(57)【要約】      （修正有）【課題】有機性排水処理系の活性汚泥に含まれる微生物叢の変化を定量的及び定性的に解析し、処理系毎に運転状態を的確に把握できる方法の提供。【解決手段】活性汚泥を利用した有機性排水の処理系において、前記処理系の活性汚泥中の微生物叢由来の遺伝子情報を可視化して検出する検出手段と、前記検出手段によって得られた遺伝子情報を、前記処理系の運転が活性化状態に有る時と標準状態に有る時の前記活性汚泥中の微生物叢由来の遺伝子情報を夫々可視化して検出し記録したデータと比較して前記処理系の運転状態を判定するモニタリング手段を有する有機性排水の処理方法、及び当該モリタリング結果に基づいて処理系の安定運転の回復のための制御を行う制御手段を有する有機性排水の処理方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
活性汚泥を利用した有機性排水の処理系において、前記処理系の活性汚泥中の微生物叢由来の遺伝子情報を可視化して検出する検出手段と、前記検出手段によって得られた遺伝子情報を、前記処理系の運転が活性化状態に有る時と標準状態に有る時の前記活性汚泥中の微生物叢由来の遺伝子情報を夫々可視化して検出し記録したデータと比較して前記処理系の運転状態を判定するモニタリング手段を有する有機性排水の処理方法。
【請求項２】
前記有機性排水が、し尿及び／又は浄化槽汚泥である請求項１に記載の有機性排水の処理方法。
【請求項３】
前記遺伝子情報が、前記微生物叢由来のDNAを電気泳動して得られたバンドパターンである請求項１又は２に記載の有機性排水の処理方法。
【請求項４】
前記バンドパターンが、前記微生物叢由来のDNAを変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法に供することによって得られたものである請求項３に記載の有機性排水の処理方法。
【請求項５】
前記モニタリング手段によって前記処理系の運転状態が前記標準状態若しくはそれに近づく状態であると判断された時に、前記活性化状態の回復のための制御を行う制御手段を有する請求項１〜４の何れか一項に記載の有機性排水の処理方法。
【請求項６】
前記制御手段が、前記活性汚泥への腐植、腐植抽出物、フミン酸、フルボ酸、硅砂及び硅石のうちの１つ又は２つ以上の供給である請求項５に記載の有機性排水の処理方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、活性汚泥を利用した有機性排水の処理方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
活性汚泥を利用した有機性排水処理技術は、糞尿や洗浄水、生活排水、工場排水などの多種多様な有機性排水の処理に広く利用されている。しかしながら、処理の主体が多種多様な微生物から構成される微生物叢であるため、安定した活性を維持できるよう微生物叢の変化を的確に把握し処理系の運転状態を管理することが必要である。しかしながら、従来においては、運転中の活性汚泥中の微生物叢の変化を定量的又は定性的に把握する手段がなかったことから、運転管理は熟練者の経験と勘に委ねられていた。そのため、当該処理系の安定運転に当たっては、多くの知識と経験が必要であった。
【０００３】
近年、活性汚泥を利用する有機性排水処理系において、運転中の活性汚泥に含まれる微生物叢を把握するための方法が報告されている。例えば、含窒素排液の生物的な汚水処理系において、T-RFLPによって活性汚泥の微生物解析を行って生物的な硝化反応系内の硝化能力を測定する方法が報告されている（特許文献１）。これは、特定の制限酵素を使用したT-RFLP解析によって得られるフラグメントサイズに基づいて硝化反応系内の微生物の硝化能力を判定するものである。更に、これを利用して、フラグメントサイズ解析による微生物情報を制御システムに導入することにより、再現性のある硝化システムを構築できることが報告されている（特許文献２）。また、メタン生成細菌由来の遺伝子を網羅的に検出できるプライマーを利用して、汚泥中のメタン生成細菌の微生物叢の構成を総括的に把握する方法が報告されている（特許文献３）。
【０００４】
しかしながら、特許文献１及び２に記載の技術は、硝化能力という特定の能力の解析に関するものである。一方、し尿などの有機性排水には多種多様な有機物や窒素化合物が含まれ、これを処理するためには汚泥中に含まれる多種多様な微生物叢の生物活性が利用される。そのため、引用文献１及び２の技術では有機性排水処理系の運転状態を総括的に把握することはできない。また、個別の処理系毎に活性汚泥中に含まれる微生物叢の構成は相違し複雑な微生物生態系を構成するが、特許文献１及び２の技術では個別の処理系に対応するものではない。また、特定の制限酵素処理によるフラグメントサイズと硝化能力との関連を見出したに過ぎず、他の制限酵素を利用した場合にはフラングメントサイズは変動するものであった。したがって、活性汚泥中に含まれる多様性に富む微生物叢の変化を定量的又は定性的に把握するには十分なものではなかった。そして、特許文献３の技術もメタン生成菌のみを対象とするものであり、かかる技術も多様性に富む微生物叢の変化を定量的又は定性的に把握するものではなく、個別の処理系の運転状態を的確に把握することはできなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００６−２５４７４７号公報
【特許文献２】特開２００６−２５５５４８号公報
【特許文献３】特開２００３−５６０８１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
依然として、有機性排水処理系の活性汚泥に含まれる微生物叢の変化を定量的及び定性的に解析し、処理系毎に運転状態を的確に把握できる技術の構築が求められていた。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
そこで、上記課題を解決するべく本発明者らは鋭意研究した結果、活性汚泥を利用した有機性排水処理系の活性汚泥中の微生物叢由来の遺伝子情報を可視化して検出する検出手段と、前記検出手段によって得られた遺伝子情報を、前記処理系の運転が活性化状態に有る時と標準状態に有る時の前記活性汚泥中の微生物叢由来の遺伝子情報を夫々可視化して検出し記録したデータと比較して前記処理系の運転状態を判定することにより、微生物叢の変遷を的確かつ迅速に把握できることを見出した。更に、その結果に基づき、活性化状態を維持できるように制御することにより、微生物叢の最適化を図れ、処理効率の向上及び処理コストの低減を実現できることを見出し、これらの知見に基づいて本発明を完成するに至った。
【０００８】
即ち、以下の〔１〕〜〔６〕に示す発明を提供する。
〔１〕活性汚泥を利用した有機性排水の処理系において、前記処理系の活性汚泥中の微生物叢由来の遺伝子情報を可視化して検出する検出手段と、前記検出手段によって得られた遺伝子情報を、前記処理系の運転が活性化状態に有る時と標準状態に有る時の前記活性汚泥中の微生物叢由来の遺伝子情報を夫々可視化して検出し記録したデータと比較して前記処理系の運転状態を判定するモニタリング手段を有する有機性排水の処理方法。
〔２〕前記有機性排水が、し尿及び／又は浄化槽汚泥である。
〔３〕前記遺伝子情報が、前記微生物叢由来のDNAを電気泳動して得られたバンドパターンである。
〔４〕前記バンドパターンが、前記微生物叢由来のDNAを変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法に供することによって得られたものである。
〔５〕前記モニタリング手段によって前記処理系の運転状態が前記標準状態若しくはそれに近づく状態であると判断された時に、前記活性化状態の回復のための制御を行う制御手段を有する。
〔６〕前記制御手段が、前記活性汚泥への腐植、腐植抽出物、フミン酸、フルボ酸、硅砂及び硅石のうちの１つ又は２つ以上の供給である。
【発明の効果】
【０００９】
上記〔１〕の構成によれば、活性汚泥中の微生物叢の変化を遺伝子情報として視覚的に解析しモニタリングすることができる。これによって、活性汚泥中の微生物叢の変遷の確認、優占微生物種等の特定微生物種の比較等を視覚的に行える。したがって、活性汚泥中の微生物叢の変化を簡便かつ迅速に確認することができ、活性汚泥を利用した有機性排水処理系の運転状態をリアルタイムにモニタリングすることができる。かかるモニタリング結果に基づいて、当該処理系の微生物叢の最適化を図れ、処理効率の向上及び処理コストの低減を実現することができる。さらに、上記構成によれば、個別の処理系毎に、運転が活性化状態及び標準状態に有る時の微生物叢の遺伝子情報を取得して記録するものである。そして、かかる遺伝子情報と運転中の活性汚泥の微生物叢の遺伝子情報と比較することから、当該処理系の運転状態を的確に把握することができる。
【００１０】
上記〔２〕の構成によれば、硝化と脱窒による窒素除去等の複雑な微生物叢の生態系を利用するし尿処理施設の安定運転に貢献することができる。
【００１１】
上記〔３〕の構成によれば、活性汚泥中の微生物叢の遺伝子情報をバンドパターンとして可視化して取得できる。これにより、微生物叢の構成を簡便かつ確実に確認することができる。そして、バンドパターンにおいて一本のバンドは１種類の微生物に対応し、バンドの強度は微生物種の菌体量を反映することから、種の優占性等を判断することができる。したがって、経時時間によるバンドパターンを観察することにより、微生物叢の変遷、優占微生物種等の特定微生物種の比較等を視覚的に解析することができる。また、運転が活性化状態及び標準状態に有る時の微生物叢の遺伝子情報との比較もバンドパターンの比較により行うことができることから、簡便かつ迅速に処理系の運転状態を確認でき、当該処理系の最適化を図ることができる。
【００１２】
上記〔４〕の構成によれば、汎用技術である変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法（DGGE）を利用することから、簡便な操作により微生物叢由来の遺伝子情報を取得することができる。
【００１３】
上記〔５〕の構成によれば、上記モニタリング手段の判定結果に基づいて、上記処理系を制御する制御手段を備えることができる。これにより、リアルタイムに微生物叢の変化をモニタリングしながら制御できることから、更なる当該処理系の微生物叢の最適化、並びに処理効率の向上及び処理コストの低減を実現することができる。
【００１４】
上記〔６〕の構成によれば、腐植、腐植抽出物、フミン酸、フルボ酸、硅砂及び硅石のうちの１つ又は２つ以上を供給することにより、上記処理系の制御を行うことができる。これにより、微生物叢の最適化、汚泥の沈降性の改善や悪臭の発生の抑制等を通して当該処理系が好適に制御され、更なる処理効率の向上及び処理コストの低減を実現することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は本発明の方法を適用した高負荷膜分離方式によるし尿処理施設の概略構成の模式図である。（実施例１）
【図２】図２は本発明の方法を適用した高負荷膜分離方式によるし尿処理施設の活性汚泥の固液分離性を確認した結果を示すグラフと活性汚泥の写真である。（実施例２）
【図３】図３は本発明の方法を適用した高負荷膜分離方式によるし尿処理施設の活性汚泥中の微生物叢をDGGEによって解析した結果を示す電気泳動パターンである。（実施例３）
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の有機性排水の処理方法は、活性汚泥を利用した有機性排水の処理系において、前記処理系の活性汚泥中の微生物叢由来の遺伝子情報を可視化して検出する検出手段と、前記検出手段によって得られた遺伝子情報を、前記処理系の運転が活性化状態に有る時と標準状態に有る時の前記活性汚泥中の微生物叢由来の遺伝子情報を夫々可視化して検出し記録したデータベースと比較して前記処理系の運転状態を判定するモニタリング手段を有して構成される。このように構成することにより、活性汚泥中の微生物叢の変化を遺伝子情報として視覚的に解析しモニタリングすることができる。これによって、活性汚泥中の微生物叢の変遷の確認、優占微生物種等の特定微生物種の比較等を視覚的に行える。したがって、活性汚泥中の微生物叢の変化を簡便かつ迅速に確認することができ、前記処理系の運転状態をリアルタイムにモニタリングすることができる。かかるモニタリング結果に基づいて、前記処理系の微生物叢の最適化を図れ、例えば、悪臭の発生や汚泥発生量等を軽減でき、処理効率の向上及び処理コストの低減を実現することができる。さらに、本発明の方法は、個別の処理系毎に、運転が活性化状態及び標準状態に有る時の微生物叢の遺伝子情報を取得して記録するものである。そして、かかる遺伝子情報と運転中の活性汚泥の微生物叢の遺伝子情報と比較することから、運転状態を的確に把握することができる。
【００１７】
有機性排水処理における活性汚泥法とは、汚泥を人為的に有機性排水に加えて、汚泥の構成成分である微生物群の生物分解作用により排水中の有機物等を分解浄化させた後、汚泥を固液分離で除去することにより清浄な水を得るものである。なお、本発明の対象となる有機性排水は有機物を含有する排水のことであり、例えば、し尿、浄化槽汚泥、生活排水、下水、有機系の産業排水等が挙げられる。
【００１８】
活性汚泥法に基づく処理系の基本的構成は、生物処理槽、及び固液分離槽を含む。まず、排水は、流量調整槽等として構成される流量調節手段により下流への流出が量的及び質的に調整される。続いて、排水は生物処理槽に受け入れられ汚泥と混和される。生物処理槽では、汚泥中の微生物群の生物分解作用によって排水中に含まれる有機物が分解処理される。ここで十分な接触時間を保った後、処理水と汚泥との混合物は固液分離槽に導かれる。固液分離槽で汚泥は固液分離され、処理水は必要に応じて消毒等の処理を経て外部に放流される。汚泥は、返送汚泥として生物処理槽に返され、再び有機物分解作業に供される。一方で、増殖した微生物に相当する量の汚泥は余剰汚泥として回収され、適宜処理されるように構成される。
【００１９】
活性汚泥は、細菌類や菌類を主な構成成分とし、原生生物等を含む多種多様な微生物が混在する複合微生物生態系を形成し、有機性排水中に含まれる有機物等の分解に寄与しつつ増殖を続ける。そして、活性汚泥は、土壌、堆肥、汚泥等から集積培養や馴化培養によって取得することができる。
【００２０】
上記処理系に、腐植、腐植抽出物、フミン酸、フルボ酸、硅砂、硅石等のうちの１つ又は２つ以上を充填したリアクターを設置することができる。汚泥の一部をリアクターに導き、上記腐植等により汚泥を改質して生物処理槽に供給するように構成する。活性汚泥に上記腐植等を継続的に添加することで、活性汚泥を構成する微生物叢が変化する。こうして、汚泥の腐敗が抑制され処理系内の汚泥の濃縮性並び沈殿性が改善し悪臭を防除すると共に、汚泥発生量を低減することができる。ここで、腐植とは、動植物および微生物の遺体が土壌中で生物群集により分解を受けて生成したポリフェノール類、キノン類、アミノ化合物が、酵素、微生物の酸化酵素、無機イオン、粘土鉱物などの触媒作用により重縮合し、土壌固有の暗色無定形コロイド状高分子化合物に変化していた物質、及び分解過程にある生物遺体成分であり、土壌性微生物を優先維持できると共に、汚泥の凝集作用や悪臭成分の除去作用等を有する。つまり、上記リアクターの設置により土壌菌群を誘導することができる。
【００２１】
生物処理槽では、有機性排水中に含まれる有機物等を汚泥中の微生物の生物活性作用により分解する。生物処理槽には、排水と汚泥を混合するための攪拌手段、活性汚泥を好気的雰囲気に調整するための曝気装置等の酸素供給手段、嫌気的条件に調整するための空気遮断手段等を含んで構成される。し尿処理を行う場合には、し尿には、BODの他に、アンモニア性窒素、有機性窒素等の窒素を含む化合物を大量に含んでいることから、汚泥中の硝酸菌と脱窒菌の２系統の微生物を利用した硝化脱窒反応が進行するように生物処理槽を構成する。例えば、深層反応槽として構成される硝化槽および脱窒槽を設けることができる。そして、硝化槽を好気的雰囲気下で硝酸菌及び亜硝酸菌によりアンモニア性窒素を酸化して硝酸を生成すると共にBODを酸化分解するように構成し、脱窒槽を嫌気的雰囲気下で硝化槽にて生じた硝酸を脱窒菌系微生物によって還元するように構成することができ、硝化槽と脱窒素の間は硝酸が硝化液として循環する手段を設ける。これにより、し尿中の総窒素、BOD及びCOD等を除去することができる。
【００２２】
固液分離槽では、前段の生物処理槽において生物分解処理された処理水を活性汚泥と分離する。固液分離槽は、生物処理槽内の汚泥と処理水の混合液を静置させ、汚泥をフロックとして沈降させて固液分離するように構成しても、精密ろ過膜を設置して汚泥と処理水の混合物をろ過することにより固液分離するように構成してもよい。精密ろ過膜としては、例えば孔径0.1〜0.4μmの微細な孔を有する中空糸膜や平膜を使用することができ、数十〜数百枚（数百〜数千本）の膜を組み合わせて膜ユニットとして構成することが好ましい。ろ過膜は、固液分離槽として設置する他、生物処理槽内に設置してもよく、浸漬膜方式、外部膜分離方式等は特に問わない。
【００２３】
本発明は、上記のように構成された処理系の生物処理槽から汚泥を採取し、汚泥を構成する微生物由来の遺伝子情報を可視化して検出することにより取得するものである。遺伝子情報の解析に先立って、DNAを顕在化せしめることを目的として、公知の核酸抽出等を行った後に適用することが好ましい。例えば、汚泥から遠心分離等の方法により微生物群を分離した後、SDS等の界面活性剤処理、リゾチーム及びプロテインナーゼ等の酵素処理、熱処理、超音波処理、カオトロピック塩での処理等、或いはこれらの組み合わせにより微生物の細胞等を破壊し、DNAを単離することが例示できる。
【００２４】
遺伝子情報を可視化して検出する検出手段は、微生物叢由来のDNAの遺伝子情報を可視化して検出できる手段であれば特に制限はない。例えば、電気泳動装置を利用してバンドパターンとして微生物叢の状態を可視化することにより行うことができる。電気泳動結果は活性汚泥を構成する微生物叢の構成により変化するため、バンドパターンにより微生物叢の構成を確認することができる。そして、バンドパターンにおいて一本のバンドは１種類の微生物に対応し、バンドの強度は微生物種の菌体量を反映することから、種の優占性等を判断することができる。したがって、経時時間によるバンドパターンを観察することにより、微生物叢の変遷、優占微生物種等の特定微生物種の比較等を視覚的に解析することができる。また、運転が活性化状態及び標準状態に有る時の微生物叢の遺伝子情報との比較も視覚的に行うことができることから、簡便かつ迅速に処理系の運転状態を確認でき、処理系の最適化を図ることができる。
【００２５】
具体的な遺伝子情報を可視化して検出する検出手段としては、例えば、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法（Denaturing Gradient Gel Electrophoresis：DGGE）、温度勾配ゲル電気泳動法（Temperature Gradient Gel Electrophoresis：TGGE）、末端蛍光修飾制限酵素断片多型分析法（Terminal-Restriction Fragment Length Polymorphism：T-RFLP）を利用することができる。DGGEは、変性剤に対する二本鎖DNAの安定性の相違に基づいて、DNAを分離する電気泳動法である。二本鎖DNAの変性剤に対する安定性は塩基配列に依存するので、例え分子量及び電荷が同じであっても塩基配列の相違に従って二本鎖DNAを分離することができる。TGGEは、熱安定性に対する二本鎖DNAの安定性の相違に基づいてDNAを分離する電気泳動法であり、温度上昇に伴う二本鎖DNAの熱変性過程を利用する。T-RFLPは、DNAの特定の塩基配列部位を切断する性質を持つ制限酵素を利用するものであり、適切な制限酵素を用いることにより、塩基配列の相違に基づいてDNAを異なる長さの断片として分離するものである。
【００２６】
DGGEを用いて汚泥中の微生物叢の遺伝子解析を行う場合には、例えば、汚泥から抽出したDNAをPCR等の核酸増幅技術を用いて増幅させる。増幅に用いるプライマーの一方にはGC塩基の含量に富んだ配列（GCクランプ）を含むように設計される。これにより、増幅断片の片側の末端部分にはGCクランプが付加される。そして、増幅断片を変性剤の濃度勾配をもたせたゲル中で電気泳動を行う。濃度勾配は進行方向に対して平行であっても垂直であってもよいが、好ましくは、電気泳動の進行方向に向かって変性剤濃度が高くなるように調製した変性剤濃度勾配ゲル中で電気泳動を行う。変性剤としては二本鎖DNAの一部分を解離できる限り特に制限はないが、尿素やホルムアミドやこれらの組み合わせを好適に利用することができ、ゲルとしてはポリアクリルアミドゲルを好適に利用することができる。ゲル上の一定位置で二本鎖DNAの水素結合の一部が解離し、一方でGCクランプ部分は結合力が強いため二本鎖を維持するため、部分的に一部が解離した形態になる。部分的に一部が解離すると抵抗の増加によりゲル内を泳動する速度が落ちる。二本鎖DNAの塩基配列により部分解離する変性剤濃度が異なるため泳動度によって二本鎖DNAを塩基配列に基づいて分離することができる。詳細には、二本鎖DNAのG-C間結合は、A-T間結合よりも強いことから、二本鎖DNAのGC含量、つまり塩基配列の相違に基づいてゲル上の移動度に差が生じバンドとして各微生物由来のDNAを分離することができる。なお、試薬、ゲルの作成手順、試料のアプライ量、電気泳動、染色、及び検出は、常法に従って行うことできる。
【００２７】
プライマーは、細菌や真菌といった幅広い微生物群が共通して保有する遺伝子を標的とするユニバーサルプライマーとして設計することができ、若しくは、特定の微生物群、例えば属及び種レベルで標的とするように設計することもできる。特に、16S rRNA遺伝子や18S rRNA遺伝子等のリボソームRNA遺伝子を標的とすることが好ましい。リボソームRNA遺伝子は、全ての微生物に普遍的に保存された保存領域と、種特異的に変異した配列を含む可変領域を有する。したがって、微生物群集を幅広く検出したい場合、特定の微生物種に焦点を合わせて検出したい場合等、目的に応じて標的領域を設定することができる。
【００２８】
増幅の標的領域が定まったならば、当該領域を増幅するため当該領域に相補的な配列を含むようにプライマーを設計する。プライマーの設計は、例えばプライマー設計支援ソフト等を利用して設計することもできる。そして、プライマーは、常法に基づいて調製することができる。例えば、ホスホアミダイト法等に用いた固相合成により化学合成することができ、市販の自動核酸合成装置により自動的に合成することも可能である。合成後のプライマーは、必要に応じてHPLC等の公知の方法により精製される。また市販のプライマーを目的に応じて選択し使用してもよい。このようなプライマーとしては、標的となる核酸分子の塩基配列に基づき、所望の増幅領域を挟んで設計され、10以上、好ましくは15以上、更に好ましくは約20〜50の塩基からなるオリゴヌクレオチドが例示される。そして、DGGEのためのプライマーは上述の通り一方にGCクランプ配列が付加される。
【００２９】
ここで、相補的とは、プライマーと標的核酸分子とが塩基対合則に従って特異的に結合し安定な二重鎖構造を形成できることを意味する。ここで、完全な相補性のみならず、プライマーと標的核酸分子が互いに安定な二重鎖構造を形成し得るのに十分である限り、いくつかの核酸塩基のみが塩基対合則に沿って適合する部分的な相補性であっても許容される。その塩基数は、標的核酸分子を特異的に認識するために十分に長くなければならないが、長すぎると逆に非特異的反応を誘発するので好ましくない。したがって、適当な長さはGC含量等の標的核酸の配列情報、並びに、反応温度、反応液中の塩濃度等の増幅反応条件など多くの因子に依存して決定される
【００３０】
ここで、処理系の運転が活性化状態に有る時とは、活性汚泥中の微生物叢が有用微生物種の優占状態にあり、生物処理によってBOD、窒素化合物等が効果的に除去されている状態にあることを意味する。例えば、汚泥の固液分離性を確認することにより活性化状態にあるか否かを判断することができ、処理後の汚泥の濃縮性が向上し良好に沈降する場合には、当該処理系の運転は活性化状態にあると判断することができる。固液分離性は、SV60、SV30等の活性汚泥沈殿率、SVI等の汚泥容量指標等を求めることにより確認することができる。そして、汚泥のフロックの大きさを観察することによっても活性化状態にあるか否かを判断することができ、大きなフロックの形成が確認された場合には汚泥の凝集性及び濃縮性が向上しているとして活性化状態にあると判断することができる。また、余剰汚泥の発生量、悪臭の発生や処理水の透明性等を確認することによっても活性化状態にあるか否かを判断することができ、この場合には余剰汚泥の発生量の低減、悪臭の発生の抑制、処理水の透明度の向上をもって活性化状態にあると判断する。
【００３１】
標準状態とは、活性化状態に比べ活性汚泥中の微生物叢の有用微生物が減衰した状態あることを意味する。活性化状態の判断と同様にして、標準状態にあるか否かを判断することができる。例えば、汚泥の固液分離性、フロックの大きさ、余剰汚泥の発生量、悪臭の発生や処理水の透明性等を確認することによって標準状態にあるか否かを判断することができる。したがって、固液分離性の低下、フロック形成能の低下、余剰汚泥の発生量の増加、悪臭の発生、処理水の透明度の低下等をもって標準状態にあると判断する。
【００３２】
そして、活性化状態に有る時の遺伝子情報、及び標準状態に有る時の遺伝子情報は、個別の処理系毎に取得する。各処理系は、その処理対象物、処理条件、使用する活性汚泥等に応じて微生物叢の構成は異なる。したがって、活性化状態及び標準状態に有る時の汚泥の微生物叢の構成は個別の処理系毎に異なることから、その遺伝子情報も個別の処理系毎に異なる。そのため個別の処理系毎に遺伝子情報を取得することにより、処理系毎に適切な運転状態を制御することができる。
【００３３】
処理系の運転中の汚泥から採取した微生物叢の遺伝子情報と、活性化状態及び標準状態に有る時の汚泥の微生物叢の遺伝子情報を比較することにより、処理系の運転が活性化状態にあるのか、標準状態にあるのか、若しくは何れの状態に近づきつつあるのか等、処理系の運転状態をリアルタイムにモニタリングすることができる。そして、検索及び比較等の容易化のために、取得した遺伝子情報を記録したデータをデータベース等として管理してもよい。
【００３４】
さらに、本発明の有機性排水の処理方法は、上記モニタリング手段の判定結果に基づき、当該処理系を制御する制御手段を備える。運転状態が前記標準状態若しくはそれに近づく状態であると判断された時に、活性化状態へ回復のための制御を行う。例えば、腐植、腐植抽出物、フミン酸、フルボ酸、硅砂、硅石等のうちの１つ又は２つ以上を添加することにより制御を行うことができる。リアルタイムに微生物叢の変化を確認しながら制御できることから、上記腐植等の添加のタイミング及び添加量の最適化を図ることができる。また、返送汚泥の量の調節、有用微生物の添加、好気的雰囲気、嫌気的雰囲気を初めとした処理条件の最適化等、活性化状態に有る時の汚泥の微生物叢を維持するように制御を行うことができる。これにより、更なる処理系の微生物叢の最適化、並びに処理効率の向上及び処理コストの低減を実現することができる。
【実施例】
【００３５】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、これらの実施例は本発明を限定するものではない。ここでは、一例として、高負荷膜分離方式によるし尿処理施設に本発明の方法を適用した場合の実施態様を示す。
【００３６】
（実施例１）
本実施例では、本発明の方法を適用した高負荷膜分離方式によるし尿処理施設について説明する。図１は、高負荷膜分離方式によるし尿処理施設の概略構成の模式図である。脱窒槽１、硝化槽２、膜原水槽３、４、膜ユニット槽５、混和槽６、凝集槽７、凝集沈殿槽８、返送汚泥槽９、汚泥調質槽１０、汚泥貯留槽１１を備える。脱窒槽１、硝化槽２、膜原水槽３、４が活性汚泥による生物分解処理が施される生物処理系統となる。
【００３７】
処理対象であるし尿及び／又は浄化槽汚泥は、流量調節槽等により流入量が質及び量的に調整されながら生物処理系統に流入する。まず、脱窒槽１に流入し、脱窒槽１では、脱窒菌が、し尿、浄化槽汚泥を電子供与体として硝化槽２で生成された硝酸を嫌気的雰囲気下において窒素に還元する。そして、硝化槽２では、し尿及び／又は浄化槽汚泥中のアンモニアを硝酸菌により好気的雰囲気下において硝酸に変換する。そして、硝化槽２と脱窒槽１との間を硝酸は硝化液として循環するように構成されており、し尿及び／又は浄化槽汚泥中の有機物（BOD）を二酸化炭素まで分解する。なお、脱窒槽１と硝化槽２は深層反応槽として構成される。脱窒槽１及び硝化槽２の下流に設けられた膜原水槽３では、硝化槽２で処理しきれず残存したアンモニアがあれば、好気的雰囲気下で硝化細菌により硝酸に変換する。膜原水槽４では、脱窒槽１で処理しきれず残存した硝酸があれば、嫌気的雰囲気下で窒素に還元する。その際、電子供与体としてメタノール等を添加する。このようにして、脱窒槽１、硝化槽２及び膜原水槽３、４では、し尿に含まれる有機物及び窒素化合物が生物学的分解される。詳細には脱窒槽１及び硝化槽２ではBOD及び窒素化合物で90％、膜原水槽３、４では残りの10％が分解除去される。そして、分解処理された処理水は汚泥と共に膜ユニット槽５に送られる。膜ユニット槽５では、処理水と汚泥とを平膜により固液分離すると共に、前段で生成された窒素を脱気する。
【００３８】
そして、膜ユニット槽５で固液分離された膜透過液は混和槽６に送られる。混和槽６では、強攪拌雰囲気でポリ硫酸第二鉄を添加し、マイナスに帯電、分散しているコロイダル状の混濁物質の表面荷電を中和し凝結させる。続いて、下流に設置された凝集槽７では、弱攪拌雰囲気で高分子凝集剤を添加し、混和槽６で発生したプラスに帯電した微細状の凝結汚泥に対し、表面荷電を中和すると共に架橋吸着作用にて微細粒子汚泥を凝集させて粗大フロックを作る。そして、凝集沈殿槽８では、生物処理しきれなかったCOD、リンを凝集剤により凝集汚泥化させ、凝集汚泥を膜透過液（処理水）から除去する。そして、凝集汚泥化後の上澄みについて、前段で凝集沈殿処理しきれなかったCOD及び色度等を活性炭により除去する。続いて、処理水の消毒を行い施設外の河川等に放流する。
【００３９】
膜ユニット槽５で固液分離された濃縮汚泥は返送汚泥槽９に送られる。そこで、濃縮汚泥の一部は返送汚泥として、前段の生物処理系統で生物分解処理が効率的に進行可能な汚泥濃度を維持するため脱窒槽１に返送される。一方、前段の生物処理系統で増殖した汚泥の内、上記濃度維持のため必要な汚泥を超える量の汚泥は余剰汚泥とされ汚泥調質槽１０に送られる。汚泥調質槽１０では余剰汚泥を散気することで減容する。つまり、汚泥が好気性消化により自己分解する。続いて、下流の汚泥貯留槽１１は、余剰汚泥を後段の脱水機に投入するためのポンプ槽である。続いて、余剰汚泥を脱水機で脱水し、その後、乾燥し有機肥料等として再利用することができる。
【００４０】
実施例１のし尿処理施設に、2011年11月2日に誘導剤として腐植及び硅石を添加して有用微生物の優先化を図った。そして、2012年3月15日に腐植及び硅石を充填したリアクターを膜ユニット槽に設置した。当該リアクターから腐植及び硅石が継続的に処理系統内に添加され、このようにして有用微生物の優先維持を図った。
【００４１】
実施例２．固液分離性の改善
本実施例では、実施例１のし尿処理施設に誘導剤として腐植及び硅石を添加した後の誘導期間中の汚泥の沈降性の変化を観察した。
【００４２】
＜手順＞
実施例１の尿処理施設の膜原水槽４の汚泥を採取し、汚泥の沈降性の変化を観察した。
１Lのガラス製メスシリンダーに上記汚泥を1,000mL添加し、60分後の汚泥界面の数値を読み取り、その数値を10で割った数値をSV60とした。なお、観察期間中の汚泥濃度は概ね10,000mg/Lであった。
【００４３】
＜結果＞
結果を図２に示す。図２中のグラフは汚泥のSV60値の経時的変化を示し、写真は各日時における汚泥の拡大写真（×40）である。2011年11月2日の誘導剤投入直後は、汚泥のフロックが小さくSV60値も高く沈降性は良くなかった。同年11月24日の汚泥のSV60値及び形態は誘導剤投入直後と同程度であり沈降性は良くなかった。誘導剤投入約１ヶ月後からSV60値が低下し汚泥の沈降性が向上し、同年12月8日頃にはSV60値は70％ほどになった。同年12月26日に汚泥を観察したところ大きなフロックを少し確認できた。その後、2012年2月1日頃にSV60値が誘導剤投入直後と同程度に戻った。そして、同年3月15日のリアクター設置後、汚泥の沈降性が再び改善し始め、その後はSV60値が50％以下になる等、汚泥は良好な沈殿性を維持し続けた。リアクターの設置約２ヵ月後の同年5月17日の汚泥を観察したところ大きなフロックを確認できた。
【００４４】
実施例３．活性汚泥の微生物叢解析
本実施例では、実施例１のし尿処理施設に誘導剤として腐食及び硅石を添加した後の誘導期間中の汚泥の微生物叢の変化を解析した。解析手段としてPCR-DGGEを用い、汚泥に含まれる微生物（細菌）のバンドパターンの解析を行った。PCR-DGGEにより得られたバンドパターンにおいて一本のバンドは1種類の微生物に対応しており、バンドの強度は種の優占性を示し、バンドパターンは試料中の微生物叢の構成を示している。以下に本実験に用いる手法並びに条件、用いる製品等を示す。
【００４５】
＜１＞DNA抽出
＜１＞−1.   UltraClean（登録商標） Microbial DNA Isolation Kitを用いたDNA抽出
＜１＞−１−１．使用試薬
DNA抽出キット(MO BIO製 UltraClean（登録商標） Microbial DNA Isolation Kit)
【００４６】
＜１＞−１−２．使用機器
（ａ）遠心機
遠心力10000×g以上の出力、及び冷却能力を有する遠心機
（ｂ）Vortexミキサー
【００４７】
＜１＞−１−３．手順
（ａ）2mLマイクロチューブ（DNA抽出キット内）に1.8mLの実施例１のし尿処理施設の膜原水槽４から採取した汚泥を加え、10000×gで30秒間、常温で遠心した。上清を捨てた後、再度10000×gで30秒間、常温で遠心して沈殿を得た。なお、上清を捨てる際には、ピペットマンを用いた。
（ｂ）沈殿にMicroBeadSolution(MBS)を300μL加え、緩やかにVortexし撹拌した。続いて、これをMicroBeadTubeに全量移した。
（ｃ）MicroBeadTubeに試薬MD1を50μL加えた。なお、試薬MD1に沈殿が認められた場合には、60℃で沈殿を溶してから添加した。
（ｄ）MicroBeadTubeを最大出力で10分間Vortexした。
（ｅ）MicroBeadTubeが遠心機に対応できるかを確かめ、10000×gで30秒間、常温で遠心して上清を得た。なお、MicroBeadTubeが破損する可能性があるので10000×g以上の遠心力にしないように配慮した。
（ｆ）上清を2mLマイクロチューブに移した（約300〜350μL程度）。
（ｇ）マイクロチューブに試薬MD2を100μL加え、5秒間Vortexした後、ヒートブロックにて4℃で5分間培養した。
（ｈ) 10000×gで1分間、常温で遠心した。
（ｉ）沈殿物を避けながら上清の全量を2mLマイクロチューブに移した(約450μL程度
)。
（ｊ）マイクロチューブに、試薬MD3を900μL加え5秒間Vortexした。なお、使用前に試薬MD3を振って混和させてから使用した。
（ｋ)前記工程（ｊ）の試料の700μLをSpinFilterに分注し、10000×gで30秒間、常温で遠心し、遠心後の流下液を捨てた。残りの試料を同様の操作でSpinFilterに分注、遠心し、流下液を捨てた。
（ｌ）更に、試薬MD4を300μL加え、10000×gで30秒間、常温で遠心し、遠心後の流下液を捨てた。
（ｍ）液の吹きこぼれに留意しながらSpinFilterを新しい2mLマイクロチューブにセットした。
（ｎ）SpinFilterのフィルター中心に試薬MD5を50μL加え、10000×gで30秒間、常温で遠心し、DNA抽出液を流下させた。なお、フィルターは廃棄した。
（ｏ）得られたDNA抽出液は使用まで-30℃で冷却保存した。
【００４８】
＜２＞PCR
＜２＞−１．使用試薬
（ａ）PCR mix(日本ジーン製  GENE RED PCR mix)
（ｂ）BSA(20mg/mL)（TaKaRa製  Bovine Serum Albumin溶液)
なお、BSAは、汚泥中に含まれる腐食成分によるPCR阻害を防ぐために添加した。
（ｃ）Template DNAとしては、上記＜１＞の「DNAの抽出」の項で得たDNAを使用した。
（ｄ）滅菌蒸留水
【００４９】
＜２＞−２．プライマー
（ａ）細菌の場合
F984GC(10μM)、R1378(10μM)を用いた。このプライマーは、細菌の16S rRNA遺伝子V6-8可変領域を標的として設計されたものである。なお、プライマーの配列情報は表１に要約した。
【００５０】
【表１】
2014121692.tif 000002
【００５１】
＜２＞−３．使用機器
サーマルサイクラー(ＡＢＩ製  GeneAmp（登録商標）PCRシステム9700)
【００５２】
＜２＞−４．手順
全工程に亘り、手袋を着用して行った。
（ａ）0.2mLチューブに表２の通りに試薬を添加した。なお、DNAの増幅効率が悪い場合にはTemplate DNAの添加量を適宜調節することができる。また、ネガティブコントロールはTemplate DNAを添加せず、同容量の滅菌蒸留水を添加することにより調製した。
（ｂ）サーマルサイクラーを起動し、ヒートブロックに0.2mLチューブをセットした。
（ｃ）サーマルサイクラーを以下の反応サイクルに設定し、PCRを行なった。反応サイクルは、以下の通りである。
細菌  ：94℃-2分間→[94℃-15秒間、55℃-30秒間、68℃-30秒間]×34
【００５３】
【表２】
2014121692.tif 000003
【００５４】
＜３＞DGGE
＜３＞−１．使用機器
（ａ）DCodeシステム(BIORAD製)
（ｂ）パワーサプライ
【００５５】
＜３＞−２．手順
（ａ）ゲル作成条件
（ａ）−１．ゲル濃度を６%、変性剤濃度勾配を50→70%に設定した。
（ａ）−２．固化時間を、室温３時間に設定した。
【００５６】
（ｂ）電気泳動及び染色条件
（ｂ）−１．ゲルへのアプライ量は5μLとした。
（ｂ）−２．泳動電圧は50V、泳動温度は58℃、泳動時間は18時間に設定した。
（ｂ）−３．電気泳動後、SYBR GOLD（20分）で染色した後、１０分間洗浄した。
（ｂ）−４．マーカーとしては、DGGE Marker III（ニッポンジーン製）を使用した。
（ｂ）−５．他所で実施された土壌微生物活性化法（ASB）(商標登録出願中）で実施したし尿処理施設から採取された汚泥についても同様に微生物叢の解析を行った。ここで、土壌微生物活性化法（ASB）は、標準活性汚泥法に土壌微生物群の生物活性による処理を付加した方法であり、処理系内に設置されたリアクターで土壌菌群を誘導、培養することにより、有機物の分解及び浄化を行う方法である。
【００５７】
＜４＞結果
結果を図３に示す。レーン１は2011年11月1日、レーン２は同年11月5日、レーン３は同年12月8日、レーン4は2012年2月1日、レーン5は同年2月21日、レーン６は同年3月28日、レーン７は土壌微生物活性化法（ASB）施設、Ｍは分子量マーカーの電気泳動結果を示す。誘導直後の2011年11月1日及び同年11月5日のバンドパターンは類似しており（レーン１、２）、また優占微生物種も同一であった（レーン１、２の丸囲み）。この微生物種は本実験のし尿処理施設特有の微生物であり、上述の土壌微生物活性化法（ASB）施設では当該微生物種は確認できなった（レーン７）。しかし、同年12月8日のバンドパターンは誘導直後とは微生物叢が変化し（レーン３とレーン１、２の比較）、優占微生物も変化したことが確認された（レーン３の丸囲み）。そして、この微生物種は、上述の土壌微生物活性化法（ASB）施設でも確認された（レーン７の丸囲み、下方）。2012年2月1日及び同年2月21日で確認されたバンドパターンは誘導直後と類似しており（レーン４、５とレーン１、２の比較）、微生物叢が元に戻ったことが確認できた。また、誘導直後に確認された本実験のし尿処理施設特有の微生物も確認された（レーン４、５の丸囲み）。その後、同年3月15日のリアクター設置の２週間後の同年3月28日のバンドパターンから、微生物叢が変化し、さらに優占微生物も変化していることが判明した（レーン６とレーン１〜５の比較）。そしてこの優占微生物種は上述の土壌微生物活性化法（ASB）施設でも確認されたものである（レーン７の丸囲み、常法）。2011年12月8日及び2012年3月28日に確認された優占微生物種は、もともとの活性汚泥中には極微量しか生息していなかったものが、腐植の添加により優占化したものと考えられる。上述の土壌微生物活性化法（ASB）施設でも確認されていることから、し尿処理過程において有用な微生物種である可能性があり、このような有用な知見を本発明の方法により遺伝子情報を可視化できたことから簡便かつ迅速に確認することができた。
【００５８】
次に、本実施例３の結果と実施例２の結果とを考察したところ、本発明の方法によって解析された可視化された遺伝子情報に基づいて、微生物叢の変化と汚泥の沈降性の相関を明らかにすることができた。例えば、実施例３において、誘導直後の微生物叢とは変化したことが確認された2011年12月８日の汚泥が、実施例２によって示されるように良好な沈降性を示す。また、同様に誘導直後の微生物叢とは変化したことが確認された2012年3月28日の汚泥が、実施例２によって示されるように良好な沈降性を示す。また、実施例３において微生物叢が類似すると判断された2011年11月1日及び同年11月5日、2012年2月1日及び2月21の汚泥の沈降性は類似したものであった。したがって、汚泥中の微生物叢の変化を追跡することにより、汚泥の状態や優占微生物種を的確に把握することができることが判明した。
【００５９】
このようにして、本発明の方法により、し尿処理施設の運転状態を的確に判断することができる。具体的には、2011年12月８日（レーン３）及び2012年3月28日（レーン６）が活性化状態にあり、その他の時点（レーン１〜２、４〜５）は標準状態にあると判断することができる。これを裏付けるため、種々の指標により運転状態を評価した結果を表３に示す。表３中、効果１のSV60（％）は、実施例２の記載に基づいて算出した。効果２の余剰汚泥発生量は、本施設に投入したし尿、浄化槽汚泥１kL当たりの余剰汚泥発生量であり乾燥重量により算出した。効果３、４は、夫々消泡剤及び次亜塩素酸ソーダの使用量を示した。
【００６０】
【表３】
2014121692.tif 000004
【００６１】
表３の結果より、DGGEにおいて活性化状態で有ると判断された場合には、汚泥の固液分離性が良好であり、余剰汚泥や泡の発生量及び臭気が低減し、良好な運転状態であることが理解できる。したがって、本発明の方法によりし尿処理施設の運転状態を的確に判断できることが、かかる結果によっても裏付けられた。
【産業上の利用可能性】
【００６２】
本発明の方法は、し尿処理施設等の有機性排水の処理方法が要求される全ての技術分野において利用可能である。
【符号の説明】
【００６３】
１  脱窒槽
２  硝化槽
３  膜原水槽
４  膜原水槽
５  膜ユニット槽
６  混和槽
７  凝集槽
８  凝集沈殿槽
９  返送汚泥槽
１０  汚泥調質槽
１１  汚泥貯留槽
【図１】
2014121692.tif 000005
【図２】
2014121692.tif 000006
【図３】
2014121692.tif 000007
【配列表】
2014121692000001.app