(57)【要約】      （修正有）【課題】ヘルパーＴ細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞）関連の免疫疾患の治療又は予防に有用な医薬組成物の提供。【解決手段】生体内でTh1型免疫応答を正に制御し、その結果としてTh2型免疫応答を負に制御し、Th1型免疫疾患の増悪及びTh2型免疫疾患の抑制に関与しているCD155とリガンドとの結合を阻害する抗CD155抗体（阻害抗体）を含む、Th1型免疫疾患の治療又は予防のための医薬組成物、あるいはCD155を活性化するアゴニスト作用を有する抗CD155抗体（アゴニスト抗体）を含む、Th2型免疫疾患の治療及び予防のための医薬組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
CD155に対する抗体又はその断片を含む、免疫疾患に対する医薬組成物。
【請求項２】
免疫疾患がTh1型又はTh2型免疫疾患である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
Th1型免疫疾患が、Th1型アレルギー疾患、自己免疫疾患、移植による拒絶反応及び移植片対宿主病からなる群から選ばれる少なくとも１種である、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
Th1型アレルギー疾患が、接触性皮膚炎、Th1型気管支喘息及びTh1型アトピー性皮膚炎からなる群から選ばれる少なくとも１種である、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
自己免疫疾患が、関節リウマチ、多発性硬化症、インスリン依存性糖尿病、クローン病、潰瘍性大腸炎、全身性エリテマトーデス、乾癬、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性血小板減少性紫斑病、自己免疫性好中球減少症、重症筋無力症、天疱瘡、慢性甲状腺炎、バセドウ病、自己免疫性肝炎及びグッドパスチャー症候群からなる群から選ばれる少なくとも１種である、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項６】
Th2型免疫疾患が、Th2型気管支喘息、Th2型アトピー性皮膚炎、アレルギー性結膜炎、アレルギー性鼻炎、蕁麻疹、アレルギー性胃腸炎、食物アレルギー及び薬物アレルギーからなる群から選ばれる少なくとも１種である、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項７】
CD155がCD4＋ T細胞上に存在するものである、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項８】
抗体がモノクローナル抗体である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項９】
抗体が、キメラ抗体、ヒト型化抗体又はヒト化抗体である、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
少なくとも１種の免疫抑制剤と併用投与するための、請求項１〜９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
少なくとも１種の免疫抑制剤が、ステロイド、カルシニューリン阻害薬、代謝拮抗型免疫抑制剤、抗体医薬及びアルキル化剤からなる群から選択される少なくとも１種の免疫抑制剤である、請求項１０に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、CD155に対する抗体を含む免疫疾患に対する医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヘルパーT細胞（CD4+ T細胞）は、様々な病原体を特異的かつ強力に排除する獲得免疫応答において、中心的な役割を果たしている。CD4+ T細胞は、それ自身が産生するサイトカインを介して他の細胞の機能を制御し、病原体に適した反応ができるように免疫応答を司っている。
【０００３】
抗原に未感作のナイーブヘルパーT細胞（CD4＋ ナイーブT細胞）は、産生するサイトカインの違いによってTh1（T helper 1）細胞、Th2細胞及びTh17細胞という3種類のエフェクター細胞、並びに抑制性の制御性T細胞（Regulatory T cell; Treg）に分化する（図１）。
Th1細胞は主にIFN-γ、IL-12によって誘導され、IFN-γ、IL-2を産生し、マクロファージを活性化し、細胞内寄生菌の排除や炎症性疾患に関与している（非特許文献１：Murphy, K. M., and S. L. Reiner. 2002. Nat Rev Immunol 2: 933-944）。
Th2細胞は主にIL-4によって誘導され、IL-4、IL-5、IL-13などを産生し、寄生虫排除や好酸球主体のアレルギーに関与している。
Th17細胞は主にIL-6とTGF-βによって誘導され、IL-17A/FやIL-22を産生し、主に細胞外細菌及び真菌の排除、自己免疫疾患などに関与しているが、慢性炎症性疾患やアレルギーにも関与しているという報告もあり、その機能は多岐に渡ると考えられている（非特許文献２：Bettelli, E. et al. 2008. Nature 453: 1051-1057）。
TregはTGF-βによって誘導され、TGF-βやIL-10を産生し、様々なエフェクター細胞に作用することにより、免疫応答の抑制に関与している。
【０００４】
CD4+ T細胞は病原体排除という生体防御機構に寄与する一方で、外来抗原のみならず、自己抗原や無害な抗原に対して過剰に反応してしまう自己免疫疾患やアレルギーなど、生体にとって有害な免疫応答においても中心的な役割を果たしている。
例えば、IV型アレルギーである接触性皮膚炎（contact hypersensitivity; CHS）は、金属イオンなどの様々な化学物質がハプテンとなり、Th1細胞が病態形成に関わる疾患の一つである(非特許文献３：Krasteva, M. et al. 1999. EJD 9: 65-76)。
自己免疫疾患やアレルギーは、その発症のトリガーや病態形成の分子メカニズムについては不明な点が多く、十分な解明がなされていない。そのため、これらの治療には対症療法が一般的であり、細胞表面分子やシグナル伝達因子など病態形成の基盤となる分子メカニズムを標的とした根本治療の確立には至っていないのが現状である。
【０００５】
CD155 (poliovirus receptor; PVR/Necl-5/Tage4)は、1989年にヒトのポリオウイルスレセプターとして初めて同定された（非特許文献４：Mendelsohn, C. L.et al. 1989. Cell 56: 855-865）。CD155は、分子量80〜90 kDaの一回膜貫通型糖タンパクであり、免疫グロブリンスーパーファミリーに属し、細胞外に三つの免疫グロブリン様ドメイン（V-C2-C2）と、細胞内にはチロシン残基を一つ有する。
【０００６】
CD155は、NK細胞やCD8+ T細胞に発現する免疫活性化受容体DNAM-1（DNAX accessory molecule-1）のリガンドであることが明らかになっている（非特許文献５：Tahara-Hanaoka, S. et al. 2005. Biochem Biophys Res Commun 329: 996-1000)。DNAM-1はマクロファージ、樹状細胞、血小板にも発現が認められている(非特許文献６：Shibuya, A. et al. 1996. Immunity 4: 573-581)。
【０００７】
本発明者は、CD8+ T細胞上のDNAM-1が抗原提示細胞上のCD155との結合を介して移植片対宿主病（Graft-versus-host disease; GVHD）を増悪することを明らかにした(非特許文献７：Nabekura, T. et al. 2010. Proc Natl Acad Sci U S A 107: 18593-18598)。Gunterらは、CD155遺伝子欠損マウスを用いて、CD155が液性免疫応答の誘導に関与しており(非特許文献８：Maier, M. K. et al. 2007. Eur J Immunol 37: 2214-2225)、さらに、彼らとMarcoらは、濾胞樹状細胞上のCD155と濾胞ヘルパーT細胞 (TFH) 上のTIGITが両細胞の接着、TFHの成熟に関与していることを明らかにした(非特許文献９：Seth, S. et al. 2009. Eur J Immunol 39: 3160-3170)。またGunterらは、CD155がCD8+ 胸腺細胞の正常な分化、T細胞上のDNAM-1の発現制御に関与していることを明らかにした(非特許文献１０：Qiu, Q.et al. 2010. J Immunol 184: 1681-1689)。
【０００８】
しかしながら、上記文献で明らかにされているのは、いずれもDNAM-1、TIGITのリガンドとしてのCD155の機能であって、CD4+ T細胞上に存在するCD155の受容体としての機能は記載されておらず、またCD155の免疫疾患に対する生体内での機能は明らかにされていない。
【０００９】
また、CD155に対する抗体については、癌の検出方法に使用できることが知られているが（特許文献１：特開２０１１−１５３９９２号公報）、免疫疾患に対する効果は知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開２０１１−１５３９９２号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Murphy, K. M., and S. L. Reiner. 2002. Nat Rev Immunol 2: 933-944
【非特許文献２】Bettelli, E. et al. 2008. Nature 453: 1051-1057
【非特許文献３】Krasteva, M. et al. 1999. EJD 9: 65-76
【非特許文献４】Mendelsohn, C. L.et al. 1989. Cell 56: 855-865
【非特許文献５】Tahara-Hanaoka, S. et al. 2005. Biochem Biophys Res Commun 329: 996-1000
【非特許文献６】Shibuya, A. et al. 1996. Immunity 4: 573-581
【非特許文献７】Nabekura, T. et al. 2010. Proc Natl Acad Sci U S A 107: 18593-18598
【非特許文献８】Maier, M. K. et al. 2007. Eur J Immunol 37: 2214-2225
【非特許文献９】Seth, S. et al. 2009. Eur J Immunol 39: 3160-3170
【非特許文献１０】Qiu, Q.et al. 2010. J Immunol 184: 1681-1689
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明はこのような状況に鑑みてなされたものであり、その解決しようとする課題は、免疫疾患の治療又は予防に有用な医薬組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、CD4+ T細胞上に存在するCD155がTh1分化の誘導に寄与する分子であることを見出した。また、本発明者は、CD155は生体内でTh1型免疫応答を正に制御し、その結果としてTh2型免疫応答を負に制御し、Th1型免疫疾患の増悪及びTh2型免疫疾患の抑制に関与していることを見出した。そして、CD155とリガンドとの結合を阻害する抗CD155抗体を用いることにより、Th1型免疫疾患の治療又は予防が可能であり、他方、CD155を活性化するアゴニスト作用を有する抗CD155抗体を用いることにより、Th2型免疫疾患の治療又は予防が可能であることを見出した。本発明は、これらの知見に基づき完成されたものである。
すなわち、本発明は以下の通りである。
【００１４】
（１）CD155に対する抗体又はその断片を含む、免疫疾患に対する医薬組成物。
（２）免疫疾患がTh1型又はTh2型免疫疾患である、上記（１）に記載の医薬組成物。
（３）Th1型免疫疾患が、Th1型アレルギー疾患、自己免疫疾患、移植による拒絶反応及び移植片対宿主病からなる群から選ばれる少なくとも１種である、上記（２）に記載の医薬組成物。
（４）Th1型アレルギー疾患が、接触性皮膚炎、Th1型気管支喘息及びTh1型アトピー性皮膚炎からなる群から選ばれる少なくとも１種である、上記（３）に記載の医薬組成物。
（５）自己免疫疾患が、関節リウマチ、多発性硬化症、インスリン依存性糖尿病、クローン病、潰瘍性大腸炎、全身性エリテマトーデス、乾癬、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性血小板減少性紫斑病、自己免疫性好中球減少症、重症筋無力症、天疱瘡、慢性甲状腺炎、バセドウ病、自己免疫性肝炎及びグッドパスチャー症候群からなる群から選ばれる少なくとも１種である、上記（３）に記載の医薬組成物。
（６）Th2型免疫疾患が、Th2型気管支喘息、Th2型アトピー性皮膚炎、アレルギー性結膜炎、アレルギー性鼻炎、蕁麻疹、アレルギー性胃腸炎、食物アレルギー及び薬物アレルギーからなる群から選ばれる少なくとも１種である、上記（２）に記載の医薬組成物。
（７）CD155がCD4＋ T細胞上に存在するものである、上記（１）に記載の医薬組成物。
（８）抗体がモノクローナル抗体である、上記（１）に記載の医薬組成物。
（９）抗体が、キメラ抗体、ヒト型化抗体又はヒト化抗体である、上記（８）に記載の医薬組成物。
（１０）少なくとも１種の免疫抑制剤と併用投与するための、上記（１）〜（９）のいずれかに記載の医薬組成物。
（１１）少なくとも１種の免疫抑制剤が、ステロイド、カルシニューリン阻害薬、代謝拮抗型免疫抑制剤、抗体医薬及びアルキル化剤からなる群から選択される少なくとも１種の免疫抑制剤である、上記（１０）に記載の医薬組成物。
【発明の効果】
【００１５】
本発明により、免疫疾患の治療又は予防に有用な医薬組成物を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ヘルパーT細胞（CD4+ T細胞）分化の分子機構と関連疾患を示す模式図である。
【図２】CD155のTh1分化誘導能の検討結果を示す図である。（A）CD155刺激によるサイトカイン産生の検討結果を示す。（B）サイトカイン産生量をELISA にて測定した結果を示す。
【図３】CD155のTh1分化誘導能の検討結果を示す図である。（A）CD155刺激による転写因子の発現解析結果を示す。（B）T-bet及びGATA3の発現をフローサイトメトリー法にて測定した結果を示す。右パネルの棒グラフは、CD4+ T 細胞中のT-bet 陽性細胞、GATA3 陽性細胞の割合を示す。
【図４】CD4+ T細胞におけるERK のリン酸化を解析した結果を示す図である。
【図５】（A）IFN-γ中和とCD155刺激によるSTAT1のリン酸化を解析した結果を示す。（B）IFN-γ欠損とCD155 刺激によるSTAT1のリン酸化を解析した結果を示す。
【図６】(A) IFN-γ中和とCD155刺激によるT-bet の発現解析結果を示す。（B）IFN-γ欠損とCD155 刺激によるT-bet の発現解析結果を示す。
【図７】(A) CD155 刺激によるIκBα の分解の解析結果を示す。（B）CD155 刺激によるNFκB 活性化の解析結果を示す。
【図８】接触性皮膚炎 (CHS) の誘導方法を示す図である。
【図９】WT およびCD155 KO マウスにおけるCHS誘発24時間後の病態の解析結果を示す図である。(A) 図８に示された方法でCHSを誘導し、耳の腫脹を計測した結果を示す。（B）(A)の耳介を採取し、HE 染色により病理組織を観察した結果を示す(200倍、スケールバーは100μm)。
【図１０】局所におけるCD4+ T細胞応答の解析結果を示す図である。（A）感作して5 日目の所属（腋窩）リンパ節を摘出し、リンパ節CD4+ T細胞における細胞内サイトカイン産生をフローサイトメトリー法にて解析した結果を示す。（B）（A）のCD4+T細胞中の各サイトカインの割合を示すグラフである。
【図１１】CD4+ T細胞上のCD155 のCHS への関与を検討した結果を示す図である。耳介の腫脹を計測した結果を示す。
【図１２】接触性皮膚炎（CHS）の誘導方法及び抗体投与方法を示す図である。
【図１３】TX56 の感作前投与によるCHS 病態の解析結果を示す図である。（A）耳介の腫脹を計測した結果を示す。（B）耳介の病理組織をHE 染色により観察した結果を示す（200 倍、スケールバーは100 μm）。
【図１４】TX56 のチャレンジ前投与によるCHS 病態の解析結果を示す図である。（A）耳介の腫脹を計測した結果を示す。（B）耳介の病理組織をHE 染色により観察した結果を示す（200 倍、スケールバーは100 μm）。
【図１５】好酸球性気道炎症の誘導方法を示す図である。
【図１６】BALB/cマウス由来CD4+ T細胞においてCD155刺激によるTh1分化を検討した結果を示す図である。
【図１７】WT及びCD155 KOマウスにおけるIgE産生を検討した結果を示す図である。
【図１８】WT及びCD155 KOマウスにおける好酸球性気道炎症の病態を解析した結果を示す図である。（A）それぞれのマウスのBAL液における好酸球の絶対数を測定した結果を示す。（B）肺の病理組織を観察した結果を示す（200 倍、スケールバーは100 μm）。
【図１９】CD155を介したTh1分化誘導の分子メカニズムを示す模式図である。
【図２０】CD155を介したTh1分化誘導に対するIFN-γの関与を検討した結果を示す図である。
【図２１】CD155を介したNFκBの活性化に対するIFN-γの関与を検討した結果を示す図である。
【図２２】IFN-γ産生に対するCD155の効果を検討した結果を示す図である。（A）マウスCD4＋ナイーブT細胞を抗CD3抗体（anti-CD3）と抗CD155抗体（TX56）又はコントロール抗体（cIg）で刺激し、IFN-γのmRNAの発現を測定した結果を示す。（B）(A)と同様にマウスCD4＋ナイーブT細胞を刺激し、CD4＋T細胞上のIFN-γ受容体をフローサイトメトリー法で検出した結果を示す。
【図２３】ヒトCD4＋T細胞のTh1分化誘導に対するCD155の作用を検討した結果を示す図である。（A）ヒト末梢血中の免疫細胞におけるCD155の発現を測定した結果を示す。（B）ヒト末梢血中のCD4＋T細胞を抗CD3抗体＋抗CD28抗体で刺激し、24時間及び48時間後のCD155の発現を測定した結果を示す。（C）ヒト臍帯血中のCD4＋ナイーブT細胞を抗CD3抗体（anti-CD3）と抗ヒトCD155抗体（TX24）又はコントロール抗体（cIg）で刺激し、PMA/Ionomycinで再刺激した後、細胞内サイトカイン産生を測定した結果を示す。（D）(C)と同様に培養6日目の細胞をPMA/Ionomycinで再刺激した後、培養上清中のサイトカイン濃度を定量した結果を示す。
【図２４】CD155を介したTh1分化誘導の分子メカニズムを示す模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本発明を詳細に説明する。以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施の形態のみに限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、様々な形態で実施をすることができる。
【００１８】
１．概要
本発明は、CD155に対する抗体又はその断片を含む、免疫疾患に対する医薬組成物であり、免疫疾患の治療又は予防に有用なものである。
CD155は、CD8+ T細胞などに存在するDNAM-1のリガンドとしての機能は知られていたが、CD4+ T細胞における受容体としての機能については明らかにされていなかった。
本発明者は、CD4+ T細胞上に存在するCD155の受容体としての機能に着目し、詳細な検討を行った。その結果、驚くべきことに、CD155はCD4+ナイーブT細胞からTh1細胞への分化誘導に寄与していることを見出した。また、本発明者は、CD155は生体内でTh1型免疫応答を正に制御し、その結果としてTh2型免疫応答を負に制御し、Th1型免疫疾患の増悪及びTh2型免疫疾患の抑制に関与していることを見出した。そして、本発明者は、CD155に対する抗体を用いることにより、Th1/Th2バランスを制御し、Th1型免疫疾患及びTh2型免疫疾患を含む幅広い免疫疾患の治療及び／又は予防が可能であることを見出した。例えば、CD155とリガンドとの結合を阻害する抗CD155抗体（阻害抗体）を用いることにより、Th1/Th2バランスがTh2に傾き、Th1型免疫疾患を治療又は予防することができる。他方、CD155を活性化するアゴニスト作用を有する抗CD155抗体（アゴニスト抗体）を用いることにより、Th1/Th2バランスがTh1に傾き、Th2型免疫疾患を治療又は予防することができる。
本発明はこのような知見に基づき完成されたものである。
【００１９】
２．CD155
本発明において、CD155は、CD4+ナイーブT細胞からTh1細胞への分化を誘導するとともに、Th1型免疫疾患の病態（症状）の悪化に関与するタンパク質であることが見出された。また、CD155は生体内においてTh2型免疫疾患を抑制していることが見出された。
本発明におけるCD155は、膜結合型（膜型）タンパク質であることが好ましく、免疫細胞上に存在（発現）するものが好ましい。免疫細胞としては、例えば、CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、ナチュラルキラー（NK）細胞、B細胞、抗原提示細胞（マクロファージ、樹状細胞等）等が挙げられる。本発明において、CD155はCD4+ T細胞上に存在するものが好ましい。
本発明におけるCD155は、任意の哺乳動物に由来するものであってもよく、そのような哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、サル、ヒトが挙げられ、好ましくは、マウス、ラット、ヒトであり、より好ましくはヒトである。
【００２０】
本発明において、マウス、ラット及びヒトのCD155のアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号２、４及び６で表される。また、マウス、ラット及びヒトのCD155をコードするDNAの塩基配列は、それぞれ、配列番号１、３及び５で表される。各アミノ酸配列及び塩基配列は、それぞれGenBankデータベースにおいて、所定のアクセッション番号（Accession No.）により登録されている。
【００２１】
マウスCD155のアミノ酸配列：NP_081790.1（配列番号２）
ラットCD155のアミノ酸配列：NP_058772.2（配列番号４）
ヒトCD155のアミノ酸配列：NP_006496.3（配列番号６）
マウスCD155をコードするDNAの塩基配列：NM_027514.2（配列番号１）
ラットCD155をコードするDNAの塩基配列：NM_017076.2（配列番号３）
ヒトCD155をコードするDNAの塩基配列：NM_006505.3（配列番号５）
【００２２】
本発明で用いられるCD155には、以下の（a）又は(b)のタンパク質が含まれる。
(a) 配列番号２、４若しくは６で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質
(b) 配列番号２、４若しくは６で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつDNAM-1と結合する活性を有するタンパク質
（c）配列番号２、４若しくは６で表されるアミノ酸配列に対して80％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつDNAM-1と結合する活性を有するタンパク質
【００２３】
本発明において、「配列番号２、４若しくは６で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質」には、配列番号２、４若しくは６で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質が含まれる。
また、「配列番号２、４若しくは６で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列」としては、例えば、
(i) 配列番号２、４又は６で表されるアミノ酸配列中の１〜１０個（例えば、１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１〜２個、さらに好ましくは１個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、
(ii) 配列番号２、４又は６で表されるアミノ酸配列中の１〜１０個（例えば、１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１〜２個、さらに好ましくは１個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、
(iii) 配列番号２、４又は６で表されるアミノ酸配列に１〜１０個（例えば、１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１〜２個、さらに好ましくは１個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、
(iv) 上記(i)〜(iii) の組合せにより変異されたアミノ酸配列
などが挙げられる。
【００２４】
本発明において「DNAM-1と結合する活性」とは、DNAM-1（CD226）と特異的に結合する活性を意味する。当該結合活性の有無については、公知の方法、例えば免疫沈降法、ウェスタンブロッティング、EIA（enzyme immunoassay）、ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)などの免疫学的手法やプルダウンアッセイ等の方法を用いることにより測定することができる。また、「DNAM-1と結合する活性」とは、配列番号２、４又は６に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質の活性を100としたときと比較して、少なくとも10%以上、20％以上、30%以上、40%以上、50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、好ましくは90%以上の活性を有することを意味する。
【００２５】
また、本発明におけるCD155には、配列番号２、４又は６で表されるアミノ酸配列のほか、配列番号２、４又は６で表されるアミノ酸配列と80％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつDNAM-1と結合する活性を有するタンパク質が挙げられる。このようなタンパク質としては、配列番号２、４又は６で表されるアミノ酸配列に対して、約80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、又は99％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつDNAM-1と結合する活性を有するもの（配列番号２、４、６で表されるアミノ酸配列と実質的に同等のアミノ酸配列）も含まれる。相同性は、インターネットを利用したホモロジー検索サイト、例えば日本DNAデータバンク（DDBJ）において、FASTA、BLAST、PSI-BLAST等の相同性検索を利用できる。また、National Center for Biotechnology Information (NCBI) において、BLASTを用いた検索を行うこともできる。
【００２６】
上記の変異を有するタンパク質を調製するために、該タンパク質をコードするDNAに変異を導入するには、Kunkel法やGapped duplex法等の部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット、例えばQuikChangeTM Site-Directed Mutagenesis Kit（ストラタジーン社製）、GeneTailorTM Site-Directed Mutagenesis System（インビトロジェン社製）、TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System（Mutan-K、Mutan-Super Express Km等：タカラバイオ社製）等を用いて行うことができる。また、「Molecular Cloning, A Laboratory Manual(4th edition)」（Cold Spring Harbor Laboratory Press (2012)）等に記載された部位特異的変異誘発法等の方法を用いることができる。
【００２７】
３．CD155に対する抗体
本発明において、CD155に対する抗体とは、上記CD155と特異的に結合する抗体を意味する。CD155に対する抗体はポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよいが、好ましくはモノクローナル抗体である。また、CD155に対する抗体には、CD155とリガンドとの結合を阻害する阻害抗体、及びCD155を活性化するアゴニスト作用を有する抗体（アゴニスト抗体）の両者が含まれる。本発明者は、CD4+ T細胞上に存在するCD155のリガンドがDNAM-1であることを見出している。
【００２８】
本明細書においては、CD155タンパク質と特異的に結合する抗体を「抗CD155抗体」とも称する。
本発明において、「特異的に結合する」とは、CD155には結合する（反応する）が、CD155以外には結合しない（反応しない）ことを意味する。結合が特異的か否かであることの確認は、免疫学的手法、例えばELISA法、ウエスタンブロット法、又は免疫組織学的染色等によって確認することができる。
【００２９】
以下、抗CD155抗体の調製方法について説明する。
（１）抗原の調製
CD155は、本発明の抗体を作製するための免疫原として使用される。
免疫原としてCD155を用いる場合、CD155の全長配列のうち一部のアミノ酸配列を含むペプチドを使用することもできる。抗原又は免疫原として用いられるCD155及び変異の導入方法等の説明については、上記「２．CD155」に記載した通りである。
【００３０】
CD155は、マウス、ラット、ヒト等の組織や細胞から精製された天然型のCD155でもよいし、遺伝子工学的に生産されたCD155でもよい。例えば、CD155が認められる生体試料を各種界面活性剤、例えばTriton-X、Sarkosylなどを用い、可溶性画分と不溶性画分に分画する。さらに不溶性画分を尿素やグアニジン塩酸などに溶解し、各種カラム、例えばヘパリンカラムあるいは結合樹脂に結合させることによりCD155を得ることができる。また、抗原として用いるCD155は、そのアミノ酸配列を指定することにより、固相法などの公知のタンパク質合成法又は市販のタンパク質合成装置を用いて合成することもできる。合成したペプチドは、Keyhole Limpet Hemocyanin（KLH）又はThyroglobulinなどの担体タンパク質と結合させ、免疫原として用いることができる。
【００３１】
（２）ポリクローナル抗体の作製
前記のようにして作製したCD155又は部分ペプチドをそれ自体で、あるいは担体、希釈剤と共に非哺乳動物、例えばウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヤギ等に投与することにより免疫する。抗原の動物１匹当たりの投与量は、アジュバントを用いるときは0.1〜10 mgである。アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント（FCA）、フロイント不完全アジュバント（FIA）、水酸化アルミニウムアジュバント等が挙げられる。免疫は、主として静脈内、皮下又は腹腔内等に注入することにより行われる。また、免疫の間隔は特に限定されず、数日から数週間間隔、好ましくは1〜2週間間隔で、2〜10回、好ましくは3〜5回免疫を行う。免疫の間隔は、当業者であれば得られる抗体価を勘案して設定することができる。3〜4回皮下免疫を行った時点で試採血を行い、抗体価を測定することが好ましい。血清中の抗体価の測定は、ELISA（enzyme-linked immunosorbent assay）、EIA（enzyme immunoassay）、放射性免疫測定法（RIA; radioimmuno assay）等によって行うことができる。抗体価が十分上昇したことを確認した後、全採血し、通常行われる方法により抗体を分離精製することができる。分離精製は、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の公知の方法を適宜選択して、又はこれらを組み合わせることにより、精製することができる。具体的には、目的の抗体を含有する血清を、CD155以外のタンパク質を結合したカラムに通し、素通り画分を採取することにより、CD155に対する特異性を向上させたポリクローナル抗体を得ることができる。
【００３２】
（３）モノクローナル抗体の作製
(i) 抗体産生細胞の採取
ポリクローナル抗体の作製と同様に、CD155又は部分ペプチドをそれ自体で、あるいは担体及び希釈剤と共に非哺乳動物に投与することにより免疫する。動物１匹当たりの抗原の投与量、用いられるアジュバントの種類、免疫方法、免疫の間隔はポリクローナル抗体の作製と同様である。最終の免疫日から1〜30日後、好ましくは2〜5日後に、抗体価の認められた個体を選択し抗体産生細胞を採集する。抗体産生細胞としては、脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血細胞等が挙げられるが、脾臓細胞又はリンパ節細胞が好ましい。
【００３３】
(ii) 細胞融合
ハイブリドーマを得るため、抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合を行う。融合操作は既知の方法、例えばKohlerらの方法に従い実施できる。抗体産生細胞と融合させるミエローマ細胞として、マウスなどの動物の一般に入手可能な株化細胞を使用することができる。使用する細胞株としては、薬剤選択性を有し、未融合の状態ではHAT選択培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジンを含む）で生存できず、抗体産生細胞と融合した状態でのみ生存できる性質を有するものが好ましい。ミエローマ細胞としては、例えばSP2/O-Ag14、PAI、P3U1、NSI/1-Ag4-1、NSO/1などのマウスミエローマ細胞株、YB2/0などのラットミエローマ細胞株などが挙げられる。
【００３４】
上記ミエローマ細胞と抗体産生細胞との細胞融合は、血清を含まないDMEM、RPMI-1640培地などの動物細胞培養用培地中で、1×108〜5×108個の抗体産生細胞と2×107〜10×107個のミエローマ細胞とを混合し（抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞比10：1〜1：1）、細胞融合促進剤存在のもとで融合反応を行う。細胞融合促進剤として、平均分子量1000〜6000ダルトンのポリエチレングリコール又はセンダイウイルス等を使用することができる。また、電気刺激（例えばエレクトロポレーション）を利用した市販の細胞融合装置を用いて抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させることもできる。
【００３５】
(iii) ハイブリドーマの選別及びクローニング
細胞融合処理後の細胞から目的とするハイブリドーマを選別する。その方法として、細胞懸濁液を、例えば10〜20%のウシ胎児血清含有RPMI-1640培地などで適当に希釈後、マイクロタイタープレート上に限界希釈法で計算上0.3 個／well程度まき、各ウェルにHAT培地などの選択培地を加え、以後適当に選択培地を交換して培養を行う。その結果、選択培地で培養開始後、10日前後から生育してくる細胞をハイブリドーマとして得ることができる。
【００３６】
次に、生育してきたハイブリドーマをさらにスクリーニングする。ハイブリドーマのスクリーニングは、通常の方法に従えばよく、特に限定されるものではない。例えば、ハイブリドーマを培養したウェルに含まれる培養上清の一部を採集し、酵素免疫測定法、放射性免疫測定法等によって、スクリーニングすることができる。具体的には、96ウエルプレートに抗原を吸着させた後、仔牛血清でブロッキングする。ハイブリドーマ細胞の培養上清を固相化した抗原に37℃で1時間反応させた後、ペルオキシダーゼ標識した抗マウスIgGを37℃で1時間反応させ、オルトフェニレンジアミンを基質として用いて発色させる。酸で反応を停止させた後、490nmの波長における吸光度を測定することにより、スクリーニングすることができる。上記測定法により陽性を示したモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを、限界希釈法等によりクローニングする。そして、最終的に、CD155に特異的に結合するモノクローナル抗体を産生する細胞であるハイブリドーマを樹立する。
【００３７】
(iv) モノクローナル抗体の採取
樹立したハイブリドーマからモノクローナル抗体を採取する方法として、通常の細胞培養法又は腹水形成法等を採用することができる。細胞培養法においては、ハイブリドーマを10％ウシ胎児血清含有RPMI-1640培地、MEM培地又は無血清培地等の動物細胞培養培地中で、通常の培養条件（例えば37℃、5% CO2濃度）で7〜14日間培養し、その培養上清から抗体を取得する。腹水形成法の場合は、ミエローマ細胞由来の哺乳動物と同種系動物、例えばマウス（BALB/c）の腹腔内にハイブリドーマを約5×106 〜2×107個投与し、ハイブリドーマを大量に増殖させる。そして、1〜2週間後に腹水を採取する。上記抗体の採取方法において抗体の精製が必要とされる場合は、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィーなどの公知の方法を適宜選択して、又はこれらを組み合わせることにより精製することができる。
【００３８】
（４）遺伝子組換え抗体の作製
本発明の抗体の好ましい態様の一つとして、遺伝子組換え抗体が挙げられる。遺伝子組換え抗体としては、限定はされないが、例えば、キメラ抗体、ヒト型化抗体及びヒト化抗体等が挙げられる。
【００３９】
キメラ抗体（すなわちヒト型キメラ抗体）は、マウス由来抗体の可変領域をヒト由来の定常領域に連結（接合）した抗体であり（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 6851-6855, (1984) 等を参照）、キメラを作製する場合は、そのように連結した抗体が得られるよう、遺伝子組換え技術によって容易に構築できる。
【００４０】
ヒト型化抗体を作製する場合は、いわゆるCDRグラフティング（CDR移植）と呼ばれる手法を採用することができる。CDRグラフティングとは、マウス抗体の可変領域から相補性決定領域（CDR）をヒト可変領域に移植して、フレームワーク領域（FR）はヒト由来のものでCDRはマウス由来のものからなる、再構成した可変領域を作製する方法である。次に、これらのヒト型化された再構成ヒト可変領域をヒト定常領域に連結する。このようなヒト型化抗体の作製法は、当分野において周知である（Nature, 321, 522-525 (1986)；J. Mol. Biol., 196, 901-917 (1987)；Queen C et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 10029-10033 (1989)；特許第2828340号公報等を参照）。
【００４１】
ヒト化抗体（完全ヒト抗体）は、一般にV領域の抗原結合部位である超可変領域（hyper variable region）、V領域のその他の部分及び定常領域の構造が、ヒトの抗体と同じ構造を有するものである。ヒト化抗体を作製する技術も公知であり、ヒトに共通の遺伝子配列については遺伝子工学的手法によって作製する方法が確立されている。ヒト化抗体は、例えば、ヒト抗体のH鎖及びL鎖の遺伝子を含むヒト染色体断片を有するヒト抗体産生マウスを用いた方法（Tomizuka, K.et al., Nature Genetics, (1977)16, 133-143; Kuroiwa, Y.et.al., Nuc. Acids Res., (1998)26, 3447-3448; Yoshida, H.et.al., Animal Cell Technology: Basic and Applied Aspects,(1999)10, 69-73 (Kitagawa, Y.,Matuda, T. and Iijima, S. eds.), Kluwer Academic Publishers; Tomizuka, K.et.al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (2000)97, 722-727 等を参照）や、ヒト抗体ライブラリーより選別したファージディスプレイ由来のヒト抗体を取得する方法（Wormstone, I. M.et.al, Investigative Ophthalmology & Visual Science., (2002)43 (7), 2301-8; Carmen, S. et.al., Briefings in Functional Genomics and Proteomics,(2002)1 (2), 189-203; Siriwardena, D. et.al., Opthalmology, (2002)109 (3), 427-431 等を参照）により取得することができる。
また、本発明においては、ハイブリドーマ又は当該ハイブリドーマから抽出したDNA若しくはRNAなどを原料として、上述した周知の方法に準じてキメラ抗体、ヒト型化抗体、ヒト化抗体を作製することができる。
【００４２】
（５）抗体断片の作製
本発明で使用されるCD155に対する抗体の断片は、CD155に特異的に結合する。
抗体の断片は、本発明の抗体の一部分の領域を意味し、例えば、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、diabody（dibodies）、dsFv、scFv（single chain Fv）などが挙げられる。上記抗体断片は、本発明の抗体を目的に応じて各種タンパク質分解酵素で切断することにより得ることができる。
例えば、Fabは、抗体分子をパパインで処理することにより、F(ab')2は、抗体分子をペプシンで処理することによりそれぞれ得ることができる。また、Fab'は、上記F(ab')2のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断することで得ることができる。
scFvの場合は、抗体のH鎖V領域及びL鎖V領域をコードするcDNAを取得し、scFvをコードするDNAを構築する。このDNAを発現ベクターに挿入し、当該発現ベクターを宿主生物に導入して発現させることにより、scFvを製造することができる。
diabodyの場合は、抗体のH鎖V領域及びL鎖V領域をコードするcDNAを取得し、ペプチドリンカーのアミノ酸配列の長さが８残基以下となるようにscFvをコードするDNAを構築する。このDNAを発現ベクターに挿入し、当該発現ベクターを宿主生物に導入して発現させることにより、diabodyを製造することができる。
dsFvの場合は、抗体のH鎖V領域及びL鎖V領域をコードするcDNAを取得し、dsFvをコードするDNAを構築する。このDNAを発現ベクターに挿入し、当該発現ベクターを宿主生物に導入して発現させることにより、dsFvを製造することができる。
【００４３】
（６）結合親和性
結合親和性は、結合定数(KA)及び解離定数(KD)により決定することができる。親和性平衡定数(K)はKA/KDの比で表される。その結合親和性は、以下のようにして検出することができる。
結合親和性は、少なくとも1×10-10 Mの解離定数(KD)を有しており、この解離定数に対し、例えば2〜5倍、5〜10倍、10〜100倍、100〜1000倍又は1000〜10,000倍高い親和性を有する。具体的には、本発明の抗体は、CD155の結合親和性に関する解離定数(KD)が、1×10-10 M、5×10-11 M、1×10-11 M、5×10-12 M、1×10-12 M、5×10-13 M、1×10-13 M、5×10-14 M、1×10-14 M、5×10-15 M、又は1×10-15 Mであり、1×10-10 M〜1×10-13 Mであることがより好ましい。あるいはこれらのKDよりも低い値であり高親和性であってもよい。
ここで、親和性の測定対象となる抗体の解離定数(KD)が、本発明の抗体のKDの約1〜100倍以内であるときは、当該抗体は、本発明の抗体と実質的に同一であるとして本発明に含まれる。
結合定数(KA)及び解離定数(KD)は、表面プラスモン共鳴(SPR)を用いて測定することができ、結合率をリアルタイムで検出し、さらにモニタリングする公知の機器及び方法を採用することができる（例えばBiacore（登録商標）T200(GE Healthcare社）、ProteON XPR36 (Bio-Rad社)など）。
【００４４】
本発明のCD155に対する抗体には、当該抗体が結合する部位（例えばエピトープ）に結合する抗体、例えば、本願実施例に記載のTX56が結合する部位に結合する抗体が含まれる。本発明の抗CD155抗体が結合する部位は、抗原であるCD155の少なくとも一部であればよく、限定されない。
【００４５】
４．医薬組成物
本発明の医薬組成物は、上記「３．CD155に対する抗体」に記載した抗体又はその断片を有効成分として含有するものであり、免疫疾患の予防又は治療用として使用され、当該予防又は治療に有効な医薬組成物である。
本発明者は、CD155が生体内でTh1型免疫応答を正に制御し、その結果としてTh2型免疫応答を負に制御し、Th1型免疫疾患の増悪及びTh2型免疫疾患の抑制に関与していることを見出した。そして、CD155とリガンドとの結合を阻害する抗CD155抗体（阻害抗体）を用いることにより、Th1型免疫疾患の治療又は予防が可能であり、他方、CD155を活性化するアゴニスト作用を有する抗CD155抗体（アゴニスト抗体）を用いることにより、Th2型免疫疾患の治療及び予防が可能であることを見出した。阻害抗体とアゴニスト抗体のいずれを用いるかは、当業者であれば対象となる患者の病態、治療又は予防の目的に応じて適宜選択することができる。
【００４６】
本発明において、「免疫疾患」とは、免疫応答が関与する疾患を意味し、このような疾患としては、例えば、Th1型免疫疾患、Th2型免疫疾患、その他Th17細胞が関与する疾患などが挙げられる。
【００４７】
Th1型免疫疾患は、主にTh1細胞による免疫応答が関与する免疫疾患を意味し、このような疾患としては、例えば、Th1型アレルギー疾患、自己免疫疾患、移植による拒絶反応、移植片対宿主病などが挙げられるが、これらに限定されない。Th1型免疫疾患は、少なくともTh1細胞による免疫応答が関与する免疫疾患であればよく、Th1細胞に加えてTh2細胞及び／又はTh17細胞がさらに関与する疾患もこれに含まれる。Th1型免疫疾患にIgEは関与しない。
【００４８】
Th1型アレルギー疾患とは、主にTh1細胞による免疫応答が関与するアレルギーであって、IgEが関与しないアレルギーを意味し、このようなアレルギー疾患としては、例えば、接触性皮膚炎、Th1型気管支喘息、Th1型アトピー性皮膚炎などが挙げられるが、これらに限定されない。Th1型アレルギー疾患は、少なくともTh1細胞による免疫応答が関与するアレルギーであればよく、Th1細胞に加えてTh2細胞及び／又はTh17細胞がさらに関与するアレルギーもこれに含まれる。
【００４９】
自己免疫疾患は、自己の構成成分（自己抗原）に対する免疫応答によって発生する疾患を意味し、そのような疾患としては、例えば、関節リウマチ、多発性硬化症、インスリン依存性糖尿病、クローン病、潰瘍性大腸炎、全身性エリテマトーデス、乾癬、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性血小板減少性紫斑病、自己免疫性好中球減少症、重症筋無力症、天疱瘡、慢性甲状腺炎、バセドウ病、自己免疫性肝炎、グッドパスチャー症候群などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５０】
Th2型免疫疾患は、主にTh2細胞による免疫応答が関与する免疫疾患を意味し、このような疾患としては、例えば、Th2型気管支喘息、Th2型アトピー性皮膚炎、アレルギー性結膜炎、アレルギー性鼻炎（例えば花粉症）、蕁麻疹、アレルギー性胃腸炎、食物アレルギー及び薬物アレルギーなどが挙げられるが、これらに限定されない。
Th2型免疫疾患は、主にTh2細胞による免疫応答が関与する免疫疾患であればよく、Th2細胞に加えてTh1細胞及び／又はTh17細胞がさらに関与する疾患もこれに含まれる。Th2型免疫疾患にはIgEが関与する。
【００５１】
接触性皮膚炎とは、外来性の刺激物質や抗原が皮膚に接触することによって発症する湿疹性の炎症反応を指す（日本皮膚科学会接触皮膚炎診療ガイドライン、日皮会誌：119（9），1757‐1793，2009）。接触性皮膚炎としては、刺激性接触性皮膚炎、アレルギー性接触性皮膚炎、光接触性皮膚炎（光毒性接触性皮膚炎、光アレルギー性接触性皮膚炎）、全身性接触性皮膚炎、接触性皮膚炎症候群などが挙げられる。本発明において、接触性皮膚炎としては、アレルギー性接触性皮膚炎、光アレルギー性接触性皮膚炎が好ましい。
【００５２】
アレルギー性接触性皮膚炎は、微量の接触性アレルゲン（例えばハプテン）で生じる皮膚炎である。アレルギー性接触皮膚炎の発症には感作相（sensitization phase）と惹起相（elicitation phase）があるとされている。感作相においては、接触性アレルゲンが皮膚表面から表皮内を通過してタンパク質と結合し、アレルゲン−タンパク質結合物を形成する。このアレルゲン−タンパク質結合物を抗原提示細胞が捕獲して所属リンパ節に遊走し抗原情報をT細胞に伝えることにより、感作が成立すると考えられている。惹起相はまだ明らかにされていないことが多いが、感作が成立した個体に再びアレルゲンが接触した後、最終的にエフェクターT細胞が表皮に遊走し、再び皮膚、特に表皮内に集まり種々のサイトカインを局所に放出し、活性化されたT細胞が表皮細胞を障害、もしくはTNF-α により直接表皮細胞が障害され、湿疹性の組織反応が形成されアレルギー性接触皮膚炎が発症すると考えられている。
【００５３】
光アレルギー性接触性皮膚炎は，UVA 照射によって生じる接触性皮膚炎であり、T 細胞が媒介する。通常のアレルギー性接触皮膚炎と同様、感作相と惹起相が存在するが、UVA 照射という操作が加わらなければ発症しない。感作物質は光ハプテンであり、UV 照射がなされるとその一部が光分解され、近傍の蛋白と共有結合する。皮膚に感作物質が接触しUVA が照射されると、皮膚樹状細胞が光ハプテン修飾を受け、光抗原を担った樹状細胞は、リンパ節に移動しナイーブT 細胞を感作する。
【００５４】
接触性皮膚炎の刺激物質又は接触アレルゲンとしては、例えば、金属（例えばコバルト、ニッケル、クロム等）、ウルシなどの植物、光ハプテン、薬剤（例えば消炎鎮痛外用薬（湿布）に含まれるインドメタシン等）、衣類（例えば樹脂加工に使用されるホルムアルデヒド等）などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５５】
気管支喘息は、アレルギー反応や感染などによる炎症が慢性化することにより、気道過敏性の亢進、可逆性の気道狭窄などが生じ、発作的な喘鳴、咳などの症状をきたす呼吸器疾患である。気管支喘息には、Th1細胞により誘導される気管支喘息（Th1型気管支喘息）、Th2細胞により誘導される気管支喘息（Th2型気管支喘息）、並びにTh1及びTh2により誘導される気管支喘息に分類される。
【００５６】
本発明において、「治療」とは、疾患の発症後に本発明の医薬組成物を被験者に接触させる（例えば、投与する）ことにより、接触させない場合に比べて、当該疾患の症状を軽減することを意味し、必ずしも疾患の症状を完全に抑制することを意味するものではない。疾患の発症とは、疾患の症状が身体に現れることを意味する。
本発明において、「予防」とは、疾患の発症前に本発明の医薬組成物を被験者に接触させる（例えば、投与する）ことにより、接触させない場合に比べて、疾患の発症後の症状を軽減することを意味し、必ずしも発症を完全に抑制することを意味するものではない。
免疫疾患の「症状」としては、例えば、発赤、腫脹、発熱、疼痛、機能障害等の炎症に起因する症状、かゆみ、水泡、潰瘍（重症例）等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５７】
本発明の医薬組成物は、本発明のCD155に対する抗体のほか、薬学的に許容できる担体を含むことができる。「薬学的に許容できる担体」とは、免疫疾患に対する医薬組成物に適する任意の担体（リポソーム、脂質小胞体、ミセル等）、希釈剤、賦形剤、湿潤剤、緩衝剤、懸濁剤、潤滑剤、アジュバント、乳化剤、崩壊剤、吸収剤、保存料、界面活性剤、着色料、着香料、又は甘味料を指す。
【００５８】
本発明の医薬組成物は、注射剤、凍結乾燥品、錠剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、顆粒剤、散剤、丸剤、シロップ剤、坐剤、バップ剤、軟膏剤、クリーム剤、点眼剤等の剤型をとることができる。注射剤などの液体製剤は、使用前に生理食塩水等で溶解する用時調製用粉末（例えば凍結乾燥粉末）の形態であってもよい。
【００５９】
本発明の医薬組成物は、当業者に既知である任意の手段によって局所的又は全身に投与することができる。本発明の医薬組成物の投与経路としては、経口投与及び非経口投与のいずれも可能であり、非経口投与の場合は、組織内投与（皮下投与、腹腔内投与、筋肉内投与、静脈内投与など）、皮内投与、局所投与（経皮投与など）又は経直腸的に投与することができる。本発明の医薬組成物は、これらの投与経路に適した投与形態で投与することができる。
【００６０】
本発明の医薬組成物の投与量は、被験者の年齢、体重、健康状態、性別、症状、投与経路、投与回数、剤型などの要因に応じて変化し、具体的な投与手順は当業者により設定することができる。例えば、成人には、本発明の医薬組成物を錠剤として投与する場合に0.1μg〜10 g、好ましくは1μg〜1 g、より好ましくは10μg〜100 mgを一日に１〜５回投与することができる。
【００６１】
投与時期は、症状に応じて適宜定めることができ、複数回分を同時に又は時間を置いて別々に投与することができる。また、本発明の医薬組成物は、疾患の発症前に被験者に投与してもよいし、疾患の発症後に投与してもよい。例えば、接触性皮膚炎においては、感作相の前若しくは後、及び／又は惹起相の前若しくは後のいずれに投与してもよい。
【００６２】
本発明の医薬組成物は、哺乳動物を被験者として投与することができる。哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ヤギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、ウマ、サル、ヒトなどが挙げられる。
本発明においては、CD155に対する抗体又はこれを含む医薬組成物を被験者に投与することにより、免疫疾患を治療又は予防することができる。すなわち、本発明の医薬組成物は、免疫疾患の治療又は予防方法に使用することができる。
【００６３】
５．併用療法
本発明の医薬組成物は、免疫抑制剤の少なくとも１種と併用投与するために用いることができる。本発明の医薬組成物等と免疫抑制剤の少なくとも1種とを併用投与することにより、それぞれ単独で用いるよりもさらに優れた効果が期待される。優れた効果には、治療効果を維持しつつ従来よりも副作用を軽減するという効果が含まれる。
本発明において「併用」とは、本発明の医薬組成物等と免疫抑制剤の少なくとも1種とを、同時又は別々に投与することを意味する。「同時」とは、一つの投与スケジュールにおいて同一のタイミングで投与されることを意味し、投与の時分が完全に同一である必要はない。「別々」とは、一つの投与スケジュールにおいて異なるタイミングで投与されることを意味する。
本発明の併用療法に用いる医薬組成物及び免疫抑制剤の投与形態、投与経路、投与対象は特に限定されず、上記「４．医薬組成物」の記載に準じて適宜選択することができる。また、併用する薬剤の投与形態又は投与量が互いに異なっていてもよく、その併用する組み合わせにより、適宜調整することができる。
本発明の医薬組成物を免疫抑制剤と併用する場合は、投与量を適宜減らすことも可能である。従って、本発明の医薬組成物と免疫抑制剤との組合せにおいては、
(i) 本発明の医薬組成物の有効量と、免疫抑制剤の有効量、
(ii) 本発明の医薬組成物の有効量と、免疫抑制剤の非有効量、
(iii) 本発明の医薬組成物の非有効量と、免疫抑制剤の有効量、及び
(iv) 本発明の医薬組成物の非有効量と、免疫抑制剤の非有効量
の組合せを採用することができる。
医薬組成物及び免疫抑制剤の一方又は両者が非有効量の使用態様であっても、併用により薬理効果を発揮することができる場合は、そのような態様により併用投与することができる。
例えば、本発明のCD155に対する抗体と、免疫抑制剤とを併用する場合の割合は、限定されるものではないが、例えば、約1000〜1：1、好ましくは約100〜1：1、より好ましくは約10〜1：1である。
【００６４】
本発明に使用される免疫抑制剤としては、ステロイド、カルシニューリン阻害薬、代謝拮抗型免疫抑制剤、抗体医薬、アルキル化剤などが挙げられる。
ステロイドとしては、例えば、メチルプレドニゾロン、ソルメドロールなどが挙げられる。カルシニューリン阻害薬としては、例えば、タクロリムス、シクロスポリン、シロリムスなどが挙げられる。代謝拮抗型免疫抑制剤としては、例えば、ミゾリビン、ミコフェノール酸モフェチル、アザチオプリン、メルカプトプリン、メトトレキサートなどが挙げられる。抗体医薬としては、例えば、ムロモナブCD3、抗リンパ球グロブリン（ALG）、パシリキシマブなどが挙げられる。アルキル化剤としては、例えばシクロフォスファミドなどが挙げられる。
【００６５】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００６６】
１．材料及び方法
（１）マウス
C57BL/6マウス及びBALB/cマウスは8〜12週齢を用い、Clea Japan, Inc (Tokyo, Japan) より購入した。C57BL/6背景及びBALB/cA背景CD155遺伝子欠損マウスはGunter Bernhardt博士らによって作製された（Maier, M. K. et al. 2007. Eur J Immunol 37: 2214-2225）。
IFN-γ遺伝子欠損マウスとRag-1遺伝子欠損マウスはJackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) より購入した。いずれもSPF (specific pathogen free) の環境下にて飼育し、筑波大学生命科学動物資源センターの規約に従い実験を行った。
【００６７】
（２）抗体、サイトカイン
抗マウスCD3、CD4、CD8、CD62L、CD44、Siglec-F、CD11b、CD16/32、IFN-γ、IL-4、IL-17抗体及びアイソタイプコントロール抗体は、BD Bioscience (San Jose, CA, USA) より購入した。抗マウスT-bet、GATA-3抗体はeBioscience (San Diego, CA, USA) より購入した。抗リン酸化マウスERK、STAT1およびERK、STAT1、IκBα抗体はCell Signaling (Danvers, MA, USA) より購入した。抗マウスNFκB抗体はSanta Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA) より購入した。抗マウスβ-actin抗体はSigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) より購入した。ELISAに用いた精製およびビオチン化抗マウスIFN-γ、IgE抗体はBD Bioscienceより、horseradish peroxidase (HRP) 標識ストレプトアビジン、抗ラットIgG、抗マウスIgG抗体はGE Healthcare Biosciences (Little Chalfont, UK) より購入した。
CD155に対する抗体（抗CD155抗体 (TX56)）は、以下のようにして作製した。
マウスCD155を抗原として用いてWisterラットに免疫した後、10〜30日後に当該ラットから脾臓またはリンパ節を採取し、脾臓細胞またはリンパ節細胞とミエローマ細胞株とをペグチン等により融合し、さらに融合細胞から抗体産生ハイブリドーマをスクリーニングすることによりTX56産生ハイブリドーマを取得した。TX56産生ハイブリドーマをマウスの腹腔内に投与し、ハイブリドーマを大量に増殖させた。1〜2週間後に腹水を採取し、ラット抗マウスCD155抗体（TX56）として用いた。
本発明者らが作製した抗CD155抗体 (TX56)及び抗DNAM-1抗体 (TX42) のアイソタイプは、いずれもラットIgG2aである。またいずれもリガンドとの結合を阻害する抗体であり、生体内において免疫細胞を除去しない。抗CD155抗体 (TX56)の作製方法の詳細は、Tahara-Hanaoka S, et al. (2006) Blood 107: 1491-1496、Iguchi-Manaka A, et al. (2008) J Exp Med 205: 2959-2964、Nabekura T, et al. (2010) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 107: 18593-18598などに記載されている。
また、本実施例で用いたマウス抗ヒトCD155抗体（TX24）（Tahara-Hanaoka, S. et al. (2004) Int Immunol 16:533-538)は、抗原としてヒトCD155を用い、免疫動物としてマウスを用いた以外は上記TX56の作製方法と同様の方法により作製した。
リコンビナントマウスIL-2はBD Bioscienceより購入した。
【００６８】
（３）フローサイトメトリー解析
洗浄液（2%ウシ胎児血清を加えたPBS）にて洗浄した細胞浮遊液を1×106個／サンプルに調整し、氷上で抗CD16/32抗体（2.4G2）0.5μgにてFcレセプターに対するブロックを10分行った後、一次抗体にて氷上で20分反応させ、次いで二次抗体にて氷上で20分反応させ染色を行った。細胞を洗浄液（2%ウシ胎児血清を加えたPBS）で洗浄後、フローサイトメトリー法にて解析を行った。フローサイトメーターはFACSCalibur (BD) を用いた。データ解析はCellquest Pro (BD) およびFloJo (Tree Star, OR, USA) を用いた。
【００６９】
（４）In vitroでのCD4+ T細胞刺激実験
C57BL/6N野生型マウスより脾細胞を採取し、0.75%塩化アンモニウム溶液にて溶血後、細胞を洗浄液（2%ウシ胎児血清を加えたPBS）にて洗浄し、MACS (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany) にてCD4+ T細胞をポジティブセレクションで得た。純度は95%以上である。CD4+ T細胞を、抗CD3抗体 (0.25μg/ml) と抗CD155抗体あるいはrat IgG2aアイソタイプコントロール (20μg/ml) を37℃で2時間プレートコートしたウェルに、5×104個ずつ播種し、10%ウシ胎仔血清（Biological Industries, Kibbutz Beit-Haemek, Israel）、50μM 2-メルカプトエタノール (Sigma)、100U/mlペニシリン/0.1mg/mlストレプトマイシン（Sigma）含有の、コンプリートRPMI (Sigma）(以下「培養メディウム」と称する)にて、37℃、5%CO2環境下にて培養した。CD4+ナイーブT細胞は、MACSで採取したCD4+細胞を抗CD4抗体、抗CD62L抗体で染色し、FACSAria (BD) にてCD4+CD62Lhighの分画をソーティングして得た。CD4+ナイーブT細胞は、抗CD3抗体 (1μg/ml) と抗CD155抗体あるいはrat IgG2a (20μg/ml) を37℃で2時間プレートコートしたウェルに2.5×105個ずつ播種し、リコンビナントマウスIL-2 (20 ng/ml) 含有培養メディウムで37℃、5%CO2環境下にて6日間培養した。
【００７０】
（５）細胞内サイトカイン染色、転写因子の染色
細胞内サイトカイン染色は、まず培養細胞をPMA/Ionomycin (Sigma) をそれぞれ終濃度50 ng/ml、500 ng/mlで37℃、4時間反応し、後半の2時間はBrefeodin A (Sigma) を終濃度10μg/mlで添加した。細胞を洗浄液に回収し、表面抗原抗体 (抗CD4-APC) で氷上で30分間反応させ染色を行い、ホルムアルデヒドで室温、30分間固定したのち、抗サイトカイン抗体を30 分間反応させ染色を行った。染色はFIX and PERMキット (Invitrogen) を用い、プロトコールに従い行った。転写因子は、細胞を洗浄液に回収後、表面抗原を染色し、細胞を固定したのちに抗転写因子抗体を反応させ染色を行った。染色はFoxp3 staining kit (eBioscience) を用いた。解析はフローサイトメトリーを用いた。
【００７１】
（６）ELISA
培養上清中のIFN-γ、IL-2濃度、血清中IgE濃度は、キャプチャー抗体およびビオチン化二次抗体、HRP標識ストレプトアビジンを用いたサンドイッチELISA法にて測定した。IL-4、IL-17のELISA用キットはそれぞれBD Bioscience、R&Dより購入し、キットの添付プロトコールに従い定量した。吸光度の測定にはSpectra Max M2 (Molecular Devices, Tokyo, Japan) を用いた。
【００７２】
（７）生化学的解析
MACSにて分離したマウス脾臓CD4+ T細胞を、抗CD3抗体 (0.25μg/ml) と抗CD155抗体あるいはrat IgG2a (20μg/ml) を37℃で2時間プレートコートした48穴プレート (STAT1の解析) あるいは6穴プレート (IκBα, NFκBの解析) に1.5×105あるいは1.2×106ずつ播種し、培養メディウムにて37℃、5%CO2環境下にて表記の時間刺激培養した。全細胞溶解液は細胞を溶解バッファー(1%NP-40、PMSF、アプロチニン、Na3VO4、セリン/スレオニンフォスファターゼインヒビター) を用いて4℃、2時間で溶解して得た。核抽出液、細胞質抽出液は、Nuclear Extract kit (Active Motif, Carlsbad, CA, USA) を用い、キットのプロトコールに従い調整した。全細胞溶解液、核抽出液、細胞質抽出液は非還元条件下でSDS-PAGEにて分離した。その後PVDFメンブレン (Immobilon-P, Millipore, Billerica, MA) に転写バッファー (25 mM Tris, 195 mM glycine, 20% methanol) 中で100 V、1時間で転写した。メンブレンは3%牛血清アルブミン(BSA) 含有のTBST (pH 8.0, 10 mM Tris-buffered salineに0.5% Tween 20を0.5 g/L MgCl2を添加した洗浄液) でブロッキングをした後、一次抗体を4℃、オーバーナイトで反応させ、TBSTで洗浄し、次いでHRP標識二次抗体を室温、1時間反応させた。メンブレンを洗浄した後、基質 (Super-Signal CL-HRP substrate, Thermo Fisher Scientific, Inc, Waltham, MA, USA) と反応させ、化学発光をLAS-3000 mini (FUJIFILM, Tokyo, Japan) で検出し解析した。リブロットするためにメンブレンをRestore Western Blot Stripping Buffer (Thermo Fisher Scientific, Inc) で処理しTBSTで洗浄した後、同様の方法で一次抗体、二次抗体反応、化学発光の検出を行った。
【００７３】
（８）定量PCR
刺激培養を行った細胞を回収し、ISOGEN（NIPPON GENE, Tokyo, Japan）を用いてプロトコールに従いmRNAを抽出し、High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kits（Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA）を用いてプロトコールに従いcDNAを合成した。Platinum SYBR Green qPCR SuperMix-UDG（Invitrogen）を用いて、ABI 7500 fast（Applied Biosystems）にて解析を行った。プライマーは以下のものを用いた。
【００７４】
Tbx21 Forward: 5’-AGCAAGGACGGCGAATGTT-3’（配列番号７）
Tbx21 Reverse: 5’-GGGTGGACATATAAGCGGTTC-3’（配列番号８）
Gata3 Forward: 5’-TTATCAAGCCCAAGCGAAGG-3’（配列番号９）
Gata3 Reverse: 5’-CATTAGCGTTCCTCCTCCAGAG-3’（配列番号１０）
RORc Forward: 5’-GGAGGACAGGGAGCCAAGTT-3’（配列番号１１）
RORc Reverse: 5’-CCGTAGTGGATCCCAGATGACT-3’（配列番号１２）
Foxp3 Forward: 5’-CCCATCCCCAGGAGTCTTG3’（配列番号１３）
Foxp3 Reverse: 5’-ACCATGACTAGGGGCACTGTA-3’（配列番号１４）
Actb Forward: 5’-GGCTGTATTCCCCTCCATCG-3’（配列番号１５）
Actb Reverse: 5’-CCAGTTGGTAACAATGCCATGT-3’（配列番号１６）
PCRサイクル条件は、95℃にて10分変性後、95℃15秒、60℃1分にて40サイクル行った。
【００７５】
（９）接触性皮膚炎 (Contact Hypersensitivity; CHS)
1-クロロ-2,4-ジニトロベンゼン (DNCB) (Sigma) を100%エタノール (Sigma)に溶解し5%とし、剃毛したC57BL/6N野生型およびCD155遺伝子欠損マウスの腹部に200μl塗布して感作を行った。5日後、1% DNCBをマウスの左耳、溶媒のエタノールを右耳にそれぞれ40μlずつ塗布し、チャレンジを行った。本明細書において、「チャレンジ」とは、ある抗原に感作されている個体に再び同じ抗原を接触させ、二次応答を誘発することを意味する。24時間後、耳介の厚さを計測した。また、病理組織解析のため、耳介を摘出した。Δ耳介の厚さ（thickness）（mm）は以下の方法で算出した。
Δ耳介の厚さ（thickness）（mm）＝チャレンジした耳介の厚さ（mm）−チャレンジしていない耳介の厚さ(mm)
【００７６】
移入モデルでは、Rag-1遺伝子欠損マウスに野生型あるいはCD155遺伝子欠損CD4+ T細胞 1 x 107個と、野生型CD8+ T細胞 1×106を尾静脈より移入し、移入後1週間でCHSの誘導を開始した。
リンパ節の解析は、感作後5日目に鼠径および腋窩リンパ節を採取し、PMA/IONOで4時間刺激後、細胞内サイトカインをフローサイトメトリー法にて観察した。
【００７７】
（１０）好酸球性気道炎症
0日目及び7日目に、100μgのOVAタンパク (Sigma) を水酸化アルミニウムゲル (Sigma)と1:1で混和し、BALB/cA野生型およびCD155遺伝子欠損マウスに腹腔内投与し感作を行った。14、15及び16日目にOVAタンパク10μg/PBSあるいはPBSのみを経鼻的に投与し、チャレンジを行った。18日目に、2% 血清入り洗浄液1 mlで気管支肺胞洗浄 (BAL) を3回行い、BAL液中の細胞分画をフローサイトメトリー法にて解析した。CD45+Siglec-F+CD11b+細胞を好酸球とし、好酸球の割合とBAL液中総血球数を乗じて総好酸球を算出した。また、18日目に、病理組織解析のため、肺を摘出した。血清IgE値は、7日目と14日目に採取した血清を用いて測定した。
【００７８】
（１１）病理学的解析
耳介および肺はホルマリン固定、パラフィン包埋し、HE染色を行った。組織標本は顕微鏡BioRevo (KEYENCE, Osaka, Japan) を用いて観察した。
【００７９】
（１２）抗CD155抗体投与試験
C57BL/6N野生型マウスに抗CD155モノクローナル抗体 (TX56) あるいはコントロール抗体 (rat Ig (MP Biomedicals, Solon, OH)) を、DNCBによる感作あるいはチャレンジの2時間前にそれぞれ1.0 mg、0.5 mg経静脈投与した。
【００８０】
（１３）統計
統計学的解析はunpaired t-testを用いて行った。P<0.05を有意差ありと判定した。
【００８１】
２．結果
（１）CD155のTh1分化誘導能の検討
CD155が、共刺激分子として細胞内にシグナルを伝える機能を持つことから、CD4+ T細胞の活性化だけではなく、CD4+ナイーブT細胞からCD4+エフェクターT細胞 (Th1/Th2/Th17細胞) への機能分化に関与している可能性を検討することとした。
CD4+ナイーブT細胞をマウスの脾臓より分離し、抗CD3と抗CD155抗体（TX56）で6日間刺激培養し、PMA/Ionomycinで4時間再刺激した後、細胞内サイトカインをフローサイトメトリー法にて観察した。Th1/Th2/Th17細胞への分化を細胞内サイトカインIFN-γ/IL-2/IL-17の産生で評価した。また、上記6 日間培養した細胞を抗CD3 抗体で再刺激し、48 時間後の培養上清中のサイトカイン産生をELISA にて測定した。
フローサイトメトリー解析の結果、CD3とCD155を刺激するとCD3単独刺激に比べてIFN-γの産生が亢進していた (図2A)。また培養上清中のIFN-γの濃度をELISAにて定量した結果、CD3とCD155を刺激した方がCD3単独刺激に比べIFN-γ産生が有意に亢進していた (図2B)。一方、IL-4、IL-17産生には影響はなかった (図2A, B)。
これらのことから、CD155がCD4+ T細胞のTh1分化誘導を促進していることが示された。
【００８２】
CD4+エフェクターT細胞では、マスターレギュレーターと呼ばれる転写因子の発現が、各エフェクター細胞への分化マーカーとなっている。そこで、CD155がこれらのマスターレギュレーターの発現を制御しているか確認するため、CD4+T細胞上のCD3とCD155を同時に刺激し、T-bet (Th1のマスターレギュレーター)、GATA-3 (Th2)、RORγt (Th17)、Foxp3 (Treg) のmRNAの発現を定量PCRにて解析した。具体的には、CD4+ T 細胞を抗CD3 抗体とTX56 あるいはcIg で48 時間刺激培養し、mRNA を抽出し、T-bet, GATA3, RORγt, Foxp3 のmRNA 相対発現量を定量PCR にて解析した。未処置B6マウスの脾臓におけるmRNA 発現を1 とした。また、上記48 時間刺激培養後、T-bet, GATA3 の発現をフローサイトメトリー法にて観察した。
その結果、T-betの発現上昇およびGATA-3の発現低下が認められた (図3A)。また、フローサイトメトリー解析の結果、タンパクレベルでもT-betの発現上昇を認めた (図3B)。一方、RORγt、 Foxp3には影響を与えなかった (図3A)。これらのことから、CD155がCD4+ T細胞においてTh1分化誘導の促進に関与していることが示された。
なお、本実験では、最低２回の独立した実験を実施し、同様の結果を得た。図において、棒グラフは平均値+SD を表す。p<0.05; *, p<0.01; **, p<0.005; ***, ND; not detectable。
【００８３】
また、ヒトCD4＋T細胞のTh1分化誘導に対するCD155の効果について検討した。まず、ヒ卜末梢血中の免疫細胞におけるCD155の発現を測定した。その結果、末梢血中のCD14＋単球においてCD155の発現が認められた（図23A）。次に、ヒ卜末梢血中のCD4＋T細胞を抗CD3抗体及び抗CD28抗体で刺激し、24時間及び48時間後のCD155の発現を測定した。その結果、CD4＋T細胞の活性化に伴い、CD155の発現の上昇が認められた（図23B）。また、ヒ卜臍帯血中のCD4＋ナイーブT細胞を抗CD3抗体（anti-CD3）と抗ヒトCD155抗体（TX24）あるいはコントロール抗体（cIg）で刺激し、6日目にPMA/Ionomycinで4時間再刺激したのち、細胞内サイトカイン産生を測定した。その結果、CD3とCD155を同時に刺激した場合、CD3単独刺激に比べIFN-γの産生が亢進した。一方、IL-4及びIL-17産生には影響はなかった（図23C）。同様に、ヒ卜臍帯血中のCD4＋ナイーブT細胞を抗CD3抗体と抗ヒトCD155抗体あるいはコントロール抗体で刺激し、6日目にPMA/Ionomycinで4時間再刺激したのち、培養上清中のサイトカイン濃度を定量した。その結果、CD3とCD155を同時に刺激した場合、CD3単独刺激に比べIFN-γの産生が亢進した。一方、IL-4,IL-17産生には影響はなかった（図23D）。
これらの結果より、ヒ卜においても、CD155はCD4＋T細胞のTh1分化誘導を促進していることが明らかになった。すなわち、上記の結果により、CD155を分子標的とする本願発明はヒトの免疫疾患に対しても有効であることが示された。
【００８４】
（２）CD155によるTh1分化誘導機構の検討
CD155を介した共刺激およびTh1分化の詳細な分子メカニズムを検討するため、CD4+ T細胞の活性化および分化に関与するシグナル伝達因子を解析した。
具体的には、野生型CD4+ T細胞を抗CD3抗体と抗CD155抗体 (TX56) あるいはコントロール抗体 (cIg) で刺激し、シグナル伝達分子（ERK、STAT1、T-bet）の発現を観察した。以下、この系に基づき、以下の実験を行った。
ERKのリン酸化の解析においては、上記系において図4に示す時間刺激をした後、全細胞溶解液を抗リン酸化ERK 抗体でブロットし、その後抗ERK 抗体でリブロットした。
その結果、刺激後2分において、CD3単独刺激に比べERKのリン酸化が亢進しているのが認められた (図4)。このことから、CD155を介した共刺激シグナルはERKの活性化を増強することが示された。
ERKのリン酸化の遷延化は、GATA-3の発現を低下させ、その結果T-betの発現が上昇することで、Th1分化を誘導することが知られている（Yamane, H., J. Zhu, and W. E. Paul. 2005. J Exp Med 202: 793-804）。CD155を刺激した場合、ERKのリン酸化の遷延化は認められなかった (図4)。このことから、CD155によるTh1分化誘導はERK非依存的であることが示された。
【００８５】
次に、CD155がどのようにT-betの発現を促しているか検討するため、T-betの上流因子であるSTAT1に着目し、CD4+ T細胞を抗CD3抗体と抗CD155抗体で刺激した際のSTAT1のリン酸化を観察した。具体的には、上記系に抗IFN-γ 中和抗体又はIFN-γ 遺伝子欠損CD4+ T 細胞を用い、48 時間刺激培養した後、全細胞溶解液を抗リン酸化STAT1 抗体でブロットし、その後抗STAT1 抗体、抗β-actin 抗体でリブロットした。
その結果、CD3単独刺激に比べ、CD155を刺激するとSTAT1のリン酸化が増強された (図5A, B：左の2レーン)。また、STAT1タンパクの発現量自体も、CD155を刺激することで上昇した (図5A, B：左の2レーン)。
【００８６】
STAT1はIFN-γの刺激で、IFN-γ受容体の下流で活性化する（Murphy, K. M., and S. L. Reiner. 2002. Nat Rev Immunol 2: 933-944）。そこで、CD155が直接STAT1の活性化を引き起こしているのか、あるいは間にIFN-γを介しているのか検討するため、IFN-γ中和抗体およびIFN-γ遺伝子欠損マウスを用いて同様の解析を行った。具体的には、上記STAT1の測定と同様の刺激を行い、24 時間後のT-bet の発現をフローサイトメトリー法にて解析した。
その結果、CD155によるSTAT1のリン酸化の増強および発現上昇が、IFN-γ中和抗体の添加およびIFN-γ遺伝子欠損CD4+ T細胞で認められなくなった (図5A, B：右の2レーン)。また、STAT1の下流因子、T-betについても、IFN-γ中和抗体の添加およびIFN-γ遺伝子欠損CD4+ T細胞でCD155による発現上昇がキャンセルされた (図6A, B)。これらのことから、CD155によるSTAT1の活性化、T-betの発現上昇にはIFN-γが必須であることが明らかになった。
【００８７】
さらに、CD155を介したTh1分化誘導にIFN-γが必須であるかどうかを検討した。具体的には、OVA特異的T細胞受容体を有するトランスジェニックマウス（CD155+/+ OT-II Tgマウス又はCD155-/- OT-II Tgマウス）由来のCD4＋ナイーブT細胞を、抗IFN-γ中和抗体（anti-IFN-γ）又はコントロール抗体（clg）存在下で抗原提示細胞及びOVAペプチドと共培養し、6日目にPMA/Ionomycinで4時間再刺激したのち、細胞内サイトカイン産生を測定した。
その結果、IFN-γ中和抗体非存在下ではCD155-/- OT-II CD4＋T細胞におけるIFN-γ産生細胞の割合が、CD155+/+ OT-II CD4＋T細胞に比べて減少していた。一方IFN-γ中和抗体存在下では、その差はキャンセルされ、いずれにおいてもIFN-γ産生細胞の割合が減少した（図20）。
この結果から、CD155を介したTh1分化誘導にはIFN-γが必須であることが明らかになった。
【００８８】
次に、CD155がSTAT1やT-betの活性化の前にどのようにIFN-γ発現を制御しているのか検討することとした。IFN-γをターゲット遺伝子とする転写因子の一つにNFκBがあることが知られており、NFκBはT-betと協同してIFN-γの転写を促進することが知られている（Podojil, J. R., and S. D. Miller. 2009. ImmunolRev 229: 337-355）。そこで、CD155シグナルによるNFκBの活性化を検討することとした。NFκBは定常状態では細胞質内でIκBと結合しており、IκBが分解されIκBから遊離することで核内に移行することができる（Liou, H. C. 2002. J Biochem Mol Biol 35: 537-546）。すなわち、IκBの分解はNFκBの活性化の指標となる。そこでまず、CD4+ T細胞を抗CD3抗体と抗CD155抗体あるいはコントロール抗体で刺激し、IκBαの分解を観察した。具体的には、上記の系で図7Aに示した時間刺激した後、全細胞溶解液を抗IκBα 抗体でブロットし、その後抗β-actin 抗体でリブロットした。また、図7Bに示した時間刺激した後、核抽出液および細胞質抽出液を抗NFκBp65 抗体でブロットし、その後抗β-actin 抗体でリブロットした。
その結果、刺激後15分において、CD3単独刺激に比べCD155を刺激するとIκBαの分解の亢進が認められた (図7A)。同様の刺激でNFκB p65の核内移行を観察した結果、CD155を刺激すると核内におけるNFκB p65の量がCD3単独刺激に比べ増加しているのが認められた (図7B)。細胞内NFκB p65についてはその差を認めなかった (図7B、nuc; nuclear extracts, cyt; cytoplasimic extracts)。本実験においては、最低２回の独立した実験を実施し、同様の結果を得ている。図において、棒グラフは平均値+SD を表す。p<0.005; ***
【００８９】
また、CD155を介したNFκBの活性化にIFN-γが必須であるかどうかについて検討した。具体的には、野生型（WT）あるいはIFN-γ遺伝子欠損（Ifng-/-）マウス由来のCD4＋T細胞を抗CD3抗体（anti-CD3）と抗CD155抗体（TX56）又はコントロール抗体（clg）で15分間刺激し、IκBαの分解を観察した。
その結果、野生型CD4＋T細胞において、CD3とCD155を同時に刺激した場合、CD3単独刺激に比べIκBαの分解が亢進した。IFN-γ遺伝子欠損CD4＋T細胞においても、同様の結果であった（図21）。
この結果から、CD155を介したNFκBの活性化にはIFN-γが必須ではないことが明らかになった。
【００９０】
さらに、CD155のIFN-γ産生に対する効果を検討した。具体的には、マウスCD4＋ナイーブT細胞を抗CD3抗体（anti-CD3）と抗CD155抗体（TX56）又はコントロール抗体（cIg）で10時間刺激し、IFN-γのmRNAの発現を観察した。その結果、CD3とCD155を同時に刺激した場合、CD3単独刺激に比べてIFN-γの発現が上昇した（図22A）。また同様に、マウスCD4＋ナイーブT細胞を抗CD3抗体と抗CD155抗体又はコントロール抗体で18時間刺激し、CD4＋T細胞上のIFN-γ受容体をフローサイトメトリー法で検出した。抗IFN-γ受容体α鎖抗体として、IFN-γと競合しない2E2クローン、あるいは競合するGR20クローンを用いた。その結果、2E2で検出するとIFN-γ受容体の蛍光強度に違いがないのに対し、GR20で検出すると、CD3とCD155を同時に刺激した場合、CD3単独刺激に比べIFN-γ受容体の蛍光強度が減弱した。すなわち、CD3とCD155を同時に刺激した方が、IFN-γがIFN-γ受容体により多く結合したことが示された（図22B）。この結果から、CD155を介してIFN-γが刺激初期に産生され、IFN-γがCD4＋T細胞にオートクリンに作用していることが明らかになった。
以上の結果から、CD155はNFκBの活性化を増強することで、IFN-γの発現を上昇させ、より多く産生されたIFN-γがCD4+ T細胞にオートクリンに作用することでSTAT1、T-betの発現を上げ、その結果、Th1分化を誘導していることが示された (図19)。
より詳細には、T細胞受容体が抗原刺激を受ける際、CD155は抗原提示細胞上のリガンドから刺激を受け、細胞内にシグナルを伝達する。CD155は、T細胞受容体刺激の共刺激分子として、NFκBの活性化を促進する(図24(1))。NFκBはIFN-γ遺伝子の発現を促す(図24(2))。より多く産生されたIFN-γはオートクリンに作用し、IFN-γ受容体に結合する(図24(3))。IFN-γ受容体の下流でSTAT1の発現上昇およびリン酸化の増強が起こる(図24(4))。その下流でT-betの発現が上昇し（図24(5)）、さらにIFN-γの産生が亢進する。その結果、Th1分化が促進される。CD155はTh1分化誘導を促進するポジティブフィードバックループを開始するトリガーとなることが明らかとなった（図19及び図24）。
【００９１】
（３）CD155による接触性皮膚炎の病態の増悪の検討
CD155が生体内においてTh1型免疫応答に関与しているか検討するため、Th1型免疫応答がその病態の主体をなす接触性皮膚炎 (Contact Hypersensitivity; CHS) のマウスモデルを用い解析を行った。CHSは、0日目にDNCB (1-クロロ-2, 4-ジニトロベンゼン)を腹部に塗布して感作し、5日目に右耳に溶媒のみ、左耳にDNCB を塗布することにより耳介チャレンジすることで誘導し、耳介の腫脹で病態を評価した (図8)。
CHSをCD155遺伝子欠損マウスあるいは野生型マウスに誘導し、耳の腫脹を計測して病態の比較検討を行った結果、野生型に比べ、CD155遺伝子欠損マウスで耳介の腫脹が抑制された (図9A)。またHE 染色による病理組織解析においても、炎症細胞の浸潤および浮腫が、野生型に比べCD155遺伝子欠損マウスで軽度であった (図9B)。これらのことから、CD155はCHSの病態の増悪に関与していることが明らかになった。
【００９２】
次に、CD155がDNCBによる感作に対するTh1免疫応答に関与しているか検討するため、感作して5日目の所属（腋窩）リンパ節を摘出し、Th1分化を細胞内サイトカイン産生で評価した。具体的には、リンパ節CD4+ T 細胞における細胞内サイトカイン産生を、フローサイトメトリー法にて解析した。
その結果、野生型に比べ、CD155遺伝子欠損マウスにおいてIFN-γ産生細胞の割合が低いという結果を得た (図10A, B)。一方、IL-4、IL-17産生には影響を及ぼさなかった (図10A, B)。図10Bの棒グラフは平均値+SD を表す。p<0.05; *, p<0.01; **, p<0.005; ***
これらのことから、CD155はDNCBの感作に対してTh1型免疫応答を促進しており、それが病態の増悪に関与していることが示された。
【００９３】
CD155はCD4+ T細胞のみならず生体内の細胞に広範に発現しているため、CD4+T細胞上のCD155がCHSの病態に関与しているかを検討することとした。Rag-1遺伝子欠損マウスにCD155遺伝子欠損あるいは野生型CD4+ T細胞と、野生型CD8+ T細胞を移入し、1週間後からCHSを誘導し病態の比較検討を行った (図8)。
その結果、野生型CD4+ T細胞移入群に比べ、CD155遺伝子欠損CD4+ T細胞移入群において、耳介の腫脹が抑制された (図11)。図11において、グラフの丸印は各個体を表し、実線は平均値±SD を表す。
これらことから、CD4+ T細胞上のCD155がCHSの病態の増悪に関与していることが示された。またこの結果により、CHSに代表されるTh1型免疫疾患には、CD4+ T細胞上のCD155が重要な役割を担っていることが示された。
【００９４】
（４）CD155に対する抗体によるTh1型免疫疾患の治療及び／又は予防
抗CD155抗体であるTX56は、リガンドとの結合を阻害する阻害抗体であることがin vivoおよびin vitroの予備実験で明らかになっており、またTX56の投与によって、いずれの細胞分画も除去されないことを確認した (データ非掲載)。
抗CD155抗体の投与による治療及び予防効果を判定するため、CHSにおいてDNCBの感作前、およびチャレンジ前に抗CD155抗体あるいはコントロール抗体を投与し、CHS病態の比較検討を行った (図12)。具体的には、感作の2 時間前に抗CD155 抗体(TX56) あるいはコントロール抗体 (cIg) を、1 mg/ マウス、チャレンジの2 時間前に0.5 mg/ マウスの量でそれぞれ経静脈的に投与し、耳介の腫脹の計測又は耳介の病理組織のHE染色を行い、CHS病態を比較検討した。
その結果、感作前の投与で、コントロール抗体投与に比べ、抗CD155抗体投与によって耳介の腫脹が抑制された (図13A, B)。また、チャレンジ前投与によっても同様の結果を得た (図14A, B)。本実験では、最低２回の独立した実験を実施し、同様の結果を得ている。図13A及び図14Aにおけるグラフの丸印は各個体を表し、実線は平均値±SD を表す。p<0.05; *, p<0.01; **
これらのことから、CD155に対する抗体はCHSに対して治療及び／又は予防効果を有することが示された。
なお、CHSには、抗原に感作されてTh1細胞が分化する感作相、再び抗原に暴露され、メモリーTh1細胞が活性化し局所でエフェクター機能を発揮する惹起相がある(Krasteva, M. et al. 1999. EJD 9: 65-76)。本実施例で行った感作前の投与は感作相の抑制、チャレンジ前の投与は惹起相の抑制に相当すると考えられる。ヒトにおける接触性皮膚炎においても、その発症は2回目以降の抗原暴露によって起こるため、臨床的には惹起相が接触性皮膚炎の発症に深く関与しており、惹起相を抑制することが接触性皮膚炎発症の抑制において重要である。
すなわち、惹起相においても疾患発症の抑制効果を示した本発明の抗CD155抗体は、CHSに代表されるTh1型免疫疾患の治療及び／又は予防において、極めて顕著な効果を有する。
【００９５】
（５）CD155に対する抗体によるTh2型免疫疾患の治療及び／又は予防
Th2型気管支喘息のモデルとして好酸球性気道炎症のマウスモデルを用い、CD155のTh2型免疫疾患への関与について解析した。好酸球性気道炎症モデルにはBALB/cを用いるため、まず、CD155によるTh1分化の促進がBALB/cマウスでもB6マウスと同様に惹起されるかどうかを確認した。具体的には、BALB/cマウス由来のCD4+ T細胞を抗CD3抗体と抗CD155抗体又はコントロール抗体で刺激し、6日後の細胞内サイトカイン産生をフローサイトメトリー法により解析した。その結果、CD3単独刺激に比較してIFN-γ産生の亢進が認められ、B6マウスと同様の結果を得た (図16)。
好酸球性気道炎症は、0、７日目にOVAタンパクで感作し、14、15、16日目にOVAタンパクを経鼻的に投与することで誘発した (図15)。好酸球性気道炎症をCD155遺伝子欠損マウスまたは野生型マウスに誘導し、血清中のIgE濃度、気管支肺胞洗浄 (BAL) 液中の好酸球数、肺への炎症細胞浸潤を指標に病態の比較検討を行った (図15)。
その結果、Th2型免疫応答の指標となるIgE産生は、免疫後7、14日目において野生型に比べCD155遺伝子欠損マウスで亢進していた (図17)。未処置のCD155遺伝子欠損マウスでは、野生型マウスと同様IgEは検出されないことを予備実験で確認した(データ非掲載)。
BAL液中の血球細胞を計数し、好酸球（CD45+Siglec-F+CD11b+）をフローサイトメトリー法にて解析し、好酸球の割合と血球細胞数を乗じて好酸球の絶対数を算出した。
その結果、BAL液中の好酸球数は、野生型に比べ、CD155遺伝子欠損マウスで増加していた (図18A)。HE染色を用いた肺の病理組織解析の結果、PBSのみでチャレンジすると炎症細胞の浸潤は観察されないのに対し、OVAでチャレンジした場合は肺への炎症細胞の浸潤が認められ、その程度はCD155遺伝子欠損マウスの方が野生型よりも激しいという結果を得た (図18B)。なお、本実験では、最低２回の独立した実験を実施し、同様の結果を得た。図18A において、グラフの丸印は各個体を表し、実線は平均値+SD を表す。p<0.05; *、 p<0.005; ***。
これらの結果から、CD155遺伝子欠損マウスではTh2型免疫応答が亢進していること、すなわちCD155は生体内でTh2型免疫応答を抑制していることが示された。また、これらの結果から、CD155に対しアゴニスト作用を有する抗CD155抗体を用いてCD155を活性化することにより、Th2型免疫疾患を治療又は予防できることが示唆された。
【００９６】
以上より、CD155は、T細胞受容体刺激の共刺激分子として、NFκBの活性化を促進し、IFN-γの産生を促して、IFN-γによるポジティブフィードバックを介してTh1分化を誘導することが示された。
また、CD155は生体内でTh1/Th2免疫応答のバランスを制御していることが示され、CD155に対する抗体は、マウス、ヒト等の哺乳動物において、Th1型免疫疾患及びTh2型免疫疾患を含む幅広い免疫疾患の治療及び／又は予防効果を有することが示された。
【産業上の利用可能性】
【００９７】
本発明により、免疫疾患の治療又は予防に有用な医薬組成物を提供することができる。
【配列表フリーテキスト】
【００９８】
配列番号７：合成DNA
配列番号８：合成DNA
配列番号９：合成DNA
配列番号１０：合成DNA
配列番号１１：合成DNA
配列番号１２：合成DNA
配列番号１３：合成DNA
配列番号１４：合成DNA
配列番号１５：合成DNA
配列番号１６：合成DNA
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【配列表】
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