(57)【要約】【課題】分類不能型株のインフルエンザ菌（ＮＴＨｉ）のポリヌクレオチド配列および該ポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドならびにその使用を提供すること。【解決手段】本発明はまた、中耳および／または鼻咽頭へのＮＴＨｉ感染中または該感染に応答して上方調節されるＮＴＨｉ遺伝子に関する。本発明はまた、本発明のＮＴＨｉポリペプチドに特異的な抗体を提供する。ヒトまたは試料、例えば、血清、痰、耳液、血液、尿、リンパ液および脳脊髄液などにおいてＮＴＨｉ菌を検出する方法が想定される。このような方法は、特異的ポリヌクレオチドプローブを用いてＮＴＨｉポリヌクレオチドを検出すること、または特異的抗体を用いてＮＴＨｉポリペプチドを検出することを含む。本発明ではまた、このようなＮＴＨｉ菌の検出方法を用いる診断用キットが想定される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００５年６月１６日に出願された米国仮出願第６０／６９１，２１４号、および２００４年３月５日に出願された米国出願第１０／７９５，１５９号（これは、２００３年３月６日に出願された米国仮出願第６０／４５３，１３４号への優先権を主張する）への優先権を主張する。これらの全ては、それらの全体において本明細書で参考として援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、分類不能型インフルエンザ菌（ＮＴＨｉ）ゲノムのポリヌクレオチド配列、該ゲノム内に含まれるＮＴＨｉ遺伝子および該ポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドに関する。本発明はまた、このようなＮＴＨｉポリヌクレオチドおよびＮＴＨｉポリペプチドの使用、例えば、ワクチンおよびＮＴＨｉ関連障害を処置および予防する方法に関する。本発明はまた、中耳または鼻咽頭のＮＴＨｉ感染中または該感染に応答して上方調節されるＮＴＨｉ遺伝子に関する。
【背景技術】
【０００３】
（背景）
中耳炎（ＯＭ）は、世界中で非常によく見られる小児疾患であり、緊急治療室での小児の往診の主な原因である（非特許文献１）。最近の統計学的データにより、１９９０年では２，４５０万人の小児科医の診療所での往診がＯＭのためになされたことが示されており、１９８０年代に報告されたものの２００％を超える増加を表す。長引いても死亡率と関連することは稀であるが、ＯＭに関連する罹病率は相当である。聴力低下は、この疾患に伴う一般的な問題であり、しばしば、子供の行動、教育および言語能力の発達に影響する（非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４）。ＯＭの社会経済的影響もまた大きく、ＯＭの診断およびマネージメントの直接および間接費用は、米国だけで年間５０億ドルを超える（非特許文献５）。
【０００４】
抗生物質療法は一般的であり、中耳腔換気用チューブの外科的留置は、滲出液の排出、感染の浄化および中耳内の液の蓄積に伴う痛みの緩和の点では成功裏であるが、多数の抗生物質耐性菌の出現およびチューブ留置に伴う侵襲性の性質により、ＯＭのマネージメント、好ましくは予防に対するより有効で許容されるアプローチの必要性が促されている。慢性ＯＭの外科的マネージメントは、子供に対して全身麻酔下での鼓膜を介する中耳腔換気用チューブの挿入を伴う。この手順は一般的であり（普及率は約１３％である；Ｂｒｉｇｈｔら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ，８３（７）：１０２６−８，１９９３）、中耳の蓄積液の排出による有痛症状の緩和の点で非常に有効であるが、処置の侵襲性の性質およびその施術（ｉｎｃｕｍｂｅｎｔ）の危険性のため、非難されている（Ｂｅｒｍａｎら、Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ，９３（３）：３５３−６３，１９９４；Ｂｒｉｇｈｔら、前掲）。；Ｃｉｍｏｎｓ，ＡＳＭ  Ｎｅｗｓ，６０：５２７−５２８；Ｐａａｐ，Ａｎｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ．，３０（１１）：１２９１−７，１９９６）。
【０００５】
ワクチン開発における進歩は、７価莢膜−コンジュゲートワクチンＰＲＥＶＮＡＲ（登録商標）（ＥｓｋｏｌａおよびＫｉｌｐｉ，Ｐｅｄｒｉａｔｒ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．Ｊ．１６：Ｓ７２−７８，２０００）の最近の認可および発売によって示されるように、急性ＯＭ（ＡＯＭ）の主な原因因子である肺炎連鎖球菌に関して最も進んでいる。ＰＲＥＶＮＡＲ（登録商標）は、浸潤性の肺炎球菌疾患に非常に有効であるが、ＯＭに関する範囲は期待はずれ（６〜８％）であり、該ワクチンに含まれていない血清型のため、ＯＭ症例数が増加しているという報告がある（Ｂｌａｃｋら，Ｐｅｄｒｉａｔｒ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ  Ｊ．，１９：１８７−１９５；Ｅｓｋｏｌａら，Ｐｅｄｒｉａｔｒ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ  Ｊ，１９：Ｓ７２−７８，２０００；Ｅｓｋｏｌａら，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４４：４０３−４０９，２００１；Ｓｎｏｗら，Ｏｔｏｌ．Ｎｅｕｒｏｔｏｌ．，．２３：１−２，２００２）。滲出液を伴う慢性ＯＭにおいてよく見られるグラム陰性病原体である分類不能型インフルエンザ菌（ＮＴＨｉ）に関してはほとんど進歩していない（非特許文献６；非特許文献７）。ＮＴＨｉに対する有効なワクチンの開発の障害は、現時点におけるＮＴＨｉ誘導型中耳疾患の病因の理解が不充分なことである。この遅滞の一因は、該疾患が、良性の鼻咽頭共生生物の一宿主免疫学的寛容から、通常無菌の中耳空間への日和見的侵入菌に対する積極防御反応のものに進行することによる、病原菌が発現するビルレンス因子と宿主の免疫応答との動態的相互作用の理解の欠如である。
【０００６】
Ｒｄ菌株は、現在の小ゲノム配列決定原理のための代表例の生物体であり、インフルエンザ菌生物学の研究のための重要なモデル生物体であるが、Ｒｄ菌株は、ヘモフィルス属の構成員によって引き起こされる病原性の研究には不充分なモデルである。インフルエンザ菌のｂ血清型菌株は、浸潤性疾患（例えば、髄膜炎）を引き起こし、分類不能型インフルエンザ菌（ＮＴＨｉ）菌株は、主に、限局性呼吸器疾患、特に中耳炎（ＯＭ）、急性副鼻腔炎、市中肺炎において役割を有し、慢性閉塞性肺疾患または嚢胞性線維症の患者に重要な結果をもたらす（Ｋｉｌｐｉら，Ｐｅｄｉａｔｒ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  Ｊ  ２０：６５４−６２，２００１；Ｍｕｒｐｈｙ，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ
１６：１２９−３４，２００３；Ｒｏｍａｎら，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ４２：１４５０−９，２００４；Ｓｅｔｈｉ，Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ  １４：３３６−６３，２００１；Ｓｔ  Ｇｅｍｅ，Ｖａｃｃｉｎｅ  １９  Ｓｕｐｐｌ  ｌ：Ｓ４１−５０，２０００）。しかしながら、Ｒｄ菌株はｄ血清型菌株の誘導体である。ｄ血清型菌株が疾患と関連するのは稀である（Ｄａｉｎｅｓら，Ｊ  Ｍｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ５２：２７７−８２  ２００３；Ｈｅａｔｈら，Ｐｅｄｉａｔｒ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  Ｊ  ２０：３００−５，２００１；Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚら，Ｉｎｆｅｃｔ
Ｉｍｍｕｎ  ７１：１６３５−４２，２００３，Ｓｋｏｃｚｙｎｓｋａら，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ４３：９３８−４１，２００５）。生物体の生物学の研究における最も有用なデータセットの一例はそのゲノム配列であるため、いくつかの調査により、ｂ型インフルエンザ菌菌株、インフルエンザ菌Ｂｉｏｇｒｏｕｐ  Ａｅｇｙｐｔｉｕｓ菌株またはＲｄ菌株には存在しない分類不能型菌株に見られる遺伝子が同定および特性評価された（Ｂｅｒｇｍａｎら，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ７１：１０９８−１０８，２００３；Ｃｈａｎｇら，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ６８：２６３０−７，２０００；Ｅｒｄｏｓら，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｐｅｄｉａｔｒ  Ｏｔｏｒｈｉｎｏｌａｒｙｎｇｏｌ  ６７：７４９−５５．２００３；Ｌｉら，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ４７：１１０１−１１，２００３；ＭｃＭｉｃｈａｅｌ  ＆  Ｇｒｅｅｎ，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇ  Ｄｒｕｇｓ  ４：９５３−８，２００３；Ｐｏｍｐｏｓｉｅｌｌｏ  ＆  Ｄｅｍｐｌｅ，２００１；Ｓｍｏｏｔら，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ７０：２６９４−９，２００２）。
現在、どのようにしてＮＴＨｉが小児においてＯＭを引き起こすのかの理解は不充分である。ＯＭの誘導に必要な推定ビルレンス因子の同定は、宿主−病原体相互作用の理解、そして最終的には潜在的なワクチン候補および化学療法の標的の同定に大きく寄与する。中耳炎のマネージメント、好ましくは予防に対するより有効で許容されるアプローチを開発する多大な必要性が存在する。ワクチン開発は、非常に有望であり、本目的を達成するための費用効果のある方法である（非特許文献８：非特許文献９）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｉｎｆａｎｔｅ−ＲｉｖａｎｄおよびＦｅｒｎａｎｄｅｚ，Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．Ｒｅｖ．（１９９３）１５：４４４−４６５
【非特許文献２】Ｂａｌｄｗｉｎ，Ａｍ．Ｊ．Ｏｔｏｌ（１９９３）１４：６０１−６０４
【非特許文献３】Ｈｕｎｔｅｒら，Ａｎｎ．Ｏｔｏｌ．Ｒｈｉｎｏｌ．Ｌａｒｙｎｇｏｌ．Ｓｕｐｐｌ（１９９４）１６３：５９−６１
【非特許文献４】Ｔｅｅｌｅら、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．（１９９０）１６２：６８５−６９４
【非特許文献５】Ｋａｐｌａｎら，Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．Ｊ．（１９９７）１６：Ｓ９−１１
【非特許文献６】Ｋｌｅｉｎ，Ｐｅｄｒｉａｔｒ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ  Ｊ（１９９７）１６：Ｓ５−８
【非特許文献７】Ｓｐｉｎｏｌａら，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．（１９８６）１５４：１００−１０９
【非特許文献８】Ｇｉｅｂａｎｋ，Ｐｅｄｒｉａｔｒ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ  Ｊ（１９９４）１３（１１）：１０６４−８
【非特許文献９】Ｋａｒｍａら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｄｒｉｔｒ．ＯｔｏｒｈｉｎｏｌａｒｙｎｇｏＬ（１９９５）３２（Ｓｕｐｐｌ．）：Ｓ１２７−３４
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の概要）
本発明は、ＮＴＨｉ  インフルエンザ８６−０２８ＮＰ菌株のゲノム配列の同定およびキャラクタライゼーションならびにそれにコードされるポリペプチド配列を提供する。ＮＴＨｉゲノム配列の３倍解析を、配列番号：１〜５７６として示す一連のコンティグ配列に示し（ｓｅｔ  ｏｕｔ）、その後のゲノム配列の８倍解析を、配列番号：６７５〜６８５として示す一連の１１個のコンティグ配列に示す。これらのコンティグは生データであり、当業者によって、常套的な方法を用い、重複配列を比較することにより、これらのコンティグをアセンブルし、ＮＴＨｉ  ８６−０２８ＮＰ菌株の完全なゲノムが構築され得る。
【０００９】
ＮＴＨｉ  ８６−０２８ＮＰ菌株の注釈付きの完全なゲノムを、配列番号：７７２として示す。オープンリーディングフレームを表６に、配列番号：７７３〜２５９３として示す。得られる遺伝子産物のアミノ酸配列を、配列番号：２５９４〜４４１４として示す。該ゲノムは、１．９１ｋｂの大きさであり、Ｒｄ菌株のゲノムよりもわずかに大きい。Ｒｄ菌株のゲノムに対する総ゲノム再編成のいくつかの領域ならびに８６−０２８ＮＰ菌株に特有のいくつかの遺伝子が同定されている。
【００１０】
本発明はまた、本発明のＮＴＨｉポリペプチドに特異的な抗体を提供する。ヒトまたは試料、例えば、血清、痰、耳液、血液、尿、リンパ液および脳脊髄液などにおいてＮＴＨｉ菌を検出する方法が想定される。このような方法は、特異的ポリヌクレオチドプローブを用いてＮＴＨｉポリヌクレオチドを検出すること、または特異的抗体を用いてＮＴＨｉポリペプチドを検出することを含む。本発明ではまた、このようなＮＴＨｉ菌の検出方法を用いる診断用キットが想定される。
【００１１】
本発明ではまた、本発明のＮＴＨｉポリペプチドまたはそのＮＴＨｉペプチドを投与することによる、免疫応答の惹起方法が想定される。このような方法は、ＮＴＨｉ感染によって引き起こされる疾患、例えばＯＭなどの処置および／または予防のために、ＮＴＨｉポリペプチドまたはＮＴＨｉペプチドをワクチンとして投与することを含む。以下のＮＴＨｉ遺伝子は、中耳および／または鼻咽頭感染中または該感染に応答して上方調節される。これらの遺伝子：ＨｉｓＢ、ｌｐｐＢ、ｓａｐＡ、ｌｏｌＡ、ｒｂｓＣ、ｐｕｒＥ、ｒｉｂＢ、ａｒｃＢ、ｕｘｕＡ、ｄｓｂＢ、ｕｒｅＨ、ｌｉｃＣ、ＨＩ１６４７、ｉｓｐＺ
、ｒａｄＣ、ｍｕｋＦ、ｇｌｐＲ、ｉｈｆＢ、ａｒｇＲ、ｃｓｐＤ、ＨＩ００９４、ＨＩ１１６３、ＨＩ１０６３、ＨＩ０６６５、ＨＩ１２９２、ＨＩ１０６４にコードされるポリペプチドおよびそのペプチドが可能なＯＭワクチン候補および／または化学療法の標的として想定される。ＮＴＨｉ  ＨｉｓＢ遺伝子は、ヌクレオチド配列配列番号：６１５として示され、配列番号：６１６で示されるアミノ酸配列をコードする。ＮＴＨｉ  ｓａｐＡ遺伝子は、ヌクレオチド配列配列番号：６１７で示され、配列番号：６１８で示されるアミノ酸配列をコードする。ＮＴＨｉ  ｒｂｓＣ遺伝子は、ヌクレオチド配列配列番号：６１９で示され、配列番号：６２０で示されるアミノ酸配列をコードする。ＮＴＨｉ  ｐｕｒＥ遺伝子は、ヌクレオチド配列配列番号：６２１で示され、配列番号：６２２で示されるアミノ酸配列をコードする。ＮＴＨｉ  ｒｉｂＢ遺伝子は、ヌクレオチド配列配列番号：６２３で示され、配列番号：６２４で示されるアミノ酸配列をコードする。ＮＴＨｉ
ａｒｃＢ遺伝子は、ヌクレオチド配列配列番号：６２５で示され、配列番号：６２６で示されるアミノ酸配列をコードする。ＮＴＨｉ  ｕｘｕＡ遺伝子は、ヌクレオチド配列配列番号：６２７で示され、配列番号：６２８で示されるアミノ酸配列をコードする。ＮＴＨｉ  ｄｓｂＢ遺伝子は、ヌクレオチド配列配列番号：６２９で示され、配列番号：６３０で示されるアミノ酸配列をコードする。ＮＴＨｉ  ｕｒｅＨ遺伝子は、ヌクレオチド配列配列番号：６３１で示され、配列番号：６３２で示されるアミノ酸配列をコードする。ＮＴＨｉ  ｌｉｃＣ遺伝子は、ヌクレオチド配列配列番号：６３３で示され、配列番号：６３４で示されるアミノ酸配列をコードする。ＮＴＨｉ  ＨＩ１６４７遺伝子は、ヌクレオチド配列配列番号：６３５で示され、配列番号：６３６で示されるアミノ酸配列をコードする。ＮＴＨｉ  ｉｓｐＺ遺伝子は、ヌクレオチド配列配列番号：６３７で示され、配列番号：６３８で示されるアミノ酸配列をコードする。ＮＴＨｉ  ｒａｄＣ遺伝子は、ヌクレオチド配列配列番号：６３９で示され、配列番号：６４０で示されるアミノ酸配列をコードする。ＮＴＨｉ  ｍｕｋＦ遺伝子は、ヌクレオチド配列配列番号：６４１で示され、配列番号：６４２で示されるアミノ酸配列をコードする。ＮＴＨｉ  ｇｌｐＲ遺伝子は、ヌクレオチド配列配列番号：６４３で示され、配列番号：６４４で示されるアミノ酸配列をコードする。ＮＴＨｉ  ｉｈｆＢ遺伝子は、ヌクレオチド配列配列番号：６４５で示され、配列番号：６４６で示されるアミノ酸配列をコードする。ＮＴＨｉ  ａｒｇＲ遺伝子は、ヌクレオチド配列配列番号：６４７で示され、配列番号：６４８で示されるアミノ酸配列をコードする。ＮＴＨｉ  ｃｓｐＤ遺伝子は、ヌクレオチド配列配列番号：６４９で示され、配列番号：６５０で示されるアミノ酸配列をコードする。ＮＴＨｉ  ＨＩ１１６３遺伝子は、ヌクレオチド配列配列番号：６５１で示され、配列番号：６５２で示されるアミノ酸配列をコードする。ＮＴＨｉ  ＨＩ１０６３遺伝子は、ヌクレオチド配列配列番号：６５３で示され、配列番号：６５４で示されるアミノ酸配列をコードする。ＮＴＨｉ  ＨＩ０６６５遺伝子は、ヌクレオチド配列配列番号：６５５で示され、配列番号：６５６で示されるアミノ酸配列をコードする。ＮＴＨｉ  ＨＩ１２９２遺伝子は、ヌクレオチド配列配列番号：６５７で示され、配列番号：６５８で示されるアミノ酸配列をコードする。
【００１２】
配列番号：１〜５７６、配列番号：６７５〜６８５として示されるポリヌクレオチド配列および表４と４Ｂに示すヌクレオチド配列に含まれる該新規なＮＴＨｉ遺伝子はまた、中耳および／または鼻咽頭感染中に上方調節され、したがって、ＯＭワクチン候補および／または化学療法の標的をコードしていると想定される。また、以下のＮＴＨｉ遺伝子は、ビルレンス関連遺伝子であると想定され、したがって、有力なＯＭワクチンおよび／または化学療法の標的：ＨＩ１３８６、ＨＩ１４６２、ＨＩ１３６９、ｌａｖ、ＨＩ１５９８をコードしていると想定される。ＮＴＨｉ  ＨＩ１３８６遺伝子配列は、配列番号：６５９として示され、配列番号：６６０で示されるアミノ酸配列をコードする。ＮＴＨｉ  ＨＩ１４６２遺伝子配列は、配列番号：６６１として示され、配列番号：６６２で示されるアミノ酸配列をコードする。ＮＴＨｉ  ＨＩ１３６９遺伝子配列は、配列番号：６６５として示され、配列番号：６６６で示されるアミノ酸配列をコードする。ＮＴＨｉ  ｌａｖ遺伝子配列は、配列番号：６６３として示され、配列番号：６６４で示されるアミノ酸配列をコードする。ＮＴＨｉ  ＨＩ１５９８遺伝子配列は、配列番号：６６９および配列番号：６７１として示され、配列番号：６７０および配列番号：６７２で示されるアミノ酸配列をコードする。ビルレンスと関連するさらなるＮＴＨｉ遺伝子としては、配列番号：６６７および配列番号：６７３として示されるポリヌクレオチド配列が挙げられる。
【００１３】
ＮＴＨｉ感染の処置または予防方法として、本発明では、ＮＴＨｉポリペプチドの発現または活性を阻害する分子であって、感染中、上方調節されるか、または活性である分子を投与することが想定される。特に、本発明では、ＮＴＨｉ感染中に上方調節されるＮＴＨｉ遺伝子に特異的に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与することにより、ＮＴＨｉタンパク質発現をモジュレートすることを含む、ＮＴＨｉ感染の処置または予防方法が想定され、かかる遺伝子としては、ｈｉｓＢ、ｌｐｐＢ、ｓａｐＡ、ｌｏｌＡ、ｒｂｓＣ、ｐｕｒＥ、ｒｉｂＢ、ａｒｃＢ、ｕｘｕＡ、ｄｓｂＢ、ｕｒｅＨ、ｌｉｃＣ、ＨＩ１６４７、ｉｓｐＺ、ｒａｄＣ、ｍｕｋＦ、ｇｌｐＲ、ｉｈｆＢ、ａｒｇＲ、ｃｓｐＤ、ＨＩ００９４、ＨＩ１１６３、ＨＩ１０６３、ＨＩ０６６５、ＨＩ１２９２、ＨＩ１０６４が挙げられる。本発明ではまた、これらの（ｔｈｅｓｅｓ）遺伝子にコードされるタンパク質の活性をモジュレートする抗体または小分子を投与することを含む、ＮＴＨｉ感染の処置または予防方法が想定される。配列  配列番号：１〜５７６、配列番号：６７５〜６８５として示されるポリヌクレオチドおよび表４と４Ｂに示すヌクレオチド配列に含まれる該新規なＮＴＨｉ遺伝子はまた、中耳および／または鼻咽頭感染中に上方調節され、したがって、このようなポリヌクレオチド配列に特異的に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチドもまた想定される。
【００１４】
本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチド
本発明は、ＮＴＨｉ  ８６−０２８ＮＰ菌株ゲノムの配列を提供する。該ゲノム配列の３倍解析を、本明細書において「コンティグ１〜５７６」で表す一連のコンティグ配列として示す。各コンティグを、その「コンティグ番号」と相関する配列同定番号  で表示する。したがって、配列番号：１〜５７６で示される本発明のコンティグ。これらのコンティグポリヌクレオチド配列は、常套的な方法を用いてＮＴＨｉ  ８６−０２８ＮＰ菌株の完全なゲノム配列にアセンブルされ得る。ＮＴＨｉ菌株８２−０２８ＮＰゲノムの８倍配列解析が終了したら、該ゲノム配列を、本明細書において配列番号：６７５〜６８５で表す１１個のコンティグに編集した。最後に、該完全なゲノムを、本明細書において配列番号：７７２で表す１つの核酸配列として示す。
【００１５】
本発明は、配列番号：１〜５７６、配列番号：６７５〜６８５、配列番号：７７３〜２５９３のコンティグ内に含まれるＮＴＨｉポリヌクレオチド配列およびオープンリーディングフレーム、ならびに表３Ｂ、表４Ｂおよび表５に示すヌクレオチド配列を提供する。本発明はまた、本発明のＮＴＨｉポリヌクレオチドにコードされるポリペプチド配列、例えば、配列番号：２５９４〜４４１４、表３Ｂ、表４Ｂおよび表５に示すアミノ酸配列などを提供する。本発明は、ストリンジェント条件下で、（ａ）配列番号：１〜５７６；配列番号：６７５〜６８５、配列番号：７７３〜２５９３のヌクレオチド配列および本明細書の表３Ｂ、表４Ｂおよび表５に示すヌクレオチド配列の相補配列、（ｂ）上記の任意のポリヌクレオチドの対立遺伝子バリアントであるポリヌクレオチド；（ｃ）上記の任意のタンパク質の種ホモログをコードするポリヌクレオチド；または（ｄ）本発明のＮＴＨｉポリペプチドの特異的ドメインもしくは切断型を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドを提供する。
【００１６】
本発明のＮＴＨｉポリヌクレオチドはまた、上記のポリヌクレオチドと実質的に等価なヌクレオチド配列を含む。本発明によるポリヌクレオチドは、上記のＮＴＨｉポリヌクレオチドに対して、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％または８９％、より典型的には少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％または９４％、さらにより典型的には少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するものであり得る。
【００１７】
本発明の核酸配列の範囲内には、ストリンジェント条件下で、配列番号：１〜５７６、配列番号：６７５〜６８５、配列番号：７７３〜２５９３のＮＴＨｉ  ヌクレオチド配列、ならびに本明細書の表３Ｂ、表４Ｂおよび表５に示すヌクレオチド配列、またはその相補配列にハイブリダイズする核酸配列断片が含まれ、該断片は、約５個より多くのヌクレオチド、好ましくは７個のヌクレオチド、より好ましくは９個より多くのヌクレオチド、最も好ましくは１７個より多くのヌクレオチドである。例えば、本発明のポリヌクレオチドの任意の１つに選択的な（すなわち、特異的にハイブリダイズする）１５、１７または２０個以上のヌクレオチドの断片が想定される。ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズすることができるプローブにより、本発明のＮＴＨｉポリヌクレオチド配列が、同じ遺伝子ファミリー内の他のポリヌクレオチド配列と区別され得るか、またはＮＴＨｉ遺伝子が他の細菌の遺伝子と区別され得、好ましくは特異的ヌクレオチド配列に基づくものである。
【００１８】
用語「ストリンジェント」は、当該技術分野においてストリンジェントと一般的に理解される条件をいうために使用される。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、主に、温度、イオン強度および変性剤（例えば、ホルムアミドなど）の濃度によって決定される。ハイブリダイゼーションおよび洗浄のストリンジェント条件の例は、０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム、６５〜６８℃または０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウムおよび５０％ホルムアミド、４２℃である。Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．１９８９）を参照のこと。よりストリンジェント条件（例えば、より高温、より低イオン強度、より高ホルムアミド、または他の変性剤など）もまた使用され得るが、ハイブリダイゼーションの速度が影響を受ける。デオキシオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションが懸念される場合、さらなる例示的なストリンジェントハイブリダイゼーション条件としては、３７℃（１４塩基オリゴの場合）、４８℃（１７塩基オリゴの場合）、５５℃（２０塩基オリゴの場合）および６０℃（２３塩基オリゴの場合）での６×ＳＳＣ  ０．０５％ピロリン酸ナトリウム中での洗浄が挙げられる。
【００１９】
他の薬剤を、非特異的および／またはバックグラウンドハイブリダイゼーションを低減させる目的でハイブリダイゼーションおよび洗浄バッファー中に含めてもよい。例は、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％ピロリン酸ナトリウム、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム、ＮａＤｏｄＳＯ４、（ＳＤＳ）、フィコール、デンハルト溶液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ（または他の非相補ＤＮＡ）、および硫酸デキストランであるが、他の適当な薬剤もまた使用され得る。このような添加剤の濃度および型は、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに実質的に影響を与えることなく、変更され得る。ハイブリダイゼーション実験は、通常、ｐＨ６．８〜７．４で行なわれるが、典型的なイオン強度条件では、ハイブリダイゼーションの速度は、ほぼｐＨに非依存性である。Ａｎｄｅｒｓｏｎら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｃｈ．４，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ
Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）を参照のこと。ハイブリダイゼーション条件は、これらの可変量を適合させるため、および関連のある異なる配列のＤＮＡがハイブリッドを形成するのを可能にするために、当業者によって調整され得る。
【００２０】
本発明の範囲内に含まれる配列は、このような特定の配列に限定されないだけでなく、その対立遺伝子および種の異型も包含する。対立遺伝子および種の異型は、配列番号：１〜５７６、配列番号：６７５〜６８５、配列番号：７７３〜２５９３に示した配列、および本明細書の表３Ｂ、表４Ｂおよび表５に示したヌクレオチド配列、好ましくは、そのオープンリーディングフレーム、代表的なその断片または配列番号：１〜５７６、配列番号：６７５〜６８５、配列番号：７７３〜２５９３内のオープンリーディングフレーム、表３Ｂ、表４Ｂおよび表５に示すヌクレオチド配列と少なくとも９０％同一である、好ましくは９５％同一であるヌクレオチド配列を、同じ種の別の単離ヌクレオチド（ｉｓｏｌｅｔｅ）由来の配列と比較することにより、常套的に決定され得る。２つの配列間の同一性および類似性を決定するための好ましいコｋンピュータプログラム法としては、限定されないが、ＧＣＧ  プログラムパッケージ、例えば、ＧＡＰ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら，Ｎｉｉｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．，１２：３８７，１９８４；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ
Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮおよびＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｊ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，２１５：４０３−４１０，１９９０）が挙げられる。ＢＬＡＳＴＸ  プログラムは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）および他の供給源（ＢＬＡＳＴ  Ｍａｎｕａｌ，Ａｌｔｓｃｈｕｌら  ＮＣＢ／ＮＬＭ／ＮＩＨ  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ  ２０８９４；Ａｌｔｓｃｈｕｌら、前掲）から公に入手可能である。よく知られたＳｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムもまた、同一性を決定するために使用され得る。
【００２１】
さらにまた、コドンの多様性に適合させるため、本発明は、本明細書に開示する特定のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）にコードされるものと同じアミノ酸配列をコードする核酸分子を包含する。すなわち、ＯＲＦのコード領域において、１つのコドンを、同じアミノ酸をコードする別のコドンと置換することが明白に想定され得る。
【００２２】
本発明の単離されたポリペプチドとしては、限定されないが、配列番号：１〜５７６、配列番号：６７５〜６８５、配列番号：７７３〜２５９３として示されるポリヌクレオチド配列内に含まれるヌクレオチド配列、ならびに表３Ｂ、表４Ｂおよび表５に示すヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド、または対応する完全長もしくは成熟タンパク質が挙げられる。本発明のポリペプチドとしては、本明細書の表３Ｂ、表４Ｂおよび表５に示す配列番号：６１６、配列番号：６１８、配列番号：６２０、配列番号：６２２、配列番号：６２４、配列番号：６２６、配列番号：６２８、配列番号：６２８、配列番号：６３０、配列番号：６３２、配列番号：６３４、配列番号：６３６、配列番号：６３８、配列番号：６４０、配列番号：６４２、配列番号：６４４、配列番号：６４６、配列番号：６４８、配列番号：６５０、配列番号：６５２、配列番号：６５４、配列番号：６５６、配列番号：６５８、配列番号：６６０、配列番号：６６２、配列番号：６６４、配列番号：６６６、配列番号：６６８、配列番号：６７０、配列番号：６７２、配列番号：６７４、配列番号：６８７、配列番号：６８９、配列番号：６９１、配列番号：６９３、配列番号：６９５、配列番号：６９７、配列番号：６９９、配列番号：７０１、配列番号：７０３、配列番号：７０５、配列番号：７０７、配列番号：７０９、配列番号：７１１、配列番号：７１３、配列番号：７１５、配列番号：７１７、配列番号：７１９、配列番号：７２１、配列番号：７２３、配列番号：７２５、配列番号：７２７、配列番号：７２９、配列番号：７３１、配列番号：７３３、配列番号：７３５、配列番号：７３７、配列番号：７３９、配列番号：７４１、配列番号：７４３、配列番号：７４５、配列番号：７４７、配列番号：７４９、配列番号：７５１、配列番号：７５３、配列番号：７５５、配列番号：７５７、配列番号：７５９、配列番号：７６１、７６３、配列番号：７６５、配列番号：７６７、配列番号：７６９または配列番号：７７１、配列番号：２５９４〜４４１４のアミノ酸配列が挙げられる。
【００２３】
また、本発明のポリペプチドとしては、好ましくは生物学的または免疫学的活性を有し、（ａ）配列番号：１〜５７６、配列番号：６７５〜６８５、配列番号：７７３〜２５９３として示されるヌクレオチド配列、ならびに表３Ｂ、表４Ｂおよび表５に示すヌクレオチド配列内に含まれるオープンリーディングフレームまたは（ｂ）（ａ）のポリヌクレオチドの相補配列にストリンジェントハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドが挙げられる。
【００２４】
本発明はまた、本発明のアミノ酸配列の生物学的に活性または免疫学的に活性なバリアント、および生物学的および／または免疫学的活性を保持している、その「実質的な等価物」（例えば、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、典型的には少なくとも約９５％、９６％、９７％、より典型的には少なくとも約９８％または最も典型的には少なくとも約９９％のアミノ酸同一性を有する）を提供する。対立遺伝子バリアントにコードされるポリペプチドは、配列番号：１〜５７６、配列番号：６７５〜６８５、配列番号：７７３〜２５９３に示されるヌクレオチド配列、ならびに配列番号：２５９４〜４４１４として、および本明細書の表３Ｂ、表４Ｂと表５に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列内に含まれるポリヌクレオチドにコードされるポリペプチド、ならびに配列番号：２５９４〜４４１４、本明細書の表３Ｂ、表４Ｂおよび表５に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと比べて、同様の、増大された、または低下した活性を有するものであり得る。
【００２５】
ＮＴＨｉペプチドとは、配列番号：１〜５７６、配列番号：６７５〜６８５、配列番号：７７３〜２５９３に示されるヌクレオチド配列、または本明細書の表３Ｂ、表４Ｂおよび表５に示すヌクレオチド配列
にコードされるＮＴＨｉポリペプチドの断片、および配列番号：２５９４〜４４１４  本明細書の表３Ｂ、表４Ｂおよび表５に占められるアミノ酸配列を有するポリペプチドをいう。好ましいＮＴＨｉペプチドは、生物学的および／または免疫学的に活性である。
【００２６】
さらに、本発明は、本発明のＮＴＨｉ核酸断片または本発明の核酸断片の縮重バリアントにコードされる、単離されたＮＴＨｉポリペプチドまたはＮＴＨｉペプチドを提供する。用語「縮重バリアント」は、本発明の核酸断片（例えば、ＯＲＦ）をヌクレオチド配列は異なるが、遺伝暗号の縮重のため、同一のＮＴＨｉポリペプチド配列をコードするヌクレオチド断片をいう。本発明の好ましい核酸断片は、タンパク質をコードするＯＲＦである。
【００２７】
本発明はまた、該ポリペプチドの生物学的および／または免疫学的活性に影響を及ぼさない１つ以上の同類アミノ酸置換を有するＮＴＨｉポリペプチドを提供する。あるはまた、本発明のＮＴＨｉポリペプチドは、生物学的活性を改変するものまたは改変しないものであり得る同類アミノ酸置換を有することが想定される。用語「同類アミノ酸置換」は、天然のアミノ酸残基と、基準残基、例えば、天然に存在するアミノ酸および天然に存在しないアミノ酸との、その位置でのアミノ酸残基の極性または電荷に対して影響がほとんどまたは全くないような置換をいう。例えば、同類置換は、ポリペプチド内の無極性残基と任意の他の無極性残基との置き換えによりもたらされる。
さらに、該ポリペプチド内の任意の天然の残基はまた、「アラニンスキャニング変異誘発」法に従ってアラニンで置換され得る。天然に存在するアミノ酸は、その側差に基づき、以下のとおりに特徴づけされる：塩基性：アルギニン、リシン、ヒスチジン；酸性：グルタミン酸、アスパラギン酸；非電荷極性：グルタミン、アスパラギン、セリン、トレオニン、チロシン；および無極性：フェニルアラニン、トリプトファン、システイン、グリシン、アラニン、バリン、プロリン、メチオニン、ロイシン、ノルロイシン、イソロイシン。アミノ酸置換に関する一般規則を以下の表１に示す。
【００２８】
【表１】
2014147397.tif 000002
ＮＴＨｉポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに相補的なアンチセンスポリヌクレオチドもまた提供される。
【００２９】
本発明では、本発明のポリヌクレオチドが増幅または発現のためにベクター内に挿入され得ることが想定される。発現のためには、該ポリヌクレオチドを、適切な発現制御配列、例えば、プロモーターおよびポリアデニル化シグナル配列などに作動可能に連結させる。さらに、本発明のポリヌクレオチドを含む細胞が提供される。例示的な原核生物宿主としては、大腸菌、バチルス属、ストレプトミセス属、シュードモナス属、サルモネラ属およびセラチア属などの細菌が挙げられる。
【００３０】
用語「単離される」は、物質が、これが天然に存在する環境のその他の成分から取り出されており、該成分を本質的に含まないことをいう。例えば、ポリペプチドは、他の細胞性タンパク質から分離されたものであり、またはＤＮＡは、これが天然状態で存在するゲノム内でこれとフランキングしている他のＤＮＡ分離されたものである。
【００３１】
免疫応答を惹起するための抗体および方法
本発明は、ＮＴＨｉポリペプチドに特有（すなわち、特異的）な抗原性エピトープに結合する抗体を提供する。また、多数のインフルエンザ菌亜型間に共通する抗原性エピトープを含むが、任意の他の抗原性エピトープに関して他と異なる抗体を提供する。該抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、その特異的エピトープに結合する能力を保持している抗体断片（例えば、Ｆｖ、ＦａｂおよびＦ（ａｂ）２断片）、単鎖抗体ならびにヒト抗体またはヒト化抗体であり得る。抗体は、当該技術分野において標準的な手法によって作製され得る。
【００３２】
インフルエンザ菌の莢膜多糖類を模倣する抗原により、インビトロアッセイで細菌を死滅させる能力を示す抗体が生成されることが、当該技術分野において知られている。このような抗体はまた、動物モデル系において、インフルエンザ菌による抗原刺激を防御することが知られている。この研究は、莢膜多糖類（ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｒｉｄｅ）に対する抗体が、おそらく、ヒトにおいて防御的免疫応答を惹起することを示す。本発明は、インフルエンザ菌を死滅させるとともに、ＮＴＨｉ感染からヒトを保護する能力を示す、ＮＴＨｉ本発明のポリペプチドおよびその断片に特異的な抗体を提供する。本発明はまた、インフルエンザ菌のビルレンスを低減させる、付着を阻害する、細胞分裂を阻害する、および／または上皮内への侵入を阻害する、あるいは、インフルエンザ菌の食作用を増強する、本発明のＮＴＨｉポリペプチドに特異的な抗体を提供する。
【００３３】
インビトロ補体媒介性殺菌アッセイ系（Ｍｕｓｈｅｒら，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．３９：２９７−３０４，１９８３；Ａｎｄｅｒｓｏｎら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．５１：３１−３８，１９７２）が、抗ＮＴＨｉ抗体の殺菌活性を測定するために使用され得る。ｔｈｅ  ａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ＮＴＨｉポリペプチドがＮＴＨｉペプチドが防御的抗体応答を惹起する能力に関するさらなるデータは、感染の動物モデル、例えば、本明細書に記載のチンチラのモデル系を用いることにより得られ得る。
【００３４】
また、ＮＴＨｉのエピトープに対する予備形成抗体、例えば、ＮＴＨｉ  ＯＭＰ、ＬＯＳまたは非被膜タンパク質に対する抗体などの投与による受動免疫療法により、宿主に対して短期的防御を付与することが可能である。したがって、想定されるワクチン製剤は、受動免疫療法における使用のための抗体を生成させるために使用され得る。異種免疫グロブリンは、その外来免疫学的成分に対して免疫応答が誘発され得るため、ヒト免疫グロブリンがヒト用の薬に好ましい。かかる受動免疫処置は、緊急的に、特別な危険に曝された非免疫処置個体の即座の防御のために使用され得る。あるはまた、このような抗体は、抗イディオタイプ抗体の作製において使用され得、これが、こんどはＮＴＨｉ  エピトープに対する免疫応答を刺激するための抗原として使用され得る。
【００３５】
本発明では、個体においてＮＴＨｉに対する免疫応答を惹起する方法が想定される。
この方法により、ＮＴＨｉ菌の死滅、細胞へのＮＴＨｉ付着の阻止および／またはＮＴＨｉ複製の遅滞の１種類以上を含む免疫応答が惹起される。本発明の組成物の「免疫学的用量」は、投与前に検出可能な免疫応答と比べて、または投与前の標準的な免疫応答と比べて、投与後に検出可能な体液性および／または細胞性免疫応答を生じさせるものである。本発明では、該方法によりもたらされる免疫応答が防御的および／または治療的であり得ることが想定される。一実施形態において、該方法は、本発明のＮＴＨｉタンパク質またはＮＴＨｉペプチドを含む組成物の免疫学的用量を投与する工程を含む。ＮＴＨｉタンパク質またはその抗原性ペプチドは、それ自体では抗体を産生し得ないが、第１のタンパク質を安定化させ、かつ免疫学的および防御的特性を有する融合タンパク質を産生することができる補助タンパク質と融合させてもよい。したがって、有効組換えタンパク質は、好ましくは、抗原性補助タンパク質、例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）またはβ−ガラクトシダーゼ、該タンパク質を可溶化し、その産生および精製を助長する比較的大きな補助タンパク質をさらに含む。またさらに、補助タンパク質は、免疫系の全身性刺激を提供するという意味で、アジュバントとしての機能を果たすものであり得る。補助タンパク質は、第１のタンパク質のアミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかに結合され得る。本発明により、本発明のポリヌクレオチドにコードされるＮＴＨｉポリペプチドまたはその抗原性ペプチドを含む組成物、特にワクチン組成物、および方法が提供される。
【００３６】
本発明ではまた、個体において多数のインフルエンザ菌亜型に対する免疫応答を惹起する方法が想定される。この方法により、インフルエンザ菌の死滅、細胞へのインフルエンザ菌付着の阻止および／またはインフルエンザ菌複製の遅滞の１種類以上を含む免疫応答が惹起される。この方法は、多数のインフルエンザ菌亜型間に共通する抗原性エピトープを含むが、任意の他の抗原性エピトープに関して他と異なる本発明のＮＴＨｉタンパク質またはＮＴＨｉペプチドを含む組成物の免疫学的用量を投与する工程を含む。
【００３７】
別の実施形態において、該方法は、本発明のＮＴＨｉタンパク質またはＮＴＨｉペプチドを発現する細胞を含む組成物の免疫学的用量を投与することを含む。また別の実施形態において、該方法は、本発明のＮＴＨｉタンパク質またはＮＴＨｉペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組成物の免疫学的用量を投与することを含む。該ポリヌクレオチドは、任意の他の核酸と会合されていない裸のポリヌクレオチドであってもよく、ベクター、例えば、プラスミドまたはウイルスベクター（例えば、あでの随伴ウイルスベクターまたはアデノウイルスベクター）内に存在するものであったもよい。本発明の組成物は、１種類以上のＮＴＨｉタンパク質またはＮＴＨｉペプチドを単独、またはＮＴＨｉ菌に対する免疫応答を惹起する他のエピトープとの組合せで含むものであり得る。本発明の組成物はまた、１種類以上のＮＴＨｉタンパク質またはペプチドを、１種類以上の  インフルエンザ菌亜型に対する免疫応答を惹起するエピトープとの組合せで含むものであり得る。該組成物の投与は、当該技術分野において標準的な経路、例えば、非経口、静脈内、経口、口腔内、経鼻、肺経由、経直腸または経膣によるものであり得る。該方法は、一人の個体に組合せで使用され得る。該方法は、個体のＮＴＨｉ感染の前包埋後に使用され得る。
【００３８】
中耳および／または鼻咽頭のＮＴＨｉ感染の際に上方調節される遺伝子、ならびにＮＴＨｉビルレンスと関連する遺伝子を、本明細書において記載する。このようなＮＴＨｉ遺伝子にコードされるポリペプチドおよびそのペプチドは、ＮＴＨｉ感染と関連する障害、例えばＯＭなどを処置または予防するための免疫応答の惹起に有用であると想定される。このような遺伝子にコードされるポリペプチドの一例としては、ヒスチジン生合成タンパク質、リポタンパク質Ｂ、ペプチドＡＢＣ輸送体、ペリプラズムＳａｐＡ前駆体、外膜リポタンパク質担体タンパク質前駆体、リボース輸送系パーミアーゼタンパク質、ホスホリボシルアミノイミダゾールカルボキシラーゼ触媒性サブユニット、ＰｕｒＥ、ホスホリボシルアミノイミダゾールカルボキシラーゼ触媒性サブユニット、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ、マンノン酸脱水酵素、ジスルフィドオキシドレダクターゼ、ウレアーゼアクセサリータンパク質、ホスホコリンシチジリル（ｃｙｔｉｄｙｌｙｌ）トランスフェラーゼ、推定ピリドキシン生合成タンパク質、一重項酸素抵抗性タンパク質、細胞内隔壁化タンパク質、ＤＮＡ修復タンパク質、ＭｕｋＦタンパク質、グリセロール−３−ホスフェートレギュロンレセプター、組込み宿主因子βサブユニット、アルギニン抑制因子、コールドショック様タンパク質、ストレス応答タンパク質、ＬｉｃＡ、ＭｕｋＦ、ＲａｄＡおよびＨＩ００９４、ＨＩ１１６３、ＨＩ０６６５、ＨＩ１２９２、ＨＩ１０６４  ＨＩ１８６、ＨＩ０３５２遺伝子にコードされる仮想タンパク質が挙げられる。ＮＴＨｉ
ＯＭＰ、ＬＯＳおよび非被膜タンパク質もまた、ＮＴＨｉ感染と関連する障害の予防および処置のための免疫応答を惹起することが想定される。
【００３９】
本発明は、個体において宿主細胞へのＮＴＨｉ菌の結合を阻止する方法を含む。該方法は、ＮＴＨｉの細胞付着の結合を阻止する本発明の抗体またはポリペプチドを投与することを含む。あるはまた、ＮＴＨｉの細胞付着の結合を阻止する１種類以上の小分子の投与が想定される。本発明の抗体、ポリペプチドまたは小分子がＮＴＨｉの細胞付着を阻止する能力を示すために、インビトロアッセイが使用され得る。
【００４０】
ＮＴＨｉの細胞付着を阻止する本発明の抗体、本発明のポリペプチドおよび／または本発明の小分子を含む医薬組成物が提供される。該医薬組成物は、前述の活性成分の１種類単独からなるものであってもよく、前述の活性成分の組合せを含むものであってもよく、細菌感染を処置するために使用されるさらなる活性成分を含むものであってもよい。医薬組成物は、医薬として有効な担体などの１種類以上の付加的成分を含んでいてもよい。医薬組成物の投与の投薬量および頻度は、標準的な手法によって決定され、例えば、個体の体重および年齢、投与経路ならびに症状の重篤度に依存する。医薬組成物の投与は、当該技術分野において標準的な経路、例えば、非経口、静脈内、経口、口腔内、経鼻、肺経由、経直腸または経膣によるものであり得る。
【００４１】
また、本発明により、個体においてＮＴＨｉ感染を検出するための方法が提供される。一実施形態において、該方法は、試料中の本発明のＮＴＨｉポリヌクレオチドを、該ポリヌクレオチドに特異的に結合するプライマーまたはプローブ用いて検出することを含む。該ポリヌクレオチドの検出は、例えば、ハイブリダイゼーションおよびＰＣＲを伴う当該技術分野において常套的な数多くの手法によってなされ得る。
【００４２】
本発明の抗体はまた、インフルエンザ菌感染が疑われる個体の種々の体液におけるＮＴＨｉ抗原（ＮＴＨｉポリペプチドおよびそのペプチド）の検出のための診断用アッセイにおける使用のための試薬を提供するために使用され得る。別の実施形態において、本発明のＮＴＨｉタンパク質およびペプチドは、種々の患者組織および体液、例えば、限定されないが：血液、血清、耳液、髄液、痰、尿、リンパ液および脳脊髄液におけるＮＴＨｉの検出のためのイムノアッセイにおける抗原として使用され得る。本発明の抗原は、当該技術分野において知られた任意のイムノアッセイ系、例えば、限定されないが：ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡアッセイ、サンドイッチアッセイ、沈降素反応、ゲル拡散沈降素反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、蛍光イムノアッセイ、プロテインＡイムノアッセイおよび免疫電気泳動アッセイにおいて使用され得る。
【００４３】
ワクチンおよび化学療法標的
本発明の一態様は、個体にＮＴＨｉ抗原タンパク質またはその抗原性ペプチドを接種することを含む、個体、特に哺乳動物における免疫学的応答を低減させるための方法に関する。
【００４４】
本発明はまた、本発明の免疫学的組換えＮＴＨｉタンパク質またはＮＴＨｉペプチドを、適当な担体とともに含むワクチン製剤を提供する。ワクチン候補および／または化学療法の標的として想定されるＮＴＨｉポリペプチドおよびそのペプチドとしては、限定されないが、ヒスチジン生合成タンパク質、リポタンパク質Ｂ、ペプチドＡＢＣ輸送体、ペリプラズムＳａｐＡ前駆体、外膜リポタンパク質担体タンパク質前駆体、リボース輸送系パーミアーゼタンパク質、ホスホリボシルアミノイミダゾールカルボキシラーゼ触媒性サブユニット、ＰｕｒＥ、３，４−ジヒドロキシ（ｄｉｈｙｄｒｏｘｔ）−２−ブトン４−ホスフェートシンターゼ、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ、マンノン酸脱水酵素、ジスルフィドオキシドレダクターゼ、ウレアーゼアクセサリータンパク質、ホスホコリンシチジリルトランスフェラーゼ、推定ピリドキシン生合成タンパク質、一重項酸素抵抗性タンパク質、細胞内隔壁化タンパク質、ＤＮＡ修復タンパク質、ＭＵＫＦタンパク質、グリセロール−３−ホスフェートレギュロンレセプター、組込み宿主因子βサブユニット、アルギニン抑制因子、コールドショック様タンパク質、ストレス応答タンパク質、ＬｉｃＡ、ＲａｄＡならびにＨＩ００９４、ＨＩ１１６３、ＨＩ０６６５、ＨＩ１２９２、ＨＩ１０６４  ＨＩ１３８６、ＨＩ０３５２遺伝子にコードされる仮想タンパク質、配列番号：１〜５７６、配列番号：６７５〜６８５、配列番号：７７３〜２５９３として示すヌクレオチド配列および本明細書の表３Ｂ、表４Ｂおよび表５に示すヌクレオチド配列内に存在する新規なＮＴＨｉポリヌクレオチド配列にコードされるＮＴＨｉ  ＯＭＰ、ＮＴＨｉ  ＬＯＳおよびＮＴＨｉ非被膜タンパク質ならびにポリペプチド、ならびに配列番号：２５９４〜４４１４、本明細書の表３Ｂ、表４Ｂおよび表５に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドが挙げられる。
【００４５】
該タンパク質は、胃の中で分解され得るため、好ましくは、非経口、例えば、皮下、筋肉内、静脈内または皮内である投与で投与する。非経口投与に適した製剤としては、水性および非水性の滅菌注射用液剤（これは、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤および製剤を個体の体液（好ましくは血液）と等張性にする溶質を含んでいてもよい）；ならびに水性および非水性滅菌懸濁剤（これは、懸濁剤または増粘剤を含んでいてもよい）が挙げられる。該製剤は、単位投与容器または反復投与容器、例えば、密閉アンプルおよびバイアル内に提示され得、使用直前に滅菌液状担体の添加のみが必要とされる凍結乾燥条件で保存され得る。該ワクチン製剤はまた、製剤の免疫原性を増強するためのアジュバント系（例えば、水中油型および当該技術分野において知られた他の系など）を含んでいてもよい。投薬量は、ワクチンの比活性に依存し、常套的な実験手法容易に決定され得る。
【００４６】
Ａ．ペプチドワクチン
ペプチドワクチンなどのペプチド治療用薬剤は、当該技術分野においてよく知られており、製剤分野での使用が増大している。かかるペプチド化合物の非経口投与に一貫する欠点は、急速な分解または変性であった。輸液ポンプならびにワックスまたはオイル埋入物は、治療用薬剤の長期投与のために、ペプチド様治療用薬剤の存在を延長させるためと、かかる薬剤の完全性を保持するための両方に対する取り組みにおいて使用されている。さらにまた、該ペプチド様薬剤は、理想的には、長期間（特に、該ペプチド様薬剤の各エピトープに関して）天然状態の立体構造を維持するものであるのがよく、さらに、抗原刺激された動物または免疫処置したヒトにおいて免疫学的応答が誘導されるのに適した様式で提示されるものであるのがよい。
【００４７】
本発明のＮＴＨｉ抗原性ペプチドは、いくつかの慣用的な様式で調製され得る。短鎖ペプチド配列は、標準的な手段を用い、化学合成によって調製され得る。特に簡便であるのは固相手法である（例えば、Ｅｒｉｋｓｏｎら，Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（１９７６）ｖ．２，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐ．２５５を参照）。自動固相合成装置が市販されている。また、配列の修飾は、適切な残基の置換、付加または欠失によって容易になされる。例えば、担体タンパク質への簡便な連結のためのスルフヒドリル基をもたらすため、システイン残基がカルボキシ末端に付加され得、またはスペーサーエレメント、例えば、さらなるグリシン残基などが、該ペプチドのＣ末端連結アミノ酸とその残部間の配列内に組み込まれ得る。短鎖ＮＴＨｉペプチドはまた、組換え手法によって作製され得る。この長さのペプチドのコード配列は、化学的手法、例えば、Ｍａｔｔｅｕｃｃｉら，ＪＡｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ，１０３：３１８５（１９８１）に記載のホスホトリエステル法によって容易に合成され得る。
【００４８】
本明細書において想定される一部のＮＴＨｉペプチド配列は、免疫原性であるには小さすぎると考えられ得、この性質を付与するために担体物質に結合させ得る。かかる連結を作出する当該技術分野において知られた任意の方法が使用され得る。連結は、ジスルフィド結合を一方の官能基の末端に生成させ、ペプチド結合を他方に生成させるヘテロ二官能性薬剤、例えば、ジスルフィドアミド形成剤（例えば、Ｎ−スクシジミジル（ｓｕｃｃｉｄｉｍｉｄｙｌ）−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ））（例えば、Ｊａｎｓｅｎら，Ｉｍｍｕｎ．Ｒｅｖ．６２：１８５，１９８２を参照）およびジスルフィド結合ではなくチオエーテルを形成する二官能性カップリング剤、例えば、６−マレイミドカプロン酸、２−ブロモ酢酸、２−ヨード酢酸、４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロへキサン−１−カルボン酸などの反応性エステル、ならびにスクシンイミドまたは１−ヒドロキシ−２−ニトロ−４−スルホン酸と合わせ、スクシンイミジル４−（Ｎ−ｍａｒｅイミド−メチル）シクロへキサン−１−カルボキシレート（ｃａｒｏｂｘｙｌａｔｅ）（ＳＭＣＣ）などのナトリウム塩にすることによりカルボキシル基を活性化させるカップリング剤を用いて形成され得る。
【００４９】
Ｂ．ワクチン組成物および投与
免疫原を初回抗原刺激投与し、続いて該免疫原を１回以上の追加免疫刺激に曝露することは、有効なワクチンとするために必要であり得る（Ｋｒａｍｐら，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，２５：７７１−７７３，１９７９；Ｄａｖｉｓら，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，１４：３４１−８  １９８６  １９８７）。共投与されると免疫応答が有益に増強され得るタンパク質またはポリペプチドの例としては、サイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ）、サイトカイン誘導分子（例えば、Ｌｅａｆ）または共起刺激分子が挙げられる。ヘルパー（ＨＴＬ）エピトープを細胞内標的化シグナルに連結し、ＣＴＬエピトープとは別に発現させてもよい。これにより、ＣＴＬ  エピトープと異なる細胞区画へのＨＴＬエピトープの指向が可能となり得る。必要な場合は、これにより、ＭＨＣクラスＩＩ経路内へのＨＴＬエピトープのより効率的な侵入を助長し、それによりＣＴＬ誘導を改善し得る。ＣＴＬ誘導とは対照的に、ある種の疾患では、免疫抑制分子（例えば、ＴＧＦ−β）の共発現によって免疫応答を特異的に低下させることが有益であり得る。  
【００５０】
理想的には、免疫原は２つの特性；対応する抗体の形成を刺激する能力、およびこのような抗体と特異的に反応する傾向を示すものである。免疫原は、抗体のコーミング（ｃｏｍｂｉｎｇ）部位によって認識され得る免疫原の最小の部分であるエピトープを１つ以上有する。特別な場合では、免疫原、免疫原の画分または免疫原が提示される条件は、所望の免疫学的応答を促すのに不充分であり、不充分な免疫性がもたらされる。これは、しばしば、ペプチドまたは他の小分子が免疫原として使用される場合である。また、免疫調節物質（例えば、サイトカイン、例えばインターロイキン）などの他の物質をワクチンと合わせてもよい。
【００５１】
ワクチン分野では、免疫原ともに使用して免疫応答を増強するアジュバントと呼ばれるある種の物質の使用が認識されている。アジュバントは、アジュバントの使用なしで惹起され得るものより速くて大きな免疫応答を惹起するためにさらに使用される。また、アジュバントは、アジュバントを含めない場合に必要とされ得るより少ない免疫原を用いて免疫学的応答をもたらすため、免疫学的防御をもたらすある種の抗体サブクラスの産生を増大させるため、または免疫応答の成分（例えば、体液性、細胞性）を増強するために使用され得る。既知のアジュバントとしては、フロイントアジュバントなどの乳剤および他の油状乳剤、百日咳菌、ＭＦ５９、Ｑｕｉｌｌａｊａ  ｓａｐｏｎａｒｉａ（ＱＳ２１）由来の精製サポニン、水酸化物、リン酸塩およびミョウバンなどのアルミニウム塩、リン酸カルシウム（および他の金属塩）、水酸化アルミニウム塩などのゲル、マイコバクテリウムの産性物、例えばムラミルジペプチド、固形物質、リポソームおよびビロソームなどの粒子が挙げられる。アジュバントとして使用されることが知られている天然産物および細菌の産生物の例としては、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、ＲＣ−５２９（合成ＭＰＬ様アセチル化単糖）、ＯＭ−１７４（これは、大腸菌由来のリピドＡ誘導体である）、ホロ毒素、例えばコレラ毒素（ＣＴ）またはその誘導体の１つ、百日咳毒素（ＰＴ）および大腸菌の非耐熱性毒素（ＬＴ）またはその誘導体の１つ、ならびにＣｐＧオリゴヌクレオチドが挙げられる。アジュバント活性は、いくつかの要素、例えば、担体効果、デポ形成、リンパ球再循環の改変、Ｔ−リンパ球の刺激、Ｂ−リンパ球の直接刺激およびマクロファージの刺激などによって影響され得る。
【００５２】
ワクチンは、典型的には注射用剤として、液状の液剤もしくは懸濁剤のいずれかとして調製され、注射前に液体中で液剤もしくは懸濁剤にするのに適した固形形態もまた調製され得る。また、該調製物は乳化されたものであってもよい。免疫学的活性成分は、多くの場合、薬学的に許容され得、活性成分と適合性である賦形剤と混合される。好適な賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、およびその組合せである。また、所望の場合、ワクチンに、ワクチンの有効性を増強する少量の補助物質、例えば、湿潤剤もしくは乳化剤、ｐＨ緩衝剤またはアジュバントなどを含めてもよい。ワクチンは、注射によって非経口で、例えば、皮下または筋肉内のいずれかで慣用的に投与される。他の投与様式に適したさらなる製剤としては、坐薬および、場合によっては経口製剤が挙げられる。坐薬では、従来の結合剤および担体として、例えば、ポリアルキレン（ａｌｋａｌｅｎｅ）グリコールまたはトリグリセリドが挙げられ得る。かかる坐薬は、０．５％〜１０％、好ましくは１〜２％の範囲の活性成分を含有する混合物から形成され得る。経口製剤は、例えば、医薬等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの通常使用される賦形剤を含む。このような組成物は、液剤、懸濁剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、徐放製剤または粉末剤の形態をとり、１０％〜９５％、好ましくは２５〜７０％の活性成分を含有する。
【００５３】
また、ワクチンは、ジェット式注射器、極微針、エレクトロポレーション、ソノポレーション、マイクロカプセル封入、ポリマーまたはリポソームを用いる経皮的経路、ネブライザー、エーロゾルおよび経鼻スプレー剤用いる経粘膜経路および鼻腔内経路により投与され得る。天然または合成のポリマー、例えば、デンプン、アルギネートおよびキトサン、Ｄ−ポリＬ−ラクテート（ＰＬＡ）、Ｄ−ポリＤＬ−乳酸−コグリコール酸ミクロスフィア、ポリカプロラクトン、ポリオルトエステル、ポリ無水物ならびにポリホスファゼン
ポリホスファタザン（ｐｈｏｓｐｈａｔａｚａｎｅ）などを用いるマイクロカプセル封入は、経皮的経路および経粘膜投与の両方に有用である。合成ポリオルニテート、ポリリシンおよびポリアルギニンまたは両親媒性ペプチドを含むポリマー複合体は、経皮的送達系に有用である。また、その両親媒性の性質により、リポソームは、経皮的、経粘膜および鼻腔内ワクチン送達系に想定される。ワクチン送達に使用される一般的な脂質としては、Ｎ−（１）２，３−（ジオレイル−ジヒドロキシプロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム−メチル硫酸塩（ＤＯＴＡＰ）、塩化ジオレイルオキシプロピル−トリメチルアンモニウムＤＯＴＭＡ、ジミスチルオキシプロピル−３−ジメチル−ヒドロキシエチルアンモニウム（ＤＭＲＩＥ）、臭化ジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡＢ）および９Ｎ（Ｎ’，Ｎ−ジメチルアミノエタン）カルバモイル）コレステロール（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）が挙げられる。ヘルパー脂質とリポソームの組合せにより、皮膚を通したリポソームの取込みが増強される。このようなヘルパー脂質としては、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジラウトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＬＰＥ）、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）が挙げられる。また、チリのユッカ（ｓｏａｐ  ｔｒｅｅ）樹皮から誘導されるトリテルペノイドグリコシドまたはサポニン（Ｑｕｉｌｌａｊａ  ｓａｐｏｎａｒｉａ）およびキトサン（脱アセチル化キタン（ｃｈｉｔａｎ））は、鼻腔内および経粘膜ワクチン送達に有用なアジュバントとして想定される。
【００５４】
該タンパク質は、中性形態または塩形態としてワクチンに製剤化され得る。薬学的に許容され得る塩としては、酸付加塩（ペプチドの遊離アミノ基と形成される）および無機酸、例えば、塩酸もしくはリン酸など）と形成されるもの、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸が挙げられる。また、遊離カルボキシル基と形成される塩は、無機塩基、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムまたは第２鉄の水酸化物など、ならびにイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジンおよびプロカインなどの有機塩基から誘導され得る。
【００５５】
ワクチンは、投薬製剤と適合性の様式で、治療上有効で免疫原性となるような量で投与される。投与される量は、処置される被験体、被験体の免疫系が抗体を合成する能力、および所望される防御の程度に依存する。投与に必要とされる活性成分の正確な量は、担当医師の判断に依存し、各個体に対して独自である。しかしながら、適当な投薬量範囲は、個体１人あたり活性成分ほぼ数百マイクログラム程度である。また、初期投与および追加免疫刺激注射に好適なレジメン（ｒｅｇｉｍｅ）は種々であるが、初期投与後、１ないし３ヶ月間隔で後続の注射または他の投与を行なうのが典型的である。
【００５６】
本明細書に記載のワクチン組成物での免疫処置の際、宿主の免疫系は、所望の抗原に特異的なＣＴＬを大量に産生することによりワクチンに対して応答し、宿主は、後の感染に対して少なくとも部分的に免疫性となるか、または慢性感染の発症に対して抵抗性となる。本発明のＮＴＨｉポリペプチドまたはＮＴＨｉペプチドを含有するワクチン組成物は、細菌感染に易感染性あるいはそのリスクがある患者に対して、その抗原に対する免疫応答を惹起し、したがって、患者自身の免疫応答能を増強するために投与される。この使用において、この場合も、正確な量は、患者の健康状態および体重、投与様式、製剤の性質などに依存するが、一般的に、約１．０μｇ〜約５０００／７０キログラム患者、より一般的には約１０〜約５００ｍｇ／７０ｋｇ体重の範囲である。治療目的または免疫処置目的のため、本発明のＮＴＨｉポリペプチドまたはＮＴＨｉペプチドはまた、弱毒化ウイルス宿主、例えば、ワクシニアまたは鶏痘によって発現させ得る。このアプローチは、本発明のペプチドをコードするヌクレオチド配列を発現させるためのベクターとしてワクシニアウイルスの使用を伴う。急性または慢性感染宿主または非感染宿主内に導入されると、組換えワクシニアウイルスは免疫学的ペプチドを発現し、それにより宿主ＣＴＬ応答が惹起される。
【００５７】
体液性免疫応答は、多くのよく知られた方法、例えば、単純放射免疫拡散アッセイ（Ｓｉｎｇｌｅ  Ｒａｄｉａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｄｉｆｆｕｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙ）（ＳＲＩＤ）、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）および血球凝集阻害アッセイ（ＨＡＩ）などによって測定され得る。特に、ＳＲＩＤでは、試験対象の免疫原を含有するゲル（例えば、アガロースなど）の層が用いられる。ゲルを切り出して凹部を作り、試験対象の血清を凹部内に入れる。ゲル内への抗体拡散により沈殿環の形成がもたらされ、その面積は試験対象の血清の抗体の濃度に比例する。ＥＩＡは、ＥＬＩＳＡ（酵素結合イムノアッセイ）としても知られ、試料中の全抗体を測定するために使用される。免疫原をマイクロタイタープレートの表面に吸着させる。試験血清を該プレートに曝露した後、酵素結合免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧなど）に曝露する。プレートに付着した酵素の活性を、分光測光法などの任意の簡便な手段によって定量され、試験試料中に存在する免疫原に対して指向される抗体の濃度に比例する。ＨＡＩでは、免疫原、例えばウイルス系タンパク質がトリ赤血球（など）を凝集させる能力が利用される。該アッセイでは、中和抗体、すなわち、血液凝集を阻害し得る抗体が検出される。試験血清の希釈物を標準濃度の免疫原とともにインキュベートした後、赤血球を添加する。中和抗体の存在により、免疫原による赤血球の凝集が阻害される。細胞性免疫応答を測定するための試験は、遅延型過敏症の測定または標的免疫原に対するリンパ球の増殖性応答の測定を含む。
【００５８】
分類不能型インフルエンザ菌（ＮＴＨｉ）
インフルエンザ菌は、小型の非運動性グラム陰性菌である。他のインフルエンザ菌株とは異なり、分類不能型インフルエンザ菌（ＮＴＨｉ）菌株は、多糖莢膜を欠き、時として「非莢膜性」と示される。ＮＴＨｉ菌株は、被包性菌株と遺伝学的に異なり、ｂ型インフルエンザ単離菌よりも不均質性（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｏｕｓ）である。ＮＴＨｉは、ヒト宿主に対して複雑な一連の抗原を提示する。防御をもたらし得る可能な抗原としては、ＯＭＰ、リポ多糖類、リポタンパク質、接着性タンパク質および非被膜タンパク質が挙げられる。
【００５９】
ヒトは、インフルエンザ菌（ｉｎｆｌｕｅｎｚｅ）の唯一の宿主である。ＮＴＨｉ菌株は、通常、鼻咽頭および後部口腔咽頭部を含む上気道、下気道ならびに女性の生殖管に宿する。ＮＴＨｉは、ヒトにおいて広範囲の疾患、例えば、限定されないが、中耳炎、肺炎、副鼻腔炎、敗血症、心内膜炎、喉頭蓋炎、化膿性関節炎、髄膜炎、分娩後および新生児感染、分娩後および新生児セプシス、急性および慢性の卵管炎／卵管炎（ｓａｌｐｉｎｇｉｔｉｓ）、喉頭蓋炎（ｅｐｉｇｌｏｔｔｉｓ）、心膜炎、蜂巣炎、骨髄炎、心内膜炎、胆嚢炎、腹腔内感染、尿路感染症、乳様突起炎、大動脈移植片感染症、結膜炎（ｃｏｎｊｕｎｃｔｉｔｉｖｉｔｉｓ）、ブラジル紫斑熱、不顕性菌血症ならびに潜在する肺疾患、例えば、慢性気管支炎、気管支拡張症（ｂｒｏｎｃｈｉｅｔａｓｉｓ）および嚢胞性線維症などの増悪を引き起こす。
【００６０】
ＮＴＨｉの疫学的試験により、該菌株は、外膜タンパク質プロフィール（Ｂａｒｅｎｌｃａｍｐら，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，３６：５３５−４０，１９８２）、酵素アロタイプ（Ｍｕｓｓｅｒら，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，５２：１８３−１９１，１９８６）および他の一般的に使用される疫学的ツールに関して不均一であることが示された。亜型ＮＴＨｉに対していくつかの試みがなされているが、方法論はいずれも完全に満足のいくものではなかった。ＮＴＨｉの外膜タンパク質組成物は、ほぼ２０のタンパク質からなる。すべてのＮＴＨｉ菌株は、３０，０００および１６，６００ダルトンの分子量を有する２つの共通するＯＭＰを含む。ＮＴＨｉ菌株は、３２，０００〜４２，０００ダルトンの範囲内の２つのＯＭＰに基づいて亜型に分けられ得る。ＮＴＨｉのリポ多糖プロフィールは、グラム陰性腸内細菌と基本的に異なり、２０，０００ダルトン未満の範囲における１〜４個の異なるバンドに分かれる。
【００６１】
基本型のＮＴＨｉ単離菌は、低継代単離菌８６−０２８ＮＰであり、これは、慢性中耳炎の小児から採取された。この菌株は、インビトロ（Ｂａｋａｌｅｔｚら，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，５３：３３１−５，１９８８；Ｈｏｌｍｅｓら，Ｍｉｃｒｏｂ．Ｐａｔｈｏｇ．，２３：１５７−６６，１９９７）ならびにチンチラＯＭモデル（本明細書に記載）（Ｂａｋａｌｅｔｚら，Ｖａｃｃｉｎｅ，１５：９５５−６１，１９９７；Ｓｕｚｕｋｉら，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，６２：１７１０−８，１９９４；ＤｅＭａｒｉａら，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，６４：５１８７−９２，１９９６）において充分特性評価されている。８６−０２８ＮＰ菌株は、本明細書に記載のように、中耳炎のチンチラモデルでの発現において上方調節される遺伝子、およびチンチラの中耳内でのＮＴＨｉの生存に必要な遺伝子を同定するために使用した。
【００６２】
ＤＦＩストラテジー
異差蛍光誘導（ＤＦＩ）ストラテジーを、本明細書において、チンチラ動物モデルのＯＭ時に誘導されるＮＴＨｉ遺伝子を同定するために使用した。感染中、菌体のビルレンスに寄与する細菌遺伝子を同定するため、いくつかの方法を開発した。かかる方法としては、インビボ発現手法（ＩＶＥＴ）（この場合、細菌のプロモーターにより、宿主内での生存に必要とされる必須栄養素の合成に必要な遺伝子（１つまたは複数）の発現が調節される）；シグニチャータグ化（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ−ｔａｇｇｅｄ）突然変異誘発（ＳＴＭ）（変異されると、微生物のビルレンス特性を改変する遺伝子のタグ特異的同定を可能にする；ＤＮＡマイクロアレイ手法（転写活性遺伝子を全体的にスクリーニングするため）およびＤＦＩ（ＦＡＣＳ解析を用いて転写活性プロモーターを選択する（Ｃｈｉａｎｇら，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５３：１２９−１５４，１９９９）が挙げられる。ＤＦＩは、発現の基礎レベルとは無関係に差次的に調節される遺伝子の同定を可能にするハイスループット法であるが、インビトロでの培養に不可欠なものを排除しない。
【００６３】
ＤＦＩは、多くの微生物において成功裏に利用されている。例えば、ＧＦＰレポーター系およびフローサイトメトリーを用いて、マクロファージとの相互作用の際のマイコバクテリウムの遺伝子発現が研究された（Ｄｈａｎｄａｙｕｔｈａｐａｎｉら，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１７：９０１−９１２，１９９５）。プロモータートラップ系を用いて、サルモネラ属がインビボ増殖を刺激する環境に供された場合、および培養マクロファージ様細胞によってインターナリゼーションされた場合に、その転写が増大する遺伝子が同定された（ＶａｌｄｉｖｉａおよびＦａｌｋｏｗ，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２２：３６７−３７８，１９９６；ＶａｌｄｉｖｉａおよびＦａｌｋｏｗ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７７：２００７−２０１１，１９９７；ＶａｌｄｉｖｉａおよびＦａｌｋｏｗ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１：３５９−３６３，１９９８）。また、ＤＦＩを用いて、感染を刺激する種々のインビトロ条件で培養すると、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよびＳ．ａｕｒｅｕｓにおいて発現されるプロモーターが同定されている（Ｍａｒｒａら，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，１４８：１４８３−１４９１，２００２；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９７：１６７１−１６７６，２０００）。また、ＤＦＩを用いて、環境性刺激に応答したＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓにおける遺伝子調節（ＤｕｎｎおよびＨａｎｄｅｌｓｍａｎ，Ｇｅｎｅ，２２６：２９７−３０５，１９９９）、能力刺激ペプチドに応答したＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅにおける遺伝子調節（Ｂａｒｔｉｌｓｏｎら，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，３９：１２６−１３５，２００１）、ならびに宿主細胞との相互作用時および該細胞内への侵入時のＢａｒｔｏｎｅｌｌａ  ｈｅｎｓｅｌａｅ（ＬｅｅおよびＦａｌｋｏｗ，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，６６：３９６４−３９６７，１９９８）、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  Ｗｉｌｓｏｎら，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，６９：５０１６−５０２４，２００１）、Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ａｂｏｒｔｕｓ（Ｅｓｋｒａら，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，６９：７７３６−７７４２，２００１）および大腸菌（Ｂａｄｇｅｒら，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，３６：１７４−１８２，２０００）における遺伝子調節が研究された。
【００６４】
ＤＦＩは、インビボ環境を刺激するために設計された感染の細胞培養モデルまたはインビトロ条件において活性なプロモーターを同定するために成功裏に使用されたが、ＤＦＩは、完全体の動物内の特定の生物学的ニッチにおいて調節されるプロモーターを同定するためには、ほとんど適用されていない。これは、おそらく、インビボ環境からの分取に伴う数多くの課題ためである。宿主の炎症性応答、播種および／または感染部位からの菌体のクリアランス、ならびに上皮細胞への細菌の付着（おそらく、バイオフィルム形成による）により、細菌は、生体動物からの回復に利用不可能となり得る。これらの要素は、とりわけ、該細菌がこのような変化を感知し、これに応答すると、微小環境の複雑さ、および遺伝子発現の不均一性に寄与する。最近、ＤＦＩを用い、該細菌を気道感染のマウスモデルおよびＯＭのアレチネズミ感染モデルにおいてスクリーニングすると、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅにおいて発現されるプロモーターが同定された（Ｍａｒｒａら，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７０：１４２２−３３，２００２；Ｍａｒｒａら，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１４８：１４８３−９１，２００２）。
【００６５】
動物モデル
チンチラモデルは、広く認められたＯＭの実験モデルである。特に、ＮＴＨｉ誘導型ＯＭのチンチラモデルは充分特性評価されており（Ｂａｋａｌｅｔｚら，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１６８：８６５−８７２，１９９３；ＢａｋａｌｅｔｚおよびＨｏｌｍｅｓ，Ｃｌｉｎ．Ｄｉａｇｎ．Ｌａｂ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ａ：２２３−２２５，１９９７；ＳｕｚｕｋｉおよびＢａｋａｌｅｔｚ，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，６２：１７１０−１７１８，１９９４）、ＯＭに対する痘苗原としてのいくつかのＮＴＨｉ外膜タンパク質、外膜タンパク質の組合せ、キメラ合成ペプチドワクチン成分およびアジュバント製剤の防御的有効性を調べるために使用されている（Ｂａｋａｌｅｔｚら，Ｖａｃｃｉｎｅ，１５：９５５−９６１，１９９７；Ｂａｋａｌｅｔｚら，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，６１：２７４６−２７６２，１９９９；Ｋｅｎｎｅｄｙら，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，６８：２７５６−２７６５，２０００）。
【００６６】
特に、アデノウイルスがチンチラにインフルエンザ菌誘導型中耳炎をもたらす独自のインビボモデルが存在し、これにより、ＮＴＨｉの生物学的評価のための関連する細胞、組織および器官の培養系の確立が可能となった（Ｂａｋａｌｅｔｚら，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１６８：８６５−７２，１９９３；Ｓｕｚｕｋｉら，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ６２：１７１０−８，１９９４）。アデノウイルス感染を単独で用い、誘導された血清抗体の鼓室内への漏出が評価され（Ｂａｋａｌｅｔｚら，ＣＨｎ．Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｌａｂ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，４（２）：２２３−５，１９９７）、ＮＴＨｉとともに共病原体として用い、中耳炎に対する痘苗原としての種々のＮＴＨｉ外膜タンパク質、ＯＭＰの組合せ、キメラ合成ペプチドワクチン成分およびアジュバント製剤を標的化するいくつかの能動および受動免疫処置レジメンの防御的有効性が調べられた（Ｂａｋａｌｅｔｚら，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，６７（６）：２７４６−６２，１９９９；Ｋｅｎｎｅｄｙら，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．，６８（５）：２７５６−６５，２０００；Ｎｏｖｏｔｎｙら，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ６８（４）：２１１９−２８，２０００；Ｐｏｏｌｍａｎら，Ｖａｃｃｉｎｅ  １９（Ｓｕｐｐｌ．１）：Ｓ１０８−１５，２０００）。
【００６７】
中耳のＮＴＨｉ感染に応答してインビボで上方調節される遺伝子
中耳のＮＴＨｉ感染に応答して差次的に調節されるプロモーターを同定するため、プロモータートラップライブラリーを構築し、分取パラメータを規定した。プロモータートラップライブラリーの一部分をチンチラの中耳内に直接接種し、ＯＭ発症を、ビデオ耳鏡検査およびティンパノメトリによって２４時間および４８時間の時点でモニターした。また、中耳液を感染２４時間および４８時間後に採取した。２色ＦＡＣＳ解析を用い、ＧＦＰを発現している細菌を、他の細胞および滲出液に付随する残屑から単離した（ｉｓｏｌａｔｅｄ）。単離後、ｇｆｐｍｕｔ３遺伝子の５’のインフルエンザ菌挿入配列のＤＮＡ配列を決定し、解析した。このようにした、本発明者らは、ＡＯＭ時にＮＴＨｉがチンチラの中耳環境を感知し、これに応答すると上方調節される遺伝子を同定した。以下の遺伝子が同定され、これらは、ＮＴＨｉ感染時に上方調節されるため、ＮＴＨｉ感染およびビルレンスにおいて役割を果たしている可能性がある。
【００６８】
実施例７において後述するように、ｇｆｐ発現クローンの上記のＤＦＩ手順および続くＦＡＣＳ解析の後、潜在的なインビボ調節プロモーターを含む５２個の候補クローンが単離された。これらのクローンが制御する遺伝子を、概要および細胞内での機能に基づいて分類し、一般的な代謝過程、環境情報的プロセッシングおよび膜輸送、膜タンパク質および仮想タンパク質を含む。これらの５２個のクローンのうち８個は、ＮＴＨｉ８６−０２８ＮＰ菌株に特異的配列を含む。重要なことに、３個のクローンを、１匹より多くの動物における独立したスクリーニングで単離し、それにより単離方法を確認した。
【００６９】
該ＦＡＣＳデータを独立して確認するため、本発明者らは、候補遺伝子の相対発現を定量的ＲＴ−ＰＣＲによって調べた。親８６−０２８ＮＰ菌株を本試験に使用した。したがって、遺伝子調節に対してプラスミドコピー数の影響がない野生型遺伝子発現を解析し、ＦＡＣＳによる偽陽性クローン同定の識別を可能にした。インフルエンザＲｄ菌株で同定されたものと同様の配列を含む４４個の候補クローンのうち、２６個の遺伝子（６０％）について、インビトロおよびインビボでの遺伝子発現の定量的比較により、ＮＴＨｉがチンチラの中耳内に存在する環境的なきっかけ（ｃｕｅ）に応答すると、上方調節された遺伝子発現が確認された。この解析により、膜輸送、環境情報的プロセッシング、細胞性代謝、遺伝子調節ならびに未知機能を有する仮想タンパク質に関与する遺伝子の発現を駆動するインビボ調節型プロモーターが同定された。（実施例６の表４参照）。
【００７０】
定量的ＲＴ−ＰＣＲにより、ｌｏｌＡ発現の２倍増加が示された。内膜から外膜へのリポタンパク質輸送が可能となった。細菌は、中耳環境内で急速に増殖し、４８時間以内に、中耳液１ｍｌあたり５．０×１０８ＣＦＵ  ＮＴＨｉに達する。細菌は、該環境を感知し、これに応答して、増殖および生存のための必須栄養素を獲得または合成する。リボース糖輸送における膜成分をコードする遺伝子ｒｂｓＣ（配列番号：６１９）は、インビトロでの細胞培養と比べ、インビボでは５倍の発現増加を示した。また、代謝過程に関与する多くの遺伝子は、インビトロでの細胞培養と比べ、インビボでは遺伝子発現の劇的な増加を示す。これらとしては、リボフラビン合成遺伝子ＨｂＢ（配列番号：６２３）、プリンヌクレオチド生合成遺伝子ｐｕｒＥ（配列番号：６２１）、尿素回路によるアルギニン分解に関与するオルニチンカルバモイルトランスフェラーゼａｒｃＢ（配列番号：６２５）、ならびにＤ−グルクロネートの取込みおよびグリセルアルデヒド３−リン酸への形質転換に必要とされるマンノネート（ｍａｎｎｏｎａｔｅ）ヒドロラーゼをコードするｕｘｕＡ（配列番号：６２７）が挙げられる。また、程度は低いが、ヒスチジン生合成のための遺伝子（ｈｉｓＢ；配列番号：６１５）、ＤＮＡ修復のための遺伝子（ｒａｄＣ；配列番号：６３９）および推定細胞内隔壁化膜貫通タンパク質の遺伝子（ｉｓｐＺ；配列番号：６３７）も上方調節された。
【００７１】
ジスルフィド結合形成は、細菌内での多くの分泌タンパク質のフォールディングおよび合成に重要である。原核生物では、ＤｓｂＡおよびＤｓｂＢがジスルフィドの形成を担う酸化的経路を構成する。ＤｓｂＢはＤｓｂＡを再酸化し、これは、ジスルフィドが変性ポリペプチドに直接結合することを表す。ＤｓｂＢは、酸化キノンから新たにジスルフィドを生成させることが示されている（ＣｏｌｌｅｔおよびＢａｒｄｗｅｌｌ，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，４４：１−８，２００２）。インフルエンザＲｄ菌株では、ＤｓｂＡは、形質転換能に必要とされる（Ｔｏｍｂ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｄ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８９：１０２５２−１０２５６，１９９２）。ここでは、ほぼ３倍のｄｓｂＢ遺伝子（配列番号：６２９）の転写増加が示され、中耳環境内で増殖するＴＨｉに対するジスルフィド相互交換の重要な役割が明らかになった。
【００７２】
中耳での細菌のコロニー形成は、正常な滅菌環境であり、宿主炎症性応答および続いて好中球浸潤をもたらす。細菌は、この宿主の応答に対処するため、数多くの戦略を進化させてきた。ＮＴＨｉは、ヘリコバクター属において活性ウレアーゼの発現に必要とされ、酸耐性に関与することが示されている（Ｙｏｕｎｇら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｏｌ．，１７８：６４８７−６４９５，１９９６）遺伝子のホモログであるｕｒｅＨ（配列番号：６３１）遺伝子発現を増大させる（４倍）。最近、ウレアーゼ活性は、感染時に起こるｐＨの減少を打ち消すことにより、慢性のＡｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ感染において役割を果たしている可能性があることが報告された（Ｂａｌｔｅｓら，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，６９：４７２−４７８，２０００；Ｂａｌｔｅｓら，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，６９：４７２−４７８，２００１；ＢｏｓｓｅおよびＭａｃｈｉｎｅｓ，Ｃａｎ．Ｊ．Ｖｅｔ．Ｒｅｓ．，６４：１４５−１５０）。中耳滲出液由来のＮＴＨｉ単離菌に関するバイオタイプ解析により、８７％はウレアーゼ陽性であることが示された（ＤｅＭａｒｉａら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２０：１１０２−１１０４，１９８４）。しかしながら、ＮＴＨｉビルレンスにおけるウレアーゼの役割は未知である。同様に、その産物がＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのピリドキシン生合成タンパク質に対して８８％の配列同一性および抗酸化剤としての機能を果たし得る推定一重項酸素抵抗性タンパク質に対して６０％相同性を示す遺伝子発現の増大。ホスホリルコリン（ＣｈｏＰ）は、ＮＴＨｉの病因に関与している（Ｗｅｉｓｅｒら，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，６５：９４３−９５０，１９９７）。ＮＴＨｉは、ｐｈａｓｅ  ｖａｒｉａｔｉｏｎによってＣｈｏＰ発現モジュレートし、細胞表面上のＬＯＳを修飾する。ＣｈｏＰは、抗菌性ペプチドに対する感受性を低下させることによって気道内のＮＴＨｉ残留に寄与し得（Ｌｙｓｅｃｋｏら，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，６８：１６６４−１６７１，２０００）、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）によって媒介される血清殺傷性に対する感受性を改変し得る（Ｗｅｉｓｅｒら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８７：６３１−６４０，１９９８）。チンチラ鼻咽頭では、ＣｈｏＰ＋菌株がより多くのコロニー形成を示すため、鼻咽頭および中耳腔の微小環境ではＣｈｏＰ＋表現型が選択され得る（Ｔｏｎｇら，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，６８：４５９３−４５９７，２０００）。また、ｌｉｃＣ遺伝子（配列番号：６３３）の発現も増大された。ｌｉｃＣ遺伝子は、ホスホリルコリン誘導性ＬＯＳの生合成において役割を果たすホスホリルコリンシチジリルトランスフェラーゼをコードする（Ｒｏｃｋら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｏｌ，１８３：４９２７−４９３１，２００１）。
【００７３】
また、インビボ誘導型遺伝子のうち、その産物が、続いて遺伝子発現またはＤＮＡ複製を調節する一連のものも含まれる。このような遺伝子としては、ｇｌｐリプレッサーｇｌｐＲ（配列番号：６４３）によるグリセロール代謝の転写調節、アルギニン抑制因子遺伝子ａｒｇＲ（配列番号：６４７）、および組込み宿主因子（ＩＨＦ）βサブユニットｉｈｆＢ（配列番号：６４５）が挙げられる。ＩＨＦはヒストン様タンパク質であり、これは、特定配列のＤＮＡに結合し、複製、部位特異的組換えおよび転写に関与するアクセサリー因子であり、多数のオペロンの活性を改変させる（Ｇｏｏｓｅｎおよびｖａｎ  ｄｅ  Ｐｕｔｔｅ，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１６：１−７，１９９５）。また、ＣｓｐＤは、大腸菌において定常期誘導性ストレス応答の際、ＤＮＡ複製を阻害し（Ｙａｍａｎａｋａら，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，３９：１５７２−１５８４，２００１）、ｍｕｋＦ（配列番号：６４１）遺伝子タンパク質ホモログは、細胞分離前に、よりコンパクトな形態へのヌクレオチド（ｎｕｃｌｅｉｏｄ）構造のリモデリングに寄与する（ＳａｗｉｔｚｋｅおよびＡｕｓｔｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃＬ  Ｕ．Ｓ．Ａ．，６２：１７１０−１７１８，２０００）。また、本明細書に記載のＤＦＩストラテジーにより、未知機能の遺伝子に関してインビボで誘導されるプロモーターが同定された。仮想タンパク質ＨＩ００９４では、ＯＭ初期に遺伝子発現の８倍増加が示されたが、その役割は依然として未知である。ＨＩ１１６３（配列番号：６５１）は、大腸菌の推定オキシダーゼである仮想ＹｄｉＪタンパク質と、５８％アミノ酸同一性を示した。
【００７４】
高密度トランスポゾン変異誘発ストラテジーを用いて、富化培地での増殖に不可欠なインフルエンザ菌遺伝子が同定された（Ａｋｅｒｌｅｙら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｄ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９９：９６６−９７１，２００２）。６つの遺伝子が、本明細書に記載のスクリーニングにおいて同定され、これらは、Ａｋｅｒｌｅｙら、前掲に記載の必須遺伝子の組に含まれる（ｈｉｓＢ、ｌｐｐＢ、ｌｏｌＡ、ｉｓｐＺ、ｍｕｋＦおよび未知ＨＩ０６６５）。最近、２つのヒト気道由来上皮細胞株と相互作用すると発現される分類不能型インフルエンザ菌の遺伝子が同定された。このような遺伝子には、代謝過程、ストレス応答、遺伝子発現、細胞外被の生合成、ＤＮＡ関連プロセス、細胞分裂および未知機能のＯＲＦのコードタンパク質に関与するものが含まれた。（Ｕｌｓｅｎら，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４５：４８５−５００，２００２）。同様に、ストレス応答遺伝子であるｃｓｐＤ（配列番号：６４９）、プリンおよびリボフラビンの生合成に関与する遺伝子、および未知機能のｖａｐＡが、本明細書に記載のスクリーニングにおいて同定された。ｖａｐＡの発現はインビトロで検出されたが、ｖａｐＡ遺伝子発現は、インビボでは２倍増加した。これらの特有のアプローチでは、ＮＴＨｉ誘導型ＯＭにおいて上方調節され、したがって、おそらくＮＴＨｉ感染およびビルレンスにおいて役割を果たしており、ＮＴＨｉ関連障害のワクチンおよびアンチセンス療法ならびに他の治療的処置方法の潜在的候補であり得る既知遺伝子が同定された。
また、ＤＦＩストラテジーにより、未知機能の遺伝子に関してインビボで誘導されるプロモーターの同定がもたらされた。仮想タンパク質ＨＩ００９４では、ＯＭ初期に遺伝子発現において８倍増加が示されたが、その役割は依然として未知である。ＨＩ１１６３（配列番号：６５１）は、大腸菌の推定オキシダーゼである仮想ＹｄｉＪタンパク質と、５８％アミノ酸同一性を示した。したがって、このような仮想遺伝子は、おそらく、ＮＴＨｉ感染によって誘導されるＯＭにおいて役割を果たしている。
例えば、本発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
配列番号：５７７〜５７９、配列番号：５８９〜６１４、配列番号：６７５〜６８５、配列番号：６１５、配列番号：６１７、配列番号：６１９、配列番号：６２１、配列番号：６２３、配列番号：６２５、配列番号：６２７、配列番号：６２９、配列番号：６３１、配列番号：６３３、配列番号：６３５、配列番号：６３７、配列番号：６３９、配列番号：６４１、配列番号：６４３、配列番号：６４５、配列番号：６４７、配列番号：６４９、配列番号：６５１、配列番号：６５３、配列番号：６５５、配列番号：６５７、配列番号：６５９、配列番号：６６１、配列番号：６６３、配列番号：６６５、配列番号：６６７、配列番号：６６９、６７１、配列番号：６７３、配列番号：６８６、配列番号：６８８、配列番号：６９２、配列番号：６９４、配列番号：６９６、配列番号：６９８、配列番号：７００、配列番号：７０２、配列番号：７０４、配列番号：７０６、配列番号：７０８、配列番号：７１０、配列番号：７１２、配列番号：７１４、配列番号：７１６、配列番号：７１８、配列番号：７２０、配列番号：７２２、配列番号：７２４、配列番号：７２６、配列番号：７２８、配列番号：７３０、配列番号：７３２、配列番号：７３４、配列番号：７３６、配列番号：７３８、配列番号：７４０、配列番号：７４２、配列番号：７４４、配列番号：７４６、配列番号：７４８、配列番号：７５０、配列番号：７５２、配列番号：７５４、配列番号：７５６、配列番号：７５８、配列番号：７６０、配列番号：７６２、配列番号：７６４、配列番号：７６６、配列番号：７６８  配列番号：７７０または配列番号：７７３〜２５９３のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
（項目２）
項目１に記載のヌクレオチド配列の組またはその断片にコードされるアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
（項目３）
配列番号：６１６、配列番号：６１８、配列番号：６２０、配列番号：６２２、配列番号：６２４、配列番号：６２６、配列番号：６２８、配列番号：６２８、配列番号：６３０、配列番号：６３２、配列番号：６３４、配列番号：６３６、配列番号：６３８、配列番号：６４０、配列番号：６４２、配列番号：６４４、配列番号：６４６、配列番号：６４８、配列番号：６５０、配列番号：６５２、配列番号：６５４、配列番号：６５６、配列番号：６５８、配列番号：６６０、配列番号：６６２、配列番号：６６４、配列番号：６６６、配列番号：６６８、配列番号：６７０、配列番号：６７２、配列番号：６７４、配列番号：６８７、配列番号：６８９、配列番号：６９１、配列番号：６９３、配列番号：６９５、配列番号：６９７、配列番号：６９９、配列番号：７０１、配列番号：７０３、配列番号：７０５、配列番号：７０７、配列番号：７０９、配列番号：７１１、配列番号：７１３、配列番号：７１５、配列番号：７１７、配列番号：７１９、配列番号：７２１、配列番号：７２３、配列番号：７２５、配列番号：７２７、配列番号：７２９、配列番号：７３１、配列番号：７３３、配列番号：７３５、配列番号：７３７、配列番号：７３９、配列番号：７４１、配列番号：７４３、配列番号：７４５、配列番号：７４７、配列番号：７４９、配列番号：７５１、配列番号：７５３、配列番号：７５５、配列番号：７５７、配列番号：７５９、配列番号：７６１、７６３、配列番号：７６５、配列番号：７６７、配列番号：７６９、配列番号：７７１または配列番号：２５８１〜４４１４のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
（項目４）
項目２または３に記載のポリペプチドおよび薬学的に許容され得る担体を含む組成物。
（項目５）
項目２もしくは３に記載のポリペプチドまたはその断片に特異的に結合する抗体。
（項目６）
項目５に記載の抗体および薬学的に許容され得る担体を含む組成物。
（項目７）
生物学的試料内のＮＴＨｉ菌を検出するための方法であって、
（ａ）項目１に記載のポリヌクレオチドまたはその断片を生物学的試料と接触させる工程、および
（ｂ）該試料内での該ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションを検出する工程、
を包含する、方法。
（項目８）
生物学的試料内のＮＴＨｉ菌を検出するための方法であって、
（ａ）項目５に記載の抗体と生物学的試料を接触させる工程、および
（ｂ）該試料内での該抗体の結合を検出する工程
を包含する、方法。
（項目９）
前記生物学的試料が、血清、痰、耳液、血液、尿、リンパ液および脳脊髄液からなる群より選択される、項目７または８に記載の方法。
（項目１０）
ＮＴＨｉ菌に対する免疫応答を惹起させるための方法であって、免疫原性的に有効な用量の項目２または３に記載のポリペプチドまたはその断片を、ＮＴＨｉ菌感染のリスクのある患者に投与する工程を包含する、方法。
（項目１１）
項目２または３に記載のポリペプチドまたはその断片および医薬用に適した担体を含むワクチン。
（項目１２）
前記免疫応答が、ＮＴＨｉ菌の死滅、ＮＴＨｉ菌の複製の遅滞またはＮＴＨｉ菌の結合の阻止の１種類以上を含む項目１０に記載の方法。
（項目１３）
前記ＮＴＨｉ感染が中耳内である、項目１０に記載の方法。
（項目１４）
ＮＴＨｉ菌感染を処置または予防する方法であって、項目２または３に記載のポリペプチドの発現または活性を阻害する分子を、処置または予防を必要とする患者に投与する工程を包含する、方法。
（項目１５）
前記ＮＴＨｉポリペプチドが、ｈｉｓＢ、ｌｐｐＢ、ｓａｐＡ、ｒｂｓＣ、ｐｕｒｅ、ｒｉｂ、ａｒｃＢ、ｕｘｕＡ、ｌｉｃＣ、ｉｓｐＺ、ｍｕｋＦ、ｇｌｐＲ、ｉｈｆＢ、ｃｓｐＤ、ｌａｖ、ＨＩ１６４７、ＨＩ００９４、ＨＩ１１６３、ＨＩ０６６５、ＨＩ１２９２、ＨＩ１０６４、ＨＩ１３８６、ＨＩ１４６２、ＨＩ１３６９およびＨＩ１５９８からなる群より選択されるＮＴＨｉ遺伝子にコードされる、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記ＮＴＨｉポリペプチドが、配列番号：６１６、配列番号：６１８、配列番号：６２０、配列番号：６２２、配列番号：６２４、配列番号：６２６、配列番号：６２８、配列番号：６３４、配列番号：６３８、配列番号：６４２、配列番号：６４４、配列番号：６４６、配列番号：６５０、配列番号：６５２、配列番号：６５６、配列番号：６５８、配列番号：６６０、配列番号：６６２、配列番号：６６４、配列番号：６６６、配列番号：６６８、配列番号：６７０、配列番号：６７２および配列番号：６７４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、項目１４に記載の方法。
（項目１７）
前記必要とする患者に投与される前記分子がアンチセンスオリゴヌクレオチドである、項目１４に記載の方法。
（項目１８）
前記必要とする患者に投与される前記分子が抗体である、項目１４に記載の方法。
（項目１９）
前記必要とする患者に投与される前記分子が小分子である、項目１４に記載の方法。
（項目２０）
前記ＮＴＨｉ感染が中耳内である、項目１４に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】図１は、一群のインフルエンザ単離菌におけるＬＫＰ遺伝子領域を示す。８６−０２８ＮＰ菌株の配列は、この領域において、ＮＴＨｉ菌株Ｒ３００１の配列と同一である。これらのＮＴＨｉはともに、赤血球凝集性線毛（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｎｇ  ｐｉｌｕｓ）をコードするｈｉｆ遺伝子クラスターを欠く。
【図２】図２は、一群のインフルエンザ単離菌におけるｒｆａＤ領域を示す。８６−０２８ＮＰ菌株ゲノムのｒｆａＤ領域内の遺伝子構成は、Ｒｄ菌株のゲノムのものと類似するが、調べたほとんどのＮＴＨｉのゲノムに見られるこれらの遺伝子の構成と異なる。
【図３Ａ】図３Ａ〜３Ｍは、表４に示すヌクレオチド配列（配列番号：５８９〜６１４）を示し、これらは、ＯＭ感染時、上方調節されると同定された（実施例６参照）。また、既知遺伝子に対応するヌクレオチド（ｎｔ．）および配列番号：１〜５７６として示すコンティグ配列に対応するｎｔ．を示す。
【図３Ｂ】図３Ａ〜３Ｍは、表４に示すヌクレオチド配列（配列番号：５８９〜６１４）を示し、これらは、ＯＭ感染時、上方調節されると同定された（実施例６参照）。また、既知遺伝子に対応するヌクレオチド（ｎｔ．）および配列番号：１〜５７６として示すコンティグ配列に対応するｎｔ．を示す。
【図３Ｃ】図３Ａ〜３Ｍは、表４に示すヌクレオチド配列（配列番号：５８９〜６１４）を示し、これらは、ＯＭ感染時、上方調節されると同定された（実施例６参照）。また、既知遺伝子に対応するヌクレオチド（ｎｔ．）および配列番号：１〜５７６として示すコンティグ配列に対応するｎｔ．を示す。
【図３Ｄ】図３Ａ〜３Ｍは、表４に示すヌクレオチド配列（配列番号：５８９〜６１４）を示し、これらは、ＯＭ感染時、上方調節されると同定された（実施例６参照）。また、既知遺伝子に対応するヌクレオチド（ｎｔ．）および配列番号：１〜５７６として示すコンティグ配列に対応するｎｔ．を示す。
【図３Ｅ】図３Ａ〜３Ｍは、表４に示すヌクレオチド配列（配列番号：５８９〜６１４）を示し、これらは、ＯＭ感染時、上方調節されると同定された（実施例６参照）。また、既知遺伝子に対応するヌクレオチド（ｎｔ．）および配列番号：１〜５７６として示すコンティグ配列に対応するｎｔ．を示す。
【図３Ｆ】図３Ａ〜３Ｍは、表４に示すヌクレオチド配列（配列番号：５８９〜６１４）を示し、これらは、ＯＭ感染時、上方調節されると同定された（実施例６参照）。また、既知遺伝子に対応するヌクレオチド（ｎｔ．）および配列番号：１〜５７６として示すコンティグ配列に対応するｎｔ．を示す。
【図３Ｇ】図３Ａ〜３Ｍは、表４に示すヌクレオチド配列（配列番号：５８９〜６１４）を示し、これらは、ＯＭ感染時、上方調節されると同定された（実施例６参照）。また、既知遺伝子に対応するヌクレオチド（ｎｔ．）および配列番号：１〜５７６として示すコンティグ配列に対応するｎｔ．を示す。
【図３Ｈ】図３Ａ〜３Ｍは、表４に示すヌクレオチド配列（配列番号：５８９〜６１４）を示し、これらは、ＯＭ感染時、上方調節されると同定された（実施例６参照）。また、既知遺伝子に対応するヌクレオチド（ｎｔ．）および配列番号：１〜５７６として示すコンティグ配列に対応するｎｔ．を示す。
【図３Ｉ】図３Ａ〜３Ｍは、表４に示すヌクレオチド配列（配列番号：５８９〜６１４）を示し、これらは、ＯＭ感染時、上方調節されると同定された（実施例６参照）。また、既知遺伝子に対応するヌクレオチド（ｎｔ．）および配列番号：１〜５７６として示すコンティグ配列に対応するｎｔ．を示す。
【図３Ｊ】図３Ａ〜３Ｍは、表４に示すヌクレオチド配列（配列番号：５８９〜６１４）を示し、これらは、ＯＭ感染時、上方調節されると同定された（実施例６参照）。また、既知遺伝子に対応するヌクレオチド（ｎｔ．）および配列番号：１〜５７６として示すコンティグ配列に対応するｎｔ．を示す。
【図３Ｋ】図３Ａ〜３Ｍは、表４に示すヌクレオチド配列（配列番号：５８９〜６１４）を示し、これらは、ＯＭ感染時、上方調節されると同定された（実施例６参照）。また、既知遺伝子に対応するヌクレオチド（ｎｔ．）および配列番号：１〜５７６として示すコンティグ配列に対応するｎｔ．を示す。
【図３Ｌ】図３Ａ〜３Ｍは、表４に示すヌクレオチド配列（配列番号：５８９〜６１４）を示し、これらは、ＯＭ感染時、上方調節されると同定された（実施例６参照）。また、既知遺伝子に対応するヌクレオチド（ｎｔ．）および配列番号：１〜５７６として示すコンティグ配列に対応するｎｔ．を示す。
【図３Ｍ】図３Ａ〜３Ｍは、表４に示すヌクレオチド配列（配列番号：５８９〜６１４）を示し、これらは、ＯＭ感染時、上方調節されると同定された（実施例６参照）。また、既知遺伝子に対応するヌクレオチド（ｎｔ．）および配列番号：１〜５７６として示すコンティグ配列に対応するｎｔ．を示す。
【発明を実施するための形態】
【００７６】
（詳細な説明）
以下の実施例は、本発明を説明する。ここで、実施例１はＮＴＨｉゲノムの配列を示し、実施例２は同定されたコンティグおよび最初の遺伝子発見を示し、実施例３はＮＴＨｉ
プロモータートラップライブラリーの構築を示し、実施例４はＧＦＰを発現する８６−０２８ＮＰ誘導体の解析を示し、実施例５は中耳液由来の細菌の直接標識を示し、実施例６は、急性中耳炎においてインビボで誘導されるプロモーターの同定を示し、実施例７はビルレンス関連遺伝子の同定を示し、実施例８は、ＮＴＨｉ特異的遺伝子配列の同定を示し、実施例９は、完全ＮＴＨｉ８６−０２８ＮＰゲノムの解析を示し、実施例１０では、ＮＴＨｉ８６−０２８ＮＰ菌株およびインフルエンザ菌ｄ血清型菌株ｋｗ２０のゲノムＤＮＡ配列を比較している。
【００７７】
実施例１
分類不能型インフルエンザ菌のゲノムの配列
ＮＴＨｉ８６−０２８ＮＰ菌株は、コロンブス小児病院において、慢性ＯＭのため鼓膜切開およびチューブ挿入を受けた小児患者から採取された、最小限に継代された臨床用単離菌である（Ｂａｋａｌｅｔｚら  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，５６（２）：３３１−３３５，１９８８）。８６−０２８ＮＰ菌株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ  ２０１０８
ＵＳＡ）に２００２年１０月１６日に寄託し、受託番号ＰＴＡ−４７６４が付与された。
【００７８】
ＮＴＨｉのビルレンス決定基の同定に、より広くアプローチするための取り組みにおいて、ＮＴＨｉ８６−０２８ＮＰ菌株のゲノムを３倍の範囲まで配列決定した。Ｐｕｒｅｇｅｎｅプロトコルを用いて８６−０２８ＮＰ菌株から染色体ＤＮＡを調製し、Ｈｙｄｒｏｓｈｅａｒ装置（Ｇｅｎｅ  Ｍａｃｈｉｎｅｓ）により２〜４ｋｂの大きさに切断した。切断されたＤＮＡをエタノール沈殿させ、クレノウ酵素とＴ４  ＤＮＡポリメラーゼの混合物を用いて末端修復し、アガロースゲル電気泳動によってサイズ選択し、Ｃｈｉｓｓｏｅら（Ｍｅｔｈｏｄｓ：ａ  Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ３：５５−６５，１９９１）およびＳａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９）に記載のような２〜４ｋｂ断片を得た。これらの断片をベクターｐＵＣ１８内に、Ｓｍａｌ制限部位（ホスファターゼ処理済）を用いてクローニングし、大腸菌ＸＬ−Ｉ  Ｂｌｕｅ内に形質転換し、アンピシリン耐性に関して選択した。挿入物を含むコロニーを、Ｘ−ｇａｌを入れたＬＢ−Ａｍｐプレート上にて青／白スクリーニングによって同定し、１．５ｍｌのＴＢ−Ａｍｐ（ＴＢ＝Ｔｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ）培養液を入れた９６ディープェルプレートに移した。このディープェルプレート培養物を、一晩（１８〜２２時間）３７℃で培養した。鋳型の調製、配列決定およびコンティグ編集を行なった。
【００７９】
自動鋳型調製を、Ｃｈｉｓｓｏｅら、前掲に記載のＢｅｃｋｍａｎ  Ｂｉｏｍｅｋ  ２０００自動ロボットワークステーションにおいて行なった。簡単には、上記で調製されたクローンの入った各９６ディープェルプレートを遠心分離して細胞をペレット化し、上清みを廃棄し、細胞を−２０℃で凍結させた（必要な場合）。４つの９６ディープェルブロックをＢｉｏｍｅｋの台上に配置し、液体処理ロボットを用い、Ｃｈｉｓｓｏｅら、前掲に記載の自動型の典型的なＳＤＳ−ＮａＯＨ溶解プロトコルを使用して鋳型を調製した。最後にエタノール沈殿させた鋳型を、各々、５０μｌのｄｄＨ２Ｏに溶解し、ＤＮＡ配列決定に使用した。
【００８０】
配列決定反応は、Ｒｏｂｂｉｎｓ  Ｈｙｄｒａ  ９６ロボットを用いて、鋳型（９６ウェルプレートから）を３８４ウェルプレートに再度整列させることにより行なった。ＰＥ
Ｂｉｇ−Ｄｙｅ（登録商標）ターミネーターおよび普遍的プライマー（Ｍ１３フォワードおよびリバース）用いてサイクル型配列決定反応を行ない、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ５０カラム上で浄化し、ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３７００キャピラリー電気泳動ＤＮＡ配列決定装置において製造業者の使用説明書に従って解析した。配列決定の読み値（８２１９）を５７６個のコンティグ（本明細書における配列番号：１〜５７６）に編集した。３倍配列決定の統計学的データ表２Ａに示す。アセンブリ１７の全特異的配列は１．７４Ｍｂである
【００８１】
【表２】
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続いて、ＮＴＨｉゲノムの８倍配列決定解析を行なった。８倍配列決定により、ＮＴＨｉゲノムを１１個のコンティグに編集した。コンティグ５、８、９、１０、１２〜１８を、本明細書において配列番号：６７５〜６８５として示す。８倍配列決定の統計学的データを表２Ｂに示す。
【００８２】
【表３】
2014147397.tif 000004
実施例２
コンティグの説明および所期遺伝子の発見
３倍配列解析で同定された≧５０００ｂｐ長さを有する８８個のコンティグのうち７５個は、ＢＬＡＳＴＮにより、インフルエンザＲｄ菌株の遺伝子と有意な類似性を示す。インフルエンザ８６−０２８ＮＰ菌株における遺伝子順序とインフルエンザＲｄ菌株との潜在的関連性を視覚化するため、８６−０２８ＮＰ  ３倍コンティグの組とＲｄ遺伝子の組を、ＢＬＡＳＴＮを用いて双方向で比較した。コンティグをＲｄ遺伝子ヒット遺伝子の座標に基づいて分類し、各コンティグを、Ｒａｙら，（Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  １７：１１０５−１２，２００１）に記載のとおりに見られる最小座標に固定（ａｎｃｈｏｒ）することにより、結果を遺伝子順序対コンティグの間隙（ｓｐａｃｅ）においてプロットした。このようにして比較し、完全に既知のゲノムと同一の遺伝子順序を有するゲノムの不完全なアセンブリにより、単調に増大する段階工程の形態が示され得る。
【００８３】
ＢＬＡＳＴＸを用い、Ｒｄ菌株のゲノム内の遺伝子ならびにインフルエンザＲｄ菌株に見られない遺伝子に対して相同性を有する配列のヒットを同定した。Ｒｄ菌株配列に対するヒットはデｓータセットから除外し、その他のヒットを表３Ａにまとめる。データは以下：コンティグ＃（配列番号：＃）、第１欄；各ヒットのＥスコア、第２欄；記載のコンティグのアミノ酸翻訳部分に対して相同性を有したタンパク質の名称、第３欄；該ホモログを産性する生物体、第４欄；第３欄に示したタンパク質の各々のＧｅｎｂａｎｋ確認用タンパク質、第５欄；コンティグ内の対応するヌクレオチド（配列番号：で示す）のように表示する。ほとんどの場合でいくつかのホモログが同定されたが、明確にするため、相同性の大きいタンパク質を表３Ａに示す。
【００８４】
表３Ａに示した一部の遺伝子の配列を、ＮＴＨｉゲノムの８倍配列決定において同定した。表３Ｂに、１１個のコンティグ内のこれらの遺伝子の位置、完全長オープンリーディングフレーム配列（配列番号：で特定）、オープンリーディングフレームにコードされる誘導アミノ酸配列、およびＢＬＡＳＴＸによって同定された高い相同性を有する遺伝子（表３Ａに記載）を示す。
【００８５】
ＮＴＨｉおよびＲｄ菌株における比較的短い範囲の遺伝子構成を調べるため、充分報告された２つの遺伝子クラスター内の遺伝子順序を比較した。まず、赤血球凝集性線毛（ＬＫＰ）遺伝子領域内に存在する遺伝子を調べた。（Ｍｈｌａｎｇａ−Ｍｕｔａｎｇａｄｕｒａら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８０（１７）：４６９３−７０３，１９９８）。線毛遺伝子クラスターは、ｐｕｒＥ遺伝子とｐｅｐＮ遺伝子の間に位置し、その断片のみを図１に示す。ｂ血清型の菌株であるＥａｇａｎは、ｈｉｆＡＢＣＤＥ遺伝子クラスターを含み、赤血球凝集性線毛を産生する。Ｒｄ菌株は、ｈｉｃＡＢ遺伝子ならびにｈｉｆＡＢＣＤＥ遺伝子クラスターを欠く。一般に、これまでに調査された分類不能型菌株は、ｈｉｃＡＢ遺伝子を含んでいたが、赤血球凝集性線毛をコードするｈｉｆ遺伝子は含んでいなかった。８６−０２８ＮＰ菌株の配列（本明細書に記載）は、この領域において、ＮＴＨｉ菌株Ｒ３００１の配列と同一である（図１）。ｒｆａＤ遺伝子は、内毒素の生合成に関与する酵素をコードする。また、ＮＴＨｉ  ２０１９菌株由来のｒｆａＤ遺伝子は、Ｎｉｃｈｏｌｓらによって特性評価された（Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ６５（４）：１３７７−８６，１９９７）。２０１９菌株において、ｒｆａＤ遺伝子は、内毒素生合成に関与する別の酵素をコードするｒｆａＦ遺伝子のすぐ上流に存在する。Ｒｄ菌株の遺伝子構成は異なる；ｒｆａＤ遺伝子とｒｆａＦ遺伝子は、ほぼ１１ｋｂの配列によって分断されている。調査されたほとんどの分類不能型菌株は、２０１９菌株に見られる遺伝子構成を含んでいた。対照的に、８６−０２８ＮＰ菌株は、Ｒｄ菌株に見られるものと同一の遺伝子構成を有する（図２）。
【００８６】
現在の（ｃｕｒｒｅｎｔ）アセンブリの大域解析により、遺伝子の含有量および順序は、Ｒｄ菌株のものと類似していることが示される。より詳細な解析によって、ＰａｓｔｅｕｒｅｌｌａｃｅａｅおよびＮＴＨｉ遺伝子の含有量と順序がＲｄ菌株に見られるものと異なる一部の領域では、これまでにわかっていない相当な数のＮＴＨｉ遺伝子が存在することが明らかになった。したがって、現在のデータにより、８６−０２８ＮＰ菌株ゲノムは、Ｒｄおよび非Ｒｄ様の特徴の複雑な寄せ集めを含むことが示される。
【００８７】
また、ＤＦＩストラテジーにより、遺伝子発現が増大された新規なＮＴＨｉ配列が同定された。他の生物体（主にグラム陰性細菌）ＯＲＦに対して相同性を有する遺伝子または遺伝子断片を含有するこのような新規なコンティグ配列の一覧を表３Ａに示す。例えば、コンティグ４４２（配列番号：４４２）のヌクレオチド配列であるヌクレオチド１４９８〜１８４５は、インフルエンザＲｄ菌株のリポタンパク質Ｂ（ＬｐｐＢ）のアミノ酸１〜１１６をコードする配列に対して高度に相同である。該遺伝子は、定常期生存遺伝子ｕｒＥと、最近同定され細菌リポタンパク質ＬｐｐＢ／ＮｌｐＤ（これは、ビルレンスと関連している）に対して高度に相同な４３ｋＤの抗原性外膜リポタンパク質をコードする遺伝子との間に位置する（Ｐａｄｍａｌａｙａｍら，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，６８：４９７２−４９７９，２０００）。最近、Ｚｈａｎｇおよび協働者らによって、ｎｌｐＤおよびｓｕｒＥ遺伝子発現は、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａにおいて細菌増殖の定常期に誘導されることが示された（Ｚｈａｎｇら，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｃａｍｂ），９：１０９５−１１０６，２００１）。したがって、中耳内のストレス誘導条件下では、このＮＴＨｉリポタンパク質が発現され得る。
【００８８】
【表４】
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【００８９】
【表５】
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【００９０】
【表６】
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【００９１】
【表７】
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【００９２】
【表８】
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【００９３】
【表９】
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【００９４】
【表１０】
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【００９５】
【表１１】
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【００９６】
【表１２】
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【００９７】
【表１３】
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【００９８】
【表１４】
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【００９９】
【表１５】
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【０１００】
【表１６】
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【０１０１】
【表１７】
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【０１０２】
【表１８】
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【０１０３】
【表１９】
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【０１０４】
【表２０】
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【０１０５】
【表２１】
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【０１０６】
【表２２】
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【０１０７】
【表２３】
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実施例３
ＮＴＨｉプロモータートラップライブラリーの構築
ＮＴＨｉの潜在的ビルレンス決定基を同定するため、ＮＴＨｉ誘導型中耳炎（ＯＭ）のチンチラモデルの特定の１つの解剖学的ニッチにおいて、疾患進行初期に、細菌の遺伝子発現をディファレンシャル蛍光誘導（ＤＦＩ）によってモニターした。ＮＴＨｉ８６−０２８ＮＰ菌株のゲノムＤＮＡ断片を、プロモータートラップライブラリーを用いてプロモーターなしのｇｆｐｍｕｔ３遺伝子の上流にクローニングした。プラスミドｐＧＺＲＳ３９Ａは、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅから単離されたｐＧＺＲＳ−１の誘導体であり、Ａ．ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ−大腸菌シャトルベクターである。このプラスミドは、Ａ．ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来の複製起点、ｐＵＣ１９由来のｌａｃＺａ遺伝子およびＴｎ９０３由来のカナマイシン耐性遺伝子を含む（Ｗｅｓｔら，Ｇｅｎｅｓ，１６０：８１−８６，１９９５）。
【０１０８】
プロモータートラップベクターは、ＧＴＰ変異型ｇｆｐｍｕｆｉ遺伝子をＢａｍＨＩからＥｃｏＲＩ方向の断片としてｐＧＺＲＳ−３９Ａ内にクローニングし、ｐＲＳＭ２１６７を形成することにより構築した。この変異型ＧＴＰ遺伝子は、２つのアミノ酸変化Ｓ６５ＧおよびＳ７２Ａを含み、これらにより、４８８ｎｍで励起すると蛍光発光が増強される。また、この変異型は、高可溶性および発色団形成の高反応速度論を有する（Ｃｏｒｍａｃｋら，Ｇｅｎｅ，１７３：３３−３８，１９９６）。このプラスミドで、エレクトロポレーションによってＮＴＨｉ８６−０２８ＮＰ菌株を形質転換し、親プラスミド８６−０２８ＮＰ菌株／ｐＲＳＭ２１６９を作製した。
【０１０９】
ランダムゲノムＤＮＡ断片（実施例１に記載）を調製し、プロモータープローブベクターン内にライゲーションした。８６−０２８ＮＰ菌株からゲノムＤＮＡを、Ｐｕｒｅｇｅｎｅ  ＤＮＡ単離キット（Ｇｅｎｔｒａ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を製造業者のプロトコルに従って用いて単離した。制限障壁のため、プラスミドＤＮＡを単離し、これをライブラリーの作製に用いることが必要であった。単離したＤＮＡは、Ｓａｕ３ＡＩ（ＮＥＢ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ；０．２５単位／μｇ  ＤＮＡ）で１時間３７℃にて部分消化し、ゲル電気泳動によって分離し、Ｑｉａｇｅｎゲル抽出キットを用いて０．５〜１．５ｋｂの大きさのＤＮＡ断片を回収した。ベクター作製のため、ｐＲＳＭ２１６７を一晩培養物から、Ｗｉｚａｒｄ  Ｐｌｕｓ  Ｍａｘｉｐｒｅｐ  ＤＮＡ精製系（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ）を製造業者のプロトコルに従ってを用いて単離した。
【０１１０】
プラスミドＤＮＡをＢａｍＨＩ消化によって線状化し、５’リン酸基を、ウシ腸アルカリホスファターゼ（ＣＩＡＰ；ＧｉｂｃｏＢＲＬ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）での処理によって除去した。ゲノムＤＮＡ断片を、この線状化ホスファターゼ処理ベクターを用いてライゲートし、改良プロトコル（Ｍｉｔｃｈｅｌｌら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９：３６２５−３６２８，１９９１）に従ってエレクトロポレーション用に作製したコンピテントＮＰ菌株内にエレクトロポレーションした。プラスミドＤＮＡをエレクトロポレーションしてＮＴＨｉ８６−０２８ＮＰ菌株内に戻すと、形質転換効率は１０００倍改善された。簡単には、細胞をＯＤ６０Ｏ＝０．３まで、ｓＢＨＩ（脳心臓浸出物）培養液中で３７℃、２２０ｒｐｍにて培養した。細胞を氷上で３０分間冷却し、続いて、等容量の０．５×ＳＧ（１×ＳＧ：１５％グリセロール、２７２ｍＭスクロース）で４℃にて洗浄した。洗浄を合計３回繰返した。続いて、細胞をＩ×ＳＧ中で１００×濃縮容量まで希釈した。ＢｉｏＲａｄ  Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  ＩＩセットを２００オーム、２．５ｋＶおよび２５μＦで用いて細胞をエレクトロポレーションし、次いで、１ｍｌの予備加温ｓＢＨＩ中で希釈し、３７℃、５％ＣＯ２で２時間インキュベートし、形質転換体の一晩培養のためのチョコレート寒天上にプレーティングした。
【０１１１】
形質転換体を選択し、１０００クローンのプール毎に、２０％グリセロール（ｖｏｌ／ｖｏｌ）を含有するスキムミルク中で凍結させた。６８，０００構成員のｇｆｐプロモータープローブライブラリーを作製した。ＣｌａｒｋｅおよびＣａｒｂｏｎ（Ｃｅｌｌ，９：９１−９９，１９７６）の確率計算を用い、８６−０２８ＮＰ菌株ＤＮＡ（１．８×１０６ｂｐ／ゲノム）の３００ｂｐ断片のライブラリー内に所与のＤＮＡ配列が提示される確率９９％を得るためには、２７，６２９個のクローンのライブラリーが必要であった。したがって、本発明のライブラリーは、８６−０２８ＮＰゲノムの２．５倍範囲を提示する。
【０１１２】
このライブラリーの質を評価するため、５０個のクローンを無作為に選択して一晩チョコレート寒天上で培養し、プラスミドを単離して挿入ＤＮＡを配列した。選択されたクローンの大部分（６４％）は、２００〜５００ｂｐの範囲の挿入物サイズを有したが、３２％は５００ｂｐを超えていた。この大部分の挿入物は、インフルエンザＲｄ菌株の特異的オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に対して相同性を示し、１５個のクローンは、８６−０２８ＮＰ菌株のＤＮＡに特有の配列を有した。Ｒｄ菌株に対して相同性を有するクローンのうち、６０％は正しい向きであり、その３６％は、ＯＲＦの上流に配列を含んでいた。大部分のクローンは、５００ｂｐ未満の挿入物サイズを有していたが、挿入物サイズが小さいこととＧＦＰ発現の増大との間に相関性は認められなかった。実際、４個のクローンは、インビトロで軽微から中程度の蛍光を示し、そのうち３個は、２００〜５００塩基対の挿入物サイズを有し、１個は７００塩基対より大きい挿入物を有した。
【０１１３】
ライブラリーの一部（ほぼ１０００個のクローン）をチョコレート寒天上で培養し、ＰＢＳ中に採取し、フローサイトメトリーによってＧＦＰ蛍光について解析した。挿入ＤＮＡのないプロモータートラップベクターを含む８６−０２８ＮＰ菌株／ｐＲＳＭ２１６９と比べ、該ライブラリークローンのプールは、蛍光強度の増大を示す。したがって、該ライブラリーは、種々の活性レベルのプロモーターを有するクローンを含む。
【０１１４】
実施例４
ＧＦＰを発現する８６−０２８ＮＰ誘導体の解析
ｇｆｐ発現菌を同定および分取するために必要なＦＡＣＳパラメータ確立するため、種々のレベルのｇｆｐ発現を示す一群の単離菌を用いた。８６−０２８ＮＰ菌株／ｐＲＳＭ２１６９（陰性対照）を用いてバックグラウンド蛍光を評価し、したがって、観察される任意の蛍光は、ｇｆｐ発現を誘導するｌａｃＺプロモーターによるものであり得る。しかしながら、この菌株は検出可能なレベルのＧＦＰを産生せず、実際、親８６−０２８ＮＰ菌株と比較した場合、蛍光の増大は示されない。高レベルｇｆｐ発現単離菌を、外膜タンパク質Ｐ２発現のための強力プロモーターを含有する５００ｂｐ断片を、ＳａｌＩ−ＢａｍＨＩ消化ｐＲＳＭ２１６７内にクローニングすることにより作製した。このプラスミドで、エレクトロポレーションにより８６−０２８ＮＰを形質転換し、高レベルｇｆｐ発現８６−０２８ＮＰ菌株／ｐＲＳＭ２２１１（高度に蛍光性の対照）を作製した。この菌株は、８６−０２８ＮＰ菌株／ｐＲＳＭ２１６９と比べて、ほぼ１００倍のＧＦＰ蛍光増加を示した。中間蛍光誘導体クローン８６−０２８ＮＰ／ｐＫＭＭ４Ｂ５（中間蛍光性の対照）は、ＦＡＣＳ解析によって単離し、予備実験において、および細胞分取ための対照としての両方に使用した。ｇｆｐ発現をインビトロで誘導するプロモーターを含有するＤＮＡ断片は、他の生物体のＤＮＡに対して既知の相同性を持たない８６−０２８ＮＰ菌株に特有である。このクローンは、８６−０２８ＮＰ菌株／ｐＲＳＭ２１６９と比べて、ほぼ１０倍の蛍光増加を示す。
【０１１５】
対照菌株を、チョコレート寒天上での培養から再懸濁させ、交差反応性Ｐｈｙｃｏｐｒｏｂｅ  Ｒ−ＰＥ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（１００μｌのＰＢＳ中１０μｇ／ｍｌ；Ｂｉｏｍｅｄａ  Ｃｏｒｐ）で３０分間４℃にて標識した。３回連続洗浄して未結合抗体を除去した後、ＦＡＣＳ解析のため、細菌を３００μｌのＤＰＢＳ中に再懸濁した。これらの対照調製物を用い、４８８ｎｍのアルゴンレーザー発光器を取り付けたＣｏｕｌｔｅｒ  Ｅｐｉｃｓ  Ｅｌｉｔｅフローサイトメーター（Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｃｏｒｐ．）を使用して、適切なサイズおよび蛍光ゲートを設定した。細菌は、ｌｏｇ前方角および側方散乱検出に基づいた大きさに関して、ならびに細菌のＦＩＴＣ／ＰＥ標識による分取に関してゲーティングさせた。分取細胞を定温ｓＢＨＩ中に回収し、チョコレート寒天上にプレーティングした。一晩培養後、細胞は、二次ラウンドの感染のために回収するか、または個々に選択し、一晩培養し、インビトロ培養したときの蛍光に関して個々のクローンによってスクリーニングし、２０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）グリセロールを含有するスキムミルク中で凍結させた後、プラスミドの単離および挿入ＤＮＡの配列決定を行なった。対照菌株の分取効率を、Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＥＰＩＣＳフローサイトメーター（Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｃｏｒｐ．）を用いて確認した。
【０１１６】
多くのプラスミドは、抗生物質選別の非存在下では、インビトロで速やかに分離した。したがって、ここで使用したプロモータートラップベクターにこの事象の傾向があるか否かを評価するため、８６−０２８ＮＰ菌株／ｐＲＳＭ２２１１（高度に蛍光性の対照）の単一のコロニーをチョコレート寒天上に単離し、抗生物質選別の非存在下で２０回継代した。抗生物質の存在下で培養した細菌と比較した場合、蛍光強度の有意な減少は観察されなかった。また、該プラスミドは、抗生物質選別の非存在下、インビボで維持される。チンチラから採取した細菌含有中耳液を、カナマイシン含有または無含有チョコレート寒天上にプレーティングした場合、同様の細菌の計数が観察された。これらのデータは、プロモータートラップベクターが、抗生物質選別の非存在下で安定に維持されたことを示す。
【０１１７】
プラスミドの安定性の問題に加え、宿主−病原体相互作用を試験するためのレポーターとしてのＧＦＰの使用に関する初期の研究により、ＧＦＰは、低毒性を有する細胞質タンパク質として継続的に合成され得、細菌の細胞表面動力学に対する影響は最小限であることが示された（Ｃｈａｌｆｉｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６３：８０２−８０５，１９９４）。高レベルｇｆｐ発現性誘導体の構築により、ＮＴＨｉに対するＧＦＰ毒性の評価が可能となった。野生型菌株（８６−０２８ＮＰ）と高ＧＦＰ産生８６−０２８ＮＰ菌株／ｐＲＳＭ２２１１両方の増殖曲線を、同様の条件下で培養した場合で比較した。増殖速度は同様であり、ＧＦＰ発現は該細胞に対して毒性でなかったことを示す。
【０１１８】
８６−０２８ＮＰ  ｇｆｐ発現性誘導体を用い、効率的な細胞分取のためのパラメータを規定した。８６−０２８ＮＰ菌株／ｐＲＳＭ２１６９を、中間ｇｆｐ発現性誘導体である８６−０２８ＮＰ菌株／ｐＫＭＭ４Ｂ５と、１００：１の比で混合し、全細菌集団と比べて少量割合のｇｆｐ発現クローンを含むことが予測されるインビボ環境をシミュレーションした。この混合物をＦＡＣＳ解析に供し、１．８％の最大蛍光集団および５２％の最小蛍光集団が回収された。分取された集団のフローサイトメトリー解析により、細菌集団の６５％に８６−０２８ＮＰ菌株／ｐＫＭＭ４Ｂ５の富化が示され、これは、陰性集団において分取した場合では観察されなかった現象である。後続の分取ラウンドでは、この中間蛍光集団がさらに富化されることが予測され得る。陰性分取において蛍光細菌の量が減少し得ないことは、陰性分取のために設定されたゲートの大きさのためであった。ＧＦＰ陰性細胞は、１０％の最小蛍光集団においてゲーティングすることにより富化された。
【０１１９】
実施例５
中耳液からの細菌の直接標識
同様のストラテジー（実施例５に記載）を、ＡＯＭ時にチンチラの中耳から採取した滲出液からの蛍光クローンの分取に適用した。本発明者らがディファレンシャル蛍光誘導（ＤＦＩ）をインビボで使用可能であることは、本発明者らがｇｆｐ発現菌を分取を、非蛍光細菌、蛍光および非蛍光細胞性残屑ならびに真核生物細胞からできる能力に依存した。
【０１２０】
耳鏡検査またはティンパノメトリのいずれかで中耳感染の徴候のない健常な成体チンチラ（Ｃｈｉｎｃｈｉｌｌａ  ｌａｎｉｇｅｒａ）を用い、ライブラリーを、インビボでのプロモーター活性についてスクリーニングした。ＮＴＨｉ／ｐＲＳＭ２１６９  ライブラリーの２つのプール（各々１０００個のクローン）を一晩、カナマイシンを含有するチョコレート寒天上で培養した。ライブラリーを合わせ、低温の１０ｍＭ滅菌ＰＢＳ中で３．３×１０６ＣＦＵ／ｍｌまで希釈し、３００μｌ（１．０×１０６ＣＦＵ；５００ＣＦＵ／クローン）を用いて、左および右のチンチラの経水疱腔（ｔｒａｎｓｂｕｌｌａｒ  ｃａｖｉｔｙ）に接種した（２０００クローン／耳）。ＯＭ発症を、ビデオ耳鏡検査およびティンパノメトリによって２４時間および４８時間の時点でモニターした。細菌は中耳腔内で増殖し、予測どおり、４８時間までに、イノキュラム用量の５００倍の濃度に達した（Ｂａｋａｌｅｔｚら，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ６７：２７４６−６２，１９９９）。この細菌の宿主環境への適応により炎症性応答がもたらされ、これは、紅斑、鼓膜の血管拡張および腫脹、多核白血球（ＰＭＮ）の浸潤、ならびに採取した滲出液の耳鏡検査および顕微鏡検査によって観察される中耳腔内への液の蓄積によって示される。２４時間および４８時間後、鼓室のタッピングによって中耳液を採取し、ＦＡＣＳ用に調製した。
【０１２１】
この解析を、中耳液内で採取され得る細菌に限定したことに注目することは重要である。場合によっては、ＦＡＣＳ解析用の細菌を採取するために、中耳腔を洗浄することが必要であった。したがって、この解析には、ＮＴＨｉが粘膜にゆるく結合すると上方調節される遺伝子が含まれる。ＮＴＨｉは、ＯＭのチンチラモデルの中耳腔内でバイオフィルムを形成することが観察されている（Ｅｒｈｌｉｃｈら，ＪＡＭＡ，２８７：１７１０−５，２００２）。本明細書に記載のプロトコルでは、プランクトン様集団から採取されるクローンを選択するため、該細菌が粘膜のバイオフィルムと結合すると遺伝子が上方調節されるクローンが採取されることは期待されない。しかしながら、中耳粘膜のホモジネーション、続いて細菌細胞の単離を行ない、本発明者らによって、このようなクローンの採取が可能となり得る。また、一部のＧＦＰ発現クローンは、滲出液において採取されるが、滲出液中に剥離細胞として、または凝集して存在する真核生物細胞に接着していることが考えられる。このような細菌は、分取効率を損なうことなく滲出液から採取するのは困難である。したがって、中耳液を粘液溶解剤で処理し、次いで遠心分離して大きな集塊および真核生物細胞を除去した後、標識した。
【０１２２】
チンチラの中耳液は、必要な場合には、滅菌生理食塩水で２５０μｌまで希釈した。等容量のＮ−アセチル−Ｌ−システイン（０．５％；ｗ／ｖ）含有ＤＰＢＳ（ｐＨ７．４）を、粘液溶解剤として室温で５分間添加した（ＭｉｙａｍｏｔｏおよびＢａｋａｌｅｔｚ，Ｍｉｃｒｏｂ．Ｐａｔｈｏｇ．，２１：３４３−３５６  １９９６）。液体を遠心分離し（３００×ｇ、５分間）、細胞性残屑、赤血球および炎症性細胞を除去した。細菌を含む上清みを新たなチューブに移した。細菌を、ＮＴＨｉ  ８６−０２８ＮＰ菌株由来の完全ＯＭＰ調製物に対して指向されたチンチラ抗血清（１：５０希釈度）とともに、４５分間４℃にてインキュベートし、遠心分離（２０００×ｇ、５分間）によってペレット化し、０．０５％ウシ血清アルブミンを含有する冷ＤＰＢＳで２回洗浄した。続いて、細菌を交差反応性フィコプローブ（ｐｈｙｃｏｐｒｏｂｅ）Ｒ−ＰＥ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（１００μｌのＰＢＳ中１０μｇ／ｍｌ；Ｂｉｏｍｅｄａ  Ｃｏｒｐ）で、３０分間４℃にて標識した。３回連続洗浄して未結合抗体を除去した後、ＦＡＣＳ解析のため、細胞を３００μｌのＤＰＢＳ中に再懸濁した。
【０１２３】
実施例６
急性中耳炎においてインビボで誘導されるプロモーターの同定
プロモータートラップライブラリーで形質転換したインフルエンザ菌８６−０２８ＮＰを一晩、チョコレート寒天上で培養した。インビトロでｇｆｐを発現させたプロモーターを含むクローンを選択するため、ライブラリーを１回のＦＡＣＳ解析（実施例６に記載のもの）に供し、低レベル量のＧＦＰを発現するクローンのみを採取した。このクローンをプールし、チンチラの中耳に経水疱的に接種するために使用した。感染の２４時間および４８時間後、細菌を含む滲出液を鼓室のタッピングによって取り出した。細菌をＲ−ＰＥ標識抗体で間接的に標識し、蛍光タグ化細菌をゲーティングさせるが、同時に発現しているものは分取することによるＦＡＣＳ解析に供した。このクローンを用い、さらなる富化のために動物を再感染させた。最終回の分取後、単一のコロニー単離菌を、蛍光の消失についてインビトロでスクリーニングした。
【０１２４】
ＦＡＣＳ解析によって単離されたクローン（インビボでＧＦＰ蛍光に対して陽性）（これは、インビトロでは蛍光を発しなかった）を、プラスミドの単離および挿入ＤＮＡ配列の同定のために調製した。このクローンを一晩、カナマイシンを含有するチョコレート寒天プレート上で培養し、Ｑｉａｐｒｅｐ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を製造業者のプロトコルに従って用い、プラスミドの単離のために調製した。プラスミド挿入ＤＮＡは、ｇｆｐｍｕｔ３遺伝子に相補的であり該挿入ＤＮＡの下流にあるプライマー５’−ＴＧＣＣＣＡＴＴＡＡＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＴＡ−３’（配列番号：５８８）を用いて配列決定した。配列決定反応は、ＡＢＩ  ｐｒｉｓｍ  ＢｉｇＤｙｅ（登録商標）ターミネーターサイクル型配列決定既製反応キット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を製造業者のプロトコルに従って使用し、Ｇｅｎｅ  Ａｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ
９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）用いて行なった。次いで、該配列を、９６ウェルマルチスクリーンＨＶプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）内のセファデックスＧ−５０に通すことによって精製し、続いて、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３１００  ＤＮＡ解析装置（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）にて解析した。
【０１２５】
挿入配列を、インフルエンザＲｄ菌株の完全にアノテートされた配列と比較した。Ｒｄ菌株に対してヌクレオチド相同性をもたない挿入物を、続いて、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＸアルゴリズムを用いて解析した。ＤＮＡＳＴＡＲ（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｅ）を用い、さらなる配列解析を行なった。正しい向きであり推定ＯＲＦの５’側に配列を含む挿入配列は、ＮＴＨｉ菌がチンチラの中耳内に存在すると優先的に活性となる推定プロモーターを含んでいた。
【０１２６】
インビボで調節される推定プロモーターを有する５２個のクローンを単離した。インフルエンザＲｄ菌株で同定されたものと同様の配列を含む４４個の候補クローンのうち、２６個の遺伝子（６０％）について、インビトロおよびインビボでの遺伝子発現の定量的比較により、ＮＴＨｉがチンチラの中耳内に存在する環境的なきっかけに応答すると、上方調節された遺伝子発現が確認され、このような遺伝子を以下の表４Ａにまとめる。遺伝子の発現を駆動するインビボ調節プロモーターは、膜輸送、環境情報的プロセッシング、細胞性代謝、遺伝子調節ならびに未知機能を有する仮想タンパク質に関与すると推定される。
【０１２７】
推定プロモーター候補のインビボでの誘導を確認するため、ＮＴＨｉ  ８６−０２８ＮＰ菌株を、対数増殖期中期までインビトロで、またはインビボで４８時間培養した場合のメッセンジャーＲＮＡの発現の相対量を比較した。ＴＲＩｚｏｌ  ＬＳ試薬（Ｇｉｂｃｏ
Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を製造業者のプロトコルに従って用い、ＲＮＡを単離した。ＤＮＡをＲＮＡ調製物から、ＤＮＡ遊離キット（Ａｍｂｉｏｎ）を製造業者のプロトコルに従ってを用いて取り出した。ＤＮアーゼＩ処理ＲＮＡ試料をＱｉａｇｅｎ
ＲＮｅａｓｙカラムに通すことによって精製した。ＲＮＡの純度および完全性を、それぞれ、２６０／２８０ｎｍでの分光測光装置の読み値によって、およびＡｇｉｌｅｎｔ  ２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）において評価した。
【０１２８】
該ＦＡＣＳデータを独立して確認するため、本発明者らは、候補遺伝子の相対発現を定量的ＲＴ−ＰＣＲによって調べた。親８６−０２８ＮＰ菌株を本試験に使用した。１工程ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＲＴ−ＰＣＲキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いるリアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲにより、製造業者の使用説明書に従って転写レベルを評価した。簡単には、ＦＡＣＳ解析で同定された推定インビボ誘導プロモーターの下流のオープンリーディングフレームに対して作製されたプライマーを用い、遺伝子特異的ｍＲＮＡを逆転写し、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７７００配列検出系（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）にてＲＴ−ＰＣＲによって増幅した。ジャイレース（ｇｙｒ）の遺伝子断片を増幅することにより既知量の細菌ゲノムＤＮＡ（１０２〜１０７ゲノムコピーＤＮＡ）に対して作成した標準曲線を用い、産物の量を算出した。ＲＮＡ調製物中のＤＮＡの非存在（−ＲＴ対照）、ならびに鋳型ＲＮＡを含まない対照試料中のプライマー二量体の非存在を確認するための対照を並行して解析した。また、ＲＴ−ＰＣＲ産物をゲル電気泳動によって解析し、すべての場合で、適切な塩基対サイズの単一の産物が観察された。試料間の細菌ＲＮＡの量を、ｇｙｒ発現（本発明者らがインビトロで試験した種々の培養条件下で構成的に発現されることが示された）に対して標準化した。既知量の細菌ゲノムＤＮＡ（１０２〜１０７ゲノムコピーＤＮＡ）を用い、ジャイレース（ｇｙｒ）の遺伝子断片を増幅させることによりＲＴ−ＰＣＲ定量の標準曲線を作成した。ジャイレースは、種々の培養条件下にてインビトロで構成的に発現され、したがって、試料間の全細菌ＲＮＡレベルを標準化するために使用した。インビボでの相対遺伝子発現を、インビトロでの遺伝子発現のものと比較し、増加倍数で示したデータを表４Ａにまとめる。
【０１２９】
ＮＴＨｉゲノムの８倍配列決定により、表４Ａに示す遺伝子のほとんどの完全長オープンリーディングフレームが同定された。表４Ｂには、ＮＴＨｉゲノム内の完全長ヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列を示す。便宜上、表４Ｂには、チンチラの中耳に存在する環境的なきっかけによる遺伝子の誘導倍率ならびに該遺伝子の産物および機能を繰り返し記載する。
【０１３０】
【表２４】
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【０１３１】
【表２５】
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【０１３２】
【表２６】
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実施例７
ビルレンス関連遺伝子の同定
多くの細菌種において、ビルレンス関連遺伝子のサブセットは、短い反復配列の複製エラーによって調節される。このような反復配列は、遺伝子の５’側またはコード配列内に存在し得、その存在は該遺伝子の発現制御の表示であり、ビルレンスとの関連性を示す。反復配列の付加または欠失により、特定のビルレンス決定基の発現または発現の欠損がもたらされる。
【０１３３】
ＮＴＨｉインフルエンザ８６−０２８ＮＰ菌株のコンティグの組は、短いオリゴヌクレオチド反復配列についてクエリーを行なった。該反復配列の周囲領域を解析し、該反復配列と関連する遺伝子（１つまたは複数）を同定した。表５に、同定された反復配列および各反復配列と関連するＯＲＦ（ＢＬＡＳＴによって同定）を示す。
【０１３４】
さらなる配列解析によって、ビルレンス関連遺伝子の完全長ヌクレオチド配列およびそのＯＲＦにコードされる対応アミノ酸配列が同定された。誘導されたアミノ酸配列は、記載のＧｅｎｂａｎｋ配列に対して高度に相同性である。
【０１３５】
【表２７】
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【０１３６】
【表２８】
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実施例８
ＮＴＨｉ特異的遺伝子配列の同定
ＮＴＨｉビルレンスと関連する遺伝子もまた、ＮＴＨｉ菌を組織に感染させた場合の遺伝子の発現レベルと、ＮＴＨｉを人工研究用培地上で培養した場合の同じ遺伝子の発現レベルを比較することにより同定された。これらの新規な遺伝子は、実施例４〜６で上記のプロモータートラップ手法を用いて同定され、続いて、既知のＲｄゲノムと比較すると、これらの遺伝子はＮＴＨｉ  ８６−０２８ＮＰ菌株に特有であることが示された。
【０１３７】
このスクリーニング手順を用いて同定されたＤＮＡ配列を配列番号：５７７〜５８０として示す。これらの配列は、インフルエンザ菌Ｒｄゲノム配列におけるホモログを有する遺伝子または遺伝子断片を含んでいなかった。これらは、チンチラの中耳内でのＮＴＨｉ感染時の発現レベルから、完全に新規な配列ではないが、おそらく、これらの遺伝子の発現は、ＮＴＨｉビルレンスに関与している。
【０１３８】
実施例９
ＮＴＨｉ  ８６−０２８ＮＰ菌株の完全な配列解析
ライブラリーの構築：８６−０２８ＮＰ菌株から、Ｐｕｒｅｇｅｎｅ試薬（Ｇｅｎｔｒａ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を用いて染色体ＤＮＡを調製した。このゲノムの最初のショットガン配列決定のため、ゲノムＤＮＡの１〜２ｋｂおよび２〜４ｋｂのライブラリーをｐＵＣ１８において、既報のとおりにして構築した（Ｍｕｎｓｏｎら，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ７２：３００２−１０，２００４）。骨格形成用（ｓｃａｆｆｏｌｄｉｎｇ）ライブラリーでは、ゲノムＤＮＡを平均断片サイズ４０ｋｂに、Ｈａｍｉｌｔｏｎシリンジを用いて手作業で切断した。末端修復後、０．７％低融点アガロースゲルを用いて、断片を分画した。３０ｋｂより大きい断片を切り出し、ｐＥｐｉＦＯＳ−５へのゲル内ライゲーションを行なった。ゲルから回収したライゲーション混合物をλファージ内にインビトロでパッケージングし、ＥＰＩ１００細胞（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のトランスフェクションのために使用した。
。
【０１３９】
配列決定：配列決定のショットガン部分では、前述のＰＥ  Ｂｉｇ−Ｄｙｅ（登録商標）ターミネーターおよび普遍的プライマー（Ｍ１３フォワードおよびリバース）を用い、サイクル型配列決定反応を実施した（Ｍｕｎｓｏｎら，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ７２：３００２−１０，２００４）。骨格形成用ライブラリーの末端を配列決定するため、プラスミドを、まず、Ｒ．Ｅ．Ａ．Ｌ．Ｐｒｅｐ  ９６  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ  Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて精製し、次いで、ＴｅｍｐｌｉＰｈｉ（登録商標）ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いて増幅した後、ＰＥ  Ｂｉｇ−Ｄｙｅ（登録商標）ターミネーターならびにｐＥｐｉＦＯＳ−５フォワードおよびリバース配列決定用プライマー（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて反応を実施した。該プロジェクトの浄化（ｃｌｅａｎ−ｕｐ）部分のための反応は、ＰＥ  Ｂｉｇ−Ｄｙｅ（登録商標）ターミネーターおよびカスタムプライマー（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）を用いて実施した。過剰の色素ターミネーターをＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ５０カラムで９６ウェル形式にて除去し、ＡＢＩ  ３７００またはＡＢＩ  ３１００キャピラリー電気泳動ＤＮＡ配列決定装置（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）のいずれかにて配列を決定した。
【０１４０】
ゲノム閉鎖：骨格形成用ライブラリーおよびＰＣＲ由来の対の末端配列を用いて、コンティグを順に並べ、配列が少ない範囲の領域に配列を付加した。対のカスタムプライマー（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）は、各コンティグならびに配列が少ない範囲の領域に隣接する領域の両端に結合するように設計した。介在領域は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第３版）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ．，２００１に記載の標準的なＰＣＲプロトコルにより、Ｔａｑポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を用いて増幅し、両方の鎖を配列決定した。骨格形成用ライブラリー由来のクローンを鋳型として用い、リボソームのＲＮＡオペロンおよびＨＭＷ遺伝子クラスターを完全に配列決定した。
【０１４１】
編集：Ｐｈｒｅｄ／Ｐｈｒａｐをデータ編集に使用し、Ｍｕｎｓｏｎら，Ｉｎｆｅｃｔ
Ｉｍｍｕｎ  ７２：３００２−１０，２００４に記載のデフォルト編集パラメータを用いた（Ｅｗｉｎｇら，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ  ８：１８６−９４，１９９８；Ｅｗｉｎｇら，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ  ８：１７５−８５，１９８８；Ｇｏｒｄｏｎら，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ  ８：１９５−２０２，１９９８）。５０７個のクローン由来の対の末端配列データを用い、ＤＮＡＳＴＡＲ  総合ソフトウェアＳｅｑｍａｎ  ＩＩプログラムを使用して編集データを確認した。
【０１４２】
データ解析：Ｇｌｉｍｍｅｒ２長ｏｒｆプログラム（Ｄｅｌｃｈｅｒら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２７：４６３６−４１，１９９９）によって同定された１１７８個の最長ＯＲＦの組に対して調整されたＧｌｉｍｍｅｒ２（ｖ２．１３）を用いてコード領域を同定した。Ｇｌｉｍｍｅｒ  ＯＲＦの組を、Ｒｄ菌株プロテオーム、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベース、ＮＣＢＩ  ＣＯＧデータベースおよびＫｌＥＧＧデータベースに対して検索することにより、類似性による自動アノテーションを行なった。Ｒｄ菌株データベースを８６−０２８ＮＰ菌株ＯＲＦの組と、トリクロス（ｔｒｉｃｒｏｓｓ）を用いて双方向で比較し、類似性の高信頼度領域を決定し、ゲノム組織のドットプロット比較を得た（Ｒａｙら，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  １７：１１０５−１２，２００１）。
【０１４３】
自動的に推定されたアノテーション情報を、Ａｒｔｅｍｉｓ（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚら，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ７１：１６３５−４２，２００３）を用いてマニュアルでさらに操作（ｃｕｒａｔｅ）して目的のゲノム領域を視覚化および境界画定し、カスタムＦｉｌｅＭａｋｅｒ  Ｐｒｏデータベースを作成し、次いで、これをマニュアル改定の適用および機能の割当てに関連するデータの取得に使用した。主な自動比較にはＦＡＳＴＡ解析を使用した。８０−０２８ＮＰ菌株のゲノムとＲｄ菌株のゲノム間の強いシンテニーにより、大部分の遺伝子機能の自動的な割当てが可能であり、マッチングでは、アミノ酸レベルで９０％以上の類似性を有していた。Ｒｄ菌株のゲノムに対してほぼ１対１の８６−０２８ＮＰ菌株ゲノムのマッピングが、Ｒｄ菌株ＯＲＦの８６−０２８ＮＰ菌株ゲノム配列上へのアセンブリおよび８６−０２８ＮＰ菌株ＯＲＦのＲｄゲノム上への逆アセンブリ（ＳｅｑＭａｎプログラムをヌクレオチドレベルで８０％同一性のアセンブリ基準で使用）によって確認された。
【０１４４】
マニュアルＢＬＡＳＴ解析を用い、既知遺伝子に対して強い類似性を示さなかったＯＲＦの潜在的機能を調査した。自動割当てのマニュアル操作は、アノテーションが現在の文献に従うように行ない、自動化アルゴリズムが誤りをもたらし易いいくつかの位置（特に、ＨＭＷ遺伝子クラスター、ヘモグロビン結合タンパク質およびｈｓｄ遺伝子クラスター、その高いファミリー類似性により自動割当てが混同される）を修復した。
【０１４５】
ｔＲＮＡ遺伝子をｔＲＮＡｓｃａｎ−ＳＥ  ｖｌ．１１（Ｌｏｗｅら，Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２５：９５５−６４，１９９７）によって同定した。ｒＲＮＡオペロンをＲｄ菌株との１６、２３および５Ｓ  ｒＲＮＡ類似性、ならびにこれらの遺伝子を含む隣接部のＣＬＵＳＴＡＬＷアラインメントに基づいて同定し、半保存領域の境界を決定した。
【０１４６】
インフルエンザ菌（ｉｎｆｌｕｅｎｎｚａｅ）８６−０２８ＮＰ菌株の完全なゲノムＤＮＡ配列を、配列番号：７７２として示す。該ゲノムＤＮＡ内のオープンリーディングフレームを配列番号：７７３〜２５９３として示し、表６に示す。得られる遺伝子産物を配列番号：２５８１〜４４１４として示し、表７に示す。オープンリーディングフレームのヌクレオチドの前に示す「ｃ」は、オープンリーディングフレームが配列番号：７２２として示す配列の５’−３’配列に相補的であることを示す。表６において、ＮＴＨｉ特異的遺伝子に印を付けている。このゲノム配列は、ＧｅｎＢａｎｋから受託番号ＣＰ００００５７（これは、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）として入手可能である。
【０１４７】
下記のオープンリーディングフレーム：配列番号：８２２（ｋｄｇＫ）、配列番号：９２８、配列番号：９９４（ｂｏｌＡ）、配列番号：２７６（ａｄｈＣ）配列番号：１１０２（ｄｕｓＣ）、配列番号：１１２１（ｍｅｒＰ）、配列番号：１１３５、配列番号：１２３６、配列番号：１２５４、配列番号：１３７６（ｌｉｃ２Ｃ）、配列番号：１４３１（ｈｇｐＤ）、配列番号：１５０２、配列番号：１５０５（ｐｐｘ）、配列番号：１５２３（ｈｇｐＣ）、配列番号：１５８５（ｌｅｘ２Ａ）、配列番号：１６３７配列番号：１７１３、配列番号：１８５６（ｍｏｄ）、配列番号：１８９９、配列番号：２００６、配列番号：２０８０、配列番号：２１５５、配列番号：２２０２、配列番号：２２５７、配列番号：２３３１、配列番号：２３４５、配列番号：２３６５、配列番号：２５５５（ｍｅｔＥ）および配列番号：２５６３（ｐｍｉ）は、これらのヌクレオチド配列がその配列内にフレームシフトまたは終止コドンを含むため、表６において偽遺伝子と規定している。ｈｇｐＤ、ｈｇｐＣ、ｌｅｘ２ＡおよびＮＴＨＩ１７６９遺伝子は、リーディングフレーム内外への配列シフトを引き起こす偶発性（ｃｏｎｔｉｎｇｅｎｃｙ）反復配列を含み、生じるアミノ酸配列（配列番号：３２４２、３３３２および４１４２）は部分翻訳物である。このような偶発性反復配列により、インフルエンザ菌において遺伝子発現が調節され、したがって、このようなタンパク質をコードする遺伝子は、１つ以上の反復配列の挿入または欠失後、正確に翻訳される。
【０１４８】
【表２９】
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【０１４９】
【表３０】
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【０１５０】
【表３１】
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【０１５１】
【表３２】
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【０１５２】
【表３３】
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【０１５３】
【表３４】
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【０１５４】
【表３５】
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【０１５５】
【表３６】
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【０１５６】
【表３７】
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【０１５７】
【表３８】
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【０１５８】
【表３９】
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【０１５９】
【表４０】
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【０１６０】
【表４１】
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【０１６１】
【表４２】
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【０１６２】
【表４３】
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【０１６３】
【表４４】
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【０１６４】
【表４５】
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【０１６５】
【表４６】
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【０１６６】
【表４７】
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【０１６７】
【表４８】
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【０１６８】
【表４９】
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【０１６９】
【表５０】
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【０１７０】
【表５１】
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【０１７１】
【表５２】
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【０１７２】
【表５３】
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【０１７３】
【表５４】
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【０１７４】
【表５５】
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【０１７５】
【表５６】
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【表５７】
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【表５９】
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【０１７９】
【表６０】
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【０１８０】
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【表６４】
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【表７０】
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【０１９０】
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【表７８】
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【表７９】
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【０１９９】
【表８０】
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【０２００】
【表８１】
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【０２０１】
【表８２】
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【０２０２】
【表８３】
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【０２０３】
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【０２０４】
【表８５】
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【０２０６】
【表８７】
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【０２０７】
【表８８】
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【０２０８】
【表８９】
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【０２０９】
【表９０】
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【表９１】
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【表９２】
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【０２１３】
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【０２１４】
【表９５】
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【０２１５】
【表９６】
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【０２１６】
【表９７】
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【０２１７】
【表９８】
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【０２１８】
【表９９】
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【０２１９】
【表１００】
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【０２２０】
【表１０１】
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【０２２１】
【表１０２】
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【０２２２】
【表１０３】
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【０２２３】
【表１０４】
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【０２２４】
【表１０５】
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【０２２５】
【表１０６】
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【０２２６】
【表１０７】
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【０２２７】
【表１０８】
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【０２２８】
【表１０９】
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【０２２９】
【表１１０】
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実施例１０
ＮＴＨｉ、８６−０２８ＮＰ菌株およびインフルエンザＲｄ菌株のゲノムの比較
８６−０２８ＮＰ菌株のゲノム配列は、１，９１３，４２８ｂｐを含む。これは、Ｒｄ菌株のゲノム（１，８３０，１３７ｂｐ）（Ｆｌｅｉｓｃｈｍａｎｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ
２６９：４９６−５１２，１９９５）よりほぼ４パーセント大きい。また、多数の遺伝子が８６−０２８ＮＰ菌株に存在する（Ｒｄ菌株で１７４３に対して１９４２）。該遺伝子の相補性を、ＤＮＡＳＴＡＲ総合ソフトウェアのＳｅｑｍａｎプログラムを用いてＲｄ菌株のものと比較した。排除値としてヌクレオチドレベルで８０％同一性では、Ｒｄ菌株のゲノムには存在しない２８５個のＯＲＦが８６−０２８ＮＰゲノムにおいて同定され、８６−０２８ＮＰ菌株ゲノムには存在しない１６７個のＯＲＦがＲｄ菌株のゲノムにおいて同定された。
【０２３０】
８６−０２８ＮＰ菌株は、Ｒｄ菌株と同様、６個のリボソームオペロンを有する。ｔＲＮＡｓｃａｎ−ＳＥ  ｖｌ．１１を用い、２０個の共通アミノ酸を表す５８個のｔＲＮＡ遺伝子が８６−０２８ＮＰ菌株ゲノムにおいて同定された。ｔＲＮＡ−Ｇｌｕ、ｔＲＮＡ−ＡｌａおよびｔＲＮＡ−Ｉｌｅ遺伝子は、１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子と２３ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の間のスペーサー領域内に位置した。ＵＣＡアンチコドンを含むｔＲＮＡ遺伝子もまた同定された。このアンチコドンはオパール終止コドンに相当し、典型的には、セレノシステインを組み込むオパール抑制ｔＲＮＡと関連している。ｔＲＮＡは、Ｓｅｃ  ｔＲＮＡ特異的伸長因子であるｓｅｌＢ（ＮＴＨＩ０８３６）と、セレンの組込みによってセレノシステインを形成する予備としてセリンをデヒドロアラニンに変換させる酵素であるｓｅｌＡ（ＮＴＨＩ０８３５）をコードする２つの遺伝子と隣接している（Ｆｏｒｃｈｈａｍｍｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：４５３−６，１９８９）。セレノホスフェートシンテターゼをコードするｓｅｌＤ遺伝子（ＮＴＨＩ０２９７）もまた同定された。このセレノシステイン系の重要性は、おそらくセレノシステインコドンとして読まれるインフレームＴＧＡ終止コドンを含むギ酸デヒドロゲナーゼのαサブユニットのコード配列（ＮＴＨＩ０００７）によって証明される。インフレームＴＧＡ終止コドンは、Ｒｄ菌株のギ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ＧｅｎＰｅｐｔ受託番号Ｐ４６４４８）の現在のアノテーションにおいて既に記載されて注釈されている。  
【０２３１】
８６−０２８ＮＰ菌株とＲｄ菌株の遺伝子順序の解析に関与するゲノム間の全体比較により、大きな逆位の形態の単一の大きな再編成が示されている。この４７１ｋｂの逆位は、８６−０２８ＮＰ菌株ゲノムのほぼ２５％を表し、ＮＴＨＩ１３９１およびＮＴＨＩ１３９４（それぞれＨＩ１２１８およびＨＩ１６４５のホモログ）またはＮＴＨＩ１９４９およびＮＴＨＩ１９５０（それぞれＨＩ１２１９およびＨＩ１６４７のホモログ）で境界されている。ＨＩ１２１９およびＨＩ１６４６は、Ｒｄ菌株において一部重複した遺伝子であり、ｃｍｋＡおよびｃｍｋＢとアノテートされている（シチジレートキナーゼ）。１つのｃｍｋ遺伝子（ＮＴＨＩ１９４９）が、８６−０２８ＮＰ菌株内にｃｍｋ様小断片とともに、ＮＴＨＩ１３９１とＮＴＨＩ１３９４の間に存在する。骨格形成用ライブラリー由来のいくつかのクローンは、８６−０２８ＮＰゲノム内で該逆位の各末端が重複しており、本発明者らのアセンブリが認証される。この大きな逆位内には、いくつかの挿入部があり、その最大のものはほぼ１３ｋｂ、２７ｋｂおよび５１ｋｂの大きさである。これらの領域は、主に仮想遺伝子および仮想保存遺伝子ならびにファージ遺伝子のいくつかのホモログを含む。例えば、２７ｋｂ挿入部は、ＨＰ１−およびＨＰ２様ファージ遺伝子の残部を含む。最大挿入部は、インテグラーゼ遺伝子のホモログと境界されている。Ｒｄ菌株では、ｍｕ様ファージがこの領域に局在している（Ｍｏｒｇａｎら，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３１７：３３７−５９，２００２）。このファージは、８６−０２８ＮＰ菌株ゲノムには存在しない。また、この大きな逆位領域内には、Ｒｄゲノムとのシンテニーを回復させる２１ｋｂ逆位が存在する。
【０２３２】
この大きな逆位に加え、８６−０２８ＮＰ菌株は、Ｒｄ菌株のゲノムとの共線形成（ｃｏ−ｌｉｎｅａｒｉｔｙ）と相違する他の領域を有する。これらには、Ｒｄ菌株に存在するＤＮＡとの明白な相同性もたない配列を含む５ｋｂより大きい９つの領域が含まれる。これらの領域のうち２つは、後述するＨＭＷ付着因子を含む。仮想遺伝子は、該特異的領域のうち６つで優位を占める。第９番目の領域はほぼ５６ｋｂの大きさである。これは、ＮＴＨＩ０１００とＮＴＨＩ０１６５の間に存在する。ＢＬＡＳＴｎ解析により、ＩＣＥＨｉｎ８６−０２８ＮＰと表示するこの領域内の遺伝子は、ｂ型インフルエンザ菌プラスミド内の遺伝子ＩＣＥＨｉｎ１０５６（Ｍｏｈｄ−Ｚａｉｎら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ
１８６：８１１４−２２，２００４）に対して高い相同性を有することが示された。ＩＣＥＨｉｎ１０５６は、一連の共通コア遺伝子によって規定されるゲノムアイランドの拡張ファミリーの一構成員である（Ｍｏｈｄ−Ｚａｉｎら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １８６：８１１４−２２，２００４）。ＩＣＥＨｉｎ８６−０２８ＮＰは、４５個のＩＣＥＨｍ  １０５６  ＯＲＦのホモログを有する。これらには、主に、プラスミドの複製およびコンジュゲーションにおいて推定される役割を有するタンパク質をコードするＩＣＥＨｉｎ８６−０２８ＮＰの５’末端付近のＯＲＦ（規定のコア遺伝子を含む）、ならびに主に、膜会合性またはまたは膜輸送性のいずれかであり得ることが示唆されるモチーフを有する保存仮想タンパク質をコードする３’末端付近のＯＲＦが含まれる。注目すべきことは、ＩＣＥＨｉｎ８６−０２８ＮＰが、ＩＣＥＨｉｎ１０５６には見られるテトラサイクリン、クロラムフェニコールおよびβ−ラクタム耐性に関与するタンパク質をコードする遺伝子を欠くことである。ＩＣＥＨｉｎ８６−０２８ＮＰ内には、トランスポゼース、レソルバーゼおよび推定インテグラーゼ調節因子が散在しており、これは、ＩＣＥＨｉｎ８６−０２８ＮＰが、いくつかの可動性遺伝因子に由来する複合エレメントであることを示す。
【０２３３】
ＩＣＥＨｉｎ１５０６は、ａｔｔＰ部位と表示される配列を第１の遺伝子の５’側に有する。８６−０２８ＮＰ菌株には、このａｔｔＰ部位の完璧なコピーがＮＴＨＩ０１０１の５’側に存在し、単一ヌクレオチド変化を有するこのａｔｔＰ部位のコピーがＮＴＨＩ０１６４の３’側に存在する。ａｔｔＰ部位は、ゲノムアイランドを形成する細菌染色体内への可動性遺伝因子の組込みに関与しており、おそらく、この大きな遺伝物質セクションが８６−０２８ＮＰ菌株ゲノム内に組み込まれた状態となる機構を示唆する（Ｄｉｍｏｐｏｕｌｏｕら，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  ４６：１６０２−３，２００２）。ＩＣＥＨｉｎ８６−０２８ＮＰは、その他の任意の関連ゲノムアイランドより少なく、８６−０２８ＮＰ菌株のゲノム全体のＧ＋Ｃ含量３８％に近い３９％のＧ＋Ｃ含量を有する。これは、このエレメントについて長期ゲノム関連を暗示する。このエレメントとともに、膜会合タンパク質および分泌タンパク質をコードしていると考えられるＩＣＥＨｉｎ１５０６のものに相同な遺伝子（Ｄｉｍｏｐｏｕｌｏｕら，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  ４６：１６０２−３，２００２）のその相補配列の存在は、８６−０２８ＮＰ菌株のビルレンスの重要な暗示を有し得る
パスツレラ科（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｃｅａｅ）のいくつかの構成員、例えば、ヘモフィラス  デュクレイ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｄｕｃｒｅｙｉ）、パスツレラ  マルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）およびアクチノバチラス  アクチノマイセテムコミタンス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ）は、充分特性評価されたタンパク質毒素を産性する。対照的に、インフルエンザ菌は、タンパク質毒素を産性しないようであり、推定タンパク質毒素をコードする遺伝子は、８６−０２８ＮＰ菌株ゲノムにおいて同定されなかった。インフルエンザ菌では、内毒素生合成を担うグリコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子、および感染過程において細菌に増強された「適応度」を付与するタンパク質をコードする遺伝子が、一般的にビルレンス決定基とみなされている。これらの遺伝子としては、付着因子、ヘムおよびヘモグロビン結合タンパク質をコードするもの、ならびに酸化的ストレスを防御するタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。
【０２３４】
偶発性遺伝子
インフルエンザ菌は、限定数の２成分調節系および他の総合調節因子を有する。Ｍｏｘｏｎおよび協働者らにより、「単純偶発性（ｓｉｍｐｌｅ  ｃｏｎｔｉｎｇｅｎｃｙ）遺伝子座」と称する遺伝子座が遺伝子発現調節の代替機構を提供し、したがって、該生物体が変化する環境条件に速やかに応答する能力に寄与することにより、生物体の適応度が増大すると論じられた。これらの遺伝子座は、短いタンデム反復配列を、コード領域内またはコード領域の５’側のいずれかに含む。ＤＮＡ複製中、リーディングフレーム内での反復配列の付加または欠損により、リーディングフレームの改変がもたらされる。コード領域の５’側に局在する場合、反復配列の付加または欠損により、プロモーター活性の変化がもたらされる（Ｂａｙｌｉｓｓら，Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １０７：６５７−６２，２００１）。単純反復配列を含む遺伝子座は、例えば、インフルエンザ菌において広範に研究されている（Ｈｏｏｄら，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９３：１１１２１−５，１９９６）。以下のセクションに相変異性（ｐｈａｓｅ  ｖａｒｉａｂｌｅ）として記載する遺伝子座のいくつかは、単純反復配列を含む。
【０２３５】
付着因子
８６−０２８ＮＰ菌株は、主に宿主細胞への付着において機能する産物をコードするいくつかの遺伝子を保有する（表８）。これらのうちの１つである外膜タンパク質Ｐ５は、以前に同定され、その機能が注意深く分析された（Ｊｉａｎｇら，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ６７：１８７−９２，１９９９；Ｋｅｎｎｅｄｙら，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ６８：２７５６−６５，２０００；Ｎｏｖｏｔｎｙら，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７１：１９７８−８３，２００３；Ｎｏｖｏｔｎｙら，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ６８：２１１９−２８，２０００；Ｎｏｖｏｔｎｙら，Ｖａｃｃｉｎｅ  ２０：３５９０−７，２００２；Ｓｉｒａｋｏｖａら，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ６２：２００２−２０，１９９４）。８６−０２８ＮＰ菌株は、Ｒｄ菌株Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよびＰ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａ由来のｐｉｌＡＢＣＤのホモログである４つの遺伝子を含む遺伝子クラスターを保有する（Ｂａｋａｌｅｔｚら，Ｉｎｆｅｃｔ
Ｉｍｍｕｎ  ７３：１６３５−４，２００５；Ｄｏｕｇｈｔｙら，Ｖｅｔ  Ｍｉｃｒｏ
ｂｉｏｌ  ７２：７９−９０，２０００；Ｒｕｆｆｏｌｏら，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ
６５：３３９−４３，１９９７  Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎら，Ｖｅｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ
９２：１２１−３４，２００３）。これらの遺伝子は、ｃｏｍＥ遺伝子および未同定遺伝子とともに、鼻咽頭組織への８６−０２８ＮＰ菌株の付着において役割を有するＩＶ型線毛をコードする（Ｋｅｎｎｅｄｙら，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，６８：２７５６−２７６５，２０００）。
【０２３６】
８６−０２８ＮＰ菌株は、Ｒｄ菌株には存在しない２つの高分子量（ＨＭＷ）付着因子遺伝子クラスターを保有する。該高分子量付着因子は、最初にＮＴＨｉ  １２菌株において特性評価され、これは、各々、３種類のタンパク質（ＨＭＷＡ、ＨＭＷＢおよびＨＭＷＣ）をコードする２つのＨＭＷ遺伝子クラスターを有する。ＨＭＷＡは、該付着因子の構造的成分であり、ＨＭＷＢは、膜貫通転位において役割を有する一方、ＨＭＷＣは、ＨＭＷＡのグリコシル化に必要とされる（Ｂａｒｅｎｋａｍｐら，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ
６０：１３０２−１３，１９９２；Ｂａｒｅｎｋａｍｐら，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ
６２：３３２０−８；１９９４；Ｇｒａｓｓら，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ４８：７３７−５１，２００３；Ｓｔ  Ｇｅｍｅら，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ２７：６１７−３０，１９９８）。同様に、８６−０２８ＮＰ菌株の２つのＨＭＷ遺伝子クラスターは、１２菌株と同じ遺伝子状況でＨｍｗＡ、ＢおよびＣ遺伝子のホモログを含む（Ｂｕｓｃｈｅｒら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １８６：４２０９−１７，２００４）。８６−０２８ＮＰ菌株由来のＨＭＷ１ＡおよびＨＭＷ２Ａタンパク質は、主要相違領域、例えば、ＨＭＷ２Ａ  内の４１アミノ酸挿入部とＣ末端に向かって７２％同一である。８６−０２８ＮＰ菌株由来のＨＭＷＢとＨＭＷＣの対のタンパク質は、それぞれ９９％同一である。配列ＡＴＣＴＴＴＣは、ｈｍｗ１Ａの上流で１７回およびｈｍｗ２Ａの上流で２３回反復される。１２菌株では、この配列の１６反復配列が、各ｈｍｗ遺伝子クラスターの５’側に見られる（Ｂａｒｅｎｋａｍｐら，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ６０：１３０２−１３，１９９２）。
【０２３７】
Ｈａｐは、ＩｇＡｌプロテアーゼの触媒性ドメインに相同なドメインを有する自己輸送型タンパク質である。ＮＴＨＩ０３５４遺伝子は、ＮＴＨｉ菌株Ｎ１８７由来のＨａｐと８３％同一性を有するタンパク質をコードする（Ｓｔ  Ｇｅｍｅら，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １４：２１７−３，１９９４）。８６−０２８ＮＰ菌株は、ＨＭＷ１およびＨＭＷ２を保有する他のＮＴＨｉ菌株と同様、別のヘモフィルス属付着因子であるＨｉａをコードする遺伝子を欠く（Ｂａｒｅｎｋａｍｐら，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １９：１２１５−２３，１９９６）。また、８６−０２８ＮＰ菌株は、本発明者らが以前に報告したように、赤血球凝集性線毛をコードするｈｉｆ遺伝子クラスターを欠く（Ｍｕｎｓｏｎら，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ７２：３００２−１０，２００４）。
【０２３８】
【表１１１】
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表８、９および１０において、「ＮＴＨＩ番号」は、Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ−Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  ８６０２８  ＮＰウェブサイトおよびＧｅｎｂａｎｋ  受託番号ＣＰ００００５７で表示されるＮＴＨｉ  ８６−０２８ＮＰ菌株ゲノム  内の遺伝子座タグ番号を示す。「ＨＩ番号」は、ＴＩＧＲ（Ｔｈｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｒｅｄｅａｒｃ）内の対応する遺伝子座タグ番号を示す。
【０２３９】
リポオリゴ糖合成［［当初の出願の第１３頁参照］
インフルエンザ菌リポオリゴ糖（ＬＯＳ）の構造、生合成およびビルレンスにおける役割は、広範に研究されている。表９に、リポオリゴ糖生合成に関与する遺伝子の一覧を網羅する。８６−０２８ＮＰ菌株は、ＬＯＳの七炭糖−Ｋｄｏ−リピドＡ部分合成するのに必要とされる遺伝子の完全な相補配列を有する。ｌｇｔＦおよびｌｐｓＡ遺伝子は、グルコース、およびグルコースまたはガラクトースを七炭糖の第１および第３残基にそれぞれ付加するグリコシルトランスフェラーゼをコードする。これらの遺伝子はともに、８６−０２８ＮＰ菌株ゲノム内に存在し、したがって、おそらく、炭水化物鎖は、８６−０２８ＮＰ菌株ＬＯＳの第１七炭糖残基および第３七炭糖残基から伸長され得る（Ｈｏｏｄら，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １５０：２０８９−９７，２００４）。ｂ血清型菌株ＲＭ１５３において、ｌｉｃ２Ｃ遺伝子は、グルコースを第２七炭糖に付加するグリコシルトランスフェラーゼをコードする（Ｈｏｏｄら，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １５０：２０８９−９７，２００４）。８６−０２８ＮＰ菌株ゲノムでは、この遺伝子はフレームシフトを含む。相変異性ｌｉｃ２ＡおよびｌｉｃＡ遺伝子は、それぞれ、ガラクトシルトランスフェラーゼおよびコリンキナーゼをコードし、８６−０２８ＮＰ菌株ゲノム内に存在する（Ｈｉｇｈら，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ９：１２７５−８２，１９９３；Ｈｏｏｄら，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  １１：９５７−６７，２００１；Ｗｅｉｓｅｒら，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ６５：９４３−５０，１９９７）。ｌｅｘ２Ｂ遺伝子は、ｂ血清型ＤＬ４２菌株ならびにいくつかの他の血清型分類可能菌株においてグリコシルトランスフェラーゼをコードし、８６−０２８ＮＰ菌株ゲノム内に存在する（Ｇｒｉｆｆｉｎら，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４９：３１６５−７５，２００３；Ｊａｒｏｓｉｋら，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ６２：４８６１−７，１９９４）。ＤＬ４２菌株のｌｅｘ２Ｂ遺伝子に対して５’側は、短い相変異性ｌｅｘ２Ａ遺伝子である。８６−０２８ＮＰ菌株では、この遺伝子は、１つの４ヌクレオチド反復配列の欠損および５ｂｐ欠失のため、ＤＬ４２配列（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｕ０５６７０）と比べるとフレーム外である。最近、Ｈｏｏｄおよび協働者らにより、Ｒｄ菌株において、ＨＩ０８６６〜ＨＩ０８７４を含むＨｍｇと表示される遺伝子座が報告された（Ｈｏｏｄら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １８６：７４２９−３９，２００４）。ｒｍｌＢのホモログは例外として、これらの遺伝子は、８６−０２８ＮＰ菌株ゲノムには存在しない。これには、ＮＴＨＩ  ２０１９菌株においてバイオフィルム形成に重要であることが最近示されたシアリルトランスフェラーゼをコードするｓｉａＡ遺伝子が含まれる（Ｇｒｅｉｎｅｒら，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ
７２：４２４９−６０，２００４；Ｊｏｎｅｓら，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７７：１４５９８−６１１，２００２）。別のシアリルトランスフェラーゼをコードするｌｉｃ３Ａ遺伝子のホモログの２つのコピー（Ｈｏｏｄら，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ３９：３４１−５０，２００１；Ｊｏｎｅｓら，ＪＢｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７７：１４５９８−６１１，２００２）、ならびに別のシアリルトランスフェラーゼをコードするｌｓｇＢ遺伝子の１つのコピー（Ｊｏｎｅｓら，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７７：１４５９８−６１１，２００２）が、８６−０２８ＮＰ菌株ゲノムにおいて同定された。
【０２４０】
【表１１２】
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【０２４１】
【表１１３】
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【０２４２】
【表１１４】
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鉄分獲得
インフルエンザ菌株は、ヘムの中間体前駆体であるプロトポルフィリンＩＸ（ＰＰＩＸ）とともにヘムまたは鉄分のいずれかの絶対要件を有する（Ｅｖａｎｓら，Ｊ  Ｍｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ７：３５９−６５，１９７４；Ｗｈｉｔｅら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  ８５：８４２−５０，１９６３）。表１０に、鉄分獲得に関与する遺伝子の一覧を網羅する。３種類のヘモグロビンおよびヘモグロビン−ハプトグロビン結合タンパク質ＨｇｐＡ、ＨｇｐＢおよびＨｇｐＣがｂ型インフルエンザ菌ＨＩ６８９菌株において同定された（Ｊｉｎら，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４５（Ｐｔ  ４）：９０５−１４，１９９９；Ｍｏｒｔｏｎら，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ６７：２７２９−３９，１９９９；Ｒｅｎら，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ６６：４７３３−４１，１９９８）。ＨＩ６８９菌株では、これらの遺伝子は、ＣＣＡＡ４ヌクレオチド反復配列を有し、スリップストランド（ｓｌｉｐ−ｓｔｒａｎｄ）誤対合によって調節されることが知られている。これらの遺伝子のうち２つは、８６−０２８ＮＰ菌株内に存在する。これらはともに、ＣＣＡＡ反復配列を含み、ｈｇｐＢ遺伝子はインフレームであるが、ｈｇｐＣ遺伝子はフレーム外である。ＣＣＡＡ反復配列を含む第３の遺伝子の誘導アミノ酸配列は、ｈｇｐＡと４５％同一である。本発明者らは、この遺伝子をｈｇｐＤと命名した。この遺伝子はフレーム外である。ヘムおよびヘム−ヘモペキシン錯体をコードするｂ型インフルエンザ菌のｈｘｕＡＢＣ遺伝子のホモログ（Ｃｏｐｅら，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ６９：２３５３−６３，２００１；Ｃｏｐｅら，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ６６：４５１１−６，１９９８；Ｃｏｐｅら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １７７：２６４４−５３，１９９５）ならびにｈｅｍＲ受容体のホモログが同定された。８６−０２８ＮＰ菌株はまた、ヘム結合リポタンパク質ＨｂｐＡをコードする遺伝子を有する（Ｈｅａｔｈら，Ｐｅｄｉａｔｒ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  Ｊ  ２０：３００−５，２００１）。ｈｂｐＡの下流は、その産物が、推定ヘム利用タンパク質を含むクラスターであるＣＯＧ０７４８の構成員である仮想遺伝子であるＮＴＨＩ１０２２である。最近ｂ型インフルエンザ菌において同定され、一般的なヘム利用タンパク質をコードするｈｕｐ遺伝子のホモログもまた同定された（Ｍｏｒｔｏｎら，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １５０：３９２３−３３，２００４）。
【０２４３】
ヘム輸送系に加え、鉄輸送系ｗｅｒｅもまた同定された。ｈｉｔＡＢＣ遺伝子はそれぞれ、シデロフォア欠損大腸菌株にｂ型インフルエンザ菌の菌株からクローニングしたＨｔＡＢＣ遺伝子を補完することにより完結に特性評価された高度に特異的な鉄イオンＡＢＣ輸送系の構成員であるＦｂｐＡＢＣタンパク質をコードする（Ａｎｄｅｒｓｏｎら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １８６：６２２０−９，２００４）。ｔｂｐＡＢ（Ｇｒａｙ−Ｏｗｅｎら，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ６３：１２０１−１０，１９９５；Ｇｒａｙ−Ｏｗｅｎら，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ６３：３８０９−１５，１９９５）ならびにｈｆｅＡＢＣＤと表示され、鉄取込みに関与するＡＢＣ輸送系のホモログであり、かつ最初にペスト菌において特性評価された（Ｂｅａｒｄｅｎら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １８０：１１３５−４７，１９９８）遺伝子にコードされるトランスフェリン結合タンパク質１および２が同定された。この後者の遺伝子クラスターは、Ｒｄ菌株にも存在する。ＮＴＨＩ２０３５  は、Ｍｎ２＋およびＦｅ２＋輸送体のＮＲＡＭＰファミリーの推定ホモログをコードする（Ｒｉｃｈｅｒら，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｅｖｏｌ  ５７：３６３−７，２００３）。
【０２４４】
上記のように、インフルエンザ菌は、インビトロでの増殖のためのヘムの供給源として、ＰＰＩＸとともに鉄分を利用し得る。ＰＰＩＸへの鉄の組込みを触媒する（Ｓｃｈｌｏｒら，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ６８：３００７−９，２０００）フェロキレターゼをコードするｈｅｍＨ遺伝子が同定された。調節因子をコードする遺伝子Ｆｕｒもまた同定された（Ａｎｄｒｅｗｓら，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ  ２７：２１５−３７，２００３；Ｓｍｏｏｔら，Ｊ  Ｍｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ４８：６２９−３，１９９９）。
【０２４５】
【表１１５】
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【０２４６】
【表１１６】
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酸化的ストレス
増殖に必要であるが、鉄分の能動的獲得は、菌体に対して有害な効果を有し得る。フェントン反応により、鉄分は過酸化水素と反応し、高度に反応性のヒドロキシル残基を生成させ得る。この生成物は、著しい効果、例えば、脂質過酸化および鉄分含有酵素とＤＮＡの両方に対する損傷を有する（Ｉｍｌａｙ，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ５７：３９５−４１８，２００３）。ヒドロキシル残基に対する最もよく知られた防御系は、スーパーオキシドディスムターゼＡおよびＢからなり、これらは、高度に反応性のスーパーオキシドを過酸化水素に変換し、次いで、これは、カタラーゼによって水と酸素に変換される（Ｄｅｍｐｌｅ，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ  ２５：３１５−３７，１９９１）。８６−０２８ＮＰ菌株およびＲｄ菌株は、ｓｏｄＡ遺伝子（ＮＴＨＩ１２５１）を含むが、ｓｏｄＢ遺伝子を欠く。また、両菌株とも、カタラーゼ遺伝子ｈｋｔＥ（ＮＴＨＩ１０９９）（Ｂｉｓｈａｉら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １７６：２９１４−２１，１９９４）、酸化的ストレスに対する保護に関与する遺伝子の一次調節因子（Ｍａｃｉｖｅｒ  ＆  Ｈａｎｓｅｎ，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ６４：４６１８−２９，１９９６；Ｐｏｍｐｏｓｉｅｌｌｏら，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １９：１０９−１４，２００１）をコードするｏｘｙＲ遺伝子（ＮＴＨＩ０７０４）、およびＰｒｘ／Ｇｒｘと称され、小アルキルヒドロペルオキシドに対する保護においてグルタチオン依存的役割を有するキメラペルオキシダーゼをコードする遺伝子（Ｐａｕｗｅｌｓら，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７８：１６６５８−６６，２００３；Ｖｅｒｇａｕｗｅｎら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  １８５：５５５５−６２，２００３；Ｖｅｒｇａｕｗｅｎら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １８５：１５７２−８１，２００３）を保有する。本発明者らは、以前に、Ｒｄ菌株には存在しないＰ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａペルオキシレドキシンＴｓａＡのホモログをコードする遺伝子であるＮＴＨＩ０２１２を同定した（Ｍｕｎｓｏｎら，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ７２：３００２−１０，２００４）。しかしながら、８６−０２８ＮＰ菌株は、サルモネラ属においてＴｓａＡの還元に関与していることがわかっている（Ｐｏｏｌｅら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３９：６６０２−１５，２０００）専用（ｄｅｄｉｃａｔｅｄ）アルキルヒドロペルオキシドレダクターゼであるＡｈｐＦが欠損している。酸化的ストレスに対するさらなる保護は、ｆｔｎＡおよびｆｔｎＢ（それぞれ、ＮＴＨＩ１７７３およびＮＴＨＩ１７７２）遺伝子にコードされるフェリチン様タンパク質によってもたらされ得る。これらのタンパク質の過剰発現により、鉄過剰負荷大腸菌ｆｕｒ変異型が酸化的損傷から保護されることが示された（Ｔｏｕａｔｉら，Ｊ  Ｂαｃｔｅｒｉｏｌ  １７７：２３０５−１４，１９９５）。仮想保存遺伝子ＮＴＨＩ１８１７は、ＤＮＡ結合フェリチン様タンパク質と相同性を有するタンパク質をコードする。これは、Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｃａでは鉄の存在下および食作用中の両方において酸化的ストレスに対する保護の役割を有し、サルモネラ属感染マウスモデルにおいてビルレンスに重要である（Ｈａｌｓｅｙら，Ｉｎｆｅｃｔ  ���ｍｍｕｎ  ７２：１１５５−８，２００４）非特異的ＤＮＡ結合タンパク質のＤｐｓファミリーの構成員である。大腸菌では、Ｄｐｓは、過酸化水素によって酸化された鉄分に優先的に結合し、したがって、フェントン反応によって生成されるヒドロキシル残基の発生の抑止に重要な役割を有することが示された（Ｚｈａｏら，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７７：２７６８９−９６，２００２）。
【０２４７】
分泌
Ｓｅｃ系に加え、８６−０２８ＮＰ菌株は、２つのアルギニンをそのシグナルペプチド内に有するタンパク質のＳｅｃ非依存的輸送に関与するＴａｔＡ、ＢおよびＣ  タンパク質、細胞質膜会合タンパク質をコードする遺伝子（ＮＴＨＩ０２７９、ＮＴＨＩ０２８０およびＮＴＨＩ０２８２）を有する（Ｂｏｌｈｕｉｓら，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７６：２０２１３−９，２００１；Ｙｅｎら  Ａｒｃｈ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １７７：４４１−５０，２００２）。既報のように、８６−０２８ＮＰ菌株は、自己輸送型タンパク質Ｌａｖをコードする遺伝子ＮＴＨＩ０５８５を保有する（Ｍｕｎｓｏｎら，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ７２：３００２−１０，２００４）。このタンパク質はＲｄ菌株には存在しないが、ナイセリア菌には存在し、ヘモフィルス属では、病原性菌株に限定されるようである（Ｄａｖｉｓら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １８３：４６２６−３５，２００１）。８６−０２８ＮＰ菌株はまた、ＩｇＡプロテアーゼをコードする遺伝子（ＮＴＨＩ１１６４）（ＰｏｕｌｓｅｎらＪ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １７４：２９１３−２１，１９９２）、および上記のようなＨａｐ付着因子をコードする遺伝子を有する。ともに、自己輸送体の類型のタンパク質である、上記のように、ＨＭＷ付着因子は、２パートナー分泌経路群のタンパク質の構成員である。
【０２４８】
外膜タンパク質
いくつかの外膜タンパク質（ＯＭＰ）をコードする遺伝子が、他のインフルエンザ単離菌のものとの相同性によって同定された。これらとしては、主要なＯＭＰ（すべて、最初はｂ型インフルエンザ菌において同定）；表面発現Ｐ１（ＮＴＨＩ０５２２）、ポーリンＰ２（ＮＴＨＩ０２２５）、ホスホモノエステラーゼおよびヘム輸送体Ｐ４（ＮＴＨＩ０８１６）、付着因子Ｐ５（ＮＴＨＩ１３３２）ならびにリポタンパク質Ｐ６（ＮＴＨＩ０５０１）が挙げられる。また、８６−０２８ＮＰ菌株は他のヘモフィルス属菌株と、いくつかの微量ＯＭＰを共有する。これらとしては、ｂ型インフルエンザ菌由来のＤ１５およびトランスフェリン結合タンパク質、ならびにＮＴＨｉ菌株２８９において同定されたＯＭＰ２６のホモログ（Ｍｕｎｓｏｎら，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ５６：２２３５−４２，１９８８；Ｍｕｎｓｏｎら，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ４９：５４４−９，１９８５；Ｍｕｎｓｏｎら，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ７２：６７７−８４，１９８３；Ｒｅｉｄｌら，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １８３：６２１−９，Ｒｅｉｌｌｙら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １８１：６７９７−８０５，１９９９；Ｒｅｉｌｌｙら，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ４９４：１９−２３，２００１）が挙げられる。すべては、その後、ＮＴＨｉ菌株において特性評価され、潜在的なワクチン候補として解析された（Ｐｏｏｌｍａｎら，Ｖａｃｃｉｎｅ  １９  Ｓｕｐｐｌ  １：Ｓ１０８−１５，２０００；Ｍｕｒｐｈｙら  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  １６：１２９−３４，２００３；ＭｃＭｉｃｈａｅｌら，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇ  Ｄｒｕｇｓ  ４：９５３−８，２００３  Ｃｒｉｐｐｓら，  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ８１：４６−５１，２００３；Ｂａｋａｌｅｔｚら  Ａｎｎ  Ｏｔｏｌ  Ｒｈｉｎｏｌ  Ｌａｒｙｎｇｏｌ  Ｓｕｐｐｌ  １８８：８２−９４，２００２）。
【０２４９】
制限酵素系：
８６−０２８ＮＰ菌株は、ＨｉｎｄＩＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ  ＩＩ型制限系を欠く（Ｆｌｅｉｓｃｈｍａｎｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６９：４９６−５１２．８０，１９９５；Ｎｗａｎｋｗｏら，Ｇｅｎｅ  １５０：７５−８０．１０４，１９９４，Ｓｍｉｔｈ，＆  Ｍａｒｌｅｙ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ６５：１０４−８，１９８０）。対照的に、Ｈ．ａｅｇｙｐｔｉｕｓにおいて最初に同定された（Ｓｌａｔｋｏら，Ｇｅｎｅ  ７４：４５−５０，１９８８）ＨａｅＩＩ系をコードする遺伝子は、８６−０２８ＮＰ菌株ゲノム内に存在するが、Ｒｄ菌株には存在しない。８６−０２８ＮＰ菌株およびＲｄ菌株はともに、メチルトランスフェラーゼ（ＨｓｄＭ）、配列認識タンパク質（ＨｓｄＳ）および制限酵素（ＨｓｄＲ）をコードするＨｓｄ型Ｉ制限系を有する（Ｒｏｂｅｒｔｓら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３１：１８０５−１２，２００３）。これらの伝子は、Ｒｄ菌株のゲノムでは隣接している（ＨＩ１２８５〜ＨＩ１２８７）。８６−０２８ＮＰゲノムは、各々４つの遺伝子を含有する３つのｈｓｄ様遺伝子座を含む。ｈｓｄ系の１つはＮＴＨＩ１８３８〜ＮＴＨＩ１８４３にコードされている。この遺伝子クラスターでは、ＮＴＨＩ１８４１は仮想タンパク質をコードする。第２のｈｓｄ様遺伝子座はＮＴＨＩ０３１４〜ＮＴＨＩ０３１８にコードされている。この遺伝子クラスターでは、ＮＴＨＩ０３１６は推定アンチコドンヌクレアーゼをコードする。このｈｓｄ様系は、大腸菌のｐｒｒ系に類似したものであり得る（Ｔｙｎｄａｌｌら，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２３７：２６６−７４，１９９４）。第３のｈｓｄ遺伝子座はＮＴＨＩ０１８８〜ＮＴＨＩ０１９３にコードされている。この遺伝子クラスターでは、ＮＴＨＩ０１９０  は、ヘリックス−ターン−ヘリックスドメインを有する推定転写調節因子をコードする。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図３Ｇ】
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【図３Ｈ】
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【図３Ｉ】
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【図３Ｊ】
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【図３Ｋ】
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【図３Ｌ】
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【図３Ｍ】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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