(57)【要約】    【課題】  長期に亙って安全且つ簡便に投与し得る血管新生阻害剤及び血管新生阻害用飲食組成物の提供。    【解決手段】  アガリクス・ブラゼイ・ムリル（ヒメマツタケ）子実体から水溶性多糖類を抽出除去した残渣から、5w%水酸化ナトリウム水溶液を用いて抽出することにより得られる、グルカン：タンパク＝55:43[w/w]の(1→6)-β-D-グルカンの蛋白多糖体を有効成分とする血管新生阻害剤、および、その(1→6)-β-D-グルカンの蛋白多糖体を含有する血管新生阻害用飲食組成物。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
(1→6)-β-D-グルカン含有物を有効成分とする血管新生阻害剤。
【請求項２】
(1→6)-β-D-グルカン含有物が、(1→6)-β-D-グルカン蛋白多糖体である請求項１記載の血管新生阻害剤。
【請求項３】
(1→6)-β-D-グルカン含有物が、下記理化学的性質(a)乃至(i)を有する蛋白多糖体である請求項１又は２記載の血管新生阻害剤。
(a)元素分析：
C 41.87%
H 7.15%
N 6.88%
糖含量 50.2%
蛋白質含量 43.3%
(b)分子量：１乃至５万
(c)比旋光度：
【化１】
2014001188.tif 000005
(c=1.0 , 5% NaOH)
(d)赤外線吸収スペクトル：第１図に示す。
(e)核磁気共鳴スペクトル：第２図に示す。
(f)溶解性：アルカリに可溶、水及びDMSO(ジメチルスルフォキシド)にそれぞれやや溶解、有機溶媒に不溶
(g)呈色皮応：フェノール硫酸およびニンヒドリン反応に陽性
(h)色：灰白色
(i)アミノ酸組成（モル％）：
Asp 10.7
Thr 5.2
Ser 5.3
Glu 11.1
Gly 9.3
Ala 11.9
Val 4.9
Met 1.1
Ile 3.3
Leu 10.8
Tyr 2.4
Phe 4.5
Lys 5.3
His 2.1
Arg 5.2
Pro 6.9
合計 100%
【請求項４】
(1→6)-β-D-グルカン含有物が、アガリクス・ブラゼイ・ムリル子実体由来である請求項１、２又は３記載の血管新生阻害剤。
【請求項５】
(1→6)-β-D-グルカン含有物が、アガリクス・ブラゼイ・ムリル子実体から水溶性多糖類を抽出除去した残渣から、5w%水酸化ナトリウム水溶液を用いて30℃で抽出することにより得られる、グルカン：タンパク＝55:43[w/w]の(1→6)-β-D-グルカンの蛋白多糖体である請求項４記載の血管新生阻害剤。
【請求項６】
経口投与剤である請求項１乃至５の何れか１項に記載の血管新生阻害剤。
【請求項７】
血管内皮細胞増殖因子(VEGF)誘導による血管新生を阻害する請求項１乃至６の何れか１項に記載の血管新生阻害剤。
【請求項８】
血管内皮細胞増殖因子(VEGF)の分泌減少により血管新生を阻害する請求項１乃至６の何れか１項に記載の血管新生阻害剤。
【請求項９】
(1→6)-β-D-グルカン含有物を含有してなる血管新生阻害用飲食組成物。
【請求項１０】
(1→6)-β-D-グルカン含有物が、(1→6)-β-D-グルカン蛋白多糖体である請求項９記載の血管新生阻害用飲食組成物。
【請求項１１】
(1→6)-β-D-グルカン含有物が、下記理化学的性質(a)乃至(i)を有する蛋白多糖体である請求項９又は１０記載の血管新生阻害用飲食組成物。
(a)元素分析：
C 41.87%
H 7.15%
N 6.88%
糖含量 50.2%
蛋白質含量 43.3%
(b)分子量：１乃至５万
(c)比旋光度：
【化２】
2014001188.tif 000006
(c=1.0 , 5% NaOH)
(d)赤外線吸収スペクトル：第１図に示す。
(e)核磁気共鳴スペクトル：第２図に示す。
(f)溶解性：アルカリに可溶、水及びDMSO(ジメチルスルフォキシド)にそれぞれやや溶解、有機溶媒に不溶
(g)呈色皮応：フェノール硫酸およびニンヒドリン反応に陽性
(h)色：灰白色
(i)アミノ酸組成（モル％）：
Asp 10.7
Thr 5.2
Ser 5.3
Glu 11.1
Gly 9.3
Ala 11.9
Val 4.9
Met 1.1
Ile 3.3
Leu 10.8
Tyr 2.4
Phe 4.5
Lys 5.3
His 2.1
Arg 5.2
Pro 6.9
合計 100%
【請求項１２】
上記(1→6)-β-D-グルカン含有物が、アガリクス・ブラゼイ・ムリル子実体由来である請求項９、１０又は１１記載の血管新生阻害用飲食組成物。
【請求項１３】
(1→6)-β-D-グルカン含有物が、アガリクス・ブラゼイ・ムリル子実体から水溶性多糖類を抽出除去した残渣から、5w%水酸化ナトリウム水溶液を用いて30℃で抽出することにより得られる、グルカン：タンパク＝55:43[w/w]の(1→6)-β-D-グルカンの蛋白多糖体である請求項１２記載の血管新生阻害用飲食組成物。
【請求項１４】
血管内皮細胞増殖因子(VEGF)誘導による血管新生を阻害する請求項９乃至１３の何れか１項に記載の血管新生阻害用飲食組成物。
【請求項１５】
血管内皮細胞増殖因子(VEGF)の分泌減少により血管新生を阻害する請求項９乃至１３の何れか１項に記載の血管新生阻害用飲食組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血管新生阻害剤及び血管新生阻害用飲食組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
新生血管形成の抑制は、腫瘍又は癌の増殖又は転移、慢性炎症、関節リューマチ、網膜症、糖尿病性網膜症、加齢性黄斑変性症等の抑制に繋がると考えられている。
【０００３】
血管新生阻害作用は、サメ軟骨、緑茶成分であるエピガロカテキン（EGC）やエピガロカテキンガレート（EGCG）、大豆イソフラボンの一種であるゲニステイン、アガリクス・ブラゼイ由来のエルゴステロルやピログルタミン酸等の食品含有成分に存在することが報告されている。
【０００４】
キノコ類由来の物質の血管新生阻害作用に関しては、前記アガリクス・ブラゼイ由来のエルゴステロル（Isolation of an anti-angiogenic substance from Agaricus blazei Murill: Its antitumor and antimetastatic actions; Kimura et al.; Cancer Sci., September 2004, vol.95, no.9, 758-764 [非特許文献１]）の他、カワラタケ由来のPSK（Inhibitory effect of PSK on angiogenesis.; Wada T, Wakamatsu Y, et al.; Biotherapy 15(3):389-392, 2001 [非特許文献２]）、ハナビラタケ由来のβ-1,3-D-グルカンによるものが報告されている（Anti-angiogenic and Anti-metastatic Effects of β-1,3-D-Glucan Purified from Hanabiratake, Sparassis crispa; Kyosuke Yamamoto, Takashi Kimura et al.;  Biol.Pharm. Bull. 32(2) 259-263, 2009 [非特許文献３]）。
【０００５】
PS-Kの特長は、アスパラギン酸、グルタミン酸のほか１９種類のアミノ酸よりなる約１５％のタンパクを含有するタンパク糖でαないしβ-1,4結合を主鎖として、グルコース基５個に対して１個の割合で３または６ぐらいで分枝した構造を有するものと推定されている（多糖類の担癌動物に対する宿主効果，特にカワラタケ由来蛋白糖，PS-K，の作用について；堀越  茂；「癌と化学療法」第１巻第２号；251-257頁，1974年 [非特許文献４]）。
【０００６】
ハナビラタケの抗腫瘍を示す成分は、1,3-β-グルカンであることが大野尚仁らによって報告されている（Antitumor 1,3-β-Glucan from Cultured Fruit Body of Sparassis crispa; Naohito Ohno et al.; Biol. Pharm. Bull. vol. 23, No.7, 366-372, 2000 [非特許文献５]）。更に、当該成分が肺転移抑制効果と血管新生阻害作用を示すことを山本らが報告している（Anti-angiogenic and Anti-metastatic Effects of β-1,3-D-Glucan Purified from Hanabiratake, Sparassis crispa; Kyosuke Yamamoto, Takashi Kimura et al.;  Biol.Pharm. Bull. 32(2) 259-263, 2009 [非特許文献３]）。
【０００７】
ヒメマツタケ由来の（1→6)-β-D-グルカン蛋白複合体の抗腫瘍活性と抗腫瘍免疫学的作用メカニズムについては、すでに報告されており（Inhibitory Action of a (1→6)-β-D-Glucan-Protein Complex(FIII-2-b) Isolated from Agaricus blazei Murill ("Himematsutake") on Meth A Fibrosarcoma-Bearing Mice and Its Antitumor Mecahnism; Hiroko Itoh et al.; Jpn. J. Pharmacol. 66, 265-271, 1994 [非特許文献６]）、特開平２−７８６３０号公報に記載の通り抗腫瘍剤としての特許出願も行われている [特許文献１]。
【０００８】
この(1→6)-β-D-グルカン蛋白複合体（以下、「当該多糖」とも言う。）は、キノコ類から初めて得られた物質であり、糖部分50.2%、蛋白部分43.3%より成る多糖体である（Antitumor Activity and Some Properties of Water-insoluble Hetero-glycans from "Himematsutake," th Fruiting Body of Agaricus blazei Murill; Takashi Mizuno et al.; Agric. Biol. Chem., 54(11), 2897-2905, 1990 [非特許文献７]）。
【０００９】
β-(1→6)-グルカンとしては、すでに、Umbilicaria pustulataという地衣類に存在が知られているプスチュラン[pustulan]、 Penicillium islandicumの培養濾液より得られるイスランド酸[Islandic acid]（β-(1→6)結合の主鎖に1→4結合による側鎖が少量ついている多糖）、各種分子量の市販デキストラン[Dextran]（Pharmacia社製, α-(1→6)結合を主鎖とし少量の分枝構造をもつグルカン）、まからす麦の種子より単離されているオート・リヘニン[Oat lichenin]が知られているが、これらには、マウスザルコーマ180に対する抗腫瘍活性は認められず、血管新生阻害作用も認められない（＜癌の基礎的研究班シンポジウム記録＞「多糖類の抗癌効果の批判」地衣類の抗腫瘍性多糖類の研究−イワタケを中心として−； 西川嘉広；日本臨床  ２７巻  第６号；184-188頁，1969年 [非特許文献８]）。
【００１０】
以上の知見から、多糖体の抗腫瘍活性が、分子構造の微細な違いや立体化学的な因子により大きく影響されるものであることが示唆される。
【００１１】
当該多糖については以上のような内容が知られているが、これまで当該多糖が血管新生阻害作用を示すことは全く知られていない。
【００１２】
ヒメマツタケ（当該多糖を単離した同一のヒメマツタケ〔5.8S rDNAのITS[内部転写スペーサー領域]の遺伝子配列が同じヒメマツタケ〕）の安全性については、国立医薬品食品衛生研究所の変異遺伝部長（林真）らによる「既存天然添加物等の変異原性を中心とした安全性研究」（厚生科学特別研究事業）においてもヒメマツタケの安全性が確認されている。また、ヒメマツタケ抽出物のラット亜慢性毒性試験においても、国立医薬品食品衛生研究所  病理部  黒岩有一らによって安全性が確認されている（Lack of subchronic toxicity of an aqueous extract of Agaricus blazei Murrill in F344 rats; Y.Kuroiwa, et al.; Food and Chemical Toxicology 43(2005) 1047-1053 [非特許文献９]）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】特開平２−７８６３０号公報
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Isolation of an anti-angiogenic substance from Agaricus blazei Murill: Its antitumor and antimetastatic actions; Kimura et al.; Cancer Sci., September 2004, vol.95, no.9, 758-764
【非特許文献２】Inhibitory effect of PSK on angiogenesis.; Wada T, Wakamatsu Y, et al.; Biotherapy 15(3):389-392, 2001
【非特許文献３】Anti-angiogenic and Anti-metastatic Effects of β-1,3-D-Glucan Purified from Hanabiratake, Sparassis crispa; Kyosuke Yamamoto, Takashi Kimura et al.;  Biol.Pharm. Bull. 32(2) 259-263, 2009
【非特許文献４】多糖類の担癌動物に対する宿主効果，特にカワラタケ由来蛋白糖，PS-K，の作用について；堀越  茂；「癌と化学療法」第１巻第２号；251-257頁，1974年
【非特許文献５】Antitumor 1,3-β-Glucan from Cultured Fruit Body of Sparassis crispa; Naohito Ohno et al.; Biol. Pharm. Bull. vol. 23, No.7, 366-372, 2000
【非特許文献６】Inhibitory Action of a (1→6)-β-D-Glucan-Protein Complex(FIII-2-b) Isolated from Agaricus blazei Murill ("Himematsutake") on Meth A Fibrosarcoma-Bearing Mice and Its Antitumor Mecahnism; Hiroko Itoh et al.; Jpn. J. Pharmacol. 66, 265-271, 1994
【非特許文献７】Antitumor Activity and Some Properties of Water-insoluble Hetero-glycans from "Himematsutake," th Fruiting Body of Agaricus blazei Murill; Takashi Mizuno et al.; Agric. Biol. Chem., 54(11), 2897-2905, 1990
【非特許文献８】＜癌の基礎的研究班シンポジウム記録＞「多糖類の抗癌効果の批判」地衣類の抗腫瘍性多糖類の研究−イワタケを中心として−； 西川嘉広；日本臨床  ２７巻  第６号；184-188頁，1969年
【非特許文献９】Lack of subchronic toxicity of an aqueous extract of Agaricus blazei Murrill in F344 rats; Y.Kuroiwa, et al.; Food and Chemical Toxicology 43(2005) 1047-1053
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明は、上記のような点に鑑み行われたものであって、その目的とするところは、長期に亙って安全且つ簡便に投与し得る血管新生阻害剤及び血管新生阻害用飲食組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
[1] 上記目的を達成する本発明の血管新生阻害剤は、(1→6)-β-D-グルカン含有物を有効成分とするものである。
【００１７】
また本発明の血管新生阻害用飲食組成物は、(1→6)-β-D-グルカン含有物を含有してなるものである。
【００１８】
本発明の血管新生阻害剤又は血管新生阻害用飲食組成物を適用することにより、血管新生を効果的に阻害し得る。
【００１９】
[2] 上記(1→6)-β-D-グルカン含有物は、(1→6)-β-D-グルカン蛋白多糖体とすることができる。
【００２０】
[3] また(1→6)-β-D-グルカン含有物は、下記理化学的性質(a)乃至(i)を有する蛋白多糖体とすることができる。
(a)元素分析：
C 41.87%
H 7.15%
N 6.88%
糖含量 50.2%
蛋白質含量 43.3%
(b)分子量：１乃至５万
(c)比旋光度：
【化１】
2014001188.tif 000002
(c=1.0 , 5% NaOH)で左旋性を示す。
(d)赤外線吸収スペクトル：図１に示す。
(e)核磁気共鳴スペクトル：図２に示す。
(f)溶解性：アルカリに可溶、水及びDMSO(ジメチルスルフォキシド)にそれぞれやや溶解、有機溶媒に不溶
(g)呈色皮応：フェノール硫酸およびニンヒドリン反応に陽性
(h)色：灰白色
(i)アミノ酸組成（モル％）：
Asp 10.7
Thr 5.2
Ser 5.3
Glu 11.1
Gly 9.3
Ala 11.9
Val 4.9
Met 1.1
Ile 3.3
Leu 10.8
Tyr 2.4
Phe 4.5
Lys 5.3
His 2.1
Arg 5.2
Pro 6.9
合計 100%
【００２１】
[4] 上記(1→6)-β-D-グルカン含有物は、アガリクス・ブラゼイ・ムリル子実体由来であるものとすることができる。
【００２２】
アガリクス・ブラゼイ・ムリル子実体由来の(1→6)-β-D-グルカン含有物は、アガリクス・ブラゼイ・ムリル子実体から水溶性多糖類を抽出除去した残渣から、5w%水酸化ナトリウム水溶液を用いて30℃で抽出することにより得られる、グルカン：タンパク＝55:43[w/w]の(1→6)-β-D-グルカンの蛋白多糖体であるものとすることができる。
【００２３】
[5] 本発明の血管新生阻害剤は、経口投与剤であるものとすることができる。
【００２４】
[6] 本発明の血管新生阻害剤及び血管新生阻害用飲食組成物は、血管内皮細胞増殖因子(VEGF)誘導による血管新生を阻害するものであることが好ましい。
【００２５】
[7] また本発明の血管新生阻害剤及び血管新生阻害用飲食組成物は、血管内皮細胞増殖因子(VEGF)の分泌減少により血管新生を阻害するものであることが好ましい。
【００２６】
なお、本発明における"血管新生阻害剤"は、"血管新生阻害剤用の物質"と言い換えることができる。
【００２７】
また、本発明の血管新生阻害剤又は血管新生阻害剤用飲食組成物を適用することによる血管新生を阻害する方法は、上記[1]乃至[4]記載の(1→6)-β-D-グルカン含有物を適用することによる血管新生を阻害する方法と言い換えることができる。
【発明の効果】
【００２８】
本発明の血管新生阻害剤及び血管新生阻害用飲食組成物は、長期に亙って安全且つ簡便に投与し得、血管新生を効果的に阻害し得る。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】赤外線吸収スペクトルである。
【図２】核磁気共鳴スペクトルである。
【図３】背部皮下法による腫瘍誘導血管形成への(1→6)-β-D-グルカン蛋白多糖体の影響を示すグラフである。
【図４】マトリゲル・プラグ法によるVEGF誘導による血管新生への(1→6)-β-D-グルカン蛋白多糖体の影響を示すグラフである。
【図５】(1→6)-β-D-グルカン蛋白多糖体によるヒト臍帯静脈血管内皮細胞増殖抑制効果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
[1] 本発明における血管新生阻害剤の有効成分は、(1→6)-β-D-グルカン蛋白多糖体等の(1→6)-β-D-グルカン含有物である。
【００３１】
(1) 血管新生阻害剤の有効成分としての(1→6)-β-D-グルカン含有物は、例えば次のようにして得ることができる。
【００３２】
アガリクス・ブラゼイ・ムリル（ヒメマツタケ）の生の子実体又は乾燥した子実休を使用し、生の子実体の場合は千切りにし、乾燥品の場合には粉砕する。千切りあるいは粉砕した子実体は低級脂肪族アルコールあるいは20%以下の水を含有する低級脂肪族アルコールによって抽出前処理することにより低分子成分を除去する。
【００３３】
次に、抽出後の残渣に対し熱水での抽出を行い、水溶性成分を除去する。この抽出残渣を風乾し、シュウ酸アンモニウム水溶液で抽出を行う。さらに、その抽出残渣に5%水酸化ナトリウム水溶液を加え30℃で抽出を行う。
【００３４】
この抽出液を酢酸で中和し、pH5乃至6に調整し、生じた沈澱を除去する。次にゲルろ過によって、蛋白質・多糖体両分を分離する。更に、これを透析し、その他の公知の精製手段により脱塩精製し、精製液を濃縮した後、常法によって凍結乾燥すると灰白色粉末体を得ることができる。
【００３５】
(2) 理化学的性質
【００３６】
血管新生阻害剤の有効成分としての(1→6)-β-D-グルカン蛋白多糖体等の(1→6)-β-D-グルカン含有物の理化学的性質は下記の通りである。
(a) 元素分析の結果
【００３７】
C  41.8、 H 7.15%, N 6.88%であり、フェノ-ル・硫酸法による糖含量（グルコース換算）43.3%、Lowry法による蛋白質（牛アルブミン換算）50.2%を含有する蛋白多糖体である。
【００３８】
構成糖は、アルジトール・アセテートのガスクロマトグラフィーで大部分はグルコースからなり微量のキシロース、ガラクトース、マルトースを含有する。箱守法によるメチル化分折及び1H、13C NMR分析によりグルコースのβ1一6結合を認める。
(b) ゲルろ過によって求めた分子量は約１乃至５万である。
(c) 比旋光度：
【化２】
2014001188.tif 000003
(c=1.0 , 5% NaOH)で左旋性を示す。
(d) 赤外線吸収スペクトルをKBr錠剤法で測定した結果を図１に示す。
(e) 核磁気共鳴スペクトル(13C-NMR)を、0.3M  NaODに溶解させて測定した結果を図２に示す。
(f) 1乃至10%水酸化ナトリウム等のアルカリに可溶であり、水、酸およびDMS0（ジメチルスルフォキシド）にやや溶解し、有機溶媒たとえばエタノール、アセトン、エーテル、クロロホルム等には不溶である。
(g) アンスロン硫酸試薬、ニンヒドリン反応試薬に対して陽牲である。
(h) 凍結乾燥によって得られた粉末は灰白色を呈する。
(i) アミノ酸組成（モル%）6M塩酸と110℃、20時間加水分解したものを、日立835型アミノ酸分析計によって測定した結果、Asp 10.7、Thr 5.2、Ser 5.3、Glu 11.1、Gly 9.3、Ala 11.9、Val 4.9、Met 1.1、Ile 3.3、Leu 10.8、Tyr 2.4、Phe 4.5、Lys 5.3、His 2.1、Arg 5.2、Pro 6.9を示す。
【００３９】
(3) 急性毒性
【００４０】
ICRマウス（雌、5週令）の腹腔内または経口１回投与による急性毒性試験（１週間観察）において、本発明における上記(1→6)-β-D-グルカン含有物は500mg/kgで死亡率はともに0/7であるマウスにおける重大な体重変化は見られなかった（特開平２−７８６３０号公報）。
【００４１】
[2] 本発明の血管新生阻害剤は、上記(1→6)-β-D-グルカン蛋白多糖体等の(1→6)-β-D-グルカン含有物を有効成分とするものであって、経口投与に適し、成人に対する投与量は、１日当り０．１乃至１０ｇ程度が適当である。但し、(1→6)-β-D-グルカン蛋白多糖体等の(1→6)-β-D-グルカン含有物は人体に対する毒性を有しないため、これに限定されるものではない。
【００４２】
本発明の血管新生阻害剤における経口投与の形態に特に限定はないが、例えば、粉末、錠剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤とすることができる。
【００４３】
また種々の形態を形成する上で、各種賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、コーティング剤、着色剤、矯味剤、矯臭剤、可塑剤等を適宜用いることができる。
【００４４】
賦形剤の例としては、糖類（乳糖，白糖，ブドウ糖，マンニトール），デンプン（バレイショ，コムギ，トウモロコシ），無機物（炭酸カルシウム，硫酸カルシウム，炭酸水素ナトリウム，塩化ナトリウム），結晶セルロース，植物末（カンゾウ末，ゲンチアナ末）等を挙げることができる。
【００４５】
結合剤の例としては、デンプンのり液，アラビアゴム，ゼラチン，アルギン酸ナトリウム，メチ／レセルロース（ＭＣ），エチルセルロース（ＥＣ），ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ），ポリビニルアルコール（ＰＶＡ），ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ），カルポキシメチルセルロース（ＣＭＣ）等を挙げることができる。
【００４６】
崩壊剤の例としては、デンプン，寒天，ゼラチン末，結晶セルロース，ＣＭＣ・Ｎａ，ＣＭＣ・Ｃａ，炭酸カルシウム，炭酸水素ナトリウム，アルギン酸ナトリウム等を挙げることができる。
【００４７】
滑沢剤の例としては、ステアリン酸マグネシウム，タルク，水素添加植物油，マクロゴール，シリコーン油等を挙げることができる。
【００４８】
コーティング剤の例としては、糖衣（白糖，ＨＰＣ，セラック），膠衣（ゼラチン，グリセリン，ソルビトール），フイルムコーティング〔ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ），ＥＣ，ＨＰＣ，ＰＶＰ〕，腸溶性コーティング〔ヒドロキシプロビルメチルセルロースフタレート（ＨＰＭＣＰ），セルロースアセテートフタレート（ＣＡＰ）〕等を挙げることができる。
【００４９】
着色剤の例としては、水溶性食用色素，レーキ色素）等を挙げることができる。矯味剤の例としては、乳糖，白糖，ブドウ糖，マンニトール）等を挙げることができる。矯臭剤の例としては、芳香性精油類），光線遮断剤（酸化チタン）等を挙げることができる。可塑剤の例としては、フタル酸エステル類，植物油，ポリエチレングリコール）等を挙げることができる。
【００５０】
本発明の血管新生阻害剤用飲食組成物は、例えば栄養食品、栄養補助食品又は飲料用液体等を構成する飲食組成物中に(1→6)-β-D-グルカン蛋白多糖体等の(1→6)-β-D-グルカン含有物を含有した形態とすることができ、本発明の効果を損なわない各種成分を含むものとすることができる。
【００５１】
このような血管新生阻害剤及び血管新生阻害剤用飲食組成物は、長期に亙って安全且つ簡便に投与し得、血管新生を効果的に阻害し得る。
【実施例】
【００５２】
(1→6)-β-D-グルカン蛋白多糖体［以下、「ABP」とも言う。］の経口投与による血管新生阻害効果についての試験を行った。
【００５３】
(1) 被験物質及び供試動物
【００５４】
Kawagishiらの手法［Kawagishi H, Kanao T, et al.: Formolysis of a potent antitumor (l-6)-β-D-glucan-protein complex from Agaricus blazei fruiting bodies and antitumor activity of the resulting products. Carbohydr Polym 12: 393-403 1990］に従い、アガリクス・ブラゼイ・ムリル（ヒメマツタケ）の子実体から温水可溶性多糖類を抽出した後、不溶性多糖類を1%シュウ酸アンモニウム水溶液、5%水酸化ナトリウム水溶液、20%水酸化ナトリウム水溶液、5%塩化リチウム-ジメチルアセトアミド水溶液の順に連続抽出することによって得た不溶性分画を、エタノール沈殿、ゲルろ過などによって更に分画化して、被験物質である。(1→6)-β-D-グルカン蛋白多糖体を得た。その理化学的性質は上記の通りである。
【００５５】
体重１５−２０ｇの５週齢の雌性A/J Jms Slcマウス（株式会社日本エスエルシーより入手）を供試動物とした。これらのマウスには、CE-7ペレット食（株式会社日本クレア製）を与えて飼育し、水は自由に摂取させた。
【００５６】
(2) 背部皮下法［Dorsal Air Sac（DAS）法］による腫瘍誘導性血管新生の評価
【００５７】
DAS法は、Yamamotoらの手法［Yamamoto K, Kimura T,: Anti-angiogenic and anti-metastatic effects of β-1,3-D-glucan purified from Hanabiratake, Sparassis crispa. Biol Pharm Bull 32(2): 259-263 2009］に従って行い、若干の修正を加えた。
【００５８】
すなわち、拡散チャンバーリングの両面を膜フィルターで被覆し、結果として得られたチャンバーをP-7423細胞（肺腫瘍細胞7423）5×105細胞（PBS 150 μL）で充填した。それぞれのP-7423含有チャンバーは、第０日に雌性A/J Jms Slcマウスの背部皮下に移植した。対照群にはPBS含有チャンバーを移植した。何れのPBSも、リン酸緩衝生理食塩水中にペニシリンを1万単位/mL含有している抗菌・抗真菌溶液（×100）（和光純薬工業社製）である。
【００５９】
ABPは、第１日から第１４日まで１日２回経口投与した。
【００６０】
第１５日に各マウスを犠牲死させ、移植領域の腫瘍細胞誘導性血管新生を観察した。チャンバー移植領域内の新生血管に特徴的なジグザグ型の構造を持つ３mmより長い新規形成血管の数を図３に示す。図３において、値は平均±標準誤差を示すものであり（n = 7）、＊は、有意差あり（p < 0.05、P-7423のみの対照群との比較）を意味する。
【００６１】
チャンバーP-7423移植後に血管新生が強力に誘導されたが、この腫瘍誘導性血管新生はABPの経口投与によって有意に阻害された。
【００６２】
(3) マトリゲル・プラグ法によるVEGF誘導性血管新生の評価
【００６３】
マトリゲル・プラグ法は、Passanitiらの手法［Passaniti A, Taylor RM, et al.: A simple, quantitative method for assessing angiogenesis and antiangiogenic agents using reconstituted basement membrane, heparin, and fibroblast growth factor. Lab Invest 67: 519-528 1992］に従って行った。
【００６４】
すなわち、各雌性A/J Jms Slcマウスを対象として、VEGF （組換えマウスVEGF，Sigma社[米国]より入手）20 ng/mL及びヘパリン32 U/mLを含有しているマトリゲル0.5 mLを第０日に皮下注した。対照群にはマトリゲルのみ皮下注した。
【００６５】
ABPは、第１日から第１４日まで１日２回経口投与した。
【００６６】
第１５日に各マトリゲルを摘出して秤量し、ゲルをdispase-II（Roche Diagnostics社製）1.5 mg/mLで処理した後、ヘモグロビン含有量をQuantichrom Hemoglobinアッセイキット（株式会社フナコシ製）によって計測した。結果を図４に示す。
【００６７】
図４中、(A)はマトリゲルの重量を示し、(B)はマトリゲル内のヘモグロビン含有量を示す。図４において、値は平均±標準誤差を示すものであり（n = 7）、＊は、有意差あり（p < 0.05、VEGFのみの対照群との比較）を意味する。
【００６８】
マトリゲル重量とヘモグロビン含有量は、VEGF含有マトリゲル注入群の方が、マトリゲルのみ注入群よりも著明に高値であった。一方、この血管新生反応は、ABPの経口投与によって有意に阻害された。
【００６９】
(4) P-7423（肺腫瘍細胞7423）細胞におけるVEGFの分泌
【００７０】
P-7423肺癌細胞を完全培地の24穴プレートで増殖させ培養した（37℃、5%炭酸ガス、24時間）。
【００７１】
培地をFBS（ウシ胎仔血清，  Gibco BRL社[ニュージーランド]より入手）及びABP 0、20、200 μg/mLをそれぞれ添加したRPMI-1640（P-7423系の5×105生存細胞の単一細胞懸濁液）で置換し、低酸素条件下で培養した（37℃、95%窒素/5%炭酸ガス、18時間）後、馴化培地のVEGF蛋白含量をELISAキット（Santa Cruz Biotechnology社製）によって分析した。
【００７２】
低酸素状態下におけるP-7423細胞培養上清のVEGF発現に対するABPの効果を、各ABP濃度についてのP-7423細胞のVEGF（pg/mL）として表１に示す。表１において、値は平均±標準誤差として示すものであり（n = 4）、＊は、有意差あり（p < 0.01、対照群との比較）を意味する。
【００７３】
【表１】
2014001188.tif 000004
【００７４】
表１に示されるように、VEGF分泌量はABP 200 μg/mLによって有意に減少した。
【００７５】
(5) HUVEC増殖アッセイ
【００７６】
血管新生は、内皮細胞が増殖して、血管増殖に必要な細胞数を提供する必要があるとか、細胞が遊走し得る必要があるといった幾つかの特性に依存している。血管新生においては血管内皮細胞が重要な役割を果たしているため、HUVECに対するABPの作用を検討した。
【００７７】
HUVEC（ヒト臍帯静脈内皮細胞，クラボウ社より入手）を2%（v/v）FBS（ウシ胎仔血清，  Gibco BRL社[ニュージーランド]より入手）添加DMEM（ダルベッコ変法イーグル培地，日水製薬社より入手）に懸濁（40,000細胞/mL）させ、ゼラチン化96穴培養皿に留置し（0.1 mL/穴）、培養した（37℃、5%炭酸ガス、24時間）。
【００７８】
培地を5%（v/v）FBS添加DMEM 0.1 mLで置換して24、48、72時間それぞれ培養するか、あるいはABP 2、20、200 μg/mLを添加してそれぞれ培養した（48時間、37℃、5%炭酸ガス）。細胞増殖はMTTアッセイによって評価した（Carmichael J, DeGraff WG, et al.: Evaluation of a tetrazolium-based semiautomated colorimetric assay. Assessment of chemosensitivity testing. Cancer Res 47: 936-942 1987）。結果を図５に示す。
【００７９】
図５中、増殖率(%)は、DMEMのみで培養した細胞数を100%とした場合の、異なる濃度でABPを添加した培地での細胞数の比率を示す。図５において、値は平均±標準誤差を示すものであり（n = 6）、＊は、有意差あり（p < 0.05、DMEM処理の対照群との比較）を意味する。
【００８０】
HUVECの増殖は、ABP（2、20、200 μg/mL）によって用量依存的に抑制された。
【００８１】
すなわち、ABPはin vitroでHUVECの増殖を直接的に抑制することが示された。HUVECに対するABPの抑制作用機序は不明であるが、細胞毒性作用の可能性がある。
【００８２】
腫瘍誘導性血管新生が、アガリクス・ブラゼイから単離したエルゴステロールによって阻害されることは既に見い出されている。C. vesicolor由来の真菌蛋白結合多糖類（クレスチン）もまた、血管新生阻害剤として作用することが報告されている。
【００８３】
しかし、クレスチンはβ-1,4-結合グルカンを主鎖として有し、蛋白領域に結合しているβ-1,3結合とβ-1,6結合を側鎖として有している。
【００８４】
したがって、（1→6）-β-D-グルカンを有しているABPは、新規の血管新生阻害剤であり、特に経口投与時に効果を発揮すると考えられる。
【図１】
2014001188.tif 000007
【図２】
2014001188.tif 000008
【図３】
2014001188.tif 000009
【図４】
2014001188.tif 000010
【図５】
2014001188.tif 000011