(57)【要約】【課題】消費者および使用者に対して安全性が高く、安価な植物病害抵抗性増強剤とそれを用いた植物病害防除法を提供すること。【解決手段】Ｌ−体又はＤ−体の、グルタミン酸、アスパラギン、アスパラギン酸、スレオニン、アラニン、バリン、アルギニン、及びセリンからなる群から選ばれるアミノ酸を含むイネの病害抵抗性増強剤をイネに施用することにより、イネいもち病、イネ白葉枯病等の病害を防除する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルタミン酸、アスパラギン、アスパラギン酸、スレオニン、アラニン、バリン、アルギニン、及びセリンからなる群から選ばれるアミノ酸を含むイネの病害抵抗性増強剤。
【請求項２】
根圏施用又は葉面散布によりイネに施用される、請求項１に記載の病害抵抗性増強剤。
【請求項３】
病害が、イネいもち病、又はイネ白葉枯病である、請求項１〜３いずれか一項に記載の病害抵抗性増強剤。
【請求項４】
前記アミノ酸を、合計量で０．２〜２００ｍＭ含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の病害抵抗性増強剤。
【請求項５】
前記アミノ酸がＬ−体である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の病害抵抗性増強剤。
【請求項６】
前記アミノ酸がＤ−体である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の病害抵抗性増強剤。
【請求項７】
さらに、アミノ酸以外のイネ病害抵抗性誘導剤を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の病害抵抗性増強剤。
【請求項８】
グルタミン酸を含む、請求項７に記載の病害抵抗性増強剤。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の病害抵抗性増強剤をイネに施用することを特徴とする、イネの病害を防除する方法。
【請求項１０】
前記病害抵抗性増強剤を、前記アミノ酸の量として、０．２〜２００ｍＭ／１００〜５０００Ｌ／ヘクタールの施用量で施用する、請求項９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アミノ酸を有効成分として、環境負荷が少なくかつ使用者および消費者にとって安全なイネの病害抵抗性増強剤、及び病害防除方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
農作物の病害を防除する方法においては、植物病原菌に対する殺菌作用を有する化学物質や病原菌の感染機能を阻害する薬剤などを有効成分とする化学農薬が主として用いられている。しかしながら、このようなタイプの農薬は標的生物以外にも少なからず影響を及ぼすと考えられている。近年の食料品に対する消費者の安全意識の高まりとともに、化学合成農薬の不使用、使用量の低減、天然系農薬による病害防除技術が強く求められるようになってきている。
【０００３】
そのような時流の中で注目されているのが、植物本来の病害抵抗性を増強させる技術である。
【０００４】
植物が有する病原菌に対する抵抗性は、静的（受動的）抵抗性と動的（能動的）に大別される。静的抵抗性とは、植物細胞壁の硬さや厚さ、ポリフェノール類の蓄積など、病原菌の感染を受ける前から植物が具備している物理的・化学的な性質による抵抗性を意味する。これに対し、動的抵抗性は、植物細胞または組織が外敵の攻撃やその予兆を察知して積極的に発動する一連の防御応答を意味する。高等植物の動的反応としては、活性酸素の生成とそれに伴う過敏感細胞死、パピラの形成、病原菌に対して抗菌活性をもつファイトアレキシン（phytoalexins）合成系酵素をコードする遺伝子群の発現上昇、侵入菌の細胞壁を分解するキチナーゼやグルカナーゼ、あるいはその他のＰＲ（Pathogenesis-related）タンパク質の合成などがある（例えば非特許文献１）。
【０００５】
植物と非親和性関係の病原体、またはエリシターなどで植物を人為的に処理することによって植物組織に構築される、物理的・化学的な障壁に基づいた抵抗性を、誘導抵抗性と呼ぶ。この現象は、抵抗性誘導物質と呼ばれる特定の物質で植物を前処理することによって、植物が本来有する動的抵抗性が引き出された結果であるとみなすことができる。
【０００６】
他方、誘導抵抗性と比べると応答は微弱であるが、病原菌の侵入を受けると、動的抵抗性を迅速かつ強力に誘導できる状態が植物細胞内に作り出される現象をプライミングという。
【０００７】
動的抵抗性は、空間的な差異から局部獲得（誘導）抵抗性（Localized Acquired Resistance：ＬＡＲ）と全身獲得（誘導）抵抗性（Systemic Acquired Resistance：ＳＡＲ）に分類される。ＳＡＲとは、基本的には植物体の一部に化学的、物理的または生物的ストレスを与えたとき、その情報が全身に伝わるとともにそのストレスに対する新たな抵抗性が全身に誘導される現象をいう。ＬＡＲはＳＡＲとは区別されている。ＬＡＲが全身的に誘導されたものがＳＡＲとの考えもあるが、ＳＡＲは複数のシグナルを介して伝達されていると考えられ、病害応答遺伝子の発現パターンからも、質的に両者はまったく同じではないと考えられている（例えば非特許文献１）。
【０００８】
ＳＡＲにおいて中心的な働きをする物質として、サリチル酸（ＳＡ）が古くから注目されており、多くの研究がなされている。このＳＡシグナル経路で最も重要な因子の一つがＮＰＲ１であり、ＮＰＲ１遺伝子が破壊されているシロイヌナズナではＳＡより下流でＳＡＲのシグナル伝達が遮断される上、過剰発現させることによって耐病性が誘導される（非特許文献１）。
【０００９】
イネでは、ＳＡの下流はＮＰＲ１経路とＷＲＫＹ４５経路に分岐していることが示されている（非特許文献２）。ＷＲＫＹ４５は転写因子をコードし、ＰＲタンパク質遺伝子など病害抵抗性に関わる多くの遺伝子の発現を制御している。ＷＲＫＹ４５遺伝子の強発現株ではイネいもち病菌に対し強い抵抗性を示す（非特許文献２）。
【００１０】
植物病害を防除する手段として、殺菌剤を散布することによって直接病原体を攻撃する方法の他に、静的抵抗性および動的抵抗性を利用した病害防除方法も複数提案されており、その一部は農業で実用化されている。
【００１１】
静的抵抗性を高める方法としてはケイ素を施肥する方法が広く知られている。特にイネではケイ素で処理することで細胞壁が物理的に強固になり、イネいもち病菌をはじめとする病原菌の感染を抑制すると考えられている。
【００１２】
イネをケイ素で処理することで病害を抑制する手法としては、シリカゲルを施肥する方法が知られている（非特許文献３）。また、ヒスチジン、リジン、グルタミン、グリシン、イミダゾール、ケイ酸ナトリウムをイネに施用して、ケイ酸の取り込みを促進させる方法が報告されている（非特許文献４）。
【００１３】
他方、動的抵抗性を利用した薬剤は植物抵抗性誘導剤と呼ばれる。殺菌剤など植物病原体に対して直接作用するタイプの農薬は、継続的に使用すると薬剤に対して抵抗性変異株が出現する場合が多い。これに対し植物抵抗性誘導剤は、直接病原菌に作用するのではなく、植物の抵抗性を誘導することで病害感染を防除することから、これまでにこのタイプの農薬の抵抗性変異株が出現した事例は認められていない。さらに、抵抗性誘導型農薬は生物に対する殺菌作用が少ないために、植物以外の生物を含めた環境への負荷は比較的少ないと考えられている。
【００１４】
これまで植物の病害抵抗性誘導を目的とした農薬として、プロベナゾール(商品名：オリゼメート。明治製薬（株）)、ベンゾチアゾール系(BTH)のアシベンゾラルＳメチル（ASM、商品名：バイオン。シンジェンタ ジャパン（株））、チアジアゾールカルボキサミド系のチアニジル（商品名：ブイゲット。日本農薬（株））が販売されている。
【００１５】
また、病害抵抗性を誘導する天然物由来の物質としては多糖体分解物（例えば、特許文献１）、セレブロシド類（例えば、特許文献２）、ジャスモン酸（例えば、特許文献３）、キチンオリゴ糖（例えば、非特許文献５）、β-1,3-およびβ-1,6-グルカンオリゴ糖（例えば、非特許文献６）、胆汁酸（特許文献４）、ペプチドグリカン（非特許文献７）、リポポリサッカライド(非特許文献８)などが報告されている。これらの物質は特にエリシターと呼ばれており、これらを処理することによって動的抵抗性が誘導され、ファイトアレキシンの蓄積、キチナーゼやβ−１，３−グルカナーゼなどのＰＲタンパク質の蓄積、過敏感細胞死が誘起されることが知られている（例えば、非特許文献１）。また、イネではケイ素で処理することによってファイトアレキシンの蓄積が増強されるとの報告もある（非特許文献１０）。
【００１６】
一部の植物抵抗性誘導剤は、プライミング効果物質として働いていると考えられている（例えば非特許文献１）。プライミング効果物質とは、これで植物を事前に処理することによって、エリシターや病原菌に対する細胞応答を著しく高進させ、動的抵抗性を迅速かつ強力に誘導できる状況を植物細胞内に作り出す物質を指す。プライミング効果物質としては、植物抵抗性誘導剤の他にβ−アミノ酪酸（BABA）が報告されている。
【００１７】
アミノ酸によって病害が抑制されるとの報告はいくつか存在する。プロリン（非特許文献９）がトウジンビエの病害を防除又は抑制することが報告されている。また、含硫アミノ酸（特許文献７、８）、アミノ酪酸（特許文献７）、又はグリシン（特許文献９）は、微生物やグルコース等と組み合わせることによって、植物の病害を防除、又は病害抵抗性を高めることが報告されているが、アミノ酸単独の効果ではない。さらに、アミノ酸を含む混合肥料（特許文献１０、１１、１２）や、アミノ酸発酵液（特許文献５）又は微生物菌体を酸性溶液中で加熱処理することにより得られる抽出液（特許文献６）の施用により植物病害を防除し得ることが報告されているが、これらもアミノ酸単独の効果ではない。また、アミノ酸混合物（プロリン、メチオニン）（特許文献１３）による植物病害防除も報告されているが、単独のアミノ酸による効果ではなく、病害抵抗性誘導によるものでもない。さらに、リジン又はグルタミン酸の発酵液による病害防除について報告されているが（特許文献１４）、データは記載されておらず、有効成分が不明であり、病害抵抗性誘導によるものであるかも明らかではない。また、ＤＬ−フェニルアラニンでシコクビエの葉を処理するとフェノール物質の合成が促進されること、それをイネごま葉枯病菌の胞子発芽と発芽管伸長を阻害することが報告されているが（非特許文献１１）、実際にフェニルアラニン処理が病原菌の侵入や感染を抑制するのかどうかは記載されていない。
【００１８】
イネ科植物であるイネ（Oryza sativa）に対するアミノ酸単独での病害抵抗性誘導に関しては、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−リジン、Ｌ−グルタミン、又はＬ−グリシンで水田を処理することによってイネの病害を抑制するとの報告あるが、これはケイ酸の取り込みを促進し植物細胞壁、特に葉面の物理的強度を高めるというものである（非特許文献４）。尚、同文献では、グルタミン酸による虫害抑制について記載されているが、病害については記載されていない。
【００１９】
アミノ酸と病害抵抗性との関連が示されている先行知見では、Ｌ−体が使用されており、他方のエナンチオマー（鏡像異性体）であるＤ−体に関する知見は無い。Ｄ−アミノ酸は真核生物の生体内には極わずかしか存在しておらず、その生物学的意義は不明な部分が多い。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２０】
【特許文献１】特開平5-331016号公報
【特許文献２】特許第2846610号公報
【特許文献３】特開平11-29412号公報
【特許文献４】特開2006-219372号公報
【特許文献５】特開平6-80530号公報
【特許文献６】国際公開第WO/2009/088074号
【特許文献７】特開2003-34607号公報
【特許文献８】特許第4287515号
【特許文献９】中国特許公開第1640233A
【特許文献１０】中国特許公報第1316893C
【特許文献１１】中国特許公開第1328769A
【特許文献１２】中国特許公開第101182270A
【特許文献１３】中国特許公開第101142925A
【特許文献１４】中国特許公報第1155543C
【非特許文献】
【００２１】
【非特許文献１】分子レベルから見た植物の耐病性−ポストゲノム時代の植物免疫研究−  島本功ら  秀潤社  ２００４
【非特許文献２】Shimono, M. et. al., Plant Cell,2007,19:2064-2076
【非特許文献３】Hayasaka, T., Phytopathology, 2008, 98:1038-1044
【非特許文献４】Voleti, S.R. et al., Crop Protection, 2008, 27:1398-1402
【非特許文献５】Yamada A. et. al., Biosci. Biotech. Biochem., 1993, 57(3):405-409
【非特許文献６】Yamaguchi, T. et. al., Plant Cell, 2000, 12:817-826
【非特許文献７】Gust, A.A. et. al., J. Biol. Chem., 2007, 282:32338-32348
【非特許文献８】Newman, M.A. et al., Plant J. 2002, 29:487-495
【非特許文献９】V Raj, S.N. et al., Phytoparasitica, 2004, 32:523-527
【非特許文献１０】Rodorigues, F. A., et al., Phytopathology, 2004, 94:177-183
【非特許文献１１】Purushothaman, D. et al., Current Science, 1974, 43: 47-49
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２２】
本発明は、消費者および使用者に対して安全性が高く、安価なイネの病害抵抗性増強剤とそれを用いたイネの病害防除法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
本発明者らは、イネの病害抵抗性を誘導する物質を探索したところ、Ｌ−またはＤ−アミノ酸に高い病害抵抗性誘導活性があることを発見した。特に、グルタミン酸、アスパラギン、アスパラギン酸、スレオニン、バリン、アルギニン、アラニンをイネ植物に施用することで、病害に対する動的抵抗性が全身的に誘導されることを見出した。また、これらのアミノ酸処理がイネいもち病菌のような病害に対して高い防除効果を示すことを確認した。
【００２４】
さらに、アミノ酸以外のイネ病害抵抗性誘導剤と前記アミノ酸を併用することにより、病害抵抗性誘導効果を顕著に高めることを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成されたものである。
【００２５】
すなわち本発明は、以下のとおりである。
（１）グルタミン酸、アスパラギン、アスパラギン酸、スレオニン、アラニン、バリン、アルギニン、及びセリンからなる群から選ばれるアミノ酸を含むイネの病害抵抗性増強剤。
（２）根圏施用又は葉面散布によりイネに施用される、前記病害抵抗性増強剤。
（３）病害が、イネいもち病、又はイネ白葉枯病である、前記病害抵抗性増強剤。
（４）前記アミノ酸を、合計量で０．２〜２００ｍＭ含む、前記病害抵抗性増強剤。
（５）前記アミノ酸がＬ−体である、前記病害抵抗性増強剤。
（６）前記アミノ酸がＤ−体である、前記病害抵抗性増強剤。
（７）さらに、アミノ酸以外のイネ病害抵抗性誘導剤を含む、前記病害抵抗性増強剤。
（８）グルタミン酸を含む、前記病害抵抗性増強剤。
（９）前記病害抵抗性増強剤をイネに施用することを特徴とする、イネの病害を防除する方法。
（１０）前記病害抵抗性増強剤を、前記アミノ酸の量として、０．２〜２００ｍＭ／１００〜５０００Ｌ／ヘクタールの施用量で施用する、前記方法。
【発明の効果】
【００２６】
本発明のイネ病害抵抗性増強剤は、アミノ酸を有効成分とするものであり、安全性が高く、安価に製造することができる。また、本発明の方法により、イネの病害抵抗性を効果的に増強することができる。
【００２７】
殺菌剤のような植物病原菌に対して直接作用するタイプの農薬は、継続的な使用により薬剤に対する抵抗性変異株が出現することが多いが、植物抵抗性誘導剤は、薬剤の抵抗性変異株が出現しにくく、長期間にわたる使用が可能であることが知られている。本発明の病害抵抗性増強剤の有効成分であるＬ−またはＤ−アミノ酸は、病原菌に対する直接的な殺菌作用ではなく、病害抵抗性を誘導することによって病原菌の感染を防ぐものであり、抵抗性変異株が出現しにくく、長期間にわたる使用が可能であることが期待でき、産業上極めて有用である。
【００２８】
生物はエナンチオマーを区別して認識する。Ｄ−アミノ酸は、Ｌ−アミノ酸と比較すると環境中での微生物による分解は受けにくいと考えられている。本発明の一態様では、Ｄ−アミノ酸を利用することで安定的な病害防除効果の持続が実現できると期待される。
【００２９】
既存の植物病害抵抗性誘導剤、例えば農薬登録がなされている植物病害抵抗性誘導剤とアミノ酸を混合使用することによって、防除効果を高めるか、又は植物病害抵抗性誘導剤の使用量を低減させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】アミノ酸の根圏施用によるイネいもち病防除効果を示す図。
【図２】アミノ酸の葉面散布によるイネいもち病防除効果を示す図。PBZはプロベナゾールを表す（以下、同様）。
【図３】アミノ酸の根圏施用によるイネ根組織における病害抵抗性誘導効果を示す図。cht3はキチナーゼ３遺伝子を、OsNPR1はイネゲノムにおけるNPR1遺伝子を表す。ORZはオリゼメート（プロベナゾールを有効成分とする農薬）を表す。
【図４】人工培地上で無菌的に栽培したイネのアミノ酸に対する応答を示す図。conはネガティブコントロールを表す（以下、同様）。根組織における病害応答遺伝子の発現量を示す。
【図５】プロベナゾールとアミノ酸の併用効果を示す図。根組織における病害応答遺伝子の発現量を示す。
【図６】オリゼメートとアミノ酸の併用効果を示す図。controlはコントロールを表す。第４葉における病害応答遺伝子の発現量を示す。
【図７】アミノ酸のエナンチオマー間での病害抵抗性誘導効果の違いを示す図。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００３２】
本発明のイネの病害抵抗性増強剤は、グルタミン酸、アスパラギン、アスパラギン酸、スレオニン、アラニン、バリン、アルギニン、及びセリンからなる群から選ばれるアミノ酸を有効成分として含む。これらのアミノ酸のうち、グルタミン酸、アスパラギン、アスパラギン酸、スレオニン、及びアラニンが好ましい。病害抵抗性増強剤は、各アミノ酸を単独で含んでいてもよく、任意の２種又はそれ以上のアミノ酸を含んでいてもよい。複数種のアミノ酸を含む場合、１種はグルタミン酸であることが好ましい。また、病害抵抗性増強剤は、これらのアミノ酸以外のアミノ酸を含んでいてもよい。
【００３３】
前記各アミノ酸は、Ｌ−体、Ｄ−体のいずれであってもよく、Ｌ−体及びＤ−体を任意の割合で含む混合物であってもよい。特にセリンは、Ｄ−体が好ましい。
【００３４】
アミノ酸は、フリー体でもよく、アンモニウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩等の塩であってもよい。
【００３５】
前記アミノ酸は、そのアミノ酸を含む限り形態は特に制限されず、一般に販売されている試薬、発酵法で製造した精製品又は粗精製品、精製過程で生じる副生物であってもよく、また、海産物からの抽出物、又はタンパク質の加水分解物など、前記アミノ酸を含む組成物であってもよい。
【００３６】
本発明の他の形態は、前記アミノ酸に加えて、アミノ酸以外のイネ病害抵抗性誘導剤を含む。アミノ酸以外のイネ病害抵抗性誘導剤としては、アミノ酸以外の化合物であって、イネ病害に対して動的抵抗性又はプライミングを誘導することができる物質であれば特に制限されず、プロベナゾール(商品名：オリゼメート。明治製薬（株）)、ベンゾチアゾール系(BTH)のアシベンゾラルＳメチル（ASM、商品名：バイオン。シンジェンタ ジャパン（株））、チアジアゾールカルボキサミド系のチアニジル（商品名：ブイゲット。日本農薬（株））等の市販されている薬剤が挙げられる。また、多糖体分解物（特開平5-331016号）、セレブロシド類（特許第2846610号）、ジャスモン酸（特開平11-29412号）、キチンオリゴ糖（Yamada A. et. al., Biosci. Biotech. Biochem., 1993, 57(3):405-409）、β-1,3-およびβ-1,6-グルカンオリゴ糖（Yamaguchi, T. et. al., Plant Cell, 2000, 12:817-826）、胆汁酸（特開2006-219372公報）、ペプチドグリカン（Gust, A.A. et. al., J. Biol. Chem., 2007, 282:32338-32348）、リポポリサッカライド(V Raj, S.N. et al., Phytoparasitica, 2004, 32:523-527)などの天然物由来のイネ病害抵抗性誘導物質も使用することができる。
【００３７】
尚、本発明において、「病害抵抗性増強剤」と「病害抵抗性誘導剤」の用語は、本発明の病害抵抗性増強剤と、アミノ酸以外の病害抵抗性誘導作用を有する物質を便宜的に区別するものであり、それらの作用を区別するためのものではない。本発明の病害抵抗性増強剤は、病害抵抗性誘導作用を有するものである。したがって、本発明の病害抵抗性増強剤は、病害抵抗性誘導剤と呼ぶこともできる。
【００３８】
アミノ酸と、アミノ酸以外のイネ病害抵抗性誘導剤を併用する場合、好ましいアミノ酸はグルタミン酸である。
【００３９】
植物病害抵抗性増強剤は、前記アミノ酸、及びアミノ酸以外の病害抵抗性誘導剤以外に、任意の成分を含んでいてもよい。このような成分としては、溶媒、担体、pH調整剤、植物体への展着力を高めるための展着剤、植物への浸透性を高めるための界面活性剤等の成分、肥効を高めるためのミネラル等の肥料成分、農薬成分、バインダー、増量剤等が挙げられる。これらの成分としては、本発明の効果を損なわない限り、通常農薬、肥料等に用いられている成分を用いることができる。
【００４０】
本発明によるイネ病害抵抗性増強剤の剤型は液剤、粉剤、粒剤、乳剤、水和剤、油剤、エアゾール、フロアブル剤等の何れの使用形態でも良く、施用の為の薬剤の形態、その使用形態、施用方法は特に限定されるものではない。
【００４１】
担体成分としては、例えば、本発明のイネ病害抵抗性増強剤が底床添加剤又は固形剤である場合には、バーミキュライト、タルク、珪藻土、カオリン、炭酸カルシウム、クレー、水酸化カルシウム、白土、シリカゲル等の無機質や小麦粉、澱粉等の固体担体を、また液剤である場合には、水、キシレン等の芳香族炭化水素類、エタノール、エチレングリコール等のアルコール類、アセトン等のケトン類、ジオキサン、テトラヒドロフラン等のエーテル類、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、アセトニトリル等の液体担体を用いることができる。
【００４２】
また、使用に際して、固体状又は粉体状のイネ病害抵抗性増強剤を、水、アルコール等の溶媒に溶解又は分散させてもよい。
【００４３】
また、本発明の好ましい態様によれば、イネ病害抵抗性増強剤は病害防除剤として用いられるものである。そして、本発明の別の態様によれば、本発明によるイネ病害抵抗性増強剤をイネに施用する、イネ病害防除方法が提供される。
【００４４】
イネ病害抵抗性増強剤におけるアミノ酸の含量は特に制限されず、後述の施用量に応じて適宜設定することができる。例えば、イネ病害抵抗性増強剤におけるアミノ酸の含量は、病害抵抗性増強に有効な量が施用できる限り特に制限されないが、アミノ酸を単独で含む場合は、例えば、通常０．２〜２００ｍＭ、好ましくは１〜１００ｍＭである。複数のアミノ酸を含む場合の含量は、合計で、０．２〜２００ｍＭ、好ましくは１〜１００ｍＭである。尚、前記濃度は、植物病害抵抗性増強剤が固形又は粉体状の場合は、使用時に溶液にしたときの濃度である。
【００４５】
イネ病害抵抗性増強剤が、アミノ酸以外のイネ病害抵抗性誘導剤を含む場合、その含有量は特に制限されないが、例えば、通常、０．１ｍM〜２００ｍM、好ましくは１ｍM〜５０ｍMである。農薬登録を受けているイネ病害抵抗性誘導剤については、それぞれの推奨量に依存する。
また、アミノ酸と、アミノ酸以外のイネ病害抵抗性誘導剤の量比は、例えば、通常、1:1/10000〜1：1000、好ましくは1：1/200〜1：20である。
【００４６】
本発明の病害抵抗性増強剤の対象となる植物は、イネ（Oryza sativa）である。イネの品種としては、日本晴、コシヒカリ、ひとめぼれ、ヒノヒカリ、あきたこまち、はえぬき、きらら３９７、キヌヒカリ、ほしのゆめ、つがるロマン、ななつぼし、ゆめあかり、あさひの夢、あいちのかおり、夢つくし、ササニシキ、コー・コー  ７号、コー・コー  ２３号、コー・コー  １０号、プレー  １、サンパートーン  １、カオドークマリ  １０５、ピサヌローク  １、ピサヌローク  ３、ピサヌローク  ６０−１、コー・コー  ６、ナム・ルー、チャオ・ホー、シウ・メーチャン、Ｒ２５８、ラチサイル、ＩＲ５、ペリタ１−１、シサダネ、シサンガルング、ＩＲ６４、シボゴ、コンデ、シヘラング、ドドカン、ダナウテムペ、シラタ、ＩＲ８、ＴＮ１、ウイダス、ＩＲ２０、ダナウガウング、ペタ、シアプス、メムベラモ等が挙げられるが、これらに制限されない。
【００４７】
実施例に示すように、アミノ酸施用によってイネの病害応答遺伝子の発現が顕著に上昇することが示され、アミノ酸施用による病害抵抗性は、ケイ酸など他の物質を介さない、直接的作用による動的抵抗性、特に全身獲得抵抗性の誘導によるものであることが示された。植物の動的抵抗性は病原菌に対して非特異的であることから、対象病害としては特に制限されない。例えば糸状菌、細菌、ウイルスを原因とする植物病害が含まれる。イネの代表的な病害の例としてイネ白葉枯病、イネ炭疽病、イネ紋枯病、イネ苗立枯病、イネ葉鞘褐変病、イネばか苗病、イネ縞葉枯病、イネ黄化萎縮病などが挙げられる。これらの中では、特にイネいもち病に有効である。この病害の病原菌としてはイネいもち病菌（Magnaporthe oryzae）が挙げられる。
【００４８】
また、本発明の植物病害防除法は、病害の予防を主な目的としており、病害が発生する時期に先駆けて使用することが好ましい。ただし、病害の発生後であってもその拡大を抑制したり、病害を減弱する効果は期待できる。
【００４９】
病害抵抗性増強剤を、イネに施用することにより、上記のような病害に対する抵抗性を増強することができる。施用の方法は特に制限されず、その剤形および水田の状態、農業従事者の事情に応じた方法で用いられ得る。例えば、植物の生長点のみならず、茎や葉をはじめとする植物体の一部又は全体に液剤や乳剤として散布、滴下あるいは塗布等することができる。またその他にも根圏への施用、例えば土壌への表面散布、潅注、土壌への混合、又は根への浸漬処理が挙げられる。これらの中では、根圏施用が好ましい。
尚、実施例に示されるように、本発明の病害抵抗性増強剤を根圏に施用した場合、地上部では、全身獲得抵抗性またはプライミングが誘導されることが示唆される。
【００５０】
本イネ病害抵抗性誘導剤のイネへの投与については、その頻度は投与目的やイネ固体の生育ステージ等により異なる。例えば、田植え前であればイネの苗床に施用することで幼病の病害を抑制できる。
【００５１】
病害抵抗性増強剤の施用量は、有効成分の濃度、施用時期、施用回数、植物の種類、栽培密度、生育段階、施用方法等によっても異なり得る。葉面散布では、施用量は、アミノ酸の量として、例えば、通常０．２〜２００ｍＭを１００〜５０００Ｌ／ヘクタール、好ましくは２〜１００ｍＭを５００〜１０００Ｌ／ヘクタールである。複数のアミノ酸を併用する場合は、合計量で通常０．２〜２００ｍＭを１００〜５０００Ｌ／ヘクタール、好ましくは２〜１００ｍＭを５００〜１０００Ｌ／ヘクタールが好ましい。また、病害抵抗性増強剤を根圏に施用する場合も、施用量は上記の葉面散布と同様である。
アミノ酸を含む病害抵抗性増強剤と、アミノ酸以外のイネ病害抵抗性誘導剤は、別々にイネに施用してもよい。
【実施例】
【００５２】
以下、実施例をもって本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００５３】
〔実施例１〕イネいもち病の防除効果
（１）植物体の栽培と散布方法
イネ（品種「日本晴」）の栽培は以下のように行った。園芸用培養土（パワーソイル; 呉羽化学工業株式会社）とバーミキュライト（株式会社エス・ケー・アグリ）を４：１の割合で混合した土をポット（ＢＥＥ  ＰＯＴ；キャネロン化工株式会社）に入れ、催芽させたイネを播種し、１４日間栽培した。培養庫内の温度は23〜25℃、日周は14時間明期、光強度はおよそ100μmol m-2 s-1で栽培した。
アミノ酸のイネの根圏への施用は、フードパック（中央化学株式会社、Ｃ−ＡＰフルーツ２００）に３００ｍｌの溶液を入れ、そこにイネをポットごと浸漬することで行った。またアミノ酸の葉面への直接散布は、同様の手順で生育させたイネの第４葉に、ミックスパワー（シンジェンタジャパン）を０．１％（ｖ／ｖ）加えた各溶液を噴霧することにより行った。
【００５４】
（２）イネいもち病防除評価
１０ｍＭ Ｌ−グルタミン酸ナトリウム（Ｇｌｕ）、１０ｍＭ Ｌ−アラニン（Ａｌａ）、１０ｍＭ Ｌ−アスパラギン（Ａｓｎ）、１０ｍＭ Ｌ−アスパラギン酸ナトリウム（Ａｓｐ）、１０ｍＭ Ｌ−フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、１０ｍＭ Ｌ−スレオニン（Ｔｈｒ）、１０ｍＭ Ｌ−バリン（Ｖａｌ）、又は１０ｍＭ Ｌ−アルギニン（Ａｒｇ）を、それぞれ播種して２週間後のイネの根圏、又は葉面に施用した。根圏施用の場合はその48時間後に、葉面施用の場合は24時間後に、イネいもち病菌（Magnaporthe oryzae）をイネに接種した。根圏施用は、前記のとおりポットをアミノ酸溶液に浸漬することにより、葉面施用は直接散布により、各々行った。イネいもち病菌の接種は、分生胞子懸濁液（1×105 分生胞子/mL）を葉面に噴霧することにより行った。噴霧接種後、暗所、湿室下に24時間静置することにより、イネいもち病菌を植物体に感染させた。接種４日後に各処理葉に発生した罹病性病斑数を測定することで、評価を行った。アミノ酸溶液の代りに、ネガティブコントロール区には水を、葉面散布試験ではポジティブコントロールとして0.5mMプロベナゾールを用いた。防除価は以下の式に従って算出した。３〜４回実験を繰り返し、それぞれの実験における防除価の平均を図１および図２に示す。
【００５５】
防除価＝（１−各区一葉当たりの平均病斑数／ネガティブコントロール区一葉当たりの平均病斑数）×１００
【００５６】
アミノ酸根圏施用による防除価を図１に示す。ネガティブコントロール区と比較し、いずれのアミノ酸も根圏施用により有意に病原菌の感染を防除できることが示された。また、Ｌ−フェニルアラニン以外の各アミノ酸は、Ｌ−フェニルアラニンよりも高い感性防御効果を示した。
【００５７】
アミノ酸葉面散布による防除価を図２に示す。ネガティブコントロール区と比較し、アミノ酸の葉面散布により有意に病原菌の感染を防除できることが示された。
【００５８】
本実験からアミノ酸による防除効果は葉面散布よりも根圏施用の方がより高いことが示された。
【００５９】
また、根圏施用により直接アミノ酸が接触していない葉部でも抵抗性が誘導されていることから、全身的に病害抵抗性が誘導されていることが示された。
【００６０】
〔実施例２〕病害応答遺伝子の発現上昇を指標とした植物病害抵抗性誘導の評価
（１）植物体の栽培と施用方法
イネは、培養庫内の温度は２８〜２５℃、日周は１４時間明期、光強度はおよそ３００００Ｌｘで栽培した。イネ品種は日本晴を用いた。籾殻を取り除いたイネ種子を２日間、暗下、３０℃で催芽させた。園芸用培養土（パワーソイル; 呉羽化学工業（株））とバーミキュライト（（株）エス・ケー・アグリ）を４：１の割合で混合した土をポット（ＢＥＥ  ＰＯＴ；キャネロン化工（株））に入れ、催芽させたイネを播種し、１４日間栽培した。被検試料のイネの根圏施用は、フードパック（中央化学（株）、Ｃ−ＡＰフルーツ２００）に３００ｍｌの溶液を入れ、そこにイネをポットごと浸漬することで行った。
【００６１】
（２）ＲＮＡ抽出と定量ＲＴ−ＰＣＲ
イネの病害抵抗性誘導評価は、根および第４葉を用いて行なった。
病害応答遺伝子の転写量を定量するため、上記のようにして栽培したイネから根又は第４葉をサンプリング後、直ちに液体窒素で凍結し、-80℃で保存した。凍結状態のまま植物破砕機（MM300 MIXER MILL GRINDER；Retsch)により破砕した。EZ1 RNA Tissue Mini Kit（キアゲン社）およびMagtration System 12Gc（キアゲン社）を用いてＲＮＡ抽出を行った後、ＰＣＲ装置（7500Real Time PCR System；Applied Biosystems社）を用い、定量的ＰＣＲによりキチナーゼ３遺伝子、OsＮＰＲ１遺伝子、ＷＲＫＹ４５遺伝子、及びＰＲ１０（ＰＢＺ１）遺伝子の発現量の比較を行った。内部標準には真核生物転写伸張因子ｅＥＦ−１ａ遺伝子を用いた。
キチナーゼ遺伝子、ＮＰＲ１遺伝子、ＰＢＺ１（ＰＲ１０）遺伝子（分子レベルから見た植物の耐病性−ポストゲノム時代の植物免疫研究−  島本功ら  秀潤社  ２００４）、及びＷＲＫＹ４５（Shimono, M. et. al., Plant Cell,2007,19:2064-2076）は、病害抵抗性との関連が知られている。
【００６２】
評価試験の際における病害応答遺伝子発現の発現を誘導する物質としては、Ｌ−グルタミン酸ナトリウム、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸ナトリウム、Ｌ−スレオニン、Ｌ−バリン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アラニン、Ｌ−フェニルアラニン、又は比較のために0.6％オリゼメート（明治製菓（株）の登録商標）を用いた。オリゼメートはSARを誘導する薬剤であるプロベナゾールを有効成分とする農薬（粒剤）である。
【００６３】
各種アミノ酸溶液をそれぞれ単独の１０ｍＭ濃度でイネ根圏に施用し、根組織における６時間後の遺伝子の転写量を定量した結果を図３に示す。図３には、それぞれ３反復の実験の平均値と標準誤差（ＳＥ）を示し、グルタミン酸、アスパラギン、アスパラギン酸、スレオニン、バリン、アルギニン、アラニン、又はフェニルアラニンを施用することで根組織におけるキチナーゼ３、OsＮＰＲ１、ＷＲＫＹ４５、ＰＲ１、ＰＲ１０（ＰＢＺ１）の各遺伝子の転写活性が上昇することが明らかとなった。このことは、根組織において病害応答が起こっていることを示している。尚、各アミノ酸による各遺伝子の転写活性の上昇は、Ｌ−フェニルアラニンと同程度がそれ以上であった。
【００６４】
根組織における応答は非常に安定しており、各遺伝子の転写レベルと、いもち病防除効果とが相関していた。このことから、アミノ酸を根圏施用した際に根で起こる応答がいもち病抵抗性を付与する最初の重要なステップであると考えた。
根圏施用した48時間後の地上部（第４葉）における病害応答遺伝子の転写量を測定したところ、病害応答遺伝子の明確な発現上昇が観察された。WRKY45の高発現株はイネいもち病に対し強い抵抗性を示すことが報告されている（Shimono, M. et. al., Plant Cell,2007,19:2064-2076）。実際にアミノ酸の根圏施用によって、いもち病菌の感染は顕著に抑制されることから、SARが誘導されていると考えられた。
【００６５】
〔実施例３〕アミノ酸施用による病害抵抗性誘導の機序
アミノ酸がケイ酸の吸収を促し、その結果植物の表層の物理的強化により病害抵抗性が付与されるとの報告がある（Voleti, S.R. et al., Crop Protection, 2008, 27:1398-1402）。またケイ酸によってイネ抗菌性物質、ファイトアレキシンの蓄積が誘導されるとの結果が報告されている（Rodorigues, F. A., et al., Phytopathology, 2004, 94:177-183）。
【００６６】
アミノ酸施用によるSARが、ケイ酸など他の物質を介さない、直接的作用によるものなのかを明らかにするために、下記の実験を行った。
【００６７】
ムラシゲ・スクーグ培地用混合塩類（日本製薬（株）)４．６ｇ、チアミン塩酸塩０．３ｍｇ、ニコチン酸０．５ｍｇ、ピリドキシン塩酸塩０．０５ｍｇ、ミオイノシトール１００ｍｇ、スクロース３０ｇを１リットルの純水（ミリポア社純水製造装置を使用）に溶解させ、pH5.8に調整後、ゲランガムを３ｇ加えオートクレーブ（１２０℃、２０分）した。滅菌した培養器にオートクレーブ後の培地を所定の量流し込み、冷却させ寒天培地を作製した。イネ（日本晴）の種子を２０％次亜塩素酸ナトリウムで表面殺菌後、寒天培地上に播種し１週間生育させた。クリーンベンチ内でイネを慎重に引き抜き、可能な限り根に付着した培地片を取り除いた後、殺菌済みのプラスチック容器に分注した１０ｍＭ Ｌ−グルタミン酸ナトリウム（Ｇｌｕ）、または１０ｍＭ Ｌ−アスパラギン（Ａｓｎ）に根部を浸した。ネガティブコントロールには水を、ポジティブコントロールには0.5mM プロベナゾールを用いた。４８時間、２８℃、３００００Ｌｘで培養後、根をサンプリングし、上述の方法でRNAを抽出した。ｃＤＮＡを作製後、定量的ＰＣＲによりキチナーゼ３遺伝子、OsＮＰＲ１遺伝子、ＷＲＫＹ４５遺伝子、ＰＲ１０（ＰＢＺ１）遺伝子の発現量の比較を行った。本実験では内部標準にポリユビキチン遺伝子ＰＵＢＱを用いた。
【００６８】
その結果を図４に示す。
人工培地上で無菌的に生育させたイネの根圏にアミノ酸を施用することでも、ＷＲＫＹ４５、OsNPR1、ＰＲ１ｂ、ＰＢＺ１（ＰＲ１０）、キチナーゼ３の各遺伝子の転写活性が上昇した。このことから、アミノ酸が直接イネの組織に作用することによって病害抵抗性を誘導すること、さらにその経路はケイ酸等土壌に含まれる他の物質を介したものではないことが明らかとなった。
【００６９】
また本実験により、病害抵抗性は微生物の混入や汚染によって誘起されたものではないことが示された。
【００７０】
〔実施例４〕既知の植物病害抵抗性誘導剤とアミノ酸の混合施用による病害抵抗性誘導効果の上昇
アミノ酸と既知の植物病害抵抗性誘導剤を併用することによって、植物病害抵抗性誘導効果が高まるのかを明らかにするため、以下の実験を行った。
【００７１】
根組織における病害抵抗性誘導を観察するために、上述のとおり、ムラシゲ・スクーグ培地上で無菌的に栽培したイネの根を１ｍＭプロベナゾール、１ｍＭ Ｌ−グルタミン酸ナトリウム（Ｇｌｕ）、および両者を１ｍＭずつ含む溶液に６時間浸漬させた。
また、第４葉における病害抵抗性誘導を観察するために、実施例２で記載した手順に従ってイネを生育させ、イネの根を０．３％ オリゼメート、５ｍＭ Ｌ−グルタミン酸ナトリウム（Ｇｌｕ）、および両者を前記濃度で含む溶液に４８時間浸漬した。コントロールとして水を用いた。それぞれの組織をサンプリング後、全ＲＮＡを抽出しｃＤＮＡを合成後、上記の手段でキチナーゼ３遺伝子およびＰＲ１０（ＰＢＺ１）、ＷＲＫＹ45、OsＮＰＲ１の各遺伝子の転写量を定量した。
【００７２】
根組織における各遺伝子の発現量の変化を図５に示す。
プロベナゾール、Ｌ−グルタミン酸それぞれ単独の場合に比べ、両者を併用することによって、根組織での各遺伝子発現量が顕著に上昇することが明らかとなった。
【００７３】
第４葉における各遺伝子の発現量の変化を図６に示す。
オリゼメートとＬ−グルタミン酸を併用することで、４葉部での各遺伝子発現量が上昇することが明らかとなった。
【００７４】
本実験より、アミノ酸以外の植物病害抵抗性誘導剤とアミノ酸を併用することで、全身的に病害応答遺伝子の発現が上昇することが示された。したがって、アミノ酸以外の植物病害抵抗性誘導剤とアミノ酸の併用によって、植物病害抵抗性誘導効果が高まることが示された。本発見により、農薬である植物病害抵抗性誘導剤に非農薬のアミノ酸を添加することで、農薬の使用量を削減できると考えられる。
【００７５】
〔実施例６〕アミノ酸のエナンチオマー間での病害抵抗性誘導効果の違い
タンパク質を構成するＬ−アミノ酸だけでなく、生体内にわずかしか存在しないＤ−体にも病害抵抗性を誘導する効果があるのか評価を行った。
【００７６】
上述のとおり、ムラシゲ・スクーグ培地上で無菌的に栽培したイネの根を、１ｍＭのＤ−またはＬ−体のグルタミン酸（Ｇｌｕ）、セリン（Ｓｅｒ）またはバリン（Ｖａｌ）溶液にそれぞれ６時間浸漬した。ポジティブコントロールとして１ｍＭプロベナゾールを施用した。サンプリング後全ＲＮＡを抽出しｃＤＮＡを合成後、上記の方法でキチナーゼ３およびＰＲ１０（ＰＢＺ１）、ＷＲＫＹ４５の各遺伝子の転写量を定量した。
【００７７】
その結果を図７に示す。
バリンはＬ−体のほうがＤ−体よりも強く病害抵抗性を誘導したが、グルタミン酸の場合、両者はほぼ同レベルであった。これに対しセリンはＤ−体がより強く病害抵抗性を誘導した。このことは、効果の差はあることしても、Ｌ−体だけでなくＤ−体でも病害抵抗性誘導効果が期待されることを示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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