(57)【要約】【課題】検体量が少ない場合であっても、簡便な操作で正確に検体中のチトクロムＰ４５０濃度が測定できる方法の提供。【解決手段】（ａ）検体に遷移金属カルボニル錯体を添加するステップと、  （ｂ）得られた検体に光照射して遷移金属カルボニル錯体から一酸化炭素を発生させ、検体中に含有する可能性のあるチトクロムＰ４５０と一酸化炭素を反応させるステップ、及び  （ｃ）光照射後に４５０nmを含む波長の光の吸光度を測定するステップを含む検体中のチトクロムＰ４５０濃度の測定方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）検体に遷移金属カルボニル錯体を添加するステップと、
（ｂ）得られた検体に光照射して遷移金属カルボニル錯体から一酸化炭素を発生させ、検体中に含有する可能性のあるチトクロムＰ４５０と一酸化炭素を反応させるステップ、及び
（ｃ）光照射後に４５０nmを含む波長の光の吸光度を測定するステップ
を含む検体中のチトクロムＰ４５０濃度の測定方法。
【請求項２】
遷移金属カルボニル錯体が、デカカルボニル二マンガン及びトリカルボニルジクロロルテニウムから選ばれるものである請求項１記載の測定方法。
【請求項３】
遷移金属カルボニル錯体の添加濃度が、検体に添加した後の終濃度として、１０〜５００μMである請求項１又は２記載の測定方法。
【請求項４】
光照射時間が１〜１０分間である請求項１〜３のいずれか１項記載の測定方法。
【請求項５】
光照射の光源がＬＥＤである請求項１〜４のいずれか１項記載の測定方法。
【請求項６】
各ステップをマイクロプレート上で行うものである請求項１〜５のいずれか１項記載の測定方法。
【請求項７】
チトクロムＰ４５０及び遷移金属カルボニル錯体を含有する溶液に光照射することを特徴とするチトクロムＰ４５０への一酸化炭素結合方法。
【請求項８】
遷移金属カルボニル錯体が、デカカルボニル二マンガン及びトリカルボニルジクロロルテニウムから選ばれるものである請求項７記載の結合方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、動物由来検体中のチトクロムＰ４５０濃度の測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
チトクロムＰ４５０（以下、Ｐ４５０ともいう）は、小胞体やミトコンドリアの膜に結合したプロトヘム（ポルフィリン環の中心に鉄が配位した錯体）を含有する分子量５万前後の蛋白質で、酸素原子を様々な分子に添加する酵素である。約７，０００近くのＰ４５０が、ヒトから細菌までの生物界に存在する。哺乳類では解毒、薬物代謝に関わることから生体防御に重要であると共に、ステロイド合成、アラキドン酸カスケードなど生命活動の調節を行う化合物の合成にも関わっている。薬物代謝に関しては、主にモノオキシゲナーゼ反応、他に脱ハロゲン、脱水素、脱水、還元反応、Ｃ−Ｃ結合切断、異性化反応などに関与する酵素が肝細胞や消化管等に分布し、その種類は２０を越えている。
【０００３】
従って、医薬品や機能性食品の開発にあたっては、肝臓や小腸ミクロソームのチトクロムＰ４５０濃度を測定することは、チトクロムＰ４５０の誘導や発現抑制に起因した薬物相互作用を予測するために必要である。
個々の薬物に対する代謝能を検討するには、Ｐ４５０の分子種毎の誘導能の検討が必要となるが、動物個体に対する影響を検討するには、肝臓や小腸ミクロソーム中のＰ４５０全量の濃度の測定も重要である。
【０００４】
Ｐ４５０濃度の測定方法としては、Ｐ４５０が、Ｐ４５０の鉄原子に一酸化炭素（ＣＯ）が結合すると波長４５０nmの光を吸収する性質を有することから、この性質を利用して、Ｐ４５０量を測定する一酸化炭素差スペクトル法が確立されており、具体的には、ＣＯと結合した還元型Ｐ４５０の吸光度と光路長を基に、ランバート・ベールの法則によってＰ４５０濃度を測定する方法である（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Omura T, and Sato R., J. Biol. Chem., 239, 2370-2378(1964)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、前記大村と佐藤の方法（非特許文献１）では、ＣＯと結合したＰ４５０およびＣＯと結合していないＰ４５０のΔA450-490nmを分光光度計で測定するため、ミクロセルを用いても２mL、標準セルを用いた場合は１０mLものミクロソーム懸濁液を必要とする。しかも、ミクロソーム懸濁液はその蛋白濃度を約２mg／mL程度に調製しなければならないため、ラットの消化管ミクロソームのＰ４５０量を個体毎に測定することは難しい。実際、ラットの消化管のＰ４５０量は、数個体のラット消化管のミクロソームをプールして測定した成績が報告されている。さらにＣＯをヘム蛋白に結合させるため過剰のＣＯをミクロソーム懸濁液に通気させるので、ドラフト内で行わなければならず、ミクロソーム懸濁液が泡立たないように一定の通気量を維持させる等の熟練度を要する。ミクロソーム懸濁液が少量になれば、ＣＯの通気による泡や飛沫のロスが相対的に大きく、測定精度の鈍化が懸念される等の問題がある。
従って、本発明の課題は、検体量が少ない場合であっても、簡便な操作で正確に検体中のＰ４５０濃度が測定できる方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
そこで本発明者は、検体にＣＯガスを通気させない測定手段について検討した結果、検体に遷移金属カルボニル錯体を添加しておき、次のその検体に光を照射すれば遷移金属カルボニル錯体から発生したＣＯが検体中のＰ４５０と効率良く反応するので、波長４５０nmを含む波長の光の吸光度を測定すれば、検体が少量であっても、ＣＯ通気による泡や飛沫の発生がなく、簡便な操作で、正確に検体中のＰ４５０濃度が測定できることを見出し、本発明を完成した。
【０００８】
すなわち、本発明は、次の［１］〜［８］を提供するものである。
［１］（ａ）検体に遷移金属カルボニル錯体を添加するステップと、
（ｂ）得られた検体に光照射して遷移金属カルボニル錯体から一酸化炭素を発生させ、検体中に含有する可能性のあるチトクロムＰ４５０と一酸化炭素を反応させるステップ、及び
（ｃ）光照射後に４５０nmを含む波長の光の吸光度を測定するステップ
を含む検体中のチトクロムＰ４５０濃度の測定方法。
［２］遷移金属カルボニル錯体が、デカカルボニル二マンガン及びトリカルボニルジクロロルテニウムから選ばれるものである［１］記載の測定方法。
［３］遷移金属カルボニル錯体の添加濃度が、検体に添加した後の終濃度として、１０〜５００μMである［１］又は［２］記載の測定方法。
［４］光照射時間が１〜１０分間である［１］〜［３］のいずれかに記載の測定方法。
［５］光照射の光源がＬＥＤである［１］〜［４］のいずれかに記載の測定方法。
［６］各ステップをマイクロプレート上で行うものである［１］〜［５］のいずれかに記載の測定方法。
［７］チトクロムＰ４５０及び遷移金属カルボニル錯体を含有する溶液に光照射することを特徴とするチトクロムＰ４５０への一酸化炭素結合方法。
［８］遷移金属カルボニル錯体が、デカカルボニル二マンガン及びトリカルボニルジクロロルテニウムから選ばれるものである［７］記載の結合方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明方法によれば、検体が少量であっても、ＣＯ通気による泡や飛沫の発生がなく、簡便な操作で、正確に検体中のＰ４５０濃度が測定できる。また、少量の検体が使用できること及びＣＯ通気の操作がないことから、９６穴プレート等のマイクロプレート上で多数の検体を同時に測定することが可能である。また、検体量が少量で済むことから、ラットの小腸ミクロソーム等を検体とした場合であっても、ラット個体毎のＰ４５０濃度が測定可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】アルミニウムボード上にＬＥＤ照明を設置した光照射装置の概略を示す図である。
【図２】４５０nmにピークを有する光の吸光度が各種濃度（５mM〜４０mM）のＤＭＤＣでも同様に認められたことを示す図である。
【図３】ＤＭＤＣ濃度とΔA450-490nmの関係を示す図である。
【図４】光照射の照度（lux）と吸光度（ΔA450-490nm）との関係を示す図である。
【図５】肝ミクロソーム及び小腸ミクロソーム中のＰ４５０濃度を示す図である。
【図６】本発明方法（ＤＭＤＣ）による吸光度差スペクトルは大村と佐藤の方法（Omura & Sato）による吸光度差スペクトルと同じであることを示す図である。
【図７】ミクロソーム蛋白量（Microsomal Protein）と吸光度との関係を示す図である。
【図８】本発明方法（ＤＭＤＣ）と大村と佐藤の方法（Omura & Sato）との相関関係を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明の検体中のチトクロムＰ４５０濃度測定方法は、次のステップ（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む。
（ａ）検体に遷移金属カルボニル錯体を添加するステップと、
（ｂ）得られた検体に光照射して遷移金属カルボニル錯体から一酸化炭素を発生させ、検体中に含有する可能性のあるチトクロムＰ４５０と一酸化炭素を反応させるステップ、及び
（ｃ）光照射後に４５０nmを含む波長の光の吸光度を測定するステップ。
【００１２】
ステップ（ａ）に用いる検体としては、Ｐ４５０を含有する可能性のある動物組織のミクロソーム画分、例えば肝ミクロソーム画分、小腸ミクロソーム画分、副腎皮質ミクロソーム、腎臓ミクロソーム等が挙げられ、このうち肝ミクロソーム画分、小腸ミクロソーム画分を用いるのが好ましい。また、対象動物としては、ラット等のげっ歯類、ヒト、ウシ、ブタ、ウサギ等の哺乳類の他、鳥類、魚類等が挙げられる。ここでミクロソーム画分の調製は、それ自体公知の方法により行うことができる。
【００１３】
検体量は、２００μL以上であればよく、２００μL〜１mLであるのが好ましい。
また、検体中のミクロソームタンパク濃度は、０．２〜２．０mg／mLであるのが好ましく、２．０mg／mLであるのが好ましい。
【００１４】
反応及び測定の際に用いるセルとしては、光を照射でき、かつ吸光度の測定が可能なセルであればよく、例えば標準セル、ミクロセル等でよく、さらには検体量が少なくてもよいので多穴マイクロプレートも使用可能であり、９６穴プレート等も使用可能である。
【００１５】
遷移金属カルボニル錯体としては、光照射によりＣＯを発生する能力を有するカルボニル錯体であればよく、マンガン、鉄、コバルト、銅、ニッケル、亜鉛、ロジウム、パラジウム、白金、ルテニウム等の遷移金属のカルボニル錯体が挙げられ、マンガンカルボニル錯体、鉄カルボニル錯体、コバルトカルボニル錯体、銅カルボニル錯体、亜鉛カルボニル錯体、ルテニウムカルボニル錯体等が好ましい。具体的には、デカカルボニル二マンガン（ＤＭＤＣ）、トリカルボニルジクロロルテニウム等が挙げられ、ＤＭＤＣがＣＯ発生速度の点からより好ましい。
【００１６】
遷移金属カルボニル錯体の添加濃度は、ＣＯの発生速度、ＣＯの発生量の点から、検体に添加する遷移金属カルボニル錯体溶液の濃度として、１〜５０mMが好ましく、さらに１〜３０mMが好ましく、特に５〜３０mMが好ましく、２０mMが最も好ましく、検体に添加した後の終濃度として、１０〜５００μMが好ましく、さらに１０〜３００μMが好ましく、特に５０〜３００μMが好ましく、１８０〜２００μMが最も好ましい。また遷移金属カルボニル錯体の添加量は、終濃度がこれらの範囲内になればよく、量としては少ないほうが好ましく、例えば、２μL程度であるのが好ましい。なお、遷移金属カルボニル錯体は、水性溶液、例えば水溶液として用いるのが好ましい。
【００１７】
ステップ（ａ）は、室温の条件下で行うのが好ましい。
【００１８】
次に（ｂ）得られた検体に光照射して遷移金属カルボニル錯体からＣＯを発生させ、検体中のＰ４５０とＣＯとを反応させる。照射する光の波長は、遷移金属カルボニル錯体からＣＯを発生できる波長であればよく、通常蛍光灯白色光、白熱球、ＬＥＤ白色光等を用いることができるが、発熱がない点からＬＥＤ白色光が好ましい。
【００１９】
光の照射時間は、１〜１０分間で十分であり、２〜５分間がより好ましく、４分間が特に好ましい。用いる光の照度は２００００ｌｕｘ以上がより好ましい。
【００２０】
光照射により発生したＣＯは、検体液中で直ちにＰ４５０と反応するので、泡の発生等はほとんどない。
【００２１】
（ｃ）光照射後に４５０nmを含む波長の光の吸光度を測定する。
４５０nmを含む波長の光としては、４００〜５００nm程度の波長の光であればよく、例えば４２０〜４５０nm、４２０〜５００nm、４５０〜５００nm等の波長の光が挙げられる。
吸光度の測定は、通常の分光光度計及びマイクロプレートリーダーを用いて行うことができる。
【００２２】
ステップ（ｂ）及び（ｃ）も、室温で行うのが好ましい。
【００２３】
得られた吸光度に基づき、Ｐ４５０を含まない検体で測定した吸光度を基準として、検量線を作成しておき、検体中のＰ４５０濃度を算出することができる。
【００２４】
本発明は、Ｐ４５０と遷移金属カルボニル錯体を含有する溶液に光照射することを特徴とするＰ４５０へのＣＯ結合方法でもある。
【００２５】
本発明方法においては、ステップ（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を、全てマイクロプレート上で行うことができ、多数の少量検体中のＰ４５０濃度を同時に測定することができる。また、このとき、光照射の光源としてＬＥＤを用いれば、熱の発生がないので、安定した測定値が得られる。
【実施例】
【００２６】
次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明は何らこれに限定されるものではない。
【００２７】
実施例１
（Ａ）材料と方法
５週齢の雌性Sprague-Dawley（Ｃｒｌ：ＣＤ（ＳＤ））ラットを日本チャールズ・リバー株式会社から購入し、１週間の馴化検疫の後使用した。ラットは瀉血致死させて、直ちに開腹し、小腸を摘出した。小腸ミクロソームは以下の通り調製した。氷冷した０．９％ＮａＣｌ溶液で洗浄後、管腔側を０．１％プロテアーゼ阻害剤含有の５０mMＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（pH７．４）で洗った。スライドグラスで削ぎ取った管腔側の表面をＥＤＴＡバッファー（０．８％ＮａＣｌ、０．０２％ＫＣｌ、０．０２％ＫＨ2ＰＯ4、０．１１５％Ｎａ2ＨＰＯ4、１．５mM  ＥＤＴＡ・２Ｋ、０．５mM（±）ジチオスレイトール、０．１％プロテアーゼ阻害剤）中で洗浄後、８００ｇにて１０分間、４℃で遠心した。ホモゲナイズ溶液（５mMヒスチジン、２５０mMスクロース、０．５mM  ＥＤＴＡ・２Ｋ、０．１％プロテアーゼ阻害剤）で洗浄後、管腔上皮をその約１０倍量のホモゲナイズ溶液中でホモゲナイズした。この懸濁液を１０，０００ｇにて１０分間、４℃で遠心後、上清を１０５，０００ｇで６０分間、４℃で遠心した。この沈殿物を再び上記緩衝液に懸濁後、１０５，０００ｇにて６０分間遠心分離することによりミクロソーム画分を得た。２０％グリセリンを含む１００mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（pH７．４）で沈殿物を再懸濁した。小腸に続いて肝臓を摘出し、肝臓を細切後、その３倍量の１．１５％ＫＣｌを含む０．０１Ｍ  Ｎａ・Ｋ−リン酸バッファー（pH７．４）を加えてホモゲナイズした。この懸濁液を１０，０００ｇにて２０分間遠心分離し、さらにその上清を１０５，０００ｇにて６０分間遠心分離して沈殿物を得た。この沈殿物を再び上記緩衝液に懸濁後、１０５，０００ｇにて６０分間遠心分離することによりミクロソーム画分を得た。これらの操作は３−５℃で行った。ミクロソーム調製液のタンパク濃度は９６穴プレートを用いる方法におけるタンパク濃度の検討を除いて１００mMＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（pH７．４）で約２．０mg／mLに調製した。ＤＭＤＣ（Ｍｎ2（ＣＯ）10）はSigma-Aldrichより、ＣＯガス（純度９９．９％）はＧＬサイエンスより、タンパク測定キット（Pierce BCA Reagents）はThermo Fisher Scientificより購入した。他の試薬は最上級のものを和光純薬より購入した。
分光光度計はベックマン紫外可視分光解析システムＤＵ８００（BECKMAN COULTER）を、マイクロプレートリーダーはSpectra MAX（Molecular Devices）を使用した。
【００２８】
「大村と佐藤の方法」によるＰ４５０量の測定は、以下の手順で行った。ミクロソームの蛋白濃度を０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（pH７．４）で約２mg／mLに調製して、５mLずつ２つのセル（光路１cm）に分注し、一方のセルに底から一酸化炭素を約３０秒間通気した。続いて用時調製した０．５Ｍのハイドロサルファイトナトリウム（Ｎａ2Ｓ2Ｏ4）溶液（ＳＨＳ）１０μLを加え、直ちに４２０〜４９８nm間の吸収スペクトルを測定した。同様に、もう一方のセルにＳＨＳを加え、混合後４２０〜４９８nm間の吸収スペクトルを測定した。これらの４５０〜４９０nmにおける差吸収スペクトル（ΔA450-490nm）から、次式よりＰ４５０量を計算した。なお、次式のχはミクロソームのタンパク濃度を約２．０mg／mLに希釈する際の希釈倍率、９１は光路１cmにおける吸光係数である。
【００２９】
（数１）
Ｐ４５０濃度（μＭ）＝（ΔA450-490nm）×χ×１０００／９１
【００３０】
９６穴プレートを用いるＰ４５０量の測定は、以下の手順で行った。ミクロソーム溶液０．２mLずつを、還元Ｐ４５０用と還元Ｐ４５０−ＣＯ用に添加した。還元Ｐ４５０−ＣＯ用には、ミクロソーム溶液を添加したウェルに約５０℃の加温下でジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を用いて５〜４０mMに溶解したＤＭＤＣ溶液を２μL添加後、８００〜２００００luxと２００００lux以上の光度を、１〜２０分間光照射した。照射ボード（図１）はＬＥＤ−ｔａｐｅ−ｌｉｇｈｔ（ＳＭＤ５０５０ｔｙｐｅ、白）を使って作成した。２００００lux以下の光度は９６穴プレートと照射ボードの距離を調整した。９６穴プレートの真上に照射ボードを乗せた場合、光度は測定器の測定レンジを越えて測れなかったため＞２００００luxと表記した。ＳＨＳ１０μL添加後、４２０〜４９８nm間の吸収スペクトルを測定した。還元Ｐ４５０用にはＳＨＳ添加後、４２０〜４９８nm間の吸収スペクトルを測定した。
【００３１】
９６ウェル透明マイクロプレート（BD Falcon(登録商標)日本ベクトン・ディッキンソン株式会社）を用いた。ミクロソームタンパク濃度の検討ではタンパク濃度を０．２〜２．０mg／mLに調製した。ウェルの底から溶液添加時の液面までの高さは総溶液量（０．２１２mL）と任意の８ウェルの直径（６．２４±０．７７）から６．９３３mmと求めた。光路長１cmの時の吸光係数は９１cm-1mM-1であることから、９６穴プレートの吸光係数は６３cm-1mM-1と求められた。このことから、９６穴プレートを用いたＰ４５０濃度は次式から算出した。なお、次式のχはミクロソームのタンパク濃度を約２．０mg／mLに希釈する際の希釈倍率で、１検体につき２ウェルずつ測定した。
【００３２】
（数２）
Ｐ４５０濃度（μＭ）＝（ΔA450-490nm）×χ×１０００／６３
【００３３】
（Ｂ）結果
ＤＭＤＣと９６穴プレートを用いたＰ４５０濃度の測定法を検証した。Ｐ４５０−ＣＯ体の特徴である４５０nmにピークを持つ差吸収スペクトルは種々のＤＭＤＣ濃度において認められた（図２）。差吸収スペクトルは２０mM  ＤＭＤＣを２μL添加時に最大を示し、それ以上の濃度（２５〜４０mM）ではプラトーに達した（図３）。よって、ＤＭＤＣと９６穴プレートを用いたＰ４５０濃度の測定法におけるＤＭＤＣ濃度（検体に添加するＤＭＤＣ溶液の濃度）は２０mMが最適と考えられた。
【００３４】
２０mM  ＤＭＤＣを２μL添加後、９６穴プレートを４分間、８００、２４００、２００００luxまたは２００００lux以上の光を照射した時の差吸収スペクトルを示した（図４）。照射時間に関しては、ＤＭＤＣがＰ４５０と結合するＣＯを放出するには４分間で十分であると考えられた（図５）。さらに、ＤＭＤＣを用いる方法で得られた差吸収スペクトルの波形は、「大村と佐藤の方法」による吸収スペクトルと同じであることを確認した（図６）。
【００３５】
このことから、ＤＭＤＣを用いる方法は、ミクロソームタンパク濃度を約２mg／mLとし、２０mM  ＤＭＤＣを２μL添加後、照射ボードを９６穴プレートの真上に乗せて光照射時間を４分間とする条件とした。ラットの小腸ミクロソームが少なく２mg／mLに調製出来ないことを考慮し、各濃度に調製したラットの肝ミクロソーム（０．２、０．５、０．８、１．０、１．５、２．０mg／mL）を用いて差吸収スペクトルとミクロソームタンパク濃度との相関を検討した。その結果、図７に示したように０．２〜２．０mg／mLまで良好な相関が得られた。続いて、ラット肝ミクロソーム１２検体を用いてＤＭＤＣを用いた方法と従来法で得られた差吸収スペクトルとに差がないことを確認した（図８）。図中の直線は近似曲線を示し、相関係数はＲ＝０．８０５であった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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