(57)【要約】【課題】短時間で特異的にＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅとＣ．ｐｓｉｔｔａｃｉを同時に検出できる方法を見出すこと。【解決手段】試料中のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅとＣ．ｐｓｉｔｔａｃｉをそれぞれ、あるいは、同時に検出する方法であって、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅとＣ．ｐｓｉｔｔａｃｉのＯＭＰ領域を特定のオリゴヌクレオチドプライマーと特定のオリゴヌクレオチドプローブとを用いて迅速に検出する方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよび／またはＣ．ｐｓｉｔｔａｃｉを検出する方法であって、以下の（Ａ）に示す工程により試料中のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよび／またはＣ．ｐｓｉｔｔａｃｉ由来の核酸を検出する手段を含むことを特徴とする、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよび／またはＣ．ｐｓｉｔｔａｃｉ検出方法。
（Ａ）
（１）配列番号１と９５％以上相同な塩基配列で示される核酸配列のうち一部領域を核酸増幅するための核酸プライマー対であって、以下の（Ｉ）または（ＩＩ）のいずれか１つ以上に該当する核酸プライマー対を用意する工程。
（Ｉ）フォワードプライマーが、配列番号２で示される塩基配列のうち１６塩基以上２５塩基以下の塩基配列からなる核酸プライマーである。
（ＩＩ）リバースプライマーが、配列番号３で示される塩基配列のうち１６塩基以上２３塩基以下の塩基配列からなる核酸プライマーである。
（２）被検核酸および核酸プライマー対を含む反応液によって、被検核酸を増幅する工程。
（３）工程（２）によって得られた核酸増幅産物と、該核酸増幅産物の一部と複合体を形成せしめるように設計された核酸プローブとをハイブリダイズさせ複合体を形成せしめる工程。
（４）工程（３）で得られた複合体を検出する工程。
【請求項２】
請求項１に記載のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよび／またはＣ．ｐｓｉｔｔａｃｉの検出方法において、工程（Ａ）（Ｉ）に記載のフォワードプライマーが配列番号４、５のいずれかで示される塩基配列である、請求項１に記載のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよび／またはＣ．ｐｓｉｔｔａｃｉの検出方法。
【請求項３】
請求項１に記載のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよび／またはＣ．ｐｓｉｔｔａｃｉの検出方法において、工程（Ａ）（ＩＩ）に記載のリバースプライマーが配列番号６、７のいずれかで示される塩基配列である、請求項１に記載のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよび／またはＣ．ｐｓｉｔｔａｃｉの検出方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよび／またはＣ．ｐｓｉｔｔａｃｉの検出方法において、工程（Ａ）に記載の核酸プローブが、配列番号８、９のいずれかに示される塩基配列である、請求項１〜３のいずれかに記載のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよび／またはＣ．ｐｓｉｔｔａｃｉの検出方法。
【請求項５】
請求項１に記載のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよび／またはＣ．ｐｓｉｔｔａｃｉの検出方法において、工程（Ａ）（Ｉ）に記載のフォワードプライマーが配列番号４で示される塩基配列であり、工程（Ａ）（ＩＩ）に記載のリバースプライマーが配列番号６で示される塩基配列であり、かつ、工程（Ａ）に記載の核酸プローブが、配列番号８に示される塩基配列である、請求項１に記載のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよび／またはＣ．ｐｓｉｔｔａｃｉの検出方法。
【請求項６】
請求項１に記載のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよび／またはＣ．ｐｓｉｔｔａｃｉの検出方法において、工程（Ａ）（Ｉ）に記載のフォワードプライマーが配列番号５で示される塩基配列であり、工程（Ａ）（ＩＩ）に記載のリバースプライマーが配列番号７で示される塩基配列であり、かつ、工程（Ａ）に記載の核酸プローブが、配列番号９に示される塩基配列である、請求項１に記載のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよび／またはＣ．ｐｓｉｔｔａｃｉの検出方法。
【請求項７】
請求項４〜６のいずれかに記載の核酸プローブが、末端のシトシンのうち少なくとも一つが蛍光色素で標識されている核酸プローブを用いることを特徴とするＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよび／またはＣ．ｐｓｉｔｔａｃｉの検出方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかに記載のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよび／またはＣ．ｐｓｉｔｔａｃｉの検出方法において、核酸増幅を、α型ＤＮＡポリメラーゼ、および、α型ＤＮＡポリメラーゼを変異させた変異型、のうち１つ以上を含む系で行うことを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよび／またはＣ．ｐｓｉｔｔａｃｉの検出方法。
【請求項９】
配列番号２で示される塩基配列のうち１６塩基以上２５塩基以下の塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号３で示される塩基配列のうち１６塩基以上２３塩基以下の塩基配列からなるリバースプライマーとからなる、１対のプライマー。
【請求項１０】
配列番号４、５のいずれかで示される塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号６、７のいずれかで示される塩基配列からなるリバースプライマーとからなる、［９］に記載の、１対のプライマー。
【請求項１１】
配列番号８、９のいずれかで示される塩基配列からなる、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよび／またはＣ．ｐｓｉｔｔａｃｉを検出するためのプローブ。
【請求項１２】
請求項９または１０に示される一対のプライマーと、請求項１１に示されるプローブとを組み合わせてなる、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよび／またはＣ．ｐｓｉｔｔａｃｉ検出用のプライマー・プローブのセット。
【請求項１３】
請求項７〜１２のいずれかに記載のプライマー対、プローブまたはプライマー・プローブのセットを含む、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよび／またはＣ．ｐｓｉｔｔａｃｉ検出キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は，クラミドフィラ・ニューモニエ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）および／またはクラミドフィラ・シッタシ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ  ｐｓｉｔｔａｃｉ）を分類して検出する分野に関する。（以下、クラミドフィラ属をＣ．と略称することもある。）
【背景技術】
【０００２】
クラミジア属の三つの種はヒト宿主に感染し、疾患を起こしうることから臨床的に重要である。クラミジア・トラコマチス（Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）は先進社会で最も一般的な性的伝染病であると報告されており、男女両性で性器感染症を引き起こす。クラミドフィラ・シッタシ（Ｃ．ｐｓｉｔｔａｃｉ）は種々の呼吸器感染症の原因となる。最も新しく特性化された臨床的に重要なクラミジア属の一つはクラミドフィラ・ニューモニエ（Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）であり、これも呼吸器感染症の原因となり、冠動脈疾患とも関連している。おそらく、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅはかなり最近になって特性化されたためであると思われるが、試験試料中のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅを検出するための主な方法には、培養物からの菌の単離や血清学的試験が含まれる。単離には、組織培養細胞中で菌を増殖させて封入体を形成させ、次いで、標識した種特異性抗体を使用して蛍光染色することにより封入体を検出することが含まれる。血清学的検査には、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの感染が疑われる個体から採取した試料が二つ必要である。この理由は、かなりの数の個体がＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに対する抗体を有しており、最近のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ感染症の指標としてＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに対する抗体価の上昇または抗体クラス（例えば、ＩｇＭまたはＩｇＧ）の変化を測定するからである。抗体価の上昇または抗体クラスの変化を測定するためには、急性期および回復期の血清試料を採取する。残念ながら、これらの試料は数週間または数カ月もの間隔で採取することが多い。そのため、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ感染症の検出には時間がかかる。従って、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅを特異的に、そして適時に検出できる方法および試薬が必要とされている。
【０００３】
Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅを検出するＰＣＲシステムは、汚染、抑制剤、特異性およびアッセイの複雑さなどの点でまだ改善の余地が大きい。その結果、大抵の肺炎診断は、経験的になされる。定められた処置は、一般に、肺炎連鎖球菌を標的とするＢラクタム抗生物質である。大抵の肺炎はＢラクタム抗生物質に対して反応するが、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのような変種の肺炎は反応せず、代わりにマクロライドによる処置を必要とする。その結果、経験的な診断は、不適切な抗生物質処置に導き、薬剤抵抗性および医療コストを高めるとともに疾患を悪化させることになる。したがって、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ感染を迅速に診断できる感受性のよい特異的なテストを求めるニーズが存在する。
これまで肺炎クラミジアのＤＮＡマイクロアレイを作製し、肺炎クラミジア遺伝子の発現プロファイルを検出する方法（特許文献１）、ハイブリダイゼーションアッセイと増幅に基づくアッセイ（特許文献２）が１時間以内にＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅとＣ．ｐｓｉｔｔａｃｉを同時に検出できる方法は報告されていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００３−３１０２５７
【特許文献２】特表２０００−５１１７７７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本願発明が解決しようとする課題は、短時間で特異的にＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよび／またはＣ．ｐｓｉｔｔａｃｉを検出できる方法を見出すことである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは上記課題に鑑み鋭意検討した結果、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅとＣ．ｐｓｉｔｔａｃｉのＯＭＰ領域を特異的に増幅する特定のオリゴヌクレオチドプライマー、および、該オリゴヌクレオチドプライマーを用いた核酸増幅法によって増幅される領域を特異的に検出する特定のオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより、短時間で特異的にＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅとＣ．ｐｓｉｔｔａｃｉをそれぞれ、あるいは、同時に検出できることを見出し、本発明を完成させるに至った。すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
【０００７】
［１］試料中のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよび／またはＣ．ｐｓｉｔｔａｃｉを検出する方法であって、以下の（Ａ）に示す工程により試料中のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよび／またはＣ．ｐｓｉｔｔａｃｉ由来の核酸を検出する手段を含むことを特徴とする、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよび／またはＣ．ｐｓｉｔｔａｃｉ検出方法。
（Ａ）
（１）配列番号１と９５％以上相同な塩基配列で示される核酸配列のうち一部領域を核酸増幅するための核酸プライマー対であって、以下の（Ｉ）または（ＩＩ）のいずれか１つ以上に該当する核酸プライマー対を用意する工程。
（Ｉ）フォワードプライマーが、配列番号２で示される塩基配列のうち１６塩基以上２５塩基以下の塩基配列からなる核酸プライマーである。
（ＩＩ）リバースプライマーが、配列番号３で示される塩基配列のうち１６塩基以上２３塩基以下の塩基配列からなる核酸プライマーである。
（２）被検核酸および核酸プライマー対を含む反応液によって、被検核酸を増幅する工程。
（３）工程（２）によって得られた核酸増幅産物と、該核酸増幅産物の一部と複合体を形成せしめるように設計された核酸プローブとをハイブリダイズさせ複合体を形成せしめる工程。
（４）工程（３）で得られた複合体を検出する工程。
［２］
［１］に記載のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよび／またはＣ．ｐｓｉｔｔａｃｉの検出方法において、工程（Ａ）（Ｉ）に記載のフォワードプライマーが配列番号４、５のいずれかで示される塩基配列である［１］に記載のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよび／またはＣ．ｐｓｉｔｔａｃｉの検出方法。
［３］
［１］に記載のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよび／またはＣ．ｐｓｉｔｔａｃｉの検出方法において、工程（Ａ）（ＩＩ）に記載のリバースプライマーが配列番号６、７のいずれかで示される塩基配列である［１］に記載のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよび／またはＣ．ｐｓｉｔｔａｃｉの検出方法。
［４］
［１］〜［３］のいずれかに記載のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよび／またはＣ．ｐｓｉｔｔａｃｉの検出方法において、工程（Ａ）に記載の核酸プローブが、配列番号８、９のいずれかに示される塩基配列である、［１］〜［３］のいずれかに記載のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよび／またはＣ．ｐｓｉｔｔａｃｉの検出方法。
［５］
［１］に記載のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよび／またはＣ．ｐｓｉｔｔａｃｉの検出方法において、工程（Ａ）（Ｉ）に記載のフォワードプライマーが配列番号４で示される塩基配列であり、工程（Ａ）（ＩＩ）に記載のリバースプライマーが配列番号６で示される塩基配列であり、かつ、工程（Ａ）に記載の核酸プローブが、配列番号８に示される塩基配列である、［１］に記載のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよび／またはＣ．ｐｓｉｔｔａｃｉの検出方法。
［６］
［１］に記載のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよび／またはＣ．ｐｓｉｔｔａｃｉの検出方法において、工程（Ａ）（Ｉ）に記載のフォワードプライマーが配列番号５で示される塩基配列であり、工程（Ａ）（ＩＩ）に記載のリバースプライマーが配列番号７で示される塩基配列であり、かつ、工程（Ａ）に記載の核酸プローブが、配列番号９に示される塩基配列である、［１］に記載のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよび／またはＣ．ｐｓｉｔｔａｃｉの検出方法。
［７］
［４］〜［６］のいずれかに記載の核酸プローブが、末端のシトシンのうち少なくとも一つが蛍光色素で標識されている核酸プローブを用いることを特徴とするＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよび／またはＣ．ｐｓｉｔｔａｃｉの検出方法。
［８］
［１］〜［７］のいずれかに記載のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよび／またはＣ．ｐｓｉｔｔａｃｉの検出方法において、核酸増幅を、α型ＤＮＡポリメラーゼ、および、α型ＤＮＡポリメラーゼを変異させた変異型、のうち１つ以上を含む系で行うことを特徴とする［１］〜［７］のいずれかに記載のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよび／またはＣ．ｐｓｉｔｔａｃｉの検出方法。
［９］
配列番号２で示される塩基配列のうち１６塩基以上２５塩基以下の塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号３で示される塩基配列のうち１６塩基以上２３塩基以下の塩基配列からなるリバースプライマーとからなる、１対のプライマー。
［１０］
配列番号４、５のいずれかで示される塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号６、７のいずれかで示される塩基配列からなるリバースプライマーとからなる、［９］に記載の、１対のプライマー。
［１１］
配列番号８、９のいずれかで示される塩基配列からなる、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよび／またはＣ．ｐｓｉｔｔａｃｉを検出するためのプローブ。
［１２］
［９］または［１０］に示される一対のプライマーと、［１１］に示されるプローブとを組み合わせてなる、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよび／またはＣ．ｐｓｉｔｔａｃｉ検出用のプライマー・プローブのセット。
［１３］
［７］〜［１２］のいずれかに記載のプライマー対、プローブまたはプライマー・プローブのセットを含む、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよび／またはＣ．ｐｓｉｔｔａｃｉ検出キット。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよび／またはＣ．ｐｓｉｔｔａｃｉの検出を迅速、正確、安価に行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】実施例１における融解曲線分析時の蛍光強度変化量を示す。グラフ縦軸は蛍光強度変化量、横軸は温度を示す。
【図２】実施例２における融解曲線分析時の蛍光強度変化量を示す。グラフ縦軸は蛍光強度変化量、横軸は温度を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明はＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよび／またはＣ．ｐｓｉｔｔａｃｉを検出するためのオリゴヌクレオチドプライマー（プライマー）およびオリゴヌクレオチドプローブ（プローブ）、ならびにこれらを用いてＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよび／またはＣ．ｐｓｉｔｔａｃｉを検出する方法、該方法を実施するためのキットに係る。
【００１１】
本発明ではＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよび／またはＣ．ｐｓｉｔｔａｃｉのＯＭＰの領域を検出対象としている。ＯＭＰの領域の塩基配列を配列番号１に示す。ＯＭＰ領域は、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅとＣ．ｐｓｉｔｔａｃｉで共通である。
【００１２】
［プライマー］
本発明のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよび／またはＣ．ｐｓｉｔｔａｃｉ検出方法で用いるオリゴヌクレオチドプライマーとしては、配列番号１と９５％以上相同な塩基配列で示される核酸配列のうち一部領域を核酸増幅するための核酸プライマー対であって、以下の（Ｉ）または（ＩＩ）のいずれか１つ以上に該当する核酸プライマー対が例示される。
（Ｉ）フォワードプライマーが、配列番号２で示される塩基配列のうち１６塩基以上２５塩基以下の塩基配列からなる核酸プライマー。
（ＩＩ）リバースプライマーが、配列番号３で示される塩基配列のうち１６塩基以上２３塩基以下の塩基配列からなる核酸プライマー。
【００１３】
上記の配列番号２は配列番号１で示される塩基配列の一部分である。また、配列番号３は配列番号１で示される塩基配列の相補配列の一部分である。
【００１４】
上記（Ｉ）のオリゴヌクレオチドプライマーは、配列番号２で示される塩基配列の中の連続する１６〜２５塩基のいずれかで示されるオリゴヌクレオチドプライマーであれば特に制限されない。好ましくは、配列番号４、５のいずれかで示される塩基配列からなる核酸プライマーが例示できる。上記より長い配列では検出対象の核酸配列が異なるため検出感度および特異性が低下する。
【００１５】
上記（ＩＩ）のオリゴヌクレオチドプライマーは、配列番号３で示される塩基配列の中の連続する１６〜２３塩基のいずれかで示されるオリゴヌクレオチドプライマーであれば特に制限されない。好ましくは、配列番号６、７のいずれかで示される塩基配列からなる核酸プライマーが例示できる。上記より長い配列では検出対象の核酸配列が異なるため検出感度および特異性が低下する。
【００１６】
上記（Ｉ）および（ＩＩ）のプライマーの組合せ（セット）は、上記で説明した範囲内であれば、原則、任意であり特に限定されるものではないが、好ましいセットとして、フォワードプライマーが配列番号４で示される塩基配列であり、リバースプライマーが配列番号６で示される塩基配列である、一対のプライマー、または、フォワードプライマーが配列番号５で示される塩基配列であり、リバースプライマーが配列番号７で示される塩基配列である、一対のプライマーが例示できる。
【００１７】
［プローブ］
本発明のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよび／またはＣ．ｐｓｉｔｔａｃｉ検出方法で用いるオリゴヌクレオチドプローブ（プローブ）は、特に限定されないが、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよび／またはＣ．ｐｓｉｔｔａｃｉの相同性が比較的高い領域が望ましい。望ましくは８０％以上、特に９０％以上の相同性を有する配列が望ましい。
【００１８】
上記のオリゴヌクレオチドプローブは、核酸が標識されていてもされていなくてもよい。標識される場合、標識される核酸の数に特に制限は無い。好ましくはオリゴヌクレオチドプローブの末端の核酸が標識されている形態であり、より好ましくは末端の核酸のうちどちらか片方のみが標識されている形態である。標識物質にも特に制限はないが、蛍光物質であることがより好ましい。蛍光標識としては特に標的核酸とのハイブリダイゼーション時に消光を生じる蛍光物質が好ましく、具体的には、フルオロセインまたはその誘導体（例えばフルオロセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ））、ＢＯＤＩＰＹ（商標）シリーズ、ローダミンまたはその誘導体（例えば５−カルボキシローダミン６Ｇ（ＧＲ６Ｇ）やテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ））が例示できる。
【００１９】
［検出方法］
本発明のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよび／またはＣ．ｐｓｉｔｔａｃｉ検出方法において、試料中のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよび／またはＣ．ｐｓｉｔｔａｃｉ由来の核酸を検出する方法としては、以下の（１）〜（４）の工程を例示することができる。
（１）配列番号１と９５％以上相同な塩基配列で示される核酸配列のうち一部領域を核酸増幅するための核酸プライマー対であって、以下の（Ｉ）または（ＩＩ）のいずれか１つ以上に該当する核酸プライマー対を用意する工程。
（Ｉ）フォワードプライマーが、配列番号２で示される塩基配列のうち１６塩基以上２５塩基以下の塩基配列からなる核酸プライマーである。
（ＩＩ）リバースプライマーが、配列番号３で示される塩基配列のうち１６塩基以上２３塩基以下の塩基配列からなる核酸プライマーである。
（２）被検核酸および核酸プライマー対を含む反応液によって、被検核酸を増幅する工程。
（３）工程（２）によって得られた核酸増幅産物と、該核酸増幅産物の一部と複合体を形成せしめるように設計された核酸プローブとをハイブリダイズさせ複合体を形成せしめる工程。
（４）工程（３）で得られた複合体を検出する工程。
【００２０】
［被検核酸の増幅］
本発明における被検核酸は、例えば、一本鎖でもよいし、二本鎖でもよい。二本鎖の場合は、例えば、被検核酸とプローブとをハイブリダイズさせてハイブリッド体を形成するために、加熱により前記二本鎖を一本鎖に解離させる工程を含むことが好ましい。
【００２１】
前記被検核酸の種類としては、特に制限されないが、例えば、ＤＮＡや、トータルＲＮＡ、ｍＲＮＡ等のＲＮＡ等があげられる。また、前記被検核酸は、例えば、クラミドフィラ・ニューモニエあるいはクラミドフィラ・シッタシが感染した細胞培養試料や生体試料等の試料に含まれる核酸が挙げられる。
【００２２】
前記生体試料としては、特に制限されないが、例えば、膿、胸水、咽頭拭い液、鼻腔拭い液、血液などが挙げられる。試料の採取方法、ＤＮＡやＲＮＡ等の核酸の調製方法等は、制限されず、従来公知の方法が採用できる。
【００２３】
続いて、単離したゲノムＤＮＡを鋳型として、上述のプライマー対を用いて、ＰＣＲ等の核酸増幅法によって、検出目的の塩基部位を含む配列を増幅させる。なお、ＰＣＲ等の条件は、特に制限されず、従来公知の方法により行うことができる。
【００２４】
本発明のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよび／またはＣ．ｐｓｉｔｔａｃｉの検出方法における核酸の増幅工程に用いられる具体的な核酸増幅方法としては特に限定されず、適宜公知の方法を用いることができる。例えば、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｂａｓｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＬＣＲ法（国際公開８９／１２６９６号公報、特開平２−２９３４号公報）、ＲＣＡ法（国際公開９０／１０６９号公報）、ＬＡＭＰ（ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＩＣＡＮ（ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｎｄ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｐｒｉｍｅｒ−ｉｎｉｔｉａｔｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ）法等があげられるが、ＰＣＲ法を用いることが好ましい。なお、これらの各方法において、増幅反応の条件は特に制限されず、従来公知の方法により行うことができる。
【００２５】
なかでもＰＣＲ法は、試料核酸、４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸、一対のプライマー及び耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの存在下で、変性、アニーリング、伸長の３工程からなるサイクルを繰り返すことにより、上記一対のプライマーで挟まれる試料核酸の領域を指数関数的に増幅させる方法である。すなわち、変性工程で試料の核酸を変性し、続くアニーリング工程において各プライマーと、それぞれに相補的な一本鎖試料核酸上の領域とをハイブリダイズさせ、続く伸長工程で、各プライマーを起点としてＤＮＡポリメラーゼの働きにより鋳型となる各一本鎖試料核酸に相補的なＤＮＡ鎖を伸長させ、二本鎖ＤＮＡとする。この１サイクルにより、１本の二本鎖ＤＮＡが２本の二本鎖ＤＮＡに増幅される。従って、このサイクルをｎ回繰り返せば、理論上上記一対のプライマーで挟まれた試料ＤＮＡの領域は２ｎ倍に増幅される。増幅されたＤＮＡ領域は大量に存在するので、電気泳動等の方法により容易に検出できる。よって、遺伝子増幅法を用いれば、従来では検出不可能であった、極めて微量（１分子でも可）の試料核酸をも検出することが可能であり、最近非常に広く用いられている技術である。
増幅反応としては、最初の熱変形工程が８０〜１００℃で１０秒〜１５分、繰り返しの熱変形工程が８０〜１００℃で１〜３００秒、アニーリンクが４０〜８０℃で１〜３００秒、伸長反応工程が６０〜８５℃で１〜３００秒程度行い、この繰り返しを３０〜７０回繰り返すことが好ましい。
【００２６】
核酸増幅にＰＣＲ法を用いる場合、ＤＮＡポリメラーゼには、α型ＤＮＡポリメラーゼを用いることが好ましい。その理由を以下に説明する。
【００２７】
本発明のプローブが含まれる反応系でＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよび／またはＣ．ｐｓｉｔｔａｃｉの核酸配列を増幅する場合、核酸増幅工程中に該核酸プローブが試料のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよび／またはＣ．ｐｓｉｔｔａｃｉ核酸配列またはそれらの増幅産物と結合しうる。核酸増幅工程中にＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよび／またはＣ．ｐｓｉｔｔａｃｉの核酸配列と結合した該核酸プローブは、核酸プライマーとＤＮＡポリメラーゼによる核酸増幅反応を阻害する。
【００２８】
Ｔａｑ  ＤＮＡ  ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅなどＰｏｌＩ型のＤＮＡポリメラーゼは５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を持つことが知られている。この活性のため、核酸増幅反応中に鋳型となるＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよび／またはＣ．ｐｓｉｔｔａｃｉ核酸配列と結合した核酸がある場合、該結合核酸はエキソヌクレアーゼ活性によって分解されてしまう。このため、反応系中の該核酸プローブが減少し核酸検出工程に問題が生じる可能性がある。従って、ＰｏｌＩ型ＤＮＡポリメラーゼを用いて本発明を実施することは好ましくない。
【００２９】
他方、ＫＯＤ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（超好熱始原菌Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ  ＫＯＤ１由来）などα型のＤＮＡポリメラーゼは５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を持たず、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を持つ。従って、α型ＤＮＡポリメラーゼを用いれば上記問題を解決できるのみならず、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性により核酸増幅工程において高い正確性が発揮される。
【００３０】
通常、α型ＤＮＡポリメラーゼは３’→  ５’エキソヌクレアーゼ活性のため、核酸増幅速度はＰｏｌＩ型酵素と比較して低い傾向がある。しかし、ＫＯＤ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅはα型ＤＮＡポリメラーゼでありながらＤＮＡ合成活性が高く１００塩基／秒以上のＤＮＡ合成速度を有し伸長効率が優れている。従って、本発明の実施にはα型ＤＮＡポリメラーゼの中でも、ＫＯＤ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡製、商標）を用いることが好ましい。
【００３１】
さらに、α型ＤＮＡポリメラーゼを変異させて１００塩基／秒以上のデオキシリボ核酸合成速度を達成させた変異型、あるいは、野生型および／または変異型の組み合わせにより当該性能を達成させたＤＮＡポリメラーゼ組成物も、本発明の実施に適したＤＮＡポリメラーゼとして用いることができる。
例えば、上記ＫＯＤ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ以外に、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ製、登録商標）、ＰｆｕＴｕｒｂｏ  ＤＮＡポリメラーゼ（アジレント・テクノロジー）なども利用できる。
【００３２】
［ＤＮＡ合成活性］
本明細書において、ＤＮＡ合成活性とは鋳型ＤＮＡにアニールされたオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの３’−ヒドロキシル基にデオキシリボヌクレオシド５’−トリホスフェートのα−ホスフェートを共有結合せしめることにより、デオキシリボ核酸にデオキシリボヌクレオシド５’−モノホスフェートを鋳型依存的に導入する反応を触媒する活性をいう。
【００３３】
その活性測定法は、酵素活性が高い場合には、保存緩衝液でサンプルを希釈して測定を行う。本発明では、下記Ａ液２５μｌ、Ｂ液およびＣ液各５μｌおよび滅菌水１０μｌをエッペンドルフチューブに加えて攪拌混合した後、上記酵素液５μｌを加えて７５℃で１０分間反応する。その後、氷冷し、Ｅ液５０μｌ、Ｄ液１００μｌを加えて、攪拌後、さらに１０分間氷冷する。この液をガラスフィルター（ワットマンＧＦ／Ｃフィルター）で濾過し、Ｄ液及びエタノールで充分洗浄し、フィルターの放射活性を液体シンチレーションカウンター（パッカード社製）で計測し、鋳型ＤＮＡへのヌクレオチドの取り込みを測定する。酵素活性の１単位はこの条件下で３０分あたり１０ｎモルのヌクレオチドを酸不溶性画分に取り込む酵素量とする。
Ａ：  ４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）
１６ｍＭ  塩化マグネシウム
１５ｍＭ  ジチオスレイトール
１００μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ
Ｂ：  ２μｇ／μｌ  活性化仔牛胸腺ＤＮＡ
Ｃ：  １．５ｍＭ  ｄＮＴＰ（２５０ｃｐｍ／ｐｍｏｌ〔３Ｈ〕ｄＴＴＰ）
Ｄ：  ２０％  トリクロロ酢酸（２ｍＭピロリン酸ナトリウム）
Ｅ：  １μｇ／μｌ  キャリアーＤＮＡ
【００３４】
［３’−５’エキソヌクレアーゼ活性］
本発明において、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性とは、ＤＮＡの３’末端領域を切除し、５’−モノヌクレオチドを遊離する活性をいう。
その活性測定法は、５０μｌの反応液（１２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８  ａｔ  ２５℃），  １０ｍＭ  ＫＣｌ，  ６ｍＭ  硫酸アンモニウム，１ｍＭ  ＭｇＣｌ２，  ０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００，  ０．００１％  ＢＳＡ，５  μｇ  トリチウムラベルされた大腸菌ＤＮＡ）を１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに分注し、ＤＮＡポリメラーゼを加える。７５℃で１０分間反応させた後、氷冷によって反応を停止し、次にキャリアーとして、０．１％のＢＳＡを５０μｌ加え、さらに１０％のトリクロロ酢酸、２％ピロリン酸ナトリウム溶液を１００μｌ加え混合する。氷上で１５分放置した後、１２，０００回転で１０分間遠心し沈殿を分離する。上清１００μｌの放射活性を液体シンチレーションカウンター（パッカード社製）で計測し、酸可溶性画分に遊離したヌクレオチド量を測定する。
【００３５】
［核酸増幅産物とプローブとの複合体形成］
本発明のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよび／またはＣ．ｐｓｉｔｔａｃｉ検出方法においては、上記で説明した被検核酸の増幅によって得られた増幅産物と、該核酸増幅産物の一部と複合体を形成せしめるように設計されたオリゴヌクレオチドプローブとをハイブリダイズさせ複合体を形成せしめる。
【００３６】
核酸増幅産物を含む試料に核酸プローブを添加するタイミングは、特に制限されず、例えば、前述の核酸増幅反応前、核酸増幅反応途中および核酸増幅反応後のいずれに、増幅反応の反応系に添加してもよい。
中でも、増幅反応と、後述の検出反応とを連続的に行うことができるため、増幅反応前に添加することが好ましい。このように核酸増幅反応の前に前記プローブを添加する場合は、例えば、後述のように、その３’末端に、蛍光色素を付加したり、リン酸基を付加したりすることが好ましい。
【００３７】
本発明において用いられる標識としては磁性体、電子伝達体、酵素、ビオチン、蛍光物質、ハプテン、抗原、抗体、放射性物質および発光団などがある。磁性体としては、酸化鉄、二酸化クロム、コバルト、フェライトなどが挙げられる。電子伝達体としては、フェロセン、ＰＱＱ、レドックス化合物が挙げられる。酵素としては、アルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼなどが挙げられる。蛍光物質としては、例えば，Ｃｙ５（登録商標），Ｃｙ３（登録商標），ＦＩＴＣ，ローダミン，ランタニド蛍光体，テキサスレッド，ＦＡＭ，ＪＯＥ，Ｃａｌ  Ｆｌｕｏｒ  Ｒｅｄ  ６１０（登録商標），Ｑｕａｓａｒ  ６７０（登録商標）、放射性同位体（例えば，３２Ｐ，３５Ｓ，３Ｈ，１４Ｃ，１２５Ｉ，１３１Ｉ），高電子密度試薬（例えば金），酵素（例えば，西洋ワサビペルオキシダーゼ，ベータ−ガラクトシダーゼ，ルシフェラーゼ，アルカリホスファターゼ），比色標識（例えば金コロイド），磁気標識（例えば，Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標）），ビオチン，ジゴキシゲニン，または抗血清またはモノクローナル抗体が利用可能なハプテンおよび蛋白質が挙げられる。他の標識としては，それぞれ対応するレセプターまたはオリゴヌクレオチド相補体と複合体を形成しうるリガンドまたはオリゴヌクレオチドが挙げられる。標識は，検出すべき核酸中に直接取り込ませてもよく，または検出すべき核酸にハイブリダイズまたは結合するプローブ（例えばオリゴヌクレオチド）または抗体に結合させてもよい。
好ましい検出可能な標識は蛍光標識である。本明細書において用いる場合，“蛍光標識”とは，特定の波長（励起周波数）の光を吸収し，次により長い波長（放射周波数）の光を放出する分子を表す。本明細書において用いる場合，“ドナー蛍光団”との用語は，消光剤成分と近接している場合に，放出エネルギーを消光剤に供与ないし移動させる蛍光団を意味する。消光剤成分にエネルギーを供与した結果，ドナー蛍光団それ自体は，近接して配置された消光剤成分が存在しない場合よりも少ない特定の放出周波数の光を放出する。
【００３８】
本明細書において用いる場合，“消光剤成分”との用語は，ドナー蛍光団の近傍に位置して，ドナーにより生成された放出エネルギーを取り込み，エネルギーを熱またはドナーの放出波長より長い波長の光として消散させる分子を意味する。後者の場合，消光剤はアクセプター蛍光団であると考えられる。消光成分は，近接（すなわち衝突）クエンチングにより，または蛍光共鳴エネルギー移動（“ＦＲＥＴ”）により作用する。
【００３９】
好適な蛍光成分としては，当該技術分野において知られる下記の蛍光団が挙げられる：４−アセトアミド−４’−イソチオシアナトスチルベン−２，２’−ジスルホン酸，アクリジンおよび誘導体（アクリジン，アクリジンイソチオシアネート），Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）３５０，Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８，Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５４６，Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５５５，Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５６８，Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４，Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ），５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ），４−アミノ−Ｎ−［３−ビニルスルホニル）フェニル］ナフタルイミド−３，５ジスルホネート（Ｌｕｃｉｆｅｒ  Ｙｅｌｌｏｗ  ＶＳ），Ｎ−（４−アニリノ−１−ナフチル）マレイミド，アントラニルアミド，ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）Ｒ−６Ｇ，ＢＯＰＩＰＹ（登録商標）５３０／５５０，ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬ，ブリリアントイエロー，クマリンおよび誘導体（クマリン，７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ，クマリン１２０），７−アミノ−４−トリフルオロメチルクマリン（クマリン１５１）），Ｃｙ２（登録商標），Ｃｙ３（登録商標），Ｃｙ３．５（登録商標），Ｃｙ５（登録商標），Ｃｙ５．５（登録商標），シアノシン，４’，６−ジアミニジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ），５’，５''−ジブロモピロガロール−スルホネフタレイン（Ｂｒｏｍｏｐｙｒｏｇａｌｌｏｌ  Ｒｅｄ），７−ジエチルアミノ−３−（４’−イソシアナトフェニル）−４−メチルクマリン，ジエチレントリアミン四酢酸，４，４’−ジイソチオシアナトジヒドロ−スチルベン−２，２’−ジスルホン酸，４，４’−ジイソチオシアナトスチルベン−２，２’−ジスルホン酸，塩化５−［ジメチルアミノ］ナフタレン−１−スルホニル（ＤＮＳ，塩化ダンシル），４−（４’−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ），４−ジメチルアミノフェニルアゾフェニル−４’−イソチオシアネート（ＤＡＢＩＴＣ），Ｅｃｌｉｐｓｅ（商標）（Ｅｐｏｃｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．），エオシンおよび誘導体（エオシン，エオシンイソチオシアネート），エリスロシンおよび誘導体（エリスロシンＢ，エリスロシンイソチオシアネート），エチジウム，フルオレセインおよび誘導体（５−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ），５−（４，６−ジクロロトリアジン−２−イル）アミノフルオレセイン（ＤＴＡＦ），２’，７’−ジメトキシ−４’５’−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＪＯＥ），フルオレセイン，フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ），ヘキサクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＨＥＸ），ＱＦＩＴＣ（ＸＲＩＴＣ），テトラクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）），フルオレスカミン，ＩＲ１４４，ＩＲ１４４６，マラカイトグリーンイソチオシアネート，４−メチルウンベリフェロン，オルトクレゾールフタレイン，ニトロチロシン，パラローザニリン，フェノールレッド，Ｂ−フィコエリスリン，Ｒ−フィコエリスリン，ｏ−フタルジアルデヒド，Ｏｒｅ��ｏｎ  Ｇｒｅｅｎ（登録商標），ヨウ化プロピジウム，ピレンおよび誘導体（ピレン，酪酸ピレン，酪酸スクシンイミジル１−ピレン），ＱＳＹ（登録商標）７，ＱＳＹ（登録商標）９，ＱＳＹ（登録商標）２１，ＱＳＹ（登録商標）３５（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ），リアクティブレッド４（Ｃｉｂａｃｒｏｎ（登録商標）ブリリアントレッド３Ｂ−Ａ），ローダミンおよび誘導体（６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ），６−カルボキシローダミン（Ｒ６Ｇ），リサミンローダミンＢ塩化スルホニル，ローダミン（Ｒｈｏｄ），ローダミンＢ，ローダミン１２３，ローダミングリーン，ローダミンＸイソチオシアネート，スルホローダミンＢ，スルホローダミン１０１，スルホローダミン１０１の塩化スルホニル誘導体（テキサスレッド）），Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ），テトラメチルローダミン，テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ），リボフラビン，ロゾール酸，テルビウムキレート誘導体。
【００４０】
適当な消光剤は，特定の蛍光団の蛍光スペクトルに基づいて選択する。有用な消光剤としては，例えば，ｔｈｅ  Ｂｌａｃｋ  Ｈｏｌｅ（商標）消光剤であるＢＨＱ−１，ＢＨＱ−２，およびＢＨＱ−３（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．），およびＡＴＴＯシリーズの消光剤（ＡＴＴＯ５４０Ｑ，ＡＴＴＯ５８０Ｑ，およびＡＴＴＯ６１２Ｑ；Ａｔｔｏ−ＴｅｃＧｍｂＨ）が挙げられる。
【００４１】
検出可能な標識は，核酸中に取り込ませるか，会合させるか，またはコンジュゲートさせることができる。標識は，種々の長さのスペーサーアームにより結合させて，立体傷害または他の有用なまたは望ましい特性に与える影響を低減させることができる。例えば，Ｍａｎｓｆｉｅｌｄ，９  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ  １４５−１５６（１９９５）を参照。
ハプテンとしては、ビオチン、ジゴキシゲニンなどが挙げられる。放射性物質としては、
３２Ｐ、３５Ｓなどが挙げられる。発光団としては、ルテニウム、エクオリンなどが挙げられる。該標識は、核酸検出反応に影響を与えることがなければなにを用いても良い。また反応に影響がなければオリゴヌクレオチドのどの位置に結合させてもよい。好ましくは、３’末端、５’末端部位である。
【００４２】
前記プローブは、核酸増幅産物を含む液体試料に添加してもよいし、溶媒中で核酸増幅産物と混合してもよい。前記溶媒としては、特に制限されず、例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ等の緩衝液、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＭｇＳＯ４、グリセロール、有機溶媒等、従来公知のものがあげられる。反応液の調整の方法としては、具体的には、反応液２５μｌあたり、オリゴヌクレオチドが０．５〜５０ｐｍｏｌ、×１０の緩衝液が０．５〜５０μｌ、２ｍＭのｄＮＴＰで０．５〜５０μｌ、塩類が２５ｍＭ濃度液で０．１〜３０μｌ、ＤＮＡポリメラーゼが０．１〜３０ｎｇ程度であることが好ましい。
【００４３】
検出方法としては、具体例として、単独でシグナルを示し且つハイブリッド形成によりシグナルを示さない標識化プローブ（例えば、グアニン消光プローブ）を使用した場合、一本鎖ＤＮＡとプローブとが解離している状態では蛍光を発しているが、温度の降下によりハイブリッドを形成すると、前記蛍光が減少（または消光）する。したがって、例えば、前記反応液の温度を徐々に降下させて、温度下降に伴う蛍光強度の減少を測定すればよい。他方、単独でシグナルを示さず且つハイブリッド形成によりシグナルを示す標識化プローブを使用した場合、一本鎖ＤＮＡとプローブとが解離している状態では蛍光を発していないが、温度の降下によりハイブリッドを形成すると、蛍光を発するようになる。したがって、例えば、前記反応液の温度を徐々に降下させて、温度下降に伴う蛍光強度の増加を測定すればよい。
【００４４】
前記解離工程における加熱温度は、前記増幅産物が解離できる温度であれば特に制限されないが、例えば、８５〜１００℃である。加熱時間も特に制限されないが、通常、１秒〜２０分であり、好ましくは１秒〜１０分である。
【００４５】
また、解離した一本鎖ＤＮＡと前記標識化プローブとのハイブリダイズは、例えば、前記解離工程の後、前記解離工程における加熱温度を降下させることによって行うことができる。温度条件としては、例えば、３５〜５０℃である。
【００４６】
ハイブリダイズ工程の反応系（反応系）における各組成の体積や濃度は、特に制限されない。具体例としては、前記反応系において、ＤＮＡの濃度は、例えば、０．０１〜１００μｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは０．１〜１０μｍｏｌ／Ｌ、前記標識化プローブの濃度は、例えば、前記ＤＮＡに対する添加割合を満たす範囲が好ましく、例えば、０．０１〜１００μｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは０．０１〜１０μｍｏｌ／Ｌである。
【００４７】
蛍光強度の変動を測定する際の温度範囲は、特に制限されないが、例えば、開始温度が室温〜８５℃であり、好ましくは２５〜７０℃であり、終了温度は、例えば、４０〜１０５℃である。また、温度の上昇速度は、特に制限されないが、例えば、０．０５〜２０℃／秒であり、好ましくは０．０８〜１０℃／秒である。
【００４８】
また、本発明においては、目的の塩基部位における遺伝子型の決定のために、前記シグナルの変動を解析してＴｍ（ｍｅｌｔｉｎｇ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）値として決定してもよい。
【００４９】
プライマー、プローブ、検出キット
本発明はまた、上記で説明したＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよび／またはＣ．ｐｓｉｔｔａｃｉを検出するための方法において用いるプライマー対、プローブまたは該プライマーと該プローブとを組合せたセットに関する。
【００５０】
本発明はさらに、これらのプライマー対、プローブまたはプライマー・プローブのセットを含む、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよび／またはＣ．ｐｓｉｔｔａｃｉ検出キットに関する。
本発明のキットは、その構成において、プライマー対、プローブまたはプライマー・プローブのセット以外については特に限定されない。たとえばＰＣＲ法など公知の方法において、プライマーおよび／またはプローブとして上記のものを適用すればよい。
【実施例】
【００５１】
以下実施例をもって本発明を具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００５２】
実施例１  Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの検出
＜Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅを検出するオリゴヌクレオチドの合成＞
パーキンエルマー社製ＤＮＡシンセサイザー３９２型を用いて、ホスホアミダイト法にて、配列番号４、６、８に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（以下、オリゴ４、６、８と示す）を合成した。合成はマニュアルに従い、各種オリゴヌクレオチドの脱保護はアンモニア水で５５℃、一夜実施した。オリゴヌクレオチドの精製はパーキンエルマー社ＯＰＣカラムにて実施した。もしくはＤＮＡ合成受託会社（（株）日本バイオサービス、シグマジェノシス（株）等）に依頼した。
オリゴ４はセンス鎖であり、オリゴ６がアンチセンス鎖であり組み合わせて増幅反応のオリゴヌクレオチドとして使用される。オリゴ８はプローブとして使用され、3’末端は蛍光標識される。
【００５３】
Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの検出 
＜ＰＣＲ法による増幅反応＞
Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅより抽出したＤＮＡ溶液をサンプルとして使用して、下記試薬を添加して、下記条件によりＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅを検出した。
【００５４】
＜試薬＞
以下の試薬を含む１０μｌ溶液を調製した。
ＫＯＤｐｌｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼ  ０．５Ｕ
オリゴ４  ５ｐｍｏｌ、
オリゴ６  ５０  ｐｍｏｌ、
オリゴ８（３’末端をＦＩＴＣにより標識）  ５ｐｍｏｌ、
×１０緩衝液  １μｌ、
２ｍＭ  ｄＮＴＰ  １μｌ、
２５ｍＭ  ＭｇＳＯ４  ２μｌ、
抽出ＤＮＡ溶液  １００ｎｇ
【００５５】
＜増幅条件＞
９４℃・３０秒、
９７℃・１秒、
５８℃・３秒、
６３℃・５秒（５０サイクル）
４０℃・３０秒
４０℃から７５℃に温度上昇させながら蛍光検出する。温度上昇速度は０．０９℃／秒
【００５６】
＜融解曲線解析による検出＞
融解温度解析の結果、−ｄＦ（蛍光強度変化量）／ｄＴ（温度変化量）の最も大きな値を示す温度（Ｔｍ）は、６５℃付近を示し、その時の蛍光強度変化量は下記表１および図１の通りであった。
【００５７】
【表１】
2014230510.tif 000002
【００５８】
図１のグラフから、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅゲノムの存在する場合には、明らかなピークが得られることが確認された。
本検出系において、検出まで要する時間が４０分以内であった。
【００５９】
実施例２  Ｃ．ｐｓｉｔｔａｃｉの検出
＜ＰＣＲ法による増幅反応＞
Ｃ．ｐｓｉｔｔａｃｉより抽出したＤＮＡ溶液をサンプルとして使用して、下記試薬を添加して、下記条件によりＣ．ｐｓｉｔｔａｃｉを検出した。
【００６０】
＜試薬＞
以下の試薬を含む１０μｌ溶液を調製した。
ＫＯＤｐｌｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼ  ０．５Ｕ
オリゴ４  ５ｐｍｏｌ、
オリゴ６  ５０  ｐｍｏｌ、
オリゴ８（３’末端をＦＩＴＣにより標識）  ５ｐｍｏｌ、
×１０緩衝液  １μｌ、
２ｍＭ  ｄＮＴＰ  １μｌ、
２５ｍＭ  ＭｇＳＯ４  ２μｌ、
抽出ＤＮＡ溶液  １００ｎｇ
【００６１】
＜増幅条件＞
９４℃・３０秒、
９７℃・１秒、
５８℃・３秒、
６３℃・５秒（５０サイクル）
４０℃・３０秒
４０℃から７５℃に温度上昇させながら蛍光検出する。温度上昇速度は０．２℃／秒
【００６２】
＜融解曲線解析による検出＞
融解温度解析の結果、−ｄＦ（蛍光強度変化量）／ｄＴ（温度変化量）の最も大きな値を示す温度（Ｔｍ）は、５６．９℃付近を示し、その時の蛍光強度変化量は下記表２および図２の通りであった。
【００６３】
【表２】
2014230510.tif 000003
【００６４】
図２のグラフから、Ｃ．ｐｓｉｔｔａｃｉゲノムの存在する場合には、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅゲノム検出時とは異なる温度にピークが得られることが確認された。
本検出系において、検出まで要する時間が４０分以内であった。
【００６５】
実施例３  Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの検出
＜百日咳菌を検出するオリゴヌクレオチドの合成＞
パーキンエルマー社製ＤＮＡシンセサイザー３９２型を用いて、ホスホアミダイト法にて、配列番号５、７、９に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（以下、オリゴ５、７、９と示す）を合成した。合成はマニュアルに従い、各種オリゴヌクレオチドの脱保護はアンモニア水で５５℃、一夜実施した。オリゴヌクレオチドの精製はパーキンエルマー社ＯＰＣカラムにて実施した。もしくはＤＮＡ合成受託会社（（株）日本バイオサービス、シグマジェノシス（株）等）に依頼した。
オリゴ５はセンス鎖であり、オリゴ７がアンチセンス鎖であり組み合わせて増幅反応のオリゴヌクレオチドとして使用される。オリゴ９はプローブとして使用され、３’末端は蛍光標識される。
【００６６】
＜ＰＣＲ法による増幅反応＞
Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅより抽出したＤＮＡ溶液をサンプルとして使用して、下記試薬を添加して、下記条件によりＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅを検出した。
【００６７】
＜試薬＞
以下の試薬を含む１０μｌ溶液を調製した。
ＫＯＤｐｌｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼ  ０．５Ｕ
オリゴ５  ５ｐｍｏｌ、
オリゴ７  １５  ｐｍｏｌ、
オリゴ９（３’末端をＦＩＴＣにより標識）  ５ｐｍｏｌ、
×１０緩衝液  １μｌ、
２ｍＭ  ｄＮＴＰ  １μｌ、
２５ｍＭ  ＭｇＳＯ４  ２μｌ、
抽出ＤＮＡ溶液  １００ｎｇ（ｏｒ  蒸留水）
【００６８】
＜増幅条件＞
９４℃・３０秒、
９７℃・１秒、
５８℃・３秒、
６３℃・５秒（５０サイクル）
４０℃・３０秒
４０℃から７５℃に温度上昇させながら蛍光検出する。温度上昇速度は０．２℃／秒
【００６９】
＜融解曲線解析による検出＞
融解曲線解析結果  抽出ＤＮＡを用いた場合  ６５．１℃付近にピークが認められたが、
抽出ＤＮＡがない場合は、ピークは認められなかった。
本検出系において、検出まで要する時間が４０分以内であった。
【００７０】
実施例３  Ｃ．ｐｓｉｔｔａｃｉ核酸のＰＣＲ法による増幅 
＜ＰＣＲ法による増幅反応＞
Ｃ．ｐｓｉｔｔａｃｉより抽出したＤＮＡ溶液をサンプルとして使用して、下記試薬を添加して、下記条件によりＣ．ｐｓｉｔｔａｃｉを検出した。
【００７１】
＜試薬＞
以下の試薬を含む１０μｌ溶液を調製した。
ＫＯＤｐｌｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼ  ０．５Ｕ
オリゴ５  ５ｐｍｏｌ、
オリゴ７  １５  ｐｍｏｌ、
オリゴ９（３’末端をＦＩＴＣにより標識）  ５ｐｍｏｌ、
×１０緩衝液  １μｌ、
２ｍＭ  ｄＮＴＰ  １μｌ、
２５ｍＭ  ＭｇＳＯ４  ２μｌ、
抽出ＤＮＡ溶液  １００ｎｇ（ｏｒ  蒸留水）
【００７２】
＜増幅条件＞
９４℃・３０秒、
９７℃・１秒、
５８℃・３秒、
６３℃・５秒（５０サイクル）
４０℃・３０秒
４０℃から７５℃に温度上昇させながら蛍光検出する。温度上昇速度は０．２℃／秒
【００７３】
＜融解曲線解析による検出＞
融解曲線解析結果  Ｃ．ｐｓｉｔｔａｃｉ抽出ＤＮＡを用いた場合  ５８．℃付近にピークが認められたが、抽出ＤＮＡがない場合は、ピークは認められなかった。
本検出系において、検出まで要する時間が４０分以内であった。
【産業上の利用可能性】
【００７４】
本発明をＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよび／またはＣ．ｐｓｉｔｔａｃｉの検出に利用することで、迅速性、正確性の両方に優れ、なおかつ高感度にＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよび／またはＣ．ｐｓｉｔｔａｃｉを検出することができる。
【図１】
2014230510.tif 000004
【図２】
2014230510.tif 000005
【配列表】
2014230510000001.app