(57)【要約】      （修正有）【課題】サルの新規薬物代謝酵素を提供する。【解決手段】（ａ）特定のアミノ酸配列からなるタンパク質、または（ｂ）特定のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列からなり、薬物代謝酵素であるタンパク質、タンパク質をコードする遺伝子、遺伝子を含む組換えベクター、組換えベクターを含む形質転換体、タンパク質に対する抗体、更にタンパク質と被検物質とを接触させる工程を含む被検物質の代謝に対する、前記タンパク質の関与の有無を測定する方法。及び、被検物質のサルまたはヒトにおける薬効、代謝および／または安全性を予測する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質。
（ａ）配列番号５で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号５で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列からなり、薬物代謝酵素であるタンパク質。
【請求項２】
請求項１に記載のタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項３】
請求項２に記載の遺伝子を含む組換えベクター。
【請求項４】
請求項３に記載の組換えベクターを含む形質転換体。
【請求項５】
請求項１に記載のタンパク質に対する抗体。
【請求項６】
請求項１に記載のタンパク質と被検物質とを接触させる工程を含む、
前記被検物質の代謝に対する、前記タンパク質の関与の有無を測定する方法。
【請求項７】
サルをモデル動物として、被検物質の薬効、代謝および／または安全性を試験する工程、
請求項１に記載のタンパク質と被検物質とを接触させて、前記タンパク質の関与の有無を測定する工程、
を含む、前記被検物質のサルまたはヒトにおける薬効、代謝および／または安全性を予測する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サルの新規薬物代謝酵素に関する。
【背景技術】
【０００２】
薬物代謝には、チトクロムＰ４５０（ＣＹＰ）と呼ばれるヘム酵素である薬物代酵素が深く関与していることがよく知られている。ＣＹＰは遺伝子ファミリーを形成しており、ヒトではこれまでに５７種類のＣＹＰ機能遺伝子と５８種類の偽遺伝子の存在が報告され、他の哺乳動物もそれぞれ数十種類のＣＹＰ遺伝子を有することが知られている。各ＣＹＰの構造は極めて類似しているが、基質や代謝活性がそれぞれ異なっている。
ＣＹＰは、アミノ酸配列の相同性に基づいて分類され、各ＣＹＰは、例えば「ＣＹＰ１Ａ１」というようにＣＹＰに続けてファミリー名（数字）、サブファミリー名（アルファベット）、固有名（数字）を表記することによって特定される。
【０００３】
新薬の開発過程において、ヒト臨床試験への外挿性を高めるために、薬物代謝パターンが、ヒトと非常に似ていると考えられているカニクイザルなどのサルをモデル動物として用いた薬物動態試験、薬効試験、安全性試験等の非臨床試験が広く行われている。
しかしながら、最近一部の薬物については、サルの代謝パターンがヒトの代謝パターンと異なる場合があるとの報告がなされている（非特許文献１〜４）。
【０００４】
また、特許文献１には、ＣＹＰの分子種ごとに基質が異なるとともに、最近では、各ＣＹＰの遺伝子多型によって代謝活性や基質特異性が異なることが報告されている。そして、ヒトでは個人差をもとにしたオーダーメイド医療を目指して、ＣＹＰの分子種や多型と代謝活性に関する研究が進められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００４−４号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Nartimatsu S. et al., Chem Biol Interact (2000) 127:73-90
【非特許文献２】Sharer JE. et al., Drug Metab Dispos (1995) 23:1231-1241
【非特許文献３】Stevens JC. et al., Drg Metab Dispos (1993) 21:753-760
【非特許文献４】Weaver RJ. et al., Xenobiotica (1999) 29:467-482
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
モデル動物を使用して代謝試験等を行う場合も、ヒトＣＹＰとモデル動物ＣＹＰとの相違、モデル動物間の多型等を考慮することによって、試験結果の意味をより的確に評価し、有効に活用することができると考えられる。例えば、ヒトとカニクイザルとで代謝パターンが大きく異なり、カニクイザルにおいて大きな副作用を生じさせる医薬品候補化合物があった場合、代謝パターンの相違がヒトとカニクイザルのＣＹＰの違いに起因することが判明し、ヒトにおいて同様の副作用が生じないことを確認することができれば、その化合物の開発を無駄に停止することなく、ヒト用の医薬品として開発を継続、促進できる可能性がある。しかしながら、カニクイザルやアカゲザルで種差の原因となるようなＣＹＰ分子種の探索は、あまり行われていないのが実状である。
そこで、本発明は、ヒトとサルとで、薬物の代謝パターンの異なる原因となる新規なサルの薬物代謝酵素を提供することを目的とする。
また、これらの点については、サルモデル間においてもＣＹＰの違いに起因することが判明する場合もあり、サル間においても、薬物の代謝パターンの異なる原因となる新規なサルの薬物代謝酵素を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、サルとヒトとの薬物の代謝パターンの相違を明らかにすることを目的として、また、異種のサルの薬物の代謝パターンの相違を明らかにすることをも目的として、さらに、同種のサルの薬物の代謝パターンの相違を明らかにすることをも目的として、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、特有に発現している新規な薬物代謝酵素を見出し、本発明を完成した。
【０００９】
即ち、本発明は、以下のとおりである。
［１］
以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質。
（ａ）配列番号：１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、および配列番号５からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、および配列番号５からなる群から選択されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列からなり、薬物代謝酵素であるタンパク質。
［２］
［１］に記載のタンパク質をコードする遺伝子。
［３］
［２］に記載の遺伝子を含む組換えベクター。
［４］
［３］に記載の組換えベクターを含む形質転換体。
［５］
［１］に記載のタンパク質に対する抗体。
［６］
［１］に記載のタンパク質と被検物質とを接触させる工程を含む、
前記被検物質の代謝に対する、前記タンパク質の関与の有無を測定する方法。
［７］
サルをモデル動物として、被検物質の薬効、代謝および／または安全性を試験する工程、
［１］に記載のタンパク質と被検物質とを接触させて、前記タンパク質の関与の有無を測定する工程、
を含む、前記被検物質のサルまたはヒトにおける薬効、代謝および／または安全性を予測する方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明は、新規なサルの薬物代謝酵素を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】配列番号１で示されるアカゲザルのＣＹＰ２Ｃ９３のアミノ酸配列を示す。
【図２】配列番号２で示されるカニクイザルのＣＹＰ２Ｃ９３のアミノ酸配列を示す。
【図３】配列番号３で示されるアカゲザルのＣＹＰ１Ｄ１のアミノ酸配列を示す。
【図４】配列番号４で示されるカニクイザルのＣＹＰ１Ｄ１のアミノ酸配列を示す。
【図５】配列番号５で示されるカニクイザルのＣＹＰ２Ｇ２のアミノ酸配列を示す。
【図６】配列番号６で示されるアカゲザルのＣＹＰ２Ｃ９３のｃＤＮＡの塩基配列を示す。
【図７】配列番号７で示されるカニクイザルのＣＹＰ２Ｃ９３のｃＤＮＡの塩基配列を示す。
【図８】配列番号８で示されるアカゲザルのＣＹＰ１Ｄ１のｃＤＮＡの塩基配列を示す。
【図９】配列番号９で示されるカニクイザルのＣＹＰ１Ｄ１のｃＤＮＡの塩基配列を示す。
【図１０】配列番号１０で示されるカニクイザルのＣＹＰ２Ｇ２のｃＤＮＡの塩基配列を示す。
【図１１】配列番号１１で示されるカニクイザルのＣＹＰ２Ｃ９３  ＳＶ１の塩基配列を示す。
【図１２】配列番号１２で示されるカニクイザルのＣＹＰ２Ｃ９３  ＳＶ２の塩基配列を示す。
【図１３】アカゲザルのｍｍＣＹＰ２Ｃ９３とカニクイザルのｍｆＣＹＰ２Ｃ９３のアミノ酸配列のｃＤＮＡ塩基配列から推測されるアミノ酸配列のマルチプル・アライメントを示す。破線で示している領域は、ＣＹＰに共通に存在するヘム結合領域と推定される領域である。ＳＲＳ−１〜ＳＲＳ−６として示される領域は、基質認識部位を示す。アスタリスク（＊）は、ｍｍＣＹＰ２Ｃ９３とｍｆＣＹＰ２Ｃ９３とで、アミノ酸配列が共通している部分を示す。
【図１４】ヒト（ｈ）、ラット（ｒ）、アカゲザル（ｍｍ）およびカニクイザル（ｍｆ）のＣＹＰ２Ｃアミノ酸配列と、カニクイザルｍｆＣＹＰ２Ｃ９３およびアカゲザルｍｍＣＹＰ２Ｃ９３のアミノ酸配列を使用して描いた分子進化系統樹を示す。ＣＹＰ２Ｃ９３は、いずれのヒトＣＹＰ２Ｃとも１対１の関係にはならず、ＣＹＰ２Ｃ９３がヒトには存在しない分子種である可能性が示唆された。
【図１５】肝由来のＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ産物の電気泳動の結果を示す。ＣＹＰ２Ｃ９３転写物として、ＳＶ１は通常の転写物を意味し、ＳＶ２は異常転写物を意味する。  アカゲザル（Ｎｏ．２，３，９）において、ＳＶ１とＳＶ２の双方が転写されており、カニクイザルでは、ＳＶ２のみが転写されている。
【図１６】肝由来のＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ産物の電気泳動の結果を示す。ＣＹＰ２Ｃ９３転写物として、ＳＶ１は通常の転写物を意味し、ＳＶ２は異常転写物を意味する。  アカゲザルにおいてはＳＶ１が転写されており、カニクイザルにおいては、ＳＶ１とＳＶ２の双方が転写されていることが確認できる。ただし、ここで検出されるカニクイザルＳＶ１は、エクソン１に１塩基欠損があるため、ｎｏｎ−ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌな転写物である。
【図１７】ＣＹＰ２Ｃ遺伝子の遺伝子座を示す。ＣＹＰ２Ｃ９３遺伝子は、ゲノム上に遺伝子が存在し、ＣＹＰ２Ｃ７６と共にＣＹＰ２Ｃ遺伝子クラスターの末端の、ヒトゲノムにおいては、ｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃ領域に該当する部分に位置していた。また、ＣＹＰ２Ｃ９３遺伝子に対応する、ヒトＣＹＰ遺伝子は存在していなかった。
【図１８】ＣＹＰ２Ｃ９３のｍＲＮＡ発現の組織分布を示す。ＣＹＰ２Ｃ９３のｍＲＮＡは、調べた１０種類の組織の中では肝臓で最も高く発現していた。また、肝臓以外でも、脳と精巣でも発現していることが確認された。
【図１９】ウェスタンブロットの結果を示す。
【図２０】図２０Ａは、ＳＶ１（ａ）とＳＶ２（ｂ）のエクソン１〜エクソン３のＣＹＰ２Ｃ９３遺伝子フラグメントを含むｍｉｎｉ  ｇｅｎｅ  ｐｌａｓｍｉｄの模式図を示す。図２０Ｂは、アガロースゲル上で可視化させた増幅産物を示す。図２０Ｂにおいて、レーン１と２は、参照実験を示す。レーン１は、ＳＶ１を発現しているカニクイザルの肝臓ＲＮＡを用いたＲＴ−ＰＣＲの結果を示し、レーン２は、ＳＶ１を発現しているアカゲザルの肝臓ＲＮＡを用いたＲＴ−ＰＣＲの結果を示す。レーン３は、ＩＶＳ２−１ＧのカニクイザルCYP2C９３発現プラスミドをＣＯＳ１にトランスフェクションし抽出したＲＮＡを用いて行ったＲＴ−ＰＣＲの結果を示し、それぞれ、レーン４は、ＩＶＳ２−１Ｔのカニクイザル、レーン５は、ＩＶＳ２−１Ｇのアカゲザル、レーン６は、ＩＶＳ２−１ＴのアカゲザルのＣＹＰ２Ｃ９３発現プラスミドを用いた場合の結果を示す。レーン７は、コントロール・ベクター（ネガティブコントロール）の結果を示す。図２０Ｃは、イントロン１とエクソン２の境界およびイントロン２とエクソン３の境界を示す。ＳＶ１とＳＶ２におけるエクソン配列はｂｏｘで囲み、IＶＳ−１Ｇ＞Ｔの変異は下線で示した。
【図２１】カニクイザル（ｍｆ）およびアカゲザル（ｍｍ）のＣＹＰ１Ｄ１と、ヒト（ｈ）のＣＹＰ１Ｄ１Ｐのアミノ酸配列のマルチプル・アライメントを示す。破線で示している領域は、ＣＹＰに共通に存在するヘム結合領域と推定される領域である。ＳＲＳ−１〜ＳＲＳ−６として示される領域は、基質認識部位を示す。アスタリスク（＊）は、ｍｍＣＹＰ１Ｄ１とｍｆＣＹＰ１Ｄ１とｈＣＹＰ１Ｄ１Ｐで、アミノ酸配列が共通している部分を示す。
【図２２】ヒト（ｈ）、ニホンザル（ｍｆｕ）、マーモセット（ｃｊ）、イヌ（ｄ）、ゼブラフィッシュ（ｚ）、アカゲザル（ｍｍ）およびカニクイザル（ｍｆ）のＣＹＰ１ファミリーのアミノ酸配列を使用して作成した分子進化系統樹を示す。アカゲザルとカニクイザルのＣＹＰ１Ｄ１は、ヒトのＣＹＰ１Ｄ１Ｐと1対1の関係にあることが確認された。
【図２３】ＣＹＰ１Ｄ１遺伝子の遺伝子座を示す。ＣＹＰ１Ｄ１遺伝子は、ＴＭＣ１、ＡＬＤＨ１Ａ１、およびＡＮＸ１に隣接して位置しており、その位置はサルとヒトで保存されている。
【図２４】カニクイザルＣＹＰ１Ｄ１のｍＲＮＡ発現の組織分布を示す。ＣＹＰ１Ｄ１のｍＲＮＡの発現量を１としたときの相対値で示す。
【図２５】肝ミクロソームでのＣＹＰ１Ｄ１のウェスタンブロットの結果を示す。
【図２６】カニクイザル（ｍｆ）、マウス（ｍ）、ラット（ｒ）およびウサギ（ｒａｂ）のＣＹＰ２Ｇ２とヒト（ｈ）のＣＹＰ２Ｇ２Ｐのアミノ酸配列のマルチプル・アライメントを示す。破線で示している領域は、ＣＹＰに共通に存在するヘム結合領域と推定される領域である。ＳＲＳ−１〜ＳＲＳ−６として示される領域は、基質認識部位を示す。アスタリスク（＊）は、アミノ酸配列が共通している部分を示す。
【図２７】ヒト（ｈ）およびカニクイザル（ｍｆ）のＣＹＰ２ファミリーのアミノ酸配列を使用して作成した分子進化系統樹を示す。
【図２８】カニクイザルとアカゲザルＣＹＰ２Ｇ２遺伝子のエクソン１およびエクソン３におけるシークエンスの結果を示す。ヒト遺伝子におけるナンセンス変異も示す。
【図２９】ＣＹＰ２Ｇ２のｍＲＮＡ発現の組織分布を示す。ＣＹＰ２Ｇ２のｍＲＮＡの鼻粘膜での発現量を１としたときの相対値で示す。
【図３０】鼻粘膜ミクロソームでのＣＹＰ２Ｇ２のウェスタンブロットの結果を示す。
【図３１】配列番号９６で示されるカニクイザルのＴを挿入したＣＹＰ２Ｃ９３  ＳＶ２の塩基配列を示す。
【図３２】配列番号９７で示されるカニクイザルのＴ欠損のＳＶ１とＳＶ２のアミノ酸配列を示す。
【図３３】配列番号９８で示されるカニクイザルのＴを挿入したＣＹＰ２Ｃ９３のＳＶ２のアミノ酸配列を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明を実施するための形態を詳細に説明する。なお。本発明は、以下の実施の形態に限定されるものではなく、その要旨の範囲内で種々変形して実施することができる。
【００１３】
本発明のタンパク質は、サル特異的に機能している薬物代謝酵素である。中でも、カニクイザル、アカゲザル、ニホンザル等のマカク属が属する旧世界ザルや、マーモセット等の新世界ザルに特異的な薬物代謝酵素である。
カニクイザル、アカゲザルから同定された新規ＣＹＰタンパク質のアミノ酸配列を配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５として示し、これらのアミノ酸配列を有するタンパク質は、カニクイザルまたはアカゲザルの肝臓または鼻粘膜のＲＮＡを用いて逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）によりその存在が見出されたタンパク質である。
これら新規ＣＹＰタンパク質は、新規ＣＹＰタンパク質をコードする遺伝子を適当なベクターに挿入し、このベクターを用いて宿主を形質転換することによって発現させ、得ることができる。
【００１４】
これら新規ＣＹＰタンパク質は、ヒトでは発現していないか、発現したとしても機能を持たないが、サルでは発現しているため、サルにおけるヒトとは異なる薬物の代謝パターンを確認する指標となる薬物代謝酵素である。例えば、サル特異的な薬物代謝酵素が、ある種の薬物に対する代謝活性を有する場合は、当該薬物に対する代謝パターンが、サルとヒトとにおいて異なる可能性が示唆され、サルでの特定的な薬物代謝を強く示唆することを意味する。このことは、サル間においても同様であり、特定のサルにおける特異的な薬物代謝を強く示唆することを意味する。
【００１５】
本発明のタンパク質は、それが薬物代謝酵素であって、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパクと同一の機能を有する限り、配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個（例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個）のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されている等の変異が生じていてもよい。またこれらの変異は、自然に発生したものであってもよく、人為的に改変したものであってもよい。
本発明のタンパク質は、それが薬物代謝酵素であって、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパクと同一の機能を有する限り、配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個（例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個）のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されている等の変異が生じていてもよい。またこれらの変異は、自然に発生したものであってもよく、人為的に改変したものであってもよい。
本発明のタンパク質は、それが薬物代謝酵素であって、配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるタンパクと同一の機能を有する限り、配列番号３に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個（例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個）のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されている等の変異が生じていてもよい。またこれらの変異は、自然に発生したものであってもよく、人為的に改変したものであってもよい。
本発明のタンパク質は、それが薬物代謝酵素であって、配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるタンパクと同一の機能を有する限り、配列番号４に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個（例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個）のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されている等の変異が生じていてもよい。またこれらの変異は、自然に発生したものであってもよく、人為的に改変したものであってもよい。
本発明のタンパク質は、それが薬物代謝酵素であって、配列番号５に記載のアミノ酸配列からなるタンパクと同一の機能を有する限り、配列番号５に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個（例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個）のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されている等の変異が生じていてもよい。またこれらの変異は、自然に発生したものであってもよく、人為的に改変したものであってもよい。
【００１６】
本発明の遺伝子は、本発明のタンパク質である新規ＣＹＰタンパク質をコードする遺伝子であって、ＤＮＡであってもよくＲＮＡであってもよい。また、本発明の遺伝子は、新規ＣＹＰタンパク質をコードする遺伝子であれば、構造遺伝子の状態で存在していてもよく、ｃＤＮＡとして存在していてもよく、ｍＲＮＡとして存在していてもよい。また、本発明の遺伝こは、ゲノム遺伝子であってもよく、人為的に作成したベクターにあってもよい。
本発明の遺伝子は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、または配列番号５に記載のアミノ酸配列をコードする遺伝子であるか、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されている等の変異が生じているアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。
新規ＣＹＰタンパク質をコードする遺伝子として、例えば、配列番号６−１０として記載されるｃＤＮＡであってもよく、配列番号６−１０として記載されるｃＤＮＡに相補的な遺伝子であってもよく、また、配列番号６−１０として記載されるｃＤＮＡが存在する全長のゲノム配列であってもよい。
【００１７】
また、本発明に係る遺伝子は、配列番号６−１０に記載の塩基配列若しくはその一部からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡ配列をストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、薬物代謝酵素であるタンパク質をコードするサル由来の遺伝子も含む。
ストリンジェントな条件とは、例えば、５％Ｄｅｎｈａｒｄｔ'ｓ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（０．１％Ｆｉｃｏｌｌ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％ウシ血清アルブミンを含む）と、０．５％ＳＤＳと、１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡを含む６×ＳＳＣ溶液（１×ＳＳＣは０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、１５ｍＭ  クエン酸ナトリウム）中において６５℃で洗浄する条件をいう。ストリンジェンシーは塩濃度（イオン強度）、温度等によって制御することができ、ストリンジェンシーがより高い条件、即ち塩濃度がより低く、温度がより高い条件では、相同性が十分に高いＤＮＡのみがハイブリダイズする。従って、かかる条件下で、配列番号６−１０に記載の塩基配列若しくはその一部からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡ配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡがコードするタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１−５に記載のアミノ酸配列と、それぞれ、高い相同性を有し、同一の機能を有するものと考えられる。当業者であれば、温度や塩濃度を調製することによって、ストリンジェントな条件を適宜選択することができる。
【００１８】
本発明のタンパク質および遺伝子は、そのアミノ酸配列、塩基配列および／または機能により本発明に含まれると解される限り、その由来は限定されないが、好ましくはサル由来であり、さらに好ましくは、カニクイザルまたはアカゲザル由来である。
【００１９】
本発明の組換えベクターは、上記遺伝子を含む組換えベクターであり、ベクターに本発明の遺伝子を挿入することにより、斯かる組換えベクターを提供することができる。
本発明の遺伝子を挿入するベクターとしては、挿入した遺伝子を安定に保持するものであれば、特に限定されず、例えば、大腸菌由来のプラスミド（例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５）、枯草菌由来のプラスミド（例えば、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５）、酵母由来のプラスミド（例えば、ｐＳＨ１９、ｐＳＨ１５）、λファージ系やＭ１３ファージ系などのバクテリオファージ、ＳＶ４０、パピローマウイルス、ワクシニアウイルス、レトロウイルス、バキュロウイルスなどのウイルスベクターなどが挙げられる。
ベクターには、宿主内で、本発明のタンパク質が効率よく発現されるよう、宿主に適した、プロモータ配列、エンハンサー配列、シャインダルガーノ配列、シグナル配列、ポリＡシグナルなどを適宜選択し、これら配列を挿入することができる。
【００２０】
本発明の遺伝子をベクターへ挿入する方法は、従来公知の方法を用いることができ、特に限定されず、例えば、制限酵素を用いてベクターを切断し、リガーゼ反応によって、遺伝子を該切断部位に連結する方法などが挙げられる。
【００２１】
本発明の形質転換体は、上記組換えベクターを含む形質転換体であり、組換えベクターを用いて形質転換させることにより、斯かる形質転換体を提供することができる。
組換えベクターを導入する宿主としては、特に限定されず、例えば、大腸菌や緑膿菌などのグラム陰性菌、枯草菌などのグラム陽性菌、放線菌、酵母、糸状菌、動植物培養細胞、昆虫培養細胞などが挙げられ、中でも大腸菌が好ましい。
ベクターの導入方法としては、宿主が大腸菌である場合には塩化カルシウム法、枯草菌を宿主とする場合にはコンピテントセル法や酢酸リチウム法、枯草菌、放線菌、酵母などにはプロトプラスト法、動植物細胞、酵母、細菌などに広く用いられる方法としてリン酸カルシウム共沈法、エレクトロポレーション法、ＤＥＡＥ−デキストランやポリブレンなどのポリマーと複合体を形成させる方法などから適宜選択することができる。カチオン性脂質のリポソームと複合体を形成させるリポフェクトアミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いることもできる。
【００２２】
本発明の形質転換体を培養することにより本発明のタンパク質を製造することができる。形質転換体の培養は、宿主細胞の特性、発現するタンパク質の特性、プロモータの特性などにより選択することができ、特に限定されず、例えば、ＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、Ｗｉｌｌｉａｍｓ  Ｅ培地（Ｇｉｂｃｏ）等の公知の培地を使用することができる。また、例えば抗生物質耐性を有するプラスミドを用いた場合は、当該抗生物質を培地に添加することにより目的タンパク質の発現を調節することができ、またラクトース依存性プラスミドを使用した場合はＩＰＴＧを培地に添加して発現を誘導することができる。
形質転換体を培養して発現させることにより製造される本発明のタンパク質は、通常のタンパク質の精製方法を用いて精製することができ、例えば、クロマトグラフィー、限外濾過法、塩析、浸透圧ショック法、超音波処理などの公知のタンパク質の精製方法を組み合わせて精製することができる。
クロマトグラフィー法としては、例えば、水溶液中で行うイオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、疎水クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、有機溶媒を用いる逆相クロマトグラフィーなどが挙げられる。
発現させたタンパク質は、精製前または精製後に適当なタンパク質修飾酵素を用いて修飾を加えたり部分的にペプチドを除去したりすることもできる。
タンパク質修飾酵素としては、トリプシン、キモトリプシン、プロテインキナーゼやグルコシダーゼなどが挙げられる。
【００２３】
本発明の形質転換体は、上記組換えベクターを含む形質転換体であり、組換えベクターを用いて形質転換させることにより、斯かる形質転換体を提供することができる。
本発明の抗体は、本発明のタンパク質に対する抗体であり、新規ＣＹＰタンパク質、新規ＣＹＰと機能的に同質なタンパク質、例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、または配列番号５に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列からなり、薬物代謝酵素であるタンパク質、またはそれらの部分ペプチドに特異的に結合する抗体であればよく、ポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよい。
ヒト以外の哺乳動物を本発明のタンパク質で免疫することによって得た非ヒト抗体のほか、ヒト化抗体や、遺伝子組換えにより得られた抗体であってもよい。また、本発明のタンパク質を認識する抗体であれば、キメラ抗体であってもよく、認識部位のみを有するＦａｂなどの抗体であってもよい。
【００２４】
本発明の抗体は、公知またはそれに準じた方法により製造することができるが、以下に代表的方法を例示する。
ポリクローナル抗体は、新規ＣＹＰタンパク質またはその部分ペプチドを用いて哺乳動物、好ましくはマウスやラット等のげっ歯目、ウサギ目、サルなどの霊長目の動物を免疫し、血清を得て、この血清を新規ＣＹＰタンパク質またはその部分ペプチドを固定したアフィニティーカラムに通して精製することにより得ることができる。
モノクローナル抗体は、ポリクローナル抗体の製造方法と同様に、新規ＣＹＰタンパク質またはその部分ペプチドを用いて哺乳動物を免疫し、この動物から得た抗体産生細胞と、増殖力の強いミエローマ細胞とを融合させ、個々の融合（ハイブリドーマ）細胞を分離し、求める抗体の生産能を検定することによって抗原の一つのエピトープに特異的に反応する抗体分子を1種だけ生産する細胞を選択し、この細胞を培養することによって製造することができる。また、モノクローナル抗体は、モノクローナル抗体のアミノ酸配列をコードする遺伝子をベクターに挿入し、このベクターを宿主に導入して産生させて遺伝子工学的方法で得ることもできる。ヒト抗体遺伝子を導入したトランスジェニック動物を免疫すれば、ヒト抗体を産生することもでき、マウスのモノクローナル抗体の抗原結合部位をコードするｃＤＮＡとヒトのＩｇＧ遺伝子の定常部をコードする遺伝子を連結してこれをＢリンパ球に導入すればキメラ抗体分子を生産させることもできる。
【００２５】
本発明の抗体は、本発明のタンパク質を特異的に認識して結合する限り、フラグメントや修飾された抗体であってもよい。抗体のフラグメントとしては例えば、Ｆ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ'）２、またはｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎＦｖなどが挙げられ、修飾された抗体としては例えばポリエチレングリコールなどの化合物と結合された抗体などが挙げられる。
本発明の抗体は、新規ＣＹＰタンパク質の精製や検出、定量に用いることができるし、また新規ＣＹＰタンパク質の生物学的活性を亢進または抑制する作用を有する場合には、アゴニストまたはアンタゴニストとなりうる。
【００２６】
本発明の新規ＣＹＰタンパク質は、サル特有のタンパク質であるため、新規ＣＹＰタンパク質が代謝に関与する化合物については、サルとヒトにおいて代謝パターンが異なる可能性が高い。
斯かる新規ＣＹＰタンパク質の特性を利用することにより、医薬品候補化合物などの被検物質のサルを用いた薬効、代謝および／または安全性のｉｎ  ｖｉｖｏ試験を行う前に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、新規ＣＹＰタンパク質が当該被検物質の薬物代謝に関与するかどうかを確認することにより、サルでの被検物質の薬効、代謝および／または安全性を予測することができる。また、サル特有に被検物質が代謝される場合には、サルをモデル動物として試験することの可否を評価することができる。例えば、新規ＣＹＰタンパク質が、当該被検物質の代謝に深く関与していれば、当該被検物質のヒトにおける代謝はサルと大きく異なる可能性が示唆され、サルをモデル動物として試験を行うことは望ましくないものと評価される。また、サルでの薬物代謝試験結果と、他の動物での薬物代謝試験結果を比較して、サルでの薬物代謝の特異性を検証することができる。
一方、新規ＣＹＰタンパク質が、当該物被検物質の代謝に関与していない場合は、当該被検物質はヒトと相同性の高い別の代謝酵素によって代謝される可能性が示唆され、サルをモデル動物とした試験の結果を利用して、ヒトにおける薬効、代謝および／または安全性を類推することが可能と考えられる。
このように新規ＣＹＰタンパク質を用いることによって、無駄な試験を省略し、試験を迅速化することも可能である。
【００２７】
また、ヒトとサルにおいて代謝パターンが異なる薬物は、新規ＣＹＰタンパク質がその代謝に関与している可能性が高いことが推測される。そこで、ヒトとサルにおいて代謝パターンが異なる被検物質を新規ＣＹＰタンパク質と接触させ、適当な条件でインキュベートし、新規ＣＹＰタンパク質の当該被検物質の代謝への関与を測定することによって、この代謝パターンの相違の原因を評価することが可能である。
このような方法により、代謝パターンの相違が新規ＣＹＰタンパク質に起因することがわかれば、サルをモデル動物とした試験結果に拘束されて試験を無駄に停止することなく、試験を継続、迅速化することが可能である。
【００２８】
本発明は、上述したように、本発明のタンパク質と被検物質とを接触させる工程を含む、前記被検物質の代謝に対する、前記タンパク質の関与の有無を測定する方法を提供する。また、本発明は、サルをモデル動物として、被検物質の薬効、代謝および／または安全性を試験する工程、本発明のタンパク質と被検物質とを接触させて、前記タンパク質の関与の有無を測定する工程、を含む、前記被検物質のサルまたはヒトにおける薬効、代謝および／または安全性を予測する方法を提供する。
【００２９】
本発明においては、サルとヒトとの薬物代謝パターンの相違を測定するのみならず、上述のサルとヒトとの薬物代謝パターンの相違を測定する方法に準じて、異種のサル間の薬物代謝パターンの相違や、同種のサル間の薬物代謝パターンの相違を測定することもできる。
【００３０】
本発明の新規ＣＹＰタンパク質、遺伝子、組換えベクター、形質転換体、抗体は、サルをモデル動物とした、ヒト用の医薬品候補化合物についての薬効、代謝および／または安全性を試験の評価に用いられるキットとして用いてもよい。キットには、新規ＣＹＰタンパク質が被検物質を代謝するのに必要な試薬、容器、装置などを含んでいてもよい。このようなキットは、サルをモデル動物とした試験結果と略同様の結果がヒトにおける試験でも得られるかどうかの推測や、ヒトとサルとにおいて試験結果が異なる場合の原因の究明、あるいは、サルをモデル動物として試験をすることの是非の検討などに用いることができる。
【実施例】
【００３１】
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【００３２】
実施例１：ＣＹＰ２Ｃ９３
（ＲＮＡの抽出）
組織サンプル（脳、肺、心臓、肝臓、腎臓、副腎、空腸、精巣、卵巣、および子宮）を、４−５歳齢の３−５ｋｇのカニクイザルのオス、メス３個体からそれぞれ採取した。
採取した各サンプルは、採取直後に液体窒素により凍結した。凍結サンプルは、まず、乳鉢で磨り潰し、次いで、Ｐｏｌｙｔｒｏｎ  ＰＴ１２００Ｅ（Ｋｉｎｅｍａｔｉｃａ）を用いて、ＴＲＩｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中でホモジナイズした。ＴＲＩｚｏｌの使用説明書に従って全ＲＮＡを抽出した。抽出した全ＲＮＡは、ＤＮａｓｅ  Ｉ（Ｔａｋａｒａ）で処理した後、ＧｅｎＥｌｕｔｅ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）により精製した。得られたＲＮＡは、（Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲ）において用いた。
同様にして、７歳齢の３−５ｋｇのアカゲザル１１個体および４−５歳齢の３−５ｋｇのカニクイザル８個体の肝臓に由来する全ＲＮＡ（肝臓由来の全ＲＮＡ）を抽出した。得られたＲＮＡは、ＣＹＰ２Ｃ９３の転写バリアントの発現を分析するために、転写解析において用いた。
【００３３】
（ゲノムＤＮＡの抽出）
７歳齢の３−５ｋｇのアカゲザル２個体および４−５歳齢の３−５ｋｇのカニクイザル１４１個体の全血液サンプルから、製造者の使用説明書に従って、ＰＵＲＥＧＥＮＥ(登録商標)  ＤＮＡ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  (Ｇｅｎｔｒａ  Ｓｙｓｔｅｍｓ)を用いて、ゲノムＤＮＡを調製した。
【００３４】
（ｃＤＮＡのクローニング）
Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＲＴ−ＰＣＲ）は、カニクイザルおよびアカゲザルから抽出された肝臓由来の全ＲＮＡを用いて行った。
総ＲＮＡ量１μｇ、オリゴ（ｄＴ）プライマー（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、およびＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＲＴ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む混合物中、３７℃で１時間反応させて、一本鎖ｃＤＮＡを調製した。
続いて、調製した一本鎖ｃＤＮＡをテンプレートとして用い、ＫＯＤ  Ｐｌｕｓ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡）を用いて、サーマルサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に添付の製造者の使用説明書に従って、ＰＣＲを行った。
ＰＣＲの反応条件は、初期変性反応を９５℃で２分間行い、９５℃で２０秒、５８℃で２０秒、７２℃で２分間の３５サイクルで行った。最終伸長反応を７２℃で１０分間行った。
プライマーとしては、
ｍｍＣＹＰ２Ｃｖ４（５ｒｔ１）  5’-ATGTCTGGAGAAGAGAAGGC-3’（配列番号１３）
および
ｍｍＣＹＰ２Ｃｖ４（３ｒｔ２）  5’-GACTTGCAGGTGACAAAAGATCA-3’（配列番号１４）
を用いた。
これらプライマーは、アカゲザルゲノム上に見出したＣＹＰ２Ｃ様配列をもとにデザインしたものである。
該ＣＹＰ２Ｃ様配列は、ヒトＣＹＰ２Ｃ９  ｃＤＮＡ配列を用いて、アカゲザルゲノムについてＧｅｎＢａｎｋのＢＬＡＳＴ解析を行って見出した配列である。
増幅されたｃＤＮＡは、Ａを付加した後、ＴＡＰＯ  ＴＡ  Ｃｌｏｎｏｎｇ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ｐＣＲ２．１ベクターにクローニニグし、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．０  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、インサートのシーケンス反応を行い、得られた産物をＡＢＩ−３７３０  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して泳動し、塩基配列解析を行って塩基配列データを取得した。得られたｃＤＮＡ配列をＣＹＰ２Ｃ９３とした。
【００３５】
なお、５’ＲＡＣＥ（５’  ｒａｐｉｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  ｅｎｄｓ）を行い、翻訳開始点が正しいことを確認した。
５’ＲＡＣＥは以下のプライマーを用い、上記ＰＣＲ反応と同様にして行った。
ｍｆＣＹＰ２Ｃｖ４（３ｇｓｐ１）  5’-CAACTCCTCCACAATAC-3’（for RT reaction、配列番号１５）
ｍｆＣＹＰ２Ｃｖ４（３ｇｓｐ２）  5’-CGCAGTCCTCAATGCTTCTCTTA-3’（for the initial PCR、配列番号１６）
ｍｆＣＹＰ２Ｃｖ４（３ｂｔｊ１）  5’-CCAAAATTTCGCAAGGTCAAA-3’（for the nested PCR、配列番号１７）
【００３６】
アカゲザルＣＹＰ２Ｃ９３（ｍｍＣＹＰ２Ｃ９３）の塩基配列（配列番号６）の結果から、該塩基配列は、４９０アミノ酸のＯＲＦを有していた。ＯＲＦ配列から、推測されるアミノ酸配列には、６つの基質認識部位（Gotoh, O. J Biol Chem (1992) 267:83-90）、およびヘム結合部位が存在した。ｍｍＣＹＰ２Ｃ９３のＯＲＦのアミノ酸配列（配列番号１）は、図１および図１３に示す。
一方、カニクイザルＣＹＰ２Ｃ９３（ｍｆＣＹＰ２Ｃ９３）の塩基配列の結果から、２つのｃＤＮＡが確認された（配列番号１１および配列番号１２）。エクソン２の完全長を保持する配列をＳＶ１とし（配列番号１１）、欠いている配列をＳＶ２とした（配列番号１２）。これらは、アカゲザルＣＹＰ２Ｃ９３のｃＤＮＡ配列と＞９９％の相同性を示した。ＳＶ１とＳＶ２のｃＤＮＡの塩基配列は、いずれも、エクソン１に１塩基欠損があり（ｃ．１０２Ｔ＞ｄｅｌ）、フレームシフトおよび中途終止コドンを生じていた。エクソン１の１塩基欠損（ｃ．１０２Ｔ＞ｄｅｌ）を生じていない場合の、ｍｆＣＹＰ２Ｃ９３のＯＲＦのアミノ酸配列（配列番号２）を、図２および図１３に示す。ただし、ＣＹＰ２Ｃ９３のｃ．１０２Ｔ＞ｄｅｌは、カニクイザルの１個体に確認されただけであり、多くのカニクイザルゲノムには、Ｔ欠損はないと考えられた。
【００３７】
（配列解析）
ＤＮＡＳＩＳ  Ｐｒｏ（Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）およびＧｅｎｔｙｃｓ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）を用いて、得られた塩基配列データを分析した。
ホモロジー・サーチは、ＢＬＡＳＴ  ｐｒｏｇｒａｍ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）によって行った。
ｃＤＮＡ配列から推測されるアミノ酸配列についてＣｌｕｓｔａｌＷプログラムを用いたマルチプル・アライメントを実行し、また、Ｎｅｉｇｈｏｕｒ−ｊｏｉｎｉｎｇ法により分子進化系統樹を作成した。
ヒト、カニクイザル及びアカゲザルＣＹＰ２Ｃサブファミリーのゲノム構造解析のために、ＢＬＡＴプログラム（ＵＣＳＣ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ）を用いた。
マルチプル・アラインメントの結果を図１３に、分子進化系統樹を図１４に示す。また、アカゲザルＣＹＰ２Ｃ９３とＣＹＰ２Ｃｓとの相同性解析結果を表１に示す。
【００３８】
【表１】
2014158479.tif 000002
【００３９】
アカゲザルＣＹＰ２Ｃ９３のアミノ酸配列と、ヒト（Ｈｕｍａｎ）、アカゲザル（Ｒｈｅｓｕｓ）、カニクイザル（Ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ）の他のＣＹＰ２Ｃｓのアミノ酸配列の相同性は、７１−８１％であった。最も相同性の高い配列は、ヒトＣＹＰ２Ｃ８とオーソロガスな、カニクイザルＣＹＰ２Ｃ８と、アカゲザルＣＹＰ２Ｃ７４であった。すなわち、ここで得られたアカゲザルＣＹＰ２Ｃ９３とカニクイザルＣＹＰ２Ｃ９３は、既存のヒトまたはサルのＣＹＰ２Ｃｓと相対的に低い相同性を示す、すなわち新規なＣＹＰ２Ｃ配列であることが明らかとなった。
【００４０】
（転写解析）
ＣＹＰ２Ｃ９３の転写物であるＳＶ１とＳＶ２の存在を、別途調整した、７個体のカニクイザルおよび１０個体のアカゲザルの肝ＲＮＡを用いて、ＲＴ−ＰＣＲにより、確認した。
上述の（ｃＤＮＡのクローニング）の方法と同様にして、逆転写させて一本鎖ｃＤＮＡを調製し、ＰＣＲを行った。
ＰＣＲの反応条件は、初期変性反応を９５℃で１０分間行い、９５℃で１５秒、６０℃で３０秒、６８℃で１分間の３５サイクルで行った。最終伸長反応を６８℃で５分間行った。
プライマーとしては、
ｍｆＣＹＰ２Ｃｖ４  （５ｂｔｊ１ｂ） 5’-TCCTTTCACTCTGGAGACAGAGTTC-3’（配列番号１８）
および
ｍｆＣＹＰ２Ｃｖ４  （３ｂｔｊ１）  5’-CCAAAATTTCGCAAGGTCAAA-3’（配列番号１９）
を用いた。
ＲＴ−ＰＣＲ産物の１．５％アガロースゲルを用いた電気泳動の結果を図１５および図１６に示す。
図１５と図１６の結果から、機能的なＣＹＰ２Ｃ９３は，カニクイザルにはなくアカゲザルにあること（種差）、また、アカゲザルでも半分程度の個体でしか発現していないこと（個体差）が示唆された。
【００４１】
（ＢＡＣクローン解析）
カニクイザルのＣＹＰ２Ｃ９３遺伝子座の解析をＢａｃｔｅｒｉａｌ  Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ（ＢＡＣ）クローンを用いて行った。
アカゲザルＢＡＣライブラリー（ＢＡＣＰＡＣ）を、カニクイザルＣＹＰ２Ｃ７５およびＣＹＰ２Ｃ７６  ｃＤＮＡをプローブとしてスクリーニングし、ＣＹＰ２Ｃを含むＢＡＣクローンを単離した。ライブラリー・フィルターとのハイブリダイゼーションは、ＢＡＣＰＡＣの使用説明書に従って行い、プローブは、［α］３２Ｐ−ｄＣＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の存在下で、ＲａｄＰｒｉｍｅ  ＤＮＡ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて合成した。
ＢＡＣ  ＤＮＡをＤＮＡ  ＰｈａｓｅＰｒｅｐＴＭ  ＢＡＣ  ＤＮＡ  Ｋｉｔ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）により精製した。各ＢＡＣ  ＤＮＡに含まれるＣＹＰ２Ｃ遺伝子を同定するため、精製されたＢＡＣ  ＤＮＡをテンプレートとして、１ユニットのＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、０．２ｍＭのｄＮＴＰｓ、２ｍＭのＭｇＣｌ２、５ｐｍｏｌの遺伝子特異的プライマーの総量を２０μＬとしてＰＣＲを行った。
ＰＣＲの反応条件は、初期変性反応を９５℃で１０分間行い、９５℃で２０秒、５５℃で２０秒、７２℃で１分間の３０サイクルで行った。最終伸長反応を７２℃で１０分間行った。
プライマーとしては、ｍｆＣＹＰ２Ｃ９３の５’末端解析用として、
ｍｆＣＹＰ２Ｃｖ４  （５ｂｔｊ１ａ）  5’-CTGGTGCTCTGTCTCTCCTGTT-3’（配列番号２０）
および
ｍｆＣＹＰ２Ｃｖ４  （３ｅｘ１ａ）  5’-TGCTGAAAGATTTGCTGATATTC-3’（配列番号２１）
を用い、３’末端解析用として、
ｍｆＣＹＰ２Ｃｖ４  （５ｅｘ９ａ）  5’-CTGAAATCTCTTACTGATTTAAAGGC-3’（配列番号２２）
および
ｍｆＣＹＰ２Ｃｖ４  （３ｂｔｊ３ａ） 5’-TCTGGTATGAAGGTAGCATAGAAACAAG-3’（配列番号２３）
を用いた。
また、ＣＹＰ２Ｃ８およびＣＹＰ２Ｃ７６のプライマーとして以下のプライマーを用いた（配列番号２４−３１）。
【００４２】
【表２】
2014158479.tif 000003
【００４３】
結果を図１７に示す。ＣＹＰ２Ｃ９３は、アカゲザルゲノムにおいて、ＣＹＰ２Ｃ７６に隣接しており、ＣＹＰ２Ｃクラスターの末端に位置していた。アカゲザルゲノムのＢＬＡＴ検索の結果においても、ＣＹＰ２Ｃ９３の一部の配列が、同様の位置に存在していることが確認された。このＣＹＰ２Ｃ９３の位置が、ヒトのゲノムでは遺伝子の存在しないｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃ領域に対応していた。
一方、ヒトゲノムのＢＬＡＴ検索の結果から、ＣＹＰ２Ｃ９３のｃＤＮＡと９０％以上の相同性を有する配列は、ヒトゲノム上には存在しないことが確認された。したがって、新規ＣＹＰ２Ｃ９３はヒトでは対応するＣＹＰが存在していないことが示唆される。
【００４４】
ＢＬＡＴプログラムを用い、アカゲザルゲノムとｍｍＣＹＰ２Ｃ９３のｃＤＮＡ配列とから、ＣＹＰ２Ｃ９３のエクソン−イントロン構造を分析した。ＢＬＡＴ解析において、アカゲザルゲノムは、エクソン６以外のエクソンを含むことが確認されたので、エクソン６をゲノムから増幅した。
テンプレートとしてアカゲザルのゲノムＤＮＡを用い、１ユニットのＬＡ  Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ）、０．２ｍＭのｄＮＴＰｓ、２ｍＭのＭｇＣｌ２、５ｐｍｏｌのプライマーの総量を２０μＬとして、ＰＣＲを行った。
ＰＣＲの反応条件は、初期変性反応を９５℃で２分間行い、９５℃で２０秒、５５℃で３０秒、７２℃で５分間の３５サイクルで行った。最終伸長反応を７２℃で２０分間行った。
プライマーとしては、エクソン１として、
ｍｍＣＹＰ２Ｃｖ４  （５ｉｎｔ５ｂ）  5’-GACCTTCCCAGGCTTCAG-3’（配列番号３６）
ｍｍＣＹＰ２Ｃｖ４  (３ｉｎｔ６ｂ）  5’-TCCTATTTTGGCAAACACCA-3’（配列番号３７）
を用いた。
Ａの付加後に、ＰＣＲ産物をＴＯＰＯ  ＸＬ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、添付の製造者の使用説明書に従って、ベクターにクローニングし、配列を解析した。結果を表３に示す。
【００４５】
【表３】
2014158479.tif 000004
【００４６】
エクソンおよびイントロンは、それぞれ大文字と小文字で示した。高度に保存されたＧＵ−ＡＧモチーフは、下線を付して太字で示す。
【００４７】
（エクソンの増幅）
ＳＶ２が生じる原因として，スプライシングサイトの遺伝子変異によるスプライシング・パターンの変化が考えられるため、上記の方法でエクソンの増幅を行った。以下のプライマーを使用した。
エクソン１として、
ｍｍＣＹＰ２Ｃｖ４  (５ｆｌｋ１ａ)  5’-CCTTGACTCCAATCCAATGC-3’（配列番号３２）
ｍｍＣＹＰ２Ｃｖ４  (３ｉｎｔ１ｂ)  5’-CCAAAATGTTTCTCCACTCACA-3’（配列番号３３）
および、エクソン２／３として、
ｍｍＣＹＰ２Ｃｖ４  （５ｉｎｔ１ｂ）  5’-GTTCTCCTGACCTCCGTTTC-3’（配列番号３４）
ｍｍＣＹＰ２Ｃｖ４  （３ｉｎｔ３ｂ）  5’-CTGGAACCCAGGTTTATGCT-3’（配列番号３５）
本エクソンの増幅実験は、ＩＶＳ２−１Ｇ＞Ｔを判定するためにも利用することができるため、仮にＣＹＰ２Ｃ９３のＳＶ２が個体差や種差の原因となっていれば，その原因究明や試験に供する個体選別の判定系として使用できる。
【００４８】
（Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲ）
各組織におけるＣＹＰ２Ｃ９３のｍＲＮＡの発現量を、Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲにより測定した。
各遺伝子に特異的な、プライマー及びＴａｑＭａｎプローブ（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｊａｐａｎ）は、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて設計したものを用いた。
プライマーとして、
ｍｆＣＹＰ２Ｃｖ４  （５ｂｔｊ３ａ）  5’-GAGTGGCAACTTTAAGAAAAGTGAAA-3’（配列番号３８）
ｍｆＣＹＰ２Ｃｖ４  （３ｂｔｊ３ａ） 5’-TCTGGTATGAAGGTAGCATAGAAACAAG-3’（配列番号３９）
を用いて、
プローブとして、
ｍｆＣＹＰ２Ｃｖ４  ｂｈｑ３ＦＷ
5’-FAM-CTCAATGCCACTCCCACTGCCAAA-BHQ-3’（配列番号４０）
を用いた。
プローブは、５’末端をＦＡＭ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｄｙｅにより標識した。ＲＴ反応は、ランダムプライマー(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ)を用いて行った。ＰＣＲは、ＲＴ産物の２５分の１量を用いて、全量２５μＬとしてＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７５００  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）により行った。各プライマーの最終濃度は６００ｎＭとし、プローブの最終濃度は２００ｎＭとした。サーマルサイクラーの条件は、５０℃で２分、９５℃で１０分の後、４０サイクルで９５℃で１５秒および６０℃で１分とした。
標準曲線は、対応するｃＤＮＡのプラスミドの１０倍の希釈液を用いて作成した。
すべてのＣＹＰ遺伝子に対し、アッセイの特異性の確認は、予想されたサイズの目的ＰＣＲ産物が単一のバンドとしてアガロースゲル上にあらわれること、及び、各遺伝子の相対的な発現レベルは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製のキットにより、１８ＳリボソームＲＮＡレベルを測定することにより標準化した。各遺伝子について、少なくとも３回の増幅を行った。結果を図１８に示す。
【００４９】
（Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉにおけるヘテロタンパク質の発現）
Ｔｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｖａｒｉａｎｔであるＳＶ１およびＳＶ２に対応するカニクイザルのｍｆＣＹＰ２Ｃ９３  ＳＶ１およびｍｆＣＹＰ２Ｃ９３  ＳＶ２、アカゲザルのｍｍＣＹＰ２Ｃ９３の３つの発現プラスミドを調製し、Ｉｗａｔａらの方法（Iwata, H. et al., Biochem Pharmacol (1998) 55:1315-1325）に従ってタンパク質を発現させた。
まず、得られているカニクイザルのＣＹＰ２Ｃ９３のｃＤＮＡは、ｃ.１０２Ｔ＞ｄｅｌを含むので、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅＴＭ  ＸＬ  ＩＩ  ｋｉｔ  （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ)を用いて、添付の製造者の使用説明書に従って、次のプライマー
ｍｆＣＹＰ２Ｃｖ４  (５ｑｃ１) 5’-CCTGGCCCCACtCCTCTCCCTATTATTGG-3’（配列番号４１）
ｍｆＣＹＰ２Ｃｖ４  （３ｑｃ１） 5’-CCAATAATAGGGAGAGGaGTGGGGCCAGG-3’（配列番号４２）
を用いて、ｃ．１０２にＴを挿入した。
配列番号４１および配列番号４２の配列中、小文字で表わされている塩基は、変更された塩基を意味する。
挿入された配列はシークエンシングにより確認した。
得られたプラスミドをＰＣＲのテンプレートとして用いて、ＫＯＤ  Ｐｌｕｓ  ＤＮＡＰｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔｏｙｏｂｏ）およびフォワードおよびリバースプライマーとして、次のプライマー
ｍｍＣＹＰ２Ｃｖ４  （５ｅｘｐ１ｂｏｖ） 
5’-GGAATTCCATATGGCTCTGTTATTAGCAGTTTTTCTCTGTCTCTCCTGTTTGCTTCT-3’（配列番号４３）
および
ｍｍＣＹＰ２Ｃｖ４  (３ｅｘｐ１) 5’-GCTCTAGACTTAACCTTCTTCAGACAGGAGT-3’（配列番号４４）
を用いてＰＣＲを行った
上記プライマー配列中の下線部分はＮｄｅＩ認識部位（配列番号４３）とＸｂａＩ認識部位（配列番号４４）を表し、ヒトＮＡＤＰＨ−ＣＹＰ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅのｃＤＮＡを含むｐＣＷベクターへのサブクローニングを容易にする。
Ｅ．ｃｏｌｉでのタンパク質の発現は、Ｉｗａｔａらの方法（Iwata, H. et al., Biochem Pharmacol (1998) 55:1315-1325）に従い、調製した発現プラスミドを用いて大腸菌（ＤＨ５α）にて行い、そのＥ．ｃｏｌｉ細胞からＳａｎｄｈｕらの方法（Sandhu, P. et al., Arch Biochem Biophysis (1994) 309:168-177）に従い、膜画分を調製した。
同様に、カニクイザルＣＹＰ２Ｃ８、ＣＹＰ２Ｃ１８、ＣＹＰ２Ｃ４３、ＣＹＰ２Ｃ７５およびＣＹＰ２Ｃ７６についても発現させ、膜画分を調製した。
Ｏｍｕｒａらの方法（Omura, T. et al., J Biol Chem (1964) 239:2379-2385）に従い、Ｕ−３０００  ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ）を使用して、各膜画分中のＣＹＰタンパク質の量を、また、Ｐｈｉｌｌｉｐｓらの方法（Phillips, AH. et al., J Biol Chem (1962) 237:2652-2660）に従って、ＮＡＰＤＨ−ＣＹＰ  レダクターゼの濃度を測定した。
【００５０】
（薬物の代謝活性）
Ｙａｍａｚａｋｉらの方法（Yamazaki, H. et al., Biochem Pharmacol (2002) 56:243-251）に従い、ｍｆＣＹＰ２Ｃ８、ｍｆＣＹＰ２Ｃ４３、ｍｆＣＹＰ２Ｃ７５、ｍｆＣＹＰ２Ｃ７６、ｍｆＣＹＰ２Ｃ９３（Ｔを挿入したＳＶ１バリアント）、ｍｆＣＹＰ２Ｃ９３（Ｔを挿入したＳＶ２バリアント）およびｍｍＣＹＰ２Ｃ９３を用いて、ヒトＣＹＰ２Ｃの基質である、Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ、Ｔｏｌｂｕｔａｍｉｄｅ、Ｄｉｃｌｏｆｅｎａｃ、ＦｌｕｒｂｉｐｒｏｆｅｎおよびＳ−Ｍｅｐｈｅｎｙｔｏｉｎ（各化合物はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈより購入した）に対する代謝活性を解析した。結果を表４に示す。
【００５１】
【表４】
2014158479.tif 000005
【００５２】
表４の結果から、大腸菌で発現させたＣＹＰ２Ｃ９３は、ヒトＣＹＰ２ファミリーの基質である、Ｔｏｌｂｕｔａｍｉｄｅ、Ｄｉｃｌｏｆｅｎａｃ、ＦｌｕｒｂｉｐｒｏｆｅｎおよびＳ−Ｍｅｐｈｅｎｙｔｏｉｎを代謝することがわかった。また、アカゲザルのＣＹＰ２Ｃ９３は機能的なタンパク質であり、カニクイザルのＣＹＰ２Ｃ９３＿ＳＶ１は、ｃ．１０２Ｔ＞ｄｅｌの変異がなければ機能的なタンパク質であるのに対して、エクソン２が欠損した転写物（ＳＶ２）由来のカニクイザルＣＹＰ２Ｃ９３＿ＳＶ２は、ｃ．１０２Ｔ＞ｄｅｌの変異がなくても機能的なタンパク質でとならないと考えられた。
【００５３】
（ウェスタンブロッティング解析）
ＣＹＰ２Ｃ９３に対するポリクローナル抗体は、抗原領域を推測し、該領域の特異的なアミノ酸配列に対するペプチドを用いて作製した（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃにて作製）。
Ｃ−末端のシステインのチオール基にＫｅｙｈｏｌｅ  Ｌｉｍｐｅｔ  Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎを結合させた、合成ぺプチド
NH2-QEEIDRVIGRHRSPC-COOH（配列番号４５）
を用いて、Ｎｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ  Ｗｈｉｔｅ  Ｒａｂｂｉｔを免疫して、ＣＹＰ２Ｃ９３抗体を得た。
カニクイザルのｍｆＣＹＰ２Ｃ１８、ｍｆＣＹＰ２Ｃ８、ｍｆＣＹＰ２Ｃ４３、ｍｆＣＹＰ２Ｃ７５、ｍｆＣＹＰ２Ｃ７６、およびｍｆＣＹＰ２Ｃ９３の大腸菌で発現させたＣＹＰタンパク質１．０ｐｍｏｌとＣＹＰ２Ｃ９３を発現していることが確認されたアカゲザルから取り出した肝ミクロソーム１５μｇを、１０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｐ  ｆｉｌｔｅｒ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に移行した。このフィルターを用いて、ウサギ抗ＣＹＰＣ２Ｃ９３抗体（１：１０００）、及びホースラディッシュペルオキシダーゼにコンジュゲートされたヒツジ抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｓｕｒｍｏｄｉｃｓ）を用いたイムノブロッティングを行った。
ローディングコントロールとしてのＰｒｏｔｅｉｎ  ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｉｓｏｍｅｒａｓｅ（ＰＤＩ）は、ウサギ抗ＰＤＩ抗体（１：２００、ＳａｎｔａＣｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて検出した。
製造者の使用説明書に従って、特定のバンドを、ＥＣＬ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により可視化した。結果を図１９に示す。
抗ＣＹＰＣ２Ｃ９３抗体は、ｍｆＣＹＰ２Ｃ８、ｍｆＣＹＰ２Ｃ７６およびｍｆＣＹＰ２Ｃ９３に交差性を示したが、サイズの違いからｍｆＣＹＰ２Ｃ９３のバンドは、ｍｆＣＹＰ２Ｃ８およびｍｆＣＹＰ２Ｃ７６のバンドと区別可能であった。アカゲザルの肝ミクロソームの結果から、ＣＹＰ２Ｃ９３は肝で発現していることが示唆された。
【００５４】
（エクソン２の解析）
ＩＶＳ２−１Ｇ＞Ｔ変異がエクソン２欠損の原因となり得るのか確認するために、ｍｉｎｉ  ｇｅｎｅ  ｐｌａｓｍｉｄを調製した。
テンプレートとして、ｍｆＣＹＰ２Ｃ９３  ＳＶ１およびｍｆＣＹＰ２Ｃ９３  ＳＶ２を発現するカニクイザルのゲノム、およびｍｍＣＹＰ２Ｃ９３を発現するアカゲザルゲノムを用い、エクソン１〜エクソン３のＣＹＰ２Ｃ９３遺伝子フラグメントを、１ユニットのＬＡ  Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ）、０．２ｍＭのｄＮＴＰｓ、２ｍＭのＭｇＣｌ２、５ｐｍｏｌのプライマー
ｍｍＣＹＰ２Ｃｖ４  (５ｆｌｋ１ａ)  5’-CCTTGACTCCAATCCAATGC-3’（配列番号３２）
および
ｍｍＣＹＰ２Ｃｖ４  (３ｉｎｔ３ｂ)  5’-CTGGAACCCAGGTTTATGCT-3’（配列番号３５）
の総量を２０μＬとして用いて、ＰＣＲにより増幅した。
ＰＣＲおよびシークエンスは、（エクソンの増幅）におけるエクソン６の増幅と同様にして行った。
イントロン１のスプライシングアクセプター部位にＩＶＳ２−１Ｇを持つカニクイザルＣＹＰ２Ｃ９３遺伝子断片を含むプラスミド（ｐｃＤＮＡ３．１−ｍｆＣＹＰ２Ｃ９３＿ＩＶＳ２−１Ｇ）、同じ部位にＩＶＳ２−１Ｔを持つカニクイザルＣＹＰ２Ｃ９３遺伝子断片を含むプラスミド（ｐｃＤＮＡ３．１−ｍｆＣＹＰ２Ｃ９３＿ＩＶＳ２−１Ｔ）、同じ部位にＩＶＳ２−１Ｇを持つアカゲザルＣＹＰ２Ｃ９３遺伝子断片を含むプラスミド（ｐｃＤＮＡ３．１−ｍｍＣＹＰ２Ｃ９３＿ＩＶＳ２−１Ｇ）調製した。同じ部位にＩＶＳ２−１Ｔを持つアカゲザルＣＹＰ２Ｃ９３遺伝子断片を含むプラスミド（ｐｃＤＮＡ３．１−ｍｍＣＹＰ２Ｃ９３＿ＩＶＳ２−１Ｔ）を作成するために、ＩＶＳ２−１Ｇ＞Ｔ変異を、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇ  ＸＬ  ＩＩ  ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて、ｐｃＤＮＡ３．１−ｍｍＣＹＰ２Ｃ９３＿ＩＶＳ２−１Ｇに導入した。
プライマーは、
ｍｍＣＹＰ２Ｃ９３ＩＶＳ２−２ＡＧ＞ＡＴ  （５ｑｃ１）
5’-CTCCTTTCCCAtTTCTCAAAACTC-3’（配列番号４６）
および
ｍｍＣＹＰ２Ｃ９３ＩＶＳ２−２ＡＧ＞ＡＴ  （３ｑｃ１）
5’-GAGTTTTGAGAAaTGGGAAAGGAG-3’（配列番号４７）
を用いた。なお、小文字で示された塩基は、変異された塩基を表す。
挿入された全配列をシークエンスにより確認した。得られたプラスミドを、添付の製造者の使用説明書に従って、ＣＯＳ１細胞（Ｒｉｋｅｎ）にトランスフェクトし、トランスフェクトから２４時間後に、細胞から全ＲＮＡをＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ(ＱＩＡＧＥＮ)を用いて、添付の製造者の使用説明書に従って、抽出した。
抽出した全ＲＮＡを用いて、ＲＴ反応を行った後、プライマーとして、
ｍｆＣＹＰ２Ｃｖ４  （５ｂｔｊ１ｂ） 5’-TCCTTTCACTCTGGAGACAGAGTTC-3’（配列番号２０）
および
ｍｆＣＹＰ２Ｃｖ４  （３ｂｔｊ１）  5’-CCAAAATTTCGCAAGGTCAAA-3’（配列番号２１）
を用いてＰＣＲを行った。
コントロールとして、β−アクチンのＲＴ−ＰＣＲを行ったが、ＰＣＲではプライマーとして、
ｍｆ＆ｈ＿β−アクチン（５ｑｒｔ１）  5’- AACGGTGAAGGTGACAGCA-3’（配列番号４８）
および
ｍｆ＆Ｈ＿β−アクチン（３ｑｒｔ１）  5’- AGTGGGGTGGCTTTTAGGA-3’（配列番号４９）
を用い、得られたＰＣＲ産物を、アガロースゲル上で可視化した。
結果を図２０に示す。
図２０において、発現したＣＹＰ２Ｃ９３のｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲを行うことにより、ＩＶＳ２−１ＴとＩＶＳ２−１Ｇのスプライシングへの影響を確認した。例えば，ＩＶＳ２−１ＧのプラスミドではＳＶ１のみが、ＩＶＳ２−１ＴのプラスミドではＳＶ２のみが発現していることを確認することにより、ＩＶＳ２−１ＴがＳＶ２生成、つまりａｂｅｒｒａｎｔ ｓｐｌｉｃｉｎｇによるｅｘｏｎ ２ ｓｋｉｐｐｉｎｇの原因であると考えることができる。図２０において、ＩＶＳ２−１ＴがＳＶ２生成の原因にはなっていることが確認できた。また、ＩＶＳ２−１Ｔの塩基置換をｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇすることによって、非臨床試験に供与する個体を選別したり、ＣＹＰ２Ｃ９３が関与する薬物代謝における種差や個体差の原因として提示することができると考えられた。さらに、図２０の結果から、イントロン１のスプライシングアクセプター部位のＩＶＳ２−１Ｇ＞Ｔである遺伝的バリアントは、スプライシングのパターンが変わることによりエクソン２のスキップを生じさせていることが明らかとなり、このスプライシングサイトの変異により、ＳＶ２の転写物が生じることが確認できた。ＳＶ２の存在は、ＣＹＰ２Ｃ９３により媒介される薬物代謝に影響を与えると考えられる。また、ＣＹＰ２Ｃ９３（ＳＶ１）だけ発現している個体とＳＶ２だけ発現している個体を見出して、それらの個体間で遺伝子配列を調べればスプライシングサイトに重要な配列の違いを確認することができると考えられる。
【００５５】
（遺伝子型の判定）
ｃ．１０２Ｔ＞ｄｅｌの遺伝子型を判定するため、ＧｅｎｅＭａｐｐｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて解析を行った。
テンプレートとして、カニクイザル１４１個体，アカゲザル８個体のゲノムＤＮＡを用い、（転写解析）における方法と同様にして、ＰＣＲを行った。
プライマーとしては、
ｍｆＣＹＰ２Ｃｖ４  (５ｇｍ１ａ) 5’-CTGGTGCTCTGTCTCTCCTGTT-3’（配列番号５０）
および
ｍｆＣＹＰ２Ｃｖ４  （３ｇｍｌａ）5’-TGCTGAAAGATTTGCTGATATTC-3’（配列番号５１）
を用いた。
ＰＣＲ産物は、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７３０  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で電気泳動させ、製品の製造者の使用説明書に従って、測定データを解析した。
野生型のゲノムとは異なるサイズのピークとしてｃ．１０２Ｔ＞ｄｅｌの存在が確認された。
なお、カニクイザル１４１個体中、ｃ．１０２Ｔ＞ｄｅｌ（Ｔの欠損あり）変異を有していたのは１個体のみであり、ヘテロ（核細胞にゲノムが２コピー存在するうち，一方は野生型，もう一方は変異型）であることが確認された。この結果より、ｃ．１０２Ｔ＞ｄｅｌ変異は一般的にカニクイザルに存在する変異ではなく，かなり稀な変異であると考えられ、他のカニクイザルでＳＶ１を発現している個体が存在すれば、ＣＹＰ機能を有する可能性があると考えられる。したがって、カニクイザルＣＹＰ２Ｃ９３のＳＶ１に対応するタンパクを発現させることは、サルにおけるＣＹＰ２Ｃ９３の代謝機能を調べる（種差の判定に用いることができるという）意義を有することを意味する。
【００５６】
ダイレクト・シークエンス法によって、ＩＶＳ２−１Ｇ＞Ｔの遺伝子型を決定するため、（エクソンの増幅）に記載したのようにＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物の塩基配列を決定した。
テンプレートとして、カニクイザル６個体，アカゲザル２個体のゲノムＤＮＡを用い、プライマーとしては、
ｍｍＣＹＰ２Ｃｖ４  （５ｉｎｔ１ｂ） 5’-GTTCTCCTGACCTCCGTTTC-3’（配列番号３４）
ｍｍＣＹＰ２Ｃｖ４  （３ｉｎｔ３ｂ） 5’-CTGGAACCCAGGTTTATGCT-3’（配列番号３５）
を用いた。
ＩＶＳ２−１Ｇ＞Ｔはカニクイザルでは全ての個体で確認されたがアカゲザルでは確認されなかったので，ほとんどのカニクイザルではＳＶ２を，アカゲザルではＳＶ１を発現していることと合致していた。
また、ＳＶ１は、１１のアカゲザルのうち６個体において発現し、カニクイザル８個体のうち１個体において発現していた。しかしながら、カニクイザルのＳＶ１は、稀なアレルであるｃ．１０２Ｔ＞ｄｅｌのヌル遺伝子型を示し、機能を有していないことも明らかとなった。
【００５７】
以上のように、ＣＹＰ２Ｃ９３は、ヒトには存在しない分子種であり肝臓で発現し薬物代謝機能を有することから、サルとヒトの種差の原因となりうる。また、機能的なタンパク質としてＣＹＰ２Ｃ９３がアカゲザルでは発現しているがカニクイザルでは発現していないので、ＣＹＰ２Ｃ９３が関与する薬物（特にＣＹＰ２Ｃ９３に特異的な基質）の代謝におけるカニクイザルとアカゲザルの種差の原因となり得る。さらに、機能的なタンパクをコードするＳＶ１がアカゲザルでも，調べた半分程度の個体でしかＳＶ１が発現していないので、アカゲザルでＣＹＰ２Ｃ９３が関与する薬物（特にＣＹＰ２Ｃ９３に特異的な基質）の代謝における個体差の原因となり得る。すなわち、ＣＹＰ２Ｃ９３がカニクイザルと（ＣＹＰ２Ｃ９３を発現している）アカゲザルの種差の原因になり得る。一方、ヒトとカニクイザルは機能的なＣＹＰ２Ｃ９３を持たないと考えられるので、ＣＹＰ２Ｃ９３特異的な基質の代謝はカニクイザルを用いて代謝活性を測定する方がヒトへの予測性が高まると考えられる。
【００５８】
実施例２：ＣＹＰ１Ｄ１
（ＲＮＡの抽出）
実施例１と同様にして、４−５歳齢の３−５ｋｇのカニクイザルのオス、メス３個体の組織サンプル（脳、肺、心臓、肝臓、腎臓、副腎、空腸、精巣、卵巣、および子宮）由来のＲＮＡをそれぞれ抽出した。また、４−５歳齢の３−５ｋｇのアカゲザル２個体の肝臓に由来する全ＲＮＡを抽出した。
【００５９】
（ゲノムＤＮＡの抽出）
実施例１と同様にして、７歳齢の３−５ｋｇの１０匹のアカゲザルおよび４−５歳齢の３−５ｋｇの２０匹のカニクイザルの血液サンプルから、ゲノムＤＮＡを調製した。
【００６０】
（ｃＤＮＡのクローニング）
ＲＴ−ＰＣＲを、以下に記載の条件に変更した以外は、実施例１と同様にして、アカゲザルおよびカニクイザルから抽出された肝臓由来の全ＲＮＡを用いて行った。
プライマーとしては、
ｍｍＣＹＰ１Ａ８  （５ｒｔ２）  5’-GAAATGATTCTCAACCTAGCAGTCA-3’（配列番号５２）
および
ｍｍＣＹＰ１Ａ８  （３ｒｔ２）  5’-GCATAGCTCAGGGGAATAAACTG-3’（配列番号５３）
を用いた。これらプライマーは、アカゲザル遺伝子データのコンピュータ分析により予期されたＣＹＰ様ＯＲＦ候補配列からデザインしたプライマーの塩基配列である。
増幅されたｃＤＮＡは、Ａを付加した後、ＴＡＰＯ  ＴＡ  Ｃｌｏｎｏｎｇ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ｐＣＲ２．１ベクターにクローニングし、塩基配列を決定した。得られたｃＤＮＡ配列をｍｆＣＹＰ１Ｄ１とした。
【００６１】
なお、５’ＲＡＣＥを行い、翻訳開始点が正しいことを確認した。
５’ＲＡＣＥは、以下のプライマーを用い、５’ＲＡＣＥ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  Ｒａｐｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  Ｅｎｄｓ (Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ)を用いて、上記のＲＴおよびＰＣＲ反応と同様にして行った。
ｍｆＣＹＰ１Ａ８（３ｇｓｐ１）  5’-TACTTGTTTCACCATTTC-3’（for RT reaction、配列番号５４）
ｍｆＣＹＰ１Ａ８（３ｓｅｑ２）  5’-AGACAGGCACCATGCCAAG-3’（for the initial PCR、配列番号５５）
ｍｆＣＹＰ１Ａ８（３ｇｓｐ３）  5’-CGTAAGGTAAGGATGCTCTCCA-3’（for the nested PCR、配列番号５６）
【００６２】
アカゲザルおよびカニクイザルのＣＹＰ１Ｄ１は、１６２１ｂｐの塩基配列であり、該塩基配列は、５３７アミノ酸のＯＲＦを有していた。ＯＲＦ配列から、推測されるアミノ酸配列には、６つの基質認識部位（Gotoh (1992)、J. Biol. Chem. Vol.267, p.83-90）、およびヘム結合部位が存在した。ｍｆＣＹＰ１Ｄ１およびｍｍＣＹＰ１Ｄ１のＯＲＦのアミノ酸配列は、図３、図４および図２１に示す。
【００６３】
（配列解析）
得られた塩基配列データを実施例１と同様にして解析した。
マルチプル・アラインメントの結果を図２１に、分子進化系統樹を図２２に示す。また、カニクイザルＣＹＰ１Ｄ１と他のＣＹＰ１ファミリーとのアミノ酸配列の相同性解析結果を表５に示す。
【００６４】
【表５】
2014158479.tif 000006
【００６５】
カニクイザルＣＹＰ１Ｄ１のｃＤＮＡから推測されるアミノ酸配列は、ヒトのＣＹＰ１Ｄ１Ｐ（以前ＣＹＰ１Ａ８として知られた偽遺伝子であり、ＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ１Ｂ１とヒトＣＹＰ１ファミリーを構成する。）と、９１％の相同性を示し、カニクイザルのＣＹＰ１Ａ１やＣＹＰ１Ａ２アミノ酸配列とは、４３−４４％の相同性を示すに過ぎない。なお、解析に用いたヒトＣＹＰ１Ｄ１Ｐは、ヒトゲノム上に見出されるＣＹＰ１Ｄ１Ｐ遺伝子配列から推測されるアミノ酸配列から中途終止コドンを除いたものである。
【００６６】
ＢＬＡＴプログラムを用い、アカゲザルゲノムとｍｆＣＹＰ１Ｄ１のｃＤＮＡ配列とから、ＣＹＰ１Ｄ１のエクソン−イントロン構造を分析した。結果を表６に示す。
【００６７】
【表６】
2014158479.tif 000007
【００６８】
ＣＹＰ１Ｄ１遺伝子は、１４ｋｂに渡り、６つのエクソンを有していた。エクソンおよびイントロンは、それぞれ大文字と小文字で示した。高度に保存されたＧＵ−ＡＧモチーフは、下線を付して太字で示す。
【００６９】
また、ＣＹＰ１Ｄ１のゲノム構造を調べるために，ＢＬＡＴプログラムにより、ｍｆＣＹＰ１Ｄ１のｃＤＮＡ配列をアカゲザル・ゲノムにマップしたところ、ＣＹＰ１Ｄ１遺伝子のゲノム上の位置と方向がサルとヒトで保存されていることが確認され、ＣＹＰ１Ｄ１遺伝子はサルとヒトでオーソロガスであることが分かった。結果を図２３に示す。
【００７０】
（Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲ）
以下の変更をした以外は実施例１と同様にして、各組織におけるＣＹＰ１Ｄ１のｍＲＮＡの発現量を、Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲにより測定した。
プライマーとして、
ｍｆＣＹＰ１Ａ８  （５ｂｔｊ１）  5’- TCTCCGCTACCTTCCACTGC-3’（配列番号５７）
および
ｍｆＣＹＰ１Ａ８  （３ｂｔｊ１）  5’- CAGCGTATTTGTTGTGGCATAC-3’（配列番号５８）
を用い、プローブとして、
ｍｆＣＹＰ１Ａ８ｂｈｑ１ＦＷ  5’-FAM-CGGGAGTTTTATCGGGCCCTGA-BHQ-3’（配列番号５９）
を用いた。これらプライマーとプローブは、ＣＹＰの中では比較的相同性の高いＣＹＰ１Ａ１とＣＹＰ１Ａ２を増幅しないようなプライマーおよびプローブであり、プライマーは，エクソン境界部分を挟んで作製し，万が一ゲノムＤＮＡがコンタミしていても結果に影響がないようにした。
ＣＹＰ１Ａ１のプライマーとして、
ｈ＆ｍｆＣＹＰ１Ａ１（５ａｂｉ１）  5’-AAACCTTTGAGAAGGGCCACA-3’ （配列番号６０）
ｈ＆ｍｆＣＹＰ１Ａ１（３ａｂｉ１）  5’-TCATCCAGCTGCTTCTCCTGA-3’（配列番号６１）
ＣＹＰ１Ａ２のプライマーとして、
ｈ＆ｍｆＣＹＰ１Ａ２（５ａｂｉ１）  5’-AGAGGTTCAAGGCCTTCAACC-3’（配列番号６２）
ｈ＆ｍｆＣＹＰ１Ａ２（３ａｂｉ１）  5’-GAGGCTCCAGGAGATGGCT-3’（配列番号６３）
プローブとして、ＣＹＰ１Ａ１においては、
ｈ＆ｍｆＣＹＰ１Ａ１ｍｇｂ１ＦＷ  5’-FAM- CCGGGACATCACAGAC -MGB-3’（配列番号６４）
ＣＹＰ１Ａ２においては、
ｈ＆ｍｆＣＹＰ１Ａ２ｍｇｂ１ＦＷ  5’-FAM-TGCCCTGTTCAAGCA- MGB-3’（配列番号６５）
を用いた。
プライマーセットとプローブの最終濃度は、それぞれ６００ｎＭ、２００ｎＭとした。
結果を図２４に示す。ＣＹＰ１Ｄ１は、肝臓、腎臓、空腸で発現していることが確認できたが、肝臓で最も強く発現していた。肝臓では、カニクイザル肝臓で最も高く発現するＣＹＰ１分子種として知られているＣＹＰ１Ａ１の発現量と同等であった。
【００７１】
（Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉにおけるタンパク質の発現）
以下のようにした以外は、実施例１と同様にして、ＣＹＰ１Ｄ１タンパク質を大腸菌で発現させた。
ＮｄｅＩ部位を後のＰＣＲ産物のサブクローニングにおいて用いるので、ＣＹＰ１Ｄ１のｃＤＮＡの内部ＮｄｅＩ部位は、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  ＸＬ  ＩＩ  ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ）を用いて、製造者の使用説明書に従って、アミノ酸残基を変更させることなく、変異させた。
小文字記載の塩基は変異される塩基を意味するが、用いたプライマーは以下のとおりである。
ｍｆＣＹＰ１Ａ８（ＱＣ）  
5’-CACGTACAAGATCATCTTGCTACtTATGATAAGGATCATATCCGAG-3’（配列番号６６）
ｍｆＣＹＰ１Ａ８（ＱＣ−Ｒ）
5’-CTCGGATATGATCCTTATCATAaGTAGCAAGATGATCTTGTACGTG-3’（配列番号６７）
Ｎ−末端の修飾は以下のフォワードおよびリバースプライマーを用いてＰＣＲにより実施した。
ＣＹＰ１Ｄ１として、
ｍｆＣＹＰ１Ａ８（５ｅｘｐ１ｂｏｖ）
5’-GGAATTCCATATGGCTCTGTTATTAGCAGTTTTT-CCTGGAGAGGTGACCACTT-3’（配列番号６８）
ｍｆＣＹ１Ａ８８（３ｅｘｐ１）
5’-GCTCTAGATTGCTAGTTAAGTAAATTCAAATCATC-3’（配列番号６９）
を用い、
ＣＹＰ１Ａ１として、
ｍｆＣＹＰ１Ａ１（５ｅｘｐ２ｂｏｖ）
5’-GGAATTCCATATGGCTCTGTTATTAGCAGTTTTT-GCCACGGAGTTTCTTCTAGC-3’（配列番号７０）
ｍｆＣＹＰ１Ａ１（３ｅｘｐ１）
5’- GCTCTAGA-CAGGGCTCTCAAGCACCTAA-3’（配列番号７１）
ＣＹＰ１Ａ２として、
ｍｆＣＹＰ１Ａ２（５ｅｘｐ１ｂｏｖ）
5’-GGAATTCCATATGGCTCTGTTATTAGCAGTTTTT-TTCTCGGCCACAGAGCTTC-3’（配列番号7７２）
ｍｆＣＹＰ１Ａ２（３ｅｘｐ１）
5’-GCTCTAGA-TGGTGTCTTCTTCACTTGATGG-3’（配列番号７３）
を用いた。フォワードプライマーと、リバースプライマーそれぞれで下線を付したＮｄｅＩ部位とＸｂａＩ部位は、ＰＣＲ産物をヒトＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０レダクターゼのｃＤＮＡを含むｐＣＷにサブクローニングするために用いた。
次いで、細胞膜画分を調製、ＣＹＰタンパク質の定量、ＮＡＰＤＨ−ＣＹＰ  レダクターゼの濃度を実施例１と同様にして測定した。
【００７２】
（薬物の代謝活性）
Ｙａｍａｚａｋｉらの方法（Yamazaki, H. et al., Biochem Pharmacol (2002) 56:243-251）に従って、カニクイザルＣＹＰ１Ｄ１などのＣＹＰタンパク質またはカニクイザルの肝ミクロソーム（ＢＤ−ＧＥＮＴＥＳＴ）を用いて、ＥＲＯＤ（７−エトキシレゾルフィン  Ｏ−デエチラーゼ、７−エトキシレゾルフィンはＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入したものを用いた。）の代謝活性を解析した。
１００ｍＭ  リン酸カリウムバッファー（ｐＨ  ７．４）中で、ＣＹＰタンパク質または肝ミクロソーム、ＮＡＤＰＨ産生系（０．２５ｍＭ  ＮＡＤＰ＋、２．５ｍＭ  グルコース−６−リン酸、０．２５  ｕｎｉｔ／ｍＬ  グルコース−６−リン酸でヒドロゲナーゼ）、および基質であるＥＲＯＤ（１０  μＭ）で、３７℃１０分間反応を行い、０．５０ｍＬのメタノールを加えて反応を終了させた。９００ｇで５分間遠心分離した後、上澄液をＨＰＬＣにより分析した。
結果を表７に示す。なお、代謝活性反応において、発現させたＣＹＰタンパク質（表中、ＣＹＰ１ファミリーとして記載）は２０ｐｍｏｌ／ｍＬ、肝ミクロソーム（表中、Ｌｉｖｅｒとして記載。）は０．１ｍｇ／ｍＬ用いた。それぞれ、表２３における単位は、ＣＹＰタンパク質では、ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｎｍｏｌであり、肝ミクロソームでは、ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇであった。
【００７３】
【表７】
2014158479.tif 000008
【００７４】
表７の結果から、カニクイザルのＣＹＰ１Ｄ１は、機能タンパク質として発現していると考えられた。
【００７５】
（ウェスタンブロッティング解析）
実施例１と同様にして、ＣＹＰ１Ｄ１に対するポリクローナル抗体は、特異的なアミノ酸配列を用いて作製した（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。
Ｃ−末端のシステインのチオール基にＫｅｙｈｏｌｅ  Ｌｉｍｐｅｔ  Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎを結合させた、合成ぺプチド
NH2-SKGRKQLSPPGPWS-COOH（配列番号７４）
を用いて、Ｎｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ  Ｗｈｉｔｅ  Ｒａｂｂｉｔを免疫して、ＣＹＰ１Ｄ１抗体を得た。
カニクイザルのｍｆＣＹＰ１Ａ１、ｍｆＣＹＰ１Ａ２、ｍｆＣＹＰ１Ｄ１の大腸菌で発現させたＣＹＰタンパク質１．０ｐｍｏｌとカニクイザルの肝ミクロソーム１５μｇを、１０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｐ  ｆｉｌｔｅｒ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に移行した。このフィルターを用いて、ウサギ抗ＣＹＰ１Ｄ１抗体（１：１０００）、及びホースラディッシュペルオキシダーゼにコンジュゲートされたヒツジ抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｓｕｒｍｏｄｉｃｓ）を用いたイムノブロッティングを行った。
ローディングコントロールとしてのＰｒｏｔｅｉｎ  ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｉｓｏｍｅｒａｓｅ（ＰＤＩ）は、ウサギ抗ＰＤＩ抗体（１：２００、ＳａｎｔａＣｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて検出した。
製造者の使用説明書に従って、特定のバンドを、ＥＣＬ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により可視化した。結果を図２５に示す。
【００７６】
以上のように、ヒトでは偽遺伝子となり機能を失ったＣＹＰ１Ｄ１がサルでは肝臓で発現し代謝機能を有していることから、サルのＣＹＰ１Ｄ１は、基質代謝におけるサルとヒトの種差の原因となりうる代謝酵素である。また、ＣＹＰ１Ｄ１は、サルにおいて、ＣＹＰ１ファミリーの中では，肝臓でＣＹＰ１Ａ１と同程度高く発現しているので、ＣＹＰ１ファミリーが関与する基質の代謝への寄与が大きい可能性があり、そのような基質の代謝における種差の原因ともなりうる代謝酵素である。さらに、アカゲザルやカニクイザルでは、ヒトＣＹＰ１Ｄ１Ｐ遺伝子で見られたエクソン２の３つのナンセンス変異とエクソン７の２つのナンセンス変異は確認されなかった（データ示さず）。
【００７７】
実施例３：ＣＹＰ２Ｇ２
（ＲＮＡの抽出）
実施例１と同様にして、４−５歳齢の３−５ｋｇのカニクイザルのオス、メス３個体の組織サンプル（脳、肺、心臓、肝臓、腎臓、副腎、空腸、精巣、卵巣、子宮、および鼻粘膜）由来のＲＮＡをそれぞれ抽出した。
（ゲノムＤＮＡの抽出）
実施例１と同様にして、血液サンプルから、ゲノムＤＮＡを調製した。
【００７８】
（ｃＤＮＡのクローニング）
ＲＴ−ＰＣＲを、以下に記載の条件に変更した以外は、実施例１と同様にして、カニクイザルから抽出された鼻粘膜由来の全ＲＮＡを用いて行った。
プライマーとしては、
ｍｍＣＹＰ２Ｇ２  （５ｒｔ１） 5’- GACCTGGCACCATGGAGaT-3’（配列番号７５）
および
ｍｍＣＹＰ２Ｇ２  （３ｒｔ１） 5’-CCTGAACAcGAGAGGAGAGC-3’（配列番号７６）
を用いた。これらプライマーは、アカゲザルゲノムにおいてＣＹＰ２Ｇ２配列をコードしていると考えられる遺伝子配列から推測したコード領域に対応するｃＤＮＡをＲＴ−ＰＣＲで増幅するために設計したものである。
増幅されたｃＤＮＡは、Ａを付加した後、ＴＡＰＯ  ＴＡ  Ｃｌｏｎｏｎｇ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ｐＣＲ２．１ベクターにクローニングし、塩基配列を決定した。得られたｃＤＮＡ配列をｍｆＣＹＰ２Ｇ２とした。
【００７９】
なお、５’ＲＡＣＥを行い、翻訳開始点が正しいことを確認した。
５’ＲＡＣＥは、以下のプライマーを用い、上記ＣＹＰ１Ｄ１と同様にして行った。
ｍｆＣＹＰ２Ｇ２（３ｇｓｐ１）  5’-TGACCTTGGAAGTTTC-3’（for RT reaction、配列番号７７）
ｍｆＣＹＰ２Ｇ２（３ｇｓｐ２）  5’-ACTGAACTCATCCGCTTGGTCT-3’（for the initial PCR、配列番号７８）
ｍｆＣＹＰ２Ｇ２（３ｇｓｐ３）  5’-CACAGGGCCGTATTTCTCC-3’（for the nested PCR、配列番号７９）
【００８０】
カニクイザルＣＹＰ２Ｇ２は、４９４アミノ酸残基のＯＲＦを有していた。ＯＲＦ配列から、推測されるアミノ酸配列には、６つの基質認識部位（Gotoh (1992)、J.Biol. Chem. Vol.267, p.83-90）、およびヘム結合部位が存在した。ｍｆＣＹＰ２Ｇ２のＯＲＦのアミノ酸配列は、図５および図２６に示す。
【００８１】
（配列解析）
得られた塩基配列データを実施例１と同様にして解析した。
マルチプル・アラインメントの結果を図２６に、分子進化系統樹を図２７に示す。
また、カニクイザルＣＹＰ２Ｇ２と他のＣＹＰとの、相同性解析結果を表８に示す。
【００８２】
【表８】
2014158479.tif 000009
【００８３】
カニクイザルＣＹＰ２Ｇ２のｃＤＮＡから推測されるアミノ酸配列は、ヒトのＣＹＰ２Ｇ２Ｐ（偽遺伝子である。）と、９３％の相同性を示す。なお、ＣＹＰ２Ｇ２Ｐは、ヒトゲノム上に見出されるＣＹＰ２Ｇ２Ｐ遺伝子配列から推測されるコード領域のアミノ酸配列で中途終止コドンを除いたものである。
【００８４】
ＢＬＡＴプログラムを用い、アカゲザルゲノムとｍｆＣＹＰ２Ｇ２のｃＤＮＡ配列とから、ＣＹＰ２Ｇ２のエクソン−イントロン構造を分析した。結果を表９に示す。
【００８５】
【表９】
2014158479.tif 000010
【００８６】
ＣＹＰ２Ｇ２遺伝子は、９つのエクソンを有していた。エクソンおよびイントロンは、それぞれ大文字と小文字で示した。高度に保存されたＧＵ−ＡＧモチーフは、下線を付して太字で示す。
【００８７】
（エクソンの増幅）
ヒトＣＹＰ２Ｇ２ゲノムにおいて、推測されるコード領域のエクソン１とエクソン３に中途終止コドンがあることから、サルにも同様の中途終止コドンが存在するのか調べるためにＣＹＰ２Ｇ２のエクソン１およびエクソン３を増幅して、シークエンスした。
テンプレートとしてアカゲザルまたはカニクイザルのゲノムＤＮＡを用い、１ユニットのＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）、０．２ｍＭのｄＮＴＰｓ、２ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｐｍｏｌの遺伝子特異的プライマーの総量を２０μＬとして、ＰＣＲを行った。
ＰＣＲの反応条件は、初期変性反応を９４℃１０分間行い、９４℃１５秒、５８℃３０秒、７２℃２分間の３５サイクルで行った。最終伸長反応を７２℃５分間行った。該遺伝子特異的プライマーとしては、エクソン１として、
ｍｍＣＹＰ２Ｇ２−ｅｘ１  （５ｆｌｋ１ａ）
5’-GCTGAGGCATAAGAATCACC-3’（配列番号８０）
および
ｍｍＣＹＰ２Ｇ２−ｅｘ２  （３ｉｎｔ２ｂ）
5’-CAGGCATACAACACTACGCT-3’（配列番号８１）
を用い、エクソン３として、
ｍｍＣＹＰ２Ｇ２−ｅｘ３  （５ｉｎｔ２ａ）
5’-CATCCCTCCACCTTCCTATG-3’（配列番号８２）
および
ｍｍＣＹＰ２Ｇ２−ｅｘ３  （３ｉｎｔ３ａ）
5’-ACTTTTAATATGGAAGCTGGCC-3’（配列番号８３）
を用いた。
次いで、ＰＣＲ産物を、以下のシーケンスプライマーを用いて直接シーケンスした（ダイレクト・シーケンス法）。
ｍｍＣＹＰ２Ｇ２−ｅｘ１（５ｆｌｋ１ｂ）  5’-CTCCAATGACATTCAAACCC-3’ （for exon 1、配列番号８４）
ｍｍＣＹＰ２Ｇ２−ｅｘ３（５ｉｎｔ２ｂ）  5’-GATCCTGGAGAGAGGGAACC-3’ （for exon 3、配列番号８５）
結果を表１０及び図２８に示す。
【００８８】
【表１０】
2014158479.tif 000011
【００８９】
（Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲ）
以下の変更をした以外は実施例１と同様にして、各組織におけるＣＹＰ２Ｇ２のｍＲＮＡの発現量を、Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲにより測定した。
プライマーとして、
ｍｆＣＹＰ２Ｇ２  （５ｂｔｊ１）  5’- CAGTATTTGCCAGGAAGACACAA-3’（配列番号８６）
および
ｍｆＣＹＰ２Ｇ２  （３ｂｔｊ１）  5’- GAGGACCAAGTTCTTGAGGTTGA-3’（配列番号８７）
を用い、プローブとして、
ｍｆＣＹＰ２Ｇ２ｂｈｑ１ＦＷ  
5’-FAM- CCCAAAACCCTCGGGACTTCATTG-BHQ-3’（配列番号８８）
を用いた。
プライマーセットとプローブの最終濃度は、それぞれ６００ｎＭ、２００ｎＭとした。
結果を図２９に示す。ＣＹＰ２Ｇ２は、鼻粘膜で強く発現していることが確認できたが、肝臓では発現していなかった。
【００９０】
（Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉにおけるヘテロタンパク質の発現）
以下のようにした以外は、実施例１と同様にして、ＣＹＰ２Ｇ２タンパク質を大腸菌で発現させた。Ｎ−末端の修飾は以下のフォワードおよびリバースプライマーを用いてＰＣＲにより実施した。
ｍｆＣＹＰ２Ｇ２  （５ｅｘｐ１ｂｏｖ）
5’-GGAATTCCATATGGCTCTGTTATTAGCAGTTTTTATCTTTCTGGCACTCTGCTTGTC-3’（配列番号８９）
および
ｍｆＣＹＰ２Ｇ２  （３ｅｘｐ１）  5’-GCTCTAGAGCTCAGCGGGCCACGA-3’（配列番号９０）
次いで、細胞膜画分を調製、ＣＹＰタンパク質の定量、ＮＡＰＤＨ−ＣＹＰ  レダクターゼの濃度を実施例１と同様にして測定した。
ＣＹＰ２Ａ２３、ＣＹＰ２Ａ２４、ＣＹＰ２Ａ２６のＰＣＲで用いたプライマーは以下のとおりである。
ＣＹＰ２Ａ２３/ＣＹＰ２Ａ２４では、以下の共通のプライマーを用いた。
ＦＷ  ５’-GGAATTCCATATGGCTCTGTTATTAGCAGTTTTTGTGGCCTTGCTGGCCTG-3’（配列番号９１）
ＲＶ  ５’-GCTCTAGACTCAGCGGGGCAGGAAGC-3’（配列番号９２）
ＣＹＰ２Ａ２６では、以下のプライマーを用いた。
ＦＷ  5'-GGAATTCCATATGGCTCTGTTATTAGCAGTTTTTCTCTGTCTCTCCTTTGTGC-3'（配列番号９３）
ＲＶ  5'-GCTCTAGACAGATGGGCTAGCATTCTTCA-3'（配列番号９４）
【００９１】
（薬物の代謝活性）
Ｙａｍａｚａｋｉらの方法（Yamazaki, H. et al., Biochem Pharmacol (2002) 56:243-251）に従って、ＣＹＰ２Ｇ２を用いて、クマリンの代謝活性を解析した。結果を表１１に示す。
【００９２】
【表１１】
2014158479.tif 000012
【００９３】
表１１の結果から、アカゲザルのＣＹＰ２Ｇ２は、機能タンパク質として発現していると考えられた。
【００９４】
（ウェスタンブロッティング解析）
実施例１と同様にして、ＣＹＰ２Ｇ２に対するポリクローナル抗体は、特異的なアミノ酸配列を用いて作製した（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。
Ｃ−末端のシステインのチオール基にＫｅｙｈｏｌｅ  Ｌｉｍｐｅｔ  Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎを結合させた、合成ぺプチド
NH2-YPQHFLDEQGRFKK-COOH（配列番号９５）
を用いて、Ｎｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ  Ｗｈｉｔｅ  Ｒａｂｂｉｔを免疫して、ＣＹＰ２Ｇ２抗体を得た。
カニクイザルの鼻粘膜ミクロソームは、Ｄｉｎｇらの方法（Ding, X. et al., Mol Pharmacol 37:489-496.）により作製した。
カニクイザルｍｆＣＹＰ２Ｇ２、ｍｆＣＹＰ２Ａ２３、ｍｆＣＹＰ２Ａ２４、ｍｆＣＹＰ２Ａ２６の組換タンパク質１．０ｐｍｏｌとカニクイゲザルの鼻粘膜ミクロソーム（１５μｇ、５０μｇまたは１００μｇ）を、１０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｐ  ｆｉｌｔｅｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上に移行した。このフィルターを用いて、ウサギ抗ＣＹＰ２Ｇ２抗体（１：１０００）、及びホースラディッシュペルオキシダーゼにコンジュゲートされたヒツジ抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｓｕｒｍｏｄｉｃｓ）を用いたイムノブロッティングを行った。
製造者の使用説明書に従って、特定のバンドを、ＥＣＬ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により可視化した。結果を図３０に示す。
【００９５】
以上のように、ＣＹＰ２Ｇ２は、鼻粘膜で高発現している鼻粘膜でメジャーな分子種なので，鼻粘膜でＣＹＰ２ＡやＣＹＰ２Ｇが関与する薬物代謝への寄与が大きく、また、ヌルアレルが見つかったことから個体差の原因となり得、また、その代謝におけるヒトとの種差の原因となり得る。
【配列表フリーテキスト】
【００９６】
配列番号１  アカゲザルのＣＹＰ２Ｃ９３のアミノ酸配列を示す。
配列番号２  カニクイザルのＣＹＰ２Ｃ９３のアミノ酸配列を示す。
配列番号３  アカゲザルのＣＹＰ１Ｄ１のアミノ酸配列を示す。
配列番号４  カニクイザルのＣＹＰ１Ｄ１のアミノ酸配列を示す。
配列番号５  カニクイザルのＣＹＰ２Ｇ２のアミノ酸配列を示す。
配列番号６  アカゲザルのＣＹＰ２Ｃ９３のｃＤＮＡの塩基配列を示す。
配列番号７  カニクイザルのＣＹＰ２Ｃ９３のｃＤＮＡの塩基配列を示す。
配列番号８  アカゲザルのＣＹＰ１Ｄ１のｃＤＮＡの塩基配列を示す。
配列番号９  カニクイザルのＣＹＰ１Ｄ１のｃＤＮＡの塩基配列を示す。
配列番号１０  カニクイザルのＣＹＰ２Ｇ２のｃＤＮＡの塩基配列を示す。
配列番号１１  カニクイザルのＣＹＰ２Ｃ９３  ＳＶ１の塩基配列を示す。
配列番号１２  カニクイザルのＣＹＰ２Ｃ９３  ＳＶ２の塩基配列を示す。
配列番号１３  アカゲザル上に見出したＣＹＰ２Ｃ様配列をもとにデザインした５’末端プライマーの塩基配列を示す。
配列番号１４  アカゲザル上に見出したＣＹＰ２Ｃ様配列をもとにデザインした３’末端プライマーの塩基配列を示す。
配列番号１５  ５’ＲＡＣＥおけるプライマーの塩基配列を示す。
配列番号１６  ５’ＲＡＣＥおけるプライマーの塩基配列を示す。
配列番号１７  ５’ＲＡＣＥおけるプライマーの塩基配列を示す。
配列番号１８  転写解析において用いたプライマーの塩基配列を示す。
配列番号１９  転写解析において用いたプライマーの塩基配列を示す。
配列番号２０  カニクイザルのＣＹＰ２Ｃ９３の５’末端解析用のＦプライマーの塩基配列を示す。
配列番号２１  カニクイザルのＣＹＰ２Ｃ９３の５’末端解析用のＲプライマーの塩基配列を示す。
配列番号２２  カニクイザルのＣＹＰ２Ｃ９３の３’末端解析用のＦプライマーの塩基配列を示す。
配列番号２３  カニクイザルのＣＹＰ２Ｃ９３の３’末端解析用のＲプライマーの塩基配列を示す。
配列番号２４  カニクイザルのＣＹＰ２Ｃ８の５’末端解析用のＦプライマーの塩基配列を示す。
配列番号２５  カニクイザルのＣＹＰ２Ｃ８の５’末端解析用のＲプライマーの塩基配列を示す。
配列番号２６  カニクイザルのＣＹＰ２Ｃ８の３’末端解析用のＦプライマーの塩基配列を示す。
配列番号２７  カニクイザルのＣＹＰ２Ｃ８の３’末端解析用のＲプライマーの塩基配列を示す。
配列番号２８  カニクイザルのＣＹＰ２Ｃ７６の５’末端解析用のＦプライマーの塩基配列を示す。
配列番号２９  カニクイザルのＣＹＰ２Ｃ７６の５’末端解析用のＲプライマーの塩基配列を示す。
配列番号３０  カニクイザルのＣＹＰ２Ｃ７６の３’末端解析用のＦプライマーの塩基配列を示す。
配列番号３１  カニクイザルのＣＹＰ２Ｃ７６の３’末端解析用のＲプライマーの塩基配列を示す。
配列番号３２  エクソンの増幅時に用いたエクソン１のプライマーの塩基配列を示す。
配列番号３３  エクソンの増幅時に用いたエクソン１のプライマーの塩基配列を示す。
配列番号３４  エクソンの増幅時に用いたエクソン２／３のプライマーの塩基配列を示す。
配列番号３５  エクソンの増幅時に用いたエクソン２／３のプライマーの塩基配列を示す。
配列番号３６  エクソンの増幅時に用いたエクソン６のプライマーの塩基配列を示す。
配列番号３７  エクソンの増幅時に用いたエクソン６のプライマーの塩基配列を示す。
配列番号３８  Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲにおけるＣＹＰ１Ｄ１の５’末端プライマーの塩基配列を示す。
配列番号３９  Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲにおけるＣＹＰ１Ｄ１の３’末端プライマーの塩基配列を示す。
配列番号４０  Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲにおけるプローブの塩基配列を示す。
配列番号４１  ｃ．１０２にＴを挿入する際に用いた、プライマーの塩基配列を示す。
配列番号４２  ｃ．１０２にＴを挿入する際に用いた、プライマーの塩基配列を示す。
配列番号４３  ＣＹＰ２Ａ９３のＦプライマーの塩基配列を示す。
配列番号４４  ＣＹＰ２Ａ９３のＲプライマーの塩基配列を示す。
配列番号４５  Ｃ−末端のシステインのチオール基にＫｅｙｈｏｌｅ  Ｌｉｍｐｅｔ  Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎを結合させた、合成ぺプチドのペプチド部分のアミノ酸配列を示す。
配列番号４６  ＩＶＳ２−１Ｇ＞Ｔ変異を導入するために用いたプライマーの塩基配列を示す。
配列番号４７  ＩＶＳ２−１Ｇ＞Ｔ変異を導入するために用いたプライマーの塩基配列を示す。
配列番号４８  β−アクチンのプライマーの塩基配列を示す。
配列番号４９  β−アクチンのプライマーの塩基配列を示す。
配列番号５０  ｃ．１０２Ｔ＞ｄｅｌの遺伝子型を決定するために用いたプライマーの塩基配列を示す。
配列番号５１  ｃ．１０２Ｔ＞ｄｅｌの遺伝子型を決定するために用いたプライマーの塩基配列を示す。
配列番号５２  アカゲザル遺伝子データのコンピュータ分析により予期されたＣＹＰ様ＯＲＦ候補配列からデザインした５’末端プライマーの塩基配列を示す。
配列番号５３    アカゲザル遺伝子データのコンピュータ分析により予期されたＣＹＰ様ＯＲＦ候補配列からデザインした３’末端プライマーの塩基配列を示す。
配列番号５４  ５’ＲＡＣＥおけるプライマーの塩基配列を示す。
配列番号５５  ５’ＲＡＣＥおけるプライマーの塩基配列を示す。
配列番号５６  ５’ＲＡＣＥおけるプライマーの塩基配列を示す。
配列番号５７  Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲにおけるＣＹＰ１Ｄ１の５’末端プライマーの塩基配列を示す。
配列番号５８  Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲにおけるＣＹＰ１Ｄ１の３’末端プライマーの塩基配列を示す。
配列番号５９  Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲにおけるプローブの塩基配列を示す。
配列番号６０  Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲにおけるＣＹＰ１Ａ１の５’末端プライマーの塩基配列を示す。
配列番号６１  Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲにおけるＣＹＰ１Ａ１の３’末端プライマーの塩基配列を示す。
配列番号６２  Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲにおけるＣＹＰ１Ａ２の５’末端プライマーの塩基配列を示す。
配列番号６３  Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲにおけるＣＹＰ１Ａ２の３’末端プライマーの塩基配列を示す。
配列番号６４  Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲにおけるＣＹＰ１Ａ１のプローブの塩基配列を示す。
配列番号６５  Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲにおけるＣＹＰ１Ａ２のプローブの塩基配列を示す。
配列番号６６  大腸菌に発現させる際に、ＣＹＰ１Ｄ１のＮｄｅ１部位を変異させるために用いたプライマーの塩基配列を示す。
配列番号６７  大腸菌に発現させる際に、ＣＹＰ１Ｄ１のＮｄｅ１部位を変異させるために用いたプライマーの塩基配列を示す。
配列番号６８  ＣＹＰ１Ｄ１のＦプライマーの塩基配列を示す。
配列番号６９  ＣＹＰ１Ｄ１のＲプライマーの塩基配列を示す。
配列番号７０  ＣＹＰ１Ａ１のＦプライマーの塩基配列を示す。
配列番号７１  ＣＹＰ１Ａ１のＲプライマーの塩基配列を示す。
配列番号７２  ＣＹＰ１Ａ２のＦプライマーの塩基配列を示す。
配列番号７３  ＣＹＰ１Ａ２のＲプライマーの塩基配列を示す。
配列番号７４  Ｃ−末端のシステインのチオール基にＫｅｙｈｏｌｅ  Ｌｉｍｐｅｔ  Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎを結合させた、合成ぺプチドのペプチド部分のアミノ酸配列を示す。
配列番号７５  アカゲザルゲノムにおいてＣＹＰ２Ｇ２配列をコードしていると考えられる遺伝子配列から推測したコード領域に対応するｃＤＮＡをＲＴ−ＰＣＲで増幅するために設計した５’末端プライマーの塩基配列を示す。
配列番号７６  アカゲザルゲノムにおいてＣＹＰ２Ｇ２配列をコードしていると考えられる遺伝子配列から推測したコード領域に対応するｃＤＮＡをＲＴ−ＰＣＲで増幅するために設計した３’末端プライマーの塩基配列を示す。
配列番号７７  ５’ＲＡＣＥおけるプライマーの塩基配列を示す。
配列番号７８  ５’ＲＡＣＥおけるプライマーの塩基配列を示す。
配列番号７９  ５’ＲＡＣＥおけるプライマーの塩基配列を示す。
配列番号８０  エクソン１の増幅に用いた５’末端プライマーの塩基配列を示す。
配列番号８１  エクソン１の増幅に用いた３’末端プライマーの塩基配列を示す。
配列番号８２  エクソン３の増幅に用いた５’末端プライマーの塩基配列を示す。
配列番号８３  エクソン３の増幅に用いた３’末端プライマーの塩基配列を示す。
配列番号８４  ダイレクトシークエンス法において用いた、エクソン１のシークエンスプライマーの塩基配列を示す。
配列番号８５  ダイレクトシークエンス法において用いた、エクソン３のシークエンスプライマーの塩基配列を示す。
配列番号８６  Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲにおけるＣＹＰ２Ｇ２の３’末端プライマーの塩基配列を示す。
配列番号８７  Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲにおけるＣＹＰ２Ｇ２のプローブの塩基配列を示す。
配列番号８８  Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲにおけるＣＹＰ２Ｇ２のプローブの塩基配列を示す。
配列番号８９  ＣＹＰ２Ｇ２のＦプライマーの塩基配列を示す。
配列番号９０  ＣＹＰ２Ｇ２のＲプライマーの塩基配列を示す。
配列番号９１  ＣＹＰ２Ａ２３／ＣＹＰ２Ａ２４のＦプライマーの塩基配列を示す。
配列番号９２  ＣＹＰ２Ａ２３／ＣＹＰ２Ａ２４のＲプライマーの塩基配列を示す。
配列番号９３  ＣＹＰ２Ａ２６のＦプライマーの塩基配列を示す。
配列番号９４  ＣＹＰ２Ａ２６のＲプライマーの塩基配列を示す。
配列番号９５  Ｃ−末端のシステインのチオール基にＫｅｙｈｏｌｅ  Ｌｉｍｐｅｔ  Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎを結合させた、合成ぺプチドのペプチド部分のアミノ酸配列を示す。
配列番号９６  カニクイザルのＴを挿入したＣＹＰ２Ｃ９３  ＳＶ２の塩基配列を示す。
配列番号９７  カニクイザルのＴ欠損のＳＶ１とＳＶ２のアミノ酸配列を示す。
配列番号９８  カニクイザルのＴを挿入したＣＹＰ２Ｃ９３のＳＶ２のアミノ酸配列を示す。
【図１】
2014158479.tif 000013
【図２】
2014158479.tif 000014
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2014158479.tif 000019
【図８】
2014158479.tif 000020
【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【配列表】
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