(57)【要約】【課題】所望の細胞や臓器中で標的遺伝子を可視化することができ、さらには可視化した遺伝子改変動物を生きたままの状態で精度よく解析することができるように動物の改質を行うことができるＤＮＡカセットを提供すること。【解決手段】所定の標的ＤＮＡと相同組み換えを起こして染色体に導入可能なＤＮＡカセットであって、上記標的ＤＮＡの配列の５’側と相同な配列と、上記標的ＤＮＡの配列の３’側と相同な配列と、を有し、且つ上記５’側と相同な配列と上記３’側と相同な配列とに挟まれた部分に位置し、染色体導入時に機能を発現する初期機能配列及び一対の組み換え酵素認識配列を具備する保護配列と、上記保護配列及び上記３’側と相同な配列の間に位置し、上記保護配列における少なくとも上記初期機能配列が除去された場合に初めて機能を発現する機能性遺伝子の配列と、を有することを特徴とするＤＮＡカセット。【選択図】図１
2014143962.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
所定の標的ＤＮＡと相同組み換えを起こして染色体に導入可能なＤＮＡカセットであって、
上記標的ＤＮＡの配列の５’側と相同な配列と、
上記標的ＤＮＡの配列の３’側と相同な配列と、を有し、
且つ
上記５’側と相同な配列と上記３’側と相同な配列とに挟まれた部分に位置し、染色体導入時に機能を発現する初期機能配列及び一対の組み換え酵素認識配列を具備する保護配列と、
上記保護配列及び上記３’側と相同な配列の間に位置し、上記保護配列における少なくとも上記初期機能配列が除去された場合に初めて機能を発現する機能性遺伝子の配列とを有することを特徴とするＤＮＡカセット。
【請求項２】
上記保護配列において、
上記の組み換え酵素の認識配列は人工イントロン配列内に配置されており、
上記組み換え酵素により一対の組み換え酵素認識配列の間のスタッファー配列が除去された後に５’側と３’側との両人工イントロン配列が融合して、融合配列が形成されるようになされている、
請求項１記載のＤＮＡカセット。
【請求項３】
上記初期機能配列が、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を具備する、請求項１または２に記載のＤＮＡカセット。
【請求項４】
上記初期機能配列が、
さらに選択マーカーの配列を具備する、
請求項１〜３のいずれかに記載のＤＮＡカセット。
【請求項５】
上記選択マーカーの配列が、ＧＭＲ−ｗ＋、ｍｉｎｉ−ｗｈｉｔｅ＋、ｈｓｐ７０−ｗｈｉｔｅ＋である請求項４記載のＤＮＡカセット。
【請求項６】
上記機能性遺伝子が、ルシフェラーゼである請求項１〜５のいずれかに記載のＤＮＡカセット。
【請求項７】
上記組み換え酵素の認識配列がｌｏｘＰである請求項１〜６のいずれかに記載のＤＮＡカセット。
【請求項８】
３’側の上記人工イントロン配列が、さらに、上記組み換え酵素認識配列の３’側にＣｒｅに認識されるがｌｏｘＰ配列とは相同組み換えを起こさない変異型ｌｏｘＰ配列を具備する請求項７に記載のＤＮＡカセット。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれかに記載のＤＮＡカセットを具備してなるベクター。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれかに記載のＤＮＡカセットが染色体上に存在する形質転換細胞。
【請求項１１】
請求項１０記載の形質転換細胞を具備する形質転換動物。
【請求項１２】
請求項１１記載の形質転換動物にさらに上記組み換え酵素認識配列を認識する組み換え酵素が導入されてなる機能性遺伝子発現動物。
【請求項１３】
上記組み換え酵素が組織特異的に発現する酵素である請求項１２記載の機能性遺伝子発現動物。
【請求項１４】
上記組み換え酵素がＣｒｅである請求項１２または１３に記載の機能性遺伝子発現動物。
【請求項１５】
上記機能性遺伝子発現動物が、ショウジョウバエである請求項１２〜１４のいずれかに記載の機能性遺伝子発現動物。
【請求項１６】
請求項１２〜１５のいずれかに記載の機能性遺伝子発現動物の解析を行う解析装置であって、
動物の保持部と、
画像を取得するための撮像部と、
情報処理を行う情報処理部と、
を具備する解析装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、相同組み換えのためのＤＮＡカセット、ベクター、形質転換細胞、形質転換動物、機能性遺伝子発現動物及び解析装置、さらに詳しくは、標的遺伝子の発現制御領域により発現制御を受け所望の細胞や臓器でのみ特定機能を有する遺伝子を発現させることができるＤＮＡカセット、ベクター、形質転換細胞、及び、機能性遺伝子発現動物と、機能性遺伝子発現動物を大量に精度よく解析することが可能な解析装置と、に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
生理活性物質、薬剤、毒素、食品など化学物質の生体への影響の評価解析は、さまざまな分野で利用される重要な解析であり、分子生物学的手法を用いた解析により遺伝子レベルでの解析を行うことが可能になってきている。
例えば、特許文献１では、化合物をスクリーニングする方法及び有毒化合物を示す代謝反応の治療法に関連するマイクロアレイを用いて解析する手段が提案されている。
また、他の遺伝子レベルの解析手段としては、トランスジェニック動物などの遺伝子改変動物を用い遺伝子の発現を解析する手段が挙げられ、これらの中でも遺伝子の発現を蛍光タンパク質などで可視化することにより解析する手段は動物が生きたままの状態で遺伝子の発現を解析できる。
このため、例えば、特許文献２では、個体を構成する全ての細胞種でのイノシトールリン脂質（ＰＩｓ）代謝解析を可能とし、様々な内在性あるいは外来性の物質がＰＩｓ動態に与える作用を、非侵襲的な条件下で量的、時間的・空間的な側面から明らかにするために、ＰＩｓ可視化プローブを発現するトランスジェニック動物（ＰＩｓ可視化動物）を作製する。ＰＩｓ可視化プローブ遺伝子としては、ＰＩ（３，４，５）Ｐ３やＰＩ（３，４）Ｐ２を可視化するＡｋｔプロテインキナーゼＰＨドメインとＧＦＰとの融合タンパク質をコードするｃＤＮＡや、ＰＩ（３，４，５）Ｐ３を可視化するＢｔｋ−ＰＨドメインとＧＦＰとの融合タンパク質をコードするｃＤＮＡや、ＰＩ（４，５）Ｐ２を可視化する配列番号５で示される塩基配列からなる、ホスフォリパーゼＣδＰＨドメインとＧＦＰとの融合タンパク質をコードするｃＤＮＡ等を発現するトランスジェニック動物が提案されている。
また、遺伝子発現を可視化した形質転換動物の解析に用いる装置としては、例えば、特許文献３のような、主要部が、レーザ走査型顕微鏡検査のための励起光を生成する光源モジュール、励起光をコリメートして偏向を行う走査モジュール、走査モジュールによって用意された走査ビームを顕微鏡光路内で試料の方向に向ける顕微鏡モジュールおよび試料からの光線を受け止め検出する検出モジュールから成るレーザ走査型顕微鏡において、試料が第１および第２の照明光によって照明され、その場合第１照明光ＬＱ１が試料の励起を誘起し、第２照明光ＬＱ２が周期性構造におけるコヒーレント光の回折によって生成され、それが照射横方向および照射軸方向に周期性構造を有している、高度な分解能を持つレーザ走査型顕微鏡が提案されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特表２００２−５２３１１２号公報
【０００４】
【特許文献２】特開２００６−６１０２６号公報
【０００５】
【特許文献３】特開２００６−３０１７８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、特許文献１で提案されているようにマイクロアレイを用いた方法の場合、大量の遺伝子発現の解析は可能であるが、解析するために細胞や臓器を摘出することが必要なため、生きたままの動物で解析することができず、生体内での継時的な変化を追うことは不可能である。
また、特許文献２で提案されている手段では、遺伝子が体中に幅広く発現し、遺伝子発現を可視化すると体全体が発光してしまうため、生きたままの状態では体全体での発光がノイズとなり所望の細胞や臓器中での遺伝子の発現の状態を把握することができないという問題がある。
また、特許文献３で提案されている手段を用いて解析する場合、解析に時間がかかるため大量に解析するには多大な量力を要するという問題がある。
このため、所望の細胞や臓器中で標的遺伝子を可視化することができ、さらには可視化した遺伝子改変動物を生きたままの状態で精度よく経時的に定量化することができるＤＮＡ解析手段の開発が、要望されているのが現状である。
【０００７】
したがって、本発明の目的は、所望の細胞や臓器中で標的遺伝子を可視化することができ、さらには可視化した遺伝子改変動物を生きたままの状態で精度よく解析することができるように動物の改質を行うことができるＤＮＡカセット、該ＤＮＡカセットを用いてなる形質転換細胞及び形質転換動物、並びにこれらの動物を簡易且つ簡便に、しかも連続的に且つ経時的に定量化することができる解析装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解消すべく鋭意検討した結果、
遺伝子改変動物を作成する際に使用するＤＮＡカセットを改良して、特定の組み換え酵素のみに認識される配列を組み込むことで、遺伝子発現の可視化を制御することが可能であることを知見し、さらに最適な配列構造を得るべく改良を重ね、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の各発明を提供するものである。
１．所定の標的ＤＮＡと相同組み換えを起こして染色体に導入可能なＤＮＡカセットであって、
上記標的ＤＮＡの配列の５’側と相同な配列と、
上記標的ＤＮＡの配列の３’側と相同な配列と、を有し、
且つ
上記５’側と相同な配列と上記３’側と相同な配列とに挟まれた部分に位置し、染色体導入時に機能を発現する初期機能配列及び一対の組み換え酵素認識配列を具備する保護配列と、
上記保護配列及び上記３’側と相同な配列の間に位置し、上記保護配列における少なくとも上記初期機能配列が除去された場合に初めて機能を発現する機能性遺伝子の配列とを有することを特徴とするＤＮＡカセット。
２．上記保護配列において、
上記の組み換え酵素の認識配列は人工イントロン配列内に配置されており、
上記組み換え酵素により一対の組み換え酵素認識配列の間のスタッファー配列が除去された後に５’側と３’側との両人工イントロン配列が融合して、融合配列が形成されるようになされている、
１記載のＤＮＡカセット。
３．上記初期機能配列が、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を具備する、１または２に記載のＤＮＡカセット。
４．上記初期機能配列が、
さらに選択マーカーの配列を具備する、
１〜３のいずれかに記載のＤＮＡカセット。
５．上記選択マーカーの配列が、ＧＭＲ−ｗ＋、ｍｉｎｉ−ｗｈｉｔｅ＋、ｈｓｐ７０−ｗｈｉｔｅ＋である４記載のＤＮＡカセット。
６．上記機能性遺伝子が、ルシフェラーゼである１〜５のいずれかに記載のＤＮＡカセット。
７．上記組み換え酵素の認識配列がｌｏｘＰである１〜６のいずれかに記載のＤＮＡカセット。
８．３’側の上記人工イントロン配列が、さらに、上記組み換え酵素認識配列の３’側にＣｒｅに認識されるがｌｏｘＰ配列とは相同組み換えを起こさない変異型ｌｏｘＰ配列を具備する７に記載のＤＮＡカセット。
９．１〜８のいずれかに記載のＤＮＡカセットを具備してなるベクター。
１０．１〜８のいずれかに記載のＤＮＡカセットが染色体上に存在する形質転換細胞。
１１．１０記載の形質転換細胞を具備する形質転換動物。
１２．１１記載の形質転換動物にさらに上記組み換え酵素認識配列を認識する組み換え酵素が導入されてなる機能性遺伝子発現動物。
１３．上記組み換え酵素が組織特異的に発現する酵素である１２記載の機能性遺伝子発現動物。
１４．上記組み換え酵素がＣｒｅである１２または１３に記載の機能性遺伝子発現動物。
１５．上記機能性遺伝子発現動物が、ショウジョウバエである１２〜１４のいずれかに記載の機能性遺伝子発現動物。
１６．１２〜１５のいずれかに記載の機能性遺伝子発現動物の解析を行う解析装置であって、
動物の保持部と、
画像を取得するための撮像部と、
情報処理を行う情報処理部と、
を具備する解析装置。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のＤＮＡカセットは、所望の細胞や臓器中でのみ標的遺伝子を可視化することができ、さらには可視化した遺伝子改変動物を生きたままの状態で精度よく解析することができるように動物の改質を行うことができる。このため、標的遺伝子の発現制御領域により発現制御を受け所望の細胞や臓器中でのみ特定の機能を有する遺伝子を発現させ、更にはこれを可視化できる機能性遺伝子発現動物の作成が可能であり、また、形質転換動物作成の際のスクリーニングが容易なものである。
また、本発明のＤＮＡカセットは、組み換え酵素が発現しない環境で特定の機能を有する遺伝子が発現し、組み換え酵素が発現する環境でのみ上記特定の機能を有する遺伝子と異なる機能を有する遺伝子が発現するように構成することで、遺伝子の機能解析などに利用することも可能である。
本発明の形質転換動物は、標的遺伝子の発現制御領域により発現制御を受け所望の細胞や臓器中でのみ特定の機能を有する遺伝子の発現を行い、更にはこれを可視化できる形質転換細胞及び機能性遺伝子発現動物の作製を可能にするものであり、形質転換動物作成の際のスクリーニングが容易なものである。
また、本発明の形質転換動物は、組み換え酵素が発現しない環境で特定の機能を有する遺伝子が発現し、組み換え酵素が発現する環境でのみ上記特定の機能を有する遺伝子と異なる機能を有する遺伝子が発現する動物の作製を可能にするものであり、遺伝子の機能解析などに利用することも可能である。
本発明の機能性遺伝子発現動物は、標的遺伝子の発現制御領域により発現制御を受け所望の細胞や臓器中でのみ遺伝子発現を可視化することができ、所望の細胞や臓器での遺伝子発現の状態を解析することができ、また、体中に幅広く発現するような遺伝子でも特定臓器で機能を発現させて状態解析することができるものである。
また、機能性遺伝子発現動物は、組み換え酵素が発現しない環境で特定の機能を有する遺伝子が発現し、組み換え酵素が発現する環境でのみ上記特定の機能を有する遺伝子と異なる機能を有する遺伝子が発現する動物を作成することができ遺伝子の機能解析などに利用することも可能である。
本発明の解析装置は、遺伝子発現を可視化した遺伝子改変動物を生きたまま精度よく、簡易且つ簡便に、しかも連続的に且つ経時的に定量化することができるものである。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、本発明のＤＮＡカセットの一実施形態を示す概念図である。
【図２】図２は、本発明の解析装置の一実施形態を示す概念図である。
【図３】図３は、実施例１で作成した本発明のベクターを示す概略図である。
【図４】図４は、実施例１、試験例１、比較例１および比較試験例１の発光を発光顕微鏡で観察した結果を示す図面代用写真である。
【図５】図５は、実施例２、試験例２および比較試験例２の筋肉における発光をルミノメーターで経時的に定量した結果を示す図である。
【図６】図６は、実施例３、試験例３および比較試験例３の神経における発光をルミノメーターで経時的に定量した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明をさらに詳細に説明する。
まず、本発明のＤＮＡカセットについて説明する。
【００１２】
＜全体構成＞
本発明のＤＮＡカセットは、図１に示すように、
所定の標的ＤＮＡと相同組み換えを起こして染色体に導入可能なＤＮＡカセットであって、
上記標的ＤＮＡの配列の５’側と相同な配列と、
上記標的ＤＮＡの配列の３’側と相同な配列と、を有し、
且つ
上記５’側と相同な配列と上記３’側と相同な配列とに挟まれた部分に位置し、染色体導入時に機能を発現する初期機能配列及び一対の組み換え酵素認識配列を具備する保護配列と、
上記保護配列及び上記３’側と相同な配列の間に位置し、上記保護配列における少なくとも上記初期機能配列が除去された場合に初めて機能を発現する機能性遺伝子の配列と、
を有することを特徴とする。
【００１３】
以下、詳述する。
本発明のＤＮＡカセットは所定の標的ＤＮＡと相同組み換えを起こしうるものであるが、相同組み換えによる染色体への導入に限らず、ランダムに導入されることにより染色体に導入されてもよい。
＜標的ＤＮＡ＞
標的ＤＮＡは、動物、植物などの真核生物の任意の遺伝子である。
（所定の標的ＤＮＡ）
ここで、所定の標的ＤＮＡとは、本発明のＤＮＡカセットと相同組み換えする５’非翻訳領域から３’非翻訳領域を具備する遺伝子の配列（以下「標的配列」という場合にはこの配列を意味する）を含むＤＮＡであり、標的配列を含んでいればその他の配列は特に制限されず、標的配列のみからなるＤＮＡであってもよく、他の配列を含むＤＮＡであってもよい。
【００１４】
（相同な配列）
ここで、相同な配列とは、相同組み換えを起こす程度に高い同一性を有する配列をいう。
【００１５】
（標的ＤＮＡの配列の５’側と相同な配列）
標的ＤＮＡの配列の５’側と相同な配列とは、標的ＤＮＡの５’側に位置する配列と同一性の高い配列をいう。
上記標的ＤＮＡの配列の５’側と相同な配列は、５’非翻訳領域〜開始コドンの配列である。
上記標的ＤＮＡの配列の５’側と相同な配列の長さとしては、ショウジョウバエでは２〜３ｋｂであるのが、相同組み換えのしやすさの観点から好ましい。
【００１６】
（標的ＤＮＡの配列の３’側と相同な配列）
標的ＤＮＡの配列の３’側と相同な配列とは、標的遺伝子の３’側に位置する配列と同一性の高い配列をいう。
上記標的ＤＮＡの配列の３’側と相同な配列は、終始コドン〜３’非翻訳領域の配列である。
上記標的ＤＮＡの配列の３’側と相同な配列の長さとしては、ショウジョウバエでは２〜３ｋｂであるのが、相同組み換えのしやすさの観点から好ましい。
【００１７】
本発明のＤＮＡカセットは、上記標的ＤＮＡの配列の５’側及び３’側と相同な配列とにより、上記標的ＤＮＡの配列と相同組み換えを起こすことができ、これにより、本発明のＤＮＡカセットの配列は、生体内において標的ＤＮＡの遺伝子と同じ発現の制御を極めて高い可能性で受けることができる。
【００１８】
＜保護配列＞
上記保護配列は、図１に示すように、上記５’側と相同な配列と上記３’側と相同な配列とに挟まれた部分に位置し、染色体導入時に機能を発現する初期機能配列及び一対の組み換え酵素認識配列を具備する配列である。
上記保護配列は、図１に示すように、上記組換え酵素により、上記一対の組み換え酵素認識配列の間に位置するスタッファー配列を具備し、該スタッファー配列が除去されるようになされている配列である。上記初期機能配列は上記組み換え酵素認識配列間に位置するスタッファー配列の一部として配置されている。
【００１９】
（スタッファー配列）
上記スタッファー配列は、図１に示すように、上記一対の組み換え酵素の認識配列の間に位置し、上記組み換え酵素により除去される配列である。
上記スタッファー配列は、図１に示すように、上記初期機能配列を具備し、初期機能配列としての蛍光タンパク質遺伝子等のレポーター遺伝子や選択マーカーの配列等を少なくとも具備するものであり、これにより所望の機能を発揮する。
このようなスタッファー配列があることにより、上記組み換え酵素によりスタッファー配列が除去される環境では後述する機能性遺伝子の配列が発現し、上記組み換え酵素によりスタッファー配列が除去されていない環境では、上記初期機能配列の機能が発現し得るようになされている。
このため、例えば、上記組み換え酵素を所望の細胞や臓器特異的に発現させることによって、機能性遺伝子も細胞又は臓器特異的に発現するようになり、所望の細胞や臓器中でのみ機能性遺伝子を発現させることができる。
また、例えば、上記組み換え酵素を所望の細胞や臓器特異的に発現させ且つ機能性遺伝子としてレポーター遺伝子を用いた場合、所望の細胞や臓器中でのみで標的遺伝子の発現を可視化することができる。
【００２０】
＜初期機能配列＞
上記初期機能配列は、図１に示すように、上記５’側と相同な配列と上記３’側と相同な配列とに挟まれた部分に位置し、染色体導入時に機能を発現する配列であり、上記初期機能配列は組み換え酵素が存在しない環境で発現するようになされており、組み換え酵素が存在する環境において、組み換え酵素により除去される配列である。
ここで、上記初期機能配列は機能性を有する配列を意味し、蛍光タンパク質等のレポーター遺伝子、選択マーカーの配列、公知の機能を有するタンパク質やＲＮＡをコードする遺伝子の配列、正常タンパク質を改変し機能の欠損、弱化、強化もしくは融合するなどで改質したタンパク質をコードする遺伝子の配列などの機能を有する配列をいい、それらを複数具備してもよい。
本発明で用いられる上記初期機能配列は、少なくともレポーター遺伝子及び選択マーカーの配列を具備し、レポーター遺伝子としての緑色蛍光タンパク質及び選択マーカーの配列を具備するのが好ましい。
上記初期機能配列を上記組み換え酵素が存在しない環境で発現させるようにするには、例えば、上述した５’側と相同な配列が具備する開始コドンの配列及び初期機能配列の読枠フレームを合わせた構成とする等通常この種のＤＮＡカセットにおいて採用されている構成を適宜用いることができる。
また、例えば、上記初期機能配列を、正常タンパク質をコードする遺伝子で構成し、後述する機能性配列を該正常タンパク質が変異した病気の原因遺伝子で構成した場合、該病気の原因遺伝子を組み換え酵素が発現する環境でのみ発現するようにさせることができ、特定の組織や環境における遺伝子の機能解析などに利用することも可能である。
【００２１】
（組み換え酵素）
ここで、組み換え酵素とは、特異的な核酸配列を認識する活性、前記配列を切断する活性、鎖交換に関与するトポイソメラーゼ活性、及び切断された核酸を結合させるリガーゼ活性を具備する酵素をいう。
上記組み換え酵素としては、上記の活性を具備する人工的に改変がなされた酵素や変異体酵素なども含まれる。
本発明で用いられる組み換え酵素としては、Ｃｒｅ、Ｃｒｅ−ＥＢＤ、Ｉｎｔ、Ｆｌｐなどが挙げられ、Ｃｒｅ、及び、Ｃｒｅ−ＥＢＤが好ましく挙げられる。
ここで、ＣｒｅとはＰ１ファージ由来のＣｒｅ遺伝子をいい、Ｉｎｔとはλファージのインテグラーゼ遺伝子（Ｉｎｔ）をいい、ＦｌｐとはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＦｌｐ遺伝子をいい、Ｃｒｅ−ＥＢＤとは、Ｄｅｖ  Ｇｅｎｅｓ  Ｅｖｏｌ  （２００１）  ２１１：４５８〜４６５に開示されるようなＣｒｅタンパク質にエストロゲン受容体のリガンド結合ドメイン部分のタンパク質を付加した融合タンパク質で、エストロゲンによりＣｒｅ−ＥＢＤの組み換え活性が発現するようになされているものをいう。
【００２２】
（組み換え酵素認識配列）
上記組み換え酵素の認識配列とは、上記組み換え酵素に認識される配列をいい、組み換え酵素の種類により認識配列が異なる。
組み換え酵素と、組み換え酵素の認識配列との関係を表１に示す。
【表１】
2014143962.tif 000003
即ち、本発明のＤＮＡカセットにおいては、上記組み換え酵素認識配列を認識させるためには、表１に示した組み合わせで組み換え酵素を使用する必要がある。
【００２３】
上記組み換え酵素の認識配列は、一対で用いられ、少なくとも一対の組み換え酵素の認識配列の間の遺伝子配列が除去するようになされている。
例えば、上記組み換え酵素の認識配列の対の構成については、上記組換え酵素がＣｒｅの場合には上記組換え酵素の認識配列はｌｏｘＰ配列であるが、ｌｏｘＰ配列を同方向の対にすることでＣｒｅによりｌｏｘＰ間の配列が除去されるように構成する。
また、上記の組換え酵素に認識される配列であれば、人工的に改変がなされている配列や変異型配列も使用できる。人工的に改変がなされた配列としては、例えば、特開平１１−１９６８８０に開示される改変型ｌｏｘＰ配列や、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４９９  （２００１）１４７−１５３ページに開示されるＦＡＳ配列などが挙げられる。
【００２４】
また、上記保護配列において、上記の組み換え酵素の認識配列は人工イントロン配列内に配置されており、上記組み換え酵素により上記スタッファー配列が除去された後に５’側と３’側の両人工イントロン配列とが融合して、融合配列が形成されるようになされているのが好ましい。すなわち、図１に示すように、上記保護配列を挟むように且つ上記標的ＤＮＡの配列の５’側と相同な配列及び上記標的ＤＮＡの配列の３’側と相同な配列との間に位置するように、２つの人工イントロン配列が配されて、かかる人工イントロン配列内に上記の組み換え酵素の認識配列が存在するように構成されているのが好ましい。
【００２５】
（人工イントロン配列）
ここで、人工イントロン配列は、ＲＮＡ（ｍＲＮＡ前駆体、ｐｒｅ−ｍＲＮＡともいう）として転写されたときに、生体内のスプライシング機構により除去されるようになされている配列である。
このような配列としては、転写されたＲＮＡ（ｍＲＮＡ前駆体）がスプライセオソームによりスプライシングされる配列で、ＤＮＡ配列として記載した場合に５’末端にＧＴ（ここでＧ＝グアニン、Ｔ＝チミン）及び３’末端にＡＧ（Ａ＝アデニン、Ｇ＝グアニン）のジヌクレオチドを有する配列などが挙げられる。
【００２６】
（５’側の人工イントロン配列）
上記５’側の人工イントロン配列は、上記の組み換え酵素の認識配列を有するのが好ましい。
例えば、上記５’側の人工イントロン配列は、配列番号１に示すように構成することができる。
配列番号１：
塩基番号１〜２にスプライシングのドナーサイト、
塩基番号４１〜７４に組み換え酵素で認識される配列（ｌｏｘＰ）、
塩基番号２７５〜２７６にスプライシングのアクセプターサイト、
【００２７】
（３’側の人工イントロン配列）
上記３’側の人工イントロン配列は、上記の組み換え酵素の認識配列を有するのが好ましい。
また、上記組み換え酵素の認識配列がｌｏｘＰであるとき、上記３’側の人工イントロン配列は、さらに、上記組み換え酵素の認識配列の３’側にＣｒｅに認識されるがｌｏｘＰ配列とは相同組み換えを起こさない変異型ｌｏｘＰ配列を具備するのが好ましく、ＦＡＳ配列を具備するのが特に好ましい。
ここで、 ＦＡＳ配列とはＳｉｅｇｅｌら著のＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４９９（２００１）、１４７−１５３ページに開示されるＣｒｅの標的配列のうちの一つである配列をいう。ＦＡＳ配列は、ｌｏｘＰ配列と配列が異なり、ｌｏｘＰ配列とは組換えをおこさない。
この構成により、ｌｏｘＰ配列とＦＡＳ配列とで挟んだ外来ＤＮＡ配列を、本発明のＤＮＡカセット内のｌｏｘＰ配列とＦＡＳ配列との間に正確に導入することが可能となる。
例えば、ｌｏｘＰ配列とＦＡＳ配列との間の配列をヒト遺伝子のコーディング領域の配列に置換しヒトタンパク質を発現させた場合、それを標的としたｉｎ  ｖｉｖｏ薬剤スクリーニングが可能になる。また、変異型遺伝子で置換して、その変異がどのような機能的影響をもたらすのかを、素早く検証できる。
例えば、上記３’側の人工イントロン配列は、配列番号２のように構成することができる。
配列番号２：
塩基番号１〜３４に組み換え酵素で認識される配列（ｌｏｘＰ）、
塩基番号１１５〜１４８にＦＡＳ配列、
塩基番号２６９〜２７０にスプライシングのアクセプターサイト、
【００２８】
（融合配列）
上記の組み換え酵素認識配列は人工イントロン配列内に配置されており、
上記組み換え酵素により上記スタッファー配列が除去された後に５’側と３’側の両人工イントロン配列とが融合して、融合配列が形成されるようになされている。
融合配列はｍＲＮＡ前駆体として転写され、ｍＲＮＡになるときに生体内のスプライシング機構により除去されるようになされている。
これにより、標的遺伝子の配列の５’側と相同な配列と、機能性遺伝子の配列とが、ＲＮＡにおいてスプライシングにより連結され、機能性遺伝子が発現する。
上記融合配列の一例として配列番号１と２が融合した配列を、配列番号３に示す。
配列番号：３
塩基番号１〜２にスプライシングのドナーサイト（５’側の人工イントロン配列由来）、
塩基番号４１〜７４に組み換え酵素で認識される配列（ｌｏｘＰ）、
塩基番号１５５〜１８８にＦＡＳ配列、
塩基番号３０９〜３１０にスプライシングのアクセプターサイト、（３’側の人工イントロン配列由来）
【００２９】
＜レポーター遺伝子＞
上記初期機能配列は、図１に示すように、少なくともレポーター遺伝子及び選択マーカーの配列を具備する。
上記レポーター遺伝子とは、遺伝子の発現を確認するために用いる遺伝子をいい、蛍光タンパク質遺伝子、ルシフェラーゼなどの発光反応を触媒するタンパク質の遺伝子、β−ガラクトシターゼなどの発色反応を触媒するタンパク質の遺伝子が挙げられる。
上記初期機能配列として上記レポーター遺伝子を用いる場合、上記レポーター遺伝子の配列は、５’側の人工イントロン配列の３’側に配置されるのが好ましい。これにより、転写後のＲＮＡにおいて、５’側の人工イントロン配列は、スプライシングにより除去され、上記標的遺伝子の配列の５’側と相同な配列と、上記レポーター遺伝子の配列とが連結される。
また、この構成により、上記初期機能配列としてのレポーター遺伝子は、組み換え酵素が存在しない環境で標的遺伝子の発現パターンを示す。
（蛍光タンパク質遺伝子）
上記蛍光タンパク質遺伝子としては、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）が挙げられ、緑色蛍光タンパク質が好ましく挙げられる。
また、本発明で用いることができる上記蛍光タンパク質は、人工的に改変されたものも含まれる。
【００３０】
（選択マーカーの配列）
上記選択マーカーの配列は、本発明のＤＮＡカセットで動物を形質転換した際に該ＤＮＡカセットの移入があった個体を外部から判別しやすくするために使用するための機能をもつ配列であり、組織特異的な発現を示す遺伝子、体色や体の組織に変化を及ぼす遺伝子、薬剤選択マーカーとしての遺伝子などの配列やそれらの融合配列なども用いることができる。
例えば、上記選択マーカーの配列としては、ＧＭＲ−ｗ＋、ｍｉｎｉ−ｗｈｉｔｅ＋、ｈｓｐ７０−ｗｈｉｔｅ＋などの配列が好ましく挙げられる。
ここで、ＧＭＲ−ｗ＋とは、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．（２００８）Ｓｅｐ；１８０（１）：７０３−７ページに開示されるＧＭＲの下流にショウジョウバエのｗｈｉｔｅ＋遺伝子を連結させた配列をいう。
ＧＭＲはショウジョウバエの複眼原基特異的プロモーター配列をいい、ｒｈｏｄｏｐｓｉｎ１遺伝子のプロモーターに由来する配列を５コピー隣接して並べた配列である。また、ｗｈｉｔｅ＋はショウジョウバエのｗｈｉｔｅ＋遺伝子をいい、それらを改変した配列を用いてもよい。
ここで、ｍｉｎｉ―ｗｈｉｔｅ＋とは、Ｚｈａｎｇら著Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ（９２）５５２５−５５２９ページに開示されるｗｈｉｔｅ＋遺伝子をコンパクトに改変した配列である。
また、ｈｓｐ７０−ｗｈｉｔｅ＋とは、ショウジョウバエのｈｓｐ７０遺伝子のプロモーターの配列の下流に上記のｗｈｉｔｅ＋遺伝子を連結させた配列をいう。
例えば、上記保護配列がＧＭＲ−ｗ＋を具備する本発明のＤＮＡカセットの配列を白眼のショウジョウバエの系統に移入した場合、ショウジョウバエの眼はＧＭＲ−ｗ＋により赤くなる。
これにより、移入ＤＮＡの検出や顕微鏡などを使用することなしに肉眼で、本発明のＤＮＡカセットが染色体上に移入された個体を選別することができるため、遺伝子改変動物作成の労力を大きく減らすことができる。
また、本発明のＤＮＡカセットによる形質転換動物は、上記選択マーカーを生殖細胞で保護配列が切り出されたものをみわける際に便利なマーカーとして利用することができる。
【００３１】
上記スタッファー配列には、図１に示すように、上記初期機能配列に加えてさらにポリＡシグナル配列等の初期機能配列の転写の終結やｍＲＮＡの安定化等種々機能付加のための機能付加配列をさらに配置することができる。
（ポリＡシグナル配列）
ポリＡシグナル配列は、上記蛍光タンパク質遺伝子の３’側に配置されるのが好ましい。
ここで、ポリＡシグナル配列は、転写されたｍＲＮＡにポリＡを付加する機能を有する配列をいう。
具体的には、ポリＡシグナル配列としては、ＳＶ４０ｐｏｌｙＡ配列などの配列が挙げられる。
ポリＡシグナル配列は、図１に示すように、上記蛍光タンパク質遺伝子の配列と、上記選択マーカーの配列との間に位置するのが好ましい。
これにより、蛍光タンパク質遺伝子の配列の転写を停止させることができ、かつ、蛍光タンパク質遺伝子のｍＲＮＡを安定化させ蛍光タンパク質の発現効率を高めることができる。
【００３２】
＜機能性遺伝子＞
本発明のＤＮＡカセットにおいて、機能性遺伝子は、上記組み換え酵素によりスタッファー配列が除去される環境で、発現するようになされている。
上記機能性遺伝子としては、初期機能配列と同様の遺伝子が挙げられ、中でもレポーター遺伝子が好ましく挙げられる。
ただし、上記機能性遺伝子は上記初期機能配列と異なる遺伝子を選択する必要がある。
上記レポーター遺伝子としては、上記初期機能配列と同様に、ルシフェラーゼ遺伝子を好ましく挙げることができるが、この他に蛍光タンパク質の遺伝子、β−ガラクトシターゼなどの発色反応を触媒するタンパク質の遺伝子等を用いることもできる。
機能性遺伝子としてレポーター遺伝子を用いることにより、遺伝子発現を定量的に解析することができ、特に機能性遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子を用いることにより、遺伝子発現を可視光領域で定量的に解析することができる。
ここで、ルシフェラーゼとは、ホタルや発光バクテリアなどの生物発光において、発光物質が光を放つ化学反応を触媒する作用を持つ酵素の総称をいい、上記の特徴を具備した酵素や人工的に改変がなされた酵素も含まれる。
また、励起光を必要とせず可視光領域にて観察を行うことができるため高価な設備を必要とせずに観察できる。また、励起光の照射による動物への悪影響を低減することができる。
機能性遺伝子発現動物の機能性遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子を用いる場合は、基質であるルシフェリンを餌などに混合し動物に与えることなどで、ルシフェラーゼ遺伝子が発現する組織や細胞を発光させることができる。
【００３３】
（製造方法）
本発明のＤＮＡカセットは、プラスミド、ファージ、ＢＡＣなどのＤＮＡの断片や、ＰＣＲなどによるＤＮＡの増幅産物、化学合成などにより得られるＤＮＡを用いて、ライゲーション反応や、組み換え反応などによる連結、または制限酵素処理による切断などの公知の手法を応用して作製することができる。
【００３４】
次に、本発明のベクターについて説明する。
本発明のベクターは、本発明のＤＮＡカセットを具備するベクターである。
本発明のベクターは、本発明のＤＮＡカセットを公知のベクターに、ライゲーション反応や、組み換え反応などの公知の方法で連結させることにより作製することができる。
本発明のベクターの作製には、公知のプラスミド、ファージなどのベクターを用いることができる。
【００３５】
次に、本発明の形質転換細胞について説明する。
本発明の形質転換細胞は、本発明の上記ＤＮＡカセットを１つ以上染色体上に有する細胞をいう。
本発明の形質転換細胞は、細胞に本発明のＤＮＡカセットや本発明のベクターををリン酸カルシウム法、リポフェクション法やエレクトロポレーション法などの公知の方法で導入し形質転換させることにより得ることができる。
また、形質転換動物や後述する機能性遺伝子発現動物の組織などから細胞を採取しても得ることができる。
【００３６】
＜形質転換動物＞
次に、本発明の形質転換動物について説明する。
本発明の形質転換動物は、本発明の上記ＤＮＡカセットを１つ以上染色体上に有する上記形質転換細胞を含有するヒト以外の動物をいい、後述する組み換え酵素が導入される以前のＤＮＡカセットが染色体上に導入された段階の動物である。
動物としては、昆虫、哺乳類（マウス、ラット、ハムスターなど）、魚類など形質転換が可能な動物が挙げられるが、本発明のＤＮＡカセットがレポーター遺伝子を具備する場合は胚や成体において体内の発光が体外に透過する動物が好ましい。
例えば、昆虫であればショウジョウバエ、魚類であればメダカやゼブラフィッシュ、尾索動物のカタユウレイボヤなどが好ましく挙げられ、ショウジョウバエが特に好ましく挙げられる。
ショウジョウバエは、体色が薄いためレポーター遺伝子としてのルシフェラーゼや蛍光タンパク質の体内の発光を体外へ透過しやすく、微弱な発光も観察できるため好ましい。
また、ショウジョウバエは、ヒトと相同な遺伝子を多数有し、遺伝子の研究材料として古くから研究され高度な解析技術が確立されているため、組織特異的に遺伝子を発現させるための系統も充実しており好ましい。
また、ショウジョウバエは、飼育が容易で、体型も小さく、生活環も約１０日余りと短く、低コスト化が可能であることから好ましい。
【００３７】
本発明の形質転換動物は、本発明のＤＮＡカセットをインジェクション法、エレクトロポレーション法などの公知の方法で移入し、移入後の動物を初期機能性配列の発現（眼色や、蛍光タンパク質の発現）を指標に選抜することにより得ることができる。
【００３８】
＜機能性遺伝子発現動物＞
次に、本発明の機能性遺伝子発現動物について説明する。
ここで、機能性遺伝子発現動物とは、本発明の形質転換動物（本発明の本発明の上記ＤＮＡカセットを１つ以上染色体上に有する動物）にさらに上記組み換え酵素の認識配列を認識する組み換え酵素が発現する動物をいう。
上記機能性遺伝子発現動物は、標的遺伝子が発現する組織で且つ上記の組み換え酵素が発現する部位において、上記機能性遺伝子が発現するようになされている。
上記の組み換え酵素は、組織特異的に発現するようになされているのが好ましい。
例えば、上記組み換え酵素が組織特異的に発現するようになされている場合、上記組み換え酵素が発現する組織でのみ機能性遺伝子を発現させることができる。
また、例えば、機能性遺伝子としてレポーター遺伝子を用いた場合、標的遺伝子が体全体に発現し体全体が発光するなどの理由で観察ができなかったものが、特定の組織に限定してレポーター遺伝子を発現させることで観察できるようになる。
【００３９】
また、本発明の機能性遺伝子発現動物が同一個体に複数のＤＮＡカセットを持ち、且つ、それらのＤＮＡカセットが機能性遺伝子として波長が異なるレポーター遺伝子を持つように構成した場合、同時に複数の遺伝子の発現をモニターすることも可能である。
また、例えば、標的遺伝子としてショウジョウバエのゲノムの全ての遺伝子において、本発明の機能性遺伝子発現動物を作製しライブラリー化すれば、マイクロアレイと同様にゲノムの全遺伝子の発現データを解析ができ高い時間空間分解能で取得可能な網羅的解析が可能になる。
【００４０】
本発明の機能性遺伝子発現動物の作製手段としては、例えば、本発明の形質転換動物に、組織特異的プロモーターの下流に上記組み換え酵素を組み込み、組織特異的に上記組み換え酵素が発現するようにした配列をもつＤＮＡを移入することなどが挙げられる。
また、例えば、本発明の機能性遺伝子発現動物に、ＧＡＬ４−ＵＡＳシステムを用い組織特異的にＧＡＬ４を発現しＵＡＳの下流に上記組み換え酵素を組み込んだＤＮＡを有する系統と交配しその子孫を得ることが挙げられる。
【００４１】
上記組み換え酵素の認識配列を認識する組み換え酵素としては、Ｃｒｅが好ましく、中でもＣｒｅ−ＥＢＤが好ましい。
Ｃｒｅ−ＥＢＤを用いた場合、動物にエストロゲンを与えることでＣｒｅ−ＥＢＤが活性をもち、スタッファー配列を除去することができる。
また、Ｃｒｅは細胞毒性を示すことが知られており、エストロゲンの投与を必要最小限にとどめることでＣｒｅ−ＥＢＤの組み換え活性の発現の時間も最小限になり、細胞毒性を大きく減らすことができる。
【００４２】
次に、本発明の機能性遺伝子発現動物の利用方法について説明する。
本発明の機能性遺伝子発現動物が具備する本発明のＤＮＡカセットの機能性遺伝子がルシフェラーゼである場合を例にして説明する。
本発明の形質転換動物であり上記組み換え酵素が発現する可能性のあるショウジョウバエの成虫を、交配や遺伝子導入などの手段で準備する。
得られたショウジョウバエの成虫に、ルシフェリンを混合した餌を与え、上記組み換え酵素が発現する部位を発光させる。
上記組み換え酵素が発現する部位の発光を観察し、発光している個体を選別することで、本発明のＤＮＡカセットが導入され且つ所望の臓器で上記組み換え酵素が発現する機能性遺伝子発現動物を得る。
なお、上記組み換え酵素がＣｒｅ−ＥＢＤの場合、餌にさらにエストロゲンを添加することで、Ｃｒｅ−ＥＢＤが発現する部位を発光させることができる。
なお、ルシフェリン及びエストロゲンを混合した餌は、たとえば、餌１ｍＬに対し、ルシフェリン０．１〜１ｍｇ及びエストロゲン０．１〜１ｍｇを添加したものである。
そして、得られた機能性遺伝子発現動物を顕微鏡やルミノメーターなどの発光定量装置や後述する解析装置により、種々条件下における発光の有無や強度を測定することで、環境や投与物質による生体への影響を定性的且つ定量的に分析することができる。
【００４３】
上記機能性遺伝子発現動物解析装置について図面を参照して説明する。
図２に示す解析装置１０１は、機能性遺伝子発現動物の解析を行う解析装置であって、
動物の保持部１１０と、画像を取得するための撮像部１２０と、情報処理を行う情報処理部１３０と、を具備する。
さらに詳細には、保持部１１０は、縦長の試験管状の部屋１１１が複数個連設されて形成されており、本実施形態では縦６室×横８室の計４８室からなる。そして、各部屋の上部開口はそれぞれ透明で内部が撮影可能な蓋材（図示せず）により封止可能となされている。
撮像部１２０は、各部屋の内部が個別に、複数個を同時にもしくはすべてを同時に撮影できるようになっているカメラからなる。そして、保持部１１０の上部に、公知の移動用機器を介して配置されており、上方から撮影するように構成されている。
情報処理部１３０は、カメラで撮影した画像を入力して保存するメモリー部１３１と、入力した情報を処理するＣＰＵ１３２と、処理するためのプログラムを保存すると共にＣＰＵ１３２で処理して得られた情報を保存する保存部１３３とからなる。これらの各部はハウジング１３４内に設置されており、撮像部１２０とはケーブル１２２を介して連結されている。
そして、本実施形態の解析装置を用いて機能性遺伝子発現動物の解析を行うには、まず、各部屋１１１内に機能性遺伝子発現動物を入れて蓋で封止する。この状態でそれぞれの部屋内の動物に所望の処理を行いその際の作用を、撮像部１２０で映像を取得することで観察する。この際、観察は撮像部１２０を順次移動させながら各部屋１１１の上部から各部屋１１１を順次撮影することで行う。ついで撮影した画像を時間とともに記録しつつ、撮影した画像の処理を行い、経時的な変化を記録し、保存部に保存する。そして、これらの画像を部屋ごとに経時的に並べて観察することで機能性遺伝子発現動物に対する影響を分析できる。
なお、上述した例では、撮像部１２０が各部屋の内部を個別に撮影できるようになっているカメラを用い順次移動させながら各部屋１１１を順次撮影する場合の例を示したがこれらに限定されるものではない。
例えば、部屋全体の画像を一度に取得可能なカメラを用いて画像の取得をし、解析時に各部屋のデータを分離して解析をしてもよい。また、複数のカメラを用いて同時に各部屋の内部を撮影し、個別に解析するようにしてもよい。
【実施例】
【００４４】
以下、本発明について実施例及び比較例を示してさらに具体的に説明するが本発明はこれらに何ら制限されるものではない。
【００４５】
〔実施例１〕
＜ＤＮＡカセットの製造＞
標的遺伝子としてのショウジョウバエのＴｈｏｒ（４Ｅ−ＢＰ）の５’末端の部分を特異的に増幅しＤＮＡの増副産物を得る（ＰＣＲ）ため、以下のプライマー１及び２を設計した。
プライマー１（配列番号４）：
ＡＴＧＧＧＧＴＴＡＡＣＴＣＧＡＣＴＧＧＡＴＧＡＡＴＧＴＧＧＡＴＧＧＡＴＧ
プライマー２（配列番号５）：
ＡＧＡＴＧＣＴＣＡＣＣＴＧＣＡＴＣＴＴＡＧＣＴＧＡＴＴＧＡＴＴＧＧＡＴＴＧ
なお、プライマー１には、形質転換用ベクター配列である配列番号８の４２６〜４４４の部分の配列をアダプターとして導入し、プライマー２には、形質転換用ベクター配列である配列番号８の３４０９〜３４２１の部分の配列をアダプターとして導入した。
標的遺伝子としてのＴｈｏｒ（４Ｅ−ＢＰ）の３’末端の部分を特異的に増幅するため、
以下のプライマー３及び４を設計した。
プライマー３（配列番号６）：
ＧＣＴＴＣＴＡＡＧＣＴＧＴＡＡＧＧＧＧＴＧＴＧＧＣＧＴＧＴＡＣＡＣ
プライマー４（配列番号７）：
ＧＧＧＣＣＣＣＡＡＡＧＧＡＴＣＴＧＡＣＡＡＣＧＡＣＡＴＡＧＡＣＧＡＧＡＣＣ
なお、プライマー３には、形質転換用ベクター配列である配列番号８の９６１３〜９６２２の部分の配列をアダプターとして導入し、プライマー４には、形質転換用ベクター配列である配列番号８の１１５８８〜１１６０２の部分の配列をアダプターとして導入した。
設計したプライマーを用いて、ＰＣＲ法により標的遺伝子としてのＴｈｏｒ（４Ｅ−ＢＰ）の５’末端の部分及び３’末端の部分ＤＮＡ断片を増幅し、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）のマニュアルに従いＣｌｏｎｉｎｇ  Ｅｎｈａｎｃｅｒにより処理した。
処理後の標的遺伝子としてのＴｈｏｒ（４Ｅ−ＢＰ）の５’末端の部分及び３’末端の部分ＤＮＡ断片と、予め作成したＤＮＡ断片５’側の人工イントロン、初期機能性配列としての緑色蛍光タンパク質、ＧＭＲ−ｗ＋を具備する保護配列、３’側の人工イントロン配列および機能性配列としてのルシフェラーゼ遺伝子を具備するＤＮＡ断片（配列番号８の３４０９〜９６２２部分）と、予めｐＵＣ５７に、相同組換えに必要な配列（Ｉ−ＳｃｅＩ，ＦＲＴ，ａｔｔＢ）を導入し作成した形質転換用ベクターの断片（配列番号８の１１５６６〜１４００５に１〜４４４が連結した配列）と、を混合し、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いて、組み換え反応を行い、本発明のＤＮＡカセットを含むベクターを得た。
得られたＤＮＡを大腸菌に形質転換し、ＬＢ培地で、３７℃で１６時間培養後、大腸菌を集菌し、プラスミド精製キットによりプラスミドを精製した。
得られたＤＮＡカセットを具備する本発明のベクターを図３に示し、その配列を配列番号８に示す。
配列番号８：
塩基番号１〜４４０：形質転換用ベクターの配列
塩基番号４４１〜３４０８：標的ＤＮＡ（Ｔｈｏｒ（４Ｅ−ＢＰ））の５’非翻訳領域〜開始コドン。
塩基番号３４１２〜３４１３：保護配列の５’側の人工イントロン配列のスプライシングのドナーサイト。
塩基番号３４５２〜３４８５：保護配列の組み換え酵素認識配列（５’側の人工イントロン配列の組み換え酵素認識配列（ｌｏｘＰ）。）
塩基番号３６８６〜３６８７：保護配列の５’側の人工イントロン配列のスプライシングのアクセプターサイト。
塩基番号３６８８〜３７０５：保護配列の初期機能配列としての緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の第２コドン〜終始コドン直前の塩基。
塩基番号３７０６〜４４０４：保護配列のポリＡシグナル配列（ＳＶ４０のポリＡシグナルを含む３’非翻訳領域。）
塩基番号４６９３〜７７０９：保護配列の初期機能配列としての選択マーカーの配列（ＧＭＲ−ｗｈｉｔｅ＋）の遺伝子領域
塩基番号７７３２〜７７６５：保護配列の組み換え酵素認識配列（３’側の人工イントロン配列の組み換え酵素認識配列（ｌｏｘＰ）。
塩基番号７８４６〜７８７９：保護配列の３’側の人工イントロン配列のＦＡＳ配列。
塩基番号８０００〜８００１：保護配列の３’側の人工イントロン配列のスプライシングのアクセプターサイト。
塩基番号８００２〜９６２４：機能性遺伝子としてのレポーター遺伝子（ルシフェラーゼ）の第２コドン〜終始コドン直前の塩基。
塩基番号９６２５〜１１５８７：標的ＤＮＡ（Ｔｈｏｒ（４Ｅ−ＢＰ））の終始コドン〜３’非翻訳領域。
塩基番号１１５８８〜１４００５：形質転換用ベクターの配列
＜形質転換動物作製＞
得られたＤＮＡカセットをリン酸緩衝液で、濃度４００ｎｇ／ｕＬに調整した。
濃度調整後のＤＮＡカセット、約１ｎＬを実体顕微鏡下でマイクロインジェクション装置を用いショウジョウバエの１細胞期の受精卵２００個にマイクロインジェクションした。
（形質転換動物の１次スクリーニング）
マイクロインジェクションを行った受精卵を２５℃、１２日間の条件でインキュベーションし、ショウジョウバエの成虫約５０匹を得た。
これを個体ごとにｗｈｉｔｅ系統と交配し、得られた次代のショウジョウバエの成虫の眼を観察し、眼色が赤いもの２０匹を選別した。
選別したショウジョウバエをバランサー系統に交配させ、本発明の形質転換動物としてのショウジョウバエを得た。
＜機能性遺伝子発現動物の作製＞
組み換え酵素Ｃｒｅを生殖細胞でのみ発現するｎｏｓ−Ｃｒｅ系統と、得られた形質転換動物としてのショウジョウバエとを交配させた。
ここで、ｎｏｓ−Ｃｒｅ系統とは、ショウジョウバエのｎｏｓ遺伝子プロモーターの下流にＣｒｅを連結した配列を染色体上に有する系統で、生殖細胞でＣｒｅが発現するようになされている系統である。
その結果、Ｔｈｏｒ（４−ＥＢＰ）遺伝子を標的にした本発明のＤＮＡカセットを染色体上に有し、生殖細胞の組織特異的にＣｒｅを発現する本発明の機能性遺伝子発現動物としてのショウジョウバエを得た。
＜機能性遺伝子発現動物の観察＞
得られた本発明の機能性遺伝子発現動物としてのショウジョウバエに、ルシフェリンを混合した餌を与え、生殖細胞の発光を、発光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ社製、「装置名：Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ  ＬＶ２００」）を用いて観察した。
その結果を図４に示す。
なお、ルシフェリンを混合した餌は、餌１ｇに対し、ルシフェリン６４０ｎｇを添加したものである。
【００４６】
〔比較例１〕（野生型）
機能性遺伝子発現動物の観察において、観察に供する動物を野生型のショウジョウバエに変えた以外は、実施例１と同様にして、生殖細胞の発光を、発光顕微鏡を用いて観察した。
その結果を図４に示す。
【００４７】
〔試験例１〕（飢餓ストレス）
実施例１で得られた機能性遺伝子発現動物に飢餓ストレスを与えた。それ以外の条件は実施例１と同様にして、生殖細胞の発光を発光顕微鏡で観察した。
なお、飢餓ストレスの誘導は、飢餓用培地（アガロース１％、グルコース１０％、イーストエキストラクト４％  ルシフェリン６４０ｎｇ／ｇ）で２日間飼育した形質転換動物を、低栄養培地（通常培地の組成のうち、グルコースとイーストエキストラクトを共に１％に減じたもの）に移し替えることにより行った。
その結果を図４に示す。
【００４８】
〔実施例２〕
実施例１で得られた形質転換動物に、組み換え酵素Ｃｒｅ−ＥＢＤを筋肉で発現する２４Ｂ−Ｇａｌ４／ＵＡＳｐ−Ｃｒｅ−ＥＢＤ系統を交配させて、本発明の機能性遺伝子発現動物を得た。
ここで、２４Ｂ−Ｇａｌ４／ＵＡＳｐ−Ｃｒｅ−ＥＢＤ系統とは、ショウジョウバエの２４Ｂ遺伝子のプロモーターにＧＡＬ４遺伝子を連結した配列およびＵＡＳプロモーターの下流にＣｒｅ−ＥＢＤを連結した配列を染色体上に有するショウジョウバエの系統をいう。
得られた機能性遺伝子発現動物にルシフェリン及びエストロゲンを混合した餌（餌１ｇに対し、ルシフェリン６４０ｎｇ及びエストロゲン０．３ｍｇ）を与え、餌を与えた後の２，３，４，５及び６日後の機能性遺伝子発現動物の発光をルミノメーターで測定した。
その結果を図５に示す。
【００４９】
なお、ルミノメーターを用いた経時的な発光の測定は、以下の条件で行った。
ルミノメーター（ＢＥＲＴＨＯＬＤ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社製、「装置名Ｃｅｎｔｒｏ  ＬＢ  ９６０  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ」）
測定条件：
測定温度：２５℃
測定時間：３０ｓｅｃ／ｗｅｌｌ
測定用プレート：９６ウェル  マイクロプレート白（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ社）
培地量：４０μＬ／ｗｅｌｌ
プレート用シール：Ｘ−Ｐｉｅｒｃｅ（登録商標）  Ｆｉｌｍ（Ｅｘｃｅｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）
測定用ソフトウェア：Ｍｉｃｒｏｗｉｎ（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ社）
【００５０】
〔試験例２〕
実施例２で得られた機能性遺伝子発現動物の発光を観察した。
観察時に与えた餌をエストロゲン含有量が高い餌（餌１ｇに対し、ルシフェリン６４０ｎｇ及びエストロゲン１ｍｇ）に変更した。それ以外は、実施例２と同様にして機能性遺伝子発現動物の発光をルミノメーターで測定した。
その結果を図５に示す。
【００５１】
〔比較試験例２〕
実施例２で得られた機能性遺伝子発現動物の発光を観察した。
観察時に与えた餌をエストロゲンを除いた餌（餌１ｇに対し、ルシフェリン６４０ｎｇ）に変更した。それ以外は、実施例２と同様にして機能性遺伝子発現動物の発光をルミノメーターで測定した。
その結果を図５に示す。
【００５２】
〔実施例３〕
実施例１で得られた形質転換動物に、交配するショウジョウバエを組み換え酵素Ｃｒｅ−ＥＢＤを神経で発現するｅｌａｖ−Ｇａｌ４／ＵＡＳｐ−Ｃｒｅ−ＥＢＤ系統に変更して、本発明の機能性遺伝子発現動物を得た。
ここで、ｅｌａｖ−Ｇａｌ４／ＵＡＳｐ−Ｃｒｅ−ＥＢＤ系統とは、ショウジョウバエのｅｌａｖ遺伝子のプロモーターにＧＡＬ４遺伝子を連結した配列およびＵＡＳプロモーターの下流にＣｒｅ−ＥＢＤを連結した配列を染色体上に有するショウジョウバエの系統をいう。
得られた機能性遺伝子発現動物に与えた餌及び観察は実施例２と同様にして行い機能性遺伝子発現動物の発光をルミノメーターで測定した。
その結果を図６に示す。
【００５３】
〔試験例３〕
実施例３で得られた機能性遺伝子発現動物の発光を観察した。
観察時に与えた餌をエストロゲン含有量が高い餌（餌１ｇに対し、ルシフェリン６４０ｎｇ及びエストロゲン１ｍｇ）に変更した。それ以外は、実施例３と同様にして機能性遺伝子発現動物の発光をルミノメーターで測定した。
その結果を図６に示す。
【００５４】
〔比較試験例３〕
実施例３で得られた機能性遺伝子発現動物の発光を観察した。
観察時に与えた餌をエストロゲンを除いた餌（餌１ｇに対し、ルシフェリン６４０ｎｇ）に変更した。それ以外は、実施例３と同様にして機能性遺伝子発現動物の発光をルミノメーターで測定した。
その結果を図６に示す。
【００５５】
以下、結果を説明する。
図４は、本発明の機能性遺伝子発現動物の生殖細胞の発光を、発光顕微鏡を用いて観察した結果である。
図４に示す結果から、Ｔｈｏｒ（４−ＥＢＰ）遺伝子を標的にした本発明のＤＮＡカセットを染色体上に有し、生殖細胞特異的にＣｒｅを発現する本発明の機能性遺伝子発現動物（実施例１）は、Ｃｒｅが発現する組織生殖細胞（卵巣）でのみ強く発光していた。また、飢餓ストレスをかけた個体（試験例１）では発光強度が強くなった。
野生型ショウジョウバエ（比較例１）及びＣｒｅを発現しないショウジョウバエ（比較試験例１）は、発光が検出できなかった。
【００５６】
図５及び図６は、本発明の機能性遺伝子発現動物の発光をルミノメーターで経時的に測定した結果である。
図５及び図６に示す結果から、筋肉または神経でＣｒｅ−ＥＢＤを発現するショウジョウバエで（実施例２及び３、試験例２及び３）、餌を与えてから３日目以降に発光が観察された。また、発光強度の上昇はエストロゲンの濃度依存的であった。エストロゲンを含まない餌を与えたものは発光が検出できなかった（比較試験例２及び３）。
【００５７】
これらの結果から、本発明の機能性遺伝子発現動物の発光を測定することで、目的の遺伝子を経時的に高精度で定量化ができることがわかる。
【符号の説明】
【００５８】
１０１  解析装置
１１０  保持部
１１１  部屋
１２０  撮像部
１２２  ケーブル
１３０  情報処理部
１３１  メモリー部
１３２  ＣＰＵ
１３３  保存部
１３４  ハウジング
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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