(57)【要約】      （修正有）【課題】植物組織または植物細胞を培養するための、大型の再使用可能な使い捨て型デバイスの提供。【解決手段】植物細胞及び／又は植物細胞培養のための大規模なバイオリアクターであって、４００リットル以上の培養培地において、少なくとも２回の連続する培養／採取サイクルのために連続して使用できる植物組織または植物細胞を培養するために好適な酸素飽和度および剪断力を維持するために設計される大きさおよびガス交換ポート３０を有する非剛直性の容器を含むデバイス１０。使い捨て型デバイスを使用し、植物細胞において触媒活性なヒト組換えタンパク質を産生する。【選択図】図１
2014014365.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物組織および／または植物細胞を培養および採取するための使い捨て型デバイスであって、少なくとも４００リットルの体積を有し、かつ前記デバイスが少なくとも２回の連続する培養／採取サイクルのために連続して使用されることを可能にするガス交換ポートおよび採取用ポートを伴って構成される非剛直性の容器を含み、前記ガス交換ポートが、容器の下半分において容器の周囲に沿って配置された複数のガス入口ポートを含み、前記ポートが、容器の軸から間隔を置かれて配置された容器中への出口を有する、使い捨て型デバイス。
【請求項２】
前記出口が、ポートの位置で容器の周囲に隣接している、請求項１に記載の使い捨て型デバイス。
【請求項３】
前記容器が、実質的に円筒形で対称的であり、第一の複数のポートが、容器の底部から同じ第一距離でかつ相互から間隔を置かれて配置されている、請求項１または２に記載の使い捨て型デバイス。
【請求項４】
前記容器が、倒立した円錐形の下部を有するように形成されており、前記ポートが、前記円錐形の下部に配置されている、請求項１〜３のいずれかに記載の使い捨て型デバイス。
【請求項５】
前記ポートのうち第二の複数のポートが、容器の底部から同じ第二距離でかつ相互から間隔を置かれて配置されており、前記第二距離が前記第一距離とは異なる、請求項４に記載の使い捨て型デバイス。
【請求項６】
前記ポートのうち第二の複数のポートが、容器の軸からの距離が第一の複数のポートと第二の複数のポートとの間で異なるように前記円錐形の下部に配置されている、請求項５に記載の使い捨て型デバイス。
【請求項７】
前記ポートのうちの異なるポートが、容器の底部から異なる距離で配置されている、請求項１〜４のいずれかに記載の使い捨て型デバイス。
【請求項８】
前記容器の一部が、実質的に均一な断面を有し、培地中への前記複数のガス出口が、約２０個／１平方メートル〜約７０個／１平方メートルの断面積あたりのガス入口の密度で与えられている、請求項１〜７のいずれかに記載の使い捨て型デバイス。
【請求項９】
前記容器が充填可能体積で充填されるときに、単位体積の培地あたり１分につき約０．０５体積のガス〜０．１２体積のガスの通気速度を制御するためのゲージを含む、請求項１〜８のいずれかに記載の使い捨て型デバイス。
【請求項１０】
複数のガス入口のそれぞれが、約２０立方ミリメートル〜約１８００立方ミリメートルの培地中への出口でのガス気泡体積を与える、請求項１〜９のいずれかに記載の使い捨て型デバイス。
【請求項１１】
前記採取用ポートが、少なくとも１つの前記入口ポートのレベルの下にある、請求項１〜１０のいずれかに記載の使い捨て型デバイス。
【請求項１２】
デバイスが、培地が容器中に存在するときに容器中の培地を混合するための機械的攪拌を有さない、請求項１〜１１のいずれかに記載の使い捨て型デバイス。
【請求項１３】
デバイスがスパージャーを有さない、請求項１〜１２のいずれかに記載の使い捨て型デバイス。
【請求項１４】
前記採取用ポートは、前記容器の底端部の底部に位置する、請求項１〜１３のいずれかに記載の使い捨て型デバイス。
【請求項１５】
前記底端部は、実質的に円錐台状である、請求項１〜１４のいずれかに記載の使い捨て型デバイス。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれかに記載のデバイスと、前記植物組織および／または植物細胞を培養するために好適な培養培地とを含む植物細胞培養システム。
【請求項１７】
前記培地において成長する植物細胞懸濁物または植物組織培養物をさらに含む、請求項１６に記載の植物細胞培養システム。
【請求項１８】
前記植物細胞は、組換えタンパク質を発現する、請求項１７に記載の植物細胞培養システム。
【請求項１９】
前記植物細胞は、アグロバクテリウム・リゾゲネスにより形質転換された根細胞、セロリ細胞、ショウガ細胞、西洋ワサビ細胞、タバコ細胞およびニンジン細胞からなる群から選択される、請求項１７または１８に記載の植物細胞培養システム。
【請求項２０】
前記細胞は、ヒト組換えアセチルコリンエステラーゼを発現するタバコ細胞である、請求項１９に記載の植物細胞培養システム。
【請求項２１】
前記ヒト組換えアセチルコリンエステラーゼは、アセチルコリンエステラーゼ−Ｒである、請求項２０に記載の植物細胞培養システム。
【請求項２２】
植物組織および／または植物細胞を、４００リットルを超える体積で培養および採取するための方法であって、
（ａ）少なくとも４００リットルの体積を有し、かつデバイスが少なくとも２回の連続する培養／採取サイクルのために連続して使用されることを可能にするガス交換ポートおよび採取用ポートを伴って構成される使い捨て可能な非剛直性の容器を提供すること、ただし、デバイスは、前記植物組織および／または植物細胞を培養するために好適な酸素飽和度および剪断力を維持するために設計および構築される、
（ｂ）接種物を、前記採取用ポートを介して提供すること、
（ｃ）無菌の培養培地および／または無菌の添加物を提供すること、
（ｄ）必要な場合には、前記容器を外部の光により照らすこと、および
（ｅ）前記細胞および／または組織を所望の収量にまで前記培地において成長させること
を含み、
前記ガス交換ポートが、複数のガス入口ポートを含み、方法が、前記ガス入口ポートを容器の周囲に沿って配置することを含み、前記ガス入口ポートの出口が、容器の軸から間隔を置かれて配置された位置で容器中に通じる、方法。
【請求項２３】
以下のことを含む、請求項２２に記載の方法：
ａ）約１バール〜５バールのガス圧力でガスを提供すること；
ｂ）約２０個／１平方メートル〜約７０個／１平方メートルの容器の実質的に均一な部分の断面積あたりのガス入口の密度を提供すること；
ｃ）単位体積の培地あたり１分につき約０．０５体積のガス〜０．１２体積のガスの通気速度でガスを提供すること；および
ｄ）約２０立方ミリメートル〜約１８００立方ミリメートルの前記出口でのガス気泡体積を有する気泡として前記ガスを提供すること。
【請求項２４】
前記容器に含有される液体において単位体積あたり少なくとも１５％の体積である定常状態の酸素飽和度を提供する速度で前記ガスを提供する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記ガスは、約１．５バール〜約２．５バールのガス圧力で提供される、請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記容器の一部は、実質的に均一な断面を有し、前記断面積あたりのガス入口の密度は、約４０個／１平方メートル〜約６０個／１平方メートルである、請求項２２〜２５のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
前記通気速度は、単位体積の培地あたり１分につき約０．０７体積のガス〜約０．１０体積のガスである、請求項２１〜２６のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞／組織培養のための大規模な使い捨て型バイオリアクターに関し、具体的には、植物細胞培養のための大規模なバイオリアクターに関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞培養および組織培養は、例えば、ホルモン、酵素、タンパク質、抗原、食品添加物および天然殺虫剤を含む様々な化合物の商業的規模の製造のために日常的に利用される。
【０００３】
細胞培養物および／または組織培養物を工業的規模で製造するために現在利用されている技術は、組み立ておよび維持のために費用がかかる再使用可能なガラス製またはステンレス鋼製のバイオリアクターシステムに基づく。そのようなバイオリアクターシステムでは、バッチ間における清浄化および殺菌が要求され、また、清浄化後の清浄度および清浄化後の清浄化剤残渣の存在についての費用および時間のかかる妥当性確認が必要であることに起因して、製造物を転換する間により徹底した清浄化が要求される。
【０００４】
加えて、これらのタイプの工業的バイオリアクターシステムでは、複雑で費用のかかる混合技術が用いられ、例えば、高価で複雑な無菌シールによって作動するインペラーなどが用いられる。一部の高価なバイオリアクターは、ガスをバイオリアクターの中に吹き込むことにより培地の混合およびガス飽和をもたらすように設計されたエアーリフト用マルチパート構造を含む。しかしながら、ガス圧力、気泡サイズ、および培地における望ましくない剪断力の生成のために、複雑な通気技術の実施が余儀なくされる。加えて、そのようなバイオリアクターは、その時点で要求される最大体積容量に従って設計される。従って、パイロットプラントのバイオリアクターから大規模なバイオリアクターへのスケールアップを行うときや、製造を既存のバイオリアクターの能力を超えて増大させる必要性が生じるときに、様々な問題が生じる。大容量のバイオリアクターを運転することに対する現在の代替策は、全体的な容量を増大または減少させるための一定の柔軟性を提供しながら、全体の体積容量が要求と一致する多数の小型のモジュール式のガラス製バイオリアクターまたはステンレス鋼製バイオリアクターを組み合わせることである。しかしながら、数個の小型のバイオリアクターを使用することは、費用および維持時間を増大させ、従って、数個の小型のバイオリアクターを使用することは、一個だけの大型のバイオリアクターを使用することよりも費用がかかり、かつ労働集約的である。
【０００５】
これらの制限のために、植物細胞を先行技術のバイオリアクターで培養することでは、二次代謝産物および組換えタンパク質の両方を含めて、比較的高価な抽出可能な製造物がもたらされ、そのような製造物は、代替的な製造システムによって製造される同等の製造物と商業的に競合することができない。
【０００６】
現在、植物細胞バイオリアクターで製造される、培養に基づく唯一の組換えタンパク質医薬品は、ニューカッスルウイルスの処置において獣医学的に使用される市販の抗ウイルスワクチンである。しかしながら、このワクチンのほかには、現在、非常に少数の二次代謝産物が、バイオリアクターにおける細胞培養によって製造されるにすぎない（例えば、植物代謝産物のパクリタキセル（タキソール）およびシコニンなど）。
【０００７】
商業的規模において、バイオリアクターシステムでは、従来から永久的または半永久的な成長チャンバーが用いられる。様々な使い捨て型成長チャンバーが、この技術分野ではよく知られているが、それらの成長チャンバーは、典型的には小規模な製造量について利用されており、例えば、自家醸造において、また、研究室での実験的な研究のために利用される。小規模のバイオリアクターでは、典型的には、研究室環境において利用することができる使い捨て可能なバッグが用いられる。
【０００８】
より大きい体積を伴う使用のために好適な使い捨て型バイオリアクターもまた提案されている。先行技術のシステムは、リアクター体積のスケールアップに伴ってより重要になる培養培地の撹拌および通気の要求に、いくつかの様式で対処している。Ａｐｐｌｉｋｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（オランダ）およびＳｔｅｄｉｍ  Ｉｎｃ．（フランス）は、培養培地の通気および撹拌をもたらすように培養バッグを揺り動かすモーター駆動のプラットホームに設置するように設計された５０リットルの柔軟な培養バッグを使用するＡｐｐｌｉｆｌｅｘ（登録商標）単回使用バイオリアクターシステムを提供する。類似する使い捨て型バイオリアクターデバイスが、Ｗａｖｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，ＬＬＤ（Ｓｏｍｅｒｓｅｔ、ＮＪ）によって提供される。Ｗａｖｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，ＬＬＤは、同様にモーター駆動のプラットホームによって通気および撹拌される１０００Ｌまでの体積のための培養バッグを提供する。Ｈｙｃｌｏｎｅ  Ｉｎｃ．（Ｌｏｇａｎ、ＵＴ）は、Ｂａｘｔｅｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓと共同で、ステンレス鋼製バイオリアクター槽を改良するように設計された、２５０Ｌまでの動物細胞培養のために設計された使い捨て可能な培養バッグ（単回使用バイオリアクター「ＳＵＢ」）を提供する。通気および撹拌が、培養バッグに一体化される複雑なインペラー装置に取り付けられる使い捨て型でないインペラー駆動装置によって提供される。米国特許出願第２００５／０２７２１４６号（Ｈｏｄｇｅ他）は、混合のためのインペラーブレードまたは他の機械的手段を有する１５０リットルの使い捨て型バイオリアクターを開示する。さらに別のタイプの使い捨て型バイオリアクターは、Ｕ字型のバッグを有しており、培養培地を側板の相互の持ち上げにより撹拌および通気するために、クレーン様装置を必要とする。なおもさらに別の解決策は、定期的な間隔で膨張および収縮し、これによって絞りタイプの混合運動をもたらすように作製される、柔軟な培養バッグを取り囲む加圧カフに基づく。
【０００９】
すべての上記システムにおいて、支持体システムおよび通気／撹拌システムは複雑化しており、費用がかかり、特定の使用に専用であり、また、容量において制限される。従って、たとえリアクター槽自体が使い捨て可能であり得るとしても、また、単回使用のために意図され得るとしても、これらのシステムの使用に際しては、費用のかかる設備準備および維持が要求される。
【００１０】
培養物の撹拌および通気のために空気を使用する使い捨て型バイオリアクターデバイスもまた提案されているが、気泡に基づく通気および混合を大きい体積に適合させることには問題がある。多くのより小さい体積のバイオリアクターでは、１つのガス導入口およびスパージャーにより、またはガス気泡のための他のタイプのデフューザーにより、十分な通気が提供される［例えば、Ｏｓｍｏｔｅｃ（イスラエル）によって提供されるＺｅｔａバイオリアクター（Ａｇｒｉｔｅｃｈ  Ｉｓｒａｅｌ、第１号、１９９７年（秋号）、１９頁）を参照のこと］。そのようなシステムの欠点の１つは、（デフューザーからの）非常に小さい気泡を導入することによって行われる通気が、剪断力に対して特に感受性の強い植物細胞培養物の場合には特に、細胞に対する損傷を生じさせることである。
【００１１】
医薬品使用のためのタンパク質は従来、哺乳動物または細菌の発現システムで産生されている。しかしながら、例えば、植物の分子生物学システム（例えば、アグロバクテリウム法など）を使用して、タンパク質およびペプチドの大量製造のために遺伝子を植物および植物細胞に導入することが比較的簡便であるために、植物細胞技術が、代替的なタンパク質発現システムとしてますます広まりつつある［Ｍａ，Ｊ．Ｋ．Ｃ．、Ｄｒａｋｅ，Ｐ．Ｍ．Ｗ．およびＣｈｒｉｓｔｏｕ，Ｐ．（２００３）、Ｎａｔｕｒｅ  ｒｅｖｉｅｗｓ、４、７９４〜８０５］。
【００１２】
植物細胞培養は、代謝要求に関してだけでなく、一般に大きいサイズを有する植物細胞が、従来の工業的バイオリアクターにおいて見出される剪断力に対して極めて脆いという結果としてもまた、細菌細胞培養または哺乳動物細胞培養とは異なる。従って、植物細胞培養のすべての局面の十分な通気を保証するために、十分な混合を植物細胞培養において提供することが重要である一方で、これを、培養で成長させられる脆い植物細胞に好適な様式で行わなければならない。
【００１３】
従って、製造物のより大きい収量および品質、ならびに改善された費用効果を提供するために、使い捨て可能な細胞／組織培養のための既存のシステムおよびデバイスを改善することが絶えず求められている。本発明は、組換えタンパク質を製造するための様々な細胞／細胞培養を伴う使用のために効果的である、大きい体積の、使い捨て可能な、しかし再使用可能なバイオリアクターであって、使い捨て型リアクターの体積のスケールアップに固有の問題について対処されているバイオリアクターを提供する。
【発明の概要】
【００１４】
本発明の１つの局面によれば、少なくとも４００リットルの体積を有し、かつデバイスが少なくとも２回の連続する培養／採取サイクルのために連続して使用されることを可能にするガス交換ポートおよび採取用ポートを伴って構成される非剛直性の容器を含む、植物組織および／または植物細胞を培養および採取するための使い捨て型デバイスが提供され、ここで、本デバイスは、前記植物組織および／または植物細胞を培養するために好適な酸素飽和度および剪断力を維持するために設計および構築される。
【００１５】
本発明の別の局面によれば、植物組織および／または植物細胞を、４００リットルを超える体積で培養および採取するための方法が提供され、この方法は、（ａ）少なくとも４００リットルの体積を有し、かつデバイスが少なくとも２回の連続する培養／採取サイクルのために連続して使用されることを可能にするガス交換ポートおよび採取用ポートを伴って構成される使い捨て可能な非剛直性の容器を提供すること（ただし、デバイスは、前記植物組織および／または植物細胞を培養するために好適な酸素飽和度および剪断力を維持するために設計および構築される）、および（ｂ）接種物を、前記採取用ポートを介して提供すること、（ｃ）無菌の培養培地および／または無菌の添加物を提供すること、（ｄ）必要な場合には、前記容器を外部の光により照らすこと、および（ｅ）前記細胞および／または組織を所望の収量にまで前記培地において成長させることを含む。
【００１６】
以下に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、前記植物組織および／または植物細胞を培養するために好適な前記酸素飽和度および前記剪断力は、下記のパラメーターの値または値範囲を組み合わせることによって維持される：
ａ）高さ対体積比；
ｂ）入口ガス圧力；
ｃ）断面積あたりのガス入口の密度；
ｄ）入口での通気速度；および
ｅ）入口でのガス気泡体積。
【００１７】
本発明の別の局面によれば、植物組織および／または植物細胞を培養および採取するための使い捨て型デバイスと、前記植物組織および／または植物細胞を培養するために好適な培養培地とを含む植物細胞培養システムが提供される。
【００１８】
以下に記載される本発明の好ましい実施形態におけるなおもさらなる特徴によれば、このシステムはさらに、前記培地において成長する植物細胞懸濁物または植物組織培養物を含む。
【００１９】
以下に記載される本発明の好ましい実施形態におけるなおもさらなる特徴によれば、植物細胞培養物は、植物の根から得られる植物細胞を含む。
【００２０】
以下に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、植物細胞は、アグロバクテリウム・リゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｉｈｚｏｇｅｎｅｓ）により形質転換された根細胞、セロリ細胞、ショウガ細胞、西洋ワサビ細胞およびニンジン細胞からなる群から選択される。
【００２１】
本発明のいくつかの実施形態におけるさらなる特徴によれば、植物細胞はタバコ細胞であり、より好ましくはニコチアナ・タバクム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｃｕｍ）細胞である。
【００２２】
本発明のいくつかの実施形態におけるさらなる特徴によれば、タバコ細胞はヒト組換えアセチルコリンエステラーゼを発現する。ヒト組換えアセチルコリンエステラーゼは、アセチルコリンエステラーゼ−Ｒであり得る。アセチルコリンエステラーゼ−Ｒは、配列番号９に示されるようなアミノ酸配列を有することができる。
【００２３】
本発明のいくつかの実施形態におけるさらなる特徴によれば、タバコ細胞は、配列番号９に示されるようなポリペプチドをコードする核酸配列を含む。
【００２４】
以下に記載される本発明の好ましい実施形態におけるなおもさらなる特徴によれば、パラメーターの値または値範囲は、下記の値または値範囲のうちの少なくとも１つから選択される：
ａ）約０．０６センチメートル／リットル〜約１センチメートル／リットルの高さ対体積比；
ｂ）約１バール〜５バールの入口ガス圧力；
ｃ）約２０個／１平方メートル〜約７０個／１平方メートルの断面積あたりのガス入口の密度；
ｄ）単位体積の培地あたり１分につき約０．０５体積のガス〜０．１２体積のガスである入口での通気速度；および
ｅ）約２０立方ミリメートル〜約１８００立方ミリメートルの入口でのガス気泡体積。
【００２５】
以下に記載される本発明の好ましい実施形態におけるなおもさらなる特徴によれば、酸素飽和度は、前記容器に含有される液体において単位体積あたり少なくとも１５％の体積である。
【００２６】
以下に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、該組合せは、約０．０６センチメートル／リットル〜約１センチメートル／リットルの高さ対体積比と、約１バール〜５バールの入口ガス圧力との組合せである。
【００２７】
以下に記載される本発明の好ましい実施形態におけるなおもさらなる特徴によれば、該組合せは、約０．０６センチメートル／リットル〜約１センチメートル／リットルの高さ対体積比と、約２０個／１平方メートル〜約７０個／１平方メートルの断面積あたりのガス入口の密度との組合せである。
【００２８】
以下に記載される本発明の好ましい実施形態におけるなおもさらなる特徴によれば、該組合せは、約０．０６センチメートル／リットル〜約１センチメートル／リットルの高さ対体積比と、単位体積の培地あたり１分につき約０．０５体積のガス〜０．１２体積のガスである入口での通気速度との組合せである。
【００２９】
以下に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、該組合せは、約０．０６センチメートル／リットル〜約１センチメートル／リットルの高さ対体積比と、約２０立方ミリメートル〜約１８００立方ミリメートルの入口でのガス気泡体積との組合せである。
【００３０】
以下に記載される本発明の好ましい実施形態におけるなおもさらなる特徴によれば、該組合せはさらに、約２０立方ミリメートル〜約１８００立方ミリメートルの入口でのガス気泡体積のパラメーターを含む。
【００３１】
以下に記載される本発明の好ましい実施形態におけるなおもさらなる特徴によれば、該組合せはさらに、約１バール〜５バールの入口ガス圧力のパラメーターを含む。
【００３２】
以下に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、該組合せはさらに、約２０個／１平方メートル〜約７０個／１平方メートルの断面積あたりのガス入口の密度のパラメーターを含む。
【００３３】
以下に記載される本発明の好ましい実施形態におけるなおもさらなる特徴によれば、該組合せはさらに、単位体積の培地あたり１分につき約０．０５体積のガス〜０．１２体積のガスである入口での通気速度のパラメーターを含む。
【００３４】
以下に記載される本発明の好ましい実施形態におけるなおもさらなる特徴によれば、該組合せは、約０．０６センチメートル／リットル〜約１センチメートル／リットルの高さ対体積比と、約１バール〜５バールの入口ガス圧力と、約２０個／１平方メートル〜約７０個／１平方メートルの断面積あたりのガス入口の密度と、約２０立方ミリメートル〜約１８００立方ミリメートルの入口でのガス気泡体積とを含む。
【００３５】
以下に記載される本発明の好ましい実施形態におけるなおもさらなる特徴によれば、該組合せは、約０．０６センチメートル／リットル〜約１センチメートル／リットルの高さ対体積比と、約１バール〜５バールの入口ガス圧力と、約２０個／１平方メートル〜約７０個／１平方メートルの断面積あたりのガス入口の密度と、単位体積の培地あたり１分につき約０．０５体積のガス〜０．１２体積のガスである入口での通気速度と、約２０立方ミリメートル〜約１８００立方ミリメートルの入口でのガス気泡体積との組合せである。
【００３６】
以下に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、高さ対体積比は、約０．１ｃｍ／リットル〜約０．５ｃｍ／リットルである。
【００３７】
以下に記載される本発明の好ましい実施形態におけるなおもさらなる特徴によれば、高さ対体積比は、約０．４４ｃｍ／リットルである。
【００３８】
以下に記載される本発明の好ましい実施形態におけるなおもさらなる特徴によれば、入口ガス圧力は、約１．５バール〜約４バールである。
【００３９】
以下に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、入口ガス圧力は、約１．５バール〜約２．５バールである。
【００４０】
以下に記載される本発明の好ましい実施形態におけるなおもさらなる特徴によれば、断面積あたりのガス入口の密度は、約４０個／１平方メートル〜約６０個／１平方メートルである。
【００４１】
以下に記載される本発明の好ましい実施形態におけるなおもさらなる特徴によれば、断面積あたりのガス入口の密度は、５５個／１平方メートルである。
【００４２】
以下に記載される本発明の好ましい実施形態におけるなおもさらなる特徴によれば、ガス気泡形成速度は、約２０リットル／分〜約５０リットル／分であり、より好ましくは３０リットル／分である。
【００４３】
以下に記載される本発明の好ましい実施形態におけるなおもさらなる特徴によれば、入口でのガス気泡体積は、約３００立方ミリメートルである。
【００４４】
以下に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、使い捨て型容器は、透明および／または半透明である。
【００４５】
以下に記載される本発明の好ましい実施形態におけるなおもさらなる特徴によれば、容器は、ポリエチレン、ポリカーボナート、ポリエチレンとナイロンとのコポリマー、ＰＶＣ、ならびにＥＶＡからなる群から選択される材料から作製される。
【００４６】
以下に記載される本発明の好ましい実施形態におけるなおもさらなる特徴によれば、容器は、前記材料の２層以上の積層物から作製される。
【００４７】
以下に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、デバイスはさらに、本デバイスを支持するための支持体構造物を含む。
【００４８】
以下に記載される本発明の好ましい実施形態におけるなおもさらなる特徴によれば、支持体構造物は、円錐状の基部を有する剛直な円筒状フレームを含む。
【００４９】
以下に記載される本発明の好ましい実施形態におけるなおもさらなる特徴によれば、採取用ポートは、前記容器の底端部の底部に位置する。
【００５０】
以下に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、前記採取用ポートは、前記容器の底端部の底部の近くに位置し、その結果、それぞれの採取サイクルが終了したとき、細胞および／または組織を含有する前記培地の残り部分が、ハーベスターのレベルよりも下側のレベルに至るまで前記容器の前記底端部において自動的に残留する。
【００５１】
以下に記載される本発明の好ましい実施形態におけるなおもさらなる特徴によれば、前記底端部は、実質的に円錐状である。
【００５２】
以下に記載される本発明の好ましい実施形態におけるなおもさらなる特徴によれば、前記底端部は、実質的に円錐台状である。
【００５３】
以下に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、前記容器は約４００リットル〜約３００００リットル、好ましくは約５００リットル〜８０００リットル、より好ましくは約１０００リットルの内部充満可能体積を含む。
【００５４】
以下に記載される本発明の好ましい実施形態におけるなおもさらなる特徴によれば、本発明の方法はさらに、混入物について、および／または前記容器において産生される細胞／組織の品質について調べること（ただし、混入物が見出されるか、または産生される細胞／組織が不良な品質であるならば、デバイスおよびその内容物が処分される）；混入物が見出されないならば、細胞および／または組織を含有する前記培地の一部を採取することを含む。
【００５５】
以下に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、本発明の方法はさらに、前記一部を採取する一方で、細胞および／または組織を含有する培地の残り部分を前記容器に残すことを含み、この場合、培地の前記残り部分は、次回の培養／採取サイクルのための接種物として役立つ。
【００５６】
以下に記載される本発明の好ましい実施形態におけるなおもさらなる特徴によれば、本発明の方法はさらに、無菌の培養培地および／または無菌の添加物を次回の培養／採取サイクルのために提供すること；および成長サイクルを、前記混入物が見出されるまで、または、産生される細胞／組織が不良な品質となるまで繰り返すことを含み、ただし、前記混入物が見出されるとき、または産生される細胞／組織が不良な品質であるとき、デバイスおよびその内容物が処分される。
【００５７】
以下に記載される本発明の好ましい実施形態におけるなおもさらなる特徴によれば、無菌の空気が、少なくとも１回の培養／採取サイクルの間中、連続して前記ガス交換ポートを介して供給される。
【００５８】
以下に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、無菌の空気が、少なくとも１回の培養／採取サイクルの期間中、パルス的に前記複数のガス入口を介して供給される。
【００５９】
以下に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、デバイスは、培養培地を混合および通気するための機械的手段を何ら有しない。
【００６０】
本発明は、組換えタンパク質を製造するための様々な細胞／細胞培養を伴う使用のために効果的である、大きい体積の、使い捨て可能な、しかし再使用可能なバイオリアクター、並びにその使用のための方法およびシステムを提供することによって、現在知られている構成の欠点に対処することに成功している。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
本明細書では本発明を単に例示し図面を参照して説明する。特に詳細に図面を参照して、示されている詳細が例示として本発明の好ましい実施形態を例示考察することだけを目的としており、本発明の原理や概念の側面の最も有用でかつ容易に理解される説明であると考えられるものを提供するために提示していることを強調するものである。この点について、本発明を基本的に理解するのに必要である以上に詳細に本発明の構造の詳細は示さないが、図面について行う説明によって本発明のいくつもの形態を実施する方法は当業者には明らかになるであろう。
【図１】図１は、本発明のデバイスの１つの例示的な実施形態の主要構成要素を断面側面図において例示する。
【図２】図２は、本発明のデバイスの１つの例示的な実施形態の主要構成要素と、例示的な支持体構造物とを正面図において例示する。
【図３】図３は、大規模使い捨て型バイオリアクターを使用する植物細胞培養において達成される優れた酸素飽和度を示すヒストグラムである。ニンジン細胞を異なる体積のバイオリアクター（三角フラスコ（青色の柱）；１０リットルのリアクター（ＰＸ−１０、赤色の柱）；１００リットルのリアクター（ＰＸ−１００、白色の柱）および４００リットルのリアクター（ＰＸ−４００、オレンジ色の柱））において培養培地に接種し、それぞれのシステムの最適な条件のもとで３日間〜４日間培養した（本明細書中下記の材料および方法を参照のこと）。それぞれのリアクターは、Ｏ２飽和度を示された日に求めるための無菌のシリコンチップ［（カタログ番号ＳＦＰＳＴ３ＹＯＰＳＵＰ（Ｐｒｅｓｅｎｓ  Ｐｒｅｓｉｓｉｏｎ  Ｓｅｎｓｉｎｇ  ＧｍｂＨ））］を備える［Ｏ２は、Ｆｉｂｏｘ３（Ｐｒｅｓｅｎｓ  Ｐｒｅｓｉｓｉｏｎ  Ｓｅｎｓｉｎｇ  ＧｍｂＨ）を使用して測定される］。大規模な（ＰＸ−１００型およびＰＸ−４００型の）バイオリアクターにおけるＯ２飽和度の優れたレベルに留意すること。
【図４】図４は、大規模使い捨て型バイオリアクターを使用したときの組換えＧＣＤの優れた産生を示すウエスタンブロットの写真である。異なる体積のバイオリアクターから得られる４日目または７日目の細胞培養抽出物の粗抽出物の５μｌサンプル（これは、本明細書中以下（材料および方法を参照のこと）に記載されるように調製された）をＰＡＧＥで分離し、ニトロセルロース転写メンブランにブロットし、特異的なウサギ抗ＧＣＤポリクローナル抗体と反応させた。バンドを、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ化学発光基質により可視化した。レーン１−空気吹き込みを伴う１０リットルのリアクター；レーン２−８ｍｍの内径開口部を有する１０リットルのリアクター；レーン３−１００％の酸素が４日目から加えられる１０リットルのリアクター；レーン４およびレーン５−４００リットルのリアクター、４日目；レーン６−４００リットルのリアクター、７日目；レーン７およびレーン８−１００リットルのリアクター、７日目；レーン９およびレーン１０−ｐｒＧＣＤ標準物（２５ｎｇ）。１０リットルおよび１００リットルのリアクターと比較して、著しく優れた大規模使い捨て型バイオリアクターにおけるＧＣＤの収量に留意すること。
【図５】図５ａ〜５ｂは、イオン交換クロマトグラフィーを使用したＡｎｔｉｆｏａｍ−Ｃの除去を示すＲＰ−ＨＰＬＣ分析である。０．０７５％のＡｎｔｉｆｏａｍ−Ｃエマルション（Ｄｏｗ  Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）を１５ｍｌのカチオン交換カラム（Ｂｉｏ  Ｒａｄ  ＵＳＡ）に負荷し、素通り、洗浄および塩グラジエント（０．２ＭのＮａＣｌ；１．２ＭのＮａＣｌ；および１．２ＭのＮａＣｌにおける１２％ＥｔＯＨ）溶出物のサンプルをＡｎｔｉｆｏａｍ−Ｃの検出のために２６２ｎｍでモニターした。図５ａは、カラムに負荷された溶液におけるＡｎｔｉｆｏａｍ−Ｃの検出を示す。図５ｂは、カラム素通りにおけるＡｎｔｉｆｏａｍ−Ｃの検出を示す。Ａｎｔｉｆｏａｍ−Ｃのカラムでの保持がないことに留意すること。
【図６】図６は、大規模使い捨て型バイオリアクターで産生されたＧＣＤの同一性を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析である。４００リットルのリアクターから得られるＧＣＤのサンプル（レーン１、１０μｇ）、８０リットルのリアクターから得られるＧＣＤのサンプル（レーン２およびレーン３、それぞれ１０μｇおよび２０μｇ）、および商業的に調製されるグルコセレブロシダーゼのＣｅｒｅｚｙｍｅ（１０ｎｇおよび２０ｎｇ）（レーン４およびレーン５、それぞれ１０μｇおよび２０μｇ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。バンドをクーマシーブルーによる染色によって可視化した。レーン６は分子量マーカーである。大規模バイオリアクター、小規模バイオリアクターおよび市販のグルコセレブロシダーゼ調製物に由来するＧＣＤが、電気泳動的に同一であることに留意すること。
【図７】図７は、大規模使い捨て型バイオリアクターで産生されたＧＣＤの同一性を示すウエスタンブロットである。４００リットルのリアクターから得られるＧＣＤのサンプル（レーン１およびレーン２、それぞれ５０ｎｇおよび１００ｎｇ）、８０リットルのリアクターから得られるＧＣＤのサンプル（レーン３およびレーン４、それぞれ５０ｎｇおよび１００ｎｇ）、および商業的に調製されるグルコセレブロシダーゼのＣｅｒｅｚｙｍｅ（登録商標）（レーン５およびレーン６、それぞれ５０ｎｇおよび１００ｎｇ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ニトロセルロース転写メンブランにブロットし、特異的なウサギ抗ＧＣＤポリクローナル抗体と反応させた。バンドを、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ化学発光基質によって可視化した。大規模バイオリアクター、小規模バイオリアクターおよび市販のグルコセレブロシダーゼ（Ｃｅｒｅｚｙｍｅ（登録商標））調製物に由来するＧＣＤが、電気泳動的および免疫学的に同一であることに留意すること。
【図８ａ】図８ａは、大規模使い捨て型バイオリアクターで産生されたグルコセレブロシダーゼのペプチドマッピング（トリプシン消化）を示すグラフである。小規模使い捨て型バイオリアクター（８０リットル）および大規模使い捨て型バイオリアクター（４００リットル）から採取されたグルコセレブロシダーゼのサンプルをプロテアーゼにより消化し、アミノ酸「フィンガープリント」を得るために、ＲＰ−ＨＰＬＣ  Ｊｕｐｉｔｅｒ  ４ｕ  Ｐｒｏｔｅｏ  ９０Ａカラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、００Ｇ−４３９６−Ｅ０）で分離し、フラグメントを２１４ｎｍおよび２８０ｎｍでモニターした。図８ａは、１０リットルのバイオリアクターで産生されたグルコセレブロシダーゼのプロフィルである（２１４ｎｍでの検出）。大規模使い捨て型バイオリアクターおよび小規模使い捨て型バイオリアクターについて、製造物が同一であることに留意すること。
【図８ｂ】図８ｂは、大規模使い捨て型バイオリアクターで産生されたグルコセレブロシダーゼのペプチドマッピング（トリプシン消化）を示すグラフである。小規模使い捨て型バイオリアクター（８０リットル）および大規模使い捨て型バイオリアクター（４００リットル）から採取されたグルコセレブロシダーゼのサンプルをプロテアーゼにより消化し、アミノ酸「フィンガープリント」を得るために、ＲＰ−ＨＰＬＣ  Ｊｕｐｉｔｅｒ  ４ｕ  Ｐｒｏｔｅｏ  ９０Ａカラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、００Ｇ−４３９６−Ｅ０）で分離し、フラグメントを２１４ｎｍおよび２８０ｎｍでモニターした。図８ｂは、１０リットルのバイオリアクターで産生されたグルコセレブロシダーゼのプロフィルである（２８０ｎｍでの検出）。大規模使い捨て型バイオリアクターおよび小規模使い捨て型バイオリアクターについて、製造物が同一であることに留意すること。
【図８ｃ】図８ｃは、大規模使い捨て型バイオリアクターで産生されたグルコセレブロシダーゼのペプチドマッピング（トリプシン消化）を示すグラフである。小規模使い捨て型バイオリアクター（８０リットル）および大規模使い捨て型バイオリアクター（４００リットル）から採取されたグルコセレブロシダーゼのサンプルをプロテアーゼにより消化し、アミノ酸「フィンガープリント」を得るために、ＲＰ−ＨＰＬＣ  Ｊｕｐｉｔｅｒ  ４ｕ  Ｐｒｏｔｅｏ  ９０Ａカラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、００Ｇ−４３９６−Ｅ０）で分離し、フラグメントを２１４ｎｍおよび２８０ｎｍでモニターした。図８ｃは、４００リットルのバイオリアクターで産生されたグルコセレブロシダーゼのプロフィルである（２１４ｎｍでの検出）。大規模使い捨て型バイオリアクターおよび小規模使い捨て型バイオリアクターについて、製造物が同一であることに留意すること。
【図８ｄ】図８ｄは、大規模使い捨て型バイオリアクターで産生されたグルコセレブロシダーゼのペプチドマッピング（トリプシン消化）を示すグラフである。小規模使い捨て型バイオリアクター（８０リットル）および大規模使い捨て型バイオリアクター（４００リットル）から採取されたグルコセレブロシダーゼのサンプルをプロテアーゼにより消化し、アミノ酸「フィンガープリント」を得るために、ＲＰ−ＨＰＬＣ  Ｊｕｐｉｔｅｒ  ４ｕ  Ｐｒｏｔｅｏ  ９０Ａカラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、００Ｇ−４３９６−Ｅ０）で分離し、フラグメントを２１４ｎｍおよび２８０ｎｍでモニターした。図８ｄは、４００リットルのバイオリアクターで産生されたグルコセレブロシダーゼのプロフィルである（２８０ｎｍでの検出）。大規模使い捨て型バイオリアクターおよび小規模使い捨て型バイオリアクターについて、製造物が同一であることに留意すること。
【図９】図９ａ〜９ｂは、大規模使い捨て型バイオリアクターで産生されたグルコセレブロシダーゼのＲＰ−ＨＰＬＣ分析を示すグラフである。大規模使い捨て型バイオリアクター（４００リットル）から採取されたグルコセレブロシダーゼを本明細書中以下に記載されるように精製し、Ｃ−４  ＲＰ−ＨＰＬＣカラムで分析し、２１４ｎｍ（図９ａ）および２８０ｎｍ（図９ｂ）でモニターした。ｐｒＧＣＤが、ｐｒＧＣＤ標準物の保持時間（６４．７０分）と類似する６４．１２分の保持時間を有する単一ピークとして現れることに留意すること。
【図１０】図１０は、大規模使い捨て型バイオリアクターを使用して産生されたｐｒＧＣＤの優れた純度を示すＩＥＦゲルの写真である。大規模使い捨て型バイオリアクター（４００リットル）で産生され、本明細書中以下に記載される５つのカラム精製プロセスで精製されたｐｒＧＣＤのサンプルを、小規模使い捨て型バイオリアクター（１０リットル）から精製されたｐｒＧＣＤと一緒に等電点フォーカシングゲルで分離した。レーン２−大規模、第３の精製段階；レーン３−大規模、第４の精製段階；レーン４−大規模、第５の精製段階；レーン５−小規模；レーン１およびレーン６、ＩＥＦ  ＰＩ標準物。精製のすべての段階における、大規模使い捨て型バイオリアクターから得られるｐｒＧＣＤの同一性および高レベルの純度に留意すること。
【図１１】図１１は、大規模使い捨て型バイオリアクターを使用して産生されたｐｒＧＣＤの純度を示すウエスタンブロットである。４００リットルのリアクターから得られるＧＣＤのサンプル（レーン１およびレーン２、それぞれ５０ｎｇおよび１００ｎｇ）、８０リットルのリアクターから得られるＧＣＤのサンプル（レーン３およびレーン４、それぞれ５０ｎｇおよび１００ｎｇ）、商業的に調製されるグルコセレブロシダーゼのＣｅｒｅｚｙｍｅ（レーン５およびレーン６、それぞれ５０ｎｇおよび１００ｎｇ）、およびニンジン宿主タンパク質（ＣＨＰ）（レーン７およびレーン８、それぞれ５０ｎｇおよび１００ｎｇ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ブロットし、特異的な抗ＣＨＰポリクローナル抗体と反応させた。バンドを、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ化学発光基質によって可視化した。大規模使い捨て型バイオリアクターでは、それ以外のすべてのｐｒＧＣＤ調製物の場合のように、不純物が存在しないことに留意すること。
【図１２】図１２は、培養培地の通気および混合を提供するための多数のガス入口と、例示的な円錐状の剛直な支持体構造体とを示す、本発明の例示的な使い捨て型バイオリアクターの底端部の写真である。
【図１３】図１３は、一連の、本発明の例示的な大規模使い捨て型バイオリアクターを示す写真である。
【図１４】図１４は、再使用可能な採取用ポートを示す、本発明の例示的なバイオリアクターの写真である。
【図１５】図１５は、植物発現によるヒト組換えＡＣｈＥの免疫検出を示すウエスタンブロットの写真である。本発明の１つの実施形態による大規模使い捨て型バイオリアクターで産生された組換えヒトＡＣｈＥ−Ｒ（レーン１〜レーン３）、および市販されている組換えヒトＡＣｈＥ−Ｓ（レーン４〜レーン６）の５０ｎｇ（レーン３およびレーン７）、１００ｎｇ（レーン２およびレーン６）および２００ｎｇ（レーン１およびレーン５）を、ヒト起源のＡＣｈＥのＮ末端部のペプチドに対して惹起されたアフィニティー精製によるヤギポリクローナル抗体（Ｓａｎｔａ−Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ）（ＡＣｈＥ−ＲおよびＡＣｈＥ−Ｓにおいて同一）を使用して検出した。レーン４は分子量標準物である。強い抗体結合が、すべてのサンプルにおいて明白である。
【図１６】図１６は、市販されているＡＣｈＥ−Ｓのプロフィルと比較したときの、本発明の１つの実施形態による大規模使い捨て型バイオリアクターで産生された植物発現によるヒト組換えＡＣｈＥ−ＲのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのＦｌａｍｉｎｇｏ（商標）非特異的タンパク質染色の写真である。植物発現によるＡＣｈＥ−Ｒ（レーン１〜レーン３）および哺乳動物細胞により産生されたＡＣｈＥ−Ｓ（レーン５〜レーン７）を図１３の場合のように分離し、ゲルを本明細書中に記載されるようにＦｌａｍｉｎｇｏ（商標）試薬により染色した。ＡＣｈＥ−Ｒの移動プロフィルが、抗ＡＣｈＥ抗体を使用する免疫アッセイによって検出されるＡＣｈＥ−Ｒの移動プロフィル（図１３、上記）に対応することに留意すること。さらに、図１３に示されるようにゲルで観測される単一のバンドは、精製が効率的であることを示している。
【図１７】図１７は、大規模使い捨て型バイオリアクターで培養された植物細胞におけるアセチルコリンエステラーゼ触媒活性を検出するために染色されたＫａｒｎｏｖｓｋｙアッセイゲルである。触媒活性なアセチルコリンエステラーゼ−Ｒを、本発明の１つの実施形態による４００Ｌの大規模使い捨て型バイオリアクターで培養された細胞のプールされたバッチから採取されたＢＹ−２細胞から精製した。細胞から精製されたタンパク質の減少する量（レーン１およびレーン４＝２００ｎｇ；レーン２およびレーン５＝１００ｎｇ；レーン３およびレーン６＝５０ｎｇ）を非変性条件下での１０％ネイティブポリアクリルアミドゲルで分離し、洗浄し、アセチルコリンエステラーゼ触媒活性を明らかにするために処理した（Ｋａｒｎｏｖｓｋｙ染色）。対応する量のアセチルコリン−Ｓ（レーン４〜レーン６）がコントロールとして含まれた。ＡＣｈＥ−ＲおよびＡＣｈＥ−Ｓの電気泳動を非変性条件下での１０％ネイティブポリアクリルアミドゲルにおいて行った。ゲルを４℃で処理し、Ｈ２Ｏにより３回洗浄し、アセチルチオコリン（０．５ｍｇ／ｍＬ；Ｓｉｇｍａ）、酢酸ナトリウム（６５ｍＭ、ｐＨ６．０；Ｓｉｇｍａ）、クエン酸ナトリウム（５ｍＭ；Ｓｉｇｍａ）、硫酸第二銅（３ｍＭ；Ｓｉｇｍａ）およびフェリシアン化カリウム（０．５ｍＭ；Ｒｉｅｄｅｌ  Ｄｅ  Ｈａｅｎ）を含有する緩衝液において撹拌しながら１時間インキュベートした。触媒活性を目視により検出した。上側の矢印は、ＡＣｈＥ−Ｓの四量体の移動を示す。下側の矢印は、単量体ＡＣｈＥの移動を示す。
【発明を実施するための形態】
【００６２】
本発明は、植物組織または植物細胞を培養するための、再使用可能な使い捨て型デバイスの発明である。具体的には、本発明のデバイスは、４００リットル以上の培養培地において植物組織または植物細胞を培養するために好適な溶存酸素濃度および剪断力を維持するために設計される大きさおよびガス交換ポートを有する非剛直性の容器を含む。このようなデバイスは、細胞および／または培養培地から、組換えられた、植物に由来する生物学的に活性な物質（例えば、医薬品）の産生のために形質転換された植物細胞を培養するために使用されることができる。また、本発明のデバイスを使用する植物細胞培養システムも提供される。
【００６３】
本発明の原理および作用が、図面および付随する説明を参照してより十分に理解されることができる。
【００６４】
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳しく説明する前に、本発明は、その適用において、下記の説明において示される細部、または、実施例によって例示される細部に限定されないことを理解しなければならない。本発明は他の実施形態が可能であり、または、様々な方法で実施または実行される。また、本明細書中で用いられる表現法および用語法は記述のためであって、限定であると見なしてはならないことを理解しなければならない。
【００６５】
本明細書中上記に記載されるように、使い捨て型バイオリアクターの大きい体積へのスケールアップでは、通気および混合の問題に対する独特の解決策が要求される。いくつかの先行技術バイオリアクターでは、この目的のためにガスが用いられている。米国特許出願第２００５／０２８２２６９号（Ｐｒｏｕｌｘ他）は、通気および混合を提供するために、容器の底端部に設置された入口ポートにおける組み込まれたガスデフューザーおよびガスフィルターを持つ多数のガス入口を有する使い捨て型バイオリアクターを開示する。そのような形態は、フィルターが液体培地と接触していることにより、閉塞しやすく、また、十分なガス供給を妨げやすい傾向があるという点で制限される。体積容量または大きさは、何ら開示されていない。
【００６６】
ガスを通気および撹拌のために使用する別のタイプの使い捨て型バイオリアクターが、Ｃｅｌｌｅｘｕｓ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＰＣＣ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、英国）によって提供される。このバイオリアクターは、空気またはガスを通気および混合のために導入するために、デバイスの内側底端部に沿って取り付けられるか、または設置される一体化したスパージャーチューブを有する柔軟なバッグである。Ｃｅｌｌｅｘｕｓのバイオリアクターバッグは、バッグの流体体積の大部分をバイオリアクターの上半分に集中させる独特の非対称的な幾何形状に従って設計される。この設計では、特別に設計された支持体筺体（Ｃｅｌｌｍａｋｅｒ  Ｌｉｔｅ（商標））が運転のために要求される。
【００６７】
米国特許第６４３２６９８号（Ｇａｕｇｌｅｒ他）は、線虫の培養のための柔軟な使い捨て可能な培養バッグを開示する。この培養バッグには、ガス入口およびガスデフューザーが、培養培地の通気および混合のためにチューブの形態で取り付けられる。２００リットルまでの体積が想定されているが、実施化は何ら提供されていない。具体的な大きさは、何ら開示されていない。
【００６８】
米国特許出願第２００５／０２７２１４６号（Ｈｏｄｇｅ他）は、混合のための一体化されたインペラーブレードを有する１５０リットルの使い捨て型バイオリアクターを開示する。インペラーによるバイオリアクター内の培養培地の混合は、植物細胞を培養するためには適さない剪断力を生じさせることが知られている。
【００６９】
米国特許第６３９１６８３号（Ｓｈａａｌｔｉｅｌ他）（これは、全体が本明細書中に示されるかのように参照によって本明細書に組み込まれる）は、単回使用のために、または培養および採取の多数回のサイクルのために設計され、ガス入口ポートおよびガス出口ポートを有する非剛直性のバッグを含む使い捨て可能な培養デバイスを開示する。このデバイスでは、注意深く調節された気泡体積および気泡数による空気圧が、培養物を混合および通気するために用いられる。様々な異種（哺乳動物および非哺乳動物）の組換えタンパク質を正確に発現する形質転換された植物細胞の効率的な培養が、Ｓｈａａｌｔｉｅｌによって記載されるように、このようなバイオリアクターを使用して報告されている（米国特許第６３９１６８３号、米国特許出願第１０／７８４２９５号；国際特許出願公開ＰＣＴ番号ＷＯ２００４／０９１４７５、同ＷＯ２００５／０８０５４４および同ＷＯ２００６／０４０７６１を参照のこと。これらのすべてが、全体が本明細書中に示されるかのように参照によって本明細書に組み込まれる）。しかしながら、Ｓｈａａｌｔｉｅｌ他は、米国特許第６６９１６８３号において、より小さいサイズおよび中程度のサイズの体積について好適な設計を開示しており、そのため、それらにおいて合成される組換えタンパク質の収量が制限される。
【００７０】
本発明を実施に移しているとき、本発明者らは、透明または半透明な非剛直性の材料から構成される大規模な再使用可能な使い捨て型バイオリアクターを設計している。このバイオリアクターは、少なくとも２回の連続する培養サイクルのための使用を可能にするサンプル抜取りポート、特定の大きさ、そして、４００リットルを超える体積における植物細胞の効率的な成長のために、好適な溶存酸素濃度および剪断力を伴ってバイオリアクターにおいて細胞培養物を混合および通気するために十分な様式でガスを提供するガス交換ポートを有する。
【００７１】
従って、本発明の１つの局面によれば、植物組織および／または植物細胞を培養および採取するための使い捨て可能なデバイスが提供される。
【００７２】
本発明のデバイスは、少なくとも４００リットルの体積を有し、かつデバイスが少なくとも２回の連続する培養／採取サイクルのために連続して使用されることを可能にするガス交換ポートおよび採取用ポートを伴って構成される非剛直性の容器を含む。
【００７３】
本発明のデバイスは、任意のタイプの細胞または組織を培養するために使用することができるが、植物細胞および植物組織の効率的な大規模培養を可能にするように設計される。
【００７４】
培地の酸素飽和度は、細胞の効率的な成長および組換えタンパク質の発現のために非常に重要であり、従って、バイオリアクターの適正な運転、および組換え細胞産物の産生におけるその使用に非常に重要である。植物細胞は、細菌細胞または哺乳動物細胞よりも酸素飽和度における変動の影響を受けやすいので、植物細胞の培養による成長のためのバイオリアクターの酸素飽和度は、一層より重要である（Ｓｃｈｌａｔｍａｎｎ他、Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．、１９９５、４５：４３５〜３９を参照のこと）。さらに、植物細胞は、おそらくはより大きい植物細胞サイズ、夥しい液胞形成および凝集パターンを最大の原因として、従来型バイオリアクターにおける流体力学的環境に対して敏感である。従って、ガス気泡を容器に導入することによる培養培地の通気によって混合がもたらされるが、脆い植物細胞には有害な剪断力は避けなければならない。近年、培養されている植物細胞が、致死的でない剪断力に対して感受性であり、これにより、植物細胞バイオリアクターの効率を結果として著しく制限する特徴的な「亜溶解的」応答を伴って応答することが示されている（ＮａｍｄｅｖおよびＤｕｌｏｐ、Ａｐｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐａｒｔ  Ａ、Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ、１９９５）。
【００７５】
従って、本発明のデバイスは、植物組織および／または植物細胞を４００リットル以上の体積で培養するために好適な酸素飽和度および剪断力を、培養における酸素飽和度および剪断力を決定するために非常に重要であるパラメーター、またはそのようなパラメーターの組合せを用いることによって維持する。
【００７６】
植物組織および／または植物細胞を本発明のデバイスで培養するために好適な酸素飽和度および剪断力が、ａ）高さ対体積比、ｂ）入口ガス圧力、ｃ）断面積あたりのガス入口の密度、ｄ）入口での通気速度、およびｅ）入口でのガス気泡体積の値または値範囲の組合せによって維持される。
【００７７】
高さ対体積比：機械的混合方法は、大きい体積の培地が処理されている場合には特に、植物細胞バイオリアクターにおける使用には不適である。大規模バイオリアクターにおける培養培地の通気および混合を、ガス気泡を培地の中で移動させることによって達成することができる。培地とのガス気泡の接触が広範囲であればあるほど、ガス交換の可能性が大きくなり、また、培地におけるガスの混合作用が効率的になる。従って、体積の小さいバイオリアクターの高さ対体積比がより大きい柔軟性を可能にしてきたかもしれないが、大きい体積（例えば、４００リットル以上）で使用されるためのバイオリアクターデバイスの高さ対体積比は、約０．０６センチメートル／リットル〜１センチメートル／リットルの範囲内に維持されなければならない。高さ対体積比は、デバイスの容器の高さ（長さ）およびデバイスの平均断面積から計算することができる。本明細書中で使用される場合、デバイスの体積は、高さに断面積を掛けたものである。例えば、２００センチメートルの高さ（長さ）および４００Ｌの体積を有する（例えば、約２５センチメートルの平均半径を有する）バイオリアクターについては、高さ対体積比は２００／４００であり、すなわち０．５である；３００ｃｍの高さおよび３０００Ｌの体積を有するバイオリアクターについては、高さ対体積比は３００／３０００であり、すなわち０．１である。本発明のバイオリアクターでの使用のために好適である高さ対体積比の範囲の例は、約０．０６センチメートル／リットルであり、好ましくは約０．１センチメートル／リットル〜約０．５センチメートル／リットルであり、最も好ましくは約０．４４センチメートル／リットルである。
【００７８】
さらに、高さ対体積比は、容器の潜在的な総充満可能内部体積を使用して、またはバイオリアクターにおいて流体レベルの上方に典型的に見出される「ヘッドスペース」を含まない、容器の運転のための機能的な充満可能内部体積である、総充満可能内部体積の示された一部を使用して、計算できることが理解される。
【００７９】
入口ガス圧力：十分なガス（例えば、空気または酸素）を大規模バイオリアクターの培養培地の混合および通気のために提供するためには、入口でのガス圧力が、バイオリアクターにおける液体の柱の下向きの力に打ち勝つために、また、同時に、多すぎる気泡の生成、または植物細胞培養のためには適さないサイズの気泡の生成に伴う剪断力を回避するために十分である必要がある。本発明の大規模バイオリアクターは、植物細胞培養のために好適な高さ対体積比を有するので、より小さい体積のバイオリアクターの場合よりも大きい、ガス入口でのガス圧力を必要とする。ガス圧力はバール単位で表される（１バールは１０００００パスカル（Ｐａ）または１００００００ダイン／ｃｍ２である）。ガス入口でのガス圧力をモニターするための様々な圧力計、およびガス入口でのガス圧力を制御するための様々な圧力調整器が、この技術分野では広く知られており、また、広範囲に市販されている。本発明のバイオリアクターのために好適である入口ガス圧力の範囲の例は、約１．５バール〜約４バールの範囲であり、より好ましくは約１．５バール〜約２．５バールの範囲である。
【００８０】
断面積あたりのガス入口の密度：小さい体積のバイオリアクターは、典型的には、所望の体積の十分なガス気泡をバイオリアクター槽における培養培地の混合および通気のために提供するために、１個だけまたは非常に少ない数のガス入口に制限される。他方で、大きい体積のバイオリアクター（例えば、本発明のデバイスなど）は、デバイスにおける培養培地の柱の圧縮力に打ち勝つために、また、植物細胞培養での使用のために好適な様式で混合および通気を提供するために要求される入口ガス圧力の範囲を達成するために、ガス入口のより大きい密度を必要とする。ガス入口での圧力の制御、ならびに大きい体積のバイオリアクターにおける培養培地の混合および通気のために最適な気泡サイズの維持をもたらすために、複数のガス入口が提供され、これらは、デバイスの使い捨て可能な非剛直性の容器に所定の密度で配置される。ガス入口の密度は、デバイスの容器の１平方メートルの外側表面あたりの入口の数として表される。本発明のバイオリアクターにおける使用のために好適であるガス入口の密度の範囲の例は、容器の表面の約２０個／１平方メートル〜約７０個／１平方メートルの入口である。好ましくは、断面積あたりのガス入口の密度は、約４０個〜６０個／１平方メートルの入口であり、より好ましくは５５個／１平方メートルの入口である。
【００８１】
入口での通気速度：一般には増大した通気（すなわち、より迅速なガス交換の存在）、および具体的には増大した酸素はともに、培養における細胞の成長速度を増大させる。植物細胞培養のためのより小さい体積のバイオリアクターには、典型的には、空気が、ガス入口において、０．１５ｖｖｍ〜０．３ｖｖｍ（単位体積の培地あたり１分につき０．１５体積の空気〜０．３体積の空気）の通気速度で提供され、この場合、通気速度は、体積が増大するにつれ大きくなる。しかしながら、細胞の循環の促進における気泡の有効性は、１つの大きい同等な体積の場合よりも小さい複数の閉じた体積の方が異なっており、従って、比例的でない通気速度が、同じ培地の総合体積を有する多数の小さい体積における通気速度と比較して、大きい体積における空気循環および酸素分布を促進させるために要求される。
【００８２】
本発明を実施に移しているとき、本発明者らは、驚くべきことに、大規模なバイオリアクターでは、通気速度（ｖｖｍ）を体積の増大とともに比例的に増大させるのではなく、ｖｖｍで測定される通気速度の範囲を低下させることによって、改善された結果が達成されたことを見出している。植物細胞を大きい体積のバイオリアクターで培養するために好適であるガス入口での通気速度の範囲の例は、約０．０５ｖｖｍ〜０．１２ｖｖｍであり、好ましくは約０．０７ｖｖｍ〜約０．１ｖｖｍである。そのような低下した通気速度の利点には、大きい体積のバイオリアクターでのより大きい収量、および改善されたエネルギー効率が含まれ、これらは工業的規模の培養において非常に重要である。
【００８３】
入口でのガス気泡体積：大規模なリアクターにおける好適な混合装置の重要性は、誇張しても誇張しすぎることはない。いくつかの場合において、特に植物細胞に関しては、ガス気泡サイズが、バイオリアクターにおける細胞の効率的な培養および成長のために非常に重要である。小さい気泡は、実際に植物細胞に損傷を与えることがあるが、２０立方ミリメートル以上の平均気泡体積により、この潜在的な問題が実質的に克服される。従って、ガス圧力および入口の数とともに、入口でのガス気泡体積の制御は、植物細胞を成長させるために効果的な培養培地の混合および通気を達成するために重要である。ガス入口によって送達される気泡のサイズは、デバイスの使用法に従って変化するが、入口でのガス気泡体積の好適な範囲の例は、２０立方ミリメートルの体積〜１８００立方ミリメートルを超える体積までであり、好ましくは約４０立方ミリメートル〜約１０００立方ミリメートルであり、より好ましくは約１００立方ミリメートル〜約５００立方ミリメートルであり、最も好ましくは約３００立方ミリメートルである。より小さい気泡が所望される場合、気泡のサイズを小さくしながらも、大規模な植物細胞バイオリアクターのための好適なサイズよりも小さくしないために、スパージャーをガス入口で使用することができる。
【００８４】
従って、本発明の使い捨て型バイオリアクターは、本明細書中で述べられるこれらのパラメーターに従って、大きい体積の培養条件を提供する一方で、植物細胞培養物および培地の優れた通気および非機械的混合を維持すること（これらに限定されない）を含めて、現在知られているデバイスより優れた数多くの利点を有しており、従って、これらにより、培養細胞および細胞に由来する産物の優れた収量および純度を達成する。
【００８５】
図１は、デバイス１０として本明細書中に示される、本発明のデバイスの１つの実施形態を例示する。
【００８６】
図１に示されるように、デバイス１０は、植物組織および／または植物細胞を培養および採取するために役立つ容器１２を含む。容器１２は、図１では、液体により部分的に満たされて、従って、その膨張した（比較的剛直性の）状態で示される。しかしながら、容器１２は、好ましくは非剛直性の容器として構築されること（例えば、柔軟な材料から構築されること）に留意しなければならない。従って、容器１２の内容物が容器の壁に及ぼす圧力により、容器１２の形状が維持される。空であるとき、または部分的に満たされたとき、容器１２は、本来的にはその非剛直性の設計によって、部分的または完全に折り畳むことができる。容器１２のこの特徴は、空であるとき、貯蔵および輸送を容易にする。容器１２は、約４００リットル〜約３００００リットル（より好ましくは約５００リットル〜８０００リットル、最も好ましくは約６００リットル〜３０００リットル）を収容することができる内部体積を有する。容器１２は、約０．０６センチメートル対リットル〜１センチメートル対リットルの典型的な高さ対体積比を有することができる。
【００８７】
容器１２は、好ましくは、ポリマー（例えば、ポリエチレン、ポリカーボナート、ポリエチレンとナイロンとのコポリマー、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、エチレン酢酸ビニル（ＥＶＡ）、ならびにエチレンビニルアルコール（ＥＶＯＨ）など）から構築される。様々な規格、密度およびタイプのポリマーを使用することができる（例えば、低密度ポリエチレン（ＬＤＰＥ）、超低密度ポリエチレン（ＶＬＤＰＥ）、超低密度ポリエチレン（ＵＬＤＰＥ）および線状低密度ポリエチレン（ＬＬＤＰＥ）など）。容器１２は、ポリマーシートから溶接することによって、または溶融ポリマーからブロー成形することによって、またはこの技術分野において知られているいずれかの他の標準的なプラスチック−ポリマー製造方法によって構築することができる。
【００８８】
１つの好ましい形態において、容器１２は、１つまたは複数のタイプのポリマーの数層からなる積層体から構築される。積層体は、様々な厚さを有する、類似するか、または異なる柔軟な材料から製造することができる２層、３層、４層、および７層までの層、９層までの層、１５層までの層、またはそれ以上に至るまでの層を含有することができ、材料および厚さを、例えば容器１２の流体体積に従って選択することができる。これらの層は、共押し出しによって製造することができる。積層体は、容器の内側表面および外側表面に対して特定の滑らかさまたは粗い組織、程度の差はあるが、所定の引張り強さ、弾性、柔らかさ、柔軟性、靭性、耐久性、加工性などをもたらすように設計することができる。低いレベルの不活性化された動物由来加工剤を有するか、または好ましくは有しない材料を選択することができる。スリップ剤および／または粘着防止剤（例えば、シリカまたは珪藻土など）を、摩擦を低下させるために、および／または自己接着を防止するために、積層体の層に含ませることができる。
【００８９】
本発明の容器１２は、容器に透明性および／または半透明性を与えるように設計された材料から作製することができ、いくつかの実施形態において、光が細胞または産物に損傷を与え得る場合、材料はまた、不透明とすることができる。本明細書中で使用される場合、透明は、必ずしもすべての光ではないが、ほとんどの光を容易に透過させて、透き通っていると定義され、一方、半透明は、すべての光ではないが、一部の光を透過させると定義される。１つの実施形態において、デバイスは、光合成の能力を有しない、培養されている植物細胞のためのものである。別の実施形態において、他のタイプの細胞（例えば、コケ細胞、藻類細胞、光合成能を有する光合成細菌）をこのデバイスにおいて成長させることができる。好ましくは、容器の内部体積の中に通される光は、バイオリアクターで培養される植物細胞の光合成色素および他の集光色素による使用のために好適な波長の光である。光はまた、二次代謝産物（例えば、ワイン用ブドウ細胞によるアントシアニン）の産生のために必要とされる場合がある。より好ましくは、容器１２は、培養の状態を示す可能性のある、培養および／または培養培地における変化（例えば、汚染から生じる色、細胞凝集、濁り）を検出するために、内部体積の目視または機器（例えば、分光光度法）による観察および／またはモニタリングを可能にする材料から設計される。
【００９０】
容器１２は、任意の望ましい形態で製造することができ、好ましくは、容器１２が空であるときには、平坦であり、容器１２が満たされているときには、実質的に円筒状の断面形状をもたらすことができる２つの側壁１８を介してつながれる上部１４および底部１６（図１において円錐状）を有する先細りスリーブ様の形態である。他の断面形状（例えば、長方形または多面体）もまた好適である場合がある。
【００９１】
円筒状の形状は、植物細胞培養物に対して有害である乱流を最小限にし、また、植物細胞培養物に対して有害である望まれない剪断力の生成を最小限にして混合するために、最も一様で、かつ邪魔されない流体の流れを初めから最後までもたらすので、細胞培養容器に最も適することが理解される。好ましくは、底部１６は、好適には沈降を最小限に抑える形状に形成される。例えば、底部１６は、上に向かって傾斜する（１つまたは複数の）壁を少なくとも有する（図１に示されるように）実質的には円錐台状とすることができる。本発明を実施に移しているとき、本発明者らは、この形状が、崩壊および細胞死を促進し、従って培養物の全体的な生存性に影響を及ぼし得る細胞の沈降を避けるために、円錐状の形状よりも優れていることを見出している。代替として、底部１６は実質的に円筒状とすることができ、または、代替的に凸型とすることができる。底部１６の上記の形態は、底部１６の近くで容器１２に供給されるガスが、底部１６での沈降を効果的に最小限に抑える容器内容物への混合運動を誘導することを可能にする。それにもかかわらず、底部１６は、本発明の他の実施形態では実質的に平坦にすることができる。
【００９２】
容器１２は、好適な材料の（側壁１８を形成する）２つのパネルを接合／溶接することによって製造することができる。例えば、ポリマー材料の２枚のシートをほぼ細長い長方形の形状に切断し、一方を他方の上にして置くことができる。その後、シートは、２つの長い方の辺の端に沿って、また、短い方の末端の一方の周りに沿って継ぎ目を形成するために、この技術分野において広く知られている様式で融着され、そして、継ぎ目を容器の上部１４において形成するために、再び同方向に内側に向かって移される。
【００９３】
容器の底部１６を、シートの残る短い末端を２つの傾斜する継ぎ目ラインに沿って融着することによって形成することができ、これにより、底部１６が長辺の継ぎ目から互いに一点に集まる。場合により、２つの傾斜する継ぎ目ラインを、長辺の継ぎ目に対してほぼ直交する別の融着された継ぎ目ラインによって、それらの先端の上につなぐことができる。２枚のシートを融着する前に、硬質プラスチックのボスを、（以下にさらに記載される）対応する入口ポートおよび出口ポートのための取り付け点に対応する場所に融着することができる。
【００９４】
容器１２はまた、柔軟なポリマー材料の連続したスリーブから製造することができ、これにより、継ぎ目を容器の長辺に沿って溶接する必要性がなくなり、また、連続する、切れ目のない円形の断面が容器の高さのほとんどにわたってもたらされる。溶接継ぎ目がないことにより、培養培地の通気および混合の期間中の乱流および剪断力が最小限に抑えられるので、製造用材料のスリーブを使用することが望ましい。
【００９５】
図１に示されるように、容器１２は、細胞および／または組織を含有する培地の少なくとも一部を採取し、それにより、デバイス１０が、清浄化、殺菌および／または試験をサイクル間において必要とすることなく、少なくとも２回の連続する培養サイクルまたは採取サイクルのために連続して使用されることを可能にするための採取用ポート１９Ｉをさらに含む。代替的には、採取を、バイオリアクターの内容物のすべてを排出するためにバイオリアクターの底部に位置し、従って、バイオリアクター内の全培養物の採取を可能にするさらなる採取用ポート（１９ＩＩ）を介して行うことができる。細胞および／または組織を含有する培地の残留する第２の部分は、次回の培養・採取サイクルのための接種物として役立ち、ここで、以下に記載されるように、培養培地および／または要求される添加物を与えることができる。採取ポート（１つまたは複数）１９はまた、接種物の最初の体積を容器に導入するとともに、採取物がポートを通って容器から外に流れ出ることを可能にするために使用することができる。
【００９６】
採取ポート（１つまたは複数）１９は、容器１２の内部体積と流体連絡している採取入口２２を有する採取パイプ２０と、容器１２の外側に配置される採取出口２４とを含む。代替的には、採取ポート（１つまたは複数）１９を、内側から内部体積と接触し、容器の外側への出口を有する、容器１２の中に溶接された単一のオリフィスから作製することができる。採取パイプ２０を、この技術分野では広く知られているようなポリマー材料または合金から作製することができる。
【００９７】
採取が細胞凝集塊の存在によってしばしば妨げられるので、好ましくは、大きい内径（例えば、１ｃｍ〜１０ｃｍの範囲における大きい内径）を有し、かつ／または障害物の排出を可能にする程度の弾性を有する採取パイプ２０が製造される。
【００９８】
採取ポート（１つまたは複数）１９の位置は、培地ならびに細胞および／または組織の残留する一部が、容器１２の体積の所定の割合（例えば、５％〜３５％）であるように、容器１２の体積に従って選択される。
【００９９】
採取ポート１９を、容器１２の内容物の大部分を採取する一方で、細胞および／または組織を含有する培地の一部を接種物としての使用のために保持することを可能にする、容器１２の底部に近い位置に設置することができる。
【０１００】
代替的に、または加えて、採取ポート１９ＩＩを容器１２の底部１６のさらに下方に設置することができ、従って、操作者は、細胞および／または組織を含有する培地の好適な一部が、培地ならびに細胞および／または組織の所望される一部を採取した後で容器１２に残留することを、必要な場合には手作業により確保することができる。ポート１９ＩＩを底部１６のさらに下方の位置に有することにより、培地のすべてまたはほとんどを取り出すことができる。
【０１０１】
採取用ポート１９および採取用ポート１９ＩＩの前記位置は、上記では選択すべきものとして示されるが、両方が１つのデバイス１０に組み込まれ得、これにより、操作者に選択的な採取用ポートが提供されることが理解される。
【０１０２】
採取ポート（１つまたは複数）１９は、流量調節器２６をさらに含む。流量調節器２６は、例えば、容器１２の中への、または容器１２から外への、採取ポート（１つまたは複数）１９を介する物の流れを調節するためのバルブであることが可能である。流れはまた、耐久性の殺菌可能な材料（例えば、ガラス、ステンレス鋼および硬質プラスチックなど）から作製される無菌コネクターを介して調節することができる。採取ポート（１つまたは複数）１９はまた、採取後における容器１２内への意図されない物の導入を防止するために、汚染防止器（図示せず）（例えば、流体トラップなど）を含むことができる。
【０１０３】
容器１２は、さらなるサンプル抜取りポートを含むことができ、このサンプル抜取りポートは、構造において採取ポート（１つまたは複数）１９に類似しており、採取ポート１９の近くに配置することができる。容器１２は、培地または他の添加物を導入するために、必要に応じてさらなる添加物入口５１をさらに含む。いくつかの実施形態において、添加物入口５１は、培養培地の上方の「ヘッドスペース」と連絡して容器１２の上端部に設置される。他の実施形態において、添加物入口５１は、容器１２の中央部分または底端部の近くに設置される。他の実施形態において、添加物入口５１は、培地添加期間中または培地添加後などにおける容器１２内への物の意図されない導入を防止するために、汚染防止器（図示せず）（例えば、流体トラップなど）をも含むことができる。
【０１０４】
デバイス１０はさらに、ガスを容器１２の中に、またガスを容器１２から外に連絡するための複数のガス交換ポートを含む。ガス交換ポートは、少なくとも１つのガス入口ポート２８を、ガス（例えば、空気、酸素または他のガスなど）を培地に浸透させるために、また、植物細胞培養物の通気および混合のために含み、かつ少なくとも１つのガス排出ポート３０を、容器１２の内容物（例えば、培養培地および細胞）に浸透するガスを放出するために含む。ガス入口ポートおよびガス排出ポートは、本明細書中に詳しく記載されるフィルター４９を備えることができる。１つの実施形態において、空気圧をより良く分布させる一方で、気泡の所望される流れのために必要な流入を提供するために、複数のガス入口が提供される。
【０１０５】
ガス入口ポート（１つまたは複数）２８を、１つまたは複数のガス供給チューブを介してガス供給源（例えば、ポンプ）に接続することができる。
【０１０６】
ガス入口ポート２８を柔軟な材料（例えば、シリコーン）または剛直性の材料（例えば、ステンレス鋼）から作製することができる。ガス入口ポート（１つまたは複数）２８のガス入口３４（ガス入口３４（Ｉ）は位置Ｉにおいてガス入口ポート２８（Ｉ）に対応し、ガス入口３４（ＩＩ）は位置ＩＩにおいてガス入口ポート２８（ＩＩ）に対応する）が、本明細書中上記に記載されるように、望ましくない剪断力を生じさせることなく、植物培養培地を通気および混合し、かつ沈降を防止するために好適な体積のガス気泡を提供するように設計される。ガス入口３４は、所望される気泡形状および気泡サイズを提供するために、形状を変化させることができる（狭い、広い、先細り、円錐状、丸形など）。代替的に、ポートを、採取用ポート１９について記載されるように、直径が内側開口部および外側開口部において異なる一体品に作製することができる。
【０１０７】
ガス交換ポート２８およびガス交換ポート３０、採取ポート（１つまたは複数）１９、ならびに必要に応じて使用されるサンプル抜取りポートは、この技術分野では広く知られているように、その開口部を容器１２の表面に作り、開口部をさらなる剛直性の材料または非剛直性の材料によりポートの周りで補強することによって形成される。
【０１０８】
好適な混合および通気を提供するために、複数のガス入口ポート２８を２０個〜７０個／１平方メートルの入口の密度で提供することができる。ガス入口ポート２８を、容器１２の周囲に沿って、その底端部１６から所定の距離で配置することができる。ガス入口ポート２８の存在位置は、容器の体積および高さによって、また、具体的な植物培養使用のために所望される通気のタイプによって決定される。ガス入口ポート２８を容器の底部１６から１５センチメートル〜６５センチメートに設置することができる。本発明の１つの実施形態において、ガス入口ポートの少なくとも１つは、採取用ポート１８のレベルよりも低い位置に存在する。
【０１０９】
さらなるガス入口ポート２８を、例えば、非常に大きい長さ寸法を有する容器については、または、より大きい体積の容器については、ガス入口圧力またはガス気泡体積を増大させることなくより大きい体積のガスを提供するために、必要に応じて提供することができる。さらなるガス入口ポート２８を容器１２の表面において任意の場所に設置することができ、好ましくは、培地の実質的な混合および通気を提供するために、容器１２の高さの底部側半分の部分に配置することができる。複数のガス入口ポートを有するそのような形態は、植物細胞培養物の効率的な混合および通気を提供するために、ガス入口３４（Ｉ）およびガス入口３４（ＩＩ）をそれぞれ有し、互いに所定の距離で配置される、位置Ｉにおけるガス入口ポート［２８（Ｉ）］および位置ＩＩにおけるガス入口ポート［２８（ＩＩ）］によって、本明細書において示される。ガス入口ポートは、混入するガス、流体または固体（例えば、浮遊する微生物）が容器１２の内部体積および培養培地の中に入ることを防止することができる汚染防止機構（例えば、フィルター４９またはトラップ（図示せず）など）をさらに含むことができる。
【０１１０】
容器１２は、ガス排出ポート３０を、培養培地の上方に蓄積するガスの放出および除去のために含む。ガス排出ポート３０は、容器１２の上側半分（好ましくは上側１／３）の部分において、流体（例えば、培養培地）のレベルを実質的に超え、その結果、培養培地の上方の「ヘッドスペース」と流体連絡しているような場所に設置される。ガス排出ポート３０の外側のガス排出開口部４６は、環境に通じることができ、排出ガスの流れは、ガス排出ポート３０において調節されない。場合により、また、代替として、ガス排出ポート３０は、容器１２からのガスの流れを調節し、従って、陽圧のガス圧力を容器１２の内部に生じさせ、従って、容器１２を十分に膨張させて、所望の円筒形状に維持することができるガス排出調節器４８（例えば、圧力バルブまたは圧力クランプ）をさらに含むことができる。ガス排出ポート３０は、混入するガス、流体または固体（例えば、浮遊する微生物）が容器１２の内部体積および培養培地の中に入ることを防止することができる汚染防止機構（例えば、フィルター４９またはトラップなど）をさらに含むことができる。
【０１１１】
本発明の容器１２は、少なくとも４００リットルで、数千リットルに至るまでの培養培地の体積を伴う使用のために設計されるので、また、本発明の容器１２は、本質的には柔軟であるので、デバイス１０はさらに、容器１２を所定の位置で支えるための支持体構造物を含む。
【０１１２】
図２に示されるように、支持体５０は、力を容器１２およびその中の内容物に及ぼすことなく、支えを容器１２に提供するように設計される円錐状の構造物を含むことができる。
【０１１３】
支持体５０を、スチール、木材、プラスチックまたはセラミックから製造することができる。支持体を、リング状の支持体部材５２および棒状の支持体部材５４からなる格子様構造物を形成する軽量の円筒形または楕円形の管材料から作製することができる。代替として、支持体部材は、垂直な棒様部材につながれ、かつ水平のリング状部材にさらにつながれるプレートであることが可能である。プレートは連続していることが可能であり、これにより、容器のための外殻様支持体を本質的にもたらすことができ、または、たる板様であることが可能であり、これにより、すき間が間に存在する幅広い支持体要素のリングを提供することができる。支持体構造物５０は、支えなしで立っていることができ、または移動用のキャスター（図示せず）に取り付けることができ、あるいは、支持体構造物５０は、剛直な構造物（例えば、壁、床、柱など）に取り付けることによってさらに支えることができる。
【０１１４】
容器１２は使い捨て可能であり、従って、最小限の損失および環境への影響を伴って使用（１回または複数回の培養サイクル）の後で廃棄されるように設計される。例えば、本発明のデバイスにおいて使用されるプラスチック（例えば、柔軟なプラスチックなど）から作製されるデバイスは、比較的安価であり、従って、処分することが所望されるならば、無視できるほどの経済的損失を伴って使用後に処分することができる。これらの物品の低い資本費用までもが、使用の容易さ、貯蔵、および他の実用的な検討事項を背景にして相殺されるので、これらのバイオリアクターデバイスの処分は、一般に、使用者に経済的不利益を与えない。処分は、環境を汚染し得る消毒剤および他のきつい化学物質による徹底した洗浄の必要性がなくなるという点で好都合である。従って、ポリマーの使い捨て型バイオリアクターデバイス（例えば、容器１２など）は容易に再生利用することができ、従って、その使用による汚染および環境への影響を減らすことができる。
【０１１５】
容器１２は殺菌し、再使用することができるが、容器１２は、好ましくは事前に殺菌された形態で提供され、それにより、費用および時間がかかる殺菌手順の必要性が除かれる。非剛直性容器の殺菌を、湿式殺菌プロセスおよび／または乾式殺菌プロセスを使用して行うことができる。好ましくは、殺菌は、本明細書中で述べられる柔軟な非硬質プラスチック材料を伴う使用のために適する乾式殺菌プロセスであり、例えば、この技術分野では広く知られているガンマ線照射または電子ビーム照射、およびガス（例えば、エチレンオキシド）殺菌などである。
【０１１６】
本発明の好ましい実施形態によれば、前記に記載された個々のデバイスおよび／または一組のデバイスの操作は、コンピュータ（図示せず）によって制御される。コンピュータは、場合により、また、好ましくは、温度、容器に入るガスまたはガス組合せの量および時期、容器から出ることが許されるガスの量および時期、少なくとも１つの物（例えば、栄養分および培養培地など）を加える量および時期、ならびに／あるいは光の量のうちの１つまたは複数のような、本発明による一組のデバイスおよび／または１つのデバイスを操作するパラメーターを制御することができる。コンピュータは必要な場合にはまた、産生されている廃棄物の量を検出することができる。
【０１１７】
コンピュータは、好ましくは、本発明の操作を自動化または半自動化するためのシステムの一例として、本発明の操作に関して存在する様々な測定装置につながれる。例えば、コンピュータは、好ましくは、ガスまたはガス組合せの流れを制御するための１つまたは複数の計器（図示せず）につながれる。計器は、好ましくは、好適な空気供給源に接続可能なパイプにつながれ、パイプへの空気または他のガスの流れを制御する。
【０１１８】
コンピュータはまた、好ましくは温度計につながれるが、この場合、温度計は、より好ましくは容器１２の環境に存在し、しかし、より好ましくは容器１２の内部に存在しない。コンピュータはまた、場合により、また、好ましくは、温度を制御するための機構（例えば、加熱装置および／または冷却装置など）を制御することができる。
【０１１９】
コンピュータは、場合により、また、好ましくは、栄養物／培地容器から容器１２への培地および／または他の栄養分の流れを制御するための計器につながれる。
【０１２０】
コンピュータは、好ましくは、容器の少なくとも１つのポートにつながれ、より好ましくは、少なくとも採取ポート１９につながれる。コンピュータは、必要な場合には、試験および／または採取を行うために、必要に応じて使用されるサンプル抜取りポートから容器の内容物の一部を取り出すための自動化されたサンプラーおよび／またはハーベスターを制御することができる（図示せず）。コンピュータはまた、場合により、例えば、コンピュータを操作するためのフィードバックを提供するために、内容物のこれらの一部を分析するための分析計につなぐことができる。
【０１２１】
本明細書中上記で述べられるように、デバイス１０は、植物細胞培養物を培養するために設計される。本発明のデバイスにおいて大きい体積の植物細胞を培養するために好適である培養培地は、この技術分野において知られている植物細胞培養培地のどれでもよい。好適な培養培地の具体的な、しかし限定されない例として、Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ−Ｓｋｏｏｇ培地（Ｓｉｇｍａ  Ｌｔｄ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、Ａｎｄｅｒｓｏｎ培地およびＳｃｈｅｎｋ−Ｈｉｌｄｅｂｒａｎｄｔ培地などが挙げられる。多くの植物組織培養培地が市販されている（例えば、Ｐｈｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｓｈａｗｎｅｅ  Ｍｉｓｓｉｏｎ、ＫＹ）を参照のこと）。
【０１２２】
表現「植物細胞培養（培養物）」は、任意のタイプの野生型（天然に存在する）植物細胞、または遺伝子改変された植物細胞（例えば、外因性遺伝子の安定的発現または一過性発現を行うことができる遺伝子改変された植物細胞）を示す。好ましくは、植物細胞培養（物）は、医薬品産業（薬物または薬物ＡＰＩ）、食品産業（例えば、調味料、芳香）、農業（例えば、殺虫剤）および化粧品などにおける使用のために商業的に所望される有効成分を産生する細胞の培養（培養物）を示す。
【０１２３】
好ましくは、植物細胞培養（物）は、植物組織（例えば、根または葉の分裂組織など）から得られる植物細胞を含む。より好ましくは、植物細胞は、アグロバクテリウム・リゾゲネスにより形質転換された根細胞、セロリ細胞、ショウガ細胞、タバコ細胞、アルファルファ細胞、トマト細胞、レタス細胞、西洋ワサビ細胞およびニンジン細胞からなる群から選択される。
【０１２４】
本発明において成長させることができるさらなる細胞培養物には、酵母、コケ、藻類、光合成細菌が含まれる。
【０１２５】
本発明のデバイスおよび方法による使用のために好適な植物細胞培養物には、樹立細胞株および植物の根、葉、茎および花などから作製される細胞株が含まれるが、これらに限定されない。樹立細胞株の限定されない例には、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ  Ｌ．ｃｖ  Ｂｒｉｇｈｔ  Ｙｅｌｌｏｗ−２（ＢＹ−２）細胞株およびＮｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ  Ｌ．ｃｖ  Ｐｅｔｉｔ  Ｈａｖａｎａ細胞株がある。
【０１２６】
本発明の大規模バイオリアクターに好適である混合および通気を提供するために要求される増大したガス入口圧力、増大したガス入口密度、増大したガス通気速度およびガス容積は、細胞に対して、また培地の内容物に対して有害であり得る、植物細胞培養の泡立ちという起こり得る問題を提起し得ることが理解される。泡立ちを抑制するためにこの技術分野において知られている方法には、小さい気泡を、より大きい、それほど有害でない気泡に合体させるように作用する消泡剤（例えば、シリコーン、有機ホスファートおよびアルコールなど）を使用することが含まれるが、これに限定されない。工業および食品加工において一般に使用される食品規格の消泡剤には、例えば、ポリジメチルシロキサンおよびシメチコンが含まれる。本発明の大規模使い捨て型バイオリアクターにおける消泡剤の使用は、本明細書中下記の実施例の節において詳しく記載される。
【０１２７】
本発明はまた、植物細胞を大規模使い捨て型バイオリアクターにおいて培養および採取するための方法に関する。このデバイスは、場合により、また好ましくは、本明細書中上記に記載されるデバイスに従って構成され、最も好ましくは、下記の実施例１に記載されるデバイスに従って構成される。この方法において、植物細胞は、好ましくは本発明によるデバイスの容器に入れられる。場合により、またより好ましくは、植物細胞は懸濁状態で培養される。
【０１２８】
本発明の好ましい実施形態によれば、植物細胞は液体培地での懸濁状態で培養され、この場合、少なくとも１つの無菌のガスまたはガス組合せ（複数のガス）が必要に応じて加えられる。場合により、また好ましくは、無菌のガスは、より好ましくは無菌の空気を含む無菌のガス組合せを含む。無菌のガスおよび／またはガス組合せは、好ましくは、前記に記載されるように、それぞれのサイクルの期間中に、連続的またはパルス的のどちらかで、好ましくは滅菌用フィルター（好ましくは、０．２ミクロンのフィルター）につながれる空気入口を介して容器に加えられる。
【０１２９】
無菌の培養培地および／または無菌の添加物が、好ましくは容器に入れられ、そして、好ましくは、前記に記載されるような１つまたは複数の滅菌用フィルターを通って添加物入口５１を介してバイオリアクターの中に移される。
【０１３０】
植物細胞（無菌接種物の一例として）は、場合により、また好ましくは、ハーベスターを介して加えられる。場合により、また好ましくは、容器（１２）における植物細胞は、特に容器が透明および／または半透明であるならば、例えば、外部の光（容器の外部にある照明源）により光にさらすことができる。場合により、光源が全く使用されず、場合により、容器は暗条件で維持される。
【０１３１】
細胞は、細胞および／または細胞によって産生される物質（例えば、タンパク質または二次代謝産物など）の所望される収量にまで成長させることができる。
【０１３２】
好ましい実施形態によれば、過剰な空気および／または廃棄ガスは、好ましくは、場合により、またより好ましくは連続的および／または断続的ではあるが、必要な場合にはフィルターを介して、ガス出口を経由して容器から出て行くことができる。
【０１３３】
同様に、場合により、また好ましくは、容器内の物（例えば、細胞培養培地など）は、１つまたは複数の混入物について、ならびに／あるいはこの容器で産生される細胞および／または細胞産物の品質について調べられる。より好ましくは、１つまたは複数の混入物が培養物に存在することが見出された場合、あるいは産生される細胞および／または細胞産物が不良な品質である場合、デバイスおよびその内容物が処分される。
【０１３４】
適切な時点において、特に、混入物、ならびに／あるいは不良な品質の細胞および／または細胞産物が見出されない場合、容器における物の少なくとも第１の部分が好ましくは採取される（例えば、細胞および／または細胞産物を含有する培地など）。より好ましくは、物の残留する第２の部分（例えば、細胞および／または細胞産物を含有する培地など）を容器に残留させることができ、この場合、この第２の部分が、場合により、次回の培養／採取サイクルのための接種物として役立ち得る。次いで、無菌の培養培地および／または無菌の添加物を、汚染の防止のためにフィルター４９に必要に応じてつながれる添加物入口５１を介して、次回の培養／採取サイクルのために提供することができる。
【０１３５】
前記に記載されたサイクルは、必要な場合には２回以上行われる。場合により、および好ましくは、この方法は、細胞が嫌気的に培養および／または採取されることを可能にする。
【０１３６】
そのような嫌気的な実施形態のために、酸素または空気の代わりに、不活性ガスがデバイスのガス入口を介して提供される。その少なくとも１つのデバイスのために、下記のプロセスが行われる。無菌接種物が、採取用ポートを介してデバイスに導入される。次に、無菌の培養培地および／または無菌の添加物が、共通する添加物入口配管を介してデバイスに加えられる。場合により、デバイスは、前記に記載されるように照らされる。
【０１３７】
デバイスにおける細胞は、細胞および／または細胞の産物の所望される収量にまで培地において成長させることができる。場合により、および好ましくは、過剰な空気および／または廃棄ガスは、ガス排出ポートを介して、より好ましくは連続的に、必要な場合にはフィルターを通ってデバイスから出て行くことができる。
【０１３８】
前記方法について、容器内の物は、１つまたは複数の混入物の存在、ならびに／あるいは不良な品質の細胞および／または不良な品質の細胞産物についてモニターされ、そのような場合には、容器およびその内容物は、好ましくは処分される。同様に、前記方法について、細胞および／または細胞産物は、好ましくは好適な時点で採取され、例えば、細胞産物の所望される量が産生されたときに採取される。
【０１３９】
典型的には、水精製システムにより、脱イオン化され、かつ実質的にエンドトキシンを含まない水が、高濃度培地を含むタンクに供給され、その後、希釈された培地が添加物入口を介してデバイス１０にポンプにより送られる。フィルター（典型的には０．２マイクロメートル）が、それぞれのデバイス１０における容器内容物の汚染の危険性を最小限にするために、供給パイプに取り付けられ、入口のすぐ上流側にもまた取り付けられる。代替的に、または加えて、バルブもまた、この危険性を最小限にするために使用することができる。
【０１４０】
それぞれのデバイス１０の最初の培養サイクルのために、接種物、典型的には、デバイス１０において採取することが要求されるタイプの細胞の十分なサンプルが、事前に殺菌された容器において培地または水と事前に混合され、典型的にはハーベスターポートを介してデバイス１０に導入されるが、代替的に、または場合により、別個の添加物入口ポートを介してデバイス１０に導入される。培地が、その後、ハーベスターポートを介して、または場合により使用される添加物入口ポートを介してデバイス１０に導入される。続くサイクルについては、本明細書中前記に記載されたように、培地および／または添加物のみが導入される。
【０１４１】
典型的には、空気コンプレッサーにより、実質的に殺菌された空気またはガスが、いくつかの装置を介して、例えば、粒子を除くための粗い目のフィルター、湿度を除くための乾燥機および湿度装置、ならびに混入物を除くための細かい目のフィルター（典型的には０．２マイクロメートル）を介して、それぞれのデバイス１０に提供される。好ましくは、ガス入口のすぐ上流側の別のフィルターにより、容器内容物の汚染の危険性がさらに最小限に抑えられる。
【０１４２】
それぞれのデバイス１０について、容器１２へのすべての接続、すなわち、ガス入口ポート、添加物入口ポート、および好ましくは、同様にガス排気ポート、ならびにハーベスターへの接続のすべてが、使用前に殺菌され、無菌性が、接続を層状の気流フードにおいて行うことによって、例えば、空気の供給および排気を含めて、周辺設備への接続の期間中において維持される。
【０１４３】
それぞれのデバイス１０のための温度制御が、好ましくは、好適な空気取り扱い装置によって提供される。場合により行われるデバイスの照明を、細胞成長または化合物産生のために要求されるときには、デバイス１０の周りに好適に配置される好適な蛍光灯によって提供することができる。
【０１４４】
それぞれのデバイス１０のそれぞれの培養サイクルの期間中、それぞれの対応する容器１２の内容物は、典型的には、制御された温度条件および照明条件のもとで約３日間〜約１４日間またはそれ以上にわたって通気および混合される。培養条件および培養の継続期間は、それぞれの培養サイクルの個々の要件に従って、例えば、培養されている細胞のタイプ、採取される組換え産物、および接種物の濃度などに従って決定される。
【０１４５】
それぞれのデバイス１０についての培養サイクルが終了したとき、対応するハーベスターポートは、典型的には、本明細書中前記に記載されたように、接続前および接続期間中に殺菌される好適なコネクターにより、事前に殺菌された環境につながれる。その後、採取が行われ、これにより、典型的には約１０％〜約３５％ではあるが、約２．５％〜約４５％の細胞および／または組織が、次のサイクルのための接種物として役立たせるために残される。
【０１４６】
採取された細胞／組織および／または細胞産物は、その後、必要な場合には、必要に応じて乾燥または抽出することができる。
【０１４７】
場合により行われる別の調節は、純酸素を細胞培養プロセスの期間中に加えることであり、より好ましくは、純酸素を、培養プロセスを開始した後の３日目または４日目に加えることである。
【０１４８】
本発明の大規模使い捨て型バイオリアクターにおいて培養するために好適である好ましい細胞タイプの一例は、下記の実施例の節において記載される形質転換されたニンジン細胞である。実施例の節において記載されるように、この細胞は、ヒトグルコセレブロシダーゼ（ｈＧＣＤ）をコードする外因性遺伝子を発現する、アグロバクテリウム・ツメファシエンスにより形質転換されたニンジン細胞である。本発明の１つの局面の別の実施形態において、細胞タイプはタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）である。本発明のさらに別の実施形態において、タバコ細胞はＢＹ−２細胞である。本発明の大規模使い捨て型バイオリアクターでの使用のために好適であるニンジンおよび他の細胞タイプにおける外因性遺伝子の形質転換および発現のための様々な方法が、この技術分野では広く知られている。使い捨て型バイオリアクターを使用するニンジン細胞培養および他の細胞培養における生物学的に活性な外因性タンパク質の形質転換および発現が、米国特許出願第１０／７８４２９５号およびＰＣＴ公開公報ＷＯ２００４／０９６９７８に詳しく開示される（これらは全体が本明細書中に組み込まれる）。
【０１４９】
下記の実施例の節では、上記に記載されたニンジン細胞を培養することにおける本発明のデバイスの使用、およびタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）細胞での本発明のデバイスの使用が明らかにされる。下記の実施例において示されるように、４００リットルを超える体積を有する大規模バイオリアクターデバイス１０におけるトランスジェニックニンジン細胞およびトランスジェニックタバコ細胞の培養では、組換えタンパク質の優れた収量および純度がもたらされた。ヒトグルコセレブロシダーゼを発現するニンジン細胞、およびアセチルコリンエステラーゼ−Ｒを発現するタバコ細胞を大規模使い捨て型バイオリアクターおよびより小規模の使い捨て型バイオリアクターで培養し、培養条件、収量および生成物を分析および比較した（実施例２および実施例３を参照のこと）。結果は、本発明の大規模使い捨て型バイオリアクターでは、培養培地の増大したＯ２飽和度が著しくより低い入口通気速度でもたらされ、Ｏ２飽和度が培養の少なくとも７日間にわたって３０％にまで至り、また、より大きい培養効率がもたらされ、その結果、組換えタンパク質産物のより大きい収量が得られることを示す。ペプチドマッピング（図８）、ＩＥＦ（図１０）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび免疫学的分析（図７、図１５〜図１７）、ならびにクロマトグラフィー（図６および図９）による組換えタンパク質の分析では、大規模使い捨て型バイオリアクターから採取された細胞から得られるグルコセレブロシダーゼ酵素調製物およびアセチルコリンエステラーゼ酵素調製物が、標準的規模の技術によって得られる標準的調製物のそれと同一であることが示された。このことは、８０Ｌ、４００Ｌおよび８００Ｌのバイオリアクターから採取された細胞から製造される酵素調製物の一貫性および同一性を強く示している。大規模使い捨て型バイオリアクターに由来する酵素調製物はまた、優れていないとしても、同等な触媒活性および比活性を示した（表５および図１７を参照のこと）。さらに、本発明の大規模使い捨て型バイオリアクターで産生された組換えβ−グルコセレブロシダーゼは、検出できないレベルのニンジン宿主細胞タンパク質を含有し、標準的体積の製造方法によって製造されたβ−グルコセレブロシダーゼの純度を最低でも有することが示された（図１１）。従って、本発明の大規模使い捨て型バイオリアクターは、より小さい体積で、それどころか、はるかにより小さい体積で開発された、組換えタンパク質を発現する植物細胞培養物のスケールアップのための正確で、効率的で、かつ優れてさえいる条件を提供することができる。
【実施例】
【０１５０】
次に下記の実施例が参照されるが、下記の実施例は、上記の説明と一緒に、本発明を非限定様式で例示する。
【０１５１】
本願で使用される用語と、本発明で利用される実験手順には、分子生化学、微生物学および組み換えＤＮＡの技法が広く含まれている。これらの技法は文献に詳細に説明されている。例えば以下の諸文献を参照されたい：「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻（１９９４）Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．編；Ａｕｓｕｂｅｌら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、米国メリーランド州バルチモア（１９８９）；Ｐｅｒｂａｌ「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、米国ニューヨーク（１９８８）；Ｗａｔｓｏｎら、「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ」Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ、米国ニューヨーク；Ｂｉｒｒｅｎら編「Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ」１〜４巻、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、米国ニューヨーク（１９９８）；米国特許の第４６６６８２８号、同第４６８３２０２号、同第４８０１５３１号、同第５１９２６５９号および同第５２７２０５７号に記載される方法；「Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ」Ｉ〜ＩＩＩ巻、Ｃｅｌｌｉｓ，Ｊ．Ｅ．編（１９９４）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻、Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｊ．Ｅ．編（１９９４）；Ｓｔｉｔｅｓら編「Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（第８版）、Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ＆  Ｌａｎｇｅ、米国コネティカット州ノーウォーク（１９９４）；ＭｉｓｈｅｌｌとＳｈｉｉｇｉ編「Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｗ．Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．、米国ニューヨーク（１９８０）；利用可能な免疫アッセイ法は、特許と科学文献に広範囲にわたって記載されており、例えば：米国特許の第３７９１９３２号、同第３８３９１５３号、同第３８５０７５２号、同第３８５０５７８号、同第３８５３９８７号、同第３８６７５１７号、同第３８７９２６２号、同第３９０１６５４号、同第３９３５０７４号、同第３９８４５３３号、同第３９９６３４５号、同第４０３４０７４号、同第４０９８８７６号、同第４８７９２１９号、同第５０１１７７１号および同第５２８１５２１号；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．編（１９８４）；「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．編（１９８５）；「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．編（１９８４）；「Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ」Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．編（１９８６）；「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎ��  Ｅｎｚｙｍｅｓ」ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９８６）；「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ．（１９８４）および「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」１〜３１７巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；「ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、米国カリフォルニア州サンディエゴ（１９９０）；Ｍａｒｓｈａｋら、「Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ」ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）；これらの文献の全ては、あたかも本願に完全に記載されているように援用するものである。その他の一般的な文献は、本明細書を通じて提供される。それらの文献に記載の方法は当業技術界で周知であると考えられ、読者の便宜のために提供される。それらの文献に含まれるすべての情報は本願に援用するものである。
【０１５２】
（実施例１）
大規模使い捨て型バイオリアクターにおける植物細胞の効率的な培養
大規模使い捨て型バイオリアクターを使用して産生された培養物および細胞産物の成長パラメーター、収量および特徴を調べるために、ヒトグルコセレブロシダーゼを発現するニンジン細胞を大規模使い捨て型バイオリアクターおよびより小規模の使い捨て型バイオリアクターで培養し、培養条件、収量および産物を分析および比較した。
【０１５３】
材料および実験方法：
ＧＣＤを発現するニンジン細胞の形質転換および培養：細胞の形質転換および培養を実施例２に記載されるように行った。
【０１５４】
バイオリアクターにおけるアップスケール培養での成長。ｒｈ−ＧＣＤ遺伝子を含有する遺伝子改変されたニンジン細胞カルスの約１ｃｍ（直径）を、４．４ｇｒ／ｌのＭＳＤ培地（Ｄｕｃｈｅｆａ、Ｈａａｒｌｅｍ、オランダ）、９．９ｍｇ／ｌのチアミンＨＣｌ（Ｄｕｃｈｅｆａ）、０．５ｍｇの葉酸（Ｓｉｇｍａ  Ｌｔｄ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、０．５ｍｇ／ｌのビオチン（Ｄｕｃｈｅｆａ）、０．８ｇ／ｌのカゼイン加水分解物（Ｄｕｃｈｅｆａ）、３０ｇ／ｌの糖およびホルモンの２，４−Ｄ（Ｓｉｇｍａ）を含有する、９ｃｍのプレートにおける寒天培地に置床した。カルスを２５℃で１４日間成長させた。
【０１５５】
細胞懸濁培養物を、この技術分野では広く知られているように、形質転換されたカルスを、０．２ｍｇ／ｌの２，４−ジクロロ酢酸を含有するＭＳＤ液体培地で継代培養することによって調製した。その後、細胞懸濁培養物を、２５℃で、６０ｒｐｍの振とう速度により、２５０ｍｌ三角フラスコにおいて培養した（２５ｍｌの作業体積で開始し、体積を７日間の培養の後で５０ｍｌに増大させた）。続いて、細胞培養体積を同じ条件のもとで１Ｌの三角フラスコにおいて３００ｍｌにまで増大させた。
【０１５６】
４ＬのＭＳＤ培地を含有する小型のバイオリアクター（１０Ｌ）［国際特許出願公開ＷＯ９８／１３４６９を参照のこと］の接種物を、７日間培養された２つの１Ｌ三角フラスコに由来する４００ｍｌの細胞懸濁物を加えることによって得た。１Ｌｐｍの空気流での２５℃での１週間の培養の後、ＭＤＳ培地を１０Ｌにまで加え、培養を同じ条件のもとで続けた。さらなる培養（５日）の後、細胞のほとんどを、細胞培地を８０ミクロンの網に通すことによって採取し、集めた。余分な培地を絞り出し、押し固めた細胞ケークを−７０℃で保存した。
【０１５７】
消泡剤：泡立ちを避けるために、Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ａｎｔｉｆｏａｍ  Ｃ  Ｅｍｕｌｓｉｏｎ（ポリジメチルシロキサン−ＰＤＭＳ、Ｄｏｗ  Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｍｉｄｌａｎｄ、ＭＩ）を使用した（これは、３０％のシメチコンＵＳＰ、メチルセルロース、ソルビン酸および水を含有する）。消泡剤を１０ｐｐｍの濃度で４００Ｌバイオリアクターの培地に加えた。
【０１５８】
消泡剤の分析：Ａｎｔｉｆｏａｍ  Ｃ  Ｅｍｕｌｓｉｏｎ（ＰＤＭＳ）は、抗膨満剤として、また、非規格化食品における成分として使用される。ＰＤＭＳの存在を、シメチコンエマルションについてのすべてのＵＳＰ要求事項に準じて、また、そのようなＵＳＰ要求事項に従って評価した。０．０７５％ＰＤＭＳの４５０ｍｌの溶液を１５ｍｌのカチオン交換クロマトグラフィーカラム（Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ（登録商標）Ｈｉｇｈ  Ｓ担体、ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）に負荷した。ＰＤＭＳ分析用のアリコートを、負荷物から、素通り（非結合物）から、ならびに０．２ＭのＮａＣｌ、１．２ＭのＮａＣｌ、および１．２ＭのＮａＣｌにおける１２％エタノールの３つの溶出工程から取った。
【０１５９】
異なるクロマトグラフィー工程（負荷、素通り、洗浄および溶出の工程）の期間中における採取培養物のアリコートサンプルを集め、２６２ｎｍ（Ａｎｔｉｆｏａｍ  Ｃ  Ｅｍｕｌｓｉｏｎのピーク吸光度）においてモニターされるＣ４カラムを用いてＲＰ−ＨＰＬＣ法を使用してＰＤＭＳの存在について分析した。
【０１６０】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ：ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）では、タンパク質が主にその分子量によって分離される。加えて、この技術は、タンパク質の純度および組成に関する多くの情報をもたらす。大規模使い捨て型バイオリアクターから採取された細胞から製造されるｐｒＧＣＤの分子量同一性およびタンパク質不純物パターンを、標準的なゲル分離プロトコルに従って、クーマシーブリリアントブルー染色を使用するＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって調べた。簡単に記載すると、ＳＤＳゲルは濃縮ゲル（３％）および分離ゲル（１２％）からなる。泳動緩衝液はＴｒｉｓ／ＳＤＳ（ｐＨ８．３）であり、負荷緩衝液はグリセロール−Ｔｒｉｓ−メルカプトエタノール（ｐＨ６．８）であった。
【０１６１】
逆相高速（高圧）液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）：ＲＰ−ＨＰＬＣでは、無傷なタンパク質および他の成分をタンパク質溶液から分離することが含まれる。それぞれの化合物のまさにその保持時間が特徴的であり、この保持時間により、目的とするタンパク質の同一性および純度を決定することができる。植物組換えＧＣＤ（ｐｒＧＣＤ）の特徴的なピークおよび保持時間を、定常相Ｃ−４（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｊｕｐｉｔｅｒ  ５ｕ  Ｃ４  ｐｒｏｔｅｏ  ３００Ａ、４．６ｘ２５０ｍｍ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ｔｏｒａｎｃｅ、ＣＡ）カラムを、Ａ：０．１％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ、およびＢ：０．１％ＴＦＡ／アセトニトリルの移動相グラジエントとともに使用して求めた。タンパク質の検出を、２つの波長（２１４ｎｍおよび２８０ｎｍ）で検出するダイオードアレイ分光光度計により行った。
【０１６２】
ポリクローナル抗体の調製：組換えＧＣＤ（７５マイクログラム、Ｃｅｒｅｚｙｍｅ（商標）、Ｇｅｎｚｙｍｅ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）を３ｍｌの完全フロイントアジュバント（Ｄｉｆｃｏ、Ｖｏｉｇｔ、Ｌａｗｒｅｎｃｅ、Ｋａｎｓａｓ）に懸濁し、２羽のウサギのそれぞれに注射し、その後、追加免疫注射を２週間後に与えた。ウサギは追加免疫注射の約１０日後に採血され、抗体力価が低下し始めるまで１週間の間隔で再び採血された。凝血塊を除いた後、血清を小分けし、−２０℃で保存した。
【０１６３】
ウエスタンブロッティング：ウエスタンブロットを、特異的なアフィニティー精製された抗ＧＣＤ抗体を使用することによって、大規模使い捨て型バイオリアクターから採取された細胞から精製される植物組換えＧＣＤ（ｐｒＧＣＤ）分子を、以前の製造バッチおよび市販のヒトβ−グルコセレブロシダーゼ（Ｃｅｒｅｚｙｍｅ（登録商標）、Ｇｅｎｚｙｍｅ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）との比較において特定するために行った。タンパク質の転写を、実質的には本明細書中に記載されるように行った。簡単に記載すると、ゲルからニトロセルロースへの転写を１００ボルトにおいて４℃で９０分間行った。転写後、メンブランをブロッキング緩衝液［１％ドライミルク、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（カタログ番号：Ｐ１３７９；Ｓｉｇｍａ  Ｌｔｄ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、リン酸緩衝液において］においてインキュベートした。その後、タンパク質を抗ＧＣＤ抗体とのインキュベーションによって免疫検出し、洗浄し、好適な二次抗体（例えば、ヤギ抗ウサギ（完全分子）ＨＲＰ（カタログ番号Ａ−４９１４）など）と反応させた。その後、ブロットをＥＣＬ発色剤試薬（ＲＰＮ２２０９、Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＵＫ  ＬＴＤ）により発色させ、オートラジオグラフィーを可視化のために使用した。
【０１６４】
異なるバイオリアクターおよび異なる通気法におけるｐｒＧＣＤ産生の比較：ｐｒＧＣＤを発現する組換え細胞を、４日間〜７日間、異なる体積のバイオリアクター（１０Ｌ、１００Ｌ、４００Ｌ）で成長させた。細胞を、異なる通気法（スパージャーによる通気法；８ｍｍの内腔開口部による通気法；１００％の酸素が４日目から加えられる通気法）に供される３つの異なる１０Ｌバイオリアクターで成長させた。粗抽出物のサンプル（５μｌ）を４日目または７日目に取り、２５ｎｇのｐｒＧＣＤ標準物と一緒にＰＡＧＥで分離し、ニトロセルロース転写メンブランにブロットし、特異的なウサギ抗ＧＣＤポリクローナル抗体と反応させた。バンドを、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ化学発光基質（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）によって可視化した。
【０１６５】
溶存酸素：溶存酸素速度がＫｌａの単位で示される：ｄＣ／ｄＴ＝Ｋｌａ，（Ｃｓ−Ｃ）、式中、Ｃｓは酸素の飽和レベル（ｍｇ／ｌ）であり、Ｃは実際の酸素濃度（ｍｇ／ｌ）である。
【０１６６】
通気速度：通気速度は、入口での空気流量をバイオリアクターの作業体積により除することによって計算されるように、ガス入口における、単位体積の液体体積あたり１分につき１気圧の圧力での空気の体積（体積／体積／分）と定義される。
【０１６７】
最適な通気速度の決定：最適な通気速度を決定するために、最適化を、より少ない体積のバイオリアクターの通気速度を達成するために空気流量をアップスケールし、通気速度を、最適な所定のパラメーターを達成するまで変えることによって、（１００Ｌから、４００Ｌおよび８００Ｌの大規模バイオリアクターへの）体積におけるすべての増大について行った。異なる通気速度の影響を、泡立ちレベル、液体の乱流レベル、空気の流出に対するフィルター抵抗、およびバイオリアクターの膨張を含む様々な物理的パラメーターに関して調べた。生物学的パラメーターには、１回の成長サイクル（７日）についての細胞新鮮重量（ｇｒ／Ｌ）の毎日の記録によって示されるような培養細胞の成長曲線、および７日間でのタンパク質産物収量が含まれた。１０回〜１５回の成長サイクルを、最適化された通気速度を達成するために比較した。
【０１６８】
結果
大規模使い捨て型バイオリアクターでの培養は、より低い通気速度を要求する：
増大した通気は培養における細胞の成長速度を増大させるということは、細胞培養の公理である。植物細胞培養のためのより小さい体積のバイオリアクターでは、典型的には、空気が０．１５ｖｖｍ〜０．３ｖｖｍの通気速度で提供される。驚くべきことに、様々な体積のバイオリアクターの培養効率を、最小限の剪断力を維持しながら、空気循環および酸素分布を促進させるために好適な通気速度の範囲について評価したとき、大規模バイオリアクターのための最適な通気速度が、より小さい体積のリアクターのための通気速度よりも比例的に小さかったことが見出された。下記の表１は、より小さい体積のバイオリアクター（１００Ｌまで）では、体積における増大が、効率を維持するために、通気速度における増大を要求する一方で、大規模バイオリアクター（４００Ｌ以上）では、最適な通気速度が、バイオリアクターの体積が増大するに伴って実際には低下することを示す。そのような低下は、剪断力を低下させる能力、およびエネルギー効率がより大きいことの両方のために、工業的規模の培養において好都合である。
【０１６９】
【表１】
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【０１７０】
大規模使い捨て型バイオリアクターは優れた酸素飽和度レベルをもたらす：バイオリアクターにおけるガスの導入、混合および放出に影響を及ぼす各種パラメーターの適正な組合せは、本発明の大規模使い捨て型バイオリアクターの効率的な運転にとって非常に重要である。気泡体積、通気速度、入口でのガス圧力、気泡におけるガス圧力、および培養培地の中を通り抜ける気泡の進路を、通気および混合を最適化するためにバランスさせなければならず、また、その一方で懸濁物の内部における破壊的な剪断力および乱流を最小限に抑えなければならない。これらのパラメーターを評価するために、酸素飽和度レベルを求めた。
【０１７１】
図３は、４００リットルの大規模使い捨て型バイオリアクターにおける培地のパーセントＯ２飽和度を、接種時（０日目）、ならびに培養の３日目、４日目および７日目にサンプルとして抜き取られたアリコートで測定したときの、より小型のリアクター槽（三角フラスコ、１０リットルのバイオリアクターおよび１００リットルのバイオリアクター）を使用する培地におけるＯ２飽和度と比較して示す。空気の圧力および流量は、大規模バイオリアクターでは３５Ｌ／分であり、より小型の１０リットルおよび１００リットルのリアクターでは１０Ｌ／分であった。接種後の飽和度における減少は、懸濁物における細胞含有量が比例的に増大するので、広く知られている現象である。だが、７日間にわたる緩やかな減少にもかかわらず、大規模使い捨て型バイオリアクターは、明らかに、接種後７日までのどの示された時点でも３０％を超える、培地の優れたＯ２飽和度のための条件をもたらす。
【０１７２】
下記の表２は、８００リットルのバイオリアクターが、より小さい体積のバイオリアクターと比較されたとき、Ｋｌａ（ｍｇ／Ｌ）として表される、一層より大きいＯ２飽和度レベルを達成することを示す。この優位性は、通気速度の範囲にわたって維持される。
【０１７３】
【表２】
2014014365.tif 000004
【０１７４】
大規模使い捨て型バイオリアクターは優れた組換えタンパク質収量をもたらす：培養での組換えタンパク質の産生効率に対する大規模使い捨て型バイオリアクターにおける培養の影響を明らかにするために、リアクターのそれぞれから得られる懸濁物の抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ブロットし、抗ヒトグルコセレブロシダーゼ（ＧＣＤ）抗体による免疫検出によって分析した。４００Ｌの大規模使い捨て型バイオリアクターでの組換え産物の収量（図４、レーン４〜レーン６）、ならびに１０Ｌのリアクターでの組換え産物の収量（図４、レーン１〜レーン３）、および１００Ｌのリアクターでの組換え産物の収量（図４、レーン７および８）における比較では、明らかに、大規模バイオリアクターにおける増大したタンパク質レベルおよび培地のより効率的な使用が示される。実際、４日および７日の培養での大規模バイオリアクターにおけるＧＣＤの収量（それぞれ、レーン４、レーン５およびレーン６）は、増大したガス入口内腔（図４、レーン２）および４日目からのＯ２の添加（図４、レーン３）を伴う１０ＬのリアクターにおけるＧＣＤの収量よりも優れていた。
【０１７５】
これらの結果は、本発明の大規模使い捨て型バイオリアクターでは、培養培地の増大したＯ２飽和度および培養のより高い効率がもたらされ、その結果、組換えタンパク質産物のより大きい収量およびより高いエネルギー効率が得られることを示している。
【０１７６】
大規模使い捨て型バイオリアクターにおける培養培地からの消泡剤の効率的かつ簡便な除去：より高い空気圧を大規模使い捨て型バイオリアクターの通気のために使用することにおいて、培地の泡立ちという問題は、多くの理由から避けなければならない問題であり、注意を必要とする。４００Ｌのバイオリアクターに移されるとき、消泡剤（１０ｐｐｍ）を細胞成長培地に加えた。
【０１７７】
標準化された実験室技術（例えば、ＨＰＬＣおよび原子吸光など）を使用する検出下限レベルは、およそ７ｐｐｍである。
【０１７８】
大規模使い捨て型バイオリアクターからの組換え産物の採取および精製が消泡剤残渣を除くことができることを確認するために、大過剰のＰＤＭＳ消泡剤を精製プロセスの初期段階に供し、消泡剤の存在を初めから終わりまでモニターした。
【０１７９】
図５ａは、カチオン交換カラムの負荷溶液のアリコートにおけるＰＤＭＳ消泡剤（０．０７５％）のＲＰ−ＨＰＬＣ分析を示す。保持時間（ピーク）は、２２．５３１分であった。図５ｂは、カラムの素通りにおける消泡剤を示し（保持時間２２．５５４分）、ピークのサイズおよび２６２ｎｍでの吸光度は、負荷物と類似している。ＰＤＭＳは、３つのその後の溶出工程（０．２ＭのＮａＣｌ、１．２ＭのＮａＣｌ、および１．２ＭのＮａＣｌにおける１２％エタノール）のいずれに由来するサンプルにおいても全く検出されなかった。下記の表３は、ＰＤＭＳがカラムに保持されなかったことを明瞭に示している：
【０１８０】
【表３】
2014014365.tif 000005
【０１８１】
これらの結果は、消泡剤残渣が培地から容易に除去され、単離・精製プロセスの最初の段階から検出可能なレベルよりも低いままであることを明瞭に示している。
【０１８２】
（実施例２）
大規模使い捨て型バイオリアクターを使用するニンジン細胞懸濁物でのヒトグルコセレブロシダーゼの効率的発現
本実施例は、本発明のいくつかの実施形態に従って本発明の大規模使い捨て型バイオリアクターで培養される形質転換された植物細胞を用いて行われた実験の記載を提供する。
【０１８３】
材料および実験方法
プラスミドベクター：＊ＣＥ−Ｔ  −これを、Ｇａｌｉｌｉ教授から得られたプラスミドＣＥから構築した［米国特許第５３６７１１０号、１９９４年１１月２２日］。
プラスミドＣＥをＳａｌＩにより消化した。ＳａｌＩの付着末端を、ＤＮＡポリメラーゼＩのラージフラグメントを使用して平滑末端にした。その後、プラスミドをＰｓｔＩにより消化し、ＳｍａＩおよびＰｓｔＩにより消化された塩基性エンドキチナーゼ遺伝子［Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ］由来のＥＲ標的化シグナル（ＡＴＧＡＡＧＡＣＴＡＡＴＣＴＴＴＴＴＣＴＣＴＴＴＣＴＣＡＴＣＴＴＴＴＣＡＣＴＴＣＴＣＣＴＡＴＣＡＴＴＡＴＣＣＴＣＧＧＣＣＧＡＡＴＴＣ）（配列番号６）およびタバコキチナーゼＡ由来の液胞標的化シグナル（ＧＡＴＣＴＴＴＴＡＧＴＣＧＡＴＡＣＴＡＴＧ）（配列番号５）をコードするＤＮＡフラグメントに連結した。
【０１８４】
＊ｐＧＲＥＥＮＩＩ  −これをＰ．Ｍｕｌｌｉｎｅａｕｘ博士から得た［Ｒｏｇｅｒ  Ｐ．Ｈｅｌｌｅｎｓ他（２０００）、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．  ４２：８１９〜８３２］。ｐＧＲＥＥＮＩＩベクターからの発現は、カリフラワーモザイクウイルス由来の３５Ｓプロモーター、ＴＭＶ（タバコモザイクウイルス）のΩ翻訳エンハンサーエレメント、および、アグロバクテリウム・ツメファシエンス由来のオクトピンシンターゼターミネーター配列によって制御される。
【０１８５】
ヒトグルコセレブロシダーゼ（ｈＧＣＤ）ｃＤＮＡ：ヒトグルコセレブロシダーゼをＡＴＣＣ（アクセション番号６５６９６）から得た。グルコシダーゼβ（酸性）［グルコセレブロシダーゼ］を含有するＧＣ−２．２［ＧＣＳ−２ｋｂ；λ−ＥＺＺ−γ３ホモサピエンス］。インサート長さ（ｋｂ）：２．２０；組織：繊維芽細胞ＷＩ−３８細胞。
【０１８６】
ｈＧＣＤ発現プラスミドの構築：ｈＧＣＤをコードするｃＤＮＡ（ＡＴＴＣクローン番号６５６９６）を、フォワードプライマー（５’ＣＡＧＡＡＴＴＣＧＣＣＣＧＣＣＣＣＴＧＣＡ３’）（配列番号３）およびリバースプライマー（５’ＣＴＣＡＧＡＴＣＴＴＧＧＣＧＡＴＧＣＣＡＣＡ３’）（配列番号４）を使用して増幅した。精製されたＰＣＲ  ＤＮＡ産物をＥｃｏＲＩおよびＢｇｌＩＩのエンドヌクレアーゼにより消化し（プライマー内の下線部の認識配列を参照のこと）、同じ酵素により消化された、発現カセットＣＥ−Ｔを有する中間ベクターに連結した。発現カセットを、ＳｍａＩおよびＸｂａＩの制限酵素を使用して切断し、中間ベクターから取り出し、その後、バイナリーベクターｐＧＲＥＥＮＩＩに連結し、これにより、最終的な発現ベクターを形成した。発現カセットを提供するために、カナマイシン抵抗性が、ｐＧＲＥＥＮＩＩベクターと一緒に得られるｎｏｓプロモーターにより駆動されるＮＰＴＩＩ遺伝子によって付与される。
【０１８７】
得られたプラスミドを、下記の配列決定用プライマーを使用して、シグナルの正しいインフレーム融合を保証するために配列決定した：５’側３５Ｓプロモーター：５’ＣＴＣＡＧＡＡＧＡＣＣＡＧＡＧＧＧＣ３’（配列番号１）、および、３’側ターミネーター：５’ＣＡＡＡＧＣＧＧＣＣＡＴＣＧＴＧＣ３’（配列番号２）。
【０１８８】
ニンジンカルスの確立および細胞懸濁培養：本発明者らが行ったニンジンカルスの確立および細胞懸濁培養は、Ｔｏｒｒｅｓ  Ｋ．Ｃ．によって以前に記載された通りであった（Ｔｉｓｓｕｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  ｈｏｒｔｉｃｕｌａｒ  ｃｒｏｐｓ、１１１頁、１６９）。
【０１８９】
ニンジン細胞の形質転換および形質転換細胞の単離：ニンジン細胞の形質転換は、以前に記載された方法［Ｗｕｒｔｅｌｅ，Ｅ．Ｓ．およびＢｕｌｋａ，Ｋ．Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．、６１：２５３〜２６２（１９８９）］の適合化を使用するアグロバクテリウム浸潤によって行われた。液体培地で成長する細胞を、カルスの代わりに、プロセスを通して使用した。インキュベーション時間および成長時間を、液体培養されている細胞の形質転換のために適合化した。簡単に記載すると、アグロバクテリウム細菌をエレクトロポレーションによってｐＧＲＥＥＮＩＩベクターにより形質転換し［ｄｅｎ  Ｄｕｌｋ−Ｒａ，Ａ．およびＨｏｏｙｋａａｓ、Ｐ．Ｊ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５５：６３〜７２（１９９５）］、その後、カナマイシンを使用して選抜した。ニンジン細胞をアグロバクテリウム細菌により形質転換し、液体培地においてパロモマイシン抗生物質を使用して選抜した。
【０１９０】
高レベルのＧＣＤを発現するカルスを単離するための形質転換されたニンジン細胞のスクリーニング：細胞をＳＤＳサンプル緩衝液においてホモジネートし、得られたタンパク質抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ［Ｌａｅｍｍｌｉ  Ｕ．（１９７０）、Ｎａｔｕｒｅ、２２７：６８０〜６８５］で分離し、ニトロセルロースメンブラン（ｈｙｂｏｎｄＣニトロセルロース、０．４５ミクロン、カタログ番号：ＲＰＮ２０３Ｃ；Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＵＫ  ＬＴＤ）に転写した。ＧＣＤを検出するためのウエスタンブロットを、ポリクローナル抗ｈＧＣＤ抗体（本明細書中以下に記載される）を使用して行った。
【０１９１】
大規模バイオリアクターにおける細胞の培養およびスケールアップ：細胞の培養を、本明細書中上記の実施例１で詳しく記載されるように行った。
【０１９２】
タンパク質分析：タンパク質の同一性および純度の分析を、本明細書中上記の実施例１に記載されるように行った。
【０１９３】
質量分析：質量分析法（ＭＳ）による分析を、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間／飛行時間（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析計（４７００、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）およびイオントラップ質量分析計（ＬＣＱ  ｃｌａｓｓｉｃ、Ｆｉｎｎｉｇａｎ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を使用して行った。
【０１９４】
ＲＰ−ＨＰＬＣを使用するペプチドマッピングまたはタンパク質「フィンガープリンティング」：ペプチドマッピングは、「フィンガープリンティング」と呼ばれる明確なプロフィルとともに再現性のある高分解能の分離を提供するためのＲＰ−ＨＰＬＣがタンパク質のタンパク質分解消化の後で行われる、タンパク質のタンパク質分解消化から生じるペプチドを分析するための方法である。非常に特異的な同定方法として、この分析は、標準的な製造プロセスで製造される酵素調製物と、４００Ｌのバイオリアクターから採取された細胞から製造される酵素調製物（ＰＸ−４００−ＧＣ−２；技術の範囲内において）とが同一であることを確認するために役立つ。ｐｒＧＣＤを、トリプシンと１：５０（ｗ／ｗ）で５０ｍＭの（ＮＨ４）２ＣＯ３（ｐＨ８．０）において３７℃で６時間インキュベートし、その後、室温で一晩インキュベートすることによってトリプシンにより消化した。
【０１９５】
ＲＰ−ＨＰＬＣ分析のために、５０μｇの消化ペプチドをＣ−１８カラム（カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｊｕｐｉｔｅｒ  ４ｕ  ｐｒｏｔｅｏ  ９０Ａ、４．６ｘ２５０ｍｍ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ｔｏｒａｎｃｅ、ＣＡ）に負荷し、ペプチドを分離し、本明細書中上記に記載されるように検出した。
【０１９６】
ＩＥＦ：等電点フォーカシング（ＩＥＦ）は、タンパク質を電場におけるその電荷に基づいて分離する技術である。ＩＥＦは、同定ツールとして用いられ、また、正しいｐＩ範囲を伴うパターンによって明らかにされるようなタンパク質の均一性を保証するために用いられる。ｐｒＧＣＤおよびＣｅｒｅｚｙｍｅ（登録商標）の等電点フォーカシングを標準的プロトコルに従って行った。簡単に記載すると、ｐｒＧＣＤの等電点（ｐＩ）を特定するために、精製された酵素を、指定された陽極緩衝液および陰極緩衝液ならびにｐＩ標準物（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＵＫ  ＬＴＤ）を使用して、ｐＨ範囲が３〜１０であるプレキャストポリアクリルアミドＩＥＦゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）で泳動した。ｐｒＧＣＤおよびＣｅｒｅｚｙｍｅ（登録商標）のそれぞれのサンプルに対して、０．０５％のタウロコール酸（わずかなアニオン性界面活性剤）を、ゲルにおける移動度を改善するために加えた。
【０１９７】
ｐｒＧＣＤタンパク質およびＣｅｒｅｚｙｍｅ（登録商標）タンパク質のバンド形成パターンを、製造者によって指示されるようにＢｉｏ−Ｓａｆｅ（商標）クーマシー染色（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）によって可視化した。それぞれのタンパク質バンドのｐＩを、ＩＥＦ  Ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｈｉｇｈ  Ｒａｎｇ  ｐＩ５−１０．５（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＵＫ  ＬＴＤ）のタンパク質標準物を使用することによって推定した。ｐｒＧＣＤおよび商業的に製造されるＣｅｒｅｚｙｍｅ（登録商標）の類似するバンド形成プロフィルが明らかにされた。ｐｒＧＣＤのバンド形成プロフィルはまた、バッチ間の一貫性について調べられた。
【０１９８】
酵素活性アッセイ：β−グルコセレブロシダーゼは、糖脂質グルコセレブロシドのグルコースおよびセラミドへの加水分解を触媒する。組換えグルコセレブロシダーゼの触媒活性を評価するために、合成基質を使用する酵素アッセイが、それぞれのバッチを評価するために用いられる。酵素ユニットが、３７℃における１分あたり１マイクロモルの合成基質（パラ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコピラノシド（ｐＮＰ−Ｇｌｃ））の加水分解を触媒する酵素の量として定義される。
【０１９９】
結果
大規模使い捨て型バイオリアクターから得られる組換えグルコセレブロシダーゼの特徴づけ：大規模使い捨て型バイオリアクターによってもたらされる改善された培養条件の最適な特性を明らかにするために、また、これらの条件の確実性および再現性を試験するために、大規模使い捨て型バイオリアクターで産生される組換え産物の分子的特徴および物理化学的特徴を、より小規模のバイオリアクターで産生される調製物と比較した。
【０２００】
質量分析法によって決定されるグルコセレブロシダーゼの分子量：質量分析法による分析を、タンパク質標準物を必要とすることなく、タンパク質の質量を決定するために行った。２つの質量分析方法を使用して、４００Ｌのバイオリアクターから採取された細胞から製造される酵素の分子量を決定し、これを、より小規模のリアクターで産生されるグルコセレブロシダーゼと比較した。すべての酵素調製物を同じ様式で単離および精製した。
【０２０１】
下記の表４には、両方の装置（ＬＣＱ  ｃｌａｓｓｉｃおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）によって得られるいくつかの酵素バッチの分子量がまとめられる。４００Ｌのバイオリアクターから採取された細胞から製造されるｐｒＧＣＤの様々なバッチがＰＸ４００−ＧＣによって示される。
【０２０２】
【表４】
2014014365.tif 000006
【０２０３】
質量分析の結果は、すべての調製物におけるタンパク質の分子量の推定値が通常にはおよそ６０８００ダルトンであり、４００Ｌおよび８０リットルのバイオリアクターから採取された細胞から製造されるバッチの間で一致したままであることを示す。この分子量は、５６６４２．６ダルトンを与える５０６個のアミノ酸と、残る４１５８ダルトン（約７％）を与えるグリカン構造の付加とを有するグリコシル化ポリペプチドと一致している。
【０２０４】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析およびウエスタンブロット分析による分子量および純度の確認、決定：４００Ｌのバイオリアクターから採取された細胞から製造されるグルコセレブロシダーゼの分子量同一性およびタンパク質不純物パターンを、クーマシーブリリアントブルー染色を使用してＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって調べた。
【０２０５】
図６は、標準的な酵素調製物（ＰＬＸ−ＧＣ−０１６−０５０５ＤＳ）、Ｃｅｒｅｚｙｍｅ、および４００Ｌの大規模使い捨て型バイオリアクターから採取される細胞から製造されるグルコセレブロシダーゼ（ＰＸ−４００−ＧＣ−２）のクーマシーブリリアントブルー染色によるＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。
【０２０６】
図６ではさらに、大規模バイオリアクターで培養された細胞から得られるｐｒＧＣＤが、他の方法で製造されるＧＣＤと同一に近い特性を示すことが立証される。それぞれのバッチにおけるタンパク質の移動は類似しており、推定された分子量は６０．９ｋＤであった。さらに、タンパク質バンドのパターンは、標準的なバイオリアクターから得られるバッチと、４００Ｌのバイオリアクターから得られるバッチとの間で同一であり、このことは、４００Ｌのバイオリアクターから採取された細胞から製造される酵素におけるタンパク質不純物の証拠がないことを示している。
【０２０７】
抗グルコセレブロシダーゼ抗体によるＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離タンパク質の免疫検出（ウエスタンブロット）を、４００Ｌのバイオリアクターから採取された細胞から精製されるβ−グルコセレブロシダーゼ分子を、特異的なアフィニティー精製された抗β−グルコセレブロシダーゼ抗体を使用することによって、以前に製造されたバッチおよび市販のヒトβ−グルコセレブロシダーゼ（Ｃｅｒｅｚｙｍｅ（登録商標）、Ｇｅｎｚｙｍｅ）との比較において特定するために行った。
【０２０８】
図７は、特異的なウサギ抗β−グルコセレブロシダーゼ抗体を、標準的なβ−グルコセレブロシダーゼ（ＰＬＸ−ＧＣ−０１６−０５０５ＤＳ）、Ｃｅｒｅｚｙｍｅ（登録商標）、および４００Ｌのバイオリアクターから採取された細胞から製造されるタンパク質（ＰＸ−４００−ＧＣ−２）を検出するために使用するウエスタンブロット分析を示す。特異的な抗体によって特定されるタンパク質バンドは、標準的なバイオリアクター手法のバッチと、４００Ｌのバイオリアクター手法のバッチとの間で同一である。この分析では、さらなる分解されたバンドは、４００Ｌのバイオリアクターから採取された細胞から製造される酵素タンパク質において、何ら明らかにされない。
【０２０９】
従って、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析および免疫学的分析によれば、標準的（８０Ｌ）バイオリアクターまたは４００Ｌのバイオリアクターから採取された細胞から製造される酵素の間において、同一性および純度における違いを示す証拠が何ら認められない。
【０２１０】
逆相高速（高圧）液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）を使用するペプチドマッピングまたはタンパク質「フィンガープリンティング」：標準的な製造プロセス（８０Ｌ）で製造される酵素調製物と、４００Ｌのバイオリアクターから採取された細胞から製造される酵素調製物（ＰＸ−４００ＧＣ−２）とが同一であることを確認するために、タンパク質フィンガープリンティングを、８０Ｌおよび４００Ｌのバイオリアクターから採取された細胞から製造されるｐｒＧＣＤに対して行った。
【０２１１】
図８ａおよび図８ｂは、Ｃ−１８クロマトグラフィーカラムで行われた、市販のグルコセレブロシダーゼ（ＰＬＸ−ＧＣ−０１６−０５０５ＤＳ）のトリプシン消化マップの典型的なプロフィルを示す。図８ａは、２１４ｎｍ（ペプチド結合）においてモニターされる分離されたペプチドを示し、図８ｂは、２８０ｎｍ（トリプトファンおよびチロシン）においてモニターされる分離されたペプチドを示す。図８ｃおよび図８ｄは、２１４ｎｍ（図８ｃ）および２８０ｎｍ（図８ｄ）においてモニターされる、４００Ｌのバイオリアクターから採取された細胞から調製されるグルコセレブロシダーゼ（ＰＬＸ−４００−ＧＣ−２）のトリプシン消化マップを表す。
【０２１２】
従って、大規模使い捨て型バイオリアクターから採取された細胞から得られるセレブロシダーゼ酵素調製物のペプチドマップは、標準的規模の技術により得られる標準的な調製物のペプチドマップと同一であり、このことは、８０Ｌおよび４００Ｌのバイオリアクターから採取された細胞から製造される酵素調製物の一貫性および同一性を強く示している。
【０２１３】
逆相高速（高圧）液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）：４００Ｌの大規模バイオリアクターで培養される細胞によって産生されるタンパク質のさらなる特徴づけを、ＲＰ−ＨＰＬＣにより行った。
【０２１４】
図９ａおよび図９ｂは、４００Ｌのバイオリアクターから採取された細胞から精製されるグルコセレブロシダーゼ（ＰＬＸ−４００−ＧＣ−２）の２１４ｎｍにおけるクロマトグラム（９ａ）および２８０ｎｍにおけるクロマトグラム（９ｂ）を表す。大規模使い捨て型バイオリアクターで産生される酵素タンパク質のクロマトグラムにおいて、酵素は、以前に調製されたグルコセレブロシダーゼ酵素の保持時間（６４．７０分）と類似する６４．１２分の保持時間を有する１つの無傷ピークとして現れる。
【０２１５】
従って、標準的なクロマトグラフィー条件のもとでは、大規模使い捨て型バイオリアクターおよび標準的規模の使い捨て型バイオリアクターの両方によって産生される組換えグルコセレブロシダーゼが、類似し、かつ一貫した保持時間で溶出した。１つの無傷ピークの出現は、酵素調製物の以前のバッチに対して行われた分析から得られた結果と一致している。ごく小さい不純物ピークのパターンおよびサイズが、グルコセレブロシダーゼ標準物と類似しており、しかし、不純物レベルは要求仕様の範囲内である。
【０２１６】
等電点フォーカシング（ＩＥＦ）：本発明の大規模バイオリアクターで培養された細胞によって製造される組換えタンパク質をさらに特定するために、また、本発明の大規模バイオリアクターで培養された細胞によって製造される組換えタンパク質の均一性を保証するために、大規模な４００Ｌバイオリアクターから採取された細胞（ＰＸ−４００−ＧＣ−２）、および標準的な８０Ｌリアクターの調製物から採取された細胞（ＰＬＸ−ＧＣ−０１６−０５０５ＤＳ）から得られるグルコセレブロシダーゼバンド形成プロフィルのｐＩ範囲を求めた。
【０２１７】
図１０は、標準的な体積のバイオリアクターの調製物から得られる酵素サンプル（ＰＬＸ−ＧＣ−０１６−０５０５ＤＳ）、および４００Ｌのバイオリアクターから採取された細胞から得られる酵素サンプル（ＰＸ−４００−ＧＣ−２）の、クーマシーブリリアントブルー染色によって可視化されたｐＩバンド形成パターンを、異なる精製段階（Ｃ−３、Ｃ−４およびＣ−５によってそれぞれ示される、第３、第４および第５の精製カラムの後）において示す。
【０２１８】
標準的な体積のバイオリアクターによって製造される酵素、および４００Ｌのバイオリアクターから採取された細胞から製造される酵素のプロフィルは、パターンにおけるバンドの数と、それぞれのアナログバンドの強度との両方において同一である。従って、大規模使い捨て型バイオリアクターで製造された酵素のＩＥＦイソ型パターンと、以前に製造された調製物のＩＥＦイソ型パターンとは同一である。
【０２１９】
酵素活性アッセイ：大規模バイオリアクターで製造される組換えグルコセレブロシダーゼの触媒活性を評価するために、合成基質−β−Ｄ−グルコピラノシド（ｐＮＧ−Ｇｌｃ）を使用する酵素アッセイを用いた。表５には、４００Ｌのバイオリアクターから採取された細胞から製造されるグルコセレブロシダーゼ（ＰＸ−４００−ＧＣによって示される）、および標準的な体積のバイオリアクターによって製造されるグルコセレブロシダーゼの比活性がまとめられる。
【０２２０】
【表５】
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【０２２１】
従って、４００のＬバイオリアクターから採取された細胞から製造される酵素の比活性は、標準的規模の製造で製造される酵素の比活性の範囲に含まれる。そのうえ、下記の表６に示されるように、８００リットルのバイオリアクターで成長させられるｐｒＧＣＤ発現細胞培養物の３つのロットの成長パラメーターを、４００リットルのバイオリアクターで成長させられる培養物の値と比較したとき、電気伝導率、浸透圧モル濃度および収量（細胞およびタンパク質）のパラメーターは、これら２つの大規模使い捨て型バイオリアクターにおける培養物について同じ範囲内であった。
【０２２２】
【表６】
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【０２２３】
大規模使い捨て型バイオリアクターから得られるβ−グルコセレブロシダーゼは宿主細胞タンパク質を含まない：ニンジン宿主細胞タンパク質（ＣＨＰ）の検出のために、広範囲の様々なタンパク質不純物を検出することができる高感度な免疫アッセイが開発されている。このアッセイのために、ポリクローナル抗体を、形質転換されていないニンジン細胞（β−グルコセレブロシダーゼ構築物を有しないニンジン細胞）から作製されるタンパク質調製物による免疫化によって作製した。これらのポリクローナル抗体を、組換えβ−グルコセレブロシダーゼに結合する糖との交差反応を防止するために、糖成分／残基に対してではなく、タンパク質のポリペプチドコアに対する特異的な結合を与えるためにさらに分離した。
【０２２４】
ニンジン宿主タンパク質（ＣＨＰ）調製物が、宿主に関連づけられるタンパク質不純物のための参照標準物として使用され、また、免疫アッセイのために使用されるポリクローナル抗体を調製するための抗原として使用される。
【０２２５】
図１１は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析、および特異的な抗ニンジン細胞宿主タンパク質抗体によるウエスタンブロット分析によって分析される宿主タンパク質サンプルおよびβ−グルコセレブロシダーゼの様々なバッチに対する、特異的な抗宿主タンパク質抗体の反応性を示す。標準的な体積のバイオリアクターから得られるβ−グルコセレブロシダーゼの様々なバッチ（ＰＬＸ−ＧＣ−０１６−０５０５ＤＳ）、および４００のＬバイオリアクターから採取された細胞から製造されるβ−グルコセレブロシダーゼの様々なバッチ（ＰＸ−４００ＧＣ−２）を、ニンジン宿主タンパク質抽出物から得られるサンプルと同様に分析した。４つの主要なタンパク質バンドが、ニンジン細胞宿主タンパク質サンプルにおいて特定された（図１１、レーン７およびレーン８）が、対応するＣＨＰタンパク質バンドのどれもがこれらのβ−グルコセレブロシダーゼサンプルのどちらにおいても検出されない。このことは、本発明の大規模使い捨て型バイオリアクターで製造された組換えβ−グルコセレブロシダーゼが、検出できないレベルのニンジン宿主細胞タンパク質を含有し、標準的な体積の製造方法によって製造されたβ−グルコセレブロシダーゼの純度を最低でも有することを示している。
【０２２６】
（実施例３）
大規模使い捨て型バイオリアクターを使用するＢＹ−２細胞懸濁でのヒトアセチルコリンエステラーゼの効率的発現
本実施例は、本発明の１つの実施形態に従って大規模使い捨て型バイオリアクターで培養される、ヒトアセチルコリンエステラーゼにより形質転換されたタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｃｕｍ）ＢＹ−２細胞を用いて行われた実験の記載を提供する。
【０２２７】
材料および実験方法
ｃＤＮＡ：挿入されたヒトアセチルコリンエステラーゼ「読み抜け」変異体（ＡＣｈＥ−Ｒ）をコードするｃＤＮＡを、Ｈｅｒｍｏｎａ  Ｓｏｒｅｑ博士（エルサレム・ヘブライ大学、イスラエル）から得た（エルサレム・ヘブライ大学のＹｉｓｓｕｍ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｃｏｍｐａｎｙ、番号ｐＴＭ２４０）。この遺伝子の配列を植物のために最適化した。その配列は、ＥＲ内への本来のリーダー配列（Ｎ末端での３３アミノ酸、配列番号７、これは成熟タンパク質では分解される）、および組換え遺伝子（配列番号９）のＣ末端に融合されるＥＲ保持配列（ＳＥＫＤＥＬ；配列番号８）を含む。
【０２２８】
アセチルコリンエステラーゼ発現プラスミドの構築：ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ＋プラスミド（カタログ番号２１２２０５、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を植物発現カセットの構築のための骨格として使用した。高レベル発現のために要求される必要なエレメントを有する植物発現カセットを、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ＋プラスミドに組み込んだ。この発現カセット（ＣＥ）は、ＣａＭＶの３５Ｓプロモーター、Ω翻訳エンハンサー、ならびにアグロバクテリウム・ツメファシエンスのオクトピンシンターゼ遺伝子の転写終結シグナルおよびポリアデニル化シグナルを含む（ＣＥカセット）。
【０２２９】
ＡＣｈＥ−Ｒを、ＳａｌＩおよびＰｓｔＩの制限部位（太字下線で示される）を含有する下記のプライマーを使用するＡＣｈＥ−ＲのＰＣＲ増幅によって、発現カセットを含有するＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（登録商標）発現ベクターにサブクローニングした（フォワードプライマー：５’−ＣＧＧＣＧＴＣＧＡＣＡＣＡＡＧＡＧＧＣＣＴＣＣＡＣＡＡＴ−３’（配列番号１０）；リバースプライマー：５’−ＣＣＣＣＣＴＧＣＡＧＣＴＡＧＡＧＴＴＣＡＴＣＣＴＴＣＴＣ−３’（配列番号１１））。その後、ＡＣｈＥ−Ｒのコード配列を有する発現カセットを中間ベクターから取り出し、本明細書中に記載されるように、バイナリーベクターのｐＧＲＥＥＮＩＩ  ｎｏｓ−Ｋａｎａ（Ｈｅｌｌｅｎｓ他、２０００）に、ＮｏｔＩおよびＡｃｃ６５１を使用してさらにサブクローニングした。陽性クローンを、ＰＣＲ分析および制限分析を使用して選抜した。
【０２３０】
Ａｃｈｅ−Ｒを発現するＢＹ−２細胞の形質転換、スクリーニングおよび培養：ＢＹ２細胞への浸潤に先立つアグロバクテリウムの形質転換を、以前に記載された（ｄｅｎ  Ｄｕｌｋ−ＲａｓおよびＨｏｏｙｋａｓｓ、１９９５）通りに行った。カナマイシン抵抗性が、ｐＧＲＥＥＮベクターと一緒に得られるｎｏｓプロモーターにより駆動されるＮＰＴＩＩ遺伝子によって付与されるので、カナマイシン抵抗性を形質転換体のスクリーニングおよび選抜のために使用した。
【０２３１】
遺伝子改変されたタバコ細胞（ＢＹ２系統）のアグロバクテリウムによる浸潤およびその後の培養を、本質的には、本明細書中上記の実施例２におけるニンジン細胞の形質転換について記載される通りに行った。高レベルのＡｃｈｅ−Ｒを発現するカルスについての選抜を、本明細書中に記載されるＥｌｍａｎ触媒活性アッセイおよびウエスタンブロットにより行った。選抜された細胞の細胞懸濁培養物を、一定の撹拌および制御された温度条件（２５±２℃）において、旋回式振とう機（８０ｒｐｍ）で、２５０ｍｌの三角フラスコにおける５０ｍｌの懸濁物として維持した。製造プロセスには、抗生物質のパロモマイシンおよびセフォタキシムを選抜剤として含有する培地での成長期が含まれた。
【０２３２】
バイオリアクターにおける培養物成長のスケールアップ：１０Ｌへの培養のスケールアップを段階的に行った。最初に、２００ｍＬ〜４００ｍＬの細胞懸濁物の接種物を、３．６Ｌ〜９．８Ｌの培地を含有する１２Ｌのバイオリアクターに導入した。７日間の培養（２５±２℃、１．５Ｌｐｍの無菌空気）の後、培地を１０Ｌにまで増やし、培養を同じ条件のもとでさらに７日間続けた。４００Ｌのバイオリアクターには１０Ｌの懸濁細胞を接種し、その後、３５０Ｌに至るまで培地を徐々に満たし、培養を同じ条件のもとで続けた。
【０２３３】
消泡剤（１０ｐｐｍ）を、４００Ｌに移されたときに細胞成長培地に加えた。使用された消泡剤は、本明細書中に記載されるように、Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ａｎｔｉｆｏａｍ  Ｃ  Ｅｍｕｌｓｉｏｎ（ポリジメチルシロキサン−ＰＤＭＳ）である。
【０２３４】
ウエスタンブロット：ウエスタンブロットを、ヒト起源のＡＣｈＥのＮ末端におけるペプチドに対して惹起されるアフィニティー精製されたヤギポリクローナル抗体（Ｓａｎｔａ−Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ）を用いて行った。Ｎ末端は、ＡＣｈＥのすべての形態で同一であり、従って、この抗体はＡＣｈＥ−Ｒを同様に認識することができる。検出をＥＣＬ検出キット（Ｐｉｅｒｃｅ）により行った。
【０２３５】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥを標準的な条件のもとで行った。ＡＣｈＥ−ＳおよびＡＣｈＥ−Ｒを１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。電気泳動は、Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ（商標）セル垂直電気泳動装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を混合済みの電気泳動用のＴｒｉｓ−グリシン−ＳＤＳ泳動緩衝液（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）とともに使用して行われる。１０％アクリルアミドゲルを、４０％アクリルアミド／Ｂｉｓの混合済み溶液および１０％ＳＤＳ溶液を使用して調製した。ビス−アクリルアミドゲルからニトロセルロースメンブランへのタンパク質の転写を、ブロッターＰ３レディープランを使用するｉＢｌｏｔ（商標）Ｄｒｙ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して行った。転写を室温で８分間行った。タンパク質をメンブランに転写した後、メンブランをブロキング処理し、洗浄し、Ｏｎｅ−ｓｔｅｐ（商標）Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｋｉｔ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用して一次抗体および二次抗体に結合させた。一次抗体（Ｎ−１９；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ）を１：２００の希釈でＯｎｅ−ｓｔｅｐ（商標）（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）の作業溶液に加えた。検出をＥＣＬ検出キット（Ｐｉｅｒｃｅ）により行った。ＡＣｈＥ−Ｒの免疫反応性を市販のヒト組換えＡＣｈＥ−Ｓ（Ｓｉｇｍａ）の免疫反応性と比較した。バンドを、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍａｇｅｒ  Ｇｅｌ  Ｄｏｃ  ＸＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用して検出した。
【０２３６】
Ｆｌａｍｉｎｇｏ（商標）蛍光ゲル染色：Ｆｌａｍｉｎｇｏ（商標）蛍光ゲル染色（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）は、非常に高感度で、非特異的なタンパク質染色方法である。ＡＣｈＥ−Ｒ（バッチ９〜バッチ１１）を、市販のヒト組換えＡＣｈＥ−Ｓ（Ｓｉｇｍａ）との比較で、いくつかの濃度（５０ｎｇ／サンプル、１００ｎｇ／サンプルおよび２００ｎｇ／サンプル）で負荷した。サンプルを、本明細書中に記載される標準的な手順のもとでの１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、製造者の説明書に従ってＦｌａｍｉｎｇｏ（商標）蛍光ゲル染色により染色した。
【０２３７】
Ｅｌｌｍａｎアッセイ：Ｅｌｌｍａｎ試薬をタンパク質におけるフリーチオールの修飾のために使用する（Ｅｌｌｍａｎ他、１９６１）。Ｅｌｌｍａｎ試薬は、チオールとのジスルフィド結合を迅速に形成し、４０５ｎｍにおいて測定することができる特徴的な色を有するチオラートイオンを放出する。Ｅｌｌｍａｎアッセイを、粗ホモジネートサンプルにおけるＡＣｈＥ−Ｒ活性および活性酵素の濃度を測定するために、同様にまた、精製されたサンプルにおける活性酵素の濃度を求めるために行った。酵素ユニットは、室温およびｐＨ＝７．４における１分あたり１マイクロモルの合成基質アセチルチオコリンヨージド［（２−メルカプトエチル）トリメチルアンモニウムヨージドアセタート］の、（２−メルカプトエチル）トリメチルアンモニウムヨージドおよび酢酸への加水分解を触媒する酵素の量と定義される。ＡＣｈＥ−Ｒの触媒活性を、アセチルチオコリンヨージド（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を基質として使用して求めた。サンプルを約６０ｎｇ／ｍｌ（精製サンプル）または５０ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ（粗ホモジネート）の濃度でＡＣｈＥ触媒活性について調べ、Ｅｌｌｍａｎ他（１９６１）によって開発された分光光度法による方法の後、リン酸緩衝液（０．１Ｍ；ｐＨ＝７．４；０．０２５％ＢＳＡ）に溶解した。この方法では、ＡＣｈＥ、アセチルチオコリンヨージド（２０ｍＭ）およびＥｌｌｍａｎ試薬−ＤＴＮＢ［５−５’−ジチオ−ビス（２−ニトロベンゾアート）；９ｍＭ；Ｓｉｇｍａ］が混合され、加水分解を、光学濃度を４０５ｎｍにおいて２分間隔で２０分間測定することによって分光光度法によりモニターした。陰性コントロールは、試験された抽出物を除くすべての成分を含有した。結果を時間に対してプロットし、初期速度をグラフの直線部分の傾きから計算した。
【０２３８】
それぞれのＡＣｈＥ調製物のユニット活性は、下記の式を使用して計算される：
2014014365.tif 000009
【０２３９】
特異的なＡＣｈＥ阻害剤ＤＥＰＱを使用するＥｌｌｍａｎ試薬：ＤＥＰＱ［７−（Ｏ，Ｏ−ジエチル−ホスフィニルオキシ）−１−メチルキノリニウムメチルスルファート］は、ＡＣｈＥの強力な不可逆的阻害剤であり、これを、その活性をモニターするために使用する。酵素溶液の活性部位滴定を、様々な量のＤＥＰＱ（０．２ｎＭ〜０．８ｎＭ）を加えることによってリン酸塩衝液（０．１Ｍ；ｐＨ＝７．４；０．０２５％ＢＳＡ）の存在下で行った。活性を、上記に記載されるようなＥｌｌｍａｎアッセイを使用して測定した。阻害百分率を阻害剤の濃度に対してプロットした。ＤＥＰＱは、ＡＣｈＥ−Ｒと１：１の比率で反応する。これらの値を使用して、μＭで表されるＡＣｈＥ−Ｒ濃度を求めた。
【０２４０】
Ｋａｒｎｏｖｓｋｙ染色を使用するコリンエステラーゼ活性：ＫａｒｎｏｖｓｋｙおよびＲｏｏｔｓのコリンエステラーゼ活性染色（ＫａｒｎｏｖｓｋｙおよびＲｏｏｔｓ、１９６４）は、コリンエステラーゼ（ＡＣｈＥおよびＢＣｈＥ）活性を視覚的に検出するために使用される特異的な方法である。この方法は、チオコリンエステルを基質として利用し、フェリシアニドが、コリンエステラーゼ活性により放出されるチオコリンによってフェロシアニドに還元されることに基づく。形成されるフェロシアニドが銅によって捕捉されて、フェロシアン化銅を形成し、その後、このフェロシアン化銅が肉眼によって視覚化される。
【０２４１】
ネイティブ（非変性）ＰＡＧＥ：ネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）は、ポリアクリルアミドゲルによってもたらされる均一な細孔サイズのために、サイズが５ｋＤａから２０００ｋＤａにまで及ぶタンパク質について使用される。ＳＤＳ−ＰＡＧＥとは異なり、ネイティブゲル電気泳動では、電荷を有する変性剤は使用されない。従って、分離されている分子は、分子量および固有電荷において異なる。タンパク質は、分離の間中、未変性の状態のままであるので、タンパク質を、一般的なタンパク質染色試薬によってだけでなく、酵素の特異的な触媒性質を用いる試薬によってもまた検出することができる。
【０２４２】
結果
組換えＡＣｈＥ−Ｒのプロフィル：本発明の方法によって製造される組換えＡＣｈＥ−Ｒタンパク質は、図１５（レーン１〜レーン３）に示されるように、６４ｋＤａの分子量で推定される。コントロールのＡＣｈＥ−Ｓ（レーン５〜レーン７）は、中性条件下では四量体であるが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥではその単量体に還元され、従って、ＡＣｈＥ−Ｒと同様に移動した。これは、ＡＣＥ−Ｓ単量体が約７０ｋＤａであり、ＡＣｈＥ−Ｒよりも６ｋＤａ重いからである。従って、大規模使い捨て型バイオリアクターにおいてＢＹ２タバコ細胞で発現されるＡＣｈＥ−Ｒは、ＨＥＫ２９３細胞でその単量体形態で発現される組換えヒトＡＣｈＥ−Ｓ（Ｓｉｇｍａ）と類似する（電気泳動移動度によって決定されような）３次元構造を有する。
【０２４３】
Ｆｌａｍｉｎｇｏ（商標）非特異的染色ではさらに、検出されたバンドが、抗ＡＣｈＥ抗体を使用する免疫アッセイによって検出されたのと同じ移動パターンを示すので（図１６）、組換えの、植物発現によるＡＣｈＥ−Ｒの移動プロフィルが確認される。さらに、単一の染色バンドが、図１６に示されるようにゲルで観測されたことは、植物発現による酵素タンパク質の精製が著しく効率的であったことを示している。
【０２４４】
組換えＡＣｈＥ−Ｒの活性：図１７は、植物発現によるＡＣｈＥ−Ｒポリペプチドおよび哺乳動物細胞発現によるＡＣｈＥ−Ｓポリペプチドが、Ｋａｒｎｏｖｓｋｙ染色を使用したとき、触媒的に同一であることを示す。５０ｎｇ（レーン３およびレーン６）、１００ｎｇ（レーン２およびレーン５）および２００ｎｇ（レーン１およびレーン４）のＡＣｈＥ−Ｒをゲルに負荷した。活性が３つの負荷濃度物のすべてにおいて明白であった。このことから、本発明の大規模バイオリアクターから採取されたＢＹ−２細胞から精製されるＡｃｈｅ−Ｒの活性が確認された。市販のヒト組換えＡＣｈＥ−Ｓは、その四量体形態で現れ（上側の矢印を参照のこと）、従って、ＡＣｈＥ−Ｒ単量体（下側の矢印）よりも遅く移動し、その活性を保持している。ＡＣｈＥ−Ｒ単量体のバンド（レーン１〜レーン３）と同一に移動する、レーン４〜レーン６で検出されるそれほどはっきりしていないバンドは、植物発現によるＡＣｈＥ−Ｓ単量体がサイズにおいて同一であるだけでなく、市販のヒト組換えＡＣｈＥ−Ｓと同等に触媒活性であることを示している。
【０２４５】
下記の表７は、ＤＥＰＱ阻害を使用するＥｌｌｍａｎ活性アッセイによって試験されたとき、小さい体積のバイオリアクターで製造されるバッチにおける植物発現ＡＣｈＥ−Ｒの活性および濃度と、本発明の１つの実施形態による大規模使い捨て型バイオリアクターで製造されるバッチにおける植物発現ＡＣｈＥ−Ｒの活性および濃度との比較を示す。表７は、ＡＣｈＥタンパク質の収量（ｍｇタンパク質／Ｋｇ細胞として表される）が、酵素活性の範囲における減少を伴うことなく、大規模培養デバイスでは著しく増大することを明瞭に示す。
【０２４６】
【表７】
2014014365.tif 000010
【０２４７】
従って、まとめると、これらの結果はさらに、より小さい体積の発現システムおよび動物に基づく発現システムの欠点の多くを回避しながら、組換えタンパク質の正確かつ非常に効率的な発現および翻訳後プロセシングについて、本発明のいくつかの実施形態に従って本発明の大規模使い捨て型バイオリアクターでトランスジェニック植物細胞を培養することの著しい利点を裏付けている。
【０２４８】
参考文献
Ｍａ，Ｊ．Ｋ．Ｃ，Ｄｒａｋｅ，Ｐ．Ｍ．Ｗ．，およびＣｈｒｉｓｔｏｕ，Ｐ．（２００３）Ｎａｔｕｒｅ  ｒｅｖｉｅｗｓ  ４，７９４−８０５
Ｐｒｏｕｌｘ他の米国特許出願第２００５／０２８２２６９号
Ｈｏｄｇｅ他の米国特許出願第２００５／０２７２１４６号
Ｇａｕｇｌｅｒ他の米国特許第６４３２６９８号
Ｓｃｈｌａｔｍａｎｎ他，Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．，１９９５；４５：４３５−３９
ＮａｍｄｅｖおよびＤｕｌｏｐ，Ａｐｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐａｒｔ  Ａ，Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ，１９９５
【配列表フリーテキスト】
【０２４９】
配列番号１、２、１０および１１は、一本鎖ＤＮＡヌクレオチドの配列を示す。
配列番号３および４は、一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドの配列を示す。
配列番号５は、タバコキチナーゼＡ由来の液胞標的化シグナルペプチドをコードする核酸配列を示す。
配列番号６は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓの塩基性エンドキチナーゼ遺伝子由来のＥＲシグナルペプチドをコードする核酸配列を示す。
配列番号７は、ＥＲ内へのアセチルコリンエステラーゼリーダー配列を示す。
配列番号８は、ＥＲ保持シグナルの配列を示す。
配列番号９は、アセチルコリンエステラーゼ「読み抜け」変異体（ＡＣｈＥ−Ｒ）に融合されたＥＲ内への本来のリーダー配列およびＥＲ保持配列からなる組換えタンパク質の配列を示す。
【図１】
2014014365.tif 000011
【図２】
2014014365.tif 000012
【図５】
2014014365.tif 000013
【図８ａ】
2014014365.tif 000014
【図８ｂ】
2014014365.tif 000015
【図８ｃ】
2014014365.tif 000016
【図８ｄ】
2014014365.tif 000017
【図９】
2014014365.tif 000018
【図３】
2014014365.tif 000019
【図４】
2014014365.tif 000020
【図６】
2014014365.tif 000021
【図７】
2014014365.tif 000022
【図１０】
2014014365.tif 000023
【図１１】
2014014365.tif 000024
【図１２】
2014014365.tif 000025
【図１３】
2014014365.tif 000026
【図１４】
2014014365.tif 000027
【図１５】
2014014365.tif 000028
【図１６】
2014014365.tif 000029
【図１７】
2014014365.tif 000030
【配列表】
2014014365000001.app