(57)【要約】【課題】複雑化,大型化に伴う重量増加が無く、正確な蛍光画像を測定する。【解決手段】サンプル台(４)と、蛍光物質を励起する励起光を出射する光源と、上記励起光により検出対象物からの蛍光を検出する検出光学系とを含むと共に、第１走査方向と第２走査方向との二次元走査を行う走査モジュール(９)と、走査モジュール(９)を、上記第２走査方向に往復動可能に支持する上部支持部(８)と、上部支持部(８)を上記第１走査方向に往復動可能に支持する下部支持部(７)と、上部支持部(８)に取り付けられて、サンプル台(４)の外側で且つ走査モジュール(９)の走査線上に位置して、上記光源からの励起光を検出する光検出部(３７)とを備えている。こうして、走査モジュール(９)に何ら手を加えずに上記励起光の強度を測定でき、上記検出光学系の複雑化,大型化に伴う重量増加が無く、上記検出対象物からの蛍光の強度を精度よく補正できる。【選択図】図４
2014052235.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
検出対象物が載置されるサンプル台と、
蛍光物質を励起する励起光を出射する光源と、上記励起光の照射に基づいて上記検出対象物から発せられた蛍光を検出する検出光学系とを含むと共に、第１走査方向とこの第１走査方向に略直交する第２走査方向との二次元走査を行う走査モジュールと、
上記走査モジュールを、基準台の面方向上記第２走査方向に往復動可能に支持する上部支持部と、
上記基準台に設置されると共に、上記上部支持部を、上記基準台の面方向上記第１走査方向に往復動可能に支持する下部支持部と、
上記上部支持部に取り付けられると共に、上記サンプル台の外側であって、且つ上記走査モジュールの上記第２走査方向への走査線上に位置して、上記光源からの励起光を検出する光検出部と
を備えたことを特徴とする蛍光検出装置。
【請求項２】
請求項１に記載の蛍光検出装置において、
上記光検出部によって検出された上記励起光の強度に基づいて、上記検出光学系で検出された上記検出対象物からの蛍光の強度を補正する光強度補正部を備えた
ことを特徴とする蛍光検出装置。
【請求項３】
請求項１あるいは請求項２に記載の蛍光検出装置において、
上記光検出部は、上記走査モジュールが上記二次元走査を行う際に上記励起光の検出を行うようになっている
ことを特徴とする蛍光検出装置。
【請求項４】
請求項１から請求項３までの何れか一つに記載の蛍光検出装置において、
上記光検出部は、上記走査モジュールの上記第２走査方向への往復動の折返し地点あるいは上記折返し地点よりも内側に位置している
ことを特徴とする蛍光検出装置。
【請求項５】
請求項１から請求項４までの何れか一つに記載の蛍光検出装置において、
上記光検出部によって検出された上記励起光の強度に基づいて、上記検出光学系で検出された上記検出対象物からの蛍光の位置を補正する位置補正部を備えた
ことを特徴とする蛍光検出装置。
【請求項６】
検出対象物が載置されるサンプル台と、
蛍光物質を励起する励起光を出射する光源と、上記励起光の照射に基づいて上記検出対象物から発せられた蛍光を検出する検出光学系とを含むと共に、第１走査方向とこの第１走査方向に略直交する第２走査方向との二次元走査を行う走査モジュールと、
上記走査モジュールを、基準台の面方向上記第２走査方向に往復動可能に支持する上部支持部と、
上記基準台に設置されると共に、上記上部支持部を、上記基準台の面方向上記第１走査方向に往復動可能に支持する下部支持部と、
上記上部支持部に取り付けられると共に、上記サンプル台の外側であって、且つ上記走査モジュールの上記第２走査方向への走査線上に位置して、上記光源からの励起光を受けて光を発する標識部と、
上記標識部から発せられた光を検出する光検出部と
を備えたことを特徴とする蛍光検出装置。
【請求項７】
請求項６に記載の蛍光検出装置において、
上記光検出部によって検出された上記標識部から発せられた光の強度に基づいて、上記検出光学系で検出された上記検出対象物からの蛍光の強度を補正する光強度補正部を備えた
ことを特徴とする蛍光検出装置。
【請求項８】
請求項６あるいは請求項７に記載の蛍光検出装置において、
上記光検出部は、上記走査モジュールが上記二次元走査を行う際に上記標識部から発せられた光の検出を行うようになっている
ことを特徴とする蛍光検出装置。
【請求項９】
請求項６から請求項８までの何れか一つに記載の蛍光検出装置において、
上記標識部は、上記走査モジュールの上記第２走査方向への往復動の折返し地点あるいは上記折返し地点よりも内側に位置している
ことを特徴とする蛍光検出装置。
【請求項１０】
請求項６から請求項９までの何れか一つに記載の蛍光検出装置において、
上記光検出部によって検出された上記標識部から発せられた光の強度に基づいて、上記検出光学系で検出された上記検出対象物からの蛍光の位置を補正する位置補正部を備えた
ことを特徴とする蛍光検出装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、蛍光検出装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来より、生化学分野や分子生物学分野において、蛍光色素を標識物質として利用した蛍光検出システムが広く用いられている。この蛍光検出システムを用いることによって、遺伝子配列,遺伝子の変異・多型解析,タンパク質の分離および同定等の評価を行うことができ、薬等の開発に利用されている。
【０００３】
上述のような蛍光標識を利用した評価方法としては、電気泳動によってタンパク質等の生物学的化合物をゲル内に分布させ、その生物学的化合物の分布を蛍光検出により取得するという方法がよく用いられている。上記電気泳動では、緩衝液等の溶液中に電極を設置しておき、直流電流を流すことによって上記溶液中に電場勾配を生じさせる。このとき、上記溶液中に電荷を有するタンパク質やＤＮＡ(Deoxyribonucleic acid：デオキシリボ核酸)やＲＮＡ(ribo nucleic acid：リボ核酸)がある場合に、プラス電荷を有する分子は陰極に、マイナス電荷を有する分子は陽極に引き寄せられ、生体分子の分離を行うことができる。
【０００４】
上記電気泳動を用いた評価方法の一つである二次元電気泳動は、２種類の電気泳動法を組み合わせることによって、ゲル内に生体分子を二次元的に分布させる評価方法であり、プロテオーム解析を行う上で最も有効な方法であると考えられている。
【０００５】
上記電気泳動の組み合わせとしては、例えば、一次元目としての「個々のタンパク質の等電点の違いを利用する等電点電気泳動」と、二次元目としての「タンパク質の分子量で分離を行うＳＤＳ‐ＰＡＧＥ(ドデシル硫酸ナトリウム‐ポリアクリルアミドゲル電気泳動)」との２種類が主に用いられる。こうして分離された上記生体分子としてのタンパク質に対して、蛍光色素は電気泳動前あるいは電気泳動後に付与される。
【０００６】
さらに、上述のようにして作製された上記生体分子(タンパク質)が二次元的に分布されたゲル支持体に励起光を照射し、発生した蛍光強度を取得して、それに基づいて蛍光分布(タンパク質分布)画像を表示させる画像読取装置が、生化学や分子生物学の分野で広く普及している。
【０００７】
また、上記生体分子の二次元分布を保持する方法としては、上記ゲル内に保持するだけではなく、上記ゲル内にタンパク質を分離させた後に、電気泳動や毛細管現象を利用して上記ゲルからメンブレンに転写させる方法も行われる。その場合には、上記ゲル支持体を用いた画像読取の場合と同様に、上記メンブレンである転写支持体上の蛍光分布を画像読取装置によって画像化することができる。
【０００８】
上述したような生体分子が二次元的に分布されたゲル支持体や転写支持体から生体分子分布画像を読み取る画像読取装置として、特開２００１‐７４６５６号公報(特許文献１)に開示された画像情報読取装置がある。
【０００９】
この画像情報読取装置においては、中央部に孔が形成された孔開きミラーを主走査方向に移動される光学ヘッドに搭載し、蛍光色素によって標識された生体由来物質が分布する被走査体に対して、レーザ光源からの上記蛍光色素を励起する波長帯域のレーザ光(励起光)を平面ミラーで上方に反射し、上記孔開きミラーの小孔を通過させた後、対物レンズで集光して照射する。そして、上記被走査体中の蛍光色素が励起されて発せられた蛍光が上記孔開きミラーの上記小孔の周囲で反射され、フォトマルチプライヤによって光電変換されて検出される。こうして、対応する画像信号として読み取られる。以下、上記主走査方向に直交する副走査方向に上記光学ヘッドを移動させながら上記動作を繰り返すことによって、二次元の可視画像(蛍光画像)を得るようにしている。
【００１０】
ところで、上述のような蛍光画像形成用のレーザ光源として、小型,高効率,安価,軽量なＤＰＳＳ(半導体励起固体)レーザが使用される。しかしながら、ＤＰＳＳレーザは、環境温度の変動によって光出力がドリフトする。その場合のドリフト周期は、数分から数十分の周期となる。
【００１１】
一般に、蛍光イメージャで測定されるサンプルのサイズは、大きいものでＡ４からＡ３程度のサイズに及ぶ。このような、大型のサンプルの全面を走査して蛍光画像を測定する場合に、走査開始から走査終了までには１５分〜２０分程度の時間がかかる。その間に、ＤＰＳＳレーザの出力は変動するので、本来の蛍光画像のコントストは異なるコントラストの蛍光画像が得られるという問題がある。
【００１２】
ところが、上記従来の画像情報読取装置は、レーザ光源を二次元走査させる構成ではなく、孔開きミラーおよび対物レンズのみを走査させる構成になっている。したがって、レーザ光源を走査させる必要がないため、光源の強度揺らぎが少ない比較的大型のレーザ光源を使用できる。したがって、ＤＰＳＳレーザの場合のような出力変動は発生しない。また、レーザ光源における強度の揺らぎの補正に関する記載もない。
【００１３】
また、蛍光被写体から蛍光を検出して被写体画像を形成する際に、画像中のノイズを除去する画像形成装置として、特開２００８‐２０３１３８号公報(特許文献２)に開示された蛍光検出装置がある。
【００１４】
この蛍光検出装置においては、蛍光被写体を照明する光源からの光の出力を計測する光出力計測手段による計測結果に基づいて、演算手段でノイズ画像を撮影するための蓄積時間を演算する。そして、上記演算された蓄積時間でノイズ画像を撮影し、補正手段によって、蛍光を検出して形成した撮影画像を上記ノイズ画像を用い補正するようにしている。
【００１５】
しかしながら、上記蛍光検出装置においては、蛍光検出光学系にシャッター手段や光出力計測手段を設ける必要があり、蛍光検出光学系が複雑化,大型化して重量増加となる。上記特許文献２に開示された従来の蛍光検出装置においては、サンプルはカセットトレイに載せられて搬送ステージで搬送されるので、蛍光検出光学系の重量増加は特に問題にはならない。しかしながら、静止しているサンプルに対して蛍光検出光学系が二次元走査を行ってサンプルからの蛍光を検出する場合には、上記二次元走査部の重量増加は高速スキャンを不可能にすると言う問題がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】特開２００１‐７４６５６号公報
【特許文献２】特開２００８‐２０３１３８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
そこで、この発明の課題は、蛍光検出光学系の複雑化,大型化に伴う重量増加が無く、ＤＰＳＳレーザに出力変動が生じても正確な蛍光画像を測定できる蛍光検出装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
上記課題を解決するため、この発明の蛍光検出装置は、
検出対象物が載置されるサンプル台と、
蛍光物質を励起する励起光を出射する光源と、上記励起光の照射に基づいて上記検出対象物から発せられた蛍光を検出する検出光学系とを含むと共に、第１走査方向とこの第１走査方向に略直交する第２走査方向との二次元走査を行う走査モジュールと、
上記走査モジュールを、基準台の面方向上記第２走査方向に往復動可能に支持する上部支持部と、
上記基準台に設置されると共に、上記上部支持部を、上記基準台の面方向上記第１走査方向に往復動可能に支持する下部支持部と、
上記上部支持部に取り付けられると共に、上記サンプル台の外側であって、且つ上記走査モジュールの上記第２走査方向への走査線上に位置して、上記光源からの励起光を検出する光検出部と
を備えたことを特徴としている。
【００１９】
上記構成によれば、光検出部は、下部支持部によって第１走査方向に往復動可能に支持された上部支持部に取り付けられており、上記上部支持部によって第２走査方向に往復動可能に支持された走査モジュールの上記第２走査方向への走査線上における上記サンプル台の外側に位置している。したがって、上記走査モジュールが上記第２走査方向へ走査する毎に、上記走査モジュールの光源からの励起光を検出することができる。
【００２０】
その場合に、上記走査モジュールが上記第１走査方向に移動しても、上記光検出部は、上記第１走査方向に移動する上部支持部に取り付けられているため、必ず第２走査方向の走査線上に位置している。したがって、上記走査モジュールによる上記第２走査方向への走査毎に、上記光検出部によって上記光源からの上記励起光の光強度を測定すればよく、例えば、上記走査モジュールによる上記第２走査方向への走査毎に、上記検出対象物からの蛍光の強度を上記励起光の強度に基づいて補正することが可能になる。
【００２１】
さらに、上記走査モジュールに何ら手を加えることなく、そのまま上記励起光の強度を測定することができるので、上記検出光学系の複雑化,大型化に伴う重量増加が無く、上記検出対象物からの蛍光の強度を精度よく補正することができる。
【００２２】
また、１実施の形態の蛍光検出装置では、
上記光検出部によって検出された上記励起光の強度に基づいて、上記検出光学系で検出された上記検出対象物からの蛍光の強度を補正する光強度補正部を備えている。
【００２３】
この実施の形態によれば、上記光検出部で検出された上記励起光の強度に基づいて、光強度補正部によって、上記検出光学系で検出された上記検出対象物からの蛍光の強度を補正するので、上記走査モジュールによる上記第２走査方向への走査毎に、上記検出対象物からの蛍光の強度を上記励起光の強度に基づいて補正することができる。
【００２４】
したがって、上記走査モジュールの光源がＤＰＳＳレーザである場合に、数分から数十分の周期で光出力が１０％〜２０％増減する揺らぎに起因して、上記検出対象物からの蛍光の強度に生ずる揺らぎを、上記ＤＰＳＳレーザからの励起光の強度に基づいて補正することができる。
【００２５】
また、１実施の形態の蛍光検出装置では、
上記光検出部は、上記走査モジュールが上記二次元走査を行う際に上記励起光の検出を行うようになっている。
【００２６】
上記走査モジュールは、上記第２走査方向に移動させるために外部から引っ張り力が加わるため、上記第２走査方向への走査時に上記引っ張り力によって回転応力が生ずる。そのため、この回転応力によって上記走査モジュールに微小な傾きが発生し、上記光源からの励起光の光路にずれが生じて励起光の強度に変動が発生する。したがって、上記走査モジュールが停止している状態と動作している状態とでは上記励起光の強度が異なるのである。
【００２７】
この実施の形態によれば、上記光検出部は、上記走査モジュールが上記二次元走査を行う際に上記励起光の検出を行うので、実際に上記被測定対象物からの蛍光の光強度を検出する状態に近い状態で、上記励起光の検出を行うことができる。したがって、上記検出対象物からの蛍光の強度に対する上記励起光の強度に基づく補正を、精度よく行うことができる。
【００２８】
また、１実施の形態の蛍光検出装置では、
上記光検出部は、上記走査モジュールの上記第２走査方向への往復動の折返し地点あるいは上記折返し地点よりも内側に位置している。
【００２９】
この実施の形態によれば、上記走査モジュールの上記第２走査方向への一往復動において、何れか一方の折返し地点の近傍で１回、あるいは、両方の折返し地点の近傍で２回、上記光検出部による上記励起光の検出を行うことができる。
【００３０】
ここで、上記走査モジュールに対して外部から加わる引っ張り力の向きは、上記第２走査方向への往復動の往路と復路とでは反対になるので、上記走査モジュールの傾き方向も反対となる。したがって、上記光源からの励起光の強度も上記往路と上記復路とでは異なることになる。このことから、上記走査モジュールの上記第２走査方向への一往復動における両方の折返し地点の近傍で２回の上記励起光の検出を行う方が望ましい。
【００３１】
また、１実施の形態の蛍光検出装置では、
上記光検出部によって検出された上記励起光の強度に基づいて、上記検出光学系で検出された上記検出対象物からの蛍光の位置を補正する位置補正部を備えている。
【００３２】
上記走査モジュールは、上記第２走査方向への往復動作を繰り返すことによって、本来の位置から上記第２走査方向に少しずつずれて行く経時的な変化がある。そのために、上記検出対象物からの蛍光の強度に対する上記励起光の強度に基づく正確な補正を行うためには、上記検出対象物からの蛍光の位置を補正する必要がある。
【００３３】
この実施の形態によれば、上記光検出部で検出された上記励起光の強度に基づいて、位置補正部によって、上記検出光学系で検出された上記検出対象物からの蛍光の位置を補正する。ここで、上記走査モジュールの位置は、エンコーダの値に基づいて算出される。そこで、上記光検出部による上記励起光の検出結果によって、上記エンコーダの値に基づく位置と本来の位置との間のズレ量を算出して上記エンコーダの値を補正することにより、上記蛍光の位置を補正することができる。こうして、上記検出対象物からの蛍光の位置を補正することによって、上記検出対象物からの蛍光の強度分布を正確に検出することができる。
【００３４】
ところで、上記走査モジュールの位置ずれは、上術した経時な変化の他に、上記走査モジュールを上記第２走査方向に往復動させることによる上記走査モジュールの傾きに起因する上記励起光の光路変化によっても発生し、往路と復路とで上記エンコーダに基づく位置が異なる。すなわち、往路と復路とで上記走査モジュールの傾き方向が異なるために、上記励起光による上記検出対象物の照射位置も夫々反対方向にずれる。したがって、上記走査モジュールの上記第２走査方向への一往復動における両方の折返し地点の近傍で２回の上記励起光の検出結果に基づいて、往路と復路とで夫々異なる補正値を算出して上記エンコーダの値を補正することが望ましい。
【００３５】
また、この発明の蛍光検出装置は、
検出対象物が載置されるサンプル台と、
蛍光物質を励起する励起光を出射する光源と、上記励起光の照射に基づいて上記検出対象物から発せられた蛍光を検出する検出光学系とを含むと共に、第１走査方向とこの第１走査方向に略直交する第２走査方向との二次元走査を行う走査モジュールと、
上記走査モジュールを、基準台の面方向上記第２走査方向に往復動可能に支持する上部支持部と、
上記基準台に設置されると共に、上記上部支持部を、上記基準台の面方向上記第１走査方向に往復動可能に支持する下部支持部と、
上記上部支持部に取り付けられると共に、上記サンプル台の外側であって、且つ上記走査モジュールの上記第２走査方向への走査線上に位置して、上記光源からの励起光を受けて光を発する標識部と、
上記標識部から発せられた光を検出する光検出部と
を備えたことを特徴としている。
【００３６】
ここで、上記標識部とは、例えば、反射部材あるいは蛍光部材等であって、上記光源からの励起光を受けて光を発することが可能な部材である。
【００３７】
上記構成によれば、標識部は、下部支持部によって第１走査方向に往復動可能に支持された上部支持部に取り付けられており、上記上部支持部によって第２走査方向に往復動可能に支持された走査モジュールの上記第２走査方向への走査線上における上記サンプル台の外側に位置している。したがって、上記走査モジュールが上記第２走査方向へ走査する毎に、上記走査モジュールの光源からの励起光を、上記標識部を介して光検出部によって検出することができる。
【００３８】
その場合に、上記走査モジュールが上記第１走査方向に移動しても、上記標識部は、上記第１走査方向に移動する上部支持部に取り付けられているために、必ず第２走査方向の走査線上に位置している。したがって、上記走査モジュールによる上記第２走査方向への走査毎に、上記光検出部によって上記光源からの上記励起光の光強度を測定すればよく、例えば、上記走査モジュールによる上記第２走査方向への走査毎に、上記検出対象物からの蛍光の強度を上記励起光の強度に基づいて補正することが可能になる。
【００３９】
さらに、上記走査モジュールに何ら手を加えることなく、そのまま上記励起光の強度を測定することができるので、上記検出光学系の複雑化,大型化に伴う重量増加が無く、上記検出対象物からの蛍光の強度を精度よく補正することができる。
【００４０】
また、１実施の形態の蛍光検出装置では、
上記光検出部によって検出された上記標識部から発せられた光の強度に基づいて、上記検出光学系で検出された上記検出対象物からの蛍光の強度を補正する光強度補正部を備えている。
【００４１】
この実施の形態によれば、上記走査モジュールによる上記第２走査方向への走査毎に、上記検出対象物からの蛍光の強度を上記励起光の強度に基づいて補正することができる。したがって、上記走査モジュールの光源がＤＰＳＳレーザである場合に、数分から数十分の周期で光出力が１０％〜２０％増減するＤＰＳＳレーザからの励起光の揺らぎに起因して、上記検出対象物からの蛍光の強度に生ずる揺らぎを、上記ＤＰＳＳレーザからの励起光の強度に基づいて補正することができる。
【００４２】
また、１実施の形態の蛍光検出装置では、
上記光検出部は、上記走査モジュールが上記二次元走査を行う際に上記標識部から発せられた光の検出を行うようになっている。
【００４３】
上記走査モジュールは、上記第２走査方向への走査時に引っ張り力で生ずる回転応力によって上記走査モジュールに微小な傾きが発生して励起光の強度に変動が発生するため、上記走査モジュールが停止している状態と動作している状態とでは上記励起光の強度が異なる。
【００４４】
この実施の形態によれば、上記光検出部は、上記走査モジュールが上記二次元走査を行う際に上記標識部から発せられた光の検出を行うので、実際に上記被測定対象物からの蛍光の光強度を検出する状態に近い状態で、上記励起光の検出を行うことができる。したがって、上記検出対象物からの蛍光の強度に対する上記励起光の強度に基づく補正を、精度よく行うことができる。
【００４５】
また、１実施の形態の蛍光検出装置では、
上記標識部は、上記走査モジュールの上記第２走査方向への往復動の折返し地点あるいは上記折返し地点よりも内側に位置している。
【００４６】
この実施の形態によれば、上記走査モジュールの上記第２走査方向への一往復動において、何れか一方の折返し地点の近傍で１回、あるいは、両方の折返し地点の近傍で２回、上記光検出部による上記励起光の検出を行うことができる。
【００４７】
ここで、上記走査モジュールに対して外部から加わる引っ張り力の向きは、上記第２走査方向への往復動の往路と復路とでは反対になるので上記走査モジュールの傾き方向も反対となり、上記光源からの励起光の強度も上記往路と上記復路とでは異なることになる。したがって、上記走査モジュールの上記第２走査方向への一往復動における両方の折返し地点の近傍で２回の上記励起光の検出を行う方が望ましい。
【００４８】
また、１実施の形態の蛍光検出装置では、
上記光検出部によって検出された上記標識部から発せられた光の強度に基づいて、上記検出光学系で検出された上記検出対象物からの蛍光の位置を補正する位置補正部を備えている。
【００４９】
上記走査モジュールは、上記第２走査方向への往復動作を繰り返すことによって、本来の位置から上記第２走査方向に少しずつずれて行く経時的な変化がある。そのために、上記検出対象物からの蛍光の強度に対する上記励起光の強度に基づく正確な補正を行うためには、上記検出対象物からの蛍光の位置を補正する必要がある。そして、上記走査モジュールの位置は、エンコーダの値に基づいて算出される。
【００５０】
この実施の形態によれば、上記光検出部による上記標識部から発せられた光の検出結果によって、上記エンコーダの値に基づく位置と本来の位置との間のズレ量を算出して上記エンコーダの値を補正することにより、上記蛍光の位置を補正することができる。こうして、上記検出対象物からの蛍光の位置を補正することによって、上記検出対象物からの蛍光の強度分布を正確に検出することができる。
【００５１】
ところで、上記走査モジュールの位置ずれは、上術した経時な変化の他に、上記往復動による往路と復路とで上記走査モジュールの傾き方向が異なるので、上記走査モジュールの上記第２走査方向への一往復動における両方の折返し地点の近傍で２回の上記励起光の検出結果に基づいて、往路と復路とで夫々異なる補正値を算出して上記エンコーダの値を補正することが望ましい。
【発明の効果】
【００５２】
以上より明らかなように、この発明の蛍光検出装置は、走査モジュールの光源からの励起光を検出する光検出部を、下部支持部によって第１走査方向に往復動可能に支持された上部支持部に取り付けており、上記上部支持部によって第２走査方向に往復動可能に支持された上記走査モジュールの上記第２走査方向への走査線上における上記サンプル台の外側に位置している。
【００５３】
また、この発明の蛍光検出装置は、走査モジュールの光源からの励起光を受けて光を発する標識部を、下部支持部によって第１走査方向に往復動可能に支持された上部支持部に取り付けており、上記上部支持部により第２走査方向に往復動可能に支持された走査モジュールの上記第２走査方向への走査線上における上記サンプル台の外側に位置している。
【００５４】
ここで、上記標識部とは、例えば、反射部材あるいは蛍光部材等であって、上記光源からの励起光を受けて光を発することが可能な部材である。
【００５５】
したがって、上記何れの蛍光検出装置においても、上記走査モジュールが上記第２走査方向へ走査する毎に、上記走査モジュールの光源からの励起光を上記光検出部によって検出することができ、上記検出対象物からの蛍光の強度を上記励起光の強度に基づいて補正することが可能になる。
【００５６】
さらに、上記走査モジュールに何ら手を加えることなく、そのまま上記励起光の強度を測定することができるので、上記検出光学系の複雑化,大型化に伴う重量増加が無く、上記検出対象物からの蛍光の強度を精度よく補正することができる。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】この発明の蛍光検出装置における外観図である。
【図２】図１におけるサンプル台の下部に設置された走査ステージの外観図である。
【図３】図２における第２ステージ上に載置される走査モジュールの断面図である。
【図４】図２におけるＡ‐Ａ'矢視断面図である。
【図５】ＤＰＳＳレーザの概念図である。
【図６】ＤＰＳＳレーザの光出力と経過時間との関係を示す図である。
【図７】蛍光画像の一例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００５８】
以下、この発明を図示の実施の形態により詳細に説明する。
【００５９】
・第１実施の形態
図１は、本実施の形態の蛍光検出装置における外観図である。本蛍光検出装置１は、筺体を成す本体２と、本体２の上面を覆う蓋体３とで、大まかに構成されている。本体２の上面には、ガラスでなるサンプル台４が設けられており、サンプル台４上には例えば蛍光物質によって標識された生体由来物質が分布するゲル支持体やメンブレン等の転写支持体(共に図示せず)がサンプル(検出対象物)としてセットされる。
【００６０】
そして、上記サンプル台４の下側には光学系が配置されており、サンプル台４上にセットされたサンプルに対して、励起光学系によってサンプル台４を通して下方から励起光を照射し、サンプル台４を透過してくる上記サンプルからの蛍光を検出光学系によって検出する。上記検出光学系はＰＣ(Personal computer：パーソナルコンピュータ)５等の外部端末と接続されており、ＰＣ５から測定条件の制御等を行う。さらに、ＰＣ５によって、検出データに基づいてサンプルの蛍光画像を作成し、内蔵する表示画面に上記作成した蛍光画像等を表示する。
【００６１】
図２は、上記サンプル台４の下部に設置された走査ステージ６の外観図を示す。この走査ステージ６は、基準となる基準台１４上に設置された上記下部支持部としての第１ステージ７と、第１ステージ７の上に載置された上記上部支持部としての第２ステージ８とで構成されている。そして、第２ステージ８の上に走査モジュール９が載置されている。上記蛍光を検出する上記検出光学系は走査モジュール９の中に格納されている。
【００６２】
上記走査ステージ６を構成する第１ステージ７には、第１走査方向に延在すると共に、一定の間隔で互いに対向する２本のガイドレール１０a,１０bが配設されている。また、第２ステージ８は、第１ステージ７のガイドレール１０aによって案内されて上記第１走査方向に往復動する第１ガイド部材１１と、ガイドレール１０bによって案内されて上記第１走査方向に往復動する第２ガイド部材１２とを有している。
【００６３】
上記第２ステージ８を構成する第１ガイド部材１１と第２ガイド部材１２との間には、上記第１走査方向に直交する第２走査方向に延在すると共に、一定の間隔で互いに対向する２本のガイドシャフト１３a,１３bが配設されている。また、走査モジュール９には、ガイドシャフト１３a,１３bが挿通される孔が設けられている。そして、走査モジュール９は、ガイドシャフト１３a,１３bによって案内されて上記第２走査方向に往復動するようになっている。
【００６４】
上記構成を有する走査ステージ６による走査方法は、先ず、上記第２ステージ８の第１ガイド部材１１と第２ガイド部材１２とがガイドレール１０a,１０bによって案内されて上記第１走査方向に移動して、第２ステージ８の第１ステージ７に対する位置決めが行われる。そうした後に、走査モジュール９がガイドシャフト１３a,１３bによって案内されて上記第２走査方向に移動して、走査モジュール９の第２ステージ８に対する位置決めが行われる。以後、上記動作を繰り返すことによって、サンプル１６上を二次元に走査するのである。
【００６５】
また、上記筺体を成す本体２のサンプル台４下部における走査ステージ６よりも更に下側には、第２ステージ８の第１,第２ガイド部材１１,１２を上記第１走査方向に、走査モジュール９を上記第２走査方向に移動させるためのモータ,タイミングベルト,ボールねじ,歯車,制御基板,電源および配線等の走査装置が設置されている。
【００６６】
図３は、上記第２ステージ８の上に載置される走査モジュール９の概略構成を示す縦断面図である。
【００６７】
図３において、上記走査モジュール９の上部には、サンプル台(ガラス)４の近傍に位置して、サンプル台４上にセットされたサンプル１６からの蛍光を集光する対物レンズ１７を配置している。さらに、対物レンズ１７の光軸と励起光の光源１８の光軸とが直交する位置には、光源１８から出射されて第１レンズ１９およびスポットサイズ調整レンズ２０で集光されたレーザ光等の励起光を対物レンズ１７に入射するように反射させるプリズム２１を配置している。尚、光源１８,第１レンズ１９,スポットサイズ調整レンズ２０,プリズム２１および対物レンズ１７によって励起光学系を構成している。
【００６８】
ここで、上記対物レンズ１７はレンズホルダ２７に格納されており、ステッピングモータ等の駆動部２９によって光軸方向に移動されて、焦点位置を変更可能になっている。また、スポットサイズ調整レンズ２０はレンズホルダ２８に格納されており、駆動部３０によって光軸方向に移動されて、スポットサイズを調整可能になっている。
【００６９】
また、図３において、上記対物レンズ１７の光軸上におけるプリズム２１の下方には、プリズム２１側から順に、対物レンズ１７によって集光されたサンプル１６からの蛍光を平行光に変換する第２レンズ２２、励起光カット用の波長フィルタ２３、波長フィルタ２３を通過した蛍光を集光する第３レンズ２４、および、第３レンズ２４を通過した蛍光の迷光をカットするピンホール２５が配置されている。さらに、対物レンズ１７の光軸上におけるピンホール２５の下方には、ピンホール２５を通過した蛍光を検出する検出器２６が配置されている。尚、第２レンズ２２,波長フィルタ２３,第３レンズ２４,ピンホール２５および検出器２６によって検出光学系を構成している。
【００７０】
上記構成を有する走査モジュール９では、光源１８から出射された励起光は、第１レンズ１９およびスポットサイズ調整レンズ２０で収束され、次いでプリズム２１によって反射されて、対物レンズ１７およびサンプル台４を通過して、サンプル１６における下面上の一点に集光される。その場合、プリズム２１の長手方向(第１レンズ１９の光軸に直交する方向)の長さは短く、上記長手方向に直交する方向の幅は狭くなっており、光源１８からの励起光は対物レンズ１７の光軸付近(励起光透過部)のみを通過するようになっている。
【００７１】
上記蛍光は、サンプル１６における上記励起光が照射された部分から周囲に等方的に出射される。そして、出射された蛍光のうちのガラスで成るサンプル台４を透過して対物レンズ１７に入射した成分が、対物レンズ１７,第２レンズ２２,波長フィルタ２３,第３レンズ２４およびピンホール２５を通過して、検出器２６によって検出される。そして、検出器２６で検出された信号は、内蔵されるＡＤ変換器等によってＡＤ変換等の処理が施された後に、ＰＣ５へ送出される。こうして、サンプル１６上の各測定点での蛍光強度の分布が内部メモリ等に記録される。
【００７２】
ここで、上述したように、上記対物レンズ１７を通過した蛍光は、収束光となって第２レンズ２２の方向に導かれる。そして、第２レンズ２２によって実質的に平行光になるように屈折される。また、第３レンズ２４は蛍光を集光する。また、ピンホール２５は空間的に迷光や検出面以外からの蛍光をカットするために配置される。例えば、サンプル１６の上面で発生した蛍光は、対物レンズ１７の焦点位置からずれているので、対物レンズ１７の後段に続く上記検出光学系によってピンポール２５の位置では広がった光となり、効率よくピンポールを透過することができないのである。尚、励起光カット用の波長フィルタ２３は、例えば回転フォルダ等に配置されて、励起光の波長に応じて他の波長のフィルタと交換可能になっている。
【００７３】
図３に示すように、上記対物レンズ１７における光軸を含む中央部分は、通常の凸レンズの機能(屈折のみで光を偏向)を有する凸レンズ部３１となっている。そして、サンプル１６から出射された蛍光のうち、放射角度の小さい蛍光は、この凸レンズ部３１の部分を通過して検出器２６に向かって集光される。
【００７４】
上記対物レンズ１７における凸レンズ部３１の周囲は、下方に向かって開いた円錐台形の筒状体３２となっている。そして、サンプル１６から出射された蛍光のうちの、凸レンズ部３１に入りきらないような放射角度の大きい蛍光は、筒状体３２の上端面から筒状体３２内に入射し、筒状体３２の外周面で全反射されて光軸側に偏向され、筒状体３２の下端面から検出器２６に向かって出射される。
【００７５】
以上のごとく、上記サンプル１６から出射された蛍光のうち、凸レンズ部３１に入りきらないような放射角度の大きい蛍光を、筒状体３２の外周面で全反射させることにより、通常の凸レンズでは集光できないような大きな放射角度の光をも集めることができる。そのため、検出器２６の感度アップを図ることができるのである。
【００７６】
ところで、上記光源１８として、上記ＤＰＳＳレーザを用いている。このＤＰＳＳレーザは、小型で可視領域において様々な波長で発振可能であるので、工業用途や理化学用途にしばしば用いられる。その原理は、半導体レーザダイオーから発振される励起レーザ光で固体レーザ媒質を励起し、この固体レーザ媒質から赤外レーザ光を発振させる。発振された赤外レーザ光に基づいて非線形光学結晶で第二高調波発生を起こさせて可視域の波長のレーザ光を発生させるものである。
【００７７】
図５にその概念図を示す。半導体レーザダイオード４１から出射された励起レーザ光は集光光学系４２を透過して固体レーザ媒質４３に集光される。そして、上記励起レーザ光は固体レーザ媒質４３に吸収されて固体レーザ媒質４３が励起される。こうして、固体レーザ媒質４３から発せられた赤外レーザ光は、非線形光学結晶４４に入射される。非線形光学結晶４４では、上記赤外レーザ光を基本波として第二高調波発生が起こり、可視光のレーザ光が発生する。非線形光学結晶４４を透過した赤外レーザ光は赤外光カットフィルタ４５で除かれ、可視光である第二高調波発生光のみが出力として取り出される。
【００７８】
上述のごとく、上記固体レーザ媒質４３は、上記励起レーザ光を吸収して上記赤外レーザ光を発振する。その場合に、キャビティ内に上記吸収による熱が発生する。そして、放熱が良くない環境下では固体レーザ媒質４３が膨張して光路がズレてしまい、可視光のレーザ出力に揺らぎが生ずる。
【００７９】
また、室温の変化や他の機器からの熱によって環境温度が変わると、レーザの放熱状態に影響し、レーザ出力がドリフトする。このような、環境温度の変化によるレーザの出力変動は、数分から数十分という比較的長周期の揺らぎとなる。
【００８０】
上記ＤＰＳＳレーザには、ドライバ(図示せず)を介して電流が注入される。ＤＰＳＳレーザにおける半導体レーザダイオード４１の出射側端面とは反対側の端面には、フォトダイオード(図示せず)が設置されており、半導体レーザダイオード４１の出力を検出可能になっている。そして、オートパワーコントロール(ＡＰＣ)では、検出した半導体レーザダイオード４１の出力を上記ドライバにフィードバックして、半導体レーザダイオード４１の出力が一定になるように制御している。
【００８１】
図６に、上記ＤＰＳＳレーザの光出力と経過時間との関係を示す。ＤＰＳＳレーザに電流が注入されてから２分〜３分の間は、半導体レーザダイオード４１および固体レーザ媒質４３と放熱部材とＤＰＳＳレーザの筐体との温度が変動し、上述のフィードバック制御が安定しないためにＤＰＳＳレーザの光出力は激しく変動する。そして、一定時間経過後に出力は安定するが、環境温度の変化により光出力に長周期の揺らぎが生じる。その場合に、上記ＡＰＣのフィードバック制御によって半導体レーザダイオード４１の出力は安定するのであるが、固体レーザ媒質４３および非線形光学結晶４４は上記フィードバック制御が行われないので、非線形光学結晶４４から出力される可視レーザ光には上述のような揺らぎが生ずるのである。
【００８２】
上述したように、上記励起光の光源１８として、小型,高効率,安価,軽量な上記ＤＰＳＳレーザが用いられている。こうすることによって、走査モジュール９が小型で軽量になり、高速走査を可能にしている。
【００８３】
高速走査中には、上記走査モジュール９の移動に伴って上記ＤＰＳＳレーザを用いた光源１８も移動するので、ＤＰＳＳレーザの環境温度が変化しやすい。また、本蛍光検出装置には発熱源が存在する。例えば、走査ステージ６を駆動する上記走査装置のモータや、走査モジュール９に搭載されているレンズ１７,２０を駆動するステッピングモータおよび波長フィルタ２３を切り替えるモータや、制御基板や、ＤＰＳＳレーザ用の上記ドライバ等がある。
【００８４】
これらの環境温度変化要因によって、本蛍光検出装置１の筺体を成す本体２内の環境温度は刻一刻と変化している。これに伴ってＤＰＳＳレーザの光出力も変動する。
【００８５】
本蛍光検出装置１で測定されるサンプル１６のサイズは、大きいものでＡ４からＡ３程度のサイズに及ぶ。このような大型のサンプル１６の全面を走査して蛍光画像を得る場合に、走査開始から走査終了までには１５分〜２０分程度の時間が掛かる。その間に、ＤＰＳＳレーザの光出力は数分〜数十分の周期で変動するため、本来の蛍光画像のコントラストとは異なるコントラストの蛍光画像が得られることになってしまう。
【００８６】
図７は、図中左上から走査モジュール９をラスタースキャンした場合にＰＣ５で得られる蛍光画像の一例を示す。但し、図７(a)は、上記ＤＰＳＳレーザの光出力に揺らぎが無く安定している場合である。また、図７(b)は、上記ＤＰＳＳレーザの光出力に揺らぎがある場合である。図７において、黒いスポット４０は蛍光強度が強い箇所を示している。総てのスポットの蛍光物質量が同等であれば、光出力に揺らぎの無い一定強度のＤＰＳＳレーザで蛍光光量を測定した場合には、図７(a)に示すように、スポット４０に濃度斑がない蛍光画像を得ることができる。
【００８７】
しかしながら、上記ＤＰＳＳレーザの光出力に長周期の出力変動がある場合には、総てのスポットの蛍光物質量が同等であるために本来は一定濃度の蛍光画像が得られる筈であるが、図７(b)に示すように部分的に濃度が低い蛍光画像が得られてしまう。これでは、蛍光検出装置を使用するユーザに、蛍光強度が弱いとの誤った情報を与えてしまうことになる。
【００８８】
この場合、上記走査モジュール９における光源１８からの光路上にビームスプリッタとフォトダイオードとを搭載し、走査モジュール９の走査中における光源１８からの光信号を、上記ビームスプリッタを介して上記フォトダイオードで検出してサンプル１６からの蛍光信号と同時に記憶しておく。そして、上記蛍光信号を画像化する際に、ＤＰＳＳレーザの光信号で蛍光信号を規格化することによって、上記蛍光信号における上記光信号の変動分をキャンセルさせることが可能になる。
【００８９】
ところが、その場合には、上記走査モジュール９にビームスプリッタとフォトダイオードとを搭載するため、走査モジュール９の構成部材が増加し、ビームスプリッタとフォトダイオードとの配置スペースが必要となって大型化の要因となる。また、走査モジュール９の重量増加にもつながる。
【００９０】
更には、上記光源１８からの励起光の一部を上記ビームスプリッタで反射させて上記フォトダイオードに導くので、上記励起光にロスが生じて励起光の光利用効率が低下することになる。
【００９１】
すなわち、上述したように、上記ＤＰＳＳレーザにおける光出力の揺らぎは長周期の揺らぎであるので、サンプル１６からの蛍光の総ての検出時においてＤＰＳＳレーザの光出力を規格化する必要はない。また、このように、一定の間隔で上記規格化を行えばよいのに対して、常に上記励起光の一部を上記ビームスプリッタで上記フォトダイオードに導くことは、励起光の使用効率が良くない。
【００９２】
さらには、上記フォトダイオードからの反射光が迷光となって検出器２６に入射し、蛍光光量の測定に影響を与える恐れがある。
【００９３】
そこで、本実施の形態においては、図２に示すように、上記第２ステージ８を構成する第１ガイド部材１１と第２ガイド部材１２との少なくとも何れか一方(本実施の形態では第１ガイド部材１１)に、フォトダイオードユニット３５を設けている。
【００９４】
図４は、図２におけるＡ‐Ａ'矢視断面図である。図２および図４に示すように、上記フォトダイオードユニット３５は、矩形を成す板状体の長辺を折り曲げてなるＬ字状のフォトダイオード取付部材３６と、フォトダイオード取付部材３６に取り付けられた上記光検出部としてのフォトダイオード３７とを、含んでいる。
【００９５】
図２および図４に示すように、上記フォトダイオード取付部材３６における折り曲げ箇所よりも一方側３６aの先端部は第１ガイド部材１１に取り付けられており、上記一方側３６aは垂直方向に延在している。したがって、上記折り曲げ箇所よりも他方側３６bは、第２走査方向に延在している。その場合、他方側３６bの先端３６cはサンプル台４の側端近傍に位置している。そして、他方側３６bにおける先端部の下面には受光面を下側に向けてフォトダイオード３７が取り付けられている。
【００９６】
さらに、上記走査モジュール９は、上記第２走査方向に移動する際には、サンプル台４の上記側端よりも外側まで移動するようになっている。そして、フォトダイオード３７の取り付け位置は、上記第２走査を行う走査モジュール９の折返し地点上となり、走査モジュール９が折返し地点に位置している場合に、対物レンズ１７の光軸とフォトダイオード３７の光軸とが一致するようになっている。
【００９７】
上記構成において、図７に示すようなラスタースキャンを行う場合には、先ず、走査ステージ６における第２ステージ８を上記第１走査方向の一端側の１列目に位置させ、走査モジュール９を上記折返し地点の位置に位置させる。以下、この位置を、走査モジュール９の待機位置とする。そして、本蛍光検出装置の立ち上げ時から上記ＤＰＳＳレーザの光出力が安定するまで、この待機位置で、フォトダイオード３７によって、走査モジュール９の対物レンズ１７から出射される光源１８の光出力を測定する。そして、例えばＰＣ５で光源１８の光出力を監視し、上記ＤＰＳＳレーザの光出力が電流注入後２分〜３分間の変動期を過ぎて長周期の揺らぎのみの状態になった後に、走査モジュール９を上記第２走査方向に移動させてサンプル台４上のサンプル１６からの蛍光光量の測定を開始する。
【００９８】
こうして、上記走査モジュール９による上記１列目の測定が終了すると、第２ステージ８の第１ガイド部材１１と第２ガイド部材１２とを上記第１走査方向の２列目に移動させた後、走査モジュール９を上記第２走査方向を上記１列目とは逆方向に移動させて上記２列目の測定を行う。こうして、走査モジュール９による上記２列目のサンプル１６からの蛍光光量の測定が終了する。ところが、その後も、走査モジュール９は上記第２走査方向を上記１列目とは逆方向に移動を続け、第１ガイド部材１１側の上記折返し地点に至る。
【００９９】
そうすると、上記第２ステージ８の第１ガイド部材１１と第２ガイド部材１２とが上記第１走査方向の３列目に移動される。その間、走査モジュール９は上記２走査方向には停止している。ここで、フォトダイオード３７が取り付けられたフォトダイオード取付部材３６は第１ガイド部材１１に取り付けられている。したがって、フォトダイオード３７の光軸は上記折返し地点に位置している走査モジュール９の対物レンズ１７の光軸と一致している。したがって、走査モジュール９が２列目から３列目に移動する間に、対物レンズ１７から出射される光源１８の光出力をフォトダイオード３７によって測定可能となる。
【０１００】
こうして、走査モジュール９が２列目から３列目に移動する間にフォトダイオード３７によって測定された光源１８の光量は、例えばＰＣ５のメモリにサンプル１６からの蛍光の強度と対応付けて記憶される。
【０１０１】
以下同様にして、上記走査モジュール９が上記第１走査方向に高速で往復走査を行う際に、１往復毎に、第１ガイド部材１１側の上記折返し地点において、対物レンズ１７から出射される励起光をフォトダイオード３７で受光し、受光された光量が上記メモリにサンプル１６からの蛍光の強度と対応付けて記憶される。
【０１０２】
そして、上記サンプル１６からの蛍光光量の測定が終了すると、ＰＣ５によって、上記メモリにサンプル１６からの蛍光強度に対応付けて記憶された上記励起光の強度を基準として、サンプル１６からの蛍光強度を規格化して、光源１８の光出力の変動分をキャンセルする。すなわち、本実施の形態においては、ＰＣ５を上記光強度補正部として機能させるのである。
【０１０３】
その場合における上記サンプル１６からの蛍光強度の規格化の方法については、特に限定するものではない。一番簡便な方法としては、フォトダイオード３７で受光された光量が１となるように割算を行う方法がある。
【０１０４】
上記光源１８である上記ＤＰＳＳレーザの光強度が一定であるならば、フォトダイオード３７で受光された光量も一定になる。しかしながら、上記ＤＰＳＳレーザの光強度が変動する場合には、フォトダイオード３７で受光された光量も変動する。その場合に、サンプル１６に対する励起光である上記ＤＰＳＳレーザの光強度と、測定領域である走査モジュール９の一往復間におけるサンプル１６からの蛍光強度とが比例すれのであれば、単純にサンプル１６からの蛍光強度をフォトダイオード３７で受光された光強度で割ることによって、サンプル１６からの蛍光強度における上記ＤＰＳＳレーザの光強度変動分を補正(キャンセル)することができる。
【０１０５】
これに対し、上記ＤＰＳＳレーザの光強度とサンプル１６からの蛍光強度とが比例しない場合には、上記ＤＰＳＳレーザの光強度と上記蛍光強度との関係を表す関数に応じて上記ＤＰＳＳレーザの光強度と上記蛍光強度との何れか一方に補正を行った後に、上述の割り算を行うことによって、サンプル１６からの蛍光強度における上記ＤＰＳＳレーザの光強度変動分を補正(キャンセル)することができる。
【０１０６】
また、上記走査モジュール９の一往復毎に上記ＤＰＳＳレーザの光強度のオフセット量が異なる場合には、上記一往復毎に上記ＤＰＳＳレーザの光強度から上記オフセット分を差し引いた値で、サンプル１６からの蛍光強度を割ることによって、上記補正を行うことができる。
【０１０７】
ここで、上述の説明においては、上記光源１８が単波長用の光源の場合を例に挙げて説明してきた。しかしながら、より多様な測定を可能にするために、３波長用の光源を用いても一向に差し支えない。
【０１０８】
この３波長用の光源においては、例えば、上記第１レンズ１９の光軸上に波長が５３２nmの第１光源を配置し、さらに波長が４８８nmの第２光源と波長が６３３nmの第３光源とを夫々の光軸が第１レンズ１９の光軸と直交するように配置する。そして、上記第２光源の光軸と第１レンズ１９の光軸との交差位置には、５２０nmより長い波長の光を透過するロングパスフィルタを配置し、上記第３光源の光軸と第１レンズ１９の光軸との交差位置には、６００nmよりも短い波長の光を透過するショートパスフィルタを配置する。
【０１０９】
尚、上記ロングパスフィルタおよびショートパスフィルタに替えて、ダイクロイックミラーを配置しても構わない。
【０１１０】
この場合でも、上記第１光源,第２光源および第３光源の夫々からの励起光に対して、スポットサイズ調整レンズ２０および駆動部３０によってスポットサイズを調整することができる。さらに、単波長用の光源の場合と同様にして、各光源からの励起光をフォトダイオード３７で受光し、サンプル１６からの蛍光強度を規格化することができる。
【０１１１】
以上のごとく、本実施の形態によれば、蛍光物質を励起する励起光を出射する光源１８と、上記励起光の照射に基づいてサンプル１６から発せられた蛍光を検出する上記検出光学系とを含むと共に、第１走査方向とこの第１走査方向に略直交する第２走査方向との二次元走査を行う走査モジュール９を備え、この走査モジュール９における光源１８からの励起光を検出するフォトダイオード３７を、第１ステージ７によって上記第１走査方向に往復動可能に支持された第２ステージ８の第１ガイド部材１１に取り付けている。
【０１１２】
また、上記フォトダイオード３７は、走査モジュール９の上記第２走査方向への走査線上におけるサンプル台４の外側に位置している。
【０１１３】
したがって、上記フォトダイオード３７は、走査モジュール９が上記第２走査方向へ走査する毎に、光源１８からの励起光を検出することができる。その場合、走査モジュール９が上記第１走査方向に移動しても、フォトダイオード３７は、上記第１走査方向に移動する第２ステージ８(第１ガイド部材１１)に取り付けられているので、必ず上記第２走査方向の走査線上に位置している。
【０１１４】
そのため、上記走査モジュール９による上記第２走査方向への走査毎に、フォトダイオード３７によって光源１８からの上記励起光の光強度を測定すればよく、例えば、走査モジュール９による上記第２走査方向への走査毎に、サンプル１６からの蛍光の強度を上記励起光の強度に基づいて補正することが可能になる。
【０１１５】
このように、本実施の形態においては、上記サンプル１６からの蛍光の強度を補正する際の上記励起光の強度として、上記蛍光の検出時と同様に、走査モジュール９の対物レンズ１７から出射された光の強度を検出するので、上述したように光源１８と対物レンズ１７との間から上記ビームスプリッタによって上記励起光の一部を取り出す場合に比して、上記励起光に光量ロスがなく、励起光の光利用効率の低下を防止することが可能になる。
【０１１６】
また、上記走査モジュール９に何ら手を加えることなくそのまま上記励起光の強度を測定することができ、上記検出光学系の複雑化,大型化に伴う重量増加が無く、サンプル１６からの蛍光の強度を精度よく補正することができる。
【０１１７】
さらに、上記ＰＣ５によって、フォトダイオード３７で検出された上記励起光の強度に基づいて、上記検出光学系で検出されたサンプル１６からの蛍光の強度を補正するようにしている。
【０１１８】
したがって、上記走査モジュール９の光源１８がＤＰＳＳレーザである場合に、数分から数十分の周期で光出力が１０％〜２０％増減する揺らぎに起因して、サンプル１６からの蛍光の強度に生ずる揺らぎを、上記ＤＰＳＳレーザからの励起光の強度に基づいて補正することができる。
【０１１９】
さらに、上記フォトダイオード３７による上記励起光の強度検出およびＰＣ５によるサンプル１６からの蛍光の強度補正は、走査モジュール９が上記二次元走査を行う際に行うようにしている。
【０１２０】
上記走査モジュール９は、上記走査装置からの引っ張り力によって、上記第２走査方向に移動可能になっている。したがって、上記第２走査方向への走査時には上記引っ張り力によって回転応力が生ずるため、この回転応力によって走査モジュール９に微小な傾きが発生する。その結果、光源１８からの励起光の光路にずれが生じて励起光の強度に変動が発生し、走査モジュール９が停止している状態と動作している状態とでは上記励起光の強度が異なることになる。
【０１２１】
しかしながら、上記フォトダイオード３７は、走査モジュール９が二次元走査を行う際に上記励起光の検出を行うので、実際にサンプル１６からの蛍光の光強度を検出する状態に近い状態で、上記励起光の検出を行うことができる。したがって、サンプル１６からの蛍光の強度に対する上記励起光の強度に基づく補正を、精度よく行うことができるのである。
【０１２２】
さらに、上記フォトダイオード３７は、走査モジュール９の上記第２走査方向への往復動の折返し地点に位置している。したがって、走査モジュール９の上記第２走査方向への一往復動において、何れか一方の折返し地点の近傍での１回のフォトダイオード３７による上記励起光の検出を行うことができる。
【０１２３】
このように、上記走査モジュール９の１往復毎に、フォトダイオード３７によって上記励起光の強度を検出してＰＣ５のメモリに記録するので、記憶するデータ量が必要最小限となる。
【０１２４】
ここで、上記走査モジュール９に対して上記走査装置から加えられる引っ張り力の向きは、上記第２走査方向への往復動の往路と復路とでは反対になるので、走査モジュール９の傾き方向も反対となる。したがって、光源１８からの励起光の強度も上記往路と上記復路とでは異なることになる。このことから、フォトダイオード３７を、走査モジュール９の上記第２走査方向への往復動の両折返し地点に位置させて、走査モジュール９の上記一往復動における両方の折返し地点で２回の上記励起光の検出を行う方が望ましい。
【０１２５】
尚、上記実施の形態においては、上記ＰＣ５を上記光強度補正部として機能させて、サンプル１６からの蛍光の強度を上記励起光の強度に基づいて補正するようにしている。しかしながら、ＰＣ５に上記位置補正部としての機能をも持たせることによって、フォトダイオード３７によって検出された光源１８からの上記励起光の強度に基づいて、上記検出光学系で検出されたサンプル１６からの蛍光の位置を補正することができる。
【０１２６】
上記走査モジュール９には、上記第２走査方向への往復動作を繰り返すことによって、本来の位置から上記第２走査方向に少しずつずれて行く経時的な変化がある。そのため、サンプル１６からの蛍光の強度に対する上記励起光の強度に基づく正確な補正を行うためには、サンプル１６からの蛍光の位置を補正する必要がある。
【０１２７】
そこで、上述したように、上記ＰＣ５に上記位置補正部としての機能を持たせることによって、フォトダイオード３７で検出された上記励起光の強度に基づいて、ＰＣ５によって、走査モジュール９の上記検出光学系で検出されたサンプル１６からの蛍光の位置を補正することができるのである。
【０１２８】
ここで、上記走査モジュール９の位置は、エンコーダ(図示せず)の値に基づいて算出される。そこで、フォトダイオード３７による上記励起光の検出結果によって、上記エンコーダの値に基づく走査モジュール９の位置とフォトダイオード３７の検出結果に基づく本来の走査モジュール９の位置との間のズレ量を算出して上記エンコーダの値を補正することにより、上記蛍光の位置を補正することができるのである。
【０１２９】
こうして、上記サンプル１６からの蛍光の位置を補正することによって、サンプル１６からの蛍光の強度分布を正確に検出することができる。
【０１３０】
ところで、上記走査モジュール９の位置ずれは、上術した経時な変化の他に、走査モジュール９を上記第２走査方向に往復動させることによる走査モジュール９の傾きに起因する上記励起光の光路変化によっても発生するため、往路と復路とで上記エンコーダに基づく位置が異なる。そのために、上記励起光によるサンプル１６の照射位置(スポット位置)も夫々反対方向にずれる。
【０１３１】
したがって、上記フォトダイオード３７は、走査モジュール９の上記第２走査方向への一往復動における両方の折返し地点で２回の上記励起光の検出を行い、ＰＣ５は上記励起光の検出結果に基づいて、往路と復路とで夫々異なる補正値を算出して上記エンコーダの値を補正することが望ましい。
【０１３２】
尚、本実施の形態においては、上記フォトダイオード３７を、走査モジュール９の上記第２走査方向への一往復動における折返し地点に設けている。しかしながら、この発明はこれに限定されるものではなく、走査モジュール９の上記第２走査方向への走査線上における上記折返し地点よりも内側であって且つサンプル台４の外側であれば、何れの箇所に設けても差し支えない。但し、上記折返し地点に設けた場合が、フォトダイオード３７と走査モジュール９の対物レンズ１７との光軸が一致する時間を最長にすることができる。
【０１３３】
また、上記フォトダイオード３７の配置位置をサンプル台４よりも上側にして、対物レンズ１７による上記励起光の焦点位置とは異なる位置に配置するようにしてもよい。その場合には、フォトダイオード３７からの反射光が光源１８を構成するＤＰＳＳレーザに戻り、ＤＰＳＳレーザの動作が不安定になるのを防止することができる。
【０１３４】
・第２実施の形態
本実施の形態の蛍光検出装置における外観図は、上記第１実施の形態の場合における図１と同様である。また、走査ステージの外観図も、上記第１実施の形態の場合における図２と同様である。また、走査モジュールの縦断面図も、上記第１実施の形態の場合における図３と同様である。そこで、以下においては、上記第１実施の形態の場合と同じ部材には同じ番号を付して説明を行う。
【０１３５】
上記第１実施の形態の場合においては、図４に示す走査ステージの断面図において、フォトダイオード取付部材３６に、フォトダイオード３７を取り付けている。これに対し、本実施の形態は、フォトダイオード取付部材３６に、フォトダイオード３７に替えて、例えば反射部材あるいは蛍光部材等のごとく、光源１８からの励起光を受けて光を発することが可能な部材である標識部(図示せず)を取り付けた点において、上記第１実施の形態とは異なる。そして、上記標識部から発せられた光を上記光検出部としてのフォトダイオードで検出するのである。
【０１３６】
尚、上記フォトダイオードの設置箇所については特に限定するものではなく、上記標識部から発せられた光を安定して受光できる箇所であればよい。例えば、フォトダイオード取付部材３６に取り付ければよい。
【０１３７】
このように、本実施の形態においては、上記第１実施の形態の場合と同様の走査モジュール９を備え、この走査モジュール９における光源１８からの励起光を受けて光を発する上記標識部を、第１ステージ７によって上記第１走査方向に往復動可能に支持された第２ステージ８の第１ガイド部材１１に取り付けている。また、上記標識部は、走査モジュール９の上記第２走査方向への走査線上におけるサンプル台４の外側に位置している。
【０１３８】
したがって、上記フォトダイオードは、走査モジュール９が上記第２走査方向へ走査する毎に、光源１８からの励起光を上記標識部を介して検出することができる。その場合、走査モジュール９が上記第１走査方向に移動しても、上記標識部は、上記第１走査方向に移動する第２ステージ８(第１ガイド部材１１)に取り付けられているので、必ず上記第２走査方向の走査線上に位置している。そのため、走査モジュール９による上記第２走査方向への走査毎に、上記フォトダイオードによって上記標識部から発せられた光の強度を測定すればよい。
【０１３９】
このように、本実施の形態においては、上記サンプル１６からの蛍光の強度を補正する際の上記励起光の強度として、上記蛍光の検出時と同様に、走査モジュール９の対物レンズ１７から出射された光の強度を検出するので、上述したように光源１８と対物レンズ１７との間から上記ビームスプリッタによって上記励起光の一部を取り出す場合に比して、上記励起光に光量ロスがなく、励起光の光利用効率の低下を防止することが可能になる。
【０１４０】
また、上記走査モジュール９に何ら手を加えることなくそのまま上記励起光の強度を測定することができ、上記検出光学系の複雑化,大型化に伴う重量増加が無く、サンプル１６からの蛍光の強度を精度よくＰＣ５によって補正することができる。
【０１４１】
その他、詳述はしないが、本実施の形態の場合にも、上記第１実施の形態の場合と同様の効果を奏することができる。
【０１４２】
尚、本実施の形態の場合にも、上記第１実施の形態の場合と同様に、上記ＰＣ５を上記位置補正部として機能させて、サンプル１６からの蛍光の位置を上記標識部から発せられた光の強度に基づいて補正することができる。
【０１４３】
その場合、上記第１実施の形態で述べたように、上記走査モジュール９の位置ずれは走査モジュール９の往復時の傾きに起因する上記励起光の光路変化によっても発生する。そこで、上記標識部は、走査モジュール９の上記第２走査方向への一往復動における両方の折返し地点の近傍で２回の上記発光を行い、ＰＣ５は上記標識部を介した上記励起光の検出結果に基づいて、往路と復路とで夫々異なる補正値を算出して上記エンコーダの値を補正することが望ましい。
【符号の説明】
【０１４４】
１…蛍光検出装置、
４…サンプル台、
５…ＰＣ、
６…走査ステージ、
７…第１ステージ、
８…第２ステージ、
９…走査モジュール、
１１…第１ガイド部材、
１２…第２ガイド部材、
１６…サンプル、
１７…対物レンズ、
１８…光源、
２６…検出器、
３５…フォトダイオードユニット、
３６…フォトダイオード取付部材、
３７…フォトダイオード。
【図１】
2014052235.tif 000003
【図２】
2014052235.tif 000004
【図３】
2014052235.tif 000005
【図４】
2014052235.tif 000006
【図５】
2014052235.tif 000007
【図６】
2014052235.tif 000008
【図７】
2014052235.tif 000009