(57)【要約】【課題】  設置環境の制約が少なく、観察する領域すべてにおいて実時間観察可能であるだけでなく、アッベの回折限界を超える分解能で観察可能なレーザー走査蛍光顕微鏡装置を提供する。【解決手段】  レーザー光源１ａ、コリメーターレンズ２ａ、ビーム成形光学系３ａ、音響光学変調素子４ａが並んで位置している。第１の瞳伝達拡大レンズ系６の隣りに第１の１次元走査ディバイス１１が配置されその下方に、第２の瞳伝達拡大レンズ系１２、第２の１次元走査ディバイス１３、第３の瞳伝達拡大レンズ系１５が順に配置され、この下隣に対象物Ｓと対向する対物レンズ１６が配置される。音響光学変調素子４ａからの光は、対物レンズ１６の直下のダイクロイックミラー１８を透過し、受光素子１９ａ、１９ｂで受光する。この信号が光電変換部２０ａ、２０ｂ、信号比較器２１を介してデータ処理部２２に送られる。【選択図】図１
2014052476.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛍光色素を励起し蛍光を発光させる波長のレーザー光を出射するレーザー光源と、
該レーザー光を相互に異なる周波数の２つの光に変調させつつ相互に異なる方向に出射する光変調器と、
前記２つの光を１次元走査あるいは２次元走査する走査素子面を有する走査光学素子と、
瞳位置を有し、配置されている対象物に２つの光を出射する対物レンズと、
前記光変調器の回折光出射面と該対物レンズの瞳位置とを共役な配置とするように、前記光変調器と該対物レンズとの間に位置して、前記光変調器から出射された２つの光を拡大する瞳伝達拡大レンズ系と、
対象物を透過しあるいは反射したレーザー光とこのレーザー光によって励起された蛍光とを分離する光学フィルターと、
前記光学フィルターにより分離されたレーザー光を受光し、かつ前記光変調器によって生じるビームの分離方向に沿って複数に分割されている第１の受光素子と、
前記光学フィルターにより分離された蛍光を受光し、かつ前記光変調器によって生じるビームの分離方向に沿って複数に分割されている第２の受光素子と、
前記第１の受光素子で光電変換された信号を前記光変調器の変調周波数でヘテロダイン検波し各々の信号により和算または差算を行う第１の光電変換部と、
前記第２の受光素子で光電変換された信号を前記光変調器の変調周波数でヘテロダイン検波し各々の信号により和算または差算を行う第２の光電変換部と、
前記各光電変換部の和算または差算に基づいて得られたビームの位相情報および強度情報を求める信号比較器と、
前記信号比較器の位相情報および強度情報と前記走査光学素子の制御信号とに基づき２次元の画像を構築するデータ処理部と、
を含むことを特徴とするレーザー走査蛍光顕微鏡装置。
【請求項２】
前記光学フィルターが、対象物を透過したレーザー光を反射し、レーザー光によって励起された蛍光を透過することで、これらの光を分離し、
前記第１の受光素子が、前記光学フィルターにより反射された光束を受光すると共に、前記第２の受光素子が、前記光学フィルターを透過した光束を受光することを特徴とする請求項１記載のレーザー走査蛍光顕微鏡装置。
【請求項３】
光変調器と走査光学素子との間にビームスプリッターが配置され、該ビームスプリッターが、レーザー光源からのレーザー光を透過し、対象物から反射され前記対物レンズおよび前記走査光学素子を経た光を反射して、この反射光を前記光学フィルターに送ることを特徴とする請求項１記載のレーザー走査蛍光顕微鏡装置。
【請求項４】
前記レーザー光源が、蛍光を発光させる波長のレーザー光を出射する第１のレーザー光源と、前記レーザー光と異なる波長の蛍光を発光させる波長のレーザー光を出射する第２のレーザー光源と、からなり、
前記光学フィルターが、前記第１のレーザー光源からのレーザー光を反射し、このレーザー光によって励起された蛍光を透過する第１の光学フィルターと、前記第２のレーザー光源からのレーザー光を反射し、このレーザー光によって励起された蛍光を透過する第２の光学フィルターと、からなり、
２つのレーザー光源から出射されたレーザー光を同一光路上に合波するダイクロイックミラーと、
前記第１の光学フィルターと前記第２の光学フィルターとを使用するレーザー光に合わせ切り替える切替手段と、
を有したレーザー走査蛍光顕微鏡装置であって、
前記光変調器が、各レーザー光を相互に異なる周波数の２つの光にそれぞれ変調させつつ、ビームの分離角を相互に同一とした相互に異なる方向にそれぞれ出射し、
前記第１の受光素子が、各光学フィルターで反射されたレーザー光を受光し、前記第２の受光素子が、各光学フィルターで透過した光束を受光し、
第１の光電変換部および第２の光電変換部が、前記第１のレーザー光源を使用する際には、第１の変調周波数でヘテロダイン検波し、前記第２のレーザー光源を使用する際には、第２の変調周波数でヘテロダイン検波することを特徴とする請求項１記載のレーザー走査蛍光顕微鏡装置。
【請求項５】
光変調器と走査光学素子との間にビームスプリッターが配置され、該ビームスプリッターが、レーザー光源からのレーザー光を透過し、対象物から反射され前記対物レンズおよび前記走査光学素子を経た光を反射して、前記光学フィルターに送ることを特徴とする請求項４記載のレーザー走査蛍光顕微鏡装置。
【請求項６】
前記レーザー光源が、蛍光を発光させる波長のレーザー光を出射する第１のレーザー光源と、前記レーザー光と異なる波長の蛍光を発光させる波長のレーザー光を出射する第２のレーザー光源と、からなり、
前記光変調器が、２つのレーザー光源からのレーザー光のいずれかを相互に異なる周波数の２つの光に変調させつつ相互に異なる方向に出射する第１の光変調器と、第１の光変調器とは異なる周波数の光に変調し、かつ前記第１の光変調器による光の分離方向と同一に相互に異なる方向に出射する第２の光変調器と、からなり、
２つのレーザー光源から出射したレーザー光を同一光路上に合波するダイクロイックミラーを有したレーザー走査蛍光顕微鏡装置であって、
前記光学フィルターが、第１のレーザー波長の光および、第２のレーザー波長の光により励起された蛍光を反射し、前記第１のレーザー波長の光によって励起された蛍光および、前記第２のレーザー波長の光を透過し、
前記第１の受光素子が、前記第１および第２の光変調器によって生じるビームの分離方向に沿って複数に分割され、
前記第２の受光素子が、前記第１および第２の光変調器によって生じるビームの分離方向に沿って複数に分割されていることを特徴とする請求項１記載のレーザー走査蛍光顕微鏡装置。
【請求項７】
光変調器と走査光学素子との間にビームスプリッターが配置され、該ビームスプリッターが、レーザー光源からのレーザー光を透過し、対象物から反射され前記対物レンズおよび前記走査光学素子を経た光を反射して、前記光学フィルターに送ることを特徴とする請求項６記載のレーザー走査蛍光顕微鏡装置。
【請求項８】
前記光学フィルターが、
前記第１のレーザー波長の光を反射し、かつ前記第１のレーザー波長の光によって励起された蛍光、前記第２のレーザー波長の光および、前記第２のレーザー波長の光で励起された蛍光を透過する第１の光学フィルターと、
前記第１の光学フィルターを透過した光束の内の、前記第１のレーザー波長の光によって励起された蛍光および、前記第２のレーザー波長の光を反射し、かつ前記第２のレーザー波長の光で励起された蛍光を透過する第２の光学フィルターと、
からなる請求項６記載のレーザー走査蛍光顕微鏡装置であって、
前記第１の光学フィルターを反射した光束を受光し、かつ前記第１および第２の光変調器によって生じるビームの分離方向に沿って複数に分割された第１の受光素子と、
前記第２の光学フィルターを反射した光束を受光し、かつ前記第１および第２の光変調器によって生じるビームの分離方向に沿って複数に分割された第２の受光素子と、
前記第２の光学フィルターを透過した光束を受光し、かつ前記第１および第２の光変調器によって生じるビームの分離方向に沿って複数に分割された第３の受光素子と、
前記第１の受光素子で光電変換した信号を前記第１の光変調器の変調周波数でヘテロダイン検波してから和算または差算を行う第１の光電変換部と、
前記第２の受光素子で光電変換した信号の内、前記第１のレーザー波長の光によって励起された蛍光の信号を前記第１の光変調器の変調周波数でヘテロダイン検波し、前記第２のレーザー波長の光の信号を前記第２の光変調器の変調周波数でヘテロダイン検波してから、それぞれ和算または差算を行う第２の光電変換部と、
前記第３の受光素子で光電変換された信号を前記第２の光変調器の変調周波数でヘテロダイン検波してから和算または差算を行う第３の光電変換部と、
を含むことを特徴とするレーザー走査蛍光顕微鏡装置。
【請求項９】
前記光学フィルターが、
前記第１のレーザー波長の光を反射し、かつ前記第１のレーザー波長の光によって励起された蛍光、前記第２のレーザー波長の光および前記第２のレーザー波長の光で励起された蛍光を透過する第１の光学フィルターと、
前記第１の光学フィルターを透過した光束の内の、前記第１のレーザー波長の光によって励起された蛍光、および前記第２のレーザー波長の光を反射し、かつ前記第２のレーザー波長の光で励起された蛍光を透過する第２の光学フィルターと、
からなることを特徴とする請求項７記載のレーザー走査蛍光顕微鏡装置。
【請求項１０】
励起された蛍光から光電変換された信号をヘテロダイン検波する際に、ヘテロダイン検波の位相を光変調器の変調周波数に対して補正することを特徴とする請求項１から請求項９のいずれかに記載のレーザー走査蛍光顕微鏡装置。
【請求項１１】
前記光変調器は、
前記レーザー光源から出射されたレーザー光が入射させる音響光学変調素子と、
前記音響光学変調素子にキャリア交流信号と正弦波信号を印加する信号発生器と、
を含むことを特徴とする請求項１から請求項１０のいずれかに記載のレーザー走査蛍光顕微鏡装置。
【請求項１２】
前記光変調器は、
前記レーザー光源から出射されたレーザー光が入射させる空間光変調器と、
前記空間光変調器に振幅または位相情報として正弦波状の格子縞を書き込み、キャリア交流信号と正弦波信号を印加して、前記格子縞を一定方向に移動させる信号発生器と、
を含むことを特徴とする請求項１から請求項１０のいずれかに記載のレーザー走査蛍光顕微鏡装置。
【請求項１３】
前記光電変換部で作成されたビート信号は、前記受光素子の２分割以上された複数の受光素子のすべての受光素子の和信号、または、２分割以上された分割素子の対応する位置にある受光素子同士の差信号より取得することを特徴とする請求項１から請求項１０のいずれかに記載のレーザー走査蛍光顕微鏡装置。
【請求項１４】
前記走査光学素子は、ガルバノミラー、レゾナントミラーによる１次元走査素子、非線形光学結晶やフォトニック結晶を用いた光走査ディバイス、２つの１次元走査ディバイスと瞳伝達拡大レンズ系よりなる２次元走査光学系、あるいは、１次元走査または２次元走査のマイクロミラーディバイスよりなることを特徴とする請求項１から請求項１３のいずれかに記載のレーザー走査蛍光顕微鏡装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、レーザー光の走査によって不透明物体の表面形状の観察及び計測、透明物体の表面または内部構造の観察及び蛍光観察を高速に行うレーザー走査蛍光顕微鏡装置に関し、３次元レーザー走査蛍光顕微鏡装置に好適なものである。
【背景技術】
【０００２】
微小な高さを高精度に測定するには、光へテロダイン干渉法がよく知られている。これは、周波数の異なる２つのレーザー光を干渉させ、その差の周波数のビート信号を作成し、ビート信号の位相変化を波長の1/500程度の分解能で検出して、表面の高さ方向の変化を計測するものである。このようなものとして、下記特許文献１の特開昭５９−２１４７０６号公報が具体的に知られているが、この特許文献１では、音響光学素子を用いて異なる波長からなる２つのビームを隣接して発生させ、これら２ビーム間の位相変化を検出し、その位相変化を累積して表面プロファイルを得る方法が開示されている。
【０００３】
ただし、この特許文献１では、音響光学素子に印加する直流電圧により走査を行い、かつ、正弦波信号を音響光学素子に加えて、お互いに周波数の異なる２つの空間的に分離したビームを作成していた。ここで、音響光学素子のブラッグ回折格子ｄは、超音波の速度をVa、印加する周波数をfaとすると、d=Va/faとなる。すなわち、ブラッグ回折角と印加する周波数とは、逆比例関係となる。
【０００４】
他方、生体組織を顕微観察する方法の１つとして、特定の試薬である蛍光試薬を生体組織に浸透させ、この生体組織に励起光を照射することで、特定の機能を発現する部位から蛍光を発光させて、観察する蛍光顕微鏡が知られている。また、通常の顕微鏡の分解能はいわゆるアッベの理論の限界により制限されている。この限界は、波動の有する回折現象の結果であり、越えることの出来ない理論限界とされ、通常の蛍光顕微鏡が持つ横分機能も、一般的な光学顕微鏡と同様にこのアッベの回折限界に縛られている。
【０００５】
この解決策として近年、下記非特許文献１に開示されているような、STED顕微鏡（STED: Stimulated emission depletion）、SIM顕微鏡(Structured Illumination Microscopy)、 STORM 顕微鏡（STORM :Stochastic optical reconstruction microscopy）などにおいて、蛍光を発生する部位でアッベの回折限界を超えた観察が可能と称する蛍光顕微鏡が発売されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開昭５９−２１４７０６号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】生物物理Vol. 50 (2010) No. 4 P 174-179  “超解像顕微鏡の進展”  藤田 克昌
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかし、アッベの回折限界を超えて観察可能と称するこれら蛍光顕微鏡において、この回折限界を超えて観察が可能部位は、蛍光を発光する部位に限られている。例えば、STED顕微鏡では、通常の励起用レーザー光の他に蛍光発生を抑制する別の波長のレーザー光が必要で、かつこれらレーザー光の波長の組み合わせは限定されており、様々な蛍光色素に対応できるものではなく、使い勝手が悪かった。しかも、蛍光発生を抑制するレーザー光を特殊な形状にする必要が有り、複雑な構成が必要で高額な装置となる欠点を有していた。
【０００９】
他方、SIM顕微鏡では、縞状照明光を３方向から時間をずらして別々に照明する必要があり、実時間観察が不可能である。さらに、STORM 顕微鏡では、1,000枚以上の画像を取得し解析するため、更に解析時間が長くなって動体観察が不可能である。
【００１０】
以上のように、現在実用化されているアッベの回折限界を超えた観察が可能と称する蛍光顕微鏡であっても、アッベの回折限界を超え観察が可能な部位が限られる上、実時間で３次元観察することが不可能である。
本発明は上記背景に鑑みてなされたもので、観察する領域すべてにおいて実時間観察可能であるだけでなく、アッベの回折限界を超える分解能で観察可能なレーザー走査蛍光顕微鏡装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記目的を達成させるために、本発明は、蛍光色素を励起し蛍光を発光させる波長のレーザー光を出射するレーザー光源と、
該レーザー光を相互に異なる周波数の２つの光に変調させつつ相互に異なる方向に出射する光変調器と、
前記２つの光を１次元走査あるいは２次元走査する走査素子面を有する走査光学素子と、
瞳位置を有し、配置されている対象物に２つの光を出射する対物レンズと、
前記光変調器の回折光出射面と該対物レンズの瞳位置とを共役な配置とするように、前記光変調器と該対物レンズとの間に位置して、前記光変調器から出射された２つの光を拡大する瞳伝達拡大レンズ系と、
対象物を透過しあるいは反射したレーザー光とこのレーザー光によって励起された蛍光とを分離する光学フィルターと、
前記光学フィルターにより分離されたレーザー光を受光し、かつ前記光変調器によって生じるビームの分離方向に沿って複数に分割されている第１の受光素子と、
前記光学フィルターにより分離された蛍光を受光し、かつ前記光変調器によって生じるビームの分離方向に沿って複数に分割されている第２の受光素子と、
前記第１の受光素子で光電変換された信号を前記光変調器の変調周波数でヘテロダイン検波し各々の信号により和算または差算を行う第１の光電変換部と、
前記第２の受光素子で光電変換された信号を前記光変調器の変調周波数でヘテロダイン検波し各々の信号により和算または差算を行う第２の光電変換部と、
前記各光電変換部の和算または差算に基づいて得られたビームの位相情報および強度情報を求める信号比較器と、
前記信号比較器の位相情報および強度情報と前記走査光学素子の制御信号とに基づき２次元の画像を構築するデータ処理部と、
を含むことを特徴とするレーザー走査蛍光顕微鏡装置とされるものである。
【００１２】
また、本発明においては、前記光学フィルターが、対象物を透過したレーザー光を反射し、レーザー光によって励起された蛍光を透過することで、これらの光を分離し、
前記第１の受光素子が、前記光学フィルターにより反射された光束を受光すると共に、前記第２の受光素子が、前記光学フィルターを透過した光束を受光するものが好適である。
さらに、本発明においては、光変調器と走査光学素子との間にビームスプリッターが配置され、該ビームスプリッターが、レーザー光源からのレーザー光を透過し、対象物から反射され前記対物レンズおよび前記走査光学素子を経た光を反射して、この反射光を前記光学フィルターに送るものが好適である。
【００１３】
また、本発明においては、前記レーザー光源が、蛍光を発光させる波長のレーザー光を出射する第１のレーザー光源と、前記レーザー光と異なる波長の蛍光を発光させる波長のレーザー光を出射する第２のレーザー光源と、からなり、
前記光学フィルターが、前記第１のレーザー光源からのレーザー光を反射し、このレーザー光によって励起された蛍光を透過する第１の光学フィルターと、前記第２のレーザー光源からのレーザー光を反射し、このレーザー光によって励起された蛍光を透過する第２の光学フィルターと、からなり、
２つのレーザー光源から出射されたレーザー光を同一光路上に合波するダイクロイックミラーと、
前記第１の光学フィルターと前記第２の光学フィルターとを使用するレーザー光に合わせ切り替える切替手段と、
を有したレーザー走査蛍光顕微鏡装置であって、
前記光変調器が、各レーザー光を相互に異なる周波数の２つの光にそれぞれ変調させつつ、ビームの分離角を相互に同一とした相互に異なる方向にそれぞれ出射し、
前記第１の受光素子が、各光学フィルターで反射されたレーザー光を受光し、前記第２の受光素子が、各光学フィルターで透過した光束を受光し、
第１の光電変換部および第２の光電変換部が、前記第１のレーザー光源を使用する際には、第１の変調周波数でヘテロダイン検波し、前記第２のレーザー光源を使用する際には、第２の変調周波数でヘテロダイン検波するものが好適である。
【００１４】
さらに、本発明においては、光変調器と走査光学素子との間にビームスプリッターが配置され、該ビームスプリッターが、レーザー光源からのレーザー光を透過し、対象物から反射され前記対物レンズおよび前記走査光学素子を経た光を反射して、前記光学フィルターに送るものが好適である。
【００１５】
他方、本発明においては、前記レーザー光源が、蛍光を発光させる波長のレーザー光を出射する第１のレーザー光源と、前記レーザー光と異なる波長の蛍光を発光させる波長のレーザー光を出射する第２のレーザー光源と、からなり、
前記光変調器が、２つのレーザー光源からのレーザー光のいずれかを相互に異なる周波数の２つの光に変調させつつ相互に異なる方向に出射する第１の光変調器と、第１の光変調器とは異なる周波数の光に変調し、かつ前記第１の光変調器による光の分離方向と同一に相互に異なる方向に出射する第２の光変調器と、からなり、
２つのレーザー光源から出射したレーザー光を同一光路上に合波するダイクロイックミラーを有したレーザー走査蛍光顕微鏡装置であって、
前記光学フィルターが、第１のレーザー波長の光および、第２のレーザー波長の光により励起された蛍光を反射し、前記第１のレーザー波長の光によって励起された蛍光および、前記第２のレーザー波長の光を透過し、
前記第１の受光素子が、前記第１および第２の光変調器によって生じるビームの分離方向に沿って複数に分割され、
前記第２の受光素子が、前記第１および第２の光変調器によって生じるビームの分離方向に沿って複数に分割されているものが好適である。
【００１６】
また、本発明においては、光変調器と走査光学素子との間にビームスプリッターが配置され、該ビームスプリッターが、レーザー光源からのレーザー光を透過し、対象物から反射され前記対物レンズおよび前記走査光学素子を経た光を反射して、前記光学フィルターに送るものが好適である。
【００１７】
さらに、本発明においては、前記光学フィルターが、
前記第１のレーザー波長の光を反射し、かつ前記第１のレーザー波長の光によって励起された蛍光、前記第２のレーザー波長の光および、前記第２のレーザー波長の光で励起された蛍光を透過する第１の光学フィルターと、
前記第１の光学フィルターを透過した光束の内の、前記第１のレーザー波長の光によって励起された蛍光および、前記第２のレーザー波長の光を反射し、かつ前記第２のレーザー波長の光で励起された蛍光を透過する第２の光学フィルターと、
からなる請求項６記載のレーザー走査蛍光顕微鏡装置であって、
前記第１の光学フィルターを反射した光束を受光し、かつ前記第１および第２の光変調器によって生じるビームの分離方向に沿って複数に分割された第１の受光素子と、
前記第２の光学フィルターを反射した光束を受光し、かつ前記第１および第２の光変調器によって生じるビームの分離方向に沿って複数に分割された第２の受光素子と、
前記第２の光学フィルターを透過した光束を受光し、かつ前記第１および第２の光変調器によって生じるビームの分離方向に沿って複数に分割された第３の受光素子と、
前記第１の受光素子で光電変換した信号を前記第１の光変調器の変調周波数でヘテロダイン検波してから和算または差算を行う第１の光電変換部と、
前記第２の受光素子で光電変換した信号の内、前記第１のレーザー波長の光によって励起された蛍光の信号を前記第１の光変調器の変調周波数でヘテロダイン検波し、前記第２のレーザー波長の光の信号を前記第２の光変調器の変調周波数でヘテロダイン検波してから、それぞれ和算または差算を行う第２の光電変換部と、
前記第３の受光素子で光電変換された信号を前記第２の光変調器の変調周波数でヘテロダイン検波してから和算または差算を行う第３の光電変換部と、
を含むものが好適である。
【００１８】
また、本発明においては、前記光学フィルターが、
前記第１のレーザー波長の光を反射し、かつ前記第１のレーザー波長の光によって励起された蛍光、前記第２のレーザー波長の光および前記第２のレーザー波長の光で励起された蛍光を透過する第１の光学フィルターと、
前記第１の光学フィルターを透過した光束の内の、前記第１のレーザー波長の光によって励起された蛍光、および前記第２のレーザー波長の光を反射し、かつ前記第２のレーザー波長の光で励起された蛍光を透過する第２の光学フィルターと、
からなるものが好適である。
さらに、本発明においては、励起された蛍光から光電変換された信号をヘテロダイン検波する際に、ヘテロダイン検波の位相を光変調器の変調周波数に対して補正することが好適でもある。
【００１９】
他方、本発明に係わる光変調器は、前記レーザー光源から出射されたレーザー光が入射させる音響光学素子と、前記音響光学素子にキャリア交流信号と正弦波信号を印加する信号発生器と、を含むことや、前記レーザー光源から出射されたレーザー光が入射させる空間光変調器と、前記空間光変調器に振幅または位相情報として正弦波状の格子縞を書き込み、キャリア交流信号と正弦波信号を印加して、前記格子縞を一定方向に移動させる信号発生器と、  を含むことが好適である。
【００２０】
さらに、本発明においては、前記光電変換部で作成されたビート信号は、前記受光素子の２分割以上された複数の受光素子のすべての受光素子の和信号、または、２分割以上された分割素子の対応する位置にある受光素子同士の差信号より取得することが好適である。
【００２１】
また、本発明に係わる走査光学素子は、ガルバノミラー、レゾナントミラーによる１次元走査素子、非線形光学結晶やフォトニック結晶を用いた光走査ディバイス、２つの１次元走査ディバイスと瞳伝達拡大レンズ系よりなる２次元走査光学系、あるいは、１次元走査または２次元走査のマイクロミラーディバイスよりなるものが好適である。
【００２２】
請求項に係る発明の作用を以下に説明する。
レーザー光源から出射されたレーザー光を相互に異なる周波数の２つの光に変調させつつ相互に異なる方向に光変調器が出射する。つまり、周波数fcと周波数fmの電気信号で光変調器である音響光学変調素子を駆動すると、周波数fcをキャリアとするＡＭ変調により、周波数fc+fmと周波数fc-fmを有する２つのビームが発生する。キャリア周波数である周波数fcを数十ＭＨｚ程度とし、数ＭＨｚ程度の周波数fmを付与すると、音響光学変調素子のブラッグ回折角はかなり大きくなる。
【００２３】
この音響光学変調素子より出射された光は、大きな角度差を有した２つのビームとなる。この角度差を瞳伝達拡大レンズ系である拡大光学系により、２つのビームの重なり程度を著しく小さくして、走査光学素子である２次元走査光学系に入射させる。このとき、２次元走査光学系の入射面と音響光学変調素子の出射面とが、共役な配置となるようにする。
【００２４】
このようにすると、２次元走査光学系からの出射光は、お互いに角度差が小さいビームとなるが、おのおのが有する周波数はfc+fmとfc-fmであり、変化は無い。つまり、この２つのビームを変調周波数とは無関係な上記した走査光学素子とされる１次元走査あるいは２次元走査する走査光学素子および第２の瞳伝達レンズ系を介して、対物レンズに向けて走査することにより、対象物上を２つの近接したビームで走査されることになる。
この２つの近接したビームによるビート信号は、対象物が反射物体である場合には、音響光学変調素子とほぼ共役な位置に配置された受光素子により取得することができ、対象物が透過物体である場合には、ファーフィールドではあるが対象物からあまり離れていない位置に配置した受光素子により取得することができる。
【００２５】
また、このときのビート信号は2fmとなるが、これは、十数ＭＨｚと高いビート信号として、検出される。このビート信号と基準となる信号の位相差θは、対象物の実質的な高さdや屈折率差nを反映している。すなわち、レーザー波長をλとすると、θ＝２πnd/λなる関係があるからである。
【００２６】
さらに、光電変換部が受光素子の光電変換された各々のビート信号を作成し、信号比較器がこのビート信号に基づいて得られた信号の位相差または強度差を検出し、信号比較器の位相情報または強度情報を取得して得たデータに基づき、データ処理部が処理することで、対象物が反射物体であれば表面のプロファイルが測定され、対象物が透過物体であれば、実質的な屈折率差あるいは厚みが測定される。
【００２７】
従って、走査速度を高めても、十分高いレートでデータを取得させて分解能を向上させることが可能となる。基準となる位相は、例えば、ビームスプリッターで分離した出射ビームの一部を受光し、ビート信号から求めた位相か、もしくは、対象物がない状態もしくは対象物があっても影響がないほど対物レンズをデフォーカスした状態での信号を走査信号とともにメモリーした位相をデータ処理部において使用することができる。
【００２８】
以上より本発明に係るレーザー走査蛍光顕微鏡装置によれば、２つのビーム間の距離とビート信号の周波数とを無関係に設定できるような光学系となり、近接したビームを得ると同時にビート信号の周波数を高くして、分解能と走査速度を著しく向上させることができる。
【００２９】
他方、光変調器として空間光変調器を採用した場合、この空間光変調器に短冊状の正弦波格子を書き込み、これを高速で一方向に移動させることにより、格子縞のピッチがビームの分離距離となる。次々と格子を移動させることにより、位相が変調されたことに相当するので、格子縞で生じた±１次回折光は、変調周波数の２倍だけ周波数の異なる光とすることができる。この場合、書き込み格子のピッチが十分に大きければ、近接した２つのビームを作ることができて拡大光学系の拡大率を小さくできるので、光学系を小型にすることができる。
【００３０】
以上のような光学系と光変調器により、ビート周波数作成手段と走査手段とを分離させることができる。このため、より高周波のビート信号を作成し、より走査速度を高めることができるので、データ取得を一層高速に行うことができるようになる。以上の結果として、３次元情報をビデオレート以上で取得できるとともに、ビーム分離を著しく小さくすることにより、横の分解能も顕著に向上させることができ、高さ方向の分解能も波長の1/500程度に向上できる。
【００３１】
また、２つのビームは殆ど光路を共有化しているので、外部的な環境変化、振動等に著しく強いレーザー走査蛍光顕微鏡装置とすることができる。このように２つのビームが存在している場合、受光素子としてビームの分離方向に垂直な方向に２つ以上に分割されている受光素子を用いると、全受光素子の出力の和信号では、実効上、対物レンズで集光された２つのビームの分離度に応じた位相差のビーム径に相当する領域の積分値を与えるので、微分干渉顕微鏡とほぼ等価な分解能を与えることになる。
【００３２】
他方、さらに分解能を高くするには、受光素子を音響光学変調素子によって生じるビームの分離方向に沿って光軸に対称で複数に分割されている分割受光素子を用い、複数に分割された分割受光素子の隣り合った位置にある分割受光素子同士の差信号を取得すると、実効上、対物レンズで集光された２つのビームの分離度に応じた位相差の微分のビーム径に相当する領域の積分値を与える。この場合には、和信号と比較して、位相差の生じている部分のみが位相差に寄与するので、感度が著しく高くなる。従って、ビームの分離度に応じた分解能に匹敵する横分解能の向上が図れる。
【００３３】
これは、通常の微分干渉顕微鏡には見られない際立った特長となる。この結果、波長で支配されている横分解能よりもはるかに高い横分解を得ることが出来る。ビート信号の強度に対しても同様な効果がある。
【００３４】
この一方、従来の蛍光顕微鏡では、受光系に蛍光波長のみを透過する光学フィルターを用い蛍光観察する構成となっている。超解像蛍光顕微鏡においても基本的な考え方は同じであるため、蛍光像のみ超解像が達成される。これに対して、本発明では、蛍光波長、および励起波長それぞれに独立して上記原理によるアッベの回折限界を超える超解像画像を得られる構成となっている。
【００３５】
そして、従来の蛍光顕微鏡では捨てられていた励起光波長像を取得することにより、通常の反射画像、または透過画像、および蛍光画像を同時あるいは個別にアッベの回折限界を超える超解像画像を得ることができる。しかも、３次元情報を一度の２次元走査で非常に高速に、取得することができるので、対象物の状態変化などをリアルタイムに３次元計測できる。また、ヘテロダイン検波により外来光などの迷光が除去されるため、非常にＳ／Ｎ比の良い測定が可能で、従来の蛍光顕微鏡で迷光除去のために必要であった、各種光学フィルター、および暗室環境が不要となる。
【００３６】
以上より本発明に係るレーザー走査蛍光顕微鏡装置によれば、実質上、回折限界以上の分解能を有する顕微鏡装置が実現でき、さらには、ビーム利用効率の低下を招かない光学系を実現可能ともした。
【００３７】
以上、まとめると、高さや屈折率分布などの３次元情報を一度の２次元走査で非常に高速に、また、極めて高い横分解能で取得する光利用効率の高いレーザー走査蛍光顕微鏡装置を提供することができる。従って、生きたままの細胞やマイクロマシーンなどの状態変化などをリアルタイムに３次元計測できるなど、従来の２次元情報を取得し３次元方向に積算していくようなレーザー走査型共焦点顕微鏡などとは比較にならない大きな特徴を有している。
また、透過型にすれば、生物や細胞を生きたままリアルタイムかつ高い分解能で観察、計測できるので、細胞等を不活性化して計測する電子顕微鏡にはない大きな特徴ともなる。
【発明の効果】
【００３８】
上記に示したように、本発明のレーザー走査蛍光顕微鏡装置によれば、変調が可能な音響光学変調素子または空間変調器を光変調器として用い、瞳伝達拡大レンズ系と２次元走査ディバイスと併用することにより、非常に近接した２つのビームを非常に高い変調周波数で、変調することができるので、ビデオレートの３次元計測が可能となる。また、音響光学変調素子に変調信号を加えるとともに、分離されるビームの方向に沿って複数に分割した分割受光素子を用い、すべての分割受光素子の和または対応する分割受光素子間で差演算をおこなってヘテロダイン検波することによって、極めて高い横分解能を得ることができる実時間観察可能なレーザー走査蛍光顕微鏡装置を実現できる。
【００３９】
したがって、細胞や微生物の状態変化や表面状態の過渡的な変化等を、高速に観察、計測することができる。また、既に製品化されている裸眼立体ディスプレーや偏光めがねを使用した３次元ディスプレー等を用いることにより、ビデオレートの３次元立体画像を表示することもできるので、教育や研究、医療において、有用な装置とすることができる。
【００４０】
他方、非常に近接したほぼ同一の行路を通る２つのビームを用いているので、外乱等の影響を受けにくく、また、変調光を用い検波を行うため、外来光に強く装置の設置環境に左右されにくい観察や測定が可能となる。さらに、受光素子を分割型とし、ビームを分離する方向に対して、暗線を有する少なくとも２分割以上の受光素子を用い、すべての受光素子の和演算または対応する受光素子間で、差演算をおこなってヘテロダイン検波することで、特に、差演算においては、極めて高い横分解能を得ることが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】本発明のレーザー走査蛍光顕微鏡装置に係る実施例１を示すブロック図である。
【図２】図１の矢印Ａより見た要部拡大図である。
【図３】図１の対物レンズおよび測定対象物周辺部分を拡大して示す図である。
【図４】本発明のレーザー走査蛍光顕微鏡装置に係る実施例１による対象物における照射領域を表す説明図である。
【図５】本発明のレーザー走査蛍光顕微鏡装置に係る実施例２を示すブロック図である。
【図６】本発明のレーザー走査蛍光顕微鏡装置に係る実施例３を示すブロック図である。
【図７】本発明のレーザー走査蛍光顕微鏡装置に係る実施例４を示すブロック図である。
【図８】本発明のレーザー走査蛍光顕微鏡装置に係る実施例５を示すブロック図である。
【図９】本発明のレーザー走査蛍光顕微鏡装置に係る実施例６を示すブロック図である。
【図１０】本発明のレーザー走査蛍光顕微鏡装置に係る実施例７を示すブロック図である。
【図１１】本発明のレーザー走査蛍光顕微鏡装置に係る実施例８を示すブロック図である。
【図１２】本発明のレーザー走査蛍光顕微鏡装置に係る実施例９を示すブロック図である。
【図１３】図１２の矢印Ａより見た要部拡大図である。
【図１４】本発明のレーザー走査蛍光顕微鏡装置に係る実施例１０を示すブロック図である。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
以下に、本発明に係るレーザー走査蛍光顕微鏡装置の実施例１から実施例１０を各図面に基づき、詳細に説明する。
【実施例１】
【００４３】
本発明に係るレーザー走査蛍光顕微鏡装置の実施例１を、以下に図面を参照しつつ説明する。
図１は、本実施例に係るレーザー走査蛍光顕微鏡装置の構成を示すブロック図であり、図２は、図１の矢印Ａより見た要部拡大図である。図１及び図２に示すように、光学系として、レーザー光が出射されるレーザー光源１ａと光を分離するための光変調器である音響光学変調素子（ＡＯＭ）４との間に、コリメーターレンズ２ａ及びビーム整形光学系３ａが配置されている。これらレーザー光源１ａおよび音響光学変調素子４ａは制御基板１４にそれぞれ接続されていて、この制御基板１４により動作がそれぞれ制御されるようになる。音響光学変調素子４ａに、キャリア交流信号としての周波数fcと正弦波信号としての変調周波数fmを制御基板１４に内臓の信号発生器が印加する。
【００４４】
また、音響光学変調素子４ａに対して、２群のレンズからなる第１の瞳伝達拡大レンズ系６、ビーム径を適性化するための制限開口８が順に並んで配置されている。また、第１の瞳伝達拡大レンズ系６を構成する２群のレンズの間に、光軸Ｌ外を通る不要な非回折光および高次回折光をカットするためのピンホール７が配置されている。
【００４５】
さらに、制限開口８に対して光軸Ｌの図１において右側には、入力されたレーザー光を１次元走査する第１の１次元走査ディバイス１１が配置されており、この第１の１次元走査ディバイス１１の図１において下方には、２群のレンズからなる第２の瞳伝達拡大レンズ系１２、第２の１次元走査ディバイス１３が配置されている。本実施例では、第１の１次元走査ディバイス１１で出射方向が図１において下方に変えられたビームが、これらを順に通過することになり、これら第１の１次元走査ディバイス１１、第２の瞳伝達拡大レンズ系１２及び第２の１次元走査ディバイス１３により、２次元走査光学系が構成されている。また、第２の１次元走査ディバイス１３の下隣には、２群のレンズからなる第３の瞳伝達拡大レンズ系１５、対象物Ｓと対向する対物レンズ１６が配置されている。
【００４６】
他方、対象物Ｓの直下には、波長選択性を持つダイクロイックミラー１８が設置されている。このダイクロイックミラー１８の下方には、図１及び図２に示すような直交する配置で、第１の受光素子である受光素子１９ａ及び、第２の受光素子である受光素子１９ｂが配置されている。
【００４７】
この受光素子１９ａには、第１の光電変換部である光電変換部２０ａが繋がり、受光素子１９ｂには、第２の光電変換部である光電変換部２０ｂが繋がり、これら光電変換部２０ａ、２０ｂからの信号を比較する信号比較器２１にこれらがそれぞれ接続されている。この信号比較器２１が、最終的にデータを処理して測定対象である対象物Ｓのプロフィル等を得るデータ処理部２２に繋がっている。そして、このデータ処理部２２は制御基板１４で制御されている音響光学変調素子４ａ及び走査ディバイス１１、１３の制御信号および信号比較器２１からの信号を元に対象物Ｓのプロファイル等を作成する。
【００４８】
ここで、対象物Ｓに入射されたレーザー光は、本実施例では対象物Ｓを透過するが、これに伴って対象物Ｓで蛍光を発生させる。つまり、対象物Ｓでレーザー光により励起された蛍光と透過光は、対象物Ｓの直下に設置された波長選択性を持つダイクロイックミラー１８に入射され、このダイクロイックミラー１８が、所定の波長を有する蛍光を透過し、この波長と異なる波長を有するレーザー光を光軸Ｌ外へ反射する。このダイクロイックミラー１８を透過した蛍光光束は、受光素子１９ａに導かれ、ダイクロイックミラー１８を反射したレーザー光束は、受光素子１９ｂに導かれる。
【００４９】
これに伴い、光電変換部２０ａで、各分割受光素子に１対１で対応した電気的増幅を行い、信号比較器２１において、必要に応じた素子の組合せで蛍光による和信号または差信号を作成する。また、光電変換部２０ｂで、各分割受光素子に１対１で対応した電気的増幅を行い、信号比較器２１において、必要に応じた素子の組合せでレーザー光による和信号または差信号を作成する。
【００５０】
データ処理部２２において、信号比較器２１からの信号を制御基板１４からの音響光学変調素子４aの変調信号を用いてヘテロダイン検波を行い、実質的な直交変換により強度情報と位相情報を得る。この際、光電変換部２０aで得られた蛍光による信号は励起レーザーに対し遅延が発生する。この遅延量は使用する蛍光色素および変調信号の周波数に応じ変わるため、ヘテロダイン検波の際、使用条件に合わせ遅延量に相当する変調信号の位相差を補正し検波を行う。なお、以下に説明する他の実施例においても蛍光による信号のヘテロダイン検波には、この補正がすべて適用される。また、制御基板１４から走査ディバイス１１、１３の各制御信号に合わせ、前記した強度や位相情報に基づき３次元の画像を構築し、透過像および蛍光像を個別または同時にモニターディスプレー２５で表示させる。また、データ処理部２２は得られた元画像データを電子データとして保存する機能を有す。
【００５１】
なお、上記の受光素子１９ａ、１９ｂは、音響光学変調素子４ａによって分離されたビームの方向に沿って光軸Ｌを対称にして複数に分割された分割受光素子により、それぞれ構成されている。これら２分割以上の分割受光素子は、フォトダイオードや光電子増倍管（ＰＭＴ）等によりそれぞれ構成されている。
【００５２】
受光素子１９ａ、１９ｂを構成する各分割受光素子をフォトダイオードとした場合、その素子の持つ端子間容量に反比例し遮断周波数が決まる。一般的に端子間容量は受光面積に比例するため、受光系を高速化するには受光面積の小さいフォトダイオードを使用することが望ましい。これに伴い、端子間容量の小さい小型のフォトダイオードをアレイ上に複数個配置し高速化を図り、光電変換部２０では、各フォトダイオードに１対１で対応した電気的増幅を行うことにより、必要に応じた素子の組合せで信号を形成することが出来る。
【００５３】
この一方、このレーザー光源１ａは、He-Ne等のガスレーザー、半導体レーザー、または固体レーザーであり、対象物Ｓ中の蛍光色素を励起させて蛍光を発光させる波長を有するコヒーレントなレーザー光を発生する。このレーザー光をコリメーターレンズ２ａにより平行光束にし、ビーム整形光学系３ａを用いて最適な径で音響光学変調素子４ａに入射させる。これら音響光学変調素子４ａには、制御基板１４より変調信号としてsin(2πfct)sin(2πfmt)のようなＤＳＢ変調信号を加える。
【００５４】
この様な変調を行うと、fc+fmとfc-fmの２つの周波数変調が加えられたことになる音響光学変調素子４ａは、ブラッグ回折格子のピッチdに相当する音波の粗密波を発生する。すなわち、超音波の速度をVa、印加する周波数をfとすると、d=Va/fとなる。具体的には、この粗密波により、音響光学変調素子４ａに入射されたレーザー光であるビームは、キャリア周波数fcにより回折角θを生じ、加えられた変調周波数fmによって分離角Δθの２つのビームにスプリットされ、±１次回折光に分離され、各々の回折光は周波数fc±fmの周波数で変調される。ただし、たとえば音響光学変調素子４ａの材料としてTeO2を用いた場合、この結晶内の音速は、4200ｍ/sである。
【００５５】
キャリア周波数の周波数fcとして80MHzを選択すると、ピッチはd=52.5μｍとなり、He-Neレーザーをレーザー光源１ａに用いた場合、回折角θは1.38°程度になる。このキャリア周波数に、周波数8ＭＨzのfmを加えると、±１次回折光はθ＝1.38°±0.138°の２つのビームに分離角Δθを0.276°として分離され、それぞれ88ＭＨzと72ＭＨzで変調されることになる。
【００５６】
次に、この分離角Δθを対物レンズ１６の入射瞳面で縮小する方法について述べる。
回折光が第１の瞳伝達拡大レンズ系６の光軸Ｌを通るよう、音響光学変調素子４ａから第１の瞳伝達拡大レンズ系６への入射角に回折角θの傾きを持たせる。また、第１の瞳伝達拡大レンズ系６は２群のレンズからなるのに伴い、入射側レンズ群の焦点距離をｆin 、出射側レンズ群の焦点距離をｆoutとしている。
【００５７】
音響光学変調素子４ａの出射面を第１の瞳伝達拡大レンズ系６の入射側レンズ群の焦点位置に置き、第１の瞳伝達拡大レンズ系６の２つのレンズ群間隔をｆin＋ｆoutとすると、音響光学変調素子４ａの出射面位置を第１の１次元走査ディバイス１１の偏向中心が射出側ｆoutの位置に共役となるアフォーカル光学系となっている。また、第１の瞳伝達拡大光学系６の中間焦点面付近に光軸Ｌ近傍の光束のみ透過するようピンホール７が前述のように有り、このピンホール７で光軸Ｌ外を通る不要な非回折光および高次回折光をカットする。
【００５８】
ここで、ｆin＜ｆoutとすると、ｆout／ｆin＝m1倍の拡大光学系となり、音響光学変調素子４ａで作られた分離角Δθを1/m1に縮小することができる。この一方、ビーム径はｍ1倍に拡大するため、この後の光学系による周辺光量の低下現象であるケラレを考慮し、制限開口８が第１の瞳伝達拡大レンズ系６の出射側レンズの後に挿入され、ビーム径を適性化する。
【００５９】
この制限開口８を出射した光束は、制御基板１４からの駆動信号により走査を行う第１の１次元走査ディバイス１１により偏向され、第２の瞳伝達拡大レンズ系１２に入射する。第２の瞳伝達拡大レンズ系１２は、前述の第１の瞳伝達拡大レンズ系６と同様の構成となっており、この第２の瞳伝達拡大レンズ系１２が、音響光学変調素子４ａの出射面位置、及び第１の１次元走査ディバイス１１の偏向中心と第２の１次元走査ディバイス１３の偏向中心を共役な位置関係に保つと共に、１より大きな倍率であるm2倍の拡大倍率を与える。
【００６０】
この第２の瞳伝達拡大レンズ系１２を出射した光束は、第１の１次元走査ディバイス１１の偏向方向と直交する方向に光束を偏向する第２の１次元走査ディバイス１３に入射し、これにより光束は２次元走査されることになる。そして、これら第１の１次元走査ディバイス１１及び第２の１次元走査ディバイス１３は制御基板１４に繋がっていて、レーザー光源１ａ、音響光学変調素子４ａと同期して動作するように、制御されるようになっている。
【００６１】
この第２の１次元走査ディバイス１３を出射した光束は、前述の第１の瞳伝達拡大レンズ系６と同様の構成となっている第３の瞳伝達拡大レンズ系１５に入射する。第３の瞳伝達拡大レンズ系１５は、音響光学変調素子４ａの出射面位置、第１の１次元走査ディバイス１１の偏向中心、及び第２の１次元走査ディバイス１３の偏向中心を対物レンズ１６の入射瞳面と共役な位置関係に保つと共に、１より大きな倍率であるm3倍の拡大倍率を与える。
【００６２】
以上により、第１の瞳伝達拡大レンズ系６、第２の瞳伝達拡大レンズ系１２、第３の瞳伝達拡大レンズ系１５によるm1×m2×m3＝m4倍の光学倍率によって、音響光学変調素子４ａによって作られた分離角ΔθをΔθ／m4に縮小し、対物レンズ１６に音響光学変調素子４ａで分離された２つのビームを入射する。このことにより、音響光学変調素子４ａの変調周波数ｆｍが高くしても、対象物Ｓの表面上で２つのビームによって作られる微小スポットを極めて近接させ、対象物Ｓを照明することができる。このようにして、図３の実線で示すビームＬＡおよび点線で示すビームＬＢのように、非常に接近して相互に同一径とされる２つのビームを得ることができる。
【００６３】
また、これら２つのビームＬＡ、ＬＢが有する周波数は、「光の振動数＋キャリア周波数fc±変調周波数fｍ」となる。ここで、対物レンズ１６からの２つの接近したビームＬＡ、ＬＢによって、対象物Ｓの表面上において作られる微小スポットの中心距離Δxを回折限界以下に設定したとする。この場合、各々のスポットは、アッベの理論の回折限界以下にはならないが、わずかにずらした各々別の周波数の光であるために、ヘテロダイン検波をすることにより、その和信号あるいは差信号よりビート信号を生成でき、微分情報を取得することができる。この時、和信号を用いると、実質的に微分干渉顕微鏡と等価になり、差信号を用いるとはるかに高い横分解能が得られる。
【００６４】
図１及び図２に示す受光素子１９ａ、１９ｂを、図３に示すビームＬＡ、ＬＢの分離方向に沿ってそれぞれ２分割以上に分割した複数の分割受光素子とする。例えば、ビームＬＡ、ＬＢの分離方向に対して垂直な方向に延びる図３及び図４に示す境界線Ｃを光軸Ｌ上に形成した時、この境界線Ｃと平行に暗線を有するように、これら複数の分割受光素子を配置し、その和信号あるいは差信号より、ビート信号を取得させる。この際、和信号を用いると、実質的に、微分干渉顕微鏡と等価になり、差信号を用いるとはるかに高い横分解能が得られる。これらの横分解能の向上に関しては、詳しく後に述べる。
【００６５】
まず、情報取得の高速化について述べる。図３に示すように対物レンズ１６で絞られた２つのビームＬＡ、ＬＢは、近接した２つのスポットＡ、Ｂ（図４に示す）となる。なお、スポットＡの複素振幅EaおよびスポットＢの複素振幅Ebは、下記式のようになる。
Ea=Aexpj(2π(fo+fc+fm)ｔ)
Eb=Bexpj(2π(fo+fc-fm)ｔ＋δ)
この複素振幅Ebの式のδは、ビームＬＡのスポットＡを基準としたビームＬＢのスポットＢの高さ方向の位相差を表わし、foは光の周波数を表す。なお、前述したように、この２つのスポット間隔は、音響光学変調素子４ａに加えた変調周波数ｆｍと拡大光学系の倍率m4によって決定されるので、走査速度とは無関係である。
【００６６】
受光素子１９ａ、１９ｂにより２つのビームＬＡ、ＬＢの位相差δは、ビート信号として検出される。すなわち、受光素子１９ａ、１９ｂ上の２つのビームの強度Iは、下記式に基づく値で受光素子１９ａ、１９ｂの光電変換部２０により検出され、信号比較器２１に送られる。
I=(Ea+Eb)(Ea+Eb)*=A2+B2+2ABcos(2π*2fmｔ＋δ)
したがって、信号比較器２１を用いて、周波数2fmのヘテロダイン検波の位相比較を行うことにより、位相差δを測定することができる。このようにすれば、変調周波数fmを高くし、かつ、ビームを非常に接近させることができるので、横分解能を高くすることができると同時に、データの取得を高速に行うことができる。
【００６７】
つまり、位相比較を行う時間は、変調周波数fmに逆比例するので、たとえば、ビデオレート（水平走査周波数約１６ＫＨz）で、１０００点以上のデータを取得しようとすれば、1点の情報取得の周波数は１６ＭＨzとなる。変調周波数fmを８ＭＨzにすれば、ビート周波数は、１６ＭＨzとなるので、十分にビデオレートで情報取得をすることができる。
【００６８】
この一方、製品化されている裸眼立体ディスプレーや偏光めがねを使用した３次元ディスプレー等を用いることにより、ビデオレートの３次元立体画像を表示することもできるので、教育や研究、医療において、有用な装置とすることができる。また、２つのビームの重なりの程度をビーム径よりも小さくしてあるので、２つのビームの行路差はほとんど生じていない。したがって、外乱や振動の影響も２つのビームで同時に生じるので、これらの影響が相殺される。
【００６９】
他方、本実施例では、ビームの分離度を個々のビーム径よりも非常に小さくした例を示したが、変調周波数を高くすることにより、ビームの分離度が大きくなり、かつ、ビーム径程度の分離度が必要となる場合にも、本発明の光学系が有用であることになる。
【００７０】
尚、上記実施例においては、１次元走査ディバイスを直交させて２つ配置することにより２次元走査を行う構成で説明をしたが、単純な一方向だけのデータが必要なアプリケーションであれば、１次元走査ディバイスを１段のみ使用した系でも同様な効果が得られることになる。この１次元走査ディバイスとして、マイクロマシーンの技術を用いたマイクロミラーディバイス、レゾナントミラー、ガルバノミラー、及び回転ポリゴンミラー等を用いることができる。さらに、近年開発がなされている、非線形光学結晶やフォトニック結晶を用いた高速スキャナーを使用できることにもなる。
【００７１】
また、マイクロマシーンの技術を用いたマイクロミラーディバイスにおいては、１つのディバイスで２次元走査可能なディバイスが有るが、これも使用可能であり採用すれば、第２の瞳伝達拡大光学系１２が必要なくなる。これに伴い拡大倍率がm2分小さくなるが、第１の瞳伝達拡大光学系および第３の瞳伝達拡大光学系の拡大倍率m1，m3を大きくすれば、前述のm4の拡大倍率を保持できることになる。
【００７２】
以上において、主に高速にデータを取得する手段について述べたが、次に、横分解能を著しく増大させる手段について述べる。
【００７３】
簡単のために１次元で考える。まず、表面のプロファイルd(x)の位相分布をＡejθ(x)とおく。ここで、θ(x)＝2πｄ(x)/λである。本実施例のように反射の場合には、光路差は２倍になるので、観測されるθ(x)の半分を高さ情報とすればよい。
さて、上記のように音響光学変調素子にキャリア信号fcと変調信号fmの掛け算信号（ＤＳＢ変調）を与えると、実質上、回折光は２つの僅かに分離したfc±fmの周波数を持った光となる。対物レンズで収束されるとΔｘだけ分離した２つのビームとなり、各ビームプロファイルをu(x)とする。この場合、対物レンズから離れた場所では、表面プロファイルとビームプロファイルの積のフーリエ変換となる。
【００７４】
本レーザー走査蛍光顕微鏡装置においては、一方の受光素子で受光されるビームは、ej(ωc-ωm)tで変調を受けていることになり、中心距離Δxだけ離れた他方の受光素子で受光されるビームは、ej(ωc+ωm)tで変調を受けていることになる。従って、受光素子上の複素振幅分布は、以下のようになる。
Ｅ＝∫(Ａejθ(x) u(x)ejkxdx・ej(ωc-ωm)t＋Ａejθ(x+Δx) u(x)ejkxdx・ej(ωc+ωm)tとなる。
【００７５】
これら受光素子により強度Ｉの検出を行うと、Ｉ＝ＥＥ*、さらに、２ωｍのヘテロダイン検波を行うので、以下の（１）式のようになる。
Ｉ(k)＝Ａ2∫ej(θ(x)-θ(x'+Δx') u(x) u(x’) ejk(x-x')dxdx’e-j2ωmt
＋Ａ2∫e-j(θ(x)-θ(x'+Δx') u(x) u(x’) ejk(x-x')dxdx’ej2ωmt・・・・・（１）式
【００７６】
そして、２つのビームＬＡ、ＬＢの重なっている照射領域Ａ，Ｂのほぼ中心を図４の境界線Ｃとし、この境界線Ｃを挟んだ位置であって、ビームＬＡ、ＬＢの分離方向である各々の照射領域Ａ，Ｂの分離方向に沿った位置に対応して２つの受光素子を対象物Ｓから離して配置する。
ここでまず、２つの受光素子の和信号がどのようになるかを考える。対象物Ｓから離れた位置では、フーリエ変換面であると考えられるので、受光素子で受光できる最大空間周波数をＫmaxとすると、和信号では強度Ｉが下記式から求められる。
Ｉ＝∫Ｉ(k)ｄｋ（積分範囲は-KmaxからKmax）
＝Ａ2∫cos(θ(x)−θ(x’+Δx’)−２ωｍｔ) u(x) u(x’)sin(Kmax(x-x’))/(x-x’)dxdx’
【００７７】
受光素子を近接させてより広い空間周波数まで受光するように配置すると、
sin(Kmax(x-x’))/(x-x’)＝Ｋδ(x-x’)となるので、以下の（２）式のようになる。
Ｉ＝Ａ2∫cos(θ(x) −θ(x+Δx) −２ωｍｔ) u(x)2ｄｘ・・・・・（２）式
【００７８】
すなわち、２つのビームの分離位置の位相差をビームプロファイルのウェイトで積分したことになる。
（２）式を変形すると下記の式を得る。
Ｉq＝Ａ2∫cos(θ(x)−θ(x+Δx) u(x)2ｄｘ・cos(２ωｍｔ)
Ｉi＝Ａ2∫sin(θ(x)−θ(x+Δx) u(x)2ｄｘ・sin(２ωｍｔ)
【００７９】
従って、直交変換により、観測される位相差Θは以下の（３）式のようになる。
Θ＝tan-1(∫sin(θ(x)−θ(x+Δx)) u(x)2ｄｘ/∫cos(θ(x)−θ(x+Δx)) u(x)2ｄｘ)・・・・・（３）式
【００８０】
この一方、２つの受光素子の差信号を考えると、和信号の場合と同様にして下記の式が得られる。
Ｉ＝∫Ｉ(k)ｄｋ（積分範囲は０からKmax）−∫Ｉ(k)ｄｋ（積分範囲は−Kmaxから０）
＝Ａ2∫sin(θ(x)−θ(x’+Δx’)−２ωｍｔ) u(x) u(x’)( cos(Kmax(x-x’)-1)/(x-x’)dxdx’
【００８１】
受光素子を近接させたより広い空間周波数まで受光するように配置すると、
(cos(Kmax(x-x’)-1)/(x-x’)＝δ’(x-x’)+1/x(δ(x)-1)となるので、下記（４）式のようになる。
I=Ａ2∫d/dx(sin(θ(x)―θ(x+Δx)―２ωｍｔ) )u(x)2ｄｘ・・・・・（４）式
さらに、この（４）式を変形すると、下記のようになる。
Ｉq＝Ａ2∫d/dx(sin(θ(x)−θ(x+Δx)) u(x)2ｄｘ・cos(２ωｍｔ)
Ｉi＝−Ａ2∫d/dx(cos(θ(x)−θ(x+Δx)) u(x)2ｄｘ・sin(２ωｍｔ)
【００８２】
従って、直交変換により観測される位相差Θは以下の（５）式のようになる。
Θ＝tan-1(−∫d/dx(cos(θ(x)−θ(x+Δx)) u(x)2ｄｘ/∫d/dx(sin(θ(x)−θ(x+Δx))u(x)2ｄｘ)・・・・・（５）式
【００８３】
ここで、（３）式と（５）式の比較を行う。定性的には、以下の点がわかる。
まず、（３）式では、ビームの中心距離Δxだけ離れた２点の位相差をu(x)の重み関数で、平滑化した結果として得られる位相差を示しているので、ビーム内の平均的な位相差を示している。これは、微分干渉顕微鏡と等価な処理である。
【００８４】
他方、（５）式では、ビームの中心距離Δxだけ離れた２点の位相差の微分に対して、u(x)の重み関数で、平滑化しているので、おおよそ元の関数を復元していることになる。従って、ビームを走査するとビーム分離度に相当する横分解能で、位相差および位置情報を取得することが可能となる。
【００８５】
ここでは、２分割の受光素子を適用した場合を記述したが、照射領域Ａ，Ｂの重なった領域の中心付近に、２つのビームの分離方向に沿って複数の受光素子を対象物Ｓから離して配置した場合も同様になる。特に、差出力を得る場合には、光軸Ｌの中心付近に対応して配置した複数の受光素子のうちの、対応する複数の受光素子間同士で差演算するようにすれば良い。また、複数の受光素子の和出力だけを用いるのであれば、実質上１つの受光素子を用いることで、同様のことが実現できることになる。
【００８６】
以上述べたように、フーリエ変換面にて空間周波数情報を処理することにより、特に差演算では非常に高い横分解能の向上をもたらすことができる。また、ビーム内にプロファイルの傾きがあれば、定性的には光が反射または透過する方向が異なるので、２つの受光素子に強度としての差出力が与えられることは容易に考えられる。もう少し具体的に説明すると、ビーム径よりも小さいプロファイルの変化に対しては、光が照射されている領域のフーリエ変換の０次回折波と１次回折波との干渉により形成された干渉縞のファーフィールドにおけるパターンが２つの受光素子で異なるので、受光素子の差信号はプロファイルの傾きに反映した強度差となってあらわれることになる。
【実施例２】
【００８７】
本実施例は、透過型の光学系とされる実施例１と異なり、反射型の光学系の実施例である。
図５は、本実施例のレーザー走査蛍光顕微鏡装置に係る反射型の光学系のブロック図を示している。なお、本実施例の他、以下の実施例は、実施例１と同様の構成とされている箇所を有するが、実施例１と同様に構成されている箇所の説明を省略する。
本実施例では、実施例１の照明光学系のダイクロイックミラー１８、受光素子１９ａ、１９ｂ、光電変換部２０ａ、２０ｂ等がなく、この替わりに、制限開口８と第１の１次元走査ディバイス１１の間にビームスプリッター９が配置された構造とされている。
【００８８】
従って、対象物Ｓでレーザー光により励起された蛍光および反射されたレーザー光は、照明光束と逆の光路を戻り、ビームスプリッター９に入射される。つまり、対物レンズ１６、第３の瞳伝達レンズ系１５、第２の１元走査ディバイス１３、第２の瞳伝達レンズ系１２及び第１の１元走査ディバイス１１を戻ることにより、偏向成分がキャンセルされて軸上光となり、ビームスプリッター９で直角に反射される。
【００８９】
そして、分離された光軸Ｌ上には、波長選択性を持つダイクロイックミラー２４が配置されている。このダイクロイックミラー２４の背後には受光素子２５aが配置され、分離された光軸Ｌと離れた位置には受光素子２５bが配置されている。このため、ダイクロイックミラー２４は、蛍光を透過させ、この蛍光と波長が異なるレーザー光を直角に反射するが、ダイクロイックミラー２４を透過した蛍光光束は、受光素子２５aに導かれ、ダイクロイックミラー２４を反射したレーザー光束は、受光素子２５bに導かれる。
【００９０】
但し、受光素子２５a及び受光素子２５bは、音響光学変調素子４ａによって分離されたビームの方向に沿って光軸Ｌを対称に２分割して配置されている分割受光素子により、それぞれ構成されている。この分割受光素子は、フォトダイオードや、光電子増倍管より構成されている。また、以下に説明する実施例においても分割受光素子を有するが、同様にフォトダイオードや、光電子増倍管より構成されている。
【００９１】
他方、受光素子２５aは光電変換部２６aに接続され、受光素子２５bは光電変換部２６bに接続されていて、これら光電変換部２６a、２６bは、データ処理部２２と繋がっている信号比較器２７にそれぞれ接続されている。
これに伴って、光電変換部２６aで、受光素子２５aの各分割受光素子に１対１で対応した電気的増幅を行い、信号比較器２７において必要に応じた素子の組合せで蛍光による和信号または差信号を作成する。また、光電変換部２６bで、受光素子２５bの各分割受光素子に１対１で対応した電気的増幅を行い、信号比較器２７において必要に応じた素子の組合せでレーザー光による和信号または差信号を作成する。
【００９２】
この結果として、データ処理部２２において、実施例１と同様に３次元の画像を構築し、反射像および蛍光像を個別または同時にモニターディスプレー２３で表示させる。つまり、実施例１に本実施例の受光光学系を組み込むことにより、透過／反射像を同時に取得できることになる。
【実施例３】
【００９３】
本実施例は、実施例１の１波長励起の光学系を２波長励起にする場合の実施例である。
図６は、本実施例のレーザー走査蛍光顕微鏡装置に係る２波長励起型の光学系のブロック図を示している。なお、図６における矢印Ａより見た図は、実施例１の図２と同様なので、省略する。実施例１において用いられるレーザー光源１a、コリメーターレンズ２ａ、ビーム成形光学系３ａの他、このレーザー光源１aとは異なる波長で異なる波長の蛍光を発光させるレーザー光源１bを有している。さらに、このレーザー光源１bのレーザー光を平行光束にするコリメーターレンズ２bとビーム成形光学系３bを有していて、音響光学変調素子４aに対して最適な径となるようにこのレーザー光源１bのレーザー光が成形される。これに伴い、レーザー光源１aが第１のレーザー光源であり、レーザー光源１bが第２のレーザー光源である。
【００９４】
本実施例では、これらレーザー光源１aとレーザー光源１bからの光束を同一光路上に合成するダイクロイックミラー５aがレーザー光源１aからのビームを整形する第１のビーム成形光学系３aと音響光学変調素子４aとの間の位置に設置されていて、各レーザー光源１a、１bからのビームをこのダイクロイックミラー５aが音響光学変調素子４aに入射させる。
【００９５】
本発明において光変調器として使用可能な音響光学変調素子４aによる１次回折光の回折角θは、レーザー光の波長λ、印加する周波数fa、音響光学変調素子４aの音響伝搬速度Vaとすると、θ＝λ×fa／Vaとなる。
従って、相互に波長の異なる２つレーザー光源１a、１bで音響光学変調素子４aを射出する光束の分離角を同じ角度とするためには、前出の回折角の式により印加する周波数を異ならせる必要がある。このため、各レーザー光源１a、１bを使用する際に印加する周波数を変更するが、以下の実施例においてもこのことは同様である。
【００９６】
音響光学変調素子４aの実質的な回折光出射面と走査素子面とを共役な配置と成るように第１の瞳伝達拡大レンズ系６を設置する。また、１次回折光が第１の瞳伝達拡大レンズ系６の光軸を通るよう、前記音響光学変調素子４a から第１の瞳伝達拡大レンズ系６への入射角にθの傾きを持たせる。なお、以下の照明光学系は実施例１と同じため、説明を割愛する。
【００９７】
対象物Ｓの直下には、レーザー光源１aに対応した波長選択性を持つダイクロイックミラー１８aおよび、レーザー光源１bに対応した波長選択性を持つダイクロイックミラー１８bが設置されている。対象物Ｓでレーザー光により励起された蛍光と透過光は、ダイクロイックミラー１８aまたはダイクロイックミラー１８bに入射する。ダイクロイックミラー１８aとダイクロイックミラー１８bとは、使用する励起レーザーに応じ切替機構２８により自動または手動により、切り替わる。前記切替機構２８は、リニアーアクチュエータによるスライド機構またはステッピングモータによる回転機構とすることができ、自動の場合、二つのレーザー光源１a、１bの選択に伴う励起レーザーの選択に応じ、これらスライド機構または回転機構により切替が行われる。また、手動の場合、同じく励起レーザーの選択に応じ、スライド機構または回転機構により切替を行う。
【００９８】
２つのダイクロイックミラー１８a、１８bのいずれかを透過した蛍光光束は、受光素子１９aに導かれ、２つのダイクロイックミラー１８a、１８bのいずれかを反射した反射レーザー光束は、受光素子１９bに導かれる。受光素子１９a及び受光素子１９bは、実施例１と同様に、音響光学変調素子４aによって分離されたビームの方向に沿って光軸Ｌを対称に複数に分割して配置されている分割受光素子により、それぞれ構成されている。
【００９９】
これに伴って、光電変換部２０aで、受光素子１９aの各分割受光素子に１対１で対応した電気的増幅を行い、信号比較器２１において、必要に応じた素子の組合せで蛍光による和信号または差信号を作成する。また、光電変換部２０bで、受光素子１９ｂの各分割受光素子に１対１で対応した電気的増幅を行い、信号比較器２１において、必要に応じた素子の組合せでレーザー光による和信号または差信号を作成する。
以上より、データ処理部２２において、信号比較器２１からの信号を制御基板１４からの音響光学変調素子４aの変調信号を用いてヘテロダイン検波を行い、実質的な直交変換により強度情報と位相情報を得る。
【０１００】
さらに、制御基板１４からの２次元走査ディバイスの各制御信号に合わせ、前記した強度情報や位相情報に基づき３次元の画像を構築し、透過像および蛍光像を個別または同時にモニターディスプレー２３で表示させる。また、データ処理部２２は得られた元画像データを電子データとして保存する機能を有す。
【実施例４】
【０１０１】
本実施例は、実施例３で述べた透過光学系を反射光学系とする場合の実施例である。
図７は、本実施例のレーザー走査蛍光顕微鏡装置に係る光学系のブロック図を示している。本実施例は、実施例３の照明光学系と同様に、レーザー光源１b、コリメーターレンズ２b、ビーム成形光学系３bおよびダイクロイックミラー５aを有している。
また、実施例２の反射光学系と同様に、ビームスプリッター９、ダイクロイックミラー２４a、２４b、受光素子２５a、２５b、光電変換部２６a、２６b、信号比較器２７等を有している。そして、本実施例では、受光素子２５aが第１の受光素子であり、受光素子２５bが第２の受光素子である。したがって、実施例２と同様に、対物レンズ１６から戻ってきた光束は、偏向成分がキャンセルされて、軸上光となり、ビームスプリッター９で直角に反射される。
【０１０２】
但し、本実施例では、分離された光軸Ｌ上に、レーザー光源１ａに対応した波長選択性を持つダイクロイックミラー２４aおよび、レーザー光源１ｂに対応した波長選択性を持つダイクロイックミラー２４bが配置されている。つまり、本実施例では、２つのダイクロイックミラーであるダイクロイックミラー２４a、２４bが配置されている。
【０１０３】
このため、２つのレーザー光源１ａ、１ｂから出射されて戻ってきた光束が、ダイクロイックミラー２４aまたはダイクロイックミラー２４bに入射する。なお、ダイクロイックミラー２４aとダイクロイックミラー２４bとは、使用する励起レーザーに応じ切替機構２９により自動または手動により切り替わる。前記切替機構２９も、リニアーアクチュエータによるスライド機構またはステッピングモータによる回転機構とすることができ、自動の場合、二つのレーザー光源１a、１bの選択に伴う励起レーザーの選択に応じ、これらスライド機構または回転機構により切替が行われる。また、手動の場合、同じく励起レーザーの選択に応じ、スライド機構または回転機構により切替を行う。
２つのダイクロイックミラー２４a、２４bのいずれかを透過した蛍光光束は、受光素子２５aに導かれ、２つのダイクロイックミラー２４a、２４bのいずれかを反射した反射レーザー光束は、受光素子２５bに導かれる。
【０１０４】
以上より、実施例３と同様に２つのレーザー光源１b、１ｂを有しているものの、データ処理部２２において、実施例２と同様に３次元の画像を構築し反射像および蛍光像を個別または同時にモニターディスプレー２３で表示させる。実施例２に本実施例の受光光学系を組み込むことにより、透過／反射像を同時に取得できることになる。
【実施例５】
【０１０５】
本実施例は、１つの受光素子で透過像と蛍光像を同時に観察する場合の実施例を示す。
図８は、本実施例のレーザー走査蛍光顕微鏡装置に係る光学系のブロック図を示している。本実施例は、実施例３の照明光学系と同様に、レーザー光源１b、コリメーターレンズ２b、ビーム成形光学系３bを有している。そして、本実施例では音響光学変調素子４bをも有している他、ダイクロイックミラー５ａの替わりに、音響光学変調素子４aと音響光学変調素子４bとからの光束を同一光路上に合成するダイクロイックミラー５bがこれらの間に配置されている。これに伴い、音響光学変調素子４aが第１の光変調器であり、音響光学変調素子４bが第２の光変調器である。なお、以下の照明光学系は実施例１及び実施例３と同じため、説明を割愛する。
【０１０６】
他方、本実施例では、対象物Ｓをレーザー光源１ａからのレーザー光の波長である第１のレーザー波長で励起される蛍光色素で染色する。
レーザー光源１ａ、１ｂからのレーザー光は、対象物Ｓを透過すると、第１のレーザー波長の光により蛍光が励起され、この蛍光とレーザー光源１ａ、１ｂによる透過光は、対象物Ｓ直下に設置されたダイクロイックミラー１８aに入射される。このダイクロイックミラー１８aは、第１のレーザー波長の光を反射し、第１のレーザー波長の光によって励起された蛍光および第２のレーザー波長の光を透過する、波長選択性を有しているので、対象物Ｓ直下でこれらの光が分離される。ここで、第２のレーザー波長は、レーザー光源１ｂからのレーザー光の波長とされる。
【０１０７】
ダイクロイックミラー１８aを透過した光束は、受光素子１９aに導かれる。この受光素子１９aは、音響光学変調素子４a、４bによって分離されたビームの方向に沿って光軸Ｌを対称に２分割して配置されている分割受光素子により、それぞれ構成されている。
光電変換部２０aで、受光素子１９aの各分割受光素子に１対１で対応した電気的増幅を行い、信号比較器２１aにおいて、必要に応じた素子の組合せで戻り光による和信号または差信号を作成する。
【０１０８】
信号比較器２１aからの信号は、レーザー光源１ａによって励起された蛍光と第２のレーザー波長の光が混在した信号となっている。但し、データ処理部２２において、音響光学変調素子４a、４bの変調信号を用いて信号比較器２１aからの信号を制御基板１４からの音響光学変調素子４a、４bの変調信号を用いてヘテロダイン検波を行うと、検波する周波数が異なるため、信号をそれぞれ独立して検出することが出来、実質的な直交変換により強度情報と位相情報を得ることができる。
【０１０９】
さらに、制御基板１４からの２次元走査ディバイスの各制御信号に合わせ、前記した強度情報や位相情報に基づき３次元の画像を構築し、透過像および蛍光像を個別または同時にモニターディスプレー２３で表示させる。また、データ処理部２２は得られた元画像データを電子データとして保存する機能を有す。
【実施例６】
【０１１０】
本実施例は、実施例５で述べた透過光学系を反射光学系とする場合の実施例である。
図９は、本実施例のレーザー走査蛍光顕微鏡装置に係る光学系のブロック図を示している。本実施例は、実施例５の照明光学系のように、レーザー光源１b、コリメーターレンズ２b、ビーム成形光学系３b、音響光学変調素子４bを有している他、音響光学変調素子４aと音響光学変調素子４bとからの光束を同一光路上に合成するダイクロイックミラー５bをも有している。
【０１１１】
さらに、本実施例では、実施例２と同様に制限開口８と第１の１次元走査ディバイス１１の間にビームスプリッター９が配置されている。そして、分離された光軸Ｌ上には、波長選択性を持つダイクロイックミラー２４が配置されており、このダイクロイックミラー２４の背後には受光素子２５aが配置されている。このため、ダイクロイックミラー２４は蛍光を透過した蛍光光束は、受光素子２５aに導かれる。この受光素子２５aは光電変換部２６aに接続されていて、光電変換部２６aは、データ処理部２２と繋がっている信号比較器２７に接続されている。
【０１１２】
本実施例では、対象物Ｓをレーザー光源１ａからのレーザー光の波長である第１のレーザー波長で励起される蛍光色素で染色する。
レーザー光源１ａ、１ｂからのレーザー光は対象物Ｓで反射すると、第１のレーザー波長の光により蛍光が励起され、対象物Ｓで第１のレーザー波長の光により励起された蛍光及び反射されたレーザー光は、照明光束と逆の光路を戻る。つまり、対物レンズ１６、第３の瞳伝達レンズ系１５、第２の１元走査ディバイス１３、第２の瞳伝達レンズ系１２、及び第１の１元走査ディバイス１１を戻ることにより偏向成分がキャンセルされ軸上光となり、ビームスプリッター９で直角に反射される。
【０１１３】
分離された光軸Ｌ上に位置しているダイクロイックミラー２４aは、第１のレーザー波長の光を反射し、第１のレーザー波長の光によって励起された蛍光および第２のレーザー波長の光を透過する、波長選択性を持っていて、このダイクロイックミラー２４aによってこれらが分離される。
【０１１４】
ダイクロイックミラー２４aを透過した光束は、受光素子２５aに導かれる。受光素子２５aは、音響光学変調素子４a、４bによって分離されたビームの方向に沿って光軸Ｌを対称に２分割して配置されている分割受光素子により、それぞれ構成されている。
光電変換部２６aで、受光素子２５aの各分割受光素子に１対１で対応した電気的増幅を行い、信号比較器２７aにおいて必要に応じた素子の組合せで戻り光による和信号または差信号を作成する。
【０１１５】
信号比較器２７aからの信号は、レーザー光源１ａによって励起された蛍光とレーザー光源１ｂの反射光が混在した信号となっている。但し、データ処理部２２において、実施例５と同様にそれぞれ独立して３次元の画像を構築し、反射像および蛍光像を個別または同時にモニターディスプレー２３で表示させる。実施例５に実施例６の受光光学系を組み込むことにより、透過／反射像を同時に取得できることになる。
【実施例７】
【０１１６】
本実施例は、２波長励起による蛍光を同時に観察する場合の実施例である。
図１０は、本実施例のレーザー走査蛍光顕微鏡装置に係る光学系のブロック図を示している。なお、図１０における矢印Ａより見た図は、実施例１の図２と同様なので、省略する。本実施例は、実施例５と同様の光学系とされ、ダイクロイックミラー５ａの替わりに、音響光学変調素子４aと音響光学変調素子４bとからの光束を同一光路上に合成するダイクロイックミラー５bが配置されている。なお、以下の照明光学系は実施例１及び実施例５と同じため、説明を割愛する。
【０１１７】
本実施例では、対象物Ｓを第１のレーザー波長で励起される蛍光色素と第２のレーザー波長で励起される蛍光色素で染色する。また、本実施例の対象物Ｓの直下には、ダイクロイックミラー１８aとダイクロイックミラー１８bが設置されている。
ダイクロイックミラー１８aが、第１のレーザー波長の光および、第２のレーザー波長の光によって励起された蛍光を反射し、第１のレーザー波長によって励起された蛍光および、第２のレーザー波長の光を透過する波長選択性を持っている。ダイクロイックミラー１８bが、第１のレーザー波長の光および第２のレーザー波長の光を反射し、第１のレーザー波長の光によって励起された蛍光および、第２のレーザー波長の光によって励起された蛍光を透過する波長選択性を持っている。
この際、ダイクロイックミラー１８aまたはダイクロイックミラー１８bのどちらか一方を、使用するレーザー光の波長と蛍光色素の組合せによって、切替機構２８により自動または手動により、切り替わる。前記切替機構２８は自動の場合、励起レーザーの選択に応じ、リニアーアクチュエータによるスライド機構またはステッピングモータによる回転機構により切替が行われる。また、手動の場合、励起レーザーの選択に応じ、スライド機構または回転機構により切替を行う。
【０１１８】
ダイクロイックミラー１８aまたはダイクロイックミラー１８bを透過した光束は、受光素子１９aに導かれ、ダイクロイックミラー１８aまたはダイクロイックミラー１８bを反射した光束は、受光素子１９bに導かれる。受光素子１９a、１９bは、音響光学変調素子４a、４bによって分離されたビームの方向に沿って光軸Ｌを対称に複数に分割して配置されている分割受光素子により、それぞれ構成されている。
【０１１９】
これに伴って、光電変換部２０aで、受光素子１９aの各分割受光素子に１対１で対応した電気的増幅を行い、信号比較器２１aにおいて、必要に応じた素子の組合せで戻り光による和信号または差信号を作成する。また、光電変換部２０bで、受光素子１９ｂの各分割受光素子に１対１で対応した電気的増幅を行い、信号比較器２１bにおいて、必要に応じた素子の組合せで戻り光による和信号または差信号を作成する。
【０１２０】
信号比較器２１a、２１bからの信号は、レーザー光源１ａとレーザー光源１ｂに由来の２つの信号が混在した信号となっている。但し、データ処理部２２において、音響光学変調素子４a、４bの変調信号を用いて信号比較器２１a、２１bからの信号を制御基板１４からの音響光学変調素子４a、４bの変調信号を用いてヘテロダイン検波を行うと、検波する周波数が異なるため、２つのレーザー光に由来する信号をそれぞれ独立して検出することが出来、実質的な直交変換により強度情報と位相情報を得ることができる。
【０１２１】
具体的には、ダイクロイックミラー１８aを用いたレーザー波長と蛍光波長の組合せの場合、データ処理部２２において、信号比較器２１aからの信号を元に、第１のレーザー波長によって励起された蛍光の情報および第２のレーザー波長による反射光の情報が得られ、信号比較器２１bからの信号を元に、第１のレーザー波長による反射光の情報および第２のレーザー波長によって励起された蛍光の情報が得られる。
【０１２２】
また、ダイクロイックミラー１８bを用いた場合、データ処理部２２において、信号比較器２１aからの信号を元に、第１のレーザー波長によって励起された蛍光の情報、および第２のレーザー波長によって励起された蛍光の情報が得られ、信号比較器２１bからの信号を元に、第１のレーザー波長および第２のレーザー波長による反射光の情報が得られる。
【０１２３】
さらに、制御基板１４からの２次元走査ディバイスの各制御信号に合わせ、前記した強度情報や位相情報に基づき３次元の画像を構築し、それぞれの波長を個別または同時にモニターディスプレー２３で表示させる。また、データ処理部２２は得られた元画像データを電子データとして保存する機能を有す。
【実施例８】
【０１２４】
本実施例は、実施例７で述べた透過光学系を反射光学系とする場合の実施例である。
図１１は、本実施例のレーザー走査蛍光顕微鏡装置に係る光学系のブロック図を示している。  本実施例は、実施例５と同様の光学系とされ、ダイクロイックミラー５ａの替わりに、音響光学変調素子４aと音響光学変調素子４bとからの光束を同一光路上に合成するダイクロイックミラー５bが配置されている。なお、以下の照明光学系は実施例１及び実施例２と同じため、説明を割愛する。
【０１２５】
また、実施例４の反射光学系と同様に、制限開口８と第１の１次元走査ディバイス１１の間にダイクロイックミラー９が配置されている他、ビームスプリッター９、受光素子２５a、２５b、光電変換部２６a、２６b等を有している。ただし、本実施例では、信号比較器２７の替わりに、２つの信号比較器２７ａ、２７ｂに分かれていて、光電変換部２６a、２６bがそれぞれ接続されている。
【０１２６】
本実施例では、対象物Ｓを第１のレーザー波長で励起される蛍光色素と第２のレーザー波長で励起される蛍光色素で染色する。対象物Ｓでレーザー光により励起された蛍光および反射されたレーザー光は、照明光束と逆の光路を戻る。つまり、対物レンズ１６、第３の瞳伝達レンズ系１５、第２の１元走査ディバイス１３、第２の瞳伝達レンズ系１２、及び第１の１元走査ディバイス１１を戻ることにより偏向成分がキャンセルされ軸上光となり、ビームスプリッター９で直角に反射される。
【０１２７】
分離された光軸Ｌ上には、ダイクロイックミラー２４aおよびダイクロイックミラー２４bが設置されている。
ダイクロイックミラー２４aが、第１のレーザー波長の光および第２のレーザー波長の光によって励起された蛍光を反射し、第１のレーザー波長の光によって励起された蛍光および第２のレーザー波長の光を透過する波長選択性を持っている。ダイクロイックミラー２４bが、第１のレーザー波長および第２のレーザー波長の光を反射し、第１のレーザー波長および第２のレーザー波長の光によって励起された蛍光を透過する波長選択性を持っている。
この際、ダイクロイックミラー２４aまたはダイクロイックミラー２４bのどちらか一方を、使用するレーザー波長の光と蛍光色素の組合せによって、切替機構２９により自動または手動により切り替わる。前記切替機構２９は自動の場合、励起レーザーの選択に応じ、リニアーアクチュエータによるスライド機構またはステッピングモータによる回転機構により切替が行われる。また、手動の場合、励起レーザーの選択に応じ、スライド機構または回転機構により切替を行う。
【０１２８】
ダイクロイックミラー２４aまたはダイクロイックミラー２４bを透過した光束は、受光素子２５aに導かれ、ダイクロイックミラー２４aまたはダイクロイックミラー２４bを反射した光束は、受光素子２５bに導かれる。受光素子２５a、２５bは音響光学変調素子４a、４bによって分離されたビームの方向に沿って光軸Ｌを対称に複数に分割して配置されている分割受光素子により、それぞれ構成されている。
【０１２９】
これに伴って、光電変換部２６aで、受光素子２５aの各分割受光素子に１対１で対応した電気的増幅を行い、信号比較器２７aにおいて、必要に応じた素子の組合せで戻り光による和信号または差信号を作成する。また、光電変換部２６bで、受光素子２５ｂの各分割各受光素子に１対１で対応した電気的増幅を行い、信号比較器２７bにおいて、必要に応じた素子の組合せで戻り光による和信号または差信号を作成する。
【０１３０】
以上より、データ処理部２２において、実施例５と同様にそれぞれ独立して３次元の画像を構築し、反射像および蛍光像を個別または同時にモニターディスプレー２３で表示させる。つまり、実施例７に実施例６の受光光学系を組み込むことにより、透過／反射像を同時に取得できることになる。
【実施例９】
【０１３１】
本実施例は、実施例７で述べた１つの光学フィルターで対応できない場合に対応可能とする実施例である。
図１２は、本実施例のレーザー走査蛍光顕微鏡装置に係る光学系のブロック図を示しており、図１３は、図１２の矢印Ａより見た要部拡大図である。本実施例は、実施例５と同様の光学系とされ、ダイクロイックミラー５ａの替わりに、音響光学変調素子４aと音響光学変調素子４bとからの光束を同一光路上に合成するダイクロイックミラー５bが配置されている。
【０１３２】
この他、対象物Ｓ直下に、第１の光学フィルターであるダイクロイックミラー１８ａが設置され、このダイクロイックミラー１８ａの直下に、第２の光学フィルターであるダイクロイックミラー１８ｂが設置されている。このダイクロイックミラー１８ａの横に第１の受光素子である受光素子１９aが配置され、ダイクロイックミラー１８ｂの横に第２の受光素子である受光素子１９bが配置され、ダイクロイックミラー１８ｂの直下に第３の受光素子である受光素子１９cが配置されている。
【０１３３】
３つの受光素子１９a、１９b、１９cは、音響光学変調素子４a、４bによって分離されたビームの方向に沿って光軸Ｌを対称にそれぞれ複数に分割して配置されている分割受光素子により、それぞれ構成されている。３つの受光素子１９a、１９b、１９cは、第１〜３の光電変換部である３つの光電変換部２０ａ、２０ｂ、２０ｃにそれぞれ接続され、３つの光電変換部２０ａ、２０ｂ、２０ｃは、さらに３つの信号比較器２１a、２１ｂ、２１ｃにそれぞれ接続され、３つの信号比較器２１a、２１ｂ、２１ｃがそれぞれデータ処理部２２に繋がっている。
【０１３４】
本実施例では、対象物Ｓをレーザー光が透過する。この際にレーザー光により励起された蛍光と透過光は、ダイクロイックミラー１８ａに入射されるが、このダイクロイックミラー１８ａは、第１のレーザー波長の光を反射し、第１のレーザー波長や第２のレーザー波長によって励起された蛍光および、第２のレーザー波長の光を透過する波長選択性を持っている。
また、ダイクロイックミラー１８ｂは、第１のレーザー波長の光によって励起された蛍光および第２のレーザー波長の光を反射し、第２のレーザー波長の光によって励起された蛍光を透過する波長選択性を持っている。
【０１３５】
ダイクロイックミラー１８ａで反射した光束は受光素子１９aに導かれ、光電変換部２０aで、受光素子１９aの各分割受光素子に１対１で対応した電気的増幅を行い、信号比較器２１aにおいて必要に応じた素子の組合せで戻り光による和信号または差信号を作成する。  ダイクロイックミラー１８ｂを反射した光束は受光素子１９bに導かれ、光電変換部２０bで、受光素子１９ｂの各分割受光素子に１対１で対応した電気的増幅を行い、信号比較器２１bにおいて必要に応じた素子の組合せで戻り光による和信号または差信号を作成する。ダイクロイックミラー１８ｂを透過した光束は受光素子１９cに導かれ、光電変換部２０cで、受光素子１９ｂの各分割受光素子に１対１で対応した電気的増幅を行い、信号比較器２１cにおいて必要に応じた素子の組合せで戻り光による和信号または差信号を作成する。
【０１３６】
データ処理部２２において、信号比較器２１aからの信号を元に制御基板１４からの音響光学変調素子４aの変調信号を用いてヘテロダイン検波を行い、第１のレーザー波長の光による反射光情報が得られ、実質的な直交変換により強度情報と位相情報を得る。
【０１３７】
信号比較器２１bからの信号は、レーザー光源１ａとレーザー光源１ｂに由来の２つの信号が混在した信号となっている。但し、データ処理部２２において、信号比較器２１a、２１bからの信号を制御基板１４からの音響光学変調素子４a、４bの変調信号を用いてヘテロダイン検波を行うと、検波する周波数が異なるため、２つのレーザー光に由来する信号をそれぞれ独立して検出することができる。この結果、第１のレーザー波長の光によって励起された蛍光の情報および第２のレーザー波長による反射光の情報が得られ、実質的な直交変換によりそれぞれの強度情報と位相情報を得る。
【０１３８】
データ処理部２２において、信号比較器２１cからの信号を元に制御基板１４からの音響光学変調素子４bの変調信号を用いてヘテロダイン検波を行い、第２のレーザー波長の光によって励起された蛍光の情報が得られ、実質的な直交変換により強度情報と位相情報を得る。
【０１３９】
さらに、制御基板１４からの２次元走査ディバイスの各制御信号に合わせ、前記した強度情報や位相情報に基づき３次元の画像を構築し、それぞれの波長を個別または同時にモニターディスプレー２３で表示させる。また、データ処理部２２は得られた元画像データを電子データとして保存する機能を有す。
【０１４０】
ダイクロイックミラー１８ａに、第１のレーザー波長の光を透過し、第１のレーザー波長の光、第２のレーザー波長によって励起された蛍光および第２のレーザー波長の光を反射する波長選択性を持たせた場合は、ダイクロイックミラー１８ａの反射側に隣り合わせてダイクロイックミラー１８ｂを設置すればよく、また、ダイクロイックミラー１８ｂの反射透過波長特性が逆の場合でも可能で、それぞれ、受光素子で検出可能な信号が換わることになる。
【実施例１０】
【０１４１】
本実施例は、実施例８で述べた１つの光学フィルターで対応できない場合に対応可能とする場合の実施例である。
図１４は、本実施例のレーザー走査蛍光顕微鏡装置に係る光学系のブロック図を示している。本実施例は、実施例５と同様の光学系とされ、ダイクロイックミラー５ａの替わりに、音響光学変調素子４aと音響光学変調素子４bとからの光束を同一光路上に合成するダイクロイックミラー５bが配置されている。
さらに、実施例８と同様にビームスプリッター９が配置されていて、レーザー光により励起された蛍光と反射光はこのビームスプリッター９で分離されるが、分離された光軸Ｌ上には、第１の光学フィルターであるダイクロイックミラー２４a及び第２の光学フィルターであるダイクロイックミラー２４bが設置されている。
【０１４２】
ダイクロイックミラー２４aは、第１のレーザー波長の光を反射し、第１のレーザー波長や第２のレーザー波長によって励起された蛍光および、第２のレーザー波長の光を透過する波長選択性を持っている。また、ダイクロイックミラー２４bは、第１のレーザー波長の光によって励起された蛍光および第２のレーザー波長の光を反射し、第２のレーザー波長の光によって励起された蛍光を透過する波長選択性を持っている。
【０１４３】
ダイクロイックミラー２４aを透過した光束はダイクロイックミラー２４aに導かれ、反射した光束は受光素子２５aに導かれる。ダイクロイックミラー２４bを反射した光束は受光素子２５bに導かれ、透過した光束は受光素子２５ｃに導かれる。
第１〜３の受光素子である受光素子２５a、２５ｂ、２５ｃは、音響光学変調素子４a、４bによって分離されたビームの方向に沿って光軸Ｌを対称に複数に分割して配置されている分割受光素子により、それぞれ構成されている。
【０１４４】
これに伴って、第１の光電変換部である光電変換部２６aで、受光素子２５aの各分割受光素子に１対１で対応した電気的増幅を行い、信号比較器２７aにおいて、必要に応じた素子の組合せで戻り光による和信号または差信号を作成する。また、第２の光電変換部である光電変換部２６bで、受光素子２５ｂの各分割各受光素子に１対１で対応した電気的増幅を行い、信号比較器２７bにおいて、必要に応じた素子の組合せで戻り光による和信号または差信号を作成する。さらに、第３の光電変換部である光電変換部２６ｃで、受光素子２５ｃの各分割各受光素子に１対１で対応した電気的増幅を行い、信号比較器２７ｃにおいて、必要に応じた素子の組合せで戻り光による和信号または差信号を作成する。
【０１４５】
以上より、データ処理部２２において、実施例８と同様にそれぞれ独立して３次元の画像を構築し、反射像および蛍光像を個別または同時にモニターディスプレー２３で表示させる。つまり、実施例９に実施例１０の受光光学系を組み込むことにより、透過／反射像を同時に取得できることになる。
ダイクロイックミラー２４ａに、第１のレーザー波長の光を透過し、第１のレーザー波長の光、第２のレーザー波長によって励起された蛍光および第２のレーザー波長の光を反射する波長選択性を持たせた場合は、ダイクロイックミラー２４ａの反射側に隣り合わせてダイクロイックミラー２４ｂを設置すればよく、また、ダイクロイックミラー２４ｂの反射透過波長特性が逆の場合でも可能で、それぞれ、受光素子で検出可能な信号が換わることになる。
【０１４６】
以上、本発明に係る実施の形態を説明したが、本発明は前述の実施の形態に限定されるものではなく、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で種々変形して実施することができる。
【産業上の利用可能性】
【０１４７】
本発明は、レーザー光の走査によって不透明物体の表面形状の観察及び計測、透明物体の表面または内部構造の観察及び計測を高速に行うレーザー走査蛍光顕微鏡装置だけでなく、さまざまな種類の顕微鏡に好適なものである。
【符号の説明】
【０１４８】
１a,１b    レーザー光源
２a,２b    コリメーターレンズ
３a,３b    ビーム整形光学系
４a,４b    音響光学変調素子
５a,５b    ダイクロイックミラー
６    第１の瞳伝達拡大レンズ系
７    ピンホール
８    制限開口
９    ビームスプリッター
１１    第１の１次元走査ディバイス
１２    第２の瞳伝達拡大レンズ系
１３    第２の１次元走査ディバイス
１４    制御基板
１５    第３の瞳伝達拡大レンズ系
１６    対物レンズ
１８，１８a,１８b    ダイクロイックミラー
１９a,１９b,１９c    受光素子
２０a,２０b,２０c    光電変換部
２１，２１a,２１b,２１c    信号比較器
２２    データ処理部
２３    ディスプレー
２４，２４a,２４b    ダイクロイックミラー
２５a,２５b,２５c    受光素子
２６a,２６b,２６c    光電変換部
２７，２７a,２７b,２７c    信号比較器
２８, ２９    切替機構
Ｓ    対象物
【図１】
2014052476.tif 000003
【図２】
2014052476.tif 000004
【図３】
2014052476.tif 000005
【図４】
2014052476.tif 000006
【図５】
2014052476.tif 000007
【図６】
2014052476.tif 000008
【図７】
2014052476.tif 000009
【図８】
2014052476.tif 000010
【図９】
2014052476.tif 000011
【図１０】
2014052476.tif 000012
【図１１】
2014052476.tif 000013
【図１２】
2014052476.tif 000014
【図１３】
2014052476.tif 000015
【図１４】
2014052476.tif 000016