に示されるオリゴヌクレオチドであり、エフェクター鎖（２）が配列番号２に示されるオリゴヌクレオチドであり、サポート鎖（３）が配列番号３に示されるオリゴヌクレオチドである、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド構造体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＲＮＡｉ等に有効に使用できる、オリゴヌクレオチド構造体および遺伝子発現抑制方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ガンやエイズ等の難病を効率的に治療する医薬の開発は、ライフサイエンスの分野における大きな課題の一つである。ポストゲノム時代において、遺伝子の発現を制御することが新たな難病の治療法として着目されている。
【０００３】
遺伝子治療としては、従来、アンチセンスやデコイでタンパク質の発現を制御したり、ゲノムの修復を行ったり、欠損もしくは損傷している遺伝情報を外来遺伝子の形で入れて、タンパク質の発現を誘発することが行われてきた。また、最近では、遺伝情報の発現をコントロールするＲＮＡ、いわゆるｓｉＲＮＡやｍｉＲＮＡを利用した遺伝子治療も注目を集めている。
【０００４】
ｓｉＲＮＡは、一般に、ガイド鎖ＲＮＡとパッセンジャー鎖ＲＮＡとが互いに結合して形成された二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）をいう。このｄｓＲＮＡを細胞内へ導入することによって、当該ガイド鎖ＲＮＡと相補的な配列を持つｍＲＮＡが分解される等して、遺伝子の発現が抑制される（例えば、非特許文献１〜４参照）。この現象をＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）ともいう。ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡ＊と結合してｄｓＲＮＡを形成し、ＲＮＡｉと同様の機構で遺伝子の発現を抑制する内在性分子である。
【０００５】
しかし、ｓｉＲＮＡやｍｉＲＮＡを用いて発現抑制する場合には、以下のような問題がある。ｓｉＲＮＡやｍｉＲＮＡは、原理的には、相補的な配列を持つｍＲＮＡに結合する。しかし、一塩基置換がされたｍＲＮＡに対しても、同様に結合する。このため、正常遺伝子と異常遺伝子との配列差がわずかしかない場合には、正常細胞中で正常なｍＲＮＡを分解等してしまうという問題がある。このように、ｓｉＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ医薬は副作用が大きいという問題がある。
【０００６】
この問題を解決するため、本発明者らは、以前、所望の細胞内で機能するオリゴヌクレオチド構造体を開発した（特許文献１）。この構造体は、トリガー鎖とエフェクター鎖とサポート鎖の３本のオリゴヌクレオチドで構成され、トリガー鎖が特定の他のポリヌクレオチドの配列を認識すると、構造体は崩壊してエフェクター鎖を機能させることができる。トリガー鎖の一部を、例えばガン細胞等の異常細胞内で発現し、正常細胞内で発現しない遺伝子の転写産物と相補的となるように設計しておくことで、このオリゴヌクレオチド構造体を、ガン細胞等の所望の細胞内のみで崩壊させることが企図された。
【０００７】
しかし、この特許文献１のオリゴヌクレオチド構造体には非特異的活性の問題や安定性の問題があったため、より確実に所望の細胞内のみで機能できるオリゴヌクレオチド構造体の開発が望まれていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第２０１０／００５０５５号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｆｉｒｅ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ，３９１，８０６−８１１．
【非特許文献２】Ｅｌｂａｓｈｉｒ，Ｓ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，（２００１）Ｎａｔｕｒｅ，４１１，４９４−４９８．
【非特許文献３】Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ，Ｔ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，（２００２）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９６，５５０−５５３．
【非特許文献４】Ｐａｄｄｉｓｏｎ，Ｐ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，（２００２）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ，１６，９４８−９５８．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、特定の細胞内のみで機能する、オリゴヌクレオチド構造体および遺伝子発現抑制方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記国際公開第２０１０／００５０５５号（特許文献１）に記載のオリゴヌクレオチド構造体において、トリガー鎖とサポート鎖の、エフェクター鎖結合部位に隣接する末端がステムループ構造を形成する場合に、上記非特異的活性および安定性の問題が解決されることを見出し、本発明を完成した。すなわち、本発明は以下を包含する。
［１］トリガー鎖（１）とエフェクター鎖（２）とサポート鎖（３）の３本のオリゴヌクレオチド鎖で構成されるオリゴヌクレオチド構造体であって、
前記３本のオリゴヌクレオチド鎖は、それぞれの鎖の一部が他の２本の鎖の一部と塩基対合して、全体でＹ字構造を形成し、
前記トリガー鎖（１）は、ｔ１−２部位とｔ１−１部位とｔ２部位とｔ３部位でこの順に構成され、
前記エフェクター鎖（２）は、ｅ１部位とｅ２部位で構成され、
前記サポート鎖（３）は、ｓ１部位とｓ２部位とｓ３部位でこの順に構成され、
前記ｔ２部位と前記ｅ２部位は塩基対合し、
前記ｅ１部位と前記ｓ２部位は塩基対合し、
前記ｓ１部位と前記ｔ１−１部位は塩基対合し、
前記ｔ３部位および前記ｓ３部位は、ステムループ構造を形成し、
前記エフェクター鎖（２）は、標的遺伝子転写産物の少なくとも一部と相補性を有し、
前記ｔ１−１部位と前記ｔ１−２部位からなるｔ１部位は、ＲＮＡである崩壊誘導鎖の少なくとも一部と相補性を有し、
前記トリガー鎖（１）および前記サポート鎖（３）は、ＤＮＡであり、
前記Ｙ字構造は、前記崩壊誘導鎖の少なくとも一部が前記ｔ１−２部位と塩基対合することが引き金となって崩壊する、
オリゴヌクレオチド構造体。
［２］前記エフェクター鎖（２）は、ＲＮＡである、［１］に記載のオリゴヌクレオチド構造体。
［３］前記エフェクター鎖（２）は、相補性を有するオリゴヌクレオチドであるパッセンジャー鎖と二本鎖を形成する、［１］または［２］に記載のオリゴヌクレオチド構造体。
［４］［３］に記載のオリゴヌクレオチド構造体と、前記パッセンジャー鎖とを含む、遺伝子発現抑制剤。
［５］前記パッセンジャー鎖は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＤＮＡとＲＮＡのキメラである、［４］に記載の遺伝子発現抑制剤。
［６］前記パッセンジャー鎖は、エフェクター鎖（２）と形成する二本鎖において、該パッセンジャー鎖の５’側がエフェクター鎖（２）より長い、［４］または［５］に記載の遺伝子発現抑制剤。
［７］［１］〜［３］のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド構造体または［４］〜［６］のいずれかに記載の遺伝子発現抑制剤を有効成分として含有する医薬組成物。
［８］［１］〜［３］のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド構造体または［４］〜［６］のいずれかに記載の遺伝子発現抑制剤を細胞または組織に導入し、
前記崩壊誘導鎖が存在する細胞または組織においてのみ、前記Ｙ字構造の崩壊を生じさせ、エフェクター鎖（２）が機能する、
遺伝子発現抑制方法。
［９］前記エフェクター鎖（２）が、ＲＮＡｉによって標的遺伝子発現を抑制する、［８］に記載の遺伝子発現抑制方法。
［１０］トリガー鎖（１）が配列番号１に示されるオリゴヌクレオチドであり、エフェクター鎖（２）が配列番号２に示されるオリゴヌクレオチドであり、サポート鎖（３）が配列番号３に示されるオリゴヌクレオチドである、［１］に記載のオリゴヌクレオチド構造体。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、特定の細胞内のみで機能する、オリゴヌクレオチド構造体および遺伝子発現抑制方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、本発明のオリゴヌクレオチド構造体の構成を説明する図である。
【図２】図２は、本発明のオリゴヌクレオチド構造体の崩壊の機構を説明する図である。（ａ）は、トリガー鎖の一部と相補性を有する部位を有する崩壊誘導鎖が存在する場合にオリゴヌクレオチド構造体が崩壊することを示す。（ｂ）は、前記崩壊誘導鎖が存在しない場合にオリゴヌクレオチド構造体が崩壊しないことを示す。
【図３】図３は、実施例１および２で用いたオリゴヌクレオチドを示す。大文字はＤＮＡを、小文字はＲＮＡを表す。（Ｆ）では、エフェクター鎖との二本鎖においてパッセンジャー鎖の５’側がエフェクター鎖（ガイド鎖）より長い部分を斜体下線で示す。（Ｈ）では、トリガー鎖に対するミスマッチ塩基を太字下線で示す。
【図４】図４は、実施例１で用いた測定系の構造を示す。（ａ）は、ｓｉＰｏｌＲ２Ａ−ＡＳの遺伝子発現抑制活性を測定するｐＤｓＲｅｄ２−ｓｉＰｏｌＲ２Ａ標的の主要構造の一部の概念図である。（ｂ）は、遺伝子発現抑制活性を補正するためのＧＦＰ発現ベクターであるｐＣＡＧＧＳ−ＡＦＰの主要構造の一部の概念図である。
【図５】図５は、本発明のオリゴヌクレオチド構造体を利用したｓｉＲＮＡの遺伝子発現抑制活性を示すグラフである。
【図６】図６は、ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下に、本発明を詳細に説明する。
１．定義
本発明において「オリゴヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド」および「核酸」とは、ヌクレオチドを構成単位とし、それらがホスホジエステル結合によって連結した生体高分子をいう。原則として自然界に存在する天然型ヌクレオチドが連結してなる天然型核酸を意味するが、人工核酸、または天然型核酸と人工核酸の混合物であってもよい。
【００１５】
本明細書において「天然型ヌクレオチド」とは、アデニン、グアニン、シトシンおよびチミンのいずれかの塩基を有するデオキシリボヌクレオチドおよびアデニン、グアニン、シトシンおよびウラシルのいずれかの塩基を有するリボヌクレオチドが該当する。「天然型核酸」とは、デオキシリボヌクレオチドが連結したＤＮＡおよびリボヌクレオチドが連結したＲＮＡが該当する。
【００１６】
本発明において、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドおよび核酸は、必要に応じて、リン酸基、糖および／または塩基が核酸用標識物質で標識されていてもよい。核酸用標識物質は、当該分野で公知のあらゆる物質を利用することができる。例えば、放射性同位元素（例えば、３２Ｐ、３Ｈ、１４Ｃ）、ＤＩＧ、ビオチン、蛍光色素（例えば、ＦＩＴＣ、Ｔｅｘａｓ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ７、ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＶＩＣ、ＪＯＥ、Ｒｏｘ、ＴＥＴ、Ｂｏｄｉｐｙ４９３、ＮＢＤ、ＴＡＭＲＡ）、または発光物質（例えば、アクリジニウムエスター）が挙げられる。
【００１７】
本明細書において「相補的」とは、２つの塩基間で（例えばワトソン・クリック型の）塩基対合をし得る関係を意味し、例えば、アデニンとチミンまたはウラシルとの関係、ならびにシトシンとグアニンとの関係をいう。本明細書において、ある鎖または部位が別の鎖または部位と「相補性を有する」とは、第一の核酸配列の連続する塩基が第二の核酸配列中の同じ数の連続する塩基と完全に相補的である場合だけでなく、一方または両方の核酸配列に１つまたは複数の塩基の置換、付加および／または欠失を含んでよいことを意味する。このような置換はミスマッチ塩基を生じ、付加および欠失は不対塩基（バルジ塩基）を生じ得る。本明細書において、ある鎖または部位が別の鎖または部位と「相補性を有する」場合、ある鎖または部位は、別の鎖または部位と５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上または１００％相補的であり得る。本明細書において、ある鎖または部位が別の鎖または部位と「塩基対合する」とは、第一の核酸配列の連続する塩基がすべて第二の核酸配列中の同じ数の連続する塩基と塩基対合する場合だけでなく、一方または両方の核酸配列に１つまたは複数の塩基の置換、付加および／または欠失を含んでよいことを意味する。本明細書において、ある鎖または部位が別の鎖または部位と「塩基対合する」場合、ある鎖または部位の５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上または１００％の塩基が、別の鎖または部位の塩基と塩基対合し得る。
【００１８】
本明細書において「ｓｉＲＮＡ」（低分子干渉ＲＮＡ：ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）とは、前述のように標的遺伝子の一部に相当する塩基配列を有するパッセンジャー鎖（センス鎖）およびガイド鎖（アンチセンス鎖）からなる小分子二本鎖ＲＮＡである。「ＲＮＡｉ」とは、ｓｉＲＮＡが配列特異的に標的遺伝子の発現を抑制する現象をいう。
【００１９】
本明細書において「ｍｉＲＮＡ」（ｍｉｃｒｏ  ＲＮＡ）とは、生体内に存在し、特定の遺伝子の発現を配列特異的に抑制する長さ１８〜２５塩基長の一本鎖ノンコーディングＲＮＡである。ｍｉＲＮＡは、標的遺伝子のｍＲＮＡおよびタンパク質因子と結合して複合体を形成し、主に、標的遺伝子の翻訳を阻害することが知られている。ｍｉＲＮＡは、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡと呼ばれる一本鎖の前駆体状態でゲノムから転写された後、核内でＤｒｏｓｈａと呼ばれるエンドヌクレアーゼによりｐｒｅ−ｍｉＲＮＡと呼ばれるさらなる一本鎖前駆体状態にプロセシングされ、核外でＤｉｃｅｒと呼ばれるエンドヌクレアーゼの働きによって前述のｍｉＲＮＡ鎖とｍｉＲＮＡ＊鎖（ｍｉＲＮＡスター鎖）からなる成熟型二本鎖ｍｉＲＮＡとなり、そのうちｍｉＲＮＡ鎖がＲＩＳＣ（ＲＮＡ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｃｏｍｐｌｅｘ）複合体に取り込まれて、標的遺伝子発現を抑制することが知られている（Ｄａｖｉｄ  Ｐ．Ｂａｒｔｅｌ（２００４）Ｃｅｌｌ，１１６，２８１−２９７）。
【００２０】
本明細書において「遺伝子発現抑制」とは、ｓｉＲＮＡによるＲＮＡｉ機構の誘導を介して、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドとしての作用等を介して、転写および／または転写後段階において遺伝子の発現を抑制することをいう。「遺伝子発現抑制」とは、標的遺伝子の発現をその標的遺伝子のｍＲＮＡまたはタンパク質の発現量を指標に判定した場合に、１００％抑制される場合のみならず、７５％以上、５０％以上または２０％以上抑制される場合も意味する。遺伝子発現抑制の程度は、例えば、遺伝子のｍＲＮＡまたはタンパク質の産生量を本発明のオリゴヌクレオチド構造体等を導入した細胞または個体と、非導入もしくは無関係な核酸分子等を導入した細胞または個体とで比較することによって決定できる。ｍＲＮＡの産生量は、ノーザンハイブリダイゼーションまたはＲＴ−ＰＣＲ等により測定することができ、タンパク質の産生量は、ウエスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、タンパク質の活性測定、または蛍光タンパク質からの蛍光強度等により測定することができる。
【００２１】
２．本発明のオリゴヌクレオチド構造体
２−１．概要
本発明の第１の態様は、トリガー鎖とエフェクター鎖とサポート鎖の３本のオリゴヌクレオチド鎖で構成される、オリゴヌクレオチド構造体である。このオリゴヌクレオチド構造体は、特定の細胞内のみで崩壊し、オリゴヌクレオチド構造体を構成するオリゴヌクレオチドの１つであるエフェクター鎖を機能させることができる。エフェクター鎖は、例えば、ｓｉＲＮＡのガイド鎖またはアンチセンスオリゴヌクレオチドとなり、特定の細胞内のみで標的遺伝子の発現を抑制することができる。
【００２２】
２−２．構成
図１は、本発明のオリゴヌクレオチド構造体の構成を説明する図である。図１を参照して、本発明のオリゴヌクレオチド構造体の構成を説明する。
【００２３】
本発明のオリゴヌクレオチド構造体は、トリガー鎖１とエフェクター鎖２とサポート鎖３の３本のオリゴヌクレオチド鎖で構成されている。
【００２４】
「トリガー鎖」１は、特定の細胞に存在するＲＮＡ分子である崩壊誘導鎖の少なくとも一部と相補性を有する部位（ｔ１−１部位とｔ１−２部位からなるｔ１部位）を有する鎖であり、図１に示すように、ｔ１−２部位とｔ１−１部位とｔ２部位とｔ３部位でこの順に構成される。「崩壊誘導鎖」とは、本発明のオリゴヌクレオチド構造体が崩壊してエフェクター鎖を機能させることが望まれる細胞内に存在する、好ましくは当該細胞内のみに特異的に存在するｍＲＮＡ等のＲＮＡ分子をいう。
【００２５】
「エフェクター鎖」２は、標的遺伝子転写産物の少なくとも一部と相補性を有する鎖であり、図１に示すように、ｅ１部位とｅ２部位で構成される。
【００２６】
「サポート鎖」３は、トリガー鎖１とサポート鎖２のそれぞれの一部と相補性を有する部位を有する鎖であり、図１に示すように、ｓ１部位とｓ２部位とｓ３部位でこの順に構成される。
【００２７】
トリガー鎖１とエフェクター鎖２とサポート鎖３は、それぞれの鎖の一部が、他の２本の鎖の一部と塩基対合して、全体でＹ字構造を形成している。具体的には、トリガー鎖１のｔ２部位とエフェクター鎖２のｅ２部位が、エフェクター鎖２のｅ１部位とサポート鎖３のｓ２部位が、サポート鎖３のｓ１部位とトリガー鎖１のｔ１−１部位がそれぞれ塩基対合している。これらの塩基対合は、完全に相補的であってもよいが、ミスマッチを含んでいてもよい。
【００２８】
トリガー鎖１の端部のｔ３部位およびサポート鎖３の端部のｓ３部位は、それぞれステムループ構造を形成する。このステムループ構造により、本発明のオリゴヌクレオチド構造体の安定性が向上し、トリガー鎖１が崩壊誘導鎖を認識した場合のみでＹ字構造が崩壊し得る。サポート鎖３の末端である、ｓ３部位の末端の塩基は、エフェクター鎖２の末端である、ｅ１部位の末端の塩基と隣接することが好ましい。同様に、トリガー鎖３の末端である、ｔ３部位の末端の塩基は、エフェクター鎖２の末端である、ｅ２部位の末端の塩基と隣接することが好ましい。ｔ３部位およびｓ３部位のステムループ構造は、２〜２０塩基長のステム領域および２〜１０塩基長のループ領域からなることが好ましい。すなわち、ｔ３部位およびｓ３部位は、それぞれ、（２〜２０）＋（２〜１０）＋（２〜２０）＝６〜５０塩基長であることが好ましい。ループ領域は３塩基長であることがより好ましく、塩基配列ＧＡＡ、ＧＴＡ、ＧＣＡまたはＧＧＡからなることがさらに好ましく、塩基配列ＧＡＡからなることが最も好ましい。安定なステムループ構造を形成できるからである（Ｙｏｓｈｉｚａｗａ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３６，４７６１−４７６７）。
【００２９】
トリガー鎖１のｔ１部位は、特定の細胞に存在するＲＮＡ分子である崩壊誘導鎖の少なくとも一部と相補性を有する。トリガー鎖１のｔ１部位に崩壊誘導鎖の少なくとも一部が塩基対合し、オリゴヌクレオチド構造体のＹ字構造を崩壊させることができる。トリガー鎖１のｔ１部位は、サポート鎖３の一部と塩基対合するｔ１−１部位と、サポート鎖３の一部と塩基対合しないｔ１−２部位を含む。このｔ１−２部位に崩壊誘導鎖が塩基対合することが引き金となって、鎖の交換反応が起こり、本発明のオリゴヌクレオチド構造体のＹ字構造が崩壊する。
【００３０】
本発明のオリゴヌクレオチド構造体のＹ字構造を特定の細胞内のみで崩壊させるためには、トリガー鎖１のｔ１部位は、特定の細胞で発現するｍＲＮＡ等のＲＮＡ分子である崩壊誘導鎖の少なくとも一部と相補性を有すればよい。特定の細胞としては、ガン細胞等の異常細胞、正常細胞、未分化細胞、分化細胞等が挙げられる。また、崩壊誘導鎖が、トリガー鎖１のｔ１部位と塩基対合し、オリゴヌクレオチド構造体のＹ字構造を崩壊させるためには、ｔ１−２部位は、４〜２０塩基長であればよいが、Ｙ字構造を完全に崩壊させるためには、ｔ１−２部位は、６〜２０塩基長であることが好ましい。あるいは、崩壊誘導鎖の塩基配列を調整して上記範囲にしてもよい。崩壊誘導鎖がｍＲＮＡの場合、このｍＲＮＡは、後述するエフェクター鎖２が標的とするｍＲＮＡと同一のｍＲＮＡであってもよく、異なるｍＲＮＡであってもよい。同一のｍＲＮＡである場合には、トリガー鎖１のｔ１部位が塩基対合するｍＲＮＡの部位と、エフェクター鎖２が塩基対合するｍＲＮＡの部位が異なるように、塩基配列を決定すればよい。
【００３１】
エフェクター鎖２は、オリゴヌクレオチド構造体の崩壊後にＲＮＡｉ等の機能を奏する元となるオリゴヌクレオチドである。エフェクター鎖２は、全体で（ｅ１部位＋ｅ２部位）２０〜３０塩基程度のオリゴヌクレオチドであってよい。エフェクター鎖２のｅ１部位またはｅ２部位は、６〜７塩基長以上であればよい。トリガー鎖１のｔ２部位は、エフェクター鎖２のｅ２部位と相補性を有するようにすればよい。同様に、サポート鎖３のｓ２部位は、エフェクター鎖２のｅ１部位と相補性を有するようにすればよい。
【００３２】
エフェクター鎖２は、オリゴヌクレオチド構造体の崩壊後に標的遺伝子転写産物に対して何らかの機能を奏する配列である。このため、エフェクター鎖２は、標的遺伝子転写産物の少なくとも一部と相補性を有する必要がある。エフェクター鎖２は、ｓｉＲＮＡのガイド鎖として機能してよい。あるいは、エフェクター鎖２は、アンチセンスオリゴヌクレオチドとして機能してもよい。標的遺伝子転写産物は、本発明のオリゴヌクレオチド構造体を使用する目的に応じて適宜選択すればよい。標的遺伝子としては、細胞の生存に必須の遺伝子が好ましく、転写／翻訳制御因子がより好ましく、例えばＲＮＡポリメラーゼ２サブユニットＡ（ＰｏｌＲ２Ａ）、ＲＮＡポリメラーゼ２サブユニットＦ（ＰｏｌＲ２Ｆ）、ＲＮＡポリメラーゼ２サブユニットＧ（ＰｏｌＲ２Ｇ）等が好ましいが、これらに限定されない。細胞の生存に必須の遺伝子の例は、Ｔｈａｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（２００９）Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，７６，１２４６−１２５５に記載されている。あるいは、標的遺伝子として、異常細胞、正常細胞、未分化細胞または分化細胞内のみで発現している遺伝子等、例えば、ガン細胞で特異的にもしくは多量に発現しているガン遺伝子等が挙げられる。例えば、エフェクター鎖２をガン遺伝子のｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡのガイド鎖となるように設計することで、相補性を有するパッセンジャー鎖と結合してガン遺伝子の発現を抑制することができる。
【００３３】
サポート鎖３は、エフェクター鎖２とトリガー鎖１とともに全体でＹ字構造を形成するように、サポート鎖３の一部がエフェクター鎖２とトリガー鎖１のそれぞれ一部と塩基対合する。
【００３４】
トリガー鎖１およびサポート鎖３は、ＤＮＡである。ＲＮＡである崩壊誘導鎖とサポート鎖３との交換反応が効率的に生ずるからである。トリガー鎖１およびサポート鎖３は、化学修飾されてもよい。一方、エフェクター鎖２は、ＤＮＡでもよく、またはＲＮＡでもよく、あるいはＤＮＡとＲＮＡのキメラであっても、さらに化学修飾されてもよい。エフェクター鎖２は、ＲＮＡであることが好ましい。ｓｉＲＮＡのガイド鎖として機能するからである。
【００３５】
２−３．オリゴヌクレオチド構造体の崩壊の機構
本発明のオリゴヌクレオチド構造体の崩壊の機構を、図２を参照して説明する。
図２（ａ）に示すように、本発明のオリゴヌクレオチド構造体の近傍に、トリガー鎖１のｔ１部位と相補性を有する部位を有する崩壊誘導鎖４が存在すると、崩壊誘導鎖４の少なくとも一部がトリガー鎖１のｔ１−２部位と塩基対合し、これが引き金となってサポート鎖３との間で鎖の交換反応が起こる。この交換反応により、Ｙ字構造が崩壊する。
【００３６】
Ｙ字構造の崩壊により、トリガー鎖１と崩壊誘導鎖４の結合体、およびエフェクター鎖２とサポート鎖３の結合体が生成する。この崩壊の中間体であるエフェクター鎖２とサポート鎖３の結合体は、サポート鎖３が端部のｓ３部位にステムループ構造を有するため、非特異的ＲＮＡｉ活性を示さない。
【００３７】
Ｙ字構造の崩壊後に、エフェクター鎖２と相補性を有するオリゴヌクレオチドであるパッセンジャー鎖２’が存在すると、エフェクター鎖２とパッセンジャー鎖２’は二本鎖を形成する。この二本鎖核酸分子は、ｓｉＲＮＡとして機能し、ＲＮＡｉ機構によってエフェクター鎖２と相補性を有する部位を有するｍＲＮＡの分解等により標的遺伝子発現を抑制する。
【００３８】
一方、図２（ｂ）に示すように、崩壊誘導鎖４が存在しない場合、Ｙ字構造は崩壊しない。したがって、本発明では、トリガー鎖１および崩壊誘導鎖４の選択が重要となる。崩壊誘導鎖４として、例えばガン細胞等特定の細胞内にのみ存在するものを選択することにより、特定の細胞内でのみ、Ｙ字構造を崩壊させることができる。
【００３９】
２−４．製造方法
本発明のオリゴヌクレオチド構造体の製造方法について説明する。本発明のオリゴヌクレオチド構造体は、上記「２−２．構成」で説明した構成を有するオリゴヌクレオチド構造体を調製することのできる方法であれば、当該分野で公知のあらゆる方法によって製造することができる。ここでは、一具体例を挙げて説明するが、本発明のオリゴヌクレオチド構造体の製造方法は、以下の方法に限られない。
【００４０】
本発明のオリゴヌクレオチド構造体の製造方法は、（１）設計工程、（２）合成工程、および（３）アニーリング工程を含む。
【００４１】
（１）設計工程
「設計工程」とは、本発明のオリゴヌクレオチド構造体の塩基配列を決定する工程である。
（エフェクター鎖の設計）
エフェクター鎖の設計について説明する。エフェクター鎖を機能させる標的遺伝子転写産物を決定する。次いで、標的遺伝子転写産物の少なくとも一部の塩基配列と相補性を有する塩基配列を、エフェクター鎖の塩基配列として決定する。標的遺伝子転写産物の少なくとも一部の塩基配列は、標的遺伝子の遺伝子内、５’非翻訳領域、または３’非翻訳領域等の塩基配列であってよい。この標的遺伝子転写産物の少なくとも一部の塩基配列は、２０〜３０塩基長であってよい。標的遺伝子転写産物の少なくとも一部の塩基配列に完全に相補的な塩基配列を、エフェクター鎖の塩基配列として決定してもよい。あるいは、標的遺伝子転写産物の少なくとも一部の塩基配列に完全に相補的ではなくミスマッチを有する塩基配列を、エフェクター鎖の塩基配列として決定してもよい。エフェクター鎖は、２０〜３０塩基長であってよい。決定したエフェクター鎖の塩基配列を、二つの部位に分け、一方をｅ１部位、他方をｅ２部位の塩基配列とする。
【００４２】
（トリガー鎖のｔ１部位の設計）
トリガー鎖のｔ１部位の設計について説明する。エフェクター鎖を機能させる細胞内または組織内に存在するポリヌクレオチド、好ましくはエフェクター鎖を機能させる細胞内または組織内のみに特異的に存在するＲＮＡ分子を崩壊誘導鎖として選択する。特定の細胞内または組織内に存在するＲＮＡ分子を選択する方法は、当業者に公知であり、データベースから選択してもよく、または、ｃＤＮＡサブトラクション法やマイクロアレイ等の公知の手法により行ってもよい。例えば、ガン細胞内のみで発現するガン遺伝子のｍＲＮＡを選択し得る。選択した崩壊誘導鎖の少なくとも一部の塩基配列と相補性を有する塩基配列を、トリガー鎖のｔ１部位の塩基配列として決定する。この崩壊誘導鎖の少なくとも一部の塩基配列は、他の遺伝子には見られない特有の配列であることが好ましい。この崩壊誘導鎖の少なくとも一部の塩基配列は、約１０〜４０塩基長であることが好ましい。トリガー鎖のｔ１部位は、約１０〜４０塩基長であることが好ましい。決定したトリガー鎖のｔ１部位の塩基配列を、二つの部位に分け、一方をｔ１−１部位、他方をトリガー鎖の端部のｔ１−２部位の塩基配列とする。ｔ１−２部位は約６〜２０塩基長であることが好ましい。
【００４３】
（トリガー鎖のｔ２部位ならびにサポート鎖のｓ１部位およびｓ２部位の設計）
トリガー鎖のｔ２部位ならびにサポート鎖のｓ１部位およびｓ２部位の設計について説明する。上で決定したエフェクター鎖のｅ２部位と相補性を有する塩基配列をトリガー鎖のｔ２部位の塩基配列として決定する。上で決定したトリガー鎖のｔ１−１部位と相補性を有する塩基配列をサポート鎖のｓ１部位の塩基配列として決定する。上で決定したエフェクター鎖のｅ１部位と相補性を有する塩基配列をサポート鎖のｓ２部位の塩基配列として決定する。
【００４４】
（トリガー鎖のｔ３部位およびサポート鎖のｓ３部位の設計）
トリガー鎖のｔ３部位およびサポート鎖のｓ３部位の設計について説明する。ステム領域を構成する任意の２〜２０塩基長の塩基配列を決定し、ループ領域を構成する任意の２〜１０塩基長の塩基配列を決定することにより、全体でステムループ構造を形成する塩基配列を決定し、トリガー鎖のｔ３部位およびサポート鎖のｓ３部位の塩基配列とする。このｔ３部位の塩基配列とｓ３部位の塩基配列は、異なることが好ましい。トリガー鎖の末端であるｔ３部位の末端の塩基、およびサポート鎖の末端であるｓ３部位の末端の塩基は、オリゴヌクレオチド構造体においてエフェクター鎖の末端の塩基と隣接するように設計することが好ましい。
【００４５】
上で決定した各部位の塩基配列は、塩基対合することが予定されている部位以外の部位とは塩基対合しないように設計することが好ましい。
【００４６】
（２）合成工程
「合成工程」とは、前記設計工程で決定した塩基配列に基づいて、本発明のオリゴヌクレオチド構造体を構成する各オリゴヌクレオチド、すなわちトリガー鎖、エフェクター鎖およびサポート鎖を酵素的にまたは化学合成によって製造する工程である。オリゴヌクレオチドの合成方法は、当該分野では公知の技術を用いればよい。例えば、固相合成法に従って化学合成することができる。具体的には、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌｕｍｅ  １，Ｓｅｃｔｉｏｎ  ３、Ｖｅｒｍａ  Ｓ．ａｎｄ  Ｅｃｋｓｔｅｉｎ  Ｆ．，１９９８，Ａｎｎｕｌ  Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６７，９９−１３４に記載された化学合成方法を利用すればよい。また、人工核酸や修飾核酸を含むオリゴヌクレオチドの化学合成については、多くのライフサイエンス系メーカー（例えば、タカラバイオ社、ファスマック社、ライフテクノロジー社、ジーンデザイン社、シグマ  アルドリッチ社等）の受託製造サービスを利用することもできる。化学合成後のオリゴヌクレオチドは、当該分野で公知の方法によって精製することが好ましい。精製方法としては、例えば、ゲル精製法、アフィニティーカラム精製法、ＨＰＬＣ法等が挙げられる。
【００４７】
（３）アニーリング工程
「アニーリング工程」とは、前記合成工程後の３種のオリゴヌクレオチドをアニーリングさせ、本発明のオリゴヌクレオチド構造体を形成させる工程をいう。例えば、合成されたトリガー鎖、エフェクター鎖およびサポート鎖の３種のオリゴヌクレオチドを、適当なバッファー、例えば、Ｄ−ＰＢＳ（−）（０．２ｇ／Ｌ  ＫＣｌ、８ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ、０．２ｇ／Ｌ  ＫＨ２ＰＯ４、１．１５ｇ／Ｌ  Ｎａ２ＨＰＯ４）に溶解し、混合後、９０℃に加熱後、徐々に温度を下げ、アニーリングさせればよい。トリガー鎖、エフェクター鎖およびサポート鎖の３種のオリゴヌクレオチドは、等モル量ずつ混合してアニーリングさせることが好ましい。オリゴヌクレオチドをアニーリングさせると分子内フォールディングも生じる。
【００４８】
２−５．使用方法
本発明のオリゴヌクレオチド構造体は、細胞内、組織内、または個体内に導入して、所望の場所でエフェクター鎖を機能させることができる。エフェクター鎖は、相補的に結合するオリゴヌクレオチドと二本鎖を形成し、ＲＮＡｉを誘導することによって、標的遺伝子の発現を抑制してよい。あるいは、エフェクター鎖は、標的遺伝子転写産物の少なくとも一部と塩基対合し、アンチセンスオリゴヌクレオチドとして機能して標的遺伝子の発現を抑制してもよい。
【００４９】
本発明のオリゴヌクレオチド構造体と同時に、オリゴヌクレオチド構造体のエフェクター鎖と相補性を有するオリゴヌクレオチドであるパッセンジャー鎖を導入してもよい。あるいは、本発明のオリゴヌクレオチド構造体を導入した後に、上記パッセンジャー鎖を逐次的に導入してもよいし、上記パッセンジャー鎖を導入した後に、本発明のオリゴヌクレオチド構造体を逐次的に導入してもよい。これらの場合、オリゴヌクレオチド構造体のＹ字構造の崩壊を生じた細胞内または組織内で、エフェクター鎖とパッセンジャー鎖とが二本鎖を形成し得る。
【００５０】
あるいは、本発明のオリゴヌクレオチド構造体を導入し、そのＹ字構造が崩壊した細胞内または組織内に元来存在する、エフェクター鎖と相補性を有するオリゴヌクレオチドと、エフェクター鎖とが二本鎖を形成してもよい。
【００５１】
本発明のオリゴヌクレオチド構造体は、一種類で使用してもよいが、複数種、例えば二種類のオリゴヌクレオチド構造体を使用してもよい。特に、トリガー鎖が認識する崩壊誘導鎖の塩基配列が異なるものを用いると好ましい。
【００５２】
例えば、本発明のオリゴヌクレオチド構造体のＹ字構造を崩壊させたい細胞内で特異的に発現する、遺伝子Ａが存在する場合に、一のオリゴヌクレオチド構造体のトリガー鎖に遺伝子ＡのｍＲＮＡの一部と相補性を有する配列を設け、他のオリゴヌクレオチド構造体のトリガー鎖に遺伝子ＡのｍＲＮＡの別の一部と相補性を有する配列を設ける等である。この構成により、遺伝子Ａが発現している場合に、前記二種類のオリゴヌクレオチド構造体のＹ字構造を崩壊させ、生じたエフェクター鎖どうしが二本鎖を形成する。
【００５３】
あるいは、例えば、本発明のオリゴヌクレオチド構造体のＹ字構造を崩壊させたい細胞内で特異的に発現する、異なる遺伝子Ａおよび遺伝子Ｂが存在する場合に、一のオリゴヌクレオチド構造体のトリガー鎖に遺伝子ＡのｍＲＮＡの少なくとも一部と相補性を有する配列を設け、他のオリゴヌクレオチド構造体のトリガー鎖に遺伝子ＢのｍＲＮＡの少なくとも一部と相補性を有する配列を設ける等である。この構成により、遺伝子Ａおよび遺伝子Ｂが発現している場合にのみ、前記二種類のオリゴヌクレオチド構造体のＹ字構造を崩壊させ、生じたエフェクター鎖どうしが二本鎖を形成する。
【００５４】
本発明のオリゴヌクレオチド構造体を導入する対象となるのは、標的遺伝子がその細胞内でＲＮＡに転写、またはタンパク質に翻訳され得るものであれば如何なるものであってもよい。具体的には、本発明の対象となる被導入体は、細胞、組織、または個体であってよい。
【００５５】
本発明に用いられる細胞としては、生殖系列細胞、体性細胞、分化全能細胞、多分化能細胞、分割細胞、非分割細胞、実質組織細胞、上皮細胞、不滅化細胞、または形質転換細胞等何れのものであってもよい。具体的には、例えば、幹細胞のような未分化細胞、幹細胞から分化・誘導された細胞群、器官または組織由来の細胞、あるいはその分化細胞等が挙げられる。上記分化細胞としては、例えば、脂肪細胞、繊維芽細胞、筋細胞、心筋細胞、内皮細胞、神経細胞、グリア、血液細胞、巨核球、リンパ球、マクロファージ、好中球、好酸球、好塩基球、マスト細胞、白血球、顆粒球、ケラチン生成細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、肝細胞および内分泌線または外分泌腺の細胞等が挙げられる。組織としては、神経組織、眼組織、心筋組織、上皮組織、骨髄組織、血液組織等がある。
【００５６】
本発明で被導入体として用いられる個体として、具体的には、植物、動物、原生動物、ウィルス、バクテリア、または真菌種に属するもの等が挙げられる。
【００５７】
動物は、脊椎動物または無脊椎動物であってよい。無脊椎動物としては、線虫類、キイロショウジョウバエ等の昆虫類等が挙げられる。脊椎動物としては、魚類、鳥類および哺乳動物が挙げられる。魚類は、好ましくは水産資源用魚種（例えば、サケ科、スズキ科、タラ科、ニシン科、ヒラメ科、カレイ科、アジ科、イカナゴ科、タイ科およびメバル科の魚種）である。鳥類は、好ましくは食用種（例えば、ニワトリ、ガチョウ、アヒル、カモ、合鴨、七面鳥、ウズラ、ダチョウ等）である。哺乳動物は、好ましくは家畜（ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ）、実験用動物（ハムスター、マウス、およびラット等のげっ歯類、ウサギ、イヌ、サル）、競争馬、愛玩動物（イヌ、ネコ、ウサギ、サル、げっ歯類）またはヒトである。特に好ましい生物種は、ヒトである。
【００５８】
植物は、好ましくは種子植物、より好ましくは被子植物、さらに好ましくは食用植物種、繊維資源用植物種、または木材資源用植物種である。例えば、食用植物種であれば、イネ科（例えば、イネ、コムギ、オオムギ、ライムギ、トウモロコシ、コーリャン、アワ）、マメ科（例えば、ダイズ、アズキ、グリーンピース）、ナス科（例えば、トマト、ナス、ジャガイモ、トウガラシ、ピーマン）、ヒルガオ科（例えば、サツマイモ）、バラ科（例えば、イチゴ、アーモンド、モモ、プラム、ウメ、バラ、サクラ）、アブラナ科（例えば、ダイコン、カブ、アブラナ）、アカザ科（例えば、ホウレンソウ、テンサイ）、セリ科、タデ科、ウリ科、キク科、ユリ科、サトイモ科、ブドウ科、ミカン科、ブナ科、ヤシ科等に属する食用の植物種が、繊維資源用植物種であれば、例えば、ワタ、アサ等が、また、木材資源用植物種であれば、スギ、ヒノキ、モミ、ツガ、マツ、イチイ、サクラ、カエデ、カシ、ナラ、ブナ、ニレ、ケヤキ、クルミ、ホウ、カツラ、チーク、ラワン、黒檀、マホガニー、ポプラ、ユーカリ等が挙げられる。
【００５９】
微生物は、農業で、または工業によって使用されるものが好ましく、植物または動物に対して病原性のものも好ましい。真菌には、カビおよび酵母形態両方での生物体が含まれる。
【００６０】
被導入体へのオリゴヌクレオチド構造体の導入法としては、被導入体が細胞または組織の場合は、カルシウムフォスフェート法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、ウィルス感染、あるいは形質転換法等が用いられる。また、胚に導入する方法としては、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション法、あるいはウィルス感染等が挙げられる。被導入体が植物の場合には、植物体の体腔または間質細胞等への注入または灌流、あるいは噴霧による方法を用いてもよい。また、動物個体の場合には、経口、局所、（皮下、筋肉内および静脈内投与を含む）非経口、経膣、経直腸、経鼻、経眼、腹膜内投与等によって全身的に導入する方法、あるいはエレクトロポレーション法やウィルス感染等が用いられる。経口導入のための方法には、オリゴヌクレオチド構造体を生物の食物と直接混合することができる。さらに、個体に導入する場合には、例えば埋め込み長期放出製剤等として投与することや、オリゴヌクレオチド構造体を導入した導入体を摂取させることにより行うこともできる。さらに、後述の「４−４．投与方法」に記載した投与方法を用いてもよい。
【００６１】
本発明のオリゴヌクレオチド構造体は、研究用試薬として用いることもでき、この場合、遺伝子発現抑制剤、ＲＮＡｉ試薬等として用いることができる。
【００６２】
本発明のオリゴヌクレオチド構造体は、導入される用量に応じて細胞、組織、または個体において標的遺伝子の発現を抑制する。本発明のオリゴヌクレオチド構造体は、細胞当たり少なくとも１コピーの送達を可能とする量で導入することができる。高用量（例えば、細胞当たり少なくとも５、１０、１００、５００または１０００コピー）のオリゴヌクレオチド構造体はより効果的な抑制を生じさせることができる。
【００６３】
２−６．効果
本発明のオリゴヌクレオチド構造体により、特定の種類の細胞どうし、例えば、正常細胞とガン細胞等の異常細胞、または幹細胞から分化した細胞と未分化の細胞等を区別していずれかの種類の細胞内でのみ該オリゴヌクレオチド構造体を崩壊させ、エフェクター鎖を機能させることができる。
【００６４】
本発明のオリゴヌクレオチド構造体に含まれるエフェクター鎖をｓｉＲＮＡのガイド鎖とし、相補性を有するオリゴヌクレオチドであるパッセンジャー鎖と二本鎖ｓｉＲＮＡを形成させ、ＲＮＡｉを誘導することができる。これにより、標的遺伝子の発現を抑制することができる。
【００６５】
あるいは、本発明のオリゴヌクレオチド構造体に含まれるエフェクター鎖をアンチセンスオリゴヌクレオチドとし、相補性を有する部分を有する標的遺伝子の発現を抑制することができる。
【００６６】
本発明のオリゴヌクレオチド構造体を構成するトリガー鎖とサポート鎖はＤＮＡであるため、低廉に製造することができる。
【００６７】
３．遺伝子発現抑制剤
本発明の第２の実施形態は、遺伝子発現抑制剤である。
本発明の遺伝子発現抑制剤は、前記実施形態１のオリゴヌクレオチド構造体と、後述の「パッセンジャー鎖」を含有する。
【００６８】
「パッセンジャー鎖」は、本発明のオリゴヌクレオチド構造体を構成するオリゴヌクレオチド鎖の１つであるエフェクター鎖と相補性を有するオリゴヌクレオチドである。前記実施形態１のオリゴヌクレオチド構造体のＹ字構造の崩壊後に、エフェクター鎖とパッセンジャー鎖とは二本鎖を形成する。この二本鎖核酸分子は、ｓｉＲＮＡとして機能し、ＲＮＡｉ機構によってエフェクター鎖と相補性を有する部位を有する標的遺伝子転写産物の分解等により標的遺伝子発現を抑制する。
【００６９】
パッセンジャー鎖は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＤＮＡとＲＮＡのキメラであってもよい。また、ＰＣＴ／ＪＰ２０１２／０７８３４８に記載のように、パッセンジャー鎖は、エフェクター鎖と形成する二本鎖において、該パッセンジャー鎖の５’側がエフェクター鎖より長いことが好ましく、例えば、３〜５０塩基、４〜４５塩基、５〜４０塩基、５〜３５塩基、５〜３０塩基、５〜２５塩基、６〜２４塩基、９〜２３塩基、８〜２０塩基、８〜１５塩基、８〜１０塩基または９塩基長いことが好ましい。パッセンジャー鎖は、２０〜８０塩基長であることが好ましい。
【００７０】
パッセンジャー鎖がＤＮＡである場合、パッセンジャー鎖がＲＮＡである場合に比べて、本発明の遺伝子発現抑制剤に含まれるオリゴヌクレオチド構造体のＹ字構造を崩壊誘導鎖の非存在下で崩壊させることが少ないため好ましい。一般に核酸どうしの結合力は、ＲＮＡ−ＲＮＡ、ＲＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＤＮＡの順に弱くなるため、ＤＮＡパッセンジャー鎖とエフェクター鎖との結合力は、崩壊誘導鎖の非存在下でＹ字構造を崩壊させるほど強くないからである。ＰＣＴ／ＪＰ２０１２／０７８３４８に記載のように、エフェクター鎖とパッセンジャー鎖で形成される二本鎖核酸分子において、パッセンジャー鎖がＤＮＡであって、該パッセンジャー鎖の５’側がエフェクター鎖より長い場合は、パッセンジャー鎖がＲＮＡであって、該パッセンジャー鎖の５’側がエフェクター鎖より長くない場合（例えば通常のｓｉＲＮＡの場合）と同程度の遺伝子発現抑制活性を有し得る。
【００７１】
ＰＣＴ／ＪＰ２０１２／０７８３４８に記載のように、エフェクター鎖とパッセンジャー鎖で形成される二本鎖核酸分子において、パッセンジャー鎖がＲＮＡであって、該パッセンジャー鎖の５’側がエフェクター鎖より長い場合は、パッセンジャー鎖がＲＮＡであって、該パッセンジャー鎖の５’側がエフェクター鎖より長くない場合（例えば通常のｓｉＲＮＡの場合）より高い遺伝子発現抑制活性を有し得るため好ましい。
【００７２】
本発明の遺伝子発現抑制剤は、オリゴヌクレオチド構造体とパッセンジャー鎖とを等モル量ずつ含むことが好ましい。本発明の遺伝子発現抑制剤は、有効成分であるオリゴヌクレオチド構造体およびパッセンジャー鎖が有する効果を失わない範囲において、他の成分を包含してもよい。
【００７３】
本発明の遺伝子発現抑制剤の導入対象および導入方法は、上記「２−５．使用方法」及び後述の「４−４．投与方法」に記載したものを用いることができる。
【００７４】
本発明の遺伝子発現抑制剤は、細胞内、組織内、または個体内に導入すると、崩壊誘導鎖が存在する所望の場所でオリゴヌクレオチド構造体のＹ字構造が崩壊され、エフェクター鎖とパッセンジャー鎖が二本鎖を形成してＲＮＡｉを誘導することによって、標的遺伝子の発現を抑制することができる。
【００７５】
４．医薬組成物
４−１．概要
本発明の第３の実施形態は、前記実施形態１のオリゴヌクレオチド構造体または前記実施形態２の遺伝子発現抑制剤を有効成分として含有する医薬組成物である。本発明の医薬組成物を生体に投与することによって、生体内における特定の細胞内または組織内のみでエフェクター鎖を機能させ、標的遺伝子の発現を抑制することができる。
【００７６】
４−２．構成
４−２−１．組成
（１）有効成分
本発明の医薬組成物は、有効成分として上記オリゴヌクレオチド構造体または上記遺伝子発現抑制剤を含有する。
【００７７】
本発明の医薬組成物において、医薬組成物中の有効成分であるオリゴヌクレオチド構造体または遺伝子発現抑制剤の含有量は、製薬上有効な量であればよい。本明細書において「製薬上有効な量」とは、オリゴヌクレオチド構造体中のエフェクター鎖がその機能を発揮する上で必要な用量で、かつ投与する生体に対して有害な副作用がほとんどないかまたは全くない用量を言う。具体的な用量は、使用するオリゴヌクレオチド構造体の作用効果および安定性、使用する医薬組成物の剤形、使用する担体の種類、および投与方法、被検体の情報および投与経路等によって異なる。ヒトに投与する場合、製薬上有効な量の範囲および好適な投与経路は、通常、細胞培養アッセイおよび動物実験から得られたデータに基づいて策定される。最終的な投与量は、個々の被検体に応じて医師等の判断により決定され、調整される。その際に、勘案される被検体の情報には、病気の進行度もしくは重症度、全身の健康状態、年齢、体重、性別、食生活、薬剤感受性および治療に対する耐性等が含まれる。
【００７８】
一投与単位あたりにおけるオリゴヌクレオチド構造体の含有量の具体例として、他の医薬の併用を必要としないヒト成人男子（体重６０ｋｇ）に対して、本発明の医薬組成物を注射液によって投与する場合、注射液一投与単位あたり約０．０１％（ｗ／ｖ）〜約２０％（ｗ／ｖ）、好ましくは約０．１％（ｗ／ｖ）〜約１０％（ｗ／ｖ）で本発明のオリゴヌクレオチド構造体を含んでいればよい。本発明の医薬組成物の薬理効果を得る上で、本発明のオリゴヌクレオチド構造体の大量投与が必要な場合、被検体に対する負担軽減のために数回に分割して投与することもできる。
【００７９】
（２）媒体
本発明の医薬組成物は、有効成分である本発明のオリゴヌクレオチド構造体または遺伝子発現抑制剤の媒体を含むことができる。媒体には、例えば、水、エタノール、プロピレングリコール、エトキシ化イソステアレルアルコール、ポリオキシ化イソステアレルアルコールおよびポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類のような溶媒が挙げられる。このような媒体は、使用時に殺菌されていることが望ましく、必要に応じて血液と等張に調整されていることが好ましい。
【００８０】
（３）担体
本発明の医薬組成物は、必要に応じて製薬上許容可能な担体を含むことができる。「製薬上許容可能な担体」とは、製剤技術分野において通常使用する添加剤をいう。例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、充填剤、乳化剤、流動添加調節剤、滑沢剤等が挙げられる。
【００８１】
賦形剤としては、単糖、二糖類、シクロデキストリンおよび多糖類のような糖（より具体的には、限定はしないが、グルコース、スクロース、ラクトース、ラフィノース、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、デキストリン、マルトデキストリン、デンプンおよびセルロースを含む）、金属塩（例えば、塩化ナトリウム、リン酸ナトリウムもしくはリン酸カルシウム、硫酸カルシウム、硫酸マグネシウム、炭酸カルシウム）、クエン酸、酒石酸、グリシン、低、中、高分子量のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、プルロニック、カオリン、ケイ酸、あるいはそれらの組み合わせが例として挙げられる。
【００８２】
結合剤としては、トウモロコシ、コムギ、コメ、もしくはジャガイモのデンプンを用いたデンプン糊、単シロップ、グルコース液、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、セラックおよび／またはポリビニルピロリドン等が例として挙げられる。
【００８３】
崩壊剤としては、前記デンプンや、乳糖、カルボキシメチルデンプン、架橋ポリビニルピロリドン、アガー、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、アルギン酸もしくはアルギン酸ナトリウム、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリドまたはそれらの塩が例として挙げられる。
【００８４】
充填剤としては、前記糖および／またはリン酸カルシウム（例えば、リン酸三カルシウム、もしくはリン酸水素カルシウム）が例として挙げられる。
【００８５】
乳化剤としては、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステルが例として挙げられる。
【００８６】
流動添加調節剤および滑沢剤としては、ケイ酸塩、タルク、ステアリン酸塩またはポリエチレングリコールが例として挙げられる。
【００８７】
このような担体は、主として剤形形成を容易にし、また剤形および薬剤効果を維持する他、有効成分であるオリゴヌクレオチド構造体が生体内の核酸分解酵素による分解を受け難くするために用いられるものであり、必要に応じて適宜使用すればよい。上記の添加剤の他、必要であれば矯味矯臭剤、可溶化剤、懸濁剤、希釈剤、界面活性剤、安定剤、吸収促進剤、増量剤、付湿剤、保湿剤、吸着剤、崩壊抑制剤、コーティング剤、着色剤、保存剤、抗酸化剤、香料、風味剤、甘味剤、緩衝剤等を含むこともできる。
【００８８】
（４）他の有効成分
本発明の医薬組成物は、有効成分であるオリゴヌクレオチド構造体または遺伝子発現抑制剤が有する薬理効果を失わない範囲において、他の有効成分を包含する、いわゆる複合製剤であってもよい。他の有効成分は、本発明のオリゴヌクレオチド構造体とは異なる薬理作用を有する薬剤であってもよい。例えば、抗生物質等が挙げられる。
【００８９】
４−２−２．剤形
本発明の医薬組成物の剤形は、有効成分である本発明のオリゴヌクレオチド構造体もしくは遺伝子発現抑制剤または他の付加的な有効成分を不活化させない形態であって、投与後、生体内でその薬理効果を発揮し得る形態であれば特に限定しない。一般に、天然型核酸は、生体内でヌクレアーゼ等の分解酵素による影響を受けやすいことから、本発明の医薬組成物を投与する場合には生体内で本発明のオリゴヌクレオチド構造体が分解され難い剤形が好ましい。例えば、液体、固体または半固体のいずれであってもよい。具体的な剤形としては、例えば、注射剤、懸濁剤、乳剤、点眼剤、点鼻剤、クリーム剤、軟膏剤、硬膏剤、シップ剤および座剤等の非経口剤形または液剤、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、舌下剤、トローチ剤等の経口剤形が挙げられる。好ましい剤形は、注射剤である。
【００９０】
また、本発明の医薬組成物をナノ粒子（例えば、Ｄａｖｉｓ  ＭＥ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２０１０，４６４：１０６７−１０７０に記載の標的ナノ粒子伝達システムを含む）、リポソーム（例えば、膜透過ペプチド結合リポソーム、ＳＮＡＬＰｓを含む）、コレステロール結合体の形態に調製してもよい。Ｃａｓｔａｎｏｔｔｏ  Ｄ．＆  Ｒｏｓｓｉ  ＪＪ．，Ｎａｔｕｒｅ，２００９，４５７，４２６−４３３に記載のＲＮＡｉ伝達システムを利用することもできる。
【００９１】
４−３．製造方法
本発明の医薬組成物の製造方法については、当業者に公知の製剤化方法を応用すればよい。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍｅｒｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．）に記載された方法を参照することができる。
【００９２】
４−４．投与方法
本発明の医薬組成物は、目的とする疾患の治療のために、有効成分である本発明のオリゴヌクレオチド構造体または遺伝子発現抑制剤を製薬上有効な量で生体に投与することができる。投与する対象となる生体は、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトである。
【００９３】
本発明の医薬組成物の投与方法は、全身投与または局所的投与のいずれであってもよい。疾患の種類、発症箇所または進行度等に応じて適宜選択することができる。発症箇所が局部的な疾患であれば、注射等により発症箇所およびその周辺に直接投与する局所的投与が好適である。治療すべき箇所（組織または器官）に本発明のオリゴヌクレオチド構造体を十分量投与することができ、また他の組織に影響を及ぼしにくいからである。一方、転移性癌のように治療箇所を特定できない場合や発症が全身性の疾患の場合には、静脈注射等による全身投与が好ましい。血流を介して本発明のオリゴヌクレオチド構造体を全身に行き渡らせることで、診断で発見できない病変部にも投与が可能となるからである。
【００９４】
本発明の医薬組成物の具体的な投与方法としては、有効成分であるオリゴヌクレオチド構造体または遺伝子発現抑制剤が失活しないあらゆる方法で投与することができる。例えば、非経口（例えば、注射、エアロゾル、塗布、点眼、点鼻）または経口が挙げられる。前述した理由や侵襲性が比較的低いことから、注射による投与は、特に好ましい。
【００９５】
注射による投与の場合、注入部位は、特に限定しない。例えば、静脈内、動脈内、肝臓内、筋肉内、関節内、骨髄内、髄腔内、心室内、経皮、皮下、皮内、腹腔内、鼻腔内、腸内または舌下等が挙げられる。好ましくは静脈内注射または動脈内注射等の血管内への注射である。
【００９６】
４−５．効果
本発明の医薬組成物の有効成分であるオリゴヌクレオチド構造体を構成するエフェクター鎖をｓｉＲＮＡのガイド鎖またはアンチセンスオリゴヌクレオチドとすれば、特定の細胞内のみで作用して標的遺伝子発現を抑制することができるため、副作用の少ない医薬組成物を提供することができる。
【００９７】
本発明のオリゴヌクレオチド構造体において、有効なトリガー鎖と、エフェクター鎖とを選択し、これと結合できるサポート鎖を設計することで、遺伝子が関与する疾病や個人の遺伝型が影響する疾病に対しても柔軟に対応した医薬組成物を提供することができる。
【００９８】
本発明のオリゴヌクレオチド構造体は、単純な３本の短い配列が結合した構造をしているので、毒性の少ない医薬組成物を提供することができる。
【実施例】
【００９９】
以下、実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【０１００】
＜実施例１：本発明のオリゴヌクレオチド構造体から形成される二本鎖核酸分子の遺伝子発現抑制活性の評価＞
（目的）本発明のオリゴヌクレオチド構造体から形成される二本鎖核酸分子の遺伝子発現抑制活性を、活性測定系を用いて評価した。
【０１０１】
（方法）
１．核酸分子の調製
本実施例で用いた核酸分子の分子名、その構造および塩基配列を図３に示す。大文字はＤＮＡを、小文字はＲＮＡを表す。各核酸分子を構成するＤＮＡオリゴヌクレオチド、またはＲＮＡオリゴヌクレオチドは、化学合成によって調製した。ＤＮＡオリゴヌクレオチドの合成は、ファスマック社に、またＲＮＡオリゴヌクレオチドの合成は、ファスマック社またはシグマアルドリッチ社に委託した。なお、いずれの核酸も修飾はしていない。合成後のオリゴヌクレオチドは、Ｄ−ＰＢＳ（−）（０．２ｇ／Ｌ  ＫＣｌ、８ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ、０．２ｇ／Ｌ  ＫＨ２ＰＯ４、１．１５ｇ／Ｌ  Ｎａ２ＨＰＯ４）に溶解した。核酸分子の構成に必要な各オリゴヌクレオチドを組み合わせて混合・溶解後に、それぞれ９０℃に加熱して、徐々に温度を下げてオリゴヌクレオチド間でアニーリングさせ、各核酸分子を調製した。
【０１０２】
２．遺伝子発現抑制活性の測定系の作製
ｐＤｓＲｅｄ２−Ｃ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社、カタログ番号６３２４０７）のマルチクローニングサイト（１２８８位〜１３６３位）を改変して５’−ＡＧＡＴＣＴＣＧＡＧＡＡＧＣＴＴＡＧＡＴＡＴＣＧＴＣＧＡＣＣＣＧＧＧＡＴＣＣＡＣＣＧＧＡＴＣＴＡＧＡＴＡＡＣＴＧＡ−３’（配列番号９）としたｐＤｓＲｅｄ２ＥＲＶＳＭＡを作製した。作製に用いた遺伝子工学的手法、例えば、プラスミドＤＮＡの抽出・精製、コンピテントセルの調製、大腸菌の形質転換、ＤＮＡクローニング、リガーゼ反応等は標準の手順（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ，Ｆｒｉｔｓｈ  ＥＦ，Ｍａｎｉａｔｉｓ  Ｔ  （１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｏｗ  Ｙｏｒｋ）に従った。上記配列はＤｓＲｅｄ２タンパク質のＣ末端としてＡｒｇ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−翻訳停止コドンをコードし、その直後にＥｃｏＲＶ部位（ＧＡＴＡＴＣ）を有する。
【０１０３】
このｐＤｓＲｅｄ２ＥＲＶＳＭＡをＥｃｏＲＶで切断した平滑末端に、５’−ＧＴＡＧＣＡＡＣＧＴＴＧＡＧＧＡＡＧＧＴＧＡＣＴＧＣＣＡＡＣＡＡＣＧＴＴＧＡＧＧＡＡＧＧＴＧＡＣＴＧＣＣＡＡＣＡＡＣＧＴＴＧＡＧＧＡＡＧＧＴＧＡＣＴＧＣＣＡＡ−３’（配列番号１０）／５’−ＴＴＧＧＣＡＧＴＣＡＣＣＴＴＣＣＴＣＡＡＣＧＴＴＧＴＴＧＧＣＡＧＴＣＡＣＣＴＴＣＣＴＣＡＡＣＧＴＴＧＴＴＧＧＣＡＧＴＣＡＣＣＴＴＣＣＴＣＡＡＣＧＴＴＧＣＴＡＣ−３’（配列番号１１）をアニーリングさせた二本鎖ＤＮＡを連結した。得られたプラスミドｐＤｓＲｅｄ２−ｓｉＰｏｌＲ２Ａ標的は、ＤｓＲｅｄ２遺伝子の下流に、ｓｉＰｏｌＲ２Ａ−ＡＳ（配列番号１２）に相補的な配列を３回繰り返して有する（図４ａ）。
【０１０４】
導入効率の違いを補正するために、二本鎖核酸分子の活性に関わらずＧＦＰを発現するプラスミドｐＣＡＧＧＳ−ＡＦＰ（Ｍｏｍｏｓｅ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｄｅｖ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ，４１，３３５−４４）を用いた（図４ｂ）。
【０１０５】
遺伝子発現抑制活性の測定原理は以下の通りである。ｐＤｓＲｅｄ２−ｓｉＰｏｌＲ２Ａ標的は、ＣＭＶプロモータ下流にＤｓＲｅｄ２遺伝子を有し、ＤｓＲｅｄ２遺伝子の３’−非翻訳領域（３’−ＵＴＲ）には、活性測定対象のｓｉＰｏｌＲ２Ａ−ＡＳに完全に相補的な配列が３回繰り返して設計されている。ｓｉＰｏｌＲ２Ａ−ＡＳによって、標的配列を３’−ＵＴＲに有するＤｓＲｅｄ２のＲＮＡｉが誘導され、発現が抑制される。ｐＤｓＲｅｄ２−ｓｉＰｏｌＲ２Ａ標的と同時に、二本鎖核酸分子の活性に関わらずＧＦＰを発現するｐＣＡＧＧＳ−ＡＦＰを細胞にトランスフェクションし、ＧＦＰ蛍光を用いて、導入効率の違いを補正する。二本鎖の対照ｓｉＲＮＡ（５’−ｇｃｇｃｇｃｕｕｕｇｕａｇｇａｕｕｃｇＴＴ−３’（配列番号１３）／５’−ｃｇａａｕｃｃｕａｃａａａｇｃｇｃｇｃＴＴ−３’（配列番号１４）、大文字：ＤＮＡ、小文字：ＲＮＡ）を導入した場合の比「ＤｓＲｅｄ２蛍光／ＧＦＰ蛍光」を１としたときの、各二本鎖核酸分子を導入した場合の比「ＤｓＲｅｄ２蛍光／ＧＦＰ蛍光」を正規化ＤｓＲｅｄ２／ＧＦＰ比（相対値）とする。この値は、二本鎖核酸分子の遺伝子発現抑制活性がある場合１以下になる。
【０１０６】
本実施例では、本発明のオリゴヌクレオチド構造体を構成するオリゴヌクレオチド鎖の１つであるエフェクター鎖の配列を上記ｓｉＰｏｌＲ２Ａ−ＡＳの配列とする。このエフェクター鎖（ガイド鎖）がパッセンジャー鎖と二本鎖核酸分子（ｓｉＲＮＡ）を形成し、ＲＮＡｉを誘導する。
【０１０７】
３．核酸導入方法および蛍光測定方法
９６ウェルプレートにＨＥＫ２９３Ｔ細胞を１２，０００細胞／ウェルで播種した。翌日、各５ｎＭの下記オリゴヌクレオチド、ＧＦＰを発現するプラスミドｐＣＡＧＧＳ−ＡＦＰ（５ｎｇ）、およびｐＤｓＲｅｄ２−ｓｉＰｏｌＲ２Ａ標的（５ｎｇ）を、ＭｕｌｔｉＦｅｃｔａｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて細胞にトランスフェクションした。方法はＰｒｏｍｅｇａ社のプロトコルに従った。その翌日、培地を交換し、さらに翌日に、細胞をＲＩＰＡ  ｂｕｆｆｅｒで粉砕抽出し、１３，０００×ｇにて３０分遠心して、上清を蛍光プレートリーダー（Ｆｌｕｏｒｏｓｋａｎ  Ａｓｃｅｎｔ  ＦＬ，  Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で蛍光測定した。波長は、ＧＦＰについては励起４８５ｎｍ、蛍光５３８ｎｍ、ＤｓＲｅｄ２については励起５４４ｎｍ、蛍光５９０ｎｍで測定した。
【０１０８】
（結果）
図５に結果を示す。各実験で細胞に導入したオリゴヌクレオチドは以下のとおりである。
ａ：対照ｓｉＲＮＡ
ｂ：エフェクター鎖＋ＲＮＡパッセンジャー鎖
ｃ：エフェクター鎖＋ＤＮＡパッセンジャー鎖１
ｄ：エフェクター鎖＋ＤＮＡパッセンジャー鎖２
ｅ：エフェクター鎖＋サポート鎖
ｆ：エフェクター鎖＋サポート鎖＋ＤＮＡパッセンジャー鎖２
ｇ：エフェクター鎖＋サポート鎖＋トリガー鎖
ｈ：エフェクター鎖＋サポート鎖＋トリガー鎖＋崩壊誘導鎖相当
ｉ：エフェクター鎖＋サポート鎖＋トリガー鎖＋崩壊誘導鎖相当＋ＤＮＡパッセンジャー鎖２
【０１０９】
図５から、エフェクター鎖＋サポート鎖のみでは遺伝子発現抑制活性を有さないことが示された（図５、ｅ）。よって、本発明のオリゴヌクレオチド構造体の崩壊中間体であるエフェクター鎖とサポート鎖の結合体は、望ましくない遺伝子発現抑制活性を有さないことがわかった。
【０１１０】
また、エフェクター鎖＋ＤＮＡパッセンジャー鎖１（図５、ｃ）およびエフェクター鎖＋ＤＮＡパッセンジャー鎖２（図５、ｄ）は遺伝子発現抑制活性を有することが示された。よって、パッセンジャー鎖がＤＮＡであっても、ＲＮＡｉを誘導できることがわかった。
【０１１１】
さらに、本発明のオリゴヌクレオチド構造体は、それ自体では遺伝子発現抑制活性を有さず、そして崩壊誘導鎖相当と共に細胞に導入しても遺伝子発現抑制活性を有さないことがわかった（図５、ｇおよびｈ）。一方、本発明のオリゴヌクレオチド構造体＋崩壊誘導鎖相当＋ＤＮＡパッセンジャー鎖２では、遺伝子発現抑制活性を示すことがわかった（図５、ｉ）。よって、本発明のオリゴヌクレオチド構造体は特定の崩壊誘導鎖を認識して崩壊し、エフェクター鎖がＤＮＡパッセンジャー鎖と結合し、パッセンジャー鎖の５’側がガイド鎖（エフェクター鎖）より長い二本鎖核酸分子を形成し、標的遺伝子の発現を抑制することがわかった。
【０１１２】
＜実施例２：本発明のオリゴヌクレオチド構造体の崩壊の評価＞
（目的）本発明のオリゴヌクレオチド構造体が崩壊誘導鎖によって崩壊することを、ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥによって調べた。
【０１１３】
（方法）
核酸分子の調製は実施例１に準じて行った。図３に、本実施例で用いたオリゴヌクレオチドの分子名および塩基配列を示す。
【０１１４】
下記の各オリゴヌクレオチドをＰＢＳ（−）中で混合し、室温で３０分間放置し、その後、ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ（通常のＳＤＳ−ＰＡＧＥからＳＤＳを除いたもの）によって分離した。なお、ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥは泳動槽を４℃で冷却しながら行った。泳動後、ゲルを臭化エチジウム染色し、バンドを観察した。
【０１１５】
（結果）
結果を図６に示す。各レーンは、以下のオリゴヌクレオチドを用いた結果を示す。
レーンＡ：エフェクター鎖＋ＤＮＡパッセンジャー鎖１
レーンＢ：エフェクター鎖＋ＤＮＡパッセンジャー鎖２
レーンＣ：サポート鎖＋トリガー鎖
レーンＤ：サポート鎖＋トリガー鎖＋ＤＮＡパッセンジャー鎖２
レーンＥ：エフェクター鎖＋サポート鎖＋トリガー鎖
レーンＦ：エフェクター鎖＋サポート鎖＋トリガー鎖＋ＤＮＡパッセンジャー鎖１
レーンＧ：エフェクター鎖＋サポート鎖＋トリガー鎖＋ＤＮＡパッセンジャー鎖２
レーンＨ：エフェクター鎖＋サポート鎖＋トリガー鎖＋崩壊誘導鎖相当
レーンＩ：エフェクター鎖＋サポート鎖＋トリガー鎖＋変異型崩壊誘導鎖相当
【０１１６】
本発明のオリゴヌクレオチド構造体＋崩壊誘導鎖相当では、トリガー鎖と崩壊誘導鎖相当の結合体を示すバンドが観察されたため（図６、レーンＨの矢印）、オリゴヌクレオチド構造体は崩壊誘導鎖を認識して崩壊することが示された。
【０１１７】
一方、本発明のオリゴヌクレオチド構造体＋ＤＮＡパッセンジャー鎖のみでは、オリゴヌクレオチド構造体崩壊の結果として生成される、エフェクター鎖とパッセンジャー鎖との結合体を示すバンドはほとんど観察されなかった（図６、レーンＦおよびＧの破線矢印）。このため、ＤＮＡパッセンジャー鎖は本発明のオリゴヌクレオチド構造体をほとんど崩壊させないことがわかった。一方、国際公開第２０１０／００５０５５号（特許文献１）に記載の従来型オリゴヌクレオチド構造体は、パッセンジャー鎖によってやや崩壊された（データ示さず）。このことから、本発明のオリゴヌクレオチド構造体は安定性が改善され、崩壊誘導鎖によって特異的に崩壊を誘導できることがわかった。
【０１１８】
また、トリガー鎖に対してミスマッチ塩基を有する変異型崩壊誘導鎖相当もオリゴヌクレオチド構造体の崩壊を引き起こしたことから（図６、レーンＩ）、崩壊誘導鎖はトリガー鎖に完全に相補的ではなくても崩壊を誘導できることが示された。
【符号の説明】
【０１１９】
１  トリガー鎖
２  エフェクター鎖
２’  パッセンジャー鎖
３  サポート鎖
４  崩壊誘導鎖
【配列表フリーテキスト】
【０１２０】
配列番号１：合成ＤＮＡ
配列番号２：合成ＲＮＡ
配列番号３：合成ＤＮＡ
配列番号４：合成ＲＮＡ
配列番号５：合成ＤＮＡ
配列番号６：合成ＤＮＡ
配列番号７：合成ＤＮＡ
配列番号８：合成ＤＮＡ
配列番号９：合成ＤＮＡ
配列番号１０：合成ＤＮＡ
配列番号１１：合成ＤＮＡ
配列番号１２：合成ＤＮＡ
配列番号１３：合成ＤＮＡ／ＲＮＡキメラ
配列番号１４：合成ＤＮＡ／ＲＮＡキメラ
【図１】
2014147365.tif 000003
【図２】
2014147365.tif 000004
【図３】
2014147365.tif 000005
【図４】
2014147365.tif 000006
【図５】
2014147365.tif 000007
【図６】
2014147365.tif 000008
【配列表】
2014147365000001.app