(57)【要約】      （修正有）【課題】巨大なサイズのＤＮＡ配列でも高い効率で遺伝子導入し、さらに導入遺伝子が不要になった際に除去することで遺伝子型を元に戻すことのできるシステムを提供する。【解決手段】（ａ）特定の塩基配列又はその部分配列を含む核酸、（ｂ）特定の塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、Ａｌｂａｔｒｏｓｓトランスポゾン転移活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸、（ｃ）特定の塩基配列と同一性が８０％以上の塩基配列からなり、かつ、Ａｌｂａｔｒｏｓｓトランスポゾン転移活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸、該核酸を含む新規なトランスポゾン転移酵素及びそれを用いた遺伝子導入試薬及び遺伝子導入キット。【選択図】図１
2014230515.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｇ）のいずれかに記載の核酸。
（ａ）配列番号１で示される塩基配列又はその部分配列を含む核酸
（ｂ）配列番号１からなる塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、Albatrossトランスポゾン転移活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（ｃ）配列番号１からなる塩基配列と同一性が８０％以上の塩基配列からなり、かつ、Albatrossトランスポゾン転移活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（ｄ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列又はその部分配列を含む核酸
（ｅ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、Albatrossトランスポゾン転移活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（ｆ）配列番号２からなるアミノ酸配列と同一性が８０％以上のアミノ酸配列からなり、かつ、Albatrossトランスポゾン転移活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（ｇ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、Albatrossトランスポゾン転移活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
【請求項２】
以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載のタンパク質。
（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、Albatrossトランスポゾン転移活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号２からなるアミノ酸配列と同一性が８０％以上のアミノ酸配列からなり、かつ、Albatrossトランスポゾン転移活性を有するタンパク質
【請求項３】
請求項１記載の核酸を含有する組換えベクター。
【請求項４】
請求項３記載の組換えベクターによって形質転換された形質転換体。
【請求項５】
請求項４記載の形質転換体を培養して得られるトランスポゾン転移酵素。
【請求項６】
請求項５記載のトランスポゾン転移酵素及びトランスポゾン認識配列を含む、遺伝子導入試薬。
【請求項７】
請求項５記載のトランスポゾン転移酵素を作動可能に結合した発現ベクターと、標的配列及び請求項５記載のトランスポゾン転移酵素を認識するトランスポゾン認識配列が組み込まれたコンストラクトの量比が29:1〜1:29である、請求項６記載の遺伝子導入試薬。
【請求項８】
請求項６又は７記載の遺伝子導入試薬を含む遺伝子導入キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な遺伝子導入除去方法及びそれに用いるトランスポゾン転移酵素、遺伝子導入試薬及び遺伝子導入キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
多くの遺伝子の発現は１００ｋｂ以上に及ぶ転写調節領域による制御を受けており、外来遺伝子をゲノムに導入して時期、組織特異的に発現させるためには、転写調節領域を含めた大きなゲノム領域を導入する必要がある。これまで以下のようないくつかの遺伝子導入システムが開発されてきた。
【０００３】
まず、エプスタインバーウイルスやヘルペスウイルスを用いたいわゆるエピソームベクターウイルスを用いた導入システムがあげられる。当該システムは、導入遺伝子がホストゲノムに組み込まれないため、一過的な発現しか再現できないという問題があった。さらにレトロウイルスやレンチウイルスベクターは１０ｋｂ以下の遺伝子しか導入できないことに加えて、高頻度で導入されることに起因するがん化のリスクが高いという問題があった。さらに、遺伝子をそのまま細胞核内に注入するシステムもある。当該システムは操作性に優れるものの、導入効率が悪いといった問題があった。また、ＢＡＣクローンを用いた導入システムもある。当該システムでは３００ｋｂ以上の配列を有する遺伝子を組み込むことができるが、導入効率が低いという問題があった。さらに、遺伝子が組み込まれた場合にも、複数のクローンが取り込まれて、それらが縦列に並んだコンカテマーを形成するため、宿主によるサイレンシングを受けやすいという問題があった。
【０００４】
ＤＮＡトランスポゾンを用いたシステムは、トランスポゾン認識配列をトランスポゾン転移酵素が認識して、当該認識配列を切断する原理を利用したものである。具体的には、導入されることが意図される遺伝子の両端にトランスポゾン認識配列を組み込んだコンストラクトを作製して、トランスポゾン転移酵素遺伝子を発現するコンストラクトと共に細胞内に導入することにより、トランスポゾン転移機構を介してホストゲノム内に当該遺伝子が導入されるというシステムである。当該システムは、従前のシステムに比して、導入効率が高く、コンストラクションの作製が容易であり、さらに、導入遺伝子が安定的に発現しうるという利点があった。これまでに、Sleeping Beauty、Tol2、piggyBac等のＤＮＡトランスポゾンが当該システムに用いられている。
【０００５】
ここで、Sleeping Beautyトランスポゾンはサケのゲノムに痕跡として残っている活性を失ったトランスポゾンから、その塩基配列を改変することによって人工的に作製されたトランスポゾンで、哺乳類染色体へ効率よく組み込まれ、挿入変異の危険性も低いといわれている（非特許文献１）。しかし、取り込まれる遺伝子のサイズが１．７ｋｂ以上では、サイズが１ｋｂ大きくなるたびに取り込み率が３０％低下し、導入配列が大きくなるほど導入効率が極端に低下するという問題があった。Tol2トランスポゾンはメダカゲノムからクローニングされ（非特許文献２）、１０ｋｂ程度のサイズの遺伝子を導入することができることが知られている。しかしながら、Tol2トランスポゾンを用いた遺伝子導入では、導入配列をゲノムから同様の機構により切り出す際にフットプリントとよばれる塩基の挿入や欠失が生じてしまうという問題があった。piggyBacトランスポゾンは、イラクサギンウワバ（Trichoplusia ni）由来の天然トランスポゾンで（非特許文献３）、導入配列を除去する際に変異が残らないという利点があるものの、取り込み効率を損なわずに導入できる最大サイズ長が9.7kbであり、サイズの大きい遺伝子や制御配列を組み込むと効率が低下するという問題があった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ivics Z, Hackett PB, Plasterk RH, Izsvak Z. Cell. 1997 Nov 14;91(4):501-10.
【非特許文献２】Kawakami K et al., Dev. Cell, 7, 133-144 (2004)
【非特許文献３】Ding S, Wu X, Li G, Han M, Zhuang Y, Xu T. Cell. 2005 Aug 12;122(3):473-83
【非特許文献４】Suster M. L. et al., Nat. protocols, 6, 1998-2021 (2011)
【非特許文献５】Rostovskaya M. et al., Nucleic Acid Res. October; 40(19) (2012)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
このように、遺伝子は１００ｋｂ以上に及ぶ転写調節領域による制御を受けており、外来遺伝子をゲノムに導入して時期、組織特異的に発現させるためには、転写調節領域を含めた大きなゲノム領域を導入する必要があったところ、従来の遺伝子導入システムでは、このようにサイズの大きい遺伝子や制御配列を効率よく、かつ高精度に組み込むことができず、よって、遺伝子の機能解析が制限されていたという問題があった。そこで、巨大なサイズのＤＮＡ配列でも高い効率で遺伝子導入できる遺伝子導入システムが望まれていた。
【０００８】
ここで、トランスポゾンの認識配列を逆向きに(inside-outのような状態)配置した配列を組み込んだＢＡＣクローンを作製し、転移酵素を発現するコンストラクトと共に細胞内に導入し、トランスポゾンの転移機構を利用して培養細胞内に導入する技術が知られており、比較的サイズの大きい遺伝子等を組み込むことができることが確認されている（非特許文献４及び５）。しかしながら、当該トランスポゾンでは導入した配列を除去することがほとんど不可能であるという問題があった。その理由は以下のとおりである。すなわち、トランスポゾンの転移は一般的に両端の認識配列の間の距離が短いほど効率が上がることが知られていた。ここで、従来のトランスポゾンを用いた場合にも大きいサイズのＤＮＡ断片の導入が可能であった理由は、上記のようにトランスポゾンの認識配列を逆向きに(inside-outのような状態)配置した環状ＤＮＡを用いれば、サイズの大きい標的導入配列を挟み込みつつ、かつ、認識配列の間の距離を短くすることができるからであると考えられていた。転移酵素は認識配列の向きが通常と逆向きであっても切り出せることができるからである。しかしながら、遺伝子が導入された後は、当該コンストラクトは線状（linear）になるため、今度はトランスポゾンの認識配列の間の距離が長くなり、その結果、切り出し反応の効率が低くなるのである。
【０００９】
そこで、本発明は、巨大なサイズのＤＮＡ配列でも高い効率で遺伝子導入及び除去できる遺伝子導入除去システムを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、メダカの新規ＤＮＡトランスポゾンAlbatrossの解析を行うなかで、意外にも当該ＤＮＡトランスポゾンの全長が約１５０ｋｂを上回り、これまで報告があったＤＮＡトランスポゾンの全長が数ｋｂであるのに比してはるかに大きいことを見出した。さらに、当該ＤＮＡトランスポゾンAlbatrossはメダカゲノム上で転移していることが確認されており、実際に以下のような転移活性を有することを見出した。すなわち、Albatross巨大なＤＮＡ配列を導入できること；巨大な配列をも除去しうること；及びトランスポゾン認識配列との特異性が高く、導入した目的配列について、変異を残さずに除去できる、というものである。それにより、このAlbatrossを用いて、１００ｋｂを上回る巨大なサイズのＤＮＡ配列でも高い効率で遺伝子導入及び遺伝子除去できる遺伝子導入除去システムを構築するに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）  以下の（ａ）〜（ｈ）のいずれかに記載の核酸。
（ａ）配列番号１で示される塩基配列又はその部分配列を含む核酸
（ｂ）配列番号１からなる塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、Albatrossトランスポゾン転移活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（ｃ）配列番号１からなる塩基配列と同一性が８０％以上の塩基配列からなり、かつ、Albatrossトランスポゾン転移活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（ｄ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列又はその部分配列を含む核酸
（ｅ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、Albatrossトランスポゾン転移活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（ｆ）配列番号２からなるアミノ酸配列と同一性が８０％以上のアミノ酸配列からなり、かつ、Albatrossトランスポゾン転移活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（ｇ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、Albatrossトランスポゾン転移活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（２）  以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載のタンパク質。
（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、Albatrossトランスポゾン転移活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号２からなるアミノ酸配列と同一性が８０％以上のアミノ酸配列からなり、かつ、Albatrossトランスポゾン転移活性を有するタンパク質
（３）  （１）記載の核酸を含有する組換えベクター。
（４）  （３）記載の組換えベクターによって形質転換された形質転換体。
（５）  （４）記載の形質転換体を培養して得られるトランスポゾン転移酵素。
（６）  （５）記載のトランスポゾン転移酵素及びトランスポゾン認識配列を含む、遺伝子導入試薬。
（７）  （５）記載のトランスポゾン転移酵素を作動可能に結合した発現ベクターと、標的配列及び（５）記載のトランスポゾン転移酵素を認識するトランスポゾン認識配列が組み込まれたコンストラクトの量比が２９：１〜１：２９である、（６）記載の遺伝子導入試薬。
（８）  （６）又は（７）記載の遺伝子導入試薬を含む遺伝子導入キット。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の遺伝子導入システムを用いれば、１００ｋｂを上回る巨大なサイズのＤＮＡ配列でも高い効率で遺伝子導入できる。これにより、従来の遺伝子導入システムでは不可能であった、１００ｋｂ以上に及ぶ転写調節領域による制御を受ける外来遺伝子について、転写調節領域を含めた大きなゲノム領域を導入して時期、組織特異的に発現させることができる。よって、従来機能が不明であった遺伝子についても、本発明のシステムにより初めて機能解析を進めることができるという利点がある。
【００１３】
さらに、本発明の遺伝子導入除去方法を用いれば、遺伝子導入体に遺伝子導入時に用いたのと同様のトランスポゾン転移酵素を発現させることにより、導入配列をゲノムから除去することができるという利点もある。遺伝子導入は、導入遺伝子自身の活性が生体の機能に異常をもたらしたり、挿入部位近傍の遺伝子の活性を変化させたりするリスクがあるが、本発明のトランスポゾンを用いた遺伝子導入除去方法は、必要なときに遺伝子を導入し、不要になればいつでも除去ができるという点で、非常に有用である。
【００１４】
さらに、本発明のトランスポゾン転移酵素はトランスポゾン認識配列との特異性が高く、導入した目的配列について、変異を残さずに除去できる。従って、より精度が高い細胞導入及びその除去が実現されるという利点がある。
【００１５】
本発明のトランスポゾン転移酵素系と他のトランスポゾン転移酵素系のシステムを組み合わせたベクターを作製することができるため、１の細胞導入システムで複数の細胞導入を行うことができるという利点がある。
【００１６】
上記本発明の細胞導入除去技術は、特に再生医療の発展において寄与できるという利点がある。例えば、ｉＰＳ細胞の樹立の際には複数の未分化誘導遺伝子(Oct3/4・Sox2・Klf4・c-Myc)が導入されるが、これらの遺伝子はガン化を引き起こすリスクがあるため、樹立後に実際にヒトに応用する際には除去することが必要である。しかしながら、本発明の上記方法を用いれば、遺伝子導入により幹細胞を樹立し、それにより組織・器官を再生させた後、不要となった導入遺伝子を除去し、遺伝子型を元に戻すことが可能となる。
【００１７】
さらに、本発明の遺伝子導入システムは転移酵素及びAlbatrossの両端配列しか必要なく、コンストラクションも容易であり、簡易かつ簡便な遺伝子導入ツールとしての利用価値も高い。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】本発明の遺伝子導入方法の概要を示す図である。
【図２】本発明の遺伝子導入方法の概要を示す図である。
【図３】本発明の遺伝子導入方法において、インジケータープラスミドに組み込まれていたプラスミドが切り出されたことを示す図である。
【図４】本発明の遺伝子導入除去方法のシステムの概要を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明は、新規なトランスポゾン転移酵素及びそれを用いた遺伝子導入試薬及び遺伝子導入キット並びに遺伝子導入方法に関する。以下に本発明を説明する。
【００２０】
（１）本発明の概要
本発明はトランスポゾン転移酵素及び当該酵素が認識するトランスポゾン認識配列を用いて、遺伝子導入を行う方法に関する。以下に本発明の概要について説明する。
【００２１】
トランスポゾンは移動するＤＮＡといわれるように、トランスポゾン転移酵素の作用により切断されて切り出され、染色体の別の位置に移動する。ここで、トランスポゾン転移酵素はトランスポゾンの両末端に位置する逆向き反復配列（トランスポゾン認識配列ともいう）という配列を認識して、トランスポゾンを移動させるため、両末端のトランスポゾン認識配列の間に外来遺伝子配列が挿入されていた場合には、当該外来遺伝子配列もトランスポゾンとともに移動することができる。そこで、この原理に基づいて、以下のような遺伝子導入システムが開発された。すなわち、この両末端のトランスポゾン認識配列の間に目的とする遺伝子が挿入されたトランスポゾンを作製して、細胞内に導入し、トランスポゾン転移酵素を作用させて、当該目的遺伝子をホストゲノム（染色体）へ移動させることで、目的遺伝子をホストゲノムに組み込むというものである（図１）。
【００２２】
本発明は、東アジアに生息する魚類であり、脊椎動物の遺伝学研究に使用されてきたメダカ由来の巨大なトランスポゾンAlbatrossに着目したものである。Albatrossトランスポゾンはメダカ（Oryzias latipes）ゲノムに存在するトランスポゾンで、piggyBacファミリーに属する。このAlbatrossトランスポゾンのサイズは１５０ｋｂ以上であり、これまで報告のあるトランスポゾンのサイズが数ｋｂであるのに比し、極めて大きいサイズのトランスポゾンである。Albatrossトランスポゾンが染色体上の別の領域に転移して挿入されることにより生じる突然変異体が複数存在することが知られていた。そこで、本発明者らは、当該Albatrossトランスポゾンの転移活性に着目し、その転移活性が保持されているのか否かを検討したところ、転移活性が保持されていることを見出した。さらに、本発明者らは当該Albatrossトランスポゾンに特異的に作用する、つまり、Albatrossトランスポゾン認識配列に作用するトランスポゾン転移酵素を見出したことにより、Albatrossトランスポゾン遺伝子導入システムを完成させた。このように、本発明は、上記トランスポゾン遺伝子導入システムを応用した、新規な遺伝子導入システムである。本発明のトランスポゾン遺伝子導入システムは、１００ｋｂを上回るサイズのＤＮＡ配列を効率よく導入し、のちに切り出すことができる。さらに、本発明のトランスポゾン転移酵素は配列認識特異性が高く、無用な変異体が作製されることもないという優れた特質を有する遺伝子導入除去システムとして利用価値が高い。以下、本発明の遺伝子導入（除去）方法に関して説明する。
（２）本発明のトランスポゾン転移酵素をコードする核酸
本発明のAlbatrossトランスポゾン転移酵素（以下、「本発明のトランスポゾン転移酵素」という場合もある）は、メダカ（Oryzias latipes）由来で大きさは２４９９ｂである。具体的には、第１−６番目の塩基はKozak配列を示し、第７−２４６０番目の塩基はトランスポゾン転移酵素をコードする配列であり、第２４６１-２４７８番目の塩基はlinker配列を示し、第２４７９−２４９６番目の塩基は核移行シグナル配列を示し、第２４９７−２４９９番目の塩基は終止コドンを示す。また、第１３９４-１４８９番目の塩基はイントロンである。この塩基配列を配列番号１に示す。
【００２３】
本発明のトランスポゾン転移酵素をコードする核酸とは、一本鎖及び二本鎖のＤＮＡのほか、そのＲＮＡ相補体も含み、天然由来のものであっても、人工的に作製したものであってもよい。ＤＮＡには、例えば、ゲノムＤＮＡや、前記ゲノムＤＮＡに対応するｃＤＮＡ、化学的に合成されたＤＮＡ、ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡ、及びそれらの組み合わせや、ＤＮＡとＲＮＡのハイブリッドがあげられるがこれらに限定されない。
【００２４】
本発明の核酸の好ましい態様としては、（ａ）配列番号１で示される塩基配列又はその部分配列を含む核酸；（ｂ）配列番号１からなる塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、Albatrossトランスポゾン転移活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸；（ｃ）配列番号１からなる塩基配列と同一性が８０％以上の塩基配列からなり、かつ、Albatrossトランスポゾン転移活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸；（ｄ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列又はその部分配列を含む核酸；（ｅ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、Albatrossトランスポゾン転移活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸；（ｆ）配列番号２からなるアミノ酸配列と同一性が８０％以上のアミノ酸配列からなり、かつ、Albatrossトランスポゾン転移活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸；及び（ｇ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、Albatrossトランスポゾン転移活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸等があげられる。
【００２５】
上記塩基配列を得るためには、トランスポゾン転移活性を有する生物のＥＳＴやゲノムＤＮＡの塩基配列データから、既知のトランスポゾン転移活性を有するタンパク質と同一性の高いタンパク質をコードする塩基配列を探索することもできる。ＥＳＴ解析は公知の方法を用いることができる。Albatrossトランスポゾン転移活性を有する生物としては、魚類があげられ、好ましくはメダカ等があげられるが、これに限定されない。
【００２６】
本発明のAlbatrossトランスポゾン転移酵素の塩基配列をＧｅｎＢａｎｋに登録されているアミノ酸配列に対してＢＬＡＳＴＸを用いて相同性解析を行った結果、piggyBac型転移酵素遺伝子ホモログと相同性を示した。最も同一性が高いのは、Takifugu rubripes由来の推定タンパク質piggyBac transposable element-derived protein 4-likeで、当該タンパク質由来の塩基配列のＣＤＳと本願発明のAlbatrossトランスポゾン転移酵素のＣＤＳの同一性及びアミノ酸配列の同一性をｃｌｕｓｔａｌＷにて求めると、それぞれ65.4％、47.0％であった。その他、Trichoplusia ni由来の推定タンパク質piggyBac transposaseについて、当該タンパク質由来の塩基配列のＣＤＳと本願発明のAlbatrossトランスポゾン転移酵素のＣＤＳの同一性及びアミノ酸配列の同一性をｃｌｕｓｔａｌＷにて求めると、それぞれ45.9％、27.8％であった。
【００２７】
本発明はまた、上記配列番号１で示される塩基配列（「本発明の塩基配列」と記載する場合もある）（ａ）、並びに、配列番号２で示されるアミノ酸配列（「本発明のアミノ酸配列」と記載する場合もある）からなるタンパク質をコードする塩基配列（ｄ）を含む核酸と同等の機能を有する以下の核酸をも含む。「同等の機能を有する」とは、本発明の塩基配列がコードするタンパク質及び本発明のアミノ酸配列からなるタンパク質がAlbatrossトランスポゾン転移活性を有することを意味する。Albatrossトランスポゾン転移活性は、公知の方法を用いて測定できるが、例えば、本明細書実施例３に記載のExcision assayなどがあげられる。
【００２８】
（ｂ）配列番号１からなる塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
本発明の核酸は、配列番号１からなる塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む。配列番号１及びAlbatrossトランスポゾン転移活性については上記のとおりである。
【００２９】
上記塩基配列は、当業者に公知の方法で適当な断片を用いてプローブを作製し、このプローブを用いてコロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーション、サザンブロット等の公知のハイブリダイゼーション法により、ｃＤＮＡライブラリー及びゲノムライブラリー等から得ることができる。
【００３０】
ハイブリダイゼーション法の詳細な手順については、『Molecular Cloning, A Laboratory Manual 3rd ed.』(Cold Spring Harbor Press (2001)；特にSection 6-7) 、『Current Protocols in Molecular Biology』(John Wiley & Sons (1987-1997)；特にSection6.3-6.4)、『DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach 2nd ed.』(Oxford University (1995)；ハイブリダイゼーション条件については特にSection2.10) 等を参照することができる。
【００３１】
ハイブリダイゼーション条件の強さは、主としてハイブリダイゼーション条件、より好ましくは、ハイブリダイゼーション条件及び洗浄条件によって決定される。本明細書における「ストリンジェントな条件」には、中程度又は高度にストリンジェントな条件が含まれる。
【００３２】
具体的には、中程度にストリンジェントな条件としては、例えばハイブリダイゼーション条件として、１×ＳＳＣ〜６×ＳＳＣ、４２℃〜５５℃の条件、より好ましくは、１×ＳＳＣ〜３×ＳＳＣ、４５℃〜５０℃の条件、最も好ましくは、２×ＳＳＣ、５０℃の条件があげられる。ハイブリダイゼーション溶液中に、例えば、約５０％のホルムアミドを含む場合には、上記温度よりも５ないし１５℃低い温度を採用する。洗浄条件としては、０．５×ＳＳＣ〜６×ＳＳＣ、４０℃〜６０℃があげられる。ハイブリダイゼーション及び洗浄時には、一般に、０．０５％〜０．２％、好ましくは約０．１％ＳＤＳを加えてもよい。
【００３３】
高度にストリンジェント（ハイストリンジェント）な条件としては、中程度にストリンジェントな条件よりも高い温度及び／又は低い塩濃度でのハイブリダイゼーション及び／又は洗浄を含む。例えば、ハイブリダイゼーション条件として、０．１×ＳＳＣ〜２×ＳＳＣ、５５℃〜６５℃の条件、より好ましくは、０．１×ＳＳＣ〜１×ＳＳＣ、６０℃〜６５℃の条件、最も好ましくは、０．２×ＳＳＣ、６３℃の条件があげられる。洗浄条件として、０．２×ＳＳＣ〜２×ＳＳＣ、５０℃〜６８℃、より好ましくは、０．２×ＳＳＣ、６０〜６５℃があげられる。
【００３４】
特に本発明に用いられるハイブリダイゼーション条件としては、例えば、５×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）及び５０％ホルムアミド中４２℃の条件でプレハイブリダイゼーションを行った後、プローブを添加して一晩４２℃に保ってハイブリッド形成させ、その後、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、６５℃で２０分間の洗浄を３回行うという条件があげられるが、これらに限定されない。
【００３５】
また、プローブに放射性物質を使用しない市販のハイブリダイゼーションキットを使用することもできる。具体的には、ＤＩＧ核酸検出キット（ロシュ・ダイアグノス社）、ECL direct labeling & detection system（Amersham社製）を使用したハイブリダイゼーション等があげられる。
【００３６】
本発明に含まれる核酸としては、好ましくは、配列番号１からなる塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸と２×ＳＳＣ、５０℃の条件下でハイブリダイズし、かつ、Albatrossトランスポゾン転移活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸があげられる。
【００３７】
（ｃ）配列番号１からなる塩基配列と同一性が８０％以上の塩基配列からなり、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
本発明の核酸に含まれる塩基配列は、配列番号１に示される核酸配列に対して少なくとも同一性が８０％以上の塩基配列からなり、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質をコードする。
【００３８】
好ましくは、配列番号１に示される塩基配列に対して少なくとも８０％、さらに好ましくは８５％、さらに一層好ましくは９０％（例えば、９２％以上、より一層好ましくは９５％以上、さらには９７％、９８％又は９９％）の同一性を有する塩基配列を含み、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質をコードする塩基配列があげられる。
【００３９】
２つの核酸配列の同一性％は、視覚的検査や数学的計算により決定することができるが、コンピュータープログラムを使用して２つの核酸の配列情報を比較することにより決定するのが好ましい。配列比較コンピュータープログラムとしては、例えば、米国国立医学ライブラリーのウェブサイト：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/bls.htmlから利用できるＢＬＡＳＴＮプログラム(Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-10)：バージョン２．２．７又はＷＵ−ＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズム等があげられる。ＷＵ−ＢＬＡＳＴ２．０についての標準的なデフォルトパラメーターの設定は、以下のインターネットサイト：http://blast.wustl.eduに記載されているものを用いることができる。
【００４０】
（ｅ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
本発明の核酸は、配列番号２で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む。
【００４１】
具体的には、
(i) 配列番号２に示すアミノ酸配列のうち1個又は複数個（好ましくは1個又は数個（例えば、1〜400個、1〜200個、1〜100個、1〜50個、1〜30個、1〜25個、1〜20個、1〜15個、さらに好ましくは１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１個））のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列；
(ii) 配列番号２に示すアミノ酸配列のうち1個又は複数個（好ましくは1個又は数個（例えば1〜400個、1〜200個、1〜100個、1〜50個、1〜30個、1〜25個、1〜20個、1〜15個、さらに好ましくは１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１個））のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列；
(iii) 配列番号２に示すアミノ酸配列において1個又は複数個（好ましくは1個又は数個（例えば1〜400個、1〜200個、1〜100個、1〜50個、1〜30個、1〜25個、1〜20個、1〜15個、さらに好ましくは１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１個））の他のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列；又は
(iv) 上記(i)〜(iii)を組み合わせたアミノ酸配列；
からなるタンパク質であって、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質をコードする塩基配列である。
【００４２】
上記のうち、置換は、好ましくは保存的置換である。保存的置換とは、特定のアミノ酸残基を類似の物理化学的特徴を有する残基で置き換えることであるが、もとの配列の構造に関する特徴を実質的に変化させなければいかなる置換であってもよく、例えば、置換アミノ酸が、もとの配列に存在するらせんを破壊したり、もとの配列を特徴付ける他の種類の二次構造を破壊したりしなければいかなる置換であってもよい。
【００４３】
保存的置換は、一般的には、生物学的系合成や化学的ペプチド合成で導入されるが、好ましくは、化学的ペプチド合成による。この場合、置換基には、非天然アミノ酸残基が含まれていてもよく、ペプチド模倣体や、アミノ酸配列のうち、置換されていない領域が逆転している逆転型又は同領域が反転している反転型も含まれる。
【００４４】
以下に、アミノ酸残基を置換可能な残基ごとに分類して例示するが、置換可能なアミノ酸残基は以下に記載されているものに限定されるものではない。
Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、２−アミノブタン酸、メチオニン、Ｏ−メチルセリン、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン及びシクロヘキシルアラニン
Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、２−アミノアジピン酸及び２−アミノスベリン酸
Ｃ群：アスパラギン及びグルタミン
Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、２，４−ジアミノブタン酸及び２，３−ジアミノプロピオン酸
Ｅ群：プロリン、３−ヒドロキシプロリン及び４−ヒドロキシプロリン
Ｆ群：セリン、スレオニン及びホモセリン
Ｇ群：フェニルアラニン及びチロシン
非保存的置換の場合は、上記種類のうち、ある１つのメンバーと他の種類のメンバーとを交換することができるが、この場合は、本発明のタンパク質の生物学的機能を保持するために、アミノ酸のヒドロパシー指数（ヒドロパシーアミノ酸指数）を考慮することが好ましい（Kyteら, J. Mol. Biol., 157:105-131（1982））。また、非保存的置換の場合は、親水性に基づいてアミノ酸の置換を行うことができる。本明細書及び図面において、塩基やアミノ酸及びその略語は、IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature に従うか、又は、例えば、Immunology--A Synthesis（第２版, E.S. Golub及びD.R. Gren監修, Sinauer Associates，マサチューセッツ州サンダーランド(1991)）等に記載されているような、当業界で慣用されている略語に基づく。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示す。
【００４５】
Ｄ−アミノ酸等の上記のアミノ酸の立体異性体、α,α−二置換アミノ酸等の非天然アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、乳酸、及びその他の非慣用的なアミノ酸もまた、本発明のタンパク質を構成する要素となりうる。
【００４６】
なお、本明細書で用いるタンパク質の表記法は、標準的用法及び当業界で慣用されている標記法に基づき、左方向はアミノ末端方向であり、そして右方向はカルボキシ末端方向である。同様に、一般的には、特に言及しない限り、一本鎖ポリヌクレオチド配列の左端は５’端であり、二本鎖ポリヌクレオチド配列の左方向を５’方向とする。
【００４７】
当業者であれば、当業界で公知の技術を用いて、本明細書に記載したタンパク質の適当な変異体を設計し、作製することができる。例えば、本発明のタンパク質の生物学的活性にさほど重要でないと考えられる領域をターゲティングすることにより、本発明のタンパク質の生物学的活性を損なうことなくその構造を変化させることができるタンパク質分子中の適切な領域を同定することができる。また、類似のタンパク質間で保存されている分子の残基及び領域を同定することもできる。さらに、本発明のタンパク質の生物学的活性又は構造に重要と考えられる領域中に、生物学的活性を損なわず、かつ、タンパク質のポリペプチド構造に悪影響を与えずに、保存的アミノ酸置換を導入することもできる。
【００４８】
特に、本発明のAlbatrossトランスポゾン転移酵素中には保存モチーフである「ＤＤＤモチーフ」が存在する。本モチーフは、Albatrossトランスポゾン転移酵素に必須のモチーフであって、アミノ酸配列中で保存されており、第319〜688番目のアミノ酸残基であるＤＤＤモチーフが挙げられる。従って、本発明の変異体は上記保存モチーフが保存され、かつ、本発明の上記活性が損なわれない限り、いかなる変異体であってもよい。
【００４９】
当業者であれば、本発明のタンパク質の生物学的活性又は構造に重要であり、同タンパク質のペプチドと類似するペプチドの残基を同定し、この２つのペプチドのアミノ酸残基を比較して、本発明のタンパク質と類似するタンパク質のどの残基が、生物学的活性又は構造に重要なアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基であるかを予測する、いわゆる、構造−機能研究を行うことができる。さらに、このように予測したアミノ酸残基の化学的に類似のアミノ酸置換を選択することにより、本発明のタンパク質の生物学的活性が保持されている変異体を選択することもできる。また、当業者であれば、本タンパク質の変異体の三次元構造及びアミノ酸配列を解析することもできる。さらに、得られた解析結果から、タンパク質の三次元構造に関する、アミノ酸残基のアラインメントを予測することもできる。タンパク質表面上にあると予測されるアミノ酸残基は、他の分子との重要な相互作用に関与する可能性があるが、当業者であれば、上記したような解析結果に基づいて、このようなタンパク質表面上にあると予測されるアミノ酸残基を変化させないような変異体を作製することができる。さらに、当業者であれば、本発明のタンパク質を構成する各々のアミノ酸残基のうち、一つのアミノ酸残基のみを置換するような変異体を作製することもできる。このような変異体を公知のアッセイ方法によりスクリーニングし、個々の変異体の情報を収集することができる。それにより、ある特定のアミノ酸残基が置換された変異体の生物学的活性が、本発明のタンパク質の生物学的活性に比して低下する場合、そのような生物学的活性を呈さない場合、又は、本タンパク質の生物学的活性を阻害するような不適切な活性を生じるような場合を比較することにより、本発明のタンパク質を構成する個々のアミノ酸残基の有用性を評価することができる。また、当業者であれば、このような日常的な実験から収集した情報に基づいて、単独で、又は他の突然変異と組み合わせて、本発明のタンパク質の変異体としては望ましくないアミノ酸置換を容易に解析することができる。
【００５０】
上記したように、配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質は、『Molecular Cloning, A Laboratory Manual 3rd ed.』(Cold Spring Harbor Press (2001))、『Current Protocols in Molecular Biology』(John Wiley & Sons (1987-1997)、Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488-92、Kunkel (1988) Method. Enzymol. 85: 2763-6等に記載の部位特異的変異誘発法等の方法に従って調製することができる。このようなアミノ酸の欠失、置換若しくは付加等の変異がなされた変異体の作製は、例えば、Kunkel法やGapped duplex法等の公知手法により、部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット、例えばQuikChangeTMSite-Directed Mutagenesis Kit（ストラタジーン社製）、GeneTailorTM Site-Directed Mutagenesis System（インビトロジェン社製）、TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System（Mutan-K、Mutan-Super Express Km等：タカラバイオ社製）等を用いて行うことができる。
【００５１】
なお、タンパク質のアミノ酸配列に、その活性を保持しつつ１又は複数個のアミノ酸の欠失、置換、若しくは付加を導入する方法としては、上記の部位特異的変異誘発の他にも、遺伝子を変異源で処理する方法、及び遺伝子を選択的に開裂して選択されたヌクレオチドを除去、置換若しくは付加した後に連結する方法があげられる。
【００５２】
本発明の核酸に含まれる塩基配列は、好ましくは、配列番号２で示されるアミノ酸配列において１〜２００個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、Albatrossトランスポゾン転移活性を有するタンパク質をコードする塩基配列である。本発明のタンパク質におけるアミノ酸の変異又は修飾の数、あるいは変異又は修飾の部位は、本発明の上記活性が保持される限り制限はない。本発明の上記活性の測定方法は上記のとおりである。
【００５３】
（ｆ）配列番号２からなるアミノ酸配列と同一性が８０％以上のアミノ酸配列からなり、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
本発明の核酸は、配列番号２からなるアミノ酸配列と同一性が８０％以上のアミノ酸配列からなり、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む。本発明の核酸がコードするタンパク質は、本発明の上記活性を有するタンパク質と同等の機能を有する限り、Albatrossトランスポゾン転移酵素又はAlbatrossトランスポゾン転移酵素のアミノ酸配列と同一性のあるタンパク質でもよい。
【００５４】
具体的には、配列番号２で示されるアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％、さらに好ましくは９５％以上、より一層好ましくは、９７％（例えば、９８％、さらには、９９％）以上の同一性を有するアミノ酸配列等があげられる。本発明の核酸は、好ましくは、配列番号２からなるアミノ酸配列と同一性が９５％以上のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードし、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸である。さらに好ましくは、配列番号２からなるアミノ酸配列と同一性が９８％以上のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードし、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸である。
【００５５】
２つのアミノ酸配列の同一性パーセントは、視覚的検査及び数学的計算によって決定することができる。また、コンピュータープログラムを用いて同一性パーセントを決定することもできる。そのようなコンピュータープログラムとしては、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ（Altschulら、 J. Mol. Biol., 215:403-410（1990））、及びＣｌｕｓｔａｌＷ等があげられる。特に、ＢＬＡＳＴプログラムによる同一性検索の各種条件（パラメーター）は、Altschulら（Nucl. Acids. Res., 25, p.3389-3402, 1997）に記載されたもので、米国バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）やDNA Data Bank of Japan（DDBJ）のウェブサイトから公的に入手することができる（ＢＬＡＳＴマニュアル、Altschulら NCB/NLM/NIH Bethesda, MD 20894;Altschulら）。また、遺伝情報処理ソフトウエアＧＥＮＥＴＹＸ Ｖｅｒ．７（ゼネティックス）、ＤＩＮＡＳＩＳ Ｐｒｏ（日立ソフト）、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ（Ｉｎｆｏｍａｘ）等のプログラムを用いて決定することもできる。
【００５６】
複数のアミノ酸配列を並列させる特定のアラインメントスキームは、配列のうち、特定の短い領域のマッチングをも示すことができるため、用いた配列の全長配列間に有意な関係がない場合であっても、そのような領域において、特定の配列同一性が非常に高い領域を検出することもできる。さらに、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、ＢＬＯＳＵＭ６２アミノ酸スコア付けマトリックスを用いることができるが、選択パラメーターとしては、以下のものを用いることができる：（Ａ）低い組成複雑性を有するクエリー配列のセグメント（Wootton及びFederhenのSEGプログラム（Computers and Chemistry, 1993）により決定される；Wootton及びFederhen, 1996「配列データベースにおける組成編重領域の解析（Analysis of compositionally biased regions in sequence databases）」Methods Enzymol., 266: 544-71も参照されたい）、又は、短周期性の内部リピートからなるセグメント（Claverie及びStates（Computers and Chemistry, 1993）のXNUプログラムにより決定される）をマスクするためのフィルターを含むこと、及び（Ｂ）データベース配列に対する適合を報告するための統計学的有意性の閾値、又はＥ−スコア（Karlin及びAltschul, 1990）の統計学的モデルにしたがって、単に偶然により見出される適合の期待確率；ある適合に起因する統計学的有意差がＥ−スコア閾値より大きい場合、この適合は報告されない。
【００５７】
（ｇ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
本発明の核酸は、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸である。
【００５８】
配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質及びハイブリダイズの条件は上記のとおりである。本発明の核酸としては、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸があげられる。
【００５９】
また、本発明の核酸には、配列番号１からなる塩基配列において１若しくは複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸も含まれる。具体的には、
(i) 配列番号１に示す塩基配列のうち1個又は複数個（好ましくは1個又は数個（例えば、１〜1500個、１〜1000個、１〜500個、1〜300個、1〜250個、1〜200個、1〜150個、1〜100個、1〜50個、1〜30個、1〜25個、1〜20個、1〜15個、さらに好ましくは１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１個））の塩基が欠失した塩基配列、
(ii) 配列番号１に示す塩基配列のうち1個又は複数個（好ましくは1個又は数個（例えば１〜1500個、１〜1000個、１〜500個、1〜300個、1〜250個、1〜200個、1〜150個、1〜100個、1〜50個、1〜30個、1〜25個、1〜20個、1〜15個、さらに好ましくは１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１個））の塩基が他の塩基で置換された塩基配列、
(iii) 配列番号１に示す塩基配列において1個又は複数個（好ましくは1個又は数個（例えば１〜1500個、１〜1000個、１〜500個、1〜300個、1〜250個、1〜200個、1〜150個、1〜100個、1〜50個、1〜30個、1〜25個、1〜20個、1〜15個、さらに好ましくは１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１個））の他の塩基が付加された塩基配列、又は
(iv) 上記(i)〜(iii)を組み合わせた塩基配列であって、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質をコードしている塩基配列を含む核酸を用いることもできる。
【００６０】
本発明の核酸の好ましい態様としては、以下のいずれかに記載の核酸も含まれる。
-（ａ）配列番号１で示される塩基配列又はその部分配列を含む核酸
-（ｄ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列又はその部分配列を含む核酸
（ａ）配列番号１で示される塩基配列を含む核酸及び（ｄ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸については、上記のとおりである。上記配列の部分配列とは、上記塩基配列に含まれるＯＲＦ、ＣＤＳ、生物学的活性を有する領域、以下に記載するようなプライマーとして用いた領域、プローブとなりうる領域が含まれ、天然由来のものであっても、人工的に作製したものであってもよい。
【００６１】
また、本発明の核酸には、以下の核酸：１）配列番号２で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸；配列番号１からなる塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸；配列番号１からなる塩基配列と同一性が８０％以上の塩基配列からなるタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸；配列番号２からなるアミノ酸配列と同一性が８０％以上のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸；配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸、及び、２）以下の(ａ)〜（ｅ）のいずれかである、１）に記載の核酸：（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において１〜２００個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸；（ｂ）配列番号１からなる塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸と２×ＳＳＣ、５０℃の条件下でハイブリダイズする核酸；（ｃ）配列番号１からなる塩基配列と同一性が９０％以上の塩基配列からなる塩基配列を含む核酸；（ｄ）配列番号２からなるアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸；（ｅ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸と２×ＳＳＣ、５０℃の条件下でハイブリダイズする核酸；も含まれる。
【００６２】
（３）本発明のトランスポゾン転移酵素タンパク質
本発明のタンパク質は、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（ａ）及び前記タンパク質と同等の機能を有するタンパク質を含み、天然由来のものであっても、人工的に作製したものであってもよい。配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質については、上記のとおりである。「同等の機能を有するタンパク質」とは、上記『本発明のトランスポゾン転移酵素をコードする核酸』の項で説明したとおり、「本発明の上記活性」を有するタンパク質を意味する。
【００６３】
本発明において、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質としては、以下の（ｂ）又は（ｃ）に記載のタンパク質があげられる。
（ｂ）配列番号２において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号２からなるアミノ酸配列と同一性が８０％以上のアミノ酸配列からなり、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質
上記のうち、配列番号２において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、又は、配列番号２からなるアミノ酸配列と同一性が８０％以上のアミノ酸配列については、上記、『本発明のトランスポゾン転移酵素をコードする核酸』の項で説明したとおりである。
【００６４】
また、本発明のタンパク質は、人工的に作製したものであってもよく、その場合は、Fmoc法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、tBoc法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によっても製造することができる。また、アドバンスドケムテック社製、パーキンエルマー社製、ファルマシア社製、プロテインテクノロジーインストゥルメント社製、シンセセルーベガ社製、パーセプティブ社製、島津製作所社製等のペプチド合成機を利用して化学合成することもできる。
【００６５】
また、本発明のタンパク質には、以下のタンパク質も含まれる。
１）配列番号２において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質又は配列番号２からなるアミノ酸配列と同一性が８０％以上のアミノ酸配列からなるタンパク質；並びに２）（ａ）配列番号２において１〜２００個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質；（ｂ）配列番号２からなるアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなるタンパク質
（４）本発明の核酸のクローニング
本発明のトランスポゾン転移酵素の核酸は、例えば、適切なプローブを用いてｃＤＮＡライブラリーからスクリーニングすることにより、クローニングすることができる。また、適切なプライマーを用いてＰＣＲ反応により増幅し、適切なベクターに連結することによりクローニングすることができる。さらに、別のベクターにサブクローニングすることもできる。
【００６６】
例えば、ｐＢｌｕｅ−Ｓｃｒｉｐｔ（商標）ＳＫ（＋）（Stratagene）、ｐＧＥＭ−Ｔ（Promega）、ｐＡｍｐ（TM: Gibco-BRL）、ｐ−Ｄｉｒｅｃｔ（Clontech）、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Invitrogene）等の市販のプラスミドベクター、ウイルスベクター、人口染色体ベクターやコスミドベクターを用いることができる。また、ＰＣＲ反応で増幅する場合、プライマーは、上記の配列番号１等に示される塩基配列のいずれの部分も用いることができるが、例えば、
上流側用プライマー：５’−ＧＧＡＡＴＴＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＡＣＡＡＡＧＧＣＣＧＣＡＡＡＡＧＡＡＣ−３’(配列番号５)
下流側プライマー：５’−ＧＴＣＧＡＣＣＴＡＡＡＣＣＴＴＡＣＧＣＴＴＣＴＴＣＴＴＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＣＴＧＧＧＡＣＧＣＧＴＣＴＧＴ−３’（配列番号６）
等を、各々用いることができる。そして、当該ゲノム配列に、上記プライマー及び耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ等を作用させてＰＣＲ反応を行う。上記方法は、『Molecular Cloning, A Laboratory Manual 3rd ed.』(Cold Spring Harbor Press (2001))』等に従い、当業者であれば容易に行うことができるが、本発明のＰＣＲ反応の条件としては、例えば、以下の条件があげられる。
変性温度：９５〜１００℃
アニーリング温度：４０〜６０℃
伸長温度：６０〜７５℃、
上記のサイクル数：５回程度
変性温度：９５〜１００℃
伸長温度：６０〜７５℃
上記のサイクル数２０〜３０回程度
得られたＰＣＲ産物の精製には公知の方法を用いることができる。例えば、Wizard SV Gel and PCR clean-UP System (Promega)、GENECLEAN(フナコシ)、QIAquick PCR purification Kits(QIAGEN)、ExoSAP-IT（GEヘルスケアバイオサイエンス）等のキットを用いる方法、ＤＥＡＥ−セルロース濾紙を用いる方法、透析チューブを用いる方法等がある。アガロースゲルを用いる場合には、アガロースゲル電気泳動を行い、塩基配列断片をアガロースゲルより切り出して、Wizard SV Gel and PCR clean-UP System (Promega)、GENECLEAN（フナコシ）、QIAquick Gel extraction Kits(QIAGEN)、フリーズ＆スクイーズ法等により精製することができる。
【００６７】
クローニングした核酸の塩基配列はBigDye terminator v3.1(Applied Biosystems)等のシーケンサーを用いて決定することができる。
【００６８】
（５）本発明のトランスポゾン転移酵素発現用ベクター構築及び形質転換体の作製
本発明はまた、本発明のトランスポゾン転移酵素をコードする核酸を含有する組換えベクター（以下、「ヘルパープラスミド」という場合もある）を提供する。本発明は、さらに、上記組換えベクターによって形質転換された形質転換体も提供する。
【００６９】
このような組換えベクター及び形質転換体は以下のようにして得ることができる。すなわち、本発明のトランスポゾン転移酵素をコードする核酸を有するプラスミドを、制限酵素を用いて消化する。用いる制限酵素としては、例えば、ＥｃｏＲＩ、ＫｐｎＩ、ＢａｍＨＩ及びＳａｌＩ等があげられるが、これらに限定されない。なお、末端をＴ４ポリメラーゼ処理することにより平滑化してもよい。消化後の塩基配列断片をアガロースゲル電気泳動により精製する。この塩基配列断片を、発現用ベクターに公知の方法を用いて組み込むことにより、トランスポゾン転移酵素発現用ベクターを得ることができる。この発現ベクターを宿主に導入して形質転換体を作製し、目的とするタンパク質の発現に供する。
【００７０】
このとき、発現ベクター及び宿主は、目的とするタンパク質を発現できるものであれば特に限定されず、例えば、宿主として、真菌や細菌、植物、動物若しくはそれらの細胞等があげられる。細菌として、大腸菌やバチルス・ズブチリス等があげられる。また、真菌として、糸状菌、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ (サッカロミセス・セレビシエ)等の酵母等があげられる。さらに植物としては、ナタネ、ダイズ、ワタ、ベニバナ、アマ等の油糧植物があげられる。
【００７１】
上記の宿主としては、本発明の核酸が宿主中で自立複製可能であるか、若しくは当該菌の染色体上に挿入され得る構造であることが好ましい。それと同時に、プロモーター、ターミネーターを含む構成であることが好ましい。宿主として大腸菌を使用する場合、発現ベクターとして、例えば、ＢＡＣクローンのほか、ファルマシア社のｐＧＥＸ、ｐＵＣ１８等があげられる。プロモーターとしては、例えば、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター等の大腸菌やファージ等に由来するプロモーターが用いられる。細菌への組み換えベクターの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法や塩化カルシウム法を用いることができる。
【００７２】
組換えベクターの導入方法としては、例えば、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、パーティクルデリバリー法及び核内へのＤＮＡの直接マイクロインジェクション等があげられる。栄養要求性のホスト株を用いる場合は、その栄養素を欠いた選択培地上で生育する株を選択することで、形質転換株を取得することができる。また、形質転換に薬剤耐性マーカー遺伝子を用いる場合には、その薬剤を含む選択培地にて培養を行い、薬剤耐性を示す細胞コロニーを得ることができる。
【００７３】
（６）本発明のトランスポゾン転移酵素の製造方法
本発明は、上記形質転換体から、トランスポゾン転移酵素を製造する方法を提供する。すなわち、上記形質転換体を培養して得られる培養物からトランスポゾン転移酵素を製造する方法である。具体的には、以下の方法で製造することができる。しかし、本製造方法に関しては、当該方法に限られず、一般的な公知の他の方法を用いて行うこともできる。
【００７４】
トランスポゾン転移酵素を発現させた生物の培養に用いる培地は、適当なｐＨ及び浸透圧を有し、各宿主の増殖に必要な栄養素、微量成分、血清や抗生物質等の生物材料を含んでいる培養液（培地）であれば、いかなる培養液も用いうる。例えば、トランスポゾン転移酵素を発現させた生物としてHEK293T細胞を用いた場合、培地にDMEM(Gibco)を用いることができる。培養条件は、宿主の増殖に適し、かつ生成した酵素が安定に保たれるのに適当な条件であればいかなる条件でもよいが、具体的には、嫌気度、培養時間、温度、湿度、静置培養又は振盪培養等の個々の条件を調節することができる。培養方法は、同一条件での培養（１段階培養）でもよく、２以上の異なる培養条件を用いる、いわゆる２段階培養若しくは３段階培養でもよいが、大量培養をする場合には、培養効率がよい２段階培養等が好ましい。例えば、トランスポゾン転移酵素を発現させた生物としてHEK293T細胞を用いて培地にDMEM(Gibco)を用いた場合は、5%CO2、37℃の条件で培養することができる。
（７）本発明の遺伝子導入試薬
本発明のトランスポゾン転移酵素を用いた細胞導入を行う場合は、上記した各種のトランスポゾン転移酵素のほか、トランスポゾン認識配列も組み合わせて用いる。そして、これらに加えて、他の溶媒や溶質と組み合わせて組成物とすることができる。たとえば、蒸留水、pH緩衝試薬、塩、タンパク質、界面活性剤などを組み合わせることができる。
【００７５】
本発明のトランスポゾン転移酵素は適当なベクターに組み込まれたヘルパープラスミドの状態であるのがよい（図２）。当該ヘルパープラスミドは例えば、以下の実施例１記載の方法で作製することができる。
【００７６】
本発明に関するトランスポゾン認識配列について、以下に説明する。本発明に関するAlbatrossトランスポゾン認識配列は、配列番号３及び４で示される。具体的にはAlbatrossトランスポゾン認識配列は、Albatrossの左側認識配列（配列番号３）及び右側認識配列（配列番号４）を含む。ここで、配列番号３のうち、第１−１１０番目の塩基はトランスポゾン左側外部を認識する配列部分であり、第１１１−５０８番目の塩基はトランスポゾン左側内部を認識する配列部分である。このうち、Albatrossトランスポゾンの転移に必要な認識配列は配列番号３の第１１１-１２８番目の塩基である。また、配列番号４のうち、第１−５８６番目の塩基はトランスポゾン右側内部を認識する配列部分であり、第５８７−６８２番目の塩基はトランスポゾン右側外部を認識する配列部分である。このうち、Albatrossトランスポゾンの転移に必要な認識配列は配列番号4の５６９-５８６番目の塩基である。当該トランスポゾン認識配列自体は、上記『（２）本発明のトランスポゾン転移酵素をコードする核酸』に記載した公知の方法にて獲得することができる。また、本発明に関する遺伝子導入試薬では、当該トランスポゾン認識配列はトランスポゾン認識配列を含むコンストラクト（インジケータープラスミド）の状態であるのがよい（図２）。このインジケータープラスミドについては、上記左側認識配列及び右側認識配列の間に遺伝子導入に用いる所望の標的配列が組み込まれる構造である。当該インジケータープラスミドは公知の方法を用いて作製することができるが、例えば、以下の実施例２に記載する方法で作製することができる。具体的には、まず、トランスポゾンの上記左側認識配列及び右側認識配列を各々精製したものを、例えば以下のプライマーを用いてＰＣＲ反応を行う。
左側フォワードプライマー: CATTGATGAATGAGACGGCTTTGATTTGGA（配列番号１１）
右側リバースプライマー: TGTACTCATTGAACTTTGGATGGTCACACA（配列番号１２）
ＰＣＲ条件
変性温度：９５〜１００℃
アニーリング温度：４０〜６０℃
伸長温度：６０〜７５℃、
上記のサイクル数：５回程度
変性温度：９５〜１００℃
伸長温度：６０〜７５℃
上記のサイクル数２０〜３０回程度
そして、得られた増幅産物を公知の方法で精製し、公知の方法でライゲーション、トランスフォーメーションを行うことでインジケータープラスミドを得ることができる。
【００７７】
本発明の遺伝子導入試薬には反応試薬を含めてよい。反応試薬とは適当な化学的または物理的検出手段により検出可能な標識を有する試薬である。そのような標識物質を用いる測定法に使用される標識剤として、たとえば蛍光物質、酵素、放射性同位元素、発光物質などが用いられる。標識に酵素を用いたELISA法は広く利用されている。蛍光物質として、フルオレスカミン、フルオレッセインイソチオシアネートなど、酵素として、パーオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、リンゴ酸脱水酵素、α-グルコシダーゼ、α-ガラクトシダーゼなど、放射性同位元素として、125Ｉ、131Ｉ、3Ｈ、14Ｃなど、発光物質として、ルシフェリン、ルシゲニン、ルミノール、ルミノール誘導体などが例示される。
【００７８】
さらに、反応媒体として、反応の至適条件を与えるか、反応生成物質の安定化などに有用な緩衝液、反応物質の安定化剤などが含まれる。
（８）  本発明の細胞導入キット
本発明のトランスポゾン転移酵素を用いた細胞導入を行う場合、特別の条件、操作などは必要とされない。それぞれの方法における通常の条件、操作に準じて行なわれ、必要であれば若干の修飾を加えて好適な測定系を構築できる。
【００７９】
そのためのもっとも簡便かつ効率的な測定を行なうことを可能とするのは、上記本発明の遺伝子導入試薬をキット化することである。キット化により、通常の検査室または実験室で、特殊な分析機器、熟練した操作、高度の知識は必要とせずに、効率的に定量を行なうことができる。アッセイキットの構成および形態は、とくに限定されるものでなく所定の目的を達成できるものであればその内容は限定されない。一般には候補物質試料について、スクリーニングを実行し得られた結果を解釈するための使用説明書、反応試薬、反応が行なわれる場となる反応媒体、アッセイの場を提供する基材などから構成される。さらに所望により、比較基準とするためのあるいは検量線を作成するための照合サンプル、検出器なども含んでもよい。本発明の遺伝子導入の検出確認手段としては、分光器、放射線検出器、光散乱検出器といった上記標識を検出可能なものがあげられる。
（９）本発明の細胞導入方法
本発明の上記本発明のトランスポゾン転移酵素を用いて遺伝子導入を行う方法は、以下の：（ａ）請求項５記載のトランスポゾン転移酵素を含む１又はそれ以上のトランスポゾン転移酵素を作動可能に結合した１又はそれ以上の発現ベクターを作製する工程；（ｂ）１又はそれ以上の標的配列の両端に、前記請求項５記載のトランスポゾン転移酵素を含む１又はそれ以上のトランスポゾン転移酵素が認識する１又はそれ以上のトランスポゾン認識配列を組み込んでコンストラクトを作製する工程；（ｃ）前記発現ベクターのうち１の発現ベクターと前記コンストラクトを細胞に導入して、前記トランスポゾン転移酵素を前記トランスポゾン認識配列に認識させてＤＮＡを切断させる工程；及び（ｄ）前記切断されたＤＮＡがホストゲノムに組み込まれる工程；を含む方法である。ここで、工程（ａ）及び（ｂ）については上記したとおりである。また工程（ａ）及び（ｂ）については、工程（ｃ）のときまでに工程（ａ）の発現ベクター及び工程（ｂ）のコンストラクトが調製されていればよく、両工程を同時に行ってもよく、またどちらを先に行ってもよい。
【００８０】
（ｂ）標的配列の両端に、トランスポゾン認識配列を組み込む工程については、標的配列としては、いかなるサイズの配列をも含むいかなる塩基（ゲノム）配列をも用いることができる。つまり、一本鎖及び二本鎖のＤＮＡのほか、そのＲＮＡ相補体も含み、天然由来のものであっても、人工的に作製したものであってもよい。ＤＮＡには、例えば、ゲノムＤＮＡや、前記ゲノムＤＮＡに対応するｃＤＮＡ、化学的に合成されたＤＮＡ、ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡ、及びそれらの組み合わせや、ＤＮＡとＲＮＡのハイブリッドがあげられるがこれらに限定されない。さらに、本発明の遺伝子導入方法は、１００ｋｂを上回る巨大なサイズのＤＮＡ配列でも導入できるという利点がある。
【００８１】
当該標的配列の両端に、トランスポゾン認識配列を組み込む方法は上記『（４）本発明の核酸のクローニング』や『（５）本発明のトランスポゾン転移酵素発現用ベクター構築及び形質転換体の作製』等で記載したような公知のいかなる方法をも用いることができる。例えば、当該標的配列を公知の方法で増幅、精製したものを制限酵素で処理し、同じように制限酵素で処理したトランスポゾン認識配列を含むコンストラクトと公知のライゲーション反応を行うことにより得ることができる。具体的には、ＰＣＲを用いたコンストラクト作製方法、in fusionを用いたコンストラクト作製方法及びＢＡＣを用いたコンストラクト作製方法などがあげられるがこれらに限定されない。ＰＣＲを用いたコンストラクト作製方法は、各々増幅した標的配列とトランスポゾン認識配列を含む配列とをＰＣＲ反応を用いて連結してからベクターへライゲーションする方法で、導入配列が短い場合に用いられる。in fusionを用いたコンストラクト作製方法は、組み込むベクターの末端数塩基と相補的な配列を付加したＰＣＲプライマーで、増幅した標的配列とトランスポゾン認識配列を含む配列とを増幅し、線状化したベクターとを用いてクローニングする方法で、導入配列が短い場合に用いられる。また、左右のトランスポゾン認識配列と隣接するが各々互いに相補的な配列を有するように設計されてもよい。標的配列ＢＡＣを用いたコンストラクト作製方法は、１００ｋｂを超える長い配列を導入できる。
【００８２】
工程（ｃ）前記発現ベクターと前記標的配列が組み込まれたコンストラクトを細胞に導入して、前記トランスポゾン転移酵素を前記トランスポゾン認識配列に認識させてＤＮＡを切断させる工程については、前記発現ベクター（ヘルパープラスミド）と前記標的配列が組み込まれたコンストラクト（インジケータープラスミド）を公知の方法で細胞に導入することにより行う。ここで用いうる細胞としては、目的とする本発明のトランスポゾン転移活性を発現できるものであれば特に限定されず、例えば、動物の細胞、真菌や細菌、植物、動物若しくはそれらの細胞等があげられる。動物の細胞として、HEK、特に、HEK293T、CHO、HL-60、HeLa、MDCK、NIH3T3、PC12、S2、Sf9、Veroなどがあげられる。細菌として、大腸菌やバチルス・ズブチリス等があげられる。また、真菌として、糸状菌、S.cerevisiae等の酵母等があげられる。さらに植物としては、ナタネ、ダイズ、ワタ、ベニバナ、アマ等の油糧植物があげられる。さらに、本発明のヘルパープラスミド及びインジケータープラスミドが細胞中で自立複製可能であるか、若しくは当該菌の染色体上に挿入され得る構造であることが好ましい。それと同時に、プロモーター、ターミネーターを含む構成であることが好ましい。細胞として動物由来の細胞を使用する場合、プロモーターとしては、例えば、CMVやSV40等のプロモーターが用いられる。細胞への組み換えベクターの導入方法としては、例えば、PEI-MAX (final: 8ug/ml、PSI)等の市販のキットの他、エレクトロポレーション法や塩化カルシウム法、スフェロプラスト法、パーティクルデリバリー法及び核内へのＤＮＡの直接マイクロインジェクション等があげられる。栄養要求性のホスト株を用いる場合は、その栄養素を欠いた選択培地上で生育する株を選択することで、形質転換株を取得することができる。また、形質転換に薬剤耐性マーカー遺伝子を用いる場合には、その薬剤を含む選択培地にて培養を行い、薬剤耐性を示す細胞コロニーを得ることができる。
【００８３】
さらに、本発明のヘルパープラスミド、つまり、本発明のトランスポゾン転移酵素を作動可能に結合した発現ベクターと、インジケータープラスミド、つまり、標的配列及び本発明のトランスポゾン転移酵素を認識するトランスポゾン認識配列が組み込まれたコンストラクトはいかなる量比で用いてもよいが、好ましくは、ヘルパープラスミド：インジケータープラスミドが100:1、80:1、75:1、50:1、40:1、30:1、29:1、25：1、20：1、15：1、12.5：1、10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4.5:1、4:1、3.5:1、3:1、2.5:1、2:1、1.5:1、1:1、1:1.5、1:2、1:2.5、1:3、1:3.5、1:4、1:4.5、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:12.5、1:15、1:20、1:25、1:29、1:30、1:40、1:50、1:75、1:80、1:100であり、より好ましくは、29:1、25：1、20：1、15：1、12.5：1、10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4.5:1、4:1、3.5:1、3:1、2.5:1、2:1、1.5:1、1:1、1:1.5、1:2、1:2.5、1:3、1:3.5、1:4、1:4.5、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:12.5、1:15、1:20、1:25、1:29である。
【００８４】
このように、ヘルパープラスミド及びインジケータープラスミドを細胞に適当な量比で添加し、細胞培養を行うことにより、本発明のヘルパープラスミド及び標的配列を含むインジケータープラスミドに認識させると、上記『（１）本発明の概要』に記載したように本発明のトランスポゾン転移酵素が左側認識配列と右側認識配列を認識して、当該箇所を切断する。これにより、目的とする標的配列が切り出されて、ホストゲノムに組み込まれることで、標的配列の遺伝子導入が完成する。
【００８５】
本発明のヘルパープラスミド及びインジケータープラスミドを用いた遺伝子導入方法によれば、ホストクローンに取り込まれるのは１クローンのみであるため、サイレンシングを受けることがない点で有利である。さらに、本発明のトランスポゾン転移酵素がトランスポゾン認識配列を正確に認識する。つまり、本発明は、切り出された標的配列がホストゲノムに導入された場合に、標的配列の機能を正確に再現できる方法として優れた遺伝子導入方法である。
（１０）本発明の細胞導入除去方法
さらに、本発明の遺伝子導入方法の原理を利用して、本発明のトランスポゾン転移酵素を用いて、トランスポゾン認識配列及び標的配列を含むホストゲノムから標的配列のみを切り出す（除去する）こともできる。トランスポゾン認識配列及び標的配列があるホストゲノムと本発明のトランスポゾン転移酵素を細胞に導入すると、当該トランスポゾン転移酵素がトランスポゾン認識配列を認識することにより、当該認識配列でＤＮＡが切断される。ここで、切断されて切り出されたＤＮＡには所望の標的が含まれる。このように、本発明の方法は、標的配列を含むＤＮＡをホストゲノムから除去することができる。この場合、本発明のトランスポゾン転移酵素がトランスポゾン認識配列を正確に認識するため、切断時に余分な塩基が切り取られることがなく、かつ、余分な塩基が切り残されることもない。本発明の方法は所望の標的配列を精度よく切り出すことができる点で好ましい。
【００８６】
上記方法のトランスポゾン認識配列及び標的配列を含むホストゲノムは、上記『（９）本発明の細胞導入方法』に記載した方法で作製されてもよい。この場合、上記の工程（ａ）〜（ｄ）で生成したホストゲノムに以下の：（ｅ）工程（ｄ）で前記ＤＮＡが組み込まれた細胞に前記トランスポゾン転移酵素を導入して、前記トランスポゾン転移酵素をトランスポゾン認識配列に認識させることによりＤＮＡを切断して、前記標的配列を含むＤＮＡをホストゲノムから除去する工程；及び（ｆ）前記ＤＮＡが除去された前記ホストゲノムをライゲーションする工程；を行うことにより、ホストゲノムから所望のＤＮＡを除去することができる。工程（ｅ）は、工程（ｃ）の前記発現ベクターと前記標的配列が組み込まれたコンストラクトを細胞に導入して、前記トランスポゾン転移酵素を前記トランスポゾン認識配列に認識させてＤＮＡを切断させる工程と同様の原理であり、工程（ｃ）で記載した方法で行われてよい。工程（ｆ）は転移酵素の触媒反応により工程(e)に引き続いて行われる。
【００８７】
上記の遺伝子の導入方法及び除去（切り出し）方法は本発明のトランスポゾン転移酵素及びその認識配列のセットに１又はそれ以上の他のトランスポゾン転移酵素及びその認識配列のセットを組み合わせて用いることができる（図４）。つまり、上記の方法において、１のトランスポゾン転移酵素について工程（ｅ）及び（ｆ）が行われた後、さらに１又はそれ以上の他の１のトランスポゾン転移酵素について工程（ｅ）及び（ｆ）が１又はそれ以上繰り返し行われることにより、複数の標的配列の遺伝子導入除去を所望の順序でより効果的に行うことができる。つまり、本発明では、複数のトランスポゾン転移酵素を各々認識する複数の認識配列を予め組み込んだインジケータープラスミドを作製し、当該トランスポゾン転移酵素を各々含むヘルパープラスミドを順に作用させることができる。それにより、より複雑な遺伝子導入及びその除去を実現することができる。本発明により、特にｉＰＳ細胞の樹立の際にガン化を引き起こすリスクがある未分化誘導遺伝子(Oct3/4・Sox2・Klf4・c-Myc)を導入し、その後幹細胞を樹立して組織・器官を再生させた後、当該遺伝子を除去することにより遺伝子型を元に戻すという作業が可能となる。このように、本発明の遺伝子導入除去方法は、再生医療分野で応用できるという利点がある。
【００８８】
次に、本発明を実施例によって説明するが、本発明は、これらの実施例によって限定されるものではなく、様々な変形例が含まれる。
【実施例】
【００８９】
（実施例１）
本実施例は、本発明のトランスポゾン転移酵素の塩基配列を増幅することを目的とする。
用いたトランスポゾン転移酵素のゲノム配列を配列番号１に示す。配列番号１に記載された塩基配列のうち、第１−６番目の塩基はKozak配列を示し、第７−２４６０番目の塩基はトランスポゾン転移酵素をコードする配列であり、第２４６１-２４７８番目の塩基はlinker配列を示し、第２４７９−２４９６番目の塩基は核移行シグナル配列を示し、第２４９７−２４９９番目の塩基は終止コドンを示す。
【００９０】
このトランスポゾン転移酵素のゲノム配列の増幅は、以下の方法により行った。まず、Construction of a BAC library derived from the inbred Hd-rR strain of the teleost fish, Oryzias latipes. Matsuda, M. et al.,Genes Genet. Syst. (2011)に記載の方法に従って作成されたBACライブラリーからAlbatross全長を含むBACクローン(Md-series, 13I17)をスクリーニングし、PCRにより転移酵素配列を増幅した。増幅にはprimeSTAR GXL polymerase (TaKaRa)を用いた。
増幅に用いたプライマーは以下の通りである。
フォワードプライマー: EcoRI-Kozak-Alba-F
GGAATTCCGCCACCATGAACAAAGGCCGCAAAAGAAC（配列番号５）
リバースプライマー: Alba-R-TPase+NLS+SalI
GTCGACCTAAACCTTACGCTTCTTCTTACCACCACCACCACCACCCTGGGACGCGTCTGT
（配列番号６）
増幅に用いたＰＣＲ反応条件は以下の通りである。
１.  98℃ 60秒
２.  98℃ 10秒
３.  55℃ 15秒
４.  68℃ 2分30秒（２〜４を５サイクル）
５.  98℃ 10秒
６.  68℃ 2分30秒（５〜６を２５サイクル）
７.  4℃ ∞
その後、増幅ＰＣＲ産物を電気泳動し、Wizard SV Gel and PCR clean-UP System (Promega)を用いて増幅産物を精製した。精製した増幅産物をBlunt II TOPO(invitrogen)にライゲーションして、DH5a大腸菌株にトランスフォーメーションを行い、カナマイシンプレートにストリークした。得られたコロニーを収集し、カナマイシン (50ug/ml)添加2ml LBにて37℃で一晩培養した。培養後のコロニーからQIAGEN Mini prep(QIAGEN)を用いてプラスミドの精製を行った。得られたプラスミドを制限酵素EcoRI(ToYoBo)及びSalI(TaKaRa)を用いて３時間酵素処理を行った。このとき、同時に、 pCSf107mTベクター (Secreted Frizzled-related proteins enhance the diffusion of Wnt ligands and expand their signalling range. Mii, Y. et al., Development (2009))について、EcoRI(ToYoBo)、XhoI(TaKaRa)及びCIAP(TaKaRa)を用いて３時間酵素処理を行った。酵素処理後のプラスミド及びベクターを各々電気泳動し、Wizard SV Gel and PCR clean-UP System(Promega)を用いて精製を行った。精製後のプラスミド及びベクターをLigation high v2(ToYoBo)を用いて１６℃１時間ライゲーションを行った。ライゲーション後のプラスミドベクターについて、DH5a大腸菌株にトランスフォーメーションを行い、アンピシリンプレートにストリークした。その後、コロニーを収集し、アンピシリン(50ug/ml)添加100ml LBにて37℃で一晩培養した。培養後のプラスミドをNucleobond extra midi kit（TaKaRa）を用いて精製した。これより、トランスポゾン転移酵素の塩基配列を含むベクターが増幅された。得られたプラスミドをヘルパープラスミドとした。
（実施例２）
本実施例は、Albatrossの左側認識配列及び右側認識配列を各々増幅し、インジケータープラスミドを作製することを目的とする。
Albatrossの左側認識配列（配列番号３）及び右側認識配列（配列番号４）の増幅は、以下の方法により行った。まず、Construction of a BAC library derived from the inbred Hd-rR strain of the teleost fish, Oryzias latipes. Matsuda, M. et al.,Genes Genet. Syst. (2011)に記載の方法に従って作成されたBACライブラリーからAlbatross全長を含むBACクローン(Md-series, 13I17)をスクリーニングし、PCRにより転移酵素配列を増幅した。増幅にはprimeSTAR GXL polymerase (TaKaRa)を用いた。
増幅に用いたプライマーは以下の通りである。
【００９１】
〈トランスポゾン左側認識配列用プライマー〉
Alba-indi-left-F: CATTGATGAATGAGACGGCTTTGATTTGGA（配列番号７）
Alba-indi-left-R: CCTTTCACTGGGAGGGTTATATAAATACGGAGGTC（配列番号８）
〈トランスポゾン右側認識配列用プライマー〉
Alba-indi-right-F: CCCTCCCAGTGAAAGGGAACCGGTAAAGCGAGAC（配列番号９）
Alba-indi-right-R: TGTACTCATTGAACTTTGGATGGTCACACA（配列番号１０）
増幅に用いたＰＣＲ反応条件は以下の通りである。
〈トランスポゾン左側認識配列用ＰＣＲ反応条件〉
１.  98℃ 60秒
２.  98℃ 10秒
３.  68℃ 60秒（２〜３を３０サイクル）
４.  4℃ ∞
〈トランスポゾン右側認識配列用ＰＣＲ反応条件〉
１.  98℃ 60秒
２.  98℃ 10秒
３.  68℃ 1分30秒（２〜３を３０サイクル）
４.  4℃ ∞
その後、増幅ＰＣＲ産物を電気泳動し、Wizard SV Gel and PCR clean-UP System (Promega)を用いて増幅産物を精製した。
【００９２】
次に、精製した増幅産物を等量ずつＰＣＲ反応液に加え、下記のプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行う。増幅にはprimeSTAR GXL polymerase (TaKaRa)を用いた。
【００９３】
Alba-indi-left-F: CATTGATGAATGAGACGGCTTTGATTTGGA（配列番号１１）
Alba-indi-right-R: TGTACTCATTGAACTTTGGATGGTCACACA（配列番号１２）
増幅に用いたＰＣＲ反応条件は以下の通りである。
１.  98℃ 60秒
２.  98℃ 10秒
３.  54℃ 15秒
４.  68℃ 2分00秒（２〜４を５サイクル）
５.  98℃ 10秒
６.  68℃ 2分00秒（５〜６を２５サイクル）
７.  4℃ ∞
その後、増幅ＰＣＲ産物を電気泳動し、Wizard SV Gel and PCR clean-UP System (Promega)を用いて増幅産物を精製した。精製した増幅産物をBlunt II TOPO(invitrogen)にライゲーションして、DH5a大腸菌株にトランスフォーメーションを行い、カナマイシンプレートにストリークした。得られたコロニーを収集し、カナマイシン(50ug/ml)添加2ml LBにて37℃で一晩培養した。培養後のプラスミドをNucleobond extra midi kit（TaKaRa）を用いて精製した。これより、Albatrossの左側認識配列及び右側認識配列を含むIndicatorインジケータープラスミドが得られた。
（実施例３）
本実施例は、本発明のトランスポゾン転移酵素の活性をExcision assayにて確認することを目的とする。
【００９４】
本実施例では、HEK293T細胞又はHeLa細胞を用いた。当該細胞を6cm dishに播種し、培地はDMEM(Gibco)を用いて、5%CO2、37℃の条件で培養して調製した。当該細胞を6cm dish に継代し(final 10% confluency)、一晩培養した。翌日、20%confluencyの当該細胞をPBSでwashした。当該細胞に実施例１及び２で調整したヘルパープラスミド及びインジケータープラスミドを同時にトランスフェクションした。このとき、PEI-MAX (final: 8μg/ml、PSI)を用いた。また、コトランスフェクションに用いたヘルパープラスミド及びインジケータープラスミドの量比は以下のとおりである。
【００９５】
【表１】
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上記５種類に調製した溶液を３時間インキュベートした後、DMEM 4mlに交換した。その後、細胞がconfluentになるまで培養した(3日間)。このように調製した細胞から、Selective Extraction of Polyoma DNA from Infected Mouse Cell Cultures. Hirt, B., J. Nol. Biol. (1967)の記載の方法に従って、プラスミドを抽出した。具体的には、細胞をPBSでwashし、当該細胞に0.6%SDS,0.01M EDTA溶液(pH8.0)を1ml加え、20分振とうした。細胞が溶解したら、細胞溶液を1.5mlチューブに回収した。当該チューブに5M NaClを最終濃度が1Mになるように加え、4℃に一晩放置した。その後、17000×g、4℃、30分の条件で遠心分離を行い、上清を2ml tubeに回収した。回収液に液量の９０％のイソプロパノールを加えて、さらに17000×g、4℃、15分の条件で遠心分離を行った。遠心分離後の上清を捨ててから、70%エタノールを1ml加えた。その後、さらに17000×g、室温、5分の条件で遠心分離を行った。遠心分離後の上清を捨ててから、5分間乾燥させたものを200ul TE(pH8.0)に溶かした。
【００９６】
上記で精製したプラスミドをテンプレートとして用いた。以下のプライマーを用いて、excision後の配列を、ＰＣＲ反応で増幅した。増幅にはExTaq (TaKaRa)を用いた。
【００９７】
Alba-indi-left-F  : CATTGATGAATGAGACGGCTTTGATTTGGA  （配列番号１３）
Alba-indi-right-R : TGTACTCATTGAACTTTGGATGGTCACACA  （配列番号１４）
ＰＣＲ増幅条件は以下の通りである。
〈Ｉ．excision産物の増幅条件〉
１.  94℃ 2分00秒
２.  94℃ 15秒
３.  68℃ 10秒
４.  72℃ 15秒（２〜４を５０サイクル）
５.  72℃ 5分00秒
６.  4℃  ∞
〈ＩＩ．ポジティブコントロールの増幅条件〉
１.  94℃ 2分0秒
２.  94℃ 15秒
３.  68℃ 10秒
４.  72℃ 2分00秒（２〜４を３０サイクル）
５.  72℃ 5分00秒
６.  4℃  ∞
増幅産物を電気泳動して、Wizard SV Gel and PCR clean-UP System(Promega)を用いて精製した。精製した増幅産物をTOPO TA cloning kit(invitrogen)にライゲーションした後、DH5aにトランスフォーメーションし、アンピシリンプレートにストリークした。コロニーを採取して、2mlのアンピシリン添加LB(50ug/ml)中で37℃一晩培養した。その後、QIAGEN Mini prep kit(QIAGEN)を用いてプラスミドの精製を行った。精製したプラスミドを用いて、シーケンスを行った(BigDye terminator v3.1、Applied Biosystems)。
【００９８】
その結果、コトランスフェクションに用いたヘルパープラスミド及びインジケータープラスミドのいずれの量比でも、インジケータープラスミドに組み込まれていたプラスミドが精度よく切り出されたことが確認された（図３）。
【００９９】
以上、本発明者によってなされた発明をその実施の形態に基づき具体的に説明したが、本発明は前記実施の形態に限定されるものではなく、その要旨を逸脱しない範囲で種々変更可能であることはいうまでもない。
【産業上の利用可能性】
【０１００】
本発明のトランスポゾン転移酵素により、１００ｋｂを上回る巨大なサイズのＤＮＡ配列でも高い効率で遺伝子導入できるシステムが提供される。これにより、従来の遺伝子導入システムでは不可能であった、１００ｋｂ以上に及ぶ転写調節領域による制御を受ける外来遺伝子について、転写調節領域を含めた大きなゲノム領域を導入して時期、組織特異的に発現させることができる。さらに、導入配列が不要になった場合に同手法によりゲノム内から除去することが可能になる。よって、従来機能が不明であった遺伝子についても、本発明のシステムにより初めて機能解析を進めることができるという産業上利用可能性がある。
【０１０１】
上記本発明の細胞導入除去技術は、特に再生医療の発展において重要な技術である。例えば、ｉＰＳ細胞の樹立の際には複数の未分化誘導遺伝子(Oct3/4・Sox2・Klf4・c-Myc)が導入されるが、これらの遺伝子はガン化を引き起こすリスクがあるため、樹立後に実際にヒトに応用する際には除去することが必要である。しかしながら、本発明の上記方法を用いれば、遺伝子導入により幹細胞を樹立し、それにより組織・器官を再生させた後、不要となった導入遺伝子を除去し、遺伝子型を元に戻すことが可能となる。従って、本発明は再生医療の発展に寄与できるという産業上利用可能性がある。
【配列表フリーテキスト】
【０１０２】
配列番号５：プライマー
配列番号６：プライマー
配列番号７：プライマー
配列番号８：プライマー
配列番号９：プライマー
配列番号１０：プライマー
配列番号１１：プライマー
配列番号１２：プライマー
配列番号１３：プライマー
配列番号１４：プライマー
【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図３】
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【配列表】
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