(57)【要約】【課題】人工光合成や太陽電池に用いる色素増感剤等への応用が期待できる、新規な色素結合型タンパク質を提供する。【解決手段】色素とタンパク質が結合した色素結合型タンパク質であって、色素がシフォナキサンチン、ネオキサンチン、シフォネイン、クロロフィルａおよびクロロフィルｂであり、タンパク質がＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量が２７±１ｋＤａのサブユニット３つから構成されることを特徴とする色素結合型タンパク質。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
色素とタンパク質が結合した色素結合型タンパク質であって、
色素がシフォナキサンチン、ネオキサンチン、シフォネイン、クロロフィルａおよびクロロフィルｂであり、タンパク質がＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量が２７±１ｋＤａのサブユニット３つから構成されることを特徴とする色素結合型タンパク質。
【請求項２】
シフォナキサンチン、ネオキサンチン、シフォネイン、クロロフィルａおよびクロロフィルｂのモル比が１：１：１：１０：１１である請求項１記載の色素結合型タンパク質。
【請求項３】
サブユニットのＮ末端のアミノ酸配列が、ＩＥＦＹＧＰＤＲＡＬ（配列番号１）またはＩＥＦＹＧＡＤＲＡＬ（配列番号２）である請求項１または２記載の色素結合型タンパク質。
【請求項４】
深所型の緑藻由来である請求項１〜３の何れかに記載の色素結合型タンパク質。
【請求項５】
次の工程（ａ）〜（ｃ）、
（ａ）深所型の緑藻を細胞破砕処理してチラコイド膜を調製する工程
（ｂ）得られたチラコイド膜を界面活性剤を含有する緩衝液で可溶化してチラコイド膜
の可溶化液を得る工程
（ｃ）得られた可溶化液から１５０ｋＤａ以下の画分を採取する工程
を含むことを特徴とする請求項１〜３に記載の色素結合型タンパク質の製造方法。
【請求項６】
更に、工程（ｃ）で得られた画分から１００ｋＤａ以下の画分を除去する工程を行う請求項５に記載の色素結合型タンパク質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、深所型の緑藻等に含まれる新規な色素結合型タンパク質およびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
色素とタンパク質が結合した色素結合型タンパク質の中には、光合成アンテナタンパク質と呼ばれる一群の光捕集機能性タンパク質として生体内で機能を担っているものがある。
【０００３】
このような色素結合型タンパク質としては、エンドウ豆やほうれん草において、ＬＨＣＩＩと呼ばれるタンパク質のＸ線結晶構造解析による構造の解明に至る詳細な知見が得られており、このタンパクに結合している光合成色素のルテイン（キサントフィル、カロテノイドの一種）、クロロフィルｂが可視部の光を吸収してクロロフィルａに集めるという機能について知見が得られている（非特許文献１〜２）。
【０００４】
一方、海藻由来の色素結合型タンパク質としては、フコキサンチン−クロロフィルａ／ｃタンパク質（ＦＣＰ）、シフォナキサンチン−クロロフィルａ／ｂタンパク質（ＳＣＰ）等が知られている。ＦＣＰについては、珪藻類であるキクロテラ・メネギニアーナ、ジャイアントケルプ、オキナワモズクから単離されたという報告がある（非特許文献３〜６）。また、ＳＣＰについては緑藻ミルから単離されたという報告がある（非特許文献７）。
【０００５】
しかしながら、これらの色素結合型タンパク質は、人工光合成や太陽電池に用いる色素増感剤等への応用が期待されているものの、ほとんど検討されていないのが実情であった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Liu, Z., Yan, H., Wang, K., Kuang, T.,Zhang, J., Gui, L., An, X., Chang, W., “Crystalstructure of spinach major light-harvesting complex at 2.72 A resolution”, Nature, 428 (2004) 287-292.
【非特許文献２】Standfuss, J., Terwisscha vanScheltinga, A.C., Lamborghini, M., Kuhlbrandt, W., “Mechanisnof photoprotection and nonphotochemical quenching in 0pea light-harvestingcomplex at 2.5A resolution”, EMBO J., 24 (2005) 919-928.
【非特許文献３】Supramolecular Assembly ofFucoxanthin-Chlorophyll-Protein Complexes Isolated from a Brown Alga,Petaloniafascia.Electron Microscopic Studies,Tetzuya Katoh and Tomoko Ehara,Plant CellPhysiol.1990,31(4),439-447.
【非特許文献４】Fucoxanthin-Chlorophyll Proteins inDiatoms: 18 and 19 kDa Subunits Assemble into Different Oligomeric States ,ClaudiaBu¨chel, Biochemistry 2003, 42, 13027-13034.
【非特許文献５】Subunit Composition and Pigmentationof Fucoxanthin-Chlorophyll Proteins in Diatoms: Evidence for a Subunit Involvedin Diadinoxanthin and Diatoxanthin Binding,Anja Beer, Kathi Gundermann, JanetBeckmann, and Claudia Bu¨chel,Biochemistry 2006, 45, 13046-13053.
【非特許文献６】Fujii, R., Kita, M., Iinuma, Y., Oka,N., Takaesu, Y., Taira, T., Iha, M., Cogdell, R.J., Hashimoto, H., “Isolationand purification of the major photosynthetic antenna, fucoxanthin-chlorophylla/c protein from cultured discoid germilings of the brown alga, Cladosiphonokamuranus TOKIDA (Okinawa mozuku)”, Photosynth. Res. 111(2012)157-163.
【非特許文献７】Identification of a new excited stateresponsible for the in vivo absorption band of siphonaxanthin in the green algaCodium Fragile : S.Akimoto, T.Tomo, Y.Naitoh, A.Otomo, A.Murakami, M.Mimuro, J.Phys.Chem.B111(2007)9179.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従って、本発明は人工光合成や太陽電池に用いる色素増感剤等への応用が期待できる、新規な色素結合型タンパク質を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究した結果、深所型の緑藻から、新規な色素結合型タンパク質を見出した。また、深所型の緑藻から調製した試料を、特定の分子量の画分を得る処理をすることで、少ない工程で純度の高い色素結合型タンパク質が製造できることを見出し、本発明を完成させた。
【０００９】
すなわち、本発明は色素とタンパク質が結合した色素結合型タンパク質であって、
色素がシフォナキサンチン、ネオキサンチン、シフォネイン、クロロフィルａおよびクロロフィルｂであり、タンパク質がＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量が２７±１ｋＤａのサブユニット３つから構成されることを特徴とする色素結合型タンパク質である。
【００１０】
また、本発明は次の工程（ａ）〜（ｃ）、
（ａ）深所型の緑藻を細胞破砕処理してチラコイド膜を調製する工程
（ｂ）得られたチラコイド膜を界面活性剤を含有する緩衝液で可溶化してチラコイド膜
の可溶化液を得る工程
（ｃ）得られた可溶化液から１５０ｋＤａ以下の画分を採取する工程
を含むことを特徴とする上記色素結合型タンパク質の製造方法である。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の色素結合型タンパク質は、色素としてシフォナキサンチンが結合しているために、可視光の吸収帯のいわゆるグリーンギャップと呼ばれる緑色の光の吸収率が低いところに吸収帯が現れ、グリーンギャップを低減すると共に、可視光のより広い範囲の光を利用できる。そのため、本発明の色素結合型タンパク質は光エネルギー捕獲素子に利用できる。
【００１２】
また、本発明の色素結合型タンパク質の製造方法は、深所型の緑藻から少ない工程で純度の高い色素結合型タンパク質を製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】チラコイド膜可溶化液のＩＥＣカラム（ＤＥＡＥ  ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ６５０Ｓ）の分離パターン（２８０ｎｍ検出）である。
【図２】ＩＥＣ精製後のＳＣＰの吸収スペクトルである（２５０〜８００ｎｍ）。
【図３】ＳＣＰ（実線）およびモツレミル糸状体（破線）の色素組成分析のＨＰＬＣプロファイル（４３７ｎｍ検出）である。
【図４】ＳＣＰのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果である。
【図５】ＳＣＰのＢＮ−ＰＡＧＥの結果である。
【図６】ＳＣＰの蛍光スペクトル（励起波長４３７ｎｍ（細実線）、４７３ｎｍ（破線）および５４０ｎｍ（点線））である。ＳＣＰの吸収スペクトル（長破線）および励起波長の帰属も示す。
【図７】ＳＣＰの蛍光励起スペクトル（（一点鎖線）観測波長７００ｎｍ、励起波長３６０〜６８０ｎｍ）、ＳＣＰの吸収率（破線）、および伝達効率（実線）である。
【図８】ＳＣＰの吸収スペクトルの温度による変化を示す図面である（２５０〜８００ｎｍ）。
【図９】図８のＳＣＰの吸収スペクトルの拡大図である（５２０〜５６５ｎｍ）。
【図１０】中空糸膜による濃縮液（１５０ｋＤａ以上の画分（細線）および１００ｋＤａ以上１５０ｋＤａ以下の画分（太線）の吸収スペクトルである（２５０〜８００ｎｍ）。
【図１１】中空糸膜による濃縮液（１５０ｋＤａ以上の画分（一点鎖線）および１００ｋＤａ以上１５０ｋＤａ以下の画分（実線））およびＩＥＣ精製のＳＣＰ標品（破線）のＩＥＣプロファイルである（２８０ｎｍ検出）。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の色素結合型タンパク質は、色素とタンパク質が結合したものであって、色素がシフォナキサンチン、ネオキサンチン、シフォネイン、クロロフィルａおよびクロロフィルｂであり、タンパク質がＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量が２７±１ｋＤａのサブユニット３つから構成されるものである。
【００１５】
本発明の色素結合型タンパク質を構成する色素である、シフォナキサンチン、ネオキサンチン、シフォネイン、クロロフィルａおよびクロロフィルｂのモル比１：１：１：１０：１１である。なお、上記色素のうち、シフォネインはシフォナキサンチンのヒドロキシメチル基に種々の炭化水素鎖を持つ脂肪酸等がエステル結合したものの総称である。上記モル比はこれらのエステルの総モル数から算出されたものである。また、色素にはビオラキサンチン等の他の色素が微量、例えば、シフォナキサンチンに対して０.１未満で含まれることもあるが、色素結合型タンパク質の物性には影響しない。更に、色素には原料に含まれるαカロテンは含まれない。
【００１６】
また、本発明の色素結合型タンパク質はＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量が２７±１ｋＤａのサブユニット３つから構成される。このサブユニットのＮ末端のアミノ酸配列はＩＥＦＹＧＰＤＲＡＬ（配列番号１）またはＩＥＦＹＧＡＤＲＡＬ（配列番号２）である。そのため、本発明の色素結合型タンパク質は、Ｎ末端のアミノ酸配列が配列番号１であるサブユニットがｎ個（ただしｎは０〜３の整数である）とＮ末端のアミノ酸配列が配列番号２であるサブユニットが３−ｎ個で構成される。なお、この配列番号１のアミノ酸配列と１００％相同性のあるものは未報告であり、最高でもゲノムが知られている緑藻クラミドモナスのクロロフィルａ／ｂタンパクと、８８％〜７５％の相同性である。また、このアミノ酸配列は、ホウレンソウ、えんどう豆などの高等植物由来のＬＨＣＩＩとは４０％に満たない相同性である。また、配列番号２のアミノ酸配列と１００％相同性のあるものも未報告であり、最高でもゲノムが知られている緑藻クラミドモナスのクロロフィルａ／ｂタンパクと、７８％〜６５％の相同性である。また、このアミノ酸配列は、ホウレンソウ、えんどう豆などの高等植物由来のＬＨＣＩＩとは３０％に満たない相同性である。更に、サブユニットの内部にはＥＬＥＬＩＨＡＲ（配列番号３）の部分配列があり、この配列は緑藻クラミドモナスのクロロフィルａ／ｂタンパクの部分配列と１００％の相同性であり、また、この配列は、ホウレンソウ、えんどう豆由来のＬＨＣＩＩとも９０％の相同性である。
【００１７】
更に、本発明の色素結合型タンパク質は、以下の性質を有する。
（１）吸収スペクトル（２５０〜８００ｎｍ）
吸収極大：４３７±５ｎｍ、４７３±５ｎｍ、５４０ｎｍ（肩）、６５２±０．５ｎｍ、６７３±４ｎｍ
（２）蛍光スペクトル（励起波長４００〜７００ｎｍ）
可視光領域で励起した場合、クロロフィルａから発光する。
（３）温度耐性
０．０５％ＤＭを含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．２）内では、界面活性剤（ＤＭ）ミセルの状態で緩衝水溶液中に安定に分散している。この状態では、７０℃まで安定にシフォナキサンチンを結合した状態にあり、７０℃を超えるとシフォナキサンチンを含む光合成色素を遊離し、タンパクも変性した状態となる。
【００１８】
以上説明した本発明の色素結合型タンパク質は、色素としてシフォナキサンチンが結合しているために、可視光の吸収帯のいわゆるグリーンギャップと呼ばれる緑色の光の吸収率が低いところに吸収帯が現れ、グリーンギャップを低減すると共に、可視光のより広い範囲の光を利用できる。そのため、本発明の色素結合型タンパク質は光エネルギー捕獲素子に利用できる。より具体的には、人工光合成や太陽電池に用いる色素増感剤等に利用できる。
【００１９】
本発明の色素結合型タンパク質は、例えば、上記の性質等を指標とし、深所型の緑藻を原料とし、これらから当業者に公知の方法に従って、チラコイド膜を取り出し、界面活性剤で可溶化することにより脂溶性の膜たんぱく質を取り出し、その後、イオン交換・ゲル濾過カラムクロマトグラフィーや、ショ糖密度勾配遠心法、電気泳動法等やそれらの組み合わせにより得ることができる。なお、深所型の緑藻かどうかは、５４０ｎｍ付近に吸収があるかないかで判断することができる（「海の中の森の生態‐海藻の世界をさぐる」、横浜康継、講談社、1985.  p89-95）。
【００２０】
上記した原料のうち、深所型の緑藻としては、例えば、アオサ目藻類のヤブレグサ、ウシュクアオサ、シオグサ目藻類のチャシオグサ、ミドリゲ目藻類のタマゴバロニア、タマバロニア、オオバロニア、バロニア、イワズタ属藻類、サボテングサ属藻類、マユハキモ属藻類、ハゴロモ属藻類、ミル属藻類、ハネモ属藻類等が挙げられる。これら原料の中でも、ミル属藻類が好ましく、モツレミルがより好ましい。
【００２１】
また、本発明の色素結合型タンパク質は、特に次の工程（ａ）〜（ｃ）を含むことにより、深所型の緑藻から少ない工程で純度高く得ることができる。
（ａ）深所型の緑藻を細胞破砕処理してチラコイド膜を調製する工程
（ｂ）得られたチラコイド膜を界面活性剤を含有する緩衝液で可溶化してチラコイド膜
の可溶化液を得る工程
（ｃ）得られた可溶化液から１５０ｋＤａ以下の画分を採取する工程
【００２２】
工程（ａ）で用いられる深所型の緑藻としては、上記したものを用いることができる。また、緑藻の形態としては、特に限定されないが、チラコイド膜を豊富に含むことから糸状体が好ましい。更に、天然では緑藻は紅藻などと絡み合って生育するため、これらの異種を完全に取り除くことが極めて困難であり、例え、タンパクの精製工程を増やしたり複雑化したりしてもタンパクの混在は防ぐことができない。そのため、緑藻としては単藻化されたものを用いることが好ましい。
【００２３】
深所型の緑藻の単藻化（糸状体種苗の取得）は、例えば、マイクロピペット洗浄法（有賀祐勝、井上勲、田中次郎、横浜康継、吉田忠雄、「藻類学  実験・実習」、ｐｐ１６６−１６７、講談社）等に従って行うことができる。こうして得られた単藻化した緑藻の糸状体種苗は、必要によりＴＳＰ２７（（株）サウスプロダクト製）等の栄養成分を添加した海水や人工海水を入れたフラスコ等の容器中、必要により空気を導入し、水温２５〜３０℃、光量５０〜１００ｐｐｆｄ、光周期１２Ｌ：１２Ｄの条件で１〜１０日程度培養することにより、成長した糸状体を得ることができる。
【００２４】
また、深所型の緑藻の細胞破砕処理方法としては、特に限定されず、例えば、物理的処理、化学的処理、酵素的処理、加熱処理、自己消化処理、浸透圧溶解処理、原形質溶解処理等を挙げることができる。これらの処理の中でも物理的処理が好ましい。
【００２５】
具体的に深所型の緑藻に細胞破砕処理を行うには、冷凍藻体をブレンダ―に入れ、破砕溶液を加えてブレンダ―で破砕後、超音波破砕機により処理する。そして、上記の細胞破砕処理により深所型の緑藻からチラコイド膜を調製することができる。
【００２６】
ここで用いられる破砕溶液としてはカリウムリン酸緩衝液、ショ糖、塩化カリウム、Ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ  ＨＣｌ、６−ａｍｉｎｏ−ｎ−ｈｅｘａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ等を含む緩衝液等が挙げられる。この破砕溶液は深所型の緑藻に対して、約２倍程度添加する。
【００２７】
次に、上記工程（ａ）で得られたチラコイド膜を、界面活性剤を含有する緩衝液で可溶化してチラコイド膜の可溶化液を得る（工程（ｂ））。
【００２８】
工程（ｂ）で用いられる緩衝液としてはリン酸緩衝液、トリシン緩衝液、トリス緩衝液等が挙げられる。これらの緩衝液の中でもトリシン緩衝液あるいはトリス緩衝液が好ましい。また、この緩衝液に含有させる界面活性剤としては、ｄｏｄｅｃｙｌ−β−Ｄ−ｍａｌｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（ＤＭ）、Ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ、３−［（３−Ｃｈｏｌａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏ］−１−ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ、コール酸ナトリウム等が挙げられる。本発明においてはこれらの界面活性剤の中でもＤＭが好ましい。また、緩衝液における界面活性剤の含有量は、例えば、１〜５％（ｗ／ｖ）、好ましくは５％（ｗ／ｖ）である。
【００２９】
上記した界面活性剤を含有する緩衝液でチラコイド膜を可溶化する方法は特に限定されないが、例えば、チラコイド膜と界面活性剤を含有する緩衝液を低温下、好ましくは０〜４℃で１０〜３０分間、好ましくは２０分間程度、振盪、撹拌等すればよい。
【００３０】
上記撹拌後、ろ過、遠心分離等で固液分離することによりチラコイド膜の可溶化液が得られる。
【００３１】
最後に、上記工程（ｂ）で得られたチラコイド膜の可溶化液から、１５０ｋＤａ以下の画分を採取する（工程（ｃ））。
【００３２】
工程（ｃ）においてチラコイド膜の可溶化液から、１５０ｋＤａ以下の画分を採取するには、分画分子量が１５０ｋＤａの限外ろ過膜を利用し、１５０ｋＤａ以下の画分を採取すればよい。限外ろ過膜としては、中空糸膜、スパイラル膜、チューブラー膜、平膜等の何れも用いることができる。分画の条件は特に限定されないが、中空糸膜を用いる場合には、循環流量１００−２００ｍＬ／ｍｉｎ、排出流量４−５ｍL／ｍｉｎであり、特に循環流量１００ｍＬ／ｍｉｎ、排出流量４ｍＬ／ｍｉｎが好ましい。
【００３３】
以上の工程（ａ）〜（ｃ）により４０％程度、好ましくは４２％程度の純度の本発明の色素結合型タンパク質を得ることができる。
【００３４】
なお、上記工程（ｃ）の後に１００ｋＤａ以下の画分を除去する工程を行うことが好ましい。この工程を行うことにより、更に精製が進んで６０％程度の純度となり、より純度の高い本発明の色素結合型タンパク質を得ることができる。
【００３５】
上記工程は分画分子量が１００ｋＤａの限外ろ過膜を用い、１００ｋＤａ以下の画分を除去する以外は、工程（ｃ）と同様にして行うことができる。
【００３６】
また、ここで得られた本発明の色素結合型タンパク質は、更に、イオン交換カラムクロマトグラフィー、ゲル濾過カラムクロマトグラフィー、ショ糖密度勾配、分取用電気泳動等の公知の方法により純度を高めても良い。
【００３７】
以上説明した本発明の色素結合型タンパク質の製造方法は、少ない工程で純度の高い色素結合型タンパク質を製造することができる。
【実施例】
【００３８】
以下、本発明を参考例、実施例等を挙げて詳細に説明するが、本発明はこれら参考例、実施例等に何ら限定されるものではない。
【００３９】
参  考  例  １
モツレミル糸状体の調製：
（１）モツレミルの糸状体の単藻化
モツレミルの糸状体の単藻化は文献（有賀祐勝、井上勲、田中次郎、横浜康継、吉田忠雄、「藻類学  実験・実習」、ｐｐ１６６−１６７、講談社）に記載のマイクロピペット洗浄法に従った。まず単藻化に必要な道具の作製および準備を行なった。パスツールピペットの先を熱して引き伸ばし、先端を細く加工してキャピラリーピペットを作製した。このキャピラリーピペットの先端の内径が数百マイクロメートルであることを顕微鏡で確認した後、キャピラリーピペットにエアーチューブを取り付け、キャピラリーピペットの先端を浸し、ろ過滅菌海水（０．４５μｍフィルターろ過）が毛細管現象で上昇するのを確かめた。
【００４０】
次に培養海水を調製した。オートクレーブ処理した海水に対してＴＳＰ２７（（株）サウスプロダクト製）を０．０５ｗ／ｗ％濃度で添加後、ろ過して培養海水とした。この培養海水をマルチセル（１２ウェルのプラスチック容器）のウェルに２ｍｌ入れた。また、洗浄用のろ過滅菌海水をホールスライドグラスの３つのウェルに入れた。
【００４１】
大潮干潮時の沖縄近海（水深１ｍ）で採取したモツレミル（Ｃｏｄｉｕｍ  ｉｎｔｒｉｃａｔｕｍ）の成体をほぐすようにして胞嚢をばらばらにし、胞嚢から伸長した糸（髄糸）をピンセットでつまみ取り、約１ｍｍの長さにハサミで断片化した。これを滅菌海水で濯いで、１質量％の寒天水溶液中に潜らせた後、ガラスシャーレに移した。顕微鏡下（１００〜２００倍率）でガラスシャーレの底に沈んだ付着物がない糸（髄糸）をキャピラリーピペットで吸い上げ、ホールスライドグラスのウェルに移した。ウェルで数回の吸い上げと放出を行い糸（髄糸）を洗浄した。新しいキャピラリーピペットを取り付けた後、糸（髄糸）を次のウェルに移す洗浄操作を３ウェル分繰り返し、その後マルチセルに移動した。この糸（髄糸）を培養海水を用いて、水温２５℃、光量２０ｐｐｆｄ、光周期２４Ｌ：０Ｄ（Ｌｉｇｈｔ：Ｄａｒｋ）の条件で約１ヶ月間塊状の糸状体になるまで成長させた。塊状の糸状体（湿質量０．１ｇｗ．ｗ．）をピンセットでつまみ取り、ＴＳＰ２７を０．０１ ｗ／ｗ％濃度で添加した培養海水１００ｍｌを入れたフラスコに移し、水温２８℃、光量８０ｐｐｆｄ、光周期２４Ｌ：０Ｄ、空気導入量１．０Ｌ／分の条件で約１０日間連続撹拌培養した。培養期間中は、４〜５日毎に培養海水の交換を行いながら、顕微鏡下で増体と微細藻混在の有無を確認し、微細藻類の混在が認められなかった糸状体を単藻化された糸状体種苗とした。
【００４２】
（２）モツレミル糸状体の培養
上記（１）で得られた単藻化されたモツレミルの糸状体種苗を、水温２５℃、光量６０ｐｐｆｄ、光周期１２Ｌ：１２Ｄに設定したグロースチャンバー内で培養した。培養海水は、藻類培養液ＴＳＰ２７を０．０５ｗ／ｗ％添加した滅菌海水とした。１Ｌ容量のガラス瓶に培養海水９００ｍｌを入れ、モツレミルの糸状体種苗を１ｇｗ．ｗ．（湿質量）入れた。培養瓶底部からガラス管を通して空気を２．３Ｌ／分で導入し、常時攪拌した。培養を１週間行いモツレミル糸状体を得た。
【００４３】
実  施  例  １
ＳＣＰの分離・精製：
（１）チラコイド膜の調製
参考例１で調製したモツレミル糸状体の５０ｇ（湿重量）を、凍ったままブレンダー（（株）テスコム：ＴＭ８３７）の２００ｍＬ固体用カップ内で、緩衝液Ａ（３００ｍＭのショ糖、１０ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ  ＨＣｌ、１ｍＭの６−ａｍｉｎｏ−ｎ−ｈｅｘａｎｏｉｃ  ａｃｉｄを含む１２５ｍＭのＫ２ＨＰＯ４／ＫＨ２ＰＯ４緩衝液（ｐＨ７．２））１００ｍＬと一緒に約２分間破砕した。まだ粒子が荒いこの分散液をガラスビーカーに移し、氷浴中で、超音波破砕機（（株）トミー精工：ＵＤＦ−２００）の標準プローブ（７０Ｗ、１ｓｘ４０回）で均一化した。このドロドロの溶液をＭｉｒａｃｌｏｔｈ（Ｍｅｒｃｋ社）でろ過した。ろ液を冷却遠心機（日立工機（株）：ＣＲ２２ＧＩＩＩ、アングルロータＲ２０Ａ２、３０００ｇｘ５ｍｉｎ、４℃）で沈殿させた。この緑色の沈殿物に緩衝液Ｂ（０．１ＭのＫＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡを含む５０ｍＭのＫ２ＨＰＯ４／ＫＨ２ＰＯ４緩衝液（ｐＨ７．２））を１０ｍＬ加えて懸濁し、ガラスホモジナイザーでホモジナイズして更に遠心分離（３０００ｇｘ５ｍｉｎ、４℃）した。得られた緑色の沈殿物に緩衝液Ｃ（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０））を１０ｍＬ加えて懸濁し、ホモジナイズ後に遠心分離（３０００ｇｘ５ｍｉｎ、４℃）した。この操作を２回繰り返した。得られた緑色の沈殿物に緩衝液Ｄ（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．２））を１０ｍＬ加えて懸濁し、ホモジナイズしてチラコイド膜を調製した。このチラコイド膜は使用するまで−３０℃で冷凍保存した。
【００４４】
（２）チラコイド膜の可溶化
上記（１）で得られたチラコイド膜の濃度を緩衝液Ｄで０.１４ｍｇ／ｍｌに調製したものを１２ｍｌ、界面活性剤（ｄｏｄｅｃｙｌ−β−Ｄ−ｍａｌｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ：ＤＭ）を１０％（ｗ／ｇ）含む緩衝液Ｄ１２ｍｌを混合し、氷上（０℃）で２０分間振とうした後、卓上遠心機で２秒間遠心したものの上清を試料とした。
【００４５】
（３）試料の分析
上記（２）で得られた試料を、ＤＥＡＥ  Ｔｏｙｏｐｅａｌ  ６５０Ｓ（東ソー（株））を担体とした陰イオン交換カラムクロマトグラフィー（ＩＥＣ）に展開し、５ｍＭ−４００ｍＭのＮａＣｌ濃度勾配法で精製した。およそ３００ｍＭＮａＣｌ付近に得られる濃い緑色のフラクション（５１〜６２）を集め、吸収スペクトルを確認することにより、ＳＣＰと同定した。得られたＳＣＰの色素組成を分析し、電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＢＮ−ＰＡＧＥ）によってタンパク質の純度及び分子量、会合状態を決定した。また、Ｎ末端アミノ酸シークエンスを行い、ＳＣＰの同定を行った。更に、ＳＣＰの温度耐性を調べた。
【００４６】
＜分離＞
ＩＥＣの分離パターンの一例を図１に示した。この検出は２８０ｎｍで行ったが、目視で緑色の濃いフラクションは、フラクション４０〜６４のピークであった。この図のフラクション５１〜６２を集めたものの吸収スペクトルを図２に示した。得られたフラクションの吸収スペクトルは６７６ｎｍ、６５４ｎｍ（肩）、５９９ｎｍ（肩）、５４４ｎｍ付近（ブロード）、４７４ｎｍ、４３８ｎｍに吸収極大を示した。また、この吸収スペクトルは非特許文献７が報告しているＳＣＰのスペクトルと非常に似た形状を示した。特に、タンパクに結合した際のシフォナキサンチンに特有の吸収帯である５００−５５０ｎｍの台形ピークを確認して、このフラクションがＳＣＰであると判定した。
【００４７】
＜色素組成分析＞
このＳＣＰを含むフラクションから有機溶媒（冷却したメタノール）で色素を抽出し、ＨＰＬＣによる色素組成分析を行った。各ピークの帰属は標準物質を用いて行った。また、比較として、モツレミル糸状体の凍結乾燥品のデータと共に図３に示した。この分離条件では、モツレミル糸状体に含まれる色素である特徴的な色素であるシフォナキサンチン（Ｓｘ）、ネオキサンチン（Ｎｘ）、ビオラキサンチン（Ｖｘ）、シフォネイン（Ｓｎ）、クロロフィルｂ（Ｃｈｌｂ）、クロロフィルａ（Ｃｈｌａ）、αカロテン（α）という特徴的な色素が分離される。ＳＣＰには、シフォナキサンチン（ピーク１）とシフォネイン（ピーク４）、ネオキサンチン（ピーク２）が多量に含まれており、シフォナキサンチンのピークでノーマライズすると、モツレミル糸状体とほぼ等しい割合となる。このことより、この三種類のカロテノイド（キサントフィル）は、モツレミル内で主としてＳＣＰに存在していると考えられる。高等植物（ほうれん草、エンドウ豆）の周辺アンテナタンパクであるＬＨＣＩＩでは、ネオキサンチンが３量体構造を取る鍵となるカロテノイドとして３分子（１つのサブユニットに対して１つずつ）結合していることがＸ線結晶構造解析より明らかになっているため、この色素の存在は極めて特徴的であり、ＳＣＰの立体構造がＬＨＣＩＩに類似しているのではないかという推測を裏付ける。
【００４８】
また、ＳＣＰではαカロテンは全く観測されなかった。光化学系には大量のβカロテンが蓄積されることが知られている。この種はβカロテンの代わりにαカロテンを蓄積する。このことより、この種ではαカロテンがβカロテンの代わりに光化学系に結合しているのではないかと推測できる。更に、シフォナキサンチンを基準に考えると、クロロフィルｂは糸状体の１／５程度、クロロフィルａは１／１０程度に減少している。（クロロフィル類は極めて不安定でプライムと呼ばれる異性体が抽出不純物として出てしまう場合があり、糸状体のみに見えているピーク５、６の後ろのピークはこれに相当すると考えられるので、それぞれのクロロフィル量に含めて考えている。）このことから、大量のクロロフィルａ、その半分程度のクロロフィルｂが光化学系に含まれていることが示唆される。これは、モツレミルの光化学系が、高等植物の光化学系と極めて類似していると解釈できる。
【００４９】
ＩＥＣで精製したＳＣＰの色素組成分析の結果として得られたＨＰＬＣプロファイル（図３）のピークの面積比は、測定波長における吸収量の比となるため、報告されているモル分子吸光係数で補正する（割る）ことにより、それぞれのピークのモル比（組成比）を概算することができる。その結果、シフォナキサンチン（Ｓｘ，ピーク１）：ネオキサンチン（Ｎｘ，ピーク２）：ビオラキサンチン（Ｖｘ，ピーク３）：シフォネイン（Ｓｎ，ピーク４）：クロロフィルｂ（Ｃｈｌｂ，ピーク５）：クロロフィルａ（Ｃｈｌａ，ピーク６）＝１：１：０：１：１０：１１となった。
【００５０】
＜ＳＤＳ−ＰＡＧＥ＞
ＳＣＰを構成するタンパク質の分析を行うために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥはタンパク質を変成させて一次元の鎖のようにしてＳＤＳの電荷により泳動するため、比較的タンパクの性質に依らずに分子量が決定できる手法であるが、タンパク質の高次構造は破壊され、結合している色素も全て抜け落ちた状態となる。ＩＥＣで精製したＳＣＰのタンパク質の同定を行うため、濃度を変えてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。試料番号と濃度の関係を表１に示した。また、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を図４に示した。この図が示すように、ＳＣＰ濃度が低い試料番号１〜４のレーンから、分子量２７±１ｋＤａの１バンドであることが明らかとなった。これは、非特許文献７に示されているＳＣＰのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量と極めて近いため、ＳＣＰの同定の根拠の一つとなる。更に、ＳＣＰ濃度の高い試料番号５〜８のレーンからは、このバンドの他に不純物がないことが言える。これより、ＩＥＣにより得られたこのＳＣＰは高純度であると評価できる。
【００５１】
【表１】
2014001158.tif 000003
【００５２】
＜Ｎ末端アミノ酸配列解析＞
ＳＣＰのＮ末端アミノ酸配列を解析したところ、Ｎ末端のブロッキングはなく、１０残基まで決定することができた。そのアミノ酸配列は、
ＩＥＦＹＧＰＤＲＡＬ（配列番号１）またはＩＥＦＹＧＡＤＲＡＬ（配列番号２）
であった。
【００５３】
この配列番号１のアミノ酸配列と１００％相同性のあるものは未報告であり、最高でもゲノムが知られている緑藻クラミドモナスのクロロフィルａ／ｂタンパクと、８８％〜７５％の相同性しかみられなかった。また、このアミノ酸配列は、ホウレンソウ、えんどう豆などの高等植物由来のＬＨＣＩＩとは４０％に満たない相同性しかみられなかった。また、配列番号２のアミノ酸配列と１００％相同性のあるものも未報告であり、最高でもゲノムが知られている緑藻クラミドモナスのクロロフィルａ／ｂタンパクと、７８％〜６５％の相同性しかみられなかった。また、このアミノ酸配列は、ホウレンソウ、えんどう豆などの高等植物由来のＬＨＣＩＩとは３０％に満たない相同性しかみられなかった。
【００５４】
更に、サブユニットの内部配列の部分配列のいくつかを、質量分析法を用いてマスコット解析した。その結果、クラミドモナスと１００％の相同性が得られたＥＬＥＬＩＨＡＲ（配列番号３）等がみられた。しかしながら、この配列は、ホウレンソウ、えんどう豆由来のＬＨＣＩＩとも相同性が９０％と高いことから、クロロフィルａ／ｂの結合部位に関連した配列であると考えられ、種による保存性が高い部分であるといえる。
【００５５】
このように決定されたアミノ酸配列からは、サブユニットの一部はクラミドモナスのクロロフィルａ／ｂタンパクと相同性が高いものの、Ｎ末端のアミノ酸配列の相同性が低く、質量分析法を用いたマスコット解析でも未解決のフラグメントピークが多数観測されていることから、デノボ解析を行う必要のある新規配列が多数存在することを示唆しており、サブユニットの新規性を裏付けている。よって、報告されている例では、クラミドモナスのクロロフィルａ／ｂ結合タンパクの配列と相同性が高いが、シフォナキサンチン結合型のクロロフィルａ／ｂタンパクとしては報告例がない新規なタンパク質であることが明らかとなった。
【００５６】
＜ＢＮ−ＰＡＧＥ＞
非破壊の電気泳動法を行うことにより、ＳＤＳ−ＰＡＧＥのようにタンパク質の三次構造、四次構造を破壊することなしに、生体内により近い形の、機能を示している形の分子量を推定することができる。様々な濃度のＳＣＰを非破壊の電気泳動で泳動した結果を図５に示した。試料番号と濃度の関係を表２に示した。移動度−分子量標準曲線よりＳＣＰの分子量は７２±１ｋＤａであると概算できる。ただし、ＢＮ−ＰＡＧＥは、ＣＢＢのつき方がタンパク質によって大きく変わるため、分子量の決定は基本的に難しいとされている手法である。そのため、この結果は、およそ６６ｋＤａと１４６ｋＤａの間に分子量があると評価するにとどめる。これらの電気泳動法の結果、ＳＣＰは、２７ｋＤａの一種類のタンパク質サブユニットがおよそ３量体構造をとったものとして機能している可能性が示唆された。
【００５７】
【表２】
2014001158.tif 000004
【００５８】
＜蛍光スペクトル測定＞
精製したＳＣＰの蛍光スペクトルを測定した（図６）。図６に示したように、クロロフィルａのＢバンド（４３７ｎｍ）で励起した時の蛍光スペクトル（実線）は、クロロフィルａからの蛍光スペクトルと判断できる。クロロフィルｂのＢバンド（４７３ｎｍ）で励起した時（破線）、結合性シフォナキサンチンと帰属されているピーク（５４０ｎｍ）で励起した時（点線）、それぞれが、これと一致したので、クロロフィルｂ及びシフォナキサンチンからクロロフィルａへのエネルギー伝達が行われていることが明らかとなった。すなわち単離精製したＳＣＰは光合成アンテナとしての生理活性を失っていないことが明らかとなった。
【００５９】
また、励起光の波長を４００−７００ｎｍまでスキャンして、クロロフィルの蛍光スペクトル（７００ｎｍ）の強度をプロットした蛍光励起スペクトル（図７の一点鎖線）を測定した。スペクトルを吸収率（１−Ｔ、Ｔは透過率、図７の破線）と比較すると、エネルギー伝達の効率（実線）を算出することができる。この手法により、結合性のシフォナキサンチン（図７の両矢印で示した領域）からクロロフィルａへのエネルギー伝達効率はほぼ１００％（図７の表記では１．０）であることが分かった。また、４００−５００ｎｍにおける励起エネルギー伝達効率が極めて悪い（図７の実線より６０〜７０％となる）ことより、この領域に吸収帯を持つカロテノイド（ネオキサンチン）は、クロロフィルａへのエネルギー伝達が主たる役割ではないと考えられる。ほうれん草ＬＨＣＩＩでも、ネオキサンチンは、三量体構造を取るのに必要なため、エネルギー伝達ではなく構造を保つ役割を担うと考えられているため、ここでも構造上の類似が予測され、シフォナキサンチンという結合するカロテノイドの違いが光捕獲機能を著しく向上させていることがうかがえる。
【００６０】
＜ＳＣＰの温度耐性＞
ＩＥＣ精製後のＳＣＰの０．０５％ＤＭを含む５０ｍＭトリス塩酸バッファー（ｐＨ７．２）を用いた。紫外可視吸収分光光度計（日本分光（株）：Ｖ―５３０）およびペルチェ冷却式温度コントローラー（日本分光（株）：ＥＴＣ−５０５Ｔ）と恒温セルホルダー（日本分光（株）：ＥＴＣ−５０５Ｓ）を用いて、セルの温度を４度から１０℃、２０℃、と１０℃ずつ９０℃まで上げていった。それぞれの設定温度に達してから５分間待ち、設定温度を４℃に下げてさらにコントローラーが４度を示してから５分間待った時のスペクトルを取得することを繰り返して、図８のような吸収スペクトルを得た（図９に図８の□部分の拡大図を示した）。
【００６１】
その結果、結合性シフォナキサンチン由来のバンド(５４０ｎｍ)には４℃から７０度までは、顕著な温度変化が見られなかったが、８０℃からは大きく変化した。80℃では、ほかのすべての色素由来のピークと、２８０ｎｍのタンパク由来のピークにも顕著な変化が見られていたため、７０℃から８０℃の間でタンパクそのものが大きく損なわれていると思われる。よって、ＳＣＰは、７０℃という比較的高い温度に至るまで、特徴的な色素であるシフォナキサンチンの結合が維持されるといえる。
【００６２】
＜ＳＣＰの収率＞
ＩＥＣにより高純度のＳＣＰを得ることができたので、チラコイド膜あたりのＩＥＣ純度のＳＣＰの収率を概算した。クロロフィルａ量換算で比較すると、およそ４０％という高い収率を得た。これはクロロフィルａ量換算（６７７ｎｍ付近の吸収ピーク強度をクロロフィルａの吸光係数で割り、溶液の量をかけた値）であり実測値ではないが、チラコイド膜からの収率としては極めて良いと考えられる。
【００６３】
実  施  例  ２
ＳＣＰの濃縮：
実施例１のＢＮ−ＰＡＧＥの結果より、ＳＣＰの分子量は６６ｋＤａ−１４６ｋＤａの間であると分かったので、ある分子量のものをカットすることによりＳＣＰを濃縮できることが予測される。そのため、以下のようにして分画分子量のスクリーニングを行った。
【００６４】
（１）遠心限外ろ過膜による条件検索
上記実施例１で得られたＳＣＰを５０ｋＤａ、１００ｋＤａまたは３００ｋＤａの限外ろ過膜（ビバスピン５００：ザルトリウス・メカトロニクス・ジャパン（株））を用いて３０００ｇで１０分、３０分または１時間遠心処理した。遠心処理する前の溶液の吸収スペクトルと、限外ろ過膜を透過した液の吸収スペクトルとを比較したところ、５０ＫＤａ、１００ｋＤａでは１時間遠心してもほぼ透過しなかったが３００ｋＤａ以上では１０分間の遠心でほとんど透過することが分かった。この結果より、ＳＣＰは１００ｋＤａで濃縮され、３００ｋＤａは透過すると結論づけられた。
【００６５】
また、上記実施例１で用いた試料（チラコイド膜を可溶化させた溶液）を用いて上記と同様にして遠心処理する前の溶液の吸収スペクトルと、限外ろ過膜を透過した液の吸収スペクトルとを比較した。その結果１００ｋＤａで１０分間遠心すると少し透過しているが、その後は透過せず、３００ｋＤａでは１０分〜３０分間遠心するとほとんど透過していることが分かった。よって、この結果からも、ＳＣＰは１００ｋＤａの膜では濃縮され、３００ｋＤａでは透過すると結論づけられた。
【００６６】
（２）中空糸による条件検索
上記実施例１で用いた試料（チラコイド膜を可溶化させた溶液）を、ポンプ（Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｇｅａｒ  Ｐｕｍｐ  ＭＤＧ−Ｍ２Ｔ１００Ｎ：（株）イワキ）につなげた１００ｋＤａ、１５０ｋＤａまたは５００ｋＤａのペンシルタイプ中空糸ユニット（ＭＯＬＳＥＰ  ＭＩＮＩ ＨＩＴ−１−ＦＵＳ１０８２、ＨＩＴ−１−ＦＵＳ−１５８２、ＨＩＴ−１−ＦＵＳ−５０８２：（株）ダイセン・メンブレン・システムズ）に、循環流量１００ｍＬ／ｍｉｎ、排出流量４ｍＬ／ｍｉｎで流して処理した。中空糸で処理する前の溶液の吸収スペクトルと、中空糸を透過した液の吸収スペクトルとを比較したところ、１００ｋＤａではほとんど透過しておらず、５００ｋＤａではすべてが透過したが、１５０ｋＤａでは透過液と循環液（濃縮液）の吸収スペクトルが異なることが分かった。また、１５０ｋＤａ透過液は非特許文献７のＳＣＰのスペクトルと非常に似ているが、１５０ｋＤａ循環液（濃縮液）はクロロフィルｂに由来する４８０ｎｍおよび６５０ｎｍのピークが共に小さくなっており、ＳＣＰよりもむしろ光化学系に近いスペクトルを示すことが分かった。これらの結果より、１５０ｋＤａで透過した液を１００ｋＤａで濃縮するというステップでＳＣＰらしい吸収スペクトルを示すものを濃縮できるのではないかと結論づけた。
【００６７】
次に、実際に１５０ｋＤａで透過した液を１００ｋＤａで濃縮するというステップを試みた。ポンプ１台に１５０ｋＤａの中空糸ユニットをつなげて上記と同様の流量で流して、濃縮液と透過液を得た。その後、膜を１００ｋＤａに付け替えて、１５０ｋＤａ透過液を上記と同様の流量で流して濃縮液（１００ｋＤａ以上１５０ｋＤａ以下の画分）を得た。このようにして得られた１００ｋＤａ濃縮液（１００ｋＤａ以上１５０ｋＤａ以下の画分）と、上記（１）で得られた１５０ｋＤａ濃縮液（１５０ｋＤａ以上の画分）について、吸収スペクトル測定、ＩＥＣ分析、電気泳動による評価を行った。
【００６８】
＜吸収スペクトル測定＞
吸収スペクトルによる分析結果を図１０に示した。１００ｋＤａ以上１５０ｋＤａ以下の画分（太線）は、非特許文献７のＳＣＰの吸収スペクトルを極めてよく再現していてＳＰＣが濃縮されていることが分かった。一方、１５０ｋＤａ以上の画分（細線）ではスペクトルが異なり、特にクロロフィルｂと帰属される６５２ｎｍ、４７３ｎｍのピーク（帰属は図６参照）が明らかに減少していた。この結果より、１５０ｋＤａ以上の画分には、一般にクロロフィルａ／ｂ比が大きい光化学系ＩＩの混入がある可能性が示唆された。
【００６９】
＜ＩＥＣ分析＞
ＩＥＣによる分析結果を図１１に示した。ＩＥＣで精製した後のＳＣＰ標品のプロファイルを（破線）で示した。１００ｋＤａ以上１５０ｋＤａ以下の画分（実線）、１５０ｋＤａ以上の画分（一点鎖線）共に４０ｍｌ付近（ＮａＣｌ濃度３００ｍＭ付近）で溶出するＳＣＰが主たる成分として検出された。この図はＳＣＰのピーク強度でスケールして記載している。塩濃度の勾配をかけている２５ｍＬ付近から後に出るピークを評価する。１５０ｋＤａ以上の画分（一点鎖線）は、ＳＣＰのバンドの立ち上がり前である３５ｍｌ付近から顕著なふくらみがみられ、またＳＣＰのバンドの後にも４５ｍｌ〜７５ｍｌにだらだらとした溶出バンドが検出された。これらは不純物であると考えられる。２５ｍＬから１１０ｍＬまでのピークの内、ＳＣＰのピークとみられる３０−４２ｍＬのピークの割合は、４４％（２８０ｎｍにおける吸収強度の比）となった。一方、１００ｋＤａ以上１５０ｋＤａ以下の画分（実線）では、立ち上がりに少しふくらみが見えるが、ＳＣＰのバンドのあとは比較的綺麗にゼロまで落ちている。６０ｍｌ、８８ｍｌ、１１３ｍｌにみられる小さいがシャープなピークは、この部分でそれぞれ６００ｍＭ、６００ｍＭから１Ｍ、１Ｍから０ＭというＮａＣｌ濃度の変化があることより、カラムに残ったタンパクが一気に溶出することによるバンドであると考えられ、不純物ではないと評価できる。２５ｍＬから１１０ｍＬまでのピークの内、ＳＣＰのピークとみられる３０−４３ｍＬのピークの割合は、６７％となった。この結果より、１５０ｋＤａ透過後の１００ｋＤａ濃縮液は極めて純度が高く、ＩＥＣ精製のＳＣＰと同等の純度であると評価できる。
【００７０】
＜ＳＤＳ−ＰＡＧＥ＞
ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、分子量マーカーと交互にＳＣＰ標品、１５０ｋＤａ以上の画分、１００ｋＤａ以上１５０ｋＤａ以下の画分をそれぞれ２レーンずつロードした。これよりそれぞれの分子量を計算したところ、ＳＣＰ標品は２９±２ｋＤａ（濃かったためか、誤差が大きい）であり、１５０ｋＤａ以上の画分は２７．７±０．７ｋＤａであり、１００ｋＤａ以上１５０ｋＤａ以下の画分は２７．９±０．１ｋＤａとなった。よって、誤差の範囲内で一致するＳＣＰのバンドが主成分と確認できた。また、濃い方のレーンで１５０ｋＤａ以上の画分と１００ｋＤａ以上１５０ｋＤａ以下の画分の分離を比較すると、前者はレーン全体が着色しているが後者はＳＣＰのバンドの他にほとんどバンドが検出されていないことが分かる。この結果は、ＩＥＣ分析の結果を裏付けるものとなり、双方ともＳＣＰを含むが、１５０ｋＤａ以上の画分は不純物をも蓄積し、１００ｋＤａ以上１５０ｋＤａ以下の画分は、ＳＣＰのみを蓄積しているといえる。これより、１５０ｋＤａ透過後の１００ｋＤａ濃縮液で、もくろみ通りＳＣＰが濃縮されており、純度はＩＥＣと同レベルになったと結論できる。
【００７１】
以上のことから、チラコイド膜を可溶化させた溶液から１５０ｋＤａ以下の画分を採取し、これから１００ｋＤａ以下の画分を除去することで、ＩＥＣ精製と同程度に濃縮されることが分かった。
【産業上の利用可能性】
【００７２】
本発明の色素結合型タンパク質は、これに結合しているシフォナキサンチンおよびクロロフィルｂが１００％という極めて高い効率でクロロフィルａへエネルギーを伝達するものであり、地表に届く太陽光のプロファイルの内、エネルギーの最も高い領域および光子の数の最も多い領域の光を利用する効率が極めて高いという特徴がある。
【００７３】
従って、本発明の色素結合型タンパク質は、光エネルギー捕獲素子に利用できるため、特に、人工光合成や太陽電池に応用可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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