(57)【要約】【課題】  従来は測定不可能であった微量成分であっても測定することができる分析用試薬組成物及び分析方法を提供すること。【解決手段】  微量成分の分析測定に用いられる、有機酸化合物と酸化物固体とを含有してなる分析用試薬組成物であって、上記有機酸化合物は、分子内水素結合構造を形成する水酸基を有し、上記酸化物固体は、ゼオライトなどの固体酸化物とアルカリ金属塩などのアルカリ金属化合物とを反応させて得られるアルカリ金属置換物であることを特徴とする微量成分の分析用試薬組成物。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
微量成分の分析測定に用いられる、有機酸化合物と酸化物固体とを含有してなる分析用試薬組成物であって、
上記有機酸化合物は、分子内水素結合構造を形成する水酸基を有し、
上記酸化物固体は、固体酸化物とアルカリ金属化合物とを反応させて得られるアルカリ金属置換物である
ことを特徴とする微量成分の分析用試薬組成物。
【請求項２】
上記固体酸化物がゼオライトであり、上記酸化物固体が、該ゼオライトにアルカリ金属塩を反応させて得られるゼオライトのアルカリ金属置換物である
ことを特徴とする請求項１記載の分析用試薬組成物。
【請求項３】
上記有機酸化合物と上記酸化物固体との配合比が、重量比で、１：０．１〜５である
ことを特徴とする請求項１記載の分析用試薬組成物。
【請求項４】
請求項1記載の分析用試薬組成物を未知試料に混合し、得られた混合物を質量分析法により分析することを特徴とする、
微量成分の分析方法
【請求項５】
上記分析用試薬組成物の使用量をモル比で、未知試料１に対して２０以上１５０以下とする
ことを特徴とする請求項４記載の分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分析用試薬組成物及び分析方法に関し、さらに詳しくは、質量分析の際のマトリックスの開裂を抑制し、かつ、効率的に試料のイオン化を行うことで、従来方法で検出できなかった微量試料の質量分析、マトリックス開裂産物の由来のシグナル夾雑物により測定が困難であった低分子の試料の質量分析、及び、イオン化が困難な試料の質量分析を可能にする分析用試薬組成物及び分析方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
質量分析は物質の質量を測定する手法で、化学分野をはじめとするさまざまな分野で重要な技術である。その質量分析の中でも、ＭＡＬＤＩ―ＭＳ法（マトリックス支援レーザー脱離-質量分析）は、試料をマトリックス（芳香族有機化合物など）中に混ぜて結晶を作り、これにレーザーを照射することでイオン化する方法で、タンパク質などの高分子化合物であっても安定にイオン化することができる重要な技術であり、さまざまな手法が提案されている。
このような質量分析法においては、マトリックスを工夫することにより各種微量成分の分析を可能にすべく種々検討が施されている。
たとえば、特許文献１には、ゼオライトをマトリックスとして用いることが提案されている。具体的には、ゼオライトからなるミクロ構造体がミクロ構造体のアドレス指定を可能にする分子特異的認識部位を有するナノ粒子からなる質量分析用のマトリックスが提案されている。
また、特許文献２には、有機酸化物をマトリックスとして用いることが提案されている。具体的には、有機酸のアンモニウム塩と、脂肪族炭化水素基含有化合物とポリヌクレオチド、オリゴ糖、蛋白質などとを含有する組成物をマトリックスとして用いることが提案されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特表2005-524829号公報
【０００４】
【特許文献２】特開平06-322274号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、上述の提案にかかる質量分析方法は、検出感度が悪いという問題や、ノイズが多く測定結果に悪影響を及ぼし、所望の検出対象物を特定しにくい、という問題があった。
このため、検出感度が高く、ノイズが少なく、所望の検出対象物を特定しやすい質量分析手法の開発が要望されている。
【０００６】
したがって、本発明の目的は、従来は測定不可能であった微量成分であっても測定することができる分析用試薬組成物及び分析方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解消すべく鋭意検討した結果、単にゼオライトなどの固体酸化物を用いるのではなく固体酸化物のプロトンをアルカリ金属で置換してなるアルカリ金属置換物をマトリックスとして使用することにより上記目的を達成し得ることを知見し、さらに研究を進めた結果本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の各発明を提供するものである。
１．微量成分の分析測定に用いられる、有機酸化合物と酸化物固体とを含有してなる分析用試薬組成物であって、上記有機酸化合物は、分子内水素結合構造を形成する水酸基を有し、上記酸化物固体は、固体酸化物とアルカリ金属化合物とを反応させて得られるアルカリ金属置換物であることを特徴とする微量成分の分析用試薬組成物。
２．上記固体酸化物がゼオライトであり、上記酸化物固体が、該ゼオライトにアルカリ金属塩を反応させて得られるゼオライトのアルカリ金属置換物であることを特徴とする１記載の分析用試薬組成物。
３．上記有機酸化合物と上記酸化物固体との配合比が、重量比で、１：０．１〜５であることを特徴とする１記載の分析用試薬組成物。
４．1記載の分析用試薬組成物を未知試料に混合し、得られた混合物を質量分析法により分析することを特徴とする、微量成分の分析方法
５．上記分析用試薬組成物の使用量をモル比でで、未知試料１に対して２０〜１５０とすることを特徴とする４記載の分析方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の分析用試薬組成物は、従来は測定不可能であった微量成分であっても測定することができるものである。
また、本発明の分析用試薬組成物を用いた分析方法によれば、従来方法で検出できなかった微量成分を含有する試料の質量分析が可能となり、従来は測定が困難であった成分を検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、本発明の分析方法（質量分析）のマススペクトルデータである（実施例１及び２）。
【図２】図２は、本発明の分析方法（質量分析）のマススペクトルデータである（実施例３〜５）。
【図３】図３は、本発明の分析方法（質量分析）のマススペクトルデータである（実施例６及び７並びに比較例１及び２）。
【図４】図４は、本発明の分析方法（質量分析）のマススペクトルデータである（実施例８及び９）。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、本発明をさらに詳細に説明する。
まず、本発明の分析用試薬組成物について説明する。
本発明の分析用試薬組成物は、微量成分の分析測定に用いられる、有機酸化合物と酸化物固体とを含有してなる分析用試薬組成物である。
【００１１】
以下、詳述する。
＜分析＞
本発明の分析とは質量分析をいう。上記質量分析としては、試料のイオン化にマトリックスを利用するマトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）などがあげられる。
【００１２】
＜有機酸化合物＞
本発明において用いられる上記有機酸化合物は、分子内水素結合構造を形成する水酸基を有する有機酸化合物である。
上記有機酸化合物は、分子内に1つ以上の酸性官能基と１つ以上の水酸基とを具備し、該酸性官能基の一つにおける水素原子と該水酸基の一つとで上記分子内水素結合を形成している化合物が好ましく用いられる。また、上記有機酸化合物は、さらにベンゼン環を有する化合物であるのが好ましい。この理由は定かではないが、二重結合の共役系のエネルギーが、ベンゼン環になると低下して、分子内プロトン移動先のカルボキシルの軌道エネルギーと同程度になって、相互作用が可能になり、分子内プロトン移動が起きて、消耗の効果を得るうえで有利に働くためであると考えられる。
上記酸性官能基としては、カルボキシル基、スルホン酸基等が挙げられる。
上記有機酸化合物としては、具体的には2',4',6'-トリヒドロキシアセトフェノン（ＴＨＡＰ）、α-シアノ-4-ヒドロキシけい皮酸(CHCA)、2,5-ジヒドロキシ安息香酸(DHBA)、トランス-3-インドールアクリル酸、シナピン酸(SA)等が挙げられ、使用に際しては単独又は2種以上混合して用いることができる。
【００１３】
＜酸化物固体＞
本発明において用いられる酸化物固体は、固体酸化物にアルカリ金属化合物を反応させて得られるアルカリ金属置換物である。
（固体酸化物）
上記固体酸化物は固体の酸化物であれば特に制限されず、無機酸化物、有機酸化物のいずれも用いることができるが、好ましくは無機酸化物の固体である。
上記無機酸化物としては、ゼオライト、モンモリロナイト、シリカ、アルミナ、マグネシア、ジルコニアなどを挙げることができ、中でもプロトン型ゼオライトを特に好ましく用いることができ、市販品を用いることもできる。
なお、ゼオライトは結晶性の多孔質アルミノケイ酸塩の総称であり、組成式（Ｍｎ＋）２／ｎＯ・Ａｌ２Ｏ３・ｘＳｉＯ２・ｙＨ２Ｏｎ〔陽イオンＭの価数Ｘは２以上の数を示し、Ｙは０以上の数を示す〕で表すことができる。ゼオライトは通常、骨格由来の均一な細孔を有しており、アルミニウムの部分の不足した正電荷を補う形でカチオン（Ｍｎ＋）が保持されており、上記プロトン型ゼオライトはこのＭｎ＋としてＨ＋を有するゼオライトである。
このようなプロトン型ゼオライトは、たとえばモルデナイト型ゼオライトを空気中にて３００℃以上の高温で４〜１０時間焼成することにより得ることができる。
（アルカリ金属化合物）
上記アルカリ金属化合物における上記アルカリ金属としては、リチウム、ナトリウム、カリウム、及びセシウムなどを挙げることができ、上記アルカリ金属化合物としては、酢酸リチウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、酢酸セシウム等を挙げることができ、使用に際してはそれぞれ単独で又は２種以上混合して用いることができる。また、使用に際しては水等の溶剤に溶解させた溶液として使用するのが好ましい。
（酸化物固体）
上記酸化物固体は、上記固体酸化物に上記アルカリ金属化合物を反応させることにより得ることができる。具体的には、上記アルカリ金属化合物溶液と、上記固体酸化物とを反応させることで上記固体酸化物表面のＭｎ＋、好ましくはプロトンを上記アルカリ金属原子に置換する置換反応を行うことにより得ることができる。
そして、得られる、本発明において用いられる上記酸化物固体は、上記固体酸化物の表面のプロトン等のＭｎ＋がアルカリ金属で置換されてなる固体状の酸化物である。上記酸化物固体における上記アルカリ金属の置換率は、固体酸化物上のＭｎ＋全部の８０％以上であるのが好ましく、９０％以上であるのがさらに好ましい。
上記酸化物固体の粒径は、０．０１〜１００μｍであるのが好ましく、０．１〜１０μｍであるのがさらに好ましい。また、その形状は特に制限されない。
【００１４】
＜配合比＞
上記有機酸化合物と上記酸化物固体の配合比は、本発明の所望の効果をより効果的に発現させるために、重量比で上記有機酸化合物：上記酸化物固体＝１：０．１〜５であることが好ましく、ゼオライトのユニットセル中には通常酸点数が４つあるが、この酸点数が用いる上記有機酸化合物分子数よりも多くなるように配合するのが特に好ましい。
【００１５】
＜その他の成分＞
上記以外の成分として、本発明の所望の効果を損なわない範囲で他の成分を混合してもよい。
本発明の分析用試薬組成物は、上記有機酸化合物及び上記酸化物固体、並びに必要に応じて用いられる上記の他の成分を適宜混合して使用に供することができる。
【００１６】
次に本発明の分析方法（本発明の分析用試薬組成物の使用方法）について説明する。
本発明の分析方法は、上記分析用試薬組成物を未知試料に混合し、得られた混合物を質量分析法により分析することにより実施することができる。
【００１７】
＜質量分析法＞
本発明で用いる質量分析法としては、試料のイオン化にマトリックスを利用するマトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）などがあげられ、公知のマトリックス支援レーザー脱離-飛行時間型-質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）装置などを用いて行うことができる。
【００１８】
＜未知試料＞
本発明の分析方法で測定対象である未知試料は、分析対象である微量成分を含有する混合物試料である。
【００１９】
（微量成分）
本発明の分析方法で測定可能な微量成分としては、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ法で測定可能な一般的試料が挙げられる他、従来このような質量分析法では測定不可能であるとされてきた、マルトヘキサオース、マルトヘプタオース、アセチルサリチル酸、フェノバルビタール等各種成分が挙げられる。
ここで、微量とは、通常の質量分析法における装置検出限界又は方法検出限界程度以下の量を意味する。
【００２０】
＜分析用試薬組成物の使用量＞
分析用試薬組成物の使用量は、未知試料の検出ができる量であれば特に制限されるものではないが、モル比で、未知試料１に対する下限を１０以上とするのが好ましく、２０以上とするのがより好ましく、８０以上とするのが更に好ましく、９０以上とするのが最も好ましい。また、上限を３００以下とするのが好ましく、２００以下とするのがより好ましく、１５０以下とするのが更に好ましく、１２０以下とするのが最も好ましい。この範囲内とすることにより上記の微量成分を効果的に検出することができる。換言すると、分析に際して推測により上記の範囲内となるように分析用試薬組成物の量を調整しながら分析を行うのが好ましい。
【００２１】
＜分析方法＞
以下、分析方法の概要を説明する。
まず、溶媒で未知試料を溶解した未知試料溶液と、該溶媒で本発明の分析用試薬組成物を懸濁させた分析用試薬組成物懸濁液とを作成する。
上記溶媒としては、水，アセトニトリルと水の混合溶液，クロロホルム，テトラヒドロフラン等を用いることができる。
次に、得られた未知試料溶液と分析用試薬組成物懸濁液とを質量分析装置用の試料台上で混合した後に通常の結晶化処理を行うことで質量分析用試料を調整し、最終に通常の操作方法に準じて質量分析装置により分析を行うことにより分析方法を実施できる。質量分析装置としては、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ型装置などの公知の質量分析装置を特に制限なく用いることができる。
【００２２】
＜効果＞
本発明の分析用試薬組成物及びこれを用いた本発明の分析方法は、
従来方法で検出できなかった微量成分を含有する未知試料の分析が可能である。
【実施例】
【００２３】
以下、本発明について実施例及び比較例を示してさらに具体的に説明するが本発明はこれらに何ら制限されるものではない。
〔実施例１〕分析用試薬組成物（リチウム置換ゼオライトマトリクス）の調製とマルトヘキサオースの質量分析
（酸化物固体の調整）
ゼオライト（モルデナイト型）を空気中にて７７３Ｋ（５００℃）で６時間焼成し、プロトン型ゼオライト（固体酸化物）を得た。得られたプロトン型ゼオライト３００mｇと濃度２．０ｍｏｌ／Ｌの酢酸リチウム水溶液５０ｍＬとを混合し、７０℃で１時間の条件で撹拌することにより、ゼオライト表面プロトンのアルカリ金属置換反応を行った。なお、酢酸リチウム水溶液は、アルカリ金属化合物として酢酸リチウムを用い、これを水に溶解して、２．０ｍｏｌ／Ｌ濃度とすることにより調製した。引き続き、同じカチオン置換反応をさらに２回（合計３回）行った後の生成物をろ過により分離し、４５０℃、３時間加熱処理を行うことにより、酸化物固体としてのリチウム置換ゼオライト（置換率９０％以上）を得た。
（分析用試薬組成物の調整）
リチウム置換ゼオライト８ｍｇと有機酸化合物としての２，４，６−トリヒドロキシアセトフェノン（以下、「ＴＨＡＰ」と呼ぶ）４ｍｇとを乳鉢にて混合し混合物として分析用試薬組成物（この混合物を「リチウム置換ゼオライトマトリクス」と呼ぶ）を得た。
（分析用試薬組成物溶液の調整）
次に、得られたリチウム置換ゼオライトマトリクスに、アセトニトリルと水の混合溶液（７：３、体積比）１ｍＬを添加し、懸濁させることにより、目的のリチウム置換ゼオライトマトリクス懸濁液を得た。
（試料の分析）
微量成分（分析対象成分）として糖であるマルトヘキサオースを、アセトニトリルと水とを混合してなる溶媒（７：３、体積比）に溶解させ、０．５０ｍｇ/ｍＬの濃度に調整した試料溶液を調製した。
次に、上記試料溶液１μリットルを（質量分析の試料台としての）ステンレス基板上に展開し、その溶液の上にリチウム置換ゼオライトマトリクス懸濁液１μリットルを滴下し、混合させた後、室温で乾燥させることにより、結晶化処理を行い、結晶化された分析用試料を得た。
得られた分析用試料が載置されたステンレス基板を質量分析装置（waters社製、装置名ＭＡＬＤＩ  ｍｉｃｒｏ  ＭＸ）に導入し、レーザーを照射し、イオン化させて測定を行った。測定条件は以下の通りとした。
測定条件
レーザー：ナノ秒ＹＡＧレーザー
波長：２６６ｎｍ
パルスエネルギー：５Ｊ
分析で得られた結果のマススペクトルを図１に示す。
【００２４】
〔実施例２〕
実施例１の試料をマルトヘキサオースからマルトヘプタオースに変えた以外は実施例１と同様にして、分析を行った。
分析で得られた結果のマススペクトルを図１に示す。
【００２５】
〔実施例３〕
アルカリ金属化合物を酢酸リチウムから酢酸ナトリウムに変えた以外は実施例１と同様にして酸化物固体を得、実施例１と同様にして分析用試薬組成物を得、分析を行った。
分析で得られた結果のマススペクトルを図２に示す。
【００２６】
〔実施例４〕
アルカリ金属化合物を酢酸リチウムから酢酸カリウムに変えた以外は実施例１と同様にして酸化物固体を得、実施例１と同様にして分析用試薬組成物を得、分析を行った。
分析で得られた結果のマススペクトルを図２に示す。
【００２７】
〔実施例５〕
アルカリ金属化合物を酢酸リチウムから酢酸セシウムに変えた以外は実施例１と同様にして酸化物固体を得、実施例１と同様にして分析用試薬組成物を得、分析を行った。
分析で得られた結果のマススペクトルを図２に示す。
【００２８】
〔実施例６〕
微量成分をマルトヘキサオースからアセチルサリチル酸に変えた以外は実施例１と同様にして、分析を行った。
分析で得られた結果のマススペクトルを図３に示す。
【００２９】
〔比較例１〕
リチウム置換ゼオライトマトリクス懸濁液を用いない以外は実施例６と同様にして、分析を行った。
分析で得られた結果のマススペクトルを図３に示す。
【００３０】
〔比較例２〕
分析用試薬組成物を用いない以外は実施例６と同様にして、分析を行った。
分析で得られた結果のマススペクトルを図３に示す。
【００３１】
〔実施例７〕
微量成分をアセチルサリチル酸からフェノバルビタールに変えた以外は実施例６と同様にして、分析を行った。
分析で得られた結果のマススペクトルを図３に示す。
【００３２】
〔実施例８〕
アルカリ金属化合物を酢酸リチウムから酢酸ナトリウムに変えた以外は実施例７と同様にして酸化物固体を得、実施例７と同様にして分析用試薬組成物を得、分析を行った。
分析で得られた結果のマススペクトルを図４に示す。
【００３３】
〔実施例９〕
アルカリ金属化合物を酢酸リチウムから酢酸カリウムに変えた以外は実施例７と同様にして酸化物固体を得、実施例７と同様にして分析用試薬組成物を得、分析を行った。
分析で得られた結果のマススペクトルを図４に示す。
【００３４】
以下、分析結果について説明する。
図１は本発明の分析用試薬組成物と分析方法を用いて行った分析の結果を示すチャートである。
従来法では検出が困難であったマルトヘキサオース（実施例１、図１のチャート(ａ)）ｍ/ｚ=９９８［ｍ+Ｌｉ］＋）及びマルトヘプタオース（実施例２、図１のチャート(ｂ)）の両方で明瞭なシグナルが検出されている。このことから本発明の分析用試薬組成物及び分析方法が従来検出困難であった微量成分の検出に有用であることがわかる。
【００３５】
図２は本発明の分析用試薬組成物において用いられる酸化物固体のアルカリ金属原子を比較した結果を示すチャートである。
アルカリ金属としてナトリウム（実施例３、図２のチャート(ａ)）ｍ/ｚ=１０１３［ｍ+Ｎａ］＋）、カリウム（実施例４、図２のチャート(ｂ)）ｍ/ｚ=１０３０［ｍ+Ｋ］＋）、セシウム（実施例５、図２のチャート(ｃ)）ｍ/ｚ=１１２４［ｍ+Ｃｓ］＋）のすべてで明瞭なシグナルが検出されている。このことから本発明の分析用試薬組成物及び分析方法が有用であることがわかる。
【００３６】
図３は本発明の分析用試薬組成物を用い、従来ＭＡＬＤＩ法では測定が困難なアセチルサリチル酸（ＡＳＡ）を微量成分として分析した結果を示すチャートである。
比較対象としてアセチルサリチル酸（ＡＳＡ）を一般的に用いられるマトリクスＴＨＡＰのみを用いて、従来法ＭＡＬＤＩにより測定した。その結果、ＡＳＡに関連したピークは観測できなかった（比較例１、図３のチャート（ａ））。
また、試薬を用いずにＡＳＡ単体の結晶を測定した場合でも、僅かにｍ/ｚ=２０３, ２１９にASAに不純物として混入したＮａ,Ｋが付着したピークが観測されるもののＡＳＡのピークは観測することが難しく、（比較例２、図３のチャート（ｂ））良好な分析が可能であるとは言えないことがわかる。
これに対して、Li置換ゼオライトを用いた本発明の分析用試薬組成物を用いた場合にはＡＳＡが観測できている（実施例６、図３のチャート（ｃ））のがわかる。
また、フェノバルビタール（睡眠薬）も従来ＭＡＬＤＩ法では全く検出できない試料だが、ｍ/ｚ=２３９にＬｉ付加体として極めて強く観測できている（実施例７、図３のチャート（ｃ））。
【００３７】
図４は本発明の分析用試薬組成物において用いられる酸化物固体のアルカリ金属原子を比較した結果を示すチャートである。
試料として従来ＭＡＬＤＩ法では測定が困難なＡＳＡを用いた。比較例１のチャート（図４のチャート（ａ））に比して、Na置換ゼオライを酸化物固体として用いた場合（実施例８、図４のチャート（ｂ）、ｍ/ｚ=２０３，２２５）及びK置換ゼオライトを酸化物固体として用いた場合にＡＳＡが観測できている（実施例９、図４のチャート（ｃ）、ｍ/ｚ=２１９，２５７）のがわかる。
【００３８】
図１から図４に示す結果から明らかなように、  本発明の分析用試薬組成物及びこれを用いた分析方法は、従来の分析方法では分析不可能であった物質に対しても有効なものであり、高感度な質量分析方法であることがわかる。
【産業上の利用可能性】
【００３９】
本発明の分析用試薬組成物及びこれを用いた分析方法は、
従来方法で検出できなかった微量試料の分析を行うことができるため、各種の分析を要する農業分野、輸出入管理、安全防犯分野等種々分野において活用可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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