(57)【要約】【課題】ＰＰＡＲγ活性化作用に起因する副作用が軽減され、ＰＰＡＲγ活性化作用を有する糖尿病治療薬の使用が制限されている糖尿病患者に対しても投薬可能な、糖尿病の治療剤又は予防剤を提供すること。【解決手段】本発明は、下記の化学式（Ｉ）で示されるチオウレア誘導体を有効成分として含有する、糖尿病の治療剤又は予防剤を提供する。2014198674.tif 000010【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の化学式（Ｉ）で示されるチオウレア誘導体を有効成分として含有する、糖尿病の治療剤又は予防剤。
【化１】
2014198674.tif 000009
【請求項２】
前記糖尿病は、２型糖尿病である、請求項１記載の治療剤又は予防剤。
【請求項３】
血糖降下作用を有する、請求項１又は２記載の治療剤又は予防剤。
【請求項４】
耐糖能異常改善作用を有する、請求項１〜３のいずれか一項記載の治療剤又は予防剤。
【請求項５】
ミトコンドリア機能改善作用を有する、請求項１〜４のいずれか一項記載の治療剤又は予防剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖尿病の治療剤又は予防剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病は、インスリンの量的不足又は作用不足を伴う慢性高血糖状態を主徴とする代謝疾患群である。糖尿病は、インスリン依存型糖尿病（ｉｎｓｕｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｍｅｌｉｔｕｓ：以下、ＩＤＤＭ）、インスリン非依存型糖尿病（ｎｏｎ−ｉｎｓｕｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｍｅｌｉｔｕｓ：以下、ＮＩＤＤＭ）、妊娠糖尿病（ｇｅｓｔａｔｉｏｎａｌ  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｍｅｌｉｔｕｓ：以下、ＧＤＭ）、その他特定の作用機序による糖尿病の４種類に分類される。一般的に、ＩＤＤＭを１型糖尿病、ＮＩＤＤＭを２型糖尿病とよび、糖尿病患者の約９５％は２型糖尿病に分類される（非特許文献１）。
【０００３】
２型糖尿病の患者数は世界的に増加を続けており、その背景には、食生活の欧米化若しくは自動車の普及や交通機関の発達に伴う運動不足を背景とした肥満の増加、又は、基礎代謝量の低下を原因としたインスリンの作用不足、すなわちインスリン抵抗性が強く関与している（非特許文献２）。
【０００４】
インスリン抵抗性は、骨格筋、肝臓又は脂肪組織等の末梢組織におけるインスリンの作用不足により、糖取り込み量の低下、糖新生の亢進、アディポネクチンの低下、又は、ＴＮＦ−α、レジスチン若しくはＩＬ−６等の炎症性サイトカインの増加等の変化を引き起こすことが知られており、２型糖尿病の成因とも言われている（非特許文献３）。
【０００５】
現在、上市されている２型糖尿病の治療薬は、作用機序の違いにより、主に、インスリン製剤、ＧＬＰ１受容体作動薬、スルホニル尿素薬、即効性インスリン分泌促進薬、αグルコシダーゼ阻害薬、ビグアナイド薬、ＤＰＰ４阻害薬又はチアゾリジン誘導体に分類される。
【０００６】
チアゾリジンジオン誘導体であるピオグリタゾンやロシグリタゾンは、２型糖尿病の成因であるインスリン抵抗性に対する改善作用を有する２型糖尿病治療薬である（非特許文献４）。その作用機序は、核内転写因子の一つであるペルオキシソーム増殖剤応答性受容体ガンマー（Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｇａｍｍａ：以下、ＰＰＡＲγ）を活性化することにより、障害を受けているインスリン受容体の機能回復、それに伴うインスリン感受性の向上及び末梢組織のインスリン抵抗性の改善を導き、２型糖尿病に対して治療効果を発揮するとされている（非特許文献５）。
【０００７】
近年、チアゾリジンジオン誘導体は、ＰＰＡＲγ活性化作用とは異なる作用機序で糖尿病に対して治療効果を発揮していることが報告され、例えば、２型糖尿病患者で低下したミトコンドリアＤＮＡ量の増加又はクエン酸合成酵素の活性増加（ミトコンドリア機能改善作用）により、糖尿病に対して治療効果を発揮している可能性が示されている（非特許文献６）。
【０００８】
一方、特許文献１では、下記の一般式で示されるウレア誘導体が開示され、本発明に係わるチオウレア誘導体とは異なる一部の化合物が代謝症候群及び関連障害の処置のための可溶性エポキシドヒドロラーゼ（以下、ｓＥＨ）阻害剤として有用であることが示唆されている。
【化１】
2014198674.tif 000002
［式中、Ｒ１は、置換されたアリール基等を表し、Ｒ２は、置換されたヘテロシクロアルキル基等を表し、Ｑは、酸素原子又は硫黄原子を表す。］
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際公開第２０１０／０５３８２９号
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｔｈｅ  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｍｅｌｌｉｔｕｓ、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ、１９９７年、第２０巻、ｐ．１１８３−１１９７
【非特許文献２】Ｙａｚａｋｉら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２００６年、第１２巻、ｐ．７３−７４
【非特許文献３】Ｋａｄｏｗａｋｉら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｒｅｖｉｅｗ、２００５年、第２６巻、ｐ．４３９−４５１
【非特許文献４】Ｃａｒｉｉｏｕら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ、２０１２年、第２３巻、ｐ．２０５−２１５
【非特許文献５】Ｇｉｌｌｉｅｓら、Ｄｒｕｇｓ、２０００年、第６０巻、ｐ．３３３−３４３
【非特許文献６】Ｂｏｇａｃｋａら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ、２００５年、第５４巻、ｐ．１３９２−１３９９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
しかしながら、ピオグリタゾンやロシグリタゾン等のチアゾリジンジオン誘導体は、ＰＰＡＲγ活性化作用を有しており、ＰＰＡＲγ活性化作用に起因する副作用（体重増加や浮腫等）を回避することが困難なために、心不全の患者、体重コントロールが必要な患者や既往者には使用上の制限があるのが現状である。このため、慢性疾患である糖尿病の治療においては、これら副作用を軽減した医薬品の開発が急務であり、医療の現場から切望されている。
【００１２】
また、特許文献１で開示されたウレア誘導体は、ｓＥＨ阻害作用を有することが示唆されているものの、ＰＡＲＲγ活性化作用やミトコンドリア機能改善作用を有するか否かについては明らかにされておらず、ましてや糖尿病の治療剤としての医薬用途については開示も示唆もされていない。
【００１３】
そこで、本発明の目的は、ＰＰＡＲγ活性化作用に起因する副作用が軽減され、ＰＰＡＲγ活性化作用を有する糖尿病の治療薬の使用が制限されている糖尿病患者に対しても投薬可能な、糖尿病の治療剤又は予防剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、下記の化学式（Ｉ）で示されるチオウレア誘導体がＰＰＡＲγ活性化作用を有さず、ＰＰＡＲγ活性化作用に起因する副作用が著しく軽減していること、ミトコンドリア機能改善作用を有すること、且つ、ミトコンドリア機能改善作用に基づき糖尿病に対して優れた治療効果及び予防効果を示すことを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１５】
すなわち、本発明は、下記の化学式（Ｉ）で示されるチオウレア誘導体を有効成分として含有する、糖尿病の治療剤又は予防剤を提供する。
【化２】
2014198674.tif 000003
【００１６】
上記の糖尿病の治療剤又は予防剤は、２型糖尿病の治療剤又は予防剤であることが好ましく、血糖降下作用、耐糖能異常改善作用及び／又はミトコンドリア機能改善作用を有することがさらに好ましい。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の糖尿病の治療剤又は予防剤は、血糖降下作用、耐糖能異常改善作用及び／又はミトコンドリア機能改善作用を発揮し、糖尿病を治療又は予防できる。さらに、本発明の糖尿病の治療剤又は予防剤は、ＰＰＡＲγ活性化作用を有さず、ＰＰＡＲγ活性化作用に起因する副作用が著しく軽減されていることから、ＰＰＡＲγ活性化作用を有する糖尿病治療薬の使用が制限されている糖尿病患者に対しても投薬でき、慢性的な投薬にも適している。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】実施例１の化合物のＰＰＡＲγ活性化に対する作用を示す図である。
【図２】実施例１の化合物のｉｎ  ｖｉｔｒｏミトコンドリア機能改善作用を示す図である。
【図３】実施例１の化合物の体重に対する作用を示す図である。
【図４】実施例１の化合物の随時血糖値に対する作用を示す図である。
【図５】実施例１の化合物の空腹時血糖値に対する作用を示す図である。
【図６】実施例１の化合物の耐糖能に対する作用を示す図である。
【図７】実施例１の化合物の耐糖能に対する作用を示す図である。
【図８】実施例１の化合物のｉｎ  ｖｉｖｏミトコンドリア機能改善作用を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明の糖尿病の治療剤又は予防剤は、下記の化学式（Ｉ）で示されるチオウレア誘導体を有効成分として含有することを特徴としている。
【化３】
2014198674.tif 000004
【００２０】
上記のチオウレア誘導体は、水和物、溶媒和物又は結晶多形を形成してもよい。
【００２１】
上記のチオウレア誘導体は、公知の方法又はこれに準じた方法に従って製造でき、その際、原料化合物は市販の試薬又はその塩を用いてもよい。例えば、市販されている３，５−ジクロロフェニルイソチオシアネートにエチル４−アミノ−１−ピペリジンカルボキシレートを作用させるウレア化反応又はこれに準ずる方法に従って、上記のチオウレア誘導体を製造できる。なお、上記のチオウレア誘導体は、公知の方法、例えば、溶媒抽出、再結晶及び／又はクロマトグラフィーによって単離精製できる。
【００２２】
糖尿病とは、インスリンの量的不足又は作用不足を伴う慢性高血糖状態を主徴とする代謝疾患群であり、世界保健機構、日本糖尿病学会、米国糖尿病協会又は欧州糖尿病協会等の診断基準に該当する病態を意味する。
【００２３】
糖尿病は、基本的にＩＤＤＭ、ＮＩＤＤＭ、ＧＤＭ、その他特定の作用機序による糖尿病の４種類に分類される。一般的に、ＩＤＤＭは１型糖尿病、ＮＩＤＤＭは２型糖尿病とよばれる。上記の糖尿病の治療剤又は予防剤は、２型糖尿病の治療又は予防に好ましく用いることができる。
【００２４】
また、上記の糖尿病の治療剤又は予防剤は、血糖降下作用、耐糖能異常改善作用及びミトコンドリア機能改善作用を有することがより好ましい。
【００２５】
血糖降下作用とは慢性高血糖状態において血糖値を低下させることを意味し、血糖値とは随時血糖値及び／又は空腹時血糖値を意味する。
【００２６】
耐糖能とはグルコースの処理能力の指標であり、耐糖能異常とはグルコース処理能力の低下を意味する。耐糖能異常改善作用とはグルコース処理能力を向上させる作用を意味する。
【００２７】
耐糖能は、経口ブドウ糖負荷試験（Ｏｒａｌ  Ｇｌｕｃｏｓｅ  Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  Ｔｅｓｔ：以下、ＯＧＴＴ）、静脈内ブドウ糖負荷試験（Ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ  Ｇｌｕｃｏｓｅ  Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  Ｔｅｓｔ：ＩＶＧＴＴ）、腹腔内ブドウ糖負荷試験（Ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ  Ｇｌｕｃｏｓｅ  Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  Ｔｅｓｔ：ＩＰＧＴＴ）のいずれかの方法で評価できる。
【００２８】
ミトコンドリア機能改善作用とは、低下したミトコンドリア機能を改善させる作用を意味する。ミトコンドリア機能は主にＡＴＰの合成や脂肪酸分解作用が挙げられる。ミトコンドリア機能の低下は、２型糖尿病患者で認められており、ミトコンドリア機能を改善する薬剤は、２型糖尿病に対して有効であることが示唆されている（Ｒｏｂｉｎら、Ｔｏｒｅｎｄｓ  ｉｎ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｃｉｅｎｃｅ、２０１２、第３３巻、ｐ．３４１−３５２）。したがって、上記の糖尿病の治療剤又は予防剤は、ミトコンドリア機能改善作用を有するため、その作用に基づき糖尿病、特に２型糖尿病に対して優れた治療効果及び予防効果を示す。
【００２９】
ミトコンドリア機能は、ＡＴＰ量測定、β酸化測定、ミトコンドリア呼吸測定、クエン酸合成酵素活性測定、膜電位測定、ミトコンドリア機能関連遺伝子量の測定、ミトコンドリアＤＮＡ（以下、ｍｔＤＮＡ）量の測定等のいずれか又はいくつかの方法を用いて評価できる。上記の糖尿病の治療剤又は予防剤のミトコンドリア機能改善作用は、例えば、培養細胞中のｍｔＤＮＡ量の測定又は組織中のｍｔＤＮＡ量を定量することで評価できる。
【００３０】
上記の糖尿病の治療剤又は予防剤の、糖尿病に対する効果を評価する方法としては、例えば病態モデル動物を用いた評価方法が挙げられる。病態モデル動物としては、高脂肪食誘導肥満・糖尿病マウス（Ｄｉｅｔ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｏｂｅｓｉｔｙ：ＤＩＯマウス）、肥満・２型糖尿病マウス（ｄｂ／ｄｂマウス、ｏｂ／ｏｂマウス、ＫＫ／Ｔａマウス、ＫＫ−Ａｙマウス）、肥満・２型糖尿病ラット（Ｚｕｃｋｅｒ  ｆａｔｔｙラット、Ｚｕｃｋｅｒ  ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｆａｔｔｙラット）等が挙げられる。病態モデル動物における糖尿病に対する有効性は、血中グリコヘモグロビン値（ＨｂＡｌｃ）、随時血糖値、空腹時血糖値、血中ｃ−ペプチド値、血中グリコアルブミン値、１，５−ＡＧ（１，５−アンヒドログリシトール）値、血中空腹時インスリン値、ＯＧＴＴにおける耐糖能異常改善作用、ＨＯＭＡ−ＩＲ、高インスリン正常血糖クランプ法における全身糖利用率、インスリン負荷試験（Ｉｎｓｌｉｎ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｔｅｓｔ：ＩＴＴ）におけるインスリン感受性等を指標として評価できる。
【００３１】
また、上記の糖尿病の治療剤又は予防剤は、ＰＰＡＲγ活性化作用を有さず、ＰＰＡＲγ活性化作用に起因する副作用が著しく軽減されていることから、糖尿病の治療又は予防に極めて有用である。なお、ＰＰＡＲγ活性化作用は、例えば、ＰＰＡＲγ  ｌｉｇａｎｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ（以下、ＰＰＡＲ−γＬＢＤ）に対するリガンド応答性の時間分解蛍光共鳴エネルギー転移（以下、ＴＲ−ＦＲＥＴ）を指標として評価できる。
【００３２】
一方、特許文献１で開示されたウレア誘導体は、ｓＥＨ阻害作用を有することが示唆されている。しかし、上記の糖尿病の治療剤又は予防剤と、特許文献１に記載の実施例化合物の、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるｓＥＨ阻害作用について、公知の方法（Ｗｏｌｆら、Ａｎａｔｙｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００６、第３５５巻、ｐ．７１−８０）に従い、それぞれの化合物を２μＭにおいて評価したところ、上記の糖尿病の治療剤又は予防剤のｓＥＨ阻害作用（酵素非添加、酵素添加時の反応をそれぞれ０％、１００％とした場合）は約２％、特許文献１に記載の実施例化合物のｓＥＨ阻害作用は約５２％であった。このように、上記の糖尿病の治療剤又は予防剤のｓＥＨ阻害作用は著しく弱いため、上記の糖尿病の治療剤又は予防剤の糖尿病に対する治療効果及び予防効果は、ｓＥＨ阻害作用に基づき発揮される可能性は極めて低い。
【００３３】
上記の糖尿病の治療剤又は予防剤は、哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ヒツジ、サル又はヒト）、特にヒトに対して投与した場合に、糖尿病に対する治療効果又は予防効果を発揮できる。
【００３４】
上記の糖尿病の治療剤又は予防剤の投与形態としては、上記のチオウレア誘導体を無添加の状態で又は医薬として許容される担体を配合して、経口的又は非経口的に投与できる。
【００３５】
上記の糖尿病の治療剤又は予防剤を経口投与する場合の剤形としては、例えば、錠剤（糖衣錠及びフィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤及びマイクロカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤又は懸濁剤が挙げられ、非経口投与する場合の剤形としては、例えば、注射剤、注入剤、点滴剤又は坐剤が挙げられる。また、上記の糖尿病の治療剤又は予防剤は、上記のチオウレア誘導体を、適当な基剤（例えば、酪酸の重合体、グリコール酸の重合体、酪酸−グリコール酸の共重合体、酪酸の重合体とグリコール酸の重合体との混合物又はポリグリセロール脂肪酸エステル）と組み合わせて、徐放性製剤とすることも可能であり、糖尿病の治療に有効である。
【００３６】
上記の糖尿病の治療剤又は予防剤の剤形は、製剤分野で一般的に用いられている方法に従って調製できる。この場合、必要に応じて、製剤分野において一般的に用いられる賦形剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、甘味剤、界面活性剤、懸濁化剤、乳化剤等を含有させて調製できる。
【００３７】
錠剤の調製は、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤又は滑沢剤を含有させて行うことができ、丸剤及び顆粒剤の調製は、例えば、賦形剤、結合剤又は崩壊剤を含有させて行うことができる。また、散剤及びカプセル剤の調製は、例えば、賦形剤を、シロップ剤の調製は、例えば、甘味剤を、乳剤及び懸濁剤の調製は、例えば、界面活性剤、懸濁化剤又は乳化剤を含有させて行うことができる。
【００３８】
賦形剤としては、例えば、乳糖、ブドウ糖、デンプン、ショ糖、微結晶セルロース、カンゾウ末、マンニトール、炭酸水素ナトリウム、リン酸カルシウム又は硫酸カルシウムが挙げられる。結合剤としては、例えば、デンプンのり液、アラビアゴム液、ゼラチン液、トラガント液、カルボキシメチルセルロース液、アルギン酸ナトリウム液又はグリセリンが挙げられる。崩壊剤としては、例えば、デンプン又は炭酸カルシウムが挙げられる。滑沢剤としては、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、ステアリン酸カルシウム又は精製タルクが挙げられる。甘味剤としては、例えば、ブドウ糖、果糖、転化糖、ソルビトール、キシリトール、グリセリン又は単シロップが挙げられる。界面活性剤としては、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリソルベート８０、ソルビタンモノ脂肪酸エステル又はステアリン酸ポリオキシル４０が挙げられる。懸濁化剤としては、例えば、アラビアゴム、アルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース又はベントナイトが挙げられる。乳化剤としては、例えば、アラビアゴム、トラガント、ゼラチン又はポリソルベート８０が挙げられる。
【００３９】
さらに、上記の糖尿病の治療剤又は予防剤を、上記の剤形に調製する場合は、製剤分野において一般的に用いられる、着色剤、保存剤、芳香剤、矯味剤、安定剤、粘稠剤等を添加することができる。
【００４０】
上記の糖尿病の治療剤又は予防剤は、上記のチオウレア誘導体を、０．００１〜９９重量％含有することが好ましく、０．０１〜９９重量％含有することがより好ましい。上記の糖尿病の治療剤又は予防剤の、有効投与量及び投与回数は、投与形態、患者の年齢、体重又は治療すべき症状の性質若しくは重篤度によっても異なるが、通常成人１日当り有効成分として、１〜１０００ｍｇを、好ましくは１〜３００ｍｇを、１回又は数回に分けて投与することができる。
【００４１】
なお、上記の糖尿病の治療剤又は予防剤は、単独で投与してもよいが、疾患の予防効果若しくは治療効果の補完又は増強、あるいは投与量の低減のために、他の薬剤と配合するか、他の薬剤と併用して使用することもできる。
【００４２】
上記の糖尿病の治療剤又は予防剤を併用薬剤と併用して使用する場合には、上記の糖尿病の治療剤又は予防剤、及び、併用薬剤の投与時期は特に限定されず、これらを投与対象に対して同時に投与してもよいし、時間差をおいて投与しても構わない。また、併用薬剤は低分子化合物であってもよいし、タンパク質、ポリペプチド若しくは抗体等の高分子又はワクチン等であっても構わない。併用薬剤の投与量は、臨床上用いられている投与量を基準として、適宜選択することができる。上記の糖尿病の治療剤又は予防剤と併用薬剤との配合比は、投与対象、投与ルート、対象疾患、症状、又は、上記の糖尿病の治療剤又は予防剤と併用薬剤の組み合わせ等により適宜選択することができる。例えば、投与対象がヒトである場合には、上記の糖尿病の治療剤又は予防剤に対し、併用薬剤を０．０１〜９９．９９の配合比で用いればよい。
【実施例】
【００４３】
以下、実施例を用いて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００４４】
以下の記載において、ＮＭＲデータ中の溶媒名は、測定に使用した溶媒を示している。また、４００ＭＨｚ  ＮＭＲスペクトルは、ＪＮＭ−ＡＬ４００型核磁気共鳴装置（日本電子製）を用いて測定した。ケミカルシフトは、テトラメチルシランを基準としてδ（単位：ｐｐｍ）で表し、シグナルはそれぞれｓ（一重線）、ｄ（二重線）、ｑ（四重線）、又はｍ（多重線）で表した。ＥＳＩ−ＭＳスペクトルは、１２００ＬＣ／ＭＳＤ（ＡｇｉｌｅｎｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ製）を用いて測定した。溶媒は全て市販のものを用いた。
【００４５】
（実施例１）エチル  ４−（３−（３，５−ジクロロフェニル）チオウレイド）ピペリジン−１−カルボキシレートの合成： 
【化４】
2014198674.tif 000005
３，５−ジクロロフェニルイソチオシアネート（３．９５ｇ、１９．４ｍｍｏｌ）、をトルエン（６５ｍＬ）に溶解させ、室温でエチル  ４−アミノ−１−ピペリジンカルボキシレート（３．３３ｇ、１９．４ｍｍｏｌ）をゆっくり加え、室温で２時間撹拌した。反応混合物をろ過し、ろ取した固体をトルエンで洗浄した。得られた固体を酢酸エチル（４０ｍＬ）で再結晶し、エチル  ４−（３−（３，５−ジクロロフェニル）チオウレイド）ピペリジン−１−カルボキシレート（以下、実施例１の化合物）（４．２２ｇ、１１．２ｍｍｏｌ、５７％）を白色固体として得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）
δ：１．２５（３Ｈ，ｓ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），１．２８−１．４０（２Ｈ，ｍ），２．０８−２．１７（２Ｈ，ｍ），２．８７−３．００（２Ｈ，ｍ），４．１０−４．２０（２Ｈ，ｍ），４．１２（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），４．４０−４．５５（１Ｈ，ｍ），５．８７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．１２（２Ｈ，ｓ），７．２８（１Ｈ，ｓ），７．６０（１Ｈ，ｓ）．
ＭＳ（ＥＳＩ）［Ｍ＋Ｈ］＋：３７７．
【００４６】
（実施例２）ＰＰＡＲγ活性化作用：
実施例２〜５で用いた実施例１の化合物は東レ株式会社医薬研究所内で合成し、ピオグリタゾン塩酸塩（以下、ピオグリタゾン）はＫｅｍｐｒｏｔｅｃ  Ｌｉｍｉｔｅｄから購入したものを用いた。
【００４７】
実施例１の化合物のＰＰＡＲγ活性化作用は、ヒトＰＰＡＲ−γＬＢＤに対するリガンド応答性のＴＲ−ＦＲＥＴを指標として測定した。測定にはＬａｎｔｈａＳｃｒｅｅｎ（登録商標）ＴＲ−ＦＲＥＴ  Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＰＰＡＲ）ｇａｍｍａ  Ｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（インビトロジェン）を用いた。
【００４８】
実施例１の化合物及びピオグリタゾンは、ジメチルスルホキシド（以下、ＤＭＳＯ）に溶解し、上記キットに添付のアッセイバッファーを用いて２００μＭを最大濃度として公比３で段階希釈した（１ｎＭ〜２００μＭ）。３８４ウェルブラックプレート（コーニング）に、希釈した被験化合物を１０μＬ／ウェル添加した後、氷冷したアッセイバッファーを用いて２０ｎＭに調製したＰＰＡＲγ−ＬＢＤを５μＬ／ウェル添加した。さらに、常温のアッセイバッファーを用いて調製した０．５μＭの蛍光ペプチド（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−ＴＲＡＰ２２０／ＤＲＩＰ−２  ｐｅｐｔｉｄｅ）及び２０ｎＭのテルビウム標識抗ＧＳＴ抗体を、上記の３８４ウェルブラックプレートにそれぞれ５μＬ／ウェル添加した。なお、被験化合物各濃度につき、Ｎ＝４で実施した。
【００４９】
上記の３８４ウェルブラックプレートを、遮光下、常温で２時間インキュベーションし、反応液の蛍光波長（励起波長３４０ｎｍ、蛍光波長４９０ｎｍ及び５２０ｎｍ）をマルチラベルカウンターＥｎｖｉｓｉｏｎ（パーキンエルマー）にて測定した。被験化合物添加時の５２０ｎｍにおける測定値と４９０ｎｍにおける測定値の比（被験化合物Ｒａｔｉｏ＝Ｅｍ５２０／Ｅｍ４９０）を算出し、平均値（Ｎ＝４）を求めた。また、被験化合物非添加時の５２０ｎｍにおける測定値と４９０ｎｍにおける測定値の比（被験化合物非添加Ｒａｔｉｏ＝Ｅｍ５２０／Ｅｍ４９０）も同様に算出した。得られた値から下記の式を用いて発光増加率を求めた。
発光増加率（％）＝（被験化合物Ｒａｔｉｏ−被験化合物非添加Ｒａｔｉｏ）／（被験化合物非添加Ｒａｔｉｏ）×１００
【００５０】
その結果を、図１に示す。Ｘ軸に被験化合物の濃度（Ｌｏｇ[μＭ]）、Ｙ軸に発光増加率（％）をプロットした。図中の■は実施例１の化合物、▲はピオグリタゾンを添加した場合の発光増加率（％）を示す。
【００５１】
ピオグリタゾンは濃度依存的に発光増加率の増加を示したが、実施例１の化合物は濃度依存的な発光増加率の増加を示さなかった。この結果から、ピオグリタゾンはＰＰＡＲγ活性化作用を有するが、実施例１の化合物は少なくとも１ｎＭ〜２００μＭの間ではＰＰＡＲγ活性化作用を有さないことが明らかとなった。
【００５２】
したがって、上記の糖尿病の治療剤又は予防剤は、ＰＰＡＲγ活性化作用を有さないことが示された。
【００５３】
（実施例３）  Ｉｎ  ｖｉｔｒｏミトコンドリア機能改善作用：
実施例１の化合物のｉｎ  ｖｉｔｒｏミトコンドリア機能改善作用について、マウス筋芽細胞株Ｃ２Ｃ１２細胞（ＡＴＣＣ）を用いて評価した。
【００５４】
Ｃ２Ｃ１２細胞を、１０％ウシ胎児血清（インビトロジェン）、１０Ｕ／ｍＬ  ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ及び１０μｇ／ｍＬ  ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎを含むＤＭＥＭ（ｈｉｇｈ  ｇｌｕｃｏｓｅ；ギブコ）を培養液として用いて、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター中で培養フラスコにて培養した。培養フラスコの中で７０〜８０％コンフルエントまで増殖した細胞をＰＢＳ（−）で洗浄し、０．０５％トリプシンＥＤＴＡ（ギブコ）処置で回収した後、９６ウェル培養プレート（ＢＤ）に１．５×１０４ｃｅｌｌ／ウェルとなるように播種した。
【００５５】
９６ウェル培養プレートに播種した細胞を、３７℃、５％ＣＯ２条件下で２日間培養し、コンフルエントまで増殖したことを確認後、分化誘導培地（２％ウマ血清（インビトロジェン）、１０Ｕ／ｍＬ  ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ及び１０μｇ／ｍＬ  ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎを含むＤＭＥＭ（ｈｉｇｈ  ｇｌｕｃｏｓｅ；ギブコ））に交換して、さらに３日間培養し、筋菅細胞に分化させた。
【００５６】
３日間培養後に、分化誘導培地に４０ｍＭグルコース、５０ｎｇ／ｍＬインスリン及び１０ｎｇ／ｍＬ  ＴＮＦ−αを加えた培地に交換して、インスリン抵抗性処置（以下、ＩＲ処置）を行った。また同時に、ＤＭＳＯで溶解した実施例１の化合物（最終濃度１０μＭ）及びピオグリタゾン（最終濃度５０μＭ）並びにＤＭＳＯをＩＲ処置した細胞に添加して（ＤＭＳＯ最終濃度０．５％）、引き続き２４時間培養した。また、ＩＲ処置を行わず、分化誘導培地で培養を続けた細胞をコントロールとして設けた。なお、各処置につき、Ｎ＝１で実施した。
【００５７】
ＩＲ処置から２４時間培養後に、細胞をＰＢＳ（−）で洗浄し、０．０５％トリプシンＥＤＴＡ処置で回収した後、−８０℃で凍結保存した。凍結保存した細胞からＱＩＡａｍｐ（登録商標）ＤＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（キアゲン）を用いてｔｏｔａｌ  ＤＮＡを抽出後、フェノール／クロロホルム処理及びエタノール沈殿を行い、サンプルＤＮＡを取得した。
【００５８】
サンプルＤＮＡを鋳型として、ＴａｑＭａｎ（登録商標）リアルタイムＰＣＲ法を用いて、細胞中の核ＤＮＡ量及びｍｔＤＮＡ量を定量し、核ＤＮＡ量に対するｍｔＤＮＡ量の相対比（ｍｔＤＮＡ量／核ＤＮＡ量）を算出した。なお、核ＤＮＡ量としては、核ＤＮＡにコードされるチミジンキナーゼ１のＤＮＡ量を定量し、ｍｔＤＮＡ量としては、ｍｔＤＮＡにコードされるＤ−ｌｏｏｐのＤＮＡ量を定量した。表１に、核ＤＮＡにコードされるチミジンキナーゼ１のＤＮＡを定量するためにリアルタイムＰＣＲ法に用いたプライマー及びＴａｑＭａｎプローブの配列を示す。表２に、ｍｔＤＮＡにコードされるＤ−ｌｏｏｐのＤＮＡを定量するためにリアルタイムＰＣＲ法に用いたプライマー及びＴａｑＭａｎプローブの配列を示す。
【００５９】
【表１】
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【００６０】
【表２】
2014198674.tif 000007
【００６１】
各細胞について、コントロールのｍｔＤＮＡ量の相対比（ｍｔＤＮＡ量／核ＤＮＡ量）を１．００とした際の比であるｍｔＤＮＡ量（コントロール比）を求めた結果を、図２に示す。図２の縦軸は、ｍｔＤＮＡ量（コントロール比）を示し、図２の横軸の、「コントロール」はＩＲ処置をしなかった細胞、「溶媒」はＩＲ処置した細胞にＤＭＳＯを添加した細胞、「実施例１の化合物」はＩＲ処置した細胞に実施例１の化合物を添加した細胞、「ピオグリタゾン」はＩＲ処置した細胞にピオグリタゾンを添加した細胞を示す。
【００６２】
「溶媒」細胞のｍｔＤＮＡ量（コントロール比）は０．７５であり、「溶媒」細胞では「コントロール」細胞と比較してｍｔＤＮＡ量の低下が認められた。したがって、Ｃ２Ｃ１２細胞にＩＲ処置することにより、ミトコンドリア機能が低下することが示唆された。実施例１の化合物及びピオグリタゾンのｍｔＤＮＡ量への影響を検討したところ、「実施例１の化合物」細胞のｍｔＤＮＡ量（コントロール比）は１．２６、「ピオグリタゾン」細胞のｍｔＤＮＡ量（コントロール比）は１．００であった。この結果から、実施例１の化合物は、ピオグリタゾンと同様に、ＩＲ処置によって低下したｍｔＤＮＡ量を増加させる作用を有することが明らかとなり、ミトコンドリア機能改善作用を有することが示唆された。
【００６３】
したがって、上記の糖尿病の治療剤又は予防剤は、ミトコンドリア機能改善作用を有することが示唆された。
【００６４】
（実施例４）肥満・２型糖尿病マウス（ｄｂ／ｄｂマウス）における作用：
実施例１の化合物及びピオグリタゾンの、肥満・２型糖尿病マウスにおける下記の（１）〜（４）の作用評価は、肥満・２型糖尿病マウスであるｄｂ／ｄｂマウスを用いて実施した。なお、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを正常マウスとして用いた。
【００６５】
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス及びｄｂ／ｄｂマウスを５週齢で購入し（日本クレア株式会社）、自由給餌（ＣＲＦ−１：オリエンタル酵母工業株式会社）、自由飲水環境下で１週間馴化させた。馴化後、被験化合物投与２日前に体重及び随時血糖値を測定し、体重及び随時血糖値をパラメーターとして表３の内訳で群分けを行った。
【００６６】
【表３】
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【００６７】
実施例１の化合物は１０ｍｇ／ｍＬに、ピオグリタゾンは３ｍｇ／ｍＬに、０．５％メチルセルロース溶液を用いて懸濁溶液として調製した。調製後の被験化合物を、ｄｂ／ｄｂマウスに、体重１ｋｇあたり１０ｍＬの容量で１日１回、２８日間経口投与した。同様に、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス及びｄｂ／ｄｂマウスに０．５％メチルセルロース溶液を投与した群を設けた。表３に記載の実験群は、正常マウス群が、０．５％メチルセルロース溶液をＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに投与した群、溶媒群が、０．５％メチルセルロース溶液をｄｂ／ｄｂマウスに投与した群、実施例１の化合物群が、実施例１の化合物１００ｍｇ／ｋｇをｄｂ／ｄｂマウスに投与した群、ピオグリタゾン群が、ピオグリタゾン３０ｍｇ／ｋｇをｄｂ／ｄｂマウスに投与した群を示す。これらの実験群について、以下の（１）〜（４）について評価を行った。
【００６８】
（１）体重に対する作用：
体重に対する作用は、被験化合物を２６日間投与した次の日（投与開始から２７日目の被験化合物投与前）に測定した体重を用いて評価した。
【００６９】
その結果を、図３に示す。図３の縦軸は、体重（ｇ）（平均値＋標準誤差（Ｎ＝１２〜１４））を示し、図３の横軸は、各実験群を示す。図中の＊印は、溶媒群との比較で、統計学的に有意であることを示す（ｔ検定、ｐ＜０．０５）。
【００７０】
各実験群の体重（平均値±標準誤差（Ｎ＝１２〜１４））は、正常マウス群で２３．８±０．４５ｇ、溶媒群３８．３±０．５５ｇであり、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに比しｄｂ／ｄｂマウスは明らかな肥満を呈していた。実施例１の化合物及びピオグリタゾンの体重への影響を検討したところ、実施例１の化合物群の体重は３９．７±０．５２ｇであり、溶媒群の体重と比較して統計学的に有意な差はなく、実施例１の化合物は体重に対して影響を及ぼさなかった。一方、ピオグリタゾン群の体重は４５．３±０．６８ｇであり、溶媒群の体重と比較して統計学的に有意に上昇しており（ｔ検定、ｐ＜０．０５）、ピオグリタゾンは明らかな体重増加作用を示した。
【００７１】
したがって、上記の糖尿病の治療剤又は予防剤は、チアゾリジンジオン誘導体で認められる副作用が軽減していることが示された。
【００７２】
（２）随時血糖値に対する作用：
随時血糖値に対する作用について検討した。随時血糖値は、投与開始から２６日目の被験化合物投与終了後に、２時間の絶食を行った後に測定した。血糖値測定は、尾静脈から約５μＬの血液を採取し、簡易型血糖測定装置（メディセンス・プレシジョンエクシード、アボットジャパン株式会社）を用いて実施した。なお、以下の（３）及び（４）においても、血糖値測定はこれと同じ方法を用いて実施した。
【００７３】
その結果を、図４に示す。図４の縦軸は、随時血糖値（ｍｇ／ｄＬ）（平均値＋標準誤差（Ｎ＝１２〜１４））を示し、図４の横軸は、各実験群を示す。図中の＊印は、溶媒群との比較で、統計学的に有意であることを示す（ｔ検定、ｐ＜０．０５）。
【００７４】
随時血糖値（平均値±標準誤差（Ｎ＝１２〜１４））は、正常マウス群で１４９．６±３．３２ｍｇ／ｄＬ、溶媒群で４７９．８±１６．９６ｍｇ／ｄＬであり、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに比しｄｂ／ｄｂマウスでは明らかな高血糖を呈していた。実施例１の化合物及びピオグリタゾンの随時血糖値への影響を検討したところ、実施例１の化合物群の随時血糖値は４２９．０±１４．１７ｍｇ／ｄＬ、ピオグリタゾン群の随時血糖値は３６７．５±２５．０３ｍｇ／ｄＬであり、いずれも溶媒群の随時血糖値と比較して統計学的に有意に低下していた（ｔ検定、ｐ＜０．０５）。この結果から、実施例１の化合物はｄｂ／ｄｂマウスの随時血糖値低下作用を有することが明らかとなった。
【００７５】
したがって、上記の糖尿病の治療剤又は予防剤は、肥満・２型糖尿病マウスであるｄｂ／ｄｂマウスの随時高血糖に対して低下作用を有することが示された。
【００７６】
（３）空腹時血糖値に対する作用：
空腹時血糖値に対する作用について検討した。空腹時血糖値は、投与開始から２８日目の被験化合物投与終了後に、１８時間の絶食を行った後に測定した。
【００７７】
その結果を、図５に示す。図５の縦軸は、空腹時血糖値（ｍｇ／ｄＬ）（平均値＋標準誤差（Ｎ＝６〜８））を示し、図５の横軸は、各実験群を示す。図中の＊印は、溶媒群との比較で、統計学的に有意であることを示す（ｔ検定、ｐ＜０．０５）。
【００７８】
空腹時血糖値（平均値±標準誤差（Ｎ＝６〜８））は、正常マウス群で７３．０±２．１３ｍｇ／ｄＬ、溶媒群で２５８．０±２０．００ｍｇ／ｄＬであり、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに比しｄｂ／ｄｂマウスでは明らかな高血糖を呈していた。実施例１の化合物及びピオグリタゾンの空腹時血糖値への影響を検討したところ、実施例１の化合物群の空腹時血糖値は１７０．６±２０．０４ｍｇ／ｄＬ、ピオグリタゾン群の空腹時血糖値は２２１．６±４３．３７ｍｇ／ｄＬであり、実施例１の化合物群の空腹時血糖値のみ、溶媒群の空腹時血糖値と比較して統計学的に有意に低下していた（ｔ検定、ｐ＜０．０５）。この結果から、実施例１の化合物はｄｂ／ｄｂマウスの空腹時血糖値低下作用を有し、且つその作用の程度はピオグリタゾンの作用と比較して強いことが明らかとなった。
【００７９】
したがって、上記の糖尿病の治療剤又は予防剤は、肥満・２型糖尿病マウスであるｄｂ／ｄｂマウスの空腹時高血糖に対して強い低下作用を有することが示された。
【００８０】
（４）耐糖能に対する作用：
耐糖能に対する作用について検討した。耐糖能の評価はＯＧＴＴによって行った。投与開始から２８日目の被験化合物投与終了後に、１８時間の絶食を行った後に、血糖値を測定した（これを０分時点とする）。次に、蒸留水（株式会社大塚製薬工場）を用いて０．２ｇ／ｍＬに調製したグルコース溶液を体重１ｋｇあたり１０ｍＬの容量で経口投与（２ｇ／ｋｇ）し、３０、６０、９０、１２０及び１８０分後に血糖値を測定した。Ｘ軸にグルコース溶液投与後の時間を、Ｙ軸に血糖値をプロットし、グルコース溶液投与前（０分時点）からグルコース溶液投与１８０分後の血糖値推移曲線下面積（ＡＵＣ０−１８０）を求めた。
【００８１】
その結果を、図６（経時変化）及び図７（ＡＵＣ０−１８０）に示す。図６の縦軸は、血糖値（ｍｇ／ｄＬ）（平均値±標準誤差（Ｎ＝６〜８））を示し、図６の横軸は、グルコース負荷後の時間（分）を示す。図６中の凡例は、各実験群を示す。また、図７の縦軸は、ＡＵＣ０−１８０（ｍｇ／ｄＬ×ｍｉｎ）（平均値＋標準誤差（Ｎ＝６〜８））を示し、図７の横軸は、各実験群を示す。図中の＊印は、溶媒群との比較で、統計学的に有意であることを示す（ｔ検定、ｐ＜０．０５）。
【００８２】
ｄｂ／ｄｂマウスでは全測定時点においてグルコース溶液投与後の血糖値がＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスと比較して著しく高値を示した（Ｎ＝６〜８）。ＡＵＣ０−１８０は、正常マウス群で３０２４５．０±１４６４．２４ｍｇ／ｄＬ×ｍｉｎ、溶媒群で１０３０２０．０±３９６１．１７ｍｇ／ｄＬ×ｍｉｎであり、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスと比しｄｂ／ｄｂマウスではＡＵＣ０−１８０が著しく高値を示し、耐糖能異常を呈していた。実施例１の化合物及びピオグリタゾンのｄｂ／ｄｂマウス耐糖能異常への影響を検討したところ、実施例１の化合物群及びピオグリタゾン群の血糖値は全測定時点において溶媒群の血糖値と比較して低値を示した。実施例１の化合物群のＡＵＣ０−１８０は７５８２１．３±４５４２．１８ｍｇ／ｄＬ×ｍｉｎ、ピオグリタゾン群のＡＵＣ０−１８０は６９４８１．９±６２９６．９２ｍｇ／ｄＬ×ｍｉｎであり、いずれも溶媒群のＡＵＣ０−１８０と比較して統計学的に有意に低下していた（ｔ検定、ｐ＜０．０５）。以上の結果から、実施例１の化合物は、ｄｂ／ｄｂマウスの耐糖能異常に対して改善作用を有することが明らかとなった。
【００８３】
したがって、上記の糖尿病の治療剤又は予防剤は、肥満・２型糖尿病マウスであるｄｂ／ｄｂマウスの耐糖能異常に対して改善作用を有することが示された。
【００８４】
（実施例５）Ｉｎ  ｖｉｖｏミトコンドリア機能改善作用：
実施例１の化合物のｉｎ  ｖｉｖｏミトコンドリア機能改善作用について、肥満・２型糖尿病マウスｄｂ／ｄｂマウスを用いて実施した。
【００８５】
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス及びｄｂ／ｄｂマウスを５週齢で購入し（日本クレア株式会社）、自由給餌（ＣＲＦ−１：オリエンタル酵母工業株式会社）、自由飲水環境下で飼育した。１３週齢において、体重及び随時血糖値（測定方法は実施例４と同じ）をパラメーターとして実施例４と同じ内訳（表３）で群分けを行った。
【００８６】
実施例４と同様に、実施例１の化合物及びピオグリタゾンの投与液を調製し、調製後の被験化合物を、ｄｂ／ｄｂマウスに、体重１ｋｇあたり１０ｍＬの容量で１日１回、２８日間経口投与した。同様に、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス及びｄｂ／ｄｂマウスに０．５％メチルセルロース溶液を投与した群を設けた。実験群は、表３に記載の実験群と同じである。すなわち、正常マウス群は０．５％メチルセルロース溶液をＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに投与した群、溶媒群は０．５％メチルセルロース溶液をｄｂ／ｄｂマウスに投与した群、実施例１の化合物群は実施例１の化合物１００ｍｇ／ｋｇをｄｂ／ｄｂマウスに投与した群、ピオグリタゾン群はピオグリタゾン３０ｍｇ／ｋｇをｄｂ／ｄｂマウスに投与した群を示す。
【００８７】
被験化合物投与終了後、ペントバルビタール麻酔下でマウスからヒラメ筋を採取し、直ちに液体窒素を用いて凍結し、−８０℃で保存した。ヒラメ筋からＱＩＡａｍｐ（登録商標）ＤＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（キアゲンＱＩＡＧＥＮ）を用いてｔｏｔａｌ  ＤＮＡを抽出後、フェノール／クロロホルム処理及びエタノール沈殿を行い、サンプルＤＮＡを取得した。サンプルＤＮＡを鋳型として、ＴａｑＭａｎ（登録商標）リアルタイムＰＣＲ法を用いて、組織中の核ＤＮＡ量及びｍｔＤＮＡ量を定量し、核ＤＮＡ量に対するｍｔＤＮＡ量の相対比（ｍｔＤＮＡ量／核ＤＮＡ量）を算出した。なお、実施例３で用いたものと同じプライマー及びＴａｑＭａｎプローブ（表１及び２）を用いて、実施例３と同様に、核ＤＮＡ量として、核ＤＮＡにコードされるチミジンキナーゼ１のＤＮＡ量を定量し、ｍｔＤＮＡ量として、ｍｔＤＮＡにコードされるＤ−ｌｏｏｐのＤＮＡ量を定量した。
【００８８】
各実験群について、正常マウス群のｍｔＤＮＡ量の相対比（ｍｔＤＮＡ量／核ＤＮＡ量）を１．００とした際の比であるｍｔＤＮＡ量（正常マウス比）を求めた結果を、図８に示す。図８の縦軸は、ｍｔＤＮＡ量（正常マウス比）（平均値＋標準誤差（Ｎ＝５））を示し、図８の横軸は、各実験群を示す。
【００８９】
正常マウス群のｍｔＤＮＡ量（正常マウス比）は１．００±０．０９であり、溶媒群のｍｔＤＮＡ量（正常マウス比）は０．７１±０．０６であり、溶媒群では正常マウス群と比較してｍｔＤＮＡ量は低値を示した。本結果から、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスと比較してｄｂ／ｄｂマウスの骨格筋ではミトコンドリア機能が低下していることが示唆された。実施例１の化合物及びピオグリタゾンのｍｔＤＮＡ量への影響を検討したところ、実施例１の化合物群のｍｔＤＮＡ量（正常マウス比）は０．８４±０．０４、ピオグリタゾン群のｍｔＤＮＡ量（正常マウス比）は０．７８±０．０５であった。この結果から、実施例１の化合物は、ｄｂ／ｄｂマウスのｍｔＤＮＡ量を増加させる作用を有することが明らかとなり、ミトコンドリア機能改善作用を有することが示唆された。
【００９０】
したがって、上記の糖尿病の治療剤又は予防剤は、肥満・２型糖尿病マウスであるｄｂ／ｄｂマウスにおいてミトコンドリア機能改善作用を有することが示唆された。
【００９１】
以上の実施例の結果から、実施例１の化合物は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＰＰＡＲγ活性化作用を有さず、ｍｔＤＮＡ量増加作用を有し、また、肥満・２型糖尿病マウスであるｄｂ／ｄｂマウスにおいて、チアゾリジンジオン誘導体で認められる体重増加作用という副作用が軽減され、随時血糖低下作用、強い空腹時血糖値低下作用、耐糖能改善作用及びｍｔＤＮＡ量増加作用を有することが示され、糖尿病、特に２型糖尿病に対する治療効果又は予防効果を有することが明らかとなった。これらの効果には、実施例１の化合物によるミトコンドリア機能改善作用が関与することが示唆された。
【産業上の利用可能性】
【００９２】
本発明の糖尿病の治療剤又は予防剤は、血糖降下作用、耐糖能異常改善作用及びミトコンドリア機能改善作用を有すること、また、ＰＰＡＲγ活性化作用を有さず、ＰＰＡＲγ活性化作用に起因する副作用が著しく軽減されていることから、副作用が軽減された優れた糖尿病の治療剤又は予防剤として用いることができる。
【配列表フリーテキスト】
【００９３】
配列番号１：核ＤＮＡにコードされるチミジンキナーゼ１のＤＮＡを増幅するためのＦｏｒｗａｒｄプライマーの配列を示す。
配列番号２：核ＤＮＡにコードされるチミジンキナーゼ１のＤＮＡを増幅するためのＲｅｖｅｒｓｅプライマーの配列を示す。
配列番号３：チミジンキナーゼ１のＤＮＡを定量するためのＴａｑＭａｎプローブの配列を示す。
配列番号４：ｍｔＤＮＡにコードされるＤ−ｌｏｏｐのＤＮＡを増幅するためのＦｏｒｗａｒｄプライマーの配列を示す。
配列番号５：ｍｔＤＮＡにコードされるＤ−ｌｏｏｐのＤＮＡを増幅するためのＲｅｖｅｒｓｅプライマーの配列を示す。
配列番号６：Ｄ−ｌｏｏｐのＤＮＡを定量するためのＴａｑＭａｎプローブの配列を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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