(57)【要約】【課題】本発明は、βミオシン重鎖（β−ＭＨＣ）の発現を誘導し、骨格速筋収縮タンパク質遺伝子を抑制するマイクロＲＮＡである、ｍｉＲ−２０８の同定に関する。【解決手段】この機能の阻害は、心筋線維症、心肥大、および／または心不全の治療として提案され、この機能の増大は、筋骨格障害の治療における遅筋線維遺伝子の抑制および速筋線維遺伝子の活性化に用いることができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）心肥大、心不全、または心筋梗塞後リモデリングを有する患者を同定することと、
（ｂ）前記患者の心筋細胞におけるｍｉＲ−２０８の発現または活性を阻害することと
を含む、病的心肥大または心不全を治療する方法。
【請求項２】
前記阻害が、前記患者に、ｍｉＲ−２０８のｍｉＲＮＡアンタゴニストを投与することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記投与が、心筋組織への静脈内投与または直接注射を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記投与が、前記ｍｉＲ−２０８のｍｉＲＮＡアンタゴニストの経口投与、経皮投与、徐放投与、制御放出投与、遅延放出投与、坐薬投与、または舌下投与を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記患者に第２の心肥大治療剤を投与することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記第２の治療剤が、ベータ遮断剤、強心剤、利尿剤、ＡＣＥ−Ｉ、ＡＩＩアンタゴニスト、ＢＮＰ、Ｃａ＋＋遮断剤、およびエンドセリン受容体アンタゴニスト、またはＨＤＡＣ阻害剤からなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記第２の治療剤が、ｍｉＲ−２０８の阻害と同時に投与される、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記第２の治療剤が、ｍｉＲ−２０８の阻害前または阻害後に投与される、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記治療が、病的心肥大または心不全の１つ以上の症状を改善することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記治療が、心肥大から心不全への移行を遅延させることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記１つ以上の症状の改善が、運動能の向上、心駆出量の増大、左室拡張終期圧の低下、肺毛細血管楔入圧の低下、心拍出量または心係数の増大、肺動脈圧の低下、左室収縮終期径および左室拡張終期径の減少、左室壁応力および右室壁応力の低下、壁張力の低下、生活の質の向上、および疾患に関連する罹患率または死亡率の減少を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
（ａ）病的心肥大または心不全を発症する危険性のある患者を同定することと、
（ｂ）前記患者の心筋細胞におけるｍｉＲ−２０８の発現または活性を阻害することと
を含む、病的心肥大または心不全を予防する方法。
【請求項１３】
前記阻害が、前記患者に、ｍｉＲ−２０８のｍｉＲＮＡアンタゴニストを投与することを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記投与が、心筋組織への静脈内投与または直接注射を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記投与が、ｍｉＲ−２０８の経口投与、経皮投与、徐放投与、制御放出投与、遅延放出投与、坐薬投与、または舌下投与を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記危険性のある患者が、長期間持続するコントロール不良の高血圧、是正されない弁膜症、慢性狭心症、亜急性心筋梗塞、心疾患または病的心肥大の先天的素因を含む、危険因子のリストの１つ以上を示しうる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記危険性のある患者が、心肥大の遺伝的素因を有すると診断されうる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
前記危険性のある患者が、心肥大の家族歴を有しうる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１９】
その細胞が機能的なｍｉＲ−２０８を発現しない、トランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項２０】
前記哺乳動物がマウスである、請求項１９に記載のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項２１】
その細胞が、非ヒト哺乳動物の細胞において活性な異種プロモーターの制御下にあるｍｉＲ−２０８コード領域を含む、トランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項２２】
前記哺乳動物がマウスである、請求項２１に記載のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項２３】
前記プロモーターが、組織特異的なプロモーターである、請求項２１に記載のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項２４】
前記組織特異的なプロモーターが、筋特異的なプロモーターである、請求項２３に記載のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項２５】
前記組織特異的なプロモーターが、心筋特異的なプロモーターである、請求項２３に記載のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項２６】
ネイティブなｍｉＲ−２０８対立遺伝子の一方または両方を欠く、トランスジェニック非ヒト哺乳動物細胞。
【請求項２７】
前記ネイティブなｍｉＲ−２０８対立遺伝子の両方を欠く、請求項２６に記載の細胞。
【請求項２８】
前記対象の心筋細胞におけるｍｉＲ−２０８の発現または活性を阻害することを含む、心筋梗塞を治療する方法。
【請求項２９】
前記対象の心筋細胞におけるｍｉＲ−２０８の発現または活性を阻害することを含む、心肥大および拡張型心筋症を予防する方法。
【請求項３０】
前記対象の心筋細胞におけるｍｉＲ−２０８の発現または活性を阻害することを含む、心肥大の進行を阻害する方法。
【請求項３１】
心不全または心肥大を有する対象の心筋細胞におけるｍｉＲ−２０８の発現または活性を阻害することを含む、前記対象における運動耐容能を増大させる方法。
【請求項３２】
心不全または心肥大を有する対象の心筋細胞におけるｍｉＲ−２０８の発現または活性を阻害することを含む、前記対象における入院期間を短縮する方法。
【請求項３３】
心不全または心肥大を有する対象の心筋細胞におけるｍｉＲ−２０８の発現または活性を阻害することを含む、前記対象における生活の質を向上させる方法。
【請求項３４】
心不全または心肥大を有する対象の心筋細胞におけるｍｉＲ−２０８の発現または活性を阻害することを含む、前記対象における罹患率を減少させる方法。
【請求項３５】
心不全または心肥大を有する対象の心筋細胞におけるｍｉＲ−２０８の発現または活性を阻害することを含む、前記対象における死亡率を減少させる方法。
【請求項３６】
（ａ）筋骨格障害を有するまたはその危険性のある患者を同定することと、
（ｂ）前記患者の骨格筋細胞におけるｍｉＲ−２０８の発現および／または活性を増加させることと
を含む、対象における筋骨格障害を治療または予防する方法。
【請求項３７】
前記障害が、非活動性委縮、抗重力または脱神経に応じた筋消耗からなる群から選択される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記ｍｉＲ−２０８の発現および／または活性を増加させることが、前記対象にｍｉＲ−２０８を投与することを含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
前記ｍｉＲ−２０８の発現および／または活性を増加させることが、前記対象にｍｉＲ−２０８を発現する発現ベクターを投与することを含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
前記発現ベクターが、ウイルス発現ベクターである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記ウイルス発現ベクターが、アデノウイルス発現ベクターである、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記発現ベクターが、非ウイルス発現ベクターである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４３】
前記非ウイルス発現ベクターが、脂質媒体内に含まれる、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記ｍｉＲ−２０８が、脂質媒体内に含まれる、請求項３８に記載の方法。
【請求項４５】
非ｍｉＲ−２０８療法をさらに含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項４６】
（ａ）細胞を候補化合物に接触させることと、
（ｂ）ｍｉＲ−２０８の活性または発現を評価することと、
（ｃ）工程（ｂ）における前記活性または発現を、前記候補化合物の不在下における活性または発現と比較することと、
を含み、測定した前記活性または発現の間の差から、前記候補化合物はｍｉＲ−２０８の調節物質であることが示唆される、ｍｉＲ−２０８の調節物質を同定する方法。
【請求項４７】
細胞を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて前記候補化合物と接触させる、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
細胞を、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて前記候補化合物と接触させる、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
前記ｍｉＲ−２０８の調節物質が、ｍｉＲ−２０８のアゴニストである、請求項４６に記載の方法。
【請求項５０】
前記ｍｉＲ−２０８の調節物質が、ｍｉＲ−２０８のアンタゴニストである、請求項４６に記載の方法。
【請求項５１】
前記候補化合物が、ペプチド、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、または小分子である、請求項４６に記載の方法。
【請求項５２】
前記ｍｉＲ−２０８の活性または発現を評価することが、ｍｉＲ−２０８の発現を評価することを含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項５３】
前記ｍｉＲ−２０８の発現を評価することが、ノーザンブロット法またはＲＴ−ＰＣＲ法を含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記ｍｉＲ−２０８の活性または発現を評価することが、ｍｉＲ−２０８の活性を評価することを含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項５５】
前記ｍｉＲ−２０８の活性を評価することが、ｍｉＲ−２０８によって調節される遺伝子の発現または活性を評価することを含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記ｍｉＲ−２０８によって調節される遺伝子が、βミオシン重鎖である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記ｍｉＲ−２０８によって調節される遺伝子が、骨格速筋タンパク質遺伝子である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５８】
前記骨格速筋タンパク質遺伝子が、心筋細胞におけるトロポニンＩ、トロポニンＴ３、ミオシン軽鎖、またはアルファ骨格筋アクチンである、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記ｍｉＲ−２０８の活性を評価することが、βミオシン重鎖発現レベルに対するαミオシン重鎖発現レベルの比率を評価することを含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項６０】
前記ｍｉＲ−２０８の機能または発現の阻害剤を含む、医薬組成物。
【請求項６１】
前記阻害剤が、ｍｉＲ−２０８に対する相同性を有する核酸である、請求項６０に記載の医薬組成物。
【請求項６２】
（ａ）心肥大または心不全を有する患者を同定することと、
（ｂ）前記患者にｍｉＲ−２０８阻害剤を投与することと
を含む、病的心肥大または心不全を治療する方法。
【請求項６３】
（ａ）病的筋線維症の危険性のある患者を同定することと、
（ｂ）前記患者にｍｉＲ−２０８阻害剤を投与することと
を含む、患者における筋線維症を予防する方法。
【請求項６４】
前記病的線維症が、肝線維症、肺線維症、腎線維症、心筋線維症、または糖尿病性線維症である、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
（ａ）筋骨格障害を有するか、または、筋骨格障害を発症する危険性のある患者を同定することと、
（ｂ）前記患者にｍｉＲ−２０８アゴニストを投与することと
を含む、筋骨格障害を治療する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
本発明は、米国立衛生研究所からの助成第ＨＬ５３３５１−０６号下における助成支援によりなされた。米国政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００２】
本出願は、参照によりその全内容が本明細書に組み込まれる、２００６年８月１日付の米国特許仮出願第６０／８３４，６６７号、２００７年７月３１日付の同第６０／９５２，９１１号、および２００７年７月３１日付の同第６０／９５２，９１７号に対する優先権の利益を請求する。
【０００３】
１．発明の分野
本発明は、一般に、発生生物学および分子生物学の分野に関する。より詳細には、本発明は、心筋細胞および骨格筋細胞における遺伝子調節および細胞生理学に関する。具体的には、本発明は、βミオシン重鎖（β−ＭＨＣ）の発現を低下させ、これにより心肥大および心不全を治療する、ｍｉＲＮＡの阻害に関する。また、このｍｉＲＮＡのアップレギュレーションにより、筋骨格疾患を治療することも意図する。
【背景技術】
【０００４】
２．関連する技術分野の記載
心臓にかかるストレスの増大に応答した心肥大は、基本的な適応機構である。それは、神経刺激、内分泌刺激、もしくは機械的刺激のいずれか、またはこれらの組合せの結果としての、（細胞数ではなく）細胞サイズおよび細胞重量の量的な増大を反映する特殊な過程である。心肥大に関与する別の因子である高血圧は、うっ血性心不全の頻繁な前駆形態である。心不全が生じると、通常、左室が肥大し、拡張し、駆出率などの収縮機能指数が低下する。明らかに、心肥大による応答は、複雑な一群の症候であり、心肥大をもたらす経路の解明は、各種の刺激から生じる心疾患の治療において有益となる。
【０００５】
病的心筋肥大は、心筋細胞タンパク質の増加、および初期胚発生を思わせる遺伝子プロファイルの発現を特徴とする。具体的には、βミオシン重鎖（β−ＭＨＣ）、骨格筋αアクチン（ｓＡＣＴ）、ならびに心房性ナトリウム利尿ペプチドおよび脳ナトリウム利尿ペプチド（それぞれ、ＡＮＰおよびＢＮＰ）の両方の発現が増加する一方、成体の心筋特異的遺伝子であるαミオシン重鎖（α−ＭＨＣ）および筋小胞体Ｃａ２＋−ＡＴＰアーゼ（ＳＥＲＣＡ）の発現が低下する。特に、ヒトの心不全の病理におけるＭＨＣアイソフォーム発現の変化の役割を示す説得力ある証拠が存在する。実際、α−ＭＨＣ  ｍＲＮＡレベルおよび同タンパク質レベルは、ヒト不全心（failing human heart)において顕著に低下し、ベータ遮断剤療法による左室駆出率の改善は、α−ＭＨＣ発現の正常化と関連する。加えて、ヒトα−ＭＨＣ遺伝子における変異が、肥大型心筋症と関連することが同定され、このことは、その存在量の低さにもかかわらず、α−ＭＨＣの発現レベルが、正常な心機能にとって極めて重要であることを示す。したがって、α−ＭＨＣおよびβ−ＭＨＣのいずれもが、心肥大の発症において役割を果たすことは明らかであるが、これらの産物が該病態を作り出し、かつ／または維持する際に働く正確な特徴は、不明のままである。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
したがって、本発明によれば、一実施形態において、ｍｉＲ−２０８の発現または活性の調節物質を心筋細胞に投与することを含む、心収縮性および心リモデリングを調節する方法が提供される。一実施形態では、ｍｉＲ−２０８の発現または活性の調節物質を心筋細胞に投与することを含む、心収縮タンパク質遺伝子の発現を調節する方法が提供される。該調節物質は、ｍｉＲ−２０８発現または活性のアゴニストであってもよく、またはアンタゴニストであってもよい。本発明の特定の態様では、ｍｉＲ−２０８の発現または活性の阻害剤を心筋細胞に投与することを含む、心筋細胞におけるβ−ＭＨＣの発現を低下させる方法が提供される。本発明の他の態様では、内因性ｍｉＲ−２０８の発現もしくは活性を増加させること、または外因性ｍｉＲ−２０８を心筋細胞に投与することを含む、心筋細胞におけるβ−ＭＨＣの発現を増加させる方法が提供される。本発明の一態様では、ｍｉＲ−２０８の発現または活性の阻害剤を心筋細胞に投与することを含む、心筋細胞における骨格速筋収縮タンパク質遺伝子の発現を増加させる方法が提供される。本発明の別の態様では、内因性ｍｉＲ−２０８の発現もしくは活性を増加させること、または外因性ｍｉＲ−２０８を心筋細胞に投与することを含む、心筋細胞における骨格速筋収縮タンパク質遺伝子の発現を低下させる方法が提供される。本発明の方法に従って増大または減少させることができる骨格速筋収縮タンパク質遺伝子の例には、骨格筋トロポニンＩ、トロポニンＴ３、ミオシン軽鎖、または骨格筋αアクチンがある。
【０００７】
一実施形態において、本発明は、心肥大、心不全、または心筋梗塞後リモデリングを有する患者を同定することと、該患者の心筋細胞におけるｍｉＲ−２０８の発現または活性を阻害することとを含む、病的心肥大または心不全を治療する方法を提供する。別の実施形態では、病的心肥大または心不全を発症する危険性のある患者を同定することと、該患者の心筋細胞におけるｍｉＲ−２０８の発現または活性を阻害することとを含む、病的心肥大または心不全を予防する方法が提供される。
【０００８】
一実施形態において、本発明は、前記対象の心筋細胞におけるｍｉＲ−２０８の発現または活性を阻害することを含む、心筋梗塞を治療する方法を提供する。別の実施形態において、本発明は、前記対象の心筋細胞におけるｍｉＲ−２０８の発現または活性を阻害することを含む、心肥大および拡張型心筋症を予防する方法を提供する。さらに別の実施形態において、本発明は、前記対象の心筋細胞におけるｍｉＲ−２０８の発現または活性を阻害することを含む、心肥大の進行を阻害する方法を提供する。特定の実施形態において、本発明は、心不全または心肥大を有する対象の心筋細胞におけるｍｉＲ−２０８の発現または活性を阻害することを含む、該対象における運動耐容能（exercise tolerance）を増大させ、入院期間を短縮し、生活の質を向上させ、罹患率を減少させ、かつ／または死亡率を減少させる方法を提供する。本発明の他の態様では、病態下において、ｍｉＲ−２０８の阻害剤を投与することにより、心筋細胞におけるα−ＭＨＣ発現を増加させる方法が提供される。
【０００９】
本発明の特定の態様において、ｍｉＲ−２０８の発現または活性の阻害は、ｍｉＲ−２０８のｍｉＲＮＡアンタゴニストを投与することを含む。一実施形態において、本発明は、ｍｉＲ−２０８のｍｉＲＮＡアンタゴニストを提供する。ｍｉＲ−２０８の発現または活性のｍｉＲＮＡアンタゴニストまたは他の調節物質の投与は、当業者に知られ、標的となる器官、組織、または細胞への送達に適する任意の方法により行ってよい。例えば、本発明の特定の態様において、ｍｉＲ−２０８の調節物質は、静脈内注射、動脈内注射、心膜内注射、または組織（例えば、心筋組織、骨格筋組織）への直接注射により投与してよい。一部の態様において、投与することは、ｍｉＲ−２０８の経口投与、経皮投与、腹腔内投与、皮下投与、徐放投与、制御放出投与、遅延放出投与、坐薬投与、または舌下投与を含む。
【００１０】
本発明の特定の態様において、患者における病的心肥大または心不全の治療または予防は、患者に第２の心肥大治療剤（cardiac hypertrophic therapy）を投与することをさらに含む。第２の治療剤は、例えば、ベータ遮断剤、強心剤、利尿剤、ＡＣＥ−Ｉ、ＡＩＩアンタゴニスト、ＢＮＰ、Ｃａ＋＋遮断剤、およびＥＲＡ、またはＨＤＡＣ阻害剤でよい。前記第２の治療剤は、ｍｉＲ−２０８の阻害前、阻害と同時、または阻害後に投与してよい。
【００１１】
病的心肥大または心不全の治療とは、病的心肥大または心不全の１つ以上の症状を改善することであると定義してよい。症状の改善は、例えば、運動能の向上、心駆出量（cardiac ejection volume）の増大、左室拡張終期圧の低下、肺毛細血管楔入圧の低下、心拍出量または心係数の増大、肺動脈圧の低下、左室収縮終期径および左室拡張終期径の減少、左室壁応力および右室壁応力の低下、壁張力の低下、生活の質の向上、および疾患に関連する罹患率または死亡率の減少でありうる。病的心肥大の治療とは、心肥大から心不全への移行を遅延させることであると定義してもよい。
【００１２】
本発明の特定の実施形態では、病的心肥大または心不全を発症する危険性のある患者における病的心肥大または心不全を予防する方法が提供される。病的心肥大または心不全を発症する危険性のある患者は、例えば、長期間持続するコントロール不良の（uncontrolled）高血圧、是正されない弁膜症、慢性狭心症、亜急性心筋梗塞、心疾患または病的心肥大の先天的素因を含む、１つ以上の危険因子を示しうる。特定の態様において、危険性のある患者は、心肥大への遺伝的素因を有すると診断されうる。本発明の一部の態様において、危険性のある患者は、心肥大の家族歴を有しうる。
【００１３】
一実施形態において、本発明は、ｍｉＲ−２０８を骨格筋細胞に投与することを含む、骨格筋細胞における骨格速筋収縮タンパク質遺伝子の発現または活性を低下させる方法を提供する。一実施形態において、本発明は、筋骨格障害を有するまたはその危険性のある患者を同定することと、前記患者の骨格筋細胞におけるｍｉＲ−２０８の発現および／または活性を増加させることとを含む、対象における筋骨格障害を治療または予防する方法を提供する。筋骨格障害は、例えば、非活動性委縮、抗重力または脱神経に応じた筋消耗でありうる。本発明の特定の態様において、筋骨格障害を治療または予防する方法は、第２の非ｍｉＲ−２０８治療剤を投与することをさらに含む。
【００１４】
ｍｉＲ−２０８の発現および／または活性を増加させることは、対象にｍｉＲ−２０８を投与すること、または、対象にｍｉＲ−２０８を発現する発現ベクターを投与することを含んでよい。発現ベクターは、ウイルス発現ベクターである。ウイルス発現ベクターは、例えば、アデノウイルス発現ベクターまたはレトロウイルス発現ベクターでよい。特定の態様において、発現ベクターは、非ウイルス発現ベクターである。本発明の特定の態様において、ｍｉＲ−２０８またはｍｉＲ−２０８をコードする発現ベクターは、脂質媒体に関連する。あるいは、単に、ｍｉＲ−２０８そのものを、場合によって、リポソームまたはナノ粒子などの送達媒体内に含まれた形で提供してもよい。ｍｉＲ−２０８が心臓特異的であるという事実は、他の器官における望ましくない副作用を防止するであろう。
【００１５】
一実施形態において、本発明は、（ａ）細胞を候補化合物に接触させることと、ｍｉＲ−２０８の活性または発現を評価することと、（ｂ）工程（ａ）における活性または発現を、候補化合物の不在下における活性または発現と比較することとを含み、測定した活性または発現の間の差から、候補化合物がｍｉＲ−２０８の調節物質であることが示唆される、ｍｉＲ−２０８の調節物質を同定する方法を提供する。本発明の特定の態様では、細胞を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて候補化合物と接触させる。本発明の他の態様では、細胞を、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて候補化合物と接触させる。ｍｉＲ−２０８の調節物質は、ｍｉＲ−２０８のアゴニストでもよく、またはアンタゴニストでもよい。本発明の方法に従ってスクリーニングしうる候補化合物の非限定的な例は、ペプチド、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、または小分子である。
【００１６】
ｍｉＲ−２０８の活性または発現を評価することは、ｍｉＲ−２０８の発現レベルを評価することを含んでよい。当業者は、例えば、ノーザンブロット法またはＲＴ−ＰＣＲ法を含めて、ＲＮＡ発現レベルを評価する各種の方法に精通しているであろう。ｍｉＲ−２０８の活性または発現を評価することは、ｍｉＲ−２０８の活性を評価することを含んでよい。一部の実施形態において、ｍｉＲ−２０８の活性を評価することは、ｍｉＲ−２０８によって調節される遺伝子の発現または活性を評価することを含む。ｍｉＲ−２０８によって調節される遺伝子には、例えば、αミオシン重鎖遺伝子およびβミオシン重鎖遺伝子、ならびに、骨格速筋トロポニンＩ遺伝子、同トロポニンＴ３遺伝子、同ミオシン軽鎖遺伝子、およびアルファ骨格筋アクチン（alpha skeletal actin)遺伝子など、骨格速筋タンパク質遺伝子がある。本発明の特定の態様において、ｍｉＲ−２０８の活性を評価することは、βミオシン重鎖の発現レベルに対するαミオシン重鎖の発現レベルの比率を評価することを含む。当業者は、ｍｉＲ−２０８によって調節される遺伝子の活性または発現を評価する各種の方法に精通しているであろう。このような方法は、例えば、ノーザンブロット法、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＥＬＩＳＡ法、またはウェスタンブロット法を含む。
【００１７】
一実施形態において、本発明は、（ａ）細胞を候補化合物に接触させることと、ｍｉＲ−２０８の活性または発現を評価することと、（ｂ）工程（ｂ）における活性または発現を候補化合物の不在下における活性または発現と比較することであって、測定した活性または発現の間の差が、候補化合物はｍｉＲ−２０８の調節物質であることを示すこととを含む方法により同定される、ｍｉＲ−２０８の調節物質を提供する。ｍｉＲ−２０８の調節物質は、本発明の方法による、心障害および／または筋骨格障害治療用の医薬組成物中に含まれうる。
【００１８】
別の実施形態において、本発明は、（ａ）細胞を候補化合物に接触させることと、（ｂ）ｍｉＲ−２０８の活性または発現を評価することと、（ｃ）工程（ｂ）における活性または発現を、候補化合物の不在下における活性または発現と比較することとを含み、候補化合物の不在下における細胞の活性または発現と比較して、候補化合物と接触させた細胞における活性または発現の低下から、候補化合物がｍｉＲ−２０８の阻害剤であることが示唆される方法により同定される、ｍｉＲ−２０８の阻害剤を提供する。
【００１９】
一実施形態において、本発明は、心肥大または心不全を有する患者を同定することと、該患者にｍｉＲ−２０８阻害剤を投与することとを含む、病的心肥大または心不全を治療する方法を提供する。本発明の特定の態様において、ｍｉＲ−２０８阻害剤は、（ａ）細胞を候補化合物に接触させることと、（ｂ）ｍｉＲ−２０８の活性または発現を評価することと、（ｃ）工程（ｂ）における活性または発現を、候補化合物の不在下における活性または発現と比較することとを含み、候補化合物の不在下における細胞の活性または発現と比較して、候補化合物と接触させた細胞におけるｍｉＲ−２０８の活性または発現の低下から、候補化合物がｍｉＲ−２０８の阻害剤であることが示唆される方法により同定することができる。
【００２０】
別の実施形態において、本発明は、筋骨格障害を有するかまたは筋骨格障害を発症する危険性のある患者を同定することと、該患者にｍｉＲ−２０８アゴニストを投与することとを含む、筋骨格障害を治療する方法を提供する。本発明の特定の態様において、ｍｉＲ−２０８アゴニストは、（ａ）細胞を候補化合物に接触させることと、（ｂ）ｍｉＲ−２０８の活性または発現を評価することと、（ｃ）工程（ｂ）における活性または発現を、候補化合物の不在下における活性または発現と比較することとを含み、候補化合物の不在下における細胞の活性または発現と比較して、候補化合物と接触させた細胞におけるｍｉＲ−２０８の活性または発現の増加から、候補化合物がｍｉＲ−２０８のアゴニストであることが示唆される方法により同定することができる。
【００２１】
一実施形態において、本発明は、その細胞が機能的なｍｉＲ−２０８を発現しない、トランスジェニック非ヒト哺乳動物を提供する。別の実施形態において、本発明は、その細胞が、非ヒト哺乳動物の細胞において活性な異種プロモーターの制御下にあるｍｉＲ−２０８コード領域を含む、トランスジェニック非ヒト哺乳動物を提供する。トランスジェニック哺乳動物は、例えば、マウスまたはラットでよい。プロモーターは、例えば、骨格筋特異的なプロモーターまたは心筋特異的なプロモーターなどの組織特異的なプロモーターでよい。特定の実施形態において、本発明は、ネイティブな(native）ｍｉＲ−２０８対立遺伝子の一方または両方を欠く、トランスジェニック非ヒト哺乳動物細胞を提供する。
【００２２】
特許請求の範囲および／または明細書における「含む」という用語と組み合わせて用いられる場合の「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」という語の使用は、「１つの（ｏｎｅ）」を意味することもあるが、また、「１つ以上の」、「少なくとも１つの」、および「１つまたは１つを超える」の意味とも矛盾しない。
【００２３】
本明細書に記載の任意の実施形態は、本発明の任意の方法または組成物について実行することができ、その逆もあてはまることが意図される。さらに、本発明の組成物およびキットを用いて、本発明の方法を達成することができる。
【００２４】
本出願を通して、「約」という用語は、ある値が、その値を決定するのに用いられる機器または方法の誤差の標準偏差を含むことを示すのに用いられる。
【００２５】
本開示は、代替物のみを指す定義、ならびに「および／または」を支持するが、特許請求の範囲における「または」という用語の使用は、代替物のみを指すことが明示されているか、または、代替物が相互に排他的であるのでない限り、「および／または」を意味するのに用いられる。
【００２６】
本明細書および（１つ以上の）請求項で用いられる「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」（ならびに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」など、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」の任意の形態）、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」（ならびに「有する（ｈａｖｅ）」および「有する（ｈａｓ）」など、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」の任意の形態）、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」（ならびに「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」および「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」など、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」の任意の形態）、または「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」（ならびに「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」および「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」など、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」の任意の形態）という語は、包括的または非制限的であり、列挙されていない追加のエレメントまたは方法の工程を排除しない。
【００２７】
本発明の他の目的、特徴、および利点は、以下の詳細な説明から明らかとなるであろう。しかし、詳細な説明および具体的な実施例は、本発明の具体的な実施形態を示す一方、この詳細な説明から、本発明の意図および範囲内における各種の変更および改変が当業者に明らかとなるため、例示を目的として示すに過ぎないことを理解されたい。
【００２８】
以下の図面は、本明細書の一部をなし、本発明の特定の態様をさらに示す目的で含められる。本発明は、本明細書に記載の具体的な実施形態の詳細な説明と組み合わせて、これらの図面の１つ以上を参照することにより、よりよく理解できる。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】ｍｉＲ−２０８が、心臓のα−ＭＨＣ遺伝子に含有されることを示す図である。ｍｉＲ−２０８は、αＭＨＣ遺伝子のイントロン２７によりコードされる。星印は、配列の保存を示す。
【図２】ｍｉＲ−２０８が、α−ＭＨＣと同じ発現パターンを有することを示す図である。成体マウス組織のノーザンブロット解析によるｍｉＲ−２０８転写物の検出を示す。Ｕ６  ｍＲＮＡは、ローディング対照（loading control)として役立てる。
【図３】甲状腺ホルモンによるｍｉＲ−２０８発現の調節を示す図である。（図３Ａ）ＰＴＵ／Ｔ３によるαＭＨＣおよびβＭＨＣの調節のダイアグラムを示す図である。（図３Ｂ）１週間にわたり、Ｔ３の存在および不在下においてＰＴＵでラットを処置し、リアルタイムＰＣＲ法により、αＭＨＣ  ｍＲＮＡおよびβＭＨＣ  ｍＲＮＡを検出したことを示す図である。（図３Ｃ）表示の通り、１週間にわたり、ＰＴＵまたはＰＴＵ＋Ｔ３でラットを処置し、ノーザンブロット法により、ｍｉＲ−２０８の発現を検出したことを示す図である。各条件下において、４匹の動物から得た心臓を解析した。
【図４】α−ＭＨＣ発現の阻害が、ｍｉＲ−２０８レベルの低下をもたらすことを示す図である。（図４Ａ）第０、第３、第６、第９、第１２、第１５、第１８、および第２１日におけるαＭＨＣ転写物及びβＭＨＣ転写物の相対発現レベルを示す図である（図４Ｃ）ＰＴＵ処置時の表示の時点における、ラット心筋組織におけるｍｉＲ−２０８のノーザンブロット解析を示す図である。
【図５】ｍｉＲ−２０８遺伝子のノックアウトを示す図である。（図５Ａ）相同組換えにより、ｍｉＲ−２０８変異マウスを産生する戦略を示す図である。ｍｉＲＮＡ前駆体配列は、ｌｏｘＰ部位で挟まれたネオマイシン耐性カセット（Ｎｅｏ）により置換した。ネオマイシンカセットは、ＣＡＧ−Ｃｒｅ導入遺伝子を有するトランスジェニックマウスとの異型接合マウスを交配することにより、マウス生殖系列において除去した。ＤＴＡ：ジフテリアトキシンＡ。（図５Ｂ）野生型（ＷＴ）マウスおよびｍｉＲ−２０８変異（ＫＯ）マウスから得た心臓のノーザンブロット解析による、ｍｉＲ−２０８転写物の検出を示す図である。
【図６】ｍｉＲ−２０８の欠失が、α−ＭＨＣ発現を変更しないことを示す図である。（図６Ａ）表示された遺伝子型のマウス心臓のＲＮＡに基づくＲＴ−ＰＣＲ法によるαＭＨＣ転写物の解析を示す図である。αＭＨＣエクソンに関連するプライマーの位置を示し、各試料セットの上部にプライマー対を記す。（図６Ｂ）表示された遺伝子型の新生マウス心臓におけるａＭＨＣタンパク質レベルおよびｂＭＨＣタンパク質レベルのウェスタンブロット解析を示す図である。各遺伝子型につき２匹ずつのマウスを解析した。グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）を、ローディング対照として検出した。
【図７】ｍｉＲ−２０８ノックアウトマウスにおける骨格速筋遺伝子のアップレギュレーションを示す図である。
【図８】ｍｉＲ−２０８ノックアウトマウスにおける心臓ストレス応答遺伝子の調節異常を示す図である。
【図９】心臓遺伝子調節におけるｍｉＲ−２０８の役割に関するモデルを示す図である。αＭＨＣ遺伝子は、ｍｉＲ−２０８をコードし、これが、ＴＨＲＡＰ１および骨格筋遺伝子（またおそらくは、さらなる標的）の発現を負に調節する。αＭＨＣ遺伝子とβＭＨＣ遺伝子とは関連し、ｍｉＲ−２０８は、ストレスシグナル伝達、およびＰＴＵによるＴ３シグナル伝達に対する遮断に応じる、βＭＨＣのアップレギュレーションに必要とされる。αＭＨＣおよびβＭＨＣは、それぞれ、速い収縮性および遅い収縮性を促進する。
【図１０】ヒト心臓試料：非不全心と不全心との対比を示す図である。
【図１１】ｍｉＲ−２０８の予測標的としてのＴＨＲＡＰ１を示す図である。ＴＨＲＡＰ１の３’ＵＴＲにおける推定ｍｉＲ−２０８結合部位の配列アライメントは、高レベルの相補性および配列保存を示す。
【図１２】３’ＵＴＲ  ＴＨＲＡＰ１のルシフェラーゼアッセイを示す図である。
【図１３】ｍｉＲ−２０８変異マウスの心臓における骨格速筋遺伝子のアップレギュレーションを示す図である。
【図１４】ＴＡＢ後における野生型動物およびｍｉＲ−２０８−／−動物の解析を示す図である。（図１４Ａ）疑似手術（sham operation)またはＴＡＢの後２１日間にわたり、αＭＨＣ  ｍＲＮＡ発現を野生型マウスおよびｍｉＲ−２０８−／−マウスにおけるリアルタイムＰＣＲ法により検出したことを示す図である。（図１４Ｂ）ｍｉＲ−２０８が、野生型マウスおよびｍｉＲ−２０８−／−マウスから得た心筋組織に対するノーザンブロット法により検出されたことを示す図である。（図１４Ｃ）心エコー解析が、ＴＡＢに応じて、ｍｉＲ−２０８−／−および野生型の同腹子（littermate）のいずれにおいても、収縮期左室内径（ＬＶＩＤｓ）の増大による左室内径短縮率の低下を示した図である。ＴＡＢ後の収縮期（ｓ）または拡張期（ｄ）における前壁厚および後壁厚（ＡＷ厚およびＰＷ厚）は、野生型動物と比べて、ｍｉＲ−２０８−／−動物における肥大性応答の鈍化を示す（１群当たり、ｎ＝５〜７）。＊：対応する野生型群と比べて、ｐ＜０．０５。（図１４Ｄ）野生型マウスおよびｍｉＲ−２０８トランスジェニックマウスから得た心臓に対するノーザンブロット解析による、ｍｉＲ−２０８転写物の検出を示す図である。（図１４Ｅ）αＭＨＣ、βＭＨＣ、ＡＮＦおよびＢＮＰの転写物が、表示された遺伝子型から得た心臓におけるリアルタイムＰＣＲ法により検出されたことを示す図である。値は、野生型マウスと比べた発現の倍数増加（±ＳＥＭ）として表される（ｎ＝３）。
【図１５】ｍｉＲ−２０８−／−マウスが、圧負荷（persssure overload）に応じた心肥大の低下を示す図である。（図１５Ａ）マッソントリクロームで染色した野生型マウスおよびｍｉＲ−２０８−／−マウスの心臓の組織学的切片を示す図である。ｍｉＲ−２０８の不在は、２１日間にわたりＴＡＢを受けた野生型マウスに見られた肥大および線維症を軽減する。スケールバーは、上パネルでは２ｍｍに等しく、下パネルでは２０μｍに等しい。（図１５Ｂ）βＭＨＣ、ＡＮＦ、およびＢＮＰの転写物が、疑似手術またはＴＡＢ後の野生型マウスおよびｍｉＲ−２０８−／−マウスから得た心臓におけるリアルタイムＰＣＲ法により検出されたことを示す図である。値は、疑似手術を受けた野生型マウスと比べた発現の倍数増加（±ＳＥＭ）として表される（ｎ＝３）。（図１５Ｃ）疑似手術およびＴＡＢ後２１日での成体野生型マウスおよびｍｉＲ−２０８変異マウスにおけるαＭＨＣタンパク質レベルおよびβＭＨＣタンパク質レベルのウェスタンブロット解析を示す図である。（図１５Ｄ）マッソントリクロームで染色した、カルシニューリン導入遺伝子（ＣｎＡ−Ｔｇ）を発現する６週齢マウスの心臓と、ｍｉＲ−２０８−／−；ＣｎＡ−Ｔｇマウスの心臓との組織学的切片を示す図である。ｍｉＲ−２０８の不在は、ＣｎＡ−Ｔｇマウスにおいて見られる肥大および線維症を軽減する。スケールバーは、上パネルでは２ｍｍに等しく、下パネルでは２０μｍに等しい。（図１５Ｅ）βＭＨＣ、ＡＮＦ、およびＢＮＰの転写物が、表示された遺伝子型から得た心臓におけるリアルタイムＰＣＲ法により検出されたことを示す図である。値は、野生型マウスと比べた発現の倍数増加（±ＳＥＭ）として表される（ｎ＝３）。（図１５Ｆ）ＣｎＡ導入遺伝子を有するおよび有さない、成体野生型マウスおよびｍｉＲ−２０８変異マウスにおける、αＭＨＣタンパク質レベルおよびβＭＨＣタンパク質レベルのウェスタンブロット解析を示す図である。（図１５Ｇ）成体野生型動物およびｍｉＲ−２０８トランスジェニック動物における、αＭＨＣタンパク質レベルおよびβＭＨＣタンパク質レベルのウェスタンブロット解析を示す図である。
【図１６】ＰＴＵ処置後における野生型動物およびｍｉＲ−２０８−／−動物の解析を示す図である。（図１６Ａ）ｍｉＲ−２０８が、ＰＴＵ処置後における野生型マウスおよびｍｉＲ−２０８−／−マウスから得た心筋組織に対するノーザンブロット法により検出されたことを示す図である。（図１６Ｂ）拡張期（ｄ）および収縮期（ｓ）の両方における左室内径（ＬＶＩＤ）の増大、ならびに、左室前壁および後壁（ＡＷおよびＰＷ）の菲薄化により、野生型マウスおよびｍｉＲ−２０８−／−マウスにおいて、ＰＴＵに応じた心拍数（ＨＲ）および左室内径短縮率（ＦＳ）の同等の低下を示すことを、心エコー解析が示した図である（ｎ＝６）。＊：対応する野生型群と比べて、ｐ＜０．０５。（図１６Ｃ）ＡＮＦおよびＢＮＰの転写物が、ＰＴＵ処置後における野生型マウスおよびｍｉＲ−２０８−／−マウスから得た心臓におけるリアルタイムＰＣＲ法により検出されたことを示す図である。値は、通常の食餌を受けた野生型マウスと比べた発現の−倍数増加（±ＳＥＭ）として表される（ｎ＝３）。
【図１７】ｍｉＲ−２０８によるβＭＨＣ遺伝子の甲状腺ホルモン応答性の調節を示す図である。（図１７Ａ）ＰＴＵ処置後のベースラインおよび２週間後における、野生型マウスおよびｍｉＲ−２０８変異マウスにおけるαＭＨＣ発現およびβＭＨＣ発現のウェスタンブロット解析を示す図である。（図１７Ｂ）αＭＨＣおよびβＭＨＣの転写物が、ＰＴＵ処置後における野生型マウスおよびｍｉＲ−２０８−／−マウスから得た心臓におけるリアルタイムＰＣＲ法により検出されたことを示す図である。値は、通常の食餌を受けた野生型マウスと比べた発現の倍数増加（±ＳＥＭ）として表される（ｎ＝３）。
【図１８】ｍｉＲ−２０８が、ＴＨＲＡＰ１を標的とすることを示す図である。（図１８Ａ）ＴＨＲＡＰ１の３’ＵＴＲにおける推定ｍｉＲ−２０８結合部位の配列アライメントが、高レベルの相補性および配列保存を示す図である（図１８Ｂ）ＣＯＳ１細胞に、ｍｉＲ−１２６およびｍｉＲ−２０８の発現プラスミドと共に、ＴＨＲＡＰ１  ３’ＵＴＲルシフェラーゼ構築物をトランスフェクトしたことを示す図である。値は、レポーターのみと比べたルシフェラーゼ発現の倍数変化（±ＳＤ）である。（図１８Ｃ）ＣＯＳ１細胞に、０．１〜２μｇの範囲で用量を増大させたｐＣＭＶ−ｍｉＲ−２０８と共に、ＨＡ−ＭＣＤ−ＷＴ  ＵＴＲまたはＨＡ−ＭＣＤ変異ＵＴＲをトランスフェクトしたことを示す図である。ＨＡレベルは、免疫ブロット法を用いて検出した。（図１８Ｄ）野生型動物またはｍｉＲ−２０８−／−動物から得た４００μｇのタンパク質を用いて、ＴＨＲＡＰ１により免疫沈降させた心筋細胞溶解物に対するＴＨＲＡＰ１特異的抗体を用いる、ＴＨＲＡＰ１のウェスタンブロット解析を示す図である。
【図１９】ＴＨＲＡＰ１転写物のＲＴ−ＰＣＲ解析を示す図である。野生型マウスおよびｍｉＲ−２０８−／−マウスの心臓から得たＲＮＡに対するＲＴ−ＰＣＲ法による、ＴＨＲＡＰ１転写物の解析。ｍＲＮＡ転写物におけるプライマー位置が示される。
【図２０】甲状腺ホルモン受容体シグナル伝達標的に対するリアルタイムＰＣＲ解析を示す図である。ＳＥＲＣＡ２ａおよびＰＬＢおよびＧＬＵＴ４の転写物は、野生型マウスおよびｍｉＲ−２０８−／−マウスから得た心臓におけるリアルタイムＰＣＲ法により検出された。値は、野生型マウスと比べた発現の倍数変化（±ＳＥＭ）として表される。
【図２１】野生型マウス、ｍｉＲ−２０８＋／−マウス、およびｍｉＲ−２０８−／−マウスの心臓におけるｍｉＲ−４９９の発現を示すノーザンブロット図である。野生型マウスおよび変異マウスには、ｍｉＲ−２０８発現とｍｉＲ−４９９発現との間のほか、Ｍｙｈ７ｂ発現との間にも直接的な相関が存在する。
【図２２】Ｍｙｈ７ｂ遺伝子座の構造、およびその内部におけるｍｉＲ−４９９コード領域の位置を示す図である。
【図２３】心臓およびヒラメ筋におけるｍｉＲ−４９９の発現を示す、ＲＮＡブロットについての図である。ｍｉＲ−４９９は、腓腹筋／足底筋（ＧＰ）、前脛骨筋（ＴＡ）、または長指伸筋（ＥＤＬ）などの骨格速筋線維においては発現されない。
【図２４】心疾患を有する野生型マウスにおけるｍｉＲ−４９９の発現を示すノーザンブロット図である。ＭＩ：心筋梗塞。ＣｎＡ  Ｔｇ：カルシニューリントランスジェニックマウス。
【図２５】心筋における、ｍｉＲ−２０８によるｍｉＲ−４９９の調節についての図式的ダイアグラムである。
【図２６Ａ−Ｂ】心肥大時におけるｍｉＲＮＡ発現を示す図である。（図２６Ａ）疑似手術およびＴＡＢ後２１日におけるマウス、およびＣｎＡ  Ｔｇマウスから得た代表的な心臓に対してＨ＆Ｅ染色した切片を示す図である。スケールバーは、２ｍｍに等しい。（図２６Ｂ）各種の心臓において発現が変化したマイクロＲＮＡの数を示すベン図を以下に示す。
【図２６Ｃ】心肥大時におけるｍｉＲＮＡ発現を示す図である。（図２６Ｃ）肥大時に発現が変化するマイクロＲＮＡのノーザンブロット図である。Ｕ６  ＲＮＡは、ローディング対照として検出された。
【図２７】ｍｉＲ−２９発現が、心臓ストレスに応じてダウンレギュレートされることを示す図である。野生型マウス（ＷＴ）、ならびに、カルシニューリン導入遺伝子（ＣｎＡ）またはＴＡＢにより誘導された肥大および線維症を有するマウスから得た心臓を、左側に示す。各種の心臓におけるｍｉＲ−２９の相対発現レベルを、右側に示す。
【図２８】野生型と比べて、ｍｉＲ−２０８ノックアウトマウスから得た心臓のマイクロアレイ解析を示す図である。マイクロアレイ解析は、６週齢の野生型心臓およびｍｉＲ−２０８ヌル心臓から単離されたｍＲＮＡに対して実施した。ｍｉＲ−２０８に次ぎ、最もダウンレギュレートされたｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−４９９である。
【図２９】ｍｉＲ−２９ファミリーが、ｍｉＲ−２０８ヌル心臓において、劇的にアップレギュレートされることを示す図である。
【図３０】ｍｉＲ−２９ファミリーが、線維症に関与するコラーゲンおよび細胞外マトリックスの他の成分をコードするｍＲＮＡを標的とすることを示す図である。
【図３１】ｍｉＲ−２０８およびｍｉＲ−２９ファミリーによる心筋線維症の制御モデルを示す図である。正常な心臓において、ｍｉＲ−２０８は、ｍｉＲ−２９の発現を阻害する。ｍｉＲ−２０８の不在下において、ｍｉＲ−２９発現はアップレギュレートされ、ストレスに応じた細胞外マトリックスの発現および線維症を阻止する。ｍｉＲ−２０８、ｍｉＲ−４９９、およびｍｉＲ−２９の機能は、相互に関連している。ｍｉＲ−２０８の消失は、ｍｉＲ−４９９の発現を阻止し、ｍｉＲ−２９の発現をアップレギュレートすることにより、心保護的でありえ、結果として、線維症に対する遮断をもたらしうる。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
心不全は、世界の罹患および死亡の最大原因の１つである。米国だけでも、推計で、３百万人の人々が、現在、心筋症と共に生活し、さらに４００，０００人が、毎年診断を受けていることが示される。「うっ血性心筋症」とも呼ばれる拡張型心筋症（ＤＣＭ）が、心筋症の最もよくみられる形態であり、１００，０００人あたり約４０人の推定有病率を有する（Ｄｕｒａｎｄら、１９９５年）。ＤＣＭの他の原因も存在するが、家族性拡張型心筋症は「特発性」ＤＣＭの約２０％を占めると示されている。ＤＣＭ症例の約半数は特発性であり、残りは既知の疾患過程と関連する。例えば、重度の心筋損傷は、癌化学療法で用いられる特定の薬剤（例えば、ドキソルビシンおよびダウノルビシン）から生じうる。加えて、多くのＤＣＭ患者は、慢性アルコール依存者である。これらの患者にとって幸いなことに、疾患経過の初期にアルコール消費を減らすかまたは中止すれば、心筋機能不全の進行は、停止または可逆化されうる。周産期心筋症は、感染性の続発症と関連する疾患であるので、ＤＣＭの別の特発性形態である。総じて、ＤＣＭを含む心筋症は、重大な公衆衛生問題である。
【００３１】
冠動脈疾患、心筋梗塞、うっ血性心不全、および心肥大を含む心疾患およびその症状は、今日の米国において、主要な健康リスクを明示している。これらの疾患に罹患する患者を診断、治療、および支援するための費用は、優に数十億ドルに上る。心疾患の特に重度の２つの症状が、心筋梗塞および心肥大である。心筋梗塞の場合、アテローム性動脈硬化の結果として、冠動脈において、通例では急性の血小板性冠動脈塞栓が生じ、心筋細胞死をもたらす。心臓の筋肉細胞である心筋細胞は、最終的に分化し、一般に、細胞分裂不能であるため、急性心筋梗塞の経過中に死滅すると、一般に、瘢痕組織により置き換えられる。瘢痕組織は、収縮性でなく、心機能に寄与せず、心収縮時に拡張することにより、または、心室のサイズおよび有効半径を増大させる、例えば、肥大することにより、心機能において有害な役割を果たすことが多い。心肥大の場合、１つの理論が、これを異常発生に類似する疾患であるとみなし、そのようなものとして、心臓における発生に関わるシグナルが肥大性疾患に寄与しうるかどうかという問題を提起している。心肥大は、高血圧、機械的負荷、心筋梗塞、心不整脈、内分泌障害、および心収縮タンパク質遺伝子の遺伝子変異から生じる疾患を含む、心疾患のほとんどすべての形態に対する心臓の適応的な応答である。肥大による応答が、当初は、心拍出量を増加させる補完的な機構であるのに対し、持続的な肥大は、ＤＣＭ、心不全、および突然死をもたらしうる。米国では、毎年約５０万人が心不全の診断を受け、死亡率は５０％に近い。
【００３２】
心肥大の原因および結果は、広範囲にわたって記録されているが、基礎的な分子機構は解明されていない。これらの機構を理解することが、心疾患の予防および治療における主要な関心事であり、心肥大および心不全を特異的に標的とする新薬の設計における治療様式として極めて重要となるであろう。病的心肥大は、典型的には、心損傷が心不全をもたらすほどに重度となるまでは症状をもたらさないので、心筋症の症状は、心不全に関連する症状である。これらの症状は、息切れ、運動に伴う疲労、息切れなしには横になれないこと（起座呼吸）、発作性夜間呼吸困難、心径拡大、および／または下肢の腫脹を含む。患者は、また、血圧の増加、過剰心音、心雑音、肺塞栓症および全身塞栓症、胸痛、肺うっ血、および動悸を示すことが多い。加えて、ＤＣＭは、駆出率の低下（すなわち、内因性の収縮機能およびリモデリング両方の尺度）をもたらす。該疾患は、心室拡張および心筋収縮性の低下による収縮機能の大幅な低下をさらに特徴とし、これが、多くの患者において拡張型心不全をもたらす。罹患した心臓は、また、心筋細胞／心筋機能不全の結果として、細胞／房室のリモデリングを受け、これが、「ＤＣＭ表現型」に寄与する。疾患の進行と共に、症状も進行する。ＤＣＭ患者では、心室性頻脈および心室性細動を含む、致死的な不整脈の発症率も大きく増加する。これらの患者において、失神（目眩）の発作は、突然死の前兆とみなされる。
【００３３】
拡張型心筋症の診断は、房室拡張、特に、心室拡張の実証によるのが通例である。拡張は、胸部Ｘ線撮影により観察されるのが通例であるが、心エコー図を用いるとより正確に評価される。ＤＣＭは、急性心筋炎、弁膜性心疾患、冠動脈疾患、および高血圧性心疾患との区別が困難であることが多い。拡張型心筋症の診断がなされると、潜在的に可逆性の原因を同定および治療し、さらなる心損傷を予防するために、あらゆる努力がなされる。例えば、冠動脈疾患および弁膜性心疾患は、除外しなければならない。貧血、異常頻脈、栄養失調、アルコール依存症、甲状腺疾患および／または他の問題を解決し、制御する必要がある。
【００３４】
上述の通り、薬理作用剤（pharmacological agents)による治療が、やはり、心不全の症状を軽減または除去する主要な機構を代表する。利尿剤が、軽度から中等度の心不全の第一選択治療を構成する。残念ながら、一般に用いられる利尿剤の多く（例えば、サイアザイド）は、多数の有害作用を有する。例えば、一部の利尿剤は、血清中のコレステロールおよびトリグリセリドを増大させることがある。さらに、利尿剤は、一般に、重度の心不全に罹患する患者には有効でない。
【００３５】
利尿剤が有効でない場合は、血管拡張剤を用いてよい。アンジオテンシン転換酵素（ＡＣＥ）阻害剤（例えば、エナロプリルおよびリシノプリル）は、症状の緩和を提供するだけでなく、死亡率も低減することが報告されている（Ｙｏｕｎｇら、１９８９年）。しかし、ここでも、ＡＣＥ阻害剤は、特定の病態（例えば、腎動脈狭窄症）を有する患者において禁忌される状態をもたらす有害作用と関連する。同様に、強心剤療法（すなわち、心筋の筋収縮力を増大させることにより、心拍出量を改善する薬剤）は、消化器問題および中枢神経系の機能不全を含む、一連の有害反応と関連する。
【００３６】
したがって、現在用いられる薬理作用剤は、特定の患者集団において、深刻な欠陥を有する。新規の安全で有効な作用剤(agents)が使用されれば、現在使用される薬理様式を使用できない患者、または、これらの様式からは十分な緩和を受けない患者の利益となることが疑いないであろう。ＤＣＭ患者の予後は様々であり、心室機能不全の程度によるが、死亡の大半は、診断の５年以内に起きる。
【００３７】
Ｉ．本発明
成体心臓におけるα−ＭＨＣアイソフォームとβ−ＭＨＣアイソフォームとの比率が、心収縮性の主要な決定因子である。成体心臓における主要なミオシンアイソフォームであるβ−ＭＨＣが、比較的低度のＡＴＰアーゼ活性を示すのに対し、α−ＭＨＣは、高度のＡＴＰアーゼ活性を有する。心筋梗塞、高血圧、および他の障害など各種の病的刺激に呼応して、β−ＭＨＣ発現が増加し、α−ＭＨＣ発現は低下し、結果として、筋原線維のＡＴＰアーゼ活性が低下し、心筋原線維の短縮速度が低下し、最終的な収縮機能不全をもたらす。注目すべきは、心臓のα−ＭＨＣ含量のわずかな変化が、心臓の働きに深刻な影響を及ぼしうることである。
【００３８】
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）は、より大きなｍｉＲ前駆体に由来する約２２ヌクレオチドの小さなＲＮＡである。ｍｉＲは、その配列が完全に相補的である場合は標的ｍＲＮＡの分解を促進することにより、または、その配列がミスマッチを含有する場合は翻訳を阻害することにより、該ｍＲＮＡのリプレッサーとして作用する。マイクロＲＮＡ−２０８（ｍｉＲ−２０８）は、α−ＭＨＣ遺伝子のイントロンによりコードされ、心臓において特異的に発現される。本発明者らは、ｍｉＲ−２０８ノックアウトマウスを作製し、ｍｉＲ−２０８が、成体心臓におけるβ−ＭＨＣ遺伝子発現の活性化のほか、他の複数の収縮タンパク質遺伝子の発現にも必要であることを見出した。加えて、ｍｉＲ−２０８の阻害は、心筋線維症の大幅な減少をもたらす。これらの知見は、ｍｉＲ−２０８の発現を調節する戦略が、ヒトにおける心収縮性に大きな効果を及ぼすこと、例えば、心外傷後の心臓において、ｍｉＲ−２０８の阻害がβ−ＭＨＣの発現を阻止し、α−ＭＨＣの発現を維持することを示唆する。
【００３９】
本発明の別の態様は、α−ＭＨＣ遺伝子に変異を有する個体を治療するために、内因性ｍｉＲ−２０８遺伝子を治療的に活性化させるか、または、アデノウイルスベクターもしくは他のベクターものを用いて（再び、アデノウイルスシステム異所性発現手段を用いてβ−ＭＨＣ発現を増加させる必要がない）心臓に外因性ｍｉＲ−２０８を導入することによる、ｍｉＲ−２０８の発現または活性のアゴニズムである。ｍｉＲ−２０８変異マウスの心臓における複数の骨格速筋収縮タンパク質遺伝子のアップレギュレーションは、ｍｉＲ−２０８が、通例では、骨格速筋遺伝子プログラムを抑制することも示唆する。心臓におけるこれらの遺伝子の活性化は、心収縮性を調節するための潜在的な手法を代表する。
【００４０】
加えて、本発明者らは、骨格筋における速筋線維遺伝子を抑制し、これにより、インスリン感受性および骨格筋持久性の向上と対になる遅筋線維遺伝子の相反的発現を活性化する、ｍｉＲ−２０８の使用を提供する。骨格筋における遅筋線維遺伝子の抑制および速筋線維遺伝子の活性化は、非活動性委縮、抗重力または脱神経に応じた筋消耗を含む、多数の筋骨格障害と関連する。
【００４１】
したがって、本発明者らは、ｍｉＲ−２０８が、心臓において、β−ＭＨＣ遺伝子発現の筋特異的で必須の調節物質であり、加えて心筋線維症を調節することを発見した。ｍｉＲ−２０８が、β−ＭＨＣ発現および骨格速筋遺伝子の発現を調節するという発見は、このマイクロＲＮＡの使用により心収縮性および骨格筋機能を制御することと同様、全く新規のものである。
【００４２】
ＩＩ．ｍｉＲＮＡ
Ａ．背景
２００１年に、複数のグループが、新規のクローニング法を用いて、Ｃ．エレガンス、ショウジョウバエ、およびヒトに由来する「マイクロＲＮＡ」（ｍｉＲＮＡ）の大集団を単離し同定した（Ｌａｇｏｓ−Ｑｕｉｎｔａｎａら、２００１年；Ｌａｕら、２００１年；ＬｅｅおよびＡｍｂｒｏｓ、２００１年）。内因性ｓｉＲＮＡを有さないと思われる植物および−ヒトを含む−動物において、数百種のｍｉＲＮＡが同定された。したがって、ｓｉＲＮＡに類似するが、にもかかわらず、ｍｉＲＮＡはこれらとは異なる。
【００４３】
これまでに観察されたｍｉＲＮＡは、約２１〜２２ヌクレオチドの長さであり、タンパク質をコードしない遺伝子から転写される、より長い前駆体に由来する。Ｃａｒｒｉｎｇｔｏｎら（２００３年）の概説を参照のこと。該前駆体は、自己相補性領域において相互に折り返される構造を形成し、次いで、それらは、動物におけるＤｉｃｅｒヌクレアーゼまたは植物におけるＤＣＬ１によりプロセシングされる。ｍｉＲＮＡ分子は、その標的との正確なまたは不正確な塩基対形成を介して、翻訳を遮断する。
【００４４】
ｍｉＲＮＡは、遺伝子調節に関与する。ｌｉｎ−４およびｌｅｔ−７を含む一部のｍｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡの部分的に相補的な３’側非翻訳領域（３’ＵＴＲ）に結合することにより、タンパク質の合成を阻害する。植物で見出されたＳｃａｒｅｃｒｏｗ  ｍｉＲＮＡを含む他のｍｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡと同様に機能し、完全に相補的なｍＲＮＡ配列に結合し、標的転写物を破壊する（Ｇｒｉｓｈｏｋら、２００１年）。
【００４５】
マイクロＲＮＡに関する研究は、これらの分子が真核生物の遺伝子発現の調節において果たす広範な役割を研究者らが理解し始めるにつれ、増加しつつある。最もよく理解されている２種のｍｉＲＮＡであるｌｉｎ−４およびｌｅｔ−７は、重要なｍＲＮＡファミリーの翻訳を調節することにより、Ｃ．エレガンスにおける発生タイミングを調節する（Ｐａｓｑｕｉｎｅｌｌｉ、２００２年で概説される）。Ｃ．エレガンス、ショウジョウバエ、マウス、およびヒトにおいて、数百種のｍｉＲＮＡが同定されている。遺伝子発現を調節する分子に関して予期される通り、ｍｉＲＮＡレベルは、組織および発生状態により変化することが示されている。加えて、１つの研究が、２種のｍｉＲＮＡ発現の低下と慢性リンパ性白血病との間の強い相関を示し、ｍｉＲＮＡと癌との間の関連可能性を提供している（Ｃａｌｉｎ、２００２年）。分野はいまだ新しいものの、ｍｉＲＮＡが、高等真核生物における遺伝子発現の調節において、転写因子と同じく重要となりうるという推測がなされている。
【００４６】
細胞分化、初期発生、ならびに、アポトーシスおよび脂肪代謝などの細胞過程において極めて重要な役割を果たす、ｍｉＲＮＡのいくつかの例が存在する。ｌｉｎ−４およびｌｅｔ−７は、ともに、Ｃ．エレガンスの発生時において、１つの幼虫状態から別の幼虫状態への移行を調節する（Ａｍｂｒｏｓ、２００３年）。ｍｉｒ−１４およびｂａｎｔａｍは、アポトーシスに関与する遺伝子の発現を見かけ上調節することにより細胞死を調節する、ショウジョウバエのｍｉＲＮＡである（Ｂｒｅｎｎｅｃｋｅら、２００３年、Ｘｕら、２００３年）。ｍｉＲ１４は、また、脂肪代謝にも関与している（Ｘｕら、２００３年）。ｌｓｙ−６およびｍｉＲ−２７３は、化学感覚ニューロンにおける非対称性を調節する、Ｃ．エレガンスのｍｉＲＮＡである（Ｃｈａｎｇら、２００４年）。細胞分化を調節する別の動物のｍｉＲＮＡが、造血細胞分化を導くｍｉＲ−１８１である（Ｃｈｅｎら、２００４年）。これらの分子は、既知の機能を有する動物ｍｉＲＮＡの全範囲を代表する。ｍｉＲＮＡ機能の理解の向上により、正常な発生、分化、細胞間および細胞内コミュニケーション、細胞周期、血管新生、アポトーシス、ならびに他の多数の細胞過程に寄与する調節ネットワークが解明されることは疑いない。多くの生物学的機能におけるその重要な役割を踏まえると、ｍｉＲＮＡは、治療的介入または診断的解析に重要な点をもたらす可能性が高い。
【００４７】
ｍｉＲＮＡのような生体分子の機能を特徴付けることは、分子を細胞に導入するか、または分子を細胞から除去し、結果を測定することに関わる場合が多い。細胞へのｍｉＲＮＡの導入がアポトーシスをもたらす場合、ｍｉＲＮＡがアポトーシス経路に関与していることは疑いない。細胞にｍｉＲＮＡを導入し、細胞からｍｉＲＮＡを除去する方法については説明されている。近年の２つの刊行物が、特定のｍｉＲＮＡ活性を阻害するのに用いることのできるアンチセンス分子について述べている（Ｍｅｉｓｔｅｒら、２００４年；Ｈｕｔｖａｇｎｅｒら、２００４年）。別の刊行物は、内因性ＲＮＡポリメラーゼにより転写され、細胞内にトランスフェクトされると特定のｍｉＲＮＡを産生する、プラスミドの使用について述べている（Ｚｅｎｇら、２００２年）。これらの２つの試薬セットが、単一のｍｉＲＮＡ評価に用いられている。
【００４８】
Ｂ．ｍｉＲ−２０８
ｍｉＲ−２０８は、α−ＭＨＣ遺伝子の第２７イントロン内に位置するイントロン性ｍｉＲＮＡである（図１）。ヒト、マウス、ラットおよびイヌについて、ｍｉＲ−２０８のｍｉＲＮＡ前駆体をコードする配列は、それぞれ、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７で与えられる。成熟ｍｉＲ−２０８配列は、配列番号５で与えられる。α−ＭＨＣと同様、ｍｉＲ−２０８も、心臓内のみにおいて発現される（図２）。
【００４９】
ｍｉＲＮＡ標的の同定にＰｉｃＴａｒアルゴリズム（Ｋｒｅｋら、２００５年）を用い、本発明者らは、ｍｉＲ−２０８の予測標的として、甲状腺ホルモン受容体関連タンパク質１（ＴＨＲＡＰ１）を同定した。ヒト、チンパンジー、マウス、ラット、イヌ、ニワトリ、フグ、およびミノカサゴ（zebrafish）に由来する、ＴＨＲＡＰ１の３’ＵＴＲ配列は、それぞれ、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、および配列番号１３で与えられる。
【００５０】
Ｃ．ｍｉＲ−２０８の阻害剤
一般に、ｍｉＲＮＡの阻害剤は、ｍｉＲＮＡに相補的で、ｍｉＲＮＡの機能を遮断し、短く、化学的に操作された、単鎖のオリゴヌクレオチドである、「ｍｉＲＮＡアンタゴニスト」の形態をとる（Ｋｒｕｔｚｆｅｌｄｔら、２００５年）。他の手法は、アンチセンスの２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）オリゴリボヌクレオチドを有するｍｉＲＮＡ、および、特定の「薬様（drug-like)」特性（安定性のための化学的修飾、送達のためのコレステロール結合体）と共に加工された小型の二重鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の阻害を含む（Ｋｒｕｔｚｆｅｌｄｔら、２００５年）。
【００５１】
ＩＩＩ．心肥大を治療する方法
Ａ．治療計画
心血管障害の状況下における心肥大に対する、今日の医学的管理は、レニン−アンジオテンシン系阻害剤、およびβアドレナリン作動性受容体遮断剤の少なくとも２種類の薬剤の使用を含む（Ｂｒｉｓｔｏｗ、１９９９年）。心不全の状況下における病的肥大を治療する治療剤は、アンジオテンシンＩＩ転換酵素（ＡＣＥ）阻害剤およびβアドレナリン作動性受容体遮断剤を含む（ＥｉｃｈｈｏｒｎおよびＢｒｉｓｔｏｗ、１９９６年）。心肥大の治療に開示されている他の薬剤は、アンジオテンシンＩＩ受容体アンタゴニスト（米国特許第５，６０４，２５１号）および神経ペプチドＹアンタゴニスト（ＷＯ９８／３３７９１）を含む。現在使用される医薬組成物にかかわらず、心肥大、および続発する心不全に対する予防および治療は、治療的な課題を提示し続けている。
【００５２】
非薬理治療は、主に、薬理治療に対する補助として用いられる。非薬理治療の１つの手段は、食事中のナトリウムを低減することに関わる。加えて、非薬理治療は、また、陰性強心剤（例えば、一部のカルシウムチャネル遮断剤およびジソピラミドなどの抗不整脈薬）、心臓毒（例えば、アンフェタミン）、および代用血漿（例えば、非ステロイド抗炎症剤およびグルココルチコイド）を含む、一部の沈殿薬物の除去を含む。
【００５３】
本発明の一実施形態では、ｍｉＲ−２０８阻害剤を用いる、心肥大または心不全の治療法が提供される。本出願の目的にかなう治療は、運動能の低下、血液駆出量の減少、左室拡張終期圧の増加、肺毛細血管楔入圧の増加、心拍出量すなわち心係数の減少、肺動脈圧の増加、左室収縮終期径および左室拡張終期径の増大、ならびに左室壁応力、同壁張力、および同壁厚の増大−右室についても同様−など、心肥大の１つ以上の症状を軽減することを含む。加えて、ｍｉＲ−２０８阻害剤の使用は、心肥大およびこれに関連する症状が生じることを予防しうる。
【００５４】
治療計画は、臨床状況によって変化するであろう。しかし、大半の状況において、長期的な維持が、適切であろうと思われる。また、ｍｉＲ−２０８阻害剤による心肥大の治療は、疾患進行時における短期間内など、間欠的であることが望ましい場合もある。
【００５５】
Ｂ．併用療法（combined therapy）
別の実施形態では、ｍｉＲ−２０８阻害剤を他の治療様式と組み合わせて使用することが意図される。したがって、上述の治療に加えて、より「標準的な」医薬による心治療を患者に提供してもよい。他の治療の例は、非限定的には、いわゆる「ベータ遮断剤」、抗高血圧剤、強心剤、抗血栓剤、血管拡張剤、ホルモンアンタゴニスト、強心剤、利尿剤、エンドセリン受容体アンタゴニスト、カルシウムチャネル遮断剤、ホスホジエステラーゼ阻害剤、ＡＣＥ阻害剤、アンジオテンシン２型アンタゴニストおよびサイトカイン遮断剤／阻害剤、ならびにＨＤＡＣ阻害剤を含む。
【００５６】
組合せは、両方の作用剤を含む単一組成物または薬理製剤を心筋細胞に接触させるか、または、一方の組成物が発現構築物を含み、他の組成物が作用剤を含む２つの異なる組成物または製剤を該細胞に同時に接触させることにより達成してよい。あるいは、ｍｉＲ−２０８阻害剤を用いる治療は、数分間から数週間の範囲の間隔で、他の（１つ以上の）作用剤の投与に先行または後続しうる。他の作用剤および発現構築物が細胞に個別に適用される実施形態では、一般に、作用剤および発現構築物が細胞に対してなおも有効な併用効果を及ぼしうるよう、各送達時の間で有効期間が過ぎなかったことを確認する。こうした場合、両様式は、互いに約１２〜２４時間以内に、また、より好ましくは、互いに約６〜１２時間以内に（遅延時間は約１２時間に限ることがもっとも好ましい）細胞と接触させることが通例であろうと意図される。しかし、状況によっては、治療期間をかなり延長し、各投与間に数日間（２、３、４、５、６、または７日間）から数週間（１、２、３、４、５、６、７、または８週間）を経過させることが望ましい場合もある。
【００５７】
また、ｍｉＲ−２０８阻害剤または他の作用剤の複数回の投与が望ましいであろうことも考えられる。この点については、各種の組合せを用いてよい。ｍｉＲ−２０８阻害剤を「Ａ」とし、他の作用剤を「Ｂ」とする例示については、以下の３および４回の総投与回数に基づく順列が典型例である。
A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B B/A/A A/B/B B/B/B/A B/B/A/B
A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A B/A/B/A B/A/A/B B/B/B/A
A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A A/B/B/B B/A/B/B B/B/A/B
他の組合せも、考えられる。
【００５８】
Ｃ．薬理治療剤
薬理治療剤および投与方法、用量などは、当業者によく知られており（例えば、関連部分において参照により本明細書に組み込まれる「Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ」、Ｋｌａａｓｓｅｎの「Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、および「Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｉｎｄｅｘ、第１１版」を参照のこと）、本明細書の開示に照らして、本発明と組み合わせてよい。治療される対象の状態に応じて、用量の一定の変更が必然的に生じるであろう。いかなる場合においても、投与責任者が個体対象に対する適切な用量を決定し、こうした個別の決定は、当業者の技術の範囲内にある。
【００５９】
本発明において用いうる、薬理治療剤の非限定的な例は、抗高リポタンパク血症剤、抗動脈硬化剤、抗血栓剤／線溶剤、血液凝固剤、抗不整脈剤、抗高血圧剤、昇圧剤、うっ血性心不全治療剤、抗狭心症剤、抗菌剤、またはこれらの組合せを含む。
【００６０】
加えて、本実施例（後出を参照のこと）においてβ遮断剤が用いられたのと同様、以下の任意の薬剤を用いて心治療標的遺伝子の新規のセットを開発してよいことに注意されたい。これらの遺伝子の多くは重複しうると予測されるが、新規の遺伝子標的も同様に開発しうる。
【００６１】
ｉ．抗高リポタンパク血症剤
特定の実施形態では、本明細書において「抗高リポタンパク血症剤」として知られる、１つ以上の血中脂質および／またはリポタンパク質の濃度を低下させる作用剤の投与は、特に、アテローム性動脈硬化および血管組織の肥厚または閉塞に対する治療において、本発明による心血管治療と組み合わせてよい。特定の態様において、抗高リポタンパク血症剤は、アリールオキシアルカン酸／フィブリン酸誘導体、樹脂／胆汁酸抑制剤、ＨＭＧ  ＣｏＡレダクターゼ阻害剤、ニコチン酸誘導体、甲状腺ホルモンもしくは甲状腺ホルモン類似体、その他の作用剤、またはこれらの組合せを含んでよい。
【００６２】
ａ．アリールオキシアルカン酸／フィブリン酸誘導体
アリールオキシアルカン酸／フィブリン酸誘導体の非限定的な例は、ベクロブラート、エンザフィブラート、ビニフィブラート、シプロフィブラート、クリノフィブラート、クロフィブラート（アトロミドＳ）、クロフィブリン酸、エトフィブラート、フェノフィブラート、ゲムフィブロジル（ロビド）、ニコフィブラート、ピリフィブラート、ロニフィブラート、シムフィブラート、およびテオフィブラートを含む。
【００６３】
ｂ．樹脂／胆汁酸抑制剤
樹脂／胆汁酸抑制剤の非限定的な例は、コレスチラミン（コリバル、クエストラン）、コレスチポール（コレスチド）およびポリデキシドを含む。
【００６４】
ｃ．ＨＭＧ  ＣｏＡレダクターゼ阻害剤
ＨＭＧ  ＣｏＡレダクターゼ阻害剤の非限定的な例は、ロバスタチン（メバコール）、プラバスタチン（プラボコール）、またはシンバスタチン（ゾコール）を含む。
【００６５】
ｄ．ニコチン酸誘導体
ニコチン酸誘導体の非限定的な例は、ニコチネート、アシピモックス、ニセリトロール、ニコクロネート、ニコモール、およびオキシニアク酸を含む。
【００６６】
ｅ．甲状腺ホルモンおよび類似体
甲状腺ホルモンおよびその類似体の非限定的な例は、エトロキサート、チロプロピン酸、およびチロキシンを含む。
【００６７】
ｆ．その他の抗高リポタンパク血症剤
その他の抗高リポタンパク血症剤の非限定的な例は、アシフラン、アザコステロール、ベンフルオレックス、β−ベンザルブチラミド、カルニチン、硫酸コンドロイチン、クロメストロン、デタキストラン、デキストラン硫酸ナトリウム、５，８，１１，１４，１７−エイコサペンタエノン酸、エリタデニン、フラザボール、メグルトール、メリナミド、ミタトリエンジオール、オルニチン、γ−オリザノール、パンテチン、ペンタエリスリトールテトラアセテート、α−フェニルブチラミド、ピロザジル、プロブコール（ロレルコ）、β−シトステロール、スルトシル酸−ピペラジン塩、チアデノール、トリパラノール、およびキセンブシンを含む。
【００６８】
ｉｉ．抗動脈硬化剤
抗動脈硬化剤の非限定的な例は、ピリジノールカルバメートを含む。
【００６９】
ｉｉｉ．抗血栓剤／線溶剤
特定の実施形態では、特に、アテローム性動脈硬化および血管（例えば、動脈）閉塞の治療において、凝血塊の除去または阻止に役立つ作用剤の投与を、調節物質の投与と組み合わせてよい。抗血栓剤および／または線溶剤の非限定的な例は、抗凝血剤、抗凝血剤アンタゴニスト、抗血小板剤、血栓溶解剤、血栓溶解剤アンタゴニスト、またはこれらの組合せを含む。
【００７０】
特定の態様では、例えば、アスピリン、ワルファリン（クマジン）などの、経口投与しうる抗血栓剤が好ましい。
【００７１】
ａ．抗凝血剤
抗凝血剤の非限定的な例は、アセノクマロール、アンクロッド、アニシンジオン、ブロミンジオン、クロリンジオン、クメタロール、シクロクマロール、デキストラン硫酸ナトリウム、ジクマロール、ジフェナジオン、エチルビスクマセテート、エチリデンジクマロール、フルインジオン、へパリン、ヒルジン、リアポラートナトリウム、オキサジジオン、ペントサンポリスルフェート、フェニンジオン、フェンプロクモン、ホスビチン、ピコタミド、チオクロマロール、およびワルファリンを含む。
【００７２】
ｂ．抗血小板剤
抗血小板剤の非限定的な例は、アスピリン、デキストラン、ジピリダモール（ペルサンチン）、へパリン、スルフィンピラノン（アンツラン）、およびチクロピジン（チクリド）を含む。
【００７３】
ｃ．血栓溶解剤
血栓溶解剤の非限定的な例は、組織プラスミノーゲンアクチベータ（アクチバーゼ）、プラスミン、プロウロキナーゼ、ウロキナーゼ（アボキナーゼ）、ストレプトキナーゼ（ストレプターゼ）、アニストレプラーゼ／ＡＰＳＡＣ（エミナーゼ）を含む。
【００７４】
ｉｖ．血液凝固剤
患者が、出血または出血の可能性が高い状態に罹患する特定の実施形態では、血液凝固を促進しうる作用剤を用いてよい。血液凝固促進剤の非限定的な例は、血栓溶解剤アンタゴニストおよび抗凝血剤アンタゴニストを含む。
【００７５】
ａ．抗凝血剤アンタゴニスト
抗凝血剤アンタゴニストの非限定的な例は、プロタミンおよびビタミンＫ１を含む。
【００７６】
ｂ．血栓溶解剤アンタゴニストおよび抗血栓剤
血栓溶解剤アンタゴニストの非限定的な例は、アミノカプロン酸（アミカール）およびトラネキサミン酸（アムスタット）を含む。抗血栓剤の非限定的な例は、アナグレリド、アルガトロバン、シルスタゾール、ダルトロバン、デフィブロチド、エノキサパリン、フラキシパリン、インドブフェン、ラモパラン、オザグレル、ピコタミド、プラフィブリド、テデルパリン、チクロピジン、およびトリフルサルを含む。
【００７７】
ｖ．抗不整脈剤
抗不整脈剤の非限定的な例は、クラスＩ抗不整脈剤（ナトリウムチャネル遮断剤）、クラスＩＩ抗不整脈剤（ベータアドレナリン作動性受容体遮断剤）、クラスＩＩ抗不整脈剤（再分極遅延剤）、クラスＩＶ抗不整脈剤（カルシウムチャネル遮断剤）、およびその他の抗不整脈剤を含む。
【００７８】
ａ．ナトリウムチャネル遮断剤
ナトリウムチャネル遮断剤の非限定的な例は、クラスＩＡ抗不整脈剤、クラスＩＢ抗不整脈剤、およびクラスＩＣ抗不整脈剤を含む。クラスＩＡ抗不整脈剤の非限定的な例は、ジスピラミド（ノルペース）、プロカインアミド（プロネスチル）、およびキニジン（キニデックス）を含む。クラスＩＢ抗不整脈剤の非限定的な例は、リドカイン（キシロカイン）、トカイニド（トノカード）、およびメキシレチン（メキシチル）を含む。クラスＩＣ抗不整脈剤の非限定的な例は、エンカイニド（エンカイド）およびフレカイニド（タンボコール）を含む。
【００７９】
ｂ．ベータ遮断剤
別段にβアドレナリン作動性受容体遮断剤、βアドレナリン作動性受容体アンタゴニスト、またはクラスＩＩ抗不整脈剤としても知られる、ベータ遮断剤の非限定的な例は、アセブトロール（セクトラール）、アルプレノロール、アモスラロール、アロチノロール、アテノロール、ベフノロール、ベタキソロール、ベバントロール、ビソプロロール、ボピンドロール、ブクモロール、ブフェトロール、ブフラロール、ブニトロロール、ブプラノロール、塩酸ブチドリン、ブトフィロロール、カラゾロール、カルテオロール、カルベジロール、セリプロロール、セタモロール、クロラノロール、ジレバロール、エパノロール、エスモロール（ブレビブロック）、インデノロール、ラベタロール、レボブノロール、メピンドロール、メチプラノロール、メトプロロール、モプロロール、ナドロール、ナドキソロール、ニフェナロール、ニプラジロール、オクスプレノロール、ペンブトロール、ピンドロール、プラクトロール、プロネサロール、プロパノロール（インデラル）、ソタロール（ベータペース）、スルフィナロール、タリノロール、テルタトロール、チモロール、トリプロロール、およびキシビノロールを含む。特定の態様において、ベータ遮断剤は、アリールオキシプロパノールアミン誘導体を含む。アリールオキシプロパノールアミン誘導体の非限定的な例は、アセブトロール、アルプレノロール、アロチノロール、アテノロール、ベタキソロール、ベバントロール、ビソプロロール、ボピンドロール、ブニトロロール、ブトフィロロール、カラゾロール、カルテオロール、カルベジロール、セリプロロール、セタモロール、エパノロール、インデノロール、メピンドロール、メチプラノロール、メトプロロール、モプロロール、ナドロール、ニプラジロール、オクスプレノロール、ペンブトロール、ピンドロール、プロパノロール、タリノロール、テルタトロール、チモロール、トリプロロールを含む。
【００８０】
ｃ．再分極遅延剤
クラスＩＩＩ抗不整脈剤としても知られ、再分極を遅延させる作用剤の非限定的な例は、アミオダロン（コルダロン）およびソタロール（ベータペース）を含む。
【００８１】
ｄ．カルシウムチャネル遮断剤／アンタゴニスト
クラスＩＶ抗不整脈剤としても知られる、カルシウムチャネル遮断剤の非限定的な例は、アリールアルキルアミン（例えば、ベプリジル、ジルチアゼム、フェンジリン、ガロパミル、プレニルアミン、テロジリン、ベラパミル）、ジヒドロピリジン誘導体（フェロジピン、イスラジピン、ニカルジピン、ニフェジピン、ニモジピン、ニソルジピン、ニトレンジピン）、ピペラジン誘導体（例えば、シナリジン、フルナリジン、リドフラジン）、または、ベンシクラン、エタフェノン、マグネシウム、ミベフラジル、もしくはペルヘキシリンなどの、その他のカルシウムチャネル遮断剤を含む。特定の実施形態において、カルシウムチャネル遮断剤は、長時間作用型ジヒドロピリジン（ニフェジピン型）カルシウムアンタゴニストを含む。
【００８２】
ｅ．その他の抗不整脈剤
その他の抗不整脈剤の非限定的な例は、アデノシン（アデノカード）、ジゴキシン（ラノキシン）、アセカイニド、アジマリン、アモプロキサン、アプリンジン、ブレチリウムトシレート、ブナフチン、ブトベンジン、カポベン酸、シフェンリン、ジソピラニド、ヒドロキニジン、インデカイニド、臭化イパトロピウム、リドカイン、ロラジミン、ロルカイニド、メオベンチン、モリシジン、ピルメノール、プラジマリン、プロパフェノン、ピリノリン、キニジンポリガラクツロネート、キニジンスルフェート、およびビキジルを含む。
【００８３】
ｖｉ．抗高血圧剤
抗高血圧剤の非限定的な例は、交感神経遮断剤、アルファ／ベータ遮断剤、アルファ遮断剤、抗アンジオテンシンＩＩ作用剤、ベータ遮断剤、カルシウムチャネル遮断剤、血管拡張剤、およびその他の抗高血圧剤を含む。
【００８４】
ａ．アルファ遮断剤
αアドレナリン作動性受容体遮断剤またはαアドレナリン作動性受容体アンタゴニストとしても知られる、アルファ遮断剤の非限定的な例は、アモスラロール、アロチノロール、ダピプラゾール、ドキサゾシン、エルゴロイドメシレート、フェンスピリド、インドラミン、ラベタロール、ニセルゴリン、プラゾシン、テラゾシン、トラゾリン、トリマゾシン、およびヨヒンビンを含む。特定の実施形態において、アルファ遮断剤は、キナゾリン誘導体を含んでよい。キナゾリン誘導体の非限定的な例は、アルフゾシン、ブナゾジン、ドキサゾシン、プラゾシン、テラゾシン、およびトリマゾシンを含む。
【００８５】
ｂ．アルファ／ベータ遮断剤
特定の実施形態において、抗高血圧剤は、アルファおよびベータ両方のアドレナリン作動性受容体アンタゴニストである。アルファ／ベータ遮断剤の非限定的な例は、ラベタロール（ノルモジン、トランデート）を含む。
【００８６】
ｃ．抗アンジオテンシンＩＩ作用剤
抗アンジオテンシンＩＩ作用剤の非限定的な例は、アンジオテンシン転換酵素阻害剤およびアンジオテンシンＩＩ受容体アンタゴニストを含む。アンジオテンシン転換酵素阻害剤（ＡＣＥ阻害剤）の非限定的な例は、アラセプリル、エナラプリル（バソテック）、カプトプリル、シラザプリル、デラプリル、エナラプリラート、フォシノプリル、リシノプリル、モベルトプリル、ペリンドプリル、キナプリル、およびラミプリルを含む。アンジオテンシンＩＩ受容体アンタゴニスト、ＡＮＧ受容体遮断剤、またはＡＮＧ−ＩＩ１型受容体遮断剤（ＡＲＢＳ）としても知られる、アンジオテンシンＩＩ受容体遮断剤の非限定的な例は、アンジオカンデサルタン、エプロサルタン、イルベサルタン、ロサルタン、およびバルサルタンを含む。
【００８７】
ｄ．交感神経遮断剤
交感神経遮断剤の非限定的な例は、中枢作用型交感神経遮断剤または末梢作用型交感神経遮断剤を含む。中枢神経系（ＣＮＳ）交感神経遮断剤としても知られる、中枢作用型交感神経遮断剤の非限定的な例は、クロニジン（カタプレス）、グアナベンズ（ワイテンシン）、グアンファシン（テネクス）、およびメチルドーパ（アルドメト）を含む。末梢作用型交感神経遮断剤の非限定的な例は、神経節遮断剤、アドレナリン作動性ニューロン遮断剤、βアドレナリン作動性受容体遮断剤、またはアルファ１アドレナリン作動性受容体遮断剤を含む。神経節遮断剤の非限定的な例は、メカミルアミン（インベルシン）およびトリメタファン（アルフォナド）を含む。アドレナリン作動性ニューロン遮断剤の非限定的な例は、グアネチジン（イスメリン）およびレセルピン（セルパシル）を含む。βアドレナリン作動性受容体遮断剤の非限定的な例は、アセニトロール（セクトラール）、アテノロール（テノルミン）、ベタキソロール（ケルロン）、カルテオロール（カルトロール）、ラベタロール（ノルモジン、トランデート）、メトプロロール（ロプレソール）、ナダノール（コルガード）、ペンブトロール（レバトール）、ピンドロール（ビスケン）、プロプラノロール（インデラル）、およびチモロール（ブロカドレン）を含む。アルファ１アドレナリン作動性受容体遮断剤の非限定的な例は、プラゾシン（ミニプレス）、ドキサゾシン（カルヅラ）、およびテラゾシン（ハイトリン）を含む。
【００８８】
ｅ．血管拡張剤
特定の実施形態において、心血管用治療剤は、血管拡張剤（例えば、脳血管拡張剤、冠動脈血管拡張剤、または末梢血管拡張剤）を含んでよい。特定の好ましい実施形態において、血管拡張剤は、冠動脈血管拡張剤を含む。冠動脈血管拡張剤の非限定的な例は、アモトリフェン、ベンダゾール、ベンフロジルヘミスクシネート、ベンジオダロン、クロラシジン、クロモナール、クロベンフロール、クロニトレート、ジラゼプ、ジピリダモール、ドロプレニルアミン、エフロキサート、エリスリチルテトラニトラン、エタフェノン、フェンジリン、フロレジル、ガングレフェン、ヘレストロール、ビス（β−ジエチルアミノエチルエーテル）、ヘキソベンジン、イトラミントシレート、ケリン、リドフラニン、マンニトールヘキサニトラン、メジバジン、ニトログリセリン、ペンタエリスリトールテトラニトレート、ペントリニトロール、ペルヘキシリン、ピメフィリン、トラピジル、トリクロミル、トリメタジジン、リン酸トロールニトレート、およびビスナジンを含む。
【００８９】
特定の態様において、血管拡張剤は、長期治療用血管拡張剤または高血圧緊急用血管拡張剤を含んでよい。長期治療用血管拡張剤の非限定的な例は、ヒドララジン（アプレゾリン）およびミノキシジル（ロニテン）を含む。高血圧緊急用血管拡張剤の非限定的な例は、ニトロプルシド（ニプリド）、ジアゾキシド（ハイパースタットＩＶ）、ヒドララジン（アプレゾリン）、ミノキシジル（ロニテン）、およびベラパミルを含む。
【００９０】
ｆ．その他の抗高血圧剤
その他の抗高血圧剤の非限定的な例は、アジマリン、γアミノブチル酸、ブフェニオド、シクレタニン、シクロシドミン、タンニン酸クリプテナミン、フェノルドパム、フロセキナン、ケタンセリン、メブタメート、メカミルアミン、メチルドーパ、メチル４−ピリジルケトンチオセミカルバゾン、ムゾリミン、パルギリン、ペンピジン、ピナシジル、ピペロキサン、プリマペロン、プロトベラトリン、ラウバシン、レシメトール、リルメニデン、サララジン、ニトロプルシドナトリウム、チクリナフェン、トリメタファンカムシレート、チロシナーゼ、およびウラピジルを含む。
【００９１】
特定の態様において、抗高血圧剤は、アリールエタノールアミン誘導体、ベンゾチアジアジン誘導体、Ｎ−カルボキシアルキル（ペプチド／ラクタム）誘導体、ジヒドロピリジン誘導体、グアニジン誘導体、ヒドラジン／フタラジン、イミダゾール誘導体、第四アンモニウム化合物、レゼルピン誘導体、またはスルホンアミド誘導体を含んでよい。
【００９２】
アリールエタノールアミン誘導体：アリールエタノールアミン誘導体の非限定的な例は、アモスラロール、ブフラロール、ジレバロール、ラベタロール、プロネサロール、ソタロール、およびスルフィナロールを含む。
【００９３】
ベンゾチアジアジン誘導体：ベンゾチアジアジン誘導体の非限定的な例は、アルチジド、ベンドロフルメチアジド、ベンズチアジド、ベンジルヒドロクロロチアジド、ブチアジド、クロロチアジド、クロルサリドン、シクロペンチアジド、シクロチアジド、ジアゾキシド、エピチアジド、エチアジド、フェンキゾン、ヒドロクロロチアジド、ヒドロフルメチアジド、メチクロチアジド、メチクラン、メトラゾン、パラフルチジド、ポリチアジド、テトラクロルメチアジド、およびトリクロルメチアジドを含む。
【００９４】
Ｎ−カルボキシアルキル（ペプチド／ラクタム）誘導体：Ｎ−カルボキシアルキル（ペプチド／ラクタム）誘導体の非限定的な例は、アラセプリル、カプトプリル、シラザプリル、デラプリル、エナラプリル、エナラプリラート、フォシノプリル、リシノプリル、モベルチプリル、ペリンドプリル、キナプリル、およびラミプリルを含む。
【００９５】
ジヒドロピリジン誘導体：ジヒドロピリジン誘導体の非限定的な例は、アムロジピン、フェロジピン、イスラジピン、ニカルジピン、ニフェジピン、ニルバジピン、ニソルジピン、およびニトレンジピンを含む。
【００９６】
グアニジン誘導体：グアニジン誘導体の非限定的な例は、ベタニジン、デブリソキン、グアナベンズ、グアナクリン、グアナドレル、グアナゾジン、グアネチジン、グアンファシン、グアノクロール、グアノキサベンズ、およびグアノキサンを含む。
【００９７】
ヒドラジン／フタラジン：ヒドラジン／フタラジンの非限定的な例は、ブドララジン、カドララジン、ジヒドララジン、エンドララジン、ヒドラカルバジン、ヒドララジン、フェニプラジン、ピルドララジン、およびトドララジンを含む。
【００９８】
イミダゾール誘導体：イミダゾール誘導体の非限定的な例は、クロニジン、ロフェキシジン、フェントラミン、チアメニジン、およびトロニジンを含む。
【００９９】
第四アンモニウム化合物：第四アンモニウム化合物の非限定的な例は、臭化アザメトニウム、塩化クロリソンダミン、ヘキサメトニウム、ペンタシニウムビス（メチルスルフェート）、臭化ペンタメトニウム、酒石酸ペントリニウム、塩化フェナクトロピニウム、およびトリメチジニウムメトスルフェートを含む。
【０１００】
レセルピン誘導体：レセルピン誘導体の非限定的な例は、ビエタセルピン、デセルピジン、レシナミン、レセルピン、およびシロシンゴピンを含む。
【０１０１】
スルホンアミド誘導体：スルホンアミド誘導体の非限定的な例は、アンブシド、クロパミド、フロセミド、インダパミド、キネサゾン、トリパミド、およびキシパミドを含む。
【０１０２】
ｇ．昇圧剤
昇圧剤は、一般に、手術中に生じうるショック時の血圧を上昇させるのに用いられる。抗低血圧剤としても知られる昇圧剤の非限定的な例は、アメジニウムメチルスルフェート、アンジオテンシンアミド、ジメトフリン、ドーパミン、エチフェルミン、エチレフリン、ゲペフリン、メタラミノール、ミドドリン、ノルエピネフリン、フォレドリン、およびシネフリンを含む。
【０１０３】
ｖｉｉ．うっ血性心不全治療剤
うっ血性心不全治療剤の非限定的な例は、抗アンジオテンシンＩＩ作用剤、後負荷−前負荷の軽減治療、利尿剤、および強心剤を含む。
【０１０４】
ａ．後負荷−前負荷の軽減
特定の実施形態において、アンジオテンシンアンタゴニストを忍容できない動物患者は、併用療法により治療してよい。こうした治療は、ヒドララジン（アプレゾリン）およびイソソルビドジニトレート（イソルジル、ソルビトレート）の投与を組み合わせてよい。
【０１０５】
ｂ．利尿剤
利尿剤の非限定的な例は、チアジド誘導体またはベンゾチアジアジン誘導体（例えば、アルチアジド、ベンドロフルメサジド、ベンズチアジド、ベンジルヒドロクロロチアジド、ブチアジド、クロロチアジド、クロロチアジド、クロルサリドン、シクロペンチアジド、エピチアジド、エチアジド、エチアジド、フェンキゾン、ヒドロクロロチアジド、ヒドロフルメチアジド、メチクロチアジド、メチクラン、メトラゾン、パラフルチジド、ポリチアジド、テトラクロルメチアジド、トリクロルメチアジド）、有機水銀剤（例えば、クロルメロドリン、メラルリド、メルカンファミド、メルカプトメリンナトリウム、メルクマリル酸、メルクマチリンナトリウム、塩化第一水銀、メルサリル）、プテリジン（例えば、フテレン、トリアムテレン）、プリン（例えば、アセフィリン、７−モルフォリノメチルテオフィリン、パモブロム、プロテオブロミン、テオブロミン）、アルドステロンアンタゴニスト（例えば、カンレノン、オレアンドリン、スピロノラクトン）を含むステロイド、スルホンアミド誘導体（例えば、アセタゾラミド、アンブシド、アゾセミド、ブメタニド、ブタゾラミド、クロラミノフェナミド、クロフェナミド、クロパミド、クロレキソロン、ジフェニルメタン−４，４’−ジスルホンアミド、ジスルファミド、エトキシゾラミド、フロセミド、インダパミド、メフルシド、メタゾラミド、ピレタニド、キネサゾン、トラセミド、トリパミド、キシパミド）、ウラシル（例えば、アミノメトラジン、アミソメトラジン）、カリウム保持性アンタゴニスト（例えば、アミロリド、トリアンテレン）、または、アミノジン、アルブチン、クロラザニル、エタクリン酸、エトゾリン、ヒドラカルバジン、イソソルビド、マンニトール、メトカルコン、ムゾリミン、ペルヘキシリン、チクリナフェン、および尿素など、その他の利尿剤を含む。
【０１０６】
ｃ．強心剤（inotropic agents)
強心剤（cardiotonic）としても知られる陽性強心剤の非限定的な例は、アセフィリン、アセチルジギトキシン、２−アミノ−４−ピコリン、アムリノン、ベンフロジルヘミスクシネート、ブクラデシン、セルベロシン、カンホタミド、コンバラトキシン、シマリン、デノパミン、デスラノシド、ジギタリン、ジギタリス、ジギトキシン、ジゴキシン、ドブタミン、ドーパミン、ドペキサミン、エノキシモン、エリスロフレイン、フェナルコミン、ギタリン、ギトキシン、グリコシアミン、ヘプタミノール、ヒドラスチニン、イボパミン、ラナトシド、メタミバム、ミルリノン、ネリフォリン、オレアンドリン、ウアバイン、オキシフェドリン、プレナルテロール、プロシラリジン、レシブフォゲニン、シラレン、シラレニン、ストファンチン、スルマゾール、テオブロミン、およびキシモテロールを含む。
【０１０７】
特定の態様において、強心剤は、強心配糖体、ベータアドレナリン作動性受容体アゴニスト、またはホスホジエステラーゼ阻害剤である。強心配糖体の非限定的な例は、ジゴキシン（ラノキシン）およびジギトキシン（クリストジギン）を含む。βアドレナリン作動性受容体アゴニストの非限定的な例は、アルブテロール、バンブテロール、ビトルテロール、カルブテロール、クレンブテロール、クロルプレナリン、デノパミン、ジオキシエセドリン、ドブタミン（ドブトレクス）、ドーパミン（イントロピン）、ドペキサミン、エフェンドリン、エタフェドリン、エチルノルエピネフリン、フェノテロール、フォルモテロール、ヘキソプレナリン、イボパミン、イソエタリン、イソプロテレノール、マブテロール、メタプロテレノール、メトキシフェナミン、オキシフェドリン、ピルブテロール、プロカテロール、プロトキロール、レプロテロール、リミテロール、リトドリン、ソテレノール、テルブタリン、トレトキノール、ツロブテロール、およびキサモテロールを含む。ホスホジエステラーゼ阻害剤の非限定的な例は、アムリノン（イノコール）を含む。
【０１０８】
ｄ．抗狭心症剤
抗狭心症剤は、硝酸エステル剤（organonitrates）、カルシウムチャネル遮断剤、ベータ遮断剤、およびこれらの組合せを含んでよい。
【０１０９】
ニトロ血管拡張剤としても知られる硝酸エステル剤の非限定的な例は、ニトログリセリン（ニトロビッド、ニトロスタット）、イソソルビドジニトレート（イソルジル、ソルビトレート）、およびアミルニトレート（アスピロール、バポロール）を含む。
【０１１０】
ｖｉｉｉ．エンドセリン受容体アンタゴニスト
エンドセリン（ＥＴ）は、心不全の発症に関与すると思われる強力な生理的および病態生理的効果を有する、２１アミノ酸のペプチドである。ＥＴの効果は、細胞表面受容体の２つのクラスとの相互作用により媒介される。Ａ型受容体（ＥＴ−Ａ）が、血管収縮および細胞増殖に関連するのに対し、Ｂ型受容体（ＥＴ−Ｂ）は、上皮細胞媒介の血管拡張、および、アルドステロンなどの他の神経ホルモンの放出に関連する。ＥＴの産生、またはそれが関連細胞を刺激する能力を阻害しうる薬理作用剤は、当技術分野において知られている。ＥＴ産生の阻害は、その前駆体から活性ペプチドをプロセシングすることに関わる、エンドセリン転換酵素と称する酵素を遮断する作用剤の使用に関わる。ＥＴが細胞を刺激する能力の阻害は、ＥＴとその受容体との相互作用を遮断する作用剤の使用に関わる。エンドセリン受容体アンタゴニスト（ＥＲＡ）の非限定的な例は、ボセンタン、エンラセンタン、アンブリセンタン、ダルセンタン、テゾセンタン、アトラセンタン、アボセンタン、クラゾセンタン、エドネンタン、シタクスセンタン、ＴＢＣ３７１１、ＢＱ１２３、およびＢＱ７８８を含む。
【０１１１】
Ｄ．外科的治療処置
特定の態様において、副次的治療処置は、例えば、予防的手術、診断的または病期分類的手術、治癒的および緩和的手術を含む、一部の種類の手術を含んでよい。手術、特に、治癒的手術は、本発明および１つ以上の他の作用剤など、他の治療と組み合わせて用いてよい。
【０１１２】
血管および心血管の疾患および障害用のこうした外科的治療処置は、当業者によく知られており、生体に対して手術を行うこと、心血管用の機械的人工装具を装着すること、血管形成術、冠動脈再灌流、カテーテルアブレーション、対象に植込み式心除細動器を装着すること、機械的循環補助、またはこれらの組合せを含みうるがこれに限定されない。本発明において用いうる機械的循環補助の非限定的な例は、動脈内バルーンカウンターパルセーション、左室補助機器、またはこれらの組合せを含む。
【０１１３】
Ｅ．製剤および患者への投与経路
臨床的適用を意図する場合、医薬組成物は、目的とする適用に適切な形態で調製される。一般に、これは、発熱物質のほか、ヒトまたは動物に有害でありうる他の不純物を基本的に含まない組成物を調製することを含む。
【０１１４】
一般に、適切な塩および緩衝液を用いて、送達ベクターを安定に保ち、標的細胞による取り込みを可能とすることが望ましい。緩衝液は、組換え細胞を患者に導入するときにも用いられる。本発明の水性組成物は、薬学的に許容できる担体または水性媒体中で溶解または懸濁させた、有効量のベクターまたは細胞を含む。「薬学的に許容できる」または「薬理的に許容される」という表現は、動物またはヒトに投与したとき、有害反応、アレルギー反応、または他の予期しない反応をもたらさない分子実体および組成物を指す。本明細書で用いる「薬学的に許容できる担体」は、ヒトへの投与に適する医薬品など、医薬品の調製における使用に許容可能な、溶媒、緩衝液、溶液、懸濁媒体、被覆、抗菌剤および抗真菌剤、等張性で吸収を遅延させる作用剤などを含む。薬学的に活性な物質に対するこうした媒体および作用剤の使用は、当技術分野においてよく知られている。従来の媒体または作用剤が、本発明の活性成分と適合しない場合を除き、治療用組成物におけるその使用が意図される。組成物のベクターまたは細胞を不活化しない限り、補助的な活性成分も、組成物に組み込むことができる。
【０１１５】
本発明の活性組成物は、従来の医薬製剤を含んでよい。本発明によるこれらの組成物の投与は、標的組織がその経路を介して到達可能である限り、任意の通例の経路を介してよい。これは、経口、経鼻、または口腔内を含む。あるいは、投与は、皮内注射、皮下注射、筋肉内注射、腹腔内注射、もしくは静脈内注射によってもよく、または心筋組織内への直接の注射によってもよい。こうした組成物は、通常、上記の薬学的に許容できる組成物として投与される。
【０１１６】
活性化合物は、また、非経口投与または腹腔内投与してもよい。例示としては、遊離塩基または薬理学的に許容される塩としての活性化合物溶液を、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と共に適切に混合された水中で調整することができる。懸濁液も、グリセロール、液体のポリエチレングリコール、およびこれらの混合物、ならびに油中で調製することができる。保存および使用の通常の条件下において、これらの製剤は、一般に、微生物の増殖を防止するため、防腐剤を含有する。
【０１１７】
注射使用に適する医薬形態は、例えば、滅菌水性溶液または懸濁液、および滅菌注射用溶液または懸濁液の即時調製用滅菌粉末を含む。一般に、これらの製剤は、無菌であり、容易な注射が可能である程度の液体である。製剤は、製造および保存の条件下において安定であり、細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して保護されるべきである。適切な溶媒または懸濁液媒体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体のポリエチレングリコールなど）、これらの適切な混合物、および植物油を含有してよい。適正な流動性は、例えば、レシチンなどの被覆の使用、懸濁液の場合に必要とされる粒子サイズの維持、および界面活性剤の使用により維持することができる。微生物活性の阻止は、各種の抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによりもたらしうる。多くの場合、等張剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを含むことが好ましいであろう。注射用組成物の長期にわたる吸収は、組成物における吸収遅延剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの使用によりもたらすことができる。
【０１１８】
滅菌注射用溶液は、所望に応じて他の任意の成分（例えば、上に列挙した成分）と共に、溶媒中に適量の活性化合物を組み込んだ後、濾過による滅菌を行うことにより調製してよい。一般に、懸濁液は、各種の滅菌済み活性成分を、基本的な懸濁媒体と所望の他の成分、例えば、上に列挙した成分とを含有する滅菌媒体内に組み込むことにより調製する。滅菌注射用溶液調製用の滅菌粉末の場合、調製の好ましい方法は、（１つ以上の）活性成分と、既に滅菌濾過済みのその溶液からの任意のさらなる所望の成分とを加えた粉末を産生する、真空乾燥法および凍結乾燥法を含む。
【０１１９】
経口投与の場合、本発明のポリペプチドは、一般に、賦形剤と共に組み込み、非嚥下用の口腔洗浄液および歯磨剤の形態で使用してよい。口腔洗浄液は、必要量の活性成分を、ホウ酸ナトリウム溶液（Ｄｏｂｅｌｌ溶液）などの適切な溶媒中に組み込んで調製してよい。あるいは、活性成分は、ホウ酸ナトリウム、グリセリン、および重炭酸カリウムを含有する防腐洗浄液内に組み込んでよい。活性成分は、ゲル、ペースト、粉末、およびスラリーを含む歯磨剤中に懸濁させてもよい。活性成分は、水、結合剤、研磨剤、芳香剤、発泡剤、および保湿剤を含みうるペースト状の歯磨剤に、治療上有効な量を添加してよい。
【０１２０】
本発明の組成物は、一般に、中性または塩の形態で調製してよい。薬学的に許容できる塩は、例えば、無機酸（例えば、塩酸またはリン酸）、または有機酸（例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸など）に由来する、酸添加塩（タンパク質の遊離アミノ基により形成）を含む。タンパク質の遊離カルボキシル基により形成される塩は、また、無機塩基（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、または水酸化鉄）、または有機塩基（例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなど）に由来しうる。
【０１２１】
調合後の溶液は、投与製剤に適合する方式、および治療上有効な量で投与することが好ましい。製剤は、注射用溶液、薬剤放出カプセルなど各種の剤形により、容易に投与しうる。例えば、水溶液による非経口投与の場合、一般に、溶液を適度に緩衝させ、液体の希釈剤を、まず、例えば、十分な生理食塩液またはグルコースにより等張にする。こうした水溶液は、例えば、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、および腹腔内投与に用いてよい。特に、本開示に照らせば、当業者に知られる通り、滅菌水性媒体を用いることが好ましい。例示として、単回の用量は、等張のＮａＣｌ溶液１ｍｌ中に溶解し、１０００ｍｌの皮下注入液に添加するか、または、注入予定の部位に注射してよい（例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、第１５版、１０３５〜１０３８頁、および１５７０〜１５８０頁を参照のこと）。治療される対象の状態に応じて、用量の一定の変更が必然的に生じるであろう。いかなる場合においても、投与責任者が個体対象に対する適切な用量を決定する。さらに、ヒトへの投与の場合、製剤は、ＦＤＡの生物学的製剤部局による基準が要求する、無菌性基準、発熱性基準、一般的安全性基準、および純度基準を満たすべきである。
【０１２２】
ＩＶ．筋骨格疾患および線維性疾患を治療する方法
複数の骨格速筋収縮タンパク質遺伝子のアップレギュレーションが、ｍｉＲ−２０８変異マウスの心臓で観察された。ｍｉＲ−２０８変異マウスの心臓における骨格速筋収縮タンパク質遺伝子のこのアップレギュレーションは、ｍｉＲ−２０８が、骨格速筋遺伝子プログラムを抑制することを示す。骨格筋では、遅筋線維遺伝子の抑制および速筋線維遺伝子の活性化が、非活動性委縮、抗重力または脱神経に応じた筋消耗を含む多数の筋骨格障害と関連する。したがって、骨格筋細胞におけるｍｉＲ−２０８の発現は、速筋線維遺伝子を抑制し、これにより、遅筋線維遺伝子の相反的発現を活性化するのに有用でありうる。したがって、特定の実施形態において、本発明は、筋骨格障害を有する、または筋骨格障害を発症する危険性のある対象の骨格筋にｍｉＲ−２０８を投与することにより、筋骨格障害を治療する方法を提供する。
【０１２３】
成体の骨格筋線維は、特殊化した収縮特性および代謝特性に基づき、速い単収縮サブタイプと遅い単収縮サブタイプとに種別することができる。これらの特性は、ミオシン重鎖およびミオシン軽鎖、トロポミオシン、ならびにトロポニンのほか、ミオグロビンの速筋収縮タンパク質アイソフォームおよび遅筋収縮タンパク質アイソフォームの特異的なセットの発現を反映する（Ｎａｙａら、２０００年）。遅い単収縮筋は、主に、姿勢の維持や持続的な自発運動などの長期的活動に用いられる。速い単収縮線維は、主に、強い力の瞬発的な活動に用いられる。成体骨格筋の表現型は、静的ではなく、むしろ耐荷重性および収縮使用パターンの変化に適応する能力を保持し、形態、表現型、および収縮特性における適応をもたらす。例えば、宇宙飛行の微小重力環境における体荷重の除去は、げっ歯類およびヒトのいずれについても、著明な程度の筋委縮と、遅筋性の収縮特性および代謝特性から速筋性の収縮特性および代謝特性への変化と相関するタンパク質表現型の変化とをもたらす（Ｔｓｉｋａら、２００２年；ＢａｌｄｗｉｎおよびＨａｄｄａｄ、２００１年；ＥｄｇｅｒｔｏｎおよびＲｏｙ、２０００年；Ｆｉｔｔｓら、２０００年）。したがって、特定の実施形態において、本発明は、骨格筋にｍｉＲ−２０８を投与することにより、重力低下環境に応じた筋消耗を治療または予防する方法を提供する。
【０１２４】
非活動性委縮とは、筋を使用しないことから生ずる筋委縮である。非活動性委縮は、病臥者、体肢へのギプス装着者、または他の理由による非活動者において見られるのが通例である。加えて、脱神経を含む筋原線維の電気活動の途絶が、筋委縮をもたらす。短期間の廃用後なら、筋委縮は可逆的である。しかし、極度の筋廃用は、骨格筋線維の永久的消失、および結合組織によるこれらの線維の置換をもたらしうる。骨格筋における速筋線維遺伝子を抑制し、これにより、遅筋線維遺伝子の相反的な発現を活性化することにより、筋委縮の症状を軽減または予防しうることが意図される。したがって、特定の実施形態において、本発明は、骨格筋にｍｉＲ−２０８を投与することにより、筋委縮を治療または予防する方法を提供する。
【０１２５】
心臓における線維症の制御に重要な役割を果たすことに加えて、ｍｉＲ−２９ファミリー分子の遍在的な発現は、それが、腎臓、肝臓、および肺に及ぶ場合など、他の線維化徴候においても役割を果たしうることを意味する。線維症は、また、糖尿病に続発しても観察される。１型および２型糖尿病患者は、心筋症のリスクが高い。糖尿病における心筋症は、拡張期コンプライアンスの低下、間質性線維症、および心筋細胞の肥大を含む一群の特徴と関連する。ｍｉＲ−２０８は、ｍｉＲ−２９を阻害するので、ｍｉＲ−２０８の阻害は、心線維症のほか、心臓以外の線維症をも阻止するのに用いることができる。
【０１２６】
先天性肝線維症（ＣＨＦ）は、肝臓および腎臓の両方に及ぶまれな疾患である。患者は、常染色体劣性形質として遺伝を受ける。肝臓の異常は、肝腫大、各器官から肝臓へと血液を運ぶ静脈系における圧上昇（門脈圧亢進症）、および、肝病変と呼ばれることの多い、肝臓上部や肝臓全体に広がる線維様の結合組織（肝線維症）である。罹患した個体は、また、常染色体劣性多嚢胞腎（ＡＲＰＫＤ）により引き起こされることが通例の、腎機能障害を有する。成体においてＣＨＦと関連する腎機能障害は、常染色体優性多嚢胞腎（ＡＤＰＫＤ）により引き起こされる。
【０１２７】
腎機能の進行性消失は、糸球体硬化症の発症と関連するだけでなく、間質性線維症の発症とも関連する。間質性線維症は、腎尿細管および間質毛細血管の破壊のほか、細胞外マトリックスタンパク質の蓄積をも特徴とする。尿細管間質性線維症の重症度は、ヒトおよび実験いずれの糸球体腎炎においても、進行性腎外傷の極めて重要な決定因子であると長年にわたり考えられている。
【０１２８】
肺線維症、または肺の瘢痕化は、線維化組織による正常な肺胞の漸進的な置換から生じる。瘢痕が形成されるとき、肺組織は肥厚し、肺組織が血流中に酸素を運ぶ能力の不可逆的な消失を引き起こす。症状は、息切れ（特に、労作による）、慢性的な乾燥、空咳、疲労および脱力、胸部の不快感、食欲消失および急速な体重減少を含む。
【０１２９】
肺線維症は、自己免疫障害、またはウイルス感染の後遺症でありうると主張する論者もあった。しかし、遺伝的素因が重要な因子であるという考えが、強まりつつある。ＳＰ−Ｃタンパク質の変異が、肺線維症の履歴を有する家族において存在することが分かっている。線維化過程とは、肺への微視的外傷に対する（遺伝的形質が素因となる）反応である、というのが最近の考えである。正確な原因は未知のままであるが、吸引された環境的汚染物質および職業的汚染物質、喫煙、強皮症、関節リウマチ、狼瘡、およびサルコイドーシスなどの疾患、特定の薬剤投与および治療的な放射線照射との関連づけがなされている。
【０１３０】
患者における糖尿病性心筋症は、心筋肥大、間質性線維症、毛細血管上皮病変、および毛細血管基底膜の肥厚を特徴とし、コラーゲン構造の変性に続発する。コラーゲン蓄積の増加が、心外膜領域および血管周囲領域において主に見出され、ここに、心不全をもたらすことの多い左室拡張機能の障害が誘発される。
【０１３１】
Ｖ．キット
本明細書に記載の任意の組成物は、キット中に含まれてよい。非限定的な例において、個々のｍｉＲＮＡは、キット内に含まれる。キットは、水と、ｍｉＲＮＡの２本鎖のハイブリダイゼーションを促進するハイブリダイゼーション緩衝液とをさらに含んでよい。キットは、また、細胞へのｍｉＲＮＡの送達を促進する１つ以上のトランスフェクション試薬を含んでよい。
【０１３２】
キットの成分は、水性媒体または凍結乾燥形態で包装してよい。キットの容器手段は、一般に、その中に成分を入れ、好ましくは、適切に分注しうる、少なくとも１本のバイアル、同試験管、同フラスコ、同ボトル、同シリンジ、または他の容器手段を含むであろう。キット中に複数の成分が存在する場合（標識試薬および標識は、一括包装してよい）、キットは、また、一般に、その中に追加成分を個別に入れうる第２、第３、または他の追加の容器を含有するであろう。しかし、バイアル中には、成分の様々な組合せが含まれてよい。本発明のキットは、また、核酸を収容する手段、および、他の任意の試薬容器を、市販用の密封状態において含むのが通例であろう。こうした容器は、所望のバイアルが保持される、射出成形またはブロー成形によるプラスチック製容器を含みうる。
【０１３３】
キットの成分が、１種および／または複数種の液体溶液で提供される場合、液体溶液は水溶液であり、滅菌水溶液が特に好ましい。
【０１３４】
しかし、キットの成分は、（１種以上の）乾燥粉末として提供してもよい。試薬および／または成分が、乾燥粉末として提供される場合、粉末は、適切な溶媒の添加により再構成することができる。溶媒は、また、別の容器手段により提供してもよいことが想定される。
【０１３５】
容器手段は、一般に、その中に核酸製剤を入れ、好ましくは、適切に分注する、少なくとも１本のバイアル、同試験管、同フラスコ、同ボトル、同シリンジ、および／または他の容器手段を含む。キットは、また、無菌の薬学的に許容できる緩衝液および／または他の希釈剤を収容する第２の容器手段を含んでもよい。
【０１３６】
本発明のキットは、また、バイアルを、例えば、所望のバイアルが保持される、射出成形および／またはブロー成形によるプラスチック製容器など、市販用の密封状態に収容する手段を含むのが通例であろう。
【０１３７】
こうしたキットは、また、ｍｉＲＮＡを保存もしくは維持する成分、またはその分解に対して保護する成分を含んでよい。こうした成分は、ＲＮＡアーゼ非含有でもよく、ＲＮＡアーゼに対して保護的でもよい。こうしたキットは、一般に、各個別の試薬または溶液用の個別の容器を、適切な手段で含む。
【０１３８】
キットは、また、キット成分を用いるための指示書のほか、キットに含まれない他の任意の試薬の使用のための指示書を含む。指示書は、実施できる変更形態を含んでよい。
【０１３９】
こうした試薬は、本発明のキットの実施形態であることが意図される。しかし、こうしたキットは、上に同定された特定の細目に限定されず、ｍｉＲＮＡの操作または特徴付けに用いられる任意の試薬を含んでよい。
【０１４０】
ＶＩ．スクリーニング法
本発明は、心肥大または心不全の予防または治療または可逆化に有用な、ｍｉＲ−２０８阻害剤を同定する方法をさらに含む。これらのアッセイは、候補物質の大規模なライブラリーのランダムなスクリーニングを含んでよく、あるいは、アッセイを用いて、それがｍｉＲ−２０８の発現および／または機能を阻害する可能性をより高くすると考えられる、構造的な属性に着眼して選択された特定のクラスの化合物に焦点を合わせてもよい。
【０１４１】
ｍｉＲ−２０８の調節物質を同定するには、一般に、候補物質の存在および不在下において、ｍｉＲ−２０８の機能を判定する。例えば、方法は、一般に、
（ａ）候補調節物質を供給することと、
（ｂ）候補調節物質を、ｍｉＲ−２０８と混合することと、
（ｃ）ｍｉＲ−２０８活性を測定することと、
（ｄ）工程（ｃ）における活性を、候補調節物質の不在下における活性と比較することと、
を含み、測定された活性間の差から、候補調節物質が、実際に、ｍｉＲ−２０８の調節物質であることが示唆される。アッセイは、また、単離された細胞、摘出された器官、または生体において実施できる。
【０１４２】
有効な候補物質が見出されないことがあるにもかかわらず、本発明のすべてのスクリーニング法がそれ自体において有用であることは、当然ながら理解されるであろう。本発明は、こうした候補物質をスクリーニングする方法を提供するのであり、これらを見出す方法のみを提供するのではない。
【０１４３】
Ａ．調節物質
本明細書で用いる「候補物質」という用語は、ｍｉＲ−２０８のβ−ＭＨＣ誘導機能を潜在的に調節しうる任意の分子を指す。有用な化合物の同定を「網羅的に行う」努力の中で、各種の市販供給源から有用な薬剤の基本的な基準を満たすと考えられる分子ライブラリーを得るのが通例であろう。組合せにより産生されたライブラリー（例えば、ｍｉＲＮＡアンタゴニストライブラリー）を含むこうしたライブラリーのスクリーニングは、活性について多数の関連する（および関連しない）化合物をスクリーニングする、迅速で効率的な方法である。組合せ法は、活性ではあるがその他の点では望ましくない化合物をモデルとする第２世代、第３世代、および第４世代の化合物の創出により、潜在的な薬剤の迅速な進化にも役立つ。
【０１４４】
Ｂ．ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ
行うのが迅速、廉価で、容易なアッセイは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイである。こうしたアッセイは、一般に、単離された分子を用い、迅速かつ多数において行うことができ、これにより、短期間に得られる情報量を増大させる。試験管、プレート、ディッシュ、および、試験紙またはビーズなど、他の表面を含む各種の器具を用いてアッセイを行ってよい。
【０１４５】
化合物のハイスループットスクリーニング法は、ＷＯ８４／０３５６４に記載されている。多数の小型ｍｉＲＮＡアンタゴニスト化合物は、プラスチック製ピンまたは一部の他の表面など、固体基質上で合成してよい。こうした分子は、それらがｍｉＲ−２０８とハイブリダイズする能力について、迅速にスクリーニングすることができる。
【０１４６】
Ｃ．ｉｎ  ｃｙｔｏアッセイ
本発明は、細胞におけるｍｉＲ−２０８の発現および機能を調節する能力についての化合物のスクリーニングをも意図する。この目的のために特別に遺伝子操作された細胞を含め、骨格筋細胞に由来する場合を含む各種の細胞系を、こうしたスクリーニングアッセイに用いることができる。Ｈ９Ｃ２細胞系と同様に、初代心筋細胞も用いてよい。
【０１４７】
Ｄ．ｉｎ  ｖｉｖｏアッセイ
ｉｎ  ｖｉｖｏアッセイは、特定の欠損を有するか、または、候補物質が生体内の異なる細胞に到達し作用を及ぼす能力を測定するのに用いうるマーカーを有するように遺伝子操作されたトランスジェニック動物を含む、心疾患または筋骨格疾患の各種動物モデルの使用に関わる。そのサイズ、取り扱いの容易さ、ならびにその生理的および遺伝的組成に関する情報により、マウスが、特に、トランスジェニック動物用に好ましい実施形態である。しかし、ラット、ウサギ、ハムスター、モルモット、アレチネズミ、ウッドチャック、ネコ、イヌ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマ、およびサル（チンパンジー、テナガザル、およびヒヒを含む）を含む他の動物も同様に適する。阻害剤のアッセイは、これらの任意の動物種に由来する動物モデルを用いて行ってよい。
【０１４８】
試験化合物による動物の治療は、動物への適切な形態での化合物の投与を伴うであろう。投与は、臨床的目的に用いうる任意の経路により行われるであろう。ｉｎ  ｖｉｖｏでの化合物の有効性の判定は、心肥大によるシグナル伝達経路の変化、および心肥大の物理的症状を含むがこれに限定されない各種の異なる基準を伴ってよい。また、毒性および用量反応関係の測定は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｃｙｔｏアッセイにおけるよりも動物における方が、より意義深いやり方で行うことができる。
【０１４９】
ＶＩＩ．クローニング、遺伝子導入、および遺伝子発現用のベクター
特定の実施形態内では、発現ベクターを用いて、ｍｉＲ−２０８、またはその阻害剤を発現させる。発現は、ベクター内に適切なシグナルが供給され、これが、宿主細胞における対象遺伝子の発現を導く、ウイルスおよび哺乳動物両方の供給源に由来するエンハンサー／プロモーターなど、各種の調節エレメントを含むことを必要とする。宿主細胞におけるメッセンジャーＲＮＡの安定性および翻訳可能性を最適化するよう設計されたエレメントも、定められる。産物を発現する恒久的で安定した細胞クローンを確立するための多数の有力な薬剤選択マーカーの使用条件も、薬剤選択マーカーの発現をポリペプチドの発現に関連させるエレメントと同様に提供される。
【０１５０】
Ａ．調節エレメント
本出願を通して、「発現構築物」という用語は、配列をコードする核酸の一部またはすべてが転写される能力を有する遺伝子産物をコードする核酸を含有する任意の種類の遺伝子構築物を含むことを意味する。転写物は、タンパク質に翻訳されうるが、その必要はない。特定の実施形態において、発現は、遺伝子の転写およびｍＲＮＡの遺伝子産物への翻訳をともに含む。他の実施形態において、発現は、対象遺伝子をコードする核酸の転写のみを含む。
【０１５１】
特定の実施形態において、遺伝子産物をコードする核酸は、プロモーターの転写制御下にある。「プロモーター」とは、細胞の合成機構、または導入された合成機構により認識されるＤＮＡ配列を指し、遺伝子の特異的な転写を開始するのに必要とされる。「転写制御下に」という表現は、プロモーターが、ＲＮＡポリメラーゼによる転写開始と遺伝子の発現とを制御するのに、核酸との関係で正しい位置と方向づけにあることを意味する。
【０１５２】
プロモーターという用語は、本明細書において、ＲＮＡポリメラーゼＩＩによる転写開始部位の周囲に集まる、転写制御モジュールの一群を指すのに用いられる。いかにしてプロモーターが組織化されるかについての思考の大半は、ＨＳＶチミジンキナーゼ（ｔｋ）およびＳＶ４０初期転写ユニットの場合を含む、複数のウイルスプロモーターの解析に由来する。近年の業績により増補されたこれらの研究は、プロモーターが、各々約７〜２０ｂｐのＤＮＡからなり、転写アクチベータータンパク質または転写リプレッサータンパク質に対する１つ以上の認識部位を含有する、個別的な機能モジュールからなることを示している。
【０１５３】
各プロモーター中で少なくとも１つのモジュールが、ＲＮＡ合成の開始部位を定めるよう機能する。この最もよく知られた例が、ＴＡＴＡボックスであるが、哺乳動物のターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ遺伝子のプロモーターおよびＳＶ４０後期遺伝子のプロモーターなど、ＴＡＴＡボックスを欠く一部のプロモーターにおいては、転写開始部位に重なる個別的なエレメント自体が、転写開始の位置を画定する助けとなる。
【０１５４】
さらなるプロモーターエレメントが、転写開始の頻度を調節する。多数のプロモーターが、転写開始部位の下流にある機能エレメントも同様に含有することが近年示されてはいるが、これらは、転写開始部位の３０〜１１０ｂｐ上流の領域に位置するのが通例である。エレメントが互いに対して反転したり移動したりする場合にプロモーター機能が保存されるように、プロモーターエレメント間の間隔は可動的であることが多い。ｔｋプロモーターにおいては、活性が低下し始める前に、プロモーターエレメント間の間隔が５０ｂｐまで増大しうる。個々のエレメントは、プロモーター次第で、相乗的または個別的に機能して転写を活性化しうると思われる。
【０１５５】
他の実施形態では、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の前初期遺伝子プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスの長い末端反復配列（long terminal repeat）、ラットインスリンプロモーター、およびグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼを用いて、対象コード配列の高レベルの発現を得ることができる。発現レベルが所与の目的に対して十分であるならば、対象コード配列の発現を達成するのに当技術分野でよく知られた他のウイルスプロモーターまたは哺乳動物細胞プロモーターまたは細菌ファージプロモーターの使用も意図される。
【０１５６】
よく知られた特性を有するプロモーターを用いることにより、トランスフェクションまたは形質転換後の対象タンパク質発現のレベルおよびパターンを最適化することができる。さらに、特定の生理的シグナルに応じて調節されるプロモーターを選択すれば、遺伝子産物の誘導発現を可能とすることができる。表１および２は、本発明の文脈において、対象遺伝子の発現を調節するのに用いうる、複数の調節エレメントを一覧にする。この一覧は、遺伝子発現のプロモーションに関与する可能なすべてのエレメントに対して網羅的であることを意図するものではなく、単に、その例示であることを意図するものである。
【０１５７】
エンハンサーは、同じＤＮＡ分子の遠隔の位置にあるプロモーターに由来する転写を増大させる遺伝子エレメントである。エンハンサーは、プロモーターと酷似した形で組織される。すなわち、エンハンサーは、各々が１つ以上の転写タンパク質に結合する多数の個別的なエレメントからなる。
【０１５８】
エンハンサーとプロモーターとの基本的な区別は、作動的なものである。エンハンサー領域は、全体として、遠隔の転写物を刺激する能力を有さなければならず、これは、プロモーター領域またはその構成要素であるエレメントには当てはまらなくてよい。一方、プロモーターが、特定の部位における特定の方向づけにおいてＲＮＡ合成の開始を導く１つ以上の要素を有さなければならないのに対し、エンハンサーは、これらの特異性を欠いている。プロモーターとエンハンサーとは、重複および隣接することが多く、極めて類似したモジュール構成を有することが多いと思われる。
【０１５９】
以下は、発現構築物において対象遺伝子をコードする核酸と組み合わせて用いうる、ウイルスプロモーター、細胞プロモーター／エンハンサー、および誘導プロモーター／エンハンサーの一覧である（表１および表２）。加えて、プロモーター／エンハンサーの任意の組合せ（真核生物プロモーターデータベースＥＰＤＢによる）を用いて、遺伝子発現を導くこともできる。送達複合体の部分として、または追加の遺伝子発現構築物として、適切な細菌ポリメラーゼが供給されるなら、真核生物細胞は、特定の細菌プロモーターに由来する細胞質内転写を支援することができる。
【０１６０】
【表１】
2014001243.tif 000002
【０１６１】
【表２】
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【０１６２】
【表３】
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【０１６３】
【表４】
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【０１６４】
筋特異的なプロモーター、より具体的には、心筋特異的なプロモーターを特に対象とする。これらは、ミオシン軽鎖２プロモーター（Ｆｒａｎｚら、１９９４年；Ｋｅｌｌｙら、１９９５年）、アルファアクチンプロモーター（Ｍｏｓｓら、１９９６年）、トロポニン１プロモーター（Ｂｈａｖｓａｒら、１９９６年）；Ｎａ＋／Ｃａ＋交換プロモーター（Ｂａｒｎｅｓら、１９９７年）、ジストロフィンプロモーター（Ｋｉｍｕｒａら、１９９７年）、アルファ７インテグリンプロモーター（ＺｉｏｂｅｒおよびＫｒａｍｅｒ、１９９６年）、脳ナトリウム利尿ペプチドプロモーター（ＬａＰｏｉｎｔｅら、１９９６年）、およびアルファＢクリスタリン／小型熱ショックタンパク質プロモーター（Ｇｏｐａｌ−Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ、１９９５年）、アルファミオシン重鎖プロモーター（Ｙａｍａｕｃｈｉ−Ｔａｋｉｈａｒａら、１９８９年）、およびＡＮＦプロモーター（ＬａＰｏｉｎｔｅら、１９８８年）を含む。
【０１６５】
ｃＤＮＡの挿入を用いる場合、遺伝子転写物の正しいポリアデニル化を実行するポリアデニル化シグナルを含むよう望むことが通例であろう。ポリアデニル化シグナルの性質は、本発明の実施の成功に重要であるとは考えられず、ヒト成長ホルモンのポリアデニル化シグナルおよびＳＶ４０のポリアデニル化シグナルなど、任意のこうした配列を用いてよい。また、発現カセットのエレメントとして、ターミネーターも意図される。これらのエレメントは、メッセージレベルを増強させ、該カセットから他の配列内に至るリードスルーを最小化するのに役立ちうる。
【０１６６】
Ｂ．選択マーカー
本発明の特定の実施形態において、細胞は、本発明の核酸構築物を含有し、細胞は、発現構築物中にマーカーを含むことにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで同定しうる。こうしたマーカーは、発現構築物を含有する細胞の容易な同定を可能とする、細胞への同定可能な変化を与える。通常、薬剤選択マーカーの含有は、形質転換細胞のクローニングおよび選択に役立ち、例えば、ネオマイシン、プロマイシン、ハイグロマイシン、ＤＨＦＲ、ＧＰＴ、ゼオシン、およびヒスチジノールに耐性を与える遺伝子は、有用な選択マーカーである。あるいは、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ｔｋ）またはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）などの酵素を用いてもよい。免疫マーカーを用いることもできる。遺伝子産物をコードする核酸と同時に発現される能力を有する限りにおいて、用いられる選択マーカーが重要であるとは考えられない。選択マーカーのさらなる例は、当業者によく知られている。
【０１６７】
Ｃ．多重遺伝子構築物およびＩＲＥＳ
本発明の特定の実施形態では、内部リボゾーム結合部位（ＩＲＥＳ）エレメントを用いて、多重遺伝子またはポリシストロニックのメッセージを作り出す。ＩＲＥＳエレメントは、５’側メチル化キャップ依存型翻訳のリボゾームスキャニングモデルを回避し、内部部位において翻訳を開始する能力を有する（ＰｅｌｌｅｔｉｅｒおよびＳｏｎｅｎｂｅｒｇ、１９８８年）。ピカノウイルスファミリーの２つのメンバー（ポリオウイルスおよび脳心筋炎ウイルス）に由来するＩＲＥＳエレメント（ＰｅｌｌｅｔｉｅｒおよびＳｏｎｅｎｂｅｒｇ、１９８８年）のほか、哺乳動物メッセージに由来するＩＲＥＳ（ＭａｃｅｊａｋおよびＳａｒｎｏｗ、１９９１年）も記載されている。ＩＲＥＳエレメントは、異種オープンリーディングフレームに連結することができる。各々がＩＲＥＳにより分離された複数のオープンリーディングフレームを一括して転写し、ポリシストロニックのメッセージを作り出すことができる。ＩＲＥＳエレメントにより、各オープンリーディングフレームがリボゾームに接近可能となり、効率的な翻訳が行われる。単一のメッセージを転写する単一のプロモーター／エンハンサーを用いて、複数の遺伝子を効率的に発現することができる。
【０１６８】
任意の異種オープンリーディングフレームを、ＩＲＥＳエレメントに連結することができる。これは、分泌タンパク質の遺伝子、独立の遺伝子によりコードされる多重サブユニットタンパク質の遺伝子、細胞内または膜結合タンパク質の遺伝子、および選択マーカーの遺伝子を含む。したがって、複数のタンパク質の発現を、単一の構築物および単一の選択マーカーを有する細胞内で同時に操作することができる。
【０１６９】
Ｄ．発現ベクターの送達
発現ベクターを細胞内に導入しうる多数の方法が存在する。本発明の特定の実施形態において、発現構築物は、ウイルスゲノムに由来するウイルス構築物または遺伝子操作された構築物を含む。特定のウイルスが受容体に媒介されるエンドサイトーシスを介して細胞内に入る能力、宿主細胞ゲノム中に組み込まれてウイルス遺伝子を安定的かつ効率的に発現する能力により、ウイルスは、外来遺伝子を哺乳動物細胞内に導入するための好適な候補物質となっている（Ｒｉｄｇｅｗａｙ、１９８８年；ＮｉｃｏｌａｓおよびＲｕｂｅｎｓｔｅｉｎ、１９８８年；ＢａｉｃｈｗａｌおよびＳｕｇｄｅｎ、１９８６年；Ｔｅｍｉｎ、１９８６年）。遺伝子ベクターとして用いられた最初のウイルスは、パポバウイルス（シミアンウイルス４０、ウシ乳頭腫ウイルス、およびポリオーマウイルス）（Ｒｉｄｇｅｗａｙ、１９８８年；ＢａｉｃｈｗａｌおよびＳｕｇｄｅｎ、１９８６年）およびアデノウイルス（Ｒｉｄｇｅｗａｙ、１９８８年；ＢａｉｃｈｗａｌおよびＳｕｇｄｅｎ、１９８６年）を含むＤＮＡウイルスであった。これらは、外来ＤＮＡ配列に対する容量が相対的に低く、宿主域も狭い。さらに、許容細胞におけるその発癌性および細胞変性効果は、安全性の憂慮をもたらす。これらは、最大８ｋＢの外来遺伝子物質を収容しうるのみであるが、各種細胞系および各種実験動物に容易に導入することができる（ＮｉｃｏｌａｓおよびＲｕｂｅｎｓｔｅｉｎ、１９８８年；Ｔｅｍｉｎ、１９８６年）。
【０１７０】
ｉｎ  ｖｉｖｏにおける好ましい送達法の１つは、アデノウイルス発現ベクターの使用に関わる。「アデノウイルス発現ベクター」とは、（ａ）構築物のパッケージングを支援し、（ｂ）その中にクローニングされているアンチセンスポリヌクレオチドを発現するのに十分なアデノウイルス配列を含有する構築物を含むことを意味する。この文脈において、発現は、遺伝子産物が合成されることを必要としない。
【０１７１】
発現ベクターは、アデノウイルスの遺伝子操作された形態を含む。３６ｋＢで線状の二重鎖ＤＮＡウイルスであるアデノウイルスの遺伝子構成に関する知識は、アデノウイルスの大型ＤＮＡ断片の最大７ｋＢの外来配列による置換を可能とする（ＧｒｕｎｈａｕｓおよびＨｏｒｗｉｔｚ、１９９２年）。レトロウイルスと対照的に、アデノウイルスＤＮＡは、潜在的な遺伝子毒性なしにエピソーム的に複製することができるため、宿主細胞のアデノウイルス感染では染色体への組み込みは生じない。また、アデノウイルスは、構造的に安定であり、大規模な増幅後におけるゲノムの再配列は検出されていない。アデノウイルスは、細胞周期の段階に関わらず、ほぼすべての上皮細胞に感染しうる。これまでのところ、アデノウイルス感染は、ヒトにおける急性呼吸器疾患などの軽度の疾患のみに関連すると思われる。
【０１７２】
アデノウイルスは、その中規模のゲノムサイズ、操作の容易さ、高力価、標的細胞域の広さ、および高感染性のために、遺伝子導入ベクターとしての使用に特に適する。ウイルスゲノムの両端は、ウイルスＤＮＡの複製およびパッケージングに必要なシスエレメントである１００〜２００塩基対の逆方向反復配列（ＩＴＲ）を含有する。該ゲノムの初期（Ｅ）領域および後期（Ｌ）領域は、ウイルスＤＮＡ複製の開始により分かれる異なる転写単位を含有する。Ｅ１領域（Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ）は、ウイルスゲノムおよび数個の細胞遺伝子の転写調節の原因タンパク質をコードする。Ｅ２領域（Ｅ２ＡおよびＥ２Ｂ）の発現は、ウイルスＤＮＡ複製用タンパク質の合成をもたらす。これらのタンパク質は、ＤＮＡ複製、後期遺伝子発現、および宿主細胞シャットオフに関与する（Ｒｅｎａｎ、１９９０年）。ウイルスキャプシドタンパク質の大半を含む後期遺伝子産物は、主要後期プロモーター（ＭＬＰ）により産出される単一の初代転写物の著明なプロセシング後に初めて発現される。ＭＬＰ（１６．８ｍｕに位置する）は、感染後期において特に有効であり、このプロモーターから産出されるすべてのｍＲＮＡは、これらを翻訳に好ましいｍＲＮＡとする５’側三分割リーダー（ＴＰＬ）配列を有する。
【０１７３】
現行の系では、組換えアデノウイルスは、シャトルベクターとプロウイルスベクターとの間の相同組換えから産生される。２種類のプロウイルスベクター間の可能な組換えにより、この過程から野生型のアデノウイルスを産生しうる。したがって、個別のプラークからウイルスの単一クローンを単離し、そのゲノム構造を検討することが極めて重要である。
【０１７４】
現行の複製欠損型アデノウイルスベクターの産生および増殖は、Ａｄ５  ＤＮＡ断片によりヒト胎児腎細胞から形質転換され、Ｅ１タンパク質を構成的に発現する、２９３細胞と称する固有のヘルパー細胞系に依存する（Ｇｒａｈａｍら、１９７７年）。Ｅ３領域がアデノウイルスゲノムからなくても済む（ＪｏｎｅｓおよびＳｈｅｎｋ、１９７８年）ため、現行のアデノウイルスベクターは、２９３細胞の助けをかりて、Ｅ１、Ｄ３または両領域のいずれでも外来ＤＮＡを運ぶ（ＧｒａｈａｍおよびＰｒｅｖｅｃ、１９９１年）。本来、アデノウイルスは、野生型ゲノムの約１０５％をパッケージングすることができ（Ｇｈｏｓｈ−Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙら、１９８７年）、約２ｋｂを超えるＤＮＡ容量を提供する。Ｅ１領域およびＥ３領域において置換される約５．５ｋｂのＤＮＡと組み合わせても、現行のアデノウイルスベクターの最大容量は、７．５ｋｂ未満、または、ベクター全長の約１５％未満である。アデノウイルスゲノムの８０％超は、ベクター骨格内にあり、ベクターがもたらす細胞傷害性の源である。Ｅ１欠失ウイルスの複製欠損も不完全である。
【０１７５】
ヘルパー細胞系は、ヒト胎児の腎細胞、筋細胞、造血細胞、または、他のヒト胎児間葉細胞もしくは上皮細胞などのヒト細胞に由来してよい。あるいは、ヘルパー細胞は、ヒトアデノウイルスに許容な他の哺乳動物種の細胞に由来してもよい。こうした細胞は、例えば、ベロ細胞または他のサル胎仔間葉細胞もしくは同上皮細胞を含む。上述の通り、好ましいヘルパー細胞系は、２９３細胞である。
【０１７６】
Ｒａｃｈｅｒら（１９９５年）は、２９３細胞を培養し、アデノウイルスを増殖させるための改良法を開示した。１つの方式において、個々の細胞を１００〜２００ｍｌの培地を含有する１リットルのシリコーン処理済みスピナーフラスコ（英国、ケンブリッジ、Ｔｅｃｈｎｅ社製）内に接種することにより、天然細胞凝集体を増殖させる。４０ｒｐｍでの攪拌後、トリパンブルーにより細胞生存率を推定する。別の方式では、Ｆｉｂｒａ−Ｃｅｌ微小担体（英国、ストーン、Ｂｉｂｂｙ  Ｓｔｅｒｌｉｎ社製）（５ｇ／ｌ）を、以下の通りに用いる。５ｍｌの培地に再懸濁させた細胞接種材料を２５０ｍｌのエーレンマイヤーフラスコ中の担体（５０ｍｌ）に添加し、時折攪拌しながら１〜４時間にわたり静置する。次いで、培地を５０ｍｌの新鮮培地により置換し、振盪を開始する。ウイルス産生のため、細胞を約８０％のコンフルエンスまで増殖させ、その時間経過後、培地を置換（最終容量の２５％まで）し、０．０５の感染多重度（MOI）でアデノウイルスを添加する。培養液を一晩静置し、その後、容量を１００％まで増量し、さらに７２時間の振盪を開始する。
【０１７７】
アデノウイルスベクターが複製欠損型であるか、または、少なくとも条件付きで欠損性であることの要件以外のアデノウイルスベクターの性質は、本発明の実施の成功に重要であるとは考えられない。アデノウイルスは、４２種類の異なる既知の血清型またはサブタイプＡ〜Ｆのいずれかでありうる。アデノウイルスサブグループＣの５型は、本発明での使用のための条件付き複製欠損型アデノウイルスベクターを得るために好ましい出発物質である。これは、５型アデノウイルスが、それについて多くの生化学的および遺伝学的情報が知られているヒトアデノウイルスであり、アデノウイルスをベクターとして用いる大半の構築物に歴史的に用いられてきたからである。
【０１７８】
上述の通り、本発明による通例のベクターは、複製欠損型であり、アデノウイルスＥ１領域を有さない。したがって、Ｅ１コード配列が除去された位置に対象遺伝子をコードするポリヌクレオチドを導入することが、最も好都合であろう。しかし、アデノウイルス配列内への構築物の挿入位置は、本発明に重要ではない。対象遺伝子をコードするポリヌクレオチドは、また、Ｋａｒｌｓｓｏｎら（１９８６年）が記載するＥ３置換ベクターにおける欠失Ｅ３領域の代わりに挿入してもよく、ヘルパー細胞系またはヘルパーウイルスがＥ４欠損を補完するＥ４領域に挿入してもよい。
【０１７９】
アデノウイルスは、増殖および操作が容易で、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏともに広い宿主域を示す。ウイルスのこの群は、例えば、１ｍｌ当たり１０９〜１０１２プラーク形成単位の高力価で得ることができ、高度に感染性である。アデノウイルスのライフサイクルでは、宿主細胞ゲノム内への組み込みを必要としない。アデノウイルスベクターにより送達される外来遺伝子はエピソーム性であり、したがって、宿主細胞に対する遺伝子毒性は低い。野生型アデノウイルスによるワクチン接種の研究では、副作用が報告されず（Ｃｏｕｃｈら、１９６３年；Ｔｏｐら、１９７１年）、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける遺伝子導入ベクターとしてのその安全性および治療可能性を裏付けている。
【０１８０】
アデノウイルスベクターは、真核生物の遺伝子発現（Ｌｅｖｒｅｒｏら、１９９１年；Ｇｏｍｅｚ−Ｆｏｉｘら、１９９２年）およびワクチン開発（ＧｒｕｎｈａｕｓおよびＨｏｒｗｉｔｚ、１９９２年；ＧｒａｈａｍおよびＰｒｅｖｅｃ、１９９１年）において用いられている。近年、動物試験は、組換えアデノウイルスを遺伝子治療に用いうることを示唆した（Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−ＰｅｒｒｉｃａｕｄｅｔおよびＰｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ、１９９１年；Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔら、１９９０年；Ｒｉｃｈら、１９９３年）。異なる組織への組換えアデノウイルスの投与に関する研究は、気管滴下法（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、１９９１年；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、１９９２年）、筋肉内注射（Ｒａｇｏｔら、１９９３年）、末梢静脈内注射（ＨｅｒｚおよびＧｅｒａｒｄ、１９９３年）、および定位固定法による脳内接種（Ｌｅ  Ｇａｌ  Ｌａ  Ｓａｌｌｅら、１９９３年）を含む。
【０１８１】
レートロウイルスは、そのＲＮＡを、逆転写過程により、感染細胞内において二重鎖ＤＮＡに変換する能力を特徴とする、単鎖ＲＮＡウイルスの一群である（Ｃｏｆｆｉｎ、１９９０年）。次いで、結果として得られるＤＮＡが、プロウイルスとして細胞染色体内に安定的に組み込まれ、ウイルスタンパク質の合成を導く。該組み込みは、受容細胞およびその子孫細胞におけるウイルス遺伝子配列の保持をもたらす。レトロウイルスゲノムは、キャプシドタンパク質、ポリメラーゼ酵素、およびエンベロープ成分をそれぞれコードする３つの遺伝子である、ｇａｇ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子、およびｅｎｖ遺伝子を含有する。ｇａｇ遺伝子の上流に見出される配列は、ビリオン内への該ゲノムのパッケージングシグナルを含有する。該ウイルスゲノムの５’端および３’端には、２種類の長い末端反復（ＬＴＲ）配列が存在する。これらは、強力なプロモーターおよびエンハンサーの配列を含有し、また、宿主細胞ゲノム内での組み込みにも必要である（Ｃｏｆｆｉｎ、１９９０年）。
【０１８２】
レトロウイルスベクターを構築するためには、特定のウイルス配列の代わりに、対象遺伝子をコードする核酸をウイルスゲノム内に挿入し、複製欠損型であるウイルスを産生する。ビリオンを産生するには、ｇａｇ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子、およびｅｎｖ遺伝子を含有するが、ＬＴＲおよびパッケージング成分を含まないパッケージング細胞系を構築する（Ｍａｎｎら、１９８３年）。この細胞系に、レトロウイルスのＬＴＲおよびパッケージング配列と共に、ｃＤＮＡを含有する組換えプラスミドを導入（例えば、リン酸カルシウム沈殿法により）すると、パッケージング配列は、組換えプラスミドのＲＮＡ転写物がウイルス粒子内にパッケージングされることを可能とし、次いで、これが、培地内に分泌される（ＮｉｃｏｌａｓおよびＲｕｂｅｎｓｔｅｉｎ、１９８８年；Ｔｅｍｉｎ、１９８６年；Ｍａｎｎら、１９８３年）。次いで、組換えレトロウイルスを含有する培地を回収し、場合により濃縮し、遺伝子導入に用いる。レトロウイルスベクターは、多種多様な細胞型に感染する能力を有する。しかし、組み込みおよび安定した発現には、宿主細胞の分裂を要する（Ｐａｓｋｉｎｄら、１９７５年）。
【０１８３】
レトロウイルスベクターの特異的標的化を可能とするよう設計された新規の手法が、ウイルスエンベロープへのラクトース残基の化学的な添加によるレトロウイルスの化学的改変に基づいて、近年開発された。この改変は、シアロ糖タンパク質受容体を介して、肝細胞特異的な感染を可能としうる。
【０１８４】
レトロウイルスエンベロープタンパク質および特異的な細胞受容体に対するビオチニル化抗体を用いる、組換えレトロウイルスの標的化への異なる手法が設計された。ストレプトアビジンを用いることにより、ビオチン成分を介して抗体が連結された（Ｒｏｕｘら、１９８９年）。主要組織適合性複合体クラスＩおよびクラスＩＩ抗原に対する抗体を用いると、これらは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける同種指向性ウイルスと共にこれらの表面抗原を有する、各種のヒト細胞に対する感染を示した（Ｒｏｕｘら、１９８９年）。
【０１８５】
本発明のすべての態様において、レトロウイルスベクターの使用には、一定の制限が存在する。例えば、レトロウイルスベクターは、細胞ゲノムにおけるランダムな部位内に組み込まれるのが通例である。これは、宿主遺伝子の遮断を介するまたは隣接遺伝子の機能に干渉しうるウイルスによる調節配列の挿入を介する挿入突然変異誘発をもたらしうる（Ｖａｒｍｕｓら、１９８１年）。欠損性レトロウイルスベクターの使用に関する別の憂慮は、パッケージング細胞における野生型の複製コンピテントウイルスの潜在的な出現である。これは、組換えウイルスに由来する完全な配列が、宿主細胞ゲノムに組み込まれたｇａｇ配列、ｐｏｌ配列、ｅｎｖ配列より上流において挿入される組換え事象から生じうる。しかし、組換えの可能性を顕著に低下させる新規のパッケージング細胞系が、今や使用可能である（Ｍａｒｋｏｗｉｔｚら、１９８８年；Ｈｅｒｓｄｏｒｆｆｅｒら、１９９０年）。
【０１８６】
本発明では、他のウイルスベクターを発現構築物として用いてもよい。牛痘ウイルス（Ｒｉｄｇｅｗａｙ、１９８８年；ＢａｉｃｈｗａｌおよびＳｕｇｄｅｎ、１９８６年；Ｃｏｕｐａｒら、１９８８年）、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）（Ｒｉｄｇｅｗａｙ、１９８８年；ＢａｉｃｈｗａｌおよびＳｕｇｄｅｎ、１９８６年；ＨｅｒｍｏｎａｔおよびＭｕｚｙｃｓｋａ、１９８４年）、およびヘルペスウイルスなどのウイルスに由来するベクターを用いてよい。これらは、各種の哺乳動物細胞（Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ、１９８９年；Ｒｉｄｇｅｗａｙ、１９８８年；ＢａｉｃｈｗａｌおよびＳｕｇｄｅｎ、１９８６年；Ｃｏｕｐａｒら、１９８８年；Ｈｏｒｗｉｃｈら、１９９０年）にいくつかの好適な特徴を与える。
【０１８７】
欠損性Ｂ型肝炎ウイルスの認識により、異なるウイルス配列の構造−機能関係への新たな洞察が得られた。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの研究は、そのゲノムの最大８０％の欠失にもかかわらず、ウイルスがヘルパー依存的なパッケージングおよび逆転写の能力を保持しうることを示した（Ｈｏｒｗｉｃｈら、１９９０年）。これは、該ゲノムの大部分が、外来の遺伝子物質により置換しうることを示唆した。肝向性（hepatotropism）および持続性（組み込み）が、肝指向性の遺伝子導入に特に好適な特性であった。Ｃｈａｎｇらは、ポリメラーゼコード配列、表面コード配列、およびプレ表面コード配列の代わりに、アヒルＢ型肝炎ウイルスゲノム内に、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子を導入した。該遺伝子は、野生型ウイルスと共に、鳥類肝癌細胞系内に共トランスフェクトされた。高力価の組換えウイルスを含有する培地を用いて、初代アヒルヒヨコ肝細胞に感染させた。トランスフェクション後少なくとも２４日間にわたり、安定したＣＡＴ遺伝子発現を検出した（Ｃｈａｎｇら、１９９１年）。
【０１８８】
センスまたはアンチセンスの遺伝子構築物の発現を実行するためには、発現構築物を細胞内に送達しなければならない。この送達は、形質転換細胞系用の実験手順の場合はｉｎ  ｖｉｔｒｏで、または、特定の病態の治療の場合はｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで実現しうる。送達の一機構は、発現構築物が、感染性ウイルス粒子内のキャプシドに包まれるウイルス感染を介する。
【０１８９】
培養した哺乳動物細胞内に、ウイルスを用いずに発現構築物を導入するいくつかの方法も、本発明により意図される。これらは、リン酸カルシウム沈殿法（ＧｒａｈａｍおよびＶａｎ  Ｄｅｒ  Ｅｂ、１９７３年；ＣｈｅｎおよびＯｋａｙａｍａ、１９８７年；Ｒｉｐｐｅら、１９９０年）、ＤＥＡＥデキストラン法（Ｇｏｐａｌ、１９８５年）、電気穿孔法（Ｔｕｒ−Ｋａｓｐａら、１９８６年；Ｐｏｔｔｅｒら、１９８４年）、直接微量注射法（ＨａｒｌａｎｄおよびＷｅｉｎｔｒａｕｂ、１９８５年）、ＤＮＡ充填リポソーム法（ＮｉｃｏｌａｕおよびＳｅｎｅ、１９８２年；Ｆｒａｌｅｙら、１９７９年）、およびリポフェクタミン−ＤＮＡ複合体法、細胞超音波処理法（Ｆｅｃｈｈｅｉｍｅｒら、１９８７年）、高速マイクロプロジェクタイルを用いる遺伝子ボンバードメント法（Ｙａｎｇら、１９９０年）、および受容体媒介（receptor-mediated）トランスフェクション法（ＷｕおよびＷｕ、１９８７年；ＷｕおよびＷｕ、１９８８年）を含む。これらの技法の一部は、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏでの使用に成功裏に適応しうる。
【０１９０】
発現構築物が細胞内に送達されたら、対象遺伝子をコードする核酸の位置を定め、異なる部位で発現してよい。特定の実施形態では、細胞のゲノム内に遺伝子をコードする核酸が安定的に組み込まれてもよい。この組み込みは、相同組換えによる同系の（cognate）位置および方向づけであってもよく（遺伝子置換）、ランダムかつ非特異的な位置に組み込みまれてもよい（遺伝子増大）。さらなる実施形態において、核酸は、ＤＮＡの個別のエピソーム性セグメントとして、細胞内に安定的に維持してよい。こうした核酸セグメントまたは「エピソーム」は、宿主細胞周期から独立したまたは宿主細胞周期と同期した維持および複製を可能とするのに十分な配列をコードする。発現構築物が細胞に送達され、細胞内のどこに核酸が留置されるかは、用いる発現構築物の種類に依存する。
【０１９１】
本発明のさらに別の実施形態において、発現構築物は、単純に、裸の組換えＤＮＡまたはプラスミドからなってよい。構築物の導入は、細胞膜を物理的または化学的に透過させる、上述の任意の方法により実施してよい。これは、特に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの導入に適用されるが、同様に、ｉｎ  ｖｉｖｏでの使用に適用してもよい。Ｄｕｂｅｎｓｋｙら（１９８４年）は、リン酸カルシウム沈殿物の形態におけるポリオーマウイルスＤＮＡを、成体および新生仔マウスの肝臓および脾臓内に注射することに成功し、活発なウイルス複製および短期間での感染を示した。ＢｅｎｖｅｎｉｓｔｙおよびＮｅｓｈｉｆ（１９８６年）は、また、リン酸カルシウム沈殿法によるプラスミドの直接的な腹腔内注射が、トランスフェクトされた遺伝子の発現をもたらすことを示した。対象遺伝子をコードするＤＮＡは、また、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて類似の方式で導入され、遺伝子産物を発現してもよいことが意図される。
【０１９２】
裸のＤＮＡ発現構築物を細胞内に導入する本発明のさらに別の実施形態には、粒子ボンバードメント法が関与してよい。この方法は、ＤＮＡで被覆したマイクロプロジェクタイルを高速度に加速し、これらが細胞膜を貫通し、細胞を死滅させずに細胞内に入り込むことを可能とする能力に依存する（Ｋｌｅｉｎら、１９８７年）。小粒子を加速させる複数の機器が開発されている。こうした機器の１つは、電流を発生させ、これが起動力を供給する高電圧放電による（Ｙａｎｇら、１９９０年）。使用されるマイクロプロジェクタイルは、タングステンビーズまたは金ビーズなど、生物学的に不活性な物質からなっている。
【０１９３】
ラットおよびマウスの肝臓組織、皮膚組織、および筋組織を含む、選択された器官が、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてボンバードされている（Ｙａｎｇら、１９９０年；Ｚｅｌｅｎｉｎら、１９９１年）。これは、銃と標的器官との間に介在する任意の組織を除去する、組織または細胞の手術的な露呈、すなわち、ｅｘ  ｖｉｖｏ処置を必要とすることがある。ここでも、特定の遺伝子をコードするＤＮＡが、この方法を介して送達され、さらに本発明により組み込まれてよい。
【０１９４】
本発明のさらなる実施形態において、発現構築物は、リポソーム内に封入してよい。リポソームは、リン脂質二重層による膜および内部の水性媒体を特徴とする、小胞状の構造である。多重膜リポソームは、水性媒体によって分離された複数の脂質層を有する。これらは、リン脂質を過剰な水溶液中に懸濁させるときに自発的に形成される。脂質成分は、閉じた構造の形成前における自己再配列を経て、脂質二重層間に水および溶解した溶質を封入する（ＧｈｏｓｈおよびＢａｃｈｈａｗａｔ、１９９１年）。リポフェクタミン−ＤＮＡ複合体も意図される。
【０１９５】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける外来ＤＮＡのリポソーム媒介核酸送達および発現は、非常な成功を収めた。Ｗｏｎｇら（１９８０年）は、培養ニワトリ胚、ＨｅＬａ、および肝癌細胞における外来ＤＮＡのリポソーム媒介送達および発現の妥当性を示した。Ｎｉｃｏｌａｕら（１９８７年）は、静脈内注射後のラットにおける、リポソーム媒介遺伝子導入を成功裏に達成した。
【０１９６】
本発明の特定の実施形態において、リポソームは、センダイウイルス（ＨＶＪ）により複合体化してよい。これは、細胞膜との融合を促進し、リポソームに封入されたＤＮＡが細胞内に入ることを促進することが示されている（Ｋａｎｅｄａら、１９８９年）。他の実施形態において、リポソームは、核内の非ヒストン染色体タンパク質（ＨＭＧ−１）と組み合わせて複合体化または使用してよい（Ｋａｔｏら、１９９１年）。さらなる実施形態において、リポソームは、ＨＶＪおよびＨＭＧ−１の両方と組み合わせて複合体化または使用してよい。こうした発現構築物が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおける核酸の導入および発現において成功裏に用いられる場合、それらは、本発明に適用される。ＤＮＡ構築物に細菌プロモーターを用いる場合、リポソーム内部に適切な細菌ポリメラーゼを含むことも望ましいであろう。
【０１９７】
特定の遺伝子をコードする核酸を細胞内に送達するのに用いうる他の発現構築物は、受容体媒介送達媒体である。これらは、ほとんどすべての真核細胞における受容体媒介エンドサイトーシスによる高分子の選択的な取り込みを利用する。各種受容体の細胞型特異的な分布のため、送達は、高度に特異的であり得る（ＷｕおよびＷｕ、１９９３年）。
【０１９８】
受容体媒介遺伝子標的化の媒体は、一般に、細胞の受容体特異的なリガンドおよびＤＮＡ結合作用剤の２つの成分からなる。複数のリガンドが、受容体媒介遺伝子導入に用いられている。最も広範にわたって特徴付けられているリガンドは、アシアロオロソムコイド（ＡＳＯＲ）（ＷｕおよびＷｕ、１９８７年）およびトランスフェリン（Ｗａｇｎｅｒら、１９９０年）である。近年、ＡＳＯＲと同じ受容体を認識する合成ネオ糖タンパク質が、遺伝子送達媒体として用いられ（Ｆｅｒｋｏｌら、１９９３年；Ｐｅｒａｌｅｓら、１９９４年）、表皮成長因子（ＥＧＦ）も、扁平上皮癌細胞に遺伝子を送達するのに用いられている（Ｍｙｅｒｓ、ＥＰＯ０２７３０８５）。
【０１９９】
他の実施形態において、送達媒体は、リガンドおよびリポソームを含んでよい。例えば、Ｎｉｃｏｌａｕら（１９８７年）は、リポソーム中に組み込まれたガラクトース末端のアシアルガングリオシドであるラクトシル−セラミドを用い、肝細胞によるインスリン遺伝子の取り込みの増大を観察した。したがって、リポソームを伴うまたは伴わない任意の数の受容体−リガンド系により、特定の遺伝子をコードする核酸も、細胞型に特異的に送達できることがあり得る。例えば、ＥＧＦ受容体のアップレギュレーションを示す細胞内への、核酸媒介送達用の受容体として、表皮成長因子（ＥＧＦ）を用いてよい。マンノースを用いて、肝細胞上のマンノース受容体を標的とすることができる。また、ＣＤ５（ＣＬＬ）、ＣＤ２２（リンパ腫）、ＣＤ２５（Ｔ細胞白血病）、およびＭＡＡ（黒色腫）に対する抗体も同様に、標的化部分として用いることができる。
【０２００】
特定の実施例では、オリゴヌクレオチドを、陽イオン性脂質と組み合わせて投与してよい。陽イオン性脂質の例は、リポフェクチン、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥ、およびＤＯＴＡＰを含むがこれに限定されない。参照により具体的に組み込まれる公開ＷＯ００７１０９６は、遺伝子治療に有効に用いうるコレステロール製剤またはコレステロール誘導体製剤であるＤＯＴＡＰなどの異なる製剤について記載している。他の開示も、ナノ粒子および投与法を含む、異なる脂質製剤またはリポソーム製剤について記載しており、これらは、製剤ならびに核酸の投与および送達に関連する他の態様を開示する程度に応じて、参照により具体的に組み込まれる、米国特許公開第２００３０２０３８６５号、同第２００２０１５０６２６号、同第２００３００３２６１５号、および同第２００４００４８７８７号を含むがこれに限定されない。粒子を形成するのに用いられる方法も、これらの態様に関して参照により組み込まれる、米国特許第５，８４４，１０７号、同第５，８７７，３０２号、同第６，００８，３３６号、同第６，０７７，８３５号、第５，９７２，９０１号、第６，２００，８０１号、および第５，９７２，９００号に開示されている。
【０２０１】
特定の実施形態において、遺伝子導入は、ｅｘ  ｖｉｖｏの条件下でより容易に実施してよい。ｅｘ  ｖｉｖｏでの遺伝子治療とは、動物からの細胞の単離、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける細胞内への核酸の送達、次いでまた、改変された細胞の動物体内への返還を指す。これは、動物または細胞および組織の初代培養からの組織／器官の手術的な除去を含みうる。
【０２０２】
ＶＩＩＩ．トランスジェニックマウスの作製法
本発明の特定の実施形態は、機能的ｍｉＲ−２０８対立遺伝子の一方または両方を欠くトランスジェニック動物を提供する。また、誘導プロモーター、組織選択プロモーター、または組織構成プロモーターの制御下においてｍｉＲ−２０８を発現するトランスジェニック動物、こうした動物に由来する組換え細胞系、およびトランスジェニック胚も、心筋細胞の発生および分化、ならびに病的心肥大および心不全の発症においてｍｉＲ−２０８が果たす正確な役割を判定するのに有用でありうる。さらに、これらのトランスジェニック動物は、心臓発生への洞察を提供しうる。核酸をコードする構成的に発現されたｍｉＲ−２０８の使用は、過剰発現または非制御発現のモデルを提供する。また、一方または両方の対立遺伝子において、ｍｉＲ−２０８を「ノックアウトした」トランスジェニック動物も意図される。
【０２０３】
一般的な態様において、トランスジェニック動物は、導入遺伝子の発現を可能とする方式における、ゲノム内への所与の導入遺伝子の組み込みにより産生される。トランスジェニック動物を産生する方法は、ＷａｇｎｅｒおよびＨｏｐｐｅ（米国特許第４，８７３，１９１号；参照により本明細書に組み込まれる）、ならびにＢｒｉｎｓｔｅｒら（１９８５年；参照により本明細書に組み込まれる）により全般的に記載されている。
【０２０４】
典型的には、ゲノム配列と隣接する遺伝子は、受精卵内への微量注入により導入される。微量注入された受精卵は、宿主の雌に植え込まれ、導入遺伝子の発現について子孫細胞をスクリーニングする。トランスジェニック動物は、爬虫類、両生類、鳥類、哺乳類および魚類を含むがこれに限定されない、多数の動物に由来する受精卵から産生しうる。
【０２０５】
微量注入用のＤＮＡクローンは、当技術分野で知られる任意の手段により調製することができる。例えば、微量注入用のＤＮＡクローンは、細菌プラスミド配列を除去するのに適切な酵素により切断することができ、ＤＮＡ断片は、標準的な技法を用いて、ＴＢＥ緩衝液中の１％アガロースゲル上において電気泳動させることができる。ＤＮＡバンドは、臭化エチジウム染色により可視化し、発現配列を含有するバンドは切除する。次いで、切除したバンドを、０．３Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ７．０を含有する透析バッグ内に入れる。ＤＮＡを透析バッグ内に電気溶解し、フェノール：クロロホルム比が１：１の溶液により抽出し、２倍容量のエタノールにより沈殿させる。ＤＮＡを１ｍｌの低濃度塩緩衝液（０．２Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭトリス、ｐＨ７．４、および１ｍＭ  ＥＤＴＡ）中に再溶解させ、Ｅｌｕｔｉｐ−Ｄ（商標）カラム上で精製した。カラムは、まず、３ｍｌの高濃度塩緩衝液（１Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭトリス、ｐＨ７．４、および１ｍＭ  ＥＤＴＡ）で下塗りした後、５ｍｌの低濃度塩緩衝液により洗浄した。ＤＮＡ溶液をカラム中に３回通過させて、ＤＮＡをカラムマトリクスに結合させる。３ｍｌの低濃度塩緩衝液による１回の洗浄後、ＤＮＡを０．４ｍｌの高濃度塩緩衝液により溶出し、２倍容量のエタノールにより沈殿させる。ＤＮＡ濃度は、ＵＶ分光光度計による２６０ｎｍにおける吸収により測定する。微量注入については、ＤＮＡ濃度を、５ｍＭトリス、ｐＨ７．４および０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ中３μｇ／ｍｌに調節する。微量注入用の他のＤＮＡ精製法は、Ｐａｌｍｉｔｅｒら（１９８２年）およびＳａｍｂｒｏｏｋら（２００１年）に記載されている。
【０２０６】
例示的な微量注入手順では、妊娠雌ウマの血清ゴナドトロピン（ＰＭＳＧ；Ｓｉｇｍａ社製）の５ＩＵ注射（０．１ｃｃ、腹腔内）により、６週齢の雌マウスを過剰排卵するよう誘導した４８時間後に、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ；Ｓｉｇｍａ社製）の５ＩＵ注射（０．１ｃｃ、腹腔内）を行う。ｈＣＧ注射の直後に雌を雄と一緒に入れる。ｈＣＧ注射の２１時間後、交尾した雌を、ＣＯ２窒息または頸部脱臼により屠殺し、切除した卵管から胚を回収し、０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；Ｓｉｇｍａ社製）を有するダルベッコリン酸緩衝溶液中に入れる。周囲の卵丘細胞は、ヒアルロニダーゼ（１ｍｇ／ｍｌ）により除去する。次いで、前核胚を洗浄し、注射時まで、５％ＣＯ２、９５％空気の加湿した雰囲気を有する３７．５℃インキュベーター内の０．５％ＢＳＡを含有するアール平衡化塩溶液（ＥＢＳＳ）中に入れる。胚は、２細胞段階で植え込むことができる。
【０２０７】
任意周期の成体雌マウスを、精管切除した雄と交尾させる。Ｃ５７ＢＬ／６もしくはスイスマウスまたは他の同等の株を、この目的に用いることができる。レシピエントの雌も、ドナーの雌と同時に交尾させる。胚移植時には、体重１グラム当たり２．５％のアベルチン０．０１５ｍｌの腹腔内注射によりレシピエント雌に麻酔をかける。単回の正中線背部切開により、卵管を露出させる。次いで、卵管すぐ上部の体壁を切開する。次いで、時計技師用のピンセットで、卵嚢を除去する。移植される胚をＤＰＢＳ（ダルベッコリン酸緩衝溶液）中に入れ、移植用ピペット（約１０〜１２個の胚）の先端に入れる。ピペット先端を漏斗内に挿入し、胚を移植する。移植後、２か所の縫合により、切開部を閉止する。
【０２０８】
ＩＸ．定義
本明細書で用いられる「心不全」という用語は、心臓の血液駆出能を低下させる任意の状態を意味するのに広く用いられる。結果として、該組織においては、うっ血および浮腫が発症する。心不全は、冠動脈血流の低下から生じる心筋収縮性の低下によりもたらされるのが最も頻繁であるが、しかし、心弁への損傷、ビタミン欠損、および原発性心筋疾患を含む他の多くの因子が、心不全をもたらしうる。心不全の正確な生理的機構は完全には理解されていないが、心不全は、一般に、交感神経反応、副交感神経反応、および圧受容器反応を含む、複数の心臓自律神経特性における障害に関わると考えられている。「心不全の症状」という表現は、心不全に関連する検査所見を含む、息切れ、圧痕浮腫、肝圧痛の拡大、頸静脈のうっ血、肺内ラ音など、心不全に関連するすべての続発症を広く含むように用いられる。
【０２０９】
「治療」という用語または文法的等価物は、心不全症状（すなわち、心臓の血液駆出能）の改善および／または可逆化を含む。心臓の「生理的機能の改善」は、本明細書に記載の任意の測定値（例えば、駆出率、左室内径短縮率、左室内径、心拍数などの測定値）のほか、動物の生存に対する任意の効果を用いて評価してよい。動物モデルを用いる場合、本明細書に記載の任意のアッセイを用いて、治療されたトランスジェニック動物の反応と未治療のトランスジェニック動物の反応とを比較する（加えて、治療されたおよび未治療の非トランスジェニック動物を、対照として含めてよい）。したがって、本発明のスクリーニング法で用いられる心不全に関連する任意のパラメータの改善をもたらす化合物は、治療化合物として同定されてよい。
【０２１０】
「拡張型心筋症」という用語は、収縮期における収縮機能の低下を伴う、左室の対称的拡張の存在を特徴とするのに加え、右室に及ぶことも多い心不全の種類を指す。
【０２１１】
「化合物」という用語は、疾患、疾病、病気、または身体機能の障害を治療または予防するのに用いうる、任意の化学的実体、医薬品、薬剤などを指す。化合物は、既知の治療化合物および潜在的な治療化合物をともに含む。化合物は、本発明のスクリーニング法を用いるスクリーニングにより、治療的であることを判定することができる。「既知の治療化合物」とは、こうした治療において有効であることが（例えば、動物試験またはヒトへの投与を伴う以前の経験により）示されている治療化合物を指す。別の言葉では、既知の治療化合物は、心不全治療において有効な化合物に限定されない。
【０２１２】
本明細書で用いられる「アゴニスト」という用語は、「ネイティブな（native)」化合物または「天然」化合物の作用を模倣する分子または化合物を指す。アゴニストは、立体構造、電荷、または他の特性に関して、これらの天然化合物と同種でありうる。したがって、アゴニストは、細胞表面において発現した受容体により認識されうる。この認識は、天然化合物が存在したと仮定する場合と同様に、細胞がアゴニストの存在に対して反応するよう、細胞内部における生理的および／または生化学的変化をもたらしうる。アゴニストは、対象とする分子、受容体、および／または経路と相互作用するタンパク質、核酸、炭水化物、または他の任意の分子を含みうる。
【０２１３】
本明細書で用いられる「心肥大」という用語は、成体心筋細胞が、肥大性の成長を介してストレスに応答する過程を指す。こうした成長は、細胞分裂を伴わない細胞サイズの増大、力の産生を最大化する細胞内部におけるさらなる筋節の集合、および胎児心臓遺伝子プログラムの活性化を特徴とする。心肥大は、罹患危険性および死亡危険性の増大と関連することが多く、このため、心肥大の分子機構の理解を目的とする研究は、ヒトの健康に対して重大な影響を及ぼしうるであろう。
【０２１４】
本明細書で用いられる「アンタゴニスト」および「阻害剤」という用語は、心肥大に関わりうる細胞因子の作用を阻害する分子、化合物、または核酸を指す。アンタゴニストは、立体構造、電荷、または他の特性に関して、これらの天然化合物と同種であってもよく、または同種でなくてもよい。したがって、アンタゴニストは、アゴニストにより認識されるのと同じまたは異なる受容体により認識され得る。アンタゴニストは、アゴニストの作用を阻止するアロステリック効果を有し得る。あるいは、アンタゴニストは、アゴニストの機能を阻止し得る。アゴニストとは対照的に、アンタゴニスト性化合物は、細胞因子が存在したと仮定する場合と同様に、細胞がアンタゴニストの存在に対して反応するよう、細胞内部における病的および／または生化学的変化をもたらすことはない。アンタゴニストおよび阻害剤は、対象とする受容体、分子、および／または経路と結合または相互作用するタンパク質、核酸、炭水化物、または他の任意の分子を含んでもよい。
【０２１５】
本明細書で用いられる「調節する」という用語は、生物活性の変化または変更を指す。調節は、タンパク質活性の増加または低下でもよく、腎活性の変化でもよく、結合特性の変化でもよく、対象タンパク質または他の対象構造の活性に関連する生物特性、機能特性、または免疫特性の他の任意の変化でもよい。「調節物質（modulator）」という用語は、上記の生物活性を変化させるまたは変更する能力を有する、任意の分子または化合物を指す。
【０２１６】
「βアドレナリン作動性受容体アンタゴニスト」という用語は、アドレナリン受容体（すなわち、カテコールアミン、特に、ノルエピネフリンに応答するアドレナリン作動系の受容体）のベータ（β）型を部分的または完全に遮断する能力を有する化合物または化学的実体を指す。一部のβアドレナリン作動性受容体アンタゴニストは、１つの受容体サブタイプ（一般に、β１）に対して一定の特異性を示し、こうしたアンタゴニストは、「β１特異的アドレナリン作動性受容体アンタゴニスト」および「β２特異的アドレナリン作動性受容体アンタゴニスト」と呼ばれる。「βアドレナリン作動性受容体アンタゴニスト」という用語は、選択的アンタゴニストおよび非選択的アンタゴニストである化合物を指す。βアドレナリン作動性受容体アンタゴニストの例は、アセブトロール、アテノロール、ブトキサミン、カルテオロール、エスモロール、ラベトロール、メトプロロール、ナドロール、ペンブトロール、プロパノロール、およびチモロールを含むがこれに限定されない。既知のβアドレナリン作動性受容体アンタゴニストの誘導体の使用は、本発明の方法に含まれる。実際、βアドレナリン作動性受容体アンタゴニストとして機能的に挙動する任意の化合物は、本発明の方法に含まれる。
【０２１７】
「アンジオテンシン転換酵素阻害剤」または「ＡＣＥ阻害剤」という用語は、レニン−アンジオテンシン系において、比較的不活性なアンジオテンシンＩから活性なアンジオテンシンＩＩへの転換に関わる酵素を、部分的または完全に阻害する能力を有する化合物または化学的実体を指す。加えて、ＡＣＥ阻害剤は、ブラジキニンの分解を同時に阻害し、これが、ＡＣＥ阻害剤の抗高血圧効果を顕著に促進する可能性が高い。ＡＣＥ阻害剤の例は、ベナゼプリル、カプトプリル、エナラプリル、フォシノプリル、リシノプリル、キナプリル、ラミプリルを含むがこれに限定されない。既知のＡＣＥ阻害剤の誘導体の使用は、本発明の方法に含まれる。実際、ＡＣＥ阻害剤として機能的に挙動する任意の化合物は、本発明の方法に含まれる。
【０２１８】
本明細書で用いられる「遺伝子型」という用語が、生物の実際の遺伝的構成を指すのに対し、「表現型」は、個体により示される物理的形質を指す。加えて、「表現型」は、ゲノムの選択的な発現の結果（すなわち、それは細胞の歴史および細胞外環境に対するその応答の表現である）である。実際、ヒトゲノムは、およそ３０，０００〜３５，０００個の遺伝子を含有する。各細胞型において、これらの遺伝子のごく小さな分画（すなわち、１０〜１５％）が発現される。
【実施例】
【０２１９】
Ｘ．実施例
以下の実施例は、本発明の様々な態様をさらに例示する目的で含まれる。当業者は、以下の実施例中に開示される技法が、本発明の実施において十分に機能するよう、本発明者が発見した技法および／または組成物を代表し、したがって、その実施の好ましい様態を構成すると考えうることを理解されたい。しかし、当業者は、本開示に照らして、開示される具体的な実施形態において多数の変更が可能であり、これにより、本発明の精神および範囲を逸脱せずに、なおも同様または類似の結果が得られることを理解されたい。
【０２２０】
実施例１−材料と方法
ノーザンブロット解析：非不全心または不全心を有すると診断された匿名のヒト左室の心筋組織試料をＧｉｌｅａｄ  Ｃｏｌｏｒａｄｏ社（コロラド州、ウェストミンスター）から得た。Ｔｒｉｚｏｌ試薬（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ社製）を用いて、マウス、ラット、およびヒトの心筋組織試料から全ＲＮＡを単離した。前述（１）の通り、マイクロＲＮＡを検出するノーザンブロット法を実施した。Ｕ６プローブをローディング対照（Ｕ６順行：５−ＧＴＧＣＴＣＧＣＴＴＣＧＧＣＡＧＣ−３（配列番号１８）、Ｕ６逆行：５−ＡＡＡＡＴＡＴＧＧＡＡＣＧＣＴＴＣＡＣＧＡＡＴＴＴＧＣＧ−３（配列番号１９））として役立てた。αＭＨＣ発現を検出するため、成体野生型動物および同ｍｉＲ−２０８変異動物両方の心筋組織から得た１０μｇのＲＮＡを含有するノーザンブロットを、５’ＵＴＲ領域および第１エクソンの一部に及ぶαＭＨＣのｃＤＮＡ断片によりプローブした。
【０２２１】
ＰＴＵ処置：表示の期間にわたり、Ｈａｒｌａｎ  Ｔｅｋｌａｄ社（ウィスコンシン州、マジソン）製の０．１５％ＰＴＵ（ＴＤ９７０６１）を添加したヨウ素非含有の食餌を動物に与えることにより、甲状腺ホルモン欠損症を誘導した。
【０２２２】
マイクロアレイ解析およびリアルタイムＰＣＲ解析：Ｔｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、心筋組織から得た全ＲＮＡを単離した。マイクロアレイ解析は、Ｍｏｕｓｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  ４３０  ２．０アレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）を用いて実施した。ランダムなヘキサマープライマー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）によるＲＴ−ＰＣＲ法をＲＮＡ試料に対して実行した後、ＡＢＩ社製のＴａｑｍａｎプローブを用いる定量的リアルタイムＰＣＲ法により、遺伝子サブセットの発現を解析した。
【０２２３】
ｍｉＲ−２０８変異マウスの産生：ｍｉＲ−２０８標的化ベクターを産生するため、ｍｉＲ−２０８コード領域の上流に広がる０．４ｋｂ断片（５’側アーム）を、ＳａｃＩＩおよびＮｏｔＩにより消化し、ｌｏｘＰ部位およびＦｒｔに隣接するネオマイシンカセット上流のｐＧＫｎｅｏＦ２Ｌ２ｄｔａ標的化プラスミド内に連結した。３．３ｋｂ断片（３’側アーム）は、ＳａｌＩおよびＨｉｎｄＩＩＩにより消化し、ネオマイシン耐性カセットとＤｔａ陰性選択カセットとの間のベクターに連結した。破壊された対立遺伝子を有する標的ＥＳ細胞は、５’側プローブおよび３’側プローブを用いるサザンブロット解析により同定した。ｍｉＲ−２０８を標的とする３種類のＥＳクローンを同定し、胚盤胞への注入に用いた。結果として得られるキメラマウスをＣ５７ＢＬ／６に交配させ、変異体対立遺伝子の生殖細胞系列伝達系統を得る。ＰＣＲ法のプライマー配列は、要望に応じて入手できる。
【０２２４】
ウェスタンブロット法：ミオシンは、記載の通り（Ｍｏｒｋｉｎ、２０００年）に心筋組織から抽出した。ＭＨＣアイソフォームは、ＳＤＳ  ＰＡＧＥ法により分離し、マウスモノクローナルαＭＨＣ抗体（ＢＡ−Ｇ５）（メリーランド州、ロックビル、ＡＴＣＣ製）、および、βＭＨＣに対して高度に特異的なマウスモノクローナル抗ミオシン抗体（骨格遅筋、Ｍ８４２１）（ミズーリ州、Ｓｉｇｍａ社製）によりウェスタンブロット法を実施した。すべての横紋筋ミオシンを検出するため、汎特異的抗体（マウスモノクローナル抗体３−４８；ニューヨーク州、Ａｃｃｕｒａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ＆  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いた。免疫沈降法により、４００μｇの心筋タンパク質溶解物からＴＨＲＡＰ１を検出した。４℃で１時間にわたる試料の予備洗浄後、１μｌのウサギポリクローナル抗ＴＨＲＡＰ１抗体（ロックフェラー大学、Ｒ．Ｒｏｅｄｅｒ氏のご厚意による）および１５μｌのプロテインＡビーズと共に、４℃で一晩上清をインキュベートした。溶解緩衝液により該ビーズを３回洗浄し、ＳＤＳ試料緩衝液中で煮沸した。免疫沈降したＴＨＲＡＰ１タンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分解し、希釈率１：３０００におけるウサギポリクローナル抗ＴＨＲＡＰ１抗体、および、西洋わさびペルオキシダーゼに結合した希釈率１：５０００の抗ウサギＩｇＧを用いて解析し、Ｌｕｍｉｎｏｌ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社製）により検出した。
【０２２５】
組織学的解析およびｉｎ  ｓｉｔｕにおけるＲＮＡハイブリダイゼーション：組織学的解析に用いた組織は、Ｋｒｅｂｓ−Ｈｅｎｓｅｌｈｅｉｔ液中でインキュベートし、４％パラホルムアルデヒド中で固定し、切片化し、ヘマトキシリンエオジン（ＨＥ）染色およびマッソントリクローム染色または標準的な技法によるｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション用に加工した（ＫｒｅｎｚおよびＲｏｂｂｉｎｓ、２００４年）。３５Ｓで標識したＲＮＡプローブは、Ｍａｘｉｓｃｒｉｐｔキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を用いて産生した。シグナルは、Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐを用いて赤色に疑似着色した。
【０２２６】
経胸壁心エコー法（transthoracic echocardiography）：心機能および心臓径は、Ｖｉｎｇｍｅｄ  Ｓｙｓｔｅｍ（ノルウェー、ホルテン、ＧＥ  Ｖｉｎｇｍｅｄ  Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ社製）および１１．５ＭＨｚの直線アレイトランスデューサを用いて、意識下マウスにおける二次元心エコー法により評価した。Ｍモード法を用いて、拡張終期および収縮終期における前後壁厚を測定した。左室（ＬＶ）内径（ＬＶＩＤ）は、拡張期（ＬＶＩＤｄ）または収縮期（ＬＶＩＤｓ）中の最も大きい前後径として測定した。データは、マウス遺伝子型に対して遮蔽された単一の観察者により解析された。左室内径短縮率（ＦＳ）は、以下の式：ＦＳ（％）＝［（ＬＶＩＤｄ−ＬＶＩＤｓ）／ＬＶＩＤｄ］×１００に従い計算した。
【０２２７】
トランスジェニックマウスの産生：対象ｍｉＲＮＡに隣接するマウスゲノム断片は、α−ＭＨＣおよびヒトＧＨポリ（Ａ）＋シグナルを含有する心臓特異的発現プラスミド内にサブクローニングした（ＫｉｒｉａｚｉｓおよびＫｒａｎｉａｓ、２０００年）。ゲノムＤＮＡは、マウス尾部生検から単離し、ヒトＧＨ遺伝子ポリ（Ａ）＋シグナルに特異的なプライマーを用いるＰＣＲ法により解析した。
【０２２８】
プラスミドおよびトランスフェクションアッセイ：ｍｉＲ−２０８コード領域を含む３０５ｂｐのゲノム断片をＰＣＲ法により増幅し、ｐＣＭＶ６内に連結した。マウスの全ＴＨＲＡＰ１−ＵＴＲに及ぶ１ｋｂの断片をＰＣＲ法により増幅し、ＨＡで標識付けしたｐＣＭＶ６発現構築物およびホタルルシフェラーゼ（ｆ−ｌｕｃ）レポーター構築物（Ａｍｂｉｏｎ社製、ｐＭＩＲ−ＲＥＰＯＲＴ（商標））内に連結した。ＵＣＧＵＣＵＵＡ  ｍｉＲ−２０８種結合配列の変異は、ＰＣＲ法に基づく突然変異誘発により構築した。
【０２２９】
実施例２−結果
ｍｉＲ−２０８は、心収縮機能における中心的な調節因子である。イントロン性マイクロＲＮＡは、宿主遺伝子転写物の一部として転写され、スプライシングされ、成熟ｍｉＲＮＡにプロセシングされる。ｍｉＲ−２０８は、α−ＭＨＣ遺伝子の第２７イントロン内に位置するイントロン性ｍｉＲＮＡである（図１）。α−ＭＨＣと同様、ｍｉＲ−２０８も、心臓のみにおいて発現される（図２）。生後、甲状腺ホルモンが、α−ＭＨＣの合成を刺激し、β−ＭＨＣの発現を阻害することにより、心室ミオシンアイソザイムの発現を調節する。甲状腺ホルモンシグナル伝達の遮断も、ｍｉＲ−２０８の発現に影響を及ぼすかどうかを検討するため、本発明者らは、一定期間にわたり、プロピオチオウラシル（ＰＴＵ）に曝露されたラットの心臓試料を用いた。ＰＴＵは、ヨウ素の「有機化」−そのＴ３およびＴ４内への組込み−の阻害により甲状腺ホルモンの生合成を遮断し、これによって、α−ＭＨＣ発現を抑制し、β−ＭＨＣを増大させる。成熟ｍｉＲＮＡがその後何週間にもわたって存在し続けた間、ノーザンブロット解析は、α−ＭＨＣの発現レベルと、「ステムループ」と称するｍｉＲＮＡ前駆体レベルとの間で完全な相関を示した（図３Ａ〜Ｃおよび図４Ａ〜Ｃ）。
【０２３０】
ｍｉＲ−２０８の役割を調べるため、本発明者らは、ｍｉＲ−２０８ヌルマウスを作製した（図５）。これは、α−ＭＨＣの転写または翻訳に干渉しなかったが、２カ月齢の野生型マウスおよびｍｉＲ−２０８ノックアウトマウスの心筋組織に関するマイクロアレイ解析は、ｍｉＲ−２０８の除去が、骨格速筋遺伝子の強力な誘導をもたらすことを示した（図６Ａ〜Ｂおよび図７）。
【０２３１】
心臓ストレス時におけるｍｉＲ−２０８除去の効果を検討するため、本発明者らは、野生型動物およびｍｉＲ−２０８ノックアウト動物をともに、大動脈縮窄術（ＴＡＢ）に曝露した。ＴＡＢは、心肥大およびこれに伴う肥大遺伝子発現の強力な誘導術である。野生型動物がβ−ＭＨＣ発現の大幅な増加を示すのに対し、ノックアウト動物はこの誘導を示さなかった（図８）。
【０２３２】
【表５】
2014001243.tif 000006
【０２３３】
まとめると、これらのデータは、α−ＭＨＣ遺伝子の発現が、骨格速筋遺伝子プログラムの発現をダウンレギュレートするｍｉＲＮＡの発現をさらに誘導することを示す。ｍｉＲ−２０８は、α−ＭＨＣ遺伝子内に埋め込まれており、α−ＭＨＣは、発生的シグナル、生理的シグナル、および発生的シグナルにより調節される。α−ＭＨＣは、速い収縮性の主要な決定因子である。ｍｉＲ−２０８は、その欠失が骨格速筋遺伝子発現の劇的な増加をもたらすよう、心臓における骨格速筋遺伝子を抑制する（図１３）。ｍｉＲ−２０８はまた、心臓におけるβ−ＭＨＣをアップレギュレートするようにも要求される。マイクロＲＮＡはリプレッサーとして作用するので、図９に示す通り、ｍｉＲ−２０８は、β−ＭＨＣ発現のリプレッサーを抑制すると仮定される。心臓ストレス時において、このｍｉＲＮＡは、ＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルの両方においてβ−ＭＨＣ誘導の原因となるのに対し、ｍｉＲ−２０８の不在下においてこの誘導は全く存在せず、α−ＭＨＣが唯一のミオシン重鎖アイソフォームであり続ける。ヒト不全心試料および非不全心試料におけるα−ＭＨＣ発現の解析は、不全心におけるα−ＭＨＣ発現が、非不全心におけるα−ＭＨＣ発現と比べて低下することを示した（図１０）。これらのデータは、ｍｉＲ−２０８が、心収縮機能の中心的な調節因子であり、心疾患時におけるミオシン切替えの適応不良に関わると思われることを実証する。
【０２３４】
ｍｉＲａｎｄａソフトウェア（メモリアルスローン−ケタリング癌センター内生命工学センターから入手）、および、ｍｉＲＮＡ標的同定用のＰｉｃＴａｒアルゴリズム（Ｋｒｅｋら、２００５年）を用いて、甲状腺ホルモン受容体関連タンパク質１（ＴＨＲＡＰ１）を、ｍｉＲ−２０８の予測標的として同定した。図１２は、ヒト、チンパンジー、マウス、ラット、イヌ、ニワトリ、フグ、およびミノカサゴに由来するＴＨＲＡＰ１の３’ＵＴＲ配列によるｍｉＲ−２０８のアライメントを示す。
【０２３５】
ｍｉＲ−２０８は、病的心リモデリング大を調節する。ｍｉＲ−２０８欠失に関して同型接合のマウスは、最長２０週齢まで生存し、心臓のサイズ、形状、または構造における明白な異常を示さなかった。ｍｉＲ−２０８の潜在的な機能をさらに探索するため、本発明者らは、心臓に対する後負荷の増大により心肥大を誘導し、αＭＨＣのダウンレギュレーションおよびβＭＨＣのアップレギュレーションを伴う、大動脈縮窄（ＴＡＢ）術（Ｈｉｌｌら、２０００年）に対する野生型マウスおよびｍｉＲ−２０８変異マウスの応答を比較した。αＭＨＣ  ｍＲＮＡ発現は、ＴＡＢ後、予測される通りに低下した（図１４Ａ）が、ｍｉＲ−２０８は、ＴＡＢ後２１日でもなお高度に発現し（図１４Ｂ）、その比較的長期の半減期と符合した。
【０２３６】
ＴＡＢに応答して、野生型マウスは、心筋細胞の肥大性成長および心室線維症を伴う、心質量の著明な増大を示した（図１５Ａ）。これに対し、ｍｉＲ−２０８変異動物は、ＴＡＢに応答する心筋細胞の肥大または線維症をほとんど全く示さなかった（図１５Ａ）。心エコー法は、ｍｉＲ−２０８−／−動物が、肥大性応答および収縮性低下の鈍化を示すことを確認した（図１４Ｃ）。最も注目すべきことは、変異動物が、βＭＨＣをアップレギュレートする能力を有さないことであった。その代りに、ＴＡＢに応答して、αＭＨＣタンパク質発現が、ｍｉＲ−２０８変異心臓において増大し、これは、βＭＨＣアップレギュレーションの不在下におけるＭＨＣ発現を維持する補完的機構を反映しうる。ナトリウム利尿ペプチドＡＮＦおよびＢＮＰをコードする遺伝子など、他のストレス応答性遺伝子が、ｍｉＲ−２０８変異動物において強力に誘導された（図１５Ｂ〜Ｃ）。野生型マウスおよびｍｉＲ−２０８−／−動物から得た心臓に対するマイクロアレイ解析は、ｍｉＲ−２０８の不在が、βＭＨＣ発現に対する高度に特異的な遮断をもたらすことを確認した（表４〜５）。
【０２３７】
【表６】
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【０２３８】
【表７】
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【０２３９】
【表８】
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【０２４０】
【表９】
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【０２４１】
ｍｉＲ−２０８−／−マウスは、心肥大および心不全の特に強力な刺激である活性化カルシニューリンのトランスジェニック発現に応答して、線維症および心筋細胞肥大にも抵抗性であった（図１５Ｄ）。同様に、βＭＨＣのｍＲＮＡおよびタンパク質が、６週齢のｍｉＲ−２０８−／−；ＣｎＡ−Ｔｇマウスの心臓においてアップレギュレートされなかったのに対し、ＡＮＦおよびＢＮＰは、強力に誘導された（図１５Ｅ〜Ｆ）。したがって、ｍｉＲ−２０８は、βＭＨＣおよび細胞リモデリングのアップレギュレーションに必要であるが、心臓ストレスの他のマーカーの発現には必要でない。
【０２４２】
ｍｉＲ−２０８が、βＭＨＣ発現のアップレギュレーションに十分であるかどうかを調べるため、本発明者らは、αＭＨＣプロモーターの制御下においてｍｉＲ−２０８を過剰発現したトランスジェニックマウスを産生した。αＭＨＣ−ｍｉＲ−２０８トランスジェニックマウスは生存し、野生型心臓を約３倍上回るレベルで、ｍｉＲ−２０８を発現した（図１４Ｄ）。導入遺伝子の平均的な過剰発現を代表するトランスジェニック系統から得た心臓は、２カ月齢において病的リモデリングの明白な徴候を示さなかったが、注目すべきことに、βＭＨＣ発現の劇的なアップレギュレーションを示した（図１５Ｇおよび図１４Ｅ）。心肥大時において誘導されるｍｉＲ−２１４のトランスジェニック過剰発現が、βＭＨＣ発現に対して効果を及ぼさなかったので、ｍｉＲ−２０８のこの活性は特異的であった。成体マウス心臓におけるｍｉＲ−２０８の内因性レベルが、βＭＨＣ発現のアップレギュレーションに不十分であることを踏まえると、これらのトランスジェニックマウスにおけるｍｉＲ−２０８発現の３倍の増加が、βＭＨＣ発現のアップレギュレーションをもたらしたという知見は、このマイクロＲＮＡによるβＭＨＣ発現の制御に、明確な閾値が存在することを示唆する。
【０２４３】
ｍｉＲ−２０８は、βＭＨＣのＴ３依存型抑制を調節する。Ｔ３シグナル伝達が、正のＴ３応答エレメント（ＴＲＥ）を介してαＭＨＣ転写を誘導するのに対し、βＭＨＣ遺伝子のプロモーター中における負のＴＲＥは、転写の抑制を媒介する（Ｏｊａｍａａら、２０００年）。ｍｉＲ−２０８が、βＭＨＣのＴ３依存型調節に必要であるかどうかを調べるため、変異型および野生型の同腹子に、２週間にわたってＰＴＵ含有の食餌を与え、Ｔ３シグナル伝達を遮断した。ノーザンブロット解析は、ＰＴＵ処置の２週間後に、ｍｉＲ−２０８が豊富に存在することを確認した（図１６Ａ）。予測の通り、ＰＴＵは、心拍数の減少および心収縮性の低下および心拡張の増大を誘導し、野生型動物と変異動物との間で著明な差を示さなかった（図１６Ｂ）。しかし、野生型動物が、ＰＴＵに応答して、αＭＨＣの予測された減少およびβＭＨＣの予測された増大を示したのに対し、ｍｉＲ−２０８−／−動物は、微量のβＭＨＣ発現は検出されたが、ここでも、βＭＨＣのアップレギュレーションに対して抵抗性であると思われた（図１７Ａ〜Ｂ）。ｍｉＲ−２０８−／−動物においては、ＰＴＵによりＡＮＦおよびＢＮＰがアップレギュレートされ、βＭＨＣ発現におけるｍｉＲ−２０８の特異的な役割を確認した（図１６Ｃ）。ＰＴＵは、甲状腺ホルモン受容体（ＴＲ）のシグナル伝達のみに干渉することによってαＭＨＣアイソフォームからβＭＨＣアイソフォームへの切り替えを誘導するので、これらの知見は、ｍｉＲ−２０８が、ＴＲに関わる機構を介してβＭＨＣ発現を促進することを示唆する。
【０２４４】
ｍｉＲ−２０８は、ＴＲ関連タンパク質１を標的とする。ｍｉＲ−２０８の比較的少数の予測標的の中で、ＴＲＡＰ２４０としても知られる甲状腺ホルモン受容体関連タンパク質１（ＴＨＲＡＰ１）をコードするｍＲＮＡが、ＰｉｃＴａｒ標的予測プログラム（Ｋｒｅｋら、２００５年）により、最強の予測標的として記録された。ＴＲ関連ＴＲＡＰ複合体の成分であるＴＨＲＡＰ１は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩおよび基本転写開始因子の動員により、ＴＲ活性を調節する（ＩｔｏおよびＲｏｅｄｅｒ、２００１年）。ＴＨＲＡＰ１  ｍＲＮＡの３’−ＵＴＲにおける推定ｍｉＲ−２０８結合部位は、ｍｉＲＮＡ標的化ならびに進化的保存の最も重要な決定因子である、ｍｉＲ−２０８の５’側アームとの高度な相補性を示した（図１８Ａ）。ｍｉＲ−２０８とＴＨＲＡＰ１  ３’−ＵＴＲ配列との不完全な相補性に基づき、ｍｉＲ−２０８は、ＴＨＲＡＰ１の翻訳を阻害するであろうと予測される。
【０２４５】
ＴＨＲＡＰ１  ３’−ＵＴＲにおける推定ｍｉＲ−２０８標的配列が、翻訳抑制を媒介しうるかどうかを調べるため、本発明者らは、ＴＨＲＡＰ１転写物の全長３’−ＵＴＲを、ＣＯＳ１細胞内にトランスフェクトされたルシフェラーゼ発現プラスミド内に挿入した。ＣＭＶプロモーターにより駆動されるｍｉＲ−２０８量の増大が、ルシフェラーゼ活性の用量依存的な低下をもたらしたのに対し、対照である同等量のｍｉＲ−１２６は、効果を及ぼさなかった（図１８Ｂ）。ＣＭＶ−ｍｉＲ−２０８はまた、ＴＨＲＡＰ１  ３’ＵＴＲ結合配列に連結し、ＨＡで標識付けしたマロニルＣｏＡデカルボキシラーゼ（ＭＣＤ）発現カセットの翻訳を、用量依存的に阻止したが、変異型ｍｉＲ−２０８標的配列は阻止しなかった（図１８Ｃ）。加えて、ＴＨＲＡＰ１タンパク質の発現が、野生型の同腹子と比べて、ｍｉＲ−２０８−／−マウスから得た心臓タンパク質溶解物において増大した（図１８Ｄ）のに対し、ＴＨＲＡＰ１  ｍＲＮＡは、２つの遺伝子型を有する心臓において同等であり（図１９）、ｍｉＲ−２０８が、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＴＨＲＡＰ１翻訳の負の調節因子として作用するという結論と符合する。ストレスが、ｍｉＲＮＡのアルゴノートタンパク質との会合を促進することによって、ｍｉＲＮＡの抑制作用を増大させることを示す近年の研究（Ｌｅｕｎｇら、２００６年）に照らせば、ストレス状態下において、ＴＨＲＡＰ１タンパク質発現に対するｍｉＲ−２０８の負の影響は、さらに大きくなりうる。
【０２４６】
ｍｉＲ−２０８は、ｍｉＲ−４９９の発現に必要である。心臓におけるｍｉＲ−２０８の作用機構をさらに探索するため、本発明者らは、マイクロアレイ解析により、野生型マウスおよびｍｉＲ−２０８ヌルマウスから得た心臓におけるマイクロＲＮＡ発現のパターンを定めた。変異心臓においてアップレギュレートおよびダウンレギュレートされる複数のマイクロＲＮＡの中で、本発明者らは、ｍｉＲ−４９９が、正常心臓においては高度に豊富であるが、ｍｉＲ−２０８変異型においては背景レベルを超えては発現されないことを発見した。これらの結果は、ノーザンブロット法により確認された（図２１）。
【０２４７】
ｍｉＲ−４９９遺伝子のゲノム位置についての解析は、同遺伝子が、アルファＭｈｃ遺伝子（Ｍｙｈ７ｂ）の相同体である、Ｍｙｈ７ｂ遺伝子の第２０イントロン内に含有されることを示した（図２２）。Ｍｙｈ７ｂ遺伝子は、脊椎動物において保存され、心臓および骨格遅筋（ヒラメ筋）のみにおいて発現される（図２３）。加えて、ｍｉＲ−４９９は、心肥大時においてダウンレギュレートされる（図２４）。
【０２４８】
ＭＥＦ２は、心筋および骨格筋におけるｍｉＲ−４９９発現を調節する。Ｍｙｈ７ｂ遺伝子の５’側隣接領域内において、本発明者らは、種を超えて保存される、潜在的なＭＥＦ２コンセンサス配列を同定した。この配列は、ゲルシフトアッセイにおいてＭＥＦ２に活発に結合し、この配列の変異は、トランスジェニックマウスにおけるｌａｃＺレポーターの発現を破壊した。ＭＥＦ２部位は、ＭＥＦ２による骨格筋遺伝子発現を駆動する、ｂＨＬＨタンパク質ＭｙｏＤファミリーメンバーの結合部位として役立つ、保存されたＥボックス配列（ＣＡＮＮＴＧ）に隣接していた。実際、ＭｙｏＤは、ユビキタスｂＨＬＨタンパク質Ｅ１２と共に、プロモーター由来のＥボックスに結合した。この配列の変異は、骨格筋におけるｌａｃＺ導入遺伝子の発現を阻止したが、心臓における発現には影響を及ぼさなかった。
【０２４９】
標的の同定：まとめると、本明細書で報告されるデータは、Ｍｙｈ７ｂ遺伝子のＭＥＦ２調節型発現が、骨格速筋遺伝子プログラムの発現をダウンレギュレートする、遅筋および心臓に特異的なｍｉＲＮＡの発現をさらに誘導することを示す。これらのデータは、骨格筋の線維型における中心的な調節物質としてのｍｉＲＮＡ  ４９９に証拠を提供する。
【０２５０】
ｍｉＲ−２０８は、ｍｉＲ−４９９と高度に相同的であり、両マイクロＲＮＡともに、Ｍｈｃ遺伝子のイントロンによりコードされるという注目すべき事実は、これらが、共通の調節機構を共有することを示唆する。ｍｉＲＮＡは、遺伝子発現に対して、配列特異的に負の影響を及ぼすので、高度の相同性は、ｍｉＲ−２０８およびｍｉＲ−４９９が、標的遺伝子における重複により、同等の機能を果たす素因を与える。本発明者らは、ｍｉＲ−４９９の標的として役立つと思われるＭｈｃ発現の転写調節因子を同定した。これらはまた、ｍｉＲ−２０８のノックダウンがｍｉＲ−４９９発現を除去するよう、心臓ではｍｉＲ−４９９発現がｍｉＲ−２０８により制御されることも示した。
【０２５１】
本発明者の前出のデータは、ｍｉＲ−２０８の遺伝子破壊が、心臓においてとりわけ骨格速筋遺伝子の強力な誘導をもたらすことを示したので、ｍｉＲ−４９９は、骨格筋において同等の機能を有し、線維型の主要な調節因子として作用しうる可能性が高い。この仮説の線で、この転写物のプロモーター解析は、ｍｉＲ−４９９およびその宿主転写物の発現が、骨格筋線維型および遅筋線維遺伝子発現の中心的な調節因子である、筋原性転写因子ＭＥＦ２により調節されることを示す。本発明者らは、ＭＥＦ２活性が、筋持久性を促進し、長時間の運動後における筋疲労を阻止することを示した。したがって、本発明者らは、ＭＥＦ２のこれらの作用が、少なくとも部分的には、ｍｉＲ−４９９発現の直接的な活性化に依存することを仮定する（図２５）。
【０２５２】
まとめると、これらのデータは、Ｍｙｈ７ｂ遺伝子のＭＥＦ２調節型発現が、骨格速筋遺伝子プログラムの発現をダウンレギュレートする、遅筋および心筋に特異的なｍｉＲＮＡの発現をさらに誘導することを示す。データは、骨格筋線維型における中心的な調節因子としてのｍｉＲ−４９９に証拠を提供する。ｍｉＲ−２０８およびｍｉＲ−４９９が、高度に相同性であり、両者ともＭｈｃ遺伝子のイントロンによりコードされるという注目すべき事実は、これらが、共通の調節機構を共有することを示唆する。ｍｉＲＮＡは、遺伝子発現に対して、配列特異的に負の影響を及ぼすので、高度の相同性は、ｍｉＲ−２０８およびｍｉＲ−４９９が、標的遺伝子における重複により、同等の機能を果たす素因を与える。本発明者らは、ｍｉＲ−４９９の標的として役立つと思われるＭｈｃ発現の転写調節因子を同定し、また、ｍｉＲ−２０８のノックダウンがｍｉＲ−４９９発現を除去するよう、心臓ではｍｉＲ−４９９発現がｍｉＲ−２０８により制御されることをも示した。
【０２５３】
ストレス応答性ｍｉＲＮＡによる心肥大および心不全の調節：細胞表現型の調節におけるその関与に照らして、本発明者らは、ｍｉＲＮＡが、遺伝子発現における転写および翻訳の変化をもたらすことが知られる、心臓ストレスに対する心臓の応答を調節するのに役割を果たしうると仮定した。心肥大におけるｍｉＲＮＡの潜在的な関与を探索するため、本発明者らは、１８６種類の異なるｍｉＲＮＡを表示するマイクロアレイ（Ｂａｂａｋら、２００４年）を用いて、心肥大の２つの確立されたマウスモデルにおける並列的なｍｉＲＮＡマイクロアレイ解析を実施した。心臓に対する後負荷の増大により心肥大を誘導する大動脈縮窄（ＴＡＢ）術（Ｈｉｌｌら、２０００年）を受けたマウスを、疑似手術を受けた動物と比較した。第２のモデルでは、心臓において、重度で十分に特徴付けられた肥大の形態をもたらす活性化カルシニューリン（ＣｎＡ）を発現するトランスジェニックマウス（Ｍｏｌｋｅｎｔｉｎら、１９９８年）を、野生型の同腹子と比較した（図２６Ａ）。ＴＡＢを受けたマウスの心臓から単離されたＲＮＡは、疑似手術を受けた対照と比べて、２７種類のｍｉＲＮＡの発現増加を示し、ＣｎＡ  Ｔｇマウスは、非トランスジェニック同腹子対照と比べて３３種類のｍｉＲＮＡの発現増加を示し、うち２１種類が、いずれのモデルでもアップレギュレートされた。同様に、ＴＡＢおよびＣｎＡにより誘導された肥大は、それぞれ１５および１４種類のｍｉＲＮＡの発現低下を伴い、うち７種類のｍｉＲＮＡが、共通にダウンレギュレートされた（図２６Ｂ）。これらのｍｉＲＮＡのノーザンブロット解析（本発明者らの未公刊データ）および既存のマイクロアレイ解析（Ｂａｒａｄら、２００４年；Ｓｅｍｐｅｒｅら、２００４年；Ｓｈｉｎｇａｒａら、２００５年；Ｌｉｕら、２００４年）は、これらが、広範な組織において発現されることを示す。これらの相対的な発現レベル、ヒト配列、ラット配列、およびマウス配列の保存、ならびに肥大時における発現レベルに基づき、本発明者らは、１１種類のアップレギュレートされたｍｉＲＮＡおよび５種類のダウンレギュレートされたｍｉＲＮＡに焦点を当てた（図２６Ｃ）。
【０２５４】
野生型動物およびＣｎＡ  Ｔｇ動物から得た心臓ＲＮＡのノーザンブロット解析は、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２３、ｍｉＲ−２４、ｍｉＲ−１２５ｂ、ｍｉＲ−１９５、ｍｉＲ−１９９ａ、およびｍｉＲ−２１４の発現の増加、ならびにｍｉＲ−２９ｃ、ｍｉＲ−９３、ｍｉＲ−１５０、およびｍｉＲ−１８１ｂの発現の低下を確認した（図２６Ｃおよび図２７）。まとめると、これらのデータは、心肥大時において、異なるｍｉＲＮＡが調節されることを示し、これらがこの過程の調節物質として機能しうる可能性を示唆する。
【０２５５】
ｍｉＲ−２０８による調節の下流標的としてのｍｉＲ−２９ファミリー：本発明者らは、ｍｉＲ−２０８の作用を媒介しうる下流のｍｉＲＮＡを同定しようと努める中で、野生型マウスおよびｍｉＲ−２０８ヌルマウスから得た心臓に対するｍｉＲＮＡマイクロアレイ法を実施した（図２８）。本発明者らは、ｍｉＲ−２９ファミリーの複数のメンバーが、ｍｉＲ−２０８ヌルマウスにおいてアップレギュレートされることを発見した（図２９）。標的の予測は、ｍｉＲ−２９ファミリーメンバーが、複数のコラーゲンおよび細胞外マトリックスの他の成分をコードするｍＲＮＡを標的とすることを示した（図３０）。したがって、ｍｉＲ−２０８ヌルマウスにおけるｍｉＲ−２９ファミリーメンバーのアップレギュレーションは、これらの動物において見られる線維症に対する遮断の原因となる可能性が高い（図３１）。
【０２５６】
要旨：ｍｉＲ−２９が、罹患した心臓でダウンレギュレートされ、コラーゲンおよび細胞外マトリックスタンパク質をコードするｍＲＮＡを標的とするという発見は、ｍｉＲ−２９の発現またはその標的ｍＲＮＡとの会合を促進する戦略が、病的心リモデリングおよび心筋線維症の状況下における心臓に対して、有益な効果を与える可能性が高いことを示唆する。さらに、ｍｉＲ−２９の発現または機能の増加は、肝臓、肺、腎臓、およびその他などの組織における多数の疾患に関連する線維症を予防する可能性が高い。加えて、ｍｉＲ−２０８がｍｉＲ−２９発現を抑制し、ｍｉＲ−２０８の消失がｍｉＲ−２９発現をアップレギュレートするという発見は、ｍｉＲ−２９が、心臓に対するｍｉＲ−２０８の作用の下流における媒介物質であることを示す。
【０２５７】
実施例３−考察
これらの結果は、αＭＨＣ遺伝子のイントロンによりコードされるｍｉＲ−２０８が、ストレス依存型の心筋細胞成長および遺伝子発現を調節することを示す。ｍｉＲ−２０８の不在下では、圧負荷、カルシニューリンの活性化、または甲状腺機能低下に応答してβＭＨＣ発現が成体心臓で大幅に鈍化し、これらの刺激がβＭＨＣ転写を誘導する経路は、共通のｍｉＲ−２０８感受性成分を共有することを示唆する（図９）。これに対し、新生ｍｉＲ−２０８−／−マウスの心臓では、βＭＨＣ発現が変化しなかったことは、ｍｉＲ−２０８が、βＭＨＣ発現のストレス依存型調節機構に特に関与することを示す。
【０２５８】
ｍｉＲ−２０８の作用機構への鍵は、その両方ともにβＭＨＣ発現に対する遮断、ストレス応答遺伝子のアップレギュレーション（Ｗｅｉら、２００５年；Ｐａｎｔｏｓら、２００６年）、ならびに病的肥大および線維症に対する防護（ＹａｏおよびＥｇｈｂａｌｉ、１９９２年；Ｃｈｅｎら、２０００年）を示す、ｍｉＲ−２０８−／−心臓の甲状腺機能亢進心臓との類似性からもたらされる。ｍｉＲ−２０８−／−心臓における骨格速筋遺伝子のアップレギュレーションは、甲状腺機能亢進状態における骨格速筋線維の誘導にも類似する（Ｖａｄａｓｚｏｖａら、２００４年）。Ｔ３シグナル伝達は、生後心臓におけるβＭＨＣ発現を抑制し、甲状腺機能低下をもたらすＰＴＵは、βＭＨＣを誘導する（Ｍｏｒｋｉｎ、２０００年；ＳｃｈｕｙｌｅｒおよびＹａｒｂｒｏｕｇｈ、１９９０年）。ｍｉＲ−２０８−／−心臓において、ＰＴＵがβＭＨＣ発現を誘導する能力を有さないことは、ｍｉＲ−２０８を、さらにＴ３シグナル伝達経路にも関与させる。
【０２５９】
これらの結果は、ｍｉＲ−２０８が、少なくとも部分的には、転写に正負の効果を及ぼしうるＴＲ共調節因子である、ＴＨＲＡＰ１の発現を抑制することにより作用することを示唆する（Ｐａｖｒｉら、２００５年；Ｐａｒｋら、２００５年）。ＴＲは、負のＴＲＥを介して作用し、成体心臓におけるβＭＨＣ発現を抑制する（Ｍｏｒｋｉｎ、２０００年）。したがって、ｍｉＲ−２０８の不在下においてＴＨＲＡＰ１発現が増加すれば、βＭＨＣ発現に対するＴＲの抑制活性を促進するであろうと予測され、これは、ｍｉＲ−２０８−／−心臓におけるβＭＨＣ発現の遮断と符合する。これに対して、発生時におけるαＭＨＣ発現およびβＭＨＣ発現の調節は、Ｔ３シグナル伝達から独立しており（Ｍｏｒｋｉｎ、２０００年）、ｍｉＲ−２０８による影響を受けない。ｍｉＲ−２０８−／−マウスにおいては、正常に、ホスホランバン（ＰＬＢ）および筋小胞体カルシウムＡＴＰアーゼ（ＳＥＲＣＡ）２ａおよびグルコース輸送体（ＧＬＵＴ）４などの他のＴＲ標的遺伝子が発現したことが注目される（図２０）。βＭＨＣ遺伝子は、特定のＴＲアイソフォームに応答しうると主張されている（Ｋｉｎｕｇａｗａら、２００１年；Ｍａｎｓｅｎら、２００１年；Ｋｉｎｕｇａｗａら、２００１年）。おそらく、ＴＨＲＡＰ１は、特定のＴＲアイソフォームに作用するか、または、プロモーター特異的な因子との相互作用を介して、ＴＲ依存型遺伝子のサブセットに選択的に作用する。ｍｉＲＮＡは、その効果を及ぼす下流における複数の標的を介して作用するのが一般的であるので、さらなる標的も、心臓の成長および遺伝子発現に対するｍｉＲ−２０８の効果に寄与する可能性が高い。
【０２６０】
心肥大および心不全時に生じる、βＭＨＣ組成物の比較的わずかな増加は、筋線維のＡＴＰアーゼ活性および収縮機能を低下させうる（Ａｂｒａｈａｍら、２００２年）。したがって、ｍｉＲ−２０８発現またはそのｍＲＮＡ標的との相互作用の治療的な操作は、βＭＨＣ発現を抑制することにより、潜在的に心機能を向上させうるであろう。罹患した心臓における心臓ストレス応答、および多種類のｍｉＲＮＡの調節に対するｍｉＲ−２０８の重大な影響（ｖａｎ  Ｒｏｏｉｊら、２００６年）に基づき、本発明者らは、ｍｉＲＮＡが、成体心臓およびおそらくは他の器官の機能およびそれらの疾患に対する応答の重要な調節因子であると判明するであろうと期待する。
【０２６１】
本明細書において開示され主張される組成物および方法のすべては、本開示に照らして過度な実験を行わずに、作製および実施しうる。本発明の組成物および方法を、好ましい実施形態に関して記載したが、本発明の構想、精神、および範囲から逸脱せずに、本明細書に記載の組成物および方法に対して、ならびに方法の工程またはその工程の順番において変更を加えてよいことは、当業者にとって明らかであろう。より具体的には、同一または類似の結果が達成される限り、化学的にも生理的にも同類である特定の作用剤を、本明細書に記載の作用剤に代用してよいことは明らかであろう。当業者に明らかな、こうした類似の代用および改変のすべては、付随の特許請求の範囲により定義される本発明の精神、範囲、および構想の範囲内にあることが意図される。
【０２６２】
ＸＩ．参考文献
以下の参考文献は、本発明書に記載の手順または他の詳細にとって補完的な、例示的手順または他の詳細を提供する限りにおいて、参照により、本明細書に具体的に組み込まれる。
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Ｇｏｍｅｚ−Ｆｏｉｘら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７：２５１２９−２５１３４，１９９２．
ＧｏｏｄｂｏｕｒｎおよびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：１４４７，１９８８．
Ｇｏｏｄｂｏｕｒｎら，Ｃｅｌｌ，４５：６０１，１９８６．
Ｇｏｐａｌ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，５：１１８８−１１９０，１９８５．
Ｇｏｐａｌ−Ｓｒｉｖａｓｔａｖａら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ  １５（１２）：７０８１−７０９０，１９９５．
ＧｒａｈａｍおよびＰｒｅｖｅｃ，Ｉｎ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ，  Ｍｕｒｒａｙ（Ｅｄ．），  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｌｉｆｔｏｎ，ＮＪ，７：１０９−１２８，１９９１．
ＧｒａｈａｍおよびＶａｎ  Ｄｅｒ  Ｅｂ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２：４５６−４６７，１９７３．
Ｇｒａｈａｍら，Ｊ．  Ｇｅｎ．Ｖｉｒｌ，３６（ｌ）：５９−７４，１９７７．
Ｇｒｅｅｎｅら，  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ，１０：２７２，１９８９
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ＧｒｕｎｈａｕｓおよびＨｏｒｗｉｔｚ，Ｓｅｍｉｎａｒ  ｉｎ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３：２３７−２５２，１９９２．
ＨａｒｌａｎｄおよびＷｅｉｎｔｒａｕｂ，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ，１０１（３）：１０９４−１０９９，１９８５．
ＨａｓｌｉｎｇｅｒおよびＫａｒｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：８５７２，１９８５．
ＨａｕｂｅｒおよびＣｕｌｌｅｎ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，６２：６７３，１９８８．
Ｈｅｎら，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：２４９，１９８６．
Ｈｅｎｓｅｌら，Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ  Ｒｅｓ．，８：３４７，１９８９．
ＨｅｒｍｏｎａｔおよびＭｕｚｙｃｓｋａ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６４６６−６４７０，１９８４．
ＨｅｒｒおよびＣｌａｒｋｅ，Ｃｅｌｌ，４５：４６１，１９８６．
Ｈｅｒｓｄｏｒｆｆｅｒら，ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，９：７１３−７２３，１９９０．
ＨｅｒｚおよびＧｅｒａｒｄ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：２８１２−２８１６，１９９３．
Ｈｉｌｌら，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，１０１：２８６３−２８６９，２０００．
Ｈｉｒｏｃｈｉｋａら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，６１：２５９９，１９８７．
Ｈｉｒｓｃｈら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ，１０：１９５９，１９９０．
Ｈｏｌｂｒｏｏｋら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１５７：２１１，１９８７．
ＨｏｒｌｉｃｋおよびＢｅｎｆｉｅｌｄ，ＭｏｌＣｅｌｌ．Ｂｉｏｌ，９：２３９６，１９８９．
Ｈｏｒｗｉｃｈら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，６４：６４２−６５０，１９９０．
Ｈｕａｎｇら，Ｃｅｌｌ，２７：２４５，１９８１．
Ｈｕｇら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ，８：３０６５，１９８８．
Ｈｕｔｖａｇｎｅｒら，ＰＬｏＳ  Ｂｉｏｌ，２（４）：Ｅ９８，２００４．
Ｈｗａｎｇら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ，１０：５８５，１９９０．
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Ｉｍｌｅｒら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ，７：２５５８，１９８７．
ＩｍｐｅｒｉａｌｅおよびＮｅｖｉｎｓ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ，４：８７５，１９８４．
ＩｔｏおよびＲｏｅｄｅｒ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．，１２：１２７−１３４，２００１．
Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ，８：２５５５，１９８８．
ＪａｍｅｅｌおよびＳｉｄｄｉｑｕｉ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ，６：７１０，１９８６．
Ｊａｙｎｅｓら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ，８：６２，１９８８．
Ｊｏｈｎｓｏｎら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ，９：３３９３，１９８９．
ＪｏｎｅｓおよびＳｈｅｎｋ，Ｃｅｌｌ，１３：１８１−１８８，１９７８．
ＫａｄｅｓｃｈおよびＢｅｒｇ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ，６：２５９３，１９８６．
Ｋａｎｅｄａら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４３：３７５−３７８，１９８９．
Ｋａｒｉｎら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ，７：６０６，１９８７．
Ｋａｒｉｎら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ，７：６０６，１９８７．
Ｋａｒｌｓｓｏｎら，ＥＭＢＯ  Ｊ．，５：２３７７−２３８５，１９８６．
Ｋａｔｉｎｋａら，Ｃｅｌｌ，２０：３９３，１９８０．
Ｋａｔｉｎｋａら，Ｎａｔｕｒｅ，２９０：７２０，１９８１．
Ｋａｔｏら，Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．，２６６：３３６１−３３６４，１９９１．
Ｋａｗａｍｏｔｏら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ，８：２６７，１９８８．
Ｋｅｌｌｙら，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ，１２９（２）：３８３−３９６，１９９５．
Ｋｉｌｅｄｊｉａｎら，Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，８：１４５，１９８８．
Ｋｉｍｕｒａら，Ｄｅｖ．  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ．３９（３）：２５７−２６５，１９９７．
Ｋｉｎｕｇａｗａら，Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．，８９：５９１−５９８，２００１．
Ｋｉｎｕｇａｗａら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ．，８６：５０８９−５０９０，２００１．
ＫｉｒｉａｚｉｓおよびＫｒａｎｉａｓ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ，６２：３２１−３５１，２０００．
Ｋｌａｍｕｔら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ，１０：１９３，１９９０．
Ｋｌｅｉｎら，Ｎａｔｕｒｅ，３２７：７０−７３，１９８７．
Ｋｏｃｈら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ，９：３０３，１９８９．
Ｋｒｅｋら，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，３７：４９５−５００，２００５．
Ｋｒｅｋら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，３７：４９５−５００，２００５．
ＫｒｅｎｚおよびＲｏｂｂｉｎｓ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ，４４：２３９０−２３９７，２００４．
ＫｒｉｅｇｌｅｒおよびＢｏｔｃｈａｎ，Ｉｎ：Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ｇｌｕｚｍａｎｃ（Ｅｄ．），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ，１９８２．
ＫｒｉｅｇｌｅｒおよびＢｏｔｃｈａｎ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ，３：３２５，１９８３ａ．
Ｋｒｉｅｇｌｅｒら，Ｃｅｌｌ，３８：４８３，１９８４．
Ｋｒｉｅｇｌｅｒら，Ｃｅｌｌ，５３：４５，１９８８．
Ｋｒｉｅｇｌｅｒら，Ｉｎ：Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａｌａｎ  Ｌｉｓｓ（Ｅｄ．），ＨａｍｅｒおよびＲｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８３ｂ．
Ｋｒｕｔｚｆｅｌｄｔら，Ｎａｔｕｒｅ，４３８：６８５−６８９，２００５．
Ｋｕｈｌら，Ｃｅｌｌ，５０：１０５７，１９８７．
Ｋｕｎｚら，Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１７：１１２１，１９８９．
Ｌａｇｏｓ−Ｑｕｉｎｔａｎａら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９４（５５４３）：８５３−８５８，２００１．
ＬａＰｏｉｎｔｅら，Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ  ２７（３  Ｐｔ  ２）：７１５−２２，１９９６．
ＬａＰｏｉｎｔｅら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６３（１９）：９０７５−８，１９８８．
Ｌａｒｓｅｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，８３：８２８３，１９８６．
Ｌａｓｐｉａら，Ｃｅｌｌ，５９：２８３，１９８９．
Ｌａｔｉｍｅｒら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１０：７６０，１９９０．
Ｌａｕら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９４（５５４３）：８５８−８６２，２００１．
Ｌｅ  Ｇａｌ  Ｌａ  Ｓａｌｌｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５９：９８８−９９０，１９９３．
ＬｅｅおよびＡｍｂｒｏｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９４（５５４３）：８６２−８６４，２００１．
Ｌｅｅら，Ｎａｔｕｒｅ，２９４：２２８，１９８１．
Ｌｅｅら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  ＡｃｉｄｓＲｅｓ．，１２：４１９１−２０６，１９８４．
Ｌｅｕｎｇら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，４８：１８１２５−１８１３０，２００６．
Ｌｅｖｉｎｓｏｎら，Ｎａｔｕｒｅ，２９５：７９，１９８２．
Ｌｅｖｒｅｒｏら，Ｇｅｎｅ，１０１：１９５−２０２，１９９１．
Ｌｉｎら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１０：８５０，１９９０．
Ｌｉｕら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０１：９７４０−９７４４，２００４．
Ｌｕｒｉａら，ＥＭＢＯ  Ｊ．，６：３３０７，１９８７．
ＬｕｓｋｙおよびＢｏｔｃｈａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８３：３６０９，１９８６．
Ｌｕｓｋｙら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ，３：１１０８，１９８３．
ＭａｃｅｊａｋおよびＳａｒｎｏｗ，Ｎａｔｕｒｅ，３５３：９０−９４，１９９１．
ＭａｊｏｒｓおよびＶａｒｍｕｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８０：５８６６，１９８３．
Ｍａｎｎら，Ｃｅｌｌ，３３：１５３−１５９，１９８３．
Ｍａｎｓｅｎら，ＭｏｌＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌ，１５：２１０６−２１１４，２００１．
Ｍａｒｋｏｗｉｔｚら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，６２：１１２０−１１２４，１９８８．
ＭｃＮｅａｌｌら，Ｇｅｎｅ，７６：８１，１９８９．
ＭｅｉｓｔｅｒおよびＴｕｓｃｈｌ，Ｎａｔｕｒｅ，４３１：３４３−９，２００４．
Ｍｉｋｓｉｃｅｋら，Ｃｅｌｌ，４６：２０３，１９８６．
Ｍｏｌｋｅｎｔｉｎら，Ｃｅｌｌ９３：２１５−２２８，１９９８．
ＭｏｒｄａｃｑおよびＬｉｎｚｅｒ，Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖ．，３：７６０，１９８９．
Ｍｏｒｅａｕら，Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，９：６０４７，１９８１．
Ｍｏｒｋｉｎ，Ｍｉｃｒｏｓｃ．  Ｒｅｓ．Ｔｅｃｈ．，５０：５２２−５３１，２０００．
Ｍｏｓｓら，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１（４９）：３１６８８−３１６９４，１９９６．
Ｍｕｅｓｉｎｇら，Ｃｅｌｌ，４８：６９１，１９８７．
Ｎａｙａら，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２７５（７）：４５４５−４５４８，２０００．
Ｎｇら，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１７：６０１，１９８９．
ＮｉｃｏｌａｓおよびＲｕｂｉｎｓｔｅｉｎ，Ｉｎ：Ｖｅｃｔｏｒｓ：  Ａ  ｓｕｒｖｅｙ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｕｓｅｓ，  Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ  ａｎｄ  Ｄｅｎｈａｒｄｔ  （Ｅｄｓ），Ｓｔｏｎｅｈａｍ：  Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ，４９４−５１３，１９８８．
ＮｉｃｏｌａｕおよびＳｅｎｅ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，７２１：１８５−１９０，１９８２．
Ｎｉｃｏｌａｕら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１４９：１５７−１７６，１９８７．
Ｏｊａｍａａら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１４１：２１３９−２１４４，２０００．
Ｏｎｄｅｋら，ＥＭＢＯ  Ｊ，６：１０１７，１９８７．
Ｏｒｎｉｔｚら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ，７：３４６６，１９８７．
Ｐａｌｍｉｔｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ，３００：６１１，１９８２．
Ｐａｎｔｏｓら，Ｈｏｒｍ．  Ｍｅｔａｂ．Ｒｅｓ．，３８：３０８−３１３，２００６．
Ｐａｒｋら，ＭｏＬ  Ｃｅｌｌ．，１９：６４３−６５３，２００５．
Ｐａｓｋｉｎｄら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，６７：２４２−２４８，１９７５．
ＰａｓｑｕｉｎｅｌｌｉおよびＲｕｖｋｕｎ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，１８：４９５−５１３，２００２．
Ｐａｖｒｉら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．，１８：８３−９６，２００５．
ＰＣＴ出願第ＷＯ００７１０９６号
ＰＣＴ出願第ＷＯ８４／０３５６４号
ＰＣＴ出願第ＷＯ９８／３３７９１号
Ｐｅｃｈら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ，９：３９６，１９８９．
ＰｅｌｌｅｔｉｅｒおよびＳｏｎｅｎｂｅｒｇ，Ｎａｔｕｒｅ，３３４（６１８０）：３２０−３２５，１９８８．
Ｐｅｒａｌｅｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：４０８６−４０９０，１９９４．
Ｐｅｒｅｚ−ＳｔａｂｌｅおよびＣｏｎｓｔａｎｔｉｎｉ，ＭｏＬ  Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ，１０：１１１６，１９９０．
Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ
ＰｉｃａｒｄおよびＳｃｈａｆｆｎｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ，３０７：８３，１９８４．
Ｐｉｎｋｅｒら，Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖ．，１：２６８，１９８７．
Ｐｏｎｔａら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：１０２０，１９８５．
Ｐｏｒｔｏｎら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ，１０：１０７６，１９９０．
Ｐｏｔｔｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：７１６１−７１６５，１９８４．
ＱｕｅｅｎおよびＢａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｃｅｌｌ，３５：７４１，１９８３．
Ｑｕｉｎｎら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ，９：４７１３，１９８９．
Ｒａｃｈｅｒら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，９：１６９−１７４，１９９５．
Ｒａｇｏｔら，Ｎａｔｕｒｅ，３６１：６４７−６５０，１９９３．
Ｒｅｄｏｎｄｏら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４７：１２２５，１９９０．
ＲｅｉｓｍａｎおよびＲｏｔｔｅｒ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ，９：３５７１，１９８９．
Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ‘ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１５ｔｈ  ｅｄ．，ｐａｇｅｓ  １０３５−１０３８  ａｎｄ  １５７０−１５８０，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１９８０．
Ｒｅｎａｎ，Ｒａｄｉｏｔｈｅｒ．Ｏｎｃｏｌ，１９：１９７−２１８，１９９０．
Ｒｅｓｅｎｄｅｚ  Ｊｒ．ら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ，８：４５７９，１９８８．
Ｒｉｃｈら，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，４：４６１−４７６，１９９３．
Ｒｉｄｇｅｗａｙ，Ｉｎ：Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｓｕｒｖｅｙ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｕｓｅｓ，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚら（Ｅｄｓ．），Ｓｔｏｎｅｈａｍ：Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ，４６７−４９２，１９８８．
Ｒｉｐｅら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ，９：２２２４，１９８９．
Ｒｉｐｐｅ，ら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ，１０：６８９−６９５，１９９０．
Ｒｉｔｔｌｉｎｇら，Ｎｕｃ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．，１７：１６１９，１９８９．
Ｒｏｓｅｎら，Ｃｅｌｌ，４１：８１３，１９８８．
Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５２：４３１−４３４，１９９１．
Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ，ら，Ｃｅｌｌ，６８：１４３−１５５，１９９２．
Ｒｏｕｘら，Ｐｒｏｃ．ＮａｔｌＡｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：９０７９−９０８３，１９８９．
Ｓａｋａｉら，  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖ．，２：１１４４，１９８８．
ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ３ｒｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２００１．
Ｓａｔａｋｅら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，６２：９７０，１９８８．
Ｓｃｈａｆｆｎｅｒら，Ｊ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，２０１：８１，１９８８．
ＳｃｈｕｙｌｅｒおよびＹａｒｂｒｏｕｇｈ，Ｂａｓｉｃ  Ｒｅｓ．Ｃａｒｄｉｏｌ，８５：４８１−４９４，１９９０．
Ｓｅａｒｌｅら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ，５：１４８０，１９８５．
Ｓｅｍｐｅｒｅら，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ  ５：Ｒ１３，２００４．
ＳｈａｒｐおよびＭａｒｃｉｎｉａｋ，Ｃｅｌｌ，５９：２２９，１９８９．
ＳｈａｕｌおよびＢｅｎ−Ｌｅｖｙ，ＥＭＢＯＪ．，６：１９１３，１９８７．
Ｓｈｅｒｍａｎら，  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ，９：５０，１９８９．
ＳｈｉｎｇａｒａらＲＮＡ  １１：１４６１−１４７０，２００５．
ＳｌｅｉｇｈおよびＬｏｃｋｅｔｔ，Ｊ  ＥＭＢＯ，４：３８３１，１９８５．
Ｓｐａｌｈｏｌｚら，Ｃｅｌｌ，４２：１８３，１９８５．
ＳｐａｎｄａｕおよびＬｅｅ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，６２：４２７，１９８８．
ＳｐａｎｄｉｄｏｓおよびＷｉｌｋｉｅ，ＥＭＢＯ  Ｊ．，２：１１９３，１９８３．
ＳｔｅｐｈｅｎｓおよびＨｅｎｔｓｃｈｅｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ，２４８：１，１９８７．
Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−ＰｅｒｒｉｃａｕｄｅｔおよびＰｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ，Ｉｎ：Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ，Ｅｄｓ，Ｃｏｈｅｎ−Ｈａｇｕｅｎａｕｅｒ  ａｎｄ  Ｂｏｉｒｏｎ，Ｊｏｈｎ  Ｌｉｂｂｅｙ  Ｅｕｒｏｔｅｘｔ，Ｆｒａｎｃｅ，５１−６１，１９９１．
Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔら，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ．Ｔｈｅｒ．，１：２４１−２５６，１９９０．
Ｓｔｕａｒｔら，Ｎａｔｕｒｅ，３１７：８２８，１９８５．
ＳｕｌｌｉｖａｎおよびＰｅｔｅｒｌｉｎ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ，７：３３１５，１９８７．
ＳｗａｒｔｚｅｎｄｒｕｂｅｒおよびＬｅｈｍａｎ，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，８５：１７９，１９７５．
Ｔａｋｅｂｅら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ，８：４６６，１９８８．
Ｔａｖｅｒｎｉｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ，３０１：６３４，１９８３．
ＴａｙｌｏｒおよびＫｉｎｇｓｔｏｎ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ，１０：１６５，１９９０ａ．
ＴａｙｌｏｒおよびＫｉｎｇｓｔｏｎ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ，１０：１７６，１９９０ｂ．
Ｔａｙｌｏｒら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４：１５１６０，１９８９．
Ｔｅｍｉｎ，Ｉｎ：Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ，  Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ  （Ｅｄ．），ＮＹ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，１４９−１８８，１９８６．
Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｉｎｄｅｘ，Ｅｌｅｖｅｎｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ
Ｔｈｉｅｓｅｎら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，６２：６１４，１９８８．
Ｔｏｐら，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１２４：１５５−１６０，１９７１．
Ｔｒｅｉｓｍａｎ，Ｃｅｌｌ，４６（４）：５６７−１７４，１９８６
Ｔｒｏｎｃｈｅら，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，７：１７３，１９９０．
Ｔｒｏｎｃｈｅら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ，９（１１）：４７５９−４７６６，１９８９．
ＴｒｕｄｅｌおよびＣｏｎｓｔａｎｔｉｎｉ，Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖ．，６：９５４，１９８７．
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【図７】
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【図８】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１９】
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【図２０】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図９】
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【図１０】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６Ａ−Ｂ】
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【図２６Ｃ】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【手続補正書】
【提出日】平成25年10月24日(2013.10.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
心肥大または心不全の治療または予防を必要とする患者において心肥大または心不全を治療または予防するためのｍｉＲ−２０８の阻害剤を同定する方法であって、
（ａ）細胞を候補化合物に接触させることと、
（ｂ）細胞におけるｍｉＲ−２０８の活性または発現を評価することと、
（ｃ）工程（ｂ）における前記ｍｉＲ−２０８の活性または発現を、前記候補化合物の不在下におけるｍｉＲ−２０８の活性または発現と比較することと、を含み、ｍｉＲ−２０８の活性または発現の低下から、前記候補化合物が、心肥大または心不全の治療または予防に有用なｍｉＲ−２０８の阻害剤であることが示唆される方法。
【請求項２】
前記候補化合物が、ペプチド、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、または小分子である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記候補化合物が、ｍｉＲＮＡアンタゴニストである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
細胞を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、または心疾患の動物モデルにおいてｉｎ  ｖｉｖｏで、前記候補化合物と接触させる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
細胞が、初代心筋細胞またはＨ９Ｃ２細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ｍｉＲ−２０８の発現が、ノーザンブロット法またはＲＴ−ＰＣＲ法により評価される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ｍｉＲ−２０８の活性が、ｍｉＲ−２０８によって調節される遺伝子の発現または活性を決定することによって評価される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ｍｉＲ−２０８によって調節される遺伝子が、βミオシン重鎖または骨格速筋タンパク質遺伝子である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記骨格速筋タンパク質遺伝子が、心筋細胞におけるトロポニンＩ、トロポニンＴ３、ミオシン軽鎖、またはアルファ骨格筋アクチンである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ｍｉＲ−２０８の活性が、βミオシン重鎖発現レベルに対するαミオシン重鎖発現レベルの比率を決定することにより評価される、請求項１に記載の方法。
【外国語明細書】
2014001243000001.pdf