(57)【要約】      （修正有）【課題】虚血によって損傷を受けた組織への内皮前駆細胞の輸送を増加させるための医薬の提供。【解決手段】ＩＬ−８，Ｇｒｏ−α及び間質由来因子−１（ＳＤＦ−１α）等のＣＸＣケモカインの注射による投与であって、特に末梢循環、心筋、左心室、右心室、冠動脈、脳脊髄液、または神経組織中への投与することにより血管の新生をうながす。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者の虚血によって損傷を受けた組織における血管形成を刺激する方法であって、
（ａ）前記患者のある部位から幹細胞を採取することと、
（ｂ）工程（ａ）で採取した前記幹細胞から内皮前駆細胞を回収することと、
（ｃ）患者の虚血によって損傷を受けた前記組織における血管形成を前記内皮前駆細胞が刺激するように、工程（ｂ）で得た前記内皮前駆細胞を前記患者の別の部位に導入することとを備えた方法。
【請求項２】
工程（ｂ）の後であり且つ工程（ｃ）の前に、前記内皮前駆細胞を増殖因子と接触させることによって、前記内皮前駆細胞を増殖させる請求項１の方法。
【請求項３】
前記増殖因子がサイトカインである請求項２の方法。
【請求項４】
前記サイトカインがＶＥＧＦ、ＦＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＧＦ、Ｍ−ＣＳＦ、又はＧＭ−ＣＳＦである請求項３の方法。
【請求項５】
前記増殖因子がケモカインである請求項２の方法。
【請求項６】
前記ケモカインがインターロイキン−８である請求項２の方法。
【請求項７】
前記内皮前駆細胞が、増殖の前に、他の幹細胞から分離される請求項３の方法。
【請求項８】
前記虚血によって損傷を受けた組織が心筋である請求項１の方法。
【請求項９】
前記虚血によって損傷を受けた組織が神経系組織である請求項１の方法。
【請求項１０】
前記幹細胞が前記患者の骨髄から採取される請求項１の方法。
【請求項１１】
前記骨髄からの前記幹細胞の採取が、前記患者の骨髄からの吸引によって為される請求項１０の方法。
【請求項１２】
前記患者からの前記幹細胞の採取が、
（ａ）前記患者に増殖因子を導入して、前記幹細胞を前記患者の血液中に動員することと、
（ｂ）前記幹細胞を含有する血液の試料を前記患者から採取することと
を備えた方法によって為される請求項１の方法。
【請求項１３】
前記増殖因子が、皮下、経口、静脈内、又は筋肉内から患者に導入される請求項１２の方法。
【請求項１４】
前記増殖因子が動員を誘導するケモカインである請求項１２の方法。
【請求項１５】
前記ケモカインがインターロイキン−８である請求項１４の方法。
【請求項１６】
前記増殖因子がサイトカインである請求項１２の方法。
【請求項１７】
前記サイトカインがＧ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、又はＧＭ−ＣＳＦである請求項１６の方法。
【請求項１８】
前記内皮前駆細胞が、ＣＤ１１７の発現に基づいて回収される請求項１の方法。
【請求項１９】
前記内皮前駆細胞が、ＧＡＴＡ−２被活性化遺伝子産物の発現に基づいて回収される請求項１の方法。
【請求項２０】
前記内皮前駆細胞が、ＣＤ３４、ＶＥＧＦ−Ｒ、Ｔｉｅ−２，ＧＡＴＡ−３、又はＡＣ１３３のうちの１以上の発現に基づいて回収される請求項１の方法。
【請求項２１】
前記患者が、以下のうちの１以上：心筋梗塞、慢性心不全、虚血性心疾患、冠動脈疾患、糖尿病性心疾患、出血性卒中、血栓性卒中、塞栓性卒中、虚血肢、又は組織が虚血になるその他の疾病に罹患したことがある、又は罹患している請求項１の方法。
【請求項２２】
前記患者が虚血によって損傷を受けた組織を患う前に工程（ａ）が行われ、前記患者が虚血によって損傷を受けた組織を患った後に工程（ｃ）が行われる請求項１の方法。
【請求項２３】
工程（ｂ）と（ｃ）の間の一期間に、記内皮前駆細胞が凍結される請求項１の方法。
【請求項２４】
増殖された後、工程（ｃ）が行われる前の一期間に、前記内皮前駆細胞が凍結される請求項３の方法。
【請求項２５】
末梢循環、心筋、左心室、右心室、冠動脈、脳脊髄液、神経組織、虚血性組織、又は虚血後組織中に直接注入することによって、前記内皮前駆細胞が前記患者に導入される請求項１の方法。
【請求項２６】
以下のもの：プラスミノーゲン活性化因子阻害剤の阻害剤、アンギオテンシン変換酵素阻害剤、又はβ−遮断薬のうちの１以上を患者に投与することをさらに備え、工程（ｃ）の前、同時、又は後に、このような投与を行う請求項１の方法。
【請求項２７】
患者の梗塞周囲組織における血管新生を刺激する方法であって、
（ａ）前記患者のある部位から幹細胞を採取することと、
（ｂ）工程（ａ）で採取した前記幹細胞から内皮前駆細胞を回収することと、  （ｃ）前記前駆細胞を増殖因子と接触させることによって、工程（ｂ）で回収した前記内皮前駆細胞を増殖させることと、
（ｄ）前記患者の梗塞周囲組織における血管新生を前記内皮前駆細胞が刺激するように、工程（ｃ）で得た増殖した前記内皮前駆細胞を前記患者の別の部位に導入することとを備えた方法。
【請求項２８】
患者の虚血によって損傷を受けた組織における内皮前駆細胞を増加する方法であって、  （ａ）前記患者に内皮前駆細胞を投与することと、
（ｂ）前記患者にケモカインを投与し、損傷を受けた組織における内皮前駆細胞を引き付けることとを備えた方法。
【請求項２９】
前記ケモカインが、内皮前駆細胞を投与する前に患者に投与される請求項２８の方法。
【請求項３０】
前記ケモカインが、内皮前駆細胞と同時に患者に投与される請求項２８の方法。
【請求項３１】
前記ケモカインが、内皮前駆細胞を投与する後に患者に投与される請求項２８の方法。
【請求項３２】
前記ケモカインがＣＸＣケモカインである請求項２８の方法。
【請求項３３】
前記ＣＸＣケモカインがインターロイキン−８、Ｇｒｏ−α、又は間質由来因子−１である請求項２８の方法。
【請求項３４】
前記ケモカインがＣＣケモカインである請求項２８の方法。
【請求項３５】
前記ＣＣケモカインがＲＡＮＴＥＳ、ＥＯＴＡＸＩＮ、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、又はＭＣＰ−４である請求項３４の方法。
【請求項３６】
患者の末梢循環、心筋、左心室、右心室、冠動脈、脊髄液、神経組織、虚血性組織、又は虚血後組織への注入によって、前記ケモカインが前記患者に投与される請求項２８の方法。
【請求項３７】
患者の虚血によって損傷を受けた組織への内皮前駆細胞又は血管芽細胞の輸送を増加させる方法であって、間質由来因子−１とＣＸＣＲ４との何らかの相互作用を阻害することを備えた方法。
【請求項３８】
間質由来因子−１（ＳＤＦ−１）とＣＸＣＲ４との相互作用が、前記患者に抗ＳＤＦ−１又は抗ＣＸＣＲ４モノクローナル抗体を投与することによって阻害される請求項３７の方法。
【請求項３９】
アンギオテンシン変換酵素阻害剤、ＡＴ１−受容体遮断薬、又はβ遮断薬を前記患者に投与することをさらに備えた請求項３８の方法。
【請求項４０】
患者の骨髄への内皮前駆細胞の輸送を減少させる方法であって、前記患者の骨髄での間質由来因子−１の産生を阻害することを備えた方法。
【請求項４１】
ＳＤＦ−１の産生が、患者に抗ＳＤＦ−１又は抗ＣＸＣＲ４モノクローナル抗体を投与することによって阻害される請求項４０の方法。
【請求項４２】
患者の癌を治療する方法であって、前記癌に伴って増殖している細胞によって産生された特異的ケモカインのエピトープに対して誘導されたモノクローナル抗体を前記患者に投与して、このような増殖している細胞への内皮前駆細胞の輸送を減少させることによって前記患者の前記癌を治療することを備えた方法。
【請求項４３】
患者の癌を治療する方法であって、前記癌に伴って増殖している細胞によって産生された特異的ケモカインに対する特異的受容体であり、内皮前駆細胞上に位置する特異的受容体のエピトープに対して誘導されたモノクローナル抗体を前記患者に投与して、このような増殖している細胞への内皮前駆細胞の輸送を減少させることにより、前記患者の前記癌を治療することを備えた方法。
【請求項４４】
患者の腫瘍を治療する方法であって、内皮前駆細胞上の特異的な受容体に対するアンタゴニストを前記患者に投与して、前記患者の腫瘍における血管形成を誘導する前記前駆細胞の能力を減弱せしめることにより、前記腫瘍を治療することを備えた方法。
【請求項４５】
患者の腫瘍を治療する方法であって、内皮前駆細胞上の特異的な受容体に対するアンタゴニストを前記患者に投与して、前記患者の腫瘍における血管新生を誘導する前記前駆細胞の能力を減弱せしめることにより、前記腫瘍を治療することを備えた方法。
【請求項４６】
前記受容体がＣＤ１１７である請求項５７又は５８の方法。
【請求項４７】
内皮前駆細胞又はマスト前駆細胞中に存在する目的の遺伝子を発現させる方法であって、ＧＡＴＡ−２モチーフを含有するプロモーターと前記目的の遺伝子とを含むベクターを前記細胞中に挿入することを備えた方法。
【請求項４８】
前記ベクターがトランスフェクションによって前記細胞中に挿入される請求項４７の方法。
【請求項４９】
前記プロモーターがプレプロエンドセリン−１プロモーターである請求項６２の方法。
【請求項５０】
前記プロモーターが哺乳動物起源である請求項６４の方法。
【請求項５１】
前記プロモーターがヒト起源である請求項６５の方法。
【請求項５２】
癌によって産生される特異的なケモカインのエピトープに対して誘導されたモノクローナル抗体であって、前記癌への内皮前駆細胞の輸送を低減させる効果を有する一定量のモノクローナル抗体と、薬学的に許容される担体とを備えた組成物。
【請求項５３】
患者の異常を治療する方法であって、
前記異常は、前記患者におけるＧＡＴＡ−２被活性化遺伝子産物の発現によって治療され、
（ａ）前記患者のある部位から幹細胞を採取することと、
（ｂ）工程（ａ）で採取した前記幹細胞から内皮前駆細胞を回収することと、  （ｃ）工程（ｂ）で採取した内皮前駆細胞の中からＧＡＴＡ−２を発現している内皮前駆細胞を回収することと、
（ｄ）工程（ｃ）でＧＡＴＡ−２を発現しているとして回収された前記細胞がＧＡＴＡ−２被活性化遺伝子産物を発現するように誘導することと、
（ｅ）前記患者の別の部位に、ＧＡＴＡ−２被活性化遺伝子産物を発現している工程（ｄ）で得られた前記細胞を導入して前記異常を治療することとを備えた方法。
【請求項５４】
患者の異常を治療する方法であって、
前記異常は、前記患者におけるＧＡＴＡ−２被活性化遺伝子産物の発現によって治療され、
（ａ）前記患者のある部位から幹細胞を採取することと、
（ｂ）工程（ａ）で採取した前記幹細胞からマスト前駆細胞を回収することと、
（ｃ）工程（ｂ）で採取したマスト前駆細胞の中からＧＡＴＡ−２を発現しているものを回収することと、
（ｄ）工程（ｃ）でＧＡＴＡ−２を発現しているとして回収された前記細胞がＧＡＴＡ−２被活性化遺伝子産物を発現するように誘導することと、
（ｅ）前記患者の別の部位に、ＧＡＴＡ−２被活性化遺伝子産物を発現している工程（ｄ）で得られた前記細胞を導入して前記異常を治療することとを備えた方法。
【請求項５５】
前記異常が虚血によって損傷を受けた組織である請求項５３又は５４の方法。
【請求項５６】
前記遺伝子産物がプロエンドセリンである請求項５３又は５４の方法。
【請求項５７】
前記遺伝子産物がエンドセリンである請求項５３又は５４の方法。
【請求項５８】
心筋梗塞に罹患した患者の心筋の機能を改善させる方法であって、
（ａ）前記患者中のある部位から幹細胞を採取することと、
（ｂ）前記幹細胞からＣＤ１１７を発現する細胞を回収することと、
（ｃ）前記細胞が前記患者の心筋の機能を改善するように、前記患者の異なる部位に前記回収した細胞を導入することとを備えた方法。
【請求項５９】
前記患者が哺乳動物起源である請求項４２、４３、４４又は４５の何れかに記載の方法。
【請求項６０】
前記哺乳動物がヒト起源である請求項５９の方法。
【請求項６１】
患者の虚血によって損傷を受けた組織における血管形成を刺激する方法であって、
（ａ）同種異系の幹細胞を取得することと、
（ｂ）工程（ａ）で採取した前記幹細胞から内皮前駆細胞を回収することと、  （ｃ）前記内皮前駆細胞が患者の虚血によって損傷を受けた前記組織における血管形成を刺激するように、工程（ｂ）で回収した前記内皮前駆細胞を前記患者に導入することとを備えた方法。
【請求項６２】
前記同種異系の幹細胞が、胚、胎児、又は臍帯血を起源として得られる請求項６１の方法。
【請求項６３】
患者の虚血によって損傷を受けた組織における血管新生を刺激する方法であって、
（ａ）同種異系の幹細胞を取得することと、
（ｂ）工程（ａ）で採取した前記幹細胞から内皮前駆細胞を回収することと、
（ｃ）前記内皮前駆細胞が患者の虚血によって損傷を受けた前記組織における血管新生を刺激するように、工程（ｂ）で回収した前記内皮前駆細胞を前記患者に導入することとを備えた方法。
【請求項６４】
前記同種異系の幹細胞が、胚、胎児、又は臍帯血を起源として得られる請求項６３の方法。
【請求項６５】
心筋梗塞に罹患した患者の心筋の機能を改善する方法であって、前記患者にＧ−ＣＳＦを注入して内皮前駆細胞を動員することを備えた方法。
【請求項６６】
心筋梗塞に罹患した患者の心筋の機能を改善する方法であって、前記患者に抗ＣＸＣＲ４抗体を注入することを備えた方法。
【請求項６７】
内皮前駆細胞を前記患者に導入することをさらに備えた請求項６６の方法。
【請求項６８】
前記患者にＧ−ＣＳＦを導入して内皮前駆細胞を動員することをさらに備えた請求項６７の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願は、２０００年６月５日に出願された米国特許出願第０９／５８７，４４１号の一部継続出願であり、その優先権を主張するものである。この親出願を、本明細書の一部として本願に援用する。
【０００２】
本出願を通じて、様々な文献が括弧内に引用されている。本発明が属する分野の技術水準をより完全に説明するために、本出願への参照によって、これらの文献全体の開示内容を援用する。これらの参照文献の完全な書誌的引用は、本明細書の末尾に記載されている。
【発明の背景】
【０００３】
心筋梗塞後の左心室の組織修復は、その後の心不全及び死亡の主原因である。毛細血管網は、肥大化しているが生存能力を有する心筋による要求の増加に追いつくことができず、心筋の死滅と繊維性置換が起こる。以下に記載されている本発明の第一群の実験は、成人の骨髄が胚血管芽細胞の表現型及び機能的な特徴を備えた内皮細胞前駆細胞を含有しており、これらの前駆細胞は動員、増殖させることが可能であって、実験的な心筋梗塞の後に、梗塞床（ｉｎｆａｒｃｔ  ｂｅｄ）への血管形成（ｖａｓｃｕｌｏｇｅｎｅｓｉｓ）を誘導するために使用できることを示している。新血管新生は、生存可能な心筋組織の有意且つ持続的な増加、コラーゲンの沈着の減少、及び心筋機能の改善をもたらす。単独で、又は現在用いられている療法と組合せて、サイトカインによって動員されたヒト骨髄由来の自家血管芽細胞を心筋梗塞組織の血行再建術のために使用すると、心筋梗塞後の左心室の組織修復に伴う罹患率及び死亡率が有意に減少する可能性がある。
【０００４】
狭い時間枠のうちに迅速な再潅流を行うと、急性心筋梗塞の初期死亡率が著しく減少するが、梗塞後の心不全が増加、多発する（１）。初期の梗塞部位の拡大、梗塞を取り囲む壁の厚さの漸減、及び左心室内腔の膨張を特徴とする心筋梗塞後の左心室の組織修復が、その後の心不全に対する主要な予後因子であることが明らかとされている（２、３）。このプロセスには、本来胎児の段階でしか発現されない遺伝子の転写、心臓の繊維芽細胞によるコラーゲン分泌の急速且つ進行性の増加、心室壁内への繊維組織の沈着、壁の硬さの増大、並びに弛緩期及び収縮期の両期における機能不全が伴う（４，５）。低酸素状態は心臓の繊維芽細胞によるコラーゲンの分泌を直接刺激するが、ＤＮＡ合成と細胞の増殖を抑制する（６）。動物モデルでは、実験的な心筋梗塞の後、心筋の撤去が終わった時点に遅延して再潅流を行うと、組織修復に極めて有益である（７）。さらに、梗塞に付随する開存性動脈の存在は、常に、梗塞後の期間におけるヒトの生存率の改善を伴う（８）。これは、心室の組織修復過程を改善し、壁の運動の異常な変化を抑制する梗塞血管床が十分に再潅流されることに起因するものと思われる（９）。
【０００５】
循環系の細胞因子又は骨髄由来の細胞因子のうち何れかを用いることによって、実験動物モデル中の虚血状態にした非心臓組織の再潅流を首尾よく行い得ることが最近実証された（１０−１３）。これらの研究では、これらの細胞の正確な性状は明らかにはされていないが、成人の循環系と骨髄の両者に、機能的な内皮細胞に分化する能力（血管形成と称されるプロセス（１４−１６））を有する前駆細胞が存在することが示されている。出生前期においては、ヒト及びヒトより下等な種の動脈の腹側内皮に由来する前駆細胞は、血管形成と血球新生の両プロセスに関与する細胞因子を生じることが示されている（１７、１８）。これらの細胞は、胚血管芽細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｈｅｍａｎｇｉｏｂｌａｓｔ）と名付けられ、ＣＤ３４、ＣＤ１１７（幹細胞因子受容体）、Ｆｌｋ−１（血管内皮細胞増殖因子受容体−２、ＶＥＧＦＲ−２）、及びＴｉｅ−２（アンジオポエチン受容体）の発現を特徴とし、ＶＥＧＦに反応して、芽細胞コロニーを形成する高い増殖能を有することが示された（１９−２２）。ＧＡＴＡ−２をノックアウトした胚幹細胞は、胎児の肝臓及び骨髄による終局的な造血（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｓｉｓ）及び造血の開始（ｓｅｅｄｉｎｇ）を完全に遮断するので（２３）、この後に生じる胚血管芽細胞の成人型多能性幹細胞への増殖及び分化には、ＧＡＴＡ−２転写因子の同時発現が関連しているものと思われる。さらに、胚腹側内皮（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｖｅｎｔｒａｌ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ）から分岐した造血及び内皮両細胞系列の最も初期の前駆体は、ＧＡＴＡ−２とα４−インテグリンに加え、ＶＥＧＦ受容体を発現していることが示された（２４）。本発明の第一群の実験は、成人の骨髄にもＧＡＴＡ−２陽性幹細胞前駆体が存在し、血管芽細胞の特性を表しており、血管形成を誘導するために使用することによって、実験的な心筋梗塞における組織修復と心不全を抑えることが可能であることを示している。
【０００６】
既存の成熟内皮から新しい血管が増殖することは血管新生（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）と称されており、ある種のＣＸＣケモカインを含む数多くの因子によって制御され得る（４７−５０）。これに対して、血管形成（ｖａｓｃｕｌｏｇｅｎｅｓｉｓ）は、胚血管芽細胞の表現型的特長と血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）等の受容体チロシンキナーゼによって制御される増殖／分化特性とを有する（５４−５７）骨髄由来の内皮前駆体（５１−５３）によって媒介される。治療的血管形成（５８−６１）は虚血性組織の潅流を改善させ得る能力を有するが、組織虚血の部位への内皮前駆体の選択的輸送に関与する受容体／リガンド相互作用は不明である。以下に記載されている本発明の第二群の実験は、ヒト骨髄由来の血管芽細胞上のＣＸＣ受容体とＩＬ−８及びＧｒｏ−αを含む虚血によって誘導されるＥＬＲ陽性ＣＸＣケモカインとの相互作用の結果、梗塞を起こした心筋中に血管形成が生じ得ることを示している。さらに、ＣＸＣＲ４／ＳＤＦ−１相互作用を遮断することによって、血管芽細胞を骨髄から虚血性心筋へと再誘導して輸送させることが可能となり、血管形成の増加、心筋細胞の死滅と繊維性置換（ｆｉｂｒｏｕｓ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）の減少、及び心機能の改善がもたらされる。前記実験の結果は、ＩＬ−８、Ｇｒｏ−α、及び間質由来因子−１（ＳＤＦ−１、ｓｔｒｏｍａｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆａｃｔｏｒ−１）を含むＣＸＣケモカインが成人での血管形成を制御する上で中心的な役割を果たしていることを示しており、ＣＸＣケモカインと骨髄由来の血管芽細胞上に存在するそれらの受容体との相互作用を操作すると、最適な治療的血管形成及び虚血性組織の撤去（ｓａｌｖａｇｅ）をもたらし得ることを示唆している。以下に記載されている第三群の実験は、血管芽細胞の虚血性心筋への化学走性（ｃｈｅｍｏｔａｘｉｓ）を媒介する上でもＣＣケモカインが役割を果たしていることを示している。
【０００７】
創傷治癒又は炎症中の血管新生反応は、既存の脈間構造中の内皮細胞と局所的に産生された因子によって調節される細胞外マトリックスとの接着性相互作用の変化に起因し、これによって、内皮細胞の移動、増殖、再構築、及び微小血管の形成が生じる（７０）ものと考えられている。ヒトＣＸＣケモカインファミリーは、内皮細胞に結合し、該細胞に対する強力な化学走性活性を有する小さな（＜１０ｋＤ）ヘパリン結合ポリペプチドからなる。Ｎ末端の３つのアミノ酸残基（Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ、ＥＬＲモチーフ）は、内皮細胞上に存在するＣＸＣ受容体１及び２へのＩＬ−８及びＧｒｏ−αなどのＣＸＣケモカインの結合を決定して（４９、７１）、内皮の化学走性と血管新生を促進する（４７−４８）。これに対して、ＥＬＲモチーフを欠如するＣＸＣケモカインは異なるＣＸＣ受容体に結合し、増殖因子によって媒介される血管新生を阻害する（４９−７２）。ＳＤＦ−１（ＥＬＲ陰性のＣＸＣケモカイン）は、ＣＸＣＲ４との相互作用を介した内皮の化学走性の強力な誘導物質であるが（７３）、ＳＤＦ−１の血管新生効果は、発育中の消化管の血管系に限定されるようである（５０）。
【０００８】
血管形成は、まず出生前期の間に起こり、ヒトの腹側大動脈由来の血管芽細胞が内皮性及び造血性の両細胞因子を生じる（７４、７５）。近年、成人の骨髄中にも、同様の内皮前駆細胞が同定されており（５１−５３）、虚血性組織中での血管形成を誘導する能力を有することが示されている（５９−６１）。しかしながら、このような骨髄由来の前駆体の化学遊走（ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔｉｏｎ）に必要とされる虚血性部位からのシグナル、及びこれらの部位への選択的輸送（ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ）のためにこれらの細胞によって使用される受容体は不明である。心筋梗塞の後には、新血管新生（ｎｅｏａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）プロセスが起こる（６２、６３）が、代償性の肥大が生じている生存可能な組織を維持するには不十分であって、さらなる細胞死、最初の梗塞領域の拡大、及びコラーゲン置換をもたらす（６４−６６）。組織修復（ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ）と称されるこのプロセスは、進行性の心不全をもたらす（６７−６９）。以下に記載されている実験では、ＥＬＲモチーフを含有するＣＸＣケモカインがヒト骨髄由来血管芽細胞の組織虚血部位への遊走（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）を制御するかどうかを調べるために、心筋梗塞のヌードラットモデルを使用した。さらに、選択的な骨髄のホーミングと造血性前駆体の移植は、骨髄の中に恒常的に発現されているＳＤＦ−１へのＣＸＣＲ４の結合に依存するので（７６−７８）、ＣＸＣＲ４／ＳＤＦ−１相互作用の阻害が、組織虚血部位へのヒト骨髄由来血管芽細胞の輸送を再誘導することによって、治療的血管形成を増強できるかどうかを調べた。該実験の結果は、ＩＬ−８、Ｇｒｏ−α、及びＳＤＦ−１を含むＣＸＣケモカインが成人の骨髄依存性血管形成を制御する上で中心的な役割を果たしていることを示している。さらに、以下に記載されている第四群の実験は、幹細胞が梗塞周囲の組織に血管新生を誘導することができることを示している。
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、虚血によって損傷を受けた患者の組織における血管形成を刺激する方法であって、
（ａ）前記患者のある部位から幹細胞を採取することと、
（ｂ）工程（ａ）で採取した前記幹細胞から内皮前駆細胞を回収することと、  （ｃ）患者の虚血によって損傷を受けた前記組織における血管形成を前記内皮前駆細胞が刺激するように、工程（ｂ）で得た前記内皮前駆細胞を前記患者の別の部位に導入することとを備えた方法を提供する。
【００１０】
本発明は、工程（ｂ）の後であり且つ工程（ｃ）の前に、前記内皮前駆細胞を増殖因子（ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）と接触させることによって、前記内皮前駆細胞を増殖させる前出の方法も提供する。
【００１１】
本発明は、前記増殖因子がサイトカインである前出の方法も提供する。
【００１２】
本発明は、前記サイトカインがＶＥＧＦ、ＦＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＧＦ、Ｍ−ＣＳＦ、又はＧＭ−ＣＳＦである前出の方法も提供する。
【００１３】
本発明は、前記増殖因子がケモカインである前出の方法も提供する。
【００１４】
本発明は、前記ケモカインがインターロイキン−８である前出の方法も提供する。
【００１５】
本発明は、前記内皮前駆細胞が、増殖（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）の前に、他の幹細胞から分離される前出の方法も提供する。
【００１６】
本発明は、前記虚血によって損傷を受けた組織が心筋である前出の方法も提供する。
【００１７】
本発明は、前記虚血によって損傷を受けた組織が神経系組織である前出の方法も提供する。
【００１８】
本発明は、前記幹細胞が前記患者の骨髄から採取される前出の方法も提供する。
【００１９】
本発明は、前記骨髄からの前記幹細胞の採取が、前記患者の骨髄からの吸引によって為される前出の方法も提供する。
【００２０】
本発明は、前記患者からの前記幹細胞の採取が、
（ａ）前記患者に増殖因子を導入して、前記幹細胞を前記患者の血液中に動員する（ｍｏｂｉｌｉｚｅ）ことと、
（ｂ）前記幹細胞を含有する血液の試料を前記患者から採取することと
を備えた方法によって為される前出の方法も提供する。
【００２１】
本発明は、前記増殖因子が、皮下、経口、静脈内、又は筋肉内から患者に導入される前出の方法も提供する。
【００２２】
本発明は、前記増殖因子が動員を誘導するケモカインである前出の方法も提供する。
【００２３】
本発明は、前記ケモカインがインターロイキン−８である前出の方法も提供する。
【００２４】
本発明は、前記増殖因子がサイトカインである前出の方法も提供する。
【００２５】
本発明は、前記サイトカインがＧ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、又はＧＭ−ＣＳＦである前出の方法も提供する。
【００２６】
本発明は、前記内皮前駆細胞が、ＣＤ１１７の発現に基づいて回収される前出の方法も提供する。
【００２７】
本発明は、前記内皮前駆細胞が、ＧＡＴＡ−２被活性化遺伝子産物の発現に基づいて回収される前出の方法も提供する。
【００２８】
本発明は、前記内皮前駆細胞が、ＣＤ３４、ＶＥＧＦ−Ｒ、Ｔｉｅ−２，ＧＡＴＡ−３、又はＡＣ１３３のうちの１以上の発現に基づいて回収される前出の方法も提供する。
【００２９】
本発明は、前記患者が、以下のうちの１以上：心筋梗塞、慢性心不全、虚血性心疾患、冠動脈疾患、糖尿病性心疾患、出血性卒中、血栓性卒中、塞栓性卒中、虚血肢（ｌｉｍｂ  ｉｓｃｈｅｍｉａ）、又は組織が虚血になるその他の疾病に罹患したことがある、又は罹患している前出の方法も提供する。
【００３０】
本発明は、前記患者が虚血によって損傷を受けた組織を患う前に工程（ａ）が行われ、前記患者が虚血によって損傷を受けた組織を患った後に工程（ｃ）が行われる前出の方法も提供する。
【００３１】
本発明は、工程（ｂ）と（ｃ）の間の一期間に、前記内皮前駆細胞が凍結される前出の方法も提供する。
【００３２】
本発明は、増殖された後であり且つ工程（ｃ）が行われる前の一期間に、前記内皮前駆細胞が凍結される前出の方法も提供する。
【００３３】
本発明は、末梢循環、心筋、左心室、右心室、冠動脈、脳脊髄液、神経組織、虚血性組織、又は虚血後組織中に直接注入することによって、前記内皮前駆細胞が前記患者に導入される前出の方法も提供する。
【００３４】
本発明は、以下のもの：プラスミノーゲン活性化因子阻害剤の阻害剤、アンギオテンシン変換酵素阻害剤、又はβ−遮断薬のうちの１以上を前記患者に投与することをさらに備え、工程（ｃ）の前、同時、又は後に、このような投与を行う前出の方法も提供する。
【００３５】
本発明は、患者の梗塞周囲組織における血管新生を刺激する方法であって、  （ａ）患者のある部位から幹細胞を採取することと、
（ｂ）工程（ａ）で採取した前記幹細胞から内皮前駆細胞を回収することと、  （ｃ）前記前駆細胞を増殖因子と接触させることによって、工程（ｂ）で回収した前記内皮前駆細胞を増殖させることと、
（ｄ）前記患者の梗塞周囲組織における血管新生を前記内皮前駆細胞が刺激するように、工程（ｃ）で得た増殖した前記内皮前駆細胞を前記患者の別の部位に導入することとを備えた前出の方法も提供する。
【００３６】
本発明は、虚血によって損傷を受けた患者の組織への内皮前駆細胞の輸送を選択的に増加させる方法であって、
（ａ）内皮前駆細胞を患者に投与することと、
（ｂ）ケモカインを前記患者に投与することによって、前記虚血によって損傷を受けた組織に前記内皮前駆細胞を誘引することを備えた前出の方法も提供する。
【００３７】
本発明は、前記内皮前駆細胞を投与する前に、前記ケモカインが前記患者に投与される前出の方法も提供する。
【００３８】
本発明は、前記内皮前駆細胞と同時に、前記ケモカインが前記患者に投与される前出の方法も提供する。
【００３９】
本発明は、前記内皮前駆細胞を投与した後に、前記ケモカインが前記患者に投与される前出の方法も提供する。
【００４０】
本発明は、前記ケモカインがＣＸＣケモカインである前出の方法も提供する。
【００４１】
本発明は、前記ＣＸＣケモカインがインターロイキン−８、Ｇｒｏ−α、又は間質由来因子−１からなる群から選択される前出の方法も提供する。
【００４２】
本発明は、前記ケモカインがＣＣケモカインである前出の方法も提供する。
【００４３】
前記ＣＣケモカインがＲＡＮＴＥＳ、ＥＯＴＡＸＩＮ、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、又はＭＣＰ−４からなる群から選択される請求項３４の方法。
【００４４】
本発明は、前記患者の末梢循環、心筋、左心室、右心室、冠動脈、脳脊髄液、神経組織、虚血性組織、又は虚血後組織への注入（ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）によって、前記ケモカインが前記患者に投与される前出の方法も提供する。
【００４５】
本発明は、患者の中の虚血によって損傷を受けた組織への内皮前駆細胞の輸送を増加させる方法であって、間質由来因子−１とＣＸＣＲ４との何らかの相互作用を阻害することを備えた方法も提供する。
【００４６】
本発明は、間質由来因子−１（ＳＤＦ−１）とＣＸＣＲ４との相互作用が、前記患者に抗ＳＤＦ−１又は抗ＣＸＣＲ４モノクローナル抗体を投与することによって阻害される前出の方法も提供する。
【００４７】
本発明は、アンギオテンシン変換酵素阻害剤、ＡＴ１−受容体遮断薬、又はβ遮断薬を前記患者に投与することをさらに備えた前出の方法も提供する。
【００４８】
本発明は、患者の骨髄への内皮前駆細胞の輸送を減少させる方法であって、前記患者の骨髄での間質由来因子−１の産生を阻害することを備えた方法も提供する。
【００４９】
本発明は、ＳＤＦ−１の産生が、患者に抗ＳＤＦ−１又は抗ＣＸＣＲ４モノクローナル抗体を投与することによって阻害される前出の方法も提供する。
【００５０】
本発明は、患者の癌を治療する方法であって、前記癌に関連して増殖している細胞によって産生された特異的ケモカインのエピトープに対して誘導されたモノクローナル抗体を患者に投与して、このような増殖している細胞への内皮前駆細胞の輸送を減少させ、それにより前記患者の前記癌を治療することを備えた方法も提供する。
【００５１】
本発明は、患者の癌を治療する方法であって、前記癌に伴って増殖している細胞によって産生されたケモカインに対する特異的受容体であり、内皮前駆細胞上に位置する特異的受容体のエピトープに対して誘導されたモノクローナル抗体を患者に投与して、このような増殖細胞への内皮前駆細胞の輸送を減少させることにより前記患者の前記癌を治療することを備えた方法も提供する。
【００５２】
本発明は、患者の腫瘍を治療する方法であって、内皮前駆細胞上の特異的な受容体に対するアンタゴニストを前記患者に投与して、前記患者の腫瘍における血管形成を誘導する前記前駆細胞の能力を減弱せしめることにより、前記腫瘍を治療することを備えた方法も提供する。
【００５３】
本発明は、患者の腫瘍を治療する方法であって、内皮前駆細胞上の特異的な受容体に対するアンタゴニストを前記患者に投与して、前記患者の腫瘍における血管新生を誘導する前記前駆細胞の能力を減弱せしめることにより、前記腫瘍を治療することを備えた方法も提供する。
【００５４】
本発明は、前記受容体がＣＤ１１７受容体である前出の方法も提供する。
【００５５】
本発明は、内皮前駆細胞又はマスト前駆細胞中の目的の遺伝子を発現させる方法であって、ＧＡＴＡ−２モチーフを含有するプロモーターと前記目的の遺伝子とを含むベクターを前記細胞中に挿入することを備えた方法も提供する。
【００５６】
本発明は、前記ベクターがトランスフェクションによって前記細胞中に挿入される前出の方法も提供する。
【００５７】
本発明は、前記プロモーターがプレプロエンドセリン−１プロモーターである前出の方法も提供する。
【００５８】
本発明は、前記プロモーターが哺乳動物起源である前出の方法も提供する。
【００５９】
本発明は、前記プロモーターがヒト起源である前出の方法も提供する。
【００６０】
本発明は、癌によって産生される特異的なケモカインのエピトープに対して誘導されたモノクローナル抗体であって、前記癌への内皮前駆細胞の輸送を低減させるのに有効な一定量のモノクローナル抗体と、薬学的に許容される担体とを備えた組成物を提供する。
【００６１】
本発明は、患者の異常を治療する方法であって、
前記異常は、前記患者におけるＧＡＴＡ−２被活性化遺伝子産物の発現によって治療され、
（ａ）前記患者のある部位から幹細胞を採取することと、
（ｂ）工程（ａ）で採取した前記幹細胞から内皮前駆細胞を回収することと、  （ｃ）工程（ｂ）で回収した内皮前駆細胞の中からＧＡＴＡ−２を発現している内皮前駆細胞を回収することと、
（ｄ）ＧＡＴＡ−２を発現しているとして工程（ｃ）で回収された前記細胞がＧＡＴＡ−２被活性化遺伝子産物を発現するように誘導することと、
（ｅ）前記患者の別の部位に、ＧＡＴＡ−２被活性化遺伝子産物を発現している工程（ｄ）で得られた前記細胞を導入して前記異常を治療することとを備えた方法を提供する。
【００６２】
本発明は、患者の異常を治療する方法であって、
前記異常は、前記患者におけるＧＡＴＡ−２被活性化遺伝子産物の発現によって治療され、
（ａ）前記患者のある部位から幹細胞を採取することと、
（ｂ）工程（ａ）で採取した前記幹細胞からマスト前駆細胞を回収することと、
（ｃ）工程（ｂ）で回収したマスト前駆細胞の中からＧＡＴＡ−２を発現しているマスト前駆細胞を回収することと、
（ｄ）ＧＡＴＡ−２を発現しているとして工程（ｃ）で回収された前記細胞がＧＡＴＡ−２被活性化遺伝子産物を発現するように誘導することと、
（ｅ）前記患者の別の部位に、ＧＡＴＡ−２被活性化遺伝子産物を発現している工程（ｄ）で得られた前記細胞を導入して前記異常を治療することとを備えた方法を提供する。
【００６３】
本発明は、前記異常が虚血によって損傷を受けた組織である前記方法を提供する。
【００６４】
本発明は、前記遺伝子産物がプロエンドセリンである前記方法を提供する。
【００６５】
本発明は、前記遺伝子産物がエンドセリンである前記方法を提供する。
【００６６】
本発明は、心筋梗塞に罹患した患者の心筋の機能を改善させる方法であって、  （ａ）前記患者のある部位から幹細胞を採取することと、
（ｂ）前記幹細胞からＣＤ１１７を発現する細胞を回収することと、
（ｃ）前記細胞が前記患者の心筋の機能を改善するように、前記患者の異なる部位に前記回収した細胞を導入することとを備えた方法を提供する。
【００６７】
本発明は、前記患者が哺乳動物起源である前記方法を提供する。
【００６８】
本発明は、前記哺乳動物がヒト起源である前記方法を提供する。
【００６９】
本発明は、患者の虚血によって損傷を受けた組織における血管形成を刺激する方法であって、
（ａ）同種異系（ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ）の幹細胞を取得することと、
（ｂ）工程（ａ）で採取した前記幹細胞から内皮前駆細胞を回収することと、  （ｃ）前記内皮前駆細胞が虚血によって損傷を受けた患者の前記組織における血管形成を刺激するように、工程（ｂ）で回収した前記内皮前駆細胞を前記患者に導入することとを備えた方法も提供する。
【００７０】
本発明は、前記同種異系の幹細胞が、胚、胎児、又は臍帯血を起源として取得される前記方法を提供する。
【００７１】
本発明は、患者の虚血によって損傷を受けた組織における血管新生を刺激する方法であって、
（ａ）同種異系の幹細胞を取得することと、
（ｂ）工程（ａ）で採取した前記幹細胞中の内皮前駆細胞を回収することと、  （ｃ）前記内皮前駆細胞が虚血によって損傷を受けた患者の前記組織における血管新生を刺激するように、工程（ｂ）で回収した前記内皮前駆細胞を前記患者に導入することとを備えた方法を提供する。
【００７２】
本発明は、前記同種異系の幹細胞が、胚、胎児、又は臍帯血を起源として取得される前記方法を提供する。
【００７３】
本発明は、心筋梗塞に罹患した患者の心筋の機能を改善する方法であって、前記患者にＧ−ＣＳＦを注入して内皮前駆細胞を動員することを備えた方法も提供する。
【００７４】
本発明は、心筋梗塞に罹患した患者の心筋の機能を改善する方法であって、前記患者に抗ＣＸＣＲ４抗体を注入することを備えた方法も提供する。
【００７５】
本発明は、内皮前駆細胞を前記患者に導入することをさらに備えた前出の方法も提供する。
【００７６】
本発明は、前記患者にＧ−ＣＳＦを導入して内皮前駆細胞を動員することをさらに備えた前出の方法も提供する。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１Ａ】Ｇ−ＣＳＦはＶＥＧＦ受容体を発現する２つのヒト骨髄由来の集団を動員する１つは成熟した内皮細胞の特性を備えたものであり、もう１つは胚血管芽細胞の特性を備えたものである。
【００７８】
Ａ〜Ｄは、代表的なドナー成人から白血球フェレーシス（ｌｅｕｃｏｐｈａｒｅｓｉｓ）によって採取され、Ｇ−ＣＳＦによって動員された骨髄由来の細胞の４パラメーターフローサイトメトリーによる表現型のキャラクタリゼーションを示す（２５）。生細胞（７−ＡＡＤ染色によって判定する）のみを分析した。使用した各マーカーにおいて、陰影付きの部分は、アイソタイプ対照抗体に対するバックグラウンドの蛍光の対数を表す。
【００７９】
Ａ．単核細胞の免疫選択後（２５）、９５％を超える生細胞がＣＤ３４を発現する。
【図１Ｂ】Ｇ−ＣＳＦはＶＥＧＦ受容体を発現する２つのヒト骨髄由来の集団を動員する１つは成熟した内皮細胞の特性を備えたものであり、もう１つは胚血管芽細胞の特性を備えたものである。
【００８０】
Ａ〜Ｄは、代表的なドナー成人から白血球フェレーシス（ｌｅｕｃｏｐｈａｒｅｓｉｓ）によって採取され、Ｇ−ＣＳＦによって動員された骨髄由来の細胞の４パラメーターフローサイトメトリーによる表現型のキャラクタリゼーションを示す（２５）。生細胞（７−ＡＡＤ染色によって判定する）のみを分析した。使用した各マーカーにおいて、陰影付きの部分は、アイソタイプ対照抗体に対するバックグラウンドの蛍光の対数を表す。
【００８１】
Ｂ．ＣＤ３４＋ＣＤ１１７ｄｉｍのサブセットは、成熟した血管内皮の表現型特性を備える集団を含んでいる。
【図１Ｃ】Ｇ−ＣＳＦはＶＥＧＦ受容体を発現する２つのヒト骨髄由来の集団を動員する１つは成熟した内皮細胞の特性を備えたものであり、もう１つは胚血管芽細胞の特性を備えたものである。
【００８２】
Ａ〜Ｄは、代表的なドナー成人から白血球フェレーシス（ｌｅｕｃｏｐｈａｒｅｓｉｓ）によって採取され、Ｇ−ＣＳＦによって動員された骨髄由来の細胞の４パラメーターフローサイトメトリーによる表現型のキャラクタリゼーションを示す（２５）。生細胞（７−ＡＡＤ染色によって判定する）のみを分析した。使用した各マーカーにおいて、陰影付きの部分は、アイソタイプ対照抗体に対するバックグラウンドの蛍光の対数を表す。
【００８３】
Ｃ．ＣＤ３４＋ＣＤ１１７ｂｒｉｇｈｔのサブセットは、マウス及びヒトの胚形成が急激に進行する間に生ずる初期の血管芽細胞に特徴的なマーカーを発現する集団を含んでいる。
【図１Ｄ】Ｇ−ＣＳＦはＶＥＧＦ受容体を発現する２つのヒト骨髄由来の集団を動員する１つは成熟した内皮細胞の特性を備えたものであり、もう１つは胚血管芽細胞の特性を備えたものである。
【００８４】
Ａ〜Ｄは、代表的なドナー成人から白血球フェレーシス（ｌｅｕｃｏｐｈａｒｅｓｉｓ）によって採取され、Ｇ−ＣＳＦによって動員された骨髄由来の細胞の４パラメーターフローサイトメトリーによる表現型のキャラクタリゼーションを示す（２５）。生細胞（７−ＡＡＤ染色によって判定する）のみを分析した。使用した各マーカーにおいて、陰影付きの部分は、アイソタイプ対照抗体に対するバックグラウンドの蛍光の対数を表す。
【００８５】
Ｄ．ＧＡＴＡ−２とＧＡＴＡ−３を同時発現するＣＤ３４＋ＣＤ１１７ｂｒｉｇｈｔ細胞は、血管芽細胞となり得る造血細胞を規定する別のマーカーであるＡＣ１３３も発現する。
【図２Ａ】骨髄由来の血管芽細胞（ＢＡ）は、骨髄由来の内皮細胞（ＢＭＥＣ）よりも、ＶＥＧＦと虚血の血清の両者に応答してより大きな増殖活性を有する。
【００８６】
図示されているのは、蛍光ＧＡＴＡ−２ｍＡｂによって選別され、２０％の正常なラットの血清、虚血ラットの血清、又は２０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦを含むＲＰＭＩ培地内で９６時間培養された単一ドナーのＣＤ３４陽性ヒト細胞の応答である。ＣＤ１１７ｂｒｉｇｈｔＧＡＴＡ−2ｐｏｓ細胞及びＣＤ１１７ｄｉｍＧＡＴＡ−2ｎｅｇ細胞の数は、［３Ｈ］チミジン取込み及びフローサイトメトリーの両者で定量化した。
【００８７】
Ａ．正常血清における培養と比較して、ＶＥＧＦ又は虚血の血清に対する増殖応答は、ＣＤ１１７ｂｒｉｇｈｔＧＡＴＡ−2ｐｏｓＢＡが同一ドナーのＣＤ１１７ｄｉｍＧＡＴＡ−2ｎｅｇＢＭＥＣに比べて著しく高かった（共にＰ＜０．０１）。
【図２Ｂ】骨髄由来の血管芽細胞（ＢＡ）は、骨髄由来の内皮細胞（ＢＭＥＣ）よりも、ＶＥＧＦと虚血の血清の両者に応答してより大きな増殖活性を有する。
【００８８】
図示されているのは、蛍光ＧＡＴＡ−２ｍＡｂによって選別され、２０％の正常なラットの血清、虚血ラットの血清、又は２０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦを含むＲＰＭＩ培地内で９６時間培養された単一ドナーのＣＤ３４陽性ヒト細胞の応答である。ＣＤ１１７ｂｒｉｇｈｔＧＡＴＡ−2ｐｏｓ細胞及びＣＤ１１７ｄｉｍＧＡＴＡ−2ｎｅｇ細胞の数は、［３Ｈ］チミジン取込み及びフローサイトメトリーの両者で定量化した。
【００８９】
Ｂ．ＶＥＧＦ又は虚血の血清の何れかを用いた培養によって増殖し、多パラメーターのフローサイトメトリー分析によってＣＤ１１７ｂｒｉｇｈｔＧＡＴＡ−2ｐｏｓとして特徴付けられる集団は、高い前方散乱（ｆｓｃ）によって示されるように大きな芽細胞からなっていた。
【図２Ｃ】骨髄由来の血管芽細胞（ＢＡ）は、骨髄由来の内皮細胞（ＢＭＥＣ）よりも、ＶＥＧＦと虚血の血清の両者に応答してより大きな増殖活性を有する。
【００９０】
図示されているのは、蛍光ＧＡＴＡ−２ｍＡｂによって選別され、２０％の正常なラットの血清、虚血ラットの血清、又は２０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦを含むＲＰＭＩ培地内で９６時間培養された単一ドナーのＣＤ３４陽性ヒト細胞の応答である。ＣＤ１１７ｂｒｉｇｈｔＧＡＴＡ−2ｐｏｓ細胞及びＣＤ１１７ｄｉｍＧＡＴＡ−2ｎｅｇ細胞の数は、［３Ｈ］チミジン取込み及びフローサイトメトリーの両者で定量化した。
【００９１】
Ｃ．ＣＤ１１７ｂｒｉｇｈｔＧＡＴＡ−2ｐｏｓ細胞の増殖した集団では、正常な培地を用いた培養に比べ、ＶＥＧＦを用いた培養後での成熟内皮細胞のマーカーの表面発現が増加せず、分化のない芽細胞増殖が示唆された。
【図３Ａ】高度に精製されたヒト骨髄由来ＣＤ３４細胞は、インビトロでの培養後に内皮細胞に分化する。
【００９２】
高度に精製されたＣＤ３４＋ヒト細胞を７日間内皮増殖培地中で培養すると、成熟した内皮細胞単層の形態的かつ独特な特徴を有する細胞が成長することになる。単層の大部分（＞９０％）が、
Ａ．細胞の増殖及び成長の過増殖による玉石模様、
【図３Ｂ】高度に精製されたヒト骨髄由来ＣＤ３４細胞は、インビトロでの培養後に内皮細胞に分化する。
【００９３】
高度に精製されたＣＤ３４＋ヒト細胞を７日間内皮増殖培地中で培養すると、成熟した内皮細胞単層の形態的かつ独特な特徴を有する細胞が成長することになる。単層の大部分（＞９０％）が、
Ｂ．ＤｉＩ標識されたアセチル化ＬＤＬの均一な取込み、
【図３Ｃ】高度に精製されたヒト骨髄由来ＣＤ３４細胞は、インビトロでの培養後に内皮細胞に分化する。
【００９４】
高度に精製されたＣＤ３４＋ヒト細胞を７日間内皮増殖培地中で培養すると、成熟した内皮細胞単層の形態的かつ独特な特徴を有する細胞が成長することになる。単層の大部分（＞９０％）が、
Ｃ．フルオレセインと複合されたｍＡｂを用いた免疫蛍光法によって測定したＣＤ３４の発現、
【図３Ｄ】高度に精製されたヒト骨髄由来ＣＤ３４細胞は、インビトロでの培養後に内皮細胞に分化する。
【００９５】
高度に精製されたＣＤ３４＋ヒト細胞を７日間内皮増殖培地中で培養すると、成熟した内皮細胞単層の形態的かつ独特な特徴を有する細胞が成長することになる。単層の大部分（＞９０％）が、
Ｄ．ビオチンと複合されたｍＡｂを用いた免疫ペルオキシダーゼ法によって測定した第ＶＩＩＩ因子の発現、及び
【図３Ｅ】高度に精製されたヒト骨髄由来ＣＤ３４細胞は、インビトロでの培養後に内皮細胞に分化する。
【００９６】
高度に精製されたＣＤ３４＋ヒト細胞を７日間内皮増殖培地中で培養すると、成熟した内皮細胞単層の形態的かつ独特な特徴を有する細胞が成長することになる。単層の大部分（＞９０％）が、
Ｅ．特異的プローブを用いたインサイチューハイブリダイゼーションによって決定されるｅＮＯＳの発現、を示す。
【図４−１】心筋虚血誘導後の骨髄及び末梢血管由来のヒト細胞のインビボでの遊走特性及び増殖特性  Ａ〜Ｃ．ＤｉＩ標識されたヒトＣＤ３４を豊富に含む２×１０６の細胞（ＣＤ３４純度＞９５％）、２×１０６のＣＤ３４陰性細胞（ＣＤ３４純度＜５％）、又は２×１０６の伏在静脈内皮細胞（ＳＶＥＣ）を、冠動脈結紮及び梗塞後のヌードラットに静脈内注入。各ヒト細胞集団は、４８時間で、梗塞されたラットの心筋内にほぼ同程度の浸潤を起こした。
【００９７】
Ｄ．非梗塞ラットの心臓内にヒト細胞が見られない擬似処置
【図４−２】心筋虚血誘導後の骨髄及び末梢血管由来のヒト細胞のインビボでの遊走特性及び増殖特性  Ｅ．ＣＤ３４陽性細胞（ＣＤ３４純度＞９５％）又はＣＤ３４陰性細胞（ＣＤ３４純度＜５％）の何れかを与えた梗塞ラットの骨髄及び心臓におけるヒトＧＡＴＡ−２のｍＲＮＡ発現の測定（ＧＡＰＤＨの発現によって測定した全ヒトＲＮＡに対して規格化した）。虚血組織内のＧＡＴＡ−２ｍＲＮＡを、虚血のない同一実験条件下で存在するＧＡＴＡ−２ｍＲＮＡに対する増加倍数として表す。ＣＤ３４＋又はＣＤ３４−の何れかの細胞を注入した虚血ラットの骨髄は、ほぼ同じレベルのヒトＧＡＴＡ−２ｍＲＮＡを含有し、虚血後のＧＡＴＡ−２ｍＲＮＡ発現においてほぼ同じ倍率の誘導を示した。これに対して、ＣＤ３４＋細胞を注入したラットの虚血した心臓は、ＣＤ３４−細胞を注入したものよりも極めて高いレベルのヒトＧＡＴＡ−２ｍＲＮＡを含有していた。さらに、梗塞後のＧＡＴＡ−２ｍＲＮＡの発現の増加率は、ＣＤ３４−細胞と比較して、ＣＤ３４＋細胞が浸潤した心臓の方が２．６倍高く、ＣＤ３４＋フラクション内のＧＡＴＡ２＋細胞が虚血心筋内に選択的に輸送されることが示唆された。
【図４−３】心筋虚血誘導後の骨髄及び末梢血管由来のヒト細胞のインビボでの遊走特性及び増殖特性Ｆ．ヒトＣＤ３４＋細胞を注入してから２週後のヌードラットの梗塞床内にある血管の連続断面。この血管は、ＤｉＩの同時発現によって規定されるヒト内皮細胞、フルオレセイン複合ｍＡｂを用いた免疫蛍光法によって測定されるＨＬＡ  ｃｌａｓｓ  Ｉ、及びビオチン複合ｍＡｂを用いた免疫ペルオキシダーゼ法によって測定される第ＶＩＩＩ因子を取り込む。
【図５Ａ】Ｇ−ＣＳＦに動員されたヒトＣＤ３４＋細胞を急性梗塞のラットに注入すると、心筋機能が向上する。
【００９８】
Ａ〜Ｄは、Ｇ−ＣＳＦに動員された２×１０６のヒトＣＤ３４＋（純度＞９５％）細胞、ＣＤ３４−（純度＜５％）細胞、末梢伏在静脈の細胞、又は生理食塩水を梗塞ラットの心筋へ注入することの機能上の効果を比較したものである。  Ａ．左心室駆出率（ＬＶＥＦ）は、レシピエントの各グループにおいてＬＡＤ結紮後に極度に低下したが、Ｇ−ＣＳＦによって動員された成人のＣＤ３４＋細胞の注入のみが、ＬＶＥＦの有意かつ持続的な回復を伴った（ｐ＜０．００１）。ＬＶＥＦの回復は、ＬＡＤ結紮後のＬＶＥＦと梗塞前のＬＶＥＦとの平均改善％として計算した。
【図５Ｂ】Ｇ−ＣＳＦに動員されたヒトＣＤ３４＋細胞を急性梗塞のラットに注入すると、心筋機能が向上する。
【００９９】
Ａ〜Ｄは、Ｇ−ＣＳＦに動員された２×１０６のヒトＣＤ３４＋（純度＞９５％）細胞、ＣＤ３４−（純度＜５％）細胞、末梢伏在静脈の細胞、又は生理食塩水を梗塞ラットの心筋へ注入することの機能上の効果を比較したものである。  Ｂ．同様に、左心室収縮末期の面積（ＬＶＡｓ）は、レシピエントの各グループにおいてＬＡＤ結紮後に著しく増加したが、Ｇ−ＣＳＦによって動員された成人のＣＤ３４＋細胞の注入のみが、ＬＶＡｓの有意かつ持続的な減少を伴った（ｐ＜０．００１）。ＬＶＡｓの減少は、ＬＡＤ結紮後のＬＶＡｓと梗塞前のＬＶＡｓとの平均改善％として計算した。
【図５Ｃ】Ｇ−ＣＳＦに動員されたヒトＣＤ３４＋細胞を急性梗塞のラットに注入すると、心筋機能が向上する。
【０１００】
Ａ〜Ｄは、Ｇ−ＣＳＦに動員された２×１０６のヒトＣＤ３４＋（純度＞９５％）細胞、ＣＤ３４−（純度＜５％）細胞、末梢伏在静脈の細胞、又は生理食塩水を梗塞ラットの心筋へ注入することの機能上の効果を比較したものである。  Ｃ．各グループの代表的な心臓エコー検査の例を示す。ＬＡＤ結紮後４８時間で弛緩期の機能が各ラットにおいて極度に損なわれる。注入後２週では、弛緩期の機能はＣＤ３４＋細胞を注入したラットにおいてのみ改善する。この効果は１５週の時点で持続している。
【図５Ｄ】Ｇ−ＣＳＦに動員されたヒトＣＤ３４＋細胞を急性梗塞のラットに注入すると、心筋機能が向上する。
【０１０１】
Ａ〜Ｄは、Ｇ−ＣＳＦに動員された２×１０６のヒトＣＤ３４＋（純度＞９５％）細胞、ＣＤ３４−（純度＜５％）細胞、末梢伏在静脈の細胞、又は生理食塩水を梗塞ラットの心筋へ注入することの機能上の効果を比較したものである。  Ｄ．梗塞後１５週では、ＣＤ３４＋細胞を注入したラットは他の各グループよりも、正常ラットに対する平均心係数の低下が有意に抑えられた（ｐ＜０．００１）。
【図６Ａ】Ｇ−ＣＳＦによって動員されたヒトＣＤ３４＋細胞を急性梗塞のラットに注入すると、新血管新生を誘導し、心筋の組織修復の過程を修正する。
【０１０２】
Ａ〜Ｄは、ヘマトキシリン及びエオシン（Ａ、Ｂ）又は抗第ＶＩＩＩ因子ｍＡｂ結合後の免疫ペルオキシダーゼ法（Ｃ、Ｄ）で染色した代表的な実験動物及び対照動物から得た、ＬＡＤ結紮から２週後の梗塞ラット心筋を示す。Ｅ、Ｆは、ＬＡＤ結紮から１５週後の代表的な対照動物及び実験動物から得た梗塞ラット心筋のマッソン（Ｍａｓｏｎ）トリクローム染色を示す。Ｇは、１５週の左心室組織の瘢痕／正常％のグループ間差を示す。
【０１０３】
Ａ．ヒトＣＤ３４＋細胞を注入したラットの梗塞域は、肉芽組織の微小血管分布及び細胞性の顕著な増加、多数の毛細血管（矢印の頭）、栄養供給血管（矢印）、並びにマトリックス沈着及び繊維症の減少を示す（×２００）。
【図６Ｂ】Ｇ−ＣＳＦによって動員されたヒトＣＤ３４＋細胞を急性梗塞のラットに注入すると、新血管新生を誘導し、心筋の組織修復の過程を修正する。
【０１０４】
Ａ〜Ｄは、ヘマトキシリン及びエオシン（Ａ、Ｂ）又は抗第ＶＩＩＩ因子ｍＡｂ結合後の免疫ペルオキシダーゼ法（Ｃ、Ｄ）で染色した代表的な実験動物及び対照動物から得た、ＬＡＤ結紮から２週後の梗塞ラット心筋を示す。Ｅ、Ｆは、ＬＡＤ結紮から１５週後の代表的な対照動物及び実験動物から得た梗塞ラット心筋のマッソン（Ｍａｓｏｎ）トリクローム染色を示す。Ｇは、１５週の左心室組織の瘢痕／正常％のグループ間差を示す。
【０１０５】
Ｂ．これに対して、生理食塩水を注入したコントロールラットの梗塞域は、乏細胞性の密な繊維組識（矢印）からなる心筋瘢痕を示す（×２００）。
【図６Ｃ】Ｇ−ＣＳＦによって動員されたヒトＣＤ３４＋細胞を急性梗塞のラットに注入すると、新血管新生を誘導し、心筋の組織修復の過程を修正する。
【０１０６】
Ａ〜Ｄは、ヘマトキシリン及びエオシン（Ａ、Ｂ）又は抗第ＶＩＩＩ因子ｍＡｂ結合後の免疫ペルオキシダーゼ法（Ｃ、Ｄ）で染色した代表的な実験動物及び対照動物から得た、ＬＡＤ結紮から２週後の梗塞ラット心筋を示す。Ｅ、Ｆは、ＬＡＤ結紮から１５週後の代表的な対照動物及び実験動物から得た梗塞ラット心筋のマッソン（Ｍａｓｏｎ）トリクローム染色を示す。Ｇは、１５週の左心室組織の瘢痕／正常％のグループ間差を示す。
【０１０７】
Ｃ．ヒトＣＤ３４＋細胞を注入したラットの虚血心筋は、多数の第ＶＩＩＩ因子陽性な間質内の血管芽細胞（矢印）を示し、さらに第ＶＩＩＩ因子陽性な毛細血管（矢印の頭）の広汎な増加を示す（×４００）。
【図６Ｄ】Ｇ−ＣＳＦによって動員されたヒトＣＤ３４＋細胞を急性梗塞のラットに注入すると、新血管新生を誘導し、心筋の組織修復の過程を修正する。
【０１０８】
Ａ〜Ｄは、ヘマトキシリン及びエオシン（Ａ、Ｂ）又は抗第ＶＩＩＩ因子ｍＡｂ結合後の免疫ペルオキシダーゼ法（Ｃ、Ｄ）で染色した代表的な実験動物及び対照動物から得た、ＬＡＤ結紮から２週後の梗塞ラット心筋を示す。Ｅ、Ｆは、ＬＡＤ結紮から１５週後の代表的な対照動物及び実験動物から得た梗塞ラット心筋のマッソン（Ｍａｓｏｎ）トリクローム染色を示す。Ｇは、１５週の左心室組織の瘢痕／正常％のグループ間差を示す。
【０１０９】
Ｄ．生理食塩水を注入したラットの虚血心筋は、第ＶＩＩＩ因子陽性血管芽細胞（矢印）を含有せず、第ＶＩＩＩ因子陽性血管分布を有する肉芽組織の局所領域（矢印の頭）のみを示す（×４００）。
【図６Ｅ】Ｇ−ＣＳＦによって動員されたヒトＣＤ３４＋細胞を急性梗塞のラットに注入すると、新血管新生を誘導し、心筋の組織修復の過程を修正する。
【０１１０】
Ａ〜Ｄは、ヘマトキシリン及びエオシン（Ａ、Ｂ）又は抗第ＶＩＩＩ因子ｍＡｂ結合後の免疫ペルオキシダーゼ法（Ｃ、Ｄ）で染色した代表的な実験動物及び対照動物から得た、ＬＡＤ結紮から２週後の梗塞ラット心筋を示す。Ｅ、Ｆは、ＬＡＤ結紮から１５週後の代表的な対照動物及び実験動物から得た梗塞ラット心筋のマッソン（Ｍａｓｏｎ）トリクローム染色を示す。Ｇは、１５週の左心室組織の瘢痕／正常％のグループ間差を示す。
【０１１１】
Ｅ．生理食塩水を注入したラットにおける梗塞後１５週のラット心筋のトリクローム染色（×２５）。左心室前壁（ａｎｔ．）内のコラーゲンが豊富な心筋瘢痕は、青く染色され、生きた心筋は赤く染色される。コラーゲン沈着の限局的な島（青）は、左心室後壁（ｐｏｓｔ）にも存在する。前壁の心筋の塊が広範に喪失しており、コラーゲンの沈着及び瘢痕の生成が左心室壁の厚みのほぼ全体を通じて広がり、その結果、動脈瘤の膨張及び典型的なＥＫＧ異常（持続性ＳＴ部分の上昇）を起こしている。
【図６Ｆ】Ｇ−ＣＳＦによって動員されたヒトＣＤ３４＋細胞を急性梗塞のラットに注入すると、新血管新生を誘導し、心筋の組織修復の過程を修正する。
【０１１２】
Ａ〜Ｄは、ヘマトキシリン及びエオシン（Ａ、Ｂ）又は抗第ＶＩＩＩ因子ｍＡｂ結合後の免疫ペルオキシダーゼ法（Ｃ、Ｄ）で染色した代表的な実験動物及び対照動物から得た、ＬＡＤ結紮から２週後の梗塞ラット心筋を示す。Ｅ、Ｆは、ＬＡＤ結紮から１５週後の代表的な対照動物及び実験動物から得た梗塞ラット心筋のマッソン（Ｍａｓｏｎ）トリクローム染色を示す。Ｇは、１５週の左心室組織の瘢痕／正常％のグループ間差を示す。
【０１１３】
Ｆ．これに対して、高度に精製したＣＤ３４＋細胞を注入したラット中に存在する梗塞後１５週のラット心筋のトリクローム染色（×２５）では、前壁（ａｎｔ．）内の生きた心筋の塊が増加しており、ＥＫＧが正常であるとともに、梗塞域の大きさが顕著に減少したことが示されている。梗塞域と生きた心筋の接合部では、多数の血管が明瞭である。左心室後壁（ｐｏｓｔ）には、限局性コラーゲンの沈着はない。
【図６Ｇ】Ｇ−ＣＳＦによって動員されたヒトＣＤ３４＋細胞を急性梗塞のラットに注入すると、新血管新生を誘導し、心筋の組織修復の過程を修正する。
【０１１４】
Ａ〜Ｄは、ヘマトキシリン及びエオシン（Ａ、Ｂ）又は抗第ＶＩＩＩ因子ｍＡｂ結合後の免疫ペルオキシダーゼ法（Ｃ、Ｄ）で染色した代表的な実験動物及び対照動物から得た、ＬＡＤ結紮から２週後の梗塞ラット心筋を示す。Ｅ、Ｆは、ＬＡＤ結紮から１５週後の代表的な対照動物及び実験動物から得た梗塞ラット心筋のマッソン（Ｍａｓｏｎ）トリクローム染色を示す。Ｇは、１５週の左心室組織の瘢痕／正常％のグループ間差を示す。
【０１１５】
Ｇ．ＣＤ３４＋細胞を与えたラットは、他の各グループに比べ、正常な左心室心筋に対する瘢痕組織の平均サイズが著しく減少した（ｐ＜０．０１）。心外膜及び心内膜の両領域を含む梗塞の大きさを、デジタルプラニメーター画像解析装置を用いて測定し、所与の切片での心室総外周に対する百分率で示した。各動物に対し、最終的な梗塞サイズを１０〜１５個の切片の平均値として計算した。
【図７Ａ】成人骨髄由来の内皮前駆細胞は、虚血心筋に浸潤して、梗塞床の新血管新生を誘導し、コラーゲンの沈着を抑制する。
【０１１６】
Ａ．代表的なドナー成人から白血球フェレーシスによって採取した、Ｇ−ＣＳＦによって動員された骨髄由来細胞の４パラメーターフローサイトメトリーによる表現型キャラクタリゼーション。７−ＡＡＤ染色によって規定される生細胞のみを分析した。使用した各マーカーに対して、陰影付きの部分は、アイソタイプ対照抗体に対するバックグラウンドの蛍光の対数を表す。ＣＤ３４＋ＣＤ１１７ｂｒｉｇｈｔのサブセットは、マウス及びヒトの胚形成が急激に進行する間に生ずる初期の血管芽細胞に特徴的なマーカーを発現する集団を含むが、成熟内皮のマーカーを含まない。これらの細胞は、ＣＸＣケモカイン受容体も発現する。
【図７Ｂ】成人骨髄由来の内皮前駆細胞は、虚血心筋に浸潤して、梗塞床の新血管新生を誘導し、コラーゲンの沈着を抑制する。
【０１１７】
Ｂ．ヌードラットへ静脈内注入したＤｉＩ標識ヒトＣＤ３４を豊富に含む細胞（ＣＤ３４純度＞９８％）は、冠動脈を結紮及び梗塞した後にラットの心筋に浸潤するが、擬似手術後４８時間では浸潤しない。
【図７Ｃ】成人骨髄由来の内皮前駆細胞は、虚血心筋に浸潤して、梗塞床の新血管新生を誘導し、コラーゲンの沈着を抑制する。
【０１１８】
Ｃ．純度が２％、４０％、又は９８％のＣＤ３４＋の、Ｇ−ＣＳＦによって動員された２．０×１０６のヒト骨髄由来細胞を与え、マッソンのトリクローム又は免疫ペルオキシダーゼ法で染色した、代表的なラットから得られたＬＡＤ結紮後２週の心筋梗塞床。２％又は４０％の何れかの純度のＣＤ３４＋細胞を与えたラットの梗塞域は、青く染色された乏細胞性の密な繊維組識からなる心筋瘢痕を示す（×４００）。これに対し、純度９８％のヒトＣＤ３４＋細胞を注入したラットの梗塞域は、肉芽組織の微小血管分布及び細胞性の顕著な増加、多数の毛細血管、及び最小限のマトリックス沈着と最小限の繊維症を示す（×４００）。さらに、抗第ＶＩＩＩ因子ｍＡｂの結合後の免疫ペルオキシダーゼ染色によって、純度９８％のＣＤ３４＋細胞を注入したラットの梗塞床では第ＶＩＩＩ因子陽性な毛細血管の数が著しく増加することが明らかになったが、これは他のラットのいずれにも見られない（×４００）。
【図８Ａ】ヒト骨髄由来内皮前駆細胞の梗塞部位への遊走は、心筋虚血によって誘導されるＣＸＣＲ１／２とＩＬ−８／Ｇｒｏ−αの相互作用に依存する。
【０１１９】
Ａ、Ｂ．  ＬＡＤ結紮を行っているラットのＧＡＰＤＨに対する、ラット心筋のＩＬ−８及びＧｒｏ−αｍＲＮＡ発現の時間依存的な増加。
【図８Ｂ】ヒト骨髄由来内皮前駆細胞の梗塞部位への遊走は、心筋虚血によって誘導されるＣＸＣＲ１／２とＩＬ−８／Ｇｒｏ−αの相互作用に依存する。
【０１２０】
Ａ、Ｂ．  ＬＡＤ結紮を行っているラットのＧＡＰＤＨに対する、ラット心筋のＩＬ−８及びＧｒｏ−αｍＲＮＡ発現の時間依存的な増加。
【図８Ｃ】ヒト骨髄由来内皮前駆細胞の梗塞部位への遊走は、心筋虚血によって誘導されるＣＸＣＲ１／２とＩＬ−８／Ｇｒｏ−αの相互作用に依存する。
【０１２１】
Ｃ．代表的な動物から得られた、基準時間、ＬＡＤ結紮後１２時間、４８時間でのＩＬ−８、Ｇｒｏ−α、及びＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ発現。
【図８Ｄ】ヒト骨髄由来内皮前駆細胞の梗塞部位への遊走は、心筋虚血によって誘導されるＣＸＣＲ１／２とＩＬ−８／Ｇｒｏ−αの相互作用に依存する。
【０１２２】
Ｄ．  ＬＡＤ結紮を行っているラットの血清中のラットＩＬ−８／Ｇｒｏ−αタンパク質の時間依存的測定。ヒト骨髄由来ＣＤ３４＋細胞の虚血ラット心筋への遊走は、ラットＩＬ−８又はＩＬ−８／Ｇｒｏケモカインファミリー受容体ＣＸＣＲ１及びＣＸＣＲ２の何れかに対するｍＡｂによって阻害されるが（全てｐ＜０．０１）、ＶＥＧＦ又はその受容体のＦｌｋ−１に対するｍＡｂによっては阻害されない（結果を、異なる３実験の平均値±平均値の標準誤差として表す）。
【図８Ｅ】ヒト骨髄由来内皮前駆細胞の梗塞部位への遊走は、心筋虚血によって誘導されるＣＸＣＲ１／２とＩＬ−８／Ｇｒｏ−αの相互作用に依存する。
【０１２３】
Ｅ．  ＩＬ−８又はＧｒｏ−αの何れかに対する、又はこれらの血管新生誘発性ケモカインの表面受容体（ＣＸＣＲ１又はＣＸＣＲ２）に対する遮断ｍＡｂを同時投与すると、ヒト血管芽細胞の心筋での輸送を対照抗体に比較して４０〜６０％低下させた（ｐ＜０．０１）。
【図９Ａ】ＣＸＣケモカインは、骨髄由来ヒトＣＤ３４＋細胞のラット心筋への化学走性を直接誘導する。
【０１２４】
Ａ及びＢは、４８穴の走化性チャンバー（Ｎｅｕｒｏ  Ｐｒｏｂｅ、ＭＤ）を用いた、純度９８％のヒトＣＤ３４＋細胞の様々な条件でのインビトロ化学走性の結果を示す。化学走性は、試験した１条件当たり１０高倍率視野（ｈｐｆ）を検討したのちの１ｈｐｆ当たりの遊走細胞数として定義される。
【０１２５】
Ａ．ＩＬ−８は、用量に依存して化学走性を誘導する（結果を、異なる３実験の平均値±平均値の標準誤差として表す）。
【図９Ｂ】ＣＸＣケモカインは、骨髄由来ヒトＣＤ３４＋細胞のラット心筋への化学走性を直接誘導する。
【０１２６】
Ａ及びＢは、４８穴の走化性チャンバー（Ｎｅｕｒｏ  Ｐｒｏｂｅ、ＭＤ）を用いた、純度９８％のヒトＣＤ３４＋細胞の様々な条件でのインビトロ化学走性の結果を示す。化学走性は、試験した１条件当たり１０高倍率視野（ｈｐｆ）を検討したのちの１ｈｐｆ当たりの遊走細胞数として定義される。
【０１２７】
Ｂ．化学走性は、ＩＬ−８及びＳＤＦ−１α／βに応答して増大するが、ＶＥＧＦ又はＳＣＦでは増大しない。
【図９Ｃ】ＣＸＣケモカインは、骨髄由来ヒトＣＤ３４＋細胞のラット心筋への化学走性を直接誘導する。
【０１２８】
Ａ及びＢは、４８穴の走化性チャンバー（Ｎｅｕｒｏ  Ｐｒｏｂｅ、ＭＤ）を用いた、純度９８％のヒトＣＤ３４＋細胞の様々な条件でのインビトロ化学走性の結果を示す。化学走性は、試験した１条件当たり１０高倍率視野（ｈｐｆ）を検討したのちの１ｈｐｆ当たりの遊走細胞数として定義される。
【０１２９】
Ｃ．代表的な蛍光顕微鏡法によって、静脈内に注入したＤｉＩ標識されたヒトＣＤ３４＋細胞（純度９８％）のラット心臓への浸潤が、生理食塩水を注入した場合に比べＩＬ−８を心臓内に注入した後に増加することが示された。
【図９Ｄ】ＣＸＣケモカインは、骨髄由来ヒトＣＤ３４＋細胞のラット心筋への化学走性を直接誘導する。
【０１３０】
Ａ及びＢは、４８穴の走化性チャンバー（Ｎｅｕｒｏ  Ｐｒｏｂｅ、ＭＤ）を用いた、純度９８％のヒトＣＤ３４＋細胞の様々な条件でのインビトロ化学走性の結果を示す。化学走性は、試験した１条件当たり１０高倍率視野（ｈｐｆ）を検討したのちの１ｈｐｆ当たりの遊走細胞数として定義される。
【０１３１】
Ｄ．１ｍｇ／ｍｌのＩＬ−８を心臓内に注入すると、生理食塩水、ＶＥＧＦ，又は幹細胞因子（ＳＣＦ）の注入に比べ、ＤｉＩ標識されたヒトＣＤ３４＋細胞（純度９８％）のラット心臓へのインビボでの化学走性が著しく増大する（ｐ＜０．０１、結果を異なる３実験の平均値±平均値の標準誤差として表す）。
【図１０Ａ】ＣＸＣＲ４／ＳＤＦ−１相互作用を遮断すると、静脈内に注入したヒトＣＤ３４＋血管芽細胞が骨髄から虚血心筋へ再誘導される。
【０１３２】
Ａ．図示したのは、２０％の正常なラットの血清、虚血ラットの血清、又は２０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦを含むＲＰＭＩ培地で９６時間培養した単一ドナーのＣＤ３４陽性ヒト細胞の応答である。ＣＤ１１７ｂｒｉｇｈｔＧＡＴＡ−２ｐｏｓ細胞の数は、［３Ｈ］チミジン取込み及びフローサイトメトリーの両方で定量化した。虚血の血清は、他の各条件と比較して、ＣＤ１１７ｂｒｉｇｈｔＧＡＴＡ−２ｐｏｓ細胞のより大きな増殖性応答を誘導した（いずれもｐ＜０．０１）。
【図１０Ｂ】ＣＸＣＲ４／ＳＤＦ−１相互作用を遮断すると、静脈内に注入したヒトＣＤ３４＋血管芽細胞が骨髄から虚血心筋へ再誘導される。
【０１３３】
Ｂ．静脈内注入後２〜１４日したラットの骨髄中のヒトＣＤ３４＋細胞の比率は、ＬＡＤ結紮によって誘導される虚血後に著しく増加する（結果を、３つの動物における骨髄調査の各時点での平均値±平均値の標準誤差として表す）。
【図１０Ｃ】ＣＸＣＲ４／ＳＤＦ−１相互作用を遮断すると、静脈内に注入したヒトＣＤ３４＋血管芽細胞が骨髄から虚血心筋へ再誘導される。
【０１３４】
Ｃ．  ＣＸＣＲ４、ＳＤＦ−1，又は抗ＣＤ３４に対するｍＡｂの、ＬＡＤ結紮後のラット骨髄及び心筋へのヒトＣＤ３４＋細胞輸送に対する効果。抗ＣＸＣＲ４又は抗ＳＤＦ−１を同時投与すると、純度９８％のＣＤ３４＋細胞のラット骨髄への輸送が４８時間で著しく低下し、虚血心筋への輸送が増加した（結果を、３つのＬＡＤ結紮した動物において注入後４８時間に行なった骨髄及び心臓の研究の平均値±平均値の標準誤差として表す）。
【図１０Ｄ】ＣＸＣＲ４／ＳＤＦ−１相互作用を遮断すると、静脈内に注入したヒトＣＤ３４＋血管芽細胞が骨髄から虚血心筋へ再誘導される。
【０１３５】
Ｄ．  ＣＸＣＲ４、ＳＤＦ−1，又は抗ＣＤ３４に対するｍＡｂの、ＬＡＤ結紮後のラット骨髄及び心筋へのヒトＣＤ３４＋細胞輸送に対する効果。抗ＣＸＣＲ４又は抗ＳＤＦ−１を同時投与すると、純度９８％のＣＤ３４＋細胞のラット骨髄への輸送が４８時間で著しく低下し、虚血心筋への輸送が増加した（結果を、３つのＬＡＤ結紮した動物において注入後４８時間に行なった骨髄及び心臓の研究の平均値±平均値の標準誤差として表す）。
【図１１Ａ】ヒトＣＤ３４＋血管芽細胞の梗塞部位への輸送が再誘導されると、組織修復を抑制し、心筋機能を改善する。
【０１３６】
Ａ、Ｂ．心筋梗塞後の、ヒトＣＤ３４＋細胞のＬＶＡｓの低下に対する効果（Ａ）とＬＶＥＦの改善に対する効果（Ｂ）。生理食塩水を注入した動物と比較して、純度９８%のＣＤ３４＋を含む２．０×１０６のヒト細胞を注入すると、ＬＶＥＦは有意に改善しＬＶＡｓを有意に減少させたものの（いずれもｐ＜０．０１）、純度２%及び４０％のＣＤ３４＋を含む２．０×１０６のヒト細胞を注入しても、これらのパラメーターにいかなる効果も与えなかった。しかし、抗ＣＸＣＲ４を純度４０％のＣＤ３４＋細胞と共に同時投与すると、ＬＶＥＦを有意に改善しＬＶＡｓを減少させて（いずれもｐ＜０．０１）、純度９８％のＣＤ３４＋細胞を用いたレベルに近づいた。
【図１１Ｂ】ヒトＣＤ３４＋血管芽細胞の梗塞部位への輸送が再誘導されると、組織修復を抑制し、心筋機能を改善する。
【０１３７】
Ａ、Ｂ．心筋梗塞後の、ヒトＣＤ３４＋細胞のＬＶＡｓの低下に対する効果（Ａ）とＬＶＥＦの改善に対する効果（Ｂ）。生理食塩水を注入した動物と比較して、純度９８%のＣＤ３４＋を含む２．０×１０６のヒト細胞を注入すると、ＬＶＥＦは有意に改善しＬＶＡｓを有意に減少させたものの（いずれもｐ＜０．０１）、純度２%及び４０％のＣＤ３４＋を含む２．０×１０６のヒト細胞を注入しても、これらのパラメーターにいかなる効果も与えなかった。しかし、抗ＣＸＣＲ４を純度４０％のＣＤ３４＋細胞と共に同時投与すると、ＬＶＥＦを有意に改善しＬＶＡｓを減少させて（いずれもｐ＜０．０１）、純度９８％のＣＤ３４＋細胞を用いたレベルに近づいた。
【図１１Ｃ】ヒトＣＤ３４＋血管芽細胞の梗塞部位への輸送が再誘導されると、組織修復を抑制し、心筋機能を改善する。
【０１３８】
Ｃ．ＬＡＤ結紮し、純度２%、４０％又は９８％のＣＤ３４＋を含む２．０×１０６のヒト細胞を注入してから１５週後のマッソントリクロームで染色したラット心臓の切片。純度２%及び４０％のＣＤ３４＋細胞を注入したラットの心臓は、純度９８%のＣＤ３４＋細胞を注入したラットの心臓に比べ、前壁の塊が大量に失われ、コラーゲンが沈着（青）し、中隔が肥大した。抗ＣＸＣＲ４ｍＡｂを純度４０％のＣＤ３４＋細胞と共に同時投与すると、左心室壁の塊が増加し、コラーゲン沈着が減少した。
【図１１Ｄ】ヒトＣＤ３４＋血管芽細胞の梗塞部位への輸送が再誘導されると、組織修復を抑制し、心筋機能を改善する。
【０１３９】
Ｄ．９８％を超える純度のＣＤ３４＋細胞を与えたラット、又は抗ＣＸＣＲ４ｍＡｂと共に純度４０％のＣＤ３４＋細胞を与えたラットにおける左心室心筋の平均瘢痕／正常比率は、純度２％及び４０％のＣＤ３４＋細胞を与えたラットと比較して著しく低下する（ｐ＜０．０１）ことを示している。（結果を、異なる３実験の平均値±平均値の標準誤差として表す）。
【図１２】ＣＤ３４＋ＣＤ１１７ｂｒｉｇｈｔ血管芽細胞をＬＡＤ結紮したラットの血清と共に培養すると、ＣＣＲ１及びＣＣＲ２の表面発現が増加するのに対し、ＣＣＲ３及びＣＣＲ５の表面発現は不変である。
【図１３】梗塞した心筋では、ＣＣＲに結合した幾つかのケモカインのｍＲＮＡ発現が時間に依存して増加することを示している。
【図１４】ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−３、及びＲＡＮＴＥＳに対する、あるいはエオタキシンに対する遮断ｍＡｂを同時投与すると、ヒト血管芽細胞の心筋への輸送を、対照抗体に比べて４０〜６０％だけ減少させた（ｐ＜０．０１）。
【図１５】エオタキシンを非梗塞の心臓内に注入すると、ＣＤ３４＋血管芽細胞の輸送を１．５〜１．７倍に増加させたが、他方、増殖因子ＶＥＧＦ及び幹細胞因子の注入は、血管芽細胞の増殖を増加させたものの化学走性には効果がなかった（図示せず）。
【発明を実施するための形態】
【０１４０】
本明細書において使用する次の各用語は、別段の記述がない限り、以下に述べる定義に従うものとする。
【０１４１】
本明細書において使用する「ＢＭＥＣ」は、骨髄由来の内皮細胞と定義される。
【０１４２】
本明細書において使用する血管形成は、骨髄由来の内皮細胞前駆細胞などの「プレ血液（ｐｒｅ−ｂｌｏｏｄ）」細胞からの新しい血管の生成と定義される。
【０１４３】
本明細書において使用する動員は、骨髄由来の内皮細胞前駆細胞が骨髄を離れて末梢循環に入るように誘導することと定義される。当業者であれば、動員された幹細胞を白血球フェレーシスによって身体から採取し得ることが理解できるであろう。
【０１４４】
本明細書において使用する虚血は、局所的な部位への血管が閉塞したために、その部位への血液供給（循環）が不十分であることと定義される。
【０１４５】
本明細書において使用するサイトカインは、細胞を増殖又は活性化させる因子と定義される。
【０１４６】
本明細書において使用するケモカインは、細胞を体内の異なる部位に移動させる因子と定義される。
【０１４７】
本明細書において使用する虚血性心疾患は、心臓への血液供給量が減少するあらゆる病状と定義される。
【０１４８】
本明細書において使用する「血管新生」は、既存の血管細胞からの血管の生成と定義される。
【０１４９】
本明細書において使用する虚血性心疾患は、心臓への血液供給量が減少するあらゆる病状と定義される。
【０１５０】
本明細書において使用する「ＶＥＧＦ」は、血管内皮増殖因子と定義される。「ＶＥＧＦ−Ｒ」は、血管内皮増殖因子受容体と定義される。「ＦＧＦ」は、繊維芽細胞増殖因子と定義される。「ＩＧＦ」は、インシュリン様増殖因子と定義される。「ＳＣＦ」は、幹細胞因子と定義される。「Ｇ−ＣＳＦ」は、顆粒球コロニー刺激因子と定義される。「Ｍ−ＣＳＦ」は、マクロファージコロニー刺激因子と定義される。「ＧＭ−ＣＳＦ」は、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子と定義される。「ＭＣＰ」は、単球走化性タンパク質と定義される。
【０１５１】
本明細書において使用する「ＣＸＣ」ケモカインは、ケモカインの構造と定義される。各「Ｃ」はシステインを表し、「Ｘ」は任意のアミノ酸を表す。
【０１５２】
本明細書において使用する「ＣＣ」ケモカインは、ケモカインの構造と定義される。各「Ｃ」はシステインを表す。
【０１５３】
本明細書において使用する「回収された」は、ＣＤ１１７、ＧＡＴＡ−２、ＧＡＴＡ−３、ＣＤ３４を含む（これらには限定されない）細胞上の特異的マーカーに対して作られる、検出可能に標識された抗体を結合する回収可能な細胞に基づいて細胞を検出し、取得することを意味する。
【０１５４】
本明細書に記載されている、患者に投与するケモカインは、タンパク質の形態又は核酸の形態とすることができる。
【０１５５】
本発明は、虚血によって損傷を受けた患者の組織における血管形成を刺激する方法であって、
（ａ）前記患者のある部位から幹細胞を採取することと、
（ｂ）工程（ａ）で採取した前記幹細胞から内皮前駆細胞を回収することと、  （ｃ）患者の虚血によって損傷を受けた前記組織における血管形成を前記内皮前駆細胞が刺激するように、工程（ｂ）で得た前記内皮前駆細胞を前記患者の別の部位に導入することとを備えた方法を提供する。
【０１５６】
さらなる態様において、前記内皮前駆細胞は、工程（ｂ）と工程（ｃ）の間の一期間に凍結される。ある態様において、前記虚血によって損傷を受けた組織は心筋である。別の態様において、前記虚血によって損傷を受けた組織は神経系組織である。
【０１５７】
ある態様において、工程（ｂ）の後であり且つ工程（ｃ）の前に、増殖因子と接触させることによって、前記内皮前駆細胞を増殖させる。さらなる態様において、前記増殖因子はサイトカインである。さらなる態様において、前記サイトカインはＶＥＧＦ、ＦＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＧＦ、Ｍ−ＣＳＦ、又はＧＭ−ＣＳＦである。別の態様において、前記増殖因子はケモカインである。さらなる態様において、前記ケモカインはインターロイキン−８である。ある態様において、前記内皮前駆細胞は、増殖の前に、他の幹細胞から分離される。さらなる態様において、前記内皮前駆細胞は、増殖後であり且つ工程（ｃ）の前に、一定期間凍結される。
【０１５８】
ある態様において、工程（ａ）は、前記患者が虚血によって損傷を受けた組織を患う前に行われ、工程（ｃ）は、前記患者が虚血によって損傷を受けた組織を患った後に行われる。
【０１５９】
ある態様において、前記幹細胞は、前記患者の骨髄から直接採取される。さらなる態様において、前記幹細胞は、前記患者の骨髄からの吸引によって採取される。ある態様において、前記患者からの前記幹細胞は、
（ａ）前記患者に増殖因子を導入して、前記幹細胞を前記患者の血液中に動員することと、
（ｂ）続いて、幹細胞を含有する血液の試料を前記患者から採取することとを備えた方法によって採取される。
【０１６０】
さらなる態様において、前記増殖因子は、皮下、経口、静脈内、又は筋肉内から導入される。ある態様において、前記増殖因子は動員を誘導するケモカインである。さらなる態様において、前記ケモカインはインターロイキン−８である。ある態様において、前記増殖因子はサイトカインである。さらなる態様において、前記サイトカインは、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、又はＧＭ−ＣＳＦである。
【０１６１】
本発明は、前記内皮前駆細胞が、ＣＤ１１７の発現に基づいて回収される前出の方法も提供する。
【０１６２】
本発明は、前記内皮前駆細胞が、ＧＡＴＡ−２被活性化遺伝子産物の発現に基づいて回収される前出の方法も提供する。ある態様において、前記遺伝子産物は、以下の群：プレプロエンドセリン−１、ビッグエンドセリン、エンドセリン−１から選択される。
【０１６３】
ある態様において、前記内皮前駆細胞はＧＡＴＡ−２を発現し、前記内皮前駆細胞は、細胞内ＧＡＴＡ−２の発現又はそれらの細胞中のＧＡＴＡ−２活性を検出することによって回収される。
【０１６４】
ある態様において、前記患者は、以下のうちの１以上：心筋梗塞、慢性心不全、虚血性心疾患、冠動脈疾患、糖尿病性心疾患、出血性卒中、血栓性卒中、塞栓性卒中、虚血肢、又は組織が虚血になるその他の疾病に罹患したことがある、又は罹患している。
【０１６５】
ある態様において、前記内皮前駆細胞は、末梢循環、心筋、左心室、右心室、冠動脈、脳脊髄液、神経組織、虚血性組織、又は虚血後組織中に直接注入することによって、前記患者に導入される。
【０１６６】
ある態様において、前記方法は、以下のもの：プラスミノーゲン活性化因子阻害剤の阻害剤、アンギオテンシン変換酵素阻害剤、又はβ−遮断薬のうちの１以上を前記患者に投与することをさらに備え、工程（ｃ）の前、同時、又は後に、このような投与を行う。
【０１６７】
本発明は、患者の梗塞周囲組織における血管新生を刺激する方法であって、  （ａ）患者のある部位から幹細胞を採取することと、
（ｂ）工程（ａ）で採取した前記幹細胞から内皮前駆細胞を回収することと、  （ｃ）前記前駆細胞を増殖因子と接触させることによって、工程（ｂ）で回収した前記内皮前駆細胞を増殖させることと、
（ｄ）前記内皮前駆細胞が前記患者の梗塞周囲組織における血管新生を刺激するように、工程（ｃ）で得た増殖した前記内皮前駆細胞を前記患者の別の部位に導入することとを備えた方法も提供する。
【０１６８】
本発明は、患者の虚血によって損傷を受けた組織への内皮前駆細胞の輸送を選択的に増加させる方法であって、
（ａ）内皮前駆細胞を前記患者に投与することと、
（ｂ）ケモカインを前記患者に投与することによって、前記虚血によって損傷を受けた組織に前記内皮前駆細胞を誘引することを備えた方法も提供する。
【０１６９】
ある態様では、前記内皮前駆細胞を投与する前に、前記ケモカインが前記患者に投与される前出の方法も提供する。
【０１７０】
別の態様では、前記ケモカインは、前記内皮前駆細胞を投与する前に、前記ケモカインが前記患者に投与される。別の態様では、前記ケモカインは、前記内皮前駆細胞と同時に前記患者に投与される。別の態様では、前記ケモカインは、前記内皮前駆細胞を投与した後に、前記患者に投与される。ある態様において、前記ケモカインはＣＸＣケモカインである。さらなる態様において、前記ＣＸＣケモカインは、インターロイキン−８、Ｇｒｏ−α、又は間質由来因子−１からなる群から選択される。ある態様において、前記ケモカインはＣＣケモカインである。さらなる態様において、前記ＣＣケモカインはＲＡＮＴＥＳ、ＥＯＴＡＸＩＮ、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、又はＭＣＰ−４からなる群から選択される。
【０１７１】
ある態様において、前記ケモカインは、末梢循環、心筋、左心室、右心室、冠動脈、脳脊髄液、神経組織、虚血性組織、又は虚血後組織への注入によって、前記患者に投与される。
【０１７２】
本発明は、患者の虚血によって損傷を受けた組織への内皮前駆細胞の輸送を増加させる方法であって、間質由来因子−１とＣＸＣＲ４との何らかの相互作用を阻害することを備えた方法も提供する。
【０１７３】
ある態様において、前記間質由来因子−１とＣＸＣＲ４との前記相互作用は、前記患者に抗ＳＤＦ−１又は抗ＣＸＣＲ４モノクローナル抗体を投与することによって阻害される。ある態様において、前記方法は、ＡＣＥ阻害剤、ＡＴ受容体遮断薬、又はβ遮断薬、ｎｇ酵素阻害剤（ｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）、ＡＴ１受容体遮断薬、又はβ遮断薬を前記患者に投与することをさらに備える。
【０１７４】
本発明は、患者の骨髄への内皮前駆細胞の輸送を減少させる方法であって、前記患者の骨髄での間質由来因子−１の産生を阻害することを備えた方法も提供する。ある態様において、前記ＳＤＦ−１の産生は、抗ＳＤＦ−１又は抗ＣＸＣＲ−４モノクローナル抗体を前記患者に投与することによって阻害される。
【０１７５】
本発明は、患者の癌を治療する方法であって、前記癌に伴って増殖している細胞によって産生された特異的ケモカインのエピトープに対して誘導されたモノクローナル抗体を前記患者に投与して、このような増殖している細胞への内皮前駆細胞の輸送を減少させることによって前記患者の前記癌を治療することを備えた方法も提供する。
【０１７６】
本発明は、患者の癌を治療する方法であって、前記癌に伴って増殖している細胞によって産生されたケモカインに対する特異的受容体であり、内皮前駆細胞上に位置する特異的受容体のエピトープに対して誘導されたモノクローナル抗体を前記患者に投与して、このような増殖している細胞への前記内皮前駆細胞の輸送を減少させ、それにより前記患者の前記癌を治療することを備えた方法も提供する。
【０１７７】
本発明は、患者の腫瘍を治療する方法であって、内皮前駆細胞上の特異的な受容体に対するアンタゴニストを前記患者に投与して、前記患者の腫瘍における血管形成を誘導する前記前駆細胞の能力を減弱せしめることにより、前記腫瘍を治療することを備えた方法も提供する。
【０１７８】
本発明は、患者の腫瘍を治療する方法であって、内皮前駆細胞上の特異的な受容体に対するアンタゴニストを前記患者に投与して、前記患者の腫瘍における血管新生を誘導する前記前駆細胞の能力を減弱せしめることにより、前記腫瘍を治療することを備えた方法も提供する。
【０１７９】
本発明は、内皮前駆細胞又はマスト前駆細胞中に存在する目的の遺伝子を発現させる方法であって、ＧＡＴＡ−２モチーフを含有するプロモーターと前記目的の遺伝子とを含むベクターを前記細胞中に挿入することを備えた方法も提供する。
【０１８０】
本発明は、前記ベクターがトランスフェクションによって前記細胞中に挿入される前出の方法も提供する。
【０１８１】
本発明は、前記プロモーターがプレプロエンドセリン−１プロモーターである前出の方法も提供する。
【０１８２】
本発明は、前記プロモーターが哺乳動物起源である前出の方法も提供する。
【０１８３】
本発明は、前記プロモーターがヒト起源である前出の方法も提供する。
【０１８４】
本発明は、癌によって産生される特異的なケモカインのエピトープに対して誘導されたモノクローナル抗体であって、前記癌への内皮前駆細胞の輸送を低減させる効果を有する一定量のモノクローナル抗体と、薬学的に許容される担体とを備えた組成物を提供する。
【０１８５】
本発明は、患者の異常を治療する方法であって、
前記異常は、前記患者におけるＧＡＴＡ−２被活性化遺伝子産物の発現によって治療され、
（ａ）前記患者のある部位から幹細胞を採取することと、
（ｂ）工程（ａ）で採取した前記幹細胞から内皮前駆細胞を回収することと、  （ｃ）工程（ｂ）で採取した内皮前駆細胞の中からＧＡＴＡ−２を発現している内皮前駆細胞を回収することと、
（ｄ）工程（ｃ）でＧＡＴＡ−２を発現しているとして回収された前記細胞がＧＡＴＡ−２被活性化遺伝子産物を発現するように誘導することと、
（ｅ）前記患者の別の部位に、ＧＡＴＡ−２被活性化遺伝子産物を発現している工程（ｄ）で得られた前記細胞を導入して前記異常を治療することとを備えた方法を提供する。
【０１８６】
ある態様において、前記異常は、虚血によって損傷を受けた組織である。ある態様において、前記遺伝子産物はプロエンドセリンである。ある態様において、前記遺伝子産物はエンドセリンである。ある態様において、前記患者は哺乳動物である。さらなる態様において、前記哺乳動物はヒトである。
【０１８７】
本発明は、患者の異常を治療する方法であって、
前記異常は、前記患者におけるＧＡＴＡ−２被活性化遺伝子産物の発現によって治療され、
（ａ）前記患者のある部位から幹細胞を採取することと、
（ｂ）工程（ａ）で採取した前記幹細胞からマスト前駆細胞を回収することと、
（ｃ）工程（ｂ）で回収したマスト前駆細胞の中からＧＡＴＡ−２を発現している内皮前駆細胞を回収することと、
（ｄ）工程（ｃ）でＧＡＴＡ−２を発現しているとして回収された前記細胞がＧＡＴＡ−２被活性化遺伝子産物を発現するように誘導することと、
（ｅ）前記患者の別の部位に、ＧＡＴＡ−２被活性化遺伝子産物を発現している工程（ｄ）で得られた前記細胞を導入して前記異常を治療することとを備えた方法を提供する。
【０１８８】
ある態様において、前記異常は、虚血によって損傷を受けた組織である。ある態様において、前記遺伝子産物はプロエンドセリンである。ある態様において、前記遺伝子産物はエンドセリンである。ある態様において、前記患者は哺乳動物である。さらなる態様において、前記哺乳動物はヒトである。
【０１８９】
本発明は、心筋梗塞を患った患者の心筋の機能を改善する方法であって、
（ａ）前記患者のある部位から幹細胞を採取することと、
（ｂ）前記幹細胞からＣＤ１１７を発現する細胞を回収することと、
（ｃ）前記細胞が前記患者の心筋の機能を改善するように、前記患者の異なる部位に前記回収した細胞を導入することとを備えた方法を提供する。
【０１９０】
ある態様において、前記患者は哺乳動物である。さらなる態様において、前記哺乳動物はヒトである。
【０１９１】
本発明は、患者の虚血によって損傷を受けた組織における血管形成を刺激する方法であって、
（ａ）同種異系の幹細胞を取得することと、
（ｂ）工程（ａ）で採取した前記幹細胞から内皮前駆細胞を回収することと、  （ｃ）前記内皮前駆細胞が患者の虚血によって損傷を受けた前記組織における血管形成を刺激するように、工程（ｂ）で回収した前記内皮前駆細胞を前記患者に導入することとを備えた方法も提供する。
【０１９２】
別の態様において、前記同種異系の幹細胞は、胚、胎児、又は臍帯血を起源として採取される。
【０１９３】
本発明は、患者の虚血によって損傷を受けた組織における血管新生を刺激する方法であって、
（ａ）同種異系の幹細胞を取得することと、
（ｂ）工程（ａ）で採取した前記幹細胞から内皮前駆細胞を回収することと、  （ｃ）前記内皮前駆細胞が患者の虚血によって損傷を受けた前記組織における血管新生を刺激するように、工程（ｂ）で回収した前記内皮前駆細胞を前記患者に導入することとを備えた方法を提供する。
【０１９４】
別の態様において、前記同種異系幹細胞は、胚、胎児、又は臍帯血を起源として採取される。
【０１９５】
本発明は、心筋梗塞に罹患した患者の心筋の機能を改善する方法であって、前記患者にＧ−ＣＳＦを注入して内皮前駆細胞を動員することを備えた方法も提供する。
【０１９６】
本発明は、心筋梗塞に罹患した患者の心筋の機能を改善する方法であって、前記患者に抗ＣＸＣＲ４抗体を注入することを備えた方法も提供する。ある態様において、前記方法は、前記患者に内皮前駆細胞を導入することをさらに備える。ある態様において、前記方法は、前記患者にＧ−ＣＳＦを導入して、内皮前駆細胞を動員することをさらに備える。
【０１９７】
以下に記載されている実験の詳細を参照することによって、本発明をよりよく理解することができるであろう。しかしながら、詳細に記載されている具体的な実験は、その後に記載されている特許請求の範囲においてより完全に記載されている本発明を説明するためのものにすぎないことが、当業者には容易に理解できるであろう。
【実験の詳細】
【０１９８】
第一群の実験
実験方法及び結果
１．骨髄由来細胞の動員と同定
Ｇ−ＣＳＦ動員後、高純度ヒトＣＤ３４細胞（＞９０％陽性）の６０〜８０％が幹細胞因子受容体ＣＤ１１７を同時発現し（図１ａ）、そのうち１５−２５％はＣＤ１１７の発現が明瞭で、７５〜８５％はＣＤ１１７の発現が不明瞭であった。４種類のパラメーターに関する解析により、ＶＥＧＦＲ−２（Ｆｌｋ−１）を発現する２種類のＣＤ３４細胞集団が確認された。１つ目はＣＤｄｉｍ細胞の２０〜３０％を占め、ＶＥＧＦＲ−２を高濃度に発現し、２つ目はＣＤ１１７ｂｒｉｇｈｔの１０〜１５％を占め、ＶＥＧＦＲ−２発現は低濃度であった（図１ｂ）。ＣＤ３４＋１１７ｄｉｍ細胞集団中のＶＥＧＦＲ−２陽性細胞であって、ＣＤ３４＋１１７ｂｒｉｇｈｔ分画中には含まれない細胞は、Ｔｉｅ−２、ｅｃＮＯＳ、ｖＷＦ、Ｅ−セレクチン（ＣＤ６２Ｅ）及びＩＣＡＭ（ＣＤ５４）の高発現を含む成熟血管内皮の表現型特性を示した。一方で、図１ｃで示すように、ＣＤ３４＋ＣＤ１１７ｂｒｉｇｈｔ細胞分画中に属するものであってＣＤ３４＋ＣＤ１１７ｄｉｍ細胞分画に属さないＶＥＧＦＲ−２陽性細胞は、マウス及びヒト胚形成中に出現するＧＡＴＡ−２、ＧＡＴＡ−３及び低レベルのＴｉｅ−２を含む原始血管芽細胞に特徴的なマーカーを発現した。さらに、ＧＡＴＡ−２及びＧＡＴＡ−３を同時発現したＣＤ１１７ｂｒｉｇｈｔ細胞はまた、強いＡＣ１３３陽性であった（ＡＣ１３３は、血管芽細胞になり得る造血細胞集団であることを確定するもう一つのマーカーであることが近年示唆されている（２）（図１ｄ）。しかしながら、ＡＣ１３３発現は、ＧＡＴＡ−２及びＧＡＴＡ−３が陰性であるＣＤ１１７ｄｉｍ細胞の集団においても検出されたので、胚性骨髄由来血管芽細胞（ＢＡ）表現型の同定には、ＡＣ１３３に加えてＧＡＴＡ−２、ＧＡＴＡ−３及びＣＤ１１７ｂｒｉｇｈｔが付随して発現することが必要であると本発明者らは結論する。このように、Ｇ−ＣＳＦ処理によって、成熟骨髄由来内皮細胞（ＢＭＥＣ）の大きな集団、及び胚性血管芽細胞（ＢＡ）の表現型特性を有するこれより小さな骨髄由来の集団が末梢循環に動員される。
【０１９９】
２．骨髄由来細胞の増殖
ＶＥＧＦ（２７）又は局所的虚血（１０−１３）の何れかにより動物モデルで循環する内皮細胞前駆体の出現率が増加することが示されたので、次に、ＶＥＧＦ及び虚血性血清中の因子（２８）に対するＢＡ及びＢＭＥＣの増殖応答を比較した。図２ａで示すように、ＶＥＧＦ又は虚血性血清の何れかを添加して９６時間培養を行った後、ＣＤ１１７ｂｒｉｇｈｔＧＡＴＡ−２ｐｏｓＢＡは、同じドナー由来のＣＤ１１７ｄｉｍＧＡＴＡ−２ｎｅｇＢＭＥＣと比較して有意に高い増殖応答を示した。ＶＥＧＦを添加した場合、ＢＭＥＣはベースラインを超えて１．２倍の増殖増加を示したのに対し、ＢＡの増殖は２．９倍に増加を示し（ｐ＜０．０１）、その一方で、心筋梗塞のＬｅｗラット由来の虚血性血清を添加した場合は、ＢＭＥＣの増殖は正常血清を超えて１．７倍の増加を示したのに対し、ＢＡの増殖は４．３倍の増加を示した（ｐ＜０．０１）。ＶＥＧＦ又は虚血性血清の何れかを添加して培養すると、ＧＡＴＡ−２、ＧＡＴＡ−３、及びＣＤ１１７ｂｒｉｇｈｔを含む未成熟マーカーは継続的に発現するが、成熟内皮細胞のマーカーは発現しない大型芽細胞のＢＡ集団が著しく増殖したので（図２ｂ）、芽細胞が分化せずに増殖したことが示唆される。内皮増殖培地を用いてフィブロネクチン上でＣＤ３４陽性単層培養を７日間行ったところ（２９）、増殖の著しい敷石状パターンが観察され（図３ａ）、ほとんどの接着単層（＞９５％）において、アセチル化ＬＤＬの一定の取り込み、及びＣＤ３４、第ＶＩＩＩ因子およびｅＮＯＳの同時発現を含む内皮細胞に特徴的な特性が認められた（図３ｂ−ｅ）。ＢＭＥＣ集団はＶＥＧＦ又は虚血性血清中のサイトカインに対する増殖応答が低いため、培養中に著しく過剰増殖した内皮細胞は、おそらくＧＡＴＡ−２、ＧＡＴＡ−３及びＣＤ１１７ｂｒｉｇｈｔの細胞表面への発現によって特徴付けられるＢＡ集団が起源であろう。
【０２００】
３．インビボにおける、骨髄由来ＣＤ３４＋細胞の局所的虚血部位への遊走
次に、局所的虚血誘導後、インビボにおける遊走及び増殖特性について、骨髄由来ヒト細胞と末梢血管由来ヒト細胞との比較を行った。図４ａ〜ｃで示すように、冠動脈結紮を行い、梗塞を起こさせたヌードラットに対して、２Ｘ１０６個のＤｉＩ−標識ヒトＣＤ３４陽性細胞（＞９５％  ＣＤ３４純度）、ＣＤ３４陰性細胞（＜５％  ＣＤ３４純度）、又は伏在静脈内皮細胞（ＳＶＥＣ）を静脈注射すると、４８時間後にラット心筋において同程度の浸潤が観察された（３０）。局所的梗塞を伴う心臓の非疾患部位においてはほとんどＤｉＩ標識細胞は検出されず（データを示さない）、Ｇ−ＣＳＦ動員ＣＤ３４＋細胞、成熟ヒト内皮細胞いずれも正常心筋部位には浸潤しなかったので（図４ｄ）、細胞輸送は特に梗塞領域へと向けられた。ＣＤ３４＋及びＣＤ３４−細胞の虚血性心筋への遊走は同数であったが、正常心筋に対して虚血性心筋におけるヒトＧＡＴＡ−２のｍＲＮＡ発現の比例増加率（３１）は、ＣＤ３４−細胞の場合と比較してＣＤ３４が非常に富む細胞を注射した場合は２．６倍に増加した（ｐ＜０．００１）（図４ｅ）。さらに、ヒトＣＤ３４＋細胞を注射して２週間後に、ＤｉＩ、ＨＬＡクラスＩ、及び第ＶＩＩ因子の同時発現によって定義されるヒト内皮細胞を取り込む血管を検出し得たが、ＣＤ３４−細胞又はＳＶＥｃの注射後には検出されなかった（図４ｆ）。これらの結果を考え合わせると、成人骨髄由来ヒトＣＤ３４＋細胞には、局所的虚血部位からのインビボのシグナルに選択的に応答して遊走性、局在性、及び内皮分化の増大を示す集団が含有されることが示される。
【０２０１】
４．梗塞ラット心筋へのＧ−ＣＳＦ動員ヒトＣＤ３４＋細胞注射の影響
次に、Ｇ−ＣＳＦ動員ヒトＣＤ３４＋（＞９５％）細胞、ＣＤ３４−（＜５％）細胞、末梢伏在静脈細胞、又は生理的食塩水注射による梗塞ラット心筋への機能的影響を比較した。ＬＡＤ結紮後、それぞれの群の受容動物において、左心室駆出率（ＬＶＥＦ）が２５〜４３％低下し、左心室収縮終期領域は４４〜９０％増大し、左心室機能が著しく抑制された（図５ａ及びｂ）。驚いたことには、Ｇ−ＣＳＦ動員成人ヒトＣＤ３４＋細胞を注射して２週間以内に、ＬＶＥＦが２２±６％（ｐ＜０．００１）回復した（図５ａ）。この影響は長期間続き、フォローアップ終了時である１５週間後までに、３４±４％まで増加した。その一方、Ｇ−ＣＳＦ動員ヒトＣＤ３４−細胞、伏在静脈内皮細胞、又は生理的食塩水を注射しても、ＬＶＥＦに対する影響は皆無であった。同様にして、Ｇ−ＣＳＦ動員ヒトＣＤ３４＋細胞を注射することにより、左心室収縮終期領域が、2週間後までに２６±８％、１５週間後までに３７±６％減少したが、他の受容動物群ではこのような影響は見られなかった（ｐ＜０．００１％）（図５ｂ）。各群の代表的な心エコー例を図５Ｃに示す。さらに、１５週間後のＣＤ３４＋細胞を注射したラットの梗塞後の平均心係数は、正常ラットに対して２６±８％減少したにすぎなかったが、他の各群の平均心係数は４８〜５９％減少した（ｐ＜０．００１）（図５ｄ）。
【０２０２】
梗塞して２週間後の組織学的検査（３３）によると、ＣＤ３４＋細胞注射によって、対照群と比較すると梗塞部位内において肉芽組織の微小血管形成及び細胞密度の有意な増加とマトリックス沈着及び繊維形成の減少が伴うことが明らかとなった（図６ａ及びｂ）。さらに、ヒトＣＤ３４＋細胞を注射したラットの虚血性心筋には、対照ラットの虚血性心筋と比較して、有意に多数の第ＶＩＩＩ因子陽性間質血管芽細胞及び毛細血管が含まれていた（図６ｃ及びｄ）。毛細血管数の定量によって、ＣＤ３４＋細胞を投与されたラットの梗塞部位内では新血管新生の有意な増加が示された（高倍率視野あたりの第ＶＩＩＩ因子陽性毛細血管平均数は、９２±５、対して生理食塩水対照では５１±４、ｐ＜０．０１）が、正常心筋においては示されなかった（高倍率視野当たりの毛細血管数、３６±２対３７±３）。ＣＤ３４−細胞又はＳＶＥＣが浸潤した虚血性ラット心筋では、毛細血管数の増加は全く見られなかった。梗塞して１５週間後に、高純度ＣＤ３４＋細胞を投与したラットにおいては、他の各群と比較して、前自由壁（ａｎｔｅｒｉｏｒ  ｆｒｅｅ  ｗａｌｌ）内の生存能力を有する心筋量が増加すると共に梗塞部位の有意な減少が示された（図６ｅ及びｆ）。ＣＤ３４＋細胞が浸潤した組織の梗塞部位と生存能力を有する心筋との連結部位において、多数の血管がはっきり示された。対照群では、コラーゲン沈着及び瘢痕形成が左心室壁厚のほとんど全体に広がり、動脈瘤拡大及び典型的なＥＫＧ異常が認められる一方、ＣＤ３４＋細胞を投与したラットでは、梗塞瘢痕は左心室壁厚のわずか２０〜５０％にのみ広がっていた。さらに、ＣＤ３４＋細胞を投与したラットでは、非−梗塞部位における病的なコラーゲン沈着が顕著に減少していた。全体的に、瘢痕／正常左心室心筋の平均比率は、ＣＤ３４＋細胞を投与されたラットでは１３％であり、それに対して他の各群では３６〜４５％であった（Ｐ＜０．０１）（図６ｇ）。
【０２０３】
考察
前記の実験により、ヒト骨髄由来内皮細胞前駆体による梗塞床の新血管新生によって、心筋虚血の齧歯類モデルにおいて、瘢痕発生を予防し、生存能力を有する心筋を維持し、心室機能を向上させることが示される。梗塞後、梗塞部位に接する生存能力を有する心筋組織が有意な程度に肥大を起こす（５、３４〜３５）。梗塞組織内の新血管新生は組織修復過程において不可欠な要素であると考えられているにも関わらず（３６、３７）、正常な状態下では、毛細血管ネットワークは組織成長に対応できず、肥大化しているが生存能力を有する心筋によるより大きい要求を支持することが不可能で、その後酸素供給及び栄養供給が不十分となりアポトーシスが引き起こされる。心筋梗塞瘢痕内の新血管新生の進展には、浸潤白血球上で発現しているウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕ−ＰＡ）によってプラスミノーゲンを活性化した後、潜在性のコラゲナーゼ及び他のプロテイナーゼを活性化することが必要であると考えられる（３８）。ｕ−ＰＡ−／−マウスにおいて、欠損している梗塞後心筋血行再建がコンジェニック（ｃｏｇｅｎｉｃ）野生型系統マウスからの骨髄移植により回復したことから、この過程において骨髄由来内皮前駆体が重要であることが示された（３８）。ヒト単核細胞及び腫瘍細胞系列において、ｕ−ＰＡ  ｍＲＮＡ転写及び蛋白質分解活性は、コロニー刺激因子、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、及びＧＭ−ＣＳＦによって有意に促進されるので（３９−４１）、このことは、治療によって梗塞部位の再血管形成を行うために、これらのサイトカインをインビボ又はエクスビボで使用して多数のヒト成人骨髄由来血管芽細胞を動員し、分化させ得ることの論拠となる。転写因子ＧＡＴＡ−２の細胞表面及びＲＮＡ発現によって、虚血性部位からのシグナルに応じて増殖して梗塞部位へと移動し、その後新血管新生プロセスに関与するヒト成人骨髄由来血管芽細胞が選択的に同定されると考えられる。特に興味深いことに、ＧＡＴＡ−２は、ＥＴ−１（強力な血管収縮物質であり、肥大作用を有する自己分泌ペプチドである）の前駆体分子であるプレプロエンドセリン−１（ｐｐＥＴ−１）の内皮細胞転写のコファクターである（４２）。ｐｐＥＴ−１転写は、心筋梗塞後にレニン−アンジオテンシン神経ホルモン系の活性化の結果産生されるアンジオテンシンＩＩによっても増加するため（４３）、アンジオテンシンＩＩ細胞表面受容体シグナリングとＧＡＴＡ−２転写活性化との相乗的作用により、梗塞床に浸潤している血管芽細胞は高レベルのＥＴ−１を分泌している可能性がある。梗塞瘢痕内に新たに形成された血管が、正常心筋内の血管よりも厚い壁を有し、より強い血管作動物質に対しても低い血管拡張反応を示すという所見（４４）は、自己分泌ＥＴ−１活性促進による影響と一致し、新血管新生脈管構造が浸潤したＧＡＴＡ−２陽性血管芽細胞由来である可能性を支持する。
【０２０４】
前記実験の結果を総合すると、胚性血管芽細胞の表現型特性及び機能的特性を持つＧ−ＣＳＦ動員成人ヒトＣＤ３４＋細胞を注射することによって、梗塞血管床において新血管新生を刺激することが可能であり、したがって心筋梗塞においてコラーゲン沈着及び瘢痕形成が減少することが示される。新血管新生によりもたらされる心筋組織修復の減少程度は注目すべきものであるが、ヒト血管芽細胞の注入とＡＣＥ阻害又はＡＴ１−受容体阻害とを組み合わせることによってアンジオテンシンＩＩ依存性心筋繊維芽細胞増殖、コラーゲン分泌、及びプラスミノーゲン活性因子阻害因子（ＰＡＩ）産生を低下させ、心筋機能をさらに向上させることが可能である（４５、４６）。心筋梗塞組織の血行再建のために、サイトカインによって動員されたヒト骨髄由来の自家血管芽細胞を現在用いられている治療と併用することによって（４７−４９）、心筋梗塞後の左心室の組織修復に伴う罹患率及び死亡率を有意に減少させる可能性がもたらされる。
【０２０５】
第二群の実験
方法
１．サイトカインによって動員されたヒトＣＤ３４＋細胞の精製
１０ｍｇ／ｋｇの組換えＧ−ＣＳＦ（Ａｍｇｅｎ、ＣＡ）を４日間毎日皮下注射（ＳＣ）処置したヒトから、単一ドナーの白血球フェレーシス生成物を採取した。単核細胞をフィコール−ハイパック法によって分離し、高度に精製されたＣＤ３４＋細胞（＞９８％陽性）を抗ＣＤ３４モノクロナール抗体（ｍＡｂ）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｌｔｄ、ＣＡ）で被覆された磁気ビーズを用いて採取した。精製されたＣＤ３４細胞を、ＣＤ３４、ＣＤ１１７、ＶＥＧＦＲ−２、Ｔｉｅ−２、ＧＡＴＡ−２、ＧＡＴＡ−３、ＡＣ１３３、ｖＷＦ、ｅＮＯＳ、ＣＤ５４、ＣＤ６２Ｅ、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ４に対するフルオレセイン複合ｍＡｂで染色し、ＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，  ＣＡ）を用いた４パラメーター蛍光によって分析した。
【０２０６】
２．ヒト内皮前駆細胞の増殖の研究
２０％の正常ラットの血清、虚血ラットの血清、又は２０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦの何れかを含むＲＰＭＩ培地内で、単一ドナーのＣＤ３４陽性細胞を９６時間培養し、次いで、［３Ｈ］チミジン（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ、ＩＬ、米国）（１ｍｌＣｉ／ウェル）を適用し、ＬＫ  Ｂｅｔａｐｌａｔｅ液体シンチレーションカウンター（Ｗａｌｌａｃｅ、Ｉｎｃ．、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）で取込みを測定した。各条件で９６時間培養した後、ＣＤ１１７ｂｒｉｇｈｔＧＡＴＡ−２ｐｏｓ細胞の比率もフローサイトメトリー法によって定量化した。
【０２０７】
３．ヒト骨髄由来の内皮前駆細胞の化学走性
メンブレン（８ｍｍ孔）（Ｎｅｕｒｏ  Ｐｒｏｂｅ、ＭＤ）を装着した４８穴の走化性チャンバー内に、高度に精製したＣＤ３４＋細胞（＞９８％陽性）を播種した。３７℃にて２時間インキュベートした後、チャンバーを反転させ、０．２、１．０、及び５．０ｍｇ／ｍｌのＩＬ−８、１．０ｍｇ／ｍｌのＳＤＦ−１α／β、ＶＥＧＦ、及びＳＣＦを含有する培地中で３時間にわたり細胞を培養した。前記メンブレンをメタノールを用いて固定し、Ｌｅｕｋｏｓｔａｔ（Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｉｌｌ）で染色した。１０高倍率視野内で遊走する細胞を数えて化学走性を計算した。
【０２０８】
４．動物、外科的処置、ヒト細胞の注入、及び組織への細胞遊走の定量化
Ｒｏｗｅｔｔ（ｒｎｕ／ｒｎｕ）胸腺欠損ヌードラット（Ｈａｒｌａｎ  Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、Ｉｎｄｉａｎａ）を、「Ｃｏｌｕｍｂｉａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ」によって承認された研究に使用した。麻酔後、左開胸を施行し、心膜を開き、左前下行（ＬＡＤ）冠動脈を結紮した。擬似手術したラットには、冠動脈の周囲を縫合しないで同様の外科的処置を施行した。ＬＡＤ結紮から４８時間後に、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ４、ＣＤ３４、ラットＩＬ−８（ＩｍｍｕｎｏＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、日本）及びラットＳＤＦ−１（Ｒ）＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＭＮ）、又はアイソタイプ対照抗体に対して既知の阻害活性を有するｍＡｂの存在下又は不在下で、Ｇ−ＣＳＦ動員後に単一ドナーから取り出したＤｉＩ標識された２．０×１０６のヒトＣＤ３４＋細胞（純度＞９５％、４０％、＜２％）を尾静脈に注入した。対照動物にはＬＡＤ結紮後に生理食塩水を与えた。各グループは６〜１０匹のラットからなる。注入後２日して屠殺したラットの心臓内のＤｉＩ蛍光を評価することによって、ヒト細胞を注入した後の心筋の浸潤の定量化を実施した（1高倍率視野当たりのＤｉＩ陽性な細胞の数として表され、1サンプル当たり最低５視野を調べた）。１２匹のラットにおいて、基準日、２、７、及び１４日目に、ラット骨髄の総集団に対するＨＬＡクラスＩ陽性細胞の比率を、フローサイトメトリー法及びＲＴ−ＰＣＲ法を用いて分析することによってラット骨髄のヒト細胞による浸潤の定量化を実施した。
【０２０９】
５．心筋機能の分析
細胞又は生理食塩水の注入後２、６、及び１５週で、高周波線形配列の変換器（ＳＯＮＯＳ  ５５００、Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ、Ａｎｄｏｖｅｒ、ＭＡ）を用いて、基準時間（ＬＡＤ結紮から４８時間後）に心臓エコー検査を実施した。乳頭の中間と頂端のレベルで２Ｄ画像を撮影した。２方向の面積長さ法（ｂｉ−ｐｌａｎｅ  ａｒｅａ−ｌｅｎｇｔｈ  ｍｅｔｈｏｄ）によって、弛緩期末期（ＥＤＶ）及び収縮期末期（ＥＳＶ）の左心室容積を測定し、左心室駆出率％（ＬＶＥＦ）を［（ＥＤＶ−ＥＳＶ）／ＥＤＶ］×１００として計算した。収縮期末期における左心室面積（ＬＶＡｓ）を、僧帽弁のレベルで心臓エコー検査法によって測定した。ＬＶＥＦの回復及びＬＶＡｓの減少は、ＬＡＤ結紮後の異なる時刻でのＬＶＥＦ又はＬＶＡｓのそれぞれの数値の梗塞前数値に対する平均改善度として計算した。
【０２１０】
６．組織学及び免疫組織化学
ヒト細胞又は生理食塩水を注入後２週及び１５週に、外植されたラットの心臓に対して組織学の研究を実施した。切除後、各実験動物からの左心室を頂端から底部まで１０〜１５の横断切片にスライスした。代表的な切片を組織検査のためにホルマリンに入れ、免疫ペルオキシダーゼ法を用いて抗第ＶＩＩＩ因子ｍＡｂで新たに染色して、毛細血管の密度を定量し、又はマッソントリクロームで染色して検鏡板にのせた。デジタルプラニメーター画像解析装置を用いて、心外膜及び心内膜の両領域を含めた梗塞された表面の長さを測定し、心室総外周に対する百分率で表した。各心臓からの全切片の平均値として、最終的な梗塞サイズを計算した。
【０２１１】
７．ラットのＣＸＣケモカインｍＲＮＡ及びタンパク質発現の測定
３匹の正常なラット及び１２匹のＬＡＤ結紮したラットの心臓から、標準的な方法でＰｏｌｙ（Ａ）＋ｍＲＮＡを抽出した。ＲＴ−ＰＣＲ法を使用して、基準時間、ＬＡＤ結紮してから６、１２、２４、及び４８時間のラットＩＬ−８及びＧｒｏ−αのｍＲＮＡの心筋での発現を、ＧＡＰＤＨの発現によって測定されるラットの全ＲＮＡに対して規格化した後に数量化した。オリゴ（ｄＴ）１５マー及びランダムヘキサマーでプライミングし、Ｍｏｎｏｌｅｙマウスのリンパ増殖性ウイルス逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、米国）で逆転写した後、Ｔａｑポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、米国）、放射標識ジデオキシヌクレオチド（［α３２ｐ］−ｄｄＡＴＰ：３、０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ、Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ、ＩＬ）、並びにラットＩＬ−８、Ｇｒｏ−α及びＧＡＰＤＨに対するプライマー（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｇｅｎｏｓｙｓ、ＣＡ）を用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法でｃＤＮＡを増幅した。ラットのＩＬ−８、Ｇｒｏ−α及びＧＡＰＤＨに対するプライマーペア（センス／アンチセンス）は、それぞれ、ｇａａｇａｔａｇａｔｔｇｃａｃｃｇａｔｇ（配列番号１）／ｃａｔａｇｃｃｔｃｔｃａｃａｔｔｔｃ（配列番号２）、ｇｃｇｃｃｃｇｔｃｃｇｃｃａａｔｇａｇｃｔｇｃｇｃ（配列番号３）／ｃｔｔｇｇｇｇａｃａｃｃｃｔｔｃａｇｃａｔｃｔｔｔｔｇｇ（配列番号４）、及びｃｔｃｔａｃｃｃａｃｇｇｃａａｇｔｔｃａａ（配列番号５）／ｇｇｇａｔｇａｃｃｔｔｇｃｃｃａｃａｇｃ（配列番号６）であった。２％アガロースゲルに標識された試料を加え、電気泳動法によって分離し、Ｘ線撮影のために−７０℃で６時間にわたり露光した。ラットＩＬ−８／ＧｒｏホモログＣＩＮＣ（ＩｍｍｕｎｏＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、日本）に対するポリクロナール抗体を用いた市販のＥＬＩＳＡ法によって、基準時間、ＬＡＤ結紮後６、１２、２４、及び４８時間目に、４匹のラットにおいて、ラットＩＬ−８／Ｇｒｏ−αの血清量を測定した。ラットＩＬ−８／Ｇｒｏ−αタンパク質の既知の量に対して作成された光学濃度（ＯＤ）値の標準曲線に従って、各血清試料中のタンパク質の量を計算した。
【０２１２】
実験手順及び結果
１．内皮前駆細胞の選択的輸送
９８％を超える純度になるように、Ｇ−ＣＳＦによって動員されたヒトＣＤ３４細胞に免疫的選択を施した後、６０〜８０％が幹細胞因子受容体ＣＤ１１７を同時発現した。四重パラメーター解析によって（図７ａ）、ＣＤ１１７ｂｒｉｇｈｔ細胞の１０〜１５％が胚血管芽細胞の表現型特性を示し、転写因子ＧＡＴＡ−２とＧＡＴＡ−３、及び内皮前駆細胞の指標となることが最近示された（７９）ＡＣ１３３と同様に、ＶＥＧＦＲ−２及びＴｉｅ−２の低レベルの表面発現を伴うことが見出された。これらの細胞は、ｖＷＦ、ｅＮＯＳ及びＥ−セレクチンなどの成熟内皮細胞のマーカーを発現していなかったが、ＣＸＣケモカイン受容体１、２、及び４に対しては陽性であった。ＤｉＩ標識された２．０×１０６のヒトＣＤ３４＋細胞（純度＞９８％、４０％、及び２％）をＬＡＤ結紮したＲｏｗｅｔｔヌードラットに静脈内注入すると、４８時間でラット心筋の稠密な浸潤を伴った（図７ｂ）。心臓の局所梗塞に影響されない部位にはＤｉＩ標識細胞はほとんど検出されず（図示せず）、ＤｉＩ標識細胞は擬似手術したラットからの心筋には浸潤しなかった（図７ｂ）ことから、これらのＤｉＩ標識細胞は特に梗塞部位に向けて輸送されていた。９８％を超える純度のヒトＣＤ３４＋細胞を与えたラットは、注入後２週間までに、梗塞床の微小血管分布が増加し、マトリックス沈着及び繊維症が減少することを示した（図７ｃ）。９８％を超える純度のＣＤ３４＋を含む２．０×１０６の細胞を与えたラットの梗塞床においては、２％又は４０％の何れかの純度のＣＤ３４＋を含む２．０×１０６の細胞を与えたラットの類似の領域においてよりも、１高倍率視野当たりの第ＶＩＩＩ因子陽性な毛細血管の数が３倍以上多くなった（ｐ＜０．０１、図7ｃ）。さらに、これらの毛細血管の大多数は、ＨＬＡクラスＩ分子を発現したことからヒト由来であった（図示せず）。このように、ヒト骨髄由来の様々な細胞集団が梗塞床に遊走するが、血管形成には臨界数の内皮前駆細胞が選択的に輸送されることが必要であると考えられる。
【０２１３】
２．梗塞された心筋によるＣＸＣケモカインの産生に対する虚血の影響
ヒト白血球の化学走性及び組織の浸潤は、特異的なケモカインとＣＸＣ細胞表面受容体との相互作用によって制御されるため、本発明者らは次に、梗塞されたラット心筋によって産生されるＣＸＣケモカインへの虚血の影響を検討した。図８ａ〜ｃに見られるように、梗塞された心筋では、ＣＸＣＲ１／２に結合したＥＬＲ陽性のケモカインであるＩＬ−８及びＧｒｏ−αのｍＲＮＡ発現が時間に依存した増加を示し、ＬＡＤ結紮後６〜１２時間で発現が最大となった。非梗塞の心筋と比較して、ＬＡＤ結紮後の組織は、ｍＲＮＡの総含量に対して規格化した後で、これらのＥＬＲ陽性の血管新生誘発性ケモカインの７．２〜７．５倍高いｍＲＮＡ量を発現した（ｐ＜０．００１）。さらに、血清のＩＬ−８のレベルは、ＬＡＤ結紮後６〜１２時間以内に８〜１０倍増加し（ｐ＜０．００１）、４８時間でもなお増加したままであった（図８ｄ）。ＩＬ−８又はＧｒｏ−αの何れかに対する、又はこれらの血管新生誘発性ケモカインの表面受容体（ＣＸＣＲ１又はＣＸＣＲ２）に対する遮断ｍＡｂを同時投与すると、ヒト血管芽細胞の心筋での輸送を対照抗体に比較して４０〜６０％低下させた（ｐ＜０．０１、図８Ｅ）。
【０２１４】
３．ケモカインに対するヒト骨髄由来ＣＤ３４＋血管芽細胞の化学走性応答
その後の実験で、本発明者らはヒト骨髄由来ＣＤ３４＋血管芽細胞のＩＬ−８に対するインビトロ及びインビボでの化学走性応答を直接測定した。図９ａに示すように、ヒトＣＤ３４＋細胞のインビトロでの化学走性は、濃度０．２〜５μ／ｍｌのＩＬ−８によって、用量に依存して誘導された。骨髄間質細胞によって恒常的に産生されるＥＬＲ−ケモカインであるＳＤＦ−1は、ＩＬ−８と類似の濃度にて、ほぼ同程度のＣＤ３４＋細胞の化学走性を誘導した（図９ｂ）。これに対して、増殖因子ＶＥＧＦ又は幹細胞因子（ＳＣＦ）によっては、化学走性は誘導されなかった。さらに、ＩＬ−８を１μｇ／ｍｌだけ非梗塞の心臓内に注入すると、ＣＤ３４＋細胞のインビボでの化学走性を誘導したが（図９ｃ）、対照として用いたＶＥＧＦ及びＳＣＦは何れもインビボでの化学走性に何ら効果がなかった（図９ｄ）。これらの結果を総合すると、ＥＬＲ陽性なケモカインの組織発現が亢進されると、骨髄由来の内皮前駆細胞の組織虚血部位への化学走性を誘導することによって、インビボでの血管形成が増強されることが示唆される。
【０２１５】
４．骨髄から心筋へのヒトＣＤ３４陽性細胞の輸送を再誘導するためのＣＸＣＲ４／ＳＤＦ−１相互作用の遮断
ＬＡＤ結紮したラットからの虚血性の血清は、静脈内に注入したヒトＣＤ３４＋血管芽細胞が損傷した心筋へ輸送されるのを増強するうえに、ＣＤ３４＋ＣＤ１１７ｂｒｉｇｈｔ血管芽細胞集団の循環を急速に増大させ、同時にこれらの細胞の骨髄への輸送を増加させた。図１０ａに示すように、ＶＥＧＦ又は虚血の血清の何れかを２日間培養すると、ＣＤ３４＋ＣＤ１１７ｂｒｉｇｈｔ血管芽細胞の増殖を、それぞれ２．８倍及び４．３倍に増加させた（ｐ＜０．０１）。さらに、図１０ｂに示すように、２×１０６のヒトＣＤ３４陽性細胞（純度＞９５％）を静脈内に注入後２〜１４日で、ＬＡＤ結紮後の虚血ラットから得た骨髄は、正常なラットの骨髄と比較して、５〜８倍高いレベルのヒトＣＤ３４＋ＣＤ１１７ｂｒｉｇｈｔ血管芽細胞を含有していた（ｐ＜０．００１）。ＳＤＦ−１は骨髄間質細胞によって恒常的に発現され、活発に循環している循環ＣＤ３４＋細胞の骨髄での遊走を優先的に促進するため（８０）、本発明者らは、ヒトＣＤ３４＋ＣＤ１１７ｂｒｉｇｈｔ血管芽細胞の虚血ラット骨髄へのホーミングの増加が、ＳＤＦ−１／ＣＸＣＲ４相互作用の増大のためかどうかを検討した。図１０ｃに示すように、ヒトＣＸＣＲ４又はラットＳＤＦ−１に対するｍＡｂの同時投与は、抗ＣＤ３４対照抗体と比較して、静脈内投与されたＣＤ３４＋ヒト血管芽細胞の虚血ラット骨髄への遊走を著しく阻害した（いずれもｐ＜０．００１）。さらに、ヒトＣＸＣＲ４又はラットＳＤＦ−１に対するｍＡｂの同時投与は、ＣＤ３４＋ヒト血管芽細胞の虚血ラット心筋への輸送を、それぞれ平均２４％及び１７％増加させた（いずれもｐ＜０．００１、図１０ｄ）。２週までには、ヒトＣＤ３４＋細胞を抗ＣＸＣＲ４ｍＡｂと組合せて与えたラットの心筋梗塞床は、ＣＤ３４＋細胞をアイソタイプの対照抗体と組合せて与えたラットの心筋梗塞床と比較して、微小血管分布が３倍超の増加を示した。これらの結果から、静脈内注入したＣＤ３４＋血管芽細胞は梗塞心筋へ輸送され、ＥＬＲ＋のケモカインの産生が増大するのに応答して血管形成を誘導するが、このプロセスの効率は、血管芽細胞の骨髄へのＳＤＦ−１応答性の遊走が伴うことによって著しく低下することが示唆される。ＣＸＣＲ４／ＳＤＦ−１相互作用を遮断すると、梗塞後に、拡大され循環するヒトＣＤ３４陽性細胞集団の骨髄から心筋への輸送を再誘導し、その結果、梗塞床の新血管新生を増強させる。
【０２１６】
５．心筋機能の改善
ＬＡＤ結紮後、左心室機能は極度に低下するが、９８％を超える純度のＣＤ３４＋細胞を注入すると２週間以内に左心室の大きさと機能に顕著な回復を伴い、これらの効果は経過観察した１５週の全期間にわたり持続した（図１１ａ及びｂ）。９８％を超える純度のＣＤ３４＋細胞を与えたラットでは、左心室の収縮期末期の面積が梗塞直後に比べて１５週までに平均３７±６％だけ減少し（図１１ａ）、左心室駆出率（ＬＶＥＦ）は、１５週までに平均３４±４％だけ回復した（図１１ｂ、ｐ＜０．００１）。純度２％又は４０％のＣＤ３４＋を含む、Ｇ−ＣＳＦによって動員された２×１０６のヒト細胞の静脈内注入が、虚血心筋へのほぼ同程度の輸送にもかかわらず心筋機能を顕著には改善しなかったことから、これらのパラメーターの改善は、注入されたＣＤ３４＋細胞の数に依存する（図１１ａ及びｂ）。しかし、純度４０％のＣＤ３４＋を含む、Ｇ−ＣＳＦによって動員されたヒト骨髄由来の細胞と共に、抗ＣＸＣＲ４ｍＡｂを同時投与すると、９８％を超える純度のＣＤ３４＋で観察されるレベルまで、ＬＶＥＦの回復が顕著に改善しＬＶＡｓが顕著に減少した。トリクローム染色によって、左心室の塊及びコラーゲン沈着における顕著な差異がこれらのグループ間に観察された（図１１ｃ）。純度２％のＣＤ３４を含む２×１０６のヒト細胞を与えたラットでは、左心室の前壁が繊維組織によって完全に入れ替わり、中隔の著しい代償性肥大が存在した。純度４０％のＣＤ３４を含む２×１０６のヒト細胞を与えたラットの心臓でも同様の変化が見られた。これに対して、９８％を超える純度のＣＤ３４＋を含む２×１０６のヒト細胞を与えたラットの心臓では、これより著しく大きな前壁の塊が維持され、中隔の大きさは正常であり、コラーゲンの沈着は最小限であった。特に興味深いことには、純度４０％のＣＤ３４を含む２×１０６のヒト細胞を抗ＣＸＣＲ４ｍＡｂと共に与えたラットの心臓も、同様に、心筋前壁の塊の増加、中隔肥大の減少、及びコラーゲン沈着の減少を示した。総合すると、繊維性瘢痕／正常左心室心筋の平均比率は、純度２％及び４０％のＣＤ３４＋細胞を与えたラットが３６〜４５％であるのに対して、９８％を超える純度のＣＤ３４＋細胞を与えたラット、又は純度４０％のＣＤ３４＋細胞を抗ＣＸＣＲ４ｍＡｂと共に注入したラットでは、それぞれ、１３％及び２１％であった（ｐ＜０．０１、図１１ｄ）。したがって、臨界数の内皮前駆細胞の選択的な輸送を増大することによって梗塞床の血管形成が増強されると、組織修復のプロセスがさらに抑制され、生存可能な心筋を救出し、心臓機能を改善することになる。
【０２１７】
考察
本研究は、虚血組織によって産生されるＥＬＲ＋ケモカインが、骨髄由来の内皮細胞前駆細胞に対して化学遊走物質の濃度勾配を生じることによって、虚血部位での代償的な血管形成の進展を制御することを実証するものである。ＥＬＲ＋ＣＸＣケモカインであるＩＬ−８とＥＬＲ−ＣＸＣケモカインであるＳＤＦ−１は何れも、ＣＤ３４＋内皮前駆細胞の化学走性、並びに成熟内皮に対して同様の効果を示すが（７３）、異なる血管外の部位で発現すると、内皮前駆細胞の方向性の出現に対してそれらは生物学的に相反する影響を及ぼし、その結果、組織の新血管新生に対してもそれらは生物学的に相反する影響を及ぼす。これらの相互作用を理解することで、本発明者らは、心筋での輸送を増加させ、梗塞床の血管形成を誘導し、虚血後の心室の組織修復を抑制し、心筋機能を改善するために、ヒト骨髄由来のＣＤ３４＋細胞の特異的なサブセットの化学走性特性を操作し増強することができた。
【０２１８】
基底膜を通る骨髄由来の前駆細胞の遊走は、メタロプロテイナーゼ−９（ＭＭＰ−９、ゼラチナーゼＢ）などのタンパク質分解酵素の分泌に依存するため（８１）、心臓内のメタロプロテイナーゼの活性が、血管芽細胞の循環からの血管外遊出及び梗塞域内への経内皮遊走を決定する重要な要因かもしれない。ＩＬ−８は、好中球中の細胞内貯蔵顆粒から潜在型ＭＭＰ−９を迅速に（２０分以内）放出するように誘導し（８２〜８３）、非ヒト霊長類におけるインビボでの静脈内投与後、血清のＭＭＰ−９のレベルを最大１０００倍増加させる（８４）。ＩＬ−８は骨髄前駆細胞におけるＭＭＰ−９の発現を顕著に増加させ（８１）、ＭＣＰ−９に対する中和抗体は骨髄前駆細胞の遊走を抑制するため（８５）、本発明者らの研究の結果は、血管芽細胞の浸潤とその後の梗塞床の血管形成が、ＩＬ−８に依存したＭＭＰ−９分泌の増加に起因するかもしれないことを示唆している。
【０２１９】
潜在型ＭＭＰ−９の活性化及びこれと同時に起こるマウスの心筋梗塞瘢痕組織内の新血管新生は、梗塞床に浸潤する骨髄前駆細胞によって同時発現されるウロキナーゼタイプのプラスミノゲン活性化因子（ｕ−ＰＡ）に依存することが示された（８１）。ヒト細胞内のｕ−ＰＡの転写及びタンパク質分解活性は、Ｇ−ＣＳＦ及び他のコロニー刺激因子によって顕著に増加する（８６〜８８）。ＩＬ−８によって誘導される化学走性及び前駆細胞の遊走には、機能性Ｇ−ＣＳＦ受容体を介して送達されるシグナルの存在がさらに必要とされるため（８９）、ＩＬ−８によって媒介される虚血部位への血管芽細胞の輸送にはｕ−ＰＡ活性の増加が必要である可能性がある。このことは、ＩＬ−８が高レベルで産生されたにもかかわらず、心筋梗塞後に通常観察される梗塞床における新血管新生の程度が限られていたこと（６２、６３）を説明すると思われるし、さらに虚血組織の血行再建術治療に使用するためにコロニー刺激因子をインビボ投与又はエクソビボ投与してヒト骨髄由来の血管芽細胞を動員し分化させることに理論的根拠を与える。
【０２２０】
ＣＸＣケモカインであるＳＤＦ−１の骨髄間質細胞による恒常的な産生は、造血前駆細胞の骨髄へのホーミング及び移植にとって必須であると考えられる（７６〜７８）。さらに、ＳＤＦ−１  −／−マウスは胃腸管の血管新生（５０）及び心室中隔の形成（９０）の両者に欠陥があるため、非造血組織におけるＳＤＦ−１の発現は発達中の血管系において役割を果たす。骨髄由来の内皮前駆細胞はＣＸＣＲ４を発現し（８０）、本明細書で示すようにＳＤＦ−１に対して化学走性の応答を示すため、胚形成中又は組織損傷後に、非造血部位でのＳＤＦ−１の発現が誘導されることは、組織の新血管新生のプロセスにおいて重要な要素であるかもしれない（９１）。ＣＸＣＲ４／ＳＤＦ−１相互作用の遮断によって、本発明者らがヒト骨髄由来の血管芽細胞の組織虚血部位への輸送を再誘導することができたということは、ＳＤＦ−１がヒト内皮前駆細胞に対する生物学的に活性な化学走性因子であること、並びにそれが非造血部位で発現されると血管新生誘発活性を有するかもしれないことを強く主張するものである。虚血組織部位におけるＳＤＦ−１及び他のケモカインの発現の増大及び局在化が、血管形成を増強する上でＥＬＲ＋ＣＸＣケモカインと相乗的であり得るか否かは、将来の研究課題であろう。総合すると、本研究の結果は、ＩＬ−８、Ｇｒｏ−α、及びＳＤＦ−１を含むＣＸＣケモカインがヒト骨髄に依存する血管形成を制御する際に中心的な役割を果たすこと、さらに、これらのケモカインとヒト骨髄由来の自家血管芽細胞上に存在するそれらの受容体との相互作用を操作することは、組織虚血後の治療的血管形成の潜在的な効力を増強できることを示唆するものである。
【０２２１】
第３群の実験
実験方法と結果
１．心筋虚血は、ＣＣケモカイン産生を誘導してヒトＣＤ３４＋血管芽細胞のＣＣケモカイン受容体の発現を増加させる
ヒト単核細胞の化学走性及び組織浸潤は細胞表面受容体と特定のケモカインリガンドとの相互作用によって制御されるので、血管芽細胞のＣＣケモカイン受容体発現及び梗塞ラット心筋によるＣＣケモカイン産生の速度論に対する虚血の影響を研究した。図１２に示したように、ＬＡＤ結紮ラットの血清と共にＣＤ３４＋ＣＤ１１７ｂｒｉｇｈｔ血管芽細胞を培養すると、ＣＣＲ１及びＣＣＲ２の表面発現は増加したが、ＣＣＲ３及びＣＣＲ５の表面発現に変化はなかった。
【０２２２】
図１３に示したように、梗塞した心筋では、時間に応じていくつかのＣＣＲ−結合ケモカインのｍＲＮＡ発現が増加することが示された。梗塞した心筋では、総ｍＲＮＡ含量で正規化したところ（全てｐ＜０．００１）、ＣＣＲ−２結合ＣＣケモカインＭＣＰ−１が８倍を上回る濃度で発現し、ＭＣＰ−３およびＲＡＮＴＥＳのｍＲＮＡが３〜３．５倍高い濃度で発現し、ＣＣＲ−３結合ケモカインエオタキシンも発現することが発見された。研究した梗塞組織全てにおいて、これらのＣＣケモカイン類の発現増加が示されたが、ＣＣＲ５−結合ＣＣケモカインＭＩＰ−１アルファ又はＭＩＰ−１ベータの発現誘導は示されなかったので、この遺伝子発現パターンは比較的特異的なものと考えられる。
【０２２３】
２．虚血性心筋へのヒトＣＤ３４＋血管芽細胞の輸送は、ＣＣ及びＣＸＣケモカイン類の誘導発現によって調節される
次に、虚血性心筋へのヒトの血管芽細胞の輸送が、前記で確認したＣＣケモカインの誘導発現と関連するかどうかについて研究した。ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−３、及びＲＡＮＴＥＳに対する遮断ｍＡｂ、又はエオタキシンに対する遮断ｍＡｂを同時投与すると、ヒトの血管芽細胞の心筋への輸送が対照抗体と比較して４０−６０％減少した（ｐ＜０．０１）、（図１４）。ＣＣケモカインが血管芽細胞の虚血性心筋への化学走性を媒介することを証明するために、エオタキシンに応じた血管芽細胞の化学走性をインビボで測定した。図１５に示したように、心臓の非梗塞部にエオタキシンを心臓内注射すると、ＣＤ３４＋血管芽細胞輸送の１．５−１．７倍の増加が誘導されたが、成長因子ＶＥＧＦ及び幹細胞因子を注射しても、血管芽細胞増殖は増加するものの化学走性に何ら影響はなかった（図示せず）。
【０２２４】
第４群の実験
筋細胞の大きさの決定。正常なラットの心臓及び梗塞組織切片の梗塞部位並びに梗塞周囲縁、遠位部の筋細胞をトリクローム染色して、大きさを測定した。１０−１５倍の高倍率視野の各々について１００〜２００個の筋細胞の横径及び縦径（ｍｍ）をイメージプロプラスソフトウェアを用いて４００ｘで測定した。
【０２２５】
パラフィン組織切片のＤＮＡ末端標識による筋細胞アポトーシスの測定
単一細胞レベルにおけるアポトーシスをｉｎ  ｓｉｔｕで検出するために、デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）によるＤＮＡ末端標識、ＴＵＮＥＬ法を用いた（ベーリンガーマンハイム、ドイツ・マンハイム）。生理食塩液又はＣＤ３４＋ヒト細胞のいずれかを注射して２週間後のＬＡＤ結紮ラット及び陰性対照として健康なラットから、ラットの心筋組織切片を切除した。簡単に説明すると、組織を脱パラフィン化してプロティナーゼＫで消化し、３７℃で６０分間、浸潤雰囲気中でＴｄＴ及びフルオレセイン標識ｄＵＴＰとインキュベートした。フルオレセイン特異的抗体複合アルカリホスファターゼで３０分間インキュベーションした後、ＤＮＡが断片化された核を青色に染色して、ＴＵＮＥＬ染色を視覚化した。
【０２２６】
１．新血管新生は肥大した心筋をアポトーシスから保護する
新血管新生を誘導して心臓機能の改善をもたらす機構を研究した。ＬＡＤ結紮後２週間経つと、生理食塩水対照群の梗塞周囲縁の筋細胞の外観はゆがんで形が不規則となり、筋細胞の直径は梗塞のないラットと同様となることが（０．０２０ｍｍ＋／−０．００２  対  ０．０１９ｍｍ＋／−０．００１）結果から示された。一方、ＣＤ３４＋細胞を投与したラットの梗塞周囲縁の筋細胞の形は規則正しい楕円形をしており、対照群ラットの筋細胞より有意に大きかった（直径０．０３６ｍｍ＋／−０．００４  対  ０．０１９ｍｍ＋／−０．００１、ｐ＜０．０１）。筋細胞特異的マーカーであるデスミンの染色及びＤＮＡ末端標識を同時に行うと、ＣＤ３４＋細胞を注射したラットの梗塞した左心室では、生理食塩液対照群と比較すると、検出されたアポトーシスした筋細胞の数は６分の１であった（アポトーシス指数１．２＋０．６対７．１＋０．７、ｐ＜０．０１）。これらの差は梗塞周囲縁内において特に顕著で、生理食塩水処理対照群の形状の不規則な小筋細胞は、アポトーシス核指数が最高であった。また、生理食塩水対照群では左心室壁の７５〜８０％に筋細胞のアポトーシスが広がっていたが、ＣＤ３４＋細胞を注射したラットでは、筋細胞のアポトーシスは梗塞部から遠位の左心室の最大２０〜２５％に検出されたにすぎなかった。これらの結果を総合すると、ＣＤ３４＋細胞注射によって誘導された梗塞領域の血管形成及び梗塞周囲の血管新生は、生理食塩水対照群において明らかな遠心性に広がるアポトーシス誘発プロセスを阻止して、梗塞周囲領域内の肥大した心筋の生存を可能にし、心筋機能を改善する。
【０２２７】
２．早期の新血管新生は後期の心筋組織修復を予防する
最後の実験群によって、対照群および実験群（生理食塩液対ＣＤ３４＋細胞）における２週間後の梗塞周囲縁の筋細胞のアポトーシスの程度と、その後４ヶ月にわたる心筋の組織修復の進行との比較を明らかにした。ＬＶＥＦが初期に減少し、ＬＶＡＳが増加することは同じであるが、２週間後のコラーゲン沈着又は瘢痕組織／正常な左心室心筋の平均比率は、マッソントリクローム染色によって確認したところ、生理食塩水を投与したラットでは１２％であったのに対しＣＤ３４＋細胞を投与されたラットでは３％であった。梗塞して１５週間後では、瘢痕／正常な左心室心筋の平均比率は、ＣＤ３４＋細胞を投与したラットでは１３％であったのに対して、それ以外の実験群（生理食塩水、ＣＤ３４−、ＳＶＥＣ）ではいずれも３６−４５％であった（ｐ＜０．０１）。ＣＤ３４＋細胞を投与したラットでは、ラット由来の筋細胞のみを含む前自由壁内に、生存可能な心筋量の有意な増加が示され、ヒトではなくラットのＭＨＣ分子を発現していることから、筋細胞はヒト幹細胞前駆体から再分化するのではなく本来の筋細胞を再利用することが確かめられた。対照群では、左心室壁厚のほとんど全体に渡ってコラーゲン沈着および瘢痕形成が広がっており、動脈瘤性拡張および典型的なＥＫＧ異常をともなっているが、ＣＤ３４＋細胞を投与したラットでは、左心室壁の壁厚の２０〜５０％のみに広がっていた。さらに、非梗塞領域における病的なコラーゲン沈着は、ＣＤ３４＋細胞を投与したラットでは著しく減少した。これらの結果を考え合わせると、２週間後に梗塞周囲の筋細胞においてアポトーシスの減少が観察されたことによって、肥大しているが生存可能な筋細胞の生存が延長され、１５週間後までに心筋とコラーゲン及び線維組織との置換が阻止されることが示された。
【０２２８】
考察
梗塞周囲縁および筋細胞間で増殖した毛細血管がラット由来であることが観察され、血管形成に加えて、ヒトの血管芽細胞又は同時投与したその他の骨髄由来因子は、血管新生誘発因子の豊富な発生源となることが可能で、既存の脈管系からさらに血管新生を誘導することを可能にすることを示している。
【参照文献】
【０２２９】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図６Ｇ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成25年9月4日(2013.9.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者の虚血によって損傷を受けた組織への内皮前駆細胞の輸送を増加させるための医薬の製造方法における、間質由来因子−１（ＳＤＦ−１）の使用。
【請求項２】
請求項１に記載の使用であって、前記ＳＤＦ−１がＳＤＦ−１αである使用。
【請求項３】
請求項１に記載の使用であって、前記ＳＤＦ−１がＳＤＦ−１βである使用。
【請求項４】
請求項１に記載の使用であって、前記虚血によって損傷を受けた組織が虚血心筋であり、前記内皮細胞前駆体細胞の前記虚血心筋への増加した輸送が、前記患者の虚血心筋における心臓機能を改善する請求項１の使用。
【請求項５】
請求項１に記載の使用であって、前記医薬が、末梢循環、心筋、左心室、右心室、冠動脈、脳脊髄液、または神経組織中への注射によって前記患者に投与されるべきでものである使用。
【請求項６】
請求項１に記載の使用であって、前記医薬は、心筋梗塞、慢性心不全、虚血性心疾患、冠動脈疾患、糖尿病性心疾患、出血性卒中、血栓性卒中、塞栓性卒中、虚血肢、又は組織が虚血になるその他の疾病の１以上に罹患したことがある、又は罹患している患者に投与されるべきものである使用。
【請求項７】
請求項１に記載の使用であって、前記医薬は、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤の阻害剤、アンギオテンシン変換酵素阻害剤、又はβ−遮断薬と共に投与されるべきものである使用。
【外国語明細書】
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