(57)【要約】      （修正有）【課題】免疫原性の弱い抗原に対して、免疫応答を刺激するための組成物及び方法の提供。【解決手段】対象の免疫系の細胞にてＭＡＰキナーゼ（mitogen-activated protein kinase）のシグナル伝達経路を活性化し、且つ、該対象にて免疫応答を誘導するのに十分な用量の、下記一般式で表される１種の非ステロイド性カチオン脂質を含有する組成物。2014058525.tif 000011（式中、Ｒ１は四級アンモニウム基であり、Ｙ１は、炭化水素鎖、エステル、ケトン及びペプチドから選択され、Ｒ２及びＲ３は独立して飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸、エステル結合炭化水素、蛍光体−ジエステル、及びそれらの組み合わせから選択される）【選択図】図１
2014058525.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象の免疫系の細胞にてＭＡＰキナーゼ（mitogen-activated protein kinase）のシグナル伝達経路を活性化し、且つ、該対象にて免疫応答を誘導するするのに十分な用量の、少なくとも１種のカチオン脂質を含む、組成物。
【請求項２】
カチオン脂質が、ＥＲＫ１（extracellular signal-regulated kinase 1）、ＥＲＫ２及びｐ３８の少なくとも１つを刺激することによって、ＭＡＰキナーゼシグナル伝達経路を活性化する、請求項１の組成物。
【請求項３】
カチオン脂質が以下の式
【化１】
2014058525.tif 000007
（式中、Ｒ１は四級アンモニウム基であり、Ｙ１は、炭化水素鎖、エステル、ケトン及びペプチドから選択されるスペーサーであり、Ｒ２及びＲ３は独立して飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸、エステル結合炭化水素、蛍光体−ジエステル及びそれらの組み合わせから選択される）
によって表される構造を有する非ステロイド性カチオン脂質を含む、請求項１の組成物。
【請求項４】
カチオン脂質が、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＥＰＣ及びそれらの組み合わせから選択される、請求項３の組成物。
【請求項５】
少なくとも１つの抗原をさらに含んでカチオン脂質／抗原複合体を形成し、該カチオン脂質／抗原複合体が抗原特異的な免疫応答を刺激する、請求項１の組成物。
【請求項６】
カチオン脂質が、ＥＲＫ１、ＥＲＫ２及びｐ３８の少なくとも１つを刺激することによって、ＭＡＰキナーゼのシグナル伝達経路を活性化する、請求項５の組成物。
【請求項７】
少なくとも１つの抗原が、腫瘍関連抗原、ウイルス抗原、微生物抗原及びそれらの組み合わせから選択される、請求項５の組成物。
【請求項８】
少なくとも１つの抗原が、脂質化された抗原又はその疎水性を高めるように修飾された抗原を含み、抗原と連結された疎水性基との間にリンカー配列を含有してもよい、請求項５の組成物。
【請求項９】
少なくとも１つの抗原が、リポタンパク質、リポペプチド、高い疎水性を有するアミノ酸配列で修飾されたタンパク質又はペプチド、及びそれらの組み合わせから選択される、請求項８の組成物。
【請求項１０】
少なくとも１つの抗原に結合させたアミノ酸配列をさらに含み、得られた抗原のアミノ酸配列は、該抗原が由来する母体タンパク質に見い出されない、請求項５の組成物。
【請求項１１】
少なくとも１つの抗原に結合させたアミノ酸配列をさらに含み、該アミノ酸配列は、セリンに共有結合するセリンに共有結合するリジンである、請求項５の組成物。
【請求項１２】
少なくとも１つの抗原が、該抗原上の負の電荷を高めるように操作された抗原を含む、請求項５の組成物。
【請求項１３】
対象に免疫応答を誘導する方法であって、対象の免疫系の細胞にてＭＡＰキナーゼのシグナル伝達経路の活性化を誘導するのに十分な用量の少なくとも１つのカチオン脂質を、対象に投与することを含む、方法。
【請求項１４】
カチオン脂質が、ＥＲＫ１、ＥＲＫ２及びｐ３８の少なくとも１つを刺激することによって、ＭＡＰキナーゼのシグナル伝達経路を活性化する、請求項１３の方法。
【請求項１５】
カチオン脂質が、式：
【化２】
2014058525.tif 000008
（式中、Ｒ１は四級アンモニウム基であり、Ｙ１は、炭化水素鎖、エステル、ケトン及びペプチドから選択され、Ｒ２及びＲ３は独立して飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸、エステル結合炭化水素、蛍光体−ジエステル、及びそれらの組み合わせから選択される）
によって表される構造を有する非ステロイド性カチオン脂質を含む、請求項１３の方法。
【請求項１６】
カチオン脂質が、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＥＰＣ及びそれらの組み合わせから選択される、請求項１５の方法。
【請求項１７】
少なくとも１つの抗原をカチオン脂質と共に複合体化してカチオン脂質／抗原複合体を形成させることをさらに含み、該カチオン脂質／抗原複合体は、抗原特異的な免疫応答を刺激する、請求項１３の方法。
【請求項１８】
カチオン脂質が、ＥＲＫ１、ＥＲＫ２及びｐ３８の少なくとも１つを刺激することによって、ＭＡＰキナーゼのシグナル伝達経路を活性化する、請求項１７の方法。
【請求項１９】
少なくとも１つの抗原が、腫瘍関連抗原、ウイルス抗原、微生物抗原、及びそれらの組み合わせから選択される、請求項１７の方法。
【請求項２０】
少なくとも１つの抗原が、脂質化された抗原又はその疎水性を高めるように修飾された抗原を含み、該抗原と連結された疎水性基との間にリンカー配列を含有してもよい、請求項１７の方法。
【請求項２１】
少なくとも１つの抗原が、リポタンパク質、リポペプチド、高い疎水性を有するアミノ酸配列で修飾されたタンパク質又はペプチド、及びそれらの組み合わせから選択される、請求項２０の方法。
【請求項２２】
少なくとも１つの抗原にアミノ酸配列を結合させることをさらに含み、得られた抗原のアミノ酸配列は、該抗原が由来する母体タンパク質に見い出されない、請求項１７の方法。
【請求項２３】
少なくとも１つの抗原にアミノ酸配列を結合させることをさらに含み、該アミノ酸配列は、セリンに共有結合するセリンに共有結合するリジンである、請求項１７の方法。
【請求項２４】
少なくとも１つの抗原上の負の電荷を高めるように、少なくとも１つの抗原を操作することをさらに含む、請求項１７の方法。
【請求項２５】
対象の免疫系の細胞にて反応性酸素種（「ＲＯＳ」）の産生を誘導するのに十分な用量の、少なくとも１つのカチオン脂質を含む組成物であって、誘導されるＲＯＳのレベルは、少なくとも１つのカチオン脂質の非存在下で存在する免疫応答を上回って免疫応答を高めるのに十分である、組成物。
【請求項２６】
少なくとも１つのカチオン脂質が、式：
【化３】
2014058525.tif 000009
（式中、Ｒ１は四級アンモニウム基であり、Ｙ１は、炭化水素鎖、エステル、ケトン及びペプチドから選択され、Ｒ２及びＲ３は独立して飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸、エステル結合炭化水素、蛍光体−ジエステル、及びそれらの組み合わせから選択される）
によって表される構造を有する非ステロイド性カチオン脂質を含む、請求項２５の組成物。
【請求項２７】
免疫応答を刺激するのに十分な反応性酸素種（「ＲＯＳ」）を対象にて誘導する方法であって、対象の免疫系の細胞にてＲＯＳの産生を誘導するのに十分な用量の少なくとも１つのカチオン脂質を、対象に投与することを含み、誘導されるＲＯＳのレベルは、少なくとも１つのカチオン脂質の非存在下で存在する免疫応答を上回って免疫応答を高めるのに十分である、方法。
【請求項２８】
少なくとも１つのカチオン脂質が、式：
【化４】
2014058525.tif 000010
（式中、Ｒ１は四級アンモニウム基であり、Ｙ１は、炭化水素鎖、エステル、ケトン及びペプチドから選択され、Ｒ２及びＲ３は独立して飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸、エステル結合炭化水素、蛍光体−ジエステル、及びそれらの組み合わせから選択される）
によって表される構造を有する非ステロイド性カチオン脂質を含む、請求項２７の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般に、免疫応答を刺激することに関するものであり、さらに詳しくは、免疫応答における脂質の役割に関する。
【背景技術】
【０００２】
この項は、以下に記載される及び／又は請求される本発明の種々の態様に関してもよい技術の種々の態様に読者を案内することを意図する。この議論は、読者に背景情報を提供して本発明の種々の態様のより良い理解を円滑にすることに役立つと考えられる。従って、これらの記述は、従来技術の承認としてではなく、この観点で読まれるべきであることが理解されるべきである。
【０００３】
ヒトに使用するための安全で且つ有効な免疫療法の開発は、世界中の患者にとって緊急の医学的ニーズとなっている。適当な免疫応答を誘発するために、ワクチン設計又は免疫療法において免疫応答を高める、指向する又は促進するような、免疫的な修飾因子（「免疫修飾因子」）を使用することができる［Gregoriadis, G., 免疫アジュバント：リポソームのための役割。Immunol Today 11:89 (1990)］。たとえば、ワクチンは、免疫応答を刺激する抗原を含んでもよい。しかしながら、見込みのある、抗原を含むワクチンのいくつかは、免疫系の抗原提示細胞（「ＡＰＣ」）に効率的に抗原を送達しない及び／又は抗原の免疫原性が弱いために、免疫応答の弱い賦活剤でしかない。従って、ＡＰＣに抗原を効果的に送達する、また、免疫系を刺激して抗原に応答する免疫療法が必要とされる。免疫修飾因子はそのような免疫療法として機能する可能性を有する。そのような免疫療法は、これらの及びそのほかの利益を有してもよい。たとえば、治療用ワクチンの一部として含まれる場合、免疫修飾因子は、少なくとも（１）抗原の送達及び／又はＡＰＣにおけるプロセッシングを改善し［Wang, R. F.及びWang, H. Y. 樹状細胞において抗原提示を延長することによる抗腫瘍免疫の増強。Nat Biotechnol 20:149 (2002)］、（２）ワクチン抗原に対する免疫応答の進展を支える免疫調節性サイトカインの産生を誘導するので細胞性免疫を促進し、細胞傷害性Ｔリンパ球（「ＣＴＬ」）を誘導し、（３）有効なワクチンに必要とされる免疫の回数及び抗原の量を減らし［Vogel, F. R. アジュバントによるワクチン性能の改善。Clin Infect Dis 30 Suppl 3:S266 (2000)］、（４）ワクチン抗原の生物学的な及び免疫的な半減期を増大させ、並びに（５）免疫抑制因子を阻害することによって抗原に対する免疫寛容に打ち勝つべきである［Baecher-Allan, C,及びAnderson, D. E. 担癌宿主における免疫調節。Curr Opin Immunol 18:214 (2006)］。
【０００４】
現在、免疫応答を誘発することにおいてペプチド又はタンパク質の抗原のような抗原の有効性を高めるのに使用されている、主な部類の作用剤は、油中水、アラム及び抗原の応答を高めるそのほかの化学物質のようなアジュバントであるが、それらは自体直接的な免疫調節性効果を有さないので、上述のようにこれらのアジュバントは免疫修飾因子ではない［Vogel, F. R.及びPowell, M. F.ワクチンのアジュバントと賦形剤の概要。Pharm Biotechnol 6: 141 (1995)］。そのような幾つかのアジュバントは、動物での使用で利用可能であり、その一部は臨床試験で試されている。アルミニウム塩のような従来のアジュバントに加えて、固有の免疫効果を有するインフルエンザビロソーム［Gluck, R.及びWalti, E. 2000. 免疫増強する再構成されたインフルエンザビロソーム(ＩＲＩＶ）によって補強されたＡ型肝炎ワクチンであるＥｐａｘａｌ  Ｂｅｒｎａの生物学的妥当性。Dev Biol (Basel) 103:189 (2000)］及びＣｈｉｒｏｎのＭＦ５９［Kahn, J. O., et al. ＨＩＶに感染していないヒト志願者におけるムラミルトリペプチドジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンの存在下又は非存在下でのＭＦ５９アジュバントを併用したヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）ＩＳＦ２型ｇｐ１２０サブユニットワクチンに対する臨床的及び免疫的な応答、 J Infect Dis 170:1288 (1994)］のような製品が市場に出つつある。たとえば、１ミクロン未満のエマルション系のアジュバントであるＭＦ５９は、樹状細胞によって内部に取り入れられる［Dupuis, M., et al., 筋肉内注射の後、樹状細胞は、ワクチンアジュバントを内部に取り込む。Cell Immunol 186:18 (1998)］。しかしながら、ＨＳＶ及びインフルエンザのワクチンに関する臨床試験の報告によれば［Jones, C. A.及びCunningham, A. L. 性器ヘルペス及び新生児単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）疾患を予防するためのワクチン接種戦略。Herpes 11:12 (2004)； Minutello, M. et al., ３回の連続したインフルエンザ流行期に免疫された、高齢対象におけるＭＦ５９アジュバントを併用した不活化インフルエンザサブユニットウイルスワクチンの安全性及び免疫原性。Vaccine 17:99 (1999)］、動物モデルからの証拠は、ＭＦ５９アジュバントは、Ｔ細胞の応答を増強するのではなく、中和抗体の産生を増強することを示唆している。従って、細胞性免疫応答を刺激する新しい方法が求められる。
【０００５】
さらに、上述のように、一部の抗原は、免疫応答の賦活剤としては弱い。従って、上述のような免疫応答を刺激する物質と抗原を同時投与することに加えて、免疫原性の弱い抗原を改変して、その免疫原性を高めることもできる。たとえば、免疫原性の弱い抗原を免疫原性のペプチド、多糖類又は脂質と結合させて、その免疫原性を高めることができる。しかしながら、この種の化合物に免疫原性の弱い抗原を単純に結合することは、免疫応答を誘発するのに十分ではない可能性がある。たとえば、得られる免疫応答が、弱い抗原ではなく、結合させた化合物の免疫原性のエピトープに向けられる可能性があり、又は結合させた抗原が免疫系のＡＰＣに効率的に送達されない可能性がある。従って、免疫原性の弱い抗原に対する免疫応答を刺激するための追加的な方法が必要とされる。
【発明の概要】
【０００６】
本発明の特定の例示となる態様を以下に述べる。これらの態様は、本発明が利用する特定の形態の手短な要約を読者に提供するために単に提示されるのであって、本発明の範囲を限定することを意図するものではないことが理解されるべきである。実際、本発明は、以下に明白には述べられなくてもよい種々の態様を包含してもよい。
【０００７】
本発明は、特定の用量及び組成条件のもとで（１）免疫系に効果的に抗原を提示又は送達し、且つ（２）免疫系を刺激して抗原に応答するための、新規の部類の免疫賦活剤として作用する、カチオン脂質の使用に関する。
【０００８】
リポソームは、小さな分子量の薬剤、プラスミドＤＮＡ、オリゴヌクレオチド、タンパク質及びペプチドを送達するために広範に使用されている。非ウイルス性抗原担体としてのリポソーム媒体を用いたワクチンは、生の弱毒化ワクチン又はワクシニア若しくはインフルエンザウイルスのようなウイルス媒体を用いた従来の免疫に比べて好ましい。米国特許第７，３０３，８８１号は、単純だが有効な脂質に基づいた免疫療法と、２つの分子、すなわちカチオン脂質と抗原から成り、たとえば、安定剤、アジュバント及び表面改質剤のような追加の成分を添加すればよい、カチオン脂質／抗原複合体を記載している［米国特許第７，３０３，８８１号を参照のこと］。カチオン脂質と抗原［たとえば、Ｅ７、ヒトのパピローマウイルス（「ＨＰＶ」）］から成る製剤は、マウスのモデルにてＨＰＶ陽性のＴＣ−１腫瘍に対して予防的且つ治療的な抗腫瘍免疫応答を誘導する。その結果は、抗原と複合体形成したカチオンリポソームが免疫応答を刺激し、Ｔ細胞との樹状細胞（ＡＰＣ）の相互作用を起こさせるのに役立つことを明らかにしている。
【０００９】
本発明では、強力な免疫応答を誘導するためのカチオン脂質／抗原複合体の能力をさらに理解するために行われた追加の研究によって、カチオン脂質自体が、あらゆる哺乳類種に存在するＭＡＰキナーゼ（mitogen-activated protein kinase、マイトジェン活性化タンパク質）のシグナル伝達経路の成分を活性化することによって、低用量条件下にて強力な免疫活性化因子として作用し得るという発見がもたらされた。カチオン脂質／抗原複合体は、抗原と組み合わせて、低用量条件下にて、複合体にて製剤化された抗原に特異的な強力な免疫応答を誘導する。高用量のカチオン脂質では、免疫細胞にて過剰に反応性酸素種（ＲＯＳ）が産生され、観察される免疫応答を弱める。
【００１０】
従って、本発明の態様の１つは、対象の免疫系の細胞によってＭＡＰキナーゼのシグナル伝達を活性化することにより対象において免疫応答を誘導するのに十分な用量の、少なくとも１つのカチオン脂質の組成物を提供する。
【００１１】
本発明の別の態様は、カチオン脂質を対象に投与することによってＭＡＰキナーゼのシグナル伝達を活性化することにより、対象において免疫応答を誘導する方法を提供する。
【００１２】
本発明の別の態様は、対象の免疫系の細胞において反応性酸素種（ＲＯＳ）の産生を誘導することによって免疫応答を誘導するのに十分な用量の、少なくとも１つのカチオン脂質の組成物を提供する。カチオン脂質複合体は、少なくとも１つのカチオン脂質の非存在下で存在する免疫応答を上回って免疫応答を高めるのに十分なレベルまで、ＲＯＳ産生を刺激する。
【００１３】
本発明の別の態様は、対象にカチオン脂質複合体を投与して対象の免疫系の細胞において反応性酸素種（ＲＯＳ）の産生を誘導することによって、免疫応答を誘導する方法を提供する。カチオン脂質複合体は、少なくとも１つのカチオン脂質の非存在下で存在する免疫応答を上回って免疫応答を高めるのに十分なレベルまで、ＲＯＳ産生を刺激する。
【００１４】
本発明の追加の態様は、免疫応答が抗原特異的であるカチオン脂質／抗原複合体を形成するための、少なくとも１つの抗原の添加を含む。
【００１５】
〔関連出願への相互参照〕
本出願は、「疾患の治療のためのカチオン脂質系の免疫賦活剤」と題するＬｅａｆ  Ｈｕａｎｇによって２００７年３月２２日に出願された米国特許仮出願、出願番号６０／８９６，４１２号；「疾患の治療のためのカチオン脂質系二重機能送達システム及び免疫賦活剤」と題するＬｅａｆ  Ｈｕａｎｇ及びＷｅｉｓｈｕ  Ｃｈｅｎによって２００７年４月１３日に出願された同６０／９１１，５４９号；「疾患の治療のためのカチオン脂質系二重機能送達システム及び免疫賦活剤」と題するＬｅａｆ  Ｈｕａｎｇ，  Ｗｅｉｓｈｕ  Ｃｈｅｎ及びＷｅｉｌｉ  Ｙａｎによって２００７年７月９日に出願された同６０／９４８，５１２号；及び「リポソームペプチド製剤による免疫応答の誘導」と題するＷｅｉｓｈｕ  Ｃｈｅｎ及びＬｅａｆ  Ｈｕａｎｇによって２００７年１０月３０日に出願された同６０／９８３，７９９号の利益を請求する、「カチオン脂質による免疫応答の刺激」と題するＷｅｉｓｈｕ  Ｃｈｅｎ，  Ｗｅｉｌｉ  Ｙａｎ，  Ｋｅｎｙａ  Ｔｏｎｅｙ，  Ｇｒｅｇｏｒｙ  Ｃｏｎｎ，  Ｆｒａｎｋ  Ｂｅｄｕ−Ａｄｄｏ及びＬｅａｆ  Ｈｕａｎｇによって２００８年３月１７日に出願された米国特許出願第１２／０４９，９５７号の利益を請求する。なおこれらの文書の開示の全体を参照することにより本明細書に組み入れる。
【００１６】
図面全体を通して同類の文字が同類の部分を表す添付の図面を参照して以下の詳細な説明を読めば、本発明の種々の特徴、態様及び利点がさらに理解されるようになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（「ＤＯＴＡＰ」）による樹状細胞の刺激後の、インビトロでのサイトカインの産生を示すグラフである。
【図２】図２は、フローサイトメトリーによるＣＴＬ介在性の細胞傷害性の分析である。Ｅ７特異的な細胞傷害性Ｔリンパ球（「ＣＴＬ」）のクローンを調製し、増殖させた。Ｅ７ペプチドによる５日間のインビトロでの再刺激の後、示したエフェクター対ターゲットの比にて３７℃で４時間、ＰＫＨ−６７で標識したＴＣ−１ターゲット細胞とともにエフェクター細胞をインキュベートした。非特異的なターゲット細胞の対照としてＢＬ−６を用いた。フローサイトメトリーにて、ＰＫＨ−６７陽性ターゲット細胞のゲートをかけた範囲内でＰＩ陽性である細胞の比率によって、Ｅ７特異的な殺傷の比率を決定した。１００：１のＥ：Ｔ比にて対照群と比べることによって統計的解析を行った（＊ｐ＜０．０１、＊＊ｐ＜０．００１、ｎ＝５）。
【図３】図３は、最適な脂質用量にてＤＯＴＡＰ／Ｅ７を与えたマウスにおいて観察された腫瘍に浸潤するＴリンパ球である。記載されたようにＴＣ−１腫瘍を定着させ、未処理のままにするか、又は６日目の単回注射にて処理した。１４日目に固形腫瘍を取り出し、浸潤しているリンパ球について調べた。ＦＩＴＣ結合した抗ＣＤ８抗体（Ａ、Ｂ、Ｃ）及び抗ＣＤ４抗体（Ｄ、Ｅ、Ｆ）を用いて、浸潤しているＴ細胞を判定し、その後、ＤＡＰＩによって対比染色した。３匹ずつのマウスの群から代表的な腫瘍切片を記載したように調べ、共焦点顕微鏡によって画像化した。腫瘍切片でのアポトーシスを検出するためにＴＵＮＥＬアッセイを行った（Ｇ、Ｈ、Ｉ）。
【図４】図４は、カチオン脂質による処理による液性活性の誘導を示すグラフである。
【図５】図５は、フローサイトメトリーを用いた、Ｅ７ペプチドと共にＤＯＴＡＰを与えた後のマウスにおける調節性Ｔ細胞集団の減少を説明するグラフである。
【図６】図６は、ＤＯＴＡＰ／Ｅ７製剤で処理したマウスにおけるＴＣ−１腫瘍増殖の動態である。ＴＣ−１接種後６日目に、種々の脂質濃度でのＤＯＴＡＰリポソームにて製剤化した１０μｇのＥ７ペプチドでマウスを処理した。２３日目の各群のＴＣ−１腫瘍のサイズを未処理の対照群と比較し、統計的に解析した（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【図７】図７は、ＤＯＴＡＰの皮下注射による樹状細胞の活性化と流入領域リンパ節への移動の誘導を示す。ＰＢＳ対照（Ａ、Ｃ及びＥ）、又は０．５％ＮＢＤ−ＤＯＴＡＰと共に１００ナノモルの総脂質を含有するＤＯＴＡＰ／Ｅ７（Ｂ、Ｄ及びＦ）を未処理のマウスに注射した。注射の４時間後、流入領域リンパ節を調製し、表面マーカーに対する適当な抗体で染色した。ＮＢＤとＣＤ１１ｃ（Ａ及びＢ）又はＣＤ８６（Ｃ及びＤ）の同時発現は、リンパ節全体の細胞で解析し、一方ＮＢＤとＣＤ８（Ｅ及びＦ）の同時発現は、ＣＤ３＋集団の範囲内でゲートをかけ、解析した。数字は４連一組での細胞の比率を表す。
【図８】図８は、最適なＤＯＴＡＰアジュバントにて製剤化されたＥ７による免疫が機能的ＣＤ８＋細胞を引き出すことを示す。１０５個のＣＤ８＋Ｔ細胞当たりのＣＤ８＋ＩＦＮ−γ＋細胞の数を平均値±ＳＤとして示し、無処理の対照と比較した（ｎ＝４、＊＊ｐ＜０．０１）。
【図９】図９は、Ｔ細胞応答を引き出すことが知られている強力なアジュバントと比較した、種々のカチオン脂質で構成されるカチオン脂質／Ｅ７複合体の抗腫瘍免疫応答を説明するプロットである。
【図１０】図１０は、マウスの流入領域リンパ節おける、抗腫瘍免疫応答と相関するＲＯＳの産生を説明するグラフである。Ａ：０、１５、１００又は６００ナノモルの脂質を含有するＤＯＴＡＰ／Ｅ７を注射したマウスから、流入領域リンパ節（「ＤＬＮ」）を注射の２時間後に単離した。陽性のＲＯＳシグナルを持つ細胞の相対的な比率を列記する。Ｂ：フローサイトメトリーによってＤＯＴＡＰ／Ｅ７注射の１０時間後細胞を回収することにより、ＤＬＮにおける細胞傷害性を測定した。ＤＣにおける死細胞（ＰＩ陽性）の相対的な比率（白四角）及び１０５個のＬＮ細胞当たりの生きたＤＣの数（棒）を示し、対応スチューデントｔ検定によって無処理の対照のそれと比較した（＊＊ｐ＜０．０１）。Ｃ：不活性の中性脂質、ジオレイルホスファチジルコリン（「ＤＯＰＣ」）のＤＯＴＡＰ／Ｅ７との同時製剤化（ＤＯＰＣ／ＤＯＴＡＰ＝５）によってＤＬＮ中の反応性酸素種（「ＲＯＳ」）の産生が低下し、結果的に複合体の抗腫瘍活性の低下を生じた。
【図１１】図１１は、カチオン脂質／抗原複合体により結果として生じる免疫応答に対する改善された封入効率の効果を説明する。カチオンリポソーム製剤へのＥ７リポペプチドの組み入れによって抗ＴＣ−１腫瘍活性が増強された。ＴＣ−１腫瘍担癌マウス（群当たり８〜１２匹）は、６日目に単回処理で、ＤＯＴＡＰ／Ｅ７（５又は１０ナノモルのＥ７ペプチドを含有する）又はＤＯＴＡＰ／Ｅ７リポペプチド（５ナノモルのペプチドを含有する）又はＤＯＴＡＰ脂質のみを投与された。デキストロース（５％）で処理したマウスを陰性対照として用いた。２４日目の各群の平均腫瘍サイズをＤＯＴＡＰ／Ｅ７（５ナノモル）を与えた群のそれと比較し、スチューデントのｔ検定によって解析した（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１）。
【図１２】図１２は、ＤＯＴＡＰ／Ｅ７リポペプチドによるマウスの免疫がＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＩＦＮ−γの分泌の上昇を誘導することを実証するグラフである。
【図１３】図１３は、短い無関係のアミノ酸配列に連結したペプチド抗原の増強された免疫原性を説明するグラフである。
【図１４Ａ】図１４Ａは、様々なカチオンリポソームで刺激した後のＤＣ２．４細胞における同時刺激分子、ＣＤ８０とＣＤ８６の発現を説明するグラフである。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、ＤＣ２．４細胞における同時刺激分子（ＣＤ８０）の発現に対するカチオン脂質の炭化水素鎖長依存性の発現を説明するグラフである。
【図１５】図１５は、カチオンリポソームによるケモカインとＣＤ１１ｃの転写の上方制御及びＩＬ−１の下方制御を示す。（Ａ）ＤＣ２細胞を５０μＭのＤＯＴＡＰリポソームで２４時間処理した後のｍＲＮＡレベルでの倍増加を示すアフィメトリクスマイクロアレイ解析。（Ｂ）５０μＭのＤＯＥＰＣ又はＤＯＴＡＰリポソームと共に１６時間インキュベートし、その後全ＲＮＡを抽出し、特異的プライマーと共に増幅した（陽性対照として１００ｎｇ／ｍＬのＬＰＳ）ＢＭＤＣにおいて、ＤＯＴＡＰ及び１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（「ＤＯＥＰＣ」）によってＣＣＬ２及びＣＣＬ４が上方制御されることを示すＲＴ−ＰＣＲ。
【図１６】図１６は、カチオンリポソームのみがＢＭＤＣからのＣＣＬ２の放出を誘導することを示す。
【図１７】図１７は、ＤＯＴＡＰは、用量依存的にＣＣＬ２の放出を誘導することを示す。
【図１８】図１８は、ＤＯＴＡＰが誘導するＢＭＤＣからのＣＣＬ２放出に関与するシグナル伝達経路を検討するためのＭＡＰキナーゼ阻害剤の使用を示す。６日目に、阻害剤でＢＭＤＣを２０分間予備処理し、その後、７５μＭのＤＯＴＡＰリポソームで２４時間処理した。実験に使用した濃度は、ＰＤ（ＰＤ−９８０５９）、２０μＭ；ＳＢ（ＳＢ−２０３５８０）、ｌＯμＭ；Ｕ（Ｕ−０１２６）、ｌＯμＭ；ＰＴｘ（百日咳毒素）、２００ｎｇ／ｍＬ；ＰＰ２、ｌＯμＭ；Ｗｏｒｔ（ワートマニン）、２００ｎＭ；ＧＦ（ＧＦ１０９２０３Ｘ）、２００ｎＭである。ＥＬＩＳＡによって上清を分析した。１００ｎｇ／ｍＬのＬＰＳを陽性対照とした。
【図１９】図１９は、ＢＭＤＣにおいてＤＯＴＡＰがＥＲＫ及びｐ３８の活性化を誘導することを示す。（Ａ）時間経過試験。６日目に、１０６個／ｍＬ／ウエルの密度にてＢＭＤＣを１２穴プレートに播いた。７５μＭのＤＯＴＡＰリポソームと共に示した時間それをインキュベートした。細胞を回収し、図に示された抗体を用いたウエスタンブロット解析に供した。ＥＲＫ２抗体をプローブとして同じ膜を処理し、負荷対照とした。（Ｂ）ＤＯＴＡＰが誘導するＥＲＫの活性化はｐ３８によって負に調節された。（Ｃ）ＤＯＴＡＰが誘導するＥＲＫの活性化は主としてＰＩ−３キナーゼを介するものであり、ｐ３８によって負に調節された。
【図２０】図２０は、ＥＲＫ遺伝子発現のｓｉＲＮＡのアプローチによる下方制御は、ＤＯＴＡＰが誘導するＢＭＤＣからのＣＣＬ２放出を減衰させることを示す。（Ａ）ＥＲＫ１遺伝子の発現は、ＢＭＤＣにおける２４時間の処理の後ｓｉＲＮＡによってブロックされた。（Ｂ）ｓｉＲＮＡによるＥＲＫ１のブロックは、ＤＯＴＡＰが誘導するＢＭＤＣからのＣＣＬ２放出を特異的に減衰させた。ＤＯＴＡＰ：７５＿Ｍ、ＬＰＳ：１００ｎｇ／ｍＬ、対照のｓｉＲＮＡに比べて＊ｐ＜０．０５、ｎ＝３。
【図２１】図２１は、ＤＯＴＡＰ／Ｅ７製剤は、マウスの流入領域リンパ節にてＣＣＬ２の蓄積を誘導することを示す。０日目に、ＤＯＴＡＰ／Ｅ７製剤（１００ナノモルのＤＯＴＡＰと１０μｇのＥ７ペプチド）をマウス（ｎ＝３）に注射した。示された日にマウスを屠殺し、流入リンパ節を回収した。流入領域リンパ節を１００μＬのＥＬＩＳＡ緩衝液（ＰＢＳ中１０％ＦＢＳ）にてホモジネートし、次いで、ＥＬＩＳＡによって解析し（Ａ）、又は本文に記載するようにＣＣＬ２抗体によって免疫化学的に染色した（Ｂ）。元々の倍率×４００
【図２２】図２２は、ＥＲＫの阻害は、流入領域リンパ節におけるＣＣＬ２の蓄積を減衰させ、且つＤＯＴＡＰ／Ｅ７製剤による抗腫瘍活性をブロックすることを示す。（Ａ）ＥＲＫとｐ３８の経路によって流入領域リンパ節におけるＣＣＬ２の蓄積は相互に調節された。（Ｂ）阻害剤入りまたは無しで同時製剤化したＤＯＴＡＰ／Ｅ７を投与したマウスにおける、ＴＣ−１腫瘍増殖の動態。０日目にＴＣ−１細胞（１×１０５個／マウス）をマウスに注射した（ｎ＝５）。６日目に、ＤＯＴＡＰ／Ｅ７、ＤＯＴＡＰ／Ｅ７／Ｕ−０１２６、ＤＯＴＡＰ／Ｅ７／ＳＢ又はＰＢＳでマウスを処理した。その後、腫瘍サイズを測定した。ＤＯＴＡＰ／Ｅ７と比べて＊ｐ＜０．０５。
【図２３】図２３は、カチオン脂質／抗原複合体がヒトの樹状細胞を効果的に活性化することを示す。図２０Ａ〜Ｅは、それぞれ、ＤＯＴＡＰ／Ｅ７によるＣＤ８０の刺激、ＤＯＴＡＰ／Ｅ７によるＣＤ８３の刺激、ＤＯＴＡＰ／Ｅ７によるＣＤ８６の刺激、ＤＯＥＰＣ／Ｅ７及びＤＯＴＡＰ／コレステロール／Ｅ７によるＣＤ８０の刺激、並びにＤＯＥＰＣ／Ｅ７及びＤＯＴＡＰ／コレステロール／Ｅ７によるＣＤ８３の刺激を説明する。
【図２４】図２４は、ヒト樹状細胞によるサイトカイン及びケモカインの産生を誘導するＤＯＴＡＰ／Ｅ７の能力を説明する。図２３Ａ〜Ｆは、それぞれ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣ１５及びＣＣＬ−１９の産生を説明する。
【図２５】図２５は、ヒト樹状細胞の活性化に対するカチオン脂質／抗原複合体の粒径の効果を説明する。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明の１以上の特定の実施態様を以下に記載する。これらの実施態様の簡明な説明を提供する努力において、実際の実施の特徴すべてが明細書に記載されるとはかぎらなくてもよい。そのような実際の実施の開発において多数の実施に特異的な決定が為されて、１つの実施から別の実施まで異なってもよい、開発者の特定の目標を達成しなければならないことが十分に理解されるべきである。さらに、そのような開発努力は複雑で時間がかかるかもしれないが、それにもかかわらず、この開示の利益を有する当業者にとっては、日常の仕事であることが十分に理解されるべきである。
【００１９】
本発明の要素（たとえば、その例示となる実施態様）を紹介する際、冠詞、「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」及び「ｓａｉｄ」は１以上の要素が存在することを意味することを意図する。用語「含むこと」、「包含すること」及び「有すること」は、列記された要素以外に追加の要素があってもよいことを含み、意味することを意図する。
【００２０】
本発明の態様の１つは、疾患を防ぐ又は治療するために哺乳類において免疫応答を生じるカチオン脂質を提供する。カチオン脂質は、ＭＡＰキナーゼのシグナル伝達経路の種々の成分を活性化することによって、たとえば、ケモカイン及び／又はサイトカインの産生のために用量依存性の免疫修飾因子として独立して機能することができる。最適な用量範囲は、種々の哺乳類種の範囲内で異なることが観察される。げっ歯類種では、たとえば、最適なカチオン脂質の用量は、５０〜３００ナノモルの間の範囲であってもよい。本明細書に記載される特定の用量及び組成は単に例示であり、当業者は、所与の対象での使用に適当な用量を決定することができる。別の態様では、免疫系の細胞に提示するために低用量のカチオン脂質が抗原又は薬剤と結合する一方で、同時に抗原特異的な強い免疫応答を刺激してもよい。本発明の一部の態様では、抗原はリポペプチドである。
【００２１】
米国特許第７，３０３，８８１号は、疾患関連の抗原と複合体化した複数のカチオン脂質が、特定の疾患（たとえば、ＨＰＶ陽性の癌）を防ぐ予防的免疫応答を刺激し、特定の抗原を発現する細胞を殺傷し、その結果疾患の有効な治療を生じる治療的免疫応答も刺激することを示したことを開示している。現在、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＥＰＣ及びプロピル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（「ＤＯＴＭＡ」）を用いたカチオン脂質の免疫賦活能をさらに理解するために研究が行われ、この３種のカチオン脂質が、上記で参照された特許において免疫賦活剤として実証された脂質の広い部類に分類されている。これらの研究によって、カチオン脂質は、独立して特定の低用量の範囲又は組成物の中で免疫修飾因子として機能し、抗原と共に（又はなしで）免疫応答を刺激することができるという発見がもたらされた。カチオン脂質を抗原と共に複合体化すると、抗原特異的な免疫応答が生成される。
【００２２】
別の態様では、現在記載されている特定の用量条件下で投与された本発明のカチオン脂質組成物は、ＭＡＰキナーゼのシグナル伝達経路の種々の成分の誘導を刺激して、疾患に対抗する生体の免疫応答を活性化させる一方で、同時に免疫系の細胞に抗原を送達する。以下の実施例で明らかにされるように、カチオン脂質は用量依存的に反応性酸素種（「ＲＯＳ」）の産生を誘導する。しかしながら、カチオン脂質の最適な用量を超えると、高いＲＯＳの産生が免疫系の細胞にアポトーシスを誘導し、強い免疫応答を生成する脂質の能力を弱くする。特定の範囲のＲＯＳの産生は、今度は、結果としてサイトカインやケモカインの産生を生じ、免疫応答を調節する。従って、カチオン脂質の最適な用量は、カチオン脂質の非存在下で存在する免疫応答を上回る免疫応答における増進を刺激するのに十分なＲＯＳの産生レベルを効果的に刺激する量であり（一方で免疫系の細胞に顕著な量のアポトーシス、すなわち、免疫応答を弱らせるのに十分なアポトーシスを誘導するのに十分な過剰なＲＯＳ産生を刺激しない）、且つＭＡＰキナーゼのシグナル伝達経路を活性化する量である。上述のように、最適な用量は種間で異なってもよく、当業者によって容易に決定される。
【００２３】
さらに別の態様では、抗原（単数又は複数）と併用して、最適な用量のカチオン脂質が投与される。この場合、カチオン脂質／抗原の併用は、カチオン脂質と併用されて送達された抗原に特異的である免疫応答を生成することが可能である。生成される応答には、特異的細胞傷害性Ｔ細胞、記憶Ｔ細胞又はＢ細胞が含まれ、結果として抗原に関連する特定の疾患の予防又は治療的応答を生じてもよい。
【００２４】
本発明のカチオン脂質は、カチオン脂質複合体の形態であってもよい。カチオン脂質複合体は、たとえば、リポソーム、ミセル又はエマルションのような種々の小胞の形態を取ることができる。カチオン脂質複合体は単層であっても多層であってもよい。抗原が含まれる場合、抗原はカチオン脂質複合体に封入されてもよく、封入されなくてもよい。封入されるとは、抗原が複合体の内部空間に含有されてもよく、及び／又は複合体の脂質の壁に組み入れられてもよいことを意味すると理解される。
【００２５】
本発明はさらに、これらの複合体を製造する方法に関するものであり、本方法は、任意で、過剰の個々の成分からこれらの製剤を精製する工程を含んでもよい。本発明の抗原複合体の製造については、精製工程の包含は有利な実施態様である。
【００２６】
特定の実施態様では、カチオン脂質複合体は、ｐＨ６．０〜８．０にて正の正味電荷及び／又は正に荷電した表面を有する。
【００２７】
本発明のカチオン脂質複合体に包含されてもよい任意の「抗原」は、核酸、ペプチド、リポペプチド、タンパク質、リポタンパク質、多糖類、及びカチオン脂質と直接複合体化されてもよいそのほかの高分子であってもよい。しかしながら、カチオン薬剤（たとえば、大きなカチオンタンパク質）はアニオン脂質と直接複合体化することができ、又は、最初にアニオン脂質若しくはポリマーと次いでカチオン脂質と順次、複合体化することができる。本発明の複合体によって、このプロセスの使用によって、正又は中性に荷電した薬剤の細胞への送達を可能になる。
【００２８】
本発明の態様の１つは、ケモカイン及びサイトカインの産生を刺激するカチオン脂質複合体の使用を含む。ケモカイン及びサイトカインは免疫応答の重要な調節剤である。ケモカインは元々、好中球、好酸球及び単球／マクロファージを含む炎症性細胞に対する強力な化学誘引剤として同定された。その後の研究によって、ケモカインは、樹状細胞やそのほかのリンパ球のリンパ系臓器への輸送を調節することによって、免疫反応に重大な効果を有することが明らかにされた。樹状細胞は、組織中の抗原を試食し、流入領域リンパ節に移動し、成熟してＴ細胞応答を刺激する、移動性の細胞である。ＣＣ型ケモカインの一員であるＣＣＬ２は元々、単球／マクロファージに対する走化性の活性化因子として同定された。その後の研究によって、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞及び好中球の機能にも影響を及ぼすことができることが示された。さらなる探索によって、ＣＣＬ２は、Ｔｈ１サイトカインであるインターロイキン−１２（「ＩＬ−１２」）及びインターフェロン−γ（「ＩＦＮ−γ」）の存在下で、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球（「ＣＴＬ」）活性の最も強力な活性化剤であることが見い出された。このことは、ＣＣＬ２とＩＦＮ−γの間の双方向の正の相互作用によって説明することができる。サイトカイン又はケモカインのいずれかの欠如は、Ｔｈ１の分極及びそれに続く特異的な腫瘍免疫の生成を妨害することもある。別のＣＣ型ケモカインであるＣＣＬ−４は、生体内で樹状細胞を動員し、増殖させ、プラスミドＤＮＡワクチンの免疫原性を増強することも示されている。最近、ケモカインは、ナイーブなＣＤ８＋Ｔ細胞をＣＤ４＋／樹状細胞の相互作用の部位にリクルートすることによって免疫を高め、記憶ＣＤ８＋Ｔ細胞の生成を促進することが示された。本発明のカチオン脂質複合体によって刺激されてもよいケモカインの２、３の例は、ＣＣＬ−２、ＣＣＬ−３及びＣＣＬ−４である。本発明のカチオン脂質複合体によって刺激されてもよいサイトカインの例は、ＩＬ−１２及びＩＦＮ−γである。本発明者らは、本発明のカチオン脂質複合体が、本明細書で開示されるものに加えてケモカイン及びサイトカインを刺激してもよいことを企図する。
【００２９】
さらなる態様では、本発明のカチオン脂質複合体は、たとえば、ＥＲＫ（extracellular signal-regulated kinase、細胞外シグナル調節性キナーゼ）経路（ＭＡＰキナーゼ（mitogen-activated protein kinase、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ）経路としても知られる）、ｐ３８経路、又はホスファチジルイノシトール−３（ＰＩ−３）経路のような、細胞性のキナーゼ経路を活性化することによって免疫応答を刺激する。これらの経路は、同様に免疫応答の刺激及びサイトカインやケモカインの産生を調節してもよい。これらの経路は当業者に周知である。
【００３０】
本発明のカチオン脂質複合体は、Ｔ細胞の活性を調節して免疫応答を刺激してもよい。３つのクラスのＴ細胞：ヘルパーＴ細胞、キラーＴ細胞及び調節性Ｔ細胞がある。これら３つのクラスのＴ細胞は一緒に機能して細胞性の免疫応答を調整する。キラーＴ細胞又はＣＤ８＋Ｔ細胞としても知られる細胞傷害性Ｔリンパ球（「ＣＴＬ」）は、外来抗原又は腫瘍抗原を発現する細胞を攻撃することに責務を負う。調節性Ｔ細胞のこの効果の基礎にある正確なメカニズムはよく理解されていないけれども、調節性Ｔ細胞は、ＣＴＬ介在性の免疫を弱化することに責務を負うと考えられている。調節性Ｔ細胞の活性の低下が結果としてＣＴＬ活性の増大を生じ、さらに強大な細胞性免疫応答を招くことが知られている。以下の実施例で示されるように、最適な脂質用量組成での本発明のカチオン脂質複合体は、調節性Ｔ細胞の集団を減少させることによって強力な免疫応答を刺激してもよい。
【００３１】
＜脂質＞
本発明のカチオン脂質複合体は、リポソームを形成してもよく、このリポソームは、任意で抗原と混合されるか、また、カチオン脂質だけを含有してもよいし、中性脂質との併用でカチオン脂質を含有してもよい。好適なカチオン脂質種には、３−β［４Ｎ（１Ｎ８−ジグアニジノスペルミジン）−カルバモイル］コレステロール（ＢＧＳＣ）；３−β［Ｎ，Ｎ−ジグアニジノエチル−アミノエタン）−カルバモイル］コレステロール（ＢＧＴＣ）；Ｎ，Ｎ１，Ｎ２，Ｎ３テトラ−メチルテトラパルミチルスペルミン（セルフェクチン）；Ｎ−ｔ−Ｎ’−ブチル−Ｎ’−テトラデシル−３−テトラデシル−アミノプロピオン−アミジン（ＣＬＯＮフェクチン）；ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）；１，２−ミリスチロキシプロピル−３−ジメチル−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）；２，３−ジオレオイルオキシ−Ｎ−［２（スペルミンカルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−ｐ−ロパナミニウムトリフルオロアセテート）（ＤＯＳＰＡ）；１，３−ジオレオイルオキシ−２−（６−カルボキシスペルミル）−プロピルアミド（ＤＯＳＰＥＲ）；４−（２，３−ビス−パルミトイルオキシ−プロピル）−１−メチル−１Ｈ−イミダゾール（ＤＰＩＭ）；Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２，３−ジオレオイルオキシ−１，４−ブタンジアンモニウムイオジド（Ｔｆｘ−５０）；Ｎ−１−（２、３−ジオレオイルオキシ）プロピル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）又はそのほかのＮ−（Ｎ，Ｎ−１−ジアルコキシ）−アルキル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−三置換アンモニウム界面活性剤；トリメチルアンモニウム基がブタノールスペーサーアームを介して二重鎖（ＤＯＴＢについて）又はコレステリル基（ＣｈＯＴＢについて）に接続する１，２−ジオレオイル−３−（４’−トリメチルアンモニオ）ブタノール−ｓｎ−グリセロール（ＤＯＢＴ）又はコレステリル（４’−トリメチルアンモニア)ブタノエート（ＣｈＯＴＢ）；ＷＯ９３／０３７０９で開示されたようなＤＯＲＩ（ＤＬ−１，２−ジオレオイル−３−ジメチルアミノプロピル−β−ヒドロキシエチルアンモニウム）又はＤＯＲＩＥ（ＤＬ−１，２−Ｏ−ジオレオイル−３−ジメチルアミノプロピル−β−ヒドロキシエチルアンモニウム）（ＤＯＲＩＥ）又はその類縁体；１，２−ジオレオイル−３−スシニル−ｓｎ−グリセロールコリンエステル（ＤＯＳＣ）；コレステリルヘミスクシネートエステル（ＣｈＯＳＣ）；たとえば、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（ＤＯＧＳ）及びジパルミトイルホスファチジルエタノールアミルスペルミン（ＤＰＰＥＳ）又は米国特許第５，２８３，１８５号で開示されたカチオン脂質、コレステリル−３β−カルボキシ−アミド−エチレントリメチルアンモニウムクロリド、１−ジメチルアミノ−３−トリメチルアンモニオ−ＤＬ−２−プロピル−コレステリルカルボキシレートイオジド、コレステリル−３−Ｏ−カルボキシアミドエチレンアミン、コレステリル−３−β−オキシスクシンアミド−エチレントリメチルアンモニウムイオジド、１−ジメチルアミノ−３−トリメチルアンモニオ−Ｄ��−２−プロピル−コレステリル−３−β−オキシスクシネートイオジド、２−(２−トリメチルアンモニオ）−エチルメチルアミノエチル−コレステリル−３−β−オキシスクシネートイオジド、３−β−Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）カルバモイルコレステロール（ＤＣ−ｃｈｏｌ）、及び３−β−Ｎ−(ポリエチレンイミン）−カルバモイルコレステロール；Ｏ，Ｏ−ジミリスチル−Ｎ−リシル−アスパルテート（ＤＭＫＥ）；Ｏ，Ｏ−ジミリスチル−Ｎ−リシル−グルタメート（ＤＭＫＤ）：１，２−ジミリスチルオキシプロピル−３−ジメチル−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）；１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（ＤＬＥＰＣ）；１，２−ジミリスチル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（ＤＭＥＰＣ）；１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（ＤＯＥＰＣ）；１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（ＤＰＥＰＣ）；１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（ＤＳＥＰＣ）；１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）；ジオレオイルジメチルアミノプロパン（ＤＯＤＡＰ）；１，２−パルミトイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＰＴＡＰ）；１，２−ジステアロイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＳＴＡＰ）；１，２−ミリストイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＭＴＡＰ）；及びドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）が挙げられるが、これらに限定されない。本発明は、本出願で開示されたカチオン脂質の構造的変異体及び誘導体の使用を企図する。
【００３２】
本発明の特定の態様は、以下の式によって表される構造を有する非ステロイド性カチオン脂質を包含する。
【化１】
2014058525.tif 000003
式中、Ｒ１は四級アンモニウム基であり、Ｙ１は、炭化水素鎖、エステル、ケトン及びペプチドから選択され、Ｒ２及びＲ３は独立して飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸、エステル結合炭化水素、蛍光体−ジエステル、及びそれらの組み合わせから選択される。ＤＯＴＡＰ、ＤＭＴＡＰ、ＤＳＴＡＰ、ＤＰＴＡＰ、ＤＰＥＰＣ、ＤＳＥＰＣ、ＤＭＥＰＣ、ＤＬＥＰＣ、ＤＯＥＰＣ、ＤＭＫＥ、ＤＭＫＤ、ＤＯＳＰＡ及びＤＯＴＭＡは、この一般構造を有する脂質の例である。
【００３３】
実施態様の１つでは、本発明のカチオン脂質は、脂肪親和性基とアミノ基の間の結合が水溶液中で安定である脂質である。従って、本発明の複合体の特質は、保存中のその安定性（すなわち、その製剤化の後長い間、小径を保ち、生物活性を保持する能力）である。カチオン脂質において使用されるそのような結合には、アミド結合、エステル結合、エーテル結合及びカルバモイル結合が挙げられる。当業者は、１を超えるカチオン脂質種を含有するリポソームを使用して本発明の複合体を製造してもよいことを容易に理解するであろう。たとえば、特定の薬剤送達応用について、２種のカチオン脂質種、リシル−ホスファチジルエタノールアミンとβ−アラニルコレステロールエステルを含むリポソームが開示されている［Brunette, E. et al., Nucl. Acids Res., 20:1151 (1992)］。
【００３４】
本発明での使用に好適なカチオンリポソームを考慮し、任意で抗原と混合するに際して、本発明の方法は、上記で引用されたカチオン脂質の使用にのみ拘束されるのではなく、むしろ、カチオンリポソームが製造され、得られるカチオン電荷密度が免疫応答を活性化し、誘導するのに十分である限り、いずれの脂質組成物を使用してもよいことがさらに理解されるべきである。
【００３５】
従って、本発明の複合体は、カチオン脂質に加えてそのほかの脂質を含有してもよい。これらの脂質としては、その例がリソホスファチジルコリン（１−オレオイルリソホスファチジルコリン）であるリソ脂質、コレステロール、又はジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）又はジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）を含む中性リン脂質、並びにその例がツイーン８０及びＰＥＧ−ＰＥであるポリエチレングリコール部分を含有する種々の脂肪親和性の界面活性剤が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３６】
形成される複合体の正味電荷が正である、及び／又は複合体の表面が正に荷電する限り、本発明のカチオン脂質複合体は、カチオン脂質と同様に、負に荷電した脂質も含有してもよい。本発明における負に荷電した脂質は、生理的ｐＨ又はその近傍で負の正味電荷を有する少なくとも１以上の脂質種又はこれらの組み合わせを含む脂質である。好適な負に荷電した脂質種としては、ＣＨＥＭＳ（コレステリルヘミスクシネート）、ＮＧＰＥ（Ｎ−グルタリルホスファチジルエタノールアミン）、ホスファチジルグリセロール及びホスファチジン酸又は類似のリン脂質類縁体が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３７】
本発明の薬剤送達複合体を含む脂質の製造において使用されるリポソームを製造する方法は、当業者に既知である。リポソーム調製の方法論の概説は、リポソーム技術（CFC Press New York 1984); Liposomes by Ostro (Marcel Dekker, 1987); Methods Biochem Anal. 33:337-462 (1988)及び米国特許第５，２８３，１８５号）に見い出されるかもしれない。そのような方法には、凍結融解押出し及び超音波処理が挙げられる。単層のリポソーム（平均直径約２００ｎｍ未満）及び多層のリポソーム（平均直径約３００ｎｍを超える）の双方を出発成分として用いて本発明の複合体を製造してもよい。
【００３８】
本発明のカチオン脂質複合体を製造するのに利用されるカチオンリポソームでは、リポソーム中のカチオン脂質は、リポソームの総脂質の約１０モル％〜約１００モル％、又は約２０モル％〜約８０モル％の割合で存在する。中性脂質がリポソームに含まれる場合、中性脂質は、リポソームの総脂質の約０モル％〜約９０モル％、又は約２０モル％〜約８０モル％、又は約４０モル％〜約８０モル％の濃度で存在してもよい。負に荷電した脂質がリポソームに含まれる場合、負に荷電した脂質は、リポソームの総脂質の約０モル％〜約４９モル％、又は約０モル％〜約４０モル％の範囲の濃度で存在してもよい。実施態様の１つでは、リポソームは約２：８〜約６：４の比率でカチオン脂質と中性脂質を含有する。本発明の複合体は、特定の組織又は細胞型に複合体を向ける標的化因子として機能する、修飾された脂質、タンパク質、ポリカチオン又は受容体リガンドを含有してもよいことがさらに理解される。標的化因子の例には、アシアロ糖タンパク質、インスリン、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、葉酸塩及び細胞の表面分子に対するモノクローナル抗体とポリクローナル抗体が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、複合体の循環半減期を改変するには、ポリエチレングリコール部分を含有する脂肪親和性の界面活性剤を組み入れることによって、正の表面電荷を立体的に遮蔽することができる。
【００３９】
カチオン脂質複合体は、スクロース勾配から回収した際、等張のスクロース若しくはデキストロースの溶液に保存してもよく、又は凍結乾燥し、次いで使用前に等張溶液で再構築してもよい。実施態様の１つでは、カチオン脂質複合体は溶液に保存される。特定のアッセイで本発明のカチオン脂質複合体の安定性を測定し、保存中長期間にわたるカチオン脂質複合体の物理的安定性及び生物活性を判定する。たとえば、電子顕微鏡、ゲル濾過クロマトグラフィを含む当業者に既知の方法によって、又はたとえば、実施例で記載されるようなコールターＮ４ＳＤ粒径アナライザを用いた準弾性光散乱によって、カチオン脂質複合体の直径及び電荷を測定することによりカチオン脂質複合体の物理的安定性を測定する。保存されたカチオン脂質複合体の直径が、１００％を超えて、又は５０％以下で、又は３０％以下で、カチオン脂質複合体が精製された時点で決定されたカチオン脂質複合体の直径を上回って増大しない場合、カチオン脂質複合体の物理的安定性は、保存中「実質的に不変である」といえる。
【００４０】
純粋な又は実質的に純粋な形態でカチオン脂質を投与することが可能である一方で、医薬組成物、製剤又は調製物としてそれを提示することが好ましい。本発明のカチオン脂質複合体を用いた医薬製剤は、たとえば、リン酸緩衝の生理食塩水、等張の生理食塩水又は酢酸塩若しくはＨｅｐｅｓのような低イオン強度の緩衝液（例示となるｐＨは約５．０〜約８．０）のような生理的に認容される無菌の緩衝液中にカチオン脂質複合体を含んでもよい。腫瘍内、動脈内、静脈内、気管支内、腹腔内、皮下及び筋肉内の投与のために、カチオン脂質複合体は、噴霧又は液状溶液として投与されてもよい。
【００４１】
本発明の製剤は、当該技術で既知のいかなる安定剤を組み入れてもよい。例証となる安定剤は、リポソームの二重層を堅くするのを助け、二重層の崩壊又は不安定化を防ぐのを助けるコレステロール及びそのほかのステロール類である。ポリエチレングリコール、多糖類及び単糖類のような作用剤をリポソームに組み入れてリポソーム表面を改質し、血液成分との相互作用によって不安定化されるのを防いでもよい。そのほかの例証となる安定剤は、単体で又は混合物のいずれかで使用されてもよいタンパク質、糖類、無機酸又は有機酸である。
【００４２】
多数の薬学的方法を採用して免疫刺激の持続時間を制御してもよく、改変してもよく、又は延長してもよい。ポリマー複合体、たとえば、ポリエステル、ポリアミノ酸、メチルセルロース、ポリビニル、ポリ（乳酸）及びヒドロゲル、の使用を介して、カチオン脂質をカプセル化し又は取り込み、次いでそれらを徐放させることによって、制御放出の調製物が得られる。同様のポリマーを使用してリポソームを吸収してもよい。刺激物の放出特性を変えるために、リポソームはエマルション製剤に含有されてもよい。或いは、リポソーム及びエマルションの循環時間及び半減期を増やすことが可能であるポリエチレングリコールやそのほかのポリマーのような化合物又は糖類のような物質でリポソームの表面を被覆することによって、血液循環における刺激物の存在の持続時間を増大させてもよい。
【００４３】
経口調製物が必要である場合、カチオン脂質を、当該技術で既知の典型的な医薬担体のうちでも、たとえば、スクロース、ラクトース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、又はアラビアゴムなどと組み合わせてもよい。全身性の送達のためには、カチオン脂質をカプセル又は錠剤に封入してもよい。
【００４４】
本発明のカチオン脂質の投与は、予防目的又は治療目的にいずれかであってもよい。予防的に提供される場合、カチオン脂質は、病気の証拠又は兆候に先立って提供される。治療的に提供される場合、カチオン脂質は疾患の発症時又は発症後に提供される。免疫刺激物の治療的投与は、疾患を減衰させる又は治癒させるのに役立つ。双方の目的で、カチオン脂質は、追加の作用剤又は抗原と共に投与されてもよい。カチオン脂質を、追加の作用剤又は抗原と共に投与する場合、特定の疾患に対する予防的又は治療的な効果が生成されてもよい。
【００４５】
獣医用及びヒトでの使用用の双方で、本発明の製剤は、上述のようにカチオン脂質だけを含むが、また、任意で１以上の治療成分、たとえば、抗原又は薬剤分子と共にカチオン脂質を含んでもよい。製剤は単位投与形態で好都合なように提示されてもよく、薬学技術で既知のいずれの方法で調製されてもよい。
【００４６】
＜抗原＞
実施態様の１つでは、そのほかの免疫調節剤の産生を含む種々の免疫応答を押し上げる又は低下させるために、及び免疫応答を押し上げて疾患と闘うために、カチオン脂質は追加の作用剤なしで投与される。別の実施態様では、カチオン脂質は抗原（単数又は複数）との併用で投与される。この場合、目的は、カチオン脂質と併用で送達された抗原に特異的である免疫応答を生成することである。生成される応答としては、結果としてそれら抗原に関連する特定の疾患の予防又はそれへの治療的応答を生じるような、特異的な細胞傷害性Ｔ細胞、記憶Ｔ細胞又はＢ細胞の産生が含まれてもよい。抗原は、腫瘍関連抗原又は微生物抗原又は当業者に既知のほかの抗原であることができる。
【００４７】
本明細書で使用される「腫瘍関連抗原」は、腫瘍細胞又は癌細胞に関連し、且つＭＨＣ分子の背景で抗原提示細胞の表面に発現されると免疫応答（液性及び／又は細胞性）を誘発することが可能である分子又は化合物（たとえば、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、リポタンパク質、リポペプチド、糖タンパク質、糖ペプチド、脂質、糖脂質、炭水化物、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡ）である。腫瘍関連抗原には、自己抗原、並びに、癌に特異的に関連していなくてもよいが、動物に投与した際、腫瘍若しくは癌に対する免疫応答を高める及び／又は腫瘍若しくは癌の増殖を低下させる、そのほかの抗原が含まれる。本明細書ではさらに特定の実施態様が提供される。
【００４８】
本明細書で使用される「微生物抗原」は、微生物の抗原であり、感染性ウイルス、感染性細菌、感染性寄生虫及び感染性真菌が挙げられるが、これらに限定されない。微生物抗原は、天然の微生物及び天然の単離物、その断片又は誘導体、天然に存在する微生物抗原と同一又はそれに類似する合成化合物であってもよく、好ましくは相当する微生物（天然に存在する微生物抗原がそれに由来する）に特異的な免疫応答を誘導する。好ましい実施態様では、天然に存在する微生物抗原と類似する免疫応答（液性及び／又は細胞性）を誘導するならば、化合物は天然に存在する微生物抗原に類似する。たとえば、たとえば、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、リポタンパク質、リポペプチド、糖タンパク質、糖ペプチド、脂質、糖脂質、炭水化物、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡのような天然に存在する微生物抗原と類似する化合物又は抗原は、当業者に周知である。天然に存在する微生物抗原と類似する化合物の別の非限定例は、多糖類抗原のペプチド模倣体である。本明細書ではさらに特定の実施態様が提供される。
【００４９】
用語「抗原」はさらに、本明細書で記載されるもののような既知の又は野生型の抗原のペプチド又はタンパク質の類縁体を包含することを意図する。類縁体は、野生型抗原に比べてより可溶性であるか、より安定性であってもよく、抗原をさらに免疫的に活発にする突然変異又は修飾も含有してもよい。たとえば、脂質若しくは糖の部分を付加する方法、ペプチド若しくはタンパク質のアミノ酸配列に突然変異を起こす方法、ＤＮＡ若しくはＲＮＡの配列に突然変異を起こす方法、又は当業者に既知のそのほかの修飾にて、抗原を修飾することができる。当業者に既知の常法を用いて抗原を修飾することができる。
【００５０】
また、本発明の組成物及び方法において有用であるのは、所望の抗原のアミノ酸配列と相同のアミノ酸配列を有し、相同の抗原が各腫瘍、微生物又は感染した細胞に対する免疫応答を誘導する、ペプチド又はタンパク質である。
【００５１】
実施態様の１つでは、カチオン脂質複合体における抗原は、腫瘍を防ぐ又は治療するワクチンを作製するための、腫瘍又は癌に関連する抗原、すなわち、腫瘍関連抗原を含む。そこで、実施態様の１つでは、本発明の腫瘍又は癌のワクチンは、少なくとも１つの腫瘍関連抗原の少なくとも１つのエピトープをさらに含む。別の好ましい実施態様では、本発明の腫瘍又は癌のワクチンは、１以上の腫瘍関連抗原の複数のエピトープをさらに含む。本発明のカチオン脂質複合体及び方法において用いうる腫瘍関連抗原は、本質的に免疫原性であるか、又は非免疫原性であるか、又はやや免疫原性であってもよい。本明細書で明らかにされるように、対象組成物がそのような抗原に対する免疫寛容を破壊することが可能であるので、治療効果に関して対象ワクチンにて腫瘍関連の自己抗原でさえ有利に採用されてもよい。例示となる抗原には、合成抗原、組換え抗原、外来抗原又は相同抗原が挙げられるが、これらに限定されず、抗原物質には、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、リポタンパク質、リポペプチド、糖タンパク質、糖ペプチド、脂質、糖脂質、炭水化物、ＲＮＡ及び／ＤＮＡが挙げられてもよいが、これらに限定されない。そのようなワクチンの例には、腫瘍関連抗原と共にカチオン脂質複合体を用いた、乳癌、頭頚部の癌、メラノーマ、子宮頚癌、肺癌、前立腺癌、消化器癌腫、又は免疫療法に感受性の当該技術で既知のそのほかの癌の治療又は予防が挙げられるが、これらに限定されない。リポソームに封入することなく抗原をカチオン脂質複合体と共に製剤化することも可能である。
【００５２】
癌を治療する又は予防するための方法に本発明のカチオン脂質複合体を使用してもよい。そのような場合、封入された抗原と共にリポソームを含有する医薬製剤を、免疫される哺乳類に注射する。腫瘍ワクチンによって治療されてもよい癌の例には、乳癌、頭頚部の癌、メラノーマ、子宮頚癌、肺癌、前立腺癌、消化器癌腫、又は、カチオン脂質と癌に関連する抗原又は複数のペプチド抗原を用いる、当該技術で既知のそのほかの癌の治療又は予防が挙げられるが、これらに限定されない。リポソームに抗原を封入することなく抗原をカチオン脂質複合体と共に製剤化することも可能である。
【００５３】
本発明での使用に好適な腫瘍関連抗原としては、天然に存在する分子及び修飾された分子のいずれかであって、単一の腫瘍型を示すか、幾つかの型の腫瘍の間で共有されるか、又は正常細胞に比べて独占的に発現される若しくは過剰発現されてもよい分子が挙げられる。タンパク質、糖タンパク質、リポタンパク質、ペプチド及びリポペプチドに加えて、炭水化物、ガングリオシド、糖脂質及びムチンの腫瘍特異的パターンの発現が記録されている。癌ワクチンでの使用のための例示となる腫瘍関連抗原には、癌遺伝子、腫瘍抑制遺伝子及び腫瘍細胞に特有の突然変異若しくは再構成を持つそのほかの遺伝子のタンパク産物、再活性化された胎児性遺伝子の産物、腫瘍胎児抗原、組織特異的（しかし、腫瘍特異的ではない）分化抗原、増殖因子受容体、細胞表面の炭水化物残基、外来ウイルスタンパク質並びに多数のそのほかの自己タンパク質が挙げられる。
【００５４】
腫瘍関連抗原の具体的な実施態様には、たとえば、Ｒａｓ  ｐ２１癌原遺伝子、腫瘍サプレッサーｐ５３及びＨＥＲ−２／ｎｅｕ及びＢＣＲ−ａｂｌ癌遺伝子のタンパク産物のような突然変異した又は修飾された抗原、並びにＣＤＫ４、ＭＵＭ１、カスパーゼ８及びベータカテニン；過剰発現された抗原、たとえば、ガレクチン４、ガレクチン９、炭酸脱水素酵素、アルドラーゼＡ、ＰＲＡＭＥ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＥｒｂＢ−２及びＫＳＡ、腫瘍胎児抗原、たとえば、α−フェトプロテイン(ＡＦＰ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）；自己抗原、たとえば、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）及びメラニン細胞分化抗原、たとえば、Ｍａｒｔ１／Ｍｅｌａｎ  Ａ、ｇｐｌＯＯ、ｇｐ７５、チロシナーゼ、ＴＲＰｌ及びＴＲＰ２；前立腺関連抗原、たとえば、ＰＳＡ、ＰＡＰ、ＰＳＭＡ、ＰＳＭ−Ｐｌ及びＰＳＭ−  Ｐ２；再活性化胎児性遺伝子産物、たとえば、ＭＡＧＥ  １、ＭＡＧＥ  ３、ＭＡＧＥ  ４、ＧＡＧＥ  １、ＧＡＧＥ  ２、ＢＡＧＥ、ＲＡＧＥ及びそのほかの癌精巣抗原、たとえば、ＮＹ−ＥＳＯｌ、ＳＳＸ２及びＳＣＰｌ；ムチン、たとえば、Ｍｕｃ−１  及びＭｕｃ−２；ガングリオシド、たとえば、ＧＭ２、ＧＤ２及びＧＤ３；中性糖脂質及び糖タンパク質、たとえば、ルイス（ｙ）及びグロボ−Ｈ；並びに糖タンパク質、たとえば、Ｔｎ、トンプソン−フリーデンリッヒ抗原（ＴＦ）及びｓＴｎが挙げられる。また、本明細書における腫瘍関連抗原としては、細胞全体及び腫瘍細胞の溶解物、またその免疫原性の部分、そしてＢ細胞リンパ腫に対する使用のためのＢリンパ球のモノクローナル増殖で発現された免疫グロブリンのイディオタイプも含まれる。
【００５５】
腫瘍関連抗原及びそれらの各腫瘍細胞標的には、たとえば、癌腫に対する抗原としてサイトケラチン類、特にサイトケラチン８、１８及び１９が挙げられる。上皮膜抗原（ＥＭＡ）、ヒト胎児性抗原（ＨＥＡ−１２５）、ヒト乳脂肪小球、ＭＢｒＩ、ＭＢｒ８、Ｂｅｒ−ＥＰ４、１７−１Ａ、Ｃ２６及びＴ１６も既知の癌腫抗原である。デスミン及び筋肉特異的アクチンは、筋原肉腫の抗原である。胎盤アルカリホスファターゼ、ベータ−ヒト絨毛性ゴナドトロピン及びα−フェトプロテインは、絨毛性の胚細胞の腫瘍の抗原である。前立腺特異抗原は、前立腺癌腫の抗原であり、結腸腺癌の癌胎児性抗原である。ＨＭＢ−４５はメラニン細胞の抗原である。子宮頸癌では、有用な抗原は、ヒトパピローマウイルスによってコードされればよい。クロマグラニンＡ及びシナプトフィシンは、神経内分泌及び神経外胚葉系の腫瘍の抗原である。特に関心があるのは、壊死領域を有する固形腫瘍塊を形成する侵襲性の腫瘍である。そのような壊死細胞の溶解物は、抗原提示細胞のための抗原の豊富な供給源であるので、対象療法は従来の化学療法及び／又は放射線療法と併せた有利な使用が見い出されるであろう。
【００５６】
実施態様の１つでは、ヒトのパピローマウイルスＨＰＶ抗原が使用される。腫瘍関連抗原として使用される特定のＨＰＶ抗原は、ＨＰＶの亜型１６Ｅ７である。ＨＰＶ  Ｅ７抗原／カチオン脂質複合体は、子宮頸癌を予防し、治療するのに有効である。さらに、遺伝子操作を加えたＥ７タンパク質、すなわち、抗原性活性は有するが腫瘍形成活性を欠くＥ７ｍは、有効な腫瘍関連抗原である。Ｅ７ｍ／カチオン脂質複合体は、細胞性免疫を誘導し、樹立された腫瘍の完全な退行を生じるので、強力な抗子宮頸癌ワクチンとして有用である。
【００５７】
腫瘍関連抗原は、当該技術で周知の方法によって調製することができる。たとえば、癌細胞の粗抽出物を調製すること（たとえば、Cohen et al., Cancer Res., 54:1055 (1994)に記載されたように）、抗原を部分的に精製すること、組換え技術、又は、既知の抗原のデノボ合成のいずれかによって、これらの抗原を癌細胞から調製することができる。抗原はまた、対象での発現及び免疫された対象の免疫系への提示に好適な形態で抗原性ペプチドをコードする、核酸の形態であってもよい。さらに、抗原は、完全な抗原であってもよく、又は少なくとも１つエピトープを含む、完全な抗原の断片であってもよい。
【００５８】
特定の癌への素因が知られる病原体に由来する抗原も本発明の癌ワクチンに有利に包含されてもよい。世界中の癌の発生の１６％近くが感染性病原体によるものであると推定され、多数の一般的な悪性腫瘍は、特定のウイルス遺伝子産物の発現を特徴とする。従って、癌の原因となると思われる病原体に由来する１以上の抗原を包含することは、宿主の免疫応答を広げることを助け、癌ワクチンの予防効果又は治療効果を高めるのを助ける。本明細書で提供される癌ワクチンで使用するのに特に関心のある病原体には、Ｂ型肝炎ウイルス（肝細胞癌腫）、Ｃ型肝炎（肝臓癌）、エプステインバーウイルス（ＥＢＶ）（バーキットリンパ腫、鼻咽頭癌、免疫抑制された個体におけるＰＴＬＤ）、ＨＴＬＶＬ（成人Ｔ細胞白血病）、発癌性のヒトパピローマウイルス、１６、１８、３３、４５型(成人子宮頚癌）、及びヘリコバクターピロリ菌（Ｂ細胞胃リンパ腫）が挙げられる。哺乳類及びさらに特にヒトにおいて抗原として役立ってもよいそのほかの医学的に関連する微生物は、文献に幅広く記載されており、たとえば、Ｃ．Ｇ．ＡＴｈｏｍａｓ，Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｂａｉｌｌｉｅｒｅ  Ｔｉｎｄａｌｌ，Ｇｒｅａｔ  Ｂｒｉｔａｉｎ  １９８３が挙げられ、その内容全体を参照により本明細書に組み入れる。
【００５９】
別の実施態様では、カチオン脂質複合体における抗原は、病原体に由来する又は関連する抗原、すなわち、微生物抗原を含む。そこで、実施態様の１つでは、本発明の病原体ワクチンは、少なくとも１つの微生物抗原の少なくとも１つのエピトープをさらに含む。対象ワクチンによって標的とされてもよい病原体には、ウイルス、細菌及び真菌が挙げられるが、これらに限定されない。別の実施態様では、本発明の病原体ワクチンは、１以上の微生物抗原に由来する複数のエピトープをさらに含む。
【００６０】
本発明のカチオン脂質複合体及び方法において用いうる微生物抗原、本質的に免疫原性であるか、又は非免疫原性であるか、又はやや免疫原性である。例示となる抗原には、合成抗原、組換え抗原、外来抗原又は相同抗原が挙げられるが、これらに限定されず、抗原物質には、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、リポタンパク質、リポペプチド、脂質、糖脂質、炭水化物、ＲＮＡ及び／ＤＮＡが挙げられてもよいが、これらに限定されない。
【００６１】
例示となるウイルス抗原には、哺乳類、さらに特にヒトに感染するウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。ウイルスの例には、Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ（たとえば、ＨＩＶ−１（ＨＴＬＶ−ＩＩＩ、ＬＡＶ若しくはＨＴＬＶ−ＩＩＩ／ＬＡＶ若しくはＨＩＶ−ＩＩＩとも呼ばれる）のようなヒト免疫不全症ウイルス；及びそのほかの単離物、たとえば、ＨＩＶ−ＬＰ；Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ（たとえば、ポリオウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、腸ウイルス、ヒトコクサッキーウイルス、リノウイルス、エコウイルス）；Ｃａｌｃｉｖｉｒｉｄａｅ（たとえば、胃腸炎を起こす株）；Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ（たとえば、馬脳炎ウイルス、ルベラウイルス）；Ｆｌａｖｉｒｉｄａｅ（たとえば、デングウイルス、脳炎ウイルス、黄熱病ウイルス）；Ｃｏｒｏｎｏｖｉｒｉｄａｅ（たとえば、コロナウイルス）；Ｒｈａｂｄｏｖｉｒａｄａｅ（たとえば、水疱性口内炎ウイルス、ラビエスウイルス）；Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ（たとえば、コロナウイルス）；Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ（たとえば、水疱性口内炎ウイルス、ラビエスウイルス）；Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ（たとえば、エボラウイルス）；Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ（たとえば、パラインフルエンザウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス）；Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ（たとえば、インフルエンザウイルス）；Ｂｕｎｇａｖｉｒｉｄａｅ（たとえば、ハンタンウイルス、ブンガウイルス、フレボウイルス及びナイロウイルス）；Ａｒｅｎａ  ｖｉｒｉｄａｅ（出血熱ウイルス）；Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ（たとえば、レオウイルス、オルビウイルス及びロタウイルス）；Ｂｉｒｎａｖｉｒｉｄａｅ；Ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ（Ｂ型肝炎ウイルス）；Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａ（パルボウイルス）；Ｐａｐｏｖａｖｉｒｉｄａｅ（パピローマウイルス、ポリオーマウイルス）；Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ（ほとんどのアデノウイルス）；Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ、単純性ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）１及び２、帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヘルペスウイルス；Ｐｏｘｙｉｒｉｄａｅ（痘瘡ウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス）；並びにＩｒｉｄｏｖｉｒｉｄａｅ（たとえば、アフリカブタコレラウイルス）；並びに分類されていないウイルス（たとえば、海綿状脳症の病因因子、デルタ型肝炎（Ｂ型肝炎ウイルスの不完全な付随体と考えられる）の因子、非Ａ、非Ｂ型肝炎(クラス１＝内部伝染；クラス２＝非経口伝染（すなわち、Ｃ型肝炎）の因子；ノーウォークウイルス及び関連ウイルス、及びアストロウイルス）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６２】
また、脊椎動物における対象組成物及び方法によって、グラム陰性及びグラム陽性の細菌が標的とされてもよい。そのようなグラム陽性の細菌には、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ種、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ種及びＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ種が挙げられるが、これらに限定されない。グラム陰性の細菌には、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種及びＳａｌｍｏｎｅｌｌａ種が挙げられるが、これらに限定されない。感染性細菌の具体例には、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｎｓ、Ｂｏｒｅｌｌａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ  ｓｐｓ  （たとえば、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍ．ａｖｉｕｍ、Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ、Ｍ．ｋａｎｓａｉｉ、Ｍ．ｇｏｒｄｏｎａｅ）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ（Ａ群、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ（Ｂ群、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ（ｖｉｒｉｄａｎｓ群）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｏｖｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ（ａｎａｅｒｏｂｉｃ  ｓｐｓ．）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｕｅｎｚａｅ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｒａｃｉｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ  ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｒｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｐａｓｔｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｓｐ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｉｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｉｕｍ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐｅｒｔｅｎｕｅ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ及びＡｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｉｓｒａｅｌｉｉが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６３】
対象組成物における微生物抗原の供給源としての使用を見い出してもよい細菌性病原体のポリペプチドには、せつ腫症の原因となるＡｅｒｏｍｏｎｉｓ  ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａの鉄調節性の外膜タンパク質（「ＩＲＯＭＰ」）、外膜タンパク質（「ＯＭＰ」）及びＡ−タンパク質、細菌性腎疾患（「ＢＫＤ」）の原因となるＲｅｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓａｌｍｏｎｉｎａｒｕｍのｐ５７タンパク質、主要表面関連抗原（「ｍｓａ」）、表面に発現された細胞毒素（「ｍｐｒ」）、表面に発現されたヘモリシン（「ｉｓｈ」）、及びＹｅｒｓｉｎｉｏｓｉｓの鞭毛抗原；Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌｏｓｉｓの細胞外タンパク質（「ＥＣＰ」）、鉄調節性の外膜タンパク質（「ＩＲＯＭＰ」）及び構造タンパク質；Ｖｉｂｒｏｓｉｓ  ａｎｇｕｉｌｌａｒｕｍ及びＶ．ｏｒｄａｌｉｉのＯＭＰ及び鞭毛タンパク質；Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌｏｓｉｓ  ｉｃｔａｌｕｒｉ及びＥ．ｔａｒｄａの鞭毛タンパク質、ＯＭＰタンパク質、アロＡ及びｐｕｒＡ；Ｉｃｈｔｈｙｏｐｈｔｈｉｒｉｕｓの表面抗原；Ｃｙｔｏｐｈａｇａ  ｃｏｌｕｍｎａｒｉの構造タンパク質及び調節性タンパク質；並びにＲｉｃｋｅｔｔｓｉａの構造タンパク質及び調節性タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。組換えによって又は当該技術で既知のそのほかのいずれかの手段によってそのような抗原を単離し、調製することができる。
【００６４】
病原体の例には、哺乳類、さらに特にヒトに感染する真菌がさらに挙げられるが、これらに限定されない。真菌の例には、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｉｍｍｉｔｉｓ、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ及びＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓが挙げられるが、これらに限定されない。感染性寄生虫の例には、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｍａｌａｒｉａｅ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｏｖａｌｅ及びＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｖｉｖａｘのようなＰｌａｓｍｏｄｉｕｍが挙げられるが、これらに限定されない。そのほかの感染性生物（すなわち、原生生物）には、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉが挙げられる。寄生虫病原体のポリペプチドには、Ｉｃｈｔｈｙｏｐｈｔｈｉｒｉｕｓの表面抗原が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６５】
哺乳類、さらに特にヒトにおいて抗原として役立つそのほかの医学的に関連する微生物は、文献に広範に記載されており、たとえば、Ｃ．Ｇ．Ａ．Ｔｈｏｍａｓ，  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｂａｉｌｌｉｅｒｅ  Ｔｉｎｄａｌｌ，Ｇｒｅａｔ  Ｂｒｉｔａｉｎ  １９８３（その内容全体を参照により本明細書に組み入れる）を参照されたい。感染性のヒト疾患及びヒト病原体の治療に加えて、本発明の組成物及び方法は、非ヒト哺乳類の感染を治療するのに有用である。非ヒト哺乳類の治療のための多数のワクチンは、Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｋ．獣医製品の概要、第３版、Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍｓ，Ｉｎｃ．、１９９５に開示されており；ＷＯ  ０２／０６９３６９（その開示を参照により本明細書に組み入れる）も参照されたい。
【００６６】
例示となる非ヒト病原体には、マウス乳癌ウイルス（「ＭＭＴＶ」）、ラウス肉腫ウイルス（「ＲＳＶ」）、トリ白血病ウイルス（「ＡＬＶ」）、トリ骨髄芽球症ウイルス（「ＡＭＶ」）、マウス白血病ウイルス（「ＭＬＶ」）、ネコ白血病ウイルス（「ＦｅＬＶ」）、マウス肉腫ウイルス（「ＭＳＶ」）、テナガザル白血病ウイルス（「ＧＡＬＶ」）、脾臓壊死ウイルス（「ＳＮＶ」）、細網内皮症ウイルス（「ＲＶ」）、サル肉腫ウイルス（「ＳＳＶ」）、マソン−ファイザーマネーウイルス（「ＭＰＭＶ」）、サルレトロウイルス（「ＳＲＶ−１」）、レンチウイルス、たとえば、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２，ＳＩＶ、ビスナウイルス、ネコ免疫不全症ウイルス（「ＦＩＶ」）、及びウマ感染性貧血ウイルス（「ＥＩＡＶ」）、Ｔ細胞白血病ウイルス、たとえば、ＨＴＬＶ−１、ＨＴＬＶ−ＩＩ、サルＴ細胞白血病ウイルス（「ＳＴＬＶ」）、及びウシ白血病ウイルス（「ＢＬＶ」）、及び泡沫状ウイルス、たとえば、ヒト泡沫状ウイルス（「ＨＦＶ」）、サル泡沫状ウイルス（「ＳＦＶ」）及びウシ泡沫状ウイルス（「ＢＦＶ」）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６７】
一部の実施態様では、「治療」、「治療する」及び「治療すること」は、感染性病原体を参照して本明細書で使用されるとき、病原体による感染に対する対象の抵抗力を高める又は対象が病原体に感染する可能性を減らす予防的治療、及び／又は対象が感染した後、感染と闘うための、たとえば、感染を軽減する若しくは排除する又は感染が悪化するのを防ぐための治療を言う。
【００６８】
微生物抗原は、当該技術で周知の方法によって調製することができる。たとえば、粗抽出物を生成することによって、抗原を部分的に精製することによって、或いは組換え技術によって、又は既知の抗原のデノボ合成によって、これらの抗原は、ウイルス細胞及び細菌細胞から直接調製することができる。抗原はまた、対象での発現及び免疫された対象の免疫系への提示に好適な形態で抗原性ペプチドをコードする、核酸の形態であってもよい。さらに、抗原は、完全な抗原であってもよく、又は少なくとも１つエピトープを含む、完全な抗原の断片であってもよい。
【００６９】
抗原のカチオン脂質小胞への取り込みを改善し、又免疫系の細胞への送達を改善するために、抗原を修飾してその疎水性を高め、抗原上の負の電荷を高めてもよい。分子の抗原性特性を保持する一方で、カチオン脂質の疎水性アシル鎖における抗原の溶解性を改善するために、脂質鎖又は疎水性のアミノ酸に結合することによって抗原の疎水性を高めてもよい。修飾された抗原は、リポタンパク質、リポペプチド、疎水性を高めたアミノ酸で修飾されたタンパク質又はペプチド、及びそれらの組み合わせであってもよい。修飾された抗原は、脂質と抗原の間に結合されたリンカーを有してもよく、たとえば、ジペプチドであるセリン／セリンのリンカーを介して、Ｎ末端のα又はε−パルミトイルリジンを抗原に接続してもよい。以下でさらに詳細に議論するように、ＤＯＴＡＰ／Ｅ７製剤に比べて、ＤＯＴＡＰ／Ｅ７リポペプチド複合体は、生体内で、増強された機能的な抗原特異的ＣＤ８＋Ｔリンパ球の応答を示した。さらに、抗原がカチオン脂質複合体に封入される製剤緩衝液を変更することによって、又はアニオン部分、たとえば、アニオン性アミノ酸を抗原に共有結合させることによって、抗原を操作して負の電荷を高めてもよい。
【００７０】
実施例１（以下）で明らかにされるように、Ｅ７抗原の免疫原性は、抗原を共有結合で修飾することによって高められた。アミノ酸配列を抗原に共有結合させることを、得られるアミノ酸配列が抗原が由来する母体タンパク質に見い出されないように行うことができた。修飾された抗原が、元々の抗原に比べて優れたＭＨＣクラス１結合親和性を提供することを明らかにするために研究が行われた。明らかにされたように、この優れた結合親和性は、ＨＰＶ陽性のＴＣ−１腫瘍に対する生体内での優れた抗腫瘍免疫応答の生成として説明された。本発明は、以下の実施例に照らしてさらに十分に理解されるであろう。
【実施例】
【００７１】
〔実施例１〕
特定の用量組成のカチオン脂質による免疫系及び抗原提示細胞への抗原送達に対する効果的な刺激は、疾患の予防及び治療において強力な免疫応答をもたらす
【００７２】
１．カチオン脂質（たとえば、ＤＯＴＡＰ）のみ又は抗原（たとえば、ＨＰＶタンパク質Ｅ７ペプチド抗原）を取り込んでいるカチオンリポソームを含む免疫系刺激物としての使用のためのリポソームの調製
【００７３】
細胞培養等級の水（メリーランド州、ウォーカーズビルのカムブレックスから市販されている）又はリン酸緩衝の生理食塩水をすべてのリポソーム調製手順に用いた。Ｅ７抗原は、ＨＰＶ１６Ｅ７タンパク質（ペンシルベニア州、ピッツバーグのピッツバーグ大学分子医学研究所によって合成された）に由来するＨ−２Ｄｂ拘束性のＣＴＬエピトープ（アミノ酸４９〜５７、ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ［配列番号１］であった。
【００７４】
これらの研究で使用されたリポソームは脂質フィルムを用いて作製した。脂質フィルムは、（１）クロロホルムに脂質を溶解すること及び（２）絶え間なく流れる乾燥窒素ガスのもとでクロロホルムを蒸発させることによってガラスのバイアルで作製した。一晩真空下でフィルムを保持することによって微量の有機溶媒を除去した。次いで、必要とされる量の水又は緩衝液を加えて１０ｍｇ／ｍＬの最終濃度にすることによって１２時間、脂質フィルムを水和した。次いで、槽型超音波処理器にて懸濁液を１０分間超音波処理し、その後４００、２００及び１００ｎｍの膜フィルター（ネバダ州、リノのハミルトン社から市販されている）を介して押し出し、４℃で保存した。ＤＯＴＡＰ／Ｅ７の調製については、Ｅ７ペプチドの水溶液によって脂質フィルムを再水和した。当業者に周知である一般的なリポソーム調製で使用されるそのほかの方法も使用されてもよい。
【００７５】
２．リンパ節細胞及び樹状細胞によるＩＬ−２及びＴＮＦ−αの産生は、カチオン脂質による処理の後刺激される
【００７６】
カチオン脂質、ＤＯＴＡＰの免疫賦活性のメカニズムを解明し、免疫賦活活性をさらに特徴付けるために、ＤＯＴＡＰが適切なＴｈ１サイトカイン産生を誘導してさらに免疫応答を高めるかどうかを評価することが重要である。従って、我々は、ＤＯＴＡＰの刺激に続く骨髄由来の樹状細胞（「ＢＭＤＣ」）によるサイトカインの産生を調べた。組換えｍＧＭ−ＣＳＦとｍＩＬ−４の存在下インビトロでの６日間の培養後、ＢＭＤＣ（ウエル当たり２ｍＬ中に１０６個の細胞）を、培地対照、ＤＯＴＡＰリポソーム、ＬＰＤ（カチオン脂質が複合体化したＤＮＡとプロタミン）又はリポ多糖類（ＬＰＳ）０．１μｇ／ｍＬで３７℃にて２０時間刺激した。上清中のＩＬ−１２とＴＮＦ−αの産生をＢＤのＥＬＩＳＡセットによって解析した。ＬＰＤ及びＬＰＳは陽性対照として使用した。ＬＰＤにおける細菌ＤＮＡは、トール様受容体を介して免疫系を刺激し、ＴＮＦ−αを刺激することが知られているＣｐＧモチーフを含有する。培養上清を回収し、ＩＬ−１２とＴＮＦ−αのサイトカインレベルをＥＬＩＳＡによって評価した。図１では、ＤＯＴＡＰの濃度に応答してＴＮＦ−αではなくＩＬ−１２の産生が上昇した。このことは、樹状細胞に加えて、ほかの種類の細胞、たとえば、Ｔ細胞も、生体内で見られたＤＯＴＡＰリポソームによって刺激されるＴｈ１サイトカインの産生に関与しているかもしれないことを示している。さらに、カチオン脂質が有意なレベルの炎症誘発性サイトカインＴＮＦ−αを誘導しなかったという事実は、免疫賦活のメカニズムが、トール様受容体の経路とは無関係かもしれないことを示唆している。
【００７７】
３．抗原特異的なＣＴＬ免疫応答はカチオン脂質／抗原複合体によって脂質用量依存的に誘導される。
【００７８】
０日目と７日目にメスのＣ５７ＢＬ／６マウスをＤＯＴＡＰ／Ｅ７製剤によって免疫した。種々の濃度のＤＯＴＡＰを用いたが、ＨＰＶ−１６Ｅ７抗原の濃度は、１０μｇ用量で維持した。Ｅ７抗原は、ＨＰＶ１６Ｅ７タンパク質に由来するＨ−２Ｄｂ拘束性のＣＴＬエピトープ（アミノ酸４９〜５７、ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ［配列番号１］であった。最終免疫の７日後、マウスを屠殺し、脾細胞を回収し、分離した。ＲＢＣを除いた後、完全なＲＰＭＩ１６４０培地中にて４０Ｕ／ｍＬの組換えＩＬ−１２（ミネソタ州、ミネアポリスのＲ＆Ｄシステムズから市販されている）の存在下Ｅ７ペプチド（１０μｇ／ｍＬ）で５日間、脾細胞集団（応答細胞）を刺激した。インビトロでのＣＴＬの増殖の後、応答細胞はＣＴＬのエフェクターとして使えるようになる。このアッセイでは、ＴＣ−１細胞株をターゲット細胞として用いた。ＴＣ−１細胞は、ＨＰＶ１６Ｅ６とＥ７癌遺伝子と活性化Ｈ−ｒａｓによって形質転換されたＣ５７ＢＬ／６マウスの肺上皮細胞である。エフェクターとターゲットを識別するために、製造元の指示書に従って、ＴＣ−１細胞をＰＫＨ−６７（ミズーリ州、セントルイスのシグマから市販されている）で標識した。種々のエフェクター：ターゲット（Ｅ：Ｔ）の比にてエフェクターと標識されたターゲットを９６穴プレートに入れ、３７℃にて４時間、溶解反応を行った。細胞を回収し、ＢＤのＦＡＣＳオートデジタルフローサイトメータ（カリフォルニア州、サンディエゴのＢＤバイオサイエンシズから市販されている）での解析のためにヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で染色した。ＦＬ１（ＰＫＨ−６７）陽性領域内でのＰＩ陽性細胞の比率によってＥ７特異的溶解の比率を決定した。
【００７９】
今や図２を参照して、１００ナノモルのＤＯＴＡＰでＤＯＴＡＰ／Ｅ７を与えられたマウスは、ＴＣ−１細胞の特異的殺傷を生じる有意なＣＴＬ活性を示したが、６００ナノモルのＤＯＴＡＰでＤＯＴＡＰ／Ｅ７を与えられたマウスは、殺傷効果の有意な低下を示し、カチオン脂質の用量反応効果を示すことが認められる。１５ナノモルのＤＯＴＡＰでＤＯＴＡＰ／Ｅ７を与えられたマウスは、ＰＢＳで処理した対照マウスと有意に異なるＣＴＬ活性を生じなかった。我々は、最適な用量のＤＯＴＡＰを与えた群からのエフェクター細胞をターゲットとしてのＨＰＶＥ７陰性ＢＬ６細胞とインキュベートすることによってこの殺傷がＥ７特異的であることを確認したが、無視できるほどの細胞の殺傷も生じた。ＣＴＬ介在性の殺傷に加えて、我々はまた、ナチュラルキラー（「ＮＫ」）細胞介在性の細胞傷害性も検討した。ＮＫ細胞は意図的な免疫なしで腫瘍細胞を破壊することができ、天然の免疫応答で重要な役割を担っている［Wu, J及びLanier, L L, ナチュラルキラー細胞と癌。Adv Cancer Res 90: 127 (2003); 及びLodoen, MB及びLanier, LL, 病原体に対する初期防御としてのナチュラルキラー細胞。 Curr Opin Immunol 18:391 (2006)］。種々の用量のＤＯＴＡＰでＤＯＴＡＰ／Ｅ７複合体を与えたマウスは、ＮＫ感受性のターゲットであるＹＡＣ−１細胞に対して有意な殺傷を示した。
【００８０】
４．カチオン脂質／抗原複合体の投与は、生体内で脂質用量依存的にＣＤ８＋及びＣＤ４＋のＴ細胞集団を誘導し、Ｅ７陽性腫瘍の微細環境への移動を誘導する
【００８１】
最適なＤＯＴＡＰ／Ｅ７製剤がＴリンパ球（Ｔ細胞）の産生を誘導するかどうか、及びＴリンパ球はＥ７抗原を発現する細胞の部位に効果的に移動するかどうかを理解するために、腫瘍に浸潤しているＴリンパ球の免疫組織化学的検討を行った(図３）。６〜７週令のメスＣ５７ＢＬ／６マウスをチャールズリバーラボラトリーズ（マサチューセッツ州、ウィルミントン）から購入し、すべての動物試験に用いた。０日目に毛を刈り込んだマウスのわき腹にＴＣ−１細胞（１０５個）を注射することによって皮下のＨＰＶ陽性腫瘍を定着させた。６日目に、それぞれ１０μｇのＥ７ペプチドを含有するＤＯＴＡＰ／Ｅ７（１５、１００、６００ナノモル）の選択した製剤１５０μＬをマウス（ｎ＝６）の皮下に注射した。
【００８２】
１４日目に固形のＨＰＶ陽性の腫瘍をマウスから切り出し、分離し、ティッシュ−Ｔｅｋ（登録商標）ＯＣＴコンパウンド（カリフォルニア州、トランスのサクラファインテックから市販されている）に包埋した（その後、凍結切片の調製）。クリオスタット（Ｈ／Ｉハッカーインスツルメンツ＆インダストリーズ社から市販されている）によって試料を８μｍの厚さの切片に切断した。ＦＩＴＣを結合した抗ＣＤ８抗体及び抗ＣＤ４抗体（カリフォルニア州、オーバーンのミルテンイバイオテック社から市販されている）を用いて腫瘍に浸潤しているＴ細胞を決定し、その後、ＤＡＰＩによって核を対比染色した。切片の画像は、レイカＳＰ２共焦点顕微鏡によって撮った。
【００８３】
ＴＡＣＳ（商標）ＴｄＴキット（ミネソタ州、ミネアポリスのＲ＆Ｄシステムズから市販されている）を用いてＴＵＮＥＬ解析を行い、製造元の指示書に従ってＤＡＢで発色させた。ニコンマイクロフォトＳＡ顕微鏡によって試料を画像化した。
【００８４】
図３に示されるように、無処理のマウス（図３Ａ）及び高用量のＤＯＴＡＰ組成物（６００ナノモル、図３Ｃ）を与えたマウスに比べて、１００ナノモルでＤＯＴＡＰ／Ｅ７を与えたマウスでは、ＣＤ８＋Ｔリンパ球が高い割合(約５％）で見い出された。同様の結果は、ＣＤ４＋Ｔ細胞についても見い出された（図３Ｅ〜Ｆ）。アポトーシスを判定するＴＵＮＥＬアッセイも一部の腫瘍凍結切片で行った。図３Ｈでは、無処理のマウス（図３Ｇ）及び正常で生きた腫瘍細胞を示した高用量群（図３Ｉ）に対して、１００ナノモル用量のＤＯＴＡＰ／Ｅ７複合体でマウスを処理した後では、これらのマウスの腫瘍細胞の濃縮され、断片化された核でＴＵＮＥＬ陽性反応が認められた。「抗原特異的なＣＴＬ免疫応答はカチオン脂質／抗原複合体によって脂質用量依存的に誘導される」と題される上記第３項における抗原特異的なＣＴＬ応答に対する用量反応効果と同様の、Ｔリンパ球産生に対するカチオン脂質用量の用量反応効果が認められた。
【００８５】
５．カチオン脂質／抗原複合体の投与は液性免疫を誘導する。
【００８６】
図４は、ＤＯＴＡＰとタンパク質抗原、卵白アルブミンを含有するカチオン脂質／抗原複合体をマウスに注射した結果を示す。Ｂ細胞活性を刺激して抗体産生を誘導する、液性の免疫応答として知られる複合体の能力についてマウスを評価した。ＩｇＧ抗体の形成をモニターすることによって液性応答を評価した。図４に説明されるように、ＤＯＴＡＰ／卵白アルブミン複合体は用量依存的に液性の応答を誘発した。これらのデータは、ＤＯＴＡＰ製剤を使用して細胞性と液性の双方の免疫応答を刺激してもよいことを示唆している。
【００８７】
６．カチオン脂質／抗原複合体の投与は脂質用量依存的に調節性Ｔ細胞の集団を小さくする
【００８８】
調節性Ｔ細胞は腫瘍関連抗原に対するＴ細胞免疫を弱め、奏功する免疫療法及び活性のあるワクチンを抑える主な障害であると考えられている。従って、我々は、担癌マウスにて調節性Ｔ細胞によって維持されている免疫寛容を、最適用量での治療的ワクチン製剤におけるＤＯＴＡＰ／Ｅ７が破壊する能力、よって腫瘍関連抗原に対するＴ細胞免疫を高める能力を検討した。フローサイトメトリー解析に使用された抗マウス抗体はすべてＢＤファーミンゲン（カリフォルニア州、サンディエゴ）又はバイオサイエンス社（カリフォルニア州、サンディエゴ）から購入したが、それらはそこから市販されている。脾臓細胞を回収し、１ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼと７０μｍの細胞濾過器を用いて分離した。赤血球（ＲＢＣ）を除いた後、４℃にて単一細胞の浮遊液を蛍光標識したモノクローナル抗体、抗−ＣＤ４（ＲＭ４−５）、抗−ＣＤ８ａ（５３−６．７）、抗−ＣＤ３ｅ（１４５−２ｃｌｌ）、抗−ＮＫｌ．ｌ（ｐｋｌ３６）及び抗−ＣＤ２５（ｐｃ６１．５）によって３０分間染色した。固定し、製造元の指示書に従ってＣｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ（商標）キット（ＢＤファーミンゲン）を用いて浸透化した後、５０μＬのＰｅｒｍ／Ｗａｓｈ（商標）緩衝液中の抗−Ｆｏｘｐ３（ＦＪＫ−１６ｓ）によって４℃にて３０分間細胞を染色した。さらに２回Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ（商標）緩衝液で細胞を洗浄し、次いで最終的に３００μＬの染色緩衝液に再浮遊し、ＢＤのＦＡＣＳオートデジタルフローサイトメータ（カリフォルニア州、サンディエゴのＢＤバイオサイエンシズから市販されている）で解析した。図５に示されるように、ＤＯＴＡＰ／Ｅ７複合体（１００ナノモルのＤＯＴＡＰ）を与えたマウスから回収した脾臓細胞は、高投与量（６００ナノモルのＤＯＴＡＰ）動物と違って、無処理の担癌マウスに比べて、さらに低い量の調節性Ｔ細胞亜集団（Ｆｏｘｐ３＋、ＣＤ２５＋及びＦｏｘｐ３＋／ＣＤ２５＋）を示した。
【００８９】
表１では、調節性Ｔ細胞の解析に関する１０の代表的な実験を要約する。マウスが最適なＤＯＴＡＰ／Ｅ７処理を受けた後、脾臓細胞では、ＣＤ４＋Ｔ細胞の集団が有意に増大し、同様の増大はＣＤ８＋Ｔ細胞でも見い出された（データは示さず）。さらに、この処理群では、調節性Ｔ細胞集団（Ｆｏｘｐ３＋、ＣＤ２５＋及びＦｏｘｐ３＋／ＣＤ２５＋）の有意な減少が見い出された。高用量でのＤＯＴＡＰ／Ｅ７の低下した抗腫瘍活性が、増大した調節性Ｔ細胞集団と関連することは特に明らかであった。カチオン脂質の用量反応効果が再び認められる。この結果は、最適用量の脂質での免疫療法で使用されるカチオン脂質組成物は、担癌マウスにおける寛容を破壊することによって特定の癌に対する観察される免疫応答を高め、調節性Ｔ細胞集団を抑制する一方で、機能的なＣＤ４＋及びＣＤ８＋抗原特異的Ｔリンパ球の増殖を刺激することができることを示している。
【００９０】
表１．ＤＯＴＡＰ／Ｅ７複合体で処理した後の担癌マウスの脾臓細胞における調節性Ｔ細胞亜集団の比率
2014058525.tif 000004
【００９１】
１０．変化する用量のＤＯＴＡＰにてＤＯＴＡＰ／Ｅ７組成物で処理されたマウスにおけるＴＣ−１ＨＰＶ陽性腫瘍の増殖の動態。
【００９２】
図６では、ＨＰＶ陽性腫瘍の増殖を誘導するために０日目にマウスの皮下にＴＣ−１細胞を注射した。６日目、マウスは腹部の反対側の皮下に、１０μｇのＥ７ペプチドを含有するＤＯＴＡＰ／Ｅ７組成物を投与された。複合体におけるＤＯＴＡＰ脂質の濃度は３〜６００ナノモル（３、１５、３０、７５、１５０、３００及び６００）で変化した。低用量（１５ナノモル）のＤＯＴＡＰは、２３日目で無処理の対照に比べて部分的な腫瘍阻害効果（ｐ＜０．０５）を示したが、３０、１５０又は３００ナノモルのＤＯＴＡＰは、高い有効性（ｐ＜０．０１）を示した。７５ナノモルでのＤＯＴＡＰは、最も有意な腫瘍退行効果（ｐ＜０．００１）を示した。再び、高用量のＤＯＴＡＰ（６００ナノモル）を与えられたマウスが抗腫瘍活性を示さなかったということは、高用量でのＤＯＴＡＰリポソームが免疫応答に負の調節を誘導したことを裏付けている。さらに、１００ナノモルのＤＯＴＡＰリポソームはＥ７ペプチドなしで腫瘍増殖の有意な阻害を示さなかったということは、抗腫瘍効果は抗原特異的であったことを示している。
【００９３】
１１．ＤＯＴＡＰ／Ｅ７複合体は、注射後、主として樹状細胞に取り込まれ、樹状細胞の活性化及び流入領域リンパ節への移動を誘導する。
【００９４】
未処理のマウス（ｎ＝４〜６）にＰＢＳ対照（図７Ａ、Ｃ及びＥ）又は０．５％の１−オレオイル−２−［６−［（７−ニトロ−２−１，３−ベンゾキサジアゾール−４−イル）アミノ］ヘキサノイル］−３−トリメチルアンモニウムプロパン（「ＮＢＤ−ＤＯＴＡＰ」）を伴った総脂質１００ナノモルを含有するＤＯＴＡＰ／Ｅ７(図７Ｂ、Ｄ及びＦ）を注射した。注射の４時間後、流入領域リンパ節を調製し、表面マーカーに対する適当な抗体で染色した。リンパ節の細胞全部の範囲内でＮＢＤとＣＤ１１ｃ（図７Ａ及びＢ）又はＣＤ８６（図７Ｃ及びＤ）の同時発現を解析し、一方、ＮＢＤとＣＤ８（図７Ｅ及びＦ）の同時発現は、ＣＤ３＋集団の範囲内でゲートをかけ、解析した。数字は、４連一組の細胞の比率を表した。流入領域リンパ節を回収し、注射後様々な時点でフローサイトメータによって解析した。ＮＢＤ−ＤＯＴＡＰ／Ｅ７の注射後４時間で（図７Ａ及びＢ）無処理のマウスに比べて、流入領域リンパ節でのＣＤ１１ｃ＋細胞の数は、２．５倍を超えて増えていた。ＮＢＤ＋細胞における同時刺激分子ＣＤ８６の発現を調べたところ、ＮＢＤ＋細胞が高いレベルのＣＤ８６を示した（図７Ｃ及びＤ）ということは、ＤＯＴＡＰの皮下注射は、樹状細胞の活性化を誘導したことを示している。Ｔリンパ球のようなそのほかの種類の細胞によるＮＢＤの取り込みも、抗ＣＤ３、ＣＤ４及びＣＤ８抗体の同時染色によって検討した。ＣＤ３＋細胞にゲートをかけ、ＣＤ３＋細胞を解析したところ（図７Ｅ及びＦ）、ＮＢＤ−ＤＯＴＡＰの注射後、ＮＢＤの取り込みを示さなかった。その結果は、ＮＢＤ−ＤＯＴＡＰは、免疫直後主として樹状細胞（約８０％）によって取り込まれ、ＤＯＴＡＰは、流入領域リンパ節への樹状細胞の移動を誘導し、結果として樹状細胞とＴ細胞の相互作用を生じ、強いＴ細胞の応答を引き出すことを明らかに実証した。
【００９５】
１２．特に有利な一定用量のＤＯＴＡＰで製剤化されたＤＯＴＡＰ／Ｅ７複合体による免疫は機能的なＣＤ８＋Ｔ細胞を誘発する。
【００９６】
活性化されたＴ細胞又はＮＫ細胞によって分泌されるＩＦＮ−γは、ＣＴＬ応答を誘導することと同様にＴｈ１型の免疫応答で重要な役割を担うことが知られている。ＤＯＴＡＰ／Ｅ７ワクチンによって誘導された機能的なＣＤ８＋Ｔリンパ球が必須のサイトカインを産生することができるかどうか評価するために、免疫の１週間後、対照又は免疫されたマウスから脾臓細胞を単離し、５μｇ／ｍＬのＥ７ペプチドと共に、又はペプチドなしで６時間インキュベートし、その後、ＩＦＮ−γの細胞内染色を行った。図８に示されるように、ＩＦＮ−γを産生するＣＤ８＋細胞の数は、陰性対照よりも、最適な脂質用量でのＤＯＴＡＰで製剤化されたＥ７を与えたマウス及びＬＰＤ陽性対照において有意に多かった。ＣＤ８＋細胞によるＩＦＮ−γ産生はＥ７特異的に生じた。これらの結果は、最適用量でのＤＯＴＡＰは、全身のリンパ系臓器においてＩＦＮ−γを産生するＣＤ８＋Ｔ細胞の生成と同様にＣＴＬの誘導のための強力なワクチンアジュバントであることを示している。
【００９７】
１３．抗原特異的ＣＴＬ活性を誘導することが知られている優れたアジュバントで製剤化されたＥ７の抗腫瘍活性とカチオン脂質／Ｅ７複合体の抗腫瘍効果の比較。
【００９８】
カチオン脂質／Ｅ７製剤の有効性を腫瘍に対する免疫応答を誘導するそのほかのアジュバントと比較するために、製剤当たり６〜１２匹の担癌マウスを、腫瘍定着の６日後、（１）１００ナノモル用量組成のカチオン脂質でのカチオン脂質（ＤＯＴＡＰ、ＤＯＥＰＣ及びＤＯＴＭＡ）、（２）アニオン脂質（ＤＰＰＧ）又は（３）アジュバント（完全フロインドアジュバント「ＣＦＡ」又はＣｐＧＯＤＮ１８２６）から構成されるＦ７ペプチド製剤化リポソームで処理した。図９では、２６日目、対照群に比べて、カチオン脂質製剤と同様にアジュバントを与えられたマウスは、腫瘍増殖の効果的な阻害を示した。ＣｐＧ／Ｅ７又はＣＦＡ／Ｅ７の製剤を与えたマウスに比べて、最適なＤＯＴＡＰ／Ｅ７及びＤＯＥＰＣの製剤を与えたマウスはさらに良好な抗癌活性（ｐ＜０．０１）を示した。ＣｐＧ／Ｅ７又はＣＦＡ／Ｅ７の製剤を与えたマウスに比べて、最適なＤＯＴＭＡ／Ｅ７を与えたマウスはさらに良好な抗癌活性を示した。
【００９９】
１４．カチオン脂質は用量依存的にＲＯＳの産生を誘導し、その結果、高い用量では樹状細胞の死及び免疫賦活効果の低下を生じる。
【０１００】
０、１５、１００又は６００ナノモルの脂質を含有するＤＯＴＡＰ／Ｅ７を皮下注射したマウスから注射の２時間後、流入領域リンパ節を単離した。フローサイトメトリー解析に先立って、リンパ節細胞すべてをＤＣＦＨ−ＤＡ化合物と３７℃にて３０分間インキュベートした。大顆粒細胞にゲートをかけ、ＲＯＳの存在下で蛍光生成物ＤＣＦが生成されるＲＯＳの発現について大顆粒細胞を解析した。陽性のＲＯＳシグナルを持つ細胞の相対的比率を図１０Ａに列記する。ＤＯＴＡＰ／Ｅ７の注射後１０時間で細胞を回収し、適当な抗体で染色することによって流入領域リンパ節で細胞傷害性を調べた。図１０Ｂでは、樹状細胞(ＤＣ)における死細胞の比率を線状プロット（□）で示し、１０５個のＬＮ当たりの生きたＤＣの数を棒グラフで表す。数を無処理の対照に対して正規化し、統計的に解析した（＊＊ｐ＜０．０１）。１５ナノモルのＤＯＴＡＰを与えたマウスからの細胞が基底レベルのＲＯＳ産生（＜５％）を示したのに対して、１０ナノモル用量のＤＯＴＡＰ注射のマウスからの細胞は相対的に高いレベルのＲＯＳ（約２０％）を産生した。驚くべきことに、ＤＯＴＡＰ６００ナノモル群からの大顆粒細胞の大半（約８０％）は陽性のＲＯＳシグナルを示した。皮下注射後１０時間で、リンパ節細胞をすべて回収し、フローサイトメトリーによって細胞死について解析した(図１０Ｂ)。ＣＤ１１ｃ＋（樹状細胞）集団内の細胞死（ヨウ化プロピジウム陽性）の比率は、脂質の用量と共に高まり、図１０Ａで示されたＲＯＳ産生と正に相関した。ＤＣ集団中の細胞死の比率は、未処理の対照群と比べて、高い用量のＤＯＴＡＰを注射した群については約２倍高かった。また、図１０Ｂには、ＤＯＴＡＰ脂質の用量の関数としての１０５個のリンパ節細胞当たりの生きたＣＤ１１ｃ＋細胞の数も示されている。処理群の中で、１００ナノモルの脂質を伴うＤＯＴＡＰ／Ｅ７を与えたマウスが最高の量（＊＊ｐ＜０．０１）生きた樹状細胞を示した。マウスが最適な製剤を投与された後さらに２日目に流入領域リンパ節を秤量した。総合すると、結果は、高用量のＤＯＴＡＰで誘導されるＲＯＳ産生は樹状細胞の死の原因となってもよいことを示している。
【０１０１】
さらに図１０Ｃで説明されるように、カチオン電荷の密度は、免疫賦活効果及び得られる抗癌活性に重要である。不活性の中性脂質ＤＯＰＣをカチオン脂質／Ｅ７複合体と同時製剤化することによって、ＲＯＳ生成と抗癌活性の双方が低下し、その結果カチオン電荷密度が低下した。
【０１０２】
１５．ペプチド抗原の脂質化は結果としてカチオン脂質／抗原複合体への改善された封入を生じる
【０１０３】
上述のようにカチオン脂質／抗原複合体を調製した。ＬａｖａＰｅｐ（商標）ペプチド定量キット（オーストラリア、シドニーのフルオロテクニクスから市販されている）を用いてリポソームに結合したペプチドの比率によって、ペプチドの封入効率を測定した。取り込まれていないリポペプチドは凝集して排除フィルターを通過できなかったので、１％ＳＤＳの存在下排除されたリポソームに関連する量として取り込まれたリポペプチドを測定し、平均値±ＳＤとして報告した。天然型のＥ７やＫＳＳ−Ｅ７のような水溶性ペプチドについては、Ｍｉｃｒｏｎ（登録商標）遠心フィルター（マサチューセッツ州、ベッドフォードのミリポアから市販されている）によって複合体から結合していないペプチドを分離した。製造元の指示書に従って、ＬａｖａＰｅｐ（商標）を用いて結合していないペプチドの濃度を測定した。封入の効率を（１−結合していないペプチドの％）として決定し、平均値±ＳＤとして表２に報告した（ｎ＝３）。
【０１０４】
表２．合成リポペプチドの比較、及びリポペプチド：ＤＯＴＡＰのモル比１：４０でのＤＯＴＡＰリポソームへのペプチド抗原封入効率の比較
2014058525.tif 000005
【０１０５】
１６．抗原封入効率とともにカチオン脂質／抗原複合体の抗腫瘍効果が改善する
【０１０６】
６日目（腫瘍定着後）に、ＴＣ−１腫瘍担癌マウス（群当たり８〜１２匹）を、ＤＯＴＡＰ／Ｅ７（１０ナノモル若しくは５ナノモルのペプチドを含有する）又はＤＯＴＡＰ／Ｅ７−リポペプチド製剤（５ナノモルのペプチド抗原を含有する）によって単回処理した。各場合、１００ナノモルのカチオン脂質の組成を使用した。５ナノモルのペプチドを伴うＤＯＴＡＰ／Ｅ７は有意な抗腫瘍活性を示さなかった。それに対して、ＤＯＴＡＰリポソームで製剤化された場合、５ナノモルの抗原でのＥ７−リポペプチド（α位又はε位）双方とも、５ナノモルでの天然型Ｅ７抗原によるＤＯＴＡＰと比べて有意に高い治療効果を示した（図１１）。リポペプチドによって引き出された抗腫瘍活性は、１０ナノモルによるＤＯＴＡＰ／Ｅ７のそれに似ていた。パルミトイル化Ｅ７ペプチド（ＫＳＳスペーサーなしで）であるＰＡ−Ｅ７は、ＤＯＴＡＰリポソームで製剤化された場合、ペプチドに直接脂肪酸を結合することによって多分エピトープが隠されたために、そのほかのリポペプチド製剤で見られるような高い抗腫瘍活性を示せなかった。少なくとも部分的には、抗原の高い封入効率のために、抗腫瘍活性は、ＤＯＴＡＰ／Ｅ７−リポペプチドによって高められる。このことは、抗原の疎水性を高めることによって複合体への取り込みが上昇し、その結果、抗原特異的免疫応答を高めることを実証している。デキストロース（５％）で処理したマウスを陰性対照として使用した。
【０１０７】
１７．カチオン脂質／脂質化抗原複合体は、抗原特異的なＣＴＬの応答を高める。
【０１０８】
ＤＯＴＡＰ／Ｅ７−リポペプチドによる免疫は、ＩＦＮ−γを分泌するＣＤ８＋Ｔ細胞の産生を高めた。種々の製剤をマウスに注射し、最後の免疫の７日後に、免疫したマウスから脾臓細胞を単離した。インビトロにてＥ７ペプチド（５μｇ／ｍＬ）の存在下又は非存在下で細胞を６時間刺激し、ＦＡＣＳ解析に先立って、表面ＣＤ８マーカー及び細胞内ＩＦＮ−γサイトカインで染色した。各処理群からのＣＤ８＋１０４個当たりのＣＤ８＋ＩＦＮ−γ＋二重陽性細胞の比率を平均値±ＳＤとして図１２に示し、対応ｔ検定によって統計的に解析した（＊＊ｐ＜０．０１、ｎ＝４）。
【０１０９】
ＤＯＴＡＰ／Ｅ７−リポペプチドのワクチン接種によって誘導されたエピトープ特異的免疫応答を評価するために、ＩＦＮ−γを産生するＣＤ８＋Ｔ細胞を分析した。最終免疫の１週間後、対照マウス及び免疫したマウスから脾臓細胞を単離し、５μｇ／ｍＬのＥ７ペプチドの存在下又は非存在下で刺激し、その後ＩＦＮ−γについて細胞内染色した。表２（上記）に記載されたように、また図１２に示されるように、リポペプチド抗原の場合、複合体への抗原の取り込みが有意に改善されたので、ＩＦＮ−γを産生するＣＤ８＋Ｔ細胞の数は、１０及び５ナノモルの天然型のＥ７よりもＤＯＴＡＰリポソームで製剤化された５ナノモルのε−ＰＡ−ＫＳＳ−Ｅ７を与えたマウスの方が有意に高かった。再び、同一抗原量の場合、ＫＳＳ−Ｅ７は、天然型のＥ７よりも優れた結果を示した。ＣＤ８＋細胞によるＩＦＮ−γの産生は、非投与細胞がバックグランドレベルのサイトカインしか示さなかったので、Ｅ７特異的であった。これらの結果は、疎水性を高め、ＤＯＴＡＰリポソームへの複合体化効率を高めたＥ７−リポペプチドの取り込みは、カチオン脂質／抗原複合体の有効性を明らかに高め、リンパ系臓器におけるＩＦＮ−γを産生するＣＤ８＋Ｔリンパ球の量を増やすことを示した。
【０１１０】
１８．母体ペプチドに存在する配列に無関係の短いアミノ酸配列を結合することによって、ペプチド抗原の抗原性が改善され、それは、ＤＯＴＡＰとＫＳＳ−Ｅ７ペプチドから成る脂質／抗原複合体の改善された抗腫瘍効果をもたらす
【０１１１】
結合される脂質鎖なしのＫＳＳ（リジン−セリン−セリン）−Ｅ７ペプチドは、ＤＯＴＡＰカチオン脂質で製剤化された場合、天然型のＥ７と匹敵する封入効率（表２）であるにもかかわらず、ＤＯＴＡＰ複合体で製剤化された天然型のＥ７よりもはるかに強い免疫応答を提供した（図１１及び１２）。ＭＨＣクラスＩ分子に結合し、安定化するペプチドの能力は、特異的ＣＴＬ応答を誘導する能力と直接的に相関することができることが知られている［Feltkamp, M. C. et al, 細胞傷害性Ｔリンパ球のエピトープを含有するペプチドによるワクチン接種は、ヒトのパピローマウイルス１６型で形質転換した細胞により誘導される腫瘍に対して防御する。 Eur J Immunol, 23, (9), 2242-2249 (1993)］。我々は、天然型のＥ７及びＫＳＳで延長したＥ７ペプチドのＭＨＣクラスＩ結合親和性を評価した。５×１０５個／ｍＬのマウスのリンパ腫細胞株であるＲＭＡ−Ｓ細胞を、天然型のＥ７又はＫＳＳ−Ｅ７ペプチド（１０μＭ）と共に２７℃にて一晩インキュベートした。培地と共にインキュベートした細胞を対照として用いた。次いで、細胞を３７℃で２時間インキュベートした。洗浄した後、フローサイトメトリー解析に先立って、細胞表面上のＨ−２Ｄｂ又はＨ−２Ｋｂ分子に対する蛍光標識したモノクローナル抗体で細胞を染色した。Ｅ７ペプチド（ａ．ａ．４９〜５７）は、Ｈ−２Ｄｂに拘束される既知のエピトープであり、対照に比べて、ＲＭＡ−Ｓ細胞でＨ−２Ｄｂ分子を４倍上方制御する(図１３）。ＫＫＳ−Ｅ７ペプチドについては、平均の蛍光で８倍の上昇が認められた。Ｅ７ペプチド又はＫＳＳ−Ｅ７ペプチドのいずれかと共にインキュベートした後、ＲＭＡ−Ｓ細胞でＨ−２Ｋｂ分子の上方制御は検出されなかった。結果は、ＫＳＳ−Ｅ７は、天然型のＥ７ペプチドよりもＨ−２Ｄｂ分子への結合親和性を改善しており、それはＤＯＴＡＰ／抗原複合体で製剤化された場合、優れた抗腫瘍活性をもたらすことが明らかにした。
【０１１２】
本研究によって、免疫原性ペプチドが由来する天然の母体タンパク質の配列に無関係のアミノ酸の短い配列を結合することによって、免疫原性ペプチドの免疫原性を改善する又は変更することができることが明らかにされている。
【０１１３】
１９．カチオン脂質／抗原複合体への抗原の取り込みの効率に対するカチオン脂質と抗原の間のイオン性相互作用の影響
【０１１４】
これらの研究のために、ＤＯＴＡＰをクロロホルムに可溶化し、１６×１００ｍｍのガラス管にて７ｍｇのＤＯＴＡＰから乾燥膜を調製した。減圧下で乾燥した後、（１）イオン強度の高い環境（１５ｍＭのリン酸ナトリウム、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０）又はイオン強度の低い環境（１５ｍＭのリン酸ナトリウム、５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０における０．５ｍＬの抗原）における０．５ｍＬの抗原（ＨＰＶ−１６Ｅ７、アミノ酸１１〜２０、ＹＭＬＤＬＱＰＥＴＴ、配列番号２）によってリポソームを水和した。粒径は１００ｎｍだった。
【０１１５】
微量遠心機にて５０００ｒｐｍで２０分間１００ＫＮａｎｏｓｅｐ微量フィルター（ミシガン州、アナーバーのポール社から市販されている）上で濾過することによって抗原封入効率を分析した。逆相クロマトグラフィによって出発緩衝液及びＮａｎｏｓｅｐフィルターからの通過液における抗原の濃度を解析してパーセント封入を決定した。表３に見られるように、封入効率は、（１−取り込まれなかったペプチドの％）として算出した。
【０１１６】
表３．抗原上の負の電荷を増すことによってカチオン脂質／抗原複合体への抗原の封入は高められる。
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【０１１７】
イオン強度の高い環境では、イオン性の相互作用は最小限にとどめられる。イオン強度が高ければ高いほど、製剤化緩衝液（１５０ｍＭのＮａＣｌ）のイオン強度を高めることによって負を効果的に減らし、負に荷電した抗原と正に荷電した脂質の間のイオン性の相互作用は最小限にとどめられ、結果として封入の低下を生じる。イオン強度を低下させることによって、脂質と抗原の間のイオン性の相互作用を高め、複合体への抗原のさらに大きな取り込みをもたらす。従って、製剤化緩衝液を変更するか、又はアニオン性の若しくはポリアニオン性の化合物を抗原に結合させることによって、負の電荷を高めるように抗原を操作することにより、カチオン脂質／抗原複合体への取り込み効率を高めることができる。
【０１１８】
考察
【０１１９】
米国特許第７，３０３，８８１号で記載されたように、広範なクラスのカチオン脂質が、抗原と一緒に免疫賦活剤として作用し、疾患の治療において抗原特異的な免疫応答を生成することができる。たとえば、米国特許第７，３０３，８８１号は、ＤＣ２．４樹状細胞上でのＣＤ８０／ＣＤ８６同時刺激分子の発現のカチオン脂質による刺激によって明らかにされたように、カチオン脂質で構成されるリポソームが樹状細胞を活性化することを開示している（図１４Ａ及び１４Ｂ）。図１４Ａで示されるように、様々なカチオンリポソームによるＤＣ２．４細胞におけるＣＤ８０／ＣＤ８６の発現を刺激する能力は大きく異なる。リポフェクトアミン  ＲＴＭ、ポリカチオン脂質、２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２（スペルミンカルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパンアミニウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）と中性脂質、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）の３：１（ｗ／ｗ）リポソーム製剤、及びＯ，Ｏ’−ジミリスチル−Ｎ−リシルアスパルテート（ＤＭＫＥ）とＯ，Ｏ’−ジミリスチル−Ｎ−リシル−グルタメート（ＤＭＫＤ）から調製されたリポソームは、ＣＤ２．４細胞によるＣＤ８０／ＣＤ８６の発現を強く刺激した。
【０１２０】
ＤＣ２．４細胞におけるＣＤ８０の発現を刺激する様々なカチオン脂質の能力は異なっていた。脂質の親水性の頭部及び親油性の尾部の双方がこの能力に有意な影響を有する。たとえば、エチルホスホコリン（ＥＰＣ）頭部基を持つＤＸＥＰＣは、一般に、トリメチルアンモニウムプロパン（ＴＡＰ）頭部基を持つＤＸＴＡＰよりもさらに強力である。１つの特定の頭部基構造を持つ脂質の中では、より短い（１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（ＤＬＥＰＣ−１２：０）、（１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（ＤＭＥＰＣ−１４：０）又は不飽和の（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（ＤＯＥＰＣ−１８：１））アシル鎖を持つ脂質は、さらに長い（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（ＤＰＥＰＣ−１６：０）又は飽和１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（ＤＳＥＰＣ−１６：０））アシル鎖を持つものより強力であると思われる（図１４Ｂ）。これらのデータは複数のカチオン脂質が樹状細胞の活性化を刺激することが可能であることを明らかにした。従って、３つの代表的なカチオン脂質、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＴＭＡ及びＤＯＥＰＣをさらなる研究のために選択し、カチオン脂質が免疫賦活剤として作用するメカニズムを決定した。代表的なカチオン脂質と共に本明細書で提示されるデータは、免疫応答を刺激するそのほかのカチオン脂質に外挿されてもよい。
【０１２１】
本研究のデータは、カチオン脂質が免疫系のＡＰＣを効率的に標的とし、抗原をＡＰＣに送達する媒体であるだけでなく、結果的にサイトカインやケモカインを始めとする免疫系調節性分子の産生を伴って、ＭＡＰキナーゼ依存性のシグナル伝達経路の活性化を介して免疫系に直接影響を及ぼすように、低い用量組成で強力なアジュバントとしても機能するという所見をもたらした。製剤の免疫賦活能におけるカチオン脂質の明瞭な用量反応効果が実証された。この目的を達成するために、我々は、抗原、たとえば、ＨＰＶ１６型のＥ７タンパク質のペプチドエピトープをＤＯＴＡＰ、ＤＯＴＭＡ又はＤＯＥＰＣ（Ｄ０ＴＡＰ／Ｅ７、Ｄ０ＴＭＡ／Ｅ７又はＤ０ＥＰＣ／Ｅ７）のいずれかのカチオンリポソームに封入し、約１００ナノモル用量組成で単回の皮下注射によって抗原／脂質の複合体を投与した場合、それは、マウスにおいてＨＰＶ−１６Ｅ７陽性の腫瘍ＴＣ−１の退行を誘導することを実証した。脂質／抗原の複合体を投与した際、粒子は、主要な専門的な抗原提示細胞である樹状細胞によって主として取り込まれた。実証されたように、樹状細胞の活性化の開始及び流入領域リンパ節への移動は、抗原特異的なＴＣ−１腫瘍に対する免疫応答を促進する。ＤＯＴＡＰ／Ｅ７を注射すると、機能的なＣＤ８＋Ｔリンパ球が生成され、腫瘍の微細環境に浸潤するＴ細胞の数の増加によって腫瘍サイズは小さくなり、アポトーシスが増加した。得られたベル形状（最適用量より上及び下で活性が低下する）のカチオン脂質の用量反応曲線は、非常に低い用量での活性を明示し、このことは、アジュバント又は免疫賦活剤としてのカチオン脂質の活性が、非常に強力なのでＥＣ５０は注射当たり約１５ナノモルと低いことを示している。高用量のカチオン脂質は、免疫賦活活性を排除する。我々はまた、抗原、たとえば、卵白アルブミンをカチオンリポソームに取り込み、単回の皮下注射で投与した場合、抗原に対する有効な抗体が産生されることを明らかにした。最適な用量組成で、カチオン脂質及びカチオン脂質／抗原複合体は、疾患を防ぎ、治療するのに有用な、単純で、安全な且つ非常に効率的な免疫療法を提供することは明らかである。
【０１２２】
調節性Ｔ細胞は、Ｇｅｒｓｈｏｎら［Eardley, D D, et al., Ｔ細胞セットの中での免疫調節性回路、Ｉ．ヘルパーＴ細胞はほかのＴ細胞セットを誘導してフィードバック阻害を発揮する。 J Exp Med 147: 1106; 及びCantor, H, et al., Ｔ細胞セットの中での免疫調節性回路、ＩＩ．生体内でのフィードバック阻害の生理的役割：ＮＺＢマウスには存在しない。J Exp Med 147:1116 (1978)］によって１９７０年代に最初に記載され、抑制性Ｔ細胞と呼ばれた。最近の研究は、癌患者と同様にいくつかのマウスのモデルにて腫瘍免疫の抑制においてＣＤ４＋ＣＤ２５＋調節性Ｔ細胞（Ｔ−ｒｅｇ）の役割を検討している［Comes, A, et al., ＣＤ２５＋調節性Ｔ細胞の欠如は、ＩＬ−２１を分泌する細胞性ワクチンによって免疫療法を増強する。J Immunol 176:1750 (2006)］。Ｔ−ｒｅｇ細胞の頻度は癌患者の末梢血で増加する［Sasada, T, et al., 消化器悪性腫瘍の患者におけるＣＤ４＋ＣＤ２５＋調節性Ｔ細胞：疾患の進行への調節性Ｔ細胞の関与の可能性。 Cancer 98:1089 (2003)］。それらは、腫瘍に浸潤するリンパ球及び流入領域リンパ節で濃縮される［Baecher-Allan, C, 及び Hafler, DA, ヒト疾患におけるサプレッサーＴ細胞。J Exp Med 200:273 (2004)］。また、腫瘍関連組織におけるＴ−ｒｅｇの蓄積は、乏しい予後及び生存を予測する［Baecher-Allan, C, 及びAnderson, DE 担癌宿主における免疫調節。Curr Opin Immunol 18:214 (2006)］。Ｔ−ｒｅｇがどのように正常なＴ細胞免疫を弱らせるのかというメカニズムの詳細はよく理解されていないが、抗ＣＤ２５抗体を用いてＴ−ｒｅｇ細胞をブロックすることによって抗腫瘍効果を高めることが報告されている［Attia, P, et al., メラノーマ患者における調節性Ｔリンパ球を排除するためのＩＬ−２とジフテリア毒素（Ｄｅｎｉｌｅｕｋｉｎ  Ｄｉｆｔｉｔｏｘ、ＤＡＢ３８９ＩＬ−２、ＯＮＴＡＫ）の融合タンパク質の不能。J Immunother 28:582 (2005)］。実際、ヒト対象腫瘍ワクチンを服用する患者においてエフェクターの応答とＴ−ｒｅｇの応答の双方をモニターし、性状分析する必要があることが明らかになっている［Baecher-Allan, C,及びAnderson, DE 担癌宿主における免疫調節。Curr Opin Immunol 18:214 (2006)］。本研究では、我々は、ＤＯＴＡＰ／Ｅ７の抗腫瘍活性とＴ−ｒｅｇ細胞の減少の明瞭な相関を見い出した。
【０１２３】
従って、カチオン脂質は、特定の用量にて、生体の免疫応答を調節すること及び予防的使用及び治療的使用の双方のための治療剤及びワクチンの開発に効果的に適用することができる、新規の部類の免疫賦活剤を構成する。
【０１２４】
ここ数年、免疫療法及びワクチンの開発で使用するのにタンパク質及びペプチドが重要な素質を有することが知られている。そのような療法の奏功する開発の主な欠点は、免疫系への抗原の不十分な送達である。また、多大な尽力を払って感染性疾患での使用にて及び癌の療法として安全で強力な免疫賦活剤を開発してきた。マンニドモノオレエートファミリーからの界面活性剤と鉱物油又は非鉱物油の混合物であるＳＥＰＰＩＣ社からのＭｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ（商標）５１及び７２０のようなアジュバントを始めとする現在の技術は、ヒトでの感染性疾患及び癌のためのワクチンで試されている［Aucouturier, J, et al., Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ７２０及び５１: ヒトのワクチン用のアジュバントとしての油中水エマルションの新しい生成。Expert Rev Vaccines 1:111 (2002)］。種々の研究が、抗体価を高め、特異的ＣＴＬ応答を高めるＭｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ（商標）５１及び７２０の能力を実証している［Yamshchikov, GV, et al.,メラノーマ患者の流入領域リンパ節及び末梢血におけるペプチドワクチンの免疫原性の評価。Int J Cancer 92:703 (2001)］。しかしながら、この種の油中水アジュバントは、製造工程の間で乳化の重大な工程を必要とし、それは常に容易に制御できるとはかぎらない。さらに重要なことに、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ７２０を併用した複数エピトープポリペプチドＴＡＢ９のフェーズＩ臨床試験は、低用量群の８人の志願者のうち７人が中程度又は重度の局所の炎症を示し、高用量群の８人の被験者のうち４人が肉芽腫及び無菌性膿瘍を発生したことを示した［Toledo, H, et al., ＨＩＶ−１非感染のヒト志願者におけるＭｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ７２０を併用した複数エピトープポリペプチドＴＡＢ９のフェーズＩ臨床試験。 Vaccine 19:4328 (2001)］。ＩＳＡ７２０は、代謝可能な油で構成されており、ヒトではあまり反応原性ではないと考えられる。しかしながら、ほかのアジュバントのほとんどと同様に、エマルション中の界面活性剤は、樹状細胞及びマクロファージ上のトール様受容体（ＴＬＲ）の引き金を引くので、ＮＦ−κＢの産生及び炎症性応答を誘導する［Aucouturier, J, et al., Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ７２０及び５１: ヒトのワクチン用のアジュバントとしての油中水エマルションの新しい生成。 Expert Rev Vaccines 1:111 (2002)］。
【０１２５】
我々は、カチオン脂質はＮＦ−κＢの発現を高めないことを明らかにしたが、これは、カチオン脂質による樹状細胞の刺激はＮＦ−κＢと無関係なメカニズムを介してシグナル伝達されることを示唆している［Cui, Z., et al (2005). ワクチン担体としてのＬＰＤナノ粒子の免疫賦活のメカニズム。MoI Pharm 2:22-28)］。従って、カチオンリポソームは、改善された安全性特性を持つ独特の部類のアジュバントに属するのかもしれない。
【０１２６】
我々はまた、抗原を脂質化することによって、たとえば、ＫＳＳで延長したＥ７ペプチド（α位又はε位のいずれかで）にモノパルミチン酸を連結することによって、カチオンリポソーム／抗原複合体内へのペプチドの封入効率を水溶性抗原のそれを超えて改善することができることを明らかにした。たった２つの分子から成るＤＯＴＡＰ／Ｅ７−リポペプチド複合体は、ＨＰＶ陽性のＴＣ−１細胞を撲滅するための抗原特異的なＣＴＬを生成するのに総合的な増強を誘導した。カチオン脂質の組成は１００ｎｍで維持した。抗原を減らした用量（５ナノモル以下）で担癌マウスに投与した場合、完全な用量（１０ナノモル）での元々のＤＯＴＡＰ／Ｅ７製剤に比べて、ＤＯＴＡＰ／Ｅ７−リポペプチド複合体は、優れた抗腫瘍活性を示した。リポペプチドの高められた抗原性及び抗腫瘍活性は、リポソームへのリポペプチドの高められた封入と相関した。表２に示されるように、総脂質の２．５モル％のペプチド負荷でリポペプチドの取り込み効率は９０％であったが、元々の水溶性Ｅ７ペプチドのたった約２５％が複合体に取り込まれたにすぎない。リポペプチドの同様の高められたリポソーム取り込みも報告されている［Yagi, N.et al.,ペプチドリガンドを伴った機能的なリポソームの調製及びその細胞膜への結合。Lipids, 35:673-680 (2000); 及びLiang, M. T. et al., リポソーム内へのリポペプチドの封入：脂質鎖の数、鎖長及びリポソーム調製法の影響。 Int J Pharm, 301:247-254 (2005)］。ペプチドがＭＨＣクラスＩ経路によって提示されるように、ペプチドはＡＰＣの細胞質に入らなければならない。カチオン脂質は、封入された、しかし遊離してはいないペプチドを、ＡＰＣの中に送達する。従って、ペプチドの封入が高ければ高いほど、送達は良好であり、抗原性を期待することができる。さらに、明らかにされた用量条件下で、カチオン脂質はまた強力な免疫賦活剤として作用し、抗原特異的な強い免疫応答をもたらし、結果的に観察された腫瘍細胞死を生じる。
【０１２７】
ＲＯＳの重要性は、天然の免疫応答及びＴ細胞の活性化に関係しているとみなされており［Kantengwa et al, 超酸化物アニオンはヒト樹状細胞の成熟を誘導する。 Am J Respir Crit Care Med 167:431-437 (2003)］、ＲＯＳの高い産生は細胞死をもたらす［Tobiume K, et al, ＡＳＫＩはＪＮＫ／ｐ３８  ＭＡＰキナーゼの持続した活性化及びアポトーシスに必要とされる。EMBO Rep 2:222-228 (2001)］［Aramaki Y, et al, カチオンリポソームによるＷＥＨＩ  ２３１細胞におけるアポトーシスの誘導。Pharm Resl7:515-520 (2000)］。我々は、カチオン脂質によって流入領域リンパ節の細胞でＲＯＳを誘導し、高用量のＤＯＴＡＰ脂質は樹状細胞の死を招くことを明らかにした。実際、Ｉｗａｏｋａらは、カチオンリポソームがインビトロでマクロファージにおいてＲＯＳを誘導できることを示した［Iwaoka S, et al, カチオンリポソームは、マクロファージ様のＲＡＷ２６４．７細胞においてｐ３８  ＭＡＰキナーゼカスパーゼ−８−Ｂｉｄ経路を介してアポトーシスを誘導する。J Leukoc Biol 79:184-191 (2006)］。図１０Ａに示されたデータは、ＤＯＴＡＰ／Ｅ７複合体の皮下注射の後、生体内で流入領域リンパ節にてカチオン脂質がＲＯＳを生成できることを明らかに実証している。同じデータは、高用量のカチオン脂質によって生成された過剰のＲＯＳが樹状細胞の死の増大を招くことも示唆している。これらのデータは、免疫系の細胞でＲＯＳの産生を誘導するのに十分な用量でカチオン脂質を対象に投与することを支持しており、この誘導されるＲＯＳは、カチオン脂質の非存在下で存在する免疫応答を上回って免疫応答を高めるのに十分なレベルである。高いＤＯＴＡＰ用量のＤＯＴＡＰ／Ｅ７複合体に起因する、免疫賦活と得られる抗腫瘍活性の喪失については、そのほかの理由の可能性があるかもしれない。しかしながら、ＤＬＮにおける活性化ＡＰＣの量の低下は、高用量のワクチンにおけるリンパ球浸潤(図３）、抗原特異的なＣＴＬ活性及びＩＦＮ−γの産生(図２及び図８）、並びに最も重要なことに、抗腫瘍活性（図６）の観察された低下において、確かに重要な役割を担っているはずである。他方、ＤＯＴＡＰ誘導のＲＯＳは、おそらく、たとえば、ＥＲＫやｐ３８  ＭＡＰのような、実施例２で以下に議論されるようにワクチンの活性に必要であるそれに続くシグナル伝達に介在する最初のシグナルなので、望ましいレベルのＲＯＳ産生が必要とされる。さらに、我々は、図１０Ｃにおいて免疫賦活効果及び得られる抗腫瘍活性に対するカチオン電荷の密度の重要性を明らかにした。ここでは、高い比率の不活性の中性脂質、ＤＯＰＣをカチオン脂質／Ｅ７複合体と同時製剤化することによってＲＯＳ産生と抗癌活性の双方を低下させることができ、結果としてカチオン電荷密度の低下を生じることが明らかにされる。
【０１２８】
実施例１は、免疫賦活効果におけるカチオン脂質の用量の重要性を明らかにし、癌及び細菌感染やウイルス感染のような複数の疾患の治療のために抗原特異的な強い免疫応答を生成するための、単純で且つ安全な免疫療法の開発における、カチオン脂質／抗原複合体の役割を強調している。
【０１２９】
〔実施例２〕
カチオン脂質の免疫賦活活性のメカニズム：ＭＡＰキナーゼ、ＥＲＫのリン酸化及びケモカインの誘導
Ａ．材料及び方法
１．細胞株及びペプチド
【０１３０】
ＴＣ−１細胞はＴＣ．Ｗｕ（メリーランド州、ボルチモアのジョンズ・ホプキンス大学）によって提供された。これらの細胞は、ＨＰＶ１６Ｅ６及びＥ７癌遺伝子と活性化Ｈ−ｒａｓによって形質転換されたＣ５７ＢＬ／６マウスの肺内皮細胞である。１０％ウシ胎児血清と１００Ｕ／ｍＬのペニシリンと１００ｍ／ｍＬのストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ培地（カリフォルニア州、カールズバッドのインビトロゲンから市販されている）にて細胞を増殖させた。ピッツバーグ大学、ペプチド合成施設によって、アドバンストケムテックモデル２００ペプチド合成機を用いた固相合成によりＨＰＶ１６Ｅ７タンパク質（アミノ酸４９〜５７、ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ［配列番号１］）からＭＨＣクラスＩ拘束性のペプチドを合成し、ＨＰＬＣによって精製した［Feltkamp, et al. Eur J Immunol 23:2242-2249 (1993)に記載されたように］。ｐＥＲＫ及びＥＲＫ２及びｓｉＲＮＡに特異的なマウスモノクローナル抗体は、カリフォルニア州、サンタクルーズのサンタクルーズバイオテクノロジー社から購入した。リン酸化ｐ３８（ｐ−ｐ３８）に特異的なウサギポリクローナル抗体は、マサチューセッツ州、ダンバーのセルシグナリングテクノロジー社から入手した。ＧｅｎｅＣｈｉｐマウスゲノム４３０  ２．０アレイはアフィメトリクス社から入手した。ＰＤ−９８０５９、Ｕ−０１２６、ＰＰ２、ワートマニン及びＧＦ１０９２０３Ｘは、カルビオケムから入手した。百日咳毒素及びそのほかの試薬はシグマから入手した。
【０１３１】
２．脂質／抗原複合体の調製及び物性の測定
【０１３２】
脂質はすべてアバンチ・ポラー・リピッド（アラバマ州、アラバスター）から購入した。薄膜水和、その後の押し出しによって小型の単層のＤＯＴＡＰ、ＤＯＥＰＣ及びＤＯＴＭＡのリポソームを調製した。ガラス管にて窒素流のもとでクロロホルム中の薬剤を伴った又は伴わない脂質を薄層として乾燥させた。薄膜を減圧下２〜３時間乾燥させ、次いで、最終濃度０．７ｍｇの脂質とｍＬ当たり０．１ｍｇのＥ７（モル比＝１１：１）になるようにＥ７ペプチドを含有する細胞培養等級の水（メリーランド州、ウォーカーズビルのカムブレックスから市販されている）又は緩衝液で再び水和した。穴サイズ０．４、０．２及び０．１μｍを持つポリカーボネートの膜を介して脂質分散物を順次押し出した。取り込まれなかったペプチドを除かなかった。使用までリポソームを４℃で保存した。Ｅ７ペプチドとリポソームとの結合は、リポソームに結合したペプチドの比率を測定することによって決定した。手短に言えば、ＤＯＴＡＰ／Ｅ７又はＤＯＴＡＰ／Ｅ７／薬剤（ＭＡＰキナーゼ阻害剤）複合体からの結合していないＥ７ペプチドは、Ｍｉｃｒｏｎ（登録商標）遠心濾過装置（マサチューセッツ州、ベッドフォードのミリポア）によって分離し、結合していないペプチドの濃度は、ＭｉｃｒｏＢＣＡ（商標）プロテインアッセイキット（イリノイ州、ロックフォードのピアース）によって測定した。パーセント結合していないペプチドとしてペプチド結合の効率を決定した。およそ３０％のＥ７ペプチドがリポソームに結合した。
【０１３３】
３．統計的な解析。
【０１３４】
少なくとも５回の独立した実験の平均値±ＳＤとしてデータが提示される。両側性スチューデントのｔ検定を用いて平均値の差異について統計的有意性を評価した。有意性は、ｐ＜０．０５で設定した。
【０１３５】
４．ＲＮＡの抽出及びマイクロアレイ
【０１３６】
メリーランド州、ジャーマンタウンのキアゲンからのＲＮｅａｓｙミニキットによって製造元の指示書に従ってＲＮＡを抽出した。７μｇの全ＲＮＡを用いてｃＤＮＡを合成した。この反応には、Ｔ７−（ｄＴ）２４プライマーと共にメリーランド州、ゲーサーズバーグのライフ・テクノロジーズからのカスタムｃＤＮＡキットを用いた。次いで、バイオアレイハイイールドＲＮＡ転写キットを用いたｃＤＮＡ反応からビオチン化ｃＲＮＡを生成した。次いで、チップハイブリッド形成の前に、９４℃にて３５分間、断片化緩衝液（５×断片化緩衝液：２００ｍＭのトリス酢酸塩、ｐＨ８．１、５０ＯｍＭのＫＯＡｃ、１５ＯｍＭのＭｇＯＡｃ）にてｃＲＮＡを断片化した。次いで、１５μｇの断片化ｃＲＮＡをハイブリッド形成カクテル（０．０５μｇ／μＬの断片化ｃＲＮＡ、５０ｐＭの対照オリゴヌクレオチドＢ２、ＢｉｏＢ、ＢｉｏＣ、ＢｉｏＤ及びｃｒｅハイブリッド形成対照、０．１ｍｇ／ｍＬのニシン精子ＤＮＡ、０．５ｍｇ／ｍＬのアセチル化ＢＳＡ、１００ｍＭのＭＥＳ、１ＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＥＤＴＡ、０．０１％のツイーン２０）に加えた。ハイブリッド形成に１０μｇのｃＲＮＡを用いた。ＧｅｎｅＣｈｉｐハイブリッド形成オーブン６４０にて４５℃で１６時間アレイをハイブリッド形成させた。アレイを洗浄し、ＧｅｎｅＣｈｉｐ流体工学ステーション４００にてＲ−フィコエリスリン−ストレプトアビジンによって染色した。この後、ヒューレットパッカードＧｅｎｅＡｒｒａｙスキャナーによってアレイを走査した。洗浄、走査及び基本的な解析にはアフィメトリックスＧｅｎｅＣｈｉｐマイクロアレイスイート５．０ソフトウエアを用いた。特定の遺伝子の３’から５’の強度比を調べることによって試料の質を評価した。
【０１３７】
５．骨髄由来の樹状細胞（ＢＭＤＣ）
【０１３８】
Ｉｎａｂａら、［ 顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子を添加したマウスの骨髄培養からの多数の樹状細胞の生成。J Exp Med 176:1693-702, (1992)］に記載されたものを改変した手順を用いてＢＭＤＣを生成した。手短に言えば、メスＣ５７ＢＬ／６マウスの大腿骨及び脛骨から骨髄を回収した。赤血球を溶解した後、プラスチックへの付着性によってリンパ球から樹状細胞前駆細胞を分離することができた。１０％ＦＢＳ、非必須アミノ酸、抗生物質及びＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４（Ｒ＆Ｄシステムズ）を各１，０００Ｕ／ｍＬを添加したＲＰＭＩ１６４０培地にて、残った骨髄細胞を６日間培養した。２日に一回培地を交換した。６日目に細胞をアッセイに使用した。ＣＤ１１ｃの発現についてフローサイトメトリーによって証明されたように、これらの細胞は、＞９０％樹状細胞であった。
【０１３９】
６．ＲＴ−ＰＣＲ
【０１４０】
製造元の指示書に従ってキアゲンからのＲＮｅａｓｙミニキットによってＢＭＤＣから全ＲＮＡを単離した。３７℃にて３０分間のＤＮＡ分解酵素による消化に続いて、全ＲＮＡの濃度を分光光度計によって決定した。マウスのＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４及びβ−アクチン用のプライマー対（ＣＣＬ２用の正方向プライマー：５’−ＡＡＧＣＣＡＧＣＴＣＴＣＴＣＴＴＣＣＴＣ−３’［配列番号３］及び逆方向プライマー：５’−ＣＣＴＣＴＣＴＣＴＴＴＧＡＧＣＴＴＧＧＴＧ−３’［配列番号４］；ＣＣＬ３用の正方向プライマー：５’−ＡＴＣＡＴＧＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＣＣＡＣ−３’［配列番号５］及び逆方向プライマー：５’−ＴＣＴＣＡＧＧＣＡＴＴＣＡＧＴＴＣＣＡＧ−３’［配列番号６］；β−アクチン用の正方向プライマー： ５’−ＧＣＴＣＴＧＴＧＣＡＡＡＣＣＴＡＡＣＣＣ−３’［配列番号７］及び逆方向プライマー：５’−ＴＧＴＧＡＴＧＧＴＧＧＧＡＡＴＧＧＧＴＣＡＧ−３’［配列番号８］及び逆方向プライマー：５’−ＴＴＴＧＡＴＧＴＣＡＣＧＣＡＣＧＡＴＴＴＣＣ−３’［配列番号９］）［Wang H., et al., 樹状細胞の流入リンパ節への移動を誘導することを介したＩＬ−４が介在する腫瘍免疫における単球の化学誘引性タンパク質（ＭＣＰ）−ｌ／ＣＣｈ２の関与の可能性。 Int Immunopharmacol 3:627-42, (2003)］をＩＤＴ技術によって合成した。逆転写及びＤＮＡの増幅が同一の反応で起きる一工程ＲＴ−ＰＣＴキット（カリフォルニア州、カールズバッドのインビトロゲンから市販されている）を用いてＲＴ−ＰＣＲを行った。手短に言えば、逆転写酵素とＴａｑポリメラーゼの存在下適当なプライマーを含む反応で１μｇの全ＲＮＡを鋳型として用いた。混合物を４５℃で３０分間インキュベートし、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間及び７２℃で２分間を２５回繰り返してインキュベートした。増幅の適当な陰性対照は、逆転写酵素無しの反応を含んだ。臭化エチジウムで染色した１．５％アガロースゲルのＵＶ透照によってＰＣＲ産物を視覚化した。
【０１４１】
７．ＤＯＴＡＰ刺激後のリンパ節細胞及びＢＭＤＣによるＣＣＬ２の産生
【０１４２】
メスＣ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝５）にＰＢＳ、ＤＯＴＡＰ／Ｅ７又はＤＯＴＡＰ／Ｅ７／ＭＡＰキナーゼ阻害剤を皮下注射した２日後、ＣＣＬ２  ＥＬＩＳＡキット（ＢＤ  バイオサイエンシズから市販されている）によって流入領域リンパ節内でのＣＣＬ２産生の量を解析した。記載されたようなＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４の存在下、Ｃ５７ＢＬ／６マウスからのＢＭＤＣを６日間培養した。６日目に、３７℃にて培地対照又はリポソームで１ｈ、２４ｈ又は４８ｈ、ＢＭＤＣ（１０６個／ｍＬ／ウエル）を刺激した。阻害剤の処理については、リポソーム刺激の前、阻害剤をＢＭＤＣと共に２０分間予備インキュベートした。ＣＣＬ２  ＥＬＩＳＡキットによって上清中のＣＣＬ２の産生を解析した。
【０１４３】
８．ＣＣＬ２の免疫組織化学染色
【０１４４】
２日目にマウスの流入領域リンパ節を取り出し、ＯＴＣコンパウンドに包埋し、液体窒素で急速冷凍し、免疫組織化学分析に使用するまで−８０℃で保存した。製造元のプロトコールに従って、ヤギＡＢＣ染色システム（カリフォルニア州、サンタクルーズのサンタクルーズバイオテクノロジー社から市販されている）を用いた。手短に言えば、流入領域リンパ節の８μｍの厚さのクリオスタット切片を作製し、冷アセトンで１０分間固定し、各洗浄５分間でＰＢＳによって３回洗浄した。次いで切片を順次、内因性ペルオキシダーゼをブロックするために１％の過酸化水素（Ｈ２Ｏ中）にて１０分間、ＰＢＳ中１％のブロッキング血清（ロバ血清）にて６０分間、次いで４℃にて一次抗体（１：１００希釈、カリフォルニア州、サンタクルーズのサンタクルーズバイオテクノロジー社から市販されている）と共に一晩インキュベートした。次いで、切片をＡＢ酵素試薬と共にビオチン化二次抗体（１：１５０希釈、カリフォルニア州、サンタクルーズのサンタクルーズバイオテクノロジー社から市販されている）と３０分間インキュベートし、３滴のペルオキシダーゼ基質と１０分間以上インキュベートした。
【０１４５】
９．ウエスタンブロット解析
【０１４６】
様々な処理の後、ＢＭＤＣ細胞の溶解物を回収し、細胞性タンパク質すべてをポリアクリルアミド／ＳＤＳゲル上で分離し、次いでポリジフッ化ビニリデン膜に転写した。トリス緩衝生理食塩水中５％の脱脂乳によって１時間、膜をブロックし、次いで一次抗体と共に１時間〜一晩インキュベートした。トリス緩衝生理食塩水で３回膜を洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼを結合した二次抗体と共に１時間、膜をインキュベートした。タンパク質バンドに結合したペルオキシダーゼ活性は、ＥＣＬ（アマシャム・インターナショナル）を用いた増強化学発光、次いでオートラジオグラフィによって検出した。
【０１４７】
１０．ｓｉＲＮＡ処理
【０１４８】
製造元の指示書に従って、リポフェクトアミン２０００試薬（カリフォルニア州、サンタクルーズのサンタクルーズバイオテクノロジー社から市販されている）を用いて、ＥＲＫ１用のｓｉＲＮＡ及び対照ｓｉＲＮＡ（カリフォルニア州、サンタクルーズのサンタクルーズバイオテクノロジー社から市販されている）によってＲＮＡ干渉実験を行った。手短に言えば、５日目に、１２穴プレートにウエル当たり５×１０５個のＢＭＤＣを播き、直ちに４μＬの形質移入試薬を用いて８０ｎＭのｓｉＲＮＡで形質移入した。ＤＯＴＡＰ又はＬＰＳと共にさらに１６時間細胞をインキュベートした。ＣＣＬ２についてＥＬＩＳＡによって上清を分析した。
【０１４９】
Ｂ．結果
【０１５０】
ＡＰＣの良好なモデルであることが示されている［Mendoza L., et al., ＨＰＶ１６関連腫瘍の担癌マウスにおけるＢＭＤＣ株及びＤＣ株の予防的、治療的及び抗転移的な効果。 Int J Oncol 23:243-7, (2003); Okada N., et al., マウスの樹状細胞及び樹状細胞変異体における主要組織適合複合体クラスＩ拘束性抗原提示経路に対するリポフェクチン−抗原複合体の効果。Biochim Biophys Acta 1527:97-101, (2001)］形質転換された樹状細胞株、ＤＣ２．４を用いて、アフィメトリクスマイクロアレイ解析を用いて、ＤＯＴＡＰによって誘導される包括的遺伝子調節を検討した（図１５Ａ）。データは、ＤＯＴＡＰが、単球化学誘引タンパク質−１（「ＭＣＰ−１」）／ＣＣ型ケモカイン−２（「ＣＣＬ２」）、マクロファージ炎症性タンパク質−１アルファ（「ＭＩＰ−１α」）／ＣＣ型ケモカイン−３（「ＣＣＬ３」）、マクロファージ炎症性タンパク質−１ベータ（「ＭＩＰ−１β」）／ＣＣ型ケモカイン−４（「ＣＣＬ４」）を含む幾つかのケモカインの過剰発現を誘導することを示した。ＣＣ型ケモカインの誘導のほかに、ＩＬ−１のシグナルが下方制御されたが、これは、５０μＭのＤＯＴＡＰ処理の際、ＩＬ−１βが低下し、ＩＬ−１受容体アンタゴニスト（「ＩＬ１ＲＡ」）が上昇したからである。興味深いことに、ＤＯＴＡＰリポソームによって樹状細胞マーカー、ＣＤ１１ｃが誘導されたということは、カチオン脂質が樹状細胞の成熟に役割を担っていることを示唆している。マウスＢＭＤＣによるＲＴ−ＰＣＲによってケモカインｍＲＮＡの誘導が確認された（図１５Ｂ）。
【０１５１】
前述のように、ケモカインはリンパ球の移動に関与し、免疫応答に重要な役割を担っている。ケモカインの誘導は、前述のようにカチオンリポソームの主なアジュバント活性を説明できるかもしれない。この仮説は、プロセスの根底にある詳細なメカニズムを検討するように我々を促した。様々な脂質から調製したリポソームを利用して、ケモカインの誘導がリポソームによる一般的な現象であるのかどうかを判定した。ＢＭＤＣを用いた結果、四級カチオンリポソーム（ＤＯＴＡＰ及びＤＯＥＰＣ）のみがＢＭＤＣからのＭＣＰ−１／ＣＣＬ２の放出を誘導することを示した。中性（ＤＯＰＣ及びＤＯＧ）及び負に荷電した（ＤＯＰＳ及びＤＯＰＧ）リポソームは誘導しなかった（図１６）。また、ＤＯＴＡＰ及びＤＯＤＡＰの三級アミン類縁体がいずれの活性も誘導しなかったということは、活性は、脂質において四級アミノ頭部基を必要とすることを示唆している。ＬＰＳもまた陽性対照として実験に含めた。図１６はまた、４８時間のインキュベートがさらに高いレベルのケモカイン産生を生じなかったので、カチオンリポソームによるＣＣＬ２の誘導は２４時間で最高量に達することを示している。我々のデータはまた、ＤＯＴＡＰ誘導のＣＣＬ２の発現が用量依存的であることを示している（図１７）。５μＭのＤＯＴＡＰがＢＭＤＣからの十分量のＣＣＬ２を誘導し、４５〜７５μＭで最高の誘導に達した。ＢＭＤＣにおけるＤＯＴＡＰによるＣＣＬ２の誘導にどの経路が関与しているのかを同定するために、別々のシグナル伝達経路に特異的な幾つかの阻害剤を用いた。ＥＲＫ経路に特異的な阻害剤であるＰＤ９８０５９（「ＰＤ」）及びＵ−０１２６（「Ｕ」）は、ほぼ完全にＣＣＬ２の産生をなくしたが、驚くべきことに、ｐ３８経路の阻害剤であるＳＢ２０３５８６（「ＳＢ」）は、ＤＯＴＡＰによって誘導されるＣＣＬ２産生を相乗的に高めた（図１８）。われわれのデータはまた、ＰＫＣ阻害剤、ＧＦ１０９２０３Ｘ（「ＧＦ」）及びＳｒｃキナーゼ阻害剤、ＰＰ２が阻害効果を有さなかったので、ＤＯＴＡＰによるＣＣＬ２産生にはＰＫＣ経路及びＳｒｃキナーゼは関与しないことを明瞭に示した。図１８はまた、ワートマニン（「Ｗｏｒｔ」）及び百日咳毒素（「ＰＴｘ」）が幾分阻害効果を有したので、ＰＩ−３キナーゼ及びＧｉ依存性Ｇタンパク質結合性受容体（ＧＰＣＲ）は、ＤＯＴＡＰ処理に際したＣＣＬ２の放出に関与する可能性があることを示している。
【０１５２】
幾つかのケモカインはＥＲＫ経路によって調節されていることが知られており［Yoo J. K., et al., ＩＬ−１８は、ホスファチジルイノシトール３キナーゼ／ＡｋｔとＭＥＫ／ＥＲＫ１／２の経路を介してマクロファージにおける単球走化性タンパク質−１の産生を誘導する。 J Immunol 175:8280-6, (2005)］、我々の系でも証明されている。ＥＲＫの経路の活性化を検討するためにＢＭＤＣを用いて、我々のデータは、ＤＯＴＡＰは暴露の１０分以内にＥＲＫのリン酸化を誘導し、ホスフォ−ＥＲＫ（ｐ−ＥＲＫ）は、高いレベルで少なくとも４０分間留まることを示した（図１９Ａ）。さらに、ｐ３８もまたＤＯＴＡＰによってやや活性化された。しかしながら、ＤＯＴＡＰのインキュベートに続いてＩκＢのリン酸化とそれに続く分解が検出されなかった（データは示さず）ということは、我々の以前の知見に一致して、ＤＯＴＡＰによって開始されるシグナル伝達にＮＦ−κＢが関与していなかったことを示唆している［Cui Z., et al., ワクチン担体としてのＬＰＤナノ粒子の免疫賦活メカニズム。Mol Pharm 2:22-8, (2005)］。ウエスタンブロットが、ｐ３８の阻害は、ＤＯＴＡＰによって引き金が引かれるＥＲＫのリン酸化も相乗的に高めることができることを示したということは、ＥＲＫの経路とｐ３８は相互に調節されていることを示唆している（図１９Ｂ）。言い換えれば、ｐ３８の活性化は、ＥＲＫの活性化を阻害するのかもしれない。図１８におけるＥＬＩＳＡのデータと一致して、我々のデータは、ＤＯＴＡＰによって誘導されるＥＲＫのリン酸化をワートマニンが阻害したので、ＤＯＴＡＰが誘導するＥＲＫの活性化にはＰＩ−３キナーゼが介在することを示していた。しかしながら、Ｇｉ阻害剤であるＰＴｘは、ＤＯＴＡＰが誘導するＥＲＫのリン酸化に対してわずかな阻害効果しか示さなかった（図１９Ｃ）。他方では、ＧＦ及びＰＰ２がＤＯＴＡＰによって誘導されるＥＲＫのリン酸化に効果を有さなかったので、ＰＫＣの経路及びＳｒｃキナーゼはこのプロセスに関与していない。
【０１５３】
ＤＯＴＡＰによって開始されるＣＣＬ２の放出にＥＲＫの経路が関与することをさらに検証するために、ＲＮＡ干渉のアプローチを利用してＢＭＤＣにおけるＥＲＫ遺伝子の発現をブロックした。図２０Ａは、２４時間後、特定のｓｉＲＮＡによってＥＲＫ１が下方制御されることを示した。ＥＲＫ１遺伝子の発現をブロックするｓｉＲＮＡで処理された細胞にてＤＯＴＡＰが誘導するＣＣＬ２の放出が減衰した（図２０Ｂ）。しかしながら、ＥＲＫ１が下方制御されても、ＬＰＳはＣＣＬ２の放出を誘導し続けた(図２０Ｂ）。データはまた、ＥＲＫ１のｓｉＲＮＡ処理はほかのシグナル伝達経路に影響を及ぼさなかったことを明らかにしている。
【０１５４】
今までのこところ、データは、インビトロでのＤＯＴＡＰが誘導するＥＲＫの活性化及びその下流のＣＣＬ２の誘導を明らかにしている。我々は、上記のシグナル伝達のメカニズムがインビトロでのＤＯＴＡＰのアジュバント活性に役割を担っているかどうか検討した。ＤＯＴＡＰ／Ｅ７リポソームワクチン製剤でマウスを皮下で免疫し、流入領域リンパ節を回収し、ＣＣＬ２についてＥＬＩＳＡによってアッセイした。データは、免疫後、流入領域リンパ節にＣＣＬ２が蓄積し、最大の蓄積は注射後２日だったことを示している（図２１Ａ）。免疫組織化学染色によってこれらのデータは確認された（図２１Ｂ）。同じデータはまた、ＤＯＴＡＰ／Ｅ７処理に際してさらに多くのリンパ球が流入領域リンパ節に移動し、結果的にリンパ節の肥大を生じたことも明らかにしている。
【０１５５】
ＥＲＫ及びｐ３８の経路の阻害剤もＤＯＴＡＰ／Ｅ７リポソーム複合体で製剤化した。ＤＯＴＡＰ／Ｅ７／Ｕ−０１２６及びＤＯＴＡＰ／Ｅ７／ＳＢ２０３５８０は透明な懸濁液を形成したが、ＰＤ９８０５９は、ＤＯＴＡＰ／Ｅ７複合体中で製剤化するのは困難であった。ＤＯＴＡＰ／Ｅ７／薬剤の製剤は、ＤＯＴＡＰ／Ｅ７の製剤と同様のゼータ電位、粒径及び抗原負荷能を有したということは、薬剤の取り込みがワクチンの物理的な特性を有意には変えなかったことを示している。マウスにＤＯＴＡＰ／Ｅ７／Ｕ−０１２６及びＤＯＴＡＰ／Ｅ７／ＳＢ２０３５８０を皮下注射した。インビトロのデータと一致して、ＤＯＴＡＰ／Ｅ７製剤は、流入領域リンパ節においてＣＣＬ２の蓄積を誘導し、Ｕ−０１２６及びＳＢ−２０３５８０は、ＣＣＬ２の誘導を相互に調節した（図２２Ａ）。ＥＲＫとｐ３８の経路が、ＤＯＴＡＰ／Ｅ７の抗腫瘍活性に関係するかどうかを判定するために、我々は、ＤＯＴＡＰ／Ｅ７／薬剤の製剤の抗腫瘍活性を調べた。図２２Ｂに示されるように、脂質用量１００ナノモルにてＤＯＴＡＰ／Ｅ７で処理された担癌マウスは、ＴＣ−１腫瘍の増殖に対する強い増殖阻害効果を示した。ＥＲＫの阻害剤であるＵ−０１２６は、ＤＯＴＡＰ／Ｅ７と同時製剤化した場合、ＤＯＴＡＰ／Ｅ７の抗腫瘍活性を完全に消失させた。同様に、ＳＢ−２０３５８０と同時製剤化したＤＯＴＡＰ／Ｅ７でマウスを処理した場合、抗腫瘍活性の部分的阻害が示されたということは、ｐ３８とＥＲＫの経路の双方がＤＯＴＡＰ／Ｅ７複合体の抗腫瘍活性に重要な役割を担っていることを示している。
【０１５６】
Ｃ．考察
【０１５７】
リポソームは、二層の水和させた両親媒性の脂質から成る閉鎖した小胞構造である［Small D. M., 脂質と水の表面及び全体の相互作用、とそれに伴うこれらの相互作用に基づいた生物学的に活性のある脂質の分類。Federation Proc. 29:1320-1326, (1970)］。それらが１９７４年にアジュバントとして同定されて以来［Allison A.G.及びGregoriadis G., 免疫アジュバントとしてのリポソーム。Nature 252:252, (1974)］、リポソームは、タンパク質ワクチン及びＤＮＡワクチンの送達システムとして広範に活用されている［Chen W.C.及びHuang L., ワクチン担体としての非ウイルスベクター。 Adv Genet 54:315-37, (2005); Gregoriadis G., et al.、リポソームへのワクチンの取り込み。Methods 19:156-62, (1999); Perrie Y., et al., 皮下経路を介したリポソームが介在するＤＮＡ免疫。J Drug Target 11:555-63, (2003)］。リポソームは、抗原の送達について幾つかの独特の利点を示す。先ず、特定の適用に選択することができる脂質組成、サイズ、層化性、電荷、調製方法に十分な汎用性がある。さらに、担体と抗原の比を考慮すると、リポソーム小胞系は、封入又は安定な結合の形態での抗原負荷の効率性が高い。安全性の観点からは、リポソームは生分解性であり、生体適合性であり、免疫原性が低い［Copland MJ., et al., 抗原の送達のための脂質基剤の粒子製剤。Immunol Cell Biol 83:97-105, (2005); O'Hagan D. T.及びSingh M., ワクチンアジュバント及び送達系としての微粒子。Expert Rev Vaccines 2:269-83, (2003)］。さらにリポソームは、タンパク質抗原を細胞質のＭＨＣクラスＩ経路に導入し、ＣＤ８＋Ｔ細胞の応答を生成するのに使用されている［hikh G.及びSchutze-Redelmeier M.P.,樹状細胞へのＣＴＬエピトープのリポソームによる送達。 Biosci Rep 22:339-53, (2002)］。
【０１５８】
カチオンリポソームは、負に荷電した細胞膜と相互作用することができるので、それらは、遺伝子療法及びワクチン送達に広く使用されている［Anderson P., Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ感染に対する分泌された微生物タンパク質の可溶性混合物によるマウスの有効なワクチン接種。Infect Immun 62:2536-44, (1994); Hasegawa A.,et al., ジフテリア毒素を結合したＣＤ５２コアによる鼻免疫は、メスマウスの生殖管で特異的な抗体の産生を誘導した。Am J Reprod Immunol 34:305- 11, (2002)］。しかしながら、カチオンリポソーム自体は、天然の免疫応答を活性化できるという点で不活性であるとみなされている［Moinegeon P., et al., Ｔｈ１アジュバントの合理的な設計に向けて。Vaccine 19:4363-72, (2001)］。しかしながら、カチオンリポソームはまた、同時刺激分子ＣＤ８０とＣＤ８３の発現を誘導し、ヒト樹状細胞を活性化することができる（図２３Ａ〜Ｅ及び図２５Ａ〜Ｂ）。それらはまた、疾患に対する強力な免疫応答を生成することと関連した重要なケモカイン及びサイトカインを産生するようにヒト樹状細胞を誘導する（図２４Ａ〜Ｆ）。これらの知見はすべて、樹状細胞への有効な送達以外に、カチオンリポソームは、免疫系の強力な活性化剤であることを示唆している。
【０１５９】
アラム、ＣｐＧ及びＣＦＡのような現在使用されているアジュバントとは異なって、カチオン脂質免疫賦活剤は、ＮＦ−κＢの発現を高めず、このことは、カチオン脂質による免疫系の刺激は、ＮＦ−κＢに無関係のメカニズムを介してシグナル伝達されることを明らかにしており、我々のカチオン脂質に基づいた療法からＬＰＳ様の炎症反応の可能性を排除する。これらの研究は、カチオンリポソームが、有効な送達系であることに加えて、改善された安全性特性を持つ独特の部類の免疫賦活剤に属することを示している。
【０１６０】
本明細書では、カチオンリポソームのアジュバント活性の考えられる分子メカニズムを検討した。カチオン脂質の免疫賦活活性におけるその役割について、ＭＡＰキナーゼシグナル伝達経路の種々の成分を検討した。活性のある樹状細胞賦活剤として、脂質を検討した。カチオン脂質によってケモカインの産生が誘導され、誘導には主としてＥＲＫ経路が介在することが明らかになった。さらに、データは、ｐ３８経路は、このプロセスを負に調節することを明瞭に示している。最近の報告は、ｐ３８は、主としてＥＲＫの活性を調節する能力が介在してＩＬ−２産生において負の役割を担うことを明らかにした。ｐ３８に特異的な阻害剤はＥＲＫの活性化を誘導し、最終的にはＩＬ−２遺伝子の活性化を高める［Kogkopoulou O., et al., ｐ３８ＭＡＰＫの不活化によるＩＬ−２産生の条件付上方制御にはＥｒｋｌ／２活性の増加が介在する。J Leukoc Biol 79:1052- 60, (2006)］。ｐ３８のリン酸化及び活性化が、ＥＲＫ１／２とのその相互作用を高め、ＥＲＫ１／２のホスホトランスフェラーゼの活性と相関するということは、活性化されたｐ３８はＥＲＫ１／２を隔離し、ＭＥＫ１によるリン酸化を立体的にブロックすることを示唆している［Zhang H., et al., ｐ３８ＭＡＰキナーゼとの直接的な相互作用によるＥＲＫ１及びＥＲＫ２のストレスを減らした阻害。J Biol Chem 276:6905-8, (2001)］。最近の研究は、頑強で持続するＥＲＫのリン酸化は結果として樹状細胞におけるＡＰ−１転写因子、ｃＦｏｓのリン酸化を生じ、それは、今度はＴｈ１を規定するサイトカインＩＬ−１２の発現を抑えるので、Ｔｈ２にとってより好ましい、ということを示唆する。しかしながら、我々のデータは、これらの報告に対して２つの重要な差異を示している。第１に、それらの研究で利用されたＰａｍ−３ｃｙｓ（ＴＬＲ−２リガンド）は、ＬＰＳに比べてＥＲＫの活性を高めることを示したが（Dillon et al., 2004）、カチオン脂質が誘導したＥＲＫの活性は、ＬＰＳによって認められるものより低い。我々はまた、Ｔｈ２サイトカインであるＩＬ−１０も検討したところ、結果はＤＯＴＡＰによってＩＬ−１０は誘導されないことを示した（データは示さず）。従って、ＤＯＴＡＰによって誘導されるＥＲＫのシグナルはＴｈ２の応答の引き金を引くには十分ではない。第２に、ＤＯＴＡＰが誘導したＩＬ−１シグナルの下方制御は、Ｔｈ２の応答も抑制することができた。ＤＯＴＡＰが誘導するＥＲＫの活性化は適切に制御されていると思われる。
【０１６１】
我々の結果は、ＤＯＴＡＰが誘導するＥＲＫの活性化とＣＣＬ２の誘導にはＰＩ−３キナーゼが必要とされることを示唆している。ＰＩ−３キナーゼとＥＲＫの間の正確な関係を同定するにはさらなる検討が必要である。ＥＬＩＳＡのデータは、ＤＯＴＡＰによって誘導されるＣＣＬ２の放出をＰＴｘが阻害することを示しているが、ウエスタンブロットのデータが示すように、ＤＯＴＡＰが誘導するＥＲＫのリン酸化はＰＴｘによってわずかしか阻害されない。従って、ＤＯＴＡＰによって開始されるシグナル伝達にはＧタンパク質結合受容体は関与してもしなくてもよい。興味深いことに、リソホスファチジルコリン（ＬＰＣ）はＧ２Ａ受容体依存性のＥＲＫの活性化及びＴ細胞の移動を誘導する［Radu C.G., et al.,Ｇ２Ａ受容体を介したリソホスファチジルコリンへのＴ細胞の走化性。 Proc Natl Acad Sci U S A 101:245-50, (2004)］。著者らは元々、ＬＰＣはＧ２Ａ受容体のリガンドであると報告していた［Kabarowski J.H., et al., 免疫調節性受容体Ｇ２Ａのリガンドとしてのリソホスファチジルコリン。Science 293:702-5, (2001)］が、その後、ＬＰＣが誘導するＥＲＫの活性化は、Ｇ２Ａ受容体の細胞内隔離と表面発現を調節するメカニズムを介することが明らかにされた［Wang L, et al., リソホスファチジルコリンが誘導する表面の再分布は、マウスのＧタンパク質結合受容体Ｇ２Ａのシグナル伝達を調節する。Mol Biol Cell 16:2234-47, (2005)］。活性のあるカチオン脂質は、大きな極性の頭部基及び２つの長いアシル鎖を含有する。そのような構造的特徴は、脂質膜へのその挿入を促進してもよく、結果として脂質単層の自発的な湾曲の変化の可能性、同様に膜タンパク質の立体配座の及び機能的な変化を生じる。
【０１６２】
ｐ３８はＣＣＬ２誘導のＥＲＫ活性化を負に調節するので、我々は、ＤＯＴＡＰ／Ｅ７ワクチンで製剤化されたｐ３８阻害剤、ＳＢ２０３５８０が抗腫瘍活性を高めることを期待した。しかしながら、ｐ３８はＤＯＴＡＰ／Ｅ７が誘導する腫瘍の退行に陽性の役割も担ってもよいことを示す反対の結果が見い出された。カチオンリポソームは、ｐ３８の活性化をもたらすことができる反応性酸素種（ＲＯＳ）の生成を誘導することができるので、ＤＯＴＡＰが誘導するｐ３８の活性化はＲＯＳを介することが考えられる（Iwaoka et al., 2006）。蓄積された証拠は、ｐ３８の活性化が樹状細胞からのＴｈ１サイトカインの放出を誘導することを示している［DeSilva D.R., et al., 活性化された及び反応不顕性のＴｈ１細胞におけるｐ３８マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ経路。Cell Immunol 180:116-23, (1997); Yu J.J., et al., 本来のＴｈ１細胞の調節及び表現型：サイトカインの役割とｐ３８キナーゼ経路。J Immunol 171:6112-8, (2003)］。哺乳類種では、ＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ，ｐ３８及びＪＮＫ）は、免疫応答のあらゆる態様、天然の免疫の開始相から、獲得免疫の活性化まで、及び免疫機能が完結した場合の細胞死まで関与する［Dong C, et al., 免疫応答におけるＭＡＰキナーゼ。Annu Rev Immunol 20:55-72, (2002)］。
【０１６３】
多種多様な実験的アジュバントが動物での使用に利用可能であり、その一部は臨床試験で試されている。それらには、幾つかの油中水エマルション、リポソーム及びそのほかの化学アジュバントが挙げられる［Vogel, F. R.及びPowell, M. F. ワクチンアジュバント及び賦形剤の概要。 Pharm Biotechnol 6:141 (1995)］。しかしながら、インフルエンザビロソーム［Gluck, R.及びWalti, E., 免疫増強再構成インフルエンザビロソーム（ＩＲＩＶ）をアジュバントとしたＡ型肝炎ワクチン、Ｅｐａｘａｌ  Ｂｅｒｎａの生物学的検証。Dev Biol (Basel) 103:189 (2000)］及びＣｈｉｒｏｎのＭＦ５９［Kahn, J. O., et al., ＨＩＶ非感染のヒト志願者におけるムラミルトリペプチドジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンの存在下又は非存在下でのＭＦ５９アジュバントを併用したヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）ＩＳＦ２型ｇｐｌ２０サブユニットワクチンに対する臨床的及び免疫的な応答。J Infect Dis 170:1288 (1994)］だけがアルミニウム塩以外ですでに上市されている。カチオンリポソーム（未公表データ）と同様に、アジュバントＭＦ５９に基づいた１ミクロン未満のエマルションは、樹状細胞によって内部移行させられる［Dupuis, M., et al., 筋肉注射の後、樹状細胞はワクチンアジュバントを内部移行させる。Cell Immunol 186:18 (1998)］。それは、同時送達された抗原に対する高い抗体及びＴ細胞の反応をもたらす種々の免疫活性を刺激する。しかしながら、ＨＳＶ及びインフルエンザのワクチンに関する臨床試験報告［Jones, C. A.及びCunningham, A. L., 性器ヘルペス及び新生児単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）症を防ぐためのワクチン接種戦略。 Herpes 11:12 (2004); and Minutello, M., et al., ３回の連続したインフルエンザ流行期に免疫された、高齢対象におけるＭＦ５９アジュバントを併用した不活化インフルエンザサブユニットウイルスワクチンの安全性及び免疫原性。Vaccine 17:99 (1999)］によれば、動物モデルからの証拠は、ＭＦ５９アジュバントは、Ｔ細胞の応答ではなく中和抗体を高めることを示唆している。従って、ワクチンアジュバントとしてのカチオンリポソームは、我々のデータによって示されるように、強い細胞性免疫応答を生成する点でＭＦ５９とは異なる。
【０１６４】
カチオン脂質／抗原複合体は、今までに報告された最も単純な癌ワクチン製剤であると思われる。それは、たった２つの分子、すなわち、抗原と担体だけを含有する。たとえば、樹状細胞のような抗原提示細胞の細胞質にＥ７ペプチドを送達することに加えて、ＤＯＴＡＰはまた、ＤＣも活性化するに違いない。実際、ＤＯＴＡＰのみから成るリポソームは樹状細胞にて同時刺激分子、ＣＤ８０／ＣＤ８６の発現を誘導する。
【０１６５】
結論として、我々の知見は、カチオンリポソームが強力な免疫系賦活剤であることを初めて示唆している。本明細書で報告される結果は、たとえば、ＤＯＴＡＰのようなカチオン脂質のアジュバント活性の分子メカニズムの解明に役立つ。
【０１６６】
ＤＯＴＡＰは、その発現にＥＲＫ経路が介在する幾つかのケモカイン及びサイトカインの誘導に介在する。我々の研究は、カチオンリポソームのアジュバント活性を評価するための新しい分子マーカーとしてＥＲＫ経路を同定した。これらのマーカーを、強力な脂質系アジュバント及びワクチン送達系の高処理能力スクリーニング又は設計に用いてもよい。
【０１６７】
〔実施例３〕
ヒト免疫系の細胞におけるカチオン脂質／抗原複合体の免疫賦活能の実証。
【０１６８】
１．カチオン脂質／Ｅ７複合体は、脂質用量依存的にヒト樹状細胞を活性化する。
【０１６９】
上述のようにカチオンリポソームを調製した。製剤に使用されたＥ７抗原は、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１によって拘束される同定されたヒトＥ７ペプチド（ＨＰＶ−１６  Ｅ７、アミノ酸１１−２０、ＹＭＬＤＬＱＰＥＴＴ、配列番号２）である。ペプチドは、ペンシルベニア州、ピッツバーグのピッツバーグ大学分子医学研究所によって合成された。ヒトＨＬＡ−Ａ２ヒト樹状細胞はロンザ（メリーランド州、ウォーカーズビル）から入手した。凍結したクリオバイアルを融解し、５０μｇ／ｍＬのＩＬ−４及びＧＭ−ＣＳＦを添加したＬＧＭ−３培地（メリーランド州、ウォーカーズビルのロンザから市販されている）中で、３７℃及び５％ＣＯ２にて１２穴培養皿で２ｍＬの培地に最初の播種密度１２５，０００個／ｃｍ２で樹状細胞を培養した。培養中で細胞を３日間増殖させると、顕微鏡検査では、付着性細胞と丸い細胞の混合物として見えた。
【０１７０】
３日目に、新鮮な用量の５０μｇ／ｍＬのＩＬ−４及びＧＭ−ＣＳＦで処理し（すべてのウエル）、試験ウエルは、１０ｎｇ／ｍＬのインターロイキン−１β（「ＩＬ−１β」）、インターロイキン−６（「ＩＬ−６」）及びＴＮＦ−αの混合物、及び１０μｇ／ｍＬのプロスタグランジンＥ２（「ＰＧＥ２」）（活性化の陽性対照）、無処理（活性化の陰性対照）、及び２．５、１０及び４０μＭの最終濃度でのＤＯＴＡＰ／Ｅ７、２．５、１０及び４０μＭの最終濃度でのＤＯＥＰＣ、及び２．５、１０及び４０μＭの最終濃度での脂質とコレステロールのＤＯＴＡＰ／コレステロール／Ｅ７、のいずれかで処理した。脂質二重膜の安定剤であるコレステロールは２５モル％で加えた。処理された樹状細胞を培養で２４時間維持し、表面マーカーの染色及びフローサイトメトリー解析のために回収した。回収した細胞を血球計算板で計数し、１０μＬの以下の抗体結合体：ＣＤ８０−ＦＩＴＣ、ＣＤ−８３−ＡＰＣ及びＣＤ−８６−ＰＥ（ＢＤバイオサイエンシズ）を、表面マーカーを標識するために各試料に順次加えた。その後、表面を標識された細胞はＢＤ  ＦＡＣＳキャリバーフローサイトメータを用いたフローサイトメトリーによって解析し、活性化の際産生される同時刺激樹状細胞マーカー分子、ＣＤ８０、ＣＤ８３及びＣＤ８６をモニターした。図２３のＡ，Ｂ及びＣに見られるように、種々の用量のカチオン脂質／Ｅ７複合体で処理された初代ヒト樹状細胞は、評価された、Ｔ細胞への抗原提示の成功に必要とされる樹状細胞活性化の３つの同時刺激マーカーすべてについて、それらの発現を上方制御した。図２３Ｄ及びＥに見られるように、安定剤のような追加の成分も複合体の免疫賦活能に否定的に影響することなく、医薬組成物に含めることができる。
【０１７１】
２．カチオン脂質／Ｅ７複合体はヒト樹状細胞を活性化し、ケモカイン及びサイトカインの産生を誘導する
【０１７２】
ヒトＨＬＡ−Ａ２の樹状細胞（メリーランド州、ウォーカーズビルのロンザ）を上述のように処理し、培養で増殖させた。３日目に、４０μＭのＤＯＴＡＰ／Ｅ７複合体又は５０μＭ濃度の強力な免疫賦活リポ多糖類（ＬＰＳ）（陽性対照）で細胞を処理した。アッセイウエルの培地を取り出し、微量遠心機にて１３００ｒｐｍで５分間遠心して、付着していない樹状細胞を沈殿させた。上清を取り出し、ｍＬ当たり１０μＬのプロテアーゼ阻害剤カクテルセットＩ（カタログ番号５３９１３１、カリフォルニア州、ラホヤのカルビオケム）で処理し、解析の前に凍結保存した。ピアースバイオテクノロジー社（マサチューセッツ州、ウォバーン）のサーチライト・プロテイン・アレイＭｕｌｔｉｐｌｅｘＥＬＩＳＡアッセイを用いて、サイトカインの発現について試料を解析した。
【０１７３】
ＴＮＦ−α及びＩＬ−１２の産生を評価し、細胞性の免疫応答に必須であることが分かっている選択されたケモカイン、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５及びＣＣＬ１９の産生もすべて評価した（図２４Ａ〜Ｆ）。図２４は、ＤＯＴＡＰ／Ｅ７複合体がヒト樹状細胞によるサイトカイン及びケモカインの産生を誘導することを説明している。図２４Ａ〜Ｆはそれぞれ、ＤＯＴＡＰ／Ｅ７が、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５及びＣＣＬ１９の産生を誘導したことを説明している。
【０１７４】
マウスの樹状細胞を用いた所見（実施例１）と同様に、ＬＰＳとは異なって、ＤＯＴＡＰ／Ｅ７複合体は炎症誘発性サイトカイン、ＴＮＦ−αの有意な産生を誘導しなかったということは、ヒトの系でもＮＦ−κＢが介在するシグナル伝達はカチオン脂質によって活性化されないことを裏付けている。ＤＯＴＡＰ／Ｅ７が複数のケモカインの有効な産生を刺激することは、カチオン脂質が強力な免疫賦活剤として作用し、マウスとヒト双方の免疫細胞で効率的な活性化の同様の相関を提供することを実証している。
【０１７５】
３．ヒト樹状細胞の活性化に対するＤＯＴＡＰ／Ｅ７粒径の効果
【０１７６】
ヒトＨＬＡ−Ａ２の樹状細胞（メリーランド州、ウォーカーズビルのロンザ）を上述のように処理し、培養で増殖させた。３日目に、１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１β、ＩＬ−６及びＴＮＦ−α、並びに１０μｇ／ｍＬのＰＧＥ２の混合物（活性化の陽性対照）、無処理（活性化の陰性対照）、５０μＭ濃度での強力な免疫賦活リポ多糖類（ＬＰＳ）（第２の陽性対照）、又は、粒径１００ｎｍ、２００ｎｍ及び４００ｎｍの１０μＭのＤＯＴＡＰ／Ｅ７複合体、のいずれかで試験細胞を処理した。図２５に示した結果は、免疫療法の開発において免疫応答を誘導するために、カチオン脂質／抗原複合体は広いサイズ範囲内で利用できることを明らかにしている。
【０１７７】
考察
【０１７８】
実施例１及び２で記載された研究は、カチオン脂質／抗原複合体から成る免疫療法製剤の開発をもたらした。ＤＯＴＡＰやＤＯＥＰＣのようなカチオン脂質で刺激した際、マウスの骨髄由来の樹状細胞（ＢＭＤＣ）は、同時刺激分子、ＣＤ８０及びＣＤ８６の発現について活性化された［Vangesseri et al, カチオンリポソームによる樹状細胞の免疫刺激。Mol Membr Biol 23:385-395 (2006)］。ＤＯＴＡＰで活性化したＢＭＤＣでは、ＭＡＰキナーゼシグナル伝達経路の種々の成分及びＣＣＬ２のような幾つかのケモカインの活性化も認められた。動物試験は、ＤＯＴＡＰリポソームは特定の用量範囲内で、抗原の担体及び活性化された樹状細胞の流入領域リンパ節への移動を誘導する強力なアジュバントの双方として作用し、それによって、たとえば、腫瘍のような抗原保持細胞に対する抗原特異的なＣＤ８＋Ｔリンパ球の、インビボでの生成をもたらすことを示唆していた。初代ヒト樹状細胞のインビトロでの活性化試験は、カチオン脂質が、Ｔ細胞の認識及び抗原提示に必要とされる同時刺激分子の発現に向けた樹状細胞の活性化を促す強力な免疫賦活剤であることを示している。我々はまた、ヒト樹状細胞がＤＯＴＡＰ／Ｅ７リポソームによる活性化に際してインビトロでヒトＴ細胞の有意な増殖を促すことも明らかにした。
【０１７９】
上記で報告された研究は、カチオンリポソームの特定の独特の組成物及び適用を同定し、それらのカチオンリポソームは、単純で、コスト効果のある、最も必要とされてきた、幾つかの消耗性疾患のための免疫療法を開発するのに利用できる。
【０１８０】
本発明の範囲から逸脱することなく、上述の態様及び例示となる実施態様において種々の変更を行うことができるので、上記の説明に含有されるすべてのことは、限定的ではなく例示として解釈されるべきであることが意図される。これを受けて、実施例は主としてカチオン脂質ＤＯＴＡＰ、ＤＯＥＰＣ及びＤＯＴＭＡを議論しているものの、当業者は、これらのカチオン脂質が単に例示的なものであり、本方法は、そのほかのカチオン脂質に適用可能であることを認識するであろう。
【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図２０Ｂ】
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【図２１Ａ】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ】
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【図２３Ｄ】
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【図２３Ｅ】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２４Ｃ】
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【図２４Ｄ】
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【図２４Ｅ】
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【図２４Ｆ】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図３】
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【図１５Ｂ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成25年11月18日(2013.11.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象の免疫系の細胞にてＭＡＰキナーゼ（mitogen-activated protein kinase）のシグナル伝達経路を活性化し、且つ、該対象にて免疫応答を誘導するのに十分な用量の、少なくとも１種のカチオン脂質を含む、組成物。
【外国語明細書】
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