(57)【要約】【課題】アルカリプロテアーゼを効率良く且つ安定的に生産することができる、アルカリプロテアーゼの生産方法を提供する。【解決手段】recA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を欠失又は不活性化させた枯草菌（Bacillus subtilis）を用いてアルカリプロテアーゼを生産する、アルカリプロテアーゼの生産方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
recA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を欠失又は不活性化させた枯草菌（Bacillus subtilis）を用いてアルカリプロテアーゼを生産する、アルカリプロテアーゼの生産方法。
【請求項２】
前記recA遺伝子が下記（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つのタンパク質をコードする遺伝子である、請求項１記載のアルカリプロテアーゼの生産方法。
（ａ）配列番号１２のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号１２のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、相同組換え活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号１２のアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、相同組換え活性を有するタンパク質
【請求項３】
前記枯草菌が、アルカリプロテアーゼ生産能を有する枯草菌のrecA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を欠失又は不活性化させて得られた枯草菌である、請求項１又は２記載のアルカリプロテアーゼの生産方法。
【請求項４】
前記枯草菌に異種アルカリプロテアーゼをコードする遺伝子が導入されており、前記枯草菌に異種アルカリプロテアーゼを生産させる、請求項１〜３のいずれか１項記載のアルカリプロテアーゼの生産方法。
【請求項５】
枯草菌（Bacillus subtilis）のrecA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を欠失又は不活性化させてアルカリプロテアーゼの生産性を安定的に向上させる、アルカリプロテアーゼの安定的な生産性向上方法。
【請求項６】
前記recA遺伝子が下記（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つのタンパク質をコードする遺伝子である、請求項５記載のアルカリプロテアーゼの安定的な生産性向上方法。
（ａ）配列番号１２のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号１２のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、相同組換え活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号１２のアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、相同組換え活性を有するタンパク質
【請求項７】
前記枯草菌が、アルカリプロテアーゼ生産能を有する枯草菌のrecA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を欠失又は不活性化させて得られた枯草菌である、請求項５又は６記載のアルカリプロテアーゼの生産性向上方法。
【請求項８】
前記枯草菌に異種アルカリプロテアーゼをコードする遺伝子が導入されており、前記枯草菌に異種アルカリプロテアーゼを生産させる、請求項５〜７のいずれか１項記載のアルカリプロテアーゼの生産性向上方法。
【請求項９】
枯草菌（Bacillus subtilis）のrecA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を欠失又は不活性化させてアルカリプロテアーゼの生産性を安定化させる、アルカリプロテアーゼの生産性安定化方法。
【請求項１０】
前記recA遺伝子が下記（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つのタンパク質をコードする遺伝子である、請求項９記載のアルカリプロテアーゼの生産性安定化方法。
（ａ）配列番号１２のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号１２のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、相同組換え活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号１２のアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、相同組換え活性を有するタンパク質
【請求項１１】
前記枯草菌が、アルカリプロテアーゼ生産能を有する枯草菌のrecA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を欠失又は不活性化させて得られた枯草菌である、請求項９又は１０記載のアルカリプロテアーゼの生産性安定化方法。
【請求項１２】
前記枯草菌に、異種アルカリプロテアーゼをコードする遺伝子が導入されており、前記枯草菌に異種アルカリプロテアーゼを生産させる、請求項９〜１１のいずれか１項記載のアルカリプロテアーゼの生産性安定化方法。
【請求項１３】
枯草菌（Bacillus subtilis）のrecA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を欠失又は不活性化させ、且つ異種アルカリプロテアーゼをコードする遺伝子が導入された、異種アルカリプロテアーゼ生産用組換え微生物。
【請求項１４】
前記recA遺伝子が下記（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つのタンパク質をコードする遺伝子である、請求項１３記載の微生物。
（ａ）配列番号１２のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号１２のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、相同組換え活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号１２のアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、相同組換え活性を有するタンパク質
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルカリプロテアーゼの生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
プロテアーゼは、食品・水産加工工業、皮革工業、繊維工業、醸造工業、洗剤工業などに広く用いられている酵素であるが、洗浄剤への配合も古くから行われており、現在多くのアルカリプロテアーゼが洗浄剤用酵素として用いられている。
さらに近年、特に衣料用洗剤は、環境問題の面から無リン化あるいは洗剤使用量の省力化が進められているが、これにより低下する洗浄力を補うためにアルカリプロテアーゼの配合が行われており、アルカリプロテアーゼの需要が高まっている。
【０００３】
大量に且つ廉価に高性能なアルカリプロテアーゼを生産するために、これまでに遺伝子組換え技術を用いたアルカリプロテアーゼの改変方法及び生産方法が検討されている。例えば、特許文献１〜９には、洗浄剤に適したアルカリプロテアーゼ及びその改変方法、並びに改変アルカリプロテアーゼをコードする遺伝子をバシラス・エスピー（Bacillus  sp．）などの宿主微生物に導入し、アルカリプロテアーゼを生産する方法が記載されている。
【０００４】
一方、微生物は元来、自然界における様々な環境変化に対応するための多種多様な遺伝子群を有しており、近年のゲノム解読の結果からは、細胞増殖／分裂、代謝、核酸合成、情報伝達に関わる遺伝子群、さらに多くの機能未知の遺伝子群が存在することが明らかにされている。一方で、工業的な有用物質生産に微生物を用いる場合、限定した培地成分が豊富に供給され安定に生存できる環境が与えられるため、ゲノム上にコードにされる遺伝子のなかには、有用物質の生産にとっては不要な或いは有害な働きをする遺伝子も存在する。
そこで、不要な或いは有害な働きをすると考えられる遺伝子を欠失又は不活性化することによって、有用物質（例えば異種タンパク質）の生産性を向上させるといった試みが行われている。例えば、特許文献１０には、転移因子を有する納豆菌（Bacillus subtilis  var．natto）のrecA遺伝子を欠損させることにより、植え継ぎを繰り返した場合であっても転移因子の抑制によりポリ−ガンマ−グルタミン酸の生産性を安定に保持できることが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第９９／１８２１８号公報
【特許文献２】特開２００２−２１８９８９号公報
【特許文献３】特開２００２−３０６１７６号公報
【特許文献４】特開２００３−１２５７８３号公報
【特許文献５】特開２００４−１２２号公報
【特許文献６】特開２００４−５７１９５号公報
【特許文献７】特開２００４−３０５１７５号公報
【特許文献８】特開２００４−３０５１７６号公報
【特許文献９】特開２００６−１２９８６５号公報
【特許文献１０】特開２０１０−５７３８８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、アルカリプロテアーゼを効率良く且つ安定的に生産することができる、アルカリプロテアーゼの生産方法を提供することを課題とする。
また、本発明は、アルカリプロテアーゼの生産性を向上させるとともに、その高い生産性を安定化させる、アルカリプロテアーゼの安定的な生産性向上方法を提供することを課題とする。
また、本発明は、アルカリプロテアーゼを生産する微生物のアルカリプロテアーゼの生産性を安定化させる、アルカリプロテアーゼの生産性安定化方法を提供することを課題とする。
さらに、本発明は、異種アルカリプロテアーゼを効率良く且つ安定的に生産することができる、異種アルカリプロテアーゼ生産用組換え微生物を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者等は遺伝子組換え技術を用いたアルカリプロテアーゼの高生産化について鋭意検討を行った。特許文献１０には、枯草菌（Bacillus subtilis）とは異なる性質を有する納豆菌においてrecA遺伝子を欠損させることによりポリ−ガンマ−グルタミン酸の生産性を保持することが記載されている。一方、特開平１−１９１６８９号公報には、枯草菌においてrecA遺伝子を欠損させた場合、導入するプラスミドが宿主細胞内で不安定となる場合があることが記載されている。
【０００８】
本発明者等は枯草菌を対象として検討を行った結果、recA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を欠失又は不活性化させた枯草菌を培養してアルカリプロテアーゼを生産させることで、当該遺伝子を欠失及び不活性化させない場合と比較してアルカリプロテアーゼの生産性が上昇するとともに、その高い生産性が安定化することを見出した。本発明はこの知見に基づき完成されたものである。
【０００９】
本発明は、recA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を欠失又は不活性化させた枯草菌を用いてアルカリプロテアーゼを生産する、アルカリプロテアーゼの生産方法に関する。
また、本発明は、枯草菌のrecA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を欠失又は不活性化させてアルカリプロテアーゼの生産性を安定的に向上させる、アルカリプロテアーゼの安定的な生産性向上方法に関する。
また、本発明は、枯草菌のrecA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を欠失又は不活性化させてアルカリプロテアーゼの生産性を安定化させる、アルカリプロテアーゼの生産性安定化方法に関する。
さらに、本発明は、枯草菌のrecA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を欠失又は不活性化させ、且つ異種アルカリプロテアーゼをコードする遺伝子が導入された、異種アルカリプロテアーゼ生産用組換え微生物に関する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のアルカリプロテアーゼの生産方法は、アルカリプロテアーゼを効率良く、且つ安定的に生産することができる。
また、本発明のアルカリプロテアーゼの安定的な生産性向上方法は、recA遺伝子及び当該遺伝子に相当する遺伝子を欠失及び不活性化させない場合と比較してアルカリプロテアーゼの生産性を向上させ、且つその高い生産性を安定化させることができる。
また、本発明のアルカリプロテアーゼの生産性安定化方法は、recA遺伝子及び当該遺伝子に相当する遺伝子を欠失及び不活性化させない場合と比較してアルカリプロテアーゼの生産性を安定化させることができる。
さらに、本発明の異種アルカリプロテアーゼ生産用組換え微生物は、異種アルカリプロテアーゼを効率良く且つ安定的に生産することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】SOE-PCR断片を用いた２重交差法によるrecA遺伝子欠失手順の一例を示す説明図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本明細書に記載の枯草菌の各遺伝子及び遺伝子領域の名称は、国際コンソーシアムの成果として報告され（Kunst  F.，et  al.，Nature，1997，vol．390，p．249-256）、JAFAN：Japan  Functional  Analysis  Network  for  Bacillus  subtilis（BSORF  DB）（http://bacillus.genome.ad.jp/参照)、BSORF  Bacillus  subtilis  Genome  Database（http://bacillus.genome.ad.jp/参照）において公開されている。
【００１３】
本明細書において、アミノ酸配列の同一性及び塩基配列の同一性は、Lipman-Pearson法（Lipman，DJ.，Pearson．WR.，Science，1985，vol．227，p．1435-1441）によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Win（ソフトウェア開発）のホモロジー解析（Search  homology）プログラムを用いて、Unit  size  to  compare（ktup）を2として解析を行うことにより算出される。
【００１４】
本明細書における「ストリンジェントな条件下」としては、例えばMolecular  Cloning-A  LABORATORY  MANUAL  THIRD  EDITION（Joseph  Sambrook，David  W．Russell，Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press(2001)）記載の条件が挙げられる。前記「ストリンジェントな条件」とは、例えば、ハイブリダイゼーション条件としては、５×ＳＳＣ、７１℃以上が好ましく、５×ＳＳＣ、８５℃以上がより好ましく、洗浄条件としては、１×ＳＳＣ、６０℃以上が好ましく、１×ＳＳＣ、７４℃以上がより好ましい。これら「ストリンジェントな条件」により、塩基配列同一性では約８０％以上又は約９０％以上の塩基配列を有する遺伝子の確認が可能である。
上記ＳＳＣ及び温度条件の組み合わせは例示であり、当業者であれば、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する上記の要素又は他の要素を適宜組み合わせることにより、適切なストリンジェンシーを実現することが可能である。
【００１５】
本明細書において、遺伝子の「上流」とは、翻訳開始点からの位置ではなく、対象として捉えている遺伝子又は領域の5'側に続く領域を示す。一方、遺伝子の「下流」とは、対象として捉えている遺伝子又は領域の3'側に続く領域を示す。
【００１６】
本明細書において、「アルカリプロテアーゼの生産性向上」とは、組換え微生物の１回の培養でアルカリプロテアーゼの生産性が向上することを指す。また、「アルカリプロテアーゼの安定的な生産性向上」とは、組換え微生物の継代培養や培地の置換を行ってもアルカリプロテアーゼの生産性が低下せずに向上することを指す。さらに、「アルカリプロテアーゼの生産性安定化」とは、組換え微生物の継代培養や培地の置換を行ってもアルカリプロテアーゼの生産性が低下しないこと又は低下し難くなることを指す。
【００１７】
本明細書において、「異種アルカリプロテアーゼ」とは、野生型の枯草菌が有さないアルカリプロテアーゼ又は野生型の枯草菌が有するアルカリプロテアーゼに変異が導入されたアルカリプロテアーゼを指す。さらに、「アルカリプロテアーゼをコードする遺伝子の導入」又は「異種アルカリプロテアーゼをコードする遺伝子の導入」とは、アルカリプロテアーゼをコードする遺伝子又は前記異種アルカリプロテアーゼをコードする遺伝子を枯草菌に発現可能に導入することを指す。
遺伝子の導入方法は、前記遺伝子の発現が可能であれば制限はないが、プラスミド等のベクターを用いて前記遺伝子を導入することが好ましい。当該ベクターの種類は、適宜選択することができるが、枯草菌内で自己複製可能なベクター（例えばプラスミド）であることが好ましく、多コピーのベクターであることがより好ましい。好ましいプラスミドの例としては、pT181、pC194、pUB110、pE194、pSN2、pHY300PLK等が挙げられる。
【００１８】
本発明で用いる組換え微生物は、recA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を欠失又は不活性化させた枯草菌である。枯草菌のrecA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を欠失又は不活性化することで、枯草菌のアルカリプロテアーゼ生産能を安定的に向上させることができる。本発明では、このような枯草菌を培養し、枯草菌にアルカリプロテアーゼを産生させる。
【００１９】
本明細書において、recA遺伝子は組換え酵素の１種であり相同組換え活性を有するRecAをコードする遺伝子である。ここで、枯草菌BSU16940株のRecAのアミノ酸配列を配列番号１２に、配列番号１２のアミノ酸配列からなるRecAをコードするrecA遺伝子の塩基配列を配列番号１１に、それぞれ示す。
なお、本発明においてrecA遺伝子は配列番号１１に示す塩基配列からなる遺伝子に限定されない。例えば、配列番号１２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子、配列番号１２に示すアミノ酸配列において１又は数個、好ましくは１〜１００個、より好ましくは１〜７０個、より好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、相同組換え活性を有するタンパク質をコードする遺伝子も含まれる。ここで、アミノ酸の付加には、両末端への１〜数個、好ましくは１〜１００個、より好ましくは１〜７０個、より好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個のアミノ酸の付加が含まれる。さらに、recA遺伝子には、配列番号１２に示すアミノ酸配列に対して７０％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、相同組換え活性を有するタンパク質をコードする遺伝子も含まれる。さらに、recA遺伝子には、配列番号１１に示す塩基配列に対して７０％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列からなり、相同組換え活性を有するタンパク質をコードする遺伝子も含まれる。さらに、recA遺伝子には、配列番号１１に示す塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、相同組換え活性を有するタンパク質をコードする遺伝子も含まれる。本明細書において、これらの遺伝子をrecA遺伝子に相当する遺伝子とする。
【００２０】
本発明において、recA遺伝子は、下記（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つのタンパク質をコードする遺伝子であることが好ましい。
（ａ）配列番号１２のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号１２のアミノ酸配列において１又は数個（好ましくは１〜１００個、より好ましくは１〜７０個、より好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個）のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、相同組換え活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号１２のアミノ酸配列と７０％以上（好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上）の同一性を有するアミノ酸配列からなり、相同組換え活性を有するタンパク質
【００２１】
recA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子の欠失又は不活性化は、recA遺伝子中に他のＤＮＡ断片を挿入する、又は、当該遺伝子の転写・翻訳開始領域に変異を与える等の方法によって行なうことができるが、標的遺伝子を物理的に欠失させることが好ましい。
recA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子の欠失又は不活性化の手順としては、recA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を計画的に欠失又は不活性化する方法のほか、ランダムな遺伝子の欠失又は不活性化変異を与えた後、適当な方法によりタンパク質生産性の評価及び遺伝子解析を行う方法が挙げられる。
【００２２】
recA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を欠失又は不活性化させる方法としては、常法を使用することができる。例えば、recA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子の一部を含むＤＮＡ断片を適当なプラスミド（ベクター）にクローニングして得られる環状の組換えプラスミドを親微生物細胞内に取り込ませ、recA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子の一部領域に於ける相同組換えによって親微生物ゲノム上のrecA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を分断して不活性化することが可能である（Leenhouts，K.，et  al.，Mol．Gen．Genet.，1996，vol．253，p．217-224）。
特に、相同組換えにより標的遺伝子を欠失又は不活性化する方法については、既にいくつかの報告例があり（Itaya，M.，Tanaka，T.，Mol．Gen．Genet.，1990，vol．223，p．268-272）、このような方法を繰り返すことによって、目的の組換え微生物を得ることができる。また、ランダムな遺伝子の不活性化方法としては、変異誘発剤の使用や親微生物への紫外線、ガンマ線等の照射によっても実施可能である。この場合、標的とする構造遺伝子内への塩基置換、塩基挿入或いは一部欠失といった変異導入の他に、プロモーター領域等の制御領域への同様の変異導入、または標的遺伝子の発現制御に関連する遺伝子への同様の変異導入によっても同等の効果が期待できる。さらに、より効率的な手法として、標的とする遺伝子の上流、下流領域を含むが標的とする遺伝子を含まない直鎖状のDNA断片をSOE（splicing  by  overlap  extension）-PCR法（Horton，RM.，et  al.，Gene，1989，vol．77，p．61-68）によって構築し、これを親微生物細胞内に取り込ませて親微生物ゲノム上の標的とする遺伝子の外側の２箇所で二回交差の相同組換えを起こさせることにより、ゲノム上の標的とする遺伝子を欠失させるといった手法も実施可能である（図１参照）。
【００２３】
本発明で用いる組換え微生物は、枯草菌であれば特に制限はないが、納豆菌を除く枯草菌が好ましく、Bacillus subtilis Marburg  No．168系統株がより好ましい。また、本発明で用いる組換え微生物は、本来的にアルカリプロテアーゼ生産能を有していない枯草菌であってもよいし、本来的にアルカリプロテアーゼ生産能を有している枯草菌であってもよい。本来的に異種アルカリプロテアーゼ生産能を有していない枯草菌の場合、異種アルカリプロテアーゼ生産能を付与するために、異種アルカリプロテアーゼをコードする遺伝子（以下、本明細書において「異種アルカリプロテアーゼ遺伝子」ともいう）を枯草菌に導入する必要がある。一方、本来的にアルカリプロテアーゼ生産能を有している枯草菌の場合、生産性向上に対してより大きな効果を図るべく、recA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子の欠失又は不活性化を行なえばよい。さらに、本発明で用いる組換え微生物は、トランスポゾン(Tn)や挿入配列(IS)などの転移因子を有さないことが好ましい。
【００２４】
アルカリプロテアーゼ遺伝子としては特に制限はなく、通常のアルカリプロテアーゼ遺伝子を採用することができるが、異種アルカリプロテアーゼ遺伝子が好ましい。本発明において異種アルカリプロテアーゼ遺伝子は、国際公開第９９／１８２１８号公報、特開２００２−２１８９８９号公報、特開２００２−３０６１７６号公報、特開２００３−１２５７８３号公報、特開２００４−１２２号公報、特開２００４−５７１９５号公報、特開２００４−３０５１７５号公報、特開２００４−３０５１７６号公報、又は特開２００６−１２９８６５号公報に記載のアルカリプロテアーゼ遺伝子が好ましく、配列番号１３のアミノ酸配列からなるアルカリプロテアーゼをコードする遺伝子若しくは配列番号１３のアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上の同一性をもつアミノ酸配列からなるアルカリプロテアーゼをコードする遺伝子、又は配列番号１３のアミノ酸配列若しくは配列番号１３のアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上の同一性をもつアミノ酸配列において下記（ｄ）〜（ａｓ）の少なくとも１つの変異がなされたアミノ酸配列からなるアルカリプロテアーゼをコードする遺伝子であることがより好ましい。なお、配列番号１３のアミノ酸配列を有するアルカリプロテアーゼは、プロテアーゼKP43（バシラス・エスピーKSM-KP43（FERM  BP-6532）由来、国際公開第９９／１８２１８号公報、GenBank  accession  No．AB051423参照）として公知である。
（ｄ）１３３位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基（好ましくはリジン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン、バリン、ロイシン、グリシン、セリン、グルタミン酸、アルギニン、ヒスチジン、メチオニン、トリプトファン、プロリン、フェニルアラニン又はイソロイシン）への置換
（ｅ）１３３位と１３４位又はこれらに相当する位置のアミノ酸残基の間へのアミノ酸残基（好ましくはリジン、ロイシン、セリン、メチオニン、グリシン、スレオニン、チロシン、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、アラニン、イソロイシン、トリプトファン又はアルギニン）の挿入
（ｆ）挿入前の１３４位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基（好ましくはスレオニン、セリン、グリシン又はアラニン）への置換
（ｇ）挿入前の１３５位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基（好ましくはアラニン、アルギニン又はメチオニン）への置換
（ｈ）１３２位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基（好ましくはセリン、グルタミン、メチオニン、アスパラギン、アスパラギン酸、スレオニン又はイソロイシン）への置換
（ｉ）１５位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基（好ましくはヒスチジン、システイン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、アラニン、バリン、メチオニン、トリプトファン又はフェニルアラニン）への置換
（ｊ）１６位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基（好ましくはスレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、リジン、ヒスチジン、バリン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン又はグルタミン）への置換
（ｋ）１６６位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基（好ましくはグリシン）への置換
（ｌ）１６７位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基（好ましくはバリン）への置換
（ｍ）１８７位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基（好ましくはセリン）への置換
（ｎ）３４６位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基（好ましくはアルギニン）への置換
（ｏ）４０５位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基（好ましくはアスパラギン酸）への置換
（ｐ）６３位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基（好ましくはセリン）への置換
（ｑ）８９位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基（好ましくはヒスチジン）への置換
（ｒ）１２０位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基（好ましくはアルギニン）への置換
（ｓ）６３位及び１８７位、又はこれらに相当する位置のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基（好ましくはセリン）への置換
（ｔ）２２６位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基（好ましくはチロシン）への置換
（ｕ）２９６位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基（好ましくはバリン）への置換
（ｖ）３０４位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基（好ましくはセリン）への置換
（ｗ）１６３位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基（好ましくはヒスチジン、アラニン、アスパラギン酸、フェニルアラニン、リジン、アスパラギン、セリン、イソロイシン、ロイシン、グルタミン、スレオニン又はバリン）への置換
（ｘ）１７０位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基（好ましくはバリン又はロイシン）への置換
（ｙ）１７１位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基（好ましくはアラニン、グルタミン酸、グリシン又はスレオニン）への置換
（ｚ）６５位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基（好ましくはプロリン又はトリプトファン）への置換
（ａａ）１０１位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基（好ましくはアスパラギン、セリン、スレオニン、システイン、グルタミン、チロシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、リジン、ヒスチジン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、トリプトファン、フェニルアラニン又はプロリン）への置換
（ａｂ）２７３位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基（好ましくはイソロイシン、グリシン又はスレオニン）への置換
（ａｃ）３２０位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基（好ましくはフェニルアラニン、バリン、スレオニン、ロイシン、イソロイシン又はグリシン）への置換
（ａｄ）３５９位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基（好ましくはセリン、ロイシン、バリン、イソロイシン又はグルタミン）への置換
（ａｅ）３８７位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基（好ましくはアラニン、リジン、グルタミン、グルタミン酸、アルギニン又はヒスチジン）への置換
（ａｆ）２５１位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基（好ましくはアスパラギン、グリシン、アラニン、アスパラギン酸、スレオニン、イソロイシン、バリン、ロイシン又はグルタミン）への置換
（ａｇ）８４位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基（好ましくはアルギニン）への置換
（ａｈ）１０４位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基（好ましくはプロリン、セリン、スレオニン、システイン、グルタミン、チロシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、リジン、ヒスチジン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、トリプトファン又はフェニルアラニン）への置換
（ａｉ）２５６位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基（好ましくはアラニン、スレオニン、システイン、グルタミン、チロシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、リジン、ヒスチジン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、トリプトファン、フェニルアラニン、プロリン又はセリン）への置換
（ａｊ）３６９位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基（好ましくはアスパラギン）への置換
（ａｋ）６６位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基（好ましくはグルタミン、アスパラギン酸、セリン、グルタミン酸、アラニン、スレオニン、ロイシン、メチオニン、システイン、バリン、グリシン、ヒスチジン、トリプトファン又はイソロイシン）への置換
（ａｌ）５７位、１０２位、1０３位、１０５位、１０６位、１３６位、１９３位若しくは３４２位、又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基（好ましくはリジン、セリン、グルタミン、フェニルアラニン、バリン、アルギニン、チロシン、ロイシン、イソロイシン、スレオニン、メチオニン、システイン、トリプトファン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、プロリン又はアラニン）への置換
（ａｍ）４６位若しくは２０５位、又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基（好ましくはチロシン、トリプトファン、アラニン、アスパラギン、グルタミン酸、スレオニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、ヒスチジン、セリン、リジン、グルタミン、メチオニン又はシステイン）への置換
（ａｎ）５４位、１１９位、１３８位、１４８位若しくは１９５位、又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基（好ましくはトリプトファン、フェニルアラニン、アラニン、アスパラギン、グルタミン酸、スレオニン、バリン、ヒスチジン、セリン、リジン、グルタミン、メチオニン、グリシン、アスパラギン酸、プロリン、アルギニン又はシステイン）への置換
（ａｏ）２４７位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基（好ましくはトリプトファン、フェニルアラニン、アラニン、アスパラギン、グルタミン酸、スレオニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、ヒスチジン、セリン、グルタミン、メチオニン又はシステイン）への置換
（ａｐ）１２４位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基（好ましくはアラニン又はリジン）への置換
（ａｑ）１０７位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基（好ましくはリジン、アルギニン、アラニン又はセリン）への置換
（ａｒ）２５７位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基（好ましくはバリン又はイソロイシン）への置換
（ａｓ）２６４位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基（好ましくはグルタミン、アスパラギン酸、セリン、グルタミン酸、アラニン、スレオニン、ロイシン、メチオニン、システイン、バリン、グリシン又はイソロイシン）への置換
【００２５】
また、本発明おいて、「相当する位置のアミノ酸残基」を特定する方法としては、例えばリップマン−パーソン法等の公知のアルゴリズムを用いてアミノ酸配列を比較し、各アルカリプロテアーゼのアミノ酸配列中に存在する保存アミノ酸残基に最大の同一性を与えることにより行なうことができる。プロテアーゼのアミノ酸配列をこのような方法で整列させることにより、アミノ酸配列中にある挿入、欠失にかかわらず、相同アミノ酸残基の各プロテアーゼにおける配列中の位置を決めることが可能である。相同位置は、三次元構造中で同位置に存在すると考えられ、対象のプロテアーゼの特異的機能に関して類似した効果を有することが推定できる。
【００２６】
「配列番号１３のアミノ酸配列と８０％以上の同一性をもつアミノ酸配列からなるアルカリプロテアーゼ」としては、前記に示した配列番号１３のアミノ酸配列において前記（ｄ）〜（ａｓ）の少なくとも１つの変異がなされたアミノ酸配列からなるアルカリプロテアーゼの他に、例えばプロテアーゼKP9860（バシラス・エスピーKSM-KP9860（FERM  BP-6534）由来、国際公開第９９／１８２１８号公報、GenBank  accession  No．AB046403参照）、プロテアーゼE-1（バシラスNo．D-6（FERM  P-1592）由来、特開昭４９−７１１９１号公報、GenBank  accession  No．AB046402参照）、プロテアーゼYa（バシラス・エスピーＹ（FERM  BP-1029）由来、特開昭６１−２８０２６８号公報、GenBank  accession  No．AB046404参照）、プロテアーゼSD521（バシラスSD521（FERM  P-11162）由来、特開平３−１９１７８１号公報、GenBank  accession  No．AB046405参照）、プロテアーゼA-1（NCIB12289由来、国際公開第８８／０１２９３号公報、GenBank  accession  No．AB046406参照）、プロテアーゼA-2（NCIB12513由来、国際公開第９８／５６９２７号公報参照）、プロテアーゼ9865（バシラス・エスピーKSM-9865（FERM  P-18566）由来、GenBank  accession  No．AB084155参照）などが挙げられる。
【００２７】
なお、前記アルカリプロテアーゼとして、配列番号１３のアミノ酸配列からなるアルカリプロテアーゼ、又は配列番号１３のアミノ酸配列と８０％以上（好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上）の同一性をもつアミノ酸配列からなるアルカリプロテアーゼであって、少なくとも、配列番号１３のアミノ酸配列において、３０位のアミノ酸残基又はこれに相当するアミノ酸残基がアスパラギン酸であり、７１位のアミノ酸残基又はこれに相当するアミノ酸残基がヒスチジンであり、且つ２５５位のアミノ酸残基又はこれに相当するアミノ酸残基がセリンであるアルカリプロテアーゼが好ましい。これらのアミノ酸残基は、アルカリプロテアーゼにおいて必須なアミノ酸であることが推定されている（Saekiら，Biochem．Biophys．Res．Commun.，2000，vol．279，p．313-319など参照）。
【００２８】
アルカリプロテアーゼ遺伝子は、枯草菌由来の遺伝子に限定されず、バシラス・エスピーなど枯草菌以外の微生物に由来するアルカリプロテアーゼ遺伝子であってもよい。
【００２９】
アルカリプロテアーゼ遺伝子を枯草菌で発現可能とするには通常の方法により行えばよく、例えば、国際公開第９９／１８２１８号公報、特開２００２−２１８９８９号公報、特開２００２−３０６１７６号公報、特開２００３−１２５７８３号公報、特開２００４−１２２号公報、特開２００４−５７１９５号公報、特開２００４−３０５１７５号公報、特開２００４−３０５１７６号公報、及び特開２００６−１２９８６５号公報の記載を参考にすればよい。具体的には、配列番号１３のアミノ酸配列からなるアルカリプロテアーゼ遺伝子（配列番号１４）に対して変異を施し、得られた変異遺伝子を用いて宿主を形質転換することで、アルカリプロテアーゼ遺伝子を導入することができる。配列番号１３のアミノ酸配列からなるアルカリプロテアーゼ遺伝子のクローニングは、一般的な遺伝子組換え技術を用いればよく、例えば国際公開第９９／１８２１８号公報、国際公開第９８／５６９２７号公報記載の方法に従って行なえばよい。
アルカリプロテアーゼ遺伝子の変異手段としては、一般的に行われている部異特異的変異の方法がいずれも採用できる。より具体的には、例えばSite-Directed  Mutagenesis  System  Mutan-Super  Express  Kmキット（タカラ社製）等を用いて行なうことができる。また、リコンビナントＰＣＲ（polymerase  chain  reaction）法（PCR  protocols，Academic  Press，New
York，1990）を用いることによって、遺伝子の任意の配列を、他の遺伝子の該任意の配列に相当する配列と置換することが可能である。
【００３０】
本発明において、recA遺伝子を欠失又は不活性化する時期、及びアルカリプロテアーゼ遺伝子の枯草菌への導入時期は特に限定されない。例えば、recA遺伝子を欠失又は不活性化した枯草菌にアルカリプロテアーゼ遺伝子を導入して組換え微生物を作製してもよい。あるいは、アルカリプロテアーゼ遺伝子を導入した枯草菌のゲノム上のrecA遺伝子を欠失又は不活性化してもよい。
【００３１】
以上で説明した本発明の組換え微生物を用いることによって、アルカリプロテアーゼを優れた生産性で安定的に生産することができる。生産されたアルカリプロテアーゼは、衣料洗浄剤、漂白剤、硬質表面洗浄用洗浄剤、排水管洗浄剤、義歯洗浄剤、医療器具用の殺菌洗浄剤等の様々な用途に使用することができる。特に、本発明の組換え微生物においては、従来の遺伝子組換え技術によるアルカリプロテアーゼ生産方法と比較して優れた生産性が安定的に得られることから上記用途で利用されるアルカリプロテアーゼの生産コストを大幅に低減することができる。
【００３２】
本発明の方法によるアルカリプロテアーゼの生産は、上記組換え微生物を同化性の炭素源、窒素源、その他の必須成分を含む培地に接種し、通常の微生物培養法にて培養し、培養終了後、アルカリプロテアーゼを採取・精製することにより行えばよい。培養に使用される培地の組成及び培養条件等、又はアルカリプロテアーゼの採取及び精製等の手順については、当業者が適宜選択することができる。
【００３３】
上述した実施形態に関し、本発明はさらに以下の方法、微生物及び用途を開示する。
【００３４】
＜１＞recA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を欠失又は不活性化させた枯草菌を用いてアルカリプロテアーゼを生産する、アルカリプロテアーゼの生産方法。
＜２＞枯草菌のrecA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を欠失又は不活性化させてアルカリプロテアーゼの生産性を向上させる、アルカリプロテアーゼの安定的な生産性向上方法。
＜３＞枯草菌のrecA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を欠失又は不活性化させてアルカリプロテアーゼの生産性を安定化させる、アルカリプロテアーゼの生産性安定化方法。
【００３５】
＜４＞前記recA遺伝子が下記（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つのタンパク質をコードする遺伝子である、前記＜１＞〜＜３＞のいずれか１項記載のアルカリプロテアーゼの生産方法、アルカリプロテアーゼの安定的な生産性向上方法、又はアルカリプロテアーゼの生産性安定化方法。
（ａ）配列番号１２のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号１２のアミノ酸配列において１又は数個（好ましくは１〜１００個、より好ましくは１〜７０個、より好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個）のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、相同組換え活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号１２のアミノ酸配列と７０％以上（好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上）の同一性を有するアミノ酸配列からなり、相同組換え活性を有するタンパク質
＜５＞前記枯草菌が、アルカリプロテアーゼ生産能を有する枯草菌のrecA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を欠失又は不活性化させて得られた枯草菌である、前記＜１＞〜＜４＞のいずれか１項記載のアルカリプロテアーゼの生産方法、アルカリプロテアーゼの安定的な生産性向上方法、又はアルカリプロテアーゼの生産性安定化方法。
＜６＞前記枯草菌に異種アルカリプロテアーゼをコードする遺伝子が導入されており、前記枯草菌に異種アルカリプロテアーゼを生産させる、前記＜１＞〜＜５＞のいずれか１項記載のアルカリプロテアーゼの生産方法、アルカリプロテアーゼの安定的な生産性向上方法、又はアルカリプロテアーゼの生産性安定化方法。
＜７＞前記異種アルカリプロテアーゼをコードする遺伝子が、プラスミドベクター（好ましくは多コピーのベクター、より好ましくはpT181、pC194、pUB110、pE194、pSN2、又はpHY300PLK）を用いて枯草菌に導入された、前記＜６＞項記載のアルカリプロテアーゼの生産方法、アルカリプロテアーゼの安定的な生産性向上方法、又はアルカリプロテアーゼの生産性安定化方法。
＜８＞前記異種アルカリプロテアーゼが、野生型の枯草菌が有さないアルカリプロテアーゼ又は野生型の枯草菌が有しているアルカリプロテアーゼに変異が導入されているアルカリプロテアーゼである、前記＜６＞又は＜７＞項記載のアルカリプロテアーゼの生産方法、アルカリプロテアーゼの安定的な生産性向上方法、又はアルカリプロテアーゼの生産性安定化方法。
＜９＞前記アルカリプロテアーゼが、配列番号１３のアミノ酸配列からなるアルカリプロテアーゼ若しくは配列番号１３のアミノ酸配列と８０％以上（好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上）の同一性をもつアミノ酸配列からなるアルカリプロテアーゼ、又は配列番号１３のアミノ酸配列若しくは配列番号１３のアミノ酸配列と８０％以上（好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上）の同一性をもつアミノ酸配列において下記（ｄ）〜（ａｓ）の少なくとも１つの変異がなされたアミノ酸配列からなるアルカリプロテアーゼである、前記＜１＞〜＜８＞のいずれか１項記載のアルカリプロテアーゼの生産方法、アルカリプロテアーゼの安定的な生産性向上方法、又はアルカリプロテアーゼの生産性安定化方法。
（ｄ）１３３位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基（好ましくはリジン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン、バリン、ロイシン、グリシン、セリン、グルタミン酸、アルギニン、ヒスチジン、メチオニン、トリプトファン、プロリン、フェニルアラニン又はイソロイシン）への置換
（ｅ）１３３位と１３４位又はこれらに相当する位置のアミノ酸残基の間へのアミノ酸残基（好ましくはリジン、ロイシン、セリン、メチオニン、グリシン、スレオニン、チロシン、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、アラニン、イソロイシン、トリプトファン又はアルギニン）の挿入
（ｆ）挿入前の１３４位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基（好ましくはスレオニン、セリン、グリシン又はアラニン）への置換
（ｇ）挿入前の１３５位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基（好ましくはアラニン、アルギニン又はメチオニン）への置換
（ｈ）１３２位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基（好ましくはセリン、グルタミン、メチオニン、アスパラギン、アスパラギン酸、スレオニン又はイソロイシン）への置換
（ｉ）１５位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基（好ましくはヒスチジン、システイン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、アラニン、バリン、メチオニン、トリプトファン又はフェニルアラニン）への置換
（ｊ）１６位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基（好ましくはスレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、リジン、ヒスチジン、バリン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン又はグルタミン）への置換
（ｋ）１６６位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基（好ましくはグリシン）への置換
（ｌ）１６７位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基（好ましくはバリン）への置換
（ｍ）１８７位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基（好ましくはセリン）への置換
（ｎ）３４６位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基（好ましくはアルギニン）への置換
（ｏ）４０５位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基（好ましくはアスパラギン酸）への置換
（ｐ）６３位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基（好ましくはセリン）への置換
（ｑ）８９位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基（好ましくはヒスチジン）への置換
（ｒ）１２０位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基（好ましくはアルギニン）への置換
（ｓ）６３位及び１８７位、又はこれらに相当する位置のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基（好ましくはセリン）への置換
（ｔ）２２６位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基（好ましくはチロシン）への置換
（ｕ）２９６位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基（好ましくはバリン）への置換
（ｖ）３０４位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基（好ましくはセリン）への置換
（ｗ）１６３位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基（好ましくはヒスチジン、アラニン、アスパラギン酸、フェニルアラニン、リジン、アスパラギン、セリン、イソロイシン、ロイシン、グルタミン、スレオニン又はバリン）への置換
（ｘ）１７０位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基（好ましくはバリン又はロイシン）への置換
（ｙ）１７１位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基（好ましくはアラニン、グルタミン酸、グリシン又はスレオニン）への置換
（ｚ）６５位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基（好ましくはプロリン又はトリプトファン）への置換
（ａａ）１０１位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基（好ましくはアスパラギン、セリン、スレオニン、システイン、グルタミン、チロシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、リジン、ヒスチジン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、トリプトファン、フェニルアラニン又はプロリン）への置換
（ａｂ）２７３位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基（好ましくはイソロイシン、グリシン又はスレオニン）への置換
（ａｃ）３２０位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基（好ましくはフェニルアラニン、バリン、スレオニン、ロイシン、イソロイシン又はグリシン）への置換
（ａｄ）３５９位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基（好ましくはセリン、ロイシン、バリン、イソロイシン又はグルタミン）への置換
（ａｅ）３８７位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基（好ましくはアラニン、リジン、グルタミン、グルタミン酸、アルギニン又はヒスチジン）への置換
（ａｆ）２５１位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基（好ましくはアスパラギン、グリシン、アラニン、アスパラギン酸、スレオニン、イソロイシン、バリン、ロイシン又はグルタミン）への置換
（ａｇ）８４位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基（好ましくはアルギニン）への置換
（ａｈ）１０４位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基（好ましくはプロリン、セリン、スレオニン、システイン、グルタミン、チロシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、リジン、ヒスチジン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、トリプトファン又はフェニルアラニン）への置換
（ａｉ）２５６位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基（好ましくはアラニン、スレオニン、システイン、グルタミン、チロシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、リジン、ヒスチジン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、トリプトファン、フェニルアラニン、プロリン又はセリン）への置換
（ａｊ）３６９位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基（好ましくはアスパラギン）への置換
（ａｋ）６６位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基（好ましくはグルタミン、アスパラギン酸、セリン、グルタミン酸、アラニン、スレオニン、ロイシン、メチオニン、システイン、バリン、グリシン、ヒスチジン、トリプトファン又はイソロイシン）への置換
（ａｌ）５７位、１０２位、1０３位、１０５位、１０６位、１３６位、１９３位若しくは３４２位、又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基（好ましくはリジン、セリン、グルタミン、フェニルアラニン、バリン、アルギニン、チロシン、ロイシン、イソロイシン、スレオニン、メチオニン、システイン、トリプトファン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、プロリン又はアラニン）への置換
（ａｍ）４６位若しくは２０５位、又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基（好ましくはチロシン、トリプトファン、アラニン、アスパラギン、グルタミン酸、スレオニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、ヒスチジン、セリン、リジン、グルタミン、メチオニン又はシステイン）への置換
（ａｎ）５４位、１１９位、１３８位、１４８位若しくは１９５位、又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基（好ましくはトリプトファン、フェニルアラニン、アラニン、アスパラギン、グルタミン酸、スレオニン、バリン、ヒスチジン、セリン、リジン、グルタミン、メチオニン、グリシン、アスパラギン酸、プロリン、アルギニン又はシステイン）への置換
（ａｏ）２４７位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基（好ましくはトリプトファン、フェニルアラニン、アラニン、アスパラギン、グルタミン酸、スレオニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、ヒスチジン、セリン、グルタミン、メチオニン又はシステイン）への置換
（ａｐ）１２４位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基（好ましくはアラニン又はリジン）への置換
（ａｑ）１０７位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基（好ましくはリジン、アルギニン、アラニン又はセリン）への置換
（ａｒ）２５７位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基（好ましくはバリン又はイソロイシン）への置換
（ａｓ）２６４位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基（好ましくはグルタミン、アスパラギン酸、セリン、グルタミン酸、アラニン、スレオニン、ロイシン、メチオニン、システイン、バリン、グリシン又はイソロイシン）への置換
＜１０＞前記アルカリプロテアーゼが、配列番号１３のアミノ酸配列からなるアルカリプロテアーゼ、又は配列番号１３のアミノ酸配列と８０％以上（好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上）の同一性をもつアミノ酸配列からなるアルカリプロテアーゼであって、配列番号１３のアミノ酸配列において、３０位のアミノ酸残基又はこれに相当するアミノ酸残基がアスパラギン酸であり、７１位のアミノ酸残基又はこれに相当するアミノ酸残基がヒスチジンであり、２５５位のアミノ酸残基又はこれに相当するアミノ酸残基がセリンであるアルカリプロテアーゼである、前記＜１＞〜＜９＞のいずれか１項記載のアルカリプロテアーゼの生産方法、アルカリプロテアーゼの安定的な生産性向上方法、又はアルカリプロテアーゼの生産性安定化方法。
＜１１＞前記枯草菌が転移因子（好ましくはトランスポゾン及び挿入配列）を有さない、前記＜１＞〜＜１０＞のいずれか１項記載のアルカリプロテアーゼの生産方法、アルカリプロテアーゼの安定的な生産性向上方法、又はアルカリプロテアーゼの生産性安定化方法。
＜１２＞前記枯草菌が納豆菌を除く枯草菌である、前記＜１＞〜＜１１＞のいずれか１項記載のアルカリプロテアーゼの生産方法、アルカリプロテアーゼの安定的な生産性向上方法、又はアルカリプロテアーゼの生産性安定化方法。
＜１３＞前記枯草菌がBacillus subtilis Marburg  No．168系統株である、前記＜１＞〜＜１２＞のいずれか１項記載のアルカリプロテアーゼの生産方法、アルカリプロテアーゼの安定的な生産性向上方法、又はアルカリプロテアーゼの生産性安定化方法。
＜１４＞前記枯草菌の継代培養、培地の置換、又は前記枯草菌の継代培養及び培地の置換を行いながら前記枯草菌を培養してアルカリプロテアーゼを生産する、前記＜１＞〜＜１３＞のいずれか１項記載のアルカリプロテアーゼの生産方法、アルカリプロテアーゼの安定的な生産性向上方法、又はアルカリプロテアーゼの生産性安定化方法。
【００３６】
＜１５＞枯草菌のrecA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を欠失又は不活性化させ、且つ異種アルカリプロテアーゼをコードする遺伝子が導入された、異種アルカリプロテアーゼ生産用組換え微生物。
【００３７】
＜１６＞前記recA遺伝子が前記（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つのタンパク質をコードする遺伝子である、前記＜１５＞項記載の微生物。
＜１７＞前記異種アルカリプロテアーゼをコードする遺伝子が、プラスミドベクター（好ましくは多コピーのベクター、より好ましくはpT181、pC194、pUB110、pE194、pSN2、又はpHY300PLK）を用いて枯草菌に導入された、前記＜１５＞又は＜１６＞項記載の微生物。
＜１８＞前記異種アルカリプロテアーゼが、野生型の枯草菌が有さないアルカリプロテアーゼ又は野生型の枯草菌が有しているアルカリプロテアーゼに変異が導入されているアルカリプロテアーゼである、前記＜１５＞〜＜１７＞のいずれか１項記載の微生物。
＜１９＞前記異種アルカリプロテアーゼが、配列番号１３のアミノ酸配列からなるアルカリプロテアーゼ若しくは配列番号１３のアミノ酸配列と８０％以上（好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上）の同一性をもつアミノ酸配列からなるアルカリプロテアーゼ、又は配列番号１３のアミノ酸配列若しくは配列番号１３のアミノ酸配列と８０％以上（好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上）の同一性をもつアミノ酸配列において前記（ｄ）〜（ａｓ）の少なくとも１つの変異がなされたアミノ酸配列からなるアルカリプロテアーゼである、前記＜１５＞〜＜１８＞のいずれか１項記載の微生物。
＜２０＞前記異種アルカリプロテアーゼが、配列番号１３のアミノ酸配列からなるアルカリプロテアーゼ、又は配列番号１３のアミノ酸配列と８０％以上（好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上）の同一性をもつアミノ酸配列からなるアルカリプロテアーゼであって、配列番号１３のアミノ酸配列において、３０位のアミノ酸残基又はこれに相当するアミノ酸残基がアスパラギン酸であり、７１位のアミノ酸残基又はこれに相当するアミノ酸残基がヒスチジンであり、２５５位のアミノ酸残基又はこれに相当するアミノ酸残基がセリンであるアルカリプロテアーゼである、前記＜１５＞〜＜１９＞のいずれか１項記載の微生物。
＜２１＞前記枯草菌が転移因子（好ましくはトランスポゾン及び挿入配列）を有さない、前記＜１５＞〜＜２０＞のいずれか１項記載の異種アルカリプロテアーゼ生産用組換え微生物。
＜２２＞前記枯草菌が納豆菌を除く枯草菌である、前記＜１５＞〜＜２１＞のいずれか１項記載の微生物。
＜２３＞前記枯草菌がBacillus subtilis Marburg  No．168系統株である、前記＜１５＞〜＜２２＞のいずれか１項記載の微生物。
【００３８】
＜２４＞異種アルカリプロテアーゼ生産用組換え微生物としての、recA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を欠失又は不活性化させ、且つ異種アルカリプロテアーゼをコードする遺伝子が導入された枯草菌の使用。
＜２５＞異種アルカリプロテアーゼの生産のための、recA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を欠失又は不活性化させ、且つ異種アルカリプロテアーゼをコードする遺伝子が導入された枯草菌の使用。
＜２６＞recA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を欠失又は不活性化させ、且つ異種アルカリプロテアーゼをコードする遺伝子が導入された枯草菌を、異種アルカリプロテアーゼ生産用組換え微生物として使用する方法。
【００３９】
＜２７＞前記recA遺伝子が前記（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つのタンパク質をコードする遺伝子である、前記＜２４＞〜＜２６＞のいずれか１項記載の使用又は方法。
＜２８＞前記異種アルカリプロテアーゼをコードする遺伝子が、プラスミドベクター（好ましくは多コピーのベクター、より好ましくはpT181、pC194、pUB110、pE194、pSN2、又はpHY300PLK）を用いて枯草菌に導入された、前記＜２４＞〜＜２７＞のいずれか１項記載の使用又は方法。
＜２９＞前記異種アルカリプロテアーゼが、野生型の枯草菌が有さないアルカリプロテアーゼ又は野生型の枯草菌が有しているアルカリプロテアーゼに変異が導入されているアルカリプロテアーゼである、前記＜２４＞〜＜２８＞のいずれか１項記載の使用又は方法。
＜３０＞前記異種アルカリプロテアーゼが、配列番号１３のアミノ酸配列からなるアルカリプロテアーゼ若しくは配列番号１３のアミノ酸配列と８０％以上（好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上）の同一性をもつアミノ酸配列からなるアルカリプロテアーゼ、又は配列番号１３のアミノ酸配列若しくは配列番号１３のアミノ酸配列と８０％以上（好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上）の同一性をもつアミノ酸配列において前記（ｄ）〜（ａｓ）の少なくとも１つの変異がなされたアミノ酸配列からなるアルカリプロテアーゼである、前記＜２４＞〜＜２９＞のいずれか１項記載の使用又は方法。
＜３１＞前記異種アルカリプロテアーゼが、配列番号１３のアミノ酸配列からなるアルカリプロテアーゼ、又は配列番号１３のアミノ酸配列と８０％以上（好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上）の同一性をもつアミノ酸配列からなるアルカリプロテアーゼであって、配列番号１３のアミノ酸配列において、３０位のアミノ酸残基又はこれに相当するアミノ酸残基がアスパラギン酸であり、７１位のアミノ酸残基又はこれに相当するアミノ酸残基がヒスチジンであり、２５５位のアミノ酸残基又はこれに相当するアミノ酸残基がセリンであるアルカリプロテアーゼである、前記＜２４＞〜＜３０＞のいずれか１項記載の使用又は方法。
＜３２＞前記枯草菌が転移因子（好ましくはトランスポゾン及び挿入配列）を有さない、前記＜２４＞〜＜３１＞のいずれか１項記載の使用又は方法。
＜３３＞前記枯草菌が納豆菌を除く枯草菌である、前記＜２４＞〜＜３２＞のいずれか１項記載の使用又は方法。
＜３４＞前記枯草菌がBacillus subtilis Marburg  No．168系統株である、前記＜２４＞〜＜３３＞のいずれか１項記載の使用又は方法。
【実施例】
【００４０】
以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
なお、表１には、本実施例で使用したプライマーの名称、その塩基配列及び配列番号をまとめて示した。ここで、表１に示す塩基配列において、下線部分は制限酵素認識配列を示している。また、本実施例におけるＤＮＡ断片増幅のためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）には、GeneAmp  PCR  System（アプライドバイオシステムズ社製）及びKOD-Plus-Neo  DNA  Polymerase（東洋紡績社製）、並びに付属の試薬類を用いた。
【００４１】
【表１】
2014158428.tif 000002
【００４２】
製造例１  枯草菌改変体の作製
図１に示す手順に従い、recA遺伝子を欠失させた枯草菌改変体を作製した。
【００４３】
（１）遺伝子欠失用遺伝子断片の作製
枯草菌１６８株から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、表１に示したRECA-F1（配列番号１）及びRECA-R1（配列番号２）のプライマーセットを用いて、ゲノム上のrecA遺伝子の上流領域に隣接する約０．９ｋｂの断片（Ａ）をＰＣＲにより増幅した。また、上記ゲノムＤＮＡを鋳型とし、RECA-F2（配列番号３）及びRECA-R2（配列番号４）のプライマーセットを用いて、ゲノム中のrecA遺伝子の下流領域に隣接する約０．８ｋｂの断片（Ｂ）をＰＣＲにより増幅した。また、プラスミドpDG1727（Guerout-Fleury  et  al.，Gene.，1995，vol．167，p．335-336；Bacillus  Genetic  Stock  Center［http://www.bgsc.org/］より入手可能）のＤＮＡを鋳型とし、表１に示したSPC-F（配列番号５）及びSPC-R（配列番号６）のプライマーセットを用いて、スペクチノマイシン耐性遺伝子（Ｓｐｃ）を含む約１．０ｋｂの断片（Ｃ）を調製した。
【００４４】
次に、得られたＤＮＡ断片（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）を混合して鋳型とし、RECA-F1（配列番号１）及びRECA-R2（配列番号４）のプライマーセットを用いたSOE−PCRにて3断片を（Ａ）−（Ｃ）−（Ｂ）の順になる様に結合し、約２．７ｋｂの遺伝子欠失用ＤＮＡ断片（Ｄ）を得た。
【００４５】
（２）コンピテントセルの作製
枯草菌１６８株をCI培地（０．２０質量％硫酸アンモニウム、１．４０質量％リン酸水素二カリウム、０．６０質量％リン酸二水素カリウム、０．１０質量％クエン酸三ナトリウム二水和物、０．５０質量％グルコース、０．０３質量％アミケース（SIGMA社製）、５ｍＭ塩化マグネシウム、５０μｇ／ｍＬトリプトファン）において３７℃で、生育度（ＯＤ600）の値が１程度になるまで振盪培養した。振盪培養後、培養液の一部（０．５ｍＬ）を分取し、遠心分離にて菌体のみを回収後、１ｍＬのCII培地（０．２０質量％硫酸アンモニウム、１．４０質量％リン酸水素二カリウム、０．６０質量％リン酸二水素カリウム、０．１０質量％クエン酸三ナトリウム二水和物、０．５０質量％グルコース、０．０１５質量％アミケース（SIGMA社製）、５ｍＭ塩化マグネシウム、５μｇ／ｍＬトリプトファン）に菌体を再懸濁することで、枯草菌株のコンピテントセル懸濁液を調製した。
【００４６】
（３）枯草菌１６８株の形質転換
前記（２）で調製したコンピテントセル懸濁液１００μＬに、前記（１）で得られたＤＮＡ断片（Ｄ）を最終濃度が１５μｇ／ｍＬ以上となるよう添加し、３７℃で９０分間振盪培養後、１００μＬのＬＢ液体培地（１質量％トリプトン、０．５０質量％酵母エキス、０．５０質量％ＮａＣｌ）を加え、３７℃で１時間振盪培養を行った。その後、スペクチノマイシン（１００μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ寒天培地（１質量％トリプトン、０．５０質量％酵母エキス、０．５０質量％ＮａＣｌ、１．５質量％寒天）に培養液１０μＬ又は１００μＬを塗沫した。３７℃における静置培養の後、生育したコロニーを形質転換体として分離した。得られた形質転換体のゲノムＤＮＡを抽出し、これを鋳型とするＰＣＲ及びシークエンスによってrecA遺伝子がＳｐｃ耐性遺伝子に置換した目的とする枯草菌改変体であることを確認した。以上のようにして、recA遺伝子欠失株（kao119株）を構築した。
【００４７】
製造例２  野生型アルカリプロテアーゼ（KP43）遺伝子挿入・発現用ベクターの構築
バシラス・エスピーKSM-64株（FERM  P-10482）から調製した染色体ＤＮＡを鋳型とし、プライマーSP64-F(EcoRI)（配列番号７）及びプライマーSP64-R(BamHI)（配列番号８）のプライマーセットを用いてＰＣＲを行い、バシラス・エスピーKSM-64株由来のEndo-1,4-beta-glucanase遺伝子（Genbank  ACCESSION  No．M84963）上流のプロモーター領域を含むＤＮＡ断片を調製した。このＤＮＡ断片とpHY300PLK（タカラバイオ社製）を適量混合し、制限酵素EcoRI（Ｒｏｃｈｅ社）とBamHI（Ｒｏｃｈｅ社）で二重消化したのちLigation  High（東洋紡社製）を用いてライゲーション反応（結合化）を行い、エタノール沈殿にてプラスミドを精製した。これをバチルス・エスピーKSM-9865株（FERM  P-18566）にエレクトロポレーション法にて導入して形質転換し、スキムミルク含有アルカリＬＢ寒天培地（１質量％バクトトリプトン、０．５質量％酵母エキス、１質量％塩化ナトリウム、１質量％スキムミルク、１．５質量％寒天、０．０５質量％炭酸ナトリウム、１５ｐｐｍテトラサイクリンを含む）に塗沫した。数日後に寒天培地に発生したコロニーを形質転換体として分離し、プラスミドを抽出した。マルチクローニングサイト内に挿入されたプロモーター配列の解析を行い、ＰＣＲのエラーによる意図しない変異が導入されていないことを確認し、これを組換えプラスミドpHY-SP64とした。これを制限酵素BamHI及びXbaI（Ｒｏｃｈｅ社）にて同時消化し、遺伝子挿入・発現用ベクターとした。
【００４８】
次に、野生型プロテアーゼKP43をコードする遺伝子の塩基配列（特開２００２−２１８９８９号公報参照）を含むＤＮＡ（遺伝子上流の5'末端にBamHIサイト、遺伝子下流の3'末端にXbaIサイトを有する）をBamHI及びXbaIにて同時消化し、先の遺伝子挿入・発現用ベクターと混合して、Ligation  High（東洋紡社製）を用いたライゲーション反応（結合化）により、Endo-1,4-beta-glucanase遺伝子下流にKP43をコードする遺伝子を含むプラスミドの構築を行った。ライゲーション産物をエタノール沈殿にて精製したのち、バチルス・エスピーKSM-9865株（FERM  P-18566）にエレクトロポレーション法にて導入して形質転換し、スキムミルク含有アルカリＬＢ寒天培地に塗沫した。数日後に寒天培地に出現したコロニーについて、スキムミルク溶解斑の有無からプロテアーゼ遺伝子が導入された形質転換体を選抜した。この形質転換体からプラスミドＤＮＡを抽出し、野生型プロテアーゼKP43をコードする遺伝子が正しく挿入されていることを確認し、結果得られたプラスミドをpHY-SP64-TSとした。
【００４９】
製造例３  アルカリプロテアーゼ変異体遺伝子挿入・発現用ベクターの構築
pHY300PLKを鋳型とし、プライマーpHY+1(HindIII)F（配列番号９）及びプライマーpHY+3040(HindIII)R（配列番号１０）のプライマーセットを用いて、PrimeSTAR  Mutagenesis  basal  kit（タカラバイオ社製）を用いてＰＣＲを行った。増幅産物を制限酵素HindIII（Ｒｏｃｈｅ社）で消化し、Ligation  High（東洋紡社製）を用いて分子内環化を行い、エタノール沈殿にて精製した。これをバチルス・エスピーKSM-9865株（FERM  P-18566）にエレクトロポレーション法にて導入して形質転換し、スキムミルク含有アルカリＬＢ寒天培地に塗沫した。数日後に寒天培地に発生したコロニーを形質転換体として分離し、プラスミドを抽出した。ＤＮＡシーケンサーPrism3100（ＡＢＩ社製）を用いてプラスミド全長の配列解析を行い、ＰＣＲのエラーによる意図しない変異が導入されていないことを確認し、pHA3040とした。
【００５０】
次に、バシラス・エスピーKSM-64株（FERM  P-10482）から調製した染色体ＤＮＡを鋳型とし、プライマーSP64-F(EcoRI)（配列番号７）及びプライマーSP64-R(BamHI)（配列番号８）のプライマーセットを用いてＰＣＲを行い、バシラス・エスピーKSM-64株由来のEndo-1,4-beta-glucanase遺伝子（Genbank  ACCESSION  No．M84963）上流のプロモーター領域を含むＤＮＡ断片を調製した。このＤＮＡ断片とpHA3040を適量混合し、制限酵素EcoRI（Ｒｏｃｈｅ社）とBamHI（Ｒｏｃｈｅ社）で二重消化したのちLigation  High（東洋紡社製）を用いてライゲーション反応（結合化）を行い、エタノール沈殿にてプラスミドを精製した。これをバチルス・エスピーKSM-9865株（FERM  P-18566）にエレクトロポレーション法にて導入して形質転換し、スキムミルク含有アルカリＬＢ寒天培地に塗沫した。数日後に寒天培地に発生したコロニーを形質転換体として分離し、プラスミドを抽出した。マルチクローニングサイト内に挿入されたプロモーター配列の解析を行い、ＰＣＲのエラーによる意図しない変異が導入されていないことを確認し、これを組換えプラスミドpHA3040SP64とした。これを制限酵素BamHI及びXbaI（Ｒｏｃｈｅ社）にて同時消化し、アルカリプロテアーゼ変異体遺伝子挿入・発現用ベクターとした。
【００５１】
特開２００２−２１８９８９号公報、特開２００２−３０６１７６号公報、特開２００４−１２２号公報、特開２００４−３０５１７６号公報、及び特開２００６−１２９８６５号公報の記載を参考に、プロテアーゼKP43（配列番号１３のアミノ酸配列を有するアルカリプロテアーゼ、特開２００２-２１８９８９号公報参照）に下記（１）〜（１１）の変異が逐次行われたKP43プロテアーゼ変異体（配列番号１５参照）を作製した。
（１）１９５位のチロシンをアルギニンに置換（特開２００２−２１８９８９号公報参照）
（２）３６９位のアスパラギン酸をアスパラギンに置換（特開２００２−３０６１７６号公報参照）
（３）６５位のトレオニンをプロリンに置換（特開２００４−１２２号公報参照）
（４）２７３位のバリンをイソロイシンに置換（特開２００４−１２２号公報参照）
（５）３５９位のトレオニンをセリンに置換（特開２００４−１２２号公報参照）
（６）３８７位のセリンをアラニンに置換（特開２００４−１２２号公報参照）
（７）１６６位のアスパラギンをグリシンに置換（特開２００４−３０５１７６号公報参照）
（８）１６７位のグリシンをバリンに置換（特開２００４−３０５１７６号公報参照）
（９）１３３位のアラニンをセリンに置換（特開２００６−１２９８６５号公報参照）
（１０）１３４位のバリンをスレオニンに置換（特開２００６−１２９８６５号公報参照）
（１１）１３３位と１３４位の間にセリンを挿入（特開２００６−１２９８６５号公報参照）
【００５２】
前記KP43プロテアーゼ変異体をコードする遺伝子の塩基配列を含むＤＮＡ（遺伝子上流の5'末端にBamHIサイト、遺伝子下流の3'末端にXbaIサイトを有する）をBamHI及びXbaIにて同時消化し、アルカリプロテアーゼ変異体遺伝子挿入・発現用ベクターと混合して、Ligation  High（東洋紡社製）を用いたライゲーション反応（結合化）により、Endo-1,4-beta-glucanase遺伝子下流にKP43をコードする遺伝子を含むプラスミドの構築を行った。ライゲーション産物をエタノール沈殿にて精製したのち、バチルス・エスピーKSM-9865株（FERM  P-18566）にエレクトロポレーション法にて導入して形質転換し、スキムミルク含有アルカリＬＢ寒天培地に塗沫した。数日後に寒天培地に出現したコロニーについて、スキムミルク溶解斑の有無からプロテアーゼ遺伝子が導入された形質転換体を選抜した。この形質転換体からプラスミドＤＮＡを抽出し、前記KP43プロテアーゼ変異体をコードする遺伝子が正しく挿入されていることを確認し、結果得られたプラスミドをpHA-TSMとした。
【００５３】
実施例１  アルカリプロテアーゼ生産性評価（１）
野生株である枯草菌１６８株、及び製造例１で作製した枯草菌変異株（kao119株）に対し、製造例２で作製したプラスミドpHY-SP64-TSを用い、プロトプラスト形質転換法（Mol．Gen．Genet.，1979，vol．168，p．111）によって各菌株に導入した。
得られた形質転換体を５ｍＬのＬＢ培地（１質量％トリプトン、０．５質量％酵母エキス、１質量％ＮａＣｌ、１５ｐｐｍテトラサイクリン）で一夜３０℃で振盪培養を行った（継代培養回数：１回）。さらに、この培養液を５ｍＬのＬＢ培地に接種し、一夜３０℃で振盪培養を行った（継代培養回数：２回）。次に、継代培養回数：１、２回の培養液０．４ｍＬをそれぞれ２×Ｌ−マルトース（２質量％トリプトン、１質量％酵母エキス、１質量％ＮａＣｌ、７．５質量％マルトース、７．５ｐｐｍ硫酸マンガン４−５水和物、１５ｐｐｍテトラサイクリン）２０ｍＬに接種し、３０℃にて３日間振盪培養を行った（Ｎ＝３）。
【００５４】
培養終了後、菌体を除いた培養液上清について、下記の手順でアルカリプロテアーゼ活性を測定した。
１／１５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）０．９ｍＬ、４０ｍＭ  Glt-Ala-Ala-Pro-Leu-p-ニトロアニリド／ジメチルスルホキシド溶液０．０５ｍｌを試験管に採り、３０℃で５分間保温した。これに酵素液（培養液上清）０．０５ｍｌを加えて３０℃で１０分間反応を行った後、５％（ｗ／ｖ）クエン酸水溶液２．０ｍＬを加えて反応を停止し、分光光度計を用いて４２０ｎｍにおける吸光度を測定した。なお、酵素１単位（Ｕ）は上記反応において１分間に１μｍｏｌのp-ニトロアニリンを生成する量とした。その結果を表２に示す。なお、表２において、アルカリプロテアーゼ活性の値は比活性より算出し、枯草菌１６８株を用いて培養したときの継代培養回数１回目のアルカリプロテアーゼ活性を１００とした場合の相対値で示している。
【００５５】
【表２】
2014158428.tif 000003
【００５６】
表２の結果から、枯草菌１６８株では継代培養回数の増加に伴いアルカリプロテアーゼ活性が低下した。これは、枯草菌１６８株を宿主微生物として用いた場合、アルカリプロテアーゼの生産性が低下していることを示す。
これに対し、recA遺伝子を欠失させた枯草菌にアルカリプロテアーゼ遺伝子を導入したkao119株では継代培養回数の増加に伴うアルカリプロテアーゼ活性の低下は確認されず、かつ、枯草菌１６８株に比べ高いプロテアーゼ活性を示した。これは、recA遺伝子を欠失させた枯草菌を宿主微生物として用いた場合、アルカリプロテアーゼの生産性が向上し、かつ安定化したことを示す。
【００５７】
実施例２  アルカリプロテアーゼ生産性評価（２）
野生株である枯草菌１６８株、及び製造例１で作製した枯草菌変異株（kao119株）に対し、製造例３で作製したプラスミドpHA-TSMを用い、プロトプラスト形質転換法によって各菌株に導入した。
得られた形質転換体に対して実施例１と同様に培養を行い、菌体を除いた培養液上清のプロテアーゼ活性を実施例１と同様に測定した。その結果を表３に示す。なお、表３において、アルカリプロテアーゼ活性の値は比活性より算出し、枯草菌１６８株を用いて培養したときの継代培養回数１回目のアルカリプロテアーゼ活性を１００とした場合の相対値で示している。
【００５８】
【表３】
2014158428.tif 000004
【００５９】
表３の結果から、枯草菌１６８株では継代培養回数の増加に伴いアルカリプロテアーゼ活性が低下した。これは、枯草菌１６８株を宿主微生物として用いた場合、アルカリプロテアーゼの生産性が低下していることを示す。
これに対し、recA遺伝子を欠失させた枯草菌にアルカリプロテアーゼ遺伝子を導入したkao119株では継代培養回数の増加に伴うアルカリプロテアーゼ活性の低下は確認されず、かつ、枯草菌１６８株に比べ高いプロテアーゼ活性を示した。これは、recA遺伝子を欠失させた枯草菌を宿主微生物として用いた場合、アルカリプロテアーゼの生産性が向上し、かつ安定化したことを示す。
【００６０】
以上の結果から、recA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を欠失又は不活性化させた枯草菌を用いてアルカリプロテアーゼを生産することで、アルカリプロテアーゼの生産性が安定的に向上することがわかる。
【図１】
2014158428.tif 000005
【配列表】
2014158428000001.app