(57)【要約】【課題】リグノセルロース系原料からエタノールを製造する方法において、生産効率の高いエタノール製造方法を提供する。【解決手段】リグノセルロース系原料を六炭糖発酵性微生物を用いて糖化発酵する一次糖化発酵工程、及び前記一次糖化発酵工程後の液体を五炭糖発酵性微生物を用いて発酵させる二次発酵工程、を有するリグノセルロース系原料からのエタノール製造方法において、二次発酵工程で用いる二次発酵槽の供給口へ供給される液体のグルコース濃度を０．５質量％以下に維持して二次発酵を行うこと、及び／又は前記一次糖化発酵工程で用いる一次糖化発酵槽の排出口から排出される培養液のグルコース濃度が１．０質量％以下になるような滞留時間で一次糖化発酵工程を行うことを特徴とするリグノセルロース系原料からのエタノール製造方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
リグノセルロース系原料を六炭糖発酵性微生物を用いて糖化発酵する一次糖化発酵工程、及び前記一次糖化発酵工程後の液体を五炭糖発酵性微生物を用いて発酵させる二次発酵工程、を有するリグノセルロース系原料からのエタノール製造方法において、二次発酵工程で用いる二次発酵槽の供給口へ供給される液体のグルコース濃度を０．５質量％以下に維持して二次発酵を行うこと、及び／又は前記一次糖化発酵工程で用いる一次糖化発酵槽の排出口から排出される培養液のグルコース濃度が１．０質量％以下になるような滞留時間で一次糖化発酵工程を行うことを特徴とするリグノセルロース系原料からのエタノール製造方法。
【請求項２】
前記二次発酵槽の供給口へ供給される液体のキシロース濃度を１〜８質量％に維持することを特徴とする、請求項１に記載のリグノセルロース系原料からのエタノール製造方法。
【請求項３】
前記二次発酵槽の排出口から排出された培養液を二次発酵槽の供給口へ循環させることを特徴とする、請求項１又は２に記載のリグノセルロース系原料からのエタノール製造方法。
【請求項４】
前記一次糖化発酵工程で用いる糖化発酵槽から排出された処理懸濁液を固液分離装置で固形分と液体分に分離する固液分離工程を有することを特徴とする、請求項１〜３の何れか１項に記載のリグノセルロース系原料からのエタノール製造方法。
【請求項５】
前記固液分離工程の前あるいは後にエタノール分離工程を有することを特徴とする、請求項４に記載のリグノセルロース系原料からのエタノール製造方法。
【請求項６】
前記五炭糖発酵性微生物がＰｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｈｉｈａｔａｅ、又はＰａｃｈｙｓｏｌｅｎ  ｔａｎｎｏｐｈｉｌｕｓから選ばれることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載のリグノセルロース系原料からのエタノール製造方法。
【請求項７】
前記五炭糖発酵性微生物がＰｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓであることを特徴とする、請求項１〜６の何れか１項に記載のリグノセルロース系原料からのエタノール製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リグノセルロースを含有するバイオマスから効率的にエタノールを製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
再生可能な資源であるバガスや稲わら、木材チップなどのバイオマス資源からエタノールを製造し、エネルギーや化学原料として利用する試みが国内外で進められている。
このようなバイオマス中の多糖類から発酵基質となる単糖や小糖類を製造する方法として酵素やその酵素を生産する微生物を用いて加水分解する酵素糖化法がある。これは、酵素分解により、バイオマスに含まれるセルロースやヘミセルロースが分解されて、グルコース、ガラクトース、マンノース等の六炭糖やキシロース、アラビノース等の五炭糖を生成することができる。
【０００３】
現在、工業的に用いられている酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）は、六炭糖を発酵することができるが、五炭糖を発酵する能力が低い。一方、五炭糖を発酵することができる酵母として、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓやＣａｎｄｉｄａ  ｓｈｉｈａｔａｅ等の酵母が知られているが、六炭糖発酵性酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）と比較し、六炭糖を生産する能力が低く、また、六炭糖と五炭糖が共存する培養液中では、六炭糖を資化してから五炭糖を資化するため、五炭糖をエタノールに変換するまでに時間を要するという問題がある。バイオマスの糖化処理により得られた糖化液に含まれる六炭糖だけでなく五炭糖も効率良くエタノールに変換することができれば、エタノール生産性を向上することができる。
【０００４】
前記問題を解決するために、バイオマスの酸処理またはアルカリ処理により得られた糖化液を六炭糖発酵性酵母を用いて一次発酵を行い、次に五炭糖発酵酵母を用いて二次発酵を行いエタノールを製造する方法が報告されている(特許文献１)。また、バイオマスの酸処理またはアルカリ処理により得られた糖化液を六炭糖用の培地で酵母を用いて一次糖化発酵を行い、次に五炭糖用の培地で酵母を用いて二次発酵を行いエタノールを製造する方法が報告されている(特許文献２)。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００４−３３７０９９号公報
【特許文献２】特開２００７−２０２５１７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、リグノセルロース系原料から得られた糖化液と六炭糖発酵性微生物とを用いて一次糖化発酵を行い、一次糖化発酵後の培養液と五炭糖発酵性微生物とを用いて二次発酵を行うエタノール製造工程において、効率的なエタノール生産方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意検討した結果、リグノセルロース系原料と六炭糖発酵性微生物とを用いて一次糖化発酵を行い、前記一次糖化発酵工程から排出される処理懸濁液と五炭糖発酵性微生物とを用いて二次発酵工程を行うリグノセルロース系原料からのエタノール製造方法において、二次発酵工程へ供給される培養液のグルコース濃度を０．５質量％以下に維持して二次発酵を行うことによりエタノールの生産性が向上し効率良くエタノールを生産することが可能となることを見出した。また、本発明者らは、一次糖化発酵工程で用いる糖化発酵槽の排出口から排出される培養液のグルコース濃度を１．０質量％以下になるような滞留時間で一次糖化発酵を行うことにより効率的なエタノール生産が可能となることを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。
【０００８】
即ち、本発明によれば以下の発明が提供される。
（１）リグノセルロース系原料を六炭糖発酵性微生物を用いて糖化発酵する一次糖化発酵工程、及び前記一次糖化発酵工程後の液体を五炭糖発酵性微生物を用いて発酵させる二次発酵工程、を有するリグノセルロース系原料からのエタノール製造方法において、二次発酵工程で用いる二次発酵槽の供給口へ供給される液体のグルコース濃度を０．５質量％以下に維持して二次発酵を行うこと、及び／又は前記一次糖化発酵工程で用いる一次糖化発酵槽の排出口から排出される培養液のグルコース濃度が１．０質量％以下になるような滞留時間で一次糖化発酵工程を行うことを特徴とするリグノセルロース系原料からのエタノール製造方法。
【０００９】
（２）  前記二次発酵槽の供給口へ供給される液体のキシロース濃度を１〜８質量％に維持することを特徴とする、（１）に記載のリグノセルロース系原料からのエタノール製造方法。
（３）  前記二次発酵槽の排出口から排出された培養液を二次発酵槽の供給口へ循環させることを特徴とする、（１）又は（２）に記載のリグノセルロース系原料からのエタノール製造方法。
【００１０】
（４）  前記一次糖化発酵工程で用いる糖化発酵槽から排出された処理懸濁液を固液分離装置で固形分と液体分に分離する固液分離工程を有することを特徴とする、（１）〜（３）のいずれかに記載のリグノセルロース系原料からのエタノール製造方法。
（５）  前記固液分離工程の前あるいは後にエタノール分離工程を有することを特徴とする、（４）に記載のリグノセルロース系原料からのエタノール製造方法。
【００１１】
（６）  前記五炭糖発酵性微生物がＰｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｈｉｈａｔａｅ、又はＰａｃｈｙｓｏｌｅｎ  ｔａｎｎｏｐｈｉｌｕｓから選ばれることを特徴とする、（１）〜（５）のいずれかに記載のリグノセルロース系原料からのエタノール製造方法。
（７）  前記五炭糖発酵性微生物がＰｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓであることを特徴とする、（１）〜（５）のいずれかに記載のリグノセルロース系原料からのエタノール製造方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、リグノセルロース系原料と六炭糖発酵性微生物とを用いて一次糖化発酵を行い、前記一次糖化発酵後の液体と五炭糖発酵性微生物とを用いて二次発酵を行うエタノール製造方法において、二次発酵工程で用いる二次発酵槽の供給口へ供給される液体のグルコース濃度を０．５質量％以下に維持して二次発酵を行うこと、及び／又は前記一次糖化発酵工程で用いる一次糖化発酵槽の排出口から排出される培養液のグルコース濃度が１．０質量％以下になるような滞留時間で一次糖化発酵工程を行うことにより効率良くエタノールを生産することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明のリグノセルロース系原料からのエタノールの連続生産方法を実施するための装置の一例を示す図である。
【符号の説明】
【００１４】
１：原料供給口
２：一次糖化発酵槽排出口
３：二次発酵槽供給口
４：二次発酵槽排出口
５：二次発酵液循環ライン
ＢＲ１：一次糖化発酵槽
ＢＲ２：二次発酵槽
Ｓ：固液分離装置
ＥＶ：減圧蒸留装置
Ｃ１：遠心分離機
Ｔ：培養液保管タンク
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明をさらに詳しく説明する。なお、本明細書に記載される材料、方法及び数値範囲などの説明は、当該材料、方法及び数値範囲などに限定することを意図したものではなく、また、それ以外の材料、方法及び数値範囲などの使用を除外するものでもない。
【００１６】
＜リグノセルロース系原料＞
本発明の方法で原料として使用するリグノセルロース系原料としては、木質系として、製紙用樹木、林地残材、間伐材等のチップ又は樹皮、木本性植物の切株から発生した萌芽、製材工場等から発生する鋸屑又はおがくず、街路樹の剪定枝葉、建築廃材等が挙げられ、草本系としてケナフ、稲藁、麦わら、コーンコブ、バガス等の農産廃棄物、油用作物やゴム等の工芸作物の残渣及び廃棄物（例えば、ＥＦＢ： Ｅｍｐｔｙ  Ｆｒｕｉｔ  Ｂｕｎｃｈ）、草本系エネルギー作物のエリアンサス、ミスカンサスやネピアグラス等が挙げられるが、特にこれらに限定されない。また、バイオマスとしては、木材由来の紙、古紙、パルプ、パルプスラッジ、スラッジ、下水汚泥等、食品廃棄物、等を原料として利用することができるが、特にこれらに限定されない。これらのバイオマスは、単独、あるいは複数を組み合わせて使用することができる。また、バイオマスは、乾燥固形物であっても、水分を含んだ固形物であっても、スラリーであっても用いることができる。
【００１７】
前記木質系のリグノセルロース系原料としては、特に限定するものではないが、ユーカリ（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ）属植物、アカシア（Ａｃａｃｉａ）属植物、ヤナギ（Ｓａｌｉｘ）属植物、ポプラ属植物、スギ（Ｃｒｙｐｔｏｍｅｒｉａ）属植物等が利用できる。ユーカリ属植物、アカシア属植物、ヤナギ属植物は、原料として大量に採取し易いためである。特に、ユーカリ属植物としては、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｇｌｏｂｕｌｕｓ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｐｅｌｉｔａ、アカシア属としては、Ａｃａｃｉａ  ｍａｎｇｉｕｍ、Ａｃａｃｉａ  ａｕｒｉｃｕｌｉｆｏｒｉｍｉｓ、アカシアハイブリッド（Ａｃａｃｉａ  ｍａｎｇｉｕｍとＡｃａｃｉａ  ａｕｒｉｃｕｌｉｆｏｒｉｍｉｓの交雑種）、ヤナギ属植物としては、Ｓａｌｉｘ  ｓｃｈｗｅｒｉｎｉｉを用いるのが好ましい。
木本性植物由来のリグノセルロース系原料の中では、林地残材（樹皮、枝葉を含む）、樹皮を用いるのが好ましい。例えば、製紙原料用として一般に用いられるユーカリ（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ）属又はアカシア（Ａｃａｃｉａ）属等の樹種の樹皮は、製紙原料用の製材工場やチップ工場等から安定して大量に入手可能であるため、特に好適に用いられる。
【００１８】
＜機械的処理＞
本発明では、前記リグノセルロース系原料に機械的処理を施すことが好ましいが、特に必須ではない。機械的処理としては、切断、裁断、破砕、磨砕等の任意の機械的手段が挙げられ、リグノセルロースを次工程の化学的処理工程で糖化され易い状態にすることである。使用する機械装置については特に限定されないが、例えば、一軸破砕機、二軸破砕機、ハンマークラッシャー、レファイナー、ニーダー、ボールミル等を用いることができる。
【００１９】
前記機械的処理の前工程又は後工程として、異物（石、ゴミ、金属、プラステック等のリグノセルロース以外の異物）を除去するための洗浄などによる異物除去工程を導入することもできる。
原料を洗浄する方法としては、例えば、原料に水を噴射して原料に混合されている異物を除く方法、あるいは、原料を水中に浸漬し異物を沈降させて取り除く方法等が挙げられる。また、メタルトラップ等の装置を用いて、異物を原料から分離する方法が挙げられる。
原料に異物が含まれていると、リファイナーのディスク（プレート）等の機械的処理で用いる装置の部品を破損させる可能性があるし、配管が詰まる等の製造工程内でトラブルを起こす等の問題が発生するため、異物除去工程を導入することが望ましい。
【００２０】
＜化学的処理＞
前記の機械的処理を施したリグノセルロース系原料に化学的処理を施すことが好ましいが、特に必須ではない。化学的処理としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、炭酸ナトリウム及び炭酸水素ナトリウムから選ばれる１種以上のアルカリ薬品、又は、亜硫酸ナトリウムと前記アルカリ薬品の中から選ばれる１種以上のアルカリ薬品を含有する溶液に浸漬する化学的処理を含む前処理である。また、オゾン、二酸化塩素などの酸化剤による化学的処理も可能である。
化学的処理は、前記機械的処理と組み合わせてそれらの前処理の後処理として行うことが好適である。
【００２１】
化学的処理で使用する薬品の添加量は、状況に応じて任意に調整可能であるが、薬品コスト低下の面から、またセルロースの溶出・過分解による収率低下防止の面から、リグノセルロース系原料の絶乾１００質量部に対して５０質量部以下であることが好ましい。化学的処理における薬品の水溶液への浸漬時間及び処理温度は、使用する原料や薬品によって任意に設定可能であるが、処理時間２０〜９０分、処理温度８０〜２００℃が好ましい。処理条件を厳しくすることで、原料中のセルロースの液側への溶出又は過分解が起こる場合もあるため、処理時間は７０分以下、処理温度は１８０℃以下であることが好ましい。
【００２２】
化学処理として、リグノセルロース系原料(乾燥重量)に対して１０〜７０質量％の亜硫酸ナトリウム及びｐＨ調整剤として０．１〜２０質量％のアルカリを添加することもできる。
前記の亜硫酸ナトリウムとｐH調整剤を用いる場合、リグノセルロース系原料（乾燥重量）に対する亜流酸ナトリウムの添加量は、１０〜７０質量％が好ましく、１０〜５０質量％がさらに好ましく、１０〜３０質量％が特に好ましい。一方、前記の亜硫酸ナトリウムとｐH調整剤を用いる場合、リグノセルロース系原料（乾燥重量）に対するｐH調整剤（アルカリ）の添加量は、０．１〜２０質量％が好ましく、０．１〜１０質量％がさらに好ましく、０．１〜１０質量％が特に好ましい。リグノセルロース系原料（乾燥重量）に対する亜流酸ナトリウムの添加量が７０質量％あるいはｐH調整剤の添加量が２０質量％を超えると薬品コストが上昇するため好ましくない。また、リグノセルロース系原料（乾燥重量）に対する亜流酸ナトリウムの添加量が１０質量％あるいはｐH調整剤の添加量が０．１質量％より低いとリグニン除去効果あるいはフルフラール低減効果が低下するため好ましくない。
【００２３】
リグノセルロース系原料に亜硫酸ナトリウムを前記の添加量で単独で添加して加熱処理すると、加水分解中に酢酸等の有機酸が生成するためｐＨの低下が起こり加水分解液が酸性となる。加水分解液が酸性の条件下で加水分解を継続すると加水分解で生成されたキシロースがフルフラールに変換するという問題が発生する。フルフラールは、エタノール発酵の阻害物質となるため可能な限り生成させないことが望ましい。また、発酵基質であるキシロースの収率が低下するため結果としてエタノール生産効率が低下する。本発明では、リグノセルロース系原料に前記の添加量で亜硫酸ナトリウム及びｐＨ調整剤としてアルカリを添加して加熱処理することにより、加水分解中のｐＨが中性〜弱アルカリ性に維持されるため、フルフラールの生成及びキシロースの収率低下を抑制することができる。また、加熱処理後(加水分解後)のリグノセルロースを含む水溶液のｐＨが４．０〜７．０(中性〜弱アルカリ性)となるため、加水分解処理後の廃液あるいは加水分解物を中和するための薬品の使用量を低減できるというメリットがある。
【００２４】
前記ｐＨ調整剤として用いるアルカリとしては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム等が挙げられるが、これらの薬品に特に限定されない。使用するアルカリは、水酸化ナトリウムが望ましい。
【００２５】
前記、リグノセルロース系原料(乾燥重量)に対して１０〜７０質量％の亜硫酸ナトリウム及びｐＨ調整剤として０．１〜２０質量％のアルカリを添加して加熱処理を行う場合の加熱処理温度は、８０〜２００℃が好ましく、１２０〜１８０℃がさらに好ましい。また、加熱処理時間は、１０〜３００分で行うことができるが、３０〜１２０分が好ましい。処理条件を厳しくすることで、原料中のセルロースの液側への溶出又は過分解が起こる場合もあるため、処理温度は、１８０℃以下、処理時間は１２０分以下であることが好ましい。
【００２６】
前記化学的処理により得られたリグノセルロース系原料を次工程で磨砕処理を施す前に化学的処理で使用した薬品を除去するためにリグノセルロース系原料を洗浄してもよい。洗浄方法としては、例えば、リグノセルロース系原料に洗浄水を添加しながら、洗浄ドレーナー等の洗浄装置、固液分離装置等で固形分と液体分に分離する方法が挙げられる。固液分離装置としては、スクリュープレス、フィルタープレス、ベルトプレス、ロータリープレス、ドラムフィルター、ディスクフィルター、スクリーン等が挙げられる。
【００２７】
（磨砕処理）
本発明では、特に必須ではないが、前記化学処理により得られたリグノセルロース系原料をレファイナーのディスク（プレート）のクリアランスを０．１〜２．０ｍｍの範囲で磨砕することが好ましく、０．１〜１．０ｍｍの範囲がさらに好ましく、０．１〜０．５ｍｍの範囲が特に好ましい。使用するレファイナーとしては、シングルディスクレファイナー、ダブルディスクレファイナー等を使用することができ相対するディスクのクリアランスを０．１〜２．０ｍｍの範囲に設定できるレファイナーであれば特に制限なく使用することができる。ディスクのクリアランスが２．０ｍｍを超えると糖化または糖化発酵で得られる糖収率が添加するため好ましくない。一方、ディスクのクリアランスが０．１ｍｍより低いとレファイナーで磨砕処理した後の加水分解物(固形分)の収率が低下するため好ましくない。また、ディスクのクリアランスが０．１ｍｍより低いとレファイナーの運転に要する電気消費量が増大するため好ましくない。
【００２８】
前記の磨砕処理が施されているリグノセルロース系原料を水溶液と固形分に固液分離し、固形分を糖化または糖化発酵の原料として用いる。固液分離する方法としては、例えば、スクリュープレス等を用いて水溶液と固形分に分離することができ、水溶液と固形分に分離することができる装置であれば制限なく使用することができる。
【００２９】
前記の固形分離後の原料を用いて糖化または糖化発酵を行う前に殺菌処理を行うことが好ましい。リグノセルロース系バイオマス原料中に雑菌が混入していると、酵素による糖化を行う際に雑菌が糖を消費して生成物の収量が低下してしまうという問題が発生する。
殺菌処理は、酸やアルカリなど、菌の生育困難なｐＨに原料を晒す方法でも良いが、高温下で処理する方法でも良く、両方を組み合わせても良い。酸、アルカリ処理後の原料については、中性付近、もしくは、糖化及び／又は糖化発酵工程に適したｐＨに調整した後に原料として使用することが好ましい。また、高温殺菌した場合も、室温もしくは糖化発酵工程に適した温度まで降温させてから原料として使用することが好ましい。このように、温度やｐＨを調整してから原料を送り出すことで、好適ｐＨ、好適温度外に酵素が晒されて、失活することを防ぐことができる。
【００３０】
前記の前処理が施されていてもよいリグノセルロース系原料は、一次糖化発酵工程へ供給される。
【００３１】
＜一次糖化発酵工程＞
一次糖化発酵工程で用いる六炭糖発酵性微生物は、六炭糖（グルコース、ガラクトース等）をエタノールに変換する微生物である。
酵素糖化反応に適した前処理が施されたリグノセルロース系原料は、適量の水と酵素と混合されて原料懸濁液とされ、さらに発酵性微生物（酵母、細菌等の微生物）と混合されて一次糖化発酵工程へ供給される。リグノセルロース系原料は酵素により糖化され、生成された六炭糖が六炭糖発酵性微生物によりエタノールに発酵される。一次糖化発酵工程は、糖化と発酵を同時に行う併行糖化発酵工程であっても良いし、糖化と発酵を別々に行う糖化工程及び発酵工程であっても良い。
【００３２】
図１に示すように、本発明の一例においては、一次糖化発酵槽ＢＲ１の排出口２から排出される培養液のグルコース濃度が１．０質量％以下、好ましくは０．０００００１〜１．０質量％、さらに好ましくは０．００００１〜１．０質量％、さらに好ましくは０．００００１〜０．５質量％になるように一次糖化発酵槽内での原料懸濁液の滞留時間（滞留時間＝培養槽の容量／流速：原料懸濁液が培養槽を通過する時間）を設定することが好ましい。
【００３３】
一次糖化発酵槽の排出口から排出される培養液のグルコース濃度を前記範囲にすることにより、一次糖化発酵工程の滞留時間を適切に設定でき、時間当たりのエタノール生産性が向上する。また、二次発酵槽ＢＲ２に移送される培養液に含まれるグルコース濃度が低減できるため、二次発酵において、グルコースによる五炭糖からエタノールの生産効率の低減が抑制できる。従って、五炭糖発酵性微生物による五炭糖発酵を効率的に進行させることができる。
【００３４】
一次糖化発酵工程で用いるリグノセルロース系原料の懸濁濃度は特に限定されないが、１〜３０質量％であることが好ましい。１質量％未満であると、最終的に生産物の濃度が低すぎて生産物の濃縮のコストが高くなるという問題が発生する。また、３０質量％を超えて高濃度となるにしたがって原料の攪拌が困難になり、生産性が低下するという問題が発生する。
【００３５】
一次糖化発酵で使用するセルロース分解酵素は、セロビオヒドロラーゼ活性、エンドグルカナーゼ活性、ベータグルコシダーゼ活性を有する、所謂セルラーゼと総称される酵素である。
各セルロース分解酵素は、夫々の活性を有する酵素を適宜の量で添加しても良いが、市販されているセルラーゼ製剤は、上記の各種のセルラーゼ活性を有すると同時に、ヘミセルラーゼ活性も有しているものが多いので市販のセルラーゼ製剤を用いれば良い。
【００３６】
市販のセルラーゼ製剤としては、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、ファネロケエテ（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ）属、トラメテス（Ｔｒａｍｅｔｅｓ）属、フーミコラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属などに由来するセルラーゼ製剤があるが特にこれらに限定されない。このようなセルラーゼ製剤の市販品としては、全て商品名で、例えば、セルロイシンＴ２（エイチピィアイ社製）、メイセラーゼ（明治製菓社製）、ノボザイム１８８（ノボザイム社製）、マルティフェクトＣＸ１０Ｌ（ジェネンコア社製）、ＧＣ２２０（ジェネンコア社製）等が挙げられる。
原料固形分１００質量部に対するセルラーゼ製剤の使用量は特に限定されないが、０．５〜１００質量部が好ましく、１〜５０質量部が特に好ましい。
【００３７】
一次糖化発酵工程でのｐＨは特に限定されないが、３．５〜１０．０の範囲に維持することが好ましく、４．０〜７．５の範囲に維持することがより好ましい。
【００３８】
一次糖化発酵工程の温度は、酵素の至適温度の範囲内であれば特に制限はなく、２５〜５０℃が好ましく、３０〜４０℃がさらに好ましい。反応は、連続式が好ましいが、セミバッチ式、バッチ式でも良い。
【００３９】
一次糖化発酵工程の滞留時間は特に限定されないが、３〜１００時間が好ましく、５〜５０時間さらに好ましい。
【００４０】
一次糖化発酵工程では、六炭糖（グルコース、ガラクトース等）をエタノールに変換できる六炭糖発酵性微生物を用いる。六炭糖発酵性微生物としては、サッカロマイセス・セラビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）等の酵母や細菌等を用いることができる。また、遺伝子組換技術を用いて作製した遺伝子組換微生物を用いることができる。遺伝子組換微生物としては、六炭糖と五炭糖を同時に発酵できる微生物（酵母、細菌等）を特に制限なく用いることができる。前記微生物は、培地などと同時に添加しても良い。
また、微生物は固定化しておいてもよい。微生物を固定化しておくと、次工程に微生物を液と共に送り出して再回収するという工程を省くことができるか、少なくとも回収工程にかかる負担を軽減することができるし、微生物をロスするリスクを軽減することもできる。また、微生物を固定化するほどでのメリットはないが、凝集性のある微生物を選択することにより微生物の回収を容易にすることができる。
【００４１】
本発明では特に限定されないが、酵素糖化処理工程内に電解質として水溶性塩を添加することができる。酵素糖化処理工程において、電解質を原料懸濁液に添加し原料懸濁液の電気伝導度を５〜２５ｍＳ／ｃｍの範囲に維持することが好ましい。電気伝導度を５〜２５ｍＳ／ｃｍの範囲に維持することによりリグノセルロース系原料の未反応成分や反応残渣等への酵素の吸着が抑制されるため、酵素糖化処理工程内における酵素の循環率が長期にわたって高い水準に維持することができる。酵素糖化処理工程内において、操作上、電解質を添加することが可能な工程であれば、いずれの工程においても制限なく電解質を添加することができる。一次糖化発酵工程内で添加することが操作が容易なため望ましい。
【００４２】
水溶性塩としては特に限定されないが、アルカリ金属塩及びアルカリ土類金属塩から選ばれる塩類が好ましい。アルカリ金属塩及びアルカリ土類金属塩としては、アルカリ金属やアルカリ土類金属のハロゲン化物、硫酸塩、亜硫酸塩、チオ硫酸塩、炭酸塩、炭酸水素塩、リン酸塩、リン酸二水素塩、リン酸水素二塩、酢酸塩、クエン酸塩からなる群から選ばれる水溶性塩が挙げられる。
【００４３】
一次糖化発酵工程から排出された培養液は、特に限定されないが、固液分離工程へ移送して、液体分（培養液）と固形分（残渣）に分離してもよい。但し、固液分離工程は本発明において必須ではない。固液分離を行う装置としては、スクリュープレス、スクリーン、フィルタープレス、ベルトプレス、ロータリープレス、ドラムフィルター、ディスクフィルター等を用いることができる。スクリーンとしては、振動装置が付加された振動スクリーンなどを用いることができる。
回収された固形分(残渣)は、一次糖化発酵工程へ移送し糖化発酵の原料として用いることもできる。
固液分離工程で分離された液体分（培養液）は、続いて蒸留工程へ移送してもよい。
【００４４】
＜蒸留工程＞
蒸留工程では、減圧蒸留装置により発酵生成物（エタノール）が蒸留分離される。但し、蒸留工程は本発明において必須ではない。減圧下では低い温度で発酵生成物（エタノール）を分離できるため、酵素の失活を防ぐことができる。減圧蒸留装置としては、ロータリーエバポレーター、フラッシュエバポレーターなどを用いることができる。
蒸留温度は２５〜６０℃が好ましい。２５℃未満であると、エタノールの蒸留に時間がかかって生産性が低下する。また、６０℃より高いと、酵素が熱変性して失活してしまい、新たに追加する酵素量が増加するため経済性が悪くなる。
蒸留後の液体留分（培養液）中に残る発酵生成物（エタノール）濃度は０．１質量％以下であることが好ましい。このような濃度にすることによって、後段の固液分離工程において固形物とともに排出される発酵生成物（エタノール）量を低減することができ、収率を向上させることができる。
【００４５】
＜一次遠心分離工程＞
蒸留後の液体留分（培養液）は、一次遠心分離工程へ移送され残留している残渣を遠心分離によって除去した後、液体留分は二次発酵工程へ移送してもよい。但し、一次遠心分離工程は、本発明において必須ではない。遠心分離後の残渣には、酵素、リグニン、酵母又は細菌等の微生物が含まれている。リグニンは、燃焼原料として回収しエネルギーとして利用することもできるし、リグニンを回収し有効利用することもできる。また、酵母又は細菌等の微生物を残渣から分離して、糖化発酵工程で再利用することもできる。
【００４６】
前記一次遠心分離工程で分離した残渣に吸着している酵素を遊離させるために残渣を水に懸濁し、この残渣懸濁液に水溶性塩類を添加し残渣懸濁液の電気伝道度が最終的に５〜２５ｍｓ／ｃｍとなるように調製することにより、残渣に吸着している酵素を回収することもできる。原料懸濁液に水溶性塩類を添加してからの処理時間は特に限定されないが、５〜１８０分が好ましく、１０〜６０分がさらに好ましい。
【００４７】
前記残渣に吸着している酵素を遊離させるために用いる水溶性塩類としては特に限定されないが、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム等が挙げられる。
【００４８】
前記、水溶性塩類により残渣からの酵素の回収を行った場合は、二次遠心分離工程により残渣と液体留分（酵素含有）に分離し、液体留分を酵素として糖化発酵工程へ循環させることもできる。
【００４９】
＜二次発酵工程＞
二次発酵工程で用いる五炭糖発酵性微生物とは、五炭糖（キシロース、アラビノース等）をエタノールに変換することができる微生物である。
一次遠心分離後の液体留分（培養液）には主成分として五炭糖（キシロース、アラビノース等）が含まれている。
【００５０】
二次発酵工程へ移送された液体留分（培養液）には酵素が含まれているため、残存するオリゴ糖等の鎖長の長い糖類の分解が進行するが、新たに、酵素を添加することもできる。
二次発酵工程でのｐＨは特に限定されないが、３．５〜１０．０の範囲に維持することが好ましく、４．０〜７．５の範囲に維持することがより好ましい。
二次発酵工程の温度は特に限定されないが、２５〜３５℃が好ましく、２８〜３２℃がさらに好ましい。
二次発酵工程の滞留時間は特に限定されないが、２〜１００時間が好ましく、５〜７０時間がさらに好ましい。
【００５１】
二次発酵工程では、五炭糖をエタノールに変換できる五炭糖発酵性微生物を用いる。五炭糖発酵性微生物としては特に限定されないが、ピキア・スティピティス（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓ）、キャンディダ・シハタエ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｈｉｈａｔａｅ），パチソレン・タノフィルス（Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ  ｔａｎｎｏｐｈｉｌｕｓ）等の酵母や細菌等を用いることができる。五炭糖発酵性微生物として、五炭糖発酵能力の高いＰｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓを用いるのが好ましい。
また、遺伝子組換技術を用いて作製した遺伝子組換微生物（酵母、細菌等）を用いることができる。遺伝子組換微生物としては、六炭糖と五炭糖を同時に発酵できる微生物（酵母、細菌等）を特に制限なく用いることができる。前記微生物は、培地などと同時に添加しても良い。
【００５２】
また、微生物は固定化しておいてもよい。微生物を固定化しておくと、次工程に微生物を液と共に送り出して再回収するという工程を省くことができるか、少なくとも回収工程にかかる負担を軽減することができるし、微生物をロスするリスクを軽減することもできる。また、微生物を固定化するほどでのメリットはないが、凝集性のある微生物を選択することにより微生物の回収を容易にすることができる。
【００５３】
本発明の一例においては、二次発酵工程へ供給する液体（培養液）のグルコース濃度を０．５質量％以下に維持して二次発酵を行うことが好ましく、０．０００００１〜０．５質量％の範囲に維持することがさらに好ましく、０．００００１〜０．５質量％の範囲に維持することが特に好ましい。また、二次発酵工程へ供給する液体（培養液）のキシロース濃度は特に限定されないが、１〜８質量％に維持して二次発酵を行うことが好ましく、１．５〜８質量％に維持することがさらに好ましく、２〜８質量％に維持することが特に好ましい。グルコース濃度、キシロース濃度を前記範囲に維持して二次発酵を行うことにより、グルコースによるキシロースからエタノール生産の低減が抑制されて、キシロースからエタノールへの生産が効率的に進む。グルコース濃度が０．５質量％を超えると、五炭糖発酵性微生物が優先的にグルコースをエタノールの変換し、キシロースからエタノールへの変換効率が悪くなるため好ましくない。また、キシロース濃度が８質量％を超えると、微生物の種類や菌株によっては、キシロースから生産されるエタノールの濃度上昇による生育阻害によりキシロースからエタノールへの変換効率が悪くなるため好ましくない。
【００５４】
図１に例示するように、二次発酵槽ＢＲ２の排出口４から排出された培養液をライン５を経由して、二次発酵槽ＢＲ２の供給口３へ循環させることができる。二次発酵槽ＢＲ２の供給口３へ循環させる培養液の量は、二次発酵槽ＢＲ２の排出口４から排出された培養液の全量であっても一部であってもよい。二次発酵槽ＢＲ２の排出口４から排出された培養液にキシロースが残存する場合、循環させることにより効率的にエタノールを生産することができる。
【００５５】
二次発酵槽ＢＲ２から排出された培養液には新たに生成された発酵生成物、酵素、五炭糖発性微生物が含まれており、一次糖化発酵槽ＢＲ１へ移送し、工程内を循環させる。
二次発酵工程で生成された発酵生成物を回収するために、二次発酵工程の後に蒸留工程を設置しても良い。また、二次発酵槽ＢＲ２から排出された培養液に含まれる残渣を除去するために、二次発酵工程の後に遠心分離機等の残渣分離装置を用いて残渣を除去することもできるし、二次発酵工程から排出された培養液を保管するためのタンクを設置し、タンクを経由して一次糖化発酵槽へ移送しても良い。
【実施例】
【００５６】
次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例等によって限定されるものではない。
【００５７】
［実験例１］
図１に示す製造工程で試験を実施した。
［前処理］
チップ状のユーカリ・グロブラスの林地残材（樹皮７０質量％、枝葉３０質量％）を２０ｍｍの丸孔スクリーンを取り付けた一軸破砕機（西邦機工社製、ＳＣ−１５）で破砕し原料として用いた。
上記原料１００ｋｇ（絶乾重量）に対して９７質量％亜硫酸ナトリウム２０ｋｇ及び水酸化ナトリウム１ｋｇを添加後、水を添加し水溶液の容量を１ｍ3に調整した。前記原料懸濁液を混合後、１７０℃で１時間加熱した。加熱処理後の原料懸濁液をレファイナー（熊谷理器工業製、ＫＲＫ高濃度ディスクレファイナー）でディスク（プレート）のクリアランスを１．０ｍｍに設定し磨砕した。次に２０メッシュ（８４７μｍ）のスクリーンを用いて固液分離（脱水）することにより溶液の電気伝導度が３０μＳ／ｃｍになるまで水で洗浄した。固液分離後の固形物（前処理物）を原料として糖化発酵工程に供した。
【００５８】
［一次糖化発酵］
予め、液体培地（グルコース３０ｇ／Ｌ、ポリペプトン５ｇ／Ｌ、酵母エキス３ｇ／Ｌ、麦芽エキス３ｇ／Ｌ、ｐＨ５．６）５０Ｌで六炭糖発酵性酵母としてＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ （市販酵母、商品名：Ｍａｕｒｉｖｉｎ: Ｍａｕｒｉ Ｙｅａｓｔ Ａｕｓｔｒａｌｉａ Ｐｔｙ Ｌｉｍｉｔｅｄ）を３０℃で２４時間培養した。
一次糖化発酵槽ＢＲ１にポリペプトン５ｇ／Ｌ、酵母エキス３ｇ／Ｌ、麦芽エキス３ｇ／Ｌとなるように各々を添加後，水を添加し最終容量を０．８ｍ3に調整した。酵母菌体を含む培養液を発酵槽に添加し２４時間培養した。酵母の密度が、１ｘ１０8／ｍｌに増殖した時点で、市販セルラーゼ（Ａｃｃｅｌｌｅｒａｓｅ ＤＵＥＴ、ジェネンコア社製）５０Ｌを発酵槽に添加後、原料５０ｋｇ（乾燥重量）を添加した。次に、発酵槽に水を添加し培養液の最終容量を１ｍ3に調整した。培養液のｐＨを５．０に調整し３０℃で一次糖化発酵を開始した。培養液の培養槽内での滞留時間（原料懸濁液が培養層を通過する時間：培養槽の容量／流速）を３５時間で糖化発酵を行った。すなわち、糖化発酵を開始した時点から、原料懸濁液（原料濃度１０質量％：原料を水に懸濁）を流速２８．６Ｌ／時間で発酵槽の原料供給口１から連続的に添加した。一方、原料供給開始と同時に発酵槽の培養液排出口２より２８．６Ｌ／時間で排出し、固液分離工程へ移送した。尚、連続運転中に培養液が減少した場合、自動的に培地を添加することにより培養液の最終容量を１ｍ3に維持した。培養中の培養液のｐＨを５．０に維持した。
【００５９】
［固液分離］
前記一次糖化発酵で得られた培養液を、固液分離装置Ｓ：スクリュープレス（富国工業株式会社製ＳＨＸ−２００ ｘ １５００Ｌ、スクリーンサイズ１．２ｍｍ）で固液分離して固形分（残渣）と濾液を分離した。
【００６０】
［エタノール蒸留］
前記固液分離後の濾液を減圧蒸留装置ＥＶ（エバポールＣＥＰ−１、大川原製作所）で蒸留温度：４０℃、加熱温度：８０℃、供給液量：９５Ｌ／時間の条件でエタノールを含む水溶液と液体留分（培養液）に分離した。得られたエタノールを含む水溶液の体積及びエタノール濃度を測定しエタノールの回収量を算出した。溶液中のエタノール濃度はグルコースセンサー（王子計測機器製ＢＦ−４００型）で測定した。
【００６１】
［遠心分離］
減圧蒸留装置ＥＶから分離された液体留分（培養液）をデカンタ式遠心機Ｃ１（ＩＨＩ製、ＨＳ−２０４Ｌ形）で回転数４５００ｒｐｍ、差速５．０ｒｐｍで運転し、固形分（残渣）と液体留分（培養液）に分離した。液体留分は、二次発酵槽ＢＲ２へ移送した。
【００６２】
［二次発酵］
予め液体培地（グルコース３０ｇ／Ｌ、ポリペプトン５ｇ／Ｌ、酵母エキス３ｇ／Ｌ、麦芽エキス３ｇ／Ｌ、ｐＨ５．６）５０Ｌで五炭糖発酵酵母としてＰｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓ(ＮＢＲＣ１６８７)を３０℃で２４時間培養した。
二次発酵槽ＢＲ２へ移送された培養液の容量が１ｍ3になるまで貯蔵した。発酵槽の培養液の容量が１ｍ3になった時点で、酵母菌体を密度が５ｘ１０7／ｍｌになるように培養液に添加し、３０℃で二次発酵を行った。二次発酵槽ＢＲ２内での培養液の滞留時間が３５時間になるように設定して二次発酵を行った。糖化発酵中の培養液のｐＨは５．０に維持した。二次発酵槽ＢＲ２の排出口４から分離された培養液を培養液保管タンクＴへ移送して貯蔵し、培養液保管タンクＴから一次糖化発酵槽ＢＲ１へ培養液を移送し連続的に工程内を循環させた。
【００６３】
＜データ測定＞
上記の一次糖化発酵を開始してから７０時間後(定常運転になった状態)を０時間（スタート）として、二次発酵槽ＢＲ２の供給口３から培養液を採取しグルコース濃度、及びキシロース濃度を経時的に測定した。また、二次発酵槽ＢＲ２の排出口４から培養液を採取しエタノール濃度、及び酵母の菌密度を経時的に測定した。結果を表１に示す。
【００６４】
［実験例２]
実験例１において、一次糖化発酵で原料を１５０ｋｇ添加した以外は全て実験例１と同様の方法で実施した。結果を表２に示す。
【００６５】
［実験例３]
実験例１において、一次糖化発酵で原料を２５０ｋｇ添加した以外は全て実験例１と同様の方法で実施した。結果を表３に示す。
【００６６】
［実験例４]
実験例１において、一次糖化発酵で原料を３００ｋｇ添加した以外は全て実験例１と同様の方法で実施した。実験例４を比較例とした。結果を表４に示す。
【００６７】
［実験例５]
実験例１において、一次糖化発酵において、原料を２５０ｋｇ添加し、一次糖化発酵槽ＢＲ１での培養液の滞留時間を１５時間で実施した。また、二次発酵において、二次発酵槽ＢＲ２での培養液の滞留時間を１５時間で実施した。それ以外の操作は全て実験例１と同様の方法で実施した。実験例５を比較例とした。結果を表５に示す。
【００６８】
【表１】
2014014356.tif 000003
【００６９】
【表２】
2014014356.tif 000004
【００７０】
【表３】
2014014356.tif 000005
【００７１】
【表４】
2014014356.tif 000006
【００７２】
【表５】
2014014356.tif 000007
【００７３】
表１〜３に示すように、一次糖化発酵槽（六炭糖発酵）への原料の添加量の増加に伴い（実験例１：５０ｋｇ、実験例２：１５０ｋｇ、実験例３：２５０ｋｇ）、二次発酵（五炭糖発酵）後の培養液のエタノール濃度は増加した。実験例１〜３における二次発酵槽に供給された培養液のグルコース濃度は、０．１０〜０．５０質量％、キシロース濃度は、１．５〜８．０質量％の範囲であった。
一方、表４に示すように、一次糖化発酵槽（六炭糖発酵）への原料の添加量が最も多かった実験例４（原料添加量：３００ｋｇ）では、実験例３（原料添加量：２５０ｋｇ）と比較し二次発酵（五炭糖発酵）後の培養液のエタノール濃度は低かった。実験例４における二次発酵槽に供給された培養液のグルコース濃度は、０．６７〜０．７３質量％、キシロース濃度は、７．６〜８．２質量％の範囲であり、二次発酵（五炭糖発酵）後の培養液のエタノール濃度は、０．６８〜０．７１質量％で実験例３と比較し低い値であった。
【００７４】
また、表５に示すように、一次糖化発酵槽（六炭糖発酵）への原料の添加量を２５０ｋｇ、滞留時間１５時間に短縮して実施した試験では、二次発酵槽に供給される培養液のグルコース濃度は、０．８２〜０．９２質量％、キシロース濃度は、７．５〜８．１質量％の範囲であり、二次発酵（五炭糖発酵）後の培養液のエタノール濃度は、０．５８〜０．６４質量％で実験例３と比較し低い値であった。
以上の結果から、二次発酵槽に供給される培養液のグルコース濃度が０．５０質量％以上になるとエタノール生産性が抑制されて低下することが示唆された。本発明のエタノール製造システムにおいて、二次発酵槽へ供給される培養液中のグルコース濃度を０．５質量％以下、キシロース濃度を１〜８質量％に維持して二次発酵を行うことにより効率的なエタノール生産が実施できることが判明した。
【００７５】
［実験例６］
図１に示す製造工程で試験を実施した。
［前処理］
実験例１と同様の方法で前処理を実施し、固液分離後の固形物（前処理物）を原料として糖化発酵工程に供した。
【００７６】
［一次糖化発酵］
予め、液体培地（グルコース３０ｇ／Ｌ、ポリペプトン５ｇ／Ｌ、酵母エキス３ｇ／Ｌ、麦芽エキス３ｇ／Ｌ、ｐＨ５．６）５０Ｌで六炭糖発酵酵母としてＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ （市販酵母、商品名：商品名：Ｍａｕｒｉｖｉｎ: Ｍａｕｒｉ Ｙｅａｓｔ Ａｕｓｔｒａｌｉａ Ｐｔｙ Ｌｉｍｉｔｅｄ）を３０℃で２４時間培養した。
一次糖化発酵槽ＢＲ１にポリペプトン５ｇ／Ｌ、酵母エキス３ｇ／Ｌ、麦芽エキス３ｇ／Ｌとなるように各々を添加後，水を添加し最終容量を０．８ｍ3に調整した。酵母菌体を含む培養液を発酵槽に添加し２４時間培養した。酵母の密度が、１ｘ１０8／ｍｌに増殖した時点で、市販セルラーゼ（Ａｃｃｅｌｌｅｒａｓｅ ＤＵＥＴ、ジェネンコア社製）５０Ｌを発酵槽に添加後、原料１００ｋｇ（乾燥重量）を添加した。次に、発酵槽に水を添加し培養液の最終容量を１ｍ3に調整した。培養液のｐＨを５．０に調整し３０℃で一次糖化発酵を開始した。培養液の培養槽内での滞留時間（原料懸濁液が培養層を通過する時間：培養槽の容量／流速）を２０時間で糖化発酵行った。すなわち、糖化発酵を開始した時点から、原料懸濁液（原料濃度１０質量％：原料を水に懸濁）を流速５０Ｌ／時間で発酵槽の原料供給口１から連続的に添加した。一方、原料供給開始と同時に発酵槽の培養液排出口２より５０Ｌ／時間で排出し、固液分離工程へ移送した。尚、連続運転中に培養液が減少した場合、自動的に培地を添加することにより培養液の最終容量を１ｍ3に維持した。連続運転中、培養中の培養液のｐＨを５．０に維持した。
【００７７】
［固液分離］
前記一次糖化発酵で得られた培養液を、固液分離装置Ｓ：スクリュープレス（富国工業株式会社製ＳＨＸ−２００ ｘ １５００Ｌ、スクリーンサイズ１．２ｍｍ）で固液分離して固形分（残渣）と濾液を分離した。
【００７８】
［エタノール蒸留］
前記固液分離後の濾液を減圧蒸留装置ＥＶ（エバポールＣＥＰ−１、大川原製作所）で蒸留温度：４０℃、加熱温度：８０℃、供給液量：９５Ｌ／時間の条件でエタノールを含む水溶液と濃縮培養液に分離した。得られたエタノールを含む水溶液の体積及びエタノール濃度を測定しエタノールの回収量を算出した。溶液中のエタノール濃度はグルコースセンサー（王子計測機器製ＢＦ−４００型）で測定した。
【００７９】
［遠心分離］
減圧蒸留装置ＥＶから分離された液体留分（培養液）をデカンタ式遠心機Ｃ１（ＩＨＩ製、ＨＳ−２０４Ｌ形）で回転数４５００ｒｐｍ、差速５．０ｒｐｍで運転し、固形分（残渣）と液体留分（培養液）に分離した。培養液はライン３を経由して二次発酵槽ＢＲ２へ移送した。
【００８０】
［二次発酵］
予め液体培地（グルコース３０ｇ／Ｌ、ポリペプトン５ｇ／Ｌ、酵母エキス３ｇ／Ｌ、麦芽エキス３ｇ／Ｌ、ｐＨ５．６）５０Ｌで五炭糖発酵酵母としてＰｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓ（ＮＢＲＣ１６８７）を３０℃で２４時間培養した。
二次発酵槽ＢＲ２へ移送された培養液の容量が１ｍ3になるまで貯蔵した。発酵槽の培養液の容量が１ｍ3になった時点で、酵母菌体を密度が５ｘ１０7／ｍｌになるように培養液に添加し、３０℃で二次発酵を行った。発酵中の培養液のｐＨは５．０に維持した。二次発酵槽ＢＲ２の排出口４から分離された培養液を培養液保管タンクＴへ移送して貯蔵し、培養液保管タンクＴから一次糖化発酵槽ＢＲ１へ培養液を移送し連続的に工程内を循環させた。
【００８１】
＜データ測定＞
上記の一次糖化発酵を開始してから４８時間後（定常運転になった状態）を０時間（スタート）として、一次糖化発酵槽ＢＲ１の排出口２から培養液を採取しグルコース濃度、及びエタノール濃度、酵母の菌密度を経時的に測定した。また、二次発酵槽ＢＲ２の排出口４から培養液を採取しエタノール濃度、及び酵母の菌密度を経時的に測定した。結果を表６に示す。
【００８２】
【表６】
2014014356.tif 000008
【００８３】
表６に示すように、一次糖化発酵での培養液の滞留時間を２０時間に設定した試験では、一次糖化発酵槽の排出口での培養期間中のグルコース濃度は、０．０８〜０．１８質量％であり、エタノール濃度は、５．０〜５．４質量％の範囲であった。一方、二次発酵槽の排出口でのエタノール濃度は、２．３〜２．５質量％の範囲であり、連続運転でエタノールは安定に生産された。
【００８４】
［実験例７］
実験例６において、一次糖化発酵での培養液の滞留時間（原料懸濁液が培養層を通過する時間：培養槽の容量／流速）を１５時間（流速６７Ｌ／時間）に設定し糖化発酵行った以外は全て実験例６と同様の方法で実施した。結果を表７に示す。
【００８５】
【表７】
2014014356.tif 000009
【００８６】
表７に示すように、一次糖化発酵での培養液の滞留時間を１５時間に設定した試験では、一次糖化発酵槽の排出口での培養期間中のグルコース濃度は、０．１８〜０．２４質量％であり、エタノール濃度は、４．７〜５．０質量％の範囲であった。一方、二次発酵槽の排出口でのエタノール濃度は、１．８〜２．３質量％の範囲であり、連続運転でエタノールは安定に生産された。
【００８７】
［実験例８］
実験例６において、一次糖化発酵での培養液の滞留時間（原料懸濁液が培養層を通過する時間：培養槽の容量／流速）を１０時間（流速１００Ｌ／時間）に設定し糖化発酵行った以外は全て実験例６と同様の方法で実施した。結果を表８に示す。
【００８８】
【表８】
2014014356.tif 000010
【００８９】
表８に示すように、一次糖化発酵での培養液の滞留時間を１０時間に設定した試験では、一次糖化発酵槽の排出口での培養期間中のグルコース濃度は、０．２２〜０．２５質量％であり、エタノール濃度は、４．６〜４．８質量％の範囲であった。一方、二次発酵槽の排出口でのエタノール濃度は、１．８〜２．１質量％の範囲であり、連続運転でエタノールは安定に生産された。
【００９０】
［実験例９］
実験例６において、一次糖化発酵での培養液の滞留時間（原料懸濁液が培養層を通過する時間：培養槽の容量／流速）を７．５時間（流速１３３Ｌ／時間）に設定し糖化発酵行った以外は全て実験例６と同様の方法で実施した。結果を表９に示す。
【００９１】
【表９】
2014014356.tif 000011
【００９２】
表９に示すように、一次糖化発酵での培養液の滞留時間を７．５時間に設定した試験では、一次糖化発酵槽の排出口での培養期間中のグルコース濃度は、０．３０〜０．３６質量％であり、エタノール濃度は、４．３〜４．５質量％の範囲であった。一方、二次発酵槽の排出口でのエタノール濃度は、１．６〜１．８質量％の範囲であり、連続運転でエタノールは安定に生産された。
【００９３】
［実験例１０］
実験例６において、一次糖化発酵での培養液の滞留時間（原料懸濁液が培養層を通過する時間：培養槽の容量／流速）を５時間（流速２００Ｌ／時間）に設定し糖化発酵行った以外は全て実験例６と同様の方法で実施した。結果を表１０に示す。
【００９４】
【表１０】
2014014356.tif 000012
【００９５】
表１０に示すように、一次糖化発酵での培養液の滞留時間を５時間に設定した試験では、一次糖化発酵槽の排出口での培養期間中のグルコース濃度は、０．４０〜０．４５質量％であり、エタノール濃度は、４．１〜４．４質量％の範囲であった。一方、二次発酵槽の排出口でのエタノール濃度は、１．４〜１．７質量％の範囲であり、連続運転でエタノールは安定に生産された。
【００９６】
［実験例１１］
実験例６において、一次糖化発酵での培養液の滞留時間（原料懸濁液が培養層を通過する時間：培養槽の容量／流速）を３時間（流速３３３Ｌ／時間）に設定し糖化発酵行った以外は全て実験例１と同様の方法で実施した。結果を表１１に示す。
【００９７】
【表１１】
2014014356.tif 000013
【００９８】
表１１に示すように、一次糖化発酵での培養液の滞留時間を３時間に設定した試験では、一次糖化発酵槽の排出口での培養期間中のグルコース濃度は、０．８９〜０．９４質量％であり、エタノール濃度は、３．９〜４．２質量％の範囲であった。一方、二次発酵槽の排出口でのエタノール濃度は、１．４〜１．６質量％の範囲であり、連続運転でエタノールは安定に生産されたが、実験例１０の結果（排出口のグルコース濃度：０．４０〜０．４５質量％、排出口のエタノール濃度：４．１〜４．４質量％）と大差はなかった。
【００９９】
［実験例１２］
実験例６において、一次糖化発酵での培養液の滞留時間（原料懸濁液が培養層を通過する時間：培養槽の容量／流速）を２時間（流速２００Ｌ／時間）に設定し糖化発酵行った以外は全て実験例６と同様の方法で実施した。実験例１２を比較例とした。結果を表１２に示す。
【０１００】
【表１２】
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【０１０１】
表１２に示すように、一次糖化発酵での培養液の滞留時間を２時間に設定した試験では、一次糖化発酵槽の排出口での培養期間中のグルコース濃度は、２．５７〜３．３５質量％であり、エタノール濃度は、１．０〜１．５質量％の範囲であった。一方、二次発酵槽の排出口でのエタノール濃度は、０〜０．１質量％の範囲であり、実験例６〜１１と比較し連続運転でエタノールは顕著に低下した。
【０１０２】
実験例６〜１２の結果から、一次糖化発酵槽の排出口のグルコース濃度が１．０質量％以下に維持されている条件下では、培養期間中エタノールが効率的に生産されることが判明した。この条件下では、二次発酵で使用された五炭糖発酵酵母（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓ  ）がキシロースを選択的に資化したため、エタノール生産が安定に維持できたものと考えられる。
エタノール製造工程において、エタノールの生産効率を高めるためには、可能な限り六炭糖の発酵を行う一次糖化発酵工程の滞留時間を短縮することが望ましい。前記の結果を基に、一次糖化発酵槽の排出口のグルコース濃度が１．０質量％以下になるように一次糖化発酵工程の滞留時間を可能な限り短く設定することにより、運転時間が短縮でき効率的なエタノール生産が可能となる。
【産業上の利用可能性】
【０１０３】
本発明により、リグノセルロースから生産効率の高いエタノール製造方法が提供される。
【図１】
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