(57)【要約】      （修正有）【課題】チューリップ球根由来のチューリッポシドＡ変換酵素の遺伝子断片を取得することで、チューリッポシド類をチューリッパリン類に変換する酵素活性を有するタンパク質及びそれをコードするポリヌクレオチドを提供する。【解決手段】下記（Ａ）又は（Ｂ）からなるタンパク質。（Ａ）ＴｇＴＣＥＡ−ｂ１、ＴｇＴＣＥＡ−ｂ２及びＴｇＴＣＥＡ−ｂ３のいずれかに示すアミノ酸配列を有する、タンパク質。（Ｂ）ＴｇＴＣＥＡ−ｂ１、ＴｇＴＣＥＡ−ｂ２及びＴｇＴＣＥＡ−ｂ３のいずれかに示すアミノ酸配列において、１〜２０個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加を含むアミノ酸配列を有し、チューリッポシド類をチューリッパリン類に変換する酵素活性を有する、タンパク質。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質。
（Ａ）配列番号９（ＴｇＴＣＥＡ−ｂ１）、配列番号１２（ＴｇＴＣＥＡ−ｂ２）及び配列番号１５（ＴｇＴＣＥＡ−ｂ３）のいずれかに示すアミノ酸配列を有する、タンパク質。
（Ｂ）配列番号９（ＴｇＴＣＥＡ−ｂ１）、配列番号１２（ＴｇＴＣＥＡ−ｂ２）及び配列番号１５（ＴｇＴＣＥＡ−ｂ３）のいずれかに示すアミノ酸配列において、１〜２０個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加を含むアミノ酸配列を有し、チューリッポシド類をチューリッパリン類に変換する酵素活性を有する、タンパク質。
【請求項２】
下記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号９（ＴｇＴＣＥＡ−ｂ１）、配列番号１２（ＴｇＴＣＥＡ−ｂ２）及び配列番号１５（ＴｇＴＣＥＡ−ｂ３）のいずれかに示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（ｂ）配列番号９（ＴｇＴＣＥＡ−ｂ１）、配列番号１２（ＴｇＴＣＥＡ−ｂ２）及び配列番号１５（ＴｇＴＣＥＡ−ｂ３）のいずれかに示すアミノ酸配列において、１〜２０個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加を含むアミノ酸配列を有し、チューリッポシド類をチューリッパリン類に変換する酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（ｃ）配列番号７、配列番号１０及び配列番号１３のいずれかに示す塩基配列を含むポリヌクレオチド。
（ｄ）配列番号７、配列番号１０及び配列番号１３のいずれかに示す塩基配列と９０％以上の相同性を有するポリヌクレオチドであって配列番号９、配列番号１２及び配列番号１５のいずれかに示すタンパク質と同一の機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物体内に有するチューリッポシド類からチューリッパリン類を得るのに有効な酵素及びそれをコードするポリヌクレオチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
チューリッパリン類はα−メチレン−γ−ブチロラクトン類に相当し、耐熱性を有する透明樹脂の単量体、生理活性物質の合成中間体、さらには害虫忌避剤や抗変異原性剤としての利用が多数報告されている利用価値が高い化合物である。
これまで本化合物類の製造方法としては、多大なエネルギーを消費する化学合成法に頼っており、石油非依存かつ省エネルギーな製造方法が求められていた。
本発明者らはチューリップ組織に含まれるチューリッポシド変換酵素をチューリップ組織抽出物に作用させることで、温和な条件下での簡便なチューリッパリンの調製法を確立している（特許文献１）。
また、本発明者らは酵素源として原料入手の不安定なチューリップ組織に頼ることなく、提供可能な組換え酵素の入手を目的に、チューリップ花弁からチューリッポシド変換酵素をコードする遺伝子を単離し、同組換え酵素の発現系を確立した（特許文献２）。
チューリップの花弁，球根，葯等の各種組織から酵素の精製を試みたところ、チューリッポシド変換酵素には、チューリッポシドＡとチューリッポシドＢのそれぞれの基質に適したチューリッポシドＡ変換酵素とチューリッポシドＢ変換酵素の少なくとも二種類の酵素が存在していることが確認された。
更に、球根から精製されたチューリッポシドＡ変換酵素と花弁から精製されたチューリッポシドＡ変換酵素とでは、分子質量や比活性が異なっていたことからチューリッポシドＡ変換酵素には、さらに複数のアイソザイムが存在することが示唆された。
本発明者らが詳細に検討した結果、花弁から単離されたチューリッポシドＡ変換酵素は、球根において発現が認められず、球根においては他組織とは異なるチューリッポシドＡ変換酵素アイソザイムが優先的に発現していることが想定され、本発明に至った。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２０１０−２０７２１１号公報
【特許文献２】特願２０１０−２７７４０６号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、チューリップ球根由来のチューリッポシドＡ変換酵素の遺伝子断片を取得することで、チューリッポシド類をチューリッパリン類に変換する酵素活性を有するタンパク質及びそれをコードするポリヌクレオチドの提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明に係るタンパク質は下記（Ａ）又は（Ｂ）からなる。
（Ａ）配列番号９（ＴｇＴＣＥＡ−ｂ１）、配列番号１２（ＴｇＴＣＥＡ−ｂ２）及び配列番号１５（ＴｇＴＣＥＡ−ｂ３）のいずれかに示すアミノ酸配列を有する、タンパク質。
（Ｂ）配列番号９（ＴｇＴＣＥＡ−ｂ１）、配列番号１２（ＴｇＴＣＥＡ−ｂ２）及び配列番号１５（ＴｇＴＣＥＡ−ｂ３）のいずれかに示すアミノ酸配列において、１〜２０個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加を含むアミノ酸配列を有し、チューリッポシド類をチューリッパリン類に変換する酵素活性を有する、タンパク質。
【０００６】
本発明に係るポリヌクレオチドは、下記の（ａ）〜（ｄ）のいずれかである。
（ａ）配列番号９（ＴｇＴＣＥＡ−ｂ１）、配列番号１２（ＴｇＴＣＥＡ−ｂ２）及び配列番号１５（ＴｇＴＣＥＡ−ｂ３）のいずれかに示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（ｂ）配列番号９ＴｇＴＣＥＡ−ｂ１）、配列番号１２（ＴｇＴＣＥＡ−ｂ２）及び配列番号１５（ＴｇＴＣＥＡ−ｂ３）のいずれかに示すアミノ酸配列において、１〜２０個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加を含むアミノ酸配列を有し、チューリッポシド類をチューリッパリン類に変換する酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（ｃ）配列番号７、配列番号１０及び配列番号１３のいずれかに示す塩基配列を含むポリヌクレオチド。
（ｄ）配列番号７、配列番号１０及び配列番号１３のいずれかに示す塩基配列と９０％以上の相同性を有するポリヌクレオチドであって配列番号９、配列番号１２及び配列番号１５のいずれかに示すタンパク質と同一の機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【０００７】
本発明において、チューリッポシド類は、下記化学式（１）に示すチューリッポシドＡ（ＴｕｌｉｐｏｓｉｄｅＡ）及びその類縁体又は化学式（２）に示すチューリッポシドＢ（ＴｕｌｉｐｏｓｉｄｅＢ）及びその類縁体が含まれるが、本発明に係る酵素は、そのうちチューリッポシドＡ及びその類縁体の基質に対して酵素活性が優れる。
【化１】
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【化２】
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チューリッポシドＡ又はＢの類縁体には、例えば化学式（３）（Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ６５（２００４）７３１−７３９；Ｐｌａｎｔ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ（２００５）４６：１２５−１３１）、化学式（４）（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６３（１），１５２−１５４，１９９９）、化学式（５）（Ｎａｔｕｒａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ  ５１（３），２４４−２４８（１９９７））、化学式（６）及び（７）（Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．４０  Ｎｏ．１  ４９−５１（１９９５））等が例として挙げられる。
【化３】
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【化４】
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【化５】
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【化６】
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【化７】
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【０００８】
本発明において、チューリッパリン類とは下記化学式（８）をいい、
【化８】
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（式中、Ｒ１，Ｒ２は独立して水素、水酸基又は炭素数１〜８のアルキル基を示し、Ｒ３，Ｒ４は独立して水素又は炭素数１〜８のアルキル基を示す。）
代表例としては、下記化学式（９）に示すチューリッパリンＡ（α−メチレン−γ−ブチロラクトン）及び下記化学式（１０）で示すチューリッパリンＢ（α−メチレン−β−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトン）が挙げられる。
【化９】
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【化１０】
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【発明の効果】
【０００９】
本発明に係るタンパク質はシグナルペプチドを除いた成熟ポリペプチドのコード領域の例えばＮ末端にヒスチジンタグ等を付加した大腸菌発現ベクターを構築することで、宿主大腸菌に導入し、この組換え菌を培養することでチューリッポシド変換酵素組換え酵素として発現することができる。
特に基質チューリッポシドＡに対する酵素活性に優れる。
また、Ｎ末端側のビスチジンタグを含むベクター由来１７アミノ酸を除去するとさらに活性が高くなる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】球根から得られたＴｇＴＣＥＡ−ｂ１〜ＴｇＴＣＥＡ−ｂ７のｃＤＮＡがコードするポリペプチドのアミノ酸配列のアライメントを示す。
【図２】球根（ＴｇＴＣＥＡ−ｂ１〜ＴｇＴＣＥＡ−ｂ３）及び花弁（ＴｇＴＣＡ１、ＴｇＴＣＡ２）由来チューリッポシドＡ変換酵素遺伝子ｃＤＮＡがコードするポリペプチドのアミノ酸配列のアライメントを示す。
【図３】組換え酵素の精製各段階におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。
【図４】ヒスチジンタグ除去前後の組換え酵素のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明者らは、チューリップ球根由来のチューリッポシドＡ変換酵素をコードすると予測される遺伝子断片を取得し、同酵素遺伝子のタンパク質コード領域のうち、シグナルペプチドを除いた成熟ポリペプチドコード領域のＮ末端にヒスチジンタグを付加した大腸菌発現ベクターを構築した。
このベクターを宿主大腸菌に導入し、可溶性タンパク質として発現させることで組換え型の精製酵素を得た。
以下ステップ毎に説明する。
【００１２】
＜クローニングおよびシークエンシング＞
チューリップの球根、花弁及び葯から精製したチューリッポシドＡ変換酵素（tuliposide A-converting enzyme）のＮ末端アミノ酸配列及びエステラーゼ/リパーゼファミリーに属する他植物由来酵素の保存性の高い内部アミノ酸配列に基づいて、下記の縮重プライマー（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅプライマー）を設計した。
ＴＣＥ−Ｎ−Ｆ１：gciytigaygaygarathgt（配列番号１）
ＴＣＥ−Ｎ−Ｆ２：gaygaygaratggtiytiga（配列番号２）
Ｉｎｔｅｒｎａｌ−Ｒ１：gaaiscdccdccrtgrwagta（配列番号３）
Ｉｎｔｅｒｎａｌ−Ｒ２：ccdccdccrtgrwagtarac（配列番号４）
上記縮重プライマーを用いて、チューリップ品種「紫水晶」の球根りん片由来ｍＲＮＡに対してＲＴ−ＰＣＲを行い、当該遺伝子の部分配列を取得し、さらに５’ＲＡＣＥ法及び３’ＲＡＣＥ法によりコード領域全長を含むｃＤＮＡ断片を単離した。
次に５’及び３’非翻訳領域に設計した下記のプライマーを用いて上記ｍＲＮＡに対してＲＴ−ＰＣＲを行った。
ｂＴＣＥＡ−ｆｕｌｌ−Ｆ１：ggtgtgaaatcagtaacgag（配列番号５）
ｂＴＣＥＡ−ｆｕｌｌ−Ｒ１：tcaactagcacacaacacaaac（配列番号６）
その時の条件を下記に示す。
＜ＰＣＲ反応液（５０μｌ）組成＞
５０ｎｇ／μｌ鋳型ｃＤＮＡ  １μｌ、５０ｐｍｏｌ／μｌプライマー各０．５μｌ、２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ  ５μｌ、２５ｍＭ  ＭｇＳＯ４  ３μｌ、１０ｘｂｕｆｆｅｒ  ５μｌ、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ  Ｎｅｏ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  １μｌ、水３４μｌ
＜ＰＣＲ反応サイクル＞
９４℃、２分の加熱の後、変性（９８℃、１０秒）→アニーリング（６０℃、３０秒）→伸長（６８℃、１分）の３ステップからなる反応サイクルを３５回行った。
ＰＣＲ増幅産物をｐＵＣ１９ベクターにライゲーション後、大腸菌ＤＨ５α株に形質転換し、インサートＤＮＡの挿入が確認された１２クローンについてシークエンシングしたところ、７種類の球根由来ｃＤＮＡ配列（ＴｇＴＣＥＡ−ｂ１〜ＴｇＴＣＥＡ−ｂ７）
が得られた。
その塩基配列とアミノ酸配列を下記に示す。
（１）−１．ＴｇＴＣＥＡ−ｂ１の塩基配列を（配列番号７）に示す。
（１）−２．ＴｇＴＣＥＡ−ｂ１のコドン対応アミノ酸配列を（配列番号８）に示す。
（１）−３．ＴｇＴＣＥＡ−ｂ１のアミノ酸配列を（配列番号９）に示す。
（２）−１．ＴｇＴＣＥＡ−ｂ２の塩基配列を（配列番号１０）に示す。
（２）−２．ＴｇＴＣＥＡ−ｂ２のコドン対応アミノ酸配列を（配列番号１１）に示す。
（２）−３．ＴｇＴＣＥＡ−ｂ２のアミノ酸配列を（配列番号１２）に示す。
（３）−１．ＴｇＴＣＥＡ−ｂ３の塩基配列を（配列番号１３）に示す。
（３）−２．ＴｇＴＣＥＡ−ｂ３のコドン対応アミノ酸配列を（配列番号１４）に示す。
（３）−３．ＴｇＴＣＥＡ−ｂ３のアミノ酸配列を（配列番号１５）に示す。
（４）−１．ＴｇＴＣＥＡ−ｂ４の塩基配列を（配列番号１６）に示す。
（４）−２．ＴｇＴＣＥＡ−ｂ４のコドン対応アミノ酸配列を（配列番号１７）に示す。
（４）−３．ＴｇＴＣＥＡ−ｂ４のアミノ酸配列を（配列番号１８）に示す。
（５）−１．ＴｇＴＣＥＡ−ｂ５の塩基配列を（配列番号１９）に示す。
（５）−２．ＴｇＴＣＥＡ−ｂ５のコドン対応アミノ酸配列を（配列番号２０）に示す。
（５）−３．ＴｇＴＣＥＡ−ｂ５のアミノ酸配列を（配列番号２１）に示す。
（６）−１．ＴｇＴＣＥＡ−ｂ６の塩基配列を（配列番号２２）に示す。
（６）−２．ＴｇＴＣＥＡ−ｂ６のコドン対応アミノ酸配列を（配列番号２３）に示す。
（６）−３．ＴｇＴＣＥＡ−ｂ６のアミノ酸配列を（配列番号２４）に示す。
（７）−１．ＴｇＴＣＥＡ−ｂ７の塩基配列を（配列番号２５）に示す。
（７）−２．ＴｇＴＣＥＡ−ｂ７のコドン対応アミノ酸配列を（配列番号２６）に示す。
（７）−３．ＴｇＴＣＥＡ−ｂ７のアミノ酸配列を（配列番号２７）に示す。
一方、上記ｂＴＣＥＡ−ｆｕｌｌ−Ｆ１（配列番号５）及びｂＴＣＥＡ−ｆｕｌｌ−Ｒ１（配列番号６）プライマーを用いてゲノムＰＣＲを行った結果、ゲノムクローン４種が得られた。
その時の条件を下記に示す。
＜ＰＣＲ反応液（５０μｌ）組成＞
５０ｎｇ／μｌ鋳型ゲノムＤＮＡ  １μｌ、５０ｐｍｏｌ／μｌプライマー各０．５μｌ、２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ  ５μｌ、２５ｍＭ  ＭｇＳＯ４  ３μｌ、１０ｘｂｕｆｆｅｒ  ５μｌ、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ  Ｎｅｏ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  １μｌ、水３４μｌ
＜ＰＣＲ反応サイクル＞
９４℃、２分の加熱の後、変性（９８℃、１０秒）→アニーリング（６０℃、３０秒）→伸長（６８℃、１分）の３ステップからなる反応サイクルを３５回行った。
上記ｃＤＮＡのうちゲノムクローンに含まれるものはＴｇＴＣＥＡ−ｂ１，ＴｇＴＣＥＡ−ｂ２及びＴｇＴＣＥＡ−ｂ３の３種であった。
また、ｃＤＮＡクローンとゲノムクローンの比較からＴｇＴＣＥＡ−ｂ１〜ＴｇＴＣＥＡ−ｂ３はイントロンを含まない遺伝子であることが分かった。
図１はＴｇＴＣＥＡ−ｂ１〜ＴｇＴＣＥＡ−ｂ７のアミノ酸配列を示す。
いずれも３７４アミノ酸からなるポリペプチドであり、配列を比較すると、３番目、１２番目、７３番目、７８番目、１４８番目、２８１番目、３３７番目、３４４番目のアミノ酸のみが異なる、相同性の高いものであることが分かる。
また、１塩基のみが異なるＴｇＴＣＥＡ−ｂ２とＴｇＴＣＥＡ−ｂ４のアミノ酸配列は同一であった。
ｃＤＮＡとゲノムのいずれからも単離された３種の配列ＴｇＴＣＥＡ−ｂ１〜ＴｇＴＣＥＡ−ｂ３と、本発明者らが特許文献２に示したチューリップ花弁から単離されたＴｇＴＣＥＡ１及びＴｇＴＣＥＡ２のアミノ酸配列を図２に示す。
これらのアミノ酸配列を比較すると、球根由来の３種の配列と花弁由来の２種の配列は明らかに異なるものであることが分かる。
ＴｇＴＣＥＡ−ｂ１〜ＴｇＴＣＥＡ−ｂ３は花弁由来の配列と約７７％のアミノ酸相同性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を有していた。
【００１３】
＜組換え酵素の調製＞
ＴｇＴＣＥＡ−ｂ１〜ＴｇＴＣＥＡ−ｂ３の全長アミノ酸配列と球根、花弁及び葯からの精製酵素のＮ末端配列の比較によって推定されたシグナルペプチド領域を除いた成熟ポリぺプチドを発現するように、当該配列を大腸菌発現ベクターｐＥＴ２８ａにサブクローニングした。
組換え酵素のＮ末端側にはヒスチジンタグ（６ｘＨｉｓ）を含むようにした。
組換えベクターを大腸菌ＢＬ２１Ｃｏｄｏｎ  Ｐｌｕｓ  ＲＩＬ  （ＤＥ３）に導入し、得られた組換え菌をＬＢ培地にてＯＤ６６０＝０．６−０．８に達するまで３７℃、２００ｒｐｍで培養した後、最終濃度１ｍＭのＩＰＴＧを添加し、１８℃、２００ｒｐｍで１８時間培養することで組換え酵素を発現させた。
発現誘導後の菌体に超音波処理を施し、得られた可溶性タンパク質画分をＴＡＬＯＮ  Ｍｅｔａｌ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｒｅｓｉｎを用いたアフィニティークロマトグラフィーに供した。
溶出ｂｕｆｆｅｒ［５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ  ７．５），２００ｍＭ  ＮａＣｌ，２００ｍＭイミダゾール］によって溶出された活性画分を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラムによるゲルろ過クロマトグラフィーに供し、活性画分を合一することで精製組換え酵素を得た。
組換え酵素精製時のＳＤＳ−ＰＡＧＥを図３に示す。
また、ヒスチジンタグを除去した組換え酵素は以下のように調製した。
上記ＴＡＬＯＮ樹脂から溶出ｂｕｆｆｅｒによって溶出された画分に、タンパク質１ｍｇあたり３ユニットのトロンビンを加え４℃で一晩静置反応することで、ヒスチジンタグを含むベクター由来の１７アミノ酸からなるポリペプチドを切断した。
このものをＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラムによるゲルろ過クロマトグラフィーに供し、活性画分を合一することで、ヒスチジンタグを含まない精製組換え酵素を得た。
ヒスチジンタグ除去前後の組換え酵素のＳＤＳ−ＰＡＧＥを図４に示す。
精製組換え酵素のＧ３０００ＳＷｘｌカラムによるゲルろ過クロマトグラフィー分析の結果、組換え酵素は植物体由来のｎａｔｉｖｅ酵素と同様に２量体酵素として発現していることが分かった。
【００１４】
上記にて精製した組換え酵素の酵素活性試験を次のように行った。
５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）中、４ｍＭチューリッポシドＡまたは４ｍＭチューリッポシドＢと組換え酵素を含む酵素反応液を室温で１０分インキュベートした後、０．５Ｍリン酸を加えることで反応を停止し、酵素反応生成物であるチューリッパリンＡまたはチューリッパリンＢの生成量をＨＰＬＣにて定量した。
その結果、表１に示すようにＴｇＴＣＥＡ−ｂ１〜ＴｇＴＣＥＡ−ｂ３の組換え酵素はいずれもチューリッポシドＡをチューリッパリンＡに変換する酵素活性を有していた。
また、いずれの組換え酵素もチューリッポシドＢをチューリッパリンＢに変換する酵素活性を有していたが、その活性はチューリッポシドＡに対する活性の数分の一から十数分の一と低いものであった。
さらに、３種の組換え酵素の活性はＮ末端側のヒスチジンタグを含むベクター由来１７アミノ酸を除去することで２倍程度向上することが分かった。
【００１５】
【表１】
2014014277.tif 000013
（＋）はヒスチジンタグを含むものを、（−）は含まないものを示す。
１Ｕ；１分間に１μｍｏｌのチューリッポシドをチューリッパリンに変換する酵素量
【図１】
2014014277.tif 000014
【図２】
2014014277.tif 000015
【図３】
2014014277.tif 000016
【図４】
2014014277.tif 000017
【配列表】
2014014277000001.app