(57)【要約】【課題】本発明は食品製造、保存過程で乳酸菌が受ける酸化ストレスに着目し、菌の酸化ストレス耐性を高めることによって、酸化ストレスがかかる環境下での生残性が向上した乳酸菌提供を課題とする。【解決手段】乳酸菌に対して温度処理、高濃度過酸化水素処理等を施すことにより、ｄｎａＫ、ｇｒｏＥＬ、ｇｒｏＥＳから選ばれるいずれか一種以上の遺伝子の転写量を増加させ、酸化ストレスに対する耐性の向上した乳酸菌を取得することが出来た。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｄｎａＫ、ｇｒｏＥＬ、ｇｒｏＥＳから選ばれるいずれか一種以上の遺伝子の転写量が増加したラクトバチルス属に属する乳酸菌。
【請求項２】
前記乳酸菌がラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）またはラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）であることを特徴とする請求項１に記載の乳酸菌。
【請求項３】
ｄｎａＫ、ｇｒｏＥＬ、ｇｒｏＥＳから選ばれるいずれか一種以上の遺伝子の転写量を増加させることにより、酸化ストレス耐性が向上した請求項１または２に記載の乳酸菌。
【請求項４】
前記遺伝子の転写量の増加が、ラクトバチルス属に属する乳酸菌に下記（１）〜（３）のいずれかの処理を行うことにより得られるものである、請求項１〜３のいずれかに記載の乳酸菌。
（１）ラクトバチルス属に属する乳酸菌を４２℃以上で処理する工程
（２）ラクトバチルス属に属する乳酸菌を過酸化水素１０ｐｐｍ以上で処理する工程
（３）ラクトバチルス属に属する乳酸菌のｈｒｃＡ遺伝子を破壊処理する工程
【請求項５】
前記ラクトバチルス・ガセリがＳＢＴ２０５５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９５３）、前記ラクトバチルス・アシドフィルスがＳＢＴ２０６２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１０７５）であることを特徴とする請求項２〜４のいずれかに記載のラクトバチルス・ガセリ。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載のラクトバチルス属に属する乳酸菌を含有させることを特徴とする飲食品。
【請求項７】
ｄｎａＫ、ｇｒｏＥＬ、ｇｒｏＥＳから選ばれるいずれか一種以上の遺伝子の転写量が増加したラクトバチルス属に属する乳酸菌の製造方法であって、ラクトバチルス属に属する乳酸菌に下記（１）〜（３）のいずれかの処理を行うことを特徴とする乳酸菌の製造方法。
（１）ラクトバチルス属に属する乳酸菌を４２℃以上で処理する工程
（２）ラクトバチルス属に属する乳酸菌を過酸化水素１０ｐｐｍ以上で処理する工程
（３）ラクトバチルス属に属する乳酸菌のｈｒｃＡ遺伝子を破壊処理する工程
【請求項８】
ｄｎａＫ、ｇｒｏＥＬ、ｇｒｏＥＳから選ばれるいずれか一種以上の遺伝子の転写量を増加させることによりラクトバチルス属に属する乳酸菌の酸化ストレス耐性を向上させる方法。
【請求項９】
酸化耐性が高められた乳酸菌のスクリーニング方法であって、以下の（１）〜（３）の工程を含む方法。
（１）乳酸菌に酸化耐性処理を行う工程
（２）前記酸化耐性処理を施した乳酸菌の分子シャペロン遺伝子の発現を測定する工程
（３）乳酸菌の分子シャペロン遺伝子の発現が、無処理のものに比べて高い乳酸菌を選        択する工程
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物の分子シャペロン遺伝子の発現量を増加させることによって、酸化ストレスに対する耐性が向上した微生物に関する。また、微生物に特定の処理を施すことによって分子シャペロン遺伝子の発現量を増加させ、酸化ストレスに対する耐性が向上した微生物を製造する方法に関する。さらに、酸化ストレスに対する耐性が向上した微生物を含む食品に関する。
【背景技術】
【０００２】
プロバイオティクス菌は有益な微生物として、ヨーグルト、乳酸菌飲料、整腸剤等に応用されており、整腸効果を中心として様々な機能が知られている。例えば、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ（以下、「ラクトバチルス・アシドフィルス」という場合がある。）、 Ｌｂ．ｃａｓｅｉ、 Ｌｂ．ｇａｓｓｅｒｉ（以下、「ラクトバチルス・ガセリ」という場合がある。）等のラクトバチルス属細菌が食品に利用されている。しかしながら、これらのプロバイオティクス菌がその機能を発揮するためには、生きた菌を摂取することが必須である場合も多く、プロバイオティクス菌の食品中での生残性確保は非常に重要な問題である。
【０００３】
食品の製造工程および保存中には、ｐＨや浸透圧等様々な要因がストレス因子として微生物に作用し、使用する微生物によっては生菌数が減少することがある。中でも乳酸菌等の嫌気性菌にとって、酸素は生残性に関わる重要な因子である。特に、プロバイオティクス乳酸菌に関しては、嫌気度が高い環境である腸内由来の菌が多いため、酸素に対する感受性が高い場合がある。しかし、製造工程を完全に嫌気状態にすることは不可能であり、製造後も真空包装を除くと食品中の酸素を完全に除去し、外部からの酸素の進入を遮断することは難しいことから、プロバイオティクス乳酸菌を使用した食品において、酸素による酸化ストレスは死滅の大きな要因となり得る。
【０００４】
さて、酸化ストレスによる悪影響は、酸素やその代謝物である過酸化水素（以下、「Ｈ2Ｏ2」という場合がある。）、スーパーオキシドラジカル、ヒドロキシルラジカル等の活性酸素が、菌のDNA、タンパク質等に作用すると考えられている。
【０００５】
酸化ストレスによる影響を防ぐため、一般的な微生物では、カタラーゼによるＨ2Ｏ2の分解やスーパーオキシドジスムターゼによるスーパーオキシドラジカルの除去等の酸化ストレス耐性機構が備わっており、好気的な環境に適応している。また、一部の乳酸菌では、カタラーゼ活性やスーパーオキシドジスムターゼ活性を有することが報告されている。しかし、多くのプロバイオティクス乳酸菌は、カタラーゼ活性やスーパーオキシドジスムターゼ活性を有していない。このような乳酸菌の酸化ストレス耐性機構として、NADHペルオキシダーゼによるＨ2Ｏ2分解やチオレドキシン／チオレドキシンレダクターゼシステムによる還元状態の維持（非特許文献１参照）、ｆｎｒ遺伝子（特許文献１参照）等の関与が報告されている。
【０００６】
一方、微生物のストレス耐性を高める方法としては、ｈｒｃＡ遺伝子の破壊による胃酸／胆汁酸耐性の向上（特許文献２参照）等が報告されている。さらに、酸化ストレス耐性を高める方法に関しては、遺伝子組み換えによるカタラーゼ遺伝子等の酸化ストレス消去系遺伝子の導入（特許文献３参照）が報告されている。
【０００７】
さて、変性したタンパク質の修復や、修復不能なタンパク質の分解をする分子シャペロンと呼ばれる一連のタンパク質が知られている。これら分子シャペロンは、主に熱ストレスによって合成誘導され、熱によって変性したタンパク質の修復、分解等を行うことによって微生物の熱ストレス耐性を高めることが明らかになっている。
さらに、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、Ｈ2Ｏ2によって不活化されたロダナーゼ（ｃｙａｎｉｄｅ  ｓｕｌｆｕｒｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）と分子シャペロンの一つであるＧｒｏＥＬを混合してインキュベートすると、ロダナーゼが再活性化されることが報告されている（非特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】再公表ＷＯ２００９/１５０８５６公報
【特許文献２】特許第４４７３５７０号公報
【特許文献３】特開２００９−３９０３２号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】日本乳酸菌学会編「乳酸菌とビフィズス菌のサイエンス」、京都大学学術出版会、２０１０年、ｐ．２１２−２１７
【非特許文献２】ギリッシュ  シー.  メルカニ（Ｇｉｒｉｓｈ  Ｃ．  Ｍｅｌｋａｎｉ）他２名、「バイオケミカル  アンド  バイオフィジカル  リサーチ  コミュニケーション」、２００２年、第２９４巻  ｐ．８９３−８９９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
特許文献２、３には微生物のストレス耐性、酸化ストレス耐性を高める方法が開示されているが、これらの方法は外来遺伝子の導入を伴うため、食品への応用は現状では難しい。
また、分子シャペロンが微生物の熱ストレス耐性を高めることは一般的に知られているが、例えば、酸化ストレスに対する効果はいまだに明らかになっていない。
さらに、非特許文献２は、分子シャペロンの酸化ストレスに対する効果を示唆するものであるが、試験条件は限定的であり、その具体的な作用機序、ｉｎ  ｖｉｖｏでの効果等はいまだ解明されていない。
よって、本発明は、食品製造工程および保存中に乳酸菌が受ける酸化ストレスに着目し、乳酸菌の酸化ストレス耐性を高めることによって、酸化ストレスがかかる環境下における乳酸菌の生残性を向上させることを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記課題に鑑み鋭意検討を重ねた結果、本発明者らは特定の温度、Ｈ2Ｏ2濃度条件下で乳酸菌を処理することにより、当該乳酸菌が、致死的な濃度のＨ2Ｏ2溶液中で保存した場合であっても、その生残性が高まることを見出した。さらに、特定の温度、Ｈ2Ｏ2濃度条件下で処理した乳酸菌体は、分子シャペロン遺伝子であるｄｎａＫ、ｇｒｏＥＬ、ｇｒｏＥＳ等の遺伝子の転写量が、無処理の菌体に比べて増加していることを見出し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）ｄｎａＫ、ｇｒｏＥＬ、ｇｒｏＥＳから選ばれるいずれか一種以上の遺伝子の転写量が増加したラクトバチルス属に属する乳酸菌。
（２）前記乳酸菌がラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）またはラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）であることを特徴とする上記（１）に記載の乳酸菌。
（３）ｄｎａＫ、ｇｒｏＥＬ、ｇｒｏＥＳから選ばれるいずれか一種以上の遺伝子の転写量を増加させることにより、酸化ストレス耐性が向上した上記（１）または（２）に記載の乳酸菌。
（４）前記遺伝子の転写量の増加が、ラクトバチルス属に属する乳酸菌に下記(i)〜（iii
）
のいずれかの処理を行うことにより得られるものである、上記（１）〜（３）のいずれかに記載の乳酸菌。
(i)ラクトバチルス属に属する乳酸菌を４２℃以上で処理する工程
（ii）ラクトバチルス属に属する乳酸菌を過酸化水素１０ｐｐｍ以上で処理する工程
（iii）ラクトバチルス属に属する乳酸菌のｈｒｃA遺伝子を破壊処理する工程
（５）前記ラクトバチルス・ガセリがＳＢＴ２０５５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９５３）、前記ラクトバチルス・アシドフィルスがＳＢＴ２０６２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１０７５）であることを特徴とする上記（２）〜（４）のいずれかに記載のラクトバチルス属に属する乳酸菌。
（６）上記（１）〜（５）のいずれかに記載のラクトバチルス属に属する乳酸菌を含有させることを特徴とする飲食品。
（７）ｄｎａＫ、ｇｒｏＥＬ、ｇｒｏＥＳから選ばれるいずれか一種以上の遺伝子の転写量が増加したラクトバチルス属に属する乳酸菌の製造方法であって、ラクトバチルス属に属する乳酸菌に下記(i)〜（iii）のいずれかの処理を行うことを特徴とする乳酸菌の製造方法。
(i)ラクトバチルス属に属する乳酸菌を４２℃以上で処理する工程
(ii)ラクトバチルス属に属する乳酸菌を過酸化水素１０ｐｐｍ以上で処理する工程
(iii）ラクトバチルス属に属する乳酸菌のｈｒｃA遺伝子を破壊処理する工程
（８）ｄｎａＫ、ｇｒｏＥＬ、ｇｒｏＥＳから選ばれるいずれか一種以上の遺伝子の転写量を増加させることによりラクトバチルス属に属する乳酸菌の酸化ストレス耐性を向上させる方法。
（９）酸化耐性が高められた乳酸菌のスクリーニング方法であって、以下の(i)〜（iii
）の工程を含む方法。
(i)乳酸菌に酸化耐性処理を行う工程
(ii)前記酸化耐性処理を施した乳酸菌の分子シャペロン遺伝子の発現を測定する工程
(iii)乳酸菌の分子シャペロン遺伝子の発現が、無処理のものに比べて高い乳酸菌を選択
する工程
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、ｄｎａＫ、ｇｒｏＥＬ、ｇｒｏＥＳから選ばれるいずれか一種以上の遺伝子の転写量を増加させることにより、酸化ストレス耐性が向上したラクトバチルス属に属する乳酸菌を得ることができる。得られたラクトバチルス属に属する乳酸菌は、酸化ストレスがかかる環境下において生残性を向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】ラクトバチルス・ガセリＳＢＴ２０５５を各Ｈ2Ｏ2濃度で処理した場合の各分子シャペロン遺伝子発現量を示す図である。
【図２】ラクトバチルス・ガセリＳＢＴ２０５５を各Ｈ2Ｏ2濃度で処理した場合の酸化ストレス（Ｈ2Ｏ2）耐性を示す図である。
【図３】ラクトバチルス・ガセリＳＢＴ２０５５を各温度、ｐH条件で処理した場合の分子シャペロン遺伝子発現量を示す図である。
【図４】ラクトバチルス・ガセリＳＢＴ２０５５を各温度、ｐH条件で処理した場合の酸化ストレス（Ｈ2Ｏ2）耐性を示す図である。
【図５】ラクトバチルス・ガセリＳＢＴ２０５５ΔｈｒｃA株の分子シャペロン遺伝子発現量を示す図である。
【図６】ラクトバチルス・ガセリＳＢＴ２０５５とラクトバチルス・ガセリＳＢＴ２０５５ΔｈｒｃＡ株の酸化ストレス（Ｈ2Ｏ2）耐性を示す図である。
【図７】ラクトバチルス・ガセリＳＢＴ１２６５、ＳＢＴ１７０３、ＳＢＴ０２７４を各Ｈ2Ｏ2濃度で処理した場合の酸化ストレス（Ｈ2Ｏ2）耐性を示す図である。
【図８】Ｈ2Ｏ2濃度５０ｐｐｍで処理したラクトバチルス・ガセリＳＢＴ２０５５の発酵乳中における生残性を示す図である。
【図９】ラクトバチルス・アシドフィルスＳＢＴ２０６２を各Ｈ2Ｏ2濃度で処理した場合の酸化ストレス（Ｈ2Ｏ2）耐性を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の微生物として、プロバイオティクスとして用いられる乳酸菌が挙げられる。具体的には、Lactobacillus acidophilus、Lb. gasseri、Lb. casei、Lb. salivarius、Lb. plantarum、Lb. johnsonii、Lb. reuteri、Lb. rhamnosus、Lb. fermentum、Lb. murinus 等のラクトバチルス属に属する乳酸菌が挙げられる。
【００１５】
本発明においてその発現が高められる遺伝子としては、分子シャペロン遺伝子が挙げられ、具体的には、ｄｎａＫ、ｇｒｏＥＬ、ｇｒｏＥＳ遺伝子のうちいずれか１つ以上の発現が高められることが望ましい。乳酸菌の酸化ストレス耐性に分子シャペロンが関連することは、本発明において新たに明らかになったことである。分子シャペロン遺伝子は複数の種間で広く保存されているため、酸化耐性が高い有用な菌株をスクリーニングする場合の酸化耐性マーカーとしても使用することが期待できる。
【００１６】
本発明において、乳酸菌におけるｄｎａＫ、ｇｒｏＥＬ、ｇｒｏＥＳ等の分子シャペロン遺伝子の転写量を増加させる処理としては、ｄｎａＫ、ｇｒｏＥＬ、ｇｒｏＥＳ遺伝子のいずれか一種以上の遺伝子の転写量を増加させる条件で乳酸菌を処理する方法であれば良く、特に限定はされないが、例えば、乳酸菌をＨ2Ｏ2にて処理する方法、高温環境にて処理する方法、ｈｒｃＡ遺伝子を破壊する処理方法等が挙げられる。なお、遺伝子の転写量の増加とは、遺伝子の転写量を増加させる処理を行う前の転写量を１とした場合に、１より高いことをいい、１．５倍以上、望ましくは２倍以上増加することにより、ラクトバチルス属に属する乳酸菌の酸化ストレス耐性をより向上させることができる。
Ｈ2Ｏ2にて処理する方法としては、例えば、Ｈ2Ｏ2濃度１０ｐｐｍ以上、好ましくは１０ｐｐｍ〜５０ｐｐｍ等の範囲が例示できる。また、Ｈ2Ｏ2で処理する場合の温度と時間の組み合わせとしては、３７℃〜４５℃で５〜２００分、好ましくは１０〜３０分処理する条件を挙げることができるが、処理濃度により処理温度を適宜調整することもできる。特に、Ｈ2Ｏ2濃度５０ｐｐｍ、３７℃で３０分間処理することにより、ｄｎａＫ、ｇｒｏＥＬ、ｇｒｏＥＳ遺伝子のいずれか一種以上の遺伝子の転写量をより増加させることができる。また、例えば、ブルガリクス菌などのＨ2Ｏ2を産生する乳酸菌を利用することもできる。
高温環境にて処理する方法としては、乳酸菌を増殖させるための通常の温度域よりも高い温度で処理すればよい。例えば、ラクトバチルス属やラクトバチルス・ガセリでは、通常増殖させるための温度域は３０〜３７℃であるため、４２℃以上５分以上、好ましくは４５℃以上５分以上処理を行うことが好ましい。
Ｈ2Ｏ2や高温環境で処理する場合、各菌体の培養や各処理を実施するために、還元脱脂乳培地や各菌の生育に適した合成培地、緩衝液等を用いることができる。例えば、ラクトバチルス・ガセリでは、１１％還元脱脂乳培地やMRS液体培地（ディフコ社製）等を用いることができる。
【００１７】
ｈｒｃＡ遺伝子を破壊する処理方法について以下に説明する。
ｄｎａＫ、ｇｒｏＥＬ、ｇｒｏＥＳ等の分子シャペロン遺伝子の発現抑制因子としてＨｒｃＡタンパク質が知られており、ＨｒｃＡタンパク質をコードするｈｒｃＡ遺伝子を破壊することにより、分子シャペロン遺伝子の発現が増加し、上述の処理と同様に本発明の効果を得ることができる。ｈｒｃＡ遺伝子を破壊する処理方法としては、自然育種による方法、変異剤添加、紫外線照射、放射線照射により突然変異を誘発させる方法等を使用することができる。また、Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ（ＩＳ）、トランスポゾン（Ｔｎ）等によるランダムな突然変異による方法、またはシングルおよびダブルクロスオーバー法による部位特異的な遺伝子破壊法等も可能であり、例えば、特許第４４７３５７０号の実施例（例えば実施例１８）に記載の方法により、ｈｒｃＡ遺伝子を破壊した菌株を得ることができる。
【００１８】
本発明において、分子シャペロン遺伝子の発現量を調べる方法は、分子シャペロン遺伝子の発現を高める処理の有無または、分子シャペロン発現抑制因子の破壊の有無の間で発現量を比較することができれば良い。例えば、リアルタイムＰＣＲ法によって得られる増殖曲線を、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の発現量を内在性コントロールとした比較Ｃｔ法によって解析して相対発現量を調べることができる。
【００１９】
一般的に、遺伝子の「発現」という用語は、その遺伝子の翻訳産物すなわちタンパク質の産生のことを指すが、そのほかにも、その遺伝子の転写産物すなわちｍＲＮＡの産生のことを指すこともある。本発明では、遺伝子の「発現」と言えば特にことわりがない限りタンパク質のレベルにおける発現、ｍＲＮＡのレベルにおける発現（遺伝子の転写）のいずれをも指すものとする。タンパク質のレベルにおける発現量増加はその遺伝子の機能を遂行する最終産物の増加を反映し、ｍＲＮＡのレベルにおける発現量増加はその遺伝子の活性化に伴う直接的な結果を反映する。
したがって、本発明における遺伝子の転写量の増加は、特にことわりがない限り、タンパク質量の増加、ｍＲＮＡ量の増加、遺伝子の転写量の増加と同義で用いられる。
【００２０】
本発明で得られた微生物は、果汁飲料、野菜飲料、乳製品、食肉製品、水産練製品、デザート類、ドレッシング類、健康食品類、麺類等の様々な飲食品に利用可能である。特に、発酵乳製品について、スターター菌種として使用することができる。
【００２１】
本発明でいう酸化ストレスとは、生残性に関わる重要な因子である酸素等によるストレスをいい、酸素そのものやその代謝物であるＨ2Ｏ2、スーパーオキシドラジカル、ヒドロキシルラジカル等の活性酸素によるストレスをも含め、広く酸素に起因するストレスを含むものとする。したがって、酸化ストレスに対する耐性の向上とは、これらの酸素が存在する環境下において生残性が向上することをいう。したがって、本発明の酸化ストレス耐性が向上した乳酸菌とは、特に、ｄｎａＫ、ｇｒｏＥＬ、ｇｒｏＥＳ等の分子シャペロン遺伝子の転写量を増加させる処理を行うことにより、前記処理を行わない菌体に比べて、酸化ストレス耐性、すなわち生残性が向上している乳酸菌のことをいう。例えば、乳酸菌を１００ｐｐｍのＨ2Ｏ2を添加したＭＲＳ培地中で３７℃、３０分間保存した場合の生残性が、処理を行わない場合に比べて２倍以上、好ましくは１０倍以上向上した乳酸菌がより好ましい。
このように、酸化ストレスに対する耐性が向上した乳酸菌は、当該乳酸菌を利用する食品の製造工程や食品の保存中の酸素等の存在する環境下において従来に比べて生残性が維持されるため、プロバイオティクスとしての役割を果たすことが可能である。
以下に、実施例を挙げ、本発明を詳しく説明する。しかし本発明はこの記載内容に限定されるものではない。
【実施例】
【００２２】
［実施例１］Ｈ2Ｏ2処理による分子シャペロン遺伝子発現量の変化確認試験
プロバイオティクス菌として使用されるラクトバチルス・ガセリＳＢＴ２０５５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９５３）について、様々なＨ2Ｏ2濃度で処理したときの分子シャペロン遺伝子の発現量を調べた。
（１）試験方法
i）遺伝子の転写量を増加させる処理（Ｈ2Ｏ2処理）
ＭＲＳ培地（ｐＨ６．０（ｐＨ無調整））で継代培養したラクトバチルス・ガセリＳＢＴ２０５５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９５３）菌体を遠心分離により回収した。回収した菌体を、Ｈ2Ｏ2を添加していないＭＲＳ培地（Ｈ2Ｏ2無添加区）、Ｈ2Ｏ2を１０ｐｐｍ（Ｈ2Ｏ2１０ｐｐｍ処理区）、２５ｐｐｍ（Ｈ2Ｏ2２５ｐｐｍ処理区）、５０ｐｐｍ（Ｈ2Ｏ2５０ｐｐｍ処理区）、１００ｐｐｍ（Ｈ2Ｏ2１００ｐｐｍ処理区）になるよう添加した各ＭＲＳ培地でそれぞれ懸濁し、３７℃で３０分間静置した。
ii）遺伝子の転写量測定
静置後、各菌液をサンプリングしてＲＮＡの抽出を行い、ｃＤＮＡを得た。リアルタイムＰＣＲ法によって得られる増殖曲線を、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の発現量を内在性コントロールとした比較Ｃｔ法によって解析して、分子シャペロン遺伝子の相対発現量を調べた。なお、無添加区（ｐH６、Ｈ2Ｏ2 ０ppm）中で３７℃３０分間静置したときの各遺伝子の発現量を１として、それぞれの条件の発現量Xを求めた後、log2（X）の値を相対発現量として算出した。すなわち、無添加区の場合の各遺伝子の発現量はlog2(1)=０となり、相対発現量が１のときに無添加区の場合に比べて２1倍の発現量となる。
なお、測定対象遺伝子として、分子シャペロン遺伝子であるｇｒｏＥＬ、ｇｒｏＥＳ、ｄｎａＫの他に、胆汁酸、低温、酸化ストレス等に対する耐性に関与すると細菌において報告されているｂｓｈ、ｃｆａ、ｃｌｐＣ、ｃｌｐＬ、ｃｌｐＰ、ｃｓｐＡ、ｇｓｈ、ｌｄｈ、ｐｏｘについて調べた。
（２）試験結果
各遺伝子の相対発現量を図１に示した。
ｄｎａＫ、ｇｒｏＥＬ、ｇｒｏＥＳ遺伝子については、Ｈ2Ｏ2５０ｐｐｍ処理区では、Ｈ2Ｏ2無添加区に比べて各遺伝子の発現量が４倍程度高くなっていた。一方で、Ｈ2Ｏ2１００ｐｐｍ処理区では、各遺伝子の発現量の増加は認められなかった。
また、ｃｆａ、ｃｌｐＣ、ｃｌｐＬ、ｃｌｐＰ、ｃｓｐＡ、ｇｓｈ遺伝子については、Ｈ2Ｏ2１０ｐｐｍ処理区、または２５ｐｐｍ処理区では各遺伝子の発現量の増加は認められたが、Ｈ2Ｏ2５０ｐｐｍ処理区、１００ｐｐｍ処理区では各遺伝子の発現量が減少した。
一方、ｂｓｈ、ｌｄｈ、ｐｏｘ遺伝子は、Ｈ2Ｏ2濃度が高くなるに伴い遺伝子の発現が減少した。
よって、分子シャペロン遺伝子ｄｎａＫ、ｇｒｏＥＬ、ｇｒｏＥＳは、Ｈ2Ｏ2５０ｐｐｍまで濃度依存的にその発現量が増加し、Ｈ2Ｏ2処理により、遺伝子の転写が増加していることがわかった。
【００２３】
［実施例２］酸化ストレス耐性試験
実施例１の結果から、Ｈ2Ｏ2濃度０ｐｐｍから１００ｐｐｍの間で分子シャペロン遺伝子の発現量に変化があることがわかった。
次に、これらのＨ2Ｏ2濃度で処理したラクトバチルス・ガセリＳＢＴ２０５５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９５３）の酸化ストレス（Ｈ2Ｏ2）に対する耐性を確認した。
（１）酸化ストレス耐性試験
実施例１．（１）．i）の方法に従って、０、１０、２５、５０、１００ｐｐｍ濃度に
よりＨ2Ｏ2処理を行った。
各処理後の菌液を遠心分離して、各菌体を回収し、Ｈ2Ｏ2濃度１００ｐｐｍに調整したＭＲＳ培地にそれぞれ懸濁した。保存０時間として各濃度中の菌体のサンプリングを行った後、１０℃で２４時間静置保存した。保存終了後に再度サンプリングを行った。保存２４時間後のサンプルの生菌数（Ｎ1）を保存０時間のサンプルの生菌数（Ｎ0）で除してその常用対数の値を生残性（生残率）とした（下記式）。
生残性（生残率）＝ｌｏｇ10（Ｎ1／Ｎ0）
（２）実施結果
Ｈ2Ｏ2で処理を行った菌体の生残性を図２に示した。Ｈ2Ｏ2処理により生残性が向上しており、特にＨ2Ｏ2５０ｐｐｍ処理区ではＨ2Ｏ2無添加区に比べて１００倍以上生残性が向上した。一方で、Ｈ2Ｏ2１００ｐｐｍ処理区では無添加区より生残性が低下した。
以上の結果から、Ｈ2Ｏ2１０〜５０ｐｐｍで処理を行うことにより、濃度依存的に酸化ストレス（Ｈ2Ｏ2）耐性が向上することがわかった。したがって、ｄｎａＫ、ｇｒｏＥＬ、ｇｒｏＥＳの発現量がＨ2Ｏ2耐性に関与することが明らかとなった。
【００２４】
［実施例３］ｐＨ処理、熱処理による分子シャペロン遺伝子の発現量の変化確認試験
ｐＨや温度条件を変えて処理したときの分子シャペロン遺伝子の発現量を調べた。
（１）試験方法
i）遺伝子の転写量を増加させる処理（高温環境処理）
ＭＲＳ培地（ｐＨ６．０（ｐＨ無調整））で継代培養したラクトバチルス・ガセリＳＢＴ２０５５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９５３）菌体を遠心分離により回収した。回収した菌体をＭＲＳ培地（ｐＨ６．０）または、ｐH５．０になるよう乳酸で調整したＭＲＳ培地でそれぞれ懸濁し、温度（３７℃または４５℃）、Ｈ2Ｏ2濃度（０ｐｐｍまたは５０ｐｐｍ）条件をかえて処理を行い、３０分間静置した。
（各処理条件：ｐH、温度、Ｈ2Ｏ2濃度）
・ｐH６．０、３７℃、０ｐｐｍ（「コントロール」という。）
・ｐH５．０、３７℃、０ｐｐｍ（「ｐH５．０」という。）
・ｐH６．０、４５℃、０ｐｐｍ（「４５℃」という。）
・ｐH６．０、３７℃、５０ｐｐｍ（「５０ｐｐｍ」という。）
ii）遺伝子の転写量測定
実施例１．（１）．ii）の方法に従って遺伝子転写量の測定を行った。なお、コントロ
ールの遺伝子の発現量を１としてそれぞれの条件の場合の発現量Xを求めた後、log2（X）の値を相対発現量として算出した。
なお、分子シャペロン遺伝子としては、ｄｎａＫ、ｇｒｏＥＬ、ｇｒｏＥＳについて調べた。
（２）試験結果
各条件で処理した場合の分子シャペロン遺伝子の発現量を図３に示した。
ｄｎａＫに関しては、４５℃は、コントロールに比べて４倍程度の発現量であった。５０ｐｐｍと同等の高い結果であった。
一方、ｇｒｏＥＬ、ｇｒｏＥＳに関しては、４５℃処理でコントロールの２倍以上の発現量が得られたが、Ｈ2Ｏ2５０ｐｐｍに比べると発現量は少なかった。
なお、ｐH５．０処理では、いずれの分子シャペロン遺伝子でも発現量の大きな変化は認められなかった。
【００２５】
［実施例４］酸化ストレス耐性試験
実施例３の各条件で処理を行ったラクトバチルス・ガセリＳＢＴ２０５５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１５５３５）の酸化ストレス（Ｈ2Ｏ2）に対する耐性を確認した。
(１)実施方法
ラクトバチルス・ガセリＳＢＴ２０５５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９５３）を用いて、実施例３．（１）．i）の各処理を行った。処理を施した菌体を実施例２の酸化ストレス耐性試験に従い、Ｈ2Ｏ2１００ｐｐｍに調整したＭＲＳ培地でそれぞれ懸濁して１０℃で２４時間保存し、２４時間保存後の生残性を測定した。
（２）実施結果
各条件の生残性を図４に示した。
４５℃処理、５０ｐｐｍ処理ともコントロールに比べて生残性の向上が認められた。５０ｐｐｍ処理の効果が最も高かった。
以上より、高温環境で処理を行うことにより、酸化ストレス耐性が向上することが確認できた。なお、ｐH５．０処理では生残性の向上はみられなかった。
【００２６】
［実施例５］ｈｒｃA遺伝子破壊株における分子シャペロン遺伝子の発現量の変化確認試験
分子シャペロン遺伝子ｄｎａＫ、ｇｒｏＥＬ、ｇｒｏＥＳの発現抑制因子としてHｒｃAタンパク質が知られている。そこで、特許第４４７３５７０号実施例１８の方法に従って取得したラクトバチルス・ガセリＳＢＴ２０５５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９５３）ｈｒｃＡ遺伝子破壊株（以下、「ΔｈｒｃＡ株」という。）の分子シャペロン遺伝子ｄｎａＫ、ｇｒｏＥＬ、ｇｒｏＥＳの発現量を調べた。
（１）試験方法
ＭＲＳ培地で継代培養したラクトバチルス・ガセリＳＢＴ２０５５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９５３）ΔｈｒｃＡ株の菌体を遠心分離により回収し、ｄｎａＫ、ｇｒｏＥＬ、ｇｒｏＥＳ遺伝子の発現量を調べた。遺伝子の発現量は、実施例１．（１）．ii）の方法に従ってに実施した。なお、実施例１の無添加区の各遺伝子の発現量を１としてΔｈｒｃＡ株の各遺伝子の発現量を算出した。
（２）試験結果
結果を図５に示した。ΔｈｒｃＡ株のｄｎａＫ、ｇｒｏＥＬ、ｇｒｏＥＳの相対発現量
は１６倍以上であり、発現量が著しく高いことがわかった。なお結果は示さなかったが、ｂｓｈ、ｃｆａなど実施例１に示したｄｎａＫ、ｇｒｏＥＬ、ｇｒｏＥＳ以外の遺伝子については、野生株とΔｈｒｃＡ株との間で発現量の違いはみられなかった。
【００２７】
［実施例６］酸化ストレス耐性試験
ラクトバチルス・ガセリＳＢＴ２０５５およびラクトバチルス・ガセリＳＢＴ２０５５ΔｈｒｃＡ株の酸化ストレス（Ｈ2Ｏ2）に対する耐性を確認した。
（１）実施方法
実施例２の方法に従って実施した。Ｈ2Ｏ2無添加（０ｐｐｍ）、または１００ｐｐｍに調整したＭＲＳ培地（ｐＨ６．０）でラクトバチルス・ガセリＳＢＴ２０５５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９５３、変異株と区別するために「野生株」という。）またはラクトバチルス・ガセリＳＢＴ２０５５ΔｈｒｃＡ株をそれぞれ懸濁して１０℃で２４時間保存し、
生残性を算出した。
（２）実施結果
結果を図６に示した。Ｈ2Ｏ2無添加では、両株とも生残性の低下は認められなかったが、Ｈ2Ｏ2１００ｐｐｍに保存した場合、野生株は２時間で１０,０００分の１以下まで生残性が低下した。一方、ΔｈｒｃＡ株の生残性は１００分の１以下であり、高い生残
性を示した。
以上の結果より、ｈｒｃＡ遺伝子を破壊することにより、ｄｎａＫ遺伝子等の発現が高まり、酸化ストレス耐性が向上することが確認できた。またΔｈｒｃＡ株では実施例５で
示したようにｄｎａＫ、ｇｒｏＥＬ、ｇｒｏＥＳ遺伝子の発現量が特異的に増加している。ΔｈｒｃＡ株で野生株に比べて酸化ストレス耐性が向上したことから、実施例１に示し
たｂｓｈ等の遺伝子は本発明でいう酸化ストレス耐性の向上に関与しないと言える。
【００２８】
［実施例７］酸化ストレス耐性試験
ラクトバチルス・ガセリＳＢＴ１２６５（ＦＥＲＭ Ｐ−１４８２５）、ＳＢＴ１７０３（ＦＥＲＭ  Ｐ−１７７８５）、ＳＢＴ０２７４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１０３９）の酸化ストレス耐性を確認した。
（１）実施方法
実施例１．（１）、i）の方法に従って遺伝子の転写量を増加させる処理（５０ｐｐｍ
Ｈ2Ｏ2処理）を行い、処理菌体を実施例２の方法に従って１００ｐｐｍのＨ2Ｏ2に保存し、酸化ストレス耐性を調べた。
（２）実施結果
各菌株のＨ2Ｏ2１００ｐｐｍ中での生残性を図７に示した。ラクトバチルス・ガセリＳＢＴ１２６５、ＳＢＴ１７０３、ＳＢＴ０２７４の３株とも、Ｈ2Ｏ2５０ｐｐｍで処理を行った場合に生残性の向上が確認できた。なお、結果は示さなかったが、前記３株のｄｎａＫ、ｇｒｏＥＬ、ｇｒｏＥＳの相対発現量も２倍以上に増加していた。
【００２９】
［実施例８］
ラクトバチルス・ガセリＳＢＴ２０５５について、Ｈ2Ｏ2０ｐｐｍまたは５０ｐｐｍで処理した菌を含む発酵乳を調製し、保存時のガセリ菌の生残性を調べた。
（１）発酵乳の調製
脱脂粉乳とショ糖を水に溶解し、９%(w/w)還元脱脂乳、８％(w/w)ショ糖を含む培地を調製し、当該培地を９５℃で１０分間殺菌した。前記殺菌培地にLb. delbrueckii.subsp bulgaricus およびStreptococcus thermophilusを含むスターターを接種して、４１℃でｐH４．５まで発酵させて、発酵乳を調製した。
（２）発酵乳へのガセリ菌添加と保存
MRSで培養したラクトバチルス・ガセリＳＢＴ２０５５を実施例１、（１）、i）の方法
に従ってＨ2Ｏ2濃度０ｐｐｍ、または５０ｐｐｍのMRS培地中で、３７℃で３０分間処理し、菌体を回収した。回収した菌体を１１５℃、２０分間滅菌した９％脱脂乳で懸濁してガセリ菌液とした。このガセリ菌液を、（１）で調製した発酵乳に添加、混合して１０℃で保存した。調製直後と１４日後、２８日後の生菌数を測定し、保存後（１４、２８日）のサンプルの生菌数（Ｎ1）を調製直後のサンプルの生菌数（Ｎ0）で除してその常用対数の値を生残性（生残率）とした（下記式）。
生残性（生残率）＝ｌｏｇ10（Ｎ1／Ｎ0）
（３）実施結果
保存後のガセリ菌の生残性を図８に示した。Ｈ2Ｏ2５０ｐｐｍで処理した場合、生残性はほとんど低下せず、保存２８日目では、Ｈ2Ｏ2で処理をしなかった（０ｐｐｍ）場合に比べて１０倍以上の高い生残性を示した。
以上より、本発明の微生物を用いることにより、乳製品等の飲食品中での生残性を向上させることができることが明らかである。
【００３０】
［実施例９］酸化ストレス耐性試験
ラクトバチルス・アシドフィルスＳＢＴ２０６２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１０７５）の酸化ストレス耐性を確認した。
（１）実施方法
実施例１、（１）、i）の方法に従って、遺伝子の転写量を増加させる処理（２５ｐｐｍ
Ｈ2Ｏ2処理）を行い。処理菌体を実施例２の方法により１００ｐｐｍのＨ2Ｏ2に保存し、酸化ストレス耐性を調べた。
（２）実施結果
各菌株のＨ2Ｏ2１００ｐｐｍ中での生残性を図９に示した。ラクトバチルス・アシドフィルスＳＢＴ２０６２をＨ2Ｏ2２５ｐｐｍで処理を行った場合に生残性の向上が確認できた。なお、結果は示さなかったが、ラクトバチルス・アシドフィルスＳＢＴ２０６２のｄｎａＫ、ｇｒｏＥＬ、ｇｒｏＥＳの相対発現量は２倍以上に増加していた。
【産業上の利用可能性】
【００３１】
本発明によれば、乳酸菌の分子シャペロン遺伝子の発現を高めることにより、酸化ストレスがかかる環境下でも生残性が高い乳酸菌を製造することができる。したがって、このようにして得られる乳酸菌を酸化ストレスにさらされることの多い発酵乳等の食品に使用すれば、保存後においても乳酸菌の生残性の高い食品を提供することが可能となる。
【受託番号】
【００３２】
[寄託生物材料への言及]
ラクトバチルス・ガセリＳＢＴ２０５５
イ  当該生物材料を寄託した寄託機関の名称及び住所
独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター
日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（郵便番号305-8566）
ロ  イの寄託機関に生物材料を寄託した日付
平成８年３月２７日
ハ  イの寄託機関が寄託について付した受託番号
ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９５３
【００３３】
ラクトバチルス・ガセリＳＢＴ１２６５
イ  当該生物材料を寄託した寄託機関の名称及び住所
独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター
日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（郵便番号305-8566）
ロ  イの寄託機関に生物材料を寄託した日付
平成７年３月１４日
ハ  イの寄託機関が寄託について付した受託番号
ＦＥＲＭ  Ｐ−１４８２５
【００３４】
ラクトバチルス・ガセリＳＢＴ１７０３
イ  当該生物材料を寄託した寄託機関の名称及び住所
独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター
日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（郵便番号305-8566）
ロ  イの寄託機関に生物材料を寄託した日付
平成１２年３月１５日
ハ  イの寄託機関が寄託について付した受託番号
ＦＥＲＭ  Ｐ−１７７８５
【００３５】
ラクトバチルス・ガセリＳＢＴ０２７４
イ  当該生物材料を寄託した寄託機関の名称及び住所
独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター
日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（郵便番号305-8566）
ロ  イの寄託機関に生物材料を寄託した日付
平成１２年３月１５日
ハ  イの寄託機関が寄託について付した受託番号
ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１０３９
【００３６】
ラクトバチルス・アシドフィルスＳＢＴ２０６２
イ  当該生物材料を寄託した寄託機関の名称及び住所
独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター
日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（郵便番号305-8566）
ロ  イの寄託機関に生物材料を寄託した日付
平成１年５月１８日
ハ  イの寄託機関が寄託について付した受託番号
ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１０７５
【図１】
2014121281.tif 000002
【図２】
2014121281.tif 000003
【図３】
2014121281.tif 000004
【図４】
2014121281.tif 000005
【図５】
2014121281.tif 000006
【図６】
2014121281.tif 000007
【図７】
2014121281.tif 000008
【図８】
2014121281.tif 000009
【図９】
2014121281.tif 000010