(57)【要約】【課題】簡便、迅速かつ正確にイタリアンライグラスの品種識別を行うためのプライマー対、特定マーカー遺伝子及びイタリアンライグラス品種の識別方法を提供する。【解決手段】イタリアンライグラスのゲノム上のＳＳＲ領域の両側の塩基配列を用いて設計した特定のプライマー対、イタリアンライグラスのゲノムＤＮＡをＰＣＲ増幅させた特定マーカー遺伝子、及び、該プライマー対を使用し、識別対象となるイタリアンライグラスＤＮＡをバルクすることで個体間の遺伝子のばらつきを無くし、品種特異的なＳＳＲをＰＣＲで特異的に増幅させ、増幅された断片の長さの違いを検出する品種の識別方法。【効果】単数又は複数のプライマー対を使用したＰＣＲにより、識別対象の遺伝子を増幅させ、そのマーカーのサイズ及びバンドパターンを検証することにより、イタリアンライグラスの２６品種での品種識別を行うことができる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
イタリアンライグラスの品種識別用のプライマーであって、
イタリアンライグラス及びその近縁種であるトールフェスク、ペレニアルライグラスのゲノム上におけるＳＳＲ（Ｓｉｍｐｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ
Ｒｅｐｅａｔｓ）領域の両側の塩基配列を用いて設計したプライマー対からなることを特徴とするイタリアンライグラスの品種識別用プライマー対。
【請求項２】
配列表の配列番号１〜２２のＦ（Ｆｏｒｗａｒｄ）プライマー及び配列番号２３〜４４のＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ）プライマーを１対とするプライマー対である、請求項１に記載のプライマー対。
【請求項３】
あかつき、いなずま、ウヅキアオバ、さちあおば、さつきばれ、シワスアオバ、タチマサリ、タチムシャ、タチワセ、ドライアン、ニオウダチ、ハタアオバ、ハナミワセ、びしゃもん、ミナミアオバ、優春、ワセアオバ、ワセフドウ、ワセユタカの１９品種からなるイタリアンライグラスの２倍体品種を識別する、請求項１又は２に記載の品種識別用プライマー対。
【請求項４】
アキアオバ、エース、ナガハヒカリ、ヒタチヒカリ、ミユキアオバ、タチサカエ、マンモスＢの７品種からなるイタリアンライグラスの４倍体品種を識別する、請求項１又は２に記載の品種識別用プライマー対。
【請求項５】
請求項２に記載のプライマー対の単数又は複数の組み合わせからなることを特徴とするイタリアンライグラスの品種識別用プライマーセット。
【請求項６】
請求項１又は２に記載のプライマーを利用してイタリアンライグラス及びその近縁種であるトールフェスク、ペレニアルライグラスのゲノム上におけるＳＳＲ（Ｓｉｍｐｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ
Ｒｅｐｅａｔｓ）領域をＰＣＲ増幅させたことを特徴とする特定マーカー遺伝子。
【請求項７】
請求項３に記載の１９品種及び請求項４に記載の２６品種内での品種を識別する、請求項６に記載の特定マーカー遺伝子。
【請求項８】
配列表の配列番号４５〜６４のいずれかの塩基配列を有する、請求項６に記載の特定マーカー遺伝子。
【請求項９】
イタリアンライグラス及びその近縁種であるトールフェスク、ペレニアルライグラスのゲノム上におけるＳＳＲ（Ｓｉｍｐｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ
Ｒｅｐｅａｔｓ）領域の両側の塩基配列を用いて作成したプライマーから増幅されるマーカーを使用し、識別対象のイタリアンライグラスＤＮＡのＰＣＲによる増幅を行い、その増幅産物の多型を確認することで品種の識別を行うことを特徴とするイタリアンライグラスの品種識別方法。
【請求項１０】
特定マーカー遺伝子のサイズ又はバンドパターンに基づいて、イタリアンライグラスの品種の識別を行う、請求項９に記載の品種識別方法。
【請求項１１】
あかつき、いなずま、ウヅキアオバ、さちあおば、さつきばれ、シワスアオバ、タチマサリ、タチムシャ、タチワセ、ドライアン、ニオウダチ、ハタアオバ、ハナミワセ、びしゃもん、ミナミアオバ、優春、ワセアオバ、ワセフドウ、ワセユタカの１９品種からなるイタリアンライグラスの２倍体品種を識別する、請求項９に記載の品種識別方法。
【請求項１２】
アキアオバ、エース、ナガハヒカリ、ヒタチヒカリ、ミユキアオバ、タチサカエ、マンモスＢの７品種からなるイタリアンライグラスの４倍体品種を識別する、請求項９に記載の品種識別方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イタリアンライグラスの品種識別に有用なＳＳＲプライマー対とその利用に関するものであり、更に詳しくは、イタリアンライグラスの２６品種中の１６品種の２倍体品種、及び６品種の４倍体品種を識別するために用いる、特定のＳＳＲ領域を増幅させるための遺伝子増幅用プライマーのＦプライマー及びＲプライマー対及びその利用に関するものである。本発明は、イタリアンライグラスの品種識別用のＳＳＲプライマー、該プライマーを利用してイタリアンライグラスのゲノムＤＮＡをＰＣＲ増幅させた特定マーカー遺伝子、及びその増幅断片を比較することで品種を識別することを可能とするイタリアンライグラスの品種識別方法に関する新技術・新製品を提供するものである。
【背景技術】
【０００２】
イタリアンライグラス（Ｌｏｌｉｕｍ  ｍｕｌｔｉｆｌｏｒｕｍ  Ｌａｍ．）は、主に飼料作物として利用される短年生の他殖性のイネ科植物である。
【０００３】
トールフェスク（Ｆｅｓｔｕｃａ  ａｒａｕｎｄｉｎａｃｅａ）及びペレニアルライグラス（Ｌｏｌｉｕｍ  ｐｅｒｅｎｎｅ）は、イタリアンライグラスとは近い類縁関係にあり、それらのプライマーの一部は、イタリアンライグラス遺伝子の増幅にも使用可能である。
【０００４】
イタリアンライグラスの品種識別法として、イタリアンライグラスの５品種を識別する品種識別法が開発されている（特許文献１参照）。この方法は、（ａ）：イタリアンライグラスのＤＮＡを抽出する工程、（ｂ）：工程（ａ）にて抽出されたＤＮＡを制限酵素処理後、遺伝子増幅反応に付して、前記オリゴヌクレオチドの出現頻度を調べて品種を判定する工程からなることを特徴としている。
【０００５】
この方法では、ＡＦＬＰ（Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｌｅｎｇｔｈ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）法を用いてヌクレオチドの出現頻度を調べることにより、ミナミアオバ、ニオウダチ、シワスアオバ、ワセアオバ、ワセユタカの５品種内で、対象品種であるか否かを特定している。
【０００６】
日本草地畜産種子協会飼料作物研究所では、１２品種のイタリアンライグラスを識別するためのＳＳＲプライマー対とその利用法を開発した（特許文献２参照）。この方法は、イタリアンライグラスのゲノム上のＳＳＲ領域の両端の塩基配列を用いてプライマー対として設計し、対象となるイタリアンライグラスはバルクすることで個体間の遺伝子型のばらつきを平均化し、品種特異的なＳＳＲをＰＣＲで特異的に増幅させ、増幅された断片の長さの違いを検出することで品種の識別を行うことを特徴としている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００４−２０１６２４号公報
【特許文献２】特開２００８−２３７１８０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、新規イタリアンライグラス品種の識別に対応するため、１２品種を識別する識別法（特許文献２）を基に、新たに１４品種を追加した、イタリアンライグラス２６品種での新規イタリアンライグラス品種の識別方法に関する新技術を提供することを目的とするものである。
【０００９】
本発明は、複数個体のＤＮＡを混合するバルクＤＮＡをテンプレートＤＮＡとしたイタリアンライグラスの品種の識別を可能にするＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）用のＳＳＲプライマー対、該プライマー対を利用してＰＣＲ増幅させた特定マーカー遺伝子、及びその増幅断片を比較することで品種を識別することを可能とするイタリアンライグラスの品種識別方法を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記課題を解決するための本発明は、以下の技術的手段から構成される。
（１）イタリアンライグラスの品種識別用のプライマーであって、
イタリアンライグラス及びその近縁種であるトールフェスク、ペレニアルライグラスのゲノム上におけるＳＳＲ（Ｓｉｍｐｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ
Ｒｅｐｅａｔｓ）領域の両側の塩基配列を用いて設計したプライマー対からなることを特徴とするイタリアンライグラスの品種識別用プライマー対。
（２）配列表の配列番号１〜２２のＦ（Ｆｏｒｗａｒｄ）プライマー及び配列番号２３〜４４のＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ）プライマーを１対とするプライマー対である、前記（１）に記載のプライマー対。
（３）あかつき、いなずま、ウヅキアオバ、さちあおば、さつきばれ、シワスアオバ、タチマサリ、タチムシャ、タチワセ、ドライアン、ニオウダチ、ハタアオバ、ハナミワセ、びしゃもん、ミナミアオバ、優春、ワセアオバ、ワセフドウ、ワセユタカの１９品種からなるイタリアンライグラスの２倍体品種を識別する、前記（１）又は（２）に記載の品種識別用プライマー対。
（４）アキアオバ、エース、ナガハヒカリ、ヒタチヒカリ、ミユキアオバ、タチサカエ、マンモスＢの７品種からなるイタリアンライグラスの４倍体品種を識別する、前記（１）又は（２）に記載の品種識別用プライマー対。
（５）前記（２）に記載のプライマー対の単数又は複数の組み合わせからなることを特徴とするイタリアンライグラスの品種識別用プライマーセット。
（６）前記（１）又は（２）に記載のプライマーを利用してイタリアンライグラス及びその近縁種であるトールフェスク、ペレニアルライグラスのゲノム上におけるＳＳＲ（Ｓｉｍｐｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ
Ｒｅｐｅａｔｓ）領域をＰＣＲ増幅させたことを特徴とする特定マーカー遺伝子。
（７）前記（３）に記載の１９品種及び前記（４）に記載の２６品種内での品種を識別する、前記（６）に記載の特定マーカー遺伝子。
（８）配列表の配列番号４５〜６９のいずれかの塩基配列を有する、前記（６）に記載の特定マーカー遺伝子。
（９）イタリアンライグラス及びその近縁種であるトールフェスク、ペレニアルライグラスのゲノム上におけるＳＳＲ（Ｓｉｍｐｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ
Ｒｅｐｅａｔｓ）領域の両側の塩基配列を用いて作成したプライマーから増幅されるマーカーを使用し、識別対象のイタリアンライグラスＤＮＡのＰＣＲによる増幅を行い、その増幅産物の多型を確認することで品種の識別を行うことを特徴とするイタリアンライグラスの品種識別方法。
（１０）特定マーカー遺伝子のサイズ又はバンドパターンに基づいて、イタリアンライグラスの品種の識別を行う、前記（９）に記載の品種識別方法。
（１１）あかつき、いなずま、ウヅキアオバ、さちあおば、さつきばれ、シワスアオバ、タチマサリ、タチムシャ、タチワセ、ドライアン、ニオウダチ、ハタアオバ、ハナミワセ、びしゃもん、ミナミアオバ、優春、ワセアオバ、ワセフドウ、ワセユタカの１９品種からなるイタリアンライグラスの２倍体品種を識別する、前記（９）に記載の品種識別方法。
（１２）アキアオバ、エース、ナガハヒカリ、ヒタチヒカリ、ミユキアオバ、タチサカエ、マンモスＢの７品種からなるイタリアンライグラスの４倍体品種を識別する、前記（９）に記載の品種識別方法。
【００１１】
次に、本発明について更に詳細に説明する。
本発明は、イタリアンライグラス及びその近縁種のゲノム上におけるＳＳＲ領域の両側の塩基配列を用いてプライマー対を設計し、識別対象品種の遺伝子の特定マーカーをＰＣＲ増幅し、そのマーカーのサイズ、及びバンドパターン、すなわち複数の遺伝子座のバンドの有無による組み合わせを確認することで品種を識別することを特徴とするものである。
【００１２】
本発明では、対象品種のバルクＤＮＡを使用することで１個体毎の解析を行わないため、他殖性であるイタリアンライグラス遺伝子の非特異的な個体間差をなくすことが可能となり、ＰＣＲによる遺伝子の増幅を行い、その増幅断片を比較することで、効率的に品種間の解析を行うことができる。
【００１３】
本発明では、２〜３塩基が高頻度に繰り返された配列からなるＳＳＲ領域の両側を挟むように設計した特定の遺伝子増幅用プライマー（表１参照）から構成される、単数又は複数のプライマー対を使用し、対象となるイタリアンライグラス２６品種について、ＰＣＲ増幅を行い、その増幅断片を比較することで、品種を識別する。
【００１４】
本発明では、使用時にバルクしたＤＮＡをテンプレートとすることを想定し、品種特異的なＳＳＲマーカーを選抜するため、対象品種のゲノムＤＮＡを複数個体混合することでバルクしたＤＮＡをテンプレートとして解析が行われる。そのため、例えば、濃度を一定にしたイタリアンライグラスのＤＮＡを１０個体合わせたバルクＤＮＡをテンプレートとして使用する。
【００１５】
本発明で使用されるＳＳＲプライマー対は、プライマー設計ソフトウエア「ｐｒｉｍｅｒ  ０．５，ｆｔｐ：／／ｆｔｐ−ｇｅｎｏｍｅ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｐｒｉｍｅｒ０．５」を使用して作成する。
【００１６】
本発明に係るイタリアンライグラスの品種識別に有用な特定のプライマー対を、次の表１に示す。
【００１７】
【表１】
2014198034.tif 000003
【００１８】
次に、上記表１の特定の塩基配列のプライマー対の品種内での増幅型の詳細について説明する。
プライマー「ｇ０８７（０３−１１Ｂ）」は、ウヅキアオバを識別するプライマー対で、３５０ｂｐ付近にウヅキアオバ特有の増幅を示す。
【００１９】
プライマー「Ｂ０６Ｅ０７」は、サチアオバを識別するプライマー対で、２３０ｂｐ付近にサチアオバ特有の増幅を示す。
【００２０】
プライマー「Ａ０１Ｅ１５」は、シワスアオバを識別するプライマー対で、２５５ｂｐ〜３００ｂｐの間でシワスアオバ特有の増幅を示す。
【００２１】
プライマー「Ａ１０Ｍ１５」は、タチマサリを識別するプライマー対で、２０４〜２３０ｂｐの間でタチマサリ特有の増幅を示す。
【００２２】
プライマー「Ｂ０２Ｂ０２」は、タチムシャを識別するプライマー対で、１４５〜１７５ｂｐの間でタチムシャ特有の増幅を示す。
【００２３】
プライマー「Ａ０４Ｇ１７」は、ハタアオバを識別するプライマー対で、２００ｂｐ付近でハタアオバ特有の増幅パターンを示す。
【００２４】
プライマー「Ｂ０４Ｃ０８」は、ハナミワセを識別するプライマー対で、１７５ｂｐ付近でハナミワセ特有の増幅を示す。
【００２５】
プライマー「Ａ１０Ｐ１０」は、ミナミアオバ及びいなずまを識別するプライマー対で、１２０ｂｐ付近でミナミアオバ特有の増幅を示し、１４５〜１７５ｂｐの間でいなずま特有の増幅を示す。
【００２６】
プライマー「Ｂ０４Ｇ２２」は、ミナミアオバを識別するプライマー対で、１７５ｂｐ〜２００ｂｐの間でミナミアオバ特有の増幅を示す。
【００２７】
プライマー「Ａ０３Ｋ０４」は、ワセユタカを識別するプライマー対で、２５５ｂｐ〜３００ｂｐの間でワセユタカ特有の増幅を示す。
【００２８】
プライマー「ａｇ３３０（３６＿Ｃ０３）」は、あかつきを識別するプライマー対で、あかつき特有の増幅を示す。
【００２９】
プライマー「Ｂ０２Ｏ１０」は、さつきばれを識別するプライマー対で、２５５ｂｐ〜３００ｂｐの間でさつきばれ特有の増幅を示す。
【００３０】
プライマー「Ａ０４Ｇ２０」は、ドライアンを識別するプライマー対で、１２０ｂｐ付近でドライアン特有の増幅を示す。
【００３１】
プライマー「Ａ０３Ｋ１２」は、びしゃもんを識別するプライマー対で、２３０ｂｐ付近でびしゃもん特有の増幅を示す。
【００３２】
プライマー「Ｂ０２Ａ０４」は、優春を識別するプライマー対で、１２０ｂｐ〜１７５ｂｐの間で優春特有の増幅パターンを示す。
【００３３】
プライマー「Ｄ０５Ｐ０９」は、ワセフドウを識別するプライマー対で、２５５ｂｐ〜３００ｂｐの間でワセフドウ特有の増幅を示す。
【００３４】
プライマー「Ｄ０２Ｃ１０」は、アキアオバを識別するプライマー対で、１２０ｂｐ〜１４５ｂｐの間でアキアオバ特有の増幅を示す。
【００３５】
プライマー「ＣＩ７１（ＳＲＳＣ＿００３）」は、エースを識別するプライマー対で、エース特有の増幅を示す。
【００３６】
プライマー「Ｂ０７Ｐ１８」は、ヒタチヒカリを識別するプライマー対で、２００ｂｐ〜２３０ｂｐの間でヒタチヒカリ特有の増幅を示す。
【００３７】
プライマー「Ａ０３Ｍ１６」は、ミユキアオバを識別するプライマー対で、２００ｂｐ付近にミユキアオバ特有の往復を示す。
【００３８】
プライマー「Ｂ０１Ａ０７」は、タチサカエを識別するプライマー対で、１４５ｂｐ〜１７５ｂｐの間でタチサカエ特有の増幅パターンを示す。
【００３９】
プライマー「ｇ００５（０１−０２Ｇ）」は、マンモスＢを識別するプライマー対で、２３０ｂｐ付近にマンモスＢ特有の増幅を示す。
【００４０】
上記のプライマー対を２６品種で比較した場合に見られるバンドパターンを、次の表２の２倍体品種、表３の４倍体品種に分けて簡単に示す。
【００４１】
【表２】
2014198034.tif 000004
【００４２】
【表３】
2014198034.tif 000005
【００４３】
表２、３において、＋、−、±は、以下の通りである。
＋：品種特異的な増幅があることを示す。
−：品種特異的に特定ｂｐの増幅が見られないことを示す。
±：品種特異的なバンドパターンを示す。
【発明の効果】
【００４４】
本発明により、以下の効果が奏される。
（１）イタリアンライグラスの品種を識別するＳＳＲマーカーを提供できる。
（２）単数又は複数のプライマー対を使用したＰＣＲにより、識別対象の遺伝子を増幅させ、そのマーカーのサイズ及びバンドパターンを検証することにより、イタリアンライグラスの２６品種での品種識別を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】実施例におけるｇ０８７（０３−１１Ｂ）を用いたＰＣＲの電気泳動の結果を示す。図中、Ｍはサイズマーカーを示し、目的とするｂｐ付近のマーカーサイズを示し、そのサイズを右端にｂｐで示している。それぞれの品種は、１もしくは５サンプルの電気泳動の結果を示す。左から順にウヅキアオバ、サチアオバ、シワスアオバ、タチマサリ、タチムシャ、タチワセ、ニオウダチ、ハタアオバ、ハナミワセ、ミナミアオバ、ワセアオバ、ワセユタカ、あかつき、いなずま、さつきばれ、ドライアン、びしゃもん、優春、ワセフドウ、アキアオバ、エース、ナガハヒカリ、ヒタチヒカリ、ミユキアオバ、タチサカエ、マンモスＢ、である（図１１、１８を除く図２〜２２も同様）。
【図２】実施例におけるＢ０６Ｅ０７を用いたＰＣＲの電気泳動の結果を示す。
【図３】実施例におけるＡ０１Ｅ１５を用いたＰＣＲの電気泳動の結果を示す。
【図４】実施例におけるＡ１０Ｍ１５を用いたＰＣＲの電気泳動の結果を示す。
【図５】実施例におけるＢ０２Ｂ０２を用いたＰＣＲの電気泳動の結果を示す。
【図６】実施例におけるＡ０４Ｇ１７を用いたＰＣＲの電気泳動の結果を示す。
【図７】実施例におけるＢ０４Ｃ０８を用いたＰＣＲの電気泳動の結果を示す。
【図８】実施例におけるＡ１０Ｐ１０を用いたＰＣＲの電気泳動の結果を示す。
【図９】実施例におけるＢ０４Ｇ２２を用いたＰＣＲの電気泳動の結果を示す。
【図１０】実施例におけるＡ０３Ｋ０４を用いたＰＣＲの電気泳動の結果を示す。
【図１１】実施例におけるａｇ３３０（３６ Ｃ０３）を用いたＰＣＲの電気泳動の結果を示す。それぞれの品種は、１もしくは３サンプルの電気泳動の結果を示す。右から順にウヅキアオバ、サチアオバ、シワスアオバ、タチマサリ、タチムシャ、タチワセ、ニオウダチ、ハタアオバ、ハナミワセ、ミナミアオバ、ワセアオバ、ワセユタカ、あかつき、いなずま、さつきばれ、ドライアン、びしゃもん、優春、ワセフドウ、アキアオバ、エース、ナガハヒカリ、ヒタチヒカリ、ミユキアオバ、タチサカエ、マンモスＢ、である（図１８も同様）。
【図１２】実施例におけるＢ０２Ｏ１０を用いたＰＣＲの電気泳動の結果を示す。
【図１３】実施例におけるＡ０４Ｇ２０を用いたＰＣＲの電気泳動の結果を示す。
【図１４】実施例におけるＡ０３Ｋ１２を用いたＰＣＲの電気泳動の結果を示す。
【図１５】実施例におけるＢ０２Ａ０４を用いたＰＣＲの電気泳動の結果を示す。
【図１６】実施例におけるＤ０５Ｐ０９を用いたＰＣＲの電気泳動の結果を示す。
【図１７】実施例におけるＤ０２Ｃ１０を用いたＰＣＲの電気泳動の結果を示す。
【図１８】実施例におけるＣＩ７１（ＳＲＳＣ＿００３）を用いたＰＣＲの電気泳動の結果を示す。
【図１９】実施例におけるＢ０７Ｐ１８を用いたＰＣＲの電気泳動の結果を示す。
【図２０】実施例におけるＡ０３Ｍ１６を用いたＰＣＲの電気泳動の結果を示す。
【図２１】実施例におけるＢ０１Ａ０７を用いたＰＣＲの電気泳動の結果を示す。
【図２２】実施例におけるｇ００５（０１−０２Ｇ）を用いたＰＣＲの電気泳動の結果を示す。
【図２３】本発明に係るプライマー対を用いてＰＣＲ増幅した特定マーカー遺伝子の塩基配列を示す。
【図２４】本発明に係るプライマー対を用いてＰＣＲ増幅した特定マーカー遺伝子の塩基配列を示す。
【図２５】本発明に係るプライマー対を用いてＰＣＲ増幅した特定マーカー遺伝子の塩基配列を示す。
【図２６】本発明に係るプライマー対を用いてＰＣＲ増幅した特定マーカー遺伝子の塩基配列を示す。
【図２７】本発明に係るプライマー対を用いてＰＣＲ増幅した特定マーカー遺伝子の塩基配列を示す。
【図２８】本発明に係るプライマー対を用いてＰＣＲ増幅した特定マーカー遺伝子の塩基配列を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
次に、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明は、以下の実施例によって何ら限定されるものではない。
【実施例】
【００４７】
本実施例では、国内で育成されたイタリアンライグラスのあかつき、いなずま、ウヅキアオバ、さちあおば、さつきばれ、シワスアオバ、タチマサリ、タチムシャ、タチワセ、ドライアン、ニオウダチ、ハタアオバ、ハナミワセ、びしゃもん、ミナミアオバ、優春、ワセアオバ、ワセフドウ、ワセユタカの２６品種からから、ＣＴＡＢ法を用いて、ゲノムＤＮＡを抽出した。
【００４８】
抽出したＤＮＡ溶液は、滅菌水で、ＤＮＡ濃度を２０ｎｇ／μｌに調整し、１０個体を混合してバルクＤＮＡとしたものを、ＰＣＲ用のテンプレートＤＮＡとして用いた。
【００４９】
本実施例で使用した機器は、以下の通りである。
（１）Ｔ  ＧＲＡＤＩＥＮＴ  Ｔｈｅｍｏｃｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏｍｅｔｒａ）、
（２）ＴａＫａＲａ  ＰＣＲ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  ＴＰ６００（タカラバイオ株式会社）、
（３）ｉ  Ｃｙｃｌｅｒ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）、
（４）Ｇｅｎｅ  Ａｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００（ＡＢＩ）、
（５）ＤＮＡシーケンシングシステムＬＩＣ−４２００Ｌ（ｓ）（ＬＩ−ＣＯＲ）、
（６）Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  Ｐｏｗｅｒ  Ｓｕｐｐｌｙ−ＥＰＳ  ３５０１ＸＬ（ＧＥヘルスケアジャパン）、
（７）Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  Ｕｎｉｔ  Ｇｅｎｅ  Ｐｈｏｒ（ＧＥヘルスケアジャパン）、
（８）ＡＵＴＯ  ＳＴＡＩＮＥＲ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）。
【００５０】
本実施例で使用した試薬は、以下の通りである。
〈５０％アクリルアミドゲル〉
アクリルアミドゲルとして、以下の試薬を用いた。
（１）尿素（和光）、
（２）Ｌｏｎｇ  Ｒａｎｇｅｒ  Ｇｅｌ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ用（タカラバイオ株式会社）、
（３）１０ｘＴＢＥ  ｂｕｆｆｅｒ、１０％ＡＰＳ、ＴＥＭＥＤ（和光）、
（４）Ｇｅｎｅ  Ｇｅｌ  Ｅｘｃｅｌ  １２．５／２４Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケアジャパン）、
（５）ＤＮＡ  Ｓｉｌｖｅｒ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケアジャパン）。
【００５１】
〈ＰＣＲ反応液〉
ＰＣＲ反応液として、以下の試薬を用いた。
（１）Ｇｅｎｅ  Ｔａｑ  ＮＴ（和光純薬工業株式会社）もしくはＨｙｂｒｉＰｏｌＴＭ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＢＩＯＬＩＮＥ）、
（２）１ｐｍｏｌ／μｌ  Ｍ１３  Ｆｏｗａｒｄ（−２９）Ｐｒｉｍｅｒ、ＩＲＤ７００もしくはＩＲＤ８００の蛍光標識を含む（日清紡）。
なお、サイズマーカーは、５０−３５０ｂｐ  ＳＩＺＩＮＧ  ＳＴＡＮＤＡＲＤ−ＢＵＬＫ  （ＬＩ−ＣＯＲ）を使用した。本実施例では、ＬＩ−ＣＯＲのプロトコールに基づいて、ゲルと色素マーカーの作成を行った。
【００５２】
〈ＰＣＲ反応液：計１０μｌ〉
ＰＣＲ反応液：計１０μｌは、以下の通りである。
イタリアンライグラス対象品種から抽出したバルクＤＮＡ：１μｌ
１０×Ｇｅｎｅ  Ｔａｑ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｂｕｆｆｅｒ：１μｌ
２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ  Ｍｉｘｔｕｒｅ：０．８μｌ
ｄｄＨ２Ｏ：６．５μｌ
Ｐｒｉｍｅｒ  Ｆｏｒｗａｒｄ（２０ｐｍｏｌ／μｌ）：０．０６μｌ
Ｐｒｉｍｅｒ  Ｒｅｖｅｒｓｅ（２０ｐｍｏｌ／μｌ）：０．３μｌ
Ｍ１３  Ｆｏｒｗａｒｄ（−２９）  Ｐｒｉｍｅｒ：０．３μｌ
Ｇｅｎｅ  Ｔａｑ  ＮＴ（５  ｕｎｉｔ／μｌ）：０．１μｌ
【００５３】
ＢＩＯＬＩＮＥの、ＨｙｂｒｉＰｏｌＴＭ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを使用する場合にも、ＰＣＲ反応液の調整は変わらないようにした。
【００５４】
〈ＰＣＲ条件〉
ＰＣＲ条件は、以下の通りである。
９５℃１分−６５℃１分−７２℃１分３０秒（２サイクル）９５℃１分−６５℃１分−７２℃１分３０秒（１０サイクル。１サイクルごとに６５℃を１℃ずつ下げていく）９５℃１分−５５℃１分−７２℃１分３０秒（３０サイクル）で反応させた。
【００５５】
ＰＣＲ増幅産物は、色素マーカー５μｌを加え、９０℃３分のディネーチャーを行った後、遮光し、氷上で１時間以上静置させることで安定させた後、アクリルアミドゲルを使用して電気泳動を行い、マーカーの増幅を確認した。
【００５６】
本実施例では、あかつき、いなずま、ウヅキアオバ、さちあおば、さつきばれ、シワスアオバ、タチマサリ、タチムシャ、タチワセ、ドライアン、ニオウダチ、ハタアオバ、ハナミワセ、びしゃもん、ミナミアオバ、優春、ワセアオバ、ワセフドウ、ワセユタカの２６品種を、テンプレートとして、使用した。
【００５７】
本実施例では、イタリアンライグラス２６品種それぞれの、バルクしたＤＮＡを１もしくは３〜５サンプルを使用して、電気泳動を行い、同時に比較した。
【００５８】
プライマー「ｇ０８７（０３−１１Ｂ）」を使用し、ＰＣＲを行った。その電気泳動の結果を図１に示す。３５０ｂｐ付近でウヅキアオバに特異的な増幅を示し、ウヅキアオバの識別に有効であることが判明した。
【００５９】
プライマー「Ｂ０６Ｅ０７」を使用し、ＰＣＲを行った。その電気泳動の結果を図２に示す。２３０ｂｐ付近にサチアオバに特異的な増幅を示し、サチアオバの識別に有効であることが判明した。ワセフドウに似たサイズの増幅が見られるため、「Ｄ０５Ｐ０９」を併用する必要がある。
【００６０】
プライマー「Ａ０１Ｅ１５」を使用し、ＰＣＲを行った。その電気泳動の結果を図３に示す。２５５〜３００ｂｐの間でシワスアオバに特異的な増幅を示し、シワスアオバの識別に有効であることが判明した。
【００６１】
プライマー「Ａ１０Ｍ１５」を使用し、ＰＣＲを行った。その電気泳動の結果を図４に示す。２０４〜２３０ｂｐの間でタチマサリに特異的な増幅を示し、タチマサリの識別に有効であることが判明した。
【００６２】
プライマー「Ｂ０２Ｂ０２」を使用し、ＰＣＲを行った。その電気泳動の結果を図５に示す。１４５〜１７５ｂｐの間でタチムシャに特異的な増幅を示し、タチムシャの識別に有効であることが判明した。
【００６３】
プライマー「Ａ０４Ｇ１７」を使用し、ＰＣＲを行った。その電気泳動の結果を図６に示す。２００ｂｐ付近でハタアオバに特異的な増幅を示し、ハタアオバの識別に有効であることが判明した。
【００６４】
プライマー「Ｂ０４Ｃ０８」を使用し、ＰＣＲを行った。その電気泳動の結果を図７に示す。１７５ｂｐ付近でハナミワセに特異的な増幅を示し、ハナミワセの識別に有効であることが判明した。
【００６５】
プライマー「Ａ１０Ｐ１０」を使用し、ＰＣＲを行った。その電気泳動の結果を図８に示す。１２０ｂｐの間でミナミアオバに特異的な増幅を示し、１４５〜１７５ｂｐの間でいなずまに特異的な増幅を示し、ミナミアオバ及びいなずまの識別に有効であることが判明した。
【００６６】
プライマー「Ｂ０４Ｇ２２」を使用し、ＰＣＲを行った。その電気泳動の結果を図９に示す。１７５〜２００ｂｐの間でミナミアオバに特異的な増幅を示し、ミナミアオバの識別に有効であることが判明した。
【００６７】
プライマー「Ａ０３Ｋ０４」を使用し、ＰＣＲを行った。その電気泳動の結果を図１０に示す。２５５〜３００ｂｐの間でワセユタカに特異的な増幅を示し、ワセユタカの識別に有効であることが判明した。
【００６８】
プライマー「ａｇ３３０（３６＿Ｃ０３）」を使用し、ＰＣＲを行った。その電気泳動の結果を図１１に示す。このプライマー対は、あかつき特有の増幅を示し、あかつきの識別に有効であることが判明した。
【００６９】
プライマー「Ｂ０２Ｏ１０」を使用し、ＰＣＲを行った。その電気泳動の結果を図１２に示す。２５５ｂｐ〜３００ｂｐの間でさつきばれに特異的な増幅を示し、さつきばれの識別に有効であることが判明した。
【００７０】
プライマー「Ａ０４Ｇ２０」を使用し、ＰＣＲを行った。その電気泳動の結果を図１３に示す。１２０ｂｐ付近の増幅でドライアンに特異的な増幅を示し、ドライアンの識別に有効であることが判明した。
【００７１】
プライマー「Ａ０３Ｋ１２」を使用し、ＰＣＲを行った。その電気泳動の結果を図１４に示す。２３０ｂｐ付近でびしゃもんに特異的な増幅を示し、びしゃもんの識別に有効であることが判明した。
【００７２】
プライマー「Ｂ０２Ａ０４」を使用し、ＰＣＲを行った。その電気泳動の結果を図１５に示す。１２０〜１７５ｂｐの間で優春に特異的な増幅パターンを示し、優春の識別に有効であることが判明した。
【００７３】
プライマー「Ｄ０５Ｐ０９」を使用し、ＰＣＲを行った。その電気泳動の結果を図１６に示す。２５５〜３００ｂｐの間でワセフドウに特異的な増幅を示し、ワセフドウの識別に有効であることが判明した。
【００７４】
プライマー「Ｄ０２Ｃ１０」を使用し、ＰＣＲを行った。その電気泳動の結果を図１７に示す。１２０〜１４５ｂｐの間でアキアオバに特異的な増幅を示し、アキアオバの識別に有効であることが判明した。
【００７５】
プライマー「ＣＩ７１（ＳＲＳＣ＿００３）」を使用し、ＰＣＲを行った。その電気泳動の結果を図１８に示す。このプライマー対は、エースに特異的な増幅を示し、エースの識別に有効であることが判明した。
【００７６】
プライマー「Ｂ０７Ｐ１８」を使用し、ＰＣＲを行った。その電気泳動の結果を図１９に示す。２００〜２３０ｂｐの間でヒタチヒカリに特異的な増幅を示し、ヒタチヒカリの識別に有効であることが判明した。
【００７７】
プライマー「Ａ０３Ｍ１６」を使用し、ＰＣＲを行った。その電気泳動の結果を図２０に示す。２００ｂｐ付近でミユキアオバに特異的な増幅を示し、ミユキアオバの識別に有効であることが判明した。
【００７８】
プライマー「Ｂ０１Ａ０７」を使用し、ＰＣＲを行った。その電気泳動の結果を図２１に示す。１４５〜１７５ｂｐの間でタチサカエに特異的な増幅パターンを示し、タチサカエの識別に有効であることが判明した。
【００７９】
プライマー「ＩＲｇＳＳＲ００５」を使用し、ＰＣＲを行った。その電気泳動の結果を図２２に示す。２３０ｂｐ付近でマンモスＢに特異的な増幅を示し、マンモスＢの識別に有効であることが判明した。本発明に係る特定のプライマー対を用いてＰＣＲ増幅した特定マーカー遺伝子の塩基配列を、配列表の配列番号４５〜６４に示すとともに、図２３〜２８に示す。
【産業上の利用可能性】
【００８０】
以上詳述した通り、本発明は、イタリアンライグラスの品種識別に有用なＳＳＲプライマー対とその利用に係るものであり、本発明によれば、イタリアンライグラスの品種を識別するＳＳＲマーカーを提供することができる。本発明により、単数又は複数のプライマー対を使用したＰＣＲにより識別対象の遺伝子を増幅させ、そのマーカーのサイズ及びバンドパターンを検証することにより、イタリアンライグラスの２６品種での品種識別を行うことができる。本発明は、イタリアンライグラス品種識別用プライマー対、特定マーカー遺伝子及びイタリアンライグラスの品種識別方法を提供するものとして有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【配列表】
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