(57)【要約】【課題】分子量の異なる形態で存在する被測定物質を分別測定する方法を提供すること。【解決手段】検体中の被測定物質の長鎖型および短鎖型を分別して測定する方法は、（ａ）該検体と、該長鎖型および該短鎖型に結合し得る第１の特異的結合物質が結合した微小粒子および該長鎖型に結合し得るが該短鎖型に結合しない第２の特異的結合物質が結合した微小粒子とを混合し、該微小粒子の凝集反応を測定する工程；（ｂ）該検体と、異なる認識部位で該長鎖型および該短鎖型に結合し得る、第３の特異的結合物質が結合した微小粒子および第４の特異的結合物質が結合した微小粒子とを混合し、該微小粒子の凝集反応を測定する工程；（ｃ）該（ａ）の測定値を用いて該長鎖型の量を決定する工程；および（ｄ）該（ｂ）の測定値から該（ａ）の測定値を差し引いた値を用いて該短鎖型の量を決定する工程を含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体中の被測定物質の長鎖型および短鎖型を分別して測定する方法であって、
（ａ）該検体と、第１の特異的結合物質が結合した微小粒子および第２の特異的結合物質が結合した微小粒子とを混合し、該微小粒子の凝集反応を測定する工程であって、該第１の特異的結合物質が該長鎖型および該短鎖型に結合し得る物質であり、該第２の特異的結合物質が該長鎖型に結合し得るが該短鎖型に結合しない物質である、工程；
（ｂ）該検体と、第３の特異的結合物質が結合した微小粒子および第４の特異的結合物質が結合した微小粒子とを混合し、該微小粒子の凝集反応を測定する工程であって、該第３の特異的結合物質が長鎖型および短鎖型に結合し得る物質であり、該第４の特異的結合物質が、該第３の特異的結合物質とは異なる認識部位で該長鎖型および該短鎖型に結合し得る物質である、工程；
（ｃ）該工程（ａ）の測定値を用いて該長鎖型の量を決定する工程；および
（ｄ）該工程（ｂ）の測定値から該工程（ａ）の測定値を差し引いた値を用いて該短鎖型の量を決定する工程
を含む、方法。
【請求項２】
前記第３の特異的結合物質が、前記第１の特異的結合物質と同一の物質である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記工程（ｄ）において、前記差し引いた値を補正する工程をさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記特異的結合物質が、前記被測定物質に対するモノクローナル抗体である、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記長鎖型が全長タンパク質であり、前記短鎖型がタンパク質フラグメントである、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記被測定物質がセレノプロテインＰであり、前記長鎖型が全長タンパク質であり、前記短鎖型がＮ末端側フラグメントである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
検体中の被測定物質の長鎖型および短鎖型を分別して測定するための試薬キットであって、
第１の特異的結合物質が結合した微小粒子を含む第１試薬であって、該第１の特異的結合物質が該長鎖型および該短鎖型に結合し得る物質である、第１試薬；
第２の特異的結合物質が結合した微小粒子を含む第２試薬であって、該第２の特異的結合物質が該長鎖型に結合し得るが該短鎖型に結合しない物質である、第２試薬；および
第３の特異的結合物質が結合した微小粒子を含む第３試薬であって、該第３の特異的結合物質が該長鎖型および該短鎖型に結合し得る物質である、第３試薬；および
第４の特異的結合物質が結合した微小粒子を含む第４試薬であって、該第４の特異的結合物質が、該第３の特異的結合物質とは異なる認識部位で該長鎖型および該短鎖型に結合し得る物質である、第４試薬
を含む、試薬キット。
【請求項８】
前記第１試薬および前記第２試薬が、両方を含む１つの試薬であり、そして前記第３試薬および前記第４試薬が、両方を含む１つの試薬である、請求項７に記載の試薬キット。
【請求項９】
前記第１試薬と前記第３試薬とが同一である、請求項７または８に記載の試薬キット。
【請求項１０】
指示書をさらに含む、請求項７から９のいずれかに記載の試薬キット。
【請求項１１】
検体中の被測定物質の長鎖型および短鎖型を分別して測定するための装置であって、
（Ａ）検体と、第１の特異的結合物質が結合した微小粒子および第２の特異的結合物質が結合した微小粒子とを混合し、該微小粒子の凝集反応を測定する手段であって、該第１の特異的結合物質が該長鎖型および該短鎖型に結合し得る物質であり、該第２の特異的結合物質が該長鎖型に結合し得るが該短鎖型に結合しない物質である、手段；
（Ｂ）検体と、第３の特異的結合物質が結合した微小粒子および第４の特異的結合物質が結合した微小粒子とを混合し、該微小粒子の凝集反応を測定する手段であって、該第３の特異的結合物質が該長鎖型および該短鎖型に結合し得る物質であり、該第４の特異的結合物質が、該第３の特異的結合物質とは異なる認識部位で該長鎖型および該短鎖型に結合し得る物質である、手段；
（Ｃ）該（Ａ）の測定値を用いて該長鎖型の量を決定する手段；および
（Ｄ）該（Ｂ）の測定値から該（Ａ）の測定値を差し引いた値を用いて該短鎖型の量を決定する手段
を備える、装置。
【請求項１２】
前記（Ｂ）の測定値から前記（Ａ）の測定値を差し引いた値を補正する手段をさらに備える、請求項１１に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被測定物質の分別測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、臨床検査で行われる各種測定では、自動化および測定時間の短縮が図られている。また、生体試料中の物質を測定するために免疫反応を利用する測定方法が広く用いられ、そのような測定方法としては、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）法、エンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）法、免疫比濁法、ラテックス凝集法、金コロイド凝集法、イムノクロマト法などが挙げられる。その中でも、ラテックス凝集法および金コロイド凝集法は、反応液の分離や洗浄操作を必要としないホモジニアス系での測定が可能なため、測定の自動化や短時間での測定に適している。
【０００３】
セレノプロテインＰ（ＳｅＰ）は、セレンを豊富に含む細胞外タンパク質であり、血漿セレンの５３％を占める主要なセレノプロテインである。ＳｅＰについて６種のモノクローナル抗体（ＢＤ１、ＢＤ３、ＢＦ２、ＡＥ２、ＡＨ５およびＡＡ３）が知られ、ＳｅＰ測定法として、２種のモノクローナル抗体を用いた酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）が開発されている（非特許文献１）。ＳｅＰは、血漿カリクレインでの分解を受けることにより、Ｎ末端側フラグメントおよびＣ末端側フラグメントを生じ、上記の６種のモノクローナル抗体のうち、ＢＤ１、ＢＤ３、ＢＦ２、ＡＥ２およびＡＨ５はＮ末端側フラグメントに対して特異的に反応し、ＡＡ３はＣ末端側フラグメントに対して特異的に反応する（非特許文献２）。ＡＡ３を用いたウェスタンブロット分析で確認されているように（非特許文献２）、血漿中には、ＳｅＰの全長タンパク質と、血漿カリクレインでの分解による切断で生じたフラグメントタンパク質とが存在し得る。臨床研究の促進のために、生体内における血漿カリクレインによるＳｅＰの分解の有無または程度が簡便に測定できる方法が求められている。
【０００４】
このように、被測定物質が分子量の異なる形態で存在し得る場合、短時間で簡便に、それぞれを分別して測定できる方法が求められている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Saito, Y.ら，J. Health Sci. (2001) 47巻, 346〜352頁
【非特許文献２】Saito, Y.ら，Biochem. J. (2004) 381巻, 841〜846頁
【非特許文献３】斎藤芳郎，ビタミン (2009) 83巻, 662〜665頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、分子量の異なる形態で存在する被測定物質を分別して測定する方法、特に、測定の自動化や短時間での測定に適しているホモジニアス系での測定方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、検体中の被測定物質の長鎖型および短鎖型を分別して測定する方法を提供し、この方法は、
（ａ）上記検体と、第１の特異的結合物質が結合した微小粒子および第２の特異的結合物質が結合した微小粒子とを混合し、上記微小粒子の凝集反応を測定する工程であって、上記第１の特異的結合物質が上記長鎖型および上記短鎖型に結合し得る物質であり、上記第２の特異的結合物質が上記長鎖型に結合し得るが上記短鎖型に結合しない物質である、工程；
（ｂ）上記検体と、第３の特異的結合物質が結合した微小粒子および第４の特異的結合物質が結合した微小粒子とを混合し、上記微小粒子の凝集反応を測定する工程であって、上記第３の特異的結合物質が上記長鎖型および上記短鎖型に結合し得る物質であり、上記第４の特異的結合物質が、上記第３の特異的結合物質とは異なる認識部位で上記長鎖型および上記短鎖型に結合し得る物質である、工程；
（ｃ）上記工程（ａ）の測定値を用いて上記長鎖型の量を決定する工程；および
（ｄ）上記工程（ｂ）の測定値から上記工程（ａ）の測定値を差し引いた値を用いて上記短鎖型の量を決定する工程
を含む。
【０００８】
１つの実施形態では、上記第３の特異的結合物質は、上記第１の特異的結合物質と同一の物質である。
【０００９】
１つの実施形態では、上記方法は、上記工程（ｄ）において、上記差し引いた値を補正する工程をさらに含む。
【００１０】
１つの実施形態では、上記特異的結合物質は、上記被測定物質に対するモノクローナル抗体である。
【００１１】
１つの実施形態では、上記長鎖型は全長タンパク質であり、上記短鎖型はタンパク質フラグメントである。
【００１２】
さらなる実施形態では、上記被測定物質はセレノプロテインＰであり、上記長鎖型は全長タンパク質であり、上記短鎖型はＮ末端側フラグメントである。
【００１３】
本発明はさらに、検体中の被測定物質の長鎖型および短鎖型を分別して測定するための試薬キットを提供し、このキットは、
第１の特異的結合物質が結合した微小粒子を含む試薬であって、上記第１の特異的結合物質が上記長鎖型および上記短鎖型に結合し得る物質である、第１試薬；
第２の特異的結合物質が結合した微小粒子を含む試薬であって、上記第２の特異的結合物質が上記長鎖型に結合し得るが上記短鎖型に結合しない物質である、第２試薬；
第３の特異的結合物質が結合した微小粒子を含む試薬であって、上記第３の特異的結合物質が上記長鎖型および上記短鎖型に結合し得る物質である、第３試薬；および
第４の特異的結合物質が結合した微小粒子を含む試薬であって、上記第４の特異的結合物質が、上記第３の特異的結合物質とは異なる認識部位で上記長鎖型および上記短鎖型に結合し得る物質である、第４試薬
を含む。
【００１４】
１つの実施形態では、上記第１試薬および上記第２試薬は、両方を含む１つの試薬であり、そして上記第３試薬および上記第４試薬は、両方を含む１つの試薬である。
【００１５】
１つの実施形態では、上記第１試薬と上記第３試薬とは同一である。
【００１６】
１つの実施形態では、上記試薬キットは、指示書をさらに含む。
【００１７】
本発明はさらに、検体中の被測定物質の長鎖型および短鎖型を分別して測定するための装置を提供し、この装置は、
（Ａ）検体と、第１の特異的結合物質が結合した微小粒子および第２の特異的結合物質が結合した微小粒子とを混合し、上記微小粒子の凝集反応を測定する手段であって、上記第１の特異的結合物質が上記長鎖型および上記短鎖型に結合し得る物質であり、上記第２の特異的結合物質が上記長鎖型に結合し得るが上記短鎖型に結合しない物質である、手段；
（Ｂ）検体と、第３の特異的結合物質が結合した微小粒子および第４の特異的結合物質が結合した微小粒子とを混合し、上記微小粒子の凝集反応を測定する手段であって、上記第３の特異的結合物質が上記長鎖型および上記短鎖型に結合し得る物質であり、上記第４の特異的結合物質が、上記第３の特異的結合物質とは異なる認識部位で上記長鎖型および上記短鎖型に結合し得る物質である、手段；
（Ｃ）上記（Ａ）の測定値を用いて上記長鎖型の量を決定する手段；および
（Ｄ）上記（Ｂ）の測定値から上記（Ａ）の測定値を差し引いた値を用いて上記短鎖型の量を決定する手段
を備える。
【００１８】
１つの実施形態では、上記装置は、上記（Ｂ）の測定値から上記（Ａ）の測定値を差し引いた値を補正する手段をさらに備える。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、検体中の分子量の異なる２種の形態の被測定物質を分別して測定することができる。本発明は、ホモジニアスな測定系を利用することができ、被測定物質の分子量の異なる形態の分別測定を簡便な操作で短時間に行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】血漿カリクレインによるセレノプロテインＰ（ＳｅＰ）の切断を示す模式図である。
【図２】Ｆ−ＳｅＰ測定系におけるＳｅＰ濃度と吸光度変化量との関係を示すグラフである。
【図３】Ｗ−ＳｅＰ測定系におけるＳｅＰ濃度と吸光度変化量との関係を示すグラフである。
【図４】（ａ）ＳｅＰ高濃度試料（試料１）および（ｂ）ＳｅＰ中濃度試料（試料２）についてカリクレイン無添加試料（ａ−１、ｂ−１）およびカリクレイン添加試料（ａ−２、ｂ−２）のＦ−ＳｅＰ値、Ｓ−ＳｅＰ値、およびＴｏｔａｌ−ＳｅＰ値の経時変化を示すグラフである。
【図５】Ｆ−ＳｅＰ値（Ａ）、Ｔｏｔａｌ−ＳｅＰ値（Ｂ）およびＷ−ＳｅＰ測定値（Ｃ）について、Ｆ−ＳｅＰ測定系およびＷ−ＳｅＰ測定系を用いる金コロイド凝集反応法によって決定した値と、ＥＬＩＳＡでの測定値との相関関係を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明は、検体中の被測定物質の長鎖型および短鎖型を分別して測定する方法を提供する。この方法は、（ａ）検体と、第１の特異的結合物質が結合した微小粒子および第２の特異的結合物質が結合した微小粒子とを混合し、微小粒子の凝集反応を測定する工程；（ｂ）検体と、第３の特異的結合物質が結合した微小粒子および第４の特異的結合物質が結合した微小粒子とを混合し、上記微小粒子の凝集反応を測定する工程；（ｃ）上記工程（ａ）の測定値を用いて長鎖型の量を決定する工程；および（ｄ）上記工程（ｂ）の測定値から上記工程（ａ）の測定値を差し引いた値を用いて短鎖型の量を決定する工程を含む。
【００２２】
検体は、目的の被測定物質が存在し得るものであればよく、特に制限されない。固体および液体のいずれであってもよい。血液、血漿、血清、尿、糞便（懸濁液）、髄液、腹水などの生体試料；環境中より得られたサンプルまたはその抽出物などが挙げられる。
【００２３】
被測定物質は、分子量の異なる２種の形態で存在し得る、凝集法、好適には免疫凝集法により測定可能な物質であればよい。被測定物質としては、例えば、タンパク質が当該タンパク質を分解する酵素などによる切断を受ける場合の未切断の全長タンパク質および切断で生じたタンパク質フラグメント、分子量が大きい形態および分子量が小さい形態のイソ型タンパク質などが挙げられる。本明細書においては、分子量が大きい形態を「長鎖型」、分子量が小さい形態を「短鎖型」と称する。
【００２４】
１つの実施形態では、長鎖型は全長タンパク質であり、短鎖型はタンパク質フラグメントである。タンパク質フラグメントは、被測定対象のタンパク質を分解する酵素による分解または他の要因によって該タンパク質が「切断」された場合に生じるタンパク質フラグメントであり得る。例えば、セレノプロテインＰ（ＳｅＰ）は血漿カリクレインにより切断される。図１は、血漿カリクレインによるセレノプロテインＰ（ＳｅＰ）の切断を示す模式図である。上段図は全長ＳｅＰを表し、中段および下段は血漿カリクレイン切断により生じるＳｅＰフラグメントを表す。図中、「Ｎ」および「Ｃ」はそれぞれ、Ｎ末端側およびＣ末端側を表し、「Ｓｅｃ」はセレノシステイン残基を表す。カリクレインは、２３５位のアルギニン（図１中「Ｒ２３５」）と２３６位のグルタミン（図１中「Ｑ２３６」）との間、および２４２位のアルギニン（図１中「Ｒ２４２」）と２４３位のアスパラギン酸（図１中「Ｄ２４３」）との間を切断し、ＳｅＰのＮ末端側フラグメント（アミノ酸残基１〜２３５）およびＣ末端側フラグメント（アミノ酸残基２４３〜３６１）を含む３つのフラグメントを生じ得る（図１）。「長鎖型」は、未切断の全長ＳｅＰ（アミノ酸残基１〜３６１：本明細書においては「Ｆ−ＳｅＰ」ともいう）であり、「短鎖型」は、切断で生じたＳｅＰフラグメント（本明細書においては「Ｓ−ＳｅＰ」ともいう）であり、ＳｅＰフラグメントは、例えば、Ｎ末端側フラグメント（アミノ酸残基１〜２３５）であり得る。ＳｅＰのアミノ酸配列は、非特許文献３に記載のとおりである。
【００２５】
タンパク質の切断によって２種またはそれ以上のフラグメントが生じ得る場合、その中の１つのフラグメントを標的にして測定することにより、タンパク質の切断の程度を測定することができる。
【００２６】
工程（ａ）では、第１の特異的結合物質が結合した微小粒子および第２の特異的結合物質が結合した微小粒子を凝集反応に用いる。第１の特異的結合物質は、長鎖型および短鎖型の両方に結合し得る物質である。第２の特異的結合物質は、長鎖型に結合し得るが短鎖型に結合しない物質である。長鎖型は、１つの微小粒子上の第１の特異的結合物質と、該第１の特異的結合物質が認識し得る部位で結合し、かつ別の微小粒子上の第２の特異的結合物質と、該第２の特異的結合物質が認識し得る部位で結合し得る。短鎖型は、１つの微小粒子上の第１の特異的結合物質と、該第１の特異的結合物質が認識し得る部位で結合し得るが、別の微小粒子上の第２の特異的結合物質とは、短鎖型が該第２の特異的結合物質が認識し得る部位を含まないので結合し得ない。よって、長鎖型のみが、第１の特異的結合物質が結合した微小粒子および第２の特異的結合物質が結合した微小粒子と凝集反応を生じ得る。この凝集反応は、検体中の「長鎖型」の被測定物質の量の指標となる。
【００２７】
工程（ｂ）では、ともに長鎖型および短鎖型の両方に結合し得るが、認識部位の異なる２種の特異的結合物質がそれぞれ結合した微小粒子を凝集反応に用いる。すなわち、第３の特異的結合物質が結合した微小粒子および第４の特異的結合物質が結合した微小粒子を凝集反応に用いる。第３の特異的結合物質は長鎖型および短鎖型に結合し得る物質であり、第４の特異的結合物質は、第３の特異的結合物質とは異なる認識部位で長鎖型および短鎖型に結合し得る物質である。長鎖型は、１つの微小粒子上の第３の特異的結合物質と、該第３の特異的結合物質が認識し得る部位で結合し、かつ別の微小粒子上の第４の特異的結合物質と、該第４の特異的結合物質が認識し得る部位で結合し得る。短鎖型もまた、１つの微小粒子上の第３の特異的結合物質と、該第３の特異的結合物質が認識し得る部位で結合し、かつ別の微小粒子上の第４の特異的結合物質と、該第４の特異的結合物質が認識し得る部位で結合し得る。よって、長鎖型および短鎖型の両方が、第３の特異的結合物質が結合した微小粒子および第４の特異的結合物質が結合した微小粒子と凝集反応を生じ得る。この凝集反応は、検体中の「長鎖型」および「短鎖型」の被測定物質を含む全体量の指標となる。
【００２８】
「特異的結合物質」とは、被測定物質に特異的に結合し得る物質をいう。特異的結合物質としては、免疫反応を利用する免疫学的測定法に使用され得る抗体または抗原が挙げられる。例えば、抗体または抗原、レセプター、レクチン、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）などの結合親和性を有する物質が挙げられる。好ましくは、被測定物質に対するモノクローナル抗体である。抗体はフラグメントであってもよく、Ｆａｂ、還元Ｆｃなどのフラグメントが用いられ得る。
【００２９】
第１、第３および第４の「特異的結合物質」とは、長鎖型および短鎖型の両方に特異的に結合し得るがそれ以外には結合しない物質であり得る。第１の特異的結合物質は、長鎖型および短鎖型に共通する領域内の部位を認識し、該部位で長鎖型または短鎖型に結合し得る。第２の特異的結合物質は、長鎖型にのみ存在する部位（すなわち、長鎖型において、短鎖型との共通領域を除く領域内の部位）を認識し、該部位で長鎖型に結合し得るが短鎖型には結合しない。第３の特異的結合物質および第４の特異的結合物質は、長鎖型および短鎖型に共通する領域内の部位を認識し、該部位で長鎖型または短鎖型に結合し得るが、これらの間で認識部位が異なる。
【００３０】
工程（ａ）で用いられる第１の特異的結合物質が、工程（ｂ）で用いる２種の特異的結合物質の一方と認識部位が異なる限り、第１の特異的結合物質が結合した微小粒子を、工程（ａ）および工程（ｂ）において共通して用いることができる。１つの実施形態では、第３の特異的結合物質は、第１の特異的結合物質と同一の物質である。
【００３１】
特異的結合物質が被測定物質に対するモノクローナル抗体の場合、結合のために認識する部位が異なる少なくとも３種のモノクローナル抗体が用いられ得る。例えば、長鎖型および短鎖型に共通する領域の中のそれぞれ異なる認識部位で、長鎖型および短鎖型の両方に結合し得る２種（第１の特異的結合物質と第３の特異的結合物質とが同一の物質の場合）または３種（第１の特異的結合物質と第３の特異的結合物質とが異なる物質の場合）のモノクローナル抗体、および長鎖型にのみ存在する部位（すなわち、長鎖型において、短鎖型との共通領域を除く領域内の部位）を認識し、該部位で長鎖型に結合し得る１種のモノクローナル抗体が用いられ得る。
【００３２】
長鎖型が全長タンパク質であり、短鎖型がタンパク質フラグメントである場合において、分別測定するタンパク質フラグメントは、Ｎ末端側フラグメントまたはＣ末端側フラグメントのいずれでもあり得る。Ｎ末端側フラグメントの場合、第１の特異的結合物質、第３の特異的結合物質（第１の特異的結合物質と同じであってもよい）、および第４の特異的結合物質は、被測定物質のタンパク質における全長タンパク質とＮ末端側フラグメントとの共通する領域（すなわち、Ｎ末端側フラグメントを構成する領域）内にそれぞれ異なる認識部位を有する。それぞれの特異的結合物質は、それらの認識部位で全長タンパク質またはＮ末端側フラグメントに結合し得る。第２の特異的結合物質は、被測定物質のタンパク質における上記共通領域以外の領域（例えば、Ｃ末端側フラグメントを構成する領域）内に認識部位を有し、該認識部位で全長タンパク質に結合し得るが、Ｎ末端フラグメントには結合しない。あるいは、Ｃ末端側フラグメントである場合、第１の特異的結合物質、第３の特異的結合物質（第１の特異的結合物質と同じであってもよい）、および第４の特異的結合物質は、被測定物質のタンパク質における全長タンパク質とＣ末端側フラグメントとの共通する領域（すなわち、Ｃ末端側フラグメントを構成する領域）内にそれぞれ異なる認識部位を有する。それぞれの特異的結合物質は、それらの認識部位で全長タンパク質またはＣ末端側フラグメントに結合し得る。第２の特異的結合物質は、被測定物質のタンパク質における上記共通領域以外の領域（例えば、Ｎ末端側フラグメントを構成する領域）内に認識部位を有し、該認識部位で全長タンパク質に結合し得るが、Ｃ末端フラグメントには結合しない。全長タンパク質のＮ末端側とＣ末端側とが切断されて生じる中間型フラグメントが存在する場合も同様に、第１の特異的結合物質、第２の特異的結合物質、第３の特異的結合物質、および第４の特異的結合物質を選択し得る。
【００３３】
例えば、被測定物質がＳｅＰであり、長鎖型が全長ＳｅＰであり、短鎖型がＳｅＰのＮ末端側フラグメント（アミノ酸残基１〜２３５、図１の「Ｒ２３５」を付したフラグメントにより図示される：これは、カリクレイン分解切断により生じ得る）である場合、各特異的結合物質は以下のとおりである。第１の特異的結合物質、第３の特異的結合物質（第１の特異的結合物質と同じであってもよい）、および第４の特異的結合物質は、アミノ酸残基１〜２３５のＮ末端側領域内にそれぞれ異なる認識部位を有する。それぞれの特異的結合物質は、それらの認識部位で全長ＳｅＰまたはＮ末端側フラグメントに結合し得る。第２の特異的結合物質は、アミノ酸残基１〜２３５以外の領域、好ましくはＣ末端側フラグメント（図１の「Ｄ２４３」を付したフラグメントにより図示される）を構成する領域（アミノ酸残基２４３〜３６１）内に認識部位を有し、該認識部位で全長ＳｅＰに結合し得るが、Ｎ末端フラグメントには結合しない。ＳｅＰの場合、より好ましくは、第１の特異的結合物質、第３の特異的結合物質、および第４の特異的結合物質は、ＢＤ１、ＢＤ３、ＢＦ２、ＡＥ２およびＡＨ５（非特許文献１）からなる群から選択される２種（第１の特異的結合物質が、第３の特異的結合物質と同じ物質の場合）または３種（第１の特異的結合物質が、第３の特異的結合物質と異なる物質の場合）のモノクローナル抗体である。より好ましくは、第１の特異的結合物質および第３の特異的結合物質が共通してＡＨ５であり、かつ第４の特異的結合物質はＢＤ３であり、そして第２の特異的結合物質はＡＡ３（非特許文献１）である。
【００３４】
工程（ａ）および（ｂ）は、それぞれ独立した工程であり、順序を問わない。検体の一部を工程（ａ）に用い、同じ検体の別の一部を工程（ｂ）に用い得る。
【００３５】
工程（ａ）および（ｂ）のそれぞれについて、検体と、所定の組合せの結合微小粒子とを混合する。検体は、緩衝液などで適切に希釈および／または溶解してから混合してもよい。所定の組合せの結合微小粒子の添加は、同時または順次のいずれでもよく、また添加の順序も問わない。
【００３６】
当業者が通常用いる凝集反応が行われる。例えば、免疫凝集法（ラテックス凝集法、金属コロイド凝集法など）などが挙げられる。反応液の分離、洗浄操作などを行う必要がなく、検査の自動化が容易なホモジニアス系免疫凝集法が好ましく、特にラテックス凝集法または金属コロイド凝集法（好ましくは金コロイド凝集法）が望ましい。
【００３７】
特異的結合物質を結合するための微小粒子は、免疫測定試薬として通常使用され得る微小粒子であればよく、好ましくはラテックス粒子および金属コロイド粒子である。金属コロイド粒子としては、金、銀、銅、鉄、白金、パラジウム、またはこれらの混合物（金−白金、金−銀、鉄−白金、パラジウム−白金などの混合物）が用いられる。中でも金コロイド粒子が、一般的に利用され易いため、好ましく用いられる。これらの金属コロイド粒子は、市販品を用いてもよく、あるいは当業者が通常用いる方法（例えば、塩化金酸をクエン酸ナトリウムで還元する方法）により調製したものを用いてもよい。金属コロイド粒子の粒径は、通常５ｎｍ〜１００ｎｍ、好ましくは３０ｎｍ〜６０ｎｍの範囲である。
【００３８】
特異的結合物質が結合された微小粒子（本明細書において、単に「結合微小粒子」ともいう）は、微小粒子に、特異的結合物質を当業者が通常用いる方法により結合させるかまたは吸着させることによって得られる。例えば、金コロイド粒子を微小粒子として用いる場合、調製金コロイド粒子溶液（５４０ｎｍにおける吸光度が約２．０）１Ｌに対して、通常、０．１〜１００ｍｇ、好ましくは０．５〜２０ｍｇの特異的結合物質（例えば、抗体）を添加し、冷蔵または室温下で５分〜２４時間撹拌する。次いで、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）などでブロッキングし、遠心分離などを行うことにより、目的の特異的結合物質が結合された金コロイド粒子（本明細書において、単に「結合金コロイド粒子」ともいう）を得ることができる。
【００３９】
得られた結合金コロイド粒子は、測定に必要な濃度となるように緩衝液に分散させる。緩衝液のｐＨは、粒子に結合させる特異的結合物質の金コロイド粒子への結合を考慮して選択され得るが、通常４．５〜９．５、好ましくは５．５〜９．０の範囲である。緩衝液の濃度は１〜１００ｍＭが好ましい。緩衝液としては、例えば、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩液、コハク酸緩衝液、あるいはグリシルグリシン、ＭＥＳ（２−（Ｎ−モノホリノ）エタンスルホン酸）、ＨＥＰＥＳ（Ｎ−２−ヒドロキシエチル−ピペラジン−Ｎ’−エタンスルホン酸）、ＴＥＳ（Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸）、ＭＯＰＳ（３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸）、ＰＩＰＥＳ（ピペラジン−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸））、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ（ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン）、ＣＨＥＳ（Ｎ−シクロヘキシル−２−アミノエタンスルホン酸）などのグッド緩衝液が好適に用いられる。
【００４０】
結合金コロイド粒子を分散させる緩衝液は、必要に応じて、糖および糖アルコール、アジ化ナトリウム、アルブミン、塩化ナトリウムなどの塩類、防腐剤などの添加物を含有してもよい。糖および糖アルコールとしては、グルコース、マンノース、サッカロース、ラクトース、マルトース、マンニトール、ソルビトールなどが挙げられ、その濃度は、０．０１〜１０ｗ／ｖ％が好ましい。アルブミンとしては、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）が好ましく、その濃度は０．００１〜１ｗ／ｖ％が好ましい。防腐剤としてはアジ化ナトリウムが好ましく、その濃度は、０.０１〜０．５ｗ／ｖ％が好ましい。その他の添加物としては、Ｔｗｅｅｎ２０、ポリエチレングリコールラウリルエーテル、５−ブロモサリチル酸、サリチル酸ナトリウム、安息香酸ナトリウム、ベンゼンスルホン酸ナトリウム、フェノール、チモールなどが挙げられる。
【００４１】
被測定物質と結合微小粒子（例えば、結合金コロイド粒子）との凝集反応において、反応温度および時間、ｐＨ、緩衝液の種類、共存する塩の種類や濃度、その他の共存物質などの反応条件については、従来の免疫学的反応と同様である。例えば、一般的に行われているように、反応促進の目的で、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、デキストラン、コンドロイチン硫酸ナトリウムなどの水溶性高分子を反応系に添加してもよい。
【００４２】
工程（ａ）および（ｂ）ともに、凝集反応は、検体中の被測定物質の量（または全体量）の増大によって促進される。凝集の際に生じる色差（色調変化）を光学的に測定し、検体中の被測定物質の量（または全体量）が測定される。検体と所定の組合せの結合微小粒子とを合わせて反応液を生成し、反応液中で起こる凝集反応を光学的手段において吸光度を測定し、吸光度変化の大きさから被測定物質の存在量への換算を行う。「長鎖型」の被測定物質を標準物質として検量線を作成し、吸光度変化の大きさを被測定物質の濃度に換算し得る。吸光度変化の大きさを相対的な被測定物質の量としてもよい。
【００４３】
微小粒子として金コロイドを用いる場合は、金コロイド凝集反応に起因する所定の波長における吸光度変化を測定する。反応開始後の吸光度変化は、一波長測定であっても二波長測定であってもよい。一波長測定の場合は、測定波長は、６１０ｎｍ〜８００ｎｍ、好ましくは６３０ｎｍ〜７５０ｎｍである。二波長測定の場合は、測定波長は、第一波長６１０ｎｍ〜８００ｎｍ、好ましくは６３０ｎｍ〜７５０ｎｍと、第二波長３６０ｎｍ〜６００ｎｍ、好ましくは４００ｎｍ〜５５０ｎｍである。吸光度変化とは、以下の２通りの測定により得られた値であり、いずれであってもよい：
（１）反応開始後に反応液の吸光度を適当な間隔で２回測定し、その差を吸光度変化とする；または
（２）反応開始後に反応液の吸光度を連続的に測定し、時間当たりの吸光度変化率（その最大変化率を用いる場合もある）を吸光度変化とする。
【００４４】
上記測定には、分光光度計、マイクロプレートリーダー、生化学自動分析装置などが利用できる。特に、本発明の方法を生化学自動分析装置での測定に適用することにより、多数の検体を短時間に測定することが可能である。
【００４５】
測定結果を、予め作成しておいた金コロイド凝集反応の吸光度変化と「長鎖型」の被測定物質の量（濃度）との関係を表す検量線に当てはめることにより、工程（ａ）および工程（ｂ）のそれぞれについて、検体中の被測定物質の量（濃度）を求めることができる。
【００４６】
工程（ａ）で得られた被測定物質の量の値（測定値）は検体中の長鎖型の被測定物質の量を表し得る。工程（ａ）の測定値を用いて、検体中の長鎖型の被測定物質の量を決定する（工程（ｃ））。検体中の長鎖型の被測定物質の量の決定のために、工程（ａ）の測定値をそのまま用い得る。
【００４７】
工程（ｂ）で得られた被測定物質の量の値（測定値）は、検体中の長鎖型および短鎖型の被測定物質の全体量を表し得る。検体中の短鎖型の被測定物質の量を、工程（ｂ）の測定値から工程（ａ）の測定値を差し引いた値を用いて決定する（工程（ｄ））。工程（ｂ）の測定値を「長鎖型」の被測定物質を標準物質として作成した検量線に基づいて求めた場合は、短鎖型の被測定物質の量の決定のために、必要に応じて、工程（ｂ）の測定値から工程（ａ）の測定値を差し引いた値を補正する。補正は、差し引いた値を換算係数で除することによって行われ得る。
【００４８】
補正のための換算係数は、予め設定され得る。長鎖型の被測定物質のみが存在する場合（ｉ）と、長鎖型および短鎖型の被測定物質が存在する場合（ｉｉ）（（ｉ）の長鎖型の被測定物質の量と（ｉｉ）の長鎖型および短鎖型の被測定物質の全体量とが同じであるようにする）とのそれぞれについて、工程（ａ）および（ｂ）からそれぞれの測定値を得（すなわち、（ｉ）の場合の（ａ）および（ｂ）の測定値ならびに（ｉｉ）の場合の（ａ）および（ｂ）の測定値の４つの測定値を求める）、（ａ）および（ｂ）の各々について（ｉ）と（ｉｉ）との間の測定値の変化量を求める。変化量は（ｉ）から（ｉｉ）を差し引いても、またはその逆に（ｉｉ）から（ｉ）を差し引いて求めてもよい。換算係数は、「［（ｂ）の変化量＋（ａ）の変化量］／（ａ）の変化量」で算出され得る。例えば、長鎖型の被測定物質が全長タンパク質であり、短鎖型の被測定物質が当該タンパク質を分解する酵素による切断で生じるタンパク質フラグメントである場合、全長タンパク質の酵素処理の前後の測定値の変化量を、換算係数の設定のために用い得る。酵素処理は、全長タンパク質の切断を観察できる条件であればよい。変化量の測定が容易であるため、測定対象液中に存在するほぼ全ての全長タンパク質が切断され得る条件が好ましい。換算係数の検証は、（ｉ）と（ｉｉ）とのそれぞれについて工程（ａ）および（ｂ）を行い、（ｉ）の場合の（ａ）の測定値と、（ｉｉ）の場合の差し引いた値の補正値に（ａ）の測定値を加えたものとが一致することを確認することによって行われ得る。
【００４９】
工程（ｃ）および（ｄ）について、吸光度変化が一定値以下であれば陰性、一定値以上であれば陽性として判定を行う、定性および半定量をすることも可能である。工程（ａ）の結果から長鎖型について、工程（ａ）および（ｂ）の結果から短鎖型について判定に用いることができる。
【００５０】
工程（ｃ）で得られた長鎖型の被測定物質の量と工程（ｄ）で得られた短鎖型の被測定物質の量とを加えて、検体中の全被測定物質量（合計量：長鎖型および短鎖型を含む全体の被測定物質の量）を求めることもできる。
【００５１】
本発明はさらに、検体中の被測定物質の長鎖型および短鎖型を分別して測定するための試薬キットを提供する。このキットは、第１の特異的結合物質が結合した微小粒子を含む第１試薬；第２の特異的結合物質が結合した微小粒子を含む第２試薬；および第３の特異的結合物質が結合した微小粒子を含む第３試薬；および第４の特異的結合物質が結合した微小粒子を含む第４試薬を含む。第１の特異的結合物質、第２の特異的結合物質、第３の特異的結合物質、および第４の特異的結合物質については上述したとおりである。
【００５２】
本発明の実施形態では、試薬キットは、長鎖型被測定物質測定用試薬および全被測定物質（長鎖型および短鎖型を含む全体）測定用試薬を含み、長鎖型被測定物質測定用試薬は、第１試薬および第２試薬の組合せであり、そして全被測定物質測定用試薬は、第３試薬および第４試薬の組合せであり得る。試薬キットにおいて、各試薬は、例えば、以下のように提供され得る：長鎖型被測定物質測定用の２種の試薬（第１試薬および第２試薬）は、別個に提供されてもよく、または両方を含む１つの試薬（例えば、両方を混合したもの）として提供されてもよい。全被測定物質測定用試薬の２種の試薬（第３試薬および第４試薬）もまた、別個に提供されてもよく、または両方を含む１つの試薬（例えば、両方を混合したもの）として提供されてもよい。
【００５３】
長鎖型被測定物質測定用試薬として用いられる第１試薬は、全被測定物質測定用試薬としても用いられ得る。第３試薬は、第１試薬と同じであっても、または異なっていてもよい。１つの実施態様では、第１試薬と第３試薬とは同一である。この実施形態では、試薬キットは、第１試薬、第２試薬、および第４試薬を別個に備えてもよく、または長鎖型被測定物質測定用試薬として、第１試薬および第２試薬を含む１つの試薬と、全被測定物質測定用試薬として、第１試薬および第４試薬を含む１つの試薬とを備えてもよい。
【００５４】
各試薬は、どのような形態で提供されてもよく、それぞれ個別に密封包装されて提供されることが好ましい。
【００５５】
試薬キットは、指示書をさらに含み得る。指示書は、上記の検体中の被測定物質の長鎖型および短鎖型を分別して測定する方法の手順を説明するものであり得る。指示書には、長鎖型被測定物質の測定および全被測定物質の測定のために各試薬をどんな組合せで検体に添加するか、特に、長鎖型被測定物質の測定のために第１試薬および第２試薬を用い、そして全被測定物質の測定のために第３試薬および第４試薬を用いることが記載され得る。指示書には、必要に応じて、測定値の補正の説明が記載され得る。
【００５６】
試薬キットは、検量線作成用の被測定物質の標準品、使用時に各物質を溶解して適切な濃度の溶液を調製するための緩衝液、免疫反応を促進するための補助試薬などをさらに含んでいてもよい。
【００５７】
本発明はさらに、検体中の被測定物質の長鎖型および短鎖型を分別して測定するための装置を提供する。この装置は、（Ａ）検体と、第１の特異的結合物質が結合した微小粒子および第２の特異的結合物質が結合した微小粒子とを混合し、微小粒子の凝集反応を測定する手段；（Ｂ）検体と、第３の特異的結合物質が結合した微小粒子および第４の特異的結合物質が結合した微小粒子とを混合し、微小粒子の凝集反応を測定する手段；（Ｃ）上記（Ａ）の測定値を用いて長鎖型の量を決定する手段；および（Ｄ）上記（Ｂ）の測定値から上記（Ａ）の測定値を差し引いた値を用いて短鎖型の量を決定する手段を備える。第１の特異的結合物質、第２の特異的結合物質、第３の特異的結合物質、および第４の特異的結合物質については上述したとおりである。１つの実施形態では、上記（Ｂ）の測定値から上記（Ａ）の測定値を差し引いた値を補正する手段をさらに備える。手段（Ａ）および手段（Ｂ）は別々に備えたものであっても、または共通するものであって、使用時に、添加する試薬を変更するものであってもよい。本発明の装置は、凝集反応の測定用の自動化装置に、各型の被測定物質の量を決定するための自動化プログラムを組み込んだものであり得る。
【００５８】
以下、実施例に基づいて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。
【実施例】
【００５９】
（調製例１：金コロイド液の調製）
９５℃の蒸留水１Ｌに１０ｗ／ｖ％塩化金酸水溶液２ｍＬを攪拌しながら加え、１分後に２ｗ／ｖ％クエン酸ナトリウム水溶液１０ｍＬを加え、さらに２０分間攪拌した後、３０℃に冷却した。冷却後、０．１ｗ／ｖ％炭酸カリウム水溶液でｐＨ７．１に調節した。
【００６０】
（調製例２：各種抗セレノプロテインＰ抗体結合金コロイド試薬の調製）
抗ヒトセレノプロテインＰラットモノクローナル抗体ＡＨ５、ＢＤ３およびＡＡ３は、非特許文献１に記載の手順にしたがって得たものである。ＡＨ５およびＢＤ３は、セレノプロテインＰのカリクレイン切断によって生じるセレノプロテインＰのＮ末端側を認識するモノクローナル抗体であり、ＡＡ３は、セレノプロテインＰのＣ末端側を認識するモノクローナル抗体である。
【００６１】
抗セレノプロテインＰモノクローナル抗体ＡＨ５およびＡＡ３について、抗体結合金コロイド試薬を以下のようにして調製した。抗体を、０．０５ｗ／ｖ％アジ化ナトリウムを含む１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．１）で希釈し、５０μｇ／ｍＬの濃度にした。得られた抗体溶液１００ｍＬを、調製例１で調製した約１Ｌの金コロイド液に加え、冷蔵下で２時間攪拌した。さらに、５．４６ｗ／ｖ％マンニトール、０．５ｗ／ｖ％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、および０．０５％アジ化ナトリウムを含む１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．１）を１１０ｍＬ添加し、３７℃にて９０分間攪拌した。次いで、８０００ｒｐｍで４０分間遠心分離し、上清を除去した。次いで、得られた沈殿物に、３ｗ／ｖ％マンニトール、０．１ｗ／ｖ％ＢＳＡ、および０．０５ｗ／ｖ％アジ化ナトリウムを含む５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）（Ａ溶液）を約１Ｌ加え、抗体結合金コロイド粒子を分散させた後、８０００ｒｐｍで４０分間遠心分離し、上清を除去した。さらに、沈殿物に、０．９％デキストラン硫酸ナトリウムを含むＡ溶液を加えて抗体結合金コロイド粒子を分散させ、全量を２４０ｍＬとし、これを抗体結合金コロイド試薬として回収した。
【００６２】
抗セレノプロテインＰモノクローナル抗体ＢＤ３について、抗体結合金コロイド試薬を以下のようにして調製した。抗体を、０．０５ｗ／ｖ％アジ化ナトリウムを含む５０ｍＭ  ＣＨＥＳ（ｐＨ８．８）で希釈し、５０μｇ／ｍＬの濃度にした。得られた抗体溶液１００ｍＬを、調製例１で調製した約１Ｌの金コロイド液に加え、冷蔵下で２時間攪拌した。さらに、５．４６ｗ／ｖ％マンニトール、０．５ｗ／ｖ％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、および０．０５ｗ／ｖ％アジ化ナトリウムを含む５０ｍＭ  ＣＨＥＳ（ｐＨ８．８）を１１０ｍＬ添加し、３７℃にて９０分間攪拌した。次いで、８０００ｒｐｍで４０分間遠心分離し、上清を除去した。次いで、得られた沈殿物に、３ｗ／ｖ％マンニトール、０．１ｗ／ｖ％ＢＳＡ、および０．０５ｗ／ｖ％アジ化ナトリウムを含む５０ｍＭ  ＣＨＥＳ（ｐＨ８．８）（Ｂ溶液）を約１Ｌ加え、抗体結合金コロイド粒子を分散させた。さらに、８０００ｒｐｍで４０分間遠心分離し、上清を除去した。さらに、沈殿物に、０．９ｗ／ｖ％デキストラン硫酸ナトリウムを含むＢ溶液で抗体結合金コロイド粒子を分散させ、全量を２４０ｍＬとし、これを抗体結合金コロイド試薬として回収した。
【００６３】
ＡＨ５結合金コロイド試薬、ＢＤ３結合金コロイド試薬、およびＡＡ３結合金コロイド試薬をそれぞれ、金コロイド試薬１、金コロイド試薬２、および金コロイド試薬３とした。
【００６４】
（調製例３：セレノプロテインＰ測定用試薬の調製）
５ｗ／ｖ％塩化ナトリウム、１．０ｗ／ｖ％ＥＤ、０．１ｗ／ｖ％アルキルフェニルジスルホン酸ナトリウム塩、および０．５ｗ／ｖ％ポリオキシエチレンラウリルエーテルを含む０．２５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ７．８）緩衝液に、ポリエチレングリコールを以下の実施例１−１のＦ−ＳｅＰ測定用および実施例１−２のＷ−ＳｅＰ測定用に、それぞれ２．４ｗ／ｖ％および４ｗ／ｖ％になるように添加して、試薬を得た。
【００６５】
（実施例１：Ｆ−ＳｅＰ測定系およびＷ−ＳｅＰ測定系の設計）
全長ＳｅＰ（「Ｆ−ＳｅＰ」）量の測定のために、セレノプロテインＰのＮ末端側を認識する抗体が結合した金コロイド粒子およびＣ末端側を認識する抗体が結合した金コロイド粒子を用いる測定系を設計した（本明細書において、「Ｆ−ＳｅＰ測定系」ともいう）。Ｆ−ＳｅＰ測定系では、Ｆ−ＳｅＰのみが凝集反応に関与し得る。
【００６６】
Ｆ−ＳｅＰとカリクレイン切断で生じるＳｅＰフラグメント（「Ｓ−ＳｅＰ」）とを含む全体量の測定のために、セレノプロテインＰのＮ末端側を認識する２種の異なる抗体をそれぞれ結合させた金コロイド粒子を用いる測定系を設計した（本明細書において、「Ｗ−ＳｅＰ測定系」ともいう）。Ｗ−ＳｅＰ測定系では、Ｆ−ＳｅＰとカリクレイン切断によって生じたＮ末端側フラグメントとが凝集反応に関与し得る。
【００６７】
精製ＳｅＰは、Saito, Y.ら，J. Biol. Chem. (1999) 274, 2866-2871の記載にしたがってヒト血漿から精製したものであり、これはＦ−ＳｅＰである。
【００６８】
（実施例１−１：Ｆ−ＳｅＰ測定系）
精製ＳｅＰをそれぞれ０．０ｍｇ／Ｌ、１．２５ｍｇ／Ｌ、２．５ｍｇ／Ｌ、５．０ｍｇ／Ｌ、７．５ｍｇ／Ｌ、および１０．０ｍｇ／Ｌの濃度で標準マトリックス（３ｗ／ｖ％ＢＳＡを含む５０ｍＭ  2-[ビス(2-ヒドロキシエチル)アミノ]-2-(ヒドロキシメチル)プロパン-1,3-ジオール（Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ）（ｐＨ６．５））中に含む、Ｆ−ＳｅＰ標準液を調製した。得られたＦ−ＳｅＰ標準液３μＬに、調製例３のＦ−ＳｅＰ測定用試薬を１７０μＬ分注し、３７℃にて約５分間加温し、次いで、金コロイド試薬１および金コロイド試薬３を混合したものを８５μＬ分注し、３７℃にて反応させた。次いで、得られた反応溶液を日立７０７０自動分析装置に供し、主波長５０５ｎｍおよび副波長６６０ｎｍで測光ポイント１８から３１の吸光度変化を測定し、６６０ｎｍでの吸光度変化から５０５ｎｍでの吸光度変化を差し引いた値の絶対値を求め、吸光度変化量とした。
【００６９】
図２は、Ｆ−ＳｅＰ測定系におけるＳｅＰ濃度と吸光度変化量との関係を示すグラフである。縦軸は吸光度変化量を表し、横軸はＳｅＰ濃度（ｍｇ／Ｌ）を表す。図２において、ＳｅＰ濃度依存的に吸光度変化量の増加が見られた。
【００７０】
（実施例１−２：Ｗ−ＳｅＰ測定系）
精製ＳｅＰをそれぞれ、０．０ｍｇ／Ｌ、３．０ｍｇ／Ｌ、６．０ｍｇ／Ｌ、９．０ｍｇ／Ｌ、１２．０ｍｇ／Ｌ、および１５．０ｍｇ／Ｌの濃度で含むようにした以外は、実施例１−１と同様にしてＦ−ＳｅＰ標準液を調製した。得られたＦ−ＳｅＰ標準液３μＬに、調製例３のＷ−ＳｅＰ測定用試薬を１７０μＬ分注し、３７℃にて約５分間加温し、次いで、金コロイド試薬１および金コロイド試薬２を混合したものを８５μＬ分注し、３７℃にて反応させた。実施例１−１と同様にして、得られた反応溶液の吸光度変化量を求めた。
【００７１】
図３は、Ｗ−ＳｅＰ測定系におけるＳｅＰ濃度と吸光度変化量との関係を示すグラフである。縦軸および横軸は図２と同じである。図３においても、ＳｅＰ濃度依存的に吸光度変化量の増加が見られた。
【００７２】
以下の実施例では、図２および図３をそれぞれ、Ｆ−ＳｅＰ測定系およびＷ−ＳｅＰ測定系によって試料中のＳｅＰ濃度（Ｗ−ＳｅＰ測定系の場合は全ＳｅＰ濃度）を求めるための検量線として用いた。
【００７３】
（実施例２：Ｆ−ＳｅＰ測定系およびＷ−ＳｅＰ測定系によるカリクレイン添加試料の測定）
精製ＳｅＰ（Ｆ−ＳｅＰ）を７．０ｍｇ／Ｌの濃度で含むようにした以外は、実施例１−１と同様にしてＳｅＰ含有試料を調製した。ＳｅＰ含有試料０．９ｍＬにカリクレイン（Calbiochem社、kallikrein、Human Plasma）０．０２８Ｕを添加し、３７℃にて７日間保存した。他方、ＳｅＰ含有試料にカリクレインを添加しないこと以外、同様の操作を行った。
【００７４】
０日目、１日目、２日目、３日目、および７日目に試料を採取した。採取した試料３μＬを実施例１−１に記載するようにＦ−ＳｅＰ測定系に供し、さらに別の試料３μＬを実施例１−２に記載するようにＷ−ＳｅＰ測定系に供し、吸光度変化量からそれぞれ図２および図３の検量線に基づいてＦ−ＳｅＰ測定値およびＷ−ＳｅＰ測定値を決定した（以下、本操作を、便宜上、単に「Ｆ−ＳｅＰ測定系およびＷ−ＳｅＰ測定系に供し、Ｆ−ＳｅＰ測定値およびＷ−ＳｅＰ測定値を決定した」という）。Ｆ−ＳｅＰのＳｅＰ値は、Ｆ−ＳｅＰ測定値をそのまま用い、Ｓ−ＳｅＰのＳｅＰ値は、Ｗ−ＳｅＰ測定値からＦ−ＳｅＰ測定値（すなわちＦ−ＳｅＰ値）を差し引いて求めた。
【００７５】
カリクレイン無添加の場合、Ｆ−ＳｅＰ測定値（すなわちＦ−ＳｅＰ値）、Ｓ−ＳｅＰ値およびＷ−ＳｅＰ測定値はほぼ同じ値で推移していた。カリクレイン添加の場合、反応時間の増加につれて、Ｆ−ＳｅＰ測定値（すなわちＦ−ＳｅＰ値）は減少し、Ｓ−ＳｅＰ値は増加し、Ｗ−ＳｅＰ測定値もまた増加した。
【００７６】
Ｗ−ＳｅＰ測定値は、Ｆ−ＳｅＰ濃度の検量線（図３）に基づく値である。Ｗ−ＳｅＰ測定値は、Ｆ−ＳｅＰ値の減少およびＳ−ＳｅＰ値の増加に伴い増加していた。
【００７７】
（実施例３：換算係数の設定）
精製ＳｅＰを５０ｍｇ／Ｌの濃度になるように透析液（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．１））に溶解し、精製ＳｅＰ溶液０．１ｍＬにカリクレイン０．０３５Ｕを添加し、３７℃にて１晩反応させた。カリクレインによるＳｅＰの切断は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、ほとんど全てのＳｅＰバンドが低分子側に移行したことで確認した。カリクレイン無添加で同様の操作をしたものをコントロールとした。
【００７８】
カリクレイン切断および未切断（コントロール）のそれぞれを標準マトリックスで１０倍希釈し、Ｆ−ＳｅＰ測定系およびＷ−ＳｅＰ測定系に供し、Ｆ−ＳｅＰ測定値およびＷ−ＳｅＰ測定値を決定した。測定結果は表１に示すとおりである。
【００７９】
【表１】
2014052338.tif 000002
【００８０】
表１中のＦ−ＳｅＰ測定値に関するカリクレイン処理による測定値の変化は、Ｆ−ＳｅＰ分解量と判断できる。表１の結果から、Ｆ−ＳｅＰが４．７３ｍｇ／Ｌ切断された際、Ｗ−ＳｅＰ測定値の２．８３ｍｇ／Ｌの増加が認められた。
【００８１】
以下の換算式：
換算係数（Ｋ）＝（「Ｗ−ＳｅＰ測定値の増減量」＋「Ｆ−ＳｅＰ分解量」）／「Ｆ−ＳｅＰ分解量」
にそれぞれの数値を当てはめ、換算係数を、
（２．８３＋４．７３）／４．７３＝１．６と算出した。
【００８２】
（実施例４：カリクレイン切断におけるＦ−ＳｅＰ値、Ｓ−ＳｅＰ値、Ｔｏｔａｌ−ＳｅＰ値の検証）
標準マトリックスに精製ＳｅＰを７ｍｇ／Ｌの濃度になるように溶解し、ＳｅＰ高濃度試料を調製した（試料１）。標準マトリックスに精製ＳｅＰを３．５ｍｇ／Ｌの濃度になるように溶解し、ＳｅＰ中濃度試料を調製した（試料２）。ＳｅＰ高濃度試料（試料１）およびＳｅＰ中濃度試料（試料２）のそれぞれ０．９ｍＬにカリクレイン０．０２８Ｕを添加し、３７℃にて７日間保存した。カリクレイン無添加で同様の操作をしたものをコントロールとした。０日目、１日目、２日目、３日目、および７日目に、採取した試料をＦ−ＳｅＰ測定系およびＷ−ＳｅＰ測定系に供し、Ｆ−ＳｅＰ測定値およびＷ−ＳｅＰ測定値を得、これらの測定値を用いて、Ｆ−ＳｅＰ値、Ｓ−ＳｅＰ値およびＴｏｔａｌ−ＳｅＰ値を以下のように決定した：
Ｆ−ＳｅＰ値＝「Ｆ−ＳｅＰ測定値」
Ｓ−ＳｅＰ値＝（「Ｗ−ＳｅＰ測定値」−「Ｆ−ＳｅＰ値」）／１．６
Ｔｏｔａｌ−ＳｅＰ値＝「Ｆ−ＳｅＰ値」＋「Ｓ−ＳｅＰ値」
【００８３】
結果を以下の表２および図４に示す。
【００８４】
【表２】
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【００８５】
図４は、（ａ）ＳｅＰ高濃度試料（試料１）および（ｂ）ＳｅＰ中濃度試料（試料２）についてカリクレイン無添加試料（ａ−１、ｂ−１）およびカリクレイン添加試料（ａ−２、ｂ−２）のＦ−ＳｅＰ値、Ｓ−ＳｅＰ値、およびＴｏｔａｌ−ＳｅＰ値の経時変化を示すグラフである。いずれも縦軸はＳｅＰ値（ｍｇ／Ｌ）を表し、横軸は３７℃反応時間（日）を表す。黒丸、黒菱形および黒三角はそれぞれ、Ｔｏｔａｌ−ＳｅＰ値、Ｆ−ＳｅＰ値およびＳ−ＳｅＰ値を表す。
【００８６】
Ｔｏｔａｌ−ＳｅＰ値は、カリクレインにより分解したＦ−ＳｅＰ値と生成したＳ-ＳｅＰ値との合計のＳｅＰ値であるので、理論上、反応開始時（０日目）のＦ−ＳｅＰ値を上回るものではない。試料１および２のカリクレイン添加試料において、Ｔｏｔａｌ−ＳｅＰ値は、ほぼ同じ値で推移していた。さらに、試料１および２とも、Ｔｏｔａｌ−ＳｅＰ値は、カリクレイン無添加試料とカリクレイン添加試料との間で一致していた。
【００８７】
（実施例５：Ｆ−ＳｅＰ測定系およびＷ−ＳｅＰ測定系を用いる金コロイド凝集反応法とＥＬＩＳＡとの相関）
本実施例では、Ｆ−ＳｅＰ測定系およびＷ−ＳｅＰ測定系を用いる金コロイド凝集反応法によって決定したＦ−ＳｅＰ値およびＴｏｔａｌ−ＳｅＰ値と、ＥＬＩＳＡでの測定値との相関関係を調べた。
【００８８】
２００の検体（ヒト血清）について、金コロイド凝集反応法およびＥＬＩＳＡのそれぞれによって、Ｆ−ＳｅＰ値およびＴｏｔａｌ−ＳｅＰ値を決定した。金コロイド凝集反応法では、検体をＦ−ＳｅＰ測定系およびＷ−ＳｅＰ測定系に供し、Ｆ−ＳｅＰ測定値およびＷ−ＳｅＰ測定値を決定し、Ｆ−ＳｅＰ値およびＴｏｔａｌ−ＳｅＰ値を実施例４に記載のとおりに決定した。Ｆ−ＳｅＰ測定用ＥＬＩＳＡは、一次抗体としてＡＡ３および二次抗体としてＡＨ５を使用し、Ｔｏｔａｌ−ＳｅＰ測定用ＥＬＩＳＡは、一次抗体としてＢＤ３および二次抗体としてＡＨ５を使用し、通常の方法により実施した。金コロイド凝集反応法のＷ−ＳｅＰ測定値と、ＥＬＩＳＡによるＴｏｔａｌ−ＳｅＰ値との比較もまた行った。
【００８９】
図５は、Ｆ−ＳｅＰ値（Ａ）、Ｔｏｔａｌ−ＳｅＰ値（Ｂ）およびＷ−ＳｅＰ測定値（Ｃ）について、Ｆ−ＳｅＰ測定系およびＷ−ＳｅＰ測定系を用いる金コロイド凝集反応法によって決定した値と、ＥＬＩＳＡでの測定値との相関関係を示すグラフである。図５Ａ〜Ｃにおいて、縦軸は、金コロイド凝集反応法によって決定したＳｅＰ値を表し、横軸はＥＬＩＳＡによるＳｅＰ値を表す。各検体について、金コロイド凝集反応法によるＳｅＰ値とＥＬＩＳＡによるＳｅＰ値とが交わる点にプロットをとり、回帰分析を行った。
【００９０】
Ｆ−ＳｅＰ値（Ａ）およびＴｏｔａｌ−ＳｅＰ値（Ｂ）については、金コロイド凝集反応法によって決定したＳｅＰ値とＥＬＩＳＡによるＳｅＰ値とはそれぞれほぼ一致しており、良好な相関関係であった。Ｗ−ＳｅＰ測定値（Ｃ）については、ＥＬＩＳＡのＴｏｔａｌ−ＳｅＰ値と良好な相関を示したが、直線式の傾きは約１．２であり、ＥＬＩＳＡのＴｏｔａｌ−ＳｅＰ値に比べてＷ−ＳｅＰ測定値が高くなる傾向が認められた。
【００９１】
本実施例により、金コロイド凝集反応法においてＦ−ＳｅＰよりＳ−ＳｅＰの反応性が高く、Ｗ−ＳｅＰ測定値が実際のＦ−ＳｅＰとＳ−ＳｅＰとの合計値より高くなることを裏付ける結果となった。実施例３で設定した換算係数を用いて補正することにより、Ｆ−ＳｅＰ値およびＳ−ＳｅＰ値について、ＥＬＩＳＡと同様の測定結果が得られることが実証された。
【産業上の利用可能性】
【００９２】
本発明によれば、ホモジニアスな測定系を利用して、検体中の被測定物質の分子量の異なる２種の形態を分別して測定することができる。ホモジニアスな測定系はＢ／Ｆ分離を必要としないため、自動化にも非常に適しているので、操作が容易であり、短時間で測定でき、高速度での検体処理が可能である。本発明の測定では、ＥＬＩＳＡによる測定とほぼ同程度に正確な結果を得ることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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