(57)【要約】【課題】  金属酸化物粒子または金属粒子からＩＣＧが離脱しにくいＩＣＧ含有粒子を提供することを目的とする。【解決手段】  金属酸化物粒子または金属粒子と、インドシアニングリーンの会合体と、を有するインドシアニングリーン含有粒子であって、前記インドシアニングリーンの会合体の吸光度の極大値が８８０ｎｍ以上９１０ｎｍ以下の範囲内にあることを特徴とする。【選択図】  図１
2014001175.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
金属酸化物粒子または金属粒子と、インドシアニングリーンの会合体と、を有するインドシアニングリーン含有粒子であって、前記インドシアニングリーンの会合体の吸光度の極大値が８８０ｎｍ以上９１０ｎｍ以下の範囲内にあることを特徴とするインドシアニングリーン含有粒子。
【請求項２】
前記インドシアニングリーンの会合体が、前記金属粒子または前記金属酸化物粒子に吸着していることを特徴とする請求項１に記載のインドシアニングリーン含有粒子。
【請求項３】
前記金属酸化物粒子が酸化鉄粒子であることを特徴とする請求項１または２に記載のインドシアニングリーン含有粒子。
【請求項４】
前記インドシアニングリーン含有粒子の７８０ｎｍにおける吸光度に対して、前記インドシアニングリーン含有粒子の８９５ｎｍの吸光度は２．０倍以上であることを特徴とする請求項１乃至３のいずれか一項に記載のインドシアニングリーン含有粒子。
【請求項５】
前記インドシアニングリーン含有粒子の表面に分散剤を有することを特徴とする請求項１乃至４のいずれか一項に記載のインドシアニングリーン含有粒子。
【請求項６】
前記分散剤がデキストランであることを特徴とする請求項５に記載のインドシアニングリーン含有粒子。
【請求項７】
請求項１及至６のいずれか一項に記載のインドシアニングリーン含有粒子と、分散媒とを有することを特徴とする光音響イメージング用造影剤。
【請求項８】
請求項１乃至６のいずれか一項に記載のインドシアニングリーン含有粒子の製造方法であって、インドシアニングリーンの水溶液を加熱する工程、
加熱した前記インドシアニングリーンの水溶液と金属酸化物粒子または金属粒子とを混合して混合液を得る工程、
前記混合液を加熱することを特徴とするインドシアニングリーン含有粒子の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はインドシアニングリーン含有粒子、前記インドシアニングリーン含有粒子を有する光音響イメージング用造影剤、および前記インドシアニングリーン含有粒子の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体内部の情報を可視化する手法として、光音響イメージング法が知られている。光音響イメージング法は、検体に光を照射することで検体から発せられる音響波の強度（光音響信号強度）と発生位置を測定することにより、検体内部の物質分布の画像を得る方法である。
【０００３】
酸化鉄粒子をデキストランで被覆した粒子（リゾビスト（登録商標））は、光を吸収して音響波を発生することが知られている（非特許文献１）。したがって、リゾビスト（登録商標）は光音響イメージング用造影剤として用いることができる。また、インドシアニングリーン（Ｉｎｄｏｃｙａｎｉｎｅ  Ｇｒｅｅｎ、以下ＩＣＧと略すことがある）も光を吸収し、音響波を発生することが知られている。ＩＣＧは会合体を形成していない場合、７８０ｎｍ付近の波長帯域に吸光度の極大を有する。なお、本明細書において、ＩＣＧとは下記の構造で示される化合物を指す。
【０００４】
【化１】
2014001175.tif 000003
【０００５】
ただし、対イオンはＮａ＋でなくてもよく、Ｈ＋あるいはＫ＋など任意の対イオンをもちいることができる。
【０００６】
ここで、酸化鉄粒子のように光を吸収して音響波を発生する粒子と、ＩＣＧのように光を吸収して音響波を発生するものを組み合わせた粒子を調製すれば、強い音響波を発生すると期待できる。非特許文献１では、金粒子にＩＣＧを吸着させた粒子（以下、ＩＣＧ−金プローブと呼ぶ）が開示されている。非特許文献１でＩＣＧ−金プローブは、表面増強ラマン散乱用とあるが、金粒子とＩＣＧはともに光を吸収して音響波を発生するため、強い音響波を発生する可能性がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２００５；７７：ｐｐ２３８１−２３８５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明者らは鋭意検討した結果、非特許文献１に開示のＩＣＧ−金プローブには課題があることを見出した。すなわち、ＩＣＧと、金粒子とは弱い相互作用で吸着していると考えられるため、ＩＣＧ−金プローブが水中に置かれた場合、親水性の高いＩＣＧのスルホン酸基が水分子と引きあって、ＩＣＧ−金プローブからＩＣＧが離脱してしまうと考えられる。さらに、ＩＣＧ−金プローブが血清中に置かれた場合、血清中のアルブミンなどのタンパク質とＩＣＧとが引きあって、ＩＣＧ−金プローブからＩＣＧが離脱してしまうと考えられる。
【０００９】
そこで本発明は、金属酸化物粒子または金属粒子からＩＣＧが離脱しにくい粒子を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明に係るインドシアニングリーン含有粒子は、金属酸化物粒子または金属粒子と、インドシアニングリーンの会合体と、を有するインドシアニングリーン含有粒子であって、前記インドシアニングリーンの会合体の吸光度の極大値が８８０ｎｍ以上９１０ｎｍ以下の範囲内にあることを特徴とする。
【００１１】
また、本発明に係るインドシアニングリーン含有粒子の製造方法は、インドシアニングリーンの水溶液を加熱する工程、
加熱した前記インドシアニングリーンの水溶液と金属酸化物粒子または金属粒子とを混合して混合液を得る工程、前記混合液を加熱することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１２】
本発明に係るインドシアニングリーン含有粒子によると、金属酸化物粒子または金属粒子と、ＩＣＧの会合体とを組み合わせた粒子は、その粒子が水中や、血清中におかれた場合であっても、金属酸化物粒子または金属粒子からＩＣＧが離脱しにくい。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明の実施形態に係るインドシアニングリーン含有粒子の断面を模式的に示した図である。
【図２】ＩＣＧの構造を示した図である。
【図３】本発明の実施形態に係るインドシアニングリーン含有粒子からＩＣＧが離脱しにくい理由を示すための図である。
【図４】本発明の実施例で調製したインドシアニングリーン含有粒子の吸光度の測定結果を示した図である。
【図５】本発明の実施例で調製した別のインドシアニングリーン含有粒子の吸光度の測定結果を示した図である。
【図６】本発明の実施例および比較例で調製したインドシアニングリーン含有粒子の水中での安定性の評価結果を示した図である。
【図７】本発明の実施例で調製したインドシアニングリーン含有粒子の血清中での保存安定性の評価結果を示した図である。
【図８】本発明の比較例で調製したインドシアニングリーン含有粒子の吸光度の測定結果を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明の実施形態について図１を用いて説明する。図１は本実施形態に係るインドシアニングリーン含有粒子の断面を模式的に示した図である。なお以下では「インドシアニングリーン含有粒子」を、単に「粒子」と略す。
【００１５】
（粒子）
本実施形態に係る粒子１０１は、金属酸化物粒子または金属粒子１０２と、ＩＣＧの会合体１０３と、を少なくとも有する。そして、ＩＣＧの会合体１０３の吸光度の極大値が８８０ｎｍ以上９１０ｎｍ以下の範囲内にあることを特徴とする。
【００１６】
本実施形態に係る粒子１０１が、水中や、血清中におかれた場合であっても、金属酸化物粒子または金属粒子からＩＣＧが離脱しにくい理由について図２および図３を用いて説明する。
【００１７】
図２（ａ）はＩＣＧの構造を示している。ＩＣＧを、疎水性の部位（芳香族環とメチン鎖を有する部位）２０１と、スルホン酸基を有する部位（親水性の部位）２０３と、２０１と２０３との間の部位とに分けて示すことができる。図２（ａ）を模式的に示した図が図２（ｂ）である。
【００１８】
ここで、ＩＣＧのスルホン酸基２０３のマイナス電荷と、金属酸化物粒子または金属粒子のプラス電荷とが引きあうことで、ＩＣＧは金属酸化物粒子または金属粒子に吸着する。しかし、ＩＣＧは金属酸化物粒子または金属粒子に弱い相互作用で吸着しているため、水中や血清中におかれたときに、ＩＣＧは金属粒子や金属酸化物粒子から離脱してしまう。
【００１９】
これは、親水性のスルホン酸基２０３が水分子と親和性が高いため、金属酸化物粒子または金属粒子に吸着しているスルホン酸基と引きあって、ＩＣＧを金属酸化物粒子または金属粒子から離脱させてしまうからだと考えられる。また、血清中のアルブミンなどのタンパク質はＩＣＧと引きあって、ＩＣＧが金属酸化物粒子または金属粒子から離脱してしまうことも考えられる。
【００２０】
一方、ＩＣＧは疎水性の高い部位２０１がスタッキングして複数のＩＣＧからなる会合体を形成しうる（図３（ａ））。図３（ａ）では図２（ｂ）で示したＩＣＧが会合体を形成したときの状態を模式的に示している。ＩＣＧの会合体の吸光度の極大値は会合体を形成していない場合に比べて変わる。本実施形態におけるＩＣＧの会合体の吸光度の極大値は８８０ｎｍ以上９１０ｎｍ以下の範囲内にあり、ＩＣＧのＪ会合体と呼ぶことがある。
図３（ｂ）で、２１０は金属酸化物粒子または金属粒子の表面を模式的に示したものであり、その表面にＩＣＧの会合体が吸着している図を示している。ＩＣＧの会合体は図３（ａ）のように複数のＩＣＧからなるので、ＩＣＧ単独に比べてスルホン酸基を多く有する。したがって、図３（ｂ）のように、ＩＣＧの会合体と、金属酸化物粒子または金属粒子（２１０）とは多数の点で相互作用して吸着することができる。すなわち、ＩＣＧ単独では最多でもスルホン酸基の数である２点でしか金属酸化物粒子または金属粒子と吸着できないが、ＩＣＧの会合体はＩＣＧ同士のつながりを維持したまま多点で金属酸化物粒子または金属粒子と吸着できる。よって、ＩＣＧの会合体は金属酸化物粒子または金属粒子から離脱しにくい（図３（ｂ））。
【００２１】
図３（ａ）のようにＩＣＧの会合体は親水性のスルホン酸基２０３が互いに１８０度異なる方向に向いた状態でスタッキングしている場合もある。図３（ｂ）のように、一方を向いたスルホン酸基２０３は金属酸化物粒子または金属粒子に吸着し、１８０度異なる方向を向いたスルホン酸基は粒子の外側を向いた状態となる。このように、親水性のスルホン酸基が外側を向いた状態では、水分子は粒子の外側に向いたスルホン酸基と引き合い、金属酸化物粒子または金属粒子に吸着したＩＣＧの会合体からＩＣＧが引き抜かれやすくなると思われる。しかし、ＩＣＧ同士はスタッキングしており、隣のＩＣＧと接しているため、ＩＣＧが水分子と接触する確率は、ＩＣＧ単独のときに比べて低い。水分子はＩＣＧに接近しにくく、水分子はＩＣＧを引き抜きにくい。その結果、ＩＣＧは金属酸化物粒子または金属粒子から脱離しにくい。以上述べたように、ＩＣＧの会合体を金属酸化物粒子あるいは金属粒子に吸着させた場合、ＩＣＧと金属酸化物粒子あるいは金属粒子が多数の点で吸着していること、及びＩＣＧ同士がスタッキングしているため水分子が接近しにくいことから、水中でもＩＣＧは金属酸化物粒子あるいは金属粒子から脱離しにくい。本実施形態に係る粒子は血清中におかれた場合も同様で、ＩＣＧ同士はスタッキングしているため、親和性の高い血清中のアルブミンなどのタンパク質はＩＣＧに接近しにくく、たとえ接近できたとしても多数点で金属酸化物粒子あるいは金属粒子と吸着しているため、アルブミンなどのタンパク質はＩＣＧを引き抜きにくい。このような理由で、本実施形態に係る粒子は、水中や、血清中におかれた場合であっても、金属酸化物粒子または金属粒子からＩＣＧが離脱しにくい。ここで、吸着とは、ＩＣＧの会合体と、金属酸化物粒子または金属粒子とがクーロン相互作用によって結合していることを意味する。具体的には、ＩＣＧの会合体の有するスルホン酸基のマイナス電荷と、金属酸化物粒子または金属粒子の金属原子のプラス電荷とのクーロン相互作用と考えられる。
【００２２】
また、本実施形態における粒子は、７８０ｎｍにおける吸光度に対して８９５ｎｍの吸光度は２．０倍以上であることが好ましく、２．５倍以上であることがさらに好ましい。７８０ｎｍにおける吸光度に対して粒子の８９５ｎｍの吸光度が大きいということは、粒子におけるＩＣＧの会合体の割合が多いと考えられるからである。
【００２３】
本実施形態に係る粒子は、ＩＣＧの会合体が粒子の内部に存在していてもよい。
【００２４】
また、本実施形態に係る粒子は、粒子の表面に分散剤を有していてもよい。
【００２５】
（金属酸化物粒子または金属粒子）
本実施形態における金属酸化物粒子または金属粒子は、ＩＣＧの会合体が吸着するものであれば特に限定されない。金属酸化物粒子の例としては酸化鉄粒子、酸化アルミニウム粒子、酸化マグネシウム粒子、酸化チタン粒子、酸化銅粒子、酸化亜鉛粒子、酸化マンガン粒子、酸化コバルト粒子、酸化ニッケル粒子、酸化すず粒子、酸化セリウム粒子、酸化カルシウム粒子が挙げられる。金属粒子の例としては金粒子、銀粒子、銅粒子、白金粒子が挙げられる。
【００２６】
（酸化鉄粒子）
本実施形態における金属酸化物粒子として酸化鉄粒子が好ましい。酸化鉄粒子は、近赤外波長領域の光を吸収し、また、生体での安全性が高いことが確認されているからである。
【００２７】
本実施形態における酸化鉄粒子は、Ｆｅ３Ｏ４（マグネタイト）、γ−Ｆｅ２Ｏ３（マグヘマイト）、またはこれらの混合物などが挙げられる。特に好ましくは、マグネタイトである。マグネタイトは、マグヘマイトより近赤外波長領域におけるモル吸光係数が高いことが知られており、したがって光を照射したときに発生する音響波も大きくなると考えられる。また、本実施形態における酸化鉄粒子は、単結晶、多結晶、非晶質（アモルファス）のいずれの結晶状態でもよい。本実施形態に係る粒子をＭＲＩイメージング用造影剤として用いる場合は、単結晶であることが好ましい。
【００２８】
また、本実施形態における酸化鉄粒子は磁性が有していてもよいし、有していなくてもよい。酸化鉄粒子が磁性を有している場合、磁石を用いて精製することができる。
【００２９】
（ＩＣＧの会合体）
本実施形態においてＩＣＧの会合体は、吸光度の極大値が８８０以上９１０ｎｍ以下の範囲内にある。本実施形態におけるＩＣＧの会合体の吸光度の極大値は８９０以上９００ｎｍ以下の範囲内にあることが好ましく、８９５ｎｍであることがさらに好ましい。ＩＣＧの会合体は、ＩＣＧの水溶液を加熱することで得られる。
【００３０】
（分散剤）
本実施形態における分散剤は本実施形態に係る粒子の水や血清などの水溶液中での分散性を上げるためのものである。特に酸化鉄粒子を用いる場合、凝集しやすいため、分散剤を用いることが好ましい。
【００３１】
本実施形態に係る分散剤として、多糖類、四糖類、三糖類、二糖類、単糖類、糖アルコール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等を挙げることができる。
【００３２】
多糖類として例えば、デキストラン、カルボキシデキストラン、アミノ化デキストラン、デキストリン、ヒアルロン酸ナトリウム、プルラン、アルギン酸、ペクチン、アミロペクチン、グリコーゲン、セルロース、アガロース、カラギーナン、へパリンナトリウム、キシログルカン、キサンタンガムを挙げることができる。
【００３３】
四糖類として例えば、アカルボース、スタキオースを挙げることができる。
【００３４】
三糖類として例えば、ラフィノース、メレジトース、マルトトリオースを挙げることができる。
【００３５】
二糖類として例えば、トレハロース、スクロース、ラクトース、マルトース、ツラノース、セロビオースを挙げることができる。
【００３６】
単糖類として例えば、ジヒドロキシアセトン、グリセルアルデヒド、エリトロース、エリトルロース、トレオース、リブロース、キシルロース、キシロース、リキロース、デオキシリボース、プシコース、フルクトース、ソルボース、タガトース、アミロース、グルコース、マンノース、グロース、ガラクトース、タロース、フコース、ラムノース、セドヘプツロースを挙げることができる。
【００３７】
糖アルコールとして例えば、キシリトール、イノシトール、グルコン酸カルシウム、グルコン酸ナトリウム、グルコン酸マグネシウム、ソルビトール、糖酸カルシウム、ヒドロキシプロピルセルロース、マンニトール、メグルミンを挙げることができる。
【００３８】
ＰＥＧはＰＥＧそのものでもよいし、上記の糖類に化学的に結合されていてもよい。
【００３９】
また、ＰＥＧは直鎖状であってもよいし、分岐していてもよい。
【００４０】
（粒径）
本実施形態における粒子の粒径は、動的光散乱解析装置を用いて、動的光散乱法によって測定される流体力学的直径を意味する。本実施形態に係る粒子の粒径は、１ｎｍ以上５０００ｎｍ以下であることが好ましい。また、腎臓で排泄されにくい８ｎｍ以上、ＥＰＲ（Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ）効果が期待できる１０００ｎｍ以下であることがさらに好ましい。
【００４１】
（用途）
本実施形態に係る粒子は、ＩＣＧが離脱しにくいため大きな音響波を発生するので、光音響イメージング用造影剤として好適である。
【００４２】
また、ＭＲＩ用造影剤として用いることもできる。
【００４３】
（光音響イメージング用造影剤）
本実施形態に係る光音響イメージング用造影剤は、上記本実施形態に係る粒子と分散媒とを有する。なお、光音響イメージングは、光音響トモグラフィー（断層撮影法）を含む概念である。分散媒として例えば、生理食塩水、注射用蒸留水、リン酸緩衝生理食塩水、ブドウ糖水溶液が挙げられる。また本実施形態に係る光音響イメージング用造影剤は、必要に応じて薬理上許容できる添加物、例えば血管拡張剤などを有していても良い。
【００４４】
本実施形態に係る光音響イメージング用造影剤は、上記の分散媒に予め分散させておいてもよいし、キットにしておき、生体内に投与する前に分散媒に分散させて使用してもよい。
【００４５】
本実施形態に係る光音響イメージング用造影剤は、ＥＰＲ効果を利用することで、生体内に投与したときに、生体内の正常部位に比べて腫瘍部位により多く集積させることができる。その結果、粒子を生体内に投与した後、生体に光を照射して、生体からの音響波を検出するときに、腫瘍部位から発せられる音響波を正常部位から発せられる音響波よりも大きくすることができる。従って、本実施形態に係る粒子は腫瘍部位を特異的に検出する光音響イメージング用造影剤として用いることができる。
【００４６】
（光音響イメージング方法）
本実施形態に係る光音響イメージング方法は、上記のインドシアニングリーン含有粒子または光音響イメージング用造影剤が投与された検体に６００ｎｍ乃至１３００ｎｍの波長領域の光を照射する工程と、前記検体内に存在する前記造影剤から発生する音響波を検出する工程と、を有する。
【００４７】
本実施形態に係る光音響イメージング方法の一例は以下の通りである。すなわち、本実施形態に係るインドシアニングリーン含有粒子または造影剤を検体に投与し、あるいは前記検体より得られた臓器等の試料に添加する。なお、前記検体とは、ヒト以外の、実験動物やペット等の哺乳類、その他、特に限定されない。前記検体中もしくは検体より得られた試料として例えば、臓器、組織、組織切片、細胞、細胞溶解物などを挙げることができる。本実施形態に係る造影剤の投与あるいは添加後、前記検体等に対し近赤外波長領域のレーザーパルス光を照射する。
【００４８】
次に、本実施形態に係るインドシアニングリーン含有粒子または造影剤からの光音響信号（音響波）を音響波検出器、例えば圧電トランスデューサで検出し、電気信号に変換する。この音響波検出器より得られた電気信号に基づき、前記検体等の中の吸収体の位置や大きさ、あるいは光吸光係数などの光学特性値分布を計算することができる。例えば、前記光音響信号が基準とする閾値以上で検出されれば、その検体に標的分子、あるいは、標的分子を産生する部位が存在すると推定され、または、試料に標的分子が存在する、あるいは、試料の由来となる検体に標的分子を産生する部位が存在すると推定することができる。
【００４９】
（粒子の製造方法）
本実施形態に係る粒子の製造方法は特に限定されず、ＩＣＧの会合体を調製し、調整したＩＣＧの会合体を金属酸化物粒子または金属粒子に吸着される方法や、金属酸化物粒子または金属粒子に吸着したＩＣＧを会合体にする方法などが挙げられる。
【００５０】
本実施形態に係る粒子の製造方法として例えば下記の工程（１）乃至工程（３）の各工程をこの順に有する方法が挙げられる。
工程（１）ＩＣＧの水溶液を加熱する工程
工程（２）加熱したＩＣＧの水溶液と金属酸化物粒子または金属粒子とを混合する工程
工程（３）（２）で得られた混合液を加熱する工程
本発明者らの検討によると、ＩＣＧの濃度が３．０×１０−７ｍｏｌ／ｍｌの条件で上記工程（１）乃至（３）を経て粒子を調製したところ、会合体の形成を示唆する吸光度の極大値の変化は見られなかった。一方、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｈｙｓｉｃｓ  １９９７；２２０：ｐｐ３８５−３９２では濃度が１０−６ｍｏｌ／ｍｌ以上のＩＣＧ水溶液を加熱すると、吸光度の極大の波長が７００−８００ｎｍから８９０ｎｍへシフトするとあり、１．５×１０−６ｍｏｌ／ｍｌの条件のときに実証されている。したがって、工程（１）におけるＩＣＧの濃度は１０−６ｍｏｌ／ｍｌ以上３．０×１０−７ｍｏｌ／ｍｌ未満であることが好ましく、１．５×１０−６ｍｏｌ／ｍｌ以上であることが好ましい。例えば、工程（２）において、加熱したＩＣＧ水溶液と酸化鉄粒子の水分分散液を体積比９：１で混合するならば、工程（１）のＩＣＧ水溶液濃度として１．７×１０−６ｍｏｌ／ｍｌ程度に調整することが好ましい。
【００５１】
工程（１）及び（３）で加熱する温度は４０℃以上が好ましい。４０℃以上の温度にする場合、ＩＣＧの会合体が形成されるまでの時間が短いからである。工程（１）でＩＣＧ水溶液を加熱する時間は１時間以上２４時間以下であることが好ましい。
【００５２】
また、本発明者らの検討によると、ＩＣＧ水溶液に酸化鉄粒子の水分散液を混合し加熱しても、生体内に投与するモデルとして得られた粒子と血清を混合すると、酸化鉄粒子からＩＣＧが脱落してしまった。よって、ＩＣＧ水溶液に酸化鉄粒子の水分散液を加える前に、ＩＣＧ水溶液を加熱する工程（１）が必要であると考えられる。
【実施例】
【００５３】
以下、実施例を用いて更に詳細に本発明を説明するが、本発明は、これらの実施例に限定されるものではなく、材料、組成条件、反応条件等、同様な機能、効果を有する粒子が得られる範囲で自由に変えることができる。
【００５４】
（実施例）
（酸化鉄粒子とＩＣＧの会合体を有する粒子（粒子Ａ−１、Ａ−２、Ａ−３）の調製）
下記の手順で酸化鉄粒子とＩＣＧの会合体を有する粒子（粒子Ａ−１、Ａ−２、Ａ−３）を調製した。
【００５５】
まず、１．２９ｍｇ／ｍｌの濃度となるように、ＩＣＧ（インドシアニングリーン標準品、医薬品医療機器レギュラトリーサイエンス財団製）に水を加えた。超音波を１０分間照射し、ＩＣＧを水に溶解させた。得られたＩＣＧ水溶液を３つに分け、それぞれ６５℃で１、３、６時間加熱した。加熱して得られたＩＣＧ水溶液と、酸化鉄粒子（ナノマグ４５−００−２０２、γ−Ｆｅ２Ｏ３、コアフロント株式会社製）が分散した水溶液とを９：１の体積比で混合した。用いた酸化鉄粒子の粒径を測定したところ１３３８ｎｍであった。
【００５６】
次に、ＩＣＧ水溶液と、酸化鉄粒子が分散した水溶液との混合液を、６５℃で２４時間加熱した。磁石を用いて、酸化鉄粒子を回収し、酸化鉄粒子に吸着していないＩＣＧを除去した。ＩＣＧ水溶液を１時間加熱して得られた粒子をＡ−１、３時間加熱して得られた粒子をＡ−２、６時間加熱して得られた粒子をＡ−３と呼ぶ。
【００５７】
また、動的光散乱解析装置（ＥＬＳ−Ｚ、大塚電子社製）を用いて、粒子Ａ−１、Ａ−２、及びＡ−３の粒径を測定した。１００回の積算を５回行い、算出された５つのデータの平均の粒径を求めた。粒子Ａ−１、Ａ−２、及びＡ−３の散乱平均の値はそれぞれ４８２ｎｍ、４３２ｎｍ、４１９ｎｍであった。
【００５８】
得られた粒子Ａ−１、Ａ−２、及びＡ−３について、分光光度計（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｌａｍｂｄａ  Ｂｉｏ４０）を用いて、吸光度を測定した。測定結果を図４に示す。いずれの粒子も吸光度の極大値が８９５ｎｍであった。なお、酸化鉄粒子は８９５ｎｍの波長の光をほとんど吸収しないことが知られているため、ここで測定した吸光度はＩＣＧ由来の値だと考えられる。したがって、本実施例ではＩＣＧのＪ会合体が形成されていることがわかった。
【００５９】
なお粒子Ａ−１、Ａ−２、及びＡ−３の７８０ｎｍの吸光度に対する８９５ｎｍの吸光度比はそれぞれ８９５ｎｍの吸光度／７８０ｎｍの吸光度＝３．２、３．１、及び２．６であった。
【００６０】
（分散剤を表面に有する酸化鉄粒子とＩＣＧの会合体を有する粒子（Ａ−４）の調製）
下記の手順で、分散剤としてデキストランを表面に有する酸化鉄粒子と、ＩＣＧの会合体とを有する粒子（Ａ−４）を調製した。
【００６１】
酸化鉄粒子（ナノマグ４５−００−２０２、γ−Ｆｅ２Ｏ３、コアフロント株式会社製）の代わりにデキストランを表面に有する酸化鉄粒子（ナノマグ７９−００−５０１、粒径５０ｎｍ、γ−Ｆｅ２Ｏ３、コアフロント株式会社製）を用いること以外は、実施例１と同様にして粒子を調製した。ただし、最初にＩＣＧ水溶液を加熱する時間は６時間とした。磁性カラム（ＭＡＣＳ、ミルテニーバイオテク株式会社製）を用いて、酸化鉄粒子を回収し、酸化鉄粒子に吸着していないＩＣＧを除去した。このようにして得られた粒子をＡ−４と呼ぶ。
【００６２】
粒子Ａ−１、Ａ−２、およびＡ−３と同様に、動的光散乱解析装置を用いて粒径と吸光度を測定した。散乱平均の値は９６ｎｍであった。図５に粒子Ａ−４の吸光度を測定した結果を示す。吸光度の極大値は８９５ｎｍであった。なお、酸化鉄粒子およびデキストランは８９５ｎｍの波長の光をほとんど吸収しないことが知られているため、ここで測定した吸光度はＩＣＧ由来の値だと考えられる。したがって、本実施例ではＩＣＧのＪ会合体が形成されていることがわかった。また、８９５ｎｍの吸光度／７８０ｎｍの吸光度＝２．７であった。
【００６３】
（粒子Ａ−３の水中での安定性の評価）
下記の手順で粒子Ａ−３の水中での安定性を評価した。
【００６４】
磁石を用いて、粒子Ａ−３の分散水溶液の吸光度が約２００相当になるように濃縮した。濃縮した分散水溶液の一部を２００倍に希釈し、吸光度を測定した。残りの濃縮した分散水溶液を室温で１日おいた後、２００倍に希釈し、吸光度を測定した。
【００６５】
図６（ａ）は粒子Ａ−３の吸光度を測定した結果である。波長６００ｎｍ付近と、波長９５０ｎｍ付近にはＩＣＧの吸光度のピークはないので、図６（ａ）に示すように、６００ｎｍと９５０ｎｍに接する接線を引いた。その接線と粒子Ａ−３の吸収との差をＩＣＧ会合体由来の吸収とした。粒子を１日置く前のＩＣＧ会合体由来の吸光度を１としたときの、粒子を１日置いた後のＩＣＧ会合体由来の吸光度（吸光度変化率）を求めた。ただし、粒子Ａ−３のＩＣＧ会合体由来の吸光度は波長８９５ｎｍを選択して求めた。
【００６６】
図６（ｂ）に粒子Ａ−３の吸光度変化率を示す。粒子Ａ−３は吸光度変化率は少なかったため、水中において、酸化鉄粒子からＩＣＧが離脱しにくいことがわかった。
【００６７】
（粒子Ａ−１乃至Ａ−４の血清中での安定性の評価）
粒子Ａ−１乃至Ａ−４を体内に投与したときのモデル実験として、粒子Ａ−１乃至Ａ−４を血清と混合し、粒子の安定性を調べた。手順は下記の通りである。
【００６８】
粒子Ａ−１乃至Ａ−４の分散水溶液と血清を１：９の体積比で混合した。混合直後の吸光度を測定した。
【００６９】
吸光度を測定した後、３７℃で２４時間インキュベーションして、再度吸光度を測定した。
【００７０】
再度吸光度を測定した後、粒子Ａ−１乃至Ａ−３に関しては磁石を用いて、粒子Ａ−４に関しては磁気カラムを用いて、粒子と上澄みに分離した。酸化鉄粒子に吸着しているＩＣＧの有無と、酸化鉄粒子から離脱して上澄みに漏れ出たＩＣＧの有無を確認するために、粒子の分散水溶液と上澄みの吸光度をそれぞれ算出した。粒子Ａ−３の吸光度の測定結果を図７に示した。図７において、粒子と血清とを混合した直後の吸光度を「０ｈ」、血清中で粒子を２４時間インキュベーションした後の粒子の分散液の吸光度を「２４ｈ」、血清中で粒子を２４時間インキュベーションした後の粒子の吸光度を「２４ｈ粒子」、血清中で粒子を２４時間インキュベーションした後の上澄みの吸光度を「２４ｈ上澄」と、それぞれ記載した。
【００７１】
図７の結果から、粒子Ａ−３を血清と混合して２４時間インキュベーションした後でも８９５ｎｍでの光吸収の極大は維持されていることがわかった。
【００７２】
血清中に粒子を２４時間インキュベーションしたときに、粒子にどれだけの割合のＩＣＧが離脱せずに、吸着して残っていたかを、（血清中でのＩＣＧの残存率）＝（２４時間インキュベーションした後の粒子の吸光度）／（血清と混合直後の粒子の吸光度）×１００（％）で表される指標を用いて示す。数値が高いほど、ＩＣＧは離脱しておらず、酸化鉄粒子に吸着していることを示す。
【００７３】
粒子Ａ−３については、ＩＣＧの内７５％が酸化鉄粒子に吸着していたと考えられる。
【００７４】
粒子Ａ−１、Ａ−２、Ａ−４についても粒子Ａ−３と同様に（血清中でのＩＣＧの残存率）を算出した。以上、実施例に係る粒子についての各種データをまとめて表１に示した。
【００７５】
【表１】
2014001175.tif 000004
【００７６】
表１から、実施例に係る粒子の血清中でのＩＣＧの残存率は高いため、酸化鉄粒子から離脱しにくいことがわかった。
【００７７】
（粒子Ａ−３の光音響信号強度の測定）
粒子Ａ−３の光音響信号強度の測定を以下の通り行った。
【００７８】
まず、光音響信号の計測は、パルスレーザー光を水に分散した粒子に照射し、圧電素子を用いて粒子からの光音響信号を検出し、高速プリアンプで増幅後、デジタルオシロスコープで波形を取得して行った。具体的な条件は以下の通りである。パルスレーザー光源として、チタンサファイアレーザ（Ｌｏｔｉｓ、ＬＴ−２２１１−ＰＣ）を用いた。波長９００ｎｍ、エネルギー密度は２０乃至５０ｍＪ／ｃｍ２（選択した波長に依存する）、パルス幅は約２０ナノ秒、パルス繰返周波数は１０Ｈｚとした。水に分散した粒子をおさめる測定容器には、幅１ｃｍ、光路長０．１ｃｍのポリスチレン製キュベットを用いた。光音響信号を検出する圧電素子には、エレメント径１．２７ｃｍ、中心帯域１ＭＨｚの非収束型超音波トランスデューサ（Ｐａｎａｍｅｔｒｉｃｓ−ＮＤＴ、Ｖ３０３）を用いた。水を満たしたガラス容器に前記の測定容器と圧電素子とを浸け、その間隔を２．５ｃｍとした。光音響信号を増幅する高速プリアンプは増幅度＋３０ｄＢの超音波プリアンプ（オリンパス、Ｍｏｄｅｌ  ５６８２）を用いた。増幅された信号をデジタルオシロスコープ（テクトロニクス、ＤＰＯ４１０４）に入力した。前記ガラス容器の外からパルスレーザー光を前記ポリスチレン製キュベットに照射した。この際に生じる散乱光の一部をフォトダイオードで検出し、デジタルオシロスコープにトリガー信号として入力した。デジタルオシロスコープを３２回平均表示モードとし、レーザーパルス照射３２回平均の光音響信号取得を行った。光音響信号の波形から光音響信号強度（Ｖ）を求めた。得られた光音響信号強度を照射パルスレーザーのエネルギー（Ｊ）で割った値を規格化光音響信号（ＶＪ−１）と定義した。
【００７９】
さらに、粒子Ａ−３を塩酸で溶解した後、Ｂａｔｈｏｐｈｅｎａｎｔｈｒｏｌｉｎｅ−ｄｉｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄを用いて、Ｆｅの濃度を比色定量した。
【００８０】
規格化光音響信号をＦｅ濃度で割り、鉄量あたりの規格化光音響信号ＰＡ（Ｆｅ）  （ＶＪ−１Ｍ−１）を求めた。その結果、粒子Ａ−３の規格化光音響信号ＰＡ（Ｆｅ）＝２．８×１０７  （ＶＪ−１Ｍ−１）であった。
【００８１】
（比較例１）
（酸化鉄粒子とＩＣＧを有する粒子（粒子Ｂ−１、粒子Ｂ−２）の調製）
比較例として、下記の手順で酸化鉄粒子とＩＣＧを有する粒子（粒子Ｂ−１、Ｂ−２）を調製した。原料として用いた酸化鉄粒子、ＩＣＧは、粒子Ａ−１，Ａ−２、Ａ−３を調製したときに用いたものと同じである。
【００８２】
まず、１．２９ｍｇ／ｍｌの濃度となるように、ＩＣＧに水を加えた。超音波を１０分間照射し、ＩＣＧを水に溶解させた。得られたＩＣＧ水溶液と、酸化鉄粒子が分散した水溶液とを９：１の体積比で混合して混合物を得た。得られた混合物を２つに分け、それぞれ６５℃、３７℃で２４時間加熱した。磁石を用いて酸化鉄粒子を回収し、酸化鉄粒子に吸着していないＩＣＧを除去した。６５℃で加熱して得られた粒子をＢ−１、３７℃で加熱し得られた粒子をＢ−２と呼ぶ。
【００８３】
実施例と同様にして、粒子Ｂ−１、Ｂ−２の吸光度を測定した（図８）。粒子Ｂ−１、Ｂ−２の吸光度の極大値はそれぞれ８７３ｎｍ、８５２ｎｍであった。また、粒子Ｂ−１、Ｂ−２の８９５ｎｍの吸光度／７８０ｎｍの吸光度はそれぞれ１．１、０．８であった。
【００８４】
この結果から、酸化鉄粒子とＩＣＧの水溶液とを混合する前にあらかじめＩＣＧ水溶液を加熱しなければ、酸化鉄粒子に８８０ｎｍ以上９１０ｎｍ以下の範囲内に吸光度の極大をもつ粒子はできないことがわかった。
【００８５】
（分散剤を表面に有する酸化鉄粒子とＩＣＧを有する粒子（粒子Ｂ−３）の調製）
分散剤としてデキストランを表面に有する酸化鉄粒子とＩＣＧを有する粒子（粒子Ｂ−３）を調製した。酸化鉄粒子（ナノマグ４５−００−２０２、γ−Ｆｅ２Ｏ３、コアフロント株式会社製）の代わりにデキストランを表面に有する酸化鉄粒子（ナノマグ７９−００−５０１、粒径５０ｎｍ、γ−Ｆｅ２Ｏ３、コアフロント株式会社製）を用いること以外は、粒子Ｂ−１を調製したときと同様の手順で調製を行った。得られた粒子をＢ−３と呼ぶ。
【００８６】
実施例と同様にして、粒子Ｂ−３の吸光度を測定した（図８）。粒子Ｂ−３の吸光度の極大は８７３ｎｍであった。粒子Ｂ−３の８９５ｎｍの吸光度／７８０ｎｍの吸光度は０．３であった。
【００８７】
この結果から、酸化鉄粒子とＩＣＧの水溶液とを混合する前にあらかじめＩＣＧ水溶液を加熱しなければ、酸化鉄粒子に８８０ｎｍ以上９１０ｎｍ以下の範囲内に吸光度の極大をもつ粒子はできないことがわかった。
【００８８】
（粒子Ｂ−２の水中での安定性の評価）
粒子Ｂ−２の水中での安定性を、上記（粒子Ａ−３の水中での安定性の評価）と同様にして算出粒子からＩＣＧが離脱しにくいことがわかった。粒子Ｂ−２のＩＣＧ由来の吸収として波長８５２ｎｍを選択した。
【００８９】
図４（ｂ）に粒子Ｂ−２の吸光度変化率を示す。粒子Ｂ−２では吸光度変化率が大きかったため、水中において酸化鉄粒子からＩＣＧが離脱しやすいことがわかった。
【００９０】
（粒子Ｂ−１乃至Ｂ−３の血清中での安定性の評価）
粒子Ｂ−１乃至Ｂ−３を体内に投与したときのモデル実験として、粒子Ｂ−１乃至Ｂ−３を血清と混合し、血清中でのＩＣＧの残存率を算出した。手順は（粒子Ａ−１乃至Ａ−４の血清中での安定性の評価）と同様にして行った。なお、粒子Ｂ−１、Ｂ−２は磁石を用いて、粒子Ｂ−３は磁気カラムを用いて酸化鉄粒子を粒子と上澄みに分離した。結果を表１に示した。この結果から、８８０ｎｍ以上９１０ｎｍ以下の範囲内に吸光度の極大値をもたない粒子は血清中で酸化鉄粒子からＩＣＧが脱離してしまうことがわかった。
【符号の説明】
【００９１】
１０１  粒子
１０２  金属酸化物粒子または金属粒子
１０３  ＩＣＧの会合体
【図１】
2014001175.tif 000005
【図２】
2014001175.tif 000006
【図３】
2014001175.tif 000007
【図４】
2014001175.tif 000008
【図５】
2014001175.tif 000009
【図６】
2014001175.tif 000010
【図７】
2014001175.tif 000011
【図８】
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