(57)【要約】      （修正有）【課題】組織工学的に作製された絹製角膜などの組織工学的に作製された絹製臓器、及び組織工学的に作製された絹製臓器を製造するために用いられる方法の提供。【解決手段】多数のラメラ組織層を含む、組織工学的に作製された臓器であって、該ラメラ組織層が、溝付き絹フィブロインに播種された組織特異的細胞を含む溝付き絹フィブロイン基体を含む、組織工学的に作製された臓器。ラメラ組織層が、各層への栄養分の拡散または脈管形成のために構成されたミクロ孔を含む組織工学的に作製された臓器。組織特異的細胞が基体上に細胞外マトリックスを沈着させる組織工学的に作製された臓器。【選択図】図１
2014158952.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
多数のラメラ組織層（lamellae tissue layer）を含む、組織工学的に作製された臓器（tissue-engineered organ）であって、該ラメラ組織層が、溝付き絹フィブロイン（grooved silk fibroin）に播種された組織特異的細胞を含む溝付き絹フィブロイン基体を含む、組織工学的に作製された臓器。
【請求項２】
前記ラメラ組織層が、各層への栄養分の拡散または脈管形成のために構成されたミクロ孔（micropore）を含む、請求項1記載の組織工学的に作製された臓器。
【請求項３】
組織特異的細胞が基体上に細胞外マトリックスを沈着させる、請求項1記載の組織工学的に作製された臓器。
【請求項４】
溝付き絹フィブロイン基体の厚さが10nmから1mmまでの範囲であり、溝のサイズが少なくとも125nmであり、かつ溝の厚さ深さが少なくとも100nmである、請求項1記載の組織工学的に作製された臓器。
【請求項５】
組織特異的細胞が、幹細胞、線維芽細胞、内皮細胞、上皮細胞、組織特異的細胞外マトリックスを生成することのできる脂肪細胞、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項1記載の組織工学的に作製された臓器。
【請求項６】
ミクロ孔の平均直径が500nmから100ミクロンまでの範囲である、請求項2記載の組織工学的に作製された臓器。
【請求項７】
ミクロ孔が、ポリ(エチレンオキシド)相分離化学法、レーザー焼灼法、またはそれらの組み合わせの使用を通じて作り出される、請求項2記載の組織工学的に作製された臓器。
【請求項８】
培養細胞および沈着した細胞外マトリックスを伴う絹フィブロイン基体の集成によって形成されうる任意の組織である、請求項1記載の組織工学的に作製された臓器。
【請求項９】
角膜である、請求項8記載の組織工学的に作製された臓器。
【請求項１０】
光学的に透明で、非免疫原性で、かつ生体適合性である、請求項1記載の組織工学的に作製された臓器。
【請求項１１】
組織工学的に作製された臓器を調製するための方法であって、以下の段階を含む方法：
細胞外マトリックス沈着を行うことができる組織特異的細胞が播種された溝付き絹フィブロイン基体を各層が含む、多数のラメラ組織層を調製する段階；ならびに
細胞および沈着した細胞外マトリックスに組織工学的に作製された臓器を形成させるのに十分な期間にわたって、絹フィブロイン基体上で細胞を培養する段階。
【請求項１２】
絹フィルム中にミクロ孔を作り出す段階をさらに含み、該ミクロ孔が各層への栄養分の拡散または脈管形成を可能にする、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
ミクロ孔が、ポリ(エチレンオキシド)相分離化学法、レーザー焼灼法、またはそれらの組み合わせの使用を通じて作り出される、請求項12記載の方法。
【請求項１４】
ミクロ孔の平均直径が500nmから100ミクロンまでの範囲である、請求項12記載の方法。
【請求項１５】
組織工学的に作製された臓器が非免疫原性かつ生体適合性である、請求項11記載の方法。
【請求項１６】
臓器が、骨、皮膚、心組織、心筋、筋組織、緻密（dense）結合組織、基底膜、平滑筋組織、内皮組織、および神経組織からなる群より選択される、請求項11記載の方法。
【請求項１７】
臓器が角膜である、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
組織特異的細胞が、幹細胞、線維芽細胞、組織特異的細胞外マトリックスを生成することのできる脂肪細胞、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
組織工学的に作製された臓器の調製が、内皮細胞シートをラメラ組織層の底面に追加し、上皮細胞シートをラメラ組織層の上面に追加する段階をさらに含む、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
以下のものを含む、組織工学的に作製された角膜：
細胞外マトリックス沈着物を有する線維芽細胞が播種された溝付き絹フィブロイン基体を各層が含む、少なくとも2つのラメラ組織層；
ラメラ組織層の底面上にある内皮細胞シート；および
ラメラ組織層の上面上にある上皮細胞シート。
【請求項２１】
光学的に透明で、非免疫原性で、かつ生体適合性である、請求項20記載の組織工学的に作製された角膜。
【請求項２２】
ラメラ組織層が、各層への栄養分の拡散を可能にするミクロ孔を含む、請求項20記載の組織工学的に作製された角膜。
【請求項２３】
以下の段階を含む、動物臓器の置換のためのインビトロ検査システム：
溝付き絹フィブロイン基体上で、培養された組織特異的細胞を含む培養組織系を形成させる段階であって、該培養組織系が多数のラメラ組織層を含み、各層が溝付き絹フィブロイン基体上に培養された組織特異的細胞を含む、段階；
培養組織系を、組織特異的細胞の組織構築物がネイティブ組織の特性を維持し、かつ培養組織を形成しうるまでの期間、インキュベートする段階；および
動物臓器の置換の開発に役立てるために培養組織をインビトロ研究条件下で検査する段階。
【請求項２４】
培養組織系が多数のラメラ組織層を含み、各層が溝付き絹フィブロイン基体上に培養された組織特異的細胞を含む、請求項23記載の検査システム。
【請求項２５】
培養組織系が、骨、皮膚、心組織、心筋、筋組織、緻密結合組織、基底膜、平滑筋組織、内皮組織、および神経組織からなる群より選択される、組織工学的に作製された臓器である、請求項24記載の検査システム。
【請求項２６】
組織工学的に作製された臓器が角膜である、請求項25記載の検査システム。
【請求項２７】
組織工学的に作製された角膜が、幹細胞、線維芽細胞、内皮細胞、上皮細胞、組織特異的細胞外マトリックスを生成することのできる脂肪細胞、またはそれらの組み合わせを含む、請求項26記載の検査システム。
【請求項２８】
組織工学的に作製された角膜が、光学的に透明で、非免疫原性で、かつ生体適合性である、請求項26記載の検査システム。
【請求項２９】
絹フィブロイン基体が、1つまたは複数の生体適合性ポリマーを含む絹フィブロイン溶液から調製される、請求項1記載のラメラ組織層。
【請求項３０】
絹フィブロイン基体が、1つまたは複数の生体適合性ポリマーを含む絹フィブロイン溶液から調製される、請求項11記載の方法。
【請求項３１】
絹フィブロイン基体が分解可能なように構成される、請求項1記載の組織工学的に作製された臓器。
【請求項３２】
骨、皮膚、心組織、心筋、筋組織、緻密結合組織、基底膜、平滑筋組織、内皮組織、および神経組織からなる群より選択される、請求項8記載の組織工学的に作製された臓器。
【請求項３３】
組織工学的に作製された角膜が、線維芽細胞、内皮細胞、上皮細胞、幹細胞、組織特異的細胞外マトリックスを生成することのできる脂肪細胞を含む、請求項9記載の組織工学的に作製された臓器。
【請求項３４】
インビボ植え込みシステムの製造における使用のための請求項1記載の組織工学的に作製された臓器。
【請求項３５】
組織特異的細胞が溝の幾何学的パターンに整列化される、請求項1記載の組織層。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府の援助
本発明は、NIH TERC助成金第P41 EB002520号による援助を受けた。政府は本発明に対して一定の権利を有する。
【０００２】
関連出願の相互参照
本出願は、2007年9月17日に提出された米国仮出願第60／973,023号、および2007年2月27日に提出された米国仮出願第60／903,800号に対する優先権を主張し、これらは両方ともその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０００３】
発明の分野
本発明は、組織工学的に作製された絹製角膜（tissue-engineered silk cornea）などの組織工学的に作製された絹製臓器、および組織工学的に作製された絹製臓器を製造するために用いられる方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
背景
角膜障害は毎年、白内障に次いで、世界の一般集団における重大な視覚喪失の第2位の原因となっている。角膜置換は、急速に多くの人々にとって不可欠になりつつある開発中の技術である。角膜置換療法の理由には、疾患（例えば、ヘルペス感染）に由来する瘢痕、LASIK手術に由来する合併症、遺伝性異常（例えば、フックス病）、および他の手術（例えば、白内障）に由来する合併症といった多くのものが挙げられる。
【０００５】
角膜移植のために用いられる現在の戦略では、同種材料または合成材料を利用する。しかし、これらの戦略はある程度有効であるに過ぎず、組織拒絶反応を結果的にもたらす宿主免疫応答を誘発することもある。加えて、不健康なドナー臓器に由来する疾患の移行の可能性もある。これらの問題は、角膜を移植に不適なものとし、さらには許容される同種性供給源の入手可能性にも影響を及ぼすと考えられる、矯正的眼手術の使用が増加していることによって複雑化している。
【０００６】
溝付き基体（grooved substrate）の使用は、種々の基体上での細胞および細胞外マトリックス（ECM）の整列化を誘導することが文献中に示されている（Ingber, 2003（非特許文献1）；Dalby et al., 2003（非特許文献2）；Walboomers et al,, 1999（非特許文献3）；den Braber et al., 1998（非特許文献4）；Dunn and Brown, 1986（非特許文献5））。これらの方法は、一部には、組織発生を制御するための取り組みとして用いられている。これらの研究で用いられている基体材料の大半（すなわち、チタン、ケイ素；PDMSおよびPEO）は、体内で容易には分解されないか、またはインビボでの使用には不適である。それ故に、組織発生における可能性のある応用がこれらの基体を用いて探索されているものの、基体上で増殖した培養細胞をインプラントすることはできず、それらの実用性を大きく制約している。その上、これらの材料は、正常な細胞機能および組織発生を時間経過に伴って破壊する恐れのあるストレス誘発性細胞応答の原因ともなりうる。
【０００７】
したがって、当技術分野で必要とされているのは、光学的に透明で、非免疫原性でかつ生体適合性のある材料である材料で作られた、組織工学的に作製された角膜置換システムである。本発明はその需要に応える。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ingber, 2003, J of Cell Sci, 116:1397-1408
【非特許文献２】Dalby et al., 2003, Exp Cell Res 284, 274-282
【非特許文献３】Walboomers et al,, 1999, J Biomed Mater Res, 46:212-220
【非特許文献４】den Braber et al., 1998, J Biomed Mater Res 40, 291-300
【非特許文献５】Dunn and Brown, 1986, J Cell Sci, 83:313-340
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、組織特異的細胞を含む溝付き絹フィブロイン基体（grooved silk fibroin substrate）を含む、ラメラ組織層（lamellae tissue layer）に関する。多数のラメラ組織層を用いて、ラメラ組織層を有する組織工学的に作製された臓器を作り出すことができる。
【００１０】
本発明はまた、組織工学的に作製された臓器を調製するための方法にも関する。本方法は、多数のラメラ組織層を調製する段階を伴う。各ラメラ組織層は、細胞外マトリックス沈着を行える組織特異的細胞が播種された溝付き絹フィブロイン基体を含む。本方法は続いて、細胞および沈着した細胞外マトリックスに組織工学的に作製された臓器を形成させるのに十分な期間にわたって、絹フィブロイン基体上で細胞を培養する段階を伴う。
【００１１】
本発明はまた、組織工学的に作製された角膜にも関する。組織工学的に作製された角膜は、少なくとも2つのラメラ組織層、ラメラ組織層の底面上にある内皮細胞シート、およびラメラ組織層の上面上にある上皮細胞シートを含む。ラメラ組織層のそれぞれは、細胞外マトリックス沈着物を有する線維芽細胞が播種された溝付き絹フィブロイン基体を含む。
【００１２】
本発明はまた、組織工学的に作製された臓器のインビボ植え込み（implantation）システムにも関する。本システムは、溝付き絹フィブロイン基体上で、培養された組織特異的細胞を含む組織工学的に作製された臓器を形成させる段階；組織工学的に作製された臓器内の絹フィブロイン材料を少なくとも部分的に分解させる段階；および、組織工学的に作製された臓器をネイティブ（native）組織に植え込む段階を含む。
【００１３】
本発明はまた、組織工学的に作製された臓器を調製するためのキットにも関する。本キットは、細胞外マトリックス沈着物を有する組織特異的細胞を受け入れることのできる溝付き絹フィブロイン基体を含む。本キットはまた、絹フィブロイン基体上に組織特異的細胞を播種するため、ラメラ組織層を形成するように絹フィブロイン基体を構成するため、絹フィブロイン基体上で組織特異的細胞を培養するため、またはそれらの組み合わせのための説明書も含む。
【００１４】
本発明はまた、動物臓器の置換のためのインビトロ検査システムにも関する。本システムは、溝付き絹フィブロイン基体上で、培養された組織特異的細胞を含む培養組織系を形成させる段階；培養組織系を、組織特異的細胞の組織構築物がネイティブ組織の特性を維持し、かつ培養組織を形成しうるまでの期間にわたってインキュベートする段階；および動物臓器の置換の開発に役立てるために培養組織をインビトロ研究条件下で検査する段階、を含む。
【００１５】
絹製組織構築物の広範囲にわたる潜在的用途、機械的頑健性、脈管構造が組み込まれていること、およびすべてが天然の材料組成であることは、組織工学技術における大きな進歩をもたらす。絹を基体として用いることは、細胞およびECM発生をより良く制御することを可能にするとともに、時間経過に伴う基体材料の除去という利点をももたらす。
[請求項1001]
組織特異的細胞を含む溝付き絹フィブロイン基体（grooved silk fibroin substrate）を含む、ラメラ組織層（lamellae tissue layer）。
[請求項1002]
組織特異的細胞が基体上に細胞外マトリックスを沈着させる、請求項1001記載の組織層。
[請求項1003]
溝付き絹フィブロイン基体の厚さが10nmから1mmまでの範囲であり、溝のサイズが少なくとも125nmであり、かつ溝の厚さ深さが少なくとも100nmである、請求項1001記載の組織層。
[請求項1004]
組織特異的細胞が、幹細胞、線維芽細胞、内皮細胞、上皮細胞、組織特異的細胞外マトリックスを生成することのできる脂肪細胞、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項1001記載の組織層。
[請求項1005]
多数の請求項1001記載のラメラ組織層を含む、組織工学的に作製された臓器（tissue-engineered organ）。
[請求項1006]
各層への栄養分の拡散または脈管形成を可能にするミクロ孔（micropore）を含む、請求項1005記載の組織工学的に作製された臓器。
[請求項1007]
ミクロ孔の平均直径が500nmから100ミクロンまでの範囲である、請求項1006記載の組織工学的に作製された臓器。
[請求項1008]
ミクロ孔が、ポリ(エチレンオキシド)相分離化学法、レーザー焼灼法、またはそれらの組み合わせの使用を通じて作り出される、請求項1007記載の組織工学的に作製された臓器。
[請求項1009]
培養細胞および沈着した細胞外マトリックスを伴う絹フィブロイン基体の集成によって形成されうる任意の組織である、請求項1005記載の組織工学的に作製された臓器。
[請求項1010]
角膜である、請求項1009記載の組織工学的に作製された臓器。
[請求項1011]
光学的に透明で、非免疫原性で、かつ生体適合性である、請求項1005記載の組織工学的に作製された臓器。
[請求項1012]
組織工学的に作製された臓器を調製するための方法であって、以下の段階を含む方法：
細胞外マトリックス沈着を行うことができる組織特異的細胞が播種された溝付き絹フィブロイン基体を各層が含む、多数のラメラ組織層を調製する段階；ならびに
細胞および沈着した細胞外マトリックスに組織工学的に作製された臓器を形成させるのに十分な期間にわたって、絹フィブロイン基体上で細胞を培養する段階。
[請求項1013]
絹フィルム中にミクロ孔を作り出す段階をさらに含む、請求項1012記載の方法。
[請求項1014]
ミクロ孔が、ポリ(エチレンオキシド)相分離化学法、レーザー焼灼法、またはそれらの組み合わせの使用を通じて作り出される、請求項1013記載の方法。
[請求項1015]
ミクロ孔の平均直径が500nmから100ミクロンまでの範囲である、請求項1013記載の方法。
[請求項1016]
組織工学的に作製された臓器が非免疫原性かつ生体適合性である、請求項1012記載の方法。
[請求項1017]
臓器が、骨、皮膚、心組織、心筋、筋組織、緻密（dense）結合組織、基底膜、平滑筋組織、内皮組織、および神経組織からなる群より選択される、請求項1012記載の方法。
[請求項1018]
臓器が角膜である、請求項1017記載の方法。
[請求項1019]
組織特異的細胞が、幹細胞、線維芽細胞、組織特異的細胞外マトリックスを生成することのできる脂肪細胞、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項1018記載の方法。
[請求項1020]
組織工学的に作製された臓器の調製が、内皮細胞シートをラメラ組織層の底面に追加し、上皮細胞シートをラメラ組織層の上面に追加する段階をさらに含む、請求項1019記載の方法。
[請求項1021]
以下のものを含む、組織工学的に作製された角膜：
細胞外マトリックス沈着物を有する線維芽細胞が播種された溝付き絹フィブロイン基体を各層が含む、少なくとも2つのラメラ組織層；
ラメラ組織層の底面上にある内皮細胞シート；および
ラメラ組織層の上面上にある上皮細胞シート。
[請求項1022]
光学的に透明で、非免疫原性で、かつ生体適合性である、請求項1021記載の組織工学的に作製された角膜。
[請求項1023]
ラメラ組織層が、各層への栄養分の拡散を可能にするミクロ孔を含む、請求項1021記載の組織工学的に作製された角膜。
[請求項1024]
以下の段階を含む、組織工学的に作製された臓器のインビボ植え込み（implantation）システム：
溝付き絹フィブロイン基体上で、培養された組織特異的細胞を含む組織工学的に作製された臓器を形成させる段階；
組織工学的に作製された臓器内の絹フィブロイン材料を少なくとも部分的に分解させる段階；および
組織工学的に作製された臓器をネイティブ（native）組織に植え込む段階。
[請求項1025]
組織工学的に作製された臓器が多数のラメラ組織層を含み、各層が溝付き絹フィブロイン基体上に培養された組織特異的細胞を含む、請求項1024記載の植え込みシステム。
[請求項1026]
組織工学的に作製された臓器が、臓器の各層への栄養分の拡散を可能にするミクロ孔を含む、請求項1024記載の植え込みシステム。
[請求項1027]
組織工学的に作製された臓器が、骨、皮膚、心組織、心筋、筋組織、緻密結合組織、基底膜、平滑筋組織、内皮組織、および神経組織からなる群より選択される、請求項1024記載の植え込みシステム。
[請求項1028]
組織工学的に作製された臓器が角膜である、請求項1024記載の植え込みシステム。
[請求項1029]
組織工学的に作製された角膜が、線維芽細胞、内皮細胞、上皮細胞、幹細胞、組織特異的細胞外マトリックスを生成することのできる脂肪細胞を含む、請求項1028記載の植え込みシステム。
[請求項1030]
組織工学的に作製された角膜が、光学的に透明で、非免疫原性で、かつ生体適合性である、請求項1028記載の植え込みシステム。
[請求項1031]
以下のものを含む、組織工学的に作製された臓器を調製するためのキット：
細胞外マトリックス沈着物を有する組織特異的細胞を受け入れることのできる溝付き絹フィブロイン基体、および
絹フィブロイン基体上に組織特異的細胞を播種するため、ラメラ組織層を形成するように絹フィブロイン基体を構成するため、絹フィブロイン基体上で組織特異的細胞を培養するため、またはそれらの組み合わせのための説明書。
[請求項1032]
初代細胞源から細胞を獲得するための収集用および格納用のツールセットをさらに含む、請求項1031記載のキット。
[請求項1033]
初代細胞源がヒトまたは動物である、請求項1032記載のキット。
[請求項1034]
絹フィブロイン基体に組織特異的細胞が播種された後に基体を培養するためのバイオリアクターをさらに含む、請求項1031記載のキット。
[請求項1035]
バイオリアクターが、組織特異的細胞が培養されるまで、無菌性で栄養分が満たされた条件を維持することができる、請求項1034記載のキット。
[請求項1036]
絹フィブロイン基体が、各層への栄養分の拡散を可能にするミクロ孔を含む、請求項1031記載のキット。
[請求項1037]
絹フィブロイン基体が非免疫原性かつ生体適合性である、請求項1031記載のキット。
[請求項1038]
組織工学的に作製された臓器を商業的検査の目的で調製するために用いられる、請求項1031記載のキット。
[請求項1039]
以下の段階を含む、動物臓器の置換のためのインビトロ検査システム：
溝付き絹フィブロイン基体上で、培養された組織特異的細胞を含む培養組織系を形成させる段階；
培養組織系を、組織特異的細胞の組織構築物がネイティブ組織の特性を維持し、かつ培養組織を形成しうるまでの期間、インキュベートする段階；および
動物臓器の置換の開発に役立てるために培養組織をインビトロ研究条件下で検査する段階。
[請求項1040]
培養組織系が多数のラメラ組織層を含み、各層が溝付き絹フィブロイン基体上に培養された組織特異的細胞を含む、請求項1039記載の検査システム。
[請求項1041]
培養組織系が、各層への栄養分の拡散を可能にするミクロ孔を含む、請求項1040記載の検査システム。
[請求項1042]
培養組織系が、骨、皮膚、心組織、心筋、筋組織、緻密結合組織、基底膜、平滑筋組織、内皮組織、および神経組織からなる群より選択される、組織工学的に作製された臓器である、請求項1041記載の検査システム。
[請求項1043]
組織工学的に作製された臓器が角膜である、請求項1042記載の検査システム。
[請求項1044]
組織工学的に作製された角膜が、幹細胞、線維芽細胞、内皮細胞、上皮細胞、組織特異的細胞外マトリックスを生成することのできる脂肪細胞、またはそれらの組み合わせを含む、請求項1043記載の検査システム。
[請求項1045]
組織工学的に作製された角膜が、光学的に透明で、非免疫原性で、かつ生体適合性である、請求項1043記載の検査システム。
[請求項1046]
絹フィブロイン基体が、1つまたは複数の生体適合性ポリマーを含む絹フィブロイン溶液から調製される、請求項1001記載のラメラ組織層。
[請求項1047]
絹フィブロイン基体が、1つまたは複数の生体適合性ポリマーを含む絹フィブロイン溶液から調製される、請求項1012記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】注入成形による微細溝を備えた絹フィルムを描写している。図1（a）は、溝の形状の電界放射型走査型電子顕微鏡（FESEM）画像である。図1（b）は、フィルム表面の原子間力顕微鏡（AFM）である。これらの図において、各溝はおよそ幅が1.7μmで深さが1μmである。
【図２】溝付き絹ラメラ基体上で培養した、整列化した角膜線維芽細胞を描写している。図2（a）および（c）は、パターン入りでない絹フィルム上で増殖している緑色蛍光タンパク質（GFP）標識角膜線維芽細胞の透過画像（a）および疑似着色共焦点画像（d）を示している。図2（b）および（d）は、溝付きパターン入りの絹ラメラ表面上で増殖しているGFP標識角膜線維芽細胞の透過画像（b）および疑似着色共焦点画像（d）を示している。スケールバーは100μmである。
【図３】溝付き絹ラメラ構築物上の整列化した線維芽細胞、角膜細胞およびECMの走査型電子顕微鏡（SEM）画像を描写している。図3（a）および（c）は、溝付き絹ラメラ上に整列化している線維芽細胞およびECMを示している。図3（b）は、整列化した細胞突起の拡大画像および絹ラメラ上のパターン入り溝形状の明瞭な画像を描写している。
【図４】絹フィルム上に整列化した角膜線維芽細胞および円形幾何学的パターンを伴う注入成形型を描写している。図4（a）は、円形のパターン入り絹フィルム上で増殖したGFP標識角膜線維芽細胞の蛍光画像を示しており、図4（b）は、それのデジタル強調高倍率画像を示している。図4（c）は、絹フィルム用に用いることのできる円形パターン入り注入成形型を示している。
【図５】絹ラメラ構築物におけるレーザー焼灼したミクロ孔のSEM画像を描写している。図5（a）は、直径約5ミクロンのミクロ孔の列である。スケールバーは50μmである。図5（b）は、同じく直径約5μmである、選択したミクロ孔の高拡大画像である。
【図６】種々の基体上で10日間にわたり増殖させたウサギ角膜線維芽細胞培養物に関するAlamar Blue代謝アッセイのグラフを示している。図6（a）は第1日時点の培養物のグラフを示している；図6（b）は第4日時点の培養物を示している；図6（c）は第10日時点の培養物を示している。
【図７】（a）絹でコーティングしたガラスおよび（b）リン酸三カルシウム（TCP）でコーティングしたガラス上で14日間培養下においた後の角膜線維芽細胞の位相差画像を示している。画像は320倍に拡大されている。（c）絹でコーティングしたガラスおよび（d）ガラス上で4日間培養下においた後の角膜線維芽細胞の免疫蛍光画像。カラー画像中で緑色蛍光として示されている相対的に明るい箇所はコラーゲンVタンパク質の発現を示している。
【図８】30ミクロン絹フィブロインフィルムを透過する光のパーセンテージを示しているグラフである。
【図９】絹工学的に作製された（silk-engineered）角膜を構築する好ましい方法の概略図を描写している。
【図１０】整列化した角膜線維芽細胞の画像を描写している。図10（a）は、絹製角膜構築物の中心領域内部の角膜線維芽細胞を示している。細胞の焦点面の下方に多層の細胞が見てとれる。図10（b）は、溝付き絹ラメラ構築物上で増殖している角膜線維芽細胞を示している。
【図１１】ポリ(エチレン)オキシド（PEO）相分離を用いて製造され、多孔性を呈している絹フィルム（a）、および（b）PEO相分離を用いずに製造された絹フィルム、のSEM画像を描写している。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
詳細な説明
本発明は、組織特異的細胞を含む溝付き絹フィブロイン基体を含む、ラメラ組織層に関する。多数のラメラ組織層を用いて、ラメラ組織層を有する組織工学的に作製された臓器を作り出すことができる。
【００１８】
絹フィブロインは、ラメラ組織層を構築するための多目的材料を与える。安定性（優れた強度および靱性）、生体適合性（コラーゲンまたはポリエステルよりも免疫原性および炎症誘発性が低い）、緩徐な分解性、純度（既知のバイオバーデンはない）および修飾可能性（特定の細胞結合特性または細胞活性化特性を達成するために修飾するのが容易である）は、絹フィブロインを、ラメラ組織層および組織工学的に作製された臓器を調製するための理想的な候補としている。組織工学的に作製された角膜は、透過光のほぼ100％を透過させるその能力を含む、絹フィブロインの透明性の点から特に望ましい。
【００１９】
組織特異的細胞は、所望の組織の任意の生物細胞であってよい。例えば、所望の組織が角膜であるならば、組織特異的細胞は、角膜の特質を有する、または角膜の特質を有する他の生物細胞とともに用いることのできる生物細胞であるべきである。適した組織特異的細胞には、幹細胞、線維芽細胞、内皮細胞、上皮細胞、組織特異的細胞外マトリックスを生成することのできる脂肪細胞、およびそれらの組み合わせが非限定的に含まれる。
【００２０】
溝付き絹フィブロイン基体は、細胞および細胞外マトリックスの整列化を誘導するように設計された二次加工絹フィルムである。好ましくは、溝付き絹フィブロイン基体の厚さは約10nmから約1mmまでの範囲であり、溝のサイズは少なくとも125nmであり、溝の厚さ深さは少なくとも100nmである。より好ましくは、溝付き絹フィブロイン基体の厚さは約100nmから約100μmまでの範囲であり、溝のサイズは約500nmから約10μmまでの範囲であり、溝の厚さ深さは約250nmから約5μmまでの範囲である。最も好ましくは、溝付き絹フィブロイン基体の厚さは約500nmから約10μmまでの範囲であり、溝のサイズは約1μmから約5μmまでの範囲であり、溝の厚さ深さは約500nmから約3μmまでの範囲である。［好ましい範囲を確認］。絹の回折格子は、電界放出型走査型電子顕微鏡検査および原子間力顕微鏡検査といった公知の手法により、表面形態に関して特徴づけることができる。図1を参照。
【００２１】
任意の種類の絹フィブロインを、絹フィブロイン基体を作るために用いることができる。カイコによって産生される絹フィブロインが最も一般的であり、一般に好ましい。しかし、その代わりに用いることのできる、クモ絹（spider silk）、トランスジェニック絹、遺伝子工学で作製された絹およびそれらの変形物を含む、多くのさまざまな絹がある。本明細書で用いる場合、「フィブロイン」という用語は、カイコフィブロイン、および昆虫またはクモの絹タンパク質（Lucas et al., Adv. Protein Chern 13: 107-242 (1958)）を含む。好ましくは、フィブロインは、溶解したカイコ絹またはクモ絹を含む溶液から得られる。カイコ絹タンパク質は、例えばカイコガ（Bombyx mori）から得ることができ、クモ絹はネフィラ-クラブゼス（Nephila clavzes）から得ることができる。その代わりに、絹タンパク質を、遺伝子工学で作製された絹、例えば、細菌、酵母、哺乳動物細胞、トランスジェニック動物またはトランスジェニック植物からの絹など、を含む溶液から得ることもできる。例えば、国際公開公報第WO 97/08315号および米国特許第5,245,012号を参照のこと、これらは両方ともその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【００２２】
絹フィブロイン水溶液は、絹フィブロインから、当技術分野で公知の手法を用いて調製することができる。絹フィブロイン溶液を調製するための適した工程は、PCT出願第PCT/US2004/011199号、および、「Biopolymer Photonic Crystals and Method of Manufacturing the Same」と題する、2006年11月3日に提出された米国仮出願第60／856,297号に開示されており、これらは両方ともその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【００２３】
例えば、絹フィブロイン溶液は、カイコガなどのカイコ絹の繭からセリシンを抽出することによって得ることができる。例えば、カイコガ繭を水溶液中、好ましくは約0.02M Na2CO3を有する水溶液中で約30分間煮沸する。続いて繭を、例えばセリシンタンパク質を抽出するために、水ですすぎ洗いする。続いて、抽出された絹を水溶液中、好ましくは塩水溶液中に溶解させる。この目的に有用な塩には、臭化リチウム、チオシアン酸リチウム、硝酸カルシウム、または絹糸を可溶化することができる他の化学物質が含まれる。好ましくは、抽出された絹糸を約9〜12MのLiBr溶液中に溶解させる。塩は後に、例えば透析を用いて除去することができる。
【００２４】
または、絹フィブロイン溶液を、ネフィラ-シアビペス（Nephila ciavipes）などの溶解したクモ絹を含む溶液から得ることもできる。また、絹フィブロイン溶液を、遺伝子工学で作製された絹を含む溶液から得ることもできる。遺伝子工学で作製された絹は、例えば、治療薬、例えばサイトカイン、酵素、または任意のさまざまなホルモンもしくはペプチドを基にした薬物、抗菌薬および関連基体との融合タンパク質を含むことができる。
【００２５】
また、複合マトリックスを生成させるために、生体適合性ポリマーを絹溶液に添加することもできる。本明細書に記載の組成物において有用な生体適合性ポリマーには、例えば、ポリエチレンオキシド（PEO）（米国特許第6,302,848号）、ポリエチレングリコール（PEG）（米国特許第6,395,734号）、コラーゲン（米国特許第6,127,143号）、フィブロネクチン（米国特許第5,263,992号）、ケラチン（米国特許第6,379,690号）、ポリアスパラギン酸（米国特許第5,015,476号）、ポリリジン（米国特許第4,806,355号）、アルギナート（米国特許第6,372,244号）、キトサン（米国特許第6,310,188号）、キチン（米国特許第5,093,489号）、ヒアルロン酸（米国特許第387,413号）、ペクチン（米国特許第6,325,810号）、ポリカプロラクトン（米国特許第6,337,198号）、ポリ乳酸（米国特許第6,267,776号）、ポリグリコール酸（米国特許第5,576,881号）、ポリヒドロアルカノエート（米国特許第6,245,537号）、デキストラン（米国特許第5,902,800号）およびポリ酸無水物（米国特許第5,270,419号）が含まれる。2種またはそれ以上の生体適合性ポリマーを組み合わせて用いることができる。
【００２６】
絹フィブロイン基体は、絹溶液を、マスクとしてのさまざまな線ピッチのパターン入り回折性光学面、例えば種々のホログラフィック回折格子などの上に注入成形（casting）することによって調製することができる。絹溶液が注入成形された後に、それらをフィルムとして乾燥させることができる。乾燥は、当技術分野で公知の任意の手段によって達成しうる。例えば、フィルムを減圧環境に置いて2時間またはそれ以上の時間にわたって水なましを行い、取り出して、さらに乾燥させることができる。格子マスクからの取り出しは、基体からの格子の単純な機械的持ち上げによって達成することができる。
【００２７】
絹フィブロイン基体の溝は、細胞およびECMの整列化を誘導する。このため、組織特異的細胞は細胞外マトリックスを基体上に沈着させる。図2を参照。絹フィルム上で増殖した培養細胞は、溝付きフィルムのパターンに並行して整列化してそれらのECMを形成させる。図2および3を参照。このことにより、ラメラ層上での細胞配向および組織整列化の向きを制御することが可能になり、これは組織形成において役立つものである。基体上に刻印された幾何学的図形を、細胞を整列化したパターンで増殖させるために用いることもできる。図4を参照。絹フィルム上の幾何学的パターンをさまざまに変化させることにより、標的とする組織系に向けての細胞増殖の規定された空間パターン化が可能になる。
【００２８】
続いて、そのそれぞれが絹フィルムおよび組織特異的細胞種を含む事実上二次元（2-D）の構築物である個々のラメラ組織層を、互いに積み重ねるか、または別の様式で組み合わせて、三次元（3-D）の組織工学的に作製された臓器を製造することができる。これらの2-Dラメラ構造は、それ故に、3-Dの組織工学的に作製された構築物の「構成単位」としての役を果たしうる。そのような系は、その緩徐な分解性、生体適合性、光学的透明性、ならびに取り扱いおよび縫合のための耐久性を含む、絹フィブロインの有利な材料特徴を利用する。
【００２９】
多層構築物の縁端は、拡散を防ぐために封止してもよい。絹基体は加圧力に曝された時に粘着性となるため、丸い絹フィルム形状に対応する鈍化生検パンチを、播種時に圧力を印加するために用いることができる。または、絹基体と同程度の直径のポリジメチルスルホキシド（PDMS）ディスクを、層を適切な位置に保持させるための締め付け機構として作用させることもできる。PDMSは細胞培養物において不活性であること、吸水性が低いこと、および締め付け力を誘発しうることが示されている。粘着機構が十分でなければ、フィブリン糊または同様の接着剤を用いることもできる。
【００３０】
絹フィブロインに認められるタンパク質の固有の制御および能力を考慮して、所望の組織系の機能的な物質的要件によく合致させ、続いて組織特異的細胞種と結び付けることができる。ラメラ「構成単位」組織系は、多数の臓器系に適用可能であり、さまざまな調整可能な材料特質をもたらし、かつ完全にまたは少なくとも大部分は、植え込み時に非免疫原性である生体材料で構成される。結果として得られる組織工学的に作製された臓器は、それ故に、培養細胞および沈着した細胞外マトリックスを伴う絹フィブロイン基体を含む。
【００３１】
拡散の制約のために、組織工学的に作製された臓器の中心領域に位置する細胞は、往々にして、細胞の生命を支えるために必要な十分なレベルの栄養分を受け取れない。細胞の生存性をさらによく支えるために、組織工学的に作製された臓器は、組織工学的に作製された構築物の全体にわたる栄養分の拡散を支えることのできる脈管構造ネットワークを含んでもよい。組織工学的に作製された臓器にミクロ孔を組み入れることは、効率的な栄養分の輸送のための対流を模倣し、生体構築物の各ラメラ組織層への栄養分の拡散または脈管形成を可能にする。
【００３２】
脈管構造様のミクロ孔は、ポリマー相分離化学法、レーザー焼灼法、または当技術分野で公知の他の手法を用いて、絹フィルム内部に規定されたパターンで「穿孔する」ことができる。フェムト秒レーザー焼灼技術などのレーザー焼灼技術は、材料への周辺損傷を最小限に抑えるための高エネルギーのパルスレーザー光を伴う。ポリマー相分離化学法は、十分には混合しない（油と水に類似した、不混和性の）2種のポリマーを混合させ、それが十分には混合できないことを利用して、それらが異なるドメインに分離してポリマーおよびそれらの各々の量に基づいた材料形態を生じるようにすることを伴う。ポリマー相分離に用いるのに好ましいポリマーには、ポリエチレンオキシドまたは同様の代替的ポリマーおよび蝋が含まれる。
【００３３】
絹フィルム内部の多孔性は、多くの場合、系統的に制御することができる。レーザー焼灼技術を用いる場合、多孔性はレーザーのサイズまたは焦点に基づいて変更することができる。ポリマー相分離化学法を用いる場合には、ポリマーの濃度をさまざまに変化させることにより、孔サイズの範囲および孔密度を制御することができる。注入成形容積、注入成形表面積および絹濃度といった他の変数を一定に保つこと（または複数の変数を同時に変化させること）により、多孔性のかなりの部分をポリマー濃度に依存させることができる。実施例4を参照。
【００３４】
ミクロ孔は、ラメラ組織層の材料特質が損なわれず、かつ組織発生のために頑健なマトリックスを依然として維持しうるように十分に小さくあるべきであり、なおかつ、所望の脈管形成がもたらされるように十分に大きくあるべきである。好ましくは、ミクロ孔の平均直径は約100nmから約100ミクロンまでの範囲である。より好ましくは、平均直径は約800nmから約20ミクロンまでの範囲である。最も好ましくは、平均直径は約1ミクロンから約10ミクロンまでの範囲である。［好ましい範囲を確認］。図5を参照。
【００３５】
ミクロ孔は好ましくは、標的とする組織系に対して特異的に、培養表面への栄養分の拡散が最適化されるように設計されたパターンで、組織工学的に作製された臓器内に組み入れられる。層は互いに積み重ねられるため、ミクロ孔構造は3-D構築物のすべての領域への栄養分の拡散を可能にする。
【００３６】
ミクロ孔を作り出す際には、さまざまなデザインまたはパターンを用いることができる。組織工学的に作製される角膜の場合には、50〜100μmの間隔が好ましいが、これはそれが角膜組織で認められるものに類似した平均間隔の脈管ネットワークをもたらすためである（角膜組織は毛細血管による脈管形成は受けていないが、組織を通しての栄養分の拡散を補助するネットワークを含む）。格子間隔で点在するミクロンサイズまたはナノサイズの孔のアレイを作製することは、積み重ねられた絹ラメラ組織層の全体にわたる栄養分の拡散の出入り口をもたらす。
【００３７】
ラメラ組織層を用いて、さまざまな組織型および臓器系を製造することもできる。そのような系には、骨、皮膚、心組織、心筋、筋組織、緻密（dense）結合組織、基底膜、平滑筋組織、内皮組織および神経組織が含まれうる。臓器は、培養細胞および沈着した細胞外マトリックスを伴う絹フィブロイン基体の集成によって形成されうる任意の組織から作り上げることができる。好ましくは、臓器は角膜であり、これは絹フィブロインの光学的透明性、非免疫原性および生体適合性の点から、絹に基づくラメラ組織層に特に適している。
【００３８】
本発明はまた、組織工学的に作製された臓器を調製するための方法にも関する。本方法は、多数のラメラ組織層を調製する段階を伴う。各ラメラ組織層は、細胞外マトリックス沈着を行える組織特異的細胞が播種された溝付き絹フィブロイン基体を含む。本方法は続いて、細胞および沈着した細胞外マトリックスに組織工学的に作製された臓器を形成させるのに十分な期間にわたって、絹フィブロイン基体上で細胞を培養する段階を伴う。任意で、本方法はまた、絹フィルム中にミクロ孔を作り出す段階も伴う。絹フィブロインの使用を通じて、組織工学的に作製された臓器を、非免疫原性かつ生体適合性にすることができる。
【００３９】
絹フィブロイン基体への播種は、当技術分野で公知の手段を通じて達成することができる。一般に、細胞は、それらが基体構築物の内部で培養される能力を最大限に可能にする様式で、基体中に播種されるべきである。例えば、細胞は典型的には、約1000個／cm2〜約50,000個／cm2の密度で分布させるべきである。好ましくは、細胞は、約5000個／cm2〜約20,000個／cm2の密度で分布させるべきである。当然ながら、これらの分布パターンは、細胞のサイズ、播種条件、および当業者が認識している他の要因に応じて異なりうる。
【００４０】
細胞を絹基体中に播種する時に、細胞増殖を促進させることが当技術分野で知られている他の材料を細胞に補充してもよい。細胞増殖を促進することが知られている材料には、ダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）などの細胞増殖培地、ウシ胎仔血清（FBS）、非必須アミノ酸および抗生物質、ならびに増殖因子およびモルフォゲン因子、例えば塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）、トランスフォーミング増殖因子（TGF）、血管内皮増殖因子（VEGF）、インスリン様増殖因子（IGF-I）、骨誘導性増殖因子（BMP）、神経成長因子および関連タンパク質などが含まれる。
【００４１】
細胞を播種する時に含めることのできる追加材料には、DNA、siRNA、アンチセンス、プラスミド、リポソーム、および遺伝物質の送達用の関連した系；細胞シグナル伝達カスケードを活性化するためのペプチドおよびタンパク質；細胞による鉱化作用または関連イベントを促進するためのペプチドおよびタンパク質；ゲル-組織界面を改良するための接着性のペプチドおよびタンパク質；抗菌性および抗真菌性のペプチドおよびタンパク質ならびに関連化合物が含まれる。追加材料には、薬学的製剤中に見いだされる一般的な成分、例えば公知の添加剤なども含まれうる。例示的な添加剤には、希釈剤、溶媒、緩衝剤、可溶化剤、懸濁化剤、粘度調節剤、結合剤、潤滑剤、界面活性剤、保存料および安定化剤が含まれる。
【００４２】
ラメラ組織層の絹フィブロイン基体は、培養物がその本来のマトリックスの少なくとも一部を再生するまで細胞増殖を支えるための、機械的に頑健なマトリックスを与える。細胞の培養に要する時間の量は、用いる細胞の種類、培養の条件、培養物に本来のマトリックスを表させるべき度合い、および当業者が認識している他の変数に依存する。典型的には、絹フィブロイン基体に播種した後に細胞をおよそ1〜6週間培養するが、その後の時点では、絹フィブロインタンパク質は少なくとも部分的に分解し、新たな組織構築物は本来のマトリックスのものに一致する特質を呈すると考えられる。組織工学的に作製された臓器が、典型的には、インビボ使用のための、またはエクスビボ試験用の組織系としての準備が整っているとされるのはこの点による。
【００４３】
細胞は当技術分野で公知の手法に従って培養することができる。例えば、細胞を、液内培養下、気相液相界面、もしくは選択的灌流バイオリアクター内のような器官型環境で、または絹フィブロイン基体上で細胞を培養するために適した他の環境で培養することができる。
【００４４】
組織工学的に作製された角膜を調製する場合には、内皮細胞シートをラメラ組織層の底面に追加し、上皮細胞シートをラメラ組織層の上面に追加することができる。この好ましい態様において、本発明は、少なくとも2つのラメラ組織層、ラメラ組織層の底面上にある内皮細胞シート、およびラメラ組織層の上面上にある上皮細胞シートを含む、組織工学的に作製された角膜に関する。ラメラ組織層のそれぞれは、細胞外マトリックス沈着物を有する線維芽細胞が播種された溝付き絹フィブロイン基体を含む。好ましくは、角膜は学的に透明で、非免疫原性で、かつ生体適合性であり、ラメラ組織層は各層への栄養分の拡散を可能にするミクロ孔を含む。
【００４５】
本発明はまた、組織工学的に作製された臓器のインビボ植え込みシステムにも関する。本システムは、溝付き絹フィブロイン基体上で、培養された組織特異的細胞を含む組織工学的に作製された臓器を形成させる段階；組織工学的に作製された臓器内の絹フィブロイン材料を少なくとも部分的に分解させる段階；および、組織工学的に作製された臓器をネイティブ組織に植え込む段階を含む。本インビボ植え込みシステムは、多数の臓器系に適用可能であり、さまざまな調整可能な材料特質をもたらし、かつ完全にまたは少なくとも大部分は、植え込み時に非免疫原性である生体材料で構成される。
【００４６】
組織工学的に作製された臓器の植え込みの準備がいつ整ったかの判定は、一般に、当業者の専門知識に委ねられるべきである。典型的には、ネイティブ組織への植え込みは、絹フィブロイン材料が少なくとも部分的に分解され、かつ培養物がその本来のマトリックスとなるまで、またはそれに近くなるまで再生した時点で行われる。
【００４７】
本発明はまた、組織工学的に作製された臓器を調製するためのキットにも関する。本キットは、細胞外マトリックス沈着物を有する組織特異的細胞を受け入れることのできる溝付き絹フィブロイン基体を含む。本キットはまた、絹フィブロイン基体上に組織特異的細胞を播種するため、ラメラ組織層を形成するように絹フィブロイン基体を構成するため、絹フィブロイン基体上で組織特異的細胞を培養するため、またはそれらの組み合わせのための説明書も含む。説明書は、当業者が、組織工学的に作製された臓器を調製するというその主たる用途に沿ってキットを用いることを可能にする程度に十分に詳細に用意されさえすれば十分である。
【００４８】
本キットはさらに、組織工学的に作製された臓器の調製において役立つことが当技術分野で知られている他のツールを含んでもよい。例えば、本キットは、ヒトまたは動物などの初代細胞源から細胞を獲得するための収集用および格納用のツールセットを含みうる。本キットはまた、絹フィブロイン基体を、基体に組織特異的細胞が播種された後に培養するためのバイオリアクターも含みうる。バイオリアクターは好ましくは、無菌性で栄養分が満たされた条件を、組織特異的細胞が培養されるまで維持することができる。
【００４９】
キットのさまざまな用途を想定している。本キットは、商業的検査または他の種類の商業的用途のために学術界および産業界において用いることができる。1つの好ましい態様において、本キットは、組織工学的に作製された臓器を商業的検査の目的で調製するために用いられる。
【００５０】
本発明はまた、動物臓器の置換のためのインビトロ検査システムにも関する。本システムは、溝付き絹フィブロイン基体上で、培養された組織特異的細胞を含む培養組織系を形成させる段階；培養組織系を、組織特異的細胞の組織構築物がネイティブ組織の特性を維持し、かつ培養組織を形成しうるまでの期間にわたってインキュベートする段階；および動物臓器の置換の開発に役立てるために培養組織をインビトロ研究条件下で検査する段階、を含む。
【００５１】
培養組織系をインキュベートする期間は、組織系、インキュベーション条件、置き換える臓器の量、および当業者が認識している他の変数に応じて異なる。臓器のわずかな部分のみを好適なインキュベーション条件下で置き換える場合には、大部分または全臓器を無理な条件下で置き換える場合よりも、期間が明らかに短いと考えられる。正確な期間は、臓器置換の状況下で当業者によって決定されうる。典型的には、培養組織系をおよそ1〜6週間インキュベートする。
【００５２】
培養組織の検査は、当業者が研究の場で典型的に実施すると考えられる、検査のあらゆる局面を含む。この検査を通じて得られた結果、または結果が得られなかったことは、動物臓器の置換の開発のための助けになるものと捉えられるべきである。
【００５３】
別に定める場合を除き、本明細書で用いるすべての技術用語および科学用語は、当業者に一般的に理解されているものと同じ意味を有する。本発明の実施または検査において、本明細書に記載したものと同様または等価な方法および材料を用いることができるが、好ましい方法および材料は以下に述べる。本明細書で言及したすべての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は参照により本明細書に組み入れられる。さらに、材料、方法および実施例は単なる例示に過ぎず、限定を意図したものではない。矛盾のある場合には、本明細書が定義を含めて支配的であるものとする。
【００５４】
本発明を、本発明の例示を意図した以下の実施例によってさらに特徴づける。
【実施例】
【００５５】
実施例
実施例1：角膜細胞増殖のための基体としての絹
絹は、多数のさまざまな細胞種に対して実用的な基体であることが示されている。絹製組織層は、Alamar Blue代謝細胞アッセイを用いた場合、組織培養用プラスチックとの比較で角膜細胞増殖を支えることもできる。図6を参照。図6に示されているように、絹、ガラスおよびTCPの基体上で同程度の細胞代謝速度が認められた。これらのデータは、ラメラ組織層を、組織工学の目的用の構成単位として製造しうることを示している。これはまた、絹製の組織工学的に作製された角膜の製造に対する裏づけも与える。
【００５６】
実施例2：ウサギ間質線維芽細胞
ウサギ間質線維芽細胞が絹フィブロイン基体上で増殖する能力を評価した。8％フィブロイン溶液の単層を、スピンコーター（Laurell Technologies）を用いて、12mm丸形カバーガラス上に沈着させた。スピンコーターは、ガラス表面全体にフィブロインポリマーの均等な分布を生じさせる。フィブロインでコーティングしたカバーガラスを蒸気滅菌して、24ウェル培養皿の中に置いた。初代角膜線維芽細胞を成体ウサギ角膜から単離して、TCP上で集密化するまで培養した。続いて細胞を、フィブロインでコーティングしたカバーガラス上に10,000個／cm2の密度で播種し、ダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）、10％ウシ胎仔血清（FBS）および1％のPenstrep（細胞培養物の汚染を軽減するための抗生物質処理）を含む培地を補充した。細胞を集密化するまで増殖させたところ、細胞の形態はTCP上で増殖させた線維芽細胞と類似していた。図7を参照。
【００５７】
培養した細胞が間質線維芽細胞であることを確かめるために、免疫染色を用いて、角膜間質線維芽細胞によって豊富に産生されるタンパク質であるコラーゲンVの位置を突き止めた。コラーゲンVは角膜実質細胞によって間質マトリックス内部でインサイチューで産生され、コラーゲン細線維の直径を調節するように作用する。Marchant et al., 1996；およびBirk et al., 1990を参照のこと、これらは両方ともその全体が参照により本明細書に組み入れられる。この免疫染色は、絹フィブロイン基体上に播種された角膜線維芽細胞によってこのタンパク質が生成されたという証拠を提供している。これらの予備的な結果は、ウサギ角膜線維芽細胞が絹フィブロイン基体上でそれらの分化した表現型を保持していることを示唆する。
【００５８】
実施例3：組織工学的に作製された絹製角膜
絹フィブロイン基体は細胞およびECMの発生を手引きすることのできるラメラ組織層に変容させることができ、また、栄養分の拡散を支えるために脈管形成させること、もしくは多孔性ネットワークを生成させることもできる。続いて、これらのラメラ組織層を組み合わせて、3-D組織構築物または組織工学的に作製された臓器を形成させることができる。
【００５９】
角膜組織系は、その組織が主として、細胞層が間に差し挟まれた積み重ねられた細胞外マトリックスの層で構成されるという点で、それをラメラ構造の使用のための有用なモデル系とする独特なパラメーターのセットを提供する。ラメラ組織層は、絹フィブロインがその機械的特質に関して頑健であって、播種された細胞によるネイティブ組織の置換によって自然に分解し、非免疫原性であり、かつ光学的に透明であって可視光の100％近く透過するという点で、角膜組織を形成させるために必要な正しい材料特性のセットを与える。図8を参照。
【００６０】
組織層を用いて、角膜間質組織類似体などの組織工学的に作製された臓器を製造することもできる。角膜組織全体を形成させるために用いうる方法の概略図が図9に示されている。他の相対的配置を用いることもできる。図9において、積み重ねられたラメラ組織層は、積み重ねられた間質領域のそれぞれ底面上および上面上にある内皮細胞シートと上皮細胞シートとの間に配置されている。内皮細胞シートおよび上皮細胞シートの記載に関しては、Nishida et al., 2003を参照されたく、これはその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【００６１】
続いて、組織工学的に作製された臓器の全体を、植え込みまたはエクスビボ組織実験の準備が整うまで器官型環境内で培養することができる。諸試験は、組織工学的に作製された絹製角膜構築物の中心領域内部で細胞増殖が検出されたことを示しており、このことは細胞生存性が構築物の全体にわたって存在することを示唆する。図10を参照。
【００６２】
実施例4：PEO相分離による絹フィルム多孔性の制御
材料：8％絹溶液、5％ポリ(エチレンオキシド)（PEO）溶液、水およびメタノールを用いた。乾燥器、ポリジメチルスルホキシド（PDMS）基体、Teflonカバーグラス、Teflon乾燥表面、試験管立て、ピンセット、1mLシリンジ、微量遠心管および24ウェルプレート。
【００６３】
方法：絹フィブロイン水溶液を、当技術分野で公知の標準的なプロトコールを用いて調製する。絹／PEOフィルムは、パターン入りまたは平坦な表面といったPDMS上で注入成形する。5％wt. vol.のPEO溶液を調製した。100μLの絹／PEO溶液希釈物を、2cm2のパターン入りおよび平坦な丸形PDMS表面に対して注入成形させた。フィルムを12時間かけて乾燥させた。乾燥の後に、一次β-シート結晶化を誘導するためにフィルムの水なましを6時間行った。水なましの後に、過度のフィルム脱水を防ぐためにフィルムを水浴中に浸漬させた。水浴に覆いをかけ、フィルムを24時間放置した。二次β-シート結晶化の誘導のために、1枚のフィルムを水浴から100％ MeOH浴中に移した。フィルムを2分間放置し、続いてメタノール中に浸漬させながらそれらの各々のPDMS表面を剥がした。除去したところで、フィルムをTeflonでコーティングしたスライドガラス上に浮かばせて、MeOH浴から取り出し、Teflonでコーティングした乾燥用表面（すなわち、アクリルコーティングした表面）の上に置いた。
【００６４】
結果：積み重ねられたフィルム構築物の全体にわたっての栄養分の拡散および細胞間相互作用の増加を促すためにPEO相分離化学の手法を用いて、絹フィルム内部にミクロ孔が作り出された。Jin et al., 2004を参照のこと、これはその全体が参照により本明細書に組み入れられる。注入成形に用いた絹-PEOの比は、形成され、乾燥されてPEOが抽出された時点でフィルム中に生成される孔に直接影響を及ぼした。直径が1〜3ミクロンの範囲である孔がフィルム内部に生成された。図11（a）を参照。対照的に、PEO分離法を用いなかった対照では孔が全く認められなかった。比較例として図11（b）を参照。
【００６５】
参考文献
2014158952.tif 000003
2014158952.tif 000004
2014158952.tif 000005
2014158952.tif 000006
2014158952.tif 000007
2014158952.tif 000008
2014158952.tif 000009
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年5月26日(2014.5.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組織特異的細胞を含む溝付き絹フィブロイン基体（grooved silk fibroin substrate）を含み、かつミクロ孔（micropore）を含む、ラメラ組織層（lamellae tissue layer）であって、該ミクロ孔の間隔が50μmから100μmであり、該ミクロ孔の平均直径が800nmから10ミクロンまでの範囲である、前記ラメラ組織層。
【請求項２】
前記組織特異的細胞が前記基体上に細胞外マトリックスを沈着させる、請求項1記載の組織層。
【請求項３】
前記溝付き絹フィブロイン基体の厚さが10nmから1mmまでの範囲であり、溝のサイズが少なくとも125nmであり、かつ溝の厚さ深さが少なくとも100nmである、請求項1記載の組織層。
【請求項４】
前記組織特異的細胞が、幹細胞、線維芽細胞、内皮細胞、上皮細胞、組織特異的細胞外マトリックスを生成することのできる脂肪細胞、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項1記載の組織層。
【請求項５】
多数の請求項1記載のラメラ組織層を含み、かつミクロ孔を含む、組織工学的に作製された臓器（tissue-engineered organ）であって、該ミクロ孔の間隔が50μmから100μmであり、該ミクロ孔の平均直径が800nmから10ミクロンまでの範囲である、前記組織工学的に作製された臓器。
【請求項６】
前記ミクロ孔が、ポリ(エチレンオキシド)相分離化学法、レーザー焼灼法、またはそれらの組み合わせの使用を通じて作り出される、請求項5記載の組織工学的に作製された臓器。
【請求項７】
培養細胞および沈着した細胞外マトリックスを伴う絹フィブロイン基体の集成によって形成されうる任意の組織である、請求項5記載の組織工学的に作製された臓器。
【請求項８】
角膜である、請求項7記載の組織工学的に作製された臓器。
【請求項９】
光学的に透明で、非免疫原性で、かつ生体適合性である、請求項5記載の組織工学的に作製された臓器。
【請求項１０】
組織工学的に作製された臓器を調製するための方法であって、以下の段階を含む方法：
細胞外マトリックス沈着を行うことができる組織特異的細胞が播種された溝付き絹フィブロイン基体を各層が含む、多数のラメラ組織層を調製する段階；ならびに
細胞および沈着した細胞外マトリックスに組織工学的に作製された臓器を形成させるのに十分な期間にわたって、絹フィブロイン基体上で細胞を培養する段階。
【請求項１１】
絹フィルム中にミクロ孔を作り出す段階をさらに含む、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
前記ミクロ孔が、ポリ(エチレンオキシド)相分離化学法、レーザー焼灼法、またはそれらの組み合わせの使用を通じて作り出される、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
前記ミクロ孔の平均直径が500nmから100ミクロンまでの範囲である、請求項11記載の方法。
【請求項１４】
前記組織工学的に作製された臓器が非免疫原性かつ生体適合性である、請求項10記載の方法。
【請求項１５】
前記臓器が、骨、皮膚、心組織、心筋、筋組織、緻密（dense）結合組織、基底膜、平滑筋組織、内皮組織、および神経組織からなる群より選択される、請求項10記載の方法。
【請求項１６】
前記臓器が角膜である、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
前記組織特異的細胞が、幹細胞、線維芽細胞、組織特異的細胞外マトリックスを生成することのできる脂肪細胞、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
前記組織工学的に作製された臓器の調製が、内皮細胞シートをラメラ組織層の底面に追加し、上皮細胞シートをラメラ組織層の上面に追加する段階をさらに含む、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
ラメラ組織層の底面の内皮細胞シートおよびラメラ組織層の上面の上皮細胞シートを含む、請求項5記載の組織工学的に作製された臓器。
【請求項２０】
前記組織工学的に作製された臓器の縁が封止される、請求項5記載の組織工学的に作製された臓器。
【請求項２１】
ラメラ組織層の底面の内皮細胞シートおよびラメラ組織層の上面の上皮細胞シートを含む角膜であり、かつ溝付き絹フィブロイン基体の厚さが10nmから1mmまでの範囲であり、溝のサイズが少なくとも125nmであり、溝の厚さ深さが少なくとも100nmであり、該角膜が50μmから100μmの間隔でミクロ孔を含む、請求項5記載の組織工学的に作製された臓器。
【請求項２２】
前記ミクロ孔の平均直径が1μmから10μmである、請求項5記載の組織工学的に作製された臓器。
【請求項２３】
前記ミクロ孔の平均直径が1μmから10μmである、請求項1記載の組織層。