(57)【要約】      （修正有）【課題】コレラ毒素（CT）の標的細胞への結合を担うＢ−サブユニット（CTB）を標的として新規なCT阻害ペプチド及びコレラ治療薬の提供。【解決手段】３つのリジン（Lys）が結合して形成された分子核構造の端部に位置する４つのアミノ基の各々に、特定の配列のペプチドモチーフのうちのいずれか１種が、直接またはスペーサーを介して結合したCT阻害４価ペプチドとする。Ｎ末端がアセチル化されているＣＴ阻害４価ペプチド。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
コレラ毒素に結合して毒性を阻害するCT阻害４価ペプチドであって、３つのリジン（Lys）が結合して形成された分子核構造の端部に位置する４つのアミノ基の各々に、配列番号１〜６のペプチドモチーフのうちのいずれか１種が、直接またはスペーサーを介して結合していることを特徴とするCT阻害４価ペプチド。
【請求項２】
N末端がアセチル化されていることを特徴とする請求項１のCT阻害４価ペプチド。
【請求項３】
請求項１または２のCT阻害４価ペプチドを含有することを特徴とするコレラ治療薬。 
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、CT阻害４価ペプチドおよびコレラ治療薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
これまでに本発明者らは、クラスター効果に基づく強い相互作用を阻害する新技術、多価型ペプチドライブラリー法を開発し、腸管出血性大腸菌（Enterohaemorrhagic E.coli; EHEC）が産生するShiga toxin (Stx)を標的として、一連の新規Stx阻害ペプチドを開発している（特許文献１、２）。さらに、本発明者らは、この多価型ペプチドライブラリーを応用したスクリーニング方法も開発している。具体的には、配列既知のペプチドをクラスター効果が発揮できるよう多価形の形状で、１枚のセルロースシート上に多数スポット合成し、このシート上にスポット合成された多価型ペプチドを、Stx1aのBサブユニットグロボ３糖結合部位、サイト２との高親和性結合を指標にスクリーニングすることにより、１１種の新規なStx1a阻害ペプチドを開発している（特許文献３）。
【０００３】
一方、コレラはコレラ菌を原因菌とする感染症であり、発展途上国を中心として世界各地に蔓延していることから世界レベルでの対応が求められている疾患である。この疾患は激しい水溶性下痢を主症状とし、補液等の適切な処置がなされなければ高い確率で死に至る。現在コレラ菌に対するワクチン開発が積極的に進められているが、その一方で、コレラ菌の多くが複数種の抗生物質に対して急速に耐性を獲得しつつあることから、新たな治療薬の開発が急務である。
【０００４】
コレラ菌の主要な病原因子は本菌が産生するコレラ毒素（Cholera toxin; 以下CTと記載する）である。CTはAB5型の毒素であり、タンパク質のADP-リボシル化酵素であるA-サブユニット１分子と，標的細胞上に存在する受容体を認識して結合し、その後A-サブユニットを細胞内に輸送する役割を担うB-サブユニット（CTB）５量体から構成されている。細胞内に侵入したA-サブユニットはGTP結合タンパク質であるGαをADP-リボシル化し、活性化状態に保持することによって、チャネルを介したイオンならびに水の持続的な流出を引き起こす。標的細胞上に存在するCT受容体は糖脂質の１種である、ガングリオシドGM1であることが知られている。CTB１分子はGM1の末端糖鎖部を特異的に認識し、従ってCTB５量体は最大５分子のGM1を結合しうる。この５：５の結合によって結合親和性は著しく増加することが知られており、この現象はクラスター効果と呼ばれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】WO2006／001542号公報
【特許文献２】特開2011‐079808号公報
【特許文献３】特開2011‐158341号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
このように、これまでの研究においては、主にStx阻害ペプチドの開発に多価型ペプチドライブラリー法が用いられてきたが、CTに対する阻害ペプチドについての検討は必ずしも十分になされていなかった。
【０００７】
本発明は、CTの標的細胞への結合を担うCTBを標的として、CT阻害ペプチドおよびコレラ治療薬を開発することを課題としている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記の課題を解決するために、本発明のCT阻害４価ペプチドは、コレラ毒素に結合して毒性を阻害するCT阻害４価ペプチドであって、３つのリジン（Lys）が結合して形成された分子核構造の端部に位置する４つのアミノ基の各々に、配列番号１〜６のペプチドモチーフのうちのいずれか１種が、直接またはスペーサーを介して結合していることを特徴としている。
【０００９】
このCT阻害４価ペプチドでは、N末端がアセチル化されていることが好ましい。
【００１０】
本発明のコレラ治療薬は、前記CT阻害４価ペプチドを含有することを特徴としている。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のコレラ毒素阻害４価ペプチドおよびこれを含有するコレラ治療薬によれば、CTに対して高い結合親和性で結合して、細胞毒性を効果的に阻害することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】野生型CTBおよびCTB-E51AのGM1結合活性の評価の結果を示す図である。
【図２】スクリーニングに使用した多価型ペプチドライブラリーの構造を示す図である。
【図３】多価型ペプチドライブラリーによるスクリーニングの結果を示す図である。上段から順番に１次、２次、３次ライブラリーそれぞれの構造と、各ライブラリーを用いてスクリーニング行なった結果を示す。図中のposition番号は、各ライブラリーのdegenerate positionのN末側からの位置を示す。
【図４】GGR-tetならびにMA-tetのCTB、CTB-E51Aに対する結合活性を示す図である。
【図５】CT処理によるCHO細胞の形態変化に及ぼすGGR-tetならびにMA-tetの効果を示す図である。
【図６】セルロースシート上に合成した４価ペプチドの構造を例示した図である。
【図７】（Ａ）は、GGRHRRRの各ポジションをAla置換あるいはGlu置換したペプチドのシート合成を示した図である。シート上に合成された４価ペプチドは、それぞれMA-XXXXXXX-AU-の構造を有する。図に示す配列は-XXXXXXX-の部分の配列を示している。（Ｂ）は、各シートと標識WT-CTBまたは標識E51A-CTBの結合の放射活性を検出した様子を示した図である。
【図８】（Ａ）は、GGRHRRRのポジション1Gly、ポジション2Gly、ポジション7Argを各アミノ酸で置換したペプチドのシート合成を示した図である。（Ｂ）は、各シートと標識WT-CTBまたは標識E51A-CTBの結合の放射活性を検出した様子を示した図である。
【図９】（Ａ）は、GNRHRRRのポジション1Glyおよびポジション7Argを、GGRHRRLのポジション1Glyおよびポジション２Glyを、それぞれ各種アミノ酸で置換したペプチドのシート合成を示した図である。（Ｂ）は、各シートと標識WT-CTBまたは標識E51A-CTBの結合の放射活性を検出した様子を示した図である。
【図１０】YGR-tetのWT-CTB、E51A-CTBに対する結合活性を示す図である。
【図１１】GNR-tetのWT-CTB、E51A-CTBに対する結合活性を示す図である。
【図１２】CT処理によるCHO細胞の形態変化に及ぼすYGR-tetならびにGNR-tetの効果を示す図である。
【図１３】CTによるcAMP産生に及ぼすYGR-tetならびにGNR-tetの効果を示す図である。CT処理時の細胞内cAMP産生量を100％として表示している。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明のCT阻害４価ペプチドは、CTに高い結合親和性で結合することによって、CTの細胞毒性を阻害するものである。
【００１４】
本発明のCT阻害４価ペプチドは、３つのリジン（Lys）が結合して形成された分子核構造の端部に位置する４つのアミノ基の各々に、
以下のペプチドモチーフ；
配列番号１：Gly-Gly-Arg-His-Arg-Arg-Arg（GGRHRRR）
配列番号２：Tyr-Gly-Arg-His-Arg-Arg-Leu（YGRHRRL）
配列番号３：Gly-Asn-Arg-His-Arg-Arg-Gly（GNRHRRG）
配列番号４：Gly-Lys-Arg-His-Arg-Arg-Leu（GKRHRRL）
配列番号５：Arg-Gly-Arg-His-Arg-Arg-Leu（RGRHRRL）
配列番号６：Gly-Asn-Arg-His-Arg-Arg-Arg（GNRHRRR）
のうちのいずれか１種が結合したものである。
【００１５】
すなわち、本発明のCT阻害４価ペプチドは、例えば、以下の化学式、
【００１６】
【化１】
2014198711.tif 000003
【００１７】
において、分子核構造の端部に位置するXXXX部に、配列番号１〜６のペプチドモチーフのうちのいずれか１種が４つ組み込まれた４価ペプチドが例示される。
【００１８】
以下、配列番号１のペプチドモチーフを有するCT阻害４価ペプチドを「GGR-tet」、配列番号２のペプチドモチーフを有するCT阻害４価ペプチドを「YGR-tet」、配列番号３のペプチドモチーフを有するCT阻害４価ペプチドを「GNR-tet」と記載する場合がある。
【００１９】
また、上記化学式１では、分子核構造の両端に位置する４つのアミノ基の各々に、スペーサーが結合している形態を例示しているが、スペーサーを介さず、４つのアミノ基の各々に、直接、配列番号１のペプチドモチーフを結合させることもできる。スペーサーを結合させる場合、CT毒性に対する阻害活性を損なわないものであればよく、具体的な分子、長さは限定されない。スペーサーとしては、例えば、末端にアミノ酸を有する炭素数４〜１０程度の鎖長のものが好ましく、CT毒性阻害活性としては、特に上記化学式１中の「Ｕ」で示される、amino hexanoic acid [NH2-(CH2)5-COOH]（アミノカプロン酸）を好ましく例示することができる。また、スペーサーに含まれるアミノ酸としては、例えば、アラニン（Ａ）を例示することができる。
【００２０】
さらに、本発明のCT阻害４価ペプチドは、配列番号１のペプチドモチーフの各々の末端に修飾分子を有していることが好ましい。
【００２１】
また、ペプチドモチーフの末端にＮＨ２が露出するとプラス電荷になることから、電荷調節の観点からは、配列番号１〜６のペプチドモチーフの各々の末端に、修飾分子として、電荷がない分子、さらには、疎水性の分子を結合させることも考慮される。例えば、CT阻害４価ペプチド、またはこれを含有する治療薬を経口投与する場合、消化管内でのプロテアーゼによる分解を抑えるための安定化を目的として、末端のＮＨ２をアセチル基により保護することができる。これによって、本発明のCT阻害４価ペプチドは、CT毒性に対する阻害活性が増大する。このように、ペプチドモチーフの末端の修飾分子は適宜選択することができる。
【００２２】
なお、上記化学式１で例示するペプチドは、末端にＭＡ（Met−Ala）を有しているが、これは、後述の実施例において、スクリーニングの際に導入したものを例示しており、上記化学式１のＭＡは、本発明のCT阻害４価ペプチドにおいては必ずしも必要ではない。
【００２３】
そして、本発明のCT阻害４価ペプチドの作成方法は特に限定されず、公知の方法を適宜採用することができ、例えば、ペプチド合成装置等を利用するなどの方法によって作製することができる。
【００２４】
以上のとおり、本発明のCT阻害４価ペプチドは、配列番号１〜６のペプチドモチーフのうちのいずれか１種を４つ有する４価のペプチドであり、クラスター効果によって、CTに対して強い結合親和性を発揮し、効果的にCTの細胞毒性を阻害することができる。
【００２５】
そして、本発明のCT阻害４価ペプチドはCT阻害活性を有することから、このCT阻害４価ペプチドを含有する薬剤はコレラ治療薬となる。
【００２６】
コレラ治療薬には、上記CT阻害４価ペプチド以外に、任意の製薬上許容される担体、賦形剤または安定化剤と混合することにより調製され保存することができる。
【００２７】
許容される担体、賦形剤、または安定化剤は、用いられる用量および濃度において患者に非毒性であることを条件として、剤形や投与経路に応じて適宜に選択することができる。
【００２８】
具体的には、例えば、リン酸、クエン酸、および他の有機酸などのバッファー；アスコルビン酸およびメチオニンを含む酸化防止剤；防腐剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロライド；ヘキサメトニウムクロライド；ベンズアルコニウムクロライド；ベンズエトニウムクロライド；フェノール；ブチルまたはベンジルアルコール；メチルまたはプロピルパラベン等のアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３-ペンタノール；およびｍ-クレゾールなど）；低分子量ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリシン等のアミノ酸；グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む単糖類、二糖類、および他の炭水化物EDTA等のキレート剤、スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Zn-タンパク質錯体）、ポリエチレングリコール（PEG）などの非イオン性界面活性剤などを例示することができる。
【００２９】
なお、体内に投与される薬剤は無菌であることが望ましい。また、徐放性製剤を調製してもよい。徐放性製剤の好適な例は、固体疎水性ポリマーの半透性マトリクス（例えば、フィルム、またはマイクロカプセルの形状）である。除放性マトリクスの例は、ポリエステルヒドロゲル（例えば、ポリ(２-ヒドロキシエチル-メタクリレート)またはポリ(ビニルアルコール)）、ポリアクチド（米国特許第3,773,919号）、Ｌ-グルタミン酸およびγ-エチル-Ｌ-グルタメート、非分解性エチレン-酢酸ビニル、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、ポリ-(Ｄ)-３-ヒドロキシブチル酸などを例示することができる。
【００３０】
このようにして製剤化したコレラ治療薬は、例えば、症状に応じて、経口投与、局所投与、あるいは静脈等を介して全身投与することができるが、CTは腸管内で産生されること、また標的となる細部は主に腸管上皮細胞であることから、経口投与が特に好ましい。この場合、消化管でのプロテアーゼによる分解を受けないように、本発明のCT阻害４価ペプチドに適宜な修飾を施すことが好ましい。具体的には、本発明のCT阻害４価ペプチドのN末端をアセチル化することが好ましく、これによって、経口投与時の治療効果を格段に高めることができる。
【００３１】
また、本発明のコレラ治療薬の投与量は、患者の体重、症状等に応じて決定することができ、例えば、１回当たり約５〜１００mg／Kg、目安としては、約５〜１０mg／Kg程度を目安とすることができる。
【００３２】
本発明の治療薬は、CT阻害４価ペプチドを含有し、コレラの治療に有効利用することができる。CTを標的としたコレラ治療薬はコレラ菌自体に毒性を示さないために、耐性の問題がなく、現在急速に広がっている抗生物質に対する薬剤耐性の問題を克服できると期待される。さらに、本発明のCT阻害４価ペプチドに組み込まれるペプチド性化合物（ペプチドモチーフ）は、4価の核構造に順次アミノ酸を付加することにより合成でき、1価のペプチド合成と同様の手法にて簡便にバルク合成が可能である。
【実施例】
【００３３】
以下、実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。
【００３４】
＜実施例１＞スクリーニングに使用する野生型CTBならびにCTB変異体の作成
スクリーニングにはビーズに固定された状態でのCTBが大量に必要となる。そこで、CTB遺伝子のC末端側にHis-tagを導入した組み替えCTBを大腸菌発現系を用いて大量に調製し、Ni-ビーズを用いてビーズ上に固定化した。
【００３５】
受容体結合部位に変異を有するCTB変異体作成にあたっては、GM1の末端ガラクトース結合部位を標的とした。そして、CTBの結晶構造解析に関する知見から、Glu51がGM1の末端ガラクトースとの結合に関与していると推察し、このGlu51をAlaに置換した、CTB-E51Aを同様に大量調製した。
【００３６】
得られた野生型CTBおよび、CTB-E51Aの活性の評価は、GM1との特異的な結合をELISA法を用いて検討することによって行った。具体的には、ELISAプレートにphosphatidylcholine:GM1（またはasialo-GM1）=0.1:0.025 (μg/plate、GM1は2.5％)をコートし、ビーズから溶出させた各濃度の組み替えCTBを結合後、洗浄し、残存しているCTBを特異的抗体を用いて検出した。
【００３７】
図１に、野生型CTBおよびCTB-E51AのGM1結合活性の評価の結果を示す。図１中の「WT−GM1」は野生型CTBとGM1との結合活性を、「WT−AGM1」は野生型CTBとアシアロGM1との結合活性を、「E51A−GM1」はCTB-E51AとGM1との結合活性を、「E51A−AGM1」はCTB-E51AとアシアロGM1との結合活性を示している。なお、アシアロGM1は、GM1から末端シアル酸を除去した糖脂質である。
【００３８】
図１に示したように、野生型CTBは、濃度依存的に強くGM1に結合することが確認された。一方、野生型CTBは、アシアロGM1に対しては最大結合量が1/4に低下することが確認された。この結果から、野生型CTBは、GM1を特異的に認識していることが示された。
【００３９】
さらに、CTB-E51Aは、GM1に対して、野生型CTBとほぼ同程度の最大結合量を示すが、結合親和性は1/2に減弱することが確認された。また、CTB-E51Aは、アシアロGM1に対しては野生型CTBの場合と異なり、結合活性は著しく低下することが確認された。これは、アシアロGM1の場合には末端のシアル酸が存在しないために、CTBとの結合には末端ガラクトースが重要な役割を担うが、CTB-E51Aではこのガラクトースの認識に関わる部位が変異しているために、著しく結合活性が低下した、と考えられる。
【００４０】
以上のことから、CTB-E51Aは変異導入によって高次構造に大きな影響を受けることなく、GM1に対する末端ガラクトース依存的な結合能力が低下していることが確認できた。
【００４１】
＜実施例２＞多価型ペプチドライブラリー法を用いたE51特異的結合モチーフの同定
実施例１の結果を踏まえて、多価型ペプチドライブラリーによるスクリーニングは、CTB-E51Aに比べて野生型CTBに高い結合活性を示すことを指標に行った。このスクリーニングによって、E51依存的にCTBに結合するモチーフが取得できると推察された。
【００４２】
スクリーニングに使用する多価型ペプチドライブラリーの構造を図２に示す。図中M, A, UはそれぞれMet, Ala, アミノカプロン酸を示す。XXXXはライブラリー部を示し、X (degenerate position)はCys以外の19種のアミノ酸の混合物を使用して合成を行ったことを示す。
【００４３】
まず１次ライブラリーとして、ライブラリー部が、XXXX（degenerate position が４つ）の多価型ペプチドライブラリーを用いてスクリーニングを行った。まず、各CTB固定化ビーズ（CTB量で250μg）と多価型ペプチドライブラリー（300μg）を200μlのPBS中で４℃、18時間インキュベートした。ビーズを洗浄後、30 %酢酸でCTBに結合したペプチドを溶出し、回収後、N末端側から順次アミノ酸シークエンスを行った。
【００４４】
各degenerate positionについて、検出された19種のアミノ酸の量比を算出し、その和が１９になるように補正した。さらに、各アミノ酸について、野生型CTBを用いた場合に得られた値を、CTB-E51Aを用いた場合に得られた値で割ってその比を算出し、改めてすべてのアミノ酸についての値の和が１９になるように補正した。したがって、仮に野生型CTBとCTB-E51Aとの間で各アミノ酸の選択性に差がなければその値は全て１となる。選択性の指標として、この値が1.2を超えた場合に野生型CTBに対して強い選択性がみられたと判断することとした。
【００４５】
１次ライブラリーによるスクリーニングの結果、４カ所のすべてdegenerate positionについて、塩基性アミノ酸が選択されること、特にArgが頻度高く選択されることが示された（図３上段）。
【００４６】
そこで、２次ライブラリーとして、Argを中心に導入し、その両側に３つのdegenerate positionを導入したものを作成し（図３中段）、２次ライブラリーによるスクリーニングを行ったところ、すべてのpositionで塩基性のアミノ酸が選択されること、特に固定化したArgの+2のpositionでのArgの選択性が最も高いことが示された（図３中段）。
【００４７】
そこで、RXRのモチーフを中心に持つ３次ライブラリーを作成し（図３下段）、３次ライブラリーによるスクリーニングを行い、最終的に各positionで最も強く選択されたアミノ酸を並べたモチーフ、GGRHRRR（配列番号１）を同定した（図３下段）。
【００４８】
＜実施例３＞GGR-tetのCTB結合能の評価
実施例２で同定した配列番号１のモチーフ：Gly-Gly-Arg-His-Arg-Arg-Arg（GGRHRRR）を、図２に示す多価型ペプチドライブラリーのXXXX部に組み入れた４価ペプチド（ペプチド性化合物）を合成した。以下、この４価ペプチドを「GGR-tet」（tetはテトラマーの意味）と記載する。また、negative controlとして、図２に示す多価型ペプチドライブラリーのXXXX部のみが欠損し、その他の構造は全て保持しているペプチド性化合物、MA-tetもあわせて合成した。
【００４９】
GGR-tetおよびMA-tetの、野生型CTB、CTB-E51Aそれぞれに対する結合活性をELISA法にて検討した。具体的には、ELISAプレートに各濃度のGGR-tetならびにMA-tetをコートし、CTB(1.0μg/ml)あるいはCTB-E51A (1.0μg/ml)を結合後、洗浄し、残存しているCTBあるいはCTB-E51Aを抗CTB抗体を用いて検出した。
【００５０】
結果を図４に示す。図４中の「GGR-tet  WT−CTB」は、GGR-tetと野生型CTBとの結合活性を、「GGR-tet  E51A−CTB」は、GGR-tetとCTB-E51Aとの結合活性を、「MA-tet  WT−CTB」は、MA-tetと野生型CTBとの結合活性を、「MA-tet  E51A−CTB」」は、MA-tetとはCTB-E51Aとの結合活性を示している。
【００５１】
その結果、MA-tetは、野生型CTBおよびCTB-E51Aのいずれに対して結合活性を全く示さないことが確認された。
【００５２】
GGR-tetは、野生型CTBに対して濃度依存的に強い結合活性を示すことが確認された。一方、GGR-tetは、CTB-E51Aに対しては濃度依存的に結合活性を示すものの、その最大結合活性はCTBの場合に比べて約1/2に低下していることが確認された。このことから、GGR-tetは、E51依存的にCTBに結合していることが明らかとなった。
【００５３】
＜実施例４＞GGR-tetのCT阻害能の評価
CHO細胞はCT処理によって形態が著しく変化し、紡錘形を示すようになることが知られている。本系は簡便かつ幅広く用いられているCT活性評価系である。そこで、CT処理によって誘導されるCHOの形態変化に及ぼすGGR-tetの効果を検討した。
【００５４】
GGR-tetおよびMA-tetの（30,100μg/ml）存在あるいは非存在下、CHO細胞を0.5 μg/mlのCTで処理し、３時間37℃インキュベート後の細胞形態の変化を、顕微鏡下で観察した。１処理あたり、約３００個の細胞を観察し、形態が著しく伸展し、紡錘形を示すと認められる細胞の割合を算出した。無処理の細胞では、紡錘形を示す細胞の割合は10%程度に止まるのに対し、CT処理を行うと、その割合は60%以上に増加する。
【００５５】
このとき、構造中になんのモチーフも持たないMA-tetを共存させてもその割合にはほとんど影響を与えないのに対し、GGR-tetを共存させた場合、容量依存的に紡錘形を示す細胞の割合が減少し、100μg/mlでは38%以下にまで減少することが確認された。
【００５６】
このことは、GGR-tetがE51を標的としてCTの受容体結合部位に結合することにより、CTのCHOに対する作用を阻害したことを示している。
【００５７】
以上の実施例に示した通り、CTBの受容体結合部位を標的として、多価型ペプチドライブラリースクリーニングを行うことにより、新規CTB結合モチーフ（配列番号１）を同定し、このモチーフを分子内に４個有する４価ペプチド（ペプチド性化合物）：GGR-tetは、高い親和性でCTBに結合し、CTの標的細胞に対する作用を効率よく阻害することが確認された。したがって、GGR-tetを有効成分として含有することで、コレラ治療薬（CT阻害薬）として利用することができることが明らかになった。
【００５８】
＜実施例５＞多価型ペプチドシート合成技術を用いたCTB結合モチーフの同定  GGR-tetによるCT阻害効果が確認されたことから、GGR-tetのペプチドモチーフ（GGRHRRR）をベースとして、より結合力と阻害効果に優れたモチーフの取得を試みた。
【００５９】
まず、GGRHRRRモチーフのうち、どのアミノ酸がCTBとの結合に必須なのかを同定するため、各ポジションのアミノ酸をAla置換したもの、さらに塩基性アミノ酸については電荷が異なるGlu置換を行ったもの、それぞれのペプチドをクラスター効果が発揮できるように、４価ペプチドとしてシート上に合成し、WT-CTBならびにE51A-CTBとの結合に及ぼす影響を検討した。
【００６０】
シート上に４価ペプチドを合成する方法は、本発明者によって提案されている特開２０１１−１５８３４１号公報に記載の手順に沿って行った。具体的には、合成に際しては、intavis AG社のスポットペプチドシンセサイザーを使用した。まずセルロースシート（Intavis AG社）上に存在するアミノ基に対して、Fmoc-βAla、続いてFmoc-アミノカプロン酸を反応させ、十分なスペーサー長を確保した。次にペプチド鎖を４価に分岐させるために、FmocLys(Fmoc)を２回連続で反応させ、形成された４個のアミノ基に対して均等にそれ以降の配列を与えるよう伸長反応を行った。この操作により、セルロースシート上に合成される４価ペプチドは図２に示す多価型ペプチドライブラリーの核構造と同一の核構造を有することになる（図６）。以上の操作により、シート上にスポット合成された各４価ペプチドが持つモチーフの配列と、シート上での位置情報を図７（Ａ）に示す。
【００６１】
さらに、４価ペプチド性化合物がスポット合成されたシートを5% Skim Milk Powderを用いてブロッキング後、125I-His-標識WT-CTB（1μg/ml）または125I-His-標識E51A-CTB（1μg/ml）と、それぞれ4℃、１時間インキュベーション後、洗浄し、BAS-2500にてシート上に結合した放射活性を検出し（図７（Ｂ））、定量解析を行った（表１）。  具体的には、標識WT-CTBでブロットした場合、ならびに標識E51A-CTBでブロットした場合、それぞれについて各スポットの濃さ（PSL）を定量し、各スポットのPSL値の総計がスポットの数である19になるように補正表示した。すなわち、各化合物の間で結合に差が全く存在しない場合には、値は全て1.0となる。また、結合特異性を示す指標として、補正後のWT-CTBへの結合量（WT-CTB結合力）を、補正後のE51A-CTBへの結合量（E51A-CTB結合力）で割った値、WT-CTB/E51A-CTB（結合比）を算出し、この値についても総計が19になるように補正して表示した。さらに、WT-CTBへの結合力、ならびに結合比、双方に優れていることを示す指標として、補正後のWT-CTBへの結合量と補正後の結合比をかけた値（WT-CTB結合力×結合比）を用いた。
【００６２】
結果を表１に示す。
【００６３】
【表１】
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【００６４】
表１に示したように、特にN末端から3番目から6番目のアミノ酸をそれぞれAla置換すると、GGRHRRRに比べWT-CTBへの結合量が低下すること、またGGRHRRRに存在しているいずれの塩基性アミノ酸をGluに置換してもWT-CTBへの結合量が低下すること、が明らかとなった。
【００６５】
さらに、GGRHRRRに存在している４つのArgのうちどの２つをAlaに置換してもWT-CTBへの結合量が低下すること、が明らかとなった。一方で、N末端から１番目、２番目、７番目のアミノ酸をAlaに置換しても大きな結合力の低下はみられない。さらに、この３つのアミノ酸置換体については、いずれも高いWT-CTB/E51A-CTB値（結合比）、ならびにWT-CTB結合力×結合比の値を示していた。以上の結果は、N末端側から3番目から6番目のアミノ酸、RHRRはWT-CTBとのE51特異的な結合に必須の役割を果たしていること、一方でN末端から１番目、２番目、７番目のアミノ酸は他のアミノ酸に置換可能であることを示している。  そこで次に、GGRHRRRモチーフ中のRHRRを固定し、N末端から１番目、２番目、７番目のアミノ酸を順次Cysを除く19種のアミノ酸でシャッフルしたペプチドを４価体としてスポット合成し、同様の検討を行った（図８（Ａ）（Ｂ））。定量解析を行った結果を表２に示す。表２では、各スポットのPSL値の総計がスポットの数である56になるように補正表示した。また、結合特異性を示す指標として、補正後のWT-CTBへの結合量（WT-CTB結合力）を、補正後のE51A-CTBへの結合量（E51A-CTB結合力）で割った値、WT-CTB/E51A-CTB（結合比）を算出し、この値についても総計が56になるように補正して表示した。さらに、WT-CTBへの結合力、ならびに結合比、双方に優れていることを示す指標として、補正後のWT-CTBへの結合量と補正後の結合比をかけた値（WT-CTB結合力×結合比）を用いた。結果はWT-CTB結合力の強い順に表示している。
【００６６】
【表２】
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【００６７】
表２に示したように、WT-CTBへの結合量が高いものの上位５種（WT-CTB結合力1.25以上）を選択したところ、いずれのペプチドも、高いWT-CTB結合力×結合比の値（1.48以上）を示すことが明らかとなった。すなわち、これらのペプチドはWT-CTBへの結合力ならびに結合特異性、いずれにも優れていることを示している。
【００６８】
そこで、この５種の中から、GNRHRRRならびにGGRHRRLの２種を選択し、GNRHRRRについてはポジション1Glyおよびポジション7Argを、GGRHRRLについてはポジション1Glyおよびポジション2Glyを、それぞれ各種アミノ酸で置換し、同様の検討を行った（図９）。定量解析を行った結果を表３に示す。表３では、各スポットのPSL値の総計がスポットの数である76になるように補正表示した。また、結合特異性を示す指標として、補正後のWT-CTBへの結合量（WT-CTB結合力）を、補正後のE51A-CTBへの結合量（E51A-CTB結合力）で割った値、WT-CTB/E51A-CTB（結合比）を算出し、この値についても総計が76になるように補正して表示した。さらに、WT-CTBへの結合力、ならびに結合比、双方に優れていることを示す指標として、補正後のWT-CTBへの結合量と補正後の結合比をかけた値（WT-CTB結合力×結合比）を用いた。結果はWT-CTB結合力×結合比の値の高い順に表示した。
【００６９】
【表３】
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【００７０】
その結果、WT-CTBへの結合力、ならびに結合比、双方に優れていることを示す指標である、WT-CTB結合力×結合比の値の最も高いものから５種（1.7以上）に着目した。これら５種のペプチド、
配列番号２：Tyr-Gly-Arg-His-Arg-Arg-Leu（YGRHRRL）
配列番号３：Gly-Asn-Arg-His-Arg-Arg-Gly（GNRHRRG）
配列番号４：Gly-Lys-Arg-His-Arg-Arg-Leu（GKRHRRL）
配列番号５：Arg-Gly-Arg-His-Arg-Arg-Leu（RGRHRRL）
配列番号６：Gly-Asn-Arg-His-Arg-Arg-Arg（GNRHRRR）
はいずれも高いWT-CTB結合力（1.25以上）を示していた。
【００７１】
＜実施例６＞YGR-tet、GNR-tetのCTB結合能の評価  実施例５で着目した５種のペプチドなかから、YGRHRRL（配列番号２）、GNRHRRG（配列番号３）の２種を新規CTB結合モチーフとして選択し、以下の検討に使用した。すなわち、YGRHRRL（配列番号２）およびGNRHRRG（配列番号３）のモチーフを、図２に示す多価型ペプチドライブラリーの４つのXXXX部に組み入れ、４価のペプチド性化合物を合成した（以下、YGR-tet、GNR-tetと記載する）。なお、negative controlとして、図２に示す多価型ペプチドライブラリーのXXXX部のみが欠損し、その他の構造は全て保持しているペプチド性化合物、MA-tetもあわせて合成した。
【００７２】
そして、YGR-tetならびにGNR-tetの、WT-CTB、E51A-CTBそれぞれに対する結合活性をELISA法にて検討した（図１０、図１１）。具体的には、ELISAプレートに各濃度のYGR-tet（図１０）あるいはGNR-tet（図１１）をコートし、CTB(1.0μg/ml)あるいはCTB-E51A (1.0 μg/ml)を結合後、洗浄し、残存しているWT-CTBあるいはE51A-CTBを抗CTB抗体を用いて検出した。
【００７３】
その結果、YGR-tet、GNR-tetともにWT-CTBに対して濃度依存的に強い結合活性を示すが、E51A-CTBに対しては結合活性が減弱していること、特にGNR-tetはほとんどE51A-CTBに結合しないことが確認された。すなわち、YGR-tetおよびGNR-tetは、優れた結合部位特異性を示すことが明らかとなった。
【００７４】
＜実施例７＞CTによるCHO細胞の形態変化誘導に対するYGR-tet、GNR-tetの阻害効果
実施例４と同様に、CTによるCHO細胞の形態変化誘導に対するYGR-tet、GNR-tetの阻害効果を検討したところ、いずれもGGR-tetよりも強い阻害効果を示すことが明らかとなった（図１２）。
【００７５】
＜実施例８＞CTによるCaco-2細胞でのcAMP産生に対するYGR-tet、GNR-tetの阻害効果  CTが腸管上皮細胞上の受容体を介して取り込まれると、逆行輸送を経由して、細胞質内にAサブユニットが運び込まれる。A-サブユニットはGTP結合タンパク質であるGsをADP-リボシル化し、活性化状態に保持することによってアデニレートシクラーゼを活性化する。その結果、細胞内のcAMP濃度が増加し、cAMP依存的なAキナーゼが活性化し、イオンチャネルをリン酸化することによって活性化する。その結果、Clイオンが流出し、浸透圧に従って大量の水が流出し、下痢を引き起こす。そこで、ヒト結腸がん由来細胞株であるCaco-2細胞を用いて、CTによるcAMP産生に対するYGR-tet、GNR-tetの阻害効果を検討することにした。
【００７６】
具体的には、上皮細胞様に分化させたCaco-2細胞を、YGR-tet、GNR-tet（30,100 μg/ml）存在あるいは非存在下で、30分37℃インキュベート後、1.0 μg/mlのCTを加え3時間37℃インキュベート後、細胞ライセートを調製した。PerkinElmer社のcAMP Alpha Screen Kitを用いて、各ライセート中のcAMP 産生量を測定した。
【００７７】
その結果、CT処理によりcAMPの顕著な増加（1.4nmol/mg protein）が観察されること、その一方、YGR-tetならびにGNR-tetともに容量依存的にこのcAMP産生を抑制すること、特に100μg/mlではYGR-tetで69 ％、GNR-tetで54 ％にまで低下することが示された（図１３）。
【図３】
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【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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