(57)【要約】      （修正有）【課題】虚血に関連する医学的状態の治療のための、特定な配列のアミ酸配列からなるポリペプチド、および、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの提供。【解決手段】２つのサブユニットからなるヘテロダイマー転写因子である低酸素誘導因子１（ＨＩＦ−１)の内の、サブユニットαからなるＨＩＦ−１αのアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチド。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号４の少なくとも一つのコピーを含む、内皮細胞特異的プロモーター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリペプチド、および、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および、虚血に関連する医学的状態の治療におけるそれらの使用に関連する。
【背景技術】
【０００２】
血管形成は、新しい血管が既存の血管から出芽することである。血管形成が、様々な生理学的状態（例えば、女性の生殖周期など）において、同様にまた、腫瘍、組織虚血および創傷治癒を含む病理学的状態において生じる。
【０００３】
虚血性心疾患は多くの工業国における死亡の主要な原因であり、米国だけでも毎年５０００００人を越える死亡に関わっている。現在の治療選択肢には、薬物療法、冠動脈血管形成、および、より侵襲的な冠動脈バイパス移植（ＣＡＢＧ）が含まれる。
【０００４】
しかしながら、これらすべての場合において、関与する動脈のサイズ、適切な遠位血管系がないこと、閉塞を引き起こす動脈病変の複雑さ、および、患者の全身的な臨床的状態をはじめとする様々な技術的問題により、多くの場合、虚血組織の血管再生が妨げられている。
【０００５】
近年に開発されたあまり侵襲的でない方法が治療的血管形成である。この用語は、虚血組織の血管新生を高め、従って、これにより、虚血を緩和することを目的とする前血管形成（ｐｒｏａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ）因子の導入を示す。２つの主要な方法が治療的血管形成の分野では利用されている：第１の方法が、様々なサイトカインを送達するために、裸のＤＮＡの形態であるか、または、ウイルスビヒクルによるかのどちらかでの血管形成遺伝子治療であり、この場合、最も一般に使用されるのが血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）および線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）である。より近年の方法が、完全に分化した細胞、内皮前駆細胞または間葉系幹細胞による細胞治療である。両方の方法は、動物モデルおよび初期臨床試験における成功が示されている。
【０００６】
しかしながら、治療的血管形成が、虚血性疾患を患う患者のための実際の臨床的代替法となる前には、多くの障害が依然として克服されなければならない。
【０００７】
血管形成遺伝子治療についての障害として、導入遺伝子の発現の組織特異性が必要であること、送達ビヒクルの選択、用量および時期の最適化、投与経路の最適化、ならびに、有害な事象（例えば、浮腫および腫瘍の発生など）の潜在的可能性がある。
【０００８】
血管形成遺伝子治療の成功に対する別の制限は、新たに形成された血管の成熟化およびそれに続くそれらの退行がないことであり、従って、このことが、有意な長期の治療効果を妨げている。これは、送達された血管形成遺伝子が、比較的短い期間にだけ発現されるためであり、そのため血管の成熟化および平滑筋細胞の動員が生じることが不可能になる。または、血管の成熟化が生じるために多数の血管形成因子が要求されるためであり得る。１つの考えられる解決策は、多数の血管形成因子を同時に活性化する上流側の血管形成調節因子を使用し、従って、これにより、生理学的な血管形成により類似させることである。そのような因子が低酸素誘導因子１（ＨＩＦ−１）である。
【０００９】
低酸素誘導因子−１（ＨＩＦ−１）は、４０を越える遺伝子を低酸素時に活性化する転写因子であり、かつ、酸素欠乏に対する応答の支配的調節因子である。ＨＩＦ−１は、２つのサブユニットからなるヘテロダイマー転写因子である；サブユニットαが酸素のレベルによる厳格な調節を受け、低酸素期間中に誘導され、これに対して、サブユニットβが、酸素圧にかかわらず、構成的に発現される。
【００１０】
ＨＩＦ−１αは２つのトランス活性化ドメイン（Ｎ−ＴＡＤおよびＣ−ＴＡＤ）および酸素依存的分解ドメイン（ＯＤＤＤ）を含有する。タンパク質のフォン・ヒッペル・リンドウ（ＶＨＬ）が正常酸素圧状態のもとではＨＩＦ−１αのＯＤＤＤと相互作用し、Ｅ３−ユビキチンリガーゼ複合体の一部として作用し、従って、ＨＩＦ−１αをプロテオソームでの分解に送る。低酸素では、ＨＩＦ−１αはＨＩＦ−１βと二量体化し、核におけるその標的遺伝子の転写を活性化する。
【００１１】
近年、ＨＩＦ−１αとのＶＨＬの相互作用がＨＩＦ−１αタンパク質内の２つの特定の残基のプロリルヒドロキシル化によって可能になることが示された（Ｅｐｓｔｅｉｎ，Ａ．Ｃ．ら、２００１、Ｃｅｌｌ、１０７、４３−５４；Ｍａｓｓｏｎ，Ｎ．ら、Ｅｍｂｏ  Ｊ、２０、５１９７−２０６）。
【００１２】
３つのプロリルヒドロキシラーゼ（ＰＨＤ１−３）が、ＨＩＦ−１αを正常酸素圧時にヒドロキシル化することが見出された。ＰＨＤ１およびＰＨＤ２が残基４０２および残基５６４においてヒドロキシル化し、これに対して、ＰＨＤ３は残基５６４においてのみヒドロキシル化する。
【００１３】
ＨＩＦ−１αを調節する別の機構が２００２年に発見された（Ｌａｎｄｏ，Ｄ．ら、２００２、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９５、８５８−６１）。この機構には、残基８０３におけるＨＩＦ−１αのアスパラギニルヒドロキシル化が含まれる。それは、アスパラギニルヒドロキシラーゼ（これはＨＩＦ−１阻害因子（ＦＩＨ−１）とも呼ばれる）によって行われる。このヒドロキシル化は、ＨＩＦ−１αが補因子ｐ３００と相互作用することを妨げ、従って、これにより、ＨＩＦ−１αの転写活性を妨害する。
【００１４】
従って、正常酸素圧の期間中、２つの調節機構がＨＩＦ−１α活性における低下に関わっている。一方が、プロリルヒドロキシル化によってその安定性に関係し、他方が、アスパラギニルヒドロキシル化によってその転写活性化に関係する。
【００１５】
これらのプロリルヒドロキシラーゼおよびアスパラギニルヒドロキシラーゼはすべてが、２−オキソグルタル酸および鉄に依存するジオキシゲナーゼであり、細胞の酸素についてのそれらの要求が、酸素センサーとしてのそれらの活性の基礎を提供し得る。
【００１６】
残基４０２および残基５６４における２つの特異的な点変異が、ＶＨＬとのＨＩＦ−１αの相互作用をなくし、従って、これにより、ＨＩＦ−１αを構成的に安定にすることが明らかにされた（Ｍａｓｓｏｎら、２００１、Ｅｍｂｏ  Ｊ、２０、５１９７−２０６）。得られる変異型ＨＩＦ−１αは、ＨＲＥ−ルシフェラーゼ構築物の発現を行わせることにおいて低酸素処理と同じくらい活性であった。残基５６４および残基８０３における２つの変異は、ＨＩＦ−１αに完全な転写活性を与え、この転写活性が、低酸素模倣鉄キレート剤の２，２’−ジピリジルによる処理によって得られる転写活性と類似していることが示された（Ｌａｎｄｏら、２００２、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９５、８５８−６１）。
【００１７】
残基４０１−残基６０２が欠失される変異型ｈＨＩＦ−１αをケラチン１４プロモーターの調節下で過剰発現するトランスジェニックマウスは、皮膚における血管化の増大を示した（Ｅｌｓｏｎ，Ｄ．Ａ．ら、２００１、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ、１５、２５２０−３２）。これらのマウスは、Ｇｌｕｔ−１およびＶＥＧＦ（ＨＩＦ−１αの公知の標的）のｍＲＮＡのアップレギュレーションを示した。ＶＥＧＦを過剰発現するマウスとの比較において、これらのマウスは、漏れが少なく、また、より成熟度が増加した血管を有していた。このことは、ＨＩＦ−１αが、ＶＥＧＦ単独とは対照的に、生理学的な血管形成応答と類似する、多数の血管形成因子（すなわち、エリスロポイエチン）の活性化を誘導するという事実によって説明することができる。加えて、ＨＩＦ−１αにより、ＶＥＧＦの多くのイソ型および他の遺伝子の活性化が誘導され、このような活性化は、単一のイソ型の投与によって達成することができない生理学的応答にもよく類似する。
【００１８】
ＨＩＦ−１αの構成的に活性な形態が、血管形成遺伝子治療において２０００年に最初に試験された（Ｖｉｎｃｅｎｔ，Ｋ．Ａ．ら、２０００、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、１０２、２２５５−６１）。これは、ＣＭＶプロモーターの調節下の単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）のトランス活性化ドメインＶＰ１６に結合されたＨＩＦ−１αのＤＮＡ結合ドメインおよび二量体化ドメインを含有した。得られた変異体はＨＩＦ標的遺伝子をインビトロで誘導することができた。裸のＤＮＡとして局所投与されたとき、この変異体は、毛細管密度の増大および血液灌流をマウスの後肢虚血モデルにおいて引き起こした。この同じ構築物はまた、ラットＭＩモデルにおいて筋肉内注入されたとき、治療効果を示した（Ｓｈｙｕ，Ｋ．Ｇ．ら、２００２、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｒｅｓ、５４、５７６−８３）。
【００１９】
残基４０１−残基６０２の欠失を有する構成的に活性な変異型ＨＩＦ−１αをＣＭＶプロモーターの調節下で発現するアデノウイルスは、血管形成を網膜の非虚血組織において誘導することができた（Ｋｅｌｌｙ，Ｂ．Ｄ．ら、２００３、Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ、９３、１０７４−８１）。
【００２０】
上記２つの構築物はＨＩＦ−１α分子の大きな欠損を有し、また、生来的なＨＩＦ−１αのトランス活性化ドメイン（Ｎ−ＴＡＤおよびＣ−ＴＡＤ）の一方または両方を有しておらず、そのため、これらはＨＩＦ−１αの低下した活性化能および特異性をもたらし得る。加えて、ＨＩＦ−１αがこれらの構築物ではＣＭＶ（万能的かつ非特異的なプロモーター）の調節下で発現されるが、このことにより、その適用が、非特異的な発現および起こり得る副作用のために制限され得る。
【００２１】
様々な投与経路が、末梢虚血の場合における血管内および筋肉内、ならびに、心筋虚血の場合における心筋内、心膜内および冠動脈内を含めて、治療遺伝子を虚血領域に送達するためにこれまで使用されている。静脈内経路では、侵襲的手法の必要がない容易な手段、技術的安全性および低コスト、ならびに、大きな患者集団に対して使用できることを含む様々な利点がもたらされる。しかしながら、その明白な臨床的魅力にもかかわらず、この投与経路の使用は一般的ではない。これは、ベクターの全身的分布のために、標的器官における導入遺伝子の発現が低く、全身的副作用を生じさせる非標的器官における望まれない発現を伴い、これにより、投与され得る用量が制限されるからである。この制限は結果的には、治療の効力を制限する傾向がある。前血管形成遺伝子の望まれない発現は、腫瘍の発現および網膜症を引き起こす病理学的血管形成を誘導する可能性があり、従って、許容され得ない場合がある。従って、導入遺伝子の発現を虚血性の標的器官に対して特異的に導く能力が、全身的投与が有効かつ安全であるために最も重要なことである。
【００２２】
従って、前血管形成因子、ならびに、前血管形成因子を送達する安全かつ効果的な方法が必要であることが広く認識されており、また、前血管形成因子、ならびに、前血管形成因子を送達する安全かつ効果的な方法を有することが非常に好都合である。
【発明の概要】
【００２３】
本発明の１つの局面によれば、安定的に発現され、かつ、構成的に活性である、ＨＩＦ−１αのアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチドが提供される。
【００２４】
下記に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、核酸配列は、配列番号１に示される通りである。
【００２５】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、アミノ酸配列は、配列番号２に示される通りである。
【００２６】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、アミノ酸配列は配列番号３に対して少なくとも９０％相同的であり、かつ、配列番号３のプロリン４０２に対応する位置での変異、配列番号３の５６４におけるプロリンに対応する位置での変異、および、配列番号３のアスパラギン８０３に対応する位置での変異を含む。
【００２７】
本発明の別の局面によれば、安定的に発現され、かつ、構成的に活性である、ＨＩＦ−１αのアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドが提供される。
【００２８】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、アミノ酸配列は、配列番号２に示される通りである。
【００２９】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、アミノ酸配列は配列番号３に対して少なくとも９０％相同的であり、かつ、配列番号３のプロリン４０２に対応する位置での変異、配列番号３の５６４におけるプロリンに対応する位置での変異、および、配列番号３のアスパラギン８０３に対応する位置での変異を含む。
【００３０】
本発明の別の局面によれば、本発明のポリヌクレオチドを含む核酸構築物が提供される。
【００３１】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、核酸構築物はさらに、シス調節エレメントを含む。
【００３２】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、シス調節エレメントはプロモーターエレメントを含む。
【００３３】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、プロモーターエレメントは内皮特異的プロモーターエレメントである。
【００３４】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、内皮特異的プロモーターエレメントは少なくとも１コピーのＰＰＥ−１プロモーターを含む。
【００３５】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、ＰＰＥ−１プロモーターは、配列番号４に示される通りである。
【００３６】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、シス調節エレメントはさらに、低酸素応答エレメントを含む。
【００３７】
本発明のさらに別の局面によれば、前記核酸構築物を含む細胞が提供される。
【００３８】
本発明のなおさらに別の局面によれば、前記核酸構築物を活性な作用因として含み、かつ、医薬的に許容され得るキャリアを含む医薬組成物が提供される。
【００３９】
本発明のさらなる局面によれば、低酸素または虚血、すなわち、組織灌流封入低下または「低い流量」に関連する医学的状態を治療する方法が提供され、この場合、この方法は、その必要性のある対象に、本発明のポリペプチドを対象の細胞においてアップレギュレーションすることができる作用因の治療効果的な量を投与し、それにより、血管形成関連疾患を治療することを含む。
【００４０】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、作用因は前記ポリペプチドである。
【００４１】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、作用因は前記核酸構築物である。
【００４２】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、投与することが、全身的に行われる。
【００４３】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、虚血に関連する疾患または障害が、創傷治癒、虚血性卒中、虚血性心疾患、末梢血管疾患、腎動脈疾患、胃腸病変、火傷、皮膚移植、血管移植、臓器修復、骨修復障害、肝臓障害、子宮障害、眼の血管形成障害、骨再生障害、軟骨修復障害および平滑筋細胞障害からなる群から選択される。
【００４４】
本発明は、虚血に関連する医学的状態のための新規な治療法を提供することによって、現在知られている構成の欠点に対処することに成功している。
【００４５】
別途定義されない限り、本明細書中で使用されるすべての技術的用語および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書中に記載される方法および材料と類似または同等である方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができるが、好適な方法および材料が下記に記載される。本願で挙げた刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献はすべて、全体を参照として本明細書に援用するものである。矛盾する場合には、定義を含めて、本特許明細書が優先する。加えて、材料、方法および実施例は例示にすぎず、限定であることは意図されない。
【００４６】
本明細書では本発明を単に例示し図面を参照して説明する。特に詳細に図面を参照して、示されている詳細が例示として本発明の好ましい実施形態を例示考察することだけを目的としており、本発明の原理や概念の側面の最も有用でかつ容易に理解される説明であると考えられるものを提供するために提示していることを強調するものである。この点について、本発明を基本的に理解するのに必要である以上に詳細に本発明の構造の詳細は示さないが、図面について行う説明によって本発明のいくつもの形態を実施する方法は当業者には明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１ａ】Ｐ４０２Ａ／Ｐ５６４ＧおよびＰ５６４Ａ／Ｎ８０３Ａの二重変異体と比較したときの三重変異型ＨＩＦ−１αの転写活性を例示する棒グラフである。ＨＲＥ媒介の転写を、種々のＨＩＦ−１αプラスミドまたはｐｃＤＮＡ３コントロールとのｐ２．１ＨＲＥ−ｌｕｃの同時トランスフェクションの後、ＨＥＫ２９３（図１Ａ）において測定した。データがルシフェラーゼ比として表され、β−ｇａｌに対して正規化される（平均±Ｓ．Ｄ．）。＊ｐ＜０．００１（二重変異体と比較して）。
【図１ｂ−ｃ】Ｐ４０２Ａ／Ｐ５６４ＧおよびＰ５６４Ａ／Ｎ８０３Ａの二重変異体と比較したときの三重変異型ＨＩＦ−１αの転写活性を例示する棒グラフおよび写真である。ＨＲＥ媒介の転写を、種々のＨＩＦ−１αプラスミドまたはｐｃＤＮＡ３コントロールとのｐ２．１ＨＲＥ−ｌｕｃの同時トランスフェクションの後、ＢＡＥＣ（図１Ｂ）において測定した。データがルシフェラーゼ比として表され、β−ｇａｌに対して正規化される（平均±Ｓ．Ｄ．）。＊ｐ＜０．００１（二重変異体と比較して）。図１Ｃは、ＨＩＦ−１αプラスミドまたはｐｃＤＮＡ３コントロールによるトランスフェクションの後４８時間でＨｅＬａ細胞から単離されたｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ分析である。
【図１ｄ】Ｐ４０２Ａ／Ｐ５６４ＧおよびＰ５６４Ａ／Ｎ８０３Ａの二重変異体と比較したときの三重変異型ＨＩＦ−１αの転写活性を例示する棒グラフである。２，２’−ジピリジル（２，２’−ＤＰ）による処理が図１Ｄに例示される。ＨＲＥ媒介の転写を、種々のＨＩＦ−１αプラスミドまたはｐｃＤＮＡ３コントロールとのｐ２．１ＨＲＥ−ｌｕｃの同時トランスフェクションの後、ＶＨＬ欠損の腎細胞癌細胞において測定した。データがルシフェラーゼ比として表され、β−ｇａｌに対して正規化される（平均±Ｓ．Ｄ．）。＊ｐ＜０．００１および＋ｐ＝０．００３（対Ｐ４０２Ａ／Ｐ５６４Ｇ変異体）。
【図１ｅ】Ｐ４０２Ａ／Ｐ５６４ＧおよびＰ５６４Ａ／Ｎ８０３Ａの二重変異体と比較したときの三重変異型ＨＩＦ−１αの転写活性を例示する棒グラフである。ＨＥＫ２９３細胞を、ｐ２．１ＨＲＥ−ルシフェラーゼ、ＨＩＦ−１αプラスミドおよび示された量のＦＩＨ−１アンチセンスにより共トランスフェクションした。データがルシフェラーゼ比として表され、β−ｇａｌに対して正規化される（平均±Ｓ．Ｄ．）。
【図２ａ−ｆ】三重変異型ＨＩＦ−１αがＰ４０２Ａ／Ｐ５６４ＧおよびＰ５６４Ａ／Ｎ８０３Ａの二重変異体よりも大きい血管形成能を示すことを例示する写真である。図２Ａ−図２Ｆは、ｐｃＤＮＡ３（図２Ａ）、ｗｔ−ＨＩＦ−１α（図２Ｂ）、Ｐ４０２Ａ／Ｐ５６４Ｇ（図２Ｃ）、Ｐ５６４Ａ／Ｎ８０３Ａ（図２Ｄ）、三重変異体（図２Ｅ）またはＶＥＧＦ（図２Ｆ）によりトランスフェクションされたＨＵＶＥＣにおけるインビトロ血管形成アッセイの代表的な写真である。
【図２ｇ】三重変異型ＨＩＦ−１αがＰ４０２Ａ／Ｐ５６４ＧおよびＰ５６４Ａ／Ｎ８０３Ａの二重変異体よりも大きい血管形成能を示すことを例示する棒グラフである。トランスフェクションされたＨＵＶＥＣの管形成を例示する棒グラフであり、高倍率顕微鏡視野あたりの毛細管分岐の数を計数することによって定量化されたものである。結果が５つの無作為の顕微鏡視野の平均±Ｓ．Ｄ．として表される。
【図２ｈ】三重変異型ＨＩＦ−１αがＰ４０２Ａ／Ｐ５６４ＧおよびＰ５６４Ａ／Ｎ８０３Ａの二重変異体よりも大きい血管形成能を示すことを例示する棒グラフである。ＥＬＩＳＡによって求められたときの、トランスフェクションされたＨＵＶＥＣのＶＥＧＦタンパク質濃度を例示する棒グラフであり、結果が平均±Ｓ．Ｄ．として表される。＊ｐ＝０．０２９（対Ｐ４０２Ａ／Ｐ５６４Ｇ）。
【図３】ＰＰＥＩ−３ｘプロモーターの内皮特異性および虚血特異性を例示する蛍光顕微鏡切片の写真である。図３Ａ−図３Ｆは、後肢虚血手技または擬似手技のどちらかを受けたマウスで、７日後に、生理的食塩水（図３Ａおよび図３Ｄ）、Ａｄ−ＣＭＶ−ＧＦＰ（図３Ｂおよび図３Ｅ）またはＡｄ−ＰＰＥ１−３ｘ−ＧＦＰ（図３Ｃおよび図３Ｆ）のいずれかが尾静脈を介して全身に注入されたマウスの腓腹筋の蛍光顕微鏡切片を例示する。図３Ｇ−図３Ｈは、ＧＦＰを発現する内皮細胞（矢じり）からなる毛細管内の赤血球（矢印）を示す蛍光顕微鏡観察（図３Ｇ）または位相差顕微鏡観察（図３Ｈ）で見られるような、Ａｄ−ＰＰＥ−１−３ｘ−ＧＦＰにより処置されたマウスの腓腹筋の切片を例示する。
【図４ａ−ｂ】虚血後の血管形成が局所的なＡｄ−ＣＭＶ−Ｔｒｉｐｌｅ処置およびＡｄ−ＰＰＥ−Ｔｒｉｐｌｅ処置によって増強されることを例示する。図４Ａは、左大腿動脈結紮の直後、ならびに、７日後、１４日後、２１日後および２８日後で測定された虚血性肢の血流の線グラフである。データが、右側（非虚血性）肢の灌流に対する左側（虚血性）肢の灌流の比率として表される。生理的食塩水、ｎ＝８；Ａｄ−ＣＭＶ−Ｌｕｃ、ｎ＝１１；Ａｄ−ＣＭＶ−ｗｔ、ｎ＝１１；Ａｄ−ＣＭＶ−Ｔｒｉｐｌｅ、ｎ＝１２；Ａｄ−ＰＰＥ−Ｔｒｉｐｌｅ、ｎ＝１１。図４Ｂは、手術後２８日目での虚血性肢（左肢）および非虚血性肢（右肢）の代表的なレーザードップラー血流画像である。着色画像において、正常な灌流が赤色で示され、一方、低い灌流および／または無灌流が青色で示される。
【図４ｃ−ｄ】虚血後の血管形成が局所的なＡｄ−ＣＭＶ−Ｔｒｉｐｌｅ処置およびＡｄ−ＰＰＥ−Ｔｒｉｐｌｅ処置によって増強されることを例示する。図４Ｃは、手術後２１日でのマウス後肢の代表的な写真である。図４Ｄは、足指の壊死を手術後２１日目までに示すマウスの割合を例示する棒グラフである。
【図４ｅ−ｆ】虚血後の血管形成が局所的なＡｄ−ＣＭＶ−Ｔｒｉｐｌｅ処置およびＡｄ−ＰＰＥ−Ｔｒｉｐｌｅ処置によって増強されることを例示する。大腿動脈結紮後２８日での腓腹筋の切片から得られる代表的なＣＤ３１染色（図４Ｅ）および毛細管の定量（図４Ｆ）を例示する。＊ｐ＜０．０１。
【図５ａ−ｂ】Ａｄ−ＰＰＥ−Ｔｒｉｐｌｅが、全身投与後、Ａｄ−ＣＭＶ−Ｔｒｉｐｌｅよりも低毒性であることを例示する。図５Ａは、生理的食塩水またはアデノウイルスの全身注入の後での経時的なマウス体重における変化を例示する点グラフである。図５Ｂは、生理的食塩水またはアデノウイルスの全身注入の後の５日および２１日における血清ビリルビンレベルを例示する棒グラフである。
【図５ｃ−ｄ】Ａｄ−ＰＰＥ−Ｔｒｉｐｌｅが、全身投与後、Ａｄ−ＣＭＶ−Ｔｒｉｐｌｅよりも低毒性であることを例示する。生理的食塩水またはアデノウイルスの全身注入の後の５日および２１日における、血清ＡＳＴレベル（図５Ｃ）および血清ＡＬＴレベル（図５Ｄ）を例示する棒グラフである。
【図５ｅ−ｎ】Ａｄ−ＰＰＥ−Ｔｒｉｐｌｅが、全身投与後、Ａｄ−ＣＭＶ−Ｔｒｉｐｌｅよりも低毒性であることを例示する。生理的食塩水（図５Ｅ−図５Ｆ）、ＡｄＣＭＶ−Ｌｕｃ（図５Ｇ−図５Ｈ）、ＡｄＣＭＶ−ｗｔ（図５Ｉ−図５Ｊ）、ＡｄＣＭＶ−ｔｒｉｐｌｅ（図５Ｋ−図５Ｌ）、ＡｄＰＰＥ−ｔｒｉｐｌｅ（図５Ｍ−図５Ｎ）の全身注入の後の５日（図５Ｅ、図５Ｇ、図５Ｉ、図５Ｋおよび図５Ｍ）および２１日（図５Ｆ、図５Ｈ、図５Ｊ、図５Ｌおよび図５Ｎ）におけるマウス肝臓の組織学的切片である。
【図６ａ−ｂ】虚血後の血管形成が、Ａｄ−ＣＭＶ−Ｔｒｉｐｌｅ処置によってではなく、全身的なＡｄ−ＰＰＥ−Ｔｒｉｐｌｅ処置によって増強されることを例示する。図６Ａは、左大腿動脈切除の直後、ならびに、７日後、１４日後、２１日後および２８日後で測定された虚血性肢における血流の点グラフである。データが、右側（非虚血性）肢の灌流に対する左側（虚血性）肢の灌流の比率として表される。生理的食塩水、ｎ＝９；Ａｄ−ＣＭＶ−Ｌｕｃ、ｎ＝８；Ａｄ−ＣＭＶ−ｗｔ、ｎ＝９；Ａｄ−ＣＭＶ−Ｔｒｉｐｌｅ、ｎ＝７；Ａｄ−ＰＰＥ−Ｔｒｉｐｌｅ、ｎ＝８。図６Ｂは、足指の壊死を手術後２１日目までに示すマウスの割合を例示する棒グラフである。
【図６ｃ−ｄ】虚血後の血管形成が、Ａｄ−ＣＭＶ−Ｔｒｉｐｌｅ処置によってではなく、全身的なＡｄ−ＰＰＥ−Ｔｒｉｐｌｅ処置によって増強されることを例示する。図６Ｃは、手術後２１日でのマウス後肢の代表的な写真を例示する。図６Ｄは、手術後２８日目での虚血性肢（左肢）および非虚血性肢（右肢）の代表的なレーザードップラー血流画像である。着色画像において、正常な灌流が赤色で示され、一方、低い灌流および／または無灌流が青色で示される。
【図６ｅ−ｆ】虚血後の血管形成が、Ａｄ−ＣＭＶ−Ｔｒｉｐｌｅ処置によってではなく、全身的なＡｄ−ＰＰＥ−Ｔｒｉｐｌｅ処置によって増強されることを例示する。大腿動脈結紮後２８日での腓腹筋の切片から得られる代表的なＣＤ３１染色（図６Ｅ）および毛細管の定量（図６Ｆ）を例示する。＊ｐ＜０．０１。
【図７ａ−ｂ】図７Ａは、ＢＡＥＣにおけるＨＩＦ−１α発現アデノウイルスのＨＲＥ媒介転写の比較である。ＢＡＥＣをｐ２．１  ＨＲＥ−Ｌｕｃによりトランスフェクションし、その後、２４時間後にアデノウイルスを２０のＭＯＩまたは２００のＭＯＩで感染させた。データがルシフェラーゼ光単位（平均±Ｓ．Ｄ．）として表される。図７Ｂは、ＨｅＬａ細胞におけるＨＩＦ−１αのウエスタンブロットである。ＨｅＬａ細胞の、Ａｄ−ＣＭＶ−ＧＦＰ、ＡＤ−ＣＭＶ−ｗｔＨＩＦ−１α、Ａｄ−ＣＭＶ−ＴｒｉｐｌｅまたはＡｄ−ＰＰＥ１−３ｘ−Ｔｒｉｐｌｅによる感染、あるいは、模擬感染を行った。ウエスタンブロットを感染後４８時間で行った。
【図７ｃ−ｈ】ＨＵＶＥＣにおけるＨＩＦ−１α発現アデノウイルスについてのインビトロ血管形成アッセイ。ＨＵＶＥＣに、模擬感染（Ｃ）、Ａｄ−ＣＭＶ−ＧＦＰによる感染（Ｄ）、Ａｄ−ＣＭＶ−ｗｔＨＩＦ−１αによる感染（Ｅ）、Ａｄ−ＣＭＶ−Ｔｒｉｐｌｅによる感染（Ｆ）、または、Ａｄ−ＰＰＥ１−３ｘ−Ｔｒｉｐｌｅによる感染（Ｇ）のいずれかを行った。４８時間後、インビトロ血管形成アッセイを行った。図７Ｃ−図７Ｇは管形成の代表的な写真である。図７Ｈは、ＥＬＩＳＡによって求められたときの感染ＨＵＶＥＣのＶＥＧＦタンパク質濃度を例示する棒グラフであり、結果が平均±Ｓ．Ｄ．として表される。＊ｐ＝０．０１（対Ａｄ−ＣＭＶ−ｗｔＨＩＦ−１α）。
【発明を実施するための形態】
【００４８】
本発明は、ＨＩＦ−１αポリペプチドおよびそれをコードするポリヌクレオチド、それを含む医薬組成物、ならびのその医薬組成物を製造および使用する方法の発明である。
【００４９】
特に、本発明は虚血に関連する疾患の治療に使用されることができる。
【００５０】
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳しく説明する前に、本発明は、その適用において、下記の説明において示される細部、または、実施例によって例示される細部に限定されないことを理解しなければならない。本発明は他の実施形態が可能であり、または、様々な方法で実施または実行される。また、本明細書中で用いられる表現法および用語法は記述のためであって、限定であると見なしてはならないことを理解しなければならない。
【００５１】
低酸素誘導因子１α（ＨＩＦ−１α）は、低い酸素レベルに対する応答のヘテロダイマー転写因子および重要な調節因子であり、治療的血管形成のための潜在的な候補としてこれまで示唆されている。ＨＩＦ−１αの安定化をＰ４０２ＡおよびＰ５６４Ｇの点変異によって達成することができ［Ｍａｓｓｏｎら、２００１、Ｅｍｂｏ  Ｊ、２０、５１９７−２０６］、一方で、そのＣ−トランス活性化ドメイン（Ｃ−ＴＡＤ）の構成的活性がＮ８０３Ａの点変異によって達成される［Ｌａｎｄｏら、２００２、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９５、８５８−６１］。
【００５２】
本発明を実施する間に、本発明者らは、ＨＩＦ−１αを安定にし、かつ、構成的に活性にする３つの点変異（Ｐ４０２Ａ、Ｐ５６４Ｇ、Ｎ８０３Ａ）を組み合わせるＨＩＦ−１αの変異型形態（三重変異体）を遺伝子操作した。驚くべきことに、この三重変異体は、図１Ａ−図１Ｂに例示されるように、ＨＩＦ−１αの２つの公知の二重変異型形態と比較したとき、低酸素応答エレメントに連結されたレポーター遺伝子の発現に対する相乗的な影響を示した。従って、本発明者らは、単にＨＩＦ−１α分子の安定化だけでなく、ＨＩＦ−１αのＣ−トランス活性化ドメインの構成的活性化が、最適なＨＩＦ媒介の転写および前血管形成作用のために不可欠であることを示した。従って、本発明の三重変異型ＨＩＦ−１α、または、それをコードするポリヌクレオチドは、血管形成に関連する疾患または状態を治療するために使用することができる。
【００５３】
図２Ｇ−図２Ｈに例示されるように、本発明の三重変異体は、インビトロ血管形成アッセイにおいて明らかにされるように、Ｐ４０２Ａ／Ｐ５６４ＧおよびＰ５６４Ａ／Ｎ８０３Ａの二重変異体よりも大きい血管形成能を示す。さらには、図４Ａ−図４Ｆに例示されるように、本発明の三重変異型ＨＩＦ−１αを発現するアデノウイルスは、マウスの後肢虚血モデルにおいて、野生型ＨＩＦ−１αを発現するアデノウイルス、および、コントロールと比較して、血液灌流の増加および毛細管密度の増大を示した。修飾されたプレプロエンドセリン−１プロモーターは、虚血性内皮細胞における特異的な発現を可能にすることが示された（図３Ｃおよび図３Ｆ）。そのようなプロモーターの調節下における三重変異型ＨＩＦ−１αの発現は、構成的に活性なプロモーターの制御下における三重変異体の発現と比較したとき、異所性の発現および全身的な副作用を低下させた（図５Ａ−図５Ｎおよび図６Ａ−図６Ｄ）。
【００５４】
従って、本発明の１つの局面によれば、安定的に発現され、かつ、構成的に活性である、ＨＩＦ−１αのアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドが提供される。
【００５５】
本明細書中で使用される表現「ＨＩＦ−１α」は、少なくとも、ＨＩＦ−１αの活性な一部分（すなわち、ＨＩＦ−１α活性を有する一部分）を示す。好ましくは、本発明のＨＩＦ−１αはヒトＨＩＦ−１αであり、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＭ００１５３０である。
【００５６】
本明細書中で使用される表現「ＨＩＦ−１α活性」は、少なくとも、ＨＩＦ−１αの転写因子活性、すなわち、標的の血管形成因子を転写的にアップレギュレーションするＨＩＦ−１αの能力を示す。転写因子として機能するために、ＨＩＦ−１αはＨＩＦ−１βと二量体化し、Ｐ３００などの補因子と結合する。従って、本発明のＨＩＦ−１αは好ましくは、機能的なＤＮＡ結合ドメイン、ならびに、機能的な補因子結合ドメインおよびＨＩＦ−１β結合ドメインを含む。本発明のＨＩＦ−１αは、例えば、アミノ末端またはカルボキシ末端のアミノ酸配列を含む必要はない。これは、これらの末端配列がＨＩＦ−１α活性のために要求されないからである。
【００５７】
本明細書中で使用される表現「構成的に活性な」は、細胞の低酸素状態によって調節されない転写活性を含むＨＩＦ−１αを示す。
【００５８】
本明細書中で使用される表現「安定的に発現される」は、プロテオソーム分解の増大を低酸素に対する応答において受けないポリペプチドを示す。従って、ポリペプチドの半減期がフォン・ヒッペル・リンドウ（ＶＨＬ）の存在によって変化しない。好ましくは、本発明のポリペプチドの半減期は、野生型ポリペプチド（すなわち、変異を含まないポリペプチド）の半減期の少なくとも約２倍大きく、一層より好ましくは５倍である。
【００５９】
本発明のこの局面の好ましい実施形態によれば、本発明のポリペプチドは、配列番号３に対して少なくとも５０％相同的であり、より好ましくは少なくとも６０％相同的であり、より好ましくは少なくとも７０％相同的であり、より好ましくは少なくとも８０％相同的であり、最も好ましくは少なくとも９０％相同的であり、かつ、配列番号３のプロリン４０２に対応する位置での変異、配列番号３の５６４におけるプロリンに対応する位置での変異、および、配列番号３のアスパラギン８０３に対応する位置での変異を含む。
【００６０】
本明細書中で使用される用語「変異」は、野生型配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＭ００１５３０（ＧＩ：３１０７７２１２））と比較して、アミノ酸配列における変化を示す。
【００６１】
変異は欠失または置換を含むことができる。例示的な変異には、４０２位におけるプロリンに対応するアラニン、５６４位におけるプロリンに対応するグリシン、および、８０３位におけるアスパラギンに対応するアラニンが含まれる。
【００６２】
従って、好ましい実施形態によれば、本発明のポリペプチドは、配列番号２に示される通りである。
【００６３】
加えて、本発明のポリペプチドは配列番号３の他の保存的変化を含むことができる。
【００６４】
本明細書中で使用される表現「保存的変化」は、別の生物学的に類似する残基によるアミノ酸残基の置換を示す。保存的変化の例には、１つの疎水性残基（例えば、イソロイシン、バリン、ロイシンまたはメチオニンなど）の、別の疎水性残基への置換、または、１つの極性残基の、別の極性残基への置換、例えば、リシンのアルギニンへの置換、アスパラギン酸のグルタミン酸への置換、または、アスパラギンのグルタミンへの置換などが含まれる。用語「保存的変化」にはまた、置換されたポリペプチドに対して惹起される抗体もまた非置換のポリペプチドと免疫反応するならば、置換されていない元のアミノ酸に代わる、置換されたアミノ酸の使用が含まれる。
【００６５】
タンパク質工学の様々な方法（例えば、ディスプレー技術）を、安定性および構成的活性を本発明のＨＩＦ−１αならびにＨＩＦ−１αの活性な部分に与える他の変異を明らかにするために使用することができる。
【００６６】
ディスプレーライブラリーを構築する方法が当該技術分野では広く知られている。そのような方法が、例えば、Ｙｏｕｎｇ  ＡＣ他、「クリプトコッカス・ネオフォルマンスに対する多糖結合抗体およびファージディスプレーライブラリー由来ペプチドとのその複合体の三次元構造：ペプチドミモトープを特定するための密接な関係」、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、１９９７（１２月１２日）、２７４（４）：６２２〜３４；Ｇｉｅｂｅｌ  ＬＢ他、「環状ペプチドファージライブラリーのスクリーニングによるストレプトアビジンと大きい親和性で結合するリガンドの特定」、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９５（１１月２８日）、３４（４７）：１５４３０〜５；Ｄａｖｉｅｓ  ＥＬ他、「ニワトリの免疫グロブリン遺伝子に由来するライブラリーを使用する特異的なファージディスプレー抗体の選択」、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、１９９５（１０月１２日）、１８６（ｌ）：１２５〜３５；Ｊｏｎｅｓ  Ｃ  ＲＴ他、「分子認識およびバイオセパレーションにおける現在の傾向」、Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ａ、１９９５（７月１４日）、７０７（１）：３〜２２；Ｄｅｎｇ  ＳＪ他、「合成遺伝子ライブラリーに由来する改善された炭水化物結合性単鎖抗体を選択するための基礎」、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、１９９５（５月２３日）、９２（１１）：４９９２〜６；Ｄｅｎｇ  ＳＪ他、「ファージディスプレーによる改善された炭水化物結合性の抗体単鎖可変フラグメントの選択」、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、１９９４（４月１日）、２６９（１３）：９５３３〜８に記載される（これらは参考として本明細書中に組み込まれる）。
【００６７】
安定性および構成的活性を本発明のＨＩＦ−１αに与える他の変異はまた、計算生物学を使用して明らかにすることができる。例えば、様々な変異させたＨＩＦ−１αペプチド配列を、様々な三次元コンピューター計算ツールを使用して、安定性および構成的活性を与える能力についてコンピューター分析することができる。三次元構造モデルを表示するために有用なソフトウエアプログラム、例えば、ＲＩＢＢＯＮＳ（Ｃａｒｓｏｎ，Ｍ．、１９９７、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、２７７、２５）、Ｏ（Ｊｏｎｅｓ，ＴＡ、ら、１９９１、Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．、Ａ４７、１１０）、ＤＩＮＯ（ＤＩＮＯ：Ｖｉｓｕａｌｉｚｉｎｇ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（２００１）、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｉｎｏ３ｄ．ｏｒｇ）、ならびに、ＱＵＡＮＴＡ、ＩＮＳＩＧＨＴ、ＳＹＢＹＬ、ＭＡＣＲＯＭＯＤＥ、ＩＣＭ、ＭＯＬＭＯＬ、ＲＡＳＭＯＬおよびＧＲＡＳＰ（これらは、Ｋｒａｕｌｉｓ，Ｊ．、１９９１、Ａｐｐｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ、２４、９４６に総説される）を、有望な変異型ペプチド配列をモデル化して、有用な変異を特定するために利用することができる。
【００６８】
本明細書中で使用される用語「ポリペプチド」には、天然のポリペプチド（分解産物または合成的に合成されたポリペプチドまたは組換えポリペプチドのいずれか）、ペプチド模倣体（典型的には合成的に合成されたポリペプチド）そしてポリペプチドアナログであるペプトイドおよびセミペプトイドが含まれ、これらは、例えば、ポリペプチドを体内でより安定化させる修飾、またはペプチドの細胞浸透能力を高める修飾を有し得る。そのような修飾には、Ｎ末端修飾、Ｃ末端修飾、ポリペプチド結合の修飾（ＣＨ２−ＮＨ、ＣＨ２−Ｓ、ＣＨ２−Ｓ＝Ｏ、Ｏ＝Ｃ−ＮＨ、ＣＨ２−Ｏ、ＣＨ２−ＣＨ２、Ｓ＝Ｃ−ＮＨ、ＣＨ＝ＣＨまたはＣＦ＝ＣＨを含むが、これらに限定されない）、骨格の修飾、および残基の修飾が含まれるが、これらに限定されない。ペプチド模倣体化合物を調製するための方法はこの分野では十分に知られており、例えば、Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ，Ｃ．Ａ．Ｒａｍｓｄｅｎ  Ｇｄ．，Ｃｈａｐｔｅｒ  １７．２，Ｆ．Ｃｈｏｐｌｉｎ  Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ（１９９２）に具体的に記載される（これは、全体が本明細書中に示されるように参考として組み込まれる）。これに関するさらなる詳細は本明細書中下記に示される。
【００６９】
ポリペプチド内のポリペプチド結合（−ＣＯ−ＮＨ−）は、例えば、Ｎ−メチル化結合（−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＯ−）、エステル結合（−Ｃ（Ｒ）Ｈ−Ｃ−Ｏ−Ｏ−Ｃ（Ｒ）−Ｎ−）、ケトメチレン結合（−ＣＯ−ＣＨ２−）、α−アザ結合（−ＮＨ−Ｎ（Ｒ）−ＣＯ−）（式中、Ｒは任意のアルキル（例えば、メチル）である）、カルバ結合（−ＣＨ２−ＮＨ−）、ヒドロキシエチレン結合（−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２−）、チオアミド結合（−ＣＳ−ＮＨ−）、オレフィン二重結合（−ＣＨ＝ＣＨ−）、レトロアミド結合（−ＮＨ−ＣＯ−）、ペプチド誘導体（−Ｎ（Ｒ）−ＣＨ２−ＣＯ−）（式中、Ｒは、炭素原子において自然界で示される「通常」の側鎖である）によって置換することができる。
【００７０】
これらの修飾は、ポリペプチド鎖に沿った結合の任意のところに存在させることができ、そして同時に数カ所（２カ所〜３カ所）においてさえ存在させることができる。
【００７１】
天然の芳香族アミノ酸（Ｔｒｐ、ＴｙｒおよびＰｈｅ）は、フェニルグリシン、ＴＩＣ、ナフチレンアミン（Ｎｏｌ）、Ｐｈｅの環メチル化誘導体、Ｐｈｅのハロゲン化誘導体、またはｏ−メチル−Ｔｙｒなどの合成された非天然型の酸に置換することができる。
【００７２】
上述のことに加えて、本発明のポリペプチドは一以上の修飾されたアミノ酸または一以上の非アミノ酸モノマー（例えば脂肪酸、複合体炭水化物など）も含むことができる。
【００７３】
本明細書中および請求項の節で使用される用語「アミノ酸」には、２０個の天然に存在するアミノ酸；インビボで多くの場合には翻訳後修飾されたそのようなアミノ酸（例えば、ヒドロキシプロリン、ホスホセリンおよびホスホトレオニンを含む）；および他の非通常型アミノ酸（２−アミノアジピン酸、ヒドロキシリシン、イソデスモシン、ノルバリン、ノルロイシンおよびオルニチンを含むが、これらに限定されない）が含まれることが理解される。さらに、用語「アミノ酸」には、Ｄ−アミノ酸およびＬ−アミノ酸の両方が含まれる。
【００７４】
下記の表１および表２には、本発明で使用される天然に存在するアミノ酸（表１）および非通常型アミノ酸または修飾型アミノ酸（表２）が示される。
2014121326.tif 000002
2014121326.tif 000003
2014121326.tif 000004
2014121326.tif 000005
【００７５】
本発明の単離されたポリペプチドは、例えば、標準的な固相技術を使用することによって生化学的に合成されることができる。このような方法には、完全固相合成、部分的固相合成法、フラグメント縮合、古典的な溶液合成が含まれる。これらの方法は、好ましくは、ポリペプチドが組換え技術によって作製できないとき（すなわち、ポリペプチドが核酸配列によってコードされ得ないとき）、従って、異なる化学反応を伴うとき、または短いペプチドが合成されるときに使用される。
【００７６】
固相ペプチド合成手法が当該分野では広く知られており、さらには、Ｊｏｈｎ  Ｍｏｒｒｏｗ  ＳｔｅｗａｒｔおよびＪａｎｉｓ  Ｄｉｌｌａｈａ  Ｙｏｕｎｇ、Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｅｓ（第２版、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ、１９８４）によって記載される。
【００７７】
合成ポリペプチドは調製用の高速液体クロマトグラフィーによって精製することができ［Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ  Ｔ．（１９８３）、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ（ＷＨ  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．、Ｎ．Ｙ．）］、その組成をアミノ酸配列決定によって確認することができる。
【００７８】
組換え技術は、好ましくは、本発明の単離されたポリペプチドを生成するために使用される。なぜなら、これらの技術は、比較的長い（例えば、２０アミノ酸よりも長い）ポリペプチドおよび大量のポリペプチドの生成についてより好適である。このような組換え技術は、例えば、Ｂｉｔｔｅｒ他（１９８７）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１５３：５１６〜５４４；Ｓｔｕｄｉｅｒ他（１９９０）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１８５：６０〜８９；Ｂｒｉｓｓｏｎ他（１９８４）、Ｎａｔｕｒｅ、３１０：５１１〜５１４；Ｔａｋａｍａｔｓｕ他（１９８７）、ＥＭＢＯ  Ｊ．、６：３０７〜３１１；Ｃｏｒｕｚｚｉ他（１９８４）、ＥＭＢＯ  Ｊ．、３：１６７１〜１６８０；Ｂｒｏｇｌｉ他（１９８４）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２４：８３８〜８４３；Ｇｕｒｌｅｙ他（１９８６）、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、６：５５９〜５６５；Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ＆Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ、１９８８、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ、Ｓｅｃｔｉｏｎ  ＶＩＩＩ、４２１頁〜４６３頁などによって記載される。
【００７９】
これらの技術を、本発明のポリペプチドを、インビトロ、エクスビボおよびインビボで作製するために使用することができる（後者の２つが本明細書中下記でさらに記載される）。
【００８０】
本発明の単離されたＨＩＦ−１αポリペプチドを、組換え技術を使用して作製するために、そのようなポリペプチドをコードする核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチドを使用することができる。例示的な核酸配列が配列番号１に示される。
【００８１】
用語「核酸配列」は、天然に存在する塩基、糖および共有結合によるヌクレオシド間連結（例えば、骨格）から構成されるデオキシリボ核酸配列、ならびに、それぞれの天然に存在する部分と同様に機能する、天然に存在しない部分を有するオリゴヌクレオチドを示す。組換え発現が依然として許されるならば、そのような修飾が本発明によって可能になる。
【００８２】
本発明のこの局面によるＨＩＦ−１αの核酸配列は、相補的ポリヌクレオチド配列（ｃＤＮＡ）、ゲノムポリヌクレオチド配列および／または複合ポリヌクレオチド配列（例えば、上記の組合せ）が可能である。
【００８３】
本明細書中で使用される表現「相補的ポリヌクレオチド配列」は、逆転写酵素または任意の他のＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを使用してメッセンジャーＲＮＡの逆転写から生じる配列を示す。そのような配列は続いて、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを使用してインビボまたはインビトロで増幅することができる。
【００８４】
本明細書中で使用される表現「ゲノムポリヌクレオチド配列」は、染色体に由来する（染色体から単離される）配列を示し、従って、ゲノムポリヌクレオチド配列は染色体の隣接した一部分を表す。
【００８５】
本明細書中で使用される表現「複合ポリヌクレオチド配列」は、少なくとも一部分が相補的であり、かつ、少なくとも一部分がゲノムである配列を示す。複合配列は、本発明のポリペプチドをコードするために要求されるいくつかのエキソン配列、ならびに、エキソン配列の間に介在するいくつかのイントロン配列を含むことができる。イントロン配列は、他の遺伝子のものを含めて、任意の供給源のものが可能であり、典型的には、保存されたスプライシングシグナル配列を含む。そのようなイントロン配列はさらに、シス作用の発現調節エレメントを含むことができる。
【００８６】
本発明のＨＩＦ−１αポリペプチドを、組換え技術を使用して作製するために、本発明のＨＩＦ−１αポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、ポリヌクレオチド配列がシス調節配列（例えば、プロモーター配列）の転写制御下にあるように核酸発現ベクターに連結される。
【００８７】
様々な原核細胞または真核細胞を、本発明のポリペプチドを発現させるための宿主発現システムとして使用することができる。これらには、微生物、例えば、ポリペプチドのコード配列を含有する組換えバクテリオファージＤＮＡ発現ベクター、プラスミドＤＮＡ発現ベクターまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターにより形質転換された細菌など；ポリペプチドのコード配列を含有する組換え酵母発現ベクターにより形質転換された酵母；ポリペプチドのコード配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）を感染させた植物細胞システム、または、ポリペプチドのコード配列を含有する組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミドなど）により形質転換された植物細胞システムが含まれるが、これらに限定されない。
【００８８】
本発明のこの実施形態との使用のために好適な構成的プロモーターには、ほとんどの環境的条件およびほとんどのタイプの細胞のもとで機能的である配列（すなわち、転写を行わせることができる配列）が含まれる（例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）およびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）など）。
【００８９】
本発明のこの実施形態との使用のために好適な誘導型プロモーターには、例えば、テトラサイクリン誘導プロモーター（Ｓｒｏｕｒ，Ｍ．Ａ．ら、２００３、Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．、９０：３９８−４０５）が含まれる。
【００９０】
本発明のこの実施形態による発現ベクターは、このベクターを、原核生物における複製および組込み、または、真核生物における複製および組込み、または、好ましくは両方における複製および組込みのために好適にするさらなる配列を含むことができる（例えば、シャトルベクター）。典型的なクローニングベクターは、転写開始配列および翻訳開始配列（例えば、プロモーター、エンハンサー）、ならびに、転写ターミネーターおよび翻訳ターミネーター（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含有する。
【００９１】
真核生物プロモーターは典型的には、２つのタイプの認識配列（ＴＡＴＡボックスおよび上流側のプロモーター要素）を含有する。ＴＡＴＡボックス（これは転写開始部位の２５塩基対〜３０塩基対上流側に位置する）は、ＲＮＡポリメラーゼに、ＲＮＡ合成を開始させることに関与していると考えられる。それ以外の上流側のプロモーター要素は、転写が開始される速度を決定する。
【００９２】
エンハンサー要素は、転写を、連結された相同的プロモーターまたは異種プロモーターから１０００倍まで刺激することができる。エンハンサーは、転写開始部位の下流側または上流側に置かれたとき、活性がある。ウイルスに由来する多くのエンハンサー要素は広い宿主範囲を有しており、様々な組織において活性がある。例えば、ＳＶ４０の初期遺伝子エンハンサーが多くの細胞タイプについて好適である。本発明のために好適である他のエンハンサー／プロモーター組合せには、ポリオーマウイルス、ヒトまたはマウスのサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、様々なレトロウイルス（例えば、マウス白血病ウイルス、マウス肉腫ウイルスまたはラウス肉腫ウイルス、およびＨＩＶなど）からの長末端反復に由来するものが含まれる。Ｅｎｈａｎｃｅｒｓ  ａｎｄ  Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８３）を参照のこと（これは参考として本明細書中に組み込まれる）。
【００９３】
ポリアデニル化配列もまた、本発明の発現ベクターから発現されるポリペプチドの翻訳効率を増大させるために発現ベクターに加えることができる。２つの異なった配列要素が正確かつ効率的なポリアデニル化のために要求される（ポリアデニル化部位の下流側に位置するＧＵリッチ配列またはＵリッチ配列、および、１１ヌクレオチド〜３０ヌクレオチド上流側に位置する６ヌクレオチドの高度に保存された配列（ＡＡＵＡＡＡ））。本発明のために好適である終結シグナルおよびポリアデニル化シグナルには、ＳＶ４０に由来するシグナルが含まれる。
【００９４】
既に述べられた要素に加えて、本発明の発現ベクターは、典型的には、クローン化された核酸の発現レベルを増大させるために、または、組換えＤＮＡを有する細胞の特定を容易にするために意図された他の特殊化された要素を含有することができる。例えば、数多くの動物ウイルスは、許容細胞タイプにおけるウイルスゲノムの染色体外の複製を促進させるＤＮＡ配列を含有する。このようなウイルスレプリコンを有するプラスミドは、適切な因子が、プラスミドにおいて運ばれる遺伝子によるか、または、宿主細胞のゲノムとともに運ばれる遺伝子によるかのいずれかで提供される限り、エピソームとして複製する。
【００９５】
ベクターは真核生物のレプリコンを含んでも、含まなくてもよい。真核生物のレプリコンが存在するならば、ベクターは、適切な選択マーカーを使用して真核生物細胞において増幅可能である。ベクターが真核生物のレプリコンを含まないならば、エピソーム増幅ができない。その代わり、組換えＤＮＡは、操作された細胞のゲノムに組み込まれ、その細胞において、プロモーターが所望の核酸の発現を行わせる。
【００９６】
本発明の発現ベクターはさらに、例えば、１つのｍＲＮＡからの数個のタンパク質の翻訳を可能にするさらなるポリヌクレオチド配列（例えば、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）など）、および、プロモーターキメラポリペプチドのゲノム組み込みのための配列を含むことができる。
【００９７】
哺乳動物発現ベクターの例には、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能であるｐｃＤＮＡ３、ｐｃＤＮＡ３．ｌ（＋／−）、ｐＧＬ３、ｐＺｅｏＳＶ２（＋／−）、ｐＳｅｃＴａｇ２、ｐＤｉｓｐｌａｙ、ｐＥＦ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ、ｐＣＭＶ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ、ｐＣＲ３．１、ｐＳｉｎＲｅｐ５、ＤＨ２６Ｓ、ＤＨＢＢ、ｐＮＭＴ１、ｐＮＭＴ４１、ｐＮＭＴ８１、Ｐｒｏｍｅｇａから入手可能であるｐＣＩ、Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅから入手可能であるｐＭｂａｃ、ｐＰｂａｃ、ｐＢＫ−ＲＳＶおよびｐＢＫ−ＣＭＶ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから入手可能であるｐＴＲＥＳ、ならびに、それらの誘導体が含まれる。
【００９８】
真核生物ウイルス（例えば、レトロウイルスなど）に由来する調節要素を含有する発現ベクターもまた本発明によって使用されることができる。ＳＶ４０系ベクターには、ｐＳＶＴ７およびｐＭＴ２が含まれる。ウシパピローマウイルスに由来するベクターには、ｐＢＶ−１ＭＴＨＡが含まれ、エプスタイン・バールウイルスに由来するベクターには、ｐＨＥＢＯおよびｐ２Ｏ５が含まれる。他の例示的なベクターには、ｐＭＳＧ、ｐＡＶ００９／Ａ＋、ｐＭＴＯ１０／Ａ＋、ｐＭＡＭｎｅｏ−５、バキュロウイルスｐＤＳＶＥ、および、ＳＶ−４０初期プロモーター、ＳＶ−４０後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウス乳腫瘍ウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ポリヘドリンプロモーター、または、真核生物細胞での発現のために効果的であることが示されている他のプロモーターの指揮下でのタンパク質の発現を可能にする他のベクターが含まれる。
【００９９】
様々な方法を、本発明の発現ベクターを細胞に導入するために使用することができる。そのような方法が、一般には、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９、１９９２）；Ａｕｓｕｂｅｌ他、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、Ｍｄ．（１９８９）；Ｃｈａｎｇ他、Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ、Ｍｉｃｈ．（１９９５）；Ｖｅｇａ他、Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ  Ｍｉｃｈ．（１９９５）；Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｓｕｒｖｅｙ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｕｓｅｓ、Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ、Ｂｏｓｔｏｎ  Ｍａｓｓ．（１９８８）；および、Ｇｉｌｂｏａ他［Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４（６）：５０４〜５１２、１９８６］に記載され、そのような方法には、例えば、組換えウイルスベクターを用いた安定的トランスフェクションまたは一過性トランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーションおよび感染が含まれる。加えて、陽性−陰性の選択法については米国特許第５４６４７６４号および同第５４８７９９２号を参照のこと。
【０１００】
形質転換された細胞は、多量の組換えポリペプチドの発現を可能にする効果的な条件のもとで培養される。効果的な培養条件には、タンパク質の産生を可能にする効果的な培地、バイオリアクター、温度、ｐＨおよび酸素条件が含まれるが、これらに限定されない。効果的な培地は、細胞が、本発明の組換えポリペプチドを産生するために培養される任意の培地を示す。そのような培地には、典型的には、同化可能な炭素源、窒素源およびリン酸塩源、ならびに、適切な塩、ミネラル、金属および他の栄養分（例えば、ビタミンなど）を有する水溶液が含まれる。本発明の細胞は、従来の発酵バイオリアクター、振とうフラスコ、試験管、マイクロタイターディッシュおよびペトリ皿において培養することができる。培養を、組換え細胞のために適切である温度、ｐＨおよび酸素含有量で行うことができる。そのような培養条件は当業者の専門的知識の範囲内である。
【０１０１】
（ポリペプチドをコードする）挿入されているコード配列の転写および翻訳のための必要なエレメントを含有すること以外に、本発明の発現構築物はまた、発現ポリペプチドの安定性、産生、精製、収率または活性を最適化するために操作された配列を含み得ることが理解される。
【０１０２】
産生のために使用されるベクターおよび宿主のシステムに依存して、本発明の得られるポリペプチドは組換え細胞の内部に留まり得るか、または、発酵培地に分泌され得るか、または、２つの細胞膜の間の空間（例えば、大腸菌における細胞周辺腔など）に分泌され得るか、または、細胞膜もしくはウイルス膜の外側表面に保持され得るかのいずれかである。
【０１０３】
培養における所定の時間の後、組換えポリペプチドの回収が行われる。
【０１０４】
本明細書中で使用される表現「組換えポリペプチドを回収する」は、ポリペプチドを含有する発酵培地全体を集めることを示し、分離または精製のさらなる工程を伴う必要はない。
【０１０５】
従って、本発明のポリペプチドは、様々な標準的なタンパク質精製技術を使用して精製することができ、そのようなタンパク質精製技術には、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ろ過、電気泳動、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、コンカナバリンＡクロマトグラフィー、クロマトフォーカシングおよび示差的可溶化が含まれるが、これらに限定されない。
【０１０６】
回収を容易にするために、発現されるコード配列は、本発明のポリペプチドと、融合された切断可能な部分とをコードするように操作することができる。そのような融合タンパク質は、ポリペプチドが、アフィニティークロマトグラフィーによって、例えば、切断可能な成分について特異的なカラムでの固定化によって容易に単離され得るように設計することができる。切断部位が、ポリペプチドと、切断可能な部分との間で操作される場合、ポリペプチドを、融合タンパク質をこの部位で特異的に切断する適切な酵素または作用因による処理によってクロマトグラフィーカラムから放出させることができる［例えば、Ｂｏｏｔｈら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．、１９：６５−７０（１９８８）、および、Ｇａｒｄｅｌｌａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６５：１５８５４−１５８５９（１９９０）を参照］。
【０１０７】
本発明のポリペプチドを産生させた後、変異型形態を特異的に認識し、生来的形態を認識しない抗体を作製することができる。そのような抗体は、その発現を確認するために有用であり得る。
【０１０８】
本発明のポリペプチドは血管形成作用を含むので、本発明のポリペプチドは、虚血に関連する疾患または状態の治療において使用することができる。
【０１０９】
従って、本発明の別の局面によれば、本発明のポリペプチドをアップレギュレーションすることができる作用因の治療効果的な量をその必要性のある対象に投与することを含む、虚血に関連する疾患または状態を治療する方法が提供される。
【０１１０】
本明細書中で使用される用語「治療する」は、血管形成関連疾患に関連する症状を予防すること、または、緩和すること、または、軽減することを示す。好ましくは、治療することにより、血管形成関連疾患に関連する症状が治癒し、例えば、実質的に除かれる。
【０１１１】
本明細書中で使用される用語「対象」は任意の（例えば、哺乳動物）対象を示し、好ましくは、ヒト対象を示す。
【０１１２】
本明細書中で使用される用語「低酸素」は、低下した酸素の状態を示す。これは、肺が損傷しているときに、または、血流が低下しているときに生じ得る。
【０１１３】
本明細書中で使用される用語「虚血」は、血餅（血栓）もしくは何らかの循環する異物（塞栓）によるか、または、血管障害（例えば、アテローム性動脈硬化など）による動脈または静脈の閉塞によって引き起こされ得る血流における低下を示す。あるいは、虚血は、動脈が閉塞していないが、酸素に対する標的組織の需要が供給に対して増大しているときに引き起こされ得る。血流の低下は突然の発症および短い継続時間（急性虚血）を有し得るか、あるいは、長い継続期間または頻繁な再発を伴う遅い発症（慢性虚血）を有し得る。急性虚血には多くの場合、局所的で、不可逆的な組織壊死（梗塞）が伴い、これに対して、慢性虚血には通常、一過性の低酸素の組織傷害が伴う。しかしながら、灌流の低下が長期にわたるか、または、重症であるならば、慢性虚血にもまた、梗塞が伴い得る。梗塞形成が一般には、脾臓、腎臓、肺、脳および心臓において発生し、これにより、様々な障害（例えば、腸梗塞、肺梗塞、虚血性卒中および心筋梗塞など）がもたらされる。
【０１１４】
従って、本発明では、急性、一過性または慢性的であろうとも、何らかの虚血性事象に関連する医学的状態の治療に適用することができる方法が明らかに意図される。急性の虚血性事象には、手術、臓器移植、梗塞形成（例えば、脳、腸、心筋、肺など）、外傷、発作または傷害などに関連する虚血性事象が含まれ得る。虚血に関連する慢性事象には、高血圧、糖尿病、閉塞性動脈疾患、慢性静脈不全、レイノー病、肝硬変、うっ血性心不全、全身性硬化症などが含まれ得る。
【０１１５】
虚血に関連する他の疾患または障害には、創傷治癒、胃腸病変、自己免疫疾患および神経変性障害が含まれるが、これらに限定されない。
【０１１６】
具体的な状態の例には、創傷治癒、虚血性卒中、虚血性心臓疾患、末梢血管疾患、腎動脈疾患、胃腸病変、火傷、皮膚移植、血管移植、臓器修復（例えば、エクスビボおよびインビボ）、骨修復障害、肝臓障害、子宮障害、眼の血管形成障害（すなわち、網膜剥離、加齢性黄斑変性症）、骨再生障害、軟骨修復障害および平滑筋細胞障害が含まれるが、これらに限定されない。
【０１１７】
１つの実施形態によれば、本発明のポリペプチドをアップレギュレーションすることができる作用因は本発明のＨＩＦ−１αポリペプチドであり、すなわち、本発明のＨＩＦ−１αポリペプチドが作製され、続いて、対象に投与される。本発明の単離されたポリペプチドを作製する様々な方法が本明細書中上記に記載される。
【０１１８】
本発明のＨＩＦ−１αポリペプチドは血管形成の部位（すなわち、増殖中の内皮細胞）において提供されることが好ましいので、好ましくは、本発明のＨＩＦ−１αポリペプチドは局所送達されるか、または、標的化された送達システム（例えば、標的化されたリポソーム）を含む。
【０１１９】
本発明のＨＩＦ−１αポリペプチドを血管形成部位に標的化する特に好ましい方法が、標的化された遺伝子治療による方法である。
【０１２０】
本明細書中で使用される遺伝子治療は、目的とする遺伝物質（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を、遺伝性または後天性の疾患または状態または表現型を治療または防止するために宿主に移入することを示す。目的とする遺伝物質により、インビボでのその産生が所望される産物（例えば、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、機能的ＲＮＡ、アンチセンス）がコードされる。例えば、目的とする遺伝物質は、治療的価値を有するホルモン、受容体、酵素、ポリペプチドまたはペプチドをコードすることができる。総説については、一般的には、教本「Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ」（Ａｄｖａｎｃｅｄ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ４０、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９９７）を参照。
【０１２１】
遺伝子治療に対する２つの基本的方法が進化している：（１）エクスビボ遺伝子治療、および、（２）インビボ遺伝子治療。エクスビボ遺伝子治療では、細胞が患者から取り出され、培養されながら、インビトロで処置される。一般に、機能的な置換遺伝子が、必要に応じて、適切な遺伝子送達ビヒクル／方法（トランスフェクション、形質導入、相同的組換えなど）および発現システムにより細胞に導入され、その後、修飾された細胞が培養で拡大され、宿主／患者に戻される。これらの遺伝子再移植された細胞は、トランスフェクションされた遺伝物質をその場で発現することが示されている。細胞は、対象に対して自己または非自己であり得る。非自己の細胞は、身体に投与されたときには免疫反応を誘導する可能性があるので、いくつかの方法が、非自己細胞の拒絶の可能性を減らすために開発されている。これらには、レシピエントの免疫系を抑制すること、または、非自己細胞を、移植前に、免疫隔離する半透過性膜で被包化することのいずれかが含まれる。
【０１２２】
インビボ遺伝子治療では、標的細胞が対象から取り出されず、むしろ、トランスフェクションされる遺伝物質が、その場において、すなわち、レシピエントの体内において、レシピエント生物の細胞に導入される。代替の実施形態において、宿主の遺伝子が欠陥を有するならば、その遺伝子がその場で修復される（Ｃｕｌｖｅｒ、１９９８、（Ａｂｓｔｒａｃｔ）Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ＤＮＡ  ＆  ＲＮＡ  ｂａｓｅｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｆｅｂｒｕａｒｙ  １９９８、Ｃｏｒｏｎａｄｏ、ＣＡ）。
【０１２３】
これらの遺伝子修飾された細胞は、トランスフェクションされた遺伝物質をその場で発現することが示されている。
【０１２４】
特異性を与えるために、好ましくは、本発明のポリペプチドを発現するために使用される核酸構築物は、内皮細胞特異的プロモーター配列因子を含む。内皮特異的プロモーター因子は、例えば、配列番号４に記載されるＰＰＥ−１プロモーターの少なくとも１コピーを含むことができる。本発明の核酸構築物により利用され得る好適なプロモーター／エンハンサーの例には、内皮特異的なプロモーター、例えば、プレプロエンドセリン−１（ＰＰＥ−１）プロモーター（Ｈａｒａｔｓ  Ｄ、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ、１９９５（３月）、９５（３）：１３３５〜４４）、ＰＰＥ−１−３ｘプロモーター［ＰＣＴ／ＩＬ０１／０１０５９；Ｖａｒｄａ−Ｂｌｏｏｍ  Ｎ、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ、２００１（６月）、８（１１）：８１９〜２７］、ＴＩＥ−１プロモーター（Ｓ７９３４７、Ｓ７９３４６）及びＴＩＥ−２プロモーター（Ｕ５３６０３）［Ｓａｔｏ  ＴＮ、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、１９９３（１０月１５日）、９０（２０）：９３５５〜８］、エンドグリンプロモーター［Ｙ１１６５３；Ｒｉｕｓ  Ｃ、Ｂｌｏｏｄ、１９９８（１２月１５日）、９２（１２）：４６７７〜９０］、フォンヴィレブランド因子［ＡＦ１５２４１７；Ｃｏｌｌｉｎｓ  ＣＪ、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、１９８７（７月）、８４（１３）：４３９３〜７］、ＫＤＲ／ｆｌｋ−１プロモーター［Ｘ８９７７７、Ｘ８９７７６；Ｒｏｎｉｃｋｅ  Ｖ、Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ、１９９６（８月）、７９（２）：２７７〜８５］、ＦＬＴ−１プロモーター［Ｄ６４０１６、ＡＪ２２４８６３；Ｍｏｒｉｓｈｉｔａ  Ｋ、：Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、１９９５（１１月１７日）、２７０（４６）：２７９４８〜５３］、Ｅｇｒ−１プロモーター［ＡＪ２４５９２６；Ｓｕｋｈａｔｍｅ  ＶＰ、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  Ｒｅｓ、１９８７（９月／１０月）、１（４）：３４３〜５５］、Ｅ−セレクチンプロモーター［Ｙ１２４６２；Ｃｏｌｌｉｎｓ  Ｔ、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、１９９１（２月５日）、２６６（４）：２４６６〜７３］、内皮接着分子プロモーター、例えば、ＩＣＡＭ−１［Ｘ８４７３７；Ｈｏｒｌｅｙ  ＫＪ、ＥＭＢＯ  Ｊ、１９８９（１０月）、８（１０）：２８８９〜９６］、ＶＣＡＭ−１［Ｍ９２４３１；Ｉａｄｅｍａｒｃｏ  ＭＦ、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、１９９２（８月１５日）、２６７（２３）：１６３２３〜９］、ＰＥＣＡＭ−１［ＡＪ３１３３３０、Ｘ９６８４９；ＣＤ３１、Ｎｅｗｍａｎ  ＰＪ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９０（３月９日）、２４７（４９４７）：１２１９〜２２］、血管平滑筋特異的因子、例えば、ＣＡｒＧボックス  Ｘ５３１５４及び大動脈カルボキシペプチダーゼ様タンパク質（ＡＣＬＰ）プロモーター［ＡＦ３３２５９６；Ｌａｙｎｅ  ＭＤ、Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ、２００２、９０：７２８〜７３６］、そして大動脈優先的発現遺伝子−１［Ｙｅｎ−Ｈｓｕ  Ｃｈｅｎ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、第２７６巻第５０号、４７６５８〜４７６６３、２００１年１２月１４日］が含まれる。例えばＥＰＣＲプロモーター（Ｇｕらに対する米国特許第６２００７５１号）及びＶＥＧＦプロモーター（Ｗｉｌｌｉａｍｓらに対する米国特許出願第５９１６７６３号）のような他の好適な内皮特異的プロモーターは、当該分野において周知である。
【０１２５】
好ましくは、本発明の核酸構築物はさらに、低酸素応答エレメントを含み、例えば、配列番号５に示される配列の少なくとも１コピーを含む。ＨＩＦ−１はそのような応答エレメントに結合するので、そのような応答エレメントの調節下で発現されるＨＩＦ−１α導入遺伝子は、結果的には、プロモーターをさらに活性化し、従って、正のフィードバックループをもたらし、これにより、転写応答を高めるであろう。
【０１２６】
インビボ遺伝子治療およびエクスビボ遺伝子治療の両方での感染による核酸の導入は、それ以外の示された方法を上回る利点をいくつか提供する。より高い効率をそれらの感染性質のために得ることができる。そのうえ、様々なウイルスが非常に特殊化しており、典型的には、特定の細胞タイプにおいて感染および増殖する。従って、それらの本来の特異性を、ベクターをインビボで、あるいは、組織内において、または、細胞の混合培養物において特定の細胞タイプに対して標的化するために使用することができる。ウイルスベクターもまた、標的特異性を受容体媒介の事象により変化させるために、特定の受容体またはリガンドに関して修飾することができる。
【０１２７】
加えて、組換えウイルスベクターは、側方感染および標的化特異性などの利点を提供するので、所望される核酸のインビボ発現のために有用である。側方感染は、例えば、レトロウイルスの生活環において固有的であり、１個の感染細胞が、出芽し、周囲の細胞に感染する多くの子孫ビリオンを産生するプロセスである。その結果は、そのほとんどが最初のウイルス粒子によって最初に感染しなかった広い面積が迅速に感染することである。これは、感染性媒介因子が娘子孫を介してのみ広がる垂直型の感染とは対照的である。側方に広がることができないウイルスベクターもまた作製することができる。所望される目的が、指定された遺伝子を局在化した数の標的化された細胞だけに導入することであるならば、この特徴は有用であり得る。
【０１２８】
上記のように、ウイルスは、多くの場合には宿主の防御機構を回避するように進化してきた非常に特殊化した感染性媒介因子である。典型的には、ウイルスは特定の細胞タイプにおいて感染および増殖する。ウイルスベクターの標的化特異性では、その本来の特異性が、所定の細胞タイプを特異的に標的化し、それにより、組換え遺伝子を感染細胞に導入するために利用される。本発明の方法において使用されるべきベクターは、標的化される所望の細胞タイプに依存し、当業者には知られている。
【０１２９】
アデノウイルスが、本明細書中下記で示される実施例に記載される実験において用いられるが、本発明の構築物は当業者によって他のウイルス送達システムに容易に適合化され得ることが理解される。
【０１３０】
レトロウイルスベクターを、感染性粒子として機能するように、または、１回限りの最初の感染サイクルを受けるように、そのどちらかで構築することができる。前者の場合において、ウイルスのゲノムは、ゲノムが、新しいウイルスタンパク質およびウイルスＲＮＡを合成するための必要な遺伝子、調節配列およびパッケージングシグナルのすべてを維持するように改変される。これらの分子が合成されると、宿主細胞により、ＲＮＡが、さらなる感染サイクルを受けることができる新しいウイルス粒子にパッケージングされる。ベクターのゲノムもまた、所望される組換え遺伝子をコードおよび発現するように操作される。非感染性のウイルスベクターの場合には、ベクターのゲノムは通常、ＲＮＡをウイルス粒子に被包化するために要求されるウイルスのパッケージングシグナルを破壊するように変異させられる。そのようなシグナルがない場合、形成される粒子のどれもゲノムを含有せず、従って、その後の感染サイクルを進行させることができない。特定のタイプのベクターは、意図された適用に依存する。実際のベクターもまた知られており、様々なベクターをこの分野では容易に入手することができ、または、広く知られている手法を使用して当業者によって構築することができる。
【０１３１】
条件的に複製するアデノウイルスベクターによる細胞の形質導入は、標的細胞の溶解およびウイルス感染の拡がりにおいて著しくより効果的であるので、核酸構築物は、条件的に複製するアデノウイルスを含むことができる。
【０１３２】
ウイルスベクターは、内皮細胞特異的なプロモーターを含有する場合にはまた、ウイルスベクターの標的化を高めるための他のアプローチとの組合せで使用することができる。そのようなアプローチには、短いペプチドリガンドおよび／または二重特異性もしくは二官能性の分子もしくはジアボディーが含まれる（Ｎｅｔｔｅｌｂｅｃｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、３：８８２、２００１）。
【０１３３】
本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、個体に、それ自体で、あるいは、それらが医薬的に許容され得るキャリアと混合される医薬組成物の一部として提供されることができる。
【０１３４】
本明細書中で使用される「医薬組成物」は、本明細書中に記載される有効成分の１つまたは複数と、他の化学的成分（例えば、生理学的に好適なキャリアおよび賦形剤など）との調製物を示す。医薬組成物の目的は、生物に対する化合物の投与を容易にすることである。
【０１３５】
本明細書中において、用語「有効成分（活性成分）」は、生物学的効果を担うポリペプチドまたはポリヌクレオチド調製物を示す。
【０１３６】
以降、交換可能に使用されうる表現「生理学的に許容され得るキャリア」および表現「医薬的に許容され得るキャリア」は、生物に対する著しい刺激を生じさせず、投与された化合物の生物学的な活性および性質を阻害しないキャリアまたは希釈剤を示す。アジュバントはこれらの表現に含まれる。医薬的に許容され得るキャリア中に含まれる成分の１つは、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、有機媒体および水性媒体の両方における広範囲の溶解度特性を有している生体適合性ポリマーであることができる（Ｍｕｔｔｅｒ他（１９７９））。
【０１３７】
本明細書中において、用語「賦形剤」は、有効成分の投与をさらに容易にするために医薬組成物に添加される不活性な物質を示す。賦形剤の非限定的な例には、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖およびデンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油およびポリエチレングリコールが含まれる。
【０１３８】
薬物の配合および投与のための様々な技術が“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、最新版）に見出され得る（これは参考として本明細書中に組み込まれる）。
【０１３９】
好適な投与経路には、例えば、経口送達、直腸送達、経粘膜送達、経鼻送達、腸管送達または非経口送達（これには、筋肉内注射、皮下注射および髄内注射、ならびに、クモ膜下注射、直接的な脳室内注射、心臓内注射、静脈内注射、腹腔内注射、鼻内注射または眼内注射が含まれる）が含まれ得る。
【０１４０】
あるいは、例えば、患者の身体の特定領域に直接的に調製物の注射をすることによって、全身的な方法よりも局所的に調製物を投与しうる。
【０１４１】
組換えベクターはいくつかの様式で投与することができる。例えば、内皮細胞特異的なプロモーターを含むベクターが使用されるならば、手順はその標的化特異性を利用することができ、結果として、疾患部位において局所的に投与する必要がない。従って、本発明の好ましい実施形態によれば、核酸構築物が全身的に（例えば、静脈内または皮下）投与される。実施例５に例示されるように、内皮細胞特異的なプロモーターに連結された本発明のポリヌクレオチドの全身投与は、血管形成を促進させることで疾患部位においてより効果的であるだけでなく、構成的に活性なプロモーターに連結された同じポリヌクレオチドの全身投与よりもはるかに大きい安全性プロフィルを示した。
【０１４２】
ウイルスベクターの脊髄液内への注入もまた、特に神経変性疾患の場合には投与方式として使用することができる。注入後、ウイルスベクターは、ウイルスベクターが感染のための適切な標的特異性により宿主細胞を認識するまで循環する。
【０１４３】
本発明の医薬組成物は、この分野で十分に知られているプロセスによって、例えば、混合、溶解、造粒、糖衣錠作製、研和、乳化、カプセル化、包括化または凍結乾燥の従来のプロセスによって製造することができる。
【０１４４】
本発明に従って使用される医薬組成物は、医薬品として使用され得る調製物への有効成分の加工を容易にする賦形剤および補助剤を含む１つまたは複数の医薬的に許容され得るキャリアを使用して従来の様式で配合することできる。適正な配合は、選ばれた投与経路に依存する。
【０１４５】
注射の場合、医薬組成物の有効成分は、水溶液において、好ましくは生理学的に適合し得る緩衝液（例えば、ハンクス溶液、リンゲル溶液、または生理学的な生理的食塩緩衝液など）において配合することができる。経粘膜投与の場合、浸透されるバリヤーに対して適切な浸透剤が配合において使用される。そのような浸透剤はこの分野では一般に知られている。
【０１４６】
経口投与の場合、医薬組成物は、活性化合物をこの分野で広く知られている医薬的に許容され得るキャリアと組み合わせることによって容易に配合され得る。そのようなキャリアは、本発明の化合物が、患者によって経口摂取される錠剤、ピル、糖衣錠、カプセル、液剤、ゲル、シロップ、スラリー剤および懸濁物などとして配合されることを可能にする。経口使用される薬理学的調製物を、固体の賦形剤を使用し、得られた混合物を場合により粉砕し錠剤または糖衣錠コアを得るために、所望する場合には好適な補助剤を添加した後、顆粒の混合物を加工して作製することができる。好適な賦形剤には、特に、ラクトース、スクロース、マンニトールまたはソルビトールを含む糖などの充填剤；セルロース調製物、例えば、トウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ナトリウムカルボメチルセルロースなど；および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などの生理学的に許容され得るポリマーがある。所望する場合には、架橋されたポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸もしくはその塩（例えば、アルギン酸ナトリウムなど）などの崩壊剤を加えることができる。
【０１４７】
糖衣錠コアには、好適なコーティングが施される。この目的のために、高濃度の糖溶液を使用することができ、この場合、糖溶液は、場合により、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、二酸化チタン、ラッカー溶液および好適な有機溶媒または溶媒混合物を含有し得る。色素または顔料を、活性化合物の量を明らかにするために、または活性化合物の量の種々の組合せを特徴づけるために、錠剤または糖衣錠コーティングに加えることができる。
【０１４８】
経口使用され得る医薬組成物には、ゼラチンから作製されたプッシュ・フィット型カプセル、ならびに、ゼラチンおよび可塑剤（例えば、グリセロールまたはソルビトールなど）から作製された軟いシールされたカプセルが含まれる。プッシュ・フィット型カプセルは、充填剤（例えば、ラクトースなど）、結合剤（例えば、デンプンなど）、滑剤（例えば、タルクまたはステアリン酸マグネシウムなど）および場合により安定化剤との混合で有効成分を含有することができる。軟カプセルでは、有効成分を好適な液体（例えば、脂肪油、流動パラフィンまたは液状のポリエチレングリコールなど）に溶解または懸濁させることができる。また、安定化剤を加えることができる。経口投与される配合物はすべて、選ばれた投与経路について好適な投薬形態でなければならない。
【０１４９】
口内投与の場合、組成物は、従来の様式で配合された錠剤またはトローチの形態を取ることができる。
【０１５０】
鼻吸入による投与の場合、本発明による使用のための有効成分は、好適な噴射剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタンまたは二酸化炭素）の使用により加圧パックまたはネブライザーからのエアロゾルスプレー提示物の形態で都合よく送達される。加圧されたエアロゾルの場合、投薬量単位が、計量された量を送達するためのバルブを備えることによって決定され得る。ディスペンサーにおいて使用される、例えば、ゼラチン製のカプセルおよびカートリッジで、化合物および好適な粉末基剤（例えば、ラクトースまたはデンプンなど）の粉末混合物を含有するカプセルおよびカートリッジを配合することができる。
【０１５１】
本明細書中に記載される調製物は、例えば、ボーラス注射または連続注入による非経口投与のために配合することができる。注射用配合物は、場合により保存剤が添加された、例えば、アンプルまたは多回用量容器における単位投薬形態で提供され得る。組成物は、油性ビヒクルまたは水性ビヒクルにおける懸濁物または溶液剤またはエマルションにすることができ、また、懸濁化剤、安定化剤および／または分散化剤などの配合剤を含有することができる。
【０１５２】
非経口投与される医薬組成物には、水溶性形態での活性調製物の水溶液が含まれる。また、有効成分の懸濁物を適切な油性または水性の注射用懸濁物として調製することができる。好適な親油性の溶媒またはビヒクルには、脂肪油（例えば、ゴマ油など）、または合成脂肪酸エステル（例えば、オレイン酸エチルなど）、トリグリセリドまたはリポソームが含まれる。水性の注射用懸濁物は、懸濁物の粘度を増大させる物質、例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトールまたはデキストランなどを含有することができる。場合により、懸濁物はまた、高濃度溶液の調製を可能にするために有効成分の溶解性を増大させる好適な安定化剤または薬剤を含有することができる。
【０１５３】
あるいは、有効成分は、好適なビヒクル（例えば、無菌の、パイロジェン非含有水溶液）を使用前に用いて構成される粉末形態にすることができる。
【０１５４】
本発明の医薬組成物はまた、例えば、カカオ脂または他のグリセリドなどの従来の座薬基剤を使用して、座薬または停留浣腸剤などの直腸用組成物に配合することができる。
【０１５５】
本発明に関連した使用のために好適な医薬組成物には、有効成分が、その意図された目的を達成するために効果的な量で含有される組成物が含まれる。より具体的には、治療効果的な量は、治療されている対象の病状を予防、緩和あるいは改善するために効果的であるか、または、治療されている対象の生存を延ばすために効果的である、有効成分の量を意味する。
【０１５６】
治療効果的な量の決定は、十分に当業者の能力の範囲内である。
【０１５７】
本発明の方法において使用される任意の調製物について、治療効果的な量または用量は、最初はインビトロでアッセイから推定することができる。例えば、用量は動物モデルにおいて配合することが可能であり、そのような情報は、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定するために使用することができる。
【０１５８】
本明細書中に記載される有効成分の毒性および治療効力は、細胞培養または実験動物における、インビトロで標準的な薬学的手法によって、明らかにすることができる。これらのインビトロでの細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータは、ヒトにおける使用に対する投薬量範囲を決定するために使用することができる。投薬量は、用いられる投薬形態および利用される投与経路に依存して変化し得る。正確な配合、投与経路および投薬量は、患者の状態を考慮して個々の医師によって選ぶことができる（Ｆｉｎｇｌら，（１９７５年）「Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」，Ｃｈ．１ｐ．１参照）。
【０１５９】
処置される状態の重篤度および応答性に依存して、投薬は、単回または複数回投与で行うことができ、この場合、処置期間は、数日から数週間まで、または治療が達成されるまで、または疾患状態の軽減が達成されるまで続く。
【０１６０】
投与される組成物の量は、当然のことではあるが、処置されている患者、苦痛の重篤度、投与様式、処方医の判断などに依存する。
【０１６１】
本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドが、単独での各因子の処置と比較して改良された治療効果を達成するために、さらなる活性因子と共に個体に提供されることができることは理解されるだろう。このような治療において、処置（例えば、投薬および補助剤の選択）は、組合せ治療と関連しうる有害な副作用を避けるように選択される。
【０１６２】
適合し得る医薬用キャリアに配合された本発明の調製物を含む組成物もまた、適応される状態を処置するために調製され、適切な容器に入れられ、かつ標識され得る。
【０１６３】
本発明の組成物は、所望されるならば、有効成分を含有する１つまたは複数の単位投薬形態物を含有し得るパックまたはディスペンサーデバイス（例えば、ＦＤＡ承認キットなど）で提供され得る。パックは、例えば、金属ホイルまたはプラスチックホイルを含むことができる（例えば、ブリスターパックなど）。パックまたはディスペンサーデバイスには、投与のための説明書が付随し得る。パックまたはディスペンサーデバイスはまた、医薬品の製造、使用または販売を規制する政府当局によって定められた形式で、容器に関連した通知によって適応させることがあり、この場合、そのような通知は、組成物の形態、あるいはヒトまたは動物への投与の当局による承認を反映する。そのような通知は、例えば、処方薬物について米国食品医薬品局によって承認されたラベル書きであり得るか、または、承認された製品添付文書であり得る。
【０１６４】
本発明のさらなる目的、利点および新規な特徴は、下記実施例を考察すれば、当業技術者には明らかになるであろう。なおこれら実施例は本発明を限定するものではない。さらに、先に詳述されかつ本願の特許請求の範囲の項に特許請求されている本発明の各種実施態様と側面は各々、下記実施例の実験によって支持されている。
【実施例】
【０１６５】
上記説明とともに、以下の実施例を参照して本発明を例示する。なおこれら実施例によって本発明は限定されない。
【０１６６】
本願で使用される用語と、本発明で利用される実験手順には、分子生化学、微生物学および組み換えＤＮＡの技法が広く含まれている。これらの技法は文献に詳細に説明されている。例えば以下の諸文献を参照されたい：「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻（１９９４）Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．編；Ａｕｓｕｂｅｌら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、米国メリーランド州バルチモア（１９８９）；Ｐｅｒｂａｌ「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、米国ニューヨーク（１９８８）；Ｗａｔｓｏｎら、「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ」Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ、米国ニューヨーク；Ｂｉｒｒｅｎら編「Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ」１〜４巻、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、米国ニューヨーク（１９９８）；米国特許の第４６６６８２８号、同第４６８３２０２号、同第４８０１５３１号、同第５１９２６５９号および同第５２７２０５７号に記載される方法；「Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ」Ｉ〜ＩＩＩ巻、Ｃｅｌｌｉｓ，Ｊ．Ｅ．編（１９９４）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻、Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｊ．Ｅ．編（１９９４）；Ｓｔｉｔｅｓら編「Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（第８版）、Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ＆  Ｌａｎｇｅ、米国コネティカット州ノーウォーク（１９９４）；ＭｉｓｈｅｌｌとＳｈｉｉｇｉ編「Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｗ．Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．、米国ニューヨーク（１９８０）；利用可能な免疫アッセイ法は、特許と科学文献に広範囲にわたって記載されており、例えば：米国特許の第３７９１９３２号、同第３８３９１５３号、同第３８５０７５２号、同第３８５０５７８号、同第３８５３９８７号、同第３８６７５１７号、同第３８７９２６２号、同第３９０１６５４号、同第３９３５０７４号、同第３９８４５３３号、同第３９９６３４５号、同第４０３４０７４号、同第４０９８８７６号、同第４８７９２１９号、同第５０１１７７１号および同第５２８１５２１号；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．編（１９８４）；「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．編（１９８５）；「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．編（１９８４）；「Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ」Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．編（１９８６）；「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎ��  Ｅｎｚｙｍｅｓ」ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９８６）；「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ．（１９８４）および「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」１〜３１７巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；「ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、米国カリフォルニア州サンディエゴ（１９９０）；Ｍａｒｓｈａｋら、「Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ」ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）；これらの文献の全ては、あたかも本願に完全に記載されているように援用するものである。その他の一般的な文献は、本明細書を通じて提供される。それらの文献に記載の方法は当業技術界で周知であると考えられ、読者の便宜のために提供される。それらの文献に含まれるすべての情報は本願に参考として援用するものである。
【０１６７】
実施例１
三重変異型ＨＩＦ−１αはＰ４０２Ａ／Ｐ５６４ＧおよびＰ５６４Ａ／Ｎ８０３Ａの二重変異体よりも大きい転写活性を示す
ＨＩＦ−１α内のＰ４０２ＡおよびＰ５６４Ｇの点変異は、腫瘍抑制因子ＶＨＬとのその相互作用を阻止し、従って、これにより、その後のそのプロテオソーム分解を妨げることが以前に示された。これは、低酸素状態に匹敵し得る活性レベルに達する正常酸素圧時における安定化されたＨＩＦ−１αをもたらした。同様に、Ｐ５６４Ａ／Ｎ８０３Ａの点変異を伴うＨＩＦ−１αは、低酸素模倣鉄キレート剤の２，２’−ジピリジルによる処置の後、正常酸素圧において、野生型ＨＩＦ−１αと同じくらい活性であることが明らかにされた。本発明者らは、３つすべての変異の組合せにより、Ｐ４０２Ａ／Ｐ５６４Ｇの変異体よりも活性であり、かつ、Ｐ５６４Ａ／Ｎ８０３Ａの変異体よりも安定であり、従って、これにより、治療的血管形成の目的のためにより効き目のあるものにする、「三重変異体」と呼ばれる変異されたＨＩＦ−１αがもたらされるかもしれないことを仮定した。
【０１６８】
材料および方法
細胞培養：下記の細胞株を使用した。ウシの大動脈内皮細胞（ＢＡＥＣ）をＮ．Ｓａｖｉｏｎ（Ｇｏｌｄｓｃｈｌｅｇｅｒ  Ｅｙｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｓｈｅｄａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ）から譲り受けた。ヒトの胚性腎臓細胞（ＨＥＫ２９３細胞）をＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ、米国）から購入した。２０回−２６回継代した２９３細胞を使用した。ＨｅＬａ細胞をＹ．Ｋｅｉｓａｒｙ（Ｔｅｌ  Ａｖｉｖ大学）から譲り受けた。ヒトの臍帯静脈ＥＣ（ＨＵＶＥＣ）を以前の記載［Ｊａｆｆｅ，Ｅ．Ａ．ら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ、５２、２７４５−５６（１９７３）］のように購入した。腎細胞癌（ＲＣＣ）細胞をＧ．Ｌａｖｉ（Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｓｈｅｄａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）から譲り受けた。ＢＡＥＣ、ＨＥＫ２９３細胞およびＲＣＣを、１０％のＦＣＳ、２ｍＭのグルタミンおよび１００Ｕ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシンが補充されたＤＭＥＭで培養した。ＨｅＬａ細胞を、１０％のＦＣＳおよび１００Ｕ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシンが補充されたＭＥＭで培養した。ＨＵＶＥＣをＥＧＭ−２および２％ＦＣＳ（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ、Ｓａｎ−Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、米国）において維持した。すべての細胞を３７℃において５％ＣＯ２の加湿インキュベーターで維持した。
【０１６９】
発現構築物：ｐＥＦ−ｂｏｓプラスミドにおける野生型ＨＩＦ−１αおよびＰ５６４Ａ／Ｎ８０３Ａ  ＨＩＦ−１α変異体をＭ．Ｗｈｉｔｅｌａｗ（Ａｄｅｌａｉｄｅ大学）から譲り受けた。ｐｃＤＮＡ３プラスミドにおけるＰ４０２Ａ／Ｐ５６４Ｇ  ＨＩＦ−１α変異体をＰＪ．Ｒａｔｃｌｉｆｆ（Ｏｘｆｏｒｄ大学）から譲り受けた。ｐＣＲ３．１−ＨＡ−ＦＩＨ−１アンチセンスプラスミドをＧ．Ｓｅｍｅｎｚａ（Ｊｏｈｎｓ  Ｈｏｐｋｉｎｓ大学）から譲り受けた。ｐ２．１  ＨＲＥ−ルシフェラーゼをＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ、米国）から購入し、これは以前に記載された［Ｍａｈｏｎ，Ｐ．Ｃ．ら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ、１５、２６７５−８６（２００１）］。
【０１７０】
プラスミドＳＶ４０−β−ｇａｌをＰｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、米国）から購入した。三重変異型ＨＩＦ−１αを、Ｐ５６４Ａ／Ｎ８０３Ａ  ＨＩＦ−１α変異体のＢｓｕ２６Ｉ／ＮｏｔＩ消化フラグメントをＢｓｕ２６Ｉ／ＮｏｔＩ消化のＰ４０２Ａ／Ｐ５６４Ｇ  ＨＩＦ−１αベクターに挿入することによって構築した。プラスミドの完全性をＤＮＡ配列決定によって確認した。トランスフェクション実験のために、野生型ＨＩＦ−１αのｃＤＮＡおよび変異型ＨＩＦ−１αのｃＤＮＡをｐｃＤＮＡ３ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、米国）にサブクローン化した。
【０１７１】
一過性トランスフェクション実験：ＨＥＫ２９３細胞、ＢＡＥＣ細胞およびＲＣＣ細胞を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  Ｐｌｕｓ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、米国）を製造者の説明書に従って、２００ｎｇのｐ２．１  ＨＲＥ−ルシフェラーゼ、１００ｎｇのｐＳＶ４０−β−ｇａｌ、および、１００ｎｇのｐｃＤＮＡ３空ベクター、野生型ＨＩＦ−１α、Ｐ４０２Ａ／Ｐ５６４Ｇ、Ｐ５６４Ａ／Ｎ８０３Ａまたは三重変異体のいずれかと、２４ウエルプレートにおいて三連で同時トランスフェクションした。ＦＩＨ−１アンチセンス実験のために、トランスフェクションを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  Ｐｌｕｓ試薬を使用して、１００ｎｇのｐ２．１  ＨＲＥルシフェラーゼ、１００ｎｇのｐＳＶ４０−β−ｇａｌ、１００ｎｇのｐｃＤＮＡ３空ベクター、野生型ＨＩＦ−１α、Ｐ４０２Ａ／Ｐ５６４Ｇ、Ｐ５６４Ａ／Ｎ８０３Ａまたは三重変異体のいずれか、および、０ｎｇ−４００ｎｇのｐｃＤＮＡ３−ＨＡ−ＦＩＨ−１アンチセンスまたはｐｃＤＮＡ３と、三連で行った。４８時間後、ルシフェラーゼ活性およびβ−ｇａｌ活性を、β−ｇａｌアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、米国）を製造者の説明書に従って使用して求めた。続いて、ルシフェラーゼを、Ｔｕｒｎｅｒ  Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒモデル２０ｅ（Ｔｕｒｎｅｒ  Ｄｅｓｉｇｎｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ、米国）を使用して測定した。ルシフェラーゼ活性の結果を、β−ｇａｌのレベルを使用してトランスフェクション効率について正規化した。ＨｅＬａにおけるＲＴ−ＰＣＲ実験のために、３００ｎｇの様々なプラスミドのトランスフェクションを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  Ｐｌｕｓ試薬を用いて２４ウエルプレートにおいて行った。様々なプラスミドによる、６０ｍｍディッシュで成長させたＨＵＶＥＣのマグノフェクション（Ｍａｇｎｏｆｅｃｔｉｏｎ）を、Ｐｏｌｙｍａｇ（Ｃｈｅｍｉｃｅｌｌ，ＧｍｂＨ、Ｂｅｒｌｉｎ、ドイツ）を製造者の説明書に従って使用して行った。示される場合、１５０μＭの２，２’−ジピリジルによる処理を細胞溶解前１６時間で与えた。
【０１７２】
ルシフェラーゼアッセイおよびβ−ガラクトシダーゼアッセイ：ルシフェラーゼ活性およびβ−ｇａｌ活性を、β−ｇａｌアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、米国）を製造者の説明書に従って使用して求めた。ルシフェラーゼ活性の結果を、β−ｇａｌのレベルを使用してトランスフェクション効率について正規化した。
【０１７３】
ＲＴ−ＰＣＲアッセイ：トランスフェクション後４８時間で、細胞を溶解し、総ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙミニプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を製造者のプロトコルに従って使用して単離した。その後、ＲＮＡを、ＦａｓｔＳｔａｒｔ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒキット（Ｒｏｃｈｅ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、ドイツ）を使用してｃＤＮＡに逆転写した。半定量的ＲＴ−ＰＣＲを下記の遺伝子について行った：ＨＩＦ−１α、ＧＡＰＤＨ、ＶＥＧＦ、カルボニックアンヒドラーゼ９（ＣＡ−９）およびＰＤＧＦ−Ｂ。プライマー、アニーリング温度およびサイクル数が本明細書中下記の表３に詳しく記載される。
2014121326.tif 000006
【０１７４】
結果
ヒト胚性腎臓２９３細胞（ＨＥＫ２９３）およびウシ大動脈内皮細胞（ＢＡＥＣ）の両方において、一過性トランスフェクションされた三重変異型ＨＩＦ−１αは、Ｐ４０２Ａ／Ｐ５６４ＧおよびＰ５６４Ａ／Ｎ８０３Ａの二重変異体と比較して、正常酸素圧において転写活性における２倍−２．５倍の増大を示した（図１Ａ−図１Ｂ）。
【０１７５】
三重変異体はまた、ＨＩＦ−１α標的遺伝子のより大きいｍＲＮＡ誘導を引き起こした。このことについて、異なる変異体によるＨｅＬａ細胞の一過性トランスフェクションに続いて、ｍＲＮＡ抽出およびＲＴ−ＰＣＲ分析を行った。図１Ｃに示されるように、ＨＩＦ−１α構築物によりトランスフェクションされたすべての細胞におけるＨＩＦ−１αのｍＲＮＡは、トランスフェクション後、予想されるように、同程度であり、また、空ベクターのコントロールよりもはるかに高かった。以前の結果と一致して、三重変異型ＨＩＦ−１αは、二重変異体および野生型ＨＩＦ−１αよりも大きい、ＨＩＦ−１α標的遺伝子のカルボニックアンヒドラーゼ９（ＣＡ−９）、ＶＥＧＦおよびＰＤＧＦ−ＢのｍＲＮＡ誘導を引き起こした。ＶＨＬによって媒介されるＰ５６４Ａ／Ｎ８０３Ａ変異体のタンパク質分解が理論的には、プロリルヒドロキシル化にさらされるそのＰ４０２残基のために依然として生じ得る。三重変異体と、Ｐ５６４Ａ／Ｎ８０３Ａ変異体との間での転写誘導における観測された違いがＶＨＬ媒介の分解に起因することを証明するために、ＶＨＬ欠損の腎細胞癌（ＲＣＣ）系統を使用した。正常酸素圧でのＲＣＣにおける、ＨＩＦ−１α変異体の一過性トランスフェクションの後でのルシフェラーゼのＨＲＥ媒介転写の評価では、安定化されたＰ４０２Ａ／Ｐ５６４Ｇ変異体のレベルへの野生型ＨＩＦ−１αの活性の増大が明らかになった。このことはプロテオソーム分解の阻害を示している（図１Ｄ）。予想されるように、三重変異体のレベルへのＰ５６４Ａ／Ｎ８０３Ａ変異体の活性の増大が認められた。
【０１７６】
Ｐ４０２Ａ／Ｐ５６４Ｇ変異体は、安定化されたが、理論的には、依然としてＦＩＨ−１によって残基Ｎ８０３においてヒドロキシル化される可能性があり、これにより、その不活性化が引き起こされる。このことが、この変異体と、三重変異体との間での転写における認められた違いについての最も可能性のある説明である。ＨＥＫ２９３におけるアンチセンスノックアウト処置によるＦＩＨ−１の阻害は、正常酸素圧において、野生型ＨＩＦ−１αによるＨＲＥ媒介転写の用量依存的な増大をもたらした［図１Ｅ］。予想されるように、ＦＩＨ−１の阻害は、三重変異体よりも大きいＰ４０２Ａ／Ｐ５６４Ｇ変異体の活性の倍数誘導を引き起こした。このことは、ＦＩＨ−１が、実際に少なくとも部分的に、三重変異体の以前に認められたより大きい活性に関わっていることを示している。
【０１７７】
実施例２
Ｃ−トランス活性化ドメインの活性化が最適なＨＩＦ−１α媒介の血管形成のために不可欠である。
三重変異体の増大した転写能力の意味を治療的血管形成に関して評価するために、異なる変異体の比較を、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）において、ＨＩＦ−１α構築物のトランスフェクションの後、インビトロ血管形成アッセイを使用して行った。
【０１７８】
材料および方法
インビトロ血管形成アッセイ：６０ｍｍディッシュで成長させたトランスフェクションＨＵＶＥＣまたは感染ＨＵＶＥＣをＥＧＭ−２培地で２４時間維持し、その後、ＥＢＭ−２と培地交換した。細胞をアッセイ前にＥＢＭ−２においてさらに２４時間維持した。その後、細胞をトリプシン処理し、増殖因子低減マトリゲル（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国）により事前に被覆された２４ウエルプレートにウエルあたり５００００細胞の濃度で播種した。毛細管および管の形成を８時間追跡した。毛細管形成の定量化を、５つの無作為の顕微鏡視野において高倍率顕微鏡視野あたりの毛細管分岐の数を計数することによって行った。
【０１７９】
ＶＥＧＦのＥＬＩＳＡ：６０ｍｍディッシュで成長させたトランスフェクションＨＵＶＥＣまたは感染ＨＵＶＥＣをＥＧＭ−２培地で２４時間維持し、その後、ＥＢＭ−２と培地交換した。細胞を、溶解緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）／ＰＢＳ、１％Ｔｒｉｔｏｎ、および、完全なミニプロテアーゼ阻害剤カクテル錠剤（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，ＧｍＢＨ、ドイツ））を加える前にＥＢＭ−２においてさらに２４時間維持した。細胞溶解物を１００００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。ヒトＶＥＧＦタンパク質についてのＥＬＩＳＡを製造者のプロトコル（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）に従って行った。
【０１８０】
ウエスタンブロット分析：ＨＵＶＥＣを６０ｍｍディッシュで培養し、サブコンフルエンスに成長させた。細胞に、上記で記載されるように、Ａｄ−ＰＰＥ−Ｔｒｉｐｌｅ、Ａｄ−ＣＭＶ−Ｔｒｉｐｌｅ、Ａｄ−ＣＭＶ−ｗｔまたはＡｄ−ＣＭＶ−ＧＦＰを感染させた。溶解およびタンパク質含有量の評価（ＭｉｃｒｏＢＣＡ；Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ、米国）の後、等量のタンパク質を含有するサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、Ｏｐｔｉｔｒａｎ  ＢＡ−Ｓ８３強化ニトロセルロースメンブラン（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ．、Ｋｅｅｎｅ、Ｎｅｗ  Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ、米国）に転写した。メンブランをマウス抗ヒトＨＩＦ−１αポリクローナル抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、米国）によりプローブし、その後、ＨＲＰコンジュゲート化二次抗体によりプローブし、ＥＣＬ反応を行った。
【０１８１】
結果
空ベクターは管形成を何ら引き起こさなかった一方で、すべてのＨＩＦ−１α構築物、ＶＥＧＦ陽性コントロールおよびＦＣＳ陽性コントロールは血管形成を刺激した（図２Ａ−図２Ｆ）。野生型ＨＩＦ−１αおよびＰ４０２Ａ／Ｐ５６４Ｇは、類似する程度に管形成を刺激したが、両者は、Ｐ５６４Ａ／Ｎ８０３Ａおよび三重変異体と比較して、著しく低下した血管形成作用を有していた（ｐ＜０．００１）（図２Ｇ）。これらの知見と一致して、ｗｔ−ＨＩＦ１αまたはＰ４０２Ａ／Ｐ５６４Ｇによる処理の後でのＨＵＶＥＣにおけるＶＥＧＦタンパク質濃度は非常に類似し、Ｐ５６４Ａ／Ｎ８０３Ａまたは三重変異体による処理よりも著しく低かった（ｐ＝０．０２９）（図２Ｈ）。Ｐ５６４Ａ／Ｎ８０３Ａまたは三重変異体による処理は、ｗｔ−ＨＩＦ１αおよびＰ４０２Ａ／Ｐ５６４Ｇと比較して、ＶＥＧＦタンパク質における６倍の増大および１０倍の増大をそれぞれもたらした（図２Ｈ）。これらの結果は、ＨＩＦ−１αの安定性が不十分であること、および、構成的に活性なＣ−ＴＡＤがＨＩＦ−１αの最大血管形成作用のために不可欠であることを示している。違いが、Ｐ５６４Ａ／Ｎ８０３Ａと、三重変異体との間には何ら認められなかった。これは、高いＨＩＦ−１αの過剰発現に起因し得る。それは、ヒドロキシラーゼ酵素を飽和させ、従って、これにより、安定性に起因する何らかの違いを隠した。これは、図１ＤにおいてＲＣＣ内に見出される状態に類似している。
【０１８２】
実施例３
虚血におけるＰＰＥ−１−３ｘプロモーターの発現および特異性
全身的な前血管形成遺伝子治療の実現可能性および安全性のための前提条件は、標的の虚血組織の内部での十分にロバストかつ特異的な発現である。虚血の状況における修飾ＰＰＥ−１プロモーターの発現および特異性を特徴づけるために、ＧＦＰをＰＰＥ−１−３ｘの調節下で発現するアデノウイルスを使用した（Ａｄ−ＰＰＥ−１−３ｘ−ＧＦＰ）。
【０１８３】
材料および方法
アデノウイルスベクターの構築：Ａｄ−ＰＰＥ−Ｔｒｉｐｌｅ、Ａｄ−ＣＭＶ−ＴｒｉｐｌｅおよびＡｄ−ＣＭＶ−ｗｔの各ベクターを、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、米国）による相同的組換えによって作製した。ウイルス構築物の成功した作製をＰＣＲによって確認し、その後、２回のプラーク精製を行った。ウイルスプラークは引き続いてＨＥＫ２９３における大規模精製を受け、その後、ＣｓＣｌ精製が行われた。
【０１８４】
動物：１２週齢のメスのＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｌｔｄ．、Ｊｅｒｕｓａｌｅｍ、イスラエル）を使用した。すべての動物手法はＳｈｅｄａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒの動物管理使用委員会によって承認された。
【０１８５】
後肢虚血モデルおよびアデノウイルス注入：１２週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊのメスマウスを、ケタミンおよびキシラジンの混合物を使用して麻酔した。マウスを、Ｃｏｕｆｆｉｎｈａｌら１５により記載される手順に対する修飾法によって後肢虚血に供した。左大腿動脈の上に重なる皮膚を切開し、続いて、大腿動脈を、大腿深動脈および浅大腿動脈の分岐の近位側、および、膝窩動脈の近位側で結紮した。その後、結紮部の間の動脈部分を取り出し、すべての側枝を切除した。局所的な筋肉内注入のために、２０μｌの２ｘ１０１０個のＶＰまたは生理的食塩水を３つの部位（大腿四頭筋、内転筋および腓腹筋）のそれぞれにおいて手術時に注入した。全身的な静脈内注入のために、１００μｌの１ｘ１０１１個のＶＰまたは生理的食塩水を、手術後７日で尾静脈を介して注入した。
【０１８６】
ＧＦＰ分析：マウスをウイルス注入後７日で屠殺し、腓腹筋組織を集め、０．１Ｍリン酸塩緩衝液における４％パラホルムアルデヒドにおいて４℃で２４時間固定処理し、３０％スクロース溶液に４℃で４８時間浸し、その後、ＯＣＴコンパウンド（Ｓａｋｕｒａ、ＣＡ、米国）において凍結した。組織ブロックをクライオミクロトームによって５μｍ厚の横断切片にスライスし、蛍光顕微鏡（ＦＩＴＣフィルター）で直接に観察した。すべての組織処理を、ＧＦＰの退色を防止するために薄暗い光のもとで行った。
【０１８７】
結果
マウスは大腿動脈の結紮による後肢虚血を受けたか、または、擬似手技を受け、その後、Ａｄ−ＰＰＥ−１−３ｘ−ＧＦＰが筋肉内注入された。コントロール動物には、Ａｄ−ＣＭＶ−ＧＦＰまたは生理的食塩水が注入された。Ａｄ−ＣＭＶ−ＧＦＰ注入後のＧＦＰ発現が、虚血性筋肉および非虚血性筋肉の筋細胞および内皮細胞の両方で筋肉の組織学的切片において検出された。対照的に、Ａｄ−ＰＰＥ−１−３ｘ−ＧＦＰ注入後のＧＦＰ発現が虚血性筋肉の内皮細胞において検出され、一方で、発現が非虚血性筋肉では特定されなかった。これらの結果により、修飾されたＰＰＥ−１プロモーターの、内皮および虚血状態に対する特異性が明らかにされる。
【０１８８】
Ａｄ−ＰＰＥ−１−３ｘ−ＧＦＰの静脈内送達を、このプロモーターがまた、ウイルスが体内にばらまかれ、その少ない一部のみが標的器官に到達する静脈内全身注入の後で発現を引き起こし得るかどうかを明らかにするために行った。この目的のために、後肢虚血または擬似手技を受けたマウスに、Ａｄ−ＰＰＥ−１−３ｘ−ＧＦＰ、および、コントロールとしてのＡｄ−ＣＭＶ−ＧＦＰまたは生理的食塩水を、手術後７日で尾静脈を介して注入した。大腿動脈結紮の直後、虚血性後肢における血流が正常な肢の１０％未満に低下し、また、本発明者らのモデルではほとんど存在しないので、十分な血管化が発達することを可能にし、従って、ウイルスがその虚血標的に到達することを可能にすることを目指して、７日の待機間隔を注入前に置いた。図３Ａ−図３Ｆに示されるように、ＧＦＰの非特異的な発現が、Ａｄ−ＣＭＶ−ＧＦＰの全身的注入の後、虚血性筋肉および非虚血性筋肉の両方の組織学的切片において検出された（図３Ｂおよび図３Ｅ）が、虚血性筋肉の内皮細胞だけにおけるＧＦＰの特異的な発現がＡｄ−ＰＰＥ−１−３ｘ−ＧＦＰ注入後に認められた（図３Ｃおよび図３Ｆ）。
【０１８９】
実施例４
Ａｄ−ＰＰＥ−Ｔｒｉｐｌｅ  ＨＩＦ−１αの局所的注入は虚血の血管新生を増強する
下記の実験を、ＰＰＥ−１−３ｘプロモーターの発現のもとでのアデノウイルス媒介の三重変異型ＨＩＦ−１αによる筋肉内処置が血管形成をインビボで促進させ得るかどうかを明らかにするために行った。
【０１９０】
材料および方法
後肢血流のモニタリング：マウスを麻酔し、体温変動を最小限に抑えるために３７℃での加熱プレートに５分間置いた。後肢血流を、手術直後、ならびに、手術後７日目、１４日目、２１日目および２８日目に、レーザードップラー灌流画像化装置システム（Ｍｏｏｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｌｔｄ．、英国）を用いて測定した。低い灌流および／または無灌流のシグナルが青色で表示され、これに対して、最高灌流のシグナルが赤色で表示された。カラー写真を記録し、分析を、虚血性後肢および非虚血性後肢の平均灌流を計算することによって行った。変数（例えば、周囲の光および温度など）を補償するために、結果が、右側（非虚血）後肢に対する左側（虚血）後肢における灌流の比率として表される。
【０１９１】
免疫組織化学および毛細管密度の定量：２８日目に屠殺したとき、後肢の筋肉組織を切除し、Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ  ＯＣＴコンパウンド（Ｓａｋｕｒａ  Ｆｉｎｅｔｅｋ  ＵＳＡ  Ｉｎｃ．、Ｔｏｒｒａｎｃｅ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、米国）において凍結し、横方向に凍結切片化した。ＥＣを、ラットモノクローナル抗ＣＤ３１抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、米国）を使用して免疫染色した。背景をヘマトキシリンにより染色した。
【０１９２】
結果
後肢の虚血をマウスにおいて誘導し、その後、Ａｄ−ＰＰＥ−１−３ｘ−Ｔｒｉｐｌｅ、Ａｄ−ＣＭＶ−ＴｒｉｐｌｅまたはＡｄ−ＣＭＶ−ｗｔの筋肉内注入を行った。コントロール動物には、Ａｄ−ＣＭＶ−Ｌｕｃまたは生理的食塩水を注入した。血流、臨床的結果、および、血管形成の指標を２８日の期間にわたって調べた。手術直後、虚血肢における血流がすべてのマウス群において正常な肢の１０％未満に低下した。２１日目までに、Ａｄ−ＣＭＶ−ＴｒｉｐｌｅまたはＡｄ−ＰＰＥ−１−３ｘ−Ｔｒｉｐｌｅにより処置されたマウスは、Ａｄ−ＣＭＶ−ｗｔ、Ａｄ−ＣＭＶ−Ｌｕｃまたは生理的食塩水コントロールにより処置されたマウスと比較して、後肢血流の著しい増大を示した（図４Ａ）。２８日目までに、Ａｄ−ＣＭＶ−ＴｒｉｐｌｅおよびＡｄ−ＰＰＥ−１−３ｘ−Ｔｒｉｐｌｅはともに、虚血肢における灌流を正常な肢のおよそ５０％に改善し、これらは、Ａｄ−ＣＭＶ−ｗｔまたはコントロールの処置よりも著しく大きかった（図４Ａ−図４Ｂ）。そのうえ、Ａｄ−ＣＭＶ−ＴｒｉｐｌｅまたはＡｄ−ＰＰＥ−Ｔｒｉｐｌｅによる処置は、虚血肢に対する血流の改善と一致して、虚血誘導の足指の壊死および自切（これらは、Ａｄ−ＣＭＶ−ｗｔまたはコントロールにより処置されたマウスでは顕著であった）を完全に低下させることができた（図４Ｃ−図４Ｄ）。血流の知見と一致して、ＣＤ３１染色後の筋肉の毛細管密度の定量化では、毛細管対筋繊維の比率が、Ａｄ−ＣＭＶ−Ｔｒｉｐｌｅ処置動物およびＡｄ−ＰＰＥ−１−３ｘ−Ｔｒｉｐｌｅ処置動物では、Ａｄ−ＣＭＶ−ｗｔ処置動物およびコントロール処置動物よりも大きいことが明らかにされた（図４Ｅおよび図４Ｆ）。
【０１９３】
実施例５
Ａｄ−ＰＰＥ−１−３ｘ−Ｔｒｉｐｌｅの全身投与は、Ａｄ−ＣＭＶ−Ｔｒｉｐｌｅと比較して、より安全であり、また、副作用を全く示さない
下記の実験を、Ａｄ−ＰＰＥ−１−３ｘ−Ｔｒｉｐｌｅの全身投与の安全性プロフィルをＡｄ−ＣＭＶ−Ｔｒｉｐｌｅの全身投与の安全性プロフィルと比較するために行った。アデノウイルスのほとんどが注入部位に集中する局所的な筋肉内注入とは対照的に、尾静脈を介する静脈内投与の後では、アデノウイルスのほとんどが肝臓に到達し、形質導入する。従って、処置の安全性にかかわらず、マウスにおいて発生する肝臓機能における何らかの変化および他の全身的症状発現をモニターすることは特に重要であった。
【０１９４】
材料および方法
血清ビリルビン、血清ＡＳＴおよび血清ＡＬＴの測定：マウス血清を注入後５日目および２１日目で得て、自動分析計を使用して分析した。
【０１９５】
免疫組織化学および毛細管密度の定量：実施例４に記載される通り。
【０１９６】
後肢血流のモニタリング：実施例４に記載される通り。
【０１９７】
統計学的方法：ＳｉｇｍａＳｔａｔ（ＳＰＳＳ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｃｈｉｃａｇｏ、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ、米国）を統計学的分析のために使用した。一元配置の反復測定ＡＮＯＶＡをインビトロ研究において行い、スチューデントｔ検定を後肢虚血モデルについて使用した；０．０５未満のＰを有意であると見なした。データは平均±ＳＥＭとして示される。データは、ＳｉｇｍａＰｌｏｔまたはＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｃｏｒｐ．、Ｒｅｄｍｏｎｄ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、米国）を使用してグラフ化された。
【０１９８】
結果
後肢の虚血を受けたマウスに、Ａｄ−ＰＰＥ−１−３ｘ−Ｔｒｉｐｌｅ、Ａｄ−ＣＭＶ−ＴｒｉｐｌｅおよびＡｄ−ＣＭＶ−ｗｔが、手術後７日で尾静脈を介して全身に注入され、一方で、Ａｄ−ＣＭＶ−Ｌｕｃまたは生理的食塩水がコントロールとして役立った。注入後１日で、生理的食塩水により処置されたマウスを除くマウスのすべての群が体重における顕著な低下を示した。しかしながら、すべての他のアデノウイルス処置マウスが注入後３日目までにそれらの元の体重を回復したが、Ａｄ−ＣＭＶ−Ｔｒｉｐｌｅ処置マウスは、４日目までに最大で１０％の低下に達する体重の低下を続けた（図５Ａ）。このことは全身的な障害を示している。マウスの肝臓機能検査を注入後５日で行った。検査では、生理的食塩水コントロールを上回る、Ａｄ−ＣＭＶ−Ｔｒｉｐｌｅ処置マウスにおける顕著な２５倍の血清ビリルビンの増大が明らかにされた。このことは重度の黄疸を明らかにする。Ａｄ−ＣＭＶ−ｗｔは、血清ビリルビンのより穏やかな増加を引き起こした（図５Ｃ）。さらに、血清ＡＳＴレベルおよび血清ＡＬＴレベルが、Ａｄ−ＣＭＶ−Ｔｒｉｐｌｅ処置マウス、Ａｄ−ＣＭＶ−ｗｔ処置マウス、および、同様にＡｄ−ＣＭＶ−Ｌｕｃ処置マウスでは５日目までに大きく上昇した（図５Ｂおよび図５Ｄ）。Ａｄ−ＣＭＶ−Ｔｒｉｐｌｅ処置マウスによって示される肝障害の明白な全身的症状発現とは対照的に、Ａｄ−ＰＰＥ−Ｔｒｉｐｌｅにより処置されたマウスは障害の徴候を何ら示さず、その血清ビリルビンレベル、血清ＡＳＴレベルおよび血清ＡＬＴレベルは生理的食塩水処置マウスと同程度であった。これらの知見と一致して、５日目で屠殺されたマウスの肝臓の組織学的切片は、著しい炎症およびリンパ球浸潤をＡｄ−ＣＭＶ−Ｔｒｉｐｌｅ処置マウスにおいて明らかにし、一方で、Ａｄ−ＰＰＥ−１−３ｘ−Ｔｒｉｐｌｅ、Ａｄ−ＣＭＶ−Ｌｕｃおよび生理的食塩水コントロールは病理を何ら示さなかった（図５Ｅ−図５Ｎ）。軽度のリンパ球浸潤が同様に、Ａｄ−ＣＭＶ−ｗｔ処置群において認められた。肝臓病理のこの急性期の後、Ａｄ−ＣＭＶ−Ｔｒｉｐｌｅ処置マウスは、徐々ではあるが、部分的回復を示した。Ａｄ−ＣＭＶ−Ｔｒｉｐｌｅ処置マウスはその体重を回復し、また、注入後２８日目までに、その血清ビリルビンが正常に戻っていた。しかしながら、その血清ＡＳＴおよび血清ＡＬＴは、Ａｄ−ＣＭＶ−ｗｔ群およびＡｄ−ＣＭＶ−Ｌｕｃ群と同様に、Ａｄ−ＰＰＥ−１−３ｘ−Ｔｒｉｐｌｅ処置マウスおよび生理的食塩水コントロール処置マウスと比較した場合、依然として上昇していた。この部分的な肝臓回復はまた、注入後２１日目から得られる肝臓の組織学的切片でも見られた（図５Ｅ−図５Ｎ）。このことは、軽度のリンパ球浸潤が、Ａｄ−ＣＭＶ−ｔｒｉｐｌｅにより処置された動物において残っていることを示す。
【０１９９】
処置後、Ａｄ−ＰＰＥ−Ｔｒｉｐｌｅにより処置されたマウスは、Ａｄ−ＣＭＶ−Ｔｒｉｐｌｅ群およびすべての他の処置群と比較して、虚血性後肢における血液灌流での著しくより大きい改善を明らかにした。この改善は手術後２１日目に初めて認められ、手術後２８日目までに、Ａｄ−ＣＭＶ−Ｔｒｉｐｌｅ群における３０％に対して、正常な肢のおよそ４５％の灌流に達した（図６Ａ−図６Ｂ）。虚血性後肢の臨床的結果は、Ａｄ−ＰＰＥ−Ｔｒｉｐｌｅマウスでの足指の壊死および自切における顕著な低下をすべての他の群に対して明らかにする血流増加と一致していた（図６Ｃ−図６Ｄ）。加えて、ＣＤ３１染色後の筋肉の毛細管密度の定量化では、毛細管対筋繊維の比率が、Ａｄ−ＰＰＥ−１−３ｘ−Ｔｒｉｐｌｅにより処置された群では、Ａｄ−ＣＭＶ−Ｔｒｉｐｌｅ群およびすべての他の群よりも大きいことが示された（図６Ｅ−図６Ｆ）。
【０２００】
明確にするため別個の実施態様で説明されている本発明の特定の特徴は単一の実施態様に組み合わせて提供することもできることは分かるであろう。逆に、簡潔にするため単一の実施態様で説明されている本発明の各種の特徴は別個にまたは適切なサブコンビネーションで提供することもできる。
【０２０１】
本発明はその特定の実施態様によって説明してきたが、多くの別法、変更および変形があることは当業者には明らかであることは明白である。従って、本発明は、本願の請求項の精神と広い範囲の中に入るこのような別法、変更および変形すべてを包含するものである。本願で挙げた刊行物、特許および特許願はすべて、個々の刊行物、特許および特許願が各々あたかも具体的にかつ個々に引用提示されているのと同程度に、全体を本明細書に援用するものである。さらに、本願で引用又は確認したことは本発明の先行技術として利用できるという自白とみなすべきではない。
【配列表フリーテキスト】
【０２０２】
配列番号１は、三重変異ＨＩＦ−１αコード配列の配列である。
配列番号２は、三重変異ＨＩＦ−１αの配列である。
配列番号４は、ＰＰＥ−１プロモーターの配列である。
配列番号５は、低酸素応答エレメントの配列である。
配列番号６〜１５は、一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドの配列である。
【図１ａ】
2014121326.tif 000007
【図１ｂ−ｃ】
2014121326.tif 000008
【図１ｄ】
2014121326.tif 000009
【図１ｅ】
2014121326.tif 000010
【図２ａ−ｆ】
2014121326.tif 000011
【図２ｇ】
2014121326.tif 000012
【図２ｈ】
2014121326.tif 000013
【図３】
2014121326.tif 000014
【図４ａ−ｂ】
2014121326.tif 000015
【図４ｃ−ｄ】
2014121326.tif 000016
【図４ｅ−ｆ】
2014121326.tif 000017
【図５ａ−ｂ】
2014121326.tif 000018
【図５ｃ−ｄ】
2014121326.tif 000019
【図５ｅ−ｎ】
2014121326.tif 000020
【図６ａ−ｂ】
2014121326.tif 000021
【図６ｃ−ｄ】
2014121326.tif 000022
【図６ｅ−ｆ】
2014121326.tif 000023
【図７ａ−ｂ】
2014121326.tif 000024
【図７ｃ−ｈ】
2014121326.tif 000025
【配列表】
2014121326000001.app