(57)【要約】      （修正有）【課題】大きさの異なる複数のタンパク質に対して、高いタンパク質の固定量を示すタンパク質担体を提供する。【解決手段】窒素吸着等温線からＢＪＨ法によって得られる細孔径分布の半値幅が１０〜３０ｎｍであり、金属酸化物が主成分であるメソポーラス構造を有する。前記金属酸化物が、シリコン酸化物、チタン酸化物、ジルコニウム酸化物、アルミニウム酸化物、タンタル酸化物、ニオブ酸化物、セリウム酸化物およびスズ酸化物から選ばれる少なくとも１種であるタンパク質担体。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
窒素吸着等温線からＢＪＨ法によって得られる細孔径分布の半値幅が１０〜３０ｎｍであり、金属酸化物が主成分であるメソポーラス構造を有するタンパク質担体。
【請求項２】
ＢＪＨ法によって得られる細孔径分布のピーク値に対応する細孔径が１０〜４０ｎｍである、請求項１に記載のタンパク質担体。
【請求項３】
ＢＥＴ比表面積が、５０〜５００ｍ2／ｇである、請求項１又は請求項２に記載のタンパク質担体。
【請求項４】
形状がフレーク状である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のタンパク質担体。
【請求項５】
形状が球状又はファイバー状である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のタンパク質担体。
【請求項６】
前記金属酸化物が、シリコン酸化物、チタン酸化物、ジルコニウム酸化物、アルミニウム酸化物、タンタル酸化物、ニオブ酸化物、セリウム酸化物およびスズ酸化物から選ばれる少なくとも１種である、請求項１〜５のいずれか１項に記載のタンパク質担体。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のタンパク質担体に、タンパク質を固定したタンパク質−担体複合体。
【請求項８】
前記タンパク質が、酵素である請求項７に記載のタンパク質−担体複合体。
【請求項９】
分散質として金属酸化物コロイド粒子を含み、水を分散媒とし、ｐＨが７以上である金属酸化物ゾルを、プロトン性溶媒である場合には２０℃における比誘電率が３０以下、非プロトン性溶媒である場合には２０℃における比誘電率が４０以下であるとともに、２０℃の水に対する溶解度が０．０５ｇ／１００ｍｌ以上である溶媒を含む液体中に供給して、前記液体中に前記金属酸化物コロイド粒子の凝集体を生成させる工程と、
前記凝集体を乾燥、加熱および加圧から選ばれる少なくとも一つにより処理して当該凝集体を構成する金属酸化物コロイド粒子の結着力を増加させることにより、前記凝集体を水に不溶である粒体とする工程と、
前記粒体にタンパク質を固定する工程と、含む、
タンパク質−担体複合体の製造方法。
【請求項１０】
前記ゾルを前記液体に液滴として供給する、請求項９に記載のタンパク質−担体複合体の製造方法。
【請求項１１】
前記液体を攪拌しながら前記ゾルを当該液体に供給する、請求項９又は１０に記載のタンパク質−担体複合体の製造方法。
【請求項１２】
前記粒体を３００℃以上で焼成する工程をさらに含む、請求項９〜１１のいずれか１項に記載のタンパク質−担体複合体の製造方法。
【請求項１３】
前記粒体を酸でｐＨ調整する工程をさらに含む、請求項９〜１２のいずれか１項に記載のタンパク質−担体複合体の製造方法。
【請求項１４】
前記金属酸化物コロイド粒子が、シリコン酸化物、チタン酸化物、ジルコニウム酸化物、アルミニウム酸化物、タンタル酸化物、ニオブ酸化物、セリウム酸化物およびスズ酸化物から選ばれる少なくとも１種のコロイド粒子である、請求項９〜１３のいずれか１項に記載のタンパク質−担体複合体の製造方法。
【請求項１５】
前記溶媒の少なくとも一部が２０℃において水と混和する有機溶媒Ａであり、前記粒体の少なくとも一部がフレーク状の粒体である、請求項９〜１４のいずれか１項に記載のタンパク質−担体複合体の製造方法。
【請求項１６】
前記溶媒の５０質量％以上が前記有機溶媒Ａである、請求項１５に記載のタンパク質−担体複合体の製造方法。
【請求項１７】
前記溶媒の少なくとも一部が２０℃において水と混和する有機溶媒Ａであり、前記液体が２０℃において水と混和しない有機溶媒Ｂを含み、前記粒体の少なくとも一部がファイバー状の粒体である、請求項９〜１４のいずれか１項に記載のタンパク質−担体複合体の製造方法。
【請求項１８】
２０℃の水に対する前記有機溶媒Ｂの溶解度が３０ｇ／１００ｍｌ以下である、請求項１７に記載のタンパク質−担体複合体の製造方法。
【請求項１９】
前記溶媒が、２−ブタノール、２−ブテン−１−オール、ジエチレングリコールジエチルエーテル、プロピレングリコールモノプロピルエーテル、エチレングリコールモノイソブチルエーテル、２−エチル−１，３−ヘキサンジオールおよびジエチレングリコールモノヘキシルエーテルから選ばれる少なくとも１種であり、前記粒体の少なくとも一部がファイバー状の粒体である、請求項９〜１４のいずれか１項に記載のタンパク質−担体複合体の製造方法。
【請求項２０】
前記溶媒の少なくとも一部が２０℃において水と混和しない有機溶媒Ｂ１であり、前記粒体の少なくとも一部が球状の粒体である、請求項９〜１４のいずれか１項に記載の粒体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質担体、このタンパク質担体にタンパク質を固定したタンパク質−担体複合体及びこのタンパク質−担体複合体の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
酵素などの水に可溶なタンパク質を固相に固定化して再利用する試みが行われている。固定化の手法としては、化学結合、静電相互作用又はゲル包埋等が知られている。これらの固定化方法では、固定化されたタンパク質の活性の低下が問題となっている。この活性の低下は、（１）化学修飾による活性部位への影響、（２）非特異吸着による活性の低下、（３）自己凝集体の生成、（４）熱やｐＨなどの外部環境による立体構造の変化、（５）酵素の漏洩や共存するタンパク質分解酵素による分解などの理由により起こると考えられる。
【０００３】
そこで、近年では酵素などのタンパク質を固定するタンパク質担体として、酵素などのタンパク質の大きさに近い細孔径と大きな比表面積を持つメソポーラス構造を有する担体が開発されている。特許文献１には、このようなメソポーラス構造を有する担体を得る手法として、界面活性剤のミセルのまわりに層状シリケート等の無機原料を反応させて界面活性剤／無機複合体を形成させ、この複合体からミセルを除去してメソポーラス構造を得る手法が提案されている。特許文献１には、メソポーラス構造の細孔径が固定化する酵素の直径とほぼ同じであることが好ましく、これにより酵素反応の活性が高まることが示されている。
【０００４】
さらに、特許文献２には、ＦＳＭ系メソポーラス材料（シリカ系メソポーラス材料）の細径孔を合成条件により制御して、固定化すべき酵素の大きさに相応した細孔径を有するメソポーラス構造を得ることが示されている。そして、この様なメソポーラス構造を有する担体を酵素固定用担体として用いることにより、酵素の固定量が増加し、又は、酵素の安定性が向上することが示唆されている。また、特許文献３には、ＦＳＭ系メソポーラス材料の細孔にミオグロビンを安定的に固定化するために、中心細孔直径が３〜６ｎｍであるＦＳＭ系メソポーラス材料が提案されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０００−１３９４５９号公報
【特許文献２】特開２００９−１１２２４２号公報
【特許文献３】特開２００７−５１０７６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
特許文献１〜３に記載のメソポーラス材料は、固定すべきタンパク質の種類ごとにメソポーラス材料の細径孔を調整する必要がある。また、立体構造が不明なタンパク質を固定する場合、適当な細孔径を有するメソポーラス材料を選択するために試行錯誤を繰り返さなければならないという問題があった。
【０００７】
かかる事情に鑑み、本発明は、大きさの異なる複数のタンパク質に対して、高いタンパク質の固定量を示すタンパク質担体及びそのタンパク質担体にタンパク質を固定したタンパク質−担体複合体を提供することを目的とする。また、本発明は、そのようなタンパク質−担体複合体を製造する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、窒素吸着等温線からＢＪＨ法によって得られる細孔径分布の半値幅が１０〜３０ｎｍであり、金属酸化物が主成分であるメソポーラス構造を有するタンパク質担体を提供する。また別の側面から、本発明は、上記のタンパク質担体に、タンパク質を固定したタンパク質−担体複合体を提供する。
【０００９】
さらに別の側面から、本発明は、分散質として金属酸化物コロイド粒子を含み、水を分散媒とし、ｐＨが７以上である金属酸化物ゾルを、プロトン性溶媒である場合には２０℃における比誘電率が３０以下、非プロトン性溶媒である場合には２０℃における比誘電率が４０以下であるとともに、２０℃の水に対する溶解度が０．０５ｇ／１００ｍｌ以上である溶媒を含む液体中に供給して、前記液体中に前記金属酸化物コロイド粒子の凝集体を生成させる工程と、前記凝集体を乾燥、加熱および加圧から選ばれる少なくとも一つにより処理して当該凝集体を構成する金属酸化物コロイド粒子の結着力を増加させることにより、前記凝集体を水に不溶である粒体とする工程と、前記粒体にタンパク質を固定する工程と、含む、タンパク質−担体複合体の製造方法を提供する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のタンパク質担体は、窒素吸着等温線からＢＪＨ法によって得られる細孔径分布の半値幅が１０〜３０ｎｍであるメソポーラス構造を有している。すなわち、本発明のタンパク質担体の細孔径分布は、従来のタンパク質担体と比較すると、極めて広くなっている。そして、このタンパク質担体は、大きさの異なる複数のタンパク質に対して高いタンパク質の固定量を示す。
【００１１】
また、本発明によれば、界面活性剤のミセルを鋳型としてメソポーラス材料を製造する方法によっては実現が難しかった、細孔径分布が広い担体にタンパク質を固定したタンパク質−担体複合体を製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】実施例１に係るタンパク質担体の細孔径分布
【図２】実施例２に係るタンパク質担体の細孔径分布
【図３】実施例３に係るタンパク質担体の細孔径分布
【図４】比較例１に係るタンパク質担体の細孔径分布
【図５】比較例２に係るタンパク質担体の細孔径分布
【図６Ａ】実施例１に係るタンパク質担体のＳＥＭ（走査型電子顕微鏡）写真
【図６Ｂ】実施例１に係るタンパク質担体のＤＩＣ（微分干渉顕微鏡）写真
【図７Ａ】比較例１に係るタンパク質担体のＳＥＭ写真
【図７Ｂ】比較例１に係るタンパク質担体のＤＩＣ写真
【図８Ａ】比較例２に係るタンパク質担体のＳＥＭ写真
【図８Ｂ】比較例２に係るタンパク質担体のＤＩＣ写真
【図９】リゾチーム固定の安定性の評価結果
【図１０】セルラーゼ固定の安定性の評価結果
【図１１】カタラーゼ固定の安定性の評価結果
【図１２】球状のタンパク質担体の光学顕微鏡写真
【図１３Ａ】ファイバー状のタンパク質担体を含む実施例の光学顕微鏡写真
【図１３Ｂ】ファイバー状のタンパク質担体を含む実施例のＳＥＭ写真
【図１４】本実施形態の一例に係るタンパク質担体の模式図
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の実施形態について説明する。なお、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。まず、本発明のタンパク質担体について説明する。
【００１４】
本発明のタンパク質担体は、例えば図１４に示すようなフレーク状の形状を有する。タンパク質担体は、メソ孔、すなわち、細孔径が２〜５０ｎｍである細孔を有し、金属酸化物が主成分であるメソポーラス構造を有する。ここで、主成分とは質量基準で５０％以上を占める成分をいう。本発明のタンパク質担体は、実質的に金属酸化物から構成されていてもよい（例えば、金属酸化物が質量基準で９５％以上）。タンパク質担体のメソポーラス構造は、広い細孔径分布を有する。例えば、このメソポーラス構造において、窒素吸着等温線からＢＪＨ法によって得られる細孔径分布の半値幅は１０〜３０ｎｍを示す。ここで、半値幅は、以下のようにして求めることができる。まず、窒素吸着等温線からＢＪＨ法によって得られる細孔径分布において、ピーク値を定める。ピーク値とは、細孔径分布において細孔容積の最大値である。次に、細孔径分布において、ピーク値の１／２の値を示す細孔径の値Ｐ１、Ｐ２（Ｐ２＞Ｐ１）を定める。そして、Ｐ２−Ｐ１の値を半値幅と定める。窒素吸着等温線からＢＪＨ法によって得られる細孔径分布の半値幅は、好ましくは１０〜２５ｎｍであり、より好ましくは１５〜２５ｎｍである。
【００１５】
細孔径分布の半値幅は、その細孔径分布の形状を示す。半値幅が大きい細孔径分布ほど、細孔径のばらつきが大きく、広くなだらかな分布を示す。
【００１６】
このタンパク質担体の細孔径分布の半値幅は、従来のタンパク質担体の半値幅と比較して、極めて広いと考えられる。従って、このタンパク質担体は、大きさの異なる複数のタンパク質のそれぞれの固定に適した細孔径である細孔をある程度有している。これにより、大きさの異なる複数のタンパク質に対して、高いタンパク質の固定量を示す。
【００１７】
このタンパク質担体のメソポーラス構造は、ＢＪＨ法によって得られる細孔径分布のピーク値に対応する細孔径が１０〜４０ｎｍを示す。タンパク質分子の大きさは数ｎｍ〜数十ｎｍの範囲であることが多い。従って、タンパク質担体の細孔径分布のピーク値に対応する細孔径が１０〜４０ｎｍの範囲であれば、上記の細孔径分布の半値幅の特性と相まって、大きさの異なる複数種類のタンパク質のそれぞれに対して、その固定量を増加させることができる。タンパク質担体の細孔径分布のピーク値に対応する細孔径は、好ましくは１０〜３０ｎｍであり、より好ましくは１５〜２５ｎｍである。
【００１８】
このタンパク質担体のメソポーラス構造のＢＥＴ比表面積は５０〜５００ｍ2／ｇを示す。この比表面積は、界面活性剤を鋳型として作られたメソポーラス構造を有するタンパク質担体と比較して比表面積が小さい。このため、タンパク質担体の機械的強度が大きい。これにより、攪拌時にタンパク質担体が破壊されてタンパク質が遊離してしまうことを抑制できる。また、比表面積が小さい本発明のタンパク質担体によれば、少量のタンパク質を有効に利用できる。特に、高価なタンパク質の使用量を抑制することができる。このタンパク質担体のメソポーラス構造のＢＥＴ比表面積は、好ましくは１００〜３００ｍ2／ｇであり、より好ましくは１００〜２５０ｍ2／ｇであり、さらに好ましくは１００〜２００ｍ2／ｇである。
【００１９】
上記の通り、このタンパク質担体の形状はフレーク状である。本明細書において、フレーク状とは、主面を平面または曲面とみなすことができる板状の形状を意味し、その厚みに対する主面の平均径の比が３以上の形状である。フレーク状のタンパク質担体の厚さは、好ましくは０．１μｍ〜３μｍ、より好ましくは０．２μｍ〜２μｍである。フレーク状の粒体の平均径は、その主面を面積が等しい円とみなしたときの当該円の直径であり、好ましくは１μｍ〜１ｍｍ、より好ましくは２μｍ〜０．５ｍｍ、特に好ましくは５μｍ〜０．３ｍｍである。上記主面の最小径に対する最大径の比は、好ましくは１〜１０、より好ましくは１〜４である。厚みに対する主面の平均径の比は、好ましくは５以上、さらに好ましくは１０以上、例えば３０以下、好ましくは２０以下である。
【００２０】
形状がフレーク状であるタンパク質担体は、タンパク質の溶液中で分散性に優れる。これにより、このタンパク質担体は、タンパク質を容易に固定することができる。
【００２１】
タンパク質担体の形状は、フレーク状に限らず、例えばファイバー状であってもよい。ファイバー状とは、その語義のとおり、細く伸びた糸状の形状を意味し、その径に対する長さの比が３以上である形状である。ただし、ファイバー状の粒体は、長さ方向について径が一定であるものに限らず、他の部分に比べて太いまたは細い部分が存在する形状であってもよい。この場合の径は、そのファイバーを体積が等しい円柱とみなしたときの当該円柱の底面の直径とする。また、ファイバー状の粒体は、長さ方向に真っ直ぐに伸びるものに限らず、曲がりながら伸びている形状であってもよい。ファイバー状の粒体の径は、好ましくは０．５μｍ〜１００μｍ、より好ましくは１μｍ〜１０μｍである。ファイバー状の粒体の長さは、好ましくは３μｍ〜２ｍｍ、より好ましくは１０μｍ〜５００μｍである。ファイバー状の粒体の径に対する長さの比は、好ましくは５〜１００である。
【００２２】
タンパク質担体の形状は、球状であってもよい。ここで球状とは、フレーク状にもファイバー状にも分類されない塊状であって、塊状のタンパク質担体の最小径に対する最大径の比が１〜１．５の範囲内にあるものをいう。球状のタンパク質担体の径は、好ましくは１μｍ〜１００μｍ、より好ましくは５μｍ〜５０μｍである。球状の粒体における最小径に対する最大径の比は、好ましくは１〜１．２である。
【００２３】
タンパク質が関与する反応を行うための反応器としては、例えばタンパク質を担体に固定することにより作製したタンパク質−担体複合体をカラムに充填して構成した充填カラム式リアクターがある。この充填カラム式リアクターに充填するタンパク質担体の形状がファイバー状、又は、球状であると、充填カラム式リアクターに反応物を流通させる際の圧力損失を小さくすることができる。従って、この観点からタンパク質担体の形状がファイバー状、又は、球状であってもよい。
【００２４】
タンパク質担体の主成分である金属酸化物は、シリコン酸化物、チタン酸化物、ジルコニウム酸化物、アルミニウム酸化物、タンタル酸化物、ニオブ酸化物、セリウム酸化物およびスズ酸化物から選ばれる少なくとも１種である。製造コスト等の観点から、タンパク質担体の主成分である金属酸化物は、シリコン酸化物、アルミニウム酸化物が望ましい。
【００２５】
このタンパク質担体にタンパク質を固定して、タンパク質−担体複合体を得ることができる。固定されるタンパク質は特に限定されない。固定されるタンパク質としては、（１）酵素、（２）抗体などの免疫作用に関わるタンパク質、（３）ホルモン、受容体及びその他のシグナル伝達等の生体内の情報のやり取りに関わるタンパク質、（４）レクチンなど糖鎖と結合するタンパク質、（５）膜タンパク質などの細胞接着に関わるタンパク質、（６）アクチン又はミオシン等の運動に関わるタンパク質、（７）アルブミン等の輸送や貯蔵に関わるタンパク質、（８）ＧＦＰ等の蛍光に関わるタンパク質、（９）その他の遺伝子組み換えにより作られたタンパク質が例示される。
【００２６】
免疫作用に関わるタンパク質をこのタンパク質担体に固定する場合、得られるタンパク質−担体複合体は、免疫測定や抗体に結合する抗原の分離や生成に利用することができる。逆に、このタンパク質担体に抗原を固定する場合、得られるタンパク質−担体複合体は、抗体の分離精製に利用できる。同様に、このタンパク質にレクチンを固定する場合、得られるタンパク質−担体複合体は、レクチンと結合する糖鎖を持った物質の測定や分離精製に利用できる。細胞接着に関わるタンパク質をこのタンパク質担体に固定する場合、抗体やワクチンを生産する細胞を接着させることにより、抗体やワクチンの生産に用いることができる。シグナル伝達物質は一般に非常に高価であるので、シグナル伝達物質をこのタンパク質担体に固定する場合、得られたタンパク質−担体複合体はシグナル伝達物質を再利用できるという有利な特徴を有する。
【００２７】
このタンパク質担体に固定されるタンパク質は典型的には酵素である。この酵素としては、酸化還元酵素、転移酵素、加水分解酵素、リアーゼ、イソメラーゼ及びリガーゼのいずれか１種に分類される酵素である。
【００２８】
以下に、上述のタンパク質担体及びこのタンパク質担体にタンパク質を固定したタンパク質−担体複合体の製造方法について説明する。
【００２９】
以下で説明する方法により液体中に生成するタンパク質担体の前駆体である凝集体は、そのままでは水に溶けうる状態にあり、例えば水中に投入して攪拌すると金属酸化物コロイド粒子として再び分散する。しかし、乾燥、加熱などの処理を施して金属酸化物コロイド粒子相互の結着力を増すと、凝集体は水に不溶となる。本明細書では、不溶化処理を受けた凝集体を「粒体」と呼び、その処理を受けることなく水に溶けうる状態にあるものを「凝集体」と呼ぶ。例えば、凝集体から得られた焼成体（焼結体）は「粒体」に属する。「水に不溶」であるか否かは、２０℃の水中において汎用の攪拌手段（例えばマグネティックスターラー）を用いて水を攪拌したときに水に溶けるか否かにより判断することができる。また、粒体自体、又は、粒体に必要に応じて乾燥、焼成、ｐＨ調整処理等を施したものを「タンパク質担体」と呼ぶ。
【００３０】
また、以下では、特に断らない限り、「比誘電率」および「水に対する溶解度」は、２０℃における測定値を採用する。以下で言及する「粘性率」についても、２０℃における測定値を基準とする。周知のとおり、水に対する溶解度の単位「ｇ／１００ｍｌ」は、水１００ｍｌに対する当該溶媒の限界溶解量を示す。また、水と混和するか否かの判断も、溶解度と同様、２０℃において行うこととする。
【００３１】
本明細書において、溶媒の種類を説明するために用いる用語の定義は、以下のとおりである。「プロトン性溶媒」は、その分子構造中に、プロトン供与性の官能基を有する溶媒である。プロトン供与性の官能基としては、カルボン酸基、アルコール性のヒドロキシル基などが挙げられる。「非プロトン性溶媒」は、その分子構造中に、プロトン供与性の官能基を有しない溶媒である。
【００３２】
「低誘電率」は、プロトン性溶媒については比誘電率が３０以下であることを意味する用語であり、非プロトン性溶媒については比誘電率が４０以下であることを意味する用語である。「高誘電率」は比誘電率が３０（プロトン性溶媒）または４０（非プロトン性溶媒）を超えることを意味する用語である。「極性」は、当該溶媒の水に対する溶解度が０．０５ｇ／１００ｍｌ以上であることを意味する用語であり、「非極性」は、同溶解度が０．０５ｇ／１００ｍｌ未満であることを意味する用語である。「水系」は、当該溶媒が、水と混和する、言い換えれば水に対する溶解度が無限大（∞）であって水と任意の比率で混じり合うことを意味する用語であり、「非水系」は、当該溶媒の水に対する溶解度が有限値をとることを意味する用語である。したがって、例えば「水系」である有機溶媒は、特に断らなくても「極性」有機溶媒である。
【００３３】
まず、タンパク質担体の製造方法において、タンパク質担体の前駆体である金属酸化物コロイド粒子の凝集体が生成するメカニズムを説明する。
【００３４】
周知のとおり、コロイド粒子は、その帯電によって互いに反発することによって、媒体中において安定した分散状態を維持している。コロイド粒子の間に作用する電気的反発力は、その間に介在する分散媒（本発明では液相媒体）の誘電率が小さくなればそれだけ小さくなる。本発明では、誘電率の低下に伴う反発力の減少によりコロイド粒子が凝集する現象が利用される。
【００３５】
水を分散媒とする金属酸化物ゾルを液体中に供給すると、そのゾルとゾルを受け入れた液体との界面では液相の相互拡散が始まる。液体に水と相互拡散する溶媒が含まれていて、この溶媒の比誘電率が水の比誘電率（約８０）よりも小さい場合、この溶媒と水との相互拡散により、金属酸化物コロイド粒子の間に存在する液相媒体の誘電率が低下し、これに伴ってコロイド粒子間の電気的反発力も低下する。この反発力の低下により、コロイド粒子間に作用する普遍的な引力に基づく凝集力が反発力を上回る状態に至れば、コロイド粒子は凝集する。この場合、コロイド粒子は、溶媒と水とが相互に拡散する領域（以下、この領域を「界面」と呼ぶことがある）において凝集し、コロイド粒子の凝集体として成長していく。そして、この凝集体の質量が分散を許容する重さを超えると、凝集体は界面から脱落して沈降する。
【００３６】
凝集の形態によっては、凝集体が沈降した後、その部位において新たな界面が形成される。この場合は、新たな界面で再びコロイド粒子が凝集して沈降し、次々と凝集体が生成しては沈降していく。
【００３７】
上述の機構によりコロイド粒子の凝集体を生成させるためには、プロトン性溶媒については比誘電率が３０以下の溶媒、非プロトン性溶媒については比誘電率が４０以下の溶媒を用いるべきである。比誘電率が上記の上限を上回る溶媒は、コロイド粒子が凝集する程度にはコロイド粒子間の反発力を低下させることができない。
【００３８】
プロトン性溶媒について例を挙げると、水を分散媒とする金属酸化物ゾルをエタノール（比誘電率２４）または２−エトキシエタノール（＝エチレングリコールモノエチルエーテル；同３０）に滴下すると、コロイド粒子の凝集体が生成する。これに対し、上記ゾルをメタノール（同３３）、エチレングリコール（同３９）またはプロピレングリコール（同３２）に滴下してもコロイド粒子は分散状態を維持したままとなる。非プロトン性溶媒について例を挙げると、上記金属酸化物ゾルをアセトン（比誘電率２１）またはアセトニトリル（同３８）に滴下すると、コロイド粒子の凝集体が生成する。これに対し、上記ゾルをジメチルスルホキシド（同４９）に滴下してもコロイド粒子は分散状態を維持したままとなる。
【００３９】
プロトン性溶媒の比誘電率の上限よりも非プロトン性溶媒の比誘電率の上限が高い理由は、プロトン性溶媒では比誘電率が大きくなるに従い遊離プロトンが増加し、これによるコロイド粒子の電荷二重層安定化傾向が強くなることにあると考えられる。
【００４０】
比誘電率が十分に低くても、水との親和性が極度に低い溶媒は、水と相互拡散してコロイド粒子間の反発力を低下させることができない。したがって、水への溶解度が０．０５ｇ／１００ｍｌ以上である溶媒を用いるべきである。例えば、水を分散媒とする金属酸化物ゾルを１−オクタノール（水への溶解度０．０５４ｇ／１００ｍｌ）に滴下すると、コロイド粒子の凝集体が生成する。これに対し、比誘電率が２程度であって十分に低いものの水にほとんど溶解しない溶媒であるヘキサン（水への溶解度０．００１ｇ／１００ｍｌ）に上記ゾルを滴下しても、コロイド粒子の凝集体は生成しない。本明細書において非極性溶媒に分類される程度に水にほとんど溶解しない溶媒は、極性を有する官能基を有していてもコロイド粒子を凝集させることはできない。このような非極性溶媒としてはミリスチン酸イソプロピルが挙げられる。
【００４１】
後述するとおり、得られる凝集体の形状は、用いる溶媒の水への溶解度に影響を受ける。水への溶解度が２ｇ／１００ｍｌ以上の溶媒を用いると、凝集体が、球状、ファイバー状またはフレーク状になる傾向が強まり、凝集体から得られる粒体であるタンパク質担体が好ましい形状で形成される。一方、水への溶解度が２ｇ／１００ｍｌ未満の溶媒を用いると、凝集体が、非球状の塊状となる傾向が支配的となる。したがって、使用する溶媒の水に対する溶解度は、２ｇ／１００ｍｌ以上が好ましい。
【００４２】
酸性の金属酸化物ゾルは、一般に、水和エネルギーの寄与によりコロイド粒子が互いに接近できず、安定化している。このため、酸性の金属酸化物ゾルにおいては、溶媒の相互拡散に伴う電気的反発力の低下によるコロイド粒子の凝集は生じがたい。これに対し、アルカリ性の金属酸化物ゾルでは、水和エネルギーの影響は小さく、コロイド粒子の表面における−ＭＯ-Ｈ+および−ＭＯ-Ｒ+（ただし、ＭはＳｉ、Ｔｉ、Ｚｒなどの金属元素、ＲはＮａに代表されるアルカリ金属元素）により示される電気二重層によってコロイド粒子が安定化している。このため、アルカリ性の金属酸化物ゾルでは、低誘電率極性溶媒と水との相互拡散によってコロイド粒子間の反発力が十分に低下することとなり、コロイド粒子が凝集する。厳密に言うと、分散媒の誘電率の低下によってコロイド粒子が凝集するゾルはアルカリ性である必要はなく、そのｐＨが７以上であればよい。
【００４３】
以下、タンパク質担体及びタンパク質−担体複合体を製造する各ステップの実施形態について説明する。
【００４４】
金属酸化物ゾルは、周知のとおり、金属アルコキシドを加水分解して調製することができるが、既に調製された市販品を用いてもよい。ただし、いずれの場合であっても、ｐＨが７以上のゾルを準備する必要がある。ゾルのｐＨは、金属酸化物の種類などによって好適な範囲を適宜選択すればよいが、例えば７．５以上、特に８〜１２が好ましい。金属酸化物ゾルを構成する金属酸化物コロイド粒子は、例えば、シリコン酸化物、チタン酸化物、ジルコニウム酸化物、アルミニウム酸化物、タンタル酸化物、ニオブ酸化物、セリウム酸化物およびスズ酸化物から選ばれる少なくとも１種のコロイド粒子である。
【００４５】
上述のとおり、水との相互拡散によりコロイド粒子の凝集をもたらす溶媒は低誘電率極性溶媒である。粒体の形状は低誘電率極性溶媒の種類に依存するため、低誘電率極性溶媒の種類は形成するべき粒体の形状に応じて選択するべきである。ゾルの液滴の投入などによりゾルが供給されるべき液体は、低誘電率極性溶媒のみによって構成されていてもよいが、これに限らず、比誘電率および／または水への溶解度が上述の条件を満たさない溶媒を含んでいてもよい。低誘電率極性溶媒の比率が２０質量％程度である液体に連続してゾルを供給しても（言い換えれば、ゾルの供給に伴う質量増により上記溶媒の比率が２０質量％を下回った状態においても）、コロイド粒子の凝集体を得ることは十分に可能である。しかし、ゾルが供給される液体における低誘電率極性溶媒の比率が低いと凝集することなく分散したままのコロイド粒子の比率が高くなって収率が低下することがある。ゾルが供給される液体における低誘電率極性溶媒の比率は、１５質量％以上、さらには２０質量％以上、特に３０質量％以上が好ましく、５０質量％以上を占めてもよい。この液体が２種類以上の低誘電率極性溶媒を含んでいてよいことは言うまでもない。
【００４６】
実用的な低誘電率極性溶媒は低誘電率極性有機溶媒である。低誘電率極性有機溶媒は、アルコール、アルデヒド、カルボン酸、カルボン酸エステル、エーテル、ケトン、アミン、アミド、ニトリル、複素環式化合物およびハロゲン化炭化水素から選ばれる少なくとも１種に分類される有機溶媒であることが好ましい。例えば、上述の２−エトキシエタノールは、アルコールに分類されるとともにエーテルでもある。
【００４７】
液体への金属酸化物ゾルの供給は、投入されたゾルが液体により囲まれた液滴として存在するように実施することが好ましい。これを実現するための最も確実な手段は、ゾルを液滴として投入する、言い換えれば滴下することである。製造効率を考慮して、単位時間あたりのゾルの投入量を大きくする必要があれば、２以上の滴下装置を用いて液体にゾルを滴下してもよい。本発明の好ましい実施形態では、容器に保持された液体に２以上の滴下装置から、好ましくは並行して、ゾルが滴下される。
【００４８】
ただし、液体の攪拌などにより供給されたゾルに応力を加えれば、チューブのような導入管からゾルを液体中に供給することによっても、供給されたゾルを液体中に分散させ、液滴として存在させることは可能である。この場合、導入管の排出口の内径は、５ｍｍ以下、好ましくは２ｍｍ以下、例えば０．１ｍｍ〜１ｍｍに制限することが好ましい。本発明の好ましい実施形態では、液体が攪拌されながら、ゾルが導入管を経由して当該液体中に供給され、ゾルが液体中において液滴として分散する。
【００４９】
液体の量に対してゾルの供給量が過剰となると、コロイド粒子が凝集しにくくなって凝集体の収率が低下することがある。したがって、質量基準により表示して、ゾルの供給量の総量の適切な範囲は、液体の量の２０％以下、好ましくは１０％以下、より好ましくは５％以下である。
【００５０】
低誘電率極性溶媒を含む液体への金属酸化物ゾルの供給は、この液体を攪拌しながら実施することが好ましい。攪拌により、ゾルが液滴として分散しやすくなり、水と溶媒との界面からの金属酸化物コロイド粒子の凝集体の脱離が促進されるためである。また、溶媒を攪拌しながらゾルを投入すると、攪拌しない場合と比較して、液滴は、より長時間、液相に囲まれた状態で存在することになり、同種の形状を有する粒体がより多く得られる。液滴は、例えば容器に保持された液体にその上方から液滴として投入され、また例えば容器に保持された液体中に排出口が位置するように配置された導入管を経由して投入されたゾルが分散して生成し、通常はコロイド粒子の凝集体を生成しながら液体中を沈降して容器の底部に達する。容器の底部に達した液滴からも凝集体は生成するが、この液滴を囲む界面では、凝集体の生成とその脱落による新たな界面の生成とのサイクルが循環しにくい。また、容器の底部に接した液滴から形成される凝集体は厚くなる傾向がある。このため、フレーク状の凝集体を生成していた液滴からでも、底部に達してからは、バルク化した凝集体が生じることがある。
【００５１】
液体の攪拌は、凝集体の形状にも影響を与える。ファイバー状およびフレーク状の粒体であるタンパク質担体を得るためには、金属酸化物コロイド粒子の凝集を促進するべきである。したがって、これらの形状を得るべきときには特に、液体を攪拌しながら金属酸化物ゾルを供給することが好ましい。液体の攪拌は、マグネティックスターラー、回転軸となるシャフトと攪拌翼とを備えた攪拌器など公知の攪拌機を用いて行うとよい。
【００５２】
液滴の大きさもまた、粒体の形状および大きさに影響を与える。一般に、好ましい液滴の大きさは、１つ当たり５ｍｇ〜１０００ｍｇである。液滴が小さすぎると、凝集体の大きさが制限される。したがって、特にフレーク状、ファイバー状などの粒体を得るためにコロイド粒子を凝集させるべき場合には、液体中に存在する液滴の大きさは、１つ当たり１０ｍｇ以上とすることが好ましい。ただし、液滴が大きすぎると、凝集体の形状のバラツキが大きくなることがある。したがって、液滴の大きさは、１つあたり５００ｍｇ以下が好ましい。特に好ましい液滴の大きさは、１つ当たり１０ｍｇ〜３００ｍｇである。
【００５３】
なお、液滴の投入は、スポイド、ピペットその他公知の滴下装置を用いて行えばよく、量産に際しては各種ディスペンサを用いて液滴を連続して投入することとすればよい。市販のスポイドやピペットは大きな液滴の形成に適していないため、これらを用いる場合にはその先端を適宜加工するとよい。液滴は、これらの滴下装置を用いて連続して投入していけばよく、複数の滴下装置から並行して投入してもよい。
【００５４】
生成した凝集体はそのままでは水に溶かすことができる。これは凝集体を構成する金属酸化物コロイド粒子の結着強度が十分に高くないためである。したがって、凝集体を水に不溶としてタンパク質担体に適したものとするためには、凝集体を乾燥、加熱および加圧から選ばれる少なくとも一つにより処理し、金属酸化物コロイド粒子相互の結着強度を高めるとよい。この処理によって金属酸化物コロイド粒子相互の結着は不可逆的に進行し、凝集体は水に不溶な粒体であるタンパク質担体になる。
【００５５】
凝集体を不溶とするための処理としては乾燥が便利である。凝集体は、乾燥工程によりキセロゲル化（以下、単に「ゲル化」という）して水に不溶となる。乾燥に先立って、凝集体は液体から分離される。ただし、凝集体を含む液体をそのまま保管し、必要になった段階で適宜分離および乾燥を実施してもよい。この場合は、生成した凝集体を含む液体から、凝集体が液体の残部に残るように、液体の一部を除去する工程を実施し、凝集体の含有率を高めた上で凝集体を含む液体を保管するとよい。凝集体を加熱する場合などにも、液体における凝集体の含有率を予め高めておくと処理効率が向上する。容器に保持した液体にゾルを供給すると、生成した凝集体は、容器の底部に沈降して白濁したスラリーを形成する。容器に凝集体が残るように、容器の上部から液体を除去すると、凝集体を容器に残したまま液体を分離できる。除去した液体は、金属酸化物コロイド粒子の凝集のために再利用するとよい。
【００５６】
なお、除去した液体は、そのままコロイド粒子の凝集のために再利用してもよいが、含有水分率が高くなるとコロイド粒子の凝集が起こり難くなる場合がある。したがって、蒸留、分離膜による脱水、凍結濃縮による脱水など公知の溶媒再生方法によって液体中の水分の含有率を低下させ、好ましくは液体から水分を除去し、その後にその液体を再利用するとよい。
【００５７】
凝集体の不溶化処理は加熱および／または加圧により実施することもできる。具体的には、凝集体を含む液体をそのまま、または別の溶媒（加熱処理用溶媒）と置換した後、加熱および／または加圧することにより、金属酸化物コロイド粒子相互の結着を不可逆的に進行させるとよい。
【００５８】
この場合、加熱温度は、好ましくは５０℃以上、より好ましくは７０℃以上、例えば７８〜８５℃である。加熱は液体の沸点以下で実施することになるため、液体を構成する溶媒の沸点が５０℃以下である程度に低い場合には特に、液体をより沸点の高い、例えば７０℃以上の、加熱処理用溶媒で置換してから加熱を実施することが好ましい。加熱時間は、特に限定されず、適用する温度などに応じて適宜設定すればよいが、例えば０．１〜１２時間、特に２〜８時間である。凝集体を含む液体を８２℃、８時間の条件で加熱処理したところ、処理前には水に投入し攪拌すると崩壊する程度に脆かった凝集体が、処理後には水に投入して攪拌しても形状を保持する粒体となった。このようにして、粒体であるタンパク質担体が得られる。
【００５９】
加圧処理の圧力は、好ましくは０．１１ＭＰａ以上、より好ましくは０．１２ＭＰａ以上、特に好ましくは０．１３ＭＰａ以上、例えば０．１２〜０．２０ＭＰａである。加圧処理は、例えば、凝集体を含む液体を容器に保持し、液体に接する雰囲気を上記程度の圧力とすることにより行うことができる。加圧時間は、特に限定されず、適用する圧力などに応じて適宜設定すればよいが、例えば０．２〜１０時間、特に１〜５時間である。凝集体の脆さを考慮し、加圧処理は静圧により行うことが好ましい。凝集体を含む液体をチャンバー内に保持し、０．１５ＭＰａの圧力に３時間曝したところ、処理前には水に投入し攪拌すると崩壊する程度に脆かった凝集体が、処理後には水に投入して攪拌しても形状を保持する粒体となった。加熱処理および加圧処理は、同時に、あるいは順次、実施してもよい。このようにして得られた粒体もタンパク質担体である。
【００６０】
乾燥により凝集体をゲル化させ、さらに焼成して得た粒体は、タンパク質担体として優れた機械的強度を有する。
【００６１】
乾燥処理によりゲル化させた金属酸化物粒体を得るためには、液体から凝集体を分離することが必要となる。この分離工程は、固液分離操作により、生成した凝集体を含む液体から凝集体を分離することにより実施するとよい。固液分離操作は、濾過、遠心分離、デカンテーションなど公知の手法を用いて行うことができる。分離工程を実施して液体から分離した状態で、あるいはさらに次の洗浄工程を実施した上で、凝集体を保管しておいても構わない。上述したように、分離した液体は、必要に応じて水の含有率を低下させた上で、金属コロイド粒子の凝集に再利用することができる。本発明の製造方法は、その好ましい実施形態において、液体の残部から分離した液体の一部、または凝集体から分離した液体を、コロイド粒子を凝集させるための液体の少なくとも一部として再利用する工程をさらに含む。
【００６２】
分離した凝集体は、乾燥に先立ち、洗浄して凝集体に付着した液体を洗い流すことが好ましい。この洗浄工程は、沸点が１００℃を超える溶媒を用いた場合に、その溶媒よりも低い沸点を有する洗浄剤を用いて実施することが推奨される。ただし、水を用いて凝集体を洗うと凝集体が溶けてしまうことがあるので注意が必要である。洗浄剤としては、低誘電率極性有機溶媒、特にエタノールおよびアセトンに代表される低分子量で沸点が１００℃未満の低誘電率極性有機溶媒が適している。
【００６３】
その後、凝集体を乾燥させる。この乾燥工程における乾燥条件は、特に制限されず、自然乾燥（常温における風乾）に任せてもよいが、除去するべき液体の種類に応じた温度、例えば４０〜２５０℃、特に５０〜２００℃の雰囲気中で実施するとよい。乾燥により、凝集体はゲル化して水に不溶となる。
【００６４】
乾燥後、ゲル化した粒体は、必要に応じ、焼成される。焼成により、タンパク質担体の強度の向上を図ることができる。焼成は、例えば３００〜１５００℃、特に４００〜１２００℃の雰囲気中で実施することが好ましい。すなわち、本発明の製造方法は、その好ましい実施形態において、粒体を３００℃以上で焼成する工程をさらに含む。この焼成工程は、上述の乾燥工程と一連の工程として実施してもよい。すなわち、例えば、粒体を焼成するための昇温過程において凝集体を乾燥させ、乾燥により得られた粒体をそのまま焼成しても構わない。このようにして得られた粒体もタンパク質担体である。
【００６５】
本発明の方法において金属酸化物の供給源となるｐＨ７以上の金属酸化物ゾルの市販品には、例えばナトリウムイオン（Ｎａ+）等のアルカリイオンを含む。そして、このような市販品を用いると、得られる粒体はこのようなアルカリイオンを含むことによってｐＨが７以上を示す。酵素等のタンパク質が関与する反応においては、反応に適した最適ｐＨが存在する。そのため、タンパク質担体が示すｐＨは最適ｐＨに近い方が望ましい。従って、必要に応じて、上述の粒体は、例えば塩酸などの酸を用いて粒体のｐＨが調整される。このｐＨの調整は、イオン交換水に上述の粒体を浸し、これを攪拌しながら例えば所定濃度の塩酸を滴下することにより行う。この期間において粒体を浸したイオン交換水のｐＨを測定しながら目的のｐＨとなるまで塩酸を滴下する。粒体を浸したイオン交換水のｐＨが目的のｐＨに達したら塩酸の滴下を停止する。さらに所定期間（例えば、１時間）だけ攪拌を続けて、粒体を浸したイオン交換水のｐＨに変動がないか確認してもよい。イオン交換水に浸された粒体は、例えば吸引ろ過等の固液分離操作により分離される。さらに、必要な洗浄が行われた後、例えば８０℃〜１８０℃の雰囲気で乾燥処理が施され、タンパク質担体としての粒体が得られる。
【００６６】
タンパク質が、上述のようにして得られた粒体であるタンパク質担体に固定される。酵素を例に、タンパク質の固定方法について説明する。まず、固定する酵素の最適ｐＨ付近のｐＨを示す緩衝液に酵素を溶解させ所望の濃度の酵素溶液を調整する。この酵素溶液及びタンパク質担体を共存させた状態で攪拌することにより、酵素をタンパク質担体に固定する。例えば、マイクロテストチューブにタンパク質担体及び酵素溶液を加えてマグネティックスターラーを用いて撹拌することにより、酵素の固定が行われる。これにより、タンパク質担体に酵素等のタンパク質が固定された、タンパク質−担体複合体を得ることができる。酵素以外のタンパク質も、ｐＨや温度が適宜調整されたタンパク質溶液とタンパク質担体を混合及び攪拌することにより、タンパク質担体に固定される。
【００６７】
上述したとおり、形成されるタンパク質担体の形状は、低誘電率極性溶媒の種類に影響を受ける。例えば、フレーク状のタンパク質担体の形成には、水系低誘電率有機溶媒の使用が適している。本発明の好ましい一形態では、用いる低誘電率極性溶媒の少なくとも一部が水系低誘電率有機溶媒（以下、「有機溶媒Ａ」ということがある）であり、得られる粒体の少なくとも一部がフレーク状の粒体となる。この場合、低誘電率極性有機溶媒の５０質量％以上、さらには７０質量％以上、特に９０質量％以上が有機溶媒Ａであることが好ましい。有機溶媒Ａの比率が高い溶媒を用いることにより、得られるタンパク質担体を実質的にすべて（例えば９５質量％以上）をフレーク状のタンパク質担体とすることも可能である。
【００６８】
なお、金属酸化物ゾルを供給する液体の攪拌は、フレーク状のタンパク質担体の形成に必須ではないが、液体の攪拌は、水と有機溶媒とが相互に拡散する界面を引き延ばし、この界面においてコロイド粒子が凝集してその形状がフレーク状となることに寄与する。
【００６９】
球状のタンパク質担体の製造には、非水系低誘電率極性有機溶媒の使用が適している。本発明の一形態では、用いる低誘電率極性溶媒の少なくとも一部が非水系低誘電率極性有機溶媒（以下、「有機溶媒Ｂ１」ということがある）であり、得られるタンパク質担体の少なくとも一部が球状の粒体となる。この場合、低誘電率有機溶媒の５０質量％以上、さらには７０質量％以上、特に９０質量％以上が有機溶媒Ｂ１であることが好ましい。有機溶媒Ｂ１の比率が高い溶媒を用いることにより、得られるタンパク質担体の実質的にすべて(例えば９５質量％以上)を球状の粒体とすることも可能である。有機溶媒Ｂ１としては、水への溶解度が５０ｇ／１００ｍｌ以下、特に３０ｇ／１００ｍｌ以下、とりわけ１０ｇ／１００ｍｌ未満、例えば２ｇ／１００ｍｌ以上１０ｇ／１００ｍｌ未満である溶媒を用いるとよい。この方法によれば、粒径が１μｍ以上、特に５μｍ以上の、さらには１０μｍを超える、場合によっては１５μｍを超える、球状のタンパク質担体を量産することもできる。
【００７０】
ファイバー状の粒体であるタンパク質担体の製造には、２種以上の有機溶媒を含む液体の使用が適している。本発明の一形態では、低誘電率極性溶媒の少なくとも一部が水系低誘電率極性有機溶媒（有機溶媒Ａ）であるとともに、金属酸化物ゾルが供給される液体が水と混和しない有機溶媒(以下、「有機溶媒Ｂ」ということがある)を含み、得られる粒体の少なくとも一部がファイバー状の粒体となる。有機溶媒Ｂは、非水系低誘電率極性有機溶媒（有機溶媒Ｂ１）であっても、その他の非水系有機溶媒、例えばヘキサンのような非水系低誘電率非極性有機溶媒（以下、「有機溶媒Ｂ２」ということがある）であってもよい。すなわち、ファイバー状の粒体であるタンパク質担体を製造する本発明の一形態では、ゾルが供給される液体が、低誘電率極性溶媒として有機溶媒Ａおよび有機溶媒Ｂ１を含んでいてもよく、低誘電率極性溶媒として有機溶媒Ａを含むとともに低誘電率極性溶媒には相当しない有機溶媒Ｂ２を含んでいてもよい。また、金属酸化物ゾルが供給される液体として、有機溶媒Ａと有機溶媒Ｂ１および／または有機溶媒Ｂ２とからなる混合溶媒を用いることにより、ファイバー状の粒体であるタンパク質担体を得ることとしても構わない。この場合、有機溶媒Ｂ１としては、水への溶解度が５０ｇ／１００ｍｌ以下、特に３０ｇ／１００ｍｌ以下である溶媒を用いるとよい。
【００７１】
ファイバー状の粒体は、球状などの塊状および／またはフレーク状の粒体とともに生成することが多い。生成する粒体に占めるファイバー状の粒体の比率を上げるためには、有機溶媒Ａと有機溶媒Ｂとの比率を好ましい範囲に制御することが望ましい。ファイバー状の粒体であるタンパク質担体に適した有機溶媒Ａと有機溶媒Ｂとの比率は、溶媒の種類などによって大きく相違するため、一律に記述することは難しいが、質量比により表示して、概ね５：９５〜９５：５、多くの場合１０：９０〜９０：１０の範囲内にある。
【００７２】
有機溶媒Ａに対する有機溶媒Ｂの比がファイバー状の粒体が形成される範囲の比よりも低い場合、得られるタンパク質担体は、通常、フレーク状となる。有機溶媒Ｂの比が、上記範囲に近づくと、表面に皺のような峰部が形成されたフレーク（皺のあるフレーク）が得られることがある。この皺は、有機溶媒Ｂの存在により、コロイド粒子の凝集速度が局所的に相違したことにより形成されたと考えられる。
【００７３】
有機溶媒Ａに対する有機溶媒Ｂの比がファイバー状の粒体が形成される範囲内の低い領域にある場合、太いファイバーが得られることがある。この粒体は、フレーク状の凝集体のエッジおよびフレーク状の凝集体の表面上で発達した峰部が、表面張力の影響を受けて丸まり、凝集体から分離することにより生成したと考えられる。太いファイバー状の粒体には、凝集体自体が丸まって形成されたと考えられるものが混じることもある。太いファイバー状の粒体は、その形成機構に由来して、その長手方向の形状が歪であることが多い。典型的には、太いファイバー状の粒体の径は５μｍ〜１００μｍ、長さは２０μｍ〜２０００μｍである。
【００７４】
有機溶媒Ａに対する有機溶媒Ｂの比がファイバー状の粒体の形成について適切な範囲内であると、細いファイバー状の粒体が得られる。細いファイバー状の粒体の先端には、変形した球状の微粒子が付着していることがある。この微粒子は、この粒体が太いファイバー状の粒体とは異なるメカニズムの下で形成されたことを示唆している。
【００７５】
細いファイバー状の粒体は、攪拌により液相中で糸状に引き延ばされたゾルの微小液滴に、その周囲から有機溶媒Ａが拡散して形成されたと考えられる。ゾルの液滴に拡散する有機溶媒Ａの量が限られると、コロイド粒子が凝集して沈殿する大きさに成長する前に、粘度が上昇した液滴が、細く引き延ばされると推察される。ファイバーの先端の微粒子は、粘度が高くなりすぎて引き延ばされることなく残った液滴の一部である。典型的には、細いファイバー状の粒体の径は０．５μｍ以上５μｍ未満、長さは１０μｍ〜２０００μｍである。
【００７６】
なお、ファイバー状の粒体の生成に適切な液体を用いた場合であっても、その液体の攪拌を行うことなくゾルの液滴を投入すると、ファイバー状の粒体の生成はごく限られた量となる。ファイバー状の粒体を得るためには、液体を攪拌しながら金属酸化物ゾルの液滴を投入することが好ましい。
【００７７】
有機溶媒Ａに対する有機溶媒Ｂの比がファイバー状の粒体が形成される範囲の比よりも高い場合、得られる粒体は、球状となることが多い。この粒体は、コロイド粒子の凝集がさらに制限されてゾルの粘度の上昇が緩慢になり、糸状に引き延ばされることなくその形状をほぼ保ったまま生成したと考えられる。コロイド粒子の凝集速度が極めて遅くなると、液滴が容器の壁面に衝突したため変形したり、他の液滴と合体したり、凝集途中で破壊されたりするために、非球状の粒体が生成することがある。球状または非球状である塊状の粒体は、中実の場合もあれば中空の場合もある。
【００７８】
１種類の低誘電率極性有機溶媒を用いることにより、ファイバー状の粒体であるタンパク質担体を得ることも可能である。ファイバー状の粒体の生成に適した低誘電率極性有機溶媒が備えるべき特性は、金属酸化物ゾルの種類などによってやや相違するが、一般には、以下の３つのグループＦ１〜Ｆ３に属する低誘電率極性有機溶媒がファイバー状の粒体の生成に適していると考えられる。
【００７９】
第１は、水に対する溶解度が１０ｇ／１００ｍｌ〜３０ｇ／１００ｍｌ、特に１０ｇ／１００ｍｌ〜２０ｇ／１００ｍｌであるプロトン性の低誘電率極性有機溶媒Ｆ１である。溶媒Ｆ１は、例えば、２−ブタノール（水に対する溶解度１２．５ｇ／１００ｍｌ、分子量７４）、２−ブテン−１−オール（１６．６ｇ／１００ｍｌ、７２）などの、水に対する溶解度が上記範囲内であって、好ましくは分子量が５０以上８５以下、特に６０以上８０以下の範囲にある、１価のアルコールである。これに対し、１価のアルコールではあるものの水への溶解度がやや低い１−ブタノール（水に対する溶解度７．８ｇ／１００ｍｌ）、および適切な水の溶解度を有するものの非プロトン性溶媒であるアセチルアセトン（１６ｇ／１００ｍｌ）は、単独使用によりファイバー状の粒体を生成する溶媒としては不適である。
【００８０】
第２は、水と混和するとともに、粘性率が１．３〜３ｍＰａ・ｓであって、分子量１００以上、特に１００以上２００以下の低誘電率極性有機溶媒Ｆ２である。溶媒Ｆ２は、好ましくは、ジエチレングリコールジエチルエーテル（溶解度∞、粘性率１．４ｍＰａｓ、分子量１６２）、プロピレングリコールモノプロピルエーテル（∞、２．８ｍＰａｓ、１１８）、エチレングリコールモノイソブチルエーテル（∞、２．９ｍＰａｓ、１１８）などのグリコールエーテル、特にエチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコールまたはトリプロピレングリコールのモノエーテルまたはジエーテル、とりわけ炭素数１〜４（好ましくは炭素数２〜４）のアルキル基またはアルケニル基とのモノ（ジ）エーテルである。これに対し、粘性率が高い２−ブトキシエタノール（＝エチレングリコールモノブチルエーテル、溶解度∞、粘性率３．２ｍＰａｓ、分子量１１８）、および分子量が小さい２−エトキシエタノール（＝エチレングリコールモノエチルエーテル、∞、２．１ｍＰａｓ、９０）は、ファイバー状の粒体を生成する溶媒としては不適である。
【００８１】
第３は、グループＦ１およびＦ２に属さないその他の低誘電率極性有機溶媒Ｆ３である。溶媒Ｆ３には、２−エチル−１，３−ヘキサンジオールのような低い溶解度と高い粘性率とを有する多価アルコール、およびジエチレングリコールモノヘキシルエーテルのような難溶性のグリコールエーテルが含まれる。
【００８２】
以上のグループＦ１〜Ｆ３のいずれかに属する溶媒を用いると、有機溶媒Ａと有機溶媒Ｂとを含む液体を用いたときと同様、ファイバーの生成に適した条件が整うと考えられる。この理由の詳細は不明であるが、ファイバー状の粒体が生成するためには、水に対する溶解度や比誘電率とともに、溶媒の粘性率および溶媒の分子量も考慮するべき因子の一部となるようである。粘性率はゾルの液滴の表面張力がその液滴の形状に及ぼす影響の程度との関連を通じて、分子量は水に対する溶媒の拡散速度との関連を通じて、それぞれ生成する粒体の形状を決定する要因となっている可能性がある。
【００８３】
上記に例示したとおり、ファイバー状の粒体であるタンパク質担体を得るためには、低誘電率極性溶媒が、２−ブタノール、２−ブテン−１−オール、ジエチレングリコールジエチルエーテル、プロピレングリコールモノプロピルエーテル、エチレングリコールモノイソブチルエーテル、２−エチル−１，３−ヘキサンジオールおよびジエチレングリコールモノヘキシルエーテルから選ばれる少なくとも１種であることが好ましい。
【００８４】
本発明による方法では、粒体であるタンパク質担体の基本的な形状が液相中において定まる。本発明による方法は、薄いフレーク状の粒体であるタンパク質担体の製造に適している。特に、水と混和するとともに、プロトン性溶媒については比誘電率が３０を超え、非プロトン性溶媒については比誘電率が４０を超える水系高誘電率有機溶媒（有機溶媒α）を予め混合した金属酸化物ゾルを用いる方法は、薄いフレーク状の粒体であるタンパク質担体の量産に適している。金属酸化物ゾルに混合された有機溶媒αは、液滴の界面における水と有機溶媒との相互拡散を制御し、この界面における誘電率の低下が狭い領域で生じることに寄与していると考えられる。
【００８５】
水系高誘電率極性有機溶媒（有機溶媒α）としては、炭素数が４以下の二価以上のアルコール、好ましくはジオール類またはトリオール類が好ましい。有機溶媒αとしては、具体的には、エチレングリコール（比誘電率３９）、プロピレングリコール（同３２）、ジエチレングリコール（同３２）、およびグリセリン（同４７）から選ばれる少なくとも１種が好ましい。
【００８６】
金属酸化物ゾルと有機溶媒αとの混合比は、質量比により表示して、９５：５〜５０：５０、特に９０：１０〜７０：３０が好ましい。
【００８７】
有機溶媒αをさらに含む金属酸化物ゾルを使用すれば、有機溶媒αを用いない場合よりもフレーク状のタンパク質担体の厚みが減少する。この方法は、厚みが０．５μｍ以下、特に０．４μｍ以下、例えば０．１μｍ〜０．４μｍのフレーク状のタンパク質担体の量産に適している。
【００８８】
本発明により得られる粒体であるタンパク質担体は、通常、その粒体における最大寸法が２ｍｍ以下の範囲となる。
【００８９】
本発明による方法は、窒素吸着等温線からＢＪＨ法によって得られる細孔径分布の半値幅が１０〜３０ｎｍであるメソポーラス構造を有するタンパク質担体の製造に適している。メソ孔を有するシリカ粒体（メソポーラスシリカ）の製造方法としては、界面活性剤のミセルを鋳型とするゾルゲル法が知られている。しかし、この方法では、均一な大きさの細孔径を有するメソポーラス構造が形成される傾向にあるため、細孔径分布の半値幅を上記のように大きくすることはできない。
【００９０】
本発明による方法は、平均細孔径が１０ｎｍ以上、あるいは、細孔径分布のピーク値に対応する細孔径が１０〜４０ｎｍであるメソ孔を有するメソポーラス構造のタンパク質担体の製造に適している。金属酸化物ゾルをそのまま乾燥させる手法、又は、基体上に塗布したゾルをゲル化させて引き剥がす手法を用いても、平均細孔径が１０ｎｍ以上、又は、細孔径分布のピーク値に対応する細孔径が１０〜４０ｎｍであるメソ孔を有するタンパク質担体は得られない。孔径が大きいメソ孔は、金属酸化物コロイド粒子が間隔を保持しながら液体中で凝集することにより形成されると考えられる。
【００９１】
本発明によれば、高い気孔率を有するタンパク質担体を製造することもできる。本発明によれば、３０％以上、好ましくは４０％以上、より好ましくは５０％以上、特に好ましくは６０％以上、例えば６０〜８０％の気孔率を有するタンパク質担体を得ることができる。
【００９２】
本発明により得ることができるタンパク質担体のＢＥＴ比表面積は、好ましくは５０〜５００ｍ2／ｇ、より好ましくは１００〜３００ｍ2／ｇ、特に好ましくは１００〜２５０ｍ2／ｇ、例えば１００〜２００ｍ2／ｇである。界面活性剤を用いる従来の製造方法では、細孔チャネルが導入されたメソポーラス構造となるため、得られるタンパク質担体の比表面積は５００ｍ2／ｇを大きく上回る。また、このタンパク質担体の細孔容積は、好ましくは０．１７ｃｍ3／ｇ以上、より好ましくは０．２５ｃｍ3／ｇ以上、特に好ましくは０．４３ｃｍ3／ｇ以上、とりわけ好ましくは０．５ｃｍ3／ｇ以上、例えば０．５〜０．９ｃｍ3／ｇである。このタンパク質担体の平均細孔径は、好ましくは１０〜４０ｎｍ、より好ましくは１０〜３０ｎｍ、特に好ましくは１５〜２５ｎｍである。
【実施例】
【００９３】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明する。なお、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００９４】
＜タンパク質担体の作製＞
（実施例１）
２−プロパノール５００ｍｌをビーカーに保持し、これにアルカリ性のシリカゾル（日本化学工業製「シリカドール３０Ｓ」）を０．０２ｇずつ総量５０ｇ滴下した。シリカゾルを滴下する間、２−プロパノールは、マグネティックスターラー（回転数：８００ｒｐｍ）を用いて攪拌した。シリカドール３０Ｓは、水を分散媒とするｐＨ９．０〜１０．５のコロイダルシリカであり、含まれているコロイド粒子の粒子径は７〜１０ｎｍである。２−プロパノールは、プロトン性極性溶媒に属し、比誘電率は１８であり、水への溶解度は無限大である。この操作によって、滴下したシリカゾル中のコロイド粒子が溶媒中で凝集し、溶媒中にコロイド粒子がスラリー状に凝集した。
【００９５】
次いで、コロイド粒子がスラリー状に凝集した液から、遠心分離により、スラリーを分離した。このスラリーを２−プロパノールで洗浄し、２−プロパノールをデカンテーションにより除去した。得られたコロイド粒子の凝集体を１５０℃の真空乾燥器内で乾燥させ、シリカの粉体（シリカ粒体の集合体）を得た。乾燥させたシリカの粉体を７００℃で５時間焼成し、約１４ｇの粒体を得た。
【００９６】
この粒体約１４ｇを、２００ｍｌのイオン交換水に入れ、撹拌しながら、６Ｎ（規定）塩酸を滴下した。この粒体の入ったイオン交換水のｐＨを測定しながら塩酸滴下を続け、ｐＨが５．５になったところで滴下を停止し、さらに約１時間撹拌した。その後、この粒体の入ったイオン交換水のｐＨに大きな変動が無いことを確認し、この粒体を吸引ろ過した。さらに、４００ｍｌのイオン交換水で３回洗浄し、２−プロパノールで洗浄し、１２０℃の真空乾燥器内で乾燥し、ナトリウムを除去したタンパク質担体約１３ｇを得た。
【００９７】
（実施例２）
実施例１のシリカの粉体の焼成を実施しなかったこと以外は、実施例１と同様にして実施例２のタンパク質担体を得た。
【００９８】
（実施例３）
実施例１のシリカの粉体の焼成の条件を６００℃で７時間に変更した以外は、実施例１と同様にして実施例３のタンパク質担体を得た。
【００９９】
＜細孔径分布測定＞
シリカ系メソ多孔体であるＨＭＳ（ｗｏｒｍｈｏｌｅ）（シグマアルドリッチ社製）を比較例１に係るタンパク質担体、同じくシリカ系メソ多孔体であるＭＣＭ−４１（ｈｅｘａｇｏｎａｌ）（シグマアルドリッチ社製）を比較例２に係るタンパク質担体として、実施例１〜３とともに、窒素吸着法による細孔分布測定を実施した。比較例１及び比較例２はともに界面活性剤のミセルを鋳型として作製されたメソポーラス材料である。細孔径分布は、気体吸着細孔分析装置（Ｑｕａｎｔａｃｈｒｏｍｅ社製：「ＮＯＶＡ１０００」）を用いて、窒素吸着等温線からＢＪＨ法によって得た。また同時に、細孔径分布からピーク値を定め、細孔径分布の半値幅を求めた。気孔率、細孔体積、ピーク値相当細孔径、平均細孔径及びＢＥＴ比表面積も併せて測定した。実施例１〜３の細孔径分布を図１〜図３に、比較例１の細孔径分布を図４に、比較例２の細孔径分布を図５に示す。また、実施例１〜３、比較例１及び比較例２の測定結果を表１に示す。
【０１００】
【表１】
2014014300.tif 000002
【０１０１】
表１及び図１〜図５に示す通り、比較例１の細孔径分布の半値幅が１．２４ｎｍ、比較例２の細孔径分布の半値幅が０．６３ｎｍであったのに対し、実施例１の細孔径分布の半値幅は１９．７ｎｍ、実施例２の細孔径分布の半値幅は１６．９ｎｍ、実施例３の細孔径分布の半値幅は２０．４ｎｍであった。これにより、実施例１〜３のタンパク質担体の細孔径分布がブロードであり、実施例１〜３のタンパク質担体は、細孔径が数ｎｍ〜数十ｎｍの範囲で広く分布したメソポーラス構造を有することが分かる。また、表１に示す通り、実施例１のＢＥＴ比表面積は、比較例１及び比較例２の比表面積より小さいことが分かる。
【０１０２】
＜形態観察＞
実施例１、比較例１及び比較例２について、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）（キーエンス社製、「ＶＥ−９８００」）及び微分干渉顕微鏡を用いた形態観察を行った。図６Ａ〜図８Ｂに、実施例１、比較例１及び比較例２のＳＥＭ写真及び微分干渉顕微鏡写真を示す。
【０１０３】
図６Ａに示す通り、実施例１のタンパク質担体は、厚みが１μｍ程度のフレーク状の形状であった。また、比較例１のタンパク質担体は、直径が３μｍ程度の球状の粒子であるが、図７Ａに示す通り、多くは二次粒子として存在していた。比較例２のタンパク質担体は、一部はフレーク状の粒体であるものの、多くは球状の粒体として存在していた。微分干渉顕微鏡の観察において、各タンパク質担体の懸濁液の観察試料を作製する際に、実施例１のタンパク質担体は容易に分散した。これに対し、比較例１及び比較例２のタンパク質担体はともに凝集しやすく、実施例１に比べて分散性が劣っていた。すなわち、タンパク質担体がフレーク状であると、溶液中での分散性に優れることが示唆された。従って、実施例１のタンパク質担体は、形状がフレーク状であることにより、タンパク質溶液における分散性に優れると考えられる。
【０１０４】
＜タンパク質−担体複合体の作製＞
（実施例４）
実施例１のタンパク質担体を５ｍｇ秤量し、マイクロテストチューブに入れた。分子量が１．４万、直径が約３．８ｎｍの酵素であるリゾチーム（和光純薬工業社製）をｐＨ７の緩衝液に１ｍｇ／ｍｌの濃度となるように溶解させ酵素溶液を作製した。この酵素溶液１ｍｌを回転子とともに、タンパク質担体の入ったマイクロテストチューブに加え、マグネティックスターラーを用いて撹拌しながら室温においてリゾチームを固定した。このようにして、実施例４に係るタンパク質−担体複合体を得た。
【０１０５】
（実施例５及び実施例６）
タンパク質を分子量５．２万、直径が約５ｎｍの酵素であるセルラーゼ（和光純薬工業社製）とし、緩衝液としてｐＨ５の緩衝液を用いた以外は、実施例４と同様にして、実施例５に係るタンパク質−担体複合体を得た。また、タンパク質を分子量２３万、直径が約９．２ｎｍの酵素であるカタラーゼ（和光純薬工業社製）とした以外は、実施例４と同様にして、実施例６に係るタンパク質−担体複合体を得た。
【０１０６】
（比較例３〜８）
比較例１のタンパク質担体を用いた以外は実施例４と同様にして、比較例３に係るタンパク質−担体複合体を得た。比較例２のタンパク質担体を用いた以外は実施例４と同様にして、比較例４に係るタンパク質−担体複合体を得た。比較例１のタンパク質担体を用いた以外は実施例５と同様にして、比較例５に係るタンパク質−担体複合体を得た。比較例２のタンパク質担体を用いた以外は実施例５と同様にして、比較例６に係るタンパク質−担体複合体を得た。比較例１のタンパク質担体を用いた以外は実施例６と同様にして、比較例７に係るタンパク質−担体複合体を得た。比較例２のタンパク質担体を用いた以外は実施例６と同様にして、比較例８に係るタンパク質−担体複合体を得た。
【０１０７】
＜タンパク質固定量測定＞
上述の、実施例４〜６及び比較例３〜８に係るタンパク質−担体複合体のタンパク質固定量を測定した。上述のタンパク質の固定処理を行ったマイクロテストチューブを遠心分離した上清の溶液の波長２８０ｎｍの吸光度と固定処理前の酵素溶液の波長２８０ｎｍの吸光度の差により、各実施例及び各比較例に係るタンパク質−担体複合体へのタンパク質への固定量を求めた。この結果を表２〜４に示す。
【０１０８】
【表２】
2014014300.tif 000003
【０１０９】
【表３】
2014014300.tif 000004
【０１１０】
【表４】
2014014300.tif 000005
【０１１１】
実施例１のタンパク質担体を用いて作製した実施例４〜６のタンパク質−担体複合体のリゾチーム、セルラーゼ及びカタラーゼ固定量は、比較例１又は比較例２のタンパク質担体を用いて作製した比較例３〜８のタンパク質−担体複合体のリゾチーム、セルラーゼ及びカタラーゼ固定量よりも高い値を示した。すなわち、実施例１に係るタンパク質担体は、その比表面積が比較例１及び比較例２に係るタンパク質担体の比表面積よりも小さいにもかかわらず、比較例１及び比較例２に係るタンパク質担体よりも多くのタンパク質を固定できることが示された。上記の通り、リゾチーム、セルラーゼ及びカタラーゼのそれぞれの分子量及び直径が異なっている。従って、実施例１のタンパク質担体は大きさの異なる複数種類のタンパク質のそれぞれをより多く固定できることが示された。これは、細孔径分布の半値幅が広く、大きさの異なる複数種類のタンパク質のそれぞれの固定に適した細孔をバランス良く有しているためと考えられる。また、実施例１のタンパク質担体はその多くがフレーク状である。これにより、球状で凝集しやすい比較例１及び比較例２のタンパク質担体と比較して、実施例１のタンパク質担体はタンパク質溶液中で分散しやすい。このため、実施例１の比表面積は比較例１及び比較例２より小さい比表面積であるにも関わらず、実施例１はタンパク質の高い固定量を示すと考えられる。
【０１１２】
＜タンパク質固定の安定性＞
実施例４〜６及び比較例３〜８のそれぞれについて、遠心分離した後にピペットで上清をとり除き固定処理の際と同じ緩衝液１ｍｌを添加し、マグネティックスターラーで１０分間撹拌する洗浄操作を行った。この洗浄操作を６回繰り返した。各回の洗浄操作の後に、上清中に含まれる酵素の量を波長２８０ｎｍの吸光度を測定することにより求めた。これにより、実施例４〜６及び比較例３〜８に残留する酵素量を求め、実施例１、比較例１及び比較例２の各タンパク質担体のタンパク質固定の安定性を比較した。結果を、図９〜図１１に示す。
【０１１３】
図９〜図１１に示す通り、洗浄回数１〜６回において、実施例１のタンパク質担体に残留する酵素量は、比較例１又は比較例２のタンパク質担体に残留する酵素量よりも高い値を示した。これにより、実施例１のタンパク質担体は、比較例１及び比較例２のタンパク質担体と比較して、再利用性に優れることが示唆された。
【０１１４】
＜球状のタンパク質担体の作製＞
（実施例７）
２−プロパノールに替えて、２−フェノキシエタノール（水への溶解度：２．５ｇ／１００ｍｌ、粘性率：３０．５ｍＰａ）を用いた以外は、実施例１と同様にして実施例７に係るタンパク質担体を作製した。得られたタンパク質担体の光学顕微鏡写真を図１２に示す。図１２に示す通り、得られたタンパク質担体は球状であった。
【０１１５】
＜ファイバー状のタンパク質担体の作製＞
（実施例８）
２−プロパノールに替えて、２−ブタノール（比誘電率１６、水への溶解度１２．５ｇ／１００ｍｌ）を用いた以外は、実施例８と同様にして実施例７に係るタンパク質担体を作製した。得られたタンパク質担体は、光学顕微鏡を用いて観察したところ、ファイバー状、球状及びフレーク状であった。また、ファイバー状のタンパク質担体が最も多く確認された。
【０１１６】
（実施例９）
２−ブトキシエタノール（比誘電率１０、水への溶解度無限大）７０質量％、フェノキシエタノール３０質量％の混合溶媒を用いた以外は、実施例１と同様にして実施例９に係るタンパク質担体を作製した。得られたタンパク質担体の光学顕微鏡写真を図１３Ａに、得られたタンパク質担体のＳＥＭ写真を図１３Ｂにそれぞれ示す。図１３Ａ及び図１３Ｂに示すように、得られたタンパク質担体は、フレーク状、球状及びファイバー状であった。
【０１１７】
例えば実施例７〜実施例９により得られた球状又はファイバー状のタンパク質担体にタンパク質を固定してタンパク質−担体複合体を作製し、これをカラムに充填して充填カラム式リアクターを構成することが考えられる。このような充填カラム式リアクターは圧力損失が小さいという利点を有すると考えられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１４】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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