(57)【要約】【課題】癌細胞を特異的に接着させることができる膜、上記の膜を備える基体及び細胞の採取方法を提供する。【解決手段】下記一般式（１）で表される構造単位を含むポリマーを材料に含む膜、上記の膜を備える基体及び細胞の採取方法。2014052309.tif 000006［式中、Ｒ１は水素原子又はメチル基である。］【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（１）で表される構造単位を含むことを特徴とするポリマーを材料に含むことを特徴とする膜。
【化１】
2014052309.tif 000005
［式中、Ｒ１は水素原子又はメチル基である。］
【請求項２】
前記ポリマーの数平均分子量が１０，０００〜３００，０００であることを特徴とする請求項１に記載の膜。
【請求項３】
癌細胞の採取用であることを特徴とする請求項１又は２に記載の膜。
【請求項４】
少なくとも表面の一部に請求項１〜３のいずれか一項に記載の膜を備えることを特徴とする基体。
【請求項５】
金属からなることを特徴とする請求項４に記載の基体。
【請求項６】
前記金属は、銅、ニッケル、銅及びニッケルの合金並びにこれらの表面が金めっきされたものからなる群より選択されるものであることを特徴とする請求項５に記載の基体。
【請求項７】
前記基体は、電気鋳造法によって形成されたものであることを特徴とする請求項５又は６に記載の基体。
【請求項８】
請求項４〜７のいずれか一項に記載の基体を体液に接触させることにより体液中の細胞を基体に接着させるステップを含むことを特徴とする細胞の採取方法。
【請求項９】
前記体液は、末梢血であることを特徴とする請求項８に記載の細胞の採取方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、膜、基体及び細胞の採取方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌細胞濃縮の研究・臨床的意義は極めて大きく、血液中の癌細胞を濃縮することができれば、癌の診断に応用することができる。例えば、癌の予後および治療の最も重要な要因は、初診時および処置時における癌細胞の転移の有無である。癌細胞の初期の拡散が末梢血中に及んだ場合、血中循環癌細胞（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  Ｔｕｍｏｒ  Ｃｅｌｌ、以下、場合により「ＣＴＣ」という。）を検出することは、癌の病状進行を判断する有用な手段である。
【０００３】
しかしながら、転移が始まった一般的な癌患者の場合、血液中１００億個の血球細胞あたり、ＣＴＣはおよそ１個程度存在しているに過ぎない。これに対し、血液中には、赤血球や白血球等の血液成分が圧倒的に多く存在する。したがって、極低濃度のＣＴＣを濃縮し、高感度、高効率及び高特異的に解析することは非常に困難である。例えば、磁気ビーズ、密度勾配遠心分離、マイクロ流路、フローサイトメータを用いた方法でＣＴＣを濃縮する場合、煩雑な処理が必要であるうえ、回収率が悪い場合がある。
【０００４】
ＣＴＣを分離・濃縮する他の技術として、ポリカーボネートフィルターを用いた方法が提案されている（例えば、非特許文献１及び２を参照）。また、サイズの違いを利用してＣＴＣを分離・濃縮する技術も提案されている（例えば、非特許文献３〜５及び特許文献１を参照）。
【０００５】
ところで、人工心肺等の医療用材料表面に血液が接触すると、補体系の活性化や血小板の活性化による血栓形成の誘発や溶血等の副作用が生じることが知られている。この問題を解決するために、所定の化合物で医療用材料表面を被覆することが有効であることが報告されている（例えば、特許文献２を参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００１／００１９０２９号明細書
【特許文献２】特開２００４−１６１９５４号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｖｏｎａ  Ｇ，  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ，  ｉｍｍｕｎｏｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ，  ａｎｄ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｅｔａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｉｎ  ｍａｔｅｒｎａｌ  ｂｌｏｏｄ”，  Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ．  １６０（１）：５１−８  （２００２）
【非特許文献２】Ｋａｈｎ  ＨＪ，  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｅｎｕｍｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｂｌｏｏｄ  ｏｆ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ａｆｔｅｒ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ：  ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｓｔａｇｅ”，  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  ＲｅｓＴｒｅａｔ；８６（３）：２３７−４７  （２００４）
【非特許文献３】Ｗｉｌｄｉｎｇ  Ｐ，  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｓｉｌｉｃｏｎ  Ｍｉｃｒｏｆｉｌｔｅｒ  Ｃｈａｍｂｅｒｓ”，  Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２５７（２）：９５−１００  （１９９８）
【非特許文献４】Ｙｕｅｎ  ＰＫ，  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｍｉｃｒｏｃｈｉｐ  ｍｏｄｕｌｅ  ｆｏｒ  ｂｌｏｏｄ  ｓａｍｐｌｅ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ”，  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．  １１（３）：４０５−１２  （２００１）
【非特許文献５】Ｍｏｈａｍｅｄ  Ｈ，  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ｒａｒｅ  ｃｅｌｌ  ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ  ｄｅｖｉｃｅ：  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．”，  ＩＥＥＥ  Ｔｒａｎｓ  Ｎａｎｏｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ３（４）：２５１−６  （２００４）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ＣＴＣ等の癌細胞は、血液中の血球細胞、例えば赤血球や白血球、あるいは血小板等に比べてサイズが一回り大きい。したがって、理論的には、機械的濾過法を適用してこれらの血球成分を除去し、癌細胞を濃縮することが可能である。
【０００９】
しかしながら、非特許文献１及び２のメンブレンフィルターは、ランダムに分布する孔を含み、孔径が不均一なため、癌細胞の回収率が悪い場合があった。また、非特許文献３〜５及び特許文献１の、孔径や厚みが正確に制御されたフィルターであっても、正確に解析可能な精度で癌細胞を濃縮することは困難な場合があった。
【００１０】
本発明は上記の問題点に鑑みてなされたものであり、癌細胞を特異的に接着させることができる膜、及びこの膜を備える基体を提供することを目的とする。本発明はまた、上記の基体を用いて体液中の細胞を採取する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、下記一般式（１）で表される構造単位を含むことを特徴とするポリマーを材料に含むことを特徴とする膜を提供する。一般式（１）中、Ｒ１は水素原子又はメチル基である。
【００１２】
【化１】
2014052309.tif 000002
【００１３】
上記本発明の膜は、その表面に癌細胞を特異的に接着させることができる。また、上記の膜は癌細胞の採取用膜として好適である。
【００１４】
上記のポリマーの数平均分子量は、１０，０００〜３００，０００であることが好ましい。数平均分子量がこの範囲であれば、ポリマーの取り扱いが容易な傾向にある。
【００１５】
本発明はまた、少なくとも表面の一部に上記の膜を備えることを特徴とする基体を提供する。上記本発明の基体によれば、サンプル中の癌細胞を効率よく採取することができる。
【００１６】
上記の基体は金属からなることが好ましい。また、金属は、銅、ニッケル、銅及びニッケルの合金並びにこれらの表面が金めっきされたものからなる群より選択されるものであることが好ましい。また、上記の基体は、電気鋳造法によって形成されたものであることが好ましい。
【００１７】
このような基体によれば、サンプル中の癌細胞を更に効率よく採取することができる。
【００１８】
本発明はまた、上記の基体を体液に接触させることにより体液中の細胞を基体に接着させるステップを含むことを特徴とする細胞の採取方法を提供する。
【００１９】
上記本発明の方法によれば、体液中の癌細胞を効率よく採取することができる。
【００２０】
上記の体液は、末梢血であることが好ましい。末梢血は容易に採取可能であるため、癌細胞を採取するサンプルとして使いやすい。
【発明の効果】
【００２１】
本発明により、癌細胞を特異的に接着させることができる膜、及びこの膜を備える基体を提供することができる。また、上記の基体を用いて体液中の細胞を採取する方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１は、癌細胞採取用基体の一実施形態を示す概略図である。
【図２】図２は、実験例３の結果を示すグラフである。Ａは、ポリマーで被覆したニッケル基体の結果であり、Ｂは、ポリマーで被覆したポリエチレンテレフタレート基体（陽性対照）の結果である。
【図３】図３は、実験例４の結果を示すグラフである。
【図４】図４は、実験例５の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
従来、人工心肺等の医療用材料表面に血液が接触すると、補体系の活性化や血小板の活性化による血栓形成の誘発や溶血等の副作用が生じることが問題となっていた。これに対して、下記一般式（１）で表される構造単位を含むポリマーを含む膜で医療用材料表面を被覆すると、当該膜に血液が接触した場合の血球成分の接着性が低下し、血栓形成の誘発や溶血等の副作用が抑制されることが知られている。このような、血栓形成や溶血を抑制する性質のことを血液適合性、又は生体適合性という。
【００２４】
本発明者らは、下記一般式（１）で表される構造単位を含むポリマーを含む膜の表面の特徴を検討したところ、意外なことに、当該膜においては癌細胞の接着性が高いことを初めて見出し、本発明を完成した。
【００２５】
癌細胞の採取用膜は、下記一般式（１）で表される構造単位を含むポリマーを材料に含む。すなわち、下記一般式（１）で表される構造単位を含むポリマーは、癌細胞接着性向上用ポリマーとして使用することができる。
【００２６】
【化２】
2014052309.tif 000003
【００２７】
上記一般式（１）中、Ｒ１は水素原子又はメチル基である。上記のポリマーの数平均分子量は１０，０００〜３００，０００であることが好ましい。数平均分子量がこの範囲であれば、上記のポリマーは液状とならず、取り扱いが容易な傾向にある。また、数平均分子量が上記の範囲であれば通常のラジカル重合によって合成することができる。
【００２８】
上記のポリマーは、典型的には、下記一般式（２）で表されるモノマーの溶液に適切な開始剤を添加し、一般的な方法によって重合させることにより製造することができる。下記一般式（２）中、Ｒ１は水素原子又はメチル基である。重合反応を行う温度は、４０〜１００℃が好ましく、６０〜９０℃がより好ましく、７０〜８０℃が更に好ましい。重合反応を行う圧力は常圧であることが好ましい。
【００２９】
【化３】
2014052309.tif 000004
【００３０】
一実施形態において、癌細胞の採取用膜は、上記一般式（２）で表されるモノマーと他の重合可能なモノマーとのランダムコポリマー又はブロックコポリマー又はグラフトコポリマーを材料に含む。
【００３１】
上記一般式（２）で表されるモノマーと重合可能なモノマーとしては、アクリルアミド、ｔ−ブチルアクリルアミド、ｎ−ブチルアクリルアミド、ｉ−ブチルアクリルアミド、ヘキシルアクリルアミド、ヘプチルアクリルアミド等のアルキルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド等のＮ，Ｎ−ジアルキルアクリルアミド、アミノメチルアクリレート、アミノエチルアクリレート、アミノイソプロピルアクリレート等のアミノアルキルアクリレート、ジアミノメチルアクリレート、ジアミノエチルアクリレート、ジアミノブチルアクリレート等のジアミノアルキルアクリレート、メタクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルメタクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチルメタクリルアミド等のＮ，Ｎ−ジアルキルメタクリルアミド、アミノメチルメタクリレート、アミノエチルメタクリレート等のアミノアルキルメタクリレート、ジアミノメチルメタクリレート、ジアミノエチルメタクリレート等のジアミノアルキルメタクリレート、メチルアクリレート、エチルアクリレート、イソプロピルアクリレート、ブチルアクリレート、ヘキシルアクリレート、２−エチルヘキシルアクリレート等のアルキルアクリレート、メチルメタクリレート、エチルメタクリレート、ブチルメタクリレート、ヘキシルメタクリレート等のアルキルメタクリレート、メトキシ（メタ）アクリレート等のアルコキシ（メタ）アクリレート、メトキシエチル（メタ）アクリレート等のアルコキシアルキル（メタ）アクリレート、グリシジルメタクリレート、プロピレン等が挙げられる。
【００３２】
上記一般式（２）で表されるモノマーと重合可能なモノマーは、アルキルアクリレート、アルキルメタクリレート、アルコキシ（メタ）アクリレート、アルコキシアルキル（メタ）アクリレート、グリシジルメタクリレート及びプロピレンからなる群より選ばれる１種以上のモノマーであってもよい。
【００３３】
上記一般式（２）で表されるモノマー及び上記の重合可能なモノマーとのコポリマーは、ランダムコポリマー、ブロックコポリマー、グラフトコポリマーのいずれでもよく、ランダム重合、イオン重合、マクロマーを利用した重合等の方法で製造できる。
【００３４】
上記一般式（２）で表されるモノマーと、上記の重合可能なモノマーとを共重合させる場合、上記一般式（２）で表されるモノマーは、コポリマー中の３０〜９９質量％であることが好ましく、５０〜９９質量％であることが更に好ましい。
【００３５】
上記一般式（１）で表される構造単位を含むポリマーは、典型的には、上記一般式（２）で表されるモノマーの溶液に適切な開始剤、及び、場合により上記の重合可能な１種以上のモノマーを添加し、ランダム重合、イオン重合、光重合、マクロマーを利用した重合等の方法によって重合させることにより製造することができる。重合反応を行う温度は、４０℃〜１００℃が好ましく、６０℃〜９０℃がより好ましく、７０℃〜８０℃が更に好ましい。重合反応を行う圧力は常圧であることが好ましい。
【００３６】
重合反応において、溶媒としては、上記一般式（２）で表されるモノマー及び上記の重合可能なモノマーを溶解可能な溶媒を使用できる。このような溶媒は、例えば脂肪族又は芳香族の有機溶媒であり、より具体的には、ジオキサン、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル等のエーテル系溶媒、ｏ−ジクロロベンゼン等のハロゲン化芳香族炭化水素、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド等のアミド、ジメチルスルホキシド等のスルホキシド、ベンゼン、トルエン等の芳香族炭化水素、ヘキサン、ペンタン等の脂肪族炭化水素が挙げられ、ジオキサン等のエーテル系溶媒が好ましい。
【００３７】
本発明は、上記のポリマーを材料に含む膜（以下、場合により「癌細胞採取用膜」という。）を提供する。この膜は、上記のポリマーを材料として一般的な製膜方法により形成することができる。例えば、上記のポリマーを溶媒に溶解させ、基体表面に塗布した後、溶媒を乾燥させることにより、膜を形成することができる。癌細胞採取用膜を癌細胞の採取に用いる所定形状の基体の表面に適用すると、当該膜が血液適合性を発揮するため、血液の接触時に血液成分の活性化が抑制でき、血球成分の基体への付着が抑制される。その一方、癌細胞採取用膜は、種々の癌細胞に対する接着性が良好なため、癌細胞を選択的に接着させることができる。
【００３８】
上記一般式（１）で表される構造単位を含むポリマーは、分子内に極性基としてエーテル結合及びエステル結合を有するが、これらの極性基は窒素原子（アミノ基、イミノ基）やカルボキシル基等と異なり、生体成分と強い静電相互作用を持たない。また、大きな疎水性基を持たないため、疎水性相互作用も小さい。このため、上記一般式（１）で表される構造単位を含むポリマーは、血液に対して活性が低く、優れた血液適合性を発現するものと推測される。
【００３９】
医療用材料表面と生体内組織や血液中のタンパク質との接触においては、タンパク質の吸着変性や活性化が起こらないことが好ましく、このためには、物質間に働く大きな相互作用である疎水性相互作用や静電的相互作用を小さくすることが有用であると考えられている。この点からも、癌細胞採取用膜の表面は好適な表面構造を備え得る。
【００４０】
また、癌細胞採取用膜の表面は、適度な親水性を有しているため、血液と接触した場合においても血小板の接着が軽微であり、優れた血液適合性を発現する。また、水酸基に起因した水素結合による生体成分との相互作用や吸着タンパク質の変性等も抑制されると考えられる。
【００４１】
癌細胞採取用膜、又は癌細胞採取用膜を表面に備える基体を、血液、リンパ、組織液、臍帯血等の体液に接触させることにより、赤血球、白血球、血小板等の血球成分やその他の細胞の接着が生じにくい一方で、癌細胞を選択的に接着することが可能となる。この機能の発現メカニズムについての詳細は明らかになっていないが、発明者らは、中間水の概念により説明できるものと推測している。
【００４２】
すなわち、癌細胞採取用膜の内部や表面部に存在する水には、（１）上記一般式（１）で表される構造単位を含むポリマーと弱い相互作用をしており０℃で融解する自由水、（２）上記一般式（１）で表される構造単位を含むポリマーと強い相互作用をしており−１００℃でも凍結しない不凍水、（３）自由水と不凍水の中間的な相互作用をしており０℃より低温で凍結する中間水、の３種の形態が存在すると考えられる。正常な血球細胞は、癌細胞採取用膜の内部や表面部に存在している不凍水、中間水、自由水等と水和殻を持ち、この水和構造によって安定化しているが、中間水によって不凍水がカモフラージュされ、基体表面への接着が抑制されると考えられる。一方、癌細胞は、細胞表面の糖鎖の発現が正常細胞とは異なるので、正常な血球細胞と比較して、水和構造が乱れていると考えられる。これにより、癌細胞採取用膜表面の中間水の構造をかく乱し、癌細胞採取用膜表面への接着性が発現すると考えられる。
【００４３】
癌細胞採取用膜は、あらゆる種類の癌細胞に適用可能であるが、血管への浸潤を起こしやすい上皮性細胞由来の癌に適用することが好ましく、その中でもＣＴＣが多いとされている、肺癌、大腸癌若しくは胃癌若しくは食道癌等の消化器癌、乳癌、前立腺癌に適用することが特に好ましい。
【００４４】
一実施形態において、癌細胞採取用膜は任意の基体の表面に設けることができ、癌細胞の採取に使用することが可能である。基体には貫通孔が存在しないことが好ましく、例えば、平滑な板状の形状であることが好ましい。
【００４５】
図１は、癌細胞採取用基体の一実施形態を示す概略図である。癌細胞採取用基体１００は、基体１１０からなる。少なくとも面１２０の一部は癌細胞採取用膜で被覆されている。面１２０の表面に癌細胞が捕獲される。癌細胞採取用膜は、面１２０の全体を被覆していることが好ましい。面１２０とは反対側の面の一部若しくは全体は、癌細胞採取用膜で被覆されていてもよい。
【００４６】
基体の表面に癌細胞採取用膜を適用する方法としては、被覆が最も一般的である。被覆は、上記一般式（１）で表される構造単位を含むポリマーの溶液を、浸漬法、スプレー法、スピンコート法等により基体表面に付着させた後、溶媒を除去（乾燥）することにより行われる。乾燥後の膜厚は、０．０１μｍ〜１．０ｍｍが好ましく、０．１〜１００μｍがより好ましく、０．５〜５０μｍが更に好ましい。膜厚が０．０１μｍ未満であると血球成分との非接着性や癌細胞との接着性が十分発現しない場合がある。また膜厚が１．０ｍｍを超えるとこれらの接着特性のバランスが崩れる場合がある。
【００４７】
基体に癌細胞採取用膜をより強固に固定化させるために、癌細胞採取用膜を被覆した後、基体に熱を加えてもよい。また、上記一般式（１）で表される構造単位を含むポリマーを架橋してもよい。架橋する方法として、予めポリマーの材料に架橋性モノマーを添加することが例示できる。架橋には、電子線、γ線、光照射を用いてもよい。
【００４８】
プラズマグラフト重合により基体の表面に上記一般式（１）で表される構造単位を含むポリマーの層（癌細胞採取用膜）を形成するには、約１．３３〜１３３０Ｐａ、より好ましくは６．６５〜６６５Ｐａの減圧下で、アルゴン、窒素、空気、種々のモノマー等の雰囲気下に低温プラズマを１〜３００秒間、好ましくは２〜３０秒間照射した後、上記一般式（２）で表されるモノマーを供給してプラズマ開始重合を行えばよい。
【００４９】
一実施形態において、基体の材質や形状は特に制限されることなく、例えば平滑な板、多孔質体、繊維、不織布、フィルム、シート、チューブを使うことができる。基体の材質としては、木綿、麻等の天然高分子、ナイロン、ポリエステル、ポリアクリロニトリル、ポリオレフィン、ハロゲン化ポリオレフィン、ポリウレタン、ポリアミド、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリ（メタ）アクリレート、ハロゲン化ポリオレフィンエチレン−ポリビニルアルコール共重合体、ブタジエン−アクリロニトリル共重合体等の合成高分子あるいはこれらの混合物が挙げられる。また、金属、セラミックス及びこれらの複合材料等も例示でき、複数の基体より構成されていてもよい。
【００５０】
金属としては、金、銀等の貴金属、銅、アルミニウム、タングステン、ニッケル、クロム等の卑金属、及びこれらの金属の合金並びにこれらの表面が金めっきされたものが例示できるがこれらに限定するものではない。金属は単体で用いてもよく、機能性を付与するために他の金属との合金又は金属の酸化物として用いてもよい。価格や入手の容易さの観点から、ニッケル、銅及びこれらを主成分とする金属を用いることが好ましい。ここで、主成分とは、上記基体を形成する材料のうち５０重量％以上を占める成分をいう。
【００５１】
基体の厚さは３〜１００μｍであることが好ましく、５〜５０μｍであることがより好ましく、１０〜３０μｍであることが特に好ましい。基体の厚さが３μｍより薄いと、強度が低下し、取り扱いが困難になる場合がある。また、基体の厚さが１００μｍを超えると、必要以上の材料を消費したり、加工に長時間かかったりするため、コスト的に不利になる場合がある。
【００５２】
続いて、本実施形態の癌細胞採取用基体の製造方法を説明する。癌細胞採取用基体の製造方法は、特に制限されるものではないが、例えば電気鋳造法（電鋳法）によって形成される。電気鋳造法とは、母型に厚い電気めっきを施した後に剥離する方法である。まず、ステンレス等からなる支持体上にめっきを行う。めっきの方法としては、例えば、銅めっき、はんだめっき、ニッケルめっき、金めっきなどが挙げられる。めっき処理後、めっき層を支持体及び感光層から剥離すると、めっき層が得られる。上記の方法により、このめっき層の少なくとも一部を癌細胞採取用膜で被覆することにより、癌細胞採取用基体が得られる。
【００５３】
一実施形態において、本発明は、上記の癌細胞採取用基体を体液に接触させることにより体液中の細胞を基体に接着させるステップを含むことを特徴とする細胞の採取方法を提供する。ＣＴＣ等の癌細胞を収集する体液としては、骨髄、脾臓、肝臓等にプールされている血液、リンパ、組織液、臍帯血等を利用することも可能であるが、体内を循環している末梢血を使うことが最も簡便である。末梢血中のＣＴＣの存在を検出することは、癌の病状進行を判断する有用な手段である。
【００５４】
本実施形態の細胞の採取方法は、例えば上記の癌細胞採取用基体を流路内に組み込み、流路に末梢血を導入することにより実施することができる。癌細胞は、癌細胞採取用基体上の癌細胞採取用膜の表面に採取される。流路への血液の導入には、流路の入り口方向からの加圧を用いる方法、流路の出口方向からの減圧を用いる方法、ぺリスタルティックポンプを使用する方法等が例示できる。また、使用する癌細胞採取用基体の面積は、例えば１ｍＬの血液からＣＴＣを採取する場合、１〜１０ｃｍ２が適している。
【００５５】
上記の方法でＣＴＣを採取した場合、ＣＴＣだけでなく白血球等の血球細胞も同時に採取される場合がある。このような場合には、採取された細胞に癌細胞が含まれているか否かを確認することが必要である。例えば、上記の方法でＣＴＣを採取した後、蛍光標識された癌マーカーに対する抗体で染色し、癌細胞であることを確認することができる。癌マーカーに対する抗体としては、抗ＥｐＣＡＭ抗体等が例示できる。
【００５６】
また、上記の方法で採取された細胞の遺伝子を解析することにより、癌細胞であることを確認することもできる。例えば、ｐ５３、Ｋ−ＲＡＳ、Ｈ−ＲＡＳ、Ｎ−ＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ＡＰＣ等の遺伝子における変異を解析し、癌細胞であることを確認できる。また、これらの遺伝子解析の結果は、その後の患者の治療方針の決定等にも利用することができる。あるいは、上記の方法で採取した細胞のテロメラーゼ活性等を測定することにより、癌細胞であることを確認することもできる。
【００５７】
上記の細胞の採取方法は、細胞に対するダメージが小さいため、採取された細胞を培養し、更に詳細な解析を行うこともできる。
【実施例】
【００５８】
以下、本発明を実施例に基づいて説明する。ただし、本発明は下記の実施例に制限されるものではない。
【００５９】
（実験例１）
（ポリテトラヒドロフルフリルアクリレートの合成）
上記一般式（１）において、Ｒ１が水素である、ポリテトラヒドロフルフリルアクリレートを合成した。具体的には、テトラヒドロフルフリルアクリレート１５ｇを１，４−ジオキサン６０ｇ中でアゾビスイソブチロニトリル（０．１質量％）を開始剤として、窒素バブリングしながら７５℃で１０時間重合を行った。重合反応終了後、ｎ−ヘキサンに滴下し沈殿させ、生成物を単離した。生成物をテトラヒドロフランに溶解し、さらにｎ−ヘキサンを用いて２回精製を行い、一昼夜減圧乾燥した。無色透明で高粘度のポリマーが得られた。収率は７６％であった。得られたポリマーをゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）により解析した結果、数平均分子量が２３，０００で、分子量分布（Ｍｗ／Ｍｎ）が３．３であった。
【００６０】
ポリマーの分子量は、下記ＧＰＣの測定条件にてポリスチレン換算分子量で算出した。
ポンプ：ＰＵ  Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ  ＨＰＬＣ  Ｐｕｍｐ  （Ｊａｓｃｏ製）
カラム：ＧＰＣ  Ｋ８０４（昭和電工製、Ｓｈｏｄｅｘ）
溶離液：クロロホルム
測定温度：室温
流量：１．０ｍＬ／分
検出器：Ｊａｓｃｏ  ＲＩ−１５３０型ＲＩ（Ｊａｓｃｏ製）
【００６１】
（実験例２）
（ニッケル基体の作製）
市販のチタン板上に、チタン板を陰極として電解ニッケルめっき用の電解浴（スルファミン酸ニッケル４５０ｇ／Ｌ、塩化ニッケル５ｇ／Ｌ、ホウ酸３０ｇ／Ｌの水溶液、５５℃）中に浸し、陽極を同電解浴中に浸した。両極に電圧をかけて１０μｍ厚になるようにニッケルめっきを行い、ニッケル基体を作製した。
【００６２】
（実験例３）
（ニッケル基体の被覆及び確認）
実験例１で合成したポリマーをクロロホルムに溶解し、０〜１．０質量％の範囲で濃度の異なる複数のポリマー溶液を得た。各ポリマー溶液を、実験例２で作製したニッケル基体上に塗布（キャスト）し、溶媒を乾燥させて、ニッケル基体の表面を被覆（ニッケル基体の表面にポリマーの膜を形成）した。陽性対照として、ポリエチレンテレフタレート基体上に、４０μＬのポリマー溶液（ポリマーの濃度０．２ｗｔ／ｖｏｌ％）を塗布したものを使用した。これらの基体上で水の接触角を測定し、ポリマーで被覆されていることを確認した。接触角の測定には、接触角測定装置（エルマ、ＭＯＤＥＬ  Ｇ−１−１００）を使用した。純水２μｌを各基体の表面に滴下し、３０秒後の静的接触角を測定した。図２は、実験例３の結果を示すグラフである。横軸はポリマーの濃度を示し、縦軸は水の接触角を示す。図２中、Ａはポリマーを被覆したニッケル基体の結果であり、Ｂはポリマーを被覆したポリエチレンテレフタレート基体（陽性対照）の結果である。
【００６３】
（実験例４）
（基体の準備）
実験例１で合成したポリマーを、クロロホルムに溶解し４質量％溶液を得た。この溶液を、実験例２で作製したニッケル基体上に塗布し、溶媒を乾燥させて、ニッケル基体の表面をポリマーで被覆し、実施例１のニッケル基体を作製した。Ｘ線光電子分光（島津製作所、ＥＳＣＡ−１０００）により、ニッケル基体由来のニッケルのピークが観測されず、ポリマー由来の炭素と酸素のピークが検出されたことから、ニッケル基体がポリマーを含む膜で被覆されていることを確認した。また、実験例２で作製したニッケル基体を比較例１のニッケル基体として使用した。
【００６４】
（癌細胞の接着性試験）
実施例１及び比較例１のニッケル基体上に、血清を１０％添加した培地で１０，０００個／ｍＬに調整した癌細胞懸濁液１．０ｍＬをピペットで滴下し、３７℃で６０分間静置した。癌細胞として、ヒト線維肉腫細胞株ＨＴ−１０８０を使用した。続いて、生理緩衝食塩水を用いてリンスし、基体表面に接着した細胞の数をカウントした。カウントを容易にするために、ホルムアルデヒドで細胞を固定化後、４，６−ｄｉａｍｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ（ＤＡＰＩ）で細胞核を染色した。細胞核の数を、共焦点レーザー顕微鏡（オリンパスＦＶ−１０００）を用いてカウントし、細胞の数とした。
【００６５】
図３は、実験例４の結果を示すグラフである。実験は５回ずつ行い、結果を平均値±標準偏差で示した。実施例１のニッケル基体は、比較例１のニッケル基体と比較して、接着した癌細胞数が向上した。多数の他の癌細胞においても同様の結果が確認された。
【００６６】
（実験例５）
（基体の準備）
実験例４と同様に、実施例１及び比較例１のニッケル基体を使用して実験を行った。
【００６７】
（血小板の接着性試験）
実施例１及びポリマー被覆を行わない比較例１のニッケル基体上に、クエン酸ナトリウムで抗凝固したヒト新鮮多血小板血漿０．２ｍＬをピペットで滴下し、３７℃で６０分間静置した。続いてリン酸緩衝溶液でリンスし、グルタルアルデヒドで固定した後、基体を走査型電子顕微鏡で観察し、１×１０４μｍ２の面積に接着した血小板数をカウントした。
【００６８】
図４は、実験例５の結果を示すグラフである。実験は５回ずつ行い、結果を平均値±標準偏差で示した。実施例１のニッケル基体は、比較例１のニッケル基体と比較して、接着した血小板数が少ないことが示された。
【００６９】
実験例４及び５の結果から、ポリマーで被覆した実施例１のニッケル基体は、ポリマー被覆しない比較例１と比較して、癌細胞の接着性が向上しているにもかかわらず、血球成分の接着性は小さいことが明らかとなった。したがって、癌細胞採取用膜は、血液適合性を有しつつ癌細胞を選択的に接着可能であることが示された。また、癌細胞採取用膜を癌細胞採取用基体の表面に適用することにより、癌細胞の基体への接着性を高め、癌細胞の採取効率を向上させることができる。
【符号の説明】
【００７０】
１００…癌細胞採取用基体、１１０…基体、１２０…面。
【図１】
2014052309.tif 000007
【図２】
2014052309.tif 000008
【図３】
2014052309.tif 000009
【図４】
2014052309.tif 000010