(57)【要約】【課題】優れた線維芽細胞増殖促進作用を有し、安定性および皮膚に対する高い安全性を有する成分を有効成分とする線維芽細胞増殖促進剤、抗老化剤、シワ・たるみ改善剤、および保湿剤を提供することを課題とする。【解決手段】海洋細菌の産生する酸性ムコ多糖類またはその生理学的に許容される塩もしくは誘導体を有効成分として含有する線維芽細胞増殖促進剤、抗老化剤、シワ・たるみ改善剤、および保湿剤。【選択図】図１
2014001148.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の一般式（１）
【化１】
2014001148.tif 000015
（上記の構造式において、GlcNAcpはピラノース型Ｎ-アセチルグルコサミン残基を、GlcUApはピラノース型グルクロン酸残基を、Gluはグルタミン酸を、ＤはＤ型を、ＬはＬ型を、ｎはゲル濾過クロマトグラフィーで測定した平均分子量がプルランを標準として１００万〜１５０万であることを示す繰り返しの数をそれぞれ表す。）で表される酸性ムコ多糖類またはその生理学的に許容される塩もしくは誘導体を有効成分として含有することを特徴とする線維芽細胞増殖促進剤。
【請求項２】
皮膚外用剤である請求項１に記載の線維芽細胞増殖促進剤。
【請求項３】
美容用飲食品である請求項１に記載の線維芽細胞増殖促進剤。
【請求項４】
次の一般式（１）
【化２】
2014001148.tif 000016
（上記の構造式において、GlcNAcpはピラノース型Ｎ-アセチルグルコサミン残基を、GlcUApはピラノース型グルクロン酸残基を、Gluはグルタミン酸を、ＤはＤ型を、ＬはＬ型を、ｎはゲル濾過クロマトグラフィーで測定した平均分子量がプルランを標準として１００万〜１５０万であることを示す繰り返しの数をそれぞれ表す。）で表される酸性ムコ多糖類またはその生理学的に許容される塩もしくは誘導体を有効成分として含有することを特徴とする抗老化剤。
【請求項５】
シワ・たるみ改善剤である請求項４に記載の抗老化剤。
【請求項６】
皮膚外用剤である請求項４または５に記載の抗老化剤。
【請求項７】
美容用飲食品である請求項４または５に記載の抗老化剤。
【請求項８】
次の一般式（１）
【化３】
2014001148.tif 000017
（上記の構造式において、GlcNAcpはピラノース型Ｎ-アセチルグルコサミン残基を、GlcUApはピラノース型グルクロン酸残基を、Gluはグルタミン酸を、ＤはＤ型を、ＬはＬ型を、ｎはゲル濾過クロマトグラフィーで測定した平均分子量がプルランを標準として１００万〜１５０万であることを示す繰り返しの数をそれぞれ表す。）で表される酸性ムコ多糖類またはその生理学的に許容される塩もしくは誘導体を有効成分として含有することを特徴とする保湿剤。
【請求項９】
皮膚外用剤である請求項８に記載の保湿剤。
【請求項１０】
美容用飲食品である請求項８に記載の保湿剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、海洋細菌の産生する酸性ムコ多糖類を有効成分として配合した線維芽細胞増殖促進剤、抗老化剤、シワ・たるみ改善剤、および保湿剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
皮膚の表皮および真皮は、表皮細胞、線維芽細胞および細胞外マトリックスにより構成され、線維芽細胞は結合組織を形成し、皮膚において重要な役割を果たしている。皮膚組織の相互作用が恒常性を保つことにより水分保持、柔軟性、弾力性等が確保され、肌は外見的にも張り、艶、キメがあってみずみずしい状態に維持される。
【０００３】
加齢、紫外線、空気乾燥等、ある種の外的因子の影響があると、線維芽細胞の増殖能が低下し、細胞外マトリックスの産生量が減少するとともに、老化架橋による弾力性低下を引き起こす。その結果、肌は保湿性や弾力性が低下し、張りや艶を失い、肌荒れ、シワ形成、くすみ、キメの消失等の皮膚の老化症状を呈するようになる。このように、皮膚の老化に伴う変化には線維芽細胞の増殖能の低下が深く関与していると考えられている。
【０００４】
このような知見に基づき、線維芽細胞を増殖させることによって、皮膚の老化を防止または改善することを目的として、安全性の高い天然物由来の線維芽細胞増殖促進作用を有する種々の成分や抽出物が提案されている。
【０００５】
例えば、ハス胚芽抽出物（特許文献１）、月桃抽出物（特許文献２）、カカオ豆抽出物（特許文献３）、およびその他の植物体またはその抽出物（特許文献４、特許文献５）等が提案されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００２−２９９８０号公報
【特許文献２】特開２００２−３３９０号公報
【特許文献３】特開２００８−２０８０５３号公報
【特許文献４】特開２０１１−１９５５３３号公報
【特許文献５】特開２００８−９４７３９号公報
【特許文献６】特願２０１２−５７１８５号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、上記抽出物において線維芽細胞の増殖を促進する具体的な化合物は未だほとんど特定されていない。
【０００８】
そのため未利用資源の更なる開発による線維芽細胞の増殖促進作用を有する天然系の成分が強く望まれているのが現状である。
【０００９】
そこで、本発明は、今まで探索の遅れていた海洋微生物の産生する安全性の高い天然物の中から、線維芽細胞増殖促進作用を有するものを見出し、それを有効成分とする線維芽細胞増殖促進剤、抗老化剤、シワ・たるみ改善剤、および保湿剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決するため、未利用資源の豊富な海洋微生物の産生する安全な多糖類の中から、線維芽細胞増殖促進作用を有するものについて鋭意研究を重ねた結果、海洋細菌の産生する酸性ムコ多糖類が線維芽細胞増殖促進作用を有すること、そして、それを有効成分とすることにより、皮膚の老化の予防または改善に有効な線維芽細胞増殖促進剤、抗老化剤、シワ・たるみ改善剤、および保湿剤が得られることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
即ち、本発明は海洋細菌の産生する酸性ムコ多糖類またはその生理学的に許容される塩もしくは誘導体を有効成分として含有することを特徴とする線維芽細胞増殖促進剤、抗老化剤、シワ・たるみ改善剤、および保湿剤に関する。
【００１２】
本発明の線維芽細胞増殖促進剤、抗老化剤、シワ・たるみ改善剤、および保湿剤は、下記式（１）により表わされる本酸性ムコ多糖類またはその生理学的に許容される塩もしくは誘導体（以下「本酸性ムコ多糖類」と記す）を有効成分として含有することを特徴とする。
【００１３】
【化１】
2014001148.tif 000003
（上記の構造式において、GlcNAcpはピラノース型Ｎ-アセチルグルコサミン残基を、GlcUApはピラノース型グルクロン酸残基を、Gluはグルタミン酸を、ＤはＤ型を、ＬはＬ型を、ｎはゲル濾過クロマトグラフィーで測定した平均分子量がプルランを標準として１００万〜１５０万であることを示す繰り返しの数をそれぞれ表す。）
【００１４】
海洋細菌が産生する本酸性ムコ多糖類を有効成分とする線維芽細胞増殖促進剤は、線維芽細胞に対して細胞毒性を示すことなく線維芽細胞の増殖を促進する。本酸性ムコ多糖類はまた、シワ・たるみ改善効果および保湿効果も有する。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の線維芽細胞増殖促進剤は、海洋細菌の産生する本酸性ムコ多糖類を含有することにより、安全性が高く、また保湿性に富み優れた線維芽細胞増殖促進作用を発揮することができるため、線維芽細胞増殖促進剤、抗老化剤、シワ・たるみ改善剤、および保湿剤として、これまでの多糖類にない有用性を備えている。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、ヒト皮膚線維芽細胞の増殖に対する本酸性ムコ多糖類の影響を示したものである。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下に実施形態を挙げて本発明を説明するが、本発明は以下の実施形態に限定されない。
【００１８】
本酸性ムコ多糖類は、マウスメラノーマのメラニン生成抑制作用を有し、その誘導体に抗ウイルス作用を有することが知られているが、これを皮膚の線維芽細胞増殖促進剤として使用したという報告は、現在までに全く知られていないものである。
【００１９】
本発明において、線維芽細胞増殖促進剤とは、皮膚の線維芽細胞の増殖を促進させることによって皮膚の老化の予防または治療に有効な組成物である。本発明の線維芽細胞増殖促進剤は、皮膚外用剤組成物または経口用組成物であって、化粧品や医薬部外品、および医薬品としてのローション、乳液、クリーム、パック剤、石鹸等の薬用化粧品、および医薬品としてのローション、乳液、クリーム、軟膏等の皮膚外用剤、ならびに美容用飲食品などの経口剤を含むものである。
【００２０】
本発明の線維芽細胞増殖促進用皮膚外用剤組成物は、有効成分である本酸性ムコ多糖類と、皮膚外用剤に一般に用いられている各種成分、例えば、油分、界面活性剤、紫外線吸収剤、アルコール、保湿剤、防腐剤、殺菌剤、色剤、粉末、香料、増粘剤、緩衝剤などを、その剤形にあわせ、本発明の効果を損なわない範囲で適宜配合することにより調製される。
また、本発明の線維芽細胞増殖促進用経口用組成物は、有効成分である本酸性ムコ多糖類と、経口用組成物に一般的に用いられている各種成分、例えば、賦形剤、防腐剤、色剤、香料などとを、その剤形に合わせ、本発明の効果を損なわない範囲で適宜配合することにより調製される。
【００２１】
本発明の線維芽細胞増殖促進用皮膚外用剤組成物に、本酸性ムコ多糖類を配合するに当たっては、これら化合物の線維芽細胞増殖促進作用ならびに皮膚の角質透過性等を考慮することが好ましく、一般にはこれら化合物を有効成分として少なくとも０．００１重量％以上、好ましくは０．０１〜２０．０重量％程度添加すればよい。必ずしも有効成分を単離して使用する必要はなく、必要に応じて本発明の効果を損なわない範囲で、本発明の化合物を含む粗精製物を使用することができる。
【００２２】
本発明の線維芽細胞増殖促進用皮膚外用剤組成物の剤型は任意であり、例えば化粧水等の可溶化系、乳液またはクリーム等の乳化系、あるいは軟膏または分散液などの剤型をとることができる。
また、本発明の線維芽細胞増殖促進用経口剤の剤型は任意であり、例えば錠剤、カプセル剤、液剤、シロップ剤、粉末剤、ゼリー剤などの剤型をとることができる。
こうして所望の線維芽細胞増殖促進効果、例えば顔などのシワの発生を防ぐことができ、また既に生成しているシワの改善に使用できる線維芽細胞増殖促進剤が提供される。
【００２３】
（有効成分）
本発明で使用される本酸性ムコ多糖類は、医薬として使用できる程度に精製されたものであれば、種々の方法で調製されたものを用いることができる。本酸性ムコ多糖類の調製方法としては、各種の方法が知られている。例えば、海洋微生物を炭素源として蔗糖、窒素源としてペプトン、酵母エキスを含有し海水で調製した培地で培養して産生する多糖類を採取、精製して得ることができる。
【００２４】
本酸性ムコ多糖類の産生に用いられる微生物としては、多糖類を産生しうるものであれば特に制限なく使用することができる。好ましくは海洋微生物、さらに好ましくは本酸性ムコ多糖類を産生する能力のある海洋微生物が用いられる。具体的にはコベチア（Ｃｏｂｅｔｉａ）属細菌が挙げられ、より具体的にはコベチア（Ｃｏｂｅｔｉａ）属に属し寄託番号がＦＥＲＭ Ｐ-２１２９７として寄託されている菌株またはその変異株が挙げられる。本菌株は本発明者らが瀬戸内海において海水より分離した海洋性細菌であり、その分類学的特性は、特許文献６に記載されている。
【００２５】
本酸性ムコ多糖類を産生する微生物を培養する基本培地としては、多糖類を産生しうる微生物が生育できるものであって、少なくとも炭素源と、窒素源と、各種無機塩と、および微量元素とを適量含有するものが用いられる。さらに好ましくは、前記基本培地として、コベチア（Ｃｏｂｅｔｉａ）属に属する微生物が生育できるものが用いられる。炭素源としては、グルコース、フラクトース、ガラクトース、シュクロース等の糖、あるいは糖蜜や廃糖蜜が挙げられる。炭素源として１種または２種以上を単独で、または組み合わせて用いることができる。窒素源としては、硝酸塩、アンモニウム塩等の化合物やペプトン、酵母エキス、アミノ酸などの天然物が挙げられる。窒素源として１種または２種以上を単独でまたは組み合わせて用いることができる。無機塩としては、例えば、リン酸塩、マグネシウム塩、カリウム塩等が挙げられる。無機塩として１種または２種以上を単独でまたは組み合わせて用いることができる。固体培地の場合には寒天を用いる。
【００２６】
使用する培地、培地のｐＨ、培地への添加物、培養温度などの培養条件は、通常微生物の培養の際に用いられている条件に従って設定することができる。
【００２７】
本発明における培養条件は、培養時のｐＨは微生物が生育し、かつ多糖類を産生する範囲であれば制限されないが、通常は６から７．５の範囲のｐＨが好ましい。培養温度については微生物が生育し、かつ多糖類を産生する範囲であれば制限されないが、２５℃から３０℃の範囲が多糖類の産生には良好である。培養期間は培養のｐＨや温度により変化するが、通常２日から５日が適切である。
【００２８】
上述した培地と微生物を用いて従来法を用いて微生物を培養することにより、本発明の有効成分である本酸性ムコ多糖類が効率的に産生されることとなる。
【００２９】
本発明に用いられる本酸性ムコ多糖類は、構成糖のモル比がＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン：Ｄ−グルクロン酸：Ｌ−グルタミン酸が２：１：１（モル濃度比）で、ゲル濾過クロマトグラフィーで測定した平均分子量がプルランを標準として１００〜１５０万であることが好ましい。構成成分の分析には、セルロースアセテート膜電気泳動、または高速液体クロマトグラフィーを用いることができる。この構成成分の分析には、多糖類を２Ｍのトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、または４Ｎ-ＨＣｌで１００℃、１２時間加水分解し、ロータリーエバポレイターでＴＦＡまたはＨＣｌを除いたものを検体とし、中性糖、ウロン酸、有機酸、アミノ酸およびアミノ糖の分析を行う。構成有機酸の分析にはこの他に酵素法を用いることができる。
【００３０】
本酸性ムコ多糖類の分子量の測定は、ゲル濾過クロマトグラフィー法を用いることができる。具体的には、Ａｓａｈｉｐａｋ ＧＦＡ-７Ｍ（昭和電工社製）をカラムとする高速液体クロマトグラフィー（島津製作所社製）を使用し、０．１Ｍ-ＮａＣｌを移動相とし、分子量既知のプルラン（Ｓｈｏｄｅｘ ＳＴＡＮＤＡＲＤ ＫＩＴ Ｐ-８２、昭和電工社製）を標準サンプルとして作成した分子量保持時間標準曲線を使用して測定することができる。
【００３１】
（有効成分の製造方法）
次に、本発明の線維芽細胞増殖促進剤の有効成分である本酸性ムコ多糖類の製造方法について、好ましい実施形態を挙げて説明する。尚、本酸性ムコ多糖類の生産方法は以下の製法に限定されない。
好ましい一実施形態としての本酸性ムコ多糖類の製造方法は、（ａ）培地において微生物を培養し多糖類を産生する工程と、（ｂ）産生された本酸性ムコ多糖類を抽出・回収する工程とを有する。
【００３２】
続いて、上述の実施形態を各工程毎に詳細に説明していく。
上述した本発明の線維芽細胞増殖促進剤の有効成分である本酸性ムコ多糖類の製造に適した培地を用いることが望ましく、その際に炭素源として蔗糖、窒素源としてペプトン、酵母エキスを用いることがより望ましい。
（ａ）培地において微生物を培養し多糖類を産生する工程
上述のようにして調製した培地を用いて微生物を培養して目的の多糖類を産生させるわけであるが、本酸性ムコ多糖類を得るためには微生物としてコベチア（Ｃｏｂｅｔｉａ）属の細菌を用いることが好ましい。さらに好ましくはコベチア（Ｃｏｂｅｔｉａ）属に属し寄託番号がＦＥＲＭ Ｐ-２１２９７として寄託されている菌株またはその変異株を用いることが望ましい。微生物として該菌株またはその変異株を用いることで、本酸性ムコ多糖類を効率的に産生することができる。
そして、以下に説明する抽出・回収工程を経ることにより高純度の本酸性ムコ多糖類を高収率で得ることが可能となる。
【００３３】
（ｂ）産生された所定の多糖類を抽出・回収する工程
上記製造方法で得られた培養液から本酸性ムコ多糖類を抽出する方法としては、当技術分野において知られている方法を用いることができる。例えば、培養液をそのまま、あるいは高温で殺菌した後で、遠心分離により菌体を除去し、これをそのまま、あるいは濃縮してから、２〜３倍量のエタノール、イソプロパノール、あるいはアセトン等を加え、沈殿を生じさせる。この沈殿物を再度、水あるいは１〜１５％塩化ナトリウム溶液に溶解させた後で、アルコール等による沈殿を２〜３回繰り返し、水で透析を行い、噴霧乾燥や凍結乾燥機等を用いて乾燥させることにより、本酸性ムコ多糖類を得る。これ以外にも電気透析法や限外濾過法も利用することができる。さらに精製するためには、イオン交換、ゲル濾過等の各種クロマトグラフィーや、第４級アンモニウム塩による沈殿や塩析などを用いることができる。
【００３４】
かくして本酸性ムコ多糖類が産生および回収されることになる。本発明により得られる本酸性ムコ多糖類は特に制限なく種々の用途に使用されうるものであるが、好ましくは上述の線維芽細胞増殖促進剤、抗老化剤、シワ・たるみ改善剤、および保湿剤として好適に用いられる。
【００３５】
ここで、本酸性ムコ多糖類は下記構造単位を有するものである。
【化２】
2014001148.tif 000004
(上記の構造式において、GlcNAcpはピラノース型Ｎ-アセチルグルコサミン残基を、GlcUApはピラノース型グルクロン酸残基を、Gluはグルタミン酸を、ＤはＤ型を、ＬはＬ型を、ｎはゲル濾過クロマトグラフィーで測定した平均分子量がプルランを標準として１００万〜１５０万であることを示す繰り返しの数をそれぞれ表す。) 
【００３６】
本発明では、有効成分として少なくとも０．００１重量％以上、好ましくは、０．０１〜２０重量％の本酸性ムコ多糖類を線維芽細胞増殖促進剤に配合する。この本酸性ムコ多糖類を有効成分として含有する線維芽細胞増殖促進剤は、通常使用されている皮膚外用剤基材を使用することにより、クリーム、乳液、化粧水等の適当な形態とすることができる。さらに、紫外線吸収剤、紫外線散乱剤、アルブチン等のメラニン合成抑制剤、その他の薬効成分、増粘剤、可塑剤、着色料、香料等、任意の添加物をこの線維芽細胞増殖促進剤に含有させることができる。なお、本発明の線維芽細胞増殖促進剤の有効成分である本酸性ムコ多糖類については、皮膚に対する毒性も刺激も無く、副作用も無い。また一般に多糖類には保湿効果があることおよび本酸性ムコ多糖類には天然の保湿因子として知られているグルタミン酸が含まれていることからして、本酸性ムコ多糖類を有効成分として含む本発明の線維芽細胞増殖促進剤は、線維芽細胞増殖促進効果に加えて好ましい保湿効果を有する。
【００３７】
本酸性ムコ多糖類は、線維芽細胞増殖促進作用や保湿効果を有しており、安全性にも優れているため、美容用飲食品をはじめ、健康用飲食品や機能性飲食品などに配合するのにも好適である。
【００３８】
本酸性ムコ多糖類を美容用飲食品に配合する場合、それらにおける有効成分の配合量は、使用目的、症状、性別等を考慮して適宜変更することができるが、添加対象飲食品の一般的な摂取量を考慮して、成人１日あたりの本酸性ムコ多糖類の摂取量が約１〜１０００ｍｇになるようにするのが好ましい。
【００３９】
本発明の美容用飲食品は、本酸性ムコ多糖類をその活性を妨げないような任意の飲食品に配合したものであってもよいし、本酸性ムコ多糖類を主成分とする栄養補助飲食品であってもよい。
【００４０】
以上説明した本発明の線維芽細胞増殖促進剤、皮膚外用剤および美容用飲食品は、ヒトに対して好適に適用されるものであるが、それぞれの作用効果が奏される限り、ヒト以外の動物に対しても適用することもできる。
【実施例】
【００４１】
次に実施例を挙げ、本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれら実施例になんら制約されるものではない。尚、特記しない限り、百分率（％）は重量基準である。
【００４２】
（実施例１）
ペプトン０．５％、酵母エキス０．１％、蔗糖３％の組成を有し海水で調製した培地を、温度１２１℃としたオートクレーブ中で１５分間滅菌し、本菌株（ＦＥＲＭ Ｐ-２１２９７）の斜面培養から、１白金耳を試験管中の上記滅菌培地（１０ｍｌ）に接種し、２５℃の温度で２４時間静置培養を行い、次いでこの前培養液を５００ｍｌ容の三角フラスコ中に上記組成の培地１００ｍｌ(１２１℃、１５分間滅菌)に接種し、２５℃の温度で３日間の静置培養を行った。培養後培養液を遠心分離した後濾過助剤（ラヂオライト＃５００）を用いてＧＦ-７５濾紙（Ａｄｖａｎｔｅｃ社製）で濾過し、菌体を除いた培養濾過液から分子量５万カットの中空糸ＵＦ膜モジュール(Ｓｐｅｃｔｒｕｍ社製)を備えた膜濾過装置により得られる高分子画分を短時間のうちに濃縮、脱塩回収し、活性炭処理し、凍結乾燥により粉末化した。膜濾過装置は東洋紡エンジニアリング社製ＳＹＬＳ-ＳＢ０４型を用いた。
このようにして得られた多糖画分については、セルロースアセテート膜電気泳動を用いて均一性を確認すると共に、ＤＥＡＥ-セルロースイオン交換カラムクロマト分析、化学分析、核磁気共鳴分析により、公知の本酸性ムコ多糖類であることを確認した。
【００４３】
（実施例２）
前培養までは実施例１と同様に処理し、次いでこの前培養液を５００ｍｌ容の三角フラスコ中に上記組成を有する海水から調製した滅菌培地１００ｍｌ（１２１℃、１５分間）に接種し、２５℃の温度で３日間振とう培養を行った。次いで培養液を遠心分離した後濾過助剤（ラヂオライト＃５００）を用いてＧＦ-７５濾紙（Ａｄｖａｎｔｅｃ社製）で濾過し、菌体を除いた培養濾液から分子量５万カットの中空糸ＵＦ膜モジュール（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ社製）を備えた膜濾過装置により得られる高分子画分を短時間のうちに濃縮、脱塩回収し、活性炭処理し、凍結乾燥により粉末化した。膜濾過装置は東洋紡エンジニアリング社製ＳＹＬＳ-ＳＢ０４型を用いた。このようにして得られた多糖画分については、セルロースアセテート膜電気泳動を用いて均一性を確認すると共に、ＤＥＡＥ-セルロースイオン交換カラムクロマト分析、化学分析、核磁気共鳴分析により、公知の本酸性ムコ多糖類であることを確認した。
【００４４】
（実施例３）
前培養までは実施例１と同様に処理し、上記実施例２で述べた培地に寒天を１．５％添加した寒天平板培地２５０ｍｌを平板（１８×２６ｃｍ）に広げて前培養液を塗沫し、２５℃の温度で４日間培養を行った。寒天平板の表面に生じた粘質物をかきとり、１％フェノール液に懸濁させ、遠心分離した後濾過助剤（ラヂオライト＃５００）を用いてＧＦ-７５濾紙で濾過し、菌体を除いた上澄液にエタノールを加えて沈殿する画分を集め、水に溶解後再度エタノールを加えて沈殿する画分を集め、水に溶解後透析した。次いで活性炭処理し、凍結乾燥により多糖画分を得た。このようにして得られた多糖画分については、セルロースアセテート膜電気泳動を用いて均一性を確認すると共に、ＤＥＡＥ-セルロースイオン交換カラムクロマト分析、化学分析、核磁気共鳴分析により、公知の本酸性ムコ多糖類であることを確認した。
【００４５】
（実施例４）
（ヒト線維芽細胞培養細胞株による細胞増殖試験）
実施例１で得られた本酸性ムコ多糖類を使用して、線維芽細胞に対する細胞増殖におよぼす影響を調べ、試料無添加の場合（対照）およびヒアルロン酸ナトリウム（ＨＡ）添加の場合と比較して試料添加系での細胞増殖率を求めた。
【００４６】
（細胞培養）
（１）前培養したヒト線維芽細胞（クラボウ社製）を９６穴マルチウェルプレートの各ウェルに１．０ｘ１０４細胞／ウェルの細胞数に播種した。播種２４時間後、所定濃度の被験物質を含むＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ培地に交換した。被験物質の濃度は、０ｍｇ/ｍｌ（対照）、２．５ｍｇ/ｍｌ、５．０ｍｇ/ｍｌに設定した。また、比較試料として、ヒアルロン酸ナトリウム（ＨＡ；５．０ｍｇ/ｍｌ、分子量１００万、和光純薬社製）も用いた。各試料濃度毎に３ウェルを割り当てアッセイに供した（Ｎ＝３）。細胞増殖計数用のプレート２枚を１組として各試料のアッセイに使用した。培地交換後、７２時間培養を続けた。
（２）各ウェル内の細胞数（相対値）をＭＴＴ法を用いマイクロプレートリーダー（ＢＩＯ ＲＡＤ社製）で５７０-６３０ｎｍの吸光度を測定することにより、細胞の生育度を測定した。被験物質を含まない対照の値を１００とした時の各試料の値（相対値）を求めた。これらの結果を図１に示す（平均値±ＳＥ）。
【００４７】
図１から明らかなように、対照と比較してＨＡでは繊維芽細胞の増殖促進は確認されなかったが、本酸性ムコ多糖類には線維芽細胞の増殖促進作用が認められた。
【００４８】
（処方例１）
実施例１で得られた本酸性ムコ多糖類を使用して、常法により、処方例１に示す化粧水を調製した。また、比較例として比較例１に示す化粧水を調製した。
【００４９】
【表１】
2014001148.tif 000005
【００５０】
（実施例５）
（角質水分保持試験）
処方例１および比較例１で調製した化粧水を用いて角質水分保持試験を行った。
【００５１】
（評価試験）
２０歳代〜５０歳代の健常人５名のモニターを任意に抽出したのち、被験者を室温２５℃、湿度５０％の人工環境室に６０分間馴化後、５名の前腕内側部に２ｃｍ角の正方形を２つずつ書き、皮表角質水分量計（Ｉ.Ｂ.Ｓ.製ＳＫＩＣＯＮ-２００ＥＸ）で各正方形において３回ずつ電気伝導度を測定した。その後、各正方形に処方例１および比較例１で調製した化粧水をそれぞれ２０μｌ塗布した。塗布前および塗布３時間後に電気伝導度（μＳ）を測定し、角質水分保持増加量の平均値を求めた。肌の水分量が多いほど電気伝導度（μＳ）の値が大きくなる。これを利用して角質水分保持量を評価し表２に示した（平均値±ＳＥ）。
【００５２】
結果を表２に示す。
【表２】
2014001148.tif 000006
【００５３】
表２に示すように、本酸性ムコ多糖類を配合した場合の被験者の角質水分保持量はすべての被験者で本酸性ムコ多糖類を配合しない比較例１の場合に比べて明らかに大きい値を示した。かかる結果からも、化粧水に本酸性ムコ多糖類を配合することにより、好適に角質水分量を保持していることが理解できる。
【００５４】
図１や表２から明らかなように、本酸性ムコ多糖類の添加により線維芽細胞の増殖促進効果や角質水分保持が認められ本酸性ムコ多糖類は、優れた線維芽細胞増殖作用や角質水分保持作用を有しており、線維芽細胞増殖促進剤、抗老化剤、シワ・たるみ改善剤、および保湿剤として有用である。
【００５５】
本発明に係る線維芽細胞増殖促進剤、抗老化剤、シワ・たるみ改善剤、および保湿剤は上述のように種々の剤型で使用されるが、例示として、上述の処方例１（化粧水）に加えて、美容液、クリーム、乳液、石けん、乳化型ファンデーションおよび浴用剤の処方例を処方例２〜７として、美容用飲食品の処方例を処方例８および９として下記に説明する。
【００５６】
処方例２(美容液)
下記成分により常法で美容液を調製した。
【表３】
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【００５７】
処方例３(クリーム)
下記成分Ａ、別に成分Ｂを加温溶解させてそれぞれＡ液およびＢ液とし、Ａ液にＢ液を加えて乳化し、撹拌しながら冷却し、クリームを調製した。
【表４】
2014001148.tif 000008
【００５８】
処方例４(乳液)
下記成分Ａ、別に成分Ｂを加温溶解させてそれぞれＡ液およびＢ液とし、Ａ液にＢ液を加えて乳化し、撹拌しながら冷却し、乳液を調製した。
【表５】
2014001148.tif 000009
【００５９】
処方例５(石けん)
石けん製造の常法により下記成分を混合して石けんを製造した。
【表６】
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【００６０】
処方例６(乳化型ファンデーション)
下記成分Ａを充分に混合粉砕した粉末部Ａとし、成分ＢをＢ液、成分ＣをＣ液とする。Ｃ液を加温攪拌後、Ａを添加しホモミキサー処理し、さらに加温混合したＢ液を加えてホモミキサー処理する。攪拌しながら室温まで冷却して乳化型ファンデーションを調製した。
【表７】
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【００６１】
処方例７(浴用剤)
下記成分により常法で浴用剤を調製した。
【表８】
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【００６２】
処方例８(錠剤)
下記成分Ａをそれぞれ篩過して混合し、次に成分Ｂを添加して混合した。その後、常法により打錠して、全量が６００ｍｇの錠剤を得た。
【表９】
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【００６３】
処方例９(清涼飲料)
下記成分により常法で清涼飲料を調製した。
【表１０】
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【産業上の利用可能性】
【００６４】
本発明の線維芽細胞増殖促進剤、抗老化剤、シワ・たるみ改善剤、および保湿剤は、線維芽細胞の増殖能の低下に伴う皮膚の老化症状の予防または改善に有用な皮膚外用剤および美容用飲食品などに利用できる。
【受託番号】
【００６５】
なお、本実施例において用いられた上記のＦＥＲＭ Ｐ-２１２９７菌株は、日本国独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター 〒３０５−８５６６ 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６ に寄託し、平成１９年５月１６日 受託番号 ＦＥＲＭ Ｐ-２１２９７として受託されたものである。
【図１】
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