(57)【要約】    【課題】  エステル交換用の高活性酵素剤の調製において、濃縮された高純度酵素を使用すると高エステル交換活性の酵素剤が得られるものの酵素剤が高価になるという問題がある。より簡便に、低コストで高活性酵素剤を得る方法を提供する。    【解決手段】エステル交換活性を有する酵素を、微生物の培養液由来の成分を含む組成物との接触下乾燥することにより、簡便に、低コストで高活性酵素剤を得ることができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
エステル交換活性を有する酵素を、微生物の培養液由来の成分を含む組成物との接触下乾燥することを特徴とする酵素剤の製造法。
【請求項２】
前記微生物の培養液が、油脂を含む培地で油脂分解微生物を培養したものであることを特徴とする、請求項１に記載の酵素剤の製造法。
【請求項３】
前記油脂分解微生物が、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｌｕｓ）属、ロドコッカスＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、スフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）属、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属、リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、プロピオニバクテリウム（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、バリオボラックス（Ｖａｒｉｏｖｏｒａｘ）属、及びカンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属からなる群より選ばれた一種以上の属に属するものであることを特徴とする、請求項２に記載の酵素剤の製造法。
【請求項４】
前記培養液が、菌体を除去する工程を経たものであることを特徴とする、請求項１乃至３に記載の酵素剤の製造法。
【請求項５】
前記培養液が、加熱工程または乾燥工程を経たものであることを特徴とする、請求項１乃至４に記載の酵素剤の製造法。
【請求項６】
前記エステル交換活性を有する酵素が、リパーゼであることを特徴とする、請求項１乃至５に記載の酵素剤の製造法。
【請求項７】
前記エステル交換活性を有する酵素が、濃縮工程を経て製造されたものであることを特徴とする、請求項１乃至６に記載の酵素剤の製造法。
【請求項８】
前記濃縮工程が、溶剤沈殿を含むことを特徴とする、請求項１乃至７に記載の酵素剤の製造法。
【請求項９】
担体に固定化されていることを特徴とする、請求項１乃至８に記載の酵素剤の製造法。
【請求項１０】
請求項１乃至９に記載の製造法により製造された酵素剤。
【請求項１１】
請求項１０に記載された酵素剤を用いたエステル交換油脂の製造法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、各種エステル化反応、エステル交換反応等に好適に使用できる、高活性な酵素剤及びその製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
リパーゼを触媒として使用した油脂のエステル交換反応による油脂の改質が広く行われている。これら油脂のエステル交換反応には、バッチ方式，カラムによる連続方式等があるが、従来からリパーゼを何らかの担体に固定化した、固定化リパーゼとして用いられることが多かった。リパーゼの固定化には、例えばアニオン交換樹脂（特許文献１）、フェノールホルムアルデヒド吸着樹脂（特許文献２）、疎水性多孔質担体（特許文献３）、陽イオン交換樹脂（特許文献４）、キレート樹脂（特許文献５）等が用いられてきたが、これらに記載の方法は、リパーゼを担体に固定することでエステル交換活性が低下する欠点に加え、担体が高価なためにコストが高くなる傾向があった。また、固定化時の活性を高める方法として、乳化活性のないポリヒドロキシ化合物の添加（特許文献６）、脂肪酸誘導体を添加（特許文献７）、高分子乳化剤を含む乳化組成物の添加（特許文献８）、が提案されているが、まだ充分ではない。また、酵素の活性を上昇させる手段としては、酵素純度を上げる方法が一般的であり、固定化工程において溶剤で洗浄することにより、酵素純度を上げる方法（特許文献９）が提案されているが、本方法は酵素活性は上昇するものの固定化工程が手間がかかり煩雑という問題があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開昭６０‐９８９８４号公報
【特許文献２】特開昭６１‐２０２６８８号公報
【特許文献３】特開平２‐１３８９８６号公報
【特許文献４】特開平３‐６１４８５号公報
【特許文献５】特開平１‐２６２７９５号公報
【特許文献６】特開平７‐２６５０７３号公報
【特許文献７】特開昭６２−１３４０９０号公報
【特許文献８】国際公開第２００９−０１７０８７号
【特許文献９】特開２００７−６７１７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、簡便な方法で効率良くエステル交換活性を向上させた酵素剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、上記の課題に対して鋭意研究を重ねた結果、エステル交換活性を有する酵素を、微生物の培養液成分を含む組成物との接触下乾燥して得られた酵素剤は、培養液成分を含む組成物と接触せずに得られた酵素剤よりもエステル交換活性が格段に向上し、効率良く利用できるという知見を見出し本発明を完成させた。
【０００６】
即ち、本発明は、
（１）エステル交換活性を有する酵素を、微生物の培養液由来の成分を含む組成物との接触下乾燥することを特徴とする酵素剤の製造法。
（２）前記微生物の培養液が、油脂を含む培地で油脂分解微生物を培養したものであることを特徴とする、（１）に記載の酵素剤の製造法。
（３）前記油脂分解微生物が、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｌｕｓ）属、ロドコッカスＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、スフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）属、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属、リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、プロピオニバクテリウム（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、バリオボラックス（Ｖａｒｉｏｖｏｒａｘ）属、及びカンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属からなる群より選ばれた一種以上の属に属するものであることを特徴とする、（２）に記載の酵素剤の製造法。
（４）前記培養液が、菌体を除去する工程を経たものであることを特徴とする、（１）乃至（３）に記載の酵素剤の製造法。
（５）前記培養液が、加熱工程または乾燥工程を経たものであることを特徴とする、（１）乃至（４）に記載の酵素剤の製造法。
（６）前記エステル交換活性を有する酵素が、リパーゼであることを特徴とする、（１）乃至（５）に記載の酵素剤の製造法。
（７）前記エステル交換活性を有する酵素が、濃縮工程を経て製造されたものであることを特徴とする、（１）乃至（６）に記載の酵素剤の製造法。
（８）前記濃縮工程が、溶剤沈殿を含むことを特徴とする、（１）乃至（７）に記載の酵素剤の製造法。
（９）担体に固定化されていることを特徴とする、（１）乃至（８）に記載の酵素剤の製造法。
（１０）（１）乃至（９）に記載の製造法により製造された酵素剤。
（１１）前記（１０）に記載された酵素剤を用いたエステル交換油脂の製造法。
に関するものである。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、酵素剤の製造において、加水分解活性あたりのエステル交換活性が高まるため、高価な酵素の使用量を削減することが出来、ひいてはエステル交換油の生産性を向上させることができる。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
以下、本発明を具体的に説明する。本発明で用いる微生物の培養液成分を含む組成物とは、微生物の培養液由来の成分を含む。培養液は、油脂分解微生物の培養液が好ましく、さらには「油脂分解菌を油脂を含む培地で培養した培養液」が好ましい。油脂分解微生物とは、具体的に、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｌｕｓ）属、ロドコッカスＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、スフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）属、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属、リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、プロピオニバクテリウム（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、バリオボラックス（Ｖａｒｉｏｖｏｒａｘ）属、及びカンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属などが挙げられる。
【０００９】
ここで述べる微生物由来の培養液は、各種栄養成分を含む培地に微生物を接種、培養し得られた培養物を濾過や遠心処理などによって菌体を除き、上清のみ得たものである。微生物由来の培養液は、元来種々の酵素をはじめ多彩な成分を含有する。中にはエステル交換活性を有する酵素を分解する酵素等も含まれているが、煮沸などの加熱処理や凍結乾燥等の乾燥処理を行うことで、酵素が失活していても良い。本発明は、上述した成分を組成物の必須成分とするが、その他のエステル交換活性を向上させる成分を併用することも可能である。
【００１０】
微生物の培養液成分を含む組成物とエステル交換活性を有する酵素の接触方法は特に限定されないが、乳化させることにより界面酵素であるエステル交換活性を有する酵素が効率良く活性化され、エステル交換活性を向上させるため好ましい。接触方法としては、組成物に液体の酵素を加えて均一化しても良いし、組成物を含む溶液に固体若しくは粉末の酵素を加え溶解分散させても良い。乳化の方法もとくに限定しないが、振盪機やホモミキサー等での混合でも良いし、ホモミキサー，ホモゲナイザー，ナノマイザー等を用いて適切な圧力を設定して行ったり、膜乳化や超音波を用いたりして乳化することもできる。
【００１１】
本発明で用いられるエステル交換活性を有する酵素は、好ましくはリパーゼであり、細菌，酵母，糸状菌，放線菌等に由来する、広い起源のものが使用でき、限定されるものではない。具体的には、バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｐ．）、リゾプス属（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｓｐ．）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）、キャンディダ属（Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｐ．）、ムコール属（Ｍｕｃｏｒ  ｓｐ．）、シュードモナス属（Ｐｓｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）、アルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｓｐ．）、アスロバクター属（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｕｍ  ｓｐ．）、ジオトリカム属（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｓｐ．）等が挙げられる。また、膵臓リパーゼや米糠リパーゼ等動植物由来のものも使用することができる。尚、耐熱性の高いリパーゼを用いると、高融点の油脂をエステル交換の基質として利用できるために、油脂の酸化や加水分解に伴う風味劣化に対して耐性の高い固定化酵素を得ることができる。
【００１２】
エステル交換活性を有する酵素は、リパーゼを分泌する微生物の培養液や菌体破砕・抽出液から得たものそのままでも問題ないが、好ましくは、濃縮工程を経ているものが良い。濃縮工程とは、限外濾過膜による濃縮、溶剤沈殿による濃縮などが挙げられるが、好ましくは溶剤沈殿による濃縮であり、アセトン沈殿やエタノール沈殿によるものが代表的である。また、濃縮工程や精製工程を経て製造されている市販の製剤酵素を用いても良い。
【００１３】
本発明の酵素剤は担体に固定化されているものが好ましい。固定化に利用する担体としては、多孔質のものが好ましく、珪藻土，アルミナ，セライト，セルロース及びその他のセルロース誘導体、多孔性ガラス，ガラス繊維，ケイ酸ゲル，フロリジル，イオン交換樹脂，二酸化チタン，カオリナイト，パーライト等が例示されるが、酵素分子を捉えておく機能があれば、その成分は特には限定されない。
【００１４】
固定化酵素剤の調製は、上記に記載した各種酵素と組成物を含む液を上記に記載した担体に接触させた後、乾燥させることで、酵素を担体に吸着させて行う。接触には、各種酵素と組成物を含む液に担体を浸しても良いし、担体に対して同液を噴霧しても良い。各種酵素と組成物を含む液を担体に接触させる際、担体の吸収できる水分量であることが好ましい。吸収できる水分以上の接触を行うと、担体から各種酵素と組成物を含む液が流れ出してしまうため所定の酵素量を担持させることができない。
【００１５】
酵素を吸着させた担体は、種々の方法で乾燥することができる。具体的には、減圧による乾燥手段や、相対的に低湿度の空気，窒素，その他の不活性ガスと接触させる所謂通気乾燥等の方法が挙げられる。中でも、酵素を吸収させた担体を、好ましくはその温度に於ける水の蒸気圧より低い圧力環境に保持する、減圧乾燥もしくは通気乾燥が好ましい。
【００１６】
エステル交換活性を有する酵素と微生物の培養液成分を含む組成物の混合比率は、使用するリパーゼ粉末などの酵素の量に対する比として、種々の割合とすることができる。好ましくは、酵素重量に対する、添加する微生物の培養液成分を含む組成物重量の比が、０．２倍以上が好ましく、０．５倍以上が更に好ましい。また、１．５倍以下が好ましく、１．０倍以下が更に好ましい。０．１倍未満であるとその効果が十分には発揮されない場合がある。また、２．０倍より多くなると、添加量に対する効果の伸びが頭打ち、必要以上の組成物を使用することになる。酵素と培養組成物の混合は、培養組成物を水和したものに液体の酵素を加えて均一化しても良いし、培養組成物を水和したものに固体若しくは粉末の酵素を加え溶解分散させても良い。
【００１７】
この様に調製された酵素剤は、高いエステル交換活性を有しているために、油脂の改質等に好適に用いることができる。その形態は、バッチ方式やカラムを用いた連続方式等、種々の方法に用いることができる。
【００１８】
以下に実施例を記載するが、この発明の技術思想がこれらの例示によって限定されるものではない。
【００１９】
実施例で使用したエステル交換活性の測定は以下の方法で行った。
パーム中融点画分とパーム低融点画分を６：４に配合した乾燥基質１００部に、２．７部の酵素剤を加え６０℃にて２４時間振とう反応させた反応生成物をガスクロマトグラフィーにてトリグリセリド組成を分析し、下記に示す式で反応率を求めた。
反応率［％］  ＝  （反応生成物のトリパルミチン含量）／（反応平衡組成物のトリパルミチン含量‐基質のトリパルミチン含量）
次いで、下式より初期反応速度定数ｋを求めた。
初期反応速度定数ｋ  ＝  ｌｎ［１００／（１００‐反応２４時間後の反応率［％］）］
この反応速度定数ｋと、基質に対する固定化酵素剤の添加量から、下記に示す式で算出した値をエステル交換活性値とした。
エステル交換活性値  Ｋ２４  ＝  ｋ×（原料油脂量／酵素剤添加量）
【００２０】
（試作例１）バークホルデリア・プランタリの培養によるリパーゼの作成
バークホルデリア・プランタリ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｌａｎｔａｒｉｉ）ＮＢＲＣ１０４８８４株を培地Ａにて培養した。培地Ａの組成を表１に示す。得られた培養液上清に−１０℃に冷却したアセトンを３倍量加えアセトン沈殿を行い、沈殿側を乾燥することによりバークホルデリア・プランタリのリパーゼ粉末を得た。得られたリパーゼ粉末の加水分解活性は、５８４７０Ｕｎｉｔ／ｇであった。（ＪＩＳ  Ｋ０６０１  工業用リパーゼの活性測定方法に従って測定。）
【００２１】
表１
2014198030.tif 000002
【００２２】
（試作例２）培養液成分を含む組成物の作成
試作例１で得られた培養液上清を１０分間以上煮沸することによりリパーゼを失活させ、さらに凍結乾燥することにより、バークホルデリア・プランタリの培養液成分を含む組成物を得た。
（試作例３）培地成分を含む組成物の作成
培地Ａをそのまま凍結乾燥することにより培地成分を含む組成物を得た。
（試作例４）培養液成分を含む組成物の作成
下記の表２に示す組成の培地Ｂを前記培地Ａに替えて使用した以外は試作例２と同様にして培養液成分を含む組成物を得た。
【００２３】
表２
2014198030.tif 000003
【００２４】
（実施例１〜４、比較例１〜３）酵素剤の作成及びエステル交換活性の評価
純水３．０ｇに、試作例１のリパーゼ粉末０．０５ｇ〜０．２ｇ、試作例２〜４のいずれかの組成物０〜０．２ｇ及びオレイン酸エチル０．０５ｇを加え撹拌後、固定化担体として珪藻土２．５ｇと混合し、減圧乾燥することで酵素剤を作成した。作成した酵素剤を以下に示す方法でエステル交換活性を評価した。結果を表３に示す。
【００２５】
表３
2014198030.tif 000004
【００２６】
表３において実施例１、比較例１及び２の結果より、培養液成分を含む組成物の添加がエステル交換活性を大きく上昇させ、その効果は培地成分の単純な添加効果ではなく、培養により変化または生成した成分の添加によるものであることを示している。
さらに実施例２〜４、比較例３及び４の結果より、酵素剤に担持させるリパーゼ粉末量が多いほど培養液成分を含む組成物の添加による活性上昇効果が大きいことを示している。
【００２７】
（実施例５）各種微生物の培養液成分を含む組成物の添加による効果
バークホルデリア・プランタリ以外の微生物について、試作例１に記載の培養条件で培養し、得られた培養液上清を１０分間以上煮沸することによりリパーゼを失活させ、さらに凍結乾燥することにより、各々の培養液成分を含む組成物を得た。また、微生物由来の市販リパーゼであるリパーゼＱＬＭ（名糖産業(株)製）を一旦水に分散させ、同様に煮沸処理して培養液成分を含む組成物を得た。得られた培養液成分を含む組成物を試作品２に替えて使用した以外は実施例１と同様に酵素剤を作成しエステル交換活性を評価した。結果を表４に示す。
【００２８】
表４
2014198030.tif 000005
【００２９】
表４は、添加する微生物の培養液成分を含む組成物が、バークホルデリア・プランタリ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｌａｎｔａｒｉｉ）に限らず、その他の菌種でも良いことを示している。
【００３０】
（実施例６）各種リパーゼにおける効果
試作例１のバークホルデリア・プランタリのリパーゼ粉末に替えて、市販リパーゼであるリパーゼＰＳ「アマノ」ＳＤ（天野エンザイム(株)製  加水分解活性６７００Ｕｎｉｔ／ｇ）及びリパーゼＱＬＭ（名糖産業製  加水分解活性３５６４１Ｕｎｉｔ／ｇ）を使用した以外は実施例１と同様に酵素剤を作成しエステル交換活性を評価した。結果を表５に示す。
【００３１】
表５
2014198030.tif 000006
【００３２】
表５は、エステル交換活性を有する酵素が、バークホルデリア・プランタリに限らず、その他の菌種、あるいは市販の濃縮されたリパーゼでも良いことを示している。
【産業上の利用可能性】
【００３３】
本発明により、エステル交換活性の高い酵素剤を簡便に調製できる。本発明の酵素剤使用により、エステル交換反応速度の向上や酵素剤使用量の低減が可能となるため、エステル交換油脂の製造コスト低減も可能となる。