(57)【要約】【課題】バクテリアセルロース、特に中空球状のバクテリアセルロースの新規な製造方法を提供する。【解決手段】疎水性媒体中でセルロース産生菌を培養することを特徴とする、バクテリアセルロースの製造方法。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
疎水性媒体中でセルロース産生菌を培養することを特徴とする、バクテリアセルロースの製造方法。
【請求項２】
前記バクテリアセルロースが中空球状である、請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
疎水性媒体として、シリコーンオイルを使用する、請求項１又は２記載の製造方法。
【請求項４】
中空球状のバクテリアセルロース。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バクテリアセルロースの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物がセルロースを生産するという事実は、１００年以上前にＡ．Ｊ．Ｂｒｏｗｎによって報告されている。このような、微生物が生産するセルロースは、一般にバクテリアセルロースやバイオセルロースと呼ばれている（以下、「バクテリアセルロース」あるいは「ＢＣ」と称する場合がある）。
【０００３】
バクテリアセルロースは、植物由来のセルロースには見られない優れた性質を持つことで知られている。たとえば、植物セルロースがリグニンやヘミセルロースなどを含むのに対して、バクテリアセルロースは純粋なセルロースのみであること、バクテリアセルロースの繊維幅が植物セルロースに比べ、１００分の１から１０００分の１と言われるほど細いこと、水素結合の強さや面配向性に起因した高いヤング率を有すること、液晶を形成することなど、物質としての高付加価値的特性が存在する。
【０００４】
このようなバクテリアセルロースの特性を活用し、従来から様々な利用研究が進められている。たとえば、燃料電池電解質膜への利用（非特許文献１）、ガン診断用計測デバイスやＵＶ対策化粧品（非特許文献２）など、工業、医療分野へ向けた開発である。
【０００５】
バクテリアセルロースが実際に商品化された事例としては、スピーカ等の音響振動板に利用されたケースがある（特許第２９５３７４３号）。また、バクテリアセルロースの生産量を向上させる培地の開発も従来から進められており、多くの技術的提案がなされている（特許第２７６６１６５号、特許第２８１６９３９号、特許第３８０９５５１号、特開平５−１７１８、特開平７−１８４６７５、特開平７−１８４６７７、特開平８−３４８０２、特開平９−２９６００３、特開平１０−１４６１９８、特開平１１−１８１００１、特開２０００−４８９５、特開２００５−８０５７１等）。
【０００６】
しかしながら、先に述べたような利用研究の実用化を促進するためには、バクテリアセルロースの低コスト生産を可能にすることに加えて、種々の形状のバクテリアセルロースを得ることが必要である。この課題を解決する技術として、チューブ状のバクテリアセルロースを作製する方法（非特許文献３）及び球状のバクテリアセルロースを作製する方法（非特許文献４）がすでに報告されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】セルロース学会第１３回年次大会講演要旨集、ｐ７３、２００６
【非特許文献２】化学と生物、４５、ｐ６００−６０１、２００７
【非特許文献３】Ａｎａｎｄａ  Ｐｕｔｒａ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｏｌｙｍｅｒ，  ２００８，４９，１８８５−１８９１
【非特許文献４】Ｙａｎｇ  Ｈｕ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，  ２０１０，１１，１７２７−１７３４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明が解決しようとする課題は、簡便かつ効率的にバクテリアセルロースを製造できる新規な製造方法を提供することを課題とする。また、本発明は、従来技術では製造ができなかった形状、例えば、中空球状やシート状のバクテリアセルロースの製造を可能にする方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記の課題を解決するために、本発明者が鋭意検討した結果、疎水性媒体中でセルロース産生菌を培養することが可能であり、それにより中空球状のバクテリアセルロースが得られるという新規な知見を得ることにより、本発明を完成させた。
【００１０】
すなわち、本発明は、疎水性媒体中でセルロース産生菌を培養することを特徴とする、バクテリアセルロースの製造方法に関する。
【００１１】
また、本発明は、前記バクテリアセルロースが中空球状又はシート状である、前記製造方法に関する。
【００１２】
また、本発明は、疎水性媒体として、シリコーンオイルを使用する、前記製造方法に関する。
【００１３】
さらに、本発明は中空球状のバクテリアセルロースに関する。なお、本明細書において、「球状」とは、丸みを帯びた形状のことを言い、真球状等の形状に限られるものではない。
【発明の効果】
【００１４】
本発明に係るバクテリアセルロースの製造方法によれば、簡便且つ効率的にバクテリアセルロースの製造が可能であるとともに、従来技術では不可能であった形状、例えば中空球状やシート状のバクテリアセルロースの製造も可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、乾燥後のエアロゲルの赤外吸収スペクトル（ＩＲ）を示す。
【図２】図２は、サラダオイルを使用した場合と、シリコーンオイルを使用した場合の、培養日数対セルロース生成量の違いを示す。
【図３】図３は、実施例４の培養時の写真及び得られたエアロゲルの写真を示す。
【図４】図４は、乾燥後のバクテリアセルロースのＳＥＭ像を示す。
【図５】図５は、実施例５で得られた中空球状バクテリアセルロースゲルの写真を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明を、実施形態に即して詳細に説明する。
【００１７】
本発明に係るバクテリアセルロースの製造方法は、疎水性媒体中でセルロース産生菌を培養することを特徴とする。疎水性媒体中で、セルロースゲルの製造が可能である原因は定かではないが、おそらく疎水性媒体中の溶存酸素により、培養液と疎水性媒体との界面でセルロースの産生が進行したものと考えられる。
【００１８】
疎水性媒体としては、特に制限されるものではなく、たとえば、飽和脂肪酸又は不飽和脂肪酸等の脂肪酸、脂肪族炭化水素類、環状炭化水素類、芳香族炭化水素類、複素環式化合物類、シリコーンオイルなどがあげられる。
【００１９】
飽和脂肪酸としては、ブタン酸、ペンタン酸、ヘキサン酸、ヘプタン酸、オクタン酸、ノナン酸、デカン酸、ドデカン酸、テトラデカン酸、ペンタデカン酸、ヘプタデカン酸、トクタデカン酸等の、炭素数４〜３０の直鎖又は分岐の飽和脂肪酸があげられる。不飽和脂肪酸としては、ヘキサデカン酸、オクタデカン酸、イコサン酸等の、炭素数４〜３０の直鎖又は分岐の不飽和脂肪酸があげられる。脂肪族炭化水素としては、ヘキサン、ヘプタン、デカン等の、炭素数４〜３０の脂肪族炭化水素があげられる。環状炭化水素としては、シクロヘキサン、シクロヘプタン等の、炭素数６〜３０の環状炭化水素があげられる。芳香族炭化水素としては、ベンゼン、トルエン、キシレン、ナフタレン等があげられる。複素環式化合物としては、イミダゾール、ピリジンなどがあげられる。シリコーンオイルとしては、ジメチルシリコーンオイル、環状シリコーンオイル、メチルフェニルシリコーンオイル、メチルハイドロジェンシリコーンオイル、高級脂肪酸エステル変性シリコーンオイル、アルキル・アラルキル変性シリコーンオイル、アルキル変性シリコーンオイル、アミノ変性シリコーンオイル、エポキシ変性シリコーンオイル、アルキル・ポリエーテル変性シリコーンオイル、ポリエーテル変性シリコーンオイル、カルビノール変性シリコーンオイルなどがあげられる。これらのうち、バクテリアセルロースの培養のために必要な酸素透過性を有する観点から、シリコーンオイルを使用することが好ましい。なお、疎水性媒体は一種を単独で使用しても、二種以上を組み合わせて使用しても良い。
【００２０】
中空状のバクテリアセルロースを製造するためには、疎水性媒体の比重が培養液の比重とほぼ同等、好ましくは±１０％、さらに好ましくは±５％の範囲であることが好ましい。疎水性媒体の比重と培養液の比重がほぼ同等であることにより、培養液が疎水性媒体中に浮遊し、整った中空状のバクテリアセルロースゲルの製造が可能となる。
【００２１】
バクテリアセルロース産生菌としては、特に制限はないが、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ属、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ属、Ｓａｒｃｉｎａ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ属、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ属、Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ属、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ属、Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ属などがある。これらのうち、入手および取り扱いのしやすさから、アセトバクター・キシリナム（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｉｎｕｍ）、アセトバクター・パスツリアヌス（Ａ．  ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ）、グルコナセトバクター・キシリナス（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｉｎｕｓ）等の酢酸菌が最も好ましい。
【００２２】
疎水性媒体中でセルロース産生菌を培養する具体的な方法としては、たとえば、疎水性媒体中に、セルロース産生菌及び適切な栄養素を含んだ培養液を滴下し、適当な温度で静置培養、振盪培養または通気攪拌培養することがあげられる。
【００２３】
培養液には、適切な栄養素が含まれていることが必要であり、場合により、浸透圧及び／又は水素イオン濃度を培養に適する範囲に調節することも必要である。たとえば、酢酸菌であれば、培養液には、炭素源として、グルコース（ぶどう糖）、シュクロース（砂糖）、マルトース、フラクトース、マンノース、マンニトール、ソルビトール、エリスリトール、転化糖、セロビオース、パルプスラッジ加水分解物、各種モラセス（廃糖蜜）、又はその他グリセリンを含む。特に、グルコースを含むことが好ましい。ただし、炭素源は、グルコースのみからなる必要はなく、５０％以下の他の糖類、例えば果糖、砂糖、マンノース等との混合物であってもよい。上記した炭素源を含有する澱粉水解物、シトラスモラセス、ビートモラセス、ビート搾汁、サトウキビ搾汁、果汁等をグルコースに添加して使用することもできる。
【００２４】
本発明で上記炭素源以外に必要とされる培地に添加されるものとしては、ｐＨ調整剤、消泡剤、コーンスティプリカー、アミノ酸等の各種窒素源とＮａ，Ｋ、Ｃａ、Ｆｅ、Ｚｎ、Ｍｎ，Ｃｕ、Ｍｇ等の金属イオン源、あるいは各種ビタミン類を通常微生物生産培地に配合する程度配合することができる。
【００２５】
具体的には、金属イオンを含む化合物としてはＦｅＳＯ4、ＣａＣｌ2、Ｎａ2ＭｏＯ4、ＺｎＳＯ4、ＭｎＳＯ4、ＣｕＳＯ4、ＭｇＳＯ4等の水和塩等を挙げることができる。
【００２６】
ビタミン類としては、イノシトール、ニコチン酸、ピリドキシ塩酸塩、チアミン塩酸塩、パントテン酸カルシウム、リボフラビン、ｐ−アミノ安息香酸、葉酸、ビオチン等を挙げることができる。
【００２７】
また、バクテリアセルロースを産生する培養時にエタノールを添加することがバクテリアセルロースの産生量が向上するため好ましい。このエタノールの添加は一度に添加してもよく、逐次的に添加してもよい。エタノールの添加量は、１．０ｇ／Ｌ〜６．０ｇ／Ｌの範囲が好ましい。
【００２８】
培養液のｐＨは、酢酸菌が生育できバクテリアセルロースが産生する限り特に限定されないが、一般的にはｐＨ３〜７の範囲内で培養することができる。好ましくはｐＨは４〜６であり、例えば、５付近のｐＨに設定することができる。ｐＨ調整は任意のアルカリ及び酸を用いて行うことができ、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム又は炭酸ナトリウム等のアルカリ、並びに酢酸、クエン酸、塩酸、硫酸又は硝酸等の酸を使用することができる。
【００２９】
本発明の酢酸菌を用いてバクテリアセルロースを産生する際の培養温度は通常１０〜５０℃の範囲内であり、好ましくは１０〜４０℃、より好ましくは２０〜４０℃、さらに好ましくは２５〜３５℃である。
【００３０】
培養方法としては、任意の微生物培養方法を使用することができ、静置培養、振盪培養または通気攪拌培養などを使用することができる。培養操作法としては、回分発酵法、流加回分発酵法、反復回分発酵法及び連続発酵法等を用いることができる。攪拌手段としては、例えばインペラー（攪拌羽根）、エアーリフト発酵槽、発酵ブロスのポンプ駆動循環などを単独または組合せて使用することができる。培養液滴同士の接触融合を回避するために、穴プレート、例えば９６穴プレートなどを使用し培養液滴同士を離れた状態で独立維持することができる。また、静置培養、プレートシェーカーによる振盪培養なども使用することができる。
【００３１】
培養を行う装置としては、通常の微生物を用いて食品を製造するために用いられる各種の装置を用いることができる。例えば、槽内を一定の温度に保温しうる撹拌機付ジャーファーメンターを用いることができる。培養期間は通常、１〜２５日間、好ましくは２〜１８日間である。このような培養によりバクテリアセルロースが乾燥重量で０．００１ｇ／Ｌ〜１０．０ｇ／Ｌ程度産生される。
【００３２】
培養の際には、必要に応じて、界面活性剤を使用することもできる。界面活性剤を使用することにより、疎水性媒体中の培養液滴が細かくなるので、より微細なバクテリアセルロースを製造することができる。
【００３３】
本発明の方法によって製造されるバクテリアセルロースはそのまま回収してもよいし、あるいは回収物中に含まれるセルロース性物質以外の不純物を除去する処理を行ってもよい。不純物を除去するためには、水洗、加圧脱水、希酸洗浄、アルカリ洗浄、次亜塩素酸ソーダ及び過酸化水素などの漂白剤による処理、リゾチームなどの菌体溶解酵素による処理、ラウリル硫酸ソーダ、デオキシコール酸などの界面活性剤による処理、または加熱洗浄を単独または組み合わせて行うことにより、セルロース性物質から不純物を除去することができる。また、超臨界二酸化炭素等の超臨界流体を用いて、バクテリアセルロースを乾燥させることもできる。具体的には、バクテリアセルロースの分散媒である水を、非水媒体、例えばエタノールで置換したバクテリアセルロースエタノールゲルを、例えば６０℃、２０ＭＰａの状態で、超臨界二酸化炭素を、例えば２．０ｍＬ／ｍｉｎの流速で流通しながら非水媒体を除去することでエアロゲル化することがあげられる。（非特許文献  星徹、前田英朗、溝渕耕輔、鉄川明日香、澤口孝志、矢野彰一郎、高分子論文集、２０１０、６７（５）、３１８−３２５）
【００３４】
上記のようにして得られたバクテリアセルロースは、作製条件にもよるが、中空状のものであれば、外径が通常１００μｍ〜１０ｍｍ、典型的には５００μｍ〜５ｍｍの範囲である。また、中空球状のものについては、内部に薬剤などを充填することも可能であるから、医薬品や食品用の素材として用いることができる。また、疎水性媒体と培養液界面でセルロースが生成することから、例えば、シート状のバクテリアセルロースを製造することも可能である。シート状のバクテリアセルロースは、例えば分離膜、細胞培養シート、組織癒着防止シートなどとして利用することができる。
【実施例】
【００３５】
以下、本発明を実施例に則してより詳細に説明する。
［実施例１］：植物性油（サラダオイル）を使用したシート状バクテリアセルロースの製造
試験管中に、酢酸菌（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｉｎｕｓ）、エタノール、母液（Ｄ−グルコース、ポリペプトン、硫酸マグネシウム７水和物、酵母エキス、マンニトールを含む）およびビタミン剤（ネオM.V.I-9）の母液混合液（比重１．０２）の２０ｍｌを充填した。続いて、サラダオイルを添加することにより、母液混合液の上にサラダオイル相を形成した。その後、試験管を３〜１４日間静置した。
【００３６】
培養後、サラダオイルと培養液との界面に生成した固体相を取り出し、純水により洗浄、１．０ｗｔ％水酸化ナトリウム水溶液により殺菌、及び０．５ｗｔ％次亜塩素酸ナトリウム水溶液により漂白した。続いて、超臨界二酸化炭素中で乾燥させることにより、エアロゲルを得た。
［実施例２］：シリコーンオイルを使用したシート状バクテリアセルロースの製造
サラダオイルの代わりに、シリコーンオイル（信越シリコーン社製、ＫＦ−９６、比重０．９６）を用いたこと以外は実施例１と同様にして、エアロゲルを得た。
【００３７】
実施例１の乾燥後のエアロゲルの赤外吸収スペクトル（ＩＲ）図１に示した。図１より、培養液及び疎水性媒体の界面において生成した固体相が、バクテリアセルロースであることがわかる。
【００３８】
また、サラダオイルを使用した場合と、シリコーンオイルを使用した場合の、培養日数対セルロース生成量の違いを図２にまとめた。図２より、シリコーンオイル中において、より多くのバクテリアセルロースが生成したことがわかる。
【００３９】
［実施例３］：植物性油（サラダオイル）を使用した中空球状バクテリアセルロースの製造
テフロンシャーレ中のサラダオイル（日清オイリオグループ社製、日清キャノーラ油、比重０．９１）に、酢酸菌（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｉｎｕｓ）、エタノール、母液（Ｄ−グルコース、ポリペプトン、硫酸マグネシウム７水和物、酵母エキス、マンニトールを含む）およびビタミン剤（ネオM.V.I-9）の母液混合液（比重１．０２）を、マイクロピペットを使用して滴下することにより、１０μｌ〜９０μｌの母液混合液の液滴をサラダオイル中に形成した。その後、テフロンシャーレを３０℃にて７日間静置した。
【００４０】
培養後、生成したバクテリアセルロースを取り出し、純水により洗浄、１．０ｗｔ％水酸化ナトリウム水溶液により殺菌、及び０．５ｗｔ％次亜塩素酸ナトリウム水溶液により漂白した。続いて、超臨界二酸化炭素中で乾燥させることにより、バクテリアセルロースエアロゲルを得た。
【００４１】
［実施例４］：シリコーンオイルを使用した中空球状バクテリアセルロースの製造
サラダオイルの代わりに、シリコーンオイル（信越シリコーン社製、ＫＦ−５４、比重１．０７および信越シリコーン社製、ＫＦ−５６Ａ、比重０．９９５の混合物）を用いたこと以外は実施例３と同様にして、バクテリアセルロースエアロゲルを得た。
【００４２】
図３に、実施例４の培養時の写真及び得られたエアロゲルの写真を示した。また、乾燥後のバクテリアセルロースのＳＥＭ像を図４に示した。
【００４３】
［実施例５］：シリコーンオイルを使用した中空球状バクテリアセルロースの製造
テフロンシャーレ中のシリコーンオイル（信越シリコーン社製、ＫＦ−５４、比重１．０７および信越シリコーン社製、ＫＦ−５６Ａ、比重０．９９５の混合物）に、酢酸菌（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｉｎｕｓ）、エタノール、母液（Ｄ−グルコース、ポリペプトン、硫酸マグネシウム７水和物、酵母エキス、マンニトールを含む）およびビタミン剤（ネオM.V.I-9）の母液混合液（比重１．０２）を、マイクロピペットを使用して滴下することにより、５０μｌの母液混合液の液滴、及び２０μｌの母液混合液の液滴を、それぞれ、シリコーンオイル中に形成した。その後、テフロンシャーレを３０℃にて７日間静置した。
【００４４】
培養後、生成したバクテリアセルロースを取り出し、純水により洗浄、１．０ｗｔ％水酸化ナトリウム水溶液により殺菌、及び０．５ｗｔ％次亜塩素酸ナトリウム水溶液により漂白した。図５に、５０μｌの母液混合液の液滴で得られた、漂白後の中空球状バクテリアセルロースゲルの写真と、２０μｌの母液混合液の液滴で得られた、漂白後の中空球状バクテリアセルロースゲルの写真を、それぞれ、示した。
【００４５】
図５に示すように、５０μｌの母液混合液の液滴から、直径４ｍｍの中空球状バクテリアセルロースが得られ、２０μｌの母液混合液の液滴から、直径２〜３ｍｍの中空球状バクテリアセルロースが得られた。
【産業上の利用可能性】
【００４６】
本発明に係るバクテリアセルロースの製造方法によれば、簡便且つ効率的にバクテリアセルロースの製造が可能であるとともに、従来技術では不可能であった形状、例えば中空球状やシート状のバクテリアセルロースの製造も可能になり、医薬品分野及び食料品分や等の種々の分野での利用が期待される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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