(57)【要約】      （修正有）【課題】難聴、部分的聴力欠失、内耳有毛細胞の障害または欠失による前庭難聴、変形関節症および異常細胞増殖の治療のための治療用薬剤としてのａｔｏｎａｌ関連核酸またはアミノ酸配列、または任意のそのホモログまたはオーソログの特徴付けおよび使用を提供する。【解決手段】ａｔｏｎａｌ関連核酸またはアミノ酸配列の治療用途のための組成物および方法。また、ａｔｏｎａｌ関連遺伝子の不活性化に関してヘテロ接合性の動物であって、ａｔｏｎａｌ関連プロモーター配列により推進された発現を検出するために用いられる異種核酸配列の挿入により置換された少なくとも１つのａｔｏｎａｌ関連核酸配列（当該ａｔｏｎａｌ関連核酸配列の不活性化はａｔｏｎａｌ関連遺伝子の発現を妨げる）を有する動物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａｔｏｎａｌ関連核酸配列の対立遺伝子を置換した異種核酸配列を有する動物であって、前記異種配列は前記対立遺伝子を不活性化する条件下で置換した動物。
【請求項２】
前記異種核酸配列がａｔｏｎａｌ関連調節配列の制御下で発現する、請求項１に記載の動物。
【請求項３】
前記ａｔｏｎａｌ関連対立遺伝子が両方置換している、請求項１に記載の動物。
【請求項４】
前記異種核酸配列が同一でない、請求項３に記載の動物。
【請求項５】
前記動物が検出可能な状態を有する、請求項３に記載の動物。
【請求項６】
前記検出可能な状態が有毛細胞の損失、小脳性顆粒ニューロン欠損症、聴覚障害、平衡失調、関節疾患、変形性関節症および細胞の異常増殖からなる群より選ばれる、請求項５に記載の動物。
【請求項７】
前記異種核酸配列がレポーター配列である、請求項１または３に記載の動物。
【請求項８】
前記ａｔｏｎａｌ関連対立遺伝子が調節可能なプロモーター配列の制御下でａｔｏｎａｌ関連核酸配列と置換している、請求項１または３に記載の動物。
【請求項９】
前記ａｔｏｎａｌ関連対立遺伝子が組織特異的なプロモーター配列の制御下でａｔｏｎａｌ関連核酸配列と置換している、請求項１または３に記載の動物。
【請求項１０】
前記動物がマウス、ショウジョウバエ、ゼブラフィッシュ、カエル、ラット、ハムスターおよびモルモットからなる群より選ばれる、請求項１または３に記載の動物。
【請求項１１】
動物における化合物のスクリーニング方法であって、前記化合物はａｔｏｎａｌ関連核酸配列の発現に影響を及ぼし、下記：前記化合物を前記動物に送達すること、ここで、前記動物は、異種核酸配列の挿入により不活性化されたａｔｏｎａｌ関連核酸配列の少なくとも１つの対立遺伝子を有し、前記異種核酸配列は、ａｔｏｎａｌ関連調節配列の制御下にある；および前記ａｔｏｎａｌ関連核酸配列の前記発現における変化を監視することを含む方法。
【請求項１２】
前記化合物がａｔｏｎａｌ関連核酸配列の発現に影響を及ぼす、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記化合物が動物において検出可能な状態に影響を及ぼす、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記異種核酸配列がレポーター配列である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
動物における化合物のスクリーニング方法であって、前記化合物は前記動物において検出可能な状態に影響を及ぼし、下記：前記化合物を前記動物に送達すること、ここで、前記動物におけるａｔｏｎａｌ関連核酸配列の少なくとも１つの対立遺伝子は、異種核酸配列の挿入により不活性化され、前記異種核酸配列は、ａｔｏｎａｌ関連調節配列の制御下にある；および前記動物を検出可能な状態における変化について監視することを含む方法。
【請求項１６】
前記化合物が前記検出可能な状態に影響を及ぼす、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記化合物が前記異種核酸配列の発現に影響を及ぼす、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
小脳性顆粒ニューロンまたはその前駆体における欠損を有する動物の治療方法であって、ａｔｏｎａｌ関連アミノ酸配列または核酸配列の治療上有効量を前記動物の細胞に送達することを含む方法。
【請求項１９】
動物における機械的受容器細胞の成長を促進する方法であって、ａｔｏｎａｌ関連アミノ酸配列または核酸配列の治療上有効量を前記動物の細胞に送達することを含む方法。
【請求項２０】
有毛細胞の発生方法であって、ａｔｏｎａｌ関連アミノ酸配列または核酸配列の治療上有効量を動物の細胞に送達することを含む方法。
【請求項２１】
聴覚障害に関する動物の治療方法であって、ａｔｏｎａｌ関連アミノ酸配列または核酸配列の治療上有効量を前記動物の細胞に送達することを含む方法。
【請求項２２】
平衡失調に関する動物の治療方法であって、ａｔｏｎａｌ関連アミノ酸配列または核酸配列の治療上有効量を前記動物の細胞に送達することを含む方法。
【請求項２３】
関節疾患に関する動物の治療方法であって、ａｔｏｎａｌ関連アミノ酸配列または核酸配列の治療上有効量を前記動物の細胞に送達することを含む方法。
【請求項２４】
細胞の異常増殖に関する動物の治療方法であって、ａｔｏｎａｌ関連アミノ酸配列または核酸配列の治療上有効量を前記動物の細胞に送達することを含む方法。
【請求項２５】
細胞の異常増殖に関する動物の治療方法であって、細胞におけるａｔｏｎａｌ関連核酸配列またはアミノ酸配列のレベルを変えることを含む方法。
【請求項２６】
ａｔｏｎａｌ関連核酸またはアミノ酸配列の機能損失の結果である疾患に関する動物の治療方法であって、ａｔｏｎａｌ関連アミノ酸配列または核酸配列の治療上有効量を前記動物の細胞に送達することを含む方法。
【請求項２７】
前記アミノ酸配列または核酸配列が送達ビーイクルにより送達される、請求項１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５または２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記アミノ酸配列または核酸配列が送達ビーイクルにより送達され、前記送達ビーイクルがアデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、プラスミド、リポソーム、核酸、ペプチド、脂質、炭水化物およびそれらの組合せからなる群より選ばれる、請求項１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５または２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記アミノ酸配列または核酸配列が送達ビーイクルにより送達され、前記送達ビーイクルがウイルスベクターまたは非ウイルスベクターからなる群より選ばれる、請求項１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５または２６に記載の方法。
【請求項３０】
前記アミノ酸配列または核酸配列が送達ビーイクルにより送達され、前記送達ビーイクルが細胞である、請求項１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５または２６に記載の方法。
【請求項３１】
前記ａｔｏｎａｌ関連アミノ酸配列または核酸配列がＭａｔｈ１である、請求項１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５または２６に記載の方法。
【請求項３２】
前記ａｔｏｎａｌ関連アミノ酸配列または核酸配列がＨａｔｈ１である、請求項１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５または２６に記載の方法。
【請求項３３】
前記細胞がａｔｏｎａｌ関連核酸配列またはアミノ酸配列に変異を含む、請求項１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５または２６に記載の方法。
【請求項３４】
前記アミノ酸配列が配列番号５８（Ｈａｔｈ１）の約２０個のコンティグアミノ酸残基と少なくとも約８０％の同一性を有する、請求項１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５または２６に記載の方法。
【請求項３５】
前記核酸配列が配列番号５８（Ｈａｔｈ１）の約２０個のコンティグアミノ酸残基と少なくとも約８０％の同一性を有するポリペプチドをコードする、請求項１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５または２６に記載の方法。
【請求項３６】
前記細胞がヒト細胞である、請求項１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５または２６に記載の方法。
【請求項３７】
前記送達がａｔｏｎａｌ関連アミノ酸配列または核酸配列の治療上有効量を内耳に注入することを含む、請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項３８】
前記関節疾患が変形性関節症である、請求項２３に記載の方法。
【請求項３９】
前記細胞が癌細胞である、請求項２４または２５に記載の方法。
【請求項４０】
ａｔｏｎａｌ関連アミノ酸配列または核酸配列を送達ビーイクルと組合せて含有する組成物であって、前記送達ビーイクルは、ａｔｏｎａｌ関連核酸配列またはアミノ酸配列の治療上有効量の細胞への送達を導く組成物。
【請求項４１】
前記送達ビーイクルがａｔｏｎａｌ関連核酸配列またはアミノ酸配列を動物細胞中で発現するベクターを含む、請求項４０に記載の組成物。
【請求項４２】
前記ベクターがアデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、プラスミド、リポソーム、タンパク質、脂質、炭水化物および前記ビーイクルの組合せからなる群より選ばれる、請求項４１に記載の組成物。
【請求項４３】
前記ベクターがウイルスベクターまたは非ウイルスベクターからなる群より選ばれる、請求項４１に記載の組成物。
【請求項４４】
前記送達ビーイクルが細菌毒素のレセプター結合ドメインである、請求項４０に記載の組成物。
【請求項４５】
前記ａｔｏｎａｌ関連核酸配列が細菌毒素のレセプター結合ドメインをコードする核酸配列に操作可能に連結している、請求項４０に記載の組成物。
【請求項４６】
前記ａｔｏｎａｌ関連核酸配列がタンパク質形質導入ドメインをコードする核酸配列に操作可能に連結している、請求項４０に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書の研究は、米国政府の助成金により援助された。米国政府は、本発明において一定の権利を有する。
【０００２】
本明細書は、１９９９年７月１日に出願された仮出願番号第６０／１３７，０６０号、および２０００年１月１９日に出願された第二の仮出願番号第６０／１７６，９９３号に対する優先権を主張する。
【０００３】
本発明は、一般的に、遺伝子診断および治療の分野に関し、特に、難聴、部分的聴力欠失、内耳有毛細胞の障害または欠失による前庭難聴、変形関節症および異常細胞増殖の治療のための治療用薬剤としてのａｔｏｎａｌ関連核酸またはアミノ酸配列、または任意のそのホモログまたはオーソログの特徴付けおよび使用に関する。
【背景技術】
【０００４】
細胞内および細胞間の相互作用の複雑なパターンが、感覚上皮先祖細胞の分化からニューロンの連続的発生を指示している。多重細胞外および細胞内シグナルは、この工程を調節する。鍵となる細胞内シグナルは転写因子であり、これは遺伝子のカスケードの発現を誘導する。タンパク質の塩基性ヘリックス−ループ−ヘリックス（ｂＨＬＨ）ファミリーに属している転写因子の１つの亜種が、子孫への決定または分化が起こる時点で、早期に発現する。この機能は、発生初期でのこれら遺伝子内における変異が神経構造全体を消すことができるので、とりわけ重大なものである。
【０００５】
ショウジョウバエにおいて、Ｍａｔｈ１、Ｍａｔｈ２、Ｈａｔｈ１およびＨａｔｈ２に相同な遺伝子ａｔｏｎａｌ（ａｔｏ）は、音響振動感覚器官（固有感覚、平衡および聴覚で機能する、体壁、関節および触覚にみられる感覚器官）の発生に必須のｂＨＬＨタンパク質をコードしている（Ｅｂｅｒｌ，１９９９、ＭｃＩｖｅｒ，１９８５、ｖａｎＳｔａａｄｅｎ ａｎｄ Ｒｏｍｅｒ，１９９８）。ＣＨＯは、体壁および関節（胸郭、腹、胸骨、羽、脚）および触覚内に末梢神経系（ＰＮＳ）を構成し（Ｍｏｕｌｉｎｓ，１９７６）、脊椎動物で接触および機械的受容器が行うような感覚情報を有するハエを提供する（Ｍｃｌｖｅｒ，１９８５、Ｍｏｕｌｉｎｓ，１９７６）。Ｂｏｙａｎ（Ｂｏｙａｎ，１９９３）は、進化の経路において、異なるＣＨＯが異なる昆虫において、聴覚に対して分化するようになることを提案した。この仮説は、最近ｖａｎＳｔａａｄｅｎ ａｎｄ Ｒｏｍｅｒ（１９９８）によって確かめられた。ショウジョウバエにおいて、ジョンストン（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ）器官でのＣＨＯは、二次触覚セグメントに局在し、近領域聴覚（Ｄｒｅｌｌｅｒａｎｄ Ｋｉｓｃｈｎｅｒ，１９９３、Ｅｂｅｒｌ，１９９９）および陰性走地性で機能する。
【０００６】
発生の間、ａｔｏは、ＣＨＯ創始細胞が選別される先祖細胞のクラスターに発現している（Ｊａｒｍａｎら、１９９３）。Ｄａｕｇｈｔｅｒｌｅｓｓタンパク質と二量体化し、Ｅ−ボックス配列に結合する塩基性ヘリックス−ループ−ヘリックス（ｂＨＬＨ）をコードしているので、ＣＨＯ一列配列の特定化および発生に必要である遺伝子の発現を調節することによって機能する可能性があり、それによって遺伝子を活性化する（Ｊａｒｍａｎら、１９９３）。ＣＨＯは特に、ｂＨＬＨタンパク質中のＤＮＡ結合に必要とされるａｔｏ塩基性領域によってコードされている（Ｃｈｉｅｎら、１９９６、Ｄａｖｉｓら、１９９０、Ｊａｒｍａｎａｎｄ Ａｈｍｅｄ，１９９８、Ｖａｅｓｓｉｎら、１９９０）。ａｔｏはハエにおけるＣＨＯの産出に必要かつ十分であり、ａｔｏ機能の欠失はＣＨＯの欠失を導き、一方で、ａｔｏの異所性発現は、異所性ＣＨＯ形成を引き起こす（Ｊａｒｍａｎら、１９９３）。ａｔｏｎａｌ機能を欠く成虫ハエは協同を欠き、飛ばず、聴覚が欠失している。ハエａｔｏｎａｌ遺伝子の過剰発現は、新規音響振動ニューロンを生成することができ、ａｔｏｎａｌがこのニューロン集団の発生に必要かつ十分であることを示唆している。
【０００７】
脊椎動物において、筋発生および神経発生の間、細胞発生運命特定化は、塩基性ヘリックス−ループ−ヘリックス（ｂＨＬＨ）転写因子を必要とする。Ｍａｔｈ１（マウスａｔｏｎａｌホモログ−１（ｍｏｕｓｅａｔｏｎａｌ ｈｏｍｏｌｏｇ−１）がそのような因子であり、（機械的受容器として機能する）菱脳、脊髄、小脳の外胚層、消化管、関節、耳および皮膚のメルケル細胞に発現している（Ａｋａｚａｗａら、１９９５、Ｂｅｎ−Ａｒｉｅら、１９９６、Ｂｅｎ−Ａｒｉｅら、１９９７）。Ｍａｔｈ１の標的化欠失に関するマウスヘテロ接合体（Ｍａｔｈ１+/- ）は生存可能であり、正常に見えるが、Ｍａｔｈ１ヌルマウス（Ｍａｔｈ１-/- ）は生まれてすぐに死に、小脳顆粒ニューロンが欠失している。
【０００８】
Ｍａｔｈ１はａｔｏに最も近い公知のホモログの１つであり、ｂＨＬＨ領域において８２％のアミノ酸類似性、および標的認識特異性を決定する塩基性領域の１００％保存を持つ（ｂｅｎ−Ａｒｉｅら、１９９６、Ｃｈｉｅｎら、１９９６）。Ｍａｔｈ１は、神経管の背側部分に、胚日９（Ｅ９）に始まり、ＣＮＳ内に一過性に発現する。Ｍａｔｈ１はまた、脳の第四脳室の菱唇にも発現し、そこは、Ｅ１３〜１５に、小脳顆粒細胞前駆体が生まれる場所である（Ａｌｄｅｒら、１９９６）。増殖および分化において、これらの先祖細胞は、小脳原基の外部顆粒層（ＥＧＬ）を形成するように移動する（Ｈａｔｔｅｎａｎｄ Ｈｅｉｎｔｚ，１９９５）。増殖ＥＧＬ細胞は、出産後最初の３週の間、小脳の内部顆粒層（ＩＧＬ）を産出するために、その最終成体目的地まで移動するわずか前までＭａｔｈ１を発現し続ける（Ａｋａｚａｗａら、１９９５、Ｂｅｎ−Ａｒｉｅら、１９９６）。他の細胞集団である脊髄中のニューロン前駆体の小さな集団が、Ｅ１０〜Ｅ１４の間Ｍａｔｈ１を発現している（Ａｋａｚａｗａら、１９９５、Ｂｅｎ−Ａｒｉｅら、１９９６）。これらの前駆体細胞はまた、ＬＩＭホメオドメインタンパク質（ＬＨ２ＡおよびＬＨ２Ｂ）、交連介在ニューロンのＤ１クラスのマーカーも発現している（Ｌｅｅら、１９９８）。Ｈｅｌｍｓａｎｄ Ｊｏｈｎｓｏｎ（１９９８）は、Ｍａｔｈ１調節エレメントの制御下でのｌａｃＺ発現が、発生中の小脳および脊髄でＭａｔｈ１発現パターンを再生させることを報告しており、またＭａｔｈ１が、背側交連介在ニューロンの亜集団が生じる前駆体中に発現することを実証した。
【０００９】
Ｍａｔｈ１のｉｎ ｖｉｖｏ機能を決定するために、本発明者等はＭＡＴＨ１タンパク質を欠失しているマウス（Ｍａｔｈ１-/- ）を作製した。このヌル変異体は主要な小脳異常、すなわち、Ｅ１４．５での顆粒細胞増殖および菱唇からの移動の欠失、誕生時の全ＥＧＬの欠如を引き起こす（Ｂｅｎ−Ａｒｉｅら、１９９７）。小脳顆粒ニューロンの無発生が、先祖特性化の不全または細胞の増殖および／分化不能によるためかどうか明確ではない。新生児は呼吸できず、誕生後すぐに死亡するが、脳神経または呼吸不全を説明できる脳幹核における著しい欠陥はない。
【００１０】
Ｍａｔｈ１が内耳で発現しているという事実は、Ｍａｔｈ１発現が、聴覚または平衡器官の発生に必要であることを示唆している。内耳はまず、菱脳の中神経小片５および６の間に耳プラコードと呼ばれる外胚葉膿厚化として形成される。耳プラコードは、VIIIth脳神経のニューロンの発生を生じさせ、耳胞となるために陥入し、そこより内耳が発生する。成熟哺乳動物内耳は、１つの聴覚器官、うずまき管および５つの前庭器官、すなわち卵形嚢、球形嚢および３つの骨半規管からなる。これらの器官の感覚上皮は、機械的受容性有毛細胞、支持細胞および神経末端からなる。有毛細胞は、音波および頭運動を聴覚および位置情報に変換する機械的受容体として働く。有毛細胞および支持細胞は両方とも、共通の先祖細胞より発生し、マウスにおいて胎生日１３および１８の間（Ｅ１３〜Ｅ１８）ピーク有糸分裂し、感覚上皮内で増殖および分化する。ｉｎｔ２（Ｍａｎｓｏｕｒら、１９９３、ｐａｘ２（Ｔｏｒｒｅｓら、１９９６）およびＨｍｘ３（Ｗａｎｇら、１９９８）のような、いくつかの遺伝子が内耳の発生に関係しているが、どれも有毛細胞の発生に特異的に必要であるとは示されてきていない。
【００１１】
有毛細胞への障害は、それら自身一般的な疾患である難聴および前庭不全の共通の原因である。２８００万人以上のアメリカ人が聴覚の異常を持ち、前庭不全は全人口の約４分の１で、そのうちの半数が老人である。繊細な有毛細胞は、疾患、加齢および環境傷害（たとえば抗生物質、毒素、持続性騒音）に対して傷つきやすい。これらの細胞は一度破壊されると、哺乳動物においては再生成できない。したがって、先天性、慢性または後天性変性聴覚障害および損失または平衡問題を患う患者の問題に取り組み、聴覚損失および前庭機能の治療における使用のための組成物、方法および薬剤を提供する必要がある。
【００１２】
本発明の教示の補助において、過剰発現時にＭａｔｈ１が出生後ラット内耳での余分な有毛細胞の有意な産出を誘導することを他者が実証した（Ｚｈｅｎｇａｎｄ Ｇａｏ，２０００）。簡単には、運命決定は通常、哺乳動物蝸牛有毛細胞の誕生によって完成するけれども、出生後ラットの蝸牛外植片培養物でのＭａｔｈ１の過剰発現が、結果として大上皮隆線中の感覚上皮の外に局在する蝸牛上皮細胞より由来するさらなる耳有毛細胞となる。さらに、出生後の卵形嚢支持細胞の有毛細胞への変換が、Ｍａｔｈ１発現によって促進される。Ｍａｔｈ１の、耳内での有毛細胞の産出を許容する能力は、本請求の発明の支持における強力な証拠である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｅｂｅｒｌ，１９９９
【非特許文献２】ＭｃＩｖｅｒ，１９８５
【非特許文献３】ｖａｎ Ｓｔａａｄｅｎ ａｎｄ Ｒｏｍｅｒ，１９９８
【非特許文献４】Ｍｏｕｌｉｎｓ，１９７６
【非特許文献５】Ｂｏｙａｎ，１９９３
【非特許文献６】ｖａｎ Ｓｔａａｄｅｎ ａｎｄ Ｒｏｍｅｒ（１９９８）
【非特許文献７】Ｄｒｅｌｌｅｒａｎｄ Ｋｉｓｃｈｎｅｒ，１９９３
【非特許文献８】Ｅｂｅｒｌ，１９９９
【非特許文献９】Ｊａｒｍａｎら、１９９３
【非特許文献１０】Ｃｈｉｅｎら、１９９６
【非特許文献１１】Ｄａｖｉｓら、１９９０
【非特許文献１２】Ｊａｒｍａｎａｎｄ Ａｈｍｅｄ，１９９８
【非特許文献１３】Ｖａｅｓｓｉｎら、１９９０
【非特許文献１４】Ａｋａｚａｗａら、１９９５
【非特許文献１５】Ｂｅｎ−Ａｒｉｅら、１９９６
【非特許文献１６】Ｂｅｎ−Ａｒｉｅら、１９９７
【非特許文献１７】Ｃｈｉｅｎら、１９９６
【非特許文献１８】Ａｌｄｅｒら、１９９６
【非特許文献１９】Ｈａｔｔｅｎａｎｄ Ｈｅｉｎｔｚ，１９９５
【非特許文献２０】Ｌｅｅら、１９９８
【非特許文献２１】Ｈｅｌｍｓａｎｄ Ｊｏｈｎｓｏｎ（１９９８）
【非特許文献２２】Ｍａｎｓｏｕｒら、１９９３
【非特許文献２３】Ｔｏｒｒｅｓら、１９９６
【非特許文献２４】Ｗａｎｇら、１９９８
【非特許文献２５】Ｚｈｅｎｇａｎｄ Ｇａｏ，２０００
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は、難聴、部分的聴力欠失、内耳有毛細胞の障害または欠失による前庭難聴、変形関節症および異常細胞増殖の治療のための治療用薬剤としてのａｔｏｎａｌ関連核酸またはアミノ酸配列、または任意のそのホモログまたはオーソログの特徴付けおよび使用を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明の一実施形態は、異種配列がａｔｏｎａｌ関連核酸配列の対立遺伝子を不活性化する条件下で、前記対立遺伝子を置換している異種核酸配列を有する動物である。好ましい実施形態において、前記異種配列は、ａｔｏｎａｌ関連調節配列の制御下で発現している。特定の実施形態において、両方のａｔｏｎａｌ関連対立遺伝子が置換されている。さらに詳細な実施形態において、両方のａｔｏｎａｌ関連対立遺伝子は、同一ではない異種核酸配列で置換されている。さらなる実施形態において、前記動物は、検出可能な状態であり、前記状態は、有毛細胞の欠失、小脳顆粒ニューロン欠損症、聴覚障害、平衡失調、関節疾患、変形関節症、新生物神経外胚葉細胞の異常増殖および髄芽細胞腫の形成からなる群より選択される。本発明の別の実施形態において、前記異種核酸配列は、β−ガラクトシダーゼ、グリーンフルオレセインタンパク質（ＧＦＰ）、ブルーフルオレセインタンパク質（ＢＦＰ）、ネオマイシン、カナマイシン、ルシフェラーゼ、β−グルクロニダーゼおよびクロラムフェニコールトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）からなる群より選択したレポータ配列である。別の詳細な実施形態において、前記レポータ配列は調節可能であり、脳組織、神経組織、皮膚組織、非骨化軟骨細胞、関節軟骨細胞、メルケル細胞、内耳感覚上皮および脳幹核で発現している。さらに詳細な実施形態において、前記ａｔｏｎａｌ関連対立遺伝子は、調節可能プロモータ配列または組織特異性プロモータ配列の制御下で、ａｔｏｎａｌ関連核酸配列で置換され、前記組織は、脳組織、神経組織、皮膚組織、非骨化軟骨細胞、関節軟骨細胞、メルケル細胞、内耳感覚上皮および脳幹核からなる群より選択される。さらなる実施形態において、前記動物はマウス、ショウジョウバエ、ゼブラフィッシュ、カエル、ラット、ハムスターまたはモルモットである。
【００１６】
本発明の別の実施形態は、動物における化合物のスクリーニング方法であって、前記化合物はａｔｏｎａｌ関連核酸配列の発現に影響を及ぼし、前記化合物を前記動物に送達すること、ここで、前記動物は、異種核酸配列の挿入により不活性化されたａｔｏｎａｌ関連核酸配列の少なくとも１つの対立遺伝子を有し、前記異種核酸配列は、ａｔｏｎａｌ関連調節配列の制御下にある、および前記ａｔｏｎａｌ関連核酸配列の前記発現における変化を監視することを含む。詳細な実施形態において、前記化合物は、ａｔｏｎａｌ関連核酸配列の前記発現をアップレギュレートまたはダウンレギュレートする。さらなる実施形態において、前記動物は、マウスまたはショウジョウバエである。詳細な実施形態において、異種核酸配列はレポータ配列である。さらに詳細な実施形態において、異種核酸配列は、β−ガラクトシダーゼ、グリーンフルオレセインタンパク質（ＧＦＰ）、ブルーフルオレセインタンパク質（ＢＦＰ）、ネオマイシン、カナマイシン、ルシフェラーゼ、β−グルクロニダーゼおよびクロラムフェニコールトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）からなる群より選択される。
【００１７】
本発明の別の実施形態は、ａｔｏｎａｌ関連核酸配列の発現に影響を及ぼす化合物である。詳細な実施形態において、前記化合物はａｔｏｎａｌ関連核酸配列の発現をアップレギュレートまたはダウンレギュレートする。詳細な実施形態において、前記化合物は、動物における検出可能な状態に影響を及ぼし、前記状態は、有毛細胞の欠失、小脳顆粒ニューロン欠損症、聴覚障害、平衡失調、関節疾患、変形関節症、新生物神経外胚葉細胞の異常増殖および髄芽細胞腫の形成からなる群より選択される。
【００１８】
本発明の別の実施形態は、動物における化合物のスクリーニング方法であって、前記化合物は前記動物において検出可能な状態に影響を及ぼし、前記化合物を前記動物に送達すること、ここで、前記動物におけるａｔｏｎａｌ関連核酸配列の少なくとも１つの対立遺伝子は、異種核酸配列の挿入により不活性化され、前記異種核酸配列は、ａｔｏｎａｌ関連調節配列の制御下にある、および前記動物を検出可能な状態における変化について監視することを含む。詳細な実施形態において、前記検出可能状態は、有毛細胞の欠失、小脳顆粒ニューロン欠損症、聴覚障害、平衡失調、関節疾患、変形関節症、新生物神経外胚葉細胞の異常増殖および髄芽細胞腫の形成からなる群より選択される。別の実施形態において、前記化合物の前記送達は、前記異種核酸配列の発現に影響を及ぼす。詳細な実施形態において、前記異種核酸配列の前記発現は、アップレギュレートまたはダウンレギュレートされる。さらに詳細な実施形態において、前記動物はマウス、ショウジョウバエ、ゼブラフィッシュ、カエル、ラット、ハムスターまたはモルモットである。
【００１９】
本発明の別の実施形態は化合物であって、前記化合物は、前記検出可能な状態に影響を及ぼす。詳細な実施形態において、前記化合物は異種核酸配列の発現に影響を及ぼす。さらなる詳細な実施形態において、前記化合物は異種核酸配列の発現をアップレギュレートまたはダウンレギュレートする。
【００２０】
本発明の他の実施形態は、小脳顆粒ニューロン欠損症のための、機械的受容細胞増殖の促進のための、有毛細胞の産出のための、聴覚障害または平衡失調の治療のための、関節疾患の治療のための、細胞の異常増殖の治療のための、および機能性ａｔｏｎａｌ関連核酸またはアミノ酸配列の欠失の結果である疾患の治療のための、ヒトを含む動物の治療方法である。前記方法には、治療上有効量のａｔｏｎａｌ関連核酸またはアミノ酸配列を投与することが含まれる。詳細な実施形態において、前記投与は、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノ随伴ベクター、プラスミド、または任意の他の核酸に基づくベクター、リポソーム、核酸、ペプチド、脂質、炭水化物および前記ベクターのそれらの組合せからなる群より選択したベクターによる。詳細な実施形態において、前記ベクターは非ウイルスベクターまたはウイルスベクターである。別の詳細な実施形態において、前記ベクターは細胞である。好ましい実施形態において、前記ベクターは、サイトメガロウイルスＩＥプロモーター配列およびＳＶ４０初期ポリアデニル化シグナル配列からなるアデノウイルスベクターである。別の詳細な実施形態において、前記細胞はヒト細胞である。さらに詳細な実施形態において、前記関節疾患は変形関節症である。詳細な実施形態において、前記ａｔｏｎａｌ関連核酸またはアミノ酸配列は、Ｈａｔｈ１またはＭａｔｈ１である。別の詳細な実施形態において、細胞は、ａｔｏｎａｌ関連核酸またはアミノ酸配列に改変を含有する。さらに詳細な実施形態において、アミノ酸配列は、配列番号５８の約２０個のコンティグアミノ酸残基と、少なくとも約８０％の同一性を有する。さらに詳細な実施形態において、核酸配列は、配列番号５８の約２０個のコンティグアミノ酸残基と少なくとも約８０％の同一性を持つポリペプチドをコードしている。
【００２１】
本発明の別の実施形態は、細胞の異常増殖に関する動物の治療方法であって、細胞におけるａｔｏｎａｌ関連核酸配列またはアミノ酸配列のレベルを変えることを含む方法である。詳細な実施形態において、前記改変は減少であるか、または前記核酸またはアミノ酸配列が改変を含む。
【００２２】
本発明の別の実施形態は、送達ビーイクルとの組合せでのａｔｏｎａｌ関連アミノ酸配列または核酸配列を含む組成物であって、前記ビーイクルは細胞内に治療上有効量のａｔｏｎａｌ関連核酸配列またはアミノ酸配列を送達する。詳細な実施形態において、前記ビーイクルは微生物毒素のレセプター結合領域、または任意の融合分子であり、またはタンパク質導入領域である。詳細な実施形態において、前記タンパク質導入領域は、ＨＩＶＴＡＴペプチド由来のものである。詳細な実施形態において、前記ａｔｏｎａｌ関連アミノ酸配列または核酸配列は、Ｈａｔｈ１またはＭａｔｈ１である。
【００２３】
本発明の別の実施形態は、有毛細胞の欠損に関して生物を治療するための組成物が存在し、前記生物は、ａｔｏｎａｌ関連核酸配列中の欠失を含む。詳細な実施形態において、欠損は、前記ａｔｏｎａｌ関連核酸配列の突然変異または変化である。別の詳細な実施形態において、欠損は、前記ａｔｏｎａｌ関連核酸配列の調節配列に影響を及ぼす。本発明のさらに詳細な実施形態において、有毛細胞の欠損に関して生物を治療する組成物が存在し、前記生物は、ａｔｏｎａｌ関連核酸配列の調節に関連する核酸配列中の欠損を含む。本発明のさらなる実施様態において、有毛細胞の欠損に関して生物を治療するための組成物が存在し、前記生物は、ａｔｏｎａｌ関連核酸配列の調節に関連したアミノ酸配列中の欠損を含む。
【００２４】
本発明の別の実施形態において、小脳顆粒ニューロン欠損症に関して生物を治療するための組成物が存在し、前記生物は、ａｔｏｎａｌ関連核酸配列中の欠失を含む。詳細な実施形態において、欠損は、前記ａｔｏｎａｌ関連核酸配列の突然変異または変化である。別の詳細な実施形態において、欠損は、前記ａｔｏｎａｌ関連核酸配列の調節配列に影響を及ぼす。本発明のさらなる実施形態において、小脳顆粒ニューロン欠損症に関して生物を治療する組成物が存在し、前記生物は、ａｔｏｎａｌ関連核酸配列の調節に関連する核酸配列中の欠損を含む。本発明のさらなる実施形態において、小脳顆粒ニューロン欠損症に関して生物を治療するための組成物が存在し、前記生物は、ａｔｏｎａｌ関連核酸配列の調節に関連したアミノ酸配列中の欠損を含む。
【００２５】
本発明の別の実施形態において、聴覚障害に関して生物を治療するための組成物が存在し、前記生物は、ａｔｏｎａｌ関連核酸配列中の欠損を含む。詳細な実施形態において、欠損は、前記ａｔｏｎａｌ関連核酸配列の突然変異または変化である。別の詳細な実施形態において、欠損は、前記ａｔｏｎａｌ関連核酸配列の調節配列に影響を及ぼす。本発明のさらなる実施形態において、聴覚障害に関して生物を治療する組成物が存在し、前記生物は、ａｔｏｎａｌ関連核酸配列の調節に関連する核酸配列中の欠損を含む。本発明のさらなる実施形態において、聴覚障害に関して生物を治療するための組成物が存在し、前記生物は、ａｔｏｎａｌ関連核酸配列の調節に関連したアミノ酸配列中の欠損を含む。
【００２６】
本発明の別の実施形態において、平衡失調に関して生物を治療するための組成物が存在し、前記生物は、ａｔｏｎａｌ関連核酸配列中の欠損を含む。詳細な実施形態において、欠損は、前記ａｔｏｎａｌ関連核酸配列の突然変異または変化である。別の詳細な実施形態において、欠損は、前記ａｔｏｎａｌ関連核酸配列の調節配列に影響を及ぼす。本発明のさらなる実施形態において、平衡失調に関して生物を治療する組成物が存在し、前記生物は、ａｔｏｎａｌ関連核酸配列の調節に関連する核酸配列中の欠損を含む。本発明のさらなる実施形態において、平衡失調に関して生物を治療するための組成物が存在し、前記生物は、ａｔｏｎａｌ関連核酸配列の調節に関連したアミノ酸配列中の欠損を含む。
【００２７】
本発明の別の実施形態において、変形関節症に関して生物を治療するための組成物が存在し、前記生物は、ａｔｏｎａｌ関連核酸配列中の欠損を含む。詳細な実施形態において、欠損は、前記ａｔｏｎａｌ関連核酸配列の突然変異または変化である。別の詳細な実施形態において、欠損は、前記ａｔｏｎａｌ関連核酸配列の調節配列に影響を及ぼす。本発明のさらなる実施形態において、変形関節症に関して生物を治療する組成物が存在し、前記生物は、ａｔｏｎａｌ関連核酸配列の調節に関連する核酸配列中の欠損を含む。本発明のさらなる実施形態において、変形関節症に関して生物を治療するための組成物が存在し、前記生物は、ａｔｏｎａｌ関連核酸配列の調節に関連したアミノ酸配列中の欠損を含む。
【００２８】
本発明の別の実施形態において、関節疾患に関して生物を治療するための組成物が存在し、前記生物は、ａｔｏｎａｌ関連核酸配列中の欠損を含む。詳細な実施形態において、欠損は、前記ａｔｏｎａｌ関連核酸配列の突然変異または変化である。別の詳細な実施形態において、欠損は、前記ａｔｏｎａｌ関連核酸配列の調節配列に影響を及ぼす。本発明のさらなる実施形態において、関節疾患に関して生物を治療する組成物が存在し、前記生物は、ａｔｏｎａｌ関連核酸配列の調節に関連する核酸配列中の欠損を含む。本発明のさらなる実施形態において、関節疾患に関して生物を治療するための組成物が存在し、前記生物は、ａｔｏｎａｌ関連核酸配列の調節に関連したアミノ酸配列中の欠損を含む。
【００２９】
本発明の別の実施形態において、細胞の異常増殖に関して生物を治療するための組成物が存在し、前記生物は、ａｔｏｎａｌ関連核酸配列中の欠損を含む。詳細な実施形態において、欠損は、前記ａｔｏｎａｌ関連核酸配列の突然変異または変化である。別の詳細な実施形態において、欠損は、前記ａｔｏｎａｌ関連核酸配列の調節配列に影響を及ぼす。本発明のさらなる実施形態において、細胞の異常増殖に関して生物を治療する組成物が存在し、前記生物は、ａｔｏｎａｌ関連核酸配列の調節に関連する核酸配列中の欠損を含む。本発明のさらなる実施形態において、細胞の異常増殖に関して生物を治療するための組成物が存在し、前記生物は、ａｔｏｎａｌ関連核酸配列の調節に関連したアミノ酸配列中の欠損を含む。
【００３０】
本発明の他方の実施形態において、癌に関して生物を治療するための組成物が存在し、上記生物は、ａｔｏｎａｌ関連核酸配列中の欠損を含む。詳細な実施形態において、欠損は、上記ａｔｏｎａｌ関連核酸配列の突然変異または変化である。他方の詳細な実施形態において、欠損は、上記ａｔｏｎａｌ関連核酸配列の調節配列に影響を及ぼす。本発明のさらなる実施形態において、癌に関して生物を治療する組成物が存在し、上記生物は、ａｔｏｎａｌ関連核酸配列の調節に関連する核酸配列中の欠損を含む。本発明のさらなる実施形態において、癌に関して生物を治療するための組成物が存在し、上記生物は、ａｔｏｎａｌ関連核酸配列の調節に関連したアミノ酸配列中の欠損を含む。具体的な実施形態において、上記癌は髄芽腫である。
【００３１】
別のさらなる目的、特徴および利点は、以下の明細書を読むことによって、かつその一部分を形成している付随する図面、または本開示の目的のために与えられた本発明の好適な実施形態の任意の実施例を参照することで、明らかになり、結果としてより容易に理解されるようになるであろう。
【発明の効果】
【００３２】
本発明の治療薬剤は、難聴、部分的聴力欠失、内耳有毛細胞の障害または欠失による前庭難聴、変形関節症および異常細胞増殖の治療のためのものである。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】図１Ａおよび図１Ｂは、上記Ｍａｔｈ１ヘテロ接合胎児の内耳β−Ｇａｌ染色（青色）を示す。図１Ａは、Ｍａｔｈ１+/β-Gal胎児のＥ１２．５での耳胞（ＯＶ）を示し、図１Ｂは、Ｅ１４．５での内耳を示す。感覚上皮は、蝸牛（Ｃ）、球形嚢（Ｓ）、卵形嚢（Ｕ）、および半規管膨大部（ＳＣＡ）において明確に染色された。内耳の概略図を染色とともに示し、参照として、青色は感覚上皮の位置を示す。顕微鏡での画像の原型倍率は図１Ａでは×１００、図１Ｂでは×５０である。
【図２】図２Ａ乃至図２Ｆは、野生型およびＭａｔｈ１β-Gal/ β-Galマウスにおける、Ｅ１８．５内耳感覚上皮の走査型電子顕微鏡写真の画像である。野生型マウスの上皮は図２Ａ、図２Ｃおよび図２Ｅに示し、ヌルマウスの上皮は図２Ｂ、図２Ｄ、および図２Ｆに示す。蝸牛のコルチ器官は、図２Ａおよび図２Ｂに示す。野生型マウスにおいては、３列の外毛細胞（１、２、３）、１列の内毛（Ｉ）、毛束を持つすべて（ＨＢ）がある。蝸牛の補助構造である蓋膜（ＴＭ）は基底部で観察できる。感覚上皮の上方には、痕跡運動毛（ＲＫ）を有する扁平上皮細胞（ＳＱ）がある。ヌルマウス（図２Ｂ）においては、扁平上皮細胞しかない。頭頂半規管のクリスタ膨大部は、図２Ｃおよび図２Ｄに示す。ヌルマウスクリスタは、全般的な形態において野生型マウスと同様であり、隔膜（隆起）クルシアタン（ＥＣ）を包含するが、それよりも小さい。卵形嚢の斑紋は、図２Ｅおよび図２Ｆの焦点である。また、ヌルマウスの斑紋は野生型のものよりも小さい。目盛り線は以下の通りである。すなわち、図２Ａおよび図２Ｂでは１０μｍ、図２Ｃおよび図２Ｄでは５０μｍ、図２Ｅおよび図２Ｆでは１００μｍである。
【図３】図３Ａ乃至図３Ｆは、野生型マウス（図３Ａ、図３Ｃ、図３Ｅ）およびＭａｔｈ１β-Gal/ β-Gal（図３Ｂ、図３Ｄ、図３Ｆ）の内耳感覚上皮の半薄黄筋部を示す光顕微鏡写真であり、すべてのマウスをＥ１８．５で観察した。図３Ａにおいては、野生型マウスの蝸牛で見られるように、３個の外毛細胞（１、２、３）および１個の内毛細胞（Ｉ）がある。逆に、ヌルマウス蝸牛（図３Ｂ）には、同じ領域に扁平上皮細胞（ＳＱ）しかない。野生型クリスタ膨大部（図３Ｃ）および小胞斑紋（図３Ｅ）には、毛細胞（ＨＣ）および支持細胞（ＳＣ）があるが、ヌルマウスでは支持細胞しかない（図３Ｄおよび図３Ｆ）。クリスタは、図３Ｃにおいて、毛細胞の複合膜を評価するために斜めに切断した。卵形嚢の補助構造である耳石膜（ＯＭ）は、野生型マウス（図３Ｅ）とヌルマウス（図３Ｆ）の両方にある。目盛り線は、図３Ａおよび図３Ｂでは１００μｍ、図３Ｃおよび図３Ｄでは５０μｍ、図３Ｅおよび図３Ｆでは２５μｍである。
【図４】図４Ａおよび図４Ｂは、野生型およびＭａｔｈ１β-Gal/ β-GalマウスのＥ１８．５小胞斑紋の透過電子顕微鏡写真である。図４Ａは、毛細胞（ＨＣ）および支持細胞（ＳＣ）が野生型小胞斑紋にあることを示す。対照的に、ヌルマウスでは支持細胞しかない（図４Ｂ）。毛細胞は毛束（ＨＢ）を有し、支持細胞は微繊毛（ＭＶ）を有する。毛細胞は電子密度がほとんどなく、支持細胞よりも頂部細胞核を多く有するが、後者では分泌性顆粒（ＳＧ）を有する。いくつかの未分化毛細胞（ＩＭ）が野生型において見られるが、ヌルマウスにおいてはみられない。目盛り線は、全図で１０μｍである。
【図５】図５Ａ乃至図５Ｆは、内耳感覚上皮のカルレチニン染色図を示す。野生型（図５Ａおよび図５Ｃ）およびＭａｔｈ１β-Gal/ β-Gal（図５Ｂおよび図５Ｄ）同腹子のＥ１６．５小胞を通る部位は、共焦顕微鏡観察のために、ヨードプロピジウム（赤色）で対比染色した。Ｅ１８．５野生型（図５Ｅ）およびＭａｔｈ１β-Gal/ β-Gal（図５Ｆ）のクリスタ膨大部を通って切断した部位は、免疫蛍光法顕微鏡観察のために、ＤＡＰＩ（青色）で対比染色した。クリスタは斜角に切断し、図５Ｅにおいて毛細胞の複合膜を評価している。カルレチニン（緑色、矢印）の免疫染色は、野生型の毛細胞において見られるが（図５Ａ、図５Ｃおよび図５Ｅ）、ヌルマウスにおいては見られない（図５Ｂ、図５Ｄおよび図５Ｆ）。図５Ａおよび図５Ｂの囲いの部分は、図５Ｃおよび図５Ｄにおいて拡大した領域を示す。目盛り線は、図５Ａおよび図５Ｂで１００μｍ、図５Ｃおよび５Ｄでは１５μｍ、図５Ｅおよび５Ｆでは×２００倍である。
【図６】図６Ａおよび図６Ｂは、Ｍａｔｈ１+/β-Galヘテロ接合体を用いたマウス関節軟骨中でのＭａｔｈ１の発現パターンを示す。図６Ａは、Ｐ１４マウス前肢の染色様式を示し、すべての関節での発現を示している。図６Ｂは、Ｍａｔｈ１が、骨化していない関節軟骨細胞でのみ発現することを示す、同じマウス由来のひじ関節の画像（２０倍）である。
【図７】図７Ａ乃至図７Ｃは、ｌａｃＺ遺伝子によるＭａｔｈ１コード領域の置換を示す。図７Ａ上部は、Ｍａｔｈ１遺伝子座の地図を有する。コード領域は黒色の囲いで示す。野生型および変異型対立遺伝子を検出するために用いたプローブ部位は黒色線で示す。標的ベクターは、大きなＸで示す相同組換え部位と一緒に、中位置にある。下部に示す標的座において、ｌａｃＺは、Ｍａｔｈ１調節因子の制御下で翻訳される。図７Ｂは、３’外部プローブを用いた胚性幹細胞のサザンブロット分析を示す。上部バンドはｗｔ対立遺伝子を表わし、下部のバンドは標的クローンの標的変異対立遺伝子（ｍｕｔ）を表わす。図７Ｃは、Ｍａｔｈ１β-Gal/ β-Galマウスにおいて、標的対立遺伝子の存在と野生型対立遺伝子の欠損を立証する、ヘテロ接合体マウスの子孫由来ＤＮＡのサザンブロット分析を示す（アスタリスク）。略語は次の通りである。すなわち、（Ａ）ＡｐａＩ；（Ｈ）ＨｉｎｄIII ；（ＲＩ）ＥｃｏＲＩ；（Ｓ）ＳａｌＩ；（Ｘ）ＸｂａＩ。
【図８】図８Ａ乃至図８Ｈは、Ｍａｔｈ１+/β-GalおよびＭａｔｈ１β-Gal/ β-GalマウスにおけるＭａｔｈ１／ｌａｃＺ発現および小脳表現型を示す。図８Ａは、Ｅ９．５および（図８Ｂ）Ｅ１０．５での背神経管におけるＭａｔｈ１／ｌａｃＺ発現を示す。図８Ｃは、背部（矢印）におけるＭａｔｈ１／ｌａｃＺ発現を持つＥ１０．５での後部脳での断面を示す。図８Ｄは、Ｅ１２．５胚由来の脊髄断面において、脊椎細胞が腹部へ移動する（矢印）ことを示す。図８Ｅは、斜方形唇でのＥＧＬ原種中およびＥＧＬを構成し得る移動細胞中で発現が観察されるＥ１４．５発現を示す。図８Ｆは、Ｍａｔｈ１β-Gal/ β-Galマウスにおいて、Ｍａｔｈ１／ｌａｃＺ発現が、有意に大きさが縮小した斜方形唇中で少しの細胞に制限されていることを示す。図８Ｇは、ＰＯにおいてＭａｔｈ１／ｌａｃＺはＥＧＬ中で発現することを示す。図８Ｈは、ヌルマウスではＥＧＬが欠損していることを示す。図８Ｃ乃至図８Ｈの原型倍率は１００×である。
【図９】図９Ａ乃至図９Ｇは、内耳および脳幹中のＭａｔｈ１／ｌａｃＺの発現および腹部脳橋細胞核の組織学的分析を示す。Ｅ１８．５Ｍａｔｈ１+/β-Gal小嚢クリスタのＸ−Ｇａｌ染色（図９Ａ）および、Ｍａｔｈ１+/β-Gal（図９Ｂ）およびＭａｔｈ１β-Gal/ β-Gal（図９Ｃ）の内耳感覚上皮。（図９Ａおよび図９Ｂ）の感覚上皮の上部毛細胞層におけるＭａｔｈ１／ｌａｃＺの発現および特徴的な腎杯出現（矢じり）。ヌルマウスにおいて、上皮細胞のＸ−Ｇａｌ染色は毛細胞の欠損に非特異的である（図９Ｃ）。Ｅ１８．５でのＭａｔｈ１+/β-Gal（図９Ｄ）およびＭａｔｈ１β-Gal/ β-Gal（図９Ｅ）の脳全体Ｘ−Ｇａｌ染色を示す。Ｍａｔｈ１+/β-Galマウスにおいて、脳橋細胞核（矢じり）および小脳（矢印）で陽性染色があり、それらは小脳と脳橋細胞核の両方でヌル変異体が欠損または大きく縮小されている（挿入図）。図９Ｆおよび図９Ｇは、野生型およびヌル変異体の（それぞれ図９Ｆおよび図９Ｇ）、脳橋での矢状断面のヘマトキシリンおよびエオシン染色を示し、ヌル変異体における腹部脳橋細胞核欠損を示している。原型倍率は次の通りである。すなわち、（Ａ）４００×、（ＢおよびＣ）１０００×、（ＤおよびＥ）８×、ＤおよびＥの挿入図１００×、（ＦおよびＧ）１０×。
【図１０】図１０Ａ乃至図１０Ｅは、Ｍａｔｈ１／ｌａｃＺが関節軟骨細胞で発現していることを示す。（図１０Ａ）Ｅ１２．５および（図１０Ｂ）Ｅ１６．５での胚全体のＸ−Ｇａｌ染色は、Ｍａｔｈ１／ｌａｃＺがすべての関節で発現していることを示す（図１０Ｃ）。Ｅ１８．５Ｍａｔｈ１+/β-Galマウスのひじ関節での水平断面は、休息軟骨細胞でそれが発現していることを示す（矢印）。図１０Ｄは、関節軟骨細胞（矢じり）および休息軟骨細胞（矢印）で発現しているＰ１０での上腕骨放射器官の関節での水平断面を示す。図１０Ｅは、Ｍａｔｈ１／ｌａｃＺが関節軟骨細胞で発現していることを示す、手関節での断面を高倍率で示す。原型倍率は次の通りである。すなわち、（Ｃ）１０×；（Ｄ）２０×；（Ｅ）４０×。
【図１１】図１１Ａ乃至図１１Ｌは、メルケル細胞でのＭａｔｈ１／ｌａｃＺの発現を示す。毛様および非毛様皮膚の染色した構造を同定するために、Ｅ１６．５同腹子胚を全体、断片で染色し、顕微鏡観察した。震毛での断面（図１１Ａ）、低倍率（図１１Ｂ）およびＢで、矢印で示した領域の高倍率（図１１Ｃ）の肢の肉球、および毛様皮膚（図１１Ｄ）を示す。全断面において、染色された細胞の局在化がメルケル細胞から予期された通りであった。ヌルマウスで顕微鏡欠損を探すために、実体顕微鏡を用いてＭａｔｈ１+/β-Gal（対照、パネルＥ〜Ｈ）およびＭａｔｈ１β-Gal/ β-Gal（ヌル、パネルＩ〜Ｌ）同腹子マウスの近い画像をとった。ヌルマウスでの染色は、震毛（Ｅ、Ｉ）肢関節（Ｆ、Ｊ）、および肢肉球（Ｇ、Ｋ）において、用量効果のために、強く現れた。対照的に、ヌル（Ｊ、Ｌ）マウスの染色の強さは、毛様皮膚に関連した触覚ドームで、ヘテロ接合体（Ｆ、Ｈ）マウスのそれよりも明らかに弱かった。原型倍率は次の通りである。すなわち、Ａ×２００；Ｂ×５０；Ｃ×４００；Ｄ×５００；Ｅ−Ｇ−Ｈ−Ｉ−Ｋ−Ｌ×３２；Ｆ×１６。
【図１２】図１２Ａ乃至図１２Ｅは、ＴａｂｂｙマウスにおけるｌａｃＺ染色触覚ドームの欠損を示す。Ｔａｂｂｙ／ＴａｂｂｙメスをＭａｔｈ１+/β-Galオスと交配させ、その子をＸ−Ｇａｌ染色し、Ｅ１６．５で性決定した。鼻の初期震毛の周辺での染色が、Ｔａｂｂｙ変異によるメス胚へテロ接合体（図１２Ａ）と、変異によるオス胚へミ接合体（図１２Ｂ）で見られた。二次震毛は、Ｔａｂｂｙ変異体においては数が変化することが知られているが（黒色矢印）、それもまた染色された。触覚ドームの染色は、Ｔａｂｂｙが半優性変異であるため、Ｍａｔｈ１+/β-Gal（Ｔａｂｂｙに関してｗｔ）胚（図１２Ｃ）に比べてＴａｂｂｙ／Ｘメス（図１２Ｄ）で弱かった。しかしながら、Ｔａｂｂｙ座に野生型対立遺伝子を持つメス胚で染色触覚ドームの斑点が見られた（図１２Ａの赤色矢印、および図１２Ｄ）。対照的に、へミ接合体は、メルケル細胞の発生を破壊する毛小胞体の欠損のために、染色と触覚ドームの両方を完全に欠失している（図１２Ｂおよび図１２Ｅ）。
【図１３】図１３Ａ乃至図１３Ｆは、野生型およびＭａｔｈ１ヌルマウス中のメルケル細胞のマーカー分析を示す。Ｍａｔｈ１+/+ およびＭａｔｈ１β-Gal/ β-Gal由来の皮膚断片を抗ＭＡＴＨ１抗体（図１３Ａおよび図１３Ｂ）、サイトケラチン１８（図１３Ｃおよび図１３Ｄ）、およびクロモグラニンＡ（図１３Ｅおよび図１３Ｆ）と反応させた。ＭＡＴＨ１に対するポリクローナル抗体は、野生型のまれな腹部毛小胞中の多数の基底細胞核を同定するが（図１３Ａ）、変異型マウスでは同定しない（図１３Ｂ）。サイトケラチン１８およびクロモグラニンＡに対するモノクローナル抗体は、野生型（図１３Ｃおよび図１３Ｅ）と変異型（図１３Ｄおよび図１３Ｆ）の両方のマウス中にあるメルケル細胞を同定する。原型倍率は１００×である。
【図１４】図１４Ａ乃至１４Ｇは、Ｍａｔｈ１がショウジョウバエａｔｏ変異型胚中の弦音器官ニューロンの欠損を救うことを示す。図１４Ａは、野生型ハエの胸部の背面図を示す。なお、剛毛または長剛毛の規則配列がある。図１４Ｂは、ＵＡＳ／ＧＡＬ４系（Ｂｒａｎｄａｎｄ Ｐｅｒｒｉｍｏｎ，１９９３）を用いてＭａｔｈ１を過剰発現させたトランスジェニックハエの同様の図である。この正常でない位置で起こる発現により、ＣＨＯ類でなく、外部感覚器官（機械的受容体の別の種類）である特別な剛毛が多数導かれる。正常でない位置のＣＨＯ類は多くの別の領域で産生される。図１４Ｃは、外部感覚器官に加え、６個のＣＨＯ類を含む２個の腹部クラスターの側面図であり、神経特異性抗体（Ｍａｂ２２Ｃ１０）により示す。５つのＣＨＯ類はクラスターの側面にあり、６つめはクラスターの背面にある。図１４Ｄは、ＣＨＯ類欠損のａｔｏ変異型胚の同様の図である。図１４Ｅは、正常な位置にあるａｔｏ変異型胚において新規ＣＨＯニューロンを誘導するＭａｔｈ１のユビキタス発現を示す。図１４Ｆは、プローブとしてａｔｏｃＤＮＡを用いた、第三齢脳全体のｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーションを示す。発生中の眼葉（“蹄鉄”発現型）および脳葉中央の細胞の、２個の斑点状クラスター（矢じり）を記す。図１４Ｇは、正常および正常でない位置でのＣＨＯ形成を誘導する、ショウジョウバエにおけるＭａｔｈ１発現を示す。（＋）はＣＨＯ類があることを示し、（−）はＣＨＯ類がないことを示す。第１カラム中の（＋）の数は、Ｍａｔｈ１が発現された際に観察されるＣＨＯ類の数の相対的な増加の定量に用いる。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
種々の実施形態および変更を、本発明の範囲および意図より逸脱することなく、本明細書で開示した発明になされてもよいことが当業者にて容易に明らかになる。
【００３５】
本明細書で使用する、「異常増殖」なる用語は、細胞の任意の細胞型の任意の増殖と定義し、上記細胞は正常の細胞周期進行の強制下にはなく、上記増殖は、結果として癌または他の癌のような発達となる可能性がある。
【００３６】
本明細書で使用する、「変化」なる用語は、核酸またはアミノ酸に対する任意の型の変化または改変として定義する。上記変化または改変には、突然変異、欠失、配置転換、核酸の添加が含まれる。これには、５’キャップの添加、イントロンプロセッシングおよびポリアデニル化のような転写後プロセッシングが含まれる。突然変異は、ナンセンス、ミスセンス、フレームシフトであり、または短くしたアミノ酸配列を導くことができ、またはアミノ酸の構造を変化させることができる。核酸に対する変化は、調節配列内に存在してもよく、トランス作動性因子に影響を与えてよい。また、多重変化が存在してもよい。また、上記変化または改変には、メチル化、ミリスチル化、アセチル化、グルコシル化を含むアミノ酸に対する変更、または細胞内または細胞間局在化シグナルおよび外来アミノ酸の開裂を含む上記アミノ酸のプロセッシングに関連したシグナルに対する変更が含まれる。また、上記変化は、上記タンパク質の変性または折り畳みにも影響を及ぼすことができる。
【００３７】
本明細書で使用する「ａｔｏｎａｌ関連」なる用語は、ショウジョウバエａｔｏｎａｌ核酸配列またはアミノ酸配列である任意の核酸配列またはアミノ酸配列、またはそれぞれ上記核酸またはアミノ酸配列と相同である任意の配列または類似性を有する特定の配列として定義する。配列は、哺乳動物および昆虫を含む任意の動物に存在し得る。本明細書で使用する有意な配列類似性は、２５％より大きな類似性を意味し、他方の配列の任意の領域で生じ得る。ａｔｏｎａｌ関連には、特に限定されないが、Ｍａｔｈ１（マウスａｔｏｎａｌホモログ１（ｍｏｕｓｅａｔｏｎａｌ ｈｏｍｏｌｏｇ １））、Ｃａｔｈ１（チキンａｔｏｎａｌホモログ （ｃｈｉｃｋｅｎａｔｏｎａｌ ｈｏｍｏｌｏｇ １））、Ｈａｔｈ１（ヒトａｔｏｎａｌホモログ（ｈｕｍａｎ ａｔｏｎａｌ ｈｏｍｏｌｏｇ１））およびＸａｔｈ１（アフリカツメガエルａｔｏｎａｌホモログ１（Ｘｅｎｏｐｕｓａｔｏｎａｌ ｈｏｍｏｌｏｇ １））が含まれる。さらに多重相同性または類似配列が動物内に存在し得る。
【００３８】
本明細書で使用する「小脳顆粒ニューロン欠損症」なる用語は、小脳顆粒ニューロンに関連する任意の欠損症として定義し、小脳顆粒ニューロンの欠失、小脳顆粒ニューロン前駆体細胞の欠失、顆粒細胞増殖の欠如、顆粒細胞移動の欠如、小脳外部顆粒層細胞の欠如が含まれる。
【００３９】
本明細書で使用する「欠損」なる用語は、ａｔｏｎａｌ関連配列の発現の変更、突然変異、欠陥または欠失として定義する。当業者は、発現の欠失が、本技術分野での標準の方法にて有意でないかまたは検出可能でないａｔｏｎａｌ関連配列の発現レベルに関連することを承知している。当業者はまた、ヒトのような成体生物での発現レベルの欠失または欠乏は自然に生じ、長い間に聴力の傷害を導くことも承知している。したがって、本明細書で使用する「欠損」には、ａｔｏｎａｌ関連配列の発現の自然な減少または欠失が含まれる。
【００４０】
本明細書で使用する「送達すること」なる用語は、目的地まで移動することと定義し、治療的目的のためとして投与することが含まれる。
【００４１】
本明細書で使用する「送達ビーイクル」なる用語は、他方の存在の移動に関連した存在物として定義する。上記送達ビーイクルは、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノ随伴ベクター、プラスミド、リポソーム、核酸、ペプチド、脂質、炭水化物およびそれらの組合せからなる群より選択する。
【００４２】
本明細書で使用する「検出可能状態」なる用語は、健康状態、または特定の発生学的、または病理学的症状によって特徴付けられる動物、器官または組織の状態として定義する。例としては、限定されないが、有毛細胞の欠失、小脳顆粒ニューロン欠損症、聴力障害、平衡失調、関節疾患、変形関節症および細胞の異常増殖が挙げられる。
【００４３】
本明細書で使用する「異種の」なる用語は、特定の遺伝子座に天然には存在しない核酸配列、またはそれに関連する核酸配列として定義する。代替的な実施形態において、異種核酸配列は、特定の遺伝子座には天然に存在するが、しかし天然に存在する遺伝子座と比較して分子変化を含む。例えば、ａｔｏｎａｌ関連配列の野生型遺伝子座を、同一の配列の欠陥コピーを置換するのに使用してよい。
【００４４】
本明細書で使用する「平衡失調」なる用語は、生物が十分に機能を果たさない平衡を持つような医学的状態として定義する。詳細な実施形態において、失調は前庭起始の欠陥による。他方の詳細な実施形態において、失調は、メニエール病、めまいおよびｌａｙｒｉｎｔｈｉｔｉｓに限定されないが、これらを含む平衡認知の前庭失調である。
【００４５】
本明細書で使用する「不活性化した」なる用語は、核酸配列の発現が減少しているかまたは完全に消滅している状態として定義する。上記不活性化は、他の核酸配列の輸送または挿入によって、または核酸配列の発現レベルに影響を及ぼすための、本技術分野で標準の任意の方法によって起こりうる。
【００４６】
本明細書で使用する「前駆体」なる用語は、他の細胞がその由来および／または特性を得る始原細胞として定義する。
【００４７】
本明細書で使用する「調節可能レポーター配列」なる用語は、他の配列の転写を指向する、そしてそれ自身が外来性因子または状態による調節制御下にある任意の配列として定義する。外来因子または状態には、限定はされないが、化学物質、核酸、タンパク質、ペプチド、脂質、炭水化物、糖、光、音、ホルモン、接触、または組織特異的環境への曝露等が含まれる。調節可能レポーター配列には、ＧＡＬプロモーター配列およびテトラサイクリンプロモーター／トランスアクティベーター配列等が含まれる。
【００４８】
本明細書で使用する「調節配列」なる用語は、直接的または間接的に他の配列の転写を制御する任意の配列として定義する。上記制御は転写の開始または停止に関するか、または転写の量または組織分布のいずれかであってよい。
【００４９】
本発明で使用する「レポーター配列」なる用語は、調節配列による発現を実証する任意の配列として定義する。上記レポーター配列は、ＲＮＡの形態またはタンパク質でのマーカーとして使用できる。レポーター配列には、β−ガラクトシダーゼ、グリーンフルオレセインタンパク質（ＧＦＰ）、ブルーフルオレセインタンパク質（ＢＦＰ）、ネオマイシン、カナマイシン、ルシフェラーゼ、β−グルクロニダーゼおよびクロラムフェニコールトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）等が挙げられる。本発明の特定の局面において、レポーター配列産物の存在および量は、核酸であろうとまたはアミノ酸であろうと、それを調節するプロモーター配列による転写のレベルを反映する。
【００５０】
本明細書で使用する「治療上有効」なる用語は、疾患に関連したいくつかの症状を改善するために必要な化合物の量として定義する。例えば、聴覚障害の治療において、任意の程度まで聴覚を改善し、または聴覚障害の任意の症状を抑える化合物が治療上有効である。関節疾患の治療において、健康または関節の動きを任意の程度まで改善し、または関節疾患の症状を抑える化合物が治療上有効である。細胞の異常増殖の治療において、増殖を減少させる化合物が治療上有効である。癌の治療において、例えば、細胞の増殖を減少させ、腫瘍の大きさを減少させ、転移を減少させ、上記癌に対する血管の増殖を減少させる、癌に対する免疫応答を促進する化合物が治療上有効である。化合物の治療上有効な量は、疾患を治すためには必要ではないが、しかし疾患に対する治療を提供する可能性がある。
【００５１】
本明細書で使用する「ベクター」なる用語は、特定の存在物を送達するための生物学的ビーイクルとして定義する。詳細な実施形態において、上記存在物はａｔｏｎａｌ関連核酸である。
【００５２】
本発明の１つの局面において、有毛細胞の欠失、小脳顆粒ニューロン欠損症、聴力障害、平衡失調、関節疾患、変形関節症および細胞の異常増殖のような検出可能な状態の治療用途のためのａｔｏｎａｌ関連核酸またはアミノ酸配列の使用を含む方法および薬剤がある。したがって、Ｃａｔｈ１（チキンより）、Ｈａｔｈ１（ヒトより）、Ｍａｔｈ１（マウスより）またはＸａｔｈ１（アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）より）に限定されないがこれらを含む、ショウジョウバエ由来のａｔｏｎａｌの任意のホモログまたはオーソログを本発明で使用してよい。好適な実施形態において、これらの配列は、上述した検出可能条件に対する動物、とりわけヒトの治療を指向している。それぞれ上記核酸またはアミノ酸配列に対して相同であるか、または有意な配列類似性を有する任意の配列を含むことは本発明の範囲内である。配列は、哺乳動物および昆虫を含む任意の動物で存在し得る。本明細書で使用したように、有意な配列類似性とは、類似性（アミノ酸残基または核酸塩基の同一性）が２５％以上であり、配列の任意の領域で起こり得ることを意味する。他方の実施形態において、本明細書で使用するａｔｏｎａｌ関連配列は、約５０％以上の配列類似性、約７０％以上の類似性、または約８０％以上の類似性を有する。
【００５３】
本発明の範囲内には、ａｔｏｎａｌ関連核酸配列またはアミノ酸配列を用いることが含まれ、ここで、塩基性ＨＬＨ領域のような、活性に関して重要な領域が分子内に含まれ、さらに活性に重要な領域の部分ではなく、その機能に影響を与えない核酸またはアミノ酸配列の領域内での変更、変異、欠失または置換が含まれる。
【００５４】
ａｔｏｎａｌ関連物の例には、限定はされないが、Ｍａｔｈ１（マウスａｔｏｎａｌホモログ１）、Ｃａｔｈ１（チキンａｔｏｎａｌホモログ）、Ｈａｔｈ１（ヒトａｔｏｎａｌホモログ）およびＸａｔｈ１（アフリカツメガエルａｔｏｎａｌホモログ１）が含まれる。このような例は、他の物が関連する生物で存在する可能性が非常にあるが、配列番号１〜配列番号６６で表す。当業者は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｇｅｎｂａｎｋ／ＧｅｎｂａｎｋＳｅａｒｃｈ．ｈｔｍｌ上の、ワールドワイドウェブにある核酸およびアミノ酸配列のデータベースコレクションを検索することのような、有意に同一性を有するそのような配列を同定するための方法を認識している。
【００５５】
本明細書で提供された配列および関連するジーンバンク受け入れ（ＧｅｎｂａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎ）番号は、以下のようにかっこ内で列記している。配列番号１（ＮＭ＿００５１７２）、配列番号２（ＮＰ＿００５１６３．１）、配列番号３（ＡＷ４１３２２８）、配列番号４（ＮＭ＿００９７１９）、配列番号５（ＮＰ＿０３３８４９．１）、配列番号６（ＮＭ＿００９７１８）、配列番号７（ＮＰ＿０３３８４８．１）、配列番号８（ＮＭ＿００９７１７）、配列番号９（ＮＰ＿０３３８４７．１）、配列番号１０（ＮＭ＿００７５００）、配列番号１１（ＮＰ＿０３１５２６．１）、配列番号１２（ＮＭ＿００７５０１）、配列番号１３（ＡＷ２８０５１８）、配列番号１４（ＡＷ２３６９６５）、配列番号１５（ＡＷ１６３６８３）、配列番号１６（ＡＦ１３４８６９）、配列番号１７（ＡＡＤ３１４５１．１）、配列番号１８（ＡＪ０１２６６０）、配列番号１９（ＣＡＡ１０１０６．１）、配列番号２０（ＡＪ０１２６５９）、配列番号２１（ＣＡＡ１０１０５．１）、配列番号２２（ＡＦ０７１２２３）、配列番号２３（ＡＡＣ６８８６８．１）、配列番号２４（Ｕ７６２０８）、配列番号２５（ＡＡＣ５３０２９．１）、配列番号２６（Ｕ７６２１０）、配列番号２７（ＡＡＣ５３０３３．１）、配列番号２８（Ｕ７６２０９）、配列番号２９（ＡＡＣ５３０３２．１）、配列番号３０（Ｕ７６２０７）、配列番号３１（ＡＡＣ５３０２８．１）、配列番号３２（ＡＦ０３６２５７）、配列番号３３（ＡＡＣ１５９６９．１）、配列番号３４（ＡＦ０３４７７８）、配列番号３５（ＡＪ００１１７８）、配列番号３６（ＣＡＡ０４５７２．１）、配列番号３７（Ｙ０７６２１）、配列番号３８（ＣＡＡ６８９００．１）、配列番号３９（ＡＦ０２４５３６）、配列番号４０（ＡＡＢ８２２７２．１）、配列番号４１（Ｄ８５１８８）、配列番号４２（ＢＡＡ１２７３８．１）、配列番号４３（Ｄ４４４８０）、配列番号４４（ＢＡＡ０７９２３．１）、配列番号４５（Ｄ４３６９４）、配列番号４６（ＢＡＡ０７７９１．１）、配列番号４７（Ｄ８５８４５）、配列番号４８（ＢＡＡ１２８８０．１）、配列番号４９（Ｕ９３１７１）、配列番号５０ （ＡＡＢ５８６６９．１）、配列番号５１（Ｕ９３１７０）、配列番号５２（ＡＡＢ５８６６８．１）、配列番号５３（Ｕ６１１５２）、配列番号５４（ＡＡＢ４１３０７．１）、配列番号５５（Ｕ６１１５１）、配列番号５６（ＡＡＢ４１３０６．１）、配列番号５７（Ｕ６１１４８）、配列番号５８（ＡＡＢ４１３０５．１）、配列番号５９（Ｕ６１１４９）、配列番号６０（ＡＡＢ４１３０４．１）、配列番号６１（Ｕ６１１５０）、配列番号６２（ＡＡＢ４１３０３．１）、配列番号６３（Ｌ３６６４６）、配列番号６４（ＡＡＡ２１８７９．１）、配列番号６９（ＡＡ６２５７３２）。
【００５６】
本発明の局面において、異種核酸配列がａｔｏｎａｌ関連核酸配列の対立遺伝子を不活性化する条件下で、上記対立遺伝子を置換する異種核酸を含む動物が存在する。代替的な実施形態において、異種配列を、染色体外増殖のために細胞に送達する。他方の代替的な実施形態において、異種配列を、ａｔｏｎａｌ関連核酸配列の遺伝子座以外の遺伝子座の細胞の染色体内に挿入する。好適な実施形態において、上記異種配列は、ａｔｏｎａｌ関連調節配列の制御下で発現する。詳細な実施形態において、ａｔｏｎａｌ関連対立遺伝子は両方置換される。さらに詳細な実施形態において、両方のａｔｏｎａｌ関連対立遺伝子は同一ではない異種核酸配列で置換される。トランスジェニック動物を産出する方法は、本技術分野で十分に公知である、当業者はＧｒｏｓｖｅｌｄａｎｄ Ｋｏｌｌｉａｓ（ｅｄｓ．）によるＴｒａｎｓｇｅｎｉｃＡｎｉｍａｌｓ、またはＪａｃｋｓｏｎｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）によるＭｏｕｓｅＧｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄＴｒａｎｓｇｅｎｉｃｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ等の参考文献を参照するであろう。
【００５７】
さらなる実施形態において、本発明のトランスジェニック動物は検出可能な状態を有し、上記状態は、有毛細胞の欠失、小脳顆粒ニューロン欠損症、聴力障害、平衡失調、関節疾患、変形関節症および細胞の異常増殖からなる群より選択される。本発明の他方の実施形態において、異種核酸配列は、β−ガラクトシダーゼ、グリーンフルオレセインタンパク質（ＧＦＰ）、ブルーフルオレセインタンパク質（ＢＦＰ）、ネオマイシン、カナマイシン、ルシフェラーゼ、β−グルクロニダーゼおよびクロラムフェニコールトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）からなる群より選択されるレポーター配列である。他方の詳細な実施形態において、レポーター配列は調節可能であり、脳組織、神経組織、皮膚組織、非骨化軟骨細胞、関節軟骨細胞、メルケル細胞、内耳感覚上皮細胞および脳幹核で発現している。さらに詳細な実施形態において、上記ａｔｏｎａｌ関連遺伝子座は、調節可能プロモーター配列または組織特定プロモーター配列の制御下で、ａｔｏｎａｌ関連核酸配列に置換され、上記組織は、脳組織、神経組織、皮膚組織、非骨化軟骨細胞、関節軟骨細胞、メルケル細胞、内耳感覚上皮細胞および脳幹核からなる群より選択される。さらに詳細な実施形態において、トランスジェニック動物はマウス、ショウジョウバエ、カエル、ゼブラフィッシュ、ラット、モルモットまたはハムスターである。
【００５８】
本発明の他方の実施形態は、動物における化合物のスクリーニング方法であって、前記化合物はａｔｏｎａｌ関連核酸配列の発現に影響を及ぼし、前記化合物を前記動物に送達すること、ここで、前記動物は、異種核酸配列の挿入により不活性化されたａｔｏｎａｌ関連核酸配列の少なくとも１つの対立遺伝子を有し、前記異種核酸配列は、ａｔｏｎａｌ関連調節配列の制御下にある、および前記ａｔｏｎａｌ関連核酸配列の前記発現における変化を監視することを含む。調節配列には、プロモーター配列、エンハンサーまたはサイレンサーが含まれ得る。
【００５９】
詳細な実施形態において、ａｔｏｎａｌ関連核酸配列の上記発現をアップレギュレートまたはダウンレギュレートする化合物が存在する。アップレギュレーションまたはダウンレギュレーションは、転写速度の増加またはｍＲＮＡ分解速度の減少によってよい。
【００６０】
本発明の他方の実施形態は、ａｔｏｎａｌ関連核酸配列の発現に影響を及ぼす化合物である。詳細な実施形態において、上記化合物は、ａｔｏｎａｌ関連核酸配列の発現をアップレギュレートまたはダウンレギュレートする。詳細な実施形態において、上記化合物は、動物での検出可能状態に影響を与え、上記状態は、有毛細胞の欠失、小脳顆粒ニューロン欠損症、聴力障害、平衡失調、関節疾患、変形関節症、細胞の異常増殖および癌の形成からなる群より選択される。
【００６１】
本発明の他方の実施形態は、動物における化合物のスクリーニング方法であって、前記化合物は前記動物において検出可能な状態に影響を及ぼし、前記化合物を前記動物に送達すること、ここで、前記動物におけるａｔｏｎａｌ関連核酸配列の少なくとも１つの対立遺伝子は、異種核酸配列の挿入により不活性化され、前記異種核酸配列は、ａｔｏｎａｌ関連調節配列の制御下にある、および前記動物を検出可能な状態における変化について監視することを含む。詳細な実施形態において、上記検出可能状態は、有毛細胞の欠失、小脳顆粒ニューロン欠損症、聴力障害、平衡失調、関節疾患、変形関節症、および細胞の異常増殖からなる群より選択される。他方の実施形態において、上記化合物の上記送達は、上記異種核酸配列の発現に影響を及ぼす。詳細な実施形態において、上記異種核酸配列の上記発現はアップレギュレートまたはダウンレギュレートされる。さらに詳細な実施形態において、動物はマウス、ショウジョウバエ、カエル、ゼブラフィッシュ、ラット、ハムスターまたはモルモットである。
【００６２】
本発明の他方の実施形態は、本発明のトランスジェニック動物での検出可能状態に影響を及ぼす化合物である。詳細な実施形態において、上記化合物は異種核酸配列の発現に影響を及ぼす。さらに詳細な実施形態において、上記化合物は異種核酸配列の発現をアップレギュレートまたはダウンレギュレートする。
【００６３】
本発明の別の実施形態は、小脳顆粒ニューロン欠如のために、機械的受容細胞増殖を促進するために、有毛細胞を産出するために、聴覚異常または平衡失調疾病を治療するために、関節疾患を治療するために、細胞の異常増殖を治療するために、および機能性ａｔｏｎａｌ関連核酸またはアミノ酸配列の欠失の結果である疾患の治療のために、ヒトを含む動物を治療する方法である。上記方法には、治療的効果的な量のａｔｏｎａｌ関連核酸またはアミノ酸配列を投与することが含まれる。詳細な実施形態において、上記投与は、ウイルスベクター（バクテリオファージ、動物および植物ウイルスを含む）、プラスミド、コスミド、または任意の他の核酸に基づくベクター、リポソーム、核酸、ペプチド、脂質、炭水化物および上記ベクターのそれらの組合せからなる群より選択したベクターによる。詳細な実施形態において、上記ベクターは、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、またはレンチウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、アルファウイルスベクターなどを含むアデノ随伴ベクターである。したがって、ベクターはウイルス性または非ウイルス性であってよい。好適な実施形態において、上記ベクターは、サイトメガロウイルスＩＥプロモーター配列およびＳＶ４０初期ポリアデニル化シグナル配列を含むアデノウイルスベクターである。他方の詳細な実施形態において、上記細胞はヒト細胞である。さらに詳細な実施形態において、上記関節疾患は変形関節症である。他の特定の実施様態において、細胞は、ａｔｏｎａｌ関連アミノ酸配列に改変を含有し、上記アミノ酸配列は、配列番号５８の約２０個の連続アミノ酸残基と、少なくとも約８０％の同一性を有する。
【００６４】
詳細な実施形態において、本発明はまた、小脳顆粒ニューロン欠損症、聴覚障害、平衡失調、関節疾患に対する治療を必要とする、または機械的受容性細胞増殖を促進することが必要である動物の、または機能的ａｔｏｎａｌ関連核酸またはアミノ酸配列の欠失の結果である疾患の治療方法を提供する。この方法には、配列ＡＡＮＡＲＥＲＲＲＭＨＧＬＮＨＡＦＤＱＬＲに対して少なくとも約７０％同一、好ましくは少なくとも約８０％同一、および最も好ましくは少なくとも約９０％同一であるアミノ酸を有する転写因子を、動物内の細胞に送達することが含まれる。いくつかの実施形態において、動物における細胞は、その動物の内耳に局在する。好ましくは、転写因子はＤａｕｇｈｔｅｒｌｅｓｓタンパク質への結合に対してａｔｏｎａｌと競合し（Ｊａｒｍａｎら，１９９３）、Ｍａｔｈ−１のＥ４７タンパク質への結合に対して競合する（Ａｋａｚａｗａら，１９９５）。
【００６５】
本発明の実施形態において、機能的ａｔｏｎａｌ関連核酸またはアミノ酸配列の欠失の結果である疾患に対して、生物を治療するための方法を提供する。当業者は、この欠失が成人ヒトで起こる有意な（または検出可能なレベルまでの）発現の自然な減少または欠失による可能性があることを認識している。
【００６６】
本発明の別の実施形態において、細胞内のａｔｏｎａｌ関連核酸またはアミノ酸濃度を変更することを含む、細胞の異常増殖に関して動物を治療するための方法を提供する。詳細な実施形態において、上記変更は減少であり、また、上記核酸またはアミノ酸配列は変更を含有する。
【００６７】
本発明の好適な実施形態において、本明細書で論ずる、種々の医学的状態にある生物を治療するための組成物であって、送達ビーイクルと組合わせてａｔｏｎａｌ関連核酸配列またはアミノ酸配列を含む組成物であり、上記生物は、ａｔｏｎａｌ関連核酸配列中に欠損を含む。当業者は、成人ヒトのような成体生物は、自然に有意なまたは検出可能なレベルまでａｔｏｎａｌが発現していないが、代わりに、発生の胚段階においてはａｔｏｎａｌが発現することを認識している（実施例参照）。したがって、好適な実施形態において、本明細書で論ずるような生物を治療するための組成物には、ａｔｏｎａｌ核酸またはアミノ酸配列中に突然変異を含有しないが、有意なまたは検出可能なレベルにまでは発現しないａｔｏｎａｌを自然に有する生物を治療するための組成物が包含される。
【００６８】
本発明の別の実施形態は、送達ビーイクルと組合わせてａｔｏｎａｌ関連アミノ酸配列または核酸配列を含む組成物であって、上記ビーイクルは、細胞内に治療上有効量のａｔｏｎａｌ関連核酸配列またはアミノ酸配列を送達する。詳細な実施形態において、上記ビーイクルは、微生物毒素または任意の融合分子のレセプター結合領域であり、また、タンパク質形質導入領域である。詳細な実施形態において、上記タンパク質形質導入領域はＨＩＶＴＡＴペプチドに由来する。
【００６９】
本発明の別の実施形態においては、有毛細胞が欠失した生物を治療するための組成物が存在し、上記生物は、ａｔｏｎａｌ関連核酸配列中に欠損を含む。詳細な実施形態において、欠損は、上記ａｔｏｎａｌ関連核酸配列の突然変異または変更である。他方の詳細な実施形態において、欠損は、上記ａｔｏｎａｌ関連核酸配列の調節配列に影響を及ぼす。本発明のさらなる実施形態においては、有毛細胞が欠失した生物を治療するための組成物が存在し、上記生物は、ａｔｏｎａｌ関連核酸配列の調節に関連する核酸配列中に欠損を含む。本発明のさらなる実施形態においては、有毛細胞が欠失した生物を治療するための組成物が存在し、上記生物は、ａｔｏｎａｌ関連核酸配列の調節に関連するアミノ酸配列中に欠損を含む。
【００７０】
本発明の別の実施形態においては、小脳顆粒ニューロンが欠如した生物を治療するための組成物が存在し、上記生物は、ａｔｏｎａｌ関連核酸配列中に欠損を含む。詳細な実施形態において、欠損は上記ａｔｏｎａｌ関連核酸配列の突然変異または変更である。他方の詳細な実施形態において、欠損は、上記ａｔｏｎａｌ関連核酸配列の調節配列に影響を及ぼす。本発明のさらなる実施形態においては、小脳顆粒ニューロンが欠如した生物を治療するための組成物が存在し、上記生物は、ａｔｏｎａｌ関連核酸配列の調節に関連する核酸配列中に欠損を含む。本発明のさらなる実施形態においては、小脳顆粒ニューロンが欠如した生物を治療するための組成物が存在し、上記生物は、ａｔｏｎａｌ関連核酸配列の調節に関連するアミノ酸配列中に欠損を含む。
【００７１】
本発明の別の実施形態においては、聴覚障害の生物を治療するための組成物が存在し、上記生物は、ａｔｏｎａｌ関連核酸配列中に欠損を含む。詳細な実施形態において、欠損は、上記ａｔｏｎａｌ関連核酸配列の突然変異または変更である。他方の詳細な実施形態において、欠損は、上記ａｔｏｎａｌ関連核酸配列の調節配列に影響を及ぼす。本発明のさらなる実施形態においては、聴覚障害の生物を治療するための組成物が存在し、上記生物は、ａｔｏｎａｌ関連核酸配列の調節に関連する核酸配列中に欠損を含む。本発明のさらなる実施形態においては、聴覚障害の生物を治療するための組成物が存在し、上記生物は、ａｔｏｎａｌ関連核酸配列の調節に関連するアミノ酸配列中に欠損を含む。
【００７２】
本発明の別の実施形態においては、平衡失調の生物を治療するための組成物が存在し、上記生物は、ａｔｏｎａｌ関連核酸配列中に欠損を含む。詳細な実施様態において、欠損は、上記ａｔｏｎａｌ関連核酸配列の突然変異または変更である。他方の詳細な実施形態において、欠損は、上記ａｔｏｎａｌ関連核酸配列の調節配列に影響を及ぼす。本発明のさらなる実施形態においては、平衡失調の生物を治療するための組成物が存在し、上記生物は、ａｔｏｎａｌ関連核酸配列の調節に関連する核酸配列中に欠損を含む。本発明のさらなる実施形態においては、平衡失調の生物を治療するための組成物が存在し、上記生物は、ａｔｏｎａｌ関連核酸配列の調節に関連するアミノ酸配列中に欠損を含む。
【００７３】
本発明の別の実施形態においては、変形関節症の生物を治療するための組成物が存在し、上記生物は、ａｔｏｎａｌ関連核酸配列中に欠損を含む。詳細な実施形態において、欠損は、上記ａｔｏｎａｌ関連核酸配列の突然変異または変更である。他方の詳細な実施形態において、欠損は、上記ａｔｏｎａｌ関連核酸配列の調節配列に影響を及ぼす。本発明のさらなる実施形態においては、変形関節症の生物を治療するための組成物が存在し、上記生物は、ａｔｏｎａｌ関連核酸配列の調節に関連する核酸配列中に欠損を含む。本発明のさらなる実施形態においては、変形関節症の生物を治療するための組成物が存在し、上記生物は、ａｔｏｎａｌ関連核酸配列の調節に関連するアミノ酸配列中に欠損を含む。
【００７４】
本発明の別の実施形態においては、関節疾患の生物を治療するための組成物が存在し、上記生物は、ａｔｏｎａｌ関連核酸配列中に欠損を含む。詳細な実施形態において、欠損は、上記ａｔｏｎａｌ関連核酸配列の突然変異または変更である。他方の詳細な実施形態において、欠損は、上記ａｔｏｎａｌ関連核酸配列の調節配列に影響を及ぼす。本発明のさらなる実施形態においては、関節疾患の生物を治療するための組成物が存在し、上記生物は、ａｔｏｎａｌ関連核酸配列の調節に関連する核酸配列中に欠損を含む。本発明のさらなる実施形態においては、関節疾患の生物を治療するための組成物が存在し、上記生物は、ａｔｏｎａｌ関連核酸配列の調節に関連したアミノ酸配列中に欠損を含む。
【００７５】
本発明の別の実施形態において、細胞が異常増殖した生物を治療するための組成物が存在し、上記生物は、ａｔｏｎａｌ関連核酸配列中に欠損を含む。詳細な実施形態において、欠損は、上記ａｔｏｎａｌ関連核酸配列の突然変異または変更である。他方の詳細な実施形態において、欠損は、上記ａｔｏｎａｌ関連核酸配列の調節配列に影響を及ぼす。本発明のさらなる実施形態においては、細胞が異常増殖した生物を治療するための組成物が存在し、上記生物は、ａｔｏｎａｌ関連核酸配列の調節に関連する核酸配列中に欠損を含む。本発明のさらなる実施形態においては、細胞が異常増殖した生物を治療するための組成物が存在し、上記生物は、ａｔｏｎａｌ関連核酸配列の調節に関連するアミノ酸配列中に欠損を含む。
【００７６】
本発明のさらなる実施形態においては、癌の生物を治療するための組成物が存在し、上記生物は、ａｔｏｎａｌ関連核酸配列中に欠損を含む。詳細な実施形態において、欠損は、上記ａｔｏｎａｌ関連核酸配列の突然変異または変更である。他方の詳細な実施形態において、欠損は、上記ａｔｏｎａｌ関連核酸配列の調節配列に影響を及ぼす。本発明のさらなる実施形態においては、癌の生物を治療するための組成物が存在し、上記生物は、ａｔｏｎａｌ関連核酸配列の調節に関連する核酸配列中に欠損を含む。本発明のさらなる実施形態においては、癌の生物を治療するための組成物が存在し、上記生物は、ａｔｏｎａｌ関連核酸配列の調節に関連するアミノ酸配列中に欠損を含む。詳細な実施形態において、上記癌は髄芽腫である。
【００７７】
核酸に基づく発現系
１．ベクター 
当業者は、両方とも参考文献にて本明細書に組み込まれている、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９およびＡｕｓｕｂｅｌら，１９９４に記載の標準的組換え技術によりベクターを構築する準備が十分に整うことであろう。
【００７８】
「発現ベクター」なる用語は、転写可能である遺伝子産物の少なくとも一部をコードする核酸配列を含有するベクターを指す。場合によっては、ＲＮＡ分子は次に、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドに翻訳される。別の場合では、これらの配列は、例えばアンチセンス分子またはリボザイムの産出において翻訳されない。発現ベクターは、種々の「制御配列」を含有することができ、この用語は、特定の宿主生物中に操作可能に結合したコード配列の転写あるいは翻訳に必要とされる核酸配列を指す。ベクターおよび発現ベクターは、転写および翻訳を管理する制御配列に加えて、さらに他の機能を有する、以下に記載の核酸配列を含有してもよい。
【００７９】
ａ．プロモーターおよびエンハンサー
「プロモーター」は、転写の開始および速度を制御する核酸配列の領域である制御配列である。これは、調節タンパク質および分子がＲＮＡポリメラーゼおよび他の転写因子のように結合可能である遺伝的エレメントを含有してもよい。プロモーターは、核酸配列の転写活性化に関わるｃｉｓ作動調節配列を指す「エンハンサー」と共に使用してもよく、または使用しなくてもよい。
【００８０】
通常、発現するために選択された細胞型、オルガネラおよび生物におけるＤＮＡセグメントの発現を効果的に指向するプロモーターおよび／またはエンハンサーを使用することが重要である。分子生物学の当業者は一般的に、タンパク質発現のためのプロモーター、エンハンサーおよび細胞型を組合わせて使用することを知っている。例えば、本明細書で参考文献にて組み込んだＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）を参照のこと。使用したプロモーターは、適切な条件の下で、構成的、組織特異的、誘導可能および／または有用であり、組み換えタンパク質および／またはペプチドの大規模な産出に有利である、導入したＤＮＡセグメントの発現を高レベルで指向する。プロモーターは、異種性または内因性であってもよい。
【００８１】
組織特異的プロモーターまたはエレメントの同一性、並びにそれらの活性を特性化するためのアッセイは、当業者に公知である。そのような領域としては、ヒトＬＩＭＫ２遺伝子（Ｎｏｍｏｔｏら１９９９）、ソマトスタチンレセプター２遺伝子（Ｋｒａｕｓら，１９９８）、ネズミ精巣上体レチノイン酸結合遺伝子（Ｌａｒｅｙｒｅら，１９９９）、ヒトＣＤ４（Ｚｈａｏ−Ｅｍｏｎｅｔら，１９９８）、マウスアルファ２（ＸＩ）コラーゲン（Ｔｓｕｍａｋｉら，１９９８）、Ｄ１Ａドーパミン性レセプター遺伝子（Ｌｅｅら，１９９７）、インスリン様成長因子ＩＩ（Ｗｕら，１９９７）、ヒト血小板上皮細胞接着分子−１（Ａｌｍｅｎｄｒｏら，１９９６）などが挙げられる。
【００８２】
ｂ．開始シグナルおよび内部リボソーム結合部位
また、特定の開始シグナルも、コード配列の効率的な転写のために必要とされる。これらのシグナルには、ＡＴＧ開始コドンまたは近接配列が包含される。ＡＴＧ開始コドンを包含する外来転写制御シグナルを提供する必要がある。当業者ならば、これを決定し、必要なシグナルを容易に提供することができるであろう。開始コドンは、すべての挿入物の翻訳を確実に行うために、望ましいコード配列の読みとり枠を使用する「インフレーム」でなければならないことは公知である。外来翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、天然のものであっても、合成したものであってもよい。適切な転写エンハンサーエレメントを挿入することで、発現の効率を向上させることができる。
【００８３】
本発明のある実施形態において、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）エレメントを、多重遺伝子、またはポリシストロン性メッセージを作製するのに使用する。ＩＲＥＳエレメントは、異種オープンリーディングフレームと連結させることができる。マルチオープンリーディングフレームは共に転写され、ＩＲＥＳによってそれぞれ分離され、ポリシストロン性メッセージを作製する。ＩＲＥＳエレメントによって、それぞれのオープンリーディングフレームが、効率的に翻訳するためにリボソームに近づくことが可能となる。多重遺伝子は、単一メッセージを転写するために、単一プロモーター／エンハンサーを用いて効率的に発現させることができる（参考文献として本明細書に組み込まれている、米国特許第５，９２５，５６５号および第５，９３５，８１９号参照）。
【００８４】
ｃ．マルチクローニング部位 
ベクターには、マルチクローンニング部位（ＭＣＳ）が包含されており、これは多数の制限酵素部位を含有する核酸領域で、任意のものは、標準的組換え技術と共に使用して、ベクターを消化する（参考文献として本明細書に組み込まれている、Ｃａｒｂｏｎｅｌｌｉら，１９９９、Ｌｅｖｅｎｓｏｎら，１９９８およびＣｏｃｅａ，１９９７参照）。
【００８５】
ｄ．スプライシング部位
転写された真核生物ＲＮＡ分子は、そのほとんどが初期転写物からイントロンを除去するためにＲＮＡスプライシングを受ける。遺伝的真核生物配列を含有するベクターは、ドナーおよび／またはアクセプタースプライシング部位を必要とし、タンパク質を発現させる適切な転写処理を確実に行う（参考文献として本明細書に組み込んだ、Ｃｈａｎｄｌｅｒら，１９９７参照）。
【００８６】
ｅ．ポリアデニル化シグナル
発現においては、転写物の適切なポリアデニル化に効果的な、ポリアデニル化シグナルが典型的に包含される。詳細な実施形態には、適切でおよび／または種々の標的細胞内で十分に機能することが知られている、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルおよび／またはウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルが包含される。
【００８７】
ｆ．複製の起点
宿主細胞内でベクターを増殖させるために、複製が開始される特定の核酸配列である、１つまたはそれ以上の複製部位の起点（しばしば「ｏｒｉ」と呼ばれる）を含有することができる。
【００８８】
ｇ．選択可能および選別可能マーカー
本発明のある実施形態において、細胞は本発明の核酸構造を含有し、発現ベクター中にマーカーを含有することによって、細胞はｉｎｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ ｖｉｖｏで同定することができる。このようなマーカーは、細胞に同定可能な変化を与え、発現ベクターを含有する細胞の簡単な同定を許容する。一般的には、選択可能なマーカーは、選択を許容する特性を与えるものである。正の選択可能マーカーは、マーカーの存在がその選択を可能にするものであり、一方で負の選択可能マーカーはその存在がその選択を妨げるものである。正の選択可能マーカーとしては、薬剤耐性マーカー等が挙げられる。
【００８９】
通常、薬剤選択マーカーの導入は、形質転換物のクローニングおよび同定を補助し、例えばネオマイシン、プロマイシン、ハイグロマイシン、ＤＨＦＲ、ＧＰＴ、ゼオシンおよびヒスチジノールに対する耐性を与える遺伝子が有用な選択可能マーカーである。状態の履行に基づいた形質転換物の区別を許容する表典型を与えるマーカーに加えて、その基礎が比色解析であるＧＦＰまたは増強ＧＦＰのような選別可能マーカーを包含する他の型のマーカーも企図される。あるいは、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ｔｋ）またはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）のような選別可能酵素が使用可能である。当業者は、おそらくＦＡＣＳ解析とともに、免疫学的マーカーの使用方法も公知であろう。選択および選別可能マーカーについてのさらなる例は、当業者には公知のものである。
【００９０】
２．発現系
上記組成物の少なくとも一部またはすべてを含む、多くの発現系が存在する。原核生物および／または真核生物に基づく系を、本発明とともに使用して、核酸配列、またはそれらの同起源ポリペプチド、タンパク質およびペプチドを産出することができる。多くのそのような系は商業的に広く入手可能である。
【００９１】
昆虫細胞／バキュロウイルス系は、両方とも本明細書中参考文献にて組み込まれている米国特許第５，８７１，９８６号および第４，８７９，２３６号に記載されているように、高レベルの異種核酸セグメントのタンパク質発現を産出することができ、たとえばインビトロジェン（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ（登録商標））からのＭＡＸＢＡＣ（登録商標）２．０、およびクロンテック（ＣＬＯＮＴＥＣＨ（登録商標））からのＢＡＣＫＰＡＣＫTM ＢＡＣＵＬＯＶＩＲＵＳＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＳＹＳＴＥＭの名で購入できる。発現系の他の例は、本技術分野では公知のものである。
【００９２】
核酸検出
ａｔｏｎｏｌ関連タンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドの発現を指向することにおけるそれらの使用に加えて、本明細書で開示した核酸配列には様々な他の使用法がある。例えば、これらはプローブまたはプライマーとして、または核酸ハイブリッド形成、核酸配列の増幅、核酸の検出、その他のアッセイを含む実施形態に関する任意の方法で有用である。当業者は、これらの方法の詳細に関連する以下の特許を認識している。すなわち、米国特許第５，８４０，８７３号、米国特許第５，８４３，６４０号、米国特許第５，８４３，６５０号、米国特許第５，８４３，６５１号、米国特許第５，８４３，６６３号、米国特許第５，８４６，７０８号、米国特許第５，８４６，７０９号、米国特許第５，８４６，７１７号、米国特許第５，８４６，７２６号、米国特許第５，８４６，７２９号、米国特許第５，８４６，７８３号、米国特許第５，８４９，４８１号、米国特許第５，８４９，４８３号、米国特許第５，８４９，４８６号、米国特許第５，８４９，４８７号、米国特許第５，８４９，４９７号、米国特許第５，８４９，５４６号、米国特許第５，８４９，５４７号、米国特許第５，８５１，７７０号、米国特許第５，８５１，７７２号、米国特許第５，８５３，９９０号、米国特許第５，８５３，９９３号、米国特許第５，８５３，９９２号、米国特許第５，８５６，０９２号、米国特許第５，８５８，６５２号、米国特許第５，８６１，２４４号、米国特許第５，８６３，７３２号、米国特許第５，８６３，７５３号、米国特許第５，８６６，３３１号、米国特許第５，８６６，３３６号、米国特許第５，８６６，３３７号、米国特許第５，９００，４８１号、米国特許第５，９０５，０２４号、米国特許第５，９１０，４０７号、米国特許第５，９１２，１２４号、米国特許第５，９１２，１４５号、米国特許第５，９１２，１４８号、米国特許第５，９１６，７７６号、米国特許第５，９１６，７７９号、米国特許第５，９１９，６２６号、米国特許第５，９１９，６３０号、米国特許第５，９２２，５７４号、米国特許第５，９２５，５１７号、米国特許第５，９２５，５２５号、米国特許第５，９２８，８６２号、米国特許第５，９２８，８６９号、米国特許第５，９２８，８７０号、米国特許第５，９２８，９０５号、米国特許第５，９２８，９０６号、米国特許第５，９２９，２２７号、米国特許第５，９３２，４１３号、米国特許第５，９３２，４５１号、米国特許第５，９３５，７９１号、米国特許第５，９３５，８２５号、米国特許第５，９３９，２９１号、米国特許第５，９４２，３９１号、欧州出願第３２０３０８号、欧州出願第３２９ ８２２号、ＧＢ出願第２２０２ ３２８号、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ８７／００８８０号、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ８９／０１０２５号、ＰＣＴ出願ＷＯ８８／１０３１５号、ＰＣＴ出願ＷＯ８９／０６７００号およびＰＣＴ出願ＷＯ９０／０７６４１号。
【００９３】
キット
１つの試料中に、配列番号１〜配列番号６６より選択した配列を検出するために必要な必須の物質および／または試薬のすべてをキット内で一緒にアセンブルできる。これには一般的に、配列番号１〜配列番号６６の核酸配列のような本発明の実施において、対象の個々の核酸に特異的にハイブリッド形成するように設計したプローブまたはプライマーが包含される。また、種々のポリメラーゼ（逆転写酵素、Ｔａｑなど）、デオキシヌクレオチドおよび緩衝液を包含する、核酸を増幅させるのに適した酵素を包含して、増幅のために必要な反応混合液を提供することができる。また、そのようなキットは、特定の核酸または増幅産物の検出に好適である酵素および他の試薬を包含することもできる。そのようなキットは一般的に、好適な手段で、それぞれ個々の試薬または酵素、並びにそれぞれのプローブまたはプライマー対に対する異なる容器を含む。
【００９４】
ａｔｏｎａｌ関連核酸
Ａ．核酸およびその使用 「核酸」なる語は一般的に、例えばＤＮＡ中に見られる、天然に存在するプリンまたはピリミジン塩基（例えばアデニン「Ａ」、グアニン「Ｇ」、チミン「Ｔ」およびシトシン「Ｃ」）またはＲＮＡ（例えばＡ、Ｇ、ウラシル「Ｕ」およびＣ）等の少なくとも１つの核酸塩基からなる、ＤＮＡの少なくとも１つの分子または鎖、ＲＮＡまたはそれらの誘導体または類似体を指す。「核酸」なる語は、「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」なる語を包含する。「オリゴヌクレオチド」なる語は、長さが約３〜１００核酸塩基の間である少なくとも１つの分子を指す。「ポリヌクレオチド」なる語は、長さが約１００核酸塩基以上の少なくとも１つの分子を指す。これらの定義は一般的に、少なくとも１つの一本鎖分子を指すが、詳細な実施形態においてはまた、部分的に、実質的にまたは全体的に少なくとも１つの一本鎖分子と相補的な少なくとも１つのさらなる鎖をも包含する。したがって、核酸は、１つまたはそれ以上の相補鎖（類）、または分子の鎖を備える特定の配列の「相補物（類）」を含む、少なくとも１つの二本鎖分子または少なくとも１つの三本鎖分子を包含することができる。本明細書で使用するように、一本鎖核酸は識別コード「ｓｓ」によって表すことができ、二本鎖核酸は識別コード「ｄｓ」にて、そして三本鎖核酸は識別コード「ｔｓ」にて表すことができる。
【００９５】
したがって、本発明はまた、ａｔｏｎａｌ関連核酸と相補的である少なくとも１つの核酸を包含することもできる。特定の実施形態において、本発明は、核酸配列である配列番号１〜配列番号６６で列記した核酸配列と相補的である、少なくとも１つの核酸または核酸セグメントを包含する。「相補的な」または「相補物（類）」である核酸（類）は、標準のワトソン−クリック、フーグスティーンまたは逆フーグスティーン結合相補性ルールにしたがって塩基対を形成することができるものである。また、本明細書で使用するように、「相補的」または「相補物（類）」なる語は、上記の同様のヌクレオチド比較によって査定できるような、実質的に相補的である核酸（類）を指す。「実質的に相補的」なる語は、少なくとも１つの連続核酸塩基または半連続核酸塩基からなる核酸を指し、または１つまたはそれ以上の核酸塩基部分が分子内に存在しない場合、すべて以下の核酸塩基が相対物核酸塩基と塩基対を形成しない場合でさえも、少なくとも１つの核酸鎖または二本鎖とハイブリッド形成可能である。
【００９６】
本明細書のある実施形態において、「遺伝子」は、転写する核酸を指す。本明細書で使用する場合、「遺伝子セグメント」は遺伝子の核酸セグメントである。ある局面において、遺伝子には、転写、またはメッセージ産出または組成物に関わる調節配列が包含される。特定の実施形態において、遺伝子は、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドをコードする、転写配列を含む。別の特定の局面において、遺伝子は、ａｔｏｎａｌ関連核酸を含み、および／またはａｔｏｎａｌ関連ポリペプチドまたはペプチドコード配列をコードする。本明細書で記載の用語法を保持して、「単離した遺伝子」は、他の天然に存在する遺伝子、調節配列、ポリペプチドまたはペプチドコード配列等の、別のこのような配列から実質的に単離した、転写した核酸（類）、調節配列、コード配列を含むことができる。この局面において、「遺伝子」なる語は容易に使用され、転写されたヌクレオチド配列およびその相補物からなる核酸を指す。特定の局面において、転写ヌクレオチド配列は、少なくとも１つの機能的タンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドコードユニットを含む。当業者にて理解されるであろう「遺伝子」なる機能語には、ゲノム配列、ＲＮＡまたはｃＤＮＡ配列または遺伝子の非転写部位の核酸セグメントを含み、遺伝子の非転写プロモーターまたはエンハンサー領域を限定しないが含む、より小さな遺伝子工学的に改変した核酸セグメントが含まれる。より小さな遺伝子工学的に改変した遺伝子核酸セグメントは、核酸操作技術、タンパク質、ポリペプチド、ドメイン、ペプチド、融合タンパク質、変異体および／またはそれに類似のものを用いて発現でき、または発現するように適合させることができる。
【００９７】
ある実施形態において、核酸配列は、核酸または核酸セグメントである。本明細書で使用する場合、「核酸セグメント」なる語は、非限定的な例として、ａｔｏｎａｌ関連ペプチドまたはポリペプチド配列の部分のみをコードしている、核酸の小さな断片である。したがって「核酸セグメント」は、ａｔｏｎａｌ関連ペプチドまたはポリペプチドコード領域の約２ヌクレオチド〜全長の、ａｔｏｎａｌ関連遺伝子配列（類）の任意の部分を含むことができる。ある実施形態において、「核酸セグメント」は、全長ａｔｏｎａｌ関連遺伝子（類）配列を包含する。特定の実施形態において、核酸は、配列番号１〜配列番号６６に開示した配列の約２ヌクレオチド〜全長の、配列番号１〜配列番号６６の任意の部分を含む。
【００９８】
ある実施形態において、核酸セグメントは、プローブまたはプライマーである。本明細書で使用する場合、「プローブ」は、他の核酸を検出するために使用される核酸であり、長さは、一般的に少なくとも約１０ヌクレオチドである。本明細書で使用する場合、「プライマー」は、他の核酸をポリマー化するために使用する核酸であり、長さは、一般的に約１０ヌクレオチドである。これの非限定例としては、様々な長さの核酸セグメントの作製および、核酸配列である配列番号１〜配列番号６６に開示した配列に基づくプローブおよびプライマーの配列組成物の作製である。
【００９９】
本発明の核酸（類）は、配列それ自体の長さに関わらず、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、制限酵素部位、多重クローニング部位、コードセグメント等に限定されないがそれらを含む別の核酸配列と組み合わせて、１つまたはそれ以上の核酸構築物を作製することができる。本明細書で使用する場合、「核酸構築物」は、異なる核酸配列の少なくとも２つのセグメントからなる組換え体分子である。全長は、核酸配列構築物間で相当変化し得る。したがって、ほとんど任意の長さの核酸セグメントを使用でき、全長は、好ましくは意図した核酸プロトコルでの調製または使用の簡便さによって制限される。
【０１００】
ある実施様態において、核酸構築物は組換え体ベクターである。本明細書で使用する場合、「組換えベクター」は、対象の核酸配列に対するビーイクルとして使用した核酸のマルチセグメントを含む核酸である。ある局面において、組換えベクターは発現カセットである。本明細書で使用する場合、発現カセットは、本技術分野では公知の方法によって、異なる組換えベクター間で送達可能である対象の遺伝子を含む核酸のセグメントである。
【０１０１】
特定の実施形態において、本発明は、ヒトまたはＭｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ ａｔｏｎａｌ関連配列に対応している、アミノ酸配列である配列の、配列番号２〜配列番号６６に従って、または本質的に記載された、連続アミノ酸配列をそのアミノ酸配列内に含むａｔｏｎａｌ関連タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドをコードしている核酸配列からなる、１つまたはそれ以上の組換え体ベクター（類）に関する。別の実施形態において、本発明は、そのアミノ酸配列内に、アミノ酸配列である配列番号２〜配列番号６６に従って、または本質的に記載された、連続アミノ酸配列を含むａｔｏｎａｌ関連タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドをコードする他の種からの核酸配列からなる組換えベクター（類）に関する。特定の局面において、組換えベクターはＤＮＡベクターである。
【０１０２】
アミノ酸配列または核酸配列が、付加的なＮ−またはＣ−末端アミノ酸または５’または３’配列、またはそのさまざまな組合せのような、付加的残基を含むことが可能であり、配列が、タンパク質組成物の発現が関連する生物学的タンパク質、ポリペプチドまたはペプチド活性の保持を含む、前記した基準に適合する限り、まだ本質的に本明細書で開示した配列の１つに記載したようであり得ることも理解されるであろう。末端配列の付加は、とりわけ、たとえばコード領域の５’および／または３’部分のいずれかに隣接している様々な非コード配列を含むことができる配列を提供し、または、遺伝子内で存在することが知られている、様々な内部配列、すなわちイントロンを含むことができる。
【０１０３】
本発明が、アミノ酸配列である配列番号〜配列番号６６の特定の核酸配列またはアミノ酸配列に限定されないことも理解されるであろう。組換えベクターおよび単離核酸セグメントは、したがって、これらのコード領域それ自身、基礎的コード領域内に選択的変更または改変を有する様々なコード領域を含むことができ、これらは、やはりそのようなコード領域を含むより大きなポリペプチドまたはペプチドをコードすることができ、または変異アミノ酸配列を有する生物学的に等価なタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドをコードすることができる。
【０１０４】
本発明の核酸は、生物学的機能が等価なａｔｏｎａｌ関連タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドまたはａｔｏｎａｌ関連タンパク質、ポリペプチドまたはポリペプチドを含有する。そのような配列は、核酸配列またはコードするタンパク質、ポリペプチドまたはペプチド内に天然に存在することが知られているコドン重複または機能的等価性の結果として発生しうる。あるいは、機能的に等価なタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドは、変更するアミノ酸の特性の考慮に基づいて、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチド構造の変化を遺伝子工学的にする、組換えＤＮＡ技術の適用を介して作製することができる。人間によって設計された変化は、たとえばタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの抗原性の改善または変更を誘導するために、または分子レベルでのａｔｏｎａｌ関連タンパク質、ポリペプチドまたはペプチド活性を試験するために変異体を試験するために、たとえば本明細書以下で論ずるような、部位特異的変異導入技術の適用を介して導入できる。
【０１０５】
融合タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドを、たとえばａｔｏｎａｌ関連コード領域が、望ましい機能を有する他のタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドと同一の発現ユニット内で並んでいるように調製できる。そのような発現配列の望ましい機能の非限定例には、付加した発現配列に関する精製または免疫検出目的、例えば、それぞれ欧州特許ＥＰ第２６６，０３２号またはＦｒｏｅｈｌｅｒｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．，１４：５３９９−５４０７，１９８６に記載されているようなデオキシヌクレオシドＨ−リン酸中間体を介した、アフィニティークロマトグラフィーにて精製できるタンパク質組成物、またはコード領域の酵素標識化が含まれる。
【０１０６】
本明細書で使用する場合、「生物」は、原核生物、真核生物、およびウイルス等であり得る。本明細書で使用する場合、「配列」なる語は、「核酸」および「タンパク質性」または「タンパク質性組成物」なる語の両方を包含する。本明細書で使用する場合、「タンパク質性組成物」なる語は、「タンパク質」、「ポリペプチド」および「ペプチド」なる語を包含する。本明細書で使用する場合、「人工的配列」は、遺伝子座の天然の配列から由来しない核酸の配列、並びにそのような核酸によってコードされた任意のタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの配列を指す。「合成配列」は、ｉｎｖｉｔｒｏでの酵素的産出（すなわち「酵素的に産出した」配列）またはｉｎ ｖｉｖｏでの生物学的産出（すなわち「生物学的に産出した」配列）よりも、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの化学合成にて産出された核酸またはタンパク質性組成物を指す。
【０１０７】
癌治療
本発明が、異常細胞増殖を治療するための方法および組成物を指向していることを考えると、異常細胞増殖の状態である癌の治療の議論が保証される。
【０１０８】
放射線治療、手術、化学治療および遺伝子治療のような様々な癌治療が当業者には公知であり、本発明の方法および組成物に関して使用できる。
【０１０９】
放射治療薬剤
放射治療薬剤および因子には、ＤＮＡ障害を誘導する放射および波、たとえばｇ照射、Ｘ線、ＵＶ照射、マイクロ波、電子放射、および放射性同位体等が包含される。治療は、局在化した腫瘍部位に、上述した形態の放射能を照射することで実施することができる。
【０１１０】
Ｘ線に関する用量範囲は、長期間（３〜４週間）の５０〜２００レントゲンの１日用量から、２０００〜６０００レントゲンの単一投与までである。放射性同位体に関する用量範囲は、広く変化し、同位体の半減期、放射される放射線の強度および型、新生物細胞による取り込みに依存する。
【０１１１】
手術 
癌性増殖を除去するための外科的処置は、一般的に腫瘍および癌の治療に関する標準の手順である。これは、癌性増殖すべてを除去することを試みる。しかしながら、手術は一般的に、任意の残っている新生性、または悪性細胞の破壊を確かにするために、化学治療および／または放射線治療と組み合わせる。したがって、手術は、本発明に関連して使用できる。
【０１１２】
化学治療薬剤
これらは、たとえば直接ＤＮＡを架橋する薬剤、ＤＮＡ内に挿入する薬剤、または核酸合成に影響を及ぼすことで染色体および有糸分裂異常を導く薬剤であり得る。
【０１１３】
核酸、特にＤＮＡを直接架橋する薬剤が、相乗的抗新生性結合を導くＤＮＡ障害となるように、本明細書で構想され、示される。シスプラチンのような薬剤、および他のＤＮＡアルキル化剤を使用できる。
【０１１４】
ＤＮＡに障害を与える薬剤にはまた、ＤＮＡ複製、有糸分裂および染色体分離を干渉する化合物が含まれる。これらの化合物の例には、アドリアマイシン（またはドキソルビシンとして知られている）、ＶＰ−１６（またはエトポシドとして知られている）、ベラパミル、ポドフィロトキシン等が含まれる。新生物を治療するための臨床的設定で広く使用されるこれらの化合物は、アドリアマイシンに関して、２５〜７５ｍｇ／ｍ２の容量範囲で２１日の間隔で静脈内にボーラス注射することで、またエトポシドに関しては、静脈内または経口で３５〜１００ｍｇ／ｍ２投与する。
【０１１５】
癌治療にはまた、化学的および他の型の処置両方でのさまざまな組合せ治療も含まれる。化学治療には、例えば、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、カルボプラチン、プロカルバジン、メクロレタミン、シクロホスファミド、カンプトテシン、イフォスファミド、メルファラン、クロラムブチル、ブスルファン、ニトロソ尿素、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリコマイシン、マイトマイシン、エトポシド（ＶＰ１６）、タモキシフェン、ラロキシフェン、エストロゲンレセプター結合剤、タキソール、ゲンシタビエン、ナベルビン、ファルネシル−タンパク質トランスフェラーゼ阻害剤、トランスプラチナ、５−フルオロウラシル、ビンクリスチン、ビンブラスチンおよびメトトレキサート、またはそれらの任意の類似物または誘導体変体が挙げられる。
【０１１６】
遺伝子
遺伝子治療投与
遺伝子治療に関して、当業者は、使用されるベクターが、プロモーターに操作可能に連結した対象の遺伝子、またはその好適な断片を含有しなければならないことを認識するであろう。アンチセンス遺伝子治療に関して、対象の遺伝子のアンチセンス配列またはその好適な断片が、プロモーターに操作可能に連結する。当業者は、ある例において、３’ＵＴＲ調節配列等の別の配列が、対象の遺伝子を発現する場合に有用であることを認識している。適切な場所で、遺伝子治療ベクターを、その代表的な投与経路に関して本技術分野では公知の方法にて、固体、準固体、液体または気体形態で調製品内に処方できる。本技術分野では公知の方法を、標的器官に到達するまで、組成物の放出および吸収を防止するため、または組成物の時間放出を確かにするために使用できる。医薬的に許容可能な剤型を、本発明の組成物が実現不可能でないように使用すべきである。医薬的投与剤型において、組成物を、単独で、または他の薬理学的に活性な化合物と好ましい関連で、および組合せで使用できる。治療的核酸配列を含んだ十分量のベクターを、遺伝子産物の薬理学的に効果的な用量を提供するために投与しなければならない。
【０１１７】
当業者は、異なる送達方法が、ベクターを細胞内に投与するために使用できることを認識している。例には、（１）力学的方法、たとえばエレクトロポレーション（電気的）、遺伝子銃（力学的力）または多量の液体の添加（圧力）を用いた方法、（２）上記ベクターがリポソーム、ウイルスベクターまたはトランスポーター分子のような他の存在物と複合体形成する方法が含まれる。
【０１１８】
したがって、本発明は治療的遺伝子を宿主に運ぶ方法を提供し、それには本発明のベクターを、任意の前述の投与経路または当業者に公知の他の経路、および特定の適用に関して好ましい経路のいずれかを用いて、好ましくは組成物の一部として投与することが含まれる。本発明にしたがった宿主細胞へのベクターの効果的な輸送は、治療的効果（たとえば治療している特定の疾患に関連したいくつかの症状の緩和）によって、またはさらに輸送した遺伝子または遺伝子の宿主内での発現（たとえばシークエンシング、ノザンまたはサザンハイブリッド形成、または宿主細胞中の核酸を検出するための転写アッセイとの組合せでのポリメラーゼ連鎖反応を用いて、または免疫ブロット解析、抗体仲介検出、ｍＲＮＡまたはタンパク質半減期研究、または輸送した核酸によってコードされたタンパク質またはポリペプチドを検出するための特殊化アッセイ、またはそのような輸送によるレベルまたは機能における影響）にしたがって監視できる。
【０１１９】
本明細書で記載したこれらの方法は、すべてを包含しているわけではなく、特定の適用に適したさらなる方法が当業者に対して明らかであろう。また、有効量の組成物を、類推を介して、望ましい効果が働くことが公知の化合物に近づけることができる。
【０１２０】
さらに、実際の用量およびスケジュールは、組成物が他の医薬組成物との組合せで投与されるかどうかによって、または薬物動態学、薬物素因、および代謝における個体間の差異によって変化し得る。同様に、量は、使用した特定の細胞株（たとえば細胞表面上に存在するベクターレセプターの数、または細胞株中で複製するために遺伝子送達を使用した特定のベクターの能力に基づいて）によって、ｉｎｖｉｔｒｏ適用で変化し得る。さらに、細胞あたり添加すべきベクターの量は、ベクター内に挿入した治療遺伝子の長さおよび安定性、および配列の性質によっても変化する可能性があり、とりわけ経験的に決定される必要があるパラメータであり、本発明の方法に対して固有ではない因子によって変化し得る（例えば、合成に関するコスト）。当業者は、特定の状況の緊急性にしたがって任意の必要性適合を簡単に行うことができる。
【０１２１】
治療的遺伝子を含有する細胞はまた、自殺遺伝子（すなわち、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼのような、細胞を破壊するために使用できる産物をコードしている遺伝子）を含有することができる。多くの遺伝子治療状態において、宿主細胞内での治療目的のための遺伝子を発現することが可能であることが望ましいが、一旦治療が完了し、制御不能になるか、または予想可能または望ましい結果を導かない場合、宿主細胞を破壊する能力を有することも必要である。したがって、宿主細胞での治療遺伝子の発現は、上記自殺遺伝子の産物が、プロドラッグのない状態では無害のままであるけれども、プロモーターによって駆動できる。いったん治療が完了し、もはや望ましくなく、必要でない場合、プロドラッグの投与により、自殺遺伝子産物が細胞に対して致死的になることを引き起こす。使用できる自殺遺伝子／プロドラッグ組合せの例は、単純ヘルペスウイルス−チミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）とガンシクロビル、アシクロビルまたはＦＬＡＵ、オキシドレダクターゼとシクロヘキシミド、シトシンデアミナーゼと５−フルオロシトシン、チミジンキナーゼチミジレートキナーゼ（Ｔｄｋ：：Ｔｍｋ）とＡＺＴ、およびデオキシシチジンキナーゼとシトシンアラビノシドである。
【０１２２】
細胞治療の方法を、Ｍａｔｈ１の核酸配列またはアミノ酸配列のコピーを含有する培養した細胞を導入する、本技術分野で公知の方法にて使用することができる。
【０１２３】
また他方の実施形態において、二次治療は、二次治療ポリヌクレオチドを、ａｔｏｎａｌ関連ポリペプチドの部分のすべてをコードしている第１治療ポリヌクレオチドの前、後、または同時に投与する二次遺伝子治療である。他の遺伝子産物をコードしている第２ベクターとの組合せでの、全長または部分的ａｔｏｎａｌ関連ポリペプチドいずれかをコードしているベクターの送達は、標的組織において組み合わされた抗過増殖性効果を有する可能性がある。あるいは、両方の遺伝子をコードしている単一ベクターを使用できる。
【０１２４】
免疫治療 免疫治療は、一般的に、癌細胞を標的にし、破壊するための、免疫エフェクター細胞および分子の使用を頼みにしている。免疫エフェクターは、たとえば腫瘍細胞の表面上のいくつかのマーカーに対して特異的な抗体であり得る。抗体単独で、治療のエフェクターとして役に立つことが可能であり、または細胞殺傷に実際に影響を及ぼすために他の細胞を起用することが可能である。抗体は、薬物または毒素（化学治療的、放射性核種、リシンＡ鎖、コレラ毒素、百日咳毒素など）とコンジュゲート化可能であり、単に標的化薬剤として役に立つ。あるいは、エフェクターは、腫瘍細胞標的と、直接的または間接的いずれかで相互作用する表面分子を持っているリンパ球であり得る。さまざまなエフェクター細胞には、細胞傷害性Ｔ細胞およびＮＫ細胞が含まれる。
【０１２５】
免疫治療はしたがって、Ａｄ−ｍｄａ７遺伝子治療と組合わせて、混合治療の一部として使用できるだろう。混合治療に関する一般的アプローチは、以下で論ずる。一般的に、腫瘍細胞は標的化に対して影響を受けやすい、すなわち他の細胞の大部分で存在しないいくつかのマーカーを持っていなければならない。多くの腫瘍マーカーが存在し、これらの中で任意のものは、本発明に関連して、標的化に好適であり得る。共通の腫瘍マーカーには、癌胎児性抗原、前立腺特異的抗原、泌尿器腫瘍関連抗原、胎児抗原、チロシナーゼ（ｐ９７）、ｇｐ６８、ＴＡＧ−７２、ＨＭＦＧ、シアリルルイス抗原、ＭｕｃＡ、ＭｕｃＢ、ＰＬＡＰ、エストロゲンレセプター、ラミニンレセプター、ｅｒｂＢおよびｐ１５５が包含される。
【０１２６】
混合治療 本発明を使用することにおいて、組成物を、抗癌剤のような過形成疾患の治療で効果的な他の薬剤と組み合わせることが望ましい。「抗癌」剤は、たとえば癌細胞を殺すこと、癌細胞内でアポトーシスを誘導すること、癌細胞の増殖速度を減少させること、転移の発生または数を減少させること、腫瘍サイズを減少させること、腫瘍増殖を阻害すること、腫瘍または癌細胞への血液供給を減少させること、癌細胞または腫瘍に対して免疫反応を促進させること、癌の進行を防ぐまたは阻害すること、または癌を患う対象の寿命を増加させることによって、対象中の癌に負の効果を与えることができる。さらに一般的には、これらの別の組成物は、殺すか、または細胞の増殖を阻害するために効果的な組合せ量で提供される。この方法には、細胞を同時に、発現構築物および薬剤（類）または多重因子（類）と接触させることを含むことができる。このことは、細胞を、両方の薬剤を含む単一組成物または薬理学的処方物と接触させることによって、または細胞を、２つの異なる組成物または処方物と同時に接触させることによって実施でき、ここで一方の組成物は発現構築物を含み、他方は第２薬剤（類）を含む。
【０１２７】
化学治療および放射治療剤に対する腫瘍細胞の耐性は、臨床的腫瘍学において主要な問題を提示している。現在の癌研究の１つの目標は、それを遺伝子治療と組み合わせることで、化学治療および放射治療の効果を改善する方法を探すことである。例えば、単純ヘルペス−チミジンキナーゼ（ＨＳ−ｔｋ）遺伝子は、レトロウイルスベクター系にて脳腫瘍に送達したときに、首尾良く抗ウイルス剤ガンシクロビルに対する感受性を誘導した（Ｃｕｌｖｅｒ，ｅｔａｌ．，１９９２）。本発明に関連して、ｍｄａ−７遺伝子治療は、別の前アポトーシスまたは細胞周期調節剤に加えて、化学治療、放射治療または免疫治療干渉と組み合わせて、同様に使用できる。
【０１２８】
あるいは、遺伝子治療を、数分〜数週間の範囲の間隔にて、他の薬剤治療に先んじるか、または追随することができる。他の薬剤および発現構築物を別々に細胞に適用した実施形態において、一般的に、薬剤および発現構築物が細胞において有利に混合効果を発揮できるように、有意な期間が各送達時間の間で終了しないことを確認するであろう。そのような例において、細胞を、互いに約１２〜２４時間以内に、好ましくは互いに約６〜１２時間以内に、両方のモダリティーで接触できることが企図されている。いくつかの状態において、治療の時間を有意に引き延ばすことが望ましいが、しかし、それぞれの投与の数日間（２、３、４、５、６または７日間）〜数週間（１、２、３、４、５、６、７、または８週間）経過である。
【０１２９】
さまざまな組合せを使用することができ、遺伝子治療は「Ａ」とし、放射治療または化学治療のような第２薬剤は「Ｂ」とする。
【０１３０】
Ａ／Ｂ／Ａ Ｂ／Ａ／ＢＢ／Ｂ／Ａ Ａ／Ａ／Ｂ Ａ／Ｂ／Ｂ Ｂ／Ａ／Ａ Ａ／Ｂ／Ｂ／ＢＢ／Ａ／Ｂ／Ｂ Ｂ／Ｂ／Ｂ／Ａ Ｂ／Ｂ／Ａ／Ｂ Ａ／Ａ／Ｂ／Ｂ Ａ／Ｂ／Ａ／ＢＡ／Ｂ／Ｂ／Ａ Ｂ／Ｂ／Ａ／Ａ Ｂ／Ａ／Ｂ／Ａ Ｂ／Ａ／Ａ／Ｂ Ａ／Ａ／Ａ／ＢＢ／Ａ／Ａ／Ａ Ａ／Ｂ／Ａ／Ａ Ａ／Ａ／Ｂ／Ａ
本発明の治療的発現構築物の患者への投与は、もしあるならば、ベクターの毒性を考慮して、化学治療の投与に関する一般的プロトコルに従う。治療周期を必要に応じて繰り返すことが予期される。また、種々の標準治療、並びに外科的介入を、記載した過増殖細胞治療と組み合わせて適用できる。
【０１３１】
細胞増殖の阻害
腫瘍抑制遺伝子は、過度の細胞増殖を阻害するように機能する。これらの遺伝子の不活性化は、その阻害活性を破壊し、結果として調節されない増殖を引き起こす。腫瘍サプレッサーｐ５３、ｐ１６およびＣ−ＣＡＭは、本発明で使用した詳細な実施形態である。本発明に従って使用できる他の遺伝子には、Ｒｂ、ＡＰＣ、ＤＣＣ、ＮＦ−１、ＮＦ−２、ＷＴ−１、ＭＥＮ−１、ＭＥＮ−ＩＩ、ｚａｃ１、ｐ７３、ＶＨＬ、ＭＭＡＣ１／ＰＴＥＮ、ＤＢＣＣＲ−１、ＦＣＣ、ｒｓｋ−３、ｐ２７、ｐ２７／ｐ１６融合体、ｐ２１／ｐ２７融合体、抗血栓性遺伝子（例えばＣＯＸ−１、ＴＦＰ１）、ＰＧＳ、Ｄｐ、Ｅ２Ｆ、ｒａｓ、ｍｙｃ、ｎｅｕ、ｒａｆ、ｅｒｂ、ｆｍｓ、ｔｒｋ、ｒｅｔ、ｇｓｐ、ｈｓｔ、ａｂｌ、ＥＩＡ、ｐ３００、血管新生に関する遺伝子（例えばＶＥＧＦ、ＦＧＦ、トロンボスポンジン、ＢＡＩ−１、ＧＤＡＩＦ、またはそれらのレセプター）およびＭＣＣが挙げられる。
【０１３２】
プログラムされた細胞死の調節
アポトーシス、またはプログラムされた細胞死は、正常の胚発生、成体組織中のホメオスタシスの保持、および眼下の抑制に関して本質的なプロセスである（Ｋｅｒｒｅｔ ａｌ．，１９７２）。タンパク質のＢｃｌ−２ファミリーおよびＩＣＥ様プロテアーゼが、他の系にてアポトーシスの重要なレギュレーターおよびエフェクターであることが示された。濾胞性リンパ腫に関連して発見されたＢｃｌ−２タンパク質は、逆アポトーシス刺激に応じて、アポトーシスの制御および細胞生存の促進で顕著な役割を果たす（Ｂａｋｈｓｈｉｅｔ ａｌ．，１９８５、Ｃｌｅａｒｙａｎｄ Ｓｋｌａｒ，１９８５、Ｃｌｅａｒｙｅｔ ａｌ．，１９８６、Ｔｓｕｊｉｍｏｔｏｅｔ ａｌ．，１９８５、Ｔｓｕｊｉｍｏｔｏａｎｄ Ｃｒｏｃｅ，１９８６）。進化上保存されたＢｃｌ−２タンパク質は、現在、関連タンパク質のファミリーのメンバーであると認識されており、死アゴニストまたは死アンタゴニストとして分類分けできる。異なるファミリーのメンバーが、Ｂｃｌ−２と同様の機能を有するか（例えばＢｃｌＸＬ、ＢｃｌＷ、ＢｃｌＳ、Ｍｃｌ−１、Ａ１、Ｂｆｌ−１）、またはＢｃｌ−２の機能をうち消し、細胞死を促進させる（例えばＢａｘ、Ｂａｋ、Ｂｉｋ、Ｂｉｍ、Ｂｉｄ、Ｂａｄ、Ｈａｒａｋｉｒｉ）ことが示された。
【０１３３】
他の薬剤
他の薬剤を本発明と組み合わせて使用して、治療の治療効果を向上させることが企図される。これらの追加的な薬剤には、免疫調整剤、細胞表面レセプターおよびＧＡＰジャンクションのアップレギュレーションに影響を及ぼす薬剤、細胞増殖抑制性および分化薬剤、細胞接着の阻害剤、または過増殖細胞のアポトーシス誘導剤への感受性を増加させる薬剤が含まれる。
【０１３４】
用量および処方
本発明の核酸配列およびアミノ酸配列（活性成分）を、活性成分の動物の体内での薬剤の作用部位との接触をおこす任意の方法にて様々な疾患状態の治療のために処方し、投与することができる。これらは、個々の治療的活性成分として、または治療的活性成分の組合せでのいずれかで、薬剤と共に使用することが可能である従来の方法にて投与できる。これらは単独で、または選択した投与経路、および標準の医薬的実施に基づいて選択した医薬的に許容可能な担体と共に投与できる。
【０１３５】
投与する用量は、活性成分の治療上有効量であり、もちろん特定の活性成分の薬物動態学的特性、その様式、投与経路、レシピエントの年齢、性別、健康状態および体重、症状の特徴および程度、同時治療の種類、治療の頻度および望ましい効果等の公知の因子に依存して変化する。
【０１３６】
活性成分は、カプセル、錠剤および粉末等の固体投与形態で、またはエリキセル、シロップ、エマルションおよび懸濁液等の液体投与形態で、経口にて投与できる。活性成分はまた、注射、急速点滴、鼻咽頭吸収または皮膚吸収による非経口での投与を行う処方もあり得る。薬剤は、筋肉内、静脈内または坐薬として投与できる。さらに、非経口溶液は、塩化ベンザコニウム、メチルパラベンまたはプロピルパラベンおよびクロロブタノール等の保存剤を含有することが可能である。好適な医薬的担体は、本技術分野で標準の参考文献である、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅに記載されている。
【０１３７】
さらに、標準の医薬的方法を使用して、作用の持続期間を制御することができる。これらは、本技術分野では周知であり、制御放出調節物が含まれ、適切な高分子、たとえばポリマー、ポリエステル、ポリアミノ酸、ポリビニル、ピロリドン、エチレンビニル酢酸、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースまたは硫酸プロタミンが包含される。高分子濃度および挿入方法は、放出を制御するために調節されうる。さらに、薬剤を、ポリエステル、ポリアミノ酸、ヒドロゲル、ポリ（乳酸）またはエチレンビニル酢酸コポリマー等の重合性物質の粒子中に組み込むことができる。組み込むことに加えて、これらの薬剤はまた、マイクロカプセル中に化合物を捕獲するのに使用できる。
【０１３８】
本発明の組成物の投与に関する有用な医薬的投与形態は以下のように表すことができる。
【０１３９】
カプセル：カプセルは、それぞれ治療上有効量の粉末化活性成分、１７５ミリグラムのラクトース、２４ミリグラムのタルク、および６ミリグラムのステアリン酸マグネシウムで、標準の二部分硬質ゼラチンカプセルを満たすことで調製する。
【０１４０】
軟質ゼラチンカプセル：ダイズ油中の活性成分の混合液を調製し、陽性置換ポンプの方法にて、ゼラチンに注入し、治療上有効量の活性成分を含む軟質ゼラチンカプセルを形成させる。次いでこのカプセルを洗浄し、乾燥させる。
【０１４１】
錠剤：錠剤を、投与ユニットが治療上有効量の活性成分であるように、従来の手順にて調製する。０．２ミリグラムのコロイド二酸化シリコン、５ミリグラムのステアリン酸マグネシウム、２７．５ミリグラムの微晶質セルロース、１１ミリグラムのトウモロコシデンプンおよび９８．８ミリグラムのラクトースである。適切なコーティングを、嗜好性を高めるため、または吸収を遅らせるために適用できる。
【０１４２】
注射；注射にて投与するために好適である非経口組成物は、ポリエチレングリコールおよび水１０％中で、活性成分の１．５重量％を攪拌することで調製する。この溶液を塩化ナトリウムで等張にし、滅菌する。
【０１４３】
懸濁液：水溶懸濁液を、それぞれ５ミリメーターが治療的に活性量の微細に分割された活性成分、２００ミリグラムのナトリウムカルボキシメチルセルロース、５ミリグラムの安息香酸ナトリウム、１．０グラムのソルビトール溶液Ｕ．Ｓ．Ｐ．および０．０２５ミリメーターのバニリンを含有するように、経口投与のために調製する。
【０１４４】
したがって、特定の効果を実施するために、本発明の医薬的組成物を、様々な経路で、および様々な部位へ送達することができる（例えばＲｏｓｅｎｆｅｌｄｅｔ ａｌ．（１９９１）上記、Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｒｅｓ．，３９（２）．３１１Ａ（１９９１ａ）、Ｊａｆｆｅｅｔ ａｌ．，上記、Ｂｅｒｋｎｅｒ、上記参照）。当業者は、１つ以上の投与経路を投与のために使用できるが、特定の経路が、他の経路よりもより穏やかで、より効果的な反応を提供できることを認識するであろう。局所または全身性送達を、塗布、体腔内への処方の点滴注入、エアロゾルの吸引または吸入によって、または筋肉内、静脈内、腹膜、皮下、皮内、局所適用を含む非経口導入によって実施できる。
【０１４５】
本発明の組成物は、それぞれの投与ユニット、例えば少量の、錠剤、溶液または坐薬が、先に決定した量の組成物を、単独で、または他の活性成分との好ましい組合せで含む、ユニット投与形態を提供することができる。本明細書で使用する場合、「ユニット投与形態（ｕｎｉｔｄｏｓａｇｅ ｆｏｒｍ）」なる語は、ヒトおよび動物対象に対する一体投与として好適である物理的に分離したユニットを指し、それぞれは先に決定した量の本発明の組成物を、望ましい効果を産出するのに十分な量で算出した、単独で、または他の活性成分と組合わせて含むユニットである。本発明のユニット投与形態に関する詳細は、実施すべき特定の効果、および特定の宿主での医薬的組成物に関連した特定の薬物動態学に依る。
【０１４６】
本明細書に記載のこれらの方法は、すべて包括的な意味ではなく、特定の適用に合うさらなる方法が当業者に明らかであろう。また、効果適量の組成物を、望ましい効果を発揮することが知られている化合物の類推を介してさらに最適化できる。
【０１４７】
以下の実施例は、例示するだけで、任意の様式で本発明の意図を制限することはない。
【０１４８】
（実施例）
実施例１ マウスａｔｏｎａｌホモログ１（Ｍａｔｈ１）
聴覚障害を処置するための現在の方法は、直接的に問題、すなわち聴覚器官有毛細胞集団の再生を扱うことができないことが見出された。本発明は、好ましい実施形態において、ｂＨＬＨファミリーのメンバー、Ｍａｔｈ１遺伝子または他のａｔｏｎａｌ関連核酸配列を指向し、小脳顆粒ニューロンおよび内耳有毛細胞の精製に関するその必要性を指向している。この発見は、以下に記述したように、神経発生の理解のためだけでなく、様々な一般的な障害に対する治療のための広い波及効果を有する。
【０１４９】
マウスａｔｏｎａｌホモログ１（Ｍａｔｈ１）は、小脳顆粒ニューロンの前駆体、発生脊髄の背側での少数の細胞、内耳、メルケル細胞（皮膚上の感覚受容器）および関節に発現している。さもなければ分化した細胞内でのＭａｔｈ１の過剰発現が、先祖または成熟内耳有毛細胞様細胞の形成またはそれへの分化を誘導することができる。
【０１５０】
小脳顆粒ニューロンの前駆体内でのＭａｔｈ１発現は、それが小脳および脳での機能に必要であることを示唆している。小脳は、優れた運動協調および姿勢に重要であり、その不全は、平衡、言語および指運動を混乱させる。脳発生は典型的に、菱脳中の少数の細胞集団が、外部顆粒層、脳幹、および脳橋ニューロンを形成するために、増殖し、口の周りに移動する、およそ胚日９．５（Ｅ９．５）にて始まる。このニューロン先祖の集団は、Ｍａｔｈ１を発現し続けており、小脳および脳における有力なニューロン集団である小脳顆粒ニューロンを形成するために、さらに増殖し、内部に移動する。Ｍａｔｈ１を発現していないマウスは、完全に小脳顆粒ニューロンおよびその前駆体を欠く。したがって、Ｍａｔｈ１はこれらのニューロンの産出に必須であり、１０億まで増殖し、次いで分化する能力を有し、Ｅ９．５でのニューロンの極めて散在している集団を提供する（Ｂｅｎ−Ａｒｉｅｅｔ ａｌ．，１９９７）。これらの機能は両方とも医学的に極めて重要なものである。正常の増殖を理解するために、癌で観察されるような、異常増殖を洞察する必要性がある。始原神経外胚葉型（たとえば髄芽腫）の小脳腫瘍は、子供において、最も一般的な固体悪性物である。Ｍａｔｈ１発現細胞はこれらの腫瘍に対して明らかに一因となっている。
【０１５１】
Ｍａｔｈ１は、典型的に変形関節症で退化する、非骨化関節軟骨（図６参照）で発現している。これは関節炎の最も多い形態であり、４０歳以上の９０％のヒトが１つまたはそれ以上の関節で、ある程度の変形関節症を示している。細胞産出および増殖でのＭａｔｈ１の特性を考えると、影響を及ぼす関節でのその人工的な発現は、非骨化軟骨を構成する細胞の再生を可能にすることができる。
【０１５２】
Ｍａｔｈ１遺伝子、そのヒトホモログ（Ｈａｔｈ１）または任意のそのホモログ、オーソログ、キメラ融合タンパク質または任意の好適なａｔｏｎａｌ関連核酸配列の誘導体、または任意の他のａｔｏｎａｌ関連核酸配列を使用する組成物および方法が本明細書に開示されている。哺乳動物でのＭａｔｈ１の機能について知るために、Ｍａｔｈ１遺伝子を、Ｍａｔｈ１を発現している細胞の検出を可能にする戦略を用いてマウスより欠失させた。内耳有毛細胞、またはＭａｔｈ１発現が関連している他の細胞でのＭａｔｈ１の発現を減少させるかまたは増加させるのに使用できる化合物の選別に使用できるマウスの作製および特性化が開示されている。
【０１５３】
また、Ｍａｔｈ１発現が小脳顆粒ニューロンの産出および増殖に関して必須であるため、神経外胚葉起源の新生物増殖の研究、特性化および治療に関する方法が開示されている。また、Ｍａｔｈ１が、変形関節症の発達に関連している、非骨化関節軟骨産出する細胞の発生において役割を果たすことが発見された。これらの発見は、内耳有毛細胞欠失および変形関節症のようなＭａｔｈ１機能的欠損のために起こる他の疾患の治療に関して有用である化合物のスクリーニングの方法を提供する。
【０１５４】
より詳細には、本発明は、Ｍａｔｈ１遺伝子の不活性かまたは他のａｔｏｎａｌ関連核酸配列に関する動物ヘテロ接合体を提供し、そこで少なくとも１つのＭａｔｈ１対立遺伝子または他のａｔｏｎａｌ関連核酸配列が異種核酸配列の挿入によって置換され、そこでＭａｔｈ１またはａｔｏｎａｌ関連配列の不活性化が、Ｍａｔｈ１またはａｔｏｎａｌ関連対立遺伝子の発現を抑制する。マウスはさらに、Ｍａｔｈ１または他のａｔｏｎａｌ関連配列遺伝子不活性化のためにマウスホモ接合体を作製するために使用され、さらに、第２ヘテロ接合体核酸配列を含むことが可能であり、そこで少なくとも１つの異種遺伝子が、Ｍａｔｈ１またはａｔｏｎａｌ関連配列調節エレメントによって駆動される発現を検出するのに使用される。機能的Ｍａｔｈ１またはａｔｏｎａｌ関連配列の完全な、または部分的な不活性化は、たとえば固有受容（proprioreceptory）細胞、顆粒ニューロンおよびその先祖細胞、または非骨化軟骨細胞中に検出することができる。
【０１５５】
異種核酸配列の例は、β−ガラクトシダーゼ、グリーンフルオレセインタンパク質（ＧＦＰ）、ブルーフルオレセインタンパク質（ＢＦＰ）、ネオマイシン、カナマイシン、ルシフェラーゼ、β−グルクロニダーゼおよびクロラムフェニコールトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）である。Ｍａｔｈ１またはａｔｏｎａｌ関連配列はまた、調節可能プロモーター配列の制御下で置換され、または組織特異的プロモーター配列であり得る。上記プロモーター配列は、部分的または全プロモーターを含むことができる。
【０１５６】
本発明はまた、化合物のスクリーニングのための方法として、またはその一部として使用でき、化合物の投与は、発生および／または病理学状態が、Ｍａｔｈ１またはａｔｏｎａｌ関連配列の発現の減少の結果であるような上記状態に影響を与え、化合物をＭａｔｈ１またはａｔｏｎａｌ関連配列不活性化についてホモ接合体であるトランスジェニックマウスに投与すること、および発生学的および／または病理学的状態の変化に関して上記マウスをモニタすることを含み、そこで少なくとも１つのＭａｔｈ１またはａｔｏｎａｌ関連対立遺伝子が、異種核酸配列の挿入にて不活性化されており、Ｍａｔｈ１またはａｔｏｎａｌ関連配列の不活性化が、Ｍａｔｈ１またはａｔｏｎａｌ関連遺伝子の発現を防止する。試験可能な病理学的状態の型には、有毛細胞の欠失、小脳顆粒ニューロンまたはその前駆体の欠失、顆粒細胞増殖または遊走の欠失、小脳外部顆粒層細胞の欠失、聴力障害、平衡失調、関節疾患、変形関節症、新生物神経外胚葉細胞の異常増殖および髄芽細胞腫の形成が、限定はされないが、含まれる。本明細書で使用するように、スクリーニングが、異種核酸配列の発現をアップレギュレートすることによる、生のエフェクターである化合物に関して、および異種核酸配列の発現をダウンレギュレートすることによる、負のエフェクターである化合物に関して提供される。
【０１５７】
本発明の他の実施形態は、機械的受容細胞増殖を促進する方法であり、これには、細胞を、上記細胞が内耳有毛細胞マーカーを発現することを引き起こすのに効果的な量で、Ｍａｔｈ１またはａｔｏｎａｌ関連タンパク質または遺伝子と接触させることが含まれる。本方法で使用される有毛細胞マーカーには、カルレチニンが挙げられる。細胞を、Ｍａｔｈ１またはａｔｏｎａｌ関連核酸配列またはアミノ酸配列を発現しているベクターと接触させることができる。Ｍａｔｈ１またはａｔｏｎａｌ関連核酸配列発現組換えベクターには、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノ随伴ベクター、プラスミド、または任意の他の核酸に基づいたベクター、リポソーム、核酸、ペプチド、脂質、炭水化物および上記ベクターのそれらの組合わせが包含される。Ｍａｔｈ１またはａｔｏｎａｌ関連配列は、例えばサイトメガロウイルスＩＥプロモーター配列またはサイトメガロウイルスＩＥプロモーター配列とＳＶ４０初期ポリアデニル化シグナル配列、または好ましいプロモーター配列、エンハンサー配列、およびポリアデニル化を任意の他の組み合わせの制御下で存在し得る。
【０１５８】
さらに、方法が、聴覚喪失または平衡失調のヒトを含む動物に、治療上有効量のＭａｔｈ１またはａｔｏｎａｌ関連アミノ酸配列または核酸配列を投与することを含む、聴覚障害または平衡失調を治療するために開示されている。聴覚または平衡失調は、完全であるかまたは部分的であり、１つの耳または両方の耳のいずれかに影響を与えてもよい。好ましい実施形態において、聴覚の本質的な障害が存在する。聴覚または平衡障害は、治療対象の動物内で別々に、または同時に影響を受けてよく、上記聴覚および／または平衡失調は、外傷、疾患、年齢関連状態の結果としてであり、または任意の理由による有毛細胞の欠失による。
【０１５９】
本発明はまた、送達ビーイクルと組み合わせて、Ｍａｔｈ１またはａｔｏｎａｌ関連タンパク質または遺伝子を含む組成物を指向しており、上記送達ビーイクルは、治療上有効量のＭａｔｈ１またはａｔｏｎａｌ関連配列を細胞内に送達させる。送達ビーイクルはさらに、動物細胞内のＭａｔｈ１またはａｔｏｎａｌ関連アミノ酸配列または核酸配列を含むベクターとして定義できる。上記ベクターはレトロウイルスまたはアデノウイルスベクター、または医薬的に許容可能な処方内に分散できる任意の他の核酸に基づいたベクターであり、病変内局注投与のために使用する。組成物は、Ｍａｔｈ１またはａｔｏｎａｌ関連タンパク質の細胞内への進入を促進するリポソーム、タンパク質、脂質または炭水化物を用いて送達する、部分的または完全な精製タンパク質である。送達ビーイクルとして使用できるタンパク質の例として、エキソトキシンＡ、コレラ毒素およびリシン毒素等の微生物毒素のレセプター結合領域（非触媒領域）、またはＨＩＶＴＡＴタンパク質からなるタンパク質形質導入領域が挙げられる（Ｓｃｈｗａｒｚｅ ｅｔ ａｌ．，１９９９）（実施例２２参照）。Ｍａｔｈ１を送達するための組成物は、融合タンパク質であってもよい。
【０１６０】
当業者は、本発明で開示したように、動物を治療する方法が、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、または誕生の後のいずれかでであり得ることを認識している。治療は、胚に施すことができ、またはｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｖｏいずれかで実施できる。
【０１６１】
実施例２ 変形関節症に関する動物モデル
変形関節症を制御する遺伝子の欠損に関する効果的な動物モデルは、胚発生を通して、１つまたはそれ以上の組織が機能的野生型対立遺伝子に戻ることができないように、安定に不活性化された両対立遺伝子をしばしば持つ可能性がある。遺伝子型を変えた動物の産出の１つの方法は、遺伝子ターゲッティングであり（Ｍａｎｓｏｕｒ ｅｔ ａｌ．，１９９３）、そこで、新規に導入したＤＮＡ配列（すなわち標的化配列または構築物）および染色体に存在する特定の標的化ＤＮＡ配列が、結果として新規に導入したＤＮＡ配列の一部分の標的化染色体ＤＮＡ配列内への挿入となる。この方法は、任意の望ましい遺伝子型の動物の産出することができ、選択可能マーカーを遺伝子内に挿入するか、または完全に遺伝子を他のヌクレオチド配列に置換することによって、特定の染色体遺伝子配列での、遺伝子破壊（すなわち「ノックアウト」に）に関してとりわけ有用である。
【０１６２】
ゲノム配列をノックアウトするために、クローン化した断片が入手可能でなければならず、断片内のイントロン−エクソン境界が定義される（Ｍａｎｓｏｕｒｅｔ ａｌ．，１９９３）。典型的には、標的化構築物には、染色体標的ＤＮＡに対して相同的な配列に隣接したＮｅｏ（ネオマイシン耐性、Ｍａｎｓｏｕｒｅｔ ａｌ．，１９９３参照）等の選択可能マーカーを含み、１つのこれらの隣接する配列は、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶ−ＴＫ、一般的には、ＭｃＫｎｉｇｈｔｅｔ ａｌ．，１９８０参照）である。結果的に、標的化構築物は、相同組換えが標的化染色体ＤＮＡ配列内にネオマイシン耐性マーカーの挿入となるがＨＳＶ−ＴＫ遺伝子は挿入されない胚由来幹（ＥＳ）細胞内に、たとえばエレクトロポレーションにて導入される。改変したＥＳ細胞はネオマイシン耐性およびＨＳＶ−ＴＫ耐性であり、よって、Ｇ４１８およびガンシクロビル抗生物質両方の存在下で増殖することができる。ランダム挿入物にはＨＳＶ−ＴＫ遺伝子が含まれ、したがってガンシクロビルに感受性である（Ｍａｎｓｏｕｒ，ｅｔａｌ．）。次いで陽性ＥＳクローンを芽細胞内にマイクロインジェクトして、生殖系列キメラマウスを作製し、次いでこれを交配させて、ノックアウト遺伝子に関してホモ接合体である子孫を得た。ノックアウト動物を作製するこのような一般的な方法は、マウスを用いて明らかにされている。ラット、モルモット、アレチネズミ、ハムスターおよびウサギのような他の動物の遺伝子も、好ましい標的化構造を対象の遺伝子をノックアウトするために作製するために十分なＤＮＡ配列データが入手可能であるならば使用できる。
【０１６３】
ａｔｏおよびＭａｔｈ１は高い程度の配列保存を共有しているが、発現パターンと、その機能欠失の結果の間に明らかな不一致が存在した。ａｔｏは主にハエのＰＮＳに発現し、その欠損はほぼすべてのＣＨＯの欠失を引き起こすが（Ｊａｒｍａｎｅｔ ａｌ．，１９９３）、Ｍａｔｈ１はＣＮＳに発現しており、その欠失は、ＣＮＳでの最大のニューロン集団である小脳顆粒ニューロンに欠損を導く（Ｂｅｎ−Ａｒｉｅｅｔ ａｌ．，１９９７）。ａｔｏとＭａｔｈ１間の機能的関連をより理解するために、本発明は、Ｍａｔｈ１コード領域のβ−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）での置換によるマウス内の第２Ｍａｔｈ１ヌル対立遺伝子（Ｍａｔｈ１b-gal/b-gal ）の産出およびショウジョウバエでのａｔｏのＣＮＳ発現に関する続く検索の実施を記載する。本実施例は、ａｔｏとＭａｔｈ１間の機能的関連を記載しており、ａｔｏはハエの脳に発現し、Ｍａｔｈ１調節エレメント（Ｍａｔｈ１／ｌａｃＺ）の制御下でのｌａｃＺ発現は、ＣＮＳ中の公知の発現パターン（すなわち神経管、脊髄および小脳）を複製はせず、ネズミＰＮＳの多くの他の細胞で見られる。ショウジョウバエでのＭａｔｈ１の過剰発現は、正常の位置ではないところでＣＨＯ形成を引き起こし、これは、ａｔｏおよびＭａｔｈ１が機能的に保存されているさらなる証拠を提供している。
【０１６４】
ショウジョウバエ内のａｔｏｎａｌおよびマウス内のＭａｔｈ１間の関係の一貫性および整合性は、本技術分野でのモデル系としてのこれらの使用が正しいことを示唆している。ホモログのファミリーが、ＭＡＴＨ１，２，３，４Ａ、４Ｂ、４Ｃおよび５を含むマウスでクローン化され、解析された（Ａｚａｋａｗａｅｔ ａｌ．，１９９５、Ｂａｒｔｈｏｌｏｍａａｎｄ Ｎａｖｅ，１９９４、Ｂｅｎ−Ａｒｉｅｅｔ ａｌ．，１９９７、Ｂｅｎ−Ａｒｉｅｅｔ ａｌ．，１９９６、Ｆｏｄｅｅｔ ａｌ．，１９９８、Ｍａｅｔ ａｌ．，１９９８、ＭｃＣｏｒｍｉｃｋｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｓｈｉｍｉｚｕｅｔ ａｌ．，１９９５、Ｔａｋｅｂａｙａｓｈｉｅｔ ａｌ．，１９９７）。アフリカツメガエルａｔｏｎａｌホモログＸａｔｈ１は、ショウジョウバエでは、正常ではない場所に発現し、ａｔｏと同様に振る舞うことが示された（Ｋｉｍｅｔ ａｌ．，１９９７）。さらに、Ｍａｔｈ１の正常ではない位置でのＣＨＯ形成を誘導する能力、およびＣＨＯをａｔｏ変異体胚に復帰させる能力（実施例１３参照）は、Ｍａｔｈ１、とりわけその塩基性領域が、ａｔｏによってコードされたものとは同一ではない整列同一性情報をコードしており、Ｍａｔｈ１を発現している哺乳動物細胞が、機能的に、ａｔｏを必要とするショウジョウバエ細胞と同一で、おそらく進化的に関連することの強力な証拠である。したがって、ショウジョウバエでのａｔｏｎａｌと、アフリカツメガエルでのＸａｔｈ１およびマウスでのＭａｔｈ１の間の類似性は、これらの動物が比較可能な動物モデル系であることを示唆している。さらに、とりわけヒトに関するモデル系としてのマウスの広範囲な使用もまた、ヒトでの本発明の使用を同様に許容することを示唆している。
【０１６５】
現在の本技術分野での標準である分子遺伝学の進展とともに、ヒトおよび他の種からの配列を、さまざまな生物で交換可能に使用できうる。たとえば、ラット誘導可能ｈｓｐ７０遺伝子を、誘導可能ｈｓｐ７０を過剰発現しているトランスジェニックマウスを産出するために使用し、これは、トランスジェニックマウスからの組織を、ラットｈｓｐ７０の増加による虚血障害より保護する（Ｍａｒｂｅｒｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９５：１４４６−１４５６（１９９５））。他の動物での配列が、ヒト疾病、すなわち神経変性疾病を研究するために、齧歯類モデルを開発させるために、ヒトおよび齧歯類間を含んで変換可能された。１つのそのような例は、ヒトＳＣＡ１遺伝子の発現であり、これはマウス内でａｔａｘｉｎ−１をコードしている（Ｂｕｒｒｉｇｈｔ，Ｅ．Ｎ．ｅｔａｌ．Ｃｅｌｌ ８２：９３７−９４８（１９９５））。トランスジェニックマウスが、正常またはＣＡＧ区間が拡張したかのいずれかのヒトＳＣＡ１遺伝子を発現して作製された。データは、拡張したＣＡＧ繰り返しが、十分量プリキンエ細胞中に発現しており、再生および運動失調を産出したことを例示した。この例は、マウスモデルが、常染色体優性遺伝神経学的疾患である、１型脊髄小脳性運動失調を研究するために確立されうることを示している。マウスモデルの開発に加えて、ショウジョウバエが本技術分野で顕著なモデル系である。Ｗａｒｒｉｃｋｅｔ ａｌ．（１９９９）は、ヒトｈｓｐ７０とヒト変異体ポリグルタミン（ＭＪＤｔｒ−Ｑ７８）を共発現しているトランスジェニックハエを産出した。ハエでのヒト変異体ポリグルタミンＭＪＤｔｒ−Ｑ７８のみの発現は、結果としてニューロンの大きな集合体の形成となる。しかしながら、ヒトｈｓｐ７０との共発現では、結果として集合体は抑制される。これらの例は、遺伝子の互換性が、分子遺伝学の領域で慣例的であり、モデル系は遺伝子機能を特性化するための強力なツールを提供することを示している。
【０１６６】
実施例３ トランスジェニックＭａｔｈ１マウスの作製
ＲＮＡ ｉｎｓｉｔｕハイブリッド形成によって同定できないかすかなＭａｔｈ１発現パターンを検出し、したがってさらに胚発生の間の本遺伝子の役割を明らかにするために、Ｍａｔｈ１ヌル対立遺伝子（Ｍａｔｈ１β-Gal/ β-Gal）を、Ｍａｔｈ１コード領域をβ−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）で置換することで作製した。
【０１６７】
ｌａｃＺカセットおよびＰＫＧ−ｎｅｏカセット（図７Ａ）を含む標的化構築物を、Ｍａｔｈ１コード領域を置換するために使用した。Ｍａｔｈ１の全コード領域の欠失するために、標的化構築物を、ｐＳＡｂｇａｌ／ＰＧＫ−ｎｅｏカセット（Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈａｎｄ Ｓｏｒｉａｎｏ，１９９１）に隣接した先に記載したような（Ｂｅｎ−Ａｒｉｅｅｔ ａｌ．，１９９７）５’および３’ゲノム隣接断片を含むように作製した。構築物は、ｌａｃＺ発現が内因性Ｍａｔｈ１コントロールエレメントによって操作され、一方でＰＧＫプロモーターが選択可能マーカーｎｅｏの発現を操作するように設計した。
【０１６８】
構築物をＥＳ細胞内にエレクトロポレートし、ｎｅｏに対する選択をＧ４１８にて実施した。７６のうち１４（１８％）のクローンが相同組換えが起こっていた。ＥＳ細胞、卵黄嚢および尾ＤＮＡの遺伝子型決定を、ＥｃｏＲＩ消化ＤＮＡおよび上記プローブ（Ｂｅｎ−Ａｒｉｅｅｔ ａｌ．，１９９７）のサザン解析を用いて実施した。標的構築物を胚幹（ＥＳ）細胞内にエレクトロポレートし、１４／７６（１８％）のクローンがＭａｔｈ１遺伝子座の位置に正しい相同組換えを示した（図７Ｂ）。
【０１６９】
Ｍａｔｈ１+/b-gal 対立遺伝子を持つ３つのＥＳ細胞株を宿主胚芽細胞に注入し、キメラマウスを作製した。Ｍａｔｈ+/b-gal マウスを同定し、内部交配してホモ接合体を作製した（図７Ｃ）。Ｍａｔｈ１欠失を、隣接および内部プローブ両方を用いて、サザン解析により確認した（図７Ａ）。
【０１７０】
Ｍａｔｈ１β-Gal/β-Galマウスは、Ｍａｔｈ１-/- マウスで報告された（Ｂｅｎ−Ａｒｉｅ ｅｔ ａｌ．，１９９７、２０００）表現型特徴をすべて示した。
【０１７１】
実施例４ Ｘ−ｇａｌ染色、組織学的および免疫組織学的解析
Ｅ０．５と称するプラグの初期で、胚を膣栓にてステージ決定した。胚を子宮より切り裂き、胚外膜より分離し、冷リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中に置いた。次いで胚をＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）内で３０分間固定し、冷ＰＢＳで洗浄した。卵黄嚢または尾をＤＮＡ抽出および表現型決定のために固定前に回収した。染色薬剤の浸透性を改善するために平衡化を、ＰＢＳ中の０．０２％ＮＰ４０、０．０１％デオキシコレート内で、室温にて１０分間実施した。Ｘ−ｇａｌ（Ｂｏｎｎｅｒｏｔａｎｄ Ｎｉｃｏｌａｓ，１９９３）による全体染色を、５ｍＭフェリシアン化カリウム、５ｍＭ フェロシアン化カリウム、および４０ｍｇ／ｍｋＸ−ｇａｌ（ＤＭＳＯ中に溶解）も含む、同一の平衡化緩衝液中で浸透しながら３０℃にて１６〜２４時間実施した。望ましい強度の染色が実施されると、通常１８時間以内であるが、胚をＰＢＳで洗浄し、３０分間干渉化ホルマリンで後固定し、連続的に２５、５０および７０％エタノールで脱水し、４℃にて保存した。
【０１７２】
組織学的解析のために、胚をさらに８０、９０および１００％エタノールで脱水し、Ｈｉｓｔｏｃｌｅａｒ（ナショナルダイアゴノスティックス）で処理し、Ｐａｒａｐｌａｓｔ（オックスフォード ラブウェア）内に包埋した。７〜２０μｍ切片を、マイクロトン（マイクローム）を用いて切断した。対比染色をニュークリアーファストレッド（ベクターラボラトリーズ）を用いて実施した。免疫組織学を上述のように（Ｂｅｎ−Ａｒｉｅｅｔ ａｌ．，１９９７）実施した。抗体：抗サイトケラチン１８（ＤＡＫＯ）１：２０、抗ヒトクロモグラニンＡ（ＤＡＫＯ）１：１００、抗−ＭＡＴＨ１（以下参照）１：２００。
【０１７３】
実施例５ トランスジェニックＭａｔｈ１マウスでの発現パターン
予想したように、小脳および背側脊髄でのβ−Ｇａｌ発現は、Ｍａｔｈ１のものと同一であり、興味深いことに、β−Ｇａｌはまた、Ｅ１２．５にて耳胞上皮ｈのいたるところで、そしてＥ１４．５およびＥ１５．５にて卵形嚢、球形嚢、半規管および渦巻き管の感覚上皮でも発現した。卵形嚢はＣ５７ＢＬ／１２９ＳＶＥＶマウスより得た。
【０１７４】
全妊娠期間の１日前のＥ１８．５でのＭａｔｈ１β-Gal/ β-Galマウスの内耳の肉眼形態学的解析により、野生型（ｗｔ）同腹子と比較して、全構造およびサイズに明らかな欠陥はなにもないことが明らかになった。ＶＩＩＩth脳神経の分岐が存在し、上皮に達しているが、有毛細胞がないために退化している。
【０１７５】
感覚上皮を詳細に試験した。野生型、Ｍａｔｈ１+/β-Gal、およびＭａｔｈ１β-Gal/ β-Galマウスの卵形嚢、うずまき管をノマルスキー光学器によって感覚上皮が見ることができるように切断した。毛束が野生型およびヘテロ接合体の両方の器官で存在したが、Ｍａｔｈ１ヌル同腹子では完全になかった。渦巻き管および前庭器官の走査型電子顕微鏡図（ＳＥＭ）により、ヌルマウスでの毛束がないことを確認した（図２Ａ〜図２Ｆ）。毛束の欠失が、有毛細胞がないことに関係があるかどうかを決定するために、光学顕微鏡および透過型顕微鏡（それぞれＬＭおよびＴＥＭ）を用いて、すべての内耳器官の感覚上皮の切片を試験した（図３Ａ〜図３Ｆ）。ＬＭおよびＴＥＭを上述のように（Ｌｙｓａｋｏｗｓｋｉａｎｄ Ｇｏｌｄｂｅｒｇ，１９９７）実施した。ＳＥＭに関する組織調製は、オスミウム酸染色（カコジル酸緩衝液中１％ＯｓＯ4 ）、脱水、臨界点乾燥、金によるスパッターコーティング、およびＪＥＯＬ３５Ｓ電子顕微鏡での試験からなる。
【０１７６】
光学顕微鏡により、ヌルマウスでの感覚上皮は明らかに薄く、細胞核の正常層状構造を欠き、不均一に染まり、これらはすべて有毛細胞がないことと関連する。ＴＥＭは、明らかに正常卵形嚢での有毛細胞と支持細胞を見分ける。有毛細胞は毛束、低電子密度細胞質、より先端の核を持ち、分泌顆粒を持たない（図４Ａおよび４Ｂ）。ヌル変異体の感覚上皮は、有毛細胞を完全に欠き、しかし電子密度細胞質、基底部核および分泌顆粒を含む正常な形の支持細胞は持つ（Ｒｕｓｃｈ，ｅｔａｌ．，１９９８）。しかしながら、ヘテロ接合体Ｍａｔｈ１+/b-Gal マウスは有毛細胞を残している。
【０１７７】
実施例６ トランスジェニックＭａｔｈ１マウスでの有毛細胞特異的マーカーの発現
Ｅ１８．５での有毛細胞の欠失は、ＰＯＵ領域転写因子Ｂｒｎ３ｃのない状態で観察されたような、（１）感覚細胞先祖の欠失、（２）有毛細胞に分化する先祖の不能性、または（３）分化状態を維持する有毛細胞の不能性のためであり得る。第１の可能性は、先祖が、有毛細胞および支持細胞両方を作り出すから可能性がないようである。残っている可能性を評価するために、有毛細胞特異的マーカー、カルレチニンおよびミオシンＶＩの発現を試験した。カルレチニンはタンパク質のカルシウム結合ファミリーのメンバーであり、分化有毛細胞（毛束形成の前）および成熟内耳および聴覚有毛細胞で発現しているが、支持細胞には発現していない。Ｍａｔｈ１β-Gal/ β-Galおよび野生型マウスでのカルレチニン発現を、Ｅ１５．５、Ｅ１６．５およびＥ１８．５胚の冠状切片上の免疫蛍光検査にて研究した（図５Ａ〜図５Ｆ）。
【０１７８】
免疫蛍光検査に関して、胚を１．５時間、４％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳ中で、４℃にて固定し、５時間、１５％スクロース／ＰＢＳ、次いで一晩３０％スクロース／ＰＢＳを介して浸潤させ、２−メチルブタン乾燥氷浴中で素早く凍結させた。１４μｍ切片を、クリオスタット上で切断し、ゼラチンコートスライド上に載置した。切片をスライド上で、ストレック（Ｓｔｒｅｃｋ）組織定着剤（ストレックラボラトリーズ）中に１０分間浸し、風乾することで固定化した。切片を、ＰＢＳ中の３０％正常ヒツジ血清および０．３％トライトンＸ−１００中で、室温（ＲＴ）にて１時間ブロッキングした。ラビット抗カルレチニンポリクローナル抗体（ケミコンラボラトリーズ）をブロッキング溶液中で１：２００に希釈し、４℃にて切片上で一晩インキュベートした。切片をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中でＲＴにて３回（それぞれ２０分間）洗浄した。二次抗体抗ラビット抗体、アレキサ（Ａｌｅｘａ）４８８（モレキュラープローブス）をブロッキング溶液中で１：４００に希釈し、カルレチニンの検出に使用した。切片を覆い、ＲＴにて２時間インキュベートし、ＤＡＰＩ含有ベクタシールド（Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ）（ベクター）中で洗浄および載置した。共焦点顕微鏡のために、切片を２５μｇ／ｍｌのＲＮＡｓｅと共に処理し、５０μｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウムで対比染色し、ＤＡＰＩを含まないベクタシールド（Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ）中でマウントした。染色した切片をバイオラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）１０２４共焦点顕微鏡下で観察した。
【０１７９】
カルレチニン陽性細胞は、野生型マウスの半規管および卵形嚢の感覚上皮にて明らかに見ることができるが、しかしＭａｔｈ１β-Gal/ β-Gal胚はすべての３つの状態でカルレチニンの発現を欠いている。本明細書で開示したマウスモデルを用いて、本発明者等は、有毛細胞がＭａｔｈ１β-Gal/ β-Galマウスの感覚上皮内では発生しないことを示した。（支持細胞によってところどころで分泌された）蓋膜および平衡砂膜の存在は、ＴＥＭの結果と共に、Ｍａｔｈ１β-Gal/ β-Galマウスの感覚上皮での残っている細胞が機能的な支持細胞であることを示唆している。
【０１８０】
実施例７ Ｍａｔｈ１／ｌａｃＺ発現は、発生ＣＮＳ中のＭａｔｈ１発現を模倣するＭａｔｈ１+/b-gal およびＭａｔｈ１β-Gal/β-GalマウスにおけるＥ１４．５および誕生日０（Ｐ０）での発生している小脳をＲＮＡｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリッド形成解析にて解析した。
【０１８１】
解析は、ｌａｃＺ遺伝子の発現パターンが、上述した（Ａｋａｚａｗａ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｂｅｎ−Ａｒｉｅ ｅｔ ａｌ．，１９９６）ＲＮＡ ｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド解析によって観察されたＭａｔｈ１発現パターンを正確に再産出していることを示した（図２Ａ、Ｂ、Ｅ、Ｇ）。さらに、Ｍａｔｈ１β-Gal/ β-Galマウスでの小脳表現型（図８Ｆおよび８Ｈ）は、Ｍａｔｈ１ヌルマウスで観察されたもの（Ｂｅｎ−Ａｒｉｅｅｔ ａｌ．，１９９７）と同一であった。Ｅ１４．５において、ＥＧＬの前駆体が、そこより小脳原基上を移動し、ＥＧＬを構成する、菱唇に存在する（図８Ｅ）。変異体マウスは、ヘテロ接合体マウスよりもこれらの細胞をより少なく提示している（図８Ｆ）。Ｐ０において、外部顆粒層（ＥＧＬ）のニューロンは完全に欠失していた（図８Ｈ）。
【０１８２】
発生菱脳および脊髄でのＭａｔｈ１／ｌａｃＺ発現は、Ｍａｔｈ１の発現パターンを同様に再産出した（図８Ｃ、８Ｄ）。ｉｎｓｉｔｕハイブリッド形成とｌａｃＺ染色によって示された発現パターンの唯一の顕著な差は、ｂ−ＧＡＬタンパク質の安定性のために、ｂ−ガラクトシダーゼ発現が脊髄の分化または誘導細胞で持続していることである（図８Ｄ）。要約すると、ニューロン組織発現パターンおよびＭａｔｈ１コード領域のｌａｃＺによる置換に関連した小脳表現型は、Ｍａｔｈ１発現において先に発行されたデータ（Ａｋａｚａｗａｅｔ ａｌ．，１９９５、Ｂｅｎ−Ａｒｉｅｅｔ ａｌ．，１９９７、Ｂｅｎ−Ａｒｉｅｅｔ ａｌ．，１９９６、Ｈｅｌｍｓａｎｄ Ｊｏｈｎｓｏｎ，１９８８）と一致し、外来制御エレメントがｌａｃＺ遺伝子の挿入によって崩壊しないことを示唆している。さらに、多くの先には検出されていないｌａｃＺ発現細胞のクラスターが、Ｍａｔｈ１+/b-Gal マウスの全胚および切片のＸ−ｇａｌ染色にて明らかになった（以下参照）。より早期の研究で、転写物を検出するために使用したＲＮＡｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド形成技術の空間的分解能の制限が、発現のこれらの部位を識別することから妨げた可能性がある（Ａｋａｚａｗａｅｔ ａｌ．，１９９５、Ｂｅｎ−Ａｒｉｅｅｔ ａｌ．，１９９６）。あるいは、ｌａｃＺ遺伝子産物の安定性およびシグナル増幅による感受性の増加が、相対的に低発現レベルの部位を同定することを可能にした。
【０１８３】
実施例８ Ｍａｔｈ１／ｌａｃＺは内耳感覚上皮に発現する
内耳の感覚器官は、Ｍａｔｈ１／ｌａｃＺ発現の新規に同定した部位内であり、実施例２で記載した方法を用いて示した。耳胞での発現がまずＥ１２．５で検出され、ほとんどの感覚上皮のいたるところでＥ１８．５まで続いた（Ｂｅｒｍｉｎｇｈａｍｅｔ ａｌ．，１９９９）（図９Ａ、９Ｂ）。ヌル変異体は、胚発生を通して内耳でＭａｔｈ１／ｌａｃＺを提示した（図９Ｃ）。Ｍａｔｈ１ヌル変異体は、すべての感覚器官で有毛細胞を欠いているが（Ｂｅｒｍｉｎｇｈａｍｅｔ ａｌ．，１９９９）、しかし支持細胞、他の感覚上皮由来細胞を保持している（図９Ｃ）。これらの支持細胞は、その形態学およびそれらの細胞にて部分的に分泌された重なり合った膜の存在に基づいて、機能的であるように見えた。内耳感覚上皮でのＭａｔｈ１の発現が、ＲＮＡｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド形成解析にて示されなかったが、ヌル変異体での内耳有毛細胞の完全な欠失では、Ｍａｔｈ１／ｌａｃＺ発現パターンの忠実性については、なんの疑いも残していない。
【０１８４】
Ｍａｔｈ１は、内耳での有毛細胞発生に対して明らかに必須である。その発現パターンおよびｉｎｖｉｖｏでの機能は、Ｍａｔｈ１全ニューロンホモログ、ａｔｏｎａｌ（ａｔｏ）のものと類似している（Ａ．Ｐ．Ｊａｒｍａｎ，Ｙ．Ｇｒａｕ，Ｌ．Ｙ．Ｊａｎ，Ｙ．Ｎ．Ｊａｎ，Ｃｅｌｌ７３，１３０７−２１（１９９４））。ａｔｏは、ショウジョウバエの触覚ディスク内の上皮細胞の環に発現している。これらの上皮細胞のいくつかは、続いてジョンストン（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ）器官内で機械的受容体に発達し、これは聴覚および負の走化性に必要である。興味深いことに、機械的受容体始原細胞がａｔｏ変異体では存在せず、一方で、Ｍａｔｈ１ヌルマウスではその先祖ではなく機械的受容体のみが存在しないことが明らかになった。
【０１８５】
本明細書で行った観察に基づき、本発明は、Ｍａｔｈ１が内耳有毛細胞の特性化に必要であることが認識された。ある意味、Ｍａｔｈ１は、発生感覚上皮において、「プロ有毛細胞遺伝子」として働く。２つの最近の研究に関連して、本発明者らは、本明細書で提供された結果が、有毛細胞と支持細胞を決定する外側阻害モデル（Ｈａｄｄｏｎｅｔ ａｌ．，１９９８、Ａｄａｍ，ｅｔａｌ．，１９９８）を支持する証拠を提供し、そこでは、Ｄｅｌｔａ、ＮｏｔｃｈおよびＳｅｒｒａｔｅｌの相互作用が結果として、有能な細胞のクラスターからの個々の有毛細胞分泌となる。そのようなモデルは、感覚上皮が、その機能が有毛細胞運命特定化に必須である「プロ有毛細胞遺伝子」を発現していることを理論的必然として意味する。
【０１８６】
ショウジョウバエでのａｔｏおよびアフリカツメガエルでのそのホモログＸａｔｈ１の正常ではない位置での発現（Ｋｉｍｅｔ ａｌ．，１９９７）は、特定のニューロン運命へ上皮細胞を招き入れることが可能であり、内耳上皮でのＭａｔｈ１の発現は、機能的Ｍａｔｈ１遺伝子の欠失が、難聴および前庭不全の共通の原因である可能性があることを示唆している。
【０１８７】
実施例９ Ｍａｔｈ１／ｌａｃＺは脳幹核に発現している
脳幹において、Ｍａｔｈ１／ｌａｃＺ染色が、橋核に相当する領域での腹側橋で、Ｅ１８．５〜Ｐ７で見られた（図９Ｄおよび挿入図）。この発見は、Ａｋａｚａｗａとその共同研究者らの、発生菱脳中のＭａｔｈ１−陽性細胞が延髄橋ニューロンの前駆体であるという仮説と一致している（Ａｋａｚａｗａｅｔ ａｌ．，１９９５）。そのような染色は、ヌル変異体では見られない（図９Ｅおよび挿入図）。これらのデータは、橋核中のｌａｃＺ染色の欠如が、その前駆体の遊走、増殖および／または分化の失敗による可能性を高める。腹側橋核を、切片のヘマトキシリンおよびエオシン染色にて試験し、ヌルマウスの脳幹で見えなくなっていることがわかった（図９Ｆ、図９Ｇ）。さらに、ヌルマウス新生児の呼吸不全は、これらの脳幹ニューロンの欠如による可能性がありうる。
【０１８８】
実施例１０ Ｍａｔｈ１／ｌａｃＺは軟骨細胞で発現しているＭａｔｈ１+/b-Gal ヘテロ接合体は、関節軟骨中のＭａｔｈ１の発現を提示している（図６Ａおよび図６Ｂ）。図６Ａは、前肢のすべての関節での発現を示している。肘関節のより近い試験において、Ｍａｔｈ１は、非骨化関節軟骨細胞で独占的に発現していることが示された。
【０１８９】
Ｍａｔｈ１／ｌａｃＺの発現が、早ければＥ１２．５に、尻および肩のもののような発生近位関節で検出された（図１０Ａ）。Ｘ−ｇａｌ陽性染色は、続く発生ステージにて、正常の関節の発生と平行した連続的な近位−遠位パターンで検出された（図１０Ｂ）。関節において、Ｍａｔｈ１／ｌａｃＺ発現は、間葉凝縮の直後に続き、それはＥ１１．５に始まる。凝縮した間葉細胞は軟骨に分化する（Ｂｉ ｅｔ ａｌ．，１９９９、Ｈｏｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３、Ｋａｒｓｅｎｔｙ，１９９８）。
【０１９０】
軟骨細胞は、骨形成の間、３つの主要な相、すなわち、静止、増殖および肥大にて分化する。関節軟骨を構成する静止している軟骨細胞は、関節軟骨細胞として呼ばれる（Ｂｕｃｋｗａｋｌｔｅｒａｎｄ Ｍａｎｋｉｎ，１９９８、Ｐｏｏｌｅ，１９９７）。誕生より前、静止軟骨細胞は、関節において全軟骨細胞集団を構成している。どの細胞がＭａｔｈ１／ｌａｃＺを発現しているか確立するために、Ｅ１８．５〜Ｐ７のＭａｔｈ１+/b-gal マウスからの切片をＸ−ｇａｌで染色した。Ｍａｔｈ１／ｌａｃＺは、Ｅ１８．５にて解析したすべての関節の静止軟骨細胞で発現しており、肘関節中の静止軟骨細胞を図１０Ｃで示し、図１０ＤはＰ７マウスの静止している、増殖しているそして関節軟骨細胞を示している。
【０１９１】
Ｅ１８．５胚の関節を、以下の方法で調製した抗ＭＡＴＨ１抗体で試験した。Ｍａｔｈ１オープンリーディングフレームのＮ末端１５６アミノ酸をコードしているＥｃｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片（Ｍａｔｈ１Ｄ）をｐＥＴ２８ａ＋発現ベクター（ノバジェン）内にクローン化した。Ｍａｔｈ１Ｄ断片は、Ｈｉｓタグ融合タンパク質として発現した。可溶性ＭＡＴＨ１Ｄタンパク質を、Ｈｉｓタグキット説明書（ノバジェン）に従って精製し、２ｍｇのタンパク質をチキンズ（Ｃｈｉｃｋｅｎｓ）（コカリコバイオロジカルズ社）を免疫するのに使用した。
【０１９２】
発現は、静止軟骨細胞で見ることができ、一方ヌル胚では何の発現も観察されなかった。すべての関節軟骨細胞がＭａｔｈ１／ｌａｃＺを発現していないことに気づくべきである（図１０Ｅ）。Ｍａｔｈ１ヌル変異体でのＭａｔｈ１／ｌａｃＺ発現は、Ｅ１８．５でのヘテロ相同体マウスのそれと同一であり、このことはＭａｔｈ１が静止軟骨細胞発生に必要ではないことを示している。
【０１９３】
実施例１１ Ｍａｔｈ１／ｌａｃＺはメルケル細胞に発現している
Ｅ１４．５までに、Ｍａｔｈ１／ｌａｃＺ陽性細胞が、震毛周辺およびほとんどの体の皮膚で見られた（図１０Ｂ）。体幹において、染色された細胞が、表皮隆起によって規定された縦縞パターンで整列した。この染色は、無毛皮膚ではなく、毛深い皮膚でのみ見られた。側鼻、上顎および４つの大毛を含むすべての一次（神秘的な）震毛がＭａｔｈ１／ｌａｃＺに対して陽性である。染色はまた、口唇、おとがい下、鼻および単離した眼窩（上方−、下方−および後眼窩）を含む第二震毛にて検出された（Ｙａｍａｋａｄｏａｎｄ Ｙｏｈｒｏ，１９７９）。Ｅ１５．５まで、染色が、フットパットでの細胞のクラスターで見られた（図１０Ｂ）。
【０１９４】
震毛、フットパッド、および毛深皮膚でＭａｔｈ１／ｌａｃＺ陽性細胞を同定するために、本発明者等はＭａｔｈ１+/b-gal マウス由来の組織学的切片を試験した（図１１Ａ−１１Ｄ）。震毛を介した切片は、染色された細胞が、毛シャフトのよりアピカル側に局在しており、毛自体中ではないことを示した。フットパッドを介した横断切片は、上皮層での細胞のクラスターの染色を示した（図１１Ｂ、図１１Ｃ）。図１１Ｄに示したように、幹皮膚を介した切片はＭａｔｈ１／ｌａｃＺ染色細胞のクラスターを同定した。染色された細胞は、毛深い皮膚での増加したボタン様構造内に中心を置く、蹄鉄型パターンに配置された。これらのボタン様構造は、接触ドームまたはハールシェイベン（Ｐｉｎｋｕｓ，１９０５）として同定され、厚い上皮および毛細ネットワークを備えた皮膚乳頭の増加にて特徴づけられる。接触ドームは、コート中の多の毛型間に分散している大保護毛に関連している。Ｍａｔｈ１／ｌａｃＺ染色細胞の空間的分布、Ｅ１４．５でのその発生のタイミングと、毛深い皮膚での震毛の神秘的なパッドおよび接触ドーム内での局在は、これらの細胞がメルケル細胞、ゆっくりと適応する神経突起とのＩ型機械的受容体複合体を形成する上皮中の特性化された細胞（Ｍｕｎｇｅｒ，１９９１）に相当することを示唆している。
【０１９５】
ヘテロ接合体およびホモ接合体Ｅ１６．５動物でのＭａｔｈ１／ｌａｃＺ発現パターンの比較解析の結果を、図１１Ｅ〜図１１Ｌに表している。Ｍａｔｈ１b-gal/b-gal 胚は、震毛およびフットパッドでのＭａｔｈ１+/b-gal のものと同様の染色パターンを示した（図１１Ｅ〜図１１Ｇ、図１１Ｉ〜図１１Ｋ）。反対に、毛深い皮膚の接触ドーム中の染色は、Ｍａｔｈ１b-gal/b-gal 胚でわずかに検出可能であった（図１１Ｈ、Ｌ）。ヌル動物での染色の減少が、Ｅ１８．５にて観察された。
【０１９６】
皮膚でのＭａｔｈ１／ｌａｃＺ陽性細胞をさらに規定するために、Ｍａｔｈ１+/b-gal マウスをＴａｂｂｙマウスと交配した。Ｔａｂｂｙ（Ｔａ）は、ヘミ接合体オスおよびホモ接合体メスで類似の表現型を示している自発的なＸ連結変異体である（Ｆｅｒｇｕｓｏｎｅｔ ａｌ．，１９９７）。Ｔａｂｂｙ変異体は、毛穴（チロトリック）、体幹の毛深い皮膚での接触ドームに関連するメルケル細胞亜種（Ｖｉｅｌｋｉｎｄｅｔ ａｌ．，１９９５）、および頭上の５つの第２震毛の内のいくつか（Ｇｒｕｎｅｂｅｒｇ，１９７１）を欠いている。したがって、Ｔａ／Ｔａメスをヘテロ接合体Ｍａｔｈ１+/b-gal オスと掛け合わせることで、５０％のオス子孫がＴａ／Ｙ：Ｍａｔｈ１+/b-gal であり、このことはＭａｔｈ１／ｌａｃＺ陽性細胞がメルケル細胞に相当するかどうかを査定することができる。
【０１９７】
Ｔａ／ＴａメスをＭａｔｈ1+/b-galオスと定期交配させ、胚をＥ１６．５の時点で回収した。それぞれの子供の性を、染色体Ｘからの３２０ｂｐの産物および染色体Ｙからの３００ｂｐの産物を産出するプライマー（フォワード５’−ＴＧＡＡＧＣＴＴＴＴＧＧＣＴＴＴＧＡＧ−３’、配列番号６７、およびリバース５’−ＣＣＧＣＴＧＣＣＡＡＡＴＴＣＴＴＴＧＧ−３、’配列番号６８）を用いて尾ＤＮＡにおけるＰＣＲ（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，１９９９）にて決定した。増幅条件は、９４℃で７分間の初期変性工程、７２℃で７分間の最終伸張工程を持つ、９２℃／１分間、５５℃／１分間、７２℃／１分間の３２サイクルであった。増幅産物を２％アガロースゲル上で分離した。Ｘ−ｇａｌ染色胚を、独立して２つの個体によってスコア化し、次いで決定した性と結果が適合する。
【０１９８】
Ｍａｔｈ１+/b-gal 対立遺伝子を持っているＴａｂｂｙメスおよびオスは、震毛およびフットパッドでＸ−ｇｅｌ染色を示した（図１２Ａ、図１２Ｂ）。第２震毛の数におけるＴａｂｂｙ変位の影響はとても明白であり、ヘミ接合体オスは、第２震毛で、そして体幹上で（図１２Ｅ）Ｍａｔｈ１／ｌａｃＺ陽性細胞を完全に欠く（典型的にはＴａ変異体での欠失）。Ｔａｂｂｙに関してヘテロ接合体であるメスは、ランダムＸ染色体不活性化を受けている遺伝子内の変異を持つメスで予想されるべきように（ｗｔよりも少ないが）接触ドームで、一様ではない染色を示す（図１２Ｃ、図１２Ｄ）。陽性細胞の局在化および分布、ならびにＴａｂｂｙオスの選択した震毛および体幹中でのその欠乏は、Ｍａｔｈ１が、毛深い皮膚の接触ドーム内の小胞の保護に関連するメルケル細胞中に発現していることを強く示唆している。
【０１９９】
Ｍａｔｈ１／ｌａｃＺ染色パターンは、正常のＭａｔｈ１発現パターンを反映するかどうかを確かめるため、ＭＡＴＨ１の免疫組織化学的解析を腹部皮膚（実施例２参照）からの切片で実施した。図１３Ａおよび図１３Ｂで見られるように、ＭＡＴＨ１陽性細胞は、Ｍａｔｈ１b-gal/b-gal マウスではなく、Ｍａｔｈ１+/+ マウスの毛小胞の周りに検出された。２つのメルケル細胞マーカーに対する抗体を、さらなる解析のために選択した。単純上皮に発現している抗サイトケラチン１８と、神経内分泌、内分泌およびニューロン組織の分泌顆粒に局在しているクロモグラニンである。サイトケラチン１８（図１３Ｃ、図１３Ｄ）およびクロモグラニンＡ（図１３Ｅ、図１３Ｆ）両方とも、メルケル細胞と同様にＭａｔｈ１／ｌａｃＺ陽性細胞の同定を確かにするが、Ｍａｔｈ１b-gal/b-gal マウスでの染色異常を明らかにはしなかった。したがって、Ｍａｔｈ１は神経内分泌メルケル細胞の発生に必須であるようには見えず、一方で純粋なニューロン細胞様小脳ＥＧＬおよび橋核の発生には必須であるように見える。Ｍａｔｈ１ヌル変異体が生誕時に死亡するので、本発明者らは、メルケル細胞の全クラスターが形成され、またはこれらの変異体でのメルケル細胞の機能的完全性が影響を受けるかどうか査定することはできない。
【０２００】
実施例１２Ｍａｔｈ１は、ａｔｏが検出されたハエで、チャイニーズハムスター卵巣細胞を部分的に救出する本実施例は、ａｔｏｎａｌ関連遺伝子が、自然のａｔｏｎａｌ関連遺伝子または遺伝子産物を欠失している動物中のＣＮＳの発生を誘導できることを示している。本実施例はまた、ａｔｏｎａｌ関連遺伝子が、それらはもともと発現していない種において、治療的に機能できることを示している。
【０２０１】
ａｔｏとＭａｔｈ１、およびその同一の塩基領域の発現パターンの明らかな類似性を考えると、Ｍａｔｈ１を、以下の方法にて記載したように、正常ではない位置での弦音器官を産出することでのａｔｏ過剰発現の効果を模倣するかどうかを見るために試験した。ｙｗハエとしても知られる野生型を、記載したような（Ｂｒａｎｄ ａｎｄ Ｐｅｒｒｉｍｏｎ，１９９３）ＵＡＳ−Ｍａｔｈ１構築物で形質転換した。野生型ハエｙｗでＭａｔｈ１を過剰発現させるために、ＵＡＳ−Ｍａｔｈ１ハエをＨＳ−Ｇａｌ４ハエと交配した。子孫を上述のように（Ｊａｒｍａｎｅｔ ａｌ．，１９９３）ヒートショックにかけた。ａｔｏ変異体ハエ、ｗ；ＵＡＳ−Ｍａｔｈ１／ＵＡＳ−Ｍａｔｈ１中の弦音器官の欠失を回復させるために、ａｔｏｌ／ＴＭ６ハエを、ｗ；ＨＳ−Ｇａｌ４／ＣｙＯ；ａｔｏ１／ＴＭ６ハエと交配した。胚を３時間で回収し、３時間加齢させ、３０分間、３７℃でヒートショックにかけ、ついで１２〜１５時間発生させた。胚を５０％ヘプタンを含むＰＢＳ中の４％ホルムアミド中で固定した。胚を１００％エタノールで洗浄し、ＰＢＴに移し、上述したように（Ｋａｎｉａｅｔ ａｌ．，１９９５）、ｍＡｂ２２Ｃ１０で染色し、ＰＮＳニューロンを検出した。弦音器官ニューロンをその異なる形態および位置より同定した。
【０２０２】
ＵＡＳ−Ｇａｌ４系（Ｂｒａｎｄ ａｎｄ Ｐｅｒｒｉｍｏｎ，１９９３）を用いたヒートショックによるさなぎ発生の間のＭａｔｈ１の発現は、結果として、ａｔｏ（Ｊａｒｍａｎｅｔ ａｌ．，１９９３）およびＡｃｈａｅｔｅ−Ｓｃｕｔｅｃｏｍｐｌｅｘ（ＡＳ−Ｃ）遺伝子（Ｂｒａｎｄ ａｎｄ Ｐｅｒｒｉｍｏｎ，１９９３、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ ｅｔ ａｌ．，１９９０）に関して報告されたように、胸背板（図１４Ａ、図１４Ｂ）および羽根上の不必要な外部感覚器官となる。ａｔｏと同じように、ハエでのＭａｔｈ１発現は、効率はよくないが、正常ではない場所での弦音器官を産出する（図８Ｇ）。しかしながら、ＡＳ−Ｃ遺伝子の過剰発現は、結果として正常ではない場所での弦音器官とはならない（Ｊａｒｍａｎｅｔ ａｌ．，１９９３）。したがって、Ｍａｔｈ１はａｔｏと同一の機能的特異性を持っている。
【０２０３】
いくつかのａｔｏエンハンサーが、ａｔｏ依存的であるので（Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８）、これらはＭａｔｈ１によって活性化され得、次いで正常ではない場所のＣＨＯ特定化を導く。Ｍａｔｈ１が、ハエでのａｔｏ機能を置換できるかどうかを決定するため、およびＭａｔｈ１によるＣＨＯの産出がａｔｏ活性化によるものである可能性を明らかにするために、Ｍａｔｈ１をａｔｏ変異体胚に発現させた。変異体はすべての弦音ニューロンを欠いたが（図１４Ｃ）、Ｍａｔｈ１の過剰発現は、ａｔｏと同様の様式で、これらのニューロンの欠失を部分的に回復させた。
【０２０４】
実施例１３ ＣＮＳおよびＰＮＳでのａｔｏｎａｌおよびＭａｔｈ１の重要性
過去数年間にわたり、明らかな進展が、脊椎動物神経発生におけるｂＨＬＨの役割を解明することに注がれてきた。ａｔｏまたはＡＳ−Ｃ遺伝子のようなショウジョウバエホモログが、神経発生に必要であることが先に示されたので（Ａｎｄｅｒｓｏｎ，１９９５、Ｇｕｉｌｌｅｍｏｔ，１０４６１９９５、Ｌｅｅ，１９９７、Ｔａｋｅｂａｙａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，１９９７）、神経脊椎動物ｂＨＬＨコード遺伝子が単離され、特性化された。実際、いくつかの遺伝子が、それらの欠損が神経芽細胞または感覚器官前駆体（ＳＯＰ）特性化の失敗を引き起こすので、前神経性であることが示され、一方、その過剰発現が不必要な神経前駆体の増加を導く（Ｇｈｙｓｅｎａｎｄ Ｄａｍｂｌｙ−Ｃｈａｕｄｉｅｒｅ，１９８９）。ニューロゲニン（Ｎｇｎ）１および２を除いて（Ｆｏｄｅｅｔ ａｌ．，１９９８、Ｍａｅｔ ａｌ．，１９９８）、どの脊椎動物ホモログが、そのショウジョウバエ相対物と同様の役割を果たすのか、そしてどの正確な役割の異なるｂＨＬＨタンパク質が神経発生で機能するのかまだわかっていないままである。ショウジョウバエにおいて、ａｔｏは感覚器官の特定の部分集合、弦音器官の発生に必要である（Ｊａｒｍａｎｅｔ ａｌ．，１９９３）。ＣＨＯは、ＰＮＳ（ＭｃＩｖｅｒ）の内部機械的感覚器である。そこで、ａｔｏとＣＨＯは、前神経遺伝子の機能に関して、脊椎動物と脊椎動物神経発生の分子的および発生的相関だけでなく、感覚器官機能および特性化の遺伝的保存も確かにするための優れた系を提供する。７つのａｔｏホモログをマウス中でクローン化し、解析した。マウスａｔｏｎａｌホモログ（ＭＡＴＨ）１、２、３、４Ａ（Ｎｇｎ２としても知られている）、４Ｂ（Ｎｇｎ３）、４Ｃ（Ｎｇｎ１）および５である（Ａｋａｚａｗａｅｔ ａｌ．，１９９５、Ｂａｒｔｈｏｌｏｍａａｎｄ Ｎａｖｅ，１９９４、Ｂｅｎ−Ａｒｉｅｅｔ ａｌ．，１９９７、Ｔａｋｅｂａｙａｓｈｉｅｔ ａｌ．，１９９７）。ほとんどが、ＣＮＳおよびＰＮＳ両方での神経発生の間に発現した。これらのホモログは、その配列保存の程度が異なっており、３つの群に分類できる。最も遠い関連群は、ニューロゲニンであり、Ｎｇｎ１、２および３が含まれる。これらの遺伝子産物は、ｂＨＬＨ領域に置いて、ＡＴＯと平均して５３％同一性を共有する。これらは、広く有糸分裂ＣＮＳおよび感覚神経節始原細胞で発現している。最近の研究により、これらの遺伝子が、神経芽決定で役割し、したがって正確な前神経遺伝子であることが示された（Ｆｏｄｅｅｔ ａｌ．，１９９８、Ｍａｅｔ ａｌ．，１９９８）。第２の群はＭＡＴＨ２およびＭＡＴＨ３を含み、これらはＡＴＯと、ｂＨＬＨ領域に置いて、５７％同一性を共有している。これらのタンパク質は、有糸分裂後神経細胞で機能することが仮定された（Ｂａｒｔｈｏｌｏｍａａｎｄ Ｎａｖｅ，１９９４、Ｓｈｉｍｉｚｕｅｔ ａｌ．，１９９５）。Ｍａｔｈ２発現はＣＮＳに対して確認され、一方Ｍａｔｈ３はＣＮＳおよび三叉神経と背側根神経節両方で発現している。第３の群にはＭＡＴＨ１およびＭＡＴＨ５が含まれ、これらはそれぞれＡＴＯのｂＨＬＨ領域と６７％および７１％同一性を共有する。両方の遺伝子がＡＴＯのものと同一の塩���性領域をコードしていることに注目すべきである。興味深いことに、ＡＴＯの塩基性領域は、他の前神経タンパク質（ＳＣＵＴＥ）に関して、ａｔｏ機能の欠失を置換するのに十分であるように見えた（Ｃｈｉｅｎｅｔ ａｌ．，１９９６）。Ｍａｔｈ１はまず、小脳のＥＧＬの前駆体、および背側脊髄で発現していることが示された（Ｂｅｎ−Ａｒｉｅｅｔ ａｌ．，１９９７、１９９６）。Ｍａｔｈ５は、発生網膜での分割前駆体、および迷走神経節で発現している（Ｂｒｏｗｎｅｔ ａｌ．，１９９８）。神経網膜でのＭａｔｈ５発現を除いて、これらの観察は逆説を提示する。どの脊椎動物ホモログも、ａｔｏが発現している場所と類似の末梢器官または組織で発現していない。Ｊａｒｍａｎｅｔ ａｌ．（１９９３）は、ａｔｏがＣＮＳで発現していることを報告した。本明細書に記載の実施例において、眼葉の内部増殖中心に加えて、ａｔｏは、それぞれの脳葉の細胞の小さな前方内側パッチで発現している（図８Ｆ）。しかしながら、正確にａｔｏがどんな役割をショウジョウバエＣＮＳ発生で果たしているのかはっきりしていないままであるので、ａｔｏとその脊椎動物類似体が機能的保存を示しているのかを論ずることは難しい。本発明者等の実験は、前もって特性化されていないＭａｔｈ１の発現部位を明らかにしている。予想したように、本発明者等は、Ｍａｔｈ１の発現に相当する、ＣＮＳ中でのＭａｔｈ１／ｌａｃＺの発現を発見したが、しかし本発明者等はまた、Ｍａｔｈ１が、ハエでのａｔｏ発現と著しく平行して、皮膚、関節および内耳に発現することを発見した。さらに、耳（感覚上皮）および皮膚（メルケル細胞）での発現は、その機能が機械的刺激を神経電気化学的シグナルに変換することである感覚構造に限られている。ショウジョウバエにおいて、ａｔｏが同時に２つの機能を果たしているように見られることを指摘することが重要である。ＣＨＯの前駆体を選別すること（前ニューロンの役割）のみでなく、ＣＨＯ前駆体としてこれらの前駆体を特性化すること（系列同定の役割）を必要とする（Ｊａｒｍａｎａｎｄ Ａｈｍｅｄ，１９９８、Ｊａｒｍａｎｅｔ ａｌ．，１９９３）。末梢でのＭａｔｈ１発現の特異性は、それがまた、他の感覚構造より機能的にそれらを区別するために、非常に特異的な系列同一性を持つ特定の細胞を与えることができるとの推測を促進する。Ｍａｔｈ１の、正常ではない位置でのＣＨＯ形成を誘導し、ａｔｏ変異体胚に対してＣＨＯを回復させる能力は、Ｍａｔｈ１、およびとりわけその塩基性領域が、ａｔｏによってコードされているものとは異なる系列同一性形成をコードしているといる概念を支持する。このことは、少なくとも耳および皮膚でＭａｔｈ１を発現している哺乳動物細胞は機能的に類似であり、おそらく進化上ａｔｏを必要とするショウジョウバエ細胞と関連している。さらに神経網膜におけるＭａｔｈ５の発現が、ハエでのａｔｏｎａｌの機能が、マウスでの２つの遺伝子によって実施されていることを示しており、いくつかの機械的受容体がＭａｔｈ１の制御下で、網膜発生がおそらくＭａｔｈ５の制御下である。完全に配列決定された線虫、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓにおいて、ただ１つのａｔｏｎａｌの類似物、ｌｉｎ−３２が同定���れた（Ｚｈａｏａｎｄ Ｅｍｍｏｎｓ，１９９５）ことに言及することは興味深いことである。ｌｉｎ−３２のｕ２８２対立遺伝子を持つ変異体は、感覚不感受性であり、機械的受容体でのａｔｏｎａｌ機能の遺伝的保存に関する主張を強固にする。橋核でのＭａｔｈ１／ｌａｃＺ発現のパターンは、この領域がヌル変異体にて慎重に評価すべきであることを示唆している。Ｍａｔｈ１ヌルマウスの橋にはなんの欠陥も本来検出されなかったが（Ｂｅｎ−Ａｒｉｅｅｔ ａｌ．，１９９７）、より近い解析により、この部分での橋核の欠如が明らかになった。これらのニューロンは、Ｍａｔｈ１ヌルマウスでまた欠失しているＥＧＬニューロンのように、菱唇より由来する（Ａｌｔｍａｎａｎｄ Ｂａｙｅｒ，１９９６）。皮膚および耳でのＭａｔｈ１とａｔｏ発現間で類似であるけれども、それが関節の場合当てはまるかは、明らかではない。ハエ関節でのａｔｏ発現は、脚ＣＨＯの形成に必要である。反対に、Ｍａｔｈ１は、ニューロン機能が記載されておらず、ハエにおいて対応するものが存在しない制止および関節軟骨細胞で発現している。軟骨でのＭａｔｈ１発現が、機械的受容体遺伝子に関する新規の役割を示唆しているとしてよく、または様々なＭａｔｈ１発現細胞型の発生の基礎をなしている分子事象での類似性を簡単に反映している可能性がある。あるいは、ＣＨＯはまた、ハエでの関節構造要素として機能し、または関節軟骨は、記述された機械受容性または形質導入能力を有する。現時点で、これらの可能性の１つまたは他を支持する証拠は存在しない。ａｔｏおよびＭａｔｈ１の機能の解析により、神経発生および感覚機能の進化的保存に関する我々の理解が深まるであろう。Ｍａｔｈ１発現の部位および特異性は、加齢関連または環境障害による聴覚欠損および変形関節炎のような疾病に対する遺伝子治療または遺伝子活性化アプローチのツールとして好適なものとする。
【０２０５】
実施例１４ アデノウイルスを用いたａｔｏｎａｌ関連核酸送達
ヒトアデノウイルスは、およそ３６ｋｂのゲノムサイズの二本鎖ＤＮＡ腫瘍ウイルスである。真核生物遺伝子発現に対するモデル系として、アデノウイルスが広く研究されており、十分に特性化されており、遺伝子伝達系としてアデノウイルスの発達に関する魅力的な系となる。このウイルス群は、増殖および取り扱いが簡単であり、これらはｉｎｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで広い宿主範囲を示している。細胞溶解性に感染した細胞において、アデノウイルスは宿主タンパク質合成を停止させること、多量のウイルスタンパク質を合成することへ細胞機能を指向すること、および多量のウイルスのコピーを産出することが可能である。
【０２０６】
ゲノムのＥ１領域には、ウイルスゲノムの転写調節を引き受けるタンパク質をコードしているＥ１ＡおよびＥ１Ｂ、および数個の細胞遺伝子が含まれる。Ｅ２ＡおよびＥ２Ｂを含むＥ２発現はウイルスの複製機能、たとえばＤＮＡ結合タンパク質、ＤＮＡポリメラーゼ、および複製の元となる末端タンパク質の合成を可能にする。Ｅ３遺伝子産物は、細胞傷害性Ｔ細胞および腫瘍壊死因子による細胞溶解を防ぎ、ウイルス増殖に重要である。Ｅ４タンパク質に関連した機能には、ＤＮＡ複製、遅延遺伝子発現、および宿主細胞停止が包含される。遅延遺伝子産物には、ほとんどのビリオンカプシドタンパク質が含まれ、これらは、主要な遅延プロモーターからの単一初期転写物のほとんどの処理が起こった後のみに発現する。主要遅延プロモーター（ＭＬＰ）は、感染の後期の間高い効率を示す。
【０２０７】
ウイルスの小さな部分のみがｃｉｓにて必要であるので、アデノウイルス由来ベクターは、２９３細胞のような細胞株と共に使用する場合、大きなＤＮＡ断片を置換する優れた潜在能力を提供する。Ａｄ５−形質転換ヒト胎児肝臓細胞株が、ｉｎｔｒａｎｓで必要なウイルスタンパク質を提供するために開発された。したがって、本発明者等は、アデノウイルスの特徴が、ｉｎｖｉｖｏでのＭａｔｈ１欠損細胞の標的化における使用のよい候補であることを示すと結論付けた。他の実施形態において、これらの構築物にはＨａｔｈ１または任意のａｔｏｎａｌ関連核酸配列が含まれる。
【０２０８】
外来タンパク質を細胞に送達するためのアデノウイルス系の特定の利点には、（ｉ）外来ＤＮＡによって、比較的大きなＤＮＡ部分を置換する能力、（ｉｉ）組換えアデノウイルスの構造的安定性、（ｉｉｉ）ヒトへのアデノウイルス投与の安全性、（ｉｖ）アデノウイルス感染の、癌または悪性物との任意の公知の関連がないこと、（ｖ）高力価の組換えウイルスを得る能力、（ｖｉ）アデノウイルスの高感染性が含まれる。
【０２０９】
レトロウイルスに対するアデノウイルスの１つの利点は、より高いレベルでの遺伝子の発現である。さらに、アデノウイルス複製は、レトロウイルス配列とは違い、宿主遺伝子複製に依存しない。Ｅ１領域でのアデノウイルス形質転換遺伝子は簡単に削除でき、まだ十分な発現ベクターを提供でき、アデノウイルスベクターからの癌遺伝子リスクは無視できると考えられる。
【０２１０】
一般的に、アデノウイルス遺伝子送達系は、Ｅ１のようなそのゲノムの一部分を削除することで複製不能を与え、まだその感染能力は保っている、組換え体、遺伝子工学的に改変したアデノウイルスに基づく。比較的大きな外来タンパク質を、アデノウイルスゲノムでさらなる除去を行うと、発現できる。例えば、Ｅ１およびＥ３領域両方を欠失したアデノウイルスは、１０Ｋｂまでの外来ＤＮＡを運ぶことが可能であり、２９３内で高い力価まで増殖できる。驚くべきことに、アデノウイルス感染後の導入遺伝子の持続発現が可能である。アデノウイルス遺伝子送達系の使用は、関節の発生期の、または傷害を受けた軟骨での細胞へのＭａｔｈ１の送達により有用であり得る。とりわけ、Ｍａｔｈ１アデノウイルスがＭａｔｈ１を送達し、変形関節症の結果として傷害を受けた非骨化関節軟骨中でのＭａｔｈ１遺伝子発現を与えるために使用できる。
【０２１１】
実施例１５ Ｍａｔｈ１アデノウイルス構築物
Ｍａｔｈ１の制御発現のための組換え体ウイルスを、高力価、広い標的範囲、効率のよい形質導入、および有毛細胞への細胞の形質転換に関する標的細胞中への組込みのようなアデノウイルスベクターの利点を利用して構築できる。１つの実施様態において、これらの構築物には、Ｈａｔｈ１または任意のａｔｏｎａｌ関連核酸配列が含まれる。本発明の１つの実施形態において、複製不全、ヘルパー非依存性アデノウイルスを、ヒトサイトメガロウイルスプロモーターまたはメタロチロネインプロモーターの制御下で野生型Ｍａｔｈ１配列を発現するように作製した。
【０２１２】
発現ベクター上の制御機能はしばしば、発現が哺乳動物細胞で望ましい場合にウイルスより提供される。たとえば、一般的に使用されるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）に由来する。両方ともＳＶ４０ウイルス複製起源をも含む断片としてウイルスより簡単に入手できるので、ＳＶ４０ウイルスの初期および後期プロモーターがとりわけ有用である。より小さな、またはより大きなＳＶ４０断片もまた、ウイルス複製起源に局在するＨｉｎｄＩＩＩ部位からＢｇｌＩ部位まで延びているおよそ２５０ｂｐ配列を含むという条件で使用できる。さらに、そのような制御配列が宿主細胞系または標的細胞と適合可能であるという条件で、通常Ｍａｔｈ１遺伝子配列と関連するプロモーターまたは制御配列、すなわちＭａｔｈ１プロモーターと呼ばれるものを使用することも可能であり、しばしば望ましい。１つのそのような標的細胞は、内耳有毛細胞が必要であるヒト患者での内耳に局在する。
【０２１３】
複製起源は、ＳＶ４０または他のウイルス（たとえばポリオーマ、アデノ、ＶＳＶ、ＢＰＶ）源より由来可能なような、外来起源を含むようにベクターを構築することによって提供可能であり、または宿主細胞染色体複製機構によって提供可能である。ベクターが宿主細胞染色体内に挿入される場合、後者がしばしば十分である。
【０２１４】
実施例１６ レトロウイルスを用いたａｔｏｎａｌ関連核酸送達
遺伝子送達の他のアプローチは、ウイルスが細胞内に入り、その自己の遺伝的物質をそれらに運ぶ本来の能力を利用している。レトロウイルスは、その遺伝子を宿主ゲノム内に組込む、多数の外来遺伝的物質を移送する、広範囲の種および細胞型に感染する能力により、そしてこれらが特別の細胞株に簡単にパッケージされるので、遺伝子移送ベクターとして見込みがある。レトロウイルスは、Ｍａｔｈ１の発現を減少させた、またはＭａｔｈ１の過剰発現が必要である、内耳有毛細胞内へのＭａｔｈ１の送達のためにとりわけ有用である。
【０２１５】
実施例１７ Ｍａｔｈ１レトロウイルス構築物
Ｍａｔｈ１オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を、ＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ消化によりｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔから切り出した。この断片をゲル精製し、ＫｌｅｎｏｗＤＮＡポリメラーゼにより平滑末端化した。レトロウイルスベクターｐＬＮＣＸ（クローンテック（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）より購入）をＨｐａＩで直線化し、Ｍａｔｈ１ＯＲＦ断片とライゲーションした。このライゲーション物を形質転換コンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞に形質転換した。得られた抗生物質抵抗性コロニーを、正しい構築物の存在に関してアッセイした。
【０２１６】
クローニング、再産出および増殖レトロウイルス発現ベクターは、当業者によく知られている。Ｍａｔｈ１を発現するのに使用したレトロウイルス遺伝子移送および発現系の１つの例は、クローンテックｐＬＮＣＸ、ｐＬＸＳＮおよびＬＡＰＳＮ発現ベクターである。これらベクターの増幅のために、ＰＴ６７およびＥｃｏＰａｃｋパッケージング細胞株を使用できる。哺乳動物細胞培養におけるさらなる情報のために、以下の一般的な参考文献を使用できる。Ｃｕｌｔｕｒｅｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ、Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙによる編集（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，１９９３）、およびＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌによる編集（Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ ＆Ｓｏｎｓ，１９９４）。相当する部分は参照により本明細書に組み込まれる。
【０２１７】
別の態様において、これらの構築物は、Ｈａｔｈ１またはいかなるａｔｏｎａｌ関連核酸配列でも構築することができるだろう。
【０２１８】
実施例１８ パッケージング細胞株の維持
２９３およびＰＴ６７パッケージング細胞株等のパッケージング細胞株の維持を、簡単に記載する。凍結細胞のバイアルを、液体窒素から、ちょうど融解するまで３７℃の水浴に移す。細胞への浸透圧ショックを避け、細胞の生存率を最大にするためには、１ｍｌのＤＭＥＭ（ダルベッコの改変イーグル培地）をチューブに加え、混合物を１５ｍｌのチューブに移す。さらに５ｍｌのＤＭＥＭを加え、細胞を混合する。これらの工程を繰り返した後、チューブ内の最終容量は約１２ｍｌにすべきである。次いで、細胞を５００×ｇで１０分間遠心分離する。最後に、上清を除去して、次の工程で記載された維持培地に再懸濁する。一般的に、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および４ｍＭのＬ−グルタミンを含有するＤＭＥＭ（高グルコース：４．５ｇ／Ｌ）で維持される。所望ならば、または必要により、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを加えることができる。１００ｍｍプレート当たり３〜５×１０5 で播種し、７０〜８０％コンフルエンシー（コンフルエンスは１００ｍｍプレート当たり３〜４×１０6 である）に達したときに、２〜３日毎に分割することが推奨される。例えば、ＰＴ６７細胞株は、非常に短い２倍化時間（＜１６ｈ）を有し、コンフルエントになる前に分割しなければらない。Ｅｃｏ−Ｐａｃｋ２９３細胞の２倍化時間は、２４〜３６ｈである。
【０２１９】
細胞は、培地を除去し、ＰＢＳで１回細胞を洗うことにより分割する。１〜２ｍｌのトリプシン−ＥＤＴＡで０．５〜１分間処理した後、５〜１０ｍｌの培地と血清を加えてトリプシン処理を停止させる。細胞を、ピペット操作によりやさしく、しかし完全に分散させ、再懸濁させる。あるいは、前もって決定した細胞の一部を１００ｍｍプレートに１０ｍｌの培地中に入れた後、プレートを回転または震盪させ、細胞を均等に分散させる。ＰＴ６７またはＥｃｏ−Ｐａｃｋ２９３細胞については、１：２０までの比率が通常である。
【０２２０】
一般的に、レトロウイルスベクターをパッケージング可能なＰＴ６７またはＥｃｏ−Ｐａｃｋ２９３細胞のパーセントは、細胞株の連続的な継代とともに徐々に低下する。したがって、パッケージング細胞は、培養液中での２月間の生育後には再び選択しなければならない。あるいは、ウイルスの収量を増加させるためには、新しい高力価の細胞をＣＬＯＮＴＥＣＨ等から購入することができるし、継代数の低いストックを凍結させて、貯蔵し、融解することができる。
【０２２１】
実施例１９ レトロウイルスベクターを用いる方法
以下のプロトコールを用いて、ウイルス産生、標的細胞の感染および安定なクローンの選択のためのレトロウイルスベクターをトランスフェクトする。参照により本明細書に取り込まれるRetroviruses, J. M. Coffin & H. E. Varmus 編 (1996, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY)および Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubelら編 (1994, Greene Publishing Associates and Wiley & Sons)に記載されたもの等の他の方法およびベクターを本発明で用いて、Ｍａｔｈ１を発現させることもできる。
【０２２２】
要約すると、レトロウイルスベクターのＰＴ６７細胞へのトランスフェクションは、以下のように行った。上記したように、Ｍａｔｈ１をｐＬＮＸにクローニングした。パッケージング細胞を、トランスフェクションの１２〜２４時間前に１００ｍｍプレート当たり５〜７×１０5 細胞の密度で播種した。トランスフェクションの１〜２時間前に、培地を新鮮な培地と交換した。２５μＭクロロキンをトランスフェクションの直前に添加することができる。クロロキンは、トランスフェクションの効率を２〜３倍増加させる。クロロキンの２５ｍＭ貯蔵溶液を蒸留水で作製し、濾過滅菌することができる。
【０２２３】
１００ｍｍプレートのそれぞれに、所望の方法により、例えば、標準リン酸カルシウム手法（ＣａｌＰｈｏｓＭａｍｍａｌｉａｎ ＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎＫｉｔ，＃Ｋ２０５０−１）等を用いて１０〜１５μｇのプラスミドＤＮＡをトランスフェクトする。トランスフェクション混合物の最終容量は、１ｍｌを越えてはならない。トランスフェクション溶液を培地に添加して、プレートを揺動させて均一な分散を確実にする。トランスフェクションの８時間後、グリセロールショック処理を行い、ＤＮＡの取り込みを増加させることができる。トランスフェクションの１０〜２４時間後、培地を除去し、細胞をＰＢＳで２回洗浄した後、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭを５ｍｌ加えた。培養物をさらに１２〜４８時間インキュベートして、ウイルスの力価を増加させた。ウイルスの力価は、トランスフェクション後約４８時間で最大に達し、一般的に、トランスフェクション後２４ないし７２時間の間で最大値の少なくとも３０％である。
【０２２４】
あるいは、安定なウイルス産生細胞株を選択することもできる。安定なウイルス産生細胞株を得るためには、トランスフェクトしたパッケージング細胞を、トランスフェクションの２〜３日後に選択培地中に播種する。ネオマイシン耐性のＧ４１８選択については、細胞を１週間Ｇ４１８（０．５ｍｇ／ｍｌ「活性」）の存在下で選択する。Ｐｕｒｏ、ＢｌｅｏまたはＨｙｇ等の他の選択可能マーカーを保持するベクターを用いて、同様に安定なウイルス産生細胞集団を得ることができる。１ｍｌ当たり１０5 〜１０6 個の組換えウイルス粒子の力価を生じるビリオンを産生する細胞集団が普通である。一般的に、１ｍｌ当たり１０5 〜１０6 個の組換えウイルス粒子がほとんどの目的に適する。いくつかの研究について、より高い力価のクローンを要求することができる。この場合、抗生物質の選択後、増殖させる前に、クローンシリンダーまたは限界希釈等を用いて個々のクローンを選択する。
【０２２５】
ウイルスの力価は、様々な方法で決定することができる。そのような方法の１つを下記に記載する。一過性にトランスフェクトしたまたは安定なウイルス産生パッケージング細胞株により産生されたウイルス力価は、以下のように決定する。すなわち、ＮＩＨ３Ｔ３細胞を力価手法の開始１日前に播種する。細胞は、ウエル当たり５×１０4 〜１×１０5 細胞の密度で６ウエルプレートに播種し、ウエル当たり４ｍｌの培地を加える。ウイルス含有培地をパッケージング細胞から回収し、ポリブレンを４μｇ／ｍｌの最終濃度に加える。培地を、０．４５μｍのフィルターを通過させて濾過滅菌する。ポリブレンは、ウイルスと細胞膜との間の電荷の反発を低下させるポリカチオンである。前記フィルターは、酢酸セルロースまたはポリスルホン（低タンパク質結合性）でなければならず、ニトロセルロースであってはならない。ニトロセルロースは、タンパク質をレトロウイルスの膜に結合させ、その結果、ウイルスを破壊させる。以下のようにして、連続希釈物を調製する。すなわち、通常６回の連続１０倍希釈で十分である。ウイルスを希釈するためには、４μｇ／ｍｌのポリブレンを含有する新鮮な培地を用いる。次いで、ウエルに対してウイルス含有培地を加えることにより、ＮＩＨ３Ｔ３標的細胞を感染させる。４８時間後、前記ＮＩＨ３Ｔ３細胞を染色する。ウイルスの力価は、コロニーを含有する最高の希釈度に存在するコロニーの数に希釈ファクターをかけた数に相当する。例えば、１０5 希釈中の４つのコロニーの存在は、４×１０5 のウイルス力価を示す。
【０２２６】
細胞の感染に関して、以下の手法を続けた。標的細胞を、感染の１２〜１８時間前に１００ｍｍプレート当たり３〜５×１０5 の細胞密度で播種した。生物学的アッセイに用いられうる細胞の感染に関しては、対照細胞を、同一の条件下で産生する挿入物を含まないウイルスで処理することができる。通常、細胞のウイルスへの暴露の５〜６時間後に、最大感染の半値が起こり、最大の感染は、暴露の約２４時間後に起こる。レトロウイルスの実際の逆転写およびインテグレーションは、感染の２４〜３６時間内に起こり、細胞成長の動態力学に依存する。２４時間で発現を観察することができ、約４８時間で最高に達する。あるいは、感染を約１２時間間隔で連続的に行うことができる。一般に、連続感染は感染の効率を高め、ウイルスのコピー数も増加させる。ウイルスのエンベロープにより細胞のレセプターを占領させないことを確かにするためには、各感染の間隔は、最小１２時間が推奨される。
【０２２７】
実施例２０ スクリーニングアッセイ
最後に、本発明は、全細胞アッセイ、インビボ分析および形質転換もしくは不死化細胞株に基づく、候補物質のスクリーニング方法も提供する。本方法では、レポーター遺伝子を用いて、その組換え宿主に容易に検出可能な表現型を付与する。前記表現型は、Ｍａｔｈ１が発現予定、過不足発現または過剰発現される条件下でのみ現れる一般的に、レポーター遺伝子は、他の点では宿主細胞により製造されないポリペプチドをコードし、前記ポリペプチドは、発色、蛍光、放射性同位体または分光光度分析等の分析により検出可能である。本発明では、Ｍａｔｈ１遺伝子は、マウスにおいてβ−ガラクトシダーゼで置換された。
【０２２８】
本発明のスクリーニングアッセイの例をここに表す。Ｍａｔｈ１が発現している細胞をマイクロタイターウエル中で生育させた後、一連のウエルに小分子の候補物質を連続的なモル比率で加え、例えば、化合物を再懸濁または溶解するために使用されるビーイクル単独でインキュベートした対照でのカルレチニン発現を示すのに十分なインキュベーション期間後にシグナルレベルを決定する。次いで、種々の比率の候補物質を含むウエルを、シグナル活性化について評価する。次いで、レポーター遺伝子の転写または発現の用量に相関した増進を示す候補物質を、治験治療剤としてのさらなる評価のために選択する。転写の刺激を、発現したＭａｔｈ１の非存在下で観察することができる。この場合、候補化合物は、有毛細胞の分化の正の刺激剤であるかもしれない。あるいは、候補化合物は、Ｍａｔｈ１二量体の形成またはＭａｔｈ１と１以上の転写因子との相互作用を安定化するように機能すると示唆されるであろう低レベルのＭａｔｈ１の存在下でのみ、刺激を与えるかもしれない。いずれかのクラスの候補化合物は、内耳有毛細胞の産生を刺激し、そうすることにより聴覚の欠失または平衡制御の障害をもつ患者の要求に取り組む有用な治療剤であろう。
【０２２９】
実施例２１ Ｍａｔｈ１レトロウイルスベクターでの細胞のトランスフェクション
本発明は、Ｍａｔｈ１をコードするポリヌクレオチドで形質転換したまたはトランスフェクトした組換え宿主細胞、ならびに前記形質転換したまたはトランスフェクトした細胞に由来するトランスジェニック細胞を提供する。別の態様において、これらの構築物は、Ｈａｔｈ１またはいかなるａｔｏｎａｌ関連核酸配列でも構築することができるであろう。本発明の組換え宿主細胞を、機能的Ｍａｔｈ１核酸配列またはキメラＭａｔｈ１遺伝子を含むポリヌクレオチドでトランスフェクトする。ＤＮＡ分子のような外来性ポリヌクレオチドで細胞を形質転換またはトランスフェクトする方法は、当該技術分野で公知であり、リン酸カルシウムもしくはＤＥＡＥ−デキストラン介在トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソーム介在トランスフェクション、直接マイクロインジェクションおよびアデノウイルス感染のような技術を含む。
【０２３０】
組換え構築物を用いるＭａｔｈ１発現は、その必要のある細胞へのＭａｔｈ１の送達を標的化するために使用することができる。当業者であれば、異なるプロモーター−ベクターの組合せを選択して、異なる細胞型でのＭａｔｈ１発現を操作することができる。いくつかの場合において、所望の結果がタンパク質ではなくＲＮＡでありうるし、組換えベクターは順方向または逆方向のいずれかで存在する挿入物を有するものを含むであろう。また、例えば、レトロウイルスまたは人工的な組換え系等のいくつかのベクターを設計して、タンパク質もしくはＲＮＡの構成的または誘導的発現を達成するために、細胞のゲノムまたはウイルスゲノム内に配列を取り込むことができる。
【０２３１】
多くのベクターおよび宿主は、市販品が利用可能であり、発現またはそれに続く精製を容易にする特異的な特徴を有する。例えば、タンパク質として発現されるＤＮＡは、ポリヒスチジンタグ、もしくはＨＡ、ＦＬＡＧ、ｍｙｃ、免疫化学的精製および検出のためのその他のエピトープタグ、もしくはリン酸化部位、もしくはプロテアーゼ認識部位、もしくはグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）（New England Biolabs ）等の精製を容易にする追加のタンパク質ドメインをコードする無関係の配列との融合物として存在することが多い。イントロンとエキソンを含む天然に存在するゲノムＤＮＡ配列の取り込みがなされてプロセッシングできるように、または無関係なイントロンその他の調節シグナルが成熟した翻訳可能なＲＮＡの生成に先立ってＲＮＡのプロセッシングを要求するように、ポリアデニル化、スプライシングおよび終止に関するエレメントを含むベクターを設計することも可能である。前記した系で製造されたタンパク質は、グリコシル化、リン酸化、非特異的もしくは特異的プロテオリシスまたはプロセッシング等の種々の翻訳後修飾に供される。
【０２３２】
実施例２２ アミノ酸配列としてのＭａｔｈ１の送達
ＨＩＶ由来のペプチド（１１アミノ酸）は、全長のタンパク質と融合してマウスに注射した場合に身体のすべての細胞の核に迅速に分散が可能になるということが最近報告された（Schwarzeら、１９９９）。Schwarzeらは、１５〜１２０ｋＤａのサイズにまたがるＴａｔとの融合タンパク質を作製した。彼らは、動物全体の細胞の核への融合タンパク質の迅速な取り込みを詳細に証明し、前記タンパク質の機能的活性は保持された。
【０２３３】
本発明の１つの態様において、Ｍａｔｈ１核酸配列と操作可能に連結しているＴａｔまたはＴａｔ−ＨＡ核酸配列を含む構築物が存在する。別の態様において、これらの構築物は、Ｈａｔｈ１またはいかなるａｔｏｎａｌ関連核酸配列をも含む。ベクターを細菌培養物で発現させ、融合タンパク質を精製する。この精製されたＴａｔ−Ｍａｔｈ１タンパク質またはＴａｔ−Ｈａｔｈ１タンパク質を動物に注射して、内耳、皮膚、小脳、脳幹、脊椎および関節へのＴａｔ送達系の効率を決定する。分析を行って、有毛細胞および神経再生におけるＴａｔ−Ｍａｔｈ１／Ｔａｔ−Ｈａｔｈ１タンパク質の能力を決定する。これは、それ自身の権利または他の方法もしくは遺伝子との関連のいずれかにおいて、実現性のある治療アプローチである。
【０２３４】
Ｍａｔｈ１転写にはどんな上流のエフェクターが必要であるかを知ることが実用的であるので、本明細書に開示されたＭａｔｈ１発現に影響を及ぼす化合物のスクリーニング方法は有用であるにもかかわらず、有効な候補物質を見出せないことを理解すべきである。
【０２３５】
参考文献 すべての特許および刊行物は、それぞれ個々の刊行物が具体的かつ個別的に参照により取り込まれたことを示した場合と同じ程度まで、本明細書において参照により取り込まれる。
【０２３６】
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【０２３７】
当業者であれば、本発明の目的を実行し、本明細書に記載された結果と有利性、ならびに本明細書に内在するものを得るために、本発明が十分適応されることを容易に認識する。本明細書に記載された配列、突然変異、複合体、方法、治療、医薬組成物、手段および技術は、好ましい態様の代表例を表し、例示を意図するものであり、本配列の範疇を制限するものとして意図されたものではない。そこでの変更およびその他の使用は、当業者に見出されるものであり、本発明の精神内に包含されるかまたは係属中の請求の範囲により規定されるものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年5月15日(2014.5.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸配列ＡＡＮＡＲＥＲＲＲＭＨＧＬＮＨＡＦＤＱＬＲに少なくとも８０％相同な配列を有するAtonal関連ポリペプチドまたは該ポリペプチドをコードする核酸分子を含有する組成物であって、内耳の機械的受容細胞増殖を促進するための組成物。
【請求項２】
アミノ酸配列ＡＡＮＡＲＥＲＲＲＭＨＧＬＮＨＡＦＤＱＬＲに少なくとも８０％相同な配列を有するAtonal関連ポリペプチドまたは該ポリペプチドをコードする核酸分子を含有する組成物であって、内耳の有毛細胞の生成のための組成物。
【請求項３】
アミノ酸配列ＡＡＮＡＲＥＲＲＲＭＨＧＬＮＨＡＦＤＱＬＲに少なくとも８０％相同な配列を有するAtonal関連ポリペプチドまたは該ポリペプチドをコードする核酸分子を含有する組成物であって、聴覚障害治療の為の組成物。
【請求項４】
請求項２または３のいずれかに記載の組成物であって、内耳注入用に調製されている、組成物。
【請求項５】
アミノ酸配列ＡＡＮＡＲＥＲＲＲＭＨＧＬＮＨＡＦＤＱＬＲに少なくとも８０％相同な配列を有するAtonal関連ポリペプチドまたは該ポリペプチドをコードする核酸分子を含有する組成物であって、平衡失調の治療のための組成物。
【請求項６】
アミノ酸配列ＡＡＮＡＲＥＲＲＲＭＨＧＬＮＨＡＦＤＱＬＲに少なくとも８０％相同な配列を有するAtonal関連ポリペプチドまたは該ポリペプチドをコードする核酸分子を含有する組成物であって、関節疾患の治療のための組成物。
【請求項７】
前記関節疾患が、変形性関節症である、請求項６記載の組成物。
【請求項８】
送達ビーヒクルによって投与される為に調製される請求項１〜７のいずれか１項記載の組成物。
【請求項９】
前記送達ビーヒクルが、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノ随伴ベクター、プラスミド、リポソーム、核酸、ペプチド、脂質、炭水化物、およびそれらの組合せからなる群より選ばれる、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記送達ビーイクルが、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターである、請求項８記載の組成物。
【請求項１１】
前記送達ビーイクルが細胞である、請求項８記載の組成物。
【請求項１２】
前記送達ビーヒクルが、細菌毒素の受容体結合ドメインである、請求項８記載の組成物。
【請求項１３】
前記送達ビーヒクルが、タンパク質形質導入ドメインである、請求項８記載の組成物。
【請求項１４】
前記アミノ酸配列が、Math1またはHath1である、請求項１〜１３のいずれか１項記載の組成物。
【請求項１５】
ヒトの治療用である、請求項１〜１４のいずれか１項記載の組成物。
【請求項１６】
他の治療上の遺伝子産物をコードする第二の核酸分子の投与後、前または同時に投与する為の、請求項１〜１５のいずれか１項記載の組成物。
【請求項１７】
前記アミノ酸配列をコードする核酸配列が細菌毒素のレセプター結合ドメインをコードする核酸配列に操作可能に連結している、請求項８記載の組成物。
【請求項１８】
前記アミノ酸配列をコードする核酸配列がタンパク質形質導入ドメインをコードする核酸配列に操作可能に連結している、請求項８記載の組成物。
【請求項１９】
アミノ酸配列ＡＡＮＡＲＥＲＲＲＭＨＧＬＮＨＡＦＤＱＬＲに少なくとも８０％相同な配列を有するAtonal関連ポリペプチドと所望のタンパク質を有する融合タンパク質。
【請求項２０】
請求項１９記載の融合タンパク質をコードする核酸分子。