(57)【要約】【課題】餌料効率の高い魚類の系統を開発し、当該魚類を用いた飼料効率の高い魚類の養殖方法を提供すること。【解決手段】養殖対象魚類としてレプチン又はレプチン受容体の機能的欠損を有する魚類を採用することにより、魚類養殖における飼料効率を上昇させる。一態様において、レプチン又はレプチン受容体の機能的欠損を有する魚類の飼育は、対応する野生型魚類の飽食給餌時の摂餌量を下回る給餌量で行われる。一態様において、レプチン又はレプチン受容体の機能的欠損を有する魚類は、レプチン又はレプチン受容体欠損ホモ接合体である。レプチン又はレプチン受容体欠損ホモ接合体魚類は妊性を有しているので、当該ホモ接合体の雌雄を交配することにより、容易に繁殖可能である。従って、レプチン又はレプチン受容体欠損ホモ接合体魚類を用いることにより、安定した飼料効率の高い魚類の養殖が達成される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
魚類養殖における飼料効率を上昇させる方法であって、養殖対象魚類としてレプチン又はレプチン受容体の機能的欠損を有する魚類を採用することを含む、方法。
【請求項２】
レプチン又はレプチン受容体の機能的欠損を有する魚類を、対応する野生型魚類の飽食給餌時の摂餌量を下回る給餌量で飼育することを更に含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
レプチン又はレプチン受容体の機能的欠損を有する魚類が、レプチン又はレプチン受容体欠損ホモ接合体である、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
レプチン又はレプチン受容体の機能的欠損を有する魚類を、対応する野生型魚類の飽食給餌時の摂餌量を下回る給餌量で飼育することを含む、魚類の養殖方法。
【請求項５】
レプチン又はレプチン受容体の機能的欠損を有する魚類が、レプチン又はレプチン受容体欠損ホモ接合体である、請求項４記載の方法。
【請求項６】
レプチン又はレプチン受容体欠損ホモ接合体魚類の雌雄を交配し、その子孫魚類を得ることを含む、レプチン又はレプチン受容体欠損ホモ接合体魚類の製造方法。
【請求項７】
以下の工程を含む、魚類の養殖方法：
（１）レプチン又はレプチン受容体欠損ホモ接合体魚類の雌雄を交配し、その子孫魚類を得ること；及び
（２）当該子孫魚類を飼育すること。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、飼料効率の高い魚類の養殖方法に関する。また、本発明は、魚類の繁殖方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
養殖業において、餌料費は生産コストの７割程度を占める。そのため餌料費を節約できる餌料効率の高い養殖魚の系統の開発が望まれる。家畜や家禽などの経済産業動物では、長年をかけた伝統的な選抜育種により、高産肉性（肉が多くとれる性質）、高成長、抗病性等に優れた品種改良が成功している。しかし、家畜、家禽に比べて、飼育の歴史が短い養殖魚類では、品種の作製がほとんど進んでいない。
【０００３】
レプチンは、Zhangらによって遺伝性肥満（ob/ob）マウスの病因遺伝子として同定された、摂食抑制作用を有するホルモンである（非特許文献１）。本発明者らは、TILLING法によりレプチン受容体KO（LepR-KO）メダカを作出し、LepR-KOメダカは野生型メダカと比較して摂食量が多く、成長が速いことを報告している（非特許文献２及び３）。
【０００４】
魚類に先立ち、哺乳動物においてレプチン受容体KO動物の表現型が詳細に解析されており、ホモのLepR-KO哺乳動物は不妊であるため、ヘテロLepR-KO哺乳動物を交配して、ホモのLepR-KO哺乳動物を作出し、系統を維持していく必要があることが知られている（非特許文献４）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Zhang et al., Nature, 372, 425-432, 1994
【非特許文献２】黒川忠英、アクアネット、２００９年１１月号、６６〜６９頁
【非特許文献３】苣田慎一ら、平成２３年度日本水産学会春季大会予稿集、２１９頁、平成２３年３月
【非特許文献４】Cole DL et al., Diabetologia, 14(3), 141-148, 1978
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、餌料効率の高い魚類の系統を開発し、当該魚類を用いた飼料効率の高い魚類の養殖方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記目的に鑑み、鋭意検討を行った結果、LepR-KO魚類は、野生型メダカよりも少ない餌の量で、野生型メダカと同等か、それを上回る速度で成長し得ることを見出した。更に、驚くべきことに、哺乳動物とは異なり、ホモのLepR-KO魚類は妊性を有しており、ホモの雌雄のLepR-KO魚類同士を交配することにより、繁殖可能であることを見出した。本発明者らは、これらの知見に基づき更に検討を進め、本発明を完成した。
【０００８】
即ち、本発明は以下に関する。
［１］魚類養殖における飼料効率を上昇させる方法であって、養殖対象魚類としてレプチン又はレプチン受容体の機能的欠損を有する魚類を採用することを含む、方法。
［２］レプチン又はレプチン受容体の機能的欠損を有する魚類を、対応する野生型魚類の飽食給餌時の摂餌量を下回る給餌量で飼育することを更に含む、［１］の方法。
［３］レプチン又はレプチン受容体の機能的欠損を有する魚類が、レプチン又はレプチン受容体欠損ホモ接合体である、［１］又は［２］の方法。
［４］レプチン又はレプチン受容体の機能的欠損を有する魚類を、対応する野生型魚類の飽食給餌時の摂餌量を下回る給餌量で飼育することを含む、魚類の養殖方法。
［５］レプチン又はレプチン受容体の機能的欠損を有する魚類が、レプチン又はレプチン受容体欠損ホモ接合体である、［４］記載の方法。
［６］レプチン又はレプチン受容体欠損ホモ接合体魚類の雌雄を交配し、その子孫魚類を得ることを含む、レプチン又はレプチン受容体欠損ホモ接合体魚類の製造方法。
［７］以下の工程を含む、魚類の養殖方法：
（１）レプチン又はレプチン受容体欠損ホモ接合体魚類の雌雄を交配し、その子孫魚類を得ること；及び
（２）当該子孫魚類を飼育すること。
【発明の効果】
【０００９】
養殖魚としてレプチン又はレプチン受容体の機能的欠損を有する魚類を選択することにより、飼料効率の高い魚類の養殖が可能となる。レプチン又はレプチン受容体の機能的欠損を有する魚類は、ホモ接合体でも妊性を有しているため、安定して系統を維持することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】メダカのレプチン受容体の構造、及びENU処理により得られたレプチン結合ドメインにアミノ酸置換を伴う突然変異体を表す。レプチン結合ドメインの中のC(システイン)が終止コドン（Stop）に置換した個体を交配することにより、この変異をホモに持つレプチン受容体欠損メダカ（LEPR KO）を作製した。
【図２】レプチン受容体欠損メダカと通常メダカの生殖腺の組織学的な観察像を示す。左上：通常メダカの精巣、左下：通常メダカの卵巣、右上：レプチン受容体欠損メダカの精巣、右下：レプチン受容体欠損メダカ卵巣。
【図３】レプチン受容体欠損メダカと通常メダカの産卵数、受精率、孵化率を示す。
【図４】アルテミアを用いた摂餌量試験の概要を示す。
【図５】レプチン受容体欠損メダカと通常メダカの摂餌量解析の結果を示す。Ａ：レプチン受容体欠損メダカと通常メダカの両群の摂餌速度の比較、Ｂ：両群の摂餌量の比較。
【図６】レプチン受容体欠損メダカと通常メダカの成長曲線（体重）解析の結果を表す。白四角：レプチン受容体欠損メダカ、黒三角：通常メダカを示す。*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001。
【図７】制限給餌試験におけるレプチン受容体欠損メダカと通常メダカの成長曲線（体重）解析の結果を表す。白四角：レプチン受容体欠損メダカ、黒三角：通常メダカを示す。**p<0.01, ***p<0.001。
【図８】制限給餌試験におけるレプチン受容体欠損メダカと通常メダカの成長曲線（標準体長）解析の結果を表す。白四角：レプチン受容体欠損メダカ、黒三角：通常メダカを示す。**p<0.01。
【図９】制限給餌試験におけるレプチン受容体欠損メダカと通常メダカの餌料効率（給餌量あたりの体重増加量）を示す。黒色カラム：通常メダカ、白色カラム：レプチン受容体欠損メダカを示す。
【図１０】異なる給餌量下におけるレプチン受容体欠損メダカと通常メダカの成長曲線（体重）の比較を示す。Ａ：50％給餌区、Ｂ：100％給餌区、Ｃ：200％給餌区。白四角：レプチン受容体欠損メダカ、黒三角：通常メダカを示す。*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001。
【図１１】100％及び200％給餌区のレプチン受容体欠損メダカ、並びに200％給餌区の通常メダカの3者の成長曲線（体重）の比較を示す。白四角：レプチン受容体欠損メダカ（100％給餌）、黒四角：レプチン受容体欠損メダカ（200％給餌）、黒三角：通常メダカ(200％給餌)を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は、魚類養殖における飼料効率を上昇させる方法であって、養殖対象魚類としてレプチン又はレプチン受容体欠損魚類を採用することを含む、方法を提供するものである。
【００１２】
本発明において、養殖の対象となる魚類の種類は、特に限定されないが、例えば、食用魚類としては、スズキ目魚類（マダイ、スズキ、ハタ、ティラピア、アジ、ザバ、マグロ等）、ニシン目魚類（ニシン、イワシ等）、ボラ目魚類（ボラ、ペへレイ等）、タラ目魚類（マダラ等）ウナギ目魚類（ウナギ、アナゴ等）、サケ目魚類（アユ、ニジマス、大西洋サケ等）コイ目魚類（コイ、ソウギョ、ドジョウ等）、ナマズ目魚類（ナマズ等）、カレイ目魚類（ヒラメ、カレイ等）、フグ目魚類（トラフグ、カワハギ等）、カジカ目魚類（カサゴ、メバル等）、ダツ目魚類（サンマ等）等が挙げられる。また、鑑賞用魚類としては、コイ、フナ、メダカ、キンギョ、ゼブラフィッシュ等が挙げられる。さらに、研究又は実験用魚類として、ゼブラフィッシュ、メダカ、キンギョ、ドジョウ、トゲウオ、ミドリフグ等が挙げられる。
【００１３】
本発明において、養殖の対象となる魚類の齢は特に限定されず、孵化直後〜成魚のいずれの段階であってもよい。一態様において、養殖の対象となる魚類は、性成熟前である。
【００１４】
本発明において、飼料効率とは、魚類養殖において、摂取した飼料の一定量について体重がどれだけ増加したかを示した値である。飼料効率は、体重増加量を給餌量で除することにより算出することができる。
【００１５】
本発明の方法においては、養殖対象魚類としてレプチン又はレプチン受容体の機能的欠損を含む魚類を採用する。
【００１６】
レプチンは、摂食抑制作用を有する公知のペプチドホルモンである。多くの魚類について、レプチンのアミノ酸配列やこれをコードするcDNAのヌクレオチド配列が同定されている。本発明者らは、トラフグ（アミノ酸配列：GenBankアクセッション番号BAD94444.1（2011年7月27日更新）、ヌクレオチド配列：GenBankアクセッション番号AB193547.1（2011年7月27日更新））、ミドリフグ（アミノ酸配列：GenBankアクセッション番号BAD94451.1（2011年7月27日更新）、ヌクレオチド配列：GenBankアクセッション番号AB193549.1（2011年7月27日更新））、メダカAタイプ（アミノ酸配列：GenBankアクセッション番号BAD94448.2（2011年7月27日更新）、メダカBタイプ（アミノ酸配列：GenBankアクセッション番号NP_001153914.1（2012年12月27日更新）、ヌクレオチド配列：GenBankアクセッション番号NM_001160442.2（2012年12月27日更新））、ヌクレオチド配列：GenBankアクセッション番号AB193548.2（2011年7月27日更新））、大西洋サケA1タイプ（アミノ酸配列：GenBankアクセッション番号ACZ02412.1（2010年6月14日更新）、ヌクレオチド配列：GenBankアクセッション番号FJ830677.1（2010年6月14日更新））、大西洋サケA2タイプ（アミノ酸配列：GenBankアクセッション番号ADI77098.1（2010年6月20日更新）、ヌクレオチド配列：GenBankアクセッション番号GU584004.1（2010年6月20日更新））、ホッキョクイワナ（アミノ酸配列：GenBankアクセッション番号BAH83535.1（2011年7月27日更新）、ヌクレオチド配列：GenBankアクセッション番号AB490667.1（2011年7月27日更新）及びニジマスA1タイプ（アミノ酸配列：GenBankアクセッション番号BAG09232.1（2011年7月27日更新）、ヌクレオチド配列：GenBankアクセッション番号AB354909.1（2011年7月27日更新））のレプチンのアミノ酸配列及びcDNA配列を同定している（Kurokawa et al., Peptides, 26, 745-750, 2005）。また、ゼブラフィッシュ（アミノ酸配列：GenBankアクセッション番号NP_001122048.1（2013年1月7日更新）、ヌクレオチド配列：GenBankアクセッション番号NM_001128576.1（2013年1月7日更新））、及びコイ（アミノ酸配列：GenBankアクセッション番号CAI30828.1及びCAH33827.2（2006年12月7日更新）、ヌクレオチド配列：GenBankアクセッション番号AJ868357.1及びAJ830744.2（2006年12月7日更新））、チャイロマルハタ（アミノ酸配列：AFU55260.1及びAFU55261.1（2012年10月10日）ヌクレオチド配列：GenBankアクセッション番号JX406147.1及びJX406148.1（2012年10月10日更新））、ソウギョ（アミノ酸配列：GenBankアクセッション番号ACF23048.1（2008年7月13日更新）、ヌクレオチド配列：GenBankアクセッション番号EU794002.1（2008年7月13日更新））およびキンギョ（アミノ酸配列：GenBankアクセッション番号ACL68083.1（2009年1月17日更新）及びACO82076.1（2009年4月20日更新）、ヌクレオチド配列：GenBankアクセッション番号FJ534535.1（2009年1月17日更新）及びFJ854572.1（2009年4月20日更新））のレプチンのアミノ酸配列及びcDNA配列が報告されている。
【００１７】
魚類においては、レプチン遺伝子のコピー数に関して、1または2コピー存在することが報告されている（Kurokawa et al., Peptides, 26, 745-750, 2005; Kurokawa et al., Gen Comp Endocrinol., 161 (2), 229-237, 2009; Ronnestad et al., Gen Comp Endocrinol., 168 (1), 55-70）。近年、サケ科魚類では、レプチン遺伝子が4コピー存在するという報告もある（Ronnestad et al., 7thInternational Symposium on Fish Endocrinology abstract pp222）。このように、レプチン遺伝子が複数コピー存在する場合、そのいずれの遺伝子座も本明細書におけるレプチンに包含される。
【００１８】
レプチンは、レプチン受容体を介して生体に作用する。哺乳動物では、６種類のレプチン受容体（LepRa, LepRb, LepRc, LepRd, LepRe, LepRf）が報告されているが、細胞内シグナルドメインが機能するLepRbが、本発明におけるレプチン受容体に対応する。多くの魚類について、レプチン受容体のアミノ酸配列やこれをコードするcDNAのヌクレオチド配列が同定されている。本発明者らは、トラフグ（アミノ酸配列：GenBankアクセッション番号NP_001124341.1（2012年11月9日更新）、ヌクレオチド配列：GenBankアクセッション番号NM_001130869.1（（2012年11月9日更新）、メダカ（アミノ酸配列：GenBankアクセッション番号NP_001153915.1（2012年12月27日更新）、ヌクレオチド配列：GenBankアクセッション番号NM_001160443.1（2012年12月27日更新））、及び太平洋サケ（アミノ酸配列：GenBankアクセッション番号NP_001158237.1（2012年8月30日更新）、ヌクレオチド配列：GenBankアクセッション番号NM_001164765.1（2012年8月30日更新））のレプチン受容体のアミノ酸配列及びcDNA配列を同定している。
【００１９】
上記に列挙した以外の魚類のレプチンやレプチン受容体のアミノ酸配列及びcDNA配列は、上記に列挙した魚類のレプチン又はレプチン受容体のcDNA配列に基づき、適切なプローブやプライマーを作成し、所望の魚類のcDNAライブラリーに対するプラークハイブリダイゼーションや、RT-PCR等の周知の遺伝子工学的技術を用いて、当該魚類のレプチンやレプチン受容体をコードするcDNAクローンを単離することにより、当業者であれば容易に同定することができる。
【００２０】
尚、レプチンは、哺乳動物の場合と比較して、魚類間では相同性が低いので、魚の種類によっては、上述のプラークハイブリダイゼーションやRT-PCRによっては、目的とする魚類のレプチンのcDNAクローンの単離が困難な可能性があり得る。このような場合には、レプチン遺伝子周辺のゲノム上の遺伝子（RBM28, LRRC4, Pax4等）の並び方に基づき、類似した遺伝子の並び方をしている領域をゲノム上で特定し、当該領域のヌクレオチド配列を決定し、当該領域に存在する未同定の遺伝子をGenscanプログラム（http://genes.mit.edu/GENSCAN.html）等により予測する。そして、予測遺伝子の中から、レプチンと類似した遺伝子構造やヌクレオチド配列を有する遺伝子を特定すればよい。
【００２１】
本明細書において、ポリペプチドについて、「生物Ｘ（由来）ポリペプチドＹ」とは、ポリペプチドＹのアミノ酸配列が、生物Ｘにおいて天然に発現している該ポリペプチドのアミノ酸配列（野生型アミノ酸配列）と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列を有することを意味する。同様に、本明細書において、遺伝子（ポリヌクレオチド）について、「生物Ｘ（由来）遺伝子Ｚ」とは、遺伝子Ｚのヌクレオチド配列（好ましくはｃＤＮＡ配列）が、生物Ｘにおいて天然に発現している該遺伝子のヌクレオチド配列（野生型ヌクレオチド配列）（好ましくはｃＤＮＡ配列）と同一又は実質的に同一のヌクレオチド配列を有することを意味する。「実質的に同一」とは、着目したアミノ酸配列又はヌクレオチド配列が、生物Ｘにおいて天然に発現している因子（野生型因子）のアミノ酸配列又はヌクレオチド配列と７０％以上（好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９９％以上）の同一性を有しており、且つ当該タンパク質又は遺伝子の機能（活性）が維持されていることを意味する。
【００２２】
レプチン又はレプチン受容体の機能的欠損とは、レプチン又はレプチン受容体が本来有する正常な機能（レプチン：摂食抑制作用、レプチン受容体：レプチンへ結合して細胞内へそのシグナルを伝達する活性）が十分に発揮できない状態をいい、例えば、レプチン又はレプチン受容体遺伝子が全く発現していない状態、またはレプチン又はレプチン受容体遺伝子が本来有する正常な機能が発揮できない程度にその発現量が低下している状態、あるいはレプチン又はレプチン受容体遺伝子産物の機能が完全に喪失した状態、またはレプチン又はレプチン受容体遺伝子が本来有する正常な機能が発揮できない程度にレプチン又はレプチン受容体遺伝子産物の機能が低下した状態が挙げられる。
【００２３】
一実施形態では、本発明において用いられるレプチン又はレプチン受容体の機能的欠損を含む魚類は、ゲノムＤＮＡの変異を伴う魚類、いわゆる遺伝子変異魚類であり得る。本発明の遺伝子変異魚類は、レプチン又はレプチン受容体欠損ヘテロ接合体或いはレプチン又はレプチン受容体欠損ホモ接合体であり得、好ましくは、レプチン又はレプチン受容体欠損ホモ接合体である。また、遺伝子変異は、遺伝子組み換えによる遺伝子改変とは異なり、自然界でも起こり得る突然変異によるものである。遺伝子変異には、ミュータジェンや放射線処理等により誘導した人為突然変異、及び自然突然変異が包含される。
【００２４】
本発明において用いられる遺伝子変異魚類は、自体公知の方法により製造できる。例えば、Taniguchi et al., Genome Biol. 2006;7(12):R116等に記載された方法に従い、ENU等のミュータジェン処理を施した雄の野生型魚類を、雌の野生型魚類と交配し、その子孫魚類（雄）を得ることにより、雄ヘテロ点突然変異体魚類のライブラリーを構築する。このライブラリーに含まれる各個体から精子を採取し、凍結保存する。更に、各個体のゲノムDNAを採取し、標的遺伝子（本発明においては、レプチン又はレプチン受容体遺伝子）のシークエンシングを行い、標的遺伝子に機能的欠損をもたらす変異が導入された個体を選別する。ライブラリーからの所望の変異体のスクリーニングに際しては、Tilling法（Till et al., Genome Res., 13(3), 524-530, 2003）を用いると、効率的に、大量のサンプルを処理することができる。変異の種類としては、例えば、標的遺伝子の発現調節領域における変異であって、該遺伝子の発現を低下又は喪失させるような変異、標的遺伝子のORFの途中にストップコドンを導入し、標的遺伝子の遺伝子産物の発現又は機能を喪失させるナンセンス変異、標的遺伝子のORFの途中に塩基の欠失または挿入を生じることにより、コドンの読み枠がずれて、標的遺伝子の遺伝子産物の発現又は機能を喪失させるフレームシフト変異等が挙げられるが、これらに限定されない。一態様において、レプチン受容体を標的遺伝子とする場合、レプチン受容体遺伝子のORFの膜貫通ドメインよりも上流、好ましくは、レプチン結合ドメイン内、又はレプチン結合ドメインよりも上流において、ナンセンス変異又はフレームシフト変異が導入されることにより、レプチン受容体の遺伝子産物の発現又は機能が喪失する。
【００２５】
このようにして、所望の変異を含む雄ヘテロ点突然変異体を特定し、該個体から予め採取した精子を野生型雌から採取した卵と受精することにより、レプチン又はレプチン受容体の当該点突然変異のヘテロ接合体を得る。そうして、このヘテロ接合体の雌雄を交配することにより、当該点突然変異のホモ接合体を作製することができる。
【００２６】
別の実施形態では、本発明において用いられるレプチン又はレプチン受容体の機能的欠損を含む魚類は、ゲノムＤＮＡの変異を伴わない魚類であり得る。かかる魚類は、例えば、レプチン又はレプチン受容体の発現または機能を特異的に抑制する物質（例えば、アンチセンス核酸、ｓｉＲＮＡ、これらの核酸を発現し得る発現ベクター）の魚類への投与又は魚類での強制発現により作製できる。投与は、例えば、マイクロインジェクション、リポソーム等の適切な送達手段を使用して行われ得る。
【００２７】
養殖の安定性の観点から、本発明において用いられるレプチン又はレプチン受容体の機能的欠損を含む魚類は、好ましくは、遺伝子変異魚類であり、最も好ましくは、レプチン又はレプチン受容体欠損ホモ接合体である。本明細書において、「レプチン又はレプチン受容体欠損」とは、レプチン又はレプチン受容体遺伝子の発現又はレプチン又はレプチン受容体遺伝子産物の機能を喪失させる変異を意味する。
【００２８】
また、上述の通り、魚類においては、レプチン遺伝子が複数コピー存在する種があり、複数コピーのうちの１コピーのみのレプチン遺伝子を機能的欠損としても、他方のレプチン遺伝子がこれを補完する可能性がある。従って、レプチン遺伝子に機能的欠損を導入する場合には、複数コピーの全てに機能的欠損を導入するのが好ましい。尚、レプチン受容体遺伝子は１コピーなので、機能的欠損の導入操作は、レプチン遺伝子に機能的欠損を導入する場合の半分以下で足りる。従って、本発明においては、好ましくは、レプチン受容体の機能的欠損を含む魚類が採用される。
【００２９】
レプチン又はレプチン受容体の機能的欠損を含む魚類の養殖は、レプチン又はレプチン受容体の機能的欠損を含む魚類を適切な人為的条件下で給餌しながら、市場への出荷に十分な大きさになるまで飼育することにより実施される。レプチン又はレプチン受容体の機能的欠損を含む魚類は、野生型魚類と比較して同化の効率が高く、同じ餌の量でも、野生型魚類より大きく成長する。或いは、レプチン又はレプチン受容体の機能的欠損を含む魚類は、野生型魚類よりも少ない餌の量で、野生型魚類と同等か、これを上回る大きさにまで成長し得る。従って、養殖対象魚類として、レプチン又はレプチン受容体の機能的欠損を含む魚類を採用することにより、飼料効率が上昇する。
【００３０】
一態様において、本発明の方法においては、レプチン又はレプチン受容体の機能的欠損を含む魚類は、対応する野生型魚類の飽食給餌時の摂餌量を下回る給餌量で飼育される。「飽食給餌」とは、養殖対象魚類が食べ残す量の餌を給餌することを意味する。本態様において、本発明の方法における給餌量は、対応する野生型魚類の飽食給餌時の摂餌量の例えば、９０％以下、８０％以下、７０％以下である。また、本態様において、本発明の方法における給餌量は、少なくとも体重維持量であり、例えば、対応する野生型魚類の飽食給餌時の摂餌量の３０％以上、４０％以上、５０％以上である。
【００３１】
また、本発明は、レプチン又はレプチン受容体欠損ホモ接合体魚類の雌雄を交配し、その子孫魚類を得ることを含む、レプチン又はレプチン受容体欠損ホモ接合体魚類の製造方法を提供するものである。哺乳動物においては、レプチンは雄及び雌の生殖機能に必須であり、レプチン欠損ホモ接合体及びレプチン受容体欠損ホモ接合体は不妊である。従って、レプチン又はレプチン受容体欠損ホモ接合体を製造する場合には、レプチン又はレプチン受容体欠損ヘテロ接合体の雌雄を交配する必要がある。一方、驚くべきことに、魚類においては、レプチンは、雄にとっても、雌にとっても、生殖機能に必須ではなく、レプチン又はレプチン受容体欠損ホモ接合体魚類は、野生型魚類と同等の妊性を維持する。従って、レプチン又はレプチン受容体欠損ホモ接合体魚類の雌雄を交配することにより、容易に、レプチン又はレプチン受容体欠損ホモ接合体魚類の子孫を得ることができる。これは、飼料効率の高い系統を安定に維持する観点から有利である。
【００３２】
レプチン又はレプチン受容体欠損ホモ接合体魚類の雌雄の交配は、自然交配、人工交配いずれにより実施してもよい。人工交配は、例えば、レプチン又はレプチン受容体欠損ホモ接合体魚類の雌から採取した卵と、レプチン受容体欠損ホモ接合体魚類の雄から採取した精子とを接触させることにより実施することができる。魚類の自然交配及び人工交配の方法論は当業者に周知である。
【００３３】
更に、本発明は、以下の工程を含む、魚類の養殖方法を提供するものである：
（１）レプチン又はレプチン受容体欠損ホモ接合体魚類の雌雄を交配し、その子孫魚類を得ること；及び
（２）当該子孫魚類を飼育すること。
【００３４】
工程（１）の詳細は、上述の本発明の魚類養殖における飼料効率を上昇させる方法として記載したとおりである。工程（２）の詳細は、上述の本発明のレプチン又はレプチン受容体欠損ホモ接合体魚類の製造方法として記載したとおりである。
【００３５】
工程（２）における魚類の飼育は、好ましくは対応する野生型魚類の飽食給餌時の摂餌量を下回る給餌量で行われる。
【００３６】
工程（２）で得た子孫魚類のうち、性成熟に達した雄雌の一部を、再び工程（１）に供して更なる子孫魚類を得て、これを更に工程（２）に供してもよい。このように工程（１）及び（２）のサイクルを繰り返すことにより、安定的に飼料効率の高い魚類の養殖を実施することができる。
【００３７】
刊行物、特許文献等を含む、本明細書に引用されたすべての参考文献は、引用により、それらが個々に具体的に参考として援用されかつその内容全体が具体的に記載されているのと同程度まで、本明細書に援用される。
【００３８】
以下、実施例を示して本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下に示す実施例によって何ら限定されるものではない。
【実施例】
【００３９】
［参考例１］
レプチン受容体欠損メダカの作製
本発明者らは、既に、メダカのレプチン受容体遺伝子が、第４番染色体上に１つ存在することを明らかにしている（Kurokawa et al., Gen Comp Endocrinol. 2009;161(2):229-37）。そこで、この遺伝子の塩基配列からレプチン結合ドメインを推定した。次に、この領域の変異体を得るため、TILLINGメダカ突然変異体ライブラリー（Taniguchi et al., Genome Biol. 2006;7(12):R116）の各個体（5771尾）について本領域の塩基配列を決定し、スクリーニングした。その結果、8種類のアミノ酸置換を伴う点突然変異体が得られ、そのうちの一つは終止コドンに変異したナンセンス変異であった。このレプチン受容体遺伝子のナンセンス変異を有する個体を交配し、当該変異をホモに持つレプチン受容体欠損メダカ（LEPR KO）を作製した（図１）。
【００４０】
［実施例１］
レプチン受容体欠損メダカの生殖能力
１．方法
（供試魚）
レプチン受容体欠損メダカおよび通常メダカ（Cab系統）を用いた。これらのメダカを、水温26±１℃、日長を長日条件14時間明期10時間暗期に調整した環境で飼育した。本条件では通常のメダカが孵化後3ヵ月で性成熟し、産卵を開始する。そこで、十分に成熟年齢に達している孵化後3ヵ月のレプチン受容体欠損メダカおよび通常メダカの個体を試験に用いた。
【００４１】
（生殖腺の組織学的観察）
孵化後3ヵ月のレプチン受容体欠損メダカおよび通常メダカの個体の生殖腺を、Davidson液に固定後、常法によりパラフィン切片とし、ヘマトキリン・エオジン染色を施して組織学的に観察した。
【００４２】
（繁殖力）
孵化後3ヵ月の性成熟したレプチン受容体欠損メダカおよび通常メダカについて、7.5Lのプラスチック水槽に雄4〜5尾、雌8〜10尾を収容し、産卵を行わせた。各雌個体の産卵数を測定し、受精率、孵化率を調べた。
【００４３】
２．結果
レプチン受容体欠損メダカの生殖腺の組織学的な観察を行った結果、レプチン受容体欠損メダカは、精巣、卵巣とも十分に発達しており、配偶子形成は正常であった（図２）。さらに、レプチン受容体欠損メダカ同士を交配し、産卵数、受精率、孵化率を調べた結果、通常のメダカ同士の交配の場合と同じ、産卵数、受精率、孵化率であった（図３）。これらの結果から、レプチン受容体欠損魚類の生殖能力は、正常であることが明らかになった。哺乳類では、レプチン又はレプチン受容体の機能欠損の個体は、生殖能力がないことが知られているが、魚類では、レプチンが生殖に関与していないことが示された。そのため、魚類ではホモ欠損個体同士の交配が可能で、この交配によりホモ欠損個体の次世代を得られることが明らかとなった。
【００４４】
［実施例２］
レプチン受容体欠損メダカの食欲
１．方法
（供試魚）
実施例１と同一の飼育環境で飼育した、レプチン受容体欠損メダカおよび通常メダカの成魚を用いた。摂餌量評価のため、２Ｌ水槽にレプチン受容体欠損メダカおよび通常メダカの成魚、雄３尾、雌３尾、合計６尾を入れ、水槽に数日間、馴致した。試験実施日には、前日の夜より１２時間以上絶食させ、空腹にしたメダカを用いた。
【００４５】
（摂餌量評価）
摂餌量の評価を行うために、アルテミアを用いた摂餌量試験を確立した。その概要を図４に示す。空腹にしたメダカ（合計６尾）に対して、常法により孵化させたアルテミアを２Ｌ水槽に35,000匹を1度に投与後、１時間ごとに10 mL採水し、残存アルテミア数を計測した。10mL採水中の残存アルテミア数の変化は摂餌速度を表す。単位時間あたりの摂餌量は、０時間後の10mL採水中の残存アルテミア数からX時間後の10mL採水中の残存アルテミア数を引いた差から求めた。
【００４６】
２．結果
レプチン受容体欠損メダカと通常メダカの摂餌量を比較したところ、レプチン受容体欠損メダカは、通常メダカに比べて、摂餌速度が速く、全摂餌量も1.5倍多いことが明らかになった（図５）。このことから、レプチン受容体欠損メダカは、哺乳類のレプチン機能欠損と同様に、レプチンシグナルによる摂餌抑制系が機能せず食欲旺盛であることが明らかになった。
【００４７】
［実施例３］
レプチン受容体欠損メダカの成長
１．方法
レプチン受容体欠損メダカおよび通常メダカを実施例１と同一の飼育環境で飼育し、それぞれから、300個の受精卵を得た。受精卵は、0.0001%のメチレンブルー液中に収容し、孵化まで管理した。孵化した仔魚の中から200尾を9cmシャーレに100尾ずつ分け（100尾/シャーレ）、餌としてゾウリムシを与え、1週間飼育した。孵化後１週から４週終了までは、3.5Lプラスチック水槽で飼育した。孵化後５週以降は、密度による成長へ影響を排除するため、大型の150L水槽で飼育した。餌は、孵化後１週〜３週終了まで微粒子飼料（鮎スーパーゴールド０：日清丸紅飼料株式会社）、孵化後４週〜試験終了まで海産種苗用飼料（おとひめＡ：日清丸紅飼料株式会社）、（おとひめβ１：日清丸紅飼料株式会社）を1日に4〜5回、飽食給餌し、飼育した。レプチン受容体欠損メダカおよび通常メダカの成長率を解析するために、孵化後1、2、3、4、5、および7週に各グループの１０尾を無作為にサンプリングし、体重を測定した。
【００４８】
２．結果
レプチン受容体欠損メダカと通常メダカの体重の増加を比較したところ、レプチン受容体欠損メダカは通常メダカよりも体重が増加し、孵化後4週には、体重が約1.3倍になった。孵化後2週からレプチン受容体欠損メダカの体重が有意に大きく、孵化後5週で、2.1倍、孵化後7週で1.7倍、野生型に比べて大きくなった（図６）。この結果から、レプチン受容体欠損メダカは、野生型に比べて、成長速度が速いことが示された。
【００４９】
［実施例４］
レプチン受容体欠損メダカの飼料効率
１．方法
（同一量給餌による成長試験）
レプチン受容体欠損メダカおよび通常メダカから、実施例３と同様に、受精卵を得て、孵化後１週〜４週まで下記の給餌量に従って同一量給餌を行い、飼育した。本試験では、試験開始孵化後1、2、3および4週に各グループの10尾を無作為にサンプリングし、体重、標準体長を測定した。
【００５０】
（給餌量）
給餌量は、基準給餌量として、孵化後１週は体重の90％、孵化後２週は体重の70％、孵化後３週は体重の40％で行った。実際の給餌量は、通常メダカの各週のはじめの日に測定した体重から算出した。この給餌量を、通常メダカおよびレプチン受容体欠損メダカの両方に全く同じ量を1日に5回に分けて給餌した。この際、給餌量は通常メダカの体重により規定されるので、レプチン受容体欠損メダカの体重が通常メダカよりも高い場合、本基準給餌量は、レプチン受容体欠損メダカの体重に基づき同一計算式で算出した給餌量を下回る。本基準給餌量は、通常メダカの飽食給餌時の摂餌量と同等となるように設定した。孵化後１週〜４週までの餌は、微粒子飼料（鮎スーパーゴールド０：日清丸紅飼料株式会社）を用いた。
【００５１】
２．結果
レプチン受容体欠損メダカと通常メダカの給餌量を全く同じ量に統一し、成長を比較した結果、レプチン受容体欠損メダカは、孵化後2週以降、通常メダカよりも体重が増加し、孵化後4週には、体重が約1.3倍になった（図７）。体長についても、同様な結果が得られた（図８）。このことは、同じ餌の量でも、レプチン受容体欠損メダカがより大きく成長することが明らかになった。また、給餌量１mg当たりの体重増加量を比較したところ、レプチン受容体欠損メダカは、通常メダカの約1.5倍であった（図９）。このことから、レプチン受容体欠損メダカは、通常のメダカに比べて、餌料効率が大きく（約50％）向上していることが分かった。すなわち、魚類においてレプチン受容体ホモ欠損個体は、たくさん食べて太るだけで無く、より効率的に同化（筋肉合成）をしていることが明らかとなった。
【００５２】
［実施例５］
異なる給餌量下におけるレプチン受容体欠損メダカの成長特性
１．方法
（異なる給餌量下における成長試験）
レプチン受容体欠損メダカおよび通常メダカから、実施例４と同様に、受精卵を得て、孵化後１週〜４週まで下記の給餌量に従って同一量給餌を行い、飼育した。本試験では、試験開始孵化後1、2、3および4週に各グループの10尾を無作為にサンプリングし、体重を測定した。
【００５３】
（給餌量の設定）
給餌量は、実施例４の基準給餌量と同じ量を給餌した区を100％給餌区、半分量を給餌した50％給餌区、2倍量を給餌した200％給餌区、の３つの異なる給餌量の試験区を設定した。
【００５４】
２．結果
異なる給餌量下における成長試験の結果、レプチン受容体欠損メダカは、50％給餌区、100％給餌区、200％給餌区のいずれの給餌量においても、通常メダカよりも体重が増加していた（図１０）。このことは、レプチン受容体欠損メダカは、多様な給餌量下（給餌量が、通常メダカの飽食給餌時の摂餌量以上の場合、あるいはこれを下回る場合）で、通常メダカと同じ餌の量で、通常メダカよりも大きくなることが分かった。さらに、図１１に示すように、100%給餌区のレプチン受容体欠損メダカの成長は、200％給餌区の通常メダカの成長とほぼ同じであり、図１０-AとBの比較から理解されるように、50%給餌区のレプチン受容体欠損メダカの成長は、100％給餌区の通常メダカの成長とほぼ同じであった。すなわちレプチン受容体欠損メダカは、通常メダカの1/2の給餌量で、通常メダカと同等の成長を示した。したがって、レプチン受容体欠損メダカは、より少ない餌で効率よく成長することが分かった。
【産業上の利用可能性】
【００５５】
養殖魚としてレプチン又はレプチン受容体の機能的欠損を有する魚類を選択することにより、飼料効率の高い魚類の養殖が可能となる。レプチン又はレプチン受容体の機能的欠損を有する魚類は、ホモ接合体でも妊性を有しているため、安定して系統を維持することが可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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