(57)【要約】【課題】植物培養細胞が本来有する二次代謝物の代謝フローを、合理的に新たな外来二次代謝物の産生へとスイッチングさせることを目的とする。【解決手段】植物培養細胞が産生する二次代謝産物の代謝中間体を基質とする外来二次代謝生合成遺伝子を導入したことを特徴とする。【選択図】  図７
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物培養細胞が産生する二次代謝産物の代謝中間体を基質とする外来二次代謝生合成遺伝子を導入したことを特徴とする形質転換植物培養細胞。
【請求項２】
植物培養細胞が産生する二次代謝産物の代謝中間体を基質とする外来二次代謝生合成遺伝子を導入し、
元の植物培養細胞が産生する二次代謝産物に替えて新たな二次代謝産物を産生させることを特徴とする合理的代謝フロースイッチングによる植物培養細胞を用いた生合成法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子組換え植物培養細胞に関し、特に元の植物培養細胞に有する二次代謝物の代謝フローをスイッチングさせることで得られる生合成法に係る。
【背景技術】
【０００２】
近年、石油由来の溶媒を大量に使用する化学合成に依存しない生物的物質生産法の研究が盛んに行われている。
これまでは、そのような生産法としては遺伝子組換えにより目的物質の生合成遺伝子（群）を導入する手法（合成生物学）が潮流となっている。
この場合、主として遺伝子組換え操作や培養が容易であり、細胞の増殖が速い等の理由により、微生物が宿主として用いられている。
しかし、有用物質の中には植物体に由来するものも多くあり、そのような有用物質の生合成遺伝子（群）をこれまでのように微生物を宿主として発現させ、物質を生産することには限界がある。
そこで、本発明者らは、これまでに確立した植物培養細胞の代謝能の解析や遺伝子組換え技術（特許文献１）を応用することで本発明に至った。
なお、本発明者が調査した範囲では、関連する特許文献，学術論文は見当たらなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特願２０１２−２０２１３８号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、植物培養細胞が本来有する二次代謝物の代謝フローを、合理的に新たな外来二次代謝物の産生へとスイッチングさせることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、植物培養細胞が本来有する活発な代謝フローを合理的に利用することがねらいであり、本発明に係る形質転換植物培養細胞は、植物培養細胞が産生する二次代謝産物の代謝中間体を基質とする外来二次代謝生合成遺伝子を導入したことを特徴とする。
このような形質転換植物培養細胞を用いると、元の植物培養細胞に本来有していた代謝フロー中の中間体産生能力を活用することができ、この中間体を基質として新たに有用な二次代謝物（外来二次代謝物）を生合成することができる。
具体的には、植物培養細胞が産生する二次代謝産物の代謝中間体を基質とする外来二次代謝生合成遺伝子を導入し、元の植物培養細胞が産生する二次代謝産物に替えて新たな二次代謝産物を産生させることを特徴とする。
本発明に用いることができる植物培養細胞は、植物の組織細胞を培養増殖したものをいい、植物の種類や組織の部位に特に制限はないが、新たに生合成する物質の基質となる中間体が代謝フロー中に存在するものをいう。
この元の植物培養細胞を宿主にして、元の代謝フロー中に合成される中間体を基質とするような生合成に関わる遺伝子を導入することで、新たな二次代謝物を生合成することができる。
その際、培養細胞の形質転換方法は特に限定されない。
植物組織からの培養細胞の誘導方法や培養細胞の形質転換方法は、本発明者らが先に提案した特許文献１の内容を用いてもよい。
【発明の効果】
【０００６】
本発明に係る形質転換植物培養細胞及びこれを用いた合理的代謝フロースイッチングによる生合成法は、元々の植物培養細胞が本来有する二次代謝物の産生能力を発揮させることで、代謝フロー中に多く産生する中間体を基質として外部から導入した組換え遺伝子により新たな二次代謝物を生合成できるので、外部から基質を供給する必要がない。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】ＭＳ  Ｐ６８０  Ｐｉｃ培地で培養したＨ４懸濁細胞抽出物のＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【図２】Ｈ４懸濁細胞抽出物から精製した主要未知化合物の１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ、４００ＭＨｚ）（上）および１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ、１００  ＭＨｚ）（下）スペクトルを示す。
【図３】化学合成したferuloylputrescineの１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ、４００ＭＨｚ）（上）および１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ、１００  ＭＨｚ）（下）スペクトルを示す。
【図４】Ｈ４懸濁細胞抽出物（左）と化合物合成したferuloylputrescine（右）のＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【図５】１／２ＭＳ  Ｆｒｅｅ培地で培養したＨ４懸濁細胞抽出物のＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【図６】Ｈ４懸濁細胞抽出物（左）と化学合成したp-coumaroylputrescine（右）のＨＰＬＣを示す。
【図７】Ｈ４懸濁細胞におけるヒドロキシ桂皮酸putrescineアミドの生合成およびＡＣＴ酵素の導入によるヒドロキシ桂皮酸agmatineアミド生合成への代謝フロースイッチングを示す。
【図８】ＡＣＴ組換え細胞カルスにおけるp-coumaroylagmatineおよびferuloylagmatineの生成を示す。
【図９】ＭＳ  Ｐ６８０  Ｐｉｃ培地（上）および１／２ＭＳ  Ｆｒｅｅ培地（下）で培養したＡＣＴ組換え懸濁細胞抽出物のＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【図１０】Ｈ４懸濁細胞野生株およびＡＣＴ組換え株の各培養条件における増殖曲線を示す。
【図１１】Ｈ４懸濁細胞野生株における代謝物経時変化を示す。
【図１２】Ｈ４懸濁細胞ＡＣＴ組換え株＃２２における代謝物経時変化を示す。
【図１３】Ｈ４懸濁細胞ＡＣＴ組換え株＃１５における代謝物経時変化を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本発明は、植物組織から誘導した培養細胞が本来有する二次代謝物の産生能力を活用するものであり、以下タケ植物由来の培養細胞を例に説明するが、本培養細胞に限定されるものではない。
＜ハチクＨ４懸濁培養細胞における主要二次代謝産物の同定＞
ハチク(Phyllostachys nigra)タケノコ由来のＨ４懸濁細胞は、ＭＳ(Murashige and Skoog)培地にｓｕｃｒｏｓｅを３％、Ｐｉｃｌｏｒａｍを１０μＭ添加し、ＫＨ２ＰＯ４濃度を通常の４倍である６８０ｍｇ／ｌに改変したＭＳ液体培地（以後、ＭＳ  Ｐ６８０  Ｐｉｃと略記）を用いて、２５℃、暗条件、１１０ｒｐｍで培養した。
培養８日目のＨ４懸濁細胞約１００ｍｇに、メタノール／２％酢酸１ｍｌを加えて１０分間超音波抽出後、遠心後の上清をＨＰＬＣ分析に供した。
その結果、図１のクロマトグラムに示すように、保持時間５．４分に検出される主要未知化合物を見出した。
【０００９】
次に、この未知化合物の単離・構造決定を行った。
Ｈ４懸濁細胞を上記条件下で培養し、培養６日目の培養液１Ｌから吸引ろ過によって湿重量９７．４ｇの細胞を回収した。
このものをメタノール／２％酢酸１Ｌ中、室温で１時間超音波抽出し、吸引ろ過によって細胞残渣を除いた抽出液を濃縮後、ヘキサンで３回脱脂した。
合一した水層を濃縮し、フィルターろ過したものを分取ＨＰＬＣによる精製に供した。
ＨＰＬＣ条件は以下の通りである（カラム：TSKgel ODS-80Ts  ５μｍ（２０×２５０ｍｍ）、溶媒：１４％アセトニトリル／０．１％  ＴＦＡ，流速：５ｍｌ／ｍｉｎ，検出波長：２８０ｎｍ）。
回収したフラクションを濃縮後、凍結乾燥することで５８．５ｍｇの精製物が得られた。
マススペクトル分析においてｍ／ｚ＝２６５［Ｍ＋Ｈ］＋の分子イオンピークが検出されたことから、本化合物の分子量は２６４であり、ＵＶ吸収スペクトル（λｍａｘ：２１７ｎｍ、２３３ｎｍ、２９４ｎｍ、３１９ｎｍ）の特徴およびマススペクトルのフラグメントイオン（ｍ／ｚ＝１７７）から、本化合物はケイ皮酸の誘導体であるフェルラ酸ユニットを有していると推定された。
さらに図２に示すＮＭＲスペクトルに基づいて、本化合物の構造はferuloylputrescineであると推定された。
【００１０】
次に、推定構造の証明のため、feruloylputrescineを化学合成した。
Ferulic acidとBoc-putrescineを脱水縮合剤であるN,N'-dicyclohexylcarbodiimide（ＤＣＣ）の存在下で反応させ、Boc-feruloylputrescineとした後、強酸性条件下で脱保護を行うことでferuloylputrescineを得た。
このもののＮＭＲスペクトルを図３に示す。
【００１１】
１Ｈ−、１３Ｃ−ＮＭＲのいずれにおいても、細胞抽出物から精製したもの（図２）と合成標品（図３）のスペクトルデータは完全に一致した。
さらに、マススペクトル（ｍ／ｚ＝２６５［Ｍ＋Ｈ］＋）、ＵＶ吸収スペクトル（λｍａｘ：２１８ｎｍ、２３４ｎｍ、２９３ｎｍ、３１９ｎｍ）、およびＨＰＬＣクロマトグラム上での保持時間（図４）のいずれにおいても一致がみられたことから、Ｈ４懸濁細胞中に見出された主要未知化合物の構造をferuloylputrescineと同定した。
【００１２】
活発な細胞増殖が促されるＭＳ  Ｐ６８０  Ｐｉｃ培地に対して、植物ホルモンを含まず培地中の無機塩類濃度のみを１／２に改変した１／２ＭＳ培地（以後、１／２ＭＳ  Ｆｒｅｅと略記）や１０μＭの6-benzyladenine（ＢＡ）を添加した１／２ＭＳ培地（以後、１／２ＭＳ  ＢＡと略記）中でＨ４懸濁細胞を培養すると、細胞のリグニン化が促進されることが見出されている（Shinjiro Ogita, Taiji Nomura, Takao Kishimoto and Yasuo Kato (2012) A Novel xylogenic suspension culture model for exploring lignifications in Phyllostachys bamboo. Plant Methods, 8, 40 (1-9)）。
そこで、リグニン化促進条件において培養したＨ４懸濁細胞の抽出物を分析し、feruloylputrescine以外の主要二次代謝産物の有無を調べた。
１／２ＭＳ  Ｆｒｅｅ培地での培養８日目の懸濁細胞抽出物をＨＰＬＣ分析に供したところ、図５に示すようにferuloylputrescineに加え、保持時間４．８分のピークが増殖促進条件（図１）に比べて顕著に増大していることが認められた。
【００１３】
Ｒｔ．４．８のマススペクトル分析において、ｍ／ｚ＝２３５［Ｍ＋Ｈ］＋の分子イオンピークが検出されたことから、本化合物の分子量は２３４であり、ＵＶ吸収スペクトル（λｍａｘ：２２３ｎｍ、２９１ｎｍ）の特徴およびマススペクトルのフラグメントイオン（ｍ／ｚ＝１４７）から本化合物はp-coumaroylputrescineであると推定された。
推定構造の証明のため、p-coumaric acidを原料として上記feruloylputrescineの合成と同様の方法によって、p-coumaroylputrescineを化学合成した。
合成標品のマススペクトル（ｍ／ｚ＝２３５［Ｍ＋Ｈ］＋）、UV吸収スペクトル（λｍａｘ：２２３ｎｍ、２９１ｎｍ）および図６に示したＨＰＬＣクロマトグラム上での保持時間はいずれもＲｔ．４．８のものと一致したことから、本化合物の構造をp-coumaroylputrescineと同定した。
【００１４】
＜Ｈ４細胞の形質転換＞
次に代謝フローのスイッチングを検討した。
Ｈ４懸濁細胞における主要二次代謝産物としてヒドロキシ桂皮酸アミドであるp-coumaroylputrescineとferuloylputrescineが同定されたが、一般的にヒドロキシ桂皮酸アミド類はヒドロキシ桂皮酸ＣｏＡエステルとアミン化合物の酵素的縮合によって生合成されることから、図７に代謝フローを示すようにＨ４懸濁細胞ではフェニルプロパノイド代謝系とポリアミン代謝系が非常に活発であると考えられる。
そこで、これらの生合成中間体を基質とする外来の二次代謝生合成酵素を導入し、Ｈ４細胞の代謝経路を改変することを試みた。
導入する遺伝子として、ヒドロキシ桂皮酸ＣｏＡエステルと、putrescine生合成中間体であるagmatineの縮合反応を触媒するagmatine coumaroyltransferase（ＡＣＴ）をコードするオオムギのHvACT1遺伝子（Taiji Nomura, Akihiro Ishizuka, Kazunori Kishida, A. K. M. Rafiqul Islam, Takashi R. Endo, Hajime Iwamura and Atsushi Ishihara (2007) Chromosome arm location of the genes for the biosynthesis of hordatines in barley. Genes & Genetic Systems, 82: 455-464）を選定した。
推定されるスイッチングフローを図７に示す。
【００１５】
ＨｖＡＣＴ１遺伝子をcauliflower mosaic virus 35Sプロモーターの制御下で高発現させるため、ｐＩＧ１２１−Ｈｍプラスミド（Shozo Ohta, Satoru Mita, Tsukaho Hattori and Kenzo Nakamura (1990) Construction and expression in tobacco of a β-glucuronidase (GUS) reporter gene containing an intron within the coding sequence. Plant and Cell Physiology, 31: 805-813）のＧＵＳ遺伝子領域をＨｖＡＣＴ１遺伝子に置換したＨｖＡＣＴ１／ｐＩＧ１２１Ｈｍプラスミドを作成し、金粒子をキャリアーとしたパーティクルガン法によって、ＭＳ  Ｐ６８０  Ｐｉｃ培地中、培養９〜１０日目のＨ４懸濁細胞の形質転換を行った。
形質転換後の培養は、細胞の増殖状態に応じて１〜３週間後に５０〜１００ｍｇ／ｌハイグロマイシンＢを含むＭＳ  Ｐ６８０  Ｐｉｃ／０．３％ゲランガム固体培地にて行い、増殖がみられた細胞を適宜移植した。
抗生物質を添加した固体選抜培地にて良好な増殖が見られた細胞を一次選抜株とし、その後３〜４週間ごとに継代培養を続け、安定した増殖性を示した系統から二次選抜を行い、形質転換細胞カルス１０株（＃２、３、８、１３、１５、１７、２２、２４、３１、３２）を得た。
【００１６】
＜ＡＣＴ組換え細胞における代謝物分析＞
選抜された形質転換細胞１０株について、ＡＣＴ反応産物であるp-coumaroylagmatineおよびferuloylagmatineの生成を調べるため、これら分析標品の化学合成を行った。
p-coumaric acidまたはferulic acidとN-hydroxysccinimideをＤＣＣ存在下で反応させ、活性エステル（p-coumaroyl-N-hydroxysuccinimide ester、feruloyl-N-hydroxysuccinimide ester）を調製し、このものをagmatineと反応させることで、p-coumaroylagmatineおよびferuloylagmatineを得た。
カルス細胞１００〜１５０ｍｇをエッペンチューブに取り、細胞１００ｍｇあたり１ｍｌのメタノール／２％酢酸を加えて１０分間超音波抽出し、遠心後の上清をＨＰＬＣ分析に供した。
図８に示すように分析標品との保持時間の一致を指標に、p-coumaroylagmatineおよびferuloylagmatineを定量したところ、ＡＣＴ組換え株＃２、３、８、１５、２２、３１の６株において、これら化合物の顕著な生成が認められた。
その際、生成していたのは主にp-coumaroylagmatineであり、feruloylagmatineの生成量は極微量であった。
この結果はＨｖＡＣＴ１酵素の基質特異性と一致するものであった。
すなわち、ＨｖＡＣＴ１酵素がferuloyl-CoAよりもp-coumaroyl-CoAをよい基質とすることから、p-coumaroylagmatineが優先的に合成されたものと考えられる。
【００１７】
＜ＡＣＴ組換え懸濁細胞における代謝物分析＞
カルスにおいてp-coumaroylagmatineの生成が確認された上記６株を、ＭＳ  Ｐ６８０  Ｐｉｃ液体培地を用いた懸濁培養に移し、２週間ごとに同培地で継代培養した。
そのうち、安定した増殖が見られた＃２２株について、増殖促進条件（ＭＳ  Ｐ６８０  Ｐｉｃ）およびリグニン化促進条件（１／２ＭＳ  Ｆｒｅｅ）でそれぞれ培養し、培養８日目の細胞抽出物をＨＰＬＣ分析に供した。
結果を図９に示す。
【００１８】
Ｈ４懸濁細胞野生株（図１、図５）と比較すると、いずれの培養条件においてもp-coumaroylputrescineとferuloylputrescineが減少し、保持時間７．０分、７．８／７．９分のピークが新たに検出された。
特にリグニン化促進条件（１／２ＭＳ  Ｆｒｅｅ）において両ピークの増大が認められた。
Ｒｔ．７．０はp-coumaroylagmatineと、Ｒｔ．７．８／７．９はferuloylagmatineと保持時間が一致することを上記カルス細胞抽出物の分析の際に確認しているが、正確を期すためマススペクトルおよびUV吸収スペクトルを測定し、標品との比較を行った。
Ｒｔ．７．０のマススペクトル分析ではｍ／ｚ＝２７７［Ｍ＋Ｈ］＋のp-coumaroylagmatine標品と同一の分子イオンピークが検出され、UV吸収スペクトル（λｍａｘ：２２４ｎｍ、２９３ｎｍ）も標品と同一であった。
Ｒｔ．７．８／７．９のマススペクトル分析ではｍ／ｚ＝３０７［Ｍ＋Ｈ］＋のferuloylagmatine標品と同一の分子イオンピークが検出され、UV吸収スペクトル（λｍａｘ：２１８ｎｍ、２３４ｎｍ、２９３ｎｍ、３１７ｎｍ）も標品と同一であった。
以上の結果から、Ｒｔ．７．０をp-coumaroylagmatine、Ｒｔ．７．８／７．９をferuloylagmatineと同定した。
【００１９】
＜Ｈ４懸濁細胞野生株およびＡＣＴ組換え株における代謝物蓄積量の経時分析＞
上記実験の結果、増殖促進条件とリグニン化促進条件で代謝物組成が異なることが示唆された。
また、Ｈ４懸濁細胞は２週間おきに継代していることから、増殖／リグニン化の各培養条件下における一連の培養期間中の代謝物蓄積量の変動を経時的に調べることとした。
増殖促進条件としてＭＳ  Ｐ６８０  Ｐｉｃ培地を、リグニン化促進条件として１／２ＭＳ  Ｆｒｅｅ培地および１／２ＭＳ  ＢＡ培地を用いた。
また、ＡＣＴ組換え株として上記安定増殖株＃２２に加え、＃１５も分析に供した。
２週間継代培養したＨ４懸濁細胞の野生株およびＡＣＴ組換え株（＃１５、２２）をそれぞれＭＳ  Ｐ６８０  Ｐｉｃ培地、１／２ＭＳ  Ｆｒｅｅ培地、１／２ＭＳ  ＢＡ培地で細胞密度（ここではsedimented cell volume = ＳＣＶ：沈降細胞量を用いる）を２．５％に合わせ、３００ｍｌ容三角フラスコ中、培地量１００ｍｌで培養を開始した（各条件８本ずつ）。
０日目から１６日目まで１日おきに１フラスコ分を回収し、ＳＣＶ測定および細胞抽出物中の主要代謝物のＨＰＬＣによる定量を行った。
ＳＣＶに基づく細胞の増殖曲線を図１０に示す。
【００２０】
増殖促進条件に注目すると、野生株においては図１０ａに示すように培養１４日目でＳＣＶは約８０％に達し増殖は停止しているが、ＡＣＴ組換え株では図１０ｂ，ｃに示すように＃１５、２２ともに野生株に比べて増殖の立ち上がりが遅く、培養１６日目になっても増殖が続いており、増殖周期が野生株に比べて長くなっているものと思われた。
また、リグニン化促進条件のうち１／２ＭＳ  Ｆｒｅｅ培地では野生株とＡＣＴ組換え株で差はみられないが、１／２ＭＳ  ＢＡ培地では野生株に比べてＡＣＴ組換え株の増殖が抑制されていることが分かった。
主要代謝物蓄積量の経時変化を図１１〜１３に示す。
【００２１】
野生株において、図１１に示すように増殖促進条件ではferuloylputrescineの蓄積がわずかに認められる程度であったが、リグニン化促進条件では１／２ＭＳ  Ｆｒｅｅ、１／２ＭＳ  ＢＡのいずれでも培養に伴って大幅なferuloylputrescineの増加がみられた。
一方、図１２に示すようにＡＣＴ組換え株＃２２においては、いずれの培養条件でも野生株の主要代謝産物であったferuloylputrescineが顕著に減少し、それに代わってＡＣＴ反応産物であるp-coumaroylagmatineが高蓄積しており、特に１／２ＭＳ  ＢＡ条件における蓄積量が最も高かった。
その際、上記のＡＣＴ組換えカルス細胞と同様に、蓄積量はp-coumaroylagmatineに比べて低いながらferuloylagmatineの生成も認められた。
この結果は、フェニルプロパノイド代謝経路および、arginineからagmatineを経由してputrescineを生成するポリアミン代謝経路が活発な細胞にagmatineを基質とするＡＣＴ酵素を導入したことによって、ヒドロキシ桂皮酸putrescineアミド生合成系がヒドロキシ桂皮酸agmatineアミド生合成系にスイッチングされたことによるものであると考えられる（図７）。
図１３に示すようにＡＣＴ組換え株＃１５においてもＡＣＴ反応産物であるp-coumaroylagmatineの高蓄積が見られたが、＃２２株ではp-coumaroylagmatineの生成はferuloylputrescineの減少を伴っていたのに対して、＃１５株ではferuloylputrescineの減少を伴わず、依然としてその蓄積がみられた。
＃１５株ではp-coumaroylagmatineの生成量がいずれの培養条件においても＃２２株の２倍ほど高いが、これは＃１５株のポリアミン代謝経路が＃２２株よりも活発であり、ＡＣＴ酵素に供給されるagmatine量が多いことによるものと考えられる。
その際に、ＡＣＴ酵素で処理しきれなかったagmatineがputrescine生合成に向かい、feruloylputrescineの生成に至っているものと推測される。
それぞれの細胞株について、各培養条件で主要代謝産物の蓄積量が最大に達した培養日数における、培養液１Ｌ中の細胞内の化合物蓄積量を求めた結果を表１に示す。
野生株では主要代謝産物であるferuloylputrescineの最大生産量は、リグニン化促進条件である１／２ＭＳ  Ｆｒｅｅで２０８ｍｇであり、ＡＣＴ組換え株ではferuloylputrescineに代わって主要代謝産物となったp-coumaroylagmatineの最大生産量は、＃１５株ではリグニン化促進条件１／２ＭＳ  ＢＡで３５９ｍｇ、＃２２株ではリグニン化促進条件１／２ＭＳ  Ｆｒｅｅで１７３ｍｇに達した。
このように、植物培養細胞を宿主とした合理的代謝フロースイッチングは、外来二次代謝産物の効率的生産系を確立する際に極めて有用であることが分かった。
【００２２】
【表１】
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【産業上の利用可能性】
【００２３】
本発明は、生合成の目的とする外来二次代謝物の生合成酵素遺伝子が同定されていれば、その生合成前駆体の代謝経路が活発な植物培養細胞にこの生合成遺伝子を導入すればよいので、汎用性が高く、生合成分野における適用範囲は広い。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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