(57)【要約】    【課題】十分な厚さ及び強度の膜状の結合組織体を形成することのできる膜状結合組織体形成用基材及びこれを用いた膜状結合組織体の生産方法の提供。    【解決手段】基材表面に結合組織体形成部２を設ける。結合組織体形成部２の周囲に増厚促進部３を設けて膜状結合組織体形成用基材１を全体として大きくする。膜状結合組織体形成用基材１を生体組織材料の存在する環境に配置して、基材表面に膜状の結合組織体を形成する。膜状結合組織体形成用基材１を大きくする分、膜状結合組織体の厚さが厚くなる。結合組織体のうち、増厚促進部３の表面に形成された余剰部分を除去する。厚くかつ強度の高い膜状結合組織体が得られる。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体組織材料の存在する環境に配置して基材表面に膜状の結合組織体を形成可能な基材であって、基材表面に、膜状の結合組織体を形成する結合組織体形成部が設けられ、該結合組織体形成部の周囲に前記結合組織体の増厚を促進する増厚促進部が設けられたことを特徴とする膜状結合組織体形成用基材。
【請求項２】
前記結合組織体としての人工角膜を形成可能な人工角膜形成用基材として使用されることを特徴とする請求項１に記載の膜状結合組織体形成用基材。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の膜状結合組織体形成用基材を生体組織材料の存在する環境下におく設置工程と、前記膜状結合組織体形成用基材の周囲に結合組織を形成する形成工程と、前記環境下から結合組織で被覆された前記膜状結合組織体形成用基材を取り出す取り出し工程と、前記膜状結合組織体形成用基材から結合組織を剥離して取り出す分離工程と、前記結合組織から膜状結合組織体の周囲の余剰部分を除去する除去工程と、を備えたことを特徴とする膜状結合組織体の生産方法。
【請求項４】
生体組織材料の存在する環境において基材の表面に形成され、当該膜状結合組織体の周囲の余剰部分が除去されたことを特徴とする膜状結合組織体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、人工角膜などの膜状結合組織体を形成するための膜状結合組織体形成用基材及びこれを用いた膜状結合組織体の生産方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
病気や事故で失われた細胞、組織、器官を、人工素材や細胞により再び蘇らせる再生医療の研究が数多くなされている。
【０００３】
通常、身体には自己防衛機能があり、体内の浅い位置にトゲ等の異物が侵入した場合には、これを体外へ押し出そうとする。また、体内の深い位置に異物が侵入した場合には、その周りに繊維芽細胞が徐々に集まって、主に繊維芽細胞とコラーゲンからなる結合組織体のカプセルを形成して異物を覆うことにより、体内において異物を隔離することが知られている。この後者の自己防衛反応を利用して生細胞から生体由来組織を形成する技術として、生体内に異物としての基材を埋入して結合組織体を形成する技術が複数報告されている（特許文献１〜３参照）。
【０００４】
このような手法で結合組織体を形成する場合、生体内に埋入する異物としての基材の形状や大きさを適宜設定することにより、所望の形状や大きさの結合組織体を形成することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００７−３１２８２１号公報
【特許文献２】特開２００８−２３７８９６号公報
【特許文献３】特開２０１０−０９４４７６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ところが、生体内に埋入した基材の周囲に結合組織体を形成する場合、基材の形状や大きさを適宜設定して、その周囲に所望の形状や大きさの結合組織体を形成することはできるものの、結合組織体を所望の厚さ及び強度に設定することはできず、必ずしも十分な厚さや強度の結合組織体を得ることはできない。
【０００７】
本発明は、十分な厚さ及び強度の膜状の結合組織体を形成することのできる膜状結合組織体形成用基材及びこれを用いた膜状結合組織体の生産方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記目的を達成するために、本発明に係る膜状結合組織体形成用基材は、生体組織材料の存在する環境に配置して基材表面に膜状の結合組織体を形成可能なものであり、基材表面に、膜状の結合組織体を形成する結合組織体形成部を設け、この結合組織体形成部の周囲に結合組織体の増厚を促進する増厚促進部を設けたものである。
【０００９】
上記構成によれば、基材表面に設けた結合組織体形成部の周囲に増厚促進部を設けるので、基材表面に形成する結合組織の増厚を促進することができ、基材表面に結合組織体形成部のみを設ける場合よりも、膜状結合組織体の厚さを厚くすると共に、強度を高めることができる。
【００１０】
より詳しく説明すると、膜状結合組織体の厚さに影響を与える要因として基材の大きさに着目し、膜状結合組織体の厚さと、この膜状結合組織体を形成する基材の大きさとの関係を調べたところ、基材を大きくするほど、その基材表面に形成される結合組織の厚さが厚くなると共に、強度が高くなるという知見を得ることができた。
【００１１】
そこで、基材表面に、所望の大きさの膜状結合組織体を形成するのに必要な広さの結合組織体形成部を設け、さらに、結合組織体形成部の周囲に増厚促進部を設けることにより、基材表面の全体としての大きさを大きくする。これにより、基材が全体として大きくなる分、その表面に、厚くかつ強度の高い結合組織を形成することができるので、結合組織体形成部の周囲の増厚促進部の表面に形成された余剰部分を除去することにより、厚くかつ強度の高い膜状結合組織体を得ることができる。
【００１２】
ここで、「生体組織材料」とは、所望の生体由来組織を形成するうえで必要な物質のことであり、例えば、線維芽細胞、平滑筋細胞、内皮細胞、幹細胞、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞等の動物細胞、各種たんぱく質類（コラーゲン、エラスチン）、ヒアルロン酸等の糖類、その他、細胞成長因子、サイトカイン等の生体内に存在する各種の生理活性物質が挙げられる。この「生体組織材料」には、ヒト、イヌ、ウシ、ブタ、ヤギ、ヒツジ等の哺乳類動物、鳥類、魚類、その他の動物に由来するもの、又はこれと同等の人工材料が含まれる。
【００１３】
また、「生体組織材料の存在する環境下」とは、動物（ヒト、イヌ、ウシ、ブタ、ヤギ、ヒツジ等の哺乳類動物、鳥類、魚類、その他の動物）の生体内（例えば、四肢部、腰部、背部又は腹部などの皮下、もしくは腹腔内への埋入）、又は、動物の生体外において、生体組織材料を含有する人工環境のことをいう。
【００１４】
本発明の膜状結合組織体形成用基材は、あらゆる用途の膜状結合組織体を形成することができるが、結合組織体としての人工角膜を形成するための人工角膜形成用基材として使用する基材には、本発明の構成を採用するのが特に好適である。つまり、本発明の基材で形成する膜状結合組織体は、表層を覆うあるいは膜状で機能する平面状の膜状組織として用いるものであり、心膜や硬膜、皮膚、弁膜など、どのようなものであってもよいが、角膜は、その大きさが小さい分、厚い組織を形成しにくいので、本発明の基材を用いて、人工角膜の厚さを厚くすると共に、強度を高めるのがよい。
【００１５】
また、本発明は、上記の膜状結合組織体形成用基材を用いて、膜状結合組織体を生産する方法を提供する。すなわち、本発明に係る膜状結合組織体の生産方法は、膜状結合組織体形成用基材を生体組織材料の存在する環境下におく設置工程と、膜状結合組織体形成用基材の周囲に結合組織を形成する形成工程と、環境下から結合組織で被覆された膜状結合組織体形成用基材を取り出す取り出し工程と、膜状結合組織体形成用基材から結合組織を剥離して取り出す分離工程と、結合組織から膜状結合組織体の周囲の余剰部分を除去する除去工程と、を備える。
【００１６】
この構成によれば、上記の膜状結合組織体形成用基材の構成を採用することによる効果と同じ効果を得ることができる。なお、本発明において、移植対象者に対して、自家移植、同種移植、異種移植のいずれでもよいが、拒絶反応を避ける観点からなるべく自家移植か同種移植が好ましい。また、異種移植の場合には、拒絶反応を避けるため公知の脱細胞化処理などの免疫源除去処理を施すのが好ましい。
【００１７】
また、本発明は、上記の生産方法のごとく、大き目の基材を用いて十分な厚さの結合組織を形成し、この結合組織から周囲の余剰部分を除去することによって形成した膜状結合組織体を提供する。すなわち、本発明は、生体組織材料の存在する環境において基材の表面に形成され、当該膜状結合組織体の周囲の余剰部分が除去されたことを特徴とする膜状結合組織体を提供する。
【発明の効果】
【００１８】
上記のとおり、本発明によると、結合組織体形成部の周囲に増厚促進部を設けて、基材をこれを用いて生産する膜状結合組織体よりも大き目に設定するので、基材表面に形成する結合組織の厚さを厚くすると共に、強度を高めることができる。これにより、周囲の余剰部分を除去して、厚くかつ強度の高い膜状結合組織体を得ることができ、角膜のように小さな膜状結合組織体を形成する場合であっても、十分な厚さ及び強度を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本発明に係る膜状結合組織体形成用基材の斜視図
【図２】円柱基材の表面に形成された結合組織を示す写真で、（ａ）は円柱基材の直径が１０ｍｍ、（ｂ）は円柱基材の直径が２０ｍｍ、（ｃ）は円柱基材の直径が３０ｍｍの場合を示す
【図３】円柱基材の表面に形成された結合組織の切断面を示す写真で、（ａ）は円柱基材の直径が２ｍｍ、（ｂ）は円柱基材の直径が１０ｍｍ、（ｃ）は円柱基材の直径が２０ｍｍ、（ｄ）は円柱基材の直径が３０ｍｍの場合を示す
【図４】図３の（ａ）〜（ｄ）の拡大写真
【図５】円柱状基材の軸方向長さと結合組織の厚さとの関係を示す図
【図６】人工角膜形成用基材の直径と結合組織の厚さとの関係を示す図
【図７】蒲鉾型の膜状結合組織体形成用基材の斜視図
【図８】板状の膜状結合組織体形成用基材の斜視図
【図９】正方形基材の一辺の長さと結合組織の厚さとの関係を示す図
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、本発明に係る膜状結合組織体形成用基材及びこれを用いた膜状結合組織体の生産方法を実施するための形態について、図面を用いて説明する。
【００２１】
膜状結合組織体形成用基材１は、例えば、生体組織材料の存在する環境に配置して基材表面に人工角膜として用いる膜状の結合組織体を形成するためのものであり、その人工角膜形成用基材としての基材の表面に、膜状の結合組織体を形成する結合組織体形成部２が設けられると共に、結合組織体形成部２の周囲に、結合組織体の増厚を促進する増厚促進部３が設けられている。
【００２２】
図１に示すように、膜状結合組織体形成用基材１は、一面の中央部に球面状に膨出する膨出部４が形成されると共に、膨出部４の周囲に平面状の周縁部５が形成された円盤状とされ、膨出部４の中央部に結合組織体形成部２が設定され、膨出部４の残部及び周縁部５に増厚促進部３が設定されている。なお、図１において、二点鎖線は結合組織体形成部２と増厚促進部３との境界６を示す仮想線である。
【００２３】
結合組織体形成部２は、形成しようとする人工角膜の形状及び大きさに対応させて、その形状及び大きさが設定される。また、形成しようとする人工角膜の厚さに応じて、増厚促進部３を含む膜状結合組織体形成用基材１の全体の大きさが設定される。ここで、膜状結合組織体形成用基材１の大きさは、生体組織材料の存在する環境との接触面積、すなわち膜状結合組織体形成用基材１の表面積を用いて示すことができる。
【００２４】
膜状結合組織体形成用基材１を構成する素材は、特に限定されるものではないが、生体に埋入することによる変形を防止できる程度の強度（硬度）、化学的安定性、及び、滅菌などの負荷に対する耐性を有し、さらに、生体を刺激する溶出物が全くないか少ないという条件を満たす樹脂が好ましく、シリコーン樹脂やアクリル樹脂を例示できる。さらに、膜状結合組織体形成用基材１を弾性の高い素材で構成すると、その表面に形成される結合組織体が厚くなりやすいことから、膜状結合組織体形成用基材１の少なくとも表面をシリコーン樹脂等の弾性体から構成するのがより好ましい。
【００２５】
次に、上記のような膜状結合組織体形成用基材１を用いて膜状結合組織体を生産する方法について説明する。
【００２６】
この生産方法は、膜状結合組織体形成用基材１を生体組織材料の存在する環境下におく「設置工程」と、膜状結合組織体形成用基材１の周囲に結合組織を形成する「形成工程」と、環境下から結合組織で被覆された膜状結合組織体形成用基材１を取り出す「取り出し工程」と、膜状結合組織体形成用基材１から結合組織を剥離して取り出す「分離工程」と、結合組織から人工角膜としての膜状結合組織体の周囲の余剰部分を除去する「除去工程」とからなる。
【００２７】
＜設置工程＞
膜状結合組織体形成用基材１を生体組織材料の存在する環境下へ置く。生体組織材料の存在する環境下とは、動物の生体内（例えば、皮下や腹腔内への埋入）、又は、動物の生体外において生体組織材料が浮遊する溶液中等の人工環境内が挙げられる。生体組織材料としては、ヒト、イヌ、ウシ、ブタ、ヤギ、ウサギ、ヒツジなどの他の哺乳類動物由来のものや、鳥類、魚類、その他の動物由来のもの、又は人工材料を用いることもできる。
【００２８】
膜状結合組織体形成用基材１を動物に埋入する場合には、十分な麻酔下で最小限の切開術で行い、埋入後は傷口を縫合する。膜状結合組織体形成用基材１の埋入部位としては例えば、膜状結合組織体形成用基材１を受け入れる容積を有する腹腔内、あるいは四肢部、肩部又は背部、腹部などの皮下が好ましい。また、膜状結合組織体形成用基材１を生体組織材料の存在する環境下へ置く場合には、種々の培養条件を整えてクリーンな環境下で公知の方法に従って細胞培養を行えばよい。
【００２９】
＜形成工程＞
設置工程の後、所定時間が経過することにより、膜状結合組織体形成用基材１の周囲に膜状の結合組織が形成される。結合組織は、繊維芽細胞とコラーゲンなどの細胞外マトリックスで構成され、膜状結合組織体形成用基材１の大きさに応じて十分な厚さに形成される。
【００３０】
＜取り出し工程＞
所定時間の形成工程を経て、結合組織が十分に形成された後、膜状結合組織体形成用基材１を生体組織材料の存在する環境下から取り出す取り出し工程を行う。生体組織材料の存在する環境下から取り出された膜状結合組織体形成用基材１は、全体を結合組織による膜で覆われている。
【００３１】
＜分離工程＞
膜状結合組織体形成用基材１の周縁部５を覆う結合組織を除去して、膨出部４を覆う結合組織の膜を剥がす。この結合組織の膜は、膨出部４の大きさ及び曲面形状に対応する大きさ及び形状で、膜状結合組織体形成用基材１の大きさに応じた十分な厚さに形成されている。
【００３２】
＜除去工程＞
膨出部４から剥がした結合組織の膜の周縁部の余剰部分を除去して、所望の大きさの人工角膜を得る。
【００３３】
生産された人工角膜を異種移植する場合には、移植後の拒絶反応を防ぐため、脱細胞処理、脱水処理、固定処理などの免疫源除去処理を施すのが好ましい。脱細胞処理としては、超音波処理や界面活性剤処理、コラゲナーゼなどの酵素処理によって細胞外マトリックスを溶出させて洗浄する等の方法があり、脱水処理の方法としては、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール等の水溶性有機溶媒で洗浄する方法があり、固定処理する方法としては、グルタアルデヒドやホルムアルデヒドなどのアルデヒド化合物で処理する方法がある。
【００３４】
上記構成によれば、結合組織体形成部２の周囲に増厚促進部３を設けて膜状結合組織体形成用基材１を大きくするので、その大きさに応じて十分な厚さに結合組織を形成することができる。これにより、十分な厚さに形成した結合組織の膜の周縁部の余剰部分を除去して、所望の大きさ及び曲面形状で、かつ十分な厚さの人工角膜を得ることができる。
【００３５】
ここで、基材の大きさと、その基材表面に形成される結合組織の厚さとの関係について、「円柱状基材の直径と結合組織の厚さとの関係」、「円柱状基材の軸方向長さと結合組織の厚さとの関係」、及び「膨出部を有する基材の直径と結合組織の厚さとの関係」の順に説明する。
【００３６】
＜円柱状基材の直径と結合組織の厚さとの関係＞
まず、４種類のシリコーン製の円柱状基材を体重１０ｋｇのビーグル犬の背部皮下に埋入し、そのビーグル犬を通常の飼育条件で１ヶ月飼育した後、結合組織で覆われた円柱状基材を摘出した。円柱状基材は、滅菌したシリコーン製で、軸方向長さが全て３０ｍｍ、直径が２ｍｍ、１０ｍｍ、２０ｍｍ、３０ｍｍの４種類である。
【００３７】
図２に、直径が１０ｍｍ、２０ｍｍ、３０ｍｍの３種類の円柱状基材について、結合組織で覆われた状態の外観写真を示す。皮下で形成された結合組織は主として、線維芽細胞とコラーゲンから構成され、カプセル化して円柱状基材の基材表面を覆っていた。また、結合組織の膜で覆われた円柱状基材は、皮下組織より容易に摘出することができた。
【００３８】
次いで、基材表面から結合組織を剥がして分離し、これを切断して結合組織の厚さを調べた。なお、円柱状基材と周囲の結合組織とは全く接着しておらず、両者は損傷無く容易に分離することができた。
【００３９】
図３に、直径が２ｍｍ、１０ｍｍ、２０ｍｍ、３０ｍｍの４種類の円柱状基材について、その基材表面から分離した結合組織の切断面の外観写真を示し、図４に、その拡大写真を示す。円柱状基材が直径２ｍｍの場合、結合組織の厚さが８５±２７μｍ、直径１０ｍｍでは、結合組織の厚さが２３７±５５μｍ、直径２０ｍｍでは、結合組織の厚さが３７４±１２８μｍ、直径３０ｍｍでは、結合組織の厚さが８１３±１７５μｍであった。
【００４０】
＜円柱状基材の軸方向長さと結合組織の厚さとの関係＞
直径が全て１０ｍｍ、軸方向長さが１ｍｍ、１０ｍｍ、３０ｍｍ、５０ｍｍの４種類の円柱状基材を用いて、上記の＜円柱状基材の直径と結合組織の厚さとの関係＞と同じ条件で結合組織の膜を形成し、その厚さを測定した。
【００４１】
図５に示すように、円柱状基材の軸方向長さが１ｍｍでは、結合組織の厚さが１００μｍ以下であったが、円柱状基材の軸方向長さが長くなるほど結合組織の厚さが厚くなった。
【００４２】
＜膨出部を有する基材の直径と結合組織の厚さとの関係＞
結合組織体形成部２の直径を移植に必要な角膜の大きさである７ｍｍに設定し、この結合組織体形成部２のみからなる基材と、これに膨出部４の残部及び周縁部５を加えた上記膜状結合組織体形成用基材１で直径が１０ｍｍ、２０ｍｍ、３０ｍｍ、５０ｍｍの４種類の基材との、合計５種の基材を用いて、上記の＜円柱状基材の直径と結合組織の厚さとの関係＞と同じ条件で結合組織の膜を形成し、その厚さを測定した。なお、５種類の全ての基材は、アクリル製で、周縁部５の厚さが５ｍｍである。
【００４３】
図６に示すように、結合組織体形成部２のみからなる直径７ｍｍの基材では、厚さは１００μｍ以下であるが、基材全体の直径が２０ｍｍ、３０ｍｍと大きくなるに従って結合組織が厚くなっており、基材の直径を大きくする程、厚い膜を有する結合組織が得られることがわかる。
【００４４】
角膜移植では直径が約７ｍｍで厚さが約０．５ｍｍの角膜が用いられ、表層角膜移植では直径が約７ｍｍで厚さ０．２ｍｍ〜０．４ｍｍの角膜が用いられている。したがって、結合組織体形成部２のみからなる直径７ｍｍの基材では、移植に必要な厚さの人工角膜を形成することができないが、基材全体の直径が２０ｍｍの基材では、角膜表層移植が可能な厚さの人工角膜を形成することができ、基材全体の直径が３０ｍｍ以上の基材では、角膜全層移植が可能な厚さの人工角膜を形成することができる。
【００４５】
このように、円柱状基材の直径を大きくするほど、円柱状基材の軸方向長さを長くするほど、さらに、膨出部を有する基材の直径を大きくするほど、厚い結合組織が得られることがわかる。すなわち、基材の形状による違いはあるものの、同じ形状の基材であれば、その表面積を大きくするほど、厚い結合組織が形成されることがわかる。
【００４６】
なお、本発明は、上記の実施の形態に限定されるものではなく、本発明の範囲内において、適宜変更を加えることができる。例えば、膜状結合組織体形成用基材１を用いて生産する膜状結合組織体は、表層を覆うあるいは膜状で機能する平面状の組織であればよく、人工角膜に限らず、心膜、硬膜、皮膚、弁膜等として用いることもできる。
【００４７】
また、膜状結合組織体形成用基材としては、中央部に球面状に膨出する膨出部４を有するものだけでなく、生産すべき膜状結合組織体の形状に応じて、蒲鉾型の基材７（図７参照）や板状の基材８（図８参照）を採用することもできる。なお、上記の円柱状基材、及び膨出部を有する基材だけでなく、蒲鉾型の基材７、板状の基材８についても、その大きさを大きくすることで十分に厚い結合組織が得られる。
【００４８】
例えば、図９に、板状の基材の大きさと結合組織の厚さとの関係を示す。板状の基材８は、厚さが全て１ｍｍの正方形で、一辺の長さが１０ｍｍ、３０ｍｍ、５０ｍｍ、１００ｍｍの４種類のアクリル製基材であり、上記の円柱状基材と同じ条件で結合組織の膜を形成し、その厚さを測定した。一辺の長さが１０ｍｍの基材の表面に形成される結合組織の厚さは１００μｍ以下であるが、一辺の長さが３０ｍｍの基材では、結合組織の厚さが約４００μｍ、一辺の長さが６０ｍｍの基材では、結合組織の厚さが約７００μｍ、一辺の長さが１００ｍｍの基材では、結合組織の厚さが約１０００μｍであり、基材が大きくなるほど膜の厚さが厚くなった。
【符号の説明】
【００４９】
１    膜状結合組織体形成用基材
２    結合組織体形成部
３    増厚促進部
４    膨出部
５    周縁部
６    境界
７    基材（蒲鉾型）
８    基材（板状）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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