(57)【要約】      （修正有）【課題】血管新生及び/又は脈管形成をそれぞれ促進し又は阻害し、創傷治癒、組織及び器官の再生若しくは発達又は胚発生及び/又は生殖過程を促進し、変性過程の阻害、特に、重篤な肢虚血、脳虚血又は虚血性心疾患のような虚血過程等の脈管変性過程を阻害する薬剤の提供。【解決手段】Rspo3及びRspo2が血管新生プロモーターであるという実証、並びに血管内皮増殖因子（VEGF）の正の制御剤としてのRspo2及び3の同定に基づき、Rスポンジンポリペプチド、特にRスポンジン2（Rspo2）若しくはRスポンジン3（Rspo3）又はRスポンジン核酸、或いはRスポンジン、例えばRspo2及び/又はRspo3の調節剤若しくはエフェクター若しくはモジュレーター並びにそれらの使用。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
血管新生及び/又は脈管形成の促進のための薬剤の製造における、Rスポンジンポリペプ
チド、Rスポンジン核酸又はレスポンジン(Respondin)の調節剤もしくはエフェクターもし
くはモジュレーターの使用。
【請求項２】
前記Rスポンジンポリペプチドが、ヒトRスポンジンまたはその断片、バリアント、誘導
体もしくは類似体である、請求項１記載の使用。
【請求項３】
前記Rスポンジンポリペプチドが、Rスポンジン2又は3ポリペプチドである、請求項１又
は２記載の使用。
【請求項４】
前記Rスポンジンポリペプチドが、Rスポンジン2ポリペプチドである、請求項３記載の
使用。
【請求項５】
前記Rスポンジンポリペプチドが、Rスポンジン3ポリペプチドである、請求項３記載の
使用。
【請求項６】
Rスポンジンの前記調節剤又はエフェクター又はモジュレーターが、Rスポンジンのアゴ
ニストである、請求項１記載の使用。
【請求項７】
Rスポンジンの前記アゴニストが、Rスポンジン2のアゴニストである、請求項６記載の
使用。
【請求項８】
Rスポンジンの前記アゴニストが、Rスポンジン3のアゴニストである、請求項６記載の
使用。
【請求項９】
処置が血管新生及び/又は脈管形成を促進することを包含する状態の予防又は処置のた
めの、請求項１〜８の何れか一項記載の使用。
【請求項１０】
創傷治癒、組織及び器官の再生もしくは発達又は胚発生及び/又は生殖過程の促進のた
めの、請求項１〜９の何れか一項記載の使用。
【請求項１１】
変性過程の阻害、特に、重篤な肢虚血、脳虚血又は虚血性心疾患のような虚血過程等の
脈管変性過程の阻害のための、請求項１〜９の何れか一項記載の使用。
【請求項１２】
Rスポンジンポリペプチドのレベル、活性及び/又は発現を増大させることを含む、細胞
又は生物における血管新生を促進する方法。
【請求項１３】
Rスポンジンポリペプチド又はRスポンジン核酸若しくはRスポンジンのアゴニストの治
療的有効量を、血管新生を促進する必要がある対象へ投与することを含む、血管新生を促
進する方法。
【請求項１４】
前記対象がヒトである、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
血管新生及び/又は脈管形成の阻害のための薬剤の製造におけるRスポンジンアンタゴニ
ストの使用。
【請求項１６】
Rスポンジンの前記アンタゴニストが、Rスポンジン2アンタゴニストである、請求項１
５記載の使用。
【請求項１７】
Rスポンジンの前記アンタゴニストが、Rスポンジン3アンタゴニストである、請求項１
５記載の使用。
【請求項１８】
前記Rスポンジンアンタゴニストが、抗Rスポンジン抗体である、請求項１５〜１７の何
れか一項記載の使用。
【請求項１９】
Rスポンジンアンタゴニストが、Rスポンジンの翻訳、転写、発現及び/又は活性を阻害
できる核酸分子である、請求項１５〜１７の何れか一項記載の使用。
【請求項２０】
前記Rスポンジンアンタゴニストが、アンチセンス分子又はsiRNA分子である、請求項１
９記載の使用。
【請求項２１】
処置が、血管新生及び/又は脈管形成を阻害することを包含する状態の予防又は処置の
ための、請求項１５〜２０の何れか一項記載の使用。
【請求項２２】
腫瘍の増殖、関節リウマチ、粥状硬化症、狭窄、再狭窄、網膜症、黄斑変性症又は乾癬
の処置のための、請求項２１記載の使用。
【請求項２３】
固体腫瘍の増殖の処置のための、請求項２１記載の使用。
【請求項２４】
黄斑変性症の処置のための、請求項２１記載の使用。
【請求項２５】
関節リウマチの処置のための、請求項２１記載の使用。
【請求項２６】
試料中のRスポンジンポリペプチド又はRスポンジン核酸の量、活性及び/又は発現を決
定することを含む、血管新生及び/又は脈管形成と関連した過程、状態又は障害の診断又
はモニタリング方法。
【請求項２７】
前記Rスポンジンポリペプチド又はRスポンジン核酸の量、活性及び/又は発現を、対照
試料中の前記Rスポンジンポリペプチド又はRスポンジン核酸の量、活性及び/又は発現と
比較する追加工程を含む、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
前記Rスポンジンポリペプチド又はRスポンジン核酸が、Rスポンジン2ポリペプチド又は
Rスポンジン2核酸である、請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
前記Rスポンジンポリペプチド又はRスポンジン核酸が、Rスポンジン3ポリペプチド又は
Rスポンジン3核酸である、請求項２７記載の方法。
【請求項３０】
前記試料が、体液又は組織試料である、請求項２６〜２９の何れか一項記載の方法。
【請求項３１】
修飾されたRスポンジン発現を示す組換え細胞又は非ヒトトランスジェニック生物。
【請求項３２】
血管新生及び/又は脈管形成と関連した過程、状態又は障害を調節する能力について、R
スポンジンの調節剤又はエフェクター又はモジュレーターを評価及び/又はスクリーニン
グするための、修飾されたRスポンジンの発現を示すRスポンジンポリペプチド、Rスポン
ジン核酸、組換え細胞又は非ヒトトランスジェニック生物の使用。
【請求項３３】
前記調節剤又はエフェクター又はモジュレーターが、Rスポンジンのアゴニストである
、請求項３２記載の使用。
【請求項３４】
前記調節剤又はエフェクター又はモジュレーターが、Rスポンジンのアンタゴニストで
ある、請求項３２記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（序文）
本発明は、Rスポンジンポリペプチド、特にRスポンジン2（Rspo2）もしくはRスポンジ
ン（Rspo3）又はRスポンジン核酸、又はRスポンジンの調節剤もしくはエフェクターもし
くはモジュレーターそれぞれの使用に関する。本発明は、Rspo3及びRspo2が血管新生プロ
モーターであるという実証、並びに血管内皮増殖因子（VEGF）の正の調節剤としてのRspo
2及び3の同定に基づいている。これらの結果は、血管新生中のシグナル伝達系におけるR
スポンジン、特にRspo3及び/又はRspo2についての主要な役割を示す。本発明は、血管新
生及び/又は脈管形成を調節することによって、癌を含む状態の処置におけるアゴニスト
及びアンタゴニストを含むRスポンジン3の調節剤又はエフェクター又はモジュレーターの
使用にも関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
Rスポンジンタンパク質ファミリーは、脊椎動物間で保存されており、4つの関連メンバ
ーRスポンジン1〜4（Rspo1〜4）からなる（Chenらの文献（2002, Mol. Biol. Rep. 29, 2
87-292）, Rspo3をhPWTSRと呼んだ; Kamataらの文献（2004, Biochim. Biophys. Acta. 1
676, 51-62）; Kazanskayaらの文献（2004, Dev. Cell 7, 525-534）; Kimらの文献（200
5, Science 309, 1256-1259）; Kimらの文献（2006, Cell Cycle 5, 23-26）; Namらの文
献（2006, J. Biol. Chem. 281 , 13247-13257））。ヒトRspo1〜4は、造血幹細胞の増殖
を促進できる幹細胞増殖因子様ポリペプチドとしても記載された（WO 01/77169; WO 01/0
7611）。該ヒトRspo1〜4はまた、フツリン1〜4として命名され、Wntシグナル伝達経路の
モジュレーターとして同定された（WO 2005/040418）。これらの文献の内容は、引用によ
り本明細書中に組み込まれており、該文献に開示されたRスポンジン1〜4のアミノ酸及び
核酸の配列は、本明細書に具体的に含まれる。
【０００３】
Rspo遺伝子は、Wnt/b-カテニンシグナル伝達を活性化できる分泌型タンパク質をコード
し、Rspo2は、ツメガエルにおけるWnt/b-カテニンシグナル伝達経路を介する筋形成を促
進する（Kazanskayaらの文献（2004, Dev. Cell 7, 525-534））。Rスポンジン遺伝子は
、胚発達中の多くの領域においてWnt遺伝子とともに広く同時発現し、Rスポンジン発現は
、Wntシグナルによって正に制御される（Kamataらの文献（2004, Biochim. Biophys. Act
a.1676, 51-62）; Kazanskayaらの文献（2004, Dev. Cell 7, 525-534））。さらに、分
泌型ヒトRspo1は、b-カテニンの安定化を通じて腸管上皮の増殖を促進することが報告さ
れた（Kimらの文献（2005 Science 309, 1256-9））。マウスRspo3の変異の結果、胚の致
死に至り、胎盤の発達における重度の欠損を誘導する（Aokiらの文献（Dev Biol. 2007 3
01 (1):21 8-26））。しかしながら、この変異体モデルにおいて血管の発達に及ぼす影響
は何ら報告されておらず、本明細書に開示された結果とは対照的に、胚は、出血の徴候を
まったく示さないように見え、それゆえ、本発明以前には、Rスポンジン、特にRスポンジ
ン2又は3が、血管新生及び/又は脈管形成に有意な役割を担うということに、何ら示唆は
なかった。
【０００４】
血管新生は、ポリペプチド増殖因子によって調節される可能性がある。インビトロでの
内皮細胞増殖促進活性を有するいくつものポリペプチドが同定されている。例には、酸性
及び塩基性線維芽細胞増殖因子、VEGF並びに胎盤増殖因子が含まれる。
【０００５】
VEGFは、脈管形成及び血管新生における鍵因子であり、そのシグナル伝達経路は、薬理
学的介入のための重要な標的である（Ferraraの文献（2005, Oncology 3:1 1-6）; Rosen
の文献（2005, Oncologist 10:382-91））。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、Rスポンジンポリペプチド又はRスポンジン核酸、又はRスポンジンポリペプ
チドもしくはRスポンジン核酸の調節剤もしくはエフェクターもしくはモジュレーターの
使用に関する。本発明は、Rspo3及びRspo2が、脈管形成及び血管新生のプロモーターであ
るという実証に基づいている。さらに、Rspo3及びRspo2は、内皮細胞増殖を誘導し、VEGF
の正の調節剤として同定されている。該結果は、血管新生及び/又は脈管形成中のシグナ
ル伝達系におけるRスポンジンポリペプチド、特にRspo2及び/又はRspo3についての主要な
役割を示す。
【０００７】
Rスポンジンポリペプチド（例えば、Rspo2又はRspo3）、Rスポンジン核酸、及びRスポ
ンジンのアゴニストは、処置が血管新生及び/又は脈管形成を促進することを包含する状
態の該処置において適している。
【０００８】
Rスポンジンポリペプチド（例えば、Rspo2又はRspo3）の、又はRスポンジン核酸のアン
タゴニストは、処置が血管新生及び/又は脈管形成を阻害することを包含する状態の該処
置において適している。
【０００９】
また、本発明は、診断適用のための、特に血管新生及び/又は脈管形成と関連した過程
、状態並びに障害の診断又はモニタリングのためのRスポンジンポリペプチド、Rスポンジ
ン核酸並びにRスポンジンの調節剤又はエフェクター又はモジュレーターの使用に関する
。
【００１０】
さらに、本発明は、修飾された、例えば、亢進した又は低下したRスポンジン、特にRpo
2及び/又はRspo3の発現を示す細胞及びトランスジェニック非ヒト動物に関する。
【００１１】
Rスポンジンポリペプチド及びRスポンジン核酸及び細胞又はトランスジェニック動物は
、血管新生及び/又は脈管形成のエフェクターを同定し及び/又は特徴付けるために、スク
リーニング手法において使用され得る。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】Rspo3は、ゼノパス・トロピカリスにおける血管細胞の発達に必要である。示されるように、4細胞期で、ゼノパス・トロピカリス胚を対照又はRspo3モルフォリノアンチセンスオリゴヌクレオチド（Mo）とともに注入した。 尾芽胚期で胚を固定し、血液（α-グロビン、SCL、Meadらの文献（1998, Development 125, 261 1-2620））又は形成中の血管（msr、Devicらの文献（Mech Dev. 1996; 59,129-40））のマーカーについてのインサイツハイブリダイゼーションを実施した。Rspo3 Mo処理された胚における血液マーカーの増大及びmsrの阻害に留意されたい。
【図２】Rspo3モルフォリノアンチセンスオリゴヌクレオチドの特異性の実証。 示されるように、4〜8細胞期で、アフリカツメガエルRspo2  mRNAを伴う及び伴わないRspo3モルフォリノアンチセンスオリゴヌクレオチド（Mo）をゼノパス・トロピカリス胚に、2つの腹側ブラストマー（blastomers）において注入した。原腸胚期（第10期）で、腹側帯域（VMZ）を切除し、同胞胚が第28期に到達するまで培養した。VMZを固定し、血液マーカーであるα-グロビンについいてのホールマウントインサイツハイブリダイゼーション用に加工した。α-グロビンのRspo3 Moにより誘導される増大がRspo2 mRNAによって救出されることに留意されたい。この救出は、モルフォリノ表現型の特異性を示す。
【図３】Rspo3は、ゼノパス・トロピカリスにおける血管細胞の発達を促進するのに必要であり十分である。示されるように、4細胞期で、ゼノパス・トロピカリス胚を対照又はRspo3モルフォリノアンチセンスオリゴヌクレオチド（Mo）又はアフリカツメガエルRspo2 mRNAとともに注入した。原腸胚期で、腹側帯域を切除し、第28期まで単離して培養した。示されたマーカー遺伝子についてRT-PCR分析を実施した。H4、標準化用のヒストン4。-RT、マイナス逆転写酵素対照。Rspo3のMo阻害が血管マーカーVEGF及びmsr発現を阻害し、血液マーカーであるα-グロビン及びSCLを誘導することに留意されたい。
【図４】マウス胚の脈管系におけるRspo3の発現。胎生10.5日のマウス胚におけるRspo3のインサイツハイブリダイゼーションを示す。矢印は、胚性血管における発現を指摘する。
【図５】マウスRspo3の標的変異誘発。（A）ES細胞におけるRspo3のゲノム構造及び相同的組換えに使用される標的ベクター。Flpリコンビナーゼを使用したネオマイシン選択マーカーの除去の前（B）及び後（C）の標的対立遺伝子。
【図６】Rspo3変異体マウスは、内部出血を示す。胎生10.5日での野生型（wt）及びRspo3-/-胚（変異体）マウスの写真。血管形成の不全を示す変異体マウスにおける出血に留意されたい。
【図７】Rspo3変異体マウスは、低下した血管形成を示す。胎生10.5日胚の野生型（wt）及びRspo3-/-（変異体）卵黄嚢を示す。変異体における淡い卵黄嚢に留意されたい。
【図８】Rspo3変異体マウスは、VEGF発現を喪失する。胎生9.5日の野生型（wt）及びRspo3-/-胚（変異体）の胎盤において、VEGFについてのホールマウントインサイツハイブリダイゼーションを示す。
【図９】Rspo2は、ニワトリ絨毛尿膜（CAM）アッセイにおいて血管新生を誘導する。
【図１０】Rspo2は、内皮細胞において管形成を誘導する。対照又はアフリカツメガエルRspo2条件培地をヒト内皮細胞（HDMEC）へ5日間適用した。血管新生中に特徴的である管形成を示す形態形成の誘導に留意されたい。
【図１１】Rspo2は、内皮細胞の増殖を誘導する。 対照又はアフリカツメガエルRspo2条件培地又は0.5ng/mL VEGFをヒト内皮細胞（HUVEC）へ2日間適用し、市販のキット（Roche）を使用して細胞増殖をアッセイした。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
（5.1定義）
本明細書で使用されるように、本発明に記載の「Rスポンジンポリペプチド」という用
語は、哺乳動物又は他の脊椎動物に由来し得るRスポンジンファミリーのメンバーを指す
。Rスポンジンタンパク質ファミリーは、4つの関連するメンバーであるRスポンジン1〜4
（Rspo1〜4）からなる。
【００１４】
好ましくは、Rスポンジンポリペプチドとは、ヒトRスポンジン、例えば、ヒトRスポン
ジン1、2、3又は4である。より好ましくは、Rスポンジンポリペプチドとは、Rスポンジン
2又は3ポリペプチドであり、特にヒトRスポンジン2又は3ポリペプチドである。 ヒトRス
ポンジンポリペプチド1、2、3及び4のアミノ酸配列は、WO 2005/040418に示されており、
その内容は引用により本明細書中に組み込まれている。Rスポンジンポリペプチドのさら
なる例は、ツメガエル、例えばゼノパス・トロピカリス及びアフリカツメガエル由来の、
又はマウス由来のRスポンジンである。
【００１５】
ヒトRスポンジン核酸についてのさらなる配列及びアミノ酸配列は、次のとおりである
： ヒトRスポンジン1核酸配列（NM_001038633, 配列番号16）、アミノ酸配列（ABA54597,
配列番号17）、ヒトRスポンジン2核酸配列（NM_178565, 配列番号18）、アミノ酸配列（
NP_848660, 配列番号19）、ヒトRスポンジン3核酸配列（NM_032784, 配列番号20）、アミ
ノ酸配列（NP_116173, 配列番号21）、ヒトRスポンジン4核酸配列（NM_001029871, 配列
番号22）、アミノ酸配列（NP_001025042, 配列番号23）。
【００１６】
Rスポンジンポリペプチドは、全体長を通じて個々のヒトRスポンジンポリペプチドに対
して、アミノ酸レベルで少なくとも40％、好ましくは少なくとも60％、より好ましくは少
なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％又は少なくとも99％の
配列同一性を示すポリペプチドとして、本明細書においてさらに定義される（Kazanskaya
らの文献（2004, Dev. Cell 7, 525-534））。さらに、本明細書に記載のRスポンジンポ
リペプチドは、好ましくは
i  CAMアッセイにおける血管新生の誘導
ii  内皮細胞における管形成の誘導
iii  内皮細胞増殖、特にヒト内皮細胞の増殖の誘導、及び
iv  VEGF発現の誘導
より選択される少なくとも1つの生物活性
を有するものとして特徴付けられる。
「ポリペプチド」という用語は、全長のタンパク質、タンパク質性分子、タンパク質の
断片、融合タンパク質、ペプチド、オリゴペプチド、バリアント、誘導体、類似体又はそ
れらの機能的等価物を含む。
【００１７】
本明細書で使用される「Rスポンジンと機能的に等価である」という用語は、血管新生
及び/又はVEGF発現を誘導するタンパク質を指す。遺伝子産物はそれ自体、Rスポンジン、
例えばRspop2又はRpo3内でのアミノ酸残基の欠失、付加又は置換を含有し得、従って、機
能的に等価であるRスポンジンを生成する有意なシグナル伝達能力を保持するサイレント
変化を結果的に生じる。このようなアミノ酸置換は、包含される残基の極性、電荷、溶解
度、疎水性、親水性、及び/又は両親媒性の性質における類似性に基づいてなされ得る。
例えば、負に荷電したアミノ酸には、アスパラギン酸及びグルタミン酸が含まれ；正に荷
電したアミノ酸には、リジン及びアルギニンが含まれ；類似の親水性の値を有する荷電し
ていない水溶性頭部を有するアミノ酸には以下のものが含まれる： ロイシン、イソロイ
シン、バリン；グリシン、アナリン；アスパラギン、グルタミン；セリン、トレオニン；
フェニルアラニン、チロシンである。
【００１８】
本明細書で使用されるように、「Rスポンジン核酸」という用語は、Rスポンジンファミ
リーのメンバーをコードし、哺乳動物又は他の脊椎動物に由来し得る核酸配列を指す。好
ましくは、Rスポンジン核酸は、ヒトRスポンジン、例えば、ヒトRスポンジン1、2、3又は
4をコードする。より好ましくは、Rスポンジン核酸は、Rスポンジン2又は3ポリペプチド
をコードし、特にヒトRスポンジン2又は3ポリペプチドをコードする。ヒトRスポンジン1
、2、3及び4の核酸配列は、WO 2005/040418に示されており、その内容は引用により本明
細書中に組み込まれている。Rスポンジン核酸のさらなる例は、ツメガエル、例えばゼノ
パス・トロピカリス及びアフリカツメガエル由来の、又はマウス由来のRスポンジンをコ
ードする該核酸である。
【００１９】
Rスポンジン核酸は、
（a）Rスポンジンポリペプチド、例えばヒトRスポンジン、特にRspo2及び/又はRspo3を
コードする核酸分子、
（b)ストリンジェントな条件下で、（a）の核酸分子と、及び/又は（a）の核酸分子と
相補的な核酸分子とハイブリッド形成する核酸分子、
（c）（a）及び/又は（b）の核酸分子と同一のポリペプチドをコードする核酸分子、並
びに
（d）全体長を通じて、（a）の核酸分子によってコードされるポリペプチドと少なくと
も40％、好ましくは少なくとも60％、より好ましくは少なくとも80％、及び最も好ましく
は少なくとも90％同一であるポリペプチドをコードする核酸分子
より選択される分子として、本明細書においてさらに定義される。
【００２０】
該核酸分子は、例えばDNA分子又はRNA分子であり得る。
本発明に従って使用され得る核酸分子には、同一の又は機能的に等価である遺伝子産物
をコードする配列を結果的に生じる異なるヌクレオチド残基の欠失、付加又は置換が含ま
れ得る。
【００２１】
本明細書で使用されるように、Rスポンジンポリペプチド又は核酸の「調節剤」又は「
エフェクター」又は「モジュレーター」という用語は、本明細書において同じ意味で使用
されており、上述の何れも、抗体、ペプチド、低分子量有機又は無機分子、及びRスポン
ジン、例えばRspo2及び/又はRspo3シグナル伝達を調節できる又は血管新生及び/又は脈管
形成を促進し（アゴニスト）又は阻害する（アンタゴニスト）ためにRスポンジンの発現
を調節できる潜在的に生物活性のある材料の他の源を指すものとして使用され得る。該調
節剤、エフェクター又はモジュレーターは、天然であり得又は合成で生成され得る。
【００２２】
本明細書で使用されるように、「Rスポンジンと結合できる化合物」という用語は、Rス
ポンジンポリペプチドと相互作用する、Rスポンジンの天然の又は合成で生成される調節
剤、エフェクター又はモジュレーターを指す。 このような化合物の例は、（i）天然のパ
ートナー、例えば、Rスポンジンの受容体；（ii）シグナル伝達複合体の一部である天然
分子；及び/又は他の細胞種によって産生される天然のシグナル伝達分子；（iii）天然の
又は合成で作製される抗体である。「化合物」という用語は、本明細書において、「検査
化合物」又は「薬物候補化合物」と関連して使用される。
【００２３】
本明細書で使用されるように、「Rスポンジン」という用語は、Rスポンジンの細胞内反
応を活性化し、従って血管新生及び/又は脈管形成を促進するRスポンジンの調節剤又はエ
フェクター又はモジュレーターを指す。
【００２４】
本明細書で使用されるように、「Rスポンジンのアンタゴニスト」という用語は、Rスポ
ンジンポリペプチド又はRスポンジン核酸の細胞内反応を阻害し、低下させ又は防止し、
従って血管新生及び/又は脈管形成を阻害し、低下させ又は防止するRスポンジンポリペプ
チド又はRスポンジン核酸の調節剤又はエフェクター又はモジュレーターを指す。
【００２５】
適切なアンタゴニストの例は、ドミナントネガティブ効果を有するRスポンジンの変異
した形態、Rスポンジン結合ポリペプチドであり、例えば、少なくとも1つのRスポンジン
結合部位を含有する組換え抗体又は抗体断片を含む抗Rスポンジン抗体である。Rスポンジ
ンアンタゴニストのさらなる例には、Rスポンジンの翻訳、転写、発現及び/又は活性を阻
害できる核酸があり、例えば、アプタマー、アンチセンス分子、リボザイム又はペプチド
核酸又はモルフォリノ核酸等の核酸類似体を含むsiRNA分子等のRNA干渉の可能な核酸分子
である。このような核酸は、Rスポンジン核酸に結合し得、又はRスポンジン核酸に干渉し
得る。
【００２６】
本明細書で使用されるように、「抗体」という用語には、組換えポリクローナル抗体、
モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、もしくは一本鎖抗体又はFab断片、一本
鎖断片、及びFab発現ライブラリによって作製される断片を含むこれらの断片が含まれる
が、それらに限定されるわけではない。中和抗体、すなわち、RスポンジンのVEGF結合部
位において競合するものは、診断法及び治療法にとって特に好ましい。
【００２７】
本明細書で使用されるように、「脈管形成」という用語は、血管の形成及び拡延を指す
。
本明細書で使用されるように、「血管新生」という用語は、組織の血管新生、特に、血
管内皮細胞の増殖、遊走及び浸潤並びに新たな毛細血管の発達を包含する過程を指す。
【００２８】
本明細書で使用されるように、「処置する」又は「処置」という用語は、発達を防止し
又はその病態を変化させ、これにより障害又は状態の1つ以上の症状を含む該障害、疾病
又は状態を軽減する本発明を用いて実施される介入を指す。従って、「処置する」とは、
治療的処置と予防の又は防止の手段との両者を指す。処置を必要とする者には、障害をす
でに有する者、及び障害が防止されるべきである者が含まれる。本明細書で使用されるよ
うに、「処置」という関連用語は、「処置する」という用語が上述に定義されるように、
障害、症状、疾病又は状態を処置する行為を指す。
【００２９】
本明細書で使用されるように、「処置が血管新生及び/又は脈管形成を阻害することを
包含する状態」という用語には具体的に、腫瘍の成長、例えば、固体腫瘍の成長及び転移
活性、粥状硬化症、狭窄、再狭窄、網膜症、黄斑変性症、乾癬及び関節リウマチ等の状態
が含まれる（これらに限定されるわけではない）。
【００３０】
本明細書で使用されるように、「処置が血管新生及び/又は脈管形成を促進することを
包含する状態」には具体的に、創傷治癒、組織及び器官の再生又は発達、脈管変性過程（
例えば、重篤な肢虚血又は脳虚血、虚血性心疾患）等の状態、胚発生及び生殖過程、例え
ば排卵中の黄体における卵胞の発達及び妊娠中の胎盤増殖等の雌の生殖過程が含まれる（
これらに限定されるわけではない）。
【００３１】
本明細書で使用されるように、「腫瘍」という用語は、皮膚において見出される上皮、
又は、より普遍的には、身体器官、例えば乳房、前立腺、肺、腎臓、膵臓、胃又は腸の裏
打ちから生じる悪性の新たな増殖を指す。 腫瘍はまた、隣接する組織中へ浸潤し得、遠
位の器官、例えば骨、肝臓、肺又は脳へと伝播し得る（転移し得る）。本明細書で使用さ
れるように、腫瘍という用語には、以下に限定されるわけではないが、黒色腫、リンパ腫
、白血病、線維肉腫、横紋筋肉腫、及び肥満細胞腫等の原発性及び転移性腫瘍細胞腫と、
以下に限定されるわけではないが、結腸直腸癌、前立腺癌、小細胞肺癌及び非小細胞肺癌
、乳癌、膵臓癌、膀胱癌、腎癌、胃癌、膠芽腫、原発性肝臓癌並びに卵巣癌等の組織癌腫
の種類との両者が含まれる。
【００３２】
（5.2本発明の詳細な説明）
血管新生は、創傷治癒、組織及び器官の再生、胚発生並びに排卵中の黄体における卵胞
の発達及び妊娠中の胎盤形成等の生殖過程に及ぶ多数の生理学的過程に必要とされる。血
管の異常な増殖は、関節リウマチ、網膜症、及び乾癬等の多様な疾病の重要因子であり、
これらの疾病（及び関連状態）は、本明細書で「処置が血管新生及び/又は脈管形成を阻
害することを包含する状態」と呼ばれる。 血管新生はまた、脈管形成に依存する固体腫
瘍の成長及び転移活性における重要な因子である。それゆえ、血管新生の阻害剤は、血管
の異常な増殖から生じる疾病又は該増殖を伴う疾病の処置のために、並びに固体腫瘍の成
長及び伝播を包含する悪性腫瘍の処置のために治療上使用され得る。
【００３３】
本発明は、Rスポンジンポリペプチド、Rスポンジン核酸及びRスポンジンポリペプチド
又はRスポンジン核酸の調節剤又はエフェクター又はモジュレーターの使用に関する。
本発明の第一の態様は、血管新生及び/又は脈管形成を促進する薬剤の製造のためのRス
ポンジンポリペプチド、Rスポンジン核酸又はRスポンジンアゴニストの使用に関する。
本発明のさらなる態様は、血管新生及び/又は脈管形成を阻害する薬剤の製造のためのR
スポンジンアンタゴニストの使用に関する。
【００３４】
本発明のさらなる態様は、試料中のRスポンジンポリペプチド又はRスポンジン核酸の量
、活性及び/又は発現を決定することを含む、血管新生及び/又は脈管形成と関連した過程
、状態又は障害の診断又はモニタリングのための方法及び試薬に関連する。本発明の具体
的な実施態様において、該試料中のRスポンジンポリペプチド又はRスポンジン核酸の量、
活性及び/又は発現は、対照試料中の該Rスポンジンポリペプチド又はRスポンジン核酸の
量、活性及び/又は発現と比較される。
さらに、本発明のさらなる態様は、修飾された、例えば亢進した又は低下したRスポン
ジンポリペプチド発現を示す組換え細胞及びトランスジェニック非ヒト動物に関するもの
である。
【００３５】
本発明の別の態様は、血管新生及び/又は脈管形成と関連した過程、状態又は障害を調
節する、例えば刺激し又は阻害する検査化合物の能力について該検査化合物を評価し及び
スクリーニングするための、Rスポンジンポリペプチド、Rスポンジン核酸、細胞及びトラ
ンスジェニック非ヒト動物の使用に関する。Rスポンジンのこのような調節剤は、治療上
使用され得る。例えば、Rスポンジン、例えばRspo2及び/又はRspo3のアゴニストは、創傷
治癒等の過程において使用され得；対照的に、Rspo3のアンタゴニストは、増殖のための
脈管形成に依存する腫瘍の処置において使用され得る。
【００３６】
本発明は、Rspo3が胚の脈管系において発現することを示すインサイツハイブリダイゼ
ーションからの結果に一部基づいている。本発明は、Rspo3の発現が、内皮細胞の分化、
増殖及び形態形成を促進するが、ツメガエル胚におけるアンチセンス分子による阻害又は
ノックアウトマウスにおける標的変異誘発が血管新生に干渉するという発見にも基づいて
いる。本発明は、Rspo3が、重要な血管新生因子VEGFの発現に必要かつ十分な正の調節剤
であるという発見にも基づいている。
【００３７】
従って、Rスポンジン分子の阻害は、特に処置が血管新生及び/又は脈管形成を阻害する
ことを包含する状態の治療において、Rスポンジン、例えばRspo2及び/又はRspo3、及び/
又はVEGFによって仲介される血管の異常な増殖から生じる疾病の処置に有用であり得る。
本発明は、Rスポンジンポリペプチド、Rスポンジン核酸、又はRスポンジンの調節剤も
しくはエフェクターもしくはモジュレーターに関する。
本発明によると、Rスポンジンポリペプチド又はRスポンジン核酸は、血管新生及び/又
は脈管形成を促進するために、特に血管新生及び/又は脈管形成を促進する薬剤の製造の
ために使用され得る。
本実施態様は、処置が、血管新生及び/又は脈管形成を促進することを包含する状態の
予防又は処置を包含する。
【００３８】
Rスポンジンポリペプチド又はRスポンジン核酸は、単独でまたはさらなる薬剤、例えば
、FGF、VEGF、PDGF、TNF又はL-リジン等の血管新生及び/又は脈管形成を促進するさらな
る薬剤との組み合わせでの何れかで、ヒト又は家畜の治療において使用され得る。
【００３９】
本発明の本実施態様のさらなる態様は、Rスポンジンポリペプチドのレベル、活性及び/
又は発現を増大させることを含む、細胞又は生物において血管新生を促進するための方法
に関する。本方法は、例えば治療適用のためにインビトロ又はインビボで実施され得る。
【００４０】
さらに、本発明の本実施態様は、血管新生を促進するための方法を必要とする対象へ、
Rスポンジンポリペプチド又はRスポンジン核酸の治療的有効量を投与することを含む該方
法を包含し、この中で、該対象は、好ましくはヒトである。
【００４１】
本発明の異なる実施態様は、血管新生及び/又は脈管形成を阻害する薬剤の製造のため
のRスポンジンアンタゴニストの使用に関する。Rスポンジンアンタゴニストは、好ましく
はRスポンジン2及び/又はRスポンジン3アンタゴニストである。
本発明の本実施態様は、処置が、血管新生及び/又は脈管形成を阻害することを包含す
る状態の予防又は処置を包含する。
【００４２】
本実施態様において、Rスポンジンアンタゴニストは、単独で又はさらなる薬剤との組
み合わせで、ヒト又は家畜の治療において使用され得る。例えば、腫瘍の処置は、Rスポ
ンジンアンタゴニストと抗腫瘍薬、例えば化学療法薬又は抗腫瘍抗体、例えば、ベバシズ
マブ、エンドスタチン、サリドマイド、コンブレスタチンA4、抗VEGF抗体、SU5416又はSU
6668との組み合わされた使用を含み得る。
【００４３】
好ましくは、核酸分子は、適切な宿主細胞においてRスポンジンポリペプチドの組換え
発現を方向付ける組換えDNA分子である。或いは、Rスポンジンをコードする配列の一部と
ハイブリッド形成するヌクレオチド配列は、核酸増幅及び/又はハイブリダイゼーション
アッセイ、例えばPCR、サザン及びノザンブロット分析等においても使用され得る。
【００４４】
遺伝暗号の固有の縮重に起因して、実質的に同一の又は機能的に等価のポリペプチドを
コードする核酸分子は、Rスポンジン、例えばRspo2又は3タンパク質のクローニング及び
発現のために、本発明の実施において使用され得る。このようなDNA配列には、ストリン
ジェントな条件下でツメガエル、及びマウス及び/又はヒトRスポンジン配列とハイブリッ
ド形成できるものが含まれる。好ましくは、ストリンジェントな条件下でのハイブリダイ
ゼーションとは、好ましくは55℃で、より好ましくは62℃で、及び最も好ましくは68℃で
、1×SSC緩衝液及び0.1%SDSとともに1時間、特に50℃で、好ましくは55℃で、より好まし
くは62℃で、及び最も好ましくは68℃で、0.2×SSC緩衝液及び0.1 SDS中で1時間洗浄した
後、正のハイブリダイゼーションシグナルが観察されることを意味する。
【００４５】
本発明の核酸分子は、遺伝子産物のプロセシング及び/又は発現を修飾する変化を含む
がこれに限定されない多様な目的のためにRスポンジンをコードする配列を変化させるた
めに操作され得る。例えば、変異は、当技術分野で周知の技術、例えば部位特異的変異誘
発を使用して、新たな制限部位を挿入し、グリコシル化パターン、リン酸化等を変化させ
ることで導入され得る。例えば、酵母等の特定の発現系において、宿主細胞は、遺伝子産
物を過剰にグリコシル化し得る。このような発現系を使用する場合、Rspo2又は3をコード
する配列を変化させて、何れのN結合型グリコシル化部位も排除することが好ましくあり
得る。
【００４６】
本発明の他の実施態様において、Rスポンジン核酸配列は、融合タンパク質をコードす
るために、異種配列へ連結され得る。例えば、ペプチドライブラリのスクリーニングのた
めに、市販の抗体によって認識される異種エピトープを発現するキメラRスポンジンタン
パク質をコードすることは有用であり得る。また、融合タンパク質も、Rスポンジン配列
と異種タンパク質配列との間に配置される切断部位を含有するよう操作され得る。
【００４７】
本発明の代替的な実施態様において、コードする核酸配列は、当技術分野で周知の化学
的方法を使用して、全体又は一部合成できる。例えば、Caruthersらの文献（1980, Nuc. 
Acids Res. Symp. Ser. 7: 215- 233）; Crea及びHornの文献（180, Nuc. Acids Res. 9(
10): 2331）; Matteucci及びCaruthersの文献（1980, Tetrahedron Letters 2 1: 719）;
並びにChow及びKempeの文献（1981 , Nuc. Acids Res. 9(12): 2807-2817）を参照され
たい。或いは、タンパク質自体は、化学的方法を使用してRスポンジンアミノ酸配列を全
部又は一部合成することで作製できる。例えば、ペプチドは、固相技術によって合成され
、樹脂から切断され、調製用高速液体クロマトグラフィーによって精製されることが可能
である（例えば、Creightonの文献（1983, タンパク質構造及び分子上の原理（Proteins 
Structures And Molecular Principles）, W. H. Freeman and Co., N.Y. pp. 50-60を参
照されたい）。合成ペプチドの組成は、アミノ酸分析又は配列決定（例えば、エドマン分
解手法；Creightonの文献（1983, タンパク質、構造及び分子上の原理（Proteins, Struc
tures and Molecular Principles）, W. H. Freeman and Co., N.Y., pp. 34-49）によっ
て確認され得る。
【００４８】
生物活性のあるRスポンジンポリペプチドを発現させるために、該ポリペプチドをコー
ドするヌクレオチド配列を、適切な発現ベクター、すなわち挿入されるコードする配列の
転写及び翻訳のために必要な要素を含有するベクター中へ挿入する。Rspo遺伝子産物及び
組換え発現ベクターで形質移入又は形質転換される宿主細胞又は細胞系は、多様な目的に
使用できる。これらには、Rスポンジンの活性を「中和する」ものを含む、Rスポンジンに
結合する産生抗体（すなわち、モノクローナル又はポリクローナル）が含まれるが、これ
らに限定されるわけではない。
【００４９】
当業者に周知の方法は、Rスポンジンをコードする配列及び適切な転写/翻訳調節シグナ
ルを含有する発現ベクターを構築するために使用できる。これらの方法には、インビトロ
での組換えDNA技術、合成技術及びインビボでの組換え/遺伝的組換えが含まれる。例えば
、Maniatisらの文献（1989, 分子クローニングA実験マニュアル（Molecular Cloning A L
aboratory Manual）, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y.）及びAusubelらの文献（19
89, 分子生物学における最新プロトコール（Current Protocols in Molecular Biology）
, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y.）に記載される技術を
参照されたい。
【００５０】
多様な宿主発現ベクター系が、Rスポンジンをコードする配列を発現させるために利用
され得る。これらには、Rスポンジンをコードする配列を含有する組換えバクテリオファ
ージDNA、プラスミドDNA又はコスミドDNA発現ベクターで形質転換された細菌等の微生物
；Rスポンジンをコードする配列を含有する組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵
母細胞；Rspo2又は3をコードする配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えば、
バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系；組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリ
フラワーモザイクウイルス（CaMV）；タバコモザイクウイルス（TMV））に感染した又はR
スポンジンをコードする配列を含有する組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Tiプラ
スミド）で形質転換された植物細胞系；或いは二重微小染色体（例えば、マウス細胞系）
において安定して増幅された（CHO/dhfr-）又は不安定で増幅された何れかのRスポンジン
DNAの複数のコピーを含有するよう操作された細胞系を含む組換えウイルス発現ベクター
（例えば、アデノウイルス、ワクシニアウイルス）に感染した動物細胞系が含まれるが、
これらに限定されるわけではない。
【００５１】
本発明の一実施態様において、Rスポンジンポリペプチド、例えばRspo2及び/又はRspo3
、Rスポンジン核酸、及び/又はRスポンジンを発現させる細胞系もしくは非ヒトトランス
ジェニック動物は、血管新生又は脈管形成のアゴニスト又はアンタゴニストとして作用す
るRスポンジンの調節剤又はエフェクター又はモジュレーターをスクリーニングするため
に使用され得る。例えば、内皮増殖アッセイ、ニワトリCAMアッセイ及び/又はツメガエル
VMZ分化アッセイにおいてRスポンジン、例えばRspo3の活性を中和できる抗体は、Rスポン
ジンの機能を阻害するために使用され得る。さらに、VEGF活性を模倣する抗Rspo3抗体は
、例えば創傷治癒における血管新生促進の適用のために選択され得る。或いは、組換え発
現した可溶性Rスポンジンポリペプチド又はRスポンジンポリペプチドを発現する細胞系も
しくはトランスジェニック非ヒト動物を用いたペプチドライブラリ又は有機化合物のスク
リーニングは、Rスポンジンの生物活性を調節し、例えば阻害することによって機能し、
従ってRスポンジンの血管新生及び/又は脈管形成調節剤もしくはエフェクターもしくはモ
ジュレーター、例えばRスポンジンのアンタゴニストとして適切である治療分子の同定に
有用であり得る。
【００５２】
本発明の実施態様において、修飾されたRスポンジンの発現、例えば野生型の細胞系又
は動物と比較してRスポンジンの亢進した又は低下した発現を示す操作された細胞系及び/
又はトランスジェニック非ヒト動物は、アンタゴニスト及びアゴニストをスクリーニング
し及び同定するのに利用され得る。合成化合物、天然産物、及び潜在的に生物活性のある
材料の他の源は、Rスポンジンの調節剤又はエフェクター又はモジュレーターを同定する
ための多くの方法においてスクリーニングできる。Rスポンジンポリペプチドの活性を阻
害する検査化合物の能力は、内皮増殖アッセイ、ニワトリCAMアッセイ及び/又は実施例に
おいて記載されるものなどのツメガエルVMZ分化アッセイを使用して測定され得る。
【００５３】
Rスポンジンポリペプチドに結合できる分子の同定は、組換え可溶性Rスポンジンポリペ
プチドを用いて、化合物、例えばペプチドライブラリをスクリーニングすることによって
達成され得る。Rスポンジンと相互作用して複合体を形成する化合物を同定し及び単離す
るために、Rスポンジンポリペプチドを標識し又は「タグ付けする」ことが好ましい。Rス
ポンジンポリペプチドは、標識基、例えばアルカリホスファターゼ又は西洋ワサビペルオ
キシダーゼ等の酵素へ、又はフルオレセインイソチオシアネート（FITC）、フィコエリト
リン（PE）もしくはローダミンを含み得る蛍光標識等の他の試薬へ抱合され得る。付与さ
れる何れの標識のRスポンジンに対する抱合も、当技術分野で所定の技術を使用して実施
され得る。市販の抗体が存在するエピトープを含有するポリペプチド。 エピトープ特異
的抗体は、酵素、蛍光色素又は有色ビーズもしくは磁気ビーズによる標識を含む当技術分
野で周知の方法を使用してタグ付けされ得る。
【００５４】
「タグ付けされた」Rスポンジンポリペプチド抱合体を、適切な条件下で、例えば、22
℃で30分間〜1時間、固定化された化合物のライブラリとともにインキュベートして、Rス
ポンジンポリペプチドとライブラリ内の個々の化合物との間に複合体を形成させ得る。次
に、ライブラリを洗浄して、結合していないRスポンジンポリペプチドを除去する。Rスポ
ンジンが、アルカリホスファターゼ又は西洋ワサビペルオキシダーゼと抱合した場合、ア
ルカリホスファターゼ又はペルオキシダーゼの何れか、例えばそれぞれ5-ブロモ-4-クロ
ロ-3-インドイルフォスフェート（BCIP）又は3,3',4,4"-ジアミノベンジジンの基質を含
むペトリ皿中にライブラリ全体を注ぎ得る。数分間インキュベートした後、化合物/固相-
Rスポンジン複合体は、色相を変化させ、マイクロマニピュレーターを備えた解剖顕微鏡
下で容易に同定でき、物理的に単離できる。蛍光タグ付けされたRスポンジン分子を使用
した場合、複合体は、蛍光標示式分取によって単離され得る。異種エピトープを発現する
キメラRスポンジンポリペプチドを使用した場合、化合物/Rスポンジン複合体の検出は、
標識したエピトープ特異的抗体を使用することによって達成され得る。一旦単離されると
、固相支持体に付着した化合物の同定は、例えばペプチド配列決定によって決定され得る
。
【００５５】
Rスポンジン、例えばRスポンジン3を発現する細胞系又は非ヒトトランスジェニック動
物は、多くの方法でRスポンジンの調節剤又はエフェクター又はモジュレーターをスクリ
ーニングするために使用され得る。
【００５６】
Rスポンジン活性及び/又はRスポンジンシグナル伝達に干渉するRスポンジンの調節剤又
はエフェクター又はモジュレーターの能力は、内皮増殖アッセイ、ニワトリCAMアッセイ
又はツメガエルVMZ分化アッセイを使用して測定され得る。触媒活性の活性化又は抑制、
他のタンパク質のリン酸化又は脱リン酸化、二次メッセンジャーの生成の活性化又は調節
、細胞内イオンレベルの変化、シグナル伝達分子の会合、解離又は転位、或いは特定の遺
伝子の転写又は翻訳等の他の反応もモニターされ得る。これらのアッセイは、スクリーニ
ングの経過においてこれらの目的のための開発された従来技術を使用して実施され得る。
【００５７】
リガンドの細胞性受容体への該リガンドの結合は、シグナル伝達経路を介して、多様な
細胞性過程に影響し得る。Rスポンジンシグナル伝達経路の調節下の細胞性過程には、制
御されていない細胞増殖、接触阻害の損失、分化又は細胞死の遮断等の異常な又は潜在的
に有害な過程に加え、正常な細胞性の機能、増殖、分化、細胞形状の維持、及び接着が含
まれ得るが、これらに限定されるわけではない。当技術分野において公知の技術による記
載された細胞性過程の何れの定性的又は定量的観察及び測定も、スクリーニングの経過に
おけるシグナル伝達のスコア化の一手段として有利に使用され得る。
【００５８】
多様な実施態様は、化合物がRスポンジンシグナル伝達経路の調節下で多様な細胞性過
程に影響し得る、Rスポンジンと相互作用する該化合物のスクリーニング、同定及び評価
について以下に記載される。
【００５９】
本発明には、
（a）純粋な又は半純粋な形態で、或いは生細胞全体又は固定された細胞全体で、或い
は非ヒトトランスジェニック動物において、Rスポンジンの推定上の調節剤、エフェクタ
ー又はモジュレーターをRスポンジンポリペプチドと接触させること、
（b）Rスポンジンポリペプチド、Rスポンジンの活性、及び/又はRスポンジンによって
仲介される細胞もしくは生物の表現型特性に及ぼすRスポンジンの推定上の調節剤、エフ
ェクター又はモジュレーターの効果を測定すること、
（c）測定された効果を、Rスポンジンの推定上の調節剤、エフェクター又はモジュレー
ターを用いないものと比較し、それによりRスポンジンの推定上の調節剤、エフェクター
又はモジュレーターが、Rスポンジンの細胞内反応を刺激し又は阻害するかどうかを決定
すること、
を含む、Rスポンジンの調節剤、エフェクター又はモジュレーターを同定する方法が含ま
れる。
【００６０】
Rスポンジンの調節剤、エフェクター又はモジュレーターを同定する上で有用なRスポン
ジン、例えばRspo3は、Rスポンジンと機能的に等価であり得る。Rスポンジンに対する機
能的等価物は、タンパク質分解後の当業者に公知の従来の精製手法によって、天然の又は
組換え発現したRスポンジンから調製され得る。或いは、機能的誘導体は、適切な細胞に
おける機能的ドメインを含むRスポンジンの一部を発現させることによって組換えDNA技術
によって生成され得る。機能的誘導体は、化学的にも合成され得る。Rspo3を発現する細
胞は、これらのアッセイにおける検査のために、未精製の又は精製されたRスポンジンの
源として使用され得る。或いは、生細胞全体又は固定された細胞全体が、該アッセイにお
いて直接使用され得る。
【００６１】
Rスポンジンシグナル伝達活性は、内皮増殖アッセイ、ニワトリCAMアッセイ又はツメガ
エルVMZ分化アッセイによって、及び/又はシグナルによって調節される細胞性過程をモニ
ターすることによって測定され得る。
【００６２】
また、本発明には、Rスポンジンポリペプチドに結合し得る分子を同定し得る方法であ
って：
（a）Rスポンジンポリペプチド又はその機能的等価物を固相マトリックスへ固定化する
こと；
（b）Rスポンジンポリペプチドに結合できる分子を、該分子を結合させるのに十分な間
隔で、工程（a）において生成された固相マトリックスと接触させること；
（c)固相マトリックスから結合していない物質を洗浄すること；
（d)固相に結合した分子の存在を検出すること
を含む、前記方法も含まれる。
【００６３】
上述の方法にはさらに、
（e）結合した分子を固相マトリックスから溶出し、それにより該分子を単離する
工程が含まれ得る。
【００６４】
上述の方法にはさらに、
（f）溶出された分子を同定する
工程が含まれ得る。
当技術分野で公知の多様な手法は、Rスポンジンポリペプチド、例えばRspo2又はRspo3
のエピトープに対する抗体の生成に使用され得る。
【００６５】
Rスポンジンポリペプチドに結合するモノクローナル抗体は、注入後に体内で該抗体の
位置及び分布を追随できるよう放射性標識され得る。放射性タグ付けされた抗体は、処置
が血管新生及び/又は脈管形成を包含する状態と関連したデノボ脈管形成を画像化するた
めの非侵襲性診断ツールとして使用され得る。
【００６６】
身体中の特定の部位を細胞傷害性薬物の標的とする免疫毒素も設計され得る。例えば、
高親和性Rスポンジン特異的モノクローナル抗体は、ジフテリア毒素、アブリン又はリシ
ン等の細菌又は植物の毒素と共有結合し得る。抗体/ハイブリッド分子の調製に関する一
般的な方法は、抗体上の一次アミノ基を攻撃し、ジスルフィド交換によって毒素を抗体へ
付着させるSPDP等のチオール架橋試薬の使用を包含する。ハイブリッド抗体は、Rスポン
ジンを発現する内皮細胞を特異的に除去するために使用され得る。
【００６７】
抗体の産生のために、ウサギ、マウス、ラット等を含むがこれらに限定されない多様な
宿主動物が、Rスポンジンポリペプチドを用いた注入によって免疫化され得る。多様なア
ジュバントは、フロイント（完全及び不完全）を含むがこれには限定されない宿主種、水
酸化アルミニウム等のミネラルゲル、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニ
オン、ペプチド、油乳濁液、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール等
の界面活性物質、並びにBCG（カルメット・ゲラン桿菌）及びコリネバクテリウム・パル
バム等の潜在的に有用なヒトアジュバントに応じて、免疫学的反応を増大させるために使
用され得る。
【００６８】
Rスポンジンに対するモノクローナル抗体は、培養中の連続的な細胞系によって抗体分
子の産生を供与する何れかの技術を使用することによって調製され得る。これらには、Ko
hler及びMilsteinの文献（Nature, 1975, 256: 495-497）によって最初に記載されたハイ
ブリドーマ技術、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術（Kosborらの文献（1983, Immunology To
day, 4: 72）; Coteらの文献（1983, Proc. Natl. Acad. ScL, 80: 2026-2030））及びEB
V-ハイブリドーマ技術（Coleらの文献（1985, モノクローナル抗体及び癌治療（Monoclon
al Antibodies and Cancer Therapy）, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96）が含まれるが
、これらに限定されるわけではない。さらに、適切な生物活性のヒト抗体分子由来の遺伝
子とともに、適切な抗原特異性のマウス抗体分子由来の遺伝子をスプライスすることによ
る、「キメラ抗体」の産生のために開発された技術（Morrisonらの文献（1984, Proc. Na
tl. Acad. Sci., 81: 6851-6855）; Neubergerらの文献（1984, Nature, 312: 604-608）
; Takedaらの文献（1985, Nature, 314: 452-454））が使用できる。或いは、一本鎖抗体
の産生のために記載された技術（米国特許第4,946,778号）は、Rスポンジン特異的一本鎖
抗体を産生するために適合できる。
【００６９】
Rspo3に対して特異的な結合部位を含有する抗体断片は、公知の技術によって作製され
得る。例えば、このような断片には：抗体分子のペプシン消化によって作製できるF(ab')
2断片及びF(ab')2断片のジスルフィド架橋を還元することによって作製できるFab断片が
含まれるが、これらに限定されるわけではない。或いは、Fab発現ライブラリを構築して
（Huseらの文献（1989, Science, 246: 1275-1281））、Rスポンジンに対する所望の特異
性を有するモノクローナルFab断片を迅速かつ容易に同定することができ得る。
【００７０】
Rスポンジンポリペプチドに対する抗体は、Wntシグナル伝達カスケードにおいて、Rス
ポンジンがRスポンジンの通常のパートナーに結合することを防止することによって、Rス
ポンジンの活性を拮抗し得る。それゆえ、Rスポンジン、特にRspo2又はRspo3に特異的に
結合する抗体は、血管新生及び/又は脈管形成を阻害するために使用され得るRスポンジン
のアンタゴニストであり得る。
【００７１】
さらに、ドミナントネガティブ効果を有するRスポンジンの変異した形態は、内在的に
発現する野生型Rspo3の活性を阻害するために、標的とされる細胞集団において発現し得
る。
【００７２】
Rスポンジンの核酸アンタゴニストは、本発明の範囲に含まれる。アンチセンスRNA及び
DNA分子は、標的とされるmRNAに結合し、タンパク質翻訳を防止することによって、mRNA
の翻訳を直接的に遮断するよう作用する。アンチセンスDNAに関しては、翻訳開始部位に
由来するオリゴデオキシリボヌクレオチド、例えば、Rスポンジンヌクレオチド配列の-10
〜+10の領域が好ましい。
【００７３】
リボザイムは、RNAの特異的切断を触媒できる酵素RNA分子である。リボザイム作用のメ
カニズムは、相補的な標的RNAとのリボザイム分子の配列特異的ハイブリダイゼーション
後のヌクレオチド鎖切断を包含する。Rspo3 RNA配列のヌクレオチド鎖切断を特異的かつ
効率的に触媒する操作されたハンマーヘッドモチーフのリボザイム分子は、本発明の範囲
内である。
【００７４】
何れかの潜在的なRNA標的内の特異的リボザイム切断はまず、次の配列、すなわちGUA、
GUU及びGUCを含むリボザイム切断部位について、標的分子を走査することによって同定さ
れる。一度同定されると、切断部位を含有する標的遺伝子の領域に相当する15〜20個のリ
ボヌクレオチドの短いRNA配列は、オリゴヌクレオチド配列を不適合にし得る二次構造等
の推定された構造特性について評価され得る。候補標的の適合性は、リボヌクレアーゼ保
護アッセイを使用して、相補的オリゴヌクレオチドを用いたハイブリダイゼーションに対
する該標的の到達性を検査することによっても評価され得る。
【００７５】
RNAi分子は、標的mRNA分子のRNA干渉を仲介できる二本鎖RNA分子又はその類似体であり
、例えば、好ましくは19〜25個のヌクレオチド長を有する短い二本鎖RNA分子であるsiRNA
分子、及び場合により少なくとも1つのその3'-オーバーハング又は前駆体或いはそれをコ
ードするDNA分子である。本発明のアンチセンスRNA及びDNA分子、リボザイム及びRNAi分
子は、RNA分子の合成のための当技術分野で公知の何れかの方法によって調製され得る。
これらには、例えば固相ホスホラミダイト化学合成等の当技術分野で周知のオリゴデオキ
シリボヌクレオチドを化学的に合成するための技術が含まれる。或いは、RNA分子は、ア
ンチセンスRNA分子をコードするDNA配列のインビトロ及びインビボでの転写によって生成
され得る。このようなDNA配列は、T7又はSP6ポリメラーゼプロモーター等の適切なRNAポ
リメラーゼプロモーターを組み込む多様なベクター中に組み込まれ得る。或いは、使用さ
れるプロモーターに応じてアンチセンスRNAを構成的に又は誘導的に合成するアンチセン
スcDNAコンストラクトは、細胞系へ安定して導入できる。
【００７６】
DNA分子に対する多様な修飾は、細胞内の安定性及び半減期を増大させる手段として導
入され得る。可能な修飾には、分子の5'末端及び/又は3'末端に対するモルフォリノ誘導
体の隣接する配列及びリボ-又はデオキシ-ヌクレオチドの付加或いはオリゴデオキシリボ
ヌクレオチド骨格内でのホスホジエステラーゼ連鎖よりもむしろホスホロチオエート又は
2'O-メチルの使用が含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【００７７】
Rspo3の発現及び機能的活性は、脈管系の発達及び内皮細胞の増殖と相関しており、Rsp
op3が、脈管形成過程に包含されることを示す。Rspo2又は3等のRスポンジンは、VEGFを誘
導し、VEGFは、内皮細胞に排他的に作用することが公知の分裂促進増殖因子であることが
示されている（Ferrara, N.及びHenzel, W. J.の文献（1989, Biochem. Biophys. Res. C
omm. 161 : 851-858））。
【００７８】
本発明の一実施態様において、Rspo2又は3等のRスポンジンポリペプチドは、血管新生
及び/又は脈管形成を調節するためにインビボで投与できる。例えば、Rspo2又は3の投与
は、処置が、血管新生及び/又は脈管形成を促進することを包含する状態を処置するため
に使用され得るのに対し、Rspo2又は3のアンタゴニストは、処置が、血管新生及び/又は
脈管形成を阻害することを包含する状態を処置するために使用され得る。
【００７９】
本発明の具体的な実施態様において、Rスポンジンアゴニストは、処置が、血管新生及
び/又は脈管形成を促進することを包含する状態を処置するために使用され得る。具体的
な実施態様において、該状態は、創傷治癒、組織及び器官の再生又は発達、脈管変性過程
（例えば、重篤な肢虚血又は脳虚血、虚血性心疾患）、胚発生、並びに排卵中の黄体にお
ける卵胞の発達及び妊娠中の胎盤増殖等の生殖過程からなる群より選択される。さらなる
具体的な実施態様において、該状態は、創傷治癒、組織及び器官の再生又は発達、脈管変
性過程（例えば、重篤な肢虚血又は脳虚血、虚血性心疾患）より選択される。
本発明の具体的な実施態様において、Rスポンジンアゴニストは、Rspo2アゴニスト又は
Rspo3アゴニストである。
【００８０】
本発明の具体的な実施態様において、Rスポンジンアゴニストは、Rスポンジンポリペプ
チド、Rスポンジン核酸又は小分子より選択される。本発明の最も具体的な実施態様にお
いて、Rスポンジンポリペプチドは、処置が、血管新生及び/又は脈管形成を促進すること
を包含する状態を処置するために使用され得る。本発明の最も具体的な実施態様において
、Rスポンジン核酸は、処置が、血管新生及び/又は脈管形成を促進することを包含する状
態を処置するために使用され得る。
【００８１】
本発明の具体的な実施態様において、Rスポンジンアンタゴニストは、処置が、血管新
生を阻害することを包含する状態、例えば腫瘍の発達及び転移活性、粥状硬化症、狭窄、
再狭窄、網膜症、黄斑変性症、乾癬及び関節リウマチの処置において使用され得る。具体
的な実施態様において、該状態は、固体腫瘍の成長である。さらなる具体的な実施態様に
おいて、該状態は、黄斑変性症である。さらなる具体的な実施態様において、該状態は、
関節リウマチである。
本発明の具体的な実施態様において、Rスポンジンアンタゴニストは、Rspo2アンタゴニ
スト又はRspo3アンタゴニストである。
【００８２】
本発明の具体的な実施態様において、Rスポンジンアンタゴニストは、Rスポンジンの翻
訳、転写、発現及び/又は活性を阻害できるRスポンジンの抗体又は核酸より選択される。
本発明の最も具体的な実施態様において、Rスポンジン抗体は、処置が、血管新生及び/又
は脈管形成を阻害することを包含する状態を処置するために使用され得る。本発明の最も
具体的な実施態様において、Rスポンジンの翻訳、転写、発現及び/又は活性を阻害できる
核酸は、処置が、血管新生及び/又は脈管形成を包含する状態を処置するために使用され
得る。本発明の最も具体的な実施態様において、Rスポンジンに対するsiRNA又はアンチセ
ンス核酸は、処置が、血管新生及び/又は脈管形成を促進することを包含する状態を処置
するために使用され得る。
【００８３】
Rスポンジンの医薬として活性のある調節剤又はエフェクター又はモジュレーターは、
患者へそれ自体によって、又は適切な担体もしくは賦形剤と混合した医薬組成物中での何
れかで投与できる。
【００８４】
処置されている特定の状態に応じて、これらの薬剤は、全身的に又は局所的に処方され
得及び投与され得る。処方及び投与のための技術は、「Remingtonの医薬の科学（Remingt
on's Pharmaceutical Sciences）」（Mack Publishing Co., Easton, Pa., 最新版）にお
いて見出され得る。例えば、適切な経路には、経口、直腸、経粘膜、又は腸内投与；筋肉
内、皮下、髄内注入、及びくも膜下腔内、直接的な脳室内、静脈内、腹腔内、鼻腔内、又
は眼内注入、或いは、固体腫瘍の場合、固体腫瘍へ直接的に注入されるのを含む非経口送
達が含まれ得る。注入のために、本発明の薬剤は、水溶液中で、好ましくは、ハンクス液
、リンガー液、又は生理学的塩類緩衝液等の生理学的に適合性のある緩衝液中で製剤され
得る。経粘膜投与のために、透過すべき遮蔽に適した浸透剤は、製剤中に使用される。こ
のような浸透剤は、当技術分野で一般的に公知である。
【００８５】
Rスポンジンの調節剤又はエフェクター又はモジュレーターは、当技術分野で周知の医
薬として許容し得る担体を使用して、経口投与に適した製剤へ容易に製剤できる。このよ
うな担体によって、本発明のRスポンジンの調節剤又はエフェクター又はモジュレーター
は、錠剤、ピル、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液等として、治療さ
れるべき患者による経口消化のために製剤できる。
【００８６】
本発明において使用するのに適した医薬組成物には、Rスポンジンの調節剤又はエフェ
クター又はモジュレーターが企図される目的を達成するために有効量で含有される組成物
が含まれる。有効量の決定は、特に本明細書で提供される詳細な開示の観点から、十分、
当業者の能力内である。
【００８７】
Rスポンジンの調節剤又はエフェクター又はモジュレーターに加え、これらの医薬組成
物は、医薬的に使用できる調製物へのRスポンジンの調節剤又はエフェクター又はモジュ
レーターの加工を容易にする賦形剤及び補助剤を含む医薬として許容し得る適切な担体を
含有し得る。経口投与のために製剤される調製物は、錠剤、糖衣錠、カプセル、又は溶液
の形態であり得る。
本発明の医薬組成物は、それ自体公知の様式で、例えば、従来の混合、溶解、顆粒化、
糖衣錠製造、粉末化、乳化、被包、封入の手段又は凍結乾燥の過程によって製造され得る
。
【００８８】
非経口投与のための医薬製剤には、水溶性形態にあるRスポンジンの調節剤又はエフェ
クター又はモジュレーターの水溶液が含まれる。さらに、Rスポンジンの調節剤又はエフ
ェクター又はモジュレーターの懸濁液は、適切な油状注入懸濁液として調製され得る。適
切な親油性の溶媒又は媒体には、ゴマ油等の脂肪油、又はオレイン酸エチルもしくはトリ
グリセリド等の合成脂肪酸エステル、又はリポソームが含まれる。水性注入懸濁液は、カ
ルボキシメチルセルロース、ソルビトール、又はデキストラン等の、懸濁液の粘性を増大
させる物質を含有し得る。場合により、懸濁液は、非常に濃縮された溶液の調製を可能に
するために、適切な安定剤又は、Rスポンジンの調節剤又はエフェクター又はモジュレー
ターの溶解度を増大させる薬剤も含有し得る。
【００８９】
経口使用のための医薬調製物は、錠剤又は糖衣錠中心を得るために、Rスポンジンの調
節剤又はエフェクター又はモジュレーターを固体の賦形剤と組み合わせ、場合により、得
られた混合物を粉砕し、所望の場合、適切な補助剤を添加した後、顆粒の混合物を加工す
ることによって得られ得る。適切な賦形剤は、特に、乳糖、ショ糖、マンニトール、又は
ソルビトールを含む糖類等の充填剤；例えば、トウモロコシデンプン、コムギデンプン、
コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガントガム、メチルセルロース、ヒ
ドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、及び/又
はポリビニルピロリドン（PVP）等のセルロース調製物である。所望の場合、架橋された
ポリビニルピロリドン、アガー、もしくはアルギン酸又はアルギン酸ナトリウム等のこれ
らの塩等の崩壊剤が添加され得る。
【００９０】
糖衣錠中心は、適切なコーティングとともに提供される。この目的のために、場合によ
りアラビアゴム、滑石、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコ
ール、及び/又は二酸化チタン、ラッカー溶液、並びに適切な有機溶媒又は溶媒混合物を
含有し得る濃縮された糖溶液が使用され得る。染料又は色素は、Rスポンジン用量の調節
剤又はエフェクター又はモジュレーターの異なる組み合わせを同定し又は特徴付けるため
に、錠剤又は糖衣錠コーティングへ添加され得る。
【００９１】
経口使用できる医薬調製物には、ゼラチンでできた押し込み型カプセル、並びにゼラチ
ン及びグリセロールもしくはソルビトール等の可塑剤でできた軟質の密封カプセルが含ま
れる。押し込み型カプセルは、乳糖等の充填剤、デンプン等の結合剤、及び/又は滑石も
しくはステアリン酸マグネシウム等の潤滑剤並びに、場合により、安定剤と混合してRス
ポンジンの調節剤又はエフェクター又はモジュレーターを含有できる。軟質カプセル中で
、Rスポンジンの調節剤又はエフェクター又はモジュレーターは、脂肪油、液体パラフィ
ン、又は液体ポリエチレングリコール等の適切な液体中に溶解され得又は懸濁され得る。
さらに、安定剤が添加され得る。
【００９２】
適合性のある医薬担体中に製剤される本発明のRスポンジンの調節剤又はエフェクター
又はモジュレーターを含む組成物は、適切な容器中で調製され得、配置され得、示された
状態の処置のために標識され得る。標識上に示される適切な状態には、神経膠腫又は膠芽
腫等の腫瘍の処置；並びに処置が血管新生及び/又は脈管形成を阻害することを包含する
他の状態が含まれ得る。
【００９３】
適合性のある医薬担体中に製剤される本発明のRスポンジンの調節剤又はエフェクター
又はモジュレーターを含む組成物は、適切な容器中で調製され得、配置され得、示された
状態の処置のために標識され得る。標識上に示される適切な状態には、処置が血管新生及
び/又は脈管形成を促進することを包含する状態、特に創傷治癒の処置が含まれ得る。
【００９４】
医薬組成物は、適切な固相又はゲル相の担体又は賦形剤も含み得る。このような担体又
は賦形剤の例には、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、多様な糖類、デンプン、セルロ
ース誘導体、ゼラチン、及びポリエチレングリコール等のポリマーが含まれるが、これら
に限定されるわけではない。
【００９５】
本発明のRスポンジンの調節剤又はエフェクター又はモジュレーターの多くは、医薬的
に適合性のある対イオンとともに塩として提供され得る。医薬的に適合性のある塩は、塩
酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸等を含むがこれらには限定されない
多くの酸を用いて形成され得る。塩は、対応する遊離塩基形態である水性の又は他のプロ
トン性の溶媒中でより可溶性である傾向にある。
【００９６】
本発明の方法において使用されるRスポンジンの何れの調節剤又はエフェクター又はモ
ジュレーターについても、治療的有効量は、細胞培養アッセイから初期的に概算できる。
例えば、用量は、細胞培養物中で決定されるIC50を含む循環濃度範囲を達成するために、
動物モデルにおいて製剤できる（すなわち、PTP活性の最大半量の阻害を達成する検査化
合物の濃度）。このような情報は、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定するために
使用できる。
【００９７】
治療的有効量とは、患者において症状の寛解又は生存の長期化に至るRスポンジンの調
節剤又はエフェクター又はモジュレーターの量を指す。Rスポンジンのこのような調節剤
又はエフェクター又はモジュレーターの毒性及び治療的有効性は、例えばLD50（集団の50
％致死量）及びED50（集団の50％において治療効果のある用量）を決定するために、細胞
培養物又は実験動物における標準的な医薬手法によって決定できる。毒性効果と治療効果
との間の用量比は、治療上の指標であり、LD50/ED50比として表現できる。大きな治療指
標を示すRスポンジンの調節剤又はエフェクター又はモジュレーターが好ましい。これら
の細胞培養アッセイ及び動物研究から得られたデータは、ヒトにおける使用のための薬用
量のある範囲を製剤する上で使用できる。Rスポンジンのこのような調節剤又はエフェク
ター又はモジュレーターの薬用量は、毒性がほとんど又はまったくないED50を含む循環濃
度のある範囲内に好ましくある。薬用量は、採用される製剤の形態及び利用される投与の
経路に応じて、この範囲内で変動し得る。実際の製剤、投与の経路及び薬用量は、患者の
状態の観点から、個々の医師によって選択できる（例えば、Finglらの文献（1975, 「治
療薬の薬理学的基礎（The Pharmacological Basis of Therapeutics）」, 第1章 p1を参
照されたい）。
【００９８】
製剤の量及び間隔は、Rspo3の阻害効果又は促進効果を維持するのに十分なRスポンジン
の調節剤又はエフェクター又はモジュレーターの血漿レベルを提供するよう、個々に調整
され得る。全身投与のための通常の患者の薬用量は、1〜2000mg/日、普遍的には1〜250mg
/日、典型的には10〜150mg/日の範囲である。患者の体重の点で述べると、通常の薬用量
は、0.02〜25mg/kg/日、普遍的には0.02〜3mg/kg/日、典型的には0.2〜1.5mg/kg/日の範
囲である。患者の身体表面積の点で述べると、通常の薬用量は、0.5〜1200mg/m2/日、普
遍的には0.5〜150mg/m2/日、典型的には5〜100mg/m2/日の範囲である。
【００９９】
製剤の量及び間隔は、Rスポンジンの阻害効果又は促進効果を維持するのに十分なRスポ
ンジンの調節剤又はエフェクター又はモジュレーターの血漿レベルを提供するよう、個々
に調整され得る。通常の平均血漿レベルは、50〜5000μg/mL、普遍的には50〜1000μg/mL
、及び典型的には100〜500μg/mL内で維持されるべきである。
【０１００】
或いは、全身様式よりもむしろ局所様式で、例えば、Rスポンジンの調節剤又はエフェ
クター又はモジュレーターの腫瘍中への直接的な注入を介して、しばしばデポー又は徐放
性製剤で、Rスポンジンの調節剤又はエフェクター又はモジュレーターが投与され得る。
【０１０１】
さらに、標的とされる薬物送達システム中の、例えば腫瘍特異的抗体でコーティングさ
れたリポソーム中の医薬組成物が投与され得る。リポソームは、腫瘍によって選択的に標
的とされ及び取り込まれるであろう。
局所投与又は選択的な取り込みの場合、医薬組成物の効果的な局所濃度は、血漿濃度と
関連していないかもしれない。
【０１０２】
Rスポンジン核酸又は抗体等のRスポンジンに結合できる化合物は、血管新生及び/又は
脈管形成と関連した過程、状態又は障害におけるRスポンジンの発現の検出のための診断
目的に使用され得る。
【０１０３】
Rスポンジン核酸又はRスポンジンに結合できる化合物等のRスポンジンを検出するのに
適した試薬は、Rスポンジンの異常な発現から生じ、該発現と関連し、該発現を付随する
過程、状態又は疾病の診断のための多くの用途を有し得る。診断手法は好ましくは、対象
、例えばヒト患者から得られた試料、例えば、全血、血漿、血清又は尿等の体液由来の試
料、或いは生検又は剖検の試料等の組織試料に関して実施される。例えば、Rスポンジン
配列は、増幅、例えば、Rスポンジン発現の異常性を診断するためのハイブリダイゼーシ
ョンアッセイ；例えば、インサイツハイブリダイゼーションアッセイを含むサザン又はノ
ザン分析において使用され得る。
【０１０４】
RスポンジンcDNAは、対応するmRNAの発現を検出するためのプローブとして使用され得
る。本明細書に記載される具体的な実施例において、マウス胚におけるRspo3 mRNAの発現
を分析した（図４)。Rspo3 mRNAは、胚血管において高濃度であることが発見され、内皮
細胞の増殖におけるRspo3についての役割を示した。
さらに、本発明は、以下の実施例によってより詳細に説明される。
【実施例】
【０１０５】
（6.実施例）
（6.1材料及び方法）
Rspoをコードする配列
本明細書で使用されるGenbankに寄託されるマウス及びツメガエルのRスポンジン遺伝子
のヌクレオチドをコードする配列及び推定アミノ酸配列は、
アフリカツメガエル  Rスポンジン2[gi:54145367]（配列番号1）
ゼノパス・トロピカリス  Rスポンジン3［gi:114149217］（配列番号2）
マウス  Rスポンジン3［NM_028351］（配列番号3）
である。
【０１０６】
マウス及びツメガエルの胚
Balb/cマウスを一晩交尾させ、膣栓検出の午前を妊娠の1/2日として定義した。 所定の
組織学的分析のために、組織を4％パラホルムアルデヒド中で一晩固定し、薄片作製のた
めにパラフィンワックス中で包埋した。一般的に、4μm切片を切り出し、ヘマトキシリン
・エオシンで染色した。ホールマウントインサイツハイブリダイゼーションのために、記
載のとおり、胚を固定し及び加工した（del Barcoらの文献（2003, Genes Dev. 17, 2239
-2244））。インビトロでの受精によってツメガエル胚を得、記載のとおり培養した（Gaw
antkaらの文献（1995 EMBO J. 14, 6268-79））。記載のとおりのホールマウントインサ
イツハイブリダイゼーションのために、ツメガエル胚を固定し及び加工した（Bradleyら
の文献（1996 Development 122, 2739-2750））。腹側帯域を切開し、記載のとおり培養
した（Gawantkaらの文献（1995 EMBO J. 14, 6268-79））。全長のRspo3 cDNAを使用して
、アンチセンスリボプローブを作製した。
【０１０７】
図５に示される標的ベクターを使用する標準的な手法に従ったマウス胚性幹細胞におけ
るマウスRspo3（gi:94388197）の標的変異誘発によって、Rspo3ノックアウトマウスを得
た。標準的な二倍体注入を介するC57BL/6背景において、トランスジェニックマウスを作
出した。ヘテロ接合型交雑受精によって、ホモ接合型変異体胚を作製した。次に、C57BL/
6ヘテロ接合体をCD1雌へ少なくとも6世代戻し交雑した。C57BL/7のホモ接合型胚とCD1背
景におけるホモ接合型胚との間に重大な表現型の差異は検出されなかった。PCRによって
遺伝子型を同定するために、マウスの尾部の先端又は卵黄嚢もしくは胚の部分を使用した
。3つのプライマー、すなわち5'- ATGCTTTGAGGCTTGTGACC -3'（配列番号4）、5'- TGCACC
GACTCCAGTACTGG -3'（配列番号5）及び5'- TACATTCTGGTTTCTCATCTGG-3'（配列番号6）を
使用するPCR分析によって、遺伝子型同定を所定のとおり実施した。
【０１０８】
RT-PCR
記載のとおり、RT-PCRを実施し（Gawantkaらの文献（1995 EMBO J. 14,6268-79））；
」さらなるプライマーは；XSCL（順方向、actcaccctccagacaagaa（配列番号7）；逆方向
、atttaatcaccgctgcccac（配列番号8））；α-グロビン（順方向、tccctcagaccaaaacctac
（配列番号9）；逆方向、cccctcaattttatgctggac（配列番号10））；Xmsr（順方向、aact
tcgctctcgctcctccatac（配列番号11）；逆方向、gccagcagatagcaaacaccac（配列番号12）
）、VEGF（順方向、aggcgagggagaccataaac（配列番号13）；逆方向、tctgctgcattcacactg
ac（配列番号14））であった。
【０１０９】
アフリカツメガエルRspo2条件培地の調製
アフリカツメガエルRspo2（gi:54145367）によるHEK293T細胞の形質移入及び条件培地
の回収は、記載されたとおりであった（Kazanskayaらの文献（2004, Dev. Cell 7, 525-5
34）。
【０１１０】
内皮増殖アッセイ
10%ウシ胎仔血清（FBS）を補充した内皮細胞増殖培地（Promocell）中で、ヒト臍帯静
脈内皮細胞（HUVEC）（PromoCell）を培養した。増殖研究のために、96ウェルプレート中
に50％コンフルエンスで細胞を播種し、翌日、VEGF及びアフリカツメガエルRspo2タンパ
ク質を48時間補充し、その後、BrdU（10μM）を各ウェルへ4時間添加した。Roche Applie
d Science製の細胞増殖ELISA BrdU化学発光剤を使用して、細胞増殖のBrdU分析を実施し
た。
【０１１１】
絨毛尿膜（CAM）アッセイ
ニワトリ絨毛尿膜（CAM）アッセイのために、加湿されたチャンバー中でニワトリ卵を3
7℃でインキュベートした。 発生の第3日目に、外殻中に窓を作製し、発生の第6日目に、
Rspo2又はコントロールビーズ20μL又は組換えVEGF（Sigma-Aldrich、100ng/フィルター
）を有するフィルターディスク（3MM Whatman-8mm直径）をCAMの表面上に配置した。ビー
ズ（抗FLAG M2-アガロース、Sigma）をアフリカツメガエルRspo2条件培地又は形質移入し
ていないHEK293T細胞由来の対照培地とともに一晩インキュベートし、PBS中で3回洗浄し
た。インキュベーション5日間の後、フィルターディスク及び付着したCAMを切除し、PBS
で洗浄し、ヘマトキシリン・エオシン染色を使用して組織学のために加工した。
【０１１２】
アンチセンスモルフォリノオリゴヌクレオチド
ゼノパス・トロピカリスRspo3 cDNA配列（gi:114149217）に基づいて、アンチセンスモ
ルフォリノオリゴヌクレオチドを設計した（配列：5':atgcaattgcgactgctttctctgt（配列
番号15））。
【０１１３】
（6.2結果）
図１は、ゼノパス・トロピカリスRspo3に対して向かうアンチセンスモルフォリノオリ
ゴヌクレオチドが、ツメガエルのオタマジャクシにおいて形成中の血管の発達を阻害した
ことを示す。形成中の血管についてのマーカーは、遺伝子msrであり、下方制御された。
血管の発達、言い換えれば胚の血管新生の阻害に伴って、血液細胞の発達が広がり、その
理由は、血液細胞マーカーであるα-グロビン及びSCLが広がるからである。本結果は、Rs
po3が、血液と血管発達との間の細胞の運命を切り替える発達上の調節剤であることを示
唆する。Rspo3の阻害のためのモルフォリノにより誘導される表現型の特異性は、図２に
おける救出実験によって示される。本実験において、関連する分子Rspo2は、血液マーカ
ーのα-グロビンの広がりを元に戻せた。
【０１１４】
ツメガエル胚において血管新生を促進するRspo2の能力を、図３の腹側帯域（VMZ）アッ
セイにおいて示す。Rspo2 mRNAの過剰発現は、血液細胞マーカーを阻害し、内皮マーカー
msr及び血管新生因子VEGFを誘導する。 逆に、胚の血管新生のための内在性Rspo3の動員
は、アンチセンスモルフォリノオリゴ抜くレオチドによるmsr及びVEGFの阻害によって示
される。
【０１１５】
図１〜３における例によって、脊椎動物におけるRspo3の阻害がVEGF、脈管形成及び血
管新生を阻害することが示される。それゆえ、Rspo3のアンタゴニストは、該アンタゴニ
ストが有用なVEGF、脈管形成及び血管新生を、例えば処置が血管新生及び/又は脈管形成
を阻害することを包含する状態において、計画的に阻害するのに有用であろう。
【０１１６】
血管新生を促進するRスポンジンの能力は、ツメガエルに限定されるわけではなく、哺
乳動物、例えばマウスにも拡大する。Rspo3は、マウス胚の血管に発現する（図４）。さ
らに、Rspo3変異マウスは、欠損性血管新生を示す。このことは、血管形成不全を特徴と
するように、内出血を示すこのような変異マウスの早期致死によって示される（図６）。
欠損性血管新生は、変異胚の卵黄嚢における減少した血管によっても証明される（図７）
。さらに、Rspo3の不活性化に伴って、変異胎盤においてVEGFが下方制御される（図８）
。これらの例によって、哺乳動物におけるRspo3の阻害が、VEGF、脈管形成及び血管新生
を阻害することが再度示される。
【０１１７】
血管新生を誘導するRspo2の能力は、2つの標準的なインビトロでの血管新生アッセイに
おいて示される。ニワトリ絨毛尿膜（CAM）アッセイにおいて、内皮細胞及び血管の増殖
を促進するRスポンジンの調節剤又はエフェクター又はモジュレーターの能力を測定する
。内皮細胞の増殖及び血管の強力な誘導は、VEGF又はRspo2条件培地に浸したビーズの埋
め込み後に観察された（図９）。さらに、Rspo2条件培地は、血管新生因子に対する特徴
的な反応である内皮細胞における分岐する形態形成を誘導した（図１０）。さらに、Rspo
2は、血管新生因子VEGFと同様、内皮細胞の増殖を誘導した（図１１）。
【０１１８】
本発明は、本発明の単一の態様の説明として企図される実証された実施態様による範囲
に限定されるべきではなく、何れのクローン、DNA又はRスポンジンに対する機能的等価物
も、本発明の範囲内である。実際、本明細書に記載される改変に加え、本発明の多様な改
変は、上述の説明及び付属の図から、当業者に明らかとなるであろう。このような改変は
、付属の特許請求の範囲の範囲内に収まるよう企図される。
本明細書で引用されるすべての参考文献は、そのすべての内容が全体として引用により
本明細書に組み込まれている。
【図１】
2014058551.tif 000002
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2014058551.tif 000009
【図９】
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【図１０】
2014058551.tif 000011
【図１１】
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【配列表】
2014058551000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成25年12月26日(2013.12.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血管新生及び/又は脈管形成の促進のための薬剤の製造における、Rスポンジン2及び／又はRスポンジン3アゴニストの使用であって、
該Rスポンジン2及び／又はRスポンジン3アゴニストが、
ａ）配列番号19に少なくとも80％の配列同一性を有するRスポンジン2ポリペプチド、
ｂ）配列番号21に少なくとも80％の配列同一性を有するRスポンジン3ポリペプチド、
ｃ）配列番号18に少なくとも80％の配列同一性を有するRスポンジン2核酸、
ｄ）配列番号20に少なくとも80％の配列同一性を有するRスポンジン3核酸、又は、
ｅ）ｉ）ＣＡＭアッセイにおける血管新生の誘導、ｉｉ）内皮細胞における管形成の誘導、ｉｉｉ）内皮細胞増殖の誘導、及びｉｖ）ＶＥＧＦ発現の誘導、から選択される少なくとも1の生物学的活性を発揮し得るａ）若しくはｂ）の機能的断片、
を含むものである、前記使用。
【請求項２】
前記アゴニストが、配列番号19に少なくとも80％の配列同一性を有するRスポンジン2ポリペプチドを含む、請求項１記載の使用。
【請求項３】
前記アゴニストが、配列番号21に少なくとも80％の配列同一性を有するRスポンジン3ポリペプチドを含む、請求項１記載の使用。
【請求項４】
前記アゴニストが、配列番号18に少なくとも80％の配列同一性を有するRスポンジン2核酸を含む、請求項１記載の使用。
【請求項５】
前記アゴニストが、配列番号20に少なくとも80％の配列同一性を有するRスポンジン3核酸を含む、請求項１記載の使用。
【請求項６】
前記アゴニストが、ｉ）ＣＡＭアッセイにおける血管新生の誘導、ｉｉ）内皮細胞における管形成の誘導、ｉｉｉ）内皮細胞増殖の誘導、及びｉｖ）ＶＥＧＦ発現の誘導、から選択される少なくとも1の生物学的活性を発揮し得るａ）若しくはｂ）の機能的断片を含む、請求項１記載の使用。
【請求項７】
Rスポンジン2及び／又はRスポンジン3アゴニストを含む血管新生及び/又は脈管形成の促進のための薬剤であって、該Rスポンジン2及び／又はRスポンジン3アゴニストが、
ａ）配列番号19に少なくとも80％の配列同一性を有するRスポンジン2ポリペプチド、
ｂ）配列番号21に少なくとも80％の配列同一性を有するRスポンジン3ポリペプチド、
ｃ）配列番号18に少なくとも80％の配列同一性を有するRスポンジン2核酸、
ｄ）配列番号20に少なくとも80％の配列同一性を有するRスポンジン3核酸、又は、
ｅ）ｉ）ＣＡＭアッセイにおける血管新生の誘導、ｉｉ）内皮細胞における管形成の誘導、ｉｉｉ）内皮細胞増殖の誘導、及びｉｖ）ＶＥＧＦ発現の誘導、から選択される少なくとも1の生物学的活性を発揮し得るａ）若しくはｂ）の機能的断片、
を含むものである、前記薬剤。
【外国語明細書】
2014058551000001.pdf