(57)【要約】【課題】装置のコストアップを招くことなく、光特性の異なる複数の光源により蛍光の検出を容易かつ確実に行うこと。【解決手段】第１の励起光であるたとえばインコヒーレント光の光路Ｂに対して進退自在に配置される可動光学素子４がその光路Ｂに位置することで、第２の励起光であるたとえばコヒーレント光の光路Ａが形成され、可動光学素子４がインコヒーレント光の光路Ｂから退避している状態では、インコヒーレント光の光路Ａが形成されるようにし、インコヒーレント光による試料７からの蛍光の検出と、コヒーレント光による試料７からの蛍光の検出とを行うことができるようにした。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも、微小開口回転盤の微小開口部を通過する励起光によって励起される試料からの蛍光を検出する共焦点顕微鏡であって、第１の励起光を出力する第１の光源と、第２の励起光を出力する第２の光源と、前記第１の励起光の光路に対して進退自在に配置される可動光学素子とを備え、前記可動光学素子が前記第１の励起光の光路に位置することで、前記第２の励起光の光路が形成されることを特徴とする共焦点顕微鏡。
【請求項２】
前記第１の励起光はインコヒーレントな光であり、前記第２の励起光はコヒーレントな光であることを特徴とする請求項１に記載の共焦点顕微鏡。
【請求項３】
前記可動光学素子は、一端側を支点として回動自在に配置されていることを特徴とする請求項１又は２に記載の共焦点顕微鏡。
【請求項４】
前記可動光学素子は、一端側を支点としてスライド自在に配置されていることを特徴とする請求項１又は２に記載の共焦点顕微鏡。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、複数の微小開口を有する円盤型の微小開口回転盤（微小開口回転盤とは、例えばピンホールやスリットのような微細パターンが施されたディスクを示す）を回転させて試料を光走査する共焦点顕微鏡に関し、特に、光特性の異なる複数の光源を搭載した共焦点顕微鏡に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来より、例えば、複数のピンホールの様な微小開口部が形成されたピンホール基板、例えば、ピンホール径の１０倍の間隔で螺旋状に配置したニプコウディスク（Ｎｉｐｋｏｗ  Ｄｉｓｃ）と呼ばれる円盤状の微小開口回転盤を回転させ、ピンホールを通過した光を結像する共焦点顕微鏡が知られている。
【０００３】
共焦点顕微鏡は、試料表面と共役な位置にピンホールが配置されることから共焦点効果があり、他の種類の光学顕微鏡に比べ、高解像度、高コントラストの像が得られる点に特徴を有している。
【０００４】
特に、光軸方向の分解能が高く、試料面の高さ方向の情報を高精度で得ることができる。また、試料表面のピンホールによる走査を、顕微鏡視野内の複数のピンホールが存在するディスクの高速回転で行っているため、人間の肉眼又は光検出素子のいずれによっても、他の種類の光学顕微鏡と同様にリアルタイムで試料表面を観察できる。
【０００５】
ところで、最近、１つの標本に複数の蛍光色素を標識した多重染色標本が用いられるようになっている。このような多重染色標本について、それぞれの蛍光色素に対応する蛍光を検出するには、標本からの検出光を各蛍光色素毎に複数チャンネルに分光し、これらチャンネル毎に検出光（蛍光）を取り込むようにしたものも考えられている。
【０００６】
このような多重染色標本について、それぞれの蛍光色素に対応する蛍光を検出するものとして、特許文献１に示されている共焦点スキャナ顕微鏡が知られている。
【０００７】
この共焦点スキャナ顕微鏡は、たとえば図５に示すように、それぞれ波長の異なる複数の光源１１ａ、１１ｂ、１１ｃと、レーザ光の通過と遮断を制御するスイッチング部１４と、光透過帯域の異なるフィルタ１２ａ、１２ｂ、１２ｃとを有する光源部１０を備えている。
【０００８】
スイッチング部１４を通過したレーザ光は、光ファイバ１５ａ、１５ｂ、１５ｃに入射し、光ファイバ束１５の他端から出射して、ミラー１６に入射する。ミラー１６によって反射されたレーザ光は、コリメータレンズ１７に入射すると、マイクロレンズアレイディスク１８に入射する。
【０００９】
マイクロレンズアレイディスク１８を通過したレーザ光は、ダイクロイックミラー１９ｃ及び微小開口回転盤１９のピンホールを通過し、対物レンズ１９ａにより試料１９ｂに導かれ、試料１９ｂの蛍光色素を励起する。試料１９ｂからの蛍光は再び対物レンズ１９ａ、微小開口回転盤１９のピンホールを通過し、ダイクロイックミラー１９ｃで反射して光検出部２０に導かれる。
【００１０】
光検出部２０は、ダイクロイックミラー２２ａ、２２ｂ、２２ｃと、バリアフィルタ２５ａ、２５ｂ、２５ｃと、レンズ２４ａ、２４ｂ、２４ｃと、撮像カメラ２６ａ、２６ｂ、２６ｃとを備えている。ダイクロイックミラー２２ａ、２２ｂ、２２ｃで反射された特定の波長の蛍光は、バリアフィルタ２５ａ、２５ｂ、２５ｃを透過すると、レンズ２４ａ、２４ｂ、２４ｃにより集光されて撮像カメラ２６ａ、２６ｂ、２６ｃに入射する。そして、撮像カメラ２６ａ、２６ｂ、２６ｃにより蛍光が増幅され、電気信号に変換されて出力される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特開２００４−２１２４３４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
ところで、上述した特許文献１の共焦点スキャナ顕微鏡では、それぞれ波長の異なる複数の光源１１ａ、１１ｂ、１１ｃを用いることで、それぞれの蛍光色素に対応する蛍光を検出することが可能となっている。
【００１３】
ところが、このような共焦点スキャナ顕微鏡では、コヒーレントなレーザ光により、それぞれの蛍光色素に対応する蛍光を検出することが可能となっているものの、搭載されている光学部品はコヒーレントなレーザ光に対応させている。そのため、インコヒーレントな光を発するＬＥＤ等のような光源を用いることができないという問題があった。
【００１４】
ちなみに、コヒーレントな光とインコヒーレントな光は、周知の通り、時空間的な変調状態が異なるような光特性を有している。
【００１５】
なお、インコヒーレントな光源を、コヒーレントな光源と共存させるためには、それぞれの光源からの光の光路を切り替えたりする機構等を配置することが考えられるが、この場合は装置の大型化や装置のコストアップを招いてしまうことになる。
【００１６】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、装置のコストアップを招くことなく、光特性の異なる複数の光源により蛍光の検出を容易かつ確実に行うことができる共焦点顕微鏡を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明の共焦点顕微鏡は、少なくとも、微小開口回転盤のピンホールを通過する励起光によって励起される試料からの蛍光を検出する共焦点顕微鏡であって、第１の励起光を出力する第１の光源と、第２の励起光を出力する第２の光源と、前記第１の励起光の光路に対して進退自在に配置される可動光学素子とを備え、前記可動光学素子が前記第１の励起光の光路に位置することで、前記第２の励起光の光路が形成されることを特徴とする。
【００１８】
また、前記第１の励起光はインコヒーレントな光であり、前記第２の励起光はコヒーレントな光であることを特徴とする。
【００１９】
また、前記可動光学素子は、一端側を支点として回動自在に配置されていることを特徴とする。
【００２０】
また、前記可動光学素子は、一端側を支点としてスライド自在に配置されていることを特徴とする。
【００２１】
本発明の共焦点顕微鏡では、第１の励起光の光路に対して進退自在に配置される可動光学素子が該第１の励起光の光路に位置することで、第２の励起光の光路が形成される。一方、可動光学素子が第１の励起光の光路から退避している状態では、第１の励起光の光路が形成される。
【００２２】
よって、可動光学素子の位置の切り替えにより、第１の励起光による試料からの蛍光の検出と、第２の励起光による試料からの蛍光の検出とを行うことができる。
【００２３】
また、たとえば可動光学素子の位置の切り替えを高速に行うようにすると、光特性の異なる第１の光源と第２の光源とを同時に駆動させても、第１の励起光による試料からの蛍光の検出と、第２の励起光による試料からの蛍光の検出とを同時に行うことができる。
【００２４】
ここで、光特性が異なるとは、たとえば励起光の波長が異なることである。また、たとえばレーザ光源からのレーザ光のようなコヒーレントな光や、ＬＥＤ等の光源からのインコヒーレントな光のように、たとえば時空間的な変調状態が異なることである。
【発明の効果】
【００２５】
本発明の共焦点顕微鏡によれば、可動光学素子の位置の切り替えにより、第１の励起光による試料からの蛍光の検出と、第２の励起光による試料からの蛍光の検出とを行うことができるようにしたので、装置のコストアップを招くことなく、光特性の異なる複数の光源により蛍光の検出を容易かつ確実に行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】本発明の共焦点顕微鏡の一実施形態を説明する図である
【図２】図１のレーザ光源からのコヒーレント光が出力される場合を説明するための図である。
【図３】図１のＬＥＤ光源からのインコヒーレント光が出力される場合を説明するための図である。
【図４】図１の可動光学素子の構成を変えた場合の他の実施形態を説明するための図である。
【図５】従来の共焦点スキャナ顕微鏡の一例を説明するための図である。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
以下、本発明の共焦点顕微鏡の一実施形態の詳細を、図１〜図３を参照して説明する。
【００２８】
まず、図１に示すように、共焦点顕微鏡は、レーザ光源１及びＬＥＤ光源２を備えている。ここで、たとえばＬＥＤ光源２から後述の試料７までの一点鎖線で示す光路Ｂ上には、ダイクロイックミラー３、可動光学素子４、微小開口回転盤５、対物レンズ６が配置されている。
【００２９】
なお、レーザ光源１から後述の試料７までの二点鎖線で示す光路Ａは、可動光学素子４が回動し、ＬＥＤ光源２から後述の試料７までの一点鎖線で示す光路Ｂ上に位置した際に形成させるようになっている。
【００３０】
また、ダイクロイックミラー３で反射される後述の蛍光の点線で示す光路Ｃ上には、バリアフィルタ８、撮像カメラ９が配置されている。なお、ダイクロイックミラー３で反射される後述の蛍光については、試料７からダイクロイックミラー３に到達し、上述したようにダイクロイックミラー３で反射されるが、試料７からダイクロイックミラー３までの蛍光の光路については図示を省略している。これについては、以下に説明する図２〜図４にあっても同様である。
【００３１】
また、ダイクロイックミラー３については、可動光学素子４と微小開口回転盤５との間に配置されている場合として示しているが、この例に限らず、ＬＥＤ光源２と可動光学素子４との間に配置されていてもよい。
【００３２】
ここで、レーザ光源１は、励起光であるコヒーレントなレーザ光（以下、コヒーレント光という）を出力するものである。ＬＥＤ光源２は、励起光であるインコヒーレントな光（以下、インコヒーレント光）を出力するものである。なお、コヒーレント光とインコヒーレント光は、周知の通り、時空間的な変調状態が異なるような光特性を有している。
【００３３】
ここで、インコヒーレント光を出力するものとして、ＬＥＤ光源２を例示しているが、これに限らず、ハロゲンランプ、水銀ランプ等の他の光源を用いてもよい。
【００３４】
ダイクロイックミラー３は、コヒーレント光又はインコヒーレント光と、後述の試料７からの蛍光とを分離するための光学素子である。
【００３５】
可動光学素子４は、たとえばインコヒーレント光の光路Ｂ上に対して進退自在となるように配置されている。すなわち、可動光学素子４は、該可動光学素子４の下端側に設けられた回動軸４ａを支点として矢印ａ−ｂ方向に回動自在とされている。また、回動軸４ａは、駆動機構４ｂによる駆動力により回動するようになっている。
【００３６】
なお、回動軸４ａは、可動光学素子４の下端側に限らず、上端側に設けられていてもよい。また、駆動機構４ｂに対する動作の指示は、図示しないマイコンからの制御データにより行ってもよいし、図示しない切り替えスイッチにより手動で切り替えた際の切り替え信号により行ってもよい。ただし、可動光学素子４の光路Ｂ上に対しての進退を高速で行わせる場合は、図示しないマイコンからの制御データにより行うことが好ましい。
【００３７】
そして、レーザ光源１からのコヒーレント光を後述の試料７側へ導く場合、可動光学素子４は矢印ａ方向、すなわちＬＥＤ光源２の光路Ｂ上に位置する。これにより、レーザ光源１の光路Ａが形成され、レーザ光源１からのコヒーレント光が試料７側へ反射される。
【００３８】
一方、ＬＥＤ光源２からのインコヒーレント光を後述の試料７側へ導く場合、可動光学素子４は矢印ｂ方向、すなわちＬＥＤ光源２の光路Ｂ上から退避する位置に移動する。
【００３９】
なお、可動光学素子４は、ＬＥＤ光源２からのインコヒーレント光を後述の試料７側へ反射させるとともに、後述の試料７からの蛍光をダイクロイックミラー３に向けてそのまま通過させる性質を有している。
【００４０】
すなわち、可動光学素子４としては、反射特性と透過特性の両方の性質を有した光学素子であればよく、たとえば任意の割合で反射特性と透過特性の両方の性質を有したビームスプリッター、反射特性と透過特性が５０：５０の性質を有したハーフミラー、任意の波長を反射させ、その他の波長を透過させるか又は任意の波長を透過させ、その他の波長を反射させるダイクロイックミラーのいずれかを用いることができる。
【００４１】
また、レーザ光源１及びＬＥＤ光源２の配置については、それぞれの位置を逆にすることも可能である。この場合、ＬＥＤ光源２からのインコヒーレント光を後述の試料７側へ導く場合、可動光学素子４は矢印ａ方向、すなわち上述した光路Ｂ上に位置することになる。一方、レーザ光源１からのコヒーレント光を後述の試料７側へ導く場合、可動光学素子４は矢印ｂ方向、すなわち上述した光路Ｂ上から退避する位置に移動する。
【００４２】
微小開口回転盤５は、螺旋状に設けられた図示しない複数のピンホールを有し、高速回転を行う。これにより、微小開口回転盤５のピンホールを通過したコヒーレント光又はインコヒーレント光による後述の試料７上でのラスタースキャンが行われる。
【００４３】
対物レンズ６は、微小開口回転盤５のピンホールを通過したコヒーレント光又はインコヒーレント光を試料７に集光させる。なお、試料７には、コヒーレント光又はインコヒーレント光により励起される複数の蛍光色素が標識されている。
【００４４】
そして、コヒーレント光又はインコヒーレント光により励起された蛍光は、対物レンズ６、微小開口回転盤５ダイクロイックミラー３によりバリアフィルタ８及び撮像カメラ９側に反射される。
【００４５】
ここで、バリアフィルタ８は、画像のＳＮ比を向上させるために設けられているものであって、目的とする波長以外を除去し、目的とする波長のみを撮像カメラ９に入射させることができる光学素子である。
【００４６】
撮像カメラ９は、バリアフィルタ８を通過した蛍光を受光し、これによる撮像画像を電気信号に変換して出力する。なお、その電気信号は、デジタル画像データに変換され、ダイクロイックミラー３で分岐された蛍光の色と対応付けて保存される。
【００４７】
次に、このような構成の共焦点顕微鏡による動作について説明する。まず、図２に示すように、レーザ光源１からの励起光であるコヒーレント光を出力する際、可動光学素子４が矢印ａ方向に回動し、ＬＥＤ光源２の光路Ｂ上に位置する。これにより、レーザ光源１の光路Ａが形成される。
【００４８】
このとき、レーザ光源１からのコヒーレント光は、可動光学素子４によりダイクロイックミラー３及び微小開口回転盤５側に反射し、回転している微小開口回転盤５のピンホールを通過すると、対物レンズ６により試料７上に集光される。これにより、試料７上でのラスタースキャンが行われる。
【００４９】
このとき、試料７上で励起された蛍光色素からの蛍光は、対物レンズ６、微小開口回転盤５ダイクロイックミラー３によりバリアフィルタ８及び撮像カメラ９側に反射される。
【００５０】
なお、試料７上からは、コヒーレント光の反射による反射光も、対物レンズ６及び微小開口回転盤５を通過してダイクロイックミラー３に到達する。ただし、そのダイクロイックミラー３の特性上、反射光はバリアフィルタ８及び撮像カメラ９側に反射されない。
【００５１】
ここで、バリアフィルタ８を通過した蛍光が撮像カメラ９に取り込まれると、撮像画像が電気信号に変換されて出力される。そして、その電気信号は、デジタル画像データに変換され、ダイクロイックミラー３で分岐された蛍光の色と対応付けて保存される。
【００５２】
一方、図３に示すように、ＬＥＤ光源２からの励起光であるインコヒーレント光を出力する際、可動光学素子４が矢印ｂ方向に回動し、ＬＥＤ光源２の光路Ｂ上から退避する。この場合、上述したレーザ光源１の光路Ａが無くなる。
【００５３】
このとき、ＬＥＤ光源２からのインコヒーレント光は、ダイクロイックミラー３を通過し、さらに回転している微小開口回転盤５のピンホールを通過すると、対物レンズ６により試料７上に集光される。これにより、上記同様に、試料７上でのラスタースキャンが行われる。
【００５４】
このとき、試料７上で励起された蛍光色素からの蛍光は、上記同様に、対物レンズ６、微小開口回転盤５を通過し、ダイクロイックミラー３によりバリアフィルタ８及び撮像カメラ９側に反射される。
【００５５】
なお、試料７上からは、上記同様に、インコヒーレント光の反射による反射光も、対物レンズ６及び微小開口回転盤５を通過してダイクロイックミラー３に到達するが、そのダイクロイックミラー３の特性上、バリアフィルタ８及び撮像カメラ９側へは反射されない。
【００５６】
ここで、上記同様に、バリアフィルタ８を通過した蛍光が撮像カメラ９に取り込まれると、撮像画像が電気信号に変換されて出力される。そして、その電気信号は、デジタル画像データに変換され、ダイクロイックミラー３で分岐された蛍光の色と対応付けて保存される。
【００５７】
なお、ここでは、レーザ光源１からのコヒーレント光の出力と、ＬＥＤ光源２からのインコヒーレント光の出力とが別々に行われる場合として説明したが、それぞれの出力が同時に行われることによりコヒーレント光及びインコヒーレント光に対応したそれぞれの蛍光を検出することも可能である。
【００５８】
この場合、図１に示したように、矢印ａ−ｂへの可動光学素子４の回動を高速で切り替えるようにする。これにより、たとえば可動光学素子４の切り替えタイミングに同期させて蛍光を検出するようにすると、コヒーレント光及びインコヒーレント光に対応したそれぞれの蛍光を検出することが可能となる。
【００５９】
このように、本実施形態では、第１の励起光であるたとえばインコヒーレント光の光路Ｂに対して進退自在に配置される可動光学素子４がその光路Ｂに位置することで、第２の励起光である、たとえばコヒーレント光の光路Ａが形成され、可動光学素子４がインコヒーレント光の光路Ｂから退避している状態では、インコヒーレント光の光路Ａが形成されるようにした。
【００６０】
これにより、可動光学素子４の位置の切り替えにより、インコヒーレント光による試料７からの蛍光の検出と、コヒーレント光による試料７からの蛍光の検出とを行うことができる。
【００６１】
また、たとえば可動光学素子４の位置の切り替えを高速に行うようにすると、第１の光源である、たとえばＬＥＤ光源２と第２の光源であるたとえばレーザ光源１とを同時に駆動させても、インコヒーレント光による試料７からの蛍光の検出と、コヒーレント光による試料７からの蛍光の検出とを同時に行うことができる。
【００６２】
ここで、光特性が異なるとは、たとえば励起光の波長が異なることである。また、たとえばレーザ光源からのレーザ光のようなコヒーレントな光や、ＬＥＤ等の光源からのインコヒーレントな光のように、たとえば時空間的な変調状態が異なることである。
【００６３】
なお、本実施形態では、可動光学素子４を矢印ａ−ｂへ回動させることで、たとえばインコヒーレント光の光路Ｂ上に対して進退自在となるようにした場合として説明したが、この例に限らず、可動光学素子４の進退動作を変えることも可能である。
【００６４】
この場合、たとえば図４に示すように、可動光学素子４の下端側に可動軸４ｄを設け、該可動軸４ｄを矢印ａ−ｂへスライド自在に配置する。そして、駆動機構４ｃの駆動力により、可動軸４ｄを支点として、可動光学素子４を矢印ａ−ｂへスライドさせるようにする。これにより、可動光学素子４を、たとえばインコヒーレント光の光路Ｂ上に対して進退自在となるようにすることができる。
【００６５】
また、本実施形態では、レーザ光源１及びＬＥＤ光源２をそれぞれ１個として説明したが、この例に限らず、レーザ光源１及びＬＥＤ光源２をそれぞれ複数としてもよい。この場合、それぞれのレーザ光源１及びＬＥＤ光源２を上述した光路Ａ、Ｂに位置するように切り替えるようにすればよい。
【００６６】
また、本実施形態では、微小開口回転盤５に近接させ、図５に示したマイクロレンズアレイディスク１８を配置することも可能である。この場合は、上述した可動光学素子４を、微小開口回転盤５と図５に示したマイクロレンズアレイディスク１８との間に配置すればよい。
【符号の説明】
【００６７】
１  レーザ光源
２  ＬＥＤ光源
３  ダイクロイックミラー
４  可動光学素子
４ａ  回動軸
４ｂ、４ｃ  駆動機構
４ｄ  可動軸
５  微小開口回転盤
６  対物レンズ
７  試料
８  バリアフィルタ
９  撮像カメラ
Ａ〜Ｃ  光路
【図１】
2014052534.tif 000003
【図２】
2014052534.tif 000004
【図３】
2014052534.tif 000005
【図４】
2014052534.tif 000006
【図５】
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