(57)【要約】【課題】  ＰＰＡＲ活性物質及びＰＰＡＲ活性物質を産出する微生物を簡易にスクリーニングできる形質転換酵母を提供する。【解決手段】  本発明の形質転換酵母は、ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体（ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＰＰＡＲ）を活性化させる物質を検出する形質転換酵母であって、酵母に転写共役因子ベクターを組み込むことなく、転写因子−ＰＰＡＲリガンド結合部位融合タンパク質発現ベクター及びレポーター遺伝子発現ベクターを組み込むことによってＰＰＡＲを活性化させる物質の検出を可能とした。【選択図】  図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体（ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＰＰＡＲ）を活性化させる物質を検出する形質転換酵母であって、酵母に転写因子−ＰＰＡＲリガンド結合部位融合タンパク質発現ベクター及びレポーター遺伝子発現ベクターを組み込むことによってＰＰＡＲを活性化させる物質を検出可能としたことを特徴とする形質転換酵母。
【請求項２】
前記転写因子−ＰＰＡＲリガンド結合部位融合タンパク質発現ベクターが、酵母のタンパク質発現プロモーターの下流に転写因子のＤＮＡ結合領域とＰＰＡＲリガンド結合領域の融合遺伝子を挿入したベクターであり及び前記レポーター遺伝子発現ベクターがレポーター遺伝子の上流に前記融合遺伝子の前記転写因子のＤＮＡ結合領域により遺伝子発現が起こるプロモーターを有するベクターであることを特徴とする請求項１記載の形質転換酵母。
【請求項３】
前記酵母のタンパク質発現プロモーターがＡＤＨ１プロモーターであり、前記融合遺伝子の前記転写因子のＤＮＡ結合領域がＧａｌ４のＤＮＡ結合領域であり、前記レポーター遺伝子の上流に前記融合遺伝子の前記転写因子のＤＮＡ結合領域により遺伝子発現が起こるプロモーターがＧａｌ１プロモーターであることを特徴とする請求項２記載の形質転換酵母。
【請求項４】
前記ＰＰＡＲが、ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲδ、ＰＰＡＲγのいずれかであることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の形質転換酵母。
【請求項５】
前記レポーター遺伝子がオワンクラゲ由来のＧＦＰ遺伝子（ＧＦＰ）であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の形質転換酵母。
【請求項６】
請求項1〜５のいずれかに記載の形質転換酵母と検査対象物質を混合し、前記形質転換酵母のレポーター遺伝子の発現を検知することにより前記対象物質中に含まれるＰＰＡＲリガンド物質を検出することを特徴とするＰＰＡＲ活性物質検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＰＰＡＲ活性物質検出可能な形質転換酵母、前記形質転換酵母を用いたＰＰＡＲ活性物質検出方法及びＰＰＡＲ活性物質を生成する微生物のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
脂質代謝において、細胞内の核内受容体であるペルオキシソーム増殖剤活性化受容体（ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＰＰＡＲ）が代謝制御に関与していることが知られており、このＰＰＡＲに作用する成分があれば、ＰＰＡＲを活性化することにより、脂質の消費が向上して、結果として体内の脂質の低減、メタボリックシンドロームの対策として有効性があると期待されている。
【０００３】
先行技術として、ＰＰＡＲ活性物質を検出する方法に形質転換酵母を用いる方法が特許文献１に開示されているが、この先行技術の形質転換酵母には、ＰＰＡＲと結合し転写を促進する転写共役因子を酵母中に組み込む必要があり、組み込むための工程が余分に必要であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開平１１−０５６３６９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ＰＰＡＲ活性物質を検出するのに用いる形質転換酵母であって、その形質転換酵母がより少ない工程で作り出せること及びその形質転換酵母を用いてＰＰＡＲ活性を検出すること、特に微生物が混在するような環境であってもＰＰＡＲ活性を検出できることが課題であった。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、形質転換酵母に転写共役因子ベクターを組み込まなくても、ＰＰＡＲ活性物質を検出することができる形質転換酵母を見出し、発明を完成させたものである。
すなわち、本発明は、下記に記載の事項を特徴とするものである。
[１] ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体（ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＰＰＡＲ）を活性化させる物質を検出する形質転換酵母であって、酵母に転写因子−ＰＰＡＲリガンド結合部位融合タンパク質発現ベクター及びレポーター遺伝子発現ベクターを組み込むことによってＰＰＡＲを活性化させる物質を検出可能としたことを特徴とする形質転換酵母。
[２]前記転写因子−ＰＰＡＲリガンド結合部位融合タンパク質発現ベクターが、酵母のタンパク質発現プロモーターの下流に転写因子のＤＮＡ結合領域とＰＰＡＲリガンド結合領域の融合遺伝子を挿入したベクターであり及び前記レポーター遺伝子発現ベクターがレポーター遺伝子の上流に前記融合遺伝子の前記転写因子のＤＮＡ結合領域により遺伝子発現が起こるプロモーターを有するベクターであることを特徴とする前記［１］記載の形質転換酵母。
［３］前記酵母のタンパク質発現プロモーターがＡＤＨ１プロモーターであり、前記融合遺伝子の前記転写因子のＤＮＡ結合領域がＧａｌ４のＤＮＡ結合領域であり、前記レポーター遺伝子の上流に前記融合遺伝子の前記転写因子のＤＮＡ結合領域により遺伝子発現が起こるプロモーターがＧａｌ１プロモーターであることを特徴とする前記［２］記載の形質転換酵母。
［４］前記ＰＰＡＲが、ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲδ、ＰＰＡＲγのいずれかであることを特徴とする前記［１］〜［３］のいずれかに記載の形質転換酵母。
［５］前記レポーター遺伝子がオワンクラゲ由来のＧＦＰ遺伝子（ＧＦＰ）であることを特徴とする前記［１］〜［４］のいずれかに記載の形質転換酵母。
［６］前記［１］〜［５］のいずれかに記載の形質転換酵母と検査対象物質を混合し、前記形質転換酵母のレポーター遺伝子の発現を検知することにより前記対象物質中に含まれるＰＰＡＲリガンド物質を検出することを特徴とするＰＰＡＲ活性物質検出方法。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の形質転換酵母は、酵母に転写因子−ＰＰＡＲリガンド結合部位融合タンパク質発現ベクター及びレポーター遺伝子発現ベクターを組み込んだもので、転写共役因子ベクターを組み込まなくてもレポーター遺伝子を発現することが可能であるので、組み込む遺伝子構成が少ないことから試験酵母である形質転換酵母の作製が容易であり、転写因子−ＰＰＡＲリガンド結合部位融合タンパク質の発現が容易であるという特徴を有している。
【０００８】
すなわち、本発明の形質転換酵母は、ＰＰＡＲリガンド結合領域のｃＤＮＡを転写活性の強い転写因子のＤＮＡ結合領域ｃＤＮＡと結合させているため、転写共役因子ベクターを組み込まなくてもレポーター遺伝子を発現することが可能である前記特徴を発揮するものである。
【０００９】
本発明の形質転換酵母を用いたＰＰＡＲ活性物質の検出は、動物細胞を用いたＰＰＡＲ活性検出法に比べて微生物が混在している条件下においてもＰＰＡＲ活性物質を検出することが可能である。そして、微生物共存下でＰＰＡＲの評価試験が可能なため、ＰＰＡＲ活性物質のスクリーニングだけでなく、ＰＰＡＲ活性物質を生産する微生物のスクリーニングにも利用することができる。すなわち、本発明により、ＰＰＡＲを生産する微生物が、簡単な操作により、短時間かつ高感度でスクリーニングすることが可能になった。
【００１０】
さらには本発明の形質転換酵母のレポーター遺伝子をオワンクラゲ由来のＧＦＰ遺伝子（ＧＦＰ）とすることにより他のレポーター遺伝子による遺伝子産物（酵素）のように基質を添加することなく蛍光を発する形質転換酵母とすることが出来る。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明のＰＰＡＲα−ＧＡＬ４融合タンパク質発現ベクターを示す図
【図２】本発明のＧａｌ１−ＧＦＰレポーター遺伝子発現ベクターを示す図
【図３】本発明の形質転換酵母の作製を示す模式図
【図４】本発明の形質転換酵母を用いたＰＰＡＲリガンドの測定結果を示す図
【図５】本発明の形質転換酵母を用いた発酵食品中のＰＰＡＲリガンド測定の測定結果を示す図
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の形質転換酵母は、ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体（ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＰＰＡＲ）を活性化させる物質を検出する形質転換酵母であって、酵母に転写因子−ＰＰＡＲリガンド結合部位融合タンパク質発現ベクター及びレポーター遺伝子発現ベクターを組み込むことによってＰＰＡＲを活性化させる物質を検出可能としたことを特徴とする形質転換酵母である。
【００１３】
スクリーニング対象のＰＰＡＲはその対象によってＰＰＡＲα、ＰＰＡＲδ、ＰＰＡＲγのいずれかとすることができる。ＰＰＡＲαは主に肝臓に発現し、脂肪酸代謝に関わる遺伝子群を活性化する。ＰＰＡＲδは組織全般に発現しインシュリン抵抗性の改善、脂質代謝改善に関与する。ＰＰＡＲγは主に脂肪細胞に発現し脂肪細胞の分化を制御する。
【００１４】
本発明の形質転換に用いられる酵母は、一般的な酵母菌であれば特に限定されることはないが、酵母菌の中でもサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｒｉｓ）、カンジダ・ボイニイ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｂｏｉｄｉｎｉｉ）等が好ましく特にサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）が好ましい。
【００１５】
本発明の形質転換酵母は、上記した酵母に通常用いられるベクターの挿入方法によって転写因子−ＰＰＡＲリガンド結合部位融合タンパク質発現ベクター及びレポーター遺伝子発現ベクターを組み込むことによって得ることができる。
酵母にベクターを導入する通常の方法としては、酢酸リチウム法、エレクトロポレーション法等の方法がある。
【００１６】
上記の転写因子−ＰＰＡＲリガンド結合部位融合タンパク質発現ベクターは、転写因子−ＰＰＡＲリガンド結合部位融合タンパク質を発現可能にするベクターであり、前記融合タンパク質発現ベクターは各市販の酵母用タンパク質発現ベクターを利用し、酵母のタンパク質発現プロモーターの下流に転写因子のＤＮＡ結合領域ｃＤＮＡとＰＰＡＲリガンド結合領域ｃＤＮＡの融合遺伝子をＤＮＡライゲーション法などの通常用いられる遺伝子の挿入方法によって挿入することによって作製されるベクターである。
【００１７】
転写因子のＤＮＡ結合領域ｃＤＮＡは、酵母、大腸菌などの微生物から一般的にＰＣＲ法を用いて増幅することにより獲得する。例えば、転写因子であるＧａｌ４及びＡＤＲ１は酵母から、転写因子であるＬｅｘＡは大腸菌から獲得することができる。また、ＰＰＡＲリガンド結合領域のｃＤＮＡは、動物の細胞から、一般的にＰＣＲ法を用いて増幅することにより獲得する。例えば、ＰＰＡＲαの場合はヒト肝臓組織由来のｃＤＮＡライブラリーから、ＰＰＡＲγの場合はヒト脂肪組織由来のｃＤＮＡライブラリーから、ＰＰＡＲδの場合はヒト骨肉腫細胞由来のｃＤＮＡライブラリーから獲得することができる。
【００１８】
そして、転写因子のＤＮＡ結合領域ｃＤＮＡとＰＰＡＲリガンド結合領域のｃＤＮＡをこの順序にＤＮＡリガーゼを用い結合することにより転写因子のＤＮＡ結合領域ｃＤＮＡとＰＰＡＲリガンド結合領域ｃＤＮＡの融合遺伝子を作製する。
【００１９】
前記融合遺伝子の末端に制限酵素切断部位を挿入し、制限酵素処理を行い、また前記タンパク質発現ベクターも同様の制限酵素処理を行い、ＤＮＡリガーゼを用いて前記融合遺伝子と前記タンパク質発現ベクターを結合することにより、前記転写因子−ＰＰＡＲリガンド結合部位融合タンパク質発現ベクターを作製することができる。
【００２０】
本発明において、転写因子のＤＮＡ結合領域ｃＤＮＡがＰＰＡＲリガンド結合領域ｃＤＮＡと結合した融合タンパク質発現ベクターは、転写因子−ＰＰＡＲリガンド結合領域融合タンパク質を生成する。前記融合タンパク質の転写因子は、転写共役因子ベクターを組み込まなくてもレポーター遺伝子を発現することが可能な転写活性の強い転写因子である必要があり、転写活性の強い本発明に用いられる転写因子として、Ｇａｌ４、ＬｅｘＡ、ＡＤＲ１等がある。
【００２１】
酵母のタンパク質発現プロモーターは、各市販の酵母用のタンパク質発現ベクターの中に存在するプロモーターを利用することができる。酵母のタンパク質発現ベクターに含まれるタンパク質発現プロモーターとしてＡＤＨ１プロモーター、ＰＤＣ１プロモーター、ＣＹＣ１プロモーター等がある。
【００２２】
レポーター遺伝子発現ベクターは、各種市販のレポーター遺伝子発現ベクターを用いて、ＰＣＲ法などの通常用いられる遺伝子の挿入方法によってレポーター遺伝子の上流に前記融合遺伝子の前記転写因子のＤＮＡ結合領域により遺伝子発現が起こるプロモーター遺伝子を挿入することによって作ることができる。前記プロモーター遺伝子を例示すると、転写因子がＧａｌ４の場合は、Ｇａｌ１プロモーター遺伝子であり、転写因子がＬｅｘＡの場合はＬｅｘＡオペロンであり、転写因子がＡＤＲ１である場合はＡＤＲ１トランス活性化ドメインである。
【００２３】
各種市販等で入手できるレポーター遺伝子発現ベクターのレポーター遺伝子としては、オワンクラゲ由来のＧＦＰ遺伝子（ＧＦＰ）、ホタル由来のルシフェラーゼ遺伝子（Ｌｕｃ）、大腸菌由来のβガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）等があげられる。
【００２４】
上記のレポーター遺伝子の中でもオワンクラゲのＧＦＰ遺伝子（ＧＦＰ）を用いることが特に好ましい。レポーター遺伝子としてオワンクラゲ由来のＧＦＰ遺伝子（ＧＦＰ）を用いることにより他のレポーター遺伝子による遺伝子産物のように基質を添加することなく蛍光を発する形質転換酵母とすることが出来る。
【００２５】
本発明の形質転換酵母のレポーター遺伝子が発現するメカニズムを次に説明する。
【００２６】
前記形質転換酵母を２５℃〜３５℃で２０時間から７２時間程度振とう培養することにより、前記形質転換酵母内に転写因子−ＰＰＡＲリガンド結合融合タンパク質が生成する。
【００２７】
前記転写因子−ＰＰＡＲリガンド結合部位融合タンパク質のＰＰＡＲリガンド結合部位に検査対象のＰＰＡＲリガンド物質が結合すると、前記タンパク質の転写因子ＤＮＡ結合部位がレポーター遺伝子発現ベクター上の転写因子のＤＮＡ結合領域上に結合し、下流のレポーター遺伝子が発現する。前記転写因子は、転写活性が強いため、共役転写因子を添加しなくてもレポーター遺伝子の転写が起こる。
【００２８】
次に本発明の形質転換酵母を用いてＰＰＡＲ活性物質を検出する方法について説明する。
【００２９】
ＰＰＡＲ活性物質の検出方法は、前記形質転換酵母と検査対象物質を混合することにより、前記形質転換酵母のレポーター遺伝子の発現を検知することで前記対象物質中に含まれるＰＰＡＲリガンド物質を検出することができる。
【００３０】
本発明の形質転換酵母を培養した培地に検査対象物を添加、もしくは検査対象物と培地の混合物に前記形質転換酵母を添加、もしくは検査対象物と前記形質転換酵母を培地中に添加した後に、一定期間培養を行いレポーター遺伝子の発現量を発色確認、可視光もしくは蛍光の検出等を行うことにより、検査対象物中のＰＰＡＲリガンド物質の量を測定することができる。前記一定期間培養の条件は、一般的には、温度２５℃〜４０℃、より好ましくは２８℃〜３２℃、培養時間は２０時間から７２時間である。ＰＰＡＲリガンド量が多いほどレポーター遺伝子の発現量は多く、発色、可視光量、蛍光量は多い。
添加する形質転換酵母の量は１０３個から１０５個、より好ましくは１０４個のオーダーである。
【００３１】
上記の培地としては、形質転換酵母が培養可能な培地であれば、特に限定されるものではないが、例えばＹＭ培地、ＹＰＤ培地、ＳＤ培地等が一般に用いられる。
【００３２】
本発明の形質転換酵母を用いて、例えばＰＰＡＲαに対する作用薬のスクリーニングを行うことができる。ＰＰＡＲαのリガンドとしては、クロフィブラートなどのフィブラート系の化合物や、天然物では共役不飽和脂肪酸が同定されている。ＰＰＡＲαのリガンド物質は、脂肪酸β酸化を活性化することから高脂血症の予防、改善が期待される。
【００３３】
本発明の形質転換酵母を用いて、前記のＰＰＡＲの作用薬はもちろんのこと、微生物、植物、動物などの生物からの抽出液および薬品を含む合成化学物質などが上記の検査対象物となる。さらには、ＰＰＡＲ活性物質生成微生物を上記の検査対象物とすることにより、ＰＰＡＲ活性物質生成微生物をスクリーニングすることが可能である。
【００３４】
また、本発明の形質転換酵母を用いて、ＰＰＡＲ活性物質生成微生物が上記検査対象物とする場合も前記と同様に実施することができる。その一例を、形質転換酵母をスクリーニング対象物を含んだ培地に添加する方法により説明する。スクリーニング対象物を形質転換酵母を培養する培地溶液で希釈し、その中にＰＰＡＲのリガンドを検出することが可能な形質転換酵母を添加して、一定期間培養することにより、前記形質転換酵母の発色確認又は可視光若しくは蛍光の検出等をすることによってスクリーニングすることができる。培養は、前記に示した一般的な培養条件で行うことが出来る。
【００３５】
以下、実施例により、本発明を詳しく説明するが、これらの実施例は本発明を制限するものではない。
【実施例】
【００３６】
（実施例１）  形質転換酵母の作製
（１）ＰＰＡＲα−ＧＡＬ４融合タンパク質発現ベクターの構築
Ｇａｌ４のＤＮＡ結合部位（１〜１４７）のｃＤＮＡを酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）からＰＣＲ法により取得した。また、ＰＰＡＲαのリガンド結合部位のｃＤＮＡを、ヒト肝臓組織由来のｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲ法によって取得した。Ｇａｌ４のＤＮＡ結合部位（１〜１４７）のｃＤＮＡとＰＰＡＲαのリガンド結合部位のｃＤＮＡをＤＮＡリガーゼを用いて結合することにより、Ｇａｌ４−ＰＰＡＲαリガンド結合部位融合遺伝子を作製した。取得した融合遺伝子のｃＤＮＡの前記Ｇａｌ４側の末端にＳａｌＩの制限酵素部位を挿入し、ＰＰＡＲα側の末端にＫｐｎＩの制限酵素部位を挿入し、制限酵素処理を行った。そして、市販のｐＡＵＲ１２３ベクター(タカラバイオ社製)をＳａｌＩ、ＫｐｎＩの制限酵素処理を行い、前記制限酵素処理を行った融合遺伝子のｃＤＮＡをＤＮＡリガーゼを用いて上記のようなｐＡＵＲ１２３ベクター（タカラバイオ社製）のＡＤＨ１プロモーターの下流に挿入し、ＰＰＡＲα−ＧＡＬ４融合タンパク質発現ベクターを構築した（図１）。本ベクターは抗生物質オーレオバシジンの耐性遺伝子ＡＵＲ１を保有し、本ベクターが形質転換された酵母はオーレオバシジン添加した培地で耐性を有する。
【００３７】
（２）Ｇａｌ１−ＧＦＰレポーター遺伝子発現ベクターの構築
Ｇａｌ１プロモーター遺伝子配列を酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅゲノムからＰＣＲ法によって取得した。取得したＧａｌ１プロモーター遺伝子をＤＮＡリガーゼ用いて、独自に入手したｐＰＳ２０１１−ＧＦＰベクターのＧＦＰの上流に挿入しＧａｌ１−ＧＦＰレポーター遺伝子発現ベクターを構築した（図２）。本ベクターはＵＲＡ遺伝子を保有し、本ベクターが形質転換された酵母はウラシル欠失培地で耐性を有する。
【００３８】
（３）酵母の形質転換
Ｇａｌ４を欠失した酵母細胞株Ｗ３０３Ａ株を用い、前記のＰＰＡＲα−ＧＡＬ４融合タンパク質発現ベクター及びＧａｌ１−ＧＦＰレポーター遺伝子発現ベクターをエレクトロポレーション法により導入した。形質転換後、ウラシルを欠乏させてオーレオバシジンを添加した合成培地にて培養することにより生き残った酵母を一般の酵母から選別して、両ベクターが導入された形質転換酵母を得た(図３)。
【００３９】
（実施例２）  形質転換酵母を用いたＰＰＡＲαリガンドの測定
前記形質転換酵母を２％グルコース含有ＳＤ培地（ウラシル欠失、オーレオバシジン添加）で３０℃、振とう培養により２４時間培養を実施した。培養時にＰＰＡＲαリガンド物質であるＧＷ７６１７（和光純薬）を１０−６Ｍから１０−９Ｍの濃度添加した。培養後、菌体の蛍光強度を蛍光プレートリーダー（テカン社）を用いて測定した。
【００４０】
形質転換酵母の蛍光は、ＧＷ７６１７の濃度に依存して増加した（図４）。この結果から、本形質転換酵母を用いてＰＰＡＲリガンドが濃度依存的に検出できるものと考えられた。
【００４１】
（実施例３）  発酵食品中のＰＰＡＲリガンドの測定
前記形質転換酵母を２％グルコース含有ＳＤ培地（ウラシル欠失、オーレオバシジン添加）で３０℃、振とう培養により２４時間培養を実施した。培養菌体を１０４個ずつ培養ディッシュに添加し、微生物が生存している発酵食品である味噌を１ｍｇ／ｍＬになるように蒸留水で希釈したサンプルを培養菌体と等容量添加し、２４時間培養を実施した。培養後、菌体の蛍光強度を蛍光プレートリーダー（テカン社）を用いて測定し、味噌中のＰＰＡＲαリガンド物質を検出した（図５）。図中のコントロールは、蒸留水のみを培養菌体に添加して蛍光強度を測定したものである。また、味噌は種類の違う味噌を３サンプル用いて結果を出したものである。
図５に示すように、微生物が生存した条件においても本発明の形質転換酵母を用いて、ＰＰＡＲ活性を測定することができた。また、味噌の種類の違いにより、ＰＰＡＲ活性物質量に差があることが分かった。
【産業上の利用可能性】
【００４２】
本発明の形質転換酵母は、微生物、植物、動物などの生物からの抽出液および薬品を含む合成化学物質などからＰＰＡＲ活性物質をスクリーニングしてＰＰＡＲ活性物質を同定できると、ＰＰＡＲの作用薬、サプリメント、機能性食品及び食品添加物組成物等を製造することができる。さらには、ＰＰＡＲ活性物質生成微生物をスクリーニングすることが可能であり、ＰＰＡＲ活性物質生成微生物が単離できると、その微生物を用いてＰＰＡＲ活性物質を含有する発酵食品その他ＰＰＡＲの作用薬、サプリメント、機能性食品及び食品添加物組成物等を製造することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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