(57)【要約】      （修正有）【課題】固形腫瘍及び様々な新生血管形成性の眼内疾患を処置する為血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を阻害する安定かつ可溶性の抗ＶＥＧＦモノクロナール抗体の提供。【解決手段】ウサギモノクローナル抗体からのＣＤＲを含む、可溶性で安定な抗ＶＥＧＦイムノバインダー。組換え抗体を発現するためのハイブリドーマ、核酸、ベクター、宿主細胞、及びこれらを単離する。このイムノバインダーはＶＥＧＦに結合し、したがってインビボでＶＥＧＦの機能をブロックする。これらイムノバインダーのＣＤＲは、ヒトＶＥＧＦおよび／またはそのフラグメントで免疫化したウサギから得たウサギ抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体に由来する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願明細書に記載された発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
この出願は、２００８年６月２５日に出願されたＵＳ６１／１３３，２１２、２００８年６月２５日に出願されたＵＳ６１／０７５，６９７、２００９年２月２４日に出願されたＵＳ６１／１５５，０４１、および、２００８年６月２５日に出願されたＵＳ６１／０７５，６９２への優先権を主張する。
【０００２】
本明細書を通して引用される、あらゆる特許、特許出願、および参考文献の内容は、その全体が参照によって本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
新脈管形成は、固形腫瘍、増殖性網膜症または加齢黄斑変性（ＡＭＤ）などの眼内の新生血管形成症候群、慢性関節リウマチ、および乾癬を含めた様々な障害の病原に関係づけられる（非特許文献１；非特許文献２；および「Ｐａｔｈｏｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｏｃｕｌａｒ  ｄｉｓｅａｓｅ．  Ａ  ｄｙｎａｍｉｃ  ａｐｐｒｏａｃｈ．」Ｇａｒｎｅｒ
Ａ、Ｋｌｉｎｔｗｏｒｔｈ  Ｇ  Ｋ編集、第２版、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、ＮＹ、１６２５〜１７１０頁（１９９４）におけるＧａｒｎｅｒ  Ａ、Ｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｉｓｅａｓｅｓ）。固形腫瘍では、新脈管形成および新しい脈管構造の増殖が腫瘍を生存させ、腫瘍切片における微小血管の密度と、乳がんおよび他のがんにおける患者の生存との間に相関が実証されている（非特許文献３；非特許文献４；および非特許文献５）。
【０００４】
血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）は、公知の新脈管形成および新生血管形成の制御因子であり、腫瘍および眼内の障害に付随する新生血管形成の主要なメディエータであることが示されている（非特許文献６）。ＶＥＧＦのｍＲＮＡはヒトの腫瘍の多くにおいて過剰発現され、眼の流体におけるＶＥＧＦの濃度は、糖尿病患者および他の虚血関連の網膜症患者における血管の能動的増殖の存在に高度に相関する（非特許文献７；非特許文献８；非特許文献９；非特許文献１０；およびＤｖｏｒａｋら、Ａｍ  Ｊ．  Ｐａｔｈｏｌ．、１４６巻、１０２９〜１０３９頁（１９９５年）；Ａｉｅｌｌｏら、Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．、３３１巻、１４８０〜１４８７頁（１９９４年））。さらに、最近の研究は、ＡＭＤに罹患している患者の脈絡膜新生血管膜における局在性ＶＥＧＦの存在を示している（Ｌｏｐｅｚら、Ｉｎｖｅｓｔ．  Ｏｐｈｔａｌｍｏ．  Ｖｉｓ．  Ｓｃｉ．、３７巻、８５５〜８６８頁（１９９６年））。抗ＶＥＧＦ中和抗体を用いて、ヌードマウスにおける様々なヒト腫瘍細胞系の増殖を抑制すること、また、虚血性網膜障害のモデルにおける眼内の新脈管形成を阻害することもできる（Ｋｉｍら、Ｎａｔｕｒｅ、３６２巻、８４１〜８４４頁（１９９３年）；Ｗａｒｒｅｎら、Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ、９５巻、１７８９〜１７９７頁（１９９５年）；  Ｂｏｒｇｓｔｒｏｍら、Ｃａｎｃｅｒ
Ｒｅｓ．、５６巻、４０３２〜４０３９頁（１９９６年）；およびＭｅｌｎｙｋら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、５６巻、９２１〜９２４頁（１９９６年））（Ａｄａｍｉｓら、Ａｒｃｈ．  Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ．、１１４巻、６６〜７１頁（１９９６年））。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｆｏｌｋｍａｎら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、１９９２年、２６７巻、１０９３１〜１０９３４頁
【非特許文献２】Ｋｌａｇｓｂｒｕｎら、Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．、１９９１年、５３巻、２１７〜２３９頁
【非特許文献３】Ｗｅｉｄｎｅｒら、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ、１９９１年、３２４巻、１〜６頁
【非特許文献４】Ｈｏｒａｋら、Ｌａｎｃｅｔ、１９９２年、３４０巻、１１２０〜１１２４頁
【非特許文献５】Ｍａｃｃｈｉａｒｉｎｉら、Ｌａｎｃｅｔ、１９９２年、３４０巻、１４５〜１４６頁
【非特許文献６】Ｆｅｒｒａｒａら、Ｅｎｄｏｃｒ．  Ｒｅｖ．、１９９７年、１８巻、４〜２５頁
【非特許文献７】Ｂｅｒｋｍａｎら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ、１９９３年、９１巻、１５３〜１５９頁
【非特許文献８】Ｂｒｏｗｎら、Ｈｕｍａｎ  Ｐａｔｈｏｌ．、１９９５年、２６巻、８６〜９１頁
【非特許文献９】Ｂｒｏｗｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、１９９３年、５３巻、４７２７〜４７３５頁
【非特許文献１０】Ｍａｔｔｅｒｎら、Ｂｒｉｔ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ．、１９９６年、７３巻、９３１〜９３４頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
このように、固形腫瘍および様々な新生血管形成性の眼内疾患を処置するのに用いることができる抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の概要）
本発明は、ウサギモノクローナル抗体からのＣＤＲを含む、可溶性で安定な抗ＶＥＧＦイムノバインダーを提供する。前記抗体は、ＶＥＧＦ媒介性障害の診断および／または処置のためにデザインされている。本発明の組換え抗体を発現するためのハイブリドーマ、核酸、ベクター、および宿主細胞、これらを単離するための方法、ならびに医薬における前記抗体の使用も開示する。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
可変重鎖（ＶＨ）かつ／または可変軽鎖（ＶＬ）を含む組換えイムノバインダーであって、該イムノバインダーがヒトＶＥＧＦを中和しウサギＣＤＲを含む、イムノバインダー。
（項目２）
キメラのイムノバインダーである、項目１に記載のイムノバインダー。
（項目３）
ヒト化されている、前述の項目のいずれか一項に記載のイムノバインダー。
（項目４）
配列番号１４、配列番号２６、配列番号３７、配列番号４９、配列番号６０、および配列番号７１からなる群のコンセンサス配列に少なくとも８０％の類似性を有するＣＤＲを少なくとも１つ含む、前述の項目のいずれか一項に記載のイムノバインダー。
（項目５）
配列番号２、配列番号３、配列番号１５、配列番号２７、配列番号３８、配列番号５０、および配列番号６１からなる群の配列に少なくとも８０％の類似性を有するＣＤＲを少なくとも１つ含む、前述の項目のいずれか一項に記載のイムノバインダー。
（項目６）
前記ＶＨが配列番号２、配列番号１５、および配列番号２７からなる群のＣＤＲを含み、かつ／または前記ＶＬが配列番号３８、配列番号５０、および配列番号６１からなる群のＣＤＲを含む、項目５に記載のイムノバインダー。
（項目７）
前記ＶＨが配列番号３、配列番号１５、および配列番号２７からなる群のＣＤＲを含み、かつ／または前記ＶＬが配列番号３８、配列番号５０、および配列番号６１からなる群のＣＤＲを含む、項目５に記載のイムノバインダー。
（項目８）
配列番号４、配列番号１６、配列番号２８、配列番号３９、配列番号５１、および配列番号６２からなる群の配列に少なくとも８０％の類似性を有するＣＤＲを少なくとも１つ含む、項目１から４のいずれか一項に記載のイムノバインダー。
（項目９）
前記ＶＨが配列番号４、配列番号１６、配列番号２８からなる群のＣＤＲを含み、かつ／または前記ＶＬが配列番号３９、配列番号５１、および配列番号６２からなる群のＣＤＲを含む、項目８に記載のイムノバインダー。
（項目１０）
配列番号５、配列番号１７、配列番号２９、配列番号４０、配列番号５２、および配列番号６３からなる群の配列に少なくとも８０％の類似性を有するＣＤＲを少なくとも１つ含む、項目１から４のいずれか一項に記載のイムノバインダー。
（項目１１）
前記ＶＨが配列番号５、配列番号１７、配列番号２９からなる群のＣＤＲを含み、かつ／または前記ＶＬが配列番号４０、配列番号５２、および配列番号６３からなる群のＣＤＲを含む、項目１０に記載のイムノバインダー。
（項目１２）
配列番号６、配列番号１８、配列番号３０、配列番号４１、配列番号５３、および配列番号６４からなる群の配列に少なくとも８０％の類似性を有するＣＤＲを少なくとも１つ含む、項目１から４のいずれか一項に記載のイムノバインダー。
（項目１３）
前記ＶＨが配列番号６、配列番号１８、および配列番号３０からなる群のＣＤＲを含み、かつ／または前記ＶＬが配列番号４１、配列番号５３、および配列番号６４からなる群のＣＤＲを含む、項目１２に記載のイムノバインダー。
（項目１４）
配列番号７、配列番号１９、配列番号３１、配列番号４２、配列番号５４、および配列番号６５からなる群の配列に少なくとも８０％の類似性を有するＣＤＲを少なくとも１つ含む、項目１から４のいずれか一項に記載のイムノバインダー。
（項目１５）
前記ＶＨが配列番号７、配列番号１９、および配列番号３１からなる群のＣＤＲを含み、かつ／または前記ＶＬが配列番号４２、配列番号５４、および配列番号６５からなる群のＣＤＲを含む、項目１４に記載のイムノバインダー。
（項目１６）
配列番号８、配列番号２０、配列番号３２、配列番号４３、配列番号５５、および配列番号６６からなる群の配列に少なくとも８０％の類似性を有するＣＤＲを少なくとも１つ含む、項目１から４のいずれか一項に記載のイムノバインダー。
（項目１７）
前記ＶＨが配列番号８、配列番号２０、および配列番号３２からなる群のＣＤＲを含み、かつ／または前記ＶＬが配列番号４３、配列番号５５、および配列番号６６からなる群のＣＤＲを含む、項目１６に記載のイムノバインダー。
（項目１８）
配列番号９、配列番号２１、配列番号３３、配列番号４４、配列番号５６、および配列番号６７からなる群の配列に少なくとも８０％の類似性を有するＣＤＲを少なくとも１つ含む、項目１から４のいずれか一項に記載のイムノバインダー。
（項目１９）
前記ＶＨが配列番号９、配列番号２１、および配列番号３３からなる群のＣＤＲを含み、かつ／または前記ＶＬが配列番号４４、配列番号５６、および配列番号６７からなる群のＣＤＲを含む、項目１８に記載のイムノバインダー。
（項目２０）
配列番号１０、配列番号２２、配列番号３４、配列番号４５、配列番号５７、および配列番号６８からなる群の配列に少なくとも８０％の類似性を有するＣＤＲを少なくとも１つ含む、項目１から４のいずれか一項に記載のイムノバインダー。
（項目２１）
前記ＶＨが配列番号１０、配列番号２２、および配列番号３４からなる群のＣＤＲを含み、かつ／または前記ＶＬが配列番号４５、配列番号５７、および配列番号６８からなる群のＣＤＲを含む、項目２０に記載のイムノバインダー。
（項目２２）
配列番号１１、配列番号１３、配列番号２３、配列番号２５、配列番号３５、配列番号４６、配列番号５８、および配列番号６９からなる群の配列に少なくとも８０％の類似性を有するＣＤＲを少なくとも１つ含む、項目１から４のいずれか一項に記載のイムノバインダー。
（項目２３）
前記ＶＨが、（ｉ）配列番号１１、配列番号２３、および配列番号３５からなる群、（ｉｉ）配列番号１１、配列番号２５、および配列番号３５からなる群、（ｉｉｉ）配列番号１３、配列番号２３、および配列番号３５からなる群、または（ｉｖ）配列番号１３、配列番号２５、および配列番号３５からなる群のＣＤＲを含む、項目２２に記載のイムノバインダー。
（項目２４）
前記ＶＬが、配列番号４６、配列番号５８、および配列番号６９からなる群のＣＤＲを含む、項目２３に記載のイムノバインダー。
（項目２５）
配列番号１２、配列番号２４、配列番号３６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号５９、および配列番号７０からなる群の配列に少なくとも８０％の類似性を有するＣＤＲを少なくとも１つ含む、項目１から４のいずれか一項に記載のイムノバインダー。
（項目２６）
前記ＶＨが、配列番号１２、配列番号２４、および配列番号３６からなる群のＣＤＲを含み、かつ／または前記ＶＬが、（ｉ）配列番号４７、配列番号５９、および配列番号７０からなる群のＣＤＲ、もしくは（ｉｉ）配列番号４８、配列番号５９、および配列番号７０からなる群のＣＤＲを含む、項目２５に記載のイムノバインダー。
（項目２７）
配列番号１６９の配列に少なくとも８０％の配列同一性を有する重鎖可変領域可変領域フレームワーク配列を含む、前述の項目のいずれか一項に記載のイムノバインダー。
（項目２８）
前記重鎖可変領域フレームワークが配列番号１７０または配列番号１７１である、項目２７に記載のイムノバインダー。
（項目２９）
ＡＨｏナンバリングシステムによる、前記重鎖可変領域の位置１、８３、または８７に欠失を有する、前述の項目のいずれか一項に記載のイムノバインダー。
（項目３０）
ＡＨｏナンバリングシステムによる、前記重鎖可変領域における位置２、１２、２４、２５、４６、５４、５５、８３、８４、８７、８９、１０３、１０５、１０８、または１４４の少なくとも１つに置換を有する、前述の項目のいずれか一項に記載のイムノバインダー。
（項目３１）
前記置換が、
（ａ）位置２のグルタミン、
（ｂ）位置１２のセリン、
（ｃ）位置２４のスレオニン、
（ｄ）位置２５のバリン、
（ｅ）位置４６のロイシン、
（ｆ）位置５４のチロシン、
（ｇ）位置５５のイソロイシン、
（ｈ）位置８３のアラニン、
（ｉ）位置８４のアスパラギン、
（ｊ）位置８７のアラニンまたはロイシン、
（ｋ）位置８９のアラニンまたはロイシン、
（ｌ）位置１０３のセリンまたはスレオニン、
（ｍ）位置１０５のフェニルアラニン、
（ｎ）位置１０８のアルギニン、および
（ｏ）位置１４４のセリンまたはスレオニン
からなる群より選択される、項目３０に記載のイムノバインダー。
（項目３２）
配列番号１６７の配列に少なくとも８５％の配列同一性を有する軽鎖可変領域フレームワーク配列を含む、前述の項目のいずれか一項に記載のイムノバインダー。
（項目３３）
前記軽鎖可変領域フレームワークが配列番号１６７または配列番号１６８である、項目３０に記載のイムノバインダー。
（項目３４）
ＡＨｏナンバリングシステムによる、前記軽鎖可変領域の位置１、２、または１５の少なくとも１つに置換を有する、前述の項目のいずれか一項に記載のイムノバインダー。
（項目３５）
前記置換が、
（ａ）位置１のアスパラギン酸、
（ｂ）位置２のバリン、
（ｃ）位置１５のスレオニン
からなる群より選択される、項目３４に記載のイムノバインダー。
（項目３６）
配列番号１０７に少なくとも８０％類似であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および／または配列番号７２に少なくとも８０％類似である軽鎖可変領域を含む、項目５から７、または２７から３５のいずれか一項に記載のイムノバインダー。
（項目３７）
配列番号１０９に少なくとも８０％類似であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および／または配列番号７３に少なくとも８０％類似である軽鎖可変領域を含む、項目８から９、または２７から３５のいずれか一項に記載のイムノバインダー。
（項目３８）
配列番号１１０に少なくとも８０％類似であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および／または配列番号７４に少なくとも８０％類似である軽鎖可変領域を含む、項目１０から１１、または２７から３５のいずれか一項に記載のイムノバインダー。
（項目３９）
配列番号１１１に少なくとも８０％類似であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および／または配列番号７５に少なくとも８０％類似である軽鎖可変領域を含む、項目１２から１３、または２７から３５のいずれか一項に記載のイムノバインダー。
（項目４０）
配列番号１１２に少なくとも８０％類似であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および／または配列番号７６に少なくとも８０％類似である軽鎖可変領域を含む、項目１４から１５、または２７から３５のいずれか一項に記載のイムノバインダー。
（項目４１）
配列番号１１３に少なくとも８０％類似であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および／または配列番号７７に少なくとも８０％類似である軽鎖可変領域を含む、項目１６から１７、または２７から３５のいずれか一項に記載のイムノバインダー。
（項目４２）
配列番号１７８、配列番号１７９、または配列番号１８０に少なくとも８０％の同一性を有する、項目４１に記載のイムノバインダー。
（項目４３）
配列番号１１４に少なくとも８０％類似であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および／または配列番号７８に少なくとも８０％類似である軽鎖可変領域を含む、項目１８から１９、または２７から３５のいずれか一項に記載のイムノバインダー。
（項目４４）
配列番号１１５に少なくとも８０％類似であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および／または配列番号７９に少なくとも８０％類似である軽鎖可変領域を含む、項目２０から２１、または２７から３５のいずれか一項に記載のイムノバインダー。
（項目４５）
配列番号１７７に少なくとも８０％の同一性を有する、項目４４に記載のイムノバインダー。
（項目４６）
配列番号１１６に少なくとも８０％類似であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および／または配列番号８０に少なくとも８０％類似である軽鎖可変領域を含む、項目２２から２４、または２７から３５のいずれか一項に記載のイムノバインダー。
（項目４７）
配列番号１１７に少なくとも８０％類似であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および／または配列番号８１に少なくとも８０％類似である軽鎖可変領域を含む、項目２５から２６、または２７から３５のいずれか一項に記載のイムノバインダー。
（項目４８）
配列番号１７６に少なくとも８０％の同一性を有する、項目４７に記載のイムノバインダー。
（項目４９）
前述の項目のいずれか一項に記載のイムノバインダーと、ヒトＶＥＧＦに対する結合を競合するイムノバインダー。
（項目５０）
前述の項目のいずれか一項に記載のイムノバインダーによって認識されるヒトＶＥＧＦ上のエピトープに対して、少なくとも１０７Ｍ−１の親和性で結合するイムノバインダー。
（項目５１）
ヒトおよびラット／マウスＶＥＧＦに特異的に結合する、前述の項目のいずれか一項に記載のイムノバインダー。
（項目５２）
抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、またはＤａｂである、前述の項目のいずれか一項に記載のイムノバインダー。
（項目５３）
前述の項目のいずれか一項に記載のイムノバインダー、および薬学的に許容される担体を含む組成物。
（項目５４）
前述の項目のいずれか一項に記載のイムノバインダーをコードしている、単離された核酸分子。
（項目５５）
項目５４に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
（項目５６）
項目５５に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
（項目５７）
被験体がＶＥＧＦ媒介性疾患について処置されるように、前述の項目のいずれか一項に記載のイムノバインダーを前記被験体に投与することを含む、被験体におけるヒトＶＥＧＦ媒介性疾患を処置または予防する方法。
（項目５８）
前記イムノバインダーを局所的に投与する、項目５７に記載の方法。
（項目５９）
前記ＶＥＧＦ媒介性疾患が、加齢黄斑変性、新生血管形成緑内障、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、水晶体後線維増殖症、乳癌、肺癌、胃癌、食道癌、直腸結腸癌、肝臓癌、卵巣癌、昏睡、卵巣男性胚細胞腫、子宮頸癌、子宮内膜癌、子宮内膜増殖症、子宮内膜症、線維肉腫、絨毛癌、頭部および頸部のがん、上咽頭癌、鼻咽腔癌、肝芽腫、カポジ肉腫、メラノーマ、皮膚癌、血管腫、海綿状血管腫、血管芽細胞腫、膵臓癌、網膜芽細胞腫、星細胞腫、膠芽腫、神経鞘腫、乏突起膠腫、髄芽腫、神経芽細胞腫、横紋筋肉腫、骨原性肉腫、平滑筋肉腫、尿路癌、甲状腺癌、ウィルムス腫、腎細胞癌、前立腺癌、母斑症に付随する異常血管増殖、浮腫（脳腫瘍に付随するものなど）、メグズ症候群、慢性関節リウマチ、乾癬、ならびにアテローム性動脈硬化症からなる群より選択される、項目５７または５８に記載の方法。
（項目６０）
配列番号６０〜１６６、および配列番号１７５〜１８０に記載するアミノ酸配列の任意の１つを含む抗体を生成するハイブリドーマ。
（項目６１）
ラット／マウスおよびヒトのＶＥＧＦ、またはその部分と交差反応性であるイムノバインダーを産生、または同定するのに適する免疫原。
（項目６２）
配列番号１を有する、項目６１に記載の免疫原。
（項目６３）
ラット／マウスおよびヒトのＶＥＧＦと交差反応性であるイムノバインダーを作製する方法であって、項目６１に記載の免疫原を使用する、方法。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１ａ】図１は、Ｂｉａｃｏｒｅ（ｈＶＥＧＦ１６５）を用いて、ｈＶＥＧＦ１６５と選択されたｓｃＦｖとの結合動態を示すグラフである。図１ａは、５１１ｍａｘに関して得られたデータ：Ｋａ（１／Ｍｓ）：６．５９Ｅ＋０５；ＳＥ（ｋａ）：１．１０Ｅ＋０３；ｋｄ（１／ｓ）：４．４０Ｅ−０５；ＳＥ（ｋｄ）：６．３０Ｅ−０７；ＫＤ（Ｍ）：６．６７Ｅ−１１を示す。図１ｂは、５７８ｍａｘに関して得られたデータ：Ｋａ（１／Ｍｓ）：７．００Ｅ＋０５；ＳＥ（ｋａ）：１．４０Ｅ＋０３；ｋｄ（１／ｓ）：３．０７Ｅ−０４；ＳＥ（ｋｄ）：８．５０Ｅ−０７；ＫＤ（Ｍ）：４．３９Ｅ−１０を示す。
【図１ｂ】図１は、Ｂｉａｃｏｒｅ（ｈＶＥＧＦ１６５）を用いて、ｈＶＥＧＦ１６５と選択されたｓｃＦｖとの結合動態を示すグラフである。図１ａは、５１１ｍａｘに関して得られたデータ：Ｋａ（１／Ｍｓ）：６．５９Ｅ＋０５；ＳＥ（ｋａ）：１．１０Ｅ＋０３；ｋｄ（１／ｓ）：４．４０Ｅ−０５；ＳＥ（ｋｄ）：６．３０Ｅ−０７；ＫＤ（Ｍ）：６．６７Ｅ−１１を示す。図１ｂは、５７８ｍａｘに関して得られたデータ：Ｋａ（１／Ｍｓ）：７．００Ｅ＋０５；ＳＥ（ｋａ）：１．４０Ｅ＋０３；ｋｄ（１／ｓ）：３．０７Ｅ−０４；ＳＥ（ｋｄ）：８．５０Ｅ−０７；ＫＤ（Ｍ）：４．３９Ｅ−１０を示す。
【図２ａ】図２は、ヒト、マウスおよびラットＶＥＧＦに対する５７８ｍａｘの結合動態を示すことにより種特異性を示すグラフである。図２ａは、ヒトＶＥＧＦ１６５に関して得られたデータ：Ｋａ（１／Ｍｓ）：７．００Ｅ＋０５；ＳＥ（ｋａ）：１．４０Ｅ＋０３；ｋｄ（１／ｓ）：３．０７Ｅ−０４；ＳＥ（ｋｄ）：８．５０Ｅ−０７；ＫＤ（Ｍ）：４．３９Ｅ−１０を示す。図２ｂは、マウスＶＥＧＦ１６４に関して得られたデータ：Ｋａ（１／Ｍｓ）：１．０３Ｅ＋０６；ＳＥ（ｋａ）：２．３０Ｅ＋０３；ｋｄ（１／ｓ）：４．４０Ｅ−０４；ＳＥ（ｋｄ）：９．４０Ｅ−０７；ＫＤ（Ｍ）：４．２９Ｅ−１０を示す。図２ｃは、ラットＶＥＧＦ１６４に関して得られたデータ：Ｋａ（１／Ｍｓ）：８．８３Ｅ＋０５；ＳＥ（ｋａ）：２．５０Ｅ＋０３；ｋｄ（１／ｓ）：５．２８Ｅ−０４；ＳＥ（ｋｄ）：１．２０Ｅ−０６；ＫＤ（Ｍ）：５．９８Ｅ−１０を示す。
【図２ｂ】図２は、ヒト、マウスおよびラットＶＥＧＦに対する５７８ｍａｘの結合動態を示すことにより種特異性を示すグラフである。図２ａは、ヒトＶＥＧＦ１６５に関して得られたデータ：Ｋａ（１／Ｍｓ）：７．００Ｅ＋０５；ＳＥ（ｋａ）：１．４０Ｅ＋０３；ｋｄ（１／ｓ）：３．０７Ｅ−０４；ＳＥ（ｋｄ）：８．５０Ｅ−０７；ＫＤ（Ｍ）：４．３９Ｅ−１０を示す。図２ｂは、マウスＶＥＧＦ１６４に関して得られたデータ：Ｋａ（１／Ｍｓ）：１．０３Ｅ＋０６；ＳＥ（ｋａ）：２．３０Ｅ＋０３；ｋｄ（１／ｓ）：４．４０Ｅ−０４；ＳＥ（ｋｄ）：９．４０Ｅ−０７；ＫＤ（Ｍ）：４．２９Ｅ−１０を示す。図２ｃは、ラットＶＥＧＦ１６４に関して得られたデータ：Ｋａ（１／Ｍｓ）：８．８３Ｅ＋０５；ＳＥ（ｋａ）：２．５０Ｅ＋０３；ｋｄ（１／ｓ）：５．２８Ｅ−０４；ＳＥ（ｋｄ）：１．２０Ｅ−０６；ＫＤ（Ｍ）：５．９８Ｅ−１０を示す。
【図２ｃ】図２は、ヒト、マウスおよびラットＶＥＧＦに対する５７８ｍａｘの結合動態を示すことにより種特異性を示すグラフである。図２ａは、ヒトＶＥＧＦ１６５に関して得られたデータ：Ｋａ（１／Ｍｓ）：７．００Ｅ＋０５；ＳＥ（ｋａ）：１．４０Ｅ＋０３；ｋｄ（１／ｓ）：３．０７Ｅ−０４；ＳＥ（ｋｄ）：８．５０Ｅ−０７；ＫＤ（Ｍ）：４．３９Ｅ−１０を示す。図２ｂは、マウスＶＥＧＦ１６４に関して得られたデータ：Ｋａ（１／Ｍｓ）：１．０３Ｅ＋０６；ＳＥ（ｋａ）：２．３０Ｅ＋０３；ｋｄ（１／ｓ）：４．４０Ｅ−０４；ＳＥ（ｋｄ）：９．４０Ｅ−０７；ＫＤ（Ｍ）：４．２９Ｅ−１０を示す。図２ｃは、ラットＶＥＧＦ１６４に関して得られたデータ：Ｋａ（１／Ｍｓ）：８．８３Ｅ＋０５；ＳＥ（ｋａ）：２．５０Ｅ＋０３；ｋｄ（１／ｓ）：５．２８Ｅ−０４；ＳＥ（ｋｄ）：１．２０Ｅ−０６；ＫＤ（Ｍ）：５．９８Ｅ−１０を示す。
【図３ａ】図３は、ＶＥＧＦアイソフォーム（ｈＶＥＧＦ１２１およびｈＶＥＧＦ１１０）に対する５７８ｍａｘの結合動態を示すグラフである。図３ａは、ヒトＶＥＧＦ１６５に関して得られたデータ：Ｋａ（１／Ｍｓ）：７．００Ｅ＋０５；ＳＥ（ｋａ）：１．４Ｅ＋０３；ｋｄ（１／ｓ）：３．０７Ｅ−０４；ＳＥ（ｋｄ）：８．５０Ｅ−０７；ＫＤ（Ｍ）：４．３９Ｅ−１０を示す。図３ｂは、ヒトＶＥＧＦ１２１に関して得られたデータ：Ｋａ（１／Ｍｓ）：５．８７Ｅ＋０５；ＳＥ（ｋａ）：１．２０Ｅ＋０３；ｋｄ（１／ｓ）：５．５８Ｅ−０４；ＳＥ（ｋｄ）：９．６０Ｅ−０７；ＫＤ（Ｍ）：９．５０Ｅ−１１を示す。図３ｃは、ヒトＶＥＧＦ１１０に関して得られたデータ：Ｋａ（１／Ｍｓ）：５．２３Ｅ＋０５；ＳＥ（ｋａ）：１．３０Ｅ＋０３；ｋｄ（１／ｓ）：７．２２Ｅ−０４；ＳＥ（ｋｄ）：８．１０Ｅ−０７；ＫＤ（Ｍ）：１．３８Ｅ−０９を示す。
【図３ｂ】図３は、ＶＥＧＦアイソフォーム（ｈＶＥＧＦ１２１およびｈＶＥＧＦ１１０）に対する５７８ｍａｘの結合動態を示すグラフである。図３ａは、ヒトＶＥＧＦ１６５に関して得られたデータ：Ｋａ（１／Ｍｓ）：７．００Ｅ＋０５；ＳＥ（ｋａ）：１．４Ｅ＋０３；ｋｄ（１／ｓ）：３．０７Ｅ−０４；ＳＥ（ｋｄ）：８．５０Ｅ−０７；ＫＤ（Ｍ）：４．３９Ｅ−１０を示す。図３ｂは、ヒトＶＥＧＦ１２１に関して得られたデータ：Ｋａ（１／Ｍｓ）：５．８７Ｅ＋０５；ＳＥ（ｋａ）：１．２０Ｅ＋０３；ｋｄ（１／ｓ）：５．５８Ｅ−０４；ＳＥ（ｋｄ）：９．６０Ｅ−０７；ＫＤ（Ｍ）：９．５０Ｅ−１１を示す。図３ｃは、ヒトＶＥＧＦ１１０に関して得られたデータ：Ｋａ（１／Ｍｓ）：５．２３Ｅ＋０５；ＳＥ（ｋａ）：１．３０Ｅ＋０３；ｋｄ（１／ｓ）：７．２２Ｅ−０４；ＳＥ（ｋｄ）：８．１０Ｅ−０７；ＫＤ（Ｍ）：１．３８Ｅ−０９を示す。
【図４ａ】図４は、ｈＶＥＧＦ１６５に対する５７８ｍａｘ、５７８ｍｉｎｍａｘおよび５７８ｗｔの結合動態を表すグラフである。図４ａは、５７８ｍａｘに関して得られたデータ：Ｋａ（１／Ｍｓ）：７．００Ｅ＋０５；ＳＥ（ｋａ）：１．４０Ｅ＋０３；ｋｄ（１／ｓ）：３．０７Ｅ−０４；ＳＥ（ｋｄ）：８．５０Ｅ−０７；ＫＤ（Ｍ）：４．３９Ｅ−１０を示す。図４ｂは、５７８ｍｉｎｍａｘに関して得られたデータ：Ｋａ（１／Ｍｓ）：８．０６Ｅ＋０５；ＳＥ（ｋａ）：２．１０Ｅ＋０３；ｋｄ（１／ｓ）：５．０４Ｅ−０４；ＳＥ（ｋｄ）：１．１０Ｅ−０６；ＫＤ（Ｍ）：６．２５Ｅ−１０を示す。図４ｃは、５７８ｗｔ−Ｈｉｓに関して得られたデータ：Ｋａ（１／Ｍｓ）：８．４５Ｅ＋０５；ＳＥ（ｋａ）：１．６０Ｅ＋０３；ｋｄ（１／ｓ）：１．６９Ｅ−０４；ＳＥ（ｋｄ）：７．６０Ｅ−０７；ＫＤ（Ｍ）：２．００Ｅ−１０を示す。
【図４ｂ】図４は、ｈＶＥＧＦ１６５に対する５７８ｍａｘ、５７８ｍｉｎｍａｘおよび５７８ｗｔの結合動態を表すグラフである。図４ａは、５７８ｍａｘに関して得られたデータ：Ｋａ（１／Ｍｓ）：７．００Ｅ＋０５；ＳＥ（ｋａ）：１．４０Ｅ＋０３；ｋｄ（１／ｓ）：３．０７Ｅ−０４；ＳＥ（ｋｄ）：８．５０Ｅ−０７；ＫＤ（Ｍ）：４．３９Ｅ−１０を示す。図４ｂは、５７８ｍｉｎｍａｘに関して得られたデータ：Ｋａ（１／Ｍｓ）：８．０６Ｅ＋０５；ＳＥ（ｋａ）：２．１０Ｅ＋０３；ｋｄ（１／ｓ）：５．０４Ｅ−０４；ＳＥ（ｋｄ）：１．１０Ｅ−０６；ＫＤ（Ｍ）：６．２５Ｅ−１０を示す。図４ｃは、５７８ｗｔ−Ｈｉｓに関して得られたデータ：Ｋａ（１／Ｍｓ）：８．４５Ｅ＋０５；ＳＥ（ｋａ）：１．６０Ｅ＋０３；ｋｄ（１／ｓ）：１．６９Ｅ−０４；ＳＥ（ｋｄ）：７．６０Ｅ−０７；ＫＤ（Ｍ）：２．００Ｅ−１０を示す。
【図４ｃ】図４は、ｈＶＥＧＦ１６５に対する５７８ｍａｘ、５７８ｍｉｎｍａｘおよび５７８ｗｔの結合動態を表すグラフである。図４ａは、５７８ｍａｘに関して得られたデータ：Ｋａ（１／Ｍｓ）：７．００Ｅ＋０５；ＳＥ（ｋａ）：１．４０Ｅ＋０３；ｋｄ（１／ｓ）：３．０７Ｅ−０４；ＳＥ（ｋｄ）：８．５０Ｅ−０７；ＫＤ（Ｍ）：４．３９Ｅ−１０を示す。図４ｂは、５７８ｍｉｎｍａｘに関して得られたデータ：Ｋａ（１／Ｍｓ）：８．０６Ｅ＋０５；ＳＥ（ｋａ）：２．１０Ｅ＋０３；ｋｄ（１／ｓ）：５．０４Ｅ−０４；ＳＥ（ｋｄ）：１．１０Ｅ−０６；ＫＤ（Ｍ）：６．２５Ｅ−１０を示す。図４ｃは、５７８ｗｔ−Ｈｉｓに関して得られたデータ：Ｋａ（１／Ｍｓ）：８．４５Ｅ＋０５；ＳＥ（ｋａ）：１．６０Ｅ＋０３；ｋｄ（１／ｓ）：１．６９Ｅ−０４；ＳＥ（ｋｄ）：７．６０Ｅ−０７；ＫＤ（Ｍ）：２．００Ｅ−１０を示す。
【図５】図５は、５７８ｍａｘ、５７８ｍｉｎｍａｘおよび５７８ｍｉｎｍａｘ＿ＤＨＰの熱安定性を示すグラフである（ＦＴ−ＩＲによって測定されるアンフォールディング）。図５ａ：５７８ｍｉｎｍａｘ（ＥＳＢＡ９０３）：Ｔｍ＝７１．１℃；図５ｂ：５７８ｍｉｎｍａｘ＿ＤＨＰ（♯９６１）：Ｔｍ＝７０．２°Ｃ；図５ｃ：５７８ｍａｘ（♯８２１）：Ｔｍ＝７０．４℃。
【図６−１】図６は、３０分間の熱ストレス（図６ａ：５０℃、図６ｂ：６０℃、図６ｃ：７０℃）後の５７８誘導体の変性および沈殿を示すグラフである。
【図６−２】図６は、３０分間の熱ストレス（図６ａ：５０℃、図６ｂ：６０℃、図６ｃ：７０℃）後の５７８誘導体の変性および沈殿を示すグラフである。
【図７−１】図７は、５７８ｍａｘ、５７８ｍｉｎｍａｘおよび５７８ｍｉｎｍａｘ＿ＤＨＰの溶解性を示すグラフである（硫酸アンモニウム沈殿により決定される）。図７ａ：５７８ｍａｘ（♯８２１）。Ｖ５０は２７．２４％であった。図７ｂ：５７８ｍｉｎｍａｘ（ＥＳＢＡ９０３）。Ｖ５０は、２８．１３であった。図７ｃ：５７８ｍｉｎｍａｘ＿ＤＨＰ（♯９６１）。Ｖ５０は３２．３６％であった。
【図７−２】図７は、５７８ｍａｘ、５７８ｍｉｎｍａｘおよび５７８ｍｉｎｍａｘ＿ＤＨＰの溶解性を示すグラフである（硫酸アンモニウム沈殿により決定される）。図７ａ：５７８ｍａｘ（♯８２１）。Ｖ５０は２７．２４％であった。図７ｂ：５７８ｍｉｎｍａｘ（ＥＳＢＡ９０３）。Ｖ５０は、２８．１３であった。図７ｃ：５７８ｍｉｎｍａｘ＿ＤＨＰ（♯９６１）。Ｖ５０は３２．３６％であった。
【図８−１】図８は、能力を測定する方法として、ＨＵＶＥＣアッセイと対比させてＶＥＧＦＲ２競合ＥＬＩＳＡを示すグラフである。図８ａ：ＶＥＧＦＲ２競合ＥＬＩＳＡにおけるルセンティス（Ｌｕｃｅｎｔｉｓ）と５１１ｍａｘ（♯８０２）との比較。ルセンティスのＲ２：０．９４１７；ＥＳＢＡ８０２のＲ２：０．９７００。ルセンティスのＥＣ５０：７．１３７ｎＭ；♯８０２のＥＣ５０：０．８２２１ｎＭ。図８ｂ：ＶＥＧＦＲ２競合ＥＬＩＳＡにおけるルセンティスと５７８ｍａｘ（♯８２１）との比較。図８ｃ：ＨＵＶＥＣアッセイにおけるルセンティスと５１１ｍａｘＣ−ｈｉｓと５３４ｍａｘとの比較。ルセンティスのＲ２：０．９３９９；ＥＰ５１１ｍａｘＣ−ｈｉｓのＲ２：０．９３１３、ＥＰ５３４ｍａｘのＲ２：０．７３９１。ルセンティスのＥＣ５０：０．０８８２５ｎＭ、５１１ｍａｘＣ−ｈｉｓのＥＣ５０：０．７６４６ｎＭ、５３４ｍａｘのＥＣ５０：６３．４９ｎＭ。図８ｄ：ＨＵＶＥＣアッセイにおけるルセンティスと５７８ｍｉｎと５７８ｍａｘとの比較。ルセンティスのＲ２：０．９４１９、ＥＰ５７８ｍｉｎのＲ２：０．８８８６、ＥＰ５７８ｍａｘのＲ２：０．９２７４。ルセンティスのＥＣ５０：０．１５２９ｎＭ、５７８ｍｉｎのＥＣ５０：１．５２８ｎＭ、５７８ｍａｘのＥＣ５０：０．１０３１ｎＭ。
【図８−２】図８は、能力を測定する方法として、ＨＵＶＥＣアッセイと対比させてＶＥＧＦＲ２競合ＥＬＩＳＡを示すグラフである。図８ａ：ＶＥＧＦＲ２競合ＥＬＩＳＡにおけるルセンティス（Ｌｕｃｅｎｔｉｓ）と５１１ｍａｘ（♯８０２）との比較。ルセンティスのＲ２：０．９４１７；ＥＳＢＡ８０２のＲ２：０．９７００。ルセンティスのＥＣ５０：７．１３７ｎＭ；♯８０２のＥＣ５０：０．８２２１ｎＭ。図８ｂ：ＶＥＧＦＲ２競合ＥＬＩＳＡにおけるルセンティスと５７８ｍａｘ（♯８２１）との比較。図８ｃ：ＨＵＶＥＣアッセイにおけるルセンティスと５１１ｍａｘＣ−ｈｉｓと５３４ｍａｘとの比較。ルセンティスのＲ２：０．９３９９；ＥＰ５１１ｍａｘＣ−ｈｉｓのＲ２：０．９３１３、ＥＰ５３４ｍａｘのＲ２：０．７３９１。ルセンティスのＥＣ５０：０．０８８２５ｎＭ、５１１ｍａｘＣ−ｈｉｓのＥＣ５０：０．７６４６ｎＭ、５３４ｍａｘのＥＣ５０：６３．４９ｎＭ。図８ｄ：ＨＵＶＥＣアッセイにおけるルセンティスと５７８ｍｉｎと５７８ｍａｘとの比較。ルセンティスのＲ２：０．９４１９、ＥＰ５７８ｍｉｎのＲ２：０．８８８６、ＥＰ５７８ｍａｘのＲ２：０．９２７４。ルセンティスのＥＣ５０：０．１５２９ｎＭ、５７８ｍｉｎのＥＣ５０：１．５２８ｎＭ、５７８ｍａｘのＥＣ５０：０．１０３１ｎＭ。
【図９】図９は、ｈＶＥＧＦ１６５によって誘導されるＨＵＶＥＣ増殖に対する５７８ｍｉｎｍａｘの効果を示すグラフである。アッセイのパラメータは、ｈＶＥＧＦ１６５濃度：０．０８ｎＭ（３ｎｇ／ｍｌ）；ＶＥＧＦおよび試験アイテムを用いるインキュベーション：９６ｈであった。ＥＣ５０は、ルセンティスに関して０．０８９５９ｎＭ、５７８ｍｉｎｍａｘに関して０．０５５１６ｎＭであり、Ｒ２はルセンティスに関して０．９０６６、５７８ｍｉｎｍａｘに関して０．９６２２であった。
【図１０】図１０は、マウスＶＥＧＦ１６４およびラットＶＥＧＦ１６４によって誘導されるＨＵＶＥＣ増殖に対する５７８ｍｉｎｍａｘの効果を示すグラフである。アッセイのパラメータは、マウスＶＥＧＦ１６４濃度：０．０８ｎＭ（３ｎｇ／ｍｌ）；ラットＶＥＧＦ１６４濃度：０．３ｎＭ（１１．３ｎｇ／ｍｌ）であった。両濃度は、ＶＥＧＦ誘導型ＨＵＶＥＣ増殖に関するＥＣ９０で選択された；ＶＥＧＦおよび試験アイテムを用いるインキュベーション：９６ｈ。図１０ａは、マウスＶＥＧＦに関して得られたデータを示す。ＥＣ５０は、Ｖ１２５３に関して０．１１９６ｎＭ、５７８ｍｉｎｍａｘに関して０．０６３０９ｎＭであり、Ｒ２は、ルセンティスに関して０．０２７４４、Ｖ１２５３に関して０．９３４８、およびＥＰ５７８ｍｉｎｍａｘに関して０．９７６７であった。ルセンティスは、マウスＶＥＧＦによって誘導されるＨＵＶＥＣ増殖を阻害しなかった。図１０ｂは、ラットＶＥＧＦに関して得られたデータを示す。ＥＣ５０は、Ｖ１２５３に関して１．５９７ｎＭ、５７８ｍｉｎｍａｘに関して０．０６９７４ｎＭであり、Ｒ２は、Ｖ１２５３に関して００．７６６４、５７８ｍｉｎｍａｘに関して０．６６３５であった。
【図１１】図１１は、ヌードモルモットにおいてＭｉｌｅｓアッセイを用いた効能試験を示す図である（パートＩ）。色素アラマーブルー（ａｌｍａｒ  ｂｌｕｅ）１を、ヌードモルモットに静脈内投与した。色素注射して１時間後、ｈＶＥＧＦ（２．６１ｎＭ）およびルセンティス、ＥＳＢＡ９０３または♯８０２の前混合物２を、それぞれ動物３の皮膚に注射した。溶液を注射して１時間後、動物３を安楽死させ、裸皮を採取し、浄化し、入射および透過光を用いてデジタル撮影した。注射部位に溢出したエバンスブルー色素の面積を、ＩｍａｇｅＪを用いて評価し、用量−面積の保持をプロットした。
【図１２ａ】図１２は、ヌードモルモットにおいてＭｉｌｅｓアッセイを用いた効能試験を示すグラフである（パートＩＩ）。図１２ａは、♯８０３（５１１ｍａｘ）に関して得られた結果を示す。ＥＣ５０は５．９９０ｎＭであり、２．０６０〜１７．４１ｎＭの間の統計的な広がりを有し、Ｒ２は０．５８００であった。図１２ｂは、ＥＳＢＡ９０３（５７８ｍｉｎｍａｘ）に関して得られた結果を示す。ＥＣ５０は３．９８９であり、１．４５６〜１０．９３ｎＭの間の統計的な広がりを有し、Ｒ２は０．３９２０であった。図１２ｃは、ルセンティスに関する色素漏出の面積を示す。ＥＣ５０は、曲線とあまりフィットしなかったため、ルセンティスに関して計算できなかった。
【図１２ｂ】図１２は、ヌードモルモットにおいてＭｉｌｅｓアッセイを用いた効能試験を示すグラフである（パートＩＩ）。図１２ａは、♯８０３（５１１ｍａｘ）に関して得られた結果を示す。ＥＣ５０は５．９９０ｎＭであり、２．０６０〜１７．４１ｎＭの間の統計的な広がりを有し、Ｒ２は０．５８００であった。図１２ｂは、ＥＳＢＡ９０３（５７８ｍｉｎｍａｘ）に関して得られた結果を示す。ＥＣ５０は３．９８９であり、１．４５６〜１０．９３ｎＭの間の統計的な広がりを有し、Ｒ２は０．３９２０であった。図１２ｃは、ルセンティスに関する色素漏出の面積を示す。ＥＣ５０は、曲線とあまりフィットしなかったため、ルセンティスに関して計算できなかった。
【図１２ｃ】図１２は、ヌードモルモットにおいてＭｉｌｅｓアッセイを用いた効能試験を示すグラフである（パートＩＩ）。図１２ａは、♯８０３（５１１ｍａｘ）に関して得られた結果を示す。ＥＣ５０は５．９９０ｎＭであり、２．０６０〜１７．４１ｎＭの間の統計的な広がりを有し、Ｒ２は０．５８００であった。図１２ｂは、ＥＳＢＡ９０３（５７８ｍｉｎｍａｘ）に関して得られた結果を示す。ＥＣ５０は３．９８９であり、１．４５６〜１０．９３ｎＭの間の統計的な広がりを有し、Ｒ２は０．３９２０であった。図１２ｃは、ルセンティスに関する色素漏出の面積を示す。ＥＣ５０は、曲線とあまりフィットしなかったため、ルセンティスに関して計算できなかった。
【図１３ａ】図１３は、ラットにおいて修正したｍｉｌｅｓアッセイを用いた効能試験を示すグラフである（ｈＶＥＧＦ１６５および５７８ｍｉｎｍａｘ（ＥＳＢＡ９０３）を前混合した）。図１３ａは、ラットにおけるＶＥＧＦ誘導型網膜血管性漏出に対するアバスチン（Ａｖａｓｔｉｎ）の抗透過性の効能−用量応答を示す。アバスチンは、ｈＶＥＧＦ誘導型網膜血管性透過性を阻害する。注射の前に前混合した。およそ等モル、３倍または１０倍の過剰。＊ｐ＜０．０５（ＶＥＧＦ対ＢＳＡ）、＊＊ｐ＜０．０５（アバスチン処置対ＶＥＧＦ）。図１３ｂは、ラットにおけるＶＥＧＦ誘導型網膜血管性漏出に対するＥＳＢＡ９０３の抗透過性の効能を示す。用量応答（前混合した、ｉｖｔ）。ＥＳＢＡ９０３によるｈＶＥＧＦ誘導型網膜血管性透過性の完全な阻害。注射の前に前混合した。およそ等モル、３倍または１０倍の過剰。＊ｐ＜０．０５（ＶＥＧＦ対ＢＳＡ）、＊＊ｐ＜０．０５（ＥＳＢＡ９０３処置対ＶＥＧＦ）。
【図１３ｂ】図１３は、ラットにおいて修正したｍｉｌｅｓアッセイを用いた効能試験を示すグラフである（ｈＶＥＧＦ１６５および５７８ｍｉｎｍａｘ（ＥＳＢＡ９０３）を前混合した）。図１３ａは、ラットにおけるＶＥＧＦ誘導型網膜血管性漏出に対するアバスチン（Ａｖａｓｔｉｎ）の抗透過性の効能−用量応答を示す。アバスチンは、ｈＶＥＧＦ誘導型網膜血管性透過性を阻害する。注射の前に前混合した。およそ等モル、３倍または１０倍の過剰。＊ｐ＜０．０５（ＶＥＧＦ対ＢＳＡ）、＊＊ｐ＜０．０５（アバスチン処置対ＶＥＧＦ）。図１３ｂは、ラットにおけるＶＥＧＦ誘導型網膜血管性漏出に対するＥＳＢＡ９０３の抗透過性の効能を示す。用量応答（前混合した、ｉｖｔ）。ＥＳＢＡ９０３によるｈＶＥＧＦ誘導型網膜血管性透過性の完全な阻害。注射の前に前混合した。およそ等モル、３倍または１０倍の過剰。＊ｐ＜０．０５（ＶＥＧＦ対ＢＳＡ）、＊＊ｐ＜０．０５（ＥＳＢＡ９０３処置対ＶＥＧＦ）。
【図１４】図１４は、ラットにおいて修正したｍｉｌｅｓアッセイを用いた効能試験を示すグラフである（５７８ｍｉｎｍａｘ（ＥＳＢＡ９０３）の局所投与）。ラットにおけるＶＥＧＦ誘導型網膜血管性漏出に対するＡＬ−５１２８７（ＥＳＢＡ９０３）の抗透過性の効能を、局所投与で試験した。５日間の前処置、ＥＳＢＡ９０３処方物１０ｎｇ／ｍｌを４液滴／日。＊ｐ＜０．０５（ＶＥＧＦ対ＢＳＡ）、＊＊ｐ＜０．０５（ＶＥＧＦ対ＡＬ−５１２８７）、＊＊＊ｐ＝０．０６０（ＡＬ−５１２８７対ＡＬ−５２６６７）、＊＊＊＊（ＶＥＧＦ対ＡＬ−３９３２４）；ｐ＜０．０５（ＡＬ−３９３２４対ビヒクル参照対照）。ＡＬ−５１２８７：ＥＳＢＡ９０３；ＡＬ−５２６５７：局所的なビヒクル参照対照；ＡＬ−３９３２４：低分子ＲＴＫインヒビター。
【図１５】図１５は、本明細書で使用されるようなＶＨのＣＤＲ１の定義を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
（詳細な説明）
本発明は、ウサギモノクローナル抗体からのＣＤＲを含む、可溶性で安定な抗ＶＥＧＦイムノバインダーを提供する。前記イムノバインダーは、ＶＥＧＦ媒介性障害の診断および／または処置のためにデザインされている。本発明の組換え抗体を発現するためのハイブリドーマ、核酸、ベクター、および宿主細胞、これらを単離するための方法、ならびに医薬における前記抗体の使用も開示する。
【００１０】
（定義）
本発明がより容易に理解され得るために、ある種の用語を以下の通りに定義する。さらなる定義を、詳細な説明を通して記載する。
【００１１】
「ＶＥＧＦ」という用語は、Ｌｅｕｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４６巻、１３０６頁（１９８９年）、およびＨｏｕｃｋら、Ｍｏｌ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎ．、５巻、１８０６頁（１９９１年）によって記載されている通り、アミノ酸１６５個の血管内皮細胞増殖因子、ならびに関連の、アミノ酸１２１個、１８９個、および２０６個の血管内皮細胞増殖因子を、これら増殖因子の天然に存在している対立形質および加工型と併せて意味する。
【００１２】
「ＶＥＧＦ受容体」または「ＶＥＧＦｒ」という用語は、ＶＥＧＦに対する細胞の受容体、通常、血管内皮細胞上に見られる細胞表面受容体、およびｈＶＥＧＦに結合する能力を保持しているその改変体を意味する。ＶＥＧＦ受容体の一例は、チロシンキナーゼファミリーにおける膜貫通型受容体であるｆｍｓ様チロシンキナーゼ（ｆｌｔ）である。ＤｅＶｒｉｅｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５５巻、９８９頁（１９９２年）；Ｓｈｉｂｕｙａら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、５巻、５１９頁（１９９０年）。ｆｌｔ受容体は、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、およびチロシンキナーゼ活性を有する細胞内ドメインを含んでいる。細胞外ドメインはＶＥＧＦの結合に関与し、一方、細胞内ドメインはシグナル伝達に関与している。ＶＥＧＦ受容体の別の一例はｆｌｋ−１受容体（ＫＤＲとも呼ばれる）である。Ｍａｔｔｈｅｗｓら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．、８８巻、９０２６頁（１９９１年）；Ｔｅｒｍａｎら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、６巻、１６７７頁（１９９１年）；Ｔｅｒｍａｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．、１８７巻、１５７９頁（１９９２年）。ＶＥＧＦがｆｌｔ受容体に結合すると、２０５，０００ダルトンおよび３００，０００ダルトンの見かけの分子量を有する、少なくとも２つの高分子量複合体の形成がもたらされる。３００，０００ダルトンの複合体は、ＶＥＧＦの単一分子が結合した受容体分子を２個含むダイマーであると考えられている。
【００１３】
本明細書で用いられる「ウサギ」という用語は、ｌｅｐｏｒｉｄａｅ科に属する動物を意味する。
【００１４】
本明細書で用いられる「抗体」という用語は「免疫グロブリン」の同義語である。本発明による抗体は、免疫グロブリン全体、または、単一可変ドメインであるＦｖ（Ｓｋｅｒｒａ  Ａ．およびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ，  Ａ．（１９８８年）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４０巻、１０３８〜４１頁）、ｓｃＦｖ（Ｂｉｒｄ，  Ｒ．  Ｅ．ら（１９８８年）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２巻４２３〜２６頁；Ｈｕｓｔｏｎ，  Ｊ．  Ｓ．ら（１９８８年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８５巻、５８７９〜８３頁）、Ｆａｂ、（Ｆａｂ’）２、もしくは当業者には周知の他のフラグメントなどの、免疫グロブリンの可変ドメインを少なくとも１つ含む免疫グロブリンのフラグメントであってよい。
【００１５】
「ＣＤＲ」という用語は、抗原の結合に主に寄与する抗体の可変ドメイン内の６つの超可変領域の１つを意味する。６つのＣＤＲに対して最も一般的に用いられる定義の１つは、Ｋａｂａｔ  Ｅ．Ａ．ら、（１９９１年）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ．、ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ、９１〜３２４２頁によって提供されたものである。本明細書で用いられるように、ＣＤＲのＫａｂａｔの定義は、軽鎖可変ドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３（ＣＤＲ  Ｌ１、ＣＤＲ  Ｌ２、ＣＤＲ  Ｌ３、またはＬ１、Ｌ２、Ｌ３）ならびに重鎖可変ドメインのＣＤＲ２およびＣＤＲ３（ＣＤＲ  Ｈ２、ＣＤＲ  Ｈ３、またはＨ２、Ｈ３）に対してのみあてはまる。しかし、本明細書で用いられる場合、重鎖可変ドメインのＣＤＲ１（ＣＤＲ  Ｈ１またはＨ１）は以下の残基によって定義される（Ｋａｂａｔナンバリング）：位置２６で始まり位置３６の前で終了する残基。これは、基本的には、ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｉａにより異なって定義されるＣＤＲ  Ｈ１の融合物である（説明のために図１５も参照されたい）。
【００１６】
本明細書で用いられる「抗体フレームワーク」またはあるときには「フレームワーク」のみという用語は、この可変ドメインの抗原結合性ループ（ＣＤＲ）に対する骨格として働く、ＶＬまたはＶＨいずれかの可変ドメインの部分を意味する。本質的に、これはＣＤＲのない可変ドメインである。
【００１７】
「単鎖抗体」、「単鎖Ｆｖ」、または「ｓｃＦｖ」という用語は、リンカーによって連結されている抗体重鎖可変ドメイン（または領域；ＶＨ）および抗体軽鎖可変ドメイン（または領域；ＶＬ）を含む分子を意味するものとされる。このようなｓｃＦｖ分子は、一般構造：ＮＨ２−ＶＬ−リンカー−ＶＨ−ＣＯＯＨまたはＮＨ２−ＶＨ−リンカー−ＶＬ−ＣＯＯＨを有することができる。
【００１８】
本明細書で用いられる「同一性」は、２つのポリペプチド間、分子間、または２つの核酸間でマッチする配列を意味する。比較された２つの配列の両方における位置が同じ塩基、または同じアミノ酸モノマーサブユニットによって占められている場合（例えば、各々の２つのＤＮＡ分子におけるある位置がアデニンによって占められている場合、または各々の２つのポリペプチドにおけるある位置がリジンによって占められている場合）、それぞれの分子はその位置で同一である。２つの配列間の「パーセント同一性」は、２つの配列が共有するマッチする位置（ｍａｔｃｈｉｎｇ  ｐｏｓｉｔｉｏｎ）数を、比較する位置数によって除して１００をかけた関数である。例えば、２つの配列における１０個の位置のうち６個がマッチした場合、この２つの配列は６０％の同一性を有する。一例として、ＤＮＡ配列ＣＴＧＡＣＴとＣＡＧＧＴＴとは５０％の同一性を共有する（全部で６個の位置のうち３個がマッチしている）。一般的に、２つの配列を、最大の同一性をもたらすように整列させた場合に比較が行われる。このようなアラインメントは、例えば、Ａｌｉｇｎプログラム（ＤＮＡｓｔａｒ，Ｉｎｃ．）などのコンピュータプログラムによって便利に実行される、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら、（１９７０年）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、４８巻、４４３〜４５３頁の方法を用いて提供され得る。２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、ＰＡＭ１２０ウェイト残基表、ギャップレングスペナルティ１２、およびギャップペナルティ４を用いて、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）中に組み入れられたＥ．  ＭｅｙｅｒｓおよびＷ．  Ｍｉｌｌｅｒのアルゴリズム（Ｃｏｍｐｕｔ．
Ａｐｐｌ．  Ｂｉｏｓｃｉ．、４巻１１〜１７頁（１９８８年））を用いてやはり決定することができる。さらに、２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、Ｂｌｏｓｓｕｍ  ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのいずれか、およびギャップウェイト１６、１４、１２、１０、８、６、または４、およびレングスウェイト１、２、３、４、５、または６を用いて、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍにて入手可能）においてＧＡＰプログラム中に組み入れられた、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、４８巻、４４４〜４５３頁（１９７０年））のアルゴリズムを用いて決定され得る。
【００１９】
「類似の」配列は、整列した場合に、同一および類似のアミノ酸残基を共有する配列であり、この場合、類似の残基は、整列した参照配列における対応するアミノ酸残基に対する保存的置換である。この点において、参照配列における残基の「保存的置換」は、対応する参照の残基に物理的または機能的に類似する残基、例えば、類似のサイズ、形状、電荷、化学的特性（共有結合または水素結合を形成する能力などを含む）を有する残基による置換である。したがって、「保存的置換改変」配列は、１つまたは複数の保存的置換が存在する点で、参照配列または野生型の配列とは異なるものである。２つの配列間の「パーセント類似性」は、２つの配列が共有するマッチする残基または保存的置換を含む位置の数を、比較する位置の数によって除して１００をかけた関数である。例えば、２つの配列における１０個の位置のうち６個がマッチし、１０個の位置のうち２個が保存的置換を含んでいる場合、この２つの配列は８０％ポジティブな類似性を有する。
【００２０】
本明細書で用いられる「保存的配列改変」という用語は、アミノ酸配列を含む抗体の結合性の特徴にネガティブな影響を及ぼさず、またはそれを変更しないアミノ酸の改変を意味するものとされる。このような保存的配列改変には、ヌクレオチドおよびアミノ酸の置換、付加、および欠失が含まれる。例えば、改変は、部位特異的変異誘発およびＰＣＲ媒介性の変異誘発など、当該分野で公知の標準技術によって導入されてよい。アミノ酸の保存的置換には、アミノ酸残基が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されるものが含まれる。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該分野において定義されている。これらのファミリーとしては、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性の側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、無電荷の極性の側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、無極性の側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β分枝した側鎖を有するアミノ酸（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が挙げられる。したがって、ヒト抗ＶＥＧＦ抗体における予測される非必須アミノ酸残基は、好ましくは、同一の側鎖のファミリーからの別のアミノ酸残基で置換される。抗原結合性を除去しない、ヌクレオチドおよびアミノ酸の保存的置換を同定する方法は当該分野において周知である（例えば、Ｂｒｕｍｍｅｌｌら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．、３２巻、１１８０〜１１８７頁（１９９３年）；Ｋｏｂａｙａｓｈｉら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．、１２巻（１０）：８７９〜８８４頁（１９９９年）；およびＢｕｒｋｓら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、９４巻、４１２〜４１７頁（１９９７年）を参照されたい）。
【００２１】
本明細書で用いられる「アミノ酸コンセンサス配列」は、少なくとも２つ、好ましくはそれを超える整列しているアミノ酸配列のマトリックスを用い、各位置の最も高頻度のアミノ酸残基を決定することが可能であるように、アラインメントにおけるギャップを可能にすることで産生することができるアミノ酸配列を意味する。コンセンサス配列は、各位置で最も高頻度に現れるアミノ酸を含む配列である。２つまたはそれを超えるアミノ酸が単一の位置で等しく現れる場合は、コンセンサス配列にはこれらのアミノ酸の両方または全てが含まれる。
【００２２】
タンパク質のアミノ酸配列は、様々なレベルで分析することができる。例えば、保存または変動性は、単一残基レベルで、複数残基レベルで、ギャップを有する複数の残基などで表されてよい。残基は、同一の残基の保存を示すことがあり、またはクラスレベルで保存されることがある。アミノ酸のクラスの例としては、極性無電荷Ｒ群（セリン、スレオニン、アスパラギン、およびグルタミン）、正電荷Ｒ群（リジン、アルギニン、およびヒスチジン）、負電荷Ｒ群（グルタミン酸、およびアスパラギン酸）、疎水性Ｒ群（アラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、バリン、およびチロシン）、ならびに特別なアミノ酸（システイン、グリシン、およびプロリン）が挙げられる。他のクラスは当業者には公知であり、構造決定または置換可能性を評価するための他のデータを用いて定義し得る。この意味において、置換可能なアミノ酸は、その位置で、置換され得、機能的保存を維持し得る、任意のアミノ酸を意味し得る。
【００２３】
しかし、同じクラスのアミノ酸は、その生物物理学的特性によってある程度変動することがあることが理解される。例えば、ある種の疎水性Ｒ群（例えば、アラニン、セリン、またはスレオニン）は、他の疎水性Ｒ群（例えば、バリンまたはロイシン）よりも親水性である（すなわち、親水性が高いか、または疎水性が低い）ことが理解される。相対的な親水性または疎水性は、当該分野で認められている方法を用いて決定することができる（例えば、Ｒｏｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２９巻、８３４〜８３８頁（１９８５年）、およびＣｏｒｎｅｔｔｅら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、１９５巻、６５９〜６８５頁（１９８７年）を参照されたい）。
【００２４】
本明細書で用いられる通り、１つのアミノ酸配列（例えば、最初のＶＨまたはＶＬの配列）が１つまたは複数のさらなるアミノ酸配列（例えば、データベースにおける１つまたは複数のＶＨまたはＶＬの配列）と整列する場合、１つの配列（例えば、最初のＶＨまたはＶＬの配列）におけるアミノ酸の位置は、上記の１つまたは複数のさらなるアミノ酸配列における「対応する位置」と比較されてよい。本明細書で用いられる「対応する位置」は、配列を最適に整列した場合の、すなわち、最高のパーセント同一性またはパーセント類似性を達成するように配列を整列した場合の、比較される（１つまたは複数の）配列における等しい位置を意味する。
【００２５】
本明細書で用いられる「抗体データベース」という用語は、２つまたはそれを超える抗体のアミノ酸配列のコレクション（「多様な」配列）を意味し、典型的には、数十、数百、またはさらには数千の抗体のアミノ酸配列のコレクションを意味する。抗体データベースは、抗体のＶＨ領域、抗体のＶＬ領域、もしくはその両方のコレクションなどのアミノ酸配列を蓄えることができ、またはＶＨ領域およびＶＬ領域からなるｓｃＦｖ配列のコレクションを蓄えることができる。データベースを、検索可能なコンピュータプログラム内のコンピュータ上などの、検索可能な固定媒体中に蓄えるのが好ましい。一実施形態において、抗体データベースは、生殖系列の抗体配列を含むか、またはそれからなるデータベースである。別の一実施形態において、抗体データベースは、成熟（すなわち、発現された）抗体配列を含むか、またはそれからなるデータベースである（例えば、成熟抗体配列のＫａｂａｔのデータベース、例えば、ＫＢＤデータベース）。さらに別の一実施形態において、抗体データベースは、機能的に選択された配列（例えば、ＱＣアッセイから選択された配列）を含むか、またはそれからなる。
【００２６】
「イムノバインダー」という用語は、抗体の抗原結合部位の全てまたは一部分（例えば、重鎖および／または軽鎖の可変ドメインの全てまたは一部分）を含む分子を意味し、そのためイムノバインダーは、標的の抗原を特異的に認識する。イムノバインダーの非限定的な例としては、全長の免疫グロブリン分子およびｓｃＦｖ、および、これらに限定されないが、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、およびＣＨ１ドメインからなる１価のフラグメントであるＦａｂフラグメント、（ｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結されている２つのＦａｂフラグメントを含む２価のフラグメントであるＦ（ａｂ’）２フラグメント、（ｉｉｉ）本質的に、ヒンジ領域の部分を有するＦａｂである、Ｆａｂ’フラグメント（Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｐａｕｌ編集、第３版、１９９３年）を参照されたい）、（ｉｖ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント、（ｖ）抗体の単腕のＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖフラグメント、（ｖｉ）ＶＨもしくはＶＬドメインからなるＤａｂフラグメント（Ｗａｒｄら、（１９８９年）Ｎａｔｕｒｅ、３４１巻、５４４〜５４６頁）、Ｃａｍｅｌｉｄ抗体（Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３６３巻、４４６〜４４８頁（１９９３年）およびＤｕｍｏｕｌｉｎら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、１１巻、５００〜５１５頁（２００２年）を参照されたい）またはＳｈａｒｋ抗体（例えば、ｓｈａｒｋ  Ｉｇ−ＮＡＲｓ  Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標））などの単一ドメイン抗体、ならびに（ｖｉｉ）可変ドメインおよび２つの定常ドメインを含む重鎖領域であるナノボディ、を含む抗体フラグメントが挙げられる。
【００２７】
本明細書で用いられる「機能特性」という用語は、例えば、ポリペプチドの製造上の特性または治療の効能を改善するために、改善（例えば、従来のポリペプチドに比べて）が望ましく、かつ／または当業者にとって有利であるポリペプチド（例えば、イムノバインダー）の特性である。一実施形態において、機能特性は安定性（例えば、熱安定性）である。別の一実施形態において、機能特性は溶解性（例えば、細胞性条件下の）である。さらに別の一実施形態において、機能特性は非凝集性である。なお別の一実施形態において、機能特性はタンパク質の発現（例えば、原核細胞における）である。さらに別の一実施形態において、機能特性は、対応する精製プロセスにおいて封入体を可溶化した後のリフォールディング効率である。ある実施形態において、抗原結合親和性は、改善に望ましい機能特性ではない。
【００２８】
「エピトープ」または「抗原決定基」という用語は、免疫グロブリンまたは抗体が特異的に結合する抗原上の（例えば、ＶＥＧＦ上の）部位を意味する。エピトープは、典型的には、独特の空間的コンフォメーションにおける、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５個の連続または非連続のアミノ酸を含む。例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、６６巻、Ｇ．  Ｅ．  Ｍｏｒｒｉｓ編集（１９９６年）を参照されたい。
【００２９】
「特異的結合」、「選択的結合」、「選択的に結合する」、および「特異的に結合する」という用語は、抗体が所定の抗原上のエピトープに結合することを意味する。典型的には、抗体は、約１０−８Ｍ、約１０−９Ｍ、もしくは約１０−１０Ｍ未満、またはそれよりさらに低いなどの、約１０−７Ｍ未満の親和性（ＫＤ）で結合する。
【００３０】
「ＫＤ」または「Ｋｄ」という用語は、特定の抗体−抗原相互作用の解離平衡定数を意味する。典型的には、本発明の抗体は、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ機器において表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法を用いて決定するとき、約１０−８Ｍ、約１０−９Ｍ、もしくは約１０−１０Ｍ未満、またはそれよりさらに低いなどの、約１０−７Ｍ未満の解離平衡定数（ＫＤ）でＶＥＧＦに結合する。
【００３１】
「ＶＥＧＦを中和する」、「ＶＥＧＦを阻害する」、および「ＶＥＧＦをブロックする」という用語は交換可能に用いられ、ＶＥＧＦがＶＥＧＦＲ−１および／またはＶＥＧＦＲ−２などの１つまたは複数のＶＥＧＦ受容体と相互作用するのを防ぎ、例えば、シグナル伝達の誘発を防ぐ、本発明の抗体の能力を意味する。
【００３２】
本明細書で用いられる「組換えイムノバインダー」は、組換えＤＮＡからの発現によって生成されるイムノバインダーを意味する。
【００３３】
本明細書で用いられる「キメラの」イムノバインダーは、特定の種に由来するか、または特定の抗体のクラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列に同一かまたは相同である、重鎖および／または軽鎖の部分を有し、一方（１つもしくは複数の）鎖の残りは、別の種に由来するか、または別の抗体のクラスもしくはサブクラスに属する抗体およびそのような抗体のフラグメントにおける対応する配列に同一かまたは相同である。本明細書で用いられるヒト化抗体は、キメラ抗体のサブセットである。
【００３４】
本明細書で用いられる「ヒト化抗体」は、外来の抗原に対する免疫応答を回避するために組換えＤＮＡ技術を用いて合成されたイムノバインダーである。ヒト化は、外因性供給源のモノクローナル抗体の免疫原性を低減するために十分に確立されている技術である。これは、アクセプターフレームワーク、好ましくはヒトアクセプターフレームワークの選択、アクセプターフレームワーク中に挿入されるドナーのイムノバインダーからのＣＤＲの程度、およびドナーのフレームワークからの残基のアクセプターフレームワーク中への置換に関連する。ＣＤＲをヒトアクセプターフレームワーク中に融合させるための一般的方法は、その全容が参照によって本明細書に援用されるＷｉｎｔｅｒの米国特許第５，２２５，５３９号によって開示されている。その教示が参照によってその全容において援用される米国特許第６，４０７，２１３号は、ドナーのイムノバインダーからの置換が好ましいフレームワークの数々のアミノ酸位置を開示している。
【００３５】
「核酸分子」という用語は、ＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子を意味する。核酸分子は一本鎖でも、または二本鎖でもよいが、二本鎖ＤＮＡが好ましい。核酸は、別の核酸配列と機能的関係において配置された場合、「作動可能に連結して」いる。例えば、プロモーターまたはエンハンサーがコード配列の転写に影響を及ぼす場合、その配列に作動可能に連結している。
【００３６】
「ベクター」という用語は、連結している別の核酸を運搬することができる核酸分子を意味する。ベクターの１タイプが「プラスミド」であり、これはその中にさらなるＤＮＡセグメントをライゲーション（ｌｉｇａｔｅ）することができる環状の二本鎖ＤＮＡのループを意味する。別のタイプのベクターはウイルスベクターであり、さらなるＤＮＡセグメントをウイルスゲノム中にライゲーションすることができる。ある種のベクターは、導入される宿主細胞において、自律的に複製することできる（例えば、細菌の複製開始点を有する細菌ベクター、およびエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）を、宿主細胞中への導入に際し宿主細胞のゲノム中に組み込むことができ、それによって、それらのベクターは宿主のゲノムと一緒に複製される。
【００３７】
「宿主細胞」という用語は、その中に発現ベクターが導入されている細胞を意味する。宿主細胞としては、細菌細胞、微生物細胞、植物細胞、または動物細胞が挙げられ得る。形質転換を受けやすい細菌としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉまたはサルモネラ属の菌株などの腸内細菌科のメンバー、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓなどのバチルス属、肺炎球菌、連鎖球菌およびＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅが挙げられる。適切な微生物としては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓが挙げられる。適切な動物宿主細胞系としては、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣細胞系）およびＮＳ０細胞が挙げられる。
【００３８】
「処置する（ｔｒｅａｔ）」、「処置する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、および「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」という用語は、本明細書に記載する治療的手段または予防的手段を意味する。「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」の方法は、障害または再発性の障害の１つまたは複数の症状を予防、治癒、遅延、症状の重症度の低減、または回復させるために、あるいは処置の非存在下で予想されるものを上回って被験体の生存を延長するために、処置を必要とする被験体、例えば、ＶＥＧＦ媒介性障害を有する被験体またはそのような障害を最終的に得る可能性がある被験体に対する本発明の抗体の投与を使用する。
【００３９】
「ＶＥＧＦ媒介性障害」という用語は、症状もしくは疾患状態の発症、進行、または持続がＶＥＧＦの関与を必要とする任意の障害を意味する。例示的ＶＥＧＦ媒介性障害としては、それだけには限定されないが、加齢黄斑変性、新生血管形成緑内障、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、水晶体後線維増殖症、乳癌、肺癌、胃癌、食道癌、直腸結腸癌、肝臓癌、卵巣癌、昏睡、卵巣男性胚細胞腫、子宮頸癌、子宮内膜癌、子宮内膜増殖症、子宮内膜症、線維肉腫、絨毛癌、頭部および頸部のがん、鼻咽腔癌、喉頭癌、肝芽腫、カポジ肉腫、メラノーマ、皮膚癌、血管腫、海綿状血管腫、血管芽細胞腫、膵臓癌、網膜芽細胞腫、星細胞腫、膠芽腫、神経鞘腫、乏突起膠腫、髄芽腫、神経芽細胞腫、横紋筋肉腫、骨原性肉腫、平滑筋肉腫、尿路癌、甲状腺癌、ウィルムス腫、腎細胞癌、前立腺癌、母斑症に付随する異常血管増殖、浮腫（脳腫瘍に付随するものなど）、メグズ症候群、慢性関節リウマチ、乾癬、ならびにアテローム性動脈硬化症が挙げられる。
【００４０】
「有効用量（ｄｏｓｅ）」、または「有効投与量（ｄｏｓａｇｅ）」という用語は、所望の効果を達成するのに、または少なくとも部分的に達成するのに十分な量を意味する。「治療有効用量」という用語は、すでに疾患に罹患している患者における疾患およびその合併症を治すか、または少なくとも部分的に停止させるのに十分な量と定義される。この使用に有効な量は、処置する障害の重症度、および患者自身の免疫系の全体的状態による。
【００４１】
「被験体」という用語は、任意のヒトまたは非ヒトの動物を意味する。例えば、本発明の方法および組成物を、ＶＥＧＦ媒介性障害を有する被験体を処置するのに用いることができる。
【００４２】
本明細書で用いられる「Ｍｉｎ−ｇｒａｆｔ」または「ｍｉｎ」という用語は、ウサギの可変ドメインからのウサギＣＤＲを、天然に存在するヒトアクセプターフレームワーク（ＦＷ１．４、配列番号１７２）中に融合させることによって産生されたヒト化可変ドメインを意味する。フレームワーク領域における変更はなされない。フレームワーク自体は、望ましい機能特性（溶解性および安定性）について予め選択されたものである。
【００４３】
本明細書で用いられる「Ｍａｘ−ｇｒａｆｔ」または「ｍａｘ」という用語は、ウサギの可変ドメインからのウサギＣＤＲを、「ウサギ化」、ヒトアクセプターフレームワークである「ＲａｂＴｏｒ」中に（ｒＦＷ１．４、配列番号１７３）、またはｒＦＷ１．４（ｖ２）（配列番号１７４）と呼ばれるその誘導体中に融合させることによって産生されたヒト化可変ドメインを意味する。「ＲａｂＴｏｒ」フレームワークは、推定可能前駆体配列において異なっている位置（例えば、体細胞の過剰変異中に変化し、したがって抗原の結合におそらく寄与する位置）以外のドナーのフレームワーク残基を融合させる必要なしに、実質的にあらゆるセットのウサギＣＤＲを受け入れる普遍的に適用可能なフレームワークを産生する目的で、ウサギ可変ドメインの構造および安定性に概ね関与するフレームワーク位置に、保存されているウサギの残基を組み入れることによって（そうでなければ、他の種においてかなり可変である）調製されたものである。推定可能前駆体配列は、最も近いウサギの生殖系列の対応物と定義され、最も近い生殖系列の対応物が確立できなかった場合は、ウサギのサブグループのコンセンサス配列または高パーセント値の類似性を有するウサギ配列のコンセンサス配列であると定義される。
【００４４】
本明細書で用いられる「Ｍｉｎ−Ｍａｘ」または「ｍｉｎｍａｘ」という用語は、「Ｍａｘ−ｇｒａｆｔ」の可変重鎖と組み合わされた「Ｍｉｎ−ｇｒａｆｔ」の可変軽鎖を含むヒト化可変ドメインを意味する。
【００４５】
本明細書で用いられる「Ｍａｘ−Ｍｉｎ」または「ｍａｘｍｉｎ」という用語は、「Ｍｉｎ−ｇｒａｆｔ」の可変重鎖と組み合わされた「Ｍａｘ−ｇｒａｆｔ」の可変軽鎖を含むヒト化可変ドメインを意味する。
【００４６】
産生したイムノバインダーに対して様々な用語体系を用いた。これらは、数字（例えば、♯５７８）によって通常同定される。ＥＰまたはＥＰｉなどの接頭辞を用いた場合は（例えば、Ｅｐｉ５７８と同一であるＥＰ５７８）、それによって、同じイムノバインダーを示す。イムノバインダーに、接頭辞「ＥＳＢＡ」により識別される第２の名称を与えることがある。例えば、ＥＳＢＡ９０３は、５７８ｍｉｎｍａｘ、またはＥＰ５７８ｍｉｎｍａｘ、またはＥｐｉ５７８ｍｉｎｍａｘと同じイムノバインダーを指す。
【００４７】
別段の定義がなければ、本明細書で用いる技術用語および科学用語は全て、本発明が属する技術分野における通常の技術者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本発明を実施または試験する上で、本明細書に記載したものと類似または等価の方法および材料を用いることができるが、適切な方法および材料を下に記載する。矛盾する場合には、定義を含めた本明細書が優先される。さらに、材料、方法、および実施例は例示にすぎず、限定することを意図しない。
【００４８】
本発明の様々な態様を、以下のサブセクションにおいてさらに詳しく記載する。様々な実施形態、選択、および範囲を任意に組み合わせることができることが理解される。さらに、特定の実施形態によっては、選択された定義、実施形態、または範囲を適用しなくてもよい。
【００４９】
（抗ＶＥＧＦイムノバインダー）
一態様において、本発明は、ＶＥＧＦに結合し、したがってインビボでＶＥＧＦの機能をブロックするのに適するイムノバインダーを提供する。これらイムノバインダーのＣＤＲは、ヒトＶＥＧＦおよび／またはそのフラグメント（配列番号１）で免疫化したウサギから得たウサギ抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体に由来する。本発明者らの知る限りでは、モノクローナル抗ＶＥＧＦ抗体をウサギから得、詳しく特徴付けたのはこれが初めてである。驚くべきことに、親和性（Ｋｄ）が並はずれて高いことが見出された。
【００５０】
ある実施形態において、本発明はＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、またはＣＤＲＬ３のアミノ酸配列のうちの少なくとも１つを含む、ＶＥＧＦに特異的に結合するイムノバインダーを提供する。本発明のイムノバインダーにおいて用いるための例示的ＣＤＲアミノ酸配列を、配列番号２〜７２（表１〜６）、
【００５１】
【表１】
2014158491.tif 000002
【００５２】
【表２−１】
2014158491.tif 000003
【００５３】
【表２−２】
2014158491.tif 000004
【００５４】
【表３】
2014158491.tif 000005
【００５５】
【表４−１】
2014158491.tif 000006
【００５６】
【表４−２】
2014158491.tif 000007
【００５７】
【表５】
2014158491.tif 000008
【００５８】
【表６】
2014158491.tif 000009
に記載する。
【００５９】
一実施形態において、本発明は、配列番号１４、配列番号２６、配列番号３７、配列番号４９、配列番号６０、および配列番号７１からなる群のコンセンサス配列に、少なくとも７５％の類似性、好ましくは少なくとも７５％の同一性、より好ましくは少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、さらにより好ましくは１００％の同一性を有するＣＤＲを少なくとも１つ含むイムノバインダーを提供する。好ましくは、前記イムノバインダーのＶＨは、配列番号１４、配列番号２６、および配列番号３７からなる群のＣＤＲを含み、かつ／または前記イムノバインダーのＶＬのＣＤＲは、配列番号４９、配列番号６０、および配列番号７１からなる群のＣＤＲを含む。好ましくは、ＣＤＲは、配列番号２から配列番号１３、配列番号１５から配列番号２５、配列番号２７から配列番号３６、配列番号３８から配列番号４８、配列番号５０から配列番号５９、および配列番号６１から配列番号７０からなる群より選択される。
【００６０】
別の一実施形態において、本発明は、配列番号２、配列番号３、配列番号１５、配列番号２７、配列番号３８、配列番号５０、および配列番号６１からなる群の配列に、少なくとも７５％の類似性、好ましくは少なくとも７５％の同一性、より好ましくは少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、さらにより好ましくは１００％の同一性を有するＣＤＲを少なくとも１つ含むイムノバインダーを提供する。好ましくは、前記イムノバインダーのＶＨは、配列番号２、配列番号１５、および配列番号２７からなる群のＣＤＲを含み、かつ／または前記イムノバインダーのＶＬのＣＤＲは、配列番号３８、配列番号５０、および配列番号６１からなる群のＣＤＲを含む。別の好ましい一実施形態において、前記イムノバインダーのＶＨは、配列番号３、配列番号１５、および配列番号２７からなる群のＣＤＲを含み、かつ／または前記イムノバインダーのＶＬのＣＤＲは、配列番号３８、配列番号５０、および配列番号６１からなる群のＣＤＲを含む。
【００６１】
別の一実施形態において、本発明は、配列番号４、配列番号１６、配列番号２８、配列番号３９、配列番号５１、および配列番号６２からなる群の配列に、少なくとも７５％の類似性、好ましくは少なくとも７５％の同一性、より好ましくは少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、さらにより好ましくは１００％の同一性を有するＣＤＲを少なくとも１つ含むイムノバインダーを提供する。好ましくは、前記イムノバインダーのＶＨは、配列番号４、配列番号１６、配列番号２８からなる群のＣＤＲを含み、かつ／または前記イムノバインダーのＶＬのＣＤＲは、配列番号３９、配列番号５１、および配列番号６２からなる群のＣＤＲを含む。
【００６２】
別の一実施形態において、本発明は、配列番号５、配列番号１７、配列番号２９、配列番号４０、配列番号５２、および配列番号６３からなる群の配列に、少なくとも７５％の類似性、好ましくは少なくとも７５％の同一性、より好ましくは少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、さらにより好ましくは１００％の同一性を有するＣＤＲを少なくとも１つ含むイムノバインダーを提供する。好ましくは、前記イムノバインダーのＶＨは、配列番号５、配列番号１７、配列番号２９からなる群のＣＤＲを含み、かつ／または前記イムノバインダーのＶＬのＣＤＲは、配列番号４０、配列番号５２、および配列番号６３からなる群のＣＤＲを含む。
【００６３】
別の一実施形態において、本発明は、配列番号６、配列番号１８、配列番号３０、配列番号４１、配列番号５３、および配列番号６４からなる群の配列に、少なくとも７５％の類似性、好ましくは少なくとも７５％の同一性、より好ましくは少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、さらにより好ましくは１００％の同一性を有するＣＤＲを少なくとも１つ含むイムノバインダーを提供する。好ましくは、前記イムノバインダーのＶＨは、配列番号６、配列番号１８、および配列番号３０からなる群のＣＤＲを含み、かつ／または前記イムノバインダーのＶＬのＣＤＲは、配列番号４１、配列番号５３、および配列番号６４からなる群のＣＤＲを含む。
【００６４】
別の一実施形態において、本発明は、配列番号７、配列番号１９、配列番号３１、配列番号４２、配列番号５４、および配列番号６５からなる群の配列に、少なくとも７５％の類似性、好ましくは少なくとも７５％の同一性、より好ましくは少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、さらにより好ましくは１００％の同一性を有するＣＤＲを少なくとも１つ含むイムノバインダーを提供する。好ましくは、前記イムノバインダーのＶＨは、配列番号７、配列番号１９、および配列番号３１からなる群のＣＤＲを含み、かつ／または前記イムノバインダーのＶＬのＣＤＲは、配列番号４２、配列番号５４、および配列番号６５からなる群のＣＤＲを含む。
【００６５】
別の一実施形態において、本発明は、配列番号８、配列番号２０、配列番号３２、配列番号４３、配列番号５５、および配列番号６６からなる群の配列に、少なくとも７５％の類似性、好ましくは少なくとも７５％の同一性、より好ましくは少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、さらにより好ましくは１００％の同一性を有するＣＤＲを少なくとも１つ含むイムノバインダーを提供する。好ましくは、前記イムノバインダーのＶＨは、配列番号８、配列番号２０、および配列番号３２からなる群のＣＤＲを含み、かつ／または前記イムノバインダーのＶＬのＣＤＲは、配列番号４３、配列番号５５、および配列番号６６からなる群のＣＤＲを含む。
【００６６】
別の一実施形態において、本発明は、配列番号９、配列番号２１、配列番号３３、配列番号４４、配列番号５６、および配列番号６７からなる群の配列に、少なくとも７５％の類似性、好ましくは少なくとも７５％の同一性、より好ましくは少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、さらにより好ましくは１００％の同一性を有するＣＤＲを少なくとも１つ含むイムノバインダーを提供する。好ましくは、前記イムノバインダーのＶＨは、配列番号９、配列番号２１、および配列番号３３からなる群のＣＤＲを含み、かつ／または前記イムノバインダーのＶＬのＣＤＲは、配列番号４４、配列番号５６、および配列番号６７からなる群のＣＤＲを含む。
【００６７】
別の一実施形態において、本発明は、配列番号１０、配列番号２２、配列番号３４、配列番号４５、配列番号５７、および配列番号６８からなる群の配列に、少なくとも７５％の類似性、好ましくは少なくとも７５％の同一性、より好ましくは少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、さらにより好ましくは１００％の同一性を有するＣＤＲを少なくとも１つ含むイムノバインダーを提供する。好ましくは、前記イムノバインダーのＶＨは、配列番号１０、配列番号２２、および配列番号３４からなる群のＣＤＲを含み、かつ／または前記イムノバインダーのＶＬのＣＤＲは、配列番号４５、配列番号５７、および配列番号６８からなる群のＣＤＲを含む。
【００６８】
別の一実施形態において、本発明は、配列番号１１、配列番号１３、配列番号２３、配列番号２５、配列番号３５、配列番号４６、配列番号５８、および配列番号６９からなる群の配列に、少なくとも７５％の類似性、好ましくは少なくとも７５％の同一性、より好ましくは少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、さらにより好ましくは１００％の同一性を有するＣＤＲを少なくとも１つ含むイムノバインダーを提供する。好ましくは、前記イムノバインダーのＶＨは、配列番号１１、配列番号２３、および配列番号３５からなる群のＣＤＲを含み、かつ／または前記イムノバインダーのＶＬのＣＤＲは、配列番号４６、配列番号５８、および配列番号６９からなる群のＣＤＲを含む。あるいは、前記イムノバインダーのＶＨは、配列番号１３、配列番号２５、および配列番号３５からなる群のＣＤＲを含み、かつ／または前記イムノバインダーのＶＬのＣＤＲは、配列番号４６、配列番号５８、および配列番号６９からなる群のＣＤＲを含む。
【００６９】
別の一実施形態において、本発明は、配列番号１２、配列番号２４、配列番号３６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号５９、および配列番号７０からなる群の配列に、少なくとも７５％の類似性、好ましくは少なくとも７５％の同一性、より好ましくは少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、さらにより好ましくは１００％の同一性を有するＣＤＲを少なくとも１つ含むイムノバインダーを提供する。好ましくは、前記イムノバインダーのＶＨは、配列番号１２、配列番号２４、および配列番号３６からなる群のＣＤＲを含む。さらに、またはあるいは、前記イムノバインダーのＶＬは、配列番号４７、配列番号４８、配列番号５９、および配列番号７０からなる群の、例えば、配列番号４７、配列番号５９、および配列番号７０；または配列番号４８、配列番号５９、および配列番号７０のＣＤＲを含む。
【００７０】
非常に好ましい一実施形態において、本明細書に開示するイムノバインダーはヒトＶＥＧＦを中和し、ラット／マウスのＶＥＧＦまたはその部分と交差反応性である。
【００７１】
イムノバインダーは、ＣＤＲを収容することができる抗体または任意の代替の結合性骨格を含むことができる。配列番号２〜７２に記載するＣＤＲは、当該分野で認められている任意の方法を用いて、任意の適切な結合性骨格上に融合させることができる（例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，  Ｌ．ら、（１９９８年）Ｎａｔｕｒｅ、３３２巻、３２３〜３２７頁；Ｊｏｎｅｓ，  Ｐ．ら（１９８６年）Ｎａｔｕｒｅ、３２１巻、５２２〜５２５；Ｑｕｅｅｎ，  Ｃ．ら（１９８９年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｅｅ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．、８６巻、１００２９〜１００３３頁；Ｗｉｎｔｅｒへの米国特許第５，２２５，５３９号、ならびにＱｕｅｅｎらへの米国特許第５，５３０，１０１号、同第５，５８５，０８９号、同第５，６９３，７６２号、および同第６，１８０，３７０号を参照されたい）。しかし、本明細書に開示するイムノバインダーは、ヒト化され、したがって治療的適用に適することが好ましい。
【００７２】
抗体の場合、配列番号２〜７２に記載したウサギＣＤＲを、任意の種からの任意の抗体のフレームワーク領域中に融合させてもよい。しかし、いわゆる「品質管理」スクリーニング（ＷＯ０１４８０１７）において同定されるフレームワークを含む抗体または抗体の誘導体は、一般的に高い安定性および／または溶解性を特徴としており、したがってヒトＶＥＧＦの中和など細胞外の適用の状況においても有用であり得ることが以前に見出されている。さらに、これらＶＬ（可変軽鎖）およびＶＨ（可変重鎖）の可溶かつ安定なフレームワークの１つの特定の組合せが、ウサギＣＤＲを収容するのにとりわけ適することもさらに見出された。したがって、一実施形態において、配列番号２〜７２に記載するＣＤＲを、ＥＰ１４７９６９４に開示される「品質管理」スクリーニングに由来するヒト抗体フレームワーク中に融合させる。本発明において用いるための例示的フレームワークのアミノ酸配列を、配列番号１７２から１７４に記載する。驚くべきことに、前記フレームワークまたはその誘導体中に融合させる際に、多様なウサギＣＤＲのループコンフォメーションが、ドナーのフレームワークの配列とほとんど独立に、完全に維持され得ることが見出された。さらに、前記フレームワークまたは様々なウサギＣＤＲを含むその誘導体は、ウサギの野生型単鎖とは反対に良好に発現され、かつ生成され、そして、依然としてオリジナルのドナーのウサギ抗体の親和性をほとんど完全に保持する。
【００７３】
したがって、好ましい一実施形態において、本明細書に開示するＣＤＲおよび／またはＣＤＲモチーフは、配列番号１６９の配列に少なくとも８０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも８５％、９０％、９５％、さらにより好ましくは１００％の同一性を有する重鎖可変領域フレームワーク配列において存在する。好ましい一実施形態において、重鎖可変領域フレームワーク配列は、配列番号１７０または配列番号１７１を含む。
【００７４】
好ましい一実施形態において、本明細書に開示するＣＤＲおよび／またはＣＤＲモチーフは、配列番号１６７の配列に少なくとも８５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、さらにより好ましくは１００％の同一性を有する軽鎖可変領域フレームワーク配列において存在し、軽鎖可変領域フレームワーク配列は、より好ましくは配列番号１６７または配列番号１６８を含む。
【００７５】
ウサギ抗体において、ＣＤＲは、抗体フレームワークにおけるシステイン残基にジスルフィド連結するシステイン残基を含むことがある。したがって、上記のことは、システイン残基を含むウサギＣＤＲを非ウサギのフレームワーク領域中に融合させて、例えば、ジスルフィド連結によりウサギＣＤＲの安定化を促進するための変異誘発によって非ウサギのフレームワーク中にシステイン残基を導入する場合に、必要であり得る。
【００７６】
他の実施形態において、本発明は、ＶＬまたはＶＨのアミノ酸配列のうちの少なくとも１つを含む、ＶＥＧＦに特異的に結合するイムノバインダーを提供する。本発明のイムノバインダーにおいて用いるための例示的ＶＨまたはＶＬのアミノ酸配列を、それぞれ配列番号７２〜１０６および配列番号１０７〜１６６に記載する。
【００７７】
好ましい一実施形態において、本発明は、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１３０、および配列番号１３１（それぞれＶＨ６０−１１−４、ＶＨ６０−１１−６、ＶＨ６０−１１−４ｍｉｎ、ＶＨ６０−１１−６ｍｉｎ、ＶＨ６０−１１−４ｍａｘ、およびＶＨ６０−１１−６ｍａｘ）からなる群より選択される配列に少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、９０％、９５％、最も好ましくは１００％の同一性を有するＶＨ、
ならびに／または配列番号７２、配列番号８２、および配列番号９３（それぞれＶＬ６０、ＶＬ６０ｍｉｎ、ＶＬ６０ｍａｘ）からなる群より選択される配列に少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、９０％、９５％、最も好ましくは１００％の同一性を有するＶＬを含むイムノバインダーを提供する。
【００７８】
別の好ましい一実施形態において、本発明は、配列番号１０９、配列番号１２０、および配列番号１３２（それぞれＶＨ４３５、ＶＨ４３５ｍｉｎ、およびＶＨ４３５ｍａｘ）からなる群より選択される配列に少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、９０％、９５％、最も好ましくは１００％の同一性を有するＶＨ、
ならびに／または配列番号７３、配列番号８３、および配列番号９４（それぞれＶＬ４３５、ＶＬ４３５ｍｉｎ、およびＶＬ４３５ｍａｘ）からなる群より選択される配列に少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、９０％、９５％、最も好ましくは１００％の同一性を有するＶＬを含むイムノバインダーを提供する。
【００７９】
好ましくは、前記イムノバインダーは、配列番号１７５（４３５ｍａｘ）に少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、９０％、９５％、最も好ましくは１００％の同一性を有する。
【００８０】
別の好ましい一実施形態において、本発明は、配列番号１１０、配列番号１２１、および配列番号１３３（それぞれＶＨ４５３、ＶＨ４５３ｍｉｎ、およびＶＨ４５３ｍａｘ）からなる群より選択される配列に少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、９０％、９５％、最も好ましくは１００％の同一性を有するＶＨ、
ならびに／または配列番号７４、配列番号８４、および配列番号９５（それぞれＶＬ４５３、ＶＬ４５３ｍｉｎ、およびＶＬ４５３ｍａｘ）からなる群より選択される配列に少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、９０％、９５％、最も好ましくは１００％の同一性を有するＶＬを含むイムノバインダーを提供する。
【００８１】
別の好ましい一実施形態において、本発明は、配列番号１１１、配列番号１２２、および配列番号１３４（それぞれＶＨ３７５、ＶＨ３７５ｍｉｎ、およびＶＨ３７５ｍａｘ）からなる群より選択される配列に少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、９０％、９５％、最も好ましくは１００％の同一性を有するＶＨ、
ならびに／または配列番号７５、配列番号８５、および配列番号９６（それぞれＶＬ３７５、ＶＬ３７５ｍｉｎ、およびＶＬ３７５ｍａｘ）からなる群より選択される配列に少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、９０％、９５％、最も好ましくは１００％の同一性を有するＶＬを含むイムノバインダーを提供する。
【００８２】
別の好ましい一実施形態において、本発明は、配列番号１１２、配列番号１２３、および配列番号１３５（それぞれＶＨ６１０、ＶＨ６１０ｍｉｎ、およびＶＨ６１０ｍａｘ）からなる群より選択される配列に少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、９０％、９５％、最も好ましくは１００％の同一性を有するＶＨ、
ならびに／または配列番号７６、配列番号８６、および配列番号９７（それぞれＶＬ６１０、ＶＬ６１０ｍｉｎ、およびＶＬ６１０ｍａｘ）からなる群より選択される配列に少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、９０％、９５％、最も好ましくは１００％の同一性を有するＶＬを含むイムノバインダーを提供する。
【００８３】
別の好ましい一実施形態において、本発明は、配列番号１１３、配列番号１２４、配列番号１２９、配列番号１３６、配列番号１４２、配列番号１４４、配列番号１４６、配列番号１４７、配列番号１４８、配列番号１４９、配列番号１５０、配列番号１５１、配列番号１５２、配列番号１５３、配列番号１５４、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９、配列番号１６０、配列番号１６１、配列番号１６２、配列番号１６３、配列番号１６４、配列番号１６５、および配列番号１６６（ＶＨ５７８およびその改変体）からなる群より選択される配列に少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、９０％、９５％、最も好ましくは１００％の同一性を有するＶＨ、
ならびに／または配列番号７７、配列番号８７、配列番号９２、配列番号９８、配列番号１０３、配列番号１０４、および配列番号１０５（ＶＬ５７８およびその改変体）からなる群より選択される配列に少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、９０％、９５％、最も好ましくは１００％の同一性を有するＶＬを含むイムノバインダーを提供する。
【００８４】
好ましくは、前記イムノバインダーは、配列番号１７８（５７８ｍｉｎ）、配列番号１７９（５７８ｍａｘ）、または配列番号１８０（５７８ｍｉｎｍａｘ）に少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、９０％、９５％、最も好ましくは１００％の同一性を有する。
【００８５】
別の好ましい一実施形態において、本発明は、配列番号１１４、配列番号１２５、および配列番号１３７（それぞれＶＨ５３４、ＶＨ５３４ｍｉｎ、およびＶＨ５３４ｍａｘ）からなる群より選択される配列に少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、９０％、９５％、最も好ましくは１００％の同一性を有するＶＨ、
ならびに／または配列番号７８、配列番号８８、および配列番号９９（それぞれＶＬ５３４、ＶＬ５３４ｍｉｎ、およびＶＬ５３４ｍａｘ）からなる群より選択される配列に少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、９０％、９５％、最も好ましくは１００％の同一性を有するＶＬを含むイムノバインダーを提供する。
【００８６】
別の好ましい一実施形態において、本発明は、配列番号１１５、配列番号１２６、配列番号１３８、および配列番号１４３（それぞれＶＨ５６７、ＶＨ５６７ｍｉｎ、およびＶＨ５６７ｍａｘ）からなる群より選択される配列に少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、９０％、９５％、最も好ましくは１００％の同一性を有するＶＨ、
ならびに／または配列番号７９、配列番号８９、および配列番号１００（それぞれＶＬ５６７、ＶＬ５６７ｍｉｎ、およびＶＬ５６７ｍａｘ）からなる群より選択される配列に少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、９０％、９５％、最も好ましくは１００％の同一性を有するＶＬを含むイムノバインダーを提供する。
【００８７】
好ましくは、前記イムノバインダーは、配列番号１７７（５６７ｍｉｎ）に少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、９０％、９５％、最も好ましくは１００％の同一性を有する。
【００８８】
別の好ましい一実施形態において、本発明は、配列番号１１６、配列番号１２７、配列番号１３９、および配列番号１４０（それぞれＶＨ５０９、ＶＨ５０９ｍｉｎ、ＶＨ５０９ｍａｘ、およびＶＨ５０９ｍａｘＩＩ）からなる群より選択される配列に少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、９０％、９５％、最も好ましくは１００％の同一性を有するＶＨ、
ならびに／または配列番号８０、配列番号９０、および配列番号１０１（それぞれＶＬ５０９、ＶＬ５０９ｍｉｎ、およびＶＬ５０９ｍａｘ）からなる群より選択される配列に少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、９０％、９５％、最も好ましくは１００％の同一性を有するＶＬを含むイムノバインダーを提供する。
【００８９】
別の好ましい一実施形態において、本発明は、配列番号１１７、配列番号１２８、配列番号１４１、および配列番号１４５（それぞれＶＨ５１１、ＶＨ５１１ｍｉｎ、ＶＨ５１１ｍａｘ、およびＶＨ５１１ｍａｘＤＨＰ）からなる群より選択される配列に少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、９０％、９５％、最も好ましくは１００％の同一性を有するＶＨ、
ならびに／または配列番号８１、配列番号９１、配列番号１０２、および配列番号１０６（それぞれＶＬ５１１、ＶＬ５１１ｍｉｎ、ＶＬ５１１ｍａｘ、およびＶＬ５１１ｍｉｎＣ４１Ｌ）からなる群より選択される配列に少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、９０％、９５％、最も好ましくは１００％の同一性を有するＶＬを含むイムノバインダーを提供する。
【００９０】
好ましくは、前記イムノバインダーは、配列番号１７６（５１１＿ｍａｘ）に少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、９０％、９５％、最も好ましくは１００％の同一性を有する。
【００９１】
ある実施形態において、本発明は、配列番号２〜１６６、および配列番号１７５〜１８０に記載するアミノ酸配列に実質的な類似性を有するアミノ酸配列を含む、ＶＥＧＦに特異的に結合するイムノバインダーをさらに提供し、イムノバインダーは、本発明の抗ＶＥＧＦイムノバインダーの所望の機能特性を本質的に保持、または改善する。好ましい類似性パーセント値としては、それだけには限定されないが、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の同一性が挙げられる。
【００９２】
ある実施形態において、本発明は、配列番号２〜１６６、および配列番号１７５〜１８０に記載するアミノ酸配列に実質的に同一であるアミノ酸配列を含む、ＶＥＧＦに特異的に結合するイムノバインダーをさらに提供し、イムノバインダーは、本発明の抗ＶＥＧＦイムノバインダーの所望の機能特性を保持、または改善する。好ましい同一性パーセント値としては、それだけには限定されないが、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の同一性が挙げられる。
【００９３】
ある実施形態において、本発明は、配列番号２〜１６６、および配列番号１７５〜１８０に記載するアミノ酸配列に対して保存的置換を有するアミノ酸配列を含む、ＶＥＧＦに特異的に結合するイムノバインダーをさらに提供し、イムノバインダーは、本発明の抗ＶＥＧＦイムノバインダーの所望の機能特性を保持、または改善する。
【００９４】
いくつかの実施形態において、本発明は、ヒトＶＥＧＦに特異的に結合し、他の種のＶＥＧＦ分子、例えば、マウスＶＥＧＦ、ラットＶＥＧＦ、ウサギＶＥＧＦ、またはモルモットＶＥＧＦと交差反応するイムノバインダーを提供する。特定の一実施形態において、抗ＶＥＧＦイムノバインダーは、ヒトおよびラット／マウスのＶＥＧＦに特異的に結合することができる。
【００９５】
いくつかの実施形態において、本発明は、ヒトＶＥＧＦに特異的に結合し、他の種のＶＥＧＦ分子、例えば、マウスＶＥＧＦ、ラットＶＥＧＦ、ウサギＶＥＧＦ、またはモルモットＶＥＧＦと交差反応しないイムノバインダーを提供する。
【００９６】
いくつかの実施形態において、本発明は、ヒトＶＥＧＦに特異的に結合するイムノバインダーを提供し、イムノバインダーはアフィニティ成熟している。
【００９７】
一実施形態において、本発明の抗体および抗体フラグメントは、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）またはＦａｂフラグメントである。ｓｃＦｖ抗体の場合、選択されたＶＬドメインは、柔軟なリンカーによっていずれかの配向において選択されたＶＨドメインに連結することができる。適切な最先端のリンカーはＧＧＧＧＳの繰返しアミノ酸配列またはその改変体からなる。本発明の好ましい一実施形態において、配列番号１８１に記載するアミノ酸配列の（ＧＧＧＧＳ）４リンカーは、繰返し１〜３回の改変体以外は、やはり可能である（Ｈｏｌｌｉｇｅｒら（１９９３年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、９０巻、６４４４〜６４４８頁）。本発明に用いることができる他のリンカーは、Ａｌｆｔｈａｎら（１９９５年）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．、８巻、７２５〜７３１頁、Ｃｈｏｉら（２００１年）、Ｅｕｒ．  Ｊ．  ｌｍｍｕｎｏｌ．、３１巻、９４〜１０６頁、Ｈｕら（１９９６年）、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、５６巻、３０５５〜３０６１、Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖら（１９９９年）、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、２９３巻、４１〜５６頁、およびＲｏｏｖｅｒｓら（２００１年）、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ｌｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．、５０巻、５１〜５９頁によって記載されている。配置は、ＶＬ−リンカー−ＶＨまたはＶＨ−リンカー−ＶＬのいずれかであってよく、前者の配向が好ましいものである。しかし、ＶＨまたはＶＬの単一のドメインの抗体も企図される。Ｆａｂフラグメントの場合、選択される軽鎖可変ドメインＶＬがヒトＩｇκ鎖の定常領域に融合しており、一方、適切な重鎖可変ドメインＶＨがヒトＩｇＧの最初の（Ｎ末端の）定常ドメインＣＨ１に融合している。定常ドメインのＣ末端に、または可変ドメインもしくは定常ドメインの他の部位に、鎖間ジスルフィド架橋が形成することがある。あるいは、２本の鎖が柔軟なリンカーによってやはり連結され、単鎖Ｆａｂ抗体を生じることもある。
【００９８】
本発明の抗体または抗体誘導体は、１０−１４Ｍから１０−５Ｍの範囲の解離定数ＫｄでヒトＶＥＧＦに対する親和性を有することができる。本発明の好ましい一実施形態において、Ｋｄは≦１ｎＭである。抗原に対する抗体の親和性は、適切な方法（Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｐａｕｌ，  Ｗ．Ｅ．編集、Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ（１９９２）におけるＢｅｒｚｏｆｓｋｙら、「Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ」；Ｋｕｂｙ，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｗ．Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ）およびそこに記載される方法を用いて実験的に決定することができる。
【００９９】
Ｅｐｉｔｏｍｉｃｓ社は、ウサギモノクローナル抗体である抗ＶＥＧＦ抗体を販売している（ＶＥＧＦ（Ｃ末端）Ｒａｂｂｉｔ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ、カタログ番号１９０９−１）。前記抗体は、ヒトＶＥＧＦのＣ末端上の残基に対するものであり、したがってＶＥＧＦを中和することができない。それゆえ、前記抗体は治療的適用に適さない。さらに、前記モノクローナルＩｇＧはヒト化抗体ではなく、全長の天然ウサギ免疫グロブリンである。さらに、この抗体は天然型のＶＥＧＦを認識しないことが示された。
【０１００】
（ＶＥＧＦ上の同じエピトープに結合するイムノバインダー）
別の一態様において、本発明は、配列番号２〜２１１に記載するアミノ酸配列の任意の１つを含む抗体によって認識されるＶＥＧＦ上のエピトープに結合する抗体を提供する。このような抗体は、それだけには限定されないがＥＬＩＳＡを含む標準のＶＥＧＦ結合アッセイにおいて、配列番号２〜２１１に記載するアミノ酸配列の任意の１つまたは複数を含む抗体と交差競合（ｃｒｏｓｓ−ｃｏｍｐｅｔｅ）するその能力に基づいて同定され得る。試験抗体が、配列番号２〜２１１に記載するアミノ酸配列の任意の１つまたは複数を含む抗体のヒトＶＥＧＦに対する結合を阻害する能力は、試験抗体が交差競合することができ、したがって配列番号２〜２１１に記載するアミノ酸配列の任意の１つまたは複数を含む抗体としてヒトＶＥＧＦ上の重複するエピトープと相互作用することを実証している。
【０１０１】
さらに、またはあるいは、このような抗体は、これらが同じペプチドの免疫原に結合するか否かを決定するための標準のエピトープマッピング技術を用いて同定することもできる。それだけには限定されないが、ＮＭＲ、Ｘ線結晶学、コンピュータベースのモデリング、またはタンパク質断層撮影法を含めた構造モデリング技術をやはり用いて、抗体／ＶＥＧＦ相互作用に対する正確な分子の決定基をさらに定義してもよい（Ｂａｎｙａｙら、２００４、ＡＳＳＡＹ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  （２）、５巻、５１６〜５６７頁）。実際、ＶＥＧＦの結晶構造は解明されており、ＶＥＧＦｒ結合に関与する表面のアミノ酸残基は公知である（Ｆｕｈら、２００６年、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２８１巻、６６２５〜６６３１頁）。したがって、当該分野において入手できるペプチド免疫原のアミノ酸配列およびＶＥＧＦの構造上の知識を考慮すると、配列番号２〜２１１に記載するアミノ酸配列の任意の１つまたは複数を含む抗体によって認識されるＶＥＧＦ上のエピトープに結合する抗体を同定することは、十分に当該分野の技術範囲内である。
【０１０２】
いくつかの実施形態において、配列番号２〜２１１に記載するアミノ酸配列の任意の１つまたは複数を含む抗体によって認識されるＶＥＧＦ上のエピトープに結合する抗体は、少なくとも１０７Ｍ−１、例えば、少なくとも１０７Ｍ−１、少なくとも１０８Ｍ−１、少なくとも１０９Ｍ−１、少なくとも１０１０Ｍ−１、少なくとも１０１１Ｍ−１、少なくとも１０１２Ｍ−１、または少なくとも１０１３Ｍ−１の親和性でＶＥＧＦに結合する。
【０１０３】
いくつかの実施形態において、配列番号２〜２１１に記載するアミノ酸配列の任意の１つまたは複数を含む抗体によって認識されるＶＥＧＦ上のエピトープに結合する抗体は、ヒトＶＥＧＦに特異的に結合し、他の種のＶＥＧＦ分子、例えば、マウスＶＥＧＦ、ラットＶＧＥＦ、ウサギＶＥＧＦ、またはモルモットＶＥＧＦと交差反応しない。
【０１０４】
いくつかの実施形態において、配列番号２〜２１１に記載するアミノ酸配列の任意の１つまたは複数を含む抗体によって認識されるＶＥＧＦ上のエピトープに結合する抗体は、他の種のＶＥＧＦ分子、例えば、マウスＶＥＧＦ、ラットＶＥＧＦ、またはウサギＶＥＧＦと交差反応する。
【０１０５】
（最適化された改変体）
本発明の抗体を、機能特性の増強に対して、例えば、溶解性および／または安定性の増強に対してさらに最適化してよい。
【０１０６】
ある実施形態において、本発明の抗体を、本明細書に参照によって援用される、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｂａｓｅｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｃｈａｉｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」という名称の、２００８年３月１２日出願のＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＥＰ２００８／００１９５８に開示されている「機能的コンセンサス」方法論に従って最適化する。例えば、本発明のＶＥＧＦイムノバインダーを、機能的に選択されたｓｃＦｖのデータベースと比較してＶＥＧＦイムノバインダーにおける対応する（１つまたは複数の）位置よりも変動性への耐性が大きいかまたは小さいアミノ酸残基の位置を同定することができ、それによって、このように同定された残基の（１つまたは複数の）位置が、安定性および／または溶解性などの機能性を改善するように操作するのに適することがあることを指摘している。
【０１０７】
置換のための例示的フレームワーク位置は、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ａｎｄ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｗｉｔｈ  Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ」という名称の、２００８年６月２５日出願の、ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＣＨ２００８／０００２８５、および「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｂａｓｅｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｃｈａｉｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」という名称の、２００８年６月２５日出願のＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＣＨ２００８／０００２８４に記載されている。例えば、以下の置換の１つまたは複数を、本発明のイムノバインダーの重鎖可変領域におけるアミノ酸の位置に導入することができる（以下に列挙する各アミノ酸位置に対してＡＨｏナンバリングが参照される）：
（ａ）アミノ酸位置１のＱまたはＥ；
（ｂ）アミノ酸位置６のＱまたはＥ；
（ｃ）アミノ酸位置７の、Ｔ、Ｓ、またはＡ、より好ましくはＴまたはＡ、さらにより好ましくはＴ；
（ｄ）アミノ酸位置１０の、Ａ、Ｔ、Ｐ、Ｖ、またはＤ、より好ましくはＴ、Ｐ、Ｖ、またはＤ、
（ｅ）アミノ酸位置１２の、ＬまたはＶ、より好ましくはＬ、
（ｆ）アミノ酸位置１３の、Ｖ、Ｒ、Ｑ、Ｍ、またはＫ、より好ましくはＶ、Ｒ、Ｑ、またはＭ；
（ｇ）アミノ酸位置１４の、Ｒ、Ｍ、Ｅ、Ｑ、またはＫ、より好ましくはＲ、Ｍ、ＥまたはＱ、さらにより好ましくはＲまたはＥ；
（ｈ）アミノ酸位置１９の、ＬまたはＶ、より好ましくはＬ；
（ｉ）アミノ酸位置２０の、Ｒ、Ｔ、Ｋ、またはＮ、より好ましくはＲ、Ｔ、またはＮ、さらにより好ましくはＮ；
（ｊ）アミノ酸位置２１の、Ｉ、Ｆ、Ｌ、またはＶ、より好ましくはＩ、Ｆ、またはＬ、さらにより好ましくはＩまたはＬ；
（ｋ）アミノ酸位置４５の、ＲまたはＫ、より好ましくはＫ；
（ｌ）アミノ酸位置４７の、Ｔ、Ｐ、Ｖ、ＡまたはＲ、より好ましくはＴ、Ｐ、Ｖ、またはＲ、さらにより好ましくはＲ；
（ｍ）アミノ酸位置５０の、Ｋ、Ｑ、Ｈ、またはＥ、より好ましくはＫ、Ｈ、またはＥ、さらにより好ましくはＫ；
（ｎ）アミノ酸位置５５の、ＭまたはＩ、より好ましくはＩ；
（ｏ）アミノ酸位置７７の、ＫまたはＲ、より好ましくはＫ；
（ｐ）アミノ酸位置７８の、Ａ、Ｖ、Ｌ、またはＩ、より好ましくはＡ、Ｌ、またはＩ、さらにより好ましくはＡ；
（ｑ）アミノ酸位置８２の、Ｅ、Ｒ、Ｔ、またはＡ、より好ましくはＥ、Ｔ、またはＡ、さらにより好ましくはＥ；
（ｒ）アミノ酸位置８６の、Ｔ、Ｓ、Ｉ、またはＬ、より好ましくはＴ、Ｓ、またはＬ、さらにより好ましくはＴ；
（ｓ）アミノ酸位置８７の、Ｄ、Ｓ、Ｎ、またはＧ、より好ましくはＤ、Ｎ、またはＧ、さらにより好ましくはＮ；
（ｔ）アミノ酸位置８９の、Ａ、Ｖ、Ｌ、またはＦ、より好ましくはＡ、Ｖ、またはＦ、さらにより好ましくはＶ；
（ｕ）アミノ酸位置９０の、Ｆ、Ｓ、Ｈ、Ｄ、またはＹ、より好ましくはＦ、Ｓ、Ｈ、またはＤ；
（ｖ）アミノ酸位置９２の、Ｄ、Ｑ、またはＥ、より好ましくはＤまたはＱ、さらにより好ましくはＤ；
（ｗ）アミノ酸位置９５の、Ｇ、Ｎ、Ｔ、またはＳ、より好ましくはＧ、Ｎ、またはＴ、さらにより好ましくはＧ；
（ｘ）アミノ酸位置９８の、Ｔ、Ａ、Ｐ、Ｆ、またはＳ、より好ましくはＴ、Ａ、Ｐ、またはＦ、さらにより好ましくはＦ；
（ｙ）アミノ酸位置１０３の、Ｒ、Ｑ、Ｖ、Ｉ、Ｍ、Ｆ、またはＬ、より好ましくはＲ、Ｑ、Ｉ、Ｍ、Ｆ、またはＬ、さらにより好ましくはＹ、さらにより好ましくはＬ；および（ｚ）アミノ酸位置１０７の、Ｎ、Ｓ、またはＡ、より好ましくはＮまたはＳ、さらにより好ましくはＮ。
【０１０８】
さらに、またはあるいは、以下の置換の１つまたは複数を、本発明のイムノバインダーの軽鎖可変領域中に導入することができる：
（ａａ）アミノ酸位置１の、Ｑ、Ｄ、Ｌ、Ｅ、Ｓ、またはＩ、より好ましくはＬ、Ｅ、Ｓ、またはＩ、さらにより好ましくはＬまたはＥ；
（ｂｂ）アミノ酸位置２の、Ｓ、Ａ、Ｙ、Ｉ、Ｐ、またはＴ、より好ましくはＡ、Ｙ、Ｉ、Ｐ、またはＴ、さらにより好ましくはＰまたはＴ；
（ｃｃ）アミノ酸位置３の、Ｑ、Ｖ、Ｔ、またはＩ、より好ましくはＶ、Ｔ、またはＩ、さらにより好ましくはＶまたはＴ；
（ｄｄ）アミノ酸位置４の、Ｖ、Ｌ、Ｉ、またはＭ、より好ましくはＶまたはＬ；
（ｅｅ）アミノ酸位置７の、Ｓ、Ｅ、またはＰ、より好ましくはＳまたはＥ、さらにより好ましくはＳ；
（ｆｆ）アミノ酸位置１０の、ＴまたはＩ、より好ましくはＩ；
（ｇｇ）アミノ酸位置１１の、ＡまたはＶ、より好ましくはＡ；
（ｈｈ）アミノ酸位置１２の、ＳまたはＹ、より好ましくはＹ；
（ｉｉ）アミノ酸位置１４の、Ｔ、Ｓ、またはＡ、より好ましくはＴまたはＳ、さらにより好ましくはＴ；
（ｊｊ）アミノ酸位置１８の、ＳまたはＲ、より好ましくはＳ；
（ｋｋ）アミノ酸位置２０の、ＴまたはＲ、より好ましくはＲ；
（ｌｌ）アミノ酸位置２４の、ＲまたはＱ、より好ましくはＱ；
（ｍｍ）アミノ酸位置４６の、ＨまたはＱ、より好ましくはＨ；
（ｎｎ）アミノ酸位置４７の、Ｋ、Ｒ、またはＩ、より好ましくはＲまたはＩ、さらにより好ましくはＲ；
（ｏｏ）アミノ酸位置５０の、Ｒ、Ｑ、Ｋ、Ｅ、Ｔ、またはＭ、より好ましくはＱ、Ｋ、Ｅ、ＴまたはＭ；
（ｐｐ）アミノ酸位置５３の、Ｋ、Ｔ、Ｓ、Ｎ、Ｑ、またはＰ、より好ましくはＴ、Ｓ、Ｎ、Ｑ、またはＰ；
（ｑｑ）アミノ酸位置５６の、ＩまたはＭ、より好ましくはＭ；
（ｒｒ）アミノ酸位置５７の、Ｈ、Ｓ、Ｆ、またはＹ、より好ましくはＨ、Ｓ、またはＦ；
（ｓｓ）アミノ酸位置７４の、Ｉ、Ｖ、またはＴ、より好ましくはＶまたはＴ、Ｒ、さらにより好ましくはＴ；
（ｔｔ）アミノ酸位置８２の、Ｒ、Ｑ、またはＫ、より好ましくはＲまたはＱ、さらにより好ましくはＲ；
（ｕｕ）アミノ酸位置９１の、ＬまたはＦ、より好ましくはＦ；
（ｖｖ）アミノ酸位置９２の、Ｇ、Ｄ、Ｔ、またはＡ、より好ましくはＧ、Ｄ、またはＴ、さらにより好ましくはＴ；
（ｘｘ）アミノ酸位置９４の、ＳまたはＮ、より好ましくはＮ；
（ｙｙ）アミノ酸位置１０１の、Ｆ、Ｙ、またはＳ、より好ましくはＹまたはＳ、さらにより好ましくはＳ；および
（ｚｚ）アミノ酸位置１０３の、Ｄ、Ｆ、Ｈ、Ｅ、Ｌ、Ａ、Ｔ、Ｖ、Ｓ、Ｇ、またはＩ、より好ましくはＨ、Ｅ、Ｌ、Ａ、Ｔ、Ｖ、Ｓ、Ｇ、またはＩ、さらにより好ましくはＡまたはＶ。
【０１０９】
ＡＨｏナンバリングシステムは、Ｈｏｎｅｇｇｅｒ，  Ａ．およびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ，  Ａ．、（２００１年）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、３０９巻、６５７〜６７０頁にさらに記載されている。あるいは、Ｋａｂａｔら（Ｋａｂａｔ，  Ｅ．  Ａ．ら（１９９１）、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｕ．Ｓ．  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ
ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ、第９１〜３２４２）にさらに記載されているＫａｂａｔナンバリングシステムを用いてもよい。抗体の重鎖および軽鎖の可変領域におけるアミノ酸残基の位置を同定するのに用いられる２つの異なるナンバリングシステムのための変換表は、Ａ．  Ｈｏｎｅｇｇｅｒ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、３０９巻（２００１年）６５７〜６７０頁に提供されている。
【０１１０】
他の実施形態において、本発明のイムノバインダーは、「Ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ  Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｂｉｎｄｅｒｓ」という名称の、２００８年６月２５日出願の、米国仮出願第６１／０７５，６９２号に記載されている、溶解性および／または安定性を増強する変異を１つまたは複数含んでいる。ある好ましい実施形態において、イムノバインダーは、１２、１０３、および１４４（ＡＨｏナンバリング慣例）からなる重鎖アミノ酸位置の群より選択されるアミノ酸位置に溶解性を増強する変異を含んでいる。好ましい一実施形態において、イムノバインダーは、（ａ）重鎖アミノ酸位置１２のセリン（Ｓ）；（ｂ）重鎖アミノ酸位置１０３のセリン（Ｓ）またはスレオニン（Ｔ）；および（ｃ）重鎖アミノ酸位置１４４のセリン（Ｓ）またはスレオニン（Ｔ）からなる群より選択される置換を１つまたは複数含んでいる。別の一実施形態において、イムノバインダーは、以下の置換：（ａ）重鎖アミノ酸位置１２のセリン（Ｓ）；（ｂ）重鎖アミノ酸位置１０３のセリン（Ｓ）またはスレオニン（Ｔ）；および（ｃ）重鎖アミノ酸位置１４４のセリン（Ｓ）またはスレオニン（Ｔ）を含んでいる。
【０１１１】
（ウサギ抗ＶＥＧＦ抗体を発現するハイブリドーマ）
別の一態様において、本発明は、配列番号７２〜８１、および配列番号１０７〜１１７に記載するアミノ酸配列の任意の１つまたは複数を含むモノクローナル抗体を発現するハイブリドーマを提供する。ウサギＢ細胞からハイブリドーマを産生するための方法は当該分野では周知であり、例えば、米国特許出願第２００５／００３３０３１号に開示されている。
【０１１２】
（抗ＶＥＧＦイムノバインダーの生成）
本発明の抗体または抗体誘導体を、組換え遺伝学の技術分野における日常的な技術を用いて産生してもよい。ポリペプチドの配列を知り、それをコードするｃＤＮＡを遺伝子合成によって産生することができる（ｗｗｗ．ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ．ｃｏｍ）。これらのｃＤＮＡを適切なベクタープラスミド中にクローニングすることができる。ＶＬドメインおよび／またはＶＨドメインをコードするＤＮＡを得た後は、例えば、変異誘発プライマーを用いたＰＣＲにより、部位特異的変異誘発を行って様々な誘導体を得ることができる。最良の「開始」配列を、ＶＬおよび／またはＶＨ配列における所望の変化の数に応じて選択することができる。
【０１１３】
ＣＤＲをフレームワーク領域中に組み入れるかまたは融合させるための方法は、例えばＲｉｅｃｈｍａｎｎ，  Ｌ．ら、（１９９８年）Ｎａｔｕｒｅ、３３２巻、３２３〜３２７；Ｊｏｎｅｓ，  Ｐ．ら（１９８６年）Ｎａｔｕｒｅ、３２１巻、５２２〜５２５頁；Ｑｕｅｅｎ，  Ｃ．ら（１９８９年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｅｅ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．、８６巻、１００２９〜１００３３頁；Ｗｉｎｔｅｒへの米国特許第５，２２５，５３９号、ならびにＱｕｅｅｎらへの米国特許第５，５３０，１０１号、同第５，５８５，０８９号、同第５，６９３，７６２号、および同第６，１８０，３７０号に記載されているもの、ならびに「Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒａｂｂｉｔ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｆｒａｍｅｗｏｒｋｓ」という名称の、２００８年６月２５日出願の、米国仮出願第６１／０７５，６９７号に開示されているものを含む。
【０１１４】
当業者には周知の標準のクローニング技術および変異誘発技術を用いて、Ｆａｂフラグメントを生成するために、リンカーを付着し、ドメインをシャッフルし、または融合物を構築してよい。本発明の一般的方法を開示する基本的プロトコールは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  （Ｓａｍｂｒｏｏｋ
＆  Ｒｕｓｓｅｌｌ、第３版、２００１年）、およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （Ａｕｓｕｂｅｌら、１９９９年）に記載されている。
【０１１５】
ｓｃＦｖポリペプチドをコードする遺伝子を内部に持つＤＮＡ配列、またはＦａｂフラグメントの場合はＶＬ−ＣκおよびＶＨ−ＣＨ１融合物に対する２つの遺伝子を含む２つの別々の遺伝子またはバイシストロン性オペロンのいずれかをコードするＤＮＡ配列が、適切な発現ベクターに、好ましくは誘導プロモーターを伴なう発現ベクターにクローニングされる。各遺伝子の前には翻訳を確実にする好適なリボゾーム結合部位が存在するよう、注意を払わなければならない。本発明の抗体は、開示した配列からなるのではなく、開示した配列を含むことが理解される。例えば、クローニングの戦略は、構築物が、Ｎ末端に１つまたは少数のさらなる残基を有する抗体から作られることを必要とし得る。具体的には、開始コドンに由来するメチオニンが翻訳後に切断されなかった場合、最終のタンパク質中に存在することがある。ｓｃＦｖ抗体についてのほとんどの構築物は、Ｎ末端にさらなるアラニンを生じる。本発明の好ましい一実施形態において、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるペリプラズムの発現についての発現ベクターが選択される（Ｋｒｅｂｂｅｒ、１９９７年）。前記ベクターは、切断可能なシグナル配列の前にプロモーターを含む。次いで、抗体ペプチドについてのコード配列を、インフレーム（ｉｎ  ｆｒａｍｅ）で切断可能なシグナル配列に融合する。これにより、シグナル配列が切断される細菌のペリプラズムへの、発現されたポリペプチドのターゲティングが可能になる。次いで、抗体はフォールディングされる。Ｆａｂフラグメントの場合は、ＶＬ−ＣκおよびＶＨ−ＣＨ１融合物のペプチドの両方が移行シグナルに連結していなければならない。ペプチドがペリプラズムに到達した後、Ｃ末端のシステインでＳ−Ｓ共有結合が形成される。抗体の細胞質内発現が好ましい場合、前記抗体は通常、封入体から高収率で得ることができ、封入体は他の細胞フラグメントおよびタンパク質から容易に分離され得る。この場合、封入体は、例えば塩酸グアニジン（ＧｎｄＨＣｌ）などの変性剤中に可溶化され、次いで当業者には周知の復元手順によってリフォールディングされる。
【０１１６】
ｓｃＦｖまたはＦａｂポリペプチドを発現するプラスミドを、適切な宿主、好ましくは細菌、酵母、または哺乳動物の細胞、最も好ましくは適切なＥ．ｃｏｌｉ菌株（例えば、ペリプラズムの発現についてＪＭ８３、または封入体中の発現についてＢＬ２１）の中に導入する。ポリペプチドを、ペリプラズムまたは封入体のいずれかから収集し、当業者には公知の、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、および／またはゲルろ過などの標準技術を用いて精製してよい。
【０１１７】
本発明の抗体または抗体誘導体を、収率、溶解性、およびインビトロの安定性に関して特徴付けることができる。ＶＥＧＦに対する、好ましくはヒトＶＥＧＦに対する結合能を、ＷＯ９７２９１３１に記載されている通り、組換えヒトＶＥＧＦを用いて、インビトロでＥＬＩＳＡまたは表面プラズモン共鳴法（ＢＩＡＣｏｒｅ）によって試験することができ、表面プラズモン共鳴法はまた、Ｋｏｆｆ速度定数の決定を可能にし、これは好ましくは１０−３ｓ−１未満であるべきである。≦１０ｎＭのＫｄ値が好ましい。
【０１１８】
ヒトＶＥＧＦに対する強力な結合親和性を有する抗体の他に、治療上の観点からの他の有益な特性を有する抗ＶＥＧＦ抗体を選択することも望ましい。例えば、抗体は、ＶＥＧＦに応答したＨＵＶＥＣ細胞の増殖を阻害するものであってもよい（実施例３を参照されたい）。一実施形態において、抗体は、ほぼ最大の有効濃度のＶＥＧＦ（０．０８ｎＭ）に応答したＨＵＶＥＣ細胞の増殖を阻害することができ得る。好ましくは、抗体は、この「内皮細胞増殖アッセイ」における内皮細胞のＶＥＧＦ誘導型増殖を阻害するのに約５ｎＭ以下、好ましくは約１ｎＭ以下、好ましくは約１ｎＭ以下、好ましくは約０．５ｎＭ以下、最も好ましくは約０．０６ｎＭ以下の有効用量５０（ＥＤ５０）値を有し、すなわち、これらの濃度で抗体は、インビトロでＶＥＧＦ誘導型内皮細胞の増殖を、例えば５０％以上阻害することができる。
【０１１９】
（二重特異性分子）
別の一態様において、本発明は、本発明の抗ＶＥＧＦ抗体またはそのフラグメントを含む二重特異性分子を特徴としている。本発明の抗体、またはその抗原結合部分を、誘導体化し、または別のペプチドまたはタンパク質などの別の機能性分子（例えば、別の抗体もしくは受容体に対するリガンド）に連結して、少なくとも２つの異なる結合部位または標的分子に結合する二重特異性分子を産生することができる。本発明の抗体を、誘導体化するか、または２つ以上の他の機能性分子に連結して、３つ以上の異なる結合部位および／または標的分子に結合する多重特異的分子を産生することができ、このような多重特異的分子は、本明細書で用いられる「二重特異性分子」という用語によって包含されることも意図される。本発明の二重特異性分子を作り出すには、本発明の抗体を、別の抗体、抗体フラグメント、腫瘍特異的もしくは病原体特異的な抗原、ペプチド、または結合性模倣物（ｂｉｎｄｉｎｇ  ｍｉｍｅｔｉｃ）などの１つまたは複数の他の結合性分子に、二重特異性分子が生じるように、（例えば、化学的カップリング、遺伝子融合、非共有性の会合、またはその他によって）機能的に連結してよい。したがって、本発明は、ＶＥＧＦに対する特異性を有する少なくとも１つの第１の結合性分子、および１つまたは複数のさらなる標的エピトープに対する特異性を有する第２の結合性分子を含む二重特異性分子を含む。
【０１２０】
一実施形態において、本発明の二重特異性分子は、少なくとも１つの抗体、またはその抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、または単鎖Ｆｖを含む）に対する結合特異性を含む。抗体は、その内容が参照によって明示的に援用されるＬａｄｎｅｒら、米国特許第４，９４６，７７８号に記載されているように、軽鎖または重鎖のダイマー、またはそれらの任意の最小のフラグメント（Ｆｖもしくは単鎖の構築物など）であってもよい。
【０１２１】
ヒトモノクローナル抗体が好ましいが、本発明の二重特異性分子に用いることができる他の抗体は、マウス、キメラ、およびヒト化モノクローナル抗体である。
【０１２２】
本発明の二重特異性分子を、当該分野では公知の方法を用いて、構成成分の結合特異性を結合体化することによって調製することができる。例えば、二重特異性分子の各結合特異性を別々に産生し、次いで相互に結合体化してよい。結合特異性がタンパク質またはペプチドである場合、様々なカップリング剤またはクロスリンク剤を共有性の結合体化に用いることができる。クロスリンク剤の例としては、プロテインＡ、カルボジイミド、Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチル−チオアセテート（ＳＡＴＡ）、５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＮＴＢ）、ｏ−フェニレンジマレイミド（ｏＰＤＭ）、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、およびスルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）が挙げられる（例えば、Ｋａｒｐｏｖｓｋｙら、（１９８４年）Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．、１６０巻、１６８６頁；Ｌｉｕ，  ＭＡら（１９８５年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８２巻、８６４８頁を参照されたい）。他の方法としては、Ｐａｕｌｕｓ（１９８５年）Ｂｅｈｒｉｎｇ  Ｉｎｓ．  Ｍｉｔｔ．、７８巻、１１８〜１３２号；Ｂｒｅｎｎａｎら（１９８５年）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２９巻、８１〜８３頁、およびＧｌｅｎｎｉｅら（１９８７年）Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３９巻、２３６７〜２３７５頁に記載されているものが挙げられる。好ましい結合体化剤（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）はＳＡＴＡおよびスルホ−ＳＭＣＣであり、両方ともＰｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）から入手できる。
【０１２３】
結合特異性が抗体である場合、これらは、例えば、２本の重鎖のＣ末端ヒンジ領域または他の部位によって（天然に存在しているものであれ、人工的に導入されたものであれ）、スルフヒドリル結合を介して結合体化されてよい。とりわけ好ましい一実施形態において、ヒンジ領域を、奇数個、好ましくは１個のスルフヒドリル残基を含むように修飾した後、結合体化する。
【０１２４】
あるいは、両方の結合特異性を同じベクター中にコードさせ、同じ宿主細胞中で発現、会合させてもよい。この方法は、二重特異性分子が、ｍＡｂ×ｍＡｂ、ｍＡｂ×Ｆａｂ、Ｆａｂ×Ｆ（ａｂ’）２、またはリガンド×Ｆａｂ融合タンパク質である場合にとりわけ有用である。本発明の二重特異性分子は、１つの単鎖抗体および結合決定基を含む単鎖分子、または２つの結合決定基を含む単鎖の二重特異性分子であってよい。二重特異性分子は、少なくとも２つの単鎖分子を含んでいてよい。さらに、二重特異性分子は、第１の標的に特異的に結合するｓｃＦｖであってよく、この場合、前記ｓｃＦｖのＶＨおよびＶＬは、第２の標的に対して特異的結合をもたらすドメインを含む柔軟なリンカーで連結されている。適切なリンカーは、米国仮出願第６０／９３７，８２０号に記載されている。二重特異性分子を調製するための方法は、例えば、米国特許第５，２６０，２０３号、米国特許第５，４５５，０３０号、米国特許第４，８８１，１７５号、米国特許第５，１３２，４０５号、米国特許第５，０９１，５１３号、米国特許第５，４７６，７８６号、米国特許第５，０１３，６５３号、米国特許第５，２５８，４９８号、および米国特許第５，４８２，８５８号に記載されている。
【０１２５】
二重特異性分子の、それらの特異的な標的に対する結合は、例えば、酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ＦＡＣＳ分析、生物検定（例えば、増殖阻害）または免疫ブロットアッセイによって確認することができる。これらの各アッセイは、一般的に、目的の複合体に特異的な標識した試薬（例えば、抗体）を用いることによって、特に目的とするタンパク質−抗体複合体の存在を検出するものである。例えば、ＶＥＧＦ−抗体複合体を、例えば、抗体−ＶＥＧＦ複合体を認識し、特異的に結合する、酵素が連結した抗体または抗体フラグメントを用いて検出することができる。あるいは、複合体を、様々な他の任意のイムノアッセイを用いて検出することができる。例えば、抗体は、放射性標識されていてよく、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）において用いられてよい（例えば、参照によって本明細書に援用される、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，  Ｂ．、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ、Ｓｅｖｅｎｔｈ  Ｔｒａｉｎｉｎｇ  Ｃｏｕｒｓｅ  ｏｎ  Ｒａｄｉｏｌｉｇａｎｄ  Ａｓｓａｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｔｈｅ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ、１９８６年３月を参照されたい）。放射性同位元素を、γ線計数器、もしくはシンチレーションカウンターの使用などの手段によって、またはオートラジオグラフィーによって検出することができる。
【０１２６】
（イムノコンジュゲート）
別の一態様において、本発明は、細胞毒、薬物（例えば、免疫抑制薬）、または放射性毒などの治療用部分に結合体化している、抗ＶＥＧＦ抗体、またはそのフラグメントを特色としている。このような結合体を、本明細書において「イムノコンジュゲート」と呼ぶ。１つまたは複数の細胞毒を含むイムノコンジュゲートを「免疫毒素」と呼ぶ。細胞毒または細胞毒性剤には、細胞にとって有害な（例えば、死滅させる）あらゆる薬剤が含まれる。例としては、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、エチジウムブロマイド、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびピューロマイシン、ならびにこれらの類似体または同族体が挙げられる。治療剤としては、例えば、代謝拮抗薬（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシル、ダカルバジン（ｄｅｃａｒｂａｚｉｎｅ））、アルキル化薬（例えば、メクロレタミン、チオテパ（ｔｈｉｏｅｐａ）、クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）、およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｔｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、およびシス−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）、シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（以前のダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（以前のアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、およびアントラマイシン（ＡＭＣ））、ならびに抗有糸分裂剤（例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン）がやはり挙げられる。
【０１２７】
本発明の抗体に結合体化することができる治療用細胞毒の他の好ましい例としては、デュオカルマイシン、カリケアマイシン、メイタンシン、およびオーリスタチン、ならびにこれらの誘導体が挙げられる。カリケアマイシン抗体結合体の一例は市販されている（ＭｙｌｏｔａｒｇＴＭ、Ｗｙｅｔｈ−Ａｙｅｒｓｔ）。
【０１２８】
細胞毒を、当該分野で利用可能なリンカー技術を用いて、本発明の抗体に結合体化することができる。細胞毒を抗体に結合体化するのに用いられているリンカーのタイプの例としては、それだけには限定されないが、ヒドラゾン、チオエーテル、エステル、ジスルフィド、およびペプチド含有のリンカーが含まれる。リンカーは、例えば、リソソーム区画内の低ｐＨによる切断を受けやすいもの、またはカテプシン（例えば、カテプシンＢ、Ｃ、Ｄ）など、腫瘍組織において優先的に発現されるプロテアーゼなどの、プロテアーゼによる切断を受けやすいものが選択され得る。
【０１２９】
細胞毒、リンカーのタイプ、および治療剤を抗体に結合体化するための方法のさらなる考察に関して、Ｓａｉｔｏ，  Ｇ．ら、（２００３年）Ａｄｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．  Ｒｅｖ．、５５巻、１９９〜２１５頁；Ｔｒａｉｌ，  Ｐ．  Ａ．ら、（２００３年）Ｃａｎｃｅｒ  ｌｍｍｕｎｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．、５２巻、３２８〜３３７頁；Ｐａｙｎｅ，  Ｇ．（２００３年）Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ、３巻、２０７〜２１２頁；Ａｌｌｅｎ，  Ｔ．  Ｍ．（２００２年）Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｃａｎｃｅｒ  ２巻、７５０〜７６３頁；Ｐａｓｔａｎ，  Ｉ．  およびＫｒｅｉｔｍａｎ，  Ｒ．  Ｊ．、（２００２年）Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．  Ｄｒｕｇｓ、３巻、１０８９〜１０９１頁；Ｓｅｎｔｅｒ，  Ｐ．Ｄ．およびＳｐｒｉｎｇｅｒ，  Ｃ．Ｊ．  （２００１年）Ａｄｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．  Ｒｅｖ．、５３巻、２４７〜２６４頁も参照されたい。
【０１３０】
本発明の抗体は、また、放射性同位元素に結合体化して、ラジオイムノコンジュゲート（ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）とも呼ばれる、細胞毒性の放射性医薬品を産生することもできる。診断に、または治療に用いるための抗体に結合体化することができる放射性同位元素の例としては、それだけには限定されないが、ヨウ素１３１、インジウム１１１、イットリウム９０、およびルテチウム１７７が挙げられる。ラジオイムノコンジュゲートを調製するための方法は、当該分野において確立されている。ラジオイムノコンジュゲートの例はＺｅｖａｌｉｎＴＭ（ＩＤＥＣ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）およびＢｅｘｘａｒＴＭ（Ｃｏｒｉｘａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）を含めて市販されており、本発明の抗体を用いてラジオイムノコンジュゲートを調製するのに同様の方法を用いることができる。
【０１３１】
本発明の抗体結合体を用いて、所与の生物学的応答を調節することができ、薬物部分は古典的な化学療法剤に限定されると解釈してはならない。例えば、薬物部分は、所望の生物活性を有するタンパク質またはポリペプチドであってよい。このようなタンパク質としては、例えば、酵素的に活性な毒素、またはその活性なフラグメント、例えば、アブリン、リシンＡ、シュードモナスの体外毒素、もしくはジフテリア毒素；腫瘍壊死因子もしくはインターフェロン−γなどのタンパク質；または生物学的応答調節物質、例えば、リンホカイン、インターロイキン−１（「ＩＬ−１」）、インターロイキン−２（「ＩＬ−２」）、インターロイキン−６（「ＩＬ−６」）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（「ＧＭ−ＣＳＦ」）、顆粒球コロニー刺激因子（「Ｇ−ＣＳＦ」）、もしくは他の成長因子が挙げられ得る。
【０１３２】
このような治療部分を抗体に結合体化するための技術は周知であり、例えば、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｒｅｉｓｆｅｌｄら（編集）、２４３〜５６頁、（Ａｌａｎ  Ｒ．  Ｌｉｓｓ，  Ｉｎｃ．  １９８５）における、Ａｒｎｏｎ  ら、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｏｆ  Ｄｒｕｇｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ」；Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（第２版）、Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ら（編集）、６２３〜５３頁（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｉｎｃ．、１９８７年）における、Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍら、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ’８４：
Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｐｉｎｃｈｅｒａら（編集）、４７５〜５０６頁（１９８５年）における、Ｔｈｏｒｐｅ、「Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  Ｏｆ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｉｎ
Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ：  Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ」；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｂａｌｄｗｉｎら（編集）、３０３〜１６頁（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９８５年）における、「Ａｎａｌｙｓｉｓ，  Ｒｅｓｕｌｔｓ，  Ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｕｓｅ  Ｏｆ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ」、およびＴｈｏｒｐｅら、「Ｔｈｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ
Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  Ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｔｏｘｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ」、Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｒｅｖ．、６２巻、１１９〜５８頁（１９８２年）を参照されたい。
【０１３３】
（抗ＶＥＧＦ抗体の使用）
治療的適用のために、本発明の抗ＶＥＧＦ抗体は、哺乳動物、好ましくはヒトに、局所的、眼内、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、滑膜内、鞘内、経口または吸入経路によって、ボーラスとしてかまたはある期間にわたる持続的注入によって、ヒトに静脈内投与できる形態を含む、本明細書で議論される形態などの、薬学的に許容される投薬形態で投与する。抗体はまた、腫瘍内、腫瘍周囲（ｐｅｒｉｔｕｍｏｒａｌ）、病巣内または病変周囲（ｐｅｒｉｌｅｓｉｏｎａｌ）の経路によって適切に投与され、局所性および全身性治療効果をもたらす。腹腔内経路は、例えば卵巣腫瘍の処置において、特に有用であると期待される。
【０１３４】
疾患を予防または処置するための、抗体の適切な投与量は、上で定義したように、処置する疾患のタイプ、疾患の重症度および経過、抗体を予防または治療のどちらの目的で投与するか、以前の治療、患者の病歴および抗体への応答、ならびに主治医の自由裁量に依存する。抗体は、１回でまたは一連の処置にわたって適切に患者に投与する。
【０１３５】
抗ＶＥＧＦ抗体は、本明細書で記載されるようなＶＥＧＦ媒介性疾患の処置に有用である。例えば、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）は、高齢者集団における深刻な視力喪失の主な原因である。ＡＭＤの滲出性形態は、脈絡膜新生血管形成および網膜色素上皮細胞剥離を特徴とする。脈絡膜新生血管形成は、予後の劇的な悪化に関連するため、本発明のＶＥＧＦ抗体は、ＡＭＤの重症度の低下に特に有用である。この治療の進行は、検眼鏡検査（ｏｐｔｈａｌｍｏｓｃｏｐｙ）、眼底顕微鏡および眼のコンピュータ断層撮影法を含む従来の技法によって、容易にモニターされる。
【０１３６】
ＦＤＡが認可した、ルセンティスを用いる使用に適する全ての用量およびレジメンを考慮している。他の用量およびレジメンは、２００８年６月２５日に出願された、名称「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｂｉｎｄｅｒ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ  Ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｆｏｒ  Ａｄｍｉｎｓｔｒａｔｉｏｎ」の米国仮出願第６１／０７５，６４１号および米国仮出願第６１／０５８，５０４号に記載され、本明細書に明示的に援用される。
【０１３７】
本発明の別の実施形態により、疾患の予防または処置における抗体の有効性は、抗体を連続的に投与することによって、またはそれらの目的に有効である別の薬剤、例えば、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、酸性もしくは塩基性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）または肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の新脈管形成活性を阻害または中和できる抗体、組織因子、プロテインＣまたはプロテインＳの血液凝固活性を阻害または中和できる抗体（１９９１年２月２１日に公開された、ＥｓｍｏｎらのＰＣＴ特許出願ＷＯ９１／０１７５３を参照されたい）、ＨＥＲ２受容体に結合できる抗体（１９８９年７月２７日に公開された、ＨｕｄｚｉａｋらのＰＣＴ特許出願ＷＯ８９／０６６９２を参照されたい）、または例えばアルキル化剤、光血液凝固剤（ベルテポルフィンなど）、葉酸拮抗剤、核酸代謝の代謝拮抗薬、抗生物質、ピリミジン類似体、５−フルオロウラシル、シスプラチン、プリンヌクレオシド、アミン、アミノ酸、トリアゾールヌクレオシドもしくはコルチコステロイドなどの１つまたは複数の従来の治療剤などと抗体とを組み合わせて投与することによって改善することができる。かかる他の薬剤は、投与する組成物中に存在し得、または別々に投与することができる。また、放射性物質の照射または投与を含んだとしても、抗体は、連続的または放射線学的処置と組み合わせて適切に投与される。
【０１３８】
本発明の抗体は、親和性精製剤として使用することができる。このプロセスにおいて、抗体は、当該分野で周知の方法を用いて、セファデックス樹脂または濾紙のような固相上に固定化する。固定化した抗体を、ＶＥＧＦタンパク質（またはそのフラグメント）を含む試料と接触させて精製し、その後、担体を適切な溶媒で洗浄し、これにより固定化した抗体に結合するＶＥＧＦタンパク質以外の、試料中の実質的に全ての物質が除去される。最後に、担体をｐＨ５．０のグリシン緩衝液などの別の適切な溶媒で洗浄し、これにより抗体からＶＥＧＦタンパク質が放出される。
【０１３９】
抗ＶＥＧＦ抗体はまた、ＶＥＧＦタンパク質の診断アッセイ、例えば特定の細胞、組織または血清中でのその発現を検出するのにも有用な場合がある。かかる診断方法は、がんの診断に有用な場合がある。
【０１４０】
診断的適用のために、抗体は、一般的に検出可能な部分により標識される。非常に多くの標識が利用でき、それらは概して次のカテゴリーに分類することができる：
（ａ）１１１Ｉｎ、９９Ｔｃ、１４Ｃ、１３１Ｉ、１２５Ｉ、３Ｈ、３２Ｐまたは３５Ｓなどの放射性同位元素。抗体は、例えばＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１および２巻、Ｃｏｌｉｇｅｎら編、Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．、Ｐｕｂｓ．（１９９１年）に記載の技法を用いて、放射性同位元素により標識でき、放射活性は、シンチレーション計数器を用いて測定することができる。
【０１４１】
（ｂ）希土類キレート（ユーロピウムキレート）またはフルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ダンシル、リサミン、フィコエリトリンおよびテキサスレッドなどの蛍光標識を利用することができる。蛍光標識は、例えば上記のＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙに開示されている技法を用いて、抗体と結合体化することができる。蛍光は、蛍光計を用いて定量化することができる。
【０１４２】
（ｃ）様々な酵素−基質標識を利用でき、米国特許第４，２７５，１４９号ではこれらのいくつかの概説が提供されている。酵素は、一般的に、様々な技法を用いて測定できる、色素形成基質の化学変化を触媒する。例えば、酵素は、分光光度的に測定できる、基質における色の変化を触媒することができる。あるいは、酵素は、基質の蛍光または化学発光を変えることができる。蛍光における変化を定量化するための技法は、上に記載されている。化学発光基質は、化学反応によって電子的に励起状態になり、次いで（例えば、ケミルミノメーター（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ）を用いて）測定できる光を放射し得、または蛍光アクセプターにエネルギーを供与する。酵素標識の例としては、ルシフェラーゼ（例えば、ホタルルシフェラーゼおよび細菌ルシフェラーゼ；米国特許第４，７３７，４５６号）、ルシフェリン、２，３−ジヒドロフタラジンジオン、リンゴ酸脱水素酵素、ウレアーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）などのペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、糖類酸化酵素（例えば、グルコース酸化酵素、ガラクトース酸化酵素およびグルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ）、複素環酸化酵素（ウリカーゼおよびキサンチン酸化酵素など）、ラクトペルオキシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼなどが挙げられる。酵素を抗体に結合体化するための技法は、Ｏ’Ｓｕｌｌｉｖａｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅ−Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｆｏｒ  ｕｓｅ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍ．（Ｊ．  Ｌａｎｇｏｎｅ  ＆  Ｈ．  Ｖａｎ  Ｖｕｎａｋｉｓ編）、Ａｃａｄｅｍｉｃ  ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、７３巻：１４７〜１６６頁（１９８１年）に記載されている。酵素−基質の組合せの例としては、例えば：
（ｉ）西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）と、基質としての水素ペルオキシダーゼであり、水素ペルオキシダーゼが、色素前駆体（例えば、オルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）または３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン塩酸塩（ＴＭＢ））を酸化、
（ｉｉ）アルカリホスファターゼ（ＡＰ）と、色素形成基質としてのパラ−ニトロフェニルホスフェート、および
（ｉｉｉ）ベータ−Ｄ−ガラクトシダーゼ（ベータ−Ｄ−Ｇａｌ）と色素形成基質（例えば、Ｐ−ニトロフェニル−ベータ−Ｄ−ガラクトシダーゼ）または蛍光発生基質４−メチルウンベリフェリル−ベータ−Ｄ−ガラクトシダーゼ、が挙げられる。
【０１４３】
本発明の別の実施形態では、抗ＶＥＧＦ抗体を標識する必要はなく、その存在は、ＶＥＧＦ抗体に結合する標識抗体を使用して検出することができる。
【０１４４】
本発明の抗体には、競合的結合アッセイ、直接および間接的サンドイッチアッセイおよび免疫沈降アッセイなどの任意の公知のアッセイ方法も採用することができる。Ｚｏｌａ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１４７〜１５８頁（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．  １９８７年）。
【０１４５】
競合的結合アッセイは、制限された量の抗体と結合するために試験試料分析物と競合する、標識した標準物質の能力に依存する。試験試料中のＶＥＧＦタンパク質の量は、抗体と結合状態になる標準物質の量に反比例する。結合状態になる標準物質の量の決定を容易にするために、抗体を、一般的に競合の前または後に不溶化し、抗体に結合する標準物質および分析物を、結合しないままの標準物質および分析物から都合良く分離できるようにする。
【０１４６】
サンドイッチアッセイは、検出されるタンパク質の異なる免疫原性部分またはエピトープにそれぞれが結合できる２つの抗体の使用を含む。サンドイッチアッセイでは、試験試料分析物は、固体担体上に固定化する第１抗体によって結合され、その後、第２抗体が分析物に結合し、したがって不溶性の３部分の複合体が形成される。例えば、米国特許第４，３７６，１１０号を参照されたい。第２抗体は、それ自体、検出可能な部分で標識でき（直接的サンドイッチアッセイ）、検出可能な部分で標識される抗免疫グロブリン抗体を使用して測定することもできる（間接的サンドイッチアッセイ）。例えば、サンドイッチアッセイの１種にＥＬＩＳＡアッセイがあり、これは検出可能な部分が酵素の場合である。
【０１４７】
免疫組織化学に関しては、腫瘍試料は新鮮または凍結であってよく、例えば、パラフィン中に包埋し、例えばホルマリンなどの保存剤で固定してもよい。
【０１４８】
抗体は、インビボの診断アッセイに使用することもできる。一般的に、抗体は、放射性核種（１１１Ｉｎ、９９Ｔｃ、１４Ｃ、１３１Ｉ、１２５Ｉ、３Ｈ、３２Ｐまたは３５Ｓなど）で標識し、免疫シンチグラフィ（ｉｍｍｕｎｏｓｃｉｎｔｉｏｇｒａｐｈｙ）を使用して腫瘍の場所を突き止められるようにする。
【０１４９】
本発明の抗体は、キット、すなわち診断アッセイを行うための説明書と所定量の試薬をパッケージした組合せで提供され得る。抗体が酵素で標識される場合、キットには酵素に必要な基質および補因子が含まれる（例えば、検出可能な発色団またはフルオロフォアをもたらす基質前駆体）。さらに、安定剤、緩衝液（例えば、ブロック緩衝液または溶解緩衝液）などの他の添加剤を含むことができる。様々な試薬の相対量は、幅広く変えることができ、アッセイの感度を実質的に最適にする、溶液中の試薬の濃度を可能にする。特に試薬は、通常、凍結乾燥した乾燥粉末として提供でき、溶解状態で適切な濃度を有する試薬溶液をもたらす賦形剤を含む。
【０１５０】
（薬学的調製物）
１つの態様では、本発明は、ＶＥＧＦ媒介性疾患の処置のための抗ＶＥＧＦ抗体を含む薬学的処方物を提供する。用語「薬学的処方物」とは、明白に有効である抗体または抗体誘導体の生物活性を可能にするような形態であり、処方物を投与した被験体に毒性のある追加の成分を含まない調製物をいう。「薬学的に許容される」賦形剤（ビヒクル、添加剤）とは、被験体である哺乳動物に合理的に投与し、採用する活性成分の有効用量を実現できるものである。
【０１５１】
「安定的な」処方物とは、処方物中の抗体または抗体誘導体が、保存に際しその物理的安定性および／または化学的安定性および／または生物活性を本質的に保持するものである。タンパク質の安定性を測定するための様々な分析技法は、当該分野で入手でき、例えば、Ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ、２４７〜３０１頁、Ｖｉｎｃｅｎｔ  Ｌｅｅ編、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．、Ｐｕｂｓ．（１９９１年）、およびＪｏｎｅｓ，  Ａ．  Ａｄｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖ．１０巻：２９〜９０頁（１９９３年）に概説されている。安定性は、選択した期間の間、選択した温度で測定することができる。好ましくは、処方物は、少なくとも１週間、室温（約３０℃）または４０℃で安定、および／または少なくとも３カ月から２年間、約２〜８℃で安定である。その上、処方物は、好ましくは、処方物の凍結（例えば−７０℃まで）および解凍の後も安定である。
【０１５２】
色および／または透明さの視覚的検査で、あるいはＵＶ光散乱またはサイズ排除クロマトグラフィー、または当該分野で承認されている他の適切な方法によって測定したときに、凝集、分解、沈殿および／または変性に対する、定義された公開の水準を満たす場合、抗体または抗体誘導体は、薬学的処方物において「その物理的安定性を保持する」。
【０１５３】
抗体または抗体誘導体は、所与の時間での化学的安定性が、タンパク質が以下に定義されるようなその生物活性をなおも保持すると考えられるほどであれば、薬学的処方物において「その化学的安定性を保持する」。化学的安定性は、化学変化したタンパク質の形態を検出および定量化することによって評価することができる。化学変化は、例えば、サイズ排除クロマトグラフィー、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび／またはマトリックス支援レーザー脱離イオン化／飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ  ＭＳ）を用いて評価できる、サイズ修正（例えばクリッピング（ｃｌｉｐｐｉｎｇ））に関わり得る。他のタイプの化学変化には、例えばイオン交換クロマトグラフィーによって評価できる電荷変化（例えば、脱アミドに起因して起こる）が挙げられる。
【０１５４】
抗体または抗体誘導体は、所与の時間での抗体の生物活性が、例えば、薬学的処方物が抗原結合アッセイで決定されるように調製したときに示される生物活性の、約１０％以内（アッセイのエラー内）であれば、薬学的処方物において「その生物活性を保持する」。抗体に関する他の「生物活性」アッセイは、本明細書で以下に詳しく述べる。
【０１５５】
「等張」とは、目的の処方物が、本質的にヒト血液と同じ浸透圧を有することを意味する。等張処方物は、一般的に約２５０から３５０ｍＯｓｍの浸透圧を有する。等張性は、例えば、蒸気圧またはアイスフリージング型浸透圧計を用いて測定することができる。
【０１５６】
「ポリオール」は、複数のヒドロキシル基を有する物質であり、糖（還元および非還元糖）、糖アルコールおよび糖酸が挙げられる。本明細書における好ましいポリオールは、約６００ｋＤ未満（例えば、約１２０から約４００ｋＤの範囲）の分子量を有する。「還元糖」とは、金属イオンを還元できる、またはタンパク質中のリジンおよび他のアミノ基と共有結合的に反応できるヘミアセタール基を含むものであり、「非還元糖」とは、還元糖のこれらの特性をもたないものである。還元糖の例は、フルクトース、マンノース、マルトース、ラクトース、アラビノース、キシロース、リボース、ラムノース、ガラクトースおよびグルコースである。非還元糖には、スクロース、トレハロース、ソルボース、メレジトースおよびラフィノースが挙げられる。マンニトール、キシリトール、エリスリトール、トレイトール、ソルビトールおよびグリセロールは、糖アルコールの例である。糖酸について、これには、Ｌ−グルコネートおよびその金属塩が挙げられる。処方物が凍結−解凍に対して安定であることが望まれる場合、ポリオールは、好ましくは処方物中の抗体が不安定になるような凍結温度（例えば−２０℃）での結晶化をしないものである。スクロースおよびトレハロースなどの非還元糖は、本明細書において好ましいポリオールであり、トレハロースの優れた溶液安定性の理由から、スクロースよりトレハロースが好ましい。
【０１５７】
本明細書で使用するとき、「緩衝液」とは、酸−塩基の結合体化成分の作用によるｐＨの変化に耐える緩衝溶液をいう。本発明の緩衝液は、約４．５から約８．０、好ましくは約５．５から約７の範囲のｐＨを有する。この範囲でｐＨを制御する緩衝液の例には、酢酸塩（例えば酢酸ナトリウム）、コハク酸塩（コハク酸ナトリウムなど）、グルコン酸塩、ヒスチジン、クエン酸塩および他の有機酸の緩衝液が挙げられる。凍結−解凍に対して安定的な処方物が望まれる場合、緩衝液は、好ましくはホスフェートではない。
【０１５８】
薬理学的な意味において、本発明に関連して、抗体または抗体誘導体の「治療有効量」とは、抗体または抗体誘導体が有効である処置に関して、障害の予防または処置に有効な量をいう。「疾患／障害」とは、抗体または抗体誘導体を用いた処置により利益を得る任意の状態である。これには、哺乳動物を問題の障害にかからせる病理学的状態を含む、慢性および急性の障害または疾患が含まれる。
【０１５９】
「保存剤」とは、処方物中に含まれ得、本質的にそこで細菌の作用を減少できる化合物であり、したがって、例えばマルチユーズ（ｍｕｌｔｉ−ｕｓｅ）の処方物の製造を容易にすることができる。可能性のある保存剤の例には、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、ヘキサメトニウムクロリド、ベンザルコニウムクロリド（アルキル基が長鎖の化合物であるアルキルベンジルジメチルアンモニウムクロリドの混合物）、およびベンゼトニウムクロリドが挙げられる。保存剤の他のタイプには、フェノール、ブチルおよびベンジルアルコールなどの芳香族アルコール、メチルまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３−ペンタノールならびにｍ−クレゾールが挙げられる。本明細書における最も好ましい保存剤は、ベンジルアルコールである。
【０１６０】
本発明はまた、生理学的に許容される少なくとも１つの担体または賦形剤と一緒に、１つまたは複数の抗体または抗体誘導体化合物を含む薬学的組成物も提供する。薬学的組成物は、例えば、１つまたは複数の水、緩衝液（例えば、中性緩衝生理食塩水またはホスフェート緩衝生理食塩水）、エタノール、鉱油、植物油、ジメチルスルホキシド、炭水化物（例えば、グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン）、マンニトール、タンパク質、アジュバント、ポリペプチド、またはグリシンなどのアミノ酸、抗酸化剤、ＥＤＴＡもしくはグルタチオンなどのキレート剤、および／または保存剤を含むことができる。上述のように、他の活性成分を、（必ずしも必要ではないが）本明細書で提供される薬学的組成物中に含めることができる。
【０１６１】
担体は、しばしば化合物の安定性または生物学的利用能を制御する目的のため、患者に投与する前に、抗体または抗体誘導体に関連し得る物質である。かかる処方物内部で使用するための担体は、一般的に生体適合性を有し、生分解性も有し得る。担体には、例えば、血清アルブミン（例えばヒトまたはウシ）、卵アルブミン、ペプチド、ポリリジンなどの一価または多価分子、およびアミノデキストランなどの多糖類およびポリアミドアミンが挙げられる。担体はまた、例えば、ポリラクテート、ポリグリコレート、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）、ポリアクリレート、ラテックス、デンプン、セルロースまたはデキストランを含む、ビーズおよびミクロ粒子（ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅ）などの固体担体物質も含む。担体は、共有結合（直接的またはリンカー基を介してのいずれか）、非共有結合の相互作用または混合を含む、様々な方法において化合物を有し得る。
【０１６２】
薬学的組成物は、例えば、局所、眼内、経口、経鼻、直腸または非経口投与を含む、任意の適切な投与方式に関して処方することができる。ある種の実施形態では、例えば点眼薬としての局所使用に適切な形態の組成物が好ましい。他の形態には、例えば、丸剤、錠剤、トローチ、ロゼンジ、水性もしくは油性懸濁物、分散性粉末もしくは顆粒、エマルジョン、硬もしくは軟カプセル、またはシロップもしくはエリキシル剤が挙げられる。さらなる他の実施形態内では、本明細書で提供される組成物は、凍結乾燥物として処方することができる。本明細書で使用されるような非経口という用語は、皮下、皮内、血管内（例えば静脈内）、筋肉内、脊髄、頭骸内、くも膜下腔内および腹腔内注射、ならびに任意の類似の注射または注入技法を含む。
【０１６３】
薬学的組成物は、使用するビヒクルおよび濃度に依存して、モジュレータがビヒクル中に懸濁または溶解されている、無菌注射可能な水性または油性懸濁物として調製することができる。かかる組成物は、適切な分散剤、加湿剤および／または上述のものなどの懸濁剤を使用する公知の技術に従って処方することができる。採用できる許容されるビヒクルおよび溶媒には、水、１，３−ブタンジオール、リンゲル液および等張食塩水がある。さらに、無菌の固定油は、溶媒または懸濁ビヒクルとして採用することができる。この目的のために、合成のモノまたはジグリセリドを含む、刺激の少ない任意の固定油を採用することができる。さらに、オレイン酸などの脂肪酸を、注射可能な組成物の調製に使用でき、局所麻酔剤などのアジュバント、保存剤および／または緩衝剤を、ビヒクル中に溶解することができる。
【０１６４】
薬学的組成物は、持続放出処方物（すなわち、投与後にモジュレータの徐放をもたらすカプセルなどの処方物）として処方することができる。かかる処方物は、一般的に周知の技術を用いて調製でき、例えば、経口、直腸もしくは皮下移植によって、または所望の標的部位に移植することによって投与することができる。かかる処方物内で使用するための担体は、生体適合性を有し、生分解性も有し得て、好ましくは、処方物が比較的一定レベルのモジュレータ放出を可能にする。持続放出処方物内に含まれる抗体または抗体誘導体の量は、例えば、移植の部位、放出の速度および期待される持続期間、ならびに処置または予防する疾患／障害の特性によって決まる。
【０１６５】
本明細書で提供される抗体または抗体誘導体は、一般的に、検出可能な程度にＶＥＧＦに結合し、ＶＥＧＦ媒介性疾患／障害を予防または阻害するのに十分な、体液（例えば、血液、血漿、血清、ＣＳＦ、滑液、リンパ、細胞間質液、涙または尿）中の濃度に達する量で投与する。用量は、本明細書に記載のような認識できる患者の利益をもたらすとき、有効であると考えられる。好ましい全身の用量は、１日につき、体重１キログラムにつき約０．１ｍｇから約１４０ｍｇ（１日につき患者１人につき約０．５ｍｇから約７ｇ）の範囲であり、経口での用量は、一般的に静脈内での用量より約５〜２０倍多い。担体物質と組み合わせて単回投薬形態を産出できる抗体または抗体誘導体の量は、処置される受容者（ｈｏｓｔ）および特定の投与様式によって変化する。投薬単位形態には、一般的に約１ｍｇから約５００ｍｇの間の活性成分が含まれる。
【０１６６】
薬学的組成物は、ＶＥＧＦに向けられる抗体または抗体誘導体に応答する状態を処置するためにパッケージすることができる。パッケージされた薬学的組成物は、本明細書に記載のような少なくとも１つの抗体または抗体誘導体の有効量を保持する容器、および患者への投与後に、１つの抗体または抗体誘導体に応答する疾患／障害を処置するために含有組成物を使用することを示す説明書（例えばラベル）を含むことができる。
【０１６７】
本発明の抗体または抗体誘導体は、化学的に修飾することもできる。好ましい修飾基は、例えば、場合によって置換した直鎖もしくは分岐鎖ポリアルケン、ポリアルケニレンもしくはポリオキシアルキレンポリマー、または分岐したかもしくは分岐していない多糖類などのポリマーである。かかるエフェクター基は、インビボでの抗体の半減期を長くすることができる。合成ポリマーの特定の例には、場合によって置換した直鎖または分岐鎖ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、ポリ（プロピレングリコール）、ポリ（ビニルアルコール）またはその誘導体が挙げられる。天然に存在する特定のポリマーには、ラクトース、アミロース、デキストラン、グリコゲンまたはその誘導体が挙げられる。ポリマーのサイズは、所望のように変化できるが、一般的に平均分子量は５００Ｄａから５００００Ｄａの範囲である。局所適用のために、抗体を組織に浸透するようにデザインする場合、ポリマーの好ましい分子量は、約５０００Ｄａである。ポリマー分子は、抗体、特に、ＷＯ０１９４５８５に記載のように、共有結合的に連結するヒンジペプチドを介して、Ｆａｂフラグメントの重鎖のＣ末端部に付着することができる。ＰＥＧ部分の付着に関しては、「Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、１９９２年、Ｊ．  Ｍｉｌｔｏｎ  Ｈａｒｒｉｓ（編）、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、および「Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、１９９８年、Ｍ．  Ａｓｌａｍ  ａｎｄ  Ａ．  Ｄｅｎｔ、Ｇｒｏｖｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照されたい。
【０１６８】
上記のように目的の抗体または抗体誘導体を調製した後、それを含む薬学的処方物を調製する。処方される抗体は、事前の凍結乾燥に供さず、本明細書で目的の処方物は、水性処方物である。好ましくは、処方物中の抗体または抗体誘導体は、ｓｃＦｖなどの抗体フラグメントである。処方物中に存在する抗体の治療有効量は、例えば、所望の用量体積および投与様式（複数可）を考慮に入れて決定する。約０．１ｍｇ／ｍｌから約５０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約０．５ｍｇ／ｍｌから約４０ｍｇ／ｍｌ、および最も好ましくは約１０ｍｇ／ｍｌから約２０ｍｇ／ｍｌが、処方物中の典型的な抗体濃度である。
【０１６９】
水性処方物は、ｐＨ緩衝溶液中の抗体または抗体誘導体を含めて調製する。本発明の緩衝液は、約４．５から約８．０、好ましくは約５．５から約７の範囲のｐＨを有する。この範囲内でｐＨを制御する緩衝液の例には、酢酸塩（例えば酢酸ナトリウム）、コハク酸塩（コハク酸ナトリウムなど）、グルコン酸塩、ヒスチジン、クエン酸塩および他の有機酸の緩衝液が挙げられる。緩衝液の濃度は、約１ｍＭから約５０ｍＭ、好ましくは約５ｍＭから約３０ｍＭであってよく、例えば緩衝液および処方物の所望の等張性によって決めることができる。
【０１７０】
トニシファイアー（ｔｏｎｉｃｉｆｉｅｒ）として働き、抗体を安定化できるポリオールは、処方物中に含まれる。好ましい実施形態では、抗体または抗体誘導体の沈殿を引き起こし得て、および／または低ｐＨで酸化を引き起こし得るため、処方物は塩化ナトリウムなどの塩をトニシファイ量（ｔｏｎｉｃｉｆｙｉｎｇ  ａｍｏｕｎｔ）で含まない。好ましい実施形態では、ポリオールは、スクロースまたはトレハロースなどの非還元糖である。ポリオールは、処方物の所望の等張性に対して変化できる量で処方物中に添加する。好ましくは、水性処方物は等張であり、この場合、処方物中の適切なポリオール濃度は、例えば、約１％から約１５％ｗ／ｖの範囲、好ましくは約２％から約１０％ｗ／ｖの範囲である。しかし、高張性または低張性処方物も適切であり得る。添加するポリオールの量も、ポリオールの分子量に対して変えることができる。例えば、二糖（トレハロースなど）と比較して、より少量の単糖（例えばマンニトール）を添加することができる。
【０１７１】
界面活性剤も、抗体または抗体誘導体処方物に添加する。典型的な界面活性剤には、ポリソルベート（例えば、ポリソルベート２０、８０など）またはポロキサマー（例えばポロキサマー１８８）などの非イオン性界面活性剤が挙げられる。添加する界面活性剤の量は、処方した抗体／抗体誘導体の凝集を減少させ、および／または処方物中の粒子の形成を最小化し、および／または吸着を低下させるほどの量である。例えば、界面活性剤は、約０．００１％から約０．５％、好ましくは約０．００５％から約０．２％、および最も好ましくは約０．０１％から約０．１％の量で処方物中に存在し得る。
【０１７２】
１つの実施形態では、処方物は、上記で同定した薬剤（すなわち、抗体または抗体誘導体、緩衝液、ポリオールおよび界面活性剤）を含み、本質的に、ベンジルアルコール、フェノール、ｍ−クレゾール、クロロブタノールおよび塩化ベンゼトニウムなどの１つまたは複数の保存剤を含まない。別の実施形態では、特に処方物が複数用量の処方物である場合、保存剤を処方物中に含むことができる。保存剤の濃度は、約０．１％から約２％、最も好ましくは約０．５％から約１％の範囲であってよい。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  第２１版、Ｏｓｏｌ，  Ａ．編（２００６年）に記載のものなどの、１つまたは複数の他の薬学的に許容される担体、賦形剤または安定剤を、それらが処方物の所望の特徴に悪影響を及ぼさないという条件で、処方物中に含めることができる。許容される担体、賦形剤または安定剤は、採用する投与量および濃度でレシピエントに毒性がなく、追加の緩衝剤、共溶媒、アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤、ＥＤＴＡなどのキレート剤、金属錯体（例えばＺｎ−タンパク質複合体）、ポリエステルなどの生分解性ポリマー、ならびに／またはナトリウムなどの塩形成対イオンを含む。
【０１７３】
インビボの投与に使用する処方物は、無菌でなければならない。これは、処方物を調製する前または後に、無菌ろ過膜を通すろ過によって容易に成し遂げられる。
【０１７４】
処方物は、抗体を用いる処置が必要な哺乳動物、好ましくはヒトに、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内（ｉｎｔｒａｃｅｒｏｂｒｏｓｐｉｎａｌ）、皮下、関節内、滑膜内、鞘内、経口、局所または吸入経路による、ボーラスとしてかまたはある期間にわたる持続的注入による静脈内投与などの公知の方法に従って投与する。好ましい実施形態では、処方物は、眼表面への点眼薬の局所適用によって、哺乳動物に投与する。かかる目的のために、処方物は、例えば点眼薬アプリケーターを用いて適用することができる。
【０１７５】
抗体の適切な投与量（「治療有効量」）は、例えば、処置する病状、病状の重症度および経過、抗体を予防または治療のどちらの目的で投与するか、以前の治療、患者の病歴および抗体への応答、使用する抗体のタイプ、ならびに主治医の自由裁量によって決まる。抗体または抗体誘導体は、１回または１連の処置にわたって患者に適切に投与し、診断以降の任意の時間に患者に投与することができる。抗体または抗体誘導体は、単独の処置としてか、または問題とする病状の処置に有用な他の薬物もしくは治療と併せて投与することができる。
【０１７６】
一般的な提案として、投与する抗体または抗体誘導体の治療有効量は、１回投与かまたは複数回投与かは別にして、患者の体重に対して約０．１から約５０ｍｇ／ｋｇの範囲となり、使用する抗体の典型的な範囲は、例えば、毎日の投与で約０．３から約２０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは約０．３から約１５ｍｇ／ｋｇとなる。しかし、他の投薬レジメンも有用であり得る。この治療の進行は、従来の技法によって容易にモニターされる。
【０１７７】
ＦＤＡが認可した、ルセンティスを用いる使用に適する用量およびレジメンを考慮している。
【０１７８】
他の用量およびレジメンは、２００８年６月２５日に出願された、名称「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｂｉｎｄｅｒ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ  Ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ
Ｆｏｒ  Ａｄｍｉｎｓｔｒａｔｉｏｎ」の米国仮出願第６１／０７５，６４１号に記載され、本明細書に明示的に援用される。
【０１７９】
（製造品）
本発明の別の実施形態では、本発明の水性薬学的処方物を保持する容器を含む、製造品が提供され、その使用に関する説明書が場合によって提供される。適切な容器には、例えば、ボトル、小瓶、点眼薬アプリケーターおよび注射器が挙げられる。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から形成することができる。典型的な容器は、３〜２０ｃｃの単回使用のガラスまたはプラスチックの小瓶である。あるいは、複数用量処方物用に、容器は３〜１００ｃｃのガラス小瓶であってよい。容器は処方物を保持し、容器上のラベルにより、または容器に付随したラベルにより、使用に関する指示を示すことができる。製造品は、商業および使用者の視点から望まれる他の物質をさらに含むことができ、これには、他の緩衝液、希釈液、フィルタ、針、注射器、および使用に関する説明のついた添付文書が挙げられる。
【実施例】
【０１８０】
（例示）
本開示を、さらに限定するものと解釈すべきではない以下の実施例によってさらに説明する。全ての図ならびにこの出願全体にわたって引用される全ての文献、特許および公開された特許出願の内容は、それらの全体が参照により本明細書に明示的に援用される。
【０１８１】
実施例全体にわたり、特に明記しない限り、以下の材料および方法を使用した。
【０１８２】
（一般的な材料および方法）
一般的に、本発明の実施では、特に示さない限り、化学、分子生物学、組換えＤＮＡ技術、免疫学（特に、例えば抗体技術）の従来技法、およびポリペプチド調製の標準技法を採用する。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９年）；Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、５１０、Ｐａｕｌ，  Ｓ．、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒ（１９９６年）；Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｓｅｒｉｅｓ、１６９）、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ編、Ｉｒｌ  Ｐｒ（１９９６年）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｈａｒｌｏｗら、Ｃ．Ｓ．Ｈ．Ｌ．  Ｐｒｅｓｓ，  Ｐｕｂ．（１９９９年）；およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９９２年）を参照されたい。
【０１８３】
（熱安定性の測定）
減衰全反射フーリエ変換ＩＲ（ＦＴＩＲ−ＡＴＲ）スペクトルを、Ｔｅｎｓｏｒ  ＢｒｕｋｅｒにおけるＦＴ−ＩＲ  Ｂｉｏ−ＡＴＲセルを使用して、様々な単鎖および誘導体分子に関して入手した。分子を、３ｍｇ／ｍｌまで濃縮し、ＰＢＳ（ｐＨ６．５）に対して４℃で一晩中透析し、緩衝液のフロースルー（ｆｌｏｗ  ｔｈｒｏｕｇｈ）をブランクとして採取した。変性プロファイルを、５℃ステップ（２５から９５℃）の広範な温度で分子を熱チャレンジ（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）することによって入手した。全てのスペクトルの操作は、ＯＰＵＳソフトウェアを用いて行った。主な緩衝液および一過性の雰囲気（ＣＯ２およびＨ２Ｏ）のバックグラウンドは、タンパク質スペクトルから差し引いた。結果のタンパク質スペクトルを、次いでベースライン補正し、タンパク質アミドＩスペクトルを、期待される領域における最大幅の分解可能なピークの幅から決定した。第２の誘導体スペクトルを、平滑関数による３次多項式関数を用いて、アミドＩバンドスペクトルに関して入手した。タンパク質構造における変化を、３つの低度測定に関して０％の変性、および３つの高度測定に関して１００％変性と仮定する、初期カーブフィット（ｃｕｒｖｅ−ｆｉｔ）計算についての直線検定曲線を用いて、アミドＩの第２誘導体分析によって、推定した。変性プロファイルを、ボルツマンシグモイドモデル（Ｂｏｌｔｚｍａｎｎ  ｓｉｇｍｏｉｄａｌ  ｍｏｄｅｌ）に適用する変量毎の熱アンフォールディング転移（ＴＭ）の中間点を概算するのに使用した。
【０１８４】
（溶解性の測定）
様々なｓｃＦｖ分子の相対的な溶解性を、硫酸アンモニウムの存在下でタンパク質の凝集および沈殿を増強させた後、測定した。硫酸アンモニウムを水溶液中のタンパク質に添加し、塩−タンパク質の最終混合物における飽和を５％増加させた。動的な範囲における沈殿を実験的に決定し、飽和間隔は、最終混合物において２．５％の飽和間隔までこの範囲で減少した。硫酸アンモニウムの添加後、試料を静かに混合し、６０００ｒｐｍで３０分遠心分離した。上清中に残ったタンパク質を、硫酸アンモニウムの飽和のパーセント毎に回収した。溶解曲線を、ＮａｎｏＤｒｏｐＴＭ１０００  Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒを使用するＵＶ−ＶＩＳ測定により、上清中のタンパク質濃度を測定することによって決定した。上清中に残った可溶性タンパク質の測定を正規化し、ボルツマンシグモイドモデルに適用する変量毎の相対的な溶解性の中間点を推定するのに使用した。
【０１８５】
（短期間の安定性試験）
ｓｃＦｖ分子を、可溶性凝集物および分解産物の存在に関して、４０℃で２週間インキュベートした後、調べた。１０ｍｇ／ｍｌの濃度のタンパク質を、広範なｐＨ（３．５、４．５、５．５、６．５、７．０、７．５および８．５）のＰＢＳに対して４℃で一晩中透析した。標準緩衝液ＰＢＳ（ｐＨ６．５）中の同じ濃度の対照分子を、２週間の間−８０℃で保管した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分解のバンドの決定は、ｔ＝０およびｔ＝１４ｄ時点で行い、可溶性凝集物をＳＥＣ−ＨＰＬＣにおいて評価した。４０℃で２週間後、残った活性の決定を、Ｂｉａｃｏｒｅを使用して行った。
【０１８６】
（実施例１）
（抗ＶＥＧＦ抗体を産生するための免疫化戦略）
この実施例では、新規の抗原性ＶＥＧＦ由来のペプチドを使用し、ヒト、マウスおよびウサギＶＥＧＦＡを認識できる抗体を産生させた免疫化戦略を記載する。
【０１８７】
Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈで行ったアラニンスキャニング変異誘発試験から、ＶＥＧＦｒとの高親和性の相互作用に重要なＶＥＧＦＡの残基が公知である（Ｆｕｈ，  Ｇ．ら、（２００６年）Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．２８１巻、６６２５〜６６３１頁）。受容体結合部位は、おそらくコンフォメーションエピトープを表すが、ほとんどの重要な残基は、成熟ＶＥＧＦＡの最初の１０個のアミノ酸上のアルファへリックス上にある。
【０１８８】
ウサギＶＥＧＦＡは、ヒトの配列と比較したときに、アルファへリックス中に３つのアミノ酸変化を含み、対照的にマウスＶＥＧＦＡは、この領域においてヒトと同一である。したがって、マウス−ヒト交差反応性抗体の産出のために、ウサギは、免疫化のための適切な種を示す。さらに、ウサギの免疫化は、マウスの免疫化より高い親和性を有するＡｂを導くことができる。
【０１８９】
上記の概要のように、ＶＥＧＦＡのＮ末端アルファへリックス上の残基との相互作用は、ＶＥＧＦＲ１との結合に最も重大のようである。したがって、このアミノ酸１０個の長さの範囲は、免疫化のためのエピトープとして使用することができる。あるいは、全長ＶＥＧＦＡを注射できるが、ＶＥＧＦＡ上の他のペプチド範囲はより免疫原性が高く、したがって、中和抗体を引き起こす見込みが少なくなる。この仮説は、両方ともＶＥＧＦＡのＣ末端の近くに位置する２つの異なるペプチドが、ＪｏｈｎｓｏｎおよびＷｏｌｆの方法により予測されるように潜在的に免疫原性があるという事実によって支持される。この方法は、Ｎ末端のアルファへリックスに関してごくわずかな免疫原性潜在力を予測する。したがって、アルファへリックスのみを構成するペプチドを用いる免疫化は、全長ＶＥＧＦＡを用いる免疫化より直接的であり得る。強い免疫応答を引き出す可能性は、ペプチドとキーホールリンペットヘモシアニン（Ｋｅｙｈｏｌｅ  Ｌｉｍｐｅｔ  Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ（ＫＬＨ））との融合または化学的カップリングによってさらに高めることができる。
【０１９０】
４つの免疫化戦略を以下のように行った。
Ａ．コンフォメーションバインダーを得る可能性を高めるための、全長ヒトＶＥＧＦＡ１６５を用いるウサギのプレ免疫化（ｐｒｅ−ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）。ａａ長１６−ＫＦＭＤＶＹＯＲＳＹＣＨＰ−２８（下線：受容体相互作用、二重下線、ウサギにおける不一致、Ｃｙｓは結晶構造によるジスルフィド結合に関与する）由来のペプチドでの第２追加免疫。ペプチド配列中に含まれるＣｙｓは、ＫＬＨとのカップリングに使用できるので、したがって、遊離Ｃｙｓとして露出しない。最終ペプチドは、ＫＦＭＤＶＹＱＲＳＹ−Ｃｙｓ−ＫＬＨと思われる。
Ｂ．コンフォメーションバインダーを得る可能性を高めるための、全長ＶＥＧＦＡ１６５を用いるマウスのプレ免疫化。ａａ長１６−ＫＦＭＤＶＹＯＲＳＹＣＨＰ−２８（Ｃｙｓは、結晶構造によるジスルフィド結合に関与する）由来のペプチドでの第２追加免疫。ペプチド配列中に含まれるＣｙｓは、ＫＬＨとのカップリングに使用できるので、したがって、遊離Ｃｙｓとして露出しない。最終ペプチドは、以下と思われる：ＫＦＭＤＶＹＱＲＳＹ−Ｃｙｓ−ＫＬＨ。
Ｃ．ａａ長１６−ＫＦＭＤＶＹＯＲＳＹＣＨＰ−２８（最終ペプチド：ＫＦＭＤＶＹＱＲＳＹ−Ｃｙｓ−ＫＬＨ）由来のペプチドを用いるウサギ／マウスのプレ免疫化。コンフォメーションバインダーを得る可能性を高めるための、全長ＶＥＧＦＡ１６５を用いる第２追加免疫。
Ｄ．ウサギにおける全長ＶＥＧＦＡ１６５を用いる免疫化。
【０１９１】
（実施例２）
（ＣＤＲ融合およびモノクローナルウサギ抗ＶＥＧＦ抗体の機能的ヒト化）
（ウサギＣＤＲの融合）
ヒトではないドナーの抗体と最大の配列相同性を共有するヒト抗体アクセプターのフレームワークを採用する、伝統的なヒト化方法とは異なり、ウサギＣＤＲを、フレームワークＦＷ１．４（配列番号１７２）に融合させてＭｉｎ−ｇｒａｆｔをもたらしたか、または「ウサギ化」フレームワークｒＦＷ１．４（配列番号１７３）もしくはその改変体ｒＦＷ１．４（ｖ２）（配列番号１７４）に融合させてＭａｘ−ｇｒａｆｔをもたらした。両フレームワークは、所望の機能特性（溶解性および安定性）、多種多様なウサギＣＤＲを収容する構造適合性、およびウサギの可変ドメインのコンセンサス配列との妥当な相同性に関して、第一に選択した。フレームワークｒＦＷ１．４は、ＦＷ１．４の誘導体であり、ウサギＣＤＲの実質的に任意のセットに対して、普遍的なアクセプターのフレームワークとして役立てる狙いでさらに操作した。安定かつ可溶性フレームワーク配列ＦＷ１．４は、ウサギ抗体と高い相同性を示すが、利用できる最も相同性の高い配列ではない。
【０１９２】
（結合に潜在的に関係する残基の同定）
ウサギの各可変ドメイン配列に関して、最も近いウサギの生殖系列対応物を同定した。最も近い生殖系列が確立できなかった場合、配列は、サブグループのコンセンサスまたは高いパーセント値の類似性を有するウサギの配列のコンセンサスに対して比較した。稀なフレームワークの残基は、起こり得る体細胞過剰変異の結果であって、したがって抗原の結合に関与すると考えた。結果として、かかる残基は、アセプターフレームワークｒＦＷ１．４またはｒＦＷ１．４（ｖ２）上に融合させて、Ｍａｘ−ｇｒａｆｔをもたらすためのものと考えた。特に、抗原の直接的な接触に潜在的に関係するか、またはＶＬおよびＶＨの配置に影響する残基を融合させた。さらにＣＤＲ構造に影響すると記載された残基を、必要であれば置換した。ＣＤＲをＦＷ１．４（Ｍｉｎ−ｇｒａｆｔ）上に融合させたとき、フレームワークは置換しなかった。例えば、５７８ｍｉｎｍａｘを産出するために、ｒＦＷ１．４の残基ＶＨ９４（Ｈ９４）を、ドナー配列中の対応する残基に変異させた。ウサギ抗体５７８は、Ｈ９４にＧｌｙを含み、一方、最も相同性の高い生殖系列およびウサギのコンセンサスの両方は、位置Ｈ９４にＡｒｇを含む。Ｇｌｙは、他のアミノ酸には見られない並外れた柔軟性（正のｐｈｉ角度）を有する。これは、主鎖のねじれ角度における役割、および活性に関連するループコンフォメーションの強い影響の可能性を示唆する。本明細書で開示されるようなＭａｘ−ｇｒａｆｔを得るために融合させたフレームワークの位置のさらなる例は、ｒＦＷ１．４、ｒＦＷ１．４（ｖ２）および本明細書で提供される目的のｓｃＦｖ配列のフレームワーク領域の配列をアラインメントすることによって同定することができる。当該分野で公知のウェブツールを、例えば前記目的のために使用することができる（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｃｌｕｓｔａｌｗ２／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌで２００９年６月２３日に利用できるようなＣｌｕｓｔａｌＷ、またはｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｉｎｆｏ．ｇｅｎｏｔｏｕｌ．ｆｒ／ｍｕｌｔａｌｉｎで２００９年６月２３日に利用できるようなＭｕｌｔｉＡｌｉｎ）。ｒＦＷ１．４およびｒＦＷ１．４（ｖ２）が同じ残基を含み、目的のｓｃＦｖが異なる残基を明らかにする、全てのフレームワークの位置は、Ｍａｘ−ｇｒａｆｔを得るために融合させたフレームワークの位置である。
【０１９３】
（ドメインのシャッフル）
Ｍｉｎ−ｇｒａｆｔの可変軽鎖を、Ｍａｘ−ｇｒａｆｔの可変重鎖と組み合わせて、生物物理学的特性（溶解性および安定性）および活性に関して最適な組合せを同定した。
【０１９４】
（ｓｃＦｖのクローニングおよび発現）
本明細書で記載および特徴付けされるｓｃＦｖを、以下のように産生した。ヒト化ＶＬ配列（配列番号８２〜１０６）を、配列番号１８１のリンカーを介して、ヒト化ＶＨ配列（配列番号１１８〜１６６）に連結させ、以下の配向のｓｃＦｖ：ＮＨ２−ＶＬ−リンカー−ＶＨ−ＣＯＯＨを産出した。多くの場合、様々なｓｃＦｖをコードするＤＮＡ配列を、サービス会社Ｅｎｔｅｌｅｃｈｏｎ  ＧｍｂＨ（ｗｗｗ．ｅｎｔｅｌｅｃｈｏｎ．ｃｏｍ）で新規に合成した。結果のＤＮＡ挿入物を、ｓｃＦｖのＤＮＡ配列の５’および３’末端にそれぞれ導入したＮｃｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩの制限酵素認識部位を介して、細菌発現ベクターｐＧＭＰ００２にクローニングした。ＶＬドメインのＤＮＡ配列とＶＨドメインのＤＮＡ配列との間に、ＢａｍＨＩ制限酵素認識部位が位置する。いくつかの場合、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡを新規に合成せず、ｓｃＦｖ発現構築物を、ドメインシャッフルによってクローニングした。したがって、ＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩ制限酵素認識部位を介して、ＶＬドメインを切り出して新しい構築物に導入し、ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素認識部位を介して、ＶＨドメインを切り出して新しい構築物に導入した。他の場合、点変異を、先端技術のアッセンブルＰＣＲ（ａｓｓｅｍｂｌｉｎｇ  ＰＣＲ）方法を用いて、ＶＨおよび／またはＶＬドメインに導入した。ＧＭＰ００２のクローニングは、ＷＯ２００８００６２３５の実施例１に記載されている。ｓｃＦｖの産生は、ＷＯ２００８００６２３５の実施例１に記載のＥＳＢＡ１０５に関して類似的に行った。
【０１９５】
（実施例３）
（抗ＶＥＧＦ  ｓｃＦｖのＢｉａｃｏｒｅ結合分析）
この実施例では、ｓｃＦｖのＢｉａｃｏｒｅ結合能を試験し、結合親和性を、ＢＩＡｃｏｒｅＴＭ−Ｔ１００による、典型的な表面プラズモン共鳴法を用いて測定した。この実施例および後の実施例において、これらのｓｃＦｖ候補による結合を試験したＶＥＧＦタンパク質には、精製したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ発現の組換えヒトＶＥＧＦ１６５（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ  ＥＣ  Ｌｔｄ．）、組換えヒトＶＥＧＦ１２１（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ  ＥＣ  Ｌｔｄ．）、組換えヒトＶＥＧＦ１１０（ＥＳＢＡＴｅｃｈ  ＡＧ）、組換えマウスＶＥＧＦ１６４（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ  ＥＣ  Ｌｔｄ．）、組換えラットＶＥＧＦ１６４（Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ）、組換えウサギＶＥＧＦ１１０（ＥＳＢＡＴｅｃｈ
ＡＧ）、および組換えヒトＰＬＧＦ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ  ＥＣ  Ｌｔｄ．）が含まれる。表面プラズモン共鳴実験のために、カルボキシメチル化デキストランのバイオセンサーチップ（ＣＭ４、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を、供給業者の説明書に従って、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドヒドロクロリドおよびＮ−ヒドロキシスクシンイミドを用いて活性化した。上記に例示された６つの異なる各ＶＥＧＦ形態を、標準的なアミンカップリング手順を用いて、ＣＭ４センサーチップ上の４つの異なるフローセルのうちの１つにカップリングさせた。カップリングおよびブロッキングの後、これらの固定化したＶＥＧＦ分子により得られた応答の範囲は、ｈＶＥＧＦ１６５に関しては約２５０〜５００応答単位（ＲＵ）、ｈＶＥＧＦ１１０、ｈＶＥＧＦ１２１、マウスＶＥＧＦ１６４、ラットＶＥＧＦ１６４およびウサギＶＥＧＦ１１０に関しては約２００ＲＵ、ならびにＰＬＧＦに関しては約４００ＲＵであった。タンパク質をブロッキングの前に固定化しなかったことを除き、各チップの第４のフローセルを同様に処理し、フローセルをインラインの参照として使用した。ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（０．０１ＭのＨＥＰＥＳ、  ｐＨ７．４または５、０．１５ＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％界面活性剤Ｐ２０）中の抗ＶＥＧＦ  ｓｃＦｖの様々な濃度（例えば、９０ｎＭ、３０ｎＭ、１０ｎＭ、３．３３ｎＭ、１．１１ｎＭ、０．３７ｎＭ、０．１２ｎＭおよび０．０４ｎＭ）を、５分間、３０μｌ／分の流速でフローセルに注入した。ＣＭ４チップ上のＶＥＧＦからの抗ＶＥＧＦ  ｓｃＦｖの解離を、２５℃で１０分間進行させた。インライン参照のセル補正に続いて緩衝液試料を差し引いた後、センサーグラム（ｓｅｎｓｏｒｇｒａｍ）を各抗ＶＥＧＦ  ｓｃＦｖ試料に関して作成した。見かけの解離速度定数（ｋｄ）、見かけの会合速度定数（ｋａ）、および見かけの解離平衡定数（ＫＤ）を、ＢＩＡｃｏｒｅＴ１００評価ソフトウェアバージョン１．１を用いて、１対１のＬａｎｇｍｕｉｒ結合モデル（ｏｎｅ−ｔｏ−ｏｎｅ  Ｌａｎｇｍｕｉｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｍｏｄｅｌ）を使用して計算した。
【０１９６】
１つの典型的な結果として、いくつかの主要な抗ＶＥＧＦ  ｓｃＦｖ候補を表７に列挙し、ｈＶＥＧＦ１６５とのそれらの結合親和性を示す。ＶＥＧＦＲ競合ＥＬＩＳＡおよび／またはＨＵＶＥＣアッセイを使用して測定し、後の実施例に記載される、ＶＥＧＦインヒビターとしてのそれらの能力も、表７に示す。いくつかの典型的な主要候補、例えば、５１１ｍａｘおよび５７８ｍａｘのｈＶＥＧＦ１６５への結合に関する動態曲線を図１に図示する。それらの親和性定数（ｋｄ、ｋａおよびＫＤ）も決定した。いくつかの主要な候補は、異なる供給源の様々なＶＥＧＦタンパク質への結合における種特異性も示す。例えば、結合相手としてマウスおよびラットＶＥＧＦ１６４を用いて、ｐＨ５で測定したいくつかの親和性データを表８ａおよびｂに示す。典型的な主要ｓｃＦｖ候補である５７８ｍｉｎｍａｘは、マウスおよびラットＶＥＧＦ１６４との結合において、ｐＨ５で５．７６Ｅ−１０Ｍおよび７．４８Ｅ−１０ＭのＫＤをそれぞれ有し（表８ａおよびｂ）、ｐＨ７．４で２．７３Ｅ−１１および２．１９Ｅ−１１を有する（データは示していない）。この種特異性は、５７８ｍｉｎｍａｘとヒト、マウスまたはラットＶＥＧＦタンパク質との間の結合に関する動態曲線および親和性データにおいて、図４にさらに図示する。
【０１９７】
異なる生物由来のＶＥＧＦとの結合における種特異性に加えて、多くの主要なｓｃＦｖ候補はまた、様々なＶＥＧＦアイソフォームに対しても区別される結合親和性を示す。例えば、ヒトＶＥＧＦ１６５、ＶＥＧＦ１２１およびＶＥＧＦ１１０とのいくつかのｓｃＦｖ候補の結合に関して、ｐＨ５．０で測定した親和性データを表９で比較する。いくつかの実験では、ＰＩＧＦタンパク質も、これらのｓｃＦｖ候補との結合能をもたない負の対照として使用した。また、例として、５７８ＭａｘとＶＥＧＦアイソフォームとの間の結合に関して、区別される動態曲線および親和性データを図３に図示する。
【０１９８】
本発明は、上述の主要な抗ＶＥＧＦ  ｓｃＦｖ候補に由来する誘導体も開示する。表１０に列挙するような候補５７８および５１１のいくつかの主要な誘導体を、それらの親和性および能力に関して例示する（ｐＨ５．０で測定した）。この実験では、Ｂｉａｃｏｒｅ測定を、ｈＶＥＧＦ１６５に対するこれらの誘導体の親和性に関して使用し、一方でｈＶＥＧＦＲ２競合ＥＬＩＳＡおよび／またはＨＵＶＥＣアッセイを、ＶＥＧＦを阻害するそれらの能力を定義にするために使用した（表１０）。３つの誘導体、５７８ｍａｘ、５７８ｍｉｎｍａｘおよび５７８ｗｔ−Ｈｉｓを、ｈＶＥＧＦ１６５との結合に関するそれらの動態曲線および親和性データにおいて図４にさらに例示する。
【０１９９】
主要な候補の誘導体に関して、それらの生物物理学的特徴を決定し、図５〜７および表１１に例示した。これらの特徴には、表１１に例示のように、ＦＴＩＲによって決定されるＴｍ、６０℃で３０分間インキュベーションした後のβシートまたはタンパク質損失パーセント、硫酸アンモニウム沈殿によって決定される溶解性、産生プロセス中のリフォールディング収率、およびＥ．ｃｏｌｉでの発現レベルが含まれる。３つの誘導体、５７８ｍａｘ、５７８ｍｉｎｍａｘおよび５７８ｍｉｎｍａｘ＿ＤＨＰを、ＦＴ−ＩＲによって測定された、異なる温度に対するそれらのアンフォールディング曲線におけるそれらの熱安定性に関して、特徴付けした（図５）。
【０２００】
【表７−１】
2014158491.tif 000010
【０２０１】
【表７−２】
2014158491.tif 000011
【０２０２】
【表８−１】
2014158491.tif 000012
【０２０３】
【表８−２】
2014158491.tif 000013
【０２０４】
【表９−１】
2014158491.tif 000014
【０２０５】
【表９−２】
2014158491.tif 000015
【０２０６】
【表１０−１】
2014158491.tif 000016
【０２０７】
【表１０−２】
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【０２０８】
【表１１−１】
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【０２０９】
【表１１−２】
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【０２１０】
【表１１−３】
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いくつかの誘導体を、図６に掲載のように、３０分間の熱ストレス（例えば、５０℃、６０℃または７０℃下）後のそれらの変性および沈殿に関して比較した。
【０２１１】
【表１２−１】
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【０２１２】
【表１２−２】
2014158491.tif 000022
５７８ｍａｘ、５７８ｍｉｎｍａｘおよび５７８ｍｉｎｍａｘ＿ＤＨＰを、硫酸アンモニウム沈殿によって決定された、それらの溶解性に関してさらに例示した。図７のように、硫酸アンモニウムの様々な濃度下におけるこれらの誘導体の可溶性タンパク質のパーセントを比較した。
【０２１３】
（実施例４）
（ＶＥＧＦ受容体ブロッキングアッセイ）
本発明で開示される抗ＶＥＧＦ  ｓｃＦｖ候補またはそれらの誘導体に関して、実施例３におけるＶＥＧＦへのそれらの結合親和性に加えて、ＶＥＧＦインヒビターとしてのそれらの能力も測定した。それらの能力を測定するための方法には、例えば、この実施例で例示されるようなＶＥＧＦＲ競合ＥＬＩＳＡ、およびＨＵＶＥＣアッセイが挙げられる（図８）。
【０２１４】
ＶＥＧＦＲ競合ＥＬＩＳＡアッセイには、例えば、ＶＥＧＦＲ２受容体ブロッキングアッセイおよびＶＥＧＦＲ１受容体ブロッキングアッセイが挙げられる。ＶＥＧＦＲ２受容体ブロッキングアッセイのために、ヒトＶＥＧＦ１６５を、ＰＢＳ中に０．０５μｇ／ｍｌで、９６穴Ｍａｘｉｓｏｒｐ  ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ）上にコートし、０．１％ＢＳＡおよび０．２％Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）を含むＰＢＳを用いてブロッキングした。ヒトＩｇＧ１の６×ヒスチジンタグ付Ｆｃと融合したヒトＶＥＧＦＲ２の細胞外ドメインのアミノ酸残基１〜７６４個からなる、組換えヒトＶＥＧＦＲ２／Ｆｃキメラ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．）５００ｎｇ／ｍｌを、ＰＢＳＴ中で３倍で連続希釈した抗ＶＥＧＦ  ｓｃＦｖと、まずインキュベートした。室温で３０〜６０分インキュベーションした後、混合物を、ヒトＶＥＧＦ１６５を固定化したプレートに移し、９０分間インキュベートした。ＶＥＧＦＲ２／Ｆｃキメラと固定化したＶＥＧＦ１６５との結合を、西洋ワサビペルオキシダーゼにカップリングさせたヤギ（Ｆａｂ２）抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃγ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）に続いて基質（ＢＭ  Ｂｌｕｅ  ＰＯＤ基質、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いて検出した。４５０ｎｍでの光学密度（ＯＤ  ４５０ｎｍ）を、Ｓｕｎｒｉｓｅマイクロプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ）を用いて測定した。データを、４パラメータロジティックカーブフィットを用いて分析し、ＥＣ５０値を、ｓｃＦｖの用量−応答曲線から計算した。ＶＥＧＦＲ２受容体ブロッキングアッセイによって測定された、主要な候補またはそれらの誘導体の典型的な能力を、表７および９に列挙する。
【０２１５】
ＶＥＧＦＲ１受容体ブロッキングアッセイのために、ヒトＶＥＧＦ１６５を、ＰＢＳ中に０．０１２５μｇ／ｍｌで、９６穴Ｍａｘｉｓｏｒｐ  ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ）上にコートし、０．４％ＢＳＡおよび０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳを用いてブロッキングした。ヒトＩｇＧ１の６×ヒスチジンタグ付Ｆｃと融合したヒトＶＥＧＦＲ１の細胞外ドメインのアミノ酸残基１〜６８７個からなる、組換えヒトＶＥＧＦＲ１／Ｆｃキメラ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．）１００ｎｇ／ｍｌを、ＰＢＳＴ中で３倍で連続希釈した抗ＶＥＧＦ  ｓｃＦｖと、まずインキュベートした。室温で３０〜６０分インキュベーションした後、混合物を、ヒトＶＥＧＦ１６５が固定化されたプレートに移し、９０分間インキュベートした。ＶＥＧＦＲ１／Ｆｃキメラと固定化したＶＥＧＦ１６５との結合を、西洋ワサビペルオキシダーゼにカップリングさせたヤギ（Ｆａｂ２）抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃγ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）に続いて基質（ＢＭ
Ｂｌｕｅ  ＰＯＤ基質、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いて検出した。４５０ｎｍでの光学密度（ＯＤ  ４５０ｎｍ）を、Ｓｕｎｒｉｓｅマイクロプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ）を用いて測定した。データを上記のように分析し、ＥＣ５０値を、ｓｃＦｖの用量−応答曲線から計算した。ＶＥＧＦＲ１受容体ブロッキングアッセイによって測定された、主要な候補の典型的な能力を、表７に列挙する。
【０２１６】
（実施例５）
（ＶＥＧＦ阻害のＨＵＶＥＣアッセイ）
この実施例では、開示された、ＶＥＧＦインヒビターとしての抗ＶＥＧＦ  ｓｃＦｖ候補またはそれらの誘導体の能力を測定する別の方法として、ＨＵＶＥＣアッセイを例示する。
【０２１７】
数人のドナーからプールしたヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）（Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ）を、２継代から１４継代で使用した。細胞を、０．４％ＥＣＧＳ／Ｈ、２％ウシ胎仔血清、０．１ｎｇ／ｍｌの上皮増殖因子、１μｇ／ｍｌのヒドロコルチゾン、１ｎｇ／ｍｌの塩基性線維芽細胞因子および１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を含む、５０μｌの完全内皮細胞増殖培地（ＥＣＧＭ）（Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ）中で、１０００個／穴で細胞を播種した。７から８時間後、５０μｌの飢餓培地（熱不活性化した０．５％ＦＣＳおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含むサプリメントなしのＥＣＧＭ）を細胞に添加し、細胞を１５から１６時間、飢餓状態にさせた。３倍で連続希釈した抗ＶＥＧＦ  ｓｃＦｖ（０．０２３〜１５０ｎＭ）、および組換えヒトＶＥＧＦ１６５（０．０８ｎＭ）、組換えマウスＶＥＧＦ１６４（０．０８ｎＭ）または組換えラットＶＥＧＦ１６４（０．３ｎＭ）の１つを飢餓培地中に調製し、室温で３０〜６０分間プレインキュベートした。異なる濃度のＶＥＧＦを、それらの異なる相対的な生物活性を補うために使用した。準最大（ｓｕｂｍａｘｉｍａｌ）のＶＥＧＦ誘導型増殖を刺激する濃度（ＥＣ９０）を使用した。混合物１００μｌを、ＨＵＶＥＣ懸濁物を含む９６穴組織培養プレートに添加し、３７℃／５％ＣＯ２の加湿した（ｈｕｍｉｆｉｅｄ）インキュベータ中で４日間インキュベートした。２０μｌ／穴のＷＳＴ−１細胞増殖試薬（Ｒｏｃｈｅ）を添加した後、Ｓｕｎｒｉｓｅマイクロプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ）を用いて、ＨＵＶＥＣの増殖を４５０ｎｍ（参照波長として６２０ｎｍを使用した）での吸光度を測定することによって評価した。データを、４パラメータロジティックカーブフィットを用いて分析し、５０％のＨＵＶＥＣ増殖を阻害するのに必要な抗ＶＥＧＦ  ｓｃＦｖの濃度（ＥＣ５０）を、阻害曲線から導き出した。
【０２１８】
ＨＵＶＥＣアッセイによって測定された、主要な候補またはそれらの誘導体の典型的な能力を、表７に列挙する。さらに、主要な候補の１つの誘導体、５７８ｍｉｎｍａｘによるｈＶＥＧＦ１６５誘導型ＨＵＶＥＣ増殖の阻害を、図９に例示する。ｈＶＥＧＦ１６５誘導型細胞増殖を阻害するための５７８ｍｉｎｍａｘのＥＣ５０は、０．０６ｎＭと決定される（図９）。ＶＥＧＦインヒビターとしての５７８ｍｉｎｍａｘの能力は、ルセンティスと比較して約１．６倍優れている。５７８ｍｉｎｍａｘによる、マウスまたはラットＶＥＧＦ１６４誘導型ＨＵＶＥＣ増殖の阻害も、図１０に例示する。マウスおよびラットＶＥＧＦ１６４誘導型細胞増殖を阻害するための５７８ｍｉｎｍａｘのＥＣ５０は、それぞれ０．０６ｎＭおよび０．０７ｎＭである（図１０）。したがって、マウスおよびラットＶＥＧＦは、典型的な誘導体（５７８ｍｉｎｍａｘ）による阻害に関して、ヒトＶＥＧＦと等力である。また、この実験では、ルセンティスは、齧歯動物のＶＥＧＦにより誘導される増殖を阻害しない。
【０２１９】
（実施例６）
（無毛モルモットにおけるｈＶＥＧＦ１６５誘導型血管性透過への抗ＶＥＧＦ  ｓｃＦｖの効果）
この実施例では、ヒトＶＥＧＦ１６５誘導型血管性透過への抗ＶＥＧＦ  ｓｃＦｖの効果を、Ｍｉｌｅｓアッセイを用いてモルモットにおいて評価した。１匹の動物につき３０箇所の適用部位を、耐久性マーカーを用いて雄性の無毛モルモットの背側上にマークした。処置日に、全身麻酔の下、１％エバンスブルー色素溶液１ｍｌを、各動物に静脈内投与した。色素注射して１時間後、２．６１ｎＭの組換えヒトＶＥＧＦ１６５（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ  ＥＣ  Ｌｔｄ．）および様々な濃度の抗ＶＥＧＦ  ｓｃＦｖ（０ｎＭ、０．０８５ｎＭ、０．２５６ｎＭ、０．７６７ｎＭ、２．３ｎＭ、６．９ｎＭ、２０．７ｎＭ、６２．１ｎＭ；試験アイテムにつきｎ＝７の動物）を含む試験溶液０．１ｍｌを、背側上のマークに３連で注射した（試験アイテムの濃度につき３注射）。ＰＢＳの注射を、全動物における負の対照として供給した。追加の対照として、６．９ｎＭのルセンティス（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）を全動物において注射した。
【０２２０】
試験溶液を注射して１時間後、動物を安楽死させ、裸皮を採取し、浄化し、入射および透過光を用いてデジタル撮影した。注射部位に溢出したエバンスブルー色素の面積を、ＩｍａｇｅＪを用いて評価した。各動物に関して、色素漏出の面積に対する抗ＶＥＧＦ  ｓｃＦｖ濃度を、４パラメータロジスティックカーブフィットを用いて分析した。５０％血管性漏出を阻害するのに必要な抗ＶＥＧＦ  ｓｃＦｖの濃度（ＥＣ５０）を、阻害曲線から導き出した。
【０２２１】
実験プロトコールを図１１に例示する。また、ｈＶＥＧＦの阻害におけるｓｃＦｖ候補、ＥＳＢＡ９０３（５７８ｍｉｎｍａｘ）および８０２（５１１ｍａｘ）の効能を図１１に図示し、血管系から皮膚に漏出したエバンスブルー色素を含む面積の種々のサイズによって表した。９０３および８０２に関する効能データを図１２に示す。６．９ｎＭで、９０３および８０２は、試験した全動物において、ルセンティスと比較して、ＶＥＧＦの誘導による皮膚への血管性漏出に対してより強い阻害を示した（図１２）。
【０２２２】
（実施例７）
（ラットにおけるｈＶＥＧＦ１６５誘導型網膜血管性漏出に対する局所的抗ＶＥＧＦ  ｓｃＦｖ処置の効果）
この実験では、５７８ｍｉｎｍａｘの局所的効能を、修正したＭｉｌｅｓアッセイを用いて実証する。これらの修正には、例えば、ｓｃＦｖの硝子体内注射および局所適用を用いる前混合試験が含まれる。
【０２２３】
前混合した異なる濃度の抗ＶＥＧＦ  ｓｃＦｖ（ＶＥＧＦより１０、３および１倍のモル過剰）とＶＥＧＦ（５００ｎｇ）とを、単回硝子体内注射により適用した。アバスチン（Ｒｏｃｈｅ）（ＶＥＧＦより１０、３および１倍のモル過剰）を、正の対照として使用した。５７８ｍｉｎｍａｘ用のビヒクル（クエン酸緩衝液、クエン酸ナトリウム２０ｍＭ、ＮａＣｌ１２５ｍＭ、ｐＨ７）を、負の対照として使用した。図１３に図示されるように、ｈＶＥＧＦ１６５との前混合は、５７８ｍｉｎｍａｘ（ＥＳＢＡ９０３）を促進させ、ｈＶＥＧＦ誘導型網膜血管性透過を完全に阻害した。この実験では、５７８ｍｉｎｍａｘ（ＥＳＢＡ９０３）の阻害効果は、アバスチンと比較して、より顕著であった。
【０２２４】
局所適用のために、ＶＥＧＦ刺激の５日前に、成体のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットに、１日４回（４液滴／日）両側局所投薬により、５７８ｍｉｎｍａｘ（１％＝１０ｍｇ／ｍｌ）を与えた（灌流の日（６日目）まで）。５７８ｍｉｎｍａｘ用のビヒクル（局所投薬）およびＡｌｃｏｎ  ＲＴＫｉ（１０ｍｇ／ｋｇ／ｄ、経口強制栄養）を、負および正の対照として使用した。５日目に、ラットを麻酔し、それらの瞳孔を散大させる。全動物に、両眼中に、ｈｒＶＥＧＦ５００ｎｇ（１０μｌ）の硝子体内注射を与える。ＶＥＧＦを注射して２４時間後、３％エバンスブルー色素の静脈内注入を、全身麻酔中に全動物において行う。色素を９０分間循環させた後、ラットを安楽死させる。血液試料を取り、次いでラットを無菌生理食塩水で灌流し、次いで各ラットの両眼をすぐに摘出し、手術用顕微鏡を用いて網膜を収集する。網膜および血漿試料に関して、６０μｌの上清を、６２０／７４０ｎｍで分光光度計を用いてエバンスブルー色素の吸光度（ＡＢＳ）を測定するために使用する。色素吸光度によって測定されるような、血液／網膜のバリアの崩壊およびその後の網膜血管性透過を、正味のＡＢＳ／湿重量／血漿ＡＢＳの平均±ｓ．ｅ．ｍ．として計算する。Ｐ≦０．０５が有意と考えられる一元配置ＡＮＯＶＡを、処置手段の間の全体的な差を決定するのに使用する。図１４に例示されるように、５７８ｍｉｎｍａｘ（９０３）の局所投与（５日間の前処置、１日につき４液滴）により、ｈＶＥＧＦ誘導型網膜血管性透過が有意に阻害された。これは、眼内疾患の処置に有用な、局所的に有効な抗体を実証する最初のものである。
【０２２５】
（等価物）
前述の記載を考慮して、本発明の多くの修正および代替の実施形態が、当業者に明らかである。したがって、この記載は、単なる例示として解釈すべきであり、本発明を実施するのに最良の様式を当業者に教示するためのものである。構造の詳細は、本発明の精神から逸脱することなく実質的に変えることができ、添付の特許請求の範囲内となる全ての修正の独占的使用権を保有する。本発明は、添付の特許請求の範囲および法律の適用可能な規則によって要求される程度にのみ制限されるものであると意図する。
【０２２６】
特許、特許出願、文献、書籍、論文、論述、ウェブページ、図および／または添付書類を含む、この出願に引用された全文献および類似物は、かかる文献および類似物の書式に関わらず、参照によりそれらの全体が明示的に援用される。援用された文献および類似物の１つまたは複数が、定義された用語、用語の使用法、記載された技法または同様のものを含む本明細書と異なるか相反する場合には、本明細書が優先される。
【０２２７】
本明細書で使用される節の見出しは、単に組織化のためのものであり、記載された主題を限定するものと決して解釈すべきではない。
【０２２８】
本発明は、様々な実施形態および実施例と併せて記載されているが、本教示がかかる実施形態または実施例に限定されるという意図はない。それどころか、当業者に理解されるように、本発明は、様々な代替、修正および等価物を包含する。
【０２２９】
特許請求の範囲は、その趣旨を述べない限り、記載された順番または要素に限定されると読むべきではない。形態および詳細の様々な変更は、添付の特許請求の範囲から逸脱することなく、行うことができると理解すべきである。したがって、以下の特許請求の範囲およびその等価物の範囲および精神内となる全実施形態が特許請求される。
【０２３０】
（配列表）
【０２３１】
【数１】
2014158491.tif 000023
【０２３２】
【数２】
2014158491.tif 000024
【０２３３】
【数３】
2014158491.tif 000025
【０２３４】
【数４】
2014158491.tif 000026
【０２３５】
【数５】
2014158491.tif 000027
【０２３６】
【数６】
2014158491.tif 000028
【０２３７】
【数７】
2014158491.tif 000029
【０２３８】
【数８】
2014158491.tif 000030
【０２３９】
【数９】
2014158491.tif 000031
【０２４０】
【数１０】
2014158491.tif 000032
【０２４１】
【数１１】
2014158491.tif 000033
【化１】
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【化２】
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【化３】
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【化４】
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【化５】
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【化６】
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【化７】
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【化８】
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【化９】
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【化１０】
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【化１１】
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【化１２】
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【化１３】
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【化１４】
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【化１５】
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【化１６】
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【化１７】
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【化１８】
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【化１９】
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【化２０】
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【化２１】
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【化２２】
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【化２３】
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【化２４】
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【化２５】
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【化２６】
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【化２７】
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【化２８】
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【化２９】
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【化３０】
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【化３１】
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【化３２】
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【化３３】
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【化３４】
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【化３５】
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【化３６】
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【化３７】
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【化３８】
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【化３９】
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【化４０】
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【化４１】
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【化４２】
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【化４３】
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【化４４】
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【化４５】
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【化４６】
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【化４７】
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【化４８】
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【化４９】
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【化５０】
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【化５１】
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【化５２】
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【化５３】
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【化５４】
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【化５５】
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【化５６】
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【化５７】
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【化５８】
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【化５９】
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【化６０】
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【化６１】
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【化６２】
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【化６３】
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【化６４】
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【化６５】
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【化６６】
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【化６７】
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【化６８】
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【化６９】
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【化７０】
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【化７１】
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【化７２】
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【化７３】
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【化７４】
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【化７５】
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【化７６】
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【化７７】
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【化７８】
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【化７９】
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【化８０】
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【化８１】
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【化８２】
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【化８３】
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【化８４】
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【化８５】
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【化８６】
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【化８７】
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【化８８】
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【化８９】
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【化９０】
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【化９１】
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【化９２】
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【化９３】
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【化９４】
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【化９５】
2014158491.tif 000128
【化９６】
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【化９７】
2014158491.tif 000130
【図１ａ】
2014158491.tif 000131
【図１ｂ】
2014158491.tif 000132
【図２ａ】
2014158491.tif 000133
【図２ｂ】
2014158491.tif 000134
【図２ｃ】
2014158491.tif 000135
【図３ａ】
2014158491.tif 000136
【図３ｂ】
2014158491.tif 000137
【図４ａ】
2014158491.tif 000138
【図４ｂ】
2014158491.tif 000139
【図４ｃ】
2014158491.tif 000140
【図５】
2014158491.tif 000141
【図６−１】
2014158491.tif 000142
【図６−２】
2014158491.tif 000143
【図７−１】
2014158491.tif 000144
【図７−２】
2014158491.tif 000145
【図８−１】
2014158491.tif 000146
【図８−２】
2014158491.tif 000147
【図９】
2014158491.tif 000148
【図１０】
2014158491.tif 000149
【図１１】
2014158491.tif 000150
【図１２ａ】
2014158491.tif 000151
【図１２ｂ】
2014158491.tif 000152
【図１２ｃ】
2014158491.tif 000153
【図１３ａ】
2014158491.tif 000154
【図１３ｂ】
2014158491.tif 000155
【図１４】
2014158491.tif 000156
【図１５】
2014158491.tif 000157
【配列表】
2014158491000001.app
【外国語明細書】
2014158491000001.pdf