(57)【要約】【課題】  ｐ５３タンパク質とＭＤＭ２の結合ないし相互作用を妨げる環状ペプチドを提供する。【解決手段】  本発明に係る環状ペプチドは、α−ヘリックス構造を形成するペプチドからなりＮ末端側に位置するＡブロックと、α−ヘリックス構造を形成するペプチドからなりＣ末端側に位置するＣブロックと、ＡブロックとＣブロックを共有結合で結ぶペプチドからなるＢブロックとからなるヘリックス−ループ−ヘリックス構造を有し、前記ＡブロックのＮ末端にあるアミノ酸残基と前記ＣブロックのＣ末端にあるアミノ酸残基が共有結合した環状ペプチドであって、前記Ｃブロックは、外側に向かう部分にＮ末端側から順にフェニルアラニン残基、トリプトファン残基、ロイシン残基又はリシン残基、ロイシン残基の４つのアミノ酸残基を有し、好ましくは前記Ａブロックは、外側に向かう部分に少なくとも１以上のアルギニン残基を有する。この環状ペプチドは抗腫瘍作用を有する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｐ５３とＭＤＭ２の結合ないし相互作用を阻害する作用を有する環状ペプチドであって、
該環状ペプチドは、α−ヘリックス構造を形成するペプチドからなりＮ末端側に位置するＡブロックと、α−ヘリックス構造を形成するペプチドからなりＣ末端側に位置するＣブロックと、ＡブロックとＣブロックを共有結合で結ぶペプチドからなるＢブロックとからなるヘリックス−ループ−ヘリックス構造を有し、前記ＡブロックのＮ末端にあるアミノ酸残基と前記ＣブロックのＣ末端にあるアミノ酸残基が共有結合した環状ペプチドであって、
前記Ｃブロックは、外側に向かう部分にＮ末端側から順にフェニルアラニン残基、トリプトファン残基、ロイシン残基又はリシン残基、ロイシン残基の４つのアミノ酸残基を有
する環状ペプチド。
【請求項２】
前記Ａブロックは、外側に向かう部分に少なくとも１以上のアルギニン残基を有する請求項１に記載の環状ペプチド。
【請求項３】
前記ＡブロックのＮ末端にあるアミノ酸残基と前記ＣブロックのＣ末端にあるアミノ酸残基がジスルフィド結合、チオエーテル結合、ペプチド結合、エーテル結合で共有結合した請求項１又は２に記載の環状ペプチド。
【請求項４】
前記ＡブロックのＮ末端にあるアミノ酸残基がアセチルグリシンであり、前記ＣブロックのＣ末端にあるアミノ酸残基がシステイン残基であって、前記アセチルグリシンのアセチル基と前記システインのチオール基がチオエーテル結合した請求項１〜３の何れか１項に記載の環状ペプチド。
【請求項５】
前記Ｃブロックのペプチドは、KLAALKFKLLWXKLAC（但し、Ｘはロイシン残基又はリシン残基である：配列番号１１）又はKLFALLWXLLALKAAC（但し、Ｘはロイシン残基又はリシン残基である：配列番号１２）で示されるアミノ酸配列を有する請求項１〜４の何れか１項に記載の環状ペプチド。
【請求項６】
前記Ａブロックのペプチドは、X1AX2ELX2X2LEX2ELX2X2LE（但し、Ｘ１はＮ−アセチル化されたグリシン残基、アラニン残基、バリン残基、ロイシン残基、イソロイシン残基、フェニルアラニン残基、チロシン残基、セリン残基、トリプトファン残基、スレオニン残基の何れかのＮ−アセチル化アミノ酸残基、Ｘ２はアラニン残基又はアルギニン残基である：配列番号１３）で示されるアミノ酸配列を有する請求項１〜５の何れか１項に記載の環状ペプチド。
【請求項７】
配列番号６又は９で示されるアミノ酸配列を有し、Ｎ末端のアセチルグリシンのアセチル基とＣ末端のシステインのチオール碁がチオエーテル結合した環状ペプチド。
【請求項８】
有効量の請求項１〜７の何れか１項に記載の環状ペプチドを含む抗腫瘍組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は抗腫瘍ペプチド化合物、具体的にはｐ５３とＭＤＭ２の結合ないし相互作用の阻害作用を有するペプチド化合物に関する。
【背景技術】
【０００２】
転写因子ｐ５３は、細胞を悪性転換から防御する重要な経路をコントロールするがん抑制因子である。転写因子ｐ５３はＭＤＭ２（Murine Double Minute 2）タンパク質と結合ないし相互作用をおこす。その結果、ｐ５３遺伝子の転写活性能が遮断され、ｐ５３のがん防御活性が妨げられる。このことから、ＭＤＭ２のｐ５３への結合を阻害することが抗腫瘍戦略として提示されており、数々の化合物がＭＤＭ２のｐ５３への結合ないし相互作用阻害物質として提案されている。例えば、特許文献１には、ＭＤＭ２とｐ５３との結合ないし相互作用を阻害するイミダゾール化合物が、特許文献２にはトリアゾール系化合物がそれぞれ開示されている。また、特許文献３や特許文献４にはそれぞれ特定のアミノ酸配列からなるペプチドが開示されている。
【０００３】
ところで、ｐ５３のトランス活性化ドメイン由来のペプチドに結合したＭＤＭ２の結晶構造から、ＭＤＭ２には比較的深いポケットがあり、そこにｐ５３の１７番目のアミノ酸から１２５番目のアミノ酸で構成された螺旋領域がはまることが明らかにされている（非特許文献１）。従って、このポケットにはまる低分子化合物はアンタゴニストとしてｐ５３とＭＤＭ２の結合ないし相互作用を阻害する可能性がある。また、低分子化合物は細胞膜を透過しやすいので、細胞内にてｐ５３とＭＤＭ２の結合ないし阻害作用を阻害する観点からは好都合であると言える。
【０００４】
アンタゴニストがペプチドである場合、一般的に立体構造が規制されたペプチドが選択される。多くの立体構造が規制されたペプチドはペプチド内ジスルフィド結合によりその立体構造が安定化している。しかしながら、細胞内の還元条件下ではジスルフィド結合が開裂して立体構造が壊れやすいという欠点があった。また、生体内プロテアーゼにより分解され、血清中での半減期が短いという欠点もある。従って、生体内でより安定なペプチドが求められている。
【０００５】
このような欠点を持たない安定化されたペプチドとして、ヘリックス−ループ−ヘリックス構造（Helix-Loop-Helix構造）を有するペプチドが特許文献５などに開示されている。ヘリックス−ループ−ヘリックス構造を有するペプチドは、Ｎ末側のアミノ酸配列（Ｎ末端側ヘリックス：Ａブロック）と、Ｃ末側のアミノ酸配列（Ｃ末端側ヘリックス：Ｃブロック）と、ＡブロックとＣブロックを結合するリンカー（Ｂブロック）を有する。ＡブロックとＣブロックは、リンカーの存在によりそれぞれα−ヘリカルコイルドコイル構造を形成する。このペプチドは低分子構造でありながら溶液中で安定した二次構造を取り、分子中の溶媒側に露出する部分に化学的に異なる性質の官能基を導入しやすい。このような性質を利用して、生理活性を有するヘリックス−ループ−ヘリックス構造を有する種々のペプチドが提案されている。例えば、特許文献６にはヒトインターロイキン４及びヒトインターロイキン１３のアンタゴニストが、特許文献７にはヒトインターロイキン５受容体に結合活性を有するペプチドがそれぞれ開示されている。
【０００６】
また、さらなる安定化を目指して、特許文献８にはＡブロックのＮ末端にあるアミノ酸残基とＣブロックのＣ末端にあるアミノ酸残基をチオエーテル結合等の共有結合により環状化した環状ペプチドが開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０１０−２８０６６６号公報
【特許文献２】特開２０１０−１０５９９２号公報
【特許文献３】特開２０１０−１２０８８１号公報
【特許文献４】特開２０１１−２２５５７１号公報
【特許文献５】特開平１０−２４５３９７号公報
【特許文献６】特開２００５―１５４３８２号公報
【特許文献７】特開２００８−２１４２５４号公報
【特許文献８】特開２０１１−２３１０８５号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Kussie PH, et al., Science 1996, 274, p.948-953
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明者らは、上記ヘリックス−ループ−ヘリックス構造を有するペプチドを基礎として種々のペプチドを合成したところ、ＭＤＭ２のポケットにはまり込むｐ５３の螺旋構造に位置する４つのアミノ酸を上記のヘリックス−ループ−ヘリックス構造に導入したペプチドが、優れたｐ５３とＭＤＭ２の結合ないし阻害作用を阻害すること（以下、「ｐ５３／ＭＤＭ２結合阻害作用」又は「ｐ５３／ＭＤＭ２結合阻害活性」と称する場合がある。）を見いだし、本願発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明はｐ５３／ＭＤＭ２結合阻害作用を有する新規ペプチド化合物及びｐ５３／ＭＤＭ２結合阻害活性を有する新規な抗腫瘍剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の環状ペプチドは、ｐ５３／ＭＤＭ２結合阻害作用を有する環状ペプチドであって、該環状ペプチドは、α−ヘリックス構造を形成するペプチドからなりＮ末端側に位置するＡブロックと、α−ヘリックス構造を形成するペプチドからなりＣ末端側に位置するＣブロックと、ＡブロックとＣブロックを共有結合で結ぶペプチドからなるＢブロックとからなるヘリックス−ループ−ヘリックス構造を有し、前記ＡブロックのＮ末端にあるアミノ酸残基と前記ＣブロックのＣ末端にあるアミノ酸残基が共有結合した環状ペプチドであって、前記Ｃブロックは、外側に向かう部分にＮ末端側から順にフェニルアラニン残基、トリプトファン残基、ロイシン残基又はリシン残基、ロイシン残基の４つのアミノ酸残基を有する環状ペプチドであり、より好ましくは、前記Ａブロックは、外側に向かう部分に少なくとも１以上のアルギニン残基を有する環状ペプチドである。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によると、抗腫瘍作用を有する新規ペプチド化合物が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１（ａ）（ｂ）はそれぞれ本発明に係る環状ペプチドの立体構造の一例を示す模式図である。
【図２】図２は本発明に係る環状ペプチドの円二色性スペクトルである。
【図３】図３は本発明に係る環状ペプチドの円二色性スペクトルである。
【図４】図４は本発明に係る環状ペプチドのｐ５３−ＨＤＭ２相互作用阻害活性を示すグラフである。
【図５】図５は本発明に係る環状ペプチドの細胞増殖阻害活性を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明に係る環状ペプチドは、α−ヘリックス構造を形成するペプチドからなりＮ末端側に位置するＡブロック（Ｎ末端側ヘリックス）と、α−ヘリックス構造を形成するペプチドからなりＣ末端側に位置するＣブロック（Ｃ末端側ヘリックス）と、ＡブロックとＣブロックを共有結合で結ぶペプチドからなるＢブロックとからなるヘリックス−ループ−ヘリックス構造を有する環状ペプチドであって、前記Ｃブロックは、外側に向かう部分にＮ末端側から順にフェニルアラニン残基、トリプトファン残基、ロイシン残基又はリシン残基、ロイシン残基の４つのアミノ酸残基を有し、前記ＡブロックのＮ末端にあるアミノ酸残基と前記ＣブロックのＣ末端にあるアミノ酸残基が共有結合した環状ペプチドである。
【００１５】
本発明において、「アミノ酸」とは天然に存在するＬ−アミノ酸の他Ｄ−アミノ酸を含む意味であり、「天然のアミノ酸」や「修飾されたアミノ酸」と特記される場合を除き、「天然のアミノ酸」及び「修飾されたアミノ酸」を含む意味で用いられる。
【００１６】
ヘリックス−ループ−ヘリックス構造を形成するペプチドは、前記のようにα−ヘリックス構造を形成するペプチドからなる２つのブロック、つまり、Ｎ末端側に位置するＡブロック及びＣ末端側に位置するＣブロックを有し、この２つのブロックを共有結合で結ぶＢブロックを有する。ヘリックス−ループ−ヘリックス構造は、α−ヘリカルコイルドコイル構造とも呼ばれ、この構造を有するペプチドは単一分子として溶液中で安定に存在する。この構造を形成する２つのブロックは、内側に向かう面、つまり２つのブロックＡ、Ｃが互いに向かい合う面にロイシンのような疎水性のアミノ酸残基を有している。また、外側に向かう面、つまり、２つのブロックＡ、Ｃが互いに遠ざかる面にヘリックス形成能の高いアミノ酸を有している。このようなヘリックス−ループ−ヘリックス構造は例えば特開平１０−２４５３９７号に開示されており、本明細書においては当該公報に開示された内容が適宜参照される。
【００１７】
本発明に係る環状ペプチドは、前記ヘリックス−ループ−ヘリックス構造が、Ｎ末端側に位置するＡブロックのＮ末端のアミノ酸残基と、Ｃ末端側に位置するＣブロックのＣ末端のアミノ酸残基が共有結合により結合したペプチド化合物である。
【００１８】
環状を形成するための共有結合は、分子内結合を形成できればよく、係る共有結合はチオエーテル結合、ジスルフィド結合、ペプチド結合、エーテル結合、エステル結合が例示される。分子内結合は、天然のアミノ酸と天然のアミノ酸の結合、天然のアミノ酸と修飾されたアミノ酸の結合、修飾されたアミノ酸と修飾されたアミノ酸の結合の何れでもよい。例えば、Ｎ末端のアミノ酸残基及びＣ末端のアミノ酸残基がいずれも天然のアミノ酸残基であれば、ペプチド結合により環状ペプチドが形成される。Ｎ末端のアミノ酸残基及びＣ末端のアミノ酸残基がいずれもシステイン又は修飾されたシステインであれば、ジスルフィド結合により環状ペプチドが形成される。Ｎ末端のアミノ酸残基又はＣ末端のアミノ酸残基の一方が修飾されたアミノ酸残基、例えば、アセチル化アミノ酸であり、他方のアミノ酸残基がシステイン又は修飾されたシステインであれば、チオエーテル結合が形成される。形成された環の安定性が考慮されて、結合様式が適宜選択される。係る観点から、Ｎ末端又はＣ末端の一方のアミノ酸残基がアセチル基で修飾されたＮ−アセチル化アミノ酸残基と、他方のアミノ酸残基がシステイン又は修飾されたシステインによるチオエーテル結合が好ましい。また、Ｎ−アセチル化アミノ酸残基を構成するアミノ酸は、Ｎ−アセチル化可能な中性アミノ酸又は修飾された中性アミノ酸であり、例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、チロシン、セリン、トリプトファン及びスレオニンであり得る。
【００１９】
本発明の環状ペプチドは、前記Ｃブロックの外側に向かう面に、Ｎ末端側から順にフェニルアラニン残基、トリプトファン残基、ロイシン残基又はリシン残基、ロイシン残基の４つのアミノ酸残基を有する。これらのアミノ酸残基は天然のアミノ酸残基であっても、修飾されたアミノ酸残基の何れでもよいが、ＭＤＭ２との結合ないし相互作用を考慮すると、天然のアミノ酸残基が好ましい。
【００２０】
４つのアミノ酸残基はＣブロックの外側に向かう面に位置するように配置される。従って、ペプチドの一次構造ではこの４つのアミノ酸残基は必ずしも連続するとは限らない。４つのアミノ酸は、ｐ５３タンパク質が結合するＭＤＭ２のポケットに入るように、Ｃブロックの外側に向かう位置にＮ末端側からＣ末端側に向けて配置される。４つのアミノ酸は、α−ヘリックス構造によりＣブロックを形成する２〜数回転の螺旋のうち、連続して存在する螺旋上に位置し、連続して存在する螺旋上であればいずれの螺旋上であってもよい。例えば、１番目の螺旋上の外側に向いた位置と２番目の螺旋上の外側に向いた位置に前記４つのアミノ酸が配置されたペプチドや２番目の螺旋上の外側の向いた位置と３番目の螺旋上の外側に向いた位置に前記４つのアミノ酸が配置されたペプチドが例示される。Ｃブロックを構成するアミノ酸残基数は任意であるが、２〜数回転の螺旋を形成するアミノ酸残基数、具体的には、１２〜１８残基程度が好ましい。また、Ｃブロックを構成するアミノ酸残基数と、Ａブロックを構成するアミノ酸残基数とは同数であっても、また、異数であってもよいが、安定性の観点からは同数であるのが好ましい。
【００２１】
Ｃブロックを構成するアミノ酸配列は、例えば、配列番号１１に示されるアミノ酸配列（KLAALKFKLLWXKLAC：但し、Ｘはロイシン残基又はリシン残基である。）であり、配列番号１２（KLFALLWXLLALKAAC：但し、Ｘはロイシン残基又はリシン残基である。）に示されるアミノ酸配列であり得る。
【００２２】
本発明の環状ペプチドは、好ましくは、前記Ａブロックの外側に向かう面に、１以上のアルギニン残基を有する。アルギニンは立体構造をもった低分子タンパク質の細胞膜透過性を高めることが知られており（A. Schepartz  et al., J. Am. Chem. Soc. 2008, 130, p2948-2949）、環状ペプチドの細胞透過性が高まる。この結果、細胞内においてｐ５３／ＭＤＭ２の結合活性を阻害することが期待される。
【００２３】
アルギニン残基の数はＡブロックのα−ヘリックス構造を維持できる限り多ければよく、Ａブロックにおいて外側に向くアミノ酸残基がすべてアルギニン残基であることが好ましい。Ａブロックを構成するアミノ酸配列は、例えば配列番号１３に示されるアミノ酸配列（X1AX2ELX2X2LEX2ELX2X2LE：但し、Ｘ１はＮ−アセチル化されたグリシン残基、アラニン残基、バリン残基、ロイシン残基、イソロイシン残基、フェニルアラニン残基、チロシン残基、セリン残基、トリプトファン残基、スレオニン残基の何れかのＮ−アセチル化アミノ酸残基、Ｘ２はアラニン残基又はアルギニン残基である）であり得る。
【００２４】
ＡブロックのＣ末端とＣブロックのＮ末端を結ぶＢブロックは、ヘリックス−ループ−ヘリックス構造を安定に形成するためのペプチドである。Ｂブロックは、例えば、１〜９個のグリシン残基からなるペプチド、好ましくは７〜９個のグリシン残基からなるペプチド、さらに望ましくは７個のグリシン残基からなるペプチドである。当該ペプチドとして特開平１０−２４５３９７号公報に記載されたリンカー用のペプチドも使用され得る。
【００２５】
本発明の環状ペプチドは、非環状ペプチドを得た後、これを環化させることにより製造される。非環状ペプチドは公知の方法で合成され得る。合成方法として、例えば、Fmoc法やBoc法のような固相合成法、フラグメント縮合法のような液相合成法などが例示される。操作が簡便である点から固相合成法が好ましい。固相合成法として、例えば、R.B. Merrifieldの方法（J. Am. Chem. Soc., 1963, 85, p.2149-2154）が参照される。非環状ペプチドの合成は市販のペプチド合成機器を用いて行い得る。また、非環状ペプチドは遺伝子工学的手法によっても合成され得る。遺伝子工学的手法も公知であり、上記のアミノ酸配列をコードする核酸を組み込んだ発現ベクターにより適切な宿主細胞を形質転換すればよい。
【００２６】
非環状ペプチドを環化する方法も公知であり、非環状ペプチドのＮ末端にあるアミノ酸残基と非環状ペプチドのＣ末端にあるアミノ酸残基に応じて適切な方法が選択される。例えば、チオエーテル結合による場合、Ｃ末端にシステイン残基を、Ｎ末端に天然のアミノ酸残基のアミノ基がクロロアセチル化されたＮ−クロロアセチルアミノ酸残基を有する非環状ペプチドを合成し、その後システインのチオール基とクロロアセチル基を常法により反応させて環状ペプチドを合成する。この方法には、当該非環状ペプチドを塩基性の緩衝液中で反応させる方法が例示される。ジスルフィド結合の場合には、Ｎ末端及びＣ末端にシステインを有する非環状ペプチドを合成し、その後システインのチオール基同士を常法により反応させて環状ペプチドを合成する。この方法には、空気酸化法、フェリシアン化カリウムを用いる酸化法が例示される。ペプチド結合による場合には、Ｎ末端のアミノ酸残基のアミノ基とＣ末端のアミノ酸残基のカルボキル基を常法により反応させて環状ペプチドを合成する。この方法には、ジシクロヘキシルカルボジイミドなどの縮合剤を用いる脱水縮合反応、対称酸無水物法、活性エステル法が例示される。
【００２７】
得られた環状ペプチドはｐ５３タンパク質とＭＤＭ２の結合ないし相互作用を妨げる。この結果、ｐ５３遺伝子の転写活性が正常に機能し、腫瘍の形成抑制作用が発揮される。腫瘍形成抑制作用が期待される対象は、例えば、結腸腺癌であり、甲状腺癌であり、肺癌腫であり、骨髄性白血病であり、結腸直腸癌であり、乳癌であり、肺癌であり、胃癌であり、食道癌であり、Ｂリンパ腫であり、卵巣癌であり、膀胱癌であり得る。
【００２８】
本発明に係る抗腫瘍組成物は上記の環状ペプチドを有効成分とする。本発明の抗腫瘍組成物は、有効量の環状ペプチドの他に薬理学的に許容し得る製剤用の助剤を含み得る。助剤は、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、潤沢剤、被覆剤、矯味剤、可溶化剤であり得る。当該組成物はヒトを含む動物に経口又は非経口で適用し得る形態（剤型）として提供される。当該剤型は、例えば、錠剤であり、顆粒剤であり、散剤であり、液剤であり、注射剤であり、座剤であり得る。
【００２９】
本発明に係る環状ペプチドの投与量は、性別や体重、年齢、人種、症状等に応じて当業者により適宜決定される。その投与量の下限は、例えば、０.００１μg/kg体重であり、０.０１μg/kg体重であり、０.１μg/kg体重であり、０.００１mg/kg体重であり、０.０１mg/kg体重であり、０.０５mg/kg体重であり、０.１mg/kg体重であり得る。また、その上限は、例えば、１０００mg/kg体重であり、１００mg/kg体重であり、１０mg/kg体重であり、５mg/kg体重であり、１mg/kg体重であり得る。
【００３０】
次に本発明について下記の実施例に基づいて詳細に説明する。なお、下記の実施例は例示であり、本発明は下記の実施例に限られないのはいうまでもない。
【実施例１】
【００３１】
１.非環状ペプチドの合成
表１に示された塩基配列を有する非環状ペプチドをFmoc固相合成法により合成した。15-29p53（配列番号１）、YT1（配列番号２）、YT1-S（配列番号３）、HLHp53-1A（配列番号５）、HLHp53-2A（配列番号８）、HLHp53-1C（配列番号１０）はそれぞれFmoc amide resin（置換率0.67 mmol/g）を、YT1-RS（配列番号４）、HLHp53-1R（配列番号６）、HLHp53-1RΔ（配列番号７）、HLHp53-2R（配列番号９）はそれぞれFmoc-PAL-PEG-PS（置換率0.21 mmol/g）を使用した。15-29p53、YT1、YT1-S、HLHp53-1A、HLHp53-2A、HLHp53-1Cはそれぞれpeptide synthesizer simultaneous multiple, PSSM-8 (Shimadzu)を用い、YT1-RS、HLHp53-1R、HLHp53-1RΔ、HLHp53-2Rはそれぞれ手動で合成した。ペプチド合成に使用したFmoc-アミノ酸はApplied Biosystems、nova biochem、Peptide institute, inc.、Watanabe Chem. Ind., Ltd.から購入した。２０％のPiperidine（Sigma）を含むＤＭＦ(Wako)中で１５分間反応し、Fmoc保護基を脱保護した。各カップリング工程において、ＤＭＦに溶解したFmoc-アミノ酸をHBTU（Peptide institute, inc.）／HOBt（Peptide institute, inc.）で活性化した後、３０分間、カップリング反応を行った。脱保護工程及びカップリング工程での反応後、それぞれＤＭＦによる洗浄を５回行った。カップリング反応後、表２の条件に従ってペプチドの脱樹脂・脱保護を行った。脱樹脂・脱保護したペプチドは、冷diethyl ether（nacalai tesque）中で沈殿させ、生成物を集め乾燥させた。なお、ペプチド名は、環状化前後で同一の名称を用いている。
【００３２】
【表１】
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【００３３】
ここにおいて、ペプチド15-29p53はｐ５３（タンパク質）の１５〜２９番目に対応するペプチド、ペプチドYT1は環状化がなくとも自発的なフォールディングによりヘリックス−ループ−ヘリックス構造をとるように設計された非環状ペプチド、ペプチドYT1-SはペプチドYT1のＣ末端にシステイン（Ｃ）を導入し、Ｎ末端のアラニン（Ａ）とＮ−アセチルグリシンを介してチオエーテル結合した環状ペプチド、ペプチドYT1-RSはペプチドYT1-RSのＡブロックにおいて外側を向いたアラニン（Ａ）がアルギニン（Ｒ）に置換された環状ペプチドである。これらのペプチドは対照となるペプチドである。ペプチドYT1-SやペプチドYT1-RSはそれぞれ環状化しているので、ペプチドYT1に比べてより安定したαヘリックス構造をとる。
【００３４】
ペプチドHLHp53-1A、ペプチドHLHp53-1R、ペプチドHLHp53-2A、ペプチドHLHp53-2Rはそれぞれ環状化した環状ペプチドであり、ペプチドHLHp53-1RΔはそれぞれヘリックス−ループ−ヘリックス構造を採る非環状ペプチドである。これらのペプチドにおいては、それぞれＡブロックにおいて外側にアルギニン（Ｒ）が向いており、Ｃブロックにおいて外側にフェニルアラニン（Ｆ）残基、トリプトファン（Ｗ）残基、ロイシン（Ｌ）残基又はリシン（Ｋ）残基、ロイシン（Ｌ）残基が向いている。Ｃブロックにおけるこれら４カ所のアミノ酸残基は、それぞれｐ５３の１９番目のＦ、２３番目のＷ、２４番目のＫ、２６番目のＬが対応している。そして、ペプチドHLHp53-1A、ペプチドHLHp53-1Rでは、Ｃブロックの２番目と３番目の螺旋上にフェニルアラニン（Ｆ）残基、トリプトファン（Ｗ）残基、ロイシン（Ｌ）残基又はリシン（Ｋ）残基、ロイシン（Ｌ）残基が位置しており、ペプチドHLHp53-2A、ペプチドHLHp53-2RではＣブロックの１番目と２番目の螺旋上にこれらのアミノ酸残基が位置している。ペプチドHLHp53-1CはＣブロックに相当するペプチドである。表１中、該当するアミノ酸残基には下線が引かれている。
【００３５】
【表２】
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【００３６】
２.非環状ペプチドの精製及び環状化ペプチドの分子量の確認
合成したペプチドはRP-HPLC（C18 column、250 mm x 10 mm inside diameter、YMC）により精製した。精製はHPLC装置（LaChrom ELITE (HITACHI）)を用いて、以下の条件でおこなった。次いで、精製したペプチドの分子量をMALDI-TOF-MS法（AutoflexＩＩ: Bruker Daltonics）で確認し、精製したペプチドの純度をRP-HPLC（C18 column、 250 mm x 4.6 mm inside diameter, YMC）で測定した。
【００３７】
精製後、HLHp53-1A、HLHp53-1R、HLHp53-2A、HLHp53-2R、YT1-S、YT1-RSのＮ末端側のN-(chloroacetyl) glycineとＣ末端側のシステインの間でチオエーテル結合させ、各ペプチドを環状化した。ペプチド溶液を30ｍＭのTris-HCl buffer（pH 8.5）中に室温で撹拌しながら一晩かけて滴下して反応させ、チオエーテル結合させた。環状化したペプチドを上記方法と同様にして精製した後、精製したペプチドの分子量を測定した。この結果、得られたペプチドの分子量が理値と一致し、環状化が行われていることが確認された。
【００３８】
〔HPLC分離条件〕
Column：YMC-Pack ODS-AM AM-323 250×10 mmI.D.（YMC Co.,Ltd.）
Eluent：HLHp53-1A、HLHp53-1R、HLHp53-2R、HLHp53-2RΔ、YT1-S、YT1-RS
30−50％Ｂ（0−30min、liner）
：HLHp53-2A
40−50％Ｂ（0−30min、liner)
ただし  Ａ）０.１％TFA in water（TFA：NACALAI TESQUE）
Ｂ）Acetonitrile（NACALAI TESQUE）
Flow rate：３.０ ml/min
Detection：UV at 280 nm
【００３９】
３.環状ペプチドの立体構造（円二色性スペクトル測定）
得られた環状ペプチドが二次構造−ヘリックスを維持していることを、円二色性スペクトル測定により確認した。円二色分散計（J-820、日本分光）を用い、２０μＭペプチド溶液（PBS、pH 7.4）を用いて２０℃で円二色性スペクトルを測定し、平均残基楕円率［θ］222を算出した。冷却装置としてペルチェ式恒温装置（PTC-423L、日本分光）、水冷式冷却装置（TBG 120 AA Cooling Circulator、Advantec）を用いた。サンプル測定には QUARTZ CELL（GL Science）を用いた。その結果を図２、３及び表３に示した。なお、平均残基楕円率[θ]222は次の計算式で求められる。
［θ］222＝θobs／（１０× l × C × n ）（deg.cm2/dmol）
ここでθobsは楕円率の測定値、lは光路長（cm）、Cはペプチド濃度（Ｍ）を、ｎはペプチドのアミノ酸残基数を示す。
【００４０】
二次構造−へリックスを形成している場合、円二色性スペクトルは２０８nmと２２２nmに負の極大を示す。図２及び図３に示されたように、YT1、YT1-S、YT1-RS、HLHp53-1A、HLHp53-1R、HLHp53-2A、HLHp53-2R、HLHp53-1RΔは、設計したとおりヘリックス−ループ−ヘリックス構造を維持することが確認された。他方、HLHp53-1Rの部分ペプチドであるHLHp53-1Cとp53由来ペプチド15-29ｐ５３は特定の立体構造をもたなかった。このことから、ヘリックス-ループ-ヘリックス構造を維持するためには、設計したペプチド全長が必要であることを確認した。なお、HLHp53-1Aは溶解度が低いために、平均残基楕円率を求めることができなかった。
【００４１】
４.環状ペプチドのhuman ＭＤＭ２（ＨＤＭ２）に対する結合親和力（表面プラズモン共鳴法）
ＨＤＭ２のｐ５３結合ドメインであるアミノ酸配列１７−１２５からなる合成ＨＤＭ２部分タンパク質（truncate HDM2：ｔＨＤＭ２）に対するペプチドの解離定数（ＫＤ値）を表面プラズモン共鳴法により測定した。ｔＨＤＭ２は、前記アミノ酸配列１７−１２５の領域（Science、1996、274、948-953）をコードした遺伝子をGenScriptに委託することにより合成された。タンパク合成用の遺伝子は制限酵素サイトNdeI、BamHIを含むpUC57ベクターに含まれる形で作製された。コンピテントセルDH5αに遺伝子を導入し、培養することによりtHDM2遺伝子を増幅した。プラスミド抽出はQIAprep spin miniprep kit (QIAGEN)によって精製した。制限酵素処理後、同じく制限酵素処理したベクター pET28aに導入した。His-tag融合tHDM2はBL21 (DE) E.coli細胞によって発現し、Ni sepharose high performance (GE Healthcare)を用いたNi-カラムによって精製した。さらにAKTA explorer 10S (GE Healthcare)により陽イオン交換カラム１ml HiTrap SP FF (GE Healthcare)を用いて精製した。BIACORE (GE Healthcare)を用いてSPR法により完全長ｐ５３（abcam）との相互作用を解析したところ、精製されたタンパク質は、完全長ｐ５３と同等のＫＤ値を有し、ｔＨＤＭ２の活性が確認された。
【００４２】
精製されたｔＨＤＭ２をアミンカップリング法によりセンサーチップＣＭ５（GE Healthcare）に固定した。ｔＨＤＭ２の固定化量は１５３０.０ＲＵ（Resonance Units）であった。Evaluation Software (GE Healthcare)によるカーブフィッティング解析を行い、１：１Bindingモデルを用いて解離定数（ＫＤ値）を算出した。その結果を表３及び図４に示した。
【００４３】
〔測定条件〕
装置：BIACORE T200
測定温度：２５℃
ランニングバッファー：１０ｍＭ HEPES、１５０ｍＭ NaCl、３ｍＭ EDTA、
０.００５％（v/v） surfactant P20、ｐＨ７.４
流速：３０μl/min
【００４４】
（固定化条件）
センサーチップ：ＣＭ５
装置：BIACORE T200
測定温度：２５℃
ランニングバッファー：PBS-T
PBS-T（pH 7.4）（1000ml）
１.５ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４
２.７ｍＭ  ＫＣｌ
８.１ｍＭ  ＮａＨＰＯ４
０.１４Ｍ  ＮａＣｌ
０.００５％(v/v) Surfactant P20：２５０μｌ
０.２２μｍフィルターを通し、超音波洗浄装置で脱気した。
流速：１０μl/min
リガンド：１０００μＭのｔＨＤＭ２
リガンド希釈液：５０ｍＭ酢酸緩衝液（pH 4.5）
【００４５】
ＥＤＣ(N-ethyl-N'-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride) とＮＨＳ (N-hydroxysuccinimide)の等量混合液をインジェクトし、流速１０μl/minで７分間流してセンサーチップＣＭ５表面のカルボキシル基を活性化した。ｔＨＤＭ２を５０ｍＭ酢酸緩衝液（pH 4.5）で１０００μＭに調製し、流速１０μl/minで１０分間流してセンサーチップＣＭ５の表面に固定化した。続いて１Ｍのethanolamine-HCl（pH 8.5）を流速１０μl/minで７分間流すことで未反応のカルボキシル基をキャップした。
【００４６】
ペプチドHLHp53-1R及びHLHp53-2Rはそれぞれ標的分子ＨＤＭ２へ高い結合親和力を示した。その解離定数はそれぞれ６ｎＭ、１６ｎＭであった。一方、特定の立体構造をもたないHLHp53-1CやYT1などのペプチドの結合親和力は低かった。
【００４７】
５.環状ペプチドのＨＤＭ２−ｐ５３相互作用阻害活性（ＩＣ５０）
表面プラズモン共鳴法（Surface Plasmon resonance：SPR法）により、合成したペプチドによるＨＤＭ２−ｐ５３の相互作用阻害試験を行った。
【００４８】
15-29ｐ５３を５０ｍＭホウ酸緩衝液（pH 8.5）で１０００μＭに調製した他は前記条件と同じ条件でセンサーチップＣＭ５に固定化した15-29ｐ５３に対して、ｔＨＤＭ２と各ペプチドとの競合阻害試験を行った。１００ｎＭのｔＨＤＭ２と、いくつかの濃度に調製した各ペプチドを混合し、室温で３０分間インキュベートした後、BIACORE T200を用いて下記の条件にて測定した。また、ｔＨＤＭ２のサンプルチューブへの非特異的な吸着を防ぐために１mg/mlのＢＳＡ（nacalai tesque）を加えた。測定したサンプルのうち、15-29ｐ５３はポジティブコントロール、ｔＨＤＭ２はネガティブコントロールとして利用した。３回の独立した測定を行い、その平均値を表３に示した。
【００４９】
（測定条件）
センサーチップ        ：ＣＭ５（リガンド：15-29ｐ５３、固定化量：７６.７RU）
装置                  ：BIACORE T200
測定温度：            ：２５℃
ランニングバッファー  ：PBS-T（ただし、0.05％のSurfactant P20を含む、pH 7.4）
流速                  ：２０μl/min
Contact time          ：１２０sec
Dissociation time     ：２４０sec
Regeneration          ：Glycine-HCl pH 2.0
Contact time          ：１０sec
Flow rate             ：２０μl/min
Stabilization period  ：６０sec
【００５０】
それぞれのペプチドに阻害されずに15-29ｐ５３と相互作用したｔＨＤＭ２の濃度は、ｔＨＤＭ２のみをインジェクトし、15-29ｐ５３との結合が平衡になった時のＲＵ値を１００％とみなして計算した。各ペプチドによるｔＨＤＭ２−ｐ５３の相互作用に対するＩＣ５０はＸ軸に阻害剤の濃度(Concentration inhibitor)、Ｙ軸にアナライト結合量(Normalized Response)をプロットして、以下の計算式を用いて、KaleidaGraph 4.0J (Hulinks)によって算出した(Nordin H., et al., Anal. Biochem. 2005. 340, p.359-368)。
Normalized Response＝Ｍ１−｛（Ｍ１−Ｍ２）／［１＋（Concentration inhibitor／Ｍ３）Ｍ４］｝
Ｍ１＝Ｙ軸の最小値、Ｍ２＝Ｙ軸の最大値、Ｍ３＝ＩＣ５０、Ｍ４＝勾配
【００５１】
ネガティブコントロールであるYT1、YT1-S、YT1-RS以外のペプチドは15-29ｐ５３とｔＨＤＭ２の相互作用を競合阻害した。各ペプチドのＩＣ５０は、HLHp53-1Rは８４.４ｎＭ、HLHp53-2Rは３６６.６ｎＭ、15-29p53は７２０ｎＭと求められた。このことからHLHp53ペプチドが天然のｐ５３と同じ領域で結合していることが示され、ｐ５３のアミノ酸配列のグラフティングによって設計されたヘリックス−ループ−ヘリックスペプチドがＨＤＭ２−ｐ５３の相互作用を競合阻害することが確認された。また、HLHp53-1AやHLHp53-2Aは両者の結合ないし相互作用を阻害するものと理解されるが、Ａブロックにおいて外を向くアルギニン残基が少ないために水溶性が低くなり、結果的に阻害を測定できなかった。
【００５２】
【表３】
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【００５３】
６.細胞増殖阻害活性
最も結合親和力の大きかったペプチドHLHp53-1Rならびに既知である低分子阻害剤Nutlin-3（Sigma）、さらに対照物質としてＨＤＭ２結合性をもたないペプチドYT1-RSを用い、細胞増殖阻害試験を実施した。対象細胞として、ｐ５３野生型のがん細胞HCT116（ATCC:CCL-247）とｐ５３変異型のがん細胞SW480(ATCC:CCL-228)を用いた。培養した細胞（HCT116：培地：１％pen-strep、１０％FBS、McCoy's 5A(GIBCO)、SW480培地：１％pen-strep、１０％FBS、DMEM (GIBCO)）を、それぞれ３０００cells/wellとなるように細胞培養用96-well microtest plate（BD Falcon:353072）に加え、３７℃、５％ＣＯ２条件下で、一晩静置した。各ペプチド及びNutlin-3をセルに加え、３７℃、５％ＣＯ２条件下で３日間培養した。各ペプチド及びNutlin-3に対するがん細胞の生存能は細胞増殖試薬WST-1（Roche:11644807001）によるテトラゾリウムアッセイ（In Vitro Toxicol. 1995, 8, p.187-190）によって定量した。培養したプレートにWST-1を１０μl/wellで添加し、４時間後にModel 680 microplate reader (BIO-RAD)で波長４５０ｎｍの吸光度を測定した。がん細胞の生存能はコントロールを１００％として算出した。その結果を図５に示した。ペプチドHLHp53-1RはNutlin-3と比較して優位（ｐ＜０.０５）に細胞増殖を阻害した。
【図５】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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