(57)【要約】      （修正有）【課題】タンパク質ナノカプセル製造に適した新規なイオン液体の適用、およびタンパク質ナノカプセルを容易に製造するための新規な方法を提供。【解決手段】下記式（I）：2014051435.tif 000052（式中：R1〜R4は、少なくとも1つはR5-O-(R6)n-R7-であり、他はHであり；このとき、R5は、炭素数1〜8の直鎖または分岐のアルキル基、等であり、R6は、CH2CH2O、等であり、nは、1〜3の整数であり、R7は、炭素数1〜6の直鎖または分岐鎖のアルキル基であり；Xはビス（トリフルオロメチルスルホニル）イミドイオン、炭素数1〜3のアルキルスルホン酸イオン、等から選ばれるいずれかのアニオンを示す。）で表される、イオン液体。【選択図】図１
2014051435.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（I）：
【化１】
2014051435.tif 000049
（式中：
R1〜R4は、少なくとも1つはR5-O-(R6)n-R7-であり、他はHであり；
このとき、R5は、炭素数1〜8の直鎖または分岐のアルキル基、フェニル基またはベンジル基であり、
R6は、CH2CH2Oまたは
【化２】
2014051435.tif 000050
であり、
nは、1〜3の整数であり、
R7は、炭素数1〜6の直鎖または分岐鎖のアルキル基であり；
Xは、炭素数1〜3のアルキルスルホン酸イオン、テトラフルオロホウ酸イオン、ヘキサフルオロリン酸イオン、炭素数1〜3のフルオロアルキルスルホン酸イオン、フルオロもしくはパーフルオロアルキルスルホニルアミドイオン、および炭素数1〜3のアルキル硫酸イオンから選ばれるいずれかのアニオンを示す。）で表される、イオン液体。
【請求項２】
X-が、臭化物イオン、テトラフルオロホウ酸イオン、ヘキサフルオロリン酸イオン、炭素数1〜3のアルキルスルホン酸イオン、炭素数1〜3のフルオロアルキルスルホン酸イオン、フルオロもしくはパーフルオロアルキルスルホニルアミドイオンまたは炭素数1〜3のアルキル硫酸イオンから選択される、請求項１に記載のイオン液体。
【請求項３】
X-が、Br-、BF4-、PF6-、または(YSO2)2N-（Yは、F、CF3またはC2F5である。）である、請求項２に記載のイオン液体。
【請求項４】
R1〜R4の、少なくとも２つがR5-O-(R6)n-R7-であり、他がHであり；このとき、
R5が、メチル、エチル、ブチル、イソブチル、プロピル、イソプロピル、ヘキシル、2エチルヘキシル、アリル、フェニル、またはベンジルであり、
R6が、請求項1に定義した通りであり、
nが、1〜3の整数であり、
R7が、メチル、エチル、ブチルである、請求項３に記載のイオン液体。
【請求項５】
R5が、メチルであり、
R6が、CH2CH2Oであり、
nが、1〜3の整数であり、
R7が、エチルであり、
X-が、(CF3SO2)2N-である、請求項４に記載のイオン液体。
【請求項６】
下記の構造である、請求項５に記載のイオン液体。
【化３】
2014051435.tif 000051
【請求項７】
イオン液体であって、水と相溶性であり、かつ該イオン液体を含む液相を分散媒、水性液からなるナノサイズの液滴を分散質として乳化物を形成可能な、イオン液体を用い、
イオン液体を含む連続相に、カプセル壁材を含む水性液からなるナノサイズの液滴を分散して乳化物を得て、このとき連続相と分散相との界面に壁材が配され；
該壁材を架橋して液滴を鋳型とするナノサイズのカプセルを形成させ；
カプセルを含む連続相に水を加えて水性相とし；
水性相からカプセルを回収する
工程を含む、ナノカプセルの製造方法。
【請求項８】
壁材がタンパク質であり、タンパク質ナノカプセルの製造方法である、請求項７に記載の製造方法。
【請求項９】
カプセルの表面を改質する工程をさらに含む、請求項７または８に記載の製造方法。
【請求項１０】
イオン液体が、飽和含水率が3.0〜20.0重量％であり、飽和溶解量が0.05〜0.40Mであるものである、請求項７〜９に記載の製造方法。
【請求項１１】
イオン液体が、請求項１〜６のいずれか１項に記載のイオン液体である、請求項７〜１０のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１２】
水性液からなるナノサイズの液滴が機能性物質を含み、機能性物質を内包したタンパク質ナノカプセルを製造するための、請求項７〜１１のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の製造方法で製造されたナノカプセルを含む、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イオン液体に関するものである。より詳細には、アンモニウムカチオンにアルキルエーテル基を導入したイオン液体に関するものである。本発明はまた、新規イオン液体を用いたタンパク質を壁材とするナノサイズのカプセルの製造方法にも関する。本発明により製造されたタンパク質カプセルは、ライフサイエンス、医療（治療、診断を含む。）等の分野で有用である。
【背景技術】
【０００２】
イオン液体は、常温でも結晶化せずに溶融している有機塩であり、高極性、蒸気圧が極めて低いなど塩の特徴を有した液体である。他に、不燃性、高イオン電導性、大熱容量、低粘性、不揮発性であり、広い温度域で液体であるなどの性質を持ち、これまでの溶媒では持ちえなかった様々な特徴を有している。
【０００３】
これまでに種々のイオン液体が調製され（例えば、特許文献１〜３）、有機化学反応や光化学反応の反応場、分離・抽出溶媒、分子集合体形成の媒体としての利用、リチウムイオン電池、太陽電池などへの応用が検討されてきた。
【０００４】
一方、本発明者らは、イオン液体と他の溶媒の成す界面に注目し、これを無機材料の合成場や生体高分子の集積場として利用することで、機能性マテリアルを創製してきた。イオン液体 / トルエン界面でゾル―ゲル反応を行うことにより金属酸化物のマイクロカプセルの作製に成功している（非特許文献１）。また、イオン液体 / 水界面で Au(OH)4- の光還元やタンパク質の吸着を行うことにより、金のナノシート（非特許文献２）や、タンパク質を壁材としたマイクロカプセル（非特許文献３）の調製にも成功している。このタンパク質マイクロカプセルの調製方法においては、イオン液体中に導入したマイクロ水滴を鋳型として利用することにより、有機溶媒を一切使用しない。
【０００５】
核酸や酵素などを内包したナノカプセルは、ドラッグターゲティング等におけるナノキャリアとして注目されている。これまでに、天然のウイルスキャプシドや両親媒性分子の自己集合により形成される球状集合体を利用する調製方法や、テンプレート粒子と交互積層法を組み合わせた中空粒子作製法などが開発されてきた（例えば、特許文献４）。タンパク質カプセルは、優れた生分解性を有することから、ナノキャリアとして特に有望視されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開2011-137807
【特許文献２】特開2012-12313
【特許文献３】特開2012-31137
【特許文献４】特開2007-209307
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】T. Nakashima, and N. Kimizuka, J. Am. Chem. Soc., 125, 6386 (2003).
【非特許文献２】T. Soejima, and N. Kimizuka, Chem. Lett., 34, 1234 (2005).
【非特許文献３】森川全章, 仁位梨沙, 高岡亜紀, 君塚信夫, 日本化学会第87春季年会講演予稿集, 4K6-11 (2007)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
微小カプセルを生体に適用するには、1. 適切なサイズ、2. 表面修飾性、3. 内包性が重要である。したがって、用途に応じた望ましい粒径に制御でき、また表面修飾や種々の物質の内包が可能なタンパク質カプセルが得られれば、医療分野への更なる応用が期待できる。
【０００９】
これまで、本発明者らは、水との相溶性が低いイオン液体と高いイオン液体を組み合わせて用いることで、イオン液体 / 水界面で形成されるタンパク質カプセルのサイズの縮小化を検討した。そして、水との相溶性が低いイオン液体（1-ブチル-3-メチルイミダゾリウムビストリフルオロメタンスルホニルイミド）に相溶性が高いイオン液体（1-ブチル-3-メチルイミダゾリウムブロミド）を加えて用いることで、サイズが数百 nm〜数 mmに分布するタンパク質カプセルが調製できることを確認した。しかしながら、得られたタンパク質カプセルは分散性が高く、イオン液体相から回収することが困難であった。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、ジエチルグリコール基を有する第三級アンモニウムイオンをカチオン、ビス(トリフルオロメタンスルホニル)イミドイオンをアニオンとする新しいイオン液体を調製した。このイオン液体と水とを含む連続相中では、水滴がナノサイズで分散可能であり、またイオン液体が水との相溶性が高いため、ナノカプセル調製後は、連続相を水に溶解させ、水とともにイオン液体を除去できた。また、カプセル粒子の調製に際しては、タンパク質溶液を多孔質膜を通過させる膜乳化法を適用し、物理的に液滴の大きさを小さくすることにより、カプセルのサイズ制御を試みた。そのようにして得られた知見に基づいて、本発明を完成した。
【００１１】
本発明は、以下を提供する。
[１］  下記式（I）：
【００１２】
【化１】
2014051435.tif 000003
（式中：
R1〜R4は、少なくとも1つはR5-O-(R6)n-R7-であり、他はHであり；
このとき、R5は、炭素数1〜8の直鎖または分岐のアルキル基、フェニル基またはベンジル基であり、
R6は、CH2CH2Oまたは
【００１３】
【化２】
2014051435.tif 000004
【００１４】
であり、
nは、1〜3の整数であり、
R7は、炭素数1〜6の直鎖または分岐鎖のアルキル基であり；
Xは、炭素数1〜3のアルキルスルホン酸イオン、テトラフルオロホウ酸イオン、ヘキサフルオロリン酸イオン、炭素数1〜3のフルオロアルキルスルホン酸イオン、フルオロもしくはパーフルオロアルキルスルホニルアミドイオン、および炭素数1〜3のアルキル硫酸イオンから選ばれるいずれかのアニオンを示す。）で表される、イオン液体。
[２］  X-が、臭化物イオン、テトラフルオロホウ酸イオン、ヘキサフルオロリン酸イオン、炭素数1〜3のアルキルスルホン酸イオン、炭素数1〜3のフルオロアルキルスルホン酸イオン、フルオロもしくはパーフルオロアルキルスルホニルアミドイオンまたは炭素数1〜3のアルキル硫酸イオンから選択される、[１］に記載のイオン液体。
[３］  X-が、Br-、BF4-、PF6-、または(YSO2)2N-（Yは、F、CF3またはC2F5である。）である、[２］に記載のイオン液体。
[４］  R1〜R4の、少なくとも２つがR5-O-(R6)n-R7-であり、他がHであり；このとき、
R5が、メチル、エチル、ブチル、イソブチル、プロピル、イソプロピル、ヘキシル、2エチルヘキシル、アリル、フェニル、またはベンジルであり、
R6が、1に定義した通りであり、
nが、1〜3の整数であり、
R7が、メチル、エチル、ブチルである、３に記載のイオン液体。
[５］    R5が、メチルであり、
R6が、CH2CH2Oであり、
nが、1〜3の整数であり、
R7が、エチルであり、
X-が、(CF3SO2)2N-である、[４］に記載のイオン液体。
[６］  下記の構造である、[５］に記載のイオン液体。
【００１５】
【化３】
2014051435.tif 000005
【００１６】
[７］  イオン液体であって、水と相溶性であり、かつ該イオン液体を含む液相を分散媒、水性液からなるナノサイズの液滴を分散質として乳化物を形成可能な、イオン液体を用い、
イオン液体を含む連続相に、カプセル壁材を含む水性液からなるナノサイズの液滴を分散して乳化物を得て、このとき連続相と分散相との界面に壁材が配され；
該壁材を架橋して液滴を鋳型とするナノサイズのカプセルを形成させ；
カプセルを含む連続相に水を加えて水性相とし；
水性相からカプセルを回収する
工程を含む、ナノカプセルの製造方法。
[８］  壁材がタンパク質であり、タンパク質ナノカプセルの製造方法である、[７］に記載の製造方法。
[９］  カプセルの表面を改質する工程をさらに含む、[７］または[８］に記載の製造方法。
[１０］  イオン液体が、飽和含水率が3.0〜20.0重量％であり、飽和溶解量が0.05〜0.40Mであるものである、[７］〜[９］に記載の製造方法。
[１１］  イオン液体が、１〜６のいずれか１項に記載のイオン液体である、[７］〜[１０］のいずれか１項に記載の製造方法。
[１２］  水性液からなるナノサイズの液滴が機能性物質を含み、機能性物質を内包したタンパク質ナノカプセルを製造するための、[７］〜[１１］のいずれか１項に記載の製造方法。
[１３］  [１２］に記載の製造方法で製造されたナノカプセルを含む、医薬組成物。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、本発明によって提供される、タンパク質ナノカプセルの製造方法の概念図である。本発明者らは、水との相溶性を高めた新規イオン液体を用い、多孔性膜を介したエクストリュ―ジョン法によるタンパク質ナノカプセルの調製について検討した。その結果、イオン液体中のナノカプセルを一段階で水中に抽出する手法を達成できた。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明は、下記式（I）で表される新規イオン液体を提供する。
【００１９】
【化４】
2014051435.tif 000006
【００２０】
式中：
R1〜R4は、少なくとも1つはR5-O-(R6)n-R7-であり、他はHであり；
このとき、R5は、炭素数1〜8の直鎖または分岐のアルキル基、フェニル基またはベンジル基であり、
R6はCH2CH2Oまたは
【化５】
2014051435.tif 000007
であり、
nは、1〜3の整数であり、
R7は、炭素数1〜6の直鎖または分岐鎖のアルキル基であり；
Xは、炭素数1〜3のアルキルスルホン酸イオン、テトラフルオロホウ酸イオン、ヘキサフルオロリン酸イオン、炭素数1〜3のフルオロアルキルスルホン酸イオン、フルオロもしくはパーフルオロアルキルスルホニルアミドイオン、および炭素数1〜3のアルキル硫酸イオンから選ばれるいずれかのアニオンを示す。
【００２１】
カチオン部分：
本発明で「R1〜R4は、少なくとも1つはR5-O-(R6)n-R7-であり、他はHである」というときは、特に記載した場合を除き、R1〜R4がすべてR5-O-(R6)n-R7-であり、HであるR1〜R4が存在しない場合も包含する。R1〜R4のうち、２以上がR5-O-(R6)n-R7-であるとき、それぞれはR5-O-(R6)n-R7-で定義される限り、同一であってもよく、異なっていてもよい。本発明の一の態様においては、R1〜R4のうち、２以上がR5-O-(R6)n-R7-であるとき、それぞれは同一であってもよい。一般に，対称性の高い分子は融点が高くなる傾向があり、対称性を低くすると融点が下がる。一方、柔軟なエーテル鎖は、結晶化を抑制する。よって式（I）で表される化合物は、各R1〜R4が同一であり、対称的な構造であっても、イオン液体でありうるという特徴を有する。
本発明の式（I）で表される新規イオン液体の、他の好ましい態様の１つにおいては、
R1〜R4の、少なくとも２つがR5-O-(R6)n-R7-であり、他がHであり；このとき、R5が、メチル、エチル、ブチル、イソブチル、プロピル、イソプロピル、ヘキシル、2エチルヘキシル、アリル、フェニル、またはベンジルであり、R6が、上に定義した通りであり、
nが、1〜3の整数であり、R7が、メチル、エチル、ブチルである。
【００２２】
本発明の式（I）で表される新規イオン液体の、他の好ましい態様の１つにおいては、R5が、メチルであり、R6が、CH2CH2Oであり、nが、1〜3の整数であり、R7が、エチルである。
本発明の式（I）で表される新規イオン液体における、より具体的なカチオン部分の例は、下記のものである。
【００２３】
【化６】
2014051435.tif 000008
【００２４】
アニオン部分：
本発明の式（I）で表される新規イオン液体の好ましい態様の１つにおいては、X-が、臭化物イオン、テトラフルオロホウ酸イオン、ヘキサフルオロリン酸イオン、炭素数1〜3のアルキルスルホン酸イオン、炭素数1〜3のフルオロアルキルスルホン酸イオン、フルオロもしくはパーフルオロアルキルスルホニルアミドイオン、または炭素数1〜3のアルキル硫酸イオンから選択される。
【００２５】
炭素数1〜3のアルキルスルホン酸イオンの例は、メタンスルホネートイオン（CH3SO3-）である。
【００２６】
炭素数1〜3のフルオロアルキルスルホン酸イオンの例は、トリフルオロスルホン酸イオン（CF3SO3-）である。
【００２７】
フルオロもしくはパーフルオロアルキルスルホニルアミドイオンの例は、(YSO2)2N-（Yは、F、CF3またはC2F5である。）であり、より詳細な例は、ビス（トリフルオロメチルスルホニル）イミドイオン（(CF3SO2)2N-）である。
【００２８】
炭素数1〜3のアルキル硫酸イオンの例は、メチル硫酸イオン（CH3SO4-）である。
【００２９】
本発明の式（I）で表される新規イオン液体の、他の好ましい態様の１つにおいては、X-が、Br-、BF4-、PF6-、または(YSO2)2N-（Yは、F、CF3またはC2F5である。）である。
【００３０】
本発明の式（I）で表される新規イオン液体の、特に好ましい態様の１つにおいては、X-が、ビス（トリフルオロメチルスルホニル）イミドイオン（(CF3SO2)2N-）である。このイオンを、「Tf2N」と記載することがある。
【００３１】
本発明の式（I）で表される新規イオン液体の、より具体的な例は下記のものである。
【００３２】
【化７】
2014051435.tif 000009
【００３３】
本発明のイオン液体の製造は、当業者であれば、本明細書の実施例の記載と技術水準に基づき、入手可能な出発材料より適宜合成可能である。
【００３４】
本発明により提供される式（I）で表される新規イオン液体は、有機化学反応、光化学反応のための反応場として、分離・抽出溶媒として、また分子集合体形成媒体として利用することができる。本発明により提供される式（I）で表される新規イオン液体は、次に説明するタンパク質ナノカプセル製造において用いるのに、特に適している。
【００３５】
〔タンパク質ナノカプセルの製造方法〕
本発明はまた、水と相溶性であるイオン液体を用いた、タンパク質のナノカプセルの製造方法を提供する。
【００３６】
本発明の製造方法に用いられるイオン液体は、水と相溶性であるのみならず、かつ当該イオン液体を含む液相を分散媒、水性液からなるナノサイズの液滴を分散質として乳化物を形成可能なものである。このようなイオン液体の典型例は、上述した式（I）で表されるイオン液体である。
【００３７】
本発明において、イオン液体の性質に関し、水と「相溶性」であるというときは、特に記載した場合を除き、水とイオン液体が任意の組成比で自由に混合可能ではなく、混合比に拠り、均一相になったり、二相分離したりする性質を指す。通常、水へのイオン液体の溶解度、およびイオン液体への水の溶解度それぞれが、比較的高い場合に、相溶性である。なお、イオン液体への水の溶解度は、「飽和含水率」として表すことができ、また水へのイオン液体の溶解度は、「飽和溶解量」として表すことができる。本発明において「飽和含水率」または「飽和溶解量」について、値を示すときは、特に記載した場合を除き、25℃における値である。
【００３８】
水との相溶性が高い、という点に関し、上述の式Iで表されるイオン液体において、特に重要な構造は、エーテル酸素を含むアンモニウムカチオン部分である。式Iで表されるイオン液体以外のイオン液体であっても、水との適切な程度の相溶性を有していれば、本発明の製造方法への適用が期待できる。例えば、イオン液体として汎用な、ジアルキルイミダゾリウム塩においては、水溶性の高いものが知られており、アルキル基の比較的短い化合物や、アルキル鎖の末端に水酸基を有する化合物が水との相溶性が高いことが報告されている。
【００３９】
具体的には、飽和含水率および飽和溶解量が、トリス[2-(2-メトキシエトキシ)エチル]アンモニウム-ビストリフルオロメタンスルホニルイミドと同程度、より具体的には、飽和溶解量が0.05〜0.40M、好ましくは0.052〜0.35M、より好ましくは0.054〜0.30Mであり、飽和溶解量がいずれの場合においても、飽和含水率が3.0〜20.0重量％、好ましくは6.0〜18.0重量％、より好ましくは7.0〜16.0重量％であるイオン溶液を、好適に用いることができるであろう。
【００４０】
本発明への適用が期待できるイオン液体の例は、下記に示すものである。
【００４１】
【化８】
2014051435.tif 000010
【００４２】
上記のイオン液体の製造方法ついては、J. Phys. Chem. B 2008, 112, 1218-1225およびAnal. Chem. 2006, 78, 7735-7742を参考にすることができる。これらのイオン液体の飽和含水率は、7〜10 wt%、飽和溶解量は55〜260 mMである。
【００４３】
本発明の製造方法は、具体的には、下記の工程を含む：
(1)  イオン液体を含む連続相に、壁材を含む水性液からなるナノサイズの液滴を分散して乳化物を得る工程；
(2)  工程(1)により、このとき連続相と分散相との界面に壁材が配されるが、該壁材を架橋して液滴を鋳型とするナノサイズのカプセルを形成させる工程；
(3)  カプセルを含む連続相に水を加えて水性相とする工程；そして
(4)  水性相からカプセルを回収する工程。
このような製造方法の概略を、図１に示した。
【００４４】
本発明においては、イオン液体／水界面に配されることができ、および界面において架橋などにより安定な膜を形成することができるものであれば、種々の壁材を用いうる。壁材の典型的な例は、タンパク質であるが、本発明者らは、従来の疎水性イオン液体を用いた方法では、タンパク質以外の材料を壁材として用いて、マイクロカプセルを調製できることを確認している。例えば、アミノ基を有する多糖（キトサン等）、アミノ基を側鎖に有する合成ポリペプチド（ポリリシン等）、アミノ基を有する合成高分子（ポリアリルアミン等）は、本発明の製造方法において、壁材として、好適に用いることができるであろう。本明細書では、本発明のナノカプセルの製造方法を、壁材としてタンパク質を用いた場合を例に説明することがあるが、その説明は、特に記載した場合を除き、他の壁材を用いた場合にも当てはまる。
【００４５】
工程(1)は、イオン液体を含む連続相に、タンパク質を含む水性液からなるナノサイズの液滴を分散して乳化物を得る工程である。連続相は、通常、イオン液体のほかタンパク質を含む水性液由来のものを含む。
水性液は、典型的には、カプセル形成上有効な濃度でタンパク質を水または適切な水性
緩衝液に溶解したものである。タンパク質の濃度は、当業者であれば適宜設計できる。タンパク質は、リジン残基のε-アミノ基、システイン残基のSH基等、架橋可能な基を有している種々のものを用いることができる。
【００４６】
水性液には、機能性物質を溶解または分散させることにより、得られるナノカプセルに機能性物質を内包させることができる。内包させる物質は、治療薬、診断薬、造影剤、抗体、核酸等であり得る。
【００４７】
工程２における乳化方法は、ナノサイズの乳化のための従来技術が利用できる。これには、撹拌法（高圧ホモゲナイザー乳化法を含む）、膜透過法が含まれる。膜を透過させることにより分散させる液滴の大きさを制御する膜透過法は、本発明の製造方法においては、サイズ制御が容易、サイズをナノオーダーにできる、サイズ分布をより均一にできる（粒度分布がシャープ）である等の観点から、本発明へ好ましく適用することができる。
【００４８】
工程(1)により、連続相と分散相との界面にタンパク質が配される。
【００４９】
工程(2)は、該界面タンパク質を架橋して液滴を鋳型とするナノサイズのカプセルを形成させる工程である。架橋に際しては、グルタルアルデヒドのような、架橋剤を添加することによって行ってもよい。
【００５０】
工程(3)は、カプセルを含む連続相に水を加えて水性相とする工程である。用いられるイオン液体は水と相溶するものであるので、このような工程の実施が可能である。水性相からは、遠心分離等の固液分離のための方法に拠り、容易にカプセルを回収することができる。
【００５１】
本発明の製造方法はさらに、(5)  カプセルの表面を改質する工程を含んでいてもよい。改質の目的は特に限定されず、カプセル表面の親水性または疎水性を高めるために実施してもよく、またカプセルを標識するために実施してもよい。
【００５２】
標識のための蛍光基の例は、下記である。
【００５３】
【化９】
2014051435.tif 000011
【００５４】
本発明により得られたナノカプセルは、医薬組成物として使用することできる。本発明において「医薬組成物」というときは、特に記載した場合を除き、疾患または状態の、診断、予防または治療のために用いられる組成物をいう。
【００５５】
医薬組成物として用いる場合、タンパク質ナノカプセルのサイズが重要であろう。再送の設計に際しては、EPR 効果（腫瘍組織では,正常組織に比べ血管透過性が著しく亢進しているため,高分子や微粒子が血管より流出しやすい。また、リンパ系が未発達なため,腫瘍組織に到達した物質は蓄積する現象）を考慮し、カプセルの平均粒子径を、50〜200 nmとすることができる。また、細胞表面のレセプターに結合する分子（リガンド）をカプセルの表面に修飾することで、標的細胞への内包薬剤の選択的送達が期待できる。
【実施例】
【００５６】
〔実施例１：[1]・Tf2N の合成〕
【化１０】
2014051435.tif 000012
【００５７】
1 L 三角フラスコに蒸留トリス[2-(2-メトキシエトキシ)エチル]アミン（M.W. 323.43、ALDRICH）94.55 g（0.292 mol）を加え、次に 1 M HCl 292 ml（0.292 mol）を加えた。これに、リチウムビス(トリフルオロメタンスルホニル)イミド（LiTf2N）（M.W. 287.08、関東化学）92 g（0.321 mol）を加え、1 h 撹拌したところ二相にわかれた。このとき、上相は黄色の水相であり、下相は茶黄色で粘性のあるイオン液体相だった。水相側を除去し、残ったイオン液体相に超純水を加えて分液により洗浄を行った。この分液による洗浄を 3 回行ったのち、イオン液体相を脱色するためにメタノール 250 ml 加え、活性炭を大さじ 6 杯加え、アルミホイルで遮光しながら 1.5 h 撹拌した。 その後、吸引ろ過により活性炭を除去した。この脱色操作を 7 回繰り返したのち、吸引ろ過およびメンブレンフィルターろ過を行い、活性炭を完全に除去した。この溶液中のメタノールを減圧留去により取り除いたのち、真空ラインを用いてイオン液体中の水を除去した。このイオン液体の 1H-NMR 測定を行い、合成を確認した。
【００５８】
【数１】
2014051435.tif 000013
【００５９】
【表１】
2014051435.tif 000014
【００６０】
【数２】
2014051435.tif 000015
【００６１】
【表２】
2014051435.tif 000016
【００６２】
化合物 1 のみの場合に比べて、合成したイオン液体の a プロトンの化学シフトのピークは、2.79 ppmから 3.84 ppm にシフトしていた。
【００６３】
水と実施例１で得られた[1]・Tf2Nを、 1：1（体積比）でサンプル管に加え、3 時間撹拌したところ、水と [1]・Tf2N は完全には混和せず、エマルションができた。これを 30 分間静置すると水相（上相）と [1]・Tf2N 相（下相）に分かれた。水相の重さを測ると 1.01727 g/ml だったため、この比重と純水の比重（1.0 g/ml）を用いて「[1]・Tf2N の水中での飽和溶解量」を計算したところ、0.0629 g/ml（0.10 M）となった。また、「[1]・Tf2N の飽和含水率」を求めるために、[1]・Tf2N 相をカールフィッシャー測定したところ 9.849 wt% H2O であることがわかった。
【００６４】
・化合物名：Tris[2-(2-methoxyethoxy)ethyl]ammonium bis(trifluoromethanesulfonyl) imide
分子量：604.59
比重：1.38 g/ml（実測値）
飽和含水率：9.849 wt%
水中での飽和溶解量：0.0629 g/ml（0.10 M）
【００６５】
〔実施例２：タンパク質ナノカプセルの製造（１）〕
これまでは、撹拌法によりタンパク質ナノカプセルの作製を試みた。しかし、様々な条件を試みたが、期待される粒径の縮小化は見られなかった。そこで、リポソーム調整器を用いて、1 μm のメンブレンフィルター膜を通過させることにより物理的に水滴の大きさを小さくし、それによるカプセルのサイズ制御を試みた。
【００６６】
（実験操作）
リポソーム調整器（AVESTIN, メンブレンフィルター：孔径 1 μm, polycarbonate 製）の片側のハミルトンシリンジ（容量：500 μl）に、順に [1](Tf2N)（M.W. 604.59、実施例１）475 μl、0.5 wt% タンパク質水溶液（ALDRICH）50 μlを加えた。次に、タンパク質水溶液は膜を通過しないように、イオン液体である [1](Tf2N) だけ膜を 8 回通過させた。その後、タンパク質水溶液も膜を通過させ、プランジャーを 41 回交互に押し込み、エクストル―ジョンを行った。得られたエマルションを丸底容器に入れ、1,000 rpmで攪拌しながら 25 % グルタルアルデド溶液（M.W. 100.12、キシダ化学）10 μl を加え、30 ℃で 30 分間攪拌した。これを 0.01 M 2-アミノエタノール水溶液（M.W. 61.08、キシダ化学）11 ml（グルタルアルデヒドの 4 等量）に撹拌しながら少しずつ滴下していき、イオン液体を完全に水に溶解させた（CLSM 観察（Fig. 5、6）を行った）。これをガラスの遠心管に移し、遠心分離（約 5 秒）をしたのち、上積み液を除去した。これに超純水を加えて、手ではじいて分散させたのち、遠心分離（約 5 秒）を行い、上積み液を除去して洗浄した。
この操作を下線部分のタンパク質が変わるように、下表に従って同様に行ったのち、SEM 観察を行った。また SEM 写真から、粒径分布を求めた。
【００６７】
【表３】
2014051435.tif 000017
【００６８】
【化１１】
2014051435.tif 000018
【００６９】
【化１２】
2014051435.tif 000019
【００７０】
【化１３】
2014051435.tif 000020
【００７１】
（結果および考察）
エクストルージョン法により数百 nm サイズのタンパク質カプセルが製造できた。FITC アルブミンに比べて牛血清アルブミンのカプセルサイズが少し大きくなっており、粒径分布も多少広くなっているが、これはプランジャーを押し込む速度などの実験操作による可能性がある。また、FITC アルブミンのフルオレセインはリシン残基の NH2 部位に結合しているので、牛血清アルブミンに比べてカチオン性が低くなっている。そのため、FITC アルブミンのほうが界面へ集まりにくくなり、カプセルサイズが小さくなっている可能性がある。
【００７２】
見た目の形状は FITC アルブミンではしぼんだものが見られるが、牛血清アルブミンではきれいな球状のものしか見られない。この理由として、FITC アルブミンカプセルの膜は牛血清アルブミンカプセルよりも薄い可能性が考えられる。
SEM 像からタンパク質カプセル同士が凝集していることが確認される。これは、乾燥過程による可能性があるが、エタノールアミンに抽出した時点で、目視でも固体を確認できるので条件的に凝集しやすい可能性もある。
【００７３】
〔実施例３：タンパク質ナノカプセルの製造（２）〜膜の孔径の影響についての検討〜〕
タンパク質が FITC アルブミンの場合、孔径が 1 μm のメンブレンフィルターでは、平均粒径 285 nm のタンパク質ナノカプセルを製造できた。膜の孔径を小さくすることで、さらに小さなナノカプセルの作製が期待できる。そこで、孔径が400 nm、100 nm の膜においてエクストルージョン法を行い、それによるカプセルのサイズ制御を試みた。
【００７４】
（実験操作）
リポソーム調整器（AVESTIN, メンブレンフィルター：孔径 1,000 nm, polycarbonate 製）の片側のハミルトンシリンジ（容量：500 μl）に、順に [1](Tf2N)（M.W. 604.59、実施例１合成品）475 μl、0.5 wt% FITC アルブミン水溶液（ALDRICH）50 μlを加えた。次に、FITC アルブミン水溶液は膜を通過しないように、イオン液体である [1](Tf2N) だけ膜を 8 回通過させた。その後、FITC アルブミン水溶液も膜を通過させ、プランジャーを 41 回交互に押し込み、エクストル―ジョンを行った。得られたエマルションを丸底容器に入れ、1,000 rpmで攪拌しながら 25 % グルタルアルデド溶液（M.W. 100.12、キシダ化学）10 μl を加え、30 ℃で 30 分間攪拌した。これを 0.01 M 2-アミノエタノール水溶液（M.W. 61.08、キシダ化学）11 ml（グルタルアルデヒドの 4 等量）に撹拌しながら少しずつ滴下していき、イオン液体を完全に水に溶解させた（CLSM 観察）。これをガラスの遠心管に移し、遠心分離（約 5 秒）をしたのち、上積み液を除去した。これに超純水を加えて、手ではじいて分散させたのち、遠心分離（約 5 秒）を行い、上積み液を除去して洗浄した。
この操作を下線部分の膜の孔径が変わるように、下表に従って同様に行ったのち、SEM 観察を行った。また SEM 写真から粒径分布を求めた。
【００７５】
【表４】
2014051435.tif 000021
【００７６】
【化１４】
2014051435.tif 000022
【００７７】
【化１５】
2014051435.tif 000023
【００７８】
（結果および考察）
膜の孔径を 1,000 nm から 400 nm に小さくしたが、得られたタンパク質ナノカプセルの大きさはあまり変わらなかった。また、孔径が 400 nm では粒径分布が広くなっている。これらはプランジャーを押し込む速度などの実験操作による可能性がある。一方、孔径 100 nm の場合は膜が破れてしまい、きれいなナノカプセルを作製することができなかった。孔径が小さくなることでイオン液体やタンパク質カプセルが通過しにくくなり、膜にかかる圧力が大きくなったためと考えられる。この問題を解決するには、イオン液体中の含水量を増やし、流動性を上げる必要がある。今回は室温で実験を行ったが、より高い温度でも行えれば膜を通過しやすくなると思われる。
【００７９】
〔評価１：タンパク質ナノカプセルへのデキストランの内包〕
実施例２のタンパク質ナノカプセルの作製では、エクストルージョン法によりタンパク質ナノカプセルが得られることがわかった。そのため、そのカプセルに物質を内包できるかどうか実験を行った。イオン液体 / 水界面を用いて、タンパク質が界面に集合することでカプセルを形成するので、内包したい物質をタンパク質水溶液の中に溶かしておくことで容易に内包できる可能性がある。
【００８０】
（実験操作）
リポソーム調整器（AVESTIN、メンブレンフィルター：孔径 1 μm, polycarbonate 製）の片側のハミルトンシリンジ（容量：500 μl）に、順に [1](Tf2N)（M.W. 604.59、実施例１合成品）475 μl、0.5 wt% 牛血清アルブミン（ALDRICH）と 0.05 wt % フルオレセイン修飾デキストラン（M.W. 40,000、ALDRICH）からなる水溶液50 μlを加えた。次に、イオン液体である [1](Tf2N) だけ膜を 8 回通過させた。その後、牛血清アルブミンとフルオレセイン修飾デキストランからなる水溶液も膜を通過させ、プランジャーを 41 回交互に押し込み、膜乳化を行った。得られたエマルションを丸底容器に入れ、1,000 rpmで攪拌しながら 25 % グルタルアルデド溶液（M.W. 100.12、キシダ化学）10 μl を加え、30 ℃で 30 分間攪拌した。これを 0.01 M 2-アミノエタノール水溶液（M.W. 61.08、キシダ化学）11 ml（グルタルアルデヒドの 4 等量）に撹拌しながら少しずつ滴下していき、イオン液体を完全に水に溶解させたのち CLSM 観察を行った。
【００８１】
【化１６】
2014051435.tif 000024
【００８２】
（結果および考察）
上のCLSM像中、(1)は数百 nm のサイズであり、フルオレセイン修飾デキストラン（M.W. 40,000）を内包した牛血清アルブミンカプセルと思われる。また、(1)ではフルオレセインに由来する発光が観察されるのに対し、(2)の水相では発光が見られない。もしデキストランが内包されていないのであれば、すべての点においてフルオレセイン由来の発光が確認されると思われる。したがって、カプセル内にデキストランが内包されていることを示している。
【００８３】
〔参考例１：水と混和するイオン液体（emimBF4）によるタンパク質カプセル製造（１）〜エクストルージョン法による〜〕
水と混和するイオン液体（emimBF4（M.W. 197.97、関東化学））を用いて、タンパク質カプセル製造を試みた。
【００８４】
【化１７】
2014051435.tif 000025
【００８５】
（実験操作）
リポソーム調整器（AVESTIN, メンブレンフィルター：孔径 400 nm polycarbonate 製）の片側のハミルトンシリンジ（容量：500μl）に、順に emimBF4（M.W. 197.97、関東化学）475 μl、0.5 wt% FITC アルブミン水溶液 50 μl を加えた。次に、FITC アルブミン水溶液は膜を通過しないように、イオン液体である emimBF4だけ膜を 8 回通過させた。この時点で、タンパク質が変性し、凝集し始めてるのを確認した。その後、FITC アルブミン水溶液も膜を通過させ、プランジャーを 41 回交互に押し込み、エクストルージョンを行った。
【００８６】
【化１８】
2014051435.tif 000026
【００８７】
（結果および考察）
emimBF4 を用いると膜にはタンパク質が多く残った。これはemimBF4 が水と混和することにより、タンパク質の大きな凝集体ができたためと思われる。一方、[1]Tf2N を用いた場合は、膜にはほとんどタンパク質は残っておらず、カプセルとして通過したことがわかる。
【００８８】
〔参考例２：水と混和するイオン液体（emimBF4）によるタンパク質カプセル製造（２）〜撹拌法による〜〕
（実験操作）
USI 恒温槽付き撹拌装置（Max：1,000 rpm）にガラス製の丸底容器をはめこみ、温度を 30 ℃に設定した。30 ℃になったのち、[1](Tf2N)（M.W. 634.65、実施例１合成品）1.9 ml（含水率：0.80 wt % H2O）を加え、ゆっくりと撹拌しながら15 分間静置した。その後、1.0 wt % フルオレセイン修飾アルブミン水溶液（FITC アルブミン）（ALDRICH）0.1 ml を滴下し、20 分間撹拌（1,000 rpm）した。次に、25 % グルタルアルデヒド溶液（M.W. 100.12、キシダ化学）40 μl を加え、30 分間撹拌し続けた。この溶液をガラスの遠心管に加え、遠心分離（10 分）を行ったのち、上積みのイオン液体部分を取り除いた。これに、0.1 M 2-アミノエタノール水溶液（M.W. 61.08、キシダ化学）を加え、指で軽くはじき水相側にタンパク質カプセルを抽出した。抽出したタンパク質カプセルを含む水溶液を遠心分離（約 5 秒）したのち、上積み液を除去した。これに超純水を加えて、指ではじいて分散させたのち、遠心分離（約 5 秒）を行い、上積み液を除去した。これを 3 回繰り返し、タンパク質カプセルを洗浄した。その後、SEM および CLSM 観察を行った。
【００８９】
【化１９】
2014051435.tif 000027
【００９０】
【化２０】
2014051435.tif 000028
【００９１】
（結果および考察）
emimBF4 をイオン液体として用いると凝集体ができ、タンパク質カプセルは得られなかった。これは emimBF4 が水と混和するため、カプセル形成の鋳型となるエマルションが出来ないためだと思われる。これにより、[1]Tf2N がタンパク質ナノカプセル製造に適していることが示された。なお、
【００９２】
〔実施例３：タンパク質ナノカプセルの製造（３）〜膜の通過回数の影響についての検討〜〕
今までエクストル―ジョン法では、膜を 41 回通過させてタンパク質ナノカプセル作製を行ってきた。しかしながら、この回数が適切かわからないので、通過回数を変えて CLSM 観察を行った。
（実験操作）
リポソーム調整器（AVESTIN, メンブレンフィルター：孔径 400 nm, polycarbonate 製）の片側のハミルトンシリンジ（容量：500 μl）に、順に[1](Tf2N)（M.W. 604.59、実施例1合成品）475 μl、0.5 wt% タンパク質水溶液（ALDRICH）50 μlを加えた。次に、タンパク質水溶液は膜を通過しないように、イオン液体である [1](Tf2N) だけ膜を 8 回通過させた。その後、タンパク質水溶液も膜を通過させ、プランジャーを 41 回交互に押し込み、エクストル―ジョンを行った。その際、1, 11, 21, 31, 41 回において CLSM 観察を行った。
【００９３】
【化２１】
2014051435.tif 000029
【００９４】
（結果および考察）
膜の通過回数 1 回では、タンパク質水溶液が集まっており、ナノカプセルができなかった。11 回、21 回では小さなものが増えてきたが、まだ大きなものも見られた。31 回、41 回まで行うと、小さなタンパク質カプセルが形成していることがわかった。このことから、何度も膜を通過するうちに、水滴が小さくなり、その界面でナノカプセルが形成していると考えられる。
【００９５】
〔実施例４：タンパク質ナノカプセルの製造（３）〜水中での分散性の向上〜〕
これまで、エクストル―ジョン後の SEM 観察により、ナノカプセルの形成を確認してきた。しかし、ナノカプセルが凝集している可能性が示唆された。そこで、水中にタンパク質カプセルを抽出する際のエタノールアミンの濃度を上げ、分散性の向上を目指すとともに、ナノカプセルの粒度分布をDLSで測定した。
（実験操作）
リポソーム調整器（AVESTIN, メンブレンフィルター：孔径 1,000 nm, polycarbonate 製）の片側のハミルトンシリンジ（容量：500 μl）に、順に[1](Tf2N)（M.W. 604.59、筆者合成品）475 μl、0.5 wt% FITC アルブミン水溶液（ALDRICH）50 μlを加えた。次に、FITC アルブミン水溶液は膜を通過しないように、イオン液体である [1](Tf2N) だけ膜を 8 回通過させた。その後、FITC アルブミン水溶液も膜を通過させ、プランジャーを 41 回交互に押し込み、エクストル―ジョンを行った。得られたエマルションを丸底容器に入れ、1,000 rpmで攪拌しながら 25 % グルタルアルデド溶液（M.W. 100.12、キシダ化学）10 μl を加え、30 ℃で 30 分間攪拌した。これを 0.1 M 2-アミノエタノール水溶液（M.W. 61.08、キシダ化学）11 ml に撹拌しながら少しずつ滴下していき、イオン液体を完全に水に溶解させた。その後、DLS 測定（透析前）を行った。また、残りの水溶液のうち 500 μl を透析し、不要物を除去したのち再度 DLS 測定を行った。透析は pH により、エタノールアミンが除去できたかどうかで追跡した。
【化２２】
2014051435.tif 000030
【００９６】
（結果および考察）
透析前の DLS 測定では、粒径が数百 nm のカプセルが確認できた。したがって、カプセルは凝集しておらず、分散していると考えられた。また、透析後の DLS 測定でも同様にナノカプセルを確認できた。したがって、純水中でも、カプセルは分散していると考えられる。
【００９７】
〔合成例１：イオン液体の原料化合物tetrakis(2-(2-methoyethoxy)ethyl)ammmoniumの合成〕
【化２３】
2014051435.tif 000031
【００９８】
1-1.  Dietylene Glycol Monomethyl Ether のトシル化
【化２４】
2014051435.tif 000032
【００９９】
Dietylene Glycol Monomethyl Ether （東京化成, Mw.120.15）を減圧蒸留した。このDietylene Glycol Monomethyl Ether 20.0ｇ(1.66×10-1mol) をピリジン40ｍLに溶解させた後、攪拌しながら0℃まで冷却した。これに、tosyl chloride（キシダ, Mw=190.65）63.0g（3.3×10-1mol）のピリジン溶液75mL を45分間で滴下した。30分間室温で放置した後、100ｍLのミリQ水で希薄した。これにジエチルエーテルを加えエーテル抽出した後、エーテル相を5％HCl 50mL で洗浄した。分液し、エーテル層を硫酸ナトリウムで乾燥させた。濾過した後、ジエチルエーテルを減圧留去すると薄黄色の液体を得た。
【０１００】
展開溶媒にヘキサン/酢酸エチル（ v/v, 1：1 ）を用いてTLCを行うと、Tosyl Dietylene Glycol Monomethyl Ether (RF=0.5) , ピリジン (RF=0.4), 原料 (RF=0), の３スポット現れたため、カラムクロマトグラフィーで分離した。分離後再びTLCを行うとピリジンのピークも見えたため、凍結乾燥を行うと、Tosyl Dietylene Glycol Monomethyl Ether (RF=0.5)の1スポットとなった。
【０１０１】
【数３】
2014051435.tif 000033
【０１０２】
【表５】
2014051435.tif 000034
【０１０３】
1-2.  Tosyl Dietylene Glycol Monomethyl Ether と trisMEEA の反応
【０１０４】
【化２５】
2014051435.tif 000035
【０１０５】
trisMEEA（ALDRICH, Mw=323.43）5.0g  (15.4mmol) と1-1で合成したTosyl Dietylene Glycol Monomethyl Ether 8.49g (30.9mmol) を混合した後、5mL トルエンを加え加熱還流（100℃）した。五時間後、水を加え抽出し凍結乾燥を行うと黄色の粘性のある液体が得られた。tetrakisMEEAは陽イオンであるため、弱酸性のH+型の陽イオン交換樹脂に吸着させた後、塩酸を流すことにより、黄色の液体として生成された。
【数４】
2014051435.tif 000036
【表６】
2014051435.tif 000037
【０１０６】
〔合成例２：イオン液体の原料化合物bisMEEAの製造〕
【０１０７】
【化２６】
2014051435.tif 000038
【０１０８】
2-1.  2-methoxyethanol のトシル化
【０１０９】
【化２７】
2014051435.tif 000039
【０１１０】
2-methoxyethanol（キシダ, Fw=76.10）を減圧蒸留した。2-methoxyethanol  12.63g (1.66×10-1mmol) をピリジン40ｍLに溶解させた後、攪拌しながら0℃まで冷却した。これに、tosyl chloride（キシダ, Mw=190.65）62.9g（3.3×10-1mol）のピリジン溶液75mL を55分間で滴下した。1時間室温で放置した後、100ｍLのミリQ水で希薄した。これにジエチルエーテルを加えエーテル抽出した後、エーテル相を5％HCl 50mL で洗浄した。分液し、エーテル層を硫酸ナトリウムで乾燥させた。濾過した後、ジエチルエーテルを減圧留去すると薄黄色の液体を得た。収量：6.69g (29.1mmol)。収率：17.5%。
【０１１１】
【数５】
2014051435.tif 000040
【０１１２】
【表７】
2014051435.tif 000041
【０１１３】
2-2.   N- trityldiethanolamine の合成
【０１１４】
【化２８】
2014051435.tif 000042
【０１１５】
diethanolamine（Fw.105.14, キシダ）を減圧蒸留した。200ml 三角フラスコに蒸留した diethanolamine 8.34g (79.3mmol) のDMF溶液 34ml を加えて0℃まで冷却した後、tritylchloride（Mw.278.78, キシダ）9.97g (35.8mmol) のジクロロメタン溶液 21ml を13分間滴下した。0℃で36時間放置後、ジエチルエーテル 19ml と水 25 ml 加えると2層に分離した。沈殿が生じる予定だったが生じなかったため、下層の有機層を分液漏斗を用いて分取し1時間減圧留去した。溶媒がすべて除去されなかったため、残った溶液にジエチルエーテルを加えエーテル抽出すると、白い沈殿物を得られた。16時間フリーザーで放置した後、吸引濾過し水/アセトン (1/2) で再結晶を行った。白色の固体が得られた。
収量：5.31 g (15.2mmol)。収率：42.6％。
【０１１６】
展開溶媒ヘキサン/AcOEt , 50/50のTCLで、RF=0.18にスポットが見られた。
【数６】
2014051435.tif 000043
【０１１７】
【表８】
2014051435.tif 000044
【０１１８】
2-3.  N,N-bis(bisethyleneglycolmonomethyleter)tritylamine の合成
【０１１９】
【化２９】
2014051435.tif 000045
【０１２０】
50％ NaOH 水溶液 24mL と触媒として用いる Tetrabutylammonium Hydrogen Sulfate （東京化成, Mw=339.53）の入った丸底フラスコに N-trityldiethanolamine 4.02g と2-1で合成した2-Methoxyethyl p-Toluenesulfonate 6.62g のTHF溶液40ｍLを加えた。これを18時間加熱還流（70℃）した後、80ｍL のミリQ水 80ｍLで希釈した。ここにジエチルエーテルを加えてエーテル抽出を行い、エーテル層をNa2SO4 で乾燥した。そして、濾過を行い、ジエチルエーテルを減圧留去した。その後，シリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒；酢酸エチル：ヘキサン=2：1）にて, Rf値 = 0.4の成分を単離した．
【０１２１】
2-4.  polyethoxylamineの脱トリチル化
【０１２２】
【化３０】
2014051435.tif 000046
【０１２３】
5％HClが入っている滴下漏斗付の丸底フラスコに220mgのN,N-bis(bisethyleneglycol‐monomethyleter)tritylamineを溶かしたメタノール溶液1.41mlを室温で滴下した。15分間室温で放置し沈殿したtritylcarbinolをろ過した。次に残量が初めの水層の量とほぼ等しくなるまで減圧留去した後、1.06mlのジエチルエーテルでエーテル抽出した。溶液を飽和重炭酸ナトリウムで塩基性化し、水を減圧留去した。ジクロロメタンを加え15分攪拌し残った固体をろ過した。有機相をNa2SO4で乾燥し、減圧留去した。
【０１２４】
【数７】
2014051435.tif 000047
【表９】
2014051435.tif 000048
【図１】
2014051435.tif 000053