(57)【要約】      （修正有）【課題】医療における使用、特に、患者における非癌症状の予防もしくは治療または疼痛の緩和における使用のためのペプチド分子または核酸分子、ペプチドまたは核酸分子を含む医薬組成物の提供。【解決手段】特定の配列を有する組換えペプチド分子、及び劾ペプチド分子をコードするポリヌクレオチド配列からなる単離された組換え核酸分子であり、更に、炎症症状の予防および／または治療のための劾核酸分子を含む医薬組成物。【選択図】図１
2014158471.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の群：
(i)   MSKLIEYDETARRAMEVGMDKLADTVRVT; 
(ii)  LGPRGRHVVLAKAFGGPTVTN; 
(iii) DGVTVAREIELEDPFEDLGAQLVKSVATKTNDV; 
(iv)  AGDGTTTATILAQALIKGGLRLVAAGVN; 
(v)   PIALGVGIGKAADAVSEALLASATP; 
(vi)  EEGIVPGGGASLIHQARKALTELRASL; 
(vii) TGDEVLGVDVFSEALAAPLFWIAANAGL; 
(viii)DGSVVVNKVSELPAGHGLNVNTLSYGDLAAD; 
(ix)  GVIDPVKVTRSAVLNASSVARMVLTTETVVV; 
(x)   LTTETVVVDKPAKAEDHDHHHGHAH; 
(xi)  (i)〜(x)のいずれかで定義されたポリペプチド配列に対して66％もしくは70％もしくは75％もしくは80％もしくは85％もしくは90％もしくは95％を超える同一性を有し、(i)〜(x)のいずれかで定義されたポリペプチド配列と等価な機能を有するポリペプチド配列；ならびに
(xii) (i)〜(xi)のいずれかで定義されたポリペプチド配列と等価な機能を有する、(i)〜(xi)のいずれかで定義されたポリペプチド配列の断片、
から選択されるポリペプチド配列を含むか、またはそれからなる単離された、または組換えペプチド分子。
【請求項２】
下記の群：
(a) 下記：
(i)   MSKLIEYDETARRAMEVGMDKLADTVRVT;
(ii)  LGPRGRHVVLAKAFGGPTVTN; 
(iii) DGVTVAREIELEDPFEDLGAQLVKSVATKTNDV; 
(iv)  AGDGTTTATILAQALIKGGLRLVAAGVN; 
(v)   PIALGVGIGKAADAVSEALLASATP; 
(vi)  EEGIVPGGGASLIHQARKALTELRASL; 
(vii) TGDEVLGVDVFSEALAAPLFWIAANAGL; 
(viii)DGSVVVNKVSELPAGHGLNVNTLSYGDLAAD; 
(ix)  GVIDPVKVTRSAVLNASSVARMVLTTETVVV; 
(x)   LTTETVVVDKPAKAEDHDHHHGHAH;
からなる群より選択されるポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチド配列；
(b) (a)で定義されたポリヌクレオチド配列に対して66％もしくは70％もしくは75％もしくは80％もしくは85％もしくは90％もしくは95％を超える同一性を有するポリヌクレオチド配列；または(i)〜(x)のいずれかで定義されたポリペプチド配列と等価な機能を有するポリペプチド配列をコードする、2xSSC、65℃の条件下で(a)で定義されたポリヌクレオチド配列にハイブリダイズするポリヌクレオチド配列；ならびに
(c) (i)〜(x)のいずれかで定義されたポリペプチド配列と等価な機能を有するポリペプチド配列をコードする、(a)または(b)で定義されたポリヌクレオチド配列の断片、
から選択されるポリヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる単離された、または組換え核酸分子。
【請求項３】
医療における使用のための請求項１に記載のペプチド分子。
【請求項４】
医療における使用のための請求項２に記載の核酸分子。
【請求項５】
非癌症状または癌症状の予防および／または治療における使用のための請求項１に記載のペプチド分子。
【請求項６】
非癌症状または癌症状の予防および／または治療における使用のための請求項２に記載の核酸分子。
【請求項７】
非癌症状または癌症状の予防および／または治療のための医薬の製造における、請求項１に記載のペプチド分子または請求項２に記載の核酸分子の使用。
【請求項８】
請求項１に記載のペプチド分子と、製薬上許容し得る賦形剤とを含むか、またはそれからなる医薬組成物。
【請求項９】
請求項２に記載の核酸分子と、製薬上許容し得る賦形剤とを含むか、またはそれからなる医薬組成物。
【請求項１０】
非癌症状または癌症状の予防または治療における使用のためのものである、請求項８または９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
有効量の請求項１に記載のペプチド分子または請求項８もしくは１０に記載の医薬組成物を、それを必要とする患者に投与する工程を含む、患者における非癌症状または癌症状を予防および／または治療する方法。
【請求項１２】
有効量の請求項２に記載の核酸分子または請求項９もしくは１０に記載の医薬組成物を、それを必要とする患者に投与する工程を含む、患者における非癌症状または癌症状を予防および／または治療する方法。
【請求項１３】
非癌症状が、溶血性貧血、血小板減少症、甲状腺炎、悪性貧血、アジソン病、自己免疫性糖尿病、重症筋無力症、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、アテローム性動脈硬化症、および自己免疫性脳炎などの自己免疫障害；湿疹、皮膚炎、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎などのアレルギー症状；アレルギー性気道疾患；好酸球増加症候群；接触皮膚炎、食物アレルギー；ならびにアレルギー喘息、内因性喘息、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、好酸球性肺炎、アレルギー性気管支炎気管支拡張症、職業性喘息、反応性気道疾患症候群、間質性肺疾患、好酸球増加症候群、寄生性肺疾患などの好酸球性気道炎症および気道過敏症を特徴とする呼吸器疾患を含むか、またはそれらからなる群より選択される、請求項５に記載のペプチド分子または請求項６に記載の核酸分子または請求項７に記載の使用または請求項１０に記載の医薬組成物または請求項１１もしくは１２に記載の方法。
【請求項１４】
非癌症状が喘息である、請求項５に記載のペプチド分子または請求項６に記載の核酸分子または請求項７に記載の使用または請求項１０に記載の医薬組成物または請求項１１もしくは１２に記載の方法。
【請求項１５】
非癌症状が関節炎である、請求項５に記載のペプチド分子または請求項６に記載の核酸分子または請求項７に記載の使用または請求項１０に記載の医薬組成物または請求項１１もしくは１２に記載の方法。
【請求項１６】
非癌症状が、固相腫瘍／悪性腫瘍、局所進行性腫瘍、ヒト軟組織肉腫、リンパ行性転移を含む転移性癌、多発性骨髄腫、急性および慢性白血病ならびにリンパ腫を含む血液細胞悪性腫瘍、口腔癌、喉頭癌および甲状腺癌を含む頭部および頸部癌、小細胞癌および非小細胞癌を含む肺癌、小細胞癌および腺管癌を含む乳癌、食道癌、胃癌、結腸癌、結腸直腸癌および結腸直腸新生物に関連するポリープを含む胃腸癌、膵臓癌、肝臓癌、膀胱癌および前立腺癌を含む泌尿器癌、卵巣癌、子宮(子宮内膜を含む)癌および卵胞中の固形腫瘍を含む女性生殖路の悪性腫瘍、腎細胞癌を含む腎臓癌、内因性脳腫瘍、神経芽細胞腫、星状細胞脳腫瘍、グリオーマ、中枢神経系における転移性腫瘍細胞侵襲を含む脳癌、骨腫を含む骨癌、悪性メラノーマ、ヒト皮膚ケラチノサイトの腫瘍進行、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、血管周囲細胞腫およびカポジ肉腫を含む皮膚癌を含むか、またはそれらからなる群より選択される、請求項５に記載のペプチド分子または請求項６に記載の核酸分子または請求項７に記載の使用または請求項１０に記載の医薬組成物または請求項１１もしくは１２に記載の方法。
【請求項１７】
疼痛の緩和における使用のための請求項１に記載のペプチド分子。
【請求項１８】
疼痛の緩和における使用のための請求項２に記載の核酸分子。
【請求項１９】
疼痛の緩和における使用のためのものである請求項８または９に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
疼痛の緩和のための医薬の製造における請求項１に記載のペプチド分子または請求項２に記載の核酸分子の使用。
【請求項２１】
前記医薬が、前記ペプチド分子または前記核酸分子の作用を補助するか、または増加させるための少なくとも1種の添加物をさらに含む、請求項２０に記載の使用。
【請求項２２】
前記添加物が、パラセタモール、アスピリン、イブプロフェン、他の非ステロイド系抗炎症剤(NSAIDS)、シクロオキシゲナーゼ-2-選択的阻害剤(CSI)、アヘン剤の少なくとも1種から選択される、請求項２１に記載の使用。
【請求項２３】
前記医薬が疼痛緩和の延長または持続を提供する、請求項２０〜２２のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２４】
日用量レベルが、単回用量または分割用量で投与される0.0001〜100,000 mgである、請求項２０〜２３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２５】
日用量レベルが0.0001〜1000 mgである、請求項２４に記載の使用。
【請求項２６】
患者への用量投与間の時間が6〜12時間である、請求項２４または２５に記載の使用。
【請求項２７】
患者への用量投与間の時間が以前の投与後9〜12時間である、請求項２４または２５に記載の使用。
【請求項２８】
患者への用量投与間の時間が12時間〜12日間である、請求項２４または２５に記載の使用。
【請求項２９】
患者への用量投与間の時間が12日間〜6ヶ月間である、請求項２４または２５に記載の使用。
【請求項３０】
前記医薬を用いてヒトまたは動物の患者における疼痛を緩和させる、請求項２０〜２９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３１】
前記医薬組成物または医薬を製剤化して、鼻内、経口、非経口、局所、眼内、坐剤、ペッサリーまたは吸入経路を含むか、またはそれからなる群より選択される少なくとも1種の経路による投与を可能にする、請求項８〜１０もしくは１８のいずれか１項に記載の医薬組成物または請求項７もしくは２０〜３０のいずれか１項に記載の医薬。
【請求項３２】
疼痛が、背痛、頭痛、歯痛、耳痛、関節炎、痛風、軟組織外傷、靱帯および／もしくは腱の外傷的損傷、骨折、癌、術後疼痛、月経痛、分娩痛、腎臓管痛、内臓痛、熱傷、膿瘍ならびに他の感染症を含むか、またはそれからなる群より選択される、請求項１６に記載のペプチド分子または請求項１７に記載の核酸分子または請求項２９に記載の医薬組成物または請求項７もしくは２０〜３０のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３３】
有効量の請求項１に記載のペプチド分子または請求項８〜１０、２０もしくは３１のいずれか１項に記載の医薬組成物を、それを必要とする患者に投与する工程を含む、患者における疼痛を緩和する方法。
【請求項３４】
有効量の請求項２に記載の核酸分子または請求項８〜１０、２０もしくは３１のいずれか１項に記載の医薬組成物を、それを必要とする患者に投与する工程を含む、患者における疼痛を緩和する方法。
【請求項３５】
アジュバントとしての請求項１に記載のペプチド分子または請求項２に記載の核酸分子の使用。
【請求項３６】
(i)請求項１に記載のペプチド分子または請求項２に記載の核酸分子と、(ii)抗原とを含むアジュバント系。
【請求項３７】
前記抗原が、炭疽菌抗原、コレラ抗原、ジフテリア抗原、ヘモフィルス・インフルエンザb(Hib)抗原、A型肝炎抗原、B型肝炎抗原、インフルエンザ抗原、日本脳炎抗原、麻疹、おたふく風邪および風疹(MMR)抗原、髄膜炎菌抗原、百日咳抗原、肺炎球菌抗原、ポリオ抗原、ラビ抗原、風疹抗原、天然痘および／もしくはワクシニア抗原、破傷風抗原、ダニ媒介脳炎抗原、結核抗原、腸チフス抗原、水痘／帯状疱疹抗原、黄熱病抗原ならびに動物用ワクチン抗原を含むか、またはそれからなる群より選択される、請求項３６に記載のアジュバント系。
【請求項３８】
請求項１に記載のペプチド分子または請求項２に記載の核酸分子を投与する工程を含む、細胞中でのサイトカイン産生を刺激する方法。
【請求項３９】
サイトカイン産生が正常レベルと比較して少なくとも10倍増加する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記サイトカインが、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、TNF-α、インターフェロン-γ、GM-CSFを含むか、またはそれからなる群より選択される、請求項３８または３９に記載の方法。
【請求項４１】
下記の工程：
i)試験サンプルを提供すること；
ii)試験サンプルと細胞を接触させること；
iii)細胞による1種以上のサイトカインの産生のレベルを測定および／または検出すること；
iv)(iii)における1種以上のサイトカインの産生のレベルと、対照サンプル中の該1種以上のサイトカインの産生のレベルとを比較すること、
を含むか、またはそれからなる、請求項１に記載のペプチド分子または請求項２に記載の核酸分子のサンプル中での存在および／または量を評価する方法であって、
対照サンプルと比較して試験サンプルにより誘導される1種以上のサイトカインの産生のより高いレベルが、請求項１に記載のペプチド分子または請求項２に記載の核酸分子の試験サンプル中での存在および／または量を示す、前記方法。
【請求項４２】
添付の明細書および図面を参照して本明細書に実質的に記載されるペプチド分子または核酸分子。
【請求項４３】
添付の明細書および図面を参照して本明細書に実質的に記載される医薬組成物、使用または方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シャペロニン60.1に由来するポリペプチドならびに疾患の治療における、および疼痛緩和剤としてのその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
熱ショックポリペプチドは、全ての生物に認められる分子のファミリーであり、その機能は生物学的プロセッシングおよび生物分子の安定性を助けることである(Zugel & Kauffman (1999) Role of heat shock polypeptides in protection from and pathogenesis of infectious diseases. Clin. Microbiol. Rev. (12)1: 19-39; Ranfordら(2000) Chaperonins are cell signalling polypeptides: - the unfolding biology of molecular chaperones. Exp. Rev. Mol. Med., 15 September, www.ermn.cbcu.cam.ac.uk/00002015h.htm)。
【０００３】
熱ショックポリペプチドは、全ての細胞区画に存在し、様々な生物分子と相互作用する能力を有する。特に、熱ショックポリペプチドは、ポリペプチドおよびその任意の複合体の集合から分解までの任意の時点でのポリペプチド折畳みおよびポリペプチド転位を助け、それに影響する。熱ショックポリペプチドのヘルパー性質により、それらは分子シャペロンとしても知られるようになった(Laskeyら(1978) Nucleosomes are assembled by an acidic polypeptide, which binds histones and transfers them to DNA. Nature (275):416-420)。
【０００４】
熱ショックポリペプチドは、限定されるものではないが、温度変化(上昇および低下の両方)、およびサイトカインなどの病態生理学的シグナルを含む、環境ストレスに応答して細胞により合成される。環境ストレスに応答して、熱ショックポリペプチドは、他のポリペプチドを加工して、ストレスの存在に起因して生じる任意の変性からそのようなポリペプチドを保護するその能力を使用する。この機構はまた、前記タンパク質を含む細胞を保護するのに役立つ。
【０００５】
シャペロニンポリペプチドは、ポリペプチド折畳みにおける役割がよく知られている熱ショックポリペプチドの亜群である。シャペロニンポリペプチドの2つのファミリー、シャペロニン60(約60 kDa)およびシャペロニン10(約10 kDa)ファミリーが存在する(Ranford, 2000)。最も特性評価されたシャペロニンは、大腸菌に由来するものであり、シャペロニン60およびシャペロニン10の特徴的な構造が確立されている。多くの他の生物のシャペロニン複合体はまた、実質的にはこの特徴的な構造に一致する。
【０００６】
シャペロニンの特徴的な構造は、互いに面し、シャペロニン10モノマーから構成されるヘプタマー環によりキャップ付けされた2個のヘプタマー環(7個のシャペロニン60モノマーから構成される)から形成される複合体である。
【０００７】
従来は、シャペロニンは、標的ポリペプチドが環形成したヘプタマーの中心核に進入する時にポリペプチド折畳みを援助し、ATPからのエネルギーのその後の放出時に、標的ポリペプチドはシャペロニン構造のコンフォメーション変化により中心核から放出される(Ransonら(1998) Review Article: Chaperones. Biochem. J (333): 233-242)。
【０００８】
マイコバクテリウム・ツベルクロシス(Mycobacterium tuberculosis(M. tuberculosis))は、他の公知のシャペロニンとのアミノ酸配列同一性に基づいて命名されたポリペプチドであるシャペロニン60.1(cpn 60.1)を産生する。さらなるM. tuberculosisのシャペロニンポリペプチドは、シャペロニン10(cpn 10)およびシャペロニン60.2(cpn 60.2)である。シャペロニン60.2は、cpn 60.1に対して59.6％のアミノ酸配列同一性および65.6％の核酸配列同一性を示す。
【０００９】
本発明は、癌症状および非癌症状の予防および／または治療における、マイコバクテリウム・ツベルクロシスまたは関連する原核生物に由来するシャペロニン60.1またはその機能的に等価な分子の断片の使用に関する。非癌症状の例としては、自己免疫障害、骨粗鬆症、アレルギー障害もしくは免疫活性化の症状、特に、喘息、ならびに／またはTヘルパーリンパ球2(Th2)型免疫応答により典型化される症状および／もしくは好酸球増加症に関連する症状ならびにin vitroもしくはin vivoで免疫応答メディエーター、例えば、サイトカインの産生を刺激する方法が挙げられる。
【００１０】
自己免疫は、「自己」への寛容性の喪失を反映し、正常な細胞または組織の不適切な破壊をもたらす。多くの症状においては、自己抗体が認められるが、疾患の原因よりもむしろ効果を反映し得る。しかしながら、いくつかの疾患においては、自己抗体は第1の、主要な、または唯一の検出可能な異常である。この点で関連する分子の1つのクラスは、免疫原性の高いシャペロニンである。シャペロニンは分子シャペロンと呼ばれるタンパク質群に属し、非天然タンパク質に結合し、ATP依存的触媒プロセスにおいて、それらが機能的タンパク質に必要とされる正確な三次元形態に折畳まれるのを援助する。
【００１１】
シャペロニンは、単球、マクロファージ、線維芽細胞様細胞、おそらく他の型の細胞、およびT細胞などの、多くのレベルで同時に免疫系を刺激すると考えられる。哺乳動物における免疫防御を、「先天的」および「適応」防御に分けることができる。食細胞、ナチュラルキラー細胞および補体などの既に定位置にあるものは先天的であると考えられる。チャレンジの際に、適応免疫はBおよびTリンパ球の形態で活性化される。シャペロニンは先天的防御機構、特に、食細胞に対して直接作用することが知られている。それらはまた、強力な適応免疫応答、すなわち、いくつかの場合、保護的であってよい抗体の産生およびTリンパ球の刺激を刺激する。注目すべきことに、それらは宿主防御にとって重要であると考えられるサイトカイン分泌を誘導する。しかしながら、いくつかの場合、シャペロニンの存在が宿主にとって損傷的であり得ると考えられる。
【００１２】
自己免疫疾患におけるシャペロニンの役割は、議論の余地がある。シャペロニンを含有する生物による感染／免疫は普遍的であり、健康な人々はシャペロニン特異的抗体の産生などの自己シャペロニンに対するT細胞応答を有するが、古典的自己免疫疾患は全く珍しい。従って、シャペロニンに対する免疫反応の存在は偶発的であり、重要ではない。
【００１３】
しかしながら、分子擬態理論は、自己免疫疾患におけるシャペロニンの関与を示唆しており、微生物起源および哺乳動物起源のシャペロニン間での高レベルのアミノ酸配列保存に基づいている。この理論は、様々な微生物による感染の間に、微生物と哺乳動物の間で共有されるシャペロニンエピトープがTリンパ球を刺激すると提唱している。この理論に従えば、共有されたシャペロニンエピトープの高レベルのシャペロニン提示は、自己シャペロニンに対する寛容性を破壊し、自己免疫疾患が発症する。
【００１４】
腫瘍から得られたシャペロニンは、これらの腫瘍に対して壊死効果をもたらすことが見出されている。これを腫瘍抗原の免疫学的認識を増強することにより達成することができると示唆されているが、この機構は未知である。従って、シャペロニンは細菌感染および癌に対する防御適応免疫を誘導するようである。
【００１５】
喘息などのアレルギー反応は、比例的に不適切であるか、または誤った免疫応答と関連する。例えば、喘息の有病率は増加しており、全事例を治療するための有効な療法は未だに発見されていない。現在の治療は、いくつかの副作用を有する免疫抑制的糖質コルチコステロイド、βアゴニスト、クロモグリケート、ロイコトリエン改変剤などを用いることが多い。
【００１６】
そのようなアレルギー反応においては、高いIgEレベルが生じ、Tヘルパーリンパ球-2 (Th2)免疫応答がTh1応答よりも優位であり、炎症応答をもたらす。Th1応答は主に微生物感染に対して保護的であると考えられ、サイトカイン、特に、インターロイキン-12 (IL-12)、IL-2およびインターフェロン-γにより促進される。対照的に、Th2応答は、好適な遺伝的背景においては、有害なアレルギー性組織損傷と関連する。
【００１７】
しかしながら、自己免疫障害、例えば、アジュバント関節炎などの他の症状においては、過度に活動的なTh1応答が障害の原因であると示唆されている。従って、Th1からTh2応答またはTh2からTh1応答への変換は、上記障害の治療において有用であり得る。
【００１８】
L. monocytogenes、M. bovisおよびM. tuberculosisなどの細菌はTh2をTh1応答に変換することができることが知られているが、この変換の原因となる分子は同定されていない。
【００１９】
しかしながら、当業界における提言は、Th1応答を誘導することができるM. lepraeに由来する熱ショックタンパク質hsp65と関係していた(Lowrieら、1999, Nature, 400, p269-271; Bonatoら、1998, Infect. Immun., 66, p169-175)。その相同体であるM. tuberculosisに由来するhsp65は、ヒト単球を刺激して、前炎症性サイトカインを合成し、単球およびヒト血管内皮細胞を活性化する能力を有する(Friedlandら、1993, Clin. Exp. Immunol., 91, p5862; Peetermansら、1995, Infect. Immun., 63, p3454-3458; Verdegaalら、1996, J. Immunol., 157, p369-376)。
【００２０】
本発明はまた、疼痛の緩和におけるシャペロニン60.1の断片またはマイコバクテリウム・ツベルクロシスもしくは関連する原核生物に由来する機能的に等価な分子の使用に関する。
【００２１】
疼痛緩和は通常、経口または非経口薬剤により達成される。多くの場合、効率的な疼痛緩和を、パラセタモール、アスピリンおよびイブプロフェンなどの他の非ステロイド系抗炎症剤(NSAIDS)、ならびにシクロオキシゲナーゼ-2-選択的阻害剤(CSI)などの広く知られた疼痛緩和剤を用いて達成することができる。麻薬性鎮痛剤は、中枢神経系(CNS)中の特定の受容体に作用する。コデインおよびジヒドロコデインは中程度に強力な麻薬性鎮痛剤であり、中毒の可能性は低い。モルヒネおよびメタドンなどの他のより強力な麻薬性鎮痛剤を用いて、重篤な疼痛を制御することができる。
【００２２】
現在公知の疼痛緩和剤については様々な問題が存在する。これらの薬剤は比較的短い作用時間であり、鎮痛作用は数時間しか続かない。通常、この薬剤の反復投与が疼痛を制御するのに必要である。次善の疼痛緩和は別の共通問題であり、患者が用量を増加させるか、または薬剤の変更をもたらす。NSAIDSの場合、消化不良および潰瘍などの不快な胃腸副作用が一般的であり、約2/3の使用者が、副作用および弱い効力のため、少なくとも1回はNSAIDSのブランドを変更する(Steinfeld SおよびBjorke PA. Results from a patient survey to assess gastrointestinal burden of non-steroidal anti-inflammatory drug therapy contrasted with a review of data from EVA to determine satisfaction with rofecoxib. Rheumatology (Oxford) 2002, 41(S1), 23-27)。さらに、NSAIDおよびCSIは心血管合併症を生じ得る(Hillis W S, (2000) Areas of emerging interest in analgesia: cardiovascular complications. Am. J. Ther. 9(3) 259-69)。アスピリンは少ない割合ではあるが子供においてライ症候群を引き起こすことがあるため、アスピリンは子供においては使用不可である。パラセタモールは、過剰投与が肝毒性であるため、注意をもって使用しなければならない(Cranswick, N., Coghlan D. Paracetamol efficacy and safety in children: the first 40 years (200) Am. J. Ther. 7(2) 135-41)。麻薬性鎮痛剤は、眠気、便秘、悪心、頭痛および眩暈などの様々な副作用を有する。モルヒネなどの強力な麻薬性鎮痛剤の反復投与は中毒を引き起こし得る。
【００２３】
現在の疼痛緩和剤を超える疼痛緩和剤としてのシャペロニンの利点は、それらが有害な副作用がより少ないということである。20億人の人々が結核を発症することなくM. tuberculosisを担持すると見積もられている。M. tuberculosisの担持は、胃腸副作用、心血管合併症、肝毒性、ライ症候群または中毒などの一般的に知られる疼痛緩和剤に見られる副作用と関連していない。
【００２４】
以前から公知の疼痛緩和剤を超えるさらなる利点は、シャペロニンの鎮痛作用がより長く持続することである。
【発明の概要】
【００２５】
この背景に対して、本発明者らはここで驚くべきことに、癌および非癌症状の両方を治療し、またin vivoおよびin vitroで疼痛緩和を提供することができるマイコバクテリウム・ツベルクロシスのシャペロニンタンパク質シャペロニン60.1(本明細書ではCpn60.1とも呼ばれる)のペプチドおよびポリペプチド断片を同定した。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】反復オボアルブミンチャレンジの24時間後の気道への好酸球の動員は、Cpn60.2ではなく、Cpn60.1、Cpn10を用いて処理されたマウスにおいて阻害された。垂直線は、4〜12(Cpn60.1)、3〜5(Cpn60.2)、4〜10(Cpn10)匹の動物／群の平均の標準誤差(SEM)を表す。*オボアルブミンのみと比較した好酸球の割合(％)の有意な低下。
【図２】反復オボアルブミンチャレンジの24時間後のメタコリンに対する気管支過敏性は、Cpn60.2ではなく、Cpn60.1、Cpn10を用いて処理されたマウスにおいて低下した(n=16-17)。垂直線はSEMを表す。
【図３】反復オボアルブミンチャレンジの24時間後のBAL液中のサイトカインのレベルは、Cpn60.1を用いて処理されたマウスにおいて阻害された。垂直線はSEMを表す。*オボアルブミンのみと比較したサイトカインのレベルの有意な低下(n=8-10)。
【図４】OVAで感作されたレシピエントマウスへのin vitroでのCpn10で予備処理された樹状細胞(10μg/ml)の導入は、肺への好酸球移動を有意に阻害した。垂直線はSEMを表す。*未処理のDCを点滴された感作マウスと比較した好酸球数の有意な低下(n=9-15)。
【図５】48時間、Cpn60.1でパルスされた樹状細胞は、用量依存的様式でIL12を産生した。Cpn10(10μg/ml)を用いる樹状細胞の予備処理は、低レベルのIL12を誘導した。細胞をシャペロニンで48時間刺激し、4回試験し、各柱は2回の実験の平均を表す。垂直線は標準偏差(SD)を表す。
【図６】24時間のCpn60.1と樹状細胞との予備インキュベーションは、LPSにより誘導されるIL12産生を阻害する。細胞をシャペロニンで248時間刺激し、LPSでさらに24時間刺激した。全ての濃度を4回試験し、各柱は2回の実験の平均を表す。垂直線はSDを表す。
【図７】Cpn60.1またはCpn10 (10μg/ml)を用いる樹状細胞の予備処理は、樹状細胞とRD11.10 T細胞の同時培養物中でのIL4のレベルを抑制した。IL5およびIL10はこの培養物中では検出されなかった。樹状細胞をシャペロニンで24時間刺激した後、それらをDO.11細胞と同時培養した。この同時培養物を6日間維持し、細胞を抗CD3および抗CD28でさらに24時間刺激した。上清を回収し、4回試験した。垂直線はSDを表す。
【図８】C57Bl/6マウスの脾臓細胞と、様々な濃度のCpn60.1およびそのペプチドとの予備処理は、in vitroでIL-12放出を誘導する。培地は5μg/mlのポリミキシンBを含んでいた。細胞をシャペロニンで24時間刺激し、上清を4回試験した。各線は2回の実験の平均を表す。
【図９】TLR4 KOマウスから回収された脾臓細胞は、その野生型対応物C57bl/6マウスと比較した場合、シャペロニン60.1およびそのペプチドに対する減少した応答を提供した。TLR2 KOマウスはまた、シャペロニンに対する阻害された応答も提供した。全ての濃度を4回試験した。垂直線はSDを表す。
【図１０】反復オボアルブミンチャレンジの24時間後の気道への全細胞の動員は、Cpn60およびCpn60.1-ペプチド4で処理されたマウスにおいて阻害された。垂直線は、5〜9匹の動物／群のSEMを表す。*模擬群と比較した全細胞数の有意な減少。**オボアルブミンのみと比較した全細胞数の有意な減少。
【図１１】反復オボアルブミンチャレンジの24時間後の気道への好酸球の動員は、Cpn60およびCpn60.1-ペプチド4で処理されたマウスにおいて阻害された。垂直線は、5〜9匹の動物／群のSEMを表す。*模擬群と比較した好酸球数の有意な減少。**オボアルブミンのみと比較した好酸球数の有意な減少。
【図１２】反復オボアルブミンチャレンジの24時間後のBAL液中のIL-5のレベルは、Cpn60.1またはCpn60.1-ペプチド4で処理されたマウスにおいて有意に阻害されなかった。垂直線はSEMを表す。
【図１３】反復オボアルブミンチャレンジの24時間後の血清中に循環する全IgEのレベルは、Cpn60.1-ペプチド4(0.005μg/マウス)で処理されたマウスにおいて有意に阻害された。垂直線はSEMを表す。**オボアルブミンのみと比較した全IgEのレベルの有意な増加。
【図１４】CFA処理されたラット(n=6)における機械的痛覚過敏に対するCpn60.1の効果を示す。
【図１５】CFA処理されたラット(n=6)における温熱性痛覚過敏に対するCpn60.1の効果を示す。
【図１６】UV処理されたラット(n=6)における機械的痛覚過敏に対するCpn60.1の効果を示す。
【図１７】UV処理されたラット(n=6)における温熱性痛覚過敏に対するCpn60.1の効果を示す。
【図１８】Cpn60.1を用いるヒト末梢血単球の予備処理は、LPSにより誘導されるTNF-α分泌を抑制する。データは、増加する濃度のCpn60.1を用いるTNF-α分泌の減衰を示す。最大阻害は1ng/mlであったが、有意ではなかった。データを平均±SEM(n=5)として表した。
【図１９】Cpn60.1を用いるヒト末梢血単球の予備処理は、ポリミキシンBの存在下でLPSにより誘導されるTNF-α分泌を抑制する。データは、増加する濃度のCpn60.1を用いるTNF-α分泌の減衰を示す。最大阻害は1ng/mlであった。データを平均±SEM(n=5)として表した。
【図２０】Cpn10を用いるヒト末梢血単球の予備処理は、LPSにより誘導されるTNF-α分泌を抑制しない。Cpn10は、LPSと比較した場合、任意の濃度でのTNF-α分泌の阻害において効果を有さなかった。データを平均±SEM(n=5)として表した。
【図２１】Cpn60.1またはCpn60.1ペプチドを用いるヒト末梢血単球の予備処理は、LPSにより誘導されるTNF-α放出を抑制する。データを、3回の2つの別々の実験の平均として表し、対照値％として表す。
【図２２】24時間での増加する濃度のLPS(1μg/ml)対塩水でチャレンジしたマウス(n=4)の洗浄液から回収された好中球の総数を示す。
【図２３】24時間でのLPSで処理されたマウス(1μg/ml)およびCpn60.1で処理されたマウス(n=4)の洗浄液から回収された好中球の総数を示す。
【図２４】24時間での増加する濃度のLPS(1μg/ml)対塩水でチャレンジしたマウス(n=4)の洗浄液から回収された好中球の総数を示す。Cpn60.1で処理された動物はLPSにより誘導される好中球増加を減少させた。LPSで処理された群(*p<0.05)と比較して有意に阻害された。
【図２５−１】マイコバクテリウム・ツベルクロシスCpn60.1の赤道ドメインを包含するペプチドを示す。赤道ドメインに、配列の下の黒色の実線および囲み／矢印によりマークを付す。ペプチド1、2、5、7、8、9、10は高度に表面露出されており、および／またはCpn60.1とCpn60.2の間で高度に相違する領域であり、従って、潜在的に最も興味深いペプチドであるべきである。ペプチド3および9は表面露出されているが、推定オリゴマー構造の内部面に向かっており、研究にとって高度に興味深い。ペプチド4および6は両方とも構造中に部分的に埋まっており、潜在的興味が相対的により低い。
【図２５−２】図２５−１の続きである。
【図２５−３】図２５−２の続きである。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
かくして、第1の態様において、本発明は、下記群：
(i)   MSKLIEYDETARRAMEVGMDKLADTVRVT;
(ii)  LGPRGRHVVLAKAFGGPTVTN;
(iii) DGVTVAREIELEDPFEDLGAQLVKSVATKTNDV;
(iv)  AGDGTTTATILAQALIKGGLRLVAAGVN;
(v)   PIALGVGIGKAADAVSEALLASATP;
(vi)  EEGIVPGGGASLIHQARKALTELRASL;
(vii) TGDEVLGVDVFSEALAAPLFWIAANAGL;
(viii)DGSVVVNKVSELPAGHGLNVNTLSYGDLAAD;
(ix)  GVIDPVKVTRSAVLNASSVARMVLTTETVVV;
(x)   LTTETVVVDKPAKAEDHDHHHGHAH;
(xi)  (i)〜(x)のいずれかで定義されたポリペプチド配列に対して66％もしくは70％もしくは75％もしくは80％もしくは85％もしくは90％もしくは95％を超える同一性を有し、(i)〜(x)のいずれかで定義されたポリペプチド配列と等価な機能を有するポリペプチド配列；
(xii) (i)〜(xi)のいずれかで定義されたポリペプチド配列と等価な機能を有する(i)〜(xi)のいずれかで定義されたポリペプチド配列の断片；
から選択されるポリペプチド配列を含むか、またはそれからなる単離された、または組換えペプチド分子を提供する。
【００２８】
「ポリペプチド」は、ペプチド、タンパク質およびペプチド模倣化合物をも含む。用語「ペプチド模倣化合物」とは、治療剤としての特定のペプチドのコンフォメーションおよび望ましい特徴を模倣するが、望ましくない特徴を回避する化合物を指す。
【００２９】
「(i)〜(x)のいずれかで定義されたポリペプチド配列と等価な機能」は、定義されたポリペプチド配列により示されるか、またはそれに帰する任意の機能と同一であるか、または実質的に類似する機能的活性を有する任意のペプチド、ポリペプチドおよび／またはその断片を含む。例えば、(i)〜(x)で定義されたポリペプチド配列は、抗炎症特性(添付の実施例に例示される)を示し、非癌症状の予防および／もしくは治療、または疼痛の緩和におけるその使用を可能にする。
【００３０】
機能的等価性を、例えば、添付の実施例に記載の方法を用いて測定することができる(例えば、加熱したプレート上での足の潜時を測定するか、またはin vivoもしくはin vitroでの炎症性サイトカインの放出を測定することによる)。
【００３１】
用語「ポリペプチド」または「ペプチド」または「アミノ酸配列」とは、オリゴペプチド、ペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質配列またはその断片および天然分子もしくは合成分子を指す。ポリペプチド「断片」、「部分」または「区分」は、少なくとも約5個のアミノ酸、好ましくは少なくとも約7個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも約9個のアミノ酸および最も好ましくは少なくとも約17個以上のアミノ酸のアミノ酸残基のストレッチである。ペプチドは好ましくは、約200個以下のアミノ酸、より好ましくは150個未満のアミノ酸および最も好ましくは100個未満のアミノ酸である。好ましくは、前記ペプチドは約5〜約200個のアミノ酸である。活性であるためには、任意のポリペプチドは生物活性および／または免疫学的活性を示すのに十分な長さを有していなければならない。
【００３２】
用語「天然ポリペプチド」とは、遺伝子工学的に操作されていない細胞により産生されるポリペプチドを指し、具体的には、限定されるものではないが、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化およびアシル化などのポリペプチドの翻訳後修飾の結果生じる様々なポリペプチドを意図する。
【００３３】
用語「誘導体」とは、ヒトタンパク質においては通常は起こらない、ユビキチン化、標識(例えば、放射性核種もしくは様々な酵素を用いる)、ペグ化(ポリエチレングリコールを用いる誘導体化)などの共有ポリマー結合およびオルニチンなどのアミノ酸の化学的合成による挿入もしくは置換などの技術により化学的に改変されたポリペプチドを指す。
【００３４】
用語「変異体」(または「類似体」)とは、例えば、組換えDNA技術を用いて作製されたアミノ酸挿入、欠失、および置換により、天然ポリペプチドと異なる任意のポリペプチドを指す。目的の活性を無効にすることなく、どのアミノ酸残基を置換、付加または欠失させることができるかを決定するための指針を、特定のポリペプチドの配列と、相同なペプチドの配列とを比較し、高い相同性の領域(保存領域)中で作られるアミノ酸配列変化の数を最小化するか、またはアミノ酸をコンセンサス配列と置換することにより見出すことができる。
【００３５】
あるいは、これらの同じか、または類似するポリペプチドをコードする組換え変異体を、遺伝子コード中の「冗長性」を利用することにより合成または選択することができる。様々な制限部位を作製するサイレント変化などの様々なコドン置換を導入して、プラスミドもしくはウイルスベクター中へのクローニングまたは特定の原核系もしくは真核系中での発現を最適化することができる。ポリヌクレオチド配列中の突然変異を、ポリペプチドまたは該ポリペプチドに付加された他のペプチドのドメイン中に反映させて、該ポリペプチドの任意の部分の特性を改変し、リガンド結合親和性、鎖間親和性、または分解／回転率などの特性を変化させることができる。
【００３６】
好ましくは、アミノ酸「置換」は、あるアミノ酸を、類似する構造的および／または化学的特性を有する別のアミノ酸に置換する結果、すなわち、保存的アミノ酸置換である。「保存的」アミノ酸置換を、関与する残基の極性、電荷、可溶性、疎水性、親水性、および／または両親媒性における類似性に基づいて作製することができる。例えば、非極性(疎水性)アミノ酸としては、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンが挙げられる；極性中性アミノ酸としては、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンが挙げられる；正に荷電した(塩基性)アミノ酸としては、アルギニン、リジン、およびヒスチジンが挙げられる；ならびに負に荷電した(酸性)アミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられる。「挿入」または「欠失」は、好ましくは約1〜20アミノ酸、より好ましくは1〜10アミノ酸の範囲である。許容される変化を、組換えDNA技術を用いてポリペプチド分子中にアミノ酸の挿入、欠失、または置換を体系的に作製し、得られる組換え変異体を活性についてアッセイすることにより実験的に決定することができる。
【００３７】
あるいは、機能の変化を望む場合、挿入、欠失または非保存的変化を遺伝子操作して、変化したポリペプチドを作製することができる。そのような変化は、例えば、本発明のポリペプチドの1個以上の生物学的機能または生化学的特性を変化させることができる。例えば、そのような変化は、リガンド結合親和性、鎖間親和性、または分解／回転率などのポリペプチド特性を変化させることができる。さらに、そのような変化を選択して、発現のために選択された宿主細胞中での発現、スケールアップなどのためにより良好に適合させたポリペプチドを作製することができる。例えば、システイン残基を欠失させるか、または別のアミノ酸残基で置換して、ジスルフィド架橋を排除することができる。
【００３８】
生物活性を示すことができる本発明のタンパク質の断片も、本発明により包含される。前記タンパク質の断片は線状の形態にあってもよく、またはそれらを、例えば、H.U.Saragoviら、Bio/Technology 10, 773-778 (1992)およびR.S. McDowellら、J. Amer. Chem. Soc. 114, 9245-9253 (1992)(両方とも参照により本明細書に組み入れられるものとする)に記載のような公知の方法を用いて環化することができる。そのような断片を、タンパク質結合部位の価数を増加させることなどの多くの目的のために免疫グロブリンなどの担体分子に融合させることができる。
【００３９】
本発明はさらに、下記群：
(a) 下記群：
(i)   MSKLIEYDETARRAMEVGMDKLADTVRVT;
(ii)  LGPRGRHVVLAKAFGGPTVTN;
(iii) DGVTVAREIELEDPFEDLGAQLVKSVATKTNDV;
(iv)  AGDGTTTATILAQALIKGGLRLVAAGVN;
(v)   PIALGVGIGKAADAVSEALLASATP;
(vi)  EEGIVPGGGASLIHQARKALTELRASL;
(vii) TGDEVLGVDVFSEALAAPLFWIAANAGL;
(viii)DGSVVVNKVSELPAGHGLNVNTLSYGDLAAD;
(ix)  GVIDPVKVTRSAVLNASSVARMVLTTETVVV;
(x)   LTTETVVVDKPAKAEDHDHHHGHAH;
からなる群より選択されるポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチド配列；
(b) (a)で定義されたポリヌクレオチド配列に対して66％もしくは70％もしくは75％もしくは80％もしくは85％もしくは90％もしくは95％を超える同一性を有するポリヌクレオチド配列；または(i)〜(x)のいずれかで定義されたポリペプチド配列と等価な機能を有するポリペプチド配列をコードする、2xSSC、65℃の条件下で(a)で定義されたポリヌクレオチド配列にハイブリダイズするポリヌクレオチド配列；ならびに
(c) (i)〜(x)のいずれかで定義されたポリペプチド配列と等価な機能を有するポリペプチド配列をコードする(a)または(b)で定義されたポリヌクレオチド配列の断片、
から選択されるポリヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる単離された、または組換え核酸分子を提供する。
【００４０】
用語「ヌクレオチド配列」または「核酸」または「ポリヌクレオチド」または「オリゴヌクレオチド」は互換的に用いられ、ヌクレオチドのヘテロポリマーまたはこれらのヌクレオチドの配列を指す。これらの語句はまた、一本鎖もしくは二本鎖であってよく、ペプチド核酸(PNA)もしくは任意のDNA様もしくはRNA様材料に対してセンスもしくはアンチセンス鎖であってよいゲノムもしくは合成起源のDNAもしくはRNAを指す。本明細書の配列においては、Aはアデニン、Cはシトシン、Tはチミン、Gはグアニンであり、NはA、C、GまたはT(U)である。ポリヌクレオチドがRNAである場合、本明細書で提供される配列中のT(チミン)はU(ウラシル)で置換されていると意図される。一般的には、本発明により提供される核酸断片を、ゲノムおよび短いオリゴヌクレオチドリンカーの断片から、または一連のオリゴヌクレオチドから、または個々のヌクレオチドから集合させて、微生物もしくはウイルスオペロン、または真核遺伝子から誘導された調節エレメントを含む組換え転写単位中で発現され得る合成核酸を提供することができる。
【００４１】
本発明のポリヌクレオチドは、天然または全体的もしくは部分的に合成のDNA、例えば、cDNAおよびゲノムDNA、ならびにRNA、例えば、mRNAを含む。このポリヌクレオチドは、cDNAのコード領域の全部を含んでもよく、またはcDNAのコード領域の一部であってもよい。
【００４２】
本発明はまた、本明細書に開示されたcDNA配列に対応する遺伝子も提供する。対応する遺伝子を、本明細書に開示された配列情報を用いて、公知の方法に従って単離することができる。そのような方法は、好適なゲノムライブラリーまたはゲノム材料の他の起源中での遺伝子の同定および／または増幅のための、開示された配列情報からのプローブまたはプライマーの調製を含む。さらなる5'および3'配列を、当業界で公知の方法を用いて取得することができる。例えば、本発明の任意のポリヌクレオチドに対応する完全長cDNAまたはゲノムDNAを、本発明の任意のポリヌクレオチドまたはその一部をプローブとして用いて、好適なハイブリダイゼーション条件下で好適なcDNAまたはゲノムDNAライブラリーをスクリーニングすることにより取得することができる。あるいは、本発明のポリヌクレオチドを、好適なゲノムDNAまたはcDNAライブラリー中での遺伝子の同定および／または増幅を可能にする好適なプライマーのための基礎として用いることができる。
【００４３】
本発明の核酸配列を、ESTならびにdbEST、gbpri、およびUniGeneなどの1個以上の公共データベースから取得された配列(cDNAおよびゲノム配列など)から集合させることができる。EST配列は、配列情報の同定、代表的な断片もしくは区分情報、または完全長遺伝子に関する新規区分情報を提供することができる。
【００４４】
本発明のポリヌクレオチドはまた、上記のポリヌクレオチドと実質的に等価であるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドも提供する。本発明に従うポリヌクレオチドは、例えば、上記のポリヌクレオチドに対して少なくとも約65％、少なくとも約70％、少なくとも約75％、少なくとも約80％、81％、82％、83％、84％、より典型的には、少なくとも約85％、86％、87％、88％、89％、より典型的には、少なくとも約90％、91％、92％、93％、94％、およびさらにより典型的には、少なくとも約95％、96％、97％、98％、99％の配列同一性を有し得る。
【００４５】
本発明のヌクレオチド配列のいずれかにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列断片であって、約5個を超えるヌクレオチド、好ましくは7個のヌクレオチド、より好ましくは9個を超えるヌクレオチドおよび最も好ましくは17個を超えるヌクレオチドである前記断片が本発明の核酸配列の範囲内に含まれる。本発明のポリヌクレオチドのいずれか1個に対して選択的である(すなわち、特異的にハイブリダイズする)、例えば、15、17または20個以上のヌクレオチドの断片が意図される。ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズすることができるプローブは、同じファミリーの遺伝子中の他のポリヌクレオチド配列から本発明のポリヌクレオチド配列を識別するか、または他の種の遺伝子からヒト遺伝子を識別することができ、好ましくはユニークなヌクレオチド配列に基づく。
【００４６】
本発明の範囲内にある配列は、これらの特異的配列に限定されないだけでなく、その対立遺伝子変異体および種変異体を含む。対立遺伝子変異体および種変異体を、本発明で提供される配列、その代表的な断片、または本発明のヌクレオチド配列と少なくとも90％、好ましくは95％同一であるヌクレオチド配列と、同じ種の別の単離物に由来する配列とを比較することにより日常的に決定することができる。さらに、コドン変動性を提供するために、本発明は、本明細書に開示された特定のORFと同じアミノ酸配列をコードする核酸分子を含む。換言すれば、ORFのコード領域中では、1個のコドンの、同じアミノ酸をコードする別のコドンへの置換が明確に意図される。
【００４７】
用語「ストリンジェント」は、当業界で一般的にストリンジェントであると理解される条件を指すように用いられる。ストリンジェントな条件は、高度にストリンジェントな条件(すなわち、0.5 M NaHPO4、7％ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、1 mM EDTA中、65℃でのフィルターに結合したDNAへのハイブリダイゼーション、および0.1 x SSC/0.1％SDS中、68℃での洗浄)、ならびに中程度にストリンジェントな条件(すなわち、0.2 x SSC/0.1％SDS中、42℃での洗浄)を含んでもよい。他の例示的なハイブリダイゼーション条件は、本明細書の実施例に記載されている。
【００４８】
デオキシオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションの例においては、さらなる例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、6 x SSC/0.05％ピロリン酸ナトリウム中、37℃(14塩基のオリゴヌクレオチドについて)、48℃(17塩基のオリゴについて)、55℃(20塩基のオリゴヌクレオチドについて)、および60℃(23塩基のオリゴヌクレオチドについて)での洗浄を含む。
【００４９】
SSCは、0.15 M NaCl、0.015 Mクエン酸ナトリウム、pH 7.2と定義される。
【００５０】
「同一性」とは、配列を整列させ、ギャップを導入し、必要に応じて、配列同一性の最大％を達成し、配列同一性の一部として任意の保存的置換を考慮しない後の、目的の配列のアミノ酸残基もしくは核酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基もしくは核酸残基の数もしくは％(結果の提示に依存する)を意味する。
【００５１】
2個のポリヌクレオチドまたはポリペプチド間の配列同一性％を、好適なコンピュータープログラム、例えば、University of Wisconsin Genetic Computing GroupのGAPプログラムを用いて決定することができ、同一性％は、配列が最適に整列されたポリペプチドと関連して算出されると理解されるであろう。あるいは、アラインメントを、Clustal Wプログラムを用いて実行することができる(Thompsonら(1994) Nucleic Acids Res. 22, 4673-80)。用いられるパラメーターは以下のようなものであってよい：ファストペアワイズアラインメントパラメーター：K-tuple(ワード)サイズ；1、ウィンドウサイズ；5、ギャップペナルティ；3、トップ斜線数；5。スコアリング方法：x％；複数のアラインメントパラメーター：ギャップオープンペナルティ；10、ギャップ伸長ペナルティ；0.05。スコアリングマトリックス：BLOSUM。
【００５２】
本明細書で用いられる「実質的に等価な」または「実質的に類似する」とは、1個以上の置換、欠失、または付加により参照配列から変化する、ヌクレオチドおよびアミノ酸配列の両方、例えば、突然変異配列を指し、その正味の効果は、参照配列と対象配列の間の有害な機能的相違をもたらさない。典型的には、そのような実質的に等価な配列は、本明細書に列挙されたものの1つから約35％以下変化する(すなわち、対応する参照配列と比較して、実質的に等価な配列中の個々の残基の置換、付加、および／または欠失の数を実質的に等価な配列中の残基の総数で割ったものが、約0.35以下である)。そのような配列を、列挙された配列に対して65％の配列同一性を有すると言う。一実施形態においては、本発明の実質的に等価な、例えば、突然変異配列は、列挙された配列から30％以下(70％の配列同一性)；この実施形態の変形においては、25％以下(75％の配列同一性)；およびこの実施形態のさらなる変形においては、20％以下(80％の配列同一性)ならびにこの実施形態のさらなる変形においては、10％以下(90％の配列同一性)ならびにこの実施形態のさらなる変形においては、5％以下(95％の配列同一性)変化する。本発明に従う実質的に等価な、例えば、突然変異アミノ酸配列は、好ましくは、列挙されたアミノ酸配列と少なくとも80％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも85％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも90％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも95％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも98％の配列同一性、および最も好ましくは、少なくとも99％の配列同一性を有する。本発明の実質的に等価なヌクレオチド配列は、例えば、遺伝子コードの冗長性または縮重性を考慮に入れて、より低い配列同一性％を有してもよい。好ましくは、前記ヌクレオチド配列は、少なくとも約65％の同一性、より好ましくは、少なくとも約75％の同一性、より好ましくは、少なくとも約80％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも85％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも90％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも約95％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも98％の配列同一性、および最も好ましくは少なくとも99％の配列同一性を有する。本発明の目的のために、実質的に等価な生物活性および実質的に等価な発現特性を有する配列は実質的に等価であると考えられる。等価性を決定するために、成熟配列のトランケーション(例えば、疑似停止コドンを作る突然変異を介する)を無視すべきである。配列同一性を、例えば、Jotun Hein法(Hein, J. (1990) Methods Enzymol. 183: 626-645)を用いて決定することができる。配列間の同一性を、当業界で公知の他の方法により、例えば、ハイブリダイゼーション条件を変化させることにより決定することもできる。
【００５３】
本発明はさらに、医療(医学)における使用のための本発明に従うペプチド分子および／または医療における使用のための本発明に従う核酸分子を提供する。
【００５４】
好ましくは、本発明は、非癌症状または癌症状を予防および／または治療するのに使用するための本発明に従う(本発明に係る)ペプチド分子および／または本発明に従う核酸分子を提供する。
【００５５】
本発明はさらに、非癌症状または癌症状を予防および／または治療するための医薬の製造における本発明のペプチド分子または核酸分子の使用を提供する。
【００５６】
さらなる態様においては、本発明は、本発明に従うペプチド分子と製薬上許容し得る賦形剤とを含むか、またはそれからなる医薬組成物を提供する。
【００５７】
さらなる態様においては、本発明は、本発明に従う核酸分子と製薬上許容し得る賦形剤とを含むか、またはそれからなる医薬組成物を提供する。
【００５８】
本発明の分子、医薬および医薬組成物を、注入可能な持続放出薬剤送達系を用いて送達することができる。これらのものを注射の頻度を低下させるために特異的に設計する。そのような系の例は、一度注入されたら、長期間にわたってrhGHをゆっくり放出する、生分解性ミクロスフェア中に組換えヒト成長ホルモン(rhGH)を封入したNutropin Depotである。好ましくは、送達を筋肉内(i.m.)および／または皮下(s.c.)および／または静脈内(i.v.)的に実施する。
【００５９】
本発明の分子、医薬および医薬組成物を、薬剤を必要な部位に直接放出する外科的に埋め込まれた装置により投与することができる。例えば、Vitrasertは、ガンシクロビルを眼内に直接放出して、CMV網膜炎を治療する。この毒性薬剤の疾患部位への直接適用は、薬剤の有意な全身副作用なしに有効な療法を達成する。
【００６０】
エレクトロポレーション療法(EPT)系を、本発明の薬剤、医薬および医薬組成物の投与に用いることもできる。パルス電界を細胞に送達する装置は、薬剤に対する細胞膜の透過性を増加させ、細胞内薬剤送達の有意な増強をもたらす。
【００６１】
本発明の分子、医薬および医薬組成物を、エレクトロインコーポレーション(EI)により送達することもできる。EIは、皮膚の表面上の直径最大30μmの小粒子がエレクトロポレーションに用いられるものと同一であるか、またはそれと類似する電気パルスを経験する時に起こる。EIにおいては、これらの粒子は、角質層を通って皮膚のより深い層に移動する。この粒子を薬剤もしくは遺伝子を用いてロードするか、もしくはコーティングするか、または該粒子は単に薬剤が進入することができる皮膚中に孔を生成する「弾丸」として作用することができる。
【００６２】
本発明の分子、医薬および医薬組成物の送達の代替的な方法は、温度感受性であるReGel注入系である。体温より低い温度では、ReGelは注入可能な液体であるが、体温では、それはゲル容器をすぐに形成し、公知の、安全な、生分解性ポリマー中にゆっくり腐食し、溶解する。活性物質は、生物ポリマーが溶解するにつれて時間と共に送達される。
【００６３】
本発明の分子、医薬および医薬組成物を経口的に送達することもできる。このプロセスは、タンパク質およびペプチドを同時送達するための体内でのビタミンB12および／またはビタミンDの経口摂取のための天然プロセスを用いる。ビタミンB12および／またはビタミンD取込み系に乗ることにより、本発明の核酸、分子および医薬製剤は腸壁を通って移動することができる。ビタミンB12類似体および／もしくはビタミンD類似体と、複合体のビタミンB12部分／ビタミンD部分中の内在因子(IF)に対する有意な親和性および該複合体の活性物質の有意な生物活性の両方を保持する薬剤との間で複合体が合成される。
【００６４】
本発明の分子、医薬および医薬組成物を、「Trojanペプチド」により細胞に導入することができる。これらのものは、転位特性を有し、細胞膜を横断して親水性化合物を運搬することができるペネトラチンと呼ばれるポリペプチドのクラスである。この系は、オリゴペプチドの細胞質および核への直接的標的化を可能にし、非細胞型特異的であり、高度に効率的であってよい。Derossiら(1998), Trends Cell Biol 8, 84-87を参照されたい。
【００６５】
好ましくは、本発明の医薬および／または医薬組成物は、活性成分の日用量もしくは単位、日低用量またはその好適な画分を含む単位用量である。
【００６６】
通常、本発明の分子、医薬および医薬組成物を、製薬上許容し得る剤形中、必要に応じて、非毒性有機性、もしくは無機性の酸、もしくは塩基の付加塩の形態の活性成分を含む医薬組成物の形態で、経口的に、または任意の非経口経路により投与する。治療しようとする障害および患者、ならびに投与経路に応じて、前記組成物を変化する用量で投与することができる。
【００６７】
ヒト療法においては、本発明の分子、医薬および医薬組成物を単独で投与することができるが、一般的には、意図される投与経路および標準的な製薬実務に関して選択された好適な医薬賦形剤、希釈剤または担体と混合して投与する。
【００６８】
例えば、本発明の分子、医薬および医薬組成物を、即時放出、遅延放出または制御放出適用のために、香料または着色料を含んでもよい、錠剤、カプセル剤、胚珠、エリキシル剤、溶液または懸濁液の形態で、経口投与、頬投与または舌下投与することができる。本発明の分子、医薬および医薬組成物を、海綿体内注入を介して投与することもできる。
【００６９】
そのような錠剤は、微結晶セルロース、ラクトース、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸水素二カルシウムおよびグリシンなどの賦形剤、デンプン(好ましくは、トウモロコシ、ジャガイモもしくはタピオカデンプン)、グリコール酸ナトリウムデンプン、クロスカルメロースナトリウムおよび特定のケイ酸複合体などの崩壊剤、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース(HPMC)、ヒドロキシプロピルセルロース(HPC)、スクロース、ゼラチンおよびアカシアなどの顆粒状結合剤を含んでもよい。さらに、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、グリセリルベヘネートおよびタルクなどの潤滑剤を含有させてもよい。
【００７０】
類似する型の固体組成物を、ゼラチンカプセル中の充填剤として用いることもできる。これに関連する好ましい賦形剤としては、ラクトース、デンプン、セルロース、ミルクシュガーまたは高分子量ポリエチレングリコールが挙げられる。水性懸濁液および／またはエリキシル剤のために、本発明の薬剤を様々な甘味料もしくは香料、着色物質もしくは染料と、乳化剤および／もしくは懸濁剤と、ならびに水、エタノール、プロピレングリコールおよびグリセリンなどの希釈剤と、ならびにその混合物と混合することができる。
【００７１】
また、本発明の分子、医薬および医薬組成物を、非経口的に、例えば、静脈内的、動脈内的、腹腔内的、莢膜内的、心室内的、胸骨内的、頭蓋内的、筋肉内的もしくは皮下的に投与するか、またはそれらを注入技術により投与することもできる。それらは、他の物質、例えば、血液と等張性の溶液を作るのに十分な塩もしくはグルコースを含んでもよい滅菌水性溶液の形態で最良に用いられる。必要に応じて、水性溶液を好適に緩衝化すべきである(好ましくは、3〜9のpH)。滅菌条件下での好適な非経口製剤の調製は、当業者にはよく知られる標準的な製薬技術により容易に達成される。
【００７２】
非経口投与にとって好適な医薬および医薬組成物としては、製剤を意図される賦形剤の血液と等張性にする酸化防止剤、バッファー、静菌剤および溶質を含んでもよい水性および非水性滅菌注入溶液；ならびに懸濁剤および増粘剤を含んでもよい水性および非水性滅菌懸濁液が挙げられる。前記医薬および組成物を、単回投与もしくは複数回投与容器、例えば、密封されたアンプルおよびバイアル中に提供し、使用の直前に滅菌液体担体、例えば、注射用の水の添加のみを要する凍結乾燥状態で保存することができる。即席注射溶液および懸濁液を、以前に記載の種類の滅菌粉末、顆粒および錠剤から調製することができる。
【００７３】
ヒト患者への経口および非経口投与のために、日用量レベルの本発明の分子、医薬および医薬組成物は通常、単回用量または分割用量で投与される0.1〜100 mg／成人／日であってよい。
【００７４】
かくして、例えば、本発明の分子の錠剤またはカプセル剤は、必要に応じて、1回または一時に2回以上の投与のために0.1〜100 mgの活性薬剤を含んでもよい。任意の事象において、医師は、任意の個々の患者にとって最も好適であろう実際の用量を決定することができ、それは特定の患者の年齢、体重および応答に応じて変化するであろう。上記用量は平均的な事例の例である。勿論、より高いか、またはより低い用量範囲が相応しい個別の例も存在し得るが、そのようなものは本発明の範囲内にある。
【００７５】
本発明の分子、医薬および医薬組成物を、鼻内投与するか、または吸入により投与することもでき、好適な推進剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、1,1,1,2-テトラフルオロエタン(HFA 134A、もしくは1,1,1,2,3,3,3-ヘプタフルオロプロパン(HFA 227EA)などのヒドロフルオロアルカン、二酸化炭素または他の好適な気体を用いて、加圧容器、ポンプ、スプレーまたはネブライザーから、乾燥粉末吸入器またはエアロゾルスプレー提供物の形態で都合良く送達する。加圧されたエアロゾルの場合、用量単位を、一定量を送達するためのバルブを提供することにより決定することができる。加圧された容器、ポンプ、スプレーまたはネブライザーは、例えば、潤滑剤、例えば、トリオレイン酸ソルビタンをさらに含んでもよい、エタノールと、溶媒としての推進剤との混合物を用いる、活性薬剤の溶液または懸濁液を含んでもよい。吸入器またはインサフレーター中での使用のためのカプセルおよびカートリッジ(例えば、ゼラチンから作製する)を、本発明の薬剤と、ラクトースまたはデンプンなどの好適な粉末基剤との粉末混合物を含むように製剤化することができる。
【００７６】
エアロゾルまたは乾燥粉末製剤を、それぞれの一定用量または「パフ」が、患者への送達のための少なくとも0.1 mgの本発明の分子を含むように準備するのが好ましい。エアロゾルを含む全体の日用量は、患者に応じて変化し、1日を通して単回用量またはより通常は、分割用量で投与することができることが理解されるであろう。
【００７７】
あるいは、本発明の分子、医薬および医薬組成物を、坐剤もしくはペッサリーの形態で投与するか、またはそれらをローション、溶液、クリーム、ゲル、軟膏もしくは散布剤の形態で局所的に適用することができる。本発明の分子、医薬および医薬組成物を、例えば、皮膚パッチを用いることにより経皮的に投与することもできる。それらを、特に眼の疾患を治療するために、眼内経路により投与することもできる。
【００７８】
眼科的使用のために、本発明の分子、医薬および医薬組成物を、必要に応じて、塩化ベンジルアルコニウムなどの保存剤と組合わせた、等張性のpH調整された滅菌塩水中の微小懸濁液として、または好ましくは、等張性のpH調整された滅菌塩水中の溶液として製剤化することができる。あるいは、それらを、ワセリンなどの軟膏中で製剤化することができる。
【００７９】
皮膚に局所的に適用するために、本発明の分子、医薬および医薬組成物を、例えば、1種以上の以下のもの：鉱油、液体ワセリン、白色ワセリン、プロピレングリコール、ポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン剤、乳化ワックスおよび水との混合物中に懸濁または溶解された活性薬剤を含む好適な軟膏として製剤化することができる。あるいは、それらを、例えば、1種以上の以下のもの：鉱油、モノステアリン酸ソルビタン、ポリエチレングリコール、液体パラフィン、ポリソルベート60、セチルエステルワックス、セテアリルアルコール、2-オクチルドデカノール、ベンジルアルコールおよび水の混合物中に懸濁または溶解された好適なローションまたはクリームとして製剤化することができる。
【００８０】
口中での局所投与にとって好適な製剤としては、香料基剤、通常はスクロールおよびアカシアもしくはトラガカント中の活性成分を含むロゼンジ剤；ゼラチンおよびグリセリン、もしくはスクロースおよびアカシアなどの不活性基剤中の活性成分を含むトローチ剤；ならびに好適な液体担体中の活性成分を含む口内洗浄液が挙げられる。
【００８１】
一般的には、ヒトにおいては、本発明の分子、医薬および医薬組成物の経口または非経口投与が好ましい経路であり、最も都合がよい。
【００８２】
獣医学的使用のためには、本発明の分子、医薬および医薬組成物を、通常の獣医学的実務に従って、好適に許容し得る製剤として投与し、獣医であれば、特定の動物にとって最も好適であろう投薬計画および投与経路を決定できるであろう。
【００８３】
便利には、前記製剤は医薬製剤である。有利には、前記製剤は動物用製剤である。
【００８４】
好ましくは、前記医薬組成物は非癌症状の予防または治療における使用のためのものである。
【００８５】
さらなる態様においては、本発明は、患者における非癌症状もしくは癌症状を予防および／または治療する方法であって、それを必要とする患者に、有効量の本発明に従うペプチド分子もしくは本発明に従う核酸分子、または本発明に従う医薬組成物を投与する工程を含む前記方法を提供する。
【００８６】
「治療上有効量」または「有効量」とは、被験体に単独で、もしくは別の薬剤と組合わせて投与した場合、疾患の症候、障害、もしくは症状を改善する本発明に従うペプチド分子または本発明に従う核酸分子の量を意味する。
【００８７】
「自己免疫疾患」とは、自己免疫プロセスが疾患の病因に寄与することが示され得る事例の意味を含む。そのような疾患は、典型的にはTヘルパーリンパ球-1(Th-1)型免疫応答と関連する。
【００８８】
「アレルギー症状」とは、Tヘルパーリンパ球-2(Th-2)型免疫応答と関連する症状の意味を含む。アレルギー反応においては、高いIgEレベルが生じ、Th-2免疫応答がTh-1応答よりも優勢であり、炎症応答をもたらす。アレルギー症状の例としては、喘息、鼻炎／花粉症、湿疹およびアナフィラキシーが挙げられる。
【００８９】
「アジュバント」とは、抗原中に組込まれるか、または抗原と同時に投与した場合、免疫応答を促進する任意の物質を意味する。
【００９０】
典型的には、非癌症状は、溶血性貧血、血小板減少症、甲状腺炎、悪性貧血、アジソン病、自己免疫性糖尿病、重症筋無力症、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、アテローム性動脈硬化症、および自己免疫性脳炎などの自己免疫障害；湿疹、皮膚炎、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎などのアレルギー症状；アレルギー性気道疾患；好酸球増加症候群；接触皮膚炎、食物アレルギー；ならびにアレルギー喘息、内因性喘息、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、好酸球性肺炎、アレルギー性気管支炎、気管支拡張症、職業性喘息、反応性気道疾患症候群、間質性肺疾患、好酸球増加症候群、寄生性肺疾患などの好酸球性気道炎症および気道過敏症を特徴とする呼吸器疾患を含むか、またはそれらからなる群より選択される。
【００９１】
自己免疫症状のさらなる例は、例えば、結合組織疾患、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、慢性関節リウマチ、自己免疫性肺炎症、ギランバレー症候群、自己免疫性甲状腺炎、インスリン依存的糖尿病、重症筋無力症、移植片対宿主疾患および自己免疫性炎症性眼病である。本発明のそのようなタンパク質(または抗体などのそのアンタゴニスト)はまた、喘息(特に、アレルギー喘息)または他の呼吸器問題などの、アレルギー反応および症状(例えば、アナフィラキシー、血清病、薬物反応、食物アレルギー、昆虫毒アレルギー、肥満細胞症、アレルギー性鼻炎、過敏性肺炎、じんましん、血管性浮腫、湿疹、アトピー性皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、多形性紅斑、スティーブンスジョンソン症候群、アレルギー性結膜炎、アトピー性角結膜炎、性病性角結膜炎、巨大乳頭結膜炎および接触アレルギー)の治療において有用であってよい。免疫抑制剤が望まれる他の症状(例えば、器官移植など)も、本発明のタンパク質(またはそのアンタゴニスト)を用いて治療可能であってよい。アレルギー反応に対する前記ポリペプチドまたはそのアンタゴニストの治療効果を、累積接触増強試験(Lastbornら、Toxicology 125: 59-66, 1998)、皮膚プリックテスト(Hoffmannら、Allergy 54: 446-54, 1999)、モルモット皮膚感作試験(Vohrら、Arch. Toxocol. 73: 501-9)、およびマウス局所リンパ節アッセイ(Kimberら、J. Toxicol. Environ. Health 53: 563-79)などのin vivo動物モデルにより評価することができる。
【００９２】
胸腺細胞または脾臓細胞の細胞傷害性に関する好適なアッセイとしては、限定されるものではないが、Current Protocols in Immunology, J.E. Coliganら、Strober(編)、Greene Puplishing Associates and Wiley-Interscience(出版)(第3章、In vitro assay for Mouse Lymphocyte Function 3.1-3.19; 第7章、Immunologic studies in Humans)；Herrmannら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2488-2492, 1981；Herrmannら、J. Immunol. 128: 1968-1974, 1982；Handaら、J. Immunol. 135: 1564-1572, 1985; Takaiら、I. Immunol. 137: 3494-3500, 1986; Takaiら、J. Immunol. 140: 508-512, 1988; Bowmanら、J. Virology 61: 1992-1998; Bertagnolliら、Cellular Immunology 133: 327-341, 1991；Brownら、J. Immunol. 153: 3079-3092, 1994に記載のものが挙げられる。
【００９３】
T細胞依存的免疫グロブリン応答およびアイソタイプスイッチングに関するアッセイ(特に、T細胞依存的抗体応答を調節し、Th1/Th2プロフィールに影響するタンパク質を同定するであろう)としては、限定されるものではないが、Maliszewski, J. Immunol. 144: 3028-3033, 1990；ならびにAssays for B cell function: In vitro antibody production, Mond, J.J.およびBrunswick, M. In Current Protocols in Immunology. J.E. Coliganら(編)、Vol 1 pp. 3.8.1-3.8.16, John WileyおよびSons, Toronto. 1994に記載のものが挙げられる。
【００９４】
混合リンパ球反応(MLR)アッセイ(特に、Th1およびCTL応答を主に生成するタンパク質を同定するであろう)としては、限定されるものではないが、Current Protocols in Immunology, J.E. Coliganら(編)、Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience(出版) (第3章、In vitro assay for Mouse Lymphocyte Function 3.1-3.19; 第7章、Immunologic studies in Humans)；Takaiら、I. Immunol. 137: 3494-3500, 1986; Takaiら、J. Immunol. 140: 508-512, 1988; Bertagnolliら、J. Immunol. 149: 3778-3783, 1992に記載のものが挙げられる。
【００９５】
樹状細胞依存的アッセイ(特に、ナイーブなT細胞を活性化する樹状細胞により発現されるタンパク質を同定するであろう)としては、限定されるものではないが、Gueryら、J. Immunol. 134: 536-544, 1995；Inabaら、J. Experimental Medicine 173: 549-559, 1991; Macatoniaら、J. Immunol. 154: 5071-5079, 1995: Porgadorら、J. Experimental Medicine 182: 255-260, 1995; Nairら、J. Virology 67: 4062-4069, 1993; Huangら、Science 264: 961-965, 1994; Macatoniaら、J. Experimental Medicine 169: 1255-1264, 1989; Bhardwajら、J. Clinical Investigation 94: 797-807, 1994；およびInabaら、J. Experimental Medicine 172: 631-640, 1990に記載のものが挙げられる。
【００９６】
リンパ球生存／アポトーシスに関するアッセイ(特に、スーパー抗原誘導後にアポトーシスを防止するタンパク質およびリンパ球ホメオスタシスを調節するタンパク質を同定するであろう)としては、限定されるものではないが、Darzynkiewiczら、Cytometry 13: 795-808, 1992; Gorczycaら、Leukemia 7:659-670, 1993; Gorczycaら、Cancer Research 53: 1945-1951, 1993; Itohら、Cell 66: 233-243, 1991; Zacharchuk, J. Immunol. 145:4037-4035, 1990; Zamaiら、Cytometry 14: 891-897, 1993; Gorczycaら、Int. J. Oncol. 1:639-648, 1992に記載のものが挙げられる。
【００９７】
初期段階のT細胞コミットメントおよび発生に影響するタンパク質に関するアッセイとしては、限定されるものではないが、Anticaら、Blood 84: 111-117, 1994; Fineら、Cellular Immunology 155: 111-122, 1994; Galyら、Blood 85: 2770-2778, 1995; Tokiら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7548-7551, 1991に記載のものが挙げられる。
【００９８】
本発明の組成物はまた、抗炎症活性を示すことができる。抗炎症活性を、炎症応答に関与する細胞に対して刺激を提供することにより、細胞間相互作用(例えば、細胞接着など)を阻害もしくは促進することにより、炎症プロセスに関与する細胞の走化性を阻害もしくは促進することにより、細胞溢出を阻害もしくは促進することにより、または炎症応答をより直接的に阻害もしくは促進する他の因子の産生を刺激もしくは抑制することにより達成することができる。そのような活性を有する化合物を用いて、限定されるものではないが、感染に関連する暗示(敗血性ショック、敗血症もしくは全身性炎症応答症候群(SIRS)など)、虚血-再かん流障害、内毒素致死性、関節炎、補体媒介性超急性拒絶、腎炎、サイトカインもしくはケモカイン誘導性肺損傷、炎症性腸疾患、クローン病またはTNFもしくはIL-1などのサイトカインの過剰産生の結果などの慢性または急性症状を含む炎症症状を治療することができる。また、本発明の組成物は、抗原物質または材料に対するアナフィラキシーおよび過敏症を治療するのにも有用であってよい。本発明の組成物を用いて、限定されるものではないが、敗血症、急性膵炎、内毒素ショック、サイトカイン誘導性ショック、慢性関節リウマチ、慢性炎症性関節炎、1型糖尿病に由来する膵臓細胞損傷、移植片対宿主疾患、炎症性腸疾患、肺疾患に関連する炎症、他の自己免疫疾患もしくは炎症疾患、急性もしくは慢性骨髄性白血病のため、または子宮内感染に対して二次性の早産の予防におけるなどの抗増殖剤などの症状を予防または治療することができる。
【００９９】
好ましい実施形態においては、非癌症状は喘息である；あるいは、非癌症状は関節炎である。
【０１００】
慢性関節リウマチに対する本発明の組成物の免疫抑制効果を、実験動物モデル系において決定する。実験モデル系は、ラットにおけるアジュバント誘導性関節炎であり、そのプロトコルはJ. Holoshitzら、1983, Science, 219:56またはB. Waksmanら、1963, Int. Arch. Allergy Appl. Immunol., 23:129により記載されている。疾患の誘導を、完全Freundアジュバント(CFA)中の殺傷されたマイコバクテリウム・ツベルクロシスの懸濁液の1回の注射、一般的には皮内注射により引き起こすことができる。注射経路を変更することもできるが、ラットにアジュバント混合物を尾の基部に注射してもよい。前記ポリペプチドを、約1〜5 mg/kgの用量でリン酸緩衝溶液(PBS)中で投与する。対照はPBSのみを投与することからなる。
【０１０１】
試験化合物の効果を試験するための手順は、CFA中の殺傷されたマイコバクテリウム・ツベルクロシスを皮内注射した後、試験化合物をすぐに投与し、続いて、24日目まで1日おきに処理することからなる。マイコバクテリウムCFAの注射の14、15、18、20、22および24日後に、全体の関節炎スコアを上記のJ. Holoskitzにより記載のように取得することができる。データの分析は、試験化合物が関節炎スコアの減少により測定されるように関節の腫れに対して劇的な効果を有することを示すであろう。
【０１０２】
癌治療は、腫瘍細胞増殖を阻害すること、血管新生(腫瘍増殖を支援するのに必要な新しい血管の増殖)を阻害すること、および／または腫瘍細胞の運動性もしくは侵襲性を低下させることにより転移を禁ずることより腫瘍退縮を促進する。本発明の治療用組成物は、固相腫瘍／悪性腫瘍、局所進行性腫瘍、ヒト軟組織肉腫、転移性癌、例えば、リンパ行性転移、血液細胞悪性腫瘍、例えば、多発性骨髄腫、急性および慢性白血病、ならびにリンパ腫、頭部および頸部癌、例えば、口腔癌、喉頭癌および甲状腺癌、肺癌、例えば、小細胞癌および非小細胞癌、乳癌、例えば、小細胞癌および腺管癌、胃腸癌、例えば、食道癌、胃癌、結腸癌、結腸直腸癌および結腸直腸新生物に関連するポリープ、膵臓癌、肝臓癌、泌尿器癌、例えば、膀胱癌および前立腺癌、女性生殖路の悪性腫瘍、例えば、卵巣癌、子宮(子宮内膜を含む)癌、および卵胞中の固形腫瘍、腎臓癌、例えば、腎細胞癌、脳癌、例えば、内因性脳腫瘍、神経芽細胞腫、星状細胞脳腫瘍、グリオーマ、中枢神経系における転移性腫瘍細胞侵襲、骨癌、例えば、骨腫、皮膚癌、例えば、悪性メラノーマ、ヒト皮膚ケラチノサイトの腫瘍進行、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、血管周囲細胞腫およびカポジ肉腫などの成人および小児の癌において有効であってよい。
【０１０３】
本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、またはポリペプチドの調節因子(本発明のポリペプチドの生物活性の阻害剤および刺激剤など)を投与して、癌を治療することができる。治療用組成物を、単独で、または外科手術、化学療法、放射線療法、温熱療法、およびレーザー療法などのアジュバント癌療法と組合わせて治療上有効用量で投与することができ、癌を根絶させる必要なく、例えば、腫瘍サイズの低下、腫瘍増殖速度の遅延、転移の阻害、またはさもなければ、全体の臨床状態の改善などの有益な効果を提供することができる。
【０１０４】
前記組成物を、抗癌剤カクテルの一部として治療上有効量で投与することもできる。抗癌剤カクテルは、送達のための製薬上許容し得る担体に加えて、本発明のポリペプチドもしくは調節因子と、1種以上の抗癌剤との混合物である。当業界でよく知られ、本発明のポリペプチドもしくは調節因子と組合わせた治療として用いることができる抗癌剤としては、アクチノマイシンD、アミノグルテチミド、アスパラギナーゼ、ブレオマイシン、ブスルファン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン(cis-DDP)、シクロホスファミド、シタラビンHCl(シトシンアラビノシド)、デカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシンHCl、ドキソルビシンHCl、エストラムスチンリン酸ナトリウム、エトポシド(V16-213)、フロクスリジン、5-フルオロウラシル(5-Fu)、フルタミド、ヒドロキシウレア(ヒドロキシカルバミド)、イフォスファミド、インターフェロンα-2a、インターフェロンα-2b、酢酸ロイプロリド(LHRH-放出因子類似体)、ロムスチン、メクロレタミンHCl(窒素マスタード)、メルファラン、メルカプトプリン、メスナ、メトトレキサート(MTX)、マイトマイシン、ミトキサントロンHCl、オクトレオチド、プリカマイシン、プロカルバジンHCl、ストレプトゾシン、クエン酸タモキシフェン、チオグアニン、チオテパ、硫酸ビンブラスチン、硫酸ビンクリスチン、アムサクリン、アザシチジン、ヘキサメチルメラミン、インターロイキン-2、ミトグアゾン、ペントスタチン、セムスチン、テニポシド、および硫酸ビンデシンが挙げられる。
【０１０５】
さらに、本発明の治療用組成物を、癌の予防的治療に用いることができる。個体に癌が生じやすくなる当業界で公知の遺伝的条件および／または環境状況(例えば、発癌物質への曝露)が存在する。これらの環境下では、治療上有効量の本発明のポリペプチドを用いてこれらの個体を治療して、癌を生じる危険性を低下させることが有益であり得る。
【０１０６】
in vitroモデルを用いて、潜在的な癌治療としての本発明のポリペプチドの有効用量を決定することができる。これらのin vitroモデルとしては、培養腫瘍細胞の増殖アッセイ、軟寒天中での培養腫瘍細胞の増殖(Freshney, (1987) Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, Wily-Liss, New York, NY Ch 18およびCh 21を参照)、Giovanellaら、J. Natl. Can. Inst., 52: 921-30 (1974)に記載のヌードマウスにおける腫瘍系、Pilkingtonら、Anticancer Res., 17: 4107-9 (1997)に記載のBoyden Chamberアッセイにおける腫瘍細胞の運動性および侵襲性、ならびにそれぞれ、Ribattaら、Intl. J. Dev. Biol., 40: 1189-97 (1999)およびLiら、Clin. Exp. Metastasis, 17:423-9 (1999)に記載のようなニワトリ絨毛尿膜の血管形成の誘導もしくは血管内皮細胞移動の誘導などの血管新生アッセイが挙げられる。好適な腫瘍細胞系は、例えば、American Type Tissue Culture Collectionカタログから入手可能である。
【０１０７】
白血病および関連障害を、本発明のポリヌクレオチドおよび／もしくはポリペプチドの機能を促進するか、または阻害する治療剤の投与により治療または予防することができる。そのような白血病および関連障害としては、限定されるものではないが、急性白血病、急性リンパ球性白血病、急性骨髄球性白血病、骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性、赤白血病、慢性白血病、慢性骨髄球性(顆粒球性)白血病および慢性リンパ球性白血病(そのような障害の概説については、Fishmanら、1985, Medicine、第2版、J. B. Lippincott Co., Philadelphiaを参照されたい)。
【０１０８】
さらなる態様においては、本発明は、疼痛の緩和における使用のための、本発明に従うペプチド分子または本発明に従う核酸分子を提供する。
【０１０９】
さらなる態様においては、本発明は、疼痛の緩和における使用のためのものである医薬組成物を提供する。本発明に従う好ましい医薬組成物は上記のものおよび添付の実施例に記載のものである。
【０１１０】
さらなる態様においては、本発明は、疼痛の緩和のための医薬の製造における本発明に従うペプチド分子または本発明に従う核酸分子の使用を提供する。
【０１１１】
「疼痛の緩和における使用」とは、個体により感じられる疼痛に影響する任意の治療を含み、そのような影響は、ヒトまたは動物患者における、疼痛感の、開始の遅延、重篤度の低下、期間の減少、および／もしくは除去(ならびに／または鎮痛および／もしくは超鎮痛)を含む。また、「疼痛」とは、鎮痛および／または超鎮痛を含む。「超鎮痛」とは、疼痛感のより早い開始、重篤度の増加、期間の増加、および／または罹患性の増加を意味する。
【０１１２】
好ましい実施形態においては、前記医薬は、ペプチド分子または核酸分子の作用を援助するか、または増加させるための少なくとも1種の添加物をさらに含む。典型的には、この添加物を、パラセタモール、アスピリン、イブプロフェン、他の非ステロイド系抗炎症剤(NSAIDS)、シクロオキシゲナーゼ-2-選択的阻害剤(CSI)、アヘン剤の少なくとも1種から選択する。
【０１１３】
「添加物」とは、主医薬に加えて提供され、主医薬とは無関係に、または主医薬と共に薬理学的に活性である成分であり、それによって医薬中でのその存在が主医薬の作用を援助するか、または増加させる前記成分を含む。
【０１１４】
好ましくは、前記医薬は延長された、または持続的な疼痛緩和を提供する。
【０１１５】
有利には、本発明に従う使用においては、日用量レベルは、単回または分割用量で投与される、0.0001〜100,000 mgであろう；好ましくは、日用量レベルは0.0001〜1000 mgである。
【０１１６】
好ましい医薬製剤としては、活性成分が、少なくとも1重量％(少なくとも10重量％、好ましくは少なくとも30重量％および最も好ましくは少なくとも50重量％)で存在するものが挙げられる。すなわち、医薬組成物の活性成分と他の成分(すなわち、アジュバント、希釈剤および担体の添加)の比率は、重量で少なくとも1:99(例えば、少なくとも10:90、好ましくは少なくとも30:70および最も好ましくは少なくとも50:50)である。
【０１１７】
典型的には、患者への用量投与間の時間は6〜12時間である；好ましい実施形態においては、患者への用量投与間の時間は、以前の投与の9〜12時間後である；より好ましくは、患者への用量投与間の時間は、12時間〜12日である；さらにより好ましくは、患者への用量投与間の時間は12日〜6ヶ月である。
【０１１８】
好ましい実施形態においては、本発明は、本発明の医薬を用いてヒトまたは動物の患者における疼痛を緩和させる使用を提供する。
【０１１９】
好ましくは、本発明の医薬組成物または医薬を、鼻内；経口；非経口；局所；眼内；坐剤；ペッサリー；もしくは吸入経路を含むか、またはそれからなる群より選択される少なくとも1種の経路による投与を可能にするように製剤化する。そのような投与経路にとって好適な製剤は薬学および医学の当業者にはよく知られており、例示的な製剤は上記および添付の実施例に記載されている。
【０１２０】
好ましくは、前記疼痛は、背痛；頭痛；歯痛；耳痛；関節炎；痛風；軟組織外傷；靱帯および／もしくは腱の外傷的損傷；骨折；癌；術後疼痛；月経痛；分娩痛；腎臓管痛；内臓痛；熱傷；膿瘍；ならびに他の感染症を含むか、またはそれからなる群より選択される。
【０１２１】
さらなる態様においては、本発明は、有効量の本発明のペプチド分子および／もしくは本発明の核酸分子ならびに／または本発明の医薬組成物を、それを必要とする患者に投与する工程を含む、患者における疼痛を緩和する方法を提供する。
【０１２２】
さらなる態様においては、本発明は、アジュバントとしての本発明に従うペプチド分子および／または本発明に従う核酸分子の使用を提供する。
【０１２３】
さらなる態様においては、本発明は、(i)本発明に従うペプチド分子および／または本発明に従う核酸分子と、(ii)抗原とを含むアジュバント系を提供する。
【０１２４】
好ましくは、前記抗原は、炭疽菌抗原；コレラ抗原；ジフテリア抗原；ヘモフィルス・インフルエンザb(Hib)抗原；A型肝炎抗原；B型肝炎抗原；インフルエンザ抗原；日本脳炎抗原；麻疹、おたふく風邪および風疹(MMR)抗原；髄膜炎菌抗原；百日咳抗原；肺炎球菌抗原；ポリオ抗原；ラビ抗原；風疹抗原；天然痘および／もしくはワクシニア抗原；破傷風抗原；ダニ媒介脳炎抗原；結核抗原；腸チフス抗原；水痘／帯状疱疹抗原；黄熱病抗原；ならびに動物用ワクチン抗原を含むか、またはそれからなる群より選択される。
【０１２５】
さらなる態様においては、本発明は、本発明に従うペプチド分子または本発明に従う核酸分子を投与する工程を含む、細胞中でのサイトカイン産生を刺激する方法を提供する。
【０１２６】
好ましくは、サイトカイン産生は正常レベルと比較して少なくとも10倍増加する。特定の細胞型の正常レベルを、以下に考察されるか、または実施例に記載されるアッセイのいずれかにおいて、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドに曝露されない対照サンプルを用いて容易に決定することができる。
【０１２７】
本発明のポリペプチドは、サイトカイン、細胞増殖(誘導もしくは阻害)もしくは細胞分化(誘導もしくは阻害)に関する活性を示してもよく、または特定の細胞集団において他のサイトカインの産生を誘導してもよい。本発明のポリヌクレオチドは、そのような属性を示すポリペプチドをコードしてもよい。全ての公知のサイトカインを含む現在までに発見された多くのタンパク質因子は、1種以上の因子に依存する細胞増殖アッセイにおいて活性を示してきた、従って、このアッセイはサイトカイン活性の都合の良い確認として役立つ。本発明の治療用組成物の活性は、限定されるものではないが、32D、DA2、DA1G、T10、B9、B9/11、BaF3、MC9/G、M+(preB M+、2E8、RB5、DA1、123、T1165、HT2、CTLL2、TF-1、Mo7e、CMK、HUVEC、およびCacoなどの細胞系のためのいくつかの日常的な因子依存的細胞増殖アッセイのいずれか1つにより証明される。
【０１２８】
T細胞または胸腺細胞増殖に関するアッセイとしては、限定されるものではないが、Current Protocols in Immunology, J. E. Coliganら(編)、Pub. Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience  (第3章、In vitro assays for Mouse Lymphocyte Function 3.1-3.19; 第7章、Immunologic studies in Humans); Takaiら、J. Immunol. 137:3494-3500, 1986; Bertagnolliら、J. Immunol. 145:1706-1712, 1990; Bertagnolli ら、Cellular Immunology 133:327-341, 1991; Bertagnolliら、I. Immunol. 149:3778-3783, 1992; Bowmanら、I Immunol. 152:1756-1761, 1994に記載のものが挙げられる。
【０１２９】
サイトカイン産生および／または脾臓細胞、リンパ節細胞もしくは胸腺細胞の増殖に関するアッセイとしては、限定されるものではないが、Polyclonal T cell stimulation, Kruisbeek, A. M.およびShevach, E. M.  In Current Protocols in Immunology. J. E. Coligan(編)Vol 1 pp. 3.12.1-3.12.14, John Wiley and Sons, Toronto. 1994; ならびにMeasurement of mouse and human interleukin-γ, Schreiber, R. D. In Current Protocols in Immunology. J. E. Coligan(編)Vol 1 pp. 6.8.1-6.8.8, John Wiley and Sons, Toronto. 1994に記載のものが挙げられる。
【０１３０】
造血細胞およびリンパ球産生細胞の増殖および分化に関するアッセイとしては、限定されるものではないが、Measurement of Human and Murine Interleukin 2 and Interleukin 4, Bottomly, K., Davis, L. S.およびLipsky, P. E. In Current Protocols in Immunology. J. E. Coligan(編)Vol 1 pp. 6.3.1-6.3.12, John Wiley and Sons, Toronto. 1991; deVries ら、J. Exp. Med. 173:1205-1211, 1991; Moreauら、Nature 336:690-692, 1988; Greenberger ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2931-2938, 1983; Measurement of mouse and human interleukin 6--Nordan, R. In Current Protocols in Immunology.  J. E. Coligan(編)Vol 1 pp. 6.6.1-6.6.5, John Wiley and Sons, Toronto.  1991; Smithら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83:1857-1861, 1986; Measurement of human Interleukin 11--Bennett, F., Giannotti, J., Clark, S. C.およびTurner, K. J. In Current Protocols in Immunology. J. E. Coligan(編)Vol 1 pp. 6.15.1 John Wiley and Sons, Toronto. 1991; Measurement of mouse and human Interleukin 9--Ciarletta, A., Giannotti, J., Clark, S. C.およびTurner, K. J. In Current Protocols in Immunology. J. E. Coligan(編)Vol 1 pp. 6.13.1, John Wiley and Sons, Toronto. 1991に記載のものが挙げられる。
【０１３１】
抗原に対するT細胞クローン応答に関するアッセイ(特に、増殖およびサイトカイン産生を測定することによりAPC-T細胞相互作用に影響し、ならびにT細胞効果を指令するタンパク質を同定するであろう)としては、限定されるものではないが、Current Protocols in Immunology, J. E. Coligan, A. M. Kruisbeek, D. H. Margulies, E. M. Shevach, W Strober(編), Pub. Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience  (第3章、In vitro assays for Mouse Lymphocyte Function; 第6章、Cytokines and their cellular receptors; 第7章、Immunologic studies in Humans); Weinbergerら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:6091-6095, 1980; Weinbergerら、Eur. J. Immun. 11:405-411, 1981; Takaiら、J. Immunol. 137:3494-3500, 1986; Takaiら、J. Immunol. 140:508-512, 1988に記載のものが挙げられる。
【０１３２】
好ましい実施形態においては、前記サイトカインを、IL-1β；IL-2；IL-6；IL-8；IL-10；IL-12；TNF-α；インターフェロン-γ；GM-CSFを含むか、またはそれからなる群より選択する。
【０１３３】
本発明はさらに、本発明に従うペプチド分子または本発明に従う核酸分子のサンプル中の存在および／または量を評価する方法であって、
i)試験サンプルを提供する工程；
ii)試験サンプルと細胞とを接触させる工程；
iii)細胞による1種以上のサイトカインの産生のレベルを測定および／または検出する工程；
iv)(iii)中の1種以上のサイトカインの産生のレベルと、対照サンプル中の1種以上のサイトカインの産生のレベルとを比較する工程；
を含むか、またはそれからなり、
対照サンプルと比較して試験サンプルにより誘導された1種以上のサイトカインの産生のより高いレベルが、本発明に従うペプチド分子または本発明に従う核酸分子の試験サンプル中での存在および／または量を示す、前記方法を提供する。
【０１３４】
「MT60.1」、「Mtcpn60.1」、「cpn 60.1」、「60.1」および「シャペロニン60.1」は、図25に示されるアミノ酸配列を指すように本明細書を通して互換的に用いられる。
【０１３５】
本明細書中の明らかに以前に公開された文書の一覧または考察は、この文書が当業界の状態の一部であるか、または共通の一般的知識であることの承認として必ずしも取られるべきではない。
【０１３６】
ここで、本発明の特定の態様を具体化する好ましい非限定例を、図面を参照して説明する。
【０１３７】
(実施例)
実施例の概説
本発明者らの実験の目的は、アレルギー性炎症のモデルにおけるシャペロニンの抗炎症特性を調査することであった。その結果は、Cpn60.1とCpn10の両方がin vivoでアレルギー性炎症応答を阻害し、細胞レベルで樹状細胞機能を阻害することができ、in vivoでのこれらの分子の抗炎症特性を説明することができることを示す本発明者らの以前の知見を拡張するものである。
【０１３８】
Cpn60.1のこの抗炎症特性の構造的決定因子が依然として確立されるべきである。従って、Cpn60.1の様々なペプチド配列を、in vitroおよびin vivoでの潜在的な抗炎症特性について調査した。いくつかのこれらのペプチドはin vitroで免疫調節活性を有し、in vivoで抗炎症特性を有するようであったが、これはシャペロニン内に存在する活性の構造的決定因子が新規抗炎症剤を見出すための調査の影響を受けやすいことを示唆している。
【０１３９】
実施例1 - アレルギー性炎症のマウスモデルにおけるCpn60.1および10の効果
喘息などのアレルギー疾患は、Th2リンパ球の過剰な活性に関連すると考えられ、従って免疫偏向を誘導するように設計された戦略は喘息におけるアレルギー性炎症を抑制するのに有用であり得る。M. tuberculosisとワクチンM. bovis BCG(M. tuberculosisと抗原的に非常に類似している(Harboe M.ら、Scand J Immunol. 1979; 9:115-24))は両方とも、アレルギー性肺炎症を抑制することができることが示されている。Helperby Therapeuticsに由来するデータは、M. tuberculosisが3個のシャペロニン、すなわち、60.1、60.2および10を有することを確認した。さらに、本発明者らは、60.2ではなく、Cpn10および60.1が喘息のマウスモデルにおいて肺炎症を抑制することを以前に証明した(Riffo-Vasquez, Y.ら、Clin. Exp. Allergy, 2004, 34:712-19)。
【０１４０】
肺におけるアレルギー性炎症は、7日間隔での1 mgのミョウバン中の10μgのオボアルブミン(OVA)の2回の腹腔内注入により誘導される。対照動物はミョウバンのみを受ける。14日目に、全ての動物を、3日連続で1日1回、OVAのエアロゾルに25分間曝露する。全ての測定を最後の抗原チャレンジの24時間後に実施する。
【０１４１】
本発明者らは、OVAの2回目の注入の24時間前および各抗原チャレンジの1時間前の10μgのCpn60.1またはCpn10の気管内投与が、気道炎症(図1)、過敏性(図2)および肺でのサイトカイン放出(図3)を有意に阻害することができることを示した。しかしながら、これらのシャペロニンがin vivoでこの効果を発揮する機構は依然として確立されていない。
【０１４２】
実施例2 - マウス樹状細胞機能に対するCpn10およびCpn60.1の効果
マイコバクテリウムの熱ショックタンパク質(hsp)は、hspと外因性タンパク質との間の複合体形成を要することなく、抗原プロセッシングおよびT細胞への該タンパク質の樹状細胞(DC)による提示を増強することができることが示された(Chen K.ら、J. Leuk. Biol., 2004, 75:1-7)。
【０１４３】
Cpn10および60.1がin vivoでアレルギー性肺炎症を調節する機構を明確にするために、本発明者らはin vitroで骨髄樹状細胞機能に対するこれらのシャペロニンの効果を調査した。
【０１４４】
Balb/cマウスに由来する骨髄細胞を回収し、8 ng/mlのマウスGM-CSFを含有する完全ダルベッコ改変イーグル培地中で6日間培養した。培養の6日目に、細胞を回収し、接着細胞の除去のために1時間再塗布し、洗浄し、表面マーカー発現の分析および移動実験のために6穴プレート中に2 x 106細胞／ウェルで塗布し、サイトカイン測定のために96穴プレート中に105細胞／ウェルで塗布した。他の実験においては、細胞をシャペロニンと共に24時間、106細胞／ウェルでインキュベートした後、LPS(10 ng/ml)と共にさらに24時間インキュベートした。
【０１４５】
DCをCpn10 (10μg/ml)と共に24時間、in vitroで予備処理した後、OVA感作されたレシピエントマウスの肺に局所的に投与した。この処理により、肺への好酸球移動が有意に阻害され(図4)、これはシャペロニン自身についてin vivoで観察される効果を再現している。
【０１４６】
Cpn60.1 (0.1-30μg/ml)を用いるin vitroでのDCの予備処理は、用量依存的様式でIL-12の放出を誘導した。しかしながら、Cpn10(10μg/ml)を用いるDCの予備処理はLPSおよびCpn60.1と比較してより低レベルのIL-12放出を誘導した(図5)。
【０１４７】
Cpn10ではなくCpn60.1と共にDCを24時間予備インキュベートしたところ、LPSにより誘導されるIL12産生が阻害された(図6)。
【０１４８】
24時間、Cpn60.1(10μg/ml)またはCpn10(10μg/ml)と共に予備処理されたDCは、DC/T細胞同時培養物中でRD11.10 T細胞からのIL4の放出を抑制した。培養の6日後、細胞を抗CD3および抗CD28でさらに24時間刺激し、上清を回収した。IL5およびIL10はこの培養物中で検出されなかった(図7)。
【０１４９】
実施例3 - in vitroでのシャペロニン60.1ペプチドの効果
観察された生物学的作用の原因となるシャペロニン60.1の構造的決定因子を決定するために、本発明者らは、様々なin vitro生物アッセイにおいて、この研究でペプチド1、2、3、4および6と命名された5つの異なるペプチド配列の効果を調査した。
【０１５０】
具体的な配列を以下に示す：
2014158471.tif 000003
【０１５１】
これらの実験において用いたCpn60.1バッチ：Cpn60.1 1_04-03/1。
【０１５２】
本発明者らは、脾臓細胞の培養物中でのこれらのペプチドの効果を調査した。脾臓をC57Bl/6マウスまたはTLR4およびTLR2 KOマウスから回収した。器官を無菌条件で軟化させ、細胞懸濁液を70μmの細胞ストレーナーを通過させた。赤血球を滅菌水を用いる浸透圧チョックにより除去した。残った細胞を洗浄し、IL-12測定のために106細胞／ウェルで塗布した。細胞を様々な濃度のペプチドまたはシャペロニン60.1(0.001-30μg/ml)と共にインキュベートした。24時間後に上清を回収し、-20℃で保持した。IL-12を従来のELISAアッセイにより測定した。
【０１５３】
本発明者らの実験観察により、Cpn60.1および全てのペプチドが脾臓細胞培養物中でIL-12放出を誘導することが示された。より低濃度(0.001〜0.1μg/ml)では、ペプチド4がCpn60.1よりも有効である。しかしながら、より高い濃度(0.1〜30μg/ml)では、このペプチドはCpn60.1と比較して低下した効果を示した。ペプチド6は、Cpn60と比較して、より高い濃度では類似する効果を有するが、より低濃度ではあまり強力でない効果を有する(図8)。全ての培養を、ポリミキシンBの存在下で実施して、測定された機能的応答に対するLPS夾雑の効果を除外した。
【０１５４】
本発明者らはさらに、脾臓細胞のこれらのペプチド配列に対する応答におけるtoll受容体(TLR)の役割を試験した。TLR4 KOマウスから回収された脾臓細胞は、その野生型対応物C57bl/6マウスと比較した場合、シャペロニン60.1およびそのペプチドに応答してIL-12を産生するその能力において有意に不応性であった。TLR2 KOマウスに由来する脾臓細胞はまた、シャペロニンおよびそのペプチドに応答してIL-12を産生するその能力において不応性であった。
【０１５５】
このin vitro試験は、これらのペプチド断片の生物活性がTLR2およびTLR4の活性化により媒介されることを示している(図9)。
【０１５６】
実施例4 - in vivoでのシャペロニンペプチドの効果
本発明者らは次に、以前に記載されたin vitro試験から得られた結果に照らして、アレルギー性気道炎症に対する低濃度のCpn60.1およびCpn60.1-ペプチド4の効果を調査した。
【０１５７】
これらの実験を実施するために、本発明者らは、本発明者らの免疫プロトコルをわずかに改変した。肺におけるアレルギー性炎症を、7日間隔で100μgのミョウバン中の10μgのオボアルブミン(OVA)の2回の鼻内点滴により誘導する。対照動物はミョウバンのみを受ける。14日目に、全ての動物を、3日連続で1日1回、25分間、OVAのエアロゾルに曝露する。全ての測定を、最後の抗原チャレンジの24時間後に実施する。
【０１５８】
本発明者らは、Cpn60.1 (1μg)の鼻内投与が、急性抗原チャレンジ後に肺に動員される細胞の総数を有意に阻害することを示した(図10)。気道への好酸球動員に対するCpn60.1およびペプチド4の効果はより広範囲であった(図11)。低用量のCpn60.1 (0.1および1μg)およびペプチド4(0.005μg)は共に、炎症細胞からのIL-5の産生による障害により引き起こされない好酸球の動員の有意な低下を引き起こした(図12)。興味深いことに、低用量のペプチド4はこのアレルギーモデルにおける総IgE産生に影響した(図13)。
【０１５９】
実施例5 - 疼痛モデルにおけるCpn60.1
Cpn60.1の効果を、2つの疼痛モデル、完全Freundアジュバント(CFA)誘導性痛覚過敏および紫外線日焼け誘導性痛覚過敏において調査した。機械的痛覚過敏を、後足に増加する力を加えたVon Freyフィラメントを用いて測定した。温熱性痛覚過敏を、熱源から後足を引き出すのにかかる時間を用いて測定した。Cpn60.1 (50 & 500μg/kg)を、オスのWistarラット(200 g)に皮下的に7日間、慢性的に投与した。1日おきに、機械的および温度的異痛に対する行動的応答を記録した。基線記録の後、CFAを後足に注射して、痛覚過敏を誘導し、行動試験を行った。Cpn60.1の用量はいずれも、対照であるイブプロフェン(100 mg/kg)と比較してCFA誘導性痛覚過敏を低下させなかった(図14および15)。痛覚過敏の別のモデルを試験したが、今回はUV日焼けを用いて異痛を誘導した。再度、Cpn60.1はイブプロフェンで処理した群と比較して、痛覚過敏を阻害する効果をほとんど有さなかった(図16および17)。
【０１６０】
実施例6 - ヒト炎症細胞に関するin vitro試験
本発明者らは、Cpn60.1とこのタンパク質の様々なペプチド配列の効力を比較するためのヒト単球アッセイを確立した。ヒト単球を、健康なボランティアに由来する末梢静脈血から密度依存的遠心分離により取得した。次いで、単球を単離し、2 x 106個の細胞/mlの密度に調整された細胞と共に精製し、1時間30分インキュベートした。次いで、プレートをHanks溶液で2回洗浄した。次いで、0.9 mlのRPMI培地を各ウェルに添加した後、ポリミキシン-B(5μg/ml)を添加した。30分後、0.0001〜1000 ng/mlの0.1 mlのCpnまたはペプチドをウェルに添加した。次いで、細胞を37℃、5％CO2で1時間インキュベートした。培地を除去し、細胞を洗浄した。0.9 mlの培地を各ウェルに添加した後、0.1 mlのLPS(1 ng/ml)を添加し、24時間インキュベートした。上清を各ウェルから取得し、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)のために凍結した。
【０１６１】
本発明者らは、Cpn60.1単独でヒト単球を刺激して、TNF-α分泌を誘導することができるが、既に確立された炎症刺激原(すなわち、LPSの存在下)に添加した場合、Cpn60.1は低用量(1 ng/ml)でTNF-α分泌を阻害することを証明した(図18)。対照的に、Cpn10は、ヒト単球からのTNF-α分泌を阻害できなかった(図20)。しかしながら、前記タンパク質は、LPS夾雑の程度を有するようであり、ポリミキシンBの存在下で、この夾雑は低下する(図19)。LPS夾雑とのこの潜在的交絡は、Cpn60.1のペプチド配列を用いる場合に回避される。このペプチドはまた、低濃度でTNF-α分泌を阻害するようであった(図21)。
【０１６２】
実施例7 - 非アレルギー性炎症のモデルにおけるCpn60.1
ヒト炎症細胞における阻害効果のため、本発明者らは、Cpn60.1がin vivo系において好中球動員を阻害することができるかどうかを調査した。これをさらに支持するために、Riffo-Vasquezらは、M. tuberculosisシャペロンが、アレルギー性炎症のマウスモデルにおいて好酸球動員および気管支過敏を抑制することができることを最近示した(Riffo-Vasquez Y, Spina D, Page Cら、Effect of Mycobacterium tuberculosis chaperonins on bronchial eosinophilia and hyper-responsiveness in a murine model of allergic inflammation. Clin. Exp Allergy, 2004; 34(5); 712-719)。
【０１６３】
メスのBalb/cマウスを、ポリミキシンB(5μg/ml)の非存在下で、またはLPS夾雑の効果を除外するためにポリミキシンB(5μg/ml)を用いる予備処理後に、3日間、Cpn60.1 (1μg/ml)で鼻内的に予備処理した。Cpn60.1の最後の投与の30分後、マウスをLPS (1μg/ml)で処理した。好中球流入および肺におけるTNF-α放出を、24時間後に気管支肺胞洗浄により決定した。LPSは、対照と比較して好中球増加の用量依存的増加を誘導した(図22)。興味深いことに、Cpn60.1で予備処理した群は、好中球増加の抑制を示したが、TNF-α分泌は有意に減衰しなかった(図24)。ポリミキシンBによるマウスの処理は、好中球動員を抑制するCpn60.1の能力に差異はなかったが、これはこの効果がLPSとの夾雑によっては説明することができないことを示している。Cpn60.1単独で処理したマウスにおいては好中球動員は観察されなかったが、LPSとの夾雑が好中球増加を引き起こすことができないことをさらに可能にする(図23)。
【０１６４】
実施例8 - 例示的医薬製剤
本発明の分子を単独で投与することができるが、1種以上の許容し得る担体と共に、医薬製剤としてそれを提供することが好ましい。この担体は、本発明の薬剤と適合可能であるという意味で「許容可能」であり、そのレシピエントにとって有害ではない必要がある。典型的には、前記担体は、滅菌されており、発熱源を含まない水または塩水であろう。
【０１６５】
以下の例は、活性成分が本発明の分子である本発明に従う医薬および医薬組成物を例示する。
【０１６６】
好ましくは、本発明の分子を10μg〜500 mgの量で提供する。10μg〜500 mgの本発明の分子の量を含む以下の例示的医薬および医薬組成物を調製することができることが理解されるであろう。例えば、本発明の分子を、従って変化する残りの成分の量を含む以下の例示的医薬および医薬組成物に示される10番目もしくは100番目または200番目または500番目の量で提供することができる。
【０１６７】
例A：錠剤
活性成分                    1 mg
ラクトース                  200 mg
デンプン                    50 mg
ポリビニルピロリドン        5 mg
ステアリン酸マグネシウム    4 mg
錠剤を、湿式造粒、次いで圧縮により前記成分から調製する。
【０１６８】
例B：点眼剤
活性成分                    1 mg
塩化ナトリウム、分析等級    0.9 g
チオマーサル                0.001 g
純水                        100 mlに
pH                          7.5に調整
【０１６９】
例C：錠剤製剤
以下の製剤AおよびBを、ポビドンの溶液と共に成分の湿式造粒、次いでステアリン酸マグネシウムの添加および圧縮により調製する。
【０１７０】
製剤A
mg/錠剤 mg/錠剤
(a)活性成分                             1          1
(b)ラクトースB.P.                      210        26
(c)ポビドンB.P.                        15         9
(d)グリコール酸ナトリウムデンプン       20         12
(e)ステアリン酸マグネシウム             5          3
−
251        51
製剤B
mg/錠剤 mg/錠剤
(a)活性成分                             1          1
(b)ラクトース                           150        -
(c)Avicel PH 101(登録商標)              60         26
(d)ポビドンB.P.                        15          9
(e)グリコール酸ナトリウムデンプン       20         12
(f)ステアリン酸マグネシウム             5          3
−
251        51
製剤C
mg/錠剤
活性成分                                1
ラクトース                              200
デンプン                                50
ポビドン                                5
ステアリン酸マグネシウム                4
−
260
【０１７１】
以下の製剤DおよびEを、混合した成分の直接的圧縮により調製する。製剤Eで用いられるラクトースは直接圧縮型のものである。
【０１７２】
製剤D
mg/カプセル
活性成分                                1
予備ゼラチン化デンプンNF15             150
−
151
製剤E
mg/カプセル
活性成分                                1
ラクトース                              150
Avicel(登録商標)                        100
−
251
【０１７３】
製剤F(制御放出製剤)
この製剤を、ポビドンの溶液と共に成分(以下に記載)の湿式造粒、次いでステアリン酸マグネシウムの添加および圧縮により調製する。
【０１７４】
mg/錠剤
(a)活性成分                             1
(b)ヒドロキシプロピルメチルセルロース  112
(Methocel K4M Premium)(登録商標)
(c)ラクトースB.P.                      53
(d)ポビドンB.P.C.                      28
(e)ステアリン酸マグネシウム            7
−
201
薬剤の放出は、約6〜8時間の期間にわたって起こり、12時間後に完了した。
【０１７５】
例D：カプセル製剤
製剤A
カプセル製剤を、上記の例Cの製剤Dの成分を混合し、2部分硬質ゼラチンカプセルに充填することにより調製する。製剤B(下記)を同様の様式で調製する。
【０１７６】
製剤B
mg/カプセル
(a)活性成分                             1
(b)ラクトースB.P.                      143
(c)グリコール酸ナトリウムデンプン       25
(d)ステアリン酸マグネシウム             2
−
171
製剤C
mg/カプセル
(a)活性成分                             1
(b)マクロゴール4000 BP                  350
−
351
カプセルを、マクロゴール4000 BPを融解させ、融解物中に活性成分を分散させ、融解物を2部分硬質ゼラチンカプセルに充填することにより調製する。
【０１７７】
製剤D mg/カプセル
活性成分                                1
レシチン                                100
ラッカセイ油                            100
−
201
カプセルを、レシチンおよびラッカセイ油中に活性成分を分散させ、分散物を軟質伸縮ゼラチンカプセルに充填することにより調製する。
【０１７８】
製剤E(制御放出カプセル)
以下の制御放出カプセル製剤を、押出機を用いて成分a、bおよびcを押出した後、押出物を球形化し、乾燥することにより調製する。次いで、乾燥ペレットを放出制御膜(d)でコーティングし、2部分硬質ゼラチンカプセルに充填する。
【０１７９】
mg/カプセル
(a)活性成分                             1
(b)微結晶セルロース                     125
(c)ラクトースBP                         125
(d)エチルセルロース                     13
−
264
【０１８０】
例E：注射用製剤
活性成分                                1 mg
滅菌、発熱物質非含有リン酸バッファー(pH 7.0)  10 mlに
活性成分をほとんどのリン酸バッファー(35〜40℃)に溶解した後、用量を作り、滅菌微孔性フィルターを通して滅菌10 ml琥珀色ガラスバイアル(1型)中に濾過し、滅菌ブタおよびオーバーシールを用いて密閉する。
【０１８１】
例F：筋肉内注射
活性成分                                1 mg
ベンジルアルコール                      0.10 g
Glucofurol 75(登録商標)                 1.45 g
注射用の水                              3.00 mlに
活性成分をグリコフロールに溶解する。次いで、ベンジルアルコールを添加し、溶解し、水を加えて3 mlにする。次いで、混合物を滅菌微孔性フィルターを通して濾過し、滅菌3 mlガラスバイアル(1型)中に密閉する。
【０１８２】
例G：シロップ懸濁液
活性成分                                1 mg
ソルビトール溶液                        1.5000 g
グリセロール                            2.0000 g
分散性セルロース                        0.0750 g
安息香酸ナトリウム                      0.0050 g
香料、桃17.42.3169                      0.0125 ml
精製水                                  5.0000 mlに
安息香酸ナトリウムを一部の精製水に溶解し、ソルビトール溶液を添加する。活性成分を添加し、分散させる。グリセロール中に増粘剤(分散性セルロース)を分散させる。2つの分散物を混合し、精製水を用いて必要な容量まで作る。懸濁液の追加の剪断により、必要に応じてさらなる濃縮を達成する。
【０１８３】
例H：坐剤
mg/坐剤
活性成分(63μm)*                              1
Hard Fat, BP(Witepsol H15 - Dynamit Nobel)    1770
−
1771
*活性成分を、少なくとも90％の粒子が63μm以下の直径のものである粉末として用いる。
【０１８４】
Witepsol H15の1/5を最大45℃で上記スチームジャケットパン中で融解させる。活性成分を200μmの篩いを通して篩い分けし、カッティングヘッドを固定したシルバーソンを用いて、滑らかな分散物が達成されるまで、混合しながら融解した基剤に添加する。混合物を45℃に維持し、残りのWitepsol H15を懸濁液に添加し、均質な混合物を確保するために攪拌する。全懸濁液を250μmのステンレススチール製スクリーンを通過させ、連続的に攪拌しながら、40℃に冷却させる。38℃〜40℃の温度で、2.02 gの混合物を好適なプラスチック型に充填する。坐剤を室温まで冷却させる。
【０１８５】
例I：ペッサリー
mg/ペッサリー
活性成分                                  1
無水デキストロース                        380
ジャガイモデンプン                        363
ステアリン酸マグネシウム                  7
−
751
上記の成分を直接混合し、得られた混合物の直接圧縮によりペッサリーを調製する。
【０１８６】
実施例9 - 本発明の分子を用いる非癌障害の治療
関節炎を有する患者に、1日あたり1 mgの本発明の薬剤を筋肉内的に投与するか、または本発明の方法に従ってこの用量を送達するデポー調製物を投与する。
【０１８７】
実施例10 - 疼痛緩和の方法
本発明の分子は、以下の疼痛の発生における有効な疼痛緩和を提供するであろう：背痛、頭痛、歯痛、耳痛、関節炎、痛風、軟組織外傷、靱帯／腱の外傷性損傷、骨折、癌、術後疼痛、月経痛、分娩痛、腎臓管疼痛、内臓痛、熱傷、膿瘍および他の感染症。
【０１８８】
これらの症状のいずれかの治療のための提唱された治療経路および治療計画は、吸入器を介して送達される吸入による12時間毎に1回の0.1 mg〜1 gの投与である。しかしながら、当業者であれば、多くの好適な治療計画は、個人および感じられる疼痛の重篤度に依存することを知っているであろう。
【図１】
2014158471.tif 000004
【図２】
2014158471.tif 000005
【図３】
2014158471.tif 000006
【図４】
2014158471.tif 000007
【図５】
2014158471.tif 000008
【図６】
2014158471.tif 000009
【図７】
2014158471.tif 000010
【図８】
2014158471.tif 000011
【図９】
2014158471.tif 000012
【図１０】
2014158471.tif 000013
【図１１】
2014158471.tif 000014
【図１２】
2014158471.tif 000015
【図１３】
2014158471.tif 000016
【図１４】
2014158471.tif 000017
【図１５】
2014158471.tif 000018
【図１６】
2014158471.tif 000019
【図１７】
2014158471.tif 000020
【図１８】
2014158471.tif 000021
【図１９】
2014158471.tif 000022
【図２０】
2014158471.tif 000023
【図２１】
2014158471.tif 000024
【図２２】
2014158471.tif 000025
【図２３】
2014158471.tif 000026
【図２４】
2014158471.tif 000027
【図２５−１】
2014158471.tif 000028
【図２５−２】
2014158471.tif 000029
【図２５−３】
2014158471.tif 000030
【配列表】
2014158471000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成26年4月18日(2014.4.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のポリペプチド配列：
DGSVVVNKVSELPAGHGLNVNTLSYGDLAAD
からなる単離された、または組換えペプチド分子。
【請求項２】
以下のポリペプチド配列：
DGSVVVNKVSELPAGHGLNVNTLSYGDLAAD
をコードするポリヌクレオチド配列からなる単離された、または組換え核酸分子。
【請求項３】
請求項１に記載のペプチド分子または請求項２に記載の核酸分子を含む医薬組成物。
【請求項４】
さらに製薬上許容し得る賦形剤を含む、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
炎症症状の予防および／または治療のための、請求項３または４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
炎症症状が、急性炎症症状である、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
関節炎、好ましくは慢性関節リウマチ、；湿疹、皮膚炎、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎などのアレルギー症状；アレルギー性気道疾患；好酸球増加症候群；接触皮膚炎、食物アレルギー；ならびにアレルギー喘息、内因性喘息、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、好酸球性肺炎、アレルギー性気管支炎気管支拡張症、職業性喘息、反応性気道疾患症候群、間質性肺疾患、好酸球増加症候群、寄生性肺疾患などの好酸球性気道炎症および気道過敏症を特徴とする呼吸器疾患から選択される炎症症状の予防および／または治療のための、請求項３または請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項８】
症状が関節炎またはアレルギー性気道疾患である、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
炎症症状が：感染に関連する暗示(敗血性ショック、敗血症もしくは全身性炎症応答症候群(SIRS)など)、虚血-再かん流障害、内毒素致死性、関節炎、補体媒介性超急性拒絶、腎炎、サイトカインもしくはケモカイン誘導性肺損傷、炎症性腸疾患、クローン病またはTNFもしくはIL-1などのサイトカインの過剰産生の結果からなる群より選択される、請求項５に記載の医薬組成物。
【外国語明細書】
2014158471000001.pdf