(57)【要約】      （修正有）【課題】皮膚炎症性疾患、障害もしくは症状の治療方法の提供。【解決手段】皮膚において正常にはカスパーゼ−８により制御されているタンパク質をモジュレートすること、または皮膚におけるカスパーゼ−８活性もしくはレベルを増加させることによる、炎症性皮膚疾患、障害もしくは症状の治療または予防であって、（i）カスパーゼ−８またはそのフラグメント、（ii）カスパーゼ−８またはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド、（iii）（ii）のポリヌクレオチドを含む発現ベクターから選択される薬剤を局所投与する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）カスパーゼ−８、（ii）カスパーゼ−８をコードするポリヌクレオチド、（iii）（ii）のポリヌクレオチドを含む発現ベクター、から選択される薬剤の、炎症性皮膚疾患、障害もしくは症状を治療または予防するための医薬の製造における使用であって、炎症性皮膚疾患が乾癬である使用。
【請求項２】
薬剤がカスパーゼ−８である請求項１記載の使用。
【請求項３】
薬剤がカスパーゼ−８をコードするポリヌクレオチドである請求項１記載の使用。
【請求項４】
薬剤が、カスパーゼ−８をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターである請求項１記載の使用。
【請求項５】
医薬が局所投与用である請求項１〜４のいずれかに記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は皮膚疾患、障害もしくは症状の病状（pathology）または経過におけるカスパーゼ−８活性の効果に関する。
【背景技術】
【０００２】
カスパーゼシステインプロテアーゼファミリーのメンバーは様々な細胞死誘導薬剤によって活性化されて一連の細胞死関連細胞タンパク質を切断し、これによってプログラム細胞死（またはアポトーシス）を誘導する。異なった種類のカスパーゼはこの課程で固有の役割を果たしている。エフェクターカスパーゼ（effector caspases）と名付けられたいくつかのカスパーゼは、細胞死に関連した基質の大部分の切断に関わっている。イニシエーターカスパーゼ（initiator caspases）と名付けられた他のカスパーゼは、特異的なＮ末端の認識配列を通じて相互作用する別個の細胞死誘導因子によるそれら自身の活性化につづいて、エフェクターカスパーゼを活性化する働きをする。カスパーゼがリンパ球、造血前駆細胞、内皮細胞およびその他の細胞を含む様々な細胞の中で、生体機能に関与していることを示している証拠が徐々に示されてきている（kangら、2004）。現在までに、これらの非アポトーシス性機能への、また、カスパーゼがこれらの非アポトーシス性機能を調節する機構への、種々のカスパーゼの相対的な寄与については、依然として殆ど知られていない。与えられた状況の中で、カスパーゼの活性化が、死をもたらすのか、または生体機能を促進するのか、を決定している機構がどのようなものであるのかは未だ明らかではない。いくつかの研究は、細胞死の誘導とは異なり、カスパーゼの非アポトーシス性機能は、それらの酵素機能とは関係なく、むしろ、他のシグナル伝達タンパク質のアダプタータンパク質またはアロステリック調節因子としてのカスパーゼの役割に関与していることを示唆している（Chaudharyら、2000）。これに対して、他の研究は、カスパーゼの酵素活性がまさに非アポトーシス性機能に寄与していることを示唆している（Hasegawaら、2005）。
【０００３】
人体のもっとも広範囲でかつ環境に曝される表面として、皮膚は宿主防衛の中心的役割を担っている。皮膚は表皮（epidermis）、真皮（dermis）、および皮下組織（hypodermis）の三つの層からなる。このうち、表皮は皮膚のもっとも外側の層であり、層状の扁平上皮を形成しており、基底層、有棘層、顆粒層および角質層から成り立っている（FuchstとSegre、2000、LavkerとSun、2000）。基底層の表皮ケラチノサイトは増殖能をもち、表皮幹細胞プールを構成する。一過性増殖細胞は、３〜５回さらに細胞分裂を行なった幹細胞である。それらは、その後、基底層から上方へと移動し、最終分化することになる（Potten、1981、AdamsとWatt、1990）。
【０００４】
ケラチノサイトの増殖と分化はＥＧＦ、トランスフォーミング成長因子（transforming-growth factor）（ＴＧＦ）−α、ヘパリン結合型ＥＧＦ類似因子（heparin binding EGF-like factor）（ＨＢ−ＥＧＦ）、アンフィレグリン（amphiregulin）、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、ＴＧＦ−β、インシュリン様成長因子（insulin-like growth factor）、血小板由来成長因子（platelet derived growth factor）（ＰＤＧＦ）、へパトサイト成長因子（ＨＧＦ）、ＩＬ−６、ＩＬ−１およびＴＮＦ−αを含む数多くの成長因子とサイトカインにより調節される（BennettとSchultz、1993、PeusとPittelkow、1996、Martin、1997）。
【０００５】
アトピー性皮膚炎（ＡＤ）は慢性的な炎症性皮膚疾患であるが、これは年齢に関わらず起こり、また、子供に非常によく見られるものである。ＡＤは子供の１０％以上および大人の１〜３％に発症すると報告されている。
【０００６】
ＡＤは正常なアトピー性でない個人にとっては無害である環境素因的なトリガーに対する皮膚の非常に高い反応性に関係している。現在までに、ＡＤの診断のための客観的な臨床検査は存在せず、そして、診断は幼児および子供の掻痒（pruritus）、顔面、伸筋に沿った（extensor）湿疹（eczema）、さらに、大人の屈面性湿疹（flexural eczema）、湿疹の慢性化といった臨床的な観察に基づいて行われている。ＡＤの診断は、また、病変の分布と継続期間、またしばしばアトピー性障害の家族歴、苔蘚化（lichenification）の存在に基づいても行われる（MERK  マニュアル  オンライン）。アトピー性皮膚炎は幼児の脂漏性皮膚炎（seborrheic dermatitis）やいかなる年代にも発症する接触性皮膚炎と差別化することがしばしば困難であるので、医師は確信的な診断を下すまでに、数度にわたって患者を診察しなければならない。
【０００７】
皮膚への水分補給（skin hydration）、刺激物を避けること、抗ヒスタミン剤、局所的なコルチコステロイド剤（corticosteroids）およびより新しい局所的免疫モジュレーター（immunomodulators）がＡＤ治療の中心である。しかしながら、ＡＤは通常、治療に対して難治性であり、局部的かつ体系的な局所用ステロイド剤の副作用は広く知られるところである。
【０００８】
ＡＤに関する免疫的な基礎の理解がこの疾患を治療するための新しいアプローチの開発のためには必要である。ＡＤは血清中のＩｇＥレベルの上昇、アレルギー性鼻炎、喘息、フードアレルギーといった抹消の好酸球増加症によって特徴付けられる疾患と症状に関係しており、また、ＡＤに悩まされている患者の大部分は、徐々にアレルギー性鼻炎や喘息を発症する。
【０００９】
Leung（2004）による最近のレビューは、ＡＤの免疫学的特徴についてまとめている。たとえば、大部分のＡＤ患者は高い循環好酸球（circulating eosinophils）値を持ち、また、Ｔ細胞の機能不全によって引き起こされる、イムノグロブリンＥ（ＩｇＥ）レベルの増加が見られる。ＩＬ−４、ＩＬ−５、およびＩＬ−１３の増加を引き起こすＴｈ２細胞の頻度の高さがＡＤをもつ患者の抹消血液に示されている。ＡＤにおけるＴｈ２細胞の発達（development）に寄与する要因として、サイトカイン、サイトカイン（ＩＬ−４）生産における遺伝子の差異、薬理要因（ＣＡＭＰフォスフォジエステラーゼ活性の増加したモノサイト）そして抗原提示細胞（Ｔｈ２細胞への皮膚のアレルゲン提示に役割をもつ、増加したＩｇＥをもつランゲルハンス細胞）があげられる。
【００１０】
ＩＬ−４およびＩＬ−３は生殖細胞転写（germline transcription）のレベルにおけるＩｇＥ生産の増加を促進する唯一のサイトカインである。ＩＬ−５は、好酸球生成（eosinophilopoiesis）、活性化、走化性（chemotaxis）を誘起する。好酸球は、反応性に富むＯ２中間体と毒性のある顆粒タンパク質の遊離によって細胞を傷つけるサイトカインと伝達物質（mediator）を分泌する。好酸性顆粒タンパク質はＡＤの血清中で増加しており、これは疾患の活性と関連している。
【００１１】
乾癬は乾燥した、境界のはっきりした（well-circumscribed）、銀色状の様々なサイズの落屑性丘疹で特徴付けられる、よくみられる慢性かつ再発しやすい疾患である。
【００１２】
乾癬は１つまたは２つの病変から、広範囲にわたる湿疹まで、重篤性が異なり、しばしば関節の不全、または剥離と関係している。乾癬の原因は知られていないが、厚い落屑（scaling）は、伝統的に表皮細胞増殖の増加と付随的な真皮の炎症が原因であると考えられてきた。免疫抑制剤であるシクロスポリンに対する乾癬の反応は、プライマリーな病原因子は免疫学的であるかもしれないことを暗示している。約２〜４％の白人および、より少数の黒人が感染する。乾癬の発病は一般的に１０歳から４０歳の間であるが、しかし、どの年代も除外されることはない。乾癬の家族歴もまた一般的である。
【００１３】
乾癬の発病は通常段階的である。典型的な疾患過程は、頻度と期間の異なる慢性化した寛解と再発（また時々の急性な悪化）の１つである。乾癬の憎悪（flares）を引き起こす要因は、局所的な外傷（koebnerの現象においては、病変は外傷を受けた場所に現れる）、そして、しばしば炎症（koebnerの現象の変異形）、深刻な日焼け、ヴァイルマイア（viremia）、アレルギー性の対薬剤反応、局部的かつ体系的薬剤（すなわち、クロロキン（chloroquine）対マラリア治療である、リチウム剤（lithium）、ブロッカー薬（-blockers）、インターフェロン剤（interferon-）など）、または体系的なコルチコステロイド剤の使用中止を含む。一部の患者（特に子供の場合）は、急性のＡ型溶連菌ＵＲＩの感染後、乾癬性皮疹をおこす可能性がある。
【００１４】
乾癬は特徴的に（耳介後部の領域を含む）頭皮、四肢伸側（extensor surface of the extremities）（特にひじおよびひざ）、仙骨神経領域（sacral area）、臀部、そしてペニスに現れる。爪、眉毛、脇の下、臍、肛門領域にもまた発症する。しばしば、疾患はジェネラライズされる。
【００１５】
典型的な病変は鋭角に区切られ、様々に掻痒性であり、卵形または環形の紅斑性丘疹（erythematous papules or plaques）であり、重なり合った肉厚な銀色状の雲母のようなまたはわずかにオパールのような輝きを持つ鱗屑（scales）で覆われている。丘疹はしばしば延伸し互いにくっつきあって、環状およびらせん状の大きな斑をつくるが、この現象は皮膚のＴ細胞リンパ腫でより一般的である。病変は瘢痕を伴うことなく治癒し、髪の毛の成長には通常変化は見られない。爪の障害は３０〜５０％の患者におこり、点刻（stippling）、穴（pitting）、傷み（fraying）、脱色、または爪甲の末端と外側縁との剥離（爪甲離床症）（onycholysis）、肥大化（thickening）、爪甲の下への角質細胞の残骸（hyperkeratotic debris）の蓄積など、真菌感染に臨床的に類似している。
【００１６】
乾癬性紅皮性（erythrodermic psoriasis）（剥脱性乾癬性皮膚炎(exfoliative psoriatic dermatitis)）は治療に対し難治性である。全ての皮膚の表面は赤くなり、細かい鱗屑で覆われており、典型的な乾癬性病変というものはおそらく不明瞭か全く見られないかもしれない。全身衰弱をもたらし、入院加療を必要とする場合もある。
【００１７】
膿疱性乾癬（pustular psoriasis）は無菌性の膿胞によって特徴付けられ、ジェネラライズされる（von Zumbusch型）か、手のひらまたは足の裏（Barber型乾癬）に局在化している。
【００１８】
乾癬は脂漏性湿疹、インサイチュー（in situ）扁平上皮細胞癌（Bowen型疾患、特に体幹に存在する場合、二期梅毒（secondary syphilis）、皮膚糸状菌感染、皮膚紅斑性狼瘡、湿疹、苔癬、バラ色粃糠疹、引っかき傷による局所的な湿疹（慢性単純性苔癬(lichen simplex chronicus)）、と混同されるかもしれない。しかしながら、視診による診断が困難をともなうことは少ない。すなわち、たとえばくっきりとした領域をもつ乾燥した、うず高い、大きな銀色上の鱗屑をともなう乾癬の病変は通常、脂漏性湿疹の広範性でグリーシーな黄色身を帯びた鱗屑から識別可能であるためである。
【００１９】
典型的な病変の生検で見つかることは、一般的に特徴的であるが、異形な病変は異型な特徴をもち、生検をあまり役に立たないものにする。すなわち、その他の皮膚疾患が顕微鏡的診断を困難または疑わしいものにするかもしれない乾癬様の組織学的特徴をもつことがある。
【００２０】
乾癬の予後は疾患に罹患初期の範囲と深刻度に依存している。ふつう、罹患が早い年齢で起こるほど、深刻度も増す。急性の罹患は一般的に治癒するが、永久的な寛解はまれである。
【発明の概要】
【００２１】
本発明は（i）カスパーゼ−８またはそのフラグメント、（ii）カスパーゼ−８またはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド、（iii）（ii）のポリヌクレオチドを含む発現ベクター、（iv）カスパーゼ−８のレベルまたは活性の活性化剤、（v）カスパーゼ−８活性化の天然阻害剤（natural inhibitor）に対する阻害剤、（vi）皮膚中でカスパーゼ−８活性によって正常には下方調節されるタンパク質の活性またはそのレベルに対する阻害剤、（vii）皮膚中でカスパーゼ−８により正常には上方調節されるタンパク質のレベルまたは活性に対する活性化剤から選択される薬剤の、炎症性皮膚疾患、障害もしくは症状を予防または治療するための医薬の製造における使用に関する。
【００２２】
本発明の目的の１つは、皮膚炎症性疾患、障害もしくは症状の治療方法であって、必要とする被験体に治療的に有効量の、（ｉ）カスパーゼ−８またはそのフラグメント、（ii）カスパーゼ−８またはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド、（iii）（ii）のポリヌクレオチドを含む発現ベクター、（iv）カスパーゼ−８のレベルまたは活性に対する活性化剤、（v）カスパーゼ−８活性化の天然阻害剤に対する阻害剤、（vi）皮膚中でカスパーゼ−８活性によって正常には下方調節されるタンパク質のレベルまたは活性に対する阻害剤、（vii）皮膚中でカスパーゼ−８活性により正常には上方調節されるタンパク質のレベルまたは活性に対する活性化剤から選択される分子を投与することを含む方法を提供することである。
【００２３】
カスパーゼ−８レベルまたは活性の活性化剤は、ＦＡＤＤ、カスパーゼ−６、カスパーゼ−３またはＴＮＦ／ＮＧＦファミリーの受容体を含むが、これらに限定されるものではない。
【００２４】
カスパーゼ−８活性化の天然阻害剤に対する阻害剤はｃＦＬＩＰショート、ｃＦＬＩＰロングの阻害剤、そしてｃＦＬＩＰショート、ｃＦＬＩＰロング、またはカスパーゼ−８およびカスパーゼ−１０関連ＲＩＮＧタンパク質に特異的なｓｉＲＮＡやｓｈＲＮＡなどのカスパーゼ−８およびカスパーゼ−１０関連ＲＩＮＧタンパク質である。
【００２５】
カスパーゼ−８の活性により皮膚中で正常には下方調節されるタンパク質の活性またはレベルに対する阻害剤である薬剤は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、およびそれらの相同ヒト遺伝子から選択される配列によりコードされるタンパク質の活性またはレベルに対する阻害剤である。本発明の実施様態は、薬剤が配列番号２またはその相同ヒト遺伝子に示される配列によってコードされるタンパク質の活性またはレベルに対する阻害剤である。本発明の別の実施様態は、薬剤が配列番号３またはその相同ヒト遺伝子に示される配列によってコードされるタンパク質の活性またはレベルに対する阻害剤である。他の実施様態では、阻害剤が配列番号１によって、好ましくは配列番号２、配列番号３またはそれらの相同ヒト遺伝子に示される配列によってコードされるタンパク質に特異的なｓｉＲＮＡやｓｈＲＮＡであるものである。
【００２６】
一実施様態では、疾患はアトピー性皮膚炎である。
【００２７】
他の実施様態では、疾患は乾癬である。
【００２８】
本発明のさらなる実施様態では、薬剤は局所的に使用されるかまたは投与される。
【００２９】
別の側面では、本発明は、薬学的に許容され得る担体と、配列番号１、配列番号２および配列番号３および／またはそれらの相同ヒト遺伝子の配列によってコードされるタンパク質の発現のレベルまたは活性に対する阻害剤とを含む医薬組成物に関する。
【００３０】
一実施様態では、本発明は、薬学的に許容され得る担体と、配列番号１、配列番号２および／またはそれらの相同ヒト遺伝子の配列によってコードされるタンパク質の発現のレベルまたは活性に対する阻害剤とを含む医薬組成物に関する。
【００３１】
別の実施様態では、本発明は、薬学的に許容され得る担体と、配列番号１、配列番号３および／またはそれらの相同ヒト遺伝子の配列によってコードされるタンパク質の発現のレベルまたは活性に対する阻害剤とを含む医薬組成物に関する。
【００３２】
さらなる別の実施様態では、本発明は、薬学的に許容され得る担体と、配列番号２、および配列番号３および／またはそれらの相同ヒト遺伝子の配列によってコードされるタンパク質の発現のレベルまたは活性に対する阻害剤とを含む医薬組成物に関する。
【００３３】
別の実施様態では、阻害剤は、配列番号１、配列番号２、配列番号３またはそれらの相同ヒト遺伝子に示される配列によってコードされるタンパク質の発現を止めることのできるｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡである。
【００３４】
別の実施様態では、阻害剤は、配列番号２、配列番号３またはそれらの相同ヒト遺伝子に示される配列によってコードされるタンパク質に特異的なｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡである。
【００３５】
さらに別の実施様態では、医薬組成物はアトピー性皮膚炎の治療のためのものである。
【００３６】
また別の実施様態では、医薬組成物は乾癬の治療のためのものである。
【００３７】
また別の側面として、本発明は、個体における皮膚中のカスパーゼ−８欠損と関連する皮膚疾患、障害もしくは症状、または該皮膚疾患、障害もしくは症状を発症する素因の診断のための方法であって、被験体の皮膚サンプルおよび少なくとも１つの健常対照個体の皮膚サンプル中で、カスパーゼ−８の発現レベルまたは活性を測定すること、および／または被験体からの皮膚サンプル中のカスパーゼ−８をコードする核酸の異常を検知することを含み、該少なくとも１つの健常対照個体のサンプルと比較した場合の被験体のサンプル中のカスパーゼ−８の活性または発現レベルの減少の検出、および／または被験体のカスパーゼ−８をコードする核酸の異常の検出が、該皮膚疾患、障害もしくは症状、または被験体の該皮膚疾患、障害もしくは症状を発症する素因を示す方法を提供する。
【００３８】
一実施様態では、この方法は、上皮ケラチノサイトでのカスパーゼ−８欠損に関連する皮膚疾患、障害もしくは症状、または該皮膚疾患、障害もしくは症状を発症する素因を個体において診断するためのものである。
【００３９】
さらに、ある実施様態では、この方法は、アトピー性皮膚炎を診断するためのものである。
【００４０】
さらに、他の実施様態では、この方法は、乾癬を診断するためのものである。
【００４１】
さらなる側面として、本発明は、個体における炎症性皮膚疾患、障害もしくは症状、または該皮膚疾患、障害もしくは症状を発症する素因を診断する方法であって、被験体の皮膚サンプルおよび少なくとも１つの健常対照個体の皮膚サンプルにおいて、配列番号１、配列番号２および配列番号３に示される遺伝子に相同なヒト遺伝子によってコードされるタンパク質の発現レベルまたは活性を測定することを含み、該少なくとも１つの健常対照個体のサンプルと比較した場合の被験体のサンプル中の配列番号１、配列番号２および配列番号３に示される遺伝子に相同なヒト遺伝子によってコードされるタンパク質の発現レベルまたは活性の増加の検出が、該皮膚疾患、障害もしくは症状、または被験体の該皮膚疾患、障害もしくは症状を発症する素因を示す方法を提供する。
【００４２】
さらなる別の側面として、本発明は、個体における炎症性皮膚疾患、障害もしくは症状、または該皮膚疾患、障害もしくは症状を発症する素因を診断する方法であって、被験体の皮膚サンプルおよび少なくとも１つの健常な対照個体の皮膚サンプルにおいて、配列番号２に示される遺伝子に相同なヒト遺伝子によってコードされるタンパク質の発現レベルまたは活性を測定することを含み、該少なくとも１つの健常対照個体のサンプルと比較した場合の被験体のサンプル中の配列番号２に示される遺伝子に相同なヒト遺伝子によってコードされるタンパク質の発現レベルまたは活性の増加の検出が、該皮膚疾患、障害もしくは症状、または被験体の該皮膚疾患、障害もしくは症状を発症する素因を示す方法を提供する。
【００４３】
さらなる別の側面では、本発明は、個体における炎症性皮膚疾患、障害もしくは症状、または該皮膚疾患、障害もしくは症状を発症する素因を診断する方法であって、被験体の皮膚サンプルおよび少なくとも１つの健常対照個体の皮膚のサンプルにおいて、配列番号３に示される遺伝子に相同なヒト遺伝子によってコードされるタンパク質の発現レベルまたは活性を測定することを含み、該少なくとも１つの健常対照個体のサンプルと比較した場合の被験体のサンプル中の配列番号３に示される遺伝子に相同なヒト遺伝子によってコードされるタンパク質の発現レベルまたは活性の増加の検出が、該皮膚疾患、障害もしくは症状、または被験体の該皮膚疾患、障害もしくは症状を発症する素因を示す方法を提供する。
【００４４】
なおさらなる側面では、本発明は、個体における炎症性皮膚疾患、障害もしくは症状、または該皮膚疾患、障害もしくは症状を発症する素因を診断する方法であって、被験体の皮膚サンプルおよび少なくとも１つの健常対照個体の皮膚のサンプルにおいて、ＩＳＧ１５（Ｇｌｐ２）、Ｃｘｃｌ１０、Ｃ９０ｒｆ２６と呼ばれる９２３０１１７Ｎ１０Ｒｉｋ（ＩＬ３３）のヒトオルソログ、ＩＬ１９、Ｓｐｒｒ２ｆ、Ｓ１００ａ９、ＩＬ−６、ＭＭＰ１３、Ｃｃｌ３またはＩＬ１ｂから選択されるタンパク質の１つ、またはそれ以上、すなわち２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、もしくは全部の発現レベルまたは活性と、９２３０１１７Ｅ２０Ｒｉｋ（配列番号２）に相同なヒト遺伝子によってコードされるタンパク質、または２０１０００２Ｎ０４Ｒｉｋ（配列番号３）に相同なヒト遺伝子によってコードされるタンパク質の発現レベルまたは活性とを測定することを含み、該少なくとも１つの健常対照個体のサンプルと比較した場合の被験体のサンプル中のＩＳＧ１５（Ｇｌｐ２）、Ｃｘｃｌ１０、Ｃ９０ｒｆ２６と呼ばれる９２３０１１７Ｎ１０Ｒｉｋ（ＩＬ３３）のヒトオルソログ、ＩＬ１９、Ｓｐｒｒ２ｆ、Ｓ１００ａ９、ＩＬ−６、ＭＭＰ１３，Ｃｃｌ３またはＩＬ１ｂから選択されるタンパク質の１つ、またはそれ以上、すなわち２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、もしくは全部の発現レベルまたは活性と、９２３０１１７Ｅ２０Ｒｉｋ（配列番号２）に相同なヒト遺伝子によってコードされるタンパク質、または２０１０００２Ｎ０４Ｒｉｋ（配列番号３）に相同なヒト遺伝子によってコードされるタンパク質の発現レベルまたは活性との増加の検出が、該皮膚疾患、障害もしくは症状、または被験体の該皮膚疾患、障害もしくは症状を発症する素因を示す方法を提供する。
【００４５】
本発明の一実施様態では、皮膚サンプルにおけるタンパク質の発現レベルまたは活性の測定が逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）分析、イムノアッセイ、インサイチュハイブリダイゼーション分析および／または酵素活性を測定することによってなされる。
【００４６】
本発明の一実施様態では、皮膚サンプルは表皮からなる。
【００４７】
本発明のさらなる一実施様態では、炎症性皮膚疾患はアトピー性皮膚炎である。
【００４８】
本発明の他のさらなる一実施様態では、炎症性皮膚疾患は乾癬である。
【００４９】
別の側面では、本発明は炎症性皮膚疾患、障害または症状の動物モデルの作出方法であって、ケラチノサイトにおけるカスパーゼ−８の発現レベルまたは活性が停止されている動物を作り上げることを含む。その方法は、動物の上皮ケラチノサイトにおけるカスパーゼ−８をノックアウトすること、またはカスパーゼ−８  ＢＡＣ−Ｃ３６２Ｓ突然変異体（mutant）などの酵素活性を欠いたカスパーゼ−８突然変異体のトランスジェニック（transgenic）発現を動物に誘導することを用い得る。動物モデルはマウス動物モデルであり得る。
【００５０】
一実施様態では、アトピー性皮膚炎のための動物モデルの作出方法が提供される。
【００５１】
他の実施様態では、乾癬のための動物モデルの作出方法が提供される。
【００５２】
本発明は、炎症性疾患、障害もしくはその症状といった、皮膚疾患、障害もしくはその症状の病状または経過に関与し、発現レベルまたは活性が皮膚におけるカスパーゼ−８活性によって正常には調節されている標的タンパク質を同定する方法であって、カスパーゼ−８の発現レベルまたは活性が停止されている上皮ケラチノサイトを含む皮膚サンプルにおける遺伝子発現のプロファイルを、正常なカスパーゼ−８の発現レベルまたは活性を有する上皮ケラチノサイトを含む皮膚サンプルにおける遺伝子発現のプロファイルと比較する工程、正常なカスパーゼ−８の発現レベルまたは活性を有する上皮ケラチノサイトを含む皮膚のサンプルにおいてカスパーゼ−８によってその発現が、正常には上方調節または下方調節される遺伝子、およびカスパーゼ−８の発現レベルまたは活性が停止されている上皮ケラチノサイトを含む皮膚サンプルにおいてその発現が下方調節または上方調節される遺伝子をそれぞれ評価する工程を含み、カスパーゼ−８の発現レベルまたは活性が停止されている上皮ケラチノサイトを含むサンプルにおいてその発現が下方調節または上方調節される遺伝子が、該皮膚疾患、障害もしくはその症状の病状または経過に関与する、候補標的タンパク質をコードする方法に関する。
【００５３】
本発明の一実施様態では、疾患はアトピー性皮膚炎である。
【００５４】
本発明の別の実施様態では、疾患はアトピー性乾癬である。
【００５５】
さらに別の側面では、本発明は、配列番号２に示される遺伝子に相同なヒト遺伝子によってコードされ、炎症性皮膚疾患、障害もしくはその症状の病状または経過に関与する標的タンパク質を提供する。
【００５６】
さらに別の側面として、本発明は、配列番号３に示される遺伝子に相同なヒト遺伝子によってコードされ、炎症性皮膚疾患、障害もしくはその症状の病状または経過に関与する標的タンパク質を提供する。
【００５７】
ある側面では、本発明は、皮膚炎症性疾患、障害もしくは症状の治療または予防のための候補化合物をスクリーニングする方法であって、カスパーゼ−８の発現レベルまたは活性が停止されているケラチノサイトを含む細胞の培養物を提供すること、該細胞にテスト化合物を導入すること、細胞の培養液中のカルシウム濃度を増加させることによって細胞分化を誘発すること、テスト化合物の存在下または非存在下で、皮膚の分化マーカーおよび／またはｐ２１ＡＲＦの発現レベルを測定することを含み、テスト化合物の存在下における皮膚の分化マーカーの発現レベルの増加、および／またはｐ２１ＡＲＦの減少が、テスト化合物が該疾患、障害もしくは症状の治療または予防のための候補化合物であることを示す方法を提供する。
【００５８】
本発明の一実施様態では、分化マーカーはケラチン１、フィラグリン（filagrin）、および／またはロリクリン（loricrin）である。
【００５９】
ある側面では、本発明はまた、皮膚炎症性疾患、障害または症状を治療するための候補化合物の有効性をテストするための方法であって、本発明によって作出される動物モデルに候補のテスト化合物を投与することおよび該動物モデルにおいて皮膚の病状の予防または軽減を評価することを含む方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１Ａ】酵素的に不活性なカスパーゼ−８を発現させたトランスジェニックマウスが炎症性皮膚疾患を発症していることを示す。左側のパネルは各サンプルにおけるＰＣＲジェノタイピングを示しており、サンプルは（左から右へ）内因性のカスパーゼ−８遺伝子のみをもつ対照マウス（＋／＋）、内因性のカスパーゼ−８遺伝子とＢＡＣ由来のカスパーゼ−８をもつトランスジェニックマウス（＋／＋ＢＡＣ）、カスパーゼ−８バックグラウンドを部分的にノックアウトしたＢＡＣカスパーゼ−８をもつトランスジェニックマウス（カスパーゼ−８の１つの対立遺伝子のみがノックアウトされている）（＋／−ＢＡＣ）、およびカスパーゼ−８バックグラウンドのフルノックアウトのＢＡＣカスパーゼ−８のみをもつトランスジェニックマウス（−／−ＢＡＣ）である。子宮内で死亡したカスパーゼ−８フルノックアウトマウスの場合と異なり、−／−ＢＡＣマウスは生存できた。右側のパネルの初めの半分はＰＣＲのジェノタイピングを示しており、サンプルは（左から右へ）、＋／＋、＋／＋ＢＡＣ、および＋／＋ＢＡＣ  Ｃ３６２Ｓ（残基３６２のシステインがセリンに代えられている酵素活性を持たない突然変異体カスパーゼ−８のＢＡＣをもつ）である。右側のパネルの二番目の半分は始めの半分のものと同じサンプルかつ同じ順番のものであるが、野生型のカスパーゼ−８から突然変異体ＢＡＣ−Ｃ３６２Ｓと区別するためにＨｉｎｄ  ＩＩＩで制限されたものである。ＨｉｎｄＩＩＩはＢＡＣ−Ｃ３６２Ｓ突然変異体のカスパーゼ−８を確かに切断する（矢印）、しかし、内因性またはＢＡＣ  ＷＴカスパーゼ−８は切断しない。
【図１Ｂ】酵素的に不活性なカスパーゼ−８を発現させたトランスジェニックマウスが炎症性皮膚疾患を発症していることを示す。サンプル中のカスパーゼ−８発現のウエスタンブロット分析を示し、サンプルは対照マウス（＋／＋）または内因性カスパーゼ−８に加えて、同起源のカスパーゼ−８プロモーターにより制御されるトランスジェニックなＢＡＣカスパーゼ−８を発現させたトランスジェニックマウス（＋／＋ＢＡＣ）の、（左から右へ）肝臓、脾臓、腎臓、胸腺、肺、脳、および皮膚である。上部のパネルはカスパーゼ−８の合計（内因性およびトランスジェニック）のレベルを示している。１番目のレーンは＋／＋マウスの所定の組織内のカスパーゼ−８のレベルを、二番目のレーンは、内因性およびトランスジェニック起源から発現されたカスパーゼ−８をもつ＋／＋ＢＡＣマウスの同じ組織におけるカスパーゼ−８を示している。中央のパネルはトランスジェニックマウスのみに存在するＧＦＰを示しており、そのレベルはトランスジェニックなカスパーゼ−８の発現レベルと密接な相関関係にある（カスパーゼ−８およびＧＦＰの発現はともに同起源のカスパーゼ−８プロモーターの制御下にある）。下側のパネルはそれぞれ異なるレーンにロードしたタンパク質の量の対照としてのアクチンのレベルを示している（約２５μｇの組織溶解物/レーン）。対照およびトランスジェニックマウスにおけるカスパーゼ−８の合計およびＧＦＰの発現の観察されたパターンは、トランスジェニックカスパーゼ−８は内因性カスパーゼ−と同様に、肝臓、脾臓、腎臓、胸腺、および肺で高いレベルで発現されているが、脳では発現されなかったことを示している。また、内因性およびトランスジェニックカスパーゼ−８はともに、皮膚で発現することが観察された。これゆえ、同起源のカスパーゼ−８プロモーターは内因性およびトランスジェニックカスパーゼ−８の両方の、類似の組織特異的な発現を可能にしている。
【図１Ｃ】酵素的に不活性なカスパーゼ−８を発現させたトランスジェニックマウスが炎症性皮膚疾患を発症していることを示す。カスパーゼ−８バックグラウンドの部分的ノックアウト（Ｃａｓｐ８＋／−）の突然変異体カスパーゼ−８（ＢＡＣ  Ｃ３６２Ｓ）を発現しているトランスジェニックマウスの生後５日（Ｐ５）、生後７日（Ｐ７）、および生後１４日（Ｐ１４）の一般的な外観を示す。図の結果は、酵素活性が欠損しているミュータントカスパーゼ−８を発現しているマウスは、たとえ内因性カスパーゼ−８の存在下であっても、時間と共に進行する皮膚疾患を発症することを示している。
【図１Ｄ】酵素的に不活性なカスパーゼ−８を発現させたトランスジェニックマウスが炎症性皮膚疾患を発症していることを示す。生後０日（Ｐ０）と生後７日（Ｐ７）の、ＢＡＣ  Ｃ３６２Ｓをもつトランスジェニックマウスおよび対照マウスのヘマトキシリン/イオシンで染色した皮膚の区分の組織学的分析を示す。図に示された結果は、対照マウス（ＷＴ）ではＰ０（生後２４時間以内）での表皮層はＰ７の場合よりもより厚かったことを表している。Ｐ０では、トランスジェニックマウスと対照マウスの組織学的パターンに明らかな違いは見られなかった。Ｐ７では、突然変異体カスパーゼ−８を発現しているトランスジェニックマウスにおいて細胞の湿潤と厚みを増した表皮によって明確に示される違いが見られた。
【図１Ｅ】酵素的に不活性なカスパーゼ−８を発現させたトランスジェニックマウスが炎症性皮膚疾患を発症していることを示す。上記の実験で使用されたＢＡＣの修飾の概要の図によって表している（材料と方法を参照）。
【図２Ａ】カスパーゼ−８を表皮特異的にノックアウトしたマウスが炎症性皮膚疾患を発症することを示す。上のパネルは、Ｃａｓｐ−８fl/-Ｃｒｅ−またはＣａｓｐ−８fl/-Ｃｒｅ＋マウスの（左から右へと）皮膚全体、表皮、および真皮からのサンプルにおけるカスパーゼ−８欠失をゲノムＰＣＲにより見積もっている。下のパネルは、Ｋ５Ｃａｓｐ−８fl/-Ｃｒｅ−またはＫ５Ｃａｓｐ−８fl/-Ｃｒｅ＋マウスの表皮または真皮からのサンプルにおけるカスパーゼ−８欠失をウエスタンブロット分析により見積もっている。
【図２Ｂ】カスパーゼ−８を表皮特異的にノックアウトしたマウスが炎症性皮膚疾患を発症することを示しており、Ｐ７  ＲＯＳＡ２６Ｃａｓｐ−８fl/+Ｋ５−Ｃｒｅ(上部パネル)およびＲＯＳＡ２６ＣＣａｓｐ−８fl/-Ｋ５−Ｃｒｅマウス(下部パネル)の皮膚からの細胞区分におけるβガラクトシダーゼ発現の分析を示している。結果は、マウスの毛嚢および表皮における特異的なＣｒｅ誘導性の発現（より濃い染色）を支持している。
【図２Ｃ】カスパーゼ−８を表皮特異的にノックアウトしたマウスが炎症性皮膚疾患を発症することを示しており、生後の異なる時間における野生型(上部パネル)およびＴＮＦ−／−ノックアウトバックグラウンド（下部パネル）でのＣａｓｐ−８fl/-Ｋ５−Ｃｒｅマウスの表現型を示している。得られた結果はＴＮＦ欠損マウスではカスパーゼ−８欠損によって媒介される皮膚疾患の始まりは予防されないが、遅らされる。
【図２Ｄ】カスパーゼ−８を表皮特異的にノックアウトしたマウスが炎症性皮膚疾患を発症することを示しており、Ｋ５Ｆ／−マウス（Ｃａｓｐ−８fl/-Ｋ５−Ｃｒｅマウス）およびＴＮＦ-/-Ｋ５ＦＩ／−マウスの生存曲線を示している。図に示された結果はＴＮＦ欠損は表皮特異的にカスパーゼ−８をノックアウトしたマウスの死を遅らせることを表している。
【図３Ａ】Ｃａｓｐ−８fl/-Ｋ５−Ｃｒｅにおける組織学的分析と皮膚の炎症の評価を示す。Ｐ０（左側）とＰ７(右側)の表皮をターゲットしたカスパーゼ−８欠損マウス（sＫＯ,下部のパネル）とＷＴマウス（上部のパネル）のヘマトキシリン／エオシン染色を表している。Ｐ０では、ＷＴとカスパーゼ−８欠損マウスとの間で違いはまったく認められなかった。ｐ７では、Ｃａｓｐ−８fl/-Ｋ５−Ｃｒｅ  Ｐ７マウスの真皮において細胞性の増加が認められた。
【図３Ｂ】Ｃａｓｐ−８fl/-Ｋ５−Ｃｒｅにおける組織学的分析と皮膚の炎症の評価を示しており、Ｐ７における、マクロファージ（Ｆ４／８０抗体）、ＷＴマウスもしくはＣａｓｐ−８fl/-Ｋ５−Ｃｒｅマウスの皮膚区分における好酸球(フェノールレッド取り込み)とＴリンパ球（抗ＣＤ３抗体）の染色を示している。図中の結果はマクロファージと好酸球の湿潤とを示しているが、Ｃａｓｐ−８fl/-Ｋ５−Ｃｒｅマウスの皮膚のT細胞では見られなかった。同一の染色パターンがＴＮＦＲ１−/−バックグラウンドのＣａｓｐ−８fl/-Ｋ５−Ｃｒｅにおいて観察された（データは示していない）。注目すべきは好酸球もまたＣａｓｐ−８fl/-Ｋ５−Ｃｒｅマウスの表皮中の膿疱に蓄積していることである。これらの結果は皮膚を標的としたカスパーゼ−８欠損マウスに発症している皮膚疾患が炎症性であることを示している。
【図３Ｃ】Ｃａｓｐ−８fl/-Ｋ５−Ｃｒｅにおける組織学的分析と皮膚の炎症の評価を示しており、Ｐ３マウスの表皮病変の領域における炎症の制限を示している。真皮の細胞性の一般的な増加（上部パネル）、Ｆ４/８０−陽性細胞の蓄積（中央のパネル）、および表皮の活性化に対するマーカーである抗ケラチン６による染色（下部パネル）が表皮が肥大化した領域（点線で線引きされた領域）に限られていることを示している。
【図４Ａ】カスパーゼ−８欠損表皮の免疫組織学的分析を示している。右側のパネルはＷＴマウス（左側）の皮膚、Ｃａｓｐ−８fl/-Ｋ５−Ｃｒｅマウスの皮膚病変（中央）、同じＣａｓｐ−８fl/-Ｋ５−Ｃｒｅマウスの深刻な皮膚病変（右側）の部位のＰ７における免疫染色を表している。基底層マーカーであるＫ１４の免疫染色はＣａｓｐ−８fl/-Ｋ５−Ｃｒｅ表皮の至るところにこのタンパクの発現が延伸していることを示している。すなわち、分化マーカーＫ１（顆粒層）インボルクリン(角質層)、フィラグリン(角質層)、およびロリクリン(角質層)に対する染色はＰ７でのより深刻なＣａｓｐ−８fl/-Ｋ５−Ｃｒｅ病変領域での組織化されていない局在化、マーカーの減少、および次第にこれらのタンパクの完全な喪失を表すようになる。さらに、一般的な表皮活性化のマーカーである抗Ｋ６による大量染色を示している。これらの変化はひとつとして、Ｐ０（左側パネル）およびＰ１（データは示していない）では認められなかった。
【図４Ｂ】カスパーゼ−８欠損表皮の免疫組織学的分析を示しており、Ｐ０（左側パネル）およびＰ７（右側パネル）におけるＷＴおよびＫＯマウスの皮膚区分のｃＪｕｎリン酸化に対する免疫染色を表している。異なる皮膚区分をテストしてもいかなる違いも見られなかった。
【図４Ｃ】カスパーゼ−８欠損表皮の免疫組織学的分析を示しており、Ｐ７でのＣａｓｐ−８fl/+Ｋ５−ＣｒｅおよびＣａｓｐ−８fl/-Ｋ５−Ｃｒｅの表皮におけるアポトーシスを評価するためのＴＵＮＥＬ染色（右側）および細胞増殖を決定するＫｉ６７染色（左側）を示している。結果はアポトーシスの増加（矢印で示されている）とＣａｓｐ−８fl/-Ｋ５−Ｃｒｅマウスの皮膚サンプルにおける細胞増殖の増加を示している。
【図５】皮膚の層およびそれぞれの皮膚層における特異的タンパクの発現の概略図を表している。皮膚には２つの大きな層（真皮および表皮）が存在する。表皮は基底層、有棘層（上基底層）、粉留層、および角質層の４層からなっている。それぞれの層は異なるタンパクを発現している。
【図６】０．１２ｍＭのカルシウムに暴露に続き所定の時間（時間）溶解された、Ｐ３のＣａｓｐ−８fl/+Ｋ５−ＣｒｅおよびＣａｓｐ−８fl/-Ｋ５−Ｃｒｅマウス由来の培養されたケラチノサイトからの全てのタンパク質のウエスタンブロット分析を示している。フィラグリン（Ｆｉｌａ）およびロリクリン（Ｌｏｒｉ）が最終分化のマーカーとして、ケラチン１（ＣＫ１）が中間分化マーカーとして使用された。ケラチン１４（ＣＫ１４）はローディングコントロールとして用いられた。図に示された結果は正常なカスパーゼ−８を発現している細胞とは異なり、カスパーゼ−８欠損細胞はＣａ２＋によって誘発される分化マーカーである、ｆｉｌａ、ｌｏｒｉ、ＣＫ１を示さないことを表している。
【図７Ａ】所定の時間（時間）０．１２ｍＭのカルシウムの存在下培養された付加ケラチノサイトにおける分化マーカーの発現を示している。付加ケラチノサイトからの全体の細胞抽出物（１５μｇ）がウエスタンブロットによって分析された。Ｐ０以外の、Ｐ１、Ｐ４でのＣａｓｐ−８fl/+Ｋ５−ＣｒｅおよびＣａｓｐ−８fl/-Ｋ５−Ｃｒｅマウスからの培養されたケラチノサイトのおける分化マーカーの不完全な発現を、ロリクリンおよびフラグリンに対する抗体を用いたウエスタンブロットによって示している。
【図７Ｂ】所定の時間（時間）０．１２ｍＭのカルシウムの存在下培養された付加ケラチノサイトにおける分化マーカーの発現を示している。付加ケラチノサイトからの全体の細胞抽出物（１５μｇ）がウエスタンブロットによって分析された。Ｐ３の培養液のＣａｓｐ−８fl/+Ｋ５−Ｃｒｅケラチノサイト中でのカルシウム刺激下での適応するｐ２１の分解とロリクリン発現の欠損を示している。
【図８Ａ】Ｃａｓｐ−８fl/-Ｋ５−Ｃｒｅにおける遺伝子発現の上方調節をＲＴ−ＰＣＲによって示している。ＲＮＡはカスパーゼ８欠損または野生型の動物の出生前（Ｄ−１）、生後直後（Ｐ０）、または１日（Ｐ１）、２日（Ｐ２）、３日（Ｐ３）、５日（Ｐ５）に表皮から単離され、Ｇｌｐ２、Ｃｘｃｌ１０、９２３０１１７Ｎ１０Ｒｉｋ（ＩＬ３３)、ＩＬ１９、ｌｆｌ２０２ｂ、２０１０００２Ｎｏ４Ｒｉｋ（配列番号３）、Ｓｐｒｒ２ｆ、Ｓ１００ａ９、ＩＬ−６、９２３０１１７Ｅ２０Ｒｉｋ（配列番号２）、ＭＭＰ１３、Ｃｃｌ３、Ｒｐｔｎ、ＩＬ１ｂ、ＩＬ１ａおよびアクチンベータ(対照として)の１６の遺伝子の発現をリアルタイムＰＣＲによって決定するために使用された。ヒートマップの下の括弧内の数字は、それぞれの示された遺伝子のｍＲＮＡ発現の顕著な増加を示しているカスパーゼ−８欠損動物の全体数（全体で２２匹テストされたうち）を示している。顕著なｍＲＮＡｓの上方調節を示すカスパーゼ８欠損個体の割合がヒートマップの方形中に表されている。
【図８Ｂ】Ｃａｓｐ−８fl/-Ｋ５−Ｃｒｅにおける遺伝子発現の上方調節をＲＴ−ＰＣＲによって示している。図８Ａと同じ分析を示しているが、ＴＮＦ−／−バックグラウンドでカスパーゼ８欠損動物からのサンプルで行われたものである。
【図９】Ｓ１００Ａ９のｍＲＮＡ発現がノックアウトマウスの皮膚の病変において劇的に上方調節されていることをインサイチュハイブリダイゼーション分析によって示している。検知はＤｉｇラベルされたｓ１００ａ９プローブを用いて行われた。
【図１０Ａ】カスパーゼ８欠損皮膚におけるｓｔａｔ１およびｓｔａｔ３の活性化を示している。リン酸化されたｓｔａｔ１、ｓｔａｔ３、および全体のｓｔａｔ３のウエスタンブロット分析が、カスパーゼ−８−（ＫＯ）およびカスパーゼ−８＋（ＷＴ）マウス（Ｐ４，２個体）の上皮から抽出された全体のタンパク質のサンプルで行われた。同じサンプルのアクチンレベルがローディングコントロールとして見積もられた。
【図１０Ｂ】カスパーゼ−８欠損皮膚におけるカスパーゼ−１４の活性化を示している。ウエスタンブロット分析が、カスパーゼ−１４の活性化とプロセッシングの程度を示すためにカスパーゼ−８−（ＫＯ）およびカスパーゼ−８＋（ＷＴ）マウス（Ｐ４，２個体）の上皮から抽出された全体のタンパク質のサンプルで行われた。
【図１０Ｃ】カスパーゼ−８欠損皮膚におけるｓ１００ａ８タンパク質の差異的発現を示している。Ｓ１００ａ８のレベルはカスパーゼ−８−（ＫＯ）およびカスパーゼ−８＋（ＷＴ）マウス（Ｐ４，２個体）から抽出された表皮、真皮、および全体の皮膚のサンプルのウエスタンブロット分析によって決定された。
【発明を実施するための形態】
【００６１】
本発明により、皮膚におけるカスパーゼ−８の欠損が炎症性皮膚疾患の発症に関連しているということが見出された。本発明者らは、明らかに内因性のカスパーゼ−８の活性を阻害する、酵素的に不活性なカスパーゼ−８（ＢＡＣ−Ｃ３６２Ｓ）のマウスにおけるトランスジェニック発現、または、マウスにおけるケラチノサイト中のカスパーゼ−８の特異的な欠失が、炎症性の皮膚肥厚を誘発することを見出した。本発明者らはまた、ケラチノサイト分化の停止がカスパーゼ−８の活性の欠損によって誘導される病状に関与することを見出した。驚くべきことに、ケラチノサイトにおけるカスパーゼ−８の特異的な欠失を有するマウス（Ｃａｓｐ−８fl/-Ｋ５−Ｃｒｅマウス）または酵素的に不活性なカスパーゼ−８を発現するトランスジェニックマウス（Ｃａｓｐ−８-/+／ＢＡＣ−Ｃ３６２Ｓマウス）の表皮は、アトピー性皮膚炎（ＡＤ）患者の表皮と類似の特徴、たとえば、損傷部位での好酸球の局所的な増加、およびＴＨ２応答の誘発などを示した。
【００６２】
皮膚炎症性疾患、障害または症状の発症は、皮膚におけるカスパーゼ−８欠損により引き起こされるという本発明による知見は、該疾患、障害または症状の治療または予防のための新しい療法の開発に道をつけるものである。
【００６３】
したがって、本発明は、皮膚中のカスパーゼ−８によって正常には制御されるタンパク質をモジュレートすることによる、または皮膚中のカスパーゼ−８を増加させることによる、炎症性皮膚疾患、障害もしくは症状の予防または治療に関する。よって、ある側面では、本発明は、カスパーゼ−８またはそのフラグメント、カスパーゼ−８またはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含むベクター、カスパーゼ−８のレベルまたは活性の活性化剤、カスパーゼ−８活性化の天然阻害剤に対する阻害剤、皮膚中でカスパーゼ−８活性によって正常には下方調節されるタンパク質のレベルまたは活性に対する阻害剤、および皮膚中でカスパーゼ−８活性により正常には上方調節されるタンパク質のレベルまたは活性に対する活性化剤から選択される薬剤の、炎症性皮膚疾患、障害もしくは症状を治療または予防するための医薬の製造における使用に関する。
【００６４】
本出願人によるＵＳ  ６，３９９，３２７および同６，５８６，５７１は、参考文献として本願明細書に組み込まれるものであるが、とりわけカスパーゼ−８（または、以前にＭＡＣＨと定義されていたもの）のアミノ酸配列およびカスパーゼ−８をコードするヌクレオチド配列、カスパーゼ−８のプロテアーゼ（つまり酵素）活性のアッセイ、ならびにカスパーゼ−８のＭＯＲＴ−１（またはＦＡＤＤ）タンパク質への結合について開示しているものである。
【００６５】
本発明による「フラグメント」は、カスパーゼ−８の活性フラグメントであり得る。フラグメントという用語は、カスパーゼ−８分子のどのような部分集合、すなわち、カスパーゼ−８の所望の生物学的活性を保持している、より短いペプチドをも意味する。フラグメントは、カスパーゼ−８のどちらかの末端からアミノ酸を取り除くことによって、および、結果的にえられたフラグメントの酵素活性をテストすることによって容易に製造され得る。プロテアーゼが、ポリペプチドのＮ末端もしくはＣ末端のどちらかから一度に１つずつのアミノ酸を取り除くために使用され得ることは公知である。これゆえ、望ましい生物学的活性を保持しているフラグメントを決定することは、単なる機械的なやり方である実験のみを含み、本出願のＵＳ６，３９９，３２７号および同６，５８６，５７１号に記載されている。
【００６６】
カスパーゼ−８と定性的にまったく同じ生物学的活性を有する修飾されたカスパーゼ−８分子も、本発明によって本明細書に包含されていることを理解すべきである。これらの修飾されたカスパーゼ−８には、（ｉ）突然変異タンパク質（muteins）、１または複数のアミノ酸残基が欠失、または異なるアミノ酸残基で置換され、および／または１または複数のアミノ酸残基が付加された類似体であって、元のタンパク質と比べて得られた生成物の活性度が大幅に変化することなく、そして既知の合成および／または部位特異的突然変異誘発法の技術によって得られる類似体、（ii）依然として薬学的に許容され、すなわち、タンパク質の活性を壊していない限りで、アミノ酸残基の側鎖における官能基、またはＮおよび／またはＣ末端基の化学的置換によって得られる機能性誘導体（たとえば、エステル、アミドおよびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の側鎖を含み得る）、ならびに（iii）ポリペプチドのカルボキシル基の塩およびアミノ基の酸付加塩の両方を含む塩、が含まれる。
【００６７】
本発明はまた、炎症性皮膚疾患、障害もしくは症状の治療または予防のための医薬の製造における、カスパーゼ−８もしくはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド、または、該ポリヌクレオチドを含む発現ベクターの使用に関する。
【００６８】
本明細書において使用される場合、「核酸分子」または「ポリヌクレオチド」という用語は、一本鎖または二本鎖のどちらかの形であるデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド重合体を意味しており、他で特に示されない限り、天然に存在するヌクレオチドと同様に機能することのできる天然に存在するヌクレオチドの既知の類似体を含むポリヌクレオチドを包含する。核酸分子がＤＮＡ配列によって表される場合、これはまた、対応するＲＮＡ配列（「Ｕ」（ウリジン）が「Ｔ」（チミジン）に取って替わっている）を有するＲＮＡ分子を含むことは理解されるであろう。
【００６９】
本発明のポリヌクレオチドは、縮重コドンを含む、および／または該ポリヌクレオチドの相補配列に高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、ポリヌクレオチドも含む。
【００７０】
「ストリンジェントな条件」という用語は、核酸のハイブリダイゼーション反応で使用される温度およびイオン条件を意味している（Ausubelら、Current Protocols in Molecular Biology, supra, Interscience, NY., §§6.3 および 6.4 (1987、1992）、および Sambrookら、(Sambrook, J. C., Fritsch, E. F.,および Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY)。ストリンジェントな条件は配列依存であり、異なる環境パラメータ下では異なっている。一般的に、ストリンジェントな条件は、定義されたイオン強度とｐＨにおける特異的な配列の融解温度（Ｔｍ）よりも、約５〜１０℃または５〜２０℃低い温度となるように選択される。Ｔｍは、定義されたイオン強度とｐＨにおいて、標的配列の５０％が、完全に合致したプローブにハイブリダイズする温度である。ストリンジェントな条件とは、塩濃度が約１．０Ｍナトリウムイオン未満、典型的にはｐＨ７．０〜８．３で約０．０１〜１．０Ｍナトリウムイオン（もしくは他の塩）であり、そして温度が短いプローブの場合（たとえば、１０〜５０ヌクレオチド）少なくとも３０℃、長いプローブの場合（たとえば、５０ヌクレオチドより長い）約６０℃である条件であり得る。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドなどの不安定化薬剤の添加によっても達成される。ストリンジェントな条件の例は、研究対象であるハイブリッドの推定Ｔｍより５〜１０℃低い温度で、たとえば、２×ＳＳＣおよび０．５％ＳＤＳ中で５分、２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中で１５分；０．１×ＳＳＣおよび０．５％ＳＤＳ中、３７℃で３０〜６０分、そしてその後、０．１×ＳＳＣおよび０．５％ＳＤＳ中、６８℃で３０〜６０分の洗浄条件を含む。
【００７１】
本発明のポリヌクレオチドはまた、縮重コドンを含むポリヌクレオチドをも含む。遺伝子コードの縮重のため、多くの機能的に同一なポリヌクレオチドが任意の所定のポリペプチドをコードする。たとえば、コドンＣＧＵ、ＣＧＣ、ＣＧＡ、ＣＧＧ、ＡＧＡおよびＡＧＧはすべてアミノ酸のアルギニンをコードする。したがって、アルギニンがコドンにより特定されるすべての位置で、コドンはコードされたポリペプチドを変えることなく記載された対応するいかなるコドンにも変えられることができる。通常はメチオニンに対する唯一のコドンであるＡＵＧ、および通常はトリプトファンに対する唯一のコドンであるＵＵＧを除いて、ポリヌクレオチドにおけるそれぞれのコドンは標準的な技術によって機能的に同一な分子を得るように改変されうる。
【００７２】
発現ベクターは本技術分野においてよく知られており、たとえば、Current Protocols in Molecular Biologyなどに記載されている。発現ベクターはプラスミドベクターでも、ウイルスベクターでもその類似物でもよい。一般的に、ベクターは本発明のポリヌクレオチドによってコードされるものとは独立している選択可能なマーカーを含み、そしてさらに、プロモーターやポリアデニレーション（polyadenylation）のシグナル伝達配列といった転写制御エレメント、またはリボソーム結合部位などの翻訳制御エレメントを含む。プロモーター配列は、そこに作動可能に連結されるポリヌクレオチドの組織特異的な発現を提供する。一実施様態では、プロモーターは皮膚細胞中で活性である。
本発明の別の実施様態では、プロモーターは表皮細胞中で活性である。
【００７３】
本発明は、また、皮膚炎症性疾患、障害または症状におけるカスパーゼ−８のレベルまたは活性の活性化剤の使用を提供する。
【００７４】
本明細書の記載における「タンパク質の活性化剤」という用語は、タンパク質、ヌクレオチドおよび低分子などの任意の薬剤を意味し、該タンパク質の生成および／または作用を上方調節することができるものである。たとえば、カスパーゼ−８の活性化剤は皮膚中でカスパーゼ−８の上流に働く分子であり得る。
【００７５】
カスパーゼ−８の活性化剤の例としては、ＦＡＤＤ、カスパーゼ−８を切断することのできるカスパーゼ、すなわちカスパーゼ−６およびカスパーゼ−３、および間接的には、ＴＮＦ／ＮＧＦファミリーの種々のデス受容体が挙げられるが、これらに限定されるものではない。的確な細胞のセットアップ次第で、ｃＦＬＩＰロングもまたカスパーゼ−８活性化剤として働く。
【００７６】
カスパーゼ−８の内因性の生成を誘発および／または促進するためのベクターは、本発明によるカスパーゼ−８の活性化剤としてもまた考慮される。ベクターは、カスパーゼ−８の発現を促進することのできる制御配列を含む。このような制御配列は、たとえば、プロモーターまたはエンハンサーである。制御配列はその後、相同的組み替えによりゲノムの正しい座に導入され、それにより、制御配列が、誘導または促進されることを必要とする遺伝子と作動可能に連結する。その技術は通常、「内因性遺伝子活性化」（ＥＧＡ）と言及されるものであり、それはたとえば、ＷＯ９１／０９９５５に記載されており、文献引用により本明細書に完全に組み入れられているものである。
【００７７】
本発明はまた、皮膚の炎症性疾患、障害または症状におけるカスパーゼ−８活性化の天然阻害剤に対する阻害剤の使用を提供する。
【００７８】
次にあげるものは、カスパーゼ活性化に対する天然阻害剤の例であって、これらの活性またはレベルは本発明によって阻害され得る。これら天然阻害剤は、（ｉ）ｃＦＬＩＰショート（ＣＡＳＨベータ）、（ii）ｃＦＬＩＰロング（ＣＡＳＨアルファ）、（iii）カスパーゼ−８およびカスパーゼ−１０関連ＲＩＮＧタンパク質（CARPs, McDonald ER 3rd, El-Deiry WS, Proc Natl Acad Sci USA. 2004 Apr 20; 101(16）: 6170-5）を含むが、これらに限定はされない。
【００７９】
本発明において意味される「阻害剤」という用語は、タンパク質（たとえば、特異的な抗体）、ヌクレオチド（たとえば、特異的なアンチセンスおよび低分子干渉ＲＮＡｓ［ｓｉＲＮＡ］）、ならびにタンパク質の生成および／または作用が、減衰、低減、または部分的、実質的もしくは完全に抑制、またはブロックされるような方法で、該タンパク質の生成および／または作用を下方調節できるような特異的な阻害機能をもつ低分子をさす。
【００８０】
たとえば、特異的なｓｉＲＮＡは、特異的なｍＲＮＡ標的の転写後のサイレンシングのために使用されうる（DorsettおよびTuschl 2004）。ＲＮＡｉにおける標的特異性は、ＲＮＡ−ＲＮＡの配列認識および塩基対合を通じてなされる。ｓｉＲＮＡは、典型的には１９〜２１塩基対の長さであり、各３’末端で突出している２つのヌクレオチドを有する二本鎖ＲＮＡである。最大限の安定のために、２つの２’デオキシヌクレオチドが３’の突出として用いられる。またその代わりに、遺伝子抑制（gene silencing）の効率の向上を示していることから、２７塩基の平滑末端のヌクレオチドも使用可能である（Kim, Behlkeら、2005）。ｓｉＲＮＡの細胞への運搬は、リポソームへのカプセル化または高脂溶性薬剤への共有結合によって促進される（Soutschekら、2004）。
【００８１】
発現の阻害剤のその他の例は、特異的な短いヘアピン構造を有するＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である。ｓｈＲＮＡ発現ベクターを構築するための設計およびクローニングストラテジーは技術的に知られている（McIntyreおよびGregoryら、BMC Biotechnology 2006, 6:1）。
【００８２】
ある側面では、本発明は、皮膚中でカスパーゼ−８の活性により正常には下方調節されるタンパク質のレベルまたは活性の阻害剤の、炎症性皮膚疾患、障害もしくは症状の治療または予防における使用に関する。
【００８３】
皮膚中でカスパーゼ−８の活性により正常には下方調節されるタンパク質は、皮膚中のカスパーゼ−８の活性またはレベルが妨げられたとき、上方調節されるようになる。次にあげるものは、正常には皮膚中でカスパーゼ−８活性により直接的または間接的に下方調節されるタンパク質の非限定的な例であり、本発明により見出されたものである。すなわち、ＩＳＧ１５（Ｇｌｐ２）、Ｃｘｃｌ１０、Ｃ９０ｒｆ２６と呼ばれる９２３０１１７Ｎ１０Ｒｉｋ（ＩＬ３３）のヒトオルソログ、ＩＬ１９、Ｓｐｒｒ２ｆ、Ｓ１００ａ９、ＩＬ−６、ＭＭＰ１３、Ｃｃｌ３、ＩＬ１ｂおよび９２３０１１７Ｅ２０Ｒｉｋ（配列番号２）、２０１０００２Ｎ０４Ｒｉｋ（配列番号３）によってコードされるタンパク質に対する相同ヒトタンパク質のような未知の機能のタンパク質である。
【００８４】
一実施様態では、本発明は、配列番号１、好ましくは、配列番号２および／または配列番号３またはそれらの相同ヒト遺伝子によりコードされるタンパク質のレベルまたは活性を阻害することのできる阻害剤の使用に関する。阻害剤は、配列番号１、望ましくは、配列番号２、配列番号３および／またはそれらの相同ヒト遺伝子に特異的なｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡである。
【００８５】
配列番号１に示される配列によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列は配列番号４であり、配列番号２に示される配列によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列は配列番号５であり、配列番号３に示される配列によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列は配列番号６である。
【００８６】
もう１つの側面では、本発明は、皮膚中でカスパーゼ−８活性により正常には活性化または上方調節されるタンパク質のレベルまたは活性に対する活性化剤の、炎症性皮膚疾患、障害もしくは症状の治療または予防における使用に関する。これらのタンパク質は、以下に述べるような皮膚の炎症性疾患、障害もしくは症状の病状または経過に関与する標的タンパク質を同定またはスクリーニングのための本発明に基づく方法によって同定またはスクリーニングされることができる。
【００８７】
本発明による薬剤または分子は、様々な方法または経路で使用され得る。たとえば、薬剤または分子は、局所的に、皮膚中に、皮膚にまたは皮膚上に使用でき、また、上皮または内皮組織を通じて吸収させることができる。
【００８８】
本発明者らは、本発明によって、カスパーゼ−８欠損によって媒介される炎症性肥厚化が上皮基底層における細胞分裂の促進を示しており、分化を抑制しているにも関わらず、病理学的状態はアポトーシス不全とは関連していないことを見出した。実際、Ｃａｓｐ−８-/+／ＢＡＣ−Ｃ３６２ＳとＣａｓｐ−８fl/-Ｋ５−Ｃｒｅとの上皮組織中の瀕死の細胞（dying cells）の発生率は、正常な上皮組織に比べ高かった（図４Ｃ）。加えて、カスパーゼ−８欠損の上皮組織における病理学的状態は、角化不全（cornification failure）とケラチノサイトの死の停止とは無関係であった（図１Ｄ）。実際、角化はケラチノサイトの死によるものであるにも関わらず、この細胞死はアポトーシスの特性の大部分を表していない。
【００８９】
機能が未だに知られていない唯一のカスパーゼ、カスパーゼ−１４は、上皮細胞中で独自に発現し、角化の間に切断されることが再現性良く示されている（Takahashiら、1998、Lippensら、およびLippensら、2003）。本発明者らは、本発明によって、カスパーゼ−１４の切断または活性化はカスパーゼ−８欠損によって媒介される炎症性の肥厚化に影響していないことを見出した。
【００９０】
酵素的に不活性なカスパーゼ−８の過剰発現がＮＦ−κＢ活性化の引き金となること、および、カスパーゼ−８の非アポトーシス性機能の少なくとも１部分に関与していると考えられる酵素的に不活性なカスパーゼ−８のホモログであるｃＦＬＩＰのシグナリング伝達活性の証拠を考慮して、カスパーゼ−８の非アポトーシス性機能はそれ自身の酵素活性には依存していないと技術的には推測されてきた。しかしながら、カスパーゼ−８のＴ細胞の増殖に対する寄与は、その酵素的な機能に依存することが、最近技術的に示された。後者の場合、その証拠は、ｐ６５／ｐ５０  ＮＦ−κＢ二量体の活性化におけるカスパーゼ−８の酵素機能の役割として表されていた。本発明者らは、本発明によって、表皮の分化におけるカスパーゼ−８の役割がその酵素的能力には依存しないことを見出した。
【００９１】
カスパーゼ−８欠損表皮の病状は多少ｐ６５ＮＦ−κＢ欠損の皮膚に見られるものと似ている（Zhangら、2004）が、これら２つのケースで関係している細胞の事象は異なっているように見える。たとえば、表皮でのｐ６５ＮＦ−κＢ活性の停止はケラチノサイトの過剰な増殖という結果を生み、カスパーゼ−８欠損の場合と異なり、基底層の際立った肥厚化によって明示されるが、ケラチノサイトの分化には影響を及ぼさないように見える。さらには、ケラチノサイトにおけるＮＦ−κＢ活性化の停止から生じる皮膚の病状がＪｕｎリン酸化反応（Jun phosphorylation）の過度な増加に起因したものであり、完全にＴＮＦの機能に依存しているのに対し、カスパーゼ−８欠損から生じる病状はＪｕｎリン酸化反応のいかなる増加も伴わず、そして、ＴＮＦによって促進されるにも関わらず、それに完全に依存しているわけではない。これゆえ、カスパーゼ−８欠損から生じる病状は、ｐ６５／ｐ５０  ＮＦ−κＢ二量体の活性化の制御におけるカスパーゼ−８の役割を反映しているものではないと考えられる。実際、本発明者らは本発明により、カスパーゼ−８欠損の上皮をもつモデルマウスにおけるこれらのＮＦ−κＢタンパク質の核転座の程度を正常なマウスと比較しても差が見られないことを見出した。
【００９２】
本発明者らの発見は、カスパーゼ−８遺伝子をケラチノサイトに特異的に欠失させたマウスが炎症性の皮膚障害を発症し、それは、ある程度ＴＮＦによって持続させられることを示している。しかしながら、本発明者らは本発明によって、病状を開始させる不十分な分化がカスパーゼ−８の細胞自律的な（cell-autonomous）役割を反映しており、それは、ＴＮＦからは独立しているが、カスパーゼ−８の酵素活性には依然依存していることを見出した。
【００９３】
本発明によって得られた結果は、本発明の薬剤を投与されることによって好ましくは治療または予防される皮膚疾患が、皮膚中およびとくに表皮中におけるカスパーゼ−８欠損によって引き起こされる炎症性疾患で見出されるものに似た、１または複数の組織学的および／または免疫学的特性を表す皮膚疾患であって、該皮膚疾患が、（i）真皮中での白血球の蓄積、大部分が単核性のファゴサイトおよび／または好酸球；（ii）ＴまたはＢリンパ球いずれかの増加の欠如；（iii）表皮中、特に上皮病変でのケラチン６の発現；（iv）ケラチン１４（Ｋ１４）の基底層上部（suprabasal）での著しい発現；（v）Ｋ６およびＫ１４の全ての生存能力のある層における発現；（vi）基底層上部でのケラチン１（Ｋ１）の発現の減少または欠如；（vii）ケラチン１、ロリクリンおよびフィラグリンから選択される１または複数の皮膚の分化マーカーの減少または欠如；（viii）ＩＳＧ１５（Ｇｌｐ２）、Ｃｘｃｌ１０、Ｃ９０ｒｆ２６と呼ばれる９２３０１１７Ｎ１０Ｒｉｋ（ＩＬ３３）のヒトオルソログ、ＩＬ１９、Ｓｐｒｒ２ｆ、Ｓ１００ａ９、ＩＬ−６、ＭＭＰ１３、Ｃｃｌ３またはＩＬ１ｂから選択される１つ、またはそれ以上、すなわち２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つもしくは全部のタンパク質の発現の増加；（ix）配列番号２または配列番号３によってコードされるタンパク質に相同なヒトタンパク質の発現の増加；（ｘ）ＩＬ−４、ＩＬ−５（このサイトカインによって媒介される好酸球の増加によって証明された、Kupperら、2004）およびＩＬ−１９の増加した発現によって支持されるＴＨ２応答の増加；（xi）Ｓｔａｔ−１およびＳｔａｔ−３の表皮中での活性化；（xii）真皮中でのＳ１００Ａ８の上方調節；ならびに（xiii）カスパーゼ−１４のプロセッシングへの障害がないことから選択される特徴の１つ、またはそれ以上、すなわち２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つもしくは全部を含む皮膚疾患であることを示している。たとえば、ＡＤはＣａｓｐ−８fl/-Ｋ５−ＣｒｅマウスおよびＣａｓｐ−８−／＋／ＢＡＣ−Ｃ３６２Ｓマウスの表皮に見出される性質と類似した、好酸球の蓄積やＴＨ２応答の増加などの性質を有するため、本発明による薬剤は、ＡＤに似ている疾患を治療することに使用することができる。
【００９４】
したがって、カスパーゼ−８またはそのフラグメント、カスパーゼ−８またはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含むベクター、カスパーゼ−８の活性またはレベルの活性化剤、カスパーゼ−８活性の天然阻害剤に対する阻害剤、皮膚中でカスパーゼ−８活性により正常には下方調節されるタンパク質の活性またはレベルの阻害剤、皮膚中でカスパーゼ−８活性により正常には上方調節されるタンパク質の活性またはレベルの活性化剤から選択される薬剤を投与することによって、最適に治療または予防される疾患は、乾癬とアトピー性皮膚炎とを含むが、これらに限定はされない。
【００９５】
さらなる本発明の側面は、炎症性皮膚炎、障害もしくは症状の病状または経過に関与する標的タンパク質を同定する方法に関する。本発明によって本発明者らは、皮膚疾患、障害もしくは症状の病状または経過に関与し、その発現レベルまたは活性が正常には皮膚中のカスパーゼ−８活性によって調節される標的タンパク質を同定する方法であって、カスパーゼ−８の発現レベルまたは活性が停止されている上皮ケラチノサイトを含む皮膚サンプル中の遺伝子発現のプロファイルを正常なカスパーゼ−８の発現レベルまたは活性を有する上皮ケラチノサイトの皮膚サンプル中の遺伝子発現のプロファイルと比較すること、ならびに正常なカスパーゼ−８の発現レベルまたは活性をもつ上皮ケラチノサイトを含む皮膚サンプル中においてカスパーゼ−８によって発現が正常には上方調節または下方調節され、かつカスパーゼ−８の発現レベルまたは活性が停止されている上皮ケラチノサイトを含むサンプル中ではその発現が下方調節または上方調節される遺伝子を評価することを含み、カスパーゼ−８の発現レベルまたは活性が停止されている上皮ケラチノサイトを含むサンプル中で発現が下方調節または上方調節される遺伝子が、該皮膚疾患、障害および症状の病状または経過に関与する候補標的タンパク質をコードする方法を開発した。
【００９６】
ある実施様態では、本発明の方法はヒトまたはマウス由来の皮膚のサンプルを用いる。
【００９７】
遺伝子発現のプロファイルは、以下の実施例に示されるように、マイクロアレイ分析やウエスタンブロット分析、インサイチュハイブリダイゼーション、およびＲＴ−ＰＣＲなどいった技術的に良く知られた手段によって測定することができる。本発明の一実施様態では、遺伝子発現のプロファイルは、本願発明の非限定的な実施例で行われるような、ジーンアレイによってモニターされる。
【００９８】
本発明の方法を使用することで、本発明者らはカスパーゼ−８の活性化が停止されている上皮ケラチノサイトを含む皮膚のサンプル中で発現が上方調節される以下の遺伝子（およびコードされるタンパク質）、ＩＳＧ１５（Ｇｌｐ２）、Ｃｘｃｌ１０、Ｃ９０ｒｆ２６と呼ばれる９２３０１１７Ｎ１０Ｒｉｋ（ＩＬ３３）のヒトオルソログ、ＩＬ１９、Ｓｐｒｒ２ｆ、Ｓ１００ａ９、ＩＬ−６、ＭＭＰ１３、Ｃｃｌ３、ＩＬ１ｂを同定した。これらの遺伝子は炎症の過程に関係している。これゆえ、本発明の一実施様態の方法では、本発明の方法は乾癬およびアトピー性皮膚炎といった炎症性皮膚疾患、障害もしくは症状の経過または病因に関与している標的遺伝子（またはコードされるタンパク質）の同定を可能にした。配列番号１によってコードされるタンパク質、および９２３０１１７Ｅ２０Ｒｉｋ（配列番号２）および２０１０００２Ｎ０４Ｒｉｋ（配列番号３）によってコードされる未知の機能をもつタンパク質が、本発明の方法によって、ここで積極的に選択された。これらのタンパク質または相同ヒトタンパク質は皮膚中でカスパーゼ−８によって調節されるため、それらは、皮膚の発達および／もしくは恒常性（homeostasis）において役割を果たしている。そして、これゆえ、それらは、炎症性皮膚疾患、障害もしくは症状の病状または経過に関与している標的タンパク質の候補である。
【００９９】
これゆえ、配列番号１、配列番号２、および／または配列番号３に対応する遺伝子またはそれらの相同ヒト遺伝子の発現に対する阻害剤、および／または該遺伝子でコードされるタンパク質の阻害剤は、アトピー性皮膚炎または乾癬といった皮膚の炎症性疾患、障害もしくは症状の治療または予防に有益である。
【０１００】
これゆえ、ある側面として、本発明は、炎症性皮膚疾患、障害もしくは症状の治療または予防のための薬剤の製造における、配列番号１、配列番号２、および／または配列番号３に対応する遺伝子またはそれらの相同ヒト遺伝子の阻害剤、および／またはそれぞれの該遺伝子でコードされるタンパク質の阻害剤の使用に関する。
【０１０１】
別の側面としては、本発明は、薬学的に許容され得る担体と、配列番号１、配列番号２および配列番号３から選択される配列を含む遺伝子またはそれらの相同ヒト遺伝子の阻害剤、および／または該遺伝子によってコードされるタンパク質の阻害剤とを含む、たとえば、アトピー性皮膚炎または乾癬といった皮膚の炎症性疾患、障害もしくは症状の治療または予防のための医薬組成物に関する。
【０１０２】
ある実施様態では、本発明は、薬学的に許容され得る担体と、配列番号２の配列を含む遺伝子またはその相同ヒト遺伝子の阻害剤および／または該遺伝子によってコードされるタンパク質の阻害剤とを含む医薬組成物に関する。
【０１０３】
他の実施様態では、本発明は、薬学的に許容され得る担体と、配列番号３の配列を含む遺伝子またはその相同ヒト遺伝子の阻害剤および／または該遺伝子によってコードされるタンパク質の阻害剤とを含む医薬組成物に関するものである。
【０１０４】
さらなる本発明の実施様態では、医薬組成物における阻害剤は、配列番号１、好ましくは、配列番号２、配列番号３またはそれらの相同ヒト遺伝子に特異的なｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡである。
【０１０５】
主要なエフェクターカスパーゼであるカスパーゼ−３の機能に関する文献（Okumuraら、2004）は、さまざまな薬剤による死誘発におけるカスパーゼ−３の関与を除いても、カスパーゼ−３は、妊娠中期（midgestation）として知られる胚発育の間のある特定の段階で、マウスの皮膚の表皮の分化の誘導に関わっていることを明らかにしている。実際、カスパーゼ−３の酵素活性は、皮膚の胚発育の間の最終分化にむけたケラチノサイトの寄与を維持するために不可欠である。
【０１０６】
本発明者らは本発明によって、胚形成の初期の段階で、まさに内因性のカスパーゼ−８、およびケラチン５誘導性のＣａｓｐ−８fl/-Ｋ５−ＣｒｅマウスにおけるＣｒｅ発現が胚形成段階で起こるように、Ｃａｓｐ８ＢＡＣ−Ｃ３６２Ｓトランスジェニックがマウスに発現されているにも関わらず、これらのマウスの皮膚の病状が生後３日より以前では明らかでないことを発見した。出生の時点では、組織学上の皮膚の特徴は野生型マウスのものと区別がつかず、これは、カスパーゼ−３とは異なり、カスパーゼ−８が皮膚の上皮の胚形成において欠失可能であることを暗示している。
【０１０７】
本発明によって、皮膚中でのカスパーゼ−８の発現を標的として除去した場合、増殖性が増し、胚ケラチノサイト中ではなく、出生後に後期分化マーカーの発現が減少したので、カスパーゼ−８は出生後の表皮の形態形成においてカスパーゼ−３と同様な役割を果たしていることが示された。
【０１０８】
カスパーゼ−３の妊娠中期の固有の段階におけるケラチノサイト分化の調節への寄与は、Ｎｏｔｃｈ−１により誘導されるこの段階におけるカスパーゼ−３の発現の増加に関係しており、そして、後者のキナーゼの活性化における、カスパーゼ−３によって引き起こされるＰＫＣ−ｄのプロセッシングの役割を反映していると考えられてきた。一方、本発明者らは、カスパーゼ−８欠損はケラチノサイトにおける分化タンパク質の誘導に先んじて起こるｐ２１の下方調節に影響を及ぼすことを発見した。
【０１０９】
皮膚の正常な恒常性と皮膚の病理学的異常は表皮と真皮との間の、また、同様にこれらの二つの層のそれぞれの細胞間の、様々な可溶性伝達物質の遊離を介しての絶え間ないクロストークによって、影響されている。本発明者らは本発明によって、カスパーゼ−８が存在しない場合に観察される表皮の病状は、大部分は白血球である炎症性の細胞の真皮中への蓄積に関連しており、これらの炎症性細胞によって、ケラチノサイトそれ自身によって、またはおそらくその両者によって作られる、ＴＮＦの機能に強く影響を受けることを発見した。培養液中のケラチノサイトの分化能の評価を通じて、本発明者らはこれらの細胞の分化プログラムは、真皮中に白血球が蓄積する明らかに以前の、生後約１日で、カスパーゼ−８依存の状態にシフトすること、そしてこのシフトはＴＮＦとは独立して起こることを発見した。いくつかの分化に関連したケラチノサイトタンパク質はカスパーゼ−８欠損によって生後約１日で影響を受けることが発見された。しかしながら、インビボでの病理学的兆候は、ＴＮＦおよびおそらくはいくつかの他の白血球が生産する伝達物質には依存しない速度で、後期にしか現れない。これゆえ、本発明者らの結果はＴＮＦの機能と白血球の蓄積は上皮でおこる変化の中心的なものではなく、その中での補助の役割をしているにすぎないことを示している。
【０１１０】
本発明の他の側面は、皮膚の炎症性疾患、障害または症状を治療するための候補化合物をスクリーニングする方法に関連している。カスパーゼ−８欠損である単離されたケラチノサイトの培養における、分化に関係したケラチノサイトタンパク質はカスパーゼ−８によって影響されるという上記の発見は、皮膚の炎症性疾患、障害または症状の治療のための候補化合物のスクリーニングのための方法を開発するための方法に道をつけるものである。本発明による方法は、カスパーゼ−８の発現レベルまたは活性が停止されているケラチノサイトを含む細胞の培養を提供すること、該細胞にテスト化合物を導入すること、細胞の培養溶液中のカルシウム濃度を増加させることによって、細胞の分化を誘導すること、テスト化合物の存在下または非存在下、皮膚の分化マーカーおよび／またはｐ２１ＡＲＦの発現レベルを細胞中で計測することを含み、テスト化合物の存在下での皮膚の分化マーカーの発現レベルの増加および／またはｐ２１ＡＲＦの減少が、テスト化合物が該疾患、障害もしくは症状の治療または予防のための候補化合物であることを示す方法である。カスパーゼ−８の発現レベルまたは活性が停止されているケラチノサイトを含む細胞の培養は、たとえば実施例で示されるように、トランスジェニックに不活性なカスパーゼ−８の突然変異体を発現しているマウス、または、皮膚中でカスパーゼ−８の条件ノックアウトを示しているマウスから単離することができる。候補化合物は、化学物質のライブラリーまたは天然薬物からスクリーニングされることができる。細胞中へのテスト化合物の導入は、たとえば、テスト化合物を細胞の培養液に加えることによりなされる。細胞中でのタンパク質の発現レベルの測定は、タンパク質に特異的な抗体を使用した以下の実施例で行われたように、ＲＴ−ＰＣＲ分析によって、または、イムノアッセイ分析により行われうる。本発明の一実施様態では、たとえばイムノアッセイ分析により、ケラチン１、フィラグリンおよび／またはロリクリンのレベルを測定している。
【０１１１】
本発明によれば、本発明者らは、炎症性皮膚疾患、障害、または症状の動物モデルを、ケラチノサイトカスパーゼ−８の発現レベルまたは活性が停止されている動物を開発することにより作製した。カスパーゼ−８活性とレベルの停止は、本願発明の非限定的な実施例によって示されるように、動物の上皮のケラチノサイトのカスパーゼ−８をノックアウトすることによって、また、内因性のカスパーゼ−８をもつが、たとえば残基３６２のＣｙｓをＳｅｒに置き換えたＢＡＣ−Ｃ３６２Ｓといった酵素活性に欠けるトランスジェニックなカスパーゼ−８もまた発現している動物を開発することによってなされる。本発明の一実施様態では、動物はマウスである。
【０１１２】
本発明によれば、この動物モデルはアトピー性皮膚炎または乾癬といった皮膚の炎症性疾患、障害または症状を治療するための候補化合物の効果をテストするために使用される。これゆえ、ある側面では、本発明は、本発明に従って作製された動物モデルに候補のテスト化合物を投与すること、および該動物モデルにおける皮膚の病状の予防または減少を評価することを含む、皮膚の炎症疾患、障害または症状を治療するための候補化合物の効果をテストするための方法に関係している。
【０１１３】
ＲＴ−ＰＣＲ分析によって得られた結果は、遺伝子ＩＳＧ１５（Ｇｌｐ２）、Ｃｘｃｌ１０、Ｃ９０ｒｆ２６と呼ばれる９２３０１１７Ｎ１０Ｒｉｋ（ＩＬ３３）のヒトオルソログ、ＩＬ１９、Ｓｐｒｒ２ｆ、Ｓ１００ａ９、ＩＬ−６、ＭＭＰ１３、Ｃｃｌ３、ＩＬ１ｂ、９２３０１１７Ｅ２０Ｒｉｋ（配列番号２）の相同ヒト遺伝子、２０１０００２Ｎ０４Ｒｉｋ（配列番号３）の相同ヒト遺伝子が、正常な被験体からの皮膚のサンプルにおける該遺伝子の発現のレベルに比べて、上方調節されており、上方調節の同じパターンが皮膚中で病状が発症される以前に検知されていることを確認した（実施例６）。
【０１１４】
これゆえ、本発明のほかの側面は、炎症性の皮膚疾患、障害もしくは症状、または、個体における該疾患の障害症状が発症する素因の診断のための方法に関係している。本発明の発見に照らし合わせて、カスパーゼ−８活性または発現のレベルおよび／または皮膚中でカスパーゼ−８によって正常には制御される遺伝子の発現は、炎症性の皮膚疾患、障害もしくは症状に個体が苦しんでいるかまたは苦しむ可能性があるかどうかを見つけ出すために、個体の皮膚または表皮のサンプル中で調べられうる。たとえば、被験体の皮膚のサンプルにおいて、もしカスパーゼ−８活性または発現のレベルが下方調節されており、および／または、ＩＳＧ１５（Ｇｌｐ２）、Ｃｘｃｌ１０、Ｃ９０ｒｆ２６と呼ばれる９２３０１１７Ｎ１０Ｒｉｋ（ＩＬ３３）のヒトオルソログ、ＩＬ１９、Ｓｐｒｒ２ｆ、Ｓ１００ａ９、ＩＬ−６、ＭＭＰ１３、Ｃｃｌ３、ＩＬ１ｂ、ならびに９２３０１１７Ｅ２０Ｒｉｋ（配列番号２）および２０１０００２Ｎ０４Ｒｉｋ（配列番号３）の相同ヒト遺伝子といった最低でも１つの未知の機能の遺伝子（またはコードされるタンパク質）を含むが、それらに限定はされない遺伝子の１つ、またはそれ以上、すなわち２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、もしくは全部の発現のレベルまたは活性が上方調節されていて、それがたとえば、健常な個体の皮膚のサンプルにおける該遺伝子の発現レベルに比べて、少なくとも１５％、または１７％、２５％、３３％、５０％、６７％まで、および／または１００％であるならば、被験体が炎症性の皮膚疾患、障害もしくは症状である、または、該皮膚疾患、障害もしくは症状となりやすい、または発症しやすいとみなすことができる。
【０１１５】
これゆえ、ほかの側面として、本発明は、上皮ケラチノサイトにおけるカスパーゼ−８欠損と関係している皮膚疾患、障害もしくは症状、または該皮膚疾患、障害もしくは症状を発症する素因または可能性を、被験体において診断するための方法であって、被験体の皮膚のサンプルと少なくとも１つの健常な対照個体の皮膚のサンプルとにおいて、カスパーゼ−８のレベルまたは活性、および／または皮膚中でカスパーゼ−８によって正常には調節されており、皮膚疾患、障害または症状においては調節されていない遺伝子の発現を測定すること、および／またはカスパーゼ−８をコードする核酸塩基における異常を検知することを含み、カスパーゼ−８の活性またはレベルのレベルの減少、および／または、カスパーゼ−８をコードする核酸塩基における異常の存在、および／または、該少なくとも１つの健常な対照個体の皮膚中でのレベル、活性、または発現に比べて被験体の皮膚中でカスパーゼ−８によって正常には調節されている遺伝子の発現の非調節が、被験体における該皮膚疾患、障害もしくは症状、または該皮膚疾患、傷害、または症状を発症する素因または可能性を示す方法に関する。
【０１１６】
被験体のサンプルにおけるカスパーゼ−８の核酸塩基の異常の検知は、たとえば以下の実施例に記載されているように、被験体の皮膚のサンプルからのＲＮＡの分離、およびカスパーゼ−８のＰＣＲ増幅されたｃＤＮＡのシークエンシングといった技術的によく知られた方法によって行われ得る。
【０１１７】
カスパーゼ−８の特徴的な活性は、特異的な基質部位におけるそのタンパク質分解性活性である。これゆえ、サンプル中のカスパーゼ−８の活性は、たとえばＵＳ特許６３９９３２７の実施例３で記載されているような基質にそのようなサンプルをさらすことを含む型通りの実験方法によって決定され得る。
【０１１８】
皮膚中のカスパーゼ−８の発現レベルの測定は、サンプルをイムノアッセイにかけること、カスパーゼ−８特異的抗体を作用させること、または、サンプルからＲＮＡを抽出すること、およびカスパーゼ−８に特異的なプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲを行うことなど、技術的によく知られている方法によってなされることができる。典型的には、ＲＴ−ＰＣＲ分析は、下記の実施例に示すように、サンプルロードのための対照として、ベータアクチンなどのハウスキーピングジーン（house keeping gene）のＲＴ−ＰＣＲを含む。
【０１１９】
これゆえ、本発明は、皮膚中のカスパーゼ−８欠失と関係している皮膚疾患、障害もしくは症状、または該皮膚疾患、障害もしくは症状を発症する素因を個体において診断するための方法であって、被験体の皮膚のサンプルと少なくとも１つの健常対照個体の皮膚のサンプルにおいて、カスパーゼ−８の発現レベルまたは活性を測定すること、および／または被験体からの皮膚のサンプル中でカスパーゼ−８をコードする核酸塩基における異常を検知することを含み、該少なくとも１つの健常対照個体のサンプルと比較した被験体のサンプル中でのカスパーゼ−８の活性または発現レベルの減少の検知、および／または被験体中におけるカスパーゼ−８をコードする核酸塩基における異常の検知が、被験体における該皮膚疾患、障害もしくは症状、または該皮膚疾患、傷害または症状を発症する素因を示す方法を提供する。
【０１２０】
本発明は、また、個体の炎症性皮膚疾患、障害もしくは症状、または該皮膚疾患、障害もしくは症状を発症する素因の診断の方法であって、被験体の皮膚のサンプル中、および少なくとも１つの健常対照個体のサンプル中での、配列番号１、配列番号２および／または配列番号３に示される遺伝子に相同なヒト遺伝子によってコードされるタンパク質の活性または発現レベルを測定することを含み、該少なくとも１つの健常対照個体のサンプルに比べて、被験体のサンプル中の配列番号１、配列番号２および／または配列番号３に示される遺伝子に相同なヒト遺伝子によってコードされるタンパク質の活性または発現レベルの増加の検出が、被験体における該皮膚疾患、障害もしくは症状、または該皮膚疾患、障害もしくは症状を発症する素因を示す方法を提供する。
【０１２１】
一実施様態では、その方法は、配列番号２に示される遺伝子に相同なヒト遺伝子によってコードされるタンパク質の発現レベルの測定を含む。また、別の実施様態では、その方法は、配列番号３に示される遺伝子に相同なヒト遺伝子によってコードされるタンパク質の発現レベルの測定を含む。
【０１２２】
タンパク質の発現レベルは、技術的によく知られた、イムノアッセイおよびＲＴ−ＰＣＲといった下記に例示した方法で測定され得る。
【０１２３】
さらに、他の実施様態では、その方法は、アトピー性皮膚炎の診断、または、疾患を発症する素因の診断のためのものである。
【０１２４】
本発明はまた、炎症性皮膚疾患、障害もしくは症状、または該皮膚疾患、障害もしくは症状を発症する素因を個体において診断するための方法であって、被験体の皮膚のサンプルと少なくとも１つの健常対照個体の皮膚のサンプルにおいて、ＩＳＧ１５（Ｇｌｐ２）、Ｃｘｃｌ１０、Ｃ９０ｒｆ２６と呼ばれる９２３０１１７Ｎ１０Ｒｉｋ（ＩＬ３３）のヒトオルソログ、ＩＬ１９、Ｓｐｒｒ２ｆ、Ｓ１００ａ９、ＩＬ−６、ＭＭＰ１３、Ｃｃｌ３、またはＩＬ１ｂから選ばれたタンパク質、および９２３０１１７Ｅ２０Ｒｉｋ（配列番号２）の相同ヒト遺伝子によってコードされるタンパク質または２０１０００２Ｎ０４Ｒｉｋ（配列番号３）の相同ヒト遺伝子によってコードされるタンパク質の１つ、またはそれ以上、すなわち２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、もしくは、全部の発現レベルまたは活性を測定することを含み、該少なくとも１つの健常対照個体のサンプルに比べて、被験体のサンプル中のＩＳＧ１５（Ｇｌｐ２）、Ｃｘｃｌ１０、Ｃ９０ｒｆ２６と呼ばれる９２３０１１７Ｎ１０Ｒｉｋ（ＩＬ３３）のヒトオルソログ、ＩＬ１９、Ｓｐｒｒ２ｆ、Ｓ１００ａ９、ＩＬ−６、ＭＭＰ１３、Ｃｃｌ３、またはＩＬ１ｂから選ばれたタンパク質、および９２３０１１７Ｅ２０Ｒｉｋ（配列番号２）の相同ヒト遺伝子によってコードされるタンパク質または２０１０００２Ｎ０４Ｒｉｋ（配列番号３）の相同ヒト遺伝子によってコードされるタンパク質の該１つ、またはそれ以上、すなわち２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、もしくは全部の発現レベルまたは活性の増加の検出が、被験体における該皮膚疾患、障害もしくは症状、または該皮膚疾患、障害もしくは症状を発症する素因を示す方法を提供する。
【０１２５】
他の実施様態では、本発明の方法は少なくとも１つの健常対照個体のサンプルが用いられ、また他の実施様態では、１つの健常対照個体のサンプルが用いられ、またさらなる他の実施様態では、１つ以上、２つ、もしくは３つの健常対照個体、または、２つ、３つ、もしくはそれ以上の健常対照個体のサンプルをまとめたものが使用される。
【０１２６】
本明細書において使用される「遺伝子」とは、ポリヌクレオチドまたは、タンパク質をコードする配列を含むポリヌクレオチドの一部分を意味する。遺伝子は、イントロンと同様、５’または３’側配列（プロモーター、エンハンサー、レプレッサー、そしてその他の制御配列など）のような遺伝子をコードしていない（non-coding）配列も含むことは、技術的によく知られている。
【０１２７】
「相同な」、または「ホモログ」、または「オルソログ」という用語は、公知であり、技術的によく知られているものであり、これは共通な祖先を共有している関連しあった配列を意味しており、配列の同一性の程度をもとに決定される。これらの用語はある１つの種で発見された遺伝子と、他の種における対応するまたは等価な遺伝子との関係を述べるものである。本研究の目的として、相同な配列が比較された。「相同配列」または「ホモログ」または「オルソログ」は機能的に関連していると考えられ、信じられ、また知られている。機能的な関係は、（a）配列の同一性の程度（b）同一または類似した分子生物学的機能を含むが限定はされない数々の方法のいずれか１つによって示される。好ましくは、（a）（b）の両方が示される。配列の同一性の程度は様々であるが、望ましくは、（技術的に知られている標準的なシークエンスアライメントプログラムを用いた場合）５０％以上であり、より好ましくは少なくとも６０％以上であり、さらに望ましくは少なくとも７５％以上であり、さらに好ましくは８５％以上である。相同性は、たとえば、Current Protocols in Molecular Biology（F. M. Ausubelら、eds.、1987）のサプルメント３０、セクション７．７１８の表７．７１で議論されているような技術的にたやすく入手可能なソフトウエアプログラムを使用することで決定される。好ましいアライメントプログラムはMacVector （Oxford Molecular Ltd., Oxford, UK）およびALIGN Plus （Scientific and Educational Software, Penn.）である。他の好ましいアライメントプログラムはデフォルトのパラメータをそのまま用いたSequencher（Gene Codes, Ann Arbor, Mich.）である。
【０１２８】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、「タンパク質」という用語は、本明細書において、いかなる長さでもあるアミノ酸の重合体を示すために交換可能に使用されている。これらの用語は、糖鎖形成反応、アセチル化、およびリン酸化反応を含む反応を通じて、翻訳後に形質転換されるタンパク質を含む。
【０１２９】
本発明はまた、皮膚の炎症性疾患、障害または症状の治療に関する方法であって、治験的に十分な効果のある量の分子、または、カスパーゼ−８またはそのフラグメント、カスパーゼ−８またはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含むベクター、カスパーゼ−８の活性またはそのレベルの活性化剤、カスパーゼ−８活性化の天然阻害剤に対する阻害剤、皮膚中でカスパーゼ−８活性によって正常には下方調節されるタンパク質の活性またはそのレベルに対する阻害剤、皮膚中でカスパーゼ−８によって正常には上方調節されるタンパク質の活性またはそのレベルに対する活性化剤から選ばれる薬剤を必要としている個体に投与することを含む方法を提供する。
【０１３０】
本発明による薬剤または分子は、個体に様々な方法で投与されうる。一実施様態では、薬剤または分子は局所的に、皮膚の中に、皮膚に、皮膚の上に、投与されうる。たとえば、上皮または血管内皮細胞を通じた吸収、または、薬剤をコードするＤＮＡ分子またはポリヌクレオチドが（たとえば、ベクターを通じて）患者に投与され、活性をもつ薬剤の発現とインビボにおける分泌を引き起こす遺伝子療法のような、その他の治験的に効果のある投与方法が使用されうる。加えて、本発明による活性化構成物は、薬学的な条件を満たしている界面活性剤、賦形剤、担体、希釈液、または輸送媒体など、分子生物学的に活性である薬剤の他の構成成分と一緒に投与されうる。
【０１３１】
「薬学的に許容され得る」という定義は、活性をもつ成分の生物学的活性の効果を妨げないおよび投与された場合宿主に対して毒性を示さない、いかなる担体も含有することを意味している。たとえば、非経口投与の場合、活性を示すタンパク質は生理食塩水、デキストロース溶液、血清アルブミン、およびリンガー溶液（Ringer's solution）といった輸送媒体に注入するための単位投薬形態で処方される。
【０１３２】
本発明による、医薬物組成物の活性な構成成分は、様々な方法、または経路で個体に投与され得る。一実施様態では、活性化成分は局所的に、皮膚中に、皮膚にまたは皮膚上に投与され得る。他の治験的に効果のある投与方法はいかなるものでも使用可能である。活性をもつ成分は上皮または血管内皮細胞を通じて吸収される。活性な成分は活性のある薬剤をコードするＤＮＡ分子が（たとえば、ベクターを通じて）患者に投与され活性を有する薬剤の発現とインビボにおける分泌を引き起こす遺伝子療法によっても投与される。加えて、本発明による活性をもつ成分は薬学的に許容され得る界面活性剤、賦形剤、担体、希釈液、または輸送媒体など、分子生物学的に活性であるほかの成分とともに投与されうる。
【０１３３】
投与のほかのルートとしては、肝臓内、皮膚内、経皮的（たとえば、徐放製剤）、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、経口、硬膜外、局所性および鼻腔内ルートを含む。加えて、基質は薬学的に許容され得る界面活性剤、賦形剤、担体、希釈液、または輸送媒体など、分子生物学的に活性である薬剤の他の構成成分と一緒に投与されうる。
【０１３４】
活性のある成分は、製薬的に受け入れ可能な輸送媒体（たとえば、水、生理食塩水、デキストロース溶液）および等張性を維持するための添加物（たとえばマンニトール）または化学的安定性を維持するための添加物（たとえば防腐剤および緩衝液）と関連して、溶液、懸濁液、乳濁液、または凍結乾燥した粉末として処方されうる。製剤は一般的に使われる方法によって殺菌される。
【０１３５】
「治療的に有効量」とは、投与されたとき、活性をもつ成分が病状を予防し、疾患の経過を有益に改善し、改良することのできる量である。一回分または複数回分として個体に投与された投薬量は、活性をもつ成分の薬物動態的な特性、投与の方法、患者の容態と特性（性別、年齢、体重、健康状態、大きさ）、症状の程度、同時に行っている治療、治療の頻度、そして望む効果を含む様々な要素にしたがって異なる。定められた投薬量の範囲の調整と操作は、個体の疾患の進行における有益な改善、回復、病変の予防を決定するインビトロおよびインビボの方法と同様に、充分に当業者の能力の範囲内である。
【０１３６】
本明細書において本発明を完全に述べたところで、当業者によれば、同じことが、過度の実験をすることなしに、本発明の範囲および精神から外れることなく、等価のパラメータ、濃度、状況の広い範囲内で行われ得ることは充分に理解されるであろう。
【０１３７】
本発明は特異的な実施様態そのものとの関係によって記載されてきたが、さらなる改良が加えられうることは理解されるであろう。本願は、一般的に本発明の原則に基づくものであって、本発明に付随する公知のまたは習慣的な技術の実践にともなう、そして補足クレームの範囲に従って決定される上文の不可欠な特徴に応用されるような、現在の開示からの逸脱も含む本発明の様々な変化、使用、適応を網羅することを意図している。
【０１３８】
雑誌論文または概要、刊行されたまたは刊行されていない米国または外国の特許申請、米国または外国で査定された特許、または他の引用文献を含む、本明細書において引用された全ての参考文献は、引用された文献内に表された全てのデータ、表、図、および文章を含めて、ここに文献として完全に組み入れられる。加えて、本明細書において引用された引用文献内で引用されている引用文献の全ての内容もまた引用文献によって完全に組み入れられている。
【０１３９】
既知の方法の段階、従来の方法の段階、既知の方法、または従来の方法は、どんな場合においても、関連した技術における本発明のいかなる特徴、記載または実施様態が開示、教示、示唆されているという許可ではない。
【０１４０】
限定された実施様態の前述の記載は、他人が、当業者がもち得る知識（本明細書において引用した引用文献の内容を含む）を応用することによって、たやすく、限定された実施様態などの様々な応用に過度な実験をすることなく、また、本発明の全体的な概念から外れることなしに、改良および／または適用できる本発明の一般的な本質を完全に明らかにしているものである。これゆえ、このような適用および改変は、ここに表された教示と指導に基づいて、開示された実施様態と等価の範囲を意味の範囲内であるとみなされる。ここに表された表現または用語は、記述の目的のためであり、限定のためではないと理解されるべきである。すなわち、本発明の明細書に記載の表現または用語は、本明細書において表された教示と指導という点から、通常の当業者の知識とかね合わせて、当業者によって解釈されるべきである。
【実施例】
【０１４１】
材料および方法
（１）カスパーゼ−８を含む細菌人工染色体（ＢＡＣ）の修飾
ＲＰＣＩ−２４マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）のカスパーゼ−８を含むＢＡＣライブラリーから得られたＢＡＣクローン、（ＲＰ２４−２３８Ｂ２２）は、ＣＨＯＲＩ（ＢＡＣＰＡＣ  リソース）より得られた。ＢＡＣクローンを含有するＤＨ１０Ｂ細菌は１２．５ｍｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ培養中で培養された。細菌のコロニー中のカスパーゼ−８の存在はＥｘｏｎ８Ｆ−８Ｒ、Ｅｘｏｎ１Ｆ−１Ｒ、５’ＵＴＲＦ−Ｒ（使用されたオレゴヌクレオチドはセクション（ｉ）の下記に列挙されている）のオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲによって確認された。ＢＡＣクローンの修飾は記載どおりに（Gongら、2002およびSparwasserら、2004）、ＲＰ２４−２３８Ｂ２２クローンからのＳａｃＢ遺伝子の切除およびカスパーゼ−８遺伝子の修飾の両方のために、ｐＤｅｌｓａｃシャトルベクターを用いて、原則に沿って行われた。以下の４つの修飾が組み込まれた（概略図である図１Ｅを参照）。
【０１４２】
ａ．トランスジェニックのインビボにおける発現を観測するために、本発明者らはＩＲＥＳ配列とＧＦＰ  ｃＤＮＡを、カスパーゼ−８の終止コドンの下流であるＦＲＴリコンビネーション部位に２つの配列を隣接させることによって組み入れた。この配列をシャトルベクターに組み込むために、ＲＰ２４−２３８Ｂ２２  ＤＮＡからオリゴヌクレオチドＡＦ−ＡＲ、ＡＦ−ＡＲ２、およびＢＦ−ＢＲをそれぞれ用いてＰＣＲによりクローンされた、終止コドンの上流および下流のホモロジーアーム（ＢｏｘＡおよびＢｏｘＢ、図１Ｅに示されているターゲッティングカセットの略図を参照のこと）が、ｐＢＣ  ＦＲＴ−ＩＲＥＳ／ＧＦＰ−ＦＲＴベクターのＳａｌＩ−ＥｃｏＲＩおよびＳｐｅＩ−ＮｏｔＩ部位に導入された。インサート成分は、その後シャトルベクターに移された。
【０１４３】
ｂ．トランスジェニックの発現の観測をさらに補助するために、本発明者らは、カスパーゼ−８のＣ−末端に、ＢｏｘＡ（ＡＦ−ＡＲ２  ＰＣＲ生成物由来）と上記ａのＢｏｘＢを含むｐＢＣ  ＦＲＴ−ＩＲＥＳ／ＧＦＰ−ＦＲＴのＥｃｏＲＩ部位にＴ７をコードした配列を導入することにより、Ｔ７タグを融合させた。
【０１４４】
ｃ．トランスジェニックマウスの遺伝子型決定を容易にするために、本発明者らは、最初のカスパーゼ−８イントロンの２０ヌクレオチド配列を特異的な配列（ヌクレオチドの割合は同等）に置き換えた。ＢｏｘＣおよびＢｏｘＤはＣＦ−ＣＲおよびＤＦ−ＤＲのプライマーを用いて増幅された。これらの２つのＰＣＲ生成物は、ＣＦとＤＲのプライマーを一緒に用いた二度目のＰＣＲのテンプレートとして用いられ、結果的に２つのＰＣＲフラグメントの融合をもたらした。
【０１４５】
この研究の中で示された発見は、上記の全ての３つの修飾をもつＢＡＣを発現したマウスに関するものである。同一の発見は、１つ目の修飾（ＩＲＥＳ／ＧＦＰ）のみが導入されたＢＡＣを発現したマウスにも見られた。
【０１４６】
ｄ．触媒的に不活性なカスパーゼ−８トランスジェニックは３６２番目残基の活性部位であるシステインをセリンに変換すること（Ｃ３６２Ｓ）によって作製された。この配列と境を接しているＢｏｘＩおよびＢｏｘＪがＢｏｘ１Ｓ−１ＲおよびＪＦ−Ｂｏｘ２ＡＳのプライマーを用いたＰＣＲによって増幅、融合された。
【０１４７】
上記の全ての修飾されたカセットはｐＤｅｌｓａｃシャトルベクターのＡｓｃＩ−ＮｏｔＩ部位にクローンされた。
【０１４８】
シャトル構築物のＢＡＣをもつ細菌へのエレクトロポレーション、クロラムフェニコールとアンピシリンを用いた選択に続いて、シャトルベクターを取り込んだコロニーが、つぎのプライマー対：（ＡＢまたはＡＴＢＣＤに対してＴＢ３Ｆ−ＴＢ３Ｒ、ＣＤに対してＭｕｔＣＦ−１３７０Ｒ、ＩＪに対してＩＦ２−ＩＲ１およびＨｉｎｄＩＩＩ）を用いてダイレクトＰＣＲまたは、制限酵素分析によって同定された。
【０１４９】
各種につき２つまたは３つの陽性クローンが、それから５％スクロース中でリゾルブドＢＡＣｓを選択するために培養され、アンピシリン感受性コロニーを選択することによって、さらなる選択が行われた。上記に記載したように、陽性クローンはＰＣＲによって（ＡＢまたはＡＴＢＣＤに対してＴＢ３Ｆ−ＴＢ３Ｒ、ＴＢ４Ｆ−ＴＢ４Ｒ、ＣＤに対して１１３０Ｆ−１３７０Ｒ、ＭｕｔＣＦ−１３７０Ｒ、ＩＪに対しＩＦ２−ＪＲ１とＨｉｎｄＩＩＩ）および制限酵素分析によって確認された。
【０１５０】
使用したオリゴヌクレオチド：
2014001231.tif 000002
【０１５１】
（ii）ＢＡＣ  ＤＮＡのマイクロインジェクションのための単離
ＢＡＣ  ＤＮＡは２回のアセテート沈殿法とセシウムクロライド沈降法超遠心法によって単離された。エタノールによる洗浄の後、ＢＡＣ  ＤＮＡはＴＥ緩衝液に溶解され、ＰＩ−ＳｃｅＩエンドヌクレアーゼ（ＮＥＢ）によって直鎖状にされ、６時間、マイクロインジェクション緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０、および１００ｍＭ  ＮａＣｌ）に対して、０．０２５μｍのミリポアのメンブレンフィルターディスク上に浮かべることで、ドロップ−透析された。ＢＡＣ  ＤＮＡの量と質はＣＨＥＦ−ＤＲ  ＩＩＩ  ＰＦＥＧシステム（バイオラッド（Biorad）社、check）を用いることによる、１％アガロース中でのパルス−フィールドゲル電気泳動によって評価した（ＰＦＥＧ；５Ｖ／ｃｍ、１２０度、パルスタイム  ５〜１２０秒、２４〜３０時間）。ＤＮＡはインジェクション緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０、および１００ｍＭ  ＮａＣｌ）に２ｎｇ／μｌの濃度に希釈され、同体積の２×ポリアミン（インジェクション緩衝液中に６０ｍＭ  スペルミンと１４０ｍＭのスペルミジンを含む）を、注入のために混合した。
【０１５２】
（iii）ＢＡＣトランスジェニックマウスの作製と分析
ＤＮＡはＣＢＦ１またはＣ５７ＢＬ／６マウス由来の受精卵母細胞の前核中に、１ｎｇ／μｌの濃度で注入された。トランスジェニックマウスは尾の生検によって準備されたゲノムＤＮＡのＰＣＲ分析（Ｍｕｔ  ＣＦおよびＩＮ１−１７３０Ｒのプライマーを用いた）および末梢血液の白血球におけるＧＦＰ発現のＦＡＣＳ分析によって同定された。
【０１５３】
触媒的に不活性なカスパーゼ−８のトランスジェニックは、ＩＦ２−ＪＲ１のプライマーを用いたＰＣＲとそれに続くＨｉｎｄＩＩＩを用いた切断によって活性なものと区別された。
【０１５４】
ＢＡＣ  ｔｇマウスから抽出された様々な細胞のウエスタンブロット分析のため、野生型およびＢＡＣトランスジェニックマウスからの細胞溶解物が溶解緩衝液（１％ＳＤＳ、１ｍＭオルトバナジウム酸ナトリウム、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４）中での均一化、続いて、５分間沸騰させることによって準備された。タンパク質の濃度はＢＣＡタンパク質アッセイキット（ピアス（Pierce）社）により決定された。分取した２５μｇのタンパク質がＳＤＳ−ＰＡＧＥ、続いて、抗マウスカスパーゼ−８（3B10、A Strasser博士の好意により準備された）、抗ＧＦＰおよび抗ヒトｂ−アクチン  モノクローナル抗体（シグマ（Sigma）社）に対するイムノブロッティングにより分析された。
【０１５５】
（iv）Ｋ５ Ｃｒｅ ｃａｓｐ８fl/+およびＫ５ Ｃｒｅ ｃａｓｐ８fl/-マウスの開発
カスパーゼ−８の対立遺伝子がノックアウトされたマウス（ｃａｓｐ−８+/-、Varfolomeevら、1998）は、ケラチン−５プロモーターに特異的な上皮基底層の制御下でＣｒｅを発現させたトランスジェニックマウス系と交配された（Ｋ５ Ｃｒｅ ｃａｓｐ−８＋、Ramirezら、1994）。これらのＫ５ Ｃｒｅ Ｃａｓｐ−８＋マウスはその後、従来のカスパーゼ−８の対立遺伝子（ｃａｓｐ−８ｆｌｆｌ、Kangら、2004）のホモ接合体をもつマウスと、Ｋ５ Ｃｒｅ ｃａｓｐ８fl/+およびＫ５ Ｃｒｅ ｃａｓｐ８fl/-マウスを得るために交配された。
【０１５６】
（ｖ）組織学と免疫染色法
皮膚とその他の臓器は１０％のリン酸緩衝ホルマリン溶液、ｐＨ７．４で固定され、パラフィンに包理され、４μｍ区分に切断され、ヘマトキシリンとエオシンによって染色された。近接した区分は、例示された抗体で免疫染色するために使用された。Ｃｙ３が結合された二次抗体（ジャクソン  イムノリサーチ  ラブ（Jackson Immunoresearch Labs））が使用された。区分はさらに、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２（シグマ社）で核を観察するためにカウンター染色された。
【０１５７】
ＴＵＮＥＬ染色キット（ロッシュ  ダイアグノティクス（Roche Diagnostics）社）がアポトーシス性細胞を検知するために用いられた。
【０１５８】
ラビットの抗サイトケラチン１、６、１４、インボルクリン、フィラグリンおよびロリクリン抗体はコバンス（Covance）社より購入された。抗ｐ２１マウスはファーミンゲン（Pharmingen）社から購入された。抗Ｆ４／８０ラットはセロテック（Serotec）社より購入された。抗Ｋｉ６７ラットはＤＡＫＯ社より購入された。
【０１５９】
（vi）ケラチノサイト培養物の準備
最初のケラチノサイトは生後４日の新生マウスから単離され、培養された。表皮は４℃
で終夜３．３％トリプシン（ギブコ（Gibco）社）を用いて真皮より分離された。ケラチノサイトはＭＥＭ溶媒中で１５分間振盪することにより分離され、１０％のｃｈｅｌｅｘ処理された牛胎児血漿、抗生物質、ＫＣｌ（４００μｇ）および３％炭酸ナトリウムが補足されたＭＥＭ溶媒のディッシュに植え付けられた。
【０１６０】
実施例１：カスパーゼ−８機能に依存する表皮ケラチノサイトの正常な成長と分化
カスパーゼ−８のこの酵素がインビボにおいて及ぼす様々な効果に対する構造−機能関係を明らかにするために、本発明者らはそれらの内因性カスパーゼ−８対立遺伝子から離れて、カスパーゼ−８遺伝子のもう１つのコピー、またはそれらの様々な突然変異体を発現しているマウスを作製するために、細菌人工染色体（ＢＡＣ）が媒介するトランスジェニクス（詳細は材料および方法を参照）を行った（図１Ａ）。これらのトランスジェニクスは偏在して発現しており、内因性の遺伝子で見られたものと同じ細胞特異的な発現パターンを明示していた（図１Ｂ）。野生型のトランスジェニック（Ｃａｓｐ−８＋／＋／ＢＡＣ−ＷＴ）の発現しているマウスは、たとえこれらのマウスとカスパーゼ−８ノックアウトマウスを交配させることによって内因性カスパーゼ−８の対立遺伝子が切除された後でも、正常であるように見える。一方、酵素の活性部位の突然変異体を発現させたマウスは、酵素活性を欠失しており（Ｃａｓｐ−８ＢＡＣ−Ｃ３６２Ｓ）皮膚の病状を発症した（図１Ｃ）。このトランスジェニック突然変異体のカスパーゼ−８に加えて、二つの内因性野生型のカスパーゼ−８の対立遺伝子も有する（Ｃａｓｐ−８＋／＋／ＢＡＣ−Ｃ３６２Ｓ）マウスは生後約２〜６ヵ月でのみ、この病状を示し始めた。１つの内因性対立遺伝子が切除されたマウス（Ｃａｓｐ−８−／＋／ＢＡＣ−Ｃ３６２Ｓ）では、病状は生後４日ですでに観察可能となり、それは急速に進展した。皮膚サンプルの組織学的な分析（詳細は材料および方法を参照）は、生後２４時間ではなく生後７日で形成される炎症性過程を示唆している（図１Ｄ）。
【０１６１】
本発明者らは、酵素的に不全なカスパーゼ−８の発現、Ｃａｓｐ−８ＢＡＣ−Ｃ３６２Ｓが共に発現された能力の高い酵素の機能を妨害すること、そして、皮膚の炎症性疾患の発症を誘導することを発見した。これは、カスパーゼ−８の酵素機能が生後の皮膚の発達または恒常性に役割を果たしていることを示唆している。
【０１６２】
実施例２：カスパーゼ−８条件ノックアウトマウスは皮膚疾患の発症におけるカスパーゼ−８の機能の役割を確認する
Ｃａｓｐ８ＢＡＣ−Ｃ３６２Ｓ導入遺伝子を発現するマウスにおいて見られる皮膚の病状が表皮細胞それ自身のカスパーゼ−８の機能的役割を反映していることを確かめるために、本発明者らは、条件付カスパーゼ−８対立遺伝子をもつマウスを用い、これらの細胞において特異的にカスパーゼ−８を削除することを行った（詳細は材料および方法を参照）。１つのカスパーゼ−８の対立遺伝子の一部分がｌｏｘＰ部位に隣接しており、もう１つの対立遺伝子が削除された（Ｃａｓｐ−８fl/-）マウスをケラチノサイトに特異的なケラチン−５プロモーターの制御下、Ｃｒｅを発現しているトランスジェニックマウス系と掛け合わせることで、ＰＣＲおよびウエスタンブロット分析によって示されるように、効果的かつ限定的に表皮中のカスパーゼ−８遺伝子を削除することができた（図２Ａおよび２Ｂ）。
【０１６３】
ウエスタンブロット分析のために、皮膚はＰ０ Ｃａｓｐ−８fl/-Ｋ５−Ｃｒｅマウスより剥がされ、表皮と真皮を分離するために、６５℃にて２〜３秒インキュベートされた。表皮と真皮の両方のサンプルはＲＩＰＡ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、０．１％  ＮＰ４０、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、１ｍＭオルトバナジウム酸ナトリウム、プロテアーゼ阻害剤カクテル一式）の中で均一化され、３０分間氷上に放置された。それから、細胞の均一化物は１３０００×ｇで１５分遠心分離され、上澄みは取り除かれた。４０μｇのタンパク質抽出物は１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで分けられ、ニトロセルロースメンブレンにブロットされた。メンブレンは抗マウスカスパーゼ−８（３Ｂ１０、１；２０００倍希釈、アレクシス（Alexis）社）または抗ベータアクチン（１：１００００倍希釈、シグマ社）とインキュベートされ、製品の説明書に基づいて、抗ラットＨＲＰ（シグマ社）または標準ＥＣＬ反応（ピアス社）での抗マウスＨＲＰによって検出された。図２Ａ（下のパネル）にまとめたウエスタンブロット分析の結果は、カスパーゼ−８の削除が表皮中で形成されているが、Ｃａｓｐ−８fl/-Ｋ５−Ｃｒｅマウスにおける真皮には形成されていないことを示している。
【０１６４】
マウス（Ｃａｓｐ−８fl/-Ｋ５−Ｃｒｅ）は誕生時正常に見える。しかしながら、たった３日後には、マウスは、Ｃａｓｐ−８-/+／ＢＡＣ−Ｃ３６２Ｓマウスに生じるものとよく似た皮膚の病状の発症を開始する(図２Ｃ)。Ｃｒｅの均一的な発現と表皮における効果的なカスパーゼ−８の切除にも関わらず、病変は始め限局していたが、しかし迅速に広がり、最終的には、皮膚の全域を覆った。Ｃａｓｐ−８fl/-Ｋ５−Ｃｒｅマウスは正常なマウスより小さく、限られた時間しか生きながらえることができず（図２Ｄ）、全てのマウスは１０日の日齢で死に至った。胃縁の表皮でもまたＫ５プロモーターが発現しており、これと一致してマウスの一部は深刻な胃の病状を表し、食べることができなくなった。
【０１６５】
組織学的分析によれば（詳細は材料および方法を参照）、Ｃａｓｐ−８fl/-Ｋ５−Ｃｒｅマウスの表皮は、Ｃａｓｐ−８-/+／ＢＡＣ−Ｃ３６２Ｓマウスにおけるものとまったく同様に、真皮中の白血球の蓄積およびケラチン６の表皮における発現（炎症性と過剰増殖性の状態のマーカーである）といった炎症の特徴を、特に上皮の病変部分に示している。さらに、本発明者らは、通常基底の表皮層に限定されている、突然変異体の皮膚における重篤なケラチン１４（Ｋ１４）の基底層上への発現を発見した。Ｋ６およびＫ１４は、Ｐ７においてノックアウトの表皮の全ての生存している層に発現された（図４Ａ）。加えて、この段階で、基底層直上のケラチン１（Ｋ１）の発現とケラチノサイトの最終分化のマーカーであるロリクリンおよびフィラグリンの発現が目に見えて減少し、また、完全に失われた。真皮中に蓄積した白血球の大部分は、単核の食細胞（Ｆ４／８０抗体染色、図３Ｂ）および好酸球（フェノールレッドポジティブ）であり、ＴまたはＢリンパ球のどちらにも重篤な増殖はなかった（抗ＣＤ−３を用いた染色（図３Ｂ）、ＣＤ４５Ｒ、またはＣＤ２０抗体による染色、データはあげられていない）である。好酸球のいくばくかは表皮の小膿疱内にも蓄積した（図３Ｂ）。
【０１６６】
実施例３：ケラチノサイト中のカスパーゼ−８欠損に関係する皮膚の炎症性疾患に対するＴＮＦの寄与
ｐ６５そのものか、またはｐ６５  ＮＦ−κＢの活性化を媒介するキナーゼであるＩＫＫ２のどちらかをノックアウトすることによる、皮膚のケラチノサイトにおけるｐ６５  ＮＦ−κＢタンパク質の活性の停止は、また、炎症性の皮膚障害を引き起こす（Huら、1999、Pasparakisら、2002）。その場合、障害はＴＮＦによるケラチノサイトの慢性的な自己分泌刺激作用、およびその結果として生じる、ともに活性化されるｐ６５の抑制効果が不在の場合には過度の程度まで起こるＪｕｎリン酸化反応の増加によって引き起こされることが示された。この皮膚の炎症性疾患過程とケラチノサイト中でのカスパーゼ−８欠損の結果としておこることの間の関係を調べるために、本発明者らは後者の事象に対するＴＮＦの寄与を評価した。それぞれのノックアウトマウスを交配させることによるＣａｓｐ−８fl/-Ｋ５−ＣｒｅのマウスのＴＮＦ遺伝子またはＴＮＦレセプター１（ＴＮＦＲ１）遺伝子のどちらかの欠失は、皮膚の病状の開始を著しく遅くするという結果を生じた。さらにＴＮＦ−／−Ｃａｓｐ−８fl/-Ｋ５−Ｃｒｅマウス（図２Ｄ）およびＴＮＦ  Ｒ１−／−Ｃａｓｐ−８fl/-Ｋ５−Ｃｒｅマウス（図には示されていない）は最低でも４ヵ月間は生存能力を保持していた。皮膚の病状の開始の著しい遅れは、抗ＴＮＦ抗体、または溶解性のＴＮＦレセプターをＣａｓｐ−８fl/-Ｋ５−Ｃｒｅマウス（図には示されていない）に注入することによってもまた得ることができた。しかしながら、完全にＴＮＦに依存している、ケラチノサイト中でのｐ６５またはＩＫＫ２の欠失から生じる病状とは対照的に、カスパーゼ−８の欠失から生じる病状は、遅れはするが、最終的にはＴＮＦまたはそのレセプターを発現していないマウスにおいて完璧な範囲を覆い尽くした。実際、これらのマウスは死には至らなかったので、マウスを覆った皮膚の病状の程度はＴＮＦ能力をもつＣａｓｐ−８fl/-Ｋ５−Ｃｒｅマウスにおいて到達した範囲よりもはるかに大きなものであった。本発明者らは、組織学的な分析より、ＴＮＦ応答の不在の場合に伸びた皮膚の病変がその存在下で観察されたものからは区別できないことを見出した（データは示されていない）。ＴＮＦＲ１の欠失に加えてＴＮＦＲ２遺伝子のさらなる欠失は、皮膚の病状に影響を及ぼさなかった（データは示されていない）。
【０１６７】
ｐ６５阻害の効果からのさらなる違いは、Ｃａｓｐ−８fl/-Ｋ５−Ｃｒｅマウスの表皮において、Ｊｕｎリン酸化反応の増加がまったく認められなかったことである（図４Ｂ）。これらの発見は、カスパーゼ−８欠失はｐ６５  ＮＦ−κＢ活性化の停止という結果を招かないということを示唆している。実際、Ｃａｓｐ−８fl/-Ｋ５−Ｃｒｅマウスと正常なマウスの表皮におけるｐ６５およびｐ５０核転座の程度の間には違いは認められなかった（データは示されていない）。
【０１６８】
皮膚のケラチノサイトにおいてカスパーゼ−８がまさにどんな役割を果たしているのかということを見つけ出すために、本発明者らは始めにその欠損が細胞死、すなわち一般的にカスパーゼ−８が関連している過程に影響を及ぼすのかを調べた。Tunnelテストはカスパーゼ−８欠損の表皮中の細胞死は減少せず、むしろ顕著な増加が見られることを明らかにした（図４Ｃ、右側のパネル）。Ｋｉ６７抗原の染色による表皮中の細胞増殖の評価において、本発明者らは表皮基底層における細胞増殖の著しい増加を観察した（図４Ｃ、左側のパネル）。しかしながら、ＮＦ−κＢ欠損表皮中で見られた過剰な増殖、これは分裂細胞の層の著しい肥大を含むが、これとは対照的に、カスパーゼ−８欠損皮膚中の分裂細胞はただ１つ、または多くても２つの細胞層を占めるにすぎない。ブロモデオキシウリジンの取り込みの免疫組織化学上の評価によって皮膚の細胞増殖を評価する際に類似の観察が得られた（データは示されていない）。
【０１６９】
表皮の基底層の大きさは変化しないままである一方、ケラチノサイトの分化における明確な段階を特徴付けるタンパク質の発現パターンはカスパーゼ−８欠損皮膚中では大幅には変化しなかった（図４Ａ）。
【０１７０】
実施例４：正常な表皮およびカスパーゼ−８欠損表皮の皮膚層からのケラチノサイトの培養液中での分化能力
カスパーゼ−８欠損皮膚中に見られる細胞の分化のパターンの異常（図４Ａ）がカスパーゼ−８の細胞自律性機能、または、ケラチノサイトの他の細胞とまたは細胞外の要素との相互作用を含む、より複雑な変化を反映しているのかどうかを見出すだめに、本発明者らは正常な表皮およびカスパーゼ−８欠損表皮の皮膚層からのケラチノサイトの培養液中での分化能力を比較した(詳細は材料および方法を参照)。カルシウムイオンの増加による正常なケラチノサイトの分化の誘発は、初期の分化マーカーであるケラチン１ならびに後期の分化マーカーであるフィルガリンおよびロリクリンの効果的な誘発とともに、特徴的な形態学的変化を生じた。カルシウムのアップシフト（up-shift）はＣａｓｐ−８fl/-Ｋ５−Ｃｒｅ細胞に、正常細胞で見られるものと類似した形態学的変化を誘発した。しかしながら、ケラチン１、フィルガリンまたはロリクリンの発現の増加を誘発することはできなかった（図６および７）。この分化不全はＣａｓｐ−８fl/-Ｋ５−Ｃｒｅマウスの生後直後に得られたケラチノサイトでは見られなかった。しかし、この分化不全は、Ｃａｓｐ−８fl/-Ｋ５−Ｃｒｅの１日齢の子供の皮膚からの細胞では、この年齢でのこれらの子供はまだいかなる異常な皮膚の組織学的特徴を現していなかったにもかかわらず、明らかであった。ＴＮＦ−／−Ｃａｓｐ−８fl/-Ｋ５−ＣｒｅおよびＴＮＦ  Ｒ１−／−Ｃａｓｐ−８fl/-Ｋ５−Ｃｒｅマウスにおける病状の甚大な遅れにも関わらず、分化不全は、生後一日で既に、それらの細胞中にも見られた。
【０１７１】
細胞増殖および分化のコントロールに関わる核タンパク質であるｐ２１ＡＲＦはケラチノサイトの分化を劇的に減少させることが示されている（Dotto 2000、およびDi Cuntoら、1998）。この変化は、分化に関わる遺伝子発現の変化における原因となる役割をもっているように見受けられる。培養したケラチノサイトにおけるｐ２１ＡＲＦの量を決定することで、本発明者らはカルシウムのアップシフトによる分化の誘発に続くその減少が、カスパーゼ−８欠損細胞中では著しく遅れていることを発見した、これは、さらに、この欠損が分化プロセスにおけるいくつかの特徴を干渉していることを示している（図７Ｂ）。
【０１７２】
これゆえ、インビトロで培養されている間、カスパーゼ−８ノックアウトケラチノサイトは正常に成長し、そして、高濃度のカルシウムの適用に続いて、細胞周期から離脱していく。しかしながら、通常後期の分化段階に関係している分子事象はノックアウトの培養中では起こらない。もっとも顕著には、ロリクリンおよびフィラグリンの発現が誘導されない。さらには、細胞が後期の分化段階に入ったときｐ２１は低下しない。
【０１７３】
カスパーゼ−８のケラチノサイトの分化マーカーの発現に対する寄与が細胞自律性の様式でおこることをさらに確認するために、カスパーゼ−８がＣａｓｐ−８fl/-Ｋ５−Ｃｒｅケラチノサイトに再構成された。培養されたＣａｓｐ−８fl/-Ｋ５−Ｃｒｅケラチノサイトでは、野生型のカスパーゼ−８の発現はレンチウイルス（lenti-virus）の発現ベクターを用いることによって、もう一度実施され、そして、カルシウムのアップシフトに応答して分化マーカーを発現する能力が回復された。このようなカルシウムのアップシフトに対する応答は、細胞が酵素的に不活性なカスパーゼ−８突然変異体（Ｃａｓｐ８−Ｃ３６２Ｓ）にトランスフェクトされた場合には見られなかった。さらに、野生型のマウス由来のケラチノサイト中のこの突然変異体の発現は、それらの中での分化マーカーの発現を停止させた。類似の分化マーカーの発現の阻害が、野生型のマウス由来のケラチノサイトがカスパーゼ−８抑制作用のあるタンパク質にトランスフェクトされたとき、または、カスパーゼ−８活性化を阻害することのできる薬剤とともに処理されたときに観察された。これらの結果は、カスパーゼ−８が皮膚のケラチノサイトの分化に細胞自律性な役割をはたしており、この役割はカスパーゼ−８の酵素機能に依存していることを示していることを示している。
【０１７４】
実施例５：生後３日のＣａｓｐ−８fl/-Ｋ５−ＣｒｅマウスおよびそのＦ／＋同腹子からの皮膚におけるジーンアレイ分析
アギレント  テクノロジー（Agilent  Technologies）社より購入されたマウスオリゴマイクロアレイジーンキット（mouse oligo microarray Gene kit）（塩基長６０（60-mer）のオリゴ）が製品説明書に従って、生後３日（Ｐ３）のＣａｓｐ−８fl/-Ｋ５−Ｃｒｅマウスの皮膚からおよびそのＦ／＋同腹子からのＲＮＡサンプルに使用された。本発明者らは炎症を促進する機能で知られている、ＩＳＧ１５（Ｇｌｐ２）、Ｃｘｃｌ１０、Ｃ９０ｒｆ２６と呼ばれる９２３０１１７Ｎ１０Ｒｉｋ（ＩＬ３３）のヒトオルソログ、ＩＬ１９、Ｓｐｒｒ２ｆ、Ｓ１００ａ９、ＩＬ−６、ＭＭＰ１３、Ｃｃｌ３およびＩＬ１ｂ遺伝子がＣｒｅ  カスパーゼ−８ｆｌ／−マウスの皮膚中で著しく上方調節されていることを発見した。Ｃａｓｐ−８fl/-Ｋ５−Ｃｒｅマウスからの皮膚のサンプルにおける発現の差別パターンはタイプＴＨ２サイトカインの顕著な上方調節を示している。
【０１７５】
また未知の機能をもつ２つのｃＤＮＡＳ、９２３０１１７Ｅ２０Ｒｉｋ（配列番号２）および２０１０００２Ｎ０４Ｒｉｋ（配列番号３）がＣａｓｐ−８fl/-Ｋ５−Ｃｒｅマウス中で顕著に上方調節されていた（表１）。
【０１７６】
【表１】
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【０１７７】
実施例６：リアルタイムＰＣＲとインサイチュハイブリダイゼーションによって評価されたＣａｓｐ−８fl/-Ｋ５−Ｃｒｅマウスの皮膚サンプルにおける差異的に上方調節される遺伝子
前の実施例のジーンアレイ分析で見出された遺伝子調節の差異パターンはさらにリアルタイムＰＣＲによって評価された。この目的のために、野生型マウス、Ｃａｓｐ−８fl/-Ｋ５−Ｃｒｅマウス、またはＴＮＦ−／−Ｃａｓｐ−８fl/-Ｋ５−Ｃｒｅダブルノックアウトマウスから、生後異なる時間で、皮膚が除去された。カスパーゼ−８欠損マウスは出生１日前（Ｄ−１）、出生日（Ｐ０）、生後１日（Ｐ１）、生後２日（Ｐ２）、生後３日（Ｐ３）、および生後５日（Ｐ５）にテストされた。マウスから取り去られた皮膚は６５℃にて２〜３秒表皮と真皮とを分離するためにインキュベートされた。表皮と真皮のサンプルは粉末に加工（乳鉢と乳棒を用いて）され、そして粉末は、キアゲン社のＲｎｅａｓｙキットを製品の説明書に基づいて用いＲＮＡの単離のための出発物質として使用された。生後異なる時間で、野生型マウス、Ｃａｓｐ−８fl/-Ｋ５−Ｃｒｅマウス、またはＴＮＦ−／−Ｃａｓｐ−８fl/-Ｋ５−Ｃｒｅのダブルノックアウトマウスから取り除かれたそれぞれの皮膚サンプルから単離されたＲＮＡは、アレイ技術によって上方調節されることが判明した遺伝子に特異的なプライマーを用いたリアルタイムＰＣＲにかけられた。
【０１７８】
全てのＰＣＲ反応はアプライドバイオシステムズ社の７５００リアルタイムＰＣＲシステムで、市販されている専用のTaqman gene expression assayを用いて製造会社（アプライドバイオシステムズ社）の説明書に基づいて行われた。
【０１７９】
ＰＣＲによるそれぞれの特異的遺伝子に対して発見されたｍＲＮＡレベルは同じＰＣＲ反応でテストされたベータアクチン（ＡＣＴＢ）の対照遺伝子のｍＲＮＡのレベルを用いて標準化された。８fl/-Ｋ５−ＣｒｅマウスまたはＴＮＦ−／−Ｃａｓｐ−８fl/-Ｋ５−Ｃｒｅダブルノックアウトマウスにおける生後の所定の発達段階での特定の遺伝子のｍＲＮＡの上方調節は、８fl/-Ｋ５−ＣｒｅのマウスまたはダブルノックアウトされたＴＮＦ−／−Ｃａｓｐ−８fl/-Ｋ５−Ｃｒｅマウスの標準化されたｍＲＮＡと生後の同じ発達段階での野生型の標準化されたｍＲＮＡとの比率によって、デルタ−Ｃｔ法（LivakおよびScimittgen、2001）によって計算された。得られた比率は、ｌｏｇ２に変換され、図８のヒートマップに示されるように発現の変化の上方調節の増加の一貫性に従って、順序付けられた。図では、各々のカラムが、生前およびＰ０、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ５における８fl/-Ｋ５−Ｃｒｅマウスの皮膚中の特別な遺伝子の上方調節の割合を示している。結果は２２のテストされた８fl/-Ｋ５−Ｃｒｅマウスのうち、１９のマウスがＩＳＧ１５（Ｇｌｐ２）、１５のマウスがＣｘｃｌ１０、１５のマウスが９２３０１１７Ｎ１０Ｒｉｋ（ＩＬ３３）、１４のマウスがＩＬ１９、１４のマウスが２０１０００２Ｎ０４Ｒｉｋ（配列番号３）、１３のマウスがＳｐｒｒ２ｆ、１３のマウスがＳ１００ａ９、１２のマウスがＩＬ−６、１２のマウスが９２３０１１７Ｅ２０Ｒｉｋ（配列番号２）、１１のマウスがＭＭＰ１３、１１のマウスがＣｃｌ３、および１０のマウスがＩＬ１ｂ遺伝子の顕著な上方調節を示した。
【０１８０】
結果は２２のテストされたＴＮＦ−／−Ｃａｓｐ−８fl/-Ｋ５−Ｃｒｅダブルノックアウトマウスのうち、１１のマウスがＩＳＧ１５（Ｇｌｐ２）、１３のマウスがＣｘｃｌ１０、１３のマウスが９２３０１１７Ｎ１０Ｒｉｋ（ＩＬ３３）、１６のマウスがＩＬ１９、１１のマウスが２０１０００２Ｎ０４Ｒｉｋ（配列番号３）、１６のマウスがＳｐｒｒ２ｆ、１６のマウスがＳ１００ａ９、１６のマウスがＩＬ−６、６のマウスが９２３０１１７Ｅ２０Ｒｉｋ  （配列番号２）、１２のマウスがＭＭＰ１３、１５のマウスがＣｃｌ３、および１１のマウスがＩＬ１ｂ遺伝子の顕著な上方調節を示した。
【０１８１】
前述のとおり、皮膚の病状は生後３日で首と頭の部分に発現し、徐々に体全体に広がっていく。本発明者らは、ＲＴ−ＰＣＲにより、同じＰ３  ８fl/-Ｋ５−Ｃｒｅマウスの正常な皮膚および病状を示している皮膚からのサンプルにおいて、差異発現の同じパターンを見出した（データは示されていない）。
【０１８２】
ＲＴ−ＰＣＲ分析によって得られた結果は、向炎症性の機能をもつ遺伝子、およびＩＬ−１９などのタイプＴＨ２サイトカインをコードする遺伝子が、Ｃａｓｐ−８fl/-Ｋ５−Ｃｒｅマウスからの皮膚のサンプルにおいて、顕著に上方調節されていること、病状が発症する以前に同じ上方調節のパターンが検知されうること、ＴＮＦは皮膚の病状に主たる影響を及ぼしておらず、その病状を増幅することおよび促進することにのみ寄与していることを裏付けている。
【０１８３】
皮膚上におけるカスパーゼ−８欠損の効果はさらに、ジーンアレイ分析およびＣａｓｐ−８fl/-Ｋ５−Ｃｒｅマウスからの皮膚のサンプルのＲＴ−ＰＣＲ分析において上方調節されていることが判明したケモカインである、ｓ１００ａ９（下記参照）に対するプローブを用いて、インサイチュハイブリダイゼーションによって評価された。この目的のために、Ｐ７野生型マウスまたはＰ７  Ｃａｓｐ−８fl/-Ｋ５−Ｃｒｅマウスからの６μｍ厚さのパラフィンで処理された皮膚の区分がスライドにされた。脱パラフィン化（キシレンを１０分で２回、１００％エタノール２分ずつ２回、９５％エタノール２分、７０％エタノール２分、５０％エタノール２分）の後、スライドはプロテイナーゼＫ（１０μｇ／ｍｌ）で１０〜２０分処理され、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で固定され、そして、アセチル化（２００ｍｌのＤＥＰＣ処理された水に２．２ｍｌのトリエタノールアミン、７５０μｌの無水酢酸を加え、５分作用させた）した。その後、スライドはアンチセンスまたはセンス（対照）プローブと終夜６５℃でインキュベーションしてハイブリダイズされた。２４時間後、スライドは異なる濃度のＳＳＣ緩衝液（ａ．１０ｍＭ  ＤＴＴを含む５×ＳＳＣ中６５℃で３０分、ｂ．１０ｍＭ  ＤＴＴと５０％ホルムアミドを含む２×ＳＳＣ中６５℃で３０分、ｃ．２×ＳＳＣ中３７℃で５分を３回、ｄ．ＲＮａｓｅ  Ａ（１０μｇ／ｍｌ）を含む０．４Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、０．００５Ｍ  ＥＤＴＡ中３７℃で３０分、およびｅ．２×ＳＳＣ中３７℃で１５分、ｆ．０．１×ＳＳＣ中３７℃で１５分）で数回洗浄され、抗ＤＩＧ抗体と２時間室温でインキュベートされた。その後、スライドは染色のための基質（抗−ジゴキシゲニン−アルカリ・ホスファターゼ（Anti-Digoxigenin-Alkaline Phosphatase）、ロッシュ社）によって数時間から数日間現像された。
【０１８４】
Ｐ７野生型マウスまたはＰ７  Ｃａｓｐ−８fl/-Ｋ５−Ｃｒｅマウスの皮膚に適用されたｓ１００ａ９からのアンチセンス（配列番号３５）およびセンス（対照）プローブとのインサイチューハイブリダイゼーションの結果は図９にまとめられている。得られた結果は、ｓ１００ａ９転写が、表皮と真皮の両方においてアンチセンスプローブとプローブされたＣａｓｐ−８fl/-Ｋ５−Ｃｒｅマウスのサンプルにおいてのみ検知されたことを示している。
【０１８５】
実施例７：差異的に上方調節されるタンパク質とウエスタンブロットによって評価されたＣａｓｐ−８マウスの皮膚中のカスパーゼ−１４、Ｓｔａｔ−１、およびＳｔａｔ−３の活性化
ウエスタンブロット分析のために、Ｐ４  Ｃａｓｐ−８fl/-Ｋ５−ＣｒｅマウスまたはＰ４野生型マウスの皮膚全体、表皮、真皮のサンプルが単離された。それぞれのサンプルは乳鉢と乳棒で粉砕され、組織中の細胞は１ｍｇの組織あたり、１０μｌのＲＩＰＡ（ＲＩＰＡ緩衝液、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８、０．１％ＳＤＳ、１％ＮＰ−４０）とインキュベートすることによって溶解され、タンパク質を抽出するために使用された。次に、組織溶解物は０℃で１０分間インキュベートされ、サンプル緩衝液が添加された後、１００℃で５分間インキュベートされた。サンプルは１３００ｒｐｍで遠心分離され、上澄み液は１０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルで分離され、ニトロセルロースメンブレンにブロットされた。
【０１８６】
分離された皮膚のタンパク質を含むニトロセルロースメンブレンはＳｔａｔ−１およびＳｔａｔ−３に特異的な抗体とプローブされた。Ｓｔａｔ−１およびＳｔａｔ−３はリン酸化反応において、ＩＬ−６によって誘発され、核に転位し、皮膚の炎症性病状のマーカーとして使用されるタンパク質キナーゼによって活性化される転写因子である。Ｓｔａｔ特異的な抗体によって得られた結果は、Ｃａｓｐ−８fl/-Ｋ５−Ｃｒｅマウスの皮膚の表皮のサンプルにおいてのみ、リン酸化されたＡｔａｔ−１またはリン酸化されたＳｔａｔ−３に対応するバンドが検知されたことを示している（図１０Ａ）。
【０１８７】
プロカスパーゼ−１４は、皮膚の表皮中で活性化カスパーゼ−１４に構造的に促進されることが知られているので、カスパーゼ−８欠損によって誘導された結果生じた炎症性の病状がこの組織内でプロカスパーゼ−１４のプロセッシングの制御に関わっているのかどうかをテストすることは興味深いことである。この目的のため、分離された皮膚のタンパク質を含むニトロセルロースメンブレンが、カスパーゼ−１４に特異的な抗体とプローブされた。図１０Ｂにまとめられた結果は、プロカスパーゼ−１４のＣａｓｐ−８fl/-Ｋ５−Ｃｒｅマウスの皮膚におけるプロセッシングには変化がないことを示しており、これは、カスパーゼ−１４はカスパーゼ−８欠損によって引き起こされる病因には関与していないことを示している。
【０１８８】
Ｓ１００Ａ８はマクロファージによって発現されるケモカインである。Ｓ１００Ａ８は、本発明者らが先に、ジーンアレイによってＣａｓｐ−８fl/-Ｋ５−Ｃｒｅマウスの皮膚において、および、ＲＴ−ＰＣＲ分析によってＣａｓｐ−８fl/-Ｋ５−Ｃｒｅマウスの表皮において上方調節されることを明らかにした遺伝子である、Ｓ１００Ａ９とヘテロ二量体を作ることが知られている。Ｓ１００Ａ８タンパク質の存在は、野生型マウスまたはＣａｓｐ−８fl/-Ｋ５−Ｃｒｅマウスから単離された皮膚全体、真皮、または表皮のサンプルにおいて、ウエスタンブロットハイブリダイゼイションによって分析された。図１０Ｃにまとめられた結果は、Ｓ１００Ａ８タンパク質はＣａｓｐ−８fl/-Ｋ５−Ｃｒｅマウスにのみ検知されること、およびＳ１００Ａ８の最も高い発現が真皮中に見られたことを示している。これゆえ、これらの結果は表皮中のカスパーゼ−８の欠損が真皮中での病理学的変化を引き起こしていることを示している。
【０１８９】
実施例８：ＩＬ−１αおよびＩＬ−１βはケラチノサイト中のカスパーゼ−８欠損に関連する皮膚の炎症性疾患に寄与していない。
ＩＬ−１αおよびＩＬ−１βは、ジーンアレイによってＣａｓｐ−８fl/-Ｋ５−Ｃｒｅマウスの皮膚中で、および、ＲＴ−ＰＣＲ分析によってＣａｓｐ−８fl/-Ｋ５−Ｃｒｅマウスの表皮において、上方調節されることが見出された。本発明者らはケラチノサイト中でカスパーゼ−８欠損の結果起こる皮膚の炎症の過程におけるＩＬ−１αおよびＩＬ−１βの役割をさらに調べた。ＩＬ−１α遺伝子またはＩＬ−１β遺伝子のどちらかとＣａｓｐ−８fl/-Ｋ５−Ｃｒｅのダブルノックアウトマウスは、ＩＬ−１α遺伝子またはＩＬ−１β遺伝子のどちらかをノックアウトしたマウスとＣａｓｐ−８fl/-Ｋ５−Ｃｒｅマウスを交配することによって得られた（Horaiら、1998）。ダブルノックアウトマウスは皮膚の病状の開始において抜本的な遅れは示さなかったが、Ｃａｓｐ−８fl/-Ｋ５−Ｃｒｅマウスとして８日または９日しか生存しなかった。
【０１９０】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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