(57)【要約】【課題】受胎率の良いウシの迅速な検出に貢献できる、CTTNBP2NL遺伝子以外の新たな指標を提供すること。【解決手段】ウシから分離された核酸試料について、PKP2遺伝子、CACNB2遺伝子及びSETD6遺伝子のうちの少なくとも１つの遺伝子領域における変異の有無を検出することを含む、ウシの受胎率を判定する方法を提供した。前記各遺伝子において、変異型アリルの存在が低受胎率の指標となる。PKP2遺伝子の変異は、PKP2遺伝子の発現が抑制される変異であり、CACNB2遺伝子の変異は、CACNB2遺伝子の発現が抑制される変異であり、SETD6遺伝子の変異は、SETD6タンパク質のメチル基転移活性が上昇する変異である。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウシから分離された核酸試料について、PKP2遺伝子、CACNB2遺伝子及びSETD6遺伝子のうちの少なくとも１つの遺伝子領域における変異の有無を検出することを含む、ウシの受胎率を判定する方法であって、前記各遺伝子において、変異型アリルの存在が低受胎率の指標となる、方法。
【請求項２】
PKP2遺伝子領域における変異は、PKP2遺伝子の発現が抑制される変異であり、CACNB2遺伝子領域における変異は、CACNB2遺伝子の発現が抑制される変異であり、SETD6遺伝子領域における変異は、SETD6タンパク質のメチル基転移活性が上昇する変異である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
PKP2遺伝子領域における変異は、配列番号１に示される塩基配列における第3476番塩基及び第3477番塩基の間への挿入変異であり、CACNB2遺伝子領域における変異は、配列番号２に示される塩基配列における第2457番塩基及び第2458番塩基の間への挿入変異であり、SETD6遺伝子領域における変異は、SETD6タンパク質の第360番アミノ酸がアラニンからグルタミン酸に置換するアミノ酸置換変異である、請求項２記載の方法。
【請求項４】
PKP2遺伝子領域における前記挿入変異は、TAが挿入される変異であり、CACNB2遺伝子領域における前記挿入変異は、ATが挿入される変異であり、SETD6遺伝子領域における前記アミノ酸置換変異は、配列番号３に示される塩基配列における第3002番塩基がシトシンからアデニンに置換する変異である、請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記核酸試料がゲノミックDNA試料である請求項１ないし４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
PKP2遺伝子領域における変異の有無の検出は、配列番号１における3477番目の塩基（配列番号１０における519番目の塩基）を含む領域をゲノミックDNA試料から核酸増幅法により増幅することを含み、CACNB2遺伝子領域における変異の検出は、配列番号２における2458番目の塩基（配列番号１１における189番目の塩基）を含む領域をゲノミックDNA試料から核酸増幅法により増幅することを含み、SETD6遺伝子領域における変異の検出は、配列番号３における3002番目の塩基（配列番号１２における126番目の塩基）を含む領域をゲノミックDNA試料から核酸増幅法により増幅することを含む、請求項５記載の方法。
【請求項７】
下記の基準に基づいて受胎率が判定される、請求項１ないし６のいずれか１項に記載の方法：
PKP2遺伝子については、配列番号１における3477番目の塩基（配列番号１０における519番目の塩基）が、グアニンである場合は受胎率が高く、チミンである場合は受胎率が低い；
CACNB2遺伝子については、配列番号２における2458番目の塩基（配列番号１１における189番目の塩基）が、シトシンである場合は受胎率が高く、アデニンである場合は受胎率が低い；
SETD6遺伝子については、配列番号３における3002番目の塩基（配列番号１２における126番目の塩基）が、シトシンである場合は受胎率が高く、アデニンである場合は受胎率が低い。
【請求項８】
PKP2遺伝子領域内の変異部位を含む領域を増幅するプライマーセット、CACNB2遺伝子領域内の変異部位を含む領域を増幅するプライマーセット、及びSETD6遺伝子領域内の変異部位を含む領域を増幅するプライマーセットのうちの少なくともいずれか１つを含む、ウシの受胎率の判定試薬。
【請求項９】
PKP2遺伝子領域内の変異部位を含む領域を増幅するプライマーセットは、配列番号１における3477番目の塩基を含むウシゲノム上の領域を増幅するプライマーセットであり、CACNB2遺伝子領域内の変異部位を含む領域を増幅するプライマーセットは、配列番号２における2458番目の塩基を含むウシゲノム上の領域を増幅するプライマーセットであり、SETD6遺伝子領域内の変異部位を含む領域を増幅するプライマーセットは、配列番号３における3002番目の塩基を含むウシゲノム上の領域を増幅するプライマーセットである、請求項８記載の判定試薬。
【請求項１０】
PKP2遺伝子領域内の変異部位を含む領域を増幅するプライマーセットは、配列番号１に示す塩基配列中の第1番〜第3476番塩基の領域内の部分領域に特異的にハイブリダイズするフォワード側プライマーと、配列番号１に示す塩基配列中の第3479番〜第3985番塩基の領域内の部分領域に特異的にハイブリダイズするリバース側プライマーとのセットであり、CACNB2遺伝子領域内の変異部位を含む領域を増幅するプライマーセットは、配列番号２に示す塩基配列中の第1番〜第2457番塩基の領域内の部分領域に特異的にハイブリダイズするフォワード側プライマーと、配列番号２に示す塩基配列中の第2460番〜第2974番塩基の領域内の部分領域に特異的にハイブリダイズするリバース側プライマーとのセットであり、SETD6遺伝子領域内の変異部位を含む領域を増幅するプライマーセットは、配列番号３に示す塩基配列中の第1番〜第3001番塩基の領域内の部分領域に特異的にハイブリダイズするフォワード側プライマーと、配列番号３に示す塩基配列中の第3003番〜第3322番塩基の領域内の部分領域に特異的にハイブリダイズするリバース側プライマーとのセットである、請求項９記載の判定試薬。
【請求項１１】
PKP2遺伝子領域内の変異部位を含む領域を増幅するプライマーセットは、配列番号４に示す塩基配列からなるプライマーと、配列番号５に示す塩基配列からなるプライマーとのセットであり、CACNB2遺伝子領域内の変異部位を含む領域を増幅するプライマーセットは、配列番号６に示す塩基配列からなるプライマーと、配列番号７に示す塩基配列からなるプライマーとのセットであり、SETD6遺伝子領域内の変異部位を含む領域を増幅するプライマーセットは、配列番号８に示す塩基配列からなるプライマーと、配列番号９に示す塩基配列からなるプライマーとのセットである、請求項１０記載の判定試薬。
【請求項１２】
請求項８ないし１１のいずれか１項に記載の判定試薬を含む、ウシの受胎率の判定キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウシの受胎率の判定方法、判定試薬及び判定キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
酪農家にとって、乳牛の泌乳能力の向上と共に繁殖性の改善は重要である。近年、ホルスタインの泌乳能力は飼養管理の改善及び遺伝改良により飛躍的に向上した一方、受胎率の低下が顕著である。受胎率の低下は、泌乳量の増大によるストレス等環境要因の影響だけでなく、繁殖性の改善のための遺伝改良を行っていなかったためと考えられる。
【０００３】
本願発明者らはこれまでに、ウシのCortactin binding protein 2 N-terminal-like (CTTNBP2NL)遺伝子が受胎率に関与すること、該遺伝子の3'UTRにおける塩基置換を指標として受胎率を評価できることを報告している（非特許文献１、２）。しかしながら、CTTNBP2NL遺伝子以外で受胎率評価の指標となる遺伝子は知られていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】杉本真由美ら、「Cortactin binding protein 2 N-terminal-likeはウシ受胎率に関与する」、第34回日本分子生物学会年会プログラム・要旨集(Web)、1T11PI-4、2011年発行
【非特許文献２】杉本真由美ら、「Cortactin binding protein 2 N-terminal-likeはgap junctionの透過性調節を介して着床を阻害する」、第35回日本分子生物学会年会プログラム・要旨集(Web)、1P-0338、2012年発行
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
受胎率に差をもたらす遺伝子の変異を検出する遺伝子診断法を確立すれば、受胎率の良い個体を迅速に検出できる。したがって、本発明は、受胎率の良いウシの迅速な検出に貢献できる、CTTNBP2NL遺伝子以外の新たな指標を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本願発明者らは、鋭意研究の結果、受胎率と密接に関連する遺伝子として新たにPKP2、CACNB2、SETD6遺伝子を同定することに成功し、本願発明を完成した。
【０００７】
すなわち、本発明は、ウシから分離された核酸試料について、PKP2遺伝子、CACNB2遺伝子及びSETD6遺伝子のうちの少なくとも１つの遺伝子領域における変異の有無を検出することを含む、ウシの受胎率を判定する方法であって、前記各遺伝子において、変異型アリルの存在が低受胎率の指標となる、方法を提供する。また、本発明は、PKP2遺伝子領域内の変異部位を含む領域を増幅するプライマーセット、CACNB2遺伝子領域内の変異部位を含む領域を増幅するプライマーセット、及びSETD6遺伝子領域内の変異部位を含む領域を増幅するプライマーセットのうちの少なくともいずれか１つを含む、ウシの受胎率の判定試薬を提供する。さらに、本発明は、上記本発明の判定試薬を含む、ウシの受胎率の判定キットを提供する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、受胎率の高いウシを迅速に検出できる新たな方法が提供される。受胎率は複数の遺伝子が関わっている量的形質である。受胎率判定の指標となる遺伝子変異を複数組み合わせて調べることにより、受胎率の良いウシのスクリーニングの精度がさらに高まるので、繁殖性の改善のための遺伝改良をより迅速に進めることができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】実施例で同定されたPKP2遺伝子の変異部分を示す図である。四角は、挿入部分を検出するためのPCRプライマーPKP2-F及びPKP2-Rの該当する位置、→はプライマーの5'から3'への方向を示す。
【図２】実施例で同定されたPKP2遺伝子の変異部位近傍の塩基配列の波形データである。図１に示した領域のPCR増幅断片の塩基配列を決定すると、高受胎率型のゲノミックDNAを鋳型とした増幅断片では519番目の塩基がグアニン（G）であり、低受胎率型のゲノミックDNAを鋳型とした増幅断片では519番目の塩基にチミン（T）が見られる。
【図３】CACNB2遺伝子の変異部分を示す図である。四角は、挿入部分を検出するためのPCRプライマーCACNB2-F及びCACNB2-Rの該当する位置、→はプライマーの5'から3'への方向を示す。
【図４】実施例で同定されたCACNB2遺伝子の変異部位近傍の塩基配列の波形データである。図３に示した領域のPCR増幅断片の塩基配列を決定すると、高受胎率型のゲノミックDNAを鋳型とした増幅断片では189番目の塩基がシトシン（C）であり、低受胎率型のゲノミックDNAを鋳型とした増幅断片では189番目の塩基にアデニン（A）が見られる。
【図５】実施例で同定されたSETD6遺伝子の変異部分を示す図である。四角は、挿入部分を検出するためのPCRプライマーSETD6-F及びSETD6-Rの該当する位置、→はプライマーの5'から3'への方向を示す。
【図６】実施例で同定されたSETD6遺伝子の変異部位近傍の塩基配列の波形データである。図５に示した領域のPCR増幅断片の塩基配列を決定すると、高受胎率型のゲノミックDNAを鋳型とした増幅断片では126番目の塩基がシトシン（C）であり、低受胎率型のゲノミックDNAを鋳型とした増幅断片では126番目の塩基にアデニン（A）が見られる。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明において、「遺伝子領域」とは、タンパク質をコードする領域と、イントロン領域と、プロモーター領域、3'-及び5'-UTR等の当該遺伝子の発現の制御に関与し得る領域とを含む、ゲノム上の連続した領域をいう。具体的には、「PKP2遺伝子領域」とは、配列番号１に示した配列を含むゲノム上の領域であり、「CACNB2遺伝子領域」とは、配列番号２に示した配列を含むゲノム上の領域であり、「SETD6遺伝子領域」とは、配列番号３に示した配列を含むゲノム上の領域である。
【００１１】
本発明において、遺伝子の変異とは、基準となる塩基配列と比較して相違する部分をいう。本発明における基準となる塩基配列は、PKP2遺伝子領域では配列表の配列番号１に示す塩基配列であり、CACNB2遺伝子領域では配列番号２に示す塩基配列であり、SETD6遺伝子領域では配列番号３に示す塩基配列である。以下、本明細書において、各遺伝子領域内の部位に言及する場合、配列番号１〜３に示す基準の配列における位置で表すものとする。また、SETD6タンパク質の基準となるアミノ酸配列は配列番号１４に示すアミノ酸配列であり、SETD6タンパク質におけるアミノ酸の部位に言及する場合は、配列番号１４に示す基準配列における位置で表すものとする。
【００１２】
PKP2（plakophilin 2）遺伝子は、細胞間接着タンパク質をコードする遺伝子である。本発明におけるPKP2遺伝子領域の変異とは、ウシ体内でのPKP2遺伝子の機能が低下する変異である。ウシ体内でのPKP2遺伝子の機能の低下には、PKP2遺伝子の発現量の低下等によりウシ体内での野生型PKP2タンパク質の蓄積量が低下すること、及び生理活性が低下した変異型のPKP2タンパク質がウシ体内で産生されることが包含される。本発明におけるPKP2遺伝子領域の変異とは、典型的には、PKP2遺伝子の発現が抑制される変異であり得る。そのような変異の具体例として、配列番号１に示す塩基配列における第3476番塩基及び第3477番塩基の間への挿入変異が挙げられ、該挿入変異の具体例としては、2塩基（典型的にはTA）の挿入が挙げられる。
【００１３】
CACNB2（calcium channel, voltage-dependent, beta 2 subunit）遺伝子は、カルシウムチャネルをコードする遺伝子である。本発明におけるCACNB2遺伝子領域の変異とは、CACNB2遺伝子のウシ体内での機能が低下する変異である。CACNB2遺伝子のウシ体内での機能の低下には、CACNB2遺伝子の発現量の低下等によりウシ体内での野生型CACNB2タンパク質の蓄積量が低下すること、及び生理活性が低下した変異型のCACNB2タンパク質がウシ体内で産生されることが包含される。本発明におけるCACNB2遺伝子領域の変異とは、典型的には、CACNB2遺伝子の発現が抑制される変異であり得る。そのような変異の具体例として、配列番号２に示す塩基配列における第2457番塩基及び第2458番塩基の間への挿入変異が挙げられ、該挿入変異の具体例としては、2塩基（典型的にはAT）の挿入が挙げられる。
【００１４】
SETD6（SET domain containing 6）遺伝子は、メチル基転移酵素をコードする領域である。本発明におけるSETD6遺伝子領域の変異とは、SETD6遺伝子のウシ体内での機能が上昇する変異である。SETD6遺伝子のウシ体内での機能の上昇には、SETD6遺伝子の発現量の増大等によりウシ体内での野生型SETD6タンパク質の蓄積量が増大すること、及び生理活性が上昇した変異型のSETD6タンパク質がウシ体内で産生されることが包含される。本発明におけるSETD6遺伝子領域の変異とは、典型的には後者、すなわちSETD6タンパク質のメチル基転移活性が上昇する変異であり得る。そのような変異の具体例として、SETD6タンパク質の第360番アミノ酸がアラニンからグルタミン酸に変化するアミノ酸置換変異が挙げられる。そのようなアミノ酸置換を生じる塩基配列の変異の具体例としては、配列番号３に示す塩基配列における第3002番塩基がシトシンからアデニンに置換する一塩基置換変異が挙げられる。
【００１５】
ある遺伝子領域における変異が当該遺伝子の発現を抑制するか（あるいは上昇させるか）どうかは、例えば、下記実施例においても用いられているレポーターアッセイにより調べることができる。レポーターアッセイは周知の常法であり、そのためのキットも各種のものが市販されている。例えばルシフェラーゼレポーターアッセイの場合、遺伝子領域のうちで変異部位を含む一定の領域をルシフェラーゼ遺伝子の下流に連結したコンストラクトを構築し、インビトロで該コンストラクトを発現させ、発現したルシフェラーゼの酵素活性に基づいてルシフェラーゼ遺伝子の発現が抑制されたか（あるいは上昇したか）を評価すればよい。ルシフェラーゼの酵素活性が変異型コンストラクトで野生型コンストラクトよりも低下していた場合、その変異は遺伝子の発現を抑制する変異であると判断することができる。
【００１６】
変異型配列を有するタンパク質の生理活性については、当業者であれば、もとのタンパク質の性質に基づいて適当なアッセイ方法を選択して調べることができる。例えば、SETD6タンパク質はメチル基転移酵素であるが、任意の変異型配列を有するSETD6タンパク質のメチル基転移活性は、下記実施例に記載されるような方法で調べることができる。すなわち、変異型のアミノ酸配列をコードするcDNAを適当な培養細胞内で発現させてSETD6タンパク質変異体を産生させ、これを回収し（Hisタグ等のタグ配列を付加して培養細胞外に分泌されるように発現させれば、Hisタグを用いて免疫沈降により容易に回収可能である）、市販のメチルトランスフェラーゼアッセイキットを用いて酵素活性を評価すればよい。
【００１７】
核酸試料は特に限定されず、ゲノミックDNA試料、RNA試料（全RNA若しくはmRNA）、又はcDNA試料を用いることができる。cDNA試料は、ウシからRNAを分離し、これを鋳型とした逆転写反応により調製することができる。核酸試料としては、作業工程の簡便さから、ゲノミックDNA試料を好ましく用いることができる。
【００１８】
核酸試料を用いて遺伝子領域上の変異を調べる具体的な方法としては、例えば、核酸試料をPCR等の核酸増幅反応に付し、増幅断片の塩基配列に基づいて変異の有無を調べる方法が挙げられる。変異により野生型配列と変異型配列との間で制限酵素の認識部位に相違が生じる場合には、増幅断片の制限酵素断片長多型を解析することにより（すなわち周知のPCR-RFLP法により）変異の有無を調べることができるが、一般には、増幅断片の塩基配列を決定して変異の有無を調べる方法がより好ましい。
【００１９】
PKP2遺伝子領域の変異として、配列番号１における第3476番塩基及び第3477番塩基の間へのTA挿入変異の有無を検出する場合であれば、当該部位を含むPKP2遺伝子領域の一部（50bp〜1000bp程度の領域を増幅すれば十分である）をゲノミックDNA試料から核酸増幅法により増幅し、増幅断片の塩基配列を決定し、TA挿入があるか否かを確認すればよい。配列番号４及び５に示すプライマーセットを用いてPCRを行えば、PKP2遺伝子領域のうちで図１（配列番号１０）に示した領域が増幅される。この増幅断片における519番目（配列番号１においては3477番目）の塩基を比較すると、TA挿入がない場合はグアニンであり、TA挿入がある場合はチミンである。従って、当該TA挿入変異の有無は、簡便には、配列番号１における3477番目の塩基（配列番号１０における519番目の塩基）が何であるかを確認することによって検出することができる。
【００２０】
CACNB2遺伝子領域の変異として、配列番号２における第2457番塩基及び第2458番塩基の間へのAT挿入変異の有無を検出する場合であれば、当該部位を含むCACNB2遺伝子領域の一部（50bp〜1000bp程度の領域を増幅すれば十分である）をゲノミックDNA試料から核酸増幅法により増幅し、増幅断片の塩基配列を決定し、AT挿入があるか否かを確認すればよい。配列番号６及び７に示すプライマーセットを用いてPCRを行えば、CACNB2遺伝子領域のうちで図３（配列番号１１）に示した領域が増幅される。この増幅断片における189番目（配列番号２においては2458番目）の塩基を比較すると、AT挿入がない場合はシトシンであり、AT挿入がある場合はアデニンである。従って、当該AT挿入変異の有無は、簡便には、配列番号２における2458番目の塩基（配列番号１１における189番目の塩基）が何であるかを確認することによって検出することができる。
【００２１】
SETD6遺伝子領域の変異として、配列番号３における3002番目の塩基における置換変異（シトシンからアデニンへの置換）の有無を検出する場合であれば、当該部位を含むSETD6遺伝子領域の一部（50bp〜1000bp程度の領域を増幅すれば十分である）をゲノミックDNA試料から核酸増幅法により増幅し、増幅断片の塩基配列を決定し、上記置換変異があるか否かを確認すればよい。配列番号８及び９に示すプライマーセットを用いてPCRを行えば、SETD6遺伝子領域のうちで図５（配列番号１２）に示した領域が増幅される。上記塩基置換部位はこの増幅断片においては126番目の塩基に該当するので、当該部位がシトシンかアデニンかを確認することによって、SETD6遺伝子領域における上記した一塩基置換変異の有無を検出することができる。
【００２２】
本発明のウシの受胎率の判定方法では、PKP2遺伝子、CACNB2遺伝子及びSETD6遺伝子のうちの少なくとも１つにおける変異の有無を検出する。いずれか１つの遺伝子について調べてもよいし、複数の遺伝子について調べてもよい。受胎率の指標となることが知られているCTTNBP2NL遺伝子（非特許文献１、２）をさらに組み合わせて調べてもよい。いずれの遺伝子においても、変異型のアリルが受胎率の低さの指標となる。雌ウシについて一遺伝子を対象に変異の有無を調べた場合、片方のアリルが変異型アリルであれば、当該雌ウシは受胎率がやや低く、両方のアリルが変異型アリルであれば、当該雌牛は受胎率が低いと判定することができる。複数の遺伝子を対象に調べた場合であれば、変異型アリルの数が多いほど受胎率が低く、逆にいえば変異のない野生型アリルの数が多いほど受胎率が高いと判定することができる。雄ウシについても雌ウシと同様に受胎率判定が可能であり、雄ウシが変異型アリルを多く有すれば、該雄ウシが精子供与したウシ胎児は雌ウシにおいて受胎率が低いと判定することができる。複数の遺伝子を組み合わせて調べた場合の受胎率判定の効果は相加的である。従って、本発明の方法により受胎率が高いウシを選抜したい場合には、雄ウシ雌ウシともに、野生型アリルを多く持つ個体（変異型アリルを少なく持つ個体）を選抜して交配（人工授精も含む）させればよい
【００２３】
PKP2遺伝子、CACNB2遺伝子及びSETD6遺伝子における上記定義の通りの変異は、ウシの受胎率の指標となるので、各変異部位を含むウシゲノム上の領域を増幅するプライマーセット、すなわち、PKP2遺伝子領域内の変異部位を含む領域を増幅するプライマーセット、CACNB2遺伝子領域内の変異部位を含む領域を増幅するプライマーセット、及びSETD6遺伝子領域内の変異部位を含む領域を増幅するプライマーセットは、それぞれウシの受胎率の判定試薬として提供することができる。上記プライマーセットのうちの１つを判定試薬として提供してもよいし、複数のプライマーセットを組み合わせて判定試薬として提供することもできる。なお、これらのプライマーセットは、変異を有しない野生型配列のウシ由来の核酸試料を鋳型としたPCRに用いれば、当然ながら、変異部位に対応する部位を含む変異のない配列の増幅断片が得られる。
【００２４】
PKP2遺伝子領域内の変異部位を含む領域を増幅するプライマーセットは、例えば、配列番号１における3477番目の塩基を含むウシゲノム上の領域を増幅するプライマーセットであり得る。そのようなプライマーセットは、配列番号１に示す塩基配列中の第1番〜第3476番塩基の領域内の部分領域に特異的にハイブリダイズするフォワード側プライマーと、配列番号１に示す塩基配列中の第3479番〜第3985番塩基の領域内の部分領域に特異的にハイブリダイズするリバース側プライマーとのセットであり得る。なお、「フォワード側プライマー」とは、配列表に実際に示されている塩基配列の相補鎖にハイブリダイズするプライマーであり、「リバース側プライマー」とは、配列表に実際に示されている塩基配列にハイブリダイズするプライマーである。
【００２５】
「特異的にハイブリダイズする」とは、通常のハイブリダイズの条件下において、対象とする領域にのみハイブリダイズし、その他の領域には実質的にハイブリダイズしないという意味である。「通常のハイブリダイズの条件下」とは、通常のＰＣＲのアニーリングやプローブによる検出に用いられる条件下のことをいい、例えば、Taqポリメラーゼを用いたＰＣＲの場合には、50mM KCl、10mM Tris-HCl(pH 8.3〜9.0)、1.5mM MgCl2といった一般的な緩衝液を用いて、54℃〜60℃程度の適当なアニーリング温度で反応を行なうことをいい、また、例えばノーザンハイブリダイゼーションの場合には、5 x SSPE、50％ホルムアミド、5 x Denhardt's solution、0.1〜0.5％SDSといった一般的なハイブリダイゼーション溶液を用いて、42℃〜65℃程度の適当なハイブリダイゼーション温度で反応を行なうことをいう。ただし、適当なアニーリング温度及びハイブリダイゼーション温度は、上記例示に限定されず、プライマー又はプローブのTm値及び実験者の経験則に基づいて定められ、当業者であれば容易に定めることができる。「実質的にハイブリダイズしない」とは、全くハイブリダイズしないか、するとしても対象とする領域にハイブリダイズする量よりも大幅に少なく、相対的に無視できる程度の微量しかハイブリダイズしないという意味である。
【００２６】
そのような条件下で特異的にハイブリダイズするプライマーとしては、ハイブリダイズする部分領域と完全に相補的な塩基配列を有するプライマーが好ましいが、通常、10％以下の塩基が置換した配列を有するプライマーを用いても、対象とする部分領域にハイブリダイズして増幅が起きる場合が多い（ただし、「10％以下の塩基が置換した塩基配列」は、もとの塩基配列のうち3'末端の塩基以外の塩基が置換されていることが好ましい）。また、この分野で周知の通り、プライマーの5'末端側に例えば制限酵素認識配列等の任意の配列を付加しても、対象とする部分領域に特異的にハイブリダイズし、目的の領域を増幅することができる。
【００２７】
従って、配列番号１に示す塩基配列中の第1番〜第3476番塩基の領域内の部分領域に特異的にハイブリダイズするフォワード側プライマーには、配列番号１に示す塩基配列中の第1番〜第3476番塩基の領域内の連続する15塩基以上、好ましくは18塩基以上の塩基配列からなるプライマー、及び該塩基配列のうち10％以下の塩基が置換した塩基配列からなるプライマー、並びにこれらのプライマーの5'末端側に付加配列を有するプライマーが包含される。すなわち、該フォワード側プライマーは、配列番号１に示す塩基配列中の第1番〜第3476番塩基の領域内の連続する15塩基以上の塩基配列又は該塩基配列のうち10％以下の塩基が置換した塩基配列をその3'末端側に含むプライマーであり得る。
【００２８】
同様に、配列番号１に示す塩基配列中の第3479番〜第3985番塩基の領域内の部分領域に特異的にハイブリダイズするリバース側プライマーには、配列番号１に示す塩基配列中の第3479番〜第3985番塩基の領域内の連続する15塩基以上、好ましくは18塩基以上の塩基配列と相補的な配列からなるプライマー、及び該相補的な配列のうち10％以下の塩基が置換した塩基配列からなるプライマー、ならびにこれらのプライマーの5'末端側に付加配列を有するプライマーが包含される。すなわち、該リバース側プライマーは、配列番号１に示す塩基配列中の第3479番〜第3985番塩基の領域内の連続する15塩基以上からなる塩基配列と相補的な配列又は該相補的な配列のうち10％以下の塩基が置換した塩基配列をその3'末端側に含むプライマーであり得る。
【００２９】
下記実施例で用いられている、配列番号４に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号５に示す塩基配列からなるプライマーとのセットは、実施例で同定されたPKP2遺伝子領域におけるTA挿入変異を検出するための好ましいプライマーセットの一例であるが、ウシの受胎率の判定試薬に使用可能なPKP2遺伝子領域を増幅するプライマーセットはこれに限定されない。
【００３０】
CACNB2遺伝子領域内の変異部位を含む領域を増幅するプライマーセットは、例えば、配列番号２における2458番目の塩基を含むウシゲノム上の領域を増幅するプライマーセットであり得る。そのようなプライマーセットは、配列番号２に示す塩基配列中の第1番〜第2457番塩基の領域内の部分領域に特異的にハイブリダイズするフォワード側プライマーと、配列番号２に示す塩基配列中の第2460番〜第2974番塩基の領域内の部分領域に特異的にハイブリダイズするリバース側プライマーとのセットであり得る。
【００３１】
配列番号２に示す塩基配列中の第1番〜第2457番塩基の領域内の部分領域に特異的にハイブリダイズするフォワード側プライマーには、配列番号２に示す塩基配列中の第1番〜第2457番塩基の領域内の連続する15塩基以上、好ましくは18塩基以上の塩基配列からなるプライマー、及び該塩基配列のうち10％以下の塩基が置換した塩基配列からなるプライマー、並びにこれらのプライマーの5'末端側に付加配列を有するプライマーが包含される。すなわち、該フォワード側プライマーは、配列番号２に示す塩基配列中の第1番〜第2457番塩基の領域内の連続する15塩基以上の塩基配列又は該塩基配列のうち10％以下の塩基が置換した塩基配列をその3'末端側に含むプライマーであり得る。
【００３２】
配列番号２に示す塩基配列中の第2460番〜第2974番塩基の領域内の部分領域に特異的にハイブリダイズするリバース側プライマーには、配列番号２に示す塩基配列中の第2460番〜第2974番塩基の領域内の連続する15塩基以上、好ましくは18塩基以上の塩基配列と相補的な配列からなるプライマー、及び該相補的な配列のうち10％以下の塩基が置換した塩基配列からなるプライマー、ならびにこれらのプライマーの5'末端側に付加配列を有するプライマーが包含される。すなわち、該リバース側プライマーは、配列番号２に示す塩基配列中の第2460番〜第2974番塩基の領域内の連続する15塩基以上からなる塩基配列と相補的な配列又は該相補的な配列のうち10％以下の塩基が置換した塩基配列をその3'末端側に含むプライマーであり得る。
【００３３】
下記実施例で用いられている、配列番号６に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号７に示す塩基配列からなるプライマーとのセットは、実施例で同定されたCACNB2遺伝子領域におけるAT挿入変異を検出するための好ましいプライマーセットの一例であるが、ウシの受胎率の判定試薬に使用可能なCACNB2遺伝子領域を増幅するプライマーセットはこれに限定されない。
【００３４】
SETD6遺伝子領域内の変異部位を含む領域を増幅するプライマーセットは、例えば、配列番号３における3002番目の塩基を含むウシゲノム上の領域を増幅するプライマーセットであり得る。そのようなプライマーセットは、配列番号３に示す塩基配列中の第1番〜第3001番塩基の領域内の部分領域に特異的にハイブリダイズするフォワード側プライマーと、配列番号３に示す塩基配列中の第3003番〜第3322番塩基の領域内の部分領域に特異的にハイブリダイズするリバース側プライマーとのセットであり得る。
【００３５】
配列番号３に示す塩基配列中の第1番〜第3001番塩基の領域内の部分領域に特異的にハイブリダイズするフォワード側プライマーには、配列番号３に示す塩基配列中の第1番〜第3001番塩基の領域内の連続する15塩基以上、好ましくは18塩基以上の塩基配列からなるプライマー、及び該塩基配列のうち10％以下の塩基が置換した塩基配列からなるプライマー、並びにこれらのプライマーの5'末端側に付加配列を有するプライマーが包含される。すなわち、該フォワード側プライマーは、配列番号３に示す塩基配列中の第1番〜第3001番塩基の領域内の連続する15塩基以上の塩基配列又は該塩基配列のうち10％以下の塩基が置換した塩基配列をその3'末端側に含むプライマーであり得る。
【００３６】
配列番号３に示す塩基配列中の第3003番〜第3322番塩基の領域内の部分領域に特異的にハイブリダイズするリバース側プライマーには、配列番号３に示す塩基配列中の第3003番〜第3322番塩基の領域内の連続する15塩基以上、好ましくは18塩基以上の塩基配列と相補的な配列からなるプライマー、及び該相補的な配列のうち10％以下の塩基が置換した塩基配列からなるプライマー、ならびにこれらのプライマーの5'末端側に付加配列を有するプライマーが包含される。すなわち、該リバース側プライマーは、配列番号３に示す塩基配列中の第3003番〜第3322番塩基の領域内の連続する15塩基以上からなる塩基配列と相補的な配列又は該相補的な配列のうち10％以下の塩基が置換した塩基配列をその3'末端側に含むプライマーであり得る。
【００３７】
下記実施例で用いられている、配列番号８に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号９に示す塩基配列からなるプライマーとのセットは、実施例で同定されたSETD6遺伝子領域におけるCからAへの置換変異を検出するための好ましいプライマーセットの一例であるが、ウシの受胎率の判定試薬に使用可能なSETD6遺伝子領域を増幅するプライマーセットはこれに限定されない。
【００３８】
受胎率の判定試薬は、上記したプライマーセットのみからなるものであってもよいし、プライマーを緩衝液等に溶解させた形態であってもよく、また、乾燥させたプライマーと緩衝液等とをセットにした形態であってもよい。さらに、該試薬は、プライマーの分解防止等に有用な各種添加剤等を含んでいてもよい。
【００３９】
上記したウシの受胎率の判定試薬は、他の試薬類と適宜に組み合わせて、ウシの受胎率の判定キットとして提供することができる。PCR等の核酸増幅法に必要なプライマー以外の他の試薬類は周知である。例えば、該判定キットには、上記した受胎率の判定試薬のほか、核酸増幅反応の反応液を調製するための緩衝液や、耐熱性ポリメラーゼ等がさらに含まれ得る。
【実施例】
【００４０】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。以下の記載では、特に説明がない場合には、J. Sambrook & D. W. Russell (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001) に記載の方法、あるいはそれを適宜修飾又は改変した方法により行なった。また、市販の試薬キットや測定装置を用いている場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールの指示に従って行なった。
【００４１】
１．受胎率に関与する遺伝子の同定
(1)  ウシPKP2、CACNB2、SETD6遺伝子の塩基配列の決定
まず、ホルスタイン種集団から受胎率育種価が51%以上である受胎率の良いウシ（192頭）及び受胎率育種価が42%以下である受胎率の悪いウシ（192頭）からなる集団について、全染色体をカバーする43,924個のSNPを用いて受胎率に関連するウシ染色体の領域を同定した。このうち、強い関連の見られた第5番染色体上の受胎率制御領域に存在するPKP2遺伝子の発現の制御に関わる領域の塩基配列を解読し、受胎率の良いウシと悪いウシを比較したところ、悪いウシに特異的な挿入変異を見出した。また、別の強い関連の見られた第13番染色体上の受胎率制御領域に存在するCACNB2遺伝子の発現の制御に関わる領域の塩基配列を解読し、受胎率の良いウシと悪いウシを比較したところ、悪いウシに特異的な挿入変異を見出した。さらに、別の強い関連の見られた第18番染色体上の受胎率制御領域に存在するSETD6遺伝子のタンパク質をコードする領域の塩基配列を解読し、受胎率の良いウシと悪いウシを比較したところ、悪いウシに特異的なアミノ酸の変異を見出した。
【００４２】
なお、受胎率育種価は、河原孝吉ら、The Japanese Journal of Zootechnical Science 81(2), p.121-132, 2010-05-25の手法に従い、以下の通りに決定した。
【００４３】
分析には、1990年1月から2009年7月までの期間、北海道の牛群検定を受検したホルスタイン雌牛1,218,264頭の初産分娩後における受胎の有無(0または1)を示す記録2,391,649を利用し、分析に用いる記録は、以下の3条件を満たすものとした。
・18〜42ヶ月齢で初産分娩し、18〜54ヶ月齢で授精していること
・初産分娩後21〜160日以内に初回授精し、345日以内の授精記録であること
・2産次の分娩記録においては、在胎日数が265日〜295日であること
【００４４】
遺伝評価に使用したモデルは、単形質・閾値アニマルモデルであり、母数効果として授精月齢、授精月、及び分娩から授精までの日数、変量効果として授精した牛群・年・季節、授精した種雄牛・年、育種価、雌牛ごとの授精の繰り返し、及び残差を用いた。
【００４５】
(2)  挿入変異がPKP2又はCACNB2遺伝子の発現量に及ぼす影響
PKP2遺伝子の高受胎率型と低受胎率型それぞれのゲノム断片をつないだルシフェラーゼ遺伝子のコンストラクトを、ウシ子宮内膜由来細胞株BEnEpCに導入し、ルシフェラーゼ遺伝子の発現をルシフェラーゼ酵素の活性測定にて定量した。なお、コンストラクトの作製及びルシフェラーゼアッセイには、dual-luciferase reporter assay system (Promega, 米国ミシガン州Madison)を用いた。プライマーPKP2-F及びPKP2-Rを用いたPCR（後述）により、高受胎率型配列及び低受胎率型配列を有する牛のゲノミックDNAからそれぞれ図１に示す領域（配列番号１における第2959番〜第3534番塩基の領域、配列番号１０）を増幅し、各増幅断片を上記キットに含まれるルシフェラーゼ遺伝子の下流に連結してアッセイ用のコンストラクトとした。
【００４６】
その結果、PKP2の高受胎率遺伝子型では低受胎率遺伝子型と比べ有意に活性が上昇していることがわかった（表1）。挿入変異の結果、PKP2の発現を抑制することが受胎率低下をもたらすと考えられる。
【００４７】
また、CACNB2遺伝子についても同様に、プライマーCACNB2-F及びCACNB2-Rを用いたPCR（後述）により、高受胎率型配列及び低受胎率型配列を有する牛のゲノミックDNAからそれぞれ図２に示す領域（配列番号２における第2270番〜第2867番塩基の領域、配列番号１１）を増幅し、各増幅断片をルシフェラーゼ遺伝子の下流に連結させたコンストラクトを作製して、マウス下垂体由来細胞株LβT2に導入し、ルシフェラーゼ遺伝子の発現をルシフェラーゼ酵素の活性測定にて定量した。
【００４８】
その結果、CACNB2の高受胎率遺伝子型では低受胎率遺伝子型と比べ有意に活性が上昇していることがわかった（表2）。挿入変異の結果、CACNB2の発現を抑制することが受胎率低下をもたらすと考えられる。
【００４９】
【表１】
2014230491.tif 000003
【００５０】
【表２】
2014230491.tif 000004
【００５１】
(3)  アミノ酸変異がSETD6に及ぼす影響
メチル基転移酵素をコードするSETD6遺伝子の機能を調べるため、以下の通りの手順でSETD6遺伝子をマウス視床下部由来細胞株GT1-7に導入して発現させ、定法に従ってメチル基転移活性を測定した。
【００５２】
高受胎率のウシ及び低受胎率のウシの大脳より、TRIzol (Life Technologies, 米国カリフォルニア州Carlsbad)を用いてRNAを抽出し、ReverTra Ace（登録商標） 逆転写酵素(東洋紡, 日本国大阪)を用いてRT-PCRを行ない、SETD6遺伝子のcDNA配列（配列番号１３）を増幅した。cDNA増幅には配列番号１５及び１６に示すプライマーを用いた。得られた増幅断片をHisタグ付きの発現ベクターに組み込み、マウス視床下部由来細胞株GT1-7に導入して発現させ、Hisタグを用いて免疫沈降を行なった。免疫沈降により濃縮させた高受胎率型由来のSETD6タンパク質と低受胎率型由来のSETD6タンパク質のメチル基転移活性は、SET7/9 Histone Methltransferase Assay Kit (BPS Bioscience, 米国カリフォルニア州San Diego)を用いて測定し比較した。
【００５３】
その結果、SETD6の低受胎率遺伝子型では、高受胎率遺伝子型と比べ有意にメチル基転移活性が上昇していることがわかった（表3）。アミノ酸変異の結果、SETD6のメチル基転移活性が上昇することが受胎率低下をもたらすと考えられる。
【００５４】
【表３】
2014230491.tif 000005
【００５５】
(4)  PKP2、CACNB2、SETD6遺伝子変異が受胎率育種価に及ぼす影響
PKP2、CACNB2、SETD6遺伝子の受胎率育種価に対する影響を調べるため、種雄牛2528頭と雌牛1418頭のDNAを用いて遺伝子型を調べ、受胎率育種価を比較した。その結果、高受胎率遺伝子型をホモで有する個体では、低受胎率遺伝子型をホモで有する個体と比べて受胎率育種価が有意に高いことがわかった（表4、5、6）。このことから、低受胎率遺伝子型のPKP2、CACNB2、SETD6遺伝子を有するウシの生産効率は、高受胎率遺伝子型PKP2、CACNB2、SETD6遺伝子を有する個体と比較して減少することが考えられる。
【００５６】
【表４】
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【００５７】
【表５】
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【００５８】
【表６】
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【００５９】
２．ウシのゲノミックDNA上のPKP2、CACNB2、SETD6遺伝子の変異の有無の確認
受胎率の悪いウシに認められた変異部位を含むDNA断片を増幅するためのプライマーPKP2-F、PKP2-R、CACNB2-F、CACNB2-R、SETD6-F、SETD6-Rを合成した。配列表の配列番号4、5、6、7、8、9にそれぞれプライマーPKP2-F、PKP2-R、CACNB2-F、CACNB2-R、SETD6-F、SETD6-Rの塩基配列を示す。
【００６０】
(1)  PKP2遺伝子における高受胎率型と低受胎率型の判別
ウシの血液（抗擬固剤としてEDTA、ヘパリンを含む）より、自動核酸分離装置NA-1000（クラボウ社製）を用いてゲノミックDNAを調製した。これらのゲノミックDNAを鋳型とし、プライマーPKP2-FとPKP2-Rを用いたPCR (94 ℃で20秒、60℃で30秒、72℃で1分間からなる工程を1サイクルとした35サイクル反応)を行い、3730蛍光DNAシークエンサー（アプライドバイオシステムズ社製）を用いてPCR生成物の塩基配列を比較した。高受胎率型PKP2遺伝子を鋳型にPCRで増幅させたDNA断片（配列番号１における2959〜3534番塩基の領域、配列番号１０及び図１）では、519番目の塩基がグアニン（G）であるが、２塩基の挿入を有する低受胎率型由来の増幅断片ではチミン（T）であった。図２に示すように、当該部位における塩基を調べることにより、PKP2遺伝子の高受胎率型と低受胎率型を簡便に見分けることができることが確認された。
【００６１】
(2)  CACNB2遺伝子における高受胎率型と低受胎率型の判別
ウシの血液（抗擬固剤としてEDTA、ヘパリンを含む）より、自動核酸分離装置NA-1000（クラボウ社製）を用いてゲノミックDNAを調製した。これらのゲノミックDNAを鋳型とし、プライマーCACNB2-FとCACNB2-Rを用いたPCR (94℃で20秒、60℃で30秒、72℃で1分間からなる工程を1サイクルとした35サイクル反応)を行い、3730蛍光DNAシークエンサー（アプライドバイオシステムズ社製）を用いてPCR生成物の塩基配列を比較した。高受胎率型CACNB2遺伝子を鋳型にPCRで増幅させたDNA断片（配列番号２における2270〜2867番塩基の領域、配列番号１１及び図３）では、189番目の塩基がシトシン（C）であるが、２塩基の挿入を有する低受胎率型由来の増幅断片ではアデニン（A）であった。図4に示すように、当該部位における塩基を調べることにより、CACNB2遺伝子の高受胎率型と低受胎率型を簡便に見分けることができることが確認された。
【００６２】
(3)  SETD6遺伝子における高受胎率型と低受胎率型の判別
ウシの血液（抗擬固剤としてEDTA、ヘパリンを含む）より、自動核酸分離装置NA-1000（クラボウ社製）を用いてゲノミックDNAを調製した。これらのゲノミックDNAを鋳型とし、プライマーSETD6-FとSETD6-Rを用いたPCR (94℃で20秒、60℃で30秒、72℃で1分間からなる工程を1サイクルとした35サイクル反応)を行い、3730蛍光DNAシークエンサー（アプライドバイオシステムズ社製）を用いてPCR生成物の塩基配列を比較した。高受胎率型SETD6遺伝子を鋳型にPCRで増幅させたDNA断片（配列番号３における2877〜3322番塩基の領域、配列番号１２及び図５）では、126番目の塩基がシトシン（C）であるが、低受胎率型ではアデニン（A）であった。図6に示すように、当該部位における塩基を調べることにより、SETD6遺伝子の高受胎率型と低受胎率型を簡便に見分けることができることが確認された。
【００６３】
受胎率は複数の遺伝子が関わっている量的形質であるが、本発明により、PKP2、CACNB2、SETD6遺伝子は受胎率制御に関わる遺伝子の一部であり、ここで述べるDNA診断法で確実にPKP2、CACNB2、SETD6遺伝子における変異の有無を判定し、ウシの受胎率を判別可能であることが明らかとなった。
【図１】
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【図３】
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【図５】
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【図２】
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【図４】
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【図６】
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【配列表】
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