(57)【要約】【課題】複雑化,大型化および重量増加させずに二次元面内全域で蛍光を高速に且つ効率よく検出する。【解決手段】サンプル台４のサンプル載置面上の四隅に、蛍光性を有する傾き調整用マーク３１を塗布する。そして、走査モジュールの光源からの励起光の照射に基づいて、傾き調整用マーク３１から発せられた蛍光を、上記走査モジュールの対物レンズで集光し、検出器で検出する。したがって、４箇所の傾き調整用マーク３１からの蛍光光量のバラツキが設定値内になるようにして、サンプル台４の傾きを調整することが可能になる。こうして、上記サンプルがない場合であっても、何時でも、サンプル台４の傾きを測定できるようにし、別途サンプル台４の平行度を測定する専門の装置を追加する場合よりも構造を簡略化できる。したがって、上記検出光学系を複雑化,大型化および重量増加させずに、二次元面内全域で蛍光を高速に且つ効率よく検出可能になる。【選択図】図５
2014052252.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
検出対象物が載置される平面状のサンプル台と、
上記サンプル台における上記検出対象物が載置される面上の複数の位置に形成されると共に、蛍光性を有する傾き調整用マークと、
蛍光物質を励起する励起光を出射する光源と、上記励起光の照射に基づいて上記検出対象物および上記傾き調整用マークから発せられた蛍光を集光するレンズ素子と、このレンズ素子で集光された蛍光を検出する検出光学系とを含むと共に、上記サンプル台に略平行な平面内において第１走査方向とこの第１走査方向に略直交する第２走査方向との二次元走査を行う走査モジュールと
を備えたことを特徴とする蛍光検出装置。
【請求項２】
請求項１に記載の蛍光検出装置において、
上記走査モジュールは、光透過性を有する上記サンプル台における上記検出対象物が載置される面とは反対側の面に対向して配置されており、
上記レンズ素子は、上記サンプル台を介して、上記検出対象物および上記傾き調整用マークから発せられた蛍光を集光するようになっており、
上記傾き調整マークは、上記検出対象物が載置される領域の外側に形成されている
ことを特徴とする蛍光検出装置。
【請求項３】
請求項１あるいは請求項２に記載の蛍光検出装置において、
上記傾き調整マークの上面を覆うカバー部材を備えた
ことを特徴とする蛍光検出装置。
【請求項４】
請求項１から請求項３までの何れか一つに記載の蛍光検出装置において、
上記レンズ素子は、
屈折によって光を集光する中央部分と、この中央部分の周辺に位置して全反射によって光を集光する周辺部分とを含んで構成されており、
上記中央部分の少なくとも一部は上記励起光を透過させる励起光透過部となっている対物レンズである
ことを特徴とする蛍光検出装置。
【請求項５】
請求項１から請求項４までの何れか一つに記載の蛍光検出装置において、
上記走査モジュールは、上記傾き調整用マークから発せられた蛍光を上記検出光学系で検出する場合には、上記二次元走査を行って上記光源からの励起光で上記傾き調整用マークの照射面を走査するようになっている
ことを特徴とする蛍光検出装置。
【請求項６】
請求項１から請求項５までの何れか一つに記載の蛍光検出装置において、
上記傾き調整用マークは、予め設定された設定幅を有する複数のストライプが、予め設定された設定間隔で平行に配列されて形成されている
ことを特徴とする蛍光検出装置。
【請求項７】
請求項１から請求項６までの何れか一つに記載の蛍光検出装置において、
上記傾き調整用マークは、波長の異なる蛍光性を有する複数の部分調整用マークで構成されている
ことを特徴とする蛍光検出装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、蛍光検出装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来より、生化学分野や分子生物学分野において、蛍光色素を標識物質として利用した蛍光検出システムが広く用いられている。この蛍光検出システムを用いることによって、遺伝子配列,遺伝子の変異・多型解析,タンパク質の分離および同定等の評価を行うことができ、薬等の開発に利用されている。
【０００３】
上述のような蛍光標識を利用した評価方法としては、電気泳動によってタンパク質等の生物学的化合物をゲル内に分布させ、その生物学的化合物の分布を蛍光検出により取得するという方法がよく用いられている。上記電気泳動では、緩衝液等の溶液中に電極を設置しておき、直流電流を流すことによって上記溶液中に電場勾配を生じさせる。このとき、上記溶液中に電荷を有するタンパク質やＤＮＡ(Deoxyribonucleic acid：デオキシリボ核酸)やＲＮＡ(ribo nucleic acid：リボ核酸)がある場合に、プラス電荷を有する分子は陰極に、マイナス電荷を有する分子は陽極に引き寄せられ、生体分子の分離を行うことができる。
【０００４】
上記電気泳動を用いた評価方法の一つである二次元電気泳動は、２種類の電気泳動法を組み合わせることによって、ゲル内に生体分子を二次元的に分布させる評価方法であり、プロテオーム解析を行う上で最も有効な方法であると考えられている。
【０００５】
上記電気泳動の組み合わせとしては、例えば、一次元目としての「個々のタンパク質の等電点の違いを利用する等電点電気泳動」と、二次元目としての「タンパク質の分子量で分離を行うＳＤＳ‐ＰＡＧＥ(ドデシル硫酸ナトリウム‐ポリアクリルアミドゲル電気泳動)」との２種類が主に用いられる。こうして分離された上記生体分子としてのタンパク質に対して、蛍光色素は電気泳動前あるいは電気泳動後に付与される。
【０００６】
さらに、上述のようにして作製された上記生体分子(タンパク質)が二次元的に分布されたゲル支持体に励起光を照射し、発生した蛍光強度を取得して、それに基づいて蛍光分布(タンパク質分布)画像を表示させる画像読取装置が、生化学や分子生物学の分野で広く普及している。
【０００７】
また、上記生体分子の二次元分布を保持する方法としては、上記ゲル内に保持するだけではなく、上記ゲル内にタンパク質を分離させた後に、電気泳動や毛細管現象を利用して上記ゲルからメンブレンに転写させる方法も行われる。その場合には、上記ゲル支持体を用いた画像読取の場合と同様に、上記メンブレンである転写支持体上の蛍光分布を画像読取装置によって画像化することができる。
【０００８】
上述したような生体分子が二次元的に分布されたゲル支持体や転写支持体から生体分子分布画像を読み取る画像読取装置として、特開２００１‐７４６５６号公報(特許文献１)に開示された画像情報読取装置がある。
【０００９】
この画像情報読取装置においては、中央部に孔が形成された孔開きミラーを主走査方向に移動される光学ヘッドに搭載し、蛍光色素によって標識された生体由来物質が分布する被走査体に対して、レーザ光源からの上記蛍光色素を励起する波長帯域のレーザ光(励起光)を平面ミラーで上方に反射し、上記孔開きミラーの小孔を通過させた後、対物レンズで集光して照射する。そして、上記被走査体中の蛍光色素が励起されて発せられた蛍光が上記孔開きミラーの上記小孔の周囲で反射され、フォトマルチプライヤによって光電変換されて検出される。こうして、対応する画像信号として読み取られる。以下、上記主走査方向に直交する副走査方向に上記光学ヘッドを移動させながら上記動作を繰り返すことによって、二次元の可視画像(蛍光画像)を得るようにしている。
【００１０】
しかしながら、上記従来の画像情報読取装置には、以下のような問題がある。
【００１１】
すなわち、上記被走査体中の蛍光色素が励起されて発せられた蛍光を効率よく検出するためには、励起光である上記レーザ光の焦点位置が上記被走査体の検出面上にあり、さらに上記検出面と上記対物レンズの焦点面とが一致している必要がある。二次元走査を行う蛍光画像形成装置においては、上記検出面の全体において、上記条件が満たされている必要がある。
【００１２】
ところが、二次元走査による振動や経時変化によって上記検出面が徐々に傾くため、上記検出面と上記対物レンズの焦点面とが一致しなくなる場合があるという問題がある。
【００１３】
そこで、このような問題に対処する方法として、特許３９２８８４６号公報(特許文献２)に開示された供焦点光学系を備えたスキャナがある。
【００１４】
このスキャナにおいては、対物レンズの位置を変化させて光検出器で検出した蛍光の信号強度に基づいて、供焦点光学系としての上記対物レンズおよびレンズ等のフォーカス位置を決定し、この決定されたフォーカス位置でのデータに基づいてＥＰＲＯＭ(Erasable Programmable Read Only Memory)に記憶されていたフォーカス位置データを補正する。そして、この補正されたフォーカス位置データに基づいてステッピングモータを駆動して上記対物レンズを光軸方向に移動させて、上記対物レンズのフォーカス位置を調整するようにしている。
【００１５】
しかしながら、上記従来のスキャナには、以下のような問題がある。
【００１６】
すなわち、上記蛍光の信号強度に基づいて上記対物レンズおよび上記レンズのフォーカス位置を決定する手段や、上記対物レンズを光軸方向に移動させるステッピングモータが必要であるために、蛍光検出光学系が複雑化し、大型になる。したがって、スキャナの装置全体が大型化するという問題がある。さらに、蛍光検出光学系の重量が重くなり、高速にスキャンすることができなくなるという問題もある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１７】
【特許文献１】特開２００１‐７４６５６号公報
【特許文献２】特許３９２８８４６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
そこで、この発明の課題は、蛍光検出光学系を複雑化,大型化および重量増加させることなく、二次元面内全域において蛍光を高速に且つ効率よく検出可能な蛍光検出装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
上記課題を解決するため、この発明の蛍光検出装置は、
検出対象物が載置される平面状のサンプル台と、
上記サンプル台における上記検出対象物が載置される面上の複数の位置に形成されると共に、蛍光性を有する傾き調整用マークと、
蛍光物質を励起する励起光を出射する光源と、上記励起光の照射に基づいて上記検出対象物および上記傾き調整用マークから発せられた蛍光を集光するレンズ素子と、このレンズ素子で集光された蛍光を検出する検出光学系とを含むと共に、上記サンプル台に略平行な平面内において第１走査方向とこの第１走査方向に略直交する第２走査方向との二次元走査を行う走査モジュールと
を備えたことを特徴としている。
【００２０】
上記構成によれば、サンプル台における複数の位置に蛍光性を有する傾き調整用マークを形成しているので、走査モジュールによって、光源からの励起光の照射に基づいて上記複数の傾き調整用マークから発せられた蛍光を集光して蛍光強度検出することによって、上記サンプル台の傾きを測定することができる。
【００２１】
したがって、検出対象物がない状態であっても、何時でも上記サンプル台の傾きを測定することができ、別途上記サンプル台の平行度を測定する専門の装置を追加する場合よりも構造を簡略化できる。さらに、実際の蛍光検出に基づいて、検出感度が最大になるように上記サンプル台の傾きを調整することが可能になる。
【００２２】
すなわち、この発明によれば、上記走査モジュールの上記検出光学系を複雑化,大型化および重量増加させることなく、二次元面内全域において蛍光を高速に且つ効率よく検出可能な蛍光検出装置を提供することができるのである。
【００２３】
また、１実施の形態の蛍光検出装置では、
上記走査モジュールは、光透過性を有する上記サンプル台における上記検出対象物が載置される面とは反対側の面に対向して配置されており、
上記レンズ素子は、上記サンプル台を介して、上記検出対象物および上記傾き調整用マークから発せられた蛍光を集光するようになっており、
上記傾き調整マークは、上記検出対象物が載置される領域の外側に形成されている。
【００２４】
この実施の形態によれば、光透過性を有する上記サンプル台を介して裏面側から上記検出対象物からの蛍光を検出するようになっており、上記傾き調整マークは上記検出対象物が載置される領域の外側に形成されている。
【００２５】
したがって、上記傾き調整マークは、上記検出対象物の上記サンプル台上への載置作業および上記検出対象物からの蛍光光量の測定作業を阻害することがない。
【００２６】
また、１実施の形態の蛍光検出装置では、
上記傾き調整マークの上面を覆うカバー部材を備えている。
【００２７】
この実施の形態によれば、上記カバー部材によって、上記傾き調整マークの上面を覆っている。したがって、本蛍光検出装置外からの光が上記傾き調整用マークに入射して、上記傾き調整用マークの蛍光物質が劣化することを防ぐことができる。また、上述したように、上記走査モジュールが、上記サンプル台における上記検出対象物の載置面とは反対側の面側から蛍光を検出するようになっている場合には、上記傾き調整用マークの上部を上記カバー部材で完全に覆っても上記傾き調整用マークからの蛍光を測定する際に支障が無い。したがって、上記傾き調整用マークは上記カバー部材によって完全に外部から保護されており、上記検出対象物を栽置する際に誤って上記傾き調整用マークが傷付いたり、汚れたりすることを防止することができる。
【００２８】
また、１実施の形態の蛍光検出装置では、
上記レンズ素子は、
屈折によって光を集光する中央部分と、この中央部分の周辺に位置して全反射によって光を集光する周辺部分とを含んで構成されており、
上記中央部分の少なくとも一部は上記励起光を透過させる励起光透過部となっている対物レンズである。
【００２９】
この実施の形態によれば、上記検出対象物からの蛍光を集光する対物レンズは、屈折によって光を集光する通常の凸レンズに相当する中央部分の外周に、全反射によって光を集光する周辺部分を有している。したがって、通常の凸レンズでは集光できないような大きな放射角度の光をも集めることができ、集光光率を高めて上記検出光学系による感度アップを図ることができる。
【００３０】
このように、上記検出対象物から広い出射角度で放射状に出射された微弱な蛍光を効率よく検出するため、上記検出対象物の近くに位置する上記対物レンズによって放射状に出射された蛍光を集光し、上記検出光学系で検出する。ところが、上記構成の場合には、上記対物レンズと上記検出対象物との距離が適切な値から少しずれただけで上記対物レンズの集光効率が極端に低下してしまう。
【００３１】
さらに、上記対物レンズは、上記中央部に励起光を透過させる透過部分となっている。したがって、上記対物レンズの位置がずれると、上述のように蛍光の集光効率が低下するだけでなく、上記励起光の光路がずれてしまう。
【００３２】
しかしながら、この実施の形態においては、上述のごとく、上記複数の傾き調整用マークから発せられた蛍光を集光して蛍光強度検出することによって、上記サンプル台の傾きを調整することが可能になっている。したがって、上記対物レンズと上記検出対象物との距離のずれや上記対物レンズの位置のずれによって生ずる蛍光の集光効率の低下や上記励起光の光路ずれの問題をなくすことが可能になる。
【００３３】
また、１実施の形態の蛍光検出装置では、
上記走査モジュールは、上記傾き調整用マークから発せられた蛍光を上記検出光学系で検出する場合には、上記二次元走査を行って上記光源からの励起光で上記傾き調整用マークの照射面を走査するようになっている。
【００３４】
この実施の形態によれば、上記傾き調整用マークからの蛍光を検出する場合には、上記走査モジュールの上記光源からの励起光で上記傾き調整用マークの照射面を走査(例えば往復走査やジグザグ走査)するようにしている。したがって、上記傾き調整用マークの１点に集中して励起光を当て続けることなく蛍光光量を測定することができ、上記蛍光の経時的な輝度変化を抑制して正確に上記蛍光光量を測定することができる。さらに、上記傾き調整用マークの劣化を防止して、寿命を延ばすことができる。
【００３５】
また、１実施の形態の蛍光検出装置では、
上記傾き調整用マークは、予め設定された設定幅を有する複数のストライプが、予め設定された設定間隔で平行に配列されて形成されている。
【００３６】
この実施の形態によれば、上記走査モジュールの上記光源からの励起光を上記傾き調整用マークに照射する際に、上記複数のストライプの幅方向に上記走査モジュールを走査しながら測定することによって、上記傾き調整用マークからの蛍光強度を最大値と最小値の差である強度振幅として正確に測定することができる。
【００３７】
したがって、例えば、上記傾き調整用マークにおける上記複数のストライプによる強度振幅の平均値をとることによって、測定精度のばらつきを防止することができる。また、上記傾き調整用マークにおける測定開始位置と測定終了位置とがある程度ルーズな場合であっても、一つの上記傾き調整用マークの走査中に上記複数のストライプのパターン上を通過すれば上記強度振幅を測定できるため、１回の走査で上記傾き調整用マークの複数の測定点での蛍光強度の測定を行うことができる。
【００３８】
また、１実施の形態の蛍光検出装置では、
上記傾き調整用マークは、波長の異なる蛍光性を有する複数の部分調整用マークで構成されている。
【００３９】
この実施の形態によれば、検出対象の種類に応じて蛍光剤の種類を変えると共に、上記複数の蛍光剤の夫々からの蛍光の波長に応じて、上記傾き調整用マークを照射する励起光の波長を替える場合であっても、上記励起光の波長に合わせて上記サンプル台の傾きを調整することが可能になる。
【発明の効果】
【００４０】
以上より明らかなように、この発明の蛍光検出装置は、サンプル台における複数の位置に蛍光性を有する傾き調整用マークを形成しているので、走査モジュールによって、光源からの励起光の照射に基づいて上記複数の傾き調整用マークから発せられた蛍光を集光して蛍光強度を検出することにより、上記サンプル台の傾きを調整することが可能になる。
【００４１】
したがって、検出対象物がない状態であっても、何時でも上記サンプル台の傾きを測定することができ、別途上記サンプル台の平行度を測定する専門の装置を追加する場合よりも構造を簡略化できる。さらに、実際の蛍光検出に基づいて、検出感度が最大になるように上記サンプル台の傾きを調整することが可能になる。
【００４２】
すなわち、この発明によれば、上記走査モジュールの上記検出光学系を複雑化,大型化および重量増加させることなく、二次元面内全域において蛍光を高速に且つ効率よく検出可能な蛍光検出装置を提供することができるのである。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】この発明の蛍光検出装置における外観図である。
【図２】図１におけるサンプル台の下部に設置された走査ステージの外観図である。
【図３】図２における第２ステージ上に載置される走査モジュールの断面図である。
【図４】サンプル台の傾きを調整するための傾き調整用マークの説明図である。
【図５】図４における傾き調整用マークを含む縦断面図である。
【図６】傾き調整用マークの上面を覆うカバー部材を示す図である。
【図７】ストライプ状に形成された傾き調整用マークを示す図である。
【図８】複数の蛍光波長に対応可能な傾き調整用マークを示す図である。
【図９】複数の蛍光波長に対応可能な図８とは異なる傾き調整用マークを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
以下、この発明を図示の実施の形態により詳細に説明する。
【００４５】
図１は、本実施の形態の蛍光検出装置における外観図である。本蛍光検出装置１は、筺体を成す本体２と、本体２の上面を覆う蓋体３とで、大まかに構成されている。本体２の上面には、ガラスでなるサンプル台４が設けられており、サンプル台４上には例えば蛍光物質によって標識された生体由来物質が分布するゲル支持体やメンブレン等の転写支持体(共に図示せず)がサンプル(検出対象物)としてセットされる。
【００４６】
そして、上記サンプル台４の下側には光学系が配置されており、サンプル台４上にセットされたサンプルに対して、励起光学系によってサンプル台４を通して下方から励起光を照射し、サンプル台４を透過してくる上記サンプルからの蛍光を検出光学系によって検出する。上記検出光学系はＰＣ(Personal computer：パーソナルコンピュータ)５等の外部端末と接続されており、ＰＣ５から測定条件の制御等を行う。さらに、ＰＣ５によって、検出データに基づいてサンプルの蛍光画像を作成し、内蔵する表示画面に上記作成した蛍光画像等を表示する。
【００４７】
図２は、上記サンプル台４の下部に設置された走査ステージ６の外観図を示す。この走査ステージ６は、基準となる第１ステージ７と第１ステージ７の上に載置された第２ステージ８とで構成されている。そして、第２ステージ８の上に走査モジュール９が載置されている。上記蛍光を検出する上記検出光学系は走査モジュール９の中に格納されている。
【００４８】
上記走査ステージ６を構成する第１ステージ７には、第１走査方向に延在すると共に、一定の間隔で互いに対向する２本のガイドレール１０a,１０bが配設されている。また、第２ステージ８は、第１ステージ７のガイドレール１０aによって案内されて上記第１走査方向に往復動する第１ガイド部材１１と、ガイドレール１０bによって案内されて上記第１走査方向に往復動する第２ガイド部材１２とを有している。
【００４９】
上記第２ステージ８を構成する第１ガイド部材１１と第２ガイド部材１２との間には、上記第１走査方向に直交する第２走査方向に延在すると共に、一定の間隔で互いに対向する２本のガイドシャフト１３a,１３bが配設されている。また、走査モジュール９には、ガイドシャフト１３a,１３bが挿通される孔が設けられている。そして、走査モジュール９は、ガイドシャフト１３a,１３bによって案内されて上記第２走査方向に往復動するようになっている。
【００５０】
上記構成を有する走査ステージ６による走査方法は、先ず、上記第２ステージ８の第１ガイド部材１１と第２ガイド部材１２とがガイドレール１０a,１０bによって案内されて上記第１走査方向に移動して、第２ステージ８の第１ステージ７に対する位置決めが行われる。そうした後に、走査モジュール９がガイドシャフト１３a,１３bによって案内されて上記第２走査方向に移動して、走査モジュール９の第２ステージ８に対する位置決めが行われる。以後、上記動作を繰り返すことによって、サンプル１６上を二次元に走査するのである。
【００５１】
また、上記筺体を成す本体２のサンプル台４下部における走査ステージ６よりも更に下側には、第２ステージ８の第１,第２ガイド部材１１,１２を上記第１走査方向に、走査モジュール９を上記第２走査方向に移動させるためのモータ,タイミングベルト,ボールねじ,歯車,制御基板,電源および配線等の走査装置が設置されている。
【００５２】
図３は、上記第２ステージ８の上に載置される走査モジュール９の概略構成を示す縦断面図である。
【００５３】
図３において、上記走査モジュール９の上部には、サンプル台(ガラス)４の近傍に位置して、サンプル台４上にセットされたサンプル１６からの蛍光を集光する上記レンズ素子としての対物レンズ１７を配置している。さらに、対物レンズ１７の光軸と励起光の光源１８の光軸とが直交する位置には、光源１８から出射されて第１レンズ１９で集光されたレーザ光等の励起光を対物レンズ１７に入射するように反射させるプリズム２０を配置している。
【００５４】
上記光源１８,第１レンズ１９,プリズム２０および対物レンズ１７によって構成される励起光学系は、金属枠２１に固定・支持されている。そのために、光源１８の放熱性が良く、励起光学系は熱変形しにくい構造になっている。したがって、光源１８から出射された励起光を、サンプル１６上の微小な１点に対して、ずれることなく集光させることができる。また、サンプル１６上の１点に対するずれが少ないため、プリズム２０の長手方向(第１レンズ１９の光軸に直交する方向)の長さは短く、上記長手方向に直交する方向の幅は狭くして、小さくすることが可能である。
【００５５】
また、図３において、上記対物レンズ１７の光軸上におけるプリズム２０の下方には、プリズム２０側から順に、対物レンズ１７によって集光されたサンプル１６からの蛍光を平行光に変換する第２レンズ２２、励起光カット用の波長フィルタ２３、波長フィルタ２３を通過した蛍光を集光する第３レンズ２４、および、第３レンズ２４を通過した蛍光の迷光をカットするピンホール２５が配置されている。さらに、対物レンズ１７の光軸上におけるピンホール２５の下方には、ピンホール２５を通過した蛍光を検出する上記検出素子を含む検出器２６が配置されている。
【００５６】
上記第２レンズ２２,波長フィルタ２３,第３レンズ２４,ピンホール２５および検出器２６によって構成される検出光学系は、樹脂枠２７に固定・支持されている。
【００５７】
上述したように、図３において、蛍光の直径は大きいため、検出光学系には大口径の第２レンズ２２および第３レンズ２４を使用する。その場合、大口径のレンズ２２,２４を支持する枠を金属で作成すると検出光学系の重量が増し、走査モジュール９の高速走査が困難となり、走査時間が長くなる。
【００５８】
一方において、上記大口径のレンズ２２,２４を支持する枠を、軽量化のために何の工夫もなく樹脂枠２７にすると、枠２７が歪むことによって上記検出光学系の光軸が設計位置からずれ、検出光学系の所望の性能を得ることができない。
【００５９】
そこで、本実施の形態においては、上記検出光学系の光軸を鉛直方向になるようにし、尚且つ上記検出光学系を支持する樹脂枠２７を金属枠２１の下面に垂下するように取り付けている。こうすることで、大口径のレンズ２２,２４を支持する枠を樹脂枠２７として軽量化図った場合でも、上記検出光学系の変形は光軸方向のみに限定され、自重による光軸のずれを小さくすることができるのである。
【００６０】
上記構成を有する走査モジュール９では、光源１８から出射された励起光は、第１レンズ１９で収束され、次いでプリズム２０によって反射されて、対物レンズ１７およびサンプル台４を通過して、サンプル１６における下面上の一点に集光される。その場合、プリズム２０の長手方向(第１レンズ１９の光軸に直交する方向)の長さは短く、上記長手方向に直交する方向の幅は狭くなっており、光源１８からの励起光は対物レンズ１７の光軸付近(励起光透過部)のみを通過するようになっている。
【００６１】
上記蛍光は、サンプル１６における上記励起光が照射された部分から周囲に等方的に出射される。そして、出射された蛍光のうちのガラスで成るサンプル台４を透過して対物レンズ１７に入射した成分が、対物レンズ１７,第２レンズ２２,波長フィルタ２３,第３レンズ２４およびピンホール２５を通過して、検出器２６によって検出される。そして、検出器２６で検出された信号は、内蔵されるＡＤ変換器等によってＡＤ変換等の処理が施された後に、ＰＣ５へ送出される。こうして、サンプル１６上の各測定点での蛍光強度の分布が内部メモリ等に記録される。
【００６２】
ここで、上述したように、上記対物レンズ１７を通過した蛍光は、収束光となって第２レンズ２２の方向に導かれる。そして、第２レンズ２２によって実質的に平行光になるように屈折される。また、第３レンズ２４は蛍光を集光する。また、ピンホール２５は空間的に迷光をカットするために配置される。尚、励起光カット用の波長フィルタ２３は、例えば回転フォルダ等に配置されて、励起光の波長に応じて他の波長のフィルタ２３aと交換可能になっている。
【００６３】
図３に示すように、上記対物レンズ１７における光軸を含む中央部分は、通常の凸レンズの機能(屈折のみで光を偏向)を有する凸レンズ部２９となっている。そして、サンプル１６から出射された蛍光のうち、放射角度の小さい蛍光は、この凸レンズ部２９の部分を通過して検出器２６に向かって集光される。
【００６４】
上記対物レンズ１７における凸レンズ部２９の周囲は、下方に向かって開いた円錐台形の筒状体３０となっている。そして、サンプル１６から出射された蛍光のうちの、凸レンズ部２９に入りきらないような放射角度の大きい蛍光は、筒状体３０の上端面から筒状体３０内に入射し、筒状体３０の外周面で全反射されて光軸側に偏向され、筒状体３０の下端面から検出器２６に向かって出射される。
【００６５】
以上のごとく、上記サンプル１６から出射された蛍光のうち、凸レンズ部２９に入りきらないような放射角度の大きい蛍光を、筒状体３０の外周面で全反射させることにより、通常の凸レンズでは集光できないような大きな放射角度の光をも集めることができる。そのため、検出器２６の感度アップを図ることができるのである。
【００６６】
上記金属枠２１には、例えばタイミングベルト等の上記走査装置が接続されている。また、金属枠２１における互いに対向する側面２１a,２１a(図３では、一方の側面２１aのみが現れている)には、ガイドシャフト挿通用の穴が２つ設けられており、この穴に２本のガイドシャフト１３a,１３bが挿通されて水平に配置されている。さらに、上記検出光学系を支持する樹脂枠２７は、上記励起光学系を支持する金属枠２１の下面に、対物レンズ１７の光軸と上記検出光学系の光軸とが一致するように取り付けられて、鉛直方向に垂下されている。こうすることによって、樹脂枠２７は軽く、重心は金属枠２１側にあるため、上記走査装置によって走査する際に走査モジュール９のねじれや振動を抑えることができるのである。
【００６７】
ところで、上述のような、上記走査モジュール９の二次元走査を繰り返すことにより、二次元走査時の振動や熱等による二次元動作軸の経時的なずれによって、二次元走査平面(つまり対物レンズ１７の焦点面)に対するサンプル台４の平行度の低下が発生する。上記二次元走査平面に対してサンプル台４の平行度が低下した状態では、サンプル台４上のある位置では対物レンズ１７とサンプル台４との距離が適切であっても、他の位置では適切ではなくなるため、対物レンズ１７とサンプル台４との距離がずれた位置では検出感度が低下することになる。
【００６８】
このような問題を解消するためには、メンテナンス的な調整によって上記平行度を正常な状態に戻す必要がある。その場合の調整方法としては、上記二次元走査を行う上記走査装置を調整する方法と、サンプル台４側を調整する方法との２通りの方法がある。ところが、上記走査装置には、モーターやタイミングベルト等の各種パーツが高精度に互いの位置を保って基準台に対して安定に且つ強固に固定されており、このような複雑な構造である上記走査装置の動作軸を調整することは、現実的に困難である。また、上記走査装置の動作軸を調整可能なように構成した場合には、一般的に、上記動作軸がずれないように固定する固定の強固さが低下することになる。そのため、結果として、上記動作軸の調整が可能にはなるものの、調整頻度が高くなるという別の問題が発生することになる。したがって、サンプル台４側の調整によって走査対象平面に対する平行度を確保することが望ましいと言える。
【００６９】
そこで、本実施の形態においては、走査対象平面であるサンプル台４側を調整して上記二次元走査面である対物レンズ１７の焦点面と一致させて上記両者の平行度を確保するのである。
【００７０】
以下、上記サンプル台(ガラス)４と対物レンズ１７の焦点面とを一致させて、二次元面内全域において蛍光を高束に且つ効率よく検出することを可能にする方法に付いて、詳細に説明する。
【００７１】
本実施の形態においては、上記サンプル台４と対物レンズ１７の焦点面とを一致させる方法として、サンプル台４の傾きを調整する。
【００７２】
図４は、上記サンプル台４の傾きを調整するための傾き調整用マークを示す。本実施の形態においては、矩形状のガラスで成るサンプル台４の表面(サンプル１６の載置面)におけるサンプル１６の載置領域外の四隅に、傾き調整用マーク３１を塗布している。傾き調整マーク３１は蛍光色素を含み、走査モジュール９の光源１８から出射された励起光が照射されて蛍光を発生させる。
【００７３】
図５は、図４において、上記傾き調整用マーク３１が塗布された２箇所を含むサンプル台４の縦断面図である。筺体を成す本体２の上面には、走査モジュール９が上述のように二次元走査を行う際に光源１８からの励起光およびサンプル１６からの蛍光を通すための開口部２aが設けられており、サンプル台４は本体２の開口部２a周囲の縁部２b上に載置されている。
【００７４】
上記本体２の縁部２bにおける四隅には、図５に破線で示すような傾き調整機構３２が設けられている。この傾き調整機構３２は、縁部２bを垂直方向に貫通する孔に形成された雌ネジと、この雌ネジに螺合する雄ネジを有する傾き調整ネジ３３とによって、構成されている。そして、サンプル台４は、縁部２bを下側から上側に向かって貫通する傾き調整ネジ３３の上端部(先端部)３３a上に載置されている。そして、本体２の四隅に配置された傾き調整ネジ３３を回転させて縁部２bからの突出量を調整することによって、サンプル台４の傾きを調整するのである。ここで、傾き調整ネジ３３の回転方法については特に限定するものではなく、その都度手動で行って良いし、ＰＣ５からの制御によって行っても良い。
【００７５】
尚、図５では明示されていないが、上記サンプル台４の下面の四隅には、傾き調整ネジ３３の上端部３３aが挿入されて摺動可能に嵌合する嵌合凹部が設けられており、サンプル台４が傾斜しても４本の傾き調整ネジ３３の上端部３３aから滑り落ちないようになっている。
【００７６】
上記サンプル台傾き調整装置の構成において、サンプル台４の傾き調整は、以下のようにして行われる。
【００７７】
先ず、上述したようにして走査ステージ６を駆動させて、走査モジュール９をサンプル台４の四隅に塗布された傾き調整用マーク３１の位置に順次位置させて、各位置での傾き調整用マーク３１からの蛍光光量を検出器２６およびＰＣ５によって測定する。そして、４箇所の傾き調整用マーク３１からの蛍光光量のバラツキが予め設定された設定値以上の場合には、以下のようにしてサンプル台４の傾き調整を行う。
【００７８】
すなわち、先ず、上記４箇所の傾き調整用マーク３１のうちの蛍光光量が最も少ない傾き調整用マーク３１の位置に走査モジュール９を移動させ、当該傾き調整用マーク３１からの蛍光光量が最大になるよう、４箇所の傾き調整機構３２を用いてサンプル台４の傾き調整を行う。
【００７９】
次に、上記４箇所の傾き調整用マーク３１のうち蛍光光量が２番目に少なかった傾き調整用マーク３１の位置に走査モジュール９を移動させ、当該傾き調整用マーク３１に関して、上述と同様に、サンプル台４の傾き調整を行う。続いて、同様にして、蛍光光量が３番目および４番目に少なかった傾き調整用マーク３１に関して、上述と同様に、サンプル台４の傾き調整を行う。
【００８０】
その後、再度、上記４箇所の傾き調整用マーク３１からの蛍光光量を測定し、各蛍光光量のバラツキが上記設定値以上であれば、４箇所での蛍光光量の順位付け、この準位に応じたサンプル台４の傾き調整を行う。こうして、サンプル台４の傾きを対物レンズ１７の焦点面の傾きと同じになるように追い込んでいく。そして、４箇所の傾き調整用マーク３１からの蛍光光量のバラツキが上記設定値内になった場合に、サンプル台４の面は対物レンズ１７の焦点面(つまり第１ステージ７と第２ステージ８との駆動面)と平行になったとして、サンプル台４の傾き調整を終了するのである。
【００８１】
その場合、上記傾き調整用マーク３１は、サンプル台４におけるサンプル１６の載置面上であって、サンプル１６の載置領域の外側に形成されている。このように、傾き調整用マーク３１はサンプル１６の載置位置から離れているため、サンプル１６の載置作業や測定作業を阻害することが防止される。
【００８２】
蛍光性を有する物質は、一般的に、長時間光が当たることによって蛍光性が劣化する。そこで、傾き調整用マーク３１中の蛍光物質が劣化するのを防止する必要がある。
【００８３】
図６は、上記傾き調整用マーク３１の上面を覆って蛍光物質の劣化を防止するためのカバー部材を示す。但し、図６(a)は平面図であり、図６(b)は図６(a)のＡ‐Ａ'矢視断面図である。カバー部材３４は、遮光性を有しており、サンプル台４の四隅に形成された傾き調整用マーク３１の上面を覆って、サンプル１６の載置領域上に開口３４aが形成されるように、「ロ」字状の形状を有している。ここで、カバー部材３４の取付方法は特に限定するものではなく、サンプル台４の周囲に取り付けても良いし、蓋体３に取り付けても良い。
【００８４】
こうして、上記傾き調整用マーク３１上を遮光性のカバー部材３４で覆うことにより、本蛍光検出装置外からの光が傾き調整用マーク３１に当たって上記蛍光色素が劣化するのを防止することができる。さらに、開口３４aが形成されているので、サンプル１６をサンプル台４に載置する際に、誤って傾き調整用マーク３１を傷付けたり、汚したりすることを防止できる。
【００８５】
さらに、上記走査モジュール９の光源１８からの励起光はサンプル台４の下面側から透明なサンプル台４を透過して傾き調整用マーク３１を照射するようになっている。したがって、傾き調整用マーク３１上を遮光性のカバー部材３４で完全に覆っても傾き調整用マーク３１からの蛍光光量の測定に支障を来すことはない。また、カバー部材３４におけるサンプル１６の載置領域上には開口３４aが形成されている。したがって、サンプル台４上にサンプル１６を載置する場合の作業性を確保しつつ、傾き調整用マーク３１を完全に外光から保護することができるのである。
【００８６】
一般的に、蛍光物質に励起光を長期間宛て続けると、放射される蛍光光量が低下することになる。したがって、傾き調整用マーク３１に走査モジュール９の光源１８からの励起光を照射して傾き調整用マーク３１から出射された蛍光を検出する際に、傾き調整用マーク３１の１点に励起光を当て続けると、時間の経過と共に蛍光の輝度が減少していき、正しい蛍光強度が測定できなくなる(時間的に変動する強度は正確に測れない)。
【００８７】
そこで、本実施の形態においては、上記傾き調整用マーク３１からの蛍光を検出する際には、走査ステージ６を動作させて、励起光を、その励起光の照射対象となる傾き調整用マーク３１上を往復動させながらあるいはジグザグ動させながら照射するのである。こうすることによって、傾き調整用マーク３１からの蛍光の輝度減少を防止し、正確に蛍光光量を測定することができる。また、傾き調整用マーク３１の劣化を防止して、寿命を延ばすことができる。
【００８８】
上記傾き調整用マーク３１は、図４および図６のごとく均一の矩形状に形成しても、上述のような効果を奏することができるが、以下のようにストライプ状のパターンに形成することによって、より正確な蛍光光量を測定することが可能になる。
【００８９】
図７は、上記ストライプ状のパターンに形成された傾き調整用マーク３１を示す。図７において、傾き調整用マーク３１は、蛍光色素(蛍光体)を含む予め設定された設定幅の複数のストライプ３１aが、予め設定された設定間隔で配列されて構成されている。その場合に、ストライプ３１aの幅は隣接するストライプ３１aとの間隔よりも大きい方が、傾き調整時に蛍光が検出し易く、且つ傾き調整が容易になるために好ましい。また、各ストライプ３１aの間隔は、励起光であるレーザ光の最小スポットサイズ(仕様値)以上であれば差し支えない。尚、レーザ光の最小スポットサイズは５μm〜１０μmである。
【００９０】
図７に示すようなストライプ状のパターンを呈する傾き調整用マーク３１を、各ストライプ３１aを横断する方向に、走査モジュール９で走査しながら傾き調整用マーク３１からの蛍光光量を測定することにより、傾き調整用マーク３１の蛍光強度を強度振幅幅(最大値と最小値との差)として正確に測定することができる。そこで、例えば、複数のストライプ３１aによる強度振幅の平均値をとることによって、測定精度のばらつきを防止することが可能になる。
【００９１】
また、上記傾き調整用マーク３１において、測定開始位置と測定終了位置とがある程度ルーズであっても、一つの傾き調整用マーク３１の走査中に各ストライプ３１aのパターン上を通過すれば上記強度振幅を測定できる。そのため、１回の走査で、傾き調整用マーク３１における複数の測定点での測定を行うことができ、測定精度のばらつきを防止のための測定動作の単純化を図ることができる。
【００９２】
本蛍光検出装置によってタンパク質を検出することを想定した場合、測定対象のタンパク質の種類に応じて蛍光剤の種類を変えることが考えられる。その場合、蛍光波長が蛍光剤の種類によって異なるため、タンパク質の種類に応じて検出する蛍光波長が異なることになる。
【００９３】
異なる蛍光波長の蛍光を検出するためには、検出する蛍光波長毎に、測定対象を照射する励起光の波長を切り替える必要がある。この励起光の波長の切り替えは、透過波長領域が異なる複数の減光フィルタを用意しておき、使用する減光フィルタを切り替えることによって行うことができる。他の方法として、検出する蛍光波長毎に複数の波長の励起光源を用意しておき、使用する励起光源を切り替えてもよい。また、複数の波長の励起光源と複数の減光フィルタとを併用して、使用する励起光源の切り替えを減光フィルタと共に行っても良い。
【００９４】
その場合には、予め、検出に使用される複数の蛍光波長に対応した複数の傾き調整用マーク３１を用いて、蛍光波長に合わせてサンプル台４の傾き調整を行う必要が生ずる。
【００９５】
図８は、複数の蛍光波長に対応可能な傾き調整用マーク３１を示す。尚、本実施の形態においては、異なる蛍光波長を励起させる励起光の例として、青色４８０nmと、緑色５３２nmと、赤色６３２nmとを用いるものとする。また、これらの波長の励起光によって励起される蛍光の波長は、傾き調整用マーク３１に用いる蛍光色素の特性によって異なるが、例えば、
青色励起光(４８０nm)では、５０５nmを中心とする蛍光
緑色励起光(５３２nm)では、５７０nmを中心とする蛍光
赤色励起光(６３２nm)では、６６７nmを中心とする蛍光
が発せられる。
【００９６】
そこで、図８に示す傾き調整用マーク３１では、赤色励起光(６３２nm)で６６７nmを中心とする蛍光を発する蛍光体でなるストライプ３５と、緑色励起光(５３２nm)で５７０nmを中心とする蛍光を発する蛍光体でなるストライプ３６と、青色励起光(４８０nm)で５０５nmを中心とする蛍光を発する蛍光体でなるストライプ３７との、３本のストライプ３５〜３７を配列して構成している。
【００９７】
すなわち、本実施の形態においては、上記ストライプ３５〜３７で、上記部分調整用マークを構成しているのである。
【００９８】
こうすることによって、例えば、サンプル１６を照射する励起光として青色励起光(４８０nm)を用いる場合には、傾き調整時に、青色励起光(４８０nm)によって傾き調整用マーク３１を照射することによって、傾き調整用マーク３１を構成するストライプ３７から５０５nmを中心とする蛍光が発せられ、他のストライプ３５,３６からは蛍光が発せられない。サンプル１６を照射する励起光として他の色の励起光を用いた場合も同様である。したがって、図８に示すような構成を有する傾き調整用マーク３１を用いることにより、測定対象の物質に応じて励起光源を赤色励起光(６３２nm),緑色励起光(５３２nm)および青色励起光(４８０nm)に切り替えられる場合であっても、容易に傾き調整を行うことができるのである。
【００９９】
また、上述したように、上記傾き調整用マーク３１に対する励起光の照射は、走査モジュール９で走査しながら行うので、図９に示すように、図８に示す傾き調整用マーク３１での各ストライプ３５〜ストライプ３７の配列方向に直交する方向に各ストライプ３５〜ストライプ３７を配列させても差し支えない。
【０１００】
尚、図８および図９における各ストライプ３５〜３７の幅は、励起光であるレーザ光の最小スポットサイズ(仕様値)よりも十分大きければ問題はない。
【０１０１】
また、図８および図９に示す傾き調整用マーク３１においては、赤色励起光(６３２nm)で６６７nmを中心とする蛍光を発する蛍光体でなるストライプ３５と、緑色励起光(５３２nm)で５７０nmを中心とする蛍光を発する蛍光体でなるストライプ３６と、青色励起光（４８０nm)で５０５nmを中心とする蛍光を発する蛍光体でなるストライプ３７とを、夫々１本ずつ設けている。しかしながら、これに限定されるものではなく各ストライプ３５〜３７を夫々複数本ずつ配列することも可能である。
【０１０２】
以上のごとく、本実施の形態においては、サンプル１６が載置される平面状のサンプル台４におけるサンプル１６の載置面上の四隅に、蛍光性を有する傾き調整用マーク３１を塗布する。そして、走査モジュール９の光源１８からの蛍光物質を励起する励起光の照射に基づいて、傾き調整用マーク３１から発せられた蛍光を走査モジュール９の対物レンズ１７で集光し、検出器２６で検出する。
【０１０３】
こうして検出された４箇所の傾き調整用マーク３１からの蛍光光量のバラツキが上記設定値内になるように、傾き調整機構３２によってサンプル台４の傾きを調整するようにしている。
【０１０４】
したがって、上記サンプル１６がない場合であっても、何時でも、サンプル台４の傾きを測定することができ、別途サンプル台４の平行度を測定する専門の装置を追加する場合よりも構造を簡略化できる。さらに、実際の蛍光検出に基づいて、検出感度が最大になるようにサンプル台４の傾きを調整することができる。
【０１０５】
すなわち、本実施の形態によれば、走査モジュール９の上記検出光学系を複雑化,大型化および重量増加させることなく、二次元面内全域において蛍光を高速に且つ効率よく検出可能な蛍光検出装置を提供することができるのである。
【０１０６】
また、上記走査モジュール９は、光透過性を有するサンプル台４におけるサンプル１６が載置される面とは反対側の面に対向して配置されており、対物レンズ１７は、サンプル台４を介して、サンプル１６および傾き調整用マーク３１からの蛍光を集光するようになっている。そして、傾き調整マーク３１は、サンプル１６が載置される領域の外側に形成されている。
【０１０７】
したがって、上記傾き調整マーク３１は、サンプル１６のサンプル台４上への載置作業およびサンプル１６からの蛍光光量の測定作業を阻害することがない。
【０１０８】
また、上記傾き調整マーク３１の上面を覆うカバー部材３４を設けているので、本蛍光検出装置の外からの光が傾き調整用マーク３１に入射して、傾き調整用マーク３１の蛍光物質が劣化することを防止ができる。また、傾き調整用マーク３１はカバー部材３４によって完全に外部から保護されて、サンプル１６を栽置する際に誤って傾き調整用マーク３１が傷付いたり、汚れたりすることが防止される。
【０１０９】
また、上記対物レンズ１７は、屈折によって光を集光する上記中央部分である凸レンズ部２９と、この凸レンズ部２９の周辺に位置して全反射によって光を集光する上記周辺部分である筒状体３０とを含んで構成されている。そして、凸レンズ部２９の少なくとも一部は上記励起光を透過させる励起光透過部となっている。
【０１１０】
したがって、通常の凸レンズでは集光できないような大きな放射角度の光をも集めることができ、集光光率を高めて検出器２６による感度アップを図ることができる。
【０１１１】
また、上記傾き調整用マーク３１からの蛍光を検出する場合には、走査モジュール９の光源１８からの励起光で傾き調整用マーク３１の照射面を走査(例えば往復走査やジグザグ走査)するようにしている。したがって、傾き調整用マーク３１の１点に集中して上記励起光を当て続けることなく蛍光光量を測定することができ、上記蛍光の経時的な輝度の劣化を抑制して正確に上記蛍光光量を測定することができる。さらに、傾き調整用マーク３１の劣化を防止して、寿命を延ばすことができる。
【０１１２】
また、上記傾き調整用マーク３１を、予め設定された設定幅を有する複数のストライプ３１aを、予め設定された設定間隔で平行に配列されて形成した場合には、走査モジュール９の光源１８からの励起光を傾き調整用マーク３１に照射する際に、複数のストライプ３１aの幅方向に走査しながら測定することによって、傾き調整用マーク３１からの蛍光強度を最大値と最小値の差である強度振幅として正確に測定することができる。
【０１１３】
したがって、例えば、上記傾き調整用マーク３１における複数のストライプ３１aによる強度振幅の平均値をとることにより、測定精度のばらつきを防止することができる。また、傾き調整用マーク３１における測定開始位置と測定終了位置とがある程度ルーズな場合であっても、一つの傾き調整用マーク３１の走査中に複数のストライプ３１aのパターン上を通過すれば上記強度振幅を測定できるため、１回の走査で傾き調整用マーク３１の複数の測定点での蛍光強度の測定を行うことができる。
【０１１４】
また、上記傾き調整用マーク３１を、波長の異なる蛍光性を有する複数の上記部分調整用マークとしてのストライプ３５〜３７で構成した場合には、検出対象の種類に応じて蛍光剤の種類を変えると共に、上記複数の蛍光剤に応じて励起光の波長を替える場合であっても、上記励起光の波長に合わせてサンプル台４の傾きを調整することができる。
【０１１５】
尚、上記実施の形態においては、上記サンプル台４におけるサンプル１６の載置面上の四隅に傾き調整用マーク３１を形成しているが、この発明はこれに限定されるものではない。要は、サンプル１６の載置作業や測定作業を阻害しない複数の箇所であって、走査モジュール９によって走査可能な箇所であればよいのである。
【符号の説明】
【０１１６】
１…蛍光検出装置、
４…サンプル台、
５…ＰＣ、
６…走査ステージ、
９…走査モジュール、
１６…サンプル、
１７…対物レンズ、
１８…光源、
２６…検出器、
３１…傾き調整用マーク、
３１a,３５,３６,３７…ストライプ、
３２…傾き調整機構、
３３…調整ネジ、
３４…カバー部材、
３４a…カバー部材の開口。
【図１】
2014052252.tif 000003
【図２】
2014052252.tif 000004
【図３】
2014052252.tif 000005
【図４】
2014052252.tif 000006
【図５】
2014052252.tif 000007
【図６】
2014052252.tif 000008
【図７】
2014052252.tif 000009
【図８】
2014052252.tif 000010
【図９】
2014052252.tif 000011