(57)【要約】      （修正有）【課題】イソプレノイドの製造用の原料を供給するための、高効率で大スケールのバクテリアによるイソプレン製造プロセスの提供。【解決手段】改良された触媒活性、及び／又は溶解性を有する少なくとも1つのイソプレンシンターゼ変異体、前記変異体がイソプレンシンターゼのＮ−末端に切断を有するポプライソプレンシンターゼ変異体で全長イソプレンシンターゼより高い比活性度を有するもので当該イソプレンシンターゼ変異体をコードする非相同ポリヌクレオチド配列を備える微生物宿主細胞、及び当該微生物宿主細胞を培養してイソプレンを産出する方法。この微生物宿主細胞により産出されたイソプレンは、ゴム及びエラストマーの製造において有用である。【選択図】図９２
2014158489.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離されたポプライソプレンシンターゼ変異体であって、前記変異体がイソプレンシンターゼのＮ−末端に切断を有するポプライソプレンシンターゼ変異体。
【請求項２】
前記イソプレンシンターゼ変異体が、全長イソプレンシンターゼよりも高い比活性度を有する、請求項１に記載の単離されたポプライソプレンシンターゼ変異体。
【請求項３】
前記イソプレンシンターゼが、SEQ ID NO: 120に示すポプラ・アルバ（alba）イソプレンシンターゼである、請求項１に記載の単離されたポプライソプレンシンターゼ変異体。
【請求項４】
前記変異体が、MEA変異体 (SEQ ID NO: 122)、MSV変異体(SEQ ID NO: 124)、MVS変異体(SEQ ID NO: 126)、MTE変異体(SEQ ID NO: 128)、MNV変異体(SEQ ID NO: 130)から成る群から選択される、請求項３に記載の単離されたポプライソプレンシンターゼ変異体。
【請求項５】
前記変異体がMEA変異体 (SEQ ID NO: 122)である、請求項４に記載の単離されたポプライソプレンシンターゼ変異体。
【請求項６】
前記変異体が、TRC (-3)変異体(SEQ ID NO: 136)、TRC (-4)変異体(SEQ ID NO: 138)、TRC (-5)変異体(SEQ ID NO: 140)、TRC (-6)変異体(SEQ ID NO: 142)、及びTRC (-7)変異体(SEQ ID NO: 144)から成る群から選択される、請求項３に記載の単離されたポプライソプレンシンターゼ変異体。
【請求項７】
前記変異体が、ポプラ・トレムロイデス（tremuloides）イソプレンシンターゼの MET変異体(SEQ ID NO: 146)である、請求項１に記載の単離されたポプライソプレンシンターゼ変異体。
【請求項８】
前記変異体が、ポプラ・トリコカーパ（trichocharpa）イソプレンシンターゼの MET変異体(SEQ ID NO: 148)である、請求項１に記載の単離されたポプライソプレンシンターゼ変異体。
【請求項９】
単離されたポプライソプレンシンターゼ変異体であって、前記変異体は野生型イソプレンシンターゼのアミノ酸残基の１以上を置換して成り、前記変異体は野生型イソプレンシンターゼよりも高いイソプレンシンターゼ活性を有する、ポプライソプレンシンターゼ変異体。
【請求項１０】
向上したイソプレンシンターゼ活性が、ジメチルアリルピロホスフェート (DMAPP)の存在下において、イソプレン変異体を含む宿主細胞の方が親イソプレンシンターゼを含む宿主細胞より速く成長することにより示される、請求項９に記載の単離されたポプライソプレンシンターゼ変異体。
【請求項１１】
前記イソプレンシンターゼが、SEQ ID NO: 120に示すポプラ・アルバ（alba）イソプレンシンターゼである、請求項９に記載の単離されたポプライソプレンシンターゼ変異体。
【請求項１２】
前記変異体が、VlOM, F12S, T15A, E18G, V58I, V58F, L70Q, L70V, L70T, T71P, V79L, E89D, G94A, S119F, F120L, G127R, E175V, T212I, S257A, R262G, A266G, F280L, N297K, F305L, L319M, E323K, A328T, D342E, A359T, K366N, E368D, L374M, S396T, V418S, K438N, H440R, T442I, T442A, I449V, A469S, K500R, K505Q, G507S, S509N, F511Y, 及びN532Kから成る群から選択される１以上のアミノ酸置換を有する、請求項１１に記載の単離されたポプライソプレンシンターゼ変異体。
【請求項１３】
少なくとも１のアミノ酸置換がL70R置換である、請求項１１に記載の単離されたポプライソプレンシンターゼ変異体。
【請求項１４】
前記変異体が、G127R/F511Y, L70Q/G94A/R262G/F305L, F12S/ T15A/E18G/N297K, S396T/T442I, V10M/E323K, F120L/A266G, K438N/K500R, V79L/S509N, E175V/S257A/E368D/A469S, T71P/L374M, F280L/H440R, E89D/H440R, V58F/A328T/N532K, S119F/D342E/I449V, 及びK366N/G507Sから成る群から選択される１以上のアミノ酸置換を備える、請求項１１に記載の単離されたポプライソプレンシンターゼ変異体。
【請求項１５】
SEQ ID NO: 120 (図19)に示すアミノ酸残基から成る、結晶形態のポリペプチド。
【請求項１６】
イソプレンを産出する方法であって、（ａ）イソプレンシンターゼ変異体をコードするポリヌクレオチド配列を備える発現ベクターを有する宿主細胞を調製する工程と、（ｂ）前記宿主細胞をイソプレン産出に適した条件下で培養する工程とを備える、イソプレンを産出する方法。
【請求項１７】
さらに、(c)前記イソプレンを回収する工程を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
さらに、(d)前記イソプレンを重合させる工程を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
イソプレンシンターゼ活性の分析法であって、(a) 発現ベクターを備える宿主細胞をイソプレンシンターゼ変異体の産出に適した条件下で培養する工程と、(b)リゾチームを含む溶解緩衝液で宿主細胞を溶解して細胞溶解物を生成させる工程と、(c) ジメチルアリルジホスフェート(DMAPP)から産出されたイソプレンを測定することにより、細胞溶解物中のイソプレンシンターゼ活性を分析する工程とが含まれる、イソプレンシンターゼ活性の分析法。
【請求項２０】
前記宿主細胞が、グラム陽性バクテリア細胞、グラム陰性バクテリア細胞、糸状菌類細胞、及びイースト細胞から成る群から選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記宿主細胞が、エシェリキア(Escherichia)属 (E. coli)、パントエア(Panteoa) 属 (P. シトレア(citrea) )、バシラス(Bacillus) 属(B. スブチリス(subtilis))、ヤロウイア(Yarrowia) 属(Y. リポリティカ(lipolytica) )、及びトリコデルマ(Trichoderma) 属(T. リーゼイ(reesei)) から成る群から選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記宿主細胞を、グルコース、グリセロール、グリセリン、ジヒドロキシアセトン、酵母エキス、バイオマス、糖蜜、ショ糖、及びオイルから選択される炭素源を含有する培地を用いて培養する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
複数のサンプル中のイソプレンを高速スクリーニングで検出する方法であって、(a)  i)各々がイソプレンシンターゼを含む複数のサンプル、ii) 複数のウエルを有するガラス板、及びiii) ガラス板のシール部材を準備する工程；(b) 複数のサンプルをガラス板の複数のウエルに入れる工程；(c) ガラス板をシール部材でシールして、複数のウエルの各々のサンプル上にヘッドスペースを有するシールされたガラス板を作成する工程；(d)イソプレンシンターゼが活性になる条件下でガラス板を培養する工程；及び(e) ヘッドスペース中のイソプレンを分析する工程から成る方法。
【請求項２４】
前記イソプレンをガスクロマトグラフィー−質量分析(GC-MS)により分析する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記複数のサンプルに、プロモータに作動可能に結合されるとともにイソプレンシンターゼ変異体をコードするポリヌクレオチド配列を有する発現ベクターを含む宿主細胞が含有されている、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記複数のサンプルに、宿主細胞の溶解物、リゾチーム、及びジメチルアリルジホスフェート(DMAPP)が含有されている、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記ガラス板がディープウエルガラスブロックである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
前記複数のウエルが少なくとも24個のウエルである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２９】
前記複数のウエルの各ウエルの容積が2 ml以下である、請求項２３に記載の方法。
【請求項３０】
プロモータに作動可能に結合されるとともにイソプレンシンターゼ変異体をコードする非相同ポリヌクレオチド配列を備える宿主細胞であって、前記イソプレンシンターゼ変異体がポプライソプレンシンターゼにおいて対応する位置の1以上（1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, または10）の残基に置換を有する宿主細胞。
【請求項３１】
前記イソプレンシンターゼがSEQ ID NO: 120に示すP. アルバ・イソプレンシンターゼである、請求項３０に記載の宿主細胞。
【請求項３２】
前記変異体が、MEA変異体 (SEQ ID NO: 122)、MSV変異体(SEQ ID NO: 124)、MVS変異体(SEQ ID NO: 126)、MTE変異体(SEQ ID NO: 128)、MNV変異体(SEQ ID NO: 130)から成る群から選択される、請求項３１に記載の宿主細胞。
【請求項３３】
前記変異体が、TRC (-3)変異体(SEQ ID NO: 136)、TRC (-4)変異体(SEQ ID NO: 138)、TRC (-5) 変異体(SEQ ID NO: 140)、TRC (-6)変異体(SEQ ID NO: 142)、及びTRC (-7) 変異体(SEQ ID NO: 144) から成る群から選択される、請求項３１に記載の宿主細胞。
【請求項３４】
前記変異体が、P. トレムロイデス（tremuloides）イソプレンシンターゼ のMET変異体である(SEQ ID NO: 146)、請求項３０に記載の宿主細胞。
【請求項３５】
前記変異体が、P. トリコカーパ（trichocharpa）イソプレンシンターゼのMET変異体である(SEQ ID NO: 148）である、請求項３０に記載の宿主細胞。
【請求項３６】
前記イソプレンシンターゼ変異体が、V10M, F12S, T15A, E18G, V58I, V58F, L70Q, L70V, L70T, T71P, V79L, E89D, G94A, S119F, F120L, G127R, E175V, T212I, S257A, R262G, A266G, F280L, N297K, F305L, L319M, E323K, A328T, D342E, A359T, K366N, E368D, L374M, S396T, V418S, K438N, H440R, T442I, T442A, I449V, A469S, K500R, K505Q, G507S, S509N, F511Y, 及びN532Kから成る群から選択される1以上のアミノ酸置換を有する、請求項３１に記載の宿主細胞。
【請求項３７】
少なくとも1のアミノ酸置換がL70R置換である、請求項３６に記載の宿主細胞。
【請求項３８】
前記変異体が、G127R/F511Y, L70Q/G94A/R262G/F305L, F12S/T15A/E18G/N297K, S396T/T442I, V10M/E323K, F120L/A266G, K438N/K500R, V79L/S509N, E175V/S257A/E368D/A469S, T71P/L374M, F280L/H440R, E89D/H440R, V58F/A328T/N532K, S119F/D342E/I449V, 及び K366N/G507Sから成る群から選択される1以上のアミノ酸置換を有する、請求項３１に記載の宿主細胞。
【請求項３９】
前記ポリヌクレオチド配列がプラスミド中に含まれている、請求項３０に記載の宿主細胞。
【請求項４０】
前記ポリヌクレオチド配列が宿主細胞中の染色体に組み込まれている、請求項３９に記載の宿主細胞。
【請求項４１】
前記宿主細胞が、グラム陽性バクテリア細胞、グラム陰性バクテリア細胞、糸状菌類細胞、及びイースト細胞から成る群から選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項４２】
前記宿主細胞が、エシェリキア(Escherichia)属 (E. coli)、パントエア(Panteoa) 属 (P. シトレア(citrea) )、バシラス(Bacillus) 属(B. スブチリス(subtilis))、ヤロウイア(Yarrowia) 属(Y. リポリティカ(lipolytica) )、及びトリコデルマ(Trichoderma) 属(T. リーゼイ(reesei)) から成る群から選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項４３】
前記宿主細胞が、グルコース、グリセロール、グリセリン、ジヒドロキシアセトン、酵母エキス、バイオマス、糖蜜、ショ糖、及びオイルから選択される炭素源を含有する培地を用いて培養される、請求項３０に記載の宿主細胞。
【請求項４４】
前記宿主細胞がさらに、IDIポリペプチドをコードする非相同または天然の核酸、および／または、DXSポリペプチドをコードする非相同または天然の核酸を備え、任意に天然のDXP経路と組み合わされている、請求項３０に記載の宿主細胞。
【請求項４５】
前記宿主細胞がさらに、IDIポリペプチド及びDXSポリペプチドをコードする1以上の核酸を備える、請求項３０に記載の宿主細胞。
【請求項４６】
宿主細胞がイソプレンシンターゼ変異体、IDIポリペプチド及びDXSポリペプチドをコードする1のベクターを備える、請求項３０に記載の宿主細胞。
【請求項４７】
宿主細胞がさらに、サッカロミセス・セレビシア(Saccharomyces cerevisia) 由来の MVA経路ポリペプチド、及びエンテロコッカス・ファエカリス(Enterococcus faecalis)由来の MVA経路ポリペプチドから成る群から選択されるMVA経路ポリペプチドをコードする非相同核酸を備える、請求項４６に記載の宿主細胞。
【請求項４８】
宿主細胞がさらにMVA経路ポリペプチド及びDXSポリペプチドをコードする1以上の核酸を備え、1のベクターがイソプレンシンターゼ変異体、MVA経路ポリペプチド及びDXSポリペプチドをコードする、請求項３０に記載の宿主細胞。
【請求項４９】
宿主細胞がさらにDXSポリペプチド、IDIポリペプチド、または1以上の残りのDXP経路ポリペプチド、及びMVA経路ポリペプチドをコードする1以上の核酸を備える、請求項４８に記載の宿主細胞。
【請求項５０】
イソプレンを産出する方法であって、(a)イソプレン産出に適した培養条件下で請求項３０に記載の宿主細胞を培養する工程と、(b) イソプレンを産出する工程とが含まれる方法。
【請求項５１】
さらに、(c)イソプレンを回収する工程が含まれる、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
さらに、イソプレンを重合する工程が含まれる、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
イソプレンシンターゼを産出する方法であって、(a) (i)宿主細胞；及び(ii)プロモータに作動可能に結合するとともにイソプレンシンターゼ変異体をコードする核酸を準備する工程であって、前記イソプレンシンターゼ変異体がSEQ ID NO: 120に示すアミノ酸配列を有するP. アルバ・イソプレンシンターゼにおいて対応する位置の1以上（1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, または10）の残基における置換を有する工程と、
(b) 前記宿主細胞を前記核酸に接触させて形質転換された宿主細胞を調製する工程と、
(c) 形質転換された宿主細胞をイソプレンシンターゼの産出に適した条件下で培養する工程とが含まれる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
＜関連出願とのクロスリファレンス＞
この出願は、その全てを本願に参照として組み込む2008年4月23日出願の米国仮出願番号61/125,336に基づく利益を主張する。
【０００２】
この発明は、改良された触媒活性、および／または溶解性を有する少なくとも1のイソプレンシンターゼ酵素を含む組成物及びイソプレン産出方法に関する。この発明は特に、微生物宿主細胞中におけるイソプレン産出量が改善された植物性イソプレンシンターゼ変異体に関する。この発明の微生物により産出されたイソプレンは、ゴム及びエラストマーの製造において有用である。
【背景技術】
【０００３】
イソプレノイドは、医薬、栄養補助食品、香料、芳香剤、及びゴム製品に用いられるイソプレンポリマーである。天然のイソプレンの供給量は、自然保護の問題があるため限られている。この理由のため、及び不純物が少なく、より均一なイソプレノイド組成物を提供するために、ゴム等のイソプレノイドは合成により製造されている。
【０００４】
イソプレン(2-メチル-1,3-ブタジエン)は揮発性の炭化水素であり、水に不溶でアルコールに可溶である。市販のイソプレンは、石油のC5クラッキング留分から直接単離するか、C5イソアルカンまたはイソアルケンの脱水素により製造されている(Weissermel 及びArpe, Industrial Organic Chemistry, 4th ed., Wiley- VCH, pp. 117-122, 2003)。C5骨格を、より低分子量のサブユニットから合成することもできる。しかし、再生不能な原料に依存しない、商業的に有用なイソプレンの製造方法を開発することが望ましい。
【０００５】
イソプレンの生合成は、2つの異なる代謝経路により生じる(Julsing et al., Appl Microbiol Biotechnol, 75:1377-1384, 2007)。真核生物及び古細菌中では、イソプレンはメバロン酸経路(MVA)で産出され、真正細菌及び高級植物においては、イソプレンはメチルエリトリトールホスフェート経路(MEP) で産出される。
植物からのイソプレンの放出は光及び温度に依存し、葉の量に応じて生成量が増える。イソプレンを産出する酵素であるイソプレンシンターゼが、アスペンの木から見出され(Silver 及び Fall, Plant Physiol, 97:1588-1591, 1991; 及び Silver and Fall, J Biol Chem, 270:13010-13016, 1995)、イソプレンの葉におけるin vivo産出に関与していると考えられている。イソプレンのバクテリアによる産出も報告されており(Kuzma et al, Curr Microbiol, 30:97-103, 1995; and Wilkins, Chemosphere, 32:1427-1434, 1996)、その産出量が、バクテリアの成長フェーズと培地中の栄養分に応じて変化することが知られている(Fall et al., U.S. Patent No. 5,849,970; 及び Wagner et al., J Bacteriol, 181:4700- 4703, 1999, これらを参照として本願に組み込む)。しかし、従来技術のバクテリアを用いる方法で得られるイソプレンの量は、工業的に使用するには不十分である。
【０００６】
従って、イソプレノイドの製造用の原料を供給するための、高効率で大スケールのバクテリアによるイソプレン製造プロセスが求められている。
【０００７】
本願に引用した全ての特許、特許出願、及び刊行物は、参照として本願に組み込まれる。
【発明の概要】
【０００８】
この発明は、改良された触媒活性、および／または溶解性を有する少なくとも1のイソプレンシンターゼ酵素を含む組成物及びイソプレン産出方法に関する。この発明は特に、微生物宿主細胞中におけるイソプレン産出量が向上した植物性イソプレンシンターゼ変異体に関する。この発明に係る微生物により産出されたイソプレンは、ゴム及びエラストマーの製造において有用である。
【０００９】
詳しくは、この発明は単離されたイソプレンシンターゼ変異体に関し、この変異体はSEQ ID NO: 2に示すアミノ酸配列を含むクズ(kudzu)イソプレンシンターゼにおいて対応する1以上(1,2,3,4,5,6,7,8,9,または10)の残基の位置に、置換を有する。
いくつかの実施形態では、イソプレンシンターゼ変異体は、クズ(プエラリア(Pueraria)属)イソプレンシンターゼ変異体、またはポプラ(ポプラ(Populus) 属) イソプレンシンターゼ変異体である。
いくつかの実施形態では、1以上の残基はL26, E30, F31, Q33, L35, E36, N37, L39, K40, V41, K43, L44, R61, V62, D63, Q65, K87, E94, N95, L99, D100, N105, K137, E138, G143, E144, N182, L184, K185, G187, N189, T190, P225, H226, K247, T257, E258, M259, D266, N334, D353, S357, I358I, E361, N389, I392, I393, K398, E401, C421, Q423, Q424, E425, D426, H430, L432, R433, S434, D437, R443, L462, E463, H476, N478, D479, Q485, D508, P513, A515, Q532, Y533, L537, G538, R539, Y542, A543, 及び P557からなる群から選択されるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、1以上の残基はP24, N25, Y309, D310, L377, F381, E384, Y399, N402, A403, S406, S407, G409, A411, L413, F449, A456, T457, S458, A459, A460, E461, L462, E463, R464, G465, E466, T467, T468, N469, M523, S527, 及び Y531からなる群から選択されるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、1以上の残基はA20, N21, Y22, Q23, R271, W278, F299, V302, 及び S408からなる群から選択されるが、これらに限定されない。
また、この発明はSEQ ID NO: 2に示すアミノ酸配列を有するクズイソプレンシンターゼにおいてA20G置換を有する、単離されたイソプレンシンターゼ変異体に関する。
いくつかの実施形態では、本願の変異体は少なくとも2つ(2,3,4,5,6,7,8,9,または10)の置換を有し、置換のひとつはSEQ ID NO: 2に示すアミノ酸配列を有するクズイソプレンシンターゼにおけるA20G置換である。
また、この発明はSEQ ID NO: 2に示すアミノ酸配列を有するクズイソプレンシンターゼにおいてS408D置換を有する、単離されたイソプレンシンターゼ変異体に関する。
いくつかの実施形態では、本願の変異体は少なくとも2つ(2,3,4,5,6,7,8,9,または10)の置換を有し、置換のひとつは、SEQ ID NO: 2に示すアミノ酸配列を有するクズイソプレンシンターゼにおけるS408D置換である。
いくつかの好ましい実施形態では、本願のイソプレンシンターゼ変異体は、野生型イソプレンシンターゼと比較して少なくとも1の改善された性質を有する。
いくつかの特に好ましい実施形態では、少なくとも1の改善された性質は、比活性度(ジメチルアリルジホスフェートからのイソプレンの産出) 、及び溶解性から成る群から選択されるが、これらに限定されない。
【００１０】
さらに、この発明は本願のイソプレンシンターゼ変異体をコードするポリヌクレオチド配列に関する。
またこの発明は、本願のイソプレンシンターゼ変異体をコードするとともに、プロモータに作動可能に結合した発現ベクターに関する。
また別の実施形態では、この発明は前記発現ベクターを備える宿主細胞に関する。
また、この発明は前記宿主細胞の溶解物に関し、この溶解物にはリゾチームが含まれている。
いくつかの実施形態では溶解物のpHは中性(6.5から7.5)であり、別の実施形態では溶解物のpHは塩基性(7.5より高く9.5より低い)である。
またこの発明は、イソプレンを産出する方法に係り、この方法には (a)前記発現ベクターを備える宿主細胞を調製する工程と、(b)前記宿主細胞をイソプレン産出に適した条件下で培養する工程とが含まれる。いくつかの実施形態では、この方法にはさらに、(c) イソプレンを回収する工程が含まれる。いくつかの実施形態では、この方法にはさらに、(d) イソプレンを重合する工程が含まれる。
さらに、この発明はイソプレンシンターゼ活性の分析法に関し、この分析法は、(a) 前記発現ベクターを備える前記宿主細胞をイソプレンシンターゼ変異体の産出に適した条件下で培養する工程と、(b)リゾチームを含む溶解緩衝液で宿主細胞を溶解して細胞溶解物を生成させる工程と、(c) ジメチルアリルジホスフェート(DMAPP)から産出されたイソプレンを測定することにより、細胞溶解物中のイソプレンシンターゼ活性を分析する工程とが含まれる。
いくつかの実施形態では、宿主細胞はグラム陽性バクテリア細胞、グラム陰性バクテリア細胞、糸状菌類細胞、及びイースト細胞から成る群から選択されるが、これに限定されない。
いくつかの実施形態では、宿主細胞はエシェリキア(Escherichia)属 (E. coli)、パントエア(Panteoa) 属 (P. シトレア(citrea) )、バシラス(Bacillus) 属(B. スブチリス(subtilis))、ヤロウイア(Yarrowia) 属(Y. リポリティカ(lipolytica) )、及びトリコデルマ(Trichoderma) 属(T. リーゼイ(reesei)) から成る群から選択されるが、宿主細胞はこれらに限定されない。
いくつかの実施形態では、グルコース、グリセロール、グリセリン、ジヒドロキシアセトン、酵母エキス、バイオマス、糖蜜、ショ糖、及びオイルから選択される炭素源を含有する培地を用いて宿主細胞を培養するが、炭素源はこれらに限定されない。
【００１１】
さらに、この発明は複数のサンプル中のイソプレンを検出する方法（高速スクリーニング）に関し、この方法は(a)  i)各々がイソプレンシンターゼを含む複数のサンプル、ii) 複数のウエルを有するガラス板、及びiii) ガラス板のシール部材を準備する工程；(b) 複数のサンプルをガラス板の複数のウエルに入れる工程；(c) ガラス板をシール部材でシールして、複数のウエルの各々のサンプル上にヘッドスペースを有するシールされたガラス板を作成する工程；(d)イソプレンシンターゼが活性になる条件下でガラス板を培養する工程；及び(e) ヘッドスペース中のイソプレンを分析する工程から成る。
いくつかの実施形態では、イソプレンをガスクロマトグラフィー−質量分析(GC-MS)により分析する。いくつかの実施形態では、複数のサンプルには、プロモータに作動可能に結合されるとともに、イソプレンシンターゼ変異体をコードするポリヌクレオチド配列を有する発現ベクターを含む宿主細胞が含有されている。いくつかの実施形態では、複数のサンプルには、宿主細胞の溶解物、リゾチーム、及びジメチルアリルジホスフェート(DMAPP)が含有されている。いくつかの好ましい実施形態では、ガラス板はディープウエルガラスブロックである。いくつかの好ましい実施形態では、複数のウエルは少なくとも24ウエルである(好ましくは少なくとも48ウエル、より好ましくは少なくとも96ウエル、さらに好ましくは少なくとも192ウエル、最も好ましくは少なくとも384ウエルである)。特に好ましい実施形態では、複数のウエルの各ウエルの容積は2 ml以下である（好ましくは2 ml から0.2 ml）。
【００１２】
さらにこの発明は、プロモータに作動可能に結合されるとともにイソプレンシンターゼ変異体をコードする非相同ポリヌクレオチド配列を含む宿主細胞に関し、このイソプレンシンターゼ変異体は、SEQ ID NO: 2に示すアミノ酸配列を含むクズイソプレンシンターゼにおいて対応する位置の1以上（1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, または10）の残基が置換されている。いくつかの実施形態では、1以上の残基はL26, E30, F31, Q33, L35, E36, N37, L39, K40, V41, K43, L44, R61, V62, D63, Q65, K87, E94, N95, L99, D100, N105, K137, E138, G143, E144, N182, L184, K185, G187, N189, T190, P225, H226, K247, T257, E258, M259, D266, N334, D353, S357, I358I, E361, N389, I392, I393, K398, E401, C421, Q423, Q424, E425, D426, H430, L432, R433, S434, D437, R443, L462, E463, H476, N478, D479, Q485, D508, P513, A515, Q532, Y533, L537, G538, R539, Y542, A543, 及び P557から成る群から選択されるが、これに限定されない。
いくつかの実施形態では、1以上の残基はP24, N25, Y309, D310, L377, F381, E384, Y399, N402, A403, S406, S407, G409, A411, L413, F449, A456, T457, S458, A459, A460, E461, L462, E463, R464, G465, E466, T467, T468, N469, M523, S527, 及び Y531から成る群から選択されるが、これに限定されない。
いくつかの実施形態では、1以上の残基はA20, N21, Y22, Q23, R271, W278, F299, V302, 及びS408から成る群から選択されるが、これに限定されない。
またこの発明は、SEQ ID NO: 2に示すアミノ酸配列を有するクズイソプレンシンターゼにおいてA20G置換および／またはS408D置換を有する、単離されたイソプレンシンターゼ変異体に関する。
いくつかの好ましい実施形態では、イソプレンシンターゼ変異体は、野生型イソプレンシンターゼと比較して、少なくとも1の改善された性質を有する。特に好ましい実施形態では、少なくとも1の改善された性質は、比活性度 (ジメチルアリルジホスフェートからのイソプレンの産出)、及び溶解性から成る群から選択されるが、これに限定されない。
いくつかの好ましい実施形態では、ポリヌクレオチド配列はプラスミド中に含まれている。別の好ましい実施形態では、ポリヌクレオチド配列は宿主細胞の染色体に組み込まれている。いくつかの実施形態では、宿主細胞はグラム陽性バクテリア細胞、グラム陰性バクテリア細胞、糸状菌類細胞、及びイースト細胞から成る群から選択されるが、これに限定されない。
いくつかの実施形態では、宿主細胞はエシェリキア(Escherichia)属 (E. coli)、パントエア(Panteoa) 属 (P. シトレア(citrea) )、バシラス(Bacillus) 属(B. スブチリス(subtilis))、ヤロウイア(Yarrowia) 属(Y. リポリティカ(lipolytica) )、及びトリコデルマ(Trichoderma) 属(T. リーゼイ(reesei)) から成る群から選択されるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、グルコース、グリセロール、グリセリン、ジヒドロキシアセトン、酵母エキス、バイオマス、糖蜜、ショ糖、及びオイルから選択される炭素源を含有する培地を用いて宿主細胞を培養するが、炭素源はこれらに限定されない。
いくつかの実施形態では、宿主細胞にはさらに、IDIポリペプチドをコードする非相同または天然の核酸、および／または、DXSポリペプチドをコードする非相同または天然の核酸が含まれ、これらは天然のDXP経路 (例えば、E. coli中における天然のDXP経路に加え、dxs及びidiの発現)と組み合わされることがある。
あるいは、単一プロモータ制御発現、または強度が変化し（例GI 1.20, GI 1.5, またはGI 1.6）各遺伝子の1以上を制御するプロモータにより、全DXP経路(図15)がプラスミドにおいて発現されるか、またはオペロンとして染色体に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、宿主細胞にはさらにIDIポリペプチド及びDXSポリペプチドをコードする1以上の核酸が含まれ、いくつかの好ましい実施形態では、1のベクターがイソプレンシンターゼ変異体、 IDIポリペプチド及びDXSポリペプチドをコードする。
いくつかの実施形態では、宿主細胞にはさらにMVA経路ポリペプチド(例えばサッカロミセス・セレビシア(Saccharomyces cerevisia)、またはエンテロコッカス・ファエカリス(Enterococcus faecalis)由来の MVA経路ポリペプチド)をコードする非相同核酸が含まれている。
いくつかの実施形態では、宿主細胞にはさらにMVA経路ポリペプチド及びDXSポリペプチドをコードする核酸が含まれ、いくつかの好ましい実施形態では、1のベクターがイソプレンシンターゼ変異体、MVA経路ポリペプチド及びDXSポリペプチドをコードする。
いくつかの好ましい実施形態では、宿主細胞にはさらにDXSポリペプチド、IDIポリペプチド、または1以上の残りのDXP経路ポリペプチド、及びMVA経路ポリペプチドをコードする1以上の核酸が含まれている。いくつかの実施形態では、ベクターには選択マーカ(例えば 抗生物質耐性核酸)が含まれている。
また、この発明はイソプレンを産出する方法に関し、この方法には、(a) 宿主細胞をイソプレン産出に適した条件下で培養する工程と、(b) イソプレンを産出させる工程とが含まれる。いくつかの実施形態では、この方法にはさらに、(c) イソプレンを回収する工程が含まれる。いくつかの好ましい実施形態では、この方法にはさらに、(d) イソプレンを重合する工程が含まれる。
また、この発明はイソプレンシンターゼを産出する方法に関し、この方法には、(a) (i)宿主細胞；及び(ii)プロモータに作動可能に結合し、イソプレンシンターゼ変異体をコードする核酸を準備する工程であって、前記イソプレンシンターゼ変異体がSEQ ID NO: 2に示すアミノ酸配列を有するクズイソプレンシンターゼにおいて対応する位置の1以上（1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, または10）の残基における置換を有する工程と、
(b) 前記宿主細胞を前記核酸に接触させて形質転換された宿主細胞を調製する工程と、(c) 形質転換された宿主細胞をイソプレンシンターゼの産出に適した条件下で培養する工程とが含まれる。
【００１３】
別の側面では、この発明は単離されたポプライソプレンシンターゼ変異体に関する。ひとつの実施形態では、イソプレンシンターゼ変異体はイソプレンシンターゼのN-末端部位に切断を有する。別の実施形態では、イソプレンシンターゼ変異体は、全長イソプレンシンターゼと比較して改善された比活性度を有する。別の実施形態では、イソプレンシンターゼ変異体はSEQ ID NO: 120に示す、P. アルバ(alba)イソプレンシンターゼである。
別の実施形態では、変異体はMEA変異体 (SEQ ID NO: 122)、MSV変異体(SEQ ID NO: 124)、MVS変異体(SEQ ID NO: 126)、MTE変異体(SEQ ID NO: 128)、MNV変異体(SEQ ID NO: 130)から成る群から選択される。
別の実施形態では、変異体はMEA変異体 (SEQ ID NO: 122)である。
別の実施形態では、変異体はTRC (-3)変異体(SEQ ID NO: 136)、TRC (-4)変異体(SEQ ID NO: 138)、TRC (-5) 変異体(SEQ ID NO: 140)、TRC (-6)変異体(SEQ ID NO: 142)、及びTRC (-7) 変異体(SEQ ID NO: 144) から成る群から選択される。
別の実施形態では、変異体は、ポプラ・トレムロイデス(以下P. tremuloides)イソプレンシンターゼ (SEQ ID NO: 146)のMET変異体である。
別の実施形態では、変異体は、ポプラ・トリコカーパ(以下P. trichocharpa) イソプレンシンターゼ(SEQ ID NO: 148である。
【００１４】
別の側面では、この発明は単離されたポプライソプレンシンターゼ変異体に関し、このイソプレンシンターゼ変異体は野生型イソプレンシンターゼのアミノ酸残基の1以上が置換されたものであり、このイソプレンシンターゼ変異体は、野生型イソプレンシンターゼと比較して、向上したイソプレンシンターゼ活性を有する。
ひとつの実施形態では、向上したイソプレンシンターゼ活性は、ジメチルアリルピロホスフェート (DMAPP)の存在下において、イソプレン変異体を含む宿主細胞の方が親イソプレンシンターゼを含む宿主細胞より速く成長することにより示される。
別の実施形態では、イソプレンシンターゼはSEQ ID NO: 120に示すP. アルバイソプレンシンターゼである。
別の実施形態では、イソプレンシンターゼ変異体は、V10M, F12S, T15A, E18G, V58I, V58F, L70Q, L70V, L70T, T71P, V79L, E89D, G94A, S119F, F120L, G127R, E175V, T212I, S257A, R262G, A266G, F280L, N297K, F305L, L319M, E323K, A328T, D342E, A359T, K366N, E368D, L374M, S396T, V418S, K438N, H440R, T442I, T442A, I449V, A469S, K500R, K505Q, G507S, S509N, F511Y, 及びN532Kから成る群から選択される1以上のアミノ酸置換を有する。
別の実施形態では、少なくとも1のアミノ酸置換はL70R置換である。別の実施形態では、イソプレンシンターゼ変異体は、G127R/F511Y, L70Q/G94A/R262G/F305L, F12S/ T15A/E18G/N297K, S396T/T442I, V10M/E323K, F120L/A266G, K438N/K500R, V79L/S509N, E175V/S257A/E368D/A469S, T71P/L374M, F280L/H440R, E89D/H440R, V58F/A328T/N532K, S119F/D342E/I449V, 及び K366N/G507Sから成る群から選択される1以上のアミノ酸置換を有する。
【００１５】
別の側面では、この発明はSEQ ID NO: 120 (図19)に示すアミノ酸残基を含むポリペプチドの結晶形態に関する。
【００１６】
別の側面では、この発明はイソプレンを産出する方法に関し、この方法には (a)イソプレンシンターゼ変異体をコードするポリヌクレオチド配列を有する発現ベクターを備える宿主細胞を調製する工程と、(b)前記宿主細胞をイソプレン産出に適した条件下で培養する工程とが含まれる。ひとつの実施形態では、この方法にはさらに (c)イソプレンを回収する工程が含まれる。別の実施形態では、この方法にはさらに (d)イソプレンを重合する工程が含まれる。
【００１７】
別の側面では、この発明はイソプレンシンターゼ活性を分析する方法に関し、この方法は：(a)発現ベクターを含む宿主細胞を、イソプレンシンターゼ変異体の産出に適した条件下で培養する工程と；(b)リゾチームを含む溶解緩衝液で宿主細胞を溶解して細胞溶解物を生成させる工程と、(c) ジメチルアリルジホスフェート(DMAPP)から産出されたイソプレンを測定することにより、細胞溶解物中のイソプレンシンターゼ活性を分析する工程とが含まれる。
いくつかの実施形態では、宿主細胞はグラム陽性バクテリア細胞、グラム陰性バクテリア細胞、糸状菌類細胞、及びイースト細胞から成る群から選択される。
別の実施形態では、宿主細胞はエシェリキア(Escherichia)属 (E. coli)、パントエア(Panteoa) 属 (P. シトレア(citrea) )、バシラス(Bacillus) 属(B. スブチリス(subtilis))、ヤロウイア(Yarrowia) 属(Y. リポリティカ(lipolytica) )、及びトリコデルマ(Trichoderma) 属(T. リーゼイ(reesei)) から成る群から選択される。
別の実施形態では、グルコース、グリセロール、グリセリン、ジヒドロキシアセトン、酵母エキス、バイオマス、糖蜜、ショ糖、及びオイルから選択される炭素源を含有する培地を用いて宿主細胞を培養する。
【００１８】
別の側面では、この発明はプロモータに作動可能に結合されるとともにイソプレンシンターゼ変異体をコードする非相同ポリヌクレオチド配列を含む宿主細胞に関し、このイソプレンシンターゼ変異体は、ポプライソプレンシンターゼにおいて対応する1以上の残基の位置（1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, または10）に置換を有する。
ひとつの実施形態では、イソプレンシンターゼはSEQ ID NO: 120に示すP. アルバイソプレンシンターゼである。別の実施形態では、変異体はMEA変異体 (SEQ ID NO: 122)、MSV変異体(SEQ ID NO: 124)、MVS変異体(SEQ ID NO: 126)、MTE変異体(SEQ ID NO: 128)、MNV変異体(SEQ ID NO: 130)から成る群から選択される。
別の実施形態では、変異体はTRC (-3)変異体(SEQ ID NO: 136)、TRC (-4)変異体(SEQ ID NO: 138)、TRC (-5) 変異体(SEQ ID NO: 140)、TRC (-6)変異体(SEQ ID NO: 142)、及びTRC (-7) 変異体(SEQ ID NO: 144) から成る群から選択される。
別の実施形態では、変異体は、P. tremuloidesイソプレンシンターゼ (SEQ ID NO: 146)のMET変異体である。
別の実施形態では、変異体は、P. trichocharpa イソプレンシンターゼ(SEQ ID NO: 148である。
別の実施形態では、イソプレンシンターゼ変異体は、V10M, F12S, T15A, E18G, V58I, V58F, L70Q, L70V, L70T, T71P, V79L, E89D, G94A, S119F, F120L, G127R, E175V, T212I, S257A, R262G, A266G, F280L, N297K, F305L, L319M, E323K, A328T, D342E, A359T, K366N, E368D, L374M, S396T, V418S, K438N, H440R, T442I, T442A, I449V, A469S, K500R, K505Q, G507S, S509N, F511Y, 及びN532Kから成る群から選択される1以上のアミノ酸置換を有する。
別の実施形態では、少なくとも1のアミノ酸置換はL70R置換である。別の実施形態では、イソプレンシンターゼ変異体は、G127R/F511Y, L70Q/G94A/R262G/F305L, F12S/ T15A/E18G/N297K, S396T/T442I, V10M/E323K, F120L/A266G, K438N/K500R, V79L/S509N, E175V/S257A/E368D/A469S, T71P/L374M, F280L/H440R, E89D/H440R, V58F/A328T/N532K, S119F/D342E/I449V, 及び K366N/G507Sから成る群から選択される1以上のアミノ酸置換を有する。
別の実施形態では、ポリヌクレオチド配列はプラスミド中に含まれている。別の実施形態では、ポリヌクレオチド配列は宿主細胞中の染色体に組み込まれている。
別の実施形態では、宿主細胞はグラム陽性バクテリア細胞、グラム陰性バクテリア細胞、糸状菌類細胞、及びイースト細胞から成る群から選択される。
別の実施形態では、宿主細胞はエシェリキア(Escherichia)属 (E. coli)、パントエア(Panteoa) 属 (P. シトレア(citrea) )、バシラス(Bacillus) 属(B. スブチリス(subtilis))、ヤロウイア(Yarrowia) 属(Y. リポリティカ(lipolytica) )、及びトリコデルマ(Trichoderma) 属(T. リーゼイ(reesei)) から成る群から選択される。
別の実施形態では、グルコース、グリセロール、グリセリン、ジヒドロキシアセトン、酵母エキス、バイオマス、糖蜜、ショ糖、及びオイルから選択される炭素源を含有する培地を用いて宿主細胞を培養する。
別の実施形態では、宿主細胞にはさらに、IDIポリペプチドをコードする非相同または天然の核酸、および／または、DXSポリペプチドをコードする非相同または天然の核酸が含まれ、これらは天然のDXP経路と組み合わされていてもよい。
別の実施形態では、宿主細胞にはさらにIDIポリペプチド及びDXSポリペプチドをコードする1以上の核酸が含まれる。
別の実施形態では、1のベクターがイソプレンシンターゼ変異体、 IDIポリペプチド及びDXSポリペプチドをコードする。
別の実施形態では、宿主細胞にはさらに、サッカロミセス・セレビシア(Saccharomyces cerevisia) 由来の MVA経路ポリペプチド、及びエンテロコッカス・ファエカリス(Enterococcus faecalis)由来の MVA経路ポリペプチドから成る群から選択されるMVA経路ポリペプチドをコードする非相同核酸が含まれている。
別の実施形態では、宿主細胞にはさらにMVA経路ポリペプチド及びDXSポリペプチドをコードする1以上の核酸が含まれ、1のベクターがイソプレンシンターゼ変異体、MVA経路ポリペプチド及びDXSポリペプチドをコードする。
別の実施形態では、宿主細胞にはさらにDXSポリペプチド、IDIポリペプチド、または1以上の残りのDXP経路ポリペプチド、及びMVA経路ポリペプチドをコードする1以上の核酸が含まれている。
【００１９】
別の側面では、この発明はイソプレンを産出する方法に関し、この方法には、(a) プロモータに作動可能に結合されるとともに、イソプレンシンターゼ変異体をコードする非相同ポリヌクレオチド配列を含む宿主細胞を、イソプレン産出に適した条件下で培養する工程であって、前記イソプレンシンターゼ変異体がポプライソプレンシンターゼにおいて対応する位置の1以上（1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, または10）の残基における置換を有する工程と、(b) イソプレンを産出する工程とが含まれる。
ひとつの実施形態では、この方法にはさらに(c)イソプレンを回収する工程が含まれる。別の実施形態では、この方法にはさらにイソプレンを重合する工程が含まれる。
【００２０】
別の側面では、この発明はイソプレンシンターゼを産出させる方法に関し、この方法には、(a) (i)宿主細胞；及び(ii)プロモータに作動可能に結合し、イソプレンシンターゼ変異体をコードする核酸を準備する工程であって、前記イソプレンシンターゼ変異体がSEQ ID NO: 120に示すアミノ酸配列を有するP. アルバイソプレンシンターゼにおいて対応する位置の1以上（1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, または10）の残基における置換を有する工程と、
(b) 前記宿主細胞を前記核酸に接触させて形質転換された宿主細胞を調製する工程と、(c) 形質転換された宿主細胞をイソプレンシンターゼの産出に適した条件下で培養する工程とが含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】エシェリキア・コリ(Escherichia coli)中での発現にコドン最適化された、クズ(プエラリア・モンタナ(Pueraria montana))イソプレンシンターゼのコード配列(SEQ ID NO:1)を表わす。
【図２】クズイソプレンシンターゼのアミノ酸配列(SEQ ID NO:2) を表わす。
【図３】エシェリキア・コリ中での発現にコドン最適化された、ポプラ(Populus alba x tremula)イソプレンシンターゼのコード配列(SEQ ID NO:6)を表わす。
【図４】ポプラ(Populus alba x tremula)イソプレンシンターゼのアミノ酸配列(SEQ ID NO:7)を表わす。
【図５】クズイソプレンシンターゼの相同性モデルを表し、システイン残基を空間充填分子団(space filling molecules)として強調して図示した。
【図６】ポプライソプレンシンターゼの相同性モデルを表し、システイン残基を空間充填分子団として強調して図示した（ダークグレー）。さらに、このポプラのモデルに、図5のクズのモデルのシステイン残基を空間充填分子団(ライトグレー)として表して、重ね合わせて図示した。
【図７】実施例5のクズIspSシステイン変異体の成長曲線を表わすグラフである。
【図８】溶解細胞から得たクズIspSシステイン変異体のSDS-PAGE分析結果を表わす。ペレットと上清分画は、遠心分離により調製した。
【図９】プラスミドMCM93 (pCR2.1 -Kudzu)のマップを表わす。
【図１０】プラスミドMCM93 (SEQ ID NO:22)のヌクレオチド配列を表わす。
【図１１】pET24D-Kudzuのマップを表わす。
【図１２】pET24D-Kudzu (SEQ ID NO:23)のヌクレオチド配列を表わす。
【図１３】kudzuイソプレンシンターゼ封入体のSDS-PAGE分析結果を表す。レーンMには分子量マーカが含まれ、他のレーンには濃度が漸増する封入体精製調合液が含まれている。kudzuイソプレンシンターゼの純度は>90%と見積もられた。
【図１４】kudzu部位評価ライブラリ(SEL)に含まれる、位置Y22, A20及びS408の構成メンバーのイソプレンシンターゼ活性を表すグラフである。大部分の構成メンバーは、活性が大幅に低下しているが、同類置換の場合は活性の低下の度合いが小さい。図14 Aでは、Y22ライブラリメンバーのアッセイの結果を、独立の野生型のサンプル(丸印で示すWT)と比較して図示している。図14 Bでは、A20ライブラリメンバーのアッセイの結果を、野生型のサンプル(丸印で示すWT)と比較して表している。図14 CはS408ライブラリメンバーのアッセイの結果を表しており、S408Dメンバーは野生型コントロールの平均値より1.5から2倍高い活性を有することを示している。
【図１５】イソプレンのMVA 及び DXP代謝経路を表す(F. Bouvier et al., Progress in Lipid Res. 44: 357-429, 2005に基づく)。以下に、各経路における各ポリペプチドの代替名と、そのポリペプチドの活性を測定する方法が記載されている参考文献を示す。（これらの参考文献を、その全内容、特にMVA及びDXP経路における各ポリペプチドの活性を測定する方法に関して、参照として本願に組み込む。）＜メバロン酸経路＞: [AACT]; アセチル-CoA アセチルトランスフェラーゼ, MvaE, EC 2.3.1.9. 測定方法: J. Bacteriol., 184: 2116-2122, 2002; [HMGS]; ヒドロキシメチルグルタアリール-CoA シンターゼ, MvaS, EC 2.3.3.10. 測定方法: J. Bacteriol., 184: 4065-4070, 2002; [HMGR]; 3-ヒドロキシ-3-メチルグルタアリール-CoA リダクターゼ, MvaE, EC 1.1.1.34. 測定方法: J. Bacteriol., 184: 2116-2122, 2002; [MVK]; メバロン酸塩キナーゼ, ERG12, EC 2.7.1.36. 測定方法: Curr Genet 19:9-14, 1991. [PMK]; ホスホメバロン酸塩キナーゼ, ERG8, EC 2.7.4.2, 測定方法: MoI Cell Biol, 11:620-631, 1991; [DPMDC]; ジホスホメバロン酸塩デカルボキシラーゼ, MVDl, EC 4.1.1.33. 測定方法: Biochemistry, 33:13355-13362, 1994; [IDI]; イソペンテニル-ジホスフェート デルタ-イソメラーゼ, IDI1; EC 5.3.3.2. 測定方法: J. Biol. Chem. 264:19169-19175, 1989. ＜DXP Pathway＞ [DXS]; l-デオキシキシルロース-5-ホスフェート シンターゼ, dxs, EC 2.2.1.7. 測定方法: PNAS, 94:12857-62, 1997; [DXR]; 1-デオキシ-D-キシルロース5-ホスフェート リダクトイソメラーゼ, dxr, EC 2.2.1.7. 測定方法: Eur. J. Biochem. 269:4446- 4457, 2002; [MCT]; 4-ジホスホシチジル-2C-メチル-D-エリスリトール シンターゼ, IspD, EC 2.7.7.60. 測定方法: PNAS, 97: 6451-6456, 2000; [CMK]; 4-ジホスホシチジル-2-C-メチル-D-エリスリトール キナーゼ, IspE, EC 2.7.1.148. 測定方法: PNAS, 97:1062-1067, 2000; [MCS]; 2C-メチル-D- エリスリトール2,4-シクロジホスフェート シンターゼ, IspF, EC 4.6.1.12. 測定方法: PNAS, 96:11758-11763, 1999; [HDS]; l-ヒドロキシ-2-メチル-2-(E)-ブテニル 4-ジホスフェート シンターゼ, ispG, EC 1.17.4.3. 測定方法: J. Org. Chem., 70:9168 -9174, 2005; [HDR]; l-ヒドロキシ-2-メチル-2-(E)- ブテニル4-ジホスフェート リダクターゼ, IspH, EC 1.17.1.2. 測定方法: JACS, 126:12847-12855, 2004.
【図１６】pDu27のマップを表わす。
【図１７】pDu27中の6Xhis N-末端標識P. アルバIspSのアミノ酸配列(SEQ ID NO: 118) を表わす。
【図１８】プラスミドpDu27のヌクレオチド配列(SEQ ID NO: 119) を表わす。
【図１９】pET24a中の全長P. アルバ IspSのアミノ酸配列(SEQ ID NO: 120)を表わす。下線を付した残基は、プラスミドpDu39からpDu43におけるIspS中のN-末端切断位置を表わす。
【図２０】プラスミドP. アルバ pET24aのヌクレオチド配列(SEQ ID NO: 121) 表わす。
【図２１】精製されたIspSは、SDS-PAGE分析による低分子量「ダブレット」を示すことを表わす。
【図２２】質量分析により同定されたトリプシンペプチドを表わす。
【図２３】P. アルバ IspSのN-末端切断を有するpDu40, pDu41, pDu42 及びpDu43のマップを表わす。
【図２４】pET24a-P. アルバMEA未標識(MD09- 173株中)である、Pdu39のマップを表わす。
【図２５】pDu39中のP.アルバIspSの切断された"MEA"変異体のアミノ酸配列(SEQ ID NO: 122) を表わす。
【図２６】プラスミドpDu39のヌクレオチド配列(SEQ ID NO: 123) を表わす。
【図２７】pDu41中のP.アルバIspSの切断された"MSV"変異体のアミノ酸配列(SEQ ID NO: 124) を表わす。
【図２８】プラスミドpDu41のヌクレオチド配列(SEQ ID NO: 125) を表わす(pET24a-P.アルバ(MSV) 未標識)。
【図２９】pDu43中のP.アルバIspSの切断された"MVS"変異体のアミノ酸配列(SEQ ID NO: 126) を表わす。
【図３０】プラスミドDu43のヌクレオチド配列(SEQ ID NO: 127) を表わす(pET24a-P.アルバ(MVS) 未標識)。
【図３１】pDu42中のP. アルバ IspSの切断された"MTE" 変異体のアミノ酸配列(SEQ ID NO: 128) を表わす。
【図３２】プラスミドpDu42のヌクレオチド配列(SEQ ID NO: 129) を表わす(pET24a-P.アルバ(MTE)未標識)。
【図３３】pDu40中の切断された"MNV"P. アルバIspSのアミノ酸配列(SEQ ID NO: 130) を表わす。
【図３４】プラスミドpDu40のヌクレオチド配列(SEQ ID NO: 131) を表わす(pET24a-P.アルバ(MNV) 未標識)。
【図３５】C-末端TEV, 6XHis-標識IspS変異体の、MD09-161 及び MD09-163のマップを表わす。
【図３６】MD09-163中のP. アルバMEA(+)TEVのアミノ酸配列(SEQ ID NO: 132) を表わす。
【図３７】プラスミドMD09-163のヌクレオチド配列 (SEQ ID NO: 133)を表わす(pET24a-P.アルバ MEA(+)TEV)。CDSに下線を付し、TEVプロテアーゼ部位を太字で示した。
【図３８】MD09-161中のP. アルバ FL(+)TEVのアミノ酸配列(SEQ ID NO: 134)を表わす。
【図３９】プラスミドMD09-161のヌクレオチド配列(SEQ ID NO: 135)を表わす(pET24a-P.アルバ FL(+)TEV)。CDSに下線を付し、TEVプロテアーゼ部位を太字で示した。
【図４０】MD09-167, 全長(FL), MD09-165, 及び 切断されたイソプレンシンターゼ(MD09-173)の比活性度を表わすグラフである。全細胞溶解物の上清中に100 mM Tris, 100 mM NaCl, 50 mM MgCl2, 5 mM DMAPP, 及び2.5〜4.5 μgのイソプレンシンターゼが含まれる溶液を、30℃で15分間反応させた。
【図４１】Rate/[E] と[DMAPP]の関係を表わすグラフである。×はMD09-173を表わし、丸はMD09-167を表わし、ひし形はMD09-165を表わし、四角は全長IspSを表わす。
【図４２】イソプレンシンターゼの活性と[DMAPP]の関係を表わすグラフである。×はMD09-173切断イソプレンシンターゼのデータを表わす。丸はMD09-167イソプレンシンターゼのデータを表わす。ひし形はMD09-165イソプレンシンターゼのデータを表わす。四角は全長イソプレンシンターゼのデータを表わす。各データは、個別の培養培地で3回測定して採取した。
【図４３】kcat及び KM及びKiの変化が反応速度に及ぼす影響を表すグラフである。図43 Aにおいて、ライン1は切断イソプレンシンターゼ活性の速度式を、DMAPP濃度を変化させてプロットした全長イソプレンシンターゼの速度式で割ったものである。ライン2は、kcatを切断イソプレンシンターゼのkcatで置換した全長イソプレンシンターゼの速度式を、全長イソプレンシンターゼの速度式で割ったものである。ライン3は、KMを切断イソプレンシンターゼのKMで置換した全長イソプレンシンターゼの速度式を、全長イソプレンシンターゼの速度式で割ったものである。ライン4は、Kiを切断イソプレンシンターゼのKiで置換した全長イソプレンシンターゼの速度式を、全長イソプレンシンターゼの速度式で割ったものである。図43Bは、切断イソプレンシンターゼの速度式及び全長イソプレンシンターゼの速度式の比率と、DMAPP濃度との関係を、データフィッティングして表すグラフである。
【図４４】メバロン酸(MVA)によるMCM531の成長阻害を表わすグラフである。細胞は、ミクロタイタープレートを用いて、MVA濃度が異なるTM3培地上で培養した。4個のウエルのOD600を、図示した時間において測定した。
【図４５】L70 SSLプレートによるDMAPP評価を表わすグラフである。黒棒は全長(P. アルバpET24a)またはpDU39 (切断)のコントロールサンプルを示す。C3 (27), D3 (39), またはE3 (51)の各ウエルの変異体をさらに分析した。
【図４６】タンパク質分析に基づきDMAPP評価に供した全ての変異体の平均比活性度表わすグラフである。エラーバーは標準偏差を表す。3種のL70R変異体は、いずれもコントロール(WT) より高い活性を示した。
【図４７】全ての3 L70R変異体の平均比活性度を、"MEA" 切断P. アルバ IspS 酵素と比較して表わすグラフである。エラーバーは、標準偏差を表す。
【図４８】プラスミドpDu47-3, pDu47-4, 及び pDu47-5のマップを表す。
【図４９】プラスミドpDu47-6, pDu47-7, 及びpDu48のマップを表す。
【図５０】プラスミドpDu49, pDu50及び pDu50-4のマップを表す。
【図５１】pDu47-3中のP. アルバ TRC (-3)のアミノ酸配列(SEQ ID NO: 136) を表す。
【図５２】プラスミドpDu47-3のヌクレオチド配列(SEQ ID NO: 137) を表す。
【図５３】pDu47-4中のP. アルバ TRC (-4)のアミノ酸配列(SEQ ID NO: 138) を表す。
【図５４】プラスミドpDu47-4のヌクレオチド配列(SEQ ID NO: 139) を表す。
【図５５】pDu47-5中のP. アルバ TRC (-5)のアミノ酸配列(SEQ ID NO: 140) を表す。
【図５６】プラスミドpDu47-5のヌクレオチド配列(SEQ ID NO: 141) を表す。
【図５７】pDu47-6中のP. アルバ TRC (-6)のアミノ酸配列(SEQ ID NO: 142) を表す。
【図５８】プラスミドpDu47-6のヌクレオチド配列(SEQ ID NO: 143) を表す。
【図５９】pDu47-7中のP. アルバ TRC (-7)のアミノ酸配列(SEQ ID NO: 144) を表す。
【図６０】プラスミドpDu47-7のヌクレオチド配列(SEQ ID NO: 145) を表す。
【図６１】pDu48中のP. tremuloides TRC (MET) のアミノ酸配列 (SEQ ID NO: 146)を表す。
【図６２】プラスミドpDu48のヌクレオチド配列 (SEQ ID NO: 147) を表す。
【図６３】pDu49中のP. trichocarpa (TRC)のアミノ酸配列(SEQ ID NO: 148) を表す。
【図６４】プラスミドpDu49のヌクレオチド配列 (SEQ ID NO: 149)を表す。
【図６５】pDu50中のKudzu TRC (MEA)のアミノ酸配列(SEQ ID NO: 150) を表す。
【図６６】プラスミドpDu50のヌクレオチド配列 (SEQ ID NO: 151) を表す。
【図６７】pDu50-4中のKudzuTRC (-4)のアミノ酸配列(SEQ ID NO: 152) を表す。
【図６８】プラスミドpDu50-4のヌクレオチド配列 (SEQ ID NO: 153) を表す。
【図６９】IspSの切断変異体のDMAPP評価における生データ及びOD-規格化データを表すグラフである。
【図７０】切断IspSの比活性度を表すグラフである。切断P. アルバ, 切断P. tremuloides 及び切断P. trichocharpaの比活性度を、P. アルバ「全長」変異体の比活性度と比較した。
【図７１】プラスミドp9795のマップを表す。
【図７２】プラスミドp9795のヌクレオチド配列を表す(SEQ ID NO: 154)。
【図７３】プラスミドpTrc Kudzuのマップを表す。
【図７４】プラスミドpTrc Kudzuのヌクレオチド配列を表す(SEQ ID NO: 155)。
【図７５】プラスミドpMAL-C4Xのマップを表す。
【図７６】プラスミドpMAL-C4Xのヌクレオチド配列を表す(SEQ ID NO: 156)。
【図７７】プラスミドpMAL-C4X-Kudzuのマップを表す。
【図７８】プラスミドpMAL-C4X-Kudzuのヌクレオチド配列を表す(SEQ ID NO: 157)。
【図７９】プラスミドpET24、P. tremuloides pET24a、及びP. trichocharpa pET24aの各マップを表す。
【図８０】P. trichocharpa pET24a中のP. tremuloides IspSのアミノ酸配列(SEQ ID NO: 158) を表す。
【図８１】プラスミドP. tremuloides pET24aのヌクレオチド配列 (SEQ ID NO: 159) を表す。
【図８２】P. trichocharpa pET24a中のP. trichocharpa IspSのアミノ酸配列(SEQ ID NO: 160) を表す。
【図８３】プラスミドP. trichocharpa pET24aのヌクレオチド配列 (SEQ ID NO: 161) を表す。
【図８４】プラスミドpDu30, pDu31,及び pDu32の各マップを表す。
【図８５】pDu30中のIspS 変異体P.アルバTRC-pET200のアミノ酸配列(SEQ ID NO: 162) を表す。
【図８６】pDu30のヌクレオチド配列 (SEQ ID NO: 163)を表す。
【図８７】pDu31中のIspS 変異体P.tremTRC-pET200のアミノ酸配列(SEQ ID NO: 164) を表す。
【図８８】pDu31のヌクレオチド配列 (SEQ ID NO: 165) を表す。
【図８９】pDu32中のIspS 変異体P.trichTRC-pET200のアミノ酸配列(SEQ ID NO: 166) を表す。
【図９０】pDu32のヌクレオチド配列 (SEQ ID NO: 167) を表す。
【図９１】P. tremuloides IspSの二量体の三次元構造を表す。A鎖はダークグレー、B鎖は中間のグレー、各活性サイトの一価のマグネシウムイオンはライトグレーで示した。
【図９２】P. tremuloides IspSの構造の単量体の外観を表す。マグネシウムをライトグレーの球で示し、N- 及び C-末端を図示した。
【図９３】(A) BdpS 及びLS間、 (B) BdpS 及び poplar IspS間、(C) LS 及びポプラIspS間、及び (D) TEAS 及びポプラIspS間の各構造アライメントを表す。いずれの場合にも、第1構造をライトグレーで示し、第2構造をダークグレーで示した。二価のカチオンは、球で示した。
【図９４】BdpS 及び LS中のループの三次元構造を表す。図Aでは、LsのN-末端ループをライトグレーで図示し、BdpSのN-末端ループをダークグレーで図示している。図Bは、Loop IとLoop IIが、構造的に相同であることを表している。
【図９５】BdpSのN-末端ループ（ダークグレー）とポプラIspSのN-末端ループ（ライトグレー）は、構造的に異なることを表している。図AはN-末端ループを表し、図BはLoop IとLoop IIを表している。
【図９６】LSのN-末端ループ（ライトグレー）とポプラIspSのN-末端ループ（ダークグレー）は、構造的に異なることを表している。図AはN-末端ループを表し、図BはLoop IとLoop IIを表している。
【図９７】TEASのN-末端ループ（ライトグレー）とポプラIspSのN-末端ループ（ダークグレー）は、構造的に異なることを表している。図AはN-末端ループを表し、図BはLoop IとLoop IIを表している。TEAS中のLoop Iは乱れている。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
この発明は、改善された触媒活性および／または溶解性を有するイソプレンシンターゼ酵素を少なくとも1含む組成物及び方法に関する。この発明は特に、微生物宿主細胞中におけるイソプレン産出量が向上した植物性イソプレンシンターゼ変異体に関する。この発明の微生物により産出されたイソプレンは、ゴム及びエラストマーの製造において有用である。
【００２３】
特に断りの無い限り、この発明を実施するとき分子生物学、微生物学及び組み換えDNAの分野で当業にとって公知の方法が用いられる。このような方法は当業によく知られており、多くの文献及び論文に記載されている（例えばSambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual," Second Edition, Cold Spring Harbor, 1989; 及び Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology," 1987参照）。
【００２４】
特に断りの無い限り、全ての技術用語及び科学用語は、この発明が属する技術分野における通常の意味に従う。以下の用語について、その意味を明確にするために定義する。本願で用いる用語の意義の解釈には、例えばSingleton and Sainsbury, Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, 2d Ed., John Wiley and Sons, NY (1994); 及び Hale and Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology, Harper Perennial, NY (1991) を辞書として用いることができる。
この発明を実施する際には、本願に開示した方法及び材料と同様または均等なものを用いることができるが、本願には好ましい方法及び材料を開示した。従って、下記の定義は、明細書全体を参照してより完全に定義される。
【００２５】
また、文中の見出しはこの発明の様々な側面を限定するものではなく、明細書全体にわたり参照される。すなわち下記の定義は、明細書全体を参照してより完全に定義される。しかし、この発明の理解を容易にするために、以下の用語について、その意味を定義する。
【００２６】
＜定義＞
特に断りの無い限り、全ての技術用語及び科学用語は、この発明が属する技術分野における通常の意味に従う。この発明を実施する際には、本願に開示した方法及び材料と同様または均等なものを用いることができるが、本願には好ましい方法及び材料を開示した。従って、下記の定義は、明細書全体を参照してより完全に定義される。
【００２７】
特に断りの無い限り、原文の"a", "an,"及び"the"等の単数形には、複数形も含まれる。特に断りの無い限り、核酸配列は5' から 3'方向が左から右方向になるように記載し、アミノ酸配列はアミノ基からカルボキシル基方向が左から右方向になるように記載する。この発明は本願に開示した特定の方法、手段、試薬に限定されず、当業者が用いる通常の法、手段、試薬により種々変更することができる。
【００２８】
本願に記載された全ての上限値には、本願に明示の記載がなくても、本願に記載された全ての下限値が組み合わされる。本願に記載された全ての下限値には、本願に明示の記載がなくても、本願に記載された全ての上限値が組み合わされる。数値範囲が記載されているとき、本願に明示の記載がなくても、上限値と下限値の間の中間の数値が含まれる。
【００２９】
本願に引用する文献はすべて参照として本願に組み込まれる。しかし、本願に引用する刊行物が本願発明の範囲の先行技術を構成することを認めたものと解釈してはならない。
【００３０】
本願で言う2-メチル-l,3-ブタジエン(CAS# 78-79-5 ) (「イソプレン」)とは、3,3-ジメチルアリルピロホスフェート(DMAPP)からピロホスフェートを除去した直接かつ最終製品を意味し、 IPP分子のDMAPP分子への結合または重合を備えない。本願では、「イソプレンシンターゼ」及び「IspS」とは、ジメチルアリルピロホスフェート(DMAPP)からのピロホスフェートの除去を触媒してイソプレンを産出させる酵素を意味する。いくつかの好ましい実施形態では、IspSはクズ(kudzu)、ポプラ(poplar)、またはアカガシワ(red oak)等の植物から得られる酵素である。いくつかの実施形態では、「IspS」とは天然の成熟酵素、またはその一部を意味する。
【００３１】
関連する（または誘導体）タンパク質は「変異体タンパク質」から成る。いくつかの実施形態では、複数の変異体タンパク質は互いに、または親タンパク質（例えばSEQ ID NO:2に示すクズIspS、またはポプラIspS）とは、いくつかのアミノ酸残基が異なる。異なるアミノ酸残基の数は1以上であり、好ましくは1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, またはそれ以上のアミノ酸残基が異なる。いくつかの好ましい実施形態では、複数の変異体間で異なるアミノ酸の数は1から10である。いくつかの好ましい実施形態では、関連するタンパク質、及び特に変異体タンパク質は、アミノ酸配列同一性を少なくとも35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, または99%有する。さらに、本願の関連するタンパク質または変異体タンパク質は、他の関連するタンパク質または親タンパク質とは突起領域の数が異なるタンパク質を意味する。例えば、いくつかの実施形態では、変異体タンパク質は、対応する親タンパク質とは異なる突起領域を1, 2, 3, 4, 5, または 10備える。
【００３２】
この発明の酵素の変異体を生成させるために適した方法は公知であり、例えば部位飽和変異導入法、系統的変異導入法、挿入変異導入法、ランダム変異導入法、部位特異的変異導入法、定向進化、及びその他の様々な組み換え方法等であるが、これらに限定されない。
【００３３】
野生型及び突然変異タンパク質の分析には、適した手段または「試験」であればどのような方法でも用いることができ、対象とする性質の評価方法に基づくことが好ましい。例えば、この発明の実施形態では、1以上の次の性質を評価する：pH安定性; 熱安定性; 酸化に対する安定性; タンパク質分解に対する安定性; 溶解性; in vitroでのDMAPPからイソプレンへの転換のKm および／または比活性度; 宿主有機体(例えばE. coli)中におけるin vitroでのDMAPPからイソプレンへの転換のKm および／または比活性度;  及びDXP 経路および／またはMVA 経路の酵素の発現。この発明では、1以上の試験条件において様々な程度の安定性, 溶解性, 活性, および／または発現レベルを有する酵素を用いることを意図している。
【００３４】
本願で言う「遺伝子」とは、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド(例えばDNAの断片)を意味し、コード領域の上流側及び下流側の領域と、各コードセグメント（エクソン）間の中間配列（イントロン）とを含む。
【００３５】
本願で言う「相同遺伝子」とは、異なる種であるが、通常は関連する種に由来する遺伝子のペアを意味し、互いに調和し、互いに同等であるか、または非常に似ている。この用語には、スペシエイションによって分離された遺伝子（すなわち新種の創設）（例えばオーソロガス遺伝子）や、遺伝子の複製によって分離された遺伝子（例えばパラロガス遺伝子）が含まれる。
【００３６】
本願で言う「オーソログ」及び「オーソロガス遺伝子」とは、異なる種の遺伝子であって、共通の先祖遺伝子からスペシエイションによって進化した遺伝子を意味する（すなわち相同遺伝子）。通常、オーソログは進化の過程において同じ機能を保持している。オーソログの同定は、新たに解読されたゲノムの遺伝子の機能の信頼性の高い予測に役立つ。
【００３７】
本願で言う「パラログ」及び「パラロガス遺伝子」とは、ゲノム内での複製により関連付けられた遺伝子を意味する。オーソログでは進化の過程において同じ機能が保持されるのに対し、パラログではいくつかの機能は元のものに関係することもあるが、新たな機能が発達する。
【００３８】
本願で「相同性」というときは、類似又は同一の配列を意味し、同一であることが好ましい。この相同性は当業者において標準的な方法で測定することができる（例えば、Smith And Waterman,Adv. Appl. Math.,2:482 [1981]; Needleman And Wunsch，J. MoI. Biol．,48:443 [1970]; Pearson And Lipman,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 [1988]; ウィスコンシンジェネチックソフトウェアパッケージのGAP,BESTFIT,FASTA, 及びTFASTA等のプログラム(Genetics Computer Group、Madison,WI)；及びDevereux et al,Nucl. Acid Res.，12:387-395 [1984] 参照）。
【００３９】
本願で言う「類似配列」とは、遺伝子の機能が、クズイソプレンシンターゼ(IspS) またはポプラIspS (IspS) に基づく遺伝子と実質的に同一となる配列を意味する。さらに、類似遺伝子は、クズイソプレンシンターゼに対し配列同一性を少なくとも45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% または100% 有する。別の実施形態では、上記の1以上の性質が配列に適用される。類似配列は、配列アライメントの公知の方法により決定することができる。一般的なアライメント方法はBLASTであるが、上記及び下記に説明するように、配列のアライメントに有用な別の方法もある。
【００４０】
有用なアルゴリズムの一例はPILEUPである。PILEUPは、累進的で対合的なアライメント法を用いて、関連する配列の群から多重配列アラインメントを作り出す。アラインメントを作るための関係性の集積を示す系統樹（tree）もプロットすることができる。PILEUPは、Feng 及びDoolittleの累進的アラインメント方法を簡素化したものである（Feng and Doolittle, J.Mol.Evol.,35:351-360[1987]）。この方法は、Higgins及びSharpによって述べられた方法と同じである（Higgins and Sharp, CABIOS 5：151-153[1989]）。有用なPILEUPパラメータは、3.00のデフォルトギャップウエイト、0.10のデフォルトギャップレングスと、重み末端ギャップ（weighted end gaps）を含んでいる。
【００４１】
有用なアルゴリズムの別の例は、Altschul et al, (Altschul et al, J MoI Biol, 215:403-410, 1990; 及びKarlin et al, Proc Natl Acad Sci USA, 90:5873-5787, 1993)に記載されたBLASTアルゴリズムである。特に有用なBLASTプログラムはWU-BLAST-2プログラムである(Altschul et al., (1996) Meth. Enzymol., 266:460- 480参照)。WU-BLAST-2プログラムは幾つかのサーチパラメータを用いるがその大部分は既定値である。調節可能なパラメータは以下の値にセットされている：オーバーラップスパン=1、オーバーラップフラクション=0.125、ワードスレッシュホールド（T）=11。HSP S及びHSP S2パラメータは動的値であり、特定の配列の組成、及び所望の配列を検索するための特定のデータベースの構成に依存し、プログラム自体により決定される。しかし、この値は精度を高めるために調節することができる。アミノ酸配列相同性のパーセントの値は、同一で一致した残基の数を、配列された領域内の「より長い」残基の全ての残基数で割って決定される。この「長い」配列はアライメントされた領域内の実際の残基の大部分を有するものである（アラインメントスコアを最大化するためのWU-Blast-2により導入されたギャップは無視する）。
【００４２】
「核酸配列同一性のパーセント(%)」は、開始配列（すなわち、対象とする配列）の核酸残基と同一な、対象配列中の核酸残基のパーセントと定義される。好ましい方法では、オーバーラップスパン及びオーバーラップフラクションの初期設定値をそれぞれ1及び0.125としたWU-BLAST-2のBLASTNモジュールを用いる。
【００４３】
本願で言う「ハイブリッド化」とは、公知のように、核酸のストランドが塩基対合により相補ストランドに結合するプロセスを意味する。
【００４４】
2つの配列が中度または高度にストリンジェントな洗浄及びハイブリッド化条件下で互いに特異的にハイブリッド化されるとき、核酸配列は「選択的にハイブリッド化可能」と考えられる。ハイブリッド化条件は、核酸に結合するコンプレックスまたはプローブの融解温度(Tm) に基づく。例えば、「最大ストリンジェンシー」は通常約Tm−5℃ (プローブのTmより5℃低い温度)で生じ、「高度ストリンジェンシー」はTmより約5〜10℃低い温度で生じ、「中度ストリンジェンシー」はプローブのTmより約10〜20℃低い温度で生じ、「低ストリンジェンシー」はTmより約20〜25℃低い温度で生じる。機能的には、最大ストリンジェンシー条件は、ハイブリッド化プローブと完全に同一、またはほぼ完全に同一の配列の同定に用いられる。一方、中度または低ストリンジェンシー条件は、ポリヌクレオチド配列の相同性の同定または検出に用いることができる。
【００４５】
中度及び高度ストリンジェンシーハイブリッド化条件は周知である。高度ストリンジェンシーハイブリッド化条件の一例として、50% ホルムアミド, 5X SSC, 5X デンハート液, 0.5% SDS 及び 100 μg/ml 変成キャリヤDNAを含む溶液を用いて約42℃でハイブリッド化した後、室温で2X SSC 及び 0.5% SDSで2回洗浄し、さらに42℃で0.1X SSC 及び 0.5% SDSを用いて2回洗浄する例が挙げられる。
中度ストリンジェンシーハイブリッド化条件の一例として、20% ホルムアミド, 5 x SSC (150mM NaCl, 15 mMクエン酸三ナトリウム), 50 mMリン酸ナトリウム(pH 7.6), 5 x デンハート液, 10%硫酸デキストラン、及び20 mg/ml変成断片化処理サケ精子DNAを含む溶液を用いて37℃で一晩培養した後、濾過物を1x SSCを用いて約37〜50℃で洗浄する例が挙げられる。当業者であれば、プローブの長さ等の諸条件に適合させるために、必要に応じて温度、イオン強度等を調整することができる。
【００４６】
「組換え」とは、非相同核酸配列の導入により修飾された細胞又はベクター、あるいはそのように修飾された細胞に由来する細胞を意味する。従って組換え細胞は、その細胞の天然形態（非組換体）の遺伝子とは異なる遺伝子を発現するか、あるいは人の手が加わることにより、天然の遺伝子を過剰に発現するか、十分発現しないか、又は全く発現しない。「組換え」、「組換え操作」、及び「組換え」核酸の生成は、通常2以上の核酸断片を結合させることであり、結合によりキメラ遺伝子が生じる。
【００４７】
好ましい実施形態では、突然変異DNA配列は、少なくとも1のコドンの部位飽和変異誘発により生成させる。別の好ましい実施形態では、2以上のコドンについて部位飽和変異誘発を行う。また別の実施形態では、突然変異DNA配列は野生型配列に対する相同性が50%以上、55%以上、60%以上、65%以上、70%以上、75%以上、80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、または98%以上である。また別の実施形態では、突然変異DNA配列は、例えば放射線照射、ニトロソグアニジン等の公知の変異誘発方法を用いて、in vivoで生成させることができる。その後、所望のDNA配列を単離して、本願に開示する方法に用いる。
【００４８】
「標的配列」とは、入来配列が宿主細胞ゲノム内に挿入されることが望ましい配列をコードする宿主細胞中のDNA配列を意味する。いくつかの実施態様において、標的配列は機能性の野生型遺伝子またはオペロンをコードし、一方、他の実施態様では、標的配列は機能性突然変異遺伝子またはオペロンまたは非機能性遺伝子またはオペロンをコードする。
【００４９】
「隣接配列」とは、対象とする配列の上流または下流にある配列をいう（例えば、遺伝子A-B-Cにおいて、遺伝子BはA及びC遺伝子配列に隣接している）。
好ましい実施態様では、入来配列は相同ボックスの両側に隣接する。他の実施態様において、入来配列及び相同ボックスが一つの単位となり、この単位の両側にスタファー配列が隣接する。いくつかの実施態様において、隣接配列は一方の側（3’または5’）にのみ存在するが、好ましい実施態様では、配列の両側に隣接する。いくつかの実施態様において、隣接配列は一方の側（3’または5’）にのみ存在する。一方、好ましい実施態様では配列の両側の側面に位置する。
【００５０】
「スタファー配列」とは、相同ボックスに隣接する任意の追加のDNAをいう（通常ベクター配列）。しかし、この用語には非相同DNA配列も含まれる。理論により限定するものではないが、スタファー配列はDNA取込みを開始するために細胞に重要でない標的を与える。
【００５１】
「増幅」及び「遺伝子増幅」とは、増幅された遺伝子が当初のゲノム中に存在した数より多いコピー数で存在するようにして、特定のDNAが均衡を破って複製されるプロセスをいう。
いくつかの実施態様では、薬物存在下（例えば、阻害性酵素のインヒビター）での増殖による細胞の選択は、薬物存在下で増殖するために必要な遺伝子をコードする内因性遺伝子の増幅、またはこの遺伝子をエンコードする外因性（すなわち、入来）配列の増幅、または両方をもたらす。
【００５２】
「増幅」はテンプレート特異性に関する核酸複製の特殊なケースである。これは非特異性テンプレート複製（すなわち、テンプレート依存性であるが特定のテンプレートに依存しない複製）と対比される。
テンプレート特異性は、複製の忠実度（すなわち、適正なポリヌクレオチド配列の合成）及びヌクレオチド（リボ、またはデオキシリボ）特異性とは区別される。テンプレート特異性は「標的」特異性に関して説明されることが多い。標的配列は、それらがその他の核酸から選別するために探されるという意味において「標的」である。増幅技術はこの選別を第一に考えて設計されてきた。
【００５３】
「共増幅」とは、その他の遺伝子配列がともに導入される増幅マーカの1の細胞内への導入（すなわち、発現ベクター内に含まれる遺伝子のような1以上の非選択遺伝子を含む）及び細胞が増幅マーカとその他の非選択遺伝子配列の両方を増幅するような適当な選択圧の増幅をいう。増幅マーカは、その他の遺伝子配列に物理的に結合していてもよく、またはDNAを2つの別個の断片、すなわち一方が増幅マーカを含み、及びもう一方が非選択マーカを含む2つの断片にして、同じ細胞内に導入することもできる。
【００５４】
「増幅マーカ」、「増幅遺伝子」及び「増幅ベクター」とは、適当な増殖条件下で遺伝子の増幅を可能にする遺伝子をコードする、遺伝子またはベクターを意味する。
【００５５】
「テンプレート特異性」は、ほとんどの増幅方法において酵素の選択により達成される。増幅酵素は、使用される条件下において、非相同核酸の混合物中の特定の核酸の配列のみを処理する酵素である。
例えばQβレプリカーゼの場合、MDV-1 RNAはレプリカーゼの特異テンプレートである（例えばKacian et al, Proc Natl Acad Sci USA 69:3038, 1972参照）。その他の核酸はこの増幅酵素では複製されない。
同様に、T7 RNAポリメラーゼの場合、この増幅酵素はそれ自身のプロモーターにストリンジェントな特異性を有する（Chamberlin et al, Nature 228:227, 1970参照）。
T4 DNAリガーゼの場合、この酵素は接合部分においてオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド基質とテンプレートとの間に不整合が存在するときは、2つのオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを結紮しない（Wu and Wallace, Genomics 4:560, 1989参照）。
最後に、Taq及びPfuポリメラーゼは高温で機能する能力を有するため配列結合の高い特異性を示し、これによりプライマーにより規定される。高温にすることにより、標的配列とのプライマーハイブリダイゼーションに有利に働き、非標的配列とのハイブリダイゼーションには不利な熱力学的条件が得られる。
【００５６】
「増幅可能な核酸」とは、任意の増幅方法により増幅され得る核酸をいう。「増幅可能な核酸」には通常「サンプルテンプレート」が含まれる。
【００５７】
「サンプルテンプレート」とは、「標的」（下記に定義）が存在するか否かを分析されるサンプルから得られる核酸を意味する。一方、「バックグラウンドテンプレート」は、サンプルテンプレート以外の核酸について用いられ、サンプル内に存在していても、いなくてもよい。バックグラウンドテンプレートはほとんどの場合、故意のものではない。バックグラウンドテンプレートは前回のサンプルが残留した結果であり、あるいはサンプルから精製すべき核酸汚染物質が混入したものである。例えば、検出すべき微生物以外の生物由来の核酸が、試験サンプル内でバックグラウンドとして存在し得る。
【００５８】
「プライマー」とは、精製された制限消化などにおいて自然に生じるオリゴヌクレオチド、または合成されたオリゴヌクレオチドを意味し、核酸鎖に相補的なプライマー伸長生成物の合成が開始される条件下に置かれた場合（すなわち、ヌクレオチド及びDNAポリメラーゼなどの誘発剤の存在下で、適した温度及びpHにおかれた場合）、合成開始点として作用することができる。
プライマーは好ましくは増幅効率を最大にする1本鎖であるが、2本鎖であってもよい。2本鎖の場合、ストランドを分離処理した後、そのプライマーを伸長生成物を生成させるために用いる。好ましくは、プライマーはオリゴデオキシリボヌクレオチドである。
プライマーは誘発剤の存在下において伸長生成物の合成を開始させるために、十分に長くなければならない。プライマーの正確な長さは、誘発温度、プライマーの供給源及び使用する方法など多くの因子に依存する。
【００５９】
「プローブ」とは、精製された制限酵素消化などで自然に生じるオリゴヌクレオチド、または合成、組換えまたはPCR増幅により生成されるオリゴヌクレオチド（すなわちヌクレオチド配列）を意味し、別の対象とするオリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせることができる。プローブは1本鎖または2本鎖である。プローブは特定の遺伝子配列の検出、同定及び単離に有用である。
本発明で用るプローブは、例えば酵素（例えばELISA、あるいは酵素ベースの組織化学的分析）、蛍光、放射性及び発光性システム等の検出システムで検出できるように、「リポーター分子」で標識される。この発明は、特定の検出システムや標識に限定されるものではない。
【００６０】
「標的」とは、ポリメラーゼ連鎖反応に関して用いる場合、ポリメラーゼ連鎖反応に用いるプライマーが結合した核酸領域を意味する。従って、「標的」はその他の核酸配列から探索されるものである。「セグメント」とは、標的配列内の核酸領域と定義される。
【００６１】
「ポリメラーゼ連鎖反応」（PCR）とは、本願に引用として組み込まれる米国特許4,683,195 4,683,202, 及び4,965,188に開示された方法を意味し、クローン化または精製することなくゲノムDNAの混合物中の標的配列のセグメント濃度を増加させる方法を含む。
標的配列を増幅するこの方法は、所望の標的配列を含むDNA混合物に大過剰の2種のオリゴヌクレオチドプライマーを導入し、DNAポリメラーゼの存在下、ヒートサイクルを正確な順序で行うことからなる。2種のプライマーは、2本鎖標的配列の各鎖に相補的である。
増幅を行うために混合物を変性させ、次いでプライマーを標的分子内の相補配列にアニールする。アニーリングに続いて、ポリメラーゼを用いてプライマーを伸長させ、新しい相補鎖ペアを形成させる。
変性、プライマーアニーリング及びポリメラーゼ伸長工程は何回も繰り返すことができ（すなわち変性、アニーリング、及び伸長が1「サイクル」であり、多数の「サイクル」を繰り返し行うことができる）、所望の標的配列の増幅されたセグメントを高濃度で得ることができる。
所望の標的配列の増幅されたセグメントの長さは、お互いのプライマーの相対位置により決定されるため、この長さは制御可能である。このプロセスは繰返し可能であることから、「ポリメラーゼ連鎖反応」（以下「PCR」）と呼ばれる。所望の標的配列の増幅されたセグメントは、DNA混合物中で主要な配列（濃度に関して）となるので、「PCR増幅された」と呼ばれる。
【００６２】
「増幅試薬」とは、プライマー、核酸テンプレート及び増幅酵素以外の増幅に必要な試薬をいう（デオキシリボヌクレオチド3リン酸、バッファー等）。通常、増幅試薬はその他の反応成分と一緒に反応容器（試験管、マイクロウェル等）内に仕込まれる。
【００６３】
PCRにより、ゲノムDNA中の特異標的配列の1のコピーを、いくつかの異なる方法で検出可能なレベルまで増幅することができる（例えば、標識プローブを用いるハイブリダイゼーション；ビオチン化プライマーの導入とこれに続くアビジン−酵素結合検出；dCTPまたはdATPなどの32P-標識されたデオキシヌクレオチドトリホスフェートの増幅セグメントへの導入）。
ゲノムDNAに加えて、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列を適切なプライマー分子のセットを用いて増幅することができる。特に、PCRプロセスにより作成された増幅セグメントそれ自身が、その後継続するPCR増幅の効率的なテンプレートとなる。
【００６４】
「PCR産品」、「PCR断片」及び「増幅生成物」とは、変性、アニーリング及び伸長サイクルを2回以上行ったPCR工程後の化合物の最終混合物をいう。これらの語には、1以上の標的配列の1以上の断片の増幅が行われた場合が含まれる。
【００６５】
「RT-PCR」とは、RNA配列の複製及び増幅をいう。この方法では逆転写とPCRとが組み合わされ、ほとんどの場合、本願に参照として組み込まれる米国特許5,322,770に開示されているように、熱安定性ポリメラーゼを用いる１の酵素手順が用いられる。RT-PCRでは、RNAテンプレートはポリメラーゼの逆転写酵素活性によりcDNAに転換され、次にポリメラーゼの重合活性を用いて増幅される（すなわち、他のPCR法と同様である）。
【００６６】
「制限エンドヌクレアーゼ」及び「制限酵素」とは、細菌性酵素を意味し、いずれも2本鎖DNAを特定ヌクレオチド配列において切断し、または特定ヌクレオチド配列の近傍で切断する。
【００６７】
「制限酵素認識部位」とは、所定の制限エンドヌクレアーゼにより認識及び切断されるヌクレオチド配列を意味し、DNA断片の挿入部位であることが多い。本発明の特定の実施形態において、制限酵素認識部位は選択マーカ内及びDNA構築体の5’及び3’末端内に設定される。
【００６８】
「染色体への組み込み」とは、入来配列が宿主細胞の染色体に導入されるプロセスを意味する。形質転換DNAの相同領域が、染色体の相同領域に対しアライメントする。次に、相同ボックス間の配列がダブルクロスオーバー（すなわち相同組み換え）において入来配列によって置換される。いくつかの実施形態では、DNA構築体の不活性化染色体セグメントの相同セクションが、エシェリキア染色体の固有染色体領域の隣接相同領域に対しアライメントする。次に、固有染色体領域が、ダブルクロスオーバー中のDNA構築体により切り取られる（すなわち相同組み換え）。
【００６９】
「相同組み換え」とは、2つのDNA分子または一対の染色体の間のDNAフラグメントを、同一の部位または略同一の核酸配列の部位において交換することを意味する。好ましい実施形態では、染色体取込は相同組み換えである。
「相同配列」とは、比較するために適切にアライメントさせたとき、他の核酸またはポリペプチド配列に対し配列同一性を100%,99%,98%,97%,96%,95%,94%,93%,92%,91%,90%,88%,85%,80%,75%,または70%有する核酸またはポリペプチド配列を意味する。
いくつかの実施形態では、相同配列は85%から100%の配列同一性を有し、別の実施形態では90%から100%の配列同一性を有し、別の好ましい実施形態では95%ら100%の配列同一性を有する。
【００７０】
ここで用いる「アミノ酸」とは、ぺプチドまたはタンパク質配列またはそれらの一部をいう。「タンパク質」、「ぺプチド」及び「ポリぺプチド」の語は同義で用いられる。
【００７１】
「非相同タンパク質」とは、宿主細胞において天然では生じない得ないポリヌクレオチドまたはポリペプチドを意味する。
非相同タンパク質の例として、イソプレンシンターゼ等の酵素が挙げられる。いくつかの実施形態ではタンパク質をコードする遺伝子は天然由来の遺伝子であり、別の実施形態では変異誘導および／または合成された遺伝子が用いられる。
【００７２】
「相同タンパク質」とは、細胞において天然に生じるタンパク質またはポリペプチドを意味する。好ましい実施形態では細胞はグラム陰性細胞であり、より好ましい実施形態では細胞はエシェリキア宿主細胞である。
【００７３】
酵素が細胞中において、対応する野生型細胞中よりも高いレベルで発現されるとき、酵素が宿主細胞中で「過剰発現された」と言う。
【００７４】
本願では「タンパク質」及び「ポリペプチド」は同義で用いる。本願では生化学の命名に関するIUPAC-IUB 共同委員会(IUPAC-IUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature(JCBN))に従い定義されたアミノ酸を表す3文字のコードを用いる。遺伝子コードの縮重により、ポリペプチドは1以上のヌクレオチド配列でコードされ得る。
【００７５】
タンパク質またはペプチドの「成熟」形態とは、タンパク質またはペプチドが最終的に機能を発揮する形態を意味する。例えば、クズイソプレンシンターゼの成熟形態には、SEQ IDNO:2のアミノ酸配列が含まれる。
【００７６】
タンパク質またはペプチドの「前駆体」形態とは、タンパク質のアミノまたはカルボニル末端に作動可能に結合したプロ配列を有するタンパク質の成熟形態を意味する。この前駆体は、プロ配列のアミノ末端に作動可能に結合している「シグナル」配列も有する。この前駆体は、翻訳後活性において含まれる付加的なポリヌクレオチド（例えば、タンパク質またはポリペプチドの成熟形態から切り離されるポリペプチド）も有する。
【００７７】
「天然酵素」とは、天然に存在するものと同一の、修飾されていないアミノ酸配列を有する酵素を意味する。天然酵素には、自然発生酵素、特定の微生物中で天然に発現される酵素、または特定の微生物中で見出される酵素が含まれる。
【００７８】
2つの核酸配列またはポリヌクレオチド配列について「同一」というときは、以下説明する配列比較または配列解析アルゴリズムの1つを用いた測定において、2つの配列の一致が最大となるようにアライメントしたときに、2つの配列中の残基が同一となることを意味する。
【００７９】
「最適アラインメント」とは、最も高い同一性パーセント値を与えるアラインメントを意味する。
【００８０】
2つのアミノ酸、ポリヌクレオチド、及び／または遺伝子配列について（必要に応じて）「アミノ酸配列同一性パーセント」、「遺伝子配列同一性パーセント」及び／または「核酸／ポリヌクレオチド配列の相同性パーセント」と言うときは、配列を最適にアラインメントしたときに、2つの配列において同一となる残基のパーセントを意味する。従って80%のアミノ酸配列同一性とは、最適にアラインメントされたポリヌクレオチド配列において80%のアミノ酸が同一であることを意味する。
【００８１】
2つの核酸またはポリヌクレオチドについて「実質的に同一」であるというときは、標準的なパラメータを用いたプログラムまたはアルゴリズム（例えば、BLAST、ALIGN、CLUSTAL）により対象の配列と比較したときに、少なくとも70%の配列同一性、好ましくは少なくとも75%の配列同一性、好ましくは少なくとも80%の配列同一性、好ましくは少なくとも85%の配列同一性、好ましくは少なくとも90%の配列同一性、好ましくは少なくとも95%の配列同一性、好ましくは少なくとも97%の配列同一性、好ましくは少なくとも98%の配列同一性、及び好ましくは少なくとも99%の配列同一性を有するポリヌクレオチドまたはポリペプチドを意味する。2つのポリヌクレオチドが実質的に同一であることの指標は、第一ポリヌクレオチドが第二ポリペプチドに対し免疫学的に交差反応性を示すことである。通常、保存的なアミノ酸置換において異なるポリペプチドは、免疫学的に交差反応性である。従って、2つのポリペプチドの相違点が保存置換のみの場合は、1のポリペプチドは別のポリペプチドと実質的に同一である。2つの核酸配列が実質的に同一であることの別の指標は、2つの分子がストリンジェントな条件において互いにハイブリダイズすることである（例えば、中程度から高度にストリンジェントな条件）。
【００８２】
「単離された」または「精製された」とは、本来の環境（例えば、それが天然のものであるならば自然環境）から切り離されている物質を意味する。
例えば、その物質が特定の組成物中において天然または野生型有機体（例えばクズ）と比較して低濃度または高濃度で存在するか、または天然または野生型有機体から発現される場合には通常存在しない成分とともに存在する場合、「精製」されていると言う。このようなポリヌクレオチドはベクターの一部であり、および／または、このようなポリヌクレオチドまたはポリペプチドは組成物の一部であり、このようなベクターまたは組成物は、自然環境の一部ではない点で単離されている。
好ましい実施形態では、核酸またはタンパク質は、例えば電気泳動ゲルまたはブロットにおいて１つのバンドか検出される場合、精製されていると言う。
【００８３】
DNA配列について「単離された」というときは、本来の遺伝的環境から単離されているDNA配列を意味する。従って、単離されたDNA配列は他の入来または不要なコード配列を有しておらず、遺伝子工学によるタンパク質の生成において有用である。
また、組換えDNA配列について「単離された」というときは、宿主有機体の遺伝的環境から単離されているDNA配列を意味する。従って、単離された組換えDNA配列は他の入来または不要なコード配列（例えばE. coli中で増殖させたクズIspS発現ベクター）を有さない。
このような単離された分子は、それらの本来の環境から分離されており、cDNA及び／またはゲノムクローンを含む。本発明の単離されたDNA分子は通常付随する他の遺伝子を含まないが、プロモーター及びターミネーター等の天然の5’及び3’非翻訳領域を含む。
付随する領域の同定法は、当業者に良く知られている（例えば、Dynan and Tijan， Nature 316:774-78 1985参照）。「単離されたDNA配列」を、「クローン化されたDNA配列」と言うこともある。
【００８４】
タンパク質について「単離された」というときは、その本来の環境以外の環境で見られるタンパク質を意味する。好ましい態様において、単離されたタンパク質は実質的に他のタンパク質、特に他の相同タンパク質を含まない。
また、組換えタンパク質について「単離された」というときは、宿主有機体のタンパク性環境から単離されたタンパク質を意味する。従って、単離された組換えDNA配列は他の入来または不要なタンパク質（例えばE. coli中で増殖させた組換えクズIspS）を有さない。単離されたタンパク質は、SDS-PAGEで分析したときの純度が10%より高く、好ましくは20%より高く、更に好ましくは30%より高い。
別の実施形態では、タンパク質は、SDS-PAGEで分析したとき高度に精製された形態（すなわち純度が40%より高く、60%より高く、80%より高く、90%より高く、95%より高く、97%より高く、及び99%より高い）になっている。
【００８５】
この発明の酵素変異体の構築には、以下のカセット突然変異誘発法を用いることができる。これ以外の方法を用いることも可能である。
まず、酵素をコードする天然の遺伝子を入手し、全体あるいは一部の配列を決定する。次に、コードされたタンパク質中に1以上のアミノ酸の突然変異（欠失、挿入または置換）を発生させるために適した場所を見つけるためにスキャンする。この場所に隣接している配列について、発現したときに各種突然変異をコードするオリゴヌクレオチドのプールで遺伝子の短いセグメントを置換するための制限部位があるかどうかを評価する。このような制限部位は、好ましくは遺伝子セグメントの置換を促進するためのタンパク質遺伝子内の特徴的な部位である。
しかし、制限酵素消化によって生成させた遺伝子断片を所望の配列中に再度組み込むことができることを条件に、アミラーゼ遺伝子中において過度に冗長ではない任意の制限酵素認識部位を用いることもできる。もし、制限酵素認識部位が選択されたポイントから適切な距離内（10から15ヌクレオチド）に存在しないときは、最終構築体中のコードされたリーディングフレーム及びアミノ酸のいずれも変化させないようにしながら、遺伝子中の核酸配列のヌクレオチドを置換することによって制限酵素認識部位を生成させることができる。
所望の配列を得るために、その配列を変化させる遺伝子の変異誘導は、公知のM13プライマーを伸長させる方法によって生じさせることができる。適切な隣接領域の位置決め、及び2つの有用な制限酵素認識部位配列を発現させるために必要な変異誘導の検討は、遺伝子コードの冗長性、遺伝子の制限酵素マップ、及び多くの異なる制限酵素を考慮して行うことができる。もし、有用な隣接制限酵素認識部位が使用可能であるならば、上記の方法は、制限酵素認識部位を含まない隣接領域にのみ用いる。
【００８６】
天然DNAおよび／または合成DNAをクローン化した後、変異誘導位置に隣接している制限酵素認識部位をコグネート制限酵素により消化させ、複数のエンド末端相同オリゴヌクレオチドカセットを遺伝子中に結紮させる。この方法によって変異誘発を簡素化することができる。これは、全てのオリゴヌクレオチドを、同じ制限部位を有するとともに、制限酵素認識部位をつくるための合成リンカーが不要になるようにして合成することができるためである。
【００８７】
「対応する」とは、タンパク質またはペプチド配列中の数値で表示された位置にある残基、またはこの残基と類似、相同、または均等な残基を意味する。
「対応する領域」とは、関連するタンパク質または親タンパク質の配列上において類似する位置の範囲を意味する。
【００８８】
「組合せ変異誘発」とは、初期配列の変異体のライブラリを生成する方法を意味する。これらのライブラリにおいて、変異体は予め決められた突然変異のセットから選択される1以上の突然変異を有する。更にこの方法は、予め決められた突然変異のセットには含まれていないランダム突然変異を導入する手段を提供する。
いくつかの実施形態では、この方法には米国特許出願番号09/699,250に記載された方法が含まれる。この文献を参照として本明細書に組み込む。別の実施形態では、組合せ変異誘発法には市販のキットが用いられる（例えば、QuikChange（商標）Multisite，Stratagene，San Diego，CA）。
【００８９】
「突然変異のライブラリ」とは、そのゲノムの大部分が同一であるが、1以上の遺伝子の別の相同体を含む細胞の集団を意味する。変異体のライブラリは、例えば改善された性質を有する遺伝子またはオペロンの同定に用いることができる。
【００９０】
「開始遺伝子」及び「親遺伝子」とは、本発明により改善、または変更される対象タンパク質をコードする遺伝子を意味する。
【００９１】
「多重配列アラインメント」及び「MSA」とは、アルゴリズム（例えば、Clustal W）を用いてアライメントさせた開始遺伝子の複数の相同体の配列を意味する。
【００９２】
「コンセンサス配列」及び「カノニカル配列」とは、特定のタンパク質または対象配列の全ての変異体と比較される、元型アミノ酸配列を意味する。また、「コンセンサス配列」及び「カノニカル配列」は対象DNA配列中に最も多く存在するヌクレオチド配列を意味する。遺伝子の各位置において、コンセンサス配列により、MSA中のその位置において最も高頻度で出現するアミノ酸が与えられる。
【００９３】
「コンセンサス突然変異」とは、開始遺伝子の配列とコンセンサス配列との相違点を意味する。コンセンサス突然変異は、開始遺伝子の配列と、MSAにより得られたコンセンサス配列とを比較することにより同定される。いくつかの実施形態では、コンセンサス突然変異は、コンセンサス配列に対してより類似性が高くなるように開始遺伝子に導入される。コンセンサス突然変異には、開始遺伝子中のある位置に存在するアミノ酸を、開始剤遺伝子中におけるそのアミノ酸の出現頻度よりもMSA中のその位置における出現頻度の方が高いアミノ酸に変異させるアミノ酸変異が含まれる。従って、コンセンサス突然変異には、MSA中のアミノ酸よりも出現頻度の高いアミノ酸で開始遺伝子のアミノ酸を置き換える、全ての単一アミノ酸変異が含まれる。
【００９４】
本願では「修飾された配列」と「修飾された遺伝子」とは同義で用いられ、天然の核酸配列の欠失、挿入または中断を有する配列を意味する。
好ましい実施形態では、修飾された配列の発現生成物は切断タンパク質である（例えば修飾が配列の欠失または中断である場合）。いくつかの好ましい実施形態では、切断タンパク質は生化学的活性を保持している。
別の実施形態では、修飾された配列の発現生成物は伸長タンパク質である（例えば修飾が核酸配列への挿入である場合）。いくつかの実施形態では、挿入により切断タンパク質が生成する（例えば挿入により停止コドンが形成される場合）。すなわち、挿入により発現生成物として切断タンパク質または伸長タンパク質が得られる。
【００９５】
本願では「突然変異配列」及び「突然変異遺伝子」は同義で用いられ、宿主細胞の野生型配列において少なくとも1のコドンが変更された配列を意味する。突然変異配列の発現生成物は、野生型とは異なるアミノ酸配列を有するタンパク質である。発現生成物は変更された機能を有する（例えば、酵素活性の向上）。
【００９６】
「変異プライマー」または「変異オリゴヌクレオチド」（本願では同義で用いる）とは、テンプレート配列の一部分に対応し、それらにハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチド組成物を意味する。変異体プライマーに関して、このプライマーは正確にテンプレート核酸に一致しない。このプライマー中の1以上のミスマッチを、核酸ライブラリに所望の突然変異を導入するために利用する。
「非変異プライマー」または「非変異オリゴヌクレオチド」とは、核酸テンプレートに正確に一致するオリゴヌクレオチド組成物を意味する。本発明の1の態様では、変異プライマーのみを用いる。
別の好ましい態様では、複数のプライマーは、少なくとも1の領域に変異プライマーが含まれ、さらに非変異プライマーもオリグヌクレオチド混合物中に含まれるように設計される。変異プライマーと、少なくとも1の変異プライマーに対応する非変異プライマーとの混合物を添加することにより、様々な組合せ突然変異パターンが存在する核酸ライブラリを構築することができる。
例えば、突然変異核酸ライブラリのいくつかの構成成分が特定の部位において変異体の親配列を有し、他の構成成分がこの特定の部位に対応する部位で突然変異しているようにする場合、非変異プライマーにより所与の残基について核酸ライブラリ内に特定のレベルの非変異の構成成分を生じさせることができる。
本発明の方法では、10から50塩基の間の長さ、好ましくは約15から4 5塩基の長さの突然変異及び非変異オリゴヌクレオチドを用いる。しかし、所望の変異誘発を行うためには10塩基より短いか、あるいは50塩基より長いプライマーを用いることが必要な場合もある。
対応する変異及び非変異プライマーについては、対応するオリゴヌクレオチド同士の長さが同一である必要はないが、突然変異が導入される領域に対応する領域において重なり合うことが必要である。
【００９７】
プライマーは、本発明により予め決められた比で添加される。例えば、得られたライブラリが顕著な量の特定の突然変異を有し、同じまたは別の部位においてより少量の別の変異を有するようにする場合、添加するプライマーの量を調節することで、所望の偏りを有するライブラリを構築することができる。あるいは、より少ないまたはより多い量の非変異プライマーの添加により、突然変異核酸ライブラリにおいて対応する突然変異が生成される頻度を調節することができる。
【００９８】
本願では「野生型配列」または「野生型遺伝子」とは同義で用いられ、宿主細胞内に天然に存在する配列、または本来存在する配列を意味する。いくつかの実施形態において、野生型配列はタンパク質工学プロジェクトの開始点となる関心対象の配列を意味する。この野生型配列は相同タンパク質または非相同タンパク質のいずれかをコードする。相同タンパク質は、本発明を介入させなくても宿主細胞が生成するものである。非相同タンパク質は、本発明を介入させなければ宿主細胞が生成することができないものである。
【００９９】
「溶解物」とは、溶解細胞の内容物を含む溶液を意味する。いくつかの実施形態では、溶解物はバクテリア細胞の溶解物である(例えばEpicentreのREADYLYSETM リゾチーム溶液を用いたE. coli細胞溶解物; または、フレンチプレスした細胞を用いたE. coli細胞溶解物)。
【０１００】
「リゾチーム」とは、N-アセチルムラミン酸 と N-アセチルグルコサミンの間の結合を加水分解するグリコシダーゼを意味し、多くのバクテリアの細胞壁に含まれている重要なポリマーを切断する。この発明に適したリゾチームは、ニワトリ卵白リゾチーム(Sigma社)、T4リゾチーム、非哺乳類、非鳥類リゾチーム(READYLYSETM)、または菌類リゾチーム等であるが、これらに限定されない。
【０１０１】
「ヘッドスペース」とは、密封された容器中の固体サンプルまたは液体サンプル上にトラップされた蒸気／空気混合物を意味する。
【０１０２】
「高速スクリーニング」及び「HTS」とは、少なくとも96件のイソプレンのサンプルを4時間以内に分析することを意味する。好ましい実施形態では、サンプルの容積は2 mL未満である。
【０１０３】
特に断りのない限り、成分または組成物の量は、その成分または組成物の有効量であり、例えば市販品に含まれている残留溶媒や副生物等の不純物は含まない。
【０１０４】
酵素成分の重量は、全活性タンパク質を基準とする。特に断りのない限り、全てのパーセント及び比率は重量に基づく。特に断りのない限り、全てのパーセント及び比率は組成物全量に基づき計算する。
【０１０５】
＜発明の詳細な説明＞
イソプレンモノマーは、ポリイソプレンおよび様々なコポリマー(イソブチレン、ブタジエン、スチレンまたは他のモノマーとの共重合体)の製造に用いられる。商業的に有用な量のイソプレンを産出可能な株(原核生物または真核生物)を得るためには、MVA経路によるイソプレン産出、またはDXP経路によるイソプレン産出のいずれかの全経路を最適化する必要がある。この経路において重要な酵素は、DMAPP前駆体をイソプレンに転換するイソプレンシンターゼ(IspS)である。今のところ、同定されているイソプレンシンターゼ(IspS)は、ポプラ、ヨーロッパナラ(English oak) 、及びクズ(kudzu vine)等の、植物由来のものだけである。バシラス・スブチリス( Bacillus subtilis)等のある種のバクテリアもイソプレンを産出するが、原核生物IspSは未だに同定されておらず、バシラス中の天然IspSの活性は、商業用途には不十分である。現在同定されている植物由来IspS酵素は、E. coli中での発現によりその特性の一部が明らかにされており、またこの酵素の速度論的パラメータは、精製したタンパク質によりin vitroで測定されている。しかし、天然IspS酵素の速度論的パラメータ(Km, 速度等)は、生物学的宿主中での商業的イソプレン産出には不十分である。
【０１０６】
上記の問題を解決するため、バクテリア宿主中で植物性IspSを発現させた。さらに、関心対象の性質を変えるためにIspSの遺伝子組換えを行った。野生型及び突然変異IspSの分析を、適した方法または「試験」により行ない、好ましくは対象とする性質のアセスメントに基づいて行った。対象とする性質は、最適pH、熱安定性、(例えばTm値)、細胞内及び細胞外溶解性、Km値、kcat値、または比活性度、さらに基質または産出物阻害を含め、阻害要因に対する感受性等であるが、これらに限定されない。酸化及びタンパク質分解に対する安定性も対象とする。さらに、金属イオン効果や、イオン強度による家政科や阻害も対象となる。
これらの性質またはパラメータは、in vitroで精製または一部精製したイソプレンシンターゼを用いるか、またはDXP経路、またはin vivoでMVA経路、または双方を発現するE. coli等の宿主有機体を用いて、DMAPPをイソプレンへ転換することにより分析することができる。
この発明では、1以上の試験条件下において、様々な程度の安定性、溶解性、活性および／または発現性を示す酵素を、種々の宿主におけるイソプレン産出に用いることができる。実施例10等に開示された高速法は、対象とする性質を経済的に研究するために必要である。
【０１０７】
この発明は、より多量のイソプレンを産出する組成物および方法に関する。特に、これらの組成物及び方法によりイソプレン産出速度が増加するとともに、産出されたイソプレンの総量も増える。本願に開示するイソプレンを産出させるための生合成プロセスは、天然ゴムの理想的代替手段である。下記に述べるように、細胞にイソプレンシンターゼ(IspS)ポリペプチドをコードする非相同核酸を導入することにより、細胞から産出されるイソプレンの量が大幅に増加する。イソプレンシンターゼポリペプチドは、ジメチルアリルジホスフェート (DMAPP)をイソプレンに転換する。実施例に示すように、非相同プエラリア・モンタナ(クズ)イソプレンシンターゼポリペプチド及びその変異体を、グラム陰性バクテリア細胞(例えばエシェリキア・コリ)中で発現させた。また、実施例に示すように、ポプライソプレンシンターゼポリペプチド及びその変異体を、グラム陰性バクテリア細胞(例えばエシェリキア・コリ)中で発現させた。これはこの発明の範囲に含まれる。
【０１０８】
植物性IspSのバクテリア宿主細胞中における非相同発現により、植物性IspSを備えていない対応する細胞と比較して、イソプレン産出量が増加した。
【０１０９】
プロテアーゼ酵素の表面のアミノ酸残基を突然変異させることにより、プロテアーゼ酵素の活性、発現性、及び安定性が改善されることが開示されている(WO2008/153925, WO2008/153934, WO2008/153935)。
本願発明者らは、驚くべきことに、全く異なる酵素であるイソプレンシンターゼの表面のアミノ酸残基を突然変異させることにより、発現性、溶解性、及び活性が向上することを見出した。L70Rは、有用な表面突然変異誘発の一例である。
【０１１０】
酵素の表面のアミノ酸残基を正確に同定するためには、酵素の三次元構造の解析が必須である。イソプレンシンターゼに対し約40%の同一性を有する配列（例えばイソプレンシンターゼに類似した公知の構造を有する酵素であるボルニルシンターゼ、及びリモネンシンターゼ）の構造を用いた相同性モデル化によってモデル化された酵素の概要を明らかにすることはできるが、表面に露出している残基を正確に特定し、露出の程度を正確に定量するためには不十分である。アミノ酸残基の表面露出の程度は、その側鎖において溶媒がアクセス可能な表面積のパーセンテージにより定量することができる。
【０１１１】
＞50%溶媒に対し露出したアミノ酸残基、好ましくは＞65%溶媒に対し露出、最も好ましくは＞85%溶媒に対し露出したアミノ酸残基を標的として、イソプレンシンターゼ中に以下の突然変異を誘発させることにより、この酵素の溶解性を向上させることができる。
疎水性→正荷電、またはその逆
疎水性→負荷電、またはその逆
疎水性→中性極性、またはその逆
中性極性→正荷電、またはその逆
中性極性→負荷電、またはその逆
正荷電→負荷電、またはその逆
【０１１２】
非相同イソプレンシンターゼ核酸を含む細胞によるイソプレン産出量は、その細胞から発現されるl-デオキシ-D-キシルロース-5-ホスフェートシンターゼ(DXS)ポリペプチド、および／またはイソペンテニルジホスフェートイソメラーゼ(IDI) ポリペプチドの量を増加させることにより、さらに増やすことができる。
例えば、DXS核酸および／またはIDI核酸を細胞中に導入することができる。DXS核酸は、非相同核酸、または内因性核酸の複製である。同様に、IDI核酸は、非相同核酸、または内因性核酸の複製である。
いくつかの実施形態では、DXSおよび／またはIDIポリペプチドの量は、内因性DXSおよび／またはIDI プロモータまたは調節領域を、DXSおよび／またはIDI核酸の転写を増加させることができる別のプロモータおよび／または調節領域で置換することにより、増加させることができる。
いくつかの実施形態では、細胞には、イソプレンシンターゼポリペプチド (例えば植物性イソプレンシンターゼ核酸)をコードする非相同核酸と、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする内因性核酸の複製の両者が含まれている。
【０１１３】
コードされたDXS及びIDIポリペプチドは、イソプレンの生合成のDXP経路の一部である(図15)。DXSポリペプチドは、ピルビン酸塩とD-グリセルアルデヒド-3-ホスフェートをl-デオキシ-D-キシルロース-5-ホスフェートに転換する。理論にとらわれることは意図しないが、DXSポリペプチドの量を増加させることにより、DXP経路へ供給される炭素量が増える結果、イソプレン産出量が増加すると考えられる。
IDIポリペプチドはイソペンテニルジホスフェート(IPP) と ジメチルアリルジホスフェート(DMAPP)との相互転換を触媒する。理論にとらわれることは意図しないが、細胞中のIDIポリペプチドの量を増加させることによりIPPの量が増加し、IPPから転換されるDMAPPの量が増加する結果、DMAPPから転換されるイソプレンの量が増加すると考えられる。
【０１１４】
いくつかの実施形態では、非相同イソプレンシンターゼ核酸を含む細胞によるイソプレンの産出を、細胞中のMVAポリペプチドの発現量を増やすことによって増加させることができる(図15)。
MVA経路ポリペプチドの例として、以下のポリペプチドが挙げられる：アセチル-CoA アセチルトランスフェラーゼ(AA-CoA チオラーゼ)ポリペプチド、3-ヒドロキシ-3-メチルグルタアリール-CoA シンターゼ (HMG-CoA シンターゼ)ポリペプチド、3-ヒドロキシ-3-メチルグルタアリール-CoAリダクターゼ(HMG-CoAリダクターゼ)ポリペプチド、メバロン酸塩キナーゼ(MVK)ポリペプチド、ホスホメバロン酸塩キナーゼ(PMK)ポリペプチド、 ジホスホメバロン酸塩デカルボキシラーゼ(MVD)ポリペプチド、IDI ポリペプチド、及び2以上のMVA経路ポリペプチド活性を有するポリペプチド(例えば融合ポリペプチド)。
例えば、1以上のMVA経路核酸を細胞に導入することができる。いくつかの実施形態では、細胞には、AA-CoA チオラーゼ、HMG-CoAシンターゼ、及びHMG-CoAリダクターゼ核酸を含む、上流MVA経路が含有されている。いくつかの実施形態では、細胞には、MVK、PMK、MVD及びIDI 核酸を含む、下流MVA経路が含有されている。いくつかの実施形態では、細胞にはAA-CoA チオラーゼ、HMG-CoAシンターゼ、HMG-CoAリダクターゼ、MVK、PMK、MVD及びIDI 核酸を含む、全MVA経路が含有されている。MVA経路の核酸は非相同核酸、または内因性核酸の複製である。
いくつかの実施形態では、1以上のMVA経路ポリペプチドの量は、MVA経路核酸の内因性プロモータまたは調節領域を、MVA経路核酸の転写を増加させることができる別のプロモータまたは調節領域で置換することにより、増加させることができる。
いくつかの実施形態では、細胞には、イソプレンシンターゼポリペプチド (例えば植物性イソプレンシンターゼ核酸)をコードする非相同核酸と、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする内因性核酸の複製の両者が含まれている。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、連続培養（例えば希釈無しの連続培養）において少なくとも約5, 10, 20, 50, 75, 100, 200, 300回またはそれ以上の回数で細胞分裂させたときでも、分裂させた細胞の少なくとも一部は、非相同イソプレンシンターゼ、DXS、IDI、および／またはMVA経路核酸を保持している。
いくつかの実施形態では、非相同イソプレンシンターゼまたは内因性イソプレンシンターゼの複製、DXS、IDI、および／またはMVA経路核酸を含む核酸にはさらに、カナマイシン、アンピシリン、カルベニシリン、ゲンタマイシン、ヒグロマイシン、フレオマイシン、ブレオマイシン、ネオマイシン、またはクロラムフェニコール抗生物質耐性核酸等の、選択マーカが含まれている。
【０１１６】
＜I.  ポリペプチド及び核酸の例＞
この発明の組成物及び方法には、種々のイソプレンシンターゼ、DXS、IDI、および／またはMVA経路ポリペプチド及び核酸を用いることができる。
【０１１７】
本願に言う「ポリペプチド」には、ポリペプチド、タンパク質、ペプチド、ポリペプチドの断片、及び融合ポリペプチドが含まれ、融合ポリペプチドには、第1ポリペプチドの一部または全部（例えば、イソプレンシンターゼ、DXS、IDI、またはMVA経路ポリペプチド）と、第2ポリペプチドの一部または全部（例えばHis-tag等の融合ポリペプチドの精製または検出を促進するペプチド）とが含まれる。
いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは2以上のMVA経路ポリペプチド（例えばAA-CoA チオラーゼ及びHMG-CoA リダクターゼポリペプチド）の活性を有する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは2以上のMVA経路ポリペプチドの活性を有する天然ポリペプチド（例えばエンテロコッカス・ファエカリスmvaE核酸でコードされたポリペプチド）である。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは少なくとも約50, 100, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400またはそれ以上のアミノ酸から成る。いくつかの実施形態では、ポリペプチド断片には全長ポリペプチドに由来する少なくとも約25, 50, 75, 100, 150, 200, 300またはそれ以上の隣接アミノ酸(contiguous amino acid)が含まれ、このポリペプチド断片は対応する全長ポリペプチドの活性に対し、少なくとも約5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%,または100%の活性を有する。特定の実施形態では、ポリペプチドには、天然イソプレンシンターゼ、DXS、IDI、またはMVA経路ポリペプチドのアミノ酸配列のセグメント、または全アミノ酸配列が含まれている。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、野生型（すなわち天然の配列）イソプレンシンターゼ、DXS、IDI、またはMVA経路ポリペプチドの配列と比較して、１以上の突然変異を有する。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは単離されたポリペプチドである。「単離されたポリペプチド」とは、例えば2, 5, 10, 20, 50またはそれ以上の異なるポリペプチドから成るポリペプチドのライブラリの一部ではなく、天然においてそのポリペプチドを産出する少なくとも1の成分から分離されたポリペプチドを意味する。単離されたポリペプチドは、例えばそのポリペプチドをコードする組換え核酸を発現させることにより得ることができる。
【０１２０】
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは非相同ポリペプチドである。「非相同ポリペプチド」とは、同じ宿主細胞中で天然に発現される別のポリペプチドとはアミノ酸配列が異なるポリペプチドを意味する。
【０１２１】
「核酸」とは、一本鎖または二本鎖の形態の、2以上のデオキシリボヌクレオチドおよび／またはリボヌクレオチドを意味する。いくつかの実施形態では、核酸は組み換え核酸である。「組み換え核酸」とは、対象とする核酸が由来する天然有機体のゲノムにおいて、対象とする核酸に隣接する1以上の核酸(例えば遺伝子）を含まない核酸を意味する。この用語には、例えばベクター、自己複製プラスミドまたはウイルス、または原核生物または真核生物のゲノムDNAに導入された組み換えDNA、あるいは他の配列から独立して分離された分子(例えばcDNA、ゲノムDNA断片、あるいはPCRまたは制限エンドヌクレアーゼ消化により産出されたcDNA断片)として存在する組み換えDNAが含まれる。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、核酸は組換え核酸である。例えば、いくつかの実施形態では、組み換え核酸が、イソプレンシンターゼ、DXS, IDI, またはMVA経路と、別のポリペプチド（例えばHis-tagのように融合ポリペプチドの精製または検出を促進するペプチド)の一部または全部とを含む融合ポリペプチドをコードするようにして、イソプレンシンターゼ、DXS, IDI, またはMVA経路核酸が別のポリペプチドの全部または一部をコードする別の核酸に作動可能に結合している。
いくつかの実施形態では、組み換え核酸の一部または全部が化学的に合成される。
いくつかの実施形態では、核酸は非相同核酸である。「非相同核酸」とは、その核酸配列が同じ宿主細胞において見られる天然の核酸の配列とは異なる核酸を意味する
【０１２３】
いくつかの実施形態では、核酸には天然由来イソプレンシンターゼ, DXS, IDI,またはMVA経路核酸の核酸配列のセグメントまたは全核酸配列が含まれている。いくつかの実施形態では、核酸には天然イソプレンシンターゼ核酸, DXS, IDI,またはMVA経路核酸由来の隣接ヌクレオチドが、少なくとも約50, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800,またはこれ以上含まれている。いくつかの実施形態では、核酸には、野生型(すなわち天然の配列) イソプレンシンターゼ, DXS, IDI,またはMVA経路核酸と比較して1以上の突然変異体が含まれている。
いくつかの実施形態では、核酸はイソプレンシンターゼ, DXS, IDI,またはMVA経路核酸の転写または翻訳を増加させる1以上の突然変異(例えばサイレント突然変異)を有する。いくつかの実施形態では、核酸はイソプレンシンターゼ, DXS, IDI,またはMVA経路核酸をコードする核酸の縮重変異体である。
【０１２４】
「縮重コドン」とは、コードされたペプチドのアミノ酸配列に影響を及ぼすことなくヌクレオチド配列の変動を許容する、遺伝子コードの多様性を意味する。当業者にとって、所与のアミノ酸を特定するためにヌクレオチドコドンを使用するときに特定の宿主が示す「コドン-バイアス」は周知である。従っていくつかの実施形態では、宿主細胞中での発現を改善するための核酸を合成する際、核酸のコドン使用頻度が宿主細胞の好適なコドン使用頻度に近づくようにして核酸を設計することが好ましい。
【０１２５】
いくつかのイソプレンシンターゼ, DXS, IDI,および／またはMVA経路ポリペプチド及び核酸の登録番号の例は、特にイソプレンシンターゼ, DXS, IDI,および／またはMVA経路ポリペプチド及び核酸のアミノ酸及び核酸配列について本願に参照として組み込むU.S. Application No. 61/013,574のAppendix 1に示されている。
Keggデータベースにも、様々なイソプレンシンターゼ, DXS, IDI,および／またはMVA経路ポリペプチド及び核酸のアミノ酸配列及び核酸配列の例が含まれている。(例えば"genome.jp/kegg/pathway/map/map00100.html" 及びそこに開示された配列参照。これらは本願に参照として組み込まれ、特にイソプレンシンターゼ, DXS, IDI,および／またはMVA経路ポリペプチド及び核酸のアミノ酸及び核酸配列について本願に参照として組み込まれる。)
いくつかの実施形態では、1以上のイソプレンシンターゼ、 DXS、 IDI、及び／またはMVA経路ペプチドおよび／または核酸は、例えば2007年12月12日に公知になったU.S. Application No. 61/013,574のAppendix 1に示す登録番号に対応する配列と同じ配列を有するか、あるいは、この出願日においてKeggデータベースに示されていた配列と同じ配列を有する。以下に、別のイソプレンシンターゼ、 DXS、 IDI、及び／またはMVA経路ペプチドおよび核酸の例を示す。
【０１２６】
＜イソプレンシンターゼポリペプチド及び核酸の例＞
上記のように、イソプレンシンターゼポリペプチドはジメチルアリルジホスフェート(DMAPP)をイソプレンに転換する。イソプレンシンターゼポリペプチドの例として、ポリペプチド、ポリペプチドの断片、ペプチド、及び少なくとも1のイソプレンシンターゼポリペプチド活性を有する融合ポリペプチドが挙げられる。
ポリペプチドがイソプレンシンターゼポリペプチド活性を有するか否かは、in vitro, 細胞抽出物中、またはin vivoで、そのポリペプチドのDMAPPをイソプレンに転換する能力を測定する公知の方法によって評価することができる。
細胞抽出液中のイソプレンシンターゼポリペプチド活性は、例えばSilverらのJ. Biol. Chem. 270:13010-13016, 1995に記載された方法で測定することができる。Silverらの文献は本願に参照として組み込まれ、特にイソプレンシンターゼポリペプチド活性の評価方法に関する記載が本願に参照として組み込まれる。DMAPP (Sigma社)を窒素気流下で蒸発乾固させ、pH8.2の100mMリン酸カリウム緩衝液中に濃度100mMで再水和させ、-20℃で保管する。
測定は、20 ml のヘッドスペースバイアル中で細胞抽出液25 μlに、1M MgCl2, 1mM (250 μg/ml) DMAPP, 65 μlのPlant Extract緩衝液(PEB) (50mM Tris-HCl, pH 8.0, 20mM MgCl2, 5%グリセロール, 及び2mM DTT) を含む溶液5 μlを添加し、次に、振蕩しながら37℃で15分間培養することにより行う。ヘッドスペースバイアルは金属製スクリューキャップと、テフロン（登録商標）コーティングされたシリコーン隔膜(Agilent Technologies社)とを備える。
200μlの250mM EDTAを添加するか、または熱不活性化により反応を終了させ、GC/MSでイソプレンを定量する。
【０１２７】
イソプレンシンターゼ核酸の例として、少なくとも1のイソプレンシンターゼポリペプチド活性を有するポリペプチド、ポリペプチドの断片、ペプチド、及び融合ポリペプチドをコードする核酸が挙げられる。
イソプレンシンターゼポリペプチド及び核酸の例として、本願に開示するいずれかの有機体由来の天然ポリペプチド及び核酸、あるいは本願に開示するいずれかの有機体から派生する突然変異ポリペプチド及び突然変異核酸が挙げられる。
【０１２８】
いくつかの実施形態では、イソプレンシンターゼポリペプチドまたは核酸は、マメ科、ヤナギ科、ブナ科に由来する。
いくつかの実施形態では、イソプレンシンターゼポリペプチドまたは核酸は、プエラリア・モンタナ(Pueraria montana (kudzu)) (Sharkey et al, Plant Physiology 137: 700-712, 2005)、ポプラ(例えばポプラ・アルバ×ポプラ・トレムラ (CAC35696) Miller et al, Planta 213: 483-487, 2001), アスペン(aspen) (例えばポプラ・トレムロイデス(Populus tremuloides)) (Silver et al, JBC 270(22): 13010-1316, 1995),、またはヨーロッパナラ(Quercus robur)(Zimmer et al, WO 98/02550)由来のポリペプチドまたは核酸である。これらの文献は本願に参照として組み込まれ、特にイソプレンシンターゼ核酸とイソプレンシンターゼポリペプチドの発現に関する記載が本願に参照として組み込まれる。
好ましいイソプレンシンターゼの非限定的例示として、ジェンバンク（Genbank）登録番号AY341431, AY316691, AY279379, AJ457070, 及びAY 182241のイソプレンシンターゼが挙げられる。これらのイソプレンシンターゼは本願に参照として組み込まれ、特にイソプレンシンターゼ核酸及びポリペプチドの配列について本願に参照として組み込まれる。
いくつかの実施形態では、イソプレンシンターゼポリペプチドまたは核酸は、天然由来のポリペプチドまたはヨーロッパナラ(Quercus robur)由来の核酸ではない (すなわち、イソプレンシンターゼポリペプチドまたは核酸は天然由来以外のポリペプチド、またはQuercus robur由来以外の核酸である)。
いくつかの実施形態では、イソプレンシンターゼポリペプチドまたは核酸は、ポプラ(例えばポプラ・アルバ×ポプラ・トレムラ (CAC35696)由来の天然ポリペプチドまたは核酸ではない。
【０１２９】
＜DXSポリペプチド及び核酸の例＞
上記のように、l-デオキシ-D-キシルロース-5-ホスフェートシンターゼ(DXS)ポリペプチドは、ピルビン酸塩及びD-グリセルアルデヒド-3-ホスフェートを、l-デオキシ-D-キシルロース-5-ホスフェートに転換する。
DXSポリペプチドの例として、少なくとも1のDXSポリペプチド活性を有するポリペプチド、ポリペプチドの断片、ペプチド、及び融合ポリペプチドが挙げられる。
ポリペプチドがDXSポリペプチド活性を有するか否かは、in vitro, 細胞抽出物中、またはin vivoで、そのポリペプチドのピルビン酸塩及びD-グリセルアルデヒド-3-ホスフェートを、l-デオキシ-D-キシルロース-5-ホスフェートに転換する能力を測定する標準的方法（例えば本願に開示する方法）によって評価することができる。
DXS核酸の例には、少なくとも1のDXSポリペプチド活性を有するポリペプチド、ポリペプチドの断片、ペプチド、及び融合ポリペプチドをコードする核酸が挙げられる。
DXSポリペプチド及び核酸の例として、本願に開示するいずれかの有機体由来の天然ポリペプチド及び核酸、あるいは本願に開示するいずれかの有機体から派生する突然変異ポリペプチド及び突然変異核酸が挙げられる。
【０１３０】
＜IDIポリペプチド及び核酸の例＞
イソペンテニルジホスフェートイソメラーゼポリペプチド (イソペンテニル-ジホスフェートデルタ- イソメラーゼ、またはIDI)は、イソペンテニルジホスフェート(IPP)と、ジメチルアリルジホスフェート(DMAPP)の相互変換を触媒する (例えばconverting IPPをDMAPPに転換し、および／または、DMAPPをIPPに転換する)。
IDIポリペプチドの例として、少なくとも1のIDIポリペプチド活性を有するポリペプチド、ポリペプチドの断片、ペプチド、及び融合ポリペプチドが挙げられる。
ポリペプチドがIDIポリペプチド活性を有するか否かは、in vitro, 細胞抽出物中、またはin vivoで、そのポリペプチドのIPP 及びDMAPPを相互変換する能力を測定する標準的方法（例えば本願に開示する方法）によって評価することができる。
IDI核酸の例には、少なくとも1のIDIポリペプチド活性を有するポリペプチド、ポリペプチドの断片、ペプチド、または融合ポリペプチドをコードする核酸が挙げられる。
IDIポリペプチド及び核酸の例として、本願に開示するいずれかの有機体由来の天然ポリペプチド及び核酸、あるいは本願に開示するいずれかの有機体から派生するポリペプチド及び核酸の突然変異体が挙げられる。
【０１３１】
＜MVA経路ポリペプチド及び核酸の例＞
MVA経路のポリペプチドの例として、アセチル-CoAアセチルトランスフェラーゼ (AA-CoA チオラーゼ)ポリペプチド、3-ヒドロキシ-3-メチルグルタアリール-CoAシンターゼ(HMG-CoAシンターゼ) ポリペプチド、3-ヒドロキシ-3-メチルグルタアリール-CoAリダクターゼ(HMG-CoAリダクターゼ)ポリペプチド、 メバロン酸キナーゼ(MVK)ポリペプチド、ホスホメバロン酸キナーゼ(PMK)ポリペプチド、 ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ(MVD)ポリペプチド、IDIポリペプチド、及び2以上のMVA経路ポリペプチド活性を有するポリペプチド(例えば融合ポリペプチド)が挙げられる。
特に、MVA経路ポリペプチドには、少なくとも1のMVA経路ポリペプチド活性を有するポリペプチド、ポリペプチドの断片、ペプチド、及び融合ポリペプチドが含まれる。
MVA経路核酸の例には、少なくとも1のMVA経路ポリペプチド活性を有するポリペプチド、ポリペプチドの断片、ペプチド、及び融合ポリペプチドをコードする核酸が挙げられる。
MVA経路ポリペプチド及び核酸の例として、本願に開示するいずれかの有機体由来の天然ポリペプチド及び核酸、あるいは本願に開示するいずれかの有機体から派生するポリペプチド及び核酸の突然変異体が挙げられる。
【０１３２】
特に、アセチル-CoA アセチルトランスフェラーゼポリペプチド(AA-CoA thiolaseまたはAACT) は、2分子のアセチル-CoAをアセトアセチル-CoAに転換する。ポリペプチドがAA-CoA チオラーゼポリペプチド活性を有するか否かは、in vitro, 細胞抽出物中、またはin vivoで、そのポリペプチドのアセチル-CoAの2分子をアセトアセチル-CoAに転換する能力を測定する標準的方法（例えば本願に開示する方法）によって評価することができる。
【０１３３】
3-ヒドロキシ-3-メチルグルタアリールメチルグルタアリール-CoAシンターゼ(HMG-CoAシンターゼまたはHMGS)ポリペプチドは、アセトアセチル-CoAを3-ヒドロキシ-3-メチルグルタアリール-CoAに転換する。ポリペプチドがHMG-CoAシンターゼポリペプチド活性を有するか否かは、in vitro, 細胞抽出物中、またはin vivoで、そのポリペプチドのアセトアセチル-CoAを3-ヒドロキシ-3-メチルグルタアリール-CoAに転換する能力を測定する標準的方法（例えば本願に開示する方法）によって評価することができる。
【０１３４】
3 -ヒドロキシ-3 -メチルグルタアリール-Co Aリダクターゼ(HMG-CoAリダクターゼまたはHMGR) ポリペプチドは、3 -ヒドロキシ-3 -メチルグルタアリール-Co Aをメバロン酸塩に転換する。ポリペプチドがHMG-CoAリダクターゼポリペプチド活性を有するか否かは、in vitro, 細胞抽出物中、またはin vivoで、そのポリペプチドの3 -ヒドロキシ-3 -メチルグルタアリール-Co Aをメバロン酸塩に転換する能力を測定する標準的方法（例えば本願に開示する方法）によって評価することができる。
【０１３５】
メバロン酸キナーゼ(MVK)ポリペプチドは、メバロン酸塩をリン酸化してメバロン酸-5 -ホスフェートにする。ポリペプチドがMVKポリペプチド活性を有するか否かは、in vitro, 細胞抽出物中、またはin vivoで、そのポリペプチドのメバロン酸塩をメバロン酸-5-ホスフェートに転換する能力を測定する標準的方法（例えば本願に開示する方法）によって評価することができる。
【０１３６】
ホスホメバロン酸キナーゼ(PMK)ポリペプチドは、メバロン酸-5-ホスフェートをリン酸化してメバロン酸-5 -ジホスフェートにする。ポリペプチドがPMKポリペプチド活性を有するか否かは、in vitro, 細胞抽出物中、またはin vivoで、そのポリペプチドのメバロン酸-5-ホスフェートをメバロン酸-5 -ジホスフェートに転換する能力を測定する標準的方法（例えば本願に開示する方法）によって評価することができる。
【０１３７】
ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ(MVDまたはDPMDC)ポリペプチドは、メバロン酸-5-ジホスフェートをイソペンテニルジホスフェート(IPP)に転換する。ポリペプチドがMVDポリペプチド活性を有するか否かは、in vitro, 細胞抽出物中、またはin vivoで、そのポリペプチドのメバロン酸-5-ジホスフェートをIPPに転換する能力を測定する標準的方法（例えば本願に開示する方法）によって評価することができる。
【０１３８】
＜核酸の単離方法の例＞
イソプレンシンターゼDXS, IDI,および／またはMVA経路核酸は、標準的方法により単離することができる。対象とする有機体(例えば細菌のゲノム）から所望の核酸を得る方法は一般的であり、分子生物学の分野で周知である（例えばWO 2004/033646とそこに引用された文献が参照される。これらは本願に参照として組み込まれ、特に核酸を単離する方法が本願に組み込まれる。）
例えば、核酸の配列が公知であれば（例えば本願に開示する公知の核酸）、制限エンドヌクレアーゼ消化により適切なゲノムライブラリを構築して、所望の核酸配列と相補的なプローブを用いてスクリーニングすることができる。所望の配列を単離したら、DNAをポリメラーゼ連鎖反応(PCR) (本願に参照として組み込まれ、特にPCR法が本願に参照として組み込まれるU.S.P 4,683,202参照)等の標準的なプライマーによる増幅方法で、適切なベクターを用いた形質転換に適したDNAを大量に得ることができる。
あるいは、イソプレンシンターゼDXS, IDI,および／またはMVA経路核酸(例えば公知の核酸配列を備えるイソプレンシンターゼDXS, IDI,および／またはMVA経路核酸)を、標準的な方法を用いて化学的に合成することができる。
【０１３９】
本願の組成物及び方法に用いることができる更に別のイソプレンシンターゼDXS, IDI,および／またはMVA経路ポリペプチド及び核酸は、公知の方法で特定することができる。
例えば、天然にイソプレンを産出することが知られている有機体の染色体DNAのコスミドライブラリをE. coli等の有機体中に構築し、次にイソプレン産出についてスクリーニングを行うことができる。
イソプレンシンターゼDXS, IDI,および／またはMVA経路核酸を得る別の方法では、メタゲノミックライブラリをアッセイ（本願に開示するヘッドスペースアッセイ）するか、または保存アミノ酸の全長（例えば少なくとも3つの保存されたアミノ酸）をコードするヌクレオチドに対するプライマーを用いたPCRによりスクリーニングする。
保存アミノ酸は、公知のイソプレンシンターゼDXS, IDI,および／またはMVA経路ポリペプチドのアミノ酸配列にアライメントさせることにより特定することができる。イソプレンシンターゼポリペプチドの保存アミノ酸は、公知のイソプレンシンターゼポリペプチドのアライメントされた配列に基づき特定することができる。
天然にイソプレンを産出することが見出された有機体を標準的タンパク質精製法（公知の方法である）で精製し、得られた精製ポリペプチドの配列を標準的方法で解析する。この他の方法が、文献に記載されている（例えば、特にイソプレン合成に関与する核酸の同定方法に関して本願に参照として組み込まれるJulsing et al, Applied. Microbiol. Biotechnol. 75: 1377-84, 2007; Withers et al, Appl Environ Microbiol. 73(19):6277-83, 2007を参照)。
【０１４０】
さらに、標準的配列アライメントおよび／または構造予測プログラムを用い、公知のイソプレンシンターゼDXS, IDI,および／またはMVA経路ポリペプチド及び核酸との一次構造および／または予測されるポリペプチドの二次構造の類似性に基づいて、別のDXS, IDI,および／またはMVA経路ポリペプチド及び核酸を特定することもできる。
Swissprot-tremblデータベース（ワールドワイドウエブの"expasy.org", Swiss Institute of Bioinformatics Swiss-Prot group CMU - 1 rue Michel Servet CH- 1211 Geneva 4, Switzerland）等の標準データベースを用いてイソプレンシンターゼDXS, IDI,またはMVA経路ポリペプチド及び核酸を特定することもできる。
イソプレンシンターゼDXS, IDI,またはMVA経路ポリペプチドの二次および／または三次構造を、PredictProtein (Rost et al., The PredictProtein Server. Nucleic Acids Research 32(Web Server issue):W321-W326, 2004)等の標準構造予測プログラムの初期設定を用いて予測することもできる。
または、イソプレンシンターゼDXS, IDI,またはMVA経路ポリペプチドの実際の二次および／または三次構造を、標準的方法を用いて決定することもできる。別のイソプレンシンターゼDXS, IDI,またはMVA経路核酸を、公知のイソプレンシンターゼDXS, IDI,またはMVA経路核酸から調製したプローブとのハイブリッド化によって特定することもできる。
【０１４１】
＜プロモータとベクターの例＞
本願のイソプレンシンターゼDXS, IDI,またはMVA経路核酸は、1以上のベクターに含まれていてもよい。すなわち、この発明は、本願のイソプレンシンターゼDXS, IDI,またはMVA経路ポリペプチドをコードする1以上の核酸を備えるベクターにも関する。
「ベクター」とは、宿主細胞中で対象とする1以上の核酸を輸送し、望ましくは発現することができる構築体を意味する。ベクターの非限定的例示としてプラスミド、ビールス性ベクター、DNAまたはRNA発現ベクター、コスミド、及びファージベクターが挙げられる。いくつかの実施形態では、ベクターは発現制御配列により制御された核酸を備える。
【０１４２】
「発現制御配列」とは、対象とする核酸の転写を制御する核酸配列を意味する。発現制御配列は、構成的プロモータまたは誘導プロモータ等のプロモータ、またはエンハンサーであってもよい。「誘導プロモータ」とは、環境的または発生的調整において活性なプロモータである。発現制御配列は、転写される核酸セグメントに作動可能に結合している。
【０１４３】
いくつかの実施形態では、ベクターには選択マーカが含まれている。「選択マーカ」とは、宿主細胞中で発現することができ、導入された核酸またはベクターを含む宿主細胞の選別を容易にする核酸を意味する。選択マーカの非限定的例示として抗生物質耐性核酸(例えば、カナマイシン、アンピシリン、カルベニシリン、ゲンタマイシン、ハイグロマイシン、フレオマイシン、ブレオマイシン、ネオマイシン、またはクロラムフェニコール)および／または宿主細胞に栄養的利益等の代謝上の利益を付与する核酸が挙げられる。いくつかの実施形態では、イソプレンシンターゼDXS, IDI,またはMVA経路核酸は、選択マーカを備えない細胞の染色体に組み込まれる。
【０１４４】
好ましいベクターは、使用する宿主細胞とコンパチブルなベクターである。好ましいベクターは、例えば細菌、ビールス（例えばバクテリオファージT7またはM-13誘導ファージ等）、コスミド、酵母、または植物から誘導される。このようなベクターを得る方法、及び使用する方法は公知である（例えば特にベクターの使用に関して本願に参照として組み込まれるSambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor, 1989参照）。
【０１４５】
プロモータは周知である。宿主細胞中で機能するプロモータであれば、どのようなものでも宿主細胞中のイソプレンシンターゼDXS, IDI,またはMVA経路核酸の発現に用いることができる。
様々な宿主細胞においてイソプレンシンターゼDXS, IDI,またはMVA経路核酸の発現の推進に有用な開始制御領域またはプロモータは多数存在し、当業者に広く知られている（特に対象とする核酸の発現用ベクターに関して本願に参照として組み込まれるWO 2004/033646、及びそこに引用された文献参照）。
これらの核酸を推進可能な全てのプロモータが本願に適しており、非限定的例示としてlac, trp, λPL, λPR, T7, tac, 及びtrc (E. coli中での発現に有用)が挙げられる。
【０１４６】
いくつかの実施形態では、グルコースイソメラーゼプロモータを用いる（例えば、ポリペプチドの発現用のプロモータ及びプラスミド系について、本願に参照として組み込まれるU.S.P 7,132,527及びそこに引用された文献を参照）。公知のグルコースイソメラーゼプロモータ変異体(U.S.P 7,132,527)を用いて、グルコースイソメラーゼプロモータに作動可能に結合した核酸によりコードされるポリペプチドの発現の程度を変化させることができる。いくつかの実施形態では、グルコースイソメラーゼプロモータは低、中、または高コピープラスミドに含まれている(U.S.P 7,132,527)。
【０１４７】
いくつかの実施形態では、イソプレンシンターゼ, DXS, IDI,および／またはMVA経路核酸は、低コピープラスミド(例えば細胞1個当たり1から約4のコピーを保有するプラスミド)、中コピープラスミド(例えば細胞1個当たり約10から約15のコピーを保有するプラスミド)、または高コピープラスミド(例えば細胞1個当たり約50以上のコピーを保有するプラスミド) に含まれている。
いくつかの実施形態では、非相同または追加の内因性イソプレンシンターゼ, DXS, IDI,またはMVA経路核酸が、T7プロモータに作動可能に結合している。いくつかの実施形態では、T7プロモータに作動可能に結合した非相同または追加の内因性イソプレンシンターゼ, DXS, IDI,またはMVA経路核酸が、中または高コピープラスミドに含まれている。
いくつかの実施形態では、非相同または追加の内因性イソプレンシンターゼ, DXS, IDI,またはMVA経路核酸が、Trcプロモータに作動可能に結合している。いくつかの実施形態では、Trcプロモータに作動可能に結合した非相同または追加の内因性イソプレンシンターゼ, DXS, IDI,またはMVA経路核酸が、中または高コピープラスミドに含まれている。
いくつかの実施形態では、非相同または追加の内因性イソプレンシンターゼ, DXS, IDI,またはMVA経路核酸が、Lacプロモータに作動可能に結合している。いくつかの実施形態では、Lacプロモータに作動可能に結合した非相同または追加の内因性イソプレンシンターゼ, DXS, IDI,またはMVA経路核酸が、低コピープラスミドに含まれている。
いくつかの実施形態では、非相同または追加の内因性イソプレンシンターゼ, DXS, IDI,またはMVA経路核酸が、内因性プロモータに作動可能に結合している。この内因性プロモータは、エシェリキア(Escherichia)属、パントエア属(Pantoea)、バシラス(Bacillus) 属、ヤロウイア(Yarrowia)属、ストレプトミセス属（Streptomyces）、またはトリコデルマ属(Trichoderma)の内因性プロモータ、またはアルカリセリンプロテアーゼや、イソプレンシンターゼ, DXS, IDI,またはMVA経路の内因性プロモータ等である。
いくつかの実施形態では、内因性プロモータに作動可能に結合した非相同または追加の内因性イソプレンシンターゼ, DXS, IDI,またはMVA経路核酸は、高コピープラスミドに含まれている。いくつかの実施形態では、ベクターは細胞中の染色体に組み込まれていない複製型プラスミドである。いくつかの実施形態では、ベクターの一部または全部が細胞中の染色体に組み込まれている。
【０１４８】
いくつかの実施形態では、発現ベクターは終止配列を備える。終止制御領域は、宿主細胞中の種々の天然遺伝子に由来する。いくつかの実施形態では、終止配列とプロモータ配列は同一起源に由来する。別の実施形態では、終止配列は宿主細胞に対し内因性である。
【０１４９】
いくつかの実施形態では、プロモータ、コード、領域、及びターミネータの全てが、発現させるイソプレンシンターゼ, DXS, IDI,またはMVA経路核酸を起源とする。いくつかの実施形態では、イソプレンシンターゼ, DXS, IDI,またはMVA経路核酸のコード領域を、発現構築プロモータと終止配列の転写制御下におかれるようにして汎用発現ベクターに挿入する。いくつかの実施形態では、遺伝子の一部または全部を強いcbh1プロモータの下流側に挿入する。
【０１５０】
イソプレンシンターゼ, DXS, IDI,またはMVA経路核酸を、標準的方法 (特に適切なDNA配列のスクリーニング及びベクターの構築に関して本願に参照として組み込まれるSambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1982参照) を用いて発現ベクター等のベクター中に組み込む。
対象とする核酸 (例えばイソプレンシンターゼ, DXS, IDI,またはMVA経路核酸)、プロモータ、ターミネータ、及び多の配列を備えるDNA 構築体を結紮する方法、及びこれらを適切なベクター中に挿入する方法は周知である。
例えば制限酵素を用いて、イソプレンシンターゼ, DXS, IDI,またはMVA経路核酸、及びベクターを切り取ることができる。次に、切り取ったイソプレンシンターゼ, DXS, IDI,またはMVA経路核酸と、切り取ったベクターのコンパチブルな末端同士を結紮する。通常、結合は適切な制限酵素認識部位を結紮することにより行う。このような部位が存在しない場合は、公知の方法に従って合成オリゴヌクレオチドリンカーを用いる(特にオリゴヌクレオチドリンカーに関して本願に参照として組み込まれるSambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor, 1989, 及び Bennett and Lasure, More Gene Manipulations in Fungi, Academic Press, San Diego, pp 70-76, 1991参照)。
また、公知の組換え方法によりベクターを構築することができる (例えばInvitrogen Life Technologies社の Gateway Technology) 。
【０１５１】
いくつかの実施形態では、現在天然細胞中で見られるよりもはるかに高いレベルでイソプレンシンターゼ, DXS, IDI,またはMVA経路核酸を過剰発現させることが好ましい。これは、これらのポリペプチドをコードする核酸を、マルチコピープラスミド中に選択的にクローン化するか、これらの核酸を強誘導プロモータまたは構築プロモータの下に置くことにより達成できる。
所望のポリペプチドを過剰発現させる方法は分子生物学の分野において周知であり、その例が、クローン化技術に関して本願に参照として組み込まれるSambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor, 1989に記載されている。
【０１５２】
次の文献に、この発明に関して有用な一般的手法がさらに記載されている。Kreigler, Gene Transfer and Expression; A Laboratory Manual, 1990、及びAusubel et al, Eds. Current Protocols in Molecular Biology, 1994。これらの文献は、分子生物学及びクローン化技術に関して本願に参照として組み込まれる。
【０１５３】
＜有機体の例＞
イソプレンシンターゼ, DXS, IDI,またはMVA経路核酸 (及びこれによりコードされたポリペプチド) は、天然のイソプレンシンターゼ、 DXS、 IDI、及び／またはMVA経路核酸を含む有機体から得ることができる。上記のように、イソプレンは細菌、酵母、植物、及び動物等の様々な有機体により天然に産出されている。有機体は、イソプレンを産出するためのMVA経路、 DXP経路、またはMVA及びDXP経路の双方を備える（図15）。従って、例えばDXP経路、またはMVA及びDXP経路の双方を備える有機体からDXS核酸を得ることができる。IDI及びイソプレンシンターゼ核酸は、例えばMVA経路、 DXP経路、またはMVA及びDXP経路の双方を備える有機体から得ることができる。MVA経路核酸は、例えばMVA経路、またはMVA及びDXP経路の双方を備える有機体から得ることができる。
【０１５４】
いくつかの実施形態では、イソプレンシンターゼ, DXS, IDI,またはMVA経路核酸の核酸配列は、以下の天然有機体から産出される核酸配列と同様である。いくつかの実施形態では、イソプレンシンターゼ, DXS, IDI,またはMVA経路ポリペプチドのアミノ酸配列は、以下の天然有機体から産出されるポリペプチドの配列と同様である。いくつかの実施形態では、イソプレンシンターゼ, DXS, IDI,またはMVA経路核酸またはポリペプチドは、本願に開示する有機体に由来する核酸変異体またはポリペプチド変異体である。
「に由来する」とは、１以上の実施形態では突然変異が導入された核酸またはポリペプチドの起源を意味する。例えば、「植物ポリペプチドに由来する」ポリペプチドとは、対象とするポリペプチドが野生型 (すなわち、天然の配列) 植物ポリペプチドに1以上の突然変異を導入することにより得られたことを意味する。
【０１５５】
いくつかの実施形態では、有機体は例えばエシェリキア属（例えばE. coli）株、またはバシラス属（例えばB. スブチリス）株等のバクテリアである。
【０１５６】
「エシェリキア属」には公知のエシェリキア属に属する全ての種が含まれ、非限定的例示としてエシェリキア・コリ(E. coli), E. アデカーボキシレート(adecarboxylata), E.アルベルティー(albertii), E. ブラタエ(blattae), E.ファーグソニ(fergusonii), E. ハーマンニ(hermannii), E. セネガレンシス(senegalensis), 及び E. ブルネリス(vulneris)が挙げられる。「エシェリキア属」は無胞子グラム陰性、通性嫌気性の桿菌と定義され、エンテロバクテリアセエ属、エンテロバクテリアレス目、ガンマプロテオバクテリア網に分類される。
【０１５７】
「バシラス属」には、公知の「バシラス」属に属する全ての種が含まれ、非限定的例示としてB. スブチリス、バシラス・リケニホルミス(Licheniformis)、B. レンタス(lentus)、B.ブレビス (brevis)、B. ステアロサーモフィラス (stearothermophilus)、B.アルカロフィラス (alkalophilus)、B. アミロリケファシエンス (amyloliquefaciens)、B.クラウシー (clausii)、B.ハロヂュランス (halodurans)、B.メガテリウム (megaterium)、B.コーギュランス (coagulans)、B.サーキュランス (circulans)、B.ロータス (lautus)、及び B.チューリンゲンシス (thuringiensis)が挙げられる。
バシラス属に関して、分類学上の見直しが引き続いて行われている。したがって、本願のバシラス属には、現在は「ゲオバシラス・ステアロサーモフィラス」と呼ばれているB. ステアロサーモフィラス等の、再分類された有機体も含まれる。酸素の存在下で耐性内生胞子を産出することがバシラス属の特徴と考えられるが、このような特徴は最近アリシクロバシラス(Alicyclobacillus), アンフィバシラス(Amphibacillus), アニューリニバシラス(Aneurinibacillus), アノキシバシラス(Anoxybacillus), ブレビバシラス (Brevibacillus), フィロバシラス(Filobacillus), グラシリバシラス(Gracilibacillus), ハロバシラス(Halobacillus), パエニバシラス(Paenibacillus), サリバシラス(Salibacillus), サーモバシラス(Thermobacillus), ウレイバシラス(Ureibacillus), 及びバージバシラス (Virgibacillus)と命名されたものにも当てはまる。
【０１５８】
＜宿主細胞の例＞
この発明では、イソプレンシンターゼ、DXS, IDI, および／またはMVA経路ポリペプチドを発現させてイソプレンを産出するために、種々の宿主細胞を用いることができる。
宿主細胞の例には前記の「有機体の例」に示した有機体が含まれる。宿主細胞は、天然にイソプレンを産出するか、または天然にイソプレンを産出しない細胞である。
いくつかの実施形態では、宿主細胞は天然でDXP経路によりイソプレンを産出し、イソプレンシンターゼ、 DXS、 IDI、および／またはMVA経路核酸を追加することにより、DXP経路によるイソプレン産出が強化される。いくつかの実施形態では、宿主細胞は天然でMVA経路によりイソプレンを産出し、イソプレンシンターゼ、 DXS、 IDI、および／またはMVA経路核酸を追加することにより、MVA経路によるイソプレン産出が強化される。いくつかの実施形態では、宿主細胞は天然でDXP経路によりイソプレンを産出し、1以上のMVA経路核酸が追加されることにより、MVA経路及びDXP経路の一部または全部を用いることによってイソプレンを産出する。いくつかの実施形態では、宿主細胞は天然でDXP経路及びMVA経路によりイソプレンを産出し、1以上のイソプレンシンターゼ、 DXS、 IDI、および／またはMVA経路核酸が追加されることにより、DXP経路及びMVA経路のいずれか一方または両方によるイソプレン産出が増加する。
【０１５９】
＜形質転換方法の例＞
標準的方法により、イソプレンシンターゼ, DXS, IDI,および／またはMVA経路核酸、あるいはこれらを含むベクターを、宿主細胞(例えばバクテリア細胞) 中に挿入し、コードされたイソプレンシンターゼ, DXS, IDI,および／またはMVA経路ポリペプチドを発現させることができる。
DNA構築体又はベクターの宿主細胞中への導入方法として、形質転換、エレクトロポレーション、核酸のマイクロインジェクション、形質導入、トランスフェクション(例えばリポフェクション仲介、DEAE−デキストリン仲介トランスフェクションまたは組み換えファージビールスを用いたトランスフェクション)、リン酸カルシウムDNA沈殿によるインキュベーション、DNAで被覆したマイクロプロジェクタイルを用いた高速遺伝子銃、及びプロトプラスト融合が挙げられる。
一般的な形質転換技術は公知である。（例えばCurrent Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel et al. (eds) Chapter 9, 1987; Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor, 1989; 及び Campbell et al, Curr. Genet. 16:53-56, 1989,参照。これらの文献は、特に形質転換の方法に関して本願に参照として組み込まれる。） 
導入された核酸は染色体DNA中に組み込むか、または染色体外の複製用配列として保管する。
【０１６０】
＜細胞培養培地の例＞
この発明は、イソプレンを産出する培養物中の細胞または細胞の集団にも関する。「培地中の細胞」とは、細胞が1以上の細胞分裂することを可能にする溶液中（例えば細胞培地）にある2以上の細胞を意味する。「培養物中の細胞」には、植物組織に分化した細胞を含む生きた多細胞植物の一部である植物細胞は含まれない。いくつかの実施形態では、細胞培地には少なくとも約10, 20, 50, 100, 200, 500, 1,000, 5,000, 10,000またはそれ以上の細胞が含まれる。
【０１６１】
宿主細胞の培養には任意の炭素源を用いることができる。「炭素源」とは、1以上の炭素を含む化合物であって、宿主細胞または有機体によって代謝される化合物を意味する。例えば、宿主細胞を培養する細胞培地には、宿主細胞の生存能力または成長を維持することができる炭素源が含まれている。
【０１６２】
いくつかの実施形態では、炭素源は炭水化物 (例えばモノサッカライド、ジサッカライド、オリゴサッカライド、またはポリサッカライド)、転化糖 (例えば酵素処理されたサッカロースシロップ)、グリセロール、グリセリン (例えばバイオディーゼル油またはセッケン製造工程の副産物のグリセリン)、ジヒドロキシアセトン、1-炭素源、脂肪酸(例えば飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸、またはポリ不飽和脂肪酸)、脂質、リン脂質、グリセロ脂質、モノグリセライド、ジグリセライド、トリグリセライド、ポリペプチド (例えば微生物製または植物性タンパク質またはペプチド)、再生可能な炭素源(例えば加水分解されたバイオマス炭素源等のバイオマス炭素源)、酵母エキス、酵母エキスの成分、ポリマー、酸、アルコール、アルデヒド、ケトン、アミノ酸、コハク酸エステル、乳酸塩、アセテート、エタノール、またはこれらの2以上の組合せ等である。
いくつかの実施形態では、炭素源は光合成の生成物であり、例えばグルコースであるが、これに限定されない。
【０１６３】
モノサッカライドの例にはグルコースとフルクトースが含まれる。オリゴサッカライドの例にはラクトースとサッカロースが含まれる。ポリサッカライドの例には澱粉とセルロースが含まれる。炭水化物の例にはC6糖(例えばフルクトース、マンノース、ガラクトース、またはグルコース)及びC5糖(例えばキシロースまたはアラビノース)が含まれる。
いくつかの実施形態では、細胞培地には炭水化物と炭水化物以外の炭素源(例えばグリセロール、グリセリン、ジヒドロキシアセトン、1-炭素源、脂肪酸、脂質、リン脂質、グリセロ脂質、モノグリセライド、ジグリセライド、トリグリセライド、再生可能な炭素源、または酵母エキスの成分)とが含まれる。
いくつかの実施形態では、細胞培地には炭水化物と、ポリペプチド(例えば細菌性または植物性タンパク質またはペプチド)とが含まれる。いくつかの実施形態では、細菌性ポリペプチドは、酵母または細菌由来のポリペプチドである。いくつかの実施形態では、植物性ポリペプチドは、大豆、コーン、キャノーラ、ジャトロファ、パーム、ピーナッツ、ヒマワリ、ココナッツ、マスタード、菜種、綿実、パーム核油、オリーブ、紅花、ゴマ、または亜麻仁由来のポリペプチドである。
【０１６４】
いくつかの実施形態では、炭水化物の濃度は、ブロス1リットルについて少なくとも約5グラム(g/L, ここでブロスの容積には細胞の容積及び細胞培地の容積が含まれる) であり、例えば少なくとも約10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 80, 100, 150, 200, 300, 400g/L以上、またはこれ以上である。いくつかの実施形態では、炭水化物の濃度は約50から約400g/L、例えば約100から約360g/L、約120から約360g/L、約200から約300g/Lである。いくつかの実施形態では、この炭水化物の濃度は、宿主細胞の培養の前および／または途中に添加した炭水化物の総量に基づく濃度である。
【０１６５】
脂質の例は、C4以上の飽和、不飽和、または分岐脂肪酸を1以上含む物質である。
【０１６６】
脂肪酸の例には、式RCOOHであらわされる化合物が含まれ、ここで「R」は炭化水素である。不飽和脂肪酸の例には、「R」に少なくとも1の炭素−炭素二重結合を有する化合物が含まれる。不飽和脂肪酸の非限定的例示としてオレイン酸、バクセン酸、リノール酸、パルミテライジン酸、及びアラキドン酸が挙げられる。多価不飽和脂肪酸の例には、「R」に複数の炭素−炭素二重結合を有する化合物が含まれる。飽和脂肪酸の例には、「R」が飽和脂肪族基である化合物が含まれる。
いくつかの実施形態では、炭素源には1以上のC2からC22の脂肪酸が含まれ、例えばC12脂肪酸、C14脂肪酸、C16脂肪酸、C18脂肪酸、C20脂肪酸、C22脂肪酸が含まれる。1つの実施形態では、脂肪酸はパルミチン酸である。
いくつかの実施形態では、炭素源は脂肪酸 (例えば不飽和脂肪酸) の塩 (例えば不飽和脂肪酸)、脂肪酸 (例えば不飽和脂肪酸) の誘導体、または脂肪酸 (例えば不飽和脂肪酸) の誘導体の塩である。好ましい塩の非限定的例示として、リチウム塩、カリウム塩、及びナトリウム塩等が挙げられる。ジ−及びトリ−グリセロールは、グリセロールの脂肪酸エステルである。
【０１６７】
いくつかの実施形態では、脂質、脂肪酸、モノグリセライド、ジグリセライド、またはトリグリセライドの濃度はブロス1リットル当り少なくとも1グラム(g/L, ここでブロスの容積には細胞の容積及び細胞培地の容積が含まれる) であり、例えば少なくとも約5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 80, 100, 150, 200, 300, 400g/L以上、またはこれら以上である。
いくつかの実施形態では、脂質、脂肪酸、モノグリセライド、ジグリセライド、またはトリグリセライドの濃度は約10から約400g/Lであり、例えば約25から約300g/L、約60から約180g/L、または約75から約150g/Lである。いくつかの実施形態では、この濃度は、宿主細胞の培養の前および／または途中に添加した脂質、脂肪酸、モノグリセライド、ジグリセライド、またはトリグリセライドの総量に基づく濃度である。
いくつかの実施形態では、炭素源には(i)脂質、脂肪酸、モノグリセライド、ジグリセライド、またはトリグリセライド、及び(ii)グルコース等の炭水化物が含まれる。
いくつかの実施形態では、脂質、脂肪酸、モノグリセライド、ジグリセライド、またはトリグリセライドと炭水化物との比率は炭素を基準として（すなわち、脂質、脂肪酸、モノグリセライド、ジグリセライド、またはトリグリセライド中の炭素1個に対する炭水化物中の炭素の数）約1:1である。特定の実施形態では、脂質、脂肪酸、モノグリセライド、ジグリセライド、またはトリグリセライドの量は約60から180g/Lで、炭水化物の量は約120から360 g/Lである。
【０１６８】
微生物ポリペプチド炭素源の例には、酵母または細菌由来のポリペプチドの1以上が含まれる。植物性ポリペプチド炭素源の例には、大豆、コーン、キャノーラ、ジャトロファ、パーム、ピーナッツ、ヒマワリ、ココナッツ、マスタード、菜種、綿実、パーム核油、オリーブ、紅花、ゴマ、または亜麻仁に由来するポリペプチドの1以上が含まれる。
【０１６９】
再生可能な炭素源の例には、チーズホエーパーミエイト(cheese whey permeate)、コーンスティープリカー(cornsteep liquor)、シュガービートモラス(sugar beet molasse)、大麦モルト、及びこれらに由来する成分が含まれる。また再生可能な炭素源の例には、バイオマス中のグルコース, ヘキソース, ペントース、及びキシロース、例えばコーン、スイッチグラス、サトウキビ、発酵プロセスにおける廃細胞、及び大豆、コーン、または小麦製粉時のタンパク質副産物が含まれる。
いくつかの実施形態では、バイオマス炭素源はリノグリセロール系、ヘミグリセロール系、またはセロール系の基質であり、その非限定的例示として草、小麦、麦わら、 バガス、サトウキビバガス、軟質木材パルプ、コーン、コーン穂軸または皮、コーン穀粒、コーン穀粒繊維、コーン茎葉、スイッチグラス、籾殻、または穀物(例えばコーン、ソルガム、ライ麦、トリティケイト(triticate)、大麦、小麦、および／または蒸留酒穀物残渣)の湿式または乾式製粉における副産物が挙げられる。
セルロース系基質の例には、木、紙、及びパルプの廃材、葉状植物、及び果肉が含まれる。いくつかの実施形態では、炭素源には柄、穀粒、根、塊茎等の植物の一部分が含まれる。
いくつかの実施形態では、次の植物の一部または全部を炭素源として用いる。コーン, 小麦, ライ麦, ソルガム, トリティケイト, コメ, アワ, 大麦, キャッサバ, エンドウマメ等のマメ科植物, ジャガイモ, サツマイモ, バナナ,   サトウキビおよび／またはタピオカ。
いくつかの実施形態では、炭素源はバイオマス加水分解物であり、例えばキシロースとグルコースの両者を含むバイオマス加水分解物、またはサッカロースとグルコースの両者を含むバイオマス加水分解物である。
【０１７０】
いくつかの実施形態では、再生可能な炭素源 (例えばバイオマス)を細胞培地に添加する前に前処理する。いくつかの実施形態では、前処理には酵素的前処理、化学的前処理、及び酵素的前処理と化学的前処理の組み合わせ (例えば、特に再生可能な炭素源の前処理に関して本願に参照として組み込まれるFarzaneh et al, Bioresource Technology 96 (18): 2014-2018, 2005; U.S.P  6,176,176; U.S.P 6,106,888参照)が含まれる。
いくつかの実施形態では、再生可能な炭素源を細胞培地に添加する前に、その全部または一部を加水分解する。
【０１７１】
いくつかの実施形態では、再生可能な炭素源（例えばコーン茎葉）を細胞培地に添加する前に、アンモニア繊維膨潤(AFEX)前処理する（例えばFarzaneh et al, Bioresource Technology 96 (18): 2014-2018, 2005参照）。AFEX前処理の間、再生可能な炭素源を、液状無水アンモニアにより中程度の温度（例えば約60から約100℃）において高圧（例えば約250から約300psi）で約5分間処理する。次に、圧力を急激に下げる。
このプロセスでは、リグニン可溶化、ヘミセルロース加水分解、セルロース非結晶化、及び表面積増加等の化学的及び物理的効果の組み合わせにより、セルロースとヘミセルロースを酵素転換してほぼ完全に発酵性糖へ転換することができる。AFEX前処理ではアンモニアのほぼ全量を回収して再使用することができるとともに、残量を下流側プロセス中の細菌の窒素源として用いることができる。また、AFEX前処理では洗浄ストリームは不要である。AFEX処理後の乾燥物質の回収率は実質的に100%である。基本的にAFEXは乾燥状態から乾燥状態へのプロセスである。
処理された再生可能な炭素源は長期間安定であり、酵素加水分解または発酵プロセスへ高固形成分率で供給することができる。AFEX処理中、ヘミセルロース及びセルロースは殆ど分解せず、十分保存される。AFEX前処理した再生可能な炭素源は、酵素加水分解する前に中和する必要は無い。AFEX処理炭素源を酵素加水分解することにより、次の発酵工程で使用するための清浄な糖ストリームを製造することができる。
【０１７２】
いくつかの実施形態では、炭素源（例えば再生可能な炭素源）の濃度は、少なくとも約0.1, 0.5, 1, 1.5, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40, または50%グルコース(w/v) に等しい量である。グルコースに等しい量は、標準的HPLC法においてグルコースを参照として用いて、炭素源から生成するグルコースの量を測定することにより求めることができる。
いくつかの実施形態では、炭素源（例えば再生可能な炭素源）の濃度は、約0.1から約20%グルコースであり、例えば約0.1から約10%グルコース、約0.5から約10%グルコース、約1から約10%グルコース、約1から約5%グルコース、または約1から約2%グルコースである。
【０１７３】
いくつかの実施形態では、炭素源には酵母エキス、または酵母エキスの1以上の成分が含まれる。いくつかの実施形態では、酵母エキスの濃度は、ブロス1リットル当り少なくとも1グラム（g/L、ここでブロスの容積には細胞及び細胞培地の容積が含まれる）であり、例えば少なくとも約5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 80, 100, 150, 200, 300g/Lまたはそれ以上である。
いくつかの実施形態では、酵母エキスの濃度は、ブロス1リットル当り約1から約300g/L、例えば約1から約200g/L、約5から約200g/L、約5から約100g/L、約5から約60g/Lである。いくつかの実施形態では、酵母エキスの濃度は、宿主細胞の培養の前および／または途中に添加した酵母エキスの総量に基づく濃度である。
いくつかの実施形態では、炭素源には酵母エキス（またはその成分の1以上）と、グルコース等の他の炭素源との両者が含まれる。いくつかの実施形態では、酵母エキスと他の炭素源の比率は約1 :5、約1 : 10、または約1 :20 (w/w)である。
【０１７４】
あるいは、炭素源は二酸化炭素やメタノール等の1炭素基質でもよい。メチロトローフ酵母  (特に炭素源に関して本願に参照として組み込まれるYamada et al, Agric. Biol. Chem., 53(2) 541-543, 1989参照)  や細菌  (特に炭素源に関して本願に参照として組み込まれるHunter et al, Biochemistry, 24, 4148-4155, 1985参照)  により、1炭素基質  (例えばメタノール、ホルムアルデヒド、またはギ酸塩)  からグリセロールが産出されることが報告されている。
これらの有機体はメタンからギ酸塩の範囲の酸化状態にある1炭素基質を取り込んでグリセロールを産出することができる。炭素の取り込み経路は、リブロースモノホスフェート経由の経路、セリン経由の経路、またはキシロースモノホスフェート経由の経路(特に炭素源に関して本願に参照として組み込まれるGottschalk, Bacterial Metabolism, Second Edition, Springer-Verlag: New York, 1986参照)のいずれかである。
リブロースモノホスフェート経路では、リブロース-5-ホスフェートがギ酸塩を縮合して、フルクトースとなる炭素数6の糖が形成され、最終的に炭素数3のグリセルアルデヒド-3-ホスフェートとなる。またセリン経路では、1炭素基質を、メチレンテトラヒドロフォレートを経由して糖分解経路に取り込む。
【０１７５】
メチロトローフ有機体は、炭素数が1または2の基質の他に、例えばメチルアミン、グルコースアミン、及び種々のアミノ酸等、様々な種類の炭素含有化合物を代謝活性に利用することが知られている。
例えばメチロトローフ酵母はメチルアミンの炭素からトレハロースまたはグリセロールを形成することが知られている(例えば特に炭素源に関して本願に参照として組み込まれるBellion et al, Microb. Growth Cl Compd, [Int. Symp.], 7th ed., 415-32. Editors: Murrell et al, Publisher: Intercept, Andover, UK, 1993参照)。また、種々のカンジダ(Candida)属の種は、アラニンまたはオレイン酸を代謝する（特に炭素源に関して本願に参照として組み込まれるSulter et al, Arch. Microbiol. 153(5), 485-9, 1990）。
【０１７６】
いくつかの実施形態では、細胞を生理食塩水と栄養源を含む標準的培地で培養する（例えば、特に細胞培地に関して本願に参照として組み込まれるPourquie, J. et al, Biochemistry and Genetics of Cellulose Degradation, eds. Aubert et al, Academic Press, pp. 71-86, 1988 及び Ilmen et al, Appl. Environ. Microbiol. 63: 1298-1306, 1997参照）。
培養培地の例として、ルリアベルタニ(LB) ブロス、サブローデキストロース (SD)ブロス、またはイーストメディア(YM)ブロス等の一般的に市販されている既成の培地が挙げられる。これ以外の合成培地を用いることもできる。分子生物学または発酵の分野の当業者であれば、特定の宿主細胞の培養に適した培地を適宜選択して用いることができる。
【０１７７】
細胞培地には適切な炭素源の他に、適切なミネラル、塩、補助因子、緩衝液、及び培養に適していること、またはイソプレン産出を促進すること（例えば、特に細胞培地及び培養条件に関して本願に参照として組み込まれるWO 2004/033646及びWO 96/35796及びこれらに引用された文献参照）が当業者に知られている成分が含まれていることが望ましい。
いくつかの実施形態では、イソプレンシンターゼDXS, IDI,および／またはMVA経路核酸が誘導プロモータの制御下にある場合、イソプレンシンターゼDXS, IDI,および／またはMVA経路ポリペプチドの発現を誘発させるために有効な濃度の誘発剤（例えば糖、金属塩、または抗菌剤）を培地に添加することが望ましい。いくつかの実施形態では細胞培地には抗生物質（例えばカナマイシン）が含まれ、この抗生物質は、1以上のイソプレンシンターゼDXS, IDI,および／またはMVA経路核酸を有するベクターに含まれる抗生物質耐性核酸（例えばカナマイシン耐性核酸）に対応する。
【０１７８】
＜イソプレン産出の例＞
いくつかの実施形態では、細胞を、イソプレンが産出される条件下の細胞培地を用いて培養する。
いくつかの実施形態では、培養物中の細胞はイソプレン約1nmole/gwcm/hr以上、または 10, 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1,000, 1,250, 1,500, 1,750, 2,000, 2,500, 3,000, 4,000, 5,000nmole/gwcm/hr以上、またはこれら以上のイソプレンを産出する。ここで、nmole/gwcm/hrは湿潤細胞1グラムから1時間当り産出されるイソプレンのnmole（ナノモル）数を表す。
いくつかの実施形態では、イソプレンの量は約2から約5,000nmole/gwcm/hr、例えば約2から約100nmole/gwcm/hr、約100から約500nmole/gwcm/hr、約150から約500nmole/gwcm/hr、約500から約1,000nmole/gwcm/hr、約1,000から約2,000nmole/gwcm/hr、約2,000から約5,000nmole/gwcm/hrである。
単位nmole/gwcm/hrで表されるイソプレンの量は、特にイソプレンの産出量測定法に関して本願に参照として組み込まれるU.S.P 5,849,970に開示されている。例えば、2mLのヘッドスペース（例えば、密封したバイアル中で2mLの培地を32℃で3時間200rpmで振蕩しながら培養したときのヘッドスペース）中のイソプレンについて、標準的ガスクロマトグラフィーで分析する。標準的ガスクロマトグラフィーは、等温(85℃)で操作され、n-オクタン/porasil Cカラム(Alltech Associates, Inc社., Deerfield, Ill.)を備え、RGD2酸化水銀還元ガス検出器(Trace Analytical社, Menlo Park, CA)に接続されている(例えば、特にイソプレンの産出量測定法に関して本願に参照として組み込まれるGreenberg et al, Atmos. Environ. 27A: 2689-2692, 1993; Silver et al, Plant Physiol. 97:1588-1591, 1991参照)。
ガスクロマトグラフィー測定カーブから得られる面積を、標準イソプレン濃度検量線を用いてイソプレン量（nmol）に換算する。いくつかの実施形態では、細胞の湿潤重量のグラム数は、細胞培地のサンプルのA600の値を測定し、このA600の値を既知の細胞の湿潤重量に対するA600の値の検量線に基づいて換算することにより求める。
いくつかの実施形態では、A600の値が1の1リットルのブロス（細胞及び細胞培地の容積が含まれる）には、湿潤重量が1グラムの細胞が含まれるとみなすことにより、細胞のグラム数を求める。また、この値を培養時間、例えば3時間で割り算する。
【０１７９】
いくつかの実施形態では、培養物中の細胞は約1ng/gwcm/hr以上のイソプレンを産出し、あるいは10, 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1,000, 1,250, 1,500, 1,750, 2,000, 2,500, 3,000, 4,000, 5,000, 10,000, 100,000ng/gwcm/hr以上、またはこれ以上のイソプレンを産出する。ここで、nmole/gwcm/hrは湿潤細胞1グラムから1時間当り産出されるイソプレンのnmole（ナノモル）数を表す。
いくつかの実施形態では、産出されるイソプレンの量は、約2から約5,000ng/gwcm/hr、例えば約2から約100ng/gwcm/hr、約100から約500ng/gwcm/hr、約500から約1,000ng/gwcm/hr、約1,000から約2,000ng/gwcm/hr、または約2,000から約5,000ng/gwcm/hrである。ng/gwcm/hrで表されるイソプレンの量は、上記の単位nmole/gwcm/hrで表されるイソプレン産出値に68.1を掛けることで計算により求めることができる（下記の式5参照）。
【０１８０】
いくつかの実施形態では、培養物中の細胞は累積力価（総産出量）が約1mg/Lbroth以上のイソプレンを産出し、あるいは約10, 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1,000, 1,250, 1,500, 1,750, 2,000, 2,500, 3,000, 4,000, 5,000, 10,000, 50,000, 100,000mg/Lbroth以上、またはこれ以上のイソプレンを産出する。（ここでmg/Lbrothはブロス1リットルあたりから産出されるイソプレンのmg（ミリグラム）数を表し、ブロスの容積には細胞及び培地の容積が含まれる。）
いくつかの実施形態では、イソプレンの総産出量は約2から約5,000mg/Lbroth、例えば約2から約100mg/Lbroth、約100から約500mg/Lbroth、約500から約1,000mg/Lbroth、約1,000から約2,000mg/Lbroth、または約2,000から約5,000mg/Lbrothである。
振蕩フラスコまたは同様の培地においてイソプレンのmg数/ヘッドスペースのリットル(L)数で表されるイソプレンの固有生産性は、OD600の値が約1の細胞培地から1 mlのサンプルを採取し、このサンプルを20 mLのバイアルに入れ、30分間培養し、次にヘッドスペース中のイソプレンの量を測定することにより求めることができる。OD600の値が1.0でない場合は、OD600の値で割り算することにより、OD600の値が1.0のときの値に正規化する。イソプレンのmg数/ヘッドスペースのリットル(L)数の値に38を掛け算することにより、培養ブロスのmg/Lbroth/hr/OD600に換算することができる。単位mg/Lbroth/hr/OD600で表される値に時間数とOD600の値とを掛け算することにより、単位がイソプレンのmg数/ブロスのリットル(L)数で表される累積力価を求めることができる。
【０１８１】
単位mg/Lbroth/hrで表される発酵槽中におけるイソプレン産出速度は、発酵槽オフガスのサンプルを採取し、このサンプル中のイソプレンの量（単位はイソプレンmg/Lgas）を測定し、この測定値にブロス1リットル当りのオフガス流量(例えば1 vvm (気体容積/ブロス容積/分)これは60 Lgas/hourに等しい)を掛け算することにより求めることができる。すなわち、1 mg/Lgasのオフガス濃度は、1 vvmの気体流量における産出速度60 mg/Lbroth/hrに相当する。
所望により、単位mg/Lbroth/hrの値をOD600の値で割り算することにより、単位mg/Lbroth/hr/ODの固有速度を求めることができる。イソプレンmg/Lgasの平均値は、このイソプレン濃度の平均値に発酵中に発酵ブロス1リットルから放出されたオフガスの全量を掛け算することにより、全製品生産性(発酵ブロス1リットル当りのイソプレングラム数、mg/Lbroth)に変換することができる。すなわち、1 vvmにおいて平均オフガスイソプレン濃度0.5 mg/Lbroth/hrで10時間製造したときの全製品濃度はイソプレン300mg/Lbrothである。
【０１８２】
いくつかの実施形態では、培養物中の細胞は培地中の炭素の約0.0015モル％以上をイソプレンに転換し、あるいは培地中の炭素の0.002, 0.005, 0.01, 0.02, 0.05, 0.1, 0.12, 0.14, 0.16, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.2, 1.4モル％以上、または1.6モル％以上をイソプレンに転換する。
いくつかの実施形態では、イソプレンに転換される炭素のパーセントは約0.002から約1.6モル%、例えば約0.002から0.005%、約0.005から0.01%、約0.01から0.05%、約0.05から0.15%、0.15から0.2%、約0.2から0.3%、約0.3から0.5%、約0.5から0.8%、約0.8から1.0%、約1.0から1.6%である。
炭素からイソプレンへの転換パーセント（「炭素収率%」とも呼ぶ）は、産出されたイソプレン中の炭素モル数を、炭素源中の炭素モル数（例えばバッチ中と供給されたグルコース及び酵母エキス中の炭素モル数）で割り算することにより求めることができる。（式1に示すように）この数字に100をかけてパーセントの値とする。
【０１８３】
＜式１＞
炭素収率% = (産出されたイソプレン中の炭素モル数)/(炭素源中の炭素モル数)×100
【０１８４】
この計算では、酵母エキスは炭素を50% w/w含むとみなすことができる。
【０１８５】
＜式2＞
炭素収率% = (39.1gイソプレン×l/68.1モル/g×5C/モルmol)/[(181221gグルコース×1/180モル/g×6 C/モル) + (17780g酵母エキス×0.5×1/12モル/g)]×100 = 0.042% 
【０１８６】
当業者であれば、イソプレン産出速度または産出されたイソプレンの量を容易に他の単位に変換することができるであろう。以下に、単位間の変換式の例を示す。
【０１８７】
＜イソプレン産出速度の単位（全または固有）
＜式3＞
イソプレン1 g/Lbroth/hr = 14.7ミリモルイソプレン/Lbroth/hr (全容積速度)
【０１８８】
＜式4＞
イソプレン1ナノモル/gwcm/hr = イソプレン1ナノモル/Lbroth/hr/OD600(この変換式では、OD600の値が1のブロス1リットル中には湿潤重量1グラムの細胞が含まれているとみなす）。
【０１８９】
＜式5＞
イソプレン1ナノモル/gwcm/hr = イソプレン68.1ナノグラム/gwcm/hr (イソプレンの分子量に基づく)
【０１９０】
＜式６＞
イソプレン1ナノモル/Lgas O2/hr = イソプレン90ナノモル/Lbroth/hr （培養ブロス1リットル当りのO2流量が90 L/hrのとき）
【０１９１】
＜式7＞
イソプレン1μg/オフガス中のイソプレンLgas = イソプレン60μg/Lbroth/hr （Lbroth 当りの流量が60 Lgasのとき(1 vvm)）
【０１９２】
＜力価の単位＞（全及び固有）
＜式8＞
イソプレン1 ナノモル/タンパク質細胞mg = イソプレン150 ナノモル/Lbroth/OD600 (この変換式では、OD600の値が1のブロス1リットル中には約150ミリグラムの全タンパク質細胞が含まれるとみなす) (固有生産性)
【０１９３】
＜式9＞
イソプレン1 g/Lbroth = イソプレン14.7ミリモル/Lbroth (全力価)
【０１９４】
所望により、式10によって細胞の湿潤重量を含むいずれかの単位を、細胞の乾燥重量を含む単位に変換することができる。
【０１９５】
＜式10＞
細胞の乾燥重量 = （細胞の湿潤重量）/3.3
【０１９６】
この発明のいくつかの実施形態では、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする非相同核酸を備える細胞は、実質的に同じ条件で培養したイソプレンシンターゼポリペプチドをコードする非相同核酸を備えない対応する細胞と比較して、少なくとも約2倍, 3倍, 5倍, 10倍, 25倍, 50倍, 100倍, 150倍, 200倍, 400倍またはそれ以上の量のイソプレンを産出する。
【０１９７】
この発明のいくつかの実施形態では、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする非相同核酸及び1以上のDXS, IDI,および／またはMVA経路ポリペプチドをコードする非相同核酸を備える細胞は、実質的に同じ条件で培養したこれらの非相同核酸を備えない対応する細胞と比較して、少なくとも約2倍, 3倍, 5倍, 10倍, 25倍, 50倍, 100倍, 150倍, 200倍, 400倍またはこれ以上の量のイソプレンを産出する。
【０１９８】
＜イソプレン精製方法の例＞
いくつかの実施形態では、本願の方法にはイソプレンの回収工程が含まれる。例えば、本願の方法及び組成物を用いて産出したイソプレンを標準的方法で回収することができる。このような標準的方法の例は、ガスストリッピング、分留、吸着／脱着、パーベーパレーション、熱または真空によるイソプレンの固相からの脱着、または固相に固着または吸着させたイソプレンの溶媒による抽出 (特にイソプレンの回収及び精製方法に関して本願に参照として組み込まれるU.S.P. 4,703,007 及び4,570,029参照)等である。
いくつかの実施形態では、イソプレンの回収工程には、イソプレンを液相状態(例えばイソプレンのみの液体、またはイソプレンを含む溶媒)で単離することが含まれる。
ガスストリッピングでは、発酵オフガスから連続的に気体状イソプレンを回収する。このような気体状イソプレンの回収は種々の方法で行うことができ、非限定的例示として固相への吸着、液相への分離、または直接凝縮させることが挙げられる。いくつかの実施形態では、露点以上の希釈された気体状イソプレンを膜により濃縮して、イソプレンを液相で凝縮させることができる。    
【０１９９】
イソプレンの回収は一段階または多段階で行うことができる。いくつかの実施形態では、発酵オフガスからのイソプレンの分離と、イソプレンの液相への変換を同時に行う。例えば、イソプレンをオフガスから直接凝縮させて液相にすることができる。いくつかの実施形態では、発酵オフガスからのイソプレンの分離と、イソプレンの液相への変換とを順次行う。例えば、イソプレンを固相に吸着させ、次に溶媒で固相から抽出することができる。
【０２００】
いくつかの実施形態では、本願の方法にはさらに、イソプレンを精製する工程が含まれる。例えば、本願の組成物と方法により産出したイソプレンを標準的方法で精製することができる。精製とは、イソプレンを産出させるときに介在していた1以上の他の成分からイソプレンを分離する工程である。いくつかの実施形態では、純粋な液体のイソプレンが得られる。精製方法の例として、(i) 液相抽出物からの蒸留による分離、及び(ii)クロマトグラフィーが挙げられる。
本願では、「精製されたイソプレン」とは、イソプレンを産出させるときに介在していた1以上の他の成分から分離されたイソプレンを意味する。
いくつかの実施形態では、イソプレンはイソプレンを産出させるときに介在していた1以上の他の成分中に少なくとも約20重量%含まれる。いくつかの実施形態では、イソプレンの純度は少なくとも約25重量%, 30重量%, 40重量%, 50重量%, 60重量%, 70重量%, 75重量%, 80重量%, 90重量%, 95重量%, または99重量%である。純度は、カラムクロマトグラフィー、HPLC分析、またはGC- MS分析等の適切な方法によって求めることができる。
【０２０１】
＜イソプレンシンターゼの結晶構造＞
また、この発明は、上記及び実施例に示す植物性イソプレンシンターゼ（例えばポプラ及びクズ）及びその変異体の結晶形態に関する。ひとつの実施形態では、この発明はTable 16-7に示すポプライソプレンシンターゼの結晶構造を有するポリペプチドに関する。
【０２０２】
＜実施例＞
以下の実施例はこの発明を説明し、好ましい実施形態及び態様を例示することを目的としており、この発明の範囲を限定するものではない。
【０２０３】
以下に示す実施例では、次の略号を用いる:℃(摂氏)；rpm(回転/分)；H2O(水)；diH2O(脱イオン水)；aa 及びAA(アミノ酸)；gm (グラム)；μg 及び ug (マイクログラム); mg (ミリグラム); ng (ナノグラム); μl 及び ul (マイクロリットル); ml (ミリリットル); mm (ミリメータ); qs (十分な量); nm (ナノメータ); μm 及び um (マイクロメータ); M (モル); mM (ミリモル); μM 及び uM (マイクロモル); pM (ピコモル); U (単位); MW (分子量); sec (秒); min (分); hr (時間); OD600 (600 nmの光学密度); BSA (ウシ血清アルブミン); DMAPP (ジメチルアリルジホスフェート); DTT (ジチオスレイトール); EtOH (エタノール); IPTG (イソプロピル-ベータ-D-チオガラクトピラノサイド); isoprene (2-メチル-1,3-ブタジエン); IspS (イソプレンシンターゼ); PAGE (ポリアクリルアミドゲル電気泳動); PBS (リン酸緩衝生理食塩水[150 mM NaCl, 10 mM リン酸ナトリウム緩衝液, pH 7.2]); 及び SDS (ドデシル硫酸ナトリウム)。
【０２０４】
次に示す略号は、実施例において言及した商品またはサービスの供給元の会社名について用いる。
Agilent (Agilent Technologies社, Santa Clara, CA); Becton Coulter (Becton Coulter, Inc. 社, Fullerton, CA); Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories社, Hercules, CA); Cayman Chemical (Cayman Chemical Co. 社, Ann Arbor, MI); CTC Analytics (CTC Analytics A. G. 社, Zwingen, Switzerland); EMS (Electron Microscopy Supply社, Hatfield, PA); Epicentre (Epicentre Biotechnologies社, Madison, WI); Integrated DNA Technologies (Integrated DNA Technologies社, Coral ville, IA); Invitrogen (Invitrogen Corp. 社, Carlsbad, CA); Molecular Dynamics (Molecular Dynamics社, Sunnyvale, CA); Novagen (Novagen, Inc. 社, Madison, WI); Perkin Elmer (Perkin Elmer社, Waltham, MA); Roche (Roche Applied Science社, Indianopolis, IN); Sigma (Sigma- Aldrich社, St. Louis, MO); Stratagene (Stratagene Cloning Systems社, La Jolla, CA); Qiagen (Qiagen, Inc. 社, Valencia, CA); Takara (Takara Bio USA社, Madison, WI); Thomson Instrument (Thomson Instrument Co. 社, Oceanside, CA); V&P Scientific (V&P Scientific, Inc. 社, San Diego, CA); and Zinsser (Zinsser North America社, Northridge, CA)
【０２０５】
＜実施例１＞
＜組換えバクテリア中で発現させるためのKudzuイソプレンシンターゼのクローン化＞
この実施例では、E. coli中でkudzuイソプレンシンターゼ(IspS)を産出させる方法について説明する。
kudzu (プエラリア・モンタナ) イソプレンシンターゼ遺伝子(IspS)のタンパク質配列は、GenBank (AAQ84170)から入手した。E. coliコドンでの使用に最適化されたkudzuイソプレンシンターゼ遺伝子（SEQ ID NO:1 (図 1)参照）は、DNA2.0 (Menlo Park, CA) から購入した。
購入したプラスミドからイソプレンシンターゼ遺伝子をBspLU11I/PstIによる制限エンドヌクレアーゼ消化で分離し、ゲル精製した後、NcoI/PstIで消化されたpTrcHis2B (Invitrogen社)に結紮した。
この構築体は、イソプレンシンターゼ遺伝子中の終止コドンがPstI部位に対し5’になるように設計した。この結果、構築体を発現させたときHis-Tagはイソプレンシンターゼタンパク質に結合していなかった。得られたプラスミドpTrcKudzuの配列を、シークエンシングにより検証した。
【０２０６】
また、イソプレンシンターゼ遺伝子をpET16b (Novagen社)中にクローン化した。この場合、組換えイソプレンシンターゼタンパク質がN-末端His tagを含むようにして、イソプレンシンターゼ遺伝子をpET16b中に挿入した。
イソプレンシンターゼ遺伝子を、プライマーセットを用いたPCRによりpTrcKudzuから増幅した。用いたプライマーセットは、
pET-His-Kudzu-2F
【化１】
2014158489.tif 000003
及び
pET-His- Kudzu-R
【化２】
2014158489.tif 000004
であった。
これらのプライマーにより、遺伝子の5 '-末端にNdeI部位が付加され、3'末端にBamH1部位がそれぞれ付加された。
上記のpTrcKudzuプラスミドをテンプレートDNAとして用い、HerculaseDNAポリメラーゼ(Stratagene社)を製造者の取扱説明書に従って用い、プライマーを濃度が10 ピコモルになるように添加した。
PCRは全容積25μlで行なった。PCR産品をNdeI/BamHlで消化し、同じ酵素で消化したpET16b中にクローン化した。結紮混合物をE. coli Top 10 (Invitrogen社)中に形質転換し、正規のクローンをシークエンシングにより選択した。これにより得られ、pETNHisKudzuと命名したプラスミドを、T7プロモータから発現させるためにBL21(λDE3)pLysS 細胞(Novagen社) 中に形質転換した。
【０２０７】
また、kudzuイソプレンシンターゼ遺伝子を、低コピー数プラスミドpCL1920 (Lerner and Inouye, Nucl Acids Res, 18:4631, 1990)中にクローン化した。プライマーを用いて、上記のpTrcKudzuからkudzuイソプレンシンターゼ遺伝子を増幅した。フォワードプライマーにより、5'末端にHindIII部位及びE. coliコンセンサスRBSを付加した。PstIクローン化部位は既に終止コドンの3'のpTrcKudzuに存在しているので、リバースプライマーは最終PCR産品にPstI部位が含まれる様にして構築した。
プライマーの配列は以下の通りである。
HindIII-rbs-Kudzu F: 
【化３】
2014158489.tif 000005
及び
and BamHl-Kudzu R:
【化４】
2014158489.tif 000006
PCR産品の増幅は、ΗERCULASE DNAポリメラーゼ(Stratagene)を、10ピコモルの濃度のプライマー、及び1ナノグラムのテンプレートDNA (pTrcKudzu)とともに用いて行った。増幅には30回のサイクル(95℃で1分間、60℃で1分間、72℃で2分間)が含まれていた。PCR産品をHindIII及びPstIにより消化し、Hindlll及びPstIで既に消化されていたpCL1920に結紮した。結紮混合物をE. coli Top10中に形質転換した。いくつかの形質転換体をシークエンシングにより検査した。得られたプラスミドを、pCL-lac-Kudzuと命名した。
【０２０８】
ベータ-ラクタマーゼ遺伝子を除去するため、pTrcKudzuをBspHlで消化し、シュリンプアルカリホスファターゼ (SAP)で処理し、SAPを加熱死菌するために65℃で10分間培養し、次に2単位のKlenow Fragment (New England BioLabs社)及びdNTPSを用いて培養することによりエンドフィル(end-fill)した。5 kbの断片をアガロースゲルにより精製し、Kan(R)遺伝子に結紮した。Kan(R)遺伝子は、MCM22プライマー、MCM23プライマー、及びTaq DNAポリメラーゼを、pCR-Blunt-II-TOPO (Invitrogen社) を製造者の取扱説明書に従って用いてPCR増幅することにより調製した。PCR産品をHindIII及びPvulで消化し、Klenow Fragment及びdNTPSを用いてエンドフィルした。結紮混合物をE. coli Top 10 (Invitrogen社)化学コンピテント細胞中に形質転換し、カナマイシン耐性を賦与するプラスミドを有する形質転換細胞pTrcKudzu(kan)を、カナマイシン(50μg/ml)を含有するルリア寒天ゲル上で選択した。各プライマーの配列は下記の通りである。
MCM22
【化５】
2014158489.tif 000007
MCM23
【化６】
2014158489.tif 000008
【０２０９】
＜実施例２＞
＜組換えバクテリア中で発現させるためのポプライソプレンシンターゼのクローン化＞
この実施例では、E. coli中でポプライソプレンシンターゼ(IspS)を産出させる方法について説明する。ポプラ (ポプラ・アルバ×ポプラ・トレムラ) イソプレンシンターゼ (Schnitzler et al., Planta 222:777-786, 2005)のタンパク質配列は、GenBank (CAC35696)から入手した。E. coliにコドン最適化された遺伝子（SEQ ID NO:6 (図 3)参照）は、DNA2.0 から購入した。
購入したプラスミド(p9796-poplar)からイソプレンシンターゼ遺伝子をBspLU11I/PstIによる制限エンドヌクレアーゼ消化で分離し、ゲル精製した後、NcoI/PstIで既に消化されていたpTrcHis2Bに結紮した。
この構築体は、挿入体中の終止コドンがPstI部位の手前になり、これにより、構築体中においてHis-Tagがイソプレンシンターゼタンパク質に結合しないようにクローン化した。
得られたプラスミドpTrcPoplarを、ベクター配列(Forward及びReverse)内にハイブリッド化する市販のプライマーと、下記に示すプライマーPoplar InSeqを用いたシークエンシングにより検証した。
【化７】
2014158489.tif 000009
【０２１０】
＜実施例３＞
＜組換えバクテリア中でのイソプレン産出＞
この実施例では、組換えE. coliイソプレンを産出させ、測定する方法について説明する。
【０２１１】
＜イソプレン産出の評価＞
フラスコでの培養の場合、1 mlの培養物を振蕩フラスコから20 ml CTCヘッドスペースバイアル(Agilent社、 バイアルのカタログ# 5188 2753; キャップのカタログ# 5188 2759)へ移した。キャップを強くねじ込み、バイアルを250 rpmで振蕩しながら一定温度で培養した。30分後、バイアルをインキュベータから取り外し、下記のようにして分析した。培養槽におけるイソプレンの産出が確認されたら、培養槽のオフガスからサンプルを採取し、直ちに測定した。
【０２１２】
分析はAgilent 6890 GC/MSシステムと、このシステムに接続され、ヘッドスペースモードで作動するCTC Analytics CombiPALオートサンプラーを用いて行った。サンプル中の被検体の分離には、Agilent ΗP-5MS GC/MS カラム(30 m×0.25 mm; フィルム厚み0.25 μm)を用いた。
サンプルとして、ヘッドスペースガス500μLを注入した。GC/MS測定ではヘリウムをキャリヤガスとして用い、1 ml/分で流通させた。インジェクションポートを250℃に保ち、分割比を50:1とした。2分間の分析中、オーブンの温度を37℃に保った。Agilent 5793N質量分析選択検出器を、シングルイオンモニタリング(SIM)モードでm/z 67で用いた。この検出器のスイッチを1.4から1.7分間オフにして、永久気体を流出させた。
これらの条件下で、イソプレン(2-メチル-1,3-ブタジエン)は1.78分後に流出することが観察された。イソプレンの絶対量の定量には検量表を用いた。この結果、1 μg/Lから200 μg/Lの範囲では直線的であることが認められた。この方法の検出限界は50から100 ng/Lと見積もられた。
【０２１３】
＜II.  振蕩フラスコ中でのイソプレン産出＞
上記のベクターをE. coli株BL21 (λDE3)pLysS (Novagen社)に導入し、BL21/ptrcKudzu株、 BL21/pCL-lac-Kudzu株、及びBL21/pETHisKudzu株を産出させた。これらの株を単離するために、適切な抗生物質（BL21/ptrcKudzu 及び BL21/pETHisKudzuの場合カルベニシリン50μg/ml、BL21/pCL-lac-Kudzuの場合スペクチノマイシン50 μg/ml)を含むLA (ルリア寒天培地)上に塗布し、37℃で一晩培養した。単一コロニーを、20 mlのルリアベルタニブロス(LB)と適切な抗生物質を含むバッフル付き250ml振蕩フラスコに植菌した。培養物を200rpmで振蕩しながら、20℃で一晩成長させた。一晩培養した養培物のOD600を測定し、養培物を30mlのMagicMedia (Invitrogen社)と適切な抗生物質を含むバッフル付き250ml振蕩フラスコ中で、OD600が約0.05以下になるまで希釈した。養培物を200rpmで振蕩しながら、30℃で培養した。OD600が約0.5- 0.8になったとき、400μMのIPTGを添加し、細胞をさらに200rpmで振蕩しながら、30℃で6時間培養した。IPTGを添加した0, 2, 4 及び6時間後に、培養物のサンプル1 mlを採取し、OD600を測定し、上記のようにしてイソプレン産出量を測定した。結果を表8に示す。
【０２１４】
＜III.  14リットルの培養槽でのBL21/ptrcKudzuからのイソプレン産出＞
組み換えkudzuイソプレンシンターゼ遺伝子を含むE. coliからの大スケールでのイソプレン産出を、流加培養法により行った。発酵培地(TM2) の1リットル当りの組成は次の通りであった：K2HPO4 13.6 g、KH2PO4 13.6 g、 MgSO4 * 7H2O 2 g、クエン酸一水和物 2 g、クエン酸第二鉄アンモニウム0.3 g、(NH4) 2SO4 3.2 g、酵母エキス 5 g、1000X Modified Trace Metal Solution 1ml。
全成分をともに添加し、diH2Oに溶解させた。水酸化カリウム(KOH)でpHを6.8に調整し、定容した。最終産品を0.22 μ フィルターで濾過滅菌したが、加熱滅菌はしなかった。
1000X Modified Trace Metal Solutionの組成は以下の通りである：クエン酸* H 2O 40 g、MnSO4 * H2O 30 g、NaCl 10 g、FeSO4 * 7H2O 1 g、CoCl2 * 6H2O 1 g、ZnSO * 7H2O 1 g、CuSO4 * 5H2O 100 mg、H3BO3 100 mg、NaMoO4 * 2H2O 100 mg。
各成分を一度にdiH2Oに添加して溶解させ、HCl/NaOHでpHを3.0にし、次に定容し、0.22μのフィルターで濾過滅菌した。
【０２１５】
この実験では14 Lのバイオリアクターにおいて温度34℃、pH6.7で発酵を行い、グルコースからのイソプレンの産出をモニターしながら行った。凍結させたバイアルから採取した接種菌株のE. coli株BL21/ptrcKudzuを、2つの600 mlフラスコ中のソイトン(soytone) -酵母エキス-グルコース培地で調製した。
この培養物がOD550 = 0.6になるまで成長させた後、2つの600 mlフラスコを遠心分離し、細胞ペレットをバイオリアクターに移すために、内容物を70 mlの上清に再懸濁させた(70 mlのOD 3.1の材料)。植菌した後、所定時間毎にサンプルを採取し、上記の方法でイソプレン産出量を測定した。
【０２１６】
＜実施例４＞
＜植物性イソプレンシンターゼを改良するための部位の選択＞
植物性イソプレンシンターゼは、テルペンシンターゼと相同であると予想される。2つの相同なテルペンシンターゼの三次元構造は、ボルニルジホスフェートシンターゼ(pdbエントリー1N1B)と5-エピ-アリストロケン(aristolochene)シンターゼ(pdbエントリー5EAU)から求めた。これらの酵素の相同性は32%に過ぎないが、三次構造は保存されている。さらに、両酵素との中間複合体の構造から、三次折り畳み構造だけでなく、これらの酵素の活性部位での細部の相互作用も高度に保存されていることが示された。
【０２１７】
下記のTable 4-1に示すように、クズ及びポプラシンターゼは、ボルニルジホスフェートシンターゼと5-エピ-アリストロケン・シンターゼの場合よりも高い配列同一性を有する。
【表１】
2014158489.tif 000010
【０２１８】
ポプライソプレンシンターゼの相同性モデルを、ボルニルジホスフェートシンターゼ(BDP-シンターゼ) pdbエントリー1N24 (〜40% 配列同一性)に基づいて作成した。この相同性モデルは、MOEプログラム（The Chemical Computing Group, Inc社製）を用いて作った10種のモデルの類似性が高いことから、妥当であると考えられた。この妥当性の判断は、BDP-シンターゼの触媒作用に関係する部位に共通するアミノ酸残基の保存性に基づく。
【０２１９】
BDP-シンターゼの構造の活性部位と、ポプラIspSの相同性モデルとの比較から、金属イオン結合及びホスフェート認識に関与する活性部位が保存されていることが示された。特に、ポプラIspSのLys 272, Asp 309, Asp 313, GIu 387, Arg 450 及び Asn 453は、BDP-シンターゼ中の残基と同等であり、オーバーラップすることが認められた。この例では、ポプラIspSのアミノ酸残基の位置はSEQ ID NO:7から導かれる。また、BDP-シンターゼの中間体の位置を、ポプラIspS相同性モデルと比較した。これにより、相似する結合領域を特定し、イソペンテニルジホスフェートがポプラIspS酵素に結合して反応するために要求される接近方向を特定することができた。
【０２２０】
クズライソプレンシンターゼの相同性モデルを、ボルニルジホスフェートシンターゼ(BDP-シンターゼ) pdbエントリー1N24 (〜40% 配列同一性)に基づいて作成した。BDP-シンターゼの構造の活性部位と、クズIspSの相同性モデルとの比較から、金属イオン結合及びホスフェート認識に関与する多数の活性部位は保存されていることが示された。特にクズIspSのArg 269, Asp 306, Asp 310, GIu 384, Arg 450 及び Asn 453は、BDP-シンターゼ中の残基と同等であり、オーバーラップすることが認められた。
【０２２１】
ポプラ及びクズIspSの相同性モデルにおいて特定された活性部位残基の比較から、1の相同性モデル中の複数の残基は別の相同性モデル中の同様な残基とも相同であり、いくつかの残基について対応する位置番号が僅かにシフトすることが示された。相同性モデルに基づき、ポプラ及びクズIspS中の複数の部位を、改善された性質を有するIspS酵素変異体を産出するための突然変異誘発の対象として選定した。簡潔にいうと、金属結合、ジホスフェート認識、IPP鎖結合、および／または活性部位への接近における相互作用を変化させると考えられる、IspS中の複数の部位を選定した。
【０２２２】
＜I.   ジホスフェート/金属結合部位＞
金属及びジホスフェート (DPP)結合側鎖に近接する、ポプラIspS中のアミノ酸残基の側鎖を特定した。このような残基には、Phe 384, Tyr 402, Ala 406, Ser 409, Ala 460 及び Asn 469が含まれる。ここで、272の位置にArgを有する他の公知のポプラIspS配列との相同性を考慮すると、Lys 272は不適当である。
【０２２３】
＜II.  基質接近ループ＞
ポプラIspSの基質接近ループは、BDP-シンターゼ構造とは異なる領域にある。BDP-シンターゼ構造では、これらの残基は弧を描くセグメントを形成する。理論にこだわるものではないが、本願発明者はポプラIspSの実際の三次元構造では、このセグメントは同様の構造となると予想している。残基455から残基466を含むこのループ中の残基は、ポプラIspS酵素の活性を変化させる位置と考えられる。ポプラIspS酵素では、残基455から残基466は次の配列を有する。
【化８】
2014158489.tif 000011
【０２２４】
＜III.  イソプレニル結合部位＞
BDP-シンターゼと、反応生成物のボルニルジホスフェートとの複合体(pdbエントリー1N24)を用いて、ポプラモデル中の、基質特異性および／または反応速度（基質及び生成物の取込み及び放出速度の変化）を制御する残基を特定した。このような残基には、Arg 274, Trp 281 Phe 302, Val 305, Ser 411, Gln 415, Phe 449, Ser 537及びGlu 540が含まれる。
【表２】
2014158489.tif 000012
2014158489.tif 000013
【０２２５】
＜実施例５＞
＜クズイソプレンシンターゼ中の非保存システインの突然変異誘発＞
ボルニルジホスフェートシンターゼ結晶構造に基づいて作成したクズ及びポプライソプレンシンターゼ(IspS)相同性モデルについて、システイン残基の位置を比較した。システインはジスルフィド結合を形成して、構造を安定化させることができる。溶解性および／または活性に影響すると考えられる非保存システインを、部位特異的突然変異誘発法により変化させた。モデル化に用いたクズIspSアミノ酸配列を図 2 (SEQ ID NO:2)に示す。
図5の相同性モデルに示すように、クズIspSには(タンパク質の成熟形の位置を参照として)位置57, 291, 343, 378, 421, 446, 451 及び529に8個のシステインがある。これに対し、図6の相同性モデルに示すように、ポプラIspSアミノ酸配列中には5個のシステインがある。図6では、クズのシステインを重ね合わせて図示している。いくつかのシステインはポプラ及びクズIspS配列間で保存されており、これらの位置は構造、活性、および／またはその他のタンパク質の機能を安定化させるために重要であることが示唆される。本願に開示するように、クズ中の残余のシステイン(非保存残基 57, 291, 421 and 446)をセリンに突然変異させた。
【０２２６】
＜I.  突然変異誘発＞
QUIKCHANGETM Multi-Site Directed Mutagenesis Kit (Stratagene社)を製造者の取扱説明書に従って用いた。突然変異誘発には以下のプライマーを用いた。
【化９】
2014158489.tif 000014
【化１０】
2014158489.tif 000015
【化１１】
2014158489.tif 000016
【化１２】
2014158489.tif 000017
【化１３】
2014158489.tif 000018
【０２２７】
実施例1に示したプラスミドpTrcKudzu(kan)をテンプレートDNAに用いた。プライマーC57S-F, C291S-F, C421S-F, をC446-F単一反応で組み合わせた(100 pmol)。テンプレートDNAを添加し(〜200 ナノグラム)、0.5 μl のQuiksolutionを推奨された酵素及び緩衝液の容積となるように添加した。PCR反応は、Eppendorf PCRを用いて行い、アニール温度55℃、伸長時間12分のサイクルを30回繰り返した。他のサイクル条件は、取扱説明書に従った。PCR産品をDpnIを用いて37℃で4時間処理し(2×1 μl、各2時間)、次に5 μlの反応生成物をE. coli Top 10 (Invitrogen社)化学的コンピテント細胞中に形質転換し、カナマイシン(50 μg/ml)を含むルリア寒天上に塗布した。37℃で一夜培養した後、いくつかのコロニーを採取し、カナマイシン(50 μg/ml)を含む5 mlのルリア寒天上に植菌した。QIAprep Spin Miniprep キット(Qiagen社)を用いてプラスミドを単離し、IspS遺伝子の全長についてシークエンシングを行った。下記のTable 5-1に示すように、種々の単一及び組合せ突然変異体が得られた。
【表３】
2014158489.tif 000019
【０２２８】
全ての変異体プラスミドを、化学的コンピテントBL21(λDE3)細胞 (Novagen社)中に形質転換した。
2回目の反応では、C421S-F及びC421S-Rプライマーによる単一部位反応 QUIKCHANGETM部位特異的突然変異誘発法キット(Stratagene社)において、pTrcKudzu(kan)とC6から単離されたプラスミドDNAをテンプレートに用いた。シーケンシングにより検証し、さらに2種の株を得た。
【０２２９】
＜細胞の培養及びイソプレン産出＞
細胞の培養は、50 mg/L のカナマイシンを添加したルリアブロスを入れた5mlの試験管を30℃で振蕩しなから一夜培養することにより行った。得られた培養液を、10 g/Lのグルコース及び50 mg/Lの カナマイシンを添加したTM3ブロスで希釈した。250 mlのバッフル付きBellco Delongフラスコ中の25 ml培養液に含まれる細胞を撹拌(225 rpm)しながら30℃で培養した。無菌状態でサンプルを採取し、A600の光学密度を測定した。結果を図7に示す。培養液に200 μMのIPTGを添加して3.33時間誘導した後、さらに7.8時間培養して、集菌した。培養液を10,000 X g で 10分間遠心分離し、上清をデカンテーションし、細胞のペレットを-80℃で一晩凍結させた。
【０２３０】
凍結させた細胞のペレットを解凍し、2 mlのPEB (50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 20 mM MgCl, 2 mMジチオスレイトール, 及び 50% [v/v] グリセロール)中に再懸濁させた。20,000 psiで1回フレンチプレスによる細胞破壊を行い、細胞を溶解させた。溶解物を10,000 X gで15分間遠心分離した。上清をデカンテーションし、ペレットを2 mlのPEB中に再懸濁させた。ペレット及び上清を、還元性条件下のMES緩衝液を用い、4-12% NuPage ゲル(Invitrogen社)を含むSDS-PAGEで分析した。分子量の標準には、SeeBlue2 (Invitrogen社) を用いた。結果を図8.に示す。IspSタンパク質濃度は、BSAを標準に用いたBCA アッセイ (Pierce社) により評価した(Table 5-2)。
【０２３１】
＜III.  イソプレンシンターゼの活性と溶解性の分析＞
上清の活性を、DMAPPとの反応性により測定し、放出されたイソプレンをGC/MSで定量した。
【０２３２】
＜ヘッドスペースの分析＞
所定の培養液のサンプル200 μlを、2 ml のCTC ヘッドスペースバイアル (Agilent バイアル カタログNo. 5188 2753, 及びキャップカタログNo. 5188 2759) に植菌した。キャップをきつく締め込み、このバイアルを250 rpmで撹拌しながら37℃で培養した。30分後、バイアルをインキュベータから取り出し、室温の水道水で冷却した。バイアルをGC-MS分析用のCombiPal Headspaceオートサンプラーに入れた。
分析は、ヘッドスペースモードのCTC Analytics CombiPALオートサンプラーを備えたAgilent 6890 GC/MS装置を用いて行った。検体の分離には、Agilent HP-5MS GC/MSカラム(30 m×0.25 mm; フィルム厚0.25 μm)を用いた。オートサンプラーは、500 μLのヘッドスペースガスを注入するように設定した。GC-MS測定では、流量1 ml/分のヘリウムをキャリヤガスに用いた。インジェクションポートを250℃に保ち、分割比は50:1とした。オーブンの温度は、2分間の測定中は37℃に保った。Agilent 5793N質量選択検出器はm/z 67のシングルイオンモニター(SIM)モードで用いた。永久ガスを流出させるため、検出器を1.4から1.7分間停止させた。この条件下では、イソプレン(2メチル-l,3- ブタジエン) は1.78分後に流出した。
イソプレンの絶対量の定量には検量表を用いた。この結果、1 μg/Lから200 μg/Lの範囲では直線的であることが認められた。この方法の検出限界は50から100 ng/Lと見積もられた。
【０２３３】
＜DMAPP分析＞
フレンチプレス細胞溶解物を遠心分離して得た上清成分から採取した95 μlのサンプルを、ヘッドスペースバイアルに入れた。8 mMのDMAPPを含む100 mMリン酸カリウム緩衝液(p H 8.2)から採取した5 μLのサンプルをバイアルに添加し、密封した後、室温で30分間培養した。上記のようにして放出されたイソプレンをGC/MSで測定した。結果をTable 5-2に示す。
【表４】
2014158489.tif 000020
【０２３４】
Table 5-2に示した値は、2種の異なる濃度の抽出物の反応の平均値である。全てのシステイン突然変異を有するタンパク質は、酵素活性の大幅な低下を示すとともに、タンパク質の不溶分（ペレット）の比率が増加することから、溶解性タンパク質の減少が認められた。
【０２３５】
＜実施例６＞
＜ポプライソプレンシンターゼ中の残基の突然変異誘発＞
クズ及びポプライソプレンシンターゼのアミノ酸配列と、他のシンターゼのアミノ酸配列とのアライメントは、Vector Nti (Invitrogen社) を用いて行った。アライメントさせた配列は、ベータ-オシメンシンターゼ・ロータス・コニキュラタス(beta-ocimene synthase Lotus corniculatus)(AAT86042)； 推定テルペンシンテターゼ・メドフィカゴ・トランキュラタ(terpene synthetase Medficago trunculata)(AAV36465)；仮想タンパク質ヴィチス・ヴィニフェラ(Vitis vinifera)(can65805)；仮想タンパク質ヴィチス・ヴィニフェラ（Vitis vinifera）(CAN62729)；ピネンシンターゼ・カーカス・イレックス(Quercus ilex)(CAK55186)； IspS プエラリア・モンタナ・クズ・シャーキー(Pueraria montana (kudzu)Sharkey)(AAQ84170)；モノテルペンシンターゼ・ユカリプタスグロブルス(Eucaliptus globules)(BAF02832)；IspS ポプラ・ニグラ・フォーツナチ(Populus nigra Fortunati)(CAL69918)；IspS ポプラ・トレムロイデス・シャーキー(Populus tremuloides Sharkey)(AAQ16588)；IspS ポプラ・アルバ（Populus alba）(BAD98243)；及びIspS ポプラアルバ×トレムラジマー(Populus alba x tremula Zimmer)(CAC35696)であった。
Populus alba x tremula Zimmer(CAC35696)のデータベースから得た配列は、位置272と497に高度に保存された相異なるアミノ酸を有していた。さらに、ポプラIspSの相同性モデルの分析から、位置453を突然変異誘発の三番目の対象として選定した。
【０２３６】
＜I.   突然変異誘発＞
QUIKCHANGETM Multi-Site Directed Mutagenesis キット (Stratagene社)を製造者の取扱説明書に従って用いて、ポプラ・アルバ×トレムラIspS配列(SEQ ID NO:7)中にK272R、C497W、及びN453Dの突然変異のいずれか1、または組合わせを生じさせた。
突然変異誘発には以下のプライマーを用いた。
【化１４】
2014158489.tif 000021
【化１５】
2014158489.tif 000022
【化１６】
2014158489.tif 000023
シーケンシングには、下記のプライマーを用いた。
【化１７】
2014158489.tif 000024
【０２３７】
突然変異誘発は製造者の取扱説明書に従って行い、3種の突然変異誘発プライマーの全て(各100ng)を、テンプレートDNA（100ng)のpTrcPoplarとともに反応させた。0.5 μlのQuik Solutionを添加して、突然変異誘発反応を促進した。PCRサイクルは、アニール温度55℃、伸長時間12分で行った。他の反応条件は、取扱説明書に記載されていた指示に従った。PCR産品を、DpnIにより37℃で4時間消化し(各1 μl×2時間)、次に反応物5 μlを E. coli Top 10化学的コンピテント細胞(Invitrogen社) 中に形質転換した。いくつかのコロニーを選択し、カルベニシリン(50 μg/ml)を含む5 mlのルリアブロス(LB)中で培養した。
Qiagen QIAprep spin mini-prepキットを用いてプラスミドを単離した後、ベクター及びPoplar InSeqプライマーとハイブリダイズする、フォワード及びリバースプライマーを用いてシーケンシングを行った。  
【０２３８】
得られたpTrcPoplar変異体は、pTrcPoplar K272R, pTrcPoplar K272R/N453D、pTrcPoplar K272R/N453D/C497W、及びpTrcPoplar 272R/497Wであった。これらのプラスミドをBL21(λDE3)pLysS化学的コンピテント細胞(Novagen社) 中に形質転換して分析に供した。これらの変異体について、ヘッドスペース活性 (全細胞からのイソプレン産出) 、溶解性、及び比活性度を測定した。
【０２３９】
＜II.  細胞の培養及びイソプレン産出＞
変異体、親ポプラ株、及びpTrcKudzuを含む株を、カルベニシリン(50 μg/ml-ポプラ株)またはカナマイシン(50 μg/ml-Kudzu株) を含む5 mlのルリアベルタニ培養液中で、37℃において一夜培養した。培養液を、10g/Lのグルコースと、50 μg/mlのカルベニシリン(ポプラ変異体と野生型の場合)または50 mg/Lのカナマイシン (BL21/pTrcKudzuの場合)とを添加したTM3ブロスを用いて、OD600が0.05になるまで希釈した。
TM3ブロスの処方は次の通りである： K2HPO4 (13.6 g/l) KH2PO4 (13.6 g/1), MgSO4 * 7H2O (2 g/1) クエン酸一水和物 (2 g/L) クエン酸第二鉄アンモニウム (0.3 g/L) (NH4)2SO4 (3.2 g/L) 酵母エキス (0.2 g/L) 1 mlの1000x Trace Elements溶液、水酸化アンモニウムでpHを6.8に調整、滅菌diH2Oで定容し0.22 ミクロンのフィルターで濾過滅菌。
1000x Trace Elements溶液の処方は次の通りである：クエン酸 * H2O (40 g/L), MnSO4 * H2O (30 g/L), NaCl (10 g/L), FeSO4 * 7 H2O (1 g/L), CoCl2 * 6 H2O (1 g/L), ZnSO * 7 H2O (1 g/L), CuSO4 * 5 H2O (100 mg/L), H3BO3 (100 mg/L), NaMoO4 * 2 H2O (100 mg/L). 各成分をdiH2O中で同時に溶解させ、HCl/NaOHでpHを3.0に調整し、定容した後0.22 ミクロンのフィルターで濾過滅菌する。
【０２４０】
250 ml のバッフル付きBellco Delongフラスコ中で、25 mlの希釈された培養液を30℃で撹拌(225 rpm)しながら培養した。サンプルを無菌的に採取し、A600の光学密度を測定した。2組の培養液を調整し、1組は0.2 mM IPTGで誘導し、他方の組は誘導しなかった。200 rpmで撹拌しながら30℃で3時間成長させた後(OD600~0.5)、1組の培養液を0.2 mM IPTGで誘導し200 rpmで撹拌しながら30℃で3時間成長させ、誘導しなかった組の培養液については、さらに同じ時間培養を続けた。全ての培養液について、誘導時間の前（植菌後3時間）と、ヘッドスペースアッセイ(誘導後3時間、トータル6時間培養) によりイソプレンを測定する際に、OD600を測定した。細胞培養液を、Sorvall 高速遠心分離機を用いて7000 x gで15分間遠心分離して、細胞をペレット化した。上清を除去し、イソプレンシンターゼ活性のin vitroアッセイ用に、細胞ペレットを凍結した。培養液結果と、ヘッドスペースアッセイの結果を以下の表に示す。
【表５】
2014158489.tif 000025
【表６】
2014158489.tif 000026
【０２４１】
驚くべきことに、kudzu IspSを発現する株が、測定可能な量のイソプレンを産出した。これは、ポプラ酵素の速度論的特性はkudzu酵素の速度論的特性より優れることが文献に開示されていることを考慮すると、予想外の結果である。特に、先行技術文献によれば、比活性度(U/mg) 及びKm (μM)の値は組換えkudzu IspSの場合それぞれ0.075と7,700であり、天然アスペン(aspen) IspSの場合それぞれ0.5と8,000であり、 組換えpoplar IspSの場合それぞれ0.16 と9,000である (Silver and Fall, J Biol Chem, 270:13010-1316, 1995; Miller et al, Planta, 213:483-487, 2001; 及びSharkey et al., Plant Physiology, 137:700-712, 2005)。この文献に開示された3種の酵素のKm値は全て高く、ほぼ同一の範囲内にあるが、クズイソプレンシンターゼの比活性度の値は他の2種の酵素と比べて明らかに劣っている。
【０２４２】
＜III. イソプレンシンターゼの活性と溶解性のアッセイ＞
DMAPPはイソプレンシンターゼの直接の基質であるため、DMAPPアッセイを用いてイソプレンシンターゼの活性を直接測定することができる。ポプラ親株、ポプラ突然変異株、及び野生型クズ株のペレットを解凍し、2 mlのPEB (50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 20 mM MgCl, 2 mMジチオスレイトール, 及び 50% [v/v] グリセロール) 中に再懸濁させた。細胞を20,000 psiのフレンチプレス細胞破壊を1回行って溶解させた。溶解 物(1 ml)をマイクロフュージ(microfuge)中で、4℃において20,000 rpmで20分間遠心分離した。上清を除去し、ペレットを1 mlのPEB中に再懸濁させた。上清とペレットをSDS-PAGE及びDMAPPにより分析した。全タンパク質含有量はBCAで測定した。
【表７】
2014158489.tif 000027
【０２４３】
イソプレン産出量は、全細胞溶解物上清タンパク質に対し規格化した。
【表８】
2014158489.tif 000028
【０２４４】
イソプレン産出量は、全細胞溶解物ペレットタンパク質に対し規格化した。
【０２４５】
ポプラ変異体K272R/C497Wは、誘導された培養液の上清成分中の野生型のものと比較して、1.8倍高い活性を示した。同様に、ポプラ変異体K272R 及びK272R/C497Wは、非誘導の培養液の上清成分中の野生型のものと比較して、5.2倍及び3.4倍高い活性を示した。さらに、ポプラ変異体K272Rは、誘導された培養液のペレットの野生型のものと比較して、2倍高い活性を示した。しかし、最も重要な結果は、クズIspSの方が、ここで用いたポプラIspSより高活性であったことである（185倍）。なお、上記の表においてH2はpTrcPoplar K272R/C497W H2を消化したクローンの名称である。
【０２４６】
＜実施例7＞
＜クズイソプレンシンターゼのサブクローン化＞
この実施例では、クズイソプレンシンターゼ (IspS) SELを構築した方法について説明する。
部位評価用ライブラリ(SEL)構築用の発現ベクターを調製するために、クズイソプレンシンターゼ遺伝子をpCR2.1 ベクター(Invitrogen社)由来のpET24d ベクター(Novagen社)中にサブクローン化した。クズIspS遺伝子を、下記のMCM50及びMCM53 の2種のプライマーを用いて、pTrcKudzuテンプレートDNAから増幅した。
【化１８】
2014158489.tif 000029
及び
【化１９】
2014158489.tif 000030
PCR反応はTaq DNA Polymerase (Invitrogen社)を用いて行い、得られたPCR産品をpCR2.1-TOPO TA クローン化ベクター(Invitrogen社) 中にクローン化し、E. coli Top 10 化学的コンピテント細胞(Invitrogen社) 中に形質転換した。形質転換体をカルベニシリン (50 μg/ml)を含むL アガーに塗布し、37℃で一夜培養した。カルベニシリン50 μg/ml を含むルリアブロス培養液に単一形質転換を植菌し、37℃で一夜培養した。
正しく挿入されていることを確認するため、5つのコロニーを培養液(ルリアブロス)1 mlから単離し、QIAprep Spin Mini-prep Kit (Qiagen社)で精製したプラスミドDNAのシーケンシングによりスクリーニングした。得られたプラスミドをMCM93と命名した。このプラスミドはpCR2.1骨格にクズIspSコード配列を備えていた(図9)。MCM93 (SEQ ID NO:22)の配列を図10に示す。
【０２４７】
クズコード配列を、PciI及びBamH1 (Roche社)による制限エンドヌクレアーゼ消化と、QIAquick Gel Extraction キット(Qiagen社)を用いたゲル精製により単離した。pET24dベクターDNAをNcoI及びBamHI (Roche社)で消化し、シュリンプアルカリホスファターゼ(Roche社)で処理し、QIAprep Spin Mini-prep Kit (Qiagen社)を用いて精製した。クズIspS断片を、容積20 μlで断片対ベクターの比が 5: 1の条件下で、Rapid DNA Ligation Kit (Roche社)を用いてNcoI/BamHI消化pET24dに結紮した。結紮生成物の一部(5 μl)を、E. coli Top 10 化学的コンピテント細胞中に形質転換し、カナマイシン(50 μg/ml)を含むLアガー上に塗布した。正しく形質転換されたことをシーケンシングにより確認し、化学的コンピテントBL21(λDE3)pLysS 細胞 (Novagen社)中に形質転換した。カナマイシン(50 μg/ml)を含むLアガー上において37℃で一夜培養した後、単一コロニーを選択した。得られたプラスミドをpET24D-Kudzuと命名した。このプラスミドのマップを図11に示す。pET24D-Kudzu (SEQ ID NO:23)の配列を図12に示す。IspS活性は、実施例5に示したヘッドスペースアッセイを用いて確認した。
【０２４８】
＜実施例8＞
＜イソプレンシンターゼ部位評価ライブラリ (SEL) の構築＞
植物性IspSの速度論的パラメータを改善するために、クズ及びポプラIspS酵素の相同性モデルから選択した部位についてSELを構築した。相同性モデルから、選択した部位を操作することにより、いずれの酵素も改良されると予想されるが、この実施形態ではクズSELについて説明する。対象とするクズIspSの表面部位には、26 L, 30 E, 31 F, 33 Q, 35 L, 36 E, 37 N, 39 L, 40 K, 41 V, 43 K, 44 L, 61 R, 62 V, 63 D, 65 Q, 87 K, 94 E, 95 N, 99 L, 100 D, 105 N, 137 K, 138 E, 143 G, 144 E, 182 N, 184 L, 185 K, 187 G, 189 N, 190 T, 225 P, 226 H, 247 K, 257 T, 258 E, 259 M, 266 D, 334 N, 353 D, 357 S, 358 I, 361 E, 389 N, 392 I, 393 I, 398 K, 401 E, 421 C, 423 Q, 424 Q, 425 E, 426 D, 430 H, 432 L, 433 R, 434 S, 437 D, 443 R, 462 L, 463 E, 476 H, 478 N, 479 D, 485 Q, 508 D, 513 P, 515 A, 532 Q, 533 Y, 537 L, 538 G, 539 R, 542 Y, 543 A, 及び557 Pが含まれるが、これらに限定されない。
対象とするクズIspS活性部位の位置には、24 P, 25 N, 309 Y, 310 D, 377 L, 381 F, 384 E, 399 Y, 402 N, 403 A, 406 S, 407 S, 409 G, 411 A, 413 L, 449 F, 456 A, 457 T, 458 S, 458 S, 459 A, 460 A, 461 E, 462 L, 463 E, 464 R, 465 G, 466 E, 467 T, 468 T, 469 N, 523 M, 527 S, 及び 531 Yが含まれるが、これに限定されない。対象とするクズIspS活性部位の位置には、さらに20 A, 21 N, 22 Y, 23 Q, 271 R, 278 W, 299 F, 302 V, 及び 408 Sが含まれるが、これに限定されない。
各ライブラリSELには、最大20の異なる変異体を含むクローンが含まれる。例えば、クズイソプレンシンターゼSEL 531には、成熟クズ酵素の位置531のトリプシンをコードするDNAトリプレットが、アラニン, アスパラギン酸, システイン, グルタミン酸, フェニルアラニン, ヒスチジン, イソロイシン, リジン,ロイシン, メチオニン, アスパラギン, プロリン, グルタミン, アルギニン, セリン, スレオニン, バリン, またはトリプトファンをコードする別のDNAで置換された変異体が含まれる。
簡潔に言えば、成熟IspSのDNAコードストランド中の特定の位置のDNAトリプレットを置換した。次に、成熟IspS核酸を適切な発現ベクターに結紮し、適切な宿主細胞の形質転換に用いた。
【０２４９】
部位評価ライブラリは、合成構築対を注文するか(例えばDNA2.0)、または突然変異誘発するコドンの代わりに「nns」配列を有するプライマーを注文することにより調製した。このプライマーを用いて、既に開示されているように(例えばWO0507682A2)、市販の突然変異誘発キット(例えばStratagene)により遺伝子の所定の部位を突然変異誘発した。突然変異誘発したコドンをシークエンシングにより同定した。部位ライブラリを96ウエルマスタープレートに配列し、その後使用するために凍結させた。マスタープレートから培養物を成長させ、スクリーニングに使用した。
【０２５０】
最終目的物は、IspSを通るカーボンフローが最大になるように代謝を操作された宿主細胞中において、最適に機能するIspS酵素である。この目的を達成するために、数段階のスクリーニングを行い、正しいパラメータを確実に特定した。スクリーニングの例として、発現、HG産出のためのDMAPP供給、マイクロリアクター、タンパク質同定、及びヘッドスペースアッセイが挙げられるが、これに限定されない。
発現スクリーニング：タンパク質発現の程度を分析する方法の一例は次のとおりである。遠心分離により、細胞溶解物（溶解細胞培地から得られる）の溶解性成分と不溶性成分を調製する。得られた上清とペレットをSDS-PAGEで分析する。溶解性タンパク質のパーセントを、上清中のタンパク質対ペレット中のタンパク質の濃度分析から求める。
【０２５１】
ひとつの実施形態では、クズ部位評価ライブラリをpET24D発現ベクター中に構築する。クズイソプレンシンターゼ遺伝子を含むpET24D-Kudzuベクターを、テンプレートDNAとして用いる。
使用材料：
pET24D-Kudzu ベクター (〜50 ng/μl)
Kudzu IS 部位特異的突然変異誘発プライマー (Integrated DNA Technologies社)
QUIKCHANGETM Multi Site-Directed Mutagenesisキット (Stratagene社)
MJ Research PTC-200 Peltier Thermal Cylcer (Bio-Rad Laboratories社)
One Shot TOP10 コンピテント細胞 (Invitrogen社)
QIAprep Spin ミニプレップキット (Qiagen社)
BL21(λDE3) pLysS コンピテント細胞 (Invitrogen社)
ルリアブロス(LB) 寒天プレート
【０２５２】
方法：
突然変異誘発の方法はコドン特異的突然変異誘発法に基づいている。この方法では、鎖長が25から45ヌクレオチドで、突然変異誘発されるコドンの配列に適合するよう特別に設計された、トリプレットDNA配列NNS (N = A, C, T または G、及び S = CまたはG) を備えるシングルフォワードプライマーを用いて、特定のDNAトリプレット中で可能性のある全ての突然変異誘発を実施した。
この方法では、対象とする特定のpET24D-kudzuコドンにランダムにヌクレオチドが導入される。Table 8-1に、突然変異誘発に用いたオリゴヌクレオチドプライマーを示す。プライマー名の中の番号は、成熟クズイソプレンシンターゼ酵素配列中のコドン位置に対応する。全てのオリゴヌクレオチドプライマーは100 nmoleスケールで合成し、PAGEで精製した(Integrated DNA Technologies社)。
【表９】
2014158489.tif 000031
【０２５３】
PCR反応は、QUIKCHANGETM Multi Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene社) の取扱説明書に従い、0.5mlの薄壁PCRチューブを用いて行った。
QUIKCHANGETM Multi Site-Directed Mutagenesis Kit： lμl pET24 Kudzuベクター (50ng/μl); lμl Kudzu IS 部位特異的突然変異誘発フォワードプライマー (10μM); 2.5μl 10X QUIKCHANGETM Multi Reaction緩衝液; lμl dNTP Mix, lμl QUIKCHANGETM Multi 酵素ブレンド (2.5U/μl); 及び 18.5μl オートクレーブ蒸留水で反応物の全容積を25μl に調製した。
次の条件下でpET24 Kudzu SELを増幅した：95°Cで1分間 (1回目のサイクルのみ), 次に95℃で1分間、 55℃で1分間、65℃で12分間のサイクルを29回繰り返す。次に、各チューブに1.5μl DpnI 制限酵素を添加して反応混合物をDpnI消化させ( QUIKCHANGETM Multi Site-Directed Mutagenesis Kitに付属)、37℃で2時間培養して、親pET24D-kudzuベクターを消化させた。DpnI処理したPCR反応物をOne Shot TOP10 コンピテント細胞(Invitrogen社)中に形質転換し、50μg/ml カナマイシンを含むLB寒天プレートに塗布し、37℃で一夜培養した。翌日、96のランダムコロニーを採取し、シーケンス分析により、19の可能性のあるアミノ酸変異体のうち最低でも15の変異体を同定した。部位特異的変異体を同定した後、各変異体クローンを LB + 50μg/ml カナマイシンを入れた5mlのチューブに植菌し、撹拌(250 rpm) しながら37℃で一夜培養した。翌日、QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen)を用いてプラスミドDNAを精製した。次に、タンパク質発現のスクリーニング用に各変異体をOne Shot BL21(λDE3) pLysS コンピテント細胞(Invitrogen社) 中に形質転換し、50μg/ml カナマイシン及び30μg/ml クロラムフェニコールを含むLB寒天プレートに塗布し、37℃で一夜培養した。
【０２５４】
また、E. coli BL21(λDE3) pLysS細胞中にpET24D-Kudzu SELを産出させる別の方法も行って良好な結果を得た。寒天培地上に3mlのLB培地を塗布して、滅菌したプレートスプレッダーでかき混ぜて細胞を再懸濁させることにより、上記のDpnI処理PCR反応により得られたTOP10コンピテント細胞形質転換体を集菌した。液中に再懸濁させた3mlの細胞を、LB+50μg/ml カナマイシンを入れた25mlの振蕩フラスコ中に植菌した。液中の培養物を、撹拌(250rpm)しながら一夜培養した。翌日、QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen社)を用いて、液中の培養物からプラスミドDNAを精製した。次に、液中のプラスミドDNAをOne Shot BL21(λDE3) pLysSコンピテント細胞中に形質転換し、上記のようにしてタンパク質発現のスクリーニングを行った。
【０２５５】
96ウエルプレートにおいて、正しい構築体を4つ1組で配置してマスタープレートを調製した。正しい配列を有する1つのコロニーを用いて4つのウエルに植菌し、37℃において撹拌(200 rpm)しながら、LB+50μg/mlカナマイシンを含むLB中で数時間から一夜培養した。培養物に、滅菌したグリセロールを最終濃度が15%になるように添加した（最終容積は150-200 μl/ウエル）。次にプレートをBREATHE- EASIER (EMSカタログNo. 70536-20)膜でシールして、-80℃で保管した。
【０２５６】
＜実施例9＞
＜イソプレンシンターゼ封入体の産出と精製＞
BL21(λDE3)株中でGroELSシャペロンの存在下においてクズイソプレンシンターゼが過剰発現されたとき、クズイソプレンシンターゼを含む封入体が形成された。
簡潔に言うと、pETNHisKudzu (本願に参照として組み込むU.S. Application No. 61/013,574)を、製造者の取扱説明書に従ってpGro7 (Takara カタログNo. 3340)中にサブクローン化した。500 mLの培養液を、開示された方法に従って培養した(Whittington et al., Proc Natl Acad Sci USA, 99:15375-15380, 2002)。シャペロンが存在し低温で培養したにもかかわらず、培養液には主に封入体が生じ、活性で溶解性のタンパク質は低濃度であった。IFOLD Protein Refolding System (Novagen社 カタログNo. 71552-3)を製造者の取扱説明書に従って用いて、封入体を集菌した。この方法により、組換えクズイソプレンシンターゼが高収量(>50 mg)で得られた。封入体の純度を図13に示す。この調合液を用いて、ウサギポリコナール・アンチイソプレンシンターゼ抗血清を調製した(Invitrogen社)。
【０２５７】
＜実施例10＞
＜イソプレンシンターゼ変異体の生化学的高速スクリーニング＞
この実施例では、イソプレンシンターゼ活性の測定を高速で行う方法について説明する。
イソプレンシンターゼ変異体を発現するBL21(λDE3)pLysS E.coli宿主細胞のライブラリを、実施例8に示したようにして、96ウエルのプレートに配置し、15%グリセロールストック溶液にして-80℃で凍結し保管した。
最大96の変異体を有するプレートの分析を行うため、96-ピンのMULTI-BLOTフローティングピン装置 (V &P Scientific社 カタログNo. VP 408AF)を用いて、適切な抗生物質(例えば30 μg/mL クロラムフェニコール, 50 μg/mL カナマイシン)を含むルリアブロス寒天上に、グリセロールストックマスタープレートのレプリカを押印した。このレプリカのプレートを30℃で一夜培養してバクテリアの斑点を生じさせた。同じフローティングピン・レプリカ作成装置を用いて、0.08% Biospringer酵母エキス、1%グルコース、及び抗生物質(30 μg/mL クロラムフェニコール, 50 μg/mL カナマイシン)を添加した250 μLのTM3培地を入れた方形96-ディープ・ウエルプレートに前記寒天プレートから植菌し、30℃で一夜培養した。
TM3ブロスの処方は次の通りである： K2HPO4 (13.6 g/l) KH2PO4 (13.6 g/1), MgSO4 * 7H2O (2 g/1) クエン酸一水和物 (2 g/L) クエン酸第二鉄アンモニウム (0.3 g/L) (NH4)2SO4 (3.2 g/L) 酵母エキス (0.2 g/L) 1 mlの1000x Trace Elements溶液、水酸化アンモニウムでpHを6.8に調整、滅菌diH2Oで定容し0.22 ミクロンのフィルターで濾過滅菌。
1000x Trace Elements溶液の処方は次の通りである：クエン酸 * H2O (40 g/L), MnSO4 * H2O (30 g/L), NaCl (10 g/L), FeSO4 * 7 H2O (1 g/L), CoCl2 * 6 H2O (1 g/L), ZnSO * 7 H2O (1 g/L), CuSO4 * 5 H2O (100 mg/L), H3BO3 (100 mg/L), NaMoO4 * 2 H2O (100 mg/L). 各成分をdiH2O中で同時に溶解させ、HCl/NaOHでpHを3.0に調整し、定容した後0.22 ミクロンのフィルターで濾過滅菌する。
一夜培養した培養物を同じ培地でOD600が0.05になるまで希釈し、別の方形96-ディープ・ウエルプレート (Thomson Instrument社, カタログNo. 951652C)中で培養した。各ウエルには希釈液を600 μL入れた。各希釈液を30℃で撹拌しながらOD600が0.8になるまで培養し、IPTGを濃度が400 μMになるまで添加して誘導した。プレートを5時間培養し、品質管理と正規化を目的としてOD600を測定した。
【０２５８】
400 μLの培養物を新しい96-ウエルプレート(Perkin Elmer社, カタログNo. 6008290)に移し、Beckman Coulter Allegra 6R遠心分離機で2500 x gで遠心分離して集菌した。ペレットを200 μLの低張緩衝液(5mM MgCL2, 5mM Tris HCl, 5mM DTT pH 8.0)中に再懸濁させた後、プレートを少なくとも60分間-80℃で凍結させた。
このプレートを解凍し、32 μLのイソプレンシンターゼDMAPPアッセイ緩衝液 (57mM Tris HCl, 19 mM MgCl2, 74 μg/mL DNase I (Sigma社 カタログNo. DN-25), 2.63xl05 U/mLのREADYLYSEリゾチーム溶液 (Epicentre社 カタログNo. R1802M), 及び5 mg/mLの分子生物学グレードBSA) を添加して、細胞溶解物を調製した。プレートを25℃で振蕩しながら30分間培養した後、氷上に置いた。
イソプレンを産出させるために、溶解物のサンプル80 μLを採取し、96-ディープウエルガラスプレート(Zinsser社 カタログNo. 3600600) に移し、20 μLの100mM KHPO4, pH 8.2 (Cayman Chemical社 カタログNo. 63180) 中に10 mM DMAPPを含む溶液を添加した。このプレートをアルミプレートでシール (Beckman Coultor社 カタログNo. 538619) した後、30℃で振蕩しながら60分間培養した。酵素反応は、ガラスブロックを加熱(70℃で5分間)することにより終了させた。実施例5に示した方法により、各ウエルのヘッドスペースガスを分析した。
【０２５９】
タンパク質濃度を求めるために、5μL以上の溶解物をプレキャストゲル(Invitrogen社 カタログNo. NP0301B OX)上に展開し、ニトロセルロース膜(Invitrogen社 カタログNo. LC2000)に転写してウエスタンブロット分析を行った。一次抗体には、実施例9のアンチ-イソプレンシンターゼ抗体を用いた。一次抗体を結合させた後、定量的なシグナル測定を行うために、Alexa Fluor 488 (Invitrogen社 カタログNo. A-11008)で標識した二次抗体で発色させた。ウエスタンブロット分析操作は、Invitrogen社の取扱説明書に従って行った。蛍光シグナルの測定にはブルーフィルターをセットしたMolecular Dynamics STORM分析装置を用い、Molecular Dynamics IMAGEQUANT画像分析ソフトウエアを用いて定量分析した。ライブラリの各構成メンバーの比活性度は、イソプレン産出量を、誘導培養物のA600の値またはウエスタンブロットで求めたイソプレンシンターゼタンパク質濃度の値で割って求めた比率から計算した。イソプレンシンターゼタンパク質のスタンダードを、一次スタンダードとしてクマシー・ブリリアントブルーR250で染色したBSAによるスタンダードゲルデンシトメトリにより較正した。後の分析に備え、ライブラリ全体について比活性度の増加、減少、または無変化を一覧表にまとめた。図14に、クズ部位評価ライブラリ(SEL) の各構成メンバーの位置Y22, A20, 及び S408についてのイソプレンシンターゼ活性を表すグラフを示す。
大部分の構成メンバーは、活性が野生型よりも大幅に低下しているが、同類置換の場合は活性の低下の度合いが小さい。A20G変異体の活性は、野生型クズ酵素の活性に近いことから、組換え変異体の対象となることが示唆される。ライブラリS408のS408D変異体は野生型と比較して活性が増加していることから、また別の組換え変異体の対象となることが示唆される。
【０２６０】
＜実施例11>
＜イソプレンシンターゼの切断＞
この実施例では、精製されたポプラIspS調合液(図21参照)中に見られるダブレット(doublet)の低バンド域中のタンパク質のアミノ酸配列の同定について説明する。質量分析法により特定した推定切断部位に基づく一連のN-末端切断IspS 分子も調製した。更に切断したときのIspS活性に及ぼす影響(Williams DC, McGarvey DJ, Katahira EJ, Croteau R (1998) Biochemistry 37:12213-12220)を調べるため、より短鎖のN-末端切断IspS(pDu39における"MEA" 切断、下記参照)も調製した。
【０２６１】
＜I.  タンパク質精製用のN-末端 6XHis-標識IspS (in pDu27)の構築＞
テンプレートP. alba pET24a (図19, 20)由来の全長P. alba IspSを、PCRにより調製した。
次のPCR反応液を調合した：lμl (テンプレート)-P. alba pET24a, 5 μl 10X PfuUltraII Fusion buffer, 1 μl dNTP's (10 mM), lμlプライマー(50 μM)プライマーF-(MCM219), 1 μlプライマー(50 μM)プライマーR-(MCM 182), 41 μl diH2O 及び1 μlのPfuUltra II Fusion DNA Polymerase (Stratagene社)。
PCRサイクルのパラメータは次のとおりである：95℃で1分間, 95℃で1分間, 55℃で20秒間, 72℃で27秒間のサイクルを29回、次に72℃で3分間及び4 0Cで冷却、Eppendorf Mastercyclerを使用。
0.8% E-gel (Invitrogen社) 及び Qiagen QIAquick Gel Extraction 及び QIAprep Spin Miniprepキットを製造者の取扱説明書に従って用いてPCR産品をゲル抽出し、精製した。精製物から採取した3 μlのサンプルを製造者の取扱説明書に従ってpET200D/TOPOベクター(Invitrogen社) に結紮した。反応物を室温で5分間培養した後、6 μlのトポイソメラーゼ混合物を、製造者の取扱説明書に従ってTop 10 化学的コンピテント細胞(Invitrogen)中に形質転換した。  
形質転換をカナマイシン(50 μg/ml) (Kan50)を含むLBプレート上で選択し、37℃で一夜培養した。5つのコロニーを採取し、T7 Forward及びMCM 182プライマーを用いて、PuReTaq Ready-To-Go PCR Beads (Amersham社) によりスクリーニングした。さらに、正しいサイズの挿入を有するクローンを、T7 Forward 及び T7 Reverse プライマー(Quintara Biosciences社) を用いたシーケンシングにより検証した。
1の構築体、pDu27 (図16〜18)をさらに分析した。プラスミド調合液から1 μlのサンプルを採取し、製造者の取扱説明書に従ってBL21(λDE3)/pLysS (Invitrogen社) 中に形質転換した。形質転換体を、Kan50+ クロラムフェニコール(35 μg/ml) (Cm35) を含むLBプレート上で選択し、37℃で一夜培養した。得られた株を、N-末端 6XHis-標識P. Alba IspSの発現及び精製に供した。
【０２６２】
＜II.  6XHis-標識IspSの精製＞
＜6XHis-標識IspSの発現＞
MD08-99株から6XHis-標識IspSを発現させ、精製した。培養方法は、BL2l(λDE3)pLysS細胞中でヒスチジン標識された酵素の発現に適したものである。予定した培養の1L毎に、10 mlの一夜培養物を調製し培養を行った。25 mlフラスコ中に入れた10 ml のLB培地に、適切な抗生物質(50 mg/ml カナマイシン, 50 mg/ml クロラムフェニコール, および／または50 mg/ml カルベニシリン)を添加し、細胞の新しいプレートから採取した1のコロニーを植菌するか、またはグリセロール凍結細胞ストックから植菌した。培地を約220 rpmで振蕩しながら、30℃で一夜培養した。各培養物について、適切な抗生物質を含む1リットルのLB培地により、一日培養物を調製した。1リットルの各一日培養物に一夜培養10 mlを植菌し、約220 rpmで振蕩しながら、30〜37℃でOD600が約0.4-0.6に達するまで培養した。一日培養物を400 μM のIPTGで誘導し、220 rpmで振蕩しながら、30℃で約5-6時間培養した。細胞を10,000 x g, 4℃で10分間遠心分離して集菌した。集菌後、細胞を直接使用するか、または次回使用するまで-80℃で保存した。
【０２６３】
＜6XHis-標識IspSの精製＞
BL21(λDE3)pLysS細胞からヒスチジン標識酵素を精製するために、細胞を新品の溶菌緩衝液 (溶菌緩衝液: Ni洗浄緩衝液+ 0.5 mM PMSF, 0.01% Tween-20, 1 mg/mlリゾチーム, 0.2 mg/ml DNasel; Ni洗浄緩衝液: 50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 20 mMイミダゾール, pH 8.0) 中に穏やかに再懸濁させた。1リットルの細胞ペレットにつき約40〜50 mlの溶菌緩衝液を用いた。次に細胞を氷上で約30分間インキュベートした。次に、細胞懸濁物をフレンチプレス細胞破砕機(大型フレンチプレス細胞破砕機、1200 psi/高設定)に、溶解物が透明になるまで、2-3回通して完全に溶解させた。溶解物のサンプルを活性分析、及びゲル分析用に保管した(〜100 μl)。次に、溶解物をSorvall Discovery 90SE高速遠心分離機を用いて30,000xg, 4℃で30分間遠心分離して、溶解物を透明にした。上清を回収して保管した。「透明にした溶解物」のサンプルを活性分析、及びゲル分析用に保管した(〜100 μl)。
【０２６４】
透明にした溶解物を、濃度勾配0〜100%のNi緩衝液Bを用いて HisTrap HPカラム(GE Healthcare社)上に展開した。SDS-PAGEゲル(4-12%ゲルNUPAGE, Invitrogen社)を製造者の取扱説明書に従って用いて、サンプルを分析した。所望の分画をスピンフィルター(Vivaspin-20, Sartoris社)により濃縮し、Sephadex G25レジンを充填したHiPrep 26/10 Desaltingカラム(GE Healthcare社)を用いて脱塩した。G-25緩衝液の組成は50 rnM HEPES, 50 mM NaCl, 及び1 mM DTTで、pH 7.4であった。0% Q Seph緩衝液Aから100% Q Seph緩衝液B (Q Seph緩衝液A: 50 mM Tris, 0.05 M NaCl, 1 mM DTT, pH 7.6 及びQ Seph緩衝液B: 50 mM Tris, 1.0 M NaCl, 1 mM DTT, pH 7.6) のグラディエント溶離液を用いて、HiTrap Q HP カラム(GE社)により所望のサンプルを精製した。所望のタンパク質を含む分画を分析し、濃縮した。次に、Sephadex G25レジンを充填したHi Prep 26/10 Desaltingカラム(GE heathcare社)にサンプルを通して、試料緩衝液を1 mM DTT を含む50 mM HEPES, 50 mM NaCL, pH 7.4に交換した。必要に応じてゲル濾過の最終精製処理を行った。ゲル濾過緩衝液(50 mM HEPES, 150 mM NaCl, 1mM DTT, pH 7.4) 中のサンプルを、Hi Load 26/60 Superdex 200 prep grade (GE社) に通した。各分画を分析し、濃縮した。試料を-80℃で保管した。バンドの分析を行うために、サンプルをSDS-PAGEゲル(4〜12% NUPAGEゲル, Invitrogen)上で展開して染色し、所望のバンドを採取した後、下記の方法で処理した。
【０２６５】
＜III.  イソプレンシンターゼの質量分析＞
＜サンプル調製＞
In-GeI Digestion法及びLCQ-Deca Mass Spectrometry法(Modified Rosenfeld in-gel Digest Protocol) (Rosenfeld et al, Anal. Biochem. (1992) 203, 173-179; Hellman et al, Anal Biochem, (1995) 224, 451-455)を用いた。精製したイソプレンシンターゼのサンプルを4〜12% SDS-PAGE (NUPAGE, Invitrogen社)上で展開し、クマシー・ブリリアントブルーR-250 (Thermo Scientific社)、またはSimplyBlue Safe Stain (Invitrogen社)で染色した。対象とするバンドをゲルから採取し、脱色した。各ゲル切片を〜1 mm×lmmの賽の目上に切断し、PGC Scientific社の0.65 mL平滑チューブに入れた。各チューブに約100μLの25mM NH4HCO3/50% ACN/H2Oを添加し、10分間撹拌した。上清を除去して廃棄した。この手順を2回繰り返した。ゲル小片を、Savant SpeedVac遠心濃縮機で乾燥させた (約20から30 分間)。
【０２６６】
サンプルを還元し、分析した。還元は、乾燥したゲルに10 mM DTTを含む25 mM NH4HCO3 (そのつど調製)を25μL (または十分浸る量) 添加して行なった。各チューブを軽く振り混ぜた。反応液を50℃で1時間培養した。上清を除去し、ゲルに55 mMヨードアセトアミド(IAA)を含む25 mM NH4HCO3を25 μL以上添加した。各チューブを再度軽く振り混ぜた。室温で1時間、暗所において反応させた。上清を除去し、ゲルに〜100 μLの25mM NH4HCO3/50% ACN/H2Oを添加して10分間振り混ぜながら洗浄した。上清を除去し、この洗浄工程をもう一度行った。ゲルの小片をSpeedVac遠心濃縮機で乾燥させた(約15-30 分間)。
【０２６７】
100μLの8M尿素に400μLの0.1% n-オクチルB-D-グルコピラノシダーゼ水溶液を添加して、消化緩衝液を調製した。この消化緩衝液400μLを、新たに調製したトリプシン20μgに添加した。0.05 μg/μLのシークエンシング用トリプシン溶液は、 1.6 M尿素溶液400μL中に溶解されたシークエンシング用トリプシン(Promega社) 20 μgが入ったバイアルにより調製した。トリプシン酵素溶液は、ゲル小片が完全に浸るまで添加した。チューブをパラフィルムで覆い、37℃で一夜培養した(16-20時間)。ゲル上に小過剰の緩衝液が存在するよう注意した。 
【０２６８】
消化物を軽く振り混ぜて、ゲルからペプチドを抽出した。ゲルローディングチップを用いて、消化物の溶液を0.65 mLのシリコンガラスチューブに移した。ゲル小片に50 μL (十分浸る量) の50% ACN/0.1% FA/H2Oを添加して10分間振り混ぜ、次に5分間超音波処理した。抽出したペプチドを1本のチューブにまとめた。抽出工程は、ゲル小片が白くなって縮むまで、2回以上繰り返し行った。消化物からの抽出物を振り混ぜ、SpeedVac遠心濃縮機で55 μLまで乾燥濃縮した。容積が55 μLに満たないときは、0.1% FAを必要量添加して最終容積を55 μLにした。
【０２６９】
＜質量分析＞
サンプルをThermofinnigan (San Jose, CA) LCQ-Decaエレクトロスプレーイオン化(ESI)イオントラップ質量分析計に注入した。Vydac C18カラム(5μ, 300A, 0.2×150 mm, Michrom Bioresources社, Auburn, CA)の流量を200μL/分にした。注入量は50μLであった。カラムに注入する前に、オンライントラップカートリッジ(Peptide CapTrap, Michrom Bioresources社, Auburn, CA)で濾過した。ゲル中の消化物の分離には、次のグラディエントを用いた。(溶媒A: 0.1%トリフルオロ酢酸水溶液 (J.T. Baker, Phillipsburg社, NJ), 溶媒B: 0.08%トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液(J.T. Baker, Phillipsburg社, NJ))。
【表１０】
2014158489.tif 000032
【０２７０】
＜質量分析結果＞
タンパク質の少量のサンプル6.4 μgを、MOPS緩衝液を用い、4-12% bis-tris NUPAGE ゲル(Invitrogen社)上において、5レーンで50分間展開した。上記のようにしてゲルを2分間染色した後、15分間脱色した。ゲルを水洗し、全てのバンドを採取し、小片に切断して脱色した。ゲル小片の還元はDTTを用いて52℃で1時間行い、アルキル化はIAAを用いて室温で1時間行った。トリプシンを添加して一夜培養した。抽出したペプチドをLCQ-Deca上で展開した。図21と22に、質量分析結果を示す。低位の二重バンド(図21)がIspSと同定された。図22は、N-末端切断が (pDu27中のN-末端His-標識IspSタンパク質のペプチド配列によれば) アミノ酸39, 40, 42, 及び44の後に認められたことを表している。IspSのC-末端は元のままであった。
【０２７１】
＜IV.  N-末端切断IspS変異体の構築＞
全ての親和性標識を備えていない切断構築体は、PCR増幅のテンプレートにP. alba pET24a を用いて、QuickChange Site-directed Mutagenesisキット(Stratagene社) により行った。
関連する各切断体 (例えばQC MSVフォワード及びQC MSVリバース, Table 11-2参照) に対応するフォワード(For)及びリバース(Rev)プライマーペアによる突然変異誘発PCR産品の増幅 (Eppendorf Mastercycler Gradient PCR Machineを用いた) には、約50 ngのテンプレートDNAを用いた。
次のPCR反応混合物を用いた：1 μl P. alba pET24a, 5 μl 10X PfuUltra HF緩衝液, 1 μl dNTP's, 1 μl (50 μM) プライマーFor (e.g. QC MSV For), 1 μl (50 μM) プライマーRev (例えばQC MSV Rev), 2 μl DMSO, 39 μl diH2O, 1 μl PfuUltra HF Polymerase (Stratagene社)。
PCRサイクルには次の条件を用いた：95℃で1分間、95℃で30秒間、55℃で 1分間、68℃で7.3分間を1サイクル、次に95℃で3030秒間、55℃で 1分間、68℃で7.3分間を計１８サイクル、次に4℃にした。
PCR産品を、1-2 μlのDpnI(Roche社) により37℃で1-3時間処理した。DpnI処理した産品から5 μlのサンプルを採取し、0.8% E-gel (Invitrogen社)上で可視化した。製造者の取扱説明書に従って、各産品から採取した1 μlのサンプルを化学的コンピテントE. coli Top 10細胞 (Invitrogen社) 中に形質転換した。形質転換体を、カナマイシンを50 μg/ml (Kan50)含むLB培地上で選択し、37℃で一夜培養した。
各形質転換体から5つのコロニーを選択し、3 mlの液状LB Kan50中で静止期になるまで培養した。Qiagen ミニプレップキットを製造者の取扱説明書に従って用いて、プラスミドを精製した。T7 フォワード及びリバースプライマーを用いて、精製したプラスミドのシーケンシング(Quintara Biosciences社による)を行い、各切断体を確認した。得られた形質転換体(pDU39からpDU43, Table 11-4, 図23〜34参照) を、製造者の取扱説明書に従って化学的コンピテントE. coli BL21(λDE3) pLysS (Invitrogen社) 中に形質転換した。Table Xに切断IspS酵素の発現に用いた株を示す。
【０２７２】
親和性標識(6XHis)及びタンパク質分解標識(TEV, Tobacco Etch Virus)を備える構築体を、P. alba pET24aをテンプレートに用いたPCR反応により調製した。
次のPCR反応混合物を調製した：1u1(P. alba pET24a), 5μl 10X PfuUltraII Fusion緩衝液, 1μl dNTP's (10 mM), 1μlプライマー (50 μM) Alba FL-Ndel-For、または1μlプライマー (50 μM)Alba TRC (MEA)-Ndel-F, 1μlプライマー(50μM) Alba FLTRC (+) TEV-R, 41μl diH2O, 及び1μlのPfuUltra II Fusion DNA Polymerase (Stratagene社)。
PCRサイクルには次の条件を用いた：95℃で1分間、95℃で30秒間、55℃で20秒間、72℃で 25秒間を1サイクル、次に、95℃で30秒間、55℃で20秒間、72℃で25秒間のサイクルを28回、次に72℃で3分間、その後4℃。増幅し、0.8% E-gel (Invitrogen社)上で可視化して分子量が正しいことを確認した後、PCR産品を制限酵素Ndel and Xhol (Roche社)により37℃で2時間消化し、Qiaquick Gel Purificationシステム(Qiagen社)を製造者の取扱説明書に従って用いてゲル精製した。精製した産品3 μlを、Ndel及びXhol (Roche社)で消化したpET-24a (Invitrogen社)中に結紮し、ゲル精製した後、脱リン酸化した(シュリンプアルカリホスファターゼ, SAP (Promega社)を製造者の取扱説明書に従って用いた)。結紮には、16℃で一夜培養したT4 リガーゼ(NEB社)を用いた。結紮反応生成物を水に対し30分間透析し、反応生成物2 μlをMCM331コンピテント細胞 (下記参照) 中にエレクトロポレートした。細胞30℃で2時間回復させ、プレート上に塗布されて5 mM (R)-(-)-メバロノラクトン(MVA) (Sigma社)を含むKan50上で選択した。陽性の形質転換体を3 mlの液状LB Kan50に植菌し、QIAPrep Spin ミニプレップキット(Qiagen社)を用いてプラスミドを単離した。Ndel及びXhol (Roche社)を用いて制限酵素消化することにより挿入を検証し、陽性クローンについて、T7プロモータ及びT7ターミネータシークエンシングプライマーを用いてシークエンシングを行った(Quintara Biosciences社)。各プラスミド(プラスミドの説明はTable 11-4及び図35〜39参照) 1 μlを化学的コンピテントE. coli BL21(λDE3) pLysS (Invitrogen社)中に製造者の取扱説明書に従って形質転換した。形質転換体をLB Kan50 + Cm35 (クロラムフェニコール35 μg/ml)プレート上で選択肢、37℃で培養した。全発現株に関しては、Table 11〜5を参照されたい。
【０２７３】
MCM331株は、次のようにして調製した。メバロン酸キナーゼ、メバロン酸ホスフェートキナーゼ、メバロン酸ピロホスフェートデカルボキシラーゼ、及びIPPイソメラーゼを含む合成オペロンをE. coliの染色体に組み込んだ。所望により、別のプロモータをオペロンの5'に組み込むことによって発現を変化させることもできる。
【０２７４】
＜ i)  標的ベクターの構築＞
組み込み位置としてattTn7部位を選択した。相同性上流側領域(attTn7 up) (プライマーMCM78及びMCM79)と、相同性下流側領域(attTn7 down) (プライマーMCM88及びMCM89)を、MG1655細胞を用いてPCRにより増幅した。1 μL 10 μM プライマー, 3 μL ddH2O, 45 μL Invitrogen社 Platinum PCR Supermix High Fidelity, 及び採取したMG1655のコロニーを含む50 μLの反応液を94℃で2時間変成し、 94℃で2時間, 50℃で30分間, 及び68℃で1時間のサイクルを25回繰り返し、さらに72℃で7時間反応させた後、4℃で冷却した。得られたDNAを製造者の取扱説明書に従ってpCR2.1 (Invitrogen社)中にクローン化し、プラスミドMCM278 (attTn7 up)、及びプラスミドMCM252 (attTn7 down)を得た。MCM252由来の、消化し精製した832 bp Apal-Pvul断片を、Apal- Pvulで消化しゲル精製したプラスミドpR6K中にクローン化してプラスミドMCM276を得た。MCM278由来の、消化し精製した825bp PstI- NotI断片を、PstI- NotIで消化しゲル精製したプラスミドMCM276中にクローン化してプラスミドMCM281を得た。
【０２７５】
＜ ii)  下流経路及びプロモータのクローン化＞
MVK-PMK-MVD-IDI遺伝子を、MCM 104 及びMCM 105プライマーを備えるpTrcKKDyIkISを用い、Roche Expand Long PCR Systemを製造者の取扱説明書に従って用いて増幅した。この産品をNotI 及びApaIを用いて消化し、NotI 及びApaIで消化しゲル精製したMCM281中にクローン化した。プライマーMCM 120及びMCM127を、Stratagene Pfu Ultra IIによるGeneBridges FRT-gb2-Cm-FRTテンプレートDNA由来のCMRカセットの増幅に用いた。PCR反応液の組成は、1uL 〜10ng/μLテンプレート,プライマー各1 μL , 1.25 μL 10mM dNTPs, 5 μL 10x buffer, 1 μL 酵素, 及び39.75 μL ddH20であった。PCRは、95℃で4時間変成, 95℃で20分間, 55℃で20分間, 72℃で2時間のサイクルを5回、 95℃で20分間, 58℃で20分間, 72℃で2時間, 72℃で10時間のサイクルを25回、その後4℃で冷却する手順で行った。反応液を貯留し、Qiagen PCR精製カラムで精製し、プラスミドMCM296を含み水洗されたPirl細胞のエレクトロポレーションに用いた。エレクトロポレーションは、2 mMのキュベット中で、2.5V及び200オームの条件で行った。エレクトロポレーション反応物は、LBを用いて30℃で3時間処理して回収した。MCM330形質転換体を、CMP5とKan50を含むLA上で選択した。
【０２７６】
＜ iii)   E. coli染色体中への組込み＞
MCM330由来のMiniprepped DNA (Qiaquick Spin kit)をSnaBIで消化し、GeneBridgesプラスミドpRedET Carbを含むBL21(DE3) (Novagen社)またはMG 1655のエレクトロポレーションに用いた。
細胞を30℃で〜OD1に成るまで培養し、次に0.4% L-アラビノースを用いて37℃で1.5時間誘導した。これらの細胞を2 μLのDNAでエレクトロポレーションする前に、4 C ddH2Oで3回洗浄した。クロラムフェニコール (5 μg/ml)を含むLアガー上で組込み体を選択し、次にLアガー+カナマイシン (50 μg/ml)では成長しないことを確認した。次いで、BL21組込みMCM331、及びMG 1655組込みMCM333を凍結した。
【表１１】
2014158489.tif 000033
【表１２】
2014158489.tif 000034
【表１３】
2014158489.tif 000035
【表１４】
2014158489.tif 000036
【０２７７】
＜V.  IspS切断の生化学的分析＞
種々のN-末端切断IspS酵素の相対活性を、DMAPPアッセイにより測定した。上記の株について、96ウエルプレートを用いたDMAPPアッセイにより分析した。全ての株について4回測定した。「全長」変異体とは、P. alba pET24aプラスミド由来のBL21(λDE3) pLysS (Invitrogen社)中で発現されたIspS酵素を意味する。
【表１５】
2014158489.tif 000037
【０２７８】
＜結果＞
Table Xから、OD600について正規化したとき、株MD09-173 (プラスミドpDu39を含む), MD09-175 (pDu41を含む), MD09-176 (pDu42を含む), 及びMD09-177 (pDu43を含む) はいずれも、「全長」野生型IspS酵素 (P. alba pET24aを含む株BL21(λDE3) pLysS中に含まれる) よりも高いDMAPP活性を示すことが分かる。
【０２７９】
＜VI.   IspS 中の「MEA」切断の速度論的分析＞
相対的比活性度を測定し、「N-末端切断」 P. albaイソプレンシンターゼの速度論敵分析を行い、「全長」 P. alba イソプレンシンターゼと比較した。この分析では、4種の異なる構築体を発現する4種の株を用いた： P. alba pET24aを備えるBL21(λDE3) pLysS；MD09-173; MD09-165; 及び MD09-167 (上記で説明した株)。
これらの株はそれぞれ、「全長」P. alba IspS、「切断」P. alba IspS (the MEA切断)、「全長」C-末端TEV及びHis-標識P. alba IspS、並びに「切断」C-末端TEV及びHis-標識P. alba IspSである。下記の実施例では、「切断」とはP. alba IspSのMEA変異体を意味する。
【０２８０】
全ての株を30 mg/Lのクロラムフェニコール(Cm)と50 mg/Lのカナマイシンを含むLBに植菌し、2 mL 培養チューブ中で37℃において一夜培養した。翌朝、一夜培養物を、30 mg/Lのクロラムフェニコール(Cm)と50 mg/Lのカナマイシンを含む25mLのLBブロスで1:100に希釈し、OD〜0.5になるまで37℃で培養した。各株を3件培養した。各培養物を400 μM IPTGで誘導し、30℃で4時間培養した。20 mLの各培養物を、3000 x gで20分間遠心分離し、上清を廃棄した。ペレットを-80℃で一夜凍結した。ペレットを、100 mM Tris, 100 mM NaCl, 0.25 mg/mLリゾチーム、及び0.25 mg/mL DNAaseを含むpH 8の緩衝液中に再懸濁させた。細胞懸濁物を20,000 psiで2回フレンチプレスにより処理し、次に溶解物を14000 x gで20分間遠心分離して細胞抽出物を得た。この細胞抽出物を速度論的分析と、タンパク質濃度測定に用いた。
【０２８１】
比活性度を測定するため、各株の細胞抽出物5 μLを、5 mM DMAPPと50 mM MgCl2を含み、組成が100 mM Tris 及び100 mM NaCl (pH 8)の緩衝液中で、最終容積100 μLにして、2 mL気密バイアルを用いて30℃で15分間培養した。反応は、pH 8の500 μM EDTA溶液100 μLを添加して停止させた。サンプルをGC-MSで分析して、バイアルのヘッドスペース中のイソプレン濃度を測定した。
【０２８２】
kcat及びKMを求めるため、各株の細胞抽出物5 μLを、DMAPP を0.625から40 mMの濃度範囲で含み、組成が100 mM Tris, 50 mM MgCl2及び100 mM NaCl (pH 8)の緩衝液中で、最終容積100 μLにして、2 mL気密バイアルを用いて30℃で15分間培養した。反応は、pH 8の500 mM EDTA溶液100 μLを添加して停止させた。サンプルをGC-MSで分析して、バイアルのヘッドスペース中のイソプレン濃度を測定した。カレイダグラフ(Kaleidagraph)を用いてデータを分析し、次の非競合基質阻害の式にフィッティングさせた：rate/E = kcat*S/(KM+S*(l+S/Ki))。2.5 mM DMAPPを含むMD09-167以外の全データについて3件の計算を行なった。2.5 mM DMAPPを含むMD09-167の計算は2件行った。
【０２８３】
各サンプル中のイソプレンシンターゼの量を定量するために、細胞抽出物をCaliper 微小流量電気泳動装置 (Caliper Life Sciences社, Hopkinton, MA, USA)で分析した。微小流量チップとタンパク質のサンプルは、製造者の取扱説明書に従って調製した(LabChipTM HT Protein Express社, P/N 760301)。溶解培養物は、96-ウエルマイクロタイタープレート上で0.1% Tween 20, 0.1 mg/mlリゾチーム, 1.0 μg/ml DNAseを含む50 mM Tris pH 8.0を添加して室温で30分間培養した後、遠心分離して調製した。上清を別の96-ウエルプレートに移し、使用するまで-20℃で保管した。使用するときは、室温で30分間解凍した。軽く振り混ぜた後、各培地のサンプル2 μlを、サンプル緩衝液7μlを入れた 96-ウエルPCRプレート(Bio-Rad, Hercules社, CA,USA)に移し、次にこのプレートを温度制御可能なプレートヒータ上で90℃において5分間加熱した。プレートを放冷した後、各サンプルに水35 μlを添加した。このプレートを、製造者から供給され較正された標準タンパク質とともに、電気泳動装置で分析した。サンプルをタンパク質に非共有結合により付着する蛍光染料と混合し、次にゲルマトリックス上で電気泳動させた。タンパク質がチップの焦点を通過するときの蛍光シグナルを測定し、このシグナルを較正された1組の標準タンパク質のシグナルと比較することにより、タンパク質の定量分析を行った。
【表１６】
2014158489.tif 000038
【０２８４】
係数は、次の非競合基質阻害の式に、得られたrate/[E] vs. [DMAPP]のデータをフィッティングさせることにより求めた。
【数１】
2014158489.tif 000039
【０２８５】
比活性度(S.A.)は、全細胞溶解物の上清に由来するイソプレンシンターゼ2.5-4.5 μg, 5mM DMAPP, 50mM MgCl2, 100mM Tris, 及び100mM NaClを含む反応液により計算した。反応は、それぞれ別の3つの培養物について、30℃で15分間行った。
【０２８６】
＜結果／検討＞
各タンパク質の比活性度を求めた(図40とTable 11-7参照)。切断イソプレンシンターゼの比活性度は、全長イソプレンシンターゼの比活性度の約2倍であった。C-末端His-標識全長イソプレンシンターゼの比活性度は、全長イソプレンシンターゼと同等であった。C-末端His-標識切断イソプレンシンターゼの比活性度は、未標識切断イソプレンシンターゼより劣っていたが、いずれの全長イソプレンシンターゼよりも高い比活性度を有していた。
【０２８７】
酵素のkcat及びKM の値(図41及び42, Table 11-7参照)を求めるために、DMAPP の濃度を種々変更してDMAPPからイソプレンへの転化速度を分析した。全ての酵素は、DMAPPによる非競合基質阻害に応じた速度変化を示した。Ki値を変化させてデータに対し(データは示していない) 最もフィット(R-値)する値から求めた全長構築体のKi値は、切断構築体のKi値より大きな値であった。全てのデータを、本願の各図における10 mMのKi値にフィットさせた。切断イソプレンシンターゼのKM値は、全長イソプレンシンターゼに対し減少していた。従って、基質濃度が低下するに従い、切断イソプレンシンターゼと全長イソプレンシンターゼのイソプレンシンターゼ活性は増大する(図43参照)。切断イソプレンシンターゼのkcats値は、全長イソプレンシンターゼに対し増大していた。このため、全ての基質濃度において、切断イソプレンシンターゼのイソプレンシンターゼ活性の方が、全長イソプレンシンターゼより高くなる(図43参照)。種々のDMAPP濃度において、切断イソプレンシンターゼと全長イソプレンシンターゼとのイソプレンシンターゼ活性の比を求めた(図43参照)。
【０２８８】
＜結論＞
切断イソプレンシンターゼは、DMAPPをイソプレンに転換する触媒反応に関して、「全長」イソプレンシンターゼよりも高いkcat値と、低いKM値を示す。「切断」イソプレンシンターゼの比活性度は、「全長」イソプレンシンターゼの比活性度よりも高い。最も活性の高いイソプレンシンターゼは、未標識切断イソプレンシンターゼ"MEA" 変異体(MD09-173株中) であった。切断イソプレンシンターゼは、全長イソプレンシンターゼと比較して、イソプレン産出に用いられる有機体において、向上したイソプレンシンターゼ活性を示す。
【０２８９】
＜実施例12＞
＜イソプレンシンターゼの高濃度化−DMAPP毒性の緩和＞
この実施例では、速度論的改良、発現の向上、溶解性の向上、またはイソプレンシンターゼによりDMAPPがさらに効率的にイソプレンに転換されるその他の方法によって、優れた活性を酵素に賦与するIspS内の残基の変更を示す。この方法によれば、改良されたIspSの発現により、DMAPPの細胞内細胞毒性を緩和させることができる。イソプレン変異体の異種混合物を発現する細胞群において、最も優れた酵素はその宿主株をより多く成長させ、混合細胞群中で高濃度化される。
【０２９０】
＜I.  株の構築＞
株中に組み込まれたLambdaプロモータがmKKDyIを推進するMCM518-521株及び528-531株の構築は次のようにして行った： プライマーMCM120及びMCM224 (Table 12-1)を用いて、GeneBridges FRT-gb2-Cm-FRTテンプレート由来の耐性カセットをStratagene Herculase II Fusionキットを製造者の取扱説明書に従って用いて増幅した。4件の50 μL反応液について次のサイクルを行った：95℃で2 分間; (95℃で20秒間, 55℃で20秒間, 72℃で1分間)のサイクルを30回; 72℃で3分間; 及び4℃で冷却。4件の反応液をQiagen PCRカラムを製造者の取扱説明書に従って用いて精製し、55℃で60μLのEB中に溶出させた。
【０２９１】
プラスミドpRedET-carb (GeneBridges社)をMCM446中にエレクトロポレートした。形質転換体をSOC (Invitrogen社)中で30℃において1時間振蕩して回収した後、カルベニシリン(50 μg/ml) (carb50)を含むLBプレート上で30℃において一夜選択してした。カルベニシリン耐性のコロニーをMCM508と命名して凍結した。  
【０２９２】
MCM508株を5mLのLB/carb50培地にストリークして、30℃でOD600 が約0.5になるまで培養した。培養物に40mM L-アラビノースを添加して、37℃で1.5時間培養した。細胞を集菌し、予め精製した3μLのアンプリコンでエレクトロポレートし、37℃で1.5-3時間、500μLのSOC中に回収した。形質転換体をLB/kan10プレートを用いて37℃で選択した。 
【０２９３】
標的ローカスにおけるアンプリコンの組換えを、プライマーGB-DW及びMCM208を用いたPCRにより確認した。得られたアンプリコンのシークエンシングを行い、下記に示す配列の4種のクローンを同定した。カルベニシリン感受性クローンをMCM518〜521株と命名し、凍結した。
【０２９４】
MCM518〜521をLB kan10プレートに再度ストリークして37℃で一夜培養した。
【０２９５】
MCM518〜521を37℃でLB kan10プレートにより培養した後、プラスミドpCP20により電気形質転換(electrotransform)した(Datsenko KA, Wanner BL。PCR産品を用いてエシェリキア ・コリ K- 12中の染色体遺伝子を一段階で不活性化したもの。Proc Natl Acad Sci U S A. 2000 Jun 6;97(12):6640-5)。
細胞を500 μL SOC中で30℃において1時間振蕩して回収した。形質転換体をLB/carb50プレート上で30℃において一夜選択した。翌朝、各形質転換体のコロニーを、30℃の液体LB/carb50培地を用いて白濁が認められるまで培養した。次に、培地の温度を37℃にした。この培地から採取した細胞をLBプレート上にストリークし、37℃で一夜培養した。
【０２９６】
翌日、コロニーをLB, LB/carb50 及びLB/kan10に植菌した。LB/carb50 及びLB/kan10上では成長しなかったクローンと、LB上の植菌に由来するものを液体LB培地で培養し、MCM528〜531として凍結した。
【０２９７】
＜DNA配列＞
これらの構築体は、MCM518-521株の染色体に挿入された新規なプロモータと、mMVK ORFの先頭とを備えている。これらの構築体の上流はGeneBridges FRT-gb2-Cm-FRT カセットに由来する配列である。下流は残余のmMVK ORFと、これに続くMCM508株由来の下流MVA経路インテグロンの残余部である。
【化２０】
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【化２１】
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【化２２】
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【化２３】
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【０２９８】
neo-PL.2-mKKDyI (MCM521由来)をBL21(λDE3)中に導入して、MD09-171株を調製した。MCM521のPl溶解物を調製し、BL21(λDE3)中に導入した。導入は、公知の分子生物学的手法(Miller, A Short Course in Bacterial Genetics)により行った。導入体をKan20 LB培地上で選択した。陽性のコロニーをさらにPCRで検証し、BL21(λDE3)株中にPL.2-mKKDyIが存在することを確認した。この株中に1 μlのpCP20プラスミドを形質転換し、LB + Carb50により選択し、30℃で培養した。次に、陽性の形質転換をLBプレートにストリークし、37℃で培養してpCP20プラスミドを喪失させた。ネオマイシン(カナマイシン)耐性マーカの喪失を確認するために、37℃で培養したコロニーをLB Kan20, LB Carb50培地、及び無添加のLB培地上に植菌した。pCP20を喪失しカナマイシン耐性マーカの無いPL.2 mKKDyIが組み込まれた株は、カナマイシンとカルベニシリン に対する感受性を有するはずである。親BL21(λDE3)株をコントロールに用いて、4種のKanS CarbSについてBL21(λDE3)中のmKKDyIの存在をPCRによりチェックした。PCRによりmKKDyIの存在が確認された株を、1μlのpLysS プラスミド(Invitrogen社)で形質転換した。得られた株であるMD09-171を、下記の高濃度化の実施例に用いた。  
【表１７】
2014158489.tif 000044
【表１８】
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【０２９９】
＜II.  メバロン酸によるMCM531の成長阻害＞
MCM531 (株に関する説明を参照)の一夜培養物をOD600が0.05になるまで逆希釈(back-dilute)した(これは、96-ウエルプレートリーダーでのOD600約0.005に相当する)(SpectraMax M2, Molecular Devices)。希釈した培養物から採取した少量のサンプルを、96-ウエルディープウエルプレート上の、0, 1, 5, 10, 15 または20 mMのMVAを添加し、1% グルコース及び0.8 g/L Biospringer酵母エキス(1% Yeast extract final)を添加した標準TM3培地(13.6 g K2PO4, 13.6 g KH2PO4, 2.0 g MgSO4*7H2O) を入れた各ウエルに分注した。図44に、異なるMVA濃度におけるMCM531の成長曲線を示す。各MVA濃度において4回測定した。エラーバーは極わずかであった。図44は、MVAの濃度が5mM以上のとき、MCM531の成長が著しく阻害されることを示している。
【０３００】
＜III.  IspSの突然変異誘発と選択／高濃度化アッセイ＞
GeneMorph II EZ Cloneドメイン突然変異誘発キット(Stratagene)を製造者の取扱説明書に従って用いて、ランダムに突然変異誘発したIspS オープンリーディングフレームを調製した。テンプレート(Pdu39 (pET24a-P. alba (MEA)))を増幅するためのプライマーを下記に示す (Table 12-3, pET24 Megaprime Forward 及びReverse)。所望の突然変異誘発頻度を得るために、GeneMorph IIキットの取扱説明書に従った。1分子中に2から3の残基変化を生じさせるために、最初のPCR反応では約150ngの開始テンプレートDNAを用いた。これより少量の残基変化をIspS酵素に生じさせるときは少量のテンプレートを用い、これより多量の残基変化を生じさせるときは多量のテンプレートを用いた。得られた突然変異「メガプライマー(megaprimer)」を用いて、製造者の推薦する方法に従って残りのプラスミドを増幅した。
【０３０１】
GeneMorph IIキットにより得られた最終PCR産品を、DpnIを製造者の取扱説明書に従って用いて処理した。E. coli中に形質転換する前に、PCR産品を微少透析して脱塩する必要があった。典型的には、約20 μlのPCR産品を微少透析して、MD09- 171 (Table 12-2)株中に公知の分子生物学的方法によりエレクトロポレーションした。エレクトロポレーション後、細胞を30℃で2時間回復させ、LB培地Kan50 Cm35に塗布した。突然変異誘発により生じた全ての突然変異体を回収するため、形質転換体溶液の全てを塗布した。 
【０３０２】
高濃度化するために、全形質転換体を採取して貯留した。各貯留液から採取した少量の液を-80℃で凍結して保管した。高濃度化する前に、貯留中の異性化を最小にするために、株（コントロールまたは検体貯留液）を、Kan50を含むLBに直接植菌して数時間成長させた。この回復期間の後、細胞をKan50, 5 mM MVA, 及び200 μM IPTGを含む液体TM3培地（上記のもの）で希釈した。（正確な希釈率は、実験的に各培地／コントロール反応の各貯留液／ソースごとに決めた。）培地をOD600が5を超えない範囲で34℃において振蕩しながら培養した。この時点で、1 mlの「高濃度化」した倍地からミニプレップ法 (Qiagen社)によりプラスミドを精製した。 このプラスミド調合液を、上記のようにしてエレクトロコンピテントMD09-171細胞中に形質転換した。形質転換細胞を抗生物質を含まないLB培地中で2時間回復させた後、上記のKan50, 5 mM MVA 及び200 μM IPTGを含むTM3で希釈して2回目の高濃度化を行った。上記のように、培地をOD600が5を超えない範囲で34℃において振蕩しながら培養した。プラスミドを精製し、再度形質転換して更に「高濃度化」した。さらに選択、プラスミド精製、再形質転換を5から6回繰り返して高濃度化した。培地が均一になるまで高濃度化した。すなわち、シークエンシングにより検出されるIspS変異体が1種類だけになるまで高濃度化した。
【０３０３】
最後の高濃度化の後、プラスミドの溶液を化学的コンピテントE. coli Top 10細胞(Invitrogen社)中に、製造者の取扱説明書に従って形質転換し、回収し、Kan50を含むLB培地に塗布し、全長についてのシーケンシングを依頼して(Quintara Biosciences社)、P. alba IspSの野生型配列と比較した。
【表１９】
2014158489.tif 000046
【０３０４】
＜IV.   高濃度化により同定された個別の残基変化／DMAPP毒性緩和＞
選択／高濃度化から単離したプラスミドの全長をシーケンシングした。次の配列変化がシーケンシング(Quintara Biosciences社)により同定された。残基の番号はP. alba 「全長」配列 (P. alba pET24a; SEQ ID NO: 120)に対応し、最初のメチオニンがアミノ酸場能1である。同定された配列変化には以下が含まれていた。
【化２４】
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【０３０５】
高濃度化／DMAPP毒性緩和により同定された配列残基変化の組み合わせ(単一のIspS酵素中)は次の通りであった。
【化２５】
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【０３０６】
＜実施例１３＞
＜部位飽和ライブラリ(SSLs)の構築とL70R変異体の生化学的分析＞
この実施例は、上記の選択／高濃度化により同定した部位、及びそのほかの対象とする部位(活性部位, ポプラ属において保存された部位) において可能なアミノ酸置換が、溶解性、発現、及びIspS活性に及ぼす効果の評価に関する。
【０３０７】
＜I.  株の構築＞
上記の選択／高濃度化(L70, G94, R262, F305)により同定した残基を選び出して分析した。さらに、基質結合に関与していると推定される残基(F303, V3065, F385, S412, Q416, F450)、及び様々なポプラ種の間で異なる残基(例えばV418, T442)を選んで分析した (番号付けはP. alba IspSの「全長」アミノ酸配列に対応する)。一群のランダムなアミノ酸置換体(部位飽和ライブラリ, SSL)を調製するために、下記に示すQCプライマー (Table 13-1)を用いてpDu39 (上記参照)のQuickChange (Stratagene社) 突然変異誘発を、製造者の取扱説明書に従って行った。
PCR反応液の組成は次のとおりである：
1 μl pDu39, 5 μl 10X PfuUltra HF緩衝液, 1μl dNTP's, 1μl (50 μM) プライマー-For (例えばQC L69 F), 1μl (50μM) プライマー-Rev (例えばQC L69 R), 2μl DMSO, 39μl diH2O, 及びlμl PfuUltra HF Polymerase (Stratagene社)。
QuickChangeのPCRサイクル条件は次の通りであった：95℃で1分間, 95℃で30秒間, 55℃で1分間, 68℃で7.3分間のサイクルを1回、次いで95℃で30秒間, 55℃で1分間, 68℃で7.3分間のサイクルを17回。次に、温度を4℃まで下げた。上記の残基のコドンにNNK混合塩基を導入することにより、可能性のある20種のアミノ酸全てを表現するコドンを所定の部位に挿入することができる。得られた各突然変異誘発PCR産品1μl をDpnI処理(上記参照)し、製造者の取扱説明書に従って化学的コンピテントE. coli Top 10細胞 (Invitrogen社)中に形質転換した。全ての形質転換反応液を、抗生物質を含まない1 mlのLB培地中で37℃において1時間回復させ、LB Kan50に塗布した。翌日、LBプレートから全ての形質転換体を採取し、十分撹拌し、ミニプレップ(Qiagen社)により各プラスミドを精製した。各プラスミドを化学的コンピテントBL21(λDE3)pLysS細胞(Invitrogen社)中に、製造者の取扱説明書に従って形質転換した。得られた各形質転換反応液を1 mlのLB培地中で37℃において1時間回復させ、次に陽性コロニーの分離が生じ得るように希釈してLB Kan50 Cm35に塗布した。37℃で一夜培養した後、各コロニーを各ウエルに500μlの液体LB Kan50 Cm35培地を入れた96-ウエルディープウエルマイクロタイタープレート(VWR)の各ウエルに、各コロニーを植菌した。8つのウエル(通常カラム12, AからH)に、MD09-173株 (上記参照)またはP. alba pET24a (全長)を含むBL21(λDE3)pLysSを、DMAPPアッセイにおけるコントロールとして植菌した。マイクロタイタープレートを半透過性膜(Breathe-Easier, Diversified Biotech)でシールし、振蕩インキュベータ(Vertiga)により30℃で一夜培養した。翌日、96-ウエルプレートの各ウエルのサンプル100 μlに、新しい200 μl 96-ウエルプレートを用いて、50 μlの50%グリセロールを添加混合し、次に分析するまで-80℃で凍結した。このプレートを下記のDMAPPアッセイに用いた。
【表２０】
2014158489.tif 000049
【０３０８】
＜II.  二次評価用の「ウイナー(Winner)」プレートの調製と、改良された比活性度を有する変異体のL70Rの同定＞
野生型より高いイソプレン産出量を示す変異体を選び出し、さらに分析した。図45は各残基についてのSSLプレートの典型的なデータ例であり、この図の場合はL70のプレートである。このプレートから、C3 (27), D3 (39), 及びE3 (51)のウエルのサンプルを選び出して更に分析した。異なる残基位置(上記に示した)に変異を有し、DMAPP分析を行ったとき高いイソプレン産出量を示す変異体を-80℃で保管した(上記参照)オリジナルSSLプレートから単離し、新しい「ウイナー」プレートに再配列して二次スクリーニングを行った。コントロールとしての、MD09-173を含む2つのウエルが含まれていた。全ての変異体のシーケンシングを行い(Quintara Biosciences社)、上記のようにしてDMAPPアッセイを行った。シーケンシングの結果をTable 13-2に示す。DMAPPアッセイでは、各変異体の単一培養物をアッセイし、単一の溶解物を調製した。統計的に有意なデータを得るために4回測定した。サンプルを、Table 13-2に示すOD600においてアッセイした。タンパク質の分析は、全ての溶解物についてWestern Breeze ウエスタンブロットキット(Invitrogen社)を用いて行い、次にStorm860 (下記参照)により蛍光検出した。 
【０３０９】
＜III.  DMAPPアッセイ-培養、溶解、及びイソプレン測定＞
VP-Scientific Replication 装置と、一夜培養グリセロールストックプレートからのLBアガーCM35/Kan50 ラージパッチプレートとを用いてパッチプレートを調製した。培地を30℃で一夜(20から24時間)培養した。プレートを4℃で1週間保管した。
【０３１０】
500 mLのLB CM35/Kan50培地から一夜培養プレートを調製した。ディープ96ウエルプレートに300 μL/ウエルのLB CM35/Kan50培地を分注した。V&S Replication Toolを用いてパッチ接種材料をディープ96ウエルプレートに移した。培地にピンを浸し、次にウエル内でピンを振動させて植菌した。一夜培養プレートをBreathe-Easier Sealing Membraneでシールした。Vertiga Shakingインキュベータを用い、800 rpmで16から18時間、30℃でプレートの培養を行った。
【０３１１】
588 μL/ウエルのLB CM35/Kan50培地を分注して、ディープ96ウエル一日培養プレートを調製した。一日培養プレートをインキュベータから取り出し、50倍に希釈した。12 μLの一夜培養物を、添加LB培地が588 μL/ウエル入れられた一日培養プレート に移した。一夜培養プレートを新しいBreathe-Easier Sealing Membraneでシールし、Vertiga Shakingインキュベータを用い、800 rpmで2.25時間、34℃で培養した。
【０３１２】
IspSの発現を誘導するため、解凍した12 mM IPTGを50 mLから100 mLの滅菌した容器に入れ、培地を600 μL/ウエル入れた各ウエルに、20 μL/ウエル分注した。一夜培養プレートをBreathe-Easier Sealing Membraneで再びシールし、Vertiga Shakingインキュベータを用い、800 rpmで4時間、34℃で培養した。
【０３１３】
誘導された培養物200 μLを、450 μL Nunc保管プレートに移して細胞を集菌した。このプレートを、卓上低速遠心分離機を用いて3300 rpmで20分間、4℃において遠心分離した。上清180 μLをピペットで除去して廃棄した。このプレートをアルミホイルでシールし、プラスチック製の蓋で覆い、-80℃で凍結して保管した。
【０３１４】
各プレートのOD600を測定した。96 ウエルCostarリードプレート(#9017)に、150 μLの1x PBSを分注した。
次に、このリードプレート50 μLの培地サンプルを入れた。次に、SpectramaxプレートリーダーでOD600を測定した。 
【０３１５】
溶解：集菌したプレートを室温のウォーターバス中で4分間解凍し、Thermomixerを用いて1200 rpmで1分間、25℃において培養した。20 μL/ウエルの集菌した細胞に溶解緩衝液を80 μL/ウエルで分注した。6.25 mlの1M Tris pH 8, 625 μlの10% Tween 20, 312.5 μlの0.2 M PMSF, 462.5 μlの10 mg/ml DNAse I (Sigma), 1.25 mlの1 M MgCl2, 132.5 μlの25000 U/μl リゾチーム(Epicentre Technologies社) 及び40.968 mlのdIH20により1.25X Lysis Working Stock 緩衝液を調製した。Thermomixerを用いて、1200 rpm で30分間、25℃においてプレートを培養した。4.75 mlのdIH2Oで19 ml の1.25x Lysis Working Stockを希釈して、1x Lysis Bufferストックを調製した。
【０３１６】
次のようにして、DMAPP ワーキングストックを調製した。
【表２１】
2014158489.tif 000050
【０３１７】
希釈剤には0.1 Mリン酸カリウムを用いた。サンプルのウエルに200 uL/ウエルで分注し、氷上で保管した。
【０３１８】
DMAPP反応：1x Lysis Bufferを65 μL/ウエルで分注した。15 μL/ウエルの溶解物を96 DeepウエルZinsserガラスブロックの各サンプルウエルに移した。DMAPP試薬を20 μL/ウエルで分注した。ガラスブロックをアルミホイルでシールし、450 rpmで45分間、25℃において培養した。ガラスブロックを70℃のウォーターバスに移し、6分間放置することにより、反応を停止した。GC分析は、上記のようにして行った。
【０３１９】
＜IV.  蛍光標識二次抗体によるイソプレンシンターゼのウエスタンブロット＞
製造者の取扱説明書に従って、調製したサンプルをNativePAGETM NovexTM Bis-Trisゲル (Invitrogen社)上に展開した。展開終了後、直ちにゲルをXCeIl IITM Blot Module (Invitrogen)を製造者の取扱説明書に従って用いてニトロセルロース膜に移した。その後、膜をキットに付属していたプラスチック容器中の適切なブロッキング溶液(超濾過水31.5 ml, ブロッカー/希釈剤 (Part A) 9 ml, ブロッカー/希釈剤 (Part B) 4.5 ml)15ml中に入れ、1回転/秒に設定したロータリーシェーカーで30分間インキュベートした。ブロッキング溶液をデカンテーションにより除き、膜を20 mlの水で5分間洗浄する操作を2回行った。膜を15mlの一次抗体(Ab)溶液(15 mlのブロッキング溶液中24 μlの一次Ab)で1時間インキュベートし、次に20 ml の1x 抗体洗浄液で5分間洗浄する操作を3回行った。次に、膜を15mlの二次抗体溶液(15のブロッキング溶液中に15ulの二次 Ab (Alexa Fluor 488 ヤギ抗-ウサギ IgG (H+L, Invitrogen社)) で30分間インキュベートした。膜を20 mlの抗体洗浄液で5分間、3回洗浄し、20 mlの水で2分間、2回洗浄した。膜をペーパータオルにはさんで乾燥させ、室温で保管した後、分析に用いた。Storm 860 Molecular Imager (GMI, Inc社)を用いて蛍光バンドを検出し、定量した。
【０３２０】
＜V.   結果＞
Table 13-2に、アッセイした各変異体のシーケンシング結果, 残基変化, 平均イソプレン産出, タンパク質濃度, 及び平均比活性度(全て4回測定)に関するデータを示す。図46はTable 13-2のデータをグラフ化した図である。比活性度は、イソプレン産出(μg/1)に0.0414を掛け、次にタンパク質濃度で割って求めた。この係数(0.0414)は、シールされた2 ml GCバイアルの全ヘッドスペース容積 (1.9 ml)、溶解物の容積(15 ul)、DMAPPアッセイの時間(45分間) 、及びイソプレンの分子量から計算して求めた。すなわち、比活性度の単位はnmolイソプレン/mg Isps/分である。 
【０３２１】
Table 13-2のデータ、及び図46のグラフは、分析した全ての変異体、全てのL70R変異体は、野生型より高い比活性度を有することを示している。さらにL70R変異体を分析するために、3種の単離物(4回測定)の比活性度の値を平均し、コントロール(2種の単離物、4回測定)と比較した。すなわち、 L70R変異体は計12回測定し、野生型は8回測定した。データをTable 13-3に示す。タンパク質について補正した場合、L70R変異体はMD09-173 (MEA切断)よりも25%高い活性を有する。図47に、全てのL70R変異体の比活性度をMEAと比較して示す。エラーバーは標準偏差を表す。L70Rの2つのデータセットとMEAコントロールについて、統計的分析のためにスチューデントのT検定を行い、P-値6.0011 x 10"5を得た。
【表２２】
2014158489.tif 000051
【０３２２】
全てのプラスミドの配列は、表示したコドン以外は、Pdu39 (上記参照)と同じである。L70R変異体はグレーのハイライトで示してある。
【表２３】
2014158489.tif 000052
【０３２３】
＜実施例１４＞
＜ポプラ. アルバ, ポプラtremuloides, ポプラtrichocharpa, 及び Kudzuイソプレンシンターゼの切断＞
この実施例では、ポプラアルバ, ポプラtremuloides, ポプラtrichocharpa, 及び Kudzuの各IspS酵素における一連の切断の生成と、その活性に及ぼす効果について説明する。
【０３２４】
＜株の構築＞
全てのイソプレンシンターゼ遺伝子をE. coliにコドン最適化し、合成し、DNA2.0社 (Menlo Park, CA)でpET24a中にクローン化した。全ての切断構築体は、QuickChange Site-Directed Mutagensisキット(Stratagene社)を用いて調製した。PCR増幅のテンプレートには、上記のP. alba pET24a (プラスミド pDu47-3から-7用, 図48, 49, 51〜60参照), P. tremuloides pET24a (プラスミドpDu48, 図49C, 61 及び62参照), P. trichocharpa pET24a (pDu49, 図 50A, 63, 64参照), またはpET24d-Kudzu (pDu50及び50-4, 図50B, 50C, 65〜68参照)を用いた。
各切断(例えばQC Trunc -3 F 及び QC Trunc -3 R, Table 14-1参照)に対応するForward (For)及びReverse (Rev)プライマーペアによるPCR産品の増幅(Eppendorf Mastercycler Gradient PCR Machineを使用)には約50ngのテンプレートDNAを用いた。用いたPCR反応液は次の通りである： 1μl P. alba pET24a (または他のテンプレート), 5μl 10X PfuUltra HF緩衝液, 1μl dNTP's (10 mM), 1μl (50uM) primer-For, 1μl (50 μM) primer-Rev, 1.5μl DMSO, 39.5μl diH2O、及び 1μl PfuUltra HFポリメラーゼ。次の PCRのサイクル条件を用いた：Eppendorf Mastercycler Gradient Machineを使用し、(95℃で1分間, 95℃で1分間, 55℃で1分間,68℃で7分30秒)のサイクルを18回、次に4℃で冷却。OCR産品を37℃において1〜2μlのDpnI(Roche社)で1〜3時間処理した。DpnI処理したPCR産品5μlを、0.8% E-gel (Invitrogen社)上で可視化した。各PCR産品1μlを、化学的コンピテント E. coli Top 10細胞(Invitrogen社) 中に形質転換した(製造者の取扱説明書に従って用いた)。カナマイシン含有量が50μg/mlのLB培地(Kan50)上で形質転換体を選択し、37℃で一夜培養した。各形質転換体から5つのコロニーを選択して、3mlの液状LB Kan50培地において静止期まで培養した。QIAPrep Spinミニプレップキットを製造者の取扱説明書に従って用いてプラスミドを精製した。精製したプラスミドを、T7 Forward及びReverseプライマーを用いてシーケンシングし(Quintara Biosciences社による)、親配列との比較により各切断位置を確認した。得られたプラスミド(pDu47-3からpDu50- 4, Table 14-2参照)を、化学的コンピテントE. coli BL21(DE3) pLysS (Invitrogen社)中に、製造者の取扱説明書に従って形質転換した。Table 14-3に、切断IspS酵素の発現に用いた株を示す。
【０３２５】
37℃で一夜培養した後、各コロニーを、それぞれに500μlの液状LB Kan50 CM35培地を入れた96-ウエルディープウエルマイクロタイタープレート(VWR)の各ウエルに植菌した。次にマイクロタイタープレートを半透過性膜(Breathe-Easier, Diversified Biotech)でシールし、振蕩インキュベータ(Vertiga社)を用いて30℃で一夜培養した。翌日、96-ウエルプレートの各ウエルのサンプル100 μlに、新しい200 μl 96-ウエルプレートを用いて50 μlの50%グリセロールを添加混合し、次に分析するまで-80℃で凍結した。このプレートを用いて、実施例13に示した方法でDMAPPアッセイを行った。Table 14-4はに全サンプルの平均比活性度を示す。図69はこのデータをグラフ化した図である。
【０３２６】
実施例13に示した方法により、DMAPP活性測定とタンパク質の定量を行った。
【０３２７】
比活性度は、イソプレン産出(μg/l)に0.00776を掛け、次にタンパク質濃度(mg/ml)で割って求めた。この係数(0.00776)は、シールされた2 ml GCバイアルの全ヘッドスペース容積 (1.9 ml)、溶解物の容積(80μl)、DMAPPアッセイの時間(45分間) 、及びイソプレンの分子量から計算して求めた。すなわち、比活性度の単位はnmolイソプレン/mg IspS/分である。 
【表２４】
2014158489.tif 000053
【表２５】
2014158489.tif 000054
【表２６】
2014158489.tif 000055
【表２７】
2014158489.tif 000056
【０３２８】
Table 14-5に示す株を用いて、2回目の実験を行った。コントロールにはP. alba pET24a (全長P. alba IspS)を有するBL21 DE3 pLysSを用いた。
【表２８】
2014158489.tif 000057
【０３２９】
＜結果＞
P. alba IspSの全ての形質転換体、及びP. tremuloides and P. trichocharpa由来の2種の形質転換体を、DMAPPアッセイ及びウエスタンブロット定量分析により並行して分析し、比活性度を比較した。1の変異体について少なくとも2件のサンプルについて、イソプレン産出とIspSの量(mg/ml)を分析した。変異体MD09-174は少量のイソプレンしか産出せず、少量のタンパク質しか産出しなかったが、高い比活性度を示した。MD09-173, MD09-176, 及びMD09-197-3も高い比活性度を示した(Table 14-6及び図70参照)。最も多量のタンパク質量(μg)である、全3μgのタンパク質がMD09-176及びMD09-197-3により示された。これは、これらの変異体がより有効にE. coli BL21 DE3宿主細胞中で発現されたことを示している。
【表２９】
2014158489.tif 000058
【０３３０】
＜実施例１５＞
＜三次元構造測定用構築体＞
＜I.  pMAL-C4X Kudzuの構築＞
E. coliのコドン最適化され、Kudzu vine (プエラリア・ロバタ(Pueraria lobata))のイソプレンシンターゼ(IspS)をコードする合成遺伝子をDNA2.0社 (Menlo Park, CA)から購入し、プラスミドp9795 (図71 及び72)として用いた。挿入体をBspLU11I/PstIで消化して除去し、ゲル精製し、NcoI/PstI-消化された pTrcHis2B (Invitrogen社, Carlsbad, California)中に形質転換した。得られたプラスミドをpTrcKudzu と命名した(図73: pTrc Kudzuのマップ)。終止コドンはPstI部位の前にある。このため、構築体中において、His-TagはIspSタンパク質に結合していない。
【０３３１】
E. coliコドン最適化Kudzu遺伝子を増幅するためのPCR反応を、DNAテンプレートとしてのプラスミドpTrcKudzu、プライマーEL-959及びEL-960、10mM dNTP (Roche社, Indianapolis, IN)、及びPfu Ultra II Fusion DNAポリメラーゼ(Stratagene社, La Jolla, CA)を用いて、製造者の取扱説明書に従って行った。PCR条件は次の通りであった：95℃で2分間 (１回目のサイクルのみ), 95℃で25秒間、60℃で25秒間、72 ℃で30秒間のサイクルを28回繰り返し、最終伸長を72℃で1分間行った。次に、QIAquick PCR Purification キット(Qiagen Inc社, Valencia, CA)を用いてPCR産品を精製した。
【０３３２】
Kudzu PCR産品(1 μg)を、EcoRI及びHindIII制限エンドヌクレアーゼ (Roche社)を製造者の取扱説明書に従って用いて消化した。Kudzu遺伝子中にある内部EcoRI部位の消化を最小限にするため、消化物を37℃で30分間インキュベートした。消化したPCR産品をQIAquick PCR Purificationキットを用いて精製した。ベクターpMAL-C4X (0.5 μg) (New England Biolabs, Ipswich, MA; 図75及び76)をEcoRI及びHindIII制限エンドヌクレアーゼ (Roche社)を製造者の取扱説明書に従って用いて消化した。消化したベクターをQIAquick PCR Purificationキットを用いてゲル精製した。DNA結紮反応を、消化したKudzu PCR産品と消化したpMAL-C4Xベクターとの比を5:1にし、T4 DNAリガーゼ(New England Biolabs社)を用いて製造者の取扱説明書に従って行った。結紮反応物から少量のサンプルを採取し、TOP10 化学的コンピテント細胞(Invitrogen Corp)中に形質転換した。形質転換体を、LA + 50 μg/μlカルベニシリンのプレート上で選択した。
【０３３３】
コロニーを採取し、PuReTaq Ready-To- Go PCRビーズ(GE Healthcare,社 Piscataway, NJ)を製造者の取扱説明書に従って用いて、プライマーEL-957及びEL-966によるPCRを行うことにより、Kudzu遺伝子を含む形質転換体のスクリーニングを行った。次のPCR条件を用いた：95℃で2分間 (１回目のサイクルのみ), 95℃で30秒間、50℃で30秒間、72 ℃で40秒間のサイクルを28回繰り返し、最終伸長を72℃で1分間行った。次に、PCR産品を2% E-ゲル(Invitrogen Corp)上で分析し、600 bpの断片を検索した。正しいサイズの挿入対を有するPCR産品を、プライマーEL-950, EL-951, EL-953, 及びEL-957を用いたDNAシーケンシングに供した。DNAシーケンシングにより、プラスミドpMAL-C4X Kudzu(図77〜79)の構造を確認した。
【表３０】
2014158489.tif 000059
【０３３４】
プラスミドpMAL-C4X KudzuをOneShot BL21 (λDE3)化学的コンピテント細胞(Invitrogen Corp)中に形質転換した。発現株形質転換体をLA + 50 mg/mlカルベニシリンのプレート上で選択した。
【０３３５】
＜II.  結晶構造分析用のIspS変異体＞
この実施例では、発現、精製、及び結晶化のための親和性標識されたイソプレンシンターゼ(IspS)酵素を調製する方法について説明する。
【０３３６】
＜株の構築＞
pET200D-TOPOベクター(Invitrogen社)中に組み込むため、P. alba, P. tremuloides, and P. trichocharpa由来IspS酵素のPCR産品を、0.8% E-ゲル(Invitrogen)を製造者の取扱説明書に従って用いてゲル抽出して精製(Qiagen社)した。pET200構築のPCR反応は次のようにして行った。反応液の組成は、1μl (テンプレート)-pET24a-P.alba, 5μl 10X PfuUltraII Fusion緩衝液, 1μl dNTP's (10 mM), 1μl プライマー (50uM)プライマー F-(MCM219 または 218), 1μl プライマー (50uM) プライマー R-(MCM182), 41μl diH2O、及び 1μl のStratagene 社製PfuUltra II Fusion DNA ポリメラーゼであった。サイクル条件は、Eppendorf Mastercyclerを用いて、95℃で1分間、95℃で1分間、55℃で20秒間、72℃で27秒間のサイクルを29回、次に72℃で3分間、その後4℃で冷却した。同様の反応をP. tremuloides, P. trichocarpa, 及びKudzuについても行った。精製した産品3 μlを、製造者の取扱説明書に従ってpET200D/TOPOベクター(Invitrogen)中に結紮した。反応物を室温で5分間インキュベートし、6μlのトポイソメラーゼ混合物をE. coli Top 10化学的コンピテント細胞(Invitrogen)中に製造者の取扱説明書に従って形質転換した。形質転換体をLB Kan50上で選択し、37℃で一夜培養した。1の構築体について5つのコロニーを選び出し、T7 Forward及びMCM 182 プライマー(Table 15-2)を用い、PuReTaq Ready-To-Go PCRビーズ(Amersham社)を用いてスクリーニングした。正しいサイズの挿入体を有するクローンについてQIAPrep Spin Miniprepキット(Qiagen)を用いたプラスミドミニプレップを行い、次にT7 Forward及びT7 Reverse プライマー(Quintara Biosciences社)を用いたシークエンシングを行うことにより、さらに検証した。各IspS変異体(下記及び配列/図79〜90参照)から、完全なシークエンシングを行った1の構造体を選び出し、さらに分析した。1μlの各プラスミドを、BL21(λDE3) pLysS (Invitrogen)中に製造者の取扱説明書に従って形質転換した。形質転換体を、Kan50 + Cm35を含むLB培地上で選択し、37℃で一夜培養した。得られた株からIspS酵素変異体を発現させて精製し、結晶学的分析を行った。
【０３３７】
N-末端6His-標識IspSプラスミド、株の構築、及び精製方法は、実施例11に記載されている。
【表３１】
2014158489.tif 000060
【表３２】
2014158489.tif 000061
【表３３】
2014158489.tif 000062
【０３３８】
＜III.  TEV(タバコエッチングウイルス (Tobacco Etch Virus))またはEK (エンテロキナーゼ)-標識酵素の消化＞
＜TEV切断(MD09-165及びMD09-167株由来IspS)＞
MD09-165及びMD09-167株は実施例11に記載されている。消化を行うために、これらの酵素をNiチャージセファロース(GE Healthcare社)により精製し、1 mM DTTを含む50 mM HEPES, 50 mM NaCl, pH 7.4の緩衝液中で脱塩した。消化は、Eton Bioscience Inc社製TurboTEVプロテアーゼを用いて行った。精製した酵素10μgについて1単位のTurboTEVを用いた。消化は40℃で一夜行った。サンプルをNi緩衝液で平衡にした別のNiカラムに通して、未切断酵素、標識、TurboTEVプロテアーゼ(これも標識されている)、及び不純物を除去した。Niカラム通過物と洗浄液を、SDS-PAGEゲル(NUPAGE, Invitrogen)及びDMAPP活性アッセイにより分析した。純粋な酵素を含むサンプルを貯留し、1 mM DTTを含む50 mM NaCl pH 7.4緩衝液中で脱塩し、-80℃で保管した。
【０３３９】
＜EK切断（MD08-102 及びMD08-104株由来IspS＞
消化を行うために、これらの酵素をNiチャージセファロース(GE Healthcare社)により精製し、1 mM DTTを含む50 mM HEPES, 50 mM NaCl, pH 7.4の緩衝液中で脱塩した。
【０３４０】
消化は、EKMax (El 80-02) (Invitrogen)により行い、20 μg の精製したタンパク質に対し1単位のEKMaxを用いて、4℃で一夜行った。過剰なエンテロキナーゼを除去するために、サンプルをEK Away樹脂 (Invitrogen)に通した。サンプルをNiチャージセファロース樹脂(Ni洗浄緩衝液で平衡化)に回分注入し、4℃で30分間、時々反転させながらインキュベートした。この操作により、未切断酵素、標識、及び不純物を除去した。Niカラム通過物と洗浄液を、SDS-PAGEゲル(4-12% NUPAGE, Invitrogen)及びDMAPP活性アッセイにより分析した。純粋な酵素を含むサンプルを貯留し、1 mM DTTを含む50 mM HEPES, 50 mM NaCl pH 7.4緩衝液中で脱塩し、-80℃で保管した。
【０３４１】
＜IV.   MBP-IspSの精製＞
上記のようにして、MBP-Kudzuイソプレンシンターゼを発現させるためのpMAL-C4X Kudzuを構築した。E. coliからのMBP-Kudzuイソプレンシンターゼの産出は、15-Lスケールのバッチ培養で行った。
【０３４２】
＜培地の組成(発酵培地1リットル当たり)＞
K2HPO4 7.5 g, MgSO4 * 7H2O 2 g, クエン酸一水和物2 g, クエン酸第二鉄アンモニウム0.3 g, 酵母エキス 0.5 g, 1000X Modified Trace Metal溶液 1 ml。
全ての成分をdiH2O中に一度に投入して溶解させた。この溶液をオートクレーブで処理した。水酸化アンモニウム(30%)でpHを7.0に調整し、定容した。滅菌処理とpH調整後、グルコース10 g, チアミン* HCl 0.1 g, 及び 抗生物質を添加した。
【０３４３】
＜1000X Modified Trace Metal溶液＞
クエン酸* H2O 40 g, MnSO4 * H2O 30 g, NaCl 10 g, FeSO4 * 7H2O 1 g, CoCl2 * 6H2O 1 g, ZnSO * 7H2O 1 g, CuSO4 * 5H2O 100 mg, H3BO3 100 mg, NaMoO4 * 2H2O 100 mg。
各成分を一度にdiH2O中に投入し、HCl/NaOHでpHを3.0に調整し、定容した後、0.22ミクロンのフィルターで濾過滅菌した。
【０３４４】
発酵は、15-Lバイオリアクター中で、マルトース結合タンパク質 (MBP)-Kudzuイソプレンシンターゼ融合分子を発現するpMAL-C4Xプラスミドを含むBL21 (DE3) E. coli細胞を用いて行った。この実施例では、所望の発酵条件であるpH 7.0及び30℃でイソプレンシンターゼを産出させた。バイアル中で凍結させたE. coli株を解凍し、トリプトン-酵母エキス培地に植菌した。植菌後、550 nm(OD550)で測定したODが1.0になるまで成長させ、120 mLを用いて15-Lバイオリアクターに植菌し、初期容積を9Lにした。
【０３４５】
イソプロピル-β-D-1- チオガラクトピラノシド (IPTG)を添加して所望の分子を発現させた。OD550が10に達したとき、IPTGの濃度を1 mMにした。IPTGを添加してから3時間後に、所望の製品を含む細胞を集菌した。
【０３４６】
＜MBP-IspSの精製＞
培養物を10000 x gで15分間遠心分離した。ペレットを回収し、さらに精製するまで、-80℃で凍結させておいた。細胞をMBP-Bind 緩衝液(5% グリセロール, 20 mM Tris pH 7.4, 200 mM NaCl, 2 mM DTT, 1mg/mlリゾチーム)中に再懸濁させ、20000 psiのフレンチプレスで3回処理した。溶解物を100000 x gで1時間超遠心分離して、比較的透明な溶液を得た。遠心分離チューブの上部から、遠心分離チューブの底部のゼラチン状物質を舞い上げないようにして、上清をピペットで採取した。Superdex-200 26/60 カラム(GE healthcare社)を用いて、上清をゲル濾過した。23℃で流量が3 mL/分のMBP-Bind緩衝液によりカラムを展開した。各分画について、下記のようにしてDMAPP活性を評価した。活性な分画を貯留して、25 mLのアミロース樹脂(New England Biolabs)に通した。カラムを10カラム容量のMBP-Bind緩衝液で洗浄した後、10 mMマルトースを含むMBP-Bind緩衝液を2カラム容量用いてタンパク質を流出させ、純度>90%のMBP-IspSを得た。
【０３４７】
＜V.   DMAPPアッセイ＞
次の反応混合液をDMAPPアッセイに用いた。25 μL の溶解物混合物, 5 μLのMgCl2 (1 M), 5 μLの DMAPP (100mM), 及び 65 μLの100 mM Tris pH 8, 100 mM NaCl から成り、全容積が100 μL。反応は、気密1.8 mL GCチューブ中で、30℃において15分間行った。100 μLの500 mM EDTA (pH 8)を添加して反応を停止させた。上記のようにして、イソプレン産出量をGC/MSにより測定した。
【０３４８】
＜実施例１６＞
＜IspSの三次元構造＞
X線回折分析に適した結晶を得るために、植物性イソプレンシンターゼ(IspS)の7種の構築体を調製した。これらは、N-末端ヒスチジン標識マルトース結合タンパク質及びkudzu IspS (MBP-kudzu)を含む構築体、N-末端ヒスチジン標識を有する全長P. alba IspS(MD08-99)、最初の19のN-末端残基が除去されたP. alba IspS(MD08-100)（この構築体は精製後除去されるN-末端ヒスチジン標識を備えていた）であった。また、全長未標識P. alba IspS (strain RM11608-2)であった。ツインアルギニンモチーフの前に追加の残基を2つ有する切断P. alba IspS構築体を調製した(MD09-167)。 N-末端ヒスチジン標識とN-末端切断の両者を備えるP. tricharpa IspSを調製した(MD08-104)。また、P. tremuloides由来のIspSから成り、N-末端ヒスチジン標識とN-末端切断を備える別の構築体を調製した(MD08- 102)。種々のイソプレンシンターゼを発現する株の構築方法は、上記に示した。
【０３４９】
各構築体を精製し、結晶化条件を検討するために、濃縮タンパク質溶液を調製した。各構築体をそれぞれ別個に精製し、下記のようにして検討した。全ての社内での結晶化スクリーニングは、懸垂液滴蒸気拡散法(hanging drop vapor diffusion method)を用いて行った。少なくとも、各構築体について次の市販のスクリーニング試薬で検討した： Hampton Research社 (Aliso Viejo, CA)製のCrystal Screen、及びQiagen社 (Valencia, CA) 製のJCSG+ Suite。
【０３５０】
使用した精製MBP-kudzuは、次の市販のスクリーニング試薬を用いて行った： Hampton Research社のCrystal Screen、及びJCSG+ Suite。さらに、精製したMBP-kudzuをHauptman- Woodward Institute (Buffalo, NY)へ送り、高速スクリーニングを行うとともに、少なくとも1536種の条件を検討した。精製したMBP-kudzu融合体は殆どの条件で溶液から沈殿し、タンパク質の結晶は観察されなかった。
【０３５１】
結晶化スクリーニングに用いた次の構築体は MD08-99 (N-末端ヒスチジン標識を有する全長P. alba IspS)であった。MD08-99を精製し、ヒスチジン標識を除去した。MBP-kudzuについて、同じ3回のイニシャル結晶化スクリーニングを行った。Hampton Research Crystal Screen及びQiagen JCSG+ Suiteのそれぞれについて、複数のタンパク質濃度で検討した。いくつかのHampton Research Crystal Screenによるスクリーニング条件で、小さな針状結晶が認められた。結晶を更に改善するための検討には、IspS阻害剤イバンドロネート(ibandronate)ナトリウム(Sigma- Aldrich社, St Louis, MO)との共結晶化が含まれていた。pH、濃度、結晶化試薬を変化させて、さらに全部で288の結晶化条件を検討した。データ採取のために、9種の最もよい結晶を調整し、社内でRigaku RU200回転アノード線源及びR-AXIS IV++により試験した。これらの結晶はX線の回折を生じず、また結晶塩ではなかった。
【０３５２】
P. alba IspSのN-末端の最初の19残基を除去してMD08-100構築体を調製した。この構築体は、精製後に除去されるN-末端ヒスチジン標識を有していた。社内での結晶化スクリーニングを、Hampton Research Crystal Screen 及びQiagen JCSG+ Suiteのそれぞれについて、複数のタンパク質濃度において行った。最初にヒットした結晶には、社内のX線源を用いたときに、X線回折における分解能が16Åの六角板状結晶と、X線回折における分解能が5Åの小ロッド状結晶とが含まれていた。結晶化を更に改善するために、いずれもIspS活性の阻害剤であるイバンドロネートナトリウム、またはピロホスフェートナトリウム(Sigma-Aldrich, St Louis, MO)と、MD08-100とを共結晶化させた。いずれの阻害剤でも、結晶及びX線回折は改善されなかった。pH、濃度、結晶化試薬を変化させて、さらに168の結晶化条件を検討した。可能性の高い21種のMD08-100結晶についてのX線回折のスクリーニングにより得られた最もよい分解能は5Åであった。
【０３５３】
発酵により得られた未標識全長 P. alba IspS (RM11608-2株)を精製した。Hampton Research Crystal Screenを用いてイニシャルスクリーニングを行った結果、4種の条件下で結晶が認められた。4種の結晶全てについて、社内でX線回折試験を行った結果、3種は結晶塩であり、1種はX線回折が認められなかった。
【０３５４】
ツイン-アルギニンモチーフの前に追加の2残基を有する切断P. alba IspS構築体を調製した(MD09-167)。この構築体には、C-末端ヒスチジン標識が含まれており、結晶化の実験は、標識を切断または切断せずに行い、タンパク質濃度を変化させ、ピロホスフェートナトリウムを使用または使用せずに行った。イニシャル結晶化スクリーニングは、MBP-kudzuと同様にして行った。この構築体の結晶は、多くの条件下で認められた。528種のpH, 沈殿剤、濃度、及び阻害剤の組み合わせにより条件を最適化した。最適化実験に基づき、15種のMD09-167結晶について、社内でX線回折のスクリーニングを行った。分解能を改善するために種々の結晶凍結条件を試した結果、回折限界が10Åから6.5Åに改善された。
【０３５５】
P. tricharpa IspSを含み、N-末端ヒスチジン標識及びN-末端切断の両者を備える新たな構築体 (MD08-104)を調製した。ヒスチジン標識を切断して精製したMD08-104を、Hampton Research Crystal Screen 及びQiagen JCSG+ suiteを用いて評価した。この構築体はP. alba IspS構築体よりも沈殿が激しかった。極少量の針状結晶が認められたが、いずれの結晶もX線回折に適していなかった。
【０３５６】
N-末端ヒスチジン標識及びN-末端切断を有し、P. tremuloides由来のIspSから成る別の構築体を調製した(MD08-102)。ヒスチジン標識切断または非切断の精製したMD08-102をHampton Research Crystal Screen及びQiagen JCSG+ Suiteを用い、タンパク質濃度を変化させて評価した。いくつかの条件下でロッド状及びプレート状の結晶が認められた。結晶化を改善するため、pH、濃度、結晶化試薬を変化させて、さらに120の条件を検討した。最適化実験から、10種の結晶を社内で分析したところ、最初の最もよいX線回折は5Åであった。結晶の凍結条件をさらに改良した結果、X線回折が3.3Åのヒスチジン標識非切断の結晶を見出した。この結晶を、2μLのタンパク質(10 mg/ml, with 30mM MgCl2)に、2μLの沈殿剤溶液 [10% (wt/vol) ポリエチレングリコール8000, 0.1 M HEPES, pH 7.5, 8%エチレングリコール]を混合し、500μL の沈殿剤に対し平衡にすることにより成長させた。3週間後に、ロッド状結晶の集合体が得られた。この結晶は、正方晶空間群P43212に属し、格子定数はa = 154.2, b = 154.2, c = 142.7であった。
【０３５７】
社内でのX線回折データは、Rigaku RU200線源とR-AXIS IV++検出器を用いて、窒素気流下において100Kで採取した。液体窒素中で結晶を急速冷凍する前に、結晶を10% (wt/vol)ポリエチレングリコール 8000, 0.1 M HEPES, pH 7.5, 及び25%エチレングリコールを含む溶液に通して、凍結防止処理した。データをMosflm (Leslie, A. (1998) J. of Appl. Crystallography 30, 1036- 1040) を用いて積算し、SCALA (Collaborative Computational Project, N. (1994) Acta Crystallographica Section D 50, 760-763) を用いて測定した。得られたデータを、リモネンシンターゼのモノマー (Protein Data Bank ID 2ONH)(Berman, H., et al. (2007) Nucl. Acids Res. 35, D301-303) を開始モデルとして用い、MrBUMP (Keegan, R. M., and Winn, M. D. (2007) Acta Crystallographica Section D 63, 447-457; Vagin, A., and Teplyakov, A. (1997) J. of Appl. Crystallography 30, 1022-1025) を用いて、分子置換により位相を解析した。この結晶は非対称ユニットに1の二量体を含んでおり、溶媒含有量は66%であった。
【０３５８】
Stanford Synchrotron Radiation Laboratoryのビームライン11-1を用いて、この結晶の3.05Åのデータセットを収集した。これらのデータも、Mosflm 及び SCALAにより解析した。収集したデータと精密化統計値をTable 16-1に示す。
【０３５９】
Refmac5 (Collaborative Computational Project, N. (1994) Acta Crystallographica Section D 50, 760-763) による精密化を、可視化プログラムCoot (Emsley, P., and Cowtan, K. (2004) Acta Crystallographica Section D 60, 2126-2132) を用いた反復マニュアル・リビルディングステップを利用して行った。精密化において、タンパク質の形状をMolprobity (Davis, I. W., et al. (2007) Nucl. Acids Res., gkm216)によりチェックした。
【０３６０】
ポプラIspSの折り畳み構造は、ボルニルジホスフェートシンターゼ(Whittington, D. A., et al. (2002) Proc. Natl Acad. Sci. USA 99, 15375-15380)、リモネンシンターゼ(Hyatt, D. C, et al. (2007) Proc. Natl Acad. Sci. USA 104, 5360-5365)、及びタバコ5-エピ-アリストロケンシンターゼ (Starks, C. M., et al. (1997) Science 277, 1815-1820)と同様である。この折り畳み構造は、2つのらせん状ドメインと、活性部位を含むC-末端ドメインと、N-末端ドメイン(図90及び91)とから成る。タンパク質座標をTable 16-7に示す。
【表３４】
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【０３６１】
＜フレキシブルループ＞
イソプレンシンターゼの三次元構造の解析から、活性部位を形成するいくつかの重要なループがフレキシブルであるという、ユニークで予想外の知見が得られた。この知見は、イソプレンシンターゼの構造を、公知の他のテルペンシンターゼの構造と比較すれば直ちに理解できる(図94)。全体的に、この構造は二次構造と結合性ループのコンフォメーションにおいて、高度に保存されている。(このP.tremTRC-pET200構築体由来Poplar tremuloides IspSの例では、番号付与方法は、IspSの最初の残基を1とし、標識を含む完全配列の最初の番号を35とした。) しかし、基質結合ポケットの大部分を形成する3つのセグメント、特に切断N-末端は、残基438-453 (Loop I) 及び残基 512-527 (Loop II) から成る2つのループとともに、枝分かれしているように見える (図95から97)。これは、構造解析に用いた酵素に基質が結合していないためと考えられる。
【０３６２】
例えばこの酵素とBdpSとの比較から、残基498-513及び573-587から成るループは同じ数の残基から成り、相同性を有するが、これらの領域のアミノ酸配列は同一ではないことを見出した。関連するテルペンシンターゼについてその構造を詳しく調べれば、そのセグメントが同様のフレキシビリティを示すことが見出されると予想される。これらの可変ループ領域に対応するテルペンシンターゼの残基を、Table 16-2に示す。
【表３５】
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【０３６３】
この重要な知見は、改良されたイソプレンシンターゼの組換えに、直ちに利用できる。フレキシビリティを利用して、これらのセグメントを構成するアミノ酸を置換して基質が結合するとき酵素に生じる変形を促進し、さらに、DMAPPをイソプレンに転換する際に電子移動させるために生じ、酵素脱リン酸化中に生じると考えられる様々な速度論的段階における酵素の再配置を可能にして、酵素の性能を向上させることができる。
【０３６４】
この構造により、これらのループは少なくとも2つのコンフォメーションを取るという新たな知見が得られる。すなわち、複合化していないイソプレンシンターゼに見られるような基質が無いときの「オープン」型と、基質が結合したときの「クローズド」型、または活性型の2つのコンフォメーションである。従って、活性型のときループと接触する、Table 16-3に示す残基を修飾することも有効と考えられる。
【表３６】
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【０３６５】
＜植物性イソプレンシンターゼを改良するための部位の選定＞
植物性イソプレンシンターゼは、テルペンシンターゼと相同であると予想される。次の3種の相同性テルペンシンターゼの三次元構造は公知である：ボルニル・ジホスフェート・シンターゼ(Salvia officinalis bornyl diphosphate synthase) (BdpS; pdb entry 1NlB), メンタ・スピカタ・リモネン・シンターゼ(Mentha spicata limonene synthase) (LS; pdb entry 2ONG),及びタバコ5-エピ-アリストロケン・シンターゼ (tobacco 5-epi-aristolochene synthase) (TEAS; pdb entry 5EAS)。これらの酵素の相同性は33%に過ぎないが、三次構造は保存されている。Table 16-4に配列同一性を示し、Table 16-5に各構造間の構造相同性を示す。さらに、これら3種の酵素の中間複合体の構造から、三次折り畳み構造だけでなく、これらの酵素の活性部位の詳細な相互作用も高度に保存されていることが示された。
【表３７】
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【表３８】
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【０３６６】
このP.tremTRC-pET200構築体由来のPoplar tremuloides IspSの例では、番号付与方法は、IspSの最初の残基を1とし、標識を含む完全配列の最初の番号を35とした。
【０３６７】
BdpS構造の活性部位と、poplar IspS構造の活性部位との比較から、金属イオン結合及びホスフェート認識に関与する活性部位が保存されていることが示された。特に、poplar IspS のArg 255, Asp 292, Asp 296, Glu 370, Arg 433 及びAsn 436は、BdpS中の同等の残基とオーバーラップすることが認められた。また、BdpSの中間体のポジショニングをpoplar IspS構造と比較した。これにより、類似する結合部位と、ジメチルアリルピロホスフェートがpoplar IspS酵素に結合して反応するために必要な接近方向を特定することができた。
【０３６８】
poplar IspSの構造に基づき、性能が改良されたIspS酵素変異体を産出するための突然変異誘発の対象としての、poplar IspS中の部位を特定した。簡潔にいうと、金属結合、ジホスフェート認識、DMAPP鎖結合の相互作用、および／または活性部位へのアプローチを変化させ得る、IspS中の部位を選択した。
【０３６９】
＜I.   ジホスフェート/金属結合部位＞
金属結合およびジホスフェート結合側鎖の近傍にあるpoplar IspSのアミノ酸残基の側鎖を特定した。このような残基には、Asp 293, Tyr 385, Ser 392, 及びAsp 437が含まれていた。これらの部位を組み換えることにより、酵素活性が向上すると考えられる。
【０３７０】
＜II.  基質接近ループ＞
poplar IspSの基質接近ループは、BdpS構造とは異なる位置にある。BdpS構造では、複数の残基が活性部位の上でカーブを描いている。poplar IspS構造に基質が結合したとき、同様の構造になると考えられる。このため、これらの残基440-453 及び512-524を含め、これらのループ中の残基はpoplar IspSの活性を変化させる位置にあると考えられる。poplar IspS酵素の場合、残基440-453の配列はSASAEIARGETANSで、残基512-524の配列はYHNGDAHTSPDELである。
【０３７１】
＜III.  イソプレン結合部位＞
BdpSの複合体、及び反応生成物のボルニルジホスフェート(PDB entry 1N24)を用いて、タンパク質組換えにより基質特異性および／または反応速度(基質及び生成物の取り込み及び放出速度の変化)の調節に使用可能なpoplar IspS構造中の残基を特定した。このような残基には、Ser 261, Trp 264, Phe 285, Thr 289, Ser 393, Ser 394, Phe 432, 及びTry 512が含まれていた。
【表３９】
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【表４０】
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【０３７２】
当業者にとって、この発明の範囲及び要旨から逸脱することなく本願に開示した方法及びシステムを種々変更及び修正できることは明らかであろう。この発明について好ましい実施形態に基づき説明したが、特許請求の範囲に係る発明は、本願に記載した実施形態により限定されない。この発明の実施に当って当業者にとって明白な実施形態の種々の変更もこの発明の範囲に含まれる。
【図１】
2014158489.tif 000214
【図２】
2014158489.tif 000215
【図３】
2014158489.tif 000216
【図４】
2014158489.tif 000217
【図５】
2014158489.tif 000218
【図６】
2014158489.tif 000219
【図７】
2014158489.tif 000220
【図８】
2014158489.tif 000221
【図９】
2014158489.tif 000222
【図１０Ａ】
2014158489.tif 000223
【図１０Ｂ】
2014158489.tif 000224
【図１１】
2014158489.tif 000225
【図１２Ａ】
2014158489.tif 000226
【図１２Ｂ】
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【図１３】
2014158489.tif 000228
【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
2014158489.tif 000231
【図１５】
2014158489.tif 000232
【図１６】
2014158489.tif 000233
【図１７】
2014158489.tif 000234
【図１８Ａ】
2014158489.tif 000235
【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１９】
2014158489.tif 000238
【図２０Ａ】
2014158489.tif 000239
【図２０Ｂ】
2014158489.tif 000240
【図２０Ｃ】
2014158489.tif 000241
【図２１】
2014158489.tif 000242
【図２２】
2014158489.tif 000243
【図２３】
2014158489.tif 000244
【図２４】
2014158489.tif 000245
【図２５】
2014158489.tif 000246
【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
2014158489.tif 000248
【図２６Ｃ】
2014158489.tif 000249
【図２７】
2014158489.tif 000250
【図２８Ａ】
2014158489.tif 000251
【図２８Ｂ】
2014158489.tif 000252
【図２８Ｃ】
2014158489.tif 000253
【図２９】
2014158489.tif 000254
【図３０Ａ】
2014158489.tif 000255
【図３０Ｂ】
2014158489.tif 000256
【図３０Ｃ】
2014158489.tif 000257
【図３１】
2014158489.tif 000258
【図３２Ａ】
2014158489.tif 000259
【図３２Ｂ】
2014158489.tif 000260
【図３２Ｃ】
2014158489.tif 000261
【図３３】
2014158489.tif 000262
【図３４Ａ】
2014158489.tif 000263
【図３４Ｂ】
2014158489.tif 000264
【図３４Ｃ】
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【図３５】
2014158489.tif 000266
【図３６】
2014158489.tif 000267
【図３７Ａ】
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【図３７Ｂ】
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【図３７Ｃ】
2014158489.tif 000270
【図３８】
2014158489.tif 000271
【図３９Ａ】
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【図３９Ｂ】
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【図３９Ｃ】
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【図４０】
2014158489.tif 000275
【図４１】
2014158489.tif 000276
【図４２】
2014158489.tif 000277
【図４３】
2014158489.tif 000278
【図４４】
2014158489.tif 000279
【図４５】
2014158489.tif 000280
【図４６】
2014158489.tif 000281
【図４７】
2014158489.tif 000282
【図４８】
2014158489.tif 000283
【図４９】
2014158489.tif 000284
【図５０】
2014158489.tif 000285
【図５１】
2014158489.tif 000286
【図５２Ａ】
2014158489.tif 000287
【図５２Ｂ】
2014158489.tif 000288
【図５２Ｃ】
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【図５３】
2014158489.tif 000290
【図５４Ａ】
2014158489.tif 000291
【図５４Ｂ】
2014158489.tif 000292
【図５４Ｃ】
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【図５５】
2014158489.tif 000294
【図５６Ａ】
2014158489.tif 000295
【図５６Ｂ】
2014158489.tif 000296
【図５６Ｃ】
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【図５７】
2014158489.tif 000298
【図５８Ａ】
2014158489.tif 000299
【図５８Ｂ】
2014158489.tif 000300
【図５８Ｃ】
2014158489.tif 000301
【図５９】
2014158489.tif 000302
【図６０Ａ】
2014158489.tif 000303
【図６０Ｂ】
2014158489.tif 000304
【図６０Ｃ】
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【図６１】
2014158489.tif 000306
【図６２Ａ】
2014158489.tif 000307
【図６２Ｂ】
2014158489.tif 000308
【図６２Ｃ】
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【図６３】
2014158489.tif 000310
【図６４Ａ】
2014158489.tif 000311
【図６４Ｂ】
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【図６４Ｃ】
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【図６５】
2014158489.tif 000314
【図６６Ａ】
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【図６６Ｂ】
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【図６６Ｃ】
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【図６７】
2014158489.tif 000318
【図６８Ａ】
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【図６８Ｂ】
2014158489.tif 000320
【図６８Ｃ】
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【図６９】
2014158489.tif 000322
【図７０】
2014158489.tif 000323
【図７１】
2014158489.tif 000324
【図７２Ａ】
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【図７２Ｂ】
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【図７３】
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【図７４Ａ】
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【図７４Ｂ】
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【図７４Ｃ】
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【図７５】
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【図７６Ａ】
2014158489.tif 000332
【図７６Ｂ】
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【図７６Ｃ】
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【図７７】
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【図７８Ａ】
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【図７８Ｂ】
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【図７８Ｃ】
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【図７８Ｄ】
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【図７９】
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【図８０】
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【図８１Ａ】
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【図８１Ｂ】
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【図８１Ｃ】
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【図８２】
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【図８３Ａ】
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【図８３Ｂ】
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【図８３Ｃ】
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【図８４】
2014158489.tif 000349
【図８５】
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【図８６Ａ】
2014158489.tif 000351
【図８６Ｂ】
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【図８６Ｃ】
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【図８７】
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【図８８Ａ】
2014158489.tif 000355
【図８８Ｂ】
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【図８８Ｃ】
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【図８９】
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【図９０Ａ】
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【図９０Ｂ】
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【図９０Ｃ】
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【図９１】
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【図９２】
2014158489.tif 000363
【図９３Ａ】
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【図９３Ｂ】
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【図９３Ｃ】
2014158489.tif 000366
【図９３Ｄ】
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【図９４Ａ】
2014158489.tif 000368
【図９４Ｂ】
2014158489.tif 000369
【図９５Ａ】
2014158489.tif 000370
【図９５Ｂ】
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【図９６Ａ】
2014158489.tif 000372
【図９６Ｂ】
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【図９７Ａ】
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【図９７Ｂ】
2014158489.tif 000375
【配列表】
2014158489000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成26年5月16日(2014.5.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロモータに作動可能に結合されたイソプレンシンターゼ変異体をコードする非相同ポリヌクレオチド配列を備える単離された宿主細胞であって、前記イソプレンシンターゼ変異体がSEQ ID NO: 120に示す配列を有するポプライソプレンシンターゼにおいて対応する位置の1以上のアミノ酸残基に1以上のアミノ酸置換を有し、前記アミノ酸置換がV10M, F12S, T15A, E18G, V58I, V58F, L70Q, L70R, L70V, L70T, T71P, V79L, E89D, G94A, S119F, F120L, G127R, E175V, T212I, S257A, R262G, A266G, F280L, N297K, F305L, L319M, E323K, A328T, D342E, A359T, K366N, E368D, L374M, S396T, V418S, K438N, H440R, T442A, I449V, A469S, K500R, K505Q, G507S, S509N, F511Y, 及びN532Kから成る群から選択され、前記変異体はアミノ酸置換を有していないイソプレンシンターゼ変異体よりもジメチルアリルジホスフェート(DMAPP)をイソプレンへより効率的に転換することができる、単離された宿主細胞。
【請求項２】
少なくとも1のアミノ酸置換がL70R置換である、請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項３】
少なくとも1のアミノ酸置換がG507S置換である、請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項４】
前記変異体が、G127R/F511Y, L70Q/G94A/R262G/F305L, F12S/T15A/E18G/N297K, S396T/T442I, V10M/E323K, F120L/A266G, K438N/K500R, V79L/S509N,  E175V/S257A/E368D/A469S, T71P/L374M, F280L/H440R, E89D/H440R,  V58F/A328T/N532K, S119F/D342E/I449V, 及びK366N/G507Sから成る群から選択される1以上のアミノ酸置換を有する、請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項５】
前記ポリヌクレオチド配列がプラスミド中に含まれている、請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項６】
前記ポリヌクレオチド配列が宿主細胞中の染色体に組み込まれている、請求項５に記載の宿主細胞。
【請求項７】
前記宿主細胞が、グラム陽性バクテリア細胞、グラム陰性バクテリア細胞、糸状菌類細胞、及びイースト細胞から成る群から選択される、請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項８】
前記宿主細胞が、エシェリキア(Escherichia)属(E. coli)、パントエア(Panteoa) 属 (P. シトレア(citrea) )、バシラス(Bacillus) 属(B. スブチリス(subtilis))、サッカロミセス（Saccharomyce）属、ヤロウイア(Yarrowia) 属(Y. リポリティカ(lipolytica))、及びトリコデルマ(Trichoderma) 属(T. レーシ(reesei))から成る群から選択される、請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項９】
前記宿主細胞が、グルコース、グリセロール、グリセリン、ジヒドロキシアセトン、酵母エキス、バイオマス、糖蜜、ショ糖、及びオイルからなる群より選択される炭素源を含有する培地を用いて培養される、請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項１０】
前記宿主細胞がさらに、イソペンテニルジホスフェートデルタイソメラーゼ（IDI）ポリペプチドをコードする非相同または天然の核酸、および／または、l-デオキシキシルロース-5-ホスフェートシンターゼ（DXS）ポリペプチドをコードする非相同または天然の核酸を備え、任意に天然の1-デオキシ-D-キシルロース5-ホスフェート（DXP）経路と組み合わされている、請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項１１】
前記宿主細胞がさらに、IDIポリペプチド及びDXSポリペプチドをコードする1以上の核酸を備える、請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項１２】
宿主細胞がイソプレンシンターゼ変異体、IDIポリペプチド及びDXSポリペプチドをコードする1のベクターを備える、請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項１３】
宿主細胞がさらに、サッカロミセス・セレビシア(Saccharomyces cerevisia) 由来のメバロン酸（MVA）経路ポリペプチド、及びエンテロコッカス・ファエカリス(Enterococcus faecalis)由来のMVA経路ポリペプチドから成る群から選択されるMVA経路ポリペプチドをコードする核酸を備える、請求項１２に記載の宿主細胞。
【請求項１４】
宿主細胞がさらにMVA経路ポリペプチド及びDXSポリペプチドをコードする1以上の核酸を備え、1のベクターがイソプレンシンターゼ変異体、MVA経路ポリペプチド及びDXSポリペプチドをコードする、請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項１５】
宿主細胞がさらにDXSポリペプチド、IDIポリペプチド、または1以上の残りのDXP経路ポリペプチド、及びMVA経路ポリペプチドをコードする１以上の核酸を備える、請求項１４に記載の宿主細胞。
【請求項１６】
宿主細胞がさらにMVA経路ポリペプチドをコードする１以上の核酸を備える、請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項１７】
宿主細胞がさらにIDIポリペプチドをコードする１以上の核酸を備える、請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項１８】
イソプレンを産出する方法であって、(a)イソプレン産出に適した培養条件下で請求項１に記載の宿主細胞を培養する工程と、(b)イソプレンを産出する工程とが含まれる方法。
【請求項１９】
さらに、(c)イソプレンを回収する工程が含まれる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
さらに、(d)イソプレンを重合する工程が含まれる、請求項１９に記載の方法。