(57)【要約】      （修正有）【課題】抗酸化酵素のパフォーマンスの向上に応用されるベンゾキノン系化合物の、炎症関連の病理学的現象を抑制する用途、及びこのベンゾキノン系化合物を応用する医薬組成物の提供。【解決手段】炎症抑制用ベンゾキノン系化合物は、一般式（１）で表される構造を有する。2014058497.tif 000008一般式（１）中で、Ｒ１は水素基又は［（Ｃ４Ｈ４）ＣＨ３］ｎであり、ｎは１〜５の整数であり、Ｒ２は水素基又はメトキシ基である。該炎症抑制用ベンゾキノン系化合物は、抗酸化酵素の発現を上昇させることができる。【選択図】図５Ａ
2014058497.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（１）で表される構造を有し、
【化１】
2014058497.tif 000006
一般式（１）中で、Ｒ１は水素基又は［（Ｃ４Ｈ４）ＣＨ３］ｎであり、ｎは１〜５の整数であり、Ｒ２は水素基又はメトキシ基である抗酸化酵素の発現を上昇させるのに用いられることを特徴とする炎症抑制用ベンゾキノン系化合物。
【請求項２】
一般式（１）で表される化合物の位置異性体であり、一般式（２）で表される構造を有し、
【化２】
2014058497.tif 000007
一般式（２）中で、Ｒ１は水素基又は［（Ｃ４Ｈ４）ＣＨ３］ｎであり、ｎは１〜５の整数であることを特徴とする請求項１に記載の炎症抑制用ベンゾキノン系化合物。
【請求項３】
２，３‐ジメトキシ‐５‐メチル‐１，４‐ベンゾキノン、２‐メトキシ‐６‐メチル‐１，４‐ベンゾキノン、又は５‐メチル‐１‐ベンゾ［１，３］ジオキソール‐４，７‐ジオンであることを特徴とする請求項１に記載の炎症抑制用ベンゾキノン系化合物。
【請求項４】
前記抗酸化酵素は、ヘムオキシゲナーゼ（ｈｅｍｅ  ｏｘｙｇｅｎａｓｅ‐１；ＨＯ‐１）、キノンアクセプターオキシドレダクターゼ（ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：ｑｕｉｎｏｎｅ  ａｃｃｅｐｔｏｒ  ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ  １；ＮＱＯ‐１）、又はグルタチオン（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ；ＧＳＨ）であることを特徴とする請求項１に記載の炎症抑制用ベンゾキノン系化合物。
【請求項５】
薬物の調製に用いられることを特徴とする請求項１に記載の炎症抑制用ベンゾキノン系化合物。
【請求項６】
ＬＰＳに誘導される炎症反応、慢性炎症、粥状動脈硬化症、敗血症、冠動脈疾患、糖尿病、又は、関節炎の炎症を抑制するのに用いられることを特徴とする請求項５に記載の炎症抑制用ベンゾキノン系化合物。
【請求項７】
請求項１に記載の炎症抑制用ベンゾキノン系化合物、前記炎症抑制用ベンゾキノン系化合物を有効成分とする加工物又は天然物からの抽出物、前記炎症抑制用ベンゾキノン系化合物の薬学的に許容される塩類、および前記炎症抑制用ベンゾキノン系化合物の薬学的に許容される溶媒和物のうち少なくとも一つを含み、抗酸化酵素の発現を上昇させるのに用いられることを特徴とする医薬組成物。
【請求項８】
炎症抑制用ベンゾキノン系化合物を有効成分とする前記加工物は、樟芝の発酵液又は前記樟芝の発酵液の乾燥粉末であることを特徴とする請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
人工合成、または樟芝の発酵液由来の請求項１に記載の炎症抑制用ベンゾキノン系化合物を有効成分とすることを特徴とするサプリメント。
【請求項１０】
液状、粉末、錠剤、カプセル又は注射剤であることを特徴とする請求項９に記載のサプリメント。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、炎症抑制用ベンゾキノン系化合物に関し、特に、抗酸化酵素の発現を上昇させるのに用いられる炎症抑制用ベンゾキノン系化合物、ならびにそれを用いた医薬組成物およびサプリメントに関する。
【背景技術】
【０００２】
炎症は、体の防御反応である。慢性炎症反応は、多くの疾患に関わり、例えば、粥状動脈硬化症、敗血症、糖尿病、関節炎、自己免疫疾患、神経性疾患、肺疾患、更には癌等の病気の進行と緊密な関係があり、長引く炎症反応は、ヒトの体に対して有害であり、疾患を引き起こす可能性があり、炎症関連の疾患の死亡率も逐年増加していく傾向にある。
【０００３】
例えば、粥状動脈硬化症は、慢性炎症反応に関する病理学的現象であり、動脈管壁の内皮細胞又は平滑筋細胞の炎症が重篤化し、線維性の病変によって引き起こされ、血管壁の肥厚を引き起こす可能性があり、心血管疾患の要因の一つである。
【０００４】
多くの研究において、酸化防止物質が良好な抗炎症作用を有することが指摘されている。体内には、酸化防止防御システムがあり、ヘムオキシゲナーゼ（ｈｅｍｅ  ｏｘｙｇｅｎａｓｅ‐１；ＨＯ‐１）、キノンアクセプターオキシドレダクターゼ（ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：ｑｕｉｎｏｎｅ  ａｃｃｅｐｔｏｒ  ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ  １；ＮＱＯ‐１）、グルタチオン（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ；ＧＳＨ）等のような体内の酸化防止物質を増加すれば、ラジカルを効果的に除去し、炎症反応による影響を下げ、心血管疾患を予防し、癌血管の新生、遊走、および侵入を抑制することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平９−１７６０３８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
そのため、どのように体内の酸化防止防御能力を強め、炎症反応を下げることは、予防医学における大切な課題となる。市販の抗炎症薬物は数多くあるが、副作用を有する。現在、天然の抗炎症物質を探し、天然の抗炎症物質で抗炎症薬物を取り換え、又は抗炎症薬物の投薬量を下げることを重要視している。
本発明は、上記問題に鑑みてなされたものであり、その目的は副作用を低減する天然の炎症抑制用ベンゾキノン系化合物、ならびに、それを用いた医薬組成物およびサプリメントを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
請求項１に係る発明によると、炎症抑制用ベンゾキノン系化合物は、抗酸化酵素の発現を上昇させるのに用いられ、一般式（１）で表される構造を有する。
【化１】
2014058497.tif 000003
一般式（１）の中で、Ｒ１は水素基又は［（Ｃ４Ｈ４）ＣＨ３］ｎであり、ｎは１〜５の整数であり、Ｒ２は水素基又はメトキシ基である。
【０００８】
請求項２に係る発明によると、炎症抑制用ベンゾキノン系化合物は、一般式（１）で表される化合物の位置異性体であり、一般式（２）で表される構造を有する。
【化２】
2014058497.tif 000004
一般式（２）の中で、Ｒ１は水素基又は［（Ｃ４Ｈ４）ＣＨ３］ｎであり、ｎは１〜５の整数である。
【０００９】
請求項３に係る発明によると、炎症抑制用ベンゾキノン系化合物は、２，３‐ジメトキシ‐５‐メチル‐１，４‐ベンゾキノン、２‐メトキシ‐６‐メチル‐１，４‐ベンゾキノン、又は５‐メチル‐１‐ベンゾ［１，３］ジオキソール‐４，７‐ジオンである。
【００１０】
請求項４に係る発明によると、抗酸化酵素は、ヘムオキシゲナーゼ、キノンアクセプターオキシドレダクターゼ、又はグルタチオンである。
【００１１】
請求項５に係る発明によると、炎症抑制用ベンゾキノン系化合物は薬物の調製に用いられる。
請求項６に係る発明によると、炎症抑制用ベンゾキノン系化合物は、ＬＰＳに誘導される炎症反応、慢性炎症、粥状動脈硬化症、敗血症、冠動脈疾患、糖尿病又は関節炎等の炎症を抑制するのに用いられる。
【００１２】
請求項７に係る発明によると、医薬組成物は、抗酸化酵素の発現を上昇させるのに用いられ、炎症抑制用ベンゾキノン系化合物、炎症抑制用ベンゾキノン系化合物を有効成分とする加工物又は天然物からの抽出物、炎症抑制用ベンゾキノン系化合物の薬学的に許容される塩類、および、炎症抑制用ベンゾキノン系化合物の薬学的に許容される溶媒和物のうち少なくとも一つを含む。
【００１３】
請求項８に係る発明によると、炎症抑制用ベンゾキノン系化合物を有効成分とする加工物は、樟芝（ベニクスノキタケ）発酵液又は樟芝の発酵液の乾燥粉末である。
【００１４】
請求項９に係る発明によると、サプリメントは、炎症抑制用ベンゾキノン系化合物を有効成分とする。そのうち、炎症抑制用ベンゾキノン系化合物は、人工合成、または、樟芝の発酵液由来である。請求項１０に係る発明によると、サプリメントは、液状、粉末、錠剤、カプセル又は注射剤である。
【００１５】
本発明の炎症抑制用ベンゾキノン系化合物は、抗酸化酵素の発現を上昇させることができ、ＬＰＳに誘導される炎症反応、慢性炎症、粥状動脈硬化症、敗血症、冠動脈疾患、糖尿病又は関節炎等の炎症を抑制する医薬組成物又はサプリメントの調製に用いられることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明の一実施形態による炎症抑制用ベンゾキノン系化合物の特性図である。
【図２】本発明の一実施形態による炎症抑制用ベンゾキノン系化合物の特性図である。
【図３Ａ】本発明の一実施形態による炎症抑制用ベンゾキノン系化合物の特性図である。
【図３Ｂ】本発明の一実施形態による炎症抑制用ベンゾキノン系化合物の特性図である。
【図４Ａ】本発明の一実施形態による炎症抑制用ベンゾキノン系化合物の特性図である。
【図４Ｂ】本発明の一実施形態による炎症抑制用ベンゾキノン系化合物の特性図である。
【図５Ａ】本発明の一実施形態による炎症抑制用ベンゾキノン系化合物の特性図である。
【図５Ｂ】本発明の一実施形態による炎症抑制用ベンゾキノン系化合物の特性図である。
【図５Ｃ】本発明の一実施形態による炎症抑制用ベンゾキノン系化合物の特性図である。
【図５Ｄ】本発明の一実施形態による炎症抑制用ベンゾキノン系化合物の特性図である。
【図６】本発明の一実施形態による炎症抑制用ベンゾキノン系化合物の特性図である。
【図７Ａ】本発明の一実施形態による炎症抑制用ベンゾキノン系化合物の特性図である。
【図７Ｂ】本発明の一実施形態による炎症抑制用ベンゾキノン系化合物の特性図である。
【図８Ａ】本発明の一実施形態による炎症抑制用ベンゾキノン系化合物の特性図である。
【図８Ｂ】本発明の一実施形態による炎症抑制用ベンゾキノン系化合物の特性図である。
【図９】本発明の一実施形態による炎症抑制用ベンゾキノン系化合物の特性図である。
【図１０】本発明の一実施形態による炎症抑制用ベンゾキノン系化合物の特性図である。
【図１１】本発明の一実施形態による炎症抑制用ベンゾキノン系化合物の特性図である。
【図１２】本発明の一実施形態による炎症抑制用ベンゾキノン系化合物の特性図である。
【図１３】本発明の一実施形態による炎症抑制用ベンゾキノン系化合物の特性図である。
【図１４】本発明の一実施形態による炎症抑制用ベンゾキノン系化合物の特性図である。
【図１５】本発明の一実施形態による炎症抑制用ベンゾキノン系化合物の特性図である。
【図１６】本発明の一実施形態による炎症抑制用ベンゾキノン系化合物の特性図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
（一実施形態）
本発明の一実施形態によると、抗酸化酵素の発現を上昇させるのに用いられる炎症抑制用ベンゾキノン系化合物（以下、単に化合物（Ｉ）という）は、一般式（１）で表される構造を有し、還元型又は異性体が、化学合成、天然物、加工物由来である。
【化１】
2014058497.tif 000005
一般式（１）中で、Ｒ１は水素基又は［（Ｃ４Ｈ４）ＣＨ３］ｎであり、ｎは１〜５の整数である。Ｒ２は水素基又はメトキシ基である。
【００１８】
天然物または加工物由来の化合物（Ｉ）は、酸化型もしくは還元型、異なる構造異性体（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  ｉｓｏｍｅｒｓ）又は、位置異性体（ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎａｌ  ｉｓｏｍｅｒｓ）で天然に存在する。また、合成された化合物（Ｉ）、又は樟芝の発酵液由来の化合物（Ｉ）は、何れも抗酸化酵素の発現を上昇させる効果を有する。化合物（Ｉ）の具体的な構造において、Ｒ１は水素基であり、Ｒ２はメトキシ基である。純粋な化合物（Ｉ）による効果は、化合物（Ｉ）を主な有効成分とする混合物の効果と同様である。
【００１９】
下記実施例は、本発明の内容の特定の態様を明らかにし、当業者に本発明の内容に対する理解に寄与するためのものである。ただし、本発明の内容の範囲は、これらの実施例に限定されない。
【００２０】
（第一実施例：抗酸化酵素の発現を上昇させる化合物（Ｉ）の作用）
（実験例１：哺乳動物のマクロファージ及び表皮細胞に対する化合物（Ｉ）の安全性解析）
本実施例では、哺乳動物細胞に対する化合物（Ｉ）の安全性及び安全量を確定するために、異なる投与量の化合物（Ｉ）でマウスの単核細胞マクロファージ白血病細胞株（ＲＡＷ  ２６４．７）及びヒト血管内皮細胞株（Ｅａ  ｈｙ９２６）に対して、細胞生存検出を行う。
【００２１】
実験細胞の培養条件を５％ＣＯ２、３７℃恒温に維持する。細胞を一定数まで培養した場合、遠心して培養液を除去し、実験の２４時間前に、培養液を交換し、細胞の数を細胞計数器によって算出する。
【００２２】
細胞の生存率（ｃｅｌｌ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）の測定は、細胞賦活評価実験（Ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ａｓｓａｙ；ＭＴＴ  ａｓｓａｙ）によって行う。細胞生存検出の実方法については、Ｐａｒａｄａ‐Ｔｕｒｓｋａ等により提案されたステップを参照する。
【００２３】
図１は、異なる濃度の化合物（Ｉ）を与える場合、マウス２６４．７細胞株の生存率に対する化合物（Ｉ）の影響を定量化した図である。結果を、ｍｅａｎ±ＳＤ値で表し、ｎ＝３、ｐ＜０．０５である。
【００２４】
図１の結果が示すように、実験濃度２．５〜２０μＭの化合物（Ｉ）がマウス２６４．７細胞に２４時間作用した後、濃度が２．５〜１０μＭである場合実験細胞は依然として約９０％の生存率を維持し、濃度が１５μＭである場合生存率が約６０％にやや下がったが、濃度が２０μＭである場合依然として約６０％の生存率に維持する。上記結果から、化合物（Ｉ）の哺乳動物の細胞に対する安全性がかなり高いことが明らかである。下記で、マウス２６４．７細胞株を例として、化合物（Ｉ）のマクロファージにおける酸化防止遺伝子に対する調節パターンを分析する。
【００２５】
図２は、異なる濃度の化合物（Ｉ）を与える場合、ヒト内皮細胞株の生存率に対する化合物（Ｉ）の影響を定量化した図である。結果を、ｍｅａｎ±ＳＤ値で表し、ｎ＝３、ｐ＜０．０５である。
【００２６】
図２の結果が示すように、実験濃度５〜２０μＭの化合物（Ｉ）がヒト内皮細胞に２４時間作用した後、濃度が５〜１０μＭである場合、実験細胞は依然として約９０％の生存率に維持し、濃度が２０μＭである場合生存率が依然として８０％に維持する。上記結果から、化合物（Ｉ）の哺乳動物の細胞に対する安全性がかなり高いことが明らかである。下記で、ヒト内皮細胞株Ｅａ  ｈｙ９２６を例として、化合物（Ｉ）の内皮細胞の炎症遺伝子に対する調節パターン、及び粥状動脈硬化症に対する効果を分析する。
【００２７】
（実験例２：炎症タンパク質の発現及びサイトカインの分泌に対する化合物（Ｉ）の抑制作用）
炎症酵素（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｅｎｚｙｍｅｓ）、炎症性サイトカイン（ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ）、ケモカイン（ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｓ）、及び接着分子（ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）は、慢性炎症反応において、重要な役割を果たしていることが既に実証されており、これらの炎症因子を、細胞炎症反応の指標とみなすことができる。
【００２８】
例えば、シクロオキシゲナーゼ‐２（ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ‐２；ＣＯＸ‐２）と誘導型一酸化窒素合成酵素II（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ＮＯＳ；ｉＮＯＳ）は、マクロファージにおける炎症因子である。そのうち、ＣＯＸ‐２は、細胞が刺激されると、大量に発現され、プロスタグランジン（ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎｓ；ＰＧｓ）を大量に生成し、炎症促進、血管新生、細胞アポトーシス抑制、及び癌細胞成長促進の作用を有する。ｉＮＯＳは、マクロファージ、内皮細胞、肝細胞、及び平滑筋細胞において、シグナル伝達分子としての一酸化窒素（Ｎｉｔｒｉｃ  ｏｘｉｄｅ；ＮＯ）を合成する酵素である。ｉＮＯＳの発現と、炎症反応、敗血症及び卒中の発生とは正依存性関係を有する。
【００２９】
よって、以下、化合物（Ｉ）のマクロファージ抗炎症反応に対する効果を観察するために、前記標的細胞タンパク質について、ウエスタンブロット解析（Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ）を行い、調節した炎症の前駆物質の分泌量をそれぞれ観察する。
【００３０】
図３Ａ〜図３Ｂを参照する。図３Ａは、刺激剤の存在下で、異なる量の化合物（Ｉ）を与える場合、ウエスタンブロット解析法によって検出された、マウス２６４．７細胞における炎症前駆物質ＣＯＸ‐２の含有量に対する化合物（Ｉ）の影響を示す図である。β‐ａｃｔｉｎは、内部標準（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｃｏｎｔｒｏｌ）である。図３Ｂは、異なる量の化合物（Ｉ）を与える場合、マウス２６４．７細胞におけるＣＯＸ‐２下流の炎症性サイトカインプロスタグランジン‐Ｅ２（ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ  Ｅ２；ＰＧＥ２）の含有量に対する化合物（Ｉ）の影響を示す図である。実験において、リポ多糖類（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ；ＬＰＳ）を刺激剤として、細胞を刺激して炎症前駆物質ＣＯＸ‐２を生じさせ、異なる量の化合物（Ｉ）が存在する場合、ＬＰＳによる細胞刺激の抑制効果を観察する。
【００３１】
図３Ａの結果が示すように、刺激剤ＬＰＳが存在する場合、化合物（Ｉ）の投与量の増加に伴い、マウス２６４．７細胞における炎症タンパクＣＯＸ‐２の発現量が減少する。
【００３２】
また、図３Ｂの結果が示すように、ＬＰＳが存在する場合、化合物（Ｉ）の投与量の増加に伴い、細胞におけるＰＧＥ２の濃度が減少する。  
【００３３】
また、図４Ａ及び図４Ｂを参照する。図４Ａは、刺激剤ＬＰＳが存在する場合、異なる量の化合物（Ｉ）を与える場合、ウエスタンブロット解析法によって検出された、マウス２６４．７細胞におけるｉＮＯＳの発現状況に対する化合物（Ｉ）の影響を示す図である。β‐ａｃｔｉｎは、内部標準である。図４Ｂは、異なる量の化合物（Ｉ）を与える場合、ｉＮＯＳ下流のサイトカインＮＯの含有量割合（％）に対する化合物（Ｉ）の影響を示す図である。
【００３４】
図４Ａの結果が示すように、刺激剤ＬＰＳが存在する場合、化合物（Ｉ）の投与量の増加に伴い、マウス２６４．７細胞における炎症タンパクｉＮＯＳの発現量が減少する。
【００３５】
また、図４Ｂの結果が示すように、ＬＰＳが存在する場合、化合物（Ｉ）の投与量の増加に伴い、細胞におけるＮＯの割合が減少する。
【００３６】
従って、図３Ａ〜図４Ｂの結果から、化合物（Ｉ）は、細胞炎症タンパクＣＯＸ‐２、ｉＮＯＳの発現量に対して著しい抑制効果を有し、細胞における炎症性サイトカインＰＧＥ２及びＮＯの分泌を抑制し、炎症反応の発生を抑制することが明らかである。
【００３７】
（実験例３‐１：細胞炎症のシグナル伝達分子の発現に対する化合物（Ｉ）の抑制作用）
現在、酸化ストレスは、炎症サイトカインと炎症物質の発現を促進する可能性がある。炎症物質は、細胞核転写因子ＮＦ‐κＢ（Ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ‐Ｋａｐｐａ  Ｂ）とＡＰ‐１のような細胞内のシグナル伝達分子を活性化させ、炎症関連の遺伝子を発現させるように促し、更に、サイトカイン（ＴＮＦ‐α、ＩＬ‐Ｉβ等）、細胞接着分子（ＶＣＡＭ‐１、ＩＣＡＭ‐１、Ｅ‐ｓｅｌｅｃｔｉｎ等）、走化性物質（ＭＣＰ‐１）、及び炎症関連のタンパク等の発生を引き起こすことが知られている。
【００３８】
細胞核転写因子ＮＦ‐κＢは、ｐ５０とｐ６５からなるヘテロ二量体タンパク質であり、体の炎症を引き起こす主な調節物質である。ＮＦ‐κＢが活性化されると、細胞核及びミトコンドリアに進入し、免疫関連の遺伝子が発現される。アクチベータータンパク質‐１（ＡＰ‐１）も、炎症物質の発生を調節する。ＡＰ‐１は、ｃ‐Ｊｕｎとｃ‐Ｆｏｓからなるヘテロ二量体タンパク質であり、その発現が、分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ（Ｍｉｔｏｇｅｎ‐ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｋｉｎａｓｅ；ＭＡＰＫｓ）により調節される。
【００３９】
以下、刺激剤と化合物（Ｉ）が存在する場合、細胞核と細胞質において、細胞核転写因子ＮＦ‐κＢ及びアクチベータータンパク質‐１の活性に対する化合物（Ｉ）の影響について、分析する。
【００４０】
図５Ａは、異なる投与量の刺激剤ＬＰＳと化合物（Ｉ）を用いて、マウス２６４．７細胞株を処理する場合、ＮＦ‐κＢルシフェラーゼ活性（Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）の免疫細胞化学的解析（Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ；ＩＣＣ）による結果を定量化した図である。そのうち、空ベクトルのみを含有する形質転換体を陰性対照群（ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ）とし、化合物（Ｉ）とＬＰＳを添加しなかったものを背景値対照群とし、その転写活性を１００％とする。
【００４１】
結果が示すように、ＬＰＳは、ＮＦ‐κＢの活性（背景値対照群）を誘発するが、化合物（Ｉ）の存在下で、化合物（Ｉ）の濃度の向上に伴い、ＮＦ‐κＢの発現活性が下がる。また、化合物（Ｉ）の処理濃度が５〜１０μＭに達すると、ＮＦ‐κＢの活性が背景値以下に下がる。
【００４２】
図５Ｂは、異なる投与量の刺激剤ＬＰＳと化合物（Ｉ）を用いて、マウス２６４．７細胞株を処理する場合、そのＡＰ‐１ルシフェラーゼ活性の免疫細胞化学的解析による結果を定量化した図である。そのうち、空ベクトルのみを含有する形質転換体を陰性対照群とし、化合物（Ｉ）とＬＰＳを添加しなかったものを背景値対照群とし、その転写活性を１００％とする。
【００４３】
結果が示すように、ＬＰＳは、ＡＰ‐１の活性（背景値対照群）を誘発するが、化合物（Ｉ）の存在下で、化合物（Ｉ）濃度の向上に伴い、ＡＰ‐１の発現活性が下がる。また、化合物（Ｉ）の処理濃度が２．５μＭに達すると、ＡＰ‐１の活性が背景値以下に下がる。
【００４４】
（実験例３‐２：ＲＯＳ‐ＪＮＫ経路を調節しＮｒｆ２を活性化する化合物（Ｉ）の作用）
細胞において、ＮＦ‐κＢ及びＡＰ‐１は、ＲＯＳ‐ＪＮＫシグナル伝達経路に関与する。ＮＦ‐κＢ及びＡＰ‐１が活性化されると、引き続きｐ５０／ｐ６５（ＮＦ‐κＢ）とｃ‐Ｆｏｓ／ｃ‐Ｊｕｎ（ＡＰ１）を含むその下流の転写因子が活性化されるようになり、これらの転写因子同士が互いに協調する。
【００４５】
図５Ｃは、刺激剤が存在する場合、異なる量の化合物（Ｉ）を与える場合、ウエスタンブロット解析法によって検出された、マウス２６４．７細胞核におけるＲＯＳ‐ＪＮＫ経路関連転写因子の含有量に対する化合物（Ｉ）の影響を示す図である。Ｈｉｓｔｏｎｅは、内部標準である。
【００４６】
結果が示すように、ＬＰＳは細胞核内のｐ６５、ｐ‐ｃ‐ｆｏｓ、ｐ‐ｃ‐Ｊｕｎ５の活性化（リン酸化）を促進することができるが、化合物（Ｉ）が存在する場合、化合物（Ｉ）の濃度の向上に伴い、ｐ６５、ｐ‐ｃ‐ｆｏｓ、ｐ‐ｃ‐Ｊｕｎ５の発現活性が下がる。化合物（Ｉ）が存在する場合、Ｎｒｆ２は細胞核に転位することができ、その含有量は化合物（Ｉ）の濃度の向上に伴い増加する。
【００４７】
図５Ｄは、化合物（Ｉ）で０〜４時間処理する間の、細胞核内のＮｒｆ２の発現結果を示す図である。結果が示すように、化合物（Ｉ）の存在下で、Ｎｒｆ２を細胞核内に移行させ、高発現量を維持させることができる。
【００４８】
上記結果によると、化合物（Ｉ）は、マクロファージにおいて、ＲＯＳ‐ＪＮＫ経路を経てＮｒｆ２を活性化し、ＮＦ‐κＢによるＮｒｆ２の抑制を低減し、Ｎｒｆ２を活性化して核内に移行させて発現させることができる。
【００４９】
（実験例３‐３：化合物（Ｉ）による抗酸化酵素の発現量の増加）
上述したように、化合物（Ｉ）は、Ｎｒｆ２を活性化して核内に移行させることを促進する。従って、以下はウエスタンブロット法によって、細胞核内のＮｒｆ２結合部位のＡＲＥプロモーター配列の下流の関連抗酸化酵素の発現量を分析する。
【００５０】
図６は、化合物（Ｉ）で０〜２４時間処理する間、細胞内のＮｒｆ２及び抗酸化酵素ＨＯ‐１、ＮＱＯ‐１の発現結果を示す図である。
【００５１】
結果が示すように、細胞内のＮｒｆ２の含有量は処理時間の増加に伴い減少するが、抗酸化酵素ＨＯ‐１、ＮＱＯ‐１の発現量は処理時間の増加に伴い増加するので、ＬＰＳのＲＯＳに対する誘導能力を抑制することができる。
【００５２】
（実験例４：炎症性サイトカインの発現に対する化合物（Ｉ）の抑制作用）
腫瘍壊死因子（Ｔｕｍｏｒ  Ｎｅｃｒｏｓｉｓ  Ｆａｃｔｏｒ‐α；ＴＮＦ‐α）は、炎症性サイトカインであり、ＩＣＡＭ‐１、ＩＬ‐６、ＩＬ‐１等の炎症物質の分泌を調節して、一連の炎症プロセスを始動することができ、炎症関連の病理学的現象において、イニシエータの役割を果たしている。
【００５３】
以下、ＬＰＳを利用して、ＴＮＦ‐α及びＩＬ‐１βの発生を誘導し、マウス血清及び細胞における発現量を分析することによって、炎症性サイトカインの発現に対する化合物（Ｉ）の影響を説明する。
【００５４】
図７Ａは、異なる投与量の化合物（Ｉ）で処理する場合、マウス血清におけるＬＰＳ誘導性ＴＮＦ‐α発現の能力に対する化合物（Ｉ）の影響を示す図である。結果が示すように、血清におけるＴＮＦ‐αの含有量は、化合物（Ｉ）の処理投与量の増加に伴い減少し、化合物（Ｉ）の投与量が５ｍｇ／ｋｇに達すると、ＴＮＦ‐αの発現量の減少程度は、統計的意義を持つ。
【００５５】
図７Ｂは、異なる投与量の化合物（Ｉ）で処理する場合、マウス２６４．７細胞株におけるＬＰＳ誘導性ＴＮＦ‐αの発現能力に対する化合物（Ｉ）の影響を示す果である。結果が示すように、血清におけるＴＮＦ‐αの含有量は、化合物（Ｉ）の処理投与量の増加に伴い減少し、化合物（Ｉ）の投与量が２．５〜１０ｍｇ／ｋｇに達すると、ＴＮＦ‐αの発現量の減少程度は、統計的意義を持つ。
【００５６】
図７Ａ及び図７Ｂの結果によると、細胞実験又は動物実験の何れにおいても、化合物（Ｉ）は、ＬＰＳ誘導性ＴＮＦ‐αの発現を抑制する能力を有することが明らかである。
【００５７】
図８Ａは、異なる投与量の化合物（Ｉ）で処理する場合、マウス血清におけるＬＰＳ誘導性ＩＬ‐１βの発現能力に対する化合物（Ｉ）の影響を示す図である。図８Ａに示すように、血清におけるＩＬ‐１βの含有量は、化合物（Ｉ）の投与量の増加に伴い減少し、減少程度が統計的意義を持つ。
【００５８】
図８Ｂは、異なる投与量の化合物（Ｉ）で処理する場合、マウス２６４．７細胞株におけるＬＰＳ誘導性ＩＬ‐１βの発現能力に対する化合物（Ｉ）の影響を示す図である。図８Ｂに示すように、血清におけるＩＬ‐１βの含有量が化合物（Ｉ）の投与量の増加に伴い減少するので、化合物（Ｉ）は、ＬＰＳ誘導性ＩＬ‐１βの発現を抑制する能力を有することが明らかである。
【００５９】
図８Ａ及び図８Ｂの結果によると、細胞実験又は動物実験の何れにおいても、化合物（Ｉ）は、ＬＰＳ誘導性ＩＬ‐１βの発現を抑制する能力を有することを証明することができる。
【００６０】
化合物（Ｉ）は、マクロファージにおいて、ＲＯＳ‐ＪＮＫ経路を経てＮｒｆ２を活性化し、ＮＦ‐κＢによるＮｒｆ２への抑制を低減し、Ｎｒｆ２を活性化して核内移行させることを促進し、相対的にＡＲＥプロモーターの活性を増加し、下流の抗酸化酵素ＨＯ‐１、ＮＱＯ‐１の発現を増加させることができる。抗酸化酵素の発現の増加は、ＬＰＳによるＲＯＳを大量に誘導する能力を取り除く作用を有し、ＮＦ‐κＢとＡＰ‐１の核内移行・発現及びそのプロモーター活性を抑制し、更に、炎症タンパク質ＣＯＸ‐２とｉＮＯＳの発現及びサイトカインＮＯ、ＰＧＥ２、ＴＮＦ‐αとＩＬ‐１βの分泌を抑制することができ、抗炎症の効果を有する。
【００６１】
（第二実施例：化合物（Ｉ）の抗動脈硬化効果）
（実験例５：ＴＮＦ‐αに刺激されたヒト大動脈内皮細胞ＥＡ．  Ｈｙ９２６細胞におけるＮＦ‐κＢに関連するタンパクの発現に対する化合物（Ｉ）の抑制）
前記実験結果によると、化合物（Ｉ）は、抗酸化酵素の発現を促進し、細胞の酸化防止能力を向上させ、更に、炎症タンパク質の発現及びサイトカインの分泌を抑制し、抗炎症の効果を有することが知られている。
【００６２】
粥状動脈硬化症は、慢性炎症による病理学的現象であり、血管内皮で発現する接着分子が粥状動脈硬化症の形成において重要な役割を果たしている。このため、以下、粥状動脈硬化症が発生した関連過程における標的タンパク質によって、ＴＮＦ‐αに刺激されたヒト大動脈内皮細胞の炎症関連タンパクの発現に対する化合物（Ｉ）の影響を確認する。
【００６３】
図９は、異なる投与量の化合物（Ｉ）で処理する場合、ＴＮＦ‐αに刺激されたヒト大動脈内皮細胞株のＩκＢαと核内ＮＦ‐κＢ  ｐ６５の発現に対する化合物（Ｉ）の影響を示す図である。そのうち、ＩκＢαは、ＮＦκＢの活性化を抑制することができる。
【００６４】
結果が示すように、ＴＮＦ‐αは、ヒト大動脈内皮細胞質のＩκＢαの発現を抑制するが、化合物（Ｉ）が存在する場合、化合物（Ｉ）の投与量の増加に伴い、ＩκＢαの発現も増加する。
【００６５】
なお、ＴＮＦ‐α刺激によってヒト大動脈内皮細胞核のＮＦ‐κＢ  ｐ６５が発現されるが、化合物（Ｉ）が存在する場合、化合物（Ｉ）の投与量の増加に伴い、ＮＦ‐κＢ  ｐ６５の発現量が低下する。
【００６６】
（実験例６：白血球接着作用、並びに接着分子ＩＣＡＭ‐１及びＶＣＡＭ‐１のタンパク発現に対する化合物（Ｉ）の抑制）
動脈硬化症の初期発生の特徴は、白血球が血管内皮細胞に接着し、更に白血球が内皮細胞を通して内皮細胞の下の空間で集まり、変換し、低密度リポタンパクを貪食し、泡沫細胞を形成する。この過程は、内皮細胞上に発現される接着分子と緊密な関係がある。
【００６７】
以下、ＴＮＦ‐αを刺激剤として、ＴＮＦ‐αに刺激されたヒト大動脈内皮細胞が発現する血管接着分子（ＶＣＡＭ‐１）と細胞間接着分子（ＩＣＡＭ‐１）に対する化合物（Ｉ）の影響を確認する。
【００６８】
図１０は、異なる投与量の化合物（Ｉ）で処理する場合、ＴＮＦ‐αに刺激されたヒト大動脈内皮細胞株のＶＣＡＭ‐１とＩＣＡＭ‐１の発現に対する影響を示す図である。結果が示すように、ＴＮＦ‐α刺激によってＶＣＡＭ‐１とＩＣＡＭ‐１が発現されるが、化合物（Ｉ）が存在する場合、化合物（Ｉ）の投与量の増加に伴い、ＶＣＡＭ‐１とＩＣＡＭ‐１の発現量が減少する。
【００６９】
従って、化合物（Ｉ）は、細胞接着分子発現を抑制する能力、更に粥状動脈硬化症の発生を抑制する作用を有する。
【００７０】
（実験例７‐１：血管内皮細胞の遊走（Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）・侵入（Ｉｎｖａｓｉｏｎ）作用に対する化合物（Ｉ）の抑制作用）
動脈硬化病状の発展過程において、血管平滑筋細胞は、中膜から内膜に遊走し、内膜で増殖して積み重ねて、初期の動脈硬化の発生及び後の動脈硬化性プラークの形成に、重要な役割を果たしている。以下、細胞遊走（Ｗｏｕｎｄ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）の状況を観察することで、血管内皮細胞遊走に対する化合物（Ｉ）の影響を分析する。
【００７１】
図１１は、異なる投与量の化合物（Ｉ）で血管内皮細胞ＥＡ．  Ｈｙ９２６を処理する場合、スクラッチアッセイ解析による結果を示す顕微鏡写真によって、血管内皮細胞ＥＡ．  Ｈｙ９２６の移行能力に対する化合物（Ｉ）の影響を示す図である。
【００７２】
細胞遊走の状況を、スクラッチアッセイ（Ｗｏｕｎｄ  ｓｃｒａｔｃｈｉｎｇ  ａｓｓａｙ）によって解析し、化合物（Ｉ）を添加しなかったものを対照群として、刺激剤ＴＮＦ‐αを添加したものを比較例として、５、１０μＭの化合物（Ｉ）を添加したものを実験群とする。
【００７３】
図１１に示すように、遊走の細胞量を計数するところ、低濃度（５μＭ）化合物（Ｉ）が存在する場合、ＴＮＦ‐αに刺激された血管内皮細胞ＥＡ．  Ｈｙ９２６の遊走が著しく抑制されるが、化合物（Ｉ）の濃度が１０μＭ以上となる場合、血管内皮細胞の遊走能力がさらに著しく抑制される。
【００７４】
図１２は、異なる投与量の化合物（Ｉ）で、血管内皮細胞ＥＡ．  Ｈｙ９２６を処理した後、トランスウェル移動アッセイ（ｔｒａｎｓｗｅｌｌ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）で染色された顕微鏡写真によって、血管内皮細胞ＥＡ．  Ｈｙ９２６の侵入能力に対する化合物（Ｉ）の影響を示す図である。
【００７５】
トランスウェル移動アッセイは、細胞外マトリックスの成分としてＭａｔｒｉｇｅｌを用い、細胞間環境を模擬する。ＢＤ  Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）  Ｉｎｖａｓｉｏｎ  Ｃｈａｍｂｅｒにおける細胞がＭａｔｒｉｇｅｌ  ｍａｔｒｉｘにおける成長因子に刺激されると、細胞は、若干のマトリックス分解酵素を分泌し、Ｍａｔｒｉｇｅｌを分解し、細胞の移行を吸引することができる。細胞の移動能力が強い場合、染色した後、濾過膜上で細胞を観察することができる。
【００７６】
図１２の顕微鏡写真に示すように、細胞移行の状況を観察し、化合物（Ｉ）の濃度の増加に伴い、血管内皮細胞の移行が著しく下がることが明らかである。低濃度（５μＭ）化合物（Ｉ）が存在する場合、ＴＮＦ‐αに刺激された血管内皮細胞ＥＡ．  Ｈｙ９２６の遊走が著しく抑制されるが、化合物（Ｉ）の濃度が１０μＭ以上となる場合、血管内皮細胞の侵入能力がさらに抑制される。また、刺激剤が存在しない場合、１０μＭの化合物（Ｉ）は、血管内皮細胞ＥＡ．  Ｈｙ９２６の遊走を抑制することができる。
【００７７】
（実験例７‐２：内皮細胞血管の形成に対する化合物（Ｉ）の抑制作用）
動脈硬化症において、局所貧血で酸欠になると共に、新血管を形成することがよくある。従って、図１３は、チューブ形成アッセイ（Ｔｕｂｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）によって、ＴＮＦ‐αに刺激された血管内皮細胞ＥＡ．  Ｈｙ９２６が、化合物（Ｉ）の存在下での血管形成状况を示す図である。
【００７８】
図１３は、顕微鏡下で観察した内皮細胞の分化結果を示す。図１３に示すように、ＴＮＦ‐αの刺激によって、血管内皮細胞の形態が変わってチューブ状となるが、化合物（Ｉ）の存在下で、チューブ状となる細胞は、化合物（Ｉ）の投与量の増加に伴い減少する。従って、化合物（Ｉ）は、内皮細胞血管の形成を抑制することができる。
【００７９】
（実験例８‐１：化合物（Ｉ）による抗酸化酵素発現量の向上）
炎症反応及び酸化ストレスは、動脈硬化の過程中、重要な役割を果たしている。以下、化合物（Ｉ）を用いて異なる時間で内皮細胞を処理し、細胞におけるヘムオキシゲナーゼ‐１（ＨＯ‐１）及びグルタミン酸システインリガーゼ触媒サブユニット（γ‐ｇｌｕｔａｍｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ  ｌｉｇａｓｅ  ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｓｕｂｕｎｉｔ；γ‐ＧＣＬＣ）の含有量を検出する。
【００８０】
図１４は、１０μＭの化合物（Ｉ）を用いて細胞をそれぞれ１、３、６、１２時間処理する場合、細胞におけるＨＯ‐１及びγ‐ＧＣＬＣに対する化合物（Ｉ）の影響を示す図である。結果が示すように、化合物（Ｉ）の処理時間の増加に伴い、内皮細胞におけるＨＯ‐１及びγ‐ＧＣＬＣの何れの発現量も増加する。
【００８１】
従って、化合物（Ｉ）は、細胞におけるＨＯ‐１及びγ‐ＧＣＬＣの発現量を促進する能力を有し、細胞の酸化ストレスに対する抵抗に寄与し、粥状動脈硬化症の発生を下げる。
【００８２】
図１５は、化合物（Ｉ）を用いて細胞を１、３、６、９時間処理する場合、内皮細胞におけるＧＳＨ濃度に対する化合物（Ｉ）の影響を示す図である。図１５の結果が示すように、化合物（Ｉ）の処理時間の増加に伴い、細胞におけるＧＳＨ濃度が持続して増加し、特に、６〜９時間処理された実験群の濃度の増加程度は、統計的差異を有する。
【００８３】
（実験例８‐２：化合物（Ｉ）による細胞におけるＭＭＰ‐９、ＭＭＰ２の酵素の発現の向上）
図１６は、Ｚｙｍｏｇｒａｐｈｙ酵素活性解析法によって検出され、１ｎｇ／ｍＬのＴＮＦ‐αに刺激された細胞の誘導で発生したＭＭＰ‐９、ＭＭＰ２、ＭＭＰ‐９の酵素活性に対する化合物（Ｉ）の影響を示す図である。
【００８４】
対照群は、化合物（Ｉ）及びＴＮＦ‐αを添加しなかったものであり、その細胞がＭＭＰ２酵素活性を有する。その他の実験群としては、化合物（Ｉ）を添加しなかったものを用い、５、１０、２０μＭの化合物（Ｉ）で処理して、ＴＮＦ‐α誘導ＭＭＰｓの効果に対する化合物（Ｉ）の影響を観察する。
【００８５】
図１６に示すように、化合物（Ｉ）を添加しなかった実験群が、ＭＭＰ‐９、ＭＭＰ２の酵素活性を発現することができ、化合物（Ｉ）の投与量の増加に伴い、そのＭＭＰ‐９、ＭＭＰ２の酵素活性が、抑制されることが明らかである。化合物（Ｉ）は、ＴＮＦ‐α誘導のＭＭＰｓを抑制する効果がある。
【００８６】
本発明の実施例の化合物（Ｉ）及びその医薬組成物は、ＲＯＳ‐ＪＮＫ経路シグナル経路のシグナル伝達を調節することで、関連の病理学的現象の改善に応用され、関連病理学的症状を治療する薬物の調製に応用されることができる。
【００８７】
従って、化合物（Ｉ）又は化合物（Ｉ）を有効成分とする混合物は、ＲＯＳ‐ＪＮＫ経路シグナル経路のシグナル伝達を調節し、更に、細胞の慢性炎症反応及び粥状動脈硬化症の発生を下げることができるので、医薬組成物の形式で、慢性炎症及び粥状動脈硬化症を治療する薬物として提供することができる。また、サプリメントの形式で、保健製品として提供されることもできる。
【００８８】
例えば、化合物（Ｉ）含有の医薬組成物において、化合物（Ｉ）は、遊離状態の形式又は薬学的に許容される塩の形式で存在している。また、化合物（Ｉ）含有の医薬組成物は、例えば、賦形剤、溶媒、乳化剤、懸濁化剤、分解剤、結合剤、安定化剤、防腐剤、潤滑剤、吸収遅延剤及びリポソームのような、１つまたは複数の薬学的に許容される担体を更に備えてよい。化合物（Ｉ）含有の医薬組成物は、実際の要求によって、経口投与、注射剤又は外用剤の形式のような、投薬形式に製造され、慢性炎症及び粥状動脈硬化症の予防、又は慢性炎症及び粥状動脈硬化症の改善に用いることができる。
【００８９】
本発明の実施例の化合物（Ｉ）を有効成分として製作された医薬組成物又はサプリメントは、その化合物として、人工合成、または樟芝の発酵液由来である。サプリメントは、液状、粉末、錠剤、カプセル又は注射剤の形式であってもよい。
【００９０】
本発明では実施形態を前述の通りに説明したが、これは本発明を限定するものではなく、当業者であれば、本発明の精神と領域から逸脱しない限り、多様の変更や修正を加えることができる。従って本発明の保護範囲は、特許請求の範囲に記載された内容を基準とする。 
【図１】
2014058497.tif 000009
【図２】
2014058497.tif 000010
【図３Ａ】
2014058497.tif 000011
【図３Ｂ】
2014058497.tif 000012
【図４Ａ】
2014058497.tif 000013
【図４Ｂ】
2014058497.tif 000014
【図５Ａ】
2014058497.tif 000015
【図５Ｂ】
2014058497.tif 000016
【図５Ｃ】
2014058497.tif 000017
【図５Ｄ】
2014058497.tif 000018
【図６】
2014058497.tif 000019
【図７Ａ】
2014058497.tif 000020
【図７Ｂ】
2014058497.tif 000021
【図８Ａ】
2014058497.tif 000022
【図８Ｂ】
2014058497.tif 000023
【図９】
2014058497.tif 000024
【図１０】
2014058497.tif 000025
【図１１】
2014058497.tif 000026
【図１２】
2014058497.tif 000027
【図１３】
2014058497.tif 000028
【図１４】
2014058497.tif 000029
【図１５】
2014058497.tif 000030
【図１６】
2014058497.tif 000031