(57)【要約】【課題】再生可能なバイオマスを有用物質に変換してエネルギー源や工業原料として用いる技術を提供すること。【解決手段】キシルロキナーゼを組換え導入しおよび／またはアルドースレダクターゼを欠損させた酵母であって、該酵母の４０℃におけるキシロース同時異性化発酵収率が少なくとも２５％である、酵母、およびキシロースおよび／またはキシロースを含む糖からエタノールを生産する方法であって、該方法は、該キシロースおよび／またはキシロースを含む糖を含む原料に、この酵母接触させる工程を包含する、方法が本発明により提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
キシルロキナーゼを組換え導入しおよび／またはアルドースレダクターゼを欠損させた酵母であって、該酵母の４０℃におけるキシロース同時異性化発酵収率が少なくとも２５％である、酵母。
【請求項２】
前記酵母がＣａｎｄｉｄａ属、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｐｉｃｈｉａ属、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属、またはＨａｎｓｅｎｕｌａ属の酵母である、請求項１に記載の酵母。
【請求項３】
前記酵母がＣａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ａｎｏｍａｌａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｔｉｎｉａｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ、またはＨａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａである、請求項１または２に記載の酵母。
【請求項４】
前記酵母がＣａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａまたはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の酵母。
【請求項５】
キシルロース資化能を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の酵母。
【請求項６】
前記４０℃でのキシロース同時異性化発酵収率が少なくとも５０％である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の酵母。
【請求項７】
前記４０℃でのキシロース同時異性化発酵収率が少なくとも７５％である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の酵母。
【請求項８】
リグノセルロース利用能を有する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の酵母。
【請求項９】
前記リグノセルロース利用能は、リグノセルロースを原料としてエタノールを生成する能力である、請求項８に記載の酵母。
【請求項１０】
キシルロキナーゼを高発現させ、かつ、アルドースレダクターゼを欠損させた、請求項１〜９のいずれか１項に記載の酵母。
【請求項１１】
前記酵母がＣａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａであり、前記アルドースレダクターゼは相同組換えにより破壊されている、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の酵母。
【請求項１２】
前記キシルロキナーゼは前記酵母と同種または異種である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の酵母。
【請求項１３】
前記酵母がＣａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａであり、前記キシルロキナーゼはＣｇＸＫ（配列番号２９）である、請求項１２に記載の酵母。
【請求項１４】
前記酵母がＣａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａであり、前記キシルロキナーゼはＣｇＸＫ（配列番号２９）であり、前記アルドースレダクターゼは破壊されている、請求項１２または１３に記載の酵母。
【請求項１５】
Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ  ３１６３  ｄｇＸＫ１（受託番号  ＮＩＴＥ  Ｐ−１３５７）、Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ  ３１６３−ＣｇＸＫ（受託番号  ＮＩＴＥ  Ｐ−１３５８）、Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ  ３１６３  Δｇｒｅ３−３５（受託番号  ＮＩＴＥ  Ｐ−１３５９）またはＣ．  ｇｌａｂｒａｔａ  ＮＦＲＩ  ３１６３（ＮＩＴＥ受託番号  Ｐ−１３６０）で寄託された系統である酵母。
【請求項１６】
前記酵母がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅであり、前記アルドースレダクターゼは相同組換えにより破壊されている、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の酵母。
【請求項１７】
前記キシルロキナーゼは前記酵母と同種または異種である、請求項１〜１０または１６のいずれか１項に記載の酵母。
【請求項１８】
前記酵母がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅであり、前記キシルロキナーゼはＳｃＸＫ（配列番号３７）である、請求項１７に記載の酵母。
【請求項１９】
前記酵母がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅであり、前記キシルロキナーゼはＳｃＸＫ（配列番号３７）であり、前記アルドースレダクターゼは破壊されている、請求項１７または１８に記載の酵母。
【請求項２０】
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｓｔ１０  ｄｇＸＫ１（受託番号  ＮＩＴＥ  Ｐ−０１６１７）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｓｔ１０−ＳｃＸＫ（受託番号  ＮＩＴＥ  Ｐ−０１６１８）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｓｔ１０−１−１（受託番号  ＮＩＴＥ  Ｐ−０１６２０）、またはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｓｔ１０  Δｇｒｅ３−２（受託番号  ＮＩＴＥ  Ｐ−０１６１９）で寄託された系統である酵母。
【請求項２１】
キシロースおよび／またはキシロースを含む糖からエタノールを生産する方法であって、該方法は、該キシロースおよび／またはキシロースを含む糖を含む原料に、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の酵母を接触させる工程を包含する、方法。
【請求項２２】
前記接触は、キシロースイソメラーゼ（グルコースイソメラーゼ）の存在下で行われる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記原料はリグノセルロースを含み、前記接触は４０℃以上で行われる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記接触は、キシロースイソメラーゼ（グルコースイソメラーゼ）の存在下で行われる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記原料は稲わらを含み、前記接触は４０℃以上で行われる、請求項２１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記接触工程の前に、前記原料をアルカリ処理する工程をさらに包含する、請求項２１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記アルカリ処理は水酸化カルシウムによる、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａに相同組換えを起こして相同組換えＣａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａを生産する方法であって、該方法は、相同組換えの対象となる遺伝子の約４５％以上の長さの相同部分を両端に有する相同組換え用遺伝子構築物と、Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａとを、相同組換えを起こす条件下に供する工程を包含する、方法。
【請求項２９】
前記遺伝子はＧＲＥ３であり、前記約４５％以上の長さは０．４５ｋｂ以上である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記相同組換えＣａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａの相同組換えの対象となる遺伝子が破壊される、請求項２８または２９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概してエタノール発酵の分野の発明であり、より詳細には、キシロースを高温で発酵し、エタノールを簡便に大量に生産する方法、ならびにそれらに関連する技術、酵母等に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、石油資源に替わり再生可能なバイオマスを有用物質に変換してエネルギー源や工業原料として用いる技術が検討されるようになってきている。バイオマスを原料として微生物の発酵により生産されるエタノールは、石油資源の消費を抑え、大気中の二酸化炭素の増加を抑制するという観点から代替原料として期待されている。バイオマス、とりわけ食料とは競合しない原料として、リグノセルロースを主体とする草本類や木本類などの利用が考えられている。
【０００３】
リグノセルロースに含まれる主要な糖は、セルロースを構成するグルコースと、ヘミセルロースを構成するキシロースである。リグノセルロースを化学的あるいは酵素的に分解することにより単糖を主として含む糖化組成物が得られる。リグノセルロースからエタノールを工業的に製造するために、こうした糖化組成物中に含まれる糖を効率的に利用し、高収量でエタノール発酵できる微生物およびエタノール製造方法が求められている。
【０００４】
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ等のエタノール発酵能力の高い酵母は、一般に、グルコース、フルクトース、ガラクトースを利用することができるが、キシロースを利用できない。したがって、リグノセルロースを原料として高効率に発酵するためには、こうした酵母がキシロースを利用可能となるように改変することが求められている。
【０００５】
酵母がキシロースを利用するには、キシロース代謝経路が必要である（図１）。キシロース代謝経路としては、キシロースレダクターゼ（ＸＲ）およびキシリトールデヒドロゲナーゼ（ＸＤＨ）を用いた経路と、キシロースイソメラーゼ（ＸＩ）を用いた経路が考えられる。現在までに遺伝子組換え技術を用いてこれらの代謝経路を酵母に導入することにより、酵母にキシロース利用能を付与することが行われている（特許文献１、非特許文献１〜３）。
【０００６】
ＸＲ、ＸＤＨを利用した経路では、ＸＲおよびＸＤＨが必要とする補酵素の種類が異なることから、外来遺伝子を過剰発現させることによって補酵素のバランスがとれず、キシロースの代謝がキシリトールで止まってしまい、エタノール収率が上がらない問題がある（非特許文献４，５）。他方、ＸＩを導入する系では、酵母で十分な活性を発現可能であるＸＩはごく小数であり、嫌気性の真菌（カビ）であるＰｉｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．  Ｅ２由来のＸＩ（特許文献２）、細菌であるＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ由来のＸＩ（特許文献３）、シロアリ原生生物由来のＸＩ（特許文献４）等に限定されている。しかも、宿主酵母の染色体に多コピーのＸＩ遺伝子を挿入しなければ十分な活性が得られず、特に工業的な製造工程においては、このような多コピーの外来遺伝子を持つ遺伝子組換え体の性質を安定して維持することは困難であると考えられる。
【０００７】
キシロースを発酵するために上述の組換え体を用いる他に、自然界から単離してきたキシロース発酵能を有するＰｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓやＣａｎｄｉｄａ  ｓｈｅｈａｔａｅ等の酵母を利用する報告もある（非特許文献６）。しかしながら、これらの酵母はキシロースの代謝に酸素を必要とし、酸素存在下では培養液中に基質となる糖が無くなるとエタノールを消費してしまうことから、通気条件等の煩雑な制御を行わない限り、エタノール収率の低下が起こる。
【０００８】
また、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ等のキシロースを利用できない酵母でも、キシロースが異性化されたキシルロースは発酵できることが知られている。そこで、キシロースイソメラーゼ酵素（グルコースイソメラーゼ酵素）を培養液中に添加することにより、イソメラーゼ酵素によってキシロースがキシルロースに変換され、生成したキシルロースを酵母に発酵させる同時異性化発酵法も検討されている（図１）（非特許文献７）。
【０００９】
リグノセルロースに含まれる多糖を酵母が利用できるようにするためには、酵素や酸を用いて単糖あるいは二糖にまで分解（糖化）する必要がある。このうち、酵素による糖化は、穏和な圧力・温度で反応が行えること、硫酸等の化学薬品を大量に使用する必要が無く環境負荷が低いこと、生成糖の過分解が起こらず収率が高いこと等の利点がある。
【００１０】
また、酵素による糖化と微生物による発酵を同時に行う並行複発酵と呼ばれる発酵方法があり、高濃度のエタノールを生産するのに適した方法とされている。並行複発酵の利点としては、生成糖による酵素反応の阻害（生成物阻害）を回避できることや、発酵液中に高濃度の糖が蓄積せず酵母への浸透圧ストレスが少ないことが挙げられる。しかし、糖化酵素の反応に最適な温度（５０℃程度）と酵母の発酵に最適な温度（３０℃程度）との差が大きいことが並行複発酵を行う上での問題となっている。したがって、両者の温度差を少なくすることが並行複発酵の効率化に重要であり、その解決策の一つとして高温発酵の技術が求められている。
【００１１】
これまでに、４０℃以上の高温でも生育が良好なＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓやＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓを用いて、４２℃や４５℃の並行複発酵でグルコースが高収率で発酵されることが報告されている（非特許文献８，９）。しかしながら、キシロースを４０℃以上の培養温度において高収率で発酵できている報告はこれまでない。例えば、４０℃以上の高温でも生育可能でありキシロースを利用できる酵母としてＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．  ＩＩＰＥ４５３やＨａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａが報告されているが、これらの酵母はエタノール生成能が低い。Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．  ＩＩＰＥ４５３では、副産物であるキシリトールの蓄積量が多く、エタノール収率は理論収率の７％であった（非特許文献１０）。Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ  ３５６株は最も発酵能が高い３７℃においてもキシロースからのエタノール収率は理論収率の２４％であり、４０℃でのキシロースからのエタノール収率は１０％まで低下することが示されている（非特許文献１１）。Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａについては、遺伝子組換えによりピルビン酸デカルボキシラーゼや熱ショックタンパク質を過剰発現させたり、トレハロース蓄積量を増加させたりすることによって、エタノール生産量の増加に効果があると報告されている。しかしながら、文献中で示されているエタノール収率は５％程度と低い（非特許文献１２および１３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特開２００９−１４８２７７公報
【特許文献２】特表２００５−５１４９５１公報
【特許文献３】特表２００６−５２５０２９公報
【特許文献４】特開２０１１−１４７４４５公報
【特許文献５】特開２０１１−４７３０公報
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｃｈｕ，  Ｂ．  Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｄｖａｎｃｅｓ，  Ｖｏｌ．２５，  ｐｐ．４２５−４４１  （２００７）
【非特許文献２】Ｊｅｆｆｒｉｅｓ，  Ｔ．  Ｗ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ．１７，  ｐｐ．３２０−３２６  （２００６）
【非特許文献３】Ｊｅｆｆｒｉｅｓ，  Ｔ．  Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ．６３，  ｐｐ．４９５−５０９  （２００４）
【非特許文献４】Ｂｒｕｉｎｅｎｂｅｒｇ，  Ｐ．  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ．１８，  ｐｐ．２８７−２９２  （１９８３）
【非特許文献５】Ｋｏｅｔｔｅｒ，  Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ．３８，  ｐｐ．７７６−７８３  （１９９３）
【非特許文献６】Ｔｏｉｖｏｌａ，  Ａ．ｅｔ  ａｌ．，  Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．４７  ｐｐ．１２２１−１２２３  （１９８４）
【非特許文献７】Ｌａｓｔｉｃｋ，  Ｓ．  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．３０  ｐｐ．５７４−５７９  （１９８９）
【非特許文献８】Ｂａｌｌｅｓｔｅｒｏｓ，  Ｉ．ｅｔ  ａｌ．，  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ．２８／２９，  ｐｐ．３０７−３１５  （１９９１）
【非特許文献９】Ｋｒｉｓｈｎａ，  Ｓ．  Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．７７  ｐｐ．１９３−１９６  （２００１）
【非特許文献１０】Ｋｕｍａｒ，  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．３６  ｐｐ．１４８３−１４８９  （２００９）
【非特許文献１１】Ｒｙａｂｏｖａ，  Ｏ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，  ＦＥＭＳ  Ｙｅａｓｔ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｖｏｌ．４  ｐｐ．１５７−１６４  （２００３）
【非特許文献１２】Ｉｓｈｃｈｕｋ，  Ｏ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，  ＦＥＭＳ  Ｙｅａｓｔ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｖｏｌ．８  ｐｐ．１１６４−１１７４  （２００８）
【非特許文献１３】Ｉｓｈｃｈｕｋ，  Ｏ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｖｏｌ．１０４  ｐｐ．９１１−９１９  （２００９）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、以下を提供する。
【００１５】
１つの局面では、本発明はキシルロキナーゼを組換え導入しおよび／またはアルドースレダクターゼを欠損させた酵母であって、該酵母の４０℃におけるキシロース同時異性化発酵収率が少なくとも２５％である、酵母を提供する。
【００１６】
１つの実施形態では、本発明の酵母はＣａｎｄｉｄａ属、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｐｉｃｈｉａ属、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属、またはＨａｎｓｅｎｕｌａ属の酵母である。
【００１７】
別の実施形態では、本発明の酵母はＣａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ａｎｏｍａｌａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｔｉｎｉａｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ、またはＨａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａである。
【００１８】
好ましい実施形態では、本発明の酵母はＣａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａまたはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである。
【００１９】
好ましい実施形態では、本発明の酵母はＣａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａである。
【００２０】
好ましい実施形態では、本発明の酵母はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである。
【００２１】
別の実施形態では、本発明の酵母はキシルロース資化能を有する。
【００２２】
別の実施形態では、前記４０℃でのキシロース同時異性化発酵収率が少なくとも５０％である。
【００２３】
別の実施形態では、前記４０℃でのキシロース同時異性化発酵収率が少なくとも７５％である。
【００２４】
別の実施形態では、前記４０℃でのキシロース同時異性化発酵収率が少なくとも８０％である。
【００２５】
別の実施形態では、本発明の酵母はリグノセルロース利用能を有する、請求項１に記載の酵母である。
【００２６】
別の実施形態では、前記リグノセルロース利用能は、リグノセルロースを原料としてエタノールを生成する能力である。
【００２７】
別の実施形態では、本発明の酵母はキシルロキナーゼを高発現させ、かつ、アルドースレダクターゼを欠損させたものである。
【００２８】
別の実施形態では、本発明の酵母はＣａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａであり、前記アルドースレダクターゼは相同組換えにより破壊されている。
【００２９】
別の実施形態では、前記キシルロキナーゼは前記酵母と同種または異種である。
【００３０】
別の実施形態では、本発明の酵母は、Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａであり、前記キシルロキナーゼはＣｇＸＫ（配列番号２９）である。
【００３１】
別の実施形態では、本発明の酵母は、Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａであり、前記キシルロキナーゼはＣｇＸＫ（配列番号２９）であり、前記アルドースレダクターゼは破壊されている。
【００３２】
別の実施形態では、本発明の酵母は、Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ  ３１６３  ｄｇＸＫ１（受託番号  ＮＩＴＥ  Ｐ−１３５７）、Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ  ３１６３−ＣｇＸＫ（受託番号  ＮＩＴＥ  Ｐ−１３５８）、Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ  ３１６３  Δｇｒｅ３−３５（受託番号  ＮＩＴＥ  Ｐ−１３５９）またはＣａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ  ＮＦＲＩ３１６３（受託番号  ＮＩＴＥ  Ｐ−１３６０）で寄託された系統である。
【００３３】
別の実施形態では、本発明のＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅであり、前記アルドースレダクターゼは相同組換えにより破壊されている。
【００３４】
別の実施形態では、本発明のキシルロキナーゼは前記酵母と同種または異種である。
【００３５】
別の実施形態では、本発明の酵母がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅであり、前記キシルロキナーゼはＳｃＸＫ（配列番号３７）である。
【００３６】
別の実施形態では、本発明の酵母がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅであり、前記キシルロキナーゼはＳｃＸＫ（配列番号３７）であり、前記アルドースレダクターゼは破壊されている。
【００３７】
別の実施形態では、本発明の酵母はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｓｔ１０  ｄｇＸＫ１（受託番号  ＮＩＴＥ  Ｐ−０１６１７）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｓｔ１０−ＳｃＸＫ（受託番号  ＮＩＴＥ  Ｐ−０１６１８）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｓｔ１０−１−１（受託番号  ＮＩＴＥ  Ｐ−０１６２０）またはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｓｔ１０  Δｇｒｅ３−２（受託番号  ＮＩＴＥ  Ｐ−０１６１９）で寄託された系統である。
【００３８】
別の局面では、本発明は、キシロースおよび／またはキシロースを含む糖からエタノールを生産する方法であって、該方法は、該キシロースおよび／またはキシロースを含む糖を含む原料に、本発明の酵母を接触させる工程を包含する、方法を提供する。この酵母は、本発明の酵母が有しうる任意の実施形態を採用してもよい。
【００３９】
１つの実施形態では、前記接触は、キシロースイソメラーゼ（グルコースイソメラーゼ）の存在下で行われる。
【００４０】
別の実施形態では、前記原料はリグノセルロースを含み、前記接触は４０℃以上で行われる。
【００４１】
別の実施形態では、前記接触は、キシロースイソメラーゼ（グルコースイソメラーゼ）の存在下で行われる。
【００４２】
別の実施形態では、前記原料は稲わらを含み、前記接触は４０℃以上で行われる。
【００４３】
別の実施形態では、前記接触工程の前に、前記原料をアルカリ処理する工程をさらに包含する。
【００４４】
別の実施形態では、前記アルカリ処理は水酸化カルシウムによる。
【００４５】
別の局面では、本発明は、Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａに相同組換えを起こして相同組換えＣａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａを生産する方法であって、該方法は、相同組換えの対象となる遺伝子の約４５％以上の長さの相同部分を両端に有する相同組換え用遺伝子構築物と、Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａとを、相同組換えを起こす条件下に供する工程を包含する、方法を提供する。
【００４６】
１つの実施形態では、前記遺伝子はＧＲＥ３であり、前記約４５％以上の長さは０．４５ｋｂ以上である。
【００４７】
別の実施形態では、前記相同組換えＣａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａの相同組換えの対象となる遺伝子が破壊される。
【００４８】
これらの上記特徴は、適用可能である場合、複数が組み合わされうることが理解される。
【００４９】
従って、本発明のこれらおよび他の利点は、以下の詳細な説明を読めば、明白である。
【発明の効果】
【００５０】
リグノセルロースを原料とした燃料用エタノールの実用的な生産が可能となった。４０℃において、理論収率の２５％以上、好ましい実施形態では、理論収率の７５％以上、理論収率の８０％以上の収率でキシロースからエタノールを生産する酵母および方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】図１は、微生物におけるキシロースの代謝系および同時異性化発酵法を示す模式図である。
【図２】図２は、実施例２において行った本発明の菌株の４０℃におけるエタノール耐性の比較を示す。左のパネルから、０％（ｗ／ｖ）エタノール、５％（ｗ／ｖ）エタノール、７．５％（ｗ／ｖ）エタノールを含む寒天培地上に２種の菌株の菌液を滴下し、４０℃で静置培養を行った結果である。上列はＣａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ  ＮＦＲＩ３１６３株を示し、下列はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＡＴＣＣ２４８６０株を示す。左から１０の４乗、１０の５乗、１０の６乗、１０の７乗、１０の８乗ＣＦＵ（Ｃｏｌｏｎｙ  Ｆｏｒｍｉｎｇ  Ｕｎｉｔ）の菌体を含む菌体懸濁液を滴下した。
【図３−１】図３−１は実施例３において行ったキシロース代謝系を有する遺伝子組換え酵母を作製するためのベクター（ｐＹＰＧＥ１５Ｌ）を構築する方法の概略を示した図である。
【図３−２】図３−２は実施例３において行ったキシロース代謝系を有する遺伝子組換え酵母を作製するためのベクター（ｐＹＰＧＥ１５Ｌ−ＸＲ、ｐＹＰＧＥ１５Ｌ−ＸＤＨ、ＹＰＧＥ１５Ｌ−ＸＫ）を構築する方法の概略を示した図である。
【図３−３】図３−３は実施例３において行ったキシロース代謝系を有する遺伝子組換え酵母を作製するためのベクター（ｐＡＵＲ−ＸＲＸＤＨＸＫ）を構築する方法の概略を示した図である。
【図４】図４は、キシロース代謝系を有するＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびＣａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａの遺伝子組換え体によるグルコース・キシロース混合培地のエタノール発酵を示す図である。ＸＲ、ＸＤＨおよびＸＫを導入しキシロース発酵能を有する遺伝子組換え体を５％（ｗ／ｖ）グルコースおよび２％（ｗ／ｖ）キシロースを含むＹＰ培地で培養し、エタノール発酵を行った結果である。上列はＳ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを示し、下列はＣ．  ｇｌａｂｒａｔａの結果を示す。左のパネルから３０℃、３５℃、３７℃、４０℃での原料および生成物の各成分（黒丸：グルコース、黒四角：キシロース、白丸：エタノール、白四角：キシリトール、白三角：グリセロール）の濃度（ｇ／Ｌ）を示す。
【図５】図５は、実施例５で製造した酵母での外来遺伝子発現用ベクターであるｐＲＳ４０６−ＰＧＫｐＣＹＣｔの概略図を示す。
【図６】図６は、実施例５で製造したＣａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａのキシルロキナーゼ導入用ベクターｐＲＳ４０６−ＣｇＸＫの概略図を示す。
【図７】図７は、実施例７で製造したＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのキシルロキナーゼ導入用ベクターｐＲＳ４０６−ＸＫの概略図を示す。
【図８】図８は、実施例８の相同組換えによるＣａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ染色体上のアルドースレダクターゼ遺伝子の破壊を示す模式図および遺伝子破壊を確認したＰＣＲの結果を示す図である。上パネルでは、相同組換えのスキームおよび非相同末端結合の模式図を示す。下パネルでは、相同組換え条件に供した４７株のうち、３つの代表株のアルドースレダクターゼ（ＣｇＧＲＥ３）についてのＰＣＲの結果を示す。レーン１および２の＃１７および＃３５が相同組換えを起こしていることが判明した。
【図９】図９は、実施例８で製造したＣａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａのアルドースレダクターゼ遺伝子（ＣｇＧＲＥ３）をクローニングしたベクターｐＢＳ−ＣｇＧＲＥ３の概略図を示す。
【図１０】図１０は、実施例８で製造したＣａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ染色体上のアルドースレダクターゼ遺伝子破壊用ベクターｐＢＳ−ＣｇＧＲＥ３―ＵＲＡ３の概略図を示す。
【図１１】図１１は、実施例１１の遺伝子組換え体によるグルコース・キシロース混合培地の同時異性化発酵の結果を示す。Ｙ軸は糖およびエタノールの生成量（％（ｗ／ｖ））を示し、Ｘ軸が時間（時間）を示す。原料および生成物の各成分（グルコース、キシロース、エタノール、キシリトール）の濃度（％（ｗ／ｖ））を示す。黒丸はグルコース、黒四角はキシロース、白丸はエタノール、白四角はキシリトールを示す。
【図１２】図１２は、実施例１２の並行複発酵と同時異性化発酵との組み合わせでの結果を示す。Ｙ軸は糖およびエタノールの生成量（％（ｗ／ｖ））を示し、Ｘ軸が時間（時間）を示す。左が３０℃、右が４０℃での結果である。原料および生成物の各成分（黒丸：グルコース、黒四角：キシロース、白丸：エタノール、白四角：キシリトール）の濃度（％（ｗ／ｖ））を示す。
【図１３】図１３は、実施例１６において行った２種類の抗生物質耐性遺伝子を利用して、２本の相同染色体上のアルドースレダクターゼ遺伝子（ＧＲＥ３）を両方とも破壊した手法の模式図を示す。Ｓｔ１０−１−１では、ＧＲＥ３のホモ接合体であり、ゼオシン感受性でかつＧ４１８感受性であり、Ｓｔ１０  ＧＲＥ３：：ＺＥＯとなると（中央）、一方のＧＲＥ３がゼオシン耐性遺伝子（ＺＥＯ）に置換され、ゼオシン耐性となる。最後にＳｔ１０  Δｇｒｅ３−２になるともう一方のＧＲＥ３がＧ４１８耐性遺伝子（ＫＡＮ）に置き換わり、Ｇ４１８に対しても耐性になる（右）。
【図１４】図１４は、実施例１９において行った遺伝子組換え体によるグルコース・キシロース混合培地の同時異性化発酵の結果を示す。Ｙ軸は糖およびエタノールの生成量（％（ｗ／ｖ））を示し、Ｘ軸が時間（時間）を示す。上段はＳｔ１０−１−１を用いた結果を示し、下段はＳｔ１０  ｄｇＸＫ１を用いた結果を示す。左が３０℃、右が４０℃の結果である。原料および生成物の各成分（黒丸：グルコース、黒四角：キシロース、白丸：エタノール、白四角：キシリトール）の濃度（％（ｗ／ｖ））を示す。
【図１５】図１５は、実施例２０において行った並行複発酵と同時異性化発酵との組み合わせによる稲わらからのエタノール生産の結果を示す。Ｙ軸は糖およびエタノールの生成量（％（ｗ／ｖ））を示し、Ｘ軸が時間（時間）を示す。左が３０℃、右が４０℃の結果である。原料および生成物の各成分（黒丸：グルコース、黒四角：キシロース、白丸：エタノール、白四角：キシリトール）の濃度（％（ｗ／ｖ））を示す。
【発明を実施するための形態】
【００５２】
以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。定義された用語は、特に言及しない限り、その変化形、対応する他の品詞においても同様の定義が適用されることが理解される。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用されるすべての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。
【００５３】
（用語の定義）
本明細書において、必要に応じて、以下の略語を用いる。
【００５４】
Ｓ．：  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ：  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
Ｃ．  ：  Ｃａｎｄｉｄａ
Ｃ．  ｇｌａｂｒａｔａ：  Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ
ＸＲ：  キシロースレダクターゼ（Ｘｙｌｏｓｅ  Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）
ＸＤＨ：  キシリトールデヒドロゲナーゼ（Ｘｙｌｉｔｏｌ  Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）
ＸＫ：  キシルロキナーゼ（Ｘｙｌｕｌｏｋｉｎａｓｅ）
ＰＧＫ１ｐ：  Ｐｈｏｓｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ  ｋｉｎａｓｅ  １遺伝子プロモーター
ＣＹＣ１ｔ：  Ｉｓｏ−１−ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  ｃ遺伝子ターミネーター
ＰＣＲ：  ポリメラーゼ連鎖反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）
ＨＰＬＣ：  高速液体クロマトグラフィー
Ｕ：  Ｕｎｉｔ（単位）
以下に本明細書において用いられる各用語の意味を説明する。各用語は本明細書中、統一した意味で使用し、単独で用いられる場合も、または他の用語と組み合わされて用いられる場合も、同一の意味で用いられる。
【００５５】
本明細書において、「酵母」とは、広義に解釈され、少なくとも部分的に単純な単細胞で構成されている栄養体（葉状体）を，正常な成長条件でもつ菌類の総称であり、本発明では、例えば、Ｃａｎｄｉｄａ属、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｐｉｃｈｉａ属、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属、またはＨａｎｓｅｎｕｌａ属を含み、より詳細な例としては、Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ａｎｏｍａｌａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｔｉｎｉａｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ
ｆｒａｇｉｌｉｓ、またはＨａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａなどが挙げられ、以下の微生物学的特徴を有する菌株をいう。
・糖を代謝しエタノール発酵を行うものであること。
・好ましくは、糖が代謝される際に、乳酸発酵よりもエタノール発酵が優先されるものであること。
【００５６】
なお、４０℃におけるキシロース同時異性化発酵収率（キシロースをエタノール発酵する収率）が少なくとも２５％である酵母は、従来報告がないため、本発明は、このような酵母を提供するという意味で画期的である。
【００５７】
本明細書において「同時異性化発酵能」とは、キシロースイソメラーゼ（グルコースイソメラーゼ）添加によるキシロースの発酵能をいう。同時異性化発酵法は、キシロースイソメラーゼ酵素（グルコースイソメラーゼ酵素）を培養液中に添加することにより、イソメラーゼ酵素によってキシロースがキシルロースに変換され、生成したキシルロースを酵母に発酵させる方法をいう（Ｌａｓｔｉｃｋ，  Ｓ．Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．３０  ｐｐ．５７４−５７９  （１９８９）（非特許文献７）を参照）。
【００５８】
本明細書において４０℃における「キシロース同時異性化発酵収率」とは、４０℃で同時異性化発酵法を行ったときのエタノールの発酵収率を言う。本明細書では、格別に言及しない限り収率の定義は、「２％（ｗ／ｖ）キシロースを基質として初発菌体濃度０．３ｇ（乾燥重量）／Ｌを用いて７２時間発酵した場合のエタノール収率」を基準として用いる。発酵収率の考え方には、（１）基質として加えた量に対するエタノール生成量の割合（存在する基質からどれくらいエタノールを作ることができるか）＜対添加基質量＞、および（２）酵母が消費した基質に対するエタノール生成量の割合（使用した基質のうち、どれだけをエタノールに変えることができるか）＜対消費基質量＞があり、いずれも使用されている。エタノールを生産する場合は、基質を利用する能力も重要になることから、文献では（１）の収率を使用されることも多いため、（１）を使う方が実態に即していると言えることから汎用されており、本明細書においては、特に言及しない限り、比較の観点から（１）を使用する。なお、この場合、加えた基質を全て使い切れば（１）の収率と（２）の収率は等しくなるが、基質を全て使い切れない場合は、（１）の収率は（２）の収率よりも低くなり、特に高濃度の基質を用いたデータを比較する際には、（１）同士もしくは（２）同士の収率を比較することが重要である。なお、本明細書では、（２）を用いる場合は、たとえば、２％（ｗ／ｖ）キシロース添加を基準として用いうるが、他のデータとの比較において例えば６％（ｗ／ｖ）キシロースを使用する場合で用いられうる。
【００５９】
例えば、特定の菌株としては、Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ  ３１６３  ｄｇＸＫ１（受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１３５７）Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ  ３１６３−ＣｇＸＫ（受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１３５８）、Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ  ３１６３  Δｇｒｅ３−３５（受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１３５９）、Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ  ＮＦＲＩ  ３１６３（受託番号  ＮＩＴＥ  Ｐ−１３６０）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｓｔ１０  ｄｇＸＫ１（受託番号  ＮＩＴＥ  Ｐ−０１６１７）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｓｔ１０−ＳｃＸＫ（受託番号  ＮＩＴＥ  Ｐ−０１６１８）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｓｔ１０−１−１（受託番号  ＮＩＴＥ  Ｐ−０１６２０）またはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｓｔ１０  Δｇｒｅ３−２（受託番号  ＮＩＴＥ  Ｐ−０１６１９）で寄託された系統である酵母が挙げられる。いずれも、独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ；千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8）の特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に寄託されている。
【００６０】
本明細書において「キシルロース資化能」とは、微生物について、キシルロースを炭素源として自身の増殖に使用することが可能であることをいう。また、「キシルロース発酵能」とは、微生物がキシルロースを原料としてエタノールを生産することが可能であることをいう。さらに、「キシルロース利用能」とは、キシルロースを炭素源として使用することが可能であることをいい、キシルロース資化能やキシルロース発酵能を包含する。
【００６１】
本明細書において「リグノセルロース利用能」とは、ある微生物について、リグノセルロースを炭素源として使用することが可能であることをいう。このようなリグノセルロース利用能は、リグノセルロースを原料としてエタノールを生成する能力を包含する。
【００６２】
本明細書において「野生株」は、ある菌株について、変異を加えておらず、外来の（非自己の）遺伝子を導入していないものをさし、「天然株」とも称される。したがって、本明細書において「外来」（ｆｏｒｅｉｇｎ）とは、野生株にせよ実験室株にせよ、「外から入れた」すなわち、「非自己」あるいは「従来もっていない」という意味で用いられる。外来遺伝子は、同種または異種でありうる。例えば、キシルロキナーゼについて言及する場合、「外来」とは、そのキシルロキナーゼをコードする遺伝子を外から入れるという事項を指す。例えば、野生型の代表例としてはＣ．  ｇｌａｂｒａｔａ  ＮＦＲＩ  ３１６３（ＮＩＴＥ受託番号  Ｐ−１３６０）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｓｔ１０−１−１（受託番号  ＮＩＴＥ  Ｐ−０１６２０）が挙げられる。また、本明細書において「実験室株」とは、加工されているものをさし、外来遺伝子を有していないものも包含する。エタノール発酵に直接あるいは間接的に関与する外来遺伝子を包含していない実験室株は、エタノール発酵能に関しては、野生株と同等と考えてよい。このような外来遺伝子を包含していない実験室株としては、Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＩｎｖＳｃ１を代表例として挙げることができる。
【００６３】
したがって、本明細書において「高発現」とは、ある遺伝子（例えば、キシルロキナーゼ）について言及する場合、加工前の状態に比べて発現が増えていることをいい、同種または異種のその遺伝子を外から入れる（例えば、外来のキシルロキナーゼを組換え導入する）か、および／または、内在する同じ遺伝子の発現を増強することなどによって、達成されうる。１つの実施形態では、遺伝子組換えに用いたキシルロキナーゼ遺伝子は、それぞれ自身のキシルロキナーゼ遺伝子、すなわち、Ｃ．  ｇｌａｂｒａｔａにはＣ．  ｇｌａｂｒａｔａの由来のキシルロキナーゼ遺伝子を、Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにはＳ．
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のキシルロキナーゼ遺伝子を導入することができる。別の実施形態では、他の生物種由来の遺伝子であっても、機能的に発現すれば同様の効果があると考えられることから、同様に導入することができる。必要に応じて、単にキシルロキナーゼ遺伝子だけではなく、酵母細胞内で発現に必要なプロモーターも付加することにより発現を増強することができる。従って、キシルロキナーゼについて、高発現は、好ましい実施形態では、同種または異種のキシルロキナーゼが、酵母細胞内で発現するように遺伝子組換えにより導入されたものということができる。
【００６４】
本明細書において遺伝子の「組換え導入」は、任意の方法によって達成することができることが理解される。酵母細胞内に組換え導入された外来遺伝子は、染色体への組み込み、あるいは、自律的複製によって酵母細胞内に保持されうる。酵母細胞の染色体への外来遺伝子の組み込みは、相同性のあるＤＮＡの間で起こる相同組換え、または、相同性に関係なく起こる非相同末端結合によって達成することができる。通常、Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ等において外来遺伝子の相同組換えにより宿主細胞の染色体上の遺伝子破壊を行う場合、遺伝子組換えに使うＤＮＡ断片をＰＣＲによって簡便に調製する方法が主流である。この場合、外来遺伝子増幅用のＰＣＲプライマーの５’−末端に、４０〜５０塩基の相同組換えのターゲット部位の配列を付加したプライマーを合成し、ＰＣＲを行うことにより、外来遺伝子の外側に相同組換えに必要な配列が付加したＤＮＡ断片を得ることができる。他方、Ｃ．  ｇｌａｂｒａｔａでは非相同末端結合が優勢のため、４０〜５０塩基の相同配列では相同組換えは殆ど起こらない。
【００６５】
本明細書において遺伝子の「欠損」は、その遺伝子を物理的に存在しなくさせるかまたは機能を低減または消失させることによって、その遺伝子が最終的に実現する目的が１００％達成されないことをいう。好ましくは、そのような「欠損」は、目的とする遺伝子が実質的にまったく機能しないか、物理的に存在しないようにさせる。したがって、本明細書においてある遺伝子（例えば、アルドースレダクターゼ）について「欠損させる」とは、その遺伝子について野生株または適切な場合実験室株よりも低いかまたはないレベルで機能をさせることをいう。
【００６６】
本明細書において、「増殖（活性）」（ｇｒｏｗｔｈ  （ａｃｔｉｖｉｔｙ））とは、微生物について言及する場合、その微生物の個体・細胞などが数を増すこと、あるいはその活性をいう。
【００６７】
４０℃においてキシロース同時異性化発酵収率が高い酵母は、特に、４０℃においてキシロース同時異性化発酵収率が２０％より高い酵母は、従来の選抜法では取得が不可能または困難であった。しかし、実施例等において例示される本明細書に記載の選抜法の手順に従えば４０℃で高エタノール変換効率な酵母すなわち、４０℃においてキシロース同時異性化発酵収率が高い酵母を、当業者は容易に取得することができる。したがって、少なくとも本明細書において実証された各菌株と同属の酵母であれば、同様にして他の種でも、４０℃においてキシロース同時異性化発酵収率が高い株を取得することができることが理解される。すなわち、本明細書に記載されるような（１）４０℃でキシルロース発酵能の高い酵母株の選抜を行い、（２）外来のキシルロキナーゼを導入し、そして（３）内在性アルドースレダクターゼを欠損させるという３ステップで「同時異性化法により、４０℃でキシロースを高収率でエタノールに変換する酵母」を得ることができることが当業者に理解される。なお、キシルロキナーゼの導入とアルドースレダクターゼの欠損により、キシロース発酵能を元の株より高めることはできるものの、本発明の実施例において示されるような４０℃という発酵温度でＣ．  ｇｌａｂｒａｔａ、Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのようなきわめて高い収率（例えば、限定を意図するものではないが、７０％を超えるようなもの）は、（２）および（３）では事実上実現できなかったというべきである。また、従来技術では、キシルロースが高価なため、スクリーニングには用いにくかったと考えられる。本発明では、実施例において例示するように、キシロースイソメラーゼによりキシロースをキシルロースに変換し、キシロースとキシルロースの混合物とした後、カラムクロマトグラフィーによりキシルロースの純品を容易に調製できたことと、多量の基質を必要とする一次スクリーニングにおいてはキシルロースとキシロースの混合物を使用し、基質が比較的少量で済む二次スクリーニングにおいてキシルロースの純品を使用することによって、大規模なスクリーニングを可能にした側面もある。
【００６８】
本明細書において「キシルロキナーゼ」とは、必要に応じてＡＴＰの存在下でキシルロースをキシルロース−５−ホスフェートに変換する能力を有する酵素をいう。キシルロースはＤ体であってもＬ体であってもよいが、微生物に通常見られるキシロースの代謝経路ではＤ体が見出される。
【００６９】
本明細書において「アルドースレダクターゼ」とは、アルドース（アルデヒド基（−ＣＨＯ）を有する単糖類；例えば、キシロース等）を還元する酵素をいう。キシロースを還元する酵素はキシロースレダクターゼといい、アルドースレダクターゼに包含される。
【００７０】
本明細書において「キシロースイソメラーゼ」はキシロースをキシルロースに変換（異性化）させる酵素をいう。キシロース、キシルロースは、Ｄ体であってもＬ体であってもよいが、天然や微生物に通常見られるキシロースの代謝経路ではＤ体が見出される。また、通常微生物が有するキシロースイソメラーゼは、グルコースを異性化する能力も有することから、「グルコースイソメラーゼ」とも称され、その場合、「グルコースイソメラーゼ」は、キシロースイソメラーゼと本明細書において同義で用いられうる。
【００７１】
本明細書において「リグノセルロース」とは、本質的にリグニンとセルロース、ヘミセルロースの結合した物質であり、植物の細胞壁にみられる。リグノセルロースは地球上で最も多量に存在する有機物で，構造性多糖のセルロースおよびヘミセルロース，芳香族化合物の重合体のリグニンから構成される。リグノセルロースは作物の茎葉の主成分であり、作物個体・組織・細胞を堅固にして、外界の物理的ストレス，病原菌の侵入から作物体を守るなど、その正常な生育に欠かせない役割を果たしている。リグノセルロース系原料としては、大きく木質系原料と草本系原料に分けられる。また、これらの他に、海藻、水草などがリグノセルロース系原料に準じるものとして本発明の対象原料となる。木質系原料としては、針葉樹、広葉樹、裸子植物等の幹、枝、葉、実などを挙げることができる。しかし、一般に、木質系バイオマス原料と比較して、草本系バイオマス原料の方が木化の程度が低く、前処理条件を穏和に設定できるため、本発明のバイオマス原料としては、草本を用いることが好ましい。草本系バイオマス原料としては、稲、麦、トウモロコシ、サトウキビ、ソルガム、エリアンサス、ススキ、エンバク、牧草、単子葉類の雑草の地上部全体を用いることができる。
【００７２】
本明細書において「同種」とは、微生物またはそれが有する遺伝子等について、基準となる種と同じ種に由来することをいう。同種には、同系および自己が包含される。
【００７３】
本明細書において「異種」とは、微生物またはそれが有する遺伝子等について、基準となる種と異なる種に由来することをいう。
【００７４】
本明細書において「キシロースを含む糖」とは、キシロースを成分として含む任意の糖をいう。
【００７５】
本明細書において「接触」とは、発酵反応や酵素反応が生じるように原料と発酵体や触媒体（例えば、微生物、酵素等）とが相互作用する距離にあることをいう。
【００７６】
本明細書において「アルカリ処理」とは、アルカリで目的物を処理することをいう。
【００７７】
本明細書において「相同組換えを起こす条件」とは、相同組換えを起こす条件であれば、どのような条件でもよく、当業者は当該分野で公知の技術に従い設定することができる。
【００７８】
本明細書において「遺伝子が破壊」とは、遺伝子が本来持っている機能を有しなくなるように改変されることをいう。物理的に存在しなくなることのほか、遺伝子の一部が欠損、付加または置換されることによって、本来持っている機能を失うことも包含される。
【００７９】
（好ましい実施形態）
本発明の好ましい実施形態を、以下に掲げる。以下に提供される実施形態は、本発明のよりよい理解のために提供されるものであり、本発明の範囲は以下の記載に限定されるべきでない。従って、当業者は、本明細書中の記載を参酌して、本発明の範囲内で適宜改変を行うことができることは明らかである。
【００８０】
（高キシロース同時異性化発酵収率酵母）
１つの局面において、本発明は、高キシロース同時異性化発酵収率酵母を提供する。特に、本発明は、キシルロキナーゼを組換え導入しおよび／またはアルドースレダクターゼを欠損させた酵母であって、該酵母の４０℃におけるキシロース同時異性化発酵収率が少なくとも２５％である、酵母を提供する。好ましくは、本発明の酵母は、キシルロキナーゼを高発現させ、かつ、アルドースレダクターゼを欠損させたものである。リグノセルロースからエタノールを生産するためには、リグノセルロースを化学的あるいは酵素的に分解し酵母が利用できる糖を生成することが必要である。酵素糖化法は、化学的な糖化法と比べ、穏和な圧力・温度で糖化できること、硫酸等の化学薬品を大量に使用する必要が無く環境負荷が低いこと、生成糖の過分解が起こらず収率が高いなどの利点がある。さらに酵素による糖化反応と酵母等の微生物による発酵を同時に行う並行複発酵は、生成糖による酵素反応の阻害（生成物阻害）の問題を回避できることから、糖化効率の向上が期待され、リグノセルロースからエタノールを生産するための優れた方法の１つと考えられる。しかしながら、糖化酵素の反応に最適な温度（５０℃程度）と酵母の発酵に最適な温度（３０℃程度）の間の差が大きいことが課題であり、両者の温度差を少なくすることが、並行複発酵の効率化に重要であると考えられる。したがって、４０℃以上でのキシロース同時異性化発酵収率が高いことは本発明にとって極めて重要である。
【００８１】
Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを遺伝子組換えによりキシロース発酵能を付与した株では、４０℃以上の高温でエタノール発酵能を調べた報告は見当たらない。本発明者らが従来の方法によって作製した遺伝子組換えＳ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの４０℃でのキシロース発酵能を調べたところ、実施例３に示すように、４０℃ではエタノール発酵能が低下し、特にキシロースの利用能が著しく低下していた。
【００８２】
同時異性化発酵では、酵母のキシルロースを利用する能力が重要になってくる。Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの中でもキシルロースの発酵能が優れる株として単離されたＡＴＣＣ２４８６０株においても、３５℃での同時異性化発酵によるキシロースからのエタノール収率は３０％であり、Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにとってより過酷な生育条件である４０℃ではさらに収率が低下すると考えられる（非特許文献７）。なお、この文献では、本明細書の条件でのエタノール収率は測定されていない。
【００８３】
以上のように、４０℃以上の発酵温度で理論収率の２５％を超える収率でキシロースをエタノール発酵する酵母や酵母を用いたエタノール製造法は報告されていない。また、「２％（ｗ／ｖ）キシロースを基質として初発菌体濃度０．３ｇ（乾燥重量）／Ｌを用いて４０℃で７２時間発酵した場合のエタノール収率」でみると、２５％以上の収率のものの報告はなされていない。したがって、酵母の４０℃におけるキシロース同時異性化発酵収率が２５％以上のものを提供することにはきわめて重要な意義がある。
【００８４】
本発明の酵母は、特に特定の属ないし種に限定されるものではないが、好ましい属としては、Ｃａｎｄｉｄａ属、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｐｉｃｈｉａ属、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属、またはＨａｎｓｅｎｕｌａ属の酵母を挙げることができる。
【００８５】
好ましい実施形態では、本発明の酵母は、前記酵母がＣａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ａｎｏｍａｌａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｔｉｎｉａｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓまたはＨａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａである。理論に束縛されることを望まないが、Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの種において、本明細書で酵母の４０℃におけるキシロース同時異性化発酵収率の上昇が見られており、その他の酵母種においても４０℃以上でエタノール産生をする株を含むことが知られるものであることから、Ｃａｎｄｉｄａ種、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ種等と同様の操作が可能であると考えられるからである。
【００８６】
特に好ましい実施形態では本発明の酵母は、Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅであり、Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａおよびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのいずれも同等の操作が可能であることが判明している。理論に束縛されることを望まないが、Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの種において、本明細書で酵母の４０℃におけるキシロース同時異性化発酵収率の上昇が見られたからであり、加えて、本発明においてＣａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａは、４０℃におけるキシロース同時異性化発酵収率が少なくとも２５％、あるいは、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％以上という従来では予想もつかなかったほどの高収率を得ることができたからである。また、本発明においてＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいては、４０℃におけるキシロース同時異性化発酵収率が少なくとも２５％、あるいは、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％以上、さらに好ましくは少なくとも８０％以上という従来では予想もつかなかったほどの高収率を得ることができたからである。
【００８７】
１つの実施形態では、本発明の酵母に導入されうるキシルロキナーゼはその酵母と同種または異種でありうる。同種のものは、その酵母において機能する蓋然性が高いことから、好ましく用いられるがそれに限定されず、異種のものであってもその酵母で機能するものであれば、利用することができ、特定の特性（至適条件等）を有するキシルロキナーゼを導入する場合は異種のものを用いることが好ましいこともありうる。好ましい実施形態では、本発明の酵母はＣａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａであり、前記キシルロキナーゼはＣｇＸＫ（核酸配列は配列番号２８、アミノ酸配列は配列番号２９）である。より好ましい実施形態では、本発明の酵母は、Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａであり、前記キシルロキナーゼはＣｇＸＫ（核酸配列は配列番号２８、アミノ酸配列は配列番号２９）であり、前記アルドースレダクターゼは破壊されている。あるいは、別の好ましい実施形態では、本発明の酵母はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅであり、前記キシルロキナーゼはＳｃＸＫ（核酸配列は配列番号３６、アミノ酸配列は配列番号３７）である。より好ましい実施形態では、本発明の酵母は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅであり、前記キシルロキナーゼはＳｃＸＫ（核酸配列は配列番号３６、アミノ酸配列は配列番号３７）であり、前記アルドースレダクターゼは破壊されている。
【００８８】
１つの実施形態では、本発明の酵母はキシルロース資化能を有する。キシルロース資化能を有することにより、ペントースリン酸経路を利用してエタノールを生産することができる。
【００８９】
特定の実施形態では、本発明の酵母は、４０℃でのキシロース同時異性化発酵収率が少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％であることが好ましい。さらに好ましい実施形態では、本発明の酵母は、４０℃でのキシロース同時異性化発酵収率が、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％である。
【００９０】
１つの実施形態では、本発明の酵母はリグノセルロース利用能を有する。リグノセルロースは地球上でもっとも豊富にある有機物であり、草本系植物等にも大量に存在することから、これを利用してエタノール（バイオエタノール）を生産することができることは、エネルギー資源という観点で極めて有用である。
【００９１】
１つの実施形態では、本発明の酵母が有しうるリグノセルロース利用能は、リグノセルロースを原料としてエタノールを生成する能力である。
【００９２】
１つの具体的な実施形態では、本発明の酵母は、Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａであり、前記アルドースレダクターゼは相同組換えにより破壊されている。
【００９３】
１つの具体的な実施形態では、本発明の酵母は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅであり、前記アルドースレダクターゼは相同組換えにより破壊されている。
【００９４】
１つの具体的な実施形態では、前記キシルロキナーゼは前記酵母と同種または異種である。
【００９５】
１つの特定の実施形態では、本発明の酵母は、受託番号  ＮＩＴＥ  Ｐ−１３５７、ＮＩＴＥ  Ｐ−１３５８、ＮＩＴＥ  Ｐ−１３５９またはＮＩＴＥ  Ｐ−１３６０、受託番号  ＮＩＴＥ  Ｐ−０１６１７、受託番号  ＮＩＴＥ  Ｐ−０１６１８、受託番号  ＮＩＴＥ  Ｐ−０１６１９、受託番号  ＮＩＴＥ  Ｐ−０１６２０で寄託された系統またはそれと同一の特性を有する系統、あるいはこれらの子孫株、またはこれらに由来する系統である。
【００９６】
（エタノール生産方法）
別の局面において、本発明は、キシロースおよび／またはキシロースを含む糖からエタノールを生産する方法であって、該方法は、該キシロースおよび／またはキシロースを含む糖を含む原料に、本発明の酵母を接触させる工程を包含する、方法を提供する。ここで使用されうる酵母としては、本発明の酵母であればどのようなものを用いてもよく、上記（高キシロース同時異性化発酵収率酵母）の項目において例示される任意の実施形態を使用することができることが理解される。
【００９７】
１つの実施形態では、本発明の方法において、キシロースおよび／またはキシロースを含む糖を含む原料に、本発明の酵母を接触させる工程は、キシロースイソメラーゼ（グルコースイソメラーゼ）の存在下で行われうる。このようなキシロースイソメラーゼ（グルコースイソメラーゼ）の存在によって、同時異性化発酵が効率よく行うことができる。
【００９８】
１つの実施形態では、本発明において用いられる原料は、リグノセルロースを含む。そして、１つのさらに好ましい実施形態では、本発明において用いられる原料は、リグノセルロースを含み、接触は４０℃以上で行われる。理論に束縛されることを望まないが、高温が好ましいのは、糖化酵素の反応に最適な温度が５０℃程度と比較的高く、３０℃等４０℃未満であれば十分な糖化反応が起こらず、収率に多大な悪影響が出てしまうからである。好ましくは、本発明において用いられる原料は、リグノセルロースを含み、接触はキシロースイソメラーゼ（グルコースイソメラーゼ）の存在下で４０℃以上で行われる。使用されるキシロースイソメラーゼ（グルコースイソメラーゼ）は、どのようなものでもよいが、４０℃以上でより効率よく異性化を行うものを使用することが有利である。そのようなキシロースイソメラーゼ（グルコースイソメラーゼ）としては、Ｓｗｅｅｔｚｙｍｅ（商標）ＩＴ  Ｅｘｔｒａ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓ）を挙げることができる。１つの具体的な実施形態では、リグノセルロースの原料としては、リグノセルロース系バイオマス原料である植物体の地上部（例えば、稲、麦、トウモロコシ、サトウキビ、ソルガム、エリアンサス、ススキ、エンバク、牧草、単子葉類の雑草のうちの１以上からのものを含めることができるがこれに限定されない）を粉砕したものを用いることができる。リグノセルロースの原料としては、非可食部分であっても可食部分であってもよいが、非可食部分が食料生産との競合を避け人類との共存という意味で好ましい。具体的には、コーンエタノール製造時に圃場に蓄積するトウモロコシ茎葉（コーンストーバー）、サトウキビ搾汁後に得られるバガス、主要穀物生産時に副生される稲わら、麦わら、もみ殻、そしていわゆる資源作物としてのスイートソルガムやエリアンサス、ススキ、エンバク、牧草類、イネ科植物の植物体地上部全体など、が挙げられる。これらリグノセルロース系バイオマス原料は、易分解性糖質を含有するものを含むものである。これらのうち、特に稲わらやサトウキビバガスでは、澱粉やショ糖（スクロース）などの易分解性糖質を回収しつつ、セルロースやヘミセルロースの糖化性を向上するような前処理技術を施すことが有利でありうるため、本発明の実施においても必要に応じてこのような前処理を行ってもよいが、本発明はこれに限定されずこのような前処理技術を含めなくてもよいことが理解される。
【００９９】
１つの具体的な実施例では、本発明で用いられる原料は、稲わら、バガス、スイートソルガム、エリアンサス、ススキ、エンバクを含むがこれらに限定されない。
【０１００】
１つの実施形態では、リグニンの分解を促すため、アントラキノン、分子状酸素等の酸化剤を添加することが有効であるため、必要に応じてこのような酸化剤を添加してもよい。
【０１０１】
１つの実施形態では、原料を粉砕して用いることができる。本発明における原料の最適な粉砕度については、原料の形状、含水率、粉砕特性等に応じて異なる。例えば、稲わらを試料としてスラリーを調製した場合、アルカリ処理の効果は、脱穀後の長いものや数センチメートル程度に裁断されたものでも見出されるが、数ミリメートルから数百マイクロメートル程度の平均粒径またはそれ以下まで粉砕された試料では、薬液の浸透性や基質の表面積が向上し、前処理後の糖化効率が上昇する。粉砕時の熱による原料の損耗や基質の被覆が起こらない限り、細かく粉砕する程反応効率は向上すると考えられるが、原料に応じて、糖化効率、粉砕コストとハンドリング性を考慮した最適化を行う必要がある。
【０１０２】
１つの実施形態では、本発明の方法において接触工程の前に、原料をアルカリ処理する工程をさらに包含することが有利でありうるが、これに限定されない。アルカリ処理は例えば、特許文献５を参照することができ、この文献は参考として本明細書中で必要に応じてその全部を援用する。アルカリ処理は、例えば、水酸化カルシウム、水酸化ナトリウム等により行うことができる。ある具体的な実施形態では、原料、水酸化カルシウムおよび水を含むスラリーを調製してアルカリ処理を行い、その後二酸化炭素を通気することおよび／又は加圧することによって、中和しｐＨを５〜７に低下させることによってアルカリ処理を実現することができるがこれに限定されない。１つの実施形態では、アルカリ処理は、８０〜１８０℃で１０分〜３時間行うことができるがこれに限定されない。１つの実施形態では、アルカリ処理は、０℃〜５０℃で３日以上行うことができるがこれに限定されない。別の実施形態では、原料を粉砕した後、当該原料、水酸化カルシウムおよび水を含むスラリーを調製してアルカリ処理を行うことができる。アルカリ処理を行う際には、まず、使用される原料に対して水を加えて、その後に水酸化カルシウムまたはその水懸濁物を混合する方法や、逆に、水酸化カルシウムの粉末を加えた後に水や水蒸気を加える方法、水酸化カルシウムの添加を数段階に分けて行う方法、使用される原料中の水分を利用して、水酸化カルシウムのみを添加して混合する方法など、様々な反応混合物の調整方法が存在する。また、原料への水や試薬の浸透性を向上するため、界面活性剤を添加する方法や、減圧下において気泡を除く方法、加圧下において気泡を縮小させて液の浸透を促す方法、などが考えられる。この処理に用いる水酸化カルシウムの添加比としては、使用される原料の乾重量に対して２〜８０％の添加が可能で、望ましくは１０〜４０％の添加で行うことができる。その際、前処理反応系の水分含量は、使用される原料に対して１〜４０倍への調整が可能で、望ましくは３〜２０倍の調整を行うことができる。また、原料が有する水分を利用し、前記水分含量とすることも可能である。さらに、使用される原料の粉砕度を上げることにより、水の添加量を減らすことも可能である。このアルカリ処理により、ヘミセルロースのアセチル基やフェルロイル基などのエステルやリグニン分子内のエステルが加水分解されることにより、酵素糖化性が向上するとともに、リグニンやシリカの一部が可溶化すると考えられている。その際に、ヘミセルロースの一部も遊離・可溶化するが、セルロースやヘミセルロースの大部分は固形分として原料中に残存し、酵素糖化の基質となる。
【０１０３】
１つの実施形態では、アルカリ処理を行う場合は、中和前もしくは中和後に、スラリーの固形分を磨砕する工程を含んでいてもよいがこれに限定されない。理論に束縛されることを望まないが、例えば、アルカリ処理によってバイオマスが軟化するとともに機械的強度が減少し、後段の粉砕処理のエネルギー効率が高まることが期待できる。１つの実施形態において、本発明でアルカリ処理を行うと中和後に、塩と前処理したバイオマス原料との分離（固液分離や洗浄）を行う必要がないことから、数百マイクロメートル以下の小さい粒径の試料を用いてもロスがなく、ハンドリング性も低下しにくい。このことは、アルカリ処理を併用した場合の利点である。また、石臼などで磨り潰すグラインダー等を用いて、粉砕原料を磨砕しながらアルカリ液を浸透させる方法により、アルカリ処理の効率の向上が期待される。
【０１０４】
１つの実施形態では、本発明の方法は、得られた中間体（例えば、スラリー）にデンプン、β−（１→３），（１→４）−グルカン、セルロース、キシラン、および、これらの部分分解物、のうちの少なくとも１種類以上を糖化する酵素を添加した後、二酸化炭素を必要に応じて通気および／又は加圧しながらｐＨの上昇が起こらないように酵素糖化反応を行うことができる。このような酵素糖化反応において、前記糖化酵素に加えてさらにエタノール発酵微生物を添加し、酵素糖化反応とエタノール発酵とを並行複発酵で行うことができる。糖化酵素としては、セルラーゼ製剤、ヘミセルラーゼ製剤、β−グルコシダーゼ製剤を用いることができるが、具体的には、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、プルラナーゼ、イソアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、リケナーゼ、セロビオハイドロラーゼ、エンドグルカナーゼ、β−グルコシダーゼ、セロビオースデヒドロゲナーゼ、キシラナーゼ、α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ、β−Ｄ−キシロシダーゼ、α−グルクロニダーゼ、β−グルクロニダーゼ、アセチルキシランエステラーゼ、フェルロイルエステラーゼ、β−マンナナーゼ、β−Ｄ−マンノシダーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、キシログルカナーゼ、ガラクタナーゼ、アラビナナーゼ、ペクチナーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ等を用いることができる。
【０１０５】
本発明の方法では、酵母に原料または原料から変化した中間体を接触させる際に、二酸化炭素を必要に応じて通気および／又は加圧しながらｐＨの上昇が起こらないようにエタノール発酵させることができる。具体的な方法は、アルカリ処理後の溶液中に二酸化炭素を直接通気（例えば、バブリング、炭酸水の添加、上部からの吹きつけ等）する方法、密閉容器を用いて二酸化炭素で加圧する（陽圧にする）方法、を挙げることができる。また、さらに攪拌、振盪、低温・高圧処理などを行うことにより、二酸化炭素の溶解をより効率的にすることもできる。また、これらの方法を組み合わせて行うこともできる。アルカリ処理は、希硫酸等での処理より好ましいが、本発明はアルカリ処理を用いることに限定するものではない。稲わらでも希硫酸処理法も使えるが、このアルカリ処理法の特徴は、発酵液のｐＨが中性を維持することにある。理論に束縛されることを望まないが、同時異性化発酵では、グルコースイソメラーゼの反応に適したｐＨは中性であるのに対して、発酵液のｐＨは酸性になることが多いことから（発酵過程で有機酸が生じるため）、本発明の同時異性化発酵はこの水酸化カルシウム等によるアルカリ処理法との組み合わせに適していると考えられる。通常、Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの野生株の場合は、他の文献にあるように３５℃付近が最適と考えられ、４０℃以上では生育が不調であることから、エタノール生成には、あまり好ましくないとされていた。また、並行複発酵と同時異性化発酵とを行うことは、こと、４０℃以上での条件でみると、従来報告がなかった。それは、使用する微生物が、４０℃以上では実用上使用できるレベルでエタノール発酵しないことから、仮に他の条件で４０℃以上が好ましいとしても実現できなかったからである。
【０１０６】
（Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａの相同組換え）
１つの局面において、本発明は、Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａに相同組換えを起こして相同組換えＣａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａを生産する方法であって、該方法は、相同組換えの対象となる遺伝子の約４５％以上の長さの相同部分を両端に有する相同組換え用遺伝子構築物と、Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａとを、相同組換えを起こす条件下に供する工程を包含する、方法を提供する。
【０１０７】
１つの実施形態では、相同組換えの対象となる遺伝子はＧＲＥ３であり、前記約４５％以上の長さは０．４５ｋｂ以上である。そして、１つの実施形態では、相同組換えＣａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａの相同組換えの対象となる遺伝子が破壊される。
【０１０８】
本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。
【０１０９】
以上、本発明を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本発明を限定する目的で提供したのではない。従って、本発明の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。
【実施例】
【０１１０】
以下の実施例で用いた生物の取り扱いは、農業・食品産業技術総合研究機構において規定される基準を遵守した。
【０１１１】
（実施例１：４０℃でキシルロースを高収率で発酵する酵母の選抜）
約１４００株の酵母株から、キシルロース資化能に基づいて一次スクリーニングを行い、キシルロース資化能の高い株を選抜し、さらにこれらのキシルロース資化株よりキシルロース発酵能の高い株を二次スクリーニングにより選抜した。得られたキシルロース高発酵酵母株について、高温耐性やエタノール耐性を確認し、４０℃においてキシルロースからのエタノール生産能が高い株であるＣａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ  ＮＦＲＩ３１６３（ＮＩＴＥ受託番号  Ｐ−１３６０）を取得した。
【０１１２】
以下にその手順を示す。
【０１１３】
（キシルロースの調製）
スクリーニングに必要となるＤ−キシルロース（以下、キシルロースと略す）は、Ｏｌｓｓｏｎらの方法（Ｏｌｓｓｏｎ,  Ｌ．，  Ｅｎｚｙｍｅ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ｖｏ１．１６，ｐｐ．３８８−３９４（１９９４））に基づき調製した。以下に概略を示す。１４０ｇのキシロースを２００ｍＬの水に溶かし、８ｇの固定化グルコースイソメラーゼ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ、Ｓｗｅｅｔｚｙｍｅ  ＩＴ  Ｅｘｔｒａ、３５０Ｕ／ｇ）を加え、６０℃で１日反応させた。ここで、グルコースイソメラーゼの酵素活性１Ｕ（Ｕｎｉｔ）とは、標準的な分析条件下で、初速度１μｍｏｌ／分でグルコ-スをフルクト-スへと変換する酵素量を表す。濾過によりグルコースイソメラーゼを除いた後、ロータリーエバポレーター（岩城硝子、モデルＲＥＮ−１）により、液量が約１２０ｍＬになるまで５０℃で濃縮した。この濃縮液に１２０ｍＬの無水エタノールを加え、４℃で１週間静置し、未反応のキシロースを析出させた。析出したキシロースを濾過により取り除いた後、ロータリーエバポレーターにより濾液からエタノールを５０℃で留去させた。
【０１１４】
次に、反応液中に生成したキシルロースをカラムクロマトグラフィーにより精製した。あらかじめ１Ｍ  亜硫酸水素ナトリウム水溶液で処理することによって、カウンターイオンを亜硫酸型に置換した２５０ｇの陰イオン交換樹脂（Ｄｏｗｅｘ  １  Ｘ８、１００−２００メッシュ）を、内径２．５ｃｍ×長さ５０ｃｍのカラムに充填した。蒸留水を移動相に用い、流速１ｍＬ／分で溶出し、７ｍＬずつフラクションを分取した。各フラクションに含まれるキシルロースおよびキシロースの量を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により解析した。ＨＰＬＣ装置（島津製作所）は、送液ポンプ（モデルＬＣ−２０ＡＴ）、デガッサー（モデルＤＧＵ−２０Ａ３）、オートサンプラー（モデルＳＩＬ−２０ＡＣ）、カラムオーブン（モデルＣＴＯ−２０Ａ）、示唆屈折率検出器（モデルＲＩＤ−１０Ａ）、システムコントローラー（モデルＣＢＭ−２０Ａ）から構成され、解析ソフトにはＬＣ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（島津製作所）を用いた。配位子交換クロマトグラフィー用カラム（Ｓｈｏｄｅｘ  ＳＣ１０１１、内径８．０ｍｍ×長さ１５０ｍｍ）を用いて、カラム温度７５℃で、移動相に超純水を用いて流速０．６ｍＬ／分で分析を行った。また、カラムの保護のためにＳＣ−Ｇガードカラム（Ｓｈｏｄｅｘ）を用いた。キシルロースの純度の高いフラクションを集め、ロータリーエバポレーターを使用して５５℃で濃縮し、純度９９％のキシルロースを約３０ｇ得た。発明者の知見では、本実施例のような規模でキシルロース発酵酵母のスクリーニングを行った例は知られていない。
【０１１５】
（キシルロース資化能に基づいた一次スクリーニング）
９６穴の丸底型マイクロタイタープレート（ＣＯＲＮＩＮＧ、モデル３７９９）の各ウエルに１００μＬのＹＰＤ培地（１０ｇ／Ｌ  Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ（Ｄｉｆｃｏ）、２０ｇ／Ｌ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｏｎ（日本製薬）、２０ｇ／Ｌ  グルコース）を添加し、滅菌した爪楊枝を用いて、各ウエルに酵母株を植菌した。各マイクロタイタープレートには、農業・食品産業技術総合研究機構  食品総合研究所が保有する酵母（１枚のプレートに９５株ずつ）と、コントロールとしてＳ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＡＴＣＣ２４８６０株を植菌した。３０℃で２４時間静置培養した後、この培養液の一部（約１．２μＬ）を４８ピン・コピープレートレプリケーター（トッケン）を用いて、１％（ｗ／ｖ）キシロース及び１％（ｗ／ｖ）キシルロースを含むＹＮＢ培地（６．７ｇ／Ｌ  Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ））１００μＬを各ウエルに入れた９６穴の丸底型マイクロタイタープレート（ＣＯＲＮＩＮＧ、モデル３７９９）に植菌した。３０℃で２４時間、静置培養後、マイクロプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ、モデルＥｌｘ８００）を用いて、６３０ｎｍの波長の吸光度を測定し、培養液中の菌体濃度を求めた。コントロール株であるＡＴＣＣ２４８６０よりも菌体濃度が高いものをキシルロース資化能の高い株として選抜した。
【０１１６】
（キシルロース発酵能に基づいた二次スクリーニング）
９６穴の丸底型マイクロタイタープレート（ＣＯＲＮＩＮＧ、モデル３７９９）の各ウエルに１００μＬのＹＰＤ培地を添加し、滅菌した爪楊枝を用いて、各ウエルに酵母株を植菌した。各マイクロタイタープレートには、前項の方法によって選抜したキシルロース資化能の高い酵母株と、コントロールとしてＳ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＡＴＣＣ２４８６０株を植菌した。３０℃で２４時間静置培養した後、この培養液の一部（３０μＬ）を２％（ｗ／ｖ）キシルロースを含むＹＮＢ培地４００μＬを各ウエルに添加した９６穴の深型マイクロタイタープレート（Ｍａｔｒｉｘ、Ｓｃｒｅｅｎｍａｔｅｓ  ＤｅｅｐＷｅｌｌ  ｐｌａｔｅ）に植菌した。ウエルをシリコン製マット（Ｍａｔｒｉｘ、Ｓｃｒｅｅｎｍａｔｅｓ  ＣａｐＭａｔ）で覆い、ビニールテープを用いてマイクロタイタープレートとマットを強固に密着させた。３０℃で７２時間、振とう培養（毎分２００回転）した後、遠心分離機（トミー精工、モデルＳＵＰＲＥＭＡ２５、スイングローターＴＳ−３６Ｎ）を用いて３，１００ｘｇで１０分間遠心することにより、菌体と培養上清を分離した。２９０μＬの培養上清を９６穴のマイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ、モデル２６７２４５）に移し、シリコン製マット（Ａｘｙｇｅｎ、Ａｘｙｍａｔ  ＡＭ−２ＭＬ−ＲＤ）で覆った後、ＨＰＬＣにより、糖およびエタノール濃度を定量解析した。先に記載のＨＰＬＣ装置にイオン排除クロマトグラフィー用カラム（ＢｉｏＲａｄ、Ａｍｉｎｅｘ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  Ｃｏｌｕｍｎ）を接続し、移動相に０．００５Ｍ  硫酸を用いて、流速０．６ｍｌ／分、カラム温度５０℃で分析を行った。また、カラムの保護のためにＣａｔｉｏｎ−Ｈ  Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ（ＢｉｏＲａｄ）も接続した。コントロール株であるＳ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＡＴＣＣ２４８６０と同程度のエタノールが検出された株をキシルロース発酵能の高い株として選抜した。
【０１１７】
次に、キシルロース発酵能の高かった選抜酵母株について、Ｋｕｒｔｚｍａｎらの方法（Ｋｕｒｔｚｍａｎ，  Ｃ．Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｔｏｎｉｅ  Ｖａｎ  Ｌｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋ  Ｖｏｌ．７３  ｐｐ．３３１−３７１  （１９９８））に従い、リボソームＤＮＡの塩基配列を解析することにより種の同定を行った。ＮＬ−１プライマーおよびＮＬ−４プライマーを用いて、酵母菌体懸濁液から２６ＳリボソームＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域（約６００塩基）を増幅した。使用したプライマーの配列を以下に示す。
【０１１８】
ＮＬ−１：５’−ｇｃａｔａｔｃａａｔａａｇｃｇｇａｇｇａａａａｇ−３’（配列番号１）
ＮＬ−４：５’−ｇｇｔｃｃｇｔｇｔｔｔｃａａｇａｃｇｇ−３’（配列番号２）
ＰＣＲはＫＯＤ  ＦＸ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡ライフサインス）を使用し、９４℃４分＋［９８℃１０秒、５２℃３０秒、６８℃１分］×３０サイクルの条件で行った。得られた０．６ｋｂのＤＮＡ断片をシリカメンブレンカラム（ＧＥヘルスケア、ｉｌｌｕｓｔｒａ  ＧＦＸ  ＰＣＲ  ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  Ｂａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）を用いて精製した後、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ１．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用したサイクルシークエンス法によりシークエンス反応を行い、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて塩基配列を解読した。解読した塩基配列の相同性をＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ））プログラムを用いて解析し、種の同定を行った。なお、本明細書中の実施例におけるＰＣＲおよびサイクルシークエンスはすべてＶｅｒｉｔｉサーマルサイクラー装置（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行った。
【０１１９】
（４０℃においてキシルロース発酵能の高い株の選抜方法）
９６穴の丸底型マイクロタイタープレート（ＣＯＲＮＩＮＧ、モデル３７９９）の各ウエルに１００μＬのＹＰＤ培地を添加し、滅菌した爪楊枝を用いて、各ウエルに酵母株を植菌した。このマイクロタイタープレートには、前述の方法によって選抜したキシルロース発酵能の高い酵母株と、コントロール株であるＳ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＡＴＣＣ２４８６０を植菌した。３０℃で２４時間静置培養した後、この培養液の一部（３０μＬ）を２％（ｗ／ｖ）キシルロースを含むＹＮＢ培地４００μＬを各ウエルに添加した９６穴の深型マイクロタイタープレート（Ｍａｔｒｉｘ、Ｓｃｒｅｅｎｍａｔｅｓ  ＤｅｅｐＷｅｌｌ  ｐｌａｔｅ）に植菌した。ウエルをシリコン製マット（Ｍａｔｒｉｘ、Ｓｃｒｅｅｎｍａｔｅｓ  ＣａｐＭａｔ）で覆い、ビニールテープを用いてマイクロタイタープレートとマットを強固に密着させた。４０℃で７２時間、振とう培養（毎分２００回転）した後、遠心分離機（トミー精工、モデルＳＵＰＲＥＭＡ２５、スイングローターＴＳ−３６Ｎ）を用いて３，１００ｘｇで１０分間遠心することにより、菌体と培養上清を分離した。２９０μＬの培養上清を９６穴のマイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ、モデル２６７２４５）に移し、シリコン製マット（Ａｘｙｇｅｎ、Ａｘｙｍａｔ  ＡＭ−２ＭＬ−ＲＤ）で覆った後、ＨＰＬＣにより、前述の条件で糖及びエタノール濃度を定量解析した。最も高い濃度のエタノールが検出されたＣａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ  ＮＦＲＩ３１６３をキシルロースの高温発酵能を有している株として選抜した。
【０１２０】
以下の表に、得られた４０℃でのキシルロース発酵能の高い酵母株、スクリーニング時に生産したエタノール濃度およびリボソームＤＮＡの塩基配列に基づき決定した種名を示す。
【０１２１】
【表１】
2014014360.tif 000002
【０１２２】
（実施例２  ４０℃におけるエタノール耐性の比較）
本実施例において、実施例１において得られたＣ．  ｇｌａｂｒａｔａ  ＮＦＲＩ３１６３及びコントロール株であるＳ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＡＴＣＣ２４８６０について、以下の条件で培養を行った。１０の８乗、１０の７乗、１０の６乗、１０の５乗、１０の４乗ＣＦＵ（Ｃｏｌｏｎｙ  Ｆｏｒｍｉｎｇ  Ｕｎｉｔ）の菌体を含む菌体懸濁液５μＬをそれぞれエタノール濃度の異なる３種類（０、５％（ｗ／ｖ）、７．５％（ｗ／ｖ）エタノール）のＹＰＤ寒天培地（１０ｇ／Ｌ  Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ（Ｄｉｆｃｏ）、２０ｇ／Ｌ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｏｎ（日本製薬）、２０ｇ／Ｌ  グルコース、２０ｇ／Ｌ  ＢａｃｔｏＡｇａｒ（Ｄｉｆｃｏ））に滴下し、４０℃で３日間静置培養を行った。寒天培地上のコロニーの大きさを目視で確認し、エタノール耐性を比較した。
【０１２３】
結果を図２に示す。その結果、ＮＦＲＩ３１６３は、ＡＴＣＣ２４８６０よりも、４０℃においてエタノール存在下でも良好な生育を示した。
【０１２４】
（実施例３  キシロース代謝系を有するＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびＣａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａの遺伝子組換え体によるグルコース・キシロース混合培地のエタノール発酵）
公知の方法と同様に、ＸＲ遺伝子、ＸＤＨ遺伝子およびＸＫ遺伝子を導入することによって作製したキシロース発酵能を有する遺伝子組換え酵母を５％（ｗ／ｖ）グルコースおよび２％（ｗ／ｖ）キシロースを含むＹＰ培地（１０ｇ／Ｌ  Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ（Ｄｉｆｃｏ）、２０ｇ／Ｌ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｏｎ（日本製薬））で培養し、エタノール発酵を行った。以下に、ＸＲ遺伝子、ＸＤＨ遺伝子およびＸＫ遺伝子の導入手順を示すとともに、図３に導入のためのベクターの構築法の概略を図示した。なお、本明細書で使用した制限酵素は、タカラバイオ、東洋紡ライフサイエンス、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、いずれかの製品である。
【０１２５】
（ｐＹＰＧＥ１５Ｌの構築方法）
酵母の発現用ベクターｐＹＰＧＥ１５の遺伝子発現能力を向上させるため、当該ベクターに含まれる０．２７ｋｂ長のホスホグリセリン酸キナーゼ１遺伝子プロモーター（ＰＧＫ１ｐ）をより上流領域を含む０．７５ｋｂ長のＰＧＫ１ｐに置換した。まず、ｐＹＰＧＥ１５を制限酵素ＢｓｔＸＩで消化し、生じた粘着末端をＴ４  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ  ＤＮＡ  Ｂｌｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ）を用いて平滑化した。その後、制限酵素ＸｂａＩで消化し、元々ｐＹＰＧＥ１５に存在した０．２７ｋｂ長のＰＧＫ１ｐの大部分の領域を除去した。次に、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＩｎｖＳｃ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のゲノムＤＮＡを鋳型に、ＰＧＫｐ−ＳｍａＩプライマー及びＰＧＫｐ−ＸｂａＩ−ａｓプライマーを用いてＰＣＲにより、０．７５ｋｂ長のＰＧＫ１ｐを増幅した。使用したプライマーの配列を以下に示す。
【０１２６】
ＰＧＫｐ−ＳｍａＩ：５’−ｇｃｔｃｔａｇａｃｃｃｇｇｇａｇａｔａｔｔａｔａａｃａｔｃｔｇｃａｔａａｔａｇ−３’（配列番号３）
ＰＧＫｐ−ＸｂａＩ−ａｓ：５’−ｇｃｃｇｃｃｇｔｃｔａｇａｔｇｔｔｔｔａｔａｔｔｔｇｔｔｇｔａａａａａｇｔａｇ−３’（配列番号４）
ＰＣＲはＰｆｕＵｌｔｒａ  ＩＩ  ｆｕｓｉｏｎ  ＨＳ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用して、９５℃２分＋［９５℃２０秒、５５℃２０秒、７２℃１５秒］×３０サイクル＋７２℃３分の条件で行った。得られた０．７５ｋｂのＤＮＡ断片を制限酵素ＸｂａＩおよびＳｍａＩで消化し、上述の処理を行ったｐＹＰＧＥ１５とＱｕｉｃｋ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて連結し、大腸菌ＤＨ５αコンピテントセル（東洋紡ライフサイエンス）を形質転換し、アンピシリン耐性を獲得した大腸菌よりｉｌｌｕｓｔｒａ  ｐｌａｓｍｉｄＰｒｅｐ  Ｍｉｎｉ  Ｓｐｉｎ  Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケア）を用いて０．７５ｋｂ長のＰＧＫ１ｐを含有するベクターを調製し、ｐＹＰＧＥ１５Ｌと命名した。
【０１２７】
（ＸＲ遺伝子、ＸＤＨ遺伝子およびＸＫ遺伝子のクローニング方法）
まず、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓ  ＮＢＲＣ１００６３のゲノムＤＮＡを鋳型にして、ＸＲ−ＸｂａＩプライマーおよびＸＲ−ＫｐｎＩプライマーを用いてＸＲ遺伝子（０．９６ｋｂ）をＰＣＲ増幅により単離した。使用したプライマーの配列を以下に示す。
【０１２８】
ＸＲ−ＸｂａＩ：５’−ｇｇｇｔｃｔａｇａａｔｇｃｃｔｔｃｔａｔｔａａｇｔｔｇａａｃｔｃｔｇｇ−３’（配列番号５）
ＸＲ−ＫｐｎＩ：５’−ｇｇｇｇｔａｃｃｔｔａｇａｃｇａａｇａｔａｇｇａａｔｃｔｔｇｔｃ−３’（配列番号６）
ＰＣＲはＰｆｕＵｌｔｒａ  ＩＩ  ｆｕｓｉｏｎ  ＨＳ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを使用して、９５℃２分＋［９５℃２０秒、５５℃２０秒、７２℃１５秒］×３０サイクル＋７２℃３分の条件で行った。得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＸｂａＩおよびＫｐｎＩで消化した後、ＸｂａＩおよびＫｐｎＩで消化したｐＹＰＧＥ１５ＬにＱｕｉｃｋ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて連結した。連結物で大腸菌ＤＨ５αコンピテントセルを形質転換し、アンピシリン耐性を獲得した大腸菌よりｉｌｌｕｓｔｒａ  ｐｌａｓｍｉｄＰｒｅｐ  Ｍｉｎｉ  Ｓｐｉｎ  Ｋｉｔを用いてＸＲがクローニングされたｐＹＰＧＥ１５Ｌ−ＸＲを調製した。
【０１２９】
次に、Ｐ．  ｓｔｉｐｉｔｉｓ  ＮＢＲＣ１００６３のゲノムＤＮＡを鋳型にして、ＸＤＨ−ＸｂａＩプライマーおよびＸＤＨ−ＸｈｏＩプライマーを用いてＸＤＨ遺伝子（１．１ｋｂ）をＰＣＲ増幅により単離した。使用したプライマーの配列を以下に示す。
【０１３０】
ＸＤＨ−ＸｂａＩ：５’−ｇｇｃｔｃｔａｇａａｔｇａｃｔｇｃｔａａｃｃｃｔｔｃｃｔｔｇｇｔｇ−３’（配列番号７）
ＸＤＨ−ＸｈｏＩ：５’−ｃｃｇｃｔｃｇａｇｔｔａｃｔｃａｇｇｇｃｃｇｔｃａａｔｇａｇ−３’（配列番号８）
ＰＣＲはＰｆｕＵｌｔｒａ  ＩＩ  ｆｕｓｉｏｎ  ＨＳ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを使用して、９５℃２分＋［９５℃２０秒、５８℃２０秒、７２℃１５秒］×３０サイクル＋７２℃３分の条件で行った。得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＸｂａＩおよびＸｈｏＩで消化し、ＸｂａＩおよびＸｈｏＩで消化したｐＹＰＧＥ１５ＬにＱｕｉｃｋ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて連結した。連結物で大腸菌ＤＨ５αコンピテントセルを形質転換し、アンピシリン耐性を獲得した大腸菌よりｉｌｌｕｓｔｒａ  ｐｌａｓｍｉｄＰｒｅｐ  Ｍｉｎｉ  Ｓｐｉｎ  Ｋｉｔを用いてＸＤＨがクローニングされたｐＹＰＧＥ１５Ｌ−ＸＤＨを調製した。
【０１３１】
さらに、Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＩｎｖＳｃ１のゲノムＤＮＡを鋳型にして、ＸＫ−ＸｂａＩプライマーおよびＸＫ−ＸｈｏＩプライマーを用いてＸＫ遺伝子（１．８ｋｂ）をＰＣＲ増幅により単離した。使用したプライマーの配列を以下に示す。
【０１３２】
ＸＫ−ＸｂａＩ：５’−ｇｇｃｔｃｔａｇａａｔｇｔｔｇｔｇｔｔｃａｇｔａａｔｔｃａｇａｇａｃａｇ−３’（配列番号９）
ＸＫ−ＸｈｏＩ：５’−ｃｃｇｃｔｃｇａｇｔｔａｇａｔｇａｇａｇｔｃｔｔｔｔｃｃａｇ−３’（配列番号１０）
ＰＣＲはＰｆｕＵｌｔｒａ  ＩＩ  ｆｕｓｉｏｎ  ＨＳ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを使用して、９５℃２分＋［９５℃２０秒、５５℃２０秒、７２℃３０秒］×３０サイクル＋７２℃３分の条件で行った。得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＸｂａＩおよびＸｈｏＩで消化し、ＸｂａＩおよびＸｈｏＩで消化したｐＹＰＧＥ１５ＬにＱｕｉｃｋ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて連結した。連結物で大腸菌ＤＨ５αコンピテントセルを形質転換し、アンピシリン耐性を獲得した大腸菌よりｉｌｌｕｓｔｒａ  ｐｌａｓｍｉｄＰｒｅｐ  Ｍｉｎｉ  Ｓｐｉｎ  Ｋｉｔを用いてＸＫがクローニングされたｐＹＰＧＥ１５Ｌ−ＸＫを調製した。
【０１３３】
（ＸＲ−ＸＤＨ−ＸＫ共発現ベクターの構築方法）
まず、ｐＹＰＧＥ１５Ｌ−ＸＫを鋳型にして、ＰＧＫｐ−ＳｐｈＩプライマーおよびＣＹＣｔ−ＳｂｆＩプライマーを用いてＰＧＫ１プロモーター、ＸＫ遺伝子、ＣＹＣ１ターミネーターから成るＰＧＫ１ｐ−ＸＫ−ＣＹＣ１ｔ遺伝子カセット（２．９ｋｂ）をＰＣＲ増幅により単離した。使用したプライマーの配列を以下に示す。
【０１３４】
ＰＧＫｐ−ＳｐｈＩ：５’−ｇａｃｃｇｃａｔｇｃｃａｃａｇａｔａｔｔａｔａａｃａｔｃｔｇｃａｔａａｔａｇ−３’（配列番号１１）
ＣＹＣｔ−ＳｂｆＩ：５’−ａｇｃｃｃｃｔｇｃａｇｇａａｇｃｔｔｔｇｃａａａｔｔａａａｇｃｃｔｔｃｇ−３’（配列番号１２）
ＰＣＲはＰｆｕＵｌｔｒａ  ＩＩ  ｆｕｓｉｏｎ  ＨＳ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを使用して、９５℃２分＋［９５℃２０秒、５６℃２０秒、７２℃４５秒］×３０サイクル＋７２℃３分の条件で行った。得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＳｐｈＩおよびＳｂｆＩで消化し、ＳｐｈＩおよびＳｂｆＩで消化したｐＡＵＲ１０１（タカラバイオ；配列番号３８）にＱｕｉｃｋ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて連結した。連結物で大腸菌ＤＨ５αコンピテントセルを形質転換し、アンピシリン耐性を獲得した大腸菌よりｉｌｌｕｓｔｒａ  ｐｌａｓｍｉｄＰｒｅｐ  Ｍｉｎｉ  Ｓｐｉｎ  Ｋｉｔを用いてＸＫ発現用ベクターであるｐＡＵＲ−ＸＫ（配列番号３９）を調製した。
【０１３５】
次に、ｐＹＰＧＥ１５Ｌ−ＸＤＨを鋳型にして、ＰＧＫｐ−ＳｂｆＩプライマーおよびＣＹＣｔ−ＳａｌＩプライマーを用いてＰＧＫ１プロモーター、ＸＤＨ遺伝子、ＣＹＣ１ターミネーターから成るＰＧＫ１ｐ−ＸＤＨ−ＣＹＣ１ｔ遺伝子カセット（２．２ｋｂ）をＰＣＲ増幅により単離した。使用したプライマーの配列を以下に示す。
【０１３６】
ＰＧＫｐ−ＳｂｆＩ：５’−ｇｃｃｃｃｔｇｃａｇｇａｇａｔａｔｔａｔａａｃａｔｃｔｇｃａｔａａｔａｇ−３’（配列番号１３）
ＣＹＣｔ−ＳａｌＩ：５’−ａｇｃｃｇｔｃｇａｃａａｇｃｔｔｔｇｃａａａｔｔａａａｇｃｃｔｔｃｇ−３’（配列番号１４）
ＰＣＲはＰｆｕＵｌｔｒａ  ＩＩ  ｆｕｓｉｏｎ  ＨＳ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを使用して、９５℃２分＋［９５℃２０秒、５５℃２０秒、７２℃４５秒］×３０サイクル＋７２℃３分の条件で行った。得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＳｂｆＩおよびＳａｌＩで消化し、ＳｂｆＩおよびＳａｌＩで消化したｐＡＵＲ―ＸＫにＱｕｉｃｋ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて連結した。連結物で大腸菌ＤＨ５αコンピテントセルを形質転換し、アンピシリン耐性を獲得した大腸菌よりｉｌｌｕｓｔｒａ  ｐｌａｓｍｉｄＰｒｅｐ  Ｍｉｎｉ  Ｓｐｉｎ  Ｋｉｔを用いてＸＤＨ及びＸＫ共発現用ベクターであるｐＡＵＲ−ＸＤＨＸＫを調製した。
【０１３７】
さらに、ｐＹＰＧＥ１５Ｌ−ＸＲを鋳型にして、ＰＧＫｐ−ＳｍａＩプライマー（配列番号３）およびＣＹＣｔ−ＳａｃＩプライマーを用いてＰＧＫ１プロモーター、ＸＲ遺伝子、ＣＹＣ１ターミネーターから成るＰＧＫ１ｐ−ＸＲ−ＣＹＣ１ｔ遺伝子カセット（２．１ｋｂ）をＰＣＲ増幅により単離した。ＣＹＣｔ−ＳａｃＩプライマーの配列を以下に示す。
【０１３８】
ＣＹＣｔ−ＳａｃＩ：５’−ｇｇｃｇａｇｃｔｃａａｇｃｔｔｔｇｃａａａｔｔａａａｇｃｃｔｔｃｇ−３’（配列番号１５）
ＰＣＲはＰｆｕＵｌｔｒａ  ＩＩ  ｆｕｓｉｏｎ  ＨＳ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを使用して、９５℃２分＋［９５℃２０秒、５５℃２０秒、７２℃４５秒］×３０サイクル＋７２℃３分の条件で行った。得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＳｍａＩおよびＳａｃＩで消化した。ｐＡＵＲ―ＸＤＨＸＫをＳｍａＩで消化後、ＳａｃＩで部分消化し、１１．８ｋｂのＤＮＡ断片を調製した。これとＰＧＫ１ｐ−ＸＲ−ＣＹＣ１ｔをＱｕｉｃｋ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて連結し、大腸菌ＤＨ５αコンピテントセルを形質転換し、アンピシリン耐性を獲得した大腸菌よりｉｌｌｕｓｔｒａ  ｐｌａｓｍｉｄＰｒｅｐ
Ｍｉｎｉ  Ｓｐｉｎ  Ｋｉｔを用いてＸＲ、ＸＤＨ及びＸＫ共発現用ベクターであるｐＡＵＲ−ＸＲＸＤＨＸＫを調製した。
【０１３９】
（ＸＲ遺伝子、ＸＤＨ遺伝子およびＸＫ遺伝子の酵母への導入方法）
酵母の形質転換はＥｌｂｌｅによる酢酸リチウム法（Ｅｌｂｌｅ  Ｒ，  ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，  Ｖｏｌ．１３，  ｐｐ．１８−２０  （１９９２））に基づいて行った。以下に手順を示す。ＹＰＤ培地で１日培養したＳ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＮＢＲＣ０２２４およびＣ．  ｇｌａｂｒａｔａ  ＮＦＲＩ３１６３をそれぞれ１ｍＬの培養液から遠心分離により集菌し、各々１ｍＬの滅菌水で洗浄後、再度集菌した。Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの形質転換用には、１μｇのｐＡＵＲ−ＸＲＸＤＨＸＫを制限酵素ＢｓｉＷＩで消化し、Ｃ．  ｇｌａｂｒａｔａの形質転換用には、５μｇのｐＡＵＲ−ＸＲＸＤＨＸＫを制限酵素ＳｐｈＩで消化した。これらの直鎖状ベクターをシリカメンブレンカラム（ＧＥヘルスケア  ｉｌｌｕｓｔｒａ  ＧＦＸ  ＰＣＲ  ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  Ｂａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）を用いて精製した後、１０μＬの滅菌水で溶出し、１０μＬのキャリアーＤＮＡ（ニシン精子ＤＮＡ、１００μｇ）と混合した。これに５００μＬのＰＬＡＴＥ溶液［４０％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール＃４０００（ナカライテスク）、０．１Ｍ  酢酸リチウム、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ７．５），１ｍＭ  ＥＤＴＡ］を加え混合した溶液で、前述の酵母菌体を懸濁した。室温で１日静置後、遠心分離により集菌し、２００μＬの滅菌水で菌体を懸濁した。この菌体懸濁液を１００μＬずつ、２枚のＹＰＤ−ＡｂＡ寒天培地（１０ｇ／Ｌ  Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ（Ｄｉｆｃｏ）、２０ｇ／Ｌ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｏｎ（日本製薬）、２０ｇ／Ｌ  グルコース、０．５μｇ／ｍＬ  オーレオバシジンＡ（タカラバイオ）、２０ｇ／Ｌ  バクトアガー（Ｄｉｆｃｏ））に塗布した。３０℃で３日間静置培養し、オーレオバシジンＡ耐性を示したコロニーを単離することにより、ＸＲ−ＸＤＨ−ＸＫ系を導入したＳ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびＣ．  ｇｌａｂｒａｔａを取得し、  それぞれＳ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＸＲ−ＸＤＨ−ＸＫおよびＣ．  ｇｌａｂｒａｔａ  ＸＲ−ＸＤＨ−ＸＫと命名した。
【０１４０】
（遺伝子組換え酵母によるグルコース・キシロース混合培地のエタノール発酵）
上記により製造した遺伝子組換え酵母のエタノール発酵収率を以下の手順により測定した。Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＸＲ−ＸＤＨ−ＸＫおよびＣ．  ｇｌａｂｒａｔａ  ＸＲ−ＸＤＨ−ＸＫをそれぞれ、３０℃でＹＰＤ培地を用いて好気的に一晩種培養した後、波長６００ｎｍにおける吸光度（ＯＤ６００）を測定し、種培養液の菌体濃度を求めた。菌体濃度は、ＯＤ６００＝１の場合、０．３ｇ（乾燥重量）／Ｌに相当するものとして計算した。種培養液を遠心分離により集菌し、菌体を滅菌水で洗浄した後、容量１０ｍＬのガラスバイアル（日電理化硝子、ＳＶＧ−１０）に入った５％（ｗ／ｖ）グルコースおよび２％（ｗ／ｖ）キシロースを含有する７ｍＬのＹＰ培地に、初発菌体濃度０．３ｇ（乾燥重量）／Ｌとなるように添加した。バイアルをゴム栓（日電理化硝子、液状用ブチルゴム（大））および穴あきキャップ（日電理化硝子）にて密封した。恒温回転式浸とう培養器（タイテック、モデルＢＲ−２２ＦＰ・ＭＲ）を用いて、３０℃、３５℃、３７℃および４０℃の各温度で、２００ｒｐｍで振とう培養を行った。注射針（テルモ、２０Ｇ×７０）を用いて経時的にサンプリングを行い、採取した発酵液から遠心分離によって酵母菌体を除いた後、ＨＰＬＣによって、発酵液に含まれるエタノール及び糖類の定量分析を行った。ＨＰＬＣには、前述の島津製作所製装置に配位子交換クロマトグラフィー用カラム（Ｓｈｏｄｅｘ  ＳＰ０８１０）を接続して使用した。移動相に水を用いて、流速０．６ｍｌ／分、カラム温度８０℃で分析を行った。また、カラムの保護のために脱塩カートリッジ（ＢｉｏＲａｄ）とガードカラム（Ｓｈｏｄｅｘ  ＳＰ−Ｇ）をＳＰ０８１０カラムの前に連結した。得られたクロマトグラムについてＬＣ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ解析ソフトウエア（島津製作所）を使用してサンプルと標準品の保持時間およびピーク面積を比較することにより発酵液中のエタノールおよび糖類の定性および定量分析を行った。
【０１４１】
その結果を図４に示す。Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＸＲ−ＸＤＨ−ＸＫ、Ｃ．  ｇｌａｂｒａｔａ  ＸＲ−ＸＤＨ−ＸＫともグルコースの利用能は４０℃でも維持されていた。一方、キシロースの利用能については、Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＸＲ−ＸＤＨ−ＸＫでは３５℃まで、Ｃ．  ｇｌａｂｒａｔａ  ＸＲ−ＸＤＨ−ＸＫでは３７℃までは、比較的高い利用能を維持していたものの、それぞれ３７℃、４０℃に発酵温度が上がると著しい低下が見られた。以上により、従来の方法に基づいて製造した組換え酵母では、酵母の種類を問わず、４０℃においてキシロース発酵を行うことが困難であることを確認した。
【０１４２】
（実施例４  Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａおよびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを用いたキシロースの同時異性化発酵）
２％（ｗ／ｖ）キシロースを含むＹＰ培地にグルコースイソメラーゼ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ、Ｓｗｅｅｔｚｙｍｅ  ＩＴ  Ｅｘｔｒａ，３５Ｕ）を加えた培地を用いて、Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａおよびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの非遺伝子組換え体について、同時異性化発酵能を解析した。以下に簡単な手順を示す。
【０１４３】
（同時異性化発酵の手順）
Ｃ．  ｇｌａｂｒａｔａ  ＮＦＲＩ３１６３およびＳ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＩｎｖＳｃ１をそれぞれ、３０℃でＹＰＤ培地を用いて好気的に一晩種培養した後、ＯＤ６００を測定し、種培養液の菌体濃度を求めた。菌体濃度は、ＯＤ６００＝１の場合、０．３ｇ（乾燥重量）／Ｌに相当するものとして計算した。種培養液を遠心分離により集菌し、菌体を滅菌水で洗浄した後、容量１０ｍＬのガラスバイアル（日電理化硝子、ＳＶＧ−１０）に入った２％（ｗ／ｖ）キシロースを含有する５ｍＬのＹＰ培地に、初発菌体濃度が０．３ｇ（乾燥重量）／Ｌとなるように添加した。さらに３５Ｕのグルコースイソメラーゼ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ、Ｓｗｅｅｔｚｙｍｅ  ＩＴ  Ｅｘｔｒａ）を加えた後、バイアルをゴム栓（日電理化硝子、液状用ブチルゴム（大））および穴あきキャップ（日電理化硝子）にて密封した。恒温回転式浸とう培養器（タイテック、モデルＢＲ−２２ＦＰ・ＭＲ）を用いて、３０℃および４０℃で、２００ｒｐｍで振とう培養を行った。注射針（テルモ、２０Ｇ×７０）を用いてサンプリングを行い、採取した発酵液から遠心分離によって酵母菌体を除いた後、ＨＰＬＣによって、発酵液に含まれるエタノール及び糖類の定量分析を行った。ＨＰＬＣには、前述の島津製作所製装置に、配位子交換クロマトグラフィー用カラム（Ｓｈｏｄｅｘ  ＳＰ０８１０）を接続して使用した。移動相に水を用いて、流速０．６ｍｌ／分、カラム温度８０℃で分析を行った。また、カラムの保護のために脱塩カートリッジ（ＢｉｏＲａｄ）とガードカラム（Ｓｈｏｄｅｘ  ＳＰ−Ｇ）をＳＰ０８１０カラムの前に連結した。得られたクロマトグラムについてＬＣ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ解析ソフトウエアを使用して発酵液中のエタノールおよび糖類の定性および定量分析を行った。
【０１４４】
以下の表に７２時間発酵時の結果を示す。表中のエタノール収率は、添加基質量に対する収率であり、２％（ｗ／ｖ）キシロースを基質として初発菌体濃度０．３ｇ（乾燥重量）／Ｌを用いて７２時間発酵したときのエタノール収率を理論収率に対する百分率で示す。なお、１ｇのキシロースから０．５１ｇのエタノールの生成を理論収率とした。
【０１４５】
【表２】
2014014360.tif 000003
【０１４６】
その結果、Ｃ．  ｇｌａｂｒａｔａ  ＮＦＲＩ３１６３は、４０℃においてＳ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＩｎｖＳｃ１よりも高いエタノール収率を示し、且つ４０℃でも３０℃と同等の発酵能を示した。ただし、副産物であるキシリトールの蓄積は、発酵温度にかかわらず、Ｃ．  ｇｌａｂｒａｔａ  ＮＦＲＩ３１６３の方が、Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＩｎｖＳｃ１よりも多かった。
【０１４７】
（実施例５  Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ  ＮＦＲＩ３１６３にキシルロキナーゼを高発現させた株の作製）
本実施例では、同時異性化発酵によるキシロース発酵能のさらなる改善を目的として、Ｃ．  ｇｌａｂｒａｔａのキシルロキナーゼ遺伝子を遺伝子組換えにより上記Ｃ．  ｇｌａｂｒａｔａ  ＮＦＲＩ３１６３株に導入し、キシルロキナーゼの高発現により同時異性化発酵の収率を向上させた。以下にそのプロトコールを示す。
【０１４８】
（キシルロキナーゼ導入用ベクターの構築方法）
まず、Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＰＧＫ１ｐプロモーターとＣＹＣ１ｔターミネーターおよびウラシル要求性マーカー遺伝子（ＵＲＡ３）を含有する酵母発現用ベクターを以下の手順で構築した。ＰＧＫ１ｐを得るために、前出のｐＡＵＲ−ＸＫプラスミド（配列番号３９）を鋳型にしてＰＧＫｐ−１ＳプライマーとＰＧＫｐ−１Ａプライマーを用いてＰＣＲを行った。プライマーの配列を以下に示す。
【０１４９】
ＰＧＫｐ−１Ｓ：５’−ｇａｃｃｇａｇｃｔｃｃａｃａｇａｔａｔｔａｔａａｃａｔｃｔｇｃａｔａａｔａｇ−３’（配列番号１６）
ＰＧＫｐ−１Ａ：５’−ｇｃｃｇｃｃｇｔｃｔａｇａｔｇｔｔｔｔａｔａｔｔｔｇｔｔｇｔａａａａａｇｔａｇ−３’（配列番号１７）
ＰＣＲはＰｆｕＵｌｔｒａ  ＩＩ  ｆｕｓｉｏｎ  ＨＳ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを使用して、９５℃２分＋［９５℃２０秒、５５℃２０秒、７２℃１５秒］×３０サイクル＋７２℃３分の条件で行った。得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＳａｃＩおよびＸｂａＩで消化し、ｐＲＳ４０６ベクターのＳａｃＩおよびＸｂａＩサイトにクローニングした。ＣＹＣ１ｔ（０．２ｋｂ）は、ｐ４２４ＧＰＤベクターをＫｐｎＩおよびＸｈｏＩで消化することにより得た。このＤＮＡ断片を、ＰＧＫ１ｐをクローニングしたｐＲＳ４０６のＫｐｎＩおよびＸｈｏＩサイトにクローニングし、ｐＲＳ４０６−ＰＧＫｐＣＹＣｔを作製した。製造したベクターｐＲＳ４０６−ＰＧＫｐＣＹＣｔの概略図を図５に示す。
【０１５０】
次に、ＧｅｎＢａｎｋ  ＤＮＡデータベースに登録されていたＣ．  ｇｌａｂｒａｔａ
ＣＢＳ１３８の染色体ＤＮＡ塩基配列（アクセス番号：ＣＲ３８０９５３）の中から、Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのキシルロキナーゼ遺伝子と相同性を示す遺伝子（ＣｇＸＫ）を見出した。この配列情報を基にＣｇＸＫ−１ＳプライマーとＣｇＸＫ−２Ａプライマーを合成し、Ｃ．  ｇｌａｂｒａｔａ  ＮＦＲＩ３１６３のゲノムＤＮＡを鋳型に用いてＰＣＲ増幅によりＣｇＸＫを単離した。使用したプライマーの配列を以下に示す。
【０１５１】
ＣｇＸＫ−１Ｓ：５’−ｃｇａａｔｔｃｃａｃａａｔｇｃａａｇｇｃｇａａｇｇｔｔａｔｔａｃ−３’（配列番号１８）
ＣｇＸＫ−２Ａ：５’−ｃｃｇｃｔｃｇａｇｔｔａｃｔｔｔａａｃｔｃｔｔｃｔｔｃｔａａｔｔｔｇｃｔｃ−３’（配列番号１９）
ＰＣＲはＰｆｕＵｌｔｒａ  ＩＩ  ｆｕｓｉｏｎ  ＨＳ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを使用して、９５℃２分＋［９５℃２０秒、５５℃２０秒、７２℃３０秒］×３０サイクル＋７２℃３分の条件で行った。得られた１．８ｋｂのＤＮＡ断片を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで消化した後、ｐＲＳ４０６−ＰＧＫｐＣＹＣｔのＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩサイトにクローニングし、ｐＲＳ４０６−ＣｇＸＫを作製した。製造したベクターｐＲＳ４０６−ＣｇＸＫの概略図を図６に示す（ＣｇＸＫの核酸配列は配列番号２８でありアミノ酸配列は配列番号２９である。ｐＲＳ４０６ベクターの配列は配列番号３０である。ｐＲＳ４０６−ＣｇＸＫベクターの配列は配列番号３１である。）。
【０１５２】
（Ｃ．  ｇｌａｂｒａｔａ  ＮＦＲＩ３１６３のウラシル要求性変異株の単離）
Ｃ．  ｇｌａｂｒａｔａ  ＮＦＲＩ３１６３の抗生物質の添加を必要としない形質転換を行うために、ウラシル要求性変異株の単離を行った。ウラシル要求性変異株の単離はＢｏｅｋｅらの方法（Ｂｏｅｋｅ  ＪＤ，ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．１９７，  ｐｐ．３４５−３４６）に基づいて行った。以下に簡単な手順を示す。
【０１５３】
Ｃ．  ｇｌａｂｒａｔａ  ＮＦＲＩ３１６３をＹＰＤ培地で３０℃、１日培養後、１ｍＬの培養液から遠心分離によって集菌し、１ｍＬの滅菌水で２回洗浄した。菌体を再度１ｍＬの滅菌水に懸濁後、１００μＬずつ５−ＦＯＡ寒天培地［６．７ｇ／Ｌ  Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ  ｗｉｔｈｏｕｔ  Ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ）、０．７７ｇ／Ｌ  ＣＳＭ−Ｕｒａ（Ｓｕｎｒｉｓｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２０ｇ／Ｌ  グルコース、５０ｍｇ／Ｌ  ウラシル、１ｇ／Ｌ  ５−フルオロオロト酸（ナカライテスク）、２０ｇ／Ｌ  Ｂａｃｔｏａｇａｒ（Ｄｉｆｃｏ）］に塗布し、３０℃で４日間静置培養した。５−ＦＯＡ寒天培地上に生育してきたコロニーを、ＳＣ寒天培地［６．７ｇ／Ｌ  Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ  ｗｉｔｈｏｕｔ  Ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ、０．７９ｇ／Ｌ  ＣＳＭ（Ｓｕｎｒｉｓｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２０ｇ／Ｌ  グルコース、２０ｇ／Ｌ  Ｂａｃｔｏａｇａｒ］およびＳＣ−Ｕｒａ寒天培地［６．７ｇ／Ｌ  Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ  ｗｉｔｈｏｕｔ  Ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ、０．７７ｇ／Ｌ  ＣＳＭ―Ｕｒａ、２０ｇ／Ｌ  グルコース、２０ｇ／Ｌ  Ｂａｃｔｏａｇａｒ］にそれぞれ植菌し、３０℃で２日間静置培養した後、ＳＣで生育し、ＳＣ−Ｕｒａでは生育しない株をウラシル要求性変異株として選抜し、Ｃ．  ｇｌａｂｒａｔａ  ３１６３  ｕｒａ０１２と命名した。
【０１５４】
（ＣｇＸＫのＣ．  ｇｌａｂｒａｔａへの導入）
５μｇのｐＲＳ４０６−ＣｇＸＫを制限酵素ＳａｃＩで直鎖状にした後、３１６３  ｕｒａ０１２株をＥｌｂｌｅによる酢酸リチウム法により形質転換した。ＳＣ−Ｕｒａ寒天培地上で生育してきたコロニーを単離し、得られた形質転換株をＣａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ  ３１６３−ＣｇＸＫ＜ＮＩＴＥ受託番号：Ｐ−１３５８＞と命名し、以下の実施例で用いた。
【０１５５】
（実施例６  キシルロキナーゼ遺伝子を高発現させたＣａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａによるキシロースの同時異性化発酵）
２％（ｗ／ｖ）キシロースを含む５ｍＬのＹＰ培地にグルコースイソメラーゼ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ、Ｓｗｅｅｔｚｙｍｅ  ＩＴ  Ｅｘｔｒａ、３５Ｕ）を加え、実施例５で作製したキシルロキナーゼを高発現させたＣ．  ｇｌａｂｒａｔａ  ３１６３−ＣｇＸＫを初発菌体濃度が０．３ｇ（乾燥重量）／Ｌとなるよう添加し、７２時間同時異性化発酵を行った。発酵液に含まれるエタノールおよび糖類をＨＰＬＣにより測定し、キシロース消費量、エタノール収率およびキシリトール蓄積量を求めた。同時異性化発酵およびＨＰＬＣによる解析は、実施例４と同様に行った。結果を以下の表に示す。表中のエタノール収率は、添加基質量に対する収率であり、２％（ｗ／ｖ）キシロースを基質として初発菌体濃度０．３ｇ（乾燥重量）／Ｌを用いて７２時間発酵したときのエタノール収率を理論収率（０．５１ｇ／ｇ）に対する百分率で示す。
【０１５６】
【表３】
2014014360.tif 000004
【０１５７】
その結果、Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ  ３１６３−ＣｇＸＫは、３０℃、４０℃ともに高いキシロース消費量およびエタノール収率を示した。親株であるＮＦＲＩ３１６３株に比べ、発酵温度３０℃において２．４倍、４０℃において２．２倍、エタノール収率が向上し、４０℃でも理論収率の７０％を超える高いエタノール収率を示した。一方、４０℃におけるキシリトール蓄積量はＮＦＲＩ３１６３よりも高くなっていた。
【０１５８】
（実施例７  キシルロキナーゼを高発現させたＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅによるキシロースの同時異性化発酵）
また、Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＩｎｖＳｃ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能）にキシルロキナーゼを高発現させた株（ＩｎｖＳｃ１−ＳｃＸＫ６）を作製し、これについても同時異性化発酵のデータを取得した。以下に手順を示す。
【０１５９】
（キシルロキナーゼを高発現するＳ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの作製方法）
ｐＡＵＲ−ＸＫ（配列番号３９）を鋳型にして、ＳＸＫ−１ＳプライマーおよびＳＸＫ−１Ａプライマーを用いてＸＫ遺伝子をＰＣＲ増幅した。使用したプライマーの配列を以下に示す。
【０１６０】
ＳｃＸＫ−１Ｓ：５’−ｃｃａｔｃｇａｔｃａｃａａｔｇｔｔｇｔｇｔｔｃａｇｔａａｔｔｃａｇａｇ−３’（配列番号２０）
ＳｃＸＫ−１Ａ：５’−ｃｃｇｃｔｃｇａｇｔｔａｇａｔｇａｇａｇｔｃｔｔｔｔｃｃ−３’（配列番号２１）
ＰＣＲはＰｆｕＵｌｔｒａ  ＩＩ  ｆｕｓｉｏｎ  ＨＳ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを使用して、９５℃２分＋［９５℃２０秒、５５℃２０秒、７２℃３０秒］×３０サイクル＋７２℃３分の条件で行った。得られた１．８ｋｂのＤＮＡ断片を制限酵素ＣｌａＩおよびＸｈｏＩで消化した後、ｐＲＳ４０６−ＰＧＫｐＣＹＣｔのＣｌａＩおよびＸｈｏＩサイトにクローニングし、ｐＲＳ４０６−ＸＫを作製した。製造したベクターｐＲＳ４０６−ＸＫの概略図を図７に示す。
【０１６１】
２μｇのｐＲＳ４０６−ＸＫを制限酵素ＳｂｆＩで直鎖状にした後、Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＩｎｖＳｃ１をＥｌｂｌｅによる酢酸リチウム法により形質転換した。ＳＣ−Ｕｒａ寒天培地上で生育してきたコロニーを単離し、得られた形質転換株をＳ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＩｎｖＳｃ１−ＳｃＸＫと命名した。
【０１６２】
（キシルロキナーゼを高発現させたＳ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅによる同時異性化発酵）
２％（ｗ／ｖ）キシロースを含む５ｍＬのＹＰ培地にグルコースイソメラーゼ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ、Ｓｗｅｅｔｚｙｍｅ  ＩＴ  Ｅｘｔｒａ、３５Ｕ）を加え、Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＩｎｖＳｃ１−ＳｃＸＫを初発菌体濃度が０．３ｇ（乾燥重量）／Ｌとなるよう添加し、７２時間および１５０時間同時異性化発酵を行った。発酵液に含まれるエタノールおよび糖類をＨＰＬＣにより測定し、キシロース消費量、エタノール収率およびキシリトール蓄積量を求めた。同時異性化発酵およびＨＰＬＣによる解析は、実施例４と同様に行った。結果を以下の表に示す。表中のエタノール収率は、添加基質量に対する収率であり、２％（ｗ／ｖ）キシロースを基質として初発菌体濃度０．３ｇ（乾燥重量）／Ｌを用いて、表４は７２時間発酵したときの、表５は１５０時間発酵したときの、エタノール収率を理論収率（０．５１ｇ／ｇ）に対する百分率で示す。
【０１６３】
【表４】
2014014360.tif 000005
【０１６４】
【表５】
2014014360.tif 000006
【０１６５】
Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅでもキシルロキナーゼの高発現によって同時異性化発酵におけるキシロース消費量の増加およびエタノール収率の向上効果が得られた。キシルロキナーゼを高発現させたＩｎｖＳｃ１−ＳｃＸＫは、親株であるＩｎｖＳｃ１株に比べ、７２時間発酵時のエタノール収率は、３０℃で２．６倍、４０℃で３．２倍、１５０時間発酵時のエタノール収率は３０℃で２．０倍、４０℃で４．２倍、向上した。このように、酵母の種類に関わらず、キシロース発酵能（キシロースをエタノールに変換する能力）の向上に対して、発酵温度３０℃においてだけでなく、４０℃においても、キシルロキナーゼの高発現の効果があることが確認された。しかしながら、Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅでは４０℃におけるエタノール収率は４０％程度に留まった。すなわち、実施例６で達成されたような４０℃において７０％を超える高いエタノール収率を得るには、単にキシルロキナーゼを高発現させれば良い訳ではなく、４０℃で高いキシルロース発酵能（キシルロースをエタノールに変換する能力）を有する酵母株を宿主として使用することが必要であることが確認された。Ｃ．  ｇｌａｂｒａｔａが４０℃において高いキシルロース発酵能を有することはこれまで報告されておらず、したがって、Ｃ．  ｇｌａｂｒａｔａ  ＮＦＲＩ３１６３にキシルロキナーゼを高発現させることにより４０℃において顕著に高いキシロース同時異性化発酵能が得られることは予測できなかったものである。
【０１６６】
（実施例８  相同組換えによるＣａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ染色体上のアルドースレダクターゼ遺伝子の破壊）
Ｃ．  ｇｌａｂｒａｔａはＳ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅと異なり、通常、非相同末端結合により外来遺伝子の染色体への挿入が起こるが、相同部分を０．４５塩基対と長くとることにより、相同組換えを起こすことができた。具体的には以下のとおりに行った。その模式図は、図８上パネルに示している。図８上パネルでは、相同組換えのスキームおよび非相同末端結合の模式図を示している。以下に行った手順の概要を示す。
【０１６７】
（アルドースレダクターゼ遺伝子破壊用ＤＮＡ断片の調製方法）
ＧｅｎＢａｎｋ  ＤＮＡデータベースに登録されていたＣ．  ｇｌａｂｒａｔａ  ＣＢＳ１３８の染色体ＤＮＡ塩基配列（アクセス番号：ＣＲ３８０９５５）の中から、Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのアルドースレダクターゼ遺伝子（ＧＲＥ３）と相同性を示す遺伝子（ＣｇＧＲＥ３）を見出した。この配列情報を基にＣｇＧＲＥ３−１ＳプライマーとＣｇＧＲＥ３−１Ａプライマーを合成し、Ｃ．  ｇｌａｂｒａｔａ  ＮＦＲＩ３１６３のゲノムＤＮＡを鋳型に用いてＰＣＲ増幅によりＣｇＧＲＥ３をコードするＤＮＡ断片（１．０ｋｂ）を単離した。使用したプライマーの配列を以下に示す。
【０１６８】
ＣｇＧＲＥ３−１Ｓ：５’−ＧＧＣＧＧＡＴＣＣＡＴＧＴＣＴＡＧＴＧＴＴＧＴＴＡＣＴＴＴＧＡＡＣＡＡＴＧＧ−３’（配列番号２２）
ＣｇＧＲＥ３−１Ａ：５’−ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＴＴＡＡＧＣＡＡＡＧＡＴＴＧＧＧＡＡＣＴＴＡＣＣＡＴＣ−３’（配列番号２３）
ＰＣＲはＰｆｕＵｌｔｒａ  ＩＩ  ｆｕｓｉｏｎ  ＨＳ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを使用して、９５℃２分＋［９５℃２０秒、５８℃２０秒、７２℃１５秒］×３０サイクル＋７２℃３分の条件で行った。得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩで消化した後、ＢａｍＨＩとＸｈｏＩで消化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ（＋）ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にクローニングし、ｐＢＳ−ＣｇＧＲＥ３と命名した。図９に模式図を示す。
【０１６９】
次に、Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＵＲＡ３遺伝子およびＵＲＡ３プロモーターを、ｐＲＳ４０６ベクターを鋳型に、ＳｃＵＲＡ３−１ＳプライマーおよびＳｃＵＲＡ３−１Ａプライマーを用いて、ＰＣＲによって増幅した。使用したプライマーの配列を以下に示す。
【０１７０】
ＳｃＵＲＡ３−１Ｓ：５’−ＣＣＡＴＣＧＡＴＴＡＡＧＡＴＴＣＧＧＴＡＡＴＣＴＣＣＧＡＡＣＡＧＡＡＧＧ−３’（配列番号２４）
ＳｃＵＲＡ３−１Ａ：５’−ＣＣＡＴＣＧＡＴＴＡＡＴＴＡＧＴＴＴＴＧＣＴＧＧＣＣＧＣＡＴＣＴＴＣ−３’（配列番号２５）
ＰＣＲはＰｆｕＵｌｔｒａ  ＩＩ  ｆｕｓｉｏｎ  ＨＳ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを使用して、９５℃２分＋［９５℃２０秒、５６℃２０秒、７２℃１５秒］×３０サイクル＋７２℃３分の条件で行った。得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＣｌａＩで消化した。ｐＢＳ−ＣｇＧＲＥ３をＣｌａＩで消化し、セルフライゲーションを防ぐためにＡｎｔａｒｃｔｉｃ  Ｐｈｏｓｐａｈｔａｓｅ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して脱リン酸化処理を行った後、ＵＲＡ３およびＵＲＡ３プロモーターを挿入し、ｐＢＳ−ＣｇＧＲＥ３−ＵＲＡ３を作製した。図１０に模式図を示す。ｐＢＳ−ＣｇＧＲＥ３−ＵＲＡ３を鋳型に、ＣｇＧＲＥ３−２ＳプライマーとＣｇＧＲＥ３−２Ａプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＣｇＧＲＥ３の５’−末端から０．４５ｋｂの位置にＵＲＡ３およびＵＲＡ３プロモーターが挿入されたＤＮＡ断片（２．０ｋｂ）を増幅した。使用したプライマーの配列を以下に示す。
【０１７１】
ＣｇＧＲＥ３−２Ｓ：５’−ＡＴＧＴＣＴＡＧＴＧＴＴＧＴＴＡＣＴＴＴＧＡＡＣＡＡＴＧＧ−３’（配列番号２６）
ＣｇＧＲＥ３−２Ａ：５’−ＴＴＡＡＧＣＡＡＡＧＡＴＴＧＧＧＡＡＣＴＴＡＣＣＡＴＣ−３’（配列番号２７）
ＰＣＲはＰｆｕＵｌｔｒａ  ＩＩ  ｆｕｓｉｏｎ  ＨＳ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを使用して、９５℃２分＋［９５℃２０秒、５０℃２０秒、７２℃３０秒］×３０サイクル＋７２℃３分の条件で行った。
【０１７２】
（アルドースレダクターゼ遺伝子が欠損したＣ．  ｇｌａｂｒａｔａ株の作製方法）
前項で得られた２．０ｋｂのＤＮＡ断片を用いて、Ｃ．  ｇｌａｂｒａｔａ  ３１６３  ｕｒａ０１２株をＥｌｂｌｅによる酢酸リチウム法により形質転換した。ＳＣ−Ｕｒａ寒天培地上で生育してきたコロニーの中から、相同組換えを起こした組換え体をコロニーＰＣＲにより選抜し、Ｃ．  ｇｌａｂｒａｔａのアルドースレダクターゼ（ＣｇＧＲＥ３）破壊株を取得した。コロニーＰＣＲは、以下の条件で行った。
【０１７３】
プライマーにはＣｇＧＲＥ３−２Ｓ（配列番号２６）とＣｇＧＲＥ３−２Ａ（配列番号２７）を用いて、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼにはＭｉｇｈｔｙＡｍｐ  Ｖｅｒ．２  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ）を使用した。ＳＣ−Ｕｒａ寒天培地上に生育してきたコロニーをＰＣＲ反応液に懸濁し、９８℃２分＋［９８℃１０秒、５０℃１５秒、６８℃２分］×３０サイクルの条件でＰＣＲを行った。反応終了後、反応液の一部を０．８％（ｗ／ｖ）アガロースゲル（タカラバイオ、アガロースＬＯ３）で電気泳動し、ＰＣＲ産物のサイズを解析した。
【０１７４】
その結果を図８下パネルに示す。下パネルで示すように、コロニーＰＣＲに供した４７コロニーのうち、レーン１および２のコロニー＃１７およびコロニー＃３５が相同組換えを起こしていることが判明した。レーン３は非相同末端結合を起こしたコロニー＃１９の、レーン４は親株である３１６３  ｕｒａ０１２株のＰＣＲの結果を参考に示す。コロニー＃３５をＣ．  ｇｌａｂｒａｔａ  ３１６３  Δｇｒｅ３−３５＜ＮＩＴＥ受託番号  Ｐ−１３５９＞と命名し、以下の実施例に使用した。
【０１７５】
（実施例９  アルドースレダクターゼ破壊株によるキシロースの同時異性化発酵）
２％（ｗ／ｖ）キシロースを含む５ｍＬのＹＰ培地にグルコースイソメラーゼ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ、Ｓｗｅｅｔｚｙｍｅ  ＩＴ  Ｅｘｔｒａ、３５Ｕ）を加え、実施例８で作製したアルドースレダクターゼ遺伝子を破壊したＣａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ  ３１６３  Δｇｒｅ３−３５を用いて、７２時間同時異性化発酵を行った。
【０１７６】
その結果、Ｃ．  ｇｌａｂｒａｔａ  ３１６３  Δｇｒｅ３−３５は、３０℃、４０℃ともに、キシリトールの蓄積量が著しく減少した。キシリトール／エタノール比は、元のＮＦＲＩ３１６３株に比べ、３０℃において２１分の１に、４０℃において９分の１に減少した。また、キシロース消費量は親株と同等であるにもかかわらず、エタノール収率がＮＦＲＩ３１６３株よりも増加しており、キシリトールの生成抑制がエタノール収率の向上に有効であることを確認した。結果を以下の表に示す。表中のエタノール収率は、添加基質量に対する収率であり、２％（ｗ／ｖ）キシロースを基質として初発菌体濃度０．３ｇ（乾燥重量）／Ｌを用いて７２時間発酵したときのエタノール収率を理論収率（０．５１ｇ／ｇ）に対する百分率で示す。
【０１７７】
【表６】
2014014360.tif 000007
【０１７８】
（実施例１０  キシルロキナーゼ高発現とアルドースレダクターゼ欠損を組み合わせた遺伝子組換え体によるキシロースの同時異性化発酵）
本実施例では、キシルロキナーゼを高発現させ、アルドースレダクターゼを欠損させたＣａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ  ３１６３  ｄｇＸＫ１＜ＮＩＴＥ受託番号  Ｐ−１３５７＞を用いてキシロースの同時異性化発酵を行った。Ｃ．  ｇｌａｂｒａｔａ  ３１６３  ｄｇＸＫ１の作製は以下のとおりに行った。
【０１７９】
（作製手順）
実施例５に記載の方法と同様に５−フルオロオロト酸耐性を利用したスクリーニング方法により、Ｃ．  ｇｌａｂｒａｔａ  ３１６３  Δｇｒｅ３−３５株についてウラシル要求性変異株を取得し、３１６３  Δｇｒｅ３−３５  ｕｒａ０５と命名した。実施例５で作製したｐＲＳ−ＣｇＸＫを制限酵素ＳａｃＩで消化した後、Ｅｌｂｌｅの酢酸リチウム法により、３１６３  Δｇｒｅ３−３５  ｕｒａ０５を形質転換した。ＳＣ−Ｕｒａ寒天培地上で生育したコロニーを単離し、Ｃ．  ｇｌａｂｒａｔａ  ３１６３  ｄｇＸＫ１を取得した。
【０１８０】
２％（ｗ／ｖ）キシロースを含む５ｍＬのＹＰ培地にグルコースイソメラーゼ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ、Ｓｗｅｅｔｚｙｍｅ  ＩＴ  Ｅｘｔｒａ、３５Ｕ）を加え、７２時間同時異性化発酵を行った。その結果を表７に示す。Ｃ．  ｇｌａｂｒａｔａ  ３１６３  ｄｇＸＫ１は、３０℃、４０℃ともに高いエタノール収率と低いキシリトール蓄積を示した。エタノール収率は元のＮＦＲＩ３１６３株に比べ、３０℃において２．６倍、４０℃において２．３倍に向上した。また、キシリトール／エタノール比は、３０℃において８４分の１、４０℃において１２分の１であった。表中のエタノール収率は、添加基質量に対する収率であり、２％（ｗ／ｖ）キシロースを基質として初発菌体濃度０．３ｇ（乾燥重量）／Ｌを用いて７２時間発酵したときのエタノール収率を理論収率（０．５１ｇ／ｇ）に対する百分率で示す。
【０１８１】
【表７】
2014014360.tif 000008
【０１８２】
好ましい実施形態としてのＣａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａはキシルロキナーゼを高発現させることにより４０℃におけるキシロースの同時異性化発酵において７０％を超えるエタノール収率を得られたが、キシリトールの蓄積量が多く、エタノール収率の低下を招いていると考えられた。そこで、さらに好ましい実施形態を作製するために相同組換えによりＣ．  ｇｌａｂｒａｔａ  ＮＦＲＩ３１６３の染色体上に存在するアルドースレダクターゼをコードする遺伝子を欠損させることにより、同時異性化発酵の過程でキシロースからキシリトールが生成されることを抑制した。
【０１８３】
以上の改良により、４０℃において、理論収率の７５％以上の収率でのキシロースからのエタノールの生産を達成することができた。
【０１８４】
実施例３で示したように、従来の方法でもキシルロキナーゼを遺伝子組換えにより酵母で高発現させているものの、４０℃でキシロースを効率的に発酵することはできなかった。したがって、キシルロキナーゼの高発現が４０℃という高温におけるキシロース発酵能の向上に有効であることは予測されていなかった。また、アルドースレダクターゼの欠損により、４０℃という高温でのキシロース発酵能が上昇することも予測されていなかった。そして、４０℃でキシルロース発酵能が高い株に対して、キシルロキナーゼ活性の増強およびアルドースレダクターゼの欠損を行うことによって、得られた本実施例で証明された効果は、これまで報告されていなかったような高いキシロース発酵能である。本実施例のように同時異性化発酵に用いるために、キシルロキナーゼの高発現やアルドースレダクターゼの欠損をさせた報告はなく、両改良が４０℃という高温で同時異性化発酵においても同様の効果を起こすことは予測されていなかった。
【０１８５】
したがって、本発明の高温でのキシロース同時異性化発酵収率向上の効果は、顕著なものと評価することができる。
【０１８６】
また、４０℃で発酵する酵母の報告はあるものの、本発明で作製された、特に、Ｃ．  ｇｌａｂｒａｔａのような菌株ほどのキシロース発酵能は報告がなく、キシロース発酵能を絶対値としてみた場合でも本発明は顕著な効果を奏するというべきである。
【０１８７】
（実施例１１  遺伝子組換え体によるグルコース・キシロース混合培地の同時異性化発酵）
稲わらのグルコースおよびキシロースの含有比を模して５％（ｗ／ｖ）グルコースおよび２％（ｗ／ｖ）キシロースを加えた５ｍＬのＹＰ培地に、グルコースイソメラーゼ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ、Ｓｗｅｅｔｚｙｍｅ  ＩＴ  Ｅｘｔｒａ、  ３５Ｕ）を添加し、初発菌体濃度０．３ｇ（乾燥重量）／ＬとなるようにＣａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ  ３１６３  ｄｇＸＫ１を植菌して、同時異性化発酵を行った。
【０１８８】
結果を図１１に示す。Ｃ．  ｇｌａｂｒａｔａ  ３１６３  ｄｇＸＫ１は、３０℃、４０℃ともに高いエタノール収率と低いキシリトール蓄積を示した。特に４０℃においては、発酵７２時間で理論収率の９２％に相当する非常に高い収率でエタノールを生産した。また、グルコースイソメラーゼによって、グルコースはフルクトースに変換されるが、本株はグルコースだけでなくフルクトースも問題無くエタノール発酵することを確認した。７２時間培養時のエタノール発酵の結果を以下の表に示す。表中のエタノール収率は、添加基質量に対する収率であり、初発菌体濃度０．３ｇ（乾燥重量）／Ｌを用いて表示された基質を７２時間発酵したときのエタノール収率を理論収率に対する百分率で示す。
【０１８９】
【表８】
2014014360.tif 000009
【０１９０】
以上の実験から、本発明では、グルコース・キシロース混合培地の同時異性化発酵も効率よく行うことができることが示された。
【０１９１】
（実施例１２：並行複発酵と同時異性化発酵との組み合わせによる稲わらからのエタ
ノール生産）
本実施例では、作製したＣａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ  ３１６３  ｄｇＸＫ１の有するバイオマス原料からのエタノール発酵能を示すために、稲わらを用いて３０℃および４０℃において同時異性化発酵を組み合わせた並行複発酵によるエタノール生産を行った。以下に実験方法を示す。
【０１９２】
（稲わらの前処理方法）
徳安らの方法（特許文献５）に従い行った。乾燥稲わら（２０１０年度茨城県産コシヒカリ）をコーワカッター（新興和産業、モデルＳＵ−１６）で約１３ｍｍに切断後、ハンマーミル刃を装填したマルチミル（グローエンジニアリング、モデルＲＤ−１５）で約０．５ｍｍに粉砕した。その後、グラインダー（ウエスト、モデルＭＰＷ−Ｇ００８）をクリアランス０．５ｍｍに設定して更に粉砕した。この粉砕稲わら（５００ｍｇ）と水酸化カルシウム（１００ｍｇ）を容量１０ｍＬのガラスバイアル（日電理化硝子、ＳＶＧ−１０）に入れよく混合した後、３．３３ｍＬの蒸留水を加え、ガラスバイアルをゴム栓（日電理化硝子、液状用ブチルゴム（大））および穴あきキャップ（日電理化硝子）にて密封し、１２０℃で１時間加熱処理を行った。室温まで冷却した後、注射針（テルモ、２０Ｇ×７０）を使用してバイアル内の空気を二酸化炭素ガスに置換し、さらに、二酸化炭素ガスを１．５気圧に加圧しながら約５ｍＬ注入した。一晩、室温に放置し、稲わら前処理物を完成させた。
【０１９３】
（同時異性化発酵を組み合わせた並行複発酵方法）
稲わら前処理物の入ったバイアルを一旦開封し、グルコースイソメラーゼ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ、Ｓｗｅｅｔｚｙｍｅ  ＩＴ  Ｅｘｔｒａ、３５Ｕ）を添加した後、バイアルを再び密封し、二酸化炭素ガスを１．５気圧に加圧しながら約５ｍＬ注入した。セルラーゼ製剤（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ、Ｃｅｌｌｃｌａｓｔ  １．５Ｌ、１．１ｍｇ）、β−グルコシダーゼ製剤（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ、Ｎｏｖｏｚｙｍｅ  １８８、０．２８ｍｇ）およびヘミセルラーゼ製剤（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ、Ｕｌｔｒａｆｌｏ  Ｌ、０．４５ｍｇ）を注射針（テルモ、２０Ｇ×７０）で添加した。ＹＰＤ培地で一晩好気的に培養したＣ．  ｇｌａｂｒａｔａ  ３１６３  ｄｇＸＫ１を遠心分離で集菌し、滅菌水で洗浄した後、初発菌体濃度が１．５ｇ（乾燥重量）／Ｌとなるよう、稲わら前処理物および酵素の入ったバイアルに注射針（テルモ、２０Ｇ×７０）で添加した。酵母を加えたバイアルを３０℃および４０℃に設定した恒温器内に設置した転倒回転型撹拌器（ＡＴＲ、Ｒｏｔａｍｉｘ）に取り付け、５０ＲＰＭで回転させながら発酵を行った。注射針（テルモ、２０Ｇ×７０）を用いて経時的にサンプリングを行い、採取した発酵液から遠心分離によって酵母菌体および稲わら残渣を除き、続いて限外ろ過（ポール、ナノセップ遠心ろ過デバイス、１０Ｋ）により上清から糖化酵素を除去した後、ＨＰＬＣによって発酵液に含まれるエタノール及び糖類の定量分析を行った。ＨＰＬＣによる解析は、実施例４に記載の方法により行った。
【０１９４】
データを、以下の表および図１２に示す。表中の数値は１２０時間発酵時の結果を示す。
【０１９５】
【表９】
2014014360.tif 000010
【０１９６】
以上のように、稲わら前処理物も４０℃で並行複発酵可能であり、理論収率（稲わら中に含まれる全ての糖がエタノールに変換された場合）の７５％でエタノール発酵されたことを確認した。４０℃で並行複発酵と同時異性化発酵を組み合わせて行った例はこれまでになく、まさに、本発明において初めて達成された例であるといえる。
【０１９７】
（実施例１３：基質キシロース濃度および初発菌体濃度の変動の影響）
本実施例では、基質キシロース濃度および初発菌体濃度を変更したときの影響を確認する実験を行った。実験手順は以下のとおりである。
【０１９８】
２％（ｗ／ｖ）もしくは６％（ｗ／ｖ）キシロースを含有する５ｍＬのＹＰ培地を発酵用培地とした。ＹＰＤ培地で一晩、好気的に種培養した酵母（Ｃ．  ｇｌａｂｒａｔａ  ３１６３  ｄｇＸＫ１およびＳ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＩｎｖＳｃ１）を遠心分離により集菌した後、菌体を滅菌水で洗浄し、発酵試験に用いる酵母菌体とした。
【０１９９】
上記発酵用培地５ｍＬを１０ｍＬ容量のガラスバイアル（日電理化硝子、ＳＶＧ−１０）に入れ、そこに０．３ｇ（乾燥重量）／Ｌ、２ｇ（乾燥重量）／Ｌもしくは６ｇ（乾燥重量）／Ｌとなるよう酵母菌体を加えた。さらにグルコースイソメラーゼ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ、Ｓｗｅｅｔｚｙｍｅ  ＩＴ  Ｅｘｔｒａ）を２％（ｗ／ｖ）キシロースを含む培地には３５Ｕ、６％（ｗ／ｖ）キシロースを含む培地には１０５Ｕ加えた後、バイアルを液状用ブチルゴム（大）と穴あきキャップ（日電理化硝子）にて密封し、４０℃で同時異性化発酵を行った。発酵液に含まれるエタノールおよび糖類を高速液体クロマトグラフィーにより測定し、エタノール収率およびキシリトール蓄積量を求めた。同時異性化発酵およびＨＰＬＣによる解析は、実施例４と同様に行った。
【０２００】
以下の表に７２時間発酵における結果を示す。
【０２０１】
【表１０】
2014014360.tif 000011
【０２０２】
Ｃ．  ｇｌａｂｒａｔａ  ３１６３  ｄｇＸＫ１の４０℃でのキシロース同時異性化発酵において、初発菌体濃度を増やすことにより、エタノール収率の向上が確認された。一方、キシリトールの蓄積量の増加はほとんど無かった。６％（ｗ／ｖ）という高濃度のキシロースに対しても、初発菌体濃度を２ｇ（乾燥重量）／Ｌに増やすことにより、７０％以上のエタノール収率を確保していた。一方、Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＩｎｖＳｃ１においても、初発菌体濃度を増やすことによりエタノール収率の向上が見られたが、キシロース濃度にかかわらず、初発菌体濃度６ｇ（乾燥重量）／Ｌを用いても本発明により製造したＣ．  ｇｌａｂｒａｔａ  ３１６３  ｄｇＸＫ１の初発菌体濃度６ｇ（乾燥重量）／Ｌの場合はもとより、０．３ｇ（乾燥重量）／Ｌの場合のエタノール収率も上回ることはできなかった。このことは、Ｃ．  ｇｌａｂｒａｔａ  ３１６３  ｄｇＸＫ１の４０℃でのキシロース同時異性化発酵において顕著に優れた性能を有していることを示している。
【０２０３】
初発菌体濃度を増やせばエタノール収率は向上するが、より多くの酵母菌体を調製するために種培養の量も増やさなければならない。初発菌体濃度０．３ｇ（乾燥重量）／Ｌは、発酵液の１／１０量程度の種培養で済むため、現実的な条件である。また、並行複発酵では、発酵終了後の発酵液の中にバイオマスの残渣が存在するため、発酵液から酵母をバイオマス残渣と分けて回収し、再利用することは困難である。したがって出来るだけ少ない酵母量で発酵を行えることが並行複発酵を経済的に行うための重要な特徴のひとつであるところ、本発明では、比較的少ない種培養でも効率よく並行複発酵行うことができた点も留意すべきであることが理解される。
【０２０４】
（実施例１４  ４０℃においてキシルロース発酵能の高いＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを用いたキシロースの同時異性化発酵）
実施例１に記載の方法で、農業・食品産業技術総合研究機構  食品総合研究所が保有する酵母株の中から４０℃においてキシルロース発酵能が高いＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株としてＳｔ１０−１−１＜受託番号  ＮＩＴＥ  Ｐ−０１６２０＞を単離した。Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｓｔ１０−１−１の同時異性化発酵能について、２％（ｗ／ｖ）キシロースを含むＹＰ培地にグルコースイソメラーゼ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ、Ｓｗｅｅｔｚｙｍｅ  ＩＴ  Ｅｘｔｒａ，３５Ｕ）を加えた培地を用いて解析した。以下に手順を示す。
【０２０５】
（同時異性化発酵の手順）
Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｓｔ１０−１−１を、３０℃でＹＰＤ培地を用いて好気的に一晩種培養した後、ＯＤ６００を測定し、種培養液の菌体濃度を求めた。菌体濃度は、ＯＤ６００＝１の場合、０．４ｇ（乾燥重量）／Ｌに相当するものとして計算した。種培養液を遠心分離により集菌し、菌体を滅菌水で洗浄した後、容量１０ｍＬのガラスバイアル（日電理化硝子、ＳＶＧ−１０）に入った２％（ｗ／ｖ）キシロースを含有する５ｍＬのＹＰ培地に、初発菌体濃度が０．３ｇ（乾燥重量）／Ｌとなるように添加した。さらに３５Ｕのグルコースイソメラーゼ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ、Ｓｗｅｅｔｚｙｍｅ  ＩＴ  Ｅｘｔｒａ）を加えた後、バイアルをゴム栓（日電理化硝子、液状用ブチルゴム（大））および穴あきキャップ（日電理化硝子）にて密封した。恒温回転式浸とう培養器（タイテック、モデルＢＲ−２２ＦＰ・ＭＲ）を用いて、３０℃および４０℃で、２００ｒｐｍで振とう培養を行った。注射針（テルモ、２０Ｇ×７０）を用いてサンプリングを行い、採取した発酵液から遠心分離によって酵母菌体を除いた後、ＨＰＬＣによって、発酵液に含まれるエタノール及び糖類の定量分析を行った。ＨＰＬＣには、前述の島津製作所製装置に、配位子交換クロマトグラフィー用カラム（バイオラッド、Ａｍｉｎｅｘ  ＨＰＸ−８７Ｈ）を接続して使用した。移動相に水を用いて、流速０．６ｍｌ／分、カラム温度５０℃で分析を行った。また、カラムの保護のためにガードカラム（Ｓｈｏｄｅｘ  ＳＨ−Ｇ）をＨＰＸ−８７Ｈカラムの前に連結した。得られたクロマトグラムについてＬＣ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ解析ソフトウエアを使用して発酵液中のエタノールおよび糖類の定性および定量分析を行った。
【０２０６】
以下の表に７２時間発酵時の結果を示す。表中のエタノール収率は、添加基質量に対する収率であり、２％（ｗ／ｖ）キシロースを基質として初発菌体濃度０．３ｇ（乾燥重量）／Ｌを用いて７２時間発酵したときのエタノール収率を理論収率に対する百分率で示す。なお、１ｇのキシロースから０．５１ｇのエタノールの生成を理論収率とした。
【０２０７】
【表１１】
2014014360.tif 000012
【０２０８】
その結果、Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｓｔ１０−１−１は、４０℃において発酵能が低下することなく、むしろ３０℃よりも高いエタノール収率を示した。
【０２０９】
（実施例１５  キシルロキナーゼを高発現させた４０℃においてキシルロース発酵能の高いＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを用いたキシロースの同時異性化発酵）
本実施例では、Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのキシルロキナーゼ遺伝子を遺伝子組換えにより上記Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｓｔ１０−１−１株に導入し、キシルロキナーゼの高発現により同時異性化発酵の収率を向上させた。以下にそのプロトコールを示す。
【０２１０】
（キシルロキナーゼを高発現株の作製）
実施例３で作成したｐＡＵＲ−ＸＫ（配列番号３９）を制限酵素ＢｓｉＷＩで直鎖状にした後、Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｓｔ１０−１−１をＥｌｂｌｅによる酢酸リチウム法により形質転換した。ＹＰＤ−ＡｂＡ寒天培地上で生育してきたコロニーを単離し、得られた形質転換株をＳ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｓｔ１０−ＳｃＸＫ＜受託番号  ＮＩＴＥ  Ｐ−０１６１８＞と命名した。
【０２１１】
（同時異性化発酵の手順）
２％（ｗ／ｖ）キシロースを含む５ｍＬのＹＰ培地にグルコースイソメラーゼ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ、Ｓｗｅｅｔｚｙｍｅ  ＩＴ  Ｅｘｔｒａ、３５Ｕ）を加え、Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｓｔ１０−ＳｃＸＫ（受託番号  ＮＩＴＥ  Ｐ−０１６１８）を初発菌体濃度が０．３ｇ（乾燥重量）／Ｌとなるよう添加し、７２時間同時異性化発酵を行った。発酵液に含まれるエタノールおよび糖類をＨＰＬＣにより測定し、キシロース消費量、エタノール収率およびキシリトール蓄積量を求めた。同時異性化発酵およびＨＰＬＣによる解析は、実施例１４と同様に行った。結果を以下の表に示す。表中のエタノール収率は、添加基質量に対する収率であり、２％（ｗ／ｖ）キシロースを基質として初発菌体濃度０．３ｇ（乾燥重量）／Ｌを用いて、７２時間発酵したときのエタノール収率を理論収率（０．５１ｇ／ｇ）に対する百分率で示す。
【０２１２】
【表１２】
2014014360.tif 000013
【０２１３】
その結果、Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｓｔ１０−ＳｃＸＫは、３０℃、４０℃ともに高いキシロース消費量およびエタノール収率を示した。親株であるＳｔ１０−１−１株に比べ、発酵温度３０℃において２．４倍、４０℃において１．９倍、エタノール収率が向上し、４０℃でも理論収率の７５％を超える高いエタノール収率を示した。
【０２１４】
Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅでもキシルロキナーゼの高発現によって同時異性化発酵におけるキシロース消費量の増加およびエタノール収率の向上効果が得られることは、すでに実施例７で示しているが、この時の４０℃におけるエタノール収率は４０％程度に留まった。すなわち、本実施例で達成されたような４０℃において７５％を超える高いエタノール収率を得るには、単にキシルロキナーゼを高発現させれば良い訳ではなく、４０℃で高いキシルロース発酵能（キシルロースをエタノールに変換する能力）を有する酵母株を宿主として使用することが必要であることがここでも確認された。一般にＳ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの発酵に適した温度は３０℃〜３５℃とされており、Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにキシルロキナーゼを高発現させることにより４０℃において顕著に高いキシロース同時異性化発酵能が得られることは予測できなかったものである。
【０２１５】
（実施例１６  相同組換えによるＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ染色体上のアルドースレダクターゼ遺伝子の破壊）
相同組換えに基づく外来遺伝子の染色体への挿入によって、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの内在性アルドースレダクターゼ遺伝子（ＧＲＥ３）の破壊を行った。Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｓｔ１０−１−１は二倍体であるため、図１３に示したように、２種類の抗生物質耐性遺伝子を利用して、２本の相同染色体上のＧＲＥ３遺伝子を両方とも破壊した。以下に行った手順の概要を示す。
【０２１６】
（１本の染色体上のアルドースレダクターゼ遺伝子が欠損したＳ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株の作製方法）
ＧｅｎＢａｎｋ  ＤＮＡデータベースに登録されていたＳ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｓ２８８ｃの染色体ＤＮＡ塩基配列（アクセス番号：ＢＫ００６９３４）の中から、アルドースレダクターゼ遺伝子（ＧＲＥ３）およびその近傍の配列情報を得た。ＧＲＥ３遺伝子５’―上流領域の４０塩基に対する相同配列とｐＰＩＣＺ  Ｂプラスミド（インビトロジェン）上のＴＥＦ１プロモーターの２０塩基に対する相同配列とを連結したＧＲＥ３ＺＥＯＲ−１Ｓプライマー、およびＧＲＥ３遺伝子３’―下流領域の４０塩基に対する相同配列とｐＰＩＣＺ  Ｂプラスミド上のＣＹＣ１ターミネーターの２０塩基に対する相同配列とを連結したＧＲＥ３ＺＥＯＲ−１Ａプライマーを合成した。これらのプライマーを用いてｐＰＩＣＺ  Ｂプラスミドを鋳型にＰＣＲ増幅することにより、ゼオシン耐性遺伝子（ＺＥＯ）発現カセット（ＴＥＦ１プロモーター―ＺＥＯ―ＣＹＣ１ターミネーターの融合遺伝子）の両端に、ＧＲＥ３遺伝子の５’―および３’―近傍領域の相同配列が４０塩基ずつ付加されたＤＮＡ断片を得た。使用したプライマーの配列を以下に示す。下線部分がＧＲＥ３遺伝子の近傍領域に対する相同配列である。
【０２１７】
ＧＲＥ３ＺＥＯＲ−１Ｓ：５’−ＡＴＡＧＴＴＧＴＣＡＧＴＧＣＡＡＴＣＣＴＴＣＡＡＧＡＣＧＡＴＴＧＧＧＡＡＡＡＴＡＡＧＴＧＡＧＡＣＣＴＴＣＧＴＴＴＧＴＧＣ−３’（配列番号３２）
ＧＲＥ３ＺＥＯＲ−１Ａ：５’−ＡＴＧＴＡＡＡＡＡＴＴＴＡＴＡＣＡＣＡＴＡＴＡＣＡＧＣＡＴＣＧＧＡＡＴＧＡＧＧＧＡＴＴＡＡＡＧＣＣＴＴＣＧＡＧＣＧＴＣＣ−３’（配列番号３３）
ＰＣＲはＰｆｕＵｌｔｒａ  ＩＩ  ｆｕｓｉｏｎ  ＨＳ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを使用して、９５℃２分＋［９５℃２０秒、５５℃２０秒、７２℃３０秒］×１０サイクル＋［９５℃２０秒、６５℃２０秒、７２℃３０秒］×２０サイクル＋７２℃３分の条件で行った。
【０２１８】
ＰＣＲにより得られたＤＮＡ断片を用いてＳ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｓｔ１０−１−１株をＥｌｂｌｅによる酢酸リチウム法により形質転換し、５０  ｍｇ／Ｌ  ゼオシン（インビトロジェン）を含むＹＰＤ寒天培地上で生育したコロニーを単離し、Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｓｔ１０  ＧＲＥ３：：ＺＥＯを取得した。
【０２１９】
（２本の染色体上のアルドースレダクターゼ遺伝子が欠損したＳ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株の作製方法）
次に、ＧＲＥ３遺伝子５’―上流領域の４０塩基に対する相同配列とｐ４２７―ＴＥＦプラスミド（デュアルシステムズ・バイオテック）上のＴＥＦ１プロモーターの２０塩基に対する相同配列とを連結したＧＲＥ３ＫＡＮＲ−１Ｓプライマーおよび、ＧＲＥ３遺伝子３’―下流領域の４０塩基に対する相同配列とｐ４２７―ＴＥＦプラスミド上のＴＥＦ１ターミネーターの２０塩基に対する相同配列とを連結したＧＲＥ３ＫＡＮＲ−１Ａプライマーを合成した。これらのプライマーを用いてｐ４２７―ＴＥＦプラスミドを鋳型にＰＣＲ増幅することにより、Ｇ４１８耐性遺伝子（ＫＡＮ）発現カセット（ＴＥＦ１プロモーター―ＫＡＮ―ＴＥＦ１ターミネーターの融合遺伝子）の両端に、ＧＲＥ３遺伝子の５’―および３’―近傍領域の相同配列が４０塩基ずつ付加されたＤＮＡ断片を得た。使用したプライマーの配列を以下に示す。下線部分がＧＲＥ３遺伝子の近傍領域に対する相同配列である。なお、ＫＡＮ遺伝子がすでにＺＥＯ遺伝子が挿入されている側の染色体と相同組換えを起こさないようにするため、ＫＡＮ発現カセットの両端には、ＺＥＯ発現カセットの両端に付加したものよりも内側のＧＲＥ３近傍領域に対する相同配列を付加した。
【０２２０】
ＧＲＥ３ＫＡＮＲ−１Ｓ：５’−ＧＴＡＡＴＡＴＡＡＡＴＣＧＴＡＡＡＧＧＡＡＡＡＴＴＧＧＡＡＡＴＴＴＴＴＴＡＡＡＧＣＣＣＡＧＡＡＴＡＣＣＣＴＣＣＴＴＧＡＣ−３’
（配列番号３４）
ＧＲＥ３ＫＡＮＲ−１Ａ：５’−ＴＴＧＴＴＣＡＴＡＴＣＧＴＣＧＴＴＧＡＧＴＡＴＧＧＡＴＴＴＴＡＣＴＧＧＣＴＧＧＡＧＧＡＴＧＧＣＧＧＣＧＴＴＡＧＴＡＴＣＧ−３’（配列番号３５）
ＰＣＲはＰｆｕＵｌｔｒａ  ＩＩ  ｆｕｓｉｏｎ  ＨＳ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを使用して、９５℃２分＋［９５℃２０秒、５５℃２０秒、７２℃３０秒］×１０サイクル＋［９５℃２０秒、６５℃２０秒、７２℃３０秒］×２０サイクル＋７２℃３分の条件で行った。
【０２２１】
ＰＣＲにより得られたＤＮＡ断片を用いてＳ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｓｔ１０  ＧＲＥ３：：ＺＥＯ株をＥｌｂｌｅによる酢酸リチウム法により形質転換し、２００  ｍｇ／Ｌ  Ｇ４１８（カルバイオケム）を含むＹＰＤ寒天培地上で生育したコロニーを単離し、Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｓｔ１０  Δｇｒｅ３−２＜受託番号    ＮＩＴＥ  Ｐ−０１６１９＞と命名した。さらに、Ｓｔ１０  Δｇｒｅ３−２が、５０  ｍｇ／Ｌ  ゼオシンおよび２００  ｍｇ／Ｌ  Ｇ４１８を含むＹＰＤ寒天培地上でも生育し、両抗生物質に耐性を有していることも確認した。
【０２２２】
（実施例１７  アルドースレダクターゼ破壊株によるキシロースの同時異性化発酵）
２％（ｗ／ｖ）キシロースを含む５ｍＬのＹＰ培地にグルコースイソメラーゼ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ、Ｓｗｅｅｔｚｙｍｅ  ＩＴ  Ｅｘｔｒａ、３５Ｕ）を加え、実施例１６で作製したアルドースレダクターゼ遺伝子を破壊したＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｓｔ１０  Δｇｒｅ３−２を用いて、７２時間同時異性化発酵を行った。
【０２２３】
その結果、Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｓｔ１０  Δｇｒｅ３−２は、３０℃ではキシリトールの蓄積量に変化は無かったが、４０℃においてキシリトールの蓄積量が減少した。キシリトール／エタノール比は、親株であるＳｔ１０−１−１に比べ、４０℃において１９％減少した。結果を以下の表に示す。表中のエタノール収率は、添加基質量に対する収率であり、２％（ｗ／ｖ）キシロースを基質として初発菌体濃度０．３ｇ（乾燥重量）／Ｌを用いて７２時間発酵したときのエタノール収率を理論収率（０．５１ｇ／ｇ）に対する百分率で示す。
【０２２４】
【表１３】
2014014360.tif 000014
【０２２５】
（実施例１８  キシルロキナーゼ高発現とアルドースレダクターゼ欠損を組み合わせた遺伝子組換え体によるキシロースの同時異性化発酵）
本実施例では、キシルロキナーゼを高発現させ、アルドースレダクターゼを欠損させたＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｓｔ１０  ｄｇＸＫ１＜ＮＩＴＥ受託番号  Ｐ−０１６１７＞を用いてキシロースの同時異性化発酵を行った。Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｓｔ１０  ｄｇＸＫ１の作製は以下のとおりに行った。
【０２２６】
（作製手順）
実施例１５に記載の方法と同様にｐＡＵＲ−ＸＫ（配列番号３９）を制限酵素ＢｓｉＷＩで直鎖状にした後、Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｓｔ１０  Δｇｒｅ３−２（受託番号  ＮＩＴＥ  Ｐ−０１６１９）をＥｌｂｌｅによる酢酸リチウム法により形質転換した。ＹＰＤ−ＡｂＡ寒天培地上で生育してきたコロニーを単離し、得られた形質転換株をＳ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｓｔ１０  ｄｇＸＫ１（受託番号  ＮＩＴＥ  Ｐ−０１６１７）と命名した。
【０２２７】
（同時異性化発酵）
２％（ｗ／ｖ）キシロースを含む５ｍＬのＹＰ培地にグルコースイソメラーゼ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ、Ｓｗｅｅｔｚｙｍｅ  ＩＴ  Ｅｘｔｒａ、３５Ｕ）を加え、７２時間同時異性化発酵を行った。その結果を表１４に示す。Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｓｔ１０  ｄｇＸＫ１は、３０℃、４０℃ともに高いエタノール収率と低いキシリトール蓄積を示した。特にエタノール収率は、４０℃でも８０％以上と非常に高い値を維持していた。親株であるＳｔ１０−１−１との比較では、エタノール収率は、３０℃において２．５倍、４０℃において２．０倍に向上した。また、キシリトール／エタノール比は、３０℃において５．３分の１、４０℃において３．３分の１であった。表中のエタノール収率は、添加基質量に対する収率であり、２％（ｗ／ｖ）キシロースを基質として初発菌体濃度０．３ｇ（乾燥重量）／Ｌを用いて７２時間発酵したときのエタノール収率を理論収率（０．５１ｇ／ｇ）に対する百分率で示す。
【０２２８】
【表１４】
2014014360.tif 000015
【０２２９】
（実施例１９  遺伝子組換え体によるグルコース・キシロース混合培地の同時異性化発酵）
稲わらのグルコースおよびキシロースの含有比を模して５％（ｗ／ｖ）グルコースおよび２％（ｗ／ｖ）キシロースを加えた５ｍＬのＹＰ培地に、グルコースイソメラーゼ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ、Ｓｗｅｅｔｚｙｍｅ  ＩＴ  Ｅｘｔｒａ、  ３５Ｕ）を添加し、初発菌体濃度０．３ｇ（乾燥重量）／ＬとなるようにＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｓｔ１０−１−１あるいはＳｔ１０  ｄｇＸＫ１を植菌して、同時異性化発酵を行った。
【０２３０】
結果を図１４に示す。Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｓｔ１０  ｄｇＸＫ１（受託番号  ＮＩＴＥ  Ｐ−０１６１７）は、３０℃、４０℃ともに親株であるＳｔ１０−１−１よりも高いエタノール収率と低いキシリトール蓄積を示した。特に４０℃においては、発酵７２時間で理論収率の８８％に相当する非常に高い収率でエタノールを生産した。７２時間培養時のエタノール発酵の結果を以下の表に示す。表中のエタノール収率は、添加基質量に対する収率であり、初発菌体濃度０．３ｇ（乾燥重量）／Ｌを用いて表示された基質を７２時間発酵したときのエタノール収率を理論収率に対する百分率で示す。
【０２３１】
【表１５】
2014014360.tif 000016
【０２３２】
以上の実験から、本発明では、グルコース・キシロース混合培地の同時異性化発酵も効率よく行うことができることが示された。
【０２３３】
（実施例２０：並行複発酵と同時異性化発酵との組み合わせによる稲わらからのエタノール生産）
本実施例では、作製したＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｓｔ１０  ｄｇＸＫ１の有するバイオマス原料からのエタノール発酵能を示すために、稲わらを用いて３０℃および４０℃において同時異性化発酵を組み合わせた並行複発酵によるエタノール生産を行った。稲わらの前処理方法および同時異性化発酵を組み合わせた並行複発酵方法は、使用菌株を除き実施例１２に記載した通りである。また、ＨＰＬＣによる発酵液に含まれるエタノール及び糖類の定量分析は、実施例１４に記載の方法により行った。
【０２３４】
データを、以下の表および図１５に示す。表中の数値は１２０時間発酵時の結果を示す。
【０２３５】
【表１６】
2014014360.tif 000017
【０２３６】
以上のように、稲わら前処理物も４０℃で並行複発酵可能であり、理論収率（稲わら中に含まれる全ての糖がエタノールに変換された場合）の７１％でエタノール発酵されたことを確認した。
【０２３７】
（実施例２１：基質キシロース濃度および初発菌体濃度の変動の影響）
本実施例では、基質キシロース濃度および初発菌体濃度を変更したときの影響を確認する実験を行った。実験手順は以下のとおりである。
【０２３８】
２％（ｗ／ｖ）もしくは６％（ｗ／ｖ）キシロースを含有する５ｍＬのＹＰ培地を発酵用培地とした。ＹＰＤ培地で一晩、好気的に種培養した酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｓｔ１０  ｄｇＸＫ１（受託番号  ＮＩＴＥ  Ｐ−０１６１７））を遠心分離により集菌した後、菌体を滅菌水で洗浄し、発酵試験に用いる酵母菌体とした。
【０２３９】
上記発酵用培地５ｍＬを１０ｍＬ容量のガラスバイアル（日電理化硝子、ＳＶＧ−１０）に入れ、そこに０．３ｇ（乾燥重量）／Ｌ、２ｇ（乾燥重量）／Ｌもしくは６ｇ（乾燥重量）／Ｌとなるよう酵母菌体を加えた。さらにグルコースイソメラーゼ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ、Ｓｗｅｅｔｚｙｍｅ  ＩＴ  Ｅｘｔｒａ）を２％（ｗ／ｖ）キシロースを含む培地には３５Ｕ、６％（ｗ／ｖ）キシロースを含む培地には１０５Ｕ加えた後、バイアルを液状用ブチルゴム（大）と穴あきキャップ（日電理化硝子）にて密封し、４０℃で同時異性化発酵を行った。発酵液に含まれるエタノールおよび糖類を高速液体クロマトグラフィーにより測定し、エタノール収率およびキシリトール蓄積量を求めた。同時異性化発酵およびＨＰＬＣによる解析は、実施例１４と同様に行った。
【０２４０】
以下の表に７２時間発酵における結果を示す。
【０２４１】
【表１７】
2014014360.tif 000018
【０２４２】
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
【産業上の利用可能性】
【０２４３】
本発明はリグノセルロースを原料とした燃料用エタノールの生産に利用できるものである。グルコースイソメラーゼは中性域で活性が高いため、発酵液が中性であることが望ましく、例えば、特許文献５に記載のアルカリで前処理した稲わら等のバイオマスからのエタノール製造に利用することが可能である。
【配列表フリーテキスト】
【０２４４】
配列番号１：ＮＬ−１プライマーの核酸配列
配列番号２：ＮＬ−４プライマーの核酸配列
配列番号３：ＰＧＫｐ−ＳｍａＩプライマーの核酸配列
配列番号４：ＰＧＫｐ−ＸｂａＩ−ａｓプライマーの核酸配列
配列番号５：ＸＲ−ＸｂａＩプライマーの核酸配列
配列番号６：ＸＲ−ＫｐｎＩプライマーの核酸配列
配列番号７：ＸＤＨ−ＸｂａＩプライマーの核酸配列
配列番号８：ＸＤＨ−ＸｈｏＩプライマーの核酸配列
配列番号９：ＸＫ−ＸｂａＩプライマーの核酸配列
配列番号１０：ＸＫ−ＸｈｏＩプライマーの核酸配列
配列番号１１：ＰＧＫｐ−ＳｐｈＩプライマーの核酸配列
配列番号１２：ＣＹＣｔ−ＳｂｆＩプライマーの核酸配列
配列番号１３：ＰＧＫｐ−ＳｂｆＩプライマーの核酸配列
配列番号１４：ＣＹＣｔ−ＳａｌＩプライマーの核酸配列
配列番号１５：ＣＹＣｔ−ＳａｃＩプライマーの核酸配列
配列番号１６：ＰＧＫｐ−１Ｓプライマーの核酸配列
配列番号１７：ＰＧＫｐ−１Ａプライマーの核酸配列
配列番号１８：ＣｇＸＫ−１Ｓプライマーの核酸配列
配列番号１９：ＣｇＸＫ−２Ａプライマーの核酸配列
配列番号２０：ＳｃＸＫ−１Ｓプライマーの核酸配列
配列番号２１：ＳｃＸＫ−１Ａプライマーの核酸配列
配列番号２２：ＣｇＧＲＥ３−１Ｓプライマーの核酸配列
配列番号２３：ＣｇＧＲＥ３−１Ａプライマーの核酸配列
配列番号２４：ＳｃＵＲＡ３−１Ｓプライマーの核酸配列
配列番号２５：ＳｃＵＲＡ３−１Ａプライマーの核酸配列
配列番号２６：ＣｇＧＲＥ３−２Ｓプライマーの核酸配列
配列番号２７：ＣｇＧＲＥ３−２Ａプライマーの核酸配列
配列番号２８：ＣｇＸＫの核酸配列
配列番号２９：ＣｇＸＫのアミノ酸配列
配列番号３０：ｐＲＳ４０６ベクターの核酸配列
配列番号３１：ｐＲＳ４０６−ＣｇＸＫベクターの核酸配列
配列番号３２  ＧＲＥ３ＺＥＯＲ−１Ｓの核酸配列
配列番号３３  ＧＲＥ３ＺＥＯＲ−１Ａの核酸配列
配列番号３４  ＧＲＥ３ＫＡＮＲ−１Ｓの核酸配列
配列番号３５  ＧＲＥ３ＫＡＮＲ−１Ａの核酸配列
配列番号３６：ＳｃＸＫの核酸配列
配列番号３７：ＳｃＸＫのアミノ酸配列
配列番号３８：ｐＡＵＲ１０１ベクターの核酸配列
配列番号３９：ｐＡＵＲ−ＸＫベクターの核酸配列
【受託番号】
【０２４５】
ＮＩＴＥ  Ｐ−１３５７
ＮＩＴＥ  Ｐ−１３５８
ＮＩＴＥ  Ｐ−１３５９
ＮＩＴＥ  Ｐ−１３６０
ＮＩＴＥ  Ｐ−０１６１７
ＮＩＴＥ  Ｐ−０１６１８
ＮＩＴＥ  Ｐ−０１６１９
ＮＩＴＥ  Ｐ−０１６２０
【図１３】
2014014360.tif 000019
【図１４】
2014014360.tif 000020
【図１５】
2014014360.tif 000021
【図１】
2014014360.tif 000022
【図２】
2014014360.tif 000023
【図３−１】
2014014360.tif 000024
【図３−２】
2014014360.tif 000025
【図３−３】
2014014360.tif 000026
【図４】
2014014360.tif 000027
【図５】
2014014360.tif 000028
【図６】
2014014360.tif 000029
【図７】
2014014360.tif 000030
【図８】
2014014360.tif 000031
【図９】
2014014360.tif 000032
【図１０】
2014014360.tif 000033
【図１１】
2014014360.tif 000034
【図１２】
2014014360.tif 000035
【配列表】
2014014360000001.app