(57)【要約】【課題】非構造組換えポリマーおよびその使用の提供。【解決手段】本発明は、非構造組換えポリマー（ＵＲＰ）および１種以上のＵＲＰを含むタンパク質を提供する。本発明は、マイクロプロテイン、トキシンおよび他の関連するタンパク質性実体、ならびにこれらの実体をディスプレイする遺伝子パッケージもまた提供する。本発明は、本発明のタンパク質性実体をコードする組換えポリペプチド含有ベクター、ならびにそれらのベクターを含む宿主細胞もまた提供する。本発明の組成物は、一定の範囲の薬学的適用を含む種々の有用性を有する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願明細書に記載された発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（相互参照）
本願は、本明細書中に参考として援用される２００６年３月６日に出願された米国仮特許出願第６０／７４３，４１０号の利益を主張するものである。本願は、２００６年９月２７日に出願された第１１／５２８，９２７号および第１１／５２８，９５０号の、一部継続出願であり、第１１／５２８，９２７号および第１１／５２８，９５０号もまた２００５年９月２７日に出願された米国仮特許出願第６０／７２１，２７０号、同第６０／７２１，１８８号、および２００６年３月２１日に出願された同第６０／７４３，６２２号に対する優先権を主張するものであり、これらは全て本明細書においてその全体が参考として援用される。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
タンパク質の特性、特に、血漿クリアランスおよび免疫原性が、これらのタンパク質への親水性ポリマーの結合によって改善できることは十分に実証されてきた（非特許文献１）、（非特許文献１）、（非特許文献３）。患者の治療のためにＦＤＡによって認可されているポリマー修飾タンパク質の例は、アダジェン（Ａｄａｇｅｎ）、オンカスパー（Ｏｎｃａｓｐａｒ）、ＰＥＧ−イントロン（Ｉｎｔｒｏｎ）、ペガシス（Ｐｅｇａｓｙｓ）、ソマバート（Ｓｏｍａｖｅｒｔ）、およびニューラスタ（Ｎｅｕｌａｓｔａ）である。より多くポリマー修飾した多くのタンパク質が臨床試験中である。これらのポリマーは、非修飾タンパク質と比較して、修飾タンパク質の流体力学半径（ストークス半径とも呼ばれる）を増加させることによってそれらの効果を発揮し、これは、腎臓濾過によるクリアランスの速度を減少する（非特許文献４）。加えて、ポリマー結合は、他のタンパク質、細胞、または表面との修飾タンパク質の相互作用を減少し得る。特に、ポリマー結合は、修飾タンパク質と、抗体および免疫系の他の成分との間の相互作用を減少し、従って、修飾タンパク質に対する宿主免疫応答の形成を減少し得る。特に関心が持たれるものは、ＰＥＧ化による、すなわち、ポリエチレングリコールの直鎖状または分枝状ポリマーを結合することによる、タンパク質修飾である。ＰＥＧ化の際の免疫原性の減少は、例えば、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（非特許文献５）、抗体（非特許文献６）、スタフィロキナーゼ（非特許文献７）、およびヘモグロビン（非特許文献８）について示された。典型的には、このようなポリマーは、非修飾タンパク質が精製された後で化学修飾工程を介して、目的のタンパク質とともに結合体化される。
【０００３】
種々のポリマーがタンパク質に結合され得る。特に関心が持たれるものは、柔軟性コンホメーションを有し、かつ水溶液中で十分に水和している親水性ポリマーである。頻繁に使用されるポリマーはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。これらのポリマーは、それらの分子量に比例して、大きな流体力学半径（ｒａｄｉ）を有する傾向がある（非特許文献９）。結合したポリマーは、それらが結合したタンパク質との制限された相互作用を有する傾向があり、従って、ポリマー修飾タンパク質はその関連する機能を保持する。
【０００４】
タンパク質へのポリマーの化学的結合体化は複雑な多段階プロセスを必要とする。典型的には、タンパク質成分は、化学的結合体化工程の前に産生および精製される必要がある。結合体化工程は、分離される必要がある生成物混合物の形成を生じる可能性があり、このことは、顕著な生成物の損失を導く。代替的には、このような混合物は、最終的な薬学的製品として使用することができる。いくつかの例は、混合物として使用される、現在市販されているＰＥＧ化インターフェロンα製品である（非特許文献１０；非特許文献１１）。このような混合物は、製造および特徴付けが困難であり、これらは、減少した治療活性を有し、または治療活性を有さない異性体を含む。
【０００５】
ＰＥＧのようなポリマーの部位特異的付加を可能にする方法が記載されてきた。例としては、標的タンパク質の独特なグリコシル化部位における選択的ＰＥＧ化、または標的タンパク質に操作された非天然アミノ酸の選択的ＰＥＧ化がある。ある場合において、反応条件を注意深く制御することによって、標的タンパク質におけるリジン側鎖のＰＥＧ化を回避しながら、タンパク質のＮ末端を選択的にＰＥＧ化することが可能であった。標的タンパク質の部位特異的ＰＥＧ化のためのなお別のアプローチは、選択的結合体化を可能にするシステイン残基の導入である。これらのすべての方法は顕著な制限を有する。Ｎ末端の選択的ＰＥＧ化は注意深いプロセス制御を必要とし、副反応は排除することが困難である。ＰＥＧ化のためのシステインの導入は、タンパク質産生および／または精製と干渉し得る。非天然アミノ酸の特異的導入は、タンパク質産生のための特定の宿主生物を必要とする。ＰＥＧ化のさらなる制限は、ＰＥＧが、典型的には、類似であるが均一ではない長さを有するポリマーの混合物として製造されることである。同じ制限は、多くの他の化学ポリマーにおいて固有である。
【０００６】
複数のタンパク質モジュールを有する生成物の合成を可能にする多官能性ポリマーを使用する化学的結合体化は、単一のタンパク質ドメインのポリマー結合体化よりもさらにより複雑である。
【０００７】
最近、病原性生物のあるタンパク質が、これらの配列を含むタンパク質の比較的長い血清半減期をもたらすらしい反復ペプチド配列を含むことが観察された（非特許文献１２）。このような病原体由来の反復配列に基づくオリゴマー配列が、血清半減期の増加をもたらす他のタンパク質に融合できることもまた実証された。しかし、これらの病原体由来オリゴマーは、多くの欠点を有している。病原体由来配列は免疫原性である傾向がある。これらの配列は、これらの免疫原性を減少するように修飾され得ることが記載されてきた。しかし、免疫反応の形成に寄与する配列からＴ細胞エピトープを除去するための試みは報告されていない。さらに、病原体由来配列は、良好な溶解性および他の標的タンパク質についての非常に低い親和性を有する配列を必要とする薬理学的適用のために最適化されてはいなかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｋｏｃｈｅｎｄｏｅｒｆｅｒ，Ｇ．（２００３）Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ，３：１２５３−６１
【非特許文献２】Ｇｒｅｅｎｗａｌｄ，Ｒ．Ｂ．ら（２００３）Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ，５５：２１７−５０
【非特許文献３】Ｈａｒｒｉｓ，Ｊ．Ｍ．ら（２００３）Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ，２：２１４−２１
【非特許文献４】Ｙａｎｇ，Ｋ．ら（２００３）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ，１６：７６１−７０
【非特許文献５】Ｇａｍｅｚ，Ａ．ら（２００５）Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ，１１：９８６−９
【非特許文献６】Ｄｅｃｋｅｒｔ，Ｐ．Ｍ．ら（２０００）Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ，８７：３８２−９０
【非特許文献７】Ｃｏｌｌｅｎ，Ｄ．ら（２０００）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，１０２：１７６６−７２
【非特許文献８】Ｊｉｎ，Ｃ．ら（２００４）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｅｐｔ  Ｌｅｔｔ，１１：３５３−６０
【非特許文献９】Ｋｕｂｅｔｚｋｏ，Ｓ．ら（２００５）Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，６８：１４３９−５４
【非特許文献１０】Ｗａｎｇ，Ｂ．Ｌ．ら（１９９８）Ｊ  Ｓｕｂｍｉｃｒｏｓｃ  Ｃｙｔｏｌ  Ｐａｔｈｏｌ，３０：５０３−９
【非特許文献１１】Ｄｈａｌｌｕｉｎ，Ｃ．ら（２００５）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ，１６：５０４−１７
【非特許文献１２】Ａｌｖａｒｅｚ，Ｐ．ら（２００４）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２７９：３３７５−８１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
従って、複数のポリマーモジュールおよび複数のタンパク質モジュールを合わせて、定義されたマルチドメイン生成物にすることを可能にする組成物および方法のための顕著な必要性が存在している。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（発明の要旨）
本発明は、少なくとも４０個の連続するアミノ酸を含む非構造組換えポリマー（ＵＲＦ）を提供し、該ＵＲＦは血清タンパク質への非特異的結合が実質的に不可能であり、そして、（ａ）ＵＲＰに含まれるグリシン（Ｇ）、アスパラギン酸（Ｄ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）、およびプロリン（Ｐ）の残基の総和が、ＵＲＰの全体のアミノ酸の約８０％より多くを構成し；ならびに／または（ｂ）少なくとも５０％のアミノ酸がＣｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎアルゴニズムによって決定したとき二次構造を欠いている。関連する実施形態において、本発明は、少なくとも４０個の連続するアミノ酸を含む非構造組換えポリマー（ＵＲＦ）を提供し、該ＵＲＦは約２４時間より長いインビトロ血清分解半減期を有し、そして、（ａ）ＵＲＰに含まれるグリシン（Ｇ）、アスパラギン酸（Ｄ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）、およびプロリン（Ｐ）の残基の総和が、ＵＲＰの全体のアミノ酸の約８０％より多くを構成し；ならびに／または（ｂ）少なくとも５０％のアミノ酸がＣｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎアルゴニズムによって決定したとき二次構造を欠いている。対象のＵＲＰは非天然アミノ酸配列を含み得る。所望される場合、ＵＲＰは異種タンパク質への取り込みのために選択され、異種タンパク質へのＵＲＰの取り込みの際に、該異種タンパク質は、前記ＵＲＰが欠損している対応するタンパク質と比較して、より長い血清分泌半減期および／またはより高い溶解性を示す。半減期は、２倍、３倍、５倍、１０倍またはそれ以上延長することができる。いくつかの態様において、異種タンパク質へのＵＲＰの取り込みにより、サイズ排除クロマトグラフィによって概算したときタンパク質の見かけの分子量の少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、またはそれ以上の増加をもたらす。いくつかの態様において、ＵＲＰは、−３．５未満（例えば、−４以下、−５以下）のＴｅｐｉｔｏｐｅスコアを有する。いくつかの態様において、ＵＲＰは、大部分が親水性である残基を含み得る。所望される場合、ＵＲＰの少なくとも５０％のアミノ酸が、Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎアルゴニズムによって決定したとき二次構造を欠いている。ＵＲＰに含まれるグリシン残基は、ＵＲＰの全体のアミノ酸の少なくとも約５０％を構成していてよい。いくつかの態様において、ＵＲＰに含まれるグリシン（Ｇ）、アスパラギン酸（Ｄ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）、およびプロリン（Ｐ）からなる群より単独で選択される任意の１つの型のアミノ酸が、ＵＲＰの全体のアミノ酸の約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、またはそれ以上より多くを構成する。いくつかの態様において、ＵＲＰは、約１００個、１５０個、２００個、またはそれ以上より多くの連続するアミノ酸を含む。
【００１１】
本発明はまた、１種以上の対象ＵＲＰを含むタンパク質を提供し、対象ＵＲＰはタンパク質に関して異種である。集合体中のＵＲＰの全長は、約４０、５０、６０、１００、１５０、２００、またはそれ以上のアミノ酸を超過し得る。タンパク質は、エフェクターモジュール、結合モジュール、Ｎ末端モジュール、Ｃ末端モジュール、およびこれらの任意の組み合わせからなる群より選択される１つ以上の機能モジュールを含み得る。所望される場合、対象タンパク質は複数の結合モジュールを含み、個々の結合モジュールは、同じまたは異なる標的に対する結合特異性を示す。結合モジュールは、システインの骨格内対合によって形成されるジスルフィド含有骨格を含んでいてよい。結合モジュールは標的分子に結合していてよく、該標的は、細胞表面タンパク質、分泌タンパク質、細胞質ゾルタンパク質、および核タンパク質からなる群より選択される。標的はイオンチャネルおよび／またはＧＰＣＲであり得る。所望される場合、エフェクターモジュールはトキシンであり得る。対象のＵＲＰ含有タンパク質は、典型的には、前記ＵＲＰが欠損している対応タンパク質と比較して、少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、またはそれ以上、血清分泌半減期を延長する。
【００１２】
別個の実施形態において、本発明は、少なくとも３反復単位のアミノ酸配列を含む非天然タンパク質を提供し、各反復単位は少なくとも６個のアミノ酸を含み、少なくとも３反復単位の約６個〜約１５個の連続するアミノ酸を含むセグメントの大部分が１つ以上のネイティブヒトタンパク質に存在する。１つの態様において、反復単位内に約９個〜約１５個の連続するアミノ酸を含むセグメントの大部分、または各々のセグメントは、１つ以上のネイティブヒトタンパク質に存在する。これらのセグメントは、約９個〜約１５個のアミノ酸を含み得る。３つの反復単位が実質的な配列相同性を共有してもよく、例えば、整列した場合に、約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％より大きな配列同一性を共有する。このような非天然タンパク質もまた、結合モジュール、エフェクターモジュール、多量体化モジュール、Ｃ末端モジュール、およびＮ末端モジュールからなる群より選択される１つ以上のモジュールを含んでもよい。所望される場合、非天然タンパク質は、対象の非構造組換えポリマー（ＵＲＰ）を有する個々の反復単位を含み得る。
【００１３】
本発明はまた、対象ＵＲＰ、ＵＲＰ含有タンパク質、マイクロプロテイン、およびトキシンをコードするコード配列を含む組換えポリヌクレオチドを提供する。対象ポリヌクレオチドを含むベクター、そのベクターを有する宿主細胞、対象ＵＲＰをディスプレイする遺伝子パッケージ、ＵＲＰ含有タンパク質、トキシン、および本明細書に開示される任意の他のタンパク質性実体もまた、本発明において提供される。本発明の発現ベクターの選択ライブラリーがさらに提供される。
【００１４】
本発明は、非構造組換えポリマー（ＵＲＰ）を含むタンパク質を産生する方法も提供する。該方法は、（ｉ）タンパク質をコードする組換えポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供する工程であって、該タンパク質は１つ以上のＵＲＰを含み、該ＵＲＰは少なくとも４０個の連続するアミノ酸を含み、該ＵＲＰは血清タンパク質への非特異的結合が実質的に不可能であり、そして、（ａ）該ＵＲＰに含まれるグリシン（Ｇ）、アスパラギン酸（Ｄ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）、およびプロリン（Ｐ）の残基の総和が、該ＵＲＰの全体のアミノ酸の約８０％より多くを構成し；ならびに／または（ｂ）少なくとも５０％のアミノ酸がＣｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎアルゴニズムによって決定したとき二次構造を欠いている工程；ならびに（ｉｉ）該ポリヌクレオチドからの該タンパク質の発現をもたらすための条件下で、適切な培養培地中で上記宿主細胞を培養する工程を包含する。適切な宿主細胞は原核細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）および真核細胞である。
【００１５】
本発明はまた、タンパク質の血清分泌半減期を増加させる方法を提供し、該方法は以下：該タンパク質を１つ以上の非構造組換えポリマー（ＵＲＰ）と融合させる工程であって、該ＵＲＰは少なくとも約４０個の連続するアミノ酸を含み、そして、（ａ）該ＵＲＰに含まれるグリシン（Ｇ）、アスパラギン酸（Ｄ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）、およびプロリン（Ｐ）の残基の総和が、該ＵＲＰの全体のアミノ酸の約８０％より多くを構成し；ならびに／または（ｂ）少なくとも５０％のアミノ酸がＣｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎアルゴニズムによって決定したとき二次構造を欠いており、該ＵＲＰは血清タンパク質への非特異的結合が実質的に不可能である工程；を包含する。
【００１６】
本発明において、ゲノムパッケージ上にディスプレイされる、標的と外因性タンパク質との間の特異的相互作用の存在または不在を検出する方法も提供され、該タンパク質は１つ以上の非構造組換えポリマー（ＵＲＰ）を含み、該方法は以下：（ａ）１つ以上の非構造組換えポリマー（ＵＲＰ）を含むタンパク質をディスプレイする遺伝子パッケージを提供する工程；（ｂ）安定なタンパク質−標的複合体を産生するために適切な条件下で、遺伝子パッケージを標的と接触させる工程；および（ｃ）遺伝子パッケージ上での安定なタンパク質−標的複合体の形成を検出し、それによって、特異的相互作用の存在を検出する工程；を包含する。該方法はさらに、外因性タンパク質をコードする遺伝子パッケージからヌクレオチド配列を得る工程を包含する。いくつかの態様において、特異的相互作用の存在または不在は、ＵＲＰと血清タンパク質を含む標的との間である。いくつかの態様において、特異的相互作用の存在または不在は、ＵＲＰと血清プロテアーゼを含む標的との間である。
【００１７】
本発明において、マイクロプロテインをディスプレイする遺伝子パッケージがさらに包含され、該マイクロプロテインは、そのネイティブ標的に対する結合能を保持している。いくつかの態様において、マイクロプロテインは、ナトリウムチャネル、カリウムチャネル、カルシウムチャネル、アセチルコリンチャネル、および塩素チャネルからなる群より選択されるイオンチャネルの少なくとも１つのファミリーに向けた結合能を示す。所望される場合、マイクロプロテインはイオンチャネル結合マイクロプロテインであり、（ａ）マイクロプロテインが、対応する非修飾のマイクロプロテインと比較して、異なるファミリーのチャネルに結合し；（ｂ）マイクロプロテインが、対応する非修飾のマイクロプロテインと比較して、同じチャネルファミリーの異なるサブファミリーに結合し；（ｃ）マイクロプロテインが、対応する非修飾のマイクロプロテインと比較して、同じサブファミリーのチャネルの異なる種に結合し；（ｄ）マイクロプロテインが、対応する非修飾のマイクロプロテインと比較して、同じチャネル上の異なる部位に結合し；および／または（ｅ）マイクロプロテインが、対応する非修飾のマイクロプロテインと比較して、同じチャネルの同じ部位に結合するが、異なる生物学的効果を生じるように修飾される。いくつかの態様において、マイクロプロテインはトキシンである。本発明は、対象のマイクロプロテインおよび／またはトキシンをディスプレイする遺伝子パッケージのライブラリーも提供する。所望される場合、遺伝子パッケージは、部分的または全体にその毒性スペクトルを保持しているタンパク質性トキシンをディスプレイする。トキシンは、単一のトキシンタンパク質から誘導され得、またはトキシンのファミリーから誘導され得る。本発明は、遺伝子パッケージのライブラリーも提供し、ライブラリーはトキシンのファミリーをディスプレイし、そしてファミリーが部分的または全体にその毒性スペクトルを保持している。
【００１８】
本発明はさらに、複数のイオンチャネル結合ドメインを含むタンパク質をさらに提供し、個々のドメインは、（ａ）マイクロプロテインドメインが、対応する非修飾のマイクロプロテインドメインと比較して、異なるファミリーのチャネルに結合し；（ｂ）マイクロプロテインドメインが、対応する非修飾のマイクロプロテインドメインと比較して、同じチャネルファミリーの異なるサブファミリーに結合し；（ｃ）マイクロプロテインドメインが、対応する非修飾のマイクロプロテインドメインと比較して、同じサブファミリーの異なる種に結合し；（ｄ）マイクロプロテインドメインが、対応する非修飾のマイクロプロテインドメインと比較して、同じチャネル上の異なる部位に結合し；（ｅ）マイクロプロテインドメインが、対応する非修飾のマイクロプロテインドメインと比較して、同じチャネルの同じ部位に結合するが、異なる生物学的効果を生じ；および／または（ｆ）マイクロプロテインドメインが、対応する非修飾のマイクロプロテインドメインと比較して、同じチャネルの同じ部位に結合し、同じ生物学的効果を生じるように修飾されたマイクロプロテインドメインである。
【００１９】
所望の特性を有するマイクロプロテインを得る方法もまた、本発明で具体化され、該方法は、（ａ）対象のライブラリーを提供する工程；および（ｂ）所望の特性を有するマイクロプロテインをディスプレイする少なくとも１種のファージを得るために選択ライブラリーをスクリーニングする工程を包含する。開示される方法のいずれか１つにおける使用のためのポリヌクレオチド、ベクター、遺伝子パッケージ、宿主細胞も提供される。
【００２０】
（参照による援用）
本明細書において言及されるすべての刊行物および特許出願は、各々個々の刊行物または特許出願が、具体的かつ個別に示されて参照により組み込まれるのと同程度まで、参照により本明細書に組み込まれる。
例えば、本願発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
少なくとも４０個の連続するアミノ酸を含む非構造組換えポリマー（ＵＲＰ）であって、該ＵＲＰは血清タンパク質への非特異的結合が実質的に不可能であり、そして、
（ａ）該ＵＲＰに含まれるグリシン（Ｇ）、アスパラギン酸（Ｄ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）、およびプロリン（Ｐ）の残基の総和が、該ＵＲＰの全体のアミノ酸の約８０％より多くを構成し；ならびに／または
（ｂ）少なくとも５０％のアミノ酸がＣｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎアルゴニズムによって決定したとき二次構造を欠いている、
ポリマー。
（項目２）
少なくとも４０個の連続するアミノ酸を含む非構造組換えポリマー（ＵＲＰ）であって、該ＵＲＰは約２４時間より長いインビトロ血清分解半減期を有し、そして、
（ａ）該ＵＲＰに含まれるグリシン（Ｇ）、アスパラギン酸（Ｄ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）、およびプロリン（Ｐ）の残基の総和が、該ＵＲＰの全体のアミノ酸の約８０％より多くを構成し；ならびに／または
（ｂ）少なくとも５０％のアミノ酸がＣｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎアルゴニズムによって決定したとき二次構造を欠いている、
ポリマー。
（項目３）
前記ＵＲＰが非天然アミノ酸配列を含む、項目１または２に記載のＵＲＰ。
（項目４）
前記ＵＲＰが異種タンパク質への取り込みのために選択され、異種タンパク質への該ＵＲＰの取り込みの際に、該異種タンパク質は、該ＵＲＰが欠損している対応するタンパク質と比較して、より長い血清半減期および／またはより高い溶解性を示す、項目１または２に記載のＵＲＰ。
（項目５）
異種タンパク質への前記ＵＲＰの取り込みの際に、該異種タンパク質は、該ＵＲＰが欠損している対応するタンパク質と比較して、少なくとも２倍長い血清分泌半減期を示す、項目１または２に記載のＵＲＰ。
（項目６）
異種タンパク質への前記ＵＲＰの取り込みにより、サイズ排除クロマトグラフィによって概算したとき見かけのタンパク質の分子量の少なくとも２倍の増加をもたらす、項目１または２に記載のＵＲＰ。
（項目７）
−４未満のＴエピトープスコアを有する、項目１または２に記載の前記ＵＲＰ。
（項目８）
アミノ酸は大部分が親水性残基である、項目１または２に記載のＵＲＰ。
（項目９）
前記ＵＲＰの少なくとも５０％のアミノ酸が、Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎアルゴニズムによって決定したとき二次構造を欠いている、項目１または２に記載のＵＲＰ。
（項目１０）
前記ＵＲＰに含まれるグリシン残基が、該ＵＲＰの全体のアミノ酸の少なくとも約５０％を構成する、項目１または２に記載のＵＲＰ。
（項目１１）
グリシン（Ｇ）、アスパラギン酸（Ｄ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）、およびプロリン（Ｐ）からなる群より単独で選択されるアミノ酸の任意の１つの型が、該ＵＲＰの全体のアミノ酸の約２０％より多くを構成する、項目１または２に記載のＵＲＰ。
（項目１２）
グリシン（Ｇ）、アスパラギン酸（Ｄ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）、およびプロリン（Ｐ）からなる群より単独で選択されるアミノ酸の任意の１つの型が、前記ＵＲＰの全体のアミノ酸の約４０％より多くを構成する、項目１または２に記載のＵＲＰ。
（項目１３）
前記ＵＲＰが約１００個より多くの連続するアミノ酸を含む、項目１または２に記載のＵＲＰ。
（項目１４）
前記ＵＲＰが約２００個より多くの連続するアミノ酸を含む、項目１または２に記載のＵＲＰ。
（項目１５）
反復配列を含む、項目１または２に記載のＵＲＰ。
（項目１６）
グリシン（Ｇ）、アスパラギン酸（Ｄ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）、およびプロリン（Ｐ）からなる群より単独で選択されるアミノ酸の任意の１つの型が、前記ＵＲＰの全体のアミノ酸の５０％より多くを構成する、項目１または２に記載のＵＲＰ。
（項目１７）
前記１種以上のＵＲＰがタンパク質に関して異種である、項目１または２に記載の１種以上のＵＲＰを含むタンパク質。
（項目１８）
エフェクターモジュールを含む、項目１７に記載のタンパク質。
（項目１９）
結合モジュールを含む、項目１７に記載のタンパク質。
（項目２０）
エフェクターモジュールおよび結合モジュールを含む、項目１７に記載のタンパク質。
（項目２１）
複数の結合モジュールを含み、個々の該結合モジュールが同じまたは異なる標的に対する結合特異性を示す、項目１７に記載のタンパク質。
（項目２２）
凝集体中のＵＲＰの全長が約１５０アミノ酸を超える、項目１７に記載のタンパク質。
（項目２３）
１個以上の結合モジュールを含み、該結合モジュールが、システインの骨格内対合によって形成されるジスルフィド含有骨格を含む、項目１７に記載のタンパク質。
（項目２４）
細胞傷害性であるエフェクターモジュールを含む、項目１７に記載のタンパク質。
（項目２５）
標的分子に特異的な結合モジュールを含み、該標的が、細胞表面タンパク質、分泌タンパク質、細胞質ゾルタンパク質、および核タンパク質からなる群より選択される、項目１７に記載のタンパク質。
（項目２６）
標的分子に特異的な結合モジュールを含み、該標的がイオンチャネルである、項目１７に記載のタンパク質。
（項目２７）
前記ＵＲＰが欠損している対応するタンパク質と比較して、少なくとも２倍長い血清分泌半減期を示す、項目１７に記載のタンパク質。
（項目２８）
少なくとも３反復単位のアミノ酸配列を含む非天然タンパク質であって、各反復単位が少なくとも６アミノ酸を含み、少なくとも３反復単位の約６個〜約１５個の連続するアミノ酸を含むセグメントの大部分が１つ以上のネイティブヒトタンパク質に存在する、非天然タンパク質。
（項目２９）
前記反復単位内に約９個〜約１５個の連続するアミノ酸を含むセグメントの大部分が１つ以上のネイティブヒトタンパク質に存在する、項目２８に記載のタンパク質。
（項目３０）
前記タンパク質中に約６個〜約１５個の連続するアミノ酸を含む各セグメントが少なくとも１つのネイティブヒトタンパク質中に存在する、項目２８に記載のタンパク質。
（項目３１）
前記タンパク質中に約９個〜約１５個の連続するアミノ酸を含む各セグメントが少なくとも１つのネイティブヒトタンパク質中に存在する、項目２８に記載のタンパク質。
（項目３２）
前記少なくとも３つの反復単位が約８０％より多くの配列同一性を共有する、項目２８に記載のタンパク質。
（項目３３）
前記各反復単位が約６個〜約１５個の連続するアミノ酸を含む、項目２８に記載のタンパク質。
（項目３４）
前記各反復単位が約９個の連続するアミノ酸を含む、項目２８に記載のタンパク質。
（項目３５）
結合モジュール、エフェクターモジュール、多量体化モジュール、Ｃ末端モジュール、およびＮ末端モジュールからなる群より選択される１つ以上のモジュールを含む、項目２８に記載のタンパク質。
（項目３６）
個々の反復単位が非構造組換えポリマー（ＵＲＰ）を含む、項目２８に記載のタンパク質。
（項目３７）
前記ＵＲＰは少なくとも４０個の連続するアミノ酸を含み、該ＵＲＰは血清タンパク質への非特異的結合が実質的に不可能であり、そして、
（ａ）該ＵＲＰに含まれるグリシン（Ｇ）、アスパラギン酸（Ｄ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）、およびプロリン（Ｐ）の残基の総和が、該ＵＲＰの全体のアミノ酸の約８０％より多くを構成し；ならびに／または
（ｂ）少なくとも５０％のアミノ酸がＣｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎアルゴニズムによって決定したとき二次構造を欠いている、項目３６に記載のタンパク質。
（項目３８）
前記ＵＲＰは約２４時間より長いインビトロ血清分解半減期を有し、そして、
（ａ）該ＵＲＰに含まれるグリシン（Ｇ）、アスパラギン酸（Ｄ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）、およびプロリン（Ｐ）の残基の総和が、該ＵＲＰの全体のアミノ酸の約８０％より多くを構成し；ならびに／または
（ｂ）少なくとも５０％のアミノ酸がＣｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎアルゴニズムによって決定したとき二次構造を欠いている、
項目３６に記載のタンパク質。
（項目３９）
項目１または２に記載のＵＲＰをコードするコード配列を含む組換えポリヌクレオチド。
（項目４０）
項目１７に記載のタンパク質をコードするコード配列を含む組換えポリヌクレオチド。
（項目４１）
項目２８に記載のタンパク質をコードするコード配列を含む組換えポリヌクレオチド。
（項目４２）
項目４０に記載の組換えポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
（項目４３）
項目４１に記載の組換えポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
（項目４４）
項目４０に記載の組換えポリヌクレオチドを含むベクター。
（項目４５）
項目４１に記載の組換えポリヌクレオチドを含むベクター。
（項目４６）
項目４４に記載のベクターの１つより多くを含む発現ベクターの選択ライブラリー。
（項目４７）
項目４５に記載のベクターの１つより多くを含む発現ベクターの選択ライブラリー。
（項目４８）
項目４６に記載のライブラリーをディスプレイする遺伝子パッケージ。
（項目４９）
項目４７に記載のライブラリーをディスプレイする遺伝子パッケージ。
（項目５０）
非構造組換えポリマー（ＵＲＰ）を含むタンパク質を産生する方法であって：
（ｉ）該タンパク質をコードする組換えポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供する工程であって、該タンパク質は１つ以上のＵＲＰを含み、該ＵＲＰは少なくとも４０個の連続するアミノ酸を含み、該ＵＲＰは血清タンパク質への非特異的結合が実質的に不可能であり、そして、
（ａ）該ＵＲＰに含まれるグリシン（Ｇ）、アスパラギン酸（Ｄ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）、およびプロリン（Ｐ）の残基の総和が、該ＵＲＰの全体のアミノ酸の約８０％より多くを構成し；ならびに／または
（ｂ）少なくとも５０％のアミノ酸がＣｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎアルゴニズムによって決定したとき二次構造を欠いている、工程と；
（ｉｉ）該ポリヌクレオチドからの該タンパク質の発現をもたらすための条件下で、適切な培養培地中で該宿主細胞を培養する工程と
を包含する方法。
（項目５１）
前記ＵＲＰが約２４時間よりも長いインビトロ血清分解半減期を有する、項目５０に記載の方法。
（項目５２）
前記宿主細胞が真核細胞である、項目５０に記載の方法。
（項目５３）
前記宿主細胞がＣＨＯ細胞である、項目５０に記載の方法。
（項目５４）
前記宿主細胞が原核細胞である、項目５０に記載の方法。
（項目５５）
タンパク質の血清分泌半減期を増加させる方法であって：
該タンパク質を１つ以上の非構造組換えポリマー（ＵＲＰ）と融合させる工程であって、該ＵＲＰは少なくとも約４０個の連続するアミノ酸を含み、そして、
（ａ）該ＵＲＰに含まれるグリシン（Ｇ）、アスパラギン酸（Ｄ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）、およびプロリン（Ｐ）の残基の総和が、該ＵＲＰの全体のアミノ酸の約８０％より多くを構成し；ならびに／または
（ｂ）少なくとも５０％のアミノ酸がＣｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎアルゴニズムによって決定したとき二次構造を欠いており、該ＵＲＰは血清タンパク質への非特異的結合が実質的に不可能である、工程
を包含する方法。
（項目５６）
タンパク質の血清分泌半減期を少なくとも２倍延長する、項目５５に記載の方法。
（項目５７）
遺伝子パッケージ上にディスプレイされる、標的と外因性タンパク質との間の特異的相互作用の存在または不在を検出する方法であって、該タンパク質は、１つ以上の非構造組換えポリマー（ＵＲＰ）を含み、該方法は：
（ａ）１つ以上の非構造組換えポリマー（ＵＲＰ）を含むタンパク質をディスプレイする遺伝子パッケージを提供する工程；
（ｂ）安定なタンパク質−標的複合体を産生するために適切な条件下で、遺伝子パッケージを該標的と接触させる工程；および
（ｃ）該遺伝子パッケージ上での安定なタンパク質−標的複合体の形成を検出し、それによって、特異的相互作用の存在を検出する工程
を包含する方法。
（項目５８）
前記外因性タンパク質をコードする前記遺伝子パッケージからヌクレオチド配列を得る工程をさらに包含する、項目５７に記載の方法。
（項目５９）
前記特異的相互作用の存在または不在が、前記ＵＲＰと血清タンパク質を含む標的との間である、項目５７に記載の方法。
（項目６０）
前記特異的相互作用の存在または不在が、前記ＵＲＰと血清プロテアーゼを含む標的との間である、項目５７に記載の方法。
（項目６１）
前記標的または前記タンパク質が、細胞表面タンパク質、分泌タンパク質、細胞質ゾルタンパク質、および核タンパク質からなる群より選択される、項目５７に記載の方法。
（項目６２）
前記遺伝子パッケージがファージである、項目５７に記載の方法。
（項目６３）
前記ＵＲＰが少なくとも約４０個の連続するアミノ酸を含み、該ＵＲＰは血清タンパク質への非特異的結合が実質的に不可能であり、そしてさらに、
（ａ）ＵＲＰに含まれるグリシン（Ｇ）、アスパラギン酸（Ｄ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）、およびプロリン（Ｐ）の残基の総和が、全体のアミノ酸の約８０％より多くを構成し；ならびに／または
（ｂ）少なくとも５０％のアミノ酸がＣｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎアルゴニズムによって決定したとき二次構造を欠いている、
項目５７に記載の方法。
（項目６４）
前記ＵＲＰが少なくとも約４０個の連続するアミノ酸を含み、該ＵＲＰが約２４時間よりも長いインビトロ血清分解半減期を有する、項目５７に記載の方法。
（項目６５）
前記ＵＲＰが非天然アミノ酸配列を含む、項目５０、５５、または５７に記載の方法。
（項目６６）
前記ＵＲＰが−４以下のＴエピトープスコアを有する、項目５０、５５、または５７に記載の方法。
（項目６７）
前記ＵＲＰがＣｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎアルゴニズムによって決定したとき二次構造を欠いている、項目５０、５５、または５７に記載の方法。
（項目６８）
前記ＵＲＰに含まれるグリシン残基が、該ＵＲＰの全体のアミノ酸の少なくとも約５０％を構成する、項目５０、５５、または５７に記載の方法。
（項目６９）
前記ＵＲＰに含まれるグリシン（Ｇ）、アスパラギン酸（Ｄ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）、およびプロリン（Ｐ）の残基の総和が、該ＵＲＰの全体のアミノ酸の約６０％より多くを構成する、項目５０、５５、または５７に記載の方法。
（項目７０）
グリシン（Ｇ）、アスパラギン酸（Ｄ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）、およびプロリン（Ｐ）からなる群より選択されるアミノ酸の１つの型が、前記ＵＲＰの全体のアミノ酸の５０％より多くを構成する、項目５０または５１に記載のＵＲＰ。
（項目７１）
前記ＵＲＰが１００個より多くの連続するアミノ酸を含む、項目５０、５５、または５７に記載の方法。
（項目７２）
前記ＵＲＰが反復配列を含む、項目５０、５５、または５７に記載の方法。
（項目７３）
前記タンパク質が治療タンパク質である、項目５０、５５、または５７に記載の方法。
（項目７４）
前記タンパク質が、結合モジュール、エフェクターモジュール、多量体化モジュール、Ｃ末端モジュール、およびＮ末端モジュールからなる群より選択される１つ以上のモジュールを含む、項目５０、５５、または５７に記載の方法
【図面の簡単な説明】
【００２１】
本発明の新規な特徴は、特に、添付の特許請求の範囲に示される。本発明の特徴および利点のより良好な理解は、本発明の原理が利用される例示的な実施形態を示す以下の詳細な説明、およびその添付の図面に対する参照によって得られる。図面の説明は以下の通りである。
【図１】図１は、ＭＵＲＰのモジュール成分を示す。結合モジュール、エフェクターモジュール、および多量体化モジュールが円として示される。ＵＲＰモジュール、Ｎ末端モジュール、およびＣ末端モジュールは長方形として示される。
【図２】図２は、ＭＵＲＰのモジュール構造の例を示す。１つのＭＵＲＰ中の結合モジュール（ＢＭ）は、同一または異なる標的特異性を有し得る。
【図３】図３は、ヒト配列に基づく反復タンパク質が、Ｔ細胞エピトープを含み得る新規なアミノ酸配列を含み得ることを示す。これらの新規な配列は、隣接する反復単位間の連結部で形成される。
【図４】図４は、３つのヒトドナー配列Ｄ１、Ｄ２、およびＤ３に基づく反復タンパク質であるＵＲＰ配列の設計を図示する。このＵＲＰの反復単位は、隣接する単位間の連結部に広がる均一な９マー配列がヒトドナー配列の少なくとも１つにおいて見出すことができるように選択した。
【図５】図５は、３つのヒトタンパク質の配列に基づく反復タンパク質であるＵＲＰ配列の例である。この図の下の部分は、ＵＲＰ中に存在するすべての９マーサブ配列が少なくとも１つのヒトドナータンパク質に存在することを図示する。
【図６】図６は、ヒトＰＯＵドメイン残基１４６〜１８２に基づく実施例ベースのＵＲＰ配列である。
【図７】図７は、情報が豊富な配列間にＵＲＰモジュールを挿入することによって、このような配列でモジュールを分離することの利点を示す。この図の左側は、モジュールＡおよびＢの直接的融合が連結部において新規な配列を導くことを示す。これらの連結部配列はエピトープであり得る。この図の右半分は、モジュールＡとＢとの間のＵＲＰモジュールの挿入が、モジュールＡおよびＢからの部分配列を含むこのような接合部配列の形成を妨害することを示す。代わりに、モジュールＡおよびＢの末端は、ＵＲＰ配列を含む接合部配列を生じ、従って、低い免疫原性を有することが予測される。
【図８】図８は、ＵＲＰに基づく薬物送達構築物を示す。六角形として示されるような薬物分子はＭＵＲＰに化学的結合体化される。
【図９】図９は、プロテアーゼ感受性部位を含むＭＵＲＰを示す。ＵＲＰモジュールは、エフェクターモジュールをその機能から遮断するように設計される。プロテアーゼ切断はＵＲＰモジュールの一部を除去し、エフェクター機能の活性の増加を生じる。
【図１０】図１０は、結合モジュールとエフェクターモジュールとの間のリンカーとしてＵＲＰモジュールがいかにして働き得るかを示す。結合モジュールは標的に結合することができ、結果として標的の近傍のエフェクターモジュールの局所的濃度を増加させる。
【図１１】図１１は、短いＵＲＰモジュールのライブラリーからＵＲＰ配列をコードする遺伝子を構築するためのプロセスを示す。ＵＲＰモジュールライブラリーは、レポーターとして緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を含むスタッファーベクターに挿入され、高発現を有するＵＲＰ配列の同定を容易にし得る。この図は、長いＵＲＰ配列をコードする遺伝子が、反復二量体化によって構築され得ることを図示する。
【図１２】図１２は、死受容体のための複数の結合モジュールを含むＭＵＲＰを示す。死受容体は三量体化によって誘発され、従って、ＭＵＲＰは、細胞死を誘導する際に特に強力である１つの死受容体について少なくとも３つの結合要素を含む。この図の下の部分は、腫瘍組織について特異性を有する１つ以上の結合モジュールを加えることによって、疾患を有する組織についてＭＵＲＰの特異性を増加させることができることを図示する。
【図１３】図１３は、インターロイキン２のようなエフェクターモジュールとともに、腫瘍抗原についての特異性を有する４つの結合モジュール（長方形）を含むＭＵＲＰを示す。
【図１４】図１４は、２８８残基を有するＵＲＰモジュールの構築のためのフローチャートを示す。ＵＲＰモジュールは、ＧＦＰとともに融合タンパク質として構築した。３６アミノ酸を有するＵＲＰモジュールのライブラリーを最初に構築し、続いて反復二量体化を行い、２８８アミノ酸を有するＵＲＰモジュールを生じる（ｒＰＥＧ＿Ｈ２８８およびｒＰＥＧ＿Ｊ２８８）。
【図１５】図１５は、２８８アミノ酸を有するＵＲＰモジュールのアミノ酸配列およびヌクレオチド配列である（ｒＰＥＧ＿Ｊ２８８）。
【図１６】図１６は、２８８アミノ酸を有するＵＲＰモジュールのアミノ酸配列およびヌクレオチド配列である（ｒＰＥＧ＿Ｈ２８８）。
【図１７】図１７は、ヒトタンパク質象牙質シアロリンタンパク質のセリンリッチ配列領域のアミノ酸配列である。
【図１８】図１８は、ＭＵＲＰのデポー誘導体を示す。タンパク質は、弱いＳＳ架橋を形成し得る２つのシステイン残基を含む。タンパク質は、ＳＳ架橋をインタクトにして製造することができる。これは、還元型で製剤化して患者に注射することができる。注射後、これは、注射部位の近傍で酸化され、結果として、これは、非常に制限された拡散性を有する高分子量ポリマーを形成し得る。活性ＭＵＲＰは、制限されたタンパク質分解または架橋ＳＳ結合の制限された還元によって、注射部位からゆっくりと浸出し得る。
【図１９】図１９は、デポー型のＭＵＲＰを示す。ＭＵＲＰは、注射部位で非常に制限された拡散性を有し、制限されたタンパク質分解によって、注射部位から遊離され得る。
【図２０】図２０は、ヒスチジンリッチ配列を含むデポー型のＭＵＲＰを示す。ＭＵＲＰは、固定化ニッケルを含む不溶性ビーズと組み合わせて、製剤化しかつ注射することができる。ＭＵＲＰは注射部位でニッケルビーズに結合し、ゆっくりと循環に放出される。
【図２１】図２１は、多量体化モジュールを含むＭＵＲＰを示す。この図の上の部分は、１つの二量体化配列を含むＭＵＲＰを示す。結果として、これは、その分子量を効率的に倍加する二量体を形成する。この図の中心は、２つの多量体化配列を含む３つのＭＵＲＰ設計を示す。このようなＭＵＲＰは、非常に高い有効分子量を有する多量体を形成し得る。この図の下の部分は、細胞表面受容体に結合することが知られている複数のＲＧＤ配列を含み、従って、半減期を付与するＭＵＲＰを図示する。
【図２２】図２２は、イオンチャネル機能を遮断または調節するように設計されている種々のＭＵＲＰを示す。円は、イオンチャネルについて特異性を有する結合モジュールを示す。これらの結合モジュールは、誘導体化され得、またはイオンチャネル受容体について親和性を有する天然のトキシンと同一であり得る。この図は、他の結合ドメインを、イオンチャネル特異性結合モジュールのいずれかの側に加えることができ、従って、ＭＵＲＰに、効力の増加または特定の細胞型についての特異性を付与することを図示する。
【図２３】図２３は、半減期の増加のためのいくつかのＭＵＲＰ設計を示す。有効分子量の増加は、鎖長（Ａ）を増加すること、化学的多量体化（Ｂ）、複数コピーの結合モジュールを、非結合部位によって分離された分子に加えること（Ｃ）、Ｃに類似する化学的多量体の構築（Ｄ、Ｅ）、多量体化配列を含むこと（Ｆ）によって達成することができる。
【図２４】図２４は、組換えＵＲＰ配列への結合モジュールの化学的結合体化によって形成することができるＭＵＲＰを示す。ＵＲＰ配列は、結合体化部位として複数のリジン残基（Ｋ）を含むように設計される。
【図２５】図２５は、２ＳＳ結合モジュールのライブラリーの設計を示す。これらの配列は中心に定常１ＳＳ配列を含み、これは、１ＳＳコアから様々な距離にシステイン残基を含むランダム配列に隣接されている。
【図２６】図２６は、２ＳＳ結合モジュールの設計を示す。これらの配列は中心に定常１ＳＳ配列を含み、これは、１ＳＳコアから様々な距離にシステイン残基を含むランダム配列に隣接されている。
【図２７】図２７は、１ＳＳ結合モジュールの二量体のライブラリーの設計を示す。最初に、１ＳＳ結合モジュールのコレクションは、２回のＰＣＲ反応によって増幅される。得られるＰＣＲ産物は合わせて、二量体は引き続くＰＣＲ段階で生成される。
【図２８】図２８は、５０％マウス血清中での３日間までのインキュベーション後の、２８８アミノ酸ＵＲＰ配列ｒＰＥＧ＿Ｊ２８８を含む融合タンパク質のウェスタン分析を示す。
【図２９】図２９は、２８８アミノ酸のＵＲＰ配列に対する既存の抗体についての結合アッセイ試験の結果を示す。
【図３０】図３０は、マイクロタイタープレートにコートされたＶＥＧＦについての特異性を有する、１個（単量体）、２個（二量体）、４個（四量体）、または０個（ｒＰＥＧ３６）の結合モジュールを含むＭＵＲＰの結合を示す。
【図３１】図３１は、ＥｐＣＡＭに特異性を有するＭＵＲＰのアミノ酸配列を示す。この配列は、ＥｐＣＡＭに親和性を有する４個の結合モジュール（下線）を含む。この配列は、全体の配列の２つのみのリジン残基を含むＮ末端フラグ（Ｆｌａｇ）配列を含む。
【図３２】図３２は、１ＳＳ付加ライブラリーの設計を示す。ランダム１ＳＳモジュールは、あらかじめ選択した結合モジュールのＮ末端もしくはＣ末端に、または両側に同時に加えることができる。
【図３３】図３３は、３フィンガートキシン関連配列のアラインメントを示す。この図は、ＮＭＲによって分解された３Ｄ構造も示す。
【図３４】図３４は、３フィンガートキシンベースのライブラリーの設計を示す。Ｘと名付けた残基をランダム化した。各ランダム位置についてのコドンの選択を示す。
【図３５】図３５は、プレキシン関連配列のアラインメントを示す。
【図３６】図３６はプレキシンベースのライブラリーの設計を示す。Ｘと名付けた残基をランダム化した。各ランダム位置についてのコドンの選択を示す。
【図３７】図３７は、ＤＲ４、ＥｒｂＢ２、およびＨＧＦＲについての特異性を有するプレキシン関連結合モジュールの配列である。
【図３８】図３８は、ＶＥＧＦに特異性を有するマイクロプロテインベースの結合ドメインについての結合アッセイを示す。
【図３９】図３９は、ＶＥＧＦに特異性を有する積み上げライブラリーから単離した２ＳＳおよび３ＳＳ結合モジュールの配列を示す。タンパク質の上の部分は、熱−溶解によって精製したタンパク質のＰＡＧＥゲル分析を示す。
【図４０】図４０は、ＵＲＰ配列ｒＰＥＧ＿Ｊ７２を構築するためのクローニング段階を示す。
【図４１】図４１は、ｒＰＥＧ＿Ｊ３６と呼ばれる３６アミノ酸を有するＵＲＰモジュールのライブラリーの構築を示す。ｒＰＥＧ＿Ｊ３６をコードする領域は、ｒＰＥＧ＿Ｊ１２をコードする３つのより短いセグメントおよびストッパーモジュールをライゲーションすることによってアセンブルした。
【図４２】図４２は、スタッファーベクターｐＣＷ００５１のヌクレオチド配列および翻訳を示す。スタッファー領域にはＢｓａＩ部位およびＢｂｓＩ部位が隣接し、この領域は複数の終止コドンを含む。
【図４３】図４３は、ＧＦＰに融合されたＵＲＰ  ｒＰＥＧ＿Ｊ２８８の精製のＰＡＧＥゲルを示す。レーン２は細胞溶解物；レーン３：ＩＭＡＣによって精製された生成物；レーン４：抗Ｆｌａｇによって精製された生成物を示す。
【図４４】図４４は、ｒＰＥＧ＿Ｊ２８８と、ヒトエフェクタードメイン、インターフェロンα、Ｇ−ＣＳＦ、およびヒト成長ホルモンとの間の融合タンパク質のアミノ酸配列である。
【図４５】図４５は、ｒＰＥＧ＿Ｊ２８８と、ヒト成長ホルモン（レーン１および２）、インターフェロンα（レーン３および４）、およびＧＦＰ（レーン５および６）との間の融合タンパク質の発現のウェスタン分析を示す。可溶性および不溶性の両方の材料を、各タンパク質について分析した。
【図４６】図４６は、トキシンＯＳＫ１に基づくＭＵＲＰの設計を示す。この図は、ＵＲＰ配列および／または結合モジュールを、ＯＳＫ１のいずれかの側に加えることができることを示す。
【図４７】図４７は、対象のＵＲＰを含む例示的な生成物形式を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
（発明の詳細な説明）
本発明の好ましい実施形態は本明細書に示されかつ記載されているが、このような実施形態は例示のみのために提供されることが当業者には明らかである。本発明から逸脱することなく、多数の改変、変更、および置換が、ここで、当業者に明らかである。本明細書に記載される本発明の実施形態が、本発明を実施する際に利用され得ることが理解されるべきである。上記の特許請求の範囲は本発明の範囲を定義すること、ならびにこれらの特許請求の範囲の範囲内にある方法および構造、およびこれらの等価物がそれによって網羅されることが意図される。
【００２３】
一般的技術
本発明の実施は、他に示さない限り、当業者の範囲内にある、免疫学、生化学、化学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、ゲノミクス、および組換えＤＮＡの常套の技術を利用する。Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，第２版（１９８９）；ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編（１９８７））；ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹのシリーズ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）：ＰＣＲ  ２：Ａ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＡＰＰＲＯＡＣＨ（Ｍ．Ｊ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｇ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒ編（１９９５）），Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ編（１９８８）ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ，Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ、およびＡＮＩＭＡＬ  ＣＥＬＬ  ＣＵＬＴＵＲＥ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編（１９８７））を参照のこと。
【００２４】
定義
明細書および特許請求の範囲において使用される場合、単数形（「単数の（ａ）」、「単数の（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」）は、状況が明確に他を示さない限り、複数形の言及を含む。例えば、「細胞」という用語は、その混合物を含めて複数の細胞を含む。
【００２５】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、「アミノ酸配列」および「タンパク質」という用語は、本明細書では、任意の長さのアミノ酸のポリマーをいうために交換可能に使用される。このポリマーは直鎖状または分枝状であってもよく、これは修飾アミノ酸を含んでもよく、そしてこれは非アミノ酸によって中断されていてもよい。これらの用語は、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または任意の他の操作、例えば、標識成分との結合体化で修飾されたアミノ酸ポリマーも包含する。本明細書で使用される場合、「アミノ酸」という用語は、天然アミノ酸および／または非天然もしくは合成アミノ酸のいずれかをいい、グリシンおよびＤ型またはＬ型の光学異性体、ならびにアミノ酸アナログおよびペプチド模倣物の両方を含むがこれらに限定されない。標準的な一文字コードおよび三文字コードがアミノ酸を指定するために使用される。
【００２６】
「反復配列」とは、ペプチド配列を反復し、直接的反復を形成するオリゴマー、または複数の配列モチーフの逆配列もしくは交互の反復として記載することができる、アミノ酸配列をいう。これらの反復オリゴマー配列は、互いに対して同一または相同であり得るが、複数の反復モチーフも存在し得る。反復配列は、非常に低い情報量によって特徴付けられる。反復配列は、ＵＲＰの必要とされる特徴ではなく、ある場合において、実際に非反復配列が好ましい。
【００２７】
アミノ酸は、それらの疎水性に基づいて特徴付けることができる。多くの尺度が開発されてきた。１つの例は、Ｌｅｖｉｔｔ，Ｍら（Ｌｅｖｉｔｔ，Ｍ（１９７６）Ｊ  Ｍｏｌ
Ｂｉｏｌ  １０４，５９，＃３２３３を参照のこと、これは、Ｈｏｐｐ，ＴＰら（１９８１）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ７８，３８２４，＃３２３２に列挙されている）によって開発された尺度である。「親水性アミノ酸」の例は、アルギニン、リジン、スレオニン、アラニン、アスパラギン、およびグルタミンである。特に関心が持たれるものは、親水性アミノ酸である、アルギニン、グルタミン、およびセリン、およびグリシンである。「疎水性アミノ酸」の例は、トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン、メチオニン、ロイシン、イソロイシン、およびバリンである。
【００２８】
「変性コンホメーション」という用語は、ペプチドバックボーンの大きなコンホメーションの自由度によって特徴付けられる、溶液中のペプチドの状態を説明する。多くのペプチドおよびタンパク質は、高濃度の変性剤の存在下または高温において、変性コンホメーションをとる。変性コンホメーションにあるペプチドは特徴的なＣＤスペクトルを有し、これらは一般的に、例えば、ＮＭＲによって決定したとき遠距離相互作用の欠如によって特徴付けられる。変性コンホメーションおよび折りたたまれていないコンホメーションは同義語として使用される。
【００２９】
「非構造タンパク質（ＵＮＰ）配列」および「非構造組換えポリマー（ＵＲＰ）」という用語は、本明細書では交換可能に使用される。これらの用語は、本明細書に詳述するような生理学的条件下で、変性ペプチド配列との共通点、例えば、変性ペプチド配列のような典型的な挙動を示すことを共有するアミノ酸配列をいう。ＵＲＰ配列は明確な三次構造を欠き、これらは、例えば、Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎアルゴリズムによって検出したとき二次構造が限定されているか、またはそのような二次構造を有さない。
【００３０】
本明細書で使用される場合、「細胞表面タンパク質」という用語は、細胞の原形質膜成分をいう。これは、原形質膜を構成する、内在性および周辺膜タンパク質、糖タンパク質、ポリサッカリド、および脂質を包含する。内在性膜タンパク質は、細胞の原形質膜の脂質二重層を横切って伸びる膜貫通タンパク質である。典型的な内在性タンパク質は、一般的には疎水性アミノ酸残基を含む、少なくとも１つの膜貫通セグメントからなる。周辺膜タンパク質は、脂質二重層の疎水性内部には伸びず、これらは、直接的または間接的な、共有結合性または非共有結合性の他の膜成分との相互作用を介して、膜表面に結合する。
【００３１】
「膜」、「細胞質ゾル」、「核」、および「分泌」という用語は、細胞タンパク質に適用される場合、細胞タンパク質が、大部分、優先的に、または好ましく局在化される、細胞外および／または細胞下の位置を特定する。
【００３２】
「細胞表面受容体」は、それらのそれぞれのリガンドに結合可能である膜タンパク質のサブセットを表す。細胞表面受容体は、細胞の原形質膜に固着され、または細胞に挿入されている分子である。これらは、原形質膜の構造的な構成要素としてのみならず、種々の生物学的機能を支配する調節要素として役立つ、タンパク質、糖タンパク質、ポリサッカリド、および脂質の大きなファミリーを構成する。
【００３３】
「モジュール」という用語は、タンパク質またはペプチドの他の部分から、物理的または機能的に区別されるタンパク質の部分をいう。モジュールは１つ以上のドメインを含み得る。一般的に、モジュールまたはドメインは、サイズに関わりなく、単一の、安定な三次元構造であり得る。典型的なドメインの三次構造は溶液中で安定であり、このようなメンバーが単離され、または他のドメインに共有結合的に融合されるかに関わらず、同じままである。ドメインは、一般的に、βシート、αヘリックス、および非構造ループなどの二次構造要素の空間的な関係によって形成される特定の三次構造を有する。マイクロプロテインファミリーのドメインの中では、ジスルフィド架橋が、一般的に、三次構造を決定する主要な要素である。いくつかの例において、ドメインは、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）のような血清タンパク質またはＩｇＧ（ｈＩｇＧ１、２、３、または４）または赤血球細胞に結合する、アビディティ（同じ標的に対する複数の結合）、複数の特異性（異なる標的のための結合部位）、半減期（ドメイン、環状ペプチド、または直鎖状ペプチドを使用する）などの特異的機能活性を付与し得るモジュールである。機能的に定義されたドメインは、別個の生物学的機能を有する。受容体のリガンド結合ドメインは、例えば、リ
ガンドを結合するドメインである。抗原結合ドメインとは、抗原に結合する、抗原結合単位の部分または抗体をいう。機能的に定義されたドメインは、連続するアミノ酸配列によってコードされる必要はない。機能的に定義されたドメインは、１つ以上の物理的に定義されたドメインを含んでもよい。受容体は、例えば、細胞外リガンド結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内エフェクタードメインに分けられる。「膜貫通ドメイン」とは、膜結合を媒介するタンパク質の部分をいう。一般的に、膜固着ドメインは、疎水性アミノ酸残基から構成される。または、膜固着ドメインは、修飾アミノ酸、例えば、次にはタンパク質を膜に固着させる、脂肪酸鎖に結合されているアミノ酸を含んでもよい。
【００３４】
「天然に存在しない」は、タンパク質に適用される場合、そのタンパク質が、対応する野生型またはネイティブタンパク質とは異なる少なくとも１つのアミノ酸を含むことを意味する。非天然配列は、例えば、比較ウィンドウは目的の配列（問い合わせ配列）の長さであり、ＢＬＡＳＴ  ２．０を使用してＧｅｎｂａｎｋの非冗長（「ｎｒ」）データベースと比較する、最低最小合計確率を使用するＢＬＡＳＴ検索を実施することによって決定することができる。ＢＬＡＳＴ  ２．０アルゴニズムは、それぞれ、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０に記載されている。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを通して公的に利用可能である。
【００３５】
「宿主細胞」は、対象のベクターのためのレシピエントであり得る、またはレシピエントであった、個々の細胞または細胞培養物を含む。宿主細胞は、単一の宿主細胞の子孫を含む。その子孫は、天然の、偶発的な、または意図的な変異に起因して、もともとの親の細胞と（形態または全体のＤＮＡ相補物のゲノムで）完全に同一であることは必ずしもない場合がある。宿主細胞には、本発明のベクターを用いてインビボでトランスフェクトされた細胞が含まれる。
【００３６】
本明細書で使用される場合、「単離された」という用語は、ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、またはそのフラグメントが通常天然に結合している成分、細胞、および他のものから分離されていることを意味する。当業者に明らかであるように、天然に存在しないポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、またはそのフラグメントは、その天然に存在する対応物から区別するために「単離」を必要とはしない。加えて、ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、またはそのフラグメントの「濃縮」、「分離」、または「希釈」は、濃度または体積あたりの分子数が、その天然に存在する対応物のそれよりも、より多く「濃縮」され、そしてより少なく「分離」されるという点で、その天然に存在する対応物から区別可能である。
【００３７】
「連結された」および「融合された」または「融合」は交換可能に使用される。これらの用語は、化学的結合体化または組換え手段を含むどのような手段によっても、２つ以上の化学的要素または成分を一緒に結合することをいう。「フレーム内融合」とは、もともとのオープンリーディングフレーム（ＯＦＲ）の正確な読み枠を維持する様式で、連続するより長いＯＦＲを形成するために２つ以上のＯＦＲを結合することをいう。従って、得られる組換え融合タンパク質は、もともとのＯＦＲによってコードされるポリペプチドに対応する２つ以上のセグメントを含む単一のタンパク質である（このセグメントは、通常、天然ではそのように結合していない）。
【００３８】
ポリペプチドの状況において、「線状配列」または「配列」は、配列中の互いに隣り合っている残基がポリペプチドの一次構造で連続している、アミノ末端からカルボキシ末端の方向のポリペプチド中のアミノ酸の順序である。「部分配列」は、１つの方向または両方向でさらなる残基を含むことが知られているポリペプチドの部分の線状配列である。
【００３９】
「異種」は、遺伝子型がある実体から誘導され、その実体は比較される残りの実体から区別できることを意味する。例えば、そのネイティブコード配列から取り出され、かつネイティブ配列以外のコード配列に作動可能に連結されているグリシンリッチな配列は、異種グリシンリッチ配列である。「異種」という用語は、ポリヌクレオチド、ポリペプチドに適用される場合、そのポリヌクレオチドまたはポリペプチドが、比較される残りの実体から遺伝子型が区別できる実体から誘導されることを意味する。
【００４０】
「ポリヌクレオチド」、「核酸」、「ヌクレオチド」、および「オリゴヌクレオチド」は、交換可能に使用される。これらは、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドまたはそのアナログのいずれかである、任意の長さのポリマー型のヌクレオチドをいう。ポリヌクレオチドは任意の三次元構造を有してもよく、既知または未知の任意の機能を発揮してもよい。以下はポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子または遺伝子フラグメントのコード領域または非コード領域、連鎖解析から定義された遺伝子座、エキソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分枝鎖ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマー。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログなどの修飾ヌクレオチドを含んでもよい。存在する場合、ヌクレオチド構造に対する修飾は、ポリマーのアセンブルの前または後で付与されてもよい。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって中断されてもよい。ポリヌクレオチドは、例えば、標識成分を用いる結合体化によって、重合後にさらに修飾されてもよい。
【００４１】
「組換え」は、ポリヌクレオチドに適用される場合、ポリヌクレオチドが、天然に見出されるポリヌクレオチドから区別できる構築物を生じる、クローニング、制限および／またはライゲーション工程、ならびに他の手順の種々の組み合わせの生成物であることを意味する。
【００４２】
「遺伝子」または「遺伝子フラグメント」という用語は、本明細書では交換可能に使用される。これらは、転写および翻訳後に特定のタンパク質をコード可能である少なくとも１つのオープンリーディングフレームを含むポリヌクレオチドをいう。遺伝子または遺伝子フラグメントは、ポリヌクレオチドが全体のコード領域またはそのフラグメントを網羅し得る少なくとも１つのオープンリーディングフレームを含む限り、ゲノムまたはｃＤＮＡのそれであり得る。「融合タンパク質」は、一緒に連結されている少なくとも２つの異種ポリヌクレオチドから構成される遺伝子である。
【００４３】
「ベクター」は、宿主細胞中および／またはその間で、挿入された核酸分子を移動させる核酸分子、好ましくは自己複製する分子である。この用語は、細胞へのＤＮＡまたはＲＮＡの挿入のために主として機能するベクター、ＤＮＡまたはＲＮＡの複製のために主として機能する複製ベクター、ならびにＤＮＡまたはＲＮＡの転写および／または翻訳のために機能する発現ベクターを含む。複数の上記の機能を提供するベクターも含まれる。「発現ベクター」は、適切な宿主細胞に導入されたときに、ポリペプチドに転写および翻訳できるポリヌクレオチドである。「発現ベクター」は、通常、所望の発現生成物を生じるために機能できる発現ベクターから構成される適切な宿主細胞を暗示する。
【００４４】
「標的」は、ＭＵＲＰの状況において使用される場合、結合モジュールまたはＵＲＰ連結結合モジュールが結合でき、そして結合事象が所望の生物学的活性を生じる、生化学的分子または構造である。標的は、タンパク質によって阻害され、活性化され、またはさもなければ作用されるタンパク質のリガンドまたは受容体であり得る。標的の例は、ホルモン、サイトカイン、抗体または抗体フラグメント、細胞表面受容体、キナーゼ、増殖因子、および生物学的活性を有する他の生化学的構造である。
【００４５】
「機能モジュール」は、タンパク質生成物中の任意の非ＵＲＰであり得る。従って、機能モジュールは、結合モジュール（ＢＭ）、エフェクターモジュール（ＥＭ）、多量体化モジュール（ＭＭ）、Ｃ末端モジュール（ＣＭ）、またはＮ末端モジュール（ＮＭ）であり得る。一般的に、機能モジュールは、それらのアミノ酸配列の大量の情報量によって特徴付けられ、すなわち、これらは多くの異なるアミノ酸を含み、これらのアミノ酸の多くは機能モジュールの機能のために重要である。機能モジュールは、典型的には、二次構造および三次構造を有し、折りたたまれたタンパク質ドメインであり得、１個、２個、３個、４個、５個またはそれ以上のジスルフィド結合を含み得る。
【００４６】
「マイクロプロテイン」という用語は、ＳＣＯＰデータベースにおける分類をいう。マイクロプロテインは、通常、固定された構造を有する最小のタンパク質であり、典型的に、しかし独占的ではなく、２つのジスルフィドを有する１５個までの少ないアミノ酸、または１０個より多くのジスルフィドを有する２００個までのアミノ酸を有する。マイクロプロテインは、１個以上のマイクロプロテインドメインを含み得る。いくつかのマイクロプロテインドメインまたはドメインファミリーは、異なるジスルフィド結合パターンによって付与される、複数の事実上安定である構造、および複数の事実上類似の構造を有し得、それゆえに、安定であるという用語は、ペプチドからのマイクロプロテインおよび非マイクロプロテインドメインを区別するための比較的な方法で使用される。多くのマイクロプロテイントキシンは、単一のドメインから構成されるが、細胞表面受容体マイクロプロテインは、しばしば、複数のドメインを有する。マイクロプロテインは非常に小さくてよい。なぜなら、それらのフォールディングは、典型的な疎水性コアによって安定化される代わりに、ジスルフィド結合によって、および／またはカルシウム、マグネシウム、マンガン、銅、亜鉛、鉄、もしくは種々の他の多価イオンなどのイオンによってのいずれかで安定化されているからである。
【００４７】
「骨格」という用語は、タンパク質ライブラリーの構築における保存性の共通の配列として使用される最小限のポリペプチド「フレームワーク」または「配列モチーフ」をいう。骨格の固定または保存性残基／位置の間に、可変位置および超可変位置が存在する。アミノ酸の広い多様性が、固定された骨格残基の間の可変領域の中で提供され、標的分子への特異的結合を提供する。骨格は、典型的には、配列関連タンパク質のファミリーのアラインメント中で観察される保存性残基によって定義される。固定された残基は、とりわけ、整列されたタンパク質の機能が異なる場合に、フォールディングまたは構造のために必要とされ得る。マイクロプロテイン骨格の完全な記載は、数、位置または間隔、およびシステインの結合パターン、ならびに、カルシウムなどのイオンのための結合部位を含む、ループ中の任意の固定された残基の位置および同一性を含み得る。
【００４８】
マイクロプロテインの「フォールディング」はジスルフィド結合の結合パターン（すなわち、１−４、２−６、３−５）によって大部分が定義される。このパターンはトポロジー的に一定であり、一般的に、例えば、還元および酸化（酸化還元剤）によって、ジスルフィドを非連結および再連結することを伴うことなく、別のパターンへの転換に対して受容可能ではない。一般的に、関連配列を有する天然タンパク質は同じジスルフィド結合パターンをとる。主要な決定基は、システイン距離パターン（ＣＤＰ）およびいくつかの固定された非ｃｙｓ残基、ならびに存在する場合、金属結合部位である。少数の例では、タンパク質のフォールディングはまた、周囲の配列（すなわち、プロ−ペプチド）によって影響を受け、いくつかの場合においては、タンパク質のフォールディングを補助する二価金属イオン（すなわち、Ｃａ＋＋）にタンパク質が結合することを可能にする残基の化学的誘導体化（すなわち、γ−カルボキシル化）による。圧倒的多数のマイクロプロテインについては、このようなフォールディング補助は必要とされない。
【００４９】
しかし、同じ結合パターンを有するタンパク質は、かなり異なる構造をタンパク質に与えるために十分に大きい、長さおよびループ組成の違いに基づいて、さらに複数のフォールディングを含んでもよい。１つの例は、同じＤＢＰを有するが、非常に異なるＣＤＰを有し、異なるフォールディングであると見なされる、コノトキシン、シクロトキシン、およびアナトドメインファミリーである。タンパク質のフォールディングの決定基は、システインの数および結合パターン、システインの間隔、システインループ間の配列モチーフの違い（とりわけ、フォールディングのために必要とされるらしい固定されたループ残基）またはカルシウム（または他の金属もしくは補因子）結合部位の位置もしくは組成の違いなどの、異なるフォールディングに比較して構造を大きく変化させる任意の属性である。
【００５０】
「ジスルフィド結合パターン」または「ＤＢＰ」という用語は、タンパク質のＮ末端からＣ末端までの１−ｎで番号付けされているシステインの結合パターンをいう。ジスルフィド結合パターンはトポロジー的に一定であり、これらが、例えば、酸化還元条件を使用して、１つ以上のジスルフィド結合を外すことによって変化し得るのみであることを意味する。可能な２−、３−、および４−ジスルフィド結合パターンは、以下の段落００４８−００７５において以下に列挙されている。
【００５１】
「システイン距離パターン」または「ＣＤＰ」という用語は、直鎖状タンパク質鎖上のシステインを分ける非システインアミノ酸の数をいう。いくつかの表記法が使用される：Ｃ５Ｃ０Ｃ３Ｃは、Ｃ５ＣＣ３Ｃ、ＣｘｘｘｘｘＣＣｘｘｘＣに等しい
「ｎ６位」または「ｎ７＝４」という用語は、システイン間ループをいい、「ｎ６」はＣ６とＣ７との間のループとして定義され；「ｎ７＝４」は、Ｃ７とＣ８との間のループが、システインを数えずに４アミノ酸長であることを意味する。
【００５２】
血清分解抵抗性−タンパク質は血中での分解によって除去される可能性があり、これは、典型的には、血清または血漿のプロテアーゼを含む。この血清抵抗性は、典型的には、ある範囲の日数（すなわち、０．２５、０．５、１、２、４、８、１６日間）の間３７℃にて、ヒトの（または、必要に応じて、マウス、ラット、サルの）血清または血漿とタンパク質とを合わせることによって測定される。次いで、これらの時点についてのサンプルでウェスタンアッセイを実行し、抗体を用いてタンパク質を検出する。抗体はタンパク質中のタグに対してであり得る。タンパク質がウェスタン上で単一バンドを示すならば、この場合、タンパク質のサイズが注入タンパク質のサイズと同一であり、分解は起こっていない。ウェスタンによって判断されるように、５０％のタンパク質が分解される時点は、タンパク質の血清分解半減期である。
【００５３】
血清タンパク質結合−ＭＵＲＰは典型的には細胞表面標的および／または血清タンパク質に結合する多数のモジュールを有するが、ＵＲＰは、実質的には、意図されない活性を欠いていることが所望される。ＵＲＰは、抗体を含む、血清タンパク質との相互作用（血清タンパク質への結合）を最小化、回避するように設計される必要がある。異なるＵＲＰ設計は、ＥＬＩＳＡによって血清タンパク質結合についてスクリーニングでき、血清タンパク質を固定化し、次いでＵＲＰを添加し、インキュベートし、洗浄し、次いで結合したＵＲＰの量を検出する。１つのアプローチは、ＵＲＰに付加されたタグを認識する抗体を使用してＵＲＰを検出することである。１つの異なるアプローチは、ＵＲＰを固定化し（例えば、ＧＦＰへの融合を介して）そしてヒト血清中に入れることであり、次いで、ヤギ抗ヒトＩｇＧのような二次抗体を使用してＵＲＰに結合したままであるヒト抗体の量を検出する。これらのアプローチを使用して、本発明者らは、血清タンパク質への非常に低いレベルの結合を示すために本発明者らのＵＲＰを設計した。しかし、いくつかの適用においては、血清タンパク質または血清曝露タンパク質への結合が所望される。例えば、これは、分泌半減期をさらに延長し得るからである。このような場合において、ＨＳＡまたはＩｇＧのような血清タンパク質または血清曝露タンパク質に結合するＵＲＰを設計するためにこれらの同じアッセイを使用することができる。他の場合において、ＭＵＲＰは、ＨＡＳまたはＩｇＧなどの血清タンパク質または血清曝露タンパク質に結合するように設計されたペプチドを含む所定の結合モジュールであり得る。
【００５４】
非構造組換えポリマー（ＵＲＰ）
本発明の１つの態様は非構造組換えポリマー（ＵＲＰ）の設計である。対象ＵＲＰは、治療的および／または診断的価値のある組換えタンパク質を生成するために特に有用である。対象ＵＲＰは、１つ以上の以下の特徴を示す。
【００５５】
対象ＵＲＰは、典型的には、生理学的条件下で変性ペプチド配列と共通点を有するアミノ酸配列を含む。ＵＲＰは、典型的には、生理学的条件下で変性ペプチド配列のように振る舞う。ＵＲＰは、生理学的条件下で、十分に定義されている二次構造および三次構造を欠いている。所定のポリペプチドの二次構造および三次構造を確認するための種々の方法が当該分野で確立されている。例えば、ポリペプチドの二次構造は、「遠紫外線」スペクトル領域（１９０〜２５０ｎｍ）におけるＣＤスペクトル測定によって決定することができる。αヘリックス、βシート、およびランダムコイルの構造は、各々がＣＤスペクトルの特徴的な形状および大きさを生じる。二次構造はまた、Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎアルゴリズム（Ｃｈｏｕ，Ｐ．Ｙ．ら（１９７４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１３：２２２−４５）などの特定のコンピュータプログラムを介して確認することもできる。所定のＵＲＰ配列について、アルゴリズムは、何らかの二次構造が存在するか、または二次構造が全く存在しないかを予測することができる。一般的に、ＵＲＰ配列は、それらの低い程度の二次構造および三次構造に起因して、変性配列に類似するスペクトルを有する。所望される場合、ＵＲＰ配列は、生理学的条件下で優先的に変性コンホメーションを有するように設計することができる。ＵＲＰ配列は、典型的には、生理学的条件下で高度なコンホメーションの柔軟性を有し、これらは、同様な分子量の球状タンパク質と比較して、大きな流体力学半径（ストークス半径）を有する傾向がある。本明細書で使用される場合、生理学的条件とは、生きている対象の状態を模倣する、温度、塩濃度、ｐＨを含む一連の条件をいう。インビトロアッセイにおける使用のための生理学的に関連する条件の宿主は確立されている。一般的に、生理学的緩衝剤は、生理学的な塩濃度を含み、約６．５〜約７．８、および好ましくは、約７．０〜約７．５の範囲の中性ｐＨに調整されている。種々の生理学的緩衝剤は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）前出に列挙されており、およびそれゆえに本明細書では詳述しない。生理学的に関連性のある温度範囲は、約２５℃〜約３８℃、好ましくは、約３０℃〜約３７℃の範囲である。
【００５６】
対象ＵＲＰは、低い免疫原性を有する配列であり得る。低い免疫原性は、ＵＲＰ配列のコンホメーションの柔軟性の直接的な結果であり得る。多くの抗体は、タンパク質抗原の中のいわゆるコンホメーションのエピトープを認識する。コンホメーションのエピトープは、タンパク質抗原の複数の不連続アミノ酸配列から構成されるタンパク質表面の領域によって形成される。タンパク質の正確なフォールディングは、これらの配列を、抗体によって認識され得る十分に定義された空間配置にする。好ましいＵＲＰは、コンホメーションのエピトープの形成を回避するように設計される。例えば、特に関心が持たれるものは、水溶液中でコンパクトにフォールディングしたコンホメーションに適合する傾向が低いＵＲＰ配列である。特に、低い免疫原性は、抗原提示細胞中での抗原プロセシングに抵抗する配列を選択すること、ＭＨＣには十分に結合しない配列を選択すること、および／またはヒト配列に由来する配列を選択することによって、達成することができる。
【００５７】
対象のＵＲＰは、高度なプロテアーゼ抵抗性を有する配列であり得る。プロテアーゼ抵抗性もまた、ＵＲＰ配列のコンホメーションの柔軟性の結果であり得る。プロテアーゼ抵抗性は、既知のプロテアーゼ認識部位を回避することによって設計することができる。代替的には、プロテアーゼ抵抗性配列は、ランダムまたは半ランダム配列ライブラリーからファージディスプレイまたは関連技術によって選択することができる。特別な適用、例えば、デポータンパク質からの遅延放出のために設計される場合、血清プロテアーゼ切断部位は、ＵＲＰに構築することができる。特に関心が持たれるものは、血中で高い安定性（例えば、長い血清半減期、体液中に存在するプロテアーゼによる切断の傾向がより少ないこと）を有するＵＲＰ配列である。
【００５８】
対象ＵＲＰはまた、タンパク質へのＵＲＰの取り込みの際に、ＵＲＰを欠損している対応するタンパク質と比較した場合に、そのタンパク質がより長い血清半減期および／またはより高い溶解性を示すという点において、効果によって特徴付けることができる。［血清半減期を確認する方法は当該分野において公知である（例えば、Ａｌｖａｒｅｚ，Ｐ．ら（２００４）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２７９：３３７５−８１）。得られるタンパク質が、非修飾タンパク質と比較してより長い血清半減期を有するか否かは、当該分野において公知であるかまたは本明細書に例示される任意の方法を実施することによって容易に決定することができる。
【００５９】
対象ＵＲＰは、（ａ）ＵＲＰを含むタンパク質の血清半減期の延長；（ｂ）得られるタンパク質の溶解性の増加；（ｃ）プロテアーゼに対する抵抗性の増加；および／または（ｄ）ＵＲＰを含む得られるタンパク質の免疫原性の減少をもたらすために任意の長さであり得る。典型的には、対象ＵＲＰは、約３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、３００、４００またはそれ以上の連続するアミノ酸を有する。タンパク質に組み込まれたとき、ＵＲＰは、得られるタンパク質が複数のＵＲＰまたは複数のＵＲＰのフラグメントを含むようにフラグメント化することができる。これらの個々のＵＲＰ配列のいくつかまたはすべては、得られるタンパク質中のすべてのＵＲＰ配列の合わせた長さが少なくとも４０アミノ酸である限り、４０アミノ酸よりも短くあり得る。好ましくは、得られるタンパク質は、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、１００個、１５０個、２００個、またはそれ以上のアミノ酸を超えるＵＲＰ配列の合わせた長さを有する。
【００６０】
ＵＲＰは、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０．０、１０．５、１１．０、１１．５、１２．０、１２．５、または１３．０でさえの等電点（ｐＩ）を有し得る。
【００６１】
一般的に、ＵＲＰ配列は、親水性アミノ酸が豊富であり、低い割合の疎水性または芳香族アミノ酸を含む。適切な親水性残基には、グリシン、セリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニン、およびスレオニンが含まれるがこれらに限定されない。ＵＲＰの構築においてあまり好ましくない疎水性アミノ酸には、チロシン、ロイシン、イソロイシン、バリン、およびメチオニンが含まれる。ＵＲＰ配列はグリシンが豊富であり得るが、しかしＵＲＰ配列はまた、グルタミン、アスパラギン酸、セリン、スレオニン、またはプロリンが豊富でもあり得る。従って、優勢なアミノ酸は、Ｇ、Ｅ、Ｄ、Ｓ、Ｔ、Ａ、またはＰであり得る。プロリン残基を含めることは、タンパク質切断性分解に対する感受性を減少させる傾向がある。
【００６２】
親水性残基を含めることは、典型的には、生理学的条件下で、水または水性媒体中でのＵＲＰの溶解性を増加する。それらのアミノ酸組成の結果として、ＵＲＰ配列は水系製剤中で凝集体を形成する傾向が低く、他のタンパク質またはペプチドへのＵＲＰ配列の融合はそれらの溶解性を増強し、それらが凝集体を形成する傾向を減少し、このことが、免疫原性を減少するための別々のメカニズムである。
【００６３】
ＵＲＰ配列は、タンパク質に望ましくない特性を付与する特定のアミノ酸を回避するように設計することができる。例えば、以下のアミノ酸をほとんど含まないかまたは全く含まないようにＵＲＰ配列を設計することができる：システイン（ジスルフィド形成および酸化を回避するため）、メチオニン（酸化を回避するため）、アスパラギンおよびグルタミン（脱アミド化（ｄｅｓａｍｉｄａｔｉｏｎ）を回避するため）。
【００６４】
グリシンリッチＵＲＰ：
１つの実施形態において、対象のＵＲＰはグリシンリッチ配列（ＧＲＳ）を含む。例えば、グリシンは、これが目的の配列中に存在する最も優勢な残基であるように、優勢に存在し得る。別の例において、ＵＲＰ配列は、グリシン残基が全体のアミノ酸の少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％を構成するように設計することができる。ＵＲＰは１００％グリシンもまた含み得る。なお別の実施形態において、ＵＲＰは、少なくとも３０％のグリシンを含み、そしてトリプトファン、フェニルアラニン、チロシン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンの全体の濃度は２０％未満である。さらに別の例において、ＵＲＰは、少なくとも４０％のグリシンを含み、そしてトリプトファン、フェニルアラニン、チロシン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンの全体の濃度は１０％未満である。さらになお別の例において、ＵＲＰは、少なくとも５０％のグリシンを含み、そしてトリプトファン、フェニルアラニン、チロシン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンの全体の濃度は５％未満である。
【００６５】
ＧＲＳの長さは、約５アミノ酸から２００アミノ酸以上の間で変動し得る。例えば、単一の連続するＧＲＳの長さは、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２４０、２８０、３２０、または４００個以上のアミノ酸を含み得る。ＧＲＳは、両方の末端にグリシン残基を含み得る。
【００６６】
ＧＲＳは、顕著な含量の他のアミノ酸、例えば、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、またはＰｒｏもまた含み得る。ＧＲＳは、ＡｓｐおよびＧｌｕを含むがこれらに限定されない負に荷電したアミノ酸の顕著な画分を含み得る。ＧＲＳは、ＡｒｇまたはＬｙｓを含むがこれらに限定されない正に荷電したアミノ酸の顕著な画分を含み得る。所望される場合、ＵＲＰは、一般的には２０種類のアミノ酸の大部分から構成される典型的なタンパク質および典型的なリンカーとは対照的に、単一の型のみのアミノ酸（すなわち、ＧｌｙまたはＧｌｕ）、時折、数種類のみのアミノ酸、例えば、２種から５種のアミノ酸（例えば、Ｇ、Ｅ、Ｄ、Ｓ、Ｔ、Ａ、およびＰから選択される）を含むように設計することができる。ＵＲＰは、アミノ酸の位置の３０、２５、２０、１５、１２、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１％で負に荷電した残基（Ａｓｐ、Ｇｌｕ）を含み得る。
【００６７】
典型的には、対象のＧＲＳ含有ＵＲＰは、約３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、またはそれ以上の連続するアミノ酸を有する。タンパク質に取り込まれる場合、ＵＲＰは、得られるタンパク質が複数のＵＲＰまたは複数のＵＲＰのフラグメントを含むようにフラグメント化することができる。これらの個々のＵＲＰ配列のいくつかまたはすべては、得られるタンパク質中のすべてのＵＲＰ配列の合わせた長さが少なくとも３０アミノ酸である限り、４０アミノ酸よりも短くあり得る。好ましくは、得られるタンパク質は、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、１００個、またはそれ以上のアミノ酸を超えるＵＲＰ配列の合わせた長さを有する。
【００６８】
ＧＲＳ含有ＵＲＰは、部分的に、グリシン含有ペプチドのコンホメーションの自由度の増加に起因して、特に関心が持たれるものである。溶液中での変性ペプチドは、高度なコンホメーションの自由度を有する。このコンホメーションの自由度の多くは、受容体、抗体、またはプロテアーゼのような標的への上記ペプチドの結合の際に失われる。このエントロピーの損失は、ペプチドとその標的との間の相互作用のエネルギーによって相殺される必要がある。変性ペプチドのコンホメーションの自由度は、そのアミノ酸配列に依存する。短い側鎖を有する多くのアミノ酸を含むペプチドは、より大きな側鎖を有するアミノ酸から構成されるペプチドよりも大きなコンホメーションの自由度を有する傾向がある。アミノ酸グリシンを含むペプチドは、特に高度な自由度を有する。グリシン含有ペプチド結合は、対応するアラニン含有配列と比較して、溶液中で約３．４倍高いエントロピーを有すると見積もられている（Ｄ’Ａｑｕｉｎｏ，Ｊ．Ａ．，ら（１９９６）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，２５：１４３−５６）。この因数は、配列中のグリシン残基の数とともに増加する。結果として、このようなペプチドは、標的への結合の際により多くのエントロピーを失う傾向があり、このことは、他のタンパク質と相互作用する全体的な能力、ならびに所定の三次元構造をとるそれらの能力を減少する。グリシン−ペプチド結合の大きなコンホメーションの柔軟性もまた、タンパク質結合のＲａｍａｃｈａｎｄｒａｎプロットを分析するときに明白であり、このとき、グリシンペプチド結合は、他のペプチド結合によってまれにしか占められない領域を占める（Ｖｅｎｋａｔａｃｈａｌａｍ，Ｃ．Ｍ．ら（１９６９）Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，３８：４５−８２）。Ｓｔｉｔｅｓらは、６１種の非相同性の高解像度結晶構造からの１２，３２０残基のデータベースを研究し、２０アミノ酸の各々のφ、ψコンホメーションの優先度を決定した。ネイティブ状態のタンパク質における観察された分布は、変性状態において見出される分布もまた反映すると仮定される。これらの分布は、各残基についてのエネルギー面を見積もるために使用し、グリシンと比較して、各残基についての相対的なコンホメーションのエントロピーの計算を可能にする。最も極端な場合、プロリンによるグリシンの置き換えにおいて、コンホメーションのエントロピー変化は、２０℃において−０．８２＋／−０．０８ｋｃａｌ／ｍｏｌで、変性状態と比較してネイティブ状態を安定化する（Ｓｔｉｔｅｓ，Ｗ．Ｅ．ら（１９９５）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，２２：１３２）。これらの観察は、２０種の天然のアミノ酸の間のグリシンの特別な役割を確証する。
【００６９】
対象ＵＲＰを設計する際に、天然または非天然の配列を使用することができる。例えば、高いグリシン含量を含む天然配列の宿主は、表１、表２、表３、または表４に提供される。当業者は、ＵＲＰとしての配列の任意の１つをとり得るか、または意図される特性を達成するために配列を修飾し得る。宿主対象への免疫原性が関心の対象である場合、宿主から誘導されるグリシンリッチ配列に基づいてＧＲＳ含有ＵＲＲを設計することが好ましい。好ましいＧＲＳ含有ＵＲＰは、ヒトタンパク質からの配列、または参照ヒトタンパク質中の対応するグリシンリッチ配列に対する実質的な相同性を共有する配列である。
表１．グリシンリッチ配列を含むタンパク質の構造解析
【００７０】
【表１】
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表２．３００より多くのグリシン残基を有するＧＲＳをコードするオープンリーディングフレーム
【００７１】
【表２】
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表３．ヒトＧＲＳの例
【００７２】
【表３】
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表４．ヒトＧＲＳのさらなる例
【００７３】
【表４−１】
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【００７４】
【表４−２】
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【００７５】
【表４−３】
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【００７６】
【表４−４】
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【００７７】
【表４−５】
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【００７８】
【表４−６】
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【００７９】
【表４−７】
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非グリシン残基（ＮＧＲ）を含むＵＲＰ；
これらのＧＲＳ中の非グリシン残基の配列は、ＵＲＰ、および従って、所望のＵＲＰを含むタンパク質の特性を最適化するために選択することができる。例えば、特定の細胞、特定の細胞型、または細胞系統について得られるタンパク質の選択性を増強するためにＵＲＰの配列を最適化することができる。例えば、遍在的には発現されていないが、むしろ、心臓、肝臓、前立腺、肺、腎臓、骨髄、血液、皮膚、膀胱、脳、筋肉、神経を含む身体組織、ならびに、感染疾患、自己免疫疾患、腎臓、神経細胞、心臓の障害および癌などの疾患に罹患している選択した組織の１つ以上において示差的に発現されるタンパク質配列を取り込むことができる。特定の発生の起源を表す配列、例えば、多細胞生物における外胚葉、内胚葉、または中胚葉形成の間に、胚または成体で発現される配列を利用することができる。細胞周期の調節、細胞の分化、アポトーシス、走化性（ｃｈｅｍｏｔａｘｓｉｓ）、細胞運動、および細胞骨格再構成を含むがこれらに限定されない、特定の生物学的プロセスに関与する配列もまた利用することができる。被覆小窩、ゴルジ装置、小胞体、エンドソーム、リソソーム、およびミトコンドリアを含むがこれらに限定されない、特定の細胞下の場所：細胞外マトリックス、核、細胞質、細胞骨格、原形質、および／または細胞内膜構造に、得られるタンパク質を方向付けるための他の遍在性ではないタンパク質配列を利用することもできる。
【００８０】
種々のこれらの組織特異的、細胞型特異的、細胞下局在特異的な配列は公知であり、多数のタンパク質データベースから利用可能である。このような選択的ＵＲＰ配列は、ランダムまたは半ランダムＵＲＰ配列のライブラリーを生成すること、これらのライブラリーを動物または患者に注入すること、および組織サンプル中で所望の組織選択性を有する配列を決定することによって得ることができる。配列の決定は、質量スペクトル測定によって実施することができる。同様の方法を使用して、経口、口腔、腸管、鼻、腱鞘、腹膜、肺、直腸、または皮膚の取り込みを容易にするＵＲＰ配列を選択することができる。
【００８１】
特に関心が持たれるものは、細胞の取り込みまたは膜を通しての輸送に有利である、正に荷電したアミノ酸であるアルギニンまたはリジンが比較的豊富な領域を含むＵＲＰ配列である。ＵＲＰ配列は、１つまたはいくつかのプロテアーゼ感受性配列を含むように設計することができる。このようなＵＲＰ配列は、一旦、本発明の生成物がその標的位置に達したならば、切断可能である。この切断は、薬学的に活性なドメインの効力の増加（プロドラッグ活性化）を誘発し得、またはこれは、切断生成物の受容体への結合を増強し得る。ＵＲＰ配列は、アスパラギン酸残基またはグルタミン酸残基を導入することによって、過度の負電荷を有するように設計することができる。特に関心が持たれるものは、５％より多く、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、３０％またはそれ以上より多くのグルタミン酸、および２％未満のリジンまたはアルギニンを含むＵＲＰである。このようなＵＲＰは過度の負電荷を有し、そして結果として、これらは、ペプチドの個々の負電荷の間の静電的反発に起因して、オープン型のコンホメーションをとる傾向を有し得る。このような過度の負電荷は、それらの流体力学半径の効果的な増加に導き、そして結果として、これは、このような分子の腎クリアランスの減少に導き得る。従って、ＵＲＰ配列中の負に荷電したアミノ酸の頻度および分布を制御することによって、ＵＲＰ配列の有効な正味の電荷および流体力学半径を調節することができる。ヒトおよび動物の多くの組織および表面は過度の負電荷を有する。過度の負電荷を有するようにＵＲＰ配列を設計することによって、ＵＲＰを含む得られるタンパク質と、血管、健常組織、または種々の受容体などの種々の表面との間の非特異的相互作用を最小化することができる。
【００８２】
ＵＲＰは、形式（モチーフ）ｘの反復アミノ酸配列を有してもよく、ここで、配列モチーフは、直接反復（ＡＢＣＡＢＣＡＢＣＡＢＣ）または逆反復（ＡＢＣＣＢＡＡＢＣＣＢＡ）を形成し、これらの反復の数は、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１２個、１４個、１６個、１８個、２０個、２２個、２４個、２６個、２８個、３０個、３５個、４０個、５０個またはそれ以上であり得る。ＵＲＰまたはＵＲＰの内部の反復は、しばしば、１種、２種、３種、４種、５種、または６種の異なる型のアミノ酸のみを含む。ＵＲＰは、典型的には、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、またはそれ以上のアミノ酸長であるヒトアミノ酸配列の反復からなるが、ＵＲＰはまた、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０のアミノ酸長である非ヒトアミノ酸配列からなってもよい。
【００８３】
ヒト配列に由来するＵＲＰ：
ＵＲＰはヒト配列に由来し得る。ヒトゲノムは、１つの特定のアミノ酸が豊富である多くのサブ配列を含む。特に関心が持たれるものは、セリン、スレオニン、グルタミン酸、アスパラギン酸、またはグリシンのような親水性アミノ酸が豊富であるようなアミノ酸配列である。特に関心が持たれるものは、疎水性アミノ酸をほとんど含まないようなサブ配列である。このようなサブ配列は、水溶液中で非構造かつ高度に溶解性であることが予測される。このようなヒトサブ配列は、それらの有用性をさらに改善するように修飾され得る。図１７は、セリンが豊富であり、かつ対象ＵＲＰとして単離され得る例示的なヒト配列を示す。例示的な象牙質シアロリンタンパク質は６７０アミノ酸のサブ配列を含み、ここで、６４％の残基がセリンであり、多くの他の位置は、アスパラギン酸、アスパラギン、およびグルタミン酸などの親水性アミノ酸である。この配列は極度に反復性であり、そして結果として、これは少ない情報量を有する。このようなヒトタンパク質のサブ配列を直接使用することができる。所望される場合、その全体の特徴を保存するが、薬学的適用のためにより適切にする方法で、配列を修飾することができる。象牙質シアロリンタンパク質に関連する配列の例は、（ＳＳＤ）ｎ、（ＳＳＤＳＳＮ）ｎ、（ＳＳＥ）ｎであり、式中、ｎは約４から２００までの間である。
【００８４】
ヒトタンパク質からの配列の使用は、ヒト対象における免疫原性の減少を伴うＵＲＰの設計において特に所望される。外来性タンパク質に対する免疫応答を誘発するための鍵となる工程は、ＭＨＣクラスＩＩ受容体による該タンパク質のペプチドフラグメントの提示である。次いで、これらのＭＨＣＩＩ結合フラグメントは、Ｔ細胞受容体によって検出可能であり、これは、Ｔヘルパー細胞の増殖を誘発し、そして免疫応答を開始する。薬学的タンパク質からのＴ細胞エピトープの除去は、免疫反応を誘発するリスクを減少させるための手段として認識されてきた（Ｓｔｉｃｋｌｅｒ，Ｍ．ら（２００３）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，２８１：９５−１０８）。ＭＨＣＩＩ受容体は、典型的には、例えば、提示されたペプチドの９アミノ酸長領域を有するエピトープと相互作用する。従って、タンパク質の可能な９マーサブ配列のすべてまたは大部分がヒトタンパク質中に見出され得るならば、患者におけるタンパク質に対する免疫応答を誘発するリスクを減少することができ、もしそうであるならば、これらの配列およびこれらの配列の反復は外来性配列として患者によって認識されない。適切なアミノ酸組成を有するヒト配列をオリゴマー化しまたは連結することによるＵＲＰ配列の設計にヒト配列を組み込むことができる。これらは、直接反復または逆反復または異なる反復の混合であり得る。例えば、表２に示されるような配列をオリゴマー化することができる。このようなオリゴマーは、免疫原性であるリスクが減少している。しかし、モノマー単位間の連結配列は、図３に図示されるように、免疫反応を誘発し得るようなＴ細胞エピトープをなお含み得る。複数の重複するヒト配列に基づいてＵＲＰ配列を設計することによって、免疫応答を誘発するリスクをさらに減少することができる。このアプローチは図４に図示されている。オリゴマーの各９マーサブ配列がヒトタンパク質中に見出され得るような複数のヒト配列に基づくオリゴマーとして、図２のＵＲＰは設計される。これらの設計において、すべての９マー配列はヒト配列である。３つのヒト配列に基づくＵＲＰ配列の例は図５に示される。オリゴマーＵＲＰ配列中のすべての可能な９マーサブ配列が同じヒトタンパク質中に存在するような単一のヒト配列に基づくＵＲＰ配列を設計することもまた可能である。１つの例は、グリシンおよびプロリンが豊富であるＰＯＵドメインに基づいて、図６に示される。ＵＲＰ配列中の反復モノマーは、ヒトタンパク質の唯一のフラグメントであり、その隣接配列は、図６に図示されるような反復単位と同一である。非オリゴマー性ＵＲＰ配列は、同様に、ヒトタンパク質に基づいて設計することができる。主要な条件は、すべての９マーサブ配列がヒト配列に見出され得ることである。配列のアミノ酸組成は、好ましくは、疎水性残基をほとんど含まない。特に関心が持たれるものは、ヒト配列に基づいて設計され、かつグリシン残基の大きな画分を含むＵＲＰ配列である。
【００８５】
同様のスキームを利用して、目的の宿主に対する低い免疫原性を有する反復配列を含むＵＲＰのクラスを設計することができる。目的の宿主は、脊椎動物および無脊椎動物を含む任意の動物であり得る。好ましい宿主は、霊長類（例えば、チンパンジーおよびヒト）、クジラ類（例えば、イルカおよびクジラ）、翼手類（例えば、コウモリ）、奇蹄類（ｐｅｒｒｉｓｏｄａｃｔｙｌ）（例えば、ウマおよびサイ）、齧歯類（例えば、ラット）、および特定の種類の食虫類、例えば、トガリネズミ、モグラ、およびハリネズミなどの哺乳動物である。ヒトが宿主として選択される場合、ＵＲＰは、典型的には、反復配列または単位の複数コピーを含み、約６〜約１５個の連続するアミノ酸を含むセグメントの大部分は１つ以上のネイティブヒトタンパク質に存在する。約９から約１５個までの間の連続するアミノ酸を含むセグメントの大部分が１つ以上のネイティブヒトタンパク質において見出されるＵＲＰも設計できる。本明細書で使用される場合、セグメントの大部分は、約５０％、好ましくは６０％、好ましくは７０％、好ましくは８０％、好ましくは９０％、好ましくは１００％より多くをいう。所望される場合、反復単位の中の約６から１５個までの間のアミノ酸、好ましくは、約９から１５個までの間のアミノ酸の可能なセグメントの各々は、１つ以上のネイティブタンパク質中に存在する。ＵＲＰは、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の反復単位を有する、複数の反復単位または配列を含み得る。
【００８６】
ヒトＴ細胞エピトープを実質的に含まないＵＲＰの設計：
ＵＲＰ配列は、ヒトＴ細胞によって認識されるエピトープを実質的に含まないように設計することができる。例えば、変性した、非構造コンホメーションに有利であるアミノ酸組成物を用いて一連の半ランダム配列を合成でき、Ｔ細胞エピトープの存在について、およびこれらがヒト配列であるか否かを評価することができる。ヒトＴ細胞エピトープについてのアッセイは記載されてきた（Ｓｔｉｃｋｌｅｒ，Ｍ．ら（２００３）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，２８１：９５−１０８）。特に関心が持たれるものは、Ｔ細胞エピトープまたは非ヒト配列を生成することなくオリゴマー化できるペプチド配列である。これは、Ｔ細胞エピトープの存在について、およびヒトではない６〜１５マー、特に９マーのサブ配列の存在について、これらの配列の直接反復を試験することによって達成することができる。代替法は、ヒト配列のアセンブリについて以前の節に記載したように、反復単位にアセンブルされ得る複数のペプチド配列を評価することである。別の代替法は、ＴＥＰＩＴＯＰＥのようなエピトープ予測アルゴリズムを使用して、低スコアを生じるＵＲＰ配列を設計することである（Ｓｔｕｍｉｏｌｏ，Ｔ．ら（１９９９）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１７：５５５−６１）。Ｔ細胞エピトープを回避するための別のアプローチは、ＭＨＣ上でのペプチドディスプレイの間にアンカー残基として働き得るアミノ酸、例えば、Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｆを回避することである。疎水性アミノ酸および正に荷電したアミノ酸は、頻繁に、アンカー残基として働くことができ、ＵＲＰ残基中でのそれらの残基を最小化することは、Ｔ細胞エピトープを生成し、従って、免疫反応を誘発する確率を減少する。選択したＵＲＰは、一般的に、少なくとも１種のヒトタンパク質において見出されるサブ配列を含み、そして、疎水性アミノ酸含量が低い。
【００８７】
ＵＲＰ配列は、タンパク質産生を最小化するように設計することができる。このことは、ＤＮＡをコードすることの反復を回避または最小化することによって達成できる。ポリ−グリシンなどのＵＲＰ配列は、非常に望ましい薬学的特性を有し得るが、それらの製造は、ＧＲＳをコードするＤＮＡ配列の高いＧＣ含量に起因して、および組換えを導き得る反復するＤＮＡ配列の存在に起因して、困難であり得る。
【００８８】
上述のように、ＵＲＰは、アミノ酸レベルで高度に反復性であるように設計することができる。結果として、ＵＲＰ配列は、非常に少ない情報量を有し、免疫反応を誘発するリスクを減少することができる。
【００８９】
反復アミノ酸配列を含むＵＲＰの非限定的な例は：ポリ−グリシン、ポリ−グルタミン酸、ポリ−アスパラギン酸、ポリ−セリン、ポリ−スレオニン、（ＧＸ）ｎ、式中、ＧはグリシンでありかつＸはセリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、スレオニン、またはプロリンでありかつｎは少なくとも２０であり、（ＧＧＸ）ｎ、式中、Ｘはセリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、スレオニン、またはプロリンでありかつｎは少なくとも１３であり、（ＧＧＧＸ）ｎ、式中、Ｘはセリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、スレオニン、またはプロリンでありかつｎは少なくとも１０であり、（ＧＧＧＧＸ）ｎ、式中、Ｘはセリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、スレオニン、またはプロリンでありかつｎは少なくとも８であり、（ＧｚＸ）ｎ、式中、Ｘはセリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、スレオニン、またはプロリンであり、ｎは少なくとも１５でありかつＺは１から２０までの間である。
【００９０】
これらの反復の数は、１０から１００までの間の任意の数であり得る。本発明の生成物は、半ランダム配列であるＵＲＰ配列を含み得る。例は、少なくとも３０、４０、５０、６０、または７０％グリシンを含む半ランダム配列であり、ここで、グリシンは十分に分散されており、トリプトファン、フェニルアラニン、チロシン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンの全体の濃度が、合わせたときに、７０、６０、５０、４０、３０、２０、または１０％未満である。好ましい半ランダムＵＲＰ配列は、少なくとも４０％グリシン、ならびにトリプトファン、フェニルアラニン、チロシン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンの全体の濃度が１０％未満である。より好ましいランダムＵＲＰ配列は、少なくとも５０％グリシン、ならびにトリプトファン、フェニルアラニン、チロシン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンの全体の濃度が５％未満である。ＵＲＰ配列は、ＵＲＰ配列の２つ以上のより短いＵＲＰ配列またはフラグメントの配列を合わせることによって設計することができる。このような組み合わせは、ＵＲＰ配列を含む生成物の薬学的な特性をより良好に調節することを可能にし、そしてＵＲＰ配列をコードするＤＮＡ配列の反復性を減少させることを可能にし、このことは、発現を改善し、そしてＵＲＰをコードする配列の組換えを減少することができる。
【００９１】
ＵＲＰ配列は、以下の所望の特性のいくつかを有するように設計および選択することができる：ａ）産生宿主におけるコード配列の高い遺伝子の安定性、ｂ）高レベルの発現、ｃ）低い（予想／計算）免疫原性、ｄ）血清プロテアーゼおよび／または他の組織プロテアーゼの存在下での高い安定性、ｅ）生理学的条件下での大きな流体力学半径。複数の判断基準に合致するＵＲＰ配列を得るための１つの例示的なアプローチは、候補配列のライブラリーを構築すること、および適切なサブ配列をライブラリーから同定することである。ライブラリーは、ランダム配列および／または半ランダム配列を含み得る。特に有用性があるものはコドンライブラリーであり、これは、同一のアミノ酸残基についての複数のコドンを含むＤＮＡ分子のライブラリーである。コドンのランダム化は、特定の型の選択されたアミノ酸の位置、または大部分もしくはすべての位置に適用することができる。本物のコドンライブラリーは単一のアミノ酸配列のみをコードするが、これらは、同じ残基の位置に（関連または非関連の）アミノ酸の混合物をコードするＤＮＡ分子の集団であるアミノ酸ライブラリーと容易に合わせることができる。コドンライブラリーは、ＤＮＡレベルでは比較的低い反復性を有するが、高度に反復性であるアミノ酸配列をコードする遺伝子の同定を可能にする。これは、反復性ＤＮＡ配列が組換えを起こす傾向があり、不安定さをもたらすために、有用である。限定されたアミノ酸の多様性をコードするコドンライブラリーを構築することもできる。このようなライブラリーは、他の位置がコドンの変動を許容しながら、ある位置では限られた数のアミノ酸の導入を許容するが、すべてのコドンは同じアミノ酸をコードする。オリゴヌクレオチド合成の間に同じ位置でヌクレオチドの混合物を取り込むことによって、部分的にランダムなオリゴヌクレオチドを合成することができる。このような部分的にランダムなオリゴヌクレオチドは、重複ＰＣＲまたはライゲーションベースのアプローチによって融合することができる。特に、グリシンリッチな配列をコードする半ランダムオリゴヌクレオチドを多量体化できる。これらのオリゴヌクレオチドは、長さおよび配列およびコドン使用頻度が異なり得る。結果として、候補ＵＲＰ配列のライブラリーを得ることができる。ライブラリーを生成するための別のアプローチは、開始配列を合成し、続いて、上記配列を部分的ランダム化に供することである。このことは、突然変異誘発株中でのＵＲＰ配列をコードする遺伝子の培養によって、または突然変異誘発条件下でのそのコード遺伝子の増幅によって、行うことができる（Ｌｅｕｎｇ，Ｄ．ら（１９８９）Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，１：１１−１５）。所望の特性を有するＵＲＰ配列は、種々の方法を使用して、ライブラリーから同定することができる。高度な遺伝子の安定性を有する配列は、産生宿主中でライブラリーを培養することによって富化できる。不安定である配列は変異を蓄積し、このことは、ＤＮＡ配列決定によって同定することができる。高レベルで発現され得るＵＲＰ配列の変種は、当業者に公知である複数のプロトコールを使用するスクリーニングまたは選択によって同定することができる。例えば、ライブラリーから複数の単離物を培養し、発現レベルを比較することができる。発現レベルは、ゲル分析、分析用クロマトグラフィ、または種々のＥＬＩＳＡベースの方法によって測定することができる。個々の配列の変種の発現レベルの決定は、ｍｙｃ−タグ、Ｈｉｓ−タグ、ＨＡ−タグのような配列に候補ＵＲＰ配列のライブラリーを融合させることによって容易にすることができる。別のアプローチは、酵素、または緑色蛍光タンパク質のような他のレポータータンパク質にライブラリーを融合させることである。特に関心が持たれるものは、βラクタマーゼまたはカナマイシン−アシルトランスフェラーゼのような選択マーカーへのライブラリーの融合である。高レベルの発現および良好な遺伝子の安定性を有する変種について富化させるために抗生物質選択を使用することができる。良好なプロテアーゼ抵抗性を有する変種は、プロテアーゼとのインキュベーション後にインタクトな配列についてスクリーニングすることによって同定することができる。プロテアーゼ抵抗性ＵＲＰ配列を同定するための有効な方法は、細菌ファージディスプレイまたは関連するディスプレイ法である。急速なタンパク質分解を受ける配列がファージディスプレイによって富化され得る複数の系が記載されている。これらの方法は、プロテアーゼ抵抗性配列について富化するように容易に採用することができる。例えば、親和性タグとＭ１３ファージのｐＩＩＩタンパク質との間の候補ＵＲＰ配列のライブラリーをクローニングすることができる。次いで、このライブラリーは、プロテアーゼまたは血液もしくはリソソーム調製物のようなプロテアーゼ含有生物学的サンプルに曝露することができる。プロテアーゼ抵抗性配列を含むファージは、プロテアーゼ処理後、親和性タグへの結合によって、捕捉することができる。リソソーム調製物による分解に抵抗する配列は特に関心が持たれる。なぜなら、リソソーム分解は、樹状細胞または他の抗原提示細胞における抗原提示の間の鍵となる工程であるからである。ファージディスプレイは、低い免疫原性を有するＵＲＰ配列を同定するために、特定の免疫血清には結合しない候補ＵＲＰ配列を同定するために利用することができる。ライブラリー中のＵＲＰ配列に対する抗体を惹起するために、候補ＵＲＰ配列またはＵＲＰ配列のライブラリーを用いて動物を免疫することができる。次いで、得られる血清は、得られる免疫血清中の抗体によって認識される配列を除去または同定するためにファージパニングのために使用することができる。細菌ディスプレイ、酵母ディスプレイ、リボソームディスプレイのような他の方法は、所望の特性を有するＵＲＰの変種を同定するために利用できる。別のアプローチは、質量スペクトル分析による、目的のＵＲＰ配列の同定である。例えば、候補ＵＲＰ配列のライブラリーを、プロテアーゼまたは目的の生物学的サンプルとともにインキュベートし、そして質量スペクトル分析によって、分解に抵抗性である配列を同定できる。同様のアプローチにおいて、経口摂取を容易にするＵＲＰ配列を同定することができる。候補ＵＲＰ配列の混合物を動物またはヒトに供給し、そして質量スペクトル分析によって、組織壁（すなわち、皮膚など）最高の移動ま���は取り込み効率を有する変種を同定することができる。同様の方法で、肺、鼻内、直腸、経皮の送達のような他の取り込みメカニズムが好ましいＵＲＰ配列を同定することができる。細胞取り込みが好ましいＵＲＰ配列、または細胞取り込みに抵抗性であるＵＲＰ配列を同定することもできる。
【００９２】
ＵＲＰ配列は、上記の方法のいずれかによって設計されたＵＲＰ配列またはＵＲＰ配列のフラグメントを合わせることによって設計することができる。加えて、上記の規則に従って設計された配列を最適化するために、半ランダムアプローチを適用することができる。特に関心が持たれるものは、増強されたタンパク質の発現を改善することを目的とした、および産生宿主におけるコード遺伝子の遺伝子安定性を改善するための、コドン最適化である。コドン最適化は、グリシン豊富であるＵＲＰ配列、または非常に反復性のアミノ酸配列を有するＵＲＰ配列のために特に重要である。コドン最適化は、コンピュータプログラムを使用して実施することができ（Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎ，Ｃ．ら（２００４）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２２：３４６−５３）、そのあるものはリボソーム休止を最小化する（Ｃｏｄａ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｉｎｃ．）。ＵＲＰ配列を設計する際に、多数の特性を考慮できる。ＤＮＡ配列をコードする際の反復性を最小化できる。加えて、産生宿主によってまれにしか使用されないコドンの使用を回避または最小化できる（すなわち、大腸菌におけるＡＧＧおよびＡＧＡのアルギニンコドンならびに１つのロイシンコドン）。高レベルのグリシンを有するＤＮＡ配列は、不安定性または低発現レベルに導き得る高ＧＣ含量を有する傾向がある。従って、可能である場合、ＵＲＰコード配列のＧＣ含量が、ＵＲＰを製造するために使用される産生生物のために適切であるようにコドンを選択することが好ましい。
【００９３】
ＵＲＰをコードする遺伝子は、１つ以上の工程で、全合成、または酵素的プロセス、例えば、制限酵素媒介クローニング、ＰＣＲ、および重複伸長と組み合わせた合成のいずれかで、作製することができる。ＵＲＰモジュールは、コードされるアミノ酸配列が高度な反復性を有しながらＵＲＰモジュールをコードする遺伝子が低い反復性を有するように、構築することができる。このアプローチは図１１に図示されている。第１工程として、比較的短いＵＲＰ配列のライブラリーを構築する。これは純粋なコドンライブラリーであり得、その結果、各ライブラリーメンバーは、同じアミノ酸配列を有するが、多くの異なるコード配列が可能である。十分に発現されるライブラリーメンバーの同定を容易にするために、レポータータンパク質への融合物としてライブラリーを構築することができる。適切なレポーター遺伝子の例は、緑色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、βガラクトシダーゼである。スクリーニングによって、選択した宿主生物において高濃度で発現できる短いＵＲＰ配列を同定できる。続いて、ランダムＵＲＰ二量体のライブラリーを生成し、高レベルの発現についてのスクリーニングを反復することができる。二量体化は、ライゲーション、重複伸長、または同様のクローニング技術によって実施することができる。二量体化および引き続くスクリーニングのこのプロセスは、得られるＵＲＰ配列が所望の長さに達するまで、複数回反復することができる。選択的に、望ましくない配列を含む単離物を除去するために、ライブラリー中のクローンを配列決定することができる。短いＵＲＰ配列の初期ライブラリーは、アミノ酸配列の中である程度の変動を許容できる。例えば、多数の親水性アミノ酸が上記位置に存在し得るように、あるコドンをランダム化することができる。反復多量体化のプロセスの間、高レベル発現についてのスクリーニングに加えて、溶解度またはプロテアーゼ抵抗性のような他の特徴について、ライブラリーメンバーをスクリーニングすることができる。ＵＲＰ配列を二量体化することの代わりに、より長い多量体を生成することもできる。このことは、ＵＲＰモジュールの長さをより迅速に増加させることを可能にする。
【００９４】
多くのＵＲＰ配列は、特定のアミノ酸を大きな割合で含む。このような配列は、組換え技術によって作製することは難しい可能性がある。なぜなら、これらのコード遺伝子は、組換えに供される反復配列を含み得るからである。さらに、非常に高い頻度で特定のコドンを含む遺伝子は、産生宿主中の反復してロードされるｔＲＮＡが制限されるにつれて、発現が制限される可能性がある。１つの例は、ＧＲＳの組換え産生である。グリシン残基は、４つのトリプレット、ＧＧＧ、ＧＧＣ、ＧＧＡ、およびＧＧＴによってコードされる。結果として、ＧＲＳをコードする遺伝子は高いＧＣ含量を有する傾向があり、特に反復性である傾向がある。さらなる難問は産生宿主のコドンの偏りから生じ得る。大腸菌の場合は、２つのグリシンコドン、ＧＧＡおよびＧＧＧは、高度に発現されるタンパク質中ではまれにしか使用されない。従って、ＵＲＰ配列をコードする遺伝子のコドン最適化が非常に所望され得る。産生宿主のコドンの偏りを考慮するコンピュータプログラムを使用することによって、コドン使用頻度を最適化することができる（Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎ，Ｃ．ら（２００４）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２２：３４６−５３）。代替としては、ライブラリーのすべてのメンバーが同じアミノ酸配列をコードしているが、そこではコドン使用頻度が変化しているコドンライブラリーを構築できる。このようなライブラリーは、ＵＲＰ含有生成物の大規模スケール産生のために特に適切である、高度に発現されかつ遺伝子が安定なメンバーについてスクリーニングすることができる。
【００９５】
多価非構造組換えタンパク質（ＭＵＲＰ）：
上述のように、対象ＵＲＰは、治療的価値のあるタンパク質の設計のためのモジュールとして特に有用である。従って、本発明は、１種以上の対象ＵＲＰを含むタンパク質を提供する。このようなタンパク質は、本明細書では、多価非構造組換えタンパク質（ＭＵＲＰ）と呼ばれる。
【００９６】
ＭＵＲＰを構築するために、１つ以上のＵＲＰ配列を、タンパク質のＮ末端もしくはＣ末端に融合し、またはタンパク質の中間部、例えば、タンパク質のループもしくは目的のタンパク質のモジュールの間に挿入し、非修飾タンパク質と比較して、得られる修飾タンパク質の改善された特性を得ることができる。タンパク質に結合されたＵＲＰ配列の合わせた長さは、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、１００個、１５０個、２００個、またはそれ以上のアミノ酸であり得る。
【００９７】
対象ＭＵＲＰは、以下に詳述するような１つ以上の改善された特性を示す。
【００９８】
半減期の改善：
薬学的に活性なタンパク質にＵＲＰ配列を加えることは、そのタンパク質の多くの特性を改善し得る。特に、長いＵＲＰ配列を加えることは、タンパク質の血清半減期を顕著に増大し得る。このようなＵＲＰは、典型的には、少なくとも約４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、１００個、１５０個、２００個、またはそれ以上のアミノ酸のアミノ酸配列を含む。
【００９９】
ＵＲＰは、得られるタンパク質が複数のＵＲＰまたは複数のＵＲＰのフラグメントを含むようにフラグメント化することができる。これらの個々のＵＲＰ配列のいくつかまたはすべては、得られるタンパク質中のすべてのＵＲＰ配列の合わせた長さが少なくとも３０アミノ酸である限り、４０アミノ酸よりも短くあり得る。好ましくは、得られるタンパク質は、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、１００個、１５０個、２００個、またはそれ以上のアミノ酸を超えるＵＲＰ配列の合わせた長さを有する。１つの態様において、融合したＵＲＰＳはタンパク質の流体力学半径を増加することができ、従って、腎臓による血液からのそのタンパク質のクリアランスを減少する。非修飾タンパク質と比較した、得られる融合タンパク質の流体力学半径の増加は、超遠心分離、サイズ排除クロマトグラフィ、または光散乱によって検出することができる。
【０１００】
組織選択性の改善：
流体力学半径の増加はまた、組織への浸透の減少に導くことができ、これは、薬学的に活性なタンパク質の副作用を最小化するために利用できる。親水性ポリマーが、増強浸透性および保持（ＥＰＲ）効果によって引き起こされる、腫瘍組織中に選択的に蓄積する傾向を有することは十分に実証されている。ＥＰＲ効果の根底にある原因は、腫瘍の血管構造の漏出性の性質（ＭｃＤｏｎａｌｄ，Ｄ．Ｍ．ら（２００２）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，６２：５３８１−５）および腫瘍組織におけるリンパ排液の欠如である。それゆえに、腫瘍組織についての薬学的に活性なタンパク質の選択性は、親水性ポリマーを加えることによって増強することができる。このようなものとして、所定の薬学的に活性なタンパク質の治療指数は、対象のＵＲＰＳを取り込むことを介して増加することができる。
【０１０１】
分解からの保護および免疫原性の減少：
ＵＲＰ配列を加えることは、タンパク質のプロテアーゼ抵抗性を顕著に改善し得る。ＵＲＰ配列は、それら自体が、プロテアーゼ抵抗性であるように設計され得、そしてそれらをタンパク質に結合することによって、分解酵素の接近からタンパク質を遮断することができる。ＵＲＰ配列は、他の受容体または表面とのタンパク質の望ましくない相互作用を減少させるという目的で、薬学的に活性なタンパク質に加えることができる。これを達成するために、このような望ましくない接触を行うタンパク質の側の近傍に薬学的に活性なタンパク質にＵＲＰ配列を加えることが有益であり得る。特に、本発明の生成物に対する免疫応答を妨害するために、免疫系の任意の成分とのそれらの相互作用を減少させるという目的で、薬学的に活性なタンパク質にＵＲＰ配列を加えることができる。薬学的に活性なタンパク質にＵＲＰ配列を加えることは、既存の抗体またはＢ細胞受容体との相互作用を減少し得る。さらに、ＵＲＰ配列を加えることは、抗原提示細胞による、本発明の生成物の取り込みおよびプロセシングを減少し得る。タンパク質に１種以上のＵＲＰ配列を加えることは、その免疫原性を減少する好ましい方法である。なぜなら、これは、多くの種において免疫応答を抑制し、動物データに基づいて、患者における生成物の期待される免疫原性を予測することを可能にするからである。免疫原性のこのような種非依存性の試験は、ヒトＴ細胞エピトープの同定および除去、またはヒト配列との配列比較に基づくアプローチのためには不可能である。
【０１０２】
Ｔ細胞エピトープの中断：
ＵＲＰ配列は、Ｔ細胞エピトープを中断するためにタンパク質に導入することができる。このことは、複数の別々の機能モジュールを合わせるタンパク質のために特に有用である。Ｔ細胞エピトープの形成は、タンパク質抗原のペプチドフラグメントがＭＨＣに結合することを必要とする。ＭＨＣ分子は、提示されるペプチドの典型的には９個の連続する残基であるアミノ酸の短いセグメントと相互作用する。タンパク質分子中の異なる結合モジュールの直接融合は、２つの隣接するドメインに広がるＴ細胞エピトープに導き得る。図７に図示されるように、ＵＲＰモジュールによって機能モジュールを分離することによって、このようなモジュールにわたるＴ細胞エピトープの生成が妨害される。機能モジュール間のＵＲＰ配列の挿入はまた、抗原提示細胞におけるタンパク質分解性プロセシングと干渉し得、これは、免疫原性のさらなる減少に導く。免疫原性のリスクを減少するための別のアプローチは、生成物の機能モジュール中のＴ細胞エピトープを破壊することである。マイクロプロテインの場合において、１つのアプローチは、グリシンリッチであるいくつかのシステイン間ループ（標的結合に関与しないもの）を有することである。マイクロプロテインにおいて、それらの構造は少数のシステインに起因し、標的結合に関与しない残基の大部分またはすべてを、グリシン、セリン、グルタミン酸、スレオニンで実際に置き換えることができ、このようにして、標的への親和性に影響を与えることなく、免疫原性についての潜在性を減少する。例えば、このことは、各残基をグリシンによって置き換える、すべての残基の「グリシンスキャン」を実施すること、次いで、ファージディスプレイまたはスクリーニングを使用して、標的結合を保持するクローンを選択すること、次いで、許容されるグリシン置換のすべてを合わせることによって実行できる。一般的に、機能モジュールは、ＵＲＰモジュールよりも、Ｔ細胞エピトープを含む可能性がはるかに高い。ｇｌｙ、ｓｅｒ、ａｌａ、ｇｌｕ、ａｓｐ、ａｓｎ、ｇｌｎ、ｔｈｒのような小さな親水性残基で、決定的に重要ではないアミノ酸残基のすべてまたは多くを置き換えることによって、機能モジュール中のＴ細胞エピトープの頻度を減少することができる。置き換えを可能にする機能モジュール中の位置は、種々のランダムまたは構造ベースのタンパク質工学的アプローチを使用して同定することができる。
【０１０３】
溶解性の改善：
タンパク質の機能モジュールは限られた溶解性を有し得る。特に、結合モジュールは、それらの表面に疎水性残基を有する傾向があり、このことは、これらの溶解性を制限し得、かつ凝集に導き得る。ＵＲＰモジュールを有するこのような機能モジュールと間隔をあけ、またはこれらに隣接することによって、得られる生成物の全体の溶解性を改善することができる。このことは、特に、顕著な割合の親水性残基または電荷を有する残基を有するＵＲＰモジュールについて真実である。可溶性ＵＲＰモジュールを有する機能モジュールを分離することによって、これらの機能モジュール間の分子内相互作用を減少することができる。
【０１０４】
ｐＨプロフィールの改善および生成物の電荷の均質性：
ＵＲＰ配列は、過度の負電荷または正電荷を有するように設計することができる。結果として、これらは、酵素のｐＨプロフィールまたは結合相互作用をずらせるために利用できる任意の融合パートナーに静電場を付与する。さらに、電荷を有するＵＲＰ配列の静電場は、タンパク質生成物の表面電荷のｐＫａ値の均質性を増加することができ、このことは、リガンド相互作用のｐＨプロフィールを鋭くすること、および等電点電気泳動またはクロマトフォーカシングによって分離を鋭くすることに導く。
【０１０５】
より鋭い生成物ｐＫａに起因する精製プロフィールの改善：
溶液中の各アミノ酸は、それ自体が、単一の固定されたｐＫａを有し、これは、その官能基が半分プロトン化されているｐＨである。典型的なタンパク質において、多くの型の残基があり、近接性およびタンパク質呼吸効果（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｂｒｅａｔｈｉｎｇ  ｅｆｆｅｃｔ）に起因して、これらはまた、変動可能な方法で、互いの有効なｐＫａを変化させる。このために、広範なｐＨ条件の範囲内で、典型的なタンパク質は、数百種類ものイオン化種をとることができ、各々が、荷電アミノ酸残基および中性アミノ酸残基の非常に多くの組み合わせに起因して、異なる分子量および正味の電荷を有する。これは広いイオン化スペクトルといわれ、このようなタンパク質の分析（すなわち、質量スペクトル）および精製をより困難にする。
【０１０６】
ＰＥＧは電荷を有さず、それが結合しているタンパク質のイオン化スペクトルに影響を与えず、タンパク質が広いイオン化スペクトルを有するままにする。しかし、高含量のＧｌｙおよびＧｌｕを有するＵＲＰは、原理的には、２つの状態のみで存在する：ｐＨがグルタミン酸のｐＫａよりも下であるときの中性（−ＣＯＯＨ）、およびｐＨがグルタミン酸のｐＫａよりも上であるときの負電荷（−ＣＯＯ−）である。ＵＲＰモジュールは、単一、均質のイオン化型の分子を形成し得、質量スペクトル測定において単一の分子量を生じ得る。
【０１０７】
所望される場合、ＭＵＲＰは、ＵＲＰモジュールを通して一定の間隔で分布している単一型の電荷（Ｇｌｕ）を有するＵＲＰとの融合物として発現させることができる。２０ｋＤのＵＲＰあたり２５〜５０個のＧｌｎ残基を取り込むことを選択してもよく、これら２５〜５０残基のすべてが非常に類似したｐＫａを有する。
【０１０８】
加えて、ＩＦＮ、ｈＧＨ、またはＧＣＳＦのような小さなタンパク質（２０個の荷電残基のみを）に、２５〜５０個の負電荷を加えることは、生成物の電荷均質性を増加させ、その等電点を鋭くし、このことは、遊離のグルタミン酸に非常に接近する。
【０１０９】
タンパク質集団の電荷の均質性の増加は、従来的なＰＥＧ化と比較して、好ましいプロセシング特性、例えば、イオン交換、等電点電気泳動、質量スペクトル測定などを有する。
【０１１０】
製剤および／または送達の改善：
薬学的に活性なタンパク質へのＵＲＰ配列の付加は、得られる生成物の製剤および／または送達を顕著に単純化することができる。ＵＲＰ配列は、非常に親水性であるように設計することができ、結果として、これらは、他のヒトタンパク質に結合するために使用する疎水性パッチをしばしば含む、（例えば）ヒトタンパク質の溶解性を改善する。抗体のようなこのようなヒトタンパク質の製剤は困難な課題であり得、しばしば、それらの濃度および送達の選択肢を制限する。ＵＲＰは生成物の沈殿および凝集を減少することができ、そしてこれは、溶液中で生成物を安定化することが典型的には必要とされる、より少ない成分を含むより単純な製剤を使用することを可能にする。ＵＲＰ配列含有生成物の溶解性の改善は、より高い濃度でこれらの生成物を製剤化することを可能にし、結果として、注射可能な生成物についての注射量を減少することができ、非常に少ない注射量に制限されている在宅での注射を可能にし得る。ＵＲＰ配列の付加はまた、得られる製剤化された生成物の保存を単純化し得る。ＵＲＰ配列は、それらの経口、肺、または鼻内の取り込みを容易にするために薬学的に活性なタンパク質に加えることができる。ＵＲＰ配列は、これらがより高い生成物濃度および生成物安定性の改善を可能にするので、種々の様式の送達を可能にし得る。さらなる改善は、膜浸透を容易にするＵＲＰ配列を設計することによって達成することができる。
【０１１１】
製造の改善：
ＵＲＰ配列を付加することは、得られる生成物の製造のための顕著な利点を有し得る。多くの組換え生成物、とりわけ、ネイティブヒトタンパク質は、製造の間に凝集物を形成する傾向を有し、これらは溶解することが困難または不可能であり得、最終製品から取り出された場合でさえ、これらは再び発生し得る。これらは、通常、これらの（ネイティブヒト）タンパク質が他の（ネイティブヒト）タンパク質とそれによって接触される疎水性パッチに起因し、これらの残基を変異させることは、免疫原性のためのリスクがあると考えられている。しかし、ＵＲＰは、このようなタンパク質の疎水性を増加することができ、ヒトタンパク質の配列を変異させることなく、それらの製剤を可能にする。ＵＲＰ配列は、そのネイティブ状態に達するために、タンパク質のフォールディングを容易にし得る。多くの薬学的に活性なタンパク質が、組換え方法によって、非ネイティブ凝集状態で製造されている。これらの生成物は変性される必要があり、引き続いて、これらは、タンパク質がそれらのネイティブな活性状態にフォールディングすることを可能にする条件下でインキュベートされる。再生の間の頻繁な副反応は凝集体の形成である。タンパク質へのＵＲＰ配列の融合は、それが凝集体を形成する傾向を顕著に減少し、従って、これは、生成物の薬学的な活性成分のフォールディングを容易にする。ＵＲＰ含有生成物は、ポリマー修飾タンパク質と比較して、調製するのがはるかにより容易である。化学的ポリマー修飾は、活性タンパク質が精製された後で、余分な修飾および精製の段階を必要とする。対照的に、ＵＲＰ配列は、薬学的に活性なタンパク質と一緒に、組換えＤＮＡ法を使用して製造することができる。本発明の生成物はまた、ポリマー修飾生成物と比較して、特徴付けすることが顕著により容易である。組換え産生プロセスに起因して、規定された分子特性を有するより均質な生成物を得ることができる。ＵＲＰ配列はまた、生成物の精製を容易にし得る。例えば、ＵＲＰ配列は、アフィニティクロマトグラフィによって捕捉できるサブ配列を含むことができる。１つの例は、ヒスチジンが豊富な配列であり、これは、ニッケルのような固定化金属を用いて、樹脂上で捕捉することができる。ＵＲＰ配列はまた、過度の負または正に荷電したアミノ酸を有するように設計することができる。結果として、これらは、生成物の正味の電荷に顕著な影響を与えることができ、これは、イオン交換クロマトグラフィまたは調製用電気泳動による生成物の精製を容易にし得る。
【０１１２】
対象ＭＵＲＰは、結合モジュール、エフェクターモジュール、多量体化モジュール、Ｃ末端モジュール、およびＮ末端モジュールを含むがこれらに限定されない種々のモジュールを含み得る。図１は、複数のモジュールを有する例示的なＭＵＲＰを示す。しかし、ＭＵＲＰはまた、図２に図示される比較的単純な構造を有し得る。ＭＵＲＰはまた、フラグメント化部位を含み得る。これらは、ＭＵＲＰがそれらの標的部位に達したときに優先的に切断され得る、プロテアーゼ感受性配列または化学的に感受性の配列であり得る。
【０１１３】
結合モジュール（ＢＭ）：
本発明のＭＵＲＰは１つ以上の結合モジュールを含み得る。結合モジュール（ＢＭ）とは、細胞−、組織−、または器官−標的化のためなどの１つ以上の治療標的またはアクセサリー標的であり得る、１つまたはいくつかの標的に特異的に結合し得るペプチドまたはタンパク質の配列をいう。ＢＭは、直鎖状または環状のペプチド、システイン束縛ペプチド、マイクロプロテイン、骨格タンパク質（例えば、フィブロネクチン、アンキリン、クリスタリン、ストレプトアビジン、抗体フラグメント、ドメイン抗体）、ペプチドホルモン、増殖因子、サイトカイン、または任意の型のタンパク質ドメイン、ヒトまたは非ヒト、天然または非天然であり得、そしてこれらは、天然の骨格に基づいてもよく、または天然の骨格に基づかなくてもよく、または組み合わせに基づいてもよく、またはこれらは上記のいずれかのフラグメントであってもよい。選択的に、これらのＢＭは、結合特性、それらの安定性、または他の特性を増強するために、１つまたは複数のアミノ酸を付加、除去、または置き換えすることによって操作することができる。結合モジュールは、設計、またはファージディスプレイ、細胞ディスプレイ、リボソームディスプレイ、もしくは他のディスプレイ法を含む遺伝子パッケージディスプレイによって、天然のタンパク質から得ることができる。結合モジュールは、アビディティを生じる、同じ標的の同じコピーに結合し得、またはこれらは、同じ標的の異なるコピー（これは、例えば、細胞膜によって、これらのコピーが何らかの形で接続または連結される場合に、アビディティを生じ得る）に結合し得、またはこれらは、２つの関連しない標的（これは、例えば、膜によって、これらの標的が何らかの形で連結される場合に、アビディティを生じる）に結合し得る。結合モジュールは、ペプチドまたはタンパク質のランダムライブラリーをスクリーニングすること、またはさもなければ分析することによって同定することができる。
【０１１４】
特に所望される結合モジュールは、ＭＵＲＰへの取り込みの際に、ＭＵＲＰが所望のＴエピトープスコアを生じるものである。タンパク質のＴエピトープスコアは、Ｓｔｕｒｎｉｏｌｏ，Ｔ．ら（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １７：５５５）において開示されるような、最も一般的な複数のヒトＭＨＣ対立遺伝子に対するタンパク質の結合のＫｄ（解離定数、親和性、オフレート）のｌｏｇである。このスコアは、少なくとも１５ｌｏｇ、約１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１、０、−１、−２、−３、−４、−５（１０ｅ１０Ｋｄ）から約−５までの範囲である。好ましいＭＵＲＰは、約−３．５未満のスコアを生じる［ＫＫＷ：絶対的スケールか（Ｏｎ  ａｂｓｏｌｕａｔｅ  ｓｃａｌｅ？）］。
【０１１５】
特に関心が持たれるものはまた、２つのシステイン残基を対合させることによって形成されたジスルフィド結合を含む結合モジュールである。特定の実施形態において、結合モジュールは、高システイン含量または高ジスルフィド密度（ＨＤＤ）を有するポリペプチドを含む。ＨＤＤファミリーの結合モジュールは、典型的には、５〜５０％（５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０％）のシステイン残基を有し、各ドメインは、少なくとも２つのジスルフィドおよび選択的に、カルシウムまたは別のイオンなどの補因子を含む。
【０１１６】
ＨＤＤ骨格の存在は、これらのモジュールが小さいことを可能にするが、比較的強固な構造を依然として採用する。強固さは、高い結合親和性、抗原プロセシングに関与するプロテアーゼを含む、プロテアーゼおよび熱に対する抵抗性を得るために重要であり、従って、これらのモジュールの免疫原性が低いことまたは免疫原性がないことに寄与する。ジスルフィドフレームワークは、多くのモジュールの内部の非常に多くの疎水性側鎖相互作用のための必要性を伴うことなく、モジュールをフォールディングする。小さなサイズは、速い組織浸透のために、および経口、鼻、腸管、肺、血液脳関門などのような代替的な送達のためにもまた有利である。加えて、小さなサイズはまた、免疫原性を減少するために補助する。より高いジスルフィド密度は、ジスルフィドの数を増加させることによって、または同じ数のジスルフィドを有するが、より少ないアミノ酸を有するドメインを使用することよってのいずれかで得ることが可能である。非システイン固定残基の数を減少し、その結果、より高い割合のアミノ酸が標的結合のために利用可能であることもまた所望される。
【０１１７】
システイン含有結合モジュールは、広範なジスルフィド結合パターン（ＤＢＰ）を採用することができる。例えば、２ジスルフィドモジュールは、３つの異なるジスルフィド結合パターン（ＤＢＰ）を有し得、３ジスルフィドモジュールは、１５通りの異なるＤＢＰを有し得、４ジスルフィドモジュールは、１０５通りまでの異なるＤＢＰを有する。天然の例は、２ＳＳ  ＤＢＰのすべて、３ＳＳ  ＤＢＰの大多数、および４ＳＳ  ＤＢＰの半分未満について存在する。１つの態様において、ジスルフィド結合パターンの総数は、以下の式に従って計算することができる：エラー！オブジェクトは編集フィールドコードから作成できない。ここでｎ＝システイン残基によって形成されるジスルフィド結合の予測数であり、エラー！オブジェクトは編集フィールドコードから作成できない。は、（２ｉ−１）の結果であることを表し、ここで、ｉは１からｎまでの正の整数である。
【０１１８】
従って、１つの実施形態において、ＭＵＲＰにおいて使用されるモジュールは、標的分子に向けた結合特異性を示す、天然に存在するかまたは天然に存在しないシステイン（Ｃ）含有骨格であり、ここで、天然に存在しないシステイン（Ｃ）含有骨格は、式：エラー！オブジェクトは編集フィールドコードから作成できない。ここでｎはシステイン残基によって形成されるジスルフィド結合の予測数に等しく、エラー！オブジェクトは編集フィールドコードから作成できない。は、（２ｉ−１）の結果であることを表し、ここで、ｉは１からｎまでの正の整数である；によって表わされる順列の群から選択されるパターンに従って骨格内システインを含む。１つの態様において、天然に存在するかまたは天然に存在しないシステイン（Ｃ）含有モジュールは、Ｃ１−２、３−４、Ｃ１−３、２−４、およびＣ１−４、２−３からなる群より選択されるパターンに従ってポリペプチドに含まれるシステインを対合させることによって形成された２つのジスルフィド結合を有するポリペプチドを含み、ここで、ハイフンによってつながれた２つの数値は、ポリペプチドのＮ末端から数えた２つのシステインが対合してジスルフィド結合を形成することを示す。別の態様において、天然に存在するかまたは天然に存在しないシステイン（Ｃ）含有モジュールは、Ｃ１−２、３−４、５−６、Ｃ１−２、３−５、４−６、Ｃ１−２、３−６、４−５、Ｃ１−３、２−４、５−６、Ｃ１−３、２−５、４−６、Ｃ１−３、２−６、４−５、Ｃ１−４、２−３、５−６、Ｃ１−４、２−６、３−５、Ｃ１−５、２−３、４−６、Ｃ１−５、２−４、３−６、Ｃ１−５、２−６、３−４、Ｃ１−６、２−３、４−５、およびＣ１−６、２−５、３−４からなる群より選択されるパターンに従って、骨格内システインを対合することによって形成した３つのジスルフィド結合を有するポリペプチドを含み、ここで、ハイフンによってつながれた２つの数値は、ポリペプチドのＮ末端から数えた２つのシステインが対合してジスルフィド結合を形成することを示す。なお別の態様において、天然に存在するかまたは天然に存在しないシステイン（Ｃ）含有モジュールは、上記の式によって定義される順列の群から選択されるパターンに従って、ポリペプチド中に含まれるシステインを対合させることによって形成された少なくとも４つのジスルフィド結合を有するポリペプチドを含む。なお別の態様において、天然に存在するかまたは天然に存在しないシステイン（Ｃ）含有モジュールは、上記の式によって表される順列の群から選択されるパターンに従って、タンパク質内システインを対合させることによって形成した少なくとも５個、６個、またはそれ以上のジスルフィド結合を有するポリペプチドを含む。同時係属出願［それらの全体が参照により本明細書に援用される、出願番号１１／５２８，９２７および１１／５２８，９５０］に開示される任意のシステイン含有タンパク質または骨格は候補結合分子である。
【０１１９】
結合モジュールはまた、ジスルフィド結合したシステイン間に、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、および１２個のランダム化または部分的なランダム化アミノ酸を有する（例えば、積み上げ方式）システイン束縛環状ペプチドのライブラリーから選択することができ、いくつか場合において、システイン対の外側のさらなるランダム化アミノ酸は、種々の方法を使用して構築することができる。目的の標的についての特異性を有するライブラリーメンバーは、ファージディスプレイ、リボソームディスプレイ、酵母ディスプレイ、および当該分野において公知である他の方法を含む種々の方法を使用して同定することができる。このような環状ペプチドは、ＭＵＲＰ中の結合モジュールとして利用できる。好ましい実施形態において、１つより多くのジスルフィド結合を含む結合モジュールに導く積み上げアプローチを使用して、それらの結合親和性、タンパク質分解安定性、および／または特異性を増加させるためのシステイン束縛ペプチドをさらに操作することができる。１つの特定の積み上げアプローチは図２５に図示されている。これは、以前に選択された環状ペプチドのＮ末端側、ならびにＣ末端側における、単一のシステインおよび複数のランダム化残基の付加に基づく。図２５に図示されているように設計されたライブラリーを生成することができる。改善された特性を有する結合モジュールは、ファージディスプレイまたは類似の方法によって同定することができる。このような積み上げライブラリーは、環状ペプチドのＮ末端側ならびにＣ末端側に、１個から１２個までの間のランダムな位置を含み得る。新たに加えられたランダム側面のシステイン残基と環状ペプチド中のシステイン残基との間の距離は１残基から１２残基までの間で変動し得る。このようなライブラリーは、ライブラリーメンバーあたりに４個のシステイン残基を含み、２つのシステインはもともとの環状ペプチドから生じ、２つのシステインは新たに加えられた側面においてである。このアプローチは、１−４  ２−３  ＤＢＰまたはＤＢＰ中の変化に好ましく、既存の１−２ジスルフィド（４システイン構築物中の２−３）を開裂して、１−２  ３−４または１−３  ２−４  ＤＢＰを形成する。このような積み上げアプローチは、クローン特異的プライマーを用いて実施することができ、その結果、これは、図２５に図示されるように、ライブラリー領域間に固定された配列を遊離せず、またはこれは、以前に選択されたペプチドの両側で固定された配列を使用する（従って、遊離する）プライマーを用いて実施することができ、それゆえに、これらの同じプライマーは、図２６に図示されるように、任意の以前に選択されたクローンのために使用することができる。図２６に図示されている方法は、目的の標的についての特異性を有する環状ペプチドのコレクションに適用することができる。両方の積み上げアプローチは、積み上げによって抗ＶＥＧＦ親和性の成熟のために働くことが示された。このアプローチは、６個以上のシステイン残基を有する結合モジュールを生成するために反復することができる。
【０１２０】
２ジスルフィド配列への１ジスルフィドの別の積み上げは、図２７に図示されている。これは、以前に選択されたペプチドプールが、Ｎ末端ならびにＣ末端の位置で終了するような、１ジスルフィドペプチドの以前に選択したプールのそれ自体との二量体化を含む。このアプローチは、標的上の２つの別々のエピトープを認識する２ジスルフィド配列の積み上げに有利である。
【０１２１】
別の積み上げアプローチは、４、５、６、７、８、９、または１０アミノ酸離れている２つのシステインを含む６〜１５残基の（部分的）ランダム化配列の付加を含み、連結されたシステインの外側に、任意のさらなるランダム化位置を伴う。２システインランダム配列は、以前に選択したペプチドのＮ末端側またはＣ末端側に加えられる。このアプローチは、１−２  ３−４  ＤＢＰに有利であるが、他のＤＢＰが形成されてもよい。このアプローチは、６個以上のシステイン残基と有する結合モジュールを生成するために反復することができる。
【０１２２】
結合モジュールは、天然のタンパク質骨格に基づいて構築することができる。このような骨格は、データベース検索によって同定することができる。天然の骨格に基づくライブラリーは、ファージディスプレイパニング、続いてスクリーニングに供せられ、目的の標的に特異的に結合する配列を同定できる。
【０１２３】
天然の骨格の広範な選択が、結合分子を構築するために利用可能である。特定の骨格の選択は、意図される標的に依存する。天然の骨格の非限定的な例には、ヘビトキシン様タンパク質、例えば、ヘビ毒トキシンおよびヒト細胞表面受容体の細胞外ドメインが含まれる。ヘビ毒トキシンの非限定的な例には以下が含まれる：エラブトキシン（Ｅｒａｂｕｔｏｘｉｎ）Ｂ、γ−カルジオトキシン（ｇａｍｍａ−Ｃａｒｄｉｏｔｏｘｉｎ）、ファシクリン（Ｆａｃｉｃｕｌｉｎ）、ムスカリントキシン（Ｍｕｓｃａｒｉｎｉｎｅ  ｔｏｘｉｎ）、エラブトキシン（Ｅｒａｂｕｔｏｘｉｎ）Ａ、ニューロトキシン（Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ）Ｉ、カルジオトキシン（Ｃａｒｄｉｏｔｏｘｉｎ）Ｖ４ＩＩ（トキシン（Ｔｏｘｉｎ）ＩＩＩ）、カルジオトキシンＶ、α−コブラトキシン（ａｌｐｈａ−  Ｃｏｂｒａｔｏｘｉｎ）、ロングニューロトキシン（ｌｏｎｇ  Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ）１、ＦＳ２トキシン、ブンガロトキシン（Ｂｕｎｇａｒｏｔｏｘｉｎ）、ブカンジン（Ｂｕｃａｎｄｉｎ）、カルジオトキシンＣＴＸＩ、カルジオトキシンＣＴＸ  ＩＩＢ、カルジオトキシンＩＩ、カルジオトキシンＩＩＩ、カルジオトキシンＩＶ、コブラトキシン（Ｃｏｂｒｏｔｏｘｉｎ）２、α−トキシン（ａｌｐｈａ−ｔｏｘｉｎ）、ニューロトキシンＩＩ（コブラトキシン（Ｃｏｂｒｏｔｏｘｉｎ）Ｂ）、トキシン（Ｔｏｘｉｎ）Ｂ（ロングニューロトキシン）、カンドトキシン（Ｃａｎｄｏｔｏｘｉｎ）、ブカイン（Ｂｕｃａｉｎ）。（ヒト）細胞表面受容体の細胞外ドメインの非限定的な例には、ＣＤ５９、ＩＩ型アクチビン受容体、ＢＭＰ受容体Ｉａエクトドメイン、ＴＧＦ−β  ＩＩ型受容体細胞外ドメインが含まれる。他の天然の骨格には以下が含まれるがこれらに限定されない：Ａ−ドメイン、ＥＧＦ、Ｃａ−ＥＧＦ、ＴＮＦ−Ｒ、ノッチ（Ｎｏｔｃｈ）、ＤＳＬ、トレフォイル（Ｔｒｅｆｏｉｌ）、ＰＤ、ＴＳＰｌ、ＴＳＰ２、ＴＳＰ３、アナト（Ａｎａｔｏ）、インテグリンβ（Ｉｎｔｅｇｒｉｎ  Ｂｅｔａ）、サイログロブリン（Ｔｈｙｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）、ディフェンシン（Ｄｅｆｅｎｓｉｎ）１、ディフェンシン２、シクロチド（Ｃｙｃｌｏｔｉｄｅ）、ＳＨＫＴ、ディスインテグリンン（Ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ）、ミオトキシン（Ｍｙｏｔｏｘｉｎ）、γ−チオネイン（Ｇａｍｍａ−Ｔｈｉｏｎｅｉｎ）、コノトキシン（Ｃｏｎｏｔｏｘｉｎ）、μ−コノトキシン、ω−アトラコトキシン（Ａｔｒａｃｏｔｏｘｉｎ）、δ−アトラコトキシン、ならびに、その全体が本明細書に組み込まれる、同時係属出願番号１１／５２８，９２７および１１／５２８，９５０に開示されるさらなるファミリー。
【０１２４】
大きな変種のライブラリーの中で結合分子を同定することを可能にする、非常に様々な方法が記載されてきた。１つの方法は化学合成である。ライブラリーメンバーは、各ビーズが異なるペプチド配列を有するように、ビーズ上で合成できる。所望の特異性を有するリガンドを有するビーズは、標識された結合パートナーを使用して同定することができる。別のアプローチは、反復手順の中で特異的結合配列を同定することを可能にする、ペプチドのサブライブラリーの生成である（Ｐｉｎｉｌｌａ，Ｃ．ら（１９９２）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１３：９０１−９０５）。より一般的に使用されているものは、変種のライブラリーがファージ、タンパク質、または細胞の表面上に発現されるディスプレイ方法である。これらの方法は、一般的に、ライブラリーの各変種をコードするＤＮＡまたはＲＮＡがリガンドに物理的に連結されているものである。これは、目的のリガンドを検出または回収すること、次いで、結合したＤＮＡまたはＲＮＡを配列決定することによってそのペプチド配列を決定することを可能にする。ディスプレイ法は、当業者が、ランダム変種の大きなライブラリーから所望の結合特性を有するライブラリーメンバーを富化することを可能にする。頻繁には、所望の結合特性を有する変種は、所望の特性について富化されたライブラリーから個々の単離物をスクリーニングすることによって、富化されたライブラリーから同定することができる。ディスプレイ法の例は、ｌａｃリプレッサーへの融合（Ｃｕｌｌ，Ｍ．ら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，８９：１８６５−１８６９）、細胞表面ライブラリー（Ｗｉｔｔｒｕｐ，Ｋ．Ｄ．（２００１）Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１２：３９５−９）である。特に関心が持たれるものは、ランダムペプチドまたはタンパク質がファージ粒子に連結されている方法である。一般的に使用されるものはＭ１３ファージ（Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｐ．ら（１９９７）Ｃｈｅｍ  Ｒｅｖ，９７：３９１−４１０）およびＴ７ファージ（Ｄａｎｎｅｒ，Ｓ．ら（２００１）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，９８：１２９５４−９）である。Ｍ１３上でペプチドまたはタンパク質をディスプレイするために利用可能である複数の方法が存在している。多くの場合において、ライブラリー配列は、Ｍ１３ファージのペプチドＰＩＩＩのＮ末端に融合される。ファージは、典型的には、このタンパク質の３〜５コピーを有し、従って、このようなライブラリー中のファージは、多くの場合において、ライブラリーメンバーの３〜５の間のコピーを有する。このアプローチは、多価ディスプレイといわれる。代替は、ライブラリーがファージミド上にコードされているファージミドライブラリーである。ファージ粒子は、ヘルパーファージとともにファージミドを有する細胞の感染によって形成することができる（Ｌｏｗｍａｎ，Ｈ．Ｂ．ら（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３０：１０８３２−１０８３８）。このプロセスは、典型的には、一価ディスプレイに導く。いくつかの場合において、一価ディスプレイは、高親和性結合物を得るために好ましい。他の場合において、多価ディスプレイが好ましい（Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌｌ，Ｄ．ら（２００２）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，３２１：４９−５６）。
【０１２５】
ファージディスプレイによって所望の特徴を有する配列を富化するための種々の方法が記載されてきた。免疫チューブ、マイクロタイタープレート、磁気ビーズ、または他の表面への結合によって、目的の標的を固定化することができる。続いて、ファージディスプレイを固定化標的と接触させ、結合リガンドを欠くファージを洗浄して除き、そして標的特異的リガンドを有するファージを種々の条件によって溶出させることができる。溶出は、低ｐＨ、高ｐＨ、尿素、またはタンパク質−タンパク質接触を破壊する傾向がある他の条件によって実施することができる。結合したファージはまた、溶出するファージが加えた大腸菌宿主に直接的に感染することができるように、大腸菌細胞を加えることによって溶出させることもできる。興味深いプロトコールは、ファージ結合リガンドまたは固定化標的を分解できるプロテアーゼを用いる溶出である。プロテアーゼはまた、プロテアーゼ抵抗性ファージ結合リガンドを富化させるためのツールとして利用することができる。例えば、目的の標的へのパニングの前に、１種以上の（ヒトまたはマウス）プロテアーゼを用いてファージ結合リガンドのライブラリーをインキュベートすることができる。このプロセスは、プロテアーゼに対して不安定であるライブラリーからのリガンドを分解および除去する（Ｋｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，Ｐ．ら（１９９８）Ｆｏｌｄ  Ｄｅｓ，３：３２１−８）。リガンドのファージディスプレイライブラリーはまた、複雑な生物学的サンプルへの結合のために富化させることができる。例は、固定化細胞膜画分上（Ｔｕｒ，Ｍ．Ｋ．ら（２００３）Ｉｎｔ  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ，１１：５２３−７）または全細胞上（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ，Ｕ．Ｂ．ら（２００２）Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ，９：６０６−１２；Ｋｅｌｌｙ，Ｋ．Ａ．ら（２００３）Ｎｅｏｐｌａｓｉａ，５：４３７−４４）でのパニングである。いくつか場合において、ファージライブラリーからの細胞特異的な結合因子の富化を改善するためのパニング条件を最適化する必要がある（Ｗａｔｔｅｒｓ，Ｊ．Ｍ．ら（１９９７）Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３：２１−９）。ファージパニングは、生きている患者または動物においてもまた実施することができる。このアプローチは、血管標的に結合するリガンドの同定のために、特に関心が持たれるものである（Ａｒａｐ，Ｗ．ら（２００２）Ｎａｔ  Ｍｅｄ，８：１２１−７）。
【０１２６】
ペプチドのライブラリーをコードするＤＮＡ配列のライブラリーを生成することを当業者に可能にする、種々のクローニング方法が利用可能である。ヌクレオチドのランダム混合物は、１つまたは複数のランダム位置を含むオリゴヌクレオチドを合成するために利用することができる。このプロセスは、ランダム位置の数、ならびにランダム化の程度を制御することを可能にする。加えて、生物学的サンプルからのＤＮＡの部分消化によって、ランダムまたは半ランダムＤＮＡ配列を得ることが可能である。ランダムオリゴヌクレオチドは、あらかじめ規定された位置でランダム化されるプラスミドまたはファージのライブラリーを構築するために使用することができる。これは、（ｄｅ  Ｋｒｕｉｆ，Ｊ．ら（１９９５）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，２４８：９７−１０５）において記載されるように、ＰＣＲ融合によって行うことができる。他のプロトコールはＤＮＡライゲーションに基づく（Ｆｅｌｉｃｉ，Ｆ．，ら（１９９１）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，２２２：３０１−１０；Ｋａｙ，Ｂ．Ｋ．ら（１９９３）Ｇｅｎｅ，１２８：５９−６５）。別の一般的に使用されているアプローチはＫｕｎｋｅｌ変異誘発であり、ここでは、プラスミドまたはファージミドの変異誘発鎖は、一本鎖環状ＤＮＡを鋳型として使用して合成される。Ｓｉｄｈｕ，Ｓ．Ｓ．ら（２０００）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ，３２８：３３３−６３；Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．，ら（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ，１５４：３６７−８２を参照のこと。
【０１２７】
Ｋｕｎｋｅｌ変異誘発は、ＣＪ２３６のような大腸菌株から得ることができる、ランダムに取り込まれたウラシル残基を含む鋳型を使用する。ウラシル含有鋳型鎖は、インビトロ合成された変異誘発鎖が維持されながら、大腸菌への形質転換の際に優先的に分解される。結果として、多くの形質転換細胞は、ファージミドまたはファージの変異誘発バージョンを有する。ライブラリー中の多様性を増加させるための価値のあるアプローチは、複数のサブライブラリーを合わせることである。これらのサブライブラリーは、上記の方法のいずれかによって生成することができ、そしてこれらは、同じかまたは異なる骨格に基づき得る。
【０１２８】
短いペプチドの大きなファージライブラリーを生成するための有用な方法が最近記述された（Ｓｃｈｏｌｌｅ，Ｍ．Ｄ．ら（２００５）Ｃｏｍｂ  Ｃｈｅｍ  Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎ，８：５４５−５１）。この方法は、Ｋｕｎｋｅｌアプローチに関連しているが、これは、ランダムウラシル塩基を含む一本鎖鋳型ＤＮＡの精製を必要としない。その代わりに、この方法は、変異誘発される領域に近接して１つ以上の変異を有する鋳型ファージを用いて開始し、上記変異は、ファージを非感染性にする。この方法は、ある位置にランダム化コドンを有し、そして鋳型中のファージ不活性化変異を修正する変異誘発性オリゴヌクレオチドを使用する。結果として、変異誘発ファージ粒子のみが、形質転換後に感染性であり、そして非常に少ない親のファージがこのようなライブラリーに含まれる。この方法はさらに、いくつかの方法で修飾することができる。例えば、ファージの複数の不連続領域に同時に変異誘発するために、複数の変異誘発オリゴヌクレオチドを利用することができる。本発明者らは、さらなる困難をもたらす＜１０、１５、または２０アミノ酸の短いペプチドの代わりに、＞２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５および６０アミノ酸の全体のマイクロプロテインにこのオリゴヌクレオチドを適用することによって、このアプローチのさらに先の工程を採用した。今や、このアプローチは、単回の形質転換で１０ｅ１０より多く（１０ｅ１１まで）の形質転換体のライブラリーを生じ、その結果、１０ｅ１２の多様性を有する単一のライブラリーが１０個の形質転換体から予想される。
【０１２９】
Ｓｃｈｏｌｌｅ法の別のバリエーションは、鋳型中のアンバー終止コドンがオーカー終止コドンに転換され、次のサイクルの変異誘発では、オーカーがアンバーに転換されるように、変異誘発オリゴヌクレオチドを設計することである。この場合において、鋳型ファージおよび変異誘発ライブラリーメンバーは、大腸菌の異なるサプレッサー株の中で、オーカーサプレッサー株をアンバーサプレッサー株と交互に使用して、培養する必要がある。このことは、これらの２つの型の終止コドンと２つのサプレッサー株との間で交互に行うことによって、ファージの変異誘発の連続的なラウンドを実施することを可能にする。
【０１３０】
Ｓｃｈｏｌｌｅアプローチのなお別のバリエーションは、一本鎖ファージＤＮＡ鋳型を用いるメガプライマーの使用を含む。メガプライマーは、パニングの前のラウンドからファージの選択したプールのライブラリー挿入物から生成された長いｓｓＤＮＡである。目的は、１つ以上の領域で変異誘発した前のプールからのライブラリー挿入物の完全な多様性を獲得し、そして、さらなる領域が変異誘発できるようなやり方で、新たなライブラリーにこれを移動することである。メガプライマープロセスは、目的の遺伝子に終止コドンを含む同じ鋳型を使用して、複数のサイクルで反復することができる。メガプライマーは、１）ｓｓＤＮＡ鋳型に対する相補性について少なくとも１５塩基の５’および３’重複領域、および２）前に選択したクローンのプールからコピーした（選択的にＰＣＲによる）１つ以上（１、２、３、４、またはそれ以上）の前に選択したライブラリー領域、および３）パニングの次のラウンドにおいて選択される新たに変異誘発されたライブラリー領域を含むｓｓＤＮＡ（選択的にＰＣＲによって生成される）である。メガプライマーは、１）新たに合成されたライブラリー領域をコードする１つ以上のオリゴヌクレオチドを合成すること、および２）任意に重複ＰＣＲを使用して、前に最適化された任意の他のライブラリー領域を含むＤＮＡフラグメント（選択的に、ＰＣＲによって得られる）にこれを融合することによって、選択的に調製される。ランオフまたは合わせた（重複）ＰＣＲ産物の一本鎖ＰＣＲを使用して、前に最適化した領域のすべて、ならびに次のパニング実験において最適化されるさらなる領域についての新たなライブラリーを含む一本鎖メガプライマーを生成する。このアプローチは、サイクルあたり１０ｅ１１〜１０ｅ１２の多様性を生成する、複数の迅速なライブラリー作製のサイクルを使用し、各々は続いてパニングを行って、タンパク質の親和性成熟を可能にすることが期待される。
【０１３１】
マイクロプロテインの結合、または製造、安定性、もしくは免疫原性のような他の特性を増強する目的で、種々の方法を、（以前に選択されたかまたは未処理の）マイクロプロテインのライブラリーに配列の多様性を導入するために、または個々のマイクロプロテインクローンを変異させるために適用することができる。原理的には、ライブラリーを生成するために使用できるすべての方法はまた、マイクロプロテインの富化された（以前に選択された）ライブラリーに多様性を導入するためにも使用することができる。特に、所望の結合または他の特性を有する変種を合成し、これらの配列に基づいて部分的にランダム化されたオリゴヌクレオチドを設計することができる。このプロセスは、ランダム化の位置および程度を制御することを可能にする。種々のコンピュータアルゴリズムを使用して、複数の変種の配列データから、タンパク質中の個別の変異の有用性を推定することができる（Ｊｏｎｓｓｏｎ，Ｊ．ら（１９９３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，２１：７３３−９；Ａｍｉｎ，Ｎ．ら（２００４）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ，１７：７８７−９３）。富化ライブラリーの再変異誘発のために特に関心が持たれるものはＤＮＡシャッフリングであり（Ｓｔｅｍｍｅｒ，Ｗ．Ｐ．Ｃ．（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ，３７０：３８９−３９１）、これは、富化ライブラリー中で個々の配列の組換え体を生成する。シャッフリングは、種々の修飾ＰＣＲ条件を使用して実施することができ、鋳型は、組換えを増強するために部分的に分解されてもよい。代替は、制限酵素ベースのクローニングを使用する、あらかじめ規定した位置での組換えである。特に関心が持たれるものは、それらの配列認識部位の外側でＤＮＡを切断するＩＩＳ型制限酵素を利用する方法である（Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｊ．ら（２００１）Ｊ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，７４：３１７−３８）。非回文突出を生成する制限酵素は、複数の位置でプラスミドまたは変種をコードする他のＤＮＡを切断するために利用することができ、完全なプラスミドは、ライゲーションによって再アセンブルすることができる（Ｂｅｒｇｅｒ，Ｓ．Ｌ．ら（１９９３）Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，２１４：５７１−９）。多様性を導入するための別の方法は、ライブラリーメンバーをコードするＤＮＡ配列が変異誘発条件下でＰＣＲに供されるＰＣＲ変異誘発である。比較的高い変異頻度で変異をもたらすＰＣＲ条件が記載されている（Ｌｅｕｎｇ，Ｄ．ら（１９８９）Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，１：１１−１５）。加えて、忠実度が減少したポリメラーゼを利用することができる（Ｖａｎｈｅｒｃｋｅ，Ｔ．ら（２００５）Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，３３９：９−１４）。特に関心が持たれる方法は、変異誘発株に基づく（Ｉｒｖｉｎｇ，Ｒ．Ａ．ら（１９９６）Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２：１２７−４３；Ｃｏｉａ，Ｇ．ら（１９９７）Ｇｅｎｅ，２０１：２０３−９）。これらは、１つ以上のＤＮＡ修復遺伝子の欠損を有する株である。これらの株におけるプラスミドまたはファージまたは他のＤＮＡは、通常の複製の間に変異を蓄積する。遺伝子の多様性を導入するために変異誘発株中で個々のクローンまたは富化集団を増幅させることが��きる。上記の方法の多くは反復プロセスの中で利用することができる。全体の遺伝子、もしくは遺伝子の一部に対して、複数ラウンドの変異誘発およびスクリーニングまたはパニングを適用することが可能であり、または各々の引き続くラウンドの間にタンパク質の異なる部分を変異誘発することが可能である（Ｙａｎｇ，Ｗ．Ｐ．ら（１９９５）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，２５４：３９２−４０３）。
【０１３２】
ライブラリーは、アーティファクトを減少するためにさらに処理することができる。ファージパニングの既知のアーティファクトには以下が含まれる：１）疎水性に基づく非特異的結合、および２）標的への多価結合、これは以下のいずれかに起因する：ａ）ｐＩＩＩファージタンパク質の五価性、またはｂ）多量体を生じる、異なるマイクロプロテイン間のジスルフィドの形成に起因、またはｃ）固体支持体上の標的の高密度コーティングに起因、および３）状況依存性の標的結合、ここでは、標的の状況またはマイクロプロテインの状況が、結合または阻害活性に対して決定的になる。これらの問題の規模を最小化するために、異なる処理工程をとることができる。例えば、このような処理が全体のライブラリーに適用されるが、良くないクローンを除去するいくつかの有用な処理が、可溶性タンパク質のプールのみに、または個々の可溶性タンパク質のみに適用することができる。
【０１３３】
システイン含有骨格のライブラリーは、遊離のチオールを含むようであり、これは、他のタンパク質への架橋によって、指向性進化を複雑にし得る。１つのアプローチは、チオール除去カラムを通してライブラリーから最もよくないクローンを除去することであり、このようにして、１種以上の遊離のスルフヒドリルを有するすべてのクローンを除去する。遊離のＳＨ基を有するクローンもまた、ビオチン−ＳＨ試薬と反応させることができ、ストレプトアビジンカラムを使用して、反応性ＳＨ基を有するクローンの効率的な除去を可能にする。別のアプローチは、遊離のチオールを除去しないが、ヨード酢酸などのスルフヒドリル反応性化学物質でこれらをキャッピングすることによって、これらを不活性化することである。特に関心が持たれるものは、非特異的標的結合または修飾変種を減少する、かさ高いまたは親水性のスルフヒドリル試薬である。
【０１３４】
状況依存性の例は、ｐＩＩＩタンパク質、リンカー、ペプチドタグ、ビオチン−ストレプトアビジン、Ｆｃ、および相互作用に寄与する他の融合タンパク質を含む、一定の配列のすべてである。状況依存性を回避するための典型的なアプローチは、積み上げを回避するために、実用的である限り頻繁に、状況を切り換えることを含む。これは、異なるディスプレイ系の間で交互に行うこと（すなわち、Ｍ１３対Ｔ７，またはＭ１３対酵母）、使用されるタグおよびリンカーを交互に行うこと、固定化のために使用される（固体）支持体を交互に行うこと（すなわち、固定化学）、および標的タンパク質それ自体を交互に行うこと（異なる製造業者、異なる融合バージョン）を含んでもよい。
【０１３５】
ライブラリー処理は、好ましい品質を有するタンパク質について選択するために使用することができる。１つの選択肢は、ライブラリーから不安定な変種を除去するために、プロテアーゼを用いるライブラリーの処理である。使用されるプロテアーゼは、典型的には、適用の際に出くわすものである。肺送達のために、例えば、肺洗浄によって得られた肺プロテアーゼを使用する。同様に、血清、唾液、胃、腸、皮膚、鼻などからのプロテアーゼの混液を得る。しかし、単一の精製プロテアーゼの混液を使用することもまた可能である。プロテアーゼの広範なリストは［付録Ｅ］に示される。ファージそれ自体は、多くのプロテアーゼおよび他の過酷な処理に対して例外的に抵抗性である。
【０１３６】
例えば、最も安定な構造、すなわち、最強のジスルフィド結合を有するものについて、それを増加濃度の還元剤（すなわち、ＤＴＴ、またはβメルカプトエタノール）に曝露し、このようにして、最初に最も安定性が少ない構造を除去することによって、選択することが可能である。典型的には、所望の安定性に依存して、２．５ｍＭから、５ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、４０ｍＭ、５０ｍＭ、６０ｍＭ、７０ｍＭ、８０ｍＭ、９０ｍＭ、または１００ｍＭまでの還元剤（すなわち、ＤＴＴ、ＢＭＥ、他）濃度を使用する。
【０１３７】
高レベルの還元剤を用いて完全なディスプレイライブラリーを還元すること、続いて、タンパク質ライブラリーを徐々に再酸化してジスルフィドを再形成すること、続いて、上記のように、遊離のＳＨ基を有するクローンの除去を行うことによって、インビトロで効率的に再フォールディングできるクローンを選択することもまた可能である。このプロセスは、インビトロで低い再フォールディング効率を有するクローンを除去するために、１回または複数回適用することができる。
【０１３８】
１つのアプローチは、Ａ．Ｃ．Ｆｉｓｈｅｒら（２００６）Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ  ｅｎａｂｌｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｆｏｌｄｉｎｇ  ｑｕａｌｉｔｙ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｆｅａｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｗｉｎ−ａｒｇｉｎｉｎｅ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ  ｐａｔｈｗａｙ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（オンライン版）によって記載されているような、タンパク質発現レベル、フォールディングおよび溶解性についての遺伝子選択を適用することである。ディスプレイライブラリーのパニング後（任意）、標的結合、発現レベル、およびフォールディングについて、タンパク質レベルでの数千個のクローンのスクリーニングを回避することが望まれる。代替方法は、βラクタマーゼ融合ベクターに選択した挿入物の全体のプールをクローニングすることであり、これは、βラクタム上にプレートしたときに、著者らは、十分に発現され、完全にジスルフィド結合され、そして可溶性であるタンパク質について選択性であることを実証した。
【０１３９】
タンパク質ライブラリーのＭ１３ファージディスプレイおよび１回以上のサイクルでの標的上でのパニングの後で、進行するべき種々の方法が存在し、これには以下が含まれる：（１）ファージＥＬＩＳＡによる個々のファージクローンのスクリーニング、これは、固定化標的に結合するファージ粒子の数を測定する（抗Ｍ１３抗体を用いる）；（２）Ｍ１３からＴ７ファージディスプレイライブラリーへの移動。第２のアプローチは、価数に基づく偽陽性の発生を減少させる際に特に有用である。任意の単一ライブラリー形式が、標的との抗アビディティ接触を形成し得るクローンのために好ましい傾向がある。このことが、可溶性タンパク質のスクリーニングは重要であるが、これは退屈な解決法であることの理由である。Ｔ７ファージディスプレイにおいて達成される多価は、Ｍ１３ディスプレイにおいて達成されるものとはかなり異なっているようであり、Ｔ７とＭ１３との間のサイクリングは、価数に基づいて偽陽性の発生を減少させるための優秀なアプローチであり得る。
【０１４０】
フィルターリフトは、大きな寒天プレート上で高密度で（１０ｅ２〜１０ｅ５）増殖させた細菌コロニーを用いてであり得る別の方法論である。少量のいくつかのタンパク質は媒体から分泌され、結局はフィルターメンブレン（ニトロセルロースまたはナイロン）に結合する。次いで、フィルターは、無脂肪ミルク、１％カゼイン加水分解物、または１％ＢＳＡ溶液中でブロックされ、そして、蛍光色素または指標酵素で標識した（直接的に、または抗体もしくはビオチン−ストレプトアビジンを介して間接的に）標的タンパク質とともにインキュベートする。コロニーの位置は、プレートの背面にフィルターを重ねることによって決定し、すべてのポジティブクローンを選択し、さらなる特徴付けのために使用する。フィルターリフトの利点は、これが、異なる期間の間の洗浄後にシグナルを読み取ることによって、親和性選択的にできることである。高親和性クローンのシグナルはゆっくりと「消えていく」のに対して、低親和性クローンのシグナルは急速に消える。このような親和性の特徴付けは、典型的には、ウェルベースのアッセイとともに３点アッセイを必要とし、ウェルベースのアッセイよりも、クローンからクローンへのより良好な適合性を提供し得る。クローンのアレイへのグリッド化は、これが、コロニーのサイズまたは位置に起因する差異を最小化するので、有用である。
【０１４１】
Ｎ末端モジュール：
対象ＭＵＲＰはＮ末端モジュール（ＮＭ）を含み得、これは、例えば、ＭＵＲＰの産生を容易にする際に特に有用である。ＮＭは、生成物が大腸菌細胞質中で発現されるときに、単一のメチオニン残基であり得る。典型的な生成物形式は、治療タンパク質に融合されたＵＲＰであり、これは、Ｎ末端がホルミル−メチオニンであるように、細菌細胞質中で発現される。ホルミル−メチオニンは、永続性、またはこれが生物学的または化学的プロセシングによって除去されるならば、一過性のいずれかであり得る。
【０１４２】
ＮＭはまた、タンパク質分解性プロセシングのために操作されたペプチド配列であり得、これは、タグを除去するため、または融合タンパク質を除去するために使用することができる。Ｎ末端モジュールは、Ｆｌａｇ−、Ｍｙｃ−、ＨＡ−、またはＨｉｓ−タグなどの親和性タグを含めることによって、ＭＵＲＰの精製を容易にするように操作することができる。Ｎ末端モジュールはまた、ＭＵＲＰの検出のために使用できる親和性タグを含むことができる。ＮＭは、ＭＵＲＰの高レベル発現のために操作または選択できる。これはまた、得られるＭＵＲＰのプロテアーゼ抵抗性を増強するために操作または選択することができる。ＭＵＲＰは、発現および／または精製を容易にするＮ末端モジュールとともに産生することができる。このＮ末端モジュールは、最終産物がＮ末端モジュールを含まないように、プロテアーゼを用いる産生プロセスの間に切断して除くことができる。
【０１４３】
Ｎ末端モジュールのアミノ酸およびコドン選択を最適化するために、組換え産生を増加することができる。Ｎ末端モジュールはまた、Ｘａ因子、トロンビン、またはエンテロキナーゼ、トマトエッチウイルス（Ｔｏｍａｔｏ  Ｅｔｃｈ  Ｖｉｒｕｓ）（ＴＥＶ）プロテアーゼのような特異的プロテアーゼによって切断可能なプロセシング部位も含み得る。プロセシング部位はまた、化学的加水分解によって切断可能であるように設計することができる。１つの例は、酸性条件下で切断できるアミノ酸配列ａｓｐ−ｐｒｏである。Ｎ末端モジュールはまた、ＭＵＲＰの精製を容易にするように設計することができる。例えば、Ｎ末端モジュールは、固定化金属クロマトグラフィによる生成物捕捉を可能にする複数のｈｉｓ残基を含むように設計することができる。Ｎ末端モジュールは、抗体によって特異的に捕捉または検出できるペプチド配列を含むことができる。例は、ＦＬＡＧ、ＨＡ、ｃ−ｍｙｃである。
【０１４４】
Ｃ末端モジュール：
ＭＵＲＰはＣ末端モジュールを含み得、これは、例えば、ＭＵＲＰの産生を容易にする際に特に有用である。例えば、Ｃ末端モジュールは、融合され、それゆえに、タンパク質発現を増加し、または精製を容易にする配列を除去するためのタンパク質分解性プロセシングをもたらすための切断部位を含み得る。特に、Ｃ末端モジュールはまた、Ｘａ因子、トロンビン、ＴＥＶプロテアーゼ、またはエンテロキナーゼのような特異的プロテアーゼによって切断可能なプロセシング部位も含み得る。プロセシング部位はまた、化学的加水分解によって切断可能であるように設計することができる。１つの例は、酸性条件下で切断できるアミノ酸配列ａｓｐ−ｐｒｏである。Ｃ末端モジュールはまた、ＭＵＲＰの精製を容易にすることを目的とした親和性タグであり得る。例えば、Ｃ末端モジュールは、固定化金属クロマトグラフィによる生成物捕捉を可能にする複数のｈｉｓ残基を含むように設計することができる。Ｃ末端モジュールは、抗体によって特異的に捕捉または検出できるペプチド配列を含むことができる。タグの非限定的な例は、ＦＬＡＧ、ＨＡ、ｃ−ｍｙｃ、またはＨｉｓ−タグである。Ｃ末端モジュールはまた、得られるＭＵＲＰのプロテアーゼ抵抗性を増強するように操作または選択することができる。
【０１４５】
所望される場合、タンパク質のＮ末端はそれ自体のＣ末端に連結することができる。例えば、これらの２つのモジュールを連結することは、アミノ酸様の天然の連結（ペプチド結合）を作製することによって、または外因性連結実体を使用することによって実行することができる。特に関心が持たれるものは、これが天然に存在する、小さなタンパク質のファミリーであるシクロチドである。シクロチドのような構造形式を採用することは、エキソプロテアーゼに対するさらなる安定性を提供することが予測される。このような分子内連結は、典型的には、より低いタンパク質濃度でより良好に働く。
【０１４６】
エフェクターモジュール：
ＭＵＲＰは１つまたは複数のエフェクターモジュール（ＥＭ）を含み得るか、または全く含み得ない。エフェクターモジュールは、典型的には、標的化を提供しないが、しかし、これらは、細胞の殺傷のような治療効果のために必要とされる活性を提供する。ＥＭは、薬学的に活性な小分子（すなわち、毒性薬物）、ペプチド、またはタンパク質であり得る。非限定的な例は、サイトカイン、抗体、酵素、増殖因子、ホルモン、受容体、受容体アゴニストまたはアンタゴニストであり、その全体またはフラグメントまたはドメインには関わらない。エフェクターモジュールはまた、合成または天然に関わらず、化学的に連結された小分子薬物を有するペプチド配列を含み得る。選択的に、これらのエフェクター分子は、毒性活性の放出に導く選択条件下で化学リンカーを介して切断されてもよく、または切断されなくてもよい、エフェクターモジュールに連結することができる。ＥＭは、放射性同位元素およびそれらのキレート、ならびにＰＥＴおよびＭＲＩのための種々の標識を含み得る。エフェクターモジュールはまた、細胞または組織に対して毒性であり得る。特に関心が持たれるものは、疾患組織または疾患細胞型に特異性を有する毒性エフェクターモジュールおよび結合モジュールを含むＭＵＲＰである。このようなＭＵＲＰは、疾患組織または疾患細胞型に特異的に蓄積し得、そして疾患組織または細胞型で優先的にそれらの毒性作用を発揮し得る。以下に列挙したものは、例示的なエフェクターモジュールである。
【０１４７】
酵素−エフェクターモジュールは酵素であり得る。特に関心が持たれるものは、炭水化物、またはアミノ酸、または脂質、または補因子のような細胞増殖のために決定的に重要である代謝産物を分解する酵素である。酵素活性を有するエフェクターモジュールの他の例は、ＲＮアーゼ、ＤＮアーゼ、およびホスファターゼ、アスパラギナーゼ、ヒスチジナーゼ、アルギナーゼ、βラクタマーゼである。酵素活性を有するエフェクターモジュールは、組織または細胞に送達されたときに毒性であり得る。酵素活性を有するエフェクターモジュールは、組織または細胞に送達されたときに毒性であり得る。特に関心が持たれるものは、毒性であるエフェクターモジュールおよび疾患組織に特異的に結合する結合モジュールを合わせるＭＵＲＰである。腫瘍部位において不活性プロドラッグを活性薬物に転換する酵素もまた、潜在的なエフェクターモジュールである。
【０１４８】
薬物−対象ＭＵＲＰは、薬物であるエフェクターを含み得る。所望される場合、薬物分子の臓器選択的送達のための配列を設計することができる。１つの例は図８に図示される。ＵＲＰ配列は、疾患組織に優先的に結合するタンパク質に融合させることができる。同じＵＲＰ配列は、薬物分子の結合のために修飾され得る１つ以上のアミノ酸残基を含み得る。このような結合体は、高い特異性で疾患組織に結合し得、結合した薬物組織は、全身への薬物暴露を最小化しながら、局所的作用を生じ得る。ＭＵＲＰは、所望の作用の部位においてネイティブプロテアーゼによって切断できるプロテアーゼ感受性部位を導入することによって、標的サイズの薬物分子の放出を容易にするように設計することができる。薬物送達構築物の設計のためにＵＲＰ配列を使用することの顕著な利点は、薬物分子と、構築物の標的ドメインとの間の望ましくない相互作用を回避できることである。標的ドメインに結合体化できる多くの薬物分子は顕著な疎水性を有し、得られる結合体は凝集する傾向がある。このような構築物に疎水性ＵＲＰ配列を加えることによって、得られる送達構築物の溶解性を改善することができ、結果として、凝集の傾向を減少する。さらに、長いＵＲＰ配列を加えることによって、標的ドメインに融合することができる薬物分子の数を増加させることができる。加えて、ＵＲＰ配列の使用は、完全な結合体化を容易にするために薬物結合体化部位間の距離を最適化することを可能にする。適切な薬物のリストには以下が含まれるがこれらに限定されない：チオテパおよびシクロホスファミド（ＣＹＴＯＸＡＮ（商標））などの化学療法剤；ブスルファン、インプロスルファン、およびピポスルファンなどのスルホン酸アルキル；ベンゾドーパ、カルボクオン、メツレドーパ、およびウレドーパなどのアジリジン；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド、およびトリメチロロメラミンを含むエチレンイミンおよびメチラメルアミン；クロラムブシル、クロルナファジン、コロフォスファミド、エストラムチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノベムビクチン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチンなどのニトロソウレア；アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アウスラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カリケアマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、クエラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ユベニメックス、ジノスタチン、ゾルビシンなどの抗生物質；メトトレキサートおよび５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）などの代謝拮抗物質；デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサートなどの葉酸アナログ；フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンなどのプリンアナログ；アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロキシウリジンなどのピリミジンアナログ；カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンなどのアンドロゲン；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンなどの抗アドレナール；フロリニック酸などの葉酸補充剤；アセグラトン；アルドホスファミドグルコシド；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル；ビスアントレン；エダトラキサート；デフォファミン；デメコルシン；ジアジクオン；デュオカルマイシン、メイタンシン、オーリスタチン、エルホミチン；酢酸エリプチニウム；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒトロキシウレア；レンチナン；ロニダミン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ポドフィリン酸；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ．Ｒ（商標）；ラゾキサン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２，２’，２’’−トリクロロトリエチルアミン；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキサン、例えば、パクリタキセル（タキソール（ＴＡＸＯＬ）（商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）およびドセタキセル（タキソテレ（ＴＡＸＯＴＥＲＥ）（商標）、Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ  Ｒｏｒｅｒ，Ａｎｔｏｎｙ，Ｆｒａｎｃｅ）；クロラムブシル；ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；シスプラチンおよびカルボプラチンなどの白金アナログ；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；マイトマイシンＣ；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン；ノバントロン；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イダンドロネート；カンプトテシン−１１（ＣＰＴ−１１）；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸；エスペラマイシン；カペシタビン；および上記のいずれかの薬学的に需要可能な塩、酸、または誘導体。適切な化学療法剤の細胞添加剤として、腫瘍に対してホルモン作用を調節または阻害するように作用する抗ホルモン剤、例えば、タモキシフェン、ラロキシフェンを含む抗エストロゲン、アロマターゼ阻害剤である４（５）−イミダゾール、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ  １１７０１８、オナプリストン、およびトレミフェン（Ｆａｒｅｓｔｏｎ）；ならびに抗アンドロゲン、例えば、フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド、ゴセレリン、ドキソルビシン、ダウノマイ���ン、デュオカルマイシン、ビンクリスチン、およびビンブラスチンなどもまた含まれる。
【０１４９】
エフェクターモジュールとして使用できる他の薬物には、炎症状態、心臓疾患、感染疾患、呼吸器疾患、自己免疫疾患、神経（ｎｅｒｏｎａｌ）および筋肉の障害、代謝障害、および癌を治療するために有用であるものが含まれる。
【０１５０】
ＭＵＲＰにおけるエフェクターとして使用できるさらなる薬物には、以下のような痛みおよび炎症のための薬剤が含まれる：ヒスタミンおよびヒスタミンアンタゴニスト、ブラジキニンおよびブラジキニンアンタゴニスト、５−ヒドロキシトリプタミン（セロトニン）、膜リン脂質の選択的加水分解の生成物の生体変換によって生成される脂質物質、エイコサノイド、プロスタグランジン、トロンボキサン、ロイコトリエン、アスピリン、非ステロイド性抗炎症剤、鎮痛剤−解熱剤、プロスタグランジンおよびトロンボキサンの合成を阻害する薬剤、誘導性シクロオキシゲナーゼの選択的阻害剤、誘導性シクロオキシゲナーゼ−２の選択的阻害剤、オータコイド、パラクリンホルモン、ソマトスタチン、ガストリン、体液性および細胞性免疫応答に関与する相互作用を媒介するサイトカイン、脂質誘導性オータコイド、エイコサノイド、β−アドレナリン作動性アゴニスト、イプラトロピウム、糖質コルチコイド、メチルキサンチン、ナトリウムチャネル遮断剤、オピオイド受容体アゴニスト、カルシウムチャネル遮断剤、膜安定化剤、およびロイコトリエン阻害剤。
【０１５１】
エフェクターとして使用することができる他の薬物には、消化性潰瘍の治療のための薬剤、胃食道逆流疾患の治療のための薬剤、運動促進剤、制吐剤、過敏性腸症候群において使用される薬剤、下痢のために使用される薬剤、便秘のために使用される薬剤、炎症性腸疾患のために使用される薬剤、胆道疾患のために使用される薬剤、膵臓疾患のために使用される薬剤が含まれる。
【０１５２】
放射性核種−ＭＵＲＰは、放射性核種の組織を標的とする送達のため、ならびに放射性核種を用いる画像化のために設計することができる。ＵＲＰは画像化のために理想的である。なぜなら、ＵＲＰの長さを変化させることによって、半減期を最適化することができるからである。多くの画像化適用のために、中程度に長いＵＲＰが好ましいようであり、数日間または数週間ではなく、５分間から数時間までの半減期を提供し、ＭＵＲＰは、テクニチウム、インジウム、イットリウム、（拡張（ＥＸＰＡＮＤ））のような放射性同位元素のためのキレート剤（ＤＯＴＡなど）で修飾することが可能である、単一のまたは少数の限られた数のアミノ基のみを含むように、設計することができる。結合体化の代替方法は、予備のシステイン側鎖を通してである。このような放射性核種保有ＭＵＲＰは、腫瘍もしくは他の疾患組織の治療のため、ならびに画像化のために利用することができる。
【０１５３】
多くの薬学的に活性なタンパク質またはタンパク質ドメインは、ＭＵＲＰにおけるエフェクターモジュールとして使用することができる。例は、以下のタンパク質ならびにこれらのタンパク質のフラグメントである：サイトカイン、増殖因子、酵素、受容体、マイクロプロテイン、ホルモン、エリスロポエチン、アデノシンデイミナーゼ、アスパラギナーゼ、アルギナーゼ、インターフェロン、成長ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＭ、インスリン、ヒルジン、ＴＮＦ−受容体、ウリカーゼ、ラスブリカーゼ、アキソキン、ＲＮアーゼ、ＤＮアーゼ、ホスファターゼ、シュードモナスエキソトキシン、リシン、ゲロニン、デスモテプラーゼ、ラロニダーゼ、トロンビン、血液凝固酵素、ＶＥＧＦ、プロトロピン、ソマトロピン、アルテプラーゼ、インターロイキン、第ＩＩＶ因子、第ＶＩＩＩ因子、第Ｘ因子、第ＩＸ因子、ドルナーゼ、グルコセレブロシダーゼ、ホリトロピン、グルカゴン、甲状腺刺激ホルモン、ネシリチド、アルテプラーゼ、テリパラチド、アガルシダーゼ、ラロニダーゼ、メチオニナーゼ。
【０１５４】
プロテアーゼ活性化ＭＵＲＰ：エフェクターモジュールの治療指標を増強するために、ＵＲＰ配列中に、血清中で、またはＭＵＲＰによって治療される標的組織の中で優先的に見出されるプロテアーゼに感受性である、プロテアーゼに対して不安定な配列を挿入することができる。このアプローチは図９に示されている。ある設計は、標的組織に到達したときに選択的に活性化されるタンパク質を構築することを可能にする。特に関心が持たれるものは、疾患部位において活性化されるＭＵＲＰである。このような標的特異的な活性化を容易にするために、得られる融合タンパク質が限られた生物学的活性を有するように、エフェクターモジュールの活性部位または受容体結合部位の密接な近傍にＵＲＰ配列を結合することができる。特に関心が持たれるものは、腫瘍部位におけるエフェクターモジュールの活性化である。多くの腫瘍組織は比較的高濃度でプロテアーゼを発現し、そしてこれらの腫瘍プロテアーゼによって特異的に切断される配列は、ＵＲＰ配列に挿入することができる。例えば、多くの前立腺腫瘍組織は、セリンプロテアーゼである高濃度の前立腺抗原（ＰＳＡ）を含む。癌薬物ドキソルビシンに結合体化した、ＰＳＡに不安定であるペプチドからなるプロドラッグは、前立腺組織中で選択的活性化を示した［ＤｅＦｅｏ−Ｊｏｎｅｓ，Ｄ．ら（２０００）Ｎａｔ  Ｍｅｄ，６：１２４８］。疾患特異的活性化のために特に関心が持たれるものは、ＴＮＦα、ならびに多くのサイトカインおよびインターロイキンのような、細胞増殖抑制性または細胞傷害性活性を有するタンパク質である。別の応用は、炎症の部位またはウイルスもしくは細菌感染の部位におけるタンパク質の選択的活性化である。
【０１５５】
産生の方法−ＵＲＰ配列を含むＭＵＲＰは、当該分野において周知である分子生物学的アプローチを使用して産生することができる。種々のクローニングベクターが、哺乳動物細胞、酵母、および微生物のような種々の発現系のために利用可能である。発現宿主として特に関心が持たれるものは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、サッカロミセス−セレビジエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ、およびチャイニーズハムスター卵巣細胞である。特に関心が持たれるものは、それらのコドン使用頻度を広げるために最適化された宿主である。特に関心が持たれるものは、ＧＲＳの発現を増強するように修飾された宿主である。これは、グリシン特異的なｔＲＮＡをコードするＤＮＡを提供することによって行うことができる。加えて、グリシン特異的なｔＲＮＡの負荷が増強されるように宿主を操作することができる。増強されるタンパク質をコードするＤＮＡは、プロモーター配列に作動可能に連結することができる。増強されるタンパク質をコードするＤＮＡ、ならびに作動可能に連結されるプロモーターは、プラスミドベクター、ウイルスベクターの一部であり得、またはこれは、宿主の染色体に挿入することができる。
【０１５６】
産生のために、増強されるタンパク質の産生を容易にする条件下で、宿主を培養することができる。特に関心が持たれるものは、ＧＲＳの産生を改善する条件である。
【０１５７】
対象ＭＵＲＰは、種々の形式を採用することができる。例えば、ＭＵＲＰは、遅延放出生成物を産生するために、薬学的に活性なタンパク質に融合されたＵＲＰを含み得る。このような生成物は、局所的に、例えば、患者の皮膚にまたはその下に注射または移植することができる。その大きな流体力学半径に起因して、ＵＲＰ配列含有生成物は、注射または移植の部位からゆっくりと放出され、このことは、注射または移植の頻度の減少に導く。ＵＲＰ配列は、注射部位の薬物の局所的保持を延長するために細胞表面または組織に結合する領域を含むように設計することができる。特に関心が持たれるものは、可溶性化合物として製剤化され得るが、注射の際には凝集体を形成し、または沈殿するＵＲＰ含有生成物である。この凝集または沈殿は、製剤化された生成物のｐＨと、注射部位のｐＨとの間の変化によって誘発することができる。代替物は、酸化還元状態の変化の結果として沈殿またな凝集するＵＲＰ含有生成物である。なお別のアプローチは、非活性溶質の添加によって溶液中で安定化されるが、注射の際に、溶解性の溶質の拡散の結果として沈殿または凝集するＵＲＰ含有生成物である。別のアプローチは、それらのＵＲＰ配列中に１つまたは複数のリジン残基またはシステイン残基を含み、そして注射の前に架橋することができるＵＲＰ含有生成物を設計することである。
【０１５８】
所望される場合、ＭＵＲＰは、製造および製剤化されたときに、ならびに注射されたときに単量体であるが（ここでは、架橋されていないことを意味する）、皮下注射後には、このタンパク質は、それ自体と、またはネイティブヒトタンパク質と架橋し始め、皮膚の下でポリマーを形成し、そこから、非常に徐々にのみ、活性薬物分子が遊離する。このような放出は、図１８に図示されるように、ジスルフィド結合還元もしくはジスルフィドシャッフリングによってであり得、またはこれは、図１９に示されるようにタンパク質分解によって媒介され得、循環に活性フラグメントを放出する。これらの活性フラグメントは、長い半減期を有するために十分に大きいことが重要である。なぜなら、それらの分泌半減期が長くなるほど、放出されるタンパク質の用量がより低下し、注射される生成物のより少ない用量の使用、または注射の間のより長い時間を可能にするからである。
【０１５９】
これらの利点を提供する１つのアプローチは、タンパク質のジスルフィド媒介架橋である。例えば、タンパク質薬物は、その中に環状ペプチド（１つまたは複数）を伴って製造される。この環状ペプチドは、標的への結合に関与してもよいし、しなくてもよい。このタンパク質は、形成した環状ペプチドとともに、すなわち、酸化型で製造され、精製を単純化する。しかし、次いで、この生成物は、還元および製剤化され、このタンパク質を還元型に維持する。生成物中の他のジスルフィド含有タンパク質モジュールを還元することなく環状ペプチドが還元され得るように、低濃度の還元剤、例えば、０．２５、０．５、１．０、２．０、４．０、または８．０ｍＭのジチオスレイトールまたはβメルカプトエタノールまたはシステインまたは等価な還元剤で、環状ペプチドを還元することは重要である。システインまたはグルタチオンなどの、ＦＤＡによって認可された還元剤の使用が好ましい。皮下注射後、低分子量還元剤は急速に拡散し、またはこれは、ヒトタンパク質によって中和され、薬物を酸化的環境に暴露し，一方これはなお高モル濃度であり、このことは、異なるタンパク質鎖上に位置するシステインの架橋を引き起こし、これが、注射部位における薬物の重合に導く。環状ペプチド中のシステイン間の距離が長いほど、そして薬物の濃度が高いほど、薬物の重合の程度は高くなる。なぜなら、重合は、環状ペプチドの再形成と競合するからである。時間の経過とともに、ジスルフィドの還元および酸化は、ジスルフィドの再シャッフリングを引き起こし、これは、環状ペプチドの再形成および単量体化、ならびに薬物の再溶解に導く。ポリマーからの薬物の放出はまた、タンパク質分解を介して起こることができ、これは、血清プロテアーゼのための切断部位で構築することによって標的化および制御または増加が可能である。タンパク質の架橋は、化学的タンパク質−タンパク質架橋試薬、例えば、［表ｘ］に列挙されるものを用いて実施することができる。理想的には、これはすでにＦＤＡによって認可されている薬剤、例えば、ワクチンの結合体化、またはタンパク質への化学物質の結合体化のために使用されるものである。
【０１６０】
ジスルフィドを使用する代わりに、広範な種々の架橋剤を使用して、タンパク質分解に対してタンパク質を安定化することもできる。以下の多くの試薬が同じ名称の下でＰｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓによって販売されており、そしてそれらの使用のための指示書はオンラインで利用可能である（ｗｗｗ．ｐｉｅｒｃｅｎｅｔ．ｃｏｍ）。ジスルフィドを用いて得られるのと同じ鎖から鎖の距離を生じる試薬は、本願のために有用である可能性が最も高い。ＤＦＤＮＢなどのショートリンカー試薬は最も有望である。鎖間の距離は、ｗｗｗ．ｐｉｅｒｃｅｎｅｔ．ｃｏｍ．に示されている化学物質の構造から容易に決定することができる。
【０１６１】
そのすべてがｗｗｗ．ｐｉｅｒｃｅｎｅｔ．ｃｏｍ．に詳細に記載されている、以下の少数の基本的反応スキームに基づいて働く大量の特定の化学物質製品が存在している。有用な架橋剤の例は、イミドエステル、活性ハロゲン、マレイミド、ピリジルジスルフィド、ＮＨＳ−エステルである。ホモ二官能性架橋剤は２つの同一の反応基を有し、そしてしばしば、１工程化学架橋手順において使用される。例は、ＢＳ３（非切断性水溶性ＤＳＳアナログ）、ＢＳＯＣＯＥＳ（塩基−可逆性）、ＤＭＡ（ジメチルアジピミデート−２ＨＣｌ）、ＤＭＰ（ジメチルピメリミデート−２ＨＣｌ）、ＤＭＳ（ジメチルスベリミデート−２ＨＣｌ）、ＤＳＧ（ＤＳＳの５−炭素アナログ）、ＤＳＰ（Ｌｏｍａｎｔ試薬）、ＤＳＳ（非切断性）、ＤＳＴ（酸化試薬によって切断可能）、ＤＴＢＰ（ジメチル３，３’−ジチオビスプロピオンイミデート−２ＨＣｌ）、ＤＴＳＳＰ、ＥＧＳ、スルホ−ＥＧＳ、ＴＨＰＰ、ＴＳＡＴであり、ＤＦＤＮＢ（１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）は、小さな特別の距離間での架橋のためにとりわけ有用である（Ｋｏｒｎｂｌａｔｔ，Ｊ．Ａ．およびＬａｋｅ，Ｄ．Ｆ．（１９８０）．Ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ  ｏｆ  ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  ｏｘｉｄａｓｅ  ｓｕｂｕｎｉｔｓ  ｗｉｔｈ  ｄｉｆｌｕｏｒｏｄｉｎｉｔｒｏｂｅｎｚｅｎｅ．Ｃａｎ  Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５８，２１９−２２４）。
【０１６２】
スルフヒドリル反応性ホモ二官能性架橋剤は、スルフヒドリルと反応するホモ二官能性タンパク質架橋剤であり、しばしば、マレイミドに基づき、これは、ｐＨ６．５−７．５で−ＳＨ基と反応して、安定なチオエーテル結合を形成する。ＢＭ［ＰＥＯ］３は、スルフヒドリルからスルフヒドリルの架橋適用における結合体沈殿の潜在性を減少する、８原子ポリエステルスペーサーである。ＢＭ［ＰＥＯ］４は同様であるが、１１原子のスペーサーを有する。ＢＭＢは、４つの炭素スペーサーを有する非切断性架橋剤である。ＢＭＤＢは過ヨウ素酸で切断可能である連結を作製する。ＢＭＨは広範に使用されているホモ二官能性スルフヒドリル反応性架橋剤である。ＢＭＯＥはとりわけ短いリンカーである。ＤＰＤＰＢおよびＤＴＭＥは、切断可能なリンカーである。ＨＶＢＳは、マレイミドの加水分解の潜在性を有さない。ＴＭＥＡは別の選択肢である。ヘテロ二官能性は２つの異なる反応基を有する。例は、ＥＤＣ活性化を介するＮＨＳ−エステルおよびアミン／ヒドラジン、ＡＥＤＰ、ＡＳＢＡ（光反応性、ヨウ化可能）、ＥＤＣ（水溶性カルボジイミド）である。アミン−スルフヒドリル反応性二官能性架橋剤は、ＡＭＡＳ、ＡＰＤＰ、ＢＭＰＳ、ＥＭＣＡ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＫＭＵＡ、ＬＣ−ＳＭＣＣ、ＬＣ−ＳＰＤＰ、ＭＢＳ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ（極度に短い）、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、ＳＭＰＴ、ＳＰＤＰ、スルホ−ＥＭＣＳ、スルホ−ＧＭＢＳ、スルホ−ＫＭＵＳ、スルホ−ＬＣ−ＳＭＰＴ、スルホ−ＬＣ−ＳＰＤＰ、スルホ−ＭＢＳ、スルホ−ＳＩＡＢ、スルホ−ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＰＢである。アミノ基反応性ヘテロ二官能性架橋剤は、ＡＮＢ−ＮＯＳ、ＭＳＡ、ＮＨＳ−ＡＳＡ、ＳＡＤＰ、ＳＡＥＤ、ＳＡＮＤ、ＳＡＮＰＡＨ、ＳＡＳＤ、ＳＦＡＤ、スルホ−ＨＳＡＢ、スルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ＡＳＡ、スルホ−ＳＡＤＰ、スルホ−ＳＡＮＰＡＨ、ＴＦＣＳである。
【０１６３】
異なる遅延放出形式は、Ｈｉｓ６タグで標識した薬物を有し、これは、Ｑｉａｇｅｎから利用可能であるもののＧＭＯバージョンであるニッケル−ニトリロトリ酢酸結合体化ビーズ（Ｎｉ−ＮＴＡビーズ）とともに混合し、同時注射される。薬物はゆっくりとビーズに到達し、デポーを提供し、図２０に図示されるように遅延放出を提供する。ビーズは任意であり、さらにより大きなポリマーのアセンブリに導く、架橋されたポリマー性ニッケル−ニトリロトリ酢酸によって置き換えることができる。
【０１６４】
ＵＲＰ配列は、抗体フラグメントを二量体化するために利用された［Ｋｕｂｅｔｚｋｏ，Ｓ．ら（２００５）Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，６８：１４３９−５４］、α２Ｄ［Ｈｉｌｌ，Ｒ．ら（１９９８）Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ，１２０：１１３８−１１４５］のような多量体を形成することが知られている配列を含み得る。有用なホモ二量体化ペプチドの例は配列ＳＫＶＩＬＦＥである。有用なヘテロ二量体化配列の例は、配列ＤＡＤＡＤＡおよび関連配列とともに二量体を形成し得る、ペプチドＡＲＡＲＡＲである。多量体化は、そのアビディティを増加させることによって分子の生物学的機能を改善し得、そしてこれは、得られるＭＵＲＰの薬理学的特性および組織分布に影響を与え得る。
【０１６５】
「多量体化モジュール」は、ＭＵＲＰの二量体または多量体を容易にするアミノ酸配列である。多量体化モジュールは、それら自体に結合して、二量体または多量体を形成してもよい。代替的には、多量体化モジュールは、ＭＵＲＰの他のモジュールに結合することができる。これらは、逆平行ホモポリマーを形成するＨｙｄｒａヘッド活性化因子誘導体（ＳＫＶＩＬＦ様）のようなロイシンジッパーもしくは小さなペプチド、または高親和性逆平行ヘテロポリマーを形成するＲＡＲＡＲＡおよびＤＡＤＡＤＡのようなペプチドであり得る。１個、２個、またはそれ以上のこれらのペプチドのコピーを使用して、タンパク質の二量体、直鎖状多量体、または分枝状多量体の形成を強制することができる。
【０１６６】
結合の親和性は、ペプチドの型、長さ、および組成を変化させることによって仕立てることができる。ある適用は、図２１に図示されるようなホモ二量体を形成するペプチドを必要とする。他の適用はヘテロ二量体を必要とする。いくつかの場合において、いったん結合すると、ペプチドは、２つのたんぱく質鎖間で、典型的には、ペプチドのいずれかの側で、ジスルフィド結合を形成することによって組み込むことができる。多量体モジュールは、図２１に図示されるように、２つのＭＵＲＰ分子を一緒に連結する（ヘッドツーテール、ヘッドツーヘッド、またはテールツーテール）ために有用である。多量体化モジュールは、二量体を形成するために、Ｎ末端またはＣ末端のいずれかに局在化し得る。多量体化モジュールが両方の末端に存在する場合、長い直鎖上の多量体が形成する。タンパク質あたり２つより多くの多量体化モジュールが存在する場合、分枝ポリマーネットワークが形成し得る。多量体化および化学的結合体化の概念は合わせることができ、半減期の延長およびデポー形成のための有用性をもたらし、図２３に図示されるようなデポーまたは注射部位からの活性薬物の遅延放出をもたらす。
【０１６７】
対象ＭＵＲＰは、遺伝性または遍在性のＵＲＰを取り込み得る。１つのアプローチは、長いＵＲＰモジュールを含むＵＲＰを発現することであり、これは、半減期を提供し、特定の標的に結合するペプチド（すなわち、直鎖状、環状、２ＳＳ、３ＳＳなど）の部位特異的結合体化を可能にする複数（典型的には４〜１０個）のリジン（または他の部位）を含む。このアプローチの利点は、ＵＲＰモジュールが一般的であり、かつ任意の標的特異的ペプチドと結合体化され得ることである。理想的には、ＵＲＰへの標的特異的ペプチドの連結は指向性の連結であり、その結果、ＵＲＰ上の残基が標的特異的ペプチド上の残基とのみ反応でき、そして包括的カップリングが単一種のみを産生し得、この種は、例えば、すべてのリジンにおいてペプチドに連結されているＵＲＰである。この複合体は、その結合特性において高アビディティ多量体のように振る舞うが、製造することは簡単である。このアプローチは図２４に図示される。
【０１６８】
対象ＭＵＲＰは、組織壁を通しての送達に影響を与えるためにＵＲＰを取り込むことができる。ＵＲＰは、皮膚、経口、口腔、腸、鼻、血液−脳、肺、腱鞘、腹腔、直腸、膣、または多くの他の組織壁を通しての送達を増強するために操作することができる。
【０１６９】
経口タンパク質送達に対する鍵となる障害の１つは、消化系におけるプロテアーゼに対するタンパク質の感受性である。ＵＲＰ配列への結合体化は、薬学的に活性なタンパク質のプロテアーゼ抵抗性、従って、それらの取り込みを改善し得る。消化系におけるタンパク質の取り込みは、分子キャリアを加えることによって改善できることが示されてきた。これらのキャリアの主要な役割は、膜浸透性の改善である［Ｓｔｏｌｌ，Ｂ．Ｒ．ら（２０００）Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ，６４：２１７−２８］。従って、ＵＲＰ配列に膜浸透性を改善する配列を含めることができる。膜浸透性を改善する多くの配列が公知であり、例は、アルギニンが豊富な配列である［Ｔａｋｅｎｏｂｕ，Ｔ．ら（２００２）Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ，１：１０４３−９］。従って、２つの機能、目的のタンパク質のタンパク質分解性分解の減少、ならびに融合産物の膜浸透性の増加を合わせることによって、タンパク質の細胞または経口の取り込みを改善するＵＲＰ配列を設計することができる。選択的に、目的の薬物のための標的組織に優先的に局在しているプロテアーゼに感受性であるが、消化管におけるプロテアーゼに対しては安定である配列を、ＵＲＰ配列に加えることができる。このようなＵＲＰの例は、ＧＲＳの長い領域を含む配列、ならびに塩基性アミノ酸、特にアルギニンが豊富であり、膜移動を容易にする配列である。ＵＲＰは、鼻内、肺内、または他の送達の経路を介するタンパク質の取り込みを改善するための同様の方法で利用することができる。
【０１７０】
特異的生成物の例：
ＤＲ４／ＤＲ５アゴニスト−ＤＲ４およびＤＲ５は死受容体であり、多くの腫瘍細胞で発現されている。これらの受容体は、細胞死および腫瘍の退行に導く三量体化によって誘発させることができる。ＤＲ４またはＤＲ５についての特異性を有する結合ドメインは、ファージパニングまたは他のディスプレイ方法によって得ることができる。これらのＤＲ４またはＤＲ５特異的結合ドメインは、図１２に図示されるように、リンカーとしてＵＲＰモジュールを使用して多量体化することができる。特に関心が持たれるものは、ＤＲ４またはＤＲ５または両方についての特異性を有する３つ以上の結合モジュールを含むＭＵＲＰである。図１２に図示されるように、ＭＵＲＰは、腫瘍組織中で過剰発現される腫瘍抗原についての特異性を有するさらなる結合モジュールを含むことができる。このことは、腫瘍組織中に特異的に蓄積するＭＵＲＰを構築すること、および細胞死を誘発することを可能にする。ＭＵＲＰは、ＤＲ４またはＤＲ５のいずれかを結合するモジュールを含み得る。特に関心が持たれるものは、ＤＲ４およびＤＲ５の両方を結合する結合モジュールを含むＭＵＲＰである。
【０１７１】
腫瘍標的化インターロイキン２−インターロイキン２（ＩＬ２）は、腫瘍組織に対する免疫応答を増強し得るサイトカインである。しかし、全身性ＩＬ２治療は、顕著な副作用によって特徴付けられる。ＭＵＲＰは、図１３に図示されるように、腫瘍抗原に特異性を有する結合ドメインおよびエフェクターモジュールとしてのＩＬ２を合わせて構築することができる。このようなＭＵＲＰは、腫瘍組織に選択的に蓄積可能であり、従って、サイトカイン治療の全身性副作用を最小化しながら、腫瘍選択性免疫応答を誘発する。このようなＭＵＲＰは、ＥｐＣＡＭ、Ｈｅｒ２、ＣＥＡ、ＥＧＦＲ、Ｔｈｏｍｓｅｎ  Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｈ抗原のような種々の腫瘍抗原を標的化可能である。特に有用性があるものは、ゆっくりとした内部移行を示す腫瘍抗原に結合するＭＵＲＰである。同様のＭＵＲＰは、エフェクターモジュールとして、他のサイトカインまたは腫瘍壊死因子αを使用して設計することができる。
【０１７２】
腫瘍選択性アスパラギナーゼ−アスパラギナーゼは、急性白血病の患者を治療するために使用される。大腸菌からのアスパラギナーゼとエルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）からのアスパラギナーゼとの両方が治療のために使用される。両方の酵素が免疫原性および過敏性反応をもたらし得る。オンカスパー（Ｏｎｃａｓｐａｒ）は免疫原性を減少させたアスパラギナーゼのＰＥＧ化バージョンである。しかし、タンパク質は、製造することが困難であり、そして異性体の混合物として投与される。末端および／または内部ループにＵＲＰ配列を加えることは、均質でありかつ低い免疫原性を有するアスパラギナーゼの変種の直接的組換え製造を可能にする。種々のＵＲＰ配列および結合部位を、ＵＲＰ配列の結合のための最適位置を決定するために比較することができる。いくつかの他の酵素は、アミノ酸を分解し得、抗腫瘍活性が報告されている。例は、アルギナーゼ、メチオニナーゼ、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ、およびトリプトファナーゼである。特に関心が持たれるものは、高い比活性を有し、かつ補因子を必要としない、ストレプトマイセスマリチムス（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｉｔｉｍｕｓ）のフェニルアラニンアンモニアリアーゼである［Ｃａｌａｂｒｅｓｅ，Ｊ．Ｃ．ら（２００４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４３：１１４０３−１６］。これらの酵素の多くは、細菌または他の非ヒト起源であり、免疫反応を誘発する可能性がある。これらの酵素の免疫原性は、１つ以上のＵＲＰ配列を加えることによって減少させることができる。加えて、これらの酵素の治療指数およびＰＫ特性は、ＵＲＰ配列結合の結果として、それらの流体力学半径を増加させることによって改善することができる。
【０１７３】
対象ＭＵＲＰは、任意の細胞タンパク質を標的とするために設計することができる。非限定的なリストを以下に提供する。
【０１７４】
ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ−Ｒ１、ＶＥＧＦ−Ｒ２、ＶＥＧＦ−Ｒ３、Ｈｅｒ−１、Ｈｅｒ−２、Ｈｅｒ−３、ＥＧＦ−１、ＥＧＦ−２、ＥＧＦ−３、Ａｌｐｈａ３、ｃＭｅｔ、ＩＣＯＳ、ＣＤ４０Ｌ、ＬＦＡ−１、ｃ−Ｍｅｔ、ＩＣＯＳ、ＬＦＡ−１、ＩＬ−６、Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＯＸ４０、ＩＬ−１ｂ、．ＴＡＣＩ、ＩｇＥ、ＢＡＦＦまたはＢＬｙｓ、ＴＰＯ−Ｒ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ２８、ＩＬ−１−Ｒ１、ＴＮＦα、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、補体受容体１、ＦＧＦａ、オステオポンチン、ビトロネクチン、エフリンＡ１−Ａ５、エフリンＢ１−Ｂ３、α−２−マクログロブリン、ＣＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＣＬ６、ＣＣＬ７、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１２、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ１４、ＣＣＬ１５、ＣＸＣＬ１６、ＣＣＬ１６、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１８、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＰＤＧＦ、ＴＧＦｂ、ＧＭＣＳＦ、ＳＣＦ、ｐ４０（ＩＬ１２／ＩＬ２３）、ＩＬ１ｂ、ＩＬ１ａ、ＩＬ１ｒａ、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ８、ＩＬ１０、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ２３、Ｆａｓ、ＦａｓＬ、Ｆｌｔ３リガンド、４１ＢＢ、ＡＣＥ、ＡＣＥ−２、ＫＧＦ、ＦＧＦ−７、ＳＣＦ、ネトリン１、２、ＩＦＮａ、ｂ、ｇ、カスパーゼ２、３、７、８、１０、ＡＤＡＭ  Ｓ１、Ｓ５、８、９、１５、ＴＳ１、ＴＳ５；アディポネクチン、ＡＬＣＡＭ、ＡＬＫ−Ｉ、ＡＰＲＩＬ、アネキシンＶ、アンジオゲニン、アムフィレグリン、アンジオポエチン１、２、４、Ｂ７−１／ＣＤ８０、Ｂ７−２／ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ１、Ｂ７−Ｈ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂｃｌ−２、ＢＡＣＥ−１、ＢＡＫ、ＢＣＡＭ、ＢＤＮＦ、ｂＮＧＦ、ｂＥＣＧＦ、ＢＭＰ２、３、４、５、６、７、８；ＣＲＰ、カドヘリン６、８、１１；カテプシンＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｌ、Ｓ、Ｖ、Ｘ；ＣＤ１１ａ／ＬＦＡ−１、ＬＦＡ−３、ＧＰ２ｂ３ａ、ＧＨ受容体、ＲＳＶ  Ｆタンパク質、ＩＬ−２３（ｐ４０、ｐ１９）、ＩＬ−１２、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、α４β１、α４β７、ＴＮＦ／リンホトキシン、ＩｇＥ、ＣＤ３、ＣＤ２０、ＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ、ＢＬＹＳ／ＢＡＦＦ、ＩＬ−２Ｒ、ＨＥＲ２、ＥＧＦＲ、ＣＤ３３、ＣＤ５２、ジゴキシン、Ｒｈｏ（Ｄ）、水痘、肝炎、ＣＭＶ、破傷風、ワクシニア、抗毒素、ボツリヌス、Ｔｒａｉｌ−Ｒ１、Ｔｒａｉｌ−Ｒ２、ｃＭｅｔ、ＴＮＦ−Ｒファミリー、例えば、ＬＡ  ＮＧＦ−Ｒ、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ９５、リンホトキシンａ／ｂ受容体、Ｗｓｌ−１、ＴＬ１Ａ／ＴＮＦＳＦ１５、ＢＡＦＦ、ＢＡＦＦ−Ｒ／ＴＮＦＲＳＦ１３Ｃ、ＴＲＡＩＬ  Ｒ２／ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＴＲＡＩＬ  Ｒ２／ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、Ｆａｓ／ＴＮＦＲＳＦ６  ＣＤ２７／ＴＮＦＲＳＦ７、ＤＲ３／ＴＮＦＲＳＦ２５、ＨＶＥＭ／ＴＮＦＲＳＦ１４、ＴＲＯＹ／ＴＮＦＲＳＦ１９、ＣＤ４０リガンド／ＴＮＦＳＦ５、ＢＣＭＡ／ＴＮＦＲＳＦ１７、ＣＤ３０／ＴＮＦＲＳＦ８、ＬＩＧＨＴ／ＴＮＦＳＦ１４、４−１ＢＢ／ＴＮＦＲＳＦ９、ＣＤ４０／ＴＮＦＲＳＦ５、ＧＩＴＲ／ＴＮＦＲＳＦ１８、オステオプロテゲリン／ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ、ＲＡＮＫ／ＴＮＦＲＳＦ１１Ａ、ＴＲＡＩＬ  Ｒ３／ＴＮＦＲＳＦ１０Ｃ、ＴＲＡＩＬ／ＴＮＦＳＦ１０、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫ  Ｌ／ＴＮＦＳＦ１１、４−１ＢＢリガンド／ＴＮＦＳＦ９、ＴＷＥＡＫ／ＴＮＦＳＦ１２、ＣＤ４０リガンド／ＴＮＦＳＦ５、Ｆａｓリガンド／ＴＮＦＳＦ６、ＲＥＬＴ／ＴＮＦＲＳＦ１９Ｌ、ＡＰＲＩＬ／ＴＮＦＳＦ１３、ＤｃＲ３／ＴＮＦＲＳＦ６Ｂ、ＴＮＦ  ＲＩ／ＴＮＦＲＳＦＩＡ、ＴＲＡＩＬ  Ｒ１／ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＴＲＡＩＬ  Ｒ４／ＴＮＦＲＳＦ１０Ｄ、ＣＤ３０リガンド／ＴＮＦＳＦ８、ＧＩＴＲリガンド／ＴＮＦＳＦ１８、ＴＮＦＳＦ１８、ＴＡＣＩ／ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ、ＮＧＦＲ／ＴＮＦＲＳＦ１６、ＯＸ４０リガンド／ＴＮＦＳＦ４、ＴＲＡＩＬ  Ｒ２／ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＴＲＡＩＬ  Ｒ３／ＴＮＦＲＳＦ１０Ｃ、ＴＷＥＡＫ  Ｒ／ＴＮＦＲＳＦ１２、ＢＡＦＦ／ＢＬｙＳ／ＴＮＦＳＦ１３、ＤＲ６／ＴＮＦＲＳＦ２１、ＴＮＦα／ＴＮＦＳＦｌＡ、プロ−ＴＮＦα／ＴＮＦＳＦ１Ａ、リンホトキシンβ  Ｒ／ＴＮＦＲＳＦ３、リンホトキシンβ  Ｒ（ＬＴｂＲ）／Ｆｃキメラ、ＴＮＦ  ＲＩ／ＴＮＦＲＳＦＩＡ、ＴＮＦβ／ＴＮＦＳＦ１Ｂ、ＰＧＲＰ−Ｓ、ＴＮＦ  ＲＩ／ＴＮＦＲＳＦ１Ａ、ＴＮＦ  ＲＩＩ／ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ、ＥＤＡ−Ａ２、ＴＮＦα／ＴＮＦＳＦ１Ａ、ＥＤＡＲ、ＸＥＤＡＲ、ＴＮＦ  ＲＩ／ＴＮＦＲＳＦＩＡ。
【０１７５】
特に関心が持たれるものは、精製型で市販されているヒト標的タンパク質である。例は以下である：４ＥＢＰ１、１４−３−３ゼータ、５３ＢＰ１、２Ｂ４／ＳＬＡＭＦ４、ＣＣＬ２１／６Ｃｋｉｎｅ、４−１ＢＢ／ＴＮＦＲＳＦ９、８Ｄ６Ａ、４−１ＢＢリガンド／ＴＮＦＳＦ９、８−オキソ−ｄＧ、４−アミノ−１、８−ナフタルイミド、Ａ２Ｂ５、アミノペプチダーゼＬＲＡＰ／ＥＲＡＰ２、Ａ３３、アミノペプチダーゼＮ／ＡＮＰＥＰ、Ａａｇ、アミノペプチダーゼＰ２／ＸＰＮＰＥＰ２、ＡＢＣＧ２、アミノペプチダーゼＰ１／ＸＰＮＰＥＰ１、ＡＣＥ、アミノペプチダーゼＰＩＬＳ／ＡＲＴＳ１、ＡＣＥ−２、アムニオンレス（Ａｍｎｉｏｎｌｅｓｓ）、アクチン、アムフィレグリン、βアクチン、ＡＭＰＫ  α１／２、アクチビンＡ、ＡＭＰＫα１、アクチビンＡＢ、ＡＭＰＫα２、アクチビンＢ、ＡＭＰＫβ１、アクチビンＣ、ＡＭＰＫβ２、アクチビンＲＩＡ／ＡＬＫ−２、アンドロゲンＲ／ＮＲ３Ｃ４、アクチビンＲＩＢ／ＡＬＫ−４、アンジオゲニン、アクチビンＲＩＩＡ、アンジオポエチン−１、アクチビンＲＩＩＢ、アンジオポエチン−２、ＡＤＡＭ８、アンジオポエチン−３、ＡＤＡＭ９、アンジオポエチン−４、ＡＤＡＭ１０、アンジオポエチン様１、ＡＤＡＭ１２、アンジオポエチン様２、ＡＤＡＭ１５、アンジオポエチン様３、ＴＡＣＥ／ＡＤＡＭ１７、アンジオポエチン様４、ＡＤＡＭ１９、アンジオポエチン様７／ＣＤＴ６、ＡＤＡＭ３３、アンジオスタチン、ＡＤＡＭＴＳ４、アネキシンＡ１／アネキシンＩ、ＡＤＡＭＴＳ５、アネキシンＡ７、ＡＤＡＭＴＳ１、アネキシンＡ１０、ＡＤＡＭＴＳＬ−１／パンクチン（Ｐｕｎｃｔｉｎ）、アネキシンＶ、アディポネクチン／Ａｃｒｐ３０、ＡＮＰ、ＡＥＢＳＦ、ＡＰ部位、アグレカン、ＡＰＡＦ−Ｉ、アグリン、ＡＰＣ、ＡｇＲＰ、ＡＰＥ、ＡＧＴＲ−２、ＡＰＪ、ＡＩＦ、ＡＰＬＰ−Ｉ、Ａｋｔ、ＡＰＬＰ−２、Ａｋｔ１、アポリポタンパク質ＡＩ、Ａｋｔ２、アポリポタンパク質Ｂ、Ａｋｔ３、ＡＰＰ、血清アルブミン、ＡＰＲＩＬ／ＴＮＦＳＦ１３、ＡＬＣＡＭ、ＡＲＣ、ＡＬＫ−１、アーテミン（Ａｒｔｅｍｉｎ）、ＡＬＫ−７、アリールスルファターゼＡ／ＡＲＳＡ、アルカリホスファターゼ、ＡＳＡＨ２／Ｎ−アシルスフィンゴシンアミドヒドロラーゼ−２、α２ｕ−グロブリン、ＡＳＣ、α−１−酸性糖タンパク質、ＡＳＧＲｌ、αフェトプロテイン、ＡＳＫｌ、ＡＬＳ、ＡＴＭ、アメロブラスチン、ＡＴＲＩＰ、ＡＭＩＣＡ／ＪＡＭＬ、オーロラＡ、ＡＭＩＧＯ、オーロラＢ、ＡＭＩＧＯ２、アキシン−１、ＡＭＩＧＯ３、ＡｘＩ、アミノアシラーゼ／ＡＣＹ１、アズロシジン／ＣＡＰ３７／ＨＢＰ、アミノペプチダーゼＡ／ＥＮＰＥＰ、Ｂ４ＧＡＬＴ１、ＢＩＭ、Ｂ７−１／ＣＤ８０、６−ビオチン−１７−ＮＡＤ、Ｂ７−２／ＣＤ８６、ＢＬＡＭＥ／ＳＬＡＭＦ８、Ｂ７−Ｈ１／ＰＤ−Ｌ１、ＣＸＣＬ１３／ＢＬＣ／ＢＣＡ−１、Ｂ７−Ｈ２、ＢＬＩＭＰｌ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂｌｋ、Ｂ７−Ｈ４、ＢＭＩ−Ｉ、ＢＡＣＥ−Ｉ、ＢＭＰ−１／ＰＣＰ、ＢＡＣＥ−２、ＢＭＰ−２、Ｂａｄ、ＢＭＰ−３、ＢＡＦＦ／ＴＮＦＳＦ１３Ｂ、ＢＭＰ−３ｂ／ＧＤＦ−１０、ＢＡＦＦ  Ｒ／ＴＮＦＲＳＦ１３Ｃ、ＢＭＰ−４、Ｂａｇ−１、��ＭＰ−５、ＢＡＫ、ＢＭＰ−６、ＢＡＭＢＩ／ＮＭＡ、ＢＭＰ−７、ＢＡＲＤ１、ＢＭＰ−８、Ｂａｘ、ＢＭＰ−９、ＢＣＡＭ、ＢＭＰ−１０、Ｂｃｌ−１０、ＢＭＰ−１５／ＧＤＦ−９Ｂ、Ｂｃｌ−２、ＢＭＰＲ−ＩＡ／ＡＬＫ−３、Ｂｃｌ−２関連タンパク質Ａ１、ＢＭＰＲ−ＩＢ／ＡＬＫ−６、Ｂｃｌ−ｗ、ＢＭＰＲ−ＩＩ、Ｂｃｌ−ｘ、ＢＮＩＰ３Ｌ、Ｂｃｌ−ｘＬ、ＢＯＣ、ＢＣＭＡ／ＴＮＦＲＳＦ１７、ＢＯＫ、ＢＤＮＦ、ＢＰＤＥ、ベンズアミド、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、共通β鎖、Ｂ−Ｒａｆ、βＩＧ−Ｈ３、ＣＸＣＬ１４／ＢＲＡＫ、ベータセルリン、ＢＲＣＡ１、βディフェンシン２、ＢＲＣＡ２、ＢＩＤ、ＢＴＬＡ、ビグリカン、Ｂｕｂ−１、Ｂｉｋ様キラータンパク質、ｃ−ｊｕｎ、ＣＤ９０／Ｔｈｙ１、ｃ−Ｒｅｌ、ＣＤ９４、ＣＣＬ６／Ｃ１０、ＣＤ９７、Ｃ１ｑＲ１／ＣＤ９３、ＣＤ１５１、Ｃ１ｑＴＮＦ１、ＣＤ１６０、Ｃ１ｑＴＮＦ４、ＣＤ１６３、Ｃ１ｑＴＮＦ５、ＣＤ１６４、補体成分Ｃ１ｒ、
ＣＤ２００、補体成分Ｃ１ｓ、ＣＤ２００Ｒ１、補体成分Ｃ２、ＣＤ２２９／ＳＬＡＭＦ３、補体成分Ｃ３ａ、ＣＤ２３／ＦｃイプシロンＲＩＩ、補体成分Ｃ３ｄ、ＣＤ２Ｆ−１０／ＳＬＡＭＦ９、補体成分Ｃ５ａ、ＣＤ５Ｌ、カドヘリン−４／Ｒ−カドヘリン、ＣＤ６９、カドヘリン−６、ＣＤＣ２、カドヘリン−８、ＣＤＣ２５Ａ、カドヘリン−１１、ＣＤＣ２５Ｂ、カドヘリン−１２、ＣＤＣＰ１、カドヘリン−１３、ＣＤＯ、カドヘリン−１７、ＣＤＸ４、Ｅ−カドヘリン、ＣＥＡＣＡＭ−１／ＣＤ６６ａ、Ｎ−カドヘリン、ＣＥＡＣＡＭ−６、Ｐ−カドヘリン、セルベラス（Ｃｅｒｂｅｒｕｓ）１、ＶＥ−カドヘリン、ＣＦＴＲ、カルビンジンＤ、ｃＧＭＰ、カルシニューリンＡ、Ｃｈｅｍ  Ｒ２３、カルシニューリンＢ、ケメリン、カルレチキュリン（Ｃａｌｒｅｔｉｃｕｌｉｎ）−２、ケモカインサンプラーパック、ＣａＭキナーゼＩＩ、キチナーゼ３様１、ｃＡＭＰ、キトトリオシダーゼ／ＣＨＩＴ１、カンナビノイドＲ１、Ｃｈｋｌ、カンナビノイドＲ２／ＣＢ２／ＣＮＲ２、Ｃｈｋ２、ＣＡＲ／ＮＲ１Ｉ３、ＣＨＬ−ｌ／ＬｌＣＡＭ−２、カルボニックアンヒドラーゼＩ、コリンアセチルトランスフェラーゼ／ＣｈＡＴ、カルボニックアンヒドラーゼＩＩ、コンドロレクチン、カルボニックアンヒドラーゼＩＩＩ、コルジン（Ｃｈｏｒｄｉｎ）、カルボニックアンヒドラーゼＩＶ、コルジン様１、カルボニックアンヒドラーゼＶＡ、コルジン様２、カルボニックアンヒドラーゼＶＢ、ＣＩＮＣ−１、カルボニックアンヒドラーゼＶＩ、ＣＩＮＣ−２、カルボニックアンヒドラーゼＶＩＩ、ＣＩＮＣ−３、カルボニックアンヒドラーゼＶＩＩＩ、クラスピン、カルボニックアンヒドラーゼＩＸ、クラウジン（Ｃｌａｕｄｉｎ）−６、カルボニックアンヒドラーゼＸ、ＣＬＣ、カルボニックアンヒドラーゼＸＩＩ、ＣＬＥＣ−Ｉ、カルボニックアンヒドラーゼＸＩＩＩ、ＣＬＥＣ−２、カルボニックアンヒドラーゼＸＩＶ、ＣＬＥＣＳＦ１３／ＣＬＥＣ４Ｆ、カルボキシメチルリジン、ＣＬＥＣＳＦ８、カルボキシペプチダーゼＡ１／ＣＰＡ１、ＣＬＦ−１、カルボキシペプチダーゼＡ２、ＣＬ−Ｐ１／ＣＯＬＥＣ１２、カルボキシペプチダーゼＡ４、クラステリン、カルボキシペプチダーゼＢ１、クラステリン様１、カルボキシペプチダーゼＥ／ＣＰＥ、ＣＭＧ−２、カルボキシペプチダーゼＸｌ、ＣＭＶ  ＵＬ１４６、カルジオトロピン−１、ＣＭＶ  ＵＬ１４７、カモシンジペプチダーゼ１、ＣＮＰ、カロンテ（Ｃａｒｏｎｔｅ）、ＣＮＴＦ、ＣＡＲＴ、ＣＮＴＦ  Ｒαａ、カスパーゼ、凝固因子ＩＩ／トロンピン、カスパーゼ−１、凝固因子Ｉｌｌ／組織因子、カスパーゼ−２、凝固因子ＶＩＩ、カスパーゼ−３、凝固因子Ｘ、カスパーゼ−４、凝固因子ＸＩ、カスパーゼ−６、凝固因子ＸＩＶ／プロテインＣ、カスパーゼ−７、ＣＯＣＯ、カスパーゼ−８、コヒーシン、カスパーゼ−９、コラーゲンＩ、カスパーゼ−１０、コラーゲンＩＩ、カスパーゼ−１２、コラーゲンＩＶ、カスパーゼ−１３、共通γ鎖／ＩＬ−２Ｒγ、カスパーゼペプチド阻害因子、ＣＯＭＰ／トロンボスポンジン−５、カタラーゼ、補体成分Ｃ１ｒＬＰ、βカテニン、補体成分Ｃ１ｑＡ、カテプシン１、補体成分Ｃ１ｑＣ、カテプシン��、補体因子Ｄ、カテプシン６、補体因子Ｉ、カテプシンＡ、補体ＭＡＳＰ３、カテプシンＢ、コネキシン４３、カテプシンＣ／ＤＰＰＩ、コンタクチン−１、カテプシンＤ、コンタクチン−２／ＴＡＧ１、カテプシンＥ、コンタクチン−４、カテプシンＦ、コンタクチン−５、カテプシンＨ、コリン（Ｃｏｒｉｎ）、カテプシンＬ、コルヌリン（Ｃｏｒｎｕｌｉｎ）、カテプシンＯ、ＣＯＲＳ２６／Ｃ１ｑＴＮＦ、３、カテプシンＳ、ラット皮膚幹細胞、カテプシンＶ、コルチゾール、カテプシンＸ／Ｚ／Ｐ、ＣＯＵＰ−ＴＦ  Ｉ／ＮＲ２Ｆ１、ＣＢＰ、ＣＯＵＰ−ＴＦ  ＩＩ／ＮＲ２Ｆ２、ＣＣＩ、ＣＯＸ−Ｉ、ＣＣＫ−Ａ  Ｒ、ＣＯＸ−２、ＣＣＬ２８、ＣＲＡＣＣ／ＳＬＡＭＦ７、ＣＣＲ１、Ｃ−反応性タンパク質、ＣＣＲ２、クレアチンキナーゼ、筋肉／ＣＫＭＭ、ＣＣＲ３、クレアチニン、ＣＣＲ４、ＣＲＥＢ、ＣＣＲ５、ＣＲＥＧ、ＣＣＲ６、ＣＲＥＬＤｌ、ＣＣＲ７、ＣＲＥＬＤ２、ＣＣＲ８、ＣＲＨＢＰ、ＣＣＲ９、ＣＲＨＲ−１、ＣＣＲ１０、ＣＲＩＭ１、ＣＤ１５５／ＰＶＲ、クリプト（Ｃｒｉｐｔｏ）、ＣＤ２、ＣＲＩＳＰ−２、ＣＤ３、ＣＲＩＳＰ−３、ＣＤ４、クロスベインレス（Ｃｒｏｓｓｖｅｉｎｌｅｓｓ）−２、ＣＤ４＋／４５ＲＡ−、ＣＲＴＡＭ、ＣＤ４＋／４５ＲＯ−、ＣＲＴＨ−２、ＣＤ４＋／ＣＤ６２Ｌ−／ＣＤ４４、ＣＲＹ１、ＣＤ４＋／ＣＤ６２Ｌ＋／ＣＤ４４、クリプティック（Ｃｒｙｐｔｉｃ）、ＣＤ５、ＣＳＢ／ＥＲＣＣ６、ＣＤ６、ＣＣＬ２７／ＣＴＡＣＫ、ＣＤ８、ＣＴＧＦ／ＣＣＮ２、ＣＤ８＋／４５ＲＡ−、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ８＋／４５ＲＯ−、キュービリン（Ｃｕｂｉｌｉｎ）、ＣＤ９、ＣＸ３ＣＲ１、ＣＤ１４、ＣＸＡＤＲ、ＣＤ２７／ＴＮＦＲＳＦ７、ＣＸＣＬ１６、ＣＤ２７リガンド／ＴＮＦＳＦ７、ＣＸＣＲ３、ＣＤ２８、ＣＸＣＲ４、ＣＤ３０／ＴＮＦＲＳＦ８、ＣＸＣＲ５、ＣＤ３０リガンド／ＴＮＦＳＦ８、ＣＸＣＲ６、ＣＤ３１／ＰＥＣＡＭ−１、シクロフィリンＡ、ＣＤ３４、Ｃｙｒ６１／ＣＣＮ１、ＣＤ３６／ＳＲ−Ｂ３、シスタチンＡ、ＣＤ３８、シスタチンＢ、ＣＤ４０／ＴＮＦＲＳＦ５、シスタチンＣ、ＣＤ４０リガンド／ＴＮＦＳＦ５、シスタチンＤ、ＣＤ４３、シスタチンＥ／Ｍ、ＣＤ４４、シスタチンＦ、ＣＤ４５、シスタチンＨ、ＣＤ４６、シスタチンＨ２、ＣＤ４７、シスタチンＳ、ＣＤ４８／ＳＬＡＭＦ２、シスタチンＳＡ、ＣＤ５５／ＤＡＦ、シスタチンＳＮ、ＣＤ５８／ＬＦＡ−３、シトクロムｃ、ＣＤ５９、アポシトクロムｃ、ＣＤ６８、ホロシトクロムｃ、ＣＤ７２、サイトケラチン８、ＣＤ７４、サイトケラチン１４、ＣＤ８３、サイトケラチン１９、ＣＤ８４／ＳＬＡＭＦ５、サイトニン、Ｄ６、ＤＩＳＰ１、ＤＡＮ、Ｄｋｋ−１、ＤＡＮＣＥ、Ｄｋｋ−２、ＤＡＲＰＰ−３２、Ｄｋｋ−３、ＤＡＸ１／ＮＲ０Ｂ１、Ｄｋｋ−４、ＤＣＣ、ＤＬＥＣ、ＤＣＩＲ／ＣＬＥＣ４Ａ、ＤＬＬＩ、ＤＣＡＲ、ＤＬＬ４、ＤｃＲ３／ＴＮＦＲＳＦ６Ｂ、ｄ−ルシフェリン、ＤＣ−ＳＩＧＮ、ＤＮＡリガーゼＩＶ、ＤＣ−ＳＩＧＮＲ／ＣＤ２９９、ＤＮＡポリメラーゼβ、ＤｃＴＲＡＩＬ  Ｒ１／ＴＮＦＲＳＦ２３、ＤＮＡＭ−１、ＤｃＴＲＡＩＬ  Ｒ２／ＴＮＦＲＳＦ２２、ＤＮＡ−ＰＫｃｓ、ＤＤＲ１、ＤＮＥＲ、ＤＤＲ��、ドーパデカルボキシラーゼ／ＤＤＣ、ＤＥＣ−２０５、ＤＰＣＲ−１、デカペンタプレジック（Ｄｅｃａｐｅｎｔａｐｌｅｇｉｃ）、ＤＰＰ６、デコリン、ＤＰＰＡ４、デクチン−１／ＣＬＥＣ７Ａ、ＤＰＰＡ５／ＥＳＧ１、デクチン−２／ＣＬＥＣ６Ａ、ＤＰＰＩＩ／ＱＰＰ／ＤＰＰ７、ＤＥＰ−１／ＣＤ１４８、ＤＰＰＩＶ／ＣＤ２６、デザートヘッジホッグ（Ｄｅｓｅｒｔ  Ｈｅｄｇｅｈｏｇ）、ＤＲ３／ＴＮＦＲＳＦ２５、デスミン、ＤＲ６／ＴＮＦＲＳＦ２１、デスモグレイン−１、ＤＳＣＡＭ、デスモグレイン−２、ＤＳＣＡＭ−Ｌ１、デスモグレイン−３、ＤＳＰＧ３、ディスヘベルド（Ｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄ）−１、Ｄｔｋ、ディスヘベルド−３、ダイナミン、ＥＡＲ２／ＮＲ２Ｆ６、ＥｐｈＡ５、ＥＣＥ−１、ＥｐｈＡ６、ＥＣＥ−２、ＥｐｈＡ７、ＥＣＦ−Ｌ／ＣＨＩ３Ｌ３、ＥｐｈＡ８、ＥＣＭ−１、ＥｐｈＢ１、エコチン、ＥｐｈＢ２、ＥＤＡ、ＥｐｈＢ３、ＥＤＡ−Ａ２、ＥｐｈＢ４、ＥＤＡＲ、ＥｐｈＢ６、ＥＤＧ−１、エフリン、ＥＤＧ−５、エフリン−Ａ１、ＥＤＧ−８、エフリン−Ａ２、ｅＥＦ−２、エフリン−Ａ３、ＥＧＦ、エフリン−Ａ４、ＥＧＦ  Ｒ、エフリン−Ａ５、ＥＧＲ１、エフリン−Ｂ、ＥＧ−ＶＥＧＦ／ＰＫ１、
エフリン−Ｂ１、ｅＩＦ２α、エフリン−Ｂ２、ｅＩＦ４Ｅ、エフリン−Ｂ３、Ｅｌｋ−Ｉ、エピゲン（Ｅｐｉｇｅｎ）、ＥＭＡＰ−ＩＩ、エピモルフィン／シンタキシン２、ＥＭＭＰＲＩＮ／ＣＤ１４７、エピレグリン、ＣＸＣＬ５／ＥＮＡ、ＥＰＲ−ｌ／Ｘａ受容体、エンドカン、ＥｒｂＢ２、エンドグリン／ＣＤ１０５、ＥｒｂＢ３、エンドグリカン、ＥｒｂＢ４、エンドヌクレアーゼＩＩＩ、ＥＲＣＣｌ、エンドヌクレアーゼＩＶ、ＥＲＣＣ３、エンドヌクレアーゼＶ、ＥＲＫ１／ＥＲＫ２、エンドヌクレアーゼＶＩＩＩ、ＥＲＫ１、エンドレセペリン／パーレカン、ＥＲＫ２、エンドスタチン、ＥＲＫ３、エンドセリン−１、ＥＲＫ５／ＢＭＫ１、エングレイルド−２、ＥＲＲα／ＮＲ３Ｂｌ、ＥＮ−ＲＡＧＥ、ＥＲＲβ／ＮＲ３Ｂ２、エンテロペプチダーゼ／エンテロキナーゼ、ＥＲＲγ／ＮＲ３Ｂ３、ＣＣＬ１１１／エオタキシン、エリスロポエチン、ＣＣＬ２４／エオタキシン−２、エリスロポエチンＲ、ＣＣＬ２６／エオタキシン−３、ＥＳＡＭ、ＥｐＣＡＭ／ＴＲＯＰ−１、ＥＲα／ＮＲ３Ａ１、ＥＰＣＲ、ＥＲβ／ＮＲ３Ａ２、Ｅｐｈ、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、ＥｐｈＡｌ、エキソストシン様２／ＥＸＴＬ２、ＥｐｈＡ２、エキソストシン様３／ＥＸＴＬ３、ＥｐｈＡ３、ＦＡＢＰ１、ＦＧＦ−ＢＰ、ＦＡＢＰ２、ＦＧＦ  Ｒ１−４、ＦＡＢＰ３、ＦＧＦ  Ｒ１、ＦＡＢＰ４、ＦＧＦ  Ｒ２、ＦＡＢＰ５、ＦＧＦ  Ｒ３、ＦＡＢＰ７、ＦＧＦ  Ｒ４、ＦＡＢＰ９、ＦＧＦ  Ｒ５、補体因子Ｂ、Ｆｇｒ、ＦＡＤＤ、ＦＨＲ５、ＦＡＭ３Ａ、フィブロネクチン、ＦＡＭ３Ｂ、フィコリン−２、ＦＡＭ３Ｃ、フィコリン−３、ＦＡＭ３Ｄ、ＦＩＴＣ、線維芽細胞活性化タンパク質α／ＦＡＰ、ＦＫＢＰ３８、Ｆａｓ／ＴＮＦＲＳＦ６、Ｆｌａｐ、Ｆａｓリガンド／ＴＮＦＳＦ６、ＦＬＩＰ、ＦＡＴＰ１、ＦＬＲＧ、ＦＡＴＰ４、ＦＬＲＴ１、ＦＡＴＰ５、ＦＬＲＴ２、ＦｃγＲＩ／ＣＤ６４、ＦＬＲＴ３、ＦｃγＲＩＩＢ／ＣＤ３２ｂ、Ｆｌｔ−３、ＦｃγＲＩＩＣ／ＣＤ３２ｃ、Ｆｌｔ−３リガンド、ＦｃγＲＩＩＡ／ＣＤ３２ａ、ホリスタチン、ＦｃγＲＩＩＩ／ＣＤ１６、ホリスタチン様１、ＦｃＲＨ１／ＩＲＴＡ５、ＦｏｓＢ／Ｇ０Ｓ３、ＦｃＲＨ２／ＩＲＴＡ４、ＦｏｘＤ３、ＦｃＲＨ４／ＩＲＴＡ１、ＦｏｘＪ１、ＦｃＲＨ５／ＩＲＴＡ２、ＦｏｘＰ３、Ｆｃ受容体様３／ＣＤ１６−２、Ｆｐｇ、ＦＥＮ−Ｉ、ＦＰＲ１、フェツインＡ、ＦＰＲＬｌ、フェツインＢ、ＦＰＲＬ２、ＦＧＦ酸性、ＣＸ３ＣＬ１／フラクタルキン、ＦＧＦ塩基性、フリズルド−１、ＦＧＦ−３、フリズルド−２、ＦＧＦ−４、フリズルド−３、ＦＧＦ−５、フリズルド−４、ＦＧＦ−６、フリズルド−５、ＦＧＦ−８、フリズルド−６、ＦＧＦ−９、フリズルド−７、ＦＧＦ−１０、フリズルド−８、ＦＧＦ−１１、フリズルド−９、ＦＧＦ−１２、Ｆｒｋ、ＦＧＦ−１３、ｓＦＲＰ−１、ＦＧＦ−１６、ｓＦＲＰ−２、ＦＧＦ−１７、ｓＦＲＰ−３、ＦＧＦ−１９、ｓＦＲＰ−４、ＦＧＦ−２０、フューリン、ＦＧＦ−２１、ＦＸＲ／ＮＲ１Ｈ４、ＦＧＦ−２２、Ｆｙｎ、ＦＧＦ−２３、Ｇ９ａ／ＥＨＭＴ２、ＧＦＲα−３／ＧＤＮＦ  Ｒα−３、ＧＡＢＡ−Ａ−Ｒα１、ＧＦＲα−４／ＧＤＮＦ  Ｒα−４、ＧＡＢＡ−Ａ−Ｒα２、Ｇ��ＴＲ／ＴＮＦＲＳＦ１８、ＧＡＢＡ−Ａ−Ｒα４、ＧＩＴＲリガンド／ＴＮＦＳＦ  １８、ＧＡＢＡ−Ａ−Ｒα５、ＧＬＩ−１、ＧＡＢＡ−Ａ−Ｒα６、ＧＬＩ−２、ＧＡＢＡ−Ａ−Ｒβ１、ＧＬＰ／ＥＨＭＴ１、ＧＡＢＡ−Ａ−Ｒβ２、ＧＬＰ−Ｉ  Ｒ、ＧＡＢＡ−Ａ−Ｒβ３、グルカゴン、ＧＡＢＡ−Ａ−Ｒγ２、グルコサミン（Ｎ−アセチル）−６−スルファターゼ／ＧＮＳ、ＧＡＢＡ−Ｂ−Ｒ２、ＧＩｕＲ１、ＧＡＤ１／ＧＡＤ６７、ＧｌｕＲ２／３、ＧＡＤ２／ＧＡＤ６５、ＧｌｕＲ２、ＧＡＤＤ４５α、ＧｌｕＲ３、ＧＡＤＤ４５β、Ｇｌｕｔ１、ＧＡＤＤ４５γ、Ｇｌｕｔ２、ガレクチン−１、Ｇｌｕｔ３、ガレクチン−２、Ｇｌｕｔ４、ガレクチン−３、Ｇｌｕｔ５、ガレクチン−３ＢＰ、グルタレドキシン１、ガレクチン−４、グリシンＲ、ガレクチン−７、グリコホリンＡ、ガレクチン−８、グリピカン２、ガレクチン−９、グリピカン３、ＧａｌＮＡｃ４Ｓ−６ＳＴ、グリピカン５、ＧＡＰ−４３、グリピカン６、ＧＡＰＤＨ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇａｓ１、ＧＭ−ＣＳＦ  Ｒα、Ｇａｓ６、ＧＭＦβ、ＧＡＳＰ−１／ＷＦＩＫＫＮＲＰ、ｇｐ１３０、ＧＡＳＰ−２／ＷＦＩＫＫＮ、グリコーゲンホスホリラーゼＢＢ／ＧＰＢＢ、ＧＡＴＡ−Ｉ、ＧＰＲ１５、ＧＡＴＡ−２、ＧＰＲ３９、ＧＡＴＡ−３、ＧＰＶＩ、ＧＡＴＡ−４、ＧＲ／ＮＲ３Ｃ１、ＧＡＴＡ−５、Ｇｒ−１／Ｌｙ−６Ｇ、ＧＡＴＡ−６、グラヌリシン、ＧＢＬ、グランザイムＡ、ＧＣＮＦ／ＮＲ６Ａ１、グランザイムＢ、ＣＸＣＬ６／ＧＣＰ−２、グランザイムＤ、Ｇ−ＣＳＦ、グランザイムＧ、Ｇ−ＣＳＦ  Ｒ、グランザイムＨ、ＧＤＦ−１、ＧＲＡＳＰ、ＧＤＦ−３  ＧＲＢ２、ＧＤＦ−５、グレムリン、ＧＤＦ−６、ＧＲＯ、ＧＤＦ−７、ＣＸＣＬ１／ＧＲＯα、ＧＤＦ−８、ＣＸＣＬ２／ＧＲＯβ、ＧＤＦ−９、ＣＸＣＬ３／ＧＲＯγ、ＧＤＦ−１１、成長ホルモン、ＧＤＦ−１５、成長ホルモンＲ、ＧＤＮＦ、ＧＲＰ７５／ＨＳＰＡ９Ｂ、ＧＦＡＰ、ＧＳＫ−３α／β、ＧＦＩ−１、ＧＳＫ−３α、ＧＦＲα−１／ＧＤＮＦ  Ｒα−１、ＧＳＫ−３β、ＧＦＲα−２／ＧＤＮＦ  Ｒα−２、ＥＺＦＩＴ、Ｈ２ＡＸ、ヒスチジン、Ｈ６０、ＨＭ７４Ａ、ＨＡＩ−１、ＨＭＧＡ２、ＨＡＩ−２、ＨＭＧＢ１、ＨＡＩ−２Ａ、ＴＣＦ−２／ＨＮＦ−１β、ＨＡＩ−２Ｂ、ＨＮＦ−３β／ＦｏｘＡ２、ＨＡＮＤ１、ＨＮＦ−４α／ＮＲ２Ａ１、ＨＡＰＬＮ１、ＨＮＦ−４γ／ＮＲ２Ａ２、気道トリプシン様プロテアーゼ／ＨＡＴ、ＨＯ−１／ＨＭＯＸ１／ＨＳＰ３２、ＨＢ−ＥＧＦ、ＨＯ−２／ＨＭＯＸ２、ＣＣＬ１４ａ／ＨＣＣ−１、ＨＰＲＧ、ＣＣＬ１４ｂ／ＨＣＣ−３、Ｈｒｋ、ＣＣＬ１６／ＨＣＣ−４、ＨＲＰ−Ｉ、αＨＣＧ、ＨＳ６ＳＴ２、Ｈｃｋ、ＨＳＤ−Ｉ、ＨＣＲ／ＣＲＡＭ−Ａ／Ｂ、ＨＳＤ−２、ＨＤＧＦ、ＨＳＰ１０／ＥＰＦ、ヘモグロビン、ＨＳＰ２７、ヘパソシン、ＨＳＰ６０、ＨＥＳ−１、ＨＳＰ７０、ＨＥＳ−４、ＨＳＰ９０、ＨＧＦ、ＨＴＲＡ／プロテアーゼＤｏ、ＨＧＦ活性化因子、ＨＴＲＡ１／ＰＲＳＳ１１、ＨＧＦ  Ｒ、ＨＴＲＡ２／Ｏｍｉ、ＨＩＦ−１α、ＨＶＥＭ／ＴＮＦＲＳＦ１４、ＨＩＦ−２α、ヒアルロナン、ＨＩＮ−１／セクレトグロブリン３Ａ１、４−ヒドロキシノネナール、Ｈｉｐ、ＣＣＬ１／Ｉ−３０９／ＴＣ���−３、ＩＬ−１０、ｃＩＡＰ（パン（ｐａｎ））、ＩＬ−１０Ｒα、ｃＩＡＰ−ｌ／ＨＩＡＰ−２、ＩＬ−１０Ｒβ、ｃＩＡＰ−２／ＨＩＡＰ−１、ＩＬ−１１、ＩＢＳＰ／シアロタンパク質ＩＩ、ＩＬ−１１Ｒα、ＩＣＡＭ−１／ＣＤ５４、ＩＬ−１２、ＩＣＡＭ−２／ＣＤ１０２、ＩＬ−１２／ＩＬ−２３ｐ４０、ＩＣＡＭ−３／ＣＤ５０、ＩＬ−１２Ｒβ１、ＩＣＡＭ−５、ＩＬ−１２Ｒβ２、ＩＣＡＴ、ＩＬ−１３、ＩＣＯＳ、ＩＬ−１３Ｒα１、イズロン酸２−スルファターゼ／ＩＤＳ、ＩＬ−１３Ｒα２、ＩＦＮ、ＩＬ−１５、ＩＦＮ−α、ＩＬ−１５Ｒα、ＩＦＮ−α１、ＩＬ−１６、ＩＦＮ−α２、ＩＬ−１７、ＩＦＮ−α４ｂ、ＩＬ−１７Ｒ、ＩＦＮ−αＡ、ＩＬ−１７ＲＣ、ＩＦＮ−αＢ２、ＩＬ−１７ＲＤ、ＩＦＮ−αＣ、ＩＬ−１７Ｂ、ＩＦＮ−αＤ、ＩＬ−１７Ｂ  Ｒ、ＩＦＮ−αＦ、ＩＬ−１７Ｃ、ＩＦＮ−αＧ、ＩＬ−１７Ｄ、ＩＦＮ−αＨ２、ＩＬ−１７Ｅ、ＩＦＮ−αＩ、ＩＬ−１７Ｆ、ＩＦＮ−αＪ１、ＩＬ−１８／ＩＬ−１Ｆ４、ＩＦＮ−αＫ、ＩＬ−１８ＢＰａ、ＩＦＮ−αＷＡ、ＩＬ−１８ＢＰｃ、ＩＦＮ−α／β
Ｒ１、ＩＬ−１８ＢＰｄ、ＩＦＮ−α／β  Ｒ２、ＩＬ−１８Ｒα／ＩＬ−１Ｒ５、ＩＦＮβ、ＩＬ−１８Ｒβ／ＩＬ−１Ｒ７、ＥＦＮ−γ、ＩＬ−１９、ＩＦＮ−γＲｌ、ＩＬ−２０、ＩＦＮ−γＲ２、ＩＬ−２０Ｒα、ＩＦＮ−ω、ＩＬ−２０Ｒβ、ＩｇＥ、ＩＬ−２１、ＩＧＦＢＰ−Ｉ、ＩＬ−２１Ｒ、ＩＧＦＢＰ−２、ＩＬ−２２、ＩＧＦＢＰ−３、ＩＬ−２２Ｒ、ＩＧＦＢＰ−４、ＩＬ−２２ＢＰ、ＩＧＦＢＰ−５、ＩＬ−２３、ＩＧＦＢＰ−６、ＩＬ−２３Ｒ、ＩＧＦＢＰ−Ｌ１、ＩＬ−２４、ＩＧＦＢＰ−ｒｐ１／ＩＧＦＢＰ−７、ＩＬ−２６／ＡＫ１５５、ＩＧＦＢＰ−ｒＰ１０、ＩＬ−２７、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＬ−２８Ａ、ＩＧＦ−Ｉ  Ｒ、ＩＬ−２８Ｂ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＩＬ−２９／ＩＦＮ−λ１、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｒ、ＩＬ−３１、ＩｇＧ、ＩＬ−３１ＲＡ、ＩｇＭ、ＩＬ−３２α、ＩＧＳＦ２、ＩＬ−３３、ＩＧＳＦ４Ａ／ＳｙｎＣＡＭ、ＩＬＴ２／ＣＤ８５ｊ、ＩＧＳＦ４Ｂ、ＩＬＴ３／ＣＤ８５ｋ、ＩＧＳＦ８、ＩＬＴ４／ＣＤ８５ｄ、ＩｇＹ、ＩＬＴ５／ＣＤ８５ａ、ＩｋＢβ、ＩＬＴ６／ＣＤ８５ｅ、ＩＫＫα、インディアンヘッジホッグ（Ｉｎｄｉａｎ  Ｈｅｄｇｅｈｏｇ）、ＩＫＫイプシロン、ＩＮＳＲＲ、ＩＫＫγ、インスリン、ＩＬ−Ｉα／ＩＬ−ｌＦｌ、インスリンＲ／ＣＤ２２０、ＩＬ−１β／ＩＬ−１Ｆ２、プロインスリン、ＩＬ−１ｒａ／ＩＬ−ｌＦ３、インスリシン／ＩＤＥ、ＩＬ−１Ｆ５／ＦＩＬ１δ、インテグリンα２／ＣＤ４９ｂ、ＩＬ−１Ｆ６／ＦＩＬ１ε、インテグリンα３／ＣＤ４９ｃ、ＩＬ−１Ｆ７／ＦＩＬ１ζ、インテグリンα３βｌ／ＶＬＡ−３、ＩＬ−１Ｆ８／ＦＩＬ１η、インテグリンα４／ＣＤ４９ｄ、ＩＬ−１Ｆ９／ＩＬ−１Ｈｌ、インテグリンα５／ＣＤ４９ｅ、ＩＬ−１Ｆ１０／ＩＬ−１ＨＹ２、インテグリンα５β１、ＩＬ−Ｉ  ＲＩ５  インテグリンα６／ＣＤ４９ｆ、ＩＬ−Ｉ  ＲＩＩ、インテグリンα７、ＩＬ−Ｉ  Ｒ３／ＩＬ−１  Ｒ  ＡｃＰ、インテグリンα９、ＩＬ−Ｉ  Ｒ４／ＳＴ２、インテグリンαＥ／ＣＤ１０３、ＩＬ−Ｉ  Ｒ６／ＩＬ−１Ｒｒｐ２、インテグリンαＬ／ＣＤ１１ａ、ＩＬ−Ｉ  Ｒ８、インテグリンαＬβ２、ＩＬ−ＩＲ９、インテグリンαＭ／ＣＤ１１ｂ、ＩＬ−２、インテグリンαＭβ２、ＩＬ−２Ｒα、インテグリンαＶ／ＣＤ５１、ＩＬ−２Ｒβ、インテグリンαＶβ５、ＩＬ−３、インテグリンαＶβ３、ＩＬ−３Ｒα、インテグリンαＶβ６、ＩＬ−３Ｒβ、インテグリンαＸ／ＣＤ１１ｃ、ＩＬ−４、インテグリンβ１／ＣＤ２９、ＩＬ−４Ｒ、インテグリンβ２／ＣＤ１８、ＩＬ−５、インテグリンβ３／ＣＤ６１、ＩＬ−５Ｒα、インテグリンβ５、ＩＬ−６、インテグリンβ６、ＩＬ−６Ｒ、インテグリンβ７、ＩＬ−７、ＣＸＣＬ１０／ＩＰ−１０／ＣＲＧ−２、ＩＬ−７Ｒα／ＣＤ１２７、ＩＲＡＫＩ、ＣＸＣＲ１／ＩＬ−８ＲＡ、ＩＲＡＫ４、ＣＸＣＲ２／ＩＬ−８ＲＢ、ＩＲＳ−Ｉ、ＣＸＣＬ８／ＩＬ−８、イスレット（Ｉｓｌｅｔ）−１、ＩＬ−９、ＣＸＣＬ１１／Ｉ−ＴＡＣ、ＩＬ−９Ｒ、ジャグド（Ｊａｇｇｅｄ）１、ＪＡＭ−４／ＩＧＳＦ５、ジャグド２、ＪＮＫ、ＪＡＭ−Ａ、ＪＮＫ１／ＪＮＫ２、ＪＡＭ−Ｂ／ＶＥ−ＪＡＭ、ＪＮＫｌ、ＪＡＭ−Ｃ、ＪＮＫ２、キニノーゲン、カリクレイン３／ＰＳＡ、キニノスタチン���カリクレイン４、ＫＩＲ／ＣＤ１５８、カリクレイン５、ＫＩＲ２ＤＬ１、カリクレイン６／ニューロシン、ＫＩＲ２ＤＬ３、カリクレイン７、ＫＩＲ２ＤＬ４／ＣＤ１５８ｄ、カリクレイン８／ニューロプシン、ＫＩＲ２ＤＳ４、カリクレイン９、ＫＩＲ３ＤＬ１、血漿カリクレイン／ＫＬＫＢｌ、ＫＩＲ３ＤＬ２、カリクレイン１０、キレル（Ｋｉｒｒｅｌ）２、カリクレイン１１、ＫＬＦ４、カリクレイン１２、ＫＬＦ５、カリクレイン１３、ＫＬＦ６、カリクレイン１４、クロト（Ｋｌｏｔｈｏ）、カリクレイン１５、クロトβ、ＫＣ、ＫＯＲ、ケアプル（Ｋｅａｐｌ）、クレメン−１、ケル（Ｋｅｌｌ）、クレメン−２、ＫＧＦ／ＦＧＦ−７、ＬＡＧ−３、ＬＩＮＧＯ−２、ＬＡＩＲｌ、リピン２、ＬＡＩＲ２、リポカリン−１、ラミニンα４、リポカリン−２／ＮＧＡＬ、ラミニンγ１、５−リポキシゲナーゼ、ラミニンＩ、ＬＸＲα／ＮＲｌＨ３、ラミニンＳ、ＬＸＲβ／ＮＲｌＨ２、ラミニン−１、リビン（Ｌｉｖｉｎ）、ラミニン−５、ＬＩＸ、
ＬＡＭＰ、ＬＭＥＲ１／ＣＤ３００Ａ、ランゲリン、ＬＭＩＲ２／ＣＤ３００ｃ、ＬＡＲ、ＬＭＩＲ３／ＣＤ３００ＬＦ、ラテキシン（Ｌａｔｅｘｉｎ）、ＬＭＩＲ５／ＣＤ３００ＬＢ、ライリン（Ｌａｙｉｌｉｎ）、ＬＭＩＲ６／ＣＤ３００ＬＥ、ＬＢＰ５ＬＭＯ２、ＬＤＬ  Ｒ、ＬＯＸ−１／ＳＲ−Ｅｌ、ＬＥＣＴ２、ＬＲＨ−１／ＮＲ５Ａ２、ＬＥＤＧＦ、ＬＲＩＧ１、レフティー（Ｌｅｆｔｙ）、ＬＲＩＧ３、レフティー−１、ＬＲＰ−Ｉ、レフティー−Ａ、ＬＲＰ−６、レグマイン（Ｌｅｇｕｍａｉｎ）、ＬＳＥＣｔｉｎ／ＣＬＥＣ４Ｇ、レプチン、ルミカン、レプチンＲ、ＣＸＣＬ１５／ラングキン（Ｌｕｎｇｋｉｎｅ）、ロイコトリエンＢ４、ＸＣＬ１／リンホタクチン、ロイコトリエンＢ４  Ｒ１、リンホトキシン、ＬＩＦ、リンホトキシンβ／ＴＮＦＳＦ３５ＬＩＦ  Ｒα、リンホトキシンβＲ／ＴＮＦＲＳＦ３、ＬＩＧＨＴ／ＴＮＦＳＦ１４、Ｌｙｎ、リミチン、Ｌｙｐ、ＬＩＭＰＩＩ／ＳＲ−Ｂ２、リシルオキシダーゼホモログ２、ＬＩＮ−２８、ＬＹＶＥ−１、ＬＩＮＧＯ−１、α２−マクログロブリン、ＣＸＣＬ９／ＭＩＧ、ＭＡＤ２Ｌ１、ミメカン、ＭＡｄＣＡＭ−Ｉ、ミンジン（Ｍｉｎｄｉｎ）、ＭａｆＢ、鉱質コルチコイド（Ｍｉｎｅｒａｌｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ）Ｒ／ＮＲ３Ｃ２、ＭａｆＦ、ＣＣＬ３Ｌ１／ＭＩＰ−１αアイソフォームＬＤ７８β、ＭａｆＧ、ＣＣＬ３／ＭＩＰ−１α、ＭａｆＫ、ＣＣＬ４Ｌ１／ＬＡＧ−１、ＭＡＧ／シングレック（Ｓｉｇｌｅｃ）−４ａ、ＣＣＬ４／ＭＩＰ−１β、ＭＡＮＦ、ＣＣＬ１５／ＭＩＰ−１δ、ＭＡＰ２、ＣＣＬ９／１０／ＭＩＰ−１γ、ＭＡＰＫ、ＭＩＰ−２、マラプシン／パンクレアシン、ＣＣＬ１９／ＭＩＰ−３β、ＭＡＲＣＫＳ、ＣＣＬ２０／ＭＩＰ−３α、ＭＡＲＣＯ、ＭＩＰ−Ｉ、Ｍａｓｈ１、ＭＩＰ−ＩＩ、マトリリン（Ｍａｔｒｉｌｉｎ）−２、ＭＩＰ−ＩＩＩ、マトリリン−３、ＭＩＳ／ＡＭＨ、マトリリン−４、ＭＩＳ  ＲＩＩ、マトリプターゼ／ＳＴ１４、ＭＩＸＬ１、ＭＢＬ、ＭＫＫ３／ＭＫＫ６、ＭＢＬ−２、ＭＫＫ３、メラノコルチン３Ｒ／ＭＣ３Ｒ、ＭＫＫ４、ＭＣＡＭ／ＣＤ１４６、ＭＫＫ６、ＭＣＫ−２、ＭＫＫ７、Ｍｃｌ−１、ＭＫＰ−３、ＭＣＰ−６、ＭＬＨ−１、ＣＣＬ２／ＭＣＰ−１、ＭＬＫ４α、ＭＣＰ−１１、ＭＭＰ、ＣＣＬ８／ＭＣＰ−２、ＭＭＰ−１、ＣＣＬ７／ＭＣＰ−３／ＭＡＲＣ、ＭＭＰ−２、ＣＣＬ１３／ＭＣＰ−４、ＭＭＰ−３、ＣＣＬ１２／ＭＣＰ−５、ＭＭＰ−７、Ｍ−ＣＳＦ、ＭＭＰ−８、Ｍ−ＣＳＦ  Ｒ、ＭＭＰ−９、ＭＣＶ−ＩＩ型、ＭＭＰ−１０、ＭＤ−１、ＭＭＰ−１１、ＭＤ−２、ＭＭＰ−１２、ＣＣＬ２２／ＭＤＣ、ＭＭＰ−１３、ＭＤＬ−１／ＣＬＥＣ５Ａ、ＭＭＰ−１４、ＭＤＭ２、ＭＭＰ−１５、ＭＥＡ−１、ＭＭＰ−１６／ＭＴ３−ＭＭＰ、ＭＥＫ１／ＭＥＫ２、ＭＭＰ−２４／ＭＴ５−ＭＭＰ、ＭＥＫ１、ＭＭＰ−２５／ＭＴ６−ＭＭＰ、ＭＥＫ２、ＭＭＰ−２６、メルシン、ＭＭＲ、ＭＥＰＥ、ＭＯＧ、メプリンα、ＣＣＬ２３／ＭＰＩＦ−１、メプリンβ、Ｍ−Ｒａｓ／Ｒ−Ｒａｓ３、メール（Ｍｅｒ）、Ｍｒｅ１１、メソテリン、ＭＲＰ１メテオリン、ＭＳＫ１／ＭＳＫ２、メチオニンアミノペプチダーゼ１、ＭＳＫｌ、メチオニンアミノペプチダーゼ、Ｍ��Ｋ２、メチオニンアミノペプチダーゼ２、ＭＳＰ、ＭＦＧ−Ｅ８、ＭＳＰ  Ｒ／Ｒｏｎ、ＭＦＲＰ、Ｍｕｇ、ＭｇｃＲａｃＧＡＰ、ＭＵＬＴ−Ｉ、ＭＧＬ２、ムサシ−１、ＭＧＭＴ、ムサシ−２、ＭＩＡ、ＭｕＳＫ、ＭＩＣＡ、ＭｕｔＹ  ＤＮＡグリコシダーゼ、ＭｔＣＢ、ＭｙＤ８８、ＭＩＣＬ／ＣＬＥＣ１２Ａ、ミエロペルオキシダーゼ、β２マイクログロブリン、ミオカルジン、ミドカイン、ミオシリン（Ｍｙｏｃｉｌｉｎ）、ＭＩＦ、ミオグロビン、ＮＡＩＰ  ＮＧＦＩ−Ｂγ／ＮＲ４Ａ３、ナノグ（Ｎａｎｏｇ）、ＮｇＲ２／ＮｇＲＨｌ、ＣＸＣＬ７／ＮＡＰ−２、ＮｇＲ３／ＮｇＲＨ２、Ｎｂｓ１、ニドゲン（Ｎｉｄｏｇｅｎ）−１／エンタクチン、ＮＣＡＭ−ｌ／ＣＤ５６、ニドゲン−２、ＮＣＡＭ−Ｌｌ、一酸化窒素、ネクチン−１、ニトロチロシン、ネクチン−２／ＣＤ１１２、ＮＫＧ２Ａ、ネクチン−３、ＮＫＧ２Ｃ、ネクチン−４、ＮＫＧ２Ｄ、ネオゲニン、ＮＫｐ３０、ネプリリシン（Ｎｅｐｒｉｌｙｓｉｎ）／ＣＤ１０、ＮＫｐ４４、ネプリリシン−２／ＭＭＥＬ１／ＭＭＥＬ２、ＮＫｐ４６／ＮＣＲ１、ネスチン、ＮＫｐ８０／ＫＬＲＦｌ、ＮＥＴＯ２、ＮＫＸ２．５、ネトリン−１、ＮＭＤＡ  Ｒ、ＮＲ１サブユニット、ネトリン−２、ＮＭＤＡ  Ｒ、ＮＲ２Ａサブユニット、ネトリン−４、ＮＭＤＡ  Ｒ、ＮＲ２Ｂサブユニット、ネトリン−Ｇ１ａ、ＮＭＤＡ  Ｒ、ＮＲ２Ｃサブユニット、ネトリン−Ｇ２ａ、Ｎ−Ｍｅ−６，７−ｄｉＯＨ−ＴＩＱ、ニューレグリン−１／ＮＲＧ１、ノダール（Ｎｏｄａｌ）、ニューレグリン−３／ＮＲＧ３、ノギン（Ｎｏｇｇｉｎ）、ニューリチン（Ｎｅｕｒｉｔｉｎ）、ノゴ（Ｎｏｇｏ）受容体、ニューロ（Ｎｅｕｒｏ）Ｄ１、ノゴ−Ａ、ニューロファシン（Ｎｅｕｒｏｆａｓｃｉｎ）、ＮＯＭＯ、ニューロゲニン−１、Ｎｏｐｅ、ニューロゲニン−２、ノリン（Ｎｏｒｒｉｎ）、ニューロゲニン−３、ｅＮＯＳ、ニューロリシン（Ｎｅｕｒｏｌｙｓｉｎ）、ｉＮＯＳ、ニューロフィシン（Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｎ）ＩＩ、ｎＮＯＳ、ニューロピリン−１、ノッチ（Ｎｏｔｃｈ）−１、ニューロピリン−２、ノッチ−２、ニューロポエチン、Ｎｏｔｃｈ−３、ニューロトリミン、ノッチ−４、ニューツリン（Ｎｅｕｒｔｕｒｉｎ）、ＮＯＶ／ＣＣＮ３、ＮＦＡＭｌ、ＮＲＡＧＥ、ＮＦ−Ｈ、ＮｒＣＡＭ、ＮＦｋＢｌ、ＮＲＬ、ＮＦｋＢ２、ＮＴ−３、ＮＦ−Ｌ、ＮＴ−４、ＮＦ−Ｍ、ＮＴＢ−Ａ／ＳＬＡＭＦ６、ＮＧ２／ＭＣＳＰ、ＮＴＨｌ、ＮＧＦ  Ｒ／ＴＮＦＲＳＦ１６、ヌクレオステミン、β−ＮＧＦ、ヌール（Ｎｕｒｒ）−１／ＮＲ４Ａ２、ＮＧＦＩ−Ｂα／ＮＲ４Ａｌ、ＯＡＳ２、オレキシンＢ、ＯＢＣＡＭ、ＯＳＣＡＲ、ＯＣＡＭ、ＯＳＦ−２／ペリオスチン、ＯＣＩＬ／ＣＬＥＣ２ｄ、オンコスタチンＭ／ＯＳＭ、ＯＣＩＬＲＰ２／ＣＬＥＣ２ｉ、ＯＳＭ  Ｒβ、Ｏｃｔ−３／４、オステオアクチビン／ＧＰＮＭＢ、ＯＧＧ１、オステオアドヘリン、オリグ（Ｏｌｉｇ）１、２，３，オステオカルシン、オリグ１、オステオクリン、オリグ２、オステオポンチン、オリグ３、オステオプロテゲリン／ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ、オリゴデンドロサイトマーカーＯ１、Ｏｔｘ２、オリゴデンドロサイトマーカーＯ４、ＯＶ−６、ＯＭｇｐ、ＯＸ４０／ＴＮＦＲＳＦ���、オプチシン、ＯＸ４０リガンド／ＴＮＦＳＦ４、オレキシンＡ、ＯＡＳ２、オレキシンＢ、ＯＢＣＡＭ、ＯＳＣＡＲ、ＯＣＡＭ、ＯＳＦ−２／ペリオスチン、ＯＣＩＬ／ＣＬＥＣ２ｄ、オンコスタチンＭ／ＯＳＭ、ＯＣＩＬＲＰ２／ＣＬＥＣ２ｉ、ＯＳＭ  Ｒβ、オクト−３／４、オステオアクチビン／ＧＰＮＭＢ、ＯＧＧ１、オステオアドヘリン、オリグ１、２、３、オステオカルシン、オリグ１、オステオクリン、オリグ２、オステオポンチン、オリグ３、オステオプロテゲリン（Ｏｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ）／ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ、オリゴデンドロサイトマーカーＯ１、Ｏｔｘ２、オリゴデンドロサイトマーカーＯ４、ＯＶ−６、ＯＭｇｐ、ＯＸ４０／ＴＮＦＲＳＦ４、オプチシン、ＯＸ４０リガンド／ＴＮＦＳＦ４、オレキシンＡ、ＲＡＣＫ１、Ｒｅｔ、Ｒａｄ１、ＲＥＶ−ＥＲＢα／ＮＲ１Ｄ１、Ｒａｄ１７、ＲＥＶ−ＥＲＢβ／ＮＲ１Ｄ２、Ｒａｄ５１、Ｒｅｘ−１、Ｒａｅ−１、ＲＧＭ−Ａ、Ｒａｅ−１α、ＲＧＭ−Ｂ、Ｒａｅ−１β、ＲＧＭ−Ｃ、Ｒａｅ−１δ、Ｒｈｅｂ、Ｒａｅ−１ε、リボソームタンパク質Ｓ６、Ｒａｅ−１γ、ＲＩＰ１、Ｒａｆ−１、ＲＯＢＯ１、ＲＡＧＥ、ＲＯＢＯ２、ＲａｌＡ／ＲａｌＢ、ＲＯＢＯ３、ＲａｌＡ、ＲＯＢＯ４、ＲａｌＢ、ＲＯＲ／ＮＲ１Ｆ１−３（パン）、ＲＡＮＫ／ＴＮＦＲＳＦ１１Ａ、ＲＯＲα／ＮＲＩＦ１、ＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳ、ＲＯＲγ／ＮＲｌＦ３、Ｒａｐ１Ａ／Ｂ、ＲＴＫ様オーファン受容体１／ＲＯＲｌ、ＲＡＲα／ＮＲ１Ｂ１、ＲＴＫ様オーファン受容体２／ＲＯＲ２、ＲＡＲβ／ＮＲ１Ｂ２、ＲＰ１０５、ＲＡＲγ／ＮＲ１Ｂ３、ＲＰＡ２、Ｒａｓ、ＲＳＫ（パン）、ＲＢＰ４、ＲＳＫ１／ＲＳＫ２、ＲＥＣＫ、ＲＳＫ１、Ｒｅｇ２／ＰＡＰ、ＲＳＫ２、ＲｅｇＩ、ＲＳＫ３、ＲｅｇＩＩ  ＲＳＫ４、ＲｅｇＩＩＩ、Ｒ−スポンジン１、Ｒｅｇ  ＩＩＩａ、Ｒ−スポンジン２、Ｒｅｇ  ＩＶ、Ｒ−スポンジン３、リラキシン（Ｒｅｌａｘｉｎ）−１、ＲＵＮＸ１／ＣＢＦＡ２、リラキシン−２、ＲＵＮＸ２／ＣＢＦＡ１、リラキシン−３、ＲＵＮＸ３／ＣＢＦＡ３、ＲＥＬＭα、ＲＸＲα／ＮＲ２Ｂ１、ＲＥＬＭβ、ＲＸＲβ／ＮＲ２Ｂ２、ＲＥＬＴ／ＴＮＦＲＳＦ１９Ｌ、ＲＸＲγ／ＮＲ２Ｂ３、レジスチン（Ｒｅｓｉｓｔｉｎ）、Ｓ１００Ａ１０、ＳＬＩＴＲＫ５、Ｓ１００Ａ８、ＳＬＰＩ、Ｓ１００Ａ９、ＳＭＡＣ／Ｄｉａｂｌｏ、Ｓ１００Ｂ、Ｓｍａｄ１、Ｓ１００Ｐ、Ｓｍａｄ２、ＳＡＬＬ１、Ｓｍａｄ３、δ−サーコグリカン（Ｓａｒｃｏｇｌｙｃａｎ）、Ｓｍａｄ４、Ｓｃａ−１／Ｌｙ６、Ｓｍａｄ５、ＳＣＤ−１、Ｓｍａｄ７、ＳＣＦ、Ｓｍａｄ８、ＳＣＦ  Ｒ／ｃ−ｋｉｔ、ＳＭＣ１、ＳＣＧＦ、α−平滑筋アクチン、ＳＣＬ／Ｔａｌ１、ＳＭＵＧ１、ＳＣＰ３／ＳＹＣＰ３、スネイル（Ｓｎａｉ１）、ＣＸＣＬ１２／ＳＤＦ−１、ナトリウムカルシウム交換因子１、ＳＤＮＳＦ／ＭＣＦＤ２、ソギー（Ｓｏｇｇｙ）−１、α−セクレターゼ、ソニックヘッジホッグ、γ−セクレターゼ、ＳｏｒＣＳ１、β−セクレターゼ、ＳｏｒＣＳ３、Ｅ−セレクチン、ソーチリン（Ｓｏｒｔｉｌｉｎ）、Ｌ−セレクチン、ＳＯＳＴ、Ｐ−セレクチン、ＳＯＸ１、セマホリン３Ａ、ＳＯＸ２、セマホリン３Ｃ、ＳＯＸ３、セマホリン３Ｅ、ＳＯＸ７��セマホリン３Ｆ、ＳＯＸ９、セマホリン６Ａ、ＳＯＸ１０、セマホリン６Ｂ、ＳＯＸ１７、セマホリン６Ｃ、ＳＯＸ２１セマホリン６Ｄ、ＳＰＡＲＣ、セマホリン７Ａ、ＳＰＡＲＣ様１、セパラーゼ（Ｓｅｐａｒａｓｅ）、ＳＰ−Ｄ、セリン／スレオニンホスファターゼ基質Ｉ、スピンネシン、セルピンＡ１、Ｆ−スポンジン、セルピンＡ３、ＳＲ−ＡＩ／ＭＳＲ、セルピンＡ４／カリスタチン、Ｓｒｃ、セルピンＡ５／プロテインＣ阻害剤、ＳＲＥＣ−Ｉ／ＳＲ−Ｆ１、セルピンＡ８／アンジオテンシノーゲン、ＳＲＥＣ−ＩＩ、セルピンＢ５、ＳＳＥＡ−１、セルピンＣ１／抗トロンビン−ＩＩＩ、ＳＳＥＡ−３、セルピンＤ１／ヘパリン補因子ＩＩ、ＳＳＥＡ−４、セルピンＥ１／ＰＡＩ−１、ＳＴ７／ＬＲＰ１２、セルピンＥ２、スタビリン−１、セルピンＦ１、スタビリン−２、セルピンＦ２、スタニオカルシン（Ｓｔａｎｎｉｏｃａｌｃｉｎ）１、セルピンＧ１／Ｃ１阻害剤、スタニオカルシン２、セルピンＩ２、ＳＴＡＴ１、血清アミロイドＡ１、ＳＴＡＴ２、ＳＦ−１／ＮＲ５Ａ１、ＳＴＡＴ３、ＳＧＫ、ＳＴＡＴ４、ＳＨＢＧ、ＳＴＡＴ５ａ／ｂ、ＳＨＩＰ、ＳＴＡＴ５ａ、ＳＨＰ／ＮＲ０Ｂ２、ＳＴＡＴ５ｂ、ＳＨＰ−Ｉ、ＳＴＡＴ６、ＳＨＰ−２、ＶＥ−スタチン、ＳＩＧＩＲＲ、ステラ（Ｓｔｅｌｌａ）／Ｄｐｐａ３、シングレック（Ｓｉｇｌｅｃ）−２／ＣＤ２２、ＳＴＲＯ−Ｉ、シングレック−３／ＣＤ３３、サブスタンスＰ、シングレック−５、スルファミダーゼ、スルファミダーゼ／ＳＧＳＨ、シングレック−６、スルファターゼ修飾因子１／ＳＵＭＦ１、シングレック−７、スルファターゼ修飾因子２／ＳＵＭＦ２、シングレック−９、ＳＵＭＯ１、シングレック−１０、ＳＵＭＯ２／３／４、シングレック−１１、ＳＵＭＯ３、シングレック−Ｆ、スーパーオキシドジスムターゼ、ＳＩＧＮＲ１／ＣＤ２０９、スーパーオキシドジスムターゼ−１／Ｃｕ−Ｚｎ  ＳＯＤ、ＳＩＧＮＲ４、スーパーオキシドジスムターゼ−２／Ｍｎ−ＳＯＤ、ＳＩＲＰβ１、スーパーオキシドジスムターゼ−３／ＥＣ−ＳＯＤ、ＳＫＩ、サバイビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）、ＳＬＡＭ／ＣＤ１５０、シナプシン（Ｓｙｎａｐｓｉｎ）Ｉ、スリーピングビューティートランスポサーゼ（Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ  Ｔｒａｎｓｐｏｓａｓｅ）、シンデカン（Ｓｙｎｄｅｃａｎ）−１／ＣＤ１３８、スリット３、シ
ンデカン−２、ＳＬＩＴＲＫ１、シンデカン−３、ＳＬＩＴＲＫ２、シンデカン−４、ＳＬＩＴＲＫ４、ＴＡＣＩ／ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ、ＴＭＥＦＦ１／トモレグリン−１、ＴＡＯ２、ＴＭＥＦＦ２、ＴＡＰＰ１、ＴＮＦ−α／ＴＮＦＳＦ１Ａ、ＣＣＬ１７／ＴＡＲＣ、ＴＮＦβ／ＴＮＦＳＦ１Ｂ、Ｔａｕ、ＴＮＦ  ＲＩ／ＴＮＦＲＳＦＩＡ、ＴＣ２１／Ｒ−Ｒａｓ２、ＴＮＦ  ＲＩＩ／ＴＮＦＲＳＦＩＢ、ＴＣＡＭ−１、ＴＯＲ、ＴＣＣＲ／ＷＳＸ−１、ＴＰ−１、ＴＣ−ＰＴＰ、ＴＰ６３／ＴＰ７３Ｌ、ＴＤＧ、ＴＲ、ＣＣＪＬ２５／ＴＥＣＫ、ＴＲα／ＮＲ１Ａ１、テネイシンＣ、ＴＲβ１／ＮＲ１Ａ２、テネイシンＲ、ＴＲ２／ＮＲ２Ｃ１、ＴＥＲ−１１９、ＴＲ４／ＮＲ２Ｃ２、ＴＥＲＴ、ＴＲＡ−１−８５、テスティカン（Ｔｅｓｔｉｃａｎ）１／ＳＰＯＣＫ１、ＴＲＡＤＤ、テスティカン２／ＳＰＯＣＫ２、ＴＲＡＦ−１、テスティカン３／ＳＰＯＣＫ３、ＴＲＡＦ−２、ＴＦＰＩ、ＴＲＡＦ−３、ＴＦＰＩ−２、ＴＲＡＦ−４、ＴＧＦ−α、ＴＲＡＦ−６、ＴＧＦβ、ＴＲＡＩＬ／ＴＮＦＳＦ１０、ＴＧＦβ１、ＴＲＡＩＬ  Ｒ１／ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＬＡＰ（ＴＧＦβ１）、ＴＲＡＩＬ  Ｒ２／ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ラテント（Ｌａｔｅｎｔ）ＴＧＦβ１、ＴＲＡＩＬ  Ｒ３／ＴＮＦＲＳＦ１０Ｃ、ＴＧＦβ１．２、ＴＲＡＩＬ  Ｒ４／ＴＮＦＲＳＦ１０Ｄ、ＴＧＦβ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＴＮＦＳＦ１１、ＴＧＦβ３、ＴｆＲ（トランスフェリンＲ）、ＴＧＦβ５、アポ−トランスフェリン、ラテントＴＧＦβ  ｂｐ１、ホロ−トランスフェリン、ラテントＴＧＦβ  ｂｐ２、トラッピン−２／エラフィン、ラテントＴＧＦβ  ｂｐ４、ＴＲＥＭ−１、ＴＧＦβ  ＲＩ／ＡＬＫ−５、ＴＲＥＭ−２、ＴＧＦβ  ＲＩＩ、ＴＲＥＭ−３、ＴＧＦβ  ＲＩＩｂ、ＴＲＥＭＬ１／ＴＬＴ−１、ＴＧＦβ  ＲＩＩＩ、ＴＲＦ−１、サーモリシン、ＴＲＦ−２、チオレドキシン−１、ＴＲＨ−分解外酵素／ＴＲＨＤＥ、チオレドキシン−２、ＴＲＩＭ５、チオレドキシン−８０、トリペプチジル−ペプチダーゼＩ、チオレドキシン様５／ＴＲＰ１４、ＴｒｋＡ、ＴＨＯＰｌ、ＴｒｋＢ、トロンボモジュリン／ＣＤ１４１、ＴｒｋＣ、トロンボポエチン、ＴＲＯＰ−２、トロンボポエチンＲ、トロポニンＩペプチド３、トロンボスポンジン−１、トロポニンＴ、トロンボスポンジン−２、ＴＲＯＹ／ＴＮＦＲＳＦ１９、トロンボスポンジン−４、トリプシン１、サイモポエチン、トリプシン２／ＰＲＳＳ２、サイマス（Ｔｈｙｍｕｓ）ケモカイン−１、トリプシン３／ＰＲＳＳ３、タイ（Ｔｉｅ）−１、トリプターゼ−５／Ｐｒｓｓ３２、Ｔｉｅ−２、トリプターゼα／ＴＰＳｌ、ＴＩＭ−１／ＫＩＭ−１／ＨＡＶＣＲ、トリプターゼβ−ｌ／ＭＣＰＴ−７、ＴＩＭ−２、トリプターゼβ−２／ＴＰＳＢ２、ＴＩＭ−３、トリプターゼε／ＢＳＳＰ−４、ＴＩＭ−４、トリプターゼγ−１／ＴＰＳＧｌ、ＴＩＭ−５、トリプトファンヒドロキシラーゼ、ＴＩＭ−６、ＴＳＣ２２、ＴＩＭＰ−１、ＴＳＧ、ＴＩＭＰ−２、ＴＳＧ−６、ＴＩＭＰ−３、ＴＳＫ、ＴＩＭＰ−４、ＴＳＬＰ、ＴＬ１Ａ／ＴＮＦＳＦ１５、ＴＳＬＰ  Ｒ、ＴＬＲ１、ＴＳＰ５０、ＴＬＲ２、β−ＩＩＩチューブリン、ＴＬＲ３、ＴＷＥＡＫ／ＴＮＦＳＦ１２、ＴＬＲ４、ＴＷＥＡＫ  Ｒ／ＴＮＦＲＳＦ１２、ＴＬＲ５、Ｔｙｋ２、ＴＬＲ６、ホスホ−チロシン、ＴＬＲ９、チロシンヒドロキシラーゼ、ＴＬＸ／ＮＲ２Ｅ１、チロシンホスファターゼ基質Ｉ、ユビキチン、ＵＮＣ５Ｈ３、Ｕｇｉ、ＵＮＣ５Ｈ４、ＵＧＲＰ１、ＵＮＧ、ＵＬＢＰ−１、ｕＰＡ、ＵＬＢＰ−２、ｕＰＡＲ、ＵＬＢＰ−３、ＵＲＢ、ＵＮＣ５Ｈ１、ＵＶＤＥ、ＵＮＣ５Ｈ２、バニロイドＲ１、ＶＥＧＦ  Ｒ、ＶＡＳＡ、ＶＥＧＦ  Ｒ１／Ｆｌｔ−１、バソヒビン、ＶＥＧＦ  Ｒ２／ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１、バソリン、ＶＥＧＦ  Ｒ３／Ｆｌｔ−４、バソスタチン、バーシカム（Ｖｅｒｓｉｃａｎ）、Ｖａｖ−１、ＶＧ５Ｑ、ＶＣＡＭ−１、ＶＨＲ、ＶＤＲ／ＮＲ１Ｉ１、ビメンチン、ＶＥＧＦ、ビトロネクチン、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＬＤＬＲ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ｖＷＦ／Ａ２、ＶＥＧＦ−Ｄ、シヌクレイン−α、Ｋｕ７０、ＷＡＳＰ、Ｗｎｔ−７ｂ、ＷＩＦ−Ｉ、Ｗｎｔ−８ａ  ＷＩＳＰ−１／ＣＣＮ４、Ｗｎｔ−８ｂ、ＷＮＫ１、Ｗｎｔ−９ａ、Ｗｎｔ−１、Ｗｎｔ−９ｂ、Ｗｎｔ−３ａ、Ｗｎｔ−１０ａ、Ｗｎｔ−４、Ｗｎｔ−１０ｂ、Ｗｎｔ−５ａ、Ｗｎｔ−１１、Ｗｎｔ−５ｂ、ｗｎｖＮＳ３、Ｗｎｔ７ａ、ＸＣＲｌ、ＸＰＥ／ＤＤＢ１、ＸＥＤＡＲ、ＸＰＥ／ＤＤＢ２、Ｘｇ、ＸＰＦ、ＸＩＡＰ、ＸＰＧ、ＸＰＡ、ＸＰＶ、ＸＰＤ、ＸＲＣＣ１、Ｙｅｓ、ＹＹ１、ＥｐｈＡ４。
【０１７６】
多数のヒトイオンチャネルは特に関心が持たれる標的である。非限定的な例には以下が含まれる：５−ヒドロキシトリプタミン３受容体Ｂサブユニット、５−ヒドロキシトリプタミン３受容体前駆体、５−ヒドロキシトリプタミン受容体３サブユニットＣ、ＡＡＤ１４タンパク質、アセチルコリン受容体タンパク質、αサブユニット前駆体、アセチルコリン受容体タンパク質、βサブユニット前駆体、アセチルコリン受容体タンパク質、δサブユニット前駆体、アセチルコリン受容体タンパク質、εサブユニット前駆体、アセチルコリン受容体タンパク質、γサブユニット前駆体、酸感受性イオンチャネル３スプライシング変種ｂ、酸感受性イオンチャネル３スプライシング変種ｃ、酸感受性イオンチャネル４、ＡＤＰ−リボースピロホスファターゼ、ミトコンドリア前駆体、α１Ａ−電位依存性カルシウムチャネル、アミロリド感受性カチオンチャネル１、ニューロン性アミロリド感受性カチオンチャネル２、ニューロン性アミロリド感受性カチオンチャネル４、アイソフォーム２、アミロリド感受性ナトリウムチャネル、アミロリド感受性ナトリウムチャネルα−サブユニット、アミロリド感受性ナトリウムチャネルβ−サブユニット、アミロリド感受性ナトリウムチャネルδ−サブユニット、アミロリド感受性ナトリウムチャネルγ−サブユニット、アネキシンＡ７、アピカル様タンパク質、ＡＴＰ−感受性内向き整流カリウムチャネル１、ＡＴＰ−感受性内向き整流カリウムチャネル１０、ＡＴＰ−感受性内向き整流カリウムチャネル１１、ＡＴＰ−感受性内向き整流カリウムチャネル１４、ＡＴＰ−感受性内向き整流カリウムチャネル１５、ＡＴＰ−感受性内向き整流カリウムチャネル８、カルシウムチャネルα１２．２サブユニット、カルシウムチャネルα１２．２サブユニット、カルシウムチャネルα１Ｅサブユニット、δ１９  δ４０  δ４６  スプライシング変種、カルシウム活性化カリウムチャネルαサブユニット１、カルシウム活性化カリウムチャネルβサブユニット１、カルシウム活性化カリウムチャネルβサブユニット２、カルシウム活性化カリウムチャネルβサブユニット３、カルシウム依存性塩素チャネル−１、カチオンチャネルＴＲＰＭ４Ｂ、ＣＤＮＡ  ＦＬＪ９０４５３  ｆｉｓ、クローンＮＴ２ＲＰ３００１５４２、カリウムチャネル四量体化ドメイン含有６に高度に類似、ＣＤＮＡ  ＦＬＪ９０６６３  ｆｉｓ、クローンＰＬＡＣＥ１００５０３１、塩素細胞内チャネルタンパク質５に高度に類似、ＣＧＭＰ−で開閉されるカチオンチャネルβサブユニット、塩素チャネルタンパク質、塩素チャネルタンパク質２、塩素チャネルタンパク質３、塩素チャネルタンパク質４、塩素チャネルタンパク質５、塩素チャネルタンパク質６、塩素チャネルタンパク質ＣＩＣ−Ｋａ、塩素チャネルタンパク質Ｃ１Ｃ−Ｋｂ、塩素チャネルタンパク質、骨格筋、塩素細胞内チャネル６、塩素細胞内チャネルタンパク質３、塩素細胞内チャネルタンパク質４、塩素細胞内チャネルタンパク質５、ＣＨＲＮＡ３タンパク質、Ｃｌｅｎ３ｅタンパク質、ＣＬＣＮＫＢタンパク質、ＣＮＧＡ４タンパク質、クリン（Ｃｕｌｌｉｎ）−５、環状ＧＭＰによって開閉されるカリウムチャネル、環状ヌクレオチドによって開閉されるカチオンチ���ネル４、環状ヌクレオチドによって開閉されるカチオンチャネルα３、環状ヌクレオチドによって開閉されるカチオンチャネルβ３、環状ヌクレオチドによって開閉される嗅覚チャネル、嚢胞性線維症膜貫通伝導性調節因子、シトクロムＢ−２４５重鎖、ジヒドロピリジン感受性Ｌ型カルシウムチャネルα−２／δサブユニット前駆体、ＦＸＹＤドメイン含有イオン輸送調節因子３前駆体、ＦＸＹＤドメイン含有イオン輸送調節因子５前駆体、ＦＸＹＤドメイン含有イオン輸送調節因子６前駆体、ＦＸＹＤドメイン含有イオン輸送調節因子７、ＦＸＹＤドメイン含有イオン輸送調節因子８前駆体、Ｇタンパク質−活性化内向き整流カリウムチャネル１、Ｇタンパク質−活性化内向き整流カリウムチャネル２、Ｇタンパク質−活性化内向き整流カリウムチャネル３、Ｇタンパク質−活性化内向き整流カリウムチャネル４、γアミノ酪酸受容体α−１サブユニット前駆体、γ−アミノ酪酸受容体α−２サブユニット前駆体、γアミノ酪酸受容体α−３サブユニット前駆体、γアミノ酪酸受容体α−４サブユニット前駆体、γアミノ酪酸受容体α−５サブユニット前駆体、γアミノ酪酸受容体α−６サブユニット前駆体、γ−アミノ酪酸受容体β−１サブユニット前駆体、γアミノ酪酸受容体β−２サブユニット前駆体、γアミノ酪酸受容体β−３サブユニット前駆体、γアミノ酪酸受容体δサブユニット前駆体、γアミノ酪酸受容体εサブユニット前駆体、γ−アミノ酪酸受容体γ−１サブユニット前駆体、γアミノ酪酸受容体γ−３サブユニット前駆体、γアミノ酪酸受容体πサブユニット前駆体、γアミノ酪酸受容体ρ−１サブユニット前駆体、γアミノ酪酸受容体ρ−２サブユニット前駆体、γアミノ酪酸受容体θサブユニット前駆体、ＧｌｕＲ６カイニン酸受容体、グルタミン酸受容体１前駆体、グルタミン酸受容体２前駆体、グルタミン酸受容体３前駆体、グルタミン酸受容体４前駆体、グルタミン酸受容体７、グルタミン酸受容体Ｂ、グルタミン酸受容体δ−１サブユニット前駆体、グルタミン酸受容体、イオノトロピーカイニン酸１前駆体、グルタミン酸受容体、イオノトロピーカイニン酸２前駆体、グルタミン酸受容体、イオノトロピーカイニン酸３前駆体、グルタミン酸受容体、イオノトロピーカイニン酸４前駆体、グルタミン酸受容体、イオノトロピーカイニン酸５前駆体、グルタミン酸［ＮＭＤＡ］受容体サブユニット３Ａ前駆体、グルタミン酸［ＮＭＤＡ］受容体サブユニット３Ｂ前駆体、グルタミン酸［ＮＭＤＡ］受容体サブユニットε１前駆体、グルタミン酸［ＮＭＤＡ］受容体サブユニットε２前駆体、グルタミン酸［ＮＭＤＡ］受容体サブユニットε４前駆体、グルタミン酸［ＮＭＤＡ］受容体サブユニットζ１前駆体、グリシン受容体α−１鎖前駆体、グリシン受容体α−２鎖前駆体、グリシン受容体α−３鎖前駆体、グリシン受容体β鎖前駆体、Ｈ／ＡＣＡリボヌクレオタンパク質複合体サブユニット１、高親和性面値基グロブリンε受容体β−サブユニット、仮定のタンパク質ＤＫＦＺｐ３１３Ｉ０３３４、仮定のタンパク質ＤＫＦＺｐ７６１Ｍ１７２４、仮定のタンパク質ＦＬＪ１２２４２、仮定のタンパク質ＦＬＪ１４３８９、
仮定のタンパク質ＦＬＪ１４７９８、仮定のタンパク質ＦＬＪ１４９９５、仮定のタンパク質ＦＬＪ１６１８０、仮定のタンパク質ＦＬＪ１６８０２、仮定のタンパク質ＦＬＪ３２０６９、仮定のタンパク質ＦＬＪ３７４０１、仮定のタンパク質ＦＬＪ３８７５０、仮定のタンパク質ＦＬＪ４０１６２、仮定のタンパク質ＦＬＪ４１４１５、仮定のタンパク質ＦＬＪ９０５７６、仮定のタンパク質ＦＬＪ９０５９０、仮定のタンパク質ＦＬＪ９０６２２、仮定のタンパク質ＫＣＴＤ１５、仮定のタンパク質ＭＧＣ１５６１９、イノシトール１，４，５−三リン酸受容体１型、イノシトール１，４，５−三リン酸受容体２型、イノシトール１，４，５−三リン酸受容体３型、中間伝導性カルシウム活性化カリウムチャネルタンパク質４、内向き整流カリウムチャネル１３、内向き整流カリウムチャネル１６、内向き整流カリウムチャネル４、内向き整流Ｋ（＋）チャネルネガティブ調節因子Ｋｉｒ２．２ｖ、カイニン酸受容体サブユニットＫＡ２ａ、ＫＣＮＨ５タンパク質、ＫＣＴＤ１７タンパク質、ＫＣＴＤ２タンパク質、ケラチノサイト関連膜結合タンパク質１、Ｋｖチャネル−相互作用タンパク質４、メラスタチン１、膜タンパク質ＭＬＣ１、ＭＧＣ１５６１９タンパク質、ムコリピン−１、ムコリピン−２、ムコリピン−３、多剤耐性関連タンパク質４、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸受容体２Ｃサブユニット前駆体、ＮＡＤＰＨオキシダーゼホモログ１、Ｎａｖ１．５、ニューロンアセチルコリン受容体タンパク質、α−１０サブユニット前駆体、ニューロンアセチルコリン受容体タンパク質、α−２サブユニット前駆体、ニューロンアセチルコリン受容体タンパク質、α−３サブユニット前駆体、ニューロンアセチルコリン受容体タンパク質、α−４サブユニット前駆体、ニューロンアセチルコリン受容体タンパク質、α−５サブユニット前駆体、ニューロンアセチルコリン受容体タンパク質、α−６サブユニット前駆体、ニューロンアセチルコリン受容体タンパク質、α−７サブユニット前駆体、ニューロンアセチルコリン受容体タンパク質、α−９サブユニット前駆体、ニューロンアセチルコリン受容体タンパク質、β−２サブユニット前駆体、ニューロンアセチルコリン受容体タンパク質、β−３サブユニット前駆体、ニューロンアセチルコリン受容体タンパク質、β−４サブユニット前駆体、ニューロン電位依存性カルシウムチャネルα２Ｄサブユニット、Ｐ２Ｘプリノセプター１、Ｐ２Ｘプリノセプター２、Ｐ２Ｘプリノセプター３、Ｐ２Ｘプリノセプター４、Ｐ２Ｘプリノセプター５、Ｐ２Ｘプリノセプター６、Ｐ２Ｘプリノセプター７、膵臓カリウムチャネルＴＡＬＫ−１ｂ、膵臓カリウムチャネルＴＡＬＫ−１ｃ、膵臓カリウムチャネルＴＡＬＫ−１ｄ、ホスホレマン（Ｐｈｏｓｐｈｏｌｅｍｍａｎ）前駆体、プラスモリピン、多嚢性腎疾患２関連タンパク質、多嚢性腎疾患２様１タンパク質、多嚢性腎疾患２様２タンパク質、多嚢性腎疾患およびエッグジェリー関連タンパク質前駆体のための受容体、ポリシスチン−２、カリウムチャネル調節因子、カリウムチャネルサブファミリーＫメンバー１、カリウムチャネルサブファミリーＫメンバー１０、カリウムチャネルサブファミリーＫメンバー１２、カリウムチャネルサブファミリーＫメンバー１３、カリウムチャネルサブファミリーＫメンバー１５、カリウムチャネルサブファミリーＫメンバー１６、カリウムチャネルサブファミリーＫメンバー１７、カリウムチャネルサブファミリーＫメンバー２、カリウムチャネルサブファミリーＫメンバー３、カリウムチャネルサブファミリーＫメンバー４、カリウムチャネルサブファミリーＫメンバー５、カリウムチャネルサブファミリーＫメンバー６、カリウムチャネルサブファミリーＫメンバー７、カリウムチャネルサブファミリーＫメンバー９、カリウムチャネルテトラマー化ドメイン含有３、カリウムチャネルテトラマー化ドメイン含有タンパク質１２、カリウムチャネルテトラマー化ドメイン含有タンパク質１４、カリウムチャネルテトラマー化ドメイン含有タンパク質２、カリウムチャネルテトラマー化ドメイン含有タンパク質４、カリウムチャネルテトラマー化ドメイン含有タンパク質５、カリウムチャネルテトラマー化ドメイン含有１０、カリウムチャネルテトラマー化ドメイン含有タンパク質１３、カリウムチャネルテトラマー化ドメイン含有１、カリウム電位依存性チャネルサブファミリーＡメンバー１、カリウム電位依存性チャネルサブファミリーＡメンバー２、カリウム電位依存性チャネルサブファミリーＡメンバー４、カリウム電位依存性チャネルサブファミリーＡメンバー５、カリウム電位依存性チャネルサブファミリーＡメンバー６、カリウム電位依存性チャネルサブファミリーＢメンバー１、カリウム電位依存性チャネルサブファミリーＢメンバー２、カリウム電位依存性チャネルサブファミリーＣメンバー１、カリウム電位依存性チャネルサブファミリーＣメンバー３、カリウム電位依存性チャネルサブファミリーＣメンバー４、カリウム電位依存性チャネルサブファミリーＤメンバー１、カリウム電位依存性チャネルサブファミリーＤメンバー２、カリウム電位依存性チャネルサブファミリーＤメンバー３、カリウム電位依存性チャネルサブファミリーＥメンバー１、カリウム電位依存性チャネルサブファミリーＥメンバー２、カリウム電位依存性チャネルサブファミリーＥメンバー３、カリウム電位依存性チャネルサブファミリーＥメンバー４、カリウム電位依存性チャネルサブファミリーＦメンバー１、カリウム電位依存性チャネルサブファミリーＧメンバー１、カリウム電位依存性チャネルサブファミリーＧメンバー２、カリウム電位依存性チャネルサブファミリーＧメンバー３、カリウム電位依存性チャネルサブファミリーＧメンバー４、カリウム電位依存性チャネルサブファミリーＨメンバー１、カリウム電位依存性チャネルサブファミリーＨメンバー２、カリウム電位依存性チャネルサブファミリーＨメンバー３、カリウム電位依存性チャネルサブファミリーＨメンバー４、カリウム電位依存性チャネルサブファミリーＨメンバー５、カリウム電位依存性チャネルサブファミリーＨメンバー６、カリウム電位依存性チャネルサブファミリーＨメンバー７、カリウム電位依存性チャネルサブファミリーＨメンバー８、カリウム電位依存性チャネルサブファミリーＫＱＴメンバー１、カリウム電位依存性チャネルサブファミリーＫＱＴメンバー２、カリウム電位依存性チャネルサブファミリーＫＱＴメンバー３、カリウム電位依存性チャネルサブファミリーＫＱＴメンバー４、カリウム電位依存性チャネルサブファミリーＫＱＴメンバー５、カリウム電位依存性チャネルサブファミリーＳメンバー１、カリウム電位依存性チャネルサブファミリーＳメンバー２、カリウム電位依存性チャネルサブファミリーＳメンバー３、カリウム電位依存性チャネルサブファミリーＶメンバー２、カリウム電位依存性チャネルサブファミリーＨ、メンバー７、アイソフォーム２、カリウム／ナトリウム過分極−活性化環状ヌクレオチド−開閉チャネル１、カリウム／ナトリウム過分極−活性化環状ヌクレオチド−開閉チャネル２、カリウム／ナトリウム過分極−活性化環状ヌクレオチド−開閉チャネル３、カリウム／ナトリウム過分極−活性化環状ヌクレオチド−開閉チャネル４、可能なミトコンドリア移入受容体サブユニットＴＯＭ４０ホモログ、プリン作動性受容体Ｐ２Ｘ５、アイソフォームＡ、推定の４反復電位依存性イオンチャネル、推定の塩素チャネルタンパク質７、推定のＧｌｕＲ６カイニン酸受容体、推定のイオンチャネルタンパク質ＣＡＴＳＰＥＲ２変種１、推定のイオンチャネルタンパク質ＣＡＴＳＰＥＲ２変種２、推定のイオンチャネルタンパク質ＣＡＴＳＰＥＲ２変種３、推定のカリウムチャネルタンパク質の調節因子変種１、推定のチロシン−タンパク質ホスファターゼＴＰＴＥ、リアノジン受容体１、リアノジン受容体２、リアノジン受容体３、ＳＨ３ＫＢＰ１結合タンパク質１、短期（Ｓｈｏｒｔ）一過性受容体潜在的チャネル１、短期一過性受容体潜在的チャネル４、短期一過性受容体潜在的チャネル５、短期一過性受容体潜在的チャネル６、短期一過性受容体潜在的チャネル７、低伝導度（Ｓｍａｌｌ  ｃｏｎｄｕｃｔａｎｃｅ）カルシウム活性化カリウムチャネルタンパク質１、低伝導度カルシウム活性化カリウムチャネルタンパク質２、アイソフォームｂ、低伝導度カルシウム活性化カリウムチャネルタンパク質３、アイソフォームｂ、低伝導度カルシウム活性化カリウムチャネルＳＫ２、低伝導度カルシウム活性化カリウムチャネルＳＫ３、ナトリウムチャネル、ナトリウムチャネルβ−１サブユニット前駆体、ナトリウムチャネルタンパク質ＩＩα型サブユニット、ナトリウムチャネルタンパク質ＩＩＩα型サブユニット、ナトリウムチャネルタンパク質ＩＶα型サブユニット、ナトリウムチャネルタンパク質ＩＸα型サブユニット、ナトリウムチャネルタンパク質Ｖα型サブユニット、ナトリウムチャネルタンパク質ＶＩＩα型サブユニット、ナトリウムチャネルタンパク質ＶＩＩＩα型サブユニット、ナトリウムチャネルタンパク質Ｘα型サブユニット、ナトリウムチャネルタンパク質ＸＩα型サブユニット、ナトリウム−および塩素−活性化ＡＴＰ−感受性カリウムチャネル、ナトリウム／カリウム−輸送ＡＴＰアーゼγ鎖、精子関連カチオンチャネル１、精子関連カチオンチャネル２、アイソフォーム４、シンタキシン−１Ｂ１、一過性受容体潜在的カチオンチャネルサブファミリーＡメンバー１、一過性受容体潜在的カチオンチャネルサブファミリーＭメンバー２、一過性受容体潜在的カチオンチャネルサブファミリーＭメンバー３、一過性受容体潜在的カチオンチャネルサブファミリーＭメンバー６、一過性受容体潜在的カチオンチャネルサブファミリーＭメンバー７、一過性受容体潜在的カチオンチャネルサブファミリーＶメンバー１、一過性受容体潜在的カチオンチャネルサブファミリーＶメンバー２、一過性受容体潜在的カチオンチャネルサブファミリーＶメンバー３、一過性受容体潜在的カチオンチャネルサブファミリーＶメンバー４、一過性受容体潜在的カチオンチャネルサブファミリーＶメンバー５、一過性受容体潜在的カチオンチャネルサブファミリーＶメンバー６、一過性受容体潜在的チャネル４εスプライシング変種、一過性受容体潜在的チャネル４ζスプライシング変種、一過性受容体潜在的チャネル７γスプライシング変種、腫瘍壊死因子α−誘導性タンパク質１、内皮、
２ポアカルシウムチャネルタンパク質２、ＶＤＡＣ４タンパク質、電位依存性カリウムチャネルＫｖ３．２ｂ、電位依存性ナトリウムチャネルβ１Ｂサブユニット、電位依存性アニオンチャネル、電位依存性アニオンチャネル２、電位依存性アニオン選択性チャネルタンパク質１、電位依存性アニオン選択性チャネルタンパク質２、電位依存性アニオン選択性チャネルタンパク質３、電位依存性カルシウムチャネルγ−１サブユニット、電位依存性カルシウムチャネルγ−２サブユニット、電位依存性カルシウムチャネルγ−３サブユニット、電位依存性カルシウムチャネルγ−４サブユニット、電位依存性カルシウムチャネルγ−５サブユニット、電位依存性カルシウムチャネルγ−６サブユニット、電位依存性カルシウムチャネルγ−７サブユニット、電位依存性カルシウムチャネルγ−８サブユニット、電位依存性Ｌ型カルシウムチャネルα−１Ｃサブユニット、電位依存性Ｌ型カルシウムチャネルα−ＩＤサブユニット、電位依存性Ｌ型カルシウムチャネルα−ｌＳサブユニット、電位依存性Ｌ型カルシウムチャネルβ−１サブユニット、電位依存性Ｌ型カルシウムチャネルβ−２サブユニット、電位依存性Ｌ型カルシウムチャネルβ−３サブユニット、電位依存性Ｌ型カルシウムチャネルβ−４サブユニット、電位依存性Ｎ型カルシウムチャネルα−１Ｂサブユニット、電位依存性Ｐ／Ｑ型カルシウムチャネルα−１Ａサブユニット、電位依存性Ｒ型カルシウムチャネルα−１Ｅサブユニット、電位依存性Ｔ型カルシウムチャネルα−１Ｇサブユニット、電位依存性Ｔ型カルシウムチャネルα−１Ｈサブユニット、電位依存性Ｔ型カルシウムチャネルα−１Ｉサブユニット、電位依存性Ｌ型カルシウムチャネルα−１サブユニット電位依存性カリウムチャネルβ−１サブユニット、電位依存性カリウムチャネルβ−２サブユニット、電位依存性カリウムチャネルβ−３サブユニット、電位依存性カリウムチャネルＫＣＮＡ７。
【０１７７】
例示的なＧＰＣＲには以下が含まれるがこれらに限定されない：クラスＡロドプシン様受容体、例えば、Ｍｕｓｃ．アセチルコリン脊椎動物１型、Ｍｕｓｃ．アセチルコリン脊椎動物２型、Ｍｕｓｃ．アセチルコリン脊椎動物３型、Ｍｕｓｃ．アセチルコリン脊椎動物４型；アデノセプター（αアデノセプター１型、αアデノセプター２型、βアデノセプター１型、βアデノセプター２型、βアデノセプター３型、ドーパミン脊椎動物１型、ドーパミン脊椎動物２型、ドーパミン脊椎動物３型、ドーパミン脊椎動物４型、ヒスタミン１型、ヒスタミン２型、ヒスタミン３型、ヒスタミン４型、セロトニン１型、セロトニン２型、セロトニン３型、セロトニン４型、セロトニン５型、セロトニン６型、セロトニン７型、セロトニン８型、他の型のセロトニン、微量アミン、アンジオテンシン１型、アンジオテンシン２型、ボンベシン、ブラジキニン、Ｃ５ａアナフィラトキシン、Ｆｍｅｔ−ｌｅｕ−ｐｈｅ、ＡＰＪ様、インターロイキン−８  Ａ型、インターロイキン−８  Ｂ型、インターロイキン−８  他の型、Ｃ−Ｃケモカイン１型〜１１型および他の型、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン（２型〜６型および他の型）、Ｃ−Ｘ３−Ｃ、コレシストキニンＣＣＫ、ＣＣＫ  Ａ型、ＣＣＫ  Ｂ型、ＣＣＫ  他の型、エンドセリン、メラノコルチン（メラノサイト刺激ホルモン、副腎皮質刺激ホルモン、メラノコルチンホルモン）、Ｄｕｆｆｙ抗原、プロラクチン放出ペプチド（ＧＰＲ１０）、ニューロペプチドＹ（１型〜７型）、ニューロペプチドＹ、ニューロペプチドＹ  他、ニューロテンシン、オピオイド（Ｄ型、Ｋ型、Ｍ型、Ｘ型）、ソマトスタチン（１型〜５型）、タキキニン（サブスタンスＰ（ＮＫｌ）、サブスタンスＫ（ＮＫ２）、ニューロメジンＫ（ＮＫ３）、タキキニン様１、タキキニン様２、バソプレッシン／バソトシン（１型〜２型）、バソトシン、オキシトシン／メソトシン、コノプレッシン、ガラニン様、プロテイナーゼ活性化様、オレキシンおよびニューロペプチドＦＦ、ＱＲＦＰ、ケモカイン受容体様、ニューロメジンＵ様（ニューロメジンＵ、ＰＲＸアミド）、ホルモンタンパク質（卵胞刺激ホルモン、ルトロピン−絨毛性ゴナドトロピンホルモン、サイロトロピン、ゴナドトロピンＩ型、ＩＩ型）、（ロド）プシン、ロドプシン脊椎動物（１〜５型）、ロドプシン脊椎動物５型、ロドプシン節足動物、ロドプシン節足動物１型、ロドプシン節足動物２型、ロドプシン節足動物３型、ロドプシン軟体動物、ロドプシン、嗅覚（嗅覚ＩＩ  ｆａｍ１〜１３）、プロスタグランジン（プロスタグランジンＥ２サブタイプＥＰ１、プロスタグランジンＥ２／Ｄ２サブタイプＥＰ２、プロスタグランジンＥ２サブタイプＥＰ３、プロスタグランジンＥ２サブタイプＥＰ４、プロスタグランジンＦ２−α、プロスタサイクリン、トロンボキサン、アデノシン１型〜３型、プリノセプター、プリノセプターＰ２ＲＹ１−４、６、１１ＧＰＲ９１、プリノセプターＰ２ＲＹ５、８、９、１０ＧＰＲ３５、９２、１７４、プリノセプターＰ２ＲＹ１２−１４ＧＰＲ８７（ＵＤＰ−グルコース）、カンナビノイド、血小板活性化因子、ゴナドトロピン放出ホルモン、ゴナドトロピン放出ホルモンＩ型、ゴナドトロピン放出ホルモンＩＩ型、脂��動員ホルモン様、コラゾニン、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモンおよび分泌促進物質、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン、成長ホルモン分泌促進物質、成長ホルモン分泌促進物質様、脱皮誘発ホルモン（ＥＴＨＲ）、メラトニン、リゾスフィンゴ脂質およびＬＰＡ（ＥＤＧ）、スフィンゴシン１−リン酸Ｅｄｇ−１、リゾホスファチジン酸Ｅｄｇ−２、スフィンゴシン１−リン酸Ｅｄｇ−３、リゾホスファチジン酸Ｅｄｇ−４、スフィンゴシン１−リン酸Ｅｄｇ−５、スフィンゴシン１−リン酸Ｅｄｇ−６、リゾホスファチジン酸Ｅｄｇ−７、スフィンゴシン１−リン酸Ｅｄｇ−８、Ｅｄｇの他のロイコトリエンＢ４受容体、ロイコトリエンＢ４受容体ＢＬＴ１、ロイコトリエンＢ４受容体ＢＬＴ２、クラスＡオーファン／他、推定の神経伝達物質、ＳＲＥＢ、ＭａｓプロトオンコジーンおよびＭａｓ関連（ＭＲＧ）、ＧＰＲ４５様、システイニルロイコトリエン、Ｇ−タンパク質共役胆汁酸受容体、遊離脂肪酸受容体（ＧＰ４０、ＧＰ４１、ＧＰ４３）、クラスＢセクレチン様、カルシトニン、副腎皮質刺激ホルモン放出因子、胃抑制ペプチド、グルカゴン、成長ホルモン放出ホルモン、副甲状腺ホルモン、ＰＡＣＡＰ、セレクチン、血管作動性腸ポリペプチド、ラトロフィリン、ラトロフィリン１型、ラトロフィリン２型、ラトロフィリン３型、ＥＴＬ受容体、脳特異的血管新生阻害剤（ＢＡＩ）、Ｍｅｔｈｕｓｅｌａｈ様タンパク質（ＭＴＨ）、カドヘリンＥＧＦ  ＬＡＧ（ＣＥＬＳＲ）、非常に大きなＧ−タンパク質共役受容体、クラスＣ代謝調節型グルタミン酸／フェロモン、代謝調節型グルタミン酸グループＩ〜ＩＩＩ、カルシウム感受性様、細胞外カルシウム感受性、フェロモン、カルシウム感受性様  他、推定のフェロモン受容体、ＧＡＢＡ−Ｂ、ＧＡＢＡ−Ｂサブタイプ１、ＧＡＢＡ−Ｂサブタイプ２、ＧＡＢＡ−Ｂ様、オーファンＧＰＲＣ５、オーファンＧＰＣＲ６、セブンレスタンパク質のブライド（ＢＯＳＳ）、味覚受容体（Ｔ１Ｒ）、クラスＤ真菌フェロモン、真菌フェロモンＡ−因子様（ＳＴＥ２．ＳＴＥ３）、真菌フェロモンＢ様（ＢＡＲ、ＢＢＲ、ＲＣＢ、ＰＲＡ）、クラスＥ  ｃＡＭＰ受容体、眼白子症タンパク質、フリズルド／スムーズンドファミリー、フリズルドグループＡ（Ｆｚ１および２および４および５および７〜９）、フリズルドグループＢ（Ｆｚ３および６）、フリズルドグループＣ（他）、鋤鼻受容体、線虫化学受容体、昆虫臭気受容体、およびクラスＺ古細菌／細菌／真菌オプシン。
【０１７８】
対象ＭＵＲＰは、細胞表面タンパク質、分泌タンパク質、細胞質タンパク質、および核タンパク質を含むがこれらに限定されない任意の細胞タンパク質を標的化するために設計することができる。特に関心が持たれる標識はイオンチャネルである。
【０１７９】
イオンチャネルは、カリウムチャネル（Ｋ−チャネル）のファミリー、ナトリウムチャネル（Ｎａ−チャネル）のファミリー、塩素チャネル（Ｃｌ−チャネル）のファミリー、およびアセチルコリンチャネルのファミリーを含む、タンパク質のスーパーファミリーを構成する。これらのファミリーの各々がサブファミリーを含み、各サブファミリーは、典型的には、単一の遺伝子から誘導された特定のチャネルを含む。例えば、Ｋ−チャネルファミリーは、Ｋｖ１．ｘおよびＫｖ３．ｘと呼ばれる電位依存性Ｋ−チャネルのサブファミリーを含む。サブファミリーＫｖ１．ｘは、チャネルＫｖ１．１、Ｋｖ１．２、およびＫｖ１．３を含み、これらは、単一の遺伝子の産物に対応し、従って「種」と呼ばれる。この分類は、Ｎａ−、Ｃａ−、Ｃｌ−および他のファミリーのチャネルに同様に適用される。
【０１８０】
イオンチャネルはまた、チャネルが操作されるメカニズムに従って分類することができる。具体的には、特定のイオンがチャネルタンパク質から浸透すること、および脂質二重膜を通過することを可能にするかまたはそれを妨害するかのいずれかのためにチャネルタンパク質を開くまたは閉じるために利用される方法によって、多くの型のイオンチャネルタンパク質が特徴付けられる。チャネルタンパク質の１つの重要な型は、電位依存性チャネルタンパク質であり、これは、細胞膜にかかる電位の変化に応答して開かれるかまたは閉じられる（開閉される）。電位依存性ナトリウムチャネル１．６（Ｎａｖ１．６）は、治療標的として特に関心が持たれるものである。別の型のイオンチャネルは、機械的に開閉するチャネルであり、タンパク質に対する機械的なストレスがチャネルを開くかまたは閉じる。なお別の型は、リガンド開閉チャネルと呼ばれ、これは、特定のリガンドがタンパク質に結合しているか否かに依存して、開くかまたは閉じる。このリガンドは、神経伝達物質などのような細胞外部分であるか、またはイオンもしくはヌクレオチドなどのような細胞内部分であり得る。
【０１８１】
イオンチャネルは、一般的には、電気化学的勾配を下るイオンの受動的流動を許容するのに対して、イオンポンプは、ＡＴＰを使って勾配に逆らって輸送する。対向輸送体および共輸送体の両方である共役トランスポーターは、その勾配に逆らって１つのイオン種の移動を許容し、これは、別のイオン種の下り方向の移動によって動いている。
【０１８２】
ほぼすべての動物細胞の膜において見出される最も一般的な型のチャネルタンパク質の１つは、細胞膜を横切るカリウムイオンの特異的浸透を許容する。特に、カリウムイオンは、Ｋ＋チャネルタンパク質を通して細胞膜を横切って迅速に浸透する（１秒あたり１０−８イオンまで）。さらに、カリウムチャネルタンパク質は、カリウムイオンと、他の小さなアルカリ金属、例えば、Ｌｉ＋またはＮａ＋の間を高い忠実度で区別する能力を有する。特に、カリウムイオンは、ナトリウムイオンよりも、少なくとも１０倍多く常在している。カリウムチャネルタンパク質は、典型的には、４つのサブユニット（通常は同一である）を含み、そこで、それらの細胞表面標的は四量体として存在し、ＭＵＲＰの４価の結合を可能にする。１つの型のサブユニットは６個の長さの疎水性セグメント（これは膜貫通性であってよい）を含むのに対して、他の型は２つの疎水性セグメントを含む。
【０１８３】
別の顕著なチャネルのファミリーはカルシウムチャネルである。カルシウムは、一般的に、それらの電気生理学的特性に従って、低電位活性化（ＬＶＡ）チャネルまたは高電位活性化（ＨＶＡ）チャネルとして分類される。ＨＶＡチャネルには、Ｌ−、Ｎ−およびＰ／Ｑ−型チャネルとして知られる少なくとも３つのグループが含まれる。これらのチャネルは、電気生理学的に、ならびにそれらの薬理学的特性およびリガンド結合特性に基づいて生理学的に、互いから区別されてきた。例えば、ジヒドロピリジン、ジフェニルアルキルアミン、およびピペリジンは、Ｌ型カルシウムチャネルのα１サブユニットに結合し、神経組織中で一定の割合のＨＶＡカルシウム流を遮断し、これはＬ型カルシウム流と呼ばれる。Ｎ型カルシウムチャネルは、ωコノペプチドに感受性であるが、ニモジピンおよびニフェジピンなどのジヒドロピリジン化合物に対しては比較的感受性ではない。他方、Ｐ／Ｑ型チャネルは、ジニドロピリジンに感受性ではないが、フンネルウェブスパイダー（ｆｕｎｎｅｌ  ｗｅｂ  ｓｐｉｄｅｒ）のトキシンＡｇａ  ＩＩＩＡに感受性である。Ｒ型カルシウムチャネルは、Ｌ−、Ｎ−、Ｐ−およびＱ−型のチャネルと同様に、大きな膜脱分極によって活性化され、従って、高電位活性化（ＨＶＡ）チャネルとして分類される。Ｒ型チャネルは、一般的に、ジヒドロピリジンおよびωコノペプチドに感受性でないが、Ｐ／Ｑ、Ｌ、およびＮチャネルと同様に、フンネルウェブスパイダーのトキシンＡｇａＩＶＡに感受性である。免疫細胞化学染色研究は、これらのチャネルが脳の全体を通して、特に、深い正中構造（尾状核被殻、視床、視床下部、扁桃体、小脳）ならびに腹側中脳および脳幹の核に局在していることを示す。神経の電位感受性カルシウムチャネルは、典型的には、中心のα１サブユニット、α２／βサブユニット、βサブユニット、および９５ｋＤサブユニットからなる。
【０１８４】
さらなる非限定的な例には、Ｋｉｒ（内向き整流性カリウムチャネル）、Ｋｖ（電位依存性カリウムチャネル）、Ｎａｖ（電位依存性ナトリウムチャネル）、Ｃａｖ（電位依存性カルシウムチャネル）、ＣＮＧ（環状ヌクレオチド依存性チャネル）、ＨＣＮ（過分極活性化チャネル）、ＴＲＰ（一過性受容体電位チャネル）、ＣｌＣ（塩素チャネル）、ＣＦＴＲ（嚢胞性線維症膜貫通伝導度調節因子、塩素チャネル）、ＩＰ３Ｒ（イノシトール三リン酸受容体）、ＲＹＲ（リアノジン受容体）が含まれる。他のチャネル型は、２ポアチャネル、グルタミン酸受容体（ＡＭＰＡ、ＮＭＤＡ、ＫＡ）、Ｍ２、コネキシン、およびＣｙｓループ受容体である。
【０１８５】
Ｋｖ１．２、Ｋｖ３．１、Ｓｈａｋｅｒ、ＴＲＰＣ１、およびＴＲＰＣ５などのイオンチャネルタンパク質の共通の配置は、以下のように配置されている６個の膜貫通セグメントを有することである：
Ｎ末端−Ｓ１−Ｅ１−Ｓ２−Ｘ１−Ｓ３−Ｅ２−Ｓ４−Ｘ２−Ｓ５−Ｅ３−Ｓ６−Ｃ末端。
【０１８６】
Ｓ１−６が膜貫通配列である場合、Ｅ１−３は細胞外表面ループであり、Ｘ１−２は細胞内表面ループである。Ｅ３ループは、一般的に、３つの細胞外ループのうちの最長のものでありかつ親水性であるので、これは、薬物およびＭＵＲＰが結合するための良好な標的である。多くのチャネルのポア形成部分は、膜貫通αヘリックスの多量性（例えば、四量体性またはまれに五量体性）複合体である。一般的にポアループが存在し、これは、膜に戻るループを形成するタンパク質の領域であり、どのイオン種が浸透し得るかを決定する選択性のフィルターを形成する。このようなチャネルは「ポア−ループ」チャネルと呼ばれる。
【０１８７】
イオンチャネルは、これらが広範な生理学的プロセスに関与するので、薬物設計のための価値のある標的である。ヒトにおいては、およそ３００を超えるイオンチャネルタンパク質が存在しており、その多くは、遺伝病と関係付けられている。例えば、イオンチャネルの異常な発現または機能は、心臓、神経、筋肉、呼吸、代謝の疾患を含む、広範な疾患を引き起こすことが示されてきた。この節はイオンチャネルに焦点を当てているが、同じ概念およびアプローチは、７ＴＭ、ＩＴＭ、Ｇ−タンパク質、およびＧ−タンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）などを含むすべての膜タンパク質に等しく適用可能である。いくつかのイオンチャネルはＧＰＧＲである。
【０１８８】
イオンチャネルは、典型的には、強固に結合したアクセサリータンパク質サブユニットを含む大きな高分子複合体を形成し、このようなサブユニットの組み合わせ使用は、イオンチャネルの多様性に寄与する。これらのアクセサリータンパク質はまた、対象のＭＵＲＰ、マイクロプロテイン、およびトキシンの結合標的でもあり得る。
【０１８９】
対象ＭＵＲＰは、当該分野において公知である任意のチャネル、および本明細書で特に例示されるものに結合するように設計することができる。所望のイオンチャネル結合能力（特異性およびアビディティを包含する）を示すＭＵＲＰは、当該分野において公知である任意の組換えおよび生化学的（例えば、発現およびディスプレイ）技術によって選択することができる。例えば、ＭＵＲＰは、ファージおよび胞子を含むがこれらに限定されない遺伝子パッケージによってディスプレイすることができ、そしてインタクトな細胞膜、または好ましくは、インタクトな細胞、例えば、全体の哺乳動物細胞に対するパニングに供することができる。他の非標的細胞表面に結合するファージを除去するために、標準的なアプローチは、低いかまたは検出不可能なレベルの標的受容体を有する類似の細胞株に対する差し引きパニングを実施することであった。しかし、Ｐｏｐｋｏｖら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２９１：１３７−１５１（２００４））は、関連する細胞型が差し引きのためには理想的ではないことを示した。なぜなら、これらは一般的に、減少しているがなお有意なレベルの標的をそれらの表面に有し、このことが所望のファージクローンの数を減少するからである。標的をコードする遺伝子とともにトランスフェクトし、続いて、トランスフェクトしなかった同じ細胞株上でのネガティブ選択／差し引きを行った細胞上でのパニングのときでさえも、とりわけ、ネイティブ標的遺伝子をノックアウトしなかったときに、この問題は起こった。その代わりに、Ｐｏｐｋｏｖらは、標的がここで、活性部位を利用不可能にする高親和性、標的特異的阻害剤、例えば、低分子、ペプチド、または標的に対する抗体でブロックされた場合を例外として、通常のパニング（ポジティブ選択）のために使用されるのと同じ過度の細胞を用いて実施したならば、ネガティブ選択または差し引きパニングがはるかに良好に働くことを示した。このプロセスは「エピトープマスクした細胞を用いるネガティブ選択」と呼ばれ、これは、所望のイオンチャネル結合能を有する対象のＭＵＲＰを選択する際に特に有用である。
【０１９０】
別々の実施形態において、本発明は、マイクロプロテイン、特に、イオンチャネルの少なくとも１つのファミリーに向けた結合能を示すマイクロプロテインを提供する。本発明は、このようなマイクロプロテインをディスプレイする遺伝子パッケージも提供する。対象のマイクロプロテインが結合する非限定的なイオンチャネルの例は、ナトリウムチャネル、カリウムチャネル、カルシウムチャネル、アセチルコリンチャネル、および塩素チャネルである。特に関心が持たれるものは、ネイティブ標的に向けて結合能を示す、マイクロプロテイン、およびこのようなマイクロプロテインをディスプレイする遺伝子パッケージである。ネイティブ標的は、一般的には、マイクロプロテインが結合することが知られている、天然の分子またはフラグメント、その誘導体であり、典型的には、文献に報告されている既知の結合標的が含まれる。
【０１９１】
本発明はまた、修飾されている、イオンチャネル結合マイクロプロテインをディスプレイする遺伝子パッケージも提供する。修飾マイクロプロテインは、（ａ）対応する非修飾マイクロプロテインと比較して、異なるチャネルのファミリーに結合し；（ｂ）対応する非修飾マイクロプロテインと比較して、同じチャネルファミリーの異なるサブファミリーに結合し；（ｃ）対応する非修飾マイクロプロテインと比較して、同じチャネルのサブファミリーの異なる種に結合し；（ｄ）対応する非修飾マイクロプロテインと比較して、同じチャネル上の異なる部位に結合し；および／または（ｅ）対応する非修飾マイクロプロテインと比較して、同じチャネルの同じ部位に結合するが、異なる生物学的効果を生じる可能性がある。
【０１９２】
図２２および４６は、同じイオンチャネルの異なる部位で各々結合するマイクロプロテインドメインまたはトキシンが、いかにして単一のタンパク質に合わせることが可能かを示す。２つのマイクロプロテインが結合する２つの結合部位は、異なるファミリーからの２つのチャネル、同じファミリーであるが異なるサブファミリーからの２つのチャネル、同じサブファミリーであるが異なる種（遺伝子産物）からの２つのチャネル、もしくは同じチャネル（種）の２つの異なる結合部位であり得、またはこれらは、同じチャネル（種）の同じ結合部位に（同時または同時ではなく）結合し得る。なぜなら、チャネルは多量体であるからである。結合モジュールおよびチャネル上の部位に結合するドメインは、マイクロプロテインドメイン（天然または非天然、２〜８個のジスルフィドを含む）、１ジスルフィドペプチド、または直鎖状ペプチドであり得る。これらのモジュールは独立的に選択されかつ合わされることが可能であり、または１つの固定した活性結合モジュールの存在下で結合するようにライブラリーから選択することができる。この後者の場合には、ディスプレイライブラリーは複数のモジュールをディスプレイし、その１つが１つの変種のライブラリーを含む。典型的な目的は、出発点であった活性単量体よりも、高い親和性を有する二量体を選択することである。
【０１９３】
別の実施形態において、本発明は、複数のイオンチャネル結合ドメインを含むタンパク質を提供し、個々のドメインは以下のように修飾されたマイクロプロテインドメインである：
（ａ）マイクロプロテインドメインは、対応する非修飾マイクロプロテインと比較して、異なるチャネルのファミリーに結合する；（ｂ）マイクロプロテインドメインは、対応する非修飾マイクロプロテインと比較して、同じチャネルファミリーの異なるサブファミリーに結合する；（ｃ）マイクロプロテインドメインは、対応する非修飾マイクロプロテインと比較して、同じサブファミリーの異なる種に結合する；（ｄ）マイクロプロテインドメインは、対応する非修飾マイクロプロテインと比較して、同じチャネル上の異なる部位に結合する；（ｅ）マイクロプロテインドメインは、対応する非修飾マイクロプロテインと比較して、同じチャネルの同じ部位に結合するが、異なる生物学的効果を生じる；および／または（ｆ）マイクロプロテインドメインは、対応する非修飾マイクロプロテインと比較して、同じチャネルの同じ部位に結合して、同じ生物学的効果を生じる。所望される場合、マイクロプロテインドメインは、天然または非天然配列を含み得る。個々のドメインは、異種リンカーを介して一緒に連結することができる。個々のマイクロプロテインドメインは、同じまたは異なるチャネルファミリー、同じまたは異なるチャネルサブファミリー、同じサブファミリーの同じまたは異なる種、同じチャネルの同じまたは異なる部位に結合し得る。
【０１９４】
対象のマイクロプロテインはトキシンであり得る。好ましくは、このトキシンは、その毒性スペクトルを部分的にまたは全体的に保持している。特に、ヘビなどの毒性動物は、一連の範囲の餌および侵入者の種に遭遇し、毒素のトキシンは、異なる種の異なる受容体の活性が異なる。毒は、多数の関連するトキシンおよび関連のないトキシンからなり、各トキシンは、トキシンが測定可能な活性を有するすべての種からのすべての受容体として定義され得る「活性のスペクトル」を有する。「活性のスペクトル」のすべての標的は「ネイティブ標的」と見なされ、これは、トキシンがそれに対して活性である任意のヒト標的を含む。マイクロプロテインまたはトキシンのネイティブ標的は、トキシンが阻害することが文献中で報告されている標的のすべてを含む。標的に対する親和性または活性が高くなるほど、標的が天然のネイティブ標的である可能性がより高まるが、同じ種の中で複数の標的に対して作用するトキシンについては一般的ではない。ネイティブ標的は、トキシンがそれに対して活性である非ヒト受容体であり得る。
【０１９５】
ディスプレイベクターへの融合後にトキシンが細胞に結合する能力を保持するために、好ましくは、最小のアミノ酸鎖を形成し、電荷を有さず、そして標的へのトキシンの結合と適合可能である可能性が最も高いグリシンリッチリンカーのライブラリーをコードする合成ＤＮＡライブラリーアプローチを使用して、融合物についてＮ末端およびＣ末端の両方を試験すること、および種々の融合部位（すなわち、最初のシステインの前、またはトキシンドメインの最後のシステインの後の０、１、２、３、４、５、６アミノ酸、トキシンドメインがシステイン含有ドメインである場合）を試験することが所望され得る。Ｎ末端アミノ基およびＣ末端カルボキシル基は標的結合に関与する可能性があるので、ライブラリーは、正に荷電したアミノ基（またはトキシンのＮ末端への融合物）を模倣するためのリジンまたはアルギニン、および負に荷電したカルボキシル基（トキシンのＣ末端への融合物）を模倣するためのグルタミン酸またはアスパラギン酸を含む必要がある。
【０１９６】
ネガティブ選択の間に標的をブロックするために使用される阻害剤は、低分子、ペプチド、またはタンパク質であり得、そして天然または非天然であり得る。単純な差し引きに加えて、阻害剤の混合物の選択は、設計されているイオンチャネル阻害剤の特異性を制御するための価値のあるツールである。部分的に重複する特性および配列の類似性ならびにチャネルあたり複数のモジュール部位を有する、全体で３００種を超えるイオンチャネルが存在しているので、各々は異なる効果を有し、特異性の要求は複雑であり得る。
【０１９７】
トキシンの活性を修飾する場合、または２種の異なるトキシンを単一のタンパク質に合わせる場合、２種のトキシンは、同じチャネルに同じ部位で結合し得、かつ同じ生理学的効果を有し得、または２種のトキシンは、同じチャネルに同じ部位で結合し得、かつ異なる生理学的効果を有し得、または２種のトキシンは、同じチャネルに異なる部位で結合し得、または２種のトキシンは、同じサブファミリーに属する異なるチャネル（すなわち、Ｋｖ１．３対Ｋｖ１．２；異なる遺伝子または「種」の産物を意味する）に結合し得、または２種のトキシンは、同じファミリーに属する異なるチャネル（すなわち、両方ともＫ−チャネル）に結合し得、または２種のトキシンは、異なるファミリーに属するチャネル（すなわち、Ｋ−チャネル対Ｎａ−チャネル）に結合し得る。
【０１９８】
イオンチャネルは、典型的には、多くの膜貫通セグメント（ナトリウムチャネルでは２４個）を有し、従って、モジュレーターに多数の異なる非競合的かつ非重複結合部位を提供し、異なる方法でチャネルの活性を変化させる。１つのアプローチは、たとえ部位が関連していない場合であっても、異なる部位のための既存の結合因子から、同じイオンチャネル上の１つの部位のための結合因子を作製することである。これを達成するために、既存のトキシンは、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、または５０アミノ酸の柔軟性リンカーによって標的化トキシンから分かれている１−、２−、３−、または４−ジスルフィドタンパク質のライブラリーのための標的化剤として使用することができる。これは、標的化剤の親和性が高すぎない場合に有用であり、その結果、新たなライブラリーの親和性は、全体の親和性に対して有意な寄与を有し得ない。別のアプローチは、配列または構造が関連していない、他のチャネルのための既存のモジュレーターからのチャネルのための新たなモジュレーターを作製することである。例えば、コノトキシンファミリーは、Ｃａ−、Ｋ−、Ｎａ−チャネルおよびニコチン性アセチルコリン受容体のための配列関連および構造関連モジュレーターを含む。コノトキシン誘導体のライブラリーを使用して、Ｋ−チャネルモジュレーターをＮａ−チャネルモジュレーターに転換すること、またはその逆は実行可能であるらしい。例えば、κコノトキシンはＫ−チャネルを阻害し、μコノトキシンおよびδコノトキシンはＮａ−チャネルを阻害し、ωコノトキシンはＣａ−チャネルを阻害し、そしてαコノトキシンはアセチルコリン受容体を阻害する。
【０１９９】
各々がチャネル活性に対して異なる効果を有する、同じイオンチャネルからの異なる結合部位の近接性は、柔軟性リンカーを使用する阻害剤を連結するためにこれを魅力的にし、各々が異なる結合部位に結合する２つのドメインを有する単一の阻害剤を作製する。または、同じ部位の異なるコピーで結合する２つのドメインを有する単一のタンパク質は、二価の高親和性相互作用（アビディティ）を生じる。このアプローチは天然のトキシンによってはとられていない。おそらく、これらは最大組織浸透を有するために、速く作用しかつ小さいままである必要があることがその理由であるが、医薬品のためには、作用の速度はそれほど重要ではなく、これを魅力的なアプローチにする。
【０２００】
従って、各々がネイティブまたは修飾されている二量体、三量体、四量体、または多量体のトキシン／調節因子の組み合わせライブラリーを作製し、タンパク質レベルでこれらのライブラリーを直接スクリーニングし、または親和性（アビディティ、結合が複数の部位で同時に起こる場合）の改善について遺伝子パッケージを使用してこれらのライブラリーをパンし、次いで、タンパク質の発現および精製、続いて、パッチクランプアッセイを含む細胞ベースの活性アッセイによって、このような多量体タンパク質の特異性および活性を特徴付けることができる。個々のモジュールは、互いの単離物中で、別々にパンおよび選択でき、またはこれらは、互いの存在下で設計でき、その結果、新たなドメインが、ライブラリーのための標的化要素として働く固定された活性なコピーもまた含むライブラリーとしてディスプレイ系に加えられ、固定された活性な単量体よりも顕著に良好であるクローンのみが選択および特徴付けされる。
【０２０１】
図４６および４７は、ネイティブ（天然の）トキシンから作製できるいくつかの単量体誘導体、および標的の複数の異なる部位で結合するように作製できるいくつかの多量体を示す。リンカーはグリシンリッチｒＰＥＧとして示されるが、リンカーは任意の配列であり得、分子ライブラリー、続いてパニングを使用して最適化することもできる。上記のような種々の変異誘発ストラテジーを使用して、活性なネイティブトキシンそれ自体の内部にライブラリーを作製することができ、または標的とのさらなる接触を作製することを望んで、活性トキシンのＮ末端側またはＣ末端側にライブラリーを作製することによって、標的との接触の既存の領域を拡張することができる。このようなライブラリーは、その部位について既知の活性を有する既存のトキシンに基づき得、またはこれらは、関連性のないマイクロプロテイン骨格に基づく、ネイティブの１−、２−、３−、４−ジスルフィドライブラリーであり得る。これらのさらなる接触要素は、活性ドメインの片側または両側に加えることができ、そして既存のモジュールドメインに直接隣接でき、またはこれらは柔軟性リンカーによってそこから分離させることができる。初期の多量体または最終の改善された多量体は、ドメインの配列類似性に基づいて、または多量体のドメインの標的特異性に基づいて、ホモ多量体またはヘテロ多量体であり得る。従って、多量体を含む単量体は、同じ標的部位に結合し得るが、同じまたは異なる配列を有し得る。各チャネルのファミリーに結合することが知られている１０〜１００種の異なるネイティブトキシンを用いて、およびクローンあたり２，３、４、５、または６個のドメインを用いて、莫大な組み合わせの多様性を有するディスプレイライブラリーを、たとえネイティブトキシン配列を使用するのみであっても、作製することができる。ファミリー内でのアミノ酸の類似性または系統発生学的置換速度に基づく低レベル合成変異誘発は、高品質の変異体のライブ
ラリーを作製するために使用でき、その非常に大きな画分は機能を保持していることが予測され、目的の特性のいくつかで機能が増強される高い確率を有する。
【０２０２】
対象のＭＵＲＰ、マイクロプロテイン、またはトキシンが所定のイオンチャネルに結合する能力は、Ｈｉｌｌ係数によって測定することができる。Ｈｉｌｌ係数は結合相互作用の化学量論を示す。２のＨｉｌｌ係数は、２つの阻害剤が各チャネルに結合することを示す。アロステリック調節を評価することもでき、これは、離れた部位における結合によって引き起こされる１つの部位における活性の調節である。
【０２０３】
イオンチャネルの生物学的活性または効果、ならびに対象のＭＵＲＰ、マイクロプロテイン、またはトキシンがイオンチャネル活性を調節する能力は、種々のインビトロおよびインビボのアッセイを使用して評価することができる。例えば、電圧測定、電流測定、膜電位測定、イオン、例えば、カリウムまたはルビジウムの流入の測定、イオン濃度測定、ゲート開閉測定、二次メッセンジャーおよび転写レベルの測定、ならびに、例えば、電位感受性色素、放射性トレーサー、およびパッチクランプ電気生理学の使用のための方法が、当該分野において利用可能である。特に、このようなアッセイは、目的のイオンチャネルを阻害または活性化できるマイクロプロテインおよびトキシンについて試験するために使用できる。
【０２０４】
具体的には、調節の程度を試験するために、適切な対象との比較において、潜在的なチャネル阻害剤または活性化剤を試験できる。対照サンプルはまた、候補活性化剤または阻害剤で処理していないサンプルであり得る。所定のイオンチャネル活性値が、対照と比較して、約９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、またはそれ以下である場合に、阻害は存在する。ＩＣ５０は、阻害効果を決定するための一般的に使用される単位である（イオンチャネルの活性を５０％阻害する阻害剤の濃度）。ＩＣ９０についても同様である。チャネルの活性化は、選択した所定のイオンチャネル活性の値が、対照と比較して、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、５００％、またはそれ以上増加する場合に達成される。
【０２０５】
イオン流入の変化は、目的のチャネルを発現する細胞または膜の分極の変化（すなわち、電位）を決定することによって評価されてもよい。例えば、１つの方法は、電位クランプおよびパッチクランプ技術、例えば、「細胞結合」モード、「裏返し」モード、および「全細胞」モードを用いて電流の変化を測定すること（それによって、分極の変化を測定すること）によって、細胞の分極の変化を決定することである（例えば、Ａｃｋｅｒｍａｎら、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３６：１５７５−１５９５（１９９７）を参照のこと）。全細胞電流は、標準的な方法論を使用して便利に決定される（例えば、Ｈａｍｉｌら、Ｐｆｌｕｇｅｒｓ．Ａｒｃｈｉｖ．３９１：８５（１９８１）を参照のこと）。他の公知のアッセイには以下が含まれる：放射性標識ルビジウム流入アッセイおよび電位感受性色素を使用する蛍光アッセイ（例えば、Ｖｅｓｔｅｒｇａｒｒｄ−Ｂｏｇｉｎｄら、Ｊ．Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｂｉｏｌ．８８：６７−７５（１９８８）；Ｄａｎｉｅｌら、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｍｅｔｈ．２５：１８５−１９３（１９９１）；Ｈｏｌｅｖｉｎｓｋｙら、Ｊ．Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １３７：５９−７０（１９９４）を参照のこと）。
【０２０６】
目的のチャネルの機能に対する候補ＭＵＲＰ、マイクロプロテイン、またはトキシンの効果は、電流もしくはイオン流の変化によって、または電流および流入の変化の結果によって測定することができる。イオン流入に対する候補タンパク質の下流効果は変化し得る。従って、任意の適切な生理学的変化は、試験チャネルに対する候補タンパク質の影響を評価するために使用することができる。候補タンパク質の効果は、トキシン結合アッセイによって測定することができる。機能的な結果がインタクトな細胞または動物を使用して決定される場合、伝達物質（例えば、ドーパミン）の放出、ホルモン（例えば、インスリン）の放出、既知の遺伝子マーカーおよび特徴付けされていない遺伝子マーカーの両方への転写の変化（例えば、ノーザンブロット）、細胞量の変化（例えば、赤血球）、免疫応答（例えば、Ｔ細胞活性化）、細胞増殖またはｐＨ変化などの細胞代謝の変化、およびＣａ２＋のような細胞内二次メッセンジャーの変化などの種々の効果もまた測定することができる。
【０２０７】
イオンチャネルの鍵となる他の生物学的活性は、イオンの選択性およびゲート開閉である。選択性は、イオン種間を区別するいくつかのチャネルの能力であり、他を除外しながら、あるものを孔に通過させることを可能にする。ゲート開閉は、開いた状態と閉じた状態との間の遷移である。これらは、当該分野で公知であるか、または本明細書に開示される方法のいずれかによって評価することができる。
【０２０８】
対照のＭＵＲＰ、マイクロプロテイン、またはトキシンがそれについて選択され得る、なお別の生物学的特性は、ゲート開閉頻度とよばれる、標的チャネルが開くことおよび閉じることの頻度である。ゲート開閉頻度は、電位（電位依存性チャネルにおいて、これは、膜電位の変化によって開閉される）およびリガンド結合によって影響を受ける。開状態と閉状態との間の遷移速度は、典型的には、＜１０マイクロ秒であるが、他の分子によって増加または減少させることができる。孔を通しての流入速度（電流）は、開いている場合に、イオンチャネルについて１０ｅ７イオン／秒のオーダーであり、共役交換因子についてははるかに低い。開口後、ある電位依存性チャネルは不活性型に入り、これらは脱分極に不応性である非伝導状態である。
【実施例】
【０２０９】
実施例：ヒト配列に基づくグリシン−セリンオリゴマーの設計
ヒトゲノムデータベースを、グリシンが豊富な配列について検索した。表Ｘに示されるように、適切なドナー配列として、３つの配列を同定した。
【０２１０】
表Ｘ：ＧＲＳ設計Ａのためのドナー配列
【０２１１】
【化１】
2014198050.tif 000012
【０２１２】
【化２】
2014198050.tif 000013
表Ｘの配列に基づいて、本発明者らは、配列ＧＧＧＳＧＳＧＧＧＧＳを有するペプチドＡの複数の反復を含むグリシンリッチ配列を設計した。ペプチドＡはオリゴマー化されて、式（ＧＧＧＳＧＳＧＧＧＧＳ）ｎを有する構造を形成することができ、式中、ｎは２から４０までの間である。図５は、ペプチドＡのオリゴマーの中のすべての可能な９マーサブ配列が、表３に列挙されるタンパク質の少なくとも１つに含まれることを示す。このように、ペプチドＡのオリゴマーはヒトＴ細胞エピトープを含まない。図５の精査は、パプチドＡのオリゴマーに基づくＧＲ３が、ペプチドＡの位置のいずれかで開始および終結し得ることを明らかにする。
【０２１３】
実施例：ヒト配列に基づくグリシン−プロリンオリゴマーの設計
グリシンリッチ配列は、配列
ＧＰＧＧＧＧＧＰＧＧＧＧＧＰＧＧＧＧＰＧＧＧＧＧＧＧＰＧＧＧＧＧＧＰＧＧＧ
に基づいて設計し、これは、アクセッション番号ＮＰ＿００６２２８を有するヒトクラス４ＰＯＵドメインのアミノ酸１４２〜１８２を表す。図６は、配列ＧＧＧＧＧＰＧＧＧＧＰを有するペプチドＢのオリゴマーがＧＲＳとして使用され得ることを図示する。配列（ＧＧＧＧＧＰＧＧＧＧＰ）ｎを有するペプチドに含まれるすべての９マーサブ配列もまた、ＰＯＵドメインの配列に含まれる。従って、このようなオリゴマー配列は、Ｔ細胞エピトープを含まない。
【０２１４】
実施例：グリシン−グルタミン酸オリゴマーの設計
グリシンリッチ配列は、リボソームタンパク質Ｓ６キナーゼ（アクセッション番号ＢＡＤ９２１７０）の一部であるサブ配列ＧＡＧＧＥＧＧＧＧＥＧＧＧＰＧＧに基づいて設計することができる。例えば、配列ＧＧＧＧＥを有するペプチドＣのオリゴマーは、大部分の９マーサブ配列がリボソームタンパク質Ｓ６キナーゼの配列に含まれる配列を形成する。従って、一般構造（ＧＧＧＧＥ）ｎのオリゴマー性ＧＲＳは、Ｔ細胞エピトープを含むリスクが非常に低い。
【０２１５】
実施例：ヒト親水性グリシンリッチ配列の同定
グリシン残基が豊富であるサブ配列について、ヒトタンパク質のデータベースを検索した。これらのサブ配列は、少なくとも５０％グリシンを含んだ。以下の非グリシン残基：ＡＤＥＨＫＰＲＳＴのみがＧＲＳに存在することが許された。最小２０アミノ酸の長さを有した７０個のサブ配列を同定した。これらのサブ配列を付録Ａに列挙した。これらは、ヒトにおける低い免疫原性の潜在性を有するＧＲＳを構築するために利用できる。
【０２１６】
実施例：ｒＰＥＧ＿Ｊ２８８の構築
以下の実施例は、２８８アミノ酸配列および配列（ＧＳＧＧＥＧ）４８を有するＵＲＰ配列をコードするコドン最適化遺伝子の構築を記載する。最初に、本発明者らは、図４０に図示されるように、スタッファーベクターｐＣＷ００５１を構築した。ｐＣＷ００５１における発現カセットの配列は、図４２に示される。スタッファーベクターはｐＥＴベクターに基づき、Ｔ７プロモーターを含む。このベクターはＦｌａｇ配列をコードし、ＢｓａＩ、ＢｂｓＩ、およびＫｐｎＩ部位に隣接するスタッファー配列が続く。ＢｓａＩおよびＢｂｓＩ部位は、図４２に図示されるように、これらが消化後に適合可能な突出を生じるように挿入した。スタッファー配列にはＨｉｓ６タグおよび緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の遺伝子が続く。スタッファー配列は終止コドンを含み、従って、大腸菌細胞は、非蛍光コロニーを形成するスタッファープラスミドｐＣＷ００５１を有する。スタッファーベクターｐＣＷ００５１は、ＢｓａＩおよびＫｐｎＩで消化した。３６アミノ酸長のＵＲＰ配列をコードするコドンライブラリーは図４１に示されるように構築した。ＵＲＰ配列は、ｒＰＥＧ＿Ｊ３６と名付け、アミノ酸配列（ＧＳＧＧＥＧ）６を有した。挿入物は、アミノ酸配列ＧＳＧＧＥＧＧＳＧＧＥＧをコードする合成オリゴヌクレオチド対、ならびにＫｐｎＩ部位へのアダプターをコードするオリゴヌクレオチドの対をアニーリングすることによって得た。以下のオリゴヌクレオチドを使用した：ｐｒ＿ＬＣＷ００５７：ＡＧＧＴＡＧＴＧＧＷＧＧＷＧＡＲＧＧＷＧＧＷＴＣＹＧＧＷＧＧＡＧＡＡＧＧ、ｐｒ＿ＬＣＷ００５７ｒｅｖ：ＡＣＣＴＣＣＴＴＣＴＣＣＷＣＣＲＧＡＷＣＣＷＣＣＹＴＣＷＣＣＷＣＣＡＣＴ、ｐｒ＿３ＫｐｎＩｓｔｏｐｐｅｒ：ＡＧＧＴＴＣＧＴＣＴＴＣＡＣＴＣＧＡＧＧＧＴＡＣ、ｐｒ＿３ＫｐｎＩｓｔｏｐｐｅｒＲｅｖ：ＣＣＴＣＧＡＧＴＧＡＡＧＡＣＧＡ。アニーリングしたオリゴヌクレオチド対はライゲーションし、これは、様々な数のｒＰＥＧ＿Ｊ１２反復を表す様々な長さを有する生成物の混合物を生じる。ｒＰＥＧ＿Ｊ３６の長さに対応する生成物は、アガロースゲル電気泳動によって混合物から単離し、ＢｓａＩ／ＫｐｎＩ消化したスタッファーベクターｐＣＷ００５１にライゲーションした。ＬＣＷ００５７と名付けた得られるライブラリー中の大部分のクローンは、誘導後に緑色蛍光を示し、このことは、ｒＰＥＧ＿Ｊ３６の配列がＧＦＰ遺伝子とインフレームでライゲーションされたことを示す。スクリーニングおよびｒＰＥＧ＿Ｊ３６配列の反復多量体化のプロセスは図１４に図示されている。本発明者らは、高レベルの蛍光についてライブラリーＬＣＷ００５７からの２８８個の単離物をスクリーニングした。強力な蛍光を伴う４８個の単離物をＰＣＲによって分析し、ｒＰＥＧ＿Ｊセグメントの長さを確認し、そしてｒＰＥＧ＿Ｊ３６の予想長さを有した１６個のクローンを同定した。このプロセスは、ｒＰＥＧ＿Ｊ３６の１６個の単離物のコレクションを生じ、これは、高い発現を示し、それらのコドン使用頻度が異なっている。これらの単離物をプールし、図４０に概略されるプロセスを使用して二量体化した。プラスミド混合物は、ＢｓａＩ／ＮｃｏＩで消化し、ｒＰＥＧ＿Ｊ３６配列を含むフラグメントおよびＧＦＰの一部を単離した。同じプラスミドは、ＢｂｓＩ／ＮｃｏＩでもまた消化し、ｒＰＥＧ＿Ｊ３６を含むベクターフラグメント、プラスミドベクターの大部分、および残りのＧＦＰ遺伝子を単離した。両方のフラグメントを混合し、ライゲーションし、そしてＢＬ２１に形質転換し、単離物を蛍光についてスクリーニングした。この二量体のプロセスは、図１４に概略されているように、２回より多くラウンド反復した。各ラウンドの間、本発明者らは、ｒＰＥＧ＿Ｊ遺伝子の長さを倍加し、最終的には、ｒＰＥＧ＿Ｊ２８８をコードする遺伝子のコレクションを得た。ｒＰＥＧ＿Ｊ２８８のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を図１５に示す。ｒＰＥＧ＿Ｊ２８８モジュールが、同一のアミノ酸配列を有するのにも関わらず、それらのヌクレオチド配列が異なるｒＰＥＧ＿Ｊ３６のセグメントを含むことを見ることができる。従って、本発明者らは、遺伝子の内部の相同性を最小化し、結果として、本発明者らは、自発的組換えのリスクを減少した。本発明者らは、少なくとも２０回の倍加の間、ｒＰＥＧ＿Ｊ２８８をコードするプラスミドを有する大腸菌ＢＬ２１を培養し、そして自発的組換えは観察されなかった。
【０２１７】
実施例：ｒＰＥＧ  Ｈ２８８の構築
ｒＰＥＧ＿Ｈ２８８と名付けた２８８アミノ酸ＵＲＰをコードする遺伝子のライブラリーは、ｒＰＥＧ＿Ｊ２８８を構築するために使用したのと同じ手順を使用して構築した。ｒＰＥＧ＿Ｈ２８８はアミノ酸配列（ＧＳＧＧＥＧＧＳＧＧＳＧ）２４を有する。構築プロセスのフローチャートは図１４に示される。ｒＰＥＧ＿Ｈ２８８の１つの単離物の完全なアミノ酸配列ならびにヌクレオチド配列は図１６に示される通りである。
【０２１８】
実施例：ｒＰＥＧ  Ｊ２８８の血清安定性
Ｎ末端Ｆｌａｇタグおよび緑色蛍光タンパク質のＮ末端に融合されたＵＲＰ配列ｒＰＥＧ＿Ｊ２８８を含む融合タンパク質は、３７℃で３日間、５０％マウス血清中でインキュベートした。サンプルは様々な時点で取り出し、ＳＤＳ  ＰＡＧＥによって分析し、続いてウェスタン分析を用いる検出を行った。Ｎ末端Ｆｌａｇタグに対する抗体はウェスタン検出のために使用した。結果は図２８に示し、これは、２８８アミノ酸のＵＲＰ配列が少なくとも３日間、血清中で完全に安定であり得ることを示す。
【０２１９】
実施例：血清中でのｒＰＥＧ  Ｊ２８８に対する既存の抗体の不在
ＵＲＰに対する抗体の存在は、このグリシンリッチ配列に対する潜在的な免疫原性応答の指標である。血清中での既存の抗体の存在について試験するために、ＵＲＰ−ＧＦＰ融合物は、支持体上にＵＲＰ−ＧＦＰを固定することによってＥＬＩＳＡに供し、続いて、３０％血清とともにインキュベートした。ＵＲＰ−ＧＦＰに結合した抗体の存在は、抗ＩｇＧ西洋ワサビペルオキシダーゼ抗体および基質を使用して検出した。データは図２９に示す。このデータは、融合タンパク質が、ＧＦＰまたはＦｌａｇに対する抗体によって検出できるが、マウス血清によってはできないことを示す。これは、マウス血清がＵＲＰ配列を含む抗体を含まないことを示す。
【０２２０】
実施例：ｒＰＥＧ  Ｊ２８８を含む融合タンパク質の精製
本発明者らは、構造Ｆｌａｇ−ｒＰＥＧ＿Ｊ２８８−Ｈ６−ＧＦＰを有するタンパク質を精製した。このタンパク質は、ＳＢ培地中で大腸菌ＢＬ２１中で発現させた。培養は、１８℃で一晩、０．５ｍＭ  ＩＰＴＧで誘導した。細胞は遠心分離によって収集した。ペレットは、ベンゾナーゼおよび市販のプロテアーゼ阻害剤カクテルを含むＴＢＳ緩衝剤に再懸濁した。懸濁液はウォーターバス中で７５℃、１０分間加熱し、細胞を溶解した。不溶性物質を遠心分離によって除去した。上清を、固定化金属イオン特異性（ＩＭＡＣ）を使用して精製し、続いて、固定化抗Ｆｌａｇ抗体を使用してカラム精製した。図４３は、精製プロセスのＰＡＧＥ分析を示す。該プロセスは、少なくとも９０％純度を有するタンパク質を生じた。
【０２２１】
実施例：ｒＰＥＧ  Ｊ２８８とインターフェロンαとの間の融合タンパク質の構築
ヒトインターフェロンαをコードする遺伝子は大腸菌発現のためのコドン最適化を使用して設計した。合成遺伝子は、ｒＰＥＧ＿Ｊ２８８をコードする遺伝子と融合した。Ｈｉｓ６タグは融合タンパク質の検出および精製を容易にするためにＮ末端に配置した。融合タンパク質のアミノ酸配列は図４４に示す。
【０２２２】
実施例：ｒＰＥＧ  Ｊ２８８−Ｇ−ＣＳＦ融合物の構築
ヒトＧ−ＣＳＦをコードする遺伝子は、大腸菌発現のためにコドン最適化を使用して設計した。合成遺伝子は、ｒＰＥＧ＿Ｊ２８８をコードする遺伝子と融合した。Ｈｉｓ６タグは融合タンパク質の検出および精製を容易にするためにＮ末端に配置した。融合タンパク質のアミノ酸配列は図４４に示す。
【０２２３】
実施例：ｒＰＥＧ  Ｊ２８８−ｈＧＨ融合物の構築
ヒト成長ホルモンをコードする遺伝子は、大腸菌発現のためにコドン最適化を使用して設計した。合成遺伝子は、ｒＰＥＧ＿Ｊ２８８をコードする遺伝子と融合した。Ｈｉｓ６タグは融合タンパク質の検出および精製を容易にするためにＮ末端に配置した。融合タンパク質のアミノ酸配列は図４４に示す。
【０２２４】
実施例：ｒＰＥＧ＿Ｊ２８８とヒトタンパク質との間の融合タンパク質の発現
ｒＰＥＧ＿Ｊ２８８と２種のヒトタンパク質、インターフェロンαおよび成長ホルモンとの間の融合タンパク質を、Ｔ７発現ベクターにクローニングし、そして大腸菌ＢＬ２１に形質転換した。０．５ＯＤの光学密度まで、３７℃で細胞を増殖させた。続いて、細胞を１８℃で３０分間培養した。次いで、０．５ｍＭ  ＩＰＴＧを加え、培養物を振盪インキュベーターで１８℃にて一晩インキュベートした。細胞は遠心分離によって収集し、可溶性タンパク質はＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を使用して遊離させた。不溶性タンパク質および可溶性タンパク質の両方の画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、融合タンパク質は、検出のためにＮ末端Ｈｉｓ６タグに対する抗体を使用して、ウェスタンによって検出した。図４５は、２種の融合タンパク質、ならびに対照としてのｒＰＥＧ＿Ｊ２８８−ＧＦＰのウェスタン分析を示す。すべての融合タンパク質が発現され、タンパク質の大部分は可溶性画分に存在した。これは、ｒＰＥＧ＿Ｊ２８８の高い溶解性の証拠である。なぜなら、文献の中で報告されていた大腸菌の細胞質中のインターフェロンαおよびヒト成長ホルモンの発現の多くの試みは、不溶性の封入体の形成を生じたからである。図４５は、融合タンパク質の大多数が全長タンパク質として発現され、すなわち、不完全な合成または部分的なタンパク質分解を示唆するフラグメントが検出されなかったことを示す。
【０２２５】
実施例：ＶＥＧＦ多量体の構築および結合
システイン束縛ペプチドのライブラリーは、公表されているように構築した［Ｓｃｈｏｌｌｅ，Ｍ．Ｄ．ら（２００５）Ｃｏｍｂ  Ｃｈｅｍ  Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎ，８：５４５−５１］。これらのライブラリーはヒトＶＥＧＦに対してパンし、そしてアミノ酸配列ＦＴＣＴＮＨＷＣＰＳまたはＦＱＣＴＲＨＷＣＰＩからなる２つの結合モジュールを同定した。アミノ酸配列ＦＴＣＴＮＨＷＣＰＳをコードするオリゴヌクレオチドは、配列（ＧＧＳ）１２を有するＵＲＰ配列ｒＰＥＧ＿Ａ３６をコードするヌクレオチド配列にライゲーションした。続いて、融合配列は、ＧＦＰに融合したｒＰＥＧ＿Ａ３６によって分けられた４コピーのＶＥＧＦ結合モジュールを含む分子を構築するために、制限酵素およびライゲーション工程を使用して二量体化した。０個と４個との間のＶＥＧＦ−結合単位を含む融合タンパク質のＶＥＧＦ結合親和性は、図３０において比較した。ＧＦＰに融合されたｒＰＥＧ＿Ａ３６のみを含む融合タンパク質はＶＥＧＦに対する親和性を示さない。増加数のＶＥＧＦ結合モジュールを加えることは、得られる融合タンパク質の親和性を増加する。
【０２２６】
実施例：治療標的に対する１ＳＳ結合モジュールの発見
ランダムペプチドライブラリーは、Ｓｃｈｏｌｌｅら［Ｓｃｈｏｌｌｅ，Ｍ．Ｄ．ら（２００５）Ｃｏｍｂ  Ｃｈｅｍ  Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎ，８：５４５−５１］に従って生成した。未処理のペプチドライブラリーは、４〜１０個のランダム残基によって間隔が空いているシステインを有する、システイン束縛ペプチドを示した。ライブラリー設計は表に例証する。
【０２２７】
表Ｘ：未処理１ＳＳライブラリー
【０２２８】
【化３】
2014198050.tif 000014
ライブラリーは、以下のプロトコールを使用して、一連の治療関連標的に対してパンした。免疫吸着ＥＬＩＳＡプレート上のウェルを、ＰＢＳ中の５μｇ／ｍｌの標的抗原で４℃で一晩コートした。コートされたプレートをＰＢＳで洗浄し、非特異的部位をブロッキング緩衝剤（０．５％  ＢＳＡまたは０．５％  オボアルブミンのいずれかを含有するＰＢＳ）で室温で２時間ブロックした。次いで、プレートをＰＢＳＴ（ＰＢＳ含有０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０）で洗浄し、結合緩衝剤（０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０を含有するブロッキング緩衝剤）中の１〜５×１０１２／ｍｌのファージ粒子をウェルに加え、振盪しながら室温で２時間インキュベートした。次いで、ウェルを空にし、ＰＢＳＴで洗浄した。結合したファージ粒子を、１００ｍＭ  ＨＣｌとの室温で１０分間のインキュベーションによってウェルから溶出し、滅菌チューブに移し、そして１Ｍ  ＴＲＩＳ塩基で中和した。感染のために、５μｇ／ｍｌ  テトラサイクリンを補充したＳｕｐｅｒ  Ｂｒｏｔｈ中で増殖させた対数期の大腸菌ＳＳ３２０を中和したファージ溶離液に加え、そして培養物を３７で３０分間振盪しながらインキュベートした。次いで、感染させた培養物を、５μｇ／ｍｌテトラサイクリンを有するＳｕｐｅｒ  Ｂｒｏｔｈを含むより大きなチューブに移し、培養物は、振盪しながら３７℃で一晩インキュベートした。一晩培養物は遠心分離によって大腸菌を除き、２０％  ＰＥＧおよび２．５ＭＮａＣｌの溶液を４％の最終ＰＥＧ濃度まで加えた後で、ファージを上清から沈殿させた。沈殿したファージは遠心分離によって収集し、そしてファージペレットは１ｍｌ  ＰＢＳ中に再懸濁し、遠心分離によって残渣の大腸菌を除き、そして新鮮なチューブに移した。ファージ濃度は分光光度法で見積もり、ファージは次のラウンドの選択のために利用した。個々のクローンは、３または４ラウンドのファージパニングの後で標的結合親和性についてスクリーニングした。パニングの間に選択したファージクローンからの個々のプラークは、５μｇ／ｍｌテトラサイクリンを含むＳｕｐｅｒ  Ｂｒｏｔｈに拾い上げ、そして振盪しながら３７℃で一晩成長させた。ＥＬＩＳＡプレートは、ＰＢＳ中３μｇ／ｍｌの抗原および対照タンパク質（ＢＳＡ、オボアルブミン、ＩｇＧ）で、４℃にて一晩コートすることにより調製した。プレートはＰＢＳで洗浄し、ブロッキング緩衝剤（０．５％  ＢＳＡを含有するＰＢＳ）を用いて、室温で２時間ブロックした。一晩培養物は、遠心分離によって大腸菌を除き、上清は結合緩衝剤（０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０を含有するブロッキング緩衝剤）中で１：１０に希釈し、ＰＢＳＴ（０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ）を用いる洗浄後にＥＬＩＳＡプレートに移した。プレートは、攪拌しながら、室温で２時間インキュベートした。ＰＢＳＴを用いる洗浄後、抗Ｍ１３−ＨＲＰ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ＰＢＳ中１：５０００希釈をウェルに加えた。プレートを、振盪しながら室温で３０分間インキュベートし、ＰＢＳＴで、続いてＰＢＳで洗浄した。５０ｍＭリン酸−クエン酸緩衝剤中の０．４ｍｇ／ｍｌ  ＡＢＴＳおよび０．００１％  Ｈ２Ｏ２を含む基質溶液をウェルに加え、４０分間発色させ、そ��後プレートをプレートリーダーで４０５ｎｍにて読み取った。これらのＥＬＩＳＡの読み取りはクローンの特異性の決定を可能にし、そして抗原特異的クローンは確立された方法を介して商業的に配列決定された。
【０２２９】
表Ｘ：ＥｐＣＡＭ特異的結合モジュールの配列
【０２３０】
【化４】
2014198050.tif 000015
【０２３１】
【化５】
2014198050.tif 000016
表Ｘ：ＶＥＧＦ特異的結合モジュールの配列
【０２３２】
【化６】
2014198050.tif 000017
表Ｘ：ＣＤ２８特異的結合モジュールの配列
【０２３３】
【化７】
2014198050.tif 000018
【０２３４】
【化８】
2014198050.tif 000019
表Ｘ：ＣＤ２８特異的結合モジュールの配列
【０２３５】
【化９】
2014198050.tif 000020
表Ｘ：Ｔｉｅ１特異的結合モジュールの配列
【０２３６】
【化１０】
2014198050.tif 000021
表Ｘ：ＤＲ４特異的結合モジュールの配列
【０２３７】
【化１１】
2014198050.tif 000022
表Ｘ：ＤＲ５特異的結合モジュールの配列
【０２３８】
【化１２】
2014198050.tif 000023
表Ｘ：ＴｒｋＡ特異的結合モジュールの配列
【０２３９】
【化１３】
2014198050.tif 000024
実施例：ａＥｐＣＡＭ薬物結合体
抗ＥｐＣＡＭペプチドは、Ｓｃｈｏｌｌｅら［Ｓｃｈｏｌｌｅ，Ｍ．Ｄ．ら（２００５）Ｃｏｍｂ  Ｃｈｅｍ  Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎ，８：５４５−５１］に従って生成したランダムペプチドライブラリーから単離した。未処理ペプチドライブラリーは、４〜１０個のランダム残基で間隔が空いているシステインを有するシステイン束縛ペプチドをディスプレイした。上記のライブラリーを用いる３ラウンドの親和性選択後、いくつかのＥｐＣＡＭ特異的ペプチドリガンド（ＥｐＣａｍ１）を単離した（表Ｘ）。ＥｐＣａｍ１単離物は、４アミノ酸の保存性システイン間隔（ＣＸＸＸＸＣ）を有する。次いで、ＥｐＣａｍ１ペプチドリガンドは、３〜９残基をコードするコドンで静かにランダム化し（システインの位置以外）、ファージミドベクターに移した。プラスミドライブラリーは、引き続いて、ＥｐＣＡＭに対して親和性選択され、結合のために最適化されたペプチドリガンドを単離した（表Ｘ、ＥｐＣａｍ２）。ＥｐＣａｍ２リガンドは、保存性ＣＸＸＸＸＣシステイン間隔を含む。加えて、抗ＥｐＣａｍ配列の大部分はリジン残基を含まず、これは、結合配列の外側の遊離のアミン基への結合体化を可能にする。さらに、抗ＥｐＣａｍペプチドリガンドは、（任意の長さの）ＵＲＰ配列に遺伝的に融合し、反復二量体化を使用して多量体化することができる。得られるＥｐＣＡＭ  ＭＵＲＰは、単量体配列を超えた親和性の増加を有するＥｐＣＡＭを特異的に標的化するために使用することができる。四量体ＥｐＣＡＭ−ＵＲＰアミノ酸配列の１つの例は図３１に示される。この配列は、Ｎ末端Ｆｌａｇ−タグ中に局在する２つのみのリジン残基を含む。これらのリジン残基の側鎖は、薬物結合体化のために特に適切である。
【０２４０】
表Ｘ．抗ＥｐＣａｍ配列
【０２４１】
【化１４】
2014198050.tif 000025
実施例：ランダム配列付加
結合モジュールは、結合配列のＮ末端、Ｃ末端、またはＮ末端およびＣ末端の両方へのＵＲＰ様リンカーおよびランダム配列の付加によって、親和性成熟されまたは長くされ得る。図３２は、抗ＥｐＣＡＭ結合モジュールへの未処理のシステイン束縛配列の付加を示す。ランダム配列付加のライブラリーは、一本鎖または二本鎖のＤＮＡクローニングアプローチを使用して生成することができる。一旦生成されると、ライブラリーは、最初の標的タンパク質または第２のタンパク質に対して親和性選択することができる。例えば、抗ＥｐＣＡＭ結合モジュールを含む付加ライブラリーは、標的タンパク質への結合部位を２つ以上含む配列を選択するために使用することができる。
【０２４２】
実施例：２ＳＳ積み上げライブラリーの構築
一連のオリゴヌクレオチドを、ＶＥＧＦ結合１ＳＳペプチドＦＴＣＴＮＨＷＣＰＳに基づいてライブラリーを構築するために設計した。これらのオリゴヌクレオチドは、隣接する配列のシステイン間隔のパターンのバリエーションを組み込み、一方ＶＥＧＦ結合ペプチド配列は固定されて維持された。
【０２４３】
フォワードオリゴ
ＬＭＳ７０−１
【０２４４】
【化１５】
2014198050.tif 000026
ＬＭＳ７０−２
【０２４５】
【化１６】
2014198050.tif 000027
ＬＭＳ７０−３
【０２４６】
【化１７】
2014198050.tif 000028
ＬＭＳ７０−４
【０２４７】
【化１８】
2014198050.tif 000029
ＬＭＳ７０−５
【０２４８】
【化１９】
2014198050.tif 000030
ＬＭＳ７０−６
【０２４９】
【化２０】
2014198050.tif 000031
リバースオリゴ（逆方向相補性）
ＬＭＳ７０−１Ｒ
【０２５０】
【化２１】
2014198050.tif 000032
ＬＭＳ７０−２Ｒ
【０２５１】
【化２２】
2014198050.tif 000033
ＬＭＳ７０−３Ｒ
【０２５２】
【化２３】
2014198050.tif 000034
ＬＭＳ７０−４Ｒ
【０２５３】
【化２４】
2014198050.tif 000035
ＬＭＳ７０−５Ｒ
【０２５４】
【化２５】
2014198050.tif 000036
ＬＭＳ７０−６Ｒ
【０２５５】
【化２６】
2014198050.tif 000037
オリゴ希釈物
混合物１（１００μＭストックから）：１００μｌ  ７０−６、３３μｌ  ７０−５、１１μｌ  ７０−４、３．６６μｌ  ７０−３、１．２μｌ  ７０−２、０．４μｌ  ７０−１。
【０２５６】
混合物２（１００μＭストックから）：１００μｌ  ７０−６Ｒ、３３μｌ  ７０−５Ｒ、１１μｌ  ７０−４Ｒ、３．６６μｌ  ７０−３Ｒ、１．２μｌ  ７０−２Ｒ、０．４μｌ  ７０−１Ｒ。
ＰＣＲアセンブリ
１０．０μｌ鋳型オリゴ（５μＭ）、１０．０μｌ  １０×緩衝剤、２．０  ｄＮＴＰ（１０ｍＭ）、１．０μｌ  ｃＤＮＡポリメラーゼ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）、７７μｌ  ＤＳ  Ｈ２Ｏ。ＰＣＲプログラム：９５℃  １分間（９５℃  １５秒間、５４℃  ３０秒間、６８℃  １５秒間）×５、６８℃  １分間。
ＰＣＲ増幅
プライマー、１０．０μｌ  アセンブル緩衝剤、１０．０μｌ  １０×緩衝剤、２．０ｄＮＴＰｓ（１０ｍＭ）、１０．０μｌ  ＬＩＢＰＴＦ（５μＭ）、１０．０μｌ  ＬＩＢＰＴＲ（５μＭ）、１．０μｌ  ｃＤＮＡポリメラーゼ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）、５７μｌ  ＤＳ  Ｈ２Ｏ。ＰＣＲプログラム：９５℃  １分間（９５℃  １５秒間、５４℃  ３０秒間、６８℃  １５秒間）×２５、６８℃  １分間。産物をＡｍｉｃｏｎカラム（ｃｏｌｕｍ）Ｙ１０によって精製した。アセンブルされた産物はＳｆｉＩおよびＢｓｔＸＩで消化し、ファージミドベクターｐＭＰ００３にライゲーションした。ライゲーションは、ＭＪ  ＰＣＲマシンで１６℃にて一晩実施した。次いで、ライゲーションをＥｔＯＨ沈殿によって精製した。エレクトロポレーションによって、新鮮なコンピテントＥＲ２７３８細胞に形質転換を行った。
【０２５７】
得られるライブラリーは、以下に記載されるようにＶＥＧＦに対してパンした。１ＳＳ開始配列と比較して、ＶＥＧＦに対する結合の改善を示したいくつかの単離物を同定した。結合および発現のデータは図３８に示す。積み上げクローンの配列およびウェスタン分析の結果は図３９に示される。
【０２５８】
実施例：積み上げライブラリーのファージパニング
第１ラウンドのパニング：
１）第１ラウンド、スクリーニングされるライブラリーあたり４ウェルをコートする。Ｃｏｓｔａｒ  ９６ウェルＥＬＩＳＡプレートのウェルを、２５μｌ  ＰＢＳ中の０．２５μｇ  ＶＥＧＦ１２１抗原でコートする。プレートシーラーでプレートを覆う。コーティングは４℃で一晩、または３７℃で１時間実施することができる。
【０２５９】
２）コーティング溶液を振って落とした後、１５０μｌのＰＢＳ／ＢＳＡ  １％を加えることによってウェルをブロックする。シールし、３７℃で１時間インキュベートする。
【０２６０】
３）ブロッキング溶液を振って落とした後、５０μｌの新鮮に調製したファージ（ライブラリー再増幅プロトコールを参照のこと）をウェルに加える。第１ラウンドのみ、５μｌのＴｗｅｅｎ５％も加える。プレートをシールし、３７℃で２時間インキュベートする。
【０２６１】
その間に、２μｌのＥＲ２７３８細胞調製物とともに、２ｍｌ  ＳＢ培地プラス２μｌの５ｍｇ／ｍｌテトラサイクリンを接種し、２５０ｒｐｍで、３７℃で２．５時間増殖させる。各ライブラリーについて１培養を増殖させ、これは、ネガティブ染色を含めてスクリーニングする。ファージによる培養物の汚染を回避するために、あらゆる予防策を講じる。
【０２６２】
４）ファージ溶液を振って落とした後、１５０μｌのＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ０．５％をウェルに加え、５回上下に激しくピペッティングする。５分待ち、振って落とし、この洗浄工程を反復する。第１ラウンドにおいては、この様式で５回洗浄し、第２ラウンドでは１０回、ならびに第３ラウンド、第４ラウンド、および第５ラウンドは１５回洗浄する。
【０２６３】
５）最終洗浄溶液を振って落とした後、５０μｌの新鮮に調製したＰＢＳ中の１０ｍｇ／ｍｌトリプシンを加え、シールし、そして３７℃で３０分間インキュベートする。１０回上下に激しくピペッティングし、溶離液（第１ラウンドでは４×５０μｌ、第２ラウンドでは２×５０μｌ、その後のラウンドでは１×５０μｌ）を、準備した２ｍｌ大腸菌培養液に移し、室温で１５分間インキュベートする。
【０２６４】
６）６ｍｌのあらかじめ温めたＳＢ培地、１．６μｌのカルベニシリン、および６μｌの５ｍｇ／ｍｌテトラサイクリンを加える。培養液を５０ｍｌポリプロピレンチューブに移す。
【０２６５】
７）８ｍｌ培養液を２５０ｒｐｍで、３７℃で１時間振盪し、２．４μｌ  １００ｍｇ／ｍｌカルベニシリンを加え、そしてさらに１時間、２５０ｒｐｍで、３７℃で振盪する。
【０２６６】
８）１ｍｌのＶＣＳＭ１３ヘルパーファージを加え、５００ｍｌポリプロピレン遠心チューブに移す。９１ｍｌのあらかじめ温めた（３７℃）ＳＢ培地および４６μｌの１００ｍｇ／ｍｌカルベニシリンおよび９２μｌの５ｍｇ／ｍｌテトラサイクリンを加える。１００ｍｌ培養を３００ｒｐｍおよび３７℃で１  １／２から２時間振盪する。
【０２６７】
９）１４０μｌの５０ｍｇ／ｍｌカナマイシンを加え、３００ｒｐｍおよび３７℃の振盪を一晩継続する。
【０２６８】
１０）４０００ｒｐｍにて、１５分間、４℃で遠心分離する。上清を清浄な５００ｍｌ遠心分離ボトルに移し、２５ｍｌの２０％  ＰＥＧ−８０００／ＮａＣｌ  ２．５Ｍを加える。氷上に３０分間保存する。
【０２６９】
１１）９０００ｒｐｍにて、１５分間、４℃で遠心分離する。上清を廃棄し、ペーパータオル上に少なくとも１０分間逆さまにして液体抜きし、そして残りの液体は、ペーパータオルで遠心分離ボトルの上部から拭き取る。
【０２７０】
１２）遠心分離ボトルの側面に沿って上下にピペッティングすることによって、２ｍｌのＰＢＳ／ＢＳＡ０．５％／Ｔｗｅｅｎ０．５％緩衝剤にファージペレットを再懸濁、そして２ｍｌの微量遠心分離管に移す。１ｍｌピペットチップを使用して上下にピペッティングすることによってさらに再懸濁し、微量遠心分離機で最高速度で４℃にて１分間遠心分離し、そして０．２μｍフィルターを通して上清を滅菌２ｍｌ微量遠心分離管に入れる。
【０２７１】
１３）次のラウンドのために工程３）から続けるか、または４℃でファージ調製物を保存する。アジ化ナトリウムを、長期保存のために０．０２％（ｗ／ｖ）まで加えてもよい。新鮮に調製したファージのみが各ラウンドのために使用されるべきである。
【０２７２】
第２ラウンドパニング
第２ラウンド、スクリーニングされるライブラリーあたり２ウェルをコートする。Ｃｏｓｔａｒ９６ウェルＥＬＩＳＡプレートのウェルを、２５μｌ  ＰＢＳ中の０．２５μｇ
ＶＥＧＦ１２１抗原でコートする。プレートシーラーでプレートを覆う。コーティングは４℃で一晩、または３７℃で１時間実施することができる。
【０２７３】
富化比率計算のために、ネガティブ対照として使用される各ライブラリーのために２つのコートしていないウェルもまたブロックする。
【０２７４】
第３ラウンドパニング
第３ラウンド、スクリーニングされるライブラリーあたり１ウェルをコートする。Ｃｏｓｔａｒ  ９６ウェルＥＬＩＳＡプレートのウェルを、２５μｌ  ＰＢＳ中の０．２５μｇ  ＶＥＧＦ１２１抗原でコートする。プレートシーラーでプレートを覆う。コーティングは４℃で一晩、または３７℃で１時間実施することができる。
【０２７５】
富化比率計算のために、ネガティブ対照として使用される各ライブラリーのために１つのコートしていないウェルもまたブロックする。
【０２７６】
実施例：溶液ベースのパニング
１．製造業者に従って標的タンパク質をビオチン化する。
【０２７７】
２．ＰＢＳ中の１．０μｇのニュートラビジン（Ｐｉｅｒｃｅ）で総数８ウェル（選択あたり）をコートし、４℃で一晩インキュベートする。
【０２７８】
３．ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて、室温で１時間ウェルをブロックする。必要となるまで、プレートをブロッキング緩衝剤とともに保存する（工程６）。
【０２７９】
４．１００ｎＭ  ビオチン化標的タンパク質を使用し、ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋプラスＴｗｅｅｎ２０  ０．０５％を使用して、１００〜２００μｌの総量で１０１２ファージ／ｍｌ（ＰＢＳＴ中）を加える。
【０２８０】
５．ファージ−標的混合物を室温で少なくとも１時間転倒させる。
【０２８１】
６．７００μｌ  ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋで１００μｌファージ−標的混合物を希釈し、混合し、そして８個のニュートラビジンコートしたウェルの各々に１００μｌを加える（工程３から）。
【０２８２】
７．室温で５分間インキュベートする。
【０２８３】
８．ＰＢＳＴで８回洗浄する。
【０２８４】
９．１００μｌの１００ｍＭ  ＨＣｌで１０分間、ファージを溶出する。
【０２８５】
１０．１０μＭの１Ｍ  ＴＲＩＳ  ｐＨ＝８．０を加えることによって中和する。
【０２８６】
１１．引き続くラウンドの溶液パニングのために、プレーティングのために細胞を感染させ、またはファージを増幅する。
【０２８７】
実施例：ＶＥＧＦポジティブクローンのためのファージＥｌｉｓａによるスクリーニング
１）９６ディープウェルプレートに、５０μｇ／ｍｌカルベニシリンを含む０．５ｍｌ
ＳＢを加える。１つのコロニーを拾い上げ、ウェルに接種する。
【０２８８】
２）細菌培養物を含むプレートを、３００ｒｐｍ、３７℃で一晩振盪する。
【０２８９】
３）ＰＢＳ中で４ｎｇ／μｌ標的タンパク質溶液を調製する。２５μｌ（１００ｎｇ）のタンパク質を各ウェルに加え、４℃で一晩インキュベートする。
【０２９０】
４）コートしたＥＬＩＳＡプレートを振って乾かし、ＰＢＳで２回洗浄する。１５０μｌ／ウェル  ＰＢＳ＋０．５％  ＢＳＡ（ブロッキング緩衝剤）を加える。室温で１時間ブロックする。
【０２９１】
５）微生物ラックを遠心分離する（３０００ｒｐｍ；２０分間）。
【０２９２】
６）結合緩衝剤（ブロッキング緩衝剤＋０．５％  Ｔｗｅｅｎ２０）を調製する。ウェルあたり１３５μ結合緩衝剤を、低タンパク質結合９６ウェルプレート中でアリコートする。
【０２９３】
７）ＥＬＩＳＡプレートのウェルを振って乾かし、ＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋０．５％  Ｔｗｅｅｎ２０）で２回洗浄する。
【０２９４】
８）ＰＢＳＴ中で一晩培養物からの１５μｌファージを１：１０希釈し、ピペッティングによって混合し、そして各タンパク質コートしたウェルに３０μｌを移す。穏やかに攪拌しながら、室温で２時間インキュベートする。
【０２９５】
９）プレートをＰＢＳＴで６回洗浄する。
【０２９６】
１０）結合緩衝剤中１：５０００の抗Ｍ１３−ＨＲＰ  ５０μｌをウェルに加える。穏やかに攪拌しながら、室温で３０分間インキュベートする。
【０２９７】
１１）プレートをＰＢＳＴで４回、続いてＨ２Ｏで２回洗浄する。
【０２９８】
１２）６ｍｌのＡＢＴＳ溶液（５．８８ｍｌのクエン酸緩衝剤プラス１２０μｌ  ＡＢＴＳおよび２μｌ  Ｈ２Ｏ２）を調製する。各ＥＬＩＳＡプレート上のウェルあたり５０μｌをアリコートする。
【０２９９】
１３）室温でインキュベートし、シグナルに依存して適切な時点で（１時間まで）ＥＬＩＳＡプレートリーダーを使用して４０５ｎｍでＯ．Ｄ．を読み取る。
【０３００】
実施例：結合モジュールの二量体化
ジスルフィド結合したシステイン間の４、５、６、７、８、９、１０、１１、および１２個のランダム化または部分的ランダム化アミノ酸、および、ある場合において、システイン対の外側のさらなるランダム化アミノ酸を有する、１０ｅ９〜１０ｅ１１個の環状ペプチドのファージディスプレイしたライブラリーを、標準的な方法によって作製した。ヒトＶＥＧＦを含む、多数の標的に対するこれらの環状ペプチドライブラリーのパニングは、ｈＶＥＧＦに特異的に結合し、ＢＳＡ、オボアルブミン、またはＩｇＧには結合しないペプチドを高い信頼性で生じる。
【０３０１】
実施例：プレキシンベースのライブラリーの構築およびパニング
プレキシン骨格に基づいて２つのライブラリーを設計した。Ｐｆａｍタンパク質データベースは、図３５に示されるように、天然に存在するプレキシンドメインの系統発生学的アラインメントのために使用した。プレキシン骨格の中央部分（Ｃｙｓ２４−Ｇｌｙ２５−Ｔｒｐ２６−Ｃｙｓ２７）は、両方のライブラリー設計で保存され、Ｎ−およびＣ−ライブラリー生成のためのクロスオーバー領域として働く。両方のプレキシンライブラリーのランダム化スキームは、図３６に示される。これらの２つのライブラリーは、クロスオーバー領域において２つのライブラリーがコードするオリゴを重複させること、およびプル−スルＰＣＲ、続いて制限クローニング（ＳｆｉＩ／ＢｓｔＸＩ）を使用すること、およびファージミドベクターｐＭＰ００３にクローニングすることによって生成した。得られるプレキシンライブラリーは、ＬＭＰ０３１（Ｎ末端ライブラリー）およびＬＭＰ０３２（Ｃ末端ライブラリー）と名付け、各々は、約５×１０８個の独立した形質転換体の複雑さによって表現された。確証のために、各非選択のライブラリーからのおよそ２４個のＣａｒｂ耐性クローンをＰＣＲによって分析した。正確なサイズのフラグメント（３７５ｂｐ）を与えたクローンは、ＤＮＡ配列決定によってさらに分析した。正確な全長プレキシン配列は、それぞれ、ＬＭＰ０３１およびＬＭＰ０３２ライブラリー由来のクローンの５０％および６７％について得られた。
【０３０２】
２つのライブラリーは、５０／５０比率で一緒に混合し、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートに固定化したＶＥＧＦ、死受容体、Ｄｒ４、Ｅｒｂ２、およびＨＧＦＲに対して並行してパンした。第１ラウンドにおいては１０００ｎｇのタンパク質標的、第２ラウンドにおいては５００ｎｇ、第３ラウンドにおいては２５０ｎｇ、および第４ラウンドにおいては１００ｎｇを使用して、４ラウンドのパニングを実行した。最終ラウンドのパニング後、各選択からの１９２個のＣａｒｂ耐性クローンを、１００ｎｇの固定化タンパク質標的、ヒトＩｇＧ、オボアルブミン、およびＢＳＡへの結合について、検出のために西洋ワサビペルオキシダーゼに結合体化したポリクローナル抗Ｍ１３Ａｂを使用するファージＥＬＩＳＡによって分析した。最高の割合のポジティブクローンは、標的ＤＲ４（６９％）について得られ、続いて、標的ＥｒｂＢ２（５３％）、ＨＧＦＲ（１３％）、およびＢｏＮＴ標的（１％）の順であった。ポジティブクローンは、ＰＣＲによって、およびＤＮＡ配列決定によってさらに分析した。すべてのクローンは独特な配列を示し、１つ（対ＤＲ４）以外はＬＭＰ０３２（Ｃ末端ライブラリー）由来であった。同定された標的選択性単離物のいくつかの配列は図３７に示す。
【０３０３】
さらなる分析のために、選択された標的特異的結合因子の一団は、最初に、タンパク質発現ベクターｐＶＳ００１にサブクローニングされ、次いで、可溶性マイクロプロテインとして発現され、そして最後に、熱溶解によって精製される。精製した標的特異的マイクロプロテインは、タンパク質ＥＬＩＳＡによって分析して標的認識を確認し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって単量体形成を確認し、そして表面プラズモン共鳴によって標的へのそれらの親和性を測定する。最良のクローンは、それらの特性をさらに改善するために、次のラウンドのライブラリー世代において使用する。
【０３０４】
実施例：ヘビ毒ベースのライブラリーの構築
フィンガーチップ１の部分的にランダム化されたアミノ酸、およびフィンガー２またはフィンガーチップ３の下の部分、およびフィンガー２の上の部分を用いる３フィンガートキシン（３ＦＴ）骨格の１０ｅ８〜１０ｅ１０のファージディスプレイされたライブラリーを、標準的な方法によって作製した。
【０３０５】
２つの３ＦＴ骨格を、３ＦＴライブラリー世代（フィンガー１および２の構成）のための鋳型として使用した。３ＦＴ骨格の構造および関連する配列の複数の配列アラインメントは図３３に示される。ライブラリーは、図３４に図示されるように、トキシンの２つの表面ループがランダム化されるように設計した。部分的にランダム化された３ＦＴ骨格のライブラリーは、アニーリング領域における４つのライブラリーコードオリゴを重複させることによって、およびプル−スルＰＣＲを使用し、続いてファージミドベクターｐＭＰ００３への制限クローニング（ＳｆｉＩ／ＢｓｔＸＩ）を行うことによって生成した。得られる３ＦＴライブラリーはＬＭＰ０４１と名付けた。
【０３０６】
実施例：マイクロプロテイン骨格への結合ペプチドの移植−標的特異的ペプチド補助ランダム化
ここでの目的は、３ＳＳプラス標的特異的結合因子を生成するために、目的の標的に特異的であることが同定されたペプチドを使用することである。このストラテジーは、３ＦＴ骨格のフィンガーチップ１へのＶＥＧＦ特異的ペプチドの移動を使用すること、および高親和性ＶＥＧＦ結合因子を生成するために標的特異的配列から密接な近傍にあるフィンガー２のＡＡ残基を修飾することによって例証されている。フィンガーチップ１のＶＥＧＦ特異的配列、およびフィンガー２の部分的にランダム化された下の部分を有する１０ｅ８〜１０ｅ１０の３フィンガートキシン（３ＦＴ）骨格のファージディスプレイライブラリーは、２つのランダムフィンガー１フォワードプライマーが、以下の配列：Ｐ  Ｓ  Ｇ
Ｐ  Ｓ  Ｃ  Ｈ  Ｔ  Ｔ  Ｎ  Ｈ  Ｗ  Ｐ  Ｉ  Ｓ  Ａ  Ｖ  Ｔ  Ｃ  Ｐ  ＰをコードするＦ１−ＶＥＧＦ特異的フォワードプライマーによって置き換えられたことを例外として、上記の実施例に記載されたように標準的な方法によって作製した。
【０３０７】
部分的にランダム化されたフィンガー２を有する集中的な（ＶＥＧＦ特異的）３ＦＴ骨格ライブラリーは、アニーリング領域における４つのライブラリーコードオリゴを重複させること、およびプル−スルＰＣＲを使用し、続いてファージミドベクターｐＭＰ００３への制限クローニング（ＳｆｉＩ／ＢｓｔＸＩ）を行うことによって生成した。得られる３ＦＴライブラリーはＬＭＰ０４２と名付けた。
【０３０８】
実施例：ＭＵＲＰの血漿半減期
ＭＵＲＰの血漿半減期は、本質的に［Ｐｅｐｉｎｓｋｙ，Ｒ．Ｂ．ら（２００１）Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ，２９７：１０５９−６６］によって記載されるように、カテーテル処置したラットへのＭＵＲＰの静脈内または腹腔内注射後に測定することができる。血液サンプルは、種々の時点（５分、１５分、３０分、１時間、３時間、５時間、１日、２日、３日）に取り出すことができ、そしてＭＵＲＰの血漿濃度はＥＬＩＳＡを使用して測定することができる。薬理学的パラメーターは、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎバージョン２．０（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏｎｓｕｌｔｉｎｇ  Ｉｎｃ．，Ａｐｅｘ，ＮＣ）を使用して計算することができる。ＵＲＰモジュールの効果を分析するために、ＵＲＰモジュールを含むタンパク質の血漿半減期を、ＵＲＰモジュールを欠く同じタンパク質の血漿半減期と比較できる。
【０３０９】
実施例：ＭＵＲＰの溶解性試験
ＭＵＲＰの溶解性は、リン酸緩衝化生理食塩水のような生理学的緩衝剤中でＭＵＲＰの精製サンプルを、０．０１ｍｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌの範囲にある種々の濃度まで濃縮することによって決定することができる。サンプルは、数週間までインキュベート可能である。濃度がＭＵＲＰの溶解度を超えるサンプルは、濁度によって示されるような沈殿を示し、これは、吸収リーダーで測定できる。遠心分離または濾過によって沈殿物質を除去し、そして２８０ｎｍの吸収を測定することによる、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイのようなタンパク質アッセイを使用して、上清中の残存タンパク質の濃度を測定することができる。溶解性研究は、サンプルを−２０℃に凍結し、続いて融解することによって加速することができる。このプロセスは、乏しい溶解性タンパク質の沈殿をもたらす。
【０３１０】
実施例：ＭＵＲＰの血清結合活性
目的のＭＵＲＰをマイクロタイタープレートにコートし、そして対照タンパク質をプレートの他のウェルにコートすることができる。続いて、目的の血清サンプルを１時間ウェルに加えることができる。続いて、ウェルをプレートウォッシャーで洗浄することができる。結合した血清タンパク質は、検出のための西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼのような酵素と結合体化した血清タンパク質に対する抗体を加えることによって、検出できる。ＭＵＲＰへの血清の結合を検出する（ｄｅｔｅｃ）ための別の方法は、結合を可能にするために約１時間、目的のＭＵＲＰを血清に加えることである。続いて、ＭＵＲＰ配列中のエピトープに対する抗体を使用して、ＭＵＲＰを免疫沈殿させることができる。沈殿したサンプルは、ＰＡＧＥによって、および選択的に、ウェスタンによって分析し、ＭＵＲＰと共沈殿した任意のタンパク質を検出することができる。共沈殿を示す血清タンパク質を質量スペクトル測定によって同定することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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