(57)【要約】【課題】新潟県産コシヒカリを簡便かつ特異的に判定できる方法を開発すること。【解決手段】新潟県産コシヒカリの構成品種の第１染色体中に見出される第１標的ｍＰｉｎｇの挿入の有無を検出し得る２以上のプライマーから構成されるプライマーセットおよびそれを含むキット、ならびに新潟県産コシヒカリの構成品種の第１染色体中に見出される第１標的ｍＰｉｎｇの挿入の有無を検出し得る２以上のプライマーから構成されるプライマーセットを少なくとも用いる増幅反応により、第１標的ｍＰｉｎｇの挿入の有無を確認することを含む、コメの産地または品種の判別法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
新潟県産コシヒカリの構成品種の第１染色体中に見出される第１標的ｍＰｉｎｇの挿入の有無を検出し得る２以上のプライマーから構成されるプライマーセット。
【請求項２】
プライマーセットが、ＬＡＭＰ用プライマーセットである、請求項１記載のプライマーセット。
【請求項３】
プライマーセットが、配列番号５の塩基配列からなるプライマー、配列番号６の塩基配列からなるプライマー、配列番号７の塩基配列からなるプライマー、配列番号８の塩基配列からなるプライマー、配列番号９の塩基配列からなるプライマー、および配列番号１０の塩基配列からなるプライマーから構成される、請求項２記載のプライマーセット。
【請求項４】
以下（１）のプライマーセットと、以下（２）、（３）、（４）および（５）からなる群より選ばれる１以上のプライマーセットとを含むキット：
（１）新潟県産コシヒカリの構成品種の第１染色体中に見出される第１標的ｍＰｉｎｇの挿入の有無を検出し得る２以上のプライマーから構成される、第１のプライマーセット；ならびに
（２）新潟県産コシヒカリの構成品種の第８染色体中に見出されない第２標的ｍＰｉｎｇの挿入の有無を検出し得る２以上のプライマーから構成される、第２のプライマーセット；
（３）新潟県産コシヒカリの構成品種の第８染色体中に見出されない第３標的ｍＰｉｎｇの挿入の有無を検出し得る２以上のプライマーから構成される、第３のプライマーセット；
（４）コシヒカリ以外の品種を検出し得る２以上のプライマーから構成される、第４のプライマーセット；および
（５）コシヒカリを特異的に検出し得る２以上のプライマーから構成される、第５のプライマーセット。
【請求項５】
（１）第１のプライマーセットが、配列番号５の塩基配列からなるプライマー、配列番号６の塩基配列からなるプライマー、配列番号７の塩基配列からなるプライマー、配列番号８の塩基配列からなるプライマー、配列番号９の塩基配列からなるプライマー、および配列番号１０の塩基配列からなるプライマーから構成され、
（２）第２のプライマーセットが、配列番号１１の塩基配列からなるプライマー、配列番号１２の塩基配列からなるプライマー、配列番号１３の塩基配列からなるプライマー、配列番号１４の塩基配列からなるプライマー、配列番号１５の塩基配列からなるプライマー、および配列番号１６の塩基配列からなるプライマーから構成され、
（３）第３のプライマーセットが、配列番号１７の塩基配列からなるプライマー、配列番号１８の塩基配列からなるプライマー、配列番号１９の塩基配列からなるプライマー、配列番号２０の塩基配列からなるプライマー、配列番号２１の塩基配列からなるプライマー、および配列番号２２の塩基配列からなるプライマーから構成され、
（４）第４のプライマーセットが、配列番号２３の塩基配列からなるプライマー、配列番号２４の塩基配列からなるプライマー、配列番号２５の塩基配列からなるプライマー、配列番号２６の塩基配列からなるプライマー、配列番号２７の塩基配列からなるプライマー、および配列番号２８の塩基配列からなるプライマーから構成され、
（５）第５のプライマーセットが、配列番号２９の塩基配列からなるプライマー、配列番号３０の塩基配列からなるプライマー、配列番号３１の塩基配列からなるプライマー、配列番号３２の塩基配列からなるプライマー、配列番号３３の塩基配列からなるプライマー、および配列番号３４の塩基配列からなるプライマーから構成される、請求項４記載のキット。
【請求項６】
新潟県産コシヒカリの構成品種の第１染色体中に見出される第１標的ｍＰｉｎｇの挿入の有無を検出し得る２以上のプライマーから構成されるプライマーセットを少なくとも用いる増幅反応により、第１標的ｍＰｉｎｇの挿入の有無を確認することを含む、コメの産地または品種の判別法。
【請求項７】
以下（１）、（２）および（３）のプライマーセットを用いる増幅反応において、以下（Ｉ）、（ＩＩ）および（ＩＩＩ）の結果を確認することを特徴とする、新潟県産コシヒカリを判定する方法である、請求項６記載の判別法：
（１）新潟県産コシヒカリの構成品種の第１染色体中に見出される第１標的ｍＰｉｎｇの挿入の有無を検出し得る２以上のプライマーから構成される、第１のプライマーセット；
（２）新潟県産コシヒカリの構成品種の第８染色体中に見出されない第２標的ｍＰｉｎｇの挿入の有無を検出し得る２以上のプライマーから構成される、第２のプライマーセット；および
（３）新潟県産コシヒカリの構成品種の第８染色体中に見出されない第３標的ｍＰｉｎｇの挿入の有無を検出し得る２以上のプライマーから構成される、第３のプライマーセット；
（Ｉ）第１のプライマーセットを用いる増幅反応により、第１標的ｍＰｉｎｇが挿入されていることを確認すること；
（ＩＩ）第２のプライマーセットを用いる増幅反応により、第２標的ｍＰｉｎｇが挿入されていないことを確認すること；および
（ＩＩＩ）第３のプライマーセットを用いる増幅反応により、第３標的ｍＰｉｎｇが挿入されていないことを確認すること。
【請求項８】
以下（１）、（２）および（３）のプライマーセットを用いる増幅反応において、以下（ＩＶ）および（Ｖ）の結果を確認することを特徴とする、新潟県産コシヒカリに他県産のコシヒカリもしくは他品種のコメの混入があると判定する方法である、請求項６記載の判別法：
（１）新潟県産コシヒカリの構成品種の第１染色体中に見出される第１標的ｍＰｉｎｇの挿入の有無を検出し得る２以上のプライマーから構成される、第１のプライマーセット；
（２）新潟県産コシヒカリの構成品種の第８染色体中に見出されない第２標的ｍＰｉｎｇの挿入の有無を検出し得る２以上のプライマーから構成される、第２のプライマーセット；および
（３）新潟県産コシヒカリの構成品種の第８染色体中に見出されない第３標的ｍＰｉｎｇの挿入の有無を検出し得る２以上のプライマーから構成される、第３のプライマーセット；
（ＩＶ）第１のプライマーセットを用いる増幅反応により、第１標的ｍＰｉｎｇが挿入されていることを確認すること；および
（Ｖ）第２のプライマーセットおよび第３のプライマーセットの一方または双方を用いる増幅反応により、第２標的ｍＰｉｎｇまたは第３標的ｍＰｉｎｇが挿入されていることを確認すること。
【請求項９】
以下（１）、（４）および（５）のプライマーセットを用いる増幅反応において、以下（ＶＩ）、（ＶＩＩ）および（ＶＩＩＩ）の結果を確認することを特徴とする、コシヒカリ以外の品種のコメを判定する方法である、請求項６記載の判別法：
（１）新潟県産コシヒカリの構成品種の第１染色体中に見出される第１標的ｍＰｉｎｇの挿入の有無を検出し得る２以上のプライマーから構成される、第１のプライマーセット；
（４）コシヒカリ以外の品種のコメを検出し得る２以上のプライマーから構成される、第４のプライマーセット；および
（５）コシヒカリを特異的に検出し得る２以上のプライマーから構成される、第５のプライマーセット；
（ＶＩ）第１のプライマーセットを用いる増幅反応により、第１標的ｍＰｉｎｇが挿入されていないことを確認すること；
（ＶＩＩ）第４のプライマーセットを用いる増幅反応により、コシヒカリ以外の品種のコメであることを確認すること；および
（ＶＩＩＩ）第５のプライマーセットを用いる増幅反応により、コシヒカリでないことを確認すること。
【請求項１０】
以下（１）、（４）および（５）のプライマーセットを用いる増幅反応において、以下（ＩＸ）、（Ｘ）および（ＸＩ）の結果を確認することを特徴とする、新潟県産以外の県産のコシヒカリを判定する方法である、請求項６記載の判別法：
（１）新潟県産コシヒカリの構成品種の第１染色体中に見出される第１標的ｍＰｉｎｇの挿入の有無を検出し得る２以上のプライマーから構成される、第１のプライマーセット；
（４）コシヒカリ以外の品種のコメを検出し得る２以上のプライマーから構成される、第４のプライマーセット；および
（５）コシヒカリを特異的に検出し得る２以上のプライマーから構成される、第５のプライマーセット；
（ＩＸ）第１のプライマーセットを用いる増幅反応により、第１標的ｍＰｉｎｇが挿入されていないことを確認すること；
（Ｘ）第４のプライマーセットを用いる増幅反応により、コシヒカリ以外の品種のコメでないことを確認すること；および
（ＸＩ）第５のプライマーセットを用いる増幅反応により、コシヒカリであることを確認すること。
【請求項１１】
以下（１）、（４）および（５）のプライマーセットを用いる増幅反応において、以下（ＸＩＩ）、（ＸＩＩＩ）および（ＸＩＶ）の結果を確認することを特徴とする、コシヒカリ以外の品種のコメおよび新潟県産以外の県産のコシヒカリの混合物であることを判定する方法である、請求項６記載の判別法：
（１）新潟県産コシヒカリの構成品種の第１染色体中に見出される第１標的ｍＰｉｎｇの挿入の有無を検出し得る２以上のプライマーから構成される、第１のプライマーセット；
（４）コシヒカリ以外の品種のコメを検出し得る２以上のプライマーから構成される、第４のプライマーセット；および
（５）コシヒカリを特異的に検出し得る２以上のプライマーから構成される、第５のプライマーセット；
（ＸＩＩ）第１のプライマーセットを用いる増幅反応により、第１標的ｍＰｉｎｇが挿入されていないことを確認すること；
（ＸＩＩＩ）第４のプライマーセットを用いる増幅反応により、コシヒカリ以外の品種のコメであることを確認すること；および
（ＸＩＶ）第５のプライマーセットを用いる増幅反応により、コシヒカリであることを確認すること。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新潟県産コシヒカリの判定法およびそれに用いられるプライマーセットなどに関する。
【背景技術】
【０００２】
新潟県産コシヒカリは、他県産コシヒカリや他の主要品種に比べ約２割高い価格で取引されるため、産地偽装・品種偽装が後を絶たない。そのため、新潟県産コシヒカリを他県産・他品種のコメから簡易に識別するための手法が求められている。
【０００３】
新潟県産コシヒカリの識別方法としては、新潟県産コシヒカリが病気に強い「コシヒカリ新潟ＢＬ」に切り替えられたことを利用した識別法（特許文献１）、およびコシヒカリの産地間の違いを利用した識別法（特許文献２）が報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００４−１４１０７９号公報
【特許文献２】特開２０１１−１９３７９９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、上述した従来技術については、（１）新潟県産か否かを判定する前にコシヒカリであることを判定しておく必要があること、（２）他品種や他県産コシヒカリの混入が有った場合に正しく判定できないこと、（３）ＰＣＲ法を用いるためＤＮＡ増幅とその確認に比較的時間を要すること、などの課題がある。したがって、新潟県産コシヒカリを簡便かつ特異的に判定できる方法の開発が求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、鋭意検討した結果、新潟県産コシヒカリの構成品種の第１染色体中の特定部位をマーカーとして利用することにより、新潟県産コシヒカリを簡便かつ特異的に判定できる方法を開発することに成功した。本発明者らはまた、当該方法に用いられるプライマーセットなどを併せて開発することに成功し、もって本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
〔１〕新潟県産コシヒカリの構成品種の第１染色体中に見出される第１標的ｍＰｉｎｇの挿入の有無を検出し得る２以上のプライマーから構成されるプライマーセット。
〔２〕プライマーセットが、ＬＡＭＰ用プライマーセットである、〔１〕のプライマーセット。
〔３〕プライマーセットが、配列番号５の塩基配列からなるプライマー、配列番号６の塩基配列からなるプライマー、配列番号７の塩基配列からなるプライマー、配列番号８の塩基配列からなるプライマー、配列番号９の塩基配列からなるプライマー、および配列番号１０の塩基配列からなるプライマーから構成される、〔２〕のプライマーセット。
〔４〕以下（１）のプライマーセットと、以下（２）、（３）、（４）および（５）からなる群より選ばれる１以上のプライマーセットとを含むキット：
（１）新潟県産コシヒカリの構成品種の第１染色体中に見出される第１標的ｍＰｉｎｇの挿入の有無を検出し得る２以上のプライマーから構成される、第１のプライマーセット；ならびに
（２）新潟県産コシヒカリの構成品種の第８染色体中に見出されない第２標的ｍＰｉｎｇの挿入の有無を検出し得る２以上のプライマーから構成される、第２のプライマーセット；
（３）新潟県産コシヒカリの構成品種の第８染色体中に見出されない第３標的ｍＰｉｎｇの挿入の有無を検出し得る２以上のプライマーから構成される、第３のプライマーセット；
（４）コシヒカリ以外の品種を検出し得る２以上のプライマーから構成される、第４のプライマーセット；および
（５）コシヒカリを特異的に検出し得る２以上のプライマーから構成される、第５のプライマーセット。
〔５〕（１）第１のプライマーセットが、配列番号５の塩基配列からなるプライマー、配列番号６の塩基配列からなるプライマー、配列番号７の塩基配列からなるプライマー、配列番号８の塩基配列からなるプライマー、配列番号９の塩基配列からなるプライマー、および配列番号１０の塩基配列からなるプライマーから構成され、
（２）第２のプライマーセットが、配列番号１１の塩基配列からなるプライマー、配列番号１２の塩基配列からなるプライマー、配列番号１３の塩基配列からなるプライマー、配列番号１４の塩基配列からなるプライマー、配列番号１５の塩基配列からなるプライマー、および配列番号１６の塩基配列からなるプライマーから構成され、
（３）第３のプライマーセットが、配列番号１７の塩基配列からなるプライマー、配列番号１８の塩基配列からなるプライマー、配列番号１９の塩基配列からなるプライマー、配列番号２０の塩基配列からなるプライマー、配列番号２１の塩基配列からなるプライマー、および配列番号２２の塩基配列からなるプライマーから構成され、
（４）第４のプライマーセットが、配列番号２３の塩基配列からなるプライマー、配列番号２４の塩基配列からなるプライマー、配列番号２５の塩基配列からなるプライマー、配列番号２６の塩基配列からなるプライマー、配列番号２７の塩基配列からなるプライマー、および配列番号２８の塩基配列からなるプライマーから構成され、
（５）第５のプライマーセットが、配列番号２９の塩基配列からなるプライマー、配列番号３０の塩基配列からなるプライマー、配列番号３１の塩基配列からなるプライマー、配列番号３２の塩基配列からなるプライマー、配列番号３３の塩基配列からなるプライマー、および配列番号３４の塩基配列からなるプライマーから構成される、〔４〕のキット。
〔６〕新潟県産コシヒカリの構成品種の第１染色体中に見出される第１標的ｍＰｉｎｇの挿入の有無を検出し得る２以上のプライマーから構成されるプライマーセットを少なくとも用いる増幅反応により、第１標的ｍＰｉｎｇの挿入の有無を確認することを含む、コメの産地または品種の判別法。
〔７〕以下（１）、（２）および（３）のプライマーセットを用いる増幅反応において、以下（Ｉ）、（ＩＩ）および（ＩＩＩ）の結果を確認することを特徴とする、新潟県産コシヒカリを判定する方法である、〔６〕の判別法：
（１）新潟県産コシヒカリの構成品種の第１染色体中に見出される第１標的ｍＰｉｎｇの挿入の有無を検出し得る２以上のプライマーから構成される、第１のプライマーセット；  
（２）新潟県産コシヒカリの構成品種の第８染色体中に見出されない第２標的ｍＰｉｎｇの挿入の有無を検出し得る２以上のプライマーから構成される、第２のプライマーセット；および
（３）新潟県産コシヒカリの構成品種の第８染色体中に見出されない第３標的ｍＰｉｎｇの挿入の有無を検出し得る２以上のプライマーから構成される、第３のプライマーセット；
（Ｉ）第１のプライマーセットを用いる増幅反応により、第１標的ｍＰｉｎｇが挿入されていることを確認すること；
（ＩＩ）第２のプライマーセットを用いる増幅反応により、第２標的ｍＰｉｎｇが挿入されていないことを確認すること；および
（ＩＩＩ）第３のプライマーセットを用いる増幅反応により、第３標的ｍＰｉｎｇが挿入されていないことを確認すること。
〔８〕以下（１）、（２）および（３）のプライマーセットを用いる増幅反応において、以下（ＩＶ）および（Ｖ）の結果を確認することを特徴とする、新潟県産コシヒカリに他県産のコシヒカリもしくは他品種のコメの混入があると判定する方法である、〔６〕の判別法：
（１）新潟県産コシヒカリの構成品種の第１染色体中に見出される第１標的ｍＰｉｎｇの挿入の有無を検出し得る２以上のプライマーから構成される、第１のプライマーセット；
（２）新潟県産コシヒカリの構成品種の第８染色体中に見出されない第２標的ｍＰｉｎｇの挿入の有無を検出し得る２以上のプライマーから構成される、第２のプライマーセット；および
（３）新潟県産コシヒカリの構成品種の第８染色体中に見出されない第３標的ｍＰｉｎｇの挿入の有無を検出し得る２以上のプライマーから構成される、第３のプライマーセット；
（ＩＶ）第１のプライマーセットを用いる増幅反応により、第１標的ｍＰｉｎｇが挿入されていることを確認すること；および
（Ｖ）第２のプライマーセットおよび第３のプライマーセットの一方または双方を用いる増幅反応により、第２標的ｍＰｉｎｇまたは第３標的ｍＰｉｎｇが挿入されていることを確認すること。
〔９〕以下（１）、（４）および（５）のプライマーセットを用いる増幅反応において、以下（ＶＩ）、（ＶＩＩ）および（ＶＩＩＩ）の結果を確認することを特徴とする、コシヒカリ以外の品種のコメを判定する方法である、〔６〕の判別法：
（１）新潟県産コシヒカリの構成品種の第１染色体中に見出される第１標的ｍＰｉｎｇの挿入の有無を検出し得る２以上のプライマーから構成される、第１のプライマーセット；
（４）コシヒカリ以外の品種のコメを検出し得る２以上のプライマーから構成される、第４のプライマーセット；および
（５）コシヒカリを特異的に検出し得る２以上のプライマーから構成される、第５のプライマーセット；
（ＶＩ）第１のプライマーセットを用いる増幅反応により、第１標的ｍＰｉｎｇが挿入されていないことを確認すること；
（ＶＩＩ）第４のプライマーセットを用いる増幅反応により、コシヒカリ以外の品種のコメであることを確認すること；および
（ＶＩＩＩ）第５のプライマーセットを用いる増幅反応により、コシヒカリでないことを確認すること。
〔１０〕以下（１）、（４）および（５）のプライマーセットを用いる増幅反応において、以下（ＩＸ）、（Ｘ）および（ＸＩ）の結果を確認することを特徴とする、新潟県産以外の県産のコシヒカリを判定する方法である、〔６〕の判別法：
（１）新潟県産コシヒカリの構成品種の第１染色体中に見出される第１標的ｍＰｉｎｇの挿入の有無を検出し得る２以上のプライマーから構成される、第１のプライマーセット；
（４）コシヒカリ以外の品種のコメを検出し得る２以上のプライマーから構成される、第４のプライマーセット；および
（５）コシヒカリを特異的に検出し得る２以上のプライマーから構成される、第５のプライマーセット；
（ＩＸ）第１のプライマーセットを用いる増幅反応により、第１標的ｍＰｉｎｇが挿入されていないことを確認すること；
（Ｘ）第４のプライマーセットを用いる増幅反応により、コシヒカリ以外の品種のコメでないことを確認すること；および
（ＸＩ）第５のプライマーセットを用いる増幅反応により、コシヒカリであることを確認すること。
〔１１〕以下（１）、（４）および（５）のプライマーセットを用いる増幅反応において、以下（ＸＩＩ）、（ＸＩＩＩ）および（ＸＩＶ）の結果を確認することを特徴とする、コシヒカリ以外の品種のコメおよび新潟県産以外の県産のコシヒカリの混合物であることを判定する方法である、〔６〕の判別法：
（１）新潟県産コシヒカリの構成品種の第１染色体中に見出される第１標的ｍＰｉｎｇの挿入の有無を検出し得る２以上のプライマーから構成される、第１のプライマーセット；
（４）コシヒカリ以外の品種のコメを検出し得る２以上のプライマーから構成される、第４のプライマーセット；および
（５）コシヒカリを特異的に検出し得る２以上のプライマーから構成される、第５のプライマーセット；
（ＸＩＩ）第１のプライマーセットを用いる増幅反応により、第１標的ｍＰｉｎｇが挿入されていないことを確認すること；
（ＸＩＩＩ）第４のプライマーセットを用いる増幅反応により、コシヒカリ以外の品種のコメであることを確認すること；および
（ＸＩＶ）第５のプライマーセットを用いる増幅反応により、コシヒカリであることを確認すること。
【発明の効果】
【０００８】
本発明では、特定のプライマーセットによる増幅反応を行うだけで、新潟県産コシヒカリの判定、および他県産・他品種の混入の有無を検出することが可能である。また、ＬＡＭＰ法を用いることで１時間以内に判定を行うことが可能である。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、新潟県産コシヒカリを構成するいもち病抵抗性品種（Ｂｌａｓｔ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  Ｌｉｎｅ：ＢＬ）の第１染色体中に挿入されている第１標的ｍＰｉｎｇについて、第１標的ｍＰｉｎｇを欠落している日本晴における対応部位周辺の塩基配列（配列番号１）を示す図である。配列番号１の塩基配列は、Ｏｓ−Ｎｉｐｐｏｎｂａｒｅ−Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ−ＩＲＧＳＰ−１．０（ＩＲＧＳＰ−１．０）から入手した第１染色体の第２８４６１７８９〜２８４６３７８５番目のヌクレオチド残基からなる。下線部は、ｍＰｉｎｇの挿入が可能な標的部位（ＴＡＡ）（日本晴において第１標的ｍＰｉｎｇが挿入されていると仮定した場合に、挿入され得る部位）を示す。
【図２】図２は、新潟県産コシヒカリの構成品種の第１染色体中の第１標的ｍＰｉｎｇ挿入部位（配列番号２の塩基配列中、下線を付した１００１〜１４３０番目のヌクレオチド残基からなる部位）およびその隣接部位（それぞれ１ｋｂ）を示す図である。
【図３】図３は、新潟県産コシヒカリの構成品種の第８染色体中に見出されない第２標的ｍＰｉｎｇに関連して、日本晴における対応部位（第２標的ｍＰｉｎｇおよびその隣接部位、配列番号３）を示す図である。下線部は、第２標的ｍＰｉｎｇの塩基配列を示す。
【図４】図４は、新潟県産コシヒカリの構成品種の第８染色体中に見出されない第３標的ｍＰｉｎｇに関連して、日本晴における対応部位（第３標的ｍＰｉｎｇおよびその隣接部位、配列番号４）を示す図である。下線部は、第３標的ｍＰｉｎｇの塩基配列を示す。
【図５】図５は、ＬＡＭＰ用プライマーセットの設計に必要な各種領域の概要を示す図である。
【図６】図６は、ｍＰｉｎｇの挿入の有無を検出するための２以上のプライマーの概要を示す図である。
【図７】図７は、ＬＡＭＰ反応液の蛍光発色を利用した判定例を示す図である。（Ａ）新潟県産コシヒカリ、（Ｂ）栃木県産コシヒカリ、（Ｃ）宮城県産ひとめぼれ、（Ｄ）新潟県産コシヒカリと栃木県産コシヒカリの混合試料、（Ｅ）新潟県産コシヒカリと宮城県産ひとめぼれの混合試料、（Ｆ）栃木県産コシヒカリと宮城県産ひとめぼれの混合試料。１：ＮＫ１プライマーセット、２：ＮＫ２プライマーセット、３：ＮＫ３プライマーセット、４：ＮＫ４プライマーセット、５：ＮＫ５プライマーセット。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明は、コメの産地または品種の判別法を提供する。本発明の方法は、新潟県産コシヒカリの構成品種の第１染色体中に見出される第１標的ｍＰｉｎｇの挿入の有無を検出し得る２以上のプライマーから構成されるプライマーセットを少なくとも用いる増幅反応により、第１標的ｍＰｉｎｇの挿入の有無を確認することを含む。
【００１１】
ｍＰｉｎｇは、数あるトランスポゾンの一種である。ｍＰｉｎｇは、４３０ｂｐのポリヌクレオチドであり、ゲノム中の挿入部位のＴＡＡ若しくはＴＴＡを複製してその挿入部位の両端に持つため、挿入がある場合には（４３０ｂｐ＋３）ｂｐ長くなる（例えば、以下を参照）。
【００１２】
【化１】
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【００１３】
新潟県産コシヒカリは、複数のいもち病抵抗性品種（Ｂｌａｓｔ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  Ｌｉｎｅ：ＢＬ）から構成される。本発明によれば、このような品種に特異的なＤＮＡマーカーを利用することにより、ＢＬに切り替わった２００５年産以降（例、２００５年産〜２０１２年産の全て）の新潟県産コシヒカリを特異的に検出できる。
【００１４】
増幅反応としては、２以上のプライマーを用いたＤＮＡの増幅による検査が可能である限り特に限定されないが、例えば、等温条件下での増幅反応、非等温条件下での増幅反応が挙げられる。等温条件下での増幅反応としては、例えば、ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＩＣＡＮ（Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｎｄ  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ｐｒｉｍｅｒ−ｉｎｉｔｉａｔｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ）法、ＨＤＡ（Ｈｅｌｉｃａｓｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＲＰＡ（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法が挙げられる。非等温条件下での増幅反応としては、例えば、ＰＣＲ法が挙げられる。本発明では、増幅反応としては、等温条件下での増幅反応が好ましく、ＬＡＭＰ法がより好ましい。
【００１５】
本発明の方法では、増幅反応に供されるサンプルは、コメまたはその加工品由来のゲノムＤＮＡを含む、または含む可能性があるサンプルである。コメは、玄米または精米のいずれであってもよい。コメはまた、国産米または外国産米のいずれであってもよい。コメの加工品としては、例えば、炊飯米、加工米飯、みそ、米菓、米穀粉、包装もち、ビーフン、玄米茶、米粉パン、米粉麺、日本酒、ビールが挙げられる。
【００１６】
本発明の方法で用いられるプライマーセットとしては、例えば、以下が挙げられる：
（１）新潟県産コシヒカリの構成品種の第１染色体中に見出される第１標的ｍＰｉｎｇの挿入の有無を検出し得る２以上のプライマーから構成されるプライマーセット；ならびに
（２）新潟県産コシヒカリの構成品種の第８染色体中に見出されない第２標的ｍＰｉｎｇの挿入の有無を検出し得る２以上のプライマーから構成されるプライマーセット；
（３）新潟県産コシヒカリの構成品種の第８染色体中に見出されない第３標的ｍＰｉｎｇの挿入の有無を検出し得る２以上のプライマーから構成されるプライマーセット；
（４）コシヒカリ以外の品種を検出し得る２以上のプライマーから構成されるプライマーセット；および
（５）コシヒカリを特異的に検出し得る２以上のプライマーから構成されるプライマーセット。
【００１７】
各プライマーセットに含まれるプライマーの個数は、採用される増幅反応により変動するが、例えば、２〜６個である。
【００１８】
プライマーを構成するヌクレオチド残基（標的部位にアニーリングする相補部分のヌクレオチド残基）の数は、プライマーが標的部位にアニーリングして、目的産物を特異的に増幅できる限り特に限定されず、例えば、１５個以上、１６個以上、１７個以上、１８個以上、または２０個以上であってもよい。また、プライマーを構成するヌクレオチド残基の数は、例えば、５０個以下、４０個以下、または３０個以下であってもよい。
【００１９】
プライマーは、増幅産物の検出を容易に行うため、蛍光物質等の物質で標識されていてもよい。このような蛍光物質としては、例えば、６−ＦＡＭ、ＶＩＣ、ＮＥＤ、ＰＥＴが挙げられる。勿論、プライマーは、必ずしもこのような物質で標識される必要はない。例えば、ゲル電気泳動で増幅産物のサイズの差異を確認してもよい。また、ＬＡＭＰ法による検出では、増幅反応の副産物であるピロリン酸マグネシウムの白濁を目視で確認することにより、増幅の有無を確認できる。このような場合、蛍光物質等の物質によるプライマーの標識は不要である。
【００２０】
好ましい実施形態では、プライマーセットは、ＬＡＭＰ用プライマーセットである。ＬＡＭＰ用プライマーセットは、以下ｉ）〜ｉｖ）から構成される（図５も参照のこと）。
ｉ）ＦＩＰ（Ｆｏｒｗａｒｄ  Ｉｎｎｅｒ  Ｐｒｉｍｅｒ）：標的ＤＮＡのＦ２ｃ領域と相補的なＦ２領域を３’末端側に持ち、５’末端側に標的ＤＮＡのＦ１ｃ領域と同じ配列を持つように設計される；
ｉｉ）Ｆ３プライマー：標的ＤＮＡのＦ３ｃ領域と相補的なＦ３領域を持つように設計される；
ｉｉｉ）ＢＩＰ（Ｂａｃｋｗａｒｄ  Ｉｎｎｅｒ  Ｐｒｉｍｅｒ）：標的ＤＮＡのＢ２ｃ領域と相補的なＢ２領域を３’末端側に持ち、５’末端側に標的ＤＮＡのＢ１ｃ領域と同じ配列を持つように設計される；
ｉｖ）Ｂ３プライマー：標的ＤＮＡのＢ３ｃ領域と相補的なＢ３領域を持つように設計される。
【００２１】
好ましくは、ＬＡＭＰ用プライマーセットは、以下のループプライマーをさらに含んでいてもよい（図５も参照のこと）。
ｖ）ＬＦ（Ｌｏｏｐ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｆ）：Ｆ１領域とＦ２領域との間の部分に相補的な配列を持つように設計される；
ｖｉ）ＬＢ（Ｌｏｏｐ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｂ）：Ｂ１領域とＢ２領域との間の部分に相補的な配列を持つように設計される；
標的ＤＮＡと、Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３、Ｆ１ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ３ｃ、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ１ｃ、Ｂ２ｃ、Ｂ３ｃ領域との関係、およびＬＡＭＰ法の詳細については、例えば、栄研化学のホームページで説明されているＬＡＭＰ法の原理を参照することにより確認することができる。
【００２２】
以下、本発明の方法で好適に用いられる特定のプライマーセットについて詳述する。
【００２３】
（１）新潟県産コシヒカリの構成品種の第１染色体中に見出される第１標的ｍＰｉｎｇの挿入の有無を検出し得る２以上のプライマーから構成されるプライマーセット
新潟県産コシヒカリの構成品種の第１染色体中に挿入されている第１標的ｍＰｉｎｇは、日本米の基準品種である日本晴の第１染色体中の対応部位には挿入されていない。
このような第１標的ｍＰｉｎｇについて、日本米の基準品種である日本晴（全ゲノム配列が解読され公開済）における対応部位周辺としては、Ｏｓ−Ｎｉｐｐｏｎｂａｒｅ−Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ−ＩＲＧＳＰ−１．０（ＩＲＧＳＰ−１．０）から入手（ｈｔｔｐ：／／ｒａｐｄｂ．ｄｎａ．ａｆｆｒｃ．ｇｏ．ｊｐ）した第１染色体の第２８４６１７８９〜２８４６３７８５番目のヌクレオチド残基からなる塩基配列（配列番号１）を挙げることができる（図１）。新潟県産コシヒカリの構成品種の第１染色体中に挿入されている第１標的ｍＰｉｎｇの存在位置は、日本晴由来の配列番号１の塩基配列において、１０００番目のヌクレオチド残基と１００１番目のヌクレオチド残基との間（第１染色体の２８４６２７８８番目のヌクレオチド残基と２８４６２７８９番目のヌクレオチド残基との間）に対応する（図１）。
一方、新潟県産コシヒカリの構成品種の第１染色体中に挿入されている第１標的ｍＰｉｎｇは、配列番号２の塩基配列を有する（図２）。配列番号２の塩基配列において、１００１〜１４３０番目のヌクレオチド残基からなる部位がｍＰｉｎｇ挿入領域であり、配列番号２の塩基配列における１〜１０００番目および１４３１〜２４３０番目のヌクレオチド残基からなる領域は、それぞれ、配列番号１の塩基配列における１〜１０００番目および１００１〜２０００番目のヌクレオチド残基からなる領域と同一である。
【００２４】
配列番号２の塩基配列において、第１標的ｍＰｉｎｇの挿入領域は、１００１〜１４３０番目のヌクレオチド残基からなる領域である（図２）。したがって、第１標的ｍＰｉｎｇの挿入の有無を検出するための２以上のプライマーとして、本領域の上流部位（センス鎖またはアンチセンス鎖）に対応する塩基配列を有する第１のプライマー、および本領域の下流部位（アンチセンス鎖またはセンス鎖）に対応する塩基配列を有する第２のプライマーの組合せ（ｍＰｉｎｇの挿入の有無に応じてサイズの異なる増幅産物を得ることにより、ｍＰｉｎｇの挿入の有無を検出し得るプライマーの組合せ）、ならびに本領域の上流部位（センス鎖またはアンチセンス鎖）、または本領域の下流部位（アンチセンス鎖またはセンス鎖）に対応する塩基配列を有する第１のプライマー、および本領域（センス鎖またはアンチセンス鎖）に対応する塩基配列を有する第２のプライマーの組合せ（増幅の有無によりｍＰｉｎｇの挿入の有無を検出し得るプライマーの組合せ）を用いることができる（図６を参照）。
【００２５】
本発明では、好ましくは、増幅の有無によりｍＰｉｎｇの挿入の有無を検出し得るプライマーの組合せを用いてもよい。新潟県産コシヒカリの構成品種が上記部位にｍＰｉｎｇの挿入を有することは知られていない。また、他の品種のコメについても、上記部位にｍＰｉｎｇを有するゲノム塩基配列の報告はない。したがって、増幅の有無によりｍＰｉｎｇの挿入の有無を検出し得るプライマーの上記組合せは、新潟県産コシヒカリの構成品種が上記部位にｍＰｉｎｇの挿入を有することを本願で始めて解明したことにより、作製する動機付けが始めて生じるが、このような認識が無い場合、このような組合せのプライマーを作製する動機付けはない。
【００２６】
具体的には、第１標的ｍＰｉｎｇに対するプライマーセットとしては、以下のプライマー対から構成されるプライマーの組合せ（例、ＰＣＲ用プライマー）、およびそのようなプライマーの組合せを含む３以上のプライマーセット（例、少なくとも４つのプライマーを利用するＬＡＭＰ用プライマーセット）が挙げられる：
１ａ）配列番号１の塩基配列における１〜１０００番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第１のプライマー、および配列番号１の塩基配列における１４３１〜２４３０番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第２のプライマーの組合せ；
１ｂ）配列番号１の塩基配列における１〜１０００番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第１のプライマー、および配列番号１の塩基配列における１４３１〜２４３０番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第２のプライマーの組合せ；
１ｃ）配列番号１の塩基配列における１〜１０００番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第１のプライマー、および配列番号１の塩基配列における１００１〜１４３０番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第２のプライマーの組合せ；
１ｄ）配列番号１の塩基配列における１〜１０００番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第１のプライマー、および配列番号１の塩基配列における１００１〜１４３０番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第２のプライマーの組合せ；
１ｅ）配列番号１の塩基配列における１００１〜１４３０番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第１のプライマー、および配列番号１の塩基配列における１４３１〜２４３０番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第２のプライマーの組合せ；
１ｆ）配列番号１の塩基配列における１００１〜１４３０番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第１のプライマー、および配列番号１の塩基配列における１４３１〜２４３０番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第２のプライマーの組合せ。
【００２７】
好ましくは、第１標的ｍＰｉｎｇに対するプライマーセットは、ＬＡＭＰ用プライマーセットである。より具体的には、このようなＬＡＭＰ用プライマーセットは、以下の２つのプライマーを少なくとも含む、４つのプライマーの組合せ（ＦＩＰ、Ｆ３、ＢＩＰ、Ｂ３）から構成される：
１ａ’）配列番号１の塩基配列における１〜１０００番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を、ＦＩＰ中のＦ１ｃ領域もしくはＦ２領域として、またはＦ３領域として（好ましくは、ＦＩＰ中のＦ２領域として）有する第１のプライマー、および配列番号１の塩基配列における１４３１〜２４３０番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を、ＢＩＰ中のＢ１ｃ領域もしくはＢ２領域として、またはＢ３領域として（好ましくは、ＢＩＰ中のＢ２領域として）有する第２のプライマーを含む、４つのプライマーの組合せ；
１ｂ’）配列番号１の塩基配列における１〜１０００番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を、ＦＩＰ中のＦ１ｃ領域もしくはＦ２領域として、またはＦ３領域として（好ましくは、ＦＩＰ中のＦ２領域として）有する第１のプライマー、および配列番号１の塩基配列における１４３１〜２４３０番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を、ＢＩＰ中のＢ１ｃ領域もしくはＢ２領域として、またはＢ３領域として（好ましくは、ＢＩＰ中のＢ２領域として）有する第２のプライマーを含む、４つのプライマーの組合せ；
１ｃ’）配列番号１の塩基配列における１〜１０００番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を、ＦＩＰ中のＦ１ｃ領域もしくはＦ２領域として、またはＦ３領域として（好ましくは、ＦＩＰ中のＦ２領域として）有する第１のプライマー、および配列番号１の塩基配列における１００１〜１４３０番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を、ＢＩＰ中のＢ１ｃ領域もしくはＢ２領域として、またはＢ３領域として（好ましくは、ＢＩＰ中のＢ２領域として）有する第２のプライマーを含む、４つのプライマーの組合せ；
１ｄ’）配列番号１の塩基配列における１〜１０００番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を、ＦＩＰ中のＦ１ｃ領域もしくはＦ２領域として、またはＦ３領域として（好ましくは、ＦＩＰ中のＦ２領域として）有する第１のプライマー、および配列番号１の塩基配列における１００１〜１４３０番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を、ＢＩＰ中のＢ１ｃ領域もしくはＢ２領域として、またはＢ３領域として（好ましくは、ＢＩＰ中のＢ２領域として）有する第２のプライマーを含む、４つのプライマーの組合せ；
１ｅ’）配列番号１の塩基配列における１００１〜１４３０番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を、ＦＩＰ中のＦ１ｃ領域もしくはＦ２領域として、またはＦ３領域として（好ましくは、ＦＩＰ中のＦ２領域として）有する第１のプライマー、および配列番号１の塩基配列における１４３１〜２４３０番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を、ＢＩＰ中のＢ１ｃ領域もしくはＢ２領域として、またはＢ３領域として（好ましくは、ＢＩＰ中のＢ２領域として）有する第２のプライマーを含む、４つのプライマーの組合せ；
１ｆ’）配列番号１の塩基配列における１００１〜１４３０番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を、ＦＩＰ中のＦ１ｃ領域もしくはＦ２領域として、またはＦ３領域として（好ましくは、ＦＩＰ中のＦ２領域として）有する第１のプライマー、および配列番号１の塩基配列における１４３１〜２４３０番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を、ＢＩＰ中のＢ１ｃ領域もしくはＢ２領域として、またはＢ３領域として（好ましくは、ＢＩＰ中のＢ２領域として）有する第２のプライマーを含む、４つのプライマーの組合せ。
なお、上記１ａ’）〜１ｆ’）の４つのプライマーの組合せに加えて、２つのループプライマー（ＬＦおよびＬＢ）がさらに併用されてもよい。
【００２８】
より好ましくは、第１標的ｍＰｉｎｇに対するＬＡＭＰ用プライマーセットは、配列番号５の塩基配列からなるプライマー、配列番号６の塩基配列からなるプライマー、配列番号７の塩基配列からなるプライマー、および配列番号８の塩基配列からなるプライマーを含む。
最も好ましくは、第１標的ｍＰｉｎｇに対するＬＡＭＰ用プライマーセットはさらに、ループプライマーに対応する、配列番号９の塩基配列からなるプライマー、および配列番号１０の塩基配列を含む。したがって、本発明では、実施例に記載したＮＫ１プライマーセットが好適に用いられる。
【００２９】
（２）新潟県産コシヒカリの構成品種の第８染色体中に見出されない第２標的ｍＰｉｎｇの挿入の有無を検出し得る２以上のプライマーから構成されるプライマーセット
新潟県産コシヒカリの構成品種の第８染色体中に見出されない第２標的ｍＰｉｎｇとは、新潟県産コシヒカリの構成品種の第８染色体中には見出されないものの、日本米の基準品種である日本晴を基準とした場合に、第８染色体の５’末端から数えて２番目に見出されるｍＰｉｎｇをいう。より具体的に説明すると、日本晴におけるこのような第２標的ｍＰｉｎｇおよびその隣接部位を含む領域は、上記データベースＩＲＧＳＰ−１．０から入手できる日本晴の第８染色体の第４７１１９７０〜４７１４３９９番目のヌクレオチド残基からなる塩基配列（配列番号３）である（図３）。図３に示される配列番号３の塩基配列は、日本晴における第２標的ｍＰｉｎｇ（配列番号３の塩基配列中、下線を付した１００１〜１４３０番目のヌクレオチド残基からなる部位）およびその隣接部位（それぞれ１ｋｂ）を示す。
【００３０】
配列番号３の塩基配列において、第２標的ｍＰｉｎｇの挿入領域は、１００１〜１４３０番目のヌクレオチド残基からなる領域である（図３）。したがって、第２標的ｍＰｉｎｇの挿入の有無を検出するための２以上のプライマーとして、本領域の上流部位（センス鎖またはアンチセンス鎖）に対応する塩基配列を有する第１のプライマー、および本領域の下流部位（アンチセンス鎖またはセンス鎖）に対応する塩基配列を有する第２のプライマーの組合せ（ｍＰｉｎｇの挿入の有無に応じてサイズの異なる増幅産物を得ることにより、ｍＰｉｎｇの挿入の有無を検出し得るプライマーの組合せ）、ならびに本領域の上流部位（センス鎖またはアンチセンス鎖）、または本領域の下流部位（アンチセンス鎖またはセンス鎖）に対応する塩基配列を有する第１のプライマー、および本領域（センス鎖またはアンチセンス鎖）に対応する塩基配列を有する第２のプライマーの組合せ（増幅の有無によりｍＰｉｎｇの挿入の有無を検出し得るプライマーの組合せ）を用いることができる（図６を参照）。
【００３１】
具体的には、第２標的ｍＰｉｎｇに対するプライマーセットとしては、以下のプライマー対から構成されるプライマーの組合せ（例、ＰＣＲ用プライマー）、およびそのようなプライマーの組合せを含む３以上のプライマーセット（例、少なくとも４つのプライマーを利用するＬＡＭＰ用プライマーセット）が挙げられる：
２ａ）配列番号３の塩基配列における１〜１０００番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第１のプライマー、および配列番号３の塩基配列における１４３１〜２４３０番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第２のプライマーの組合せ；
２ｂ）配列番号３の塩基配列における１〜１０００番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第１のプライマー、および配列番号３の塩基配列における１４３１〜２４３０番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第２のプライマーの組合せ；
２ｃ）配列番号３の塩基配列における１〜１０００番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第１のプライマー、および配列番号３の塩基配列における１００１〜１４３０番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第２のプライマーの組合せ；
２ｄ）配列番号３の塩基配列における１〜１０００番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第１のプライマー、および配列番号３の塩基配列における１００１〜１４３０番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第２のプライマーの組合せ；
２ｅ）配列番号３の塩基配列における１００１〜１４３０番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第１のプライマー、および配列番号３の塩基配列における１４３１〜２４３０番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第２のプライマーの組合せ；
２ｆ）配列番号３の塩基配列における１００１〜１４３０番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第１のプライマー、および配列番号３の塩基配列における１４３１〜２４３０番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第２のプライマーの組合せ。
【００３２】
好ましくは、第２標的ｍＰｉｎｇに対するプライマーセットは、ＬＡＭＰ用プライマーセットである。より具体的には、このようなＬＡＭＰ用プライマーセットは、以下の２つのプライマーを少なくとも含む、４つのプライマーの組合せ（ＦＩＰ、Ｆ３、ＢＩＰ、Ｂ３）から構成される：
２ａ’）配列番号３の塩基配列における１〜１０００番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を、ＦＩＰ中のＦ１ｃ領域もしくはＦ２領域として、またはＦ３領域として（好ましくは、ＦＩＰ中のＦ２領域として）有する第１のプライマー、および配列番号３の塩基配列における１４３１〜２４３０番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を、ＢＩＰ中のＢ１ｃ領域もしくはＢ２領域として、またはＢ３領域として（好ましくは、ＢＩＰ中のＢ２領域として）有する第２のプライマーを含む、４つのプライマーの組合せ；
２ｂ’）配列番号３の塩基配列における１〜１０００番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を、ＦＩＰ中のＦ１ｃ領域もしくはＦ２領域として、またはＦ３領域として（好ましくは、ＦＩＰ中のＦ２領域として）有する第１のプライマー、および配列番号３の塩基配列における１４３１〜２４３０番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を、ＢＩＰ中のＢ１ｃ領域もしくはＢ２領域として、またはＢ３領域として（好ましくは、ＢＩＰ中のＢ２領域として）有する第２のプライマーを含む、４つのプライマーの組合せ；
２ｃ’）配列番号３の塩基配列における１〜１０００番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を、ＦＩＰ中のＦ１ｃ領域もしくはＦ２領域として、またはＦ３領域として（好ましくは、ＦＩＰ中のＦ２領域として）有する第１のプライマー、および配列番号３の塩基配列における１００１〜１４３０番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を、ＢＩＰ中のＢ１ｃ領域もしくはＢ２領域として、またはＢ３領域として（好ましくは、ＢＩＰ中のＢ２領域として）有する第２のプライマーを含む、４つのプライマーの組合せ；
２ｄ’）配列番号３の塩基配列における１〜１０００番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を、ＦＩＰ中のＦ１ｃ領域もしくはＦ２領域として、またはＦ３領域として（好ましくは、ＦＩＰ中のＦ２領域として）有する第１のプライマー、および配列番号３の塩基配列における１００１〜１４３０番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を、ＢＩＰ中のＢ１ｃ領域もしくはＢ２領域として、またはＢ３領域として（好ましくは、ＢＩＰ中のＢ２領域として）有する第２のプライマーを含む、４つのプライマーの組合せ；
２ｅ’）配列番号３の塩基配列における１００１〜１４３０番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を、ＦＩＰ中のＦ１ｃ領域もしくはＦ２領域として、またはＦ３領域として（好ましくは、ＦＩＰ中のＦ２領域として）有する第１のプライマー、および配列番号３の塩基配列における１４３１〜２４３０番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を、ＢＩＰ中のＢ１ｃ領域もしくはＢ２領域として、またはＢ３領域として（好ましくは、ＢＩＰ中のＢ２領域として）有する第２のプライマーを含む、４つのプライマーの組合せ；
２ｆ’）配列番号３の塩基配列における１００１〜１４３０番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を、ＦＩＰ中のＦ１ｃ領域もしくはＦ２領域として、またはＦ３領域として（好ましくは、ＦＩＰ中のＦ２領域として）有する第１のプライマー、および配列番号３の塩基配列における１４３１〜２４３０番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を、ＢＩＰ中のＢ１ｃ領域もしくはＢ２領域として、またはＢ３領域として（好ましくは、ＢＩＰ中のＢ２領域として）有する第２のプライマーを含む、４つのプライマーの組合せ。
なお、上記２ａ’）〜２ｆ’）の４つのプライマーの組合せに加えて、２つのループプライマー（ＬＦおよびＬＢ）がさらに併用されてもよい。
【００３３】
より好ましくは、第２標的ｍＰｉｎｇに対するＬＡＭＰ用プライマーセットは、配列番号１１の塩基配列からなるプライマー、配列番号１２の塩基配列からなるプライマー、配列番号１３の塩基配列からなるプライマー、および配列番号１４の塩基配列からなるプライマーを含む。
最も好ましくは、第２標的ｍＰｉｎｇに対するＬＡＭＰ用プライマーセットはさらに、ループプライマーに対応する、配列番号１５の塩基配列からなるプライマー、および配列番号１６の塩基配列を含む。したがって、本発明では、実施例に記載したＮＫ２プライマーセットが好適に用いられる。
【００３４】
（３）新潟県産コシヒカリの構成品種の第８染色体中に見出されない第３標的ｍＰｉｎｇの挿入の有無を検出し得る２以上のプライマーから構成されるプライマーセット
新潟県産コシヒカリの構成品種の第８染色体中に見出されない第３標的ｍＰｉｎｇとは、新潟県産コシヒカリの構成品種の第８染色体中には見出されないものの、日本米の基準品種である日本晴を基準とした場合に、第８染色体の５’末端から数えて１番目に見出されるｍＰｉｎｇをいう。より具体的に説明すると、日本晴におけるこのような第３標的ｍＰｉｎｇおよびその隣接部位を含む領域は、上記データベースＩＲＧＳＰ−１．０から入手できる日本晴の第８染色体の第１０１８６７２〜１０２１１０１番目のヌクレオチド残基からなる塩基配列（配列番号４）である（図４）。図４に示される配列番号４の塩基配列は、日本晴における第３標的ｍＰｉｎｇ（配列番号４の塩基配列中、下線を付した１００１〜１４３０番目のヌクレオチド残基からなる部位）およびその隣接部位（それぞれ１ｋｂ）を示す。
【００３５】
配列番号４の塩基配列において、第３標的ｍＰｉｎｇの挿入領域は、１００１〜１４３０番目のヌクレオチド残基からなる領域である（図４）。したがって、第３標的ｍＰｉｎｇの挿入の有無を検出するための２以上のプライマーとして、本領域の上流部位（センス鎖またはアンチセンス鎖）に対応する塩基配列を有する第１のプライマー、および本領域の下流部位（アンチセンス鎖またはセンス鎖）に対応する塩基配列を有する第２のプライマーの組合せ（ｍＰｉｎｇの挿入の有無に応じてサイズの異なる増幅産物を得ることにより、ｍＰｉｎｇの挿入の有無を検出し得るプライマーの組合せ）、ならびに本領域の上流部位（センス鎖またはアンチセンス鎖）、または本領域の下流部位（アンチセンス鎖またはセンス鎖）に対応する塩基配列を有する第１のプライマー、および本領域（センス鎖またはアンチセンス鎖）に対応する塩基配列を有する第２のプライマーの組合せ（増幅の有無によりｍＰｉｎｇの挿入の有無を検出し得るプライマーの組合せ）を用いることができる（図６を参照）。
【００３６】
具体的には、第４標的ｍＰｉｎｇに対するプライマーセットとしては、以下のプライマー対から構成されるプライマーの組合せ（例、ＰＣＲ用プライマー）、およびそのようなプライマーの組合せを含む３以上のプライマーセット（例、少なくとも４つのプライマーを利用するＬＡＭＰ用プライマーセット）が挙げられる：
３ａ）配列番号４の塩基配列における１〜１０００番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第１のプライマー、および配列番号４の塩基配列における１４３１〜２４３０番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第２のプライマーの組合せ；
３ｂ）配列番号４の塩基配列における１〜１０００番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第１のプライマー、および配列番号３の塩基配列における１４３１〜２４３０番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第２のプライマーの組合せ；
３ｃ）配列番号４の塩基配列における１〜１０００番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第１のプライマー、および配列番号４の塩基配列における１００１〜１４３０番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第２のプライマーの組合せ；
３ｄ）配列番号４の塩基配列における１〜１０００番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第１のプライマー、および配列番号４の塩基配列における１００１〜１４３０番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第２のプライマーの組合せ；
３ｅ）配列番号４の塩基配列における１００１〜１４３０番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第１のプライマー、および配列番号３の塩基配列における１４３１〜２４３０番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第２のプライマーの組合せ；
３ｆ）配列番号４の塩基配列における１００１〜１４３０番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第１のプライマー、および配列番号４の塩基配列における１４３１〜２４３０番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第２のプライマーの組合せ。
【００３７】
好ましくは、第３標的ｍＰｉｎｇに対するプライマーセットは、ＬＡＭＰ用プライマーセットである。より具体的には、このようなＬＡＭＰ用プライマーセットは、以下の２つのプライマーを少なくとも含む、４つのプライマーの組合せ（ＦＩＰ、Ｆ３、ＢＩＰ、Ｂ３）から構成される：
３ａ’）配列番号４の塩基配列における１〜１０００番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を、ＦＩＰ中のＦ１ｃ領域もしくはＦ２領域として、またはＦ３領域として（好ましくは、ＦＩＰ中のＦ２領域として）有する第１のプライマー、および配列番号４の塩基配列における１４３１〜２４３０番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を、ＢＩＰ中のＢ１ｃ領域もしくはＢ２領域として、またはＢ３領域として（好ましくは、ＢＩＰ中のＢ２領域として）有する第２のプライマーを含む、４つのプライマーの組合せ；
３ｂ’）配列番号４の塩基配列における１〜１０００番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を、ＦＩＰ中のＦ１ｃ領域もしくはＦ２領域として、またはＦ３領域として（好ましくは、ＦＩＰ中のＦ２領域として）有する第１のプライマー、および配列番号４の塩基配列における１４３１〜２４３０番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を、ＢＩＰ中のＢ１ｃ領域もしくはＢ２領域として、またはＢ３領域として（好ましくは、ＢＩＰ中のＢ２領域として）有する第２のプライマーを含む、４つのプライマーの組合せ；
３ｃ’）配列番号４の塩基配列における１〜１０００番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を、ＦＩＰ中のＦ１ｃ領域もしくはＦ２領域として、またはＦ３領域として（好ましくは、ＦＩＰ中のＦ２領域として）有する第１のプライマー、および配列番号４の塩基配列における１００１〜１４３０番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を、ＢＩＰ中のＢ１ｃ領域もしくはＢ２領域として、またはＢ３領域として（好ましくは、ＢＩＰ中のＢ２領域として）有する第２のプライマーを含む、４つのプライマーの組合せ；
３ｄ’）配列番号４の塩基配列における１〜１０００番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を、ＦＩＰ中のＦ１ｃ領域もしくはＦ２領域として、またはＦ３領域として（好ましくは、ＦＩＰ中のＦ２領域として）有する第１のプライマー、および配列番号４の塩基配列における１００１〜１４３０番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を、ＢＩＰ中のＢ１ｃ領域もしくはＢ２領域として、またはＢ３領域として（好ましくは、ＢＩＰ中のＢ２領域として）有する第２のプライマーを含む、４つのプライマーの組合せ；
３ｅ’）配列番号４の塩基配列における１００１〜１４３０番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を、ＦＩＰ中のＦ１ｃ領域もしくはＦ２領域として、またはＦ３領域として（好ましくは、ＦＩＰ中のＦ２領域として）有する第１のプライマー、および配列番号４の塩基配列における１４３１〜２４３０番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を、ＢＩＰ中のＢ１ｃ領域もしくはＢ２領域として、またはＢ３領域として（好ましくは、ＢＩＰ中のＢ２領域として）有する第２のプライマーを含む、４つのプライマーの組合せ；
３ｆ’）配列番号４の塩基配列における１００１〜１４３０番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を、ＦＩＰ中のＦ１ｃ領域もしくはＦ２領域として、またはＦ３領域として（好ましくは、ＦＩＰ中のＦ２領域として）有する第１のプライマー、および配列番号４の塩基配列における１４３１〜２４３０番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を、ＢＩＰ中のＢ１ｃ領域もしくはＢ２領域として、またはＢ３領域として（好ましくは、ＢＩＰ中のＢ２領域として）有する第２のプライマーを含む、４つのプライマーの組合せ。
なお、上記３ａ’）〜３ｆ’）の４つのプライマーの組合せに加えて、２つのループプライマー（ＬＦおよびＬＢ）がさらに併用されてもよい。
【００３８】
より好ましくは、第３標的ｍＰｉｎｇに対するＬＡＭＰ用プライマーセットは、配列番号１７の塩基配列からなるプライマー、配列番号１８の塩基配列からなるプライマー、配列番号１９の塩基配列からなるプライマー、および配列番号２０の塩基配列からなるプライマーを含む。
最も好ましくは、第３標的ｍＰｉｎｇに対するＬＡＭＰ用プライマーセットはさらに、ループプライマーに対応する、配列番号２１の塩基配列からなるプライマー、および配列番号２２の塩基配列を含む。したがって、本発明では、実施例に記載したＮＫ３プライマーセットが好適に用いられる。
【００３９】
（４）コシヒカリ以外の品種を検出し得る２以上のプライマーから構成されるプライマーセット
コシヒカリ以外の品種を検出し得る２以上のプライマーから構成されるプライマーセットとしては、コシヒカリ以外の品種に特異的なマーカー領域に対する任意のプライマーセットを用いることができる。コシヒカリ以外の品種は、いもち病抵抗性遺伝子Ｐｉ５−１（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＥＵ８６９１８５）を有し得る。ここで、Ｐｉ５−１の第１エキソン領域、および第２エキソン以降の領域については、コシヒカリのゲノム中にも高い相同性を有する領域が見出されるが、Ｐｉ５−１の第１イントロン領域（ＥＵ８６９１８５において５５９３〜６５６７番目の塩基配列）については、コシヒカリのゲノム中に高い相同性を有する領域は存在しない。したがって、本発明では、コシヒカリ以外の品種を検出し得る２以上のプライマーから構成されるプライマーセットとして、Ｐｉ５−１の第１イントロン領域に対するプライマーセットを用いることができる（例、日本食品化学工学会誌  第５８巻  第１２号  第５９１〜５９６頁（２０１１年）を参照）。
また、Ｐｉ５−１の第１エキソンよりも前の領域（ＥＵ８６９１８５の１〜５２７７番目の塩基配列）についても、コシヒカリのゲノム中に高い相同性を有する領域は存在しない。したがって、本発明では、コシヒカリ以外の品種を検出し得る２以上のプライマーから構成されるプライマーセットとして、Ｐｉ５−１の第１エキソンよりも前の領域に対するプライマーセット（例、本願実施例中に開示されるプライマーセット）を用いることができる。
さらに、複数のマーカーを利用してコシヒカリ以外の品種とコシヒカリとを判定する方法が数多く報告されている（例、特許公開２０１２−５５２５３、特許公開２００９−２１９４９８、特許公開２００５−７３６５５、特許公開２００３−１３５０８２、特許公開２００１−９５５８９を参照）。したがって、本発明では、このような複数のマーカーを利用することにより、コシヒカリ以外の品種を検出し得る２以上のプライマーから構成される複数のプライマーセットを用いてもよい。
【００４０】
好ましくは、コシヒカリ以外の品種に対するプライマーセットは、ＬＡＭＰ用プライマーセットである。
より好ましくは、コシヒカリ以外の品種に対するＬＡＭＰ用プライマーセットは、配列番号２３の塩基配列からなるプライマー、配列番号２４の塩基配列からなるプライマー、配列番号２５の塩基配列からなるプライマー、および配列番号２６の塩基配列からなるプライマーを含む。
最も好ましくは、コシヒカリ以外の品種に対するＬＡＭＰ用プライマーセットはさらに、ループプライマーに対応する、配列番号２７の塩基配列からなるプライマー、および配列番号２８の塩基配列を含む。したがって、本発明では、実施例に記載したＮＫ４プライマーセットが好適に用いられる。
【００４１】
（５）コシヒカリを特異的に検出し得る２以上のプライマーから構成されるプライマーセット
コシヒカリを特異的に検出し得る２以上のプライマーから構成されるプライマーセットとしては、コシヒカリに特異的なマーカー領域に対する任意のプライマーセットを用いることができる。コシヒカリは、上記Ｐｉ５−１の第１エキソン領域、および第２エキソン以降の領域と高い塩基配列相同性を有する領域を有する。しかし、Ｐｉ５−１の第１イントロン領域（ＥＵ８６９１８５において５５９３〜６５６７番目の塩基配列）については、コシヒカリのゲノム中に高い塩基配列相同性を有する領域は存在せず、非相同領域しか有しない。したがって、本発明では、コシヒカリを検出し得る２以上のプライマーから構成されるプライマーセットとして、このような非相同領域（例、日本晴（ＩＲＧＳＰ−１．０）の第９染色体の９６７３２８０〜９６７４３０２番目の塩基配列）に対するプライマーセットを用いることができる（例、日本食品化学工学会誌  第５８巻  第１２号  第５９１〜５９６頁（２０１１年）を参照）。
また、Ｐｉ５−１の第１エキソンよりも前の領域（ＥＵ８６９１８５の１〜５２７７番目の塩基配列）についても、コシヒカリのゲノム中に高い相同性を有する領域は存在しない。したがって、本発明では、コシヒカリを検出し得る２以上のプライマーから構成されるプライマーセットとして、このような領域（例、日本晴（ＩＲＧＳＰ−１．０）の第９染色体の９６７４６１８番目の塩基よりも後ろの塩基配列）に対するプライマーセットを用いることができる。
さらに、複数のマーカーを利用してコシヒカリとコシヒカリ以外の品種とを判定する方法が数多く報告されている（例、上記文献を参照）。したがって、本発明では、このような複数のマーカーを利用することにより、コシヒカリを検出し得る２以上のプライマーから構成される複数のプライマーセットを用いてもよい。
【００４２】
好ましくは、コシヒカリに対するプライマーセットは、ＬＡＭＰ用プライマーセットである。
より好ましくは、コシヒカリに対するＬＡＭＰ用プライマーセットは、配列番号２９の塩基配列からなるプライマー、配列番号３０の塩基配列からなるプライマー、配列番号３１の塩基配列からなるプライマー、および配列番号３２の塩基配列からなるプライマーを含む。
最も好ましくは、コシヒカリに対するＬＡＭＰ用プライマーセットはさらに、ループプライマーに対応する、配列番号３３の塩基配列からなるプライマー、および配列番号３４の塩基配列を含む。したがって、本発明では、実施例に記載したＮＫ５プライマーセットが好適に用いられる。
【００４３】
上述したプライマーセットを構成する各種プライマーにおける用語「均等な塩基配列」とは、イネの品種間、特に、新潟県産のコシヒカリと日本晴における塩基配列のバリエーションに対応する塩基配列であることを意味する。したがって、所定の塩基配列（例、配列番号Ｘの塩基配列においてＹ〜Ｚ番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列）に均等な塩基配列は、当該所定の塩基配列において数個（例えば１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１、２または３個）の塩基の修飾（例、置換、欠失、挿入、付加）を含む塩基配列であり得る。このような均等な塩基配列は、当該技術分野における当業者にとって明らかであり、イネの品種の遺伝子情報を登録しているデータベースを参照することにより、あるいはイネの品種における上記標的ｍＰｉｎｇの挿入領域周辺の塩基配列を解読することにより、決定できる。
【００４４】
本発明の方法では、新潟県産コシヒカリの構成品種の第１染色体中に見出される第１標的ｍＰｉｎｇの挿入の有無を検出し得る２以上のプライマーから構成されるプライマーセットを少なくとも用いる増幅反応により、第１標的ｍＰｉｎｇの挿入の有無が確認され、これによりコメの産地または品種が判定される。例えば、第１標的ｍＰｉｎｇが挿入されていることが確認された場合には、サンプルが新潟県産のコメである可能性が高い、又は新潟県産のコメを含む可能性が高いと判定できる。一方、第１標的ｍＰｉｎｇが挿入されていないことが確認された場合には、サンプルが新潟県産のコメでない可能性が高い、又は新潟県産のコメを含まない可能性が高いと判定できる。
【００４５】
一実施形態では、本発明の方法は、新潟県産コシヒカリをより正確に判定する方法に関する。
このような方法は、以下（１）、（２）および（３）のプライマーセットを用いる増幅反応において、以下（Ｉ）、（ＩＩ）および（ＩＩＩ）の結果を確認することを特徴とする：
（１）新潟県産コシヒカリの構成品種の第１染色体中に見出される第１標的ｍＰｉｎｇの挿入の有無を検出し得る２以上のプライマーから構成される、第１のプライマーセット；  
（２）新潟県産コシヒカリの構成品種の第８染色体中に見出されない第２標的ｍＰｉｎｇの挿入の有無を検出し得る２以上のプライマーから構成される、第２のプライマーセット；および
（３）新潟県産コシヒカリの構成品種の第８染色体中に見出されない第３標的ｍＰｉｎｇの挿入の有無を検出し得る２以上のプライマーから構成される、第３のプライマーセット；
（Ｉ）第１のプライマーセットを用いる増幅反応により、第１標的ｍＰｉｎｇが挿入されていることを確認すること；
（ＩＩ）第２のプライマーセットを用いる増幅反応により、第２標的ｍＰｉｎｇが挿入されていないことを確認すること；および
（ＩＩＩ）第３のプライマーセットを用いる増幅反応により、第３標的ｍＰｉｎｇが挿入されていないことを確認すること。
【００４６】
別の実施形態では、本発明の方法は、新潟県産コシヒカリに他県産のコシヒカリもしくは他品種のコメの混入があると、より正確に判定する方法に関する。
このような方法は、以下（１）、（２）および（３）のプライマーセットを用いる増幅反応において、以下（ＩＶ）および（Ｖ）の結果を確認することを特徴とする：
（１）新潟県産コシヒカリの構成品種の第１染色体中に見出される第１標的ｍＰｉｎｇの挿入の有無を検出し得る２以上のプライマーから構成される、第１のプライマーセット；  
（２）新潟県産コシヒカリの構成品種の第８染色体中に見出されない第２標的ｍＰｉｎｇの挿入の有無を検出し得る２以上のプライマーから構成される、第２のプライマーセット；および
（３）新潟県産コシヒカリの構成品種の第８染色体中に見出されない第３標的ｍＰｉｎｇの挿入の有無を検出し得る２以上のプライマーから構成される、第３のプライマーセット；
（ＩＶ）第１のプライマーセットを用いる増幅反応により、第１標的ｍＰｉｎｇが挿入されていることを確認すること；および
（Ｖ）第２のプライマーセットおよび第３のプライマーセットの一方または双方を用いる増幅反応により、第２標的ｍＰｉｎｇまたは第３標的ｍＰｉｎｇが挿入されていることを確認すること。
【００４７】
上記実施形態において、他県産のコシヒカリとしては、例えば、栃木県産、福島県産、茨城県産、富山県産、千葉県産、長野県産、石川県産、三重県産、福井県産、滋賀県産、島根県産、広島県産、兵庫県産、および山形県産のコシヒカリが挙げられる。
また、他品種のコメとしては、例えば、ひとめぼれ、あきたこまち、ヒノヒカリ、ななつぼし、はえぬき、きらら３９７、まっしぐら、こしいぶき、つがるロマン、キヌヒカリ、あさひの夢、ゆめぴりか、ふさこがね、ほしのゆめ、およびハナエチゼンが挙げられる。
【００４８】
さらに別の実施形態では、本発明の方法は、コシヒカリ以外の品種のコメを、より正確に判定する方法に関する。
このような方法は、以下（１）、（４）および（５）のプライマーセットを用いる増幅反応において、以下（ＶＩ）、（ＶＩＩ）および（ＶＩＩＩ）の結果を確認することを特徴とする：
（１）新潟県産コシヒカリの構成品種の第１染色体中に見出される第１標的ｍＰｉｎｇの挿入の有無を検出し得る２以上のプライマーから構成される、第１のプライマーセット；
（４）コシヒカリ以外の品種のコメを検出し得る２以上のプライマーから構成される、第４のプライマーセット；および
（５）コシヒカリを特異的に検出し得る２以上のプライマーから構成される、第５のプライマーセット；
（ＶＩ）第１のプライマーセットを用いる増幅反応により、第１標的ｍＰｉｎｇが挿入されていないことを確認すること；
（ＶＩＩ）第４のプライマーセットを用いる増幅反応により、コシヒカリ以外の品種のコメであることを確認すること；および
（ＶＩＩＩ）第５のプライマーセットを用いる増幅反応により、コシヒカリでないことを確認すること。
【００４９】
別の実施形態では、本発明の方法は、新潟県産以外の県産のコシヒカリを、より正確に判定する方法に関する。
このような方法は、以下（１）、（４）および（５）のプライマーセットを用いる増幅反応において、以下（ＩＸ）、（Ｘ）および（ＸＩ）の結果を確認することを特徴とする：
（１）新潟県産コシヒカリの構成品種の第１染色体中に見出される第１標的ｍＰｉｎｇの挿入の有無を検出し得る２以上のプライマーから構成される、第１のプライマーセット；
（４）コシヒカリ以外の品種のコメを検出し得る２以上のプライマーから構成される、第４のプライマーセット；および
（５）コシヒカリを特異的に検出し得る２以上のプライマーから構成される、第５のプライマーセット；
（ＩＸ）第１のプライマーセットを用いる増幅反応により、第１標的ｍＰｉｎｇが挿入されていないことを確認すること；
（Ｘ）第４のプライマーセットを用いる増幅反応により、コシヒカリ以外の品種のコメでないことを確認すること；および
（ＸＩ）第５のプライマーセットを用いる増幅反応により、コシヒカリであることを確認すること。
【００５０】
さらに別の実施形態では、本発明の方法は、コシヒカリ以外の品種のコメおよび新潟県産以外の県産のコシヒカリの混合物であることを、より正確に判定する方法に関する。
このような方法は、以下（１）、（４）および（５）のプライマーセットを用いる増幅反応において、以下（ＸＩＩ）、（ＸＩＩＩ）および（ＸＩＶ）の結果を確認することを特徴とする：
（１）新潟県産コシヒカリの構成品種の第１染色体中に見出される第１標的ｍＰｉｎｇの挿入の有無を検出し得る２以上のプライマーから構成される、第１のプライマーセット；
（４）コシヒカリ以外の品種のコメを検出し得る２以上のプライマーから構成される、第４のプライマーセット；および
（５）コシヒカリを特異的に検出し得る２以上のプライマーから構成される、第５のプライマーセット；
（ＸＩＩ）第１のプライマーセットを用いる増幅反応により、第１標的ｍＰｉｎｇが挿入されていないことを確認すること；
（ＸＩＩＩ）第４のプライマーセットを用いる増幅反応により、コシヒカリ以外の品種のコメであることを確認すること；および
（ＸＩＶ）第５のプライマーセットを用いる増幅反応により、コシヒカリであることを確認すること。
【００５１】
本発明はまた、本発明の方法で用いられる上述した各種プライマーセット、およびこのような各種プライマーセットを含むキットに関する。
【００５２】
本発明のキットは、増幅反応で用いられるタンパク質をさらに含んでいてもよい。このようなタンパク質としては、例えば、ＤＮＡポリメラーゼ（例、ＬＡＭＰでは、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ）、制限酵素、リボヌクレアーゼＨ、ライゲース、ヘリカーゼおよびリコンビナーゼが挙げられる。本発明のキットはまた、蛍光試薬、ｄＮＴＰｓ等の基質、ＡＴＰ等の補酵素を含んでいてもよい。本発明のキットはさらに、コントロールとして用いることができるハウスキーピング遺伝子（例、ＧＡＰＤＨ、β−アクチン、β２−マイクログロブリン、ＨＰＲＴ１）をコードするコントロールＤＮＡ、およびこのようなコントロールＤＮＡに対する２以上のプライマーを含んでいてもよい。本発明のキットはまた、ポジティブコントロール（例、新潟県産コシヒカリのゲノムＤＮＡ）および／またはネガティブコントロール（例、他県産コシヒカリのゲノムＤＮＡ、多品種のゲノムＤＮＡ）を含んでいてもよい。本発明のキットは、個々の容器（例、チューブ）に隔離された形態で各成分を含んでいてもよいが、２種以上の成分が同一容器中で予め混合されていてもよい。
【００５３】
以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明は、これらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００５４】
実施例１：新潟県産コシヒカリ、栃木県産コシヒカリおよび宮城県産ひとめぼれ、ならびにそれらの混合飼料の判定
１）新潟県産コシヒカリ（２０１１年産米を使用）、栃木県産コシヒカリおよび宮城県産ひとめぼれの玄米をフードミルで粉砕し、粉砕試料のうち０．５ｇからＧＭ  Ｑｕｉｃｋｅｒ  ２抽出キットを用いてＤＮＡを抽出した。
２）新潟県産コシヒカリの抽出ＤＮＡに栃木県産コシヒカリもしくは宮城県産ひとめぼれの抽出ＤＮＡを等量混合し、新潟県産コシヒカリへの擬似的な混入試料を作製した。
３）ＬＡＭＰ反応液は、表１に示される５組のプライマーセット（ＮＫ１、ＮＫ２、ＮＫ３、ＮＫ４、ＮＫ５）ごとに作製し、それぞれ２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、１０ｍＭ  ＫＣｌ、８ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０、０．８Ｍ  Ｂｅｔａｉｎ、１．４ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、０．２μＭのＦ３およびＢ３プライマー、１．６μＭのＦＩＰおよびＢＩＰプライマー、０．８μＭのＬＦおよびＬＢプライマー、８ユニットのＢｓｔ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、１μＬのＬｏｏｐａｍｐ蛍光・目視検出試薬（栄研化学）、および１０ｎｇの抽出ＤＮＡを含む全量２５μＬとした。ＮＫ１は、上記第１標的ｍＰｉｎｇの挿入の有無を検出し得る６つのプライマーから構成されるＬＡＭＰ用プライマーセットであり、第１標的ｍＰｉｎｇがゲノム中に挿入されている場合には増幅産物が生じ得るが、挿入されていない場合には増幅産物が生じ得ないように設計されている。ＮＫ２は、上記第２標的ｍＰｉｎｇの挿入の有無を検出し得る６つのプライマーから構成されるＬＡＭＰ用プライマーセットであり、第２標的ｍＰｉｎｇがゲノム中に挿入されている場合には増幅産物が生じ得るが、挿入されていない場合には増幅産物が生じ得ないように設計されている。ＮＫ３は、上記第３標的ｍＰｉｎｇの挿入の有無を検出し得る６つのプライマーから構成されるＬＡＭＰ用プライマーセットであり、第３標的ｍＰｉｎｇがゲノム中に挿入されている場合には増幅産物が生じ得るが、挿入されていない場合には増幅産物が生じ得ないように設計されている。ＮＫ４は、上記コシヒカリ以外の品種のコメを検出し得る６つのプライマーから構成されるＬＡＭＰ用プライマーセットであり、コシヒカリでは増幅産物が生じ得ないが、コシヒカリ以外の品種では増幅産物が生じ得ないように設計されている。ＮＫ５は、コシヒカリを検出し得る６つのプライマーから構成されるＬＡＭＰ用プライマーセットであり、コシヒカリでは増幅産物が生じ得るが、コシヒカリ以外の品種では増幅産物が生じ得ないように設計されている。なお、ＮＫ４およびＮＫ５の標的部位は、日本食品化学工学会誌  第５８巻  第１２号  第５９１〜５９６頁（２０１１年）に開示されるものと同様である。
４）ＬＡＭＰ増幅は、６３℃で３０分間反応させた後、８０℃で２分間加熱し反応停止した。
５）反応液に３６５ｎｍの紫外線を照射し、蛍光を発色するものを増幅有、発色しないものは増幅無として判定を行った。
６）その結果、図７に示すように、（Ａ）では、ＮＫ１の増幅とＮＫ２およびＮＫ３の非増幅により、混入のない新潟県産コシヒカリと判定できた。一方、（Ｄ）および（Ｅ）では、ＮＫ１の増幅が認められるがＮＫ２、ＮＫ３にも増幅が検出され、新潟県産コシヒカリに他県産コシヒカリもしくは他品種の混入ありと判定できた。また、（Ｂ）（Ｃ）および（Ｆ）では、ＮＫ１の非増幅により新潟県産コシヒカリ以外であると判定でき、またＮＫ４とＮＫ５の増幅結果から、（Ｂ）は他県産コシヒカリ、（Ｃ）は他品種、（Ｆ）は他県産コシヒカリと他品種の混合物であると判定できた。なお、２０１１年産の新潟県産コシヒカリのみならず、２００５〜２０１０、２０１２年の新潟県産コシヒカリについても、同様の結果が得られることも併せて確認できた。
【００５５】
【表１】
2014230526.tif 000003
【００５６】
実施例２：コシヒカリ出荷上位１５県とコシヒカリを除く出荷上位１６品種の判定
実施例１と同様にして、コシヒカリ出荷上位１５県とコシヒカリを除く出荷上位１６品種を判定した。ＬＡＭＰ反応では、表１に示される５組のプライマーセット（ＮＫ１、ＮＫ２、ＮＫ３、ＮＫ４、ＮＫ５）を用いた。結果は、表２に示すとおりであった。なお、２０１１年産の新潟県産コシヒカリのみならず、２００５〜２０１０、２０１２年の新潟県産コシヒカリについても、同様の結果が得られることも併せて確認できた。
【００５７】
【表２】
2014230526.tif 000004
【００５８】
実施例３：新潟県産コシヒカリにおけるＮＫ１プライマーセットの標的部位の周辺塩基配列の解読
新潟県産コシヒカリにおけるＮＫ１プライマーセットの標的部位の周辺塩基配列を解読した。その結果、この周辺塩基配列は、図２に示される配列番号２の塩基配列のとおりであった。また、配列番号２の塩基配列において、ｍＰｉｎｇの挿入部位（図２中、下線を付した１００１〜１４３０番目のヌクレオチド残基からなる部位）が確認された。
【産業上の利用可能性】
【００５９】
本発明によれば、新潟県産コシヒカリの判定、および他県産・他品種の混入の有無を検出することができる。
【図１】
2014230526.tif 000005
【図２】
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【図３】
2014230526.tif 000007
【図４】
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【図５】
2014230526.tif 000009
【図６】
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【図７】
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【配列表】
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