(57)【要約】      （修正有）【課題】骨格筋における糖代謝機能を改善または向上させる血糖代謝改善剤およびそれを配合した経口組成物を提供する。【解決手段】柿葉の水、エチルアルコール又は水−エチルアルコール混合液により得られる水性抽出物である水溶解性アントシアニジンに優れた骨格筋における糖代謝機能を改善または向上させる効果が存在することを見出し、運動による血糖値の低下作用を増強させるだけでなく、運動しなくても運動したときと同様な効果を得ることができる血糖代謝改善剤を見出した。【選択図】図１
2014198684.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
水溶解性アントシアニジンからなる血糖代謝改善剤。
【請求項２】
請求項１に記載の水溶解性アントシアニジンを含有する水及び/又はエチルアルコールで抽出された水性植物抽出物であることを特徴とする血糖代謝改善剤。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の血糖代謝改善剤を含有することを特徴とする経口組成物。
【請求項４】
請求項３に記載の経口組成物を充填した容器詰食品。 
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血糖代謝改善剤に関する。より詳細には、水溶解性のプロアントシアニジンを含有する骨格筋の糖代謝機能を改善または向上させる血糖代謝改善剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
高カロリー食の普及や日常の運動量の低下などの生活習慣要因により、中高年層だけでなく若年層においても糖尿病を発症する若しくはインスリン抵抗性を示す人が増えている。また、脂肪細胞の老化がインスリン抵抗性を引き起こすことも知られており、運動量も低下する老齢者においても糖尿病発症のリスクが高い。このように、日常生活の変化や老齢化社会への移行に伴い、糖尿病患者が年々爆発的に増加する傾向にあり、糖尿病予備軍である血糖代謝の異常を有する人も糖尿病患者の数倍以上存在すると考えられている。実際、国民健康・栄養調査や糖尿病実態調査でも同様な傾向が明らかにされており、わが国の糖尿病患者の増加は深刻といえる。この状況において、糖尿病が根本的な治癒ができない疾病であることから、糖尿病患者においては、病態を悪化させない、また、インスリン抵抗性を示す人に対しては、糖尿病を発症させない取組みを実行することが重要である。
【０００３】
血糖値を正常範囲で推移させ、糖尿病の発症予防や治療を行う方法としては、食事療法、運動療法および薬物療法が存在し、その単独の又は組み合わせた方法が採用されている。しかし、摂取カロリーを制限する食事療法や一定時間以上実行することが必要な運動療法は、継続的に実行できない場合が多く、特に老齢者では、基礎代謝量が大幅に低下しているだけでなく、運動能力の大幅な低下に伴う運動量の減少も深刻であり、前記の方法だけで対処することが難しい場合が増加している。一方、薬物療法も医療費増大防止の観点から満足できる対処方法とはいえず、また、予防的には採用しにくい方法である。そこで、血糖の代謝に大きな影響を与えている骨格筋における糖代謝に着目し、従来処置される治療法や予防法と併用若しくは単独で、糖尿病発症予防効果や糖尿病病態改善効果を飛躍的に増強させる手段の開発が試みられている。
【０００４】
血管（血液）から骨格筋へ糖を取り込む機序として、骨格筋を収縮させることで細胞内のＡＭＰキナーゼがリン酸化され活性化することで、最終的には細胞質内のグルコーストタンスポーター４が細胞膜中に移動し、骨格筋細胞内へ糖が取り込まれる場合が知られている。さらに、この骨格筋細胞内への糖の取り込みは、骨格筋の収縮が無くても、ＡＭＰキナーゼを活性化させることでも生じることが判っていることから、運動しなくても運動した場合と同じような効果を得られる可能性がある。この点に着目し、ＡＭＰキナーゼを活性化させる物質を経口摂取することで、血中の糖濃度を低減させる試みが提案されている。（特許文献１、２）
【０００５】
さらに、血管（血液）から骨格筋へ糖を取り込む別の機序として、血中のインスリンが骨格筋の間質を介して細胞膜表面にあるインスリン受容体に結合し、Ａｋｔのリン酸化による活性化などの情報伝達分子の活性化により、最終的には細胞質内のグルコーストタンスポーター４が細胞膜中に移動し、骨格筋細胞内へ糖が取り込まれることも知られている。この機序においては、インスリンが骨格筋に分布する毛細血管から骨格筋間質に移行するまでの経路も重要な役割を担っている。骨格筋毛細血管のe-ＮＯＳ活性化等を介した拡張機能亢進や血管新生による毛細血管密度の増加により、毛細血管の表面積と血流量の増加が起こることで、細胞へのインスリン移行が亢進し、糖代謝が改善されることがわかっている。（非特許文献１）
【０００６】
ＡＭＰキナーゼを介した前者の機序とインスリンを介した後者の機序はお互い独立して作用し、かつ両者共に、大きな糖の取り込み効果を発現させることが期待できる。健常人では、これら２つの機序が共に発現しているが、糖尿病患者やインスリン抵抗性を有する人においては、後者の機序が低下している、若しくは失われていることから、この２つの機序を合わせて発現させる若しくはそれらの機能を亢進させることにより、より健常者に近い状態を実現させることができる可能性がある。しかし、未だこれら２つの機序を併せて発現させる方法は知られておらず、具体的な解決方法の提案が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０１０−３７３２３号公報
【特許文献２】特開２０１１−３７７３２号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ, １３, ２９４−３０７,２０１１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、骨格筋における糖代謝機能を改善または向上させる血糖代謝改善剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、かかる事情に鑑み鋭意検討を重ねた結果、驚くべきことに柿葉の水溶解性のプロアントシアニジンに優れた骨格筋における糖代謝機能を改善・向上させる効果が存在することを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は、項１〜４の血糖代謝改善剤およびそれを配合した経口組成物並びに食品を提供するものである。
項１．水溶解性アントシアニジンからなる血糖代謝改善剤。
項２．項１に記載の水溶解性アントシアニジンを含有する水及び/又はエチルアルコールで抽出された水性植物抽出物であることを特徴とする血糖代謝改善剤。
項３．項１又は２に記載の血糖代謝改善剤を含有することを特徴とする経口組成物。
項４．項３に記載の経口組成物を充填した容器詰食品。 
【発明の効果】
【００１２】
本発明の血糖代謝改善剤は、ＡＭＰキナーゼの活性化を誘導することから、運動による血糖値の低下作用を増強させるだけでなく、運動しなくても運動したときと同様な効果を得ることが可能である。また、骨格筋毛細血管密度を高めることから、インスリン抵抗性の改善効果も得ることも可能である。したがって、糖尿病患者や糖尿病予備軍だけでなく、高齢者や寝たきりの人など十分な運動量が確保できない人においても血糖値を下げ、糖尿病の発症を予防したり、糖尿病の病態を改善する効果が期待できる。さらに運動前・中・後の摂取により運動の効果を高める運動効果促進剤としても有用である。また、本発明の摂取によりＡＭＰキナーゼを活性化することで、抗老化効果が期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、精製水（熱水）で抽出して得られた水性柿葉抽出物Ａの、マウス骨格筋管細胞株を用いたＡＭＰキナーゼの活性測定結果を示す。
【図２】図２は、精製水（熱水）で抽出して得られた水性柿葉抽出物Ａの、マウス骨格筋管細胞株を用いた糖取込促進測定結果を示す。
【図３】図３は、精製水（熱水）で抽出して得られた水性柿葉抽出物Ａの、ＳＴＺ糖尿病モデルマウスに対する単回投与による血糖降下作用の測定結果を示す。
【図４】図４は、精製水（熱水）で抽出して得られた水性柿葉抽出物Ａの、グレートトレランステストにおける血糖値の測定結果を示す。
【図５】図５は、精製水（熱水）で抽出して得られた水性柿葉抽出物Ａの、グレートトレランステストにおける骨格筋ＡＭＰキナーゼ活性測定の結果を示す電気泳動クロマトグラムを示す。
【図６】図６は、精製水（熱水）で抽出して得られた水性柿葉抽出物Ａの、グレートトレランステストにおける骨格筋中における総ＡＭＰＫ(ｔＡＭＰＫ)に対するリン酸化ＡＭＰＫ(ｐＡＭＰＫ)の発現比を示す。
【図７】図７は、精製水（熱水）で抽出して得られた水性柿葉抽出物Ａの、グレートトレランステストにおける骨格筋中におけるＧＡＰＤＨあたりのｅＮＯＳ測定結果を示す。
【図８】図８は、精製水（熱水）で抽出して得られた水性柿葉抽出物Ａの、グレートトレランステストにおける骨格筋中におけるＧＡＰＤＨあたりのＣＤ３１の測定結果を示す。
【図９】図９は、５０％水-エチルアルコール混合液で抽出して得られた水性柿葉抽出物Ｂおよびその分画画分の、マウス骨格筋管細胞株を用いた糖取込促進測定結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明における血糖代謝改善剤は、水溶解性プロアントシアニジンであり、柿葉などの植物を、水、エチルアルコール又は水−エチルアルコール混液で抽出することにより得られる、水性植物抽出物である。
【００１５】
本発明に使用する水溶解性プロアントシアニジンとは、第１６改正日本薬局方解説書Ａ-１３の性状の溶解性試験方法を用いて行なった場合、精製水１００ｍｌに対して１ｇ以上溶解する物質をいう。
【００１６】
本発明では水溶解性アントシアニジンを含有する、水、エチルアルコール又は水−エチルアルコール混液による抽出で得られる水性植物エキスも使用できる。植物は、水溶解性アントシアニジンを含有するものであれば特に限定するものではないが、特に柿葉が好ましい。
【００１７】
柿は、カキノキ科カキノキ属の落葉樹であり、抽出に好ましく用いる柿葉は落葉する前に樹木から採取した葉である。柿であればその品種は特に限定されることはないが、具体的には、甘果品種として、富有、次郎、甘百日、御所、花御所、晩御所、天神御所、藤原御所、徳田御所、三ヶ谷御所、禅寺丸、藤八、水島、正月などが挙げられる。渋果品種として、横野、平核無、富士、西条、堂上蜂屋、会津身不知、衣紋、祇園坊、四ツ溝、大四ツ溝、愛宕、葉隠、川端、田倉、作州身不知などが挙げられる。柿葉は、樹木から採取した後、そのまま抽出するために用いてもよいが、通常、慣用されている方法に従って前処理した後に抽出に供される。例えば、採取した後水洗し、適当な大きさ（通常３ｍｍ幅程度）に切断した後、蒸籠で蒸して乾燥することができる。採取した直後に切断し、常法に従って乾燥してもよい。或いは、通常の緑茶と同様に、蒸葉、撚稔、焙煎などの各工程を経たものであってもよい。本発明に用いる柿葉としては、加熱工程を経ずに乾燥した柿葉が好ましい。本発明の製法において使用する抽出溶媒は、水、エチルアルコール又は水−エチルアルコール混合液である。このうち、水および水−エチルアルコール混合液が好ましい。水−エチルアルコール混合液を使用する場合は、両者の混合比率は任意に変えることができる。抽出温度は、特に限定されるものではなく、抽出溶媒により０℃から溶媒の沸点程度から適宜設定することができる。具体的には、溶媒が水−エチルアルコール混合液の場合、抽出温度は３０℃〜沸点が好ましく、６０〜８０℃程度がより好ましい。溶媒が水の場合、抽出温度は６０〜１００℃程度が好ましく、７０〜１００℃程度がより好ましい。抽出時間は、溶媒が水−エチルアルコール混合液の場合、エチルアルコールの混合比率や抽出温度に応じて適宜設定することができるが、通常、数分〜２４時間程度であり、２０分〜４時間程度であることが好ましい。溶媒が水の場合、抽出時間は、１０分〜２４時間程度であり、２５分〜４時間程度であることが好ましい。柿葉と抽出溶媒の割合についても、特に限定されず適宜設定することができるが、柿葉１質量部に対して、溶媒２〜１０００質量部が適当であり、好ましくは２〜５０質量部であり、更に好ましくは３〜３０質量部程度である。上記のような抽出法により得られた水性抽出物（水性エキス）は、ろ過、遠心などの常法を用いて柿葉と分離することができる。水性抽出液は、そのまま用いてもよいし、濃縮（例えばBrix ５０〜７０程度まで濃縮）して用いてもよい。濃縮は、常法を用いて行うことができ、例えば３０〜４０ｍｍＨｇ程度の減圧下で、３０〜５０℃程度で行うことができる。また、濃縮後、凍結乾燥、噴霧乾燥、造粒乾燥などの手段によりエキス末を得ることもできる。その際、デキストリンなどの賦形剤を加えてもよい。そのまま、粉末で用いてもよく、エキス末を製造してから必要に応じて任意成分と混合・造粒し、顆粒や細粒の形態にして用いることもできる。
【００１８】
本発明の血糖代謝改善剤は経口組成物として摂取することができる。経口組成物としては、医薬品、医薬部外品のほか、糖尿病、高血糖、耐糖能異常、インスリン抵抗性、動脈硬化、肥満、体脂肪蓄積、脂質代謝異常、生活習慣病、脂肪肝等の予防・改善や糖代謝亢進、抗老化の生理機能をコンセプトとした機能性飲食品、疾病者用食品、特定保健用食品、栄養機能食品、栄養補助食品、運動療法用食品、痩身用食品などとすることができる。これら経口組成物の剤形形態としては特に限定するものではないが、例えば、ハードカプセル、ソフトカプセル、サプリメント、チュアブル錠、飲料、粉末飲料、顆粒、フィルムなどの形態のほか、飲食品として使用する場合、例えば、茶系飲料、スポーツ飲料、美容飲料、果汁飲料、炭酸飲料、アルコール飲料、清涼飲料、ゼリー飲料、水や湯、炭酸水等で希釈する濃縮タイプの飲料等の飲料、水や湯等に溶解または懸濁させて飲用する粉末や顆粒、タブレット等の乾燥固形物、タブレット菓子、ゼリー類、スナック類、焼き菓子、揚げ菓子、ケーキ類、チョコレート、ガム、飴、グミなどの菓子類、スープ類、めん類、米飯類、シリアル等などの食品形態にすることもできる。このうち通常の生活においては、サプリメントタイプ、チュアブル錠、ワンショットドリンクタイプなどの形態が好ましく、運動効果を高める目的で摂取する場合には、スポーツ飲料などの飲料の形態が最も好ましい。これらの経口組成物は容器に充填された容器詰食品として消費者に提供することができる。容器は密封できるものであれば特に限定されない。血糖代謝改善剤は、錠剤、顆粒剤、カプセル剤等の経口用固形製剤、内服液剤、シロップ剤等の経口用液体製剤などの場合は、通常、乾燥物換算でこれら経口組成物に対して、０．０１  〜９５質量％、好ましくは５〜９０質量％、最も好ましくは１０〜８０質量％配合する。上記以外の経口組成物の場合は、通常、０．００１〜５０質量％、好ましくは０．００５〜３０質量％、最も好ましくは０．０１〜１０質量％配合する
【実施例】
【００１９】
以下、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の例に限定されるものではない。なお、以下特に断りのない限り「％」は「質量％」を示す。
【００２０】
水性柿葉抽出物Ａの調製
乾燥し裁断した柿葉約１０ｇを、２０倍質量の精製水を用いて抽出した。抽出は還流抽出装置を用い、１時間、沸騰還流の条件で実施した。抽出処理後、メッシュ及び濾紙にて不溶物を除去した後に、得られた抽出液を凍結乾燥し、水性柿葉抽出物Ａ（粉末）を得た。
【００２１】
水性柿葉抽出物Ａの糖代謝改善作用の評価
前記で得られた水性柿葉抽出物Ａの糖代謝改善作用を評価した。糖代謝改善作用の評価としては。「Ｃ2Ｃ12細胞におけるＡＭＰキナーゼのリン酸化活性と６−ＮＢＤＧ取込み促進作用、ＳＴＺ糖尿病モデルマウスに対する単回投与による血糖効果作用、及びグレーストレランステスト」の測定を行なうことで実施した。
【００２２】
ＡＭＰキナーゼのリン酸化活性測定方法
下記にしたがって、ウェスタンブロッティング法を用いたＡＭＰキナーゼのリン酸化活性の測定を行った。
水性柿葉抽出物Ａ（粉末）を培地に対して最終濃度が０．０５％となるように加えて溶解し、以下の実験に用いた。ネガティブコントロールとしては何も添加していない培地、ポジティブコントロールとしてＡＩＣＡＲ（最終濃度２ｍＭ）を用いた。
マウス骨格筋管細胞株（Ｃ２Ｃ１２）を６穴細胞培養プレートに播種し、１０％ウシ胎児血清および１％抗菌剤を添加したＤＭＥＭ培地中で３７℃、５％二酸化炭素存在下で３日間培養した。細胞がコンフルエントになった状態で１％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地に交換し、さらに培養して完全に分化させた。さらに、培地を新しいものに交換したうえで、被検体を投与し３７℃、５％二酸化炭素存在下で培養した。ＰＢＳ（−）で二度細胞を洗浄後、フォスファターゼ阻害剤およびプロテアーゼ阻害剤、ＰＭＳＦを添加した細胞溶解バッファーを１５０μL加え、セルスクレイパーで細胞溶解液を回収した。細胞溶解液を超音波処理後、遠心分離にて上清を回収した。上清は測定に用いるまで−８０℃で保存した。上清のタンパク質濃度を測定し、サンプル間のタンパク濃度を一定に調整した。上清のタンパク濃度を調整後、サンプルバッファ（サーモ）を加え、熱変性させたものをウェスタンブロッティングに用いた。
7.5%の泳動ゲルを用いてSDS-PAGE後、ｉｂｌｏｔにてニトロセルロース膜に転写し、1次抗体としてリン酸化AMPK抗体(CST)および総AMPK(CST)を5%BSAまたはスキムミルクを含むTBSTにて1000倍に希釈し、4℃、シェイカー上でオバーナイト反応させた。よく洗浄後、5%スキムミルクTBSTでHRPラベルされた二次抗体（CST ,1:5000またはサンタクルーズ, 1:10000）を室温、１時間反応させた。よく洗浄後、DuraまたはECL＋で発光させ、GEのデバイスで発光強度を検出した。活性の度合いはコントロール（サンプル無添加）群を１とした相対値で示した。測定結果を表１及び図１に示す。
【００２３】
【表１】
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【００２４】
骨格筋管細胞を用いた糖取込促進活性の測定
下記にしたがって、マウス骨格筋管細胞（Ｃ2Ｃ12）を用いた糖取込促進活性の測定を行った。
凍結保管されたＣ2Ｃ12マウス骨格筋芽細胞を融解し、高グルコースＤＭＥＭ (5790)中で培養し、９６ウェルのクリアボトムのブラックマイクロタイタープレート(Falcon)に、細胞を５０００ cells / ２００uL / wellの濃度で播種し、培養後筋管細胞に分化した細胞を実験に用いた。被検体としては、水性柿葉抽出物Ａ（最終濃度：0.02%, 0.05%）、ネガティブコントロールとしては何も添加していない培地、ポジティブコントロールとしてインスリン (１０nM)を用いた。
実験当日、培地を低グルコース  ＤＭＥＭ (6047）に交換し、スタベーションを行った後、試験物を溶解した培地に交換し、６０分間インキュベートした。処理後、培地を取り除き、１００uMの光標識非加水分解性糖アナログ、6-(N-（7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl）amino)-6-Deoxyglucose（6-NBDG；invitrogen社製）を溶解した低グルコース ＤＭＥＭ培地に交換し、１０分または３０分反応させた。反応後に培地を捨て、ＰＢＳで２回洗浄後、よく水を切ったマイクロプレートについて、蛍光プレートリーダーを用い４４４ nm/５３８ nm emissionで測定した。得られた結果を表２及び図２に示した。
【００２５】
【表２】
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【００２６】
ＳＴＺ糖尿病モデルマウスに対する単回投与による血糖降下作用の評価
下記にしたがって、ＳＴＺ糖尿病モデルマウスに対する単回投与による血糖降下作用の測定を行った。
５週令のＣ５７ＢＬ/６Ｊマウスを予備飼育の後、絶食状態にてストレプトゾトシン（ＳＴＺ）の腹腔内投与(１６０ mg/kg B.W.)により糖尿病を誘導させた。投与後、２時間絶食後の血糖が２５０ mg/dL以上を呈した動物を評価に用いた。ネガティブコントロールとしては蒸留水、ポジティブコントロールとしてはメトホルミン塩酸塩（和光純薬製：Mt） １００mg/kg B.Wを用いた。水性柿葉抽出物Ａは ５００mg/kg B.W（PL-500）となるように投与した。投与時の水性柿葉抽出物Ａ濃度は、６０mg/mLであり、実際の平均投与量は、１３５．８μLであった。試験動物は２時間絶食後の血糖値の平均が同等になるように群分けし（ネガティブコントロールは７匹、他の２群は各８匹）、各試験物をゾンデにて経口投与し、投与後１、２、３時間後の血糖を測定し、初期値からの変化値（Δ血糖値）を求めた。結果を表３及び図３に示した。
【００２７】
【表３】
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【００２８】
グルコーストレランステスト  下記にしたがって、水性柿葉抽出物Ａを経口摂取させたマウスにおけるグルコーストレランステストを行った。  水性柿葉抽出物Ａを、最終濃度が０．２５％（ｗ/ｗ）となるように添加した高脂肪高ショ糖飼料（Ｆ２ＷＴＤ）および高脂肪高ショ糖飼料（ともにオリエンタル酵母工業（株）社製）を作成し、各々ペレット状に成型した。１２匹のＣ５７ＢＬ/６Ｊマウス（５週令：日本チャールス・リバー社）を1週間の予備飼育の後、１群６匹に分けて高脂肪高ショ糖飼料（ＨＦＨＳ）および柿葉エキス配合高脂肪高ショ糖飼料（ＨＦＨＳ+柿葉）を１日に約３ｇ与え、５ヶ月間飼育を行った。飼育後、グルコーストレランステストを実施した。グルコーストレランステストは、２gブドウ糖／kg body weightを腹腔内に注射し、０、３０、６０、９０、１２０分後に尾静脈血にてフリースタイルフリーダムライト（アボット社製）を用いて血糖値を測定した。さらに、1週間絶食させた後のマウスを、麻酔下で下腿部の骨格筋サンプルを採取し、凍結保存した。血糖値の測定結果を図４に示す。なお、検定は各群を独立サンプルとして統計解析ソフトＰＡＳＷ  ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  １８を用いてｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ  ｔｅｓｔにより行った。図の「＊」と「＊＊」は。各々、５％若しくは1％の危険率で有意差を認めたことを示す。  
【００２９】
ウェスタンブロッティングでの骨格筋AMPキナーゼ活性、ｅＮＯＳ、ＰＥＣＡＭの測定  前記試験で採取した骨格筋サンプルを凍結粉砕し、その一部をＴ-ＰＥＲ 緩衝液(Thermo Scientific社製)中で超音波処理後、遠心分離により上清を得た。得られた上清のタンパク質定量を行い、各サンプル間の蛋白量を一定にあわせた。濃度調整した上清タンパクにLane Marker Sample Buffer SDS (Thermo Scientific社製)を加え、９８℃で加熱変性させ、電気泳動用サンプルを調整した。４８μgタンパク量の泳動用サンプルを７．５％ゲルでＳＤＳ-ＰＡＧＥし、ｉｂｌｏｔシステム （invitrogen社製)を用いてニトロセルロース膜に転写した。転写された膜を５％スキムミルク溶液でブロッキング処理後、常法に従い、1次抗体、2次抗体と反応させた後、ECLPlus Western Blotting Detection System（GE Healthcare社製）を検出試薬として、ＬＡＳ４０００miniシステム(GE Healthcare社製)を用いてバンドを検出した。（図５）バンドの強度を画像解析ソフト(ImageQuantTL社製)により数値化し、ＡＭＰキナーゼ活性として総ＡＭＰＫ(ｔＡＭＰＫ)に対するリン酸化ＡＭＰＫ(ｐＡＭＰＫ)の発現比を、血管拡張因子であるｅＮＯＳおよび血管マーカーであるＣＤ３１は内在性コントロールのＧＡＰＤＨで補正した値についてＨＦＨＳ群を１００として相対的に示した。結果を図６、７および８に示す。  
【００３０】
表1〜３及び図１〜３に示したとおり、熱水で抽出して得られた水性柿葉エキスＡは、明らかに０．０５質量％の濃度においてＡＭＰキナーゼのリン酸化活性を有し、マウス骨格筋管細胞（Ｃ2Ｃ12）における糖取込促進活性も有し、糖尿病モデルマウスに対する血糖値低下効果も有することが判った。また、図４に示したとおり、高脂肪高ショ糖飼料に０．２５％（ｗ/ｗ）の水性柿葉抽出物Ａを添加した場合は、添加しない場合に比べてグルコース負荷後の血糖値の上昇を有意に抑制したことから、水性柿葉抽出物Ａは耐糖能低下の改善作用を有することがわかった。図４、図６に示したとおり、水性柿葉抽出物Ａは、骨格筋中のＡＭＰキナーゼのリン酸化活性を有することがわかった。また、図７、図８に示したとおり、ｅＮＯＳとＣＤ３１が増加したことから、水性柿葉抽出物Ａには、血管拡張機能および血管新生の亢進作用も有し、骨格筋組織における血流量および毛細血管密度を増大させる作用があることがわかった。
【００３１】
水性柿葉抽出物Ｂの糖代謝改善作用の評価
乾燥し裁断した柿葉約１０ｇを、２０倍質量の水−エチルアルコール混合液を用いて抽出した。抽出は還流抽出装置を用い、１時間、沸騰還流の条件で実施した。抽出処理後、メッシュ及び濾紙にて不溶物を除去した後に、エバポレーターを用いてエチルアルコールを除去し、得られた抽出液を凍結乾燥して水性柿葉抽出物Ｂ（粉末）を得た。水性柿葉エキスＢは更に分画し、各画分の糖代謝改善作用を評価した。探索は、ゲル濾過クロマトグラフィーを用いて分画し、各分画における評価は「骨格筋管細胞を用いた糖取込促進活性の測定」で実施した。
【００３２】
ゲル濾過クロマトグラフィー
Ｐｕｒｉｆ-ｅｓｐｏｉｒ２（昭光サイエンティフィック社製）およびＳｅｐｈａｄｅｘ-ＬＨ２０（ＧＥヘルスケアジャパン社製）を用いた選択吸着による分画を行なった。移動相は、水：メタノール＝１００：０〜０：１００の範囲で、２０％ずつメタノール比をステップワイズで増加させた混合溶媒を使用し、６つの画分に分画した。さらに、水：アセトン＝３０：７０の混合溶媒を用いて更に溶出を行なった。得られた７つの分画は、エバポレーターでアルコールなどの揮発成分を除去した後に、凍結乾燥を行い、各分画エキス末を得た。分画結果および当該手法にて一般的に得られる化合物を表４に示す。なお、回収率とは、アプライさせた水性柿葉エキスＢの質量に対する各画分で得られた画分エキスの質量比率である。
【００３３】
【表４】
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【００３４】
各画分エキス末の骨格筋管細胞を用いた糖取込促進活性の測定
前記と同じ方法を用いて、水性柿葉抽出物Ｂおよび各分画エキスの骨格筋管細胞を用いた糖取込促進活性を測定した。水性柿葉抽出物Ｂおよび各分画エキスは最終濃度が０．０２％となる条件で行なった。得られた結果を表５および図９に示す。
【００３５】
【表５】
2014198684.tif 000007
【００３６】
表３に示したとおり、１００％メタノールおよび水：アセトン＝３０：７０の混合溶媒において高い活性を確認した。一般的に、１００％メタノールの溶出にて得られる画分には重合度が７以下の低重合プロアントシアニジンが、水：アセトン＝３０：７０の混合溶媒の溶出にて得られる画分には重合度が８以上の高重合プロアントシアニジンが多く含有されることが知られていることから、水性柿葉抽出物Ａ中の効果成分は、水に溶解するアントシアニジンの可能性が高いことがわかった。
【００３７】
以下、本発明に係る血糖代謝改善剤を配合した経口組成物の実施例の処方を挙げるが、本発明は下記の処方に限定されるものではない。なお、特に指定の無いかぎり配合量は質量部を示す。
【００３８】
処方例１：スポーツ飲料  
成    分                                配  合  量  
水性柿葉エキスＡ                              ０．３
果糖                                          ８
食塩                                          ２
重曹                                          ２
水                                            残  部  
合    計                                ５００
【００３９】
処方例２：粉末茶  

成    分                                配  合  量  
水性柿葉エキスＡ                            ２２
香料                                          ３
デキストリン                                ７５      
合    計                                １００
【００４０】
処方例３：チュアブル錠  

成    分                                配  合  量  
水性柿葉エキスＢ                          １００
キシリトール                              ２８５
アスパルテーム                                ４
ステアリン酸マグネシウム                    １０
香料                                          １      
合    計                                ４００
【００４１】
処方例４：チューイングガム  

成    分                                配  合  量  
水性柿葉エキスＢ                          １００
ガムベース                                ５００
キシリトール                            １０００
還元パラチノース                          ７００
香料                                      ２００      
合    計                              ２５００
【００４２】
処方例５：焼き菓子  

成    分                                配  合  量  
水性柿葉エキスＡ                              ０．３
薄力粉                                      １７．８５
ベーキングパウダー                            ０．３
米油                                          ２．４
還元水あめ                                    ９
香料                                          ０．１５
合    計                                  ３０
【００４３】
処方例６：ゼリー飲料  

成    分                                配  合  量  
水性柿葉エキスＢ                              ０．３５
オリゴ糖シロップ                            ２７
還元水あめシロップ                          ２７
濃縮果汁                                      ７．２
グルコマンナン                                ５．４
ｐＨ調整剤                                    ４．５
ゲル化剤                                      ２．７
香料                                          ０．４５
水                                            残  部  
合    計                                １００
【００４４】
処方例７：ショットドリンク  

成    分                                配  合  量  
水性柿葉エキスＡ                              ０．３
オリゴ糖シロップ                            １５
還元水あめシロップ                          １５
濃縮果汁                                      ４
ｐＨ調整剤                                    ２．５
安定化剤                                      １
香料                                          ０．２５
スクラロース                                  ０．０２
水                                            残  部  
合    計                                １００
【００４５】
処方例８：カプセル剤  （300ｍｇ/個）  

成    分                                配  合  量  
水性柿葉エキスＡ                          １５０
コーンスターチ                              ６０
セルロース                                  ６０
トコフェロール                                ６
乳糖                                        ２３
安定化剤                                      １      
合    計                                ３００  
【００４６】
処方例９：錠剤（250ｍｇ錠）

成    分                                配  合  量  
水性柿葉エキスＡ                          １５０
コーンスターチ                              ２５
セルロース                                  ２５
ビタミンＣ                                  ５０      
合    計                                ２５０
【図１】
2014198684.tif 000008
【図２】
2014198684.tif 000009
【図３】
2014198684.tif 000010
【図４】
2014198684.tif 000011
【図５】
2014198684.tif 000012
【図６】
2014198684.tif 000013
【図７】
2014198684.tif 000014
【図８】
2014198684.tif 000015
【図９】
2014198684.tif 000016
【手続補正書】
【提出日】平成25年5月9日(2013.5.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
【図１】図１は、精製水（熱水）で抽出して得られた水性柿葉抽出物Ａの、マウス骨格筋管細胞株を用いたＡＭＰキナーゼの活性測定結果を示す。
【図２】図２は、精製水（熱水）で抽出して得られた水性柿葉抽出物Ａの、マウス骨格筋管細胞株を用いた糖取込促進測定結果を示す。
【図３】図３は、精製水（熱水）で抽出して得られた水性柿葉抽出物Ａの、ＳＴＺ糖尿病モデルマウスに対する単回投与による血糖降下作用の測定結果を示す。
【図４】図４は、精製水（熱水）で抽出して得られた水性柿葉抽出物Ａの長期摂取後の、グルコーストレランステストにおける血糖値の測定結果を示す。
【図５】図５は、精製水（熱水）で抽出して得られた水性柿葉抽出物Ａの長期摂取後の、骨格筋リン酸化ＡＭＰキナーゼおよび総ＡＭＰＫ発現を示す。
【図６】図６は、精製水（熱水）で抽出して得られた水性柿葉抽出物Ａの長期摂取後の、骨格筋中における総ＡＭＰＫ(ｔＡＭＰＫ)に対するリン酸化ＡＭＰＫ(ｐＡＭＰＫ)の発現比を示す。
【図７】図７は、精製水（熱水）で抽出して得られた水性柿葉抽出物Ａの長期摂取後の、骨格筋中におけるＧＡＰＤＨあたりのｅＮＯＳ発現比を示す。
【図８】図８は、精製水（熱水）で抽出して得られた水性柿葉抽出物Ａの長期摂取後の、骨格筋中におけるＧＡＰＤＨあたりのＣＤ３１の発現比を示す。
【図９】図９は、５０％水-エチルアルコール混合液で抽出して得られた水性柿葉抽出物Ｂおよびその分画画分の、マウス骨格筋管細胞株を用いた糖取込促進測定結果を示す。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
水性柿葉抽出物Ａの糖代謝改善作用の評価
前記で得られた水性柿葉抽出物Ａの糖代謝改善作用を評価した。糖代謝改善作用の評価としては。「Ｃ2Ｃ12細胞におけるＡＭＰキナーゼのリン酸化活性と６−ＮＢＤＧ取込み促進作用、ＳＴＺ糖尿病モデルマウスに対する単回投与による血糖効果作用、及び高脂肪高ショ糖負荷マウスに対する長期摂取によるグルコーストレランステストおよび骨格筋のＡＭＰＫ活性とeNOS, CD31発現」の測定を行なうことで実施した。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２３】
【表１】
2014198684.tif 000017
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２４】
骨格筋管細胞を用いた糖取込促進活性の測定
下記にしたがって、マウス骨格筋管細胞（Ｃ2Ｃ12）を用いた糖取込促進活性の測定を行った。
凍結保管されたＣ2Ｃ12マウス骨格筋芽細胞を融解し、高グルコースＤＭＥＭ (5790)中で培養し、９６ウェルのクリアボトムのブラックマイクロタイタープレート(Falcon)に、細胞を５０００ cells / ２００μL / wellの濃度で播種し、培養後筋管細胞に分化した細胞を実験に用いた。被検体としては、水性柿葉抽出物Ａ（最終濃度：0.02%, 0.05%）、ネガティブコントロールとしては何も添加していない培地、ポジティブコントロールとしてインスリン (１０nM)を用いた。
実験当日、培地を低グルコース  ＤＭＥＭ (6047)に交換し、スタベーションを行った後、試験物を溶解した培地に交換し、６０分間インキュベートした。処理後、培地を取り除き、１００μMの光標識非加水分解性糖アナログ、6-（N-（7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl）amino）-6-Deoxyglucose （6-NBDG；invitrogen社製）を溶解した低グルコース ＤＭＥＭ培地に交換し、１０分または３０分反応させた。反応後に培地を捨て、ＰＢＳで２回洗浄後、よく水を切ったマイクロプレートについて、蛍光プレートリーダーを用い４４４ nm/５３８ nm emissionで測定した。得られた結果を表２及び図２に示した。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２８】
グルコーストレランステスト
下記にしたがって、水性柿葉抽出物Ａを長期経口摂取させたマウスにおけるグルコーストレランステストを行った。
水性柿葉抽出物Ａを、最終濃度が０．２５％（ｗ/ｗ）となるように添加した高脂肪高ショ糖飼料（Ｆ２ＷＴＤ）および高脂肪高ショ糖飼料（ともにオリエンタル酵母工業（株）社製）を作成し、各々ペレット状に成型した。１２匹のＣ５７ＢＬ/６Ｊマウス（５週令：日本チャールス・リバー社）を1週間の予備飼育の後、１群６匹に分けて高脂肪高ショ糖飼料（ＨＦＨＳ）および柿葉エキス配合高脂肪高ショ糖飼料（ＨＦＨＳ+柿葉）を１日に約３ｇ与え、５ヶ月間飼育を行った。飼育後、グルコーストレランステストを実施した。グルコーストレランステストは、２gブドウ糖／kg body weightを腹腔内に注射し、０、３０、６０、９０、１２０分後に尾静脈血にてフリースタイルフリーダムライト（アボット社製）を用いて血糖値を測定した。さらに、1週間絶食させた後のマウスを、麻酔下で下腿部の骨格筋サンプルを採取し、凍結保存した。血糖値の測定結果を図４に示す。なお、検定は各群を独立サンプルとして統計解析ソフトＰＡＳＷ  ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  １８を用いてｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ  ｔｅｓｔにより行った。図の「＊」と「＊＊」は、各々、５％若しくは1％の危険率で有意差を認めたことを示す。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２９】
ウェスタンブロッティングでの骨格筋AMPキナーゼ活性、ｅＮＯＳ、ＣＤ３１発現の測定
前記試験で採取した骨格筋サンプルを凍結粉砕し、その一部をＴ-ＰＥＲ 緩衝液（Thermo  Scientific社製）中で超音波処理後、遠心分離により上清を得た。得られた上清のタンパク質定量を行い、各サンプル間の蛋白量を一定にあわせた。濃度調整した上清タンパクにLane  Marker  Sample  Buffer  SDS（Thermo  Scientific社製）を加え、９８℃で加熱変性させ、電気泳動用サンプルを調整した。４８μgタンパク量の泳動用サンプルを７．５％ゲルでＳＤＳ-ＰＡＧＥし、ｉｂｌｏｔシステム（invitrogen社製）を用いてニトロセルロース膜に転写した。転写された膜を５％スキムミルク溶液でブロッキング処理後、常法に従い、1次抗体、2次抗体と反応させた後、ECLPlus  Western  Blotting  Detection  System（GE  Healthcare社製）を検出試薬として、ＬＡＳ４０００miniシステム(GE  Healthcare社製)を用いてバンドを検出した。（図５）バンドの強度を画像解析ソフト（ImageQuantTL社製）により数値化し、ＡＭＰキナーゼ活性として総ＡＭＰＫ（ｔＡＭＰＫ）に対するリン酸化ＡＭＰＫ（ｐＡＭＰＫ）の発現比を、血管拡張因子であるｅＮＯＳおよび血管マーカーであるＣＤ３１は内在性コントロールのＧＡＰＤＨで補正した値についてＨＦＨＳ群を１００として相対的に示した。結果を図６、７および８に示す。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３０】
表1〜３及び図１〜３に示したとおり、熱水で抽出して得られた水性柿葉エキスＡは、明らかに０．０５質量％の濃度においてＡＭＰキナーゼのリン酸化活性を有し、マウス骨格筋管細胞（Ｃ2Ｃ12）における糖取込促進活性も有し、糖尿病モデルマウスに対する血糖値低下効果も有することが判った。また、図４に示したとおり、高脂肪高ショ糖飼料に０．２５％（ｗ/ｗ）の水性柿葉抽出物Ａを添加した場合は、添加しない場合に比べてグルコース負荷後の血糖値の上昇を有意に抑制したことから、水性柿葉抽出物Ａは耐糖能低下の改善作用を有することがわかった。図５、図６に示したとおり、水性柿葉抽出物Ａは、骨格筋中のＡＭＰキナーゼのリン酸化活性を有することがわかった。また、図７、図８に示したとおり、ｅＮＯＳとＣＤ３１が増加したことから、水性柿葉抽出物Ａには、血管拡張機能および血管新生の亢進作用も有し、骨格筋組織における血流量および毛細血管密度を増大させる作用があることがわかった。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３４】
各画分エキス末の骨格筋管細胞を用いた糖取込促進活性の測定
前記と同じ方法を用いて、水性柿葉抽出物Ｂおよび各分画エキスの骨格筋管細胞を用いた糖取込促進活性を測定した。水性柿葉抽出物Ｂおよび各分画エキスは最終濃度が０．０２％となる条件で行なった。得られた結果を表５および図９に示す。