(57)【要約】【課題】上皮細胞におけるヒトパピローマウイルスゲノムの特異的なメチル化に関連する化合物および方法の提供。【解決手段】本発明は、ＨＰＶ関連疾患の検出及び治療に有用な化合物及び方法に関する。本発明は、ＨＰＶの複製が自然感染した組織及び細胞において生じるメカニズムを解明したことに基づいている。さらに、本発明は、ウイルス感染細胞における、この病的細胞の前癌及び癌細胞への成長の促進を可能にするウイルスゲノムの異なる後成的変化を確認したことに基づくものである。従って、本発明は、新形成及びその前駆病変を診断する方法並びに悪性腫瘍の発症を予防し、又は腫瘍増殖を抑制する方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願明細書に記載された発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＨＰＶ関連疾患の検出及び治療に有用な化合物及び方法に関する。本発明は、ＨＰＶの複製が自然感染した組織及び細胞において生じるメカニズムを解明したことに基づいている。さらに、本発明は、ウイルス感染細胞における、この病的細胞の前癌及び癌細胞への成長の促進を可能にするウイルスゲノムの異なる後成的変化を確認したことに基づくものである。従って、本発明は、新形成及びその前駆病変を診断する方法並びに悪性腫瘍の発症を予防し、又は腫瘍増殖を抑制する方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
人体の単一の正常細胞の表現型は、特定の時点で発現される遺伝子のセットによって規定される。こうした遺伝子発現のパターンは、全ての生細胞及び複雑度の増したレベルで全ての器官に対して構造及び機能を与える蛋白質の組合せ及び個々の濃度を規定している。全ての器官が適切に機能するのに不可欠である分化過程も個々の遺伝子のレベル及び組合せの変更によって調節されている。識別的遺伝子発現パターンは、例えば、大幅に変化した遺伝子発現パターンを有する、完全な分化細胞への分化を経ることができる子孫を生じる幹細胞としての細胞の状態を決定する。こうした分化細胞は、最終的に、さらにその遺伝子発現パターンを変化させ、それにより老化してついには死にゆく細胞の特性を取り入れることによってその寿命を決定する。こうした過程の分子的調節については解明されているとはとても言えないが、いくつかの証拠は、この調節の本質的な部分がヒトゲノム内の特定のＧｐＣ島の明確なメチル化によって媒介されていることを示唆している。
【０００３】
概念的には、細胞のゲノム内のこの特定のヌクレオチド群へメチル（Ｃ（Ｈ）３）−基を付加すると、このゲノムのメチル化伸展の凝縮及び強化構造を生じ、その結果として転写の阻害がもたらされる。即ち、ゲノムの高度にメチル化された部分は、通常ｍＲＮＡに転写されない（発現抑制（ｓｉｌｅｎｃｅｄ））。このメカニズムは、遺伝子の調節及び刷り込みの重要な部分であり、生細胞におけるこうした重要なステップを決定する主要な生物学的特徴の１つである（Ｃｏｌｌａｓほか、２００７年）。分化過程におけるメチル化の詳細な影響については、これまでごく皮相的に研究されているに過ぎない（Ｋｉｅｆｅｒ、２００７年）。しかしながら、正常細胞の本格的な新生癌細胞への形質転換に関与する形質転換過程に対してより詳細な洞察が集中されている（Ｅｓｔｅｌｌｅｒ、２００７年及びＦｅｉｎｂｅｒｇ、２００４年）。特に、重要な腫瘍抑制活性を有する遺伝子群の場合、それらのプロモータ領域群のメチル化が新生癌細胞のこうした各遺伝子の発現低下を招いたことが観察されている。従って、メチル化は、欠失及び／又は突然変異に加えて、腫瘍抑制遺伝子の不活化における主要な分子段階の１つであり、多くの腫瘍抑制遺伝子、例えば、サイクリン依存性キナーゼ抑制因子ｐ１６ＩＮＫ４ａ、ＤＮＡミスマッチ修復遺伝子ＭＳＨ２、ＭＨＬ１などに関して明白に立証されている（Ｅｓｔｅｌｌｅｒ、２００７年及びＦｅｉｎｂｅｒｇ、２００４年）。
【０００４】
クロマチン構造に対する影響に加えて、異なるヌクレオチドに対してより精密にメチル化を行うことにより特定の転写因子の結合性に影響を与えることもできる（Ｋｌｏｓｅ及びＢｉｒｄ、２００６年）。従って、これによって正又は負に作用する転写因子の親和性に影響を与えることができ、それ故、この場合も上記各遺伝子の発現の活性化又は低下をもたらす、こうした転写因子の作用及び活性が修飾される。
【０００５】
ヒト・パピローマウイルスは、皮膚又は粘膜面の上皮の増殖を引き起こす重要な上皮親和性ウイルスである。こうしたウイルスは、特定の他と区別できる型のもの（ハイリスクパピローマウイルス、ＨＲ−ＨＰＶ：ｈｉｇｈ  ｒｉｓｋ  ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ）が、特に生殖器官及び最も重要なことだが子宮頚部の粘膜面の腫瘍性病変と関連付けられることが明らかとなった（ｚｕｒ  Ｈａｕｓｅｎ、２００２年）とき、特に科学的な関心を集めた。今日では、ＨＲ−ＨＰＶ型（特に、ＨＰＶ１６及び１８）の持続感染が子宮頚癌発症の必須の前提条件であることは一般に受け入れられている。Ｅ６及びＥ７と称する特定のウイルス遺伝子は、子宮頚部その他のＨＰＶ関連癌細胞では継続的に発現されていることが分かった。さらに、こうした遺伝子は、インビトロ培養一次ヒト上皮細胞において悪性形質転換を誘導することが明らかにされ、重要なことには、その発現は、子宮頚癌細胞又はその高悪性度前駆細胞の腫瘍性増殖の特徴を誘導し、維持するのに基本的に必要とされる。
【０００６】
これまでのところ、約１３種のハイリスクＨＰＶ型の特性が明らかにされている（Ｍｕｎｏｚほか、２００３年）。これらのウイルスは、臨床的に検知可能な病変を発症している（まだ発症していない）女性にもよく見られる。こうしたウイルス感染の罹患率のピークは年齢１５乃至３０歳の若い女性に見られるのに対して、より上の年齢の女性では低下する（Ｓｃｈｉｆｆｍａｎほか、２００７年）。このことは、若い男性にも同程度の頻度でみられるＨＲ−ＨＰＶ感染症が性行為感染の特徴を有することを示している。しかしながら、性別による主な相違は、男性ではＨＲ−ＨＰＶ感染がその宿主によって自覚されることがまれであり、浸潤性の癌へと進行することがない不顕性感染をもたらすのが通常であるのに対して、女性では明らかに長期の持続感染がかなりより高頻度で生じるため、最終的に浸潤性の癌へと進行する可能性のある子宮移行部の上皮細胞の悪性形質転換がもたらされることがある。興味深いことに、この現象が概して子宮頚部の移行部に存在する数少ない上皮細胞に限定されるように思われるのに対して、同程度の率で感染する上皮部位は、子宮移行部の上皮細胞と比較して悪性形質転換を受ける傾向が実質的に少ない。
【０００７】
通常の生活環の過程でＨＰＶは先ず上皮の基底及び傍基底細胞に感染する。いくつかの論拠から、このウイルスは先ず潜伏感染の状態に入ることが示唆されている（Ｌｏｎｇｗｏｒｔｈ及びＬａｉｍｉｎｓ、２００４年）。この過程では、宿主細胞が一旦分裂すると、ウイルスゲノムは単一の感染細胞当たりでは極めて低いコピー数で複製されるが、この段階ではウイルスゲノムの複製も、場合によっては溶菌感染も開始されない。技術的な限界のために、この種の潜伏感染の存在に関する正確な証拠はまだ得られていない。むしろ、これは、新規感染の証拠がなくても免疫抑制時にウイルス複製活性が再活性化されうることを示す疫学研究から予想される。こうした潜伏感染は、明らかに活動性複製感染に切り替わり得る。この場合、基底及び傍基底細胞ではウイルス遺伝子の発現活性は全くほとんど維持されないが、これらの感染上皮細胞が一旦分化し始め、この上皮の中間細胞層に達すると、こうした分化細胞層においてウイルスゲノムの複製を引き起こす遺伝子発現の増加が観察される。興味深いことに、ウイルスゲノムの複製及びウイルスの初期遺伝子の発現は、増殖能、及び最終分化上皮細胞を予めプログラムされた分化経路に押し込むこうした細胞の活性化遺伝子発現特性を不可逆的に失っていて、最終的に上皮の外表面に扁平上皮細胞残屑として崩壊する最終分化細胞に概して限定されると考えられる（Ｌｏｎｇｗｏｒｔｈ及びＬａｉｍｉｎｓ、２００４年）。中間細胞においてウイルスゲノムが複製し、上皮細胞が一旦正常な分化過程で表面細胞層に達すると、ウイルスゲノムがさらに再プログラム化され、全ての初期遺伝子の発現が止められる一方で、各外被蛋白質の翻訳をもたらす後期遺伝子Ｌ１及びＬ２の本格的な発現がここで観察される。これらの蛋白質は自然に集まって、複製されたウイルスゲノムが含まれるウイルスの外被を形成し、最終的に、この新たに合成された成熟ウイルス外被は、上皮の外面の崩壊しつつある扁平上皮細胞の残屑から放出され、更なる感染サイクルを再開することができる（図１）。これらの知見から、ウイルスの複製サイクルは正常な上皮の分化過程と厳格に連関していることが示唆される。しかしながら、上皮細胞の分化の誘因となる分子事象以後に、この複雑な複製過程を制御するウイルス遺伝子発現パターンの調節に関与する分子構造についてはこれまでのところほとんど又は全く知られていない。
【０００８】
ウイルス遺伝子発現の調節及びウイルスゲノムの複製に重要な意味を持つ構造は、長鎖制御領域（ＬＣＲ：ｌｏｎｇ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｒｅｇｉｏｎ）又は上流調節領域もしくは（ＵＲＲ：ｕｐｓｔｒｅａｍ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｒｅｇｉｏｎ）と呼ばれる配列エレメント内に保持されている。このエレメントには、重要な正及び負の転写因子の結合部位及び複製起点が存在する（図２）。
【０００９】
初期に発現されるいくつかのパピローマウイルス遺伝子の一部であるパピローマウイルスＥ２蛋白質は、ウイルスのプロモータ自体に結合することによりウイルス遺伝子の発現に対して実質的な抑制機能を有する（Ｗｅｌｌｓほか、２０００年）。従って、これは転写レプレッサーの働きをし、ＨＰＶ  ＵＲＲエレメントの制御下の遺伝子の転写を阻止する。この概念は、インビトロで増殖させた非分化上皮細胞、場合によっては基底又は傍基底細胞の類似非分化表現型を保持する癌細胞株も用いて組織培養モデルで実施されている種々の分子研究に基づいたものである。Ｅ２蛋白質が発現されると、ウイルスプロモータの下方制御及び隣接遺伝子の発現停止がもたらされることが分かっている（Ｂｏｕｖａｒｄほか、１９９４年）。
【００１０】
子宮頚癌細胞では、パピローマウイルスゲノムは、通常、宿主細胞染色体中に組み込まれることが分かっている（Ｐｅｒｔ及びＣｏｌｅｍａｎ、２００７年ｂ）。ウイルスゲノムの宿主細胞ゲノム中への組込み部位は不規則に選ばれるように思われるが、組み込まれたウイルスＤＮＡ断片のウイルスゲノムは、通常、極めて特異な仕方で保存される。まず第一に、ＵＲＲを含む断片並びに全てこれから分析されるＥ６及びＥ７遺伝子は、組み込まれたウイルスゲノムコピーからもＥ６及びＥ７遺伝子の発現を可能にする配置で保たれるのに対して、下流に位置する遺伝子Ｅ２及び後期遺伝子カセットは、通常、ＵＲＲ内の調節エレメントから切り離され、従って、機能的に、又は構造的にも不活化される（ｚｕｒ  Ｈａｕｓｅｎ、２００２年）。興味深いことに、この点に関して調べられた全てのＨＰＶ関連癌細胞で、ウイルスＥ６及びＥ７の発現を確認することができた。前述のように、これらの遺伝子は、細胞周期の調節、分化過程及び死のカスケードに少なくともある程度関与しているいくつかの宿主細胞蛋白質との複雑な相互作用を通じて複製している細胞に重要な増殖調節特性を付与する。これらの遺伝子の発現は、上皮細胞の悪性形質転換を誘導し、維持するのに重要で十分な必要条件である。これらの遺伝子の発現が形質転換細胞で遮断されれば、この細胞は細胞周期停止に陥り、増殖を止め、最終的には死滅する（ｖｏｎ  Ｋｎｅｂｅｌほか、１９８８年）。
【００１１】
この観察と一致して、ＨＲ−ＨＰＶ型のＥ２遺伝子をコードしているオープンリーディングフレームはＨＰＶ関連癌では通常、破壊されている。従って、ＨＰＶ形質転換細胞中に機能的に活性なＥ２蛋白質を再導入すると、悪性表現型の逆転、細胞周期停止及び最終的には細胞死がもたらされる（Ｗｅｌｌｓほか、２０００年）。
【００１２】
従って、宿主細胞染色体に組み込まれることによるＥ２  ＯＲＦの破壊がＨＰＶ感染上皮細胞の癌化を最終的にもたらす分子カスケードにおいて絶対必要ではないにしても重要なステップであることは、この分野の科学者の間で一般に受け入れられている（Ｐｅｔｔ及びＣｏｌｅｍａｎ、２００７年ａ、Ｐｅｔｔほか、２００６年、Ｐｅｔｔほか、２００４年並びにＡｌａｚａｗｉほか、２００２年）。
【００１３】
上皮分化の特徴とＨＰＶ複製サイクルとが密接に関連していることは、ウイルスの遺伝子発現及び複製の制御に宿主細胞の環境が重要な役割を果たしていることを示唆している（図１参照）。いくつかの証拠から、ウイルスゲノムの遺伝子発現及び複製調節においてメチル化その他の後成的制御の関与が示唆されている。こうしたデータの多くは、人工的な組織培養モデルに基づいたものである。これまでのところいずれのモデルによってもウイルスの遺伝子発現及び複製の分化依存性の調節の詳細を説明することはできなかった。
【００１４】
パピローマウイルスＤＮＡのメチル化については既に約２０年前に報告されている（Ｂｕｒｎｅｔｔ及びＳｌｅｅｍａｎ、１９８４年並びにＷｅｔｔｓｔｅｉｎ及びＳｔｅｖｅｎｓ、１９８３年）。しかしながら、パピローマウイルス遺伝子発現制御及びこれに関連した発癌効果の調節におけるその生物学的意義については依然として極めて不明のところが多い（Ｌｉｓｔほか、１９９４年、Ｒｏｓｌほか、１９９３年並びにＴｈａｉｎほか１９９６年）。子宮頚癌細胞株において、ＨＰＶ−１６及びＨＰＶ−１８ゲノムにおけるＣｐＧメチル化はＬＣＲ領域及び一部のＬ１  ＯＲＦ領域ではこのウイルスゲノムのどの他の部分よりも高い頻度で生じるように思われる（Ｂａｄａｌほか、２００４年及びＢａｄａｌほか、２００３年）。さらに、特にＬ１遺伝子のメチル化は、発癌時における宿主細胞ゲノム中への外来ウイルスＤＮＡの組込みに関連があるように思われ、このため、ＨＰＶ感染細胞の腫瘍性変化の生体指標となる可能性があることが示唆された（Ｋａｌａｎｔａｒｉほか、２００４年、Ｔｕｒａｎほか、２００６年）。別のデータからは、Ｅ２ＢＳにおけるＣｐＧメチル化が、インビトロでのＥ２蛋白質結合を妨げ（Ｔｈａｉｎほか、１９９６年）、転写活性化の際の細胞におけるＥ２蛋白質機能を調節することも示唆されている（Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｊｅｅ及びＳｅｎｇｕｐｔａ、２００６年並びにＫｉｍほか、２００３年）。しかしながら、癌におけるＤＮＡメチル化はＨＰＶ  ＤＮＡに限られるものではない。概略前述したように、これは極めて重要な特徴とみなされるが、どちらかと言えば、宿主ゲノム全体にわたってよく生じる事象である（Ｅｓｔｅｌｌｅｒ、２００７年）。多くの細胞遺伝子の過剰メチル化の頻度は、新形成の重篤度が増大するにつれて著しく増加することが分かっている（Ｂａｎｎｏほか、２００７年、Ｄｏｎｇほか、２００１年、Ｆｅｎｇほか、２００５年、Ｊｅｏｎｇほか、２００６年、Ｋａｎｇほか、２００６年、Ｌａｉほか、２００７年、Ｌｅａほか、２００４年、Ｒｅｅｓｉｎｋ−Ｐｅｔｅｒｓほか、２００４年、Ｓｅｎｇほか、２００７年、Ｓｔｅｅｎｂｅｒｇｅｎほか、２００４年、Ｖｉｒｍａｎｉほか、２００１年、Ｗｉｄｓｃｈｗｅｎｄｔｅｒほか、２００４年）。
【００１５】
最近の研究では、正常上皮細胞及び子宮頚癌細胞においてＨＰＶ１６のＥ２結合部位Ｅ２ＢＳ２乃至４内のＣｐＧのメチル化の有無が調べられた（Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｊｅｅ及びＳｅｎｇｕｐｔａ、２００６年）。この論文の著者らは、メチル化が、形質転換組織におけるＰ９７プロモータの近位にあるＥ２ＢＳ２乃至４に位置する明確なＣｐＧ島に見出されたと報告している。
【００１６】
しかしながら、この研究では、特定部位のメチル化パターンの明確な変化で異なる生物学的特徴を説明することができる明瞭で一貫したパターンを示すことができなかった。
【００１７】
Ｋｉｍら（Ｋｉｍほか、２００３年）は、Ｗ１２細胞を用いたインビトロ組織培養モデルの高度分化細胞集団において低メチル化が関連付けられると報告した。これに対して、低分化基底細胞様細胞からのＨＰＶ１６  ＬＣＲは多数のメチル化シトシンを含み、多くの場合、Ｅ２ＢＳがメチル化されていた。
【００１８】
さらに、ヒトの癌は特にＣｐＧ島においてＤＮＡメチル化のパターン変化を示すことが多いことが先行技術に開示されている。島内のメチル化は連鎖遺伝子の転写抑制を伴うことが分かっている。腫瘍の発症及び進行の全ての局面に関与する遺伝子は、メチル化され、後成的に発現抑制されるようになる可能性がある。このような発現抑制された遺伝子を再発現させると、腫瘍増殖の抑制又は抗癌療法への感受性増大をもたらすことができる。ＤＮＡメチル化を逆転することができる後成的薬剤については、現在、前臨床評価及び癌患者での臨床試験が行われている。ヌクレオシド阻害剤５−アザシチジン及びデシタビンは、多くの種類の癌に対して数多くの第１相及び第２相試験で試験されている。しかしながら、両剤の用量規定毒性は骨髄抑制であり、最もよく報告されている非血液学的有害作用は悪心及び嘔吐であった。従って、脱メチル化剤による癌の全身療法は、通常重篤な副作用を引き起こすことになる。
【００１９】
美容整形症状及び皮膚症状を処置するのに特異的ＤＮＡメチル化阻害剤を用いることができる。５−アザシチジンは正常ヒト線維芽細胞による基礎レベル及びＴＧＦβ誘導コラーゲン生合成を共に阻害することが分かっている。コラーゲンは瘢痕化に対して直接的な影響を示す。従って、ヒトの皮膚においてコラーゲンの過剰産生を抑制すると、瘢痕形成が抑制されることになる。さらに、癌性及び前癌性皮膚病変の処置にＵＶ処置と脱メチル化を併用することができる。
【００２０】
本発明は、パピローマウイルスゲノム内の異なる特定の配列エレメントのメチル化がウイルスの生活環、複製及び遺伝子発現パターンを制御しているという知見に関する。さらに、本発明は、このメチル化パターンの特定の変化が一部のパピローマウイルスにより誘発される悪性形質転換の誘導に関与しているという知見に関する。このことは、例えば子宮頚部、膣、陰門、肛門、口腔咽頭管などの体腔の粘膜上皮の病変の場合に特に重要である。脱メチル化剤による全身療法に伴う望ましくない、ある程度耐えられない副作用を克服するために、本発明者らは、特に体腔の粘膜上皮のＨＰＶ関連病変及び癌の処置において、脱メチル化剤による局所処置が患者に望ましくない副作用をもたらすことなく癌を治療するのに極めて効果的な方法となりうることを見出した。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本発明は、例えば体腔の粘膜上皮などの病変の処置及び／又は治療のための脱メチル化剤の局所適用に関する。この点に関して、本発明はさらに、ＨＰＶ関連病変の処置及び治療の方法に関する。ＨＰＶ関連病変は、例えば子宮頚癌及びその前駆症状段階並びに皮膚の疣贅を含む。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
配列番号１乃至１６からなる群から選ばれる配列を含む単離核酸。
（項目２）
ＨＰＶ関連病変の処置のための局所適用用薬剤としての脱メチル化剤。
（項目３）
５−アザシチジン、５−アザ−２０−デオキシシチジン、アラビノシル−５−アザシチジン、５−６−ジヒドロ−５−アザシチジン、５−フルオロ−２０−デオキシシチジン、エピガロカテキン３−没食子酸塩、ヒドララジン、プロカインアミド、プロカイン及びゼブラリンからなる群から選ばれる項目２に記載の脱メチル化剤。
（項目４）
前記ＨＰＶ関連病変が疣贅、外方増殖パピローマ、コンジローム、内反性パピローマ、前癌性又は癌性ＨＰＶ誘発病変、子宮頚部新形成、直腸新形成、肛門上皮の新形成、口腔咽頭の新形成又は扁桃の新形成からなる群から選ばれる、項目２又は３に記載の脱メチル化剤。
（項目５）
ａ）脱メチル化剤及びｂ）医薬用として許容可能な担体からなる医薬組成物。
（項目６）
緩衝剤、湿潤剤、賦形剤、保存剤及び抗ウイルス物質からなる群から選ばれる活性成分をさらに含む、項目５に記載の医薬組成物。
（項目７）
前記脱メチル化剤が５−アザシチジン、５−アザ−２０−デオキシシチジン、アラビノシル−５−アザシチジン、５−６−ジヒドロ−５−アザシチジン、５−フルオロ−２０−デオキシシチジン、エピガロカテキン３−没食子酸塩、ヒドララジン、プロカインアミド、プロカイン及びゼブラリンからなる群から選ばれる、項目５又は６に記載の医薬組成物。
（項目８）
前記脱メチル化剤が０．００１乃至５０％の濃度で存在する、項目５乃至７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
（項目９）
前記医薬用として許容可能な担体がステアリン酸、Ａｑｕａｐｈｏｒ（登録商標）、パルミチン酸イソプロピル、ステアリン酸ポリオキシル４０、プロピレングリコール、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸、ラウリル硫酸トリエタノールアミン、ＤＭＳＯ、ベータデクス、エデト酸二ナトリウム、ヒドロキシエチルセルロース、メチルパラベン、ナイアシンアミド、フェノキシエタノール、プロピルパラベン及び精製水から選ばれる少なくとも１成分を含む、項目５乃至８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
（項目１０）
綿、セルロース、デキストラン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ（ジメチルシロキサン）、エチレン酢酸ビニルコポリマー類、ポリカロフィル、ヒドロキシプロピルメチルセルロース及びポリアクリル酸類からなるポリマー担体上で提供される、項目５乃至９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
（項目１１）
前記ポリマー担体が子宮頚管キャップ、綿棒、タンポン、膣タンポン、膣リング、膣ストリップ、膣カプセル、生体付着性フィルム、スポンジ又はブラシである、項目５乃至１０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【００２２】
さらに、本発明は、ウイルス複製及び分子の形質転換感染への移行を阻止することによりＨＰＶ関連病変及び癌を処置するために体腔の粘膜上皮へ局所適用するための脱メチル化剤含有医薬組成物に関する。この点に関して、本発明はさらに、ＨＰＶ関連新形成の処置及び予防用医薬組成物に関する。この医薬組成物は、医薬用として許容可能な担体並びにＥ２ＢＳ１、ＮＦＩＢＳ、ＴＥＦ−１ＢＳ及び／又はＳＰ１ＢＳにおける特定のメチル化パターンを阻害する後成的阻害剤又は脱メチル化剤を含む。
【００２３】
また、本発明は、ＨＰＶ  Ｅ２ＢＳ１、ＮＦＩＢＳ及び／又はＴＥＦ−１ＢＳのメチル化パターンを測定することによって潜伏感染した細胞とＨＰＶ増殖感染細胞とを識別する方法に関する（図５参照）。
【００２４】
配列番号１乃至８の配列を含む単離核酸であって、この核酸は下記配列中、大文字で示した位置でメチル化されているものとする核酸。
【００２５】
【化１】
2014158477.tif 000002
上記配列の全てのヌクレオチドの位置はＮＣＢＩ受託番号ＮＣ＿００１５２６のＨＰＶ１６全ゲノム配列に従って引用した。大文字のＣはメチルシトシンに対応する。大文字のＧは逆相補鎖にメチルシトシンが位置する部位を示す。
【００２６】
下記の配列番号９乃至１５の単離核酸
【００２７】
【化２】
2014158477.tif 000003
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】ウイルスの生活環及び形質転換感染への進行の模式図である。
【図２】ＨＰＶ１６ゲノム及び長鎖制御領域（ＬＣＲ）又は上流調節領域（ＵＲＲ）の拡大構造の模式図である。ウイルスＥ２蛋白質及びＳＰ１転写因子の結合部位の相対的位置が示されている。
【図３】正常と腫瘍性上皮との間でＥ２ＢＳ４のメチル化パターンを比較した（Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｊｅｅ及びＳｅｎｇｕｐｔａ、２００６年）により報告されたメチル化パターンの分析結果並びにＥ２ＢＳ１における非形質転換上皮と形質転換（ｐ１６ＩＮＫ４ａ陽性）上皮との主要な相違を明らかにした本発明者らの結果の模式図である。
【図４】顕微解剖した子宮頚部上皮の例を示す図である。上部パネル：初期ＨＰＶ感染（出現しつつあるＣＩＮ１の証拠）であるが、形質転換されていないため、ｐ１６ＩＮＫ４ａが染色されていない上皮。下部パネル：無秩序なＨＰＶ  Ｅ６／Ｅ７癌遺伝子発現を示す高悪性度扁平上皮内病変及び高悪性度扁平上皮内病変（ＨＳＩＬ：ｈｉｇｈ  ｇｒａｄｅ  ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｉｎｔｒａｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｌｅｓｉｏｎ）の証拠。
【図５】ＨＰＶ１６  ＵＲＲ内の重要な転写因子結合部位のメチル化パターンを示す模式図である。
【図６】ＣＯＢＲＡアッセイの原理及びＨＰＶ１６ゲノムのＥ２ＢＳ１のいくつかの臨床サンプルの分析結果を示す図である。
【図７】正常扁平上皮の構造を示す図［ＫｏｓｓＬＧほか、１９９９年］である。
【図８】ｐ９７初期プロモータ活性に対するＥ２ＢＳ−１メチル化の影響を示す図である。
【図９】ｐ９７初期ＨＰＶ１６プロモータ活性に対する５−アザシチジンの影響を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本発明者らは、ヒトパピローマウイルスゲノムのメチル化パターン、特にウイルスの生活環の３つの想定相、即ち、ａ．潜伏感染、ｂ．複製感染及びｃ．形質転換感染におけるＵＲＲ（その同族Ｅ２ＢＳを含む）のメチル化パターンについて調べた。分化段階の異なる上皮細胞内のＨＲ−ＨＰＶゲノムの詳細なメチル化状態を明らかにするために、組織を顕微解剖し（図４参照）、異なる細胞層からのＨＰＶ配列を増幅させて、バイサルファイトシーケンシングＰＣＲ（ＢＳＰ：ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＰＣＲ）を用いたＨＰＶゲノムの異なるメチル化パターンの正確な評価を行った（図５参照）。
【００３０】
ここでいうＨＰＶ関連病変とは、急性又は持続性ＨＰＶ感染により誘発された任意の上皮の全ての変化を含む、ＨＰＶ感染により誘発された病変のことをいう。これらの病変は、臨床的影響のない小さな疣贅から、もっと正確に言えば、皮膚、生殖器官、粘膜表面などの外方増殖パピローマ、内反性パピローマを初めとするコンジローム並びに腫瘍形成性パピローマウイルス遺伝子タイプにより誘発される前癌及び浸潤性病変（それに由来する転移を含む）に及ぶものとすることができる。ＨＰＶ誘発性前癌又は癌病変の多くは、種々の上皮組織の移行部、特に、例えば、子宮頚部移行部、肛門上皮と直腸粘膜の接合部又は扁桃領域の口腔咽頭部内のような、単層腺上皮が多層扁平上皮と交わる所に生じる。
【００３１】
本発明の発明者らは、ＨＰＶの細胞変性効果の影響を未だ受けていない正常な上皮では、ウイルスゲノムが基底細胞内に存続することができることを見出し、基底及び傍基底細胞に潜伏期のウイルス感染が存在することが明らかとなった（データは図に示されていない）。この潜伏期のウイルスゲノムは分析することができたすべてのＣｐＧで完全にメチル化されており、ウイルスゲノムの全体的なメチル化によって感染の潜伏が媒介され、ウイルス遺伝子の発現が阻止されることにより感染上皮の細胞病理学的又は組織病理学的変化も防止されることが示唆される。すなわち、本発明者らは、ＨＰＶゲノムのメチル化状態と感染の潜伏様式との間に関連性があることを見出した。この時期のメチル化がＥ２ＢＳ１にも見出されることに留意することは重要である。
【００３２】
ウイルスゲノムを初期異形成病変（ＣＩＮ１）の顕微解剖された細胞から単離した場合には、宿主細胞の分化状態及びウイルスゲノム内の各ＣｐＧに応じてメチル化パターンの異なる変化が観察された（図５参照）。基底細胞層では、ＵＲＲの異なる部分にメチル化されていないＥ２ＢＳ（１乃至４）が認められた。興味深いことに、Ｅ２ＢＳ１がメチル化されなかったことによって、恐らくウイルスのエンハンサエレメントの結合及び抑制が可能となる。ウイルスＤＮＡが中間細胞層から単離された場合には、ゲノムの諸部分は脱メチル化されるようになる。これによってＮＦＩ、ＴＥＦ−１などのような正の転写因子（ＴＦ：ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ）の接近が可能となり、ウイルス遺伝子の発現が刺激される。ウイルスの遺伝子発現の増強は分化細胞内の脱メチル化が増加することに一致して生じ、従って、ウイルスゲノムの複製が開始される（図５）。
【００３３】
表面細胞層では、Ｅ２（Ｅ２ＢＳ２、３及び４）並びにＳＰ１結合部位を含む初期プロモータ内の全てのＣｐＧがメチル化され、初期プロモータ活性の不活化が示唆された。
【００３４】
すでに高悪性度扁平上皮内病変（ＨＳＩＬ：ｈｉｇｈ  ｇｒａｄｅ  ｓｑｕａｍｏｕｓ
ｉｎｔｒａｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｌｅｓｉｏｎ）へ進行し、従ってｐ１６ＩＮＫ４ａマーカ（Ｋｌａｅｓほか、２００１年）の過剰発現により明らかとなるウイルスの癌遺伝子Ｅ６及びＥ７の大量発現を示す（図４参照）病変では、Ｅ２ＢＳ１の一貫したメチル化が認められた（図５）。このことから、メチル化は、この特定の結合部位へのＥ２蛋白質の接近を阻止することによって負の転写調節を無効にし、コントロール不良の高レベルのウイルス遺伝子発現がＨＰＶ１６  ＵＲＲ（ＬＣＲ）により媒介されることを可能にすることが示唆される。
【００３５】
結合バイサルファイト制限解析（ＣＯＢＲＡ：Ｃｏｍｂｉｎｅｄ  Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ  Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ）（Ｘｉｏｎｇ及びＬａｉｒｄ、１９９７年）を用いてこのメチル化パターンを、無秩序なＥ６及びＥ７癌遺伝子の発現を示す病変のｐ１６ＩＮＫ４ａ陽性部分とＨＰＶＥ６及びＥ７遺伝子発現障害の制限を明らかに依然として維持する病変のＨＰＶに感染するもｐ１６ＩＮＫ４ａ陰性の部分との間で比較した。図６に示したデータは、Ｅ２ＢＳ１のメチル化はウイルス癌遺伝子の無秩序な発現と同時に起きるという概念を裏付けるものである。
【００３６】
Ｅ２結合部位は以下の通り定義される：
【００３７】
【化３】
2014158477.tif 000004
ＮＣＢＩアセッション番号ＮＣ＿００１５２６のＨＰＶ１６全ゲノム配列によるＢＳの位置。
【００３８】
正常上皮は、図７に示したように記述することができる。皮膚及び粘膜の最外層は、３つの主な帯域に分類することができる、形態の進行性の変化により区別される多上皮細胞層からなる（図２０）［Ｋｏｓｓ  ＬＧほか、Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｉｃ  Ｃｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ｗｉｔｈ  Ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｓ、１９９９年：ｐ．２３−３０］。
【００３９】
基底帯は、球状であり、比較的大きな核を有する低分化基底細胞の１又は２層（基底層）からなる。正常な扁平上皮では、基底幹細胞は分裂することができる唯一つの細胞である。この基底細胞は真皮から表皮を隔てる基底膜に付着している。
【００４０】
上皮の中間帯は上皮の厚さの大部分に相当し、表面に向かって大きさが増大する数層の細胞（傍基底層又は有棘層及び中間扁平層又は顆粒層）からなる。一旦基底膜に付着しなくなると、こうした細胞は細胞周期を出て、分裂を止め、分化し始める。
【００４１】
表面帯は、小さな凝縮核及びグリコーゲンで満たされている細胞質を有するより大きく扁平な細胞の列（成熟扁平層又は角質層）を含む。表面帯の外層は最終分化細胞からなる。
【００４２】
ゲノム位置７，１９８番目と１６１番目との間の分析領域には１６個のＣｐＧが含まれる（図５）。この分析領域は、５’ＬＣＲ、エンハンサ及びプロモータと呼ばれる３つの機能的に異なるセグメントに分けることができる。この５’ＬＣＲは、Ｅ２ＢＳ１（７，４５０−ｎｎｎｎｎ−７，４６１）内のＣｐＧ（ｎｔ７４５２、ｎｔ７４５８）を含む４個のＣｐＧを含む。エンハンサは、ＮＦＩＢＳ（７５４１−ｃｔｔｇｃｃａｔｇＣＧｔｇｃｃａａａｔｃ−７５６０及び７６６３−ａａｔｃａｃｔａｔｇＣＧｃｃａａＣ−６３７９）並びにＴＥＦ−１ＢＳ（７６８４−ｔａｃａｔａｃＣＧｃｔ−７６９４）内の４個のＣｐＧ（ｎｔ７５５０、７６７３、７６７９及び７６９１）を含む５個のＣｐＧを含む。プロモータ内の最後の７個のＣｐＧ、これらのうちの６個（ｎｔ７８５９、３１、３７、４３、５２、５８）は、Ｓｐ１（２５−ｔａａｇｇｇＣＧ−３２）並びに３つのＥ２結合部位（Ｅ２ＢＳ２  ７８５７−ａｃＣＧａｔｔｔｇｇｇｔ−７８６９、Ｅ２ＢＳ３  ３５−ａｃＣＧａａａｔＣＧｇｔ−４６及びＥ２ＢＳ４  ５０−ａｃＣＧａａａｃＣＧｇｔ−６１）と重複する。
【００４３】
これまでの報告に所載されていることとは対照的に、本発明者らは、ＨＰＶの細胞変性効果の影響を未だ受けていない正常上皮では、ウイルスゲノムが基底細胞内に存続することができることを見出し、基底及び傍基底細胞に潜伏期のウイルス感染が存在することが明らかに示された（データは図に示されていない）。この潜伏期のウイルスゲノムは、分析することができた１６個のＣｐＧの全てにおいて完全にメチル化されており（図５）、このことから、ウイルスゲノムの全体的なメチル化によって感染の潜伏が媒介されてウイルス遺伝子の発現が阻止され、これによって感染上皮の細胞病理学的又は組織病理学的変化も防止されることが示唆される。この知見は、これまでＨＰＶゲノムのメチル化状態と潜伏様式の感染とを関連づけるデータは報告されていないので、新規なものである。この時期において、メチル化がＥ２ＢＳ１においても見られることに留意することは重要である。
【００４４】
ウイルスゲノムを初期異形成病変（ＣＩＮ１）の顕微解剖された細胞から単離した場合には、宿主細胞の分化状態及びウイルスゲノム内の各ＣｐＧに応じてメチル化パターンの異なる変化が観察された（図５参照）。
【００４５】
プロモータ領域では、分析した１２のアンプリマークローンの、基底細胞及び中間層からの細胞画分から単離したＤＮＡは全て、メチル化されていないＣｐＧを含んでいた。表面細胞層の分化のより進んだ細胞から単離したＨＰＶ１６ＤＮＡでは著しく異なった結果が観察された。分化細胞に富んだこの表面層から単離したＨＰＶ１６ＤＮＡから作製した１２種のアンプリマークローンのうちの８種において、Ｅ２ＢＳ（２、３及び４）及びＳＰ１部位を含むプロモータ内のＣｐＧがメチル化された。
【００４６】
エンハンサ領域では、２個のＮＦＩＢＳ及び１個のＴＥＦ−１ＢＳ内の４個のＣｐＧが基底細胞内で高度にメチル化されていたが、分化のより進んだ細胞内ではメチル化の程度はより低かった。これによってＮＦＩ、ＴＥＦ−１などのような正の転写因子（ＴＦ）の接近が可能となり、ウイルス遺伝子の発現が刺激される。ウイルスの遺伝子発現の増強は分化細胞内の脱メチル化が増加することに一致して生じる（図５）。
【００４７】
５’ＬＣＲセグメントでは、４個のＣｐＧの全てが分化段階と関係なくメチル化されていなかった。興味深いことに、Ｅ２ＢＳ１がメチル化されなかったことによって、恐らくウイルスのエンハンサエレメントの結合及び抑制が可能となる。
【００４８】
すでに高悪性度扁平上皮内病変（ＨＳＩＬ）へ進行し、従ってｐ１６ＩＮＫ４ａマーカ（Ｋｌａｅｓほか、２００１年）の過剰発現により明らかとなるウイルスの癌遺伝子Ｅ６及びＥ７の大量発現を示す（図４参照）病変では、特有のメチル化パターンが認められた（図５）。プロモータ及びエンハンサ領域では、ＮＦＩＢＳ及びＴＥＦ−１ＢＳ内の４個のＣｐＧがメチル化された。５’ＬＣＲでは、Ｅ２ＢＳ１内の２個のＣｐＧを含む３個のＣｐＧがメチル化された。このことから、メチル化は、この特定の結合部位へのＥ２蛋白質の接近を阻止することによって負の転写調節を無効にし、コントロール不良の高レベルのウイルス遺伝子発現がＨＰＶ１６  ＵＲＲ（ＬＣＲ）により媒介されることを可能にすることが示唆される。
【００４９】
これによって、本発明者らは、こうした宿主細胞組織内での各ウイルスゲノムの生物学的特性を用いてウイルスゲノムの異なるメチル化パターンを示すことができた。この研究の重要な知見は以下のとおりである。
【００５０】
ウイルス活性を示さない潜伏感染細胞では、ＨＰＶゲノムは、全てではないにしても殆ど全てのＣｐＧ島において高度にメチル化され、それによってウイルス遺伝子の任意の生物学的に意義のある発現が阻止される。例えば、基底帯、中間帯及び表面帯の細胞においてＣｐＧ島の８０％超、好ましくは９０％、好ましくは９５％、より好ましくは９８％以上がメチル化される。これによって数少ない上皮幹細胞における潜伏ＨＰＶ感染の完全な隠蔽が媒介され、その後、それは不確定の期間持続することができる（図５参照）。
【００５１】
まだ特徴付けられていない条件下では、個々の細胞におけるＨＰＶ感染の潜伏状態は複製感染様式に切り替わり得る。基底細胞では、（Ｅ２ＢＳ２、３及び４並びにＳＰ１結合部位並びに（Ｅ２ＢＳ１を含む）５’長鎖制御領域内のＣｐＧを含む）初期ＨＰＶプロモータはメチル化されていないＣｐＧを含んでいた。従って、エンハンサ領域では、ＮＦＩ及びＴＥＦ−１部位内の４個のＣｐＧは高度にメチル化されていた。このメチル化のパターンは、ｐ９７プロモータの活性が低いことを示唆するものである。（図５）
中間細胞では、ＨＰＶエンハンサのメチル化の程度は、基底細胞に比し、分化のより進んだ細胞ではより低く、これによって、核因子１（ＮＦＩ：ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ  Ｉ）、転写エンハンサ因子ＴＥＦ−１（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｅｎｈａｎｃｅｒ  ｆａｃｔｏｒ−１）などの転写活性化因子の結合によるｐ９７プロモータの活性増大がもたらされる。しかしながら、初期プロモータの活性は、Ｅ２の負の制御（Ｅ２ＢＳ１脱メチル化）のために一定のレベルに維持される。
【００５２】
最終分化表面細胞では、Ｅ２（Ｅ２ＢＳ２、３及び４）並びにＳＰ１結合部位を含む初期プロモータ内の全てのＣｐＧがメチル化され、初期プロモータ活性の不活化が示唆された。
【００５３】
ウイルスゲノムのメチル化状態が実質的に宿主細胞の上皮分化の程度によって変化するという事実は、ＤＮＡのメチル化がウイルスの生活環及び恐らくまた上皮分化において重要な役割を有することを示唆している。さらに、機能的に異なる高リスク及び低リスクウイルス型の両者は、増殖性生活環を調節するための共通のメカニズムを共有していると考えられる。
【００５４】
複製感染が長期持続すると、基底及び傍基底細胞のうちの感染細胞は、基底及び傍基底細胞のメチル化プロフィルを主にＥＢＳ１、ｎｔ７４５９のメチル化を特徴とするＨＰＶ感染の形質転換様式に切り替えることができる。このＣｐＧ島のメチル化は、Ｅ２ＢＳ１へのＥ２結合の低下及び興味深いことにＵＲＲに対するその抑制機能の低下をもたらす。その結果、これによって各ＨＰＶゲノムは細胞内監視制御を緩め、基底細胞コンパートメント内でウイルス癌遺伝子Ｅ６及びＥ７の十分なレベルの発現を開始する。
【００５５】
バイサルフェートゲノム配列決定（ＢＧＳ：ｂｉｓｕｌｆａｔｅ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）法によるＨＰＶ１６のＵＲＲにおけるメチル化ＣｐＧのマッピング。
【００５６】
レーザーにより顕微解剖された分化程度の異なる（基底、中間及び表面層）細胞から単離したＤＮＡについて、バイサルファイトゲノム配列決定（ＢＧＳ）法によりＨＰＶ１６のＵＲＲのメチル化状態を分析した。
【００５７】
ＥＺＤＮＡメチル化キット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社、Ｏｒａｎｇｅ、ＣＡ）を用い、メーカーの推奨する方法に従ってＤＮＡのバイサルファイト修飾を行った。対照としてＣａｓｋｉ及びＳｉＨａ細胞株からのＤＮＡを用い、サンプルと同時に処置して完全なバイサルファイト処置を保証した。
【００５８】
ＨＰＶ１６のＵＲＲ（ｎｔ７１９８からｎｔ１６１まで；ＮＣ＿００１５２６）に架かるように設計したプライマを用いて入れ子ＢＳＭ−ＰＣＲ系を開発し、実施した（表１）。
【００５９】
【表１】
2014158477.tif 000005
ＰＣＲ反応混液は、１０×ＰＣＲ緩衝液、５μｌの５０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．５μｌの２ｍＭデオキシリボヌクレオチド三リン酸、０．５ｍＭの各ＰＣＲプライマ（１．５μｌのプライマ（２５ｐｍｏｌ／μｌ））、２．０ＵのＰｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）及び２μｌのバイサルファイト修飾ＤＮＡを含む計５０μｌとして作製した。各分析ではＤＮＡを含まない陰性対照を置いた。増幅条件は以下の通りとした：最初の９４℃２分間の変性後、９４℃３０秒間の入れ子ＰＣＲ、５０℃３０秒間のアニーリング、７２℃４０秒間及び最後に７２℃４分間の伸長の４０サイクル及び３０サイクル。ＰＣＲ産物は、電気泳動により分離し、臭化エチジウムで染色した２％アガロースゲルから単離した。次いで、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社、Ｈｉｌｄｅｎ）によりメーカーの使用説明書に従って単離ＰＣＲ産物を精製した。精製ＰＣＲ断片は、ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてクローニングし、１２の個々のクローンについて配列決定を行い、ＨＰＶ１６  ＤＮＡ内のメチル化ＣｐＧの有無及びパターンを明らかにした。バイサルファイト修飾サンプルＤＮＡの配列決定は、ＢｉｇＤｙｅターミネータ配列決定キット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を用い、メーカーの推奨する方法に従って実施した。配列決定ＰＣＲ産物はＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒで解析した。
【００６０】
ＨＰＶ１６  Ｅ２ＢＳ１のメチル化状態の測定：結合バイサルファイト制限解析（ＣＯＢＲＡ）
ＨＰＶ１６のＰ９７プロモータに対して遠位にあるＥ２ＢＳ−１［７４５０−ａｃＣＧａａｔｔＣＧｇｔ−７４６１］のメチル化状態を測定するために、結合バイサルファイト制限解析（ＣＯＢＲＡ）（Ｘｉｏｎｇ及びＬａｉｒｄ、１９９７年）を用いた。
【００６１】
ｐ１６陽性及びｐ１６陰性病変部から単離したＤＮＡを、ＥＺ  ＤＮＡメチル化キット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社、Ｏｒａｎｇｅ、ＣＡ）を用い、メーカーの推奨する方法に従ってバイサルファイト処理した。
【００６２】
処理後、５μｌのアリコートを、１×緩衝液、１．２５ｍＭデオキシヌクレオチド三リン酸混合物、２．５ｐｍｏｌの各プライマ及び１．５単位のＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を含有する溶液５０μｌ中で増幅させた。ＰＣＲは以下の通り行った。ホットスタート後のサイクルパラメータは、４５サイクルでは９４℃３０秒間、５０℃３０秒間及び７２℃６０秒間とし、最終伸長では７２℃４分間とした。ＣＯＢＲＡに用いたプライマは以下の通りとした：ｍＨＰＶ１６＿Ｅ２ＢＳ１順方向  ５’ＡＡＴＴＧＴＧＴＴＧＴＧＧＴＴＡＴＴＴＡＴＴＧ３’及びｍＨＰＶ１６＿Ｅ２ＢＳ１逆方向  ５−ＣＡＡＡＴＴＴＡＡＡＣＣＡＴＡＡＴＴＡＣＴＡＡＣ３’。
【００６３】
増幅後、制限酵素ＥｃｏＲＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社）でＰＣＲ産物を消化した。ＥｃｏＲＩは、メチル化及びバイサルファイト変換ＤＮＡに特有のＥ２ＢＳ１配列を認識する（図６）。ＤＮＡは２％アガロースゲル中で電気泳動した。ゲルは臭化エチジウムで染色した。
【００６４】
本発明者らは組織特異性を説明づけることができる。何故なら、ＨＰＶはウイルスのサイクルを支えるための特定のメチル化機構を必要とするからである。
【００６５】
これらのデータから、ウイルスゲノムのメチル化状態は実質的に宿主細胞の上皮分化の程度によって変化することが示唆される。さらに、我々の結果は、Ｅ２結合部位１のメチル化は子宮頚癌進行の初期段階において重要な役割を果たしているとも考えられることを示している。
【００６６】
従って、正常なウイルスのサイクルを妨害することができる脱メチル化剤を用いることは、結局のところ比較的理にかなっていると考えられる。本明細書でいう脱メチル化剤は、核酸のメチル化状態に影響を及ぼす任意の薬剤とすることができ、例えば、５−アザシチジン（Ｖｉｄａｚａ）、５−アザ−２０−デオキシシチジン（Ｄｅｃｉｔａｂｉｎｅ、ｄａｃｏｇｅｎ）、アラビノシル−５−アザシチジン（Ｆａｚａｒａｂｉｎｅ）、５−６−ジヒドロ−５−アザシチジン（ＤＨＡＣ）、５−フルオロ−２０−デオキシシチジン（Ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）、エピガロカテキン−３−没食子酸塩（ＥＧＣＧ）、ヒドララジン、プロカインアミド、プロカイン、ゼブラリン又はこれらの組合せとすることができる。別のクラスの脱メチル化剤としては、特定のオリゴヌクレオチド類（例えば、ＥＧＸ３０Ｐ）、特定のＲＮＡｉ又はＤＮＭＴ１アンチセンス（ＭＧ９８）がある。好ましい実施態様では、５−アザシチジン、５−アザ−２−デオキシシチジン又はこれらの組合せが用いられる。
【００６７】
本発明による局所投与用医薬組成物は、エアロゾル剤、クリーム剤、ゲル剤、液剤、軟膏剤、ペースト剤、パッチ剤、タンポン剤、キャップ剤及び任意の他のデバイス及び／又は脱メチル化剤の放出制御用製剤のような形式で提供することができる。
【００６８】
本発明の医薬組成物は活性成分をさらに含むことができる。本発明の活性薬剤を用いて、本発明の１種以上の化合物を活性成分として含有し、この活性成分の放出を制御及び調節することができる放出制御医薬製剤を形成することができる。放出制御組成物は、例えば、ポリ（ジメチルシロキサン）、エチレン酢酸ビニルコポリマー類、ポリカロフィル（ｐｏｌｙｃａｒｏｐｈｉｌ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース及びポリアクリル酸類などの適切なポリマー担体を選ぶことによって得ることができる。また、薬物放出速度及び作用持続時間は、ヒドロゲルなどのポリマー物質及びその他上記のポリマーの粒子（例えば、マイクロカプセル）に活性成分を取り込ませることによって制御することもできる。放出制御はリポソーム、ミクロスフェア、マイクロエマルションなどのようなコロイド状薬物送達系を含む方法によって達成することができる。
【００６９】
脱メチル化剤は、例えば、５−アザシチジン又は塩酸５，６−ジヒドロ−５−アザシチジンとすることができる。また、親水性クリーム又は親水性ゲルを基剤として５−アザシチジンの化学的に安定で可溶性のアナログを用いることもできる。例えば、１％クリーム剤は、ステアリン酸、Ａｑｕａｐｈｏｒ（登録商標）、パルミチン酸イソプロピル、ステアリン酸ポリオキシル４０、プロピレングリコール、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸、ラウリル硫酸トリエタノールアミン及び精製水を含む親水性クリーム基剤中に１％ｗ／ｗの５−アザシチジン又は１％ｗ／ｗの塩酸５，６−ジヒドロ−５−アザシチジンを含有する局所製剤である。
【００７０】
添加剤としては、（燐酸ナトリウムなどの）緩衝剤、（グリセリン又はソルビトールなどの）湿潤剤及び当業者に周知の他の賦形剤を挙げることができる。１％水性ゲルは、ベータデクス、エデト酸二ナトリウム、ヒドロキシエチルセルロース、メチルパラベン、ナイアシンアミド、フェノキシエタノール、プロピレングリコール、プロピルパラベン及び精製水の基剤中に１％ｗ／ｗの５−アザシチジン又は１％ｗ／ｗ又は塩酸５，６−ジヒドロ−５−アザシチジンを含有する。５−アザシチジン（１％）親水性ゲルは、蒸留水にヒドロキシエチルセルロース（Ｎａｔｒｏｓｏｌ１）を１％溶かした溶液に重量で１％の５−アザシチジンを添合することによって調製することができる。
【００７１】
このプリンシパルは、本発明の種々の活性薬剤間の組合せ又は本発明の種々の活性薬剤と抗ＨＰＶ活性を示す他の薬物との組合せに適用することができる。
【００７２】
脱メチル化剤は単独で投与することができるが、医薬製剤として与えることが好ましい。本発明の医薬組成物はａ）脱メチル化剤及びｂ）医薬用として許容可能な担体を含む。
【００７３】
別の実施態様では、この医薬組成物はａ）脱メチル化剤、ｂ）ウイルス感染に対して相乗効果をもたらす抗ウイルス剤及びｃ）医薬用として許容可能な担体を含む。
【００７４】
５−アザシチジン、５−アザ−２−デオキシシチジン又はこれらの組合せは、現在知られているか将来開発されるかもしれない種々の医薬製剤に調製することができる。
【００７５】
特定の実施態様では、５’−アザシチジンは０．００１％ｗ／ｗ乃至５０％ｗ／ｗ、より好ましくは０．００５％ｗ／ｗ乃至２０％ｗ／ｗ、より好ましくは０．００５％ｗ／ｗ乃至１０％ｗ／ｗの濃度で局所医薬組成物として適用される。この脱メチル化剤は約０．００１％乃至１０％の濃度で脱メチル化剤を含むクリーム剤である。
【００７６】
【表２】
2014158477.tif 000006
各種形態の適用スケジュール：ブラシ剤−８時間毎、タンポン剤−毎日、子宮頚部キャップ剤−２日毎。
【００７７】
５’−アザシチジンは、０．１ｎｇ乃至１００μｇの投与量、別の実施態様では０．５ｎｇ乃至５０μｇの各単回適用投与量、さらに別の実施態様では１ｎｇ乃至１０μｇの投与量、別の実施態様では５００ｎｇ乃至２μｇの投与量で使用する。本発明の特定の実施態様では、１日当たり１投与量、１日当たり２投与量、１日当たり３投与量、１日当たり４投与量又は１日当たり５以上もの投与量が適用される。本発明の特定の実施態様では、適用は、脱メチル化剤を連続的に放出する媒体を用いて連続的となるようにデザインされる。別の実施態様では、こうした投与量は毎週、週２回、週３回、隔週又は毎月与えられる。このような投与量は、例えば、計１週間、計２週間、計３週間、計４週間、計５週間、計６週間、計２ヶ月間、計３ヶ月間又はそれ以上もの間適用することができる。特定の実施態様では、適用期間は半年、１年又はそれ以上もの期間とすることができる。
【００７８】
子宮頚部への薬物送達に用いることができるデバイスの１例は綿棒又はブラシである。
【００７９】
薬物送達に用いることができるデバイスの他の例は子宮頚部キャップである。例えば、キャビティーリムキャップ（ｃａｖｉｔｙ  ｒｉｍ  ｃａｐ）は子宮頚部に付着する。このキャビティーリムキャップはＰｒｅｎｔｉｆ（登録商標）Ｃａｐｓである。このＰｒｅｎｔｉｆ（登録商標）Ｃｅｒｖｉｃａｌ  Ｃａｐは患者の子宮頚部を覆い、避妊の障壁方法として用いられる。同様に、ＴｏｄａｙＲ（登録商標）避妊用スポンジは、患者の子宮頚部にフィットするように形成されたスポンジ状デバイスであった。
【００８０】
患者の子宮頚部に関連して用いられる他のタイプのデバイスは、膣タンポン、膣リング、膣ストリップ、膣カプセル、生体付着性フィルム又はスポンジである。デバイスには、約１乃至約１０ｍｇの後成的薬剤、約１０％のヒドロキシプロピルメチルセルロース、約７０％の親水性薬物用飽和脂肪酸トリグリセリド又は脂溶性薬物用ＰＥＧ６０００／ＰＥＧ４００及び約１５％のエトキシジグリコールを含む組成物を含浸させる。
【実施例】
【００８１】
（実施例１）
メチル化パターンの検出
ＨＰＶ１６  ＵＲＲのメチル化が宿主上皮細胞の分化状態によって影響されるかどうかを調べるために、レーザーにより顕微解剖された分化程度の異なる正常上皮細胞から単離したＨＰＶ１６のＤＮＡをバイサルファイトゲノム配列決定（ＢＧＳ）法によって分析する。
【００８２】
正常上皮由来の基底細胞及び中間層からの細胞画分中のｐ９７ＨＰＶ１６プロモータはメチル化されていないＣｐＧを含有していた。これに対して、分化細胞に富んだ表面層におけるＨＰＶ１６プロモータは、Ｅ２（Ｅ２ＢＳ２、３及び４）並びにＳＰ１結合部位内のＣｐＧを含め、メチル化されていた。エンハンサ領域では、全ての分化段階において１つのＣｐＧ部位（７４５４）のメチル化の低下が見られた。従って、その他の４個のＣｐＧは、基底細胞では高度にメチル化されたが、より分化の進んだ細胞ではメチル化の程度は低い。５’ＬＣＲ領域は全ての分化段階で低メチル化状態であった。
【００８３】
さらに、結合バイサルファイト制限解析（ＣＯＢＲＡ）を用い、ＨＰＶ形質転換上皮細胞の生体指標としてのサイクリン依存性キナーゼ抑制因子ｐ１６ＩＮＫ４ａの過剰発現によって、ＨＳＩＬ病変部中のＨＰＶ１６  ＵＲＲのメチル化パターンと対応する正常上皮とを比較する。
【００８４】
これらのデータから、Ｅ２ＢＳ１のメチル化は複製ＨＰＶ感染から形質転換ＨＰＶ感染への移行過程で特異的に生じることが分かる。
【００８５】
（実施例２）
診断の評価
ＨＰＶ１６に感染した、細胞学的、組織学的に確認された低悪性度（ＬＳＩＬ、ｎ＝５３）及び高悪性度（ＨＳＩＬ、ｎ＝４８）病変部から得られた１０１個のサンプル（塗抹及びパンチ生検標本）について、結合バイサルファイト制限解析（ＣＯＢＲＡ）法によりＥ２ＢＳ１メチル化の有無を調べた。
【００８６】
特異的なＬＣＲ  ＨＰＶ１６メチル化の検出は、癌への進行の高いリスクを有する前癌病変を検出するための分子マーカとなる。
【００８７】
【表３】
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Ｅ２ＢＳ１のメチル化は高悪性度病変部の７５％に存在したが、低悪性度上皮内病変部では２２．６％に過ぎなかった。従って、特異的なＬＣＲ  ＨＰＶ１６メチル化の検出は、癌への進行のリスクが高い前癌病変を検出するための分子マーカとなり得る。
【００８８】
Ｅ２ＢＳ１へのＥ２の結合がｐ９７プロモータの活性化に関与しているかどうかを確認するために、一過性導入実験においてＰ９７の活性に対するＥ２ＢＳ１メチル化の影響を分析した。野生型ＨＰＶ１６  ＬＣＲ中にＥ２ＢＳ１内の２個のＣｐＧジヌクレオチドの選択的メチル化を生じさせた。正常なヒト陰茎包皮の角化細胞に、ＨＰＶ１６  Ｅ２のための漸増量の発現ベクターと、ルシフェラーゼ遺伝子の直前にＨＰＶ１６  ＬＣＲ全体（Ｅ２ＢＳ１−ＬＣＲ１６−Ｌｕｃ）を含むか、Ｅ２ＢＳ１内にメチル化を有するＬＣＲ（ｍｅｔｈＥ２ＢＳ１−ＬＣＲ１６−Ｌｕｃ）を含むレポータプラスミド約５０ｎｇとを同時導入した。Ｅ２ＢＳ１のメチル化により初期ｐ９７ＨＰＶ１６プロモータは４乃至６倍活性化された（図８）。このデータから、この特定結合部位へのＥ２蛋白質の結合を調節することで、メチル化はこのｐ９７プロモータを活性化し、コントロール不良の高レベルのウイルス遺伝子発現を可能にすることが示唆される。
【００８９】
さらに、こうしたデータから、Ｅ２ＢＳ１の特異的なメチル化の検出を行うことにより急性ＨＲ−ＨＰＶ感染から形質転換ＨＲ−ＨＰＶ感染へ既に移行している病変部を特定できることが分かる。従って、Ｅ２ＢＳ１のメチル化はＨＳＩＬの生体指標となりうる。
【００９０】
（実施例３）
細胞培養における５’−アザシチジンの治療的適用
ｐ９７プロモータの活性に対する後成的阻害剤（脱メチル化剤）による処置の効果をルシフェラーゼアッセイを用いて評価する。ルシフェラーゼ遺伝子の直前にクローニングしたＨＰＶ１６の完全なＬＣＲ断片を含有するレポータプラスミドＬＣＲ１６＿Ｌｕｃを導入した正常ヒト角化細胞を約５０乃至６０％の集密となるように増殖させた。２μＭ及び４μＭの５−アザシチジンで細胞を２４及び７２時間処置した。細胞に５−アザシチジンを添加すると、初期ｐ９７プロモータの活性が用量依存性に減少した。
【００９１】
図９に示したように、未分化又は分化細胞を２μＭの５−アザシチジンで処置すると、ｐ９７プロモータの活性は４０乃至６０％まで低下した）。４μＭの５’−アザシチジンで処置した両細胞とも、プロモータ活性が基底レベルまで著しく低下した。
【００９２】
これらのデータから、脱メチル化剤の１例としての５−アザシチジンの適用によってＨＰＶ１６  ＵＲＲの活性の大幅な抑制がもたらされることが分かる。従って、これは、ウイルスの生活環を遮断し、急性ＨＰＶ感染から形質転換ＨＰＶ感染への切り替えを阻止する大いなる可能性を有している。こうしたデータに基づき、このような薬剤を用いてウイルスへの複製及びそのより高悪性度の異形成さらには癌への進行を阻止することができる。
【００９３】
（実施例４）
５アザシチジンによる低悪性度子宮頚部病変の処置
低悪性度病変（ＣＩＮ１）ＨＰＶ１６陽性病変を有する患者及び低リスクＨＰＶ関連病変（コンジローム、疣贅）を有する患者を５’−アザシチジンで局所処置した。
【００９４】
重量で１％の５アザシチジンを（蒸留水にヒドロキシエチルセルロース（Ｎａｔｒｏｓｏｌ１）を１％溶かした溶液）に添合して５’−アザシチジン（１％）親水性ゲルを調製するとともに、５アザシチジンを含有しない対応するプラセボゲルを作製した。そのまま使用できるゲル（実薬及びプラセボ）を、使用直前に子宮頚部キャップの内面に付着させた活性のないスポンジによって子宮頚部キャップの内面に塗布した。調製してすぐに、医療関係者がその子宮頚部キャップを子宮頚部に設置する。従って、子宮頚部キャップの内面に付着した治療剤を子宮頚部へ直接拡散させて処置する。子宮頚部キャップは４週間２日毎に子宮頚部に設置した。薬物に接触させた最後の日の１週後に、病変並びに薬物関連副作用の兆候と症状の有無について患者を評価した。治癒は、病変が完全に消失し、コルポスコピーにより感染の臨床的兆候が存在しないことと定義した。退縮率を未処置対照群と比較する。
【００９５】
５’−アザシチジン（１％）ゲルは、プラセボ（病変の治癒率：２２．２％（２／９））よりも有意に多くの病変（８５．７％（６／７））を治癒させた。１６名の患者のうち、１０名では薬物関連有害症状の訴えがなかった。主に実薬ゲル群の６名の患者が軽度の紅斑及び浮腫をきたしたが、多くの場合、そのような症状の発現は４８時間以内に無くなった。
【００９６】
（実施例５）
脱メチル化剤による皮膚疣贅の処置
脱メチル化剤を含む種々の医薬組成物を皮膚疣贅に適用した。これらの組成物は以下の通りとした：親水性クリーム基剤中１％５’−アザシチジン、１０％５，６−ジヒドロ−５−アザシチジン及び１０％エピガロカテキン３−没食子酸塩（ＥＧＣＧ）。こうした医薬組成物を皮膚疣贅に局所適用した。５名の患者に１％５’−アザシチジン、４名の患者に１０％５，６−ジヒドロ−５−アザシチジン及び７名の患者に１０％エピガロカテキン３−没食子酸塩（ＥＧＣＧ）並びに１０名の患者にプラセボを処置した。このクリーム剤は、４週間閉鎖により毎日適用した。全ての患者を１名の医師が調べた。臨床評価は処置開始後１、２及び４週目に実施された。
【００９７】
【表４】
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退縮率は、未処置対照群に比し、処置患者でより高かった。この処置の開始２週後には、疣贅は炎症、発赤の軽微な兆候を示し、実質的により平坦になった。処置開始４週後には疣贅は治癒した。
【００９８】
塩酸５，６−ジヒドロ−５−アザシチジン及びエピガロカテキン３−没食子酸塩（ＥＧＣＧ）は皮膚疣贅に対して同様な活性を示したが、それらの濃度は５’−アザシチジンの１０倍であった。
【００９９】
（実施例６）
５アザシチジンによる高悪性度子宮頚部病変の処置
実施例４に記載した５’−アザシチジン（１％）親水性ゲルを子宮頚部のＣＩＮ２病変に適用した。
【０１００】
この治療剤を１２週間２日毎に子宮頚部キャップ及びスポンジで子宮頚部に送達してこの頚部に設置した。
【０１０１】
全ての患者に対して、薬物に接触させた最後の日の１週後に反復コルポスコープ評価を行った。以前に組織像でＣＩＮ２と判定されたのと同じ部位から頚部生検又は塗抹標本が採取された。注目される転帰は、対象者が処置を必要とする疾患、即ち、ＣＩＮ２以上の悪性度の病変を依然として有するかどうかであった。
【０１０２】
１３週目で無疾患又はＣＩＮ１への退縮は、５’−アザシチジンで６６．７％（４／６）、プラセボで１４．２％（１／７）であった。
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１】
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【配列表】
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