(57)【要約】【課題】試料を連続的に注入しながら、複数の段階のクロマトグラフィーの工程を連続的に行わせることができる分離精製装置及び方法を提供する。【解決手段】２本のカラムを並列に配し、試料溶液を連続的に注入しクロマトグラフィー精製を行わせる液体クロマトグラフィー装置ＬＣと、前記液体クロマトグラフィー装置ＬＣへ連続的に試料溶液を注入するｉｎラインと、前記液体クロマトグラフィー装置ＬＣからの精製回収溶液の排出ラインＥと、希釈用の溶液リザーバーＢと、前記排出ラインＥと前記希釈用溶液リザーバーＢからの希釈用のラインを結び溶液を混合するミキサーＭと、前記ミキサーで混合希釈された溶液を受け取る溶液リザーバーＲと、当該溶液リザーバーＲから次段階の液体クロマトグラフィー装置ＬＣのｉｎラインへつなげるためのｏｕｔラインとで構成される繰り返し構成単位を繰り返しつなげたことを特徴とする。【選択図】図６
2014001979.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料を連続的に注入しながら、複数のカラムクロマトグラフィーによるタンパク質の精製を連続した流路を経て行うことを特徴とするタンパク質の分離精製装置。
【請求項２】
請求項１に記載のタンパク質の分離精製装置において、
下図の図４に示される構成単位をｎ個、ここでｎは２以上の整数、有することを特徴とするタンパク質の分離精製装置。
ただし、図中、点線四角で囲った部分は、試料を連続的に注入することによりクロマトグラフィーの分離を行い、精製分離して得られた試料を適宜希釈し回収することを行う機能を有する構成単位を示しており、図中、Ｓは試料のリザーバーを、ｉｎは試料の注入ラインを、ＬＣは、試料を連続注入しながらクロマトグラフィーによる分離精製を行う連続クロマトグラフィー装置を、Ｅは、ＬＣで精製された試料の回収ラインを、Ｍはミキサーを、Ｂは希釈用溶媒のリザーバーを、Ｐは希釈用溶媒を送液するポンプを、Ｒは、ＬＣでの精製回収希釈した溶液のリザーバーを、ｏｕｔはＲから次のＬＣへ試料を送液するためのラインを示している。
［図４］
2014001979.tif 000009
【請求項３】
請求項２に記載のタンパク質の分離精製装置において、２つのクロマトグラフィーによるタンパク質の精製を連続した流路を経て行う、ｎが２であることを特徴とするタンパク質の分離精製装置。
【請求項４】
請求項２に記載のタンパク質の分離精製装置において、２つのクロマトグラフィーによるタンパク質の精製を連続した流路を経て行う、ｎが３であることを特徴とするタンパク質の分離精製装置。
【請求項５】
試料を連続的に注入しながら、複数のカラムクロマトグラフィーによるタンパク質の精製を連続した流路を経て行うことを特徴とするタンパク質の分離精製方法。
【請求項６】
請求項５に記載のタンパク質の分離精製方法において、
下図の図４に示される構成単位をｎ個、ここでｎは２以上の整数、有することを特徴とするタンパク質の精製方法。
ただし、図中、点線四角で囲った部分は、試料を連続的に注入することによりクロマトグラフィーの分離を行い、精製分離して得られた試料を適宜希釈し回収することを行う機能を有する構成単位を示しており、図中、Ｓは試料のリザーバーを、ｉｎは試料の注入ラインを、ＬＣは、試料を連続注入しながらクロマトグラフィーによる分離精製を行う連続クロマトグラフィー装置を、Ｅは、ＬＣで精製された試料の回収ラインを、Ｍはミキサーを、Ｂは希釈用溶媒のリザーバーを、Ｐは希釈用溶媒を送液するポンプを、Ｒは、ＬＣでの精製回収希釈した溶液のリザーバーを、ｏｕｔはＲから次のＬＣへ試料を送液するためのラインを示している。
［図４］
2014001979.tif 000010
【請求項７】
請求項６に記載のタンパク質の分離精製方法において、請求項３のｎが２であることを特徴とするタンパク質の分離精製装置によりタンパク質の精製を連続した流路を経て行うことを特徴とするタンパク質の分離精製方法。
【請求項８】
請求項７に記載のタンパク質の分離精製方法において、プロテインＡアフィニティクロマトグラフィーと陽イオン交換クロマトグラフィーを組み合わせて抗体の分離を行うことを特徴とするタンパク質の分離精製方法。
【請求項９】
請求項７に記載のタンパク質の分離精製方法において、ニッケルキレートカラムを用いたクロマトグラフィーと陰イオン交換クロマトグラフィーを組み合わせてヒスタグタンパク質の分離精製を行うことを特徴とするタンパク質の分離精製方法。
【請求項１０】
請求項６に記載のタンパク質の分離精製方法において、請求項３のｎが３であることを特徴とするタンパク質の分離精製装置によりタンパク質の精製を連続した流路を経て行うことを特徴とするタンパク質の分離精製方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載のタンパク質の分離精製方法において、プロテインＡアフィニティクロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィーおよび陰イオン交換クロマトグラフィーを組み合わせて抗体の分離を行うことを特徴とするタンパク質の分離精製方法。
【請求項１２】
請求項１０に記載のタンパク質の分離精製方法において、ニッケルキレートカラムを用いたクロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィーおよび陽イオンクロマトグラフィーを組み合わせてヒスタグタンパク質の分離精製を行うことを特徴とするタンパク質の分離精製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、溶液中の物質の分離精製に関わる分野であって、複数の段階からなる液体クロマトグラフィー工程を用いて溶液中のタンパク質を分離精製する装置及び方法に関するものである。すでに本発明者らが発明している２本のカラムを並列接続してなる分離精製装置を用いることにより、複数の段階からなる液体クロマトグラフィー工程において、試料の注入の操作を連続的に行わせ、一工程の液体クロマトグラフィー操作に要する時間とほぼ同程度の時間で、複数の液体クロマトグラフィーを用いた分離精製を完了できるという特徴を有する。
【背景技術】
【０００２】
液体クロマトグラフィーは取り扱いの容易さ、広範な分析対象、高い分離効率など、優れた性能を有することから、溶液中の物質の分離精製において有力な手段となっている。
特に、近年のタンパク質医薬品の市場の広がりに伴い、大腸菌などの宿主細胞で発現させた組み換えタンパク質などの精製に広く利用されている。
組み換えタンパク質を代表とする目的タンパク質は、大腸菌などの宿主細胞などを破砕して得られる無細胞抽出液などのタンパク質の混合溶液から、他の共雑タンパク質やそれ以外の共雑物を取り除くことにより精製がおこなわれるが、その際用いられる方法としては、目的タンパク質を共雑タンパク質ごともしくは目的タンパク質のみクロマト担体に吸着させ、その後、適切な溶出方法により、共雑タンパク質や共雑物と区別する条件で溶出回収すること、すなわち、吸着クロマトグラフィーにより分離する方法が極めて有効である。タンパク質の分離精製に用いられる液体クロマトグラフィーにおいては、吸着クロマトグラフィー以外に、分子ふるい(もしくはゲルろ過)など、タンパク質の分子サイズの差などによる方法他も利用されているが、大量のサンプルを処理でき、且つ、処理以前に比べてより濃縮した形態で回収できる方法としては、吸着クロマトグラフィーが最適であると考えられている。
タンパク質の分離精製の際に主に用いられる吸着型の液体クロマトグラフィーによる分離は、いわゆる、回分(バッチ)式の分離が広く適用されている。ここで、回分式とは、一つの充填カラムを使用し、カラムの平衡、カラムへのサンプルの注入による吸着、カラムからの目的物の溶出、及びカラムの再生と洗浄からなる一連の操作により完結する操作を示している。
バッチ式の吸着型クロマトグラフィーを適用する場合は、分離対象とする試料に合わせて、分離カラムのサイズ(容量)が定まってくる。すなわち、カラムへの目的タンパク質の吸着が完全に行われるだけの容量(結合容量)を有するカラムが最低必要となる。
従って、大容量の試料を液体クロマトグラフィーで分離精製する場合においては、試料に合わせて巨大な分離カラムを用いることが要求される。もし、巨大なカラムが準備できない場合は、試料をいくつかに分割して、液体クロマトグラフィーの操作を繰り返して行うことが必要となる。前者は、巨大なカラムを用いることによるカラムのコストと、そのサイズにあった設備を準備しなければならないなど、いわゆる、設備コストが大きな障害となる。一方、後者においては、適切なサイズに分割して、バッチ操作を行うことにより、設備コストの問題は緩和されるが、バッチ操作を繰り返すことによる操作時間が、分割の回数に比例して必要となる。すなわち、大量のサンプルの処理において長時間の処理時間を要することが大きな障害となる。
【０００３】
組み換え体で発現したタンパク質など、生体、生細胞、その培養液等を原料とするタンパク質を高度に精製して活用する場合、複数のクロマトグラフィーを用いた分離精製を行う必要がある。一般的には、タンパク質を精製する戦略としては、キャプチャー精製(Ｃａｐｔｕｒｅ)工程、中間精製(Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ)工程および最終精製(Ｐｏｌｉｓｈｉｎｇ)工程の３つのステップからなる３段階精製が適用される(ＧＥ  Ｈｅｌｔｈｃａｒｅ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ社、“はじめての抗体精製ハンドブック”)。ちなみに、３段階精製の考え方は３種類のクロマトグラフィーを行うということではないが、高純度が要求される医薬品として利用されるタンパク質の精製には、３種類以上の異なった分離カラムを用い、３種類以上のクロマトグラフィーによる分離精製工程を組み合わせることが推奨される。
例えば、抗体医薬品としての、ヒト型モノクローナル抗体の分離精製工程では、ＣＨＯ細胞で分泌発現させ、培養液中に分泌蓄積したモノクローナル抗体を含む培養上清を原材料として、第１回目のクロマトグラフィーとして、プロテインＡ担体を用いたアフィニティクロマトグラフィーによる分離精製を行い、この工程で、精製・回収した精製溶液を用いて、分離剤としてイオン交換樹脂を用いたイオン交換クロマトグラフィーによる分離精製を行い(第２回目の液体クロマトグラフィー)、この工程で、精製・回収した精製溶液を用いて、分離剤として分子ふるい効果を持つゲルろ過クロマトグラフィーや、疎水性の違いで分離する疎水クロマトグラフィー、もしくは、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーなどから選択したクロマトグラフィーによる分離精製(第３回目の液体クロマトグラフィー)を行い、非常に純度の高いモノクローナル抗体溶液を調製している。
【０００４】
このような、クロマトグラフィー工程は、回分式の工程であるため、複数のクロマトグラフィー工程の全てが回分式となり、大量のサンプルを取り扱う場合においては、一つのクロマトグラフィー工程においてでさえ、巨大なカラムを用いる、もしくは、サンプルを分割し、分割回数に応じた分離処理時間をかけるなど、カラムのコストもしくは精製処理時間の長期化等の問題が、用いるクロマトグラフィーの種類を増やすごとに大きくなる。このことが、できるだけ短期間に且つ低コストでタンパク質精製を行ううえで大きな障害となっている。
【０００５】
そこで、本発明者は、先に、２本ないし３本の分離カラムを並列化し、クロマトグラフィー時のサンプル及び分離溶液等の溶液の送液をコントロールすることにより、試料を連続的に注入しながらタンパク質の分離精製を行うことを特徴とする液体クロマトグラフィー装置を開発し既に出願している(特許文献１、２参照)。
また、本発明者は、分離カラムの並列化に関しては、試料中のタンパク質濃度、カラムの吸着容量、および、送液速度において、多くの場合、２本の分離カラムの並列化でいわゆる連続クロマトグラフィーを実現できることを示している(特許文献２参照)。
【０００６】
本発明者以外においても、クロマトグラフィーの連続化技術に関連しては、既にいくつかの試みがなされている。例えば、液体クロマトグラフィーの分野において、分離度を高めるために、複数本のカラムを無端円状に連結し、移動相の流れ方向に供給口、抜取口を切り替えていき、擬似的に固定相を移動相の流れに対して逆方向に移動させ目的成分を連続的に分離するシステム(擬似移動床法：Ｓｉｍｕｌａｔｅｄ  Ｍｏｖｉｎｇ  Ｂｅｄ(ＳＭＢ)法)が、開発され利用されている(非特許文献１、特許文献３〜５参照)。ＳＭＢの原理では、複数のカラムを並列化して、その中のひとつのカラムが、バッチ操作における「平衡化(初期化)」→「(試料タンパク質)吸着」→「(未吸着画分)洗浄」→「(目的タンパク質)溶出」→「カラム再生」のいずれかの工程を行って、次のカラムへその同じ工程を引き渡す。これを繰り返すとひとつのカラムにおいては、この５つの工程をバッチ操作のように繰り返すだけだが、全体として、いつでもどこかのカラムでそれぞれの工程が必ず行われる、という擬似的な連続操作状態が完成する。ＳＭＢ法の実現には、各種方法が考えられるが、例えば、多数本のカラムを直列に接続し、各液タンクとカラムとの接続配管の途中にロータリーバルブ等を配したシステムで構築されている例もある。この場合は、ロータリーバルブを一定時間(ピリオドタイム)毎に同時に次々と切り替えていき、各液の仕込み口、取り出し口をひとつずつ左へ順次移動させることにより行う。この方法の特徴は、２つ以上の成分を含む溶液から各成分の移動速度の差に応じて２つの画分に分離するために用いられ、８〜１６の分離カラムから構成され、優れたプロセス原理に基づき高い分離精度と効率を得ることが出来るが、設備構成及び制御が複雑になり建設コストが高価となる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０１０−２７１３００号公報
【特許文献２】特開２０１１−２１４８３７号公報
【特許文献３】特表２００８−５３９３９５号公報
【特許文献４】特表２００２−４０００８号公報
【特許文献５】特開２００３−３２９６６０号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｇｏｔｔｃｈｌｉｃｈ，Ｎ．  Ｋａｓｃｈｅ，Ｖ．(１９９７)Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ａ，ｖｏｌ．７６５，ｐｐ．２０１−２０６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、複数の液体クロマトグラフィーを用いた分離精製工程において、試料を連続的に注入しながら、すべてのクロマトグラフィーの工程を連続的に行わせることを目的としている。このことにより、バッチ式のクロマトグラフィーを用いた複数のクロマトグラフィー工程の処理時間を著しく短縮できること、および、用いるカラム担体の使用量を大幅に減らすことが可能になると考えられるからである。
【００１０】
すでに、本発明者は、一つの液体クロマトグラフィー操作においては、試料の連続注入ということを実現しているが、複数のクロマトグラフィーを連続的に行うには至っていなかった。その大きな要因としては、例えば、吸着クロマトグラフィーを例にとると、クロマトグラフィーを適用するための試料溶液について、試料中の対象タンパク質をクロマト担体に吸着させる必要があり、試料溶液が吸着できるように、例えば、溶媒交換(バッファー交換)などの前処理を施さなければならない。２段階のクロマトグラフィーを用いた精製の場合、１段階目のクロマトグラフィー精製で回収した溶液は、多くの場合、そのままの状態では、適切な吸着条件を満足せず、次のクロマトグラフィーに適用することが困難である。この場合、回分式の場合は、透析などの手段で、バッファー交換を行い、次のクロマトグラフィー用の試料としている。通常、透析操作は、クロマトグラフィーの運転時間と同程度もしくはそれよりも長時間に及ぶ。従って、この問題が解消できないと、２つのクロマトグラフィーの連続化を実現することは困難となっていたのである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
透析以外にバッファー交換と同じ効果を奏する方法としては、大量のバッファー溶液で希釈する方法が考えられるが、回分式の場合、前段階のクロマトグラフィー操作により、折角、精製濃縮した試料を希釈し大容量の溶液とすることは、当業者の多くにとっては、非効率であり、このことにより、非現実的であると考えられている。
【００１２】
本発明者は、当業者が非現実的であると考えている大量希釈によるバッファー交換法に着目し、上記問題の解消ができるものとの着想を得た。なぜならば、本発明者らがすでに開発している２本の並列カラムより構成される連続クロマトグラフィーにおいては、タンパク質溶液が希薄である場合に優位性が発揮できるという特徴を有しているからである。
【００１３】
すなわち、本発明は、試料を連続的に注入しながら、複数のカラムクロマトグラフィーによるタンパク質の精製を連続した流路を経て行うことを特徴とするタンパク質の分離精製装置である。
また、本発明はタンパク質の分離精製装置において、図４に示される構成単位をｎ個、ここでｎは２以上の整数、有することを特徴とするタンパク質の分離精製装置である。
ただし、図中、点線四角で囲った部分は、試料を連続的に注入することによりクロマトグラフィーの分離を行い、精製分離して得られた試料を適宜希釈し回収することを行う機能を有する構成単位を示しており、図中、Ｓは試料のリザーバーを、ｉｎは試料の注入ラインを、ＬＣは、試料を連続注入しながらクロマトグラフィーによる分離精製を行う連続クロマトグラフィー装置を、Ｅは、ＬＣで精製された試料の回収ラインを、Ｍはミキサーを、Ｂは希釈用溶媒のリザーバーを、Ｐは希釈用溶媒を送液するポンプを、Ｒは、ＬＣでの精製回収希釈した溶液のリザーバーを、ｏｕｔはＲから次のＬＣへ試料を送液するためのラインを示している。
また、本発明は、上記タンパク質の分離精製装置において、２つのクロマトグラフィーによるタンパク質の精製を連続した流路を経て行う、ｎが２であることを特徴とするタンパク質の分離精製装置である。
また、本発明は、上記タンパク質の分離精製装置において、２つのクロマトグラフィーによるタンパク質の精製を連続した流路を経て行う、ｎが３であることを特徴とするタンパク質の分離精製装置である。
また、本発明は、試料を連続的に注入しながら、複数のカラムクロマトグラフィーによるタンパク質の精製を連続した流路を経て行うことを特徴とするタンパク質の分離精製方法である。
また、本発明は、上記タンパク質の分離精製方法において、図４に示される構成単位をｎ個、ここでｎは２以上の整数、有することを特徴とするタンパク質の精製方法である。
ただし、図中、点線四角で囲った部分は、試料を連続的に注入することによりクロマトグラフィーの分離を行い、精製分離して得られた試料を適宜希釈し回収することを行う機能を有する構成単位を示しており、図中、Ｓは試料のリザーバーを、ｉｎは試料の注入ラインを、ＬＣは、試料を連続注入しながらクロマトグラフィーによる分離精製を行う連続クロマトグラフィー装置を、Ｅは、ＬＣで精製された試料の回収ラインを、Ｍはミキサーを、Ｂは希釈用溶媒のリザーバーを、Ｐは希釈用溶媒を送液するポンプを、Ｒは、ＬＣでの精製回収希釈した溶液のリザーバーを、ｏｕｔはＲから次のＬＣへ試料を送液するためのラインを示している。
また、本発明は、上記タンパク質の分離精製方法において、ｎが２であることを特徴とするタンパク質の分離精製装置によりタンパク質の精製を連続した流路を経て行うことを特徴とするタンパク質の分離精製方法である。
また、本発明は、上記タンパク質の分離精製方法において、プロテインＡアフィニティクロマトグラフィーと陽イオン交換クロマトグラフィーを組み合わせて抗体の分離を行うことを特徴とするタンパク質の分離精製方法である。
また、本発明は、上記タンパク質の分離精製方法において、ニッケルキレートカラムを用いたクロマトグラフィーと陰イオン交換クロマトグラフィーを組み合わせてヒスタグタンパク質の分離精製を行うことを特徴とするタンパク質の分離精製方法である。
また、本発明は、上記タンパク質の分離精製方法において、ｎが３であることを特徴とするタンパク質の分離精製装置によりタンパク質の精製を連続した流路を経て行うことを特徴とするタンパク質の分離精製方法である。
また、本発明は、上記タンパク質の分離精製方法において、プロテインＡアフィニティクロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィーおよび陰イオン交換クロマトグラフィーを組み合わせて抗体の分離を行うことを特徴とするタンパク質の分離精製方法である。
また、本発明は、上記タンパク質の分離精製方法において、ニッケルキレートカラムを用いたクロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィーおよび陽イオンクロマトグラフィーを組み合わせてヒスタグタンパク質の分離精製を行うことを特徴とするタンパク質の分離精製方法である。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の複数の段階からなるクロマトグラフィー精製では、前段階のクロマトグラフィー精製で回収した溶液を、そのまま次の段階のクロマトグラフィー精製に利用することができるようにしたので、試料を連続的に注入しながら、すべてのクロマトグラフィーの工程を連続的に行わせることができる。そのため、本発明では、バッチ式のクロマトグラフィーを用いた複数のクロマトグラフィー工程の処理時間に比べて著しく短縮でき、また、用いるカラム担体の使用量を大幅に減らすことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、並列化した２本の分離カラムのカラムスイッチにより連続クロマトグラフィーの概要を示している。
【図２】図１に示した２本のカラムを用いて、試料溶液を連続的に注入しクロマトグラフィーを繰り返し行うことの工程を模式的に示した図である。
【図３】２本のカラムを並列に配し、図２に示した工程である試料溶液を連続的に注入しクロマトグラフィーを連続的に繰り返し行わせることを行わせるための液体クロマトグラフィー装置の流路図の１例を示す図であるである。
【図４】本発明の複数の段階からなる連続クロマトグラフィー装置内のある一つのクロマトグラフィーを連続的に行わせるための構成単位を示す図である。
【図５】図４に示した構成単位の流路図の一例を示した図である。
【図６】本発明の複数の段階からなる連続クロマトグラフィー装置構成の概略図を示す図である。
【図７】図７は、別途行った第１段階のみの精製による精製回収溶液(ＡＣと表示、点線)と本実施例１における第２段階での精製回収溶液(ＡＣ＋ＩＥＸと表示、実戦)のサンプルをゲルろ過カラムで解析した調べた結果を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明者による先行発明(特許文献２)において、対象とするタンパク質試料溶液が希薄であるか否かということを、以下のように整理されている。
吸着クロマトグラフィーを用いて精製・濃縮を試みる際に、タンパク質が希薄であるか否かを論じるためには、分離カラムについて単位体積当たりの、(１)適用するカラム担体が示すタンパク質の最大結合容量(これを、Ｑ(単位：ｍｇ／ｍＬ−カラム)とあらわすことにする)、(２)タンパク質の吸着以外の操作に必要な各種溶液の総量(これを、Ｗ(単位：ｍＬ)とあらわすことにする)、(３)対象とするタンパク質溶液中のタンパク質の総量(これを、Ｐ(単位：ｍｇ)とあらわすことにする)、(４)対象とするタンパク質溶液の総容量(これを、Ｖ(単位：ｍＬ)とあらわすことにする)、という値を用いると、Ｑ×Ｗ＞Ｐ×Ｖ、という条件が成り立つ場合は、対象となるタンパク質溶液は、単に体積当たりの分離カラムに対して十分希薄であるということができる。もしくは、タンパク質溶液中のタンパク質濃度(これを、Ｃ(ｍｇ／ｍＬ)(＝Ｐ／Ｖ)とあらわすことにする)を用いると、Ｚ＝Ｑ／Ｃ(ｍＬ／ｍＬ−カラム)という値が計算されるが、Ｚカラム容量内において、吸着クロマトグラフィーにおけるタンパク質の吸着以外の操作が完了できる場合は、対象となるタンパク質溶液が希薄であるということができる。
この条件を満たすタンパク質溶液を用いると図１、２に示すように、２本の並列カラムを用いることにより、２本のうちのいずれか一方のカラムにタンパク質溶液(試料溶液)を注入しながら、他方のカラムで、洗浄→溶出→再生→平衡化(初期化)の操作を行いながら、溶出の操作のところで精製されたタンパク質を回収するという操作を、洗浄→溶出→再生→平衡化(初期化)のサイクルが終了するごとに,試料溶液を通液するカラムと洗浄→溶出→再生→平衡化(初期化)の操作を行うカラムを相互に交換する(実際には、流路を変える)ことにより、試料を連続的に注入しながら、クロマトグラフィーによる精製を行うことができる。
【００１７】
図１、２は、２本のカラムを用いて、試料溶液を連続的に注入しクロマトグラフィーを繰り返し行うことの工程を模式的に示した図である。洗浄→溶出→再生→平衡化(初期化)の操作を一つのサイクルとして、３つの引き続くサイクルにおけるカラムＡとカラムＢの工程を示している。サイクルｎ−１においては、カラム１において洗浄→溶出→再生→平衡化(初期化)の操作を行っている間中、カラム２においては試料が注入されている。カラム１の平衡化工程が終了した時点で、流路を切り替え、次のサイクル(サイクルｎ)に移り、カラム１には試料を注入し、カラム２においては、洗浄→溶出→再生→平衡化(初期化)の操作を行う、以下同様に流路を切り替え、次のサイクルに移る。この工程により、試料溶液は、カラム１もしくはカラム２のどちらか一方に送液される。このことにより、試料溶液の連続注入が実現される。また、カラム１もしくはカラム２のどちらか一方において分離カラムを用いた分離・溶出が行われ、精製分離したタンパク質を、それぞれのサイクルごとに回収できる。この操作を行わせる流路構成として図３に示した構成がある(特許文献２)。
【００１８】
液体クロマトグラフィーにより精製溶出して溶液を、次の精製段階で用いられる液体クロマトグラフィーにおける吸着条件に適した緩衝液を用いて大量に希釈することにより、吸着に適した溶液条件にできるが、この希釈操作により、タンパク質は希釈される。すなわち、希薄なタンパク質溶液を調製することが容易にでき、この希薄なタンパク質溶液は、次の精製段階に用いられる連続液体クロマトグラフィーのための試料溶液としては、希薄なタンパク質溶液であるという条件を十分満足するものと考えられる。このことにより、複数のクロマトグラフィーを連続的に行わせるための障害となっていた問題を解消できるものと考えられた。
【００１９】
すなわち、本発明者は、鋭意検討の結果、複数のクロマトグラフィーによるタンパク質の分離精製を連続的に行わせる方法として、先行する段階の液体クロマトグラフィーにより精製溶出した溶液を、溶出と同時に大量の適切な緩衝液で希釈し、これを次の段階の液体クロマトグラフィーに連続注入し、連続クロマトグラフィーを行わせ、以下同様にして、次の段階のクロマトグラフィーを行わせるという着想を得て、複数の段階からなる連続クロマトグラフィー工程を構築することにより、本発明を行った。
【００２０】
図３は、２本のカラムを並列に配し、図２に示した工程である試料溶液を連続的に注入しクロマトグラフィーを連続的に繰り返し行わせることを行わせるための液体クロマトグラフィー装置の流路図の１例を示す図である。図中、Ｓは、試料溶液のリザーバーを、Ｅ１，Ｅ２，Ｅ３，Ｅ４，Ｅ５，Ｅ６は、クロマトグラフィーに用いる各種溶液のリザーバーを示し、Ｐ１及びＰ２は送液ポンプを示し、ＲＴ１，ＲＴ２，ＲＴ３，ＲＴ４は、ロータリーバルブを示し、ＳＷ１及びＳＷ２は、電磁バルブを示し，Ｃ１、Ｃ２は、クロマトグラフィーに用いる分離カラムを示し、Ｒ，Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３，Ｒ４，Ｒ５，Ｒ６は、カラムから流れ出てきた溶液を回収するためのリザーバーを示し、ＵＶ−Ｍは、ＵＶモニターを示し、ｃｏｎは、電導度モニターを示している。
なお、ＲＴ２とＲＴ３は、２つの流路を同時に切り替えるバルブであり、図中ＲＴ２で１の流路が選択された場合、Ｐ１ポンプで送液されてきた溶液が、カラム１へ、Ｐ２ポンプで送液されてきた溶液がカラム２に流れ、ＲＴ２で２の流路が選択された場合は、Ｐ１ポンプで送液されてきた溶液が、カラム２へ、Ｐ２ポンプで送液されてきた溶液がカラム１に流れることを示している。同様に、図中ＲＴ３で１の流路が選択された場合、カラム１を通過した溶液が、Ｒで示すリザーバーに流れ、カラム２を通過した溶液が、ＵＶ−Ｍとｃｏｎで示すモニターをへて、ＲＴ４で選択されたＲ１からＲ６のいずれかのリザーバーに流れることを示し、図中ＲＴ３で２の流路が選択された場合、カラム２を通過した溶液が、Ｒで示すリザーバーに流れ、カラム１を通過した溶液が、ＵＶ−Ｍとｃｏｎで示すモニターをへて、ＲＴ４で選択されたＲ１からＲ６のいずれかのリザーバーに流れることを示している。
この、流路図は、本発明者による先行発明(特許文献２)に記載のクロマトグラフィー装置に該当する流路図と同等の流路図である。
【００２１】
図４は、本発明の複数の段階からなる連続クロマトグラフィー工程を構成する構成単位の概略図を示す。図中、Ｓは、試料溶液のリザーバーを示し、ＬＣは、図１に例示される流路構成を有する試料溶液を連続的に注入しクロマトグラフィーを連続的に繰り返し行わせることを特徴とする液体クロマトグラフィー装置から、試料溶液リザーバーＳを取り除いた装置を示し、Ｅは、図５に例示される流路構成を有する試料溶液を連続的に注入しクロマトグラフィーを連続的に繰り返し行わせることを特徴とする液体クロマトグラフィー装置のカラムから流れ出てきた溶液を回収するためのリザーバーＲ，Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３，Ｒ４，Ｒ５，Ｒ６のいずれか一つのリザーバーへの溶出出口を示し、Ｂは、バッファー交換用のための大量希釈溶液のリザーバーを示し、Ｐは、送液ポンプを示し、Ｍは、Ｅからの溶液とＰから送られてくる溶液の混合器(ミキサー)を示し、Ｒは、混合された溶液を集めるリザーバーを示す。ｏｕｔは、リザーバーＲから、次の装置へ送液ラインでつなげていることを示す。点線四角で囲んだ部分が構成単位であり、図に示すｏｕｔのラインを次の装置のｉｎのラインにつなぐことにより、構成単位を繰り返しつなげることができる(図６参照)。
【００２２】
図６は、本発明の複数の段階からなる連続クロマトグラフィー装置構成の概略図を示す。点線四角で囲った部分を次々とつなぐことにより装置が構成されていることを示している。図中記号は、図４に示したものと同一である。なお、最初の部分は、ｉｎのラインの前に、サンプルリザーバーがあり、最後の部分には、溶出して出てきた精製溶液を希釈するポンプおよびラインが取り付けられていない。図中鍵括弧でおおきく区切った部分を、繰り返しつなげることにより、クロマトによる分離工程を任意に増やすことができる。
【００２３】
本発明に使用されるクロマトグラフィー装置は、構成要素として図３及び図５に示す連続クロマトグラフィー装置を、図６に示すように結合した構成からなる構成図で持って示すことができる。
すなわち、本発明に使用される液体クロマトグラフィー装置は、図３に示すような構成でもって示される２本のカラムを並列に配し、試料溶液を連続的に注入しクロマトグラフィーを行わせることを特徴とする液体クロマトグラフィー装置(これをＬＣ部分と称する)を構成要素として有し、これに、図４で示すように、希釈用の溶液リザーバー、送液ライン、送液ポンプおよびＬＣ部分からの精製回収溶液の排出ライン(Ｅラインと称する)と希釈用のラインとを結び、これらのラインから送り込まれてくる溶液を混合するためのミキサー、混合希釈された溶液を受け取る溶液リザーバー、この溶液リザーバーから次のクロマトグラフィー装置のサンプル注入ラインをつなげるライン(ｏｕｔライン／ｉｎラインと称する)で構成される装置を繰り返し構成単位とし、この単位が、図６に示すように複数連結した構成を有する装置である。
【００２４】
本装置においては、図６に示す全体構成のうち、ＬＣで示した部分が、図３の構成で例示されるような、試料溶液を連続的に注入しクロマトグラフィーを行わせる装置であることから、すでに、本発明者らの発明(特許文献２)に示されるように２本の同一の分離担体、同一サイズのカラムを用いることにより、用いた分離担体の特性に応じた分離精製を、試料溶液を連続的に注入することにより、試料溶液が尽きるまで行うことが可能である。
【００２５】
図３で例示される装置を用いたクロマトグラフィーにおいては、図２の工程図に示されるように、分離精製された精製溶液が間欠的に回収される。回収されたタンパク質溶液は、そのままでは、次のクロマトグラフィーの工程の試料溶液としては、適さない場合が通常である。例えば、第１段階のクロマトグラフィーとして、陰イオン交換カラムを用いたとして、対象タンパク質の溶出には、試料の吸着(注入)の時に用いられた溶液よりも、より高塩濃度の溶液が用いられる。もし、第２段階のクロマトグラフィーとして、再度、陰イオン交換カラムを用いた場合、少なくとも、第１段階で溶出、回収されたタンパク質溶液の塩濃度は、第２段階のクロマトグラフィーにおいては、資料中の目的タンパクを該カラムに吸着するためには、高すぎる塩濃度であることは明白であり、このような場合は、塩濃度を下げる操作が必要である。
本発明においては、間欠的に回収するタンパク質溶液を、回収時に図４に示されるように、リザーバーＢの希釈用の溶液をポンプＰで送液し、ミキサーＭで回収されたタンパク質溶液と混合し、これをリザーバーＲに送り、Ｒに希釈回収された溶液を、次の段階の連続クロマトグラフィー装置に送り込むという操作を行う。この場合、回収された溶液の希釈倍率は、図３に示す送液ポンプＰ２の送液速度(ｐ２(ｍＬ／ｍｉｎ)とする)と図４に示す希釈用溶液を送液するポンプＰの送液速度(ｐ(ｍＬ／ｍｉｎ)とする)の値を用いて、ｐ／ｐ２の値で計算される。逆に、ｐの値を適宜変えることにより希釈倍率を変更することができる。
リザーバーＲに蓄えられた希釈された試料は、次の段階の連続クロマトグラフィー装置に供給するが、その際の送液速度は、前段階連続クロマトグラフィーのサイクル時間(これを、ＣＳ１(ｍｉｎ)とする)あたりに蓄えられる希釈・回収される試料溶液の容量(これを、ＶＲ１(ｍＬ)とする)の値から計算される値(ＶＲ１／ＣＳ１(ｍＬ／ｍｉｎ))に設定することが望ましい。何故ならば、この値を超えると、次の段階において送液する試料が不足するからである。
リザーバーＲに蓄えられた希釈された試料を、上記の計算される値に従って送液し、第２段階のクロマトグラフィーを行う。第２段階において間欠的に回収するタンパク質溶液を第１段階のクロマトグラフィーと同様に、２台目のＬＣ装置に取り付けたリザーバーＢの希釈用の溶液をポンプＰで送液し、ミキサーＭで回収されたタンパク質溶液と混合し、これをリザーバーＲに送り、Ｒに希釈回収された溶液を、第３段階の連続クロマトグラフィー装置に送り込むという操作を図５の装置構成に従って繰り返して行い、最後のクロマトグラフィーにおいてのみ、間欠的に回収するタンパク質溶液を回収するという操作を行う。
この操作において、第２段階目以降のＬＣ装置への試料の連続注入の開始は、前段階のクロマトグラフィーにおいて行われる最初のサイクルにおいて間欠的に回収するタンパク質溶液を希釈し、リザーバーＲに蓄える操作が完了した時点に行うことが望ましい。前段階における最初のサイクルにおける当該操作が完了する時点は、あらかじめ自動的に計算でき、この時点をプログラムに組み込むことができる。従って、図５に示す装置の稼働においては、２台目以降のＬＣ装置への試料注入開始時点を自動的に計算された時点から開始する様にできる。従って、第１段階目のＬＣに試料の連続注入が開始された後、自動的に計算された時点ごとに、２台目以降のＬＣに試料の連続注入がはじまる。同様に、第１台目の停止は、注入試料が完結したのち、その試料に由来する精製された溶液が回収・希釈された後に、当該カラムの再生・初期化処理が完了した時点にあらかじめ設定したタイムプログラムに従って行われる。同様に、２台目以降の装置についても同様に１台目のＬＣの停止以降設定された時点で停止される。
このように、各ＬＣ部分のポンプのオン、オフ、流速やバルブの切り替えなどは、あらかじめコンピュータ等でプログラムしておくことにより制御できる。従って、本装置を用いることにより、サンプルの送液を開始した後は、サンプルが尽きるまで、連続的に作動し、完全自動化により、タンパク質の連続精製を行うことができる。
【００２６】
［典型的な利用例］
図６に示される構成よりなる装置を用いたタンパク質の精製に関しては、各種クロマトグラフィーを色々と組み合わせることにより達成することができる。これまでに発明者らは、精製したモノクローナル抗体タンパク質とヒスタグタンパク質を用いて、表１に示すような各種クロマトグラフィーの組み合わせを用いて多段階の連続クロマトグラフィーが適用できることを確認している。当業者であれば、この結果から、アフィニティクロマトグラフィーや吸着クロマトグラフィーである(陰陽)イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを自由に組み合わせることが可能であることは容易に類推できる。更に、当業者であれば、対象となるタンパク質において、その精製手段として適用できる吸着クロマトグラフィーが複数あり、適用したクロマトグラフィーを用いて精製・回収したサンプルを適切な緩衝液で希釈することにより、異なった種類の吸着クロマトグラフィーに適用できることは自明である。従って、表1に示した結果で本発明は限定されず、タンパク質すべてについて、本発明の複数のクロマトグラフィーを組み合わせ多段階の連続クロマトグラフィーが適用可能である。
以下に、本発明の装置を用い、実際の培養液を用いて行った、２種以上の連続クロマトグラフィーによる精製の典型的な例を示す。
【００２７】
【表１】
2014001979.tif 000003
【実施例】
【００２８】
［実施例１］２段階の連続クロマトグラフィーによるＣＨＯ細胞で発現させたモノクローナル抗体の精製(表１の利用例１に対応)
ＣＨＯ細胞で発現したモノクローナル抗体の精製において、抗体のＦｃ領域を特異的に認識結合するタンパク質であるプロテインＡやプロテインＧもしくはその誘導体などのタンパク質リガンドを固定化したアフィニティ担体を用いた精製を第１段階に行い、吸着洗浄後、弱酸で溶出回収される画分を中性の緩衝液で希釈中和し、これを、陽イオン交換担体を用いたカラムクロマトグラフィーにより精製することにより、アフィニティ精製とポリッシング精製を連続的に行うことができる。
本実施例においては、サンプルとして、ＣＨＯ細胞で発現させた抗ヒトＩＬ８ヒト型モノクローナル抗体のＣＨＯ細胞培養液(培養液中の抗体濃度＝０.１３ｍｇ／ｍＬ)を８００ｍＬ用いた。
第１段階  (プロテインＡアフィニティカラム精製)
・カラム：本発明者らが開発した改変プロテインＡ(ＡＩＳＴ−２と名付けた)を配向制御固定化したシリカモノリスカラム、カラムサイズ １ｍＬ、２本並列
・カラム平衡化溶媒(図２の平衡に対応)：０.１Ｍ リン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７.２
洗浄用緩衝液(図２の洗浄に対応)：１Ｍ ＮａＣＬを含む５ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７.２
・抗体溶出用溶媒(図２の溶出に対応):０.１Ｍ クエン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ３.５
・カラム再生用溶媒(図２の再生に対応)：０.１Ｍ グリシン塩酸緩衝液、ｐＨ２.５
・希釈用緩衝液(溶出サンプルの希釈用)：２０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６.０
・サンプル送液の流速：１.０ｍＬ／ｍｉｎ
・サイクル：洗浄(１０カラム容量、流速１.０ｍＬ／ｍｉｎ)−溶出(１０カラム容量、流速１.０ｍＬ／ｍｉｎ)−再生(１０カラム容量、流速１.０ｍＬ／ｍｉｎ)−平衡化(１０カラム容量、流速１.０ｍＬ／ｍｉｎ)よりなるサイクル、サイクル時間＝４０ｍｉｎ
・溶出サンプルの回収：溶出溶液の送液開始５５秒後に回収開始、１２０秒間回収、回収と同時に希釈用緩衝液を流速１０ｍＬ／ｍｉｎで送液、Ｔ−ミキサーで混合希釈(結果１０倍希釈)
・トータルサイクル数：２０サイクル(カラムスイッチの回数)
・第１段階の稼働時間＝最初のサンプル送液時間(４０ｍｉｎ)＋２０サイクル(４０ｍｉｎ×２０＝８００ｍｉｎ)＋サンプル送液終了後の洗浄−溶出−再生―平衡化処理(４０ｍｉｎ)＝８８０ｍｉｎ
・溶出希釈回収した精製溶液の総量＝(２ｍＬ(溶出回収量)＋２０ｍＬ(希釈緩衝液))×２０(サイクル数)＝４４０ｍＬ
第２段階  (陽イオン交換クロマトグラフィー)
・第１段階にサンプル送液開始後８０ｍｉｎたった時点で第二段階のサンプル送液を開始
・カラム：ＧＥヘルスケア社製、ＨｉＴｒａｐＳＰＨＰプレパックカラム １ｍＬ、２本並列
・カラム平衡化溶媒(図２の平衡に対応)：１０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６.０
洗浄用緩衝液(図２の洗浄に対応)：５０ｍＭ ＮａＣＬを含む５ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６.０
・抗体溶出用溶媒(図２の溶出に対応):０.２Ｍ ＮａＣＬを含む５ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６.０
・カラム再生用溶媒(図２の再生に対応)：１.０Ｍ ＮａＣＬを含む５ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６.０
・サンプル送液の流速：０.５５ｍＬ／ｍｉｎ
・サイクル：洗浄(１０カラム容量、流速１.０ｍＬ／ｍｉｎ)−溶出(１０カラム容量、流速１.０ｍＬ／ｍｉｎ)−再生(１０カラム容量、流速１.０ｍＬ／ｍｉｎ)−平衡化(１０カラム容量、流速１.０ｍＬ／ｍｉｎ)よりなるサイクル、サイクル時間＝４０ｍｉｎ
・溶出サンプルの回収：溶出溶液の送液開始１７０秒後に回収開始、３６０秒間回収
・トータルサイクル数：２０サイクル(カラムスイッチの回数)
・第１段階の稼働時間＝最初のサンプル送液時間(４０ｍｉｎ)＋２０サイクル(４０ｍｉｎ×２０＝８００ｍｉｎ)＋サンプル送液終了後の洗浄−溶出−再生―平衡化処理(４０ｍｉｎ)＝８８０ｍｉｎ
・溶出回収した精製溶液の総量＝６ｍＬ(溶出回収量)×２０(サイクル数)＝１２０ｍＬ
・第２段階の稼働時間＝最初のサンプル送液時間(４０ｍｉｎ)＋２０サイクル(４０ｍｉｎ×２０＝８００ｍｉｎ)＋サンプル送液終了後の洗浄−溶出−再生―平衡化処理(４０ｍｉｎ)＝８８０ｍｉｎ
・第１段階から第２段階が終了するまでに要した時間＝８０ｍｉｎ(第１段階開始後第２段階が始まるまでの待ち時間)＋８８０ｍｉｎ(第２段階の稼働時間)＝９６０ｍｉｎ(１６時間)
表２にこの精製についての結果のまとめを示している。なお、第１段階の精製においてすでに９５%以上の精製度となっており、タンパク質量の測定および抗体量の測定の誤差が５％程度もしくはそれ以上であることから、各精製ステップ後の精製抗体量はタンパク質測定の値と同じであるとして記載している。なおタンパク質の定量はＢＣＡ法、モノクローナル抗体の定量はスピンカラム法で行った。
結果、８００ｍＬのサンプルから、１ｍＬの小さなカラム２本を用いることで、回収率約７８％で純度が９５%以上の精製が、１６時間で達成できた。
【００２９】
【表２】
2014001979.tif 000004
【００３０】
図７は、別途行った第１段階のみの性背による精製回収溶液(ＡＣと表示、点線)と本実施例における第２段階での精製回収溶液(ＡＣ＋ＩＥＸと表示、実戦)のサンプルをゲルろ過カラムで解析した調べた結果を示している。縦軸は、２８０ｎｍにおける吸収(任意単位)を横軸はサンプル注入後の経過時間(分)を示している。モノクローナル抗体の溶出位置は、約１.４分に溶出するピークに対応する。点線で示す曲線のうち、約２分に溶出するピークは、低分子物質の溶出位置に相当し、タンパク質性不純物ではないと考えられるが、２つのクロマトグラフィーを連続して行い精製することにより、非常に高純度の抗体タンパク質が得られたことを示している。
【００３１】
［実施例２］３段階の連続クロマトグラフィーによるＣＨＯ細胞で発現させたモノクローナル抗体の精製(表１の利用例２に対応)
実施例１のクロマトグラフィー操作に更に陰イオン交換クロマトグラフィー操作を行うことにより、第２段階までに操作による精製後でも極微量含まれている可能性がある核酸物質などの不純物を除去することが行われる。そこで、実施例と同様の操作に加え、第３段階として、陰イオン交換クロマトグラフィーの操作を加えて、３段階の連続クロマトグラフィーの操作を行った。条件は、第１段階までは実施例２と同じカラムと緩衝液を用いて行った。
本実施例においては、サンプルとして、ＣＨＯ細胞で発現させた抗ヒトＥＧＲＦヒト型モノクローナル抗体のＣＨＯ細胞培養液(培養液中の抗体濃度＝０.２４ｍｇ／ｍＬ)を８００ｍＬ用いた。
・第１段階：実施例１に記載の条件と同一
・第２段階  (陽イオン交換クロマトグラフィー)
・第１段階にサンプル送液開始後８０ｍｉｎたった時点で第２段階のサンプル送液を開始
・カラム：ＧＥヘルスケア社製、ＨｉＴｒａｐＳＰＨＰプレパックカラム １ｍＬ、２本並列
・カラム平衡化溶媒(図２の平衡に対応)：１０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６.０
洗浄用緩衝液(図２の洗浄に対応)：５０ｍＭ ＮａＣＬを含む５ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６.０
・抗体溶出用溶媒(図２の溶出に対応):０.２Ｍ ＮａＣＬを含む５ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６.０
・カラム再生用溶媒(図２の再生に対応)：１.０Ｍ ＮａＣＬを含む５ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６.０
・希釈用緩衝液(溶出サンプルの希釈用)：２０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ９.０
・サンプル送液の流速：０.５５ｍＬ／ｍｉｎ
・サイクル：洗浄(１０カラム容量、流速１.０ｍＬ／ｍｉｎ)−溶出(１０カラム容量、流速１.０ｍＬ／ｍｉｎ)−再生(１０カラム容量、流速１.０ｍＬ／ｍｉｎ)−平衡化(１０カラム容量、流速１.０ｍＬ／ｍｉｎ)よりなるサイクル、サイクル時間＝４０ｍｉｎ
・溶出サンプルの回収：溶出溶液の送液開始１７０秒後に回収開始、３６０秒間回収、回収と同時に希釈用緩衝液を流速１ｍＬ／ｍｉｎで送液、Ｔ−ミキサーで混合希釈(結果２倍希釈)
・トータルサイクル数：２０サイクル(カラムスイッチの回数)
・第１段階の稼働時間＝最初のサンプル送液時間(４０ｍｉｎ)＋２０サイクル(４０ｍｉｎ×２０＝８００ｍｉｎ)＋サンプル送液終了後の洗浄−溶出−再生―平衡化処理(４０ｍｉｎ)＝８８０ｍｉｎ
・溶出希釈回収した精製溶液の総量＝(６ｍＬ(溶出回収量)＋６ｍＬ(希釈緩衝液))×２０(サイクル数)＝２４０ｍＬ
・第２段階の稼働時間＝最初のサンプル送液時間(４０ｍｉｎ)＋２０サイクル(４０ｍｉｎ×２０＝８００ｍｉｎ)＋サンプル送液終了後の洗浄−溶出−再生―平衡化処理(４０ｍｉｎ)＝８８０ｍｉｎ
・第１段階から第２段階が終了するまでに要した時間＝８０ｍｉｎ(第１段階開始後第２段階が始まるまでの待ち時間)＋８８０ｍｉｎ(第２段階の稼働時間)＝９６０ｍｉｎ(１６時間)
第３段階  (陰イオン交換クロマトグラフィー)
・目的とするモノクローナル抗体は、中性付近で用いた陰イオン交換カラムに吸着しないことから、サンプル溶液を陰イオンカラムに送液し、非吸着画分を回収するということで不純物除去操作を行った。
・第２段階にサンプル送液開始後８０ｍｉｎたった時点で第３段階のサンプル送液を開始
・第３段階のサンプル送液を開始７分後に図３の流路図に示すＲリザーバーのラインで非吸着画分の回収を開始、最終サイクルの洗浄が開始後７分後まで回収を継続。
・非吸着画分として溶出回収した精製溶液の総量＝１２０ｍＬ
・カラム：ＧＥヘルスケア社製、ＨｉＴｒａｐＱＦＦプレパックカラム １ｍＬ、２本並列
・カラム平衡化溶媒(図２の平衡に対応)：１０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７.５
洗浄用緩衝液(図２の洗浄に対応)：１００ｍＭ ＮａＣＬを含む５ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７.５
・抗体溶出用溶媒(図２の溶出に対応):０.２Ｍ ＮａＣＬを含む５ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７.５
・カラム再生用溶媒(図２の再生に対応)：１.０Ｍ ＮａＣＬを含む５ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７.５
・サンプル送液の流速：０.１５ｍＬ／ｍｉｎ
・サイクル：洗浄(１０カラム容量、流速１.０ｍＬ／ｍｉｎ)−溶出(１０カラム容量、流速１.０ｍＬ／ｍｉｎ)−再生(１０カラム容量、流速１.０ｍＬ／ｍｉｎ)−平衡化(１０カラム容量、流速１.０ｍＬ／ｍｉｎ)よりなるサイクル、サイクル時間＝４０ｍｉｎ
・トータルサイクル数：２０サイクル(カラムスイッチの回数)
・第３段階の稼働時間＝最初のサンプル送液時間(４０ｍｉｎ)＋２０サイクル(４０ｍｉｎ×２０＝８００ｍｉｎ)＋サンプル送液終了後の洗浄−溶出−再生―平衡化処理(４０ｍｉｎ)＝８８０ｍｉｎ
・第１段階から第３段階が終了するまでに要した時間＝８０ｍｉｎ(第１段階開始後第２段階が始まるまでの待ち時間)＋８０ｍｉｎ(第２段階開始後第３段階が始まるまでの待ち時間)＋８８０ｍｉｎ(第３段階の稼働時間)＝１０４０ｍｉｎ(１７時間２０分)
表３にこの精製についての結果のまとめを示している。
【００３２】
【表３】
2014001979.tif 000005
【００３３】
結果、８００ｍＬのサンプルから、それぞれの段階でのクロマト分離において１ｍＬの小さなカラム２本を用いることで、回収率約６６％で純度が９５％以上の精製が、約１８時間で達成できた。
【００３４】
［実施例３］３段階の連続クロマトグラフィーによるＣＨＯ細胞で発現させたモノクローナル抗体の精製(表１の利用例５に対応)
３段階のクロマトグラフィーの順番を変更した場合においても連続処理に問題ないことを示すために、適用するカラムの順番を、陰イオン交換カラム⇒プロテインＡアフィニティカラム⇒陽イオン交換カラムの順番に変更してモノクローナル抗体の連続精製処理を行った。
本実施例においては、サンプルとして、ＣＨＯ細胞で発現させた抗ヒトＩｇＳＦ４ヒト型モノクローナル抗体のＣＨＯ細胞培養液(培養液中の抗体濃度＝０.２０ｍｇ／ｍＬ)を８００ｍＬ用いた。
第１段階  (陰イオン交換クロマトグラフィー)
・培養液中に混在する核酸などの非常に強く負に荷電する物質をあらかじめ陰イオンカラムに吸着される。一方、目的とするモノクローナル抗体は、中性付近で用いた陰イオン交換カラムに吸着しないことから、サンプル溶液を陰イオンカラムに送液し、非吸着画分を回収するということで不純物除去操作を行った。
・サンプル送液を開始５分後に図３の流路図に示すＲリザーバーのラインで非吸着画分の回収を開始、回収サンプルは、そのまま第２段階へ、最終サイクルの洗浄が開始後５分後まで回収を継続。
・カラム：ＴＯＳＯＨ社製、ＧｉｇａＣａｐ Ｑ−６５０プレパックカラム ５ｍＬ、２本並列
・カラム平衡化溶媒(図２の平衡に対応)：１０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７.５
洗浄用緩衝液(図２の洗浄に対応)：使用せず
・抗体溶出用溶媒(図２の溶出に対応):使用せず
・カラム再生用溶媒(図２の再生に対応)：１.０Ｍ ＮａＣＬを含む５ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７.５
・サンプル送液の流速：１.０ｍＬ／ｍｉｎ
・サイクル：再生(１０カラム容量、流速１.０ｍＬ／ｍｉｎ)−平衡化(１０カラム容量、流速１.０ｍＬ／ｍｉｎ)よりなるサイクル、サイクル時間＝１００ｍｉｎ
・トータルサイクル数：８サイクル(カラムスイッチの回数)
・第１段階の稼働時間＝８サイクル(１００ｍｉｎ×８＝８００ｍｉｎ)＋サンプル送液終了後の洗浄−溶出−再生―平衡化処理(１００ｍｉｎ)＝９００ｍｉｎ
第２段階  (プロテインＡアフィニティカラム精製)
・第１段階での非吸着画分をアプライ
・カラム：本発明者らが開発した改変プロテインＡ(ＡＩＳＴ−２と名付けた)を配向制御固定化したシリカモノリスカラム、カラムサイズ １ｍＬ、２本並列
・カラム平衡化溶媒(図２の平衡に対応)：０.１Ｍ リン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７.２
洗浄用緩衝液(図２の洗浄に対応)：１Ｍ ＮａＣＬを含む５ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７.２
・抗体溶出用溶媒(図２の溶出に対応):０.１Ｍ クエン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ３.５
・カラム再生用溶媒(図２の再生に対応)：０.１Ｍ グリシン塩酸緩衝液、ｐＨ２.５
・希釈用緩衝液(溶出サンプルの希釈用)：２０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６.０
・サンプル送液の流速：１.０ｍＬ／ｍｉｎ
・サイクル：洗浄(１０カラム容量、流速１.０ｍＬ／ｍｉｎ)−溶出(１０カラム容量、流速１.０ｍＬ／ｍｉｎ)−再生(１０カラム容量、流速１.０ｍＬ／ｍｉｎ)−平衡化(１０カラム容量、流速１.０ｍＬ／ｍｉｎ)よりなるサイクル、サイクル時間＝４０ｍｉｎ
・溶出サンプルの回収：溶出溶液の送液開始５５秒後に回収開始、１２０秒間回収、回収と同時に希釈用緩衝液を流速１０ｍＬ／ｍｉｎで送液、Ｔ−ミキサーで混合希釈(結果１０倍希釈)
・トータルサイクル数：２０サイクル(カラムスイッチの回数)
・第１段階の稼働時間＝最初のサンプル送液時間(４０ｍｉｎ)＋２０サイクル(４０ｍｉｎ×２０＝８００ｍｉｎ)＋サンプル送液終了後の洗浄−溶出−再生―平衡化処理(４０ｍｉｎ)＝８８０ｍｉｎ
・溶出希釈回収した精製溶液の総量＝(２ｍＬ(溶出回収量)＋２０ｍＬ(希釈緩衝液))×２０(サイクル数)＝４４０ｍＬ
・第１段階から第２段階が終了するまでに要した時間＝５ｍｉｎ(第１段階開始後第２段階が始まるまでの待ち時間)＋８８０ｍｉｎ(第２段階の稼働時間)＝８８５ｍｉｎ(約１６時間)
第３段階  (陽イオン交換クロマトグラフィー)
・第２段階にサンプル送液開始後８０ｍｉｎたった時点で第二段階のサンプル送液を開始
・カラム：ＴＯＳＯＨ社製、ＧｉｇａＣａｐ−Ｓ−６５０Ｍプレパックカラム １ｍＬ、２本並列
・カラム平衡化溶媒(図２の平衡に対応)：１０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６.０
洗浄用緩衝液(図２の洗浄に対応)：５０ｍＭ ＮａＣＬを含む５ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６.０
・抗体溶出用溶媒(図２の溶出に対応):０.２Ｍ ＮａＣＬを含む５ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６.０
・カラム再生用溶媒(図２の再生に対応)：１.０Ｍ ＮａＣＬを含む５ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６.０
・サンプル送液の流速：０.５５ｍＬ／ｍｉｎ
・サイクル：洗浄(１０カラム容量、流速１.０ｍＬ／ｍｉｎ)−溶出(１０カラム容量、流速１.０ｍＬ／ｍｉｎ)−再生(１０カラム容量、流速１.０ｍＬ／ｍｉｎ)−平衡化(１０カラム容量、流速１.０ｍＬ／ｍｉｎ)よりなるサイクル、サイクル時間＝４０ｍｉｎ
・溶出サンプルの回収：溶出溶液の送液開始１７０秒後に回収開始、３６０秒間回収
・トータルサイクル数：２０サイクル(カラムスイッチの回数)
・第３段階の稼働時間＝最初のサンプル送液時間(４０ｍｉｎ)＋２０サイクル(４０ｍｉｎ×２０＝８００ｍｉｎ)＋サンプル送液終了後の洗浄−溶出−再生―平衡化処理(４０ｍｉｎ)＝８８０ｍｉｎ
・溶出回収した精製溶液の総量＝６ｍＬ(溶出回収量)×２０(サイクル数)＝１２０ｍＬ
・第２段階の稼働時間＝最初のサンプル送液時間(４０ｍｉｎ)＋２０サイクル(４０ｍｉｎ×２０＝８００ｍｉｎ)＋サンプル送液終了後の洗浄−溶出−再生―平衡化処理(４０ｍｉｎ)＝８８０ｍｉｎ
・第１段階から第３段階が終了するまでに要した時間＝５ｍｉｎ(第１段階開始後第２段階が始まるまでの待ち時間)＋８０ｍｉｎ(第２段階開始後第３段階が始まるまでの待ち時間)＋８８０ｍｉｎ(第２段階の稼働時間)＝９６５ｍｉｎ(約１６時間)
表４にこの精製についての結果のまとめを示している。なお、第２段階の精製においてすでに９５%以上の精製度となっており、タンパク質量の測定および抗体量の測定の誤差が５%程度もしくはそれ以上であることから、第２段階および第３段階の精製ステップ後の精製抗体量はタンパク質測定の値と同じであるとして記載している。なおタンパク質の定量はＢＣＡ法、モノクローナル抗体の定量はスピンカラム法で行った。
結果適用するクロマト担体の順番を変えても、多段階連続クロマトグラフィーを適切に行うことができることが示された。
【００３５】
【表４】
2014001979.tif 000006
【００３６】
［実施例４］２段階の連続クロマトグラフィーによる大腸菌で発現させたヒスタグ付きタンパク質の精製(表１の利用例７に対応)
精製対象のタンパク質として本発明者らの発明の抗体結合性タンパク質(ＡＩＳＴ−２と呼ぶ)を用いた。ＡＩＳＴ−２を発現するためのプラスミドは、特許文献(特開２００８−１１５１５３)にＰＡＡ３Ｔで記載されている。プラスミドＰＡＡ３Ｔを形質導入した大腸菌ＪＭ１０９株を用いて、同特許文献に記載している方法に準じて、カラムクロマトグラフィーにアプライするためのサンプルを調製した。
８Ｌの培養液から遠心分離により菌体を集め、カラム平衡化溶液に懸濁し、フレンチプレスを用いて菌体を破砕した後遠心分離により不溶物を取り除いた。その後、ストレプトマイシン硫酸処理、４５％硫安処理により生じた沈殿物を遠心分離により取り除き清澄化したものをカラム精製に用いた。カラム平衡液を加え、計２Ｌのサンプル溶液とした。
第１段階  (ニッケルキレートカラム精製)
・サンプル溶液の量：２Ｌ
・カラム：ＧＥヘルスケア社製、ＨｉｓＴｒａｐＨＰプレパックカラム ５ｍＬ、２本並列
・カラム平衡化溶媒(図２の平衡に対応)：０.５Ｍ ＫＣＬおよび５ｍＭイミダゾールを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ緩衝液、ｐＨ７.６
洗浄用緩衝液(図２の洗浄に対応)：０.５Ｍ ＫＣＬおよび２０ｍＭイミダゾールを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ緩衝液、ｐＨ７.６
・抗体溶出用溶媒(図２の溶出に対応):０.１Ｍ ＫＣＬおよび０.２Ｍイミダゾールを含む５０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ緩衝液、ｐＨ７.６
・カラム再生用溶媒(図２の再生に対応)：１Ｍ ＫＣＬおよび１Ｍイミダゾールを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ緩衝液、ｐＨ７.６
・希釈用緩衝液(溶出サンプルの希釈用)：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ緩衝液、ｐＨ７.６
・サンプル送液の流速：２.５ｍＬ／ｍｉｎ
・サイクル：洗浄(１０カラム容量、流速５.０ｍＬ／ｍｉｎ)−溶出(１０カラム容量、流速５.０ｍＬ／ｍｉｎ)−再生(１０カラム容量、流速５.０ｍＬ／ｍｉｎ)−平衡化(１０カラム容量、流速５.０ｍＬ／ｍｉｎ)よりなるサイクル、サイクル時間＝４０ｍｉｎ
・溶出サンプルの回収：溶出溶液の送液開始９０秒後に回収開始、２４０秒間回収、回収と同時に希釈用緩衝液を流速５０ｍＬ／ｍｉｎで送液、Ｔ−ミキサーで混合希釈(結果１０倍希釈)
・トータルサイクル数：２０サイクル(カラムスイッチの回数)
・第１段階の稼働時間＝最初のサンプル送液時間(４０ｍｉｎ)＋２０サイクル(４０ｍｉｎ×２０＝８００ｍｉｎ)＋サンプル送液終了後の洗浄−溶出−再生―平衡化処理(４０ｍｉｎ)＝８８０ｍｉｎ
・溶出希釈回収した精製溶液の総量＝(２０ｍＬ(溶出回収量)＋２００ｍＬ(希釈緩衝液))×２０(サイクル数)＝４４００ｍＬ
第２段階  (陰イオン交換クロマトグラフィー)
・第１段階にサンプル送液開始後８０ｍｉｎたった時点で第二段階のサンプル送液を開始
・カラム：ＧＥヘルスケア社製、ＨｉＴｒａｐＱＦＦプレパックカラム ５ｍＬ、２本並列
・カラム平衡化溶媒(図２の平衡に対応)：５０ｍＭ ＫＣＬを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ緩衝液、ｐＨ７.６
洗浄用緩衝液(図２の洗浄に対応)：７５ｍＭ ＫＣＬを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ緩衝液、ｐＨ７.６
・抗体溶出用溶媒(図２の溶出に対応):０.２５Ｍ ＫＣＬを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ緩衝液、ｐＨ７.６
・カラム再生用溶媒(図２の再生に対応)：１.０Ｍ ＫＣＬを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ緩衝液、ｐＨ７.６
・サンプル送液の流速：５.５ｍＬ／ｍｉｎ
・サイクル：洗浄(１０カラム容量、流速１.０ｍＬ／ｍｉｎ)−溶出(１０カラム容量、流速１.０ｍＬ／ｍｉｎ)−再生(１０カラム容量、流速１.０ｍＬ／ｍｉｎ)−平衡化(１０カラム容量、流速１.０ｍＬ／ｍｉｎ)よりなるサイクル、サイクル時間＝４０ｍｉｎ
・溶出サンプルの回収：溶出溶液の送液開始９０秒後に回収開始、２４０秒間回収
・トータルサイクル数：２０サイクル(カラムスイッチの回数)
・第１段階の稼働時間＝最初のサンプル送液時間(４０ｍｉｎ)＋２０サイクル(４０ｍｉｎ×２０＝８００ｍｉｎ)＋サンプル送液終了後の洗浄−溶出−再生―平衡化処理(４０ｍｉｎ)＝８８０ｍｉｎ
・溶出回収した精製溶液の総量＝２０ｍＬ(溶出回収量)×２０(サイクル数)＝４００ｍＬ
・第２段階の稼働時間＝最初のサンプル送液時間(４０ｍｉｎ)＋２０サイクル(４０ｍｉｎ×２０＝８００ｍｉｎ)＋サンプル送液終了後の洗浄−溶出−再生―平衡化処理(４０ｍｉｎ)＝８８０ｍｉｎ
・第１段階から第２段階が終了するまでに要した時間＝８０ｍｉｎ(第１段階開始後第２段階が始まるまでの待ち時間)＋８８０ｍｉｎ(第２段階の稼働時間)＝９６０ｍｉｎ(１６時間)
表５に精製結果のまとめを示している。ここで、タンパク質の定量はＢＣＡ法で行い、ＡＩＳＴ−２の量については、タンパク質溶液をＳＤＳ-電気泳動法により解析し、クマジー染色により染色されたタンパク質バンドから、ＡＩＳＴ−２に相当するタンパク質バンドの含有率(％)を推定し、ＢＣＡ法で求めた溶液中の全タンパク質量に含有率を掛けた値とした。
結果、２０００ｍＬのサンプルから、５ｍＬの小さなカラム２本を用いることで、回収率約７８％で純度が９５％の精製が、１６時間で達成できた。
【００３７】
【表５】
2014001979.tif 000007
【００３８】
［実施例５］３段階の連続クロマトグラフィーによる大腸菌で発現させたヒスタグ付きタンパク質の精製(表１の利用例９に対応)
サンプルは、実施例４に用いた大腸菌で発現させたＡＩＳＴ−２の溶液を用いた。
なお、ＡＩＳＴ−２の等電点は、約４.１であり、中性条件では、陽イオン交換樹脂には結合しない。
第１段階  (ニッケルキレートカラム精製)
・サンプル溶液の量：２Ｌ
・カラム：ＴＯＳＯＨ社製、ＡＦ−Ｃｈｅｌａｔｅ−６５０Ｍ ５ｍＬ、２本並列
・カラム平衡化溶媒(図２の平衡に対応)：０.５Ｍ ＫＣＬおよび５ｍＭイミダゾールを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ緩衝液、ｐＨ７.６
洗浄用緩衝液(図２の洗浄に対応)：０.５Ｍ ＫＣＬおよび２０ｍＭイミダゾールを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ緩衝液、ｐＨ７.６
・抗体溶出用溶媒(図２の溶出に対応):０.１Ｍ ＫＣＬおよび０.２Ｍイミダゾールを含む５０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ緩衝液、ｐＨ７.６
・カラム再生用溶媒(図２の再生に対応)：１Ｍ ＫＣＬおよび１Ｍイミダゾールを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ緩衝液、ｐＨ７.６
・希釈用緩衝液(溶出サンプルの希釈用)：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ緩衝液、ｐＨ７.６
・サンプル送液の流速：２.５ｍＬ／ｍｉｎ
・サイクル：洗浄(１０カラム容量、流速５.０ｍＬ／ｍｉｎ)−溶出(１０カラム容量、流速５.０ｍＬ／ｍｉｎ)−再生(１０カラム容量、流速５.０ｍＬ／ｍｉｎ)−平衡化(１０カラム容量、流速５.０ｍＬ／ｍｉｎ)よりなるサイクル、サイクル時間＝４０ｍｉｎ
・溶出サンプルの回収：溶出溶液の送液開始８０秒後に回収開始、２４０秒間回収、回収と同時に希釈用緩衝液を流速５０ｍＬ／ｍｉｎで送液、Ｔ−ミキサーで混合希釈(結果１０倍希釈)
・トータルサイクル数：２０サイクル(カラムスイッチの回数)
・第１段階の稼働時間＝最初のサンプル送液時間(４０ｍｉｎ)＋２０サイクル(４０ｍｉｎ×２０＝８００ｍｉｎ)＋サンプル送液終了後の洗浄−溶出−再生―平衡化処理(４０ｍｉｎ)＝８８０ｍｉｎ
・溶出希釈回収した精製溶液の総量＝(２０ｍＬ(溶出回収量)＋２００ｍＬ(希釈緩衝液))×２０(サイクル数)＝４４００ｍＬ
第２段階  (陰イオン交換クロマトグラフィー)
・第１段階にサンプル送液開始後８０ｍｉｎたった時点で第二段階のサンプル送液を開始
・カラム：ＴＯＳＯＨ社製、ＧｉｇａＣａｐ Ｑ−６５０プレパックカラム ５ｍＬ、２本並列
・カラム平衡化溶媒(図２の平衡に対応)：５０ｍＭ ＫＣＬを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ緩衝液、ｐＨ７.６
洗浄用緩衝液(図２の洗浄に対応)：７５ｍＭ ＫＣＬを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ緩衝液、ｐＨ７.６
・抗体溶出用溶媒(図２の溶出に対応):０.２５Ｍ ＫＣＬを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ緩衝液、ｐＨ７.６
・カラム再生用溶媒(図２の再生に対応)：１.０Ｍ ＫＣＬを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ緩衝液、ｐＨ７.６
・希釈用緩衝液(溶出サンプルの希釈用)：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ緩衝液、ｐＨ７.６
・サンプル送液の流速：５.５ｍＬ／ｍｉｎ
・サイクル：洗浄(１０カラム容量、流速１.０ｍＬ／ｍｉｎ)−溶出(１０カラム容量、流速１.０ｍＬ／ｍｉｎ)−再生(１０カラム容量、流速１.０ｍＬ／ｍｉｎ)−平衡化(１０カラム容量、流速１.０ｍＬ／ｍｉｎ)よりなるサイクル、サイクル時間＝４０ｍｉｎ
・溶出サンプルの回収：溶出溶液の送液開始９０秒後に回収開始、２４０秒間回収、回収と同時に希釈用緩衝液を流速５０ｍＬ／ｍｉｎで送液、Ｔ−ミキサーで混合希釈(結果１０倍希釈)
・トータルサイクル数：２０サイクル(カラムスイッチの回数)
・第１段階の稼働時間＝最初のサンプル送液時間(４０ｍｉｎ)＋２０サイクル(４０ｍｉｎ×２０＝８００ｍｉｎ)＋サンプル送液終了後の洗浄−溶出−再生―平衡化処理(４０ｍｉｎ)＝８８０ｍｉｎ
・溶出希釈回収した精製溶液の総量＝(２０ｍＬ(溶出回収量)＋２００ｍＬ(希釈緩衝液))×２０(サイクル数)＝４４００ｍＬ
・第２段階の稼働時間＝最初のサンプル送液時間(４０ｍｉｎ)＋２０サイクル(４０ｍｉｎ×２０＝８００ｍｉｎ)＋サンプル送液終了後の洗浄−溶出−再生―平衡化処理(４０ｍｉｎ)＝８８０ｍｉｎ
・第１段階から第２段階が終了するまでに要した時間＝８０ｍｉｎ(第１段階開始後第２段階が始まるまでの待ち時間)＋８８０ｍｉｎ(第２段階の稼働時間)＝９６０ｍｉｎ(１６時間)
第３段階  (陰イオン交換クロマトグラフィー)
・目的とするＡＩＳＴ−２は、中性付近で用いた陽イオン交換カラムに吸着しないことから、サンプル溶液を陽イオンカラムに送液し、非吸着画分を回収するという操作を行った。
・第２段階にサンプル送液開始後８０ｍｉｎたった時点で第３段階のサンプル送液を開始
・第３段階のサンプル送液を開始２分後に図３の流路図に示すＲリザーバーのラインで非吸着画分の回収を開始、最終サイクルの洗浄が開始後２分後まで回収を継続。
・非吸着画分として溶出回収した精製溶液の総量＝４４００ｍＬ
・カラム：ＴＯＳＯＨ社製、ＧｉｇａＣａｐ−Ｓ−６５０Ｍプレパックカラム ５ｍＬ、２本並列
・カラム平衡化溶媒(図２の平衡に対応)：５０ｍＭ ＫＣＬを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ緩衝液、ｐＨ７.６
洗浄用緩衝液(図２の洗浄に対応)：７５ｍＭ ＫＣＬを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ緩衝液、ｐＨ７.６
・抗体溶出用溶媒(図２の溶出に対応):０.２５Ｍ ＫＣＬを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ緩衝液、ｐＨ７.６
・カラム再生用溶媒(図２の再生に対応)：１.０Ｍ ＫＣＬを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ緩衝液、ｐＨ７.６
・サンプル送液の流速：５.５ｍＬ／ｍｉｎ
・サイクル：洗浄(１０カラム容量、流速１.０ｍＬ／ｍｉｎ)−溶出(１０カラム容量、流速１.０ｍＬ／ｍｉｎ)−再生(１０カラム容量、流速１.０ｍＬ／ｍｉｎ)−平衡化(１０カラム容量、流速１.０ｍＬ／ｍｉｎ)よりなるサイクル、サイクル時間＝４０ｍｉｎ
・トータルサイクル数：２０サイクル(カラムスイッチの回数)
・第３段階の稼働時間＝最初のサンプル送液時間(４０ｍｉｎ)＋２０サイクル(４０ｍｉｎ×２０＝８００ｍｉｎ)＋サンプル送液終了後の洗浄−溶出−再生―平衡化処理(４０ｍｉｎ)＝８８０ｍｉｎ
・第１段階から第３段階が終了するまでに要した時間＝８０ｍｉｎ(第１段階開始後第２段階が始まるまでの待ち時間)＋８０ｍｉｎ(第２段階開始後第３段階が始まるまでの待ち時間)＋８８０ｍｉｎ(第３段階の稼働時間)＝１０４０ｍｉｎ(１７時間２０分)
表６に精製結果のまとめを示している。ここで、タンパク質の定量はＢＣＡ法で行い、ＡＩＳＴ−２の量については、タンパク質溶液をＳＤＳ-電気泳動法により解析し、クマジー染色により染色されたタンパク質バンドから、ＡＩＳＴ−２に相当するタンパク質バンドの含有率(％)を推定し、ＢＣＡ法で求めた溶液中の全タンパク質量に含有率を掛けた値とした。
【００３９】
【表６】
2014001979.tif 000008
【産業上の利用可能性】
【００４０】
本発明の複数の段階からなる液体クロマトグラフィー分離精製装置及び方法は、精製に要する時間を大幅に短くすることと精製のための高価なカラムの容量を大幅に減らすことができる。従って従来高コストとされていた抗体医薬品などのタンパク質医薬品の精製コストを大幅に低減することに寄与できる。このことは、医薬品製造分野また医薬品製造受託業者において活用されることが期待される。
【図１】
2014001979.tif 000011
【図２】
2014001979.tif 000012
【図３】
2014001979.tif 000013
【図４】
2014001979.tif 000014
【図５】
2014001979.tif 000015
【図６】
2014001979.tif 000016
【図７】
2014001979.tif 000017
【手続補正書】
【提出日】平成24年7月13日(2012.7.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料を連続的に注入しながら、複数のカラムクロマトグラフィーによるタンパク質の精製を連続した流路を経て行うことを特徴とするタンパク質の分離精製装置。
【請求項２】
請求項１に記載のタンパク質の分離精製装置において、
下記の構成単位をｎ個、ここでｎは２以上の整数、有することを特徴とするタンパク質の分離精製装置。
構成単位は、試料を連続注入しながらクロマトグラフィーによる分離精製を行う連続クロマトグラフィー装置ＬＣと、連続クロマトグラフィー装置ＬＣへ試料を注入する注入ラインｉｎと、連続クロマトグラフィー装置ＬＣで精製された試料の回収ラインＥと、希釈用溶媒のリザーバーＢと、リザーバーＢの希釈用溶媒を送液するポンプＰと、ポンプＰで送液された希釈用溶媒を回収ラインＥにミキシングするミキサーＭと、ミキサーＭでミキシングされた回収ラインＥの精製回収希釈した溶液のリザーバーＲと、Ｒから後段の構成単位へ送液するラインｏｕｔとからなり、
注入ラインｉｎは前段の構成単位のラインｏｕｔに接続され、ラインｏｕｔは後段の構成単位の注入ラインｉｎに接続されるとともに、
最初の段の構成単位の注入ラインｉｎは試料のリザーバーＳに接続され、かつ、最後の段の構成単位の回収ラインＥは、ミキサーＭで希釈されることなくリザーバーＲに回収されるものである。
【請求項３】
請求項２に記載のタンパク質の分離精製装置において、２つのクロマトグラフィーによるタンパク質の精製を連続した流路を経て行う、ｎが２であることを特徴とするタンパク質の分離精製装置。
【請求項４】
請求項２に記載のタンパク質の分離精製装置において、２つのクロマトグラフィーによるタンパク質の精製を連続した流路を経て行う、ｎが３であることを特徴とするタンパク質の分離精製装置。
【請求項５】
試料を連続的に注入しながら、複数のカラムクロマトグラフィーによるタンパク質の精製を連続した流路を経て行うことを特徴とするタンパク質の分離精製方法。
【請求項６】
請求項５に記載のタンパク質の分離精製方法において、
下記の構成単位をｎ個、ここでｎは２以上の整数、有することを特徴とするタンパク質の精製方法。
構成単位は、試料を連続注入しながらクロマトグラフィーによる分離精製を行う連続クロマトグラフィー装置ＬＣと、連続クロマトグラフィー装置ＬＣへ試料を注入する注入ラインｉｎと、連続クロマトグラフィー装置ＬＣで精製された試料の回収ラインＥと、希釈用溶媒のリザーバーＢと、リザーバーＢの希釈用溶媒を送液するポンプＰと、ポンプＰで送液された希釈用溶媒を回収ラインＥにミキシングするミキサーＭと、ミキサーＭでミキシングされた回収ラインＥの精製回収希釈した溶液のリザーバーＲと、Ｒから後段の構成単位へ送液するラインｏｕｔとからなり、
注入ラインｉｎは前段の構成単位のラインｏｕｔに接続され、ラインｏｕｔは後段の構成単位の注入ラインｉｎに接続されるとともに、
最初の段の構成単位の注入ラインｉｎは試料のリザーバーＳに接続され、かつ、最後の段の構成単位の回収ラインＥは、ミキサーＭで希釈されることなくリザーバーＲに回収されるものである。
【請求項７】
請求項６に記載のタンパク質の分離精製方法において、請求項３のｎが２であることを特徴とするタンパク質の分離精製装置によりタンパク質の精製を連続した流路を経て行うことを特徴とするタンパク質の分離精製方法。
【請求項８】
請求項７に記載のタンパク質の分離精製方法において、プロテインＡアフィニティクロマトグラフィーと陽イオン交換クロマトグラフィーを組み合わせて抗体の分離を行うことを特徴とするタンパク質の分離精製方法。
【請求項９】
請求項７に記載のタンパク質の分離精製方法において、ニッケルキレートカラムを用いたクロマトグラフィーと陰イオン交換クロマトグラフィーを組み合わせてヒスタグタンパク質の分離精製を行うことを特徴とするタンパク質の分離精製方法。
【請求項１０】
請求項６に記載のタンパク質の分離精製方法において、請求項３のｎが３であることを特徴とするタンパク質の分離精製装置によりタンパク質の精製を連続した流路を経て行うことを特徴とするタンパク質の分離精製方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載のタンパク質の分離精製方法において、プロテインＡアフィニティクロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィーおよび陰イオン交換クロマトグラフィーを組み合わせて抗体の分離を行うことを特徴とするタンパク質の分離精製方法。
【請求項１２】
請求項１０に記載のタンパク質の分離精製方法において、ニッケルキレートカラムを用いたクロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィーおよび陽イオンクロマトグラフィーを組み合わせてヒスタグタンパク質の分離精製を行うことを特徴とするタンパク質の分離精製方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
すなわち、本発明は、試料を連続的に注入しながら、複数のカラムクロマトグラフィーによるタンパク質の精製を連続した流路を経て行うことを特徴とするタンパク質の分離精製装置である。
また、本発明はタンパク質の分離精製装置において、図４に示される構成単位をｎ個、ここでｎは２以上の整数、有することを特徴とするタンパク質の分離精製装置である。
ただし、図中点線四角で囲った部分は、試料を連続的に注入することによりクロマトグラフィーの分離を行い、精製分離して得られた試料を適宜希釈し回収することを行う機能を有する構成単位を示しており、図中、Ｓは試料のリザーバーを、ｉｎは試料の注入ラインを，ＬＣは、試料を連続注入しながらクロマトグラフィーによる分離精製を行う連続クロマトグラフィー装置を、Ｅは、ＬＣで精製された試料の回収ラインを、Ｍはミキサーを、Ｂは希釈用溶媒のリザーバーを、Ｐは希釈用溶媒を送液するポンプを、Ｒは、ＬＣでの精製回収希釈した溶液のリザーバーを，ｏｕｔはＲから次のＬＣへ試料を送液するためのラインを示している。言い換えれば、構成単位は、試料を連続注入しながらクロマトグラフィーによる分離精製を行う連続クロマトグラフィー装置ＬＣと、連続クロマトグラフィー装置ＬＣへ試料を注入する注入ラインｉｎと、連続クロマトグラフィー装置ＬＣで精製された試料の回収ラインＥと、希釈用溶媒のリザーバーＢと、リザーバーＢの希釈用溶媒を送液するポンプＰと、ポンプＰで送液された希釈用溶媒を回収ラインＥにミキシングするミキサーＭと、ミキサーＭでミキシングされた回収ラインＥの精製回収希釈した溶液のリザーバーＲと、Ｒから後段の構成単位へ送液するラインｏｕｔとからなり、注入ラインｉｎは前段の構成単位のラインｏｕｔに接続され、ラインｏｕｔは後段の構成単位の注入ラインｉｎに接続されるとともに、最初の段の構成単位の注入ラインｉｎは試料のリザーバーＳに接続され、かつ、最後の段の構成単位の回収ラインＥは、ミキサーＭで希釈されることなくリザーバーＲに回収されるものである。
また、本発明は、上記タンパク質の分離精製装置において、２つのクロマトグラフィーによるタンパク質の精製を連続した流路を経て行う、ｎが２であることを特徴とするタンパク質の分離精製装置である。
また、本発明は、上記タンパク質の分離精製装置において、２つのクロマトグラフィーによるタンパク質の精製を連続した流路を経て行う、ｎが３であることを特徴とするタンパク質の分離精製装置である。
また、本発明は、試料を連続的に注入しながら、複数のカラムクロマトグラフィーによるタンパク質の精製を連続した流路を経て行うことを特徴とするタンパク質の分離精製方法である。
また、本発明は、上記タンパク質の分離精製方法において、図４に示される構成単位をｎ個、ここでｎは２以上の整数、有することを特徴とするタンパク質の精製方法である。
ただし、図中点線四角で囲った部分は、試料を連続的に注入することによりクロマトグラフィーの分離を行い、精製分離して得られた試料を適宜希釈し回収することを行う機能を有する構成単位を示しており、図中、Ｓは試料のリザーバーを、ｉｎは試料の注入ラインを，ＬＣは、試料を連続注入しながらクロマトグラフィーによる分離精製を行う連続クロマトグラフィー装置を、Ｅは、ＬＣで精製された試料の回収ラインを、Ｍはミキサーを、Ｂは希釈用溶媒のリザーバーを、Ｐは希釈用溶媒を送液するポンプを、Ｒは、ＬＣでの精製回収希釈した溶液のリザーバーを，ｏｕｔはＲから次のＬＣへ試料を送液するためのラインを示している。言い換えれば、構成単位は、試料を連続注入しながらクロマトグラフィーによる分離精製を行う連続クロマトグラフィー装置ＬＣと、連続クロマトグラフィー装置ＬＣへ試料を注入する注入ラインｉｎと、連続クロマトグラフィー装置ＬＣで精製された試料の回収ラインＥと、希釈用溶媒のリザーバーＢと、リザーバーＢの希釈用溶媒を送液するポンプＰと、ポンプＰで送液された希釈用溶媒を回収ラインＥにミキシングするミキサーＭと、ミキサーＭでミキシングされた回収ラインＥの精製回収希釈した溶液のリザーバーＲと、Ｒから後段の構成単位へ送液するラインｏｕｔとからなり、注入ラインｉｎは前段の構成単位のラインｏｕｔに接続され、ラインｏｕｔは後段の構成単位の注入ラインｉｎに接続されるとともに、最初の段の構成単位の注入ラインｉｎは試料のリザーバーＳに接続され、かつ、最後の段の構成単位の回収ラインＥは、ミキサーＭで希釈されることなくリザーバーＲに回収されるものである。
また、本発明は、上記タンパク質の分離精製方法において、ｎが２であることを特徴とするタンパク質の分離精製装置によりタンパク質の精製を連続した流路を経て行うことを特徴とするタンパク質の分離精製方法である。
また、本発明は、上記タンパク質の分離精製方法において、プロテインＡアフィニティクロマトグラフィーと陽イオン交換クロマトグラフィーを組み合わせて抗体の分離を行うことを特徴とするタンパク質の分離精製方法である。
また、本発明は、上記タンパク質の分離精製方法において、ニッケルキレートカラムを用いたクロマトグラフィーと陰イオン交換クロマトグラフィーを組み合わせてヒスタグタンパク質の分離精製を行うことを特徴とするタンパク質の分離精製方法である。
また、本発明は、上記タンパク質の分離精製方法において、ｎが３であることを特徴とするタンパク質の分離精製装置によりタンパク質の精製を連続した流路を経て行うことを特徴とするタンパク質の分離精製方法である。
また、本発明は、上記タンパク質の分離精製方法において、プロテインＡアフィニティクロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィーおよび陰イオン交換クロマトグラフィーを組み合わせて抗体の分離を行うことを特徴とするタンパク質の分離精製方法である。
また、本発明は、上記タンパク質の分離精製方法において、ニッケルキレートカラムを用いたクロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィーおよび陽イオンクロマトグラフィーを組み合わせてヒスタグタンパク質の分離精製を行うことを特徴とするタンパク質の分離精製方法である。