(57)【要約】【課題】ラウリン酸高含有油脂を高生産することができる組換え細胞の提供。【解決手段】アシルＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子と、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２−４をコードする遺伝子とが導入されている組換えクラミドモナス属細胞。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アシルＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子と、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２−４をコードする遺伝子とが導入されている組換えクラミドモナス属細胞であって、
当該アシルＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子が、以下の（ａ）〜（ｃ）：
（ａ）配列番号４に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号４に示すアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つＣ１２：０脂肪酸選択的アシルＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号４に示すアミノ酸配列において１または複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加または挿入されたアミノ酸配列を含み、且つＣ１２：０脂肪酸選択的アシルＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
からなる群より選択され、且つ
当該ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２−４をコードする遺伝子が、以下の（ｄ）〜（ｇ）：
（ｄ）配列番号８に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号８に示すヌクレオチド配列と７０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、且つジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｆ）配列番号８に示すヌクレオチド配列において１または複数個の塩基が欠失、置換、付加または挿入されたヌクレオチド配列からなり、且つジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；および
（ｇ）配列番号８に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
からなる群より選択される、組換えクラミドモナス属細胞。
【請求項２】
前記アシルＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子が、葉緑体に導入されている、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記アシルＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子が、以下の（ｈ）〜（ｋ）：
（ｈ）配列番号３に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｉ）配列番号３に示すヌクレオチド配列と７０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｊ）配列番号３に示すヌクレオチド配列において１または複数個の塩基が欠失、置換、付加または挿入されたヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；および、
（ｋ）配列番号３に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド
からなる群より選択される、請求項２記載の組換えクラミドモナス属細胞。
【請求項４】
前記ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２−４をコードする遺伝子が、Chlamydomonas reinhardtii由来の遺伝子である、請求項１〜３のいずれか１項記載の組換えクラミドモナス属細胞。
【請求項５】
前記アシルＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子が、Umbellularia californica由来の遺伝子である、請求項１〜４のいずれか１項記載の組換えクラミドモナス属細胞。
【請求項６】
クラミドモナス属細胞に、アシルＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子と、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２−４をコードする遺伝子とを導入する工程を含む、組換えクラミドモナス属細胞の製造方法であって
当該アシルＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子が、以下の（ａ）〜（ｃ）：
（ａ）配列番号４に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号４に示すアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つＣ１２：０脂肪酸選択的アシルＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号４に示すアミノ酸配列において１または複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加または挿入されたアミノ酸配列を含み、且つＣ１２：０脂肪酸選択的アシルＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
からなる群より選択され、且つ
当該ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２−４をコードする遺伝子が、以下の（ｄ）〜（ｇ）：
（ｄ）配列番号８に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号８に示すヌクレオチド配列と７０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、且つジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｆ）配列番号８に示すヌクレオチド配列において１または複数個の塩基が欠失、置換、付加または挿入されたヌクレオチド配列からなり、且つジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；および
（ｇ）配列番号８に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
からなる群より選択される、方法。
【請求項７】
前記アシルＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子が、葉緑体に導入される、請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記アシルＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子が、以下の（ｈ）〜（ｋ）：
（ｈ）配列番号３に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｉ）配列番号３に示すヌクレオチド配列と７０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｊ）配列番号３に示すヌクレオチド配列において１または複数個の塩基が欠失、置換、付加または挿入されたヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；および、
（ｋ）配列番号３に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド
からなる群より選択される、請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２−４をコードする遺伝子が、Chlamydomonas reinhardtii由来の遺伝子である、請求項６〜８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
前記アシルＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子が、Umbellularia californica由来の遺伝子である、請求項６〜９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
請求項１〜５のいずれか１項記載の組換えクラミドモナス属細胞を用いる、ラウリン酸含有油脂の製造方法。
【請求項１２】
請求項１〜５のいずれか１項記載の組換えクラミドモナス属細胞により製造された油脂を用いる、ラウリン酸の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換えクラミドモナス属及びそれを用いたラウリン酸高含有油脂の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ラウリン酸は、界面活性剤や、石鹸、シャンプーなどの原料として一般的に使用されている脂肪酸であり、ヤシ油およびパーム核油から主に製造される。しかし、ヤシ油およびパーム核油の原料であるココナツやアブラヤシは、限られた地域でしか栽培できないため、十分な量を確保することが難しい。ココナツやアブラヤシ以外のラウリン酸の原料を開発することが求められている。
【０００３】
近年、藻類を利用した油脂生産技術が注目されている。藻類は、成長が早いこと、容易に培養できること、ＣＯ2の固定化効率が高いこと、生産された油脂を容易に回収できること、培養や油脂回収に係るコストが低いことなどから、有用な油脂供給源である。
【０００４】
さらに最近、油脂生産性が向上するように遺伝的に改変された藻類が知られている。特許文献１には、脂肪酸アシルＡＣＰチオエステラーゼ、脂肪酸アシルＣｏＡ還元酵素、脂肪酸アルデヒド還元酵素、脂肪酸アシルＣｏＡ／アルデヒド還元酵素、脂肪酸アルデヒドデカルボキシラーゼおよびアシル担体タンパク質を備える群から選択される一つまたは複数のタンパク質をコードする外来遺伝子を導入した石油生産微生物が開示されている。
【０００５】
アシルＡＣＰチオエステラーゼは、葉緑体中でアシル−ＡＣＰのチオエステル結合を加水分解して脂肪酸を生成させる酵素である。アシルＡＣＰチオエステラーゼには、脂肪酸の鎖長に対する特異性が異なる種々のタイプが存在する。特定の鎖長に特異的なアシルＡＣＰチオエステラーゼを導入した細胞で、特定の鎖長の脂肪酸を選択的に合成させることができる。例えば、特許文献２には、維管束のない光合成微生物にアシルＡＣＰチオエステラーゼを導入することにより、当該微生物のＣ１０〜Ｃ１８脂肪酸の生産性を向上させる方法が開示されている。また特許文献３には、鎖長Ｃ８〜Ｃ１４のアシル−ＡＣＰを特異的に加水分解するアシルＡＣＰチオエステラーゼをコードする外来遺伝子を導入した組換えプロトテカ属細胞が開示されている。
【０００６】
藻類は、一般に、トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）として油脂を蓄積する。ＴＡＧは、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）によるアシル化により、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）から変換される。ＤＧＡＴには複数のタイプが存在することが知られている。例えば、Chlamydomonas reinhardtiiには、ＤＧＡＴ１、および４種類のＤＧＡＴ２（ＤＧＡＴ２−１、ＤＧＡＴ２−２、ＤＧＡＴ２−３、ＤＧＡＴ２−４）が存在していること知られており、ＤＧＡＴ２−１〜３は、窒素欠乏条件化でｍＲＮＡ量が増加することが報告されている（非特許文献１）。特許文献４には、ＤＧＡＴ２を過剰発現させたC.reinhardtiiを用いてＴＡＧを製造する方法が開示されている。特許文献５には、脂質合成抑制遺伝子が破壊または機能低下しているとともにSaccharomyces cerevisiaeのＤＧＡ１遺伝子が導入された、高脂質生産性微生物が開示されている。特許文献６には、Thalassiosira pseudonanaのＤＧＡＴ２遺伝子を植物に導入することによる当該植物の超長鎖多価不飽和脂肪酸の量を変化させる方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開公報第２００８／１５１１４９号
【特許文献２】国際公開公報第２０１０／０１９８１３号
【特許文献３】国際公開公報第２０１０／０６３０３２号
【特許文献４】国際公開公報第２０１１／１５６５２０号
【特許文献５】特開２００７−２０９２４０号公報
【特許文献６】国際公開公報第２００９／０８５１６９号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Plant Physiol., 2010, 154:1737-1752
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、ラウリン酸を高生産することができる組換えクラミドモナス属およびその製造方法、ならびに当該組換えクラミドモナス属を用いたラウリン酸高含有油脂の製造方法に関する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、ラウリン酸を効率良く生産することができる組換え細胞の開発を進めた。その結果、本発明者は、特定のアシルＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子と、特定のジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２−４（ＤＧＡＴ２−４）をコードする遺伝子とを組み合わせて導入した組換えクラミドモナス属細胞が、当該アシルＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子を単独で導入した組換えクラミドモナス属細胞と比較して、ラウリン酸を効率よく生産することを見出し、本発明を完成した。
【００１１】
すなわち本発明は、以下を提供する、
アシルＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子と、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２−４をコードする遺伝子とが導入されている組換えクラミドモナス属細胞であって、
当該アシルＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子が、以下の（ａ）〜（ｃ）：
（ａ）配列番号４に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号４に示すアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つＣ１２：０脂肪酸選択的アシルＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号４に示すアミノ酸配列において１または複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加または挿入されたアミノ酸配列を含み、且つＣ１２：０脂肪酸選択的アシルＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
からなる群より選択され、且つ
当該ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２−４をコードする遺伝子が、以下の（ｄ）〜（ｇ）：
（ｄ）配列番号８に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号８に示すヌクレオチド配列と７０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、且つジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｆ）配列番号８に示すヌクレオチド配列において１または複数個の塩基が欠失、置換、付加または挿入されたヌクレオチド配列からなり、且つジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；および
（ｇ）配列番号８に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
からなる群より選択される、組換えクラミドモナス属細胞。
【００１２】
また本発明は、以下を提供する、
クラミドモナス属細胞に、アシルＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子と、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２−４をコードする遺伝子とを導入する工程を含む、組換えクラミドモナス属細胞の製造方法であって
当該アシルＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子が、以下の（ａ）〜（ｃ）：
（ａ）配列番号４に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号４に示すアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つＣ１２：０脂肪酸選択的アシルＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号４に示すアミノ酸配列において１または複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加または挿入されたアミノ酸配列を含み、且つＣ１２：０脂肪酸選択的アシルＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
からなる群より選択され、且つ
当該ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２−４をコードする遺伝子が、以下の（ｄ）〜（ｇ）：
（ｄ）配列番号８に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号８に示すヌクレオチド配列と７０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、且つジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｆ）配列番号８に示すヌクレオチド配列において１または複数個の塩基が欠失、置換、付加または挿入されたヌクレオチド配列からなり、且つジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；および
（ｇ）配列番号８に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
からなる群より選択される、方法。
【００１３】
また本発明は、上記組換えクラミドモナス属細胞を用いるラウリン酸含有油脂の製造方法を提供する。
【００１４】
また本発明は、上記組換えクラミドモナス属細胞により製造された油脂を用いる、ラウリン酸の製造方法を提供する。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の組換えクラミドモナス属は高いラウリン酸生産能を有する。本発明の組換えクラミドモナス属を用いることによりラウリン酸高含有油脂を効率よく製造することが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】組換えクラミドモナス属に生産された脂肪酸中におけるラウリン酸の割合。
【図２】組換えクラミドモナス属に生産された脂肪酸中における各種脂肪酸の割合。
【図３】組換えクラミドモナス属の脂肪酸およびＴＡＧ生産量。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本明細書において、アミノ酸配列及びヌクレオチド配列の同一性（または配列同一性とも称される）は、Ｌｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法（Ｌｉｐｍａｎ，ＤＪ．，Ｐｅａｒｓｏｎ．ＷＲ．：Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７，１４３５−１４４１，１９８５）によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアＧｅｎｅｔｙｘ−Ｗｉｎ（ソフトウェア開発）のホモロジー解析（Ｓｅａｒｃｈ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ）プログラムを用いて、Ｕｎｉｔ  ｓｉｚｅ  ｔｏ  ｃｏｍｐａｒｅ（ｋｔｕｐ）を２として解析を行うことにより算出される。
【００１８】
本明細書において、別途定義されない限り、アミノ酸配列またはヌクレオチド配列におけるアミノ酸または塩基の欠失、置換、付加または挿入に関して使用される「１または複数個」とは、例えば、１〜５０個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個であり得る。また本明細書において、アミノ酸または塩基の「付加」には、配列の一末端および両末端への１〜数個のアミノ酸または塩基の付加が含まれる。
【００１９】
本明細書において、アミノ酸配列またはヌクレオチド配列における「相当する位置」または「相当する領域」は、目的アミノ酸配列を参照配列と比較し、各アミノ酸配列中に存在する保存アミノ酸残基に最大の相同性を与えるように配列を整列（アラインメント）させることにより決定することができる。アラインメントは、公知のアルゴリズムを用いて実行することができ、その手順は当業者に公知である。例えば、アラインメントは、上述のリップマン−パーソン法等に基づいて手作業で行うこともできるが、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗマルチプルアラインメントプログラム（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ，（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２，ｐ．４６７３−４６８０）をデフォルト設定で用いることにより行うことができる。Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗは、例えば、欧州バイオインフォマティクス研究所（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ：ＥＢＩ，[ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ]）や、国立遺伝学研究所が運営する日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ，[ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／Ｗｅｌｃｏｍｅ−ｊ．ｈｔｍｌ]）のウェブサイト上で利用することができる。
【００２０】
本明細書において、ハイブリダイゼーションに関する「ストリンジェントな条件」としては、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ  ＴＨＩＲＤ  ＥＤＩＴＩＯＮ（Ｊｏｓｅｐｈ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｄａｖｉｄ  Ｗ．Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２００１）記載の条件が挙げられ、例えば、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５Ｍ塩化ナトリウム、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、０．５％ＳＤＳ、５×デンハート及び１００ｍｇ／ｍＬニシン精子ＤＮＡを含む溶液にプローブとともに６５℃で８〜１６時間恒温し、ハイブリダイズさせる条件であり得る。
【００２１】
本明細書において、遺伝子の上流及び下流とは、それぞれ、対象として捉えている遺伝子または領域の５’側及び３’側に続く領域を示す。別途定義されない限り、遺伝子の上流及び下流とは、遺伝子の翻訳開始点からの上流領域及び下流領域には限定されない。
【００２２】
本明細書において、タンパク質またはポリペプチドの「Ｃ１２：０脂肪酸選択的アシルＡＣＰチオエステラーゼ活性」とは、葉緑体中でアシル−ＡＣＰのチオエステル結合を加水分解してＣ１２脂肪酸を選択的に合成する活性をいう。
【００２３】
本明細書において、タンパク質またはポリペプチドの「ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性」とは、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）をアシル化してトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）に変換する活性をいう。
【００２４】
本発明の組換えクラミドモナス属細胞は、親クラミドモナス属細胞に、アシルＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子と、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２−４をコードする遺伝子とを導入することによって作製される。
【００２５】
本発明の組換えクラミドモナス属細胞の親株となるクラミドモナス属細胞としては、任意のクラミドモナス属細胞であればよいが、Chlamydomonas reinhardtiiが好ましい。好ましいChlamydomonas reinhardtiiとしては、ＣＣ−１２５株、ＣＣ−４２５株、ＦＵＤ７株などが挙げられる。このうち、葉緑体ゲノムに存在するｐｓｂＡ遺伝子（光化学系ＩＩ反応中心コアタンパク質Ｄ１をコードする遺伝子）が欠損した株であるＦＵＤ７株がさらに好ましい。上述したChlamydomonas reinhardtii株は、いずれも、Ｄｕｋｅ  ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  Ｃｅｎｔｅｒより入手可能である。
【００２６】
本発明において、上記親株に導入される遺伝子がコードするアシルＡＣＰチオエステラーゼの例としては、配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられる。上記アシルＡＣＰチオエステラーゼの別の例としては、配列番号２に示すアミノ酸配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、なお好ましくは９５％以上、なおより好ましくは９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つＣ１２：０脂肪酸選択的アシルＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するポリペプチドが挙げられる。上記アシルＡＣＰチオエステラーゼのさらに別の例としては、配列番号２に示すアミノ酸配列において１または複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加または挿入されたアミノ酸配列からなり、且つＣ１２：０脂肪酸選択的アシルＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するポリペプチドが挙げられる。
【００２７】
さらに、上記で挙げたアシルＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子を葉緑体ゲノムに導入する場合、当該アシルＡＣＰチオエステラーゼの葉緑体移行シグナルペプチドは削除されていることが好ましい。配列番号２で示されるアシルＡＣＰチオエステラーゼの場合、そのアミノ酸配列の１〜８３番アミノ酸が、葉緑体移行シグナルペプチドである。したがって、上記で挙げたアシルＡＣＰチオエステラーゼのうち、配列番号２で示されるアミノ酸配列の１〜８３番アミノ酸、またはそれに対応する領域が削除されたアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子が、葉緑体ゲノムに導入する遺伝子として好ましい。
【００２８】
あるいは、上記で挙げたアシルＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子を核ゲノムに導入する場合、上述の葉緑体移行シグナルペプチドの削除に加え、親株となるクラミドモナス属細胞で機能する葉緑体移行シグナルペプチドが、当該アシルＡＣＰチオエステラーゼに付加されていることが好ましい。クラミドモナス属細胞で機能する葉緑体移行シグナルペプチドの好ましい例としては、Chlamydomonas reinhardtii由来Ferredoxinの葉緑体移行シグナルペプチドが挙げられる。したがって、上記で挙げたアシルＡＣＰチオエステラーゼのうち、配列番号２で示されるアミノ酸配列の１〜８３番アミノ酸、またはそれに対応する領域が削除されており、且つChlamydomonas reinhardtii由来Ferredoxinの葉緑体移行シグナルペプチドがその上流に付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子が、核ゲノムに導入する遺伝子として好ましい。
【００２９】
葉緑体移行シグナルペプチドが欠失したアシルＡＣＰチオエステラーゼの例としては、配列番号４に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられる。配列番号４のアミノ酸配列は、配列番号２のアミノ酸配列から、その葉緑体移行シグナルペプチド（１〜８３番アミノ酸）が削除された配列に相当する。
【００３０】
したがって、本発明において上記親クラミドモナス属細胞に導入されるアシルＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子としては、以下が挙げられる：
（ａ）配列番号４に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号４に示すアミノ酸配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、なお好ましくは９５％以上、なおより好ましくは９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つＣ１２：０脂肪酸選択的アシルＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号４に示すアミノ酸配列において１または複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加または挿入されたアミノ酸配列を含み、且つＣ１２：０脂肪酸選択的アシルＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【００３１】
上記（ａ）〜（ｃ）のうち、好ましい例としては、以下が挙げられる：
（ａ'）配列番号４に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｂ'）配列番号４に示すアミノ酸配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、なお好ましくは９５％以上、なおより好ましくは９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つＣ１２：０脂肪酸選択的アシルＡＣＰチオエステラーゼ活性を有し、葉緑体移行シグナルペプチドを有さないポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｃ'）配列番号４に示すアミノ酸配列において１または複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加または挿入されたアミノ酸配列からなり、且つＣ１２：０脂肪酸選択的アシルＡＣＰチオエステラーゼ活性を有し、葉緑体移行シグナルペプチドを有さないポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
これらの遺伝子は、親クラミドモナス属細胞の葉緑体ゲノムに導入する遺伝子として好適である。
【００３２】
上記（ａ）〜（ｃ）の別の好ましい例としては、以下が挙げられる：
（ａ''）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｂ''）配列番号２に示すアミノ酸配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、なお好ましくは９５％以上、なおより好ましくは９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つＣ１２：０脂肪酸選択的アシルＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｃ''）配列番号２に示すアミノ酸配列において１または複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加または挿入されたアミノ酸配列からなり、且つＣ１２：０脂肪酸選択的アシルＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【００３３】
上記（ａ）〜（ｃ）のさらに別の好ましい例としては、上記（ａ）〜（ｃ）または（ａ'）〜（ｃ'）のポリヌクレオチドの上流に、クラミドモナス属細胞で機能する葉緑体移行シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドが付加されたポリヌクレオチドが挙げられる。これらのポリヌクレオチドは、親クラミドモナス属細胞の核ゲノムに導入する遺伝子として好適である。クラミドモナス属細胞で機能する葉緑体移行シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドとしては、Chlamydomonas reinhardtii由来Ferredoxinの葉緑体移行シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチド（GenBank: AAA33085.1に記載されている配列のうち、移行シグナルとされている１〜３２塩基：配列番号２０）が挙げられる。
【００３４】
さらに、上記（ａ）〜（ｃ）のポリヌクレオチドのうち、下記に示される配列番号４のアミノ酸配列上の位置又はそれに相当する位置において、下記に示されるアミノ酸残基を有し、且つチオエステラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが好ましい。
位置                                アミノ酸残基      
８０位またはそれに相当する位置    トリプトファン
１９７位またはそれに相当する位置    アスパラギン酸
１９９位またはそれに相当する位置    アスパラギン
２０１位またはそれに相当する位置    ヒスチジン
２０７位またはそれに相当する位置    チロシン
【００３５】
さらに、上記ポリヌクレオチドのうち、下記に示される配列番号４のアミノ酸配列上の位置又はそれに相当する位置において、下記に示されるアミノ酸残基をさらに有し、且つチオエステラーゼ活性をコードするポリヌクレオチドがより好ましい。
位置                                アミノ酸残基      
３０位またはそれに相当する位置    アルギニン
３１位またはそれに相当する位置    セリン
３３位またはそれに相当する位置    グルタミン酸
３５位またはそれに相当する位置    グリシン
３７位またはそれに相当する位置    アスパラギン酸
４７位またはそれに相当する位置    アスパラギン
５０位またはそれに相当する位置    グルタミン
５５位またはそれに相当する位置    アスパラギン
６１位またはそれに相当する位置    グリシン
６６位またはそれに相当する位置    グリシン
６８位またはそれに相当する位置    グリシン
７０位またはそれに相当する位置    スレオニン
７３位またはそれに相当する位置    メチオニン
７８位またはそれに相当する位置    ロイシン
８１位またはそれに相当する位置    バリン
９２位またはそれに相当する位置    チロシン
９５位またはそれに相当する位置    トリプトファン
１０４位またはそれに相当する位置    トリプトファン
１０９位またはそれに相当する位置    グリシン
１３３位またはそれに相当する位置    セリン
１３８位またはそれに相当する位置    メチオニン
１４３位またはそれに相当する位置    アルギニン
１７３位またはそれに相当する位置    リジン
１８８位またはそれに相当する位置    グリシン
１８９位またはそれに相当する位置    ロイシン
１９１位またはそれに相当する位置    プロリン
１９３位またはそれに相当する位置    トリプトファン
１９５位またはそれに相当する位置    アスパラギン酸
２０２位またはそれに相当する位置    バリン
２０６位またはそれに相当する位置    リジン
２１０位またはそれに相当する位置    トリプトファン
２１６位またはそれに相当する位置    プロリン
２３２位またはそれに相当する位置    チロシン
２３５位またはそれに相当する位置    グルタミン酸
２４４位またはそれに相当する位置    セリン
２６１位またはそれに相当する位置    ヒスチジン
２７８位またはそれに相当する位置    トリプトファン
【００３６】
本発明において上記親クラミドモナス属細胞に導入される遺伝子がコードするアシルＡＣＰチオエステラーゼの例としては、下記に挙げるＣ１２：０特異的アシルＡＣＰチオエステラーゼが挙げられる：Umbellularia californicaアシルＡＣＰチオエステラーゼ（GenBank AAA34215.1）；Cuphea calophylla subsp. mesostemonアシルＡＣＰチオエステラーゼ（GenBank ABB71581）；Cocos nuciferaアシルＡＣＰチオエステラーゼ（CnFatB3：Jing et al. BMC Biochemistry 2011, 12:44参照）；Cinnamomum camphoraアシルＡＣＰチオエステラーゼ（GenBank AAC49151.1）；Myristica fragransアシルＡＣＰチオエステラーゼ（GenBank AAB71729）；Myristica fragransアシルＡＣＰチオエステラーゼ（GenBank AAB71730）；Cuphea lanceolataアシルＡＣＰチオエステラーゼ（GenBank CAA54060）；Cuphea hookerianaアシルＡＣＰチオエステラーゼ（GenBank Q39513）；Ulumus americanaアシルＡＣＰチオエステラーゼ(GenBank AAB71731)；Sorghum bicolorアシルＡＣＰチオエステラーゼ(GenBank EER87824)；Sorghum bicolorアシルＡＣＰチオエステラーゼ(GenBank EER88593)；Cocos nuciferaアシルＡＣＰチオエステラーゼ（CnFatB1：Jing et al. BMC Biochemistry 2011, 12:44参照）；Cocos nuciferaアシルＡＣＰチオエステラーゼ（CnFatB2：Jing et al. BMC Biochemistry 2011, 12:44参照）；Cuphea viscosissimaアシルＡＣＰチオエステラーゼ（CvFatB1：Jing et al. BMC Biochemistry 2011, 12:44参照）；Cuphea viscosissimaアシルＡＣＰチオエステラーゼ（CvFatB2：Jing et al. BMC Biochemistry 2011, 12:44参照）；Cuphea viscosissimaアシルＡＣＰチオエステラーゼ（CvFatB3：Jing et al. BMC Biochemistry 2011, 12:44参照）；Elaeis guineensisアシルＡＣＰチオエステラーゼ(GenBank AAD42220)；Desulfovibrio vulgarisアシルＡＣＰチオエステラーゼ(GenBank ACL08376)；Bacteriodes fragilisアシルＡＣＰチオエステラーゼ(GenBank CAH09236)；Parabacteriodes distasonisアシルＡＣＰチオエステラーゼ(GenBank ABR43801)；Bacteroides thetaiotaomicronアシルＡＣＰチオエステラーゼ(GenBank AAO77182)；Clostridium asparagiformeアシルＡＣＰチオエステラーゼ(GenBank EEG55387)；Bryanthella formatexigensアシルＡＣＰチオエステラーゼ(GenBank EET61113)；Geobacillus sp.アシルＡＣＰチオエステラーゼ(GenBank EDV77528)；Streptococcus dysgalactiaeアシルＡＣＰチオエステラーゼ(GenBank BAH81730)；Lactobacillus brevisアシルＡＣＰチオエステラーゼ(GenBank ABJ63754)；Lactobacillus plantarumアシルＡＣＰチオエステラーゼ(GenBank CAD63310)；Anaerococcus tetradiusアシルＡＣＰチオエステラーゼ(GenBank EEI82564)；Bdellovibrio bacteriovorusアシルＡＣＰチオエステラーゼ(GenBank CAE80300)；Clostridium thermocellumアシルＡＣＰチオエステラーゼ(GenBank ABN54268)。
このうち、ゲッケイジュ（またはCalifornia bay；Umbellularia californica）由来のアシルＡＣＰチオエステラーゼ（GenBank AAA34215.1）であって、中鎖脂肪酸特異的アシルＡＣＰチオエステラーゼの機能を有するものがより好ましい例として挙げられる。配列番号２で示される、Umbellularia californica由来のＣ１２：０特異的アシルＡＣＰチオエステラーゼがさらに好ましい。
【００３７】
上記に列挙したアシルＡＣＰチオエステラーゼは、葉緑体移行シグナルペプチドを欠失していてもよく、またはさらにクラミドモナス属細胞で機能する葉緑体移行シグナルペプチド（例えば、配列番号２０のポリヌクレオチドにコードされる、Chlamydomonas reinhardtii由来Ferredoxinの葉緑体移行シグナルペプチド）と連結されていてもよい。
【００３８】
上記アシルＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子の例としては、以下が挙げられる：
配列番号１に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
配列番号１に示すヌクレオチド配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、なお好ましくは９５％以上、なおより好ましくは９８％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、且つＣ１２：０脂肪酸選択的アシルＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
配列番号１に示すヌクレオチド配列において１または複数個の塩基が欠失、置換、付加または挿入されたヌクレオチド配列からなり、且つＣ１２：０脂肪酸選択的アシルＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；ならびに、
配列番号１に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つＣ１２：０脂肪酸選択的アシルＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【００３９】
上記アシルＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子の好ましい例としては、配列番号１で示される、ゲッケイジュ（California bay：Umbellularia californica）由来のＣ１２：０脂肪酸選択的アシルＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子が挙げられる。
【００４０】
上記で挙げたアシルＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子は、葉緑体移行シグナルペプチドをコードする領域を欠失していてもよく、またはその上流にクラミドモナス属細胞で機能する葉緑体移行シグナルペプチドをコードする領域（例えば、配列番号２０で示される、Chlamydomonas reinhardtii由来Ferredoxinの葉緑体移行シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチド）が連結されていてもよい。
【００４１】
さらに、上記で挙げたアシルＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子は、導入されるクラミドモナス属におけるコドン使用頻度にあわせて、塩基配列をさらに変更されていてもよい。クラミドモナス属のコドンの情報は、例えば、Ｃｏｄｏｎ  Ｕｓａｇｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ（［ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／］）から入手可能である。さらに、上記で挙げたアシルＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子は、それが導入されるゲノムの種類にあわせて改変され得る。例えば、上記遺伝子をクラミドモナス属の葉緑体ゲノムに導入する場合には、上記Codon Usage Databaseから、chloroplast Chlamydomonas reinhardtiiを参照し、クラミドモナス属の葉緑体ゲノムのコドン使用頻度にあわせて、塩基を改変することが好ましい。あるいは、上記遺伝子をクラミドモナス属の核ゲノムに導入する場合には、上記Codon Usage Databaseから、Chlamydomonas reinhardtiiを参照し、クラミドモナス属の核ゲノムのコドン使用頻度にあわせて塩基を改変することが好ましい。
【００４２】
配列番号３で示されるヌクレオチド配列は、配列番号１のヌクレオチド配列から、葉緑体移行シグナルペプチドをコードする領域（１〜２４９位）が欠失し、且つクラミドモナス属の葉緑体ゲノムのコドン使用頻度にあわせて塩基が改変された配列である。配列番号３で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドは、葉緑体ゲノムに導入するための遺伝子として好適である。
【００４３】
したがって、上記親クラミドモナス属細胞の葉緑体ゲノムに導入すべきアシルＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子の好ましい例としては、以下が挙げられる：
配列番号３に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
配列番号３に示すヌクレオチド配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、なお好ましくは９５％以上、なおより好ましくは９８％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、且つＣ１２：０脂肪酸選択的アシルＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
配列番号３に示すヌクレオチド配列において１または複数個の塩基が欠失、置換、付加または挿入されたヌクレオチド配列からなり、且つＣ１２：０脂肪酸選択的アシルＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；ならびに、
配列番号３に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つＣ１２：０脂肪酸選択的アシルＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【００４４】
好ましくは、上記配列番号３に示すヌクレオチド配列と７０％以上配列同一な配列、上記配列番号３に示すヌクレオチド配列において１または複数個の塩基が欠失、置換、付加または挿入された配列、および上記配列番号３のポリヌクレオチドの相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドにおいては、その塩基が、クラミドモナス属の葉緑体ゲノムのコドン使用頻度にあわせて改変されている。
【００４５】
また本発明において、上記親株に導入されるジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）２−４をコードする遺伝子の例としては：配列番号８に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；配列番号８に示すヌクレオチド配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、なお好ましくは９５％以上、なおより好ましくは９８％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；配列番号８に示すヌクレオチド配列において１または複数個の塩基が欠失、置換、付加または挿入されたヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；ならびに、配列番号８に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドが挙げられる。これらのポリヌクレオチドはいずれも、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする。
【００４６】
上記ポリヌクレオチドのうち、下記に示される配列番号８のポリヌクレオチドにコードされるアミノ酸配列（配列番号９）上の位置又はそれに相当する位置において、下記に示されるアミノ酸残基を有し、且つジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドが好ましい。
位置                                アミノ酸残基      
１０９位またはそれに相当する位置    プロリン
１１０位またはそれに相当する位置    ヒスチジン
１４８位またはそれに相当する位置    プロリン
１５１位またはそれに相当する位置    アルギニン
１８２位またはそれに相当する位置    グリシン
１８３位またはそれに相当する位置    グリシン
２０２位またはそれに相当する位置    アルギニン
２０４位またはそれに相当する位置    グリシン
２０５位またはそれに相当する位置    フェニルアラニン
２０９位またはそれに相当する位置    アラニン
２１７位またはそれに相当する位置    バリン
２１８位またはそれに相当する位置    プロリン
２２２位またはそれに相当する位置    フェニルアラニン
２２３位またはそれに相当する位置    グリシン
２７６位またはそれに相当する位置    グリシン
【００４７】
さらに、上記ポリヌクレオチドのうち、下記に示される配列番号８のポリヌクレオチドにコードされるアミノ酸配列（配列番号９）上の位置又はそれに相当する位置において、下記に示されるアミノ酸残基をさらに有し、且つジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドがより好ましい。
位置                                アミノ酸残基      
１５位またはそれに相当する位置    アラニン
２３位またはそれに相当する位置    イソロイシン
２７位またはそれに相当する位置    バリン
２９位またはそれに相当する位置    ロイシン
８４位またはそれに相当する位置    チロシン
８５位またはそれに相当する位置    フェニルアラニン
８６位またはそれに相当する位置    プロリン
９０位またはそれに相当する位置    バリン
１０１位またはそれに相当する位置    アルギニン
１０３位またはそれに相当する位置    チロシン
１０５位またはそれに相当する位置    フェニルアラニン
１０６位またはそれに相当する位置    グリシン
１１３位またはそれに相当する位置    ロイシン
１１４位またはそれに相当する位置    プロリン
１１５位またはそれに相当する位置    イソロイシン
１３９位またはそれに相当する位置    ロイシン
１４５位またはそれに相当する位置    フェニルアラニン
１５７位またはそれに相当する位置    ロイシン
１５８位またはそれに相当する位置    グリシン
１６１位またはそれに相当する位置    プロリン
１６４位またはそれに相当する位置    アルギニン
１６６位またはそれに相当する位置    セリン
１７０位またはそれに相当する位置    ロイシン
１７１位またはそれに相当する位置    ロイシン
１８０位またはそれに相当する位置    バリン
１８１位またはそれに相当する位置    プロリン
１８６位またはそれに相当する位置    グルタミン酸
１８８位またはそれに相当する位置    ロイシン
１９３位またはそれに相当する位置    グリシン
１９９位またはそれに相当する位置    ロイシン
２０６位またはそれに相当する位置    バリン
２０８位またはそれに相当する位置    ロイシン
２１３位またはそれに相当する位置    グリシン
２１４位またはそれに相当する位置    アラニン
２１６位またはそれに相当する位置    ロイシン
２１９位またはそれに相当する位置    バリン
２２８位またはそれに相当する位置    チロシン
２６６位またはそれに相当する位置    プロリン
２６８位またはそれに相当する位置    アルギニン
２７０位またはそれに相当する位置    プロリン
２７４位またはそれに相当する位置    バリン
２７５位またはそれに相当する位置    バリン
２７８位またはそれに相当する位置    プロリン
２７９位またはそれに相当する位置    イソロイシン
２８１位またはそれに相当する位置    バリン
３２４位またはそれに相当する位置    ロイシン
【００４８】
上記ＤＧＡＴ２−４をコードする遺伝子のより具体的な例としては、配列番号８で示される、Chlamydomonas reinhardtii由来のＤＧＡＴ２−４をコードする遺伝子が挙げられる。
【００４９】
上述したクラミドモナス属細胞に導入されるアシルＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子およびＤＧＡＴ２−４をコードする遺伝子は、化学的に合成してもよいが、各種生物から通常の方法に従って単離してもよい。例えば、アシルＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子であれば上述したゲッケイジュ（California  bay：Umbellularia californica）から、ＤＧＡＴ２−４をコードする遺伝子であれば上述したクラミドモナス属生物から、それぞれ単離することができる。これらの遺伝子は、例えば、上記の微生物からゲノムＤＮＡを抽出し、上記配列番号１または８で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドやそのフラグメントをプローブとしたサザンハイブリダイゼーションによって同定することができる。また例えば、公知のゲノム配列情報に基づいて上記微生物のゲノムのヌクレオチド配列と配列番号１または８のヌクレオチド配列とを比較することによって、目的のアシルＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子、または目的のＤＧＡＴ２−４をコードする遺伝子を同定することができる。同定された遺伝子はさらに、クラミドモナス属のコドン頻度にあわせて、上述した手順に従ってその塩基を改変されてもよい。あるいはさらに、葉緑体移行シグナルペプチドを削除するか、またはさらにクラミドモナス属細胞で機能する葉緑体移行シグナルペプチドと連結されてもよい。
【００５０】
本発明の組換えクラミドモナス属細胞は、上述した親クラミドモナス属細胞（宿主）に、上述したアシルＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子およびＤＧＡＴ２−４をコードする遺伝子を導入することによって作製することができる。当該アシルＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子と当該ＤＧＡＴ２−４をコードする遺伝子とは、別々に導入されてもよいが、一緒に導入されてもよい。
【００５１】
上記遺伝子の宿主への導入には、プラスミド等の通常のベクターを使用することができる。当該ベクターの種類は、宿主であるクラミドモナス属に適用できるベクターであれば特に限定されないが、例えば、pUC19やpBlueScript等の一般的なベクターが挙げられる。
【００５２】
好ましくは、宿主に導入されるアシルＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子またはＤＧＡＴ２−４をコードする遺伝子の上流には、当該遺伝子の発現を制御する制御領域が作動可能に連結されている。当該制御領域としては、目的遺伝子の上流に連結されるプロモーターおよび目的遺伝子の下流に連結されるターミネーターが挙げられる。当該制御領域は、好ましくは、宿主内における下流の遺伝子の発現を高める機能を有し、より好ましくは、下流遺伝子を発現または高発現させる機能を有する。当該制御領域の例としては、ＤＧＡＴ２−４遺伝子のためには、Chlamydomonas reinhardtii由来由来のＨｓｐ７０Ａ−Ｒｂｃｓ２プロモーターおよびＰｓａＤ等が挙げられ、アシルＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子のためには、葉緑体に導入する場合、ｐｓｂＡ、ｒｂｃＬ、ｐｓｂＤの５’−ＵＴＲ領域、３’−ＵＴＲ領域等が、核に導入する場合、上述したＤＧＡＴ２−４遺伝子のための制御領域等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５３】
本明細書において、遺伝子が「制御領域と作動可能に連結されている」とは、当該遺伝子が当該制御領域による制御の下に発現し得るように配置されていることをいう。
【００５４】
上記アシルＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子と上記ＤＧＡＴ２−４をコードする遺伝子、上記制御領域のベクターへの挿入は、当該分野における通常の方法に従って行うことができる。例えば、上記アシルＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子、上記ＤＧＡＴ２−４をコードする遺伝子、及び上記制御領域の断片をＰＣＲ等によって増幅し、これらの断片を制限酵素法等によってプラスミド等のベクターに挿入し、連結すればよい。あるいは、上記遺伝子及び制御領域の断片を予め連結した断片を作製し、これをプラスミド等のベクターに挿入してもよい。その際、上記アシルＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子と上記ＤＧＡＴ２−４をコードする遺伝子とは、１つのベクターに一緒に挿入することもできるが、別々のベクターに挿入することが好ましい。ベクター上においては、上流から、制御領域断片（プロモーター）、目的遺伝子（アシルＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子の断片またはＤＧＡＴ２−４をコードする遺伝子の断片）、制御領域断片（ターミネーター）の順で連結されているようにすればよい。アシルＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子と上記ＤＧＡＴ２−４をコードする遺伝子とを１つのベクターに挿入する場合、それぞれの遺伝子について、［プロモーター−目的遺伝子−ターミネーター］の単位がベクター内に構築されるようにすればよい。この場合、アシルＡＣＰチオエステラーゼをコードする単位とＤＧＡＴ２−４をコードする単位は、何れが上流に配置されてもよい。
【００５５】
構築された目的遺伝子を含むベクターは、エレクトロポレーション法、ガラスビーズ法、パーティクルガン法等の方により宿主に導入され得る。葉緑体へ導入する場合には、パーティクルガン法を用いるのが好ましい。
【００５６】
以上の手順で、親クラミドモナス属細胞に、アシルＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子と、ＤＧＡＴ２−４をコードする遺伝子とを導入することによって、本発明の組換えクラミドモナス属細胞を作製することができる。本発明の組換えクラミドモナス属細胞は、ラウリン酸の生産性が顕著に高く、ラウリン酸（Ｃ１２：０脂肪酸）を豊富に含む油脂を生産する。したがって、本発明の組換えクラミドモナス属細胞を培養し、当該細胞が産生した油脂を回収することによって、ラウリン酸高含有油脂を得ることができる。当該油脂は、ラウリン酸の原料として使用することができる。
【００５７】
本発明の組換えクラミドモナス属細胞の培養は、通常の手順に従えばよい。例えば、本発明の組換えクラミドモナス属細胞は、Tris-Acetate-Phosphate（ＴＡＰ）培地で、２０℃、４０００ｌｕｘ程度の光照射下（明暗１２時間周期）の条件下で培養することができる。ラウリン酸の高生産のためには窒素欠乏条件での培養も有効であり、例えば、ＴＡＰ培地に含まれるＮＨ4Ｃlを除いた培地で２０℃、４０００ｌｕｘ程度の光照射下、明暗１２時間周期の条件下で培養することが可能である。
【００５８】
以上のように、本発明のクラミドモナス属細胞を培養することによって、細胞内に油脂が生産される。生産された油脂は、公知の方法によって回収することができる。産生された油脂を単離、回収する方法としては、特に限定されず、通常生体内の脂質成分を単離する際に用いられる方法により行うことができる。例えば、培養物からろ過、遠心分離、細胞の破砕、クロロホルム/メタノール抽出法、ヘキサン抽出法、エタノール抽出法等により油脂を単離、回収することができる。またより大規模な生産の場合は、培養物より油分を圧搾または抽出により回収後、脱ガム、脱酸、脱色、脱蝋、脱臭等の一般的な精製を行い、脂質を得ることができる。本発明のクラミドモナス属細胞によって生産された油脂は、その構成脂肪酸中ラウリン酸を豊富に含有する、ラウリン酸高含有油脂である。より具体的には、本発明の組換えクラミドモナス属細胞によって生産された油脂は、上述のアシルＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子のみを導入された組換えクラミドモナス属株、または上述のアシルＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子とクラミドモナス属由来ＤＧＡＴ２−１〜２−３のいずれかをコードする遺伝子を挿入された組換えクラミドモナス属株と比べて、構成脂肪酸中に占めるラウリン酸の比率が顕著に高い。
【００５９】
本発明の組換えクラミドモナス属細胞によって生産された油脂は、ラウリン酸の原料油脂として有用である。当該油脂からのラウリン酸の製造は、公知の方法、例えば、アルカリ溶液中で70℃程度の高温で処理する方法、リパーゼ処理をする方法、高圧熱水を用いて分解する方法等により、実施することができる。
【００６０】
本発明の例示的実施形態として、さらに以下の組成物、製造方法、用途、あるいは方法を本明細書に開示する。但し、本発明はこれらの実施形態に限定されない。
【００６１】
＜１＞アシルＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子と、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２−４をコードする遺伝子とが導入されている組換えクラミドモナス属細胞であって、
当該アシルＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子が、以下の（ａ）〜（ｃ）：
（ａ）配列番号４に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号４に示すアミノ酸配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、なお好ましくは９５％以上、なおより好ましくは９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つＣ１２：０脂肪酸選択的アシルＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号４に示すアミノ酸配列において１または複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加または挿入されたアミノ酸配列を含み、且つＣ１２：０脂肪酸選択的アシルＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
からなる群より選択され、且つ
当該ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２−４をコードする遺伝子が、以下の（ｄ）〜（ｇ）：
（ｄ）配列番号８に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号８に示すヌクレオチド配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、なお好ましくは９５％以上、なおより好ましくは９８％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、且つジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｆ）配列番号８に示すヌクレオチド配列において１または複数個の塩基が欠失、置換、付加または挿入されたヌクレオチド配列からなり、且つジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；および
（ｇ）配列番号８に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
からなる群より選択される、組換えクラミドモナス属細胞。
【００６２】
＜２＞上記アシルＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子が、葉緑体に導入されている、＜１＞記載の方法。
【００６３】
＜３＞上記アシルＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子が、以下：
（ｈ）配列番号３に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｉ）配列番号３に示すヌクレオチド配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、なお好ましくは９５％以上、なおより好ましくは９８％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、且つＣ１２：０脂肪酸選択的アシルＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｊ）配列番号３に示すヌクレオチド配列において１または複数個の塩基が欠失、置換、付加または挿入されたヌクレオチド配列からなり、且つＣ１２：０脂肪酸選択的アシルＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；ならびに、
（ｋ）配列番号３に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つＣ１２：０脂肪酸選択的アシルＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
からなる群より選択される、＜２＞記載の組換えクラミドモナス属細胞。
【００６４】
＜４＞上記ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２−４をコードする遺伝子が、Chlamydomonas reinhardtii由来の遺伝子である、＜１＞〜＜３＞のいずれか１に記載の組換えクラミドモナス属細胞。
【００６５】
＜５＞上記アシルＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子が、ゲッケイジュ（Umbellularia californica）由来の遺伝子である、＜１＞〜＜４＞のいずれか１に記載の組換えクラミドモナス属細胞。
【００６６】
＜６＞クラミドモナス属細胞に、アシルＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子と、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２−４をコードする遺伝子とを導入する工程を含む、組換えクラミドモナス属細胞の製造方法であって
当該アシルＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子が、以下の（ａ）〜（ｃ）：
（ａ）配列番号４に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号４に示すアミノ酸配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、なお好ましくは９５％以上、なおより好ましくは９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つＣ１２：０脂肪酸選択的アシルＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号４に示すアミノ酸配列において１または複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加または挿入されたアミノ酸配列を含み、且つＣ１２：０脂肪酸選択的アシルＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
からなる群より選択され、且つ
当該ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２−４をコードする遺伝子が、以下の（ｄ）〜（ｇ）：
（ｄ）配列番号８に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号８に示すヌクレオチド配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、なお好ましくは９５％以上、なおより好ましくは９８％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、且つジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｆ）配列番号８に示すヌクレオチド配列において１または複数個の塩基が欠失、置換、付加または挿入されたヌクレオチド配列からなり、且つジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；および
（ｇ）配列番号８に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
からなる群より選択される、方法。
【００６７】
＜７＞上記アシルＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子が、葉緑体に導入される、＜６＞記載の方法。
【００６８】
＜８＞上記アシルＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子が、以下の（ｈ）〜（ｋ）：
（ｈ）配列番号３に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｉ）配列番号３に示すヌクレオチド配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、なお好ましくは９５％以上、なおより好ましくは９８％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、且つＣ１２：０脂肪酸選択的アシルＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｊ）配列番号３に示すヌクレオチド配列において１または複数個の塩基が欠失、置換、付加または挿入されたヌクレオチド配列からなり、且つＣ１２：０脂肪酸選択的アシルＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；ならびに、
（ｋ）配列番号３に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つＣ１２：０脂肪酸選択的アシルＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
からなる群より選択される、＜７＞記載の方法。
【００６９】
＜９＞上記ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２−４をコードする遺伝子が、Chlamydomonas reinhardtii由来の遺伝子である、＜６＞〜＜８＞のいずれか１に記載の方法。
【００７０】
＜１０＞上記アシルＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子が、ゲッケイジュ（Umbellularia californica）由来の遺伝子である、＜６＞〜＜９＞のいずれか１に記載の方法。
【００７１】
＜１１＞上記＜１＞〜＜５＞のいずれか１に記載の組換えクラミドモナス属細胞を用いるラウリン酸含有油脂の製造方法。
【００７２】
上記＜１＞〜＜５＞のいずれか１に記載の組換えクラミドモナス属細胞により製造された油脂を用いる、ラウリン酸の製造方法。
【００７３】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００７４】
実施例１：組換えクラミドモナス属の作製
１）ゲッケイジュ（California  bay：Umbellularia californica）由来アシルＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子導入用ベクターの構築
ゲッケイジュ（California  bay：Umbellularia californica）由来Ａｃｙｌ−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子（以下、ＢＴＥ遺伝子）のポリヌクレオチド（配列番号３）を、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）の提供する受託合成サービスを利用して人工的に合成した。このポリヌクレオチドは、ＢＴＥ遺伝子の全ヌクレオチド配列から葉緑体移行シグナルペプチドをコードする領域を除いたヌクレオチド配列を有する。人工合成する際に、配列番号３のポリヌクレオチド配列の塩基は、Chlamydomonas reinhardtiiのコドン使用頻度にあわせて本来のＢＴＥ遺伝子の塩基から変更された。
配列番号３のポリヌクレオチドをＰ−４８４プラスミド（Ｄｕｋｅ  ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  Ｃｅｎｔｅｒより入手）のａａｄＡ遺伝子と置き換えることにより、プラスミドＰ−４８４＋ＢＴＥを作製した。Ｐ−４８４−ＢＴＥを配列番号１０および配列番号１１のプライマー（表１）でＰＣＲ増幅し、増幅断片を、Ｐ−３２２（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  Ｃｅｎｔｅｒ）のＢａｍＨＩサイトに連結し、プラスミドＰ−３２２＋ＢＴＥを作製した。Ｐ−３２２＋ＢＴＥのＥｃｏＲＩサイトにＰ−６６（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  Ｃｅｎｔｅｒ）よりＥｃｏＲＩで切断したインサートを導入することにより、Ｐ−３２２＋６６＋ＢＴＥを作製した。
【００７５】
【表１】
2014014334.tif 000002
【００７６】
２）ＤＧＡＴ２−１〜２−４遺伝子導入用ベクターの構築
Chlamydomonas reinhardtii（CC-125株、Ｄｕｋｅ  ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  Ｃｅｎｔｅｒより入手）を、Ｔｒｉｓ−Ａｃｅｔａｔｅ−Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ培地（ＴＡＰ培地）を用いて、２０℃、４０００ｌｕｘ、明暗１２時間周期、１２０ｒｐｍで旋回培養を行った。培養液５０ｍＬを遠心して細胞を回収し、液体窒素で凍結させた後、Ｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡ抽出には、ＲＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて抽出を行った。抽出したＲＮＡからＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  Ｒｅｖ．  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてｃＤＮＡの調製を行った。調製したｃＤＮＡを、表２に示すプライマーを用いたＰＣＲにて増幅させてジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ２−１〜２−４）遺伝子をクローニングした。ＰＣＲ増幅では、ＤＧＡＴ２−１（配列番号５）には配列番号１２および１３のプライマー、ＤＧＡＴ２−２（配列番号６）には配列番号１４および１５のプライマー、ＤＧＡＴ２−３（配列番号７）には配列番号１６および１７のプライマー、ＤＧＡＴ２−４（配列番号８）には配列番号１８および１９のプライマーを使用した。
【００７７】
【表２】
2014014334.tif 000003
【００７８】
取得した遺伝子の配列を確認し、プラスミドｐＨｓｐ７０Ａ／ＲＢＣＳ２−Ｃｈｌａｍｙ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  Ｃｅｎｔｅｒ）のＸｈｏＩサイトとＢａｍＨＩサイトの間にあるルシフェラーゼ遺伝子と置き換えた。ＤＧＡＴ２−１、２−２、２−３および２−４を挿入されたプラスミドを、それぞれｐＤＧＡＴ２−１、ｐＤＧＡＴ２−２、ｐＤＧＡＴ２−３、およびｐＤＧＡＴ２−４とした。各プラスミドと、C. reinhardtiiで機能するｐａｒｏｍｏｍｙｃｉｎ耐性遺伝子を有するプラスミドｐＫＳ−ａｐｈVIII−ｌｏｘとを、ｌｏｘ配列を利用したＣｒｅ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅによって連結させた。すなわち、１００ｎｇのｐＤＧＡＴ２−１〜４、５０ｎｇのｐＫＳ−ａｐｈVIII−ｌｏｘ、１ＵのＣｒｅ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ、およびｒｅａｃｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒを混合し、３７℃にて１時間インキュベートした後、７０℃で１５分間インキュベートして酵素を失活させ、得られた反応液２μＬをＤＨ５α（E. coli）コンピテントセルに混合して形質転換を行うことにより、連結したプラスミドｐＡｐｈVIII＋ＤＧＡＴ２−１〜４を取得した。
【００７９】
３）Chlamydomonas reinhardtiiの培養
葉緑体ゲノムに存在するｐｓｂＡ遺伝子（光化学系ＩＩ反応中心コアタンパク質Ｄ１をコードする遺伝子）の欠損株であるChlamydomonas reinhardtii ＦＵＤ７株（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  Ｃｅｎｔｅｒ）を用いた。培養には、表３に記載のＴｒｉｓ−Ａｃｅｔａｔｅ−Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ培地（ＴＡＰ培地）を用いた。液体培養する場合は２０℃、明暗１２時間周期、１２０ｒｐｍで旋回培養を行った。また、固体培養する場合は、ＴＡＰ培地に終濃度２％になるようＢａｃｔｏ寒天（日本ベクトン・ディッキンソン社製）を加えて調製したＴＡＰプレート培地を用いて、２０℃、明暗１２時間周期にて静置培養を行った。
【００８０】
【表３】
2014014334.tif 000004
【００８１】
４）アシルＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子の導入
ＦＵＤ７株をＴＡＰ培地にて培養して２〜６×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍＬまで増殖させた。細胞を遠心して回収し、１×１０8ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように調製した。ＴＡＰプレート培地に懸濁した細胞５００μＬを均一に塗布した。上記１）で構築したプラスミドＰ−３２２＋６６＋ＢＴＥを、タングステン粒子（Ｂ１０、粒径１μｍ、株式会社アライドマテリアル）に結合させ、パーティクルガン（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を用いて１１００ｐｓｉにて細胞に導入した。細胞をＴＡＰ寒天培地にて回復培養を行った後、細胞を表４に記載のＨＳＭ寒天培地にて培養した。目的の遺伝子が導入された細胞は、ｐｓｂＡ遺伝子を有することにより光合成機能を回復し、ＨＳＭ寒天培地にて生育可能になる。ＨＳＭ寒天培地にて増殖した細胞を回収することにより、目的のアシルＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子が導入された形質転換体を得た。
【００８２】
【表４】
2014014334.tif 000005
【００８３】
５）ＤＧＡＴ遺伝子の導入
上記４）で得られた形質転換体を、ＴＡＰ培地２００ｍＬ、２０℃、明暗１２時間周期で、対数増殖期まで培養を行った。培養液２５ｍＬを遠心し、５０ｍＭ  Ｓｕｃｒｏｓｅを含むＴＡＰ培地で細胞を洗浄し、２５０μＬになるように濃縮した。細胞懸濁液２５０μＬをキュベット（４ｍｍ ｇａｐ）に入れ、熱変性した１０ｍｇ／ｍＬ  ｓａｌｍｏｎ  ｓｐｅｒｍＤＮＡ（５μＬ）と、線形化した２μｇの上記２）で構築したプラスミド（ｐＡｐｈVIII＋ＤＧＡＴ２−１〜４）のいずれかを混合し、１５℃で１０分間以上静置した。ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒII（ＢｉｏＲａｄ社製）を用いて１５５０Ｖ／ｃｍ（６２０Ｖ）、５００Ω、５０μＦの条件でパルスをかけ、キュベットごと１５℃で１時間静置した。静置している間は、１５分おきに混合し、遠心により細胞を回収し、細胞懸濁液を２枚の選択寒天培地（５０μｇ／ｍＬのパロモマイシンを含むＴＡＰプレート培地）の上に広げた。光照射下で１〜２週間培養し、コロニーを取得した。これらのコロニーよりＤＮＡを取得し、ゲノムＰＣＲを行うことによってＨｓｐ７０Ａ／Ｒｂｃｓ２プロモーターおよびＤＧＡＴ２遺伝子が形質転換体の核遺伝子に導入されているコロニーを選択することにより、アシルＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子とＤＧＡＴ２遺伝子とが導入された組換えクラミドモナス属株を取得した。
【００８４】
実施例２：組換えクラミドモナス属による脂質生産および生産された脂質の解析
１）組換えクラミドモナス属からの脂質抽出とメチルエステル化
実施例１で作製した組換えC.reinhardtii株をＴＡＰ培地にて２０℃、４０００ｌｕｘ程度の光照射下、明暗１２時間周期、１２０ｒｐｍで旋回培養した。定常期に達した後に、窒素成分を取り除いたＴＡＰ培地にて同条件にて培養を行った。培養液を遠心して得た沈殿画分を８０℃にて約３時間乾燥させ、固形分を乾燥藻体として取得した。乾燥藻体の乾燥重量を測定後、０．５ｍＬの１％食塩水に懸濁し、内部標準として５ｍｇ／ｍＬの７−ペンタデカノンを１０μＬ添加後、１ｍＬのクロロホルムおよび１ｍＬのメタノールを培養液に添加して激しく攪拌後３０分間静置し、その後さらに０．５ｍＬの１．５％ＫＣｌを添加して攪拌後、遠心し、クロロホルム層を回収した。窒素にて乾固後、０．７ｍＬの０．５Ｍ  ＫＯＨ−メタノール溶液を添加して７０℃にて３０分間恒温し、さらに１ｍＬの１４％三フッ化ホウ素溶液を添加し、８０℃にて１０分間恒温し、その後、ヘキサン、飽和食塩水を各１ｍＬ添加し、室温にて３０分間静置後、ヘキサン層を回収し、後述するガスクロマトグラフィ（ＧＣ）分析用のサンプルとした。
【００８５】
２）脂質のガスクロマトグラフィ分析
上記でメチルエステル化したサンプルをＧＣ分析した。使用したＧＣはカラム：ＤＢ１−ＭＳ（Ｊ＆Ｗ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｆｏｌｓｏｍ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、分析装置：６８９０Ｎ（Ａｇｉｌｅｎｔ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＳａｎｔａＣｌａｒａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて、以下の条件にて行った：［カラムオーブン温度：１００℃保持１分→１００〜３００℃（１０℃／分昇温）→３００℃保持５分（ポストラン２分）、注入口検出器温度：３００℃、注入法：スプリットモード（スプリット比＝１００：１）、サンプル注入量１μＬ、カラム流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎコンスタント、検出器：ＦＩＤ、キャリアガス：水素、メイクアップガス：ヘリウム］。ＧＣ解析により得られた波形データのピーク面積より、各脂肪酸のメチルエステル量を定量した。なお、各ピーク面積を内部標準である７−ペンタデカノンのピーク面積と比較することでサンプル間の補正を行い、解析に供したサンプル中に含まれる脂肪酸量を算出した。なお、各脂質に対応するＧＣのピークは、各脂肪酸の標準品のメチルエステルの保持時間（Retention Time、ＲＴ）、及び下記３）で述べるＧＣ／ＭＳ解析により同定した。算出された各脂肪酸量の総脂肪酸量に占める割合を求めた。
【００８６】
３）ＧＣ／ＭＳ分析
ＧＣ分析に供したサンプルを、必要に応じてＧＣ／マススペクトル（ＭＳ）分析にかけた。ＧＣ／マススペクトル（ＭＳ）分析は、キャピラリーカラム：ＤＢ１−ＭＳ、ＧＣ分析装置：７８９０Ａ（Ａｇｉｌｅｎｔ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ＭＳ分析装置：５９７５Ｃ（Ａｇｉｌｅｎｔ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて、以下の条件にて行った：［カラムオーブン温度：１００℃保持２分→１００〜３００℃（１０℃／分昇温）→３００℃保持５分（平衡時間２分、ポストラン３２０℃で５分）もしくは１００℃保持２分→１００〜２００℃（１０℃／分昇温）→２００〜３２０℃（５０℃／分昇温）→３２０℃保持５分（平衡時間２分、ポストラン３２０℃で５分）、注入口検出器温度：２５０℃、注入法：スプリットレスモード、サンプル注入量１μＬ、カラム流速：１ｍＬ／ｍｉｎコンスタント、検出器：ＦＩＤ、キャリアガス：水素、メイクアップガス：ヘリウム、溶媒待ち時間：７分もしくは３．５分、イオン化法：ＥＩ法、イオン源温度：２５０℃、インターフェース温度：３００℃、測定モード：スキャンモード（ｍ／ｚ：２０〜５５０若しくは１０〜５５０）］。
【００８７】
４）トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）の定量
ＴＡＧの定量はイアトロスキャン（三菱化学メディエンス）を用いて行った。上記１）で得た培養された組換えC.reinhardtii株の乾燥藻体を、乾燥重量を測定後、０．５ｍＬの１％食塩水に懸濁し、１ｍＬのクロロホルムおよび１ｍＬのメタノールを添加して激しく攪拌した後３０分間放置した。この溶液にさらに０．５ｍＬの１．５％ＫＣｌを添加して攪拌後、遠心し、クロロホルム層２００μＬを回収した。回収した液を窒素にて乾固後、クロロホルム１０μＬに溶解し、試料溶液を調製した。イアトロスキャンのクロマロッドの表面に１μＬ程度の試料溶液をスポットした。展開溶媒としてヘキサン：ジエチルエーテル：蟻酸＝４２：２８：０．３を用いて試料溶液を分離後、クロマロッドの表面に吸着した展開溶媒を除去した。その後、イアトロスキャンにセットし、試料溶液中のＴＡＧ量を測定した。トリステアリンを１、２、４ｍｇ／ｍＬに調製した溶液によって作成した検量線に基づき、測定したＴＡＧの量を定量した。
【００８８】
５）ラウリン酸生産量
各形質転換体における、総脂肪酸中のラウリン酸の割合を図１に示す。図１には、ＤＧＡＴ２−１、２−２、２−３または２−４を導入した形質転換体それぞれについて、最も高いＣ１２／総脂肪酸比が得られた形質転換体の結果を示した。ＢＴＥ遺伝子のみを導入した形質転換体、またはＢＴＥ遺伝子とＤＧＡＴ２−１〜２−３遺伝子のいずれかとを導入した形質転換体に比べて、ＢＴＥ遺伝子とＤＧＡＴ２−４遺伝子を導入した形質転換体では、総脂肪酸中に占めるラウリン酸の割合が顕著に増加した。
【００８９】
６）脂肪酸組成比
ＢＴＥ遺伝子のみを導入した形質転換体と、さらにＤＧＡＴ２−４遺伝子を導入した形質転換体における、総脂肪酸に占める各種脂肪酸の割合を図２に示す。ＤＧＡＴ２−４遺伝子を導入した形質転換体では、ＢＴＥ遺伝子のみを導入した形質転換体と比べてＣ１２およびＣ１４の中鎖脂肪酸の比率が増加していた。したがって、アシルＡＣＰチオエステラーゼおよびＤＧＡＴ２−４の発現を強化した形質転換体では、中鎖脂肪酸（特にラウリン酸）の総脂肪酸に対する割合が高まることがわかった。
【００９０】
７）脂肪酸およびＴＡＧ生産量
総脂肪酸量の変化、ＴＡＧ量の変化を図３に示す。
【図１】
2014014334.tif 000006
【図２】
2014014334.tif 000007
【図３】
2014014334.tif 000008
【配列表】
2014014334000001.app