(57)【要約】      （修正有）【課題】可溶性のプロトロンビンを簡便かつ大量に製造可能であることと、得られたプロトロンビンから変換したトロンビンが高い比活性を有することとの両方の条件を満足する組換え型プロトロンビンの製造方法の提供。【解決手段】マルトース結合タンパク質(MBP)、低分子ユビキチン様修飾因子(SUMO)およびNusAからなる群より選択されるタグを融合させた組換え型プロトロンビンを、鱗翅目昆虫又は、鱗翅目昆虫の培養細胞を利用した発現系で発現。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
MBP、SUMOおよびNusAからなる群より選択されるタグをコードする遺伝子と、プロトロンビンをコードする遺伝子とが組み込まれたベクターDNAを用いて、鱗翅目昆虫または前記鱗翅目昆虫の培養細胞においてタグ融合プロトロンビンを発現させる工程を含む、組換え型プロトロンビンの製造方法。
【請求項２】
前記発現工程で得られた前記鱗翅目昆虫または前記鱗翅目昆虫の培養細胞から、前記タグ融合プロトロンビンを含む可溶性画分を取得する工程をさらに含む請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記ベクターDNAにおいて、前記タグがプロトロンビンのＮ末端側に融合するように、前記タグをコードする遺伝子が組み込まれている請求項１または２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記ベクターDNAが、配列番号７〜９のいずれか１つに示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子を組み込まれている請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項５】
前記発現工程が、前記タグ融合プロトロンビンを前記鱗翅目昆虫において発現させる工程である請求項１〜４のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項６】
前記発現工程が、前記タグ融合プロトロンビンを前記鱗翅目昆虫の蛹において発現させる工程である請求項５に記載の製造方法。
【請求項７】
前記鱗翅目昆虫がカイコである請求項１〜６のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項８】
前記タグ融合プロトロンビンの発現工程が、前記ベクターDNAで組み換えたバキュロウイルスを前記鱗翅目昆虫または前記鱗翅目昆虫の培養細胞に感染させることにより行われる工程である請求項１〜７のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項９】
前記ベクターDNAにおいて、タンパク質分泌シグナル配列をコードする遺伝子がさらに組み込まれている請求項１〜８のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１０】
タンパク質分泌シグナルが、プロトロンビン由来分泌シグナル配列、カイコ由来30Kシグナル配列、およびカイコ由来SPシグナル配列からなる群より選択される少なくとも１種である請求項９に記載の製造方法。
【請求項１１】
MBP、SUMOおよびNusAからなる群より選択されるタグをコードする遺伝子と、プロトロンビンをコードする遺伝子とが組み込まれたベクターDNAで組み変えたことを特徴とする、バキュロウイルス。
【請求項１２】
前記ベクターDNAにおいて、タンパク質分泌シグナル配列をコードする遺伝子がさらに組み込まれている請求項１１に記載のバキュロウイルス。
【請求項１３】
MBP、SUMOおよびNusAからなる群より選択されるタグをコードする遺伝子と、プロトロンビンをコードする遺伝子とが組み込まれたベクターDNAを含む、組換え型プロトロンビン製造用キット。
【請求項１４】
前記ベクターDNAが、バキュロウイルスに組み込まれている請求項１３に記載のキット。
【請求項１５】
前記ベクターDNAにおいて、タンパク質分泌シグナル配列をコードする遺伝子がさらに組み込まれている請求項１３または１４に記載のキット。
【請求項１６】
MBP、SUMOおよびNusAからなる群より選択されるタグをコードする遺伝子と、プロトロンビンをコードする遺伝子とが組み込まれたベクターDNAを用いて、鱗翅目昆虫または前記鱗翅目昆虫の培養細胞において発現させたタグ融合プロトロンビン。
【請求項１７】
MBP、SUMOおよびNusAからなる群より選択されるタグをコードする遺伝子と、プロトロンビンをコードする遺伝子とが組み込まれたベクターDNAを用いて、鱗翅目昆虫または前記鱗翅目昆虫の培養細胞において発現させたタグ融合プロトロンビンから得られるトロンビンを含有するトロンビン試薬。
【請求項１８】
MBP、SUMOおよびNusAからなる群より選択されるタグをコードする遺伝子と、プロトロンビンをコードする遺伝子とが組み込まれたベクターDNAを用いて、鱗翅目昆虫または前記鱗翅目昆虫の培養細胞において発現させたタグ融合プロトロンビンから得られるトロンビンを含有するトロンビン試薬と、
被験者の血漿を希釈するための希釈用緩衝液と
を含む、凝固能検査試薬キット。
【請求項１９】
所定の濃度でフィブリノゲンを含有する標準液をさらに含む、請求項１８に記載の凝固能検査試薬キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換え型プロトロンビンの製造方法、並びにその方法に用いられるバキュロウイルスおよびキットに関する。また、本発明は、組換え型プロトロンビンの製造方法により得られたタグ融合プロトロンビンに関する。さらに、本発明は、そのタグ融合プロトロンビンから得られたトロンビンを含むトロンビン試薬および凝固能検査試薬キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
プロトロンビンは、肝臓で産生される分子量約72,000のトロンビン前駆タンパク質であり、血液凝固第II因子とも呼ばれる。プロトロンビンは、生体内で、活性化第Ｘ因子、活性化第Ｖ因子、リン脂質およびカルシウムイオンの複合体により限定分解されて、トロンビンに変換される。トロンビンは、血液凝固反応においてフィブリノゲンを限定分解してフィブリンを生成するセリンプロテアーゼであり、止血や創傷治癒などに関与する重要なタンパク質である。そのため、トロンビンは、臨床分野で止血剤や血液検査用試薬として用いられているだけでなく、分子生物学分野などでの研究用試薬としても用いられている。
【０００３】
トロンビンは血漿中に多く存在することから、製剤や試薬用トロンビンは主にヒトまたはウシの血漿を原料として調製されている。しかし、これらの原料には肝炎ウイルスやヒト免疫不全ウイルス、異常プリオンなどの感染性物質が混入している危険性がある。また、血漿は天然由来原料であるので、製品のロット間の差が問題となる。そのため、近年では、大腸菌や哺乳動物細胞を利用した遺伝子組換え技術により作製したプロトロンビンまたはプレトロンビンからトロンビンを製造する方法が研究・開発されている(特許文献１〜３参照)。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００２−３０６１６３号公報
【特許文献２】国際公開第０３／００４６４１号
【特許文献３】国際公開第２００７／０４０１６２号
【特許文献４】国際公開第２００７／１２０８０９号
【特許文献５】国際公開第２００５／００３３１３号
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Soejima K.ら、J. Biochem. vol. 130, p. 269-277 (2001)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
プロトロンビンやプレトロンビンを大腸菌で発現させた場合、そのほとんどが封入体と呼ばれる不溶性凝集体となることが知られている。したがって、回収した不溶性凝集体を変性剤により可溶化させた後、リフォールディング処理を行う必要がある。しかし、リフォールディング処理は煩雑であるうえ、プロトロンビンやプレトロンビンのような複雑な構造のタンパク質のリフォールディング効率は極めて低いことが知られている。また、リフォールディング処理によって可溶化されたトロンビン前駆体から得られたトロンビンでは、比活性(単位重量当たりの活性)が低いことが懸念される。例えば、非特許文献１には、大腸菌発現系により得たプレトロンビン２からトロンビンを調製したことについて記載されており、酵素活性を有するトロンビンは、リフォールディング処理によって可溶化されたタンパク質のうち４〜７％程度であることが示されている。すなわち、リフォールディング処理によって可溶化されたトロンビン前駆体から得られたトロンビンの比活性は、血漿由来の天然型トロンビンの４〜７％程度である。
【０００７】
哺乳動物細胞の発現系を利用した場合では、可溶性のプロトロンビンやプレトロンビンが得ることができるが、工業的規模の製造の観点からは収量が非常に少なく、また製造コストも高いという問題がある。
【０００８】
他方で、大腸菌や哺乳動物細胞を利用した発現系では、所望のタンパク質に機能性タグタンパク質を融合させた組換え型タンパク質を発現させることができる。例えば、組換え型タンパク質の精製用タグとして、6×Hisタグ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ(GST)タグ、FLAGタグ、マルトース結合タンパク質(MBP)タグなどがある。また、近年、組換え型タンパク質の発現量や可溶性を向上させるタグタンパク質が開発されている。例えば、MBPタグや低分子ユビキチン様修飾因子(SUMO)タグなどがタンパク質の可溶性を向上させるタグとして知られており、大腸菌や酵母を利用した発現系において、組換え型タンパク質の可溶性が改善されている(特許文献４および５)。
【０００９】
しかし、可溶化タグを融合させたタンパク質全体としては可溶性を保っていたとしても、目的のタンパク質部分が正しい構造となっておらず、該タンパク質が本来の活性を有していない場合があることが知られている。このように、可溶化タグの融合によって、見かけ上は可溶性となっている組換え型タンパク質は、可溶化タグを切断すると不溶性凝集体になったり、活性を失ったりする場合がある。
【００１０】
上記のような事情に鑑みて、本発明者らは、可溶性のプロトロンビンを簡便かつ大量に製造可能であることと、得られたプロトロンビンから変換したトロンビンが高い比活性を有することとの両方の条件を満足する組換え型プロトロンビンの製造方法を提供することを課題とした。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、鋭意検討した結果、所定のタグを融合させたプロトロンビンを、鱗翅目昆虫を利用した発現系で発現させることにより、可溶性のプロトロンビンを簡便かつ大量に得ることができ、得られたプロトロンビンから変換したトロンビンが高い比活性を有することを見出して、本発明を完成させた。
【００１２】
すなわち、本発明は、MBP、SUMOおよびNusAからなる群より選択されるタグをコードする遺伝子と、プロトロンビンをコードする遺伝子とが組み込まれたベクターDNAを用いて、鱗翅目昆虫または該鱗翅目昆虫の培養細胞においてタグ融合プロトロンビンを発現させる工程を含む、組換え型プロトロンビンの製造方法を提供する。また、本発明は、このベクターDNAで組み変えたことを特徴とするバキュロウイルスおよびこのベクターDNAを含む組換え型プロトロンビン製造用キットを提供する。
【００１３】
本発明は、MBP、SUMOおよびNusAからなる群より選択されるタグをコードする遺伝子と、プロトロンビンをコードする遺伝子とが組み込まれたベクターDNAを用いて、鱗翅目昆虫または該鱗翅目昆虫の培養細胞において発現させたタグ融合プロトロンビンも提供する。また、本発明は、このタグ融合プロトロンビンから得られるトロンビンを含有するトロンビン試薬を提供する。さらに、本発明は、このトロンビン試薬と、被験者の血漿を希釈するための希釈用緩衝液とを含む凝固能検査試薬キットを提供する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、可溶性の組換え型プロトロンビンを簡便かつ大量に製造することが可能となる。したがって、本発明によれば、不溶性凝集物のリフォールディング処理を行う必要がない。また、得られた組換え型プロトロンビンを活性化させることにより、天然型トロンビンとほぼ同程度の比活性を有する組換え型トロンビンを得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明のタグ融合プロトロンビンまたはタグのないプロトロンビンを発現させたカイコ蛹から調製したサンプルにおけるプロトロンビンの発現量を示す写真である。
【図２】可溶性画分に含まれる本発明のタグ融合プロトロンビン量の相対比を示すグラフである。
【図３】タグ融合プロトロンビンおよび天然型プロトロンビンから得たトロンビンの比活性を示すグラフである。
【図４Ａ】タグ融合プロトロンビンまたはタグのないプロトロンビンを発現させたカイコ蛹から調製したサンプルにおけるプロトロンビンの発現量を示す写真である。
【図４Ｂ】タグ融合プロトロンビンまたはタグのないプロトロンビンを発現させたカイコ蛹から調製したサンプルにおけるプロトロンビンの発現量を示す写真である。
【図４Ｃ】タグ融合プロトロンビンまたはタグのないプロトロンビンを発現させたカイコ蛹から調製したサンプルにおけるプロトロンビンの発現量を示す写真である。
【図４Ｄ】タグ融合プロトロンビンを発現させたカイコ蛹から調製したサンプルにおけるプロトロンビンの発現量を示す写真である。
【図５】可溶性画分に含まれるタグ融合プロトロンビン量の相対比を示すグラフである。
【図６】タグ融合プロトロンビンまたはタグのないプロトロンビンを発現させたカイコ蛹から調製したサンプルにおけるプロトロンビンの発現量を示す写真である。
【図７】可溶性画分に含まれるタグ融合プロトロンビン量の相対比を示すグラフである。
【図８Ａ】本発明のトロンビン試薬についての試料中のフィブリノゲン濃度定量のための検量線である。
【図８Ｂ】対照試薬についての試料中のフィブリノゲン濃度定量のための検量線である。
【図９Ａ】４℃における本発明のトロンビン試薬および対照試薬の保存安定性を示すグラフである。
【図９Ｂ】37℃における本発明のトロンビン試薬および対照試薬の保存安定性を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明のプロトロンビンの製造方法(以下、単に「製造方法」ともいう)では、MBP、SUMOおよびNusAからなる群より選択されるタグをコードする遺伝子と、プロトロンビンをコードする遺伝子とが組み込まれたベクターDNAを用いる。
【００１７】
MBPは約42 kDaの分子量を有するタンパク質であり、グラム陰性菌におけるマルトデキストリンの輸送に関与することが知られている。本発明の実施形態において、MBPをコードする遺伝子は、組換えタンパク質のタグとして公知のMBPタンパク質またはその誘導体をコードする単離された遺伝子であれば特に限定されないが、好ましくは大腸菌(E. coli)由来MBPをコードする遺伝子であり、より好ましくは配列番号１で表されるアミノ酸配列をコードする遺伝子である。
【００１８】
SUMOは、セントリン、SMT3、PIC1、GMP1およびUBL1とも呼ばれるユビキチン様タンパク質の一種であり、酵母からヒトを含む脊椎動物までにおいて高度に保存されていることが知られている。本発明の実施形態において、SUMOをコードする遺伝子は、組換えタンパク質のタグとして公知のSUMOタンパク質またはその誘導体をコードする単離された遺伝子であれば特に限定されないが、好ましくは酵母SUMO(SMT3)、ヒトSUMO-3またはSUMOstar(改変SUMO、LifeSensor社)をコードする遺伝子であり、より好ましくは配列番号２で表されるアミノ酸配列をコードする遺伝子である。
【００１９】
NusAは約55 kDaの分子量を有するタンパク質であり、RNAポリメラーゼと結合する転写伸長因子として知られている。本発明の実施形態において、NusAをコードする遺伝子は、組換えタンパク質のタグとして公知のNusAタンパク質またはその誘導体をコードする単離された遺伝子であれば特に限定されないが、好ましくはE. coli由来NusAまたはNus・Tag(商標)(Merck社)をコードする遺伝子であり、より好ましくは配列番号３で表されるアミノ酸配列をコードする遺伝子である。
【００２０】
プロトロンビンをコードする遺伝子は、プロトロンビン(または血液凝固第II因子)を有する所望の動物種に由来する単離されたプロトロンビン遺伝子であれば特に限定されないが、好ましくはヒトプロトロンビンをコードする遺伝子である。なお、ヒトプロトロンビン遺伝子の塩基配列自体は公知であり、例えば、米国国立医学図書館の国立生物情報センター(National Center for Biotechnology Information：NCBI)により提供されるデータベースには、アクセッションナンバーNM_000506で登録されている。
【００２１】
ベクターDNAは、鱗翅目昆虫またはこの昆虫の培養細胞での遺伝子発現を可能にするプロモータを有し、該プロモータの下流に上記の遺伝子の挿入が可能なDNAであれば特に限定されないが、好ましくは、バキュロウイルスDNAとの相同組換えにより上記の遺伝子が挿入された組換えバキュロウイルスを作製可能なトランスファーベクターである。そのようなベクターDNA自体は当該技術において公知であり、例えばpM02、pYNG、pBM030、pBM050、pVL1392などが挙げられる。なお、上記のプロモータは当該技術において公知のプロモータから適宜選択することができ、例えばポリへドリンプロモータ、p10プロモータ、カイコアクチンプロモータなどが挙げられる。
【００２２】
上記の各遺伝子を組み込まれたベクターDNAでは、プロモータの下流にタグ融合プロトロンビンをコードする遺伝子が組み込まれることとなる。ここで、タグをコードする遺伝子は、プロトロンビンをコードする遺伝子の上流または下流のいずれに挿入されていてもよいが、好ましくはプロトロンビンをコードする遺伝子の上流である。すなわち、ベクターDNAにおいては、タグがプロトロンビンのＮ末端側に融合するように該タグをコードする遺伝子が組み込まれていることが好ましい。具体的には、ベクターDNAにおいて、配列番号７〜９のいずれか１つに示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子が組み込まれていることが好ましい。ここで、プロトロンビンがトロンビンに変換される際にプロトロンビンのＮ末端側が切断されるので、タグがプロトロンビンのＮ末端側に融合している場合、プロトロンビンからトロンビンに変換させる操作によってタグの除去も同時に行うことができる。
【００２３】
本発明の実施形態においては、ベクターDNAは、タンパク質分泌シグナル配列をコードする遺伝子をさらに組み込まれていることが好ましい。そのようなタンパク質分泌シグナル配列は、組換え型プロトロンビンの作製または鱗翅目昆虫を利用する発現系において用いられる公知の配列から適宜選択することができ、例えば、プロトロンビン由来分泌シグナル配列(配列番号４)、カイコ由来30Kシグナル配列(配列番号５)およびカイコ由来SPシグナル配列(配列番号６)が挙げられる。
【００２４】
本発明の実施形態においては、ベクターDNAが、カイコ由来30Kシグナル配列およびタグがＮ末端側に融合したヒトプロトロンビンをコードする遺伝子を組み込まれていることが好ましい。
【００２５】
本発明の製造方法では、上記のベクターDNAを用いて、鱗翅目昆虫またはその昆虫の培養細胞においてタグ融合プロトロンビンを発現させる。ここで、鱗翅目昆虫は、組換えタンパク質の発現に適する公知の鱗翅目昆虫であれば特に限定されず、例えばカイコ(Bombyx mori)、クワゴマダラヒトリ(Spilosoma imparilis)、サクサン(Antheraea pernyi)、スポドプテラ・フルギペルーダ(Spodoptera frugiperda)、イラクサギンウワバ(Trichoplusiani)などが挙げられる。それらの中でもカイコが特に好ましい。また、鱗翅目昆虫の培養細胞としては、組換え型タンパク質の発現に適する鱗翅目昆虫から樹立した細胞株であれば特に限定されず、例えばBmN、BmN4、SpIm、Anpe、Sf9、Sf21、High5などが挙げられる。
【００２６】
本発明の実施形態においては、組換え型プロトロンビンを大量に製造する観点から、鱗翅目昆虫にタグ融合プロトロンビンを発現させることが好ましい。なお、鱗翅目昆虫は、成虫、蛹および幼虫のいずれの形態であってよいが、セリンプロテアーゼの活性およびバキュロウイルスへの感受性の観点から、蛹を用いることが好ましい。
【００２７】
鱗翅目昆虫またはこの鱗翅目昆虫の培養細胞においてタグ融合プロトロンビンを発現させる手段は特に限定されず、ベクターDNAの種類に応じて適宜決定できる。例えば、ベクターDNAを公知の遺伝子導入法により鱗翅目昆虫またはこの昆虫の培養細胞に直接トランスフェクションすることによって、タグ融合プロトロンビンを発現させてもよい。本発明の好ましい実施形態においては、上記のベクターDNAで組み換えたバキュロウイルスを鱗翅目昆虫またはこの昆虫の培養細胞に感染させることによってタグ融合プロトロンビンを発現させる。
【００２８】
バキュロウイルスを、所望の塩基配列を有するDNAで組み換える方法自体は当該技術において公知である。例えば、ベクターDNAがトランスファーベクターである場合は、制限酵素などにより直線化したバキュロウイルスDNAと、タグ融合プロトロンビンをコードする遺伝子が組み込まれたベクターDNAとを鱗翅目昆虫の培養細胞にコトランスフェクションし、感染細胞をスクリーニングすることにより、組換えバキュロウイルスを得ることができる。
【００２９】
本発明の実施形態において、バキュロウイルスの種類は、上記の鱗翅目昆虫またはその昆虫の培養細胞に感染可能なウイルスであれば特に限定されないが、好ましくは核多角体病ウイルス(NPV)またはその改変ウイルスである。そのようなウイルスとしては、例えばBmNPV、HycuNPV、AnpeNPV、AcNPV、カイコガ科のカイコ(Bombyx mori)やヤガ科のオートグラファ・カリフォルニカ(Autographa californica)などの両宿主に感染する組換えバキュロウイルス(特開２００３−５２３７１号公報参照)などが挙げられる。好ましい実施形態においては、システインプロテアーゼ欠損(CPd)バキュロウイルスを用いる(特願平７-３０３４８８号参照)。
【００３０】
組換えバキュロウイルスを鱗翅目昆虫またはその昆虫の培養細胞に感染させる手段は特に限定されず、当該技術において公知の方法から適宜選択できる。例えば、鱗翅目昆虫に感染させる場合は、組換えバキュロウイルスを含む液を該昆虫に注射する方法などが挙げられる。また、培養細胞に感染させる場合は、組換えバキュロウイルスを含む液を培養培地に添加すればよい。鱗翅目昆虫またはその昆虫の培養細胞にウイルスを感染させてから５〜８日間飼育または培養することにより、タグ融合プロトロンビンを発現させることができる。
【００３１】
本発明の実施形態においては、上記のようにしてタグ融合プロトロンビンを発現させた鱗翅目昆虫またはこの昆虫の培養細胞から、該タグ融合プロトロンビンを取得する手段は特に限定されない。例えば、鱗翅目昆虫の場合は、体液を採取するか、または該昆虫を破砕してホモジェネートを調製することで、タグ融合プロトロンビンを取得することができる。また、培養細胞の場合は、該細胞を物理的に破砕するか、または界面活性剤などの細胞溶解剤を含む溶液に溶解することで、タグ融合プロトロンビンを取得することができる。
【００３２】
ここで、本発明の製造方法では、発現した組換え型プロトロンビンの可溶性が著しく向上しているので、可溶性画分にタグ融合プロトロンビンが多量に含まれている。したがって、本発明の実施形態においては、上記の発現工程で得られた鱗翅目昆虫またはこの昆虫の培養細胞から、該タグ融合プロトロンビンを含む可溶性画分を取得する工程をさらに含むことが好ましい。可溶性画分は、上記のようにして得た鱗翅目昆虫の体液もしくはホモジェネート、または細胞破砕液もしくは細胞ライセートを濾過または遠心して、上清を分離することにより得ることができる。なお、遠心の際に、サンプルに任意に適当な緩衝液を添加してもよい。そのような緩衝液はタンパク質の保存に適するものであれば特に限定されず、例えば、トリス緩衝液、リン酸緩衝液などが挙げられる。
【００３３】
本発明の実施形態においては、得られた組換え型プロトロンビンを当該技術において公知の方法によりトロンビンに変換することができる。そのような方法は特に限定されず、例えば、プロトロンビン活性化酵素であるエカリンを組換え型プロトロンビンに作用させて、トロンビンを得る方法が挙げられる。また、得られたトロンビンの比活性は当該技術において公知の方法により測定することができる。例えば、トロンビンに対する発色性合成基質であるS-2238(積水メディカル株式会社)と、組換え型トロンビンとを所定の時間反応させた後、反応停止液を添加して、吸光度を測定することにより比活性を求めることができる。
【００３４】
本発明の範囲には、MBP、SUMOおよびNusAからなる群より選択されるタグをコードする遺伝子と、プロトロンビンをコードする遺伝子とが組み込まれたベクターDNAで組み変えたことを特徴とするバキュロウイルスも含まれる。このバキュロウイルスの製造および使用については、本発明の製造方法について述べたことと同様である。なお、本発明の実施形態においては、タンパク質分泌シグナル配列をコードする遺伝子がさらに組み込まれたベクターDNAで組換えられたバキュロウイルスであることが好ましい。
【００３５】
また、本発明の範囲には、MBP、SUMOおよびNusAからなる群より選択されるタグをコードする遺伝子と、プロトロンビンをコードする遺伝子とが組み込まれたベクターDNAを含む、組換え型プロトロンビン製造用キットも含まれる。このキットに含まれるベクターDNAの製造および使用については、本発明の製造方法について述べたことと同様である。
【００３６】
本発明の実施形態においては、ベクターDNAはバキュロウイルスに組み込まれていることが好ましい。あるいは、別の実施形態においては、ベクターDNAとバキュロウイルスとがそれぞれ別個の容器に収納されていてもよい。また、ベクターDNAは、タンパク質分泌シグナル配列をコードする遺伝子がさらに組み込まれていることが好ましい。
【００３７】
また、本発明の範囲には、MBP、SUMOおよびNusAからなる群より選択されるタグをコードする遺伝子と、プロトロンビンをコードする遺伝子とが組み込まれたベクターDNAを用いて、鱗翅目昆虫または前記鱗翅目昆虫の培養細胞において発現させたタグ融合プロトロンビンも含まれる。このタグ融合プロトロンビンの製造については、本発明の製造方法について述べたことと同様である。
【００３８】
また、本発明の範囲には、上述のタグ融合プロトロンビンから得られるトロンビンを含有するトロンビン試薬も含まれる。
【００３９】
本発明のトロンビン試薬は、トロンビンの安定化のために、公知の安定化剤を含むこともできる。このような安定化剤は、トロンビン試薬に通常用いられる物質であれば特に限定されないが、例えば、カルシウムイオン、有機酸、界面活性剤、タンパク質などが挙げられる。
【００４０】
カルシウムイオンは、水溶性のカルシウム化合物の添加により試薬中に供給されることが好ましい。そのようなカルシウム化合物としては、例えば、塩化カルシウム、乳酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、グルクロン酸カルシウム、酒石酸カルシウムなどが挙げられる。これらカルシウム化合物を１種類または２種以上を組み合わせて使用することができる。カルシウム化合物のトロンビンに対する安定化有効量は、トロンビン試薬の安定性を向上させる量であれば特に限定されないが、トロンビン試薬中のカルシウム化合物の濃度としては、例えば５mM〜100 mMが好しく、10 mM〜50 mMがより好ましい。
【００４１】
有機酸としては、例えば、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、吉草酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、グルコン酸、乳酸、グルクロン酸、グリコール酸、酒石酸、リンゴ酸、クエン酸、酒石酸、グルタル酸、アミノ酢酸、アミノカプロン酸などが挙げられる。これらの有機酸として、遊離酸またはその塩のいずれを用いてもよい。また、これらの有機酸を１種もしくは２種以上を組み合わせて使用することができる。有機酸の添加量は、トロンビン試薬の安定性を向上させる量であれば特に限定されないが、トロンビン試薬中の界面活性剤濃度としては、例えば10 mM〜500 mMが好しく、50 mM〜200 mMがより好ましい。
【００４２】
界面活性剤としては、陰イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、両イオン性界面活性剤および非イオン性界面活性剤から適宜選択できる。陰イオン性界面活性剤としては、例えば、ドデシル硫酸ナトリウム、ドデシルスルホン酸ナトリウム、ドデシル−Ｎ−サルコシン酸ナトリウム、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、タウロデオキシコール酸ナトリウムなどが挙げられる。陽イオン性界面活性剤としては、例えば、セチルトリメチルアンモニウムブロミド、テトラデシルアンモニウムブロミド、ドデシルピリジニウムクロリドなどが挙げられる。両イオン性界面活性剤としては、例えば、３−［(３−コラミドプピル)ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホン酸(CHAPS)、３−［(３−コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホン酸(CHAPSO)、パルミトイルリゾレシチン、ドデシル−Ｎ−ベタイン、ドデシル−β−アラニンなどが挙げられる。非イオン性界面活性剤としては、例えば、オクチルグルコシド、ペプチルチオグルコシド、デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド、ポリオキシエチレンドデシルエーテル、ポリオキシエチレンへプタメチルヘキシルエーテル、ポリオキシエチレンイソオクチルフェニルエーテル(トライトンＸシリーズ)、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、スクロース脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビトールエステル(Tweenシリーズ)などが挙げられる。
【００４３】
上記の界面活性剤のうち、非イオン性界面活性剤が特に好ましい。また、上記の界面活性剤を１種もしくは２種類以上を組み合わせて用いることができる。該界面活性剤の添加量は、トロンビン試薬の安定性を向上させる量であれば特に限定されないが、トロンビン試薬中の界面活性剤濃度としては、例えば0.001〜１重量／容量％が好しく、0.005〜0.1重量／容量％がより好ましい。
【００４４】
安定化剤としてのタンパク質としては、例えば、アルブミン、ゼラチン、グロブリンが挙げられ、これらタンパク質を１種もしくは２種以上を組み合わせて用いることができる。該タンパク質の添加量は、トロンビン試薬の安定性を向上させる量であれば特に限定されないが、トロンビン試薬中のタンパク質濃度としては、例えば0.05〜10重量／容量％が好しく、0.1〜５重量／容量％がより好ましい。
【００４５】
上記の安定化剤は、トロンビンの溶液状態での保存時、乾燥状態での保存時、凍結状態での保存時および乾燥品を溶解もしくは凍結品を融解した時などにおける、トロンビンの酵素活性への影響を考慮して選択される。さらに、複数の安定化剤を組み合わせて使用する場合においても、トロンビンの液状品にあっては液状品中に含有させ、乾燥品または凍結品にあっては最終的に液状になしたときに安定化効果が発揮されるように調整し含有させる。
【００４６】
本発明のトロンビン試薬は、緩衝剤を含むこともできる。このような緩衝剤としては、例えば、pH４〜９の範囲に緩衝能を有する緩衝剤から適宜選択して用いることができる。そのような緩衝剤としては、例えば、クエン酸、リン酸、酢酸、イミダゾール、GTA、HEPES、MOPS、BIS-TRIS、TRIS、MOPSO、ADA、MESなどから１種もしくは２種以上を組み合わせて用いることができる。これら緩衝剤の添加量は、緩衝能を有する量であれば特に限定されない。緩衝剤の添加量は、例えばトロンビン試薬中の濃度が５〜1000 mMであることが好適で、より好ましくは50〜500 mMである。
【００４７】
本発明のトロンビン試薬は、高分子多糖類を含むこともできる。このような高分子多糖類としては、例えば、デキストラン40、デキストラン70、デキストラン200,000、デキストラン500,000、フィコールなどが挙げられる。また、これら高分子多糖類を１種もしくは２種以上を組み合わせて用いることができる。これら高分子多糖類の添加量は、再現性を向上させる量であれば特に限定されない。トロンビン試薬中の高分子多糖類の濃度としては、例えば0.1〜10重量／容量％が好しく、0.3〜３重量／容量％がより好ましい。
【００４８】
本発明のトロンビン試薬は、合成高分子類を含むこともできる。このような合成高分子類としては、例えば、ポリビニルアルコール500、ポリビニルアルコール1500、ポリビニルアルコール2000、ポリエチレングリコール1500、ポリエチレングリコール2000、ポリエチレングリコール4000、ポリエチレングリコール6000、ポリエチレングリコール8000、ポリエチレングリコール20000およびポリビニルピロリドンなどが挙げられる。これら合成高分子類を１種もしくは２種以上を組み合わせて用いることができる。これら合成高分子類の添加量は、再現性を向上させる量であれば特に限定されない。トロンビン試薬中の合成高分子類の濃度としては、例えば0.1〜10重量／容量％が好しく、0.3〜３重量／容量％がより好ましい。
【００４９】
また、本発明のトロンビン試薬には適当な防腐剤を添加してもよい。防腐剤としては、例えば、シプロフロキサシン、プロピオン酸もしくは安息香酸ナトリウムなどの中から１種もしくは２種以上を組み合わせて用いることができる。また、必要に応じて、塩化ナトリウムなどの塩や、アミノ酸、糖などの一般的な安定化剤などを含ませることもある。
【００５０】
本発明のトロンビン試薬のトロンビン含量は、その活性が目的とする活性値に調整されていればよく、特に限定されない。
【００５１】
具体的なトロンビン試薬としては、例えば、200 U/mLのトロンビンと、酢酸および乳酸カルシウムを含有する緩衝液とからなるpH6.0の溶液を用いることができる。
【００５２】
本発明のトロンビン試薬は、液状品、凍結品または乾燥品であってもよい。本発明のトロンビン試薬が乾燥品である場合、精製水または緩衝液を添加することにより溶解される。
【００５３】
上記の濃度は、溶液品中の濃度を記載しているが、乾燥品などは使用時に溶解したときの濃度を記載している。
【００５４】
本発明の範囲には、上述のトロンビン試薬と、被験者の血漿を希釈するための希釈用緩衝液とを含む、凝固能検査試薬キットも含まれる。
【００５５】
本発明の凝固能検査試薬キットに含まれる希釈用緩衝液としては、例えば、MES、Bis-Tris、ADA、PIPES、ACES、MOPSO、BES、MOPS、TES、HEPES、DIPSO、TAPSO、POPSO、HEPPSO、EPPS、Tricine、Bicine、TAPS、CHES、CAPSO、CAPSなどのグッド緩衝液、バルビタール緩衝液が挙げられる。また、TC緩衝液(シスメックス株式会社製)が挙げられる。
【００５６】
本発明の凝固能検査試薬キットは、所定の濃度でフィブリノゲンを含有する標準液をさらに含んでもよい。この場合、本発明の凝固能検査試薬キットは、フィブリノゲンの定量用試薬に使用することができる。フィブリノゲンの定量の手順は、具体的には次のとおりである。まず、標準液を希釈用緩衝液で５倍、10倍、20倍に希釈する(希釈倍率は適宜調整することが可能である)。次に、各希釈標準液0.2 mLを37℃で３分間加温し、予め37℃に加温した検査試薬またはトロンビン試薬を0.1 mLずつ加え、凝固時間を測定し、各々の希釈標準液の測定値をグラフにプロットして検量線を作成する。そして、血漿検体を希釈用緩衝液で10倍希釈し(希釈倍率は適宜調整することが可能である)、得られた希釈検体について同様に凝固時間を測定し、得られた凝固時間をもとに、検量線から濃度を求めることができる。
【００５７】
また、本発明の凝固能検査試薬キットは、トロンビン阻害物質の活性、例えば、アンチトロンビン活性、ヒルジンの活性、さらには化学合成阻害剤の活性を測定するために用いることもできる。
【００５８】
上記の凝固能検査試薬キットにおいて、トロンビン試薬、および希釈用緩衝液は別々にパッケージされている。例えば、トロンビン試薬は第１の試薬容器に収容されており、希釈用緩衝液は第２の試薬容器に収容されている。また、凝固能検査試薬キットが、所定の濃度でフィブリノゲンを含有する標準液をさらに含んでいる場合、標準液は、第１および第２の試薬容器とは別の第３の試薬容器に収容されている。なお、凝固能検査試薬キットは、所望により、別の試薬を別の試薬容器に収容したものを備えてもよい。さらに、凝固能検査試薬キットは、所望により、試薬の１つまたは複数を希釈するための１種または複数の緩衝液、使用説明書、反応に用い得る容器などを備えてもよい。
【００５９】
以下に、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００６０】
実施例１：  タグ遺伝子およびヒトプロトロンビン遺伝子を組み込んだバキュロウイルスの作製
(１)ヒトプロトロンビン遺伝子のクローニング
データベースに公開されているヒトプロトロンビン遺伝子(以下、hPTH遺伝子ともいう)の塩基配列(NCBI Acc. No. NM_000506)に基づいて、hPTH遺伝子をクローニングするためのプライマーセットを設計した。各プライマーの配列を以下に示す。
Ｆ：5'- AAGAATTCATGGCCAACACCTTCTTGGAGGAG -3' (配列番号１０)
Ｒ：5'- AATCTAGACTACTCTCCAAACTGATCAATGACCTT -3' (配列番号１１)
【００６１】
上記のプライマーセットを用いて、ヒト肝臓cDNAライブラリー(clontech社)を鋳型とするPCR法によってhPTH遺伝子を単離した。単離したDNA断片をQIAquick(QIAGEN社)を用いて精製し、制限酵素EcoRIおよびXbaIで処理した後に、pM02ベクター(シスメックス株式会社)のマルチクローニングサイトへ組み込んだ。得られたプラスミドコンストラクトをpM02-hPTHと呼ぶ。
【００６２】
(２)タグをコードする遺伝子のサブクローニング
すでに報告されているmalE遺伝子、SUMO遺伝子およびNusA遺伝子の塩基配列に基づいて、各遺伝子をサブクローニングするためのプライマーセットを設計した。各プライマーの配列を以下に示す。
・malE遺伝子用プライマーセット
Ｆ：5'- AAGGTACCATGAAAATAAAAACAGGTGCGC -3'  (配列番号１２)
Ｒ：5'- TTGAATTCGCTCTGAAAGTACAGATCCTCAGTCTGCGC -3' (配列番号１３)
・SUMO遺伝子用プライマーセット
Ｆ：5'- AAGGTACCATGTCCCTGCAGGACTCAG -3' (配列番号１４)
Ｒ：5'- TTGAATTCGCTCTGAAAGTACAGATCCTCAATCTGTTCTC -3' (配列番号１５)
・NusA遺伝子用プライマーセット
Ｆ：5'- AAGAATTCGCTCTGAAAGTACAGATCCTCCGCTTCGTCAC -3' (配列番号１６)
Ｒ：5'- AAGGTACCATGAACAAAGAAATTTTGGCTGTAG -3' (配列番号１７)
【００６３】
上記のmalE遺伝子用プライマーセットを用いて、pMAL-p5x(New England Biolab社)を鋳型とするPCR法によってmalE遺伝子を単離した。同様に、SUMO遺伝子用プライマーセットおよびNusA遺伝子用プライマーセットを用いて、pI SUMOstar(LifeSensor社)およびpET-44(+)(Merck社)を鋳型とするPCR法によって、それぞれSUMO遺伝子およびNusA遺伝子を単離した。
【００６４】
(３)タグをコードする遺伝子とプロトロンビン遺伝子とを組み込んだベクターDNAの作製
単離した各タグ遺伝子のDNA断片をQIAquick(QIAGEN社)を用いて精製し、制限酵素EcoRIおよびKpnIで処理した。そして、各遺伝子のDNA断片を、pM02-hPTH中のhPTH遺伝子の上流に組み込んで、本発明のベクターDNA(トランスファープラスミド)を得た。得られた各トランスファープラスミドをそれぞれpM02-MBP-hPTH、pM02-SUMO-hPTHおよびpM02-NusA hPTHと呼ぶ。
【００６５】
(４)組換えバキュロウイルスの作製
組換えバキュロウイルスの作製は、Maedaらの方法(InverterbrateCell system and Applications, Vol.1, p.167-181,CRC Press, Boca Raton(1989))を改変して行った。具体的には次のとおりである。まず、上記のトランスファープラスミドをPlasmid purification kit(QIAGEN社)によって精製した。そして、これらのトランスファープラスミド(0.5μg)と、直鎖化したCPdバキュロウイルス(ATCC VR2500)のDNA(0.2μg)とをリポフェクション試薬(X-tremeGENE 9 DNATransfection Reagent: ロシュ社)を用いて、BmN細胞(Maeda, 1989)にコトランスフェクトした。スクリーニングは96穴プレートを利用した限界希釈法により行い、感染兆候が確認されたウイルスを選抜し、培養上清を回収した。これにより、タグをコードする遺伝子とプロトロンビン遺伝子とを組み込んだ、本発明の組換えバキュロウイルスを得た。なお、pM02-hPTHについても上記と同様にして、組換えバキュロウイルスを作製した。
【００６６】
(５)BmN細胞におけるタグ融合プロトロンビンの発現の検討
上清の回収後、BmN細胞のライセートを調製した。得られたライセートについて、SDS-PAGEおよびウエスタンブロットで解析した。なお、ウエスタンブロットには、１次抗体としてマウス抗トロンビン抗体(NOVUS社)、２次抗体として抗マウスIgG(Dako社)および検出試薬としてImmobilon Western HRP reagent(Millipore社)を用いた。その結果、BmNライセート中に、タグ融合プロトロンビンであると予測される分子量を有するタンパク質が発現していることを確認した。
【００６７】
実施例２：  カイコにおけるタグ融合プロトロンビンの発現および比活性の検討
(１)タグ融合プロトロンビンの発現
実施例１で作製した組換えバキュロウイルスを、カイコ蛹(品種：近秋錦和,上田蚕種社より蚕卵を購入し、シスメックス株式会社にて蛹まで人工飼育)へ接種した。ウイルス接種の７日後に感染した蛹を回収し、これを−80℃で凍結した。凍結した蛹をブレンダーで破砕した。得られた破砕液中の蛹残渣を低速遠心処理およびろ過によって除去して、ホモジェネートを得た。得られたホモジェネートを20000×gで30分間の遠心処理を行って、上清と沈殿物とに分離した。得られた上清を可溶性画分とし、沈殿物を不溶性画分とした。
【００６８】
得られたホモジェネート、可溶性画分および不溶性画分について、SDS-PAGEおよびマウエスタンブロットで解析した。なお、ウエスタンブロットには、１次抗体としてマウス抗トロンビン抗体(NOVUS社)、２次抗体として抗マウスIgG(Dako社)および検出試薬としてImmobilon Western HRP reagent(Millipore社)を用いた。結果を図１Ａ〜Ｄに示す。また、ウエスタンブロットの結果に基づいて、各可溶性タグ融合プロトロンビンの可溶性画分における発現量の比率を図２に示した。なお、図２のグラフでは、タグを融合していないプロトロンビン(図１Ｄ：対照区)の可溶性画分のバンド強度を１として、各可溶性タグ融合プロトロンビン(図１Ａ〜Ｃ)の可溶性画分のバンド強度の相対比を示した。
【００６９】
図１Ａ〜Ｄのホモジェネートのバンドからより、タグ融合プロトロンビンおよびタグを融合していないプロトロンビンのいずれも、カイコ蛹において発現していることがわかった。しかし、タグを融合していないプロトロンビンは、可溶性画分にはほとんど含まれていなかった。すなわち、タグを融合していない場合、カイコ蛹に発現させたプロトロンビンのほとんどが不溶性タンパク質となることがわかった。これに対して、タグとしてMBP、SUMOまたはNusAを融合したプロトロンビンは、可溶性画分に多量に含まれていることがわかった。また、図２より、いずれのタグ融合プロトロンビンも、タグを融合していないプロトロンビンに比べて、可溶性が約12倍以上となっていることがわかった。
【００７０】
(２)タグ融合プロトロンビンの比活性
上記で得られた可溶性画分を、Q sepharose FastFlow(GE healthcare社)を用いて簡易精製した。精製した可溶性画分に、プロトロンビン活性化酵素であるエカリン(Sigma社)を終濃度１U/mlとなるように添加し、37℃で２時間反応させた。得られた反応液について、SDS-PAGEおよびマウス抗トロンビン抗体(NOVUS社)を用いたウエスタンブロットで解析した。なお、ウエスタンブロットには、１次抗体としてマウス抗トロンビン抗体(NOVUS社)、２次抗体として抗マウスIgG(Dako社)および検出試薬としてImmobilon Western HRP reagent(Millipore社)を用いた。
【００７１】
ウエスタンブロットの結果、各タグ融合ヒトプロトロンビンはエカリンの作用によって活性化されて、天然型ヒトプロトロンビンと同等の分子量を有していることがわかった。そして、各タグ融合ヒトプロトロンビンから得られたトロンビンの比活性(NIH U/mg)を、トロンビンの特異的合成基質であるS-2238(積水メディカル株式会社)を用いて測定した。なお、対照として、天然型ヒトプロトロンビン(ヒト血漿由来、Calbiochem社)にエカリンを作用させて得たトロンビンを用いた。測定の結果を図３に示す。図３より、各タグ融合ヒトプロトロンビンから得られたトロンビンは、天然型と同等の比活性を有していた。
【００７２】
比較例１：  本発明のタグ以外のタグおよびシグナルペプチドの効果の検討
カイコでの組換えタンパク質発現系によりプロトロンビンを発現させる場合に、大腸菌発現系に頻用されるタグ(His、FLAG、DOCKおよびGST)が可溶性の改善に有効であるか否かを検討した。また、シグナルペプチドの種類による可溶性への影響も検討した。
【００７３】
(１)ベクターDNAの作製
実施例１で単離したhPTH遺伝子をpM01(シスメックス株式会社)ベクターに組み込み、hPTH遺伝子上流にヒトプロトロンビン由来分泌シグナルを有したベクターDNAを作製した。同様にして、hPTH遺伝子をpM15ベクター(シスメックス株式会社)、pM23ベクター(シスメックス株式会社)、pM31aベクター(シスメックス株式会社)およびpM47 ベクター(シスメックス株式会社)のそれぞれに組み込んで、ヒトプロトロンビン由来分泌シグナルを有し、C末端に6xHis、FLAG、DOCKおよびGSTをそれぞれ融合したヒトプロトロンビンをコードする遺伝子を導入したベクターDNAを作製した。次いで、単離したhPTH遺伝子をpM16ベクター(シスメックス株式会社)、pM27ベクター(シスメックス株式会社)、pM35aベクター(シスメックス株式会社)およびpM51ベクター(シスメックス株式会社)のそれぞれに組み込んで、カイコ由来30Kシグナルを有しC末端に6×Hisタグ、FLAG、DOCK、GSTをそれぞれ融合したヒトプロトロンビンをコードする遺伝子を導入したベクターDNAを作製した。次いで、単離したhPTH遺伝子をpMSP-01ベクター(シスメックス株式会社)、pM-SP06ベクター(シスメックス株式会社)、pM-SP 24ベクター(シスメックス株式会社)、pM-SP 32ベクター(シスメックス株式会社)およびpM-SP 48ベクター(シスメックス株式会社)のそれぞれに組み込んで、hPTH遺伝子上流にカイコ由来SPシグナルを有したベクターDNA、 C末端に6×Hisタグ、FLAG、DOCK、GSTをそれぞれ融合しさらにカイコ由来SPシグナルを有したヒトプロトロンビンをコードする遺伝子を導入したベクターDNAを作製した。
【００７４】
(２)組換えバキュロウイルスの作製およびタグ融合プロトロンビンの発現
上記で作製した各ベクターDNAを用いて、実施例１と同様にして組換えバキュロウイルスを作製した。そして、実施例２と同様にして、得られた各組換えバキュロウイルスをカイコ蛹に感染させ、ホモジェネート、可溶性画分および不溶性画分を調製した。
【００７５】
(３)タグ融合プロトロンビンの可溶性の検討
得られたホモジェネート、可溶性画分および不溶性画分について、SDS-PAGEおよびウエスタンブロットで解析した。なお、ウエスタンブロットには、１次抗体としてマウス抗トロンビン抗体(NOVUS社)、２次抗体として抗マウスIgG(Dako社)および検出試薬としてECL detection kit(GE healthcare社)を用いた。結果を図４Ａ〜Ｄに示す。なお、図４において、N.Cは非感染カイコを示し、P.Cは天然型ヒトプロトロンビン(ヒト血漿由来、Calbiochem社)を示す。また、ウエスタンブロットの結果に基づいて、各種のタグ融合プロトロンビンの可溶性画分における発現量の比率を、図５に示した。なお、図５のグラフでは、図４Ｂのカイコ由来30Kシグナルペプチドを融合したタグのないプロトロンビン(実施例２の対照と同じ条件)の可溶性画分のバンド強度を１として、その他の可溶性画分のバンド強度の相対比を示した。
【００７６】
図４Ａ〜Ｄのホモジェネートのバンドから、タグ融合プロトロンビンおよびタグを融合していないプロトロンビンのいずれも、カイコ蛹において発現していることがわかった。また、シグナルペプチドの種類による発現量の違いはほとんど見られなかった。しかし、His、FLAG、DOCKおよびGSTのいずれのタグを融合したプロトロンビンも、可溶性画分にはほとんど含まれていなかった。また、図５より、いずれのタグを融合したプロトロンビンも、タグを融合していないプロトロンビンに比べて、可溶性が劣っていることがわかった。すなわち、これらのタグを融合しても、カイコ蛹に発現させたプロトロンビンの可溶性は改善されないことがわかった。
【００７７】
比較例２：  本発明のタグ以外の融合タンパク質の効果の検討
カイコでの組換えタンパク質発現系によりプロトロンビンを発現させる場合に、本発明のタグ以外の融合タンパク質(Avidin、StreptavidinのFull型およびStreptavidinのCore型)が可溶性の改善に有効であるか否かを検討した。
【００７８】
(１)ベクターDNAの作製
データベースに登録されているAvidin遺伝子(NCBI Acc. No. NM_205320.1)、Streptavidin(core型およびfull型)遺伝子(NCBI Acc. No. X03591.1)の塩基配列に基づいて、人工遺伝子合成法(Life Technology社)により各遺伝子を調製した。調製した遺伝子は、5'末端にKpnIサイト、3'末端にEcoRIサイトが付加されて、pUC19(Life Technology社)に挿入されている。これらを、実施例１と同様の条件で精製および制限酵素処理を行い、各遺伝子のDNA断片を、pM02-hPTH中のhPTH遺伝子の上流に組み込んで、Ｎ末端にAvidin、Streptavidin(full)およびStreptavidin(core)をそれぞれ融合したヒトプロトロンビンをコードする遺伝子を導入したベクターDNAを調製した。
【００７９】
(２)組換えバキュロウイルスの作製およびタグ融合プロトロンビンの発現
上記で作製した各ベクターDNAを用いて、実施例１と同様にして組換えバキュロウイルスを作製した。そして、実施例２と同様にして、得られた各組換えバキュロウイルスをカイコ蛹に感染させ、ホモジェネート、可溶性画分および不溶性画分を調製した。
【００８０】
(３)タグ融合プロトロンビンの可溶性の検討
得られたホモジェネート、可溶性画分および不溶性画分について、SDS-PAGEおよびウエスタンブロットで解析した。なお、ウエスタンブロットには、１次抗体としてマウス抗トロンビン抗体(NOVUS社)、２次抗体として抗マウスIgG(Dako社)および検出試薬としてImmobilon Western HRP reagent(Millipore社)を用いた。結果を図６Ａ〜Ｄに示す。また、ウエスタンブロットの結果に基づいて、各種のタグ融合プロトロンビンの可溶性画分における発現量の比率を、図７に示した。なお、図７のグラフでは、タグのないプロトロンビン(実施例２の対照と同じ条件)の可溶性画分のバンド強度を１として、その他の可溶性画分のバンド強度の相対比を示した。
【００８１】
図６Ａ〜Ｄのホモジェネートのバンドから、タグ融合プロトロンビンおよびタグを融合していないプロトロンビンのいずれも、カイコ蛹において発現していることがわかった。また、いずれのタグを融合したプロトロンビンも、ほとんどが不溶性画分に含まれていることがわかった。また、図７より、Avidinを融合したプロトロンビンでは、可溶性が改善されないことがわかった。また、StreptavidinのFull型またはCore型を融合したプロトロンビンでは、タグのないプロトロンビンに比べて可溶性が改善されているが、十分ではないことがわかった。
【００８２】
実施例３：  トロンビン試薬の調製および試薬性能の評価
(１)トロンビン試薬の調製
本実施例では、実施例２において比活性の測定に使用したMBP融合プロトロンビンを用いた。このMBP融合プロトロンビンからエカリンを用いて活性化したトロンビンを取得した。このトロンビンと、0.9％安息香酸ナトリウムと、0.2％ Tween 80溶液とを混合し、本発明のトロンビン試薬を調製した。本試薬中のトロンビン活性は200 U/mlであった。
(２)トロンビン試薬の性能評価
上記で得られた本発明のトロンビン試薬について、感度、正確度、および安定性の評価を行った。凝固時間の測定は、コアグレックス８００(シスメックス株式会社製)を用いて行った。試料として血液凝固用コントロールＮ(シスメックス株式会社製)を、緩衝液としてTC緩衝液(シスメックス株式会社製)を用いた。対照試薬としては、ヒト由来の天然型トロンビンを含む市販試薬トロンボチェックFib(L)(シスメックス株式会社製)を用いた。対照試薬のトロンビン活性は200 U/mlであった。
【００８３】
［感度の評価］
TC緩衝液を用いて５倍、10倍、または20倍に希釈した試料100μlを37℃で１分間加温した後、予め加温した本実施例のトロンビン試薬または対照試薬50μlを添加してからの凝固時間を測定した。測定は二度行った(N1およびN2)。
感度の評価は、20倍希釈した試料を用いた際の平均凝固時間と、５倍希釈した試料を用いた際の平均凝固時間との差で評価した。結果を表１に示す。表１より、本実施例のトロンビン試薬は、対照試薬と同等の感度を有していることが検証された。
【００８４】
【表１】
2014198040.tif 000002
【００８５】
［正確性の評価］
感度試験の測定結果と試料のフィブリノゲン濃度から試料中のフィブリノゲン濃度定量のための検量線を作成した(図８Ａおよび図８Ｂ)。この検量線を用い、フィブリノゲン濃度既知(247 mg/dL：基準値)の検体の凝固時間を測定した。測定は二度行った(N1およびN2)。測定された凝固時間を用いて、回帰式よりフィブリノゲン濃度を算出した。その結果を表２に示す。本実施例の試薬を用いた場合は258.0 mg/dL、対照試薬を用いた場合は224.4 mg/dLと算出された。フィブリノゲン濃度は247 mg/dLであったため、本実施例の試薬を用いた場合は対基準値で104.5％、対照試薬を用いた場合は対基準値で90.9％であった。以上より、本実施例のトロンビン試薬は、対照試薬と同等の正確性を有していることが検証された。
【００８６】
【表２】
2014198040.tif 000003
【００８７】
［安定性の評価］
本実施例のトロンビン試薬と対照試薬を４℃または37℃に静置後、１日後、７日後、15日後、または21日後に上記正確性の試験と同様にして検体のフィブリノゲン濃度を測定した。結果を図９Ａおよび図９Ｂに示す。図９Ａおよび図９Ｂより、いずれの温度でも、本実施例のトロンビン試薬は、対照試薬と同等の保存安定性を有していることが検証された。
【図１】
2014198040.tif 000004
【図２】
2014198040.tif 000005
【図３】
2014198040.tif 000006
【図４Ａ】
2014198040.tif 000007
【図４Ｂ】
2014198040.tif 000008
【図４Ｃ】
2014198040.tif 000009
【図４Ｄ】
2014198040.tif 000010
【図５】
2014198040.tif 000011
【図６】
2014198040.tif 000012
【図７】
2014198040.tif 000013
【図８Ａ】
2014198040.tif 000014
【図８Ｂ】
2014198040.tif 000015
【図９Ａ】
2014198040.tif 000016
【図９Ｂ】
2014198040.tif 000017
【配列表】
2014198040000001.app