(57)【要約】      （修正有）【課題】本発明は、黒色腫細胞のＷｎｔ／β‐ｃａｔｅｎｉｎシグナル経路を抑制するＷｎｔ／β‐ｃａｔｅｎｉｎシグナル経路抑制用ベンゾキノン系化合物、ならびに、それを用いた皮膚癌病状改善用医薬組成物およびサプリメントを提供する。【解決手段】Ｗｎｔ／β‐ｃａｔｅｎｉｎシグナル経路抑制用ベンゾキノン系化合物は、一般式（１）で表される構造又は一般式（１）で表される化合物の還元型の構造を有する。2014058496.tif 000008一般式（１）中で、Ｒ１は水素基又は［（Ｃ４Ｈ４）ＣＨ３］ｎであり、ｎは１〜５の整数であり、Ｒ２は水素基又はメトキシ基である。【選択図】図１
2014058496.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（１）で表される構造又は一般式（１）で表される化合物の還元型の構造を有し、
【化１】
2014058496.tif 000006
一般式（１）中で、Ｒ１は水素基又は［（Ｃ４Ｈ４）ＣＨ３］ｎであり、ｎは１〜５の整数であり、Ｒ２は水素基又はメトキシ基であることを特徴とする黒色腫細胞のＷｎｔ／β‐ｃａｔｅｎｉｎシグナル経路の抑制に用いられるＷｎｔ／β‐ｃａｔｅｎｉｎシグナル経路抑制用ベンゾキノン系化合物。
【請求項２】
前記一般式（１）で表される化合物の位置異性体であり、一般式（２）で表される構造を有し、
【化２】
2014058496.tif 000007
一般式（２）中で、Ｒ１は水素基又は［（Ｃ４Ｈ４）ＣＨ３］ｎであり、ｎは１〜５の整数であることを特徴とする請求項１に記載のＷｎｔ／β‐ｃａｔｅｎｉｎシグナル経路抑制用ベンゾキノン系化合物。
【請求項３】
２，３‐ジメトキシ‐５‐メチル‐１，４‐ベンゾキノン、２‐メトキシ‐６‐メチル‐１，４‐ベンゾキノン、又は５‐メチル‐１‐ベンゾ［１，３］ジオキソール‐４，７‐ジオンであることを特徴とする請求項１に記載のＷｎｔ／β‐ｃａｔｅｎｉｎシグナル経路抑制用ベンゾキノン系化合物。
【請求項４】
黒色腫細胞の成長を抑制する薬物の調製に用いられることを特徴とする請求項１に記載のＷｎｔ／β‐ｃａｔｅｎｉｎシグナル経路抑制用ベンゾキノン系化合物。
【請求項５】
黒色腫細胞の成長を抑制する前記薬物は、黒色腫細胞増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）抑制薬物、黒色腫細胞分化（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）抑制薬物、黒色腫細胞生存（ｓｕｒｖｉｖａｌ）抑制薬物、黒色腫細胞転移（ｍｏｔｉｌｉｔｙ）抑制薬物、又は黒色腫アポトーシス（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）促成薬物を含むことを特徴とする請求項４に記載のＷｎｔ／β‐ｃａｔｅｎｉｎシグナル経路抑制用ベンゾキノン系化合物。
【請求項６】
黒色腫細胞の成長を抑制する前記薬物は、内服剤、注射剤又は皮膚外用剤であることを特徴とする請求項４に記載のＷｎｔ／β‐ｃａｔｅｎｉｎシグナル経路抑制用ベンゾキノン系化合物の用途。
【請求項７】
請求項１に記載のＷｎｔ／β‐ｃａｔｅｎｉｎシグナル経路抑制用ベンゾキノン系化合物、前記Ｗｎｔ／β‐ｃａｔｅｎｉｎシグナル経路抑制用ベンゾキノン系化合物を有効成分とする加工物又は天然物からの抽出物、前記Ｗｎｔ／β‐ｃａｔｅｎｉｎシグナル経路抑制用ベンゾキノン系化合物の薬学的に許容可能な塩類、および、前記Ｗｎｔ／β‐ｃａｔｅｎｉｎシグナル経路抑制用ベンゾキノン系化合物の薬学的に許容可能な溶媒和物のうち少なくとも一つを含むことを特徴とする皮膚癌病状改善用医薬組成物。
【請求項８】
前記Ｗｎｔ／β‐ｃａｔｅｎｉｎシグナル経路抑制用ベンゾキノン系化合物を有効成分とする加工物は、樟芝の発酵液又は前記樟芝の発酵液の乾燥粉末であることを特徴とする請求項７に記載の皮膚癌病状改善用医薬組成物。
【請求項９】
人工合成、樟芝の発酵液又は樟芝の発酵液の抽出物から得られた請求項１に記載のＷｎｔ／β‐ｃａｔｅｎｉｎシグナル経路抑制用ベンゾキノン系化合物を有効成分とすることを特徴とするサプリメント。
【請求項１０】
液状、粉末、錠剤、カプセル、又は注射剤であることを特徴とする請求項９に記載のサプリメント。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｗｎｔ／β‐ｃａｔｅｎｉｎシグナル経路抑制用ベンゾキノン系化合物、ならびに、それを用いた皮膚癌病状改善用医薬組成物およびサプリメントに関する。
【背景技術】
【０００２】
黒色腫（ｍｅｌａｎｏｍａ）は、皮膚悪性腫瘍の一つであり、悪性度が最も高く、転移しやすく、西洋人にとって皮膚病の中で罹患率が第１位を占める死亡原因である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開平１０−４５７６０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
現在、黒色腫を治療する薬物についての研究は、まだ完備されていない。黒色腫の化学治療及び放射線治療の効果が良くなく、高度の転移性が伴われているため、癌治療を補助する天然食材を求めることは、現在の重要な課題である。
【０００５】
Ｗｎｔ／β‐ｃａｔｅｎｉｎシグナル経路は、増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）、分化（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）、生存（ｓｕｒｖｉｖａｌ）、細胞アポトーシス（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）、及び細胞の転移（ｍｏｔｉｌｉｔｙ）含む数多くの細胞のプロセスを調節することができる。約３０％の黒色腫には、Ｗｎｔ／β‐ｃａｔｅｎｉｎシグナル経路の異常活性化の現象が観察されているため、Ｗｎｔ／β‐ｃａｔｅｎｉｎシグナル経路を抑制することも、黒色腫を治療する対策の一つになる。  本発明は、上述の問題に鑑みてなされたものであり、その目的は、Ｗｎｔ／β‐ｃａｔｅｎｉｎシグナル経路を抑制するＷｎｔ／β‐ｃａｔｅｎｉｎシグナル経路抑制用ベンゾキノン系化合物、ならびに、それを用いた皮膚癌病状改善用医薬組成物およびサプリメントを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
請求項１に係る発明によると、Ｗｎｔ／β‐ｃａｔｅｎｉｎシグナル経路抑制用ベンゾキノン系化合物は、一般式（１）で表される構造又は一般式（１）で表される化合物の還元型の構造を有する。
【化１】
2014058496.tif 000003
一般式（１）において、Ｒ１は水素基又は［（Ｃ４Ｈ４）ＣＨ３］ｎであり、ｎは１〜５の整数であり、Ｒ２は水素基又はメトキシ基である。
【０００７】
請求項２に係る発明によると、ベンゾキノン系化合物は、一般式（１）で表される化合物の位置異性体であり、一般式（２）で表される構造を有する。
【０００８】
【化２】
2014058496.tif 000004
一般式（２）において、Ｒ１は水素基又は［（Ｃ４Ｈ４）ＣＨ３］ｎであり、ｎは１〜５の整数である。
【０００９】
請求項３に係る発明によると、Ｗｎｔ／β‐ｃａｔｅｎｉｎシグナル経路抑制用ベンゾキノン系化合物は、２，３‐ジメトキシ‐５‐メチル‐１，４‐ベンゾキノン、２‐メトキシ‐６‐メチル‐１,４‐ベンゾキノン、または、５‐メチル‐１‐ベンゾ［１，３］ジオキソール‐４，７‐ジオンであってよい。
【００１０】
請求項４に係る発明によると、Ｗｎｔ／β‐ｃａｔｅｎｉｎシグナル経路抑制用ベンゾキノン系化合物は、黒色腫細胞の成長を抑制する薬物の調製に用いられる。
【００１１】
請求項５に係る発明によると、黒色腫細胞の成長を抑制する薬物は、黒色腫細胞増殖抑制薬物、黒色腫細胞分化抑制薬物、黒色腫細胞生存抑制薬物、黒色腫細胞転移抑制薬物、又は黒色腫アポトーシス促成薬物を含む。
【００１２】
請求項６に係る発明によると、黒色腫細胞の成長を抑制する薬物は、内服剤、注射剤、又は皮膚外用剤である。
【００１３】
請求項７に係る発明によると、皮膚癌病状改善用医薬組成物は、Ｗｎｔ／β‐ｃａｔｅｎｉｎシグナル経路抑制用ベンゾキノン系化合物、Ｗｎｔ／β‐ｃａｔｅｎｉｎシグナル経路抑制用ベンゾキノン系化合物を有効成分とする加工物又は天然物からの抽出物、Ｗｎｔ／β‐ｃａｔｅｎｉｎシグナル経路抑制用ベンゾキノン系化合物の薬学的に許容可能な塩類、および、前記Ｗｎｔ／β‐ｃａｔｅｎｉｎシグナル経路抑制用ベンゾキノン系化合物の薬学的に許容可能な溶媒和物のうち少なくとも一つを含む。
【００１４】
請求項８に係る発明によると、Ｗｎｔ／β‐ｃａｔｅｎｉｎシグナル経路抑制用ベンゾキノン系化合物を有効成分とする加工物は、樟芝（ベニクスノキタケ）の発酵液又は樟芝の発酵液の乾燥粉末である。
【００１５】
請求項９に係る発明によると、サプリメントは、人工合成、樟芝の発酵液又は樟芝の発酵液の抽出物から得られたＷｎｔ／β‐ｃａｔｅｎｉｎシグナル経路抑制用ベンゾキノン系化合物を有効成分とする。
【００１６】
請求項１０に係る発明によると、サプリメントは、液状、粉末、錠剤、カプセル又は注射剤である。
【００１７】
本発明は、さらに、黒色腫細胞のＷｎｔ／β‐ｃａｔｅｎｉｎシグナル経路への抑制に応用されるユビキノン‐０（Ｕｂｉｑｕｉｎｏｎｅ‐０）の用途を提供する。
【００１８】
本発明のＷｎｔ／β‐ｃａｔｅｎｉｎシグナル経路抑制用ベンゾキノン系化合物は、黒色腫細胞のＷｎｔ／β‐ｃａｔｅｎｉｎシグナル経路を抑制することができ、黒色腫細胞の増殖、分化、生存、および転移を抑制する薬物、又は黒色腫アポトーシス促成薬物、医薬組成物又はサプリメントを調製するのに用いられることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本発明の一実施形態によるＷｎｔ／β‐ｃａｔｅｎｉｎシグナル経路抑制用ベンゾキノン系化合物の特性図である。
【図２】本発明の一実施形態によるＷｎｔ／β‐ｃａｔｅｎｉｎシグナル経路抑制用ベンゾキノン系化合物の特性図である。
【図３】本発明の一実施形態によるＷｎｔ／β‐ｃａｔｅｎｉｎシグナル経路抑制用ベンゾキノン系化合物の特性図である。
【図４】本発明の一実施形態によるＷｎｔ／β‐ｃａｔｅｎｉｎシグナル経路抑制用ベンゾキノン系化合物の特性図である。
【図５】本発明の一実施形態によるＷｎｔ／β‐ｃａｔｅｎｉｎシグナル経路抑制用ベンゾキノン系化合物の特性図である。
【図６】本発明の一実施形態によるＷｎｔ／β‐ｃａｔｅｎｉｎシグナル経路抑制用ベンゾキノン系化合物の特性図である。
【図７】本発明の一実施形態によるＷｎｔ／β‐ｃａｔｅｎｉｎシグナル経路抑制用ベンゾキノン系化合物の特性図である。
【図８】本発明の一実施形態によるＷｎｔ／β‐ｃａｔｅｎｉｎシグナル経路抑制用ベンゾキノン系化合物の特性図である。
【図９】本発明の一実施形態によるＷｎｔ／β‐ｃａｔｅｎｉｎシグナル経路抑制用ベンゾキノン系化合物の特性図である。
【図１０】本発明の一実施形態によるＷｎｔ／β‐ｃａｔｅｎｉｎシグナル経路抑制用ベンゾキノン系化合物の特性図である。
【図１１】（ａ）は本発明の一実施形態によるＷｎｔ／β‐ｃａｔｅｎｉｎシグナル経路抑制用ベンゾキノン系化合物の特性図である。（ｂ）は（ａ）に示したものの対照群である。
【図１２】本発明の一実施形態によるＷｎｔ／β‐ｃａｔｅｎｉｎシグナル経路抑制用ベンゾキノン系化合物の特性図である。
【図１３】本発明の一実施形態によるＷｎｔ／β‐ｃａｔｅｎｉｎシグナル経路抑制用ベンゾキノン系化合物の特性図である。
【図１４】本発明の一実施形態によるＷｎｔ／β‐ｃａｔｅｎｉｎシグナル経路抑制用ベンゾキノン系化合物の特性図である。
【図１５】本発明の一実施形態によるＷｎｔ／β‐ｃａｔｅｎｉｎシグナル経路抑制用ベンゾキノン系化合物の特性図である。
【図１６】本発明の一実施形態によるＷｎｔ／β‐ｃａｔｅｎｉｎシグナル経路抑制用ベンゾキノン系化合物の特性図である。
【図１７】本発明の一実施形態によるＷｎｔ／β‐ｃａｔｅｎｉｎシグナル経路抑制用ベンゾキノン系化合物の特性図である。
【図１８】（ａ）は本発明の一実施形態によるＷｎｔ／β‐ｃａｔｅｎｉｎシグナル経路抑制用ベンゾキノン系化合物の特性図である。（ｂ）は（ａ）の部分の結果を定量化した図である。
【図１９】本発明の一実施形態によるＷｎｔ／β‐ｃａｔｅｎｉｎシグナル経路抑制用ベンゾキノン系化合物の特性図である。
【図２０】本発明の一実施形態によるＷｎｔ／β‐ｃａｔｅｎｉｎシグナル経路抑制用ベンゾキノン系化合物の特性図である。
【図２１】本発明の一実施形態によるＷｎｔ／β‐ｃａｔｅｎｉｎシグナル経路抑制用ベンゾキノン系化合物の特性図である。
【図２２】本発明の一実施形態によるＷｎｔ／β‐ｃａｔｅｎｉｎシグナル経路抑制用ベンゾキノン系化合物の特性図である。
【図２３】本発明の一実施形態によるＷｎｔ／β‐ｃａｔｅｎｉｎシグナル経路抑制用ベンゾキノン系化合物の特性図である。
【図２４】本発明の一実施形態によるＷｎｔ／β‐ｃａｔｅｎｉｎシグナル経路抑制用ベンゾキノン系化合物の特性図である。
【図２５】図２４に示した結果を定量化した図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
（一実施形態）
本発明の一実施形態によると、Ｗｎｔ／β‐ｃａｔｅｎｉｎシグナル経路抑制用ベンゾキノン系化合物（以下、は単に「化合物（Ｉ）」という）は、一般式（１）で表される構造を有し、その還元型又はその異性体が、化学合成、又は天然物、加工物又は加工物からの抽出物から得られることができる
【化１】
2014058496.tif 000005
Ｒ１は水素基又は［（Ｃ４Ｈ４）ＣＨ３］ｎであり、ｎは１〜５の整数であり、Ｒ２は水素基又はメトキシ基である。
【００２１】
ここで、天然物、加工物又は加工物からの抽出物から得られる化合物（Ｉ）は、自然状態で、酸化還元型の置換、異なる構造異性体（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  ｉｓｏｍｅｒｓ）又は位置異性体（ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎａｌ  ｉｓｏｍｅｒｓ）が生じられる。本実施形態では、合成された化合物（Ｉ）、又は樟芝の発酵液から得られた化合物（Ｉ）含有の天然物又は加工物からの抽出物に関わらず、黒色腫細胞Ｗｎｔ／β‐ｃａｔｅｎｉｎシグナル経路に対して、何れも抑制効果が一致していることを表している。そのため、下記実験例に記載の実験の目標化合物（Ｉ）の具体的な構造において、Ｒ１は水素基であり、Ｒ２はメトキシ基である。また、純粋な化合物（Ｉ）は、化合物（Ｉ）を主な有効成分とする混合物と同様な効果を有する。
【００２２】
下記の実施例は、本発明の特定の態様を明らかにし、当業者に本発明の内容に対する理解及び実施に寄与するためのものである。ただし、本発明の範囲は、これらの実施例に限定されない。
【００２３】
（第一実施例：黒色腫細胞の増殖（Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）に対する化合物（Ｉ）の抑制作用）
（実験例１‐１：黒色腫細胞の生存率に対する化合物（Ｉ）の抑制作用）
【００２４】
験用の細胞は、ヒトの正常な皮膚細胞（ＨａＣａＴ）、黒色腫瘍細胞（Ａ２０５８）、マウスの黒色腫細胞（Ｂ１６Ｆ１）、および、マウスの黒色腫高転移性細胞（Ｂ１６Ｆ１０）である。各供試細胞を適当な培養基で培養する。インキュベーターを５％ＣＯ２、３７℃恒温に維持する。細胞を一定数まで培養した場合、９００ｒｐｍの回転数で１０分間遠心して、培養液を除去する。実験の２４時間前に、培養液を交換し、細胞計数器（ｈｅｍｏｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）によって細胞の数を数える。
【００２５】
細胞の生存率（ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）の測定は、細胞賦活評価実験（Ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ａｓｓａｙ；ＭＴＴ  ａｓｓａｙ）によって行う。細胞生存率検出の実験方法については、Ｐａｒａｄａ‐Ｔｕｒｓｋａ等により提案されたステップを参照する。
【００２６】
供試細胞を、２４穴プレート（２.５×１０５  ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）に植え、翌日、細胞が壁に付着した後、ＰＢＳで洗浄する。１％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＤＭＥＭ培養液を加え、細胞を同期化させる。翌日、異なる濃度の化合物（Ｉ）を加え、３７℃、５％ＣＯ２で２４時間培養し、ＰＢＳで１回洗浄する。４００μｌのＭＴＴ試薬を加え、４時間反応させた後、４００μｌの１０％ＳＤＳを更に加え、１２時間反応させる。２００μｌの上澄みを抽出して９６穴マイクロプレートに入れ、５７０ｎｍの波長で吸光度を測定する。
【００２７】
図１は、化合物（Ｉ）の投与量が異なる場合、ヒトの正常な皮膚細胞（ＨａＣａＴ）、黒色腫瘍細胞（Ａ２０５８）、マウスの黒色腫細胞（Ｂ１６Ｆ１）、およびマウスの黒色腫高転移性細胞（Ｂ１６Ｆ１０）の生存率の抑制に対する化合物（Ｉ）の影響を定量化した図である。結果は、ｍｅａｎ±ＳＤ値で表され、ｎ＝３、ｐ＜０.０５である。
【００２８】
図１に示すように、実験濃度０〜２０μＭの化合物（Ｉ）が供試細胞に２４時間作用した後、正常な皮膚細胞ＨａＣａＴは化合物（Ｉ）の影響を受けておらず、Ａ２０５８の生存率が７０％であり、Ｂ１６Ｆ１に対するＩＣ５０濃度は約１５〜２０μＭであり、高転移性細胞Ｂ１６Ｆ１０に対するＩＣ５０濃度は約１０μＭであり、高転移性細胞Ｂ１６Ｆ１０に対する毒性が著しいことが明らかである。
【００２９】
結果から、化合物（Ｉ）は、マウスの黒色腫高転移性細胞株の活性に対して、強い抑制効果を有することが判明できる。
下記の実験例において、使用される「腫瘍細胞」、「黒色腫細胞」の用語は、特に説明しない場合、何れもマウスの黒色腫高転移性細胞株Ｂ１６Ｆ１０を指す。
【００３０】
（実験例１‐２：腫瘍細胞コロニーの形成に対する化合物（Ｉ）の抑制作用）
黒色腫高転移性細胞Ｂ１６Ｆ１０のコロニー形成に対する化合物（Ｉ）の影響を理解するために、細胞コロニー形成アッセイ（Ｃｏｌｏｎｙ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）によって観察する。
【００３１】
図２の（ａ）部分は、細胞を細胞マトリックスに付着させた後、異なる濃度の化合物（Ｉ）で２４時間反応させてから、１０％ＦＢＳを含む新鮮な細胞培養液に入替えた後、５日間培養した細胞コロニーの成長状況である。結果、化合物（Ｉ）が、黒色腫細胞のコロニー形成に対して著しい抑制作用を有することを示す。
【００３２】
図２の（ｂ）部分は、（ａ）部分に示した細胞コロニーをコンピュータで走査して、７０％のアルコールでコロニーを溶解し、吸光度５４０ｎｍで測定して得られた数値である。結果から、黒色腫細胞コロニーの数は、化合物（Ｉ）の投与量との依存性を示すことが判明できる。
【００３３】
（第二実施例：黒色腫細胞Ｗｎｔ／β‐ｃａｔｅｎｉｎ調節経路に対する化合物（Ｉ）の抑制作用）
癌細胞の成長を起動させるには、数多くのシグナル伝達経路があり、多種類のタンパク質の活性化に関わっている。３０％の黒色腫に、Ｗｎｔ／β‐ｃａｔｅｎｉｎシグナル経路の異常活性化の現象が観察できるため、Ｗｎｔ／β‐ｃａｔｅｎｉｎシグナル経路を抑制することも、黒色腫を治療する対策の一つになる。Ｗｎｔ／β‐ｃａｔｅｎｉｎシグナル経路における関連するタンパク質の発現又は活性化は、増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）、分化（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）、生存（ｓｕｒｖｉｖａｌ）、アポトーシス（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）、及び細胞の転移（ｍｏｔｉｌｉｔｙ）を含む腫瘍細胞のプロセスを調節することができる。
【００３４】
（実験例２‐１：β‐Ｃａｔｅｎｉｎのリン酸化に対する化合物（Ｉ）の促進作用）
グリコーゲンシンターゼキナーゼ‐３β（Ｇｌｙｃｏｇｅｎ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｋｉｎａｓｅ‐３  ｂｅｔａ；ＧＳＫ３β）は、多機能の酵素キナーゼであり、細胞において、グリコーゲンシンテターゼ経路に関与するほか、数多くのシグナル伝達、遺伝子発現、細胞生存又は死亡等の重要なメカニズムを調節する。β‐ｃａｔｅｎｉｎは、分解を調節することができる腫瘍に関連するタンパク質であり、現在の研究によると、β‐ｃａｔｅｎｉｎは、ＧＳＫ３βにリン酸化されることができ、β‐ｃａｔｅｎｉｎのリン酸化が癌化と緊密な関係があると考えられる。
【００３５】
以下、ウエスタンブロット解析（Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ）によって、黒色腫細胞内のβ‐ｃａｔｅｎｉｎ及びＧＳＫ３βのタンパク質の含有量及びそのリン酸化反応に対する化合物（Ｉ）の影響を観察する。
【００３６】
図３は、２４時間培養された黒色腫細胞Ｂ１６Ｆ１０が濃度０、５、１０、１５及び２０μＭの化合物（Ｉ）により処理された後、ウエスタンブロット解析によって、黒色腫細胞内のβ‐ｃａｔｅｎｉｎ及びリン酸化されたβ‐ｃａｔｅｎｉｎ（ｐ‐β‐ｃａｔｅｎｉｎ）、ならびに、ＧＳＫ３β及びリン酸化されたＧＳＫ３β（ｐ‐ＧＳＫ３β）のタンパク質の含有量を検出する結果である。β‐ａｃｔｉｎは、内部標準である。
【００３７】
ウエスタンブロット解析のステップは、下記の通りである。
細胞を４℃のＰＢＳで２回洗浄し、溶解バッファー（ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ）を加え、ラバーポリスマン（ｒｕｂｂｅｒ  ｐｏｌｉｃｅｍａｎ）で細胞をすり潰して溶解させ、この細胞溶解液を１.５ｍｌの微量遠心管に入れ、１分間振動する。また、１２０００回転数で１０分間遠心して上澄みを取って、タンパク質の濃度をＢｉｏ‐Ｒａｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔで測定する。残りのタンパク質抽出液を−７０℃で保存する。１００μｇのタンパク質溶液を取って、等体積で約２倍濃度のＳＤＳ／ｐｒｏｔｅｉｎ  ｌｏａｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒを加え、１００℃で１０分間煮沸し、冷却した後、タンパク質サンプルをそれぞれ入れて、電圧を１００ボルトに調整し、タンパク質サンプルの泳動が終わってから、タンパク質電気泳動の転写を行う。１枚のポリフッ化ビニリデン膜（ｐｏｌｙ（ｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ  ｆｌｕｏｒｉｄｅ）；ＰＶＤＦ）を取り、メタノールで濡れらした後、４℃のアイスボックスにおける転写タンクに入れて、６００マイクロアンペアの電流でタンパク質の転移を行う。４時間後、ＰＶＤＦを取り出して、１％ＢＳＡのＰＢＳ  ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎに入れて、２時間揺動した後、一次抗体のｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎに入れて、室温で１時間ゆっくり揺動する。ＰＢＳＴで、毎回３〜５分間、回転数１００ｒｐｍでＰＶＤＦ膜を３回洗浄する。異なる一次抗体により倍数になるよう希釈し、水平型回転装置において、室温で２時間揺動し、ＰＢＳＴで３回洗浄する。そして、プラスチックグリップを使用してＰＶＤＦ膜を黒色金属プレートに置き、タンパク質側が上向きになるように、１：１で混合されたＣｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｅｎｔ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅを膜に加え、冷光映像装置を用いて、異なる抗体の蛍光の強弱によって露光時間を調整してから撮影する。
【００３８】
図３の結果が示すように、化合物（Ｉ）は、処理濃度の増加に伴いβ‐ｃａｔｅｎｉｎのタンパク質発現量は減少するが、そのリン酸化タンパク質（ｐ‐β‐ｃａｔｅｎｉｎ）の発現量は濃度の増加に伴い増加し、投与量との依存性を示す。それに対して、ＧＳＫ３βの量は、化合物（Ｉ）に抑制される状況になり、そのリン酸化タンパク質（ｐ‐ＧＳＫ３β）も、化合物（Ｉ）の濃度の増加に伴い減少する。よって、化合物（Ｉ）は、腫瘍の進行への抑制に寄与するタンパク質ｐ‐β‐Ｃａｔｅｎｉｎのリン酸化を促進し、非リン酸化β‐Ｃａｔｅｎｉｎ及びＧＳＫ３βの分解を調節することができることが明らかである。
【００３９】
（実験例２‐２：Ｗｎｔ／β‐ｃａｔｅｎｉｎ調節に関連するタンパク質発現に対する化合物（Ｉ）の抑制作用）
以下、化合物（Ｉ）による黒色腫瘍高転移性細胞の抑制作用のメカニズムを説明するために、Ｗｎｔ／β‐ｃａｔｅｎｉｎ調節経路における代表的なタンパク質について、ウエスタンブロット解析を行う。
【００４０】
図４は、Ｗｎｔ‐５ａ、Ｌｏｗ‐ｄｅｎｓｉｔｙ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ‐ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ６（ＬＰＲ６）、Ａｘｉｎ、Ｄｖｌを含む黒色腫瘍細胞において、腫瘍の進行を促進するタンパク質の発現状況である。β‐ａｃｔｉｎは、内部標準である。ウエスタンブロット解析のステップは、実験例２‐１に示すようなものである。
【００４１】
図４の結果が示すように、化合物（Ｉ）の投与量の増加に伴い、黒色腫瘍高転移性細胞において、Ｗｎｔ／β‐ｃａｔｅｎｉｎ調節経路のＷｎｔ‐５ａ、ＬＰＲ６、Ａｘｉｎ、Ｄｖｌタンパク質の発現量は、何れも抑制られ、投与量との依存性を示す。
【００４２】
（実験例２‐３：β‐Ｃａｔｅｎｉｎの核内移行・発現に対する化合物（Ｉ）の抑制作用）
化合物（Ｉ）は、腫瘍の進行への抑制に寄与するタンパク質ｐ‐β‐Ｃａｔｅｎｉｎのリン酸化を促進し、非リン酸化β‐Ｃａｔｅｎｉｎ及びＧＳＫ３βの分解を調節することができる。研究によると、非リン酸化β‐ｃａｔｅｎｉｎの大部分は、核中に位置決められていることが知られており、以下、化合物（Ｉ）が存在する場合、細胞内のβ‐ｃａｔｅｎｉｎの位置について解析する。
【００４３】
図５は、細胞免疫蛍光染色（Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｅｎｒｅｎｃｅ  ｓｔａｉｎｉｎｇ）法によって、β‐Ｃａｔｅｎｉｎの一次抗体を用いて、蛍光顕微鏡で２００倍視野において観察した写真である。
【００４４】
細胞を、異なる濃度の化合物（Ｉ）で刺激した後、β‐Ｃａｔｅｎｉｎの一次抗体（１：２５０希釈）を加え、３７℃、５％ＣＯ２において２時間培養する。更に、蛍光二次抗体（１：２００希釈）を加え、最後、ＤＡＰＩ（１：１０００希釈）を加え、光線を避けるように室温で５分間放置し、蛍光顕微鏡で観察して写真を撮り（２００ｘ）、また、ｍｏｕｎｔｉｎｇ  ｇｅｌで封入する。
【００４５】
図５の結果が示すように、化合物（Ｉ）は、β‐ｃａｔｅｎｉｎの核内移行を抑制し、核質β‐ｃａｔｅｎｉｎのタンパク質発現を低下させることができ、化合物（Ｉ）がｐ‐β‐Ｃａｔｅｎｉｎのリン酸化を促進して、腫瘍の進行を抑制することができることが証明された。
【００４６】
（実験例２‐４：核内及び細胞質β‐ｃａｔｅｎｉｎ分解に対する化合物（Ｉ）の促進作用）
リン酸化されなかったβ‐ｃａｔｅｎｉｎは、細胞質に累積して細胞核に転位するため、化合物（Ｉ）が存在する場合、β‐ｃａｔｅｎｉｎの分解への促進効果があるかどうかについて、更に解析する。
【００４７】
図６は、ウエスタンブロット法によって、異なる濃度の化合物（Ｉ）で処理する場合、細胞質、核内のβ‐ｃａｔｅｎｉｎの核内、及び細胞質における発現量への影響を解析した結果を示す図である。Ｈｉｓｔｏｎｅは、核内の内部標準であり、β‐ａｃｔｉｎは、細胞質の内部標準である。
【００４８】
図６の結果が示すように、化合物（Ｉ）の処理濃度の増加に伴い、細胞質及び核内のβ‐ｃａｔｅｎｉｎ量は、何れも著しく減少する。
【００４９】
（実験例３‐１：β‐ｃａｔｅｎｉｎの分解に対する化合物（Ｉ）の促進作用）
上述したように、化合物（Ｉ）は、β‐ｃａｔｅｎｉｎの核内移行・発現を抑制し、核質β‐ｃａｔｅｎｉｎのタンパク質発現を低下させることができる。化合物（Ｉ）のＷｎｔ／β‐ｃａｔｅｎｉｎ調節経路におけるβ‐ｃａｔｅｎｉｎタンパク質量に対する影響メカニズムを明確するため、供試サンプルにプロテアソーム抑制剤（ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）、ＧＳＫ３β抑制剤、又はタンパク質合成抑制剤（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）を与える方式で、ウエスタンブロット法によって黒色腫瘍高転移性細胞内のタンパク質量の変化を解析して観察する。
【００５０】
図７は、化合物（Ｉ）及びプロテアソーム抑制剤ＭＧ１３２を同時に与えた後、β‐ｃａｔｅｎｉｎタンパク質の発現状況を示す図である。β‐ａｃｔｉｎは、内部標準である。ウエスタンブロット解析のステップについては、実験例２‐２を参照。
【００５１】
図７に示すように、化合物（Ｉ）が単独に存在する場合、β‐ｃａｔｅｎｉｎタンパク質の細胞内の量が著しく減少し、プロテアソーム抑制剤ＭＧ１３２が単独に存在する場合、β‐ｃａｔｅｎｉｎタンパク質の細胞内の量がかなり高いが、化合物（Ｉ）及びプロテアソーム抑制剤ＭＧ１３２を同時に与える場合、β‐ｃａｔｅｎｉｎのタンパク質の量が少量に回復することが明らかである。
【００５２】
図８は、化合物（Ｉ）及びＧＳＫ３β抑制剤ＳＢ２１６７６３を同時に与えた後、β‐ｃａｔｅｎｉｎタンパク質の発現状況を示す図である。
【００５３】
図８に示すように、化合物（Ｉ）が単独に存在する場合、β‐ｃａｔｅｎｉｎタンパク質の細胞内の量が著しく減少し、ＧＳＫ３β抑制剤ＳＢ２１６７６３が単独に存在する場合、β‐ｃａｔｅｎｉｎタンパク質の細胞内の量が変わらずに維持されるが、化合物（Ｉ）及びＧＳＫ３β抑制剤ＳＢ２１６７６３を同時に与える場合、β‐ｃａｔｅｎｉｎのタンパク質の量が低下することが明らかである。
【００５４】
図９は、異なる時間で化合物（Ｉ）又はタンパク質合成抑制剤（Ｃｙｃｌｏｈｅｘｉｍｉｄｅ；ＣＨＸ）を与えた後、β‐ｃａｔｅｎｉｎの発現状況を示す図である。
【００５５】
図９に示すように、タンパク質合成抑制剤ＣＨＸで細胞を０、６、１２、２４時間処理する場合、β‐ｃａｔｅｎｉｎの細胞内の量は、処理時間の増加に伴い減少し、１５μＭの化合物（Ｉ）で細胞を処理する実験群においても、同じような傾向があり、化合物（Ｉ）がβ‐ｃａｔｅｎｉｎの分解の促進に関わると推測できる。
【００５６】
（実験例３‐２：ＧＳＫ３βに依存しない、β‐ｃａｔｅｎｉｎの分解に対する化合物（Ｉ）の促進作用）
図１０は、免疫沈降法（Ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ；ＩＰ）によって、化合物（Ｉ）が存在する場合、β‐ｃａｔｅｎｉｎ及びその分解複合物におけるＧＳＫ３β、Ａｘｉｎとの交互作用を解析した結果を示す図である。
【００５７】
図１０に示すように、化合物（Ｉ）が存在する場合、β‐ｃａｔｅｎｉｎは、Ａｘｉｎと結合するが、ＧＳＫ３βとの結合が明らかでないので、化合物（Ｉ）が存在する場合、β‐ｃａｔｅｎｉｎの分解がＧＳＫ３βに依存していないことが明らかである。
【００５８】
（実験例４‐１：化合物（Ｉ）によるβ‐ｃａｔｅｎｉｎ転写活性への抑制）
化合物（Ｉ）はβ‐ｃａｔｅｎｉｎの分解に対して促進効果を有し、β‐ｃａｔｅｎｉｎレポーターアッセイ（ＴＣＦ／β‐ｃａｔｅｎｉｎ  ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ａｓｓａｙ）を行うので、β‐ｃａｔｅｎｉｎ下流の遺伝子の発現状況を知ることができる。
【００５９】
図１１の（ａ）部分は、蛍光レポーター遺伝子でβ‐ｃａｔｅｎｉｎレポーターの発現量を解析して定量化した図である。結果が示すように、化合物（Ｉ）の投与量の増加に伴い、Ｂ１６Ｆ１０細胞内のβ‐ｃａｔｅｎｉｎレポーターの発現量は低下し、即ち、化合物（Ｉ）はβ‐ｃａｔｅｎｉｎ転写活性を抑制することができる。
【００６０】
図１１の（ｂ）部分は、対照群として、ＧＳＫ３β抑制剤ＬｉＣＬ（Ｌｉｔｈｉｍ  Ｃｈｒｏｒｉｄｅ）を添加する場合の、蛍光レポーター遺伝子でβ‐ｃａｔｅｎｉｎレポーターの発現量を解析して定量化した図である。結果が示すように、ＧＳＫ３β抑制剤ＬｉＣｌのみを添加する場合、β‐ｃａｔｅｎｉｎレポーターの強度を増加できるが、化合物（Ｉ）の投与量の増加に伴い、ＬｉＣｌと化合物（Ｉ）を同時に添加し、化合物（Ｉ）は依然としてβ‐ｃａｔｅｎｉｎ転写活性への抑制作用を示す。
【００６１】
（実験例４‐２：β‐ｃａｔｅｎｉｎ下流遺伝子発現に対する化合物（Ｉ）の抑制作用）
上述したように、化合物（Ｉ）がβ‐ｃａｔｅｎｉｎレポーターの発現を低下させることができるので、腫瘍増殖促進タンパク質（ｃ‐ｍｙｃ）、細胞周期タンパク質（ｃｙｃｌｉｎ  Ｄ１）、アポトーシス抑制タンパク質（サバイビン（ｓｕｒｖｉｖｉｎ））のような、下流対象遺伝子の発現は、影響されて減少する。
【００６２】
図１２は、ウエスタンブロット法によって、化合物（Ｉ）が存在する場合、β‐ｃａｔｅｎｉｎ下流対象遺伝子産物の発現状況を解析した結果を示す図である。結果が示すように、化合物（Ｉ）の処理濃度の増加に伴い、ｃ‐ｍｙｃ、ｃｙｃｌｉｎ  Ｄ１及びｓｕｒｖｉｖｉｎの発現量の何れも減少する。
【００６３】
（第三実施例：黒色腫アポトーシス（Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）に対する化合物（Ｉ）の促進作用）
（実験例５‐１：黒色腫アポトーシスに対する化合物（Ｉ）の促進作用）
実験例１‐１及び実験例１‐２から分かれるように、化合物（Ｉ）は、黒色腫細胞の生存率を低下させる効果を有する。以下、ＤＮＡ特殊性蛍光染色法及び細胞形態解析によって、化合物（Ｉ）がアポトーシスを促進するか否かについて分析する。
【００６４】
図１３は、ターミナル・デオキシヌクレオチジル・トランスフェラーゼ‐ｄＵＴＰニック末端標識法（ｔｅｒｍｉｎａｌ‐ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｎｉｃｋ  ｅｎｄ  ｌａｂｅｌｉｎｇ；ＴＵＮＥＬ）によって、細胞内の染色体の破壊状況を解析して検出することで、検出したアポトーシスの結果を定量化した図である。図１３の結果が示すように、化合物（Ｉ）の処理濃度の増加に伴い、アポトーシスの程度が高くなる。
【００６５】
図１４は、フローサイトメトリー（ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）によって、異なる投与量の化合物（Ｉ）が存在する場合、細胞形態の変化を解析して、細胞死亡の有無を示す図である。図１４の結果が示すように、化合物（Ｉ）の処理濃度の増加に伴い、細胞が死亡になる比率が高くなる。
【００６６】
（実験例５‐２：細胞における黒色腫アポトーシス促進タンパク質の含有量に対する化合物（Ｉ）の影響）
アポトーシス経路は、一連の関連タンパク質の調節に関わっている。例えば、Ｐｒｏｃａｓｐａｓｅ‐９、Ｐｒｏｃａｓｐａｓｅ‐３は、アポトーシスを誘導するタンパク質ｃａｓｐａｓｅ‐９及びｃａｓｐａｓｅ‐３の前駆体であり、腫瘍細胞において、Ｐｒｏｃａｓｐａｓｅ‐９及びＰｒｏｃａｓｐａｓｅ‐３の活性化メカニズムが破壊されるため、癌細胞の大部分で見つけたＰｒｏｃａｓｐａｓｅ‐９、Ｐｒｏｃａｓｐａｓｅ‐３の量は、何れも正常な細胞より高い。
【００６７】
Ｂｃｌ‐２の生理機能は、アポトーシスを抑制することであり、Ｂａｘは、アポトーシス作用に関与する。また、細胞毒性薬物がアポトーシスを誘導する場合、核膜Ｂａｘの量の増加は、核タンパク質ＰＡＲＰの分解の正依存性を示す。ｐ５３は、アポトーシス活性化遺伝子であり、Ｂｃ１‐２とＢａｘ遺伝子の発現を調節することによって、アポトーシスを促進する。
【００６８】
前の実験例では、化合物（Ｉ）がアポトーシスを促進する効果を有することが既に証明されたため、アポトーシス経路に関連するタンパク質の含有量と化合物（Ｉ）投与量との依存性を検討することによって、腫瘍の進行を抑制する関連メカニズムを更に明確にすることができる。
【００６９】
図１５は、ウエスタンブロット法によって、化合物（Ｉ）が存在する場合、アポトーシス関連タンパク質の発現量を示す図である。
【００７０】
図１５の結果が示すように、化合物（Ｉ）の処理濃度の増加に伴い、Ｐｒｏｃａｓｐａｓｅ‐９、Ｐｒｏｃａｓｐａｓｅ‐３、ＰｒｏＰＡＲＰ、Ｂｃｌ‐２を含む腫瘍細胞におけるアポトーシス抑制タンパク質は、含有量が何れも低下し、化合物（Ｉ）の投与量との依存性を示す。それに対して、アポトーシス作用に関与するタンパク質Ｂａｘ及びｐ５３は、化合物（Ｉ）処理濃度の増加に伴い増加する。
【００７１】
前記結果より、化合物（Ｉ）はアポトーシスへの誘導能力を有し、そして、ｐ５３のタンパク質発現の増加、Ｂａｘ／Ｂｃｌ‐２の比率（ｒａｔｉｏ）の向上、及びｃａｓｐａｓｅ‐３、ｃａｓｐａｓｅ‐９、ＰＡＲＰの裂解も伴われていることが証明された。アポトーシス作用に関与するタンパク質発現を促進し、そして、細胞におけるアポトーシス抑制タンパク質の発現を低下させることによって、腫瘍細胞成長増殖への抑制効果を達成する。
【００７２】
（第四実施例：黒色腫細胞転移（Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ）に対する化合物（Ｉ）の抑制作用）
腫瘍転移とは、腫瘍細胞が原発巣から、一連のステップを経て、遠位部の器官組織へ拡散し、別の新しい腫瘍塊を形成する過程である。癌転移は、侵入能力（ｉｎｖａｓｉｏｎ）の起動、遊出（ｅｘｔｒａｖａｓａｔｉｏｎ）及び転移（ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ）の過程を含む。侵入の過程において、腫瘍細胞は、細胞同士の間の接着性を失い、移動性を得る。そして、遊出した細胞は、血液及びリンパ系に入り、最後、癌細胞は、目標位置に転移して、新しい腫瘍細胞になる。
【００７３】
（実験例６‐１：黒色腫細胞におけるＭＭＰｓ発現に対する化合物（Ｉ）の影響）
癌細胞転移の過程において、細胞外マトリックス（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ；ＥＣＭ）の分解が伴っていることが一般的であるが、ＥＣＭ分解の役割をするのは、主にマトリックス金属プロテアーゼ（Ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ；ＭＭＰｓ）である。腫瘍細胞は、ＭＭＰｓを大量に分泌するが、数多くの研究によると、ＭＭＰ‐２及びＭＭＰ‐９は、腫瘍転移過程において、重要な役割を果たしていると考えられる。また、マトリックス金属プロテアーゼ抑制剤ＴＩＭＰ‐１、ＴＩＭＰ‐２の発現は、ＭＭＰｓ活性の抑制、ならびに、腫瘍細胞の侵入及び転移の抑制作用を達成することができる。
【００７４】
そのため、以下、黒色腫細胞の転移に対する化合物（Ｉ）の抑制作用のメカニズムを説明するために、腫瘍転移に関連する前記細胞タンパク質について、ウエスタンブロット解析を行う。
【００７５】
図１６は、濃度が０、２.５、５、７.５μＭである異なる投与量の化合物（Ｉ）を与える場合、ウエスタンブロット解析法によって、黒色腫高転移性細胞の転移に関連するタンパク質の含有量に対する化合物（Ｉ）の影響を示す図である。β‐ａｃｔｉｎは、内部標準である。
【００７６】
図１６の結果が示すように、化合物（Ｉ）の投与量の増加に伴い、黒色腫高転移性細胞内のＭＭＰ‐２、ＭＭＰ‐９の発現が抑制され、ＭＭＰ‐２およびＭＭＰ‐９と化合物（Ｉ）の投与量とは依存性関係を有する。つまり、化合物（Ｉ）の投与量の増加に伴い、黒色腫高転移性細胞内のＴＩＭＰ‐１、ＴＩＭＰ‐２の発現量が何れも増加する。
【００７７】
前記結果から、化合物（Ｉ）は、ＭＭＰ抑制剤ＴＩＭＰ‐１、ＴＩＭＰ‐２の発現を促進し、且つＭＭＰｓの活性を抑制することによって、腫瘍細胞の侵入及び転移への抑制作用を達成することができることが明らかである。
【００７８】
（実験例６‐２：黒色腫細胞の遊走（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）に対する化合物（Ｉ）の抑制作用）
癌細胞が転移する際に、高転移性細胞株である場合、細胞が破壊される。また、細胞自身は、大量のタンパク質分解酵素を放出して、細胞外マトリックスの分解を促進する。すると、癌細胞の遊走状態を加速し、癌細胞の転移となる。
【００７９】
図１７の（ａ）部分は、異なる投与量の化合物（Ｉ）を与える場合、スクラッチアッセイ（Ｗｏｕｎｄ  ｓｃｒａｔｃｈｉｎｇ  ａｓｓａｙ）によって、黒色腫高転移性細胞の遊走に対する影響効果を解析した結果を示す図である。
【００８０】
細胞遊走（Ｗｏｕｎｄ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）の観察方法としては、Ｂ１６Ｆ１０（３×１０５）を、１２穴プレートに植え、翌日、ＰＢＳで２回洗浄し、１％ＦＢＳ含有の細胞培養液に入替え、翌日、一定のスペースがあるように穴プレートの底部をこすった後、細胞培養液を除去して、ＰＢＳで２回洗浄し、１％ＦＢＳ含有の細胞培養液及び異なる濃度の化合物（Ｉ）を加え、０、２４時間たってからそれぞれ写真を撮って細胞遊走の状況を観察する。反応が終わった後、７５％の冷えたアルコールで３０分間固定し、アルコールが完全に揮発した後、Ｇｉｅｍｓａ  Ｓｔａｉｎで染色し、顕微鏡（２００Ｘ）で、３つの視野を任意に選択し、遊走した細胞量をカウントする（Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ.,２００８）。スクラッチアッセイは、化合物（Ｉ）を添加しなかったものを対照群とし、２.５、５、７.５μＭの化合物（Ｉ）を添加したものを実験群として、細胞を２４時間処理した後、黒色腫高転移性細胞Ｂ１６Ｆ１０の遊走に対する化合物（Ｉ）の定量化結果を観察する。結果を、ｍｅａｎ±ＳＤ値で表し、ｎ＝３である。
【００８１】
図１７の（ｂ）部分に示すように、遊走する細胞量をカウントする場合、低い濃度（２.５μＭ）の化合物（Ｉ）が存在すると、２４時間後、細胞が遊走し、化合物（Ｉ）の濃度が５μＭ以上になると、細胞の遊走能力を著しく抑制されるようになる。
【００８２】
（実験例６‐３：黒色腫細胞侵入（ｉｎｖａｓｉｏｎ）に対する化合物（Ｉ）の抑制作用）
悪性腫瘍が転移しようとする場合、腫瘍細胞は、ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ（ＥＣＭ）を破壊することによって、組織の基底膜（ｂａｓｅｍｅｎｔ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）に更に侵入するのは、侵入（ｉｎｖａｓｉｏｎ）と呼ばれ、それは、金属タンパク質酵素群ＭＭＰｓの関与によって、癌細胞の侵襲能力を促進することである。
【００８３】
図１８は、トランスウェル移動アッセイ（Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ  ｉｎｖａｓｉｏｎ  ａｓｓａｙ）によって、異なる投与量の化合物（Ｉ）による黒色腫高転移性細胞侵襲への影響効果を解析した結果を示す図である。その内、（ａ）部分は、トランスウェル移動アッセイで染色された後の顕微鏡写真であり、（ｂ）部分は、（ａ）部分の結果を定量化した図である。結果を、ｍｅａｎ±ＳＤ値で表し、ｎ＝３である。
【００８４】
トランスウェル移動アッセイは、細胞外マトリックスの成分としてＭａｔｒｉｇｅｌを用い、細胞間環境を模擬することができ、ＢＤ  Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）  Ｉｎｖａｓｉｏｎ  Ｃｈａｍｂｅｒにおける細胞がＭａｔｒｉｇｅｌ  ｍａｔｒｉｘにおける成長因子に刺激されると、細胞は、若干のマトリックス分解酵素を分泌し、Ｍａｔｒｉｇｅｌを分解し、細胞の移行を吸引することができ、細胞の移動が強い場合、染色した後、濾過膜上に細胞を観察することができる。
【００８５】
実験方法は、化学誘引物質として、トランスウェル（Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ）に１０％ＦＢＳ含有のＤＭＥＭを８００μｌ加え、５００μｌの細胞（１×１０５）をトランスウェルに植え、ＦＢＳ無しのＤＭＥＭ培養液及び０．５、１、２μＭの化合物（Ｉ）をそれぞれ加え、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターに移して２０時間培養し、Ｇｉｅｍｓａで１５分間染色した後、光学顕微鏡によって２００倍視野で観察して写真を撮る。毎回の実験において、各群は、三重（ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ）のトランスウェルの平均値を代表とする。
【００８６】
トランスウェル移動アッセイの定量化方法は、トランスウェル膜の下表面における９つの視野を任意に選び取り、各視野における細胞総数を算出する。９つの視野における細胞数の平均値は、各トランスウェルの細胞の走化性移動の指標であり、毎回の実験中の各群は、三重のトランスウェルの平均値を代表とする（Ｒｏｓｅ  ｅｔ  ａｌ.,２００５）。
【００８７】
図１８（ａ）部分の顕微鏡写真によって細胞の移行状況を観察した結果、化合物（Ｉ）の濃度の増加に伴い、癌細胞の移行が著しく低下することが明確に見える。Ｂ１６Ｆ１０は、高転移性黒色腫細胞株であるため、写真において、対照群には、数多くの細胞が化学誘引物質（１０％ＦＢＳ細胞培養液）に誘引され、細胞外マトリックスを模擬するＭａｔｒｉｇｅｌを通過して、濾過膜まで移行することが観察され、２.５、５、７.５μＭの化合物（Ｉ）が加えられた実験群において、化合物（Ｉ）の濃度の増加に伴い、黒色腫細胞Ｂ１６Ｆ１０の移行が著しく低下する。
【００８８】
なお、（ｂ）部分において、カウントされた移行の細胞量は、化合物（Ｉ）の濃度の増加に伴い、移動が減少することを示す。
【００８９】
前記結果によると、化合物（Ｉ）は、ＭＭＰ‐９、ＭＭＰ‐２の発現量を低減させ、癌細胞侵入の発現を低下させることができることが明らかである。
【００９０】
（実験例７：黒色腫細胞侵襲と転移関連タンパク質発現に対する化合物（Ｉ）の抑制作用）
黒色腫高転移性細胞において、β‐ｃａｔｅｎｉｎ累積、及び下流タンパク質ｃ‐ｍｙｃ、細胞周期タンパク質Ｄ１、サバイビン等の発現増加の現象があり、β‐ｃａｔｅｎｉｎの低分子干渉ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ；ｓｉＲＮＡ）によって、β‐ｃａｔｅｎｉｎの遺伝子が失い、化合物（Ｉ）によるＷｎｔ／β‐ｃａｔｅｎｉｎシグナル経路の関連タンパク質が関与する細胞侵襲及び転移作用への調節を観察することができる。
【００９１】
図１９は、ウエスタンブロット解析法によって、化合物（Ｉ）が存在する場合、β‐ｃａｔｅｎｉｎの低分子干渉ＲＮＡにトランスフェクションされる黒色腫高転移性細胞の転移に関連するタンパク質の含有量の変化を示す図である。β‐ａｃｔｉｎは、内部標準である。結果が示すように、トランスフェクションされなかった細胞に比べ、β‐ｃａｔｅｎｉｎ低分子干渉ＲＮＡにトランスフェクションされた黒色腫高転移性細胞は、累積が少なく、化合物（Ｉ）を加えて処理すると、更に、その下流転移関連タンパク質の発現への抑制効果を持つようになる。
【００９２】
（第五実施例：ヌードマウスの黒色腫瘍の成長に対する化合物（Ｉ）の抑制作用）
前記結果により、化合物（Ｉ）は、Ｗｎｔ／β‐ｃａｔｅｎｉｎシグナル経路を抑制することによって、黒色腫高転移性細胞の成長、転移、侵入を抑制することができることが分かった。以下、生体内実験（ｉｎ  ｖｉｖｏ）の方式によって、その効能を更に検証する。
【００９３】
（実験例７‐１：腫瘍移植ヌードマウスの黒色腫瘍の成長に対する化合物（Ｉ）の抑制作用）
生体内実験を、ヌードマウス異種移植腫瘍モデル（ｎｕｄｅ  ｍｉｃｅ  ｘｅｎｏｇｒａｆｔ  ｔｕｍｏｒ  ｍｏｄｅｌ）によって行う。実験動物は、中華民国国家動物センターから購入したＢＡＬＢ／ｃ‐ｎｕ系ヌードマウスである。無菌箱で飼育し、光照射期間は、７：００〜１９：００であり、濾過された空気、滅菌された水及び飼料を提供し、自由摂食させる。８〜１０週齢の成熟した雌のヌードマウスを用いて、実験を行う。
【００９４】
黒色腫高転移性細胞Ｂ１６Ｆ１０（２×１０６／１００μｌ）を、皮下注射の方式によって、６０匹のヌードマウスの背部の一側に埋め込み、約１０日間、ヌードマウスの背部に１〜３ｍｍの腫瘍ができた後、任意に４つの群に分けて、更に、異なる投与量の化合物（Ｉ）を３つの群に投与する、その腫瘍の生成の状況を毎日観察して、撮影して保存し、３日ごとに腫瘍の体積を測定する。体積の算出方式は、１９８７年Ｏｓｂｏｒｎｅ氏らにより提案された公式に準拠する。
【００９５】
実験動物を、対照群（全く無処理）、溶剤群（生理食塩水のみ注射）及び化合物（Ｉ）注射群（投与量２ｍｇ／Ｋｇ）に分けて、毎日注射し、動物を正常な状況で飼育し、各群の実験動物の腫瘍の成長状況を比較するように、撮影して記録する。
【００９６】
図２０において、（ａ）部分は、対照群及び化合物（Ｉ）注射群のＢ１６Ｆ１０移植ヌードマウスの腫瘍体積を示す写真である。（ｂ）部分は、対照群及び化合物（Ｉ）注射群のＢ１６Ｆ１０移植ヌードマウスの成長日数と腫瘍体積とを比較する図である。（ｃ）部分は、対照群及び化合物（Ｉ）注射群のＢ１６Ｆ１０移植ヌードマウスの腫瘍の重量を比較する図である。
【００９７】
図２０の（ａ）部分により、化合物（Ｉ）を注射した移植ヌードマウスは、腫瘍の体積が対照群に比べて明らかに小さいことが分かる。
【００９８】
図２０の（ｂ）部分の比較図により、化合物（Ｉ）を注射した移植ヌードマウスは、腫瘍の体積が対照群に比べて小さいことが分かる。
【００９９】
図２０の（ｃ）部分の比較図により、その腫瘍の重量について、対照群と注射群との間には、著しく差異があることが分かる。
【０１００】
前記結果によると、化合物（Ｉ）は、腫瘍組織成長を直接に抑制する効果を有することが分かる。
【０１０１】
（実験例７‐２：腫瘍移植ヌードマウスの組織病理学による検査比較）
腫瘍移植ヌードマウスの組織病理検査を、組織病理学的なＨ＆Ｅ染色法によって行う。腫瘍及び内臓の組織を、パラフィンで埋め込み、ミクロトームで厚さ５ｍｍのスライドを切り出し、脱ろう、再水和、回復等を経て、二次水で洗浄し、Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎによって３０〜５０秒染色し、０．１％酢酸水で更に２０秒反応させ、二次水で洗浄し、最後、Ｅｏｓｉｎによって１００秒染色して、Ｈｉｓｔｏｃｌａｄで封入する。
【０１０２】
図２１は、組織病理学検査の顕微鏡写真である。図から、化合物（Ｉ）を注射しなかった対照群の移植ヌードマウスは、その腫瘍細胞が、高度な有糸分裂状態（拡大倍率４００Ｘ）を示したことに対し、化合物（Ｉ）を２ｍｇ／Ｋｇ／日で注射した注射群の移植ヌードマウスは、その腫瘍細胞が低度な有糸分裂状態（拡大倍率４００Ｘ）を示したことが明らかである。前記結果は、適当な投与量の化合物（Ｉ）を直接に注射すれば、腫瘍細胞の分裂を効果的に抑制することができることを示す。
【０１０３】
（実験例７‐３：腫瘍移植ヌードマウスのアポトーシスに対する化合物（Ｉ）注射の影響）
図２２は、化合物（Ｉ）を投与する場合、ターミナル・デオキシヌクレオチジル・トランスフェラーゼ‐ｄＵＴＰニック末端標識法（ＴＵＮＥＬ）によって、腫瘍移植ヌードマウスのアポトーシスを比較して解析した結果を示す図である。
【０１０４】
図２２の結果が示すように、２ｍｇ／ｋｇ／日の投与量で化合物（Ｉ）が注射されるヌードマウスは、その腫瘍アポトーシスの程度が注射されなかった制御群より明らかに高く、両群の差異が統計的意義を持っている。
【０１０５】
（実験例７‐４：腫瘍移植ヌードマウスの細胞内のシグナル伝達関連タンパク質の発現量に対する化合物（Ｉ）注射の影響）
腫瘍移植ヌードマウスの細胞内のシグナル伝達タンパク質の発現量を、免疫組織化学染色解析（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｔｒｙ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ）法によって行う。本実験は、Ｗｎｔ／β‐ｃａｔｅｎｉｎシグナル経路の関連タンパク質の発現について検出する。
【０１０６】
図２３（ａ）〜（ｄ）は、それぞれ腫瘍移植ヌードマウスの細胞内の各種の関連タンパク質発現量を示す、免疫組織化学染色による顕微鏡写真である。その内、（ａ）は、制御群及び注射群のβ‐ｃａｔｅｎｉｎの発現状況を示す。（ｂ）はｃｙｃｌｉｎ  Ｄ１の発現状況を示す。（ｃ）はｓｕｒｖｉｖｉｎの発現状況示す。（ｄ）はＭＭＰ‐９の発現状況を示す。右側は、（ａ）〜（ｄ）に示した結果を定量化して比較する図である。
【０１０７】
図２４の結果が示すように、制御群に比べ、２ｍｇ／Ｋｇ／日で化合物（Ｉ）を注射した注射群移植ヌードマウスは、その腫瘍組織で腫瘍の進行を促進するＷｎｔ／β‐ｃａｔｅｎｉｎシグナル経路タンパク質発現量が、何れも抑制されている。両群の差異が、何れも統計的意義を持っている。
【０１０８】
図２４は、移植ヌードマウスの腫瘍組織内のＷｎｔ／β‐ｃａｔｅｎｉｎシグナル経路関連のタンパク質の発現についてのウエスタンブロット解析を示す図である。図に示すように、化合物（Ｉ）が与えられなかった移植ヌードマウス対照群は、その腫瘍細胞において、例えば、β‐ｃａｔｅｎｉｎ、ｃ‐ｍｙｃ、ｃｙｃｌｉｎ  Ｄ１、ｓｕｒｖｉｖｉｎ、ＰｒｏＰＡＲＰ、Ｂｃｌ‐２のような、腫瘍の進行を促進するタンパク質の量は何れも高いが、例えば、ｐ５３、Ｂａｘのような、アポトーシスを促進するタンパク質の量は少ない。それに対して、２ｍｇ／Ｋｇ／日で化合物（Ｉ）を注射した注射群移植ヌードマウスは、その腫瘍組織内の腫瘍の進行を促進するタンパク質の量が何れも抑制され、アポトーシスを促進するタンパク質の量が向上する。
【０１０９】
図２５は、図２４を定量化した解析図であり、制御群の発現量を１００％として、注射群の発現が抑制され又は促進される程度を解析した結果を示す図である。その内、各タンパク質が制御群及び注射群の組織における含有量を比較し、タンパク質を問わず、両群の差異が何れも、統計的意義を持っている。また、Ｂａｘ／Ｂｃｌ２  ｒａｔｉｏから見れば、注射群の比率が制御群より著しく高く、化合物（Ｉ）が腫瘍組織のアポトーシスを促進できることを表す。
【０１１０】
上述したように、本発明の実施例の化合物（Ｉ）及びその医薬組成物は、Ｗｎｔ／β‐ｃａｔｅｎｉｎシグナル経路のシグナル伝達を調節することによって、黒色腫細胞の増殖の抑制、黒色腫細胞の転移の抑制、黒色腫癌のアポトーシスの促成、又は前記機能に関連する薬物の調製に応用されることができる。
【０１１１】
従って、化合物（Ｉ）又は化合物（Ｉ）を有効成分とする混合物は、腫瘍細胞の増殖を抑制することができるので、医薬組成物の形式で治療用の薬物として提供されることができる。また、サプリメントの形式で提供されることもできる。
【０１１２】
例えば、化合物（Ｉ）含有の医薬組成物において、化合物（Ｉ）は、遊離状態の形式又は薬学的に許容される塩の形式で存在している。また、化合物（Ｉ）含有の医薬組成物は、例えば、賦形剤、溶剤、乳化剤、懸濁化剤、分解剤、結合剤、安定化剤、防腐剤、潤滑剤、吸収遅延剤及びリポソームのような、１つまたは複数の薬学的に許容される担体を更に備えてもよい。化合物（Ｉ）含有の医薬組成物は、腫瘍細胞増殖を抑制するように、実際の要求に応じて、経口投与、注射剤又は外用塗布剤の形式で、応用することができる。
【０１１３】
本発明の実施例の化合物（Ｉ）は、人工合成、樟芝の発酵液又は樟芝の発酵液からの抽出物から得られることができる。サプリメントは、液状、粉末、錠剤、カプセル又は注射剤の形式であってもよい。
【０１１４】
本発明では実施形態を前述の通りに開示したが、これは本発明を限定するものではなく、当業者であれば、本発明の思想から逸脱しない限り、多様の変更や修正を加えることができる。従って本発明の保護範囲は、特許請求の範囲で指定した内容を基準とする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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