(57)【要約】【課題】骨代謝、骨免疫関連遺伝子変動を簡便に分類、評価することにより、間葉系幹細胞からの細胞の分化状態を評価できる手法を提供する。【解決手段】細胞分化の品質管理に関連する遺伝子群と、それらの発現量の変化を検出するためのオリゴヌクレオチドプローブ。また、当該オリゴヌクレオチドプローブを搭載したＤＮＡマイクロアレイ。さらには、間葉系幹細胞を分化させ、その遺伝子発現パターンの変化を把握することにより、特に、破骨細胞、骨芽細胞または軟骨細胞へ分化した細胞の品質を簡便に評価すること。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
間葉系幹細胞から破骨細胞、骨芽細胞又は軟骨細胞のいずれかへの分化状態を識別するための、以下の遺伝子群から選択される２種以上の遺伝子を含む分化識別用遺伝子群。
ａｇｇｒｅｃａｎ、ａｃｉｄ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ５  ｔａｒｔｒａｔｅ  ｒｅｓｉｓｔａｎｔ、ａｃｔｉｖｉｎ  Ａ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｐｅ  １、ａｃｔｉｖｉｎ  Ａ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｐｅ  １Ｂ、ａｃｔｉｖｉｎ  Ａ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｐｅ  ＩＣ、ａｃｔｉｖｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＩＩＡ、ａｃｔｉｖｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＩＩＢ、ａ  ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ  ａｎｄ  ｍｅｔａｌｌｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ  ｄｏｍａｉｎ  １７、ａ  ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ−ｌｉｋｅ  ａｎｄ  ｍｅｔａｌｌｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ  （ｒｅｐｒｏｌｙｓｉｎ  ｔｙｐｅ）  ｗｉｔｈ  ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ  ｔｙｐｅ  １  ｍｏｔｉｆ  ５  （ａｇｇｒｅｃａｎａｓｅ−２）、ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ  Ｃ１Ｑ  ａｎｄ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｄｏｍａｉｎ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ、ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  １、ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ｌｉｖｅｒ／ｂｏｎｅ／ｋｉｄｎｅｙ）、ａｎｄｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ４、ＡＴＰａｓｅ  Ｈ＋  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｉｎｇ  ｌｙｓｏｓｏｍａｌ  Ｖ０  ｓｕｂｕｎｉｔ  Ａ１、ｂｏｎｅ  ｇａｍｍａ  ｃａｒｂｏｘｙｇｌｕｔａｍａｔｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ、ｂｏｎｅ  ｇａｍｍａ−ｃａｒｂｏｘｙｇｌｕｔａｍａｔｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  １、ｂｉｇｌｙｃａｎ、ｂｏｎｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２、ｂｏｎｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ４、ｂｏｎｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ６、ｂｏｎｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ７、ｂｏｎｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｐｅ  １Ａ、ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ／ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ａｌｐｈａ、ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ｃａｌｃｉｕｍ−ｓｅｎｓｉｎｇ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ｃｏｒｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ  ｂｅｔａ、ＣＤ４４  ａｎｔｉｇｅｎ、ｃａｄｈｅｒｉｎ  １、ｃｈｏｒｄｉｎ、ｃｈｌｏｒｉｄｅ  ｃｈａｎｎｅｌ  ７、ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｔｙｐｅ  Ｘ  ａｌｐｈａ  １、ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｔｙｐｅ  Ｉ  ａｌｐｈａ  １、ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｔｙｐｅ  ＩＩ  ａｌｐｈａ  １、ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｔｙｐｅ  ＩＩＩ  ａｌｐｈａ  １、ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｔｙｐｅ  ＶＩ  ａｌｐｈａ  １、ｃｏｌｌａｇｅｎ    ｔｙｐｅ  ＩＸ  ａｌｐｈａ  １、ｃａｒｔｉｌａｇｅ  ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ  ｍａｔｒｉｘ  ｐｒｏｔｅｉｎ、ｃｏｌｏｎｙ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ  １  （ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）、ｃｏｌｏｎｙ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ  １  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ  ｓｕｌｆａｔｅ  Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  １、ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ  ｓｕｌｆａｔｅ  Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ２、ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ  ｔｉｓｓｕｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ、ｃａｔｅｎｉｎ  （ｃａｄｈｅｒｉｎ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）    ｂｅｔａ  １、ｃａｔｈｅｐｓｉｎ  Ｋ、ｃａｔｈｅｐｓｉｎ  Ｌ、ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  （Ｃ−Ｘ−Ｃ  ｍｏｔｉｆ）  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ４、ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０  ｆａｍｉｌｙ  １９  ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  ａ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  １、ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０  ｆａｍｉｌｙ  ２４  ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  ａ    ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  １、ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０  ｆａｍｉｌｙ  ２７    ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  ｂ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  １、ｄｉｃｋｋｏｐｆ  ｈｏｍｏｌｏｇ  １  （Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）、ｄｅｎｔｉｎ  ｍａｔｒｉｘ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １、ｅｐｈｒｉｎ  Ｂ２、ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ、Ｅｐｈ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ａ４、Ｅｐｈ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｂ４、ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  １  （ａｌｐｈａ）、ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ２  （ｂｅｔａ）、ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ２３、ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  １０、ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  １７、ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  １８、ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ２、ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ４、ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ８、ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  １、ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ２、ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ３、ＦＭＳ−ｌｉｋｅ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  １、ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ  １、ＦＢＪ  ｏｓｔｅｏｓａｒｃｏｍａ  ｏｎｃｏｇｅｎｅ、ＦＢＪ  ｏｓｔｅｏｓａｒｃｏｍａ  ｏｎｃｏｇｅｎｅ  Ｂ、ｆｏｓ−ｌｉｋｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  １、ｆｏｓ−ｌｉｋｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  ２、ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ、ｆｒｉｚｚｌｅｄ  ｈｏｍｏｌｏｇ  １  （Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）、ｇａｐ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ    ａｌｐｈａ  １、ＧＬＩ−Ｋｒｕｐｐｅｌ  ｆａｍｉｌｙ  ｍｅｍｂｅｒ  ＧＬＩ１、ＧＬＩ−Ｋｒｕｐｐｅｌ  ｆａｍｉｌｙ  ｍｅｍｂｅｒ  ＧＬＩ２、ＧＬＩ−Ｋｒｕｐｐｅｌ  ｆａｍｉｌｙ  ｍｅｍｂｅｒ  ＧＬＩ３、ｇｒｅｍｌｉｎ  １、ｇｒｅｍｌｉｎ  ２  ｈｏｍｏｌｏｇ  ｃｙｓｔｅｉｎｅ  ｋｎｏｔ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ  （Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）、ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  Ｉ  ｅｎｈａｎｃｅｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ３、ｐｅｒｌｅｃａｎ  （ｈｅｐａｒａｎ  ｓｕｌｆａｔｅ  ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ  ２）、ｈｙａｌｕｒｏｎｏｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ  １、ｈｙａｌｕｒｏｎｏｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ  ２、ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉａｌｏｐｒｏｔｅｉｎ、ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｂｉｎｄｉｎｇ  １、ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ２、ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ａｌｐｈａ  １、ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  （ａｌｐｈａ  ａｎｄ  ｂｅｔａ）  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  １、ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｂｅｔａ  １  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ、ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｇａｍｍａ、ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｇａｍｍａ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  １、ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｇａｍｍａ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ２、ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  １、ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ２、ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  Ｉ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ２  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、Ｉｎｄｉａｎ  ｈｅｄｇｅｈｏｇ、ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  １７Ａ、ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  １  ａｌｐｈａ、ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  １  ｂｅｔａ、ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  １  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｐｅ  Ｉ、ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ６、ｉｎｈｉｂｉｎ  ｂｅｔａ−Ａ、ｉｎｈｉｂｉｎ  ｂｅｔａ−Ｂ、ｉｎｈｉｂｉｎ  ｂｅｔａ−Ｃ、ｉｎｈｉｂｉｎ  ｂｅｔａ  Ｅ、ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ  ８、ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ａｌｐｈａ  Ｖ、ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ｂｅｔａ  ３、ｋｉｎａｓｅ  ｉｎｓｅｒｔ  ｄｏｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、６０Ｓ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌ１０Ｅ、ｋｌｏｔｈｏ、ｌｙｍｐｈｏｉｄ  ｅｎｈａｎｃｅｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ  １、ｌｅｐｔｉｎ、ｌｏｗ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ５、ｖ−ｍａｆ  ｍｕｓｃｕｌｏａｐｏｎｅｕｒｏｔｉｃ  ｆｉｂｒｏｓａｒｃｏｍａ  ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ｆａｍｉｌｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂ  （ａｖｉａｎ）、ｍａｔｒｉｘ  Ｇｌａ  ｐｒｏｔｅｉｎ、ｍｅｌａｎｏｍａ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  １、ｍｉｃｒｏｐｈｔｈａｌｍｉａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ、ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ  １３、ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ  １４  （ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｉｎｓｅｒｔｅｄ）、ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ  １ａ  （ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ  ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ）、ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ  １ｂ  （ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ  ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ）、ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ  ２、ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ  ３、ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ  ８、ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ  ９、ｈｏｍｅｏｂｏｘ  ｍｓｈ−ｌｉｋｅ  １、ｈｏｍｅｏｂｏｘ  ｍｓｈ−ｌｉｋｅ  ２、ｍｙｏｇｅｎｉｃ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  １、ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｃａｌｃｉｎｅｕｒｉｎ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  １、ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｃａｌｃｉｎｅｕｒｉｎ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ２、ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｃａｌｃｉｎｅｕｒｉｎ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ３、ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ  ｏｆ  ｋａｐｐａ  ｌｉｇｈｔ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ｇｅｎｅ  ｅｎｈａｎｃｅｒ  ｉｎ  Ｂ  ｃｅｌｌｓ  １  ｐ１０５、ｎｕ���ｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ  ｏｆ  ｋａｐｐａ  ｌｉｇｈｔ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ｇｅｎｅ  ｅｎｈａｎｃｅｒ  ｉｎ  Ｂ  ｃｅｌｌｓ  ２  ｐ４９／ｐ１００、ｎｏｇｇｉｎ、ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ｐｌａｔｅｌｅｔ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ａｌｐｈａ、ｐｌａｔｅｌｅｔ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  Ｂ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ、ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ｏｒｐｈａｎ  １、ｐｅｒｉｏｓｔｉｎ  ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｆａｃｔｏｒ、ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｇａｍｍａ、ＰＲ  ｄｏｍａｉｎ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  １  ｗｉｔｈ  ＺＮＦ  ｄｏｍａｉｎ、ｐａｔｃｈｅｄ  ｈｏｍｏｌｏｇ  １、ｐａｔｃｈｅｄ  ｄｏｍａｉｎ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  １、ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ−ｅｎｄｏｐｅｒｏｘｉｄｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ２、ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ、ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ  １  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ−ｌｉｋｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ、ｖ−ｒｅｌ  ｒｅｔｉｃｕｌｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓｉｓ  ｖｉｒａｌ  ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ｈｏｍｏｌｏｇ  Ａ  （ａｖｉａｎ）、ｒａｓ  ｈｏｍｏｌｏｇ  ｇｅｎｅ  ｆａｍｉｌｙ  ｍｅｍｂｅｒ  Ａ、ｒｕｎｔ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  １、ｒｕｎｔ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ２、ｒｕｎｔ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ３、ｓｙｎｄｅｃａｎ  ３、ＳＦＦＶ  ｐｒｏｖｉｒａｌ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  １、ｓｏｎｉｃ  ｈｅｄｇｅｈｏｇ、ＭＡＤ  ｈｏｍｏｌｏｇ  １  （Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）、ＭＡＤ  ｈｏｍｏｌｏｇ  ２  （Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）、ＭＡＤ  ｈｏｍｏｌｏｇ  ３  （Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）、ＭＡＤ  ｈｏｍｏｌｏｇ  ４  （Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）、ＭＡＤ  ｈｏ
ｍｏｌｏｇ  ５  （Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）、ＭＡＤ  ｈｏｍｏｌｏｇ  ６  （Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）、ＭＡＤ  ｈｏｍｏｌｏｇ  ７  （Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）、ＭＡＤ  ｈｏｍｏｌｏｇ  ９  （Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）、ｓｃｌｅｒｏｓｔｉｎ、ＳＲＹ−ｂｏｘ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｇｅｎｅ  ５、ＳＲＹ−ｂｏｘ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｇｅｎｅ  ６、ＳＲＹ−ｂｏｘ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｇｅｎｅ  ９、ｔｒａｎｓ−ａｃｔｉｎｇ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ３、Ｓｐ７  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ７、ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ａｃｉｄｉｃ  ｃｙｓｔｅｉｎｅ  ｒｉｃｈ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ、ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎ  １、Ｒｏｕｓ  ｓａｒｃｏｍａ  ｏｎｃｏｇｅｎｅ、ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｂｅｔａ  １、ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｂｅｔａ  ２、ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｂｅｔａ  ３、ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｂｅｔａ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｉ、ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｂｅｔａ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＩＩ、ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ７  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ  ｍｅｍｂｅｒ  ４、ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ、ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ  ｍｅｍｂｅｒ  １１ａ、ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ  ｍｅｍｂｅｒ  １ａ、ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ  ｍｅｍｂｅｒ  １ｂ、ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  （ｌｉｇａｎｄ）  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ  ｍｅｍｂｅｒ  １１、ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ  ｍｅｍｂｅｒ  １１ｂ  （ｏｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ）、ＴＮＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｆａｃｔｏｒ  ６、ｖｅｒｓｉｃａｎ、ｖｉｔａｍｉｎ  Ｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  Ａ、ｗｉｎｇｌｅｓｓ−ｒｅｌａｔｅｄ  ＭＭＴＶ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｓｉｔｅ  ３Ａ、ｗｉｎｇｌｅｓｓ−ｒｅｌａｔｅｄ  ＭＭＴＶ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｓｉｔｅ  ４、ｗｉｎｇｌｅｓｓ−ｒｅｌａｔｅｄ  ＭＭＴＶ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｓｉｔｅ  ５Ａ、ｗｉｎｇｌｅｓｓ−ｒｅｌａｔｅｄ  ＭＭＴＶ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｓｉｔｅ  ５Ｂ、ｗｉｎｇｌｅｓｓ−ｒｅｌａｔｅｄ  ＭＭＴＶ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｓｉｔｅ  ６、ｗｉｎｇｌｅｓｓ−ｒｅｌａｔｅｄ  ＭＭＴＶ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｓｉｔｅ  ７Ａ、ｗｉｎｇｌｅｓｓ−ｒｅｌａｔｅｄ  ＭＭＴＶ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｓｉｔｅ  ７Ｂ、ｓｅｍａ  ｄｏｍａｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｄｏｍａｉｎ  （Ｉｇ）  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｄｏｍａｉｎ  （ＴＭ）  ａｎｄ  ｓｈｏｒｔ  ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｄｏｍａｉｎ（ｓｅｍａｐｈｏｒｉｎ）  ４Ｄ
【請求項２】
遺伝子、前記遺伝子が転写するＲＮＡ、前記遺伝子もしくはＲＮＡの核酸配列のうち少なくとも連続した３０塩基以上の部分配列を含むオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド、のいずれかを含み、間葉系幹細胞からの、破骨細胞、骨芽細胞又は軟骨細胞へのいずれかの分化状態を、識別可能にする分別マーカーであって、
前記遺伝子が、請求項１記載の遺伝子群から選択される２種以上の遺伝子であることを特徴とする分別マーカー群。
【請求項３】
請求項２記載の分別マーカー群を用い、分別マーカーの発現の差を検出することにより、間葉系幹細胞からの、破骨細胞、骨芽細胞又は軟骨細部へのいずれかの分化状態を識別する、分化識別方法。
【請求項４】
以下の（ａ）〜（ｄ）のうち１種のＤＮＡの塩基配列及び／又は該ＤＮＡの塩基配列と相補的な塩基配列を含む細胞分化評価用オリゴヌクレオチドプローブ。
（ａ）配列番号１〜２０２に示される塩基配列から選択されるＤＮＡ
（ｂ）（ａ）のＤＮＡに対し相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ
（ｃ）（ａ）の塩基配列と同一性が８０％以上の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ）（ａ）〜（ｃ）のいずれかの塩基配列に１から数個の付加、挿入、欠損又は置換を含む塩基配列からなるＤＮＡ
【請求項５】
請求項４記載のオリゴヌクレオチドプローブが搭載された細胞分化状態評価用ＤＮＡマイクロアレイ。
【請求項６】
請求項４記載のオリゴヌクレオチドプローブを用いて、遺伝子発現量を測定する工程を含む細胞の分化状態を評価する、評価方法。
【請求項７】
請求項５記載のＤＮＡマイクロアレイを用いて、遺伝子発現量を測定する工程を含む細胞の分化状態を評価する、評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、間葉系幹細胞からの、破骨細胞、骨芽細胞又は軟骨細胞へのいずれかの分化状態を、識別可能にする遺伝子群及びその遺伝子の発現を検出することによる細胞の分化状態の評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年のバイオテクノロジー技術の発展に伴い、再生医療の進展が期待されている。その中でも再生医療のための移植材料として間葉系幹細胞が注目されている。間葉系幹細胞は哺乳類の骨髄等に存在し、脂肪細胞、軟骨細胞、骨細胞に分化する多能性の幹細胞として知られている（非特許文献１）。また、間葉系幹細胞の採取や培養に関する報告もされている（非特許文献２）。
【０００３】
間葉系幹細胞から分化する細胞として、骨関連の細胞群がある。骨は、骨の構造的、機械的及び生化学的な完全性の持続、並びにヒト身体のミネラルの恒常性を必要とする機能的に異なる細胞群からなる動的結合組織である。
【０００４】
関連する主な細胞として、例えば、骨新生、骨形成及び骨質量の維持を担う軟骨細胞や骨芽細胞、骨吸収を担う破骨細胞があげられる。
【０００５】
これらの細胞の間葉系幹細胞からの発生及び増殖は完全には解明されていないが、骨のミクロ環境中で産生される増殖因子及びサイトカイン、並びに全身性ホルモン及びマトリクス再構築遺伝子の複雑な相互作用によって支配されており、成長ホルモン、インスリン様増殖因子−１、性ステロイド、甲状腺ホルモン、ＰＴＨ及びプロスタグランジンＥ２等のカルシウム要求性ホルモン、インターロイキン−１β、インターロイキン−６、及び腫瘍壊死因子α等の種々のサイトカイン、さらには１、２５−ジヒドロキシビタミンＤ（カルシトリオール）等が調和的に作用していると考えられている。
【０００６】
間葉系幹細胞を、組織の再生医療に利用するためには、この幹細胞を生体組織から採取し、増殖し、更にそれを分化増殖して、組織の調製を行うことが必要となる。間葉系幹細胞は骨髄や骨膜に存在するが、組織再生医療への実用化のためには、間葉系幹細胞の分化状態を厳密に評価する技術を開発することが必要である。
【０００７】
これまでに間葉系幹細胞の分化状態を評価する手段として、破骨細胞の分化に関わる遺伝子を調べたもの（特許文献１）、軟骨形成に影響を及ぼし得る特定の因子を調べたもの（特許文献２）、骨芽細胞へと分化させる培養工程中での遺伝子発現変化を調べたもの（特許文献３）などがある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特表２００８−５２２６３２号公報
【特許文献２】特表２０１０−５０９９２７号公報
【特許文献３】特開２００８−１７８４０３号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】遺伝子医学、Ｖｏｌ．４、Ｎｏ．２（２０００）ｐ５８−６１
【非特許文献２】実験医学、Ｖｏｌ．１９、Ｎｏ．３（２月号）２００１、ｐ３５０−３５６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかしながら、上述の手段（特許文献１〜３）はある特定の細胞のみへの分化に関与する遺伝子をモニターするものであり、さまざまな細胞への分化の可能性をもつ間葉系幹細胞を評価するには不十分であった。すなわち、本発明の目的は、間葉系幹細胞の分化状態を評価するのに有用な遺伝子を提供することにある。さらには、その遺伝子の発現を検出するのに適した基材の提供をすることにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は、上記課題を解決するべく鋭意検討を行った結果、間葉系幹細胞が破骨細胞、骨芽細胞、軟骨細胞等に分化する過程において、それらの過程を同時に評価する遺伝子群を見出すことによって、本発明を完成させた。
【００１２】
すなわち、本発明は、以下の通りである。
（１）間葉系幹細胞から破骨細胞、骨芽細胞又は軟骨細胞のいずれかへの分化状態を識別するための、以下の遺伝子群から選択される２種以上の遺伝子を含む分化識別用遺伝子群。
【００１３】
ａｇｇｒｅｃａｎ、ａｃｉｄ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ５  ｔａｒｔｒａｔｅ  ｒｅｓｉｓｔａｎｔ、ａｃｔｉｖｉｎ  Ａ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｐｅ  １、ａｃｔｉｖｉｎ  Ａ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｐｅ  １Ｂ、ａｃｔｉｖｉｎ  Ａ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｐｅ  ＩＣ、ａｃｔｉｖｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＩＩＡ、ａｃｔｉｖｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＩＩＢ、ａ  ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ  ａｎｄ  ｍｅｔａｌｌｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ  ｄｏｍａｉｎ  １７、ａ  ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ−ｌｉｋｅ  ａｎｄ  ｍｅｔａｌｌｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ  （ｒｅｐｒｏｌｙｓｉｎ  ｔｙｐｅ）  ｗｉｔｈ  ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ  ｔｙｐｅ  １  ｍｏｔｉｆ  ５  （ａｇｇｒｅｃａｎａｓｅ−２）、ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ  Ｃ１Ｑ  ａｎｄ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｄｏｍａｉｎ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ、ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  １、ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ｌｉｖｅｒ／ｂｏｎｅ／ｋｉｄｎｅｙ）、ａｎｄｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ４、ＡＴＰａｓｅ  Ｈ＋  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｉｎｇ  ｌｙｓｏｓｏｍａｌ  Ｖ０  ｓｕｂｕｎｉｔ  Ａ１、ｂｏｎｅ  ｇａｍｍａ  ｃａｒｂｏｘｙｇｌｕｔａｍａｔｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ、ｂｏｎｅ  ｇａｍｍａ−ｃａｒｂｏｘｙｇｌｕｔａｍａｔｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  １、ｂｉｇｌｙｃａｎ、ｂｏｎｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２、ｂｏｎｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ４、ｂｏｎｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ６、ｂｏｎｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ７、ｂｏｎｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｐｅ  １Ａ、ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ／ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ａｌｐｈａ、ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ｃａｌｃｉｕｍ−ｓｅｎｓｉｎｇ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ｃｏｒｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ  ｂｅｔａ、ＣＤ４４  ａｎｔｉｇｅｎ、ｃａｄｈｅｒｉｎ  １、ｃｈｏｒｄｉｎ、ｃｈｌｏｒｉｄｅ  ｃｈａｎｎｅｌ  ７、ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｔｙｐｅ  Ｘ  ａｌｐｈａ  １、ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｔｙｐｅ  Ｉ  ａｌｐｈａ  １、ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｔｙｐｅ  ＩＩ  ａｌｐｈａ  １、ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｔｙｐｅ  ＩＩＩ  ａｌｐｈａ  １、ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｔｙｐｅ  ＶＩ  ａｌｐｈａ  １、ｃｏｌｌａｇｅｎ    ｔｙｐｅ  ＩＸ  ａｌｐｈａ  １、ｃａｒｔｉｌａｇｅ  ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ  ｍａｔｒｉｘ  ｐｒｏｔｅｉｎ、ｃｏｌｏｎｙ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ  １  （ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）、ｃｏｌｏｎｙ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ  １  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ  ｓｕｌｆａｔｅ  Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  １、ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ  ｓｕｌｆａｔｅ  Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ２、ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ  ｔｉｓｓｕｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ、ｃａｔｅｎｉｎ  （ｃａｄｈｅｒｉｎ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）    ｂｅｔａ  １、ｃａｔｈｅｐｓｉｎ  Ｋ、ｃａｔｈｅｐｓｉｎ  Ｌ、ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  （Ｃ−Ｘ−Ｃ  ｍｏｔｉｆ）  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ４、ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０  ｆａｍｉｌｙ  １９  ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  ａ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  １、ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０  ｆａｍｉｌｙ  ２４  ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  ａ    ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  １、ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０  ｆａｍｉｌｙ  ２７    ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  ｂ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  １、ｄｉｃｋｋｏｐｆ  ｈｏｍｏｌｏｇ  １  （Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）、ｄｅｎｔｉｎ  ｍａｔｒｉｘ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １、ｅｐｈｒｉｎ  Ｂ２、ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ、Ｅｐｈ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ａ４、Ｅｐｈ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｂ４、ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  １  （ａｌｐｈａ）、ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ２  （ｂｅｔａ）、ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ２３、ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  １０、ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  １７、ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  １８、ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ２、ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ４、ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ８、ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  １、ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ２、ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ３、ＦＭＳ−ｌｉｋｅ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  １、ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ  １、ＦＢＪ  ｏｓｔｅｏｓａｒｃｏｍａ  ｏｎｃｏｇｅｎｅ、ＦＢＪ  ｏｓｔｅｏｓａｒｃｏｍａ  ｏｎｃｏｇｅｎｅ  Ｂ、ｆｏｓ−ｌｉｋｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  １、ｆｏｓ−ｌｉｋｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  ２、ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ、ｆｒｉｚｚｌｅｄ  ｈｏｍｏｌｏｇ  １  （Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）、ｇａｐ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ    ａｌｐｈａ  １、ＧＬＩ−Ｋｒｕｐｐｅｌ  ｆａｍｉｌｙ  ｍｅｍｂｅｒ  ＧＬＩ１、ＧＬＩ−Ｋｒｕｐｐｅｌ  ｆａｍｉｌｙ  ｍｅｍｂｅｒ  ＧＬＩ２、ＧＬＩ−Ｋｒｕｐｐｅｌ  ｆａｍｉｌｙ  ｍｅｍｂｅｒ  ＧＬＩ３、ｇｒｅｍｌｉｎ  １、ｇｒｅｍｌｉｎ  ２  ｈｏｍｏｌｏｇ  ｃｙｓｔｅｉｎｅ  ｋｎｏｔ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ  （Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）、ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  Ｉ  ｅｎｈａｎｃｅｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ３、ｐｅｒｌｅｃａｎ  （ｈｅｐａｒａｎ  ｓｕｌｆａｔｅ  ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ  ２）、ｈｙａｌｕｒｏｎｏｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ  １、ｈｙａｌｕｒｏｎｏｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ  ２、ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉａｌｏｐｒｏｔｅｉｎ、ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｂｉｎｄｉｎｇ  １、ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ２、ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ａｌｐｈａ  １、ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  （ａｌｐｈａ  ａｎｄ  ｂｅｔａ）  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  １、ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｂｅｔａ  １  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ、ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｇａｍｍａ、ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｇａｍｍａ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  １、ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｇａｍｍａ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ２、ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  １、ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ２、ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  Ｉ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ２  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、Ｉｎｄｉａｎ  ｈｅｄｇｅｈｏｇ、ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  １７Ａ、ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  １  ａｌｐｈａ、ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  １  ｂｅｔａ、ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  １  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｐｅ  Ｉ、ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ６、ｉｎｈｉｂｉｎ  ｂｅｔａ−Ａ、ｉｎｈｉｂｉｎ  ｂｅｔａ−Ｂ、ｉｎｈｉｂｉｎ  ｂｅｔａ−Ｃ、ｉｎｈｉｂｉｎ  ｂｅｔａ  Ｅ、ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ  ８、ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ａｌｐｈａ  Ｖ、ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ｂｅｔａ  ３、ｋｉｎａｓｅ  ｉｎｓｅｒｔ  ｄｏｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、６０Ｓ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌ１０Ｅ、ｋｌｏｔｈｏ、ｌｙｍｐｈｏｉｄ  ｅｎｈａｎｃｅｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ  １、ｌｅｐｔｉｎ、ｌｏｗ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ５、ｖ−ｍａｆ  ｍｕｓｃｕｌｏａｐｏｎｅｕｒｏｔｉｃ  ｆｉｂｒｏｓａｒｃｏｍａ  ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ｆａｍｉｌｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂ  （ａｖｉａｎ）、ｍａｔｒｉｘ  Ｇｌａ  ｐｒｏｔｅｉｎ、ｍｅｌａｎｏｍａ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  １、ｍｉｃｒｏｐｈｔｈａｌｍｉａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ、ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ  １３、ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ  １４  （ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｉｎｓｅｒｔｅｄ）、ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ  １ａ  （ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ  ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ）、ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ  １ｂ  （ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ  ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ）、ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ  ２、ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ  ３、ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ  ８、ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ  ９、ｈｏｍｅｏｂｏｘ  ｍｓｈ−ｌｉｋｅ  １、ｈｏｍｅｏｂｏｘ  ｍｓｈ−ｌｉｋｅ  ２、ｍｙｏｇｅｎｉｃ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  １、ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｃａｌｃｉｎｅｕｒｉｎ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  １、ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｃａｌｃｉｎｅｕｒｉｎ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ２、ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｃａｌｃｉｎｅｕｒｉｎ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ３、ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ  ｏｆ  ｋａｐｐａ  ｌｉｇｈｔ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ｇｅｎｅ  ｅｎｈａｎｃｅｒ  ｉｎ  Ｂ  ｃｅｌｌｓ  １  ｐ１０５、ｎｕ���ｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ  ｏｆ  ｋａｐｐａ  ｌｉｇｈｔ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ｇｅｎｅ  ｅｎｈａｎｃｅｒ  ｉｎ  Ｂ  ｃｅｌｌｓ  ２  ｐ４９／ｐ１００、ｎｏｇｇｉｎ、ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ｐｌａｔｅｌｅｔ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ａｌｐｈａ、ｐｌａｔｅｌｅｔ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  Ｂ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ、ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ｏｒｐｈａｎ  １、ｐｅｒｉｏｓｔｉｎ  ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｆａｃｔｏｒ、ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｇａｍｍａ、ＰＲ  ｄｏｍａｉｎ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  １  ｗｉｔｈ  ＺＮＦ  ｄｏｍａｉｎ、ｐａｔｃｈｅｄ  ｈｏｍｏｌｏｇ  １、ｐａｔｃｈｅｄ  ｄｏｍａｉｎ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  １、ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ−ｅｎｄｏｐｅｒｏｘｉｄｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ２、ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ、ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ  １  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ−ｌｉｋｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ、ｖ−ｒｅｌ  ｒｅｔｉｃｕｌｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓｉｓ  ｖｉｒａｌ  ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ｈｏｍｏｌｏｇ  Ａ  （ａｖｉａｎ）、ｒａｓ  ｈｏｍｏｌｏｇ  ｇｅｎｅ  ｆａｍｉｌｙ  ｍｅｍｂｅｒ  Ａ、ｒｕｎｔ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  １、ｒｕｎｔ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ２、ｒｕｎｔ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ３、ｓｙｎｄｅｃａｎ  ３、ＳＦＦＶ  ｐｒｏｖｉｒａｌ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  １、ｓｏｎｉｃ  ｈｅｄｇｅｈｏｇ、ＭＡＤ  ｈｏｍｏｌｏｇ  １  （Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）、ＭＡＤ  ｈｏｍｏｌｏｇ  ２  （Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）、ＭＡＤ  ｈｏｍｏｌｏｇ  ３  （Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）、ＭＡＤ  ｈｏｍｏｌｏｇ  ４  （Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）、ＭＡＤ  ｈｏ
ｍｏｌｏｇ  ５  （Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）、ＭＡＤ  ｈｏｍｏｌｏｇ  ６  （Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）、ＭＡＤ  ｈｏｍｏｌｏｇ  ７  （Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）、ＭＡＤ  ｈｏｍｏｌｏｇ  ９  （Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）、ｓｃｌｅｒｏｓｔｉｎ、ＳＲＹ−ｂｏｘ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｇｅｎｅ  ５、ＳＲＹ−ｂｏｘ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｇｅｎｅ  ６、ＳＲＹ−ｂｏｘ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｇｅｎｅ  ９、ｔｒａｎｓ−ａｃｔｉｎｇ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ３、Ｓｐ７  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ７、ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ａｃｉｄｉｃ  ｃｙｓｔｅｉｎｅ  ｒｉｃｈ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ、ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎ  １、Ｒｏｕｓ  ｓａｒｃｏｍａ  ｏｎｃｏｇｅｎｅ、ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｂｅｔａ  １、ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｂｅｔａ  ２、ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｂｅｔａ  ３、ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｂｅｔａ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｉ、ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｂｅｔａ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＩＩ、ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ７  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ  ｍｅｍｂｅｒ  ４、ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ、ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ  ｍｅｍｂｅｒ  １１ａ、ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ  ｍｅｍｂｅｒ  １ａ、ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ  ｍｅｍｂｅｒ  １ｂ、ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  （ｌｉｇａｎｄ）  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ  ｍｅｍｂｅｒ  １１、ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ  ｍｅｍｂｅｒ  １１ｂ  （ｏｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ）、ＴＮＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｆａｃｔｏｒ  ６、ｖｅｒｓｉｃａｎ、ｖｉｔａｍｉｎ  Ｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  Ａ、ｗｉｎｇｌｅｓｓ−ｒｅｌａｔｅｄ  ＭＭＴＶ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｓｉｔｅ  ３Ａ、ｗｉｎｇｌｅｓｓ−ｒｅｌａｔｅｄ  ＭＭＴＶ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｓｉｔｅ  ４、ｗｉｎｇｌｅｓｓ−ｒｅｌａｔｅｄ  ＭＭＴＶ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｓｉｔｅ  ５Ａ、ｗｉｎｇｌｅｓｓ−ｒｅｌａｔｅｄ  ＭＭＴＶ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｓｉｔｅ  ５Ｂ、ｗｉｎｇｌｅｓｓ−ｒｅｌａｔｅｄ  ＭＭＴＶ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｓｉｔｅ  ６、ｗｉｎｇｌｅｓｓ−ｒｅｌａｔｅｄ  ＭＭＴＶ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｓｉｔｅ  ７Ａ、ｗｉｎｇｌｅｓｓ−ｒｅｌａｔｅｄ  ＭＭＴＶ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｓｉｔｅ  ７Ｂ、ｓｅｍａ  ｄｏｍａｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｄｏｍａｉｎ  （Ｉｇ）  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｄｏｍａｉｎ  （ＴＭ）  ａｎｄ  ｓｈｏｒｔ  ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｄｏｍａｉｎ（ｓｅｍａｐｈｏｒｉｎ）  ４Ｄ
（２）遺伝子、前記遺伝子が転写するＲＮＡ、前記遺伝子もしくはＲＮＡの核酸配列のうち少なくとも連続した３０塩基以上の部分配列を含むオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド、のいずれかを含み、間葉系幹細胞からの、破骨細胞、骨芽細胞又は軟骨細胞へのいずれかの分化状態を、識別可能にする分別マーカーであって、
前記遺伝子が、（１）の遺伝子群から選択される２種以上の遺伝子であることを特徴とする分別マーカー群。
（３）（２）の分別マーカー群を用い、分別マーカーの発現の差を検出することにより、間葉系幹細胞からの、破骨細胞、骨芽細胞又は軟骨細部へのいずれかの分化状態を識別する、分化識別方法。
（４）以下の（ａ）〜（ｄ）のうち１種のＤＮＡの塩基配列及び／又は該ＤＮＡの塩基配列と相補的な塩基配列を含む細胞分化評価用オリゴヌクレオチドプローブ。
（ａ）配列番号１〜２０２に示される塩基配列から選択されるＤＮＡ
（ｂ）（ａ）のＤＮＡに対し相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ
（ｃ）（ａ）の塩基配列と同一性が８０％以上の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ）（ａ）〜（ｃ）のいずれかの塩基配列に１から数個の付加、挿入、欠損又は置換を含む塩基配列からなるＤＮＡ
（５）（４）のオリゴヌクレオチドプローブが搭載された細胞分化状態評価用ＤＮＡマイクロアレイ。
（６）（４）のオリゴヌクレオチドプローブを用いて、遺伝子発現量を測定する工程を含む細胞の分化状態を評価する、評価方法。
（７）（５）のＤＮＡマイクロアレイを用いて、遺伝子発現量を測定する工程を含む細胞の分化状態を評価する、評価方法。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、細胞分化を識別する遺伝子群と、それらの発現量の変化を検出するためのオリゴヌクレオチドプローブを提供することができる。
【００１５】
また、本発明によれば、当該オリゴヌクレオチドプローブを搭載したＤＮＡマイクロアレイを提供することができる。さらには、間葉系幹細胞を分化させ、その遺伝子発現パターンの変化を把握することにより、特に、破骨細胞、骨芽細胞または軟骨細胞へ分化した細胞の分化状態を細胞の種類ごとではなく、一括して簡便に評価することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明を詳細に説明する。
＜１．破骨細胞、骨芽細胞、軟骨細胞への分化識別用遺伝子群＞
本発明における分化識別用遺伝子として関連性が深い遺伝子は、破骨細胞、骨芽細胞、軟骨細胞へ分化過程で変動が明確な遺伝子である。また、分化後分子マーカーとして発現量が維持される遺伝子である。例えば細胞種に特異的な細胞外マトリクス、基質分解酵素、分化誘導・調節転写因子、サイトカインとその受容体を機能としてコードする遺伝子、またはこれらに関連する遺伝子が挙げられる。
【００１７】
（分化識別用遺伝子群）
ａｇｇｒｅｃａｎ、ａｃｉｄ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ５  ｔａｒｔｒａｔｅ  ｒｅｓｉｓｔａｎｔ、ａｃｔｉｖｉｎ  Ａ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｐｅ  １、ａｃｔｉｖｉｎ  Ａ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｐｅ  １Ｂ、ａｃｔｉｖｉｎ  Ａ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｐｅ  ＩＣ、ａｃｔｉｖｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＩＩＡ、ａｃｔｉｖｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＩＩＢ、ａ  ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ  ａｎｄ  ｍｅｔａｌｌｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ  ｄｏｍａｉｎ  １７、ａ  ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ−ｌｉｋｅ  ａｎｄ  ｍｅｔａｌｌｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ  （ｒｅｐｒｏｌｙｓｉｎ  ｔｙｐｅ）  ｗｉｔｈ  ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ  ｔｙｐｅ  １  ｍｏｔｉｆ  ５  （ａｇｇｒｅｃａｎａｓｅ−２）、ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ  Ｃ１Ｑ  ａｎｄ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｄｏｍａｉｎ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ、ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  １、ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ｌｉｖｅｒ／ｂｏｎｅ／ｋｉｄｎｅｙ）、ａｎｄｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ４、ＡＴＰａｓｅ  Ｈ＋  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｉｎｇ  ｌｙｓｏｓｏｍａｌ  Ｖ０  ｓｕｂｕｎｉｔ  Ａ１、ｂｏｎｅ  ｇａｍｍａ  ｃａｒｂｏｘｙｇｌｕｔａｍａｔｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ、ｂｏｎｅ  ｇａｍｍａ−ｃａｒｂｏｘｙｇｌｕｔａｍａｔｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  １、ｂｉｇｌｙｃａｎ、ｂｏｎｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２、ｂｏｎｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ４、ｂｏｎｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ６、ｂｏｎｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ７、ｂｏｎｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｐｅ  １Ａ、ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ／ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ａｌｐｈａ、ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ｃａｌｃｉｕｍ−ｓｅｎｓｉｎｇ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ｃｏｒｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ  ｂｅｔａ、ＣＤ４４  ａｎｔｉｇｅｎ、ｃａｄｈｅｒｉｎ  １、ｃｈｏｒｄｉｎ、ｃｈｌｏｒｉｄｅ  ｃｈａｎｎｅｌ  ７、ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｔｙｐｅ  Ｘ  ａｌｐｈａ  １、ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｔｙｐｅ  Ｉ  ａｌｐｈａ  １、ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｔｙｐｅ  ＩＩ  ａｌｐｈａ  １、ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｔｙｐｅ  ＩＩＩ  ａｌｐｈａ  １、ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｔｙｐｅ  ＶＩ  ａｌｐｈａ  １、ｃｏｌｌａｇｅｎ    ｔｙｐｅ  ＩＸ  ａｌｐｈａ  １、ｃａｒｔｉｌａｇｅ  ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ  ｍａｔｒｉｘ  ｐｒｏｔｅｉｎ、ｃｏｌｏｎｙ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ  １  （ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）、ｃｏｌｏｎｙ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ  １  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ  ｓｕｌｆａｔｅ  Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  １、ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ  ｓｕｌｆａｔｅ  Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ２、ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ  ｔｉｓｓｕｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ、ｃａｔｅｎｉｎ  （ｃａｄｈｅｒｉｎ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）    ｂｅｔａ  １、ｃａｔｈｅｐｓｉｎ  Ｋ、ｃａｔｈｅｐｓｉｎ  Ｌ、ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  （Ｃ−Ｘ−Ｃ  ｍｏｔｉｆ）  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ４、ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０  ｆａｍｉｌｙ  １９  ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  ａ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  １、ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０  ｆａｍｉｌｙ  ２４  ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  ａ    ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  １、ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０  ｆａｍｉｌｙ  ２７    ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  ｂ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  １、ｄｉｃｋｋｏｐｆ  ｈｏｍｏｌｏｇ  １  （Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）、ｄｅｎｔｉｎ  ｍａｔｒｉｘ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １、ｅｐｈｒｉｎ  Ｂ２、ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ、Ｅｐｈ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ａ４、Ｅｐｈ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｂ４、ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  １  （ａｌｐｈａ）、ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ２  （ｂｅｔａ）、ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ２３、ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  １０、ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  １７、ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  １８、ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ２、ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ４、ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ８、ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  １、ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ２、ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ３、ＦＭＳ−ｌｉｋｅ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  １、ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ  １、ＦＢＪ  ｏｓｔｅｏｓａｒｃｏｍａ  ｏｎｃｏｇｅｎｅ、ＦＢＪ  ｏｓｔｅｏｓａｒｃｏｍａ  ｏｎｃｏｇｅｎｅ  Ｂ、ｆｏｓ−ｌｉｋｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  １、ｆｏｓ−ｌｉｋｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  ２、ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ、ｆｒｉｚｚｌｅｄ  ｈｏｍｏｌｏｇ  １  （Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）、ｇａｐ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ    ａｌｐｈａ  １、ＧＬＩ−Ｋｒｕｐｐｅｌ  ｆａｍｉｌｙ  ｍｅｍｂｅｒ  ＧＬＩ１、ＧＬＩ−Ｋｒｕｐｐｅｌ  ｆａｍｉｌｙ  ｍｅｍｂｅｒ  ＧＬＩ２、ＧＬＩ−Ｋｒｕｐｐｅｌ  ｆａｍｉｌｙ  ｍｅｍｂｅｒ  ＧＬＩ３、ｇｒｅｍｌｉｎ  １、ｇｒｅｍｌｉｎ  ２  ｈｏｍｏｌｏｇ  ｃｙｓｔｅｉｎｅ  ｋｎｏｔ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ  （Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）、ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  Ｉ  ｅｎｈａｎｃｅｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ３、ｐｅｒｌｅｃａｎ  （ｈｅｐａｒａｎ  ｓｕｌｆａｔｅ  ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ  ２）、ｈｙａｌｕｒｏｎｏｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ  １、ｈｙａｌｕｒｏｎｏｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ  ２、ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉａｌｏｐｒｏｔｅｉｎ、ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｂｉｎｄｉｎｇ  １、ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ２、ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ａｌｐｈａ  １、ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  （ａｌｐｈａ  ａｎｄ  ｂｅｔａ）  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  １、ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｂｅｔａ  １  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ、ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｇａｍｍａ、ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｇａｍｍａ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  １、ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｇａｍｍａ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ２、ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  １、ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ２、ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  Ｉ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ２  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、Ｉｎｄｉａｎ  ｈｅｄｇｅｈｏｇ、ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  １７Ａ、ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  １  ａｌｐｈａ、ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  １  ｂｅｔａ、ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  １  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｐｅ  Ｉ、ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ６、ｉｎｈｉｂｉｎ  ｂｅｔａ−Ａ、ｉｎｈｉｂｉｎ  ｂｅｔａ−Ｂ、ｉｎｈｉｂｉｎ  ｂｅｔａ−Ｃ、ｉｎｈｉｂｉｎ  ｂｅｔａ  Ｅ、ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ  ８、ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ａｌｐｈａ  Ｖ、ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ｂｅｔａ  ３、ｋｉｎａｓｅ  ｉｎｓｅｒｔ  ｄｏｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、６０Ｓ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌ１０Ｅ、ｋｌｏｔｈｏ、ｌｙｍｐｈｏｉｄ  ｅｎｈａｎｃｅｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ  １、ｌｅｐｔｉｎ、ｌｏｗ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ５、ｖ−ｍａｆ  ｍｕｓｃｕｌｏａｐｏｎｅｕｒｏｔｉｃ  ｆｉｂｒｏｓａｒｃｏｍａ  ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ｆａｍｉｌｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂ  （ａｖｉａｎ）、ｍａｔｒｉｘ  Ｇｌａ  ｐｒｏｔｅｉｎ、ｍｅｌａｎｏｍａ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  １、ｍｉｃｒｏｐｈｔｈａｌｍｉａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ、ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ  １３、ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ  １４  （ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｉｎｓｅｒｔｅｄ）、ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ  １ａ  （ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ  ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ）、ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ  １ｂ  （ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ  ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ）、ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ  ２、ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ  ３、ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ  ８、ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ  ９、ｈｏｍｅｏｂｏｘ  ｍｓｈ−ｌｉｋｅ  １、ｈｏｍｅｏｂｏｘ  ｍｓｈ−ｌｉｋｅ  ２、ｍｙｏｇｅｎｉｃ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  １、ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｃａｌｃｉｎｅｕｒｉｎ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  １、ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｃａｌｃｉｎｅｕｒｉｎ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ２、ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｃａｌｃｉｎｅｕｒｉｎ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ３、ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ  ｏｆ  ｋａｐｐａ  ｌｉｇｈｔ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ｇｅｎｅ  ｅｎｈａｎｃｅｒ  ｉｎ  Ｂ  ｃｅｌｌｓ  １  ｐ１０５、ｎｕ���ｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ  ｏｆ  ｋａｐｐａ  ｌｉｇｈｔ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ｇｅｎｅ  ｅｎｈａｎｃｅｒ  ｉｎ  Ｂ  ｃｅｌｌｓ  ２  ｐ４９／ｐ１００、ｎｏｇｇｉｎ、ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ｐｌａｔｅｌｅｔ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ａｌｐｈａ、ｐｌａｔｅｌｅｔ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  Ｂ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ、ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ｏｒｐｈａｎ  １、ｐｅｒｉｏｓｔｉｎ  ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｆａｃｔｏｒ、ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｇａｍｍａ、ＰＲ  ｄｏｍａｉｎ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  １  ｗｉｔｈ  ＺＮＦ  ｄｏｍａｉｎ、ｐａｔｃｈｅｄ  ｈｏｍｏｌｏｇ  １、ｐａｔｃｈｅｄ  ｄｏｍａｉｎ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  １、ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ−ｅｎｄｏｐｅｒｏｘｉｄｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ２、ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ、ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ  １  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ−ｌｉｋｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ、ｖ−ｒｅｌ  ｒｅｔｉｃｕｌｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓｉｓ  ｖｉｒａｌ  ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ｈｏｍｏｌｏｇ  Ａ  （ａｖｉａｎ）、ｒａｓ  ｈｏｍｏｌｏｇ  ｇｅｎｅ  ｆａｍｉｌｙ  ｍｅｍｂｅｒ  Ａ、ｒｕｎｔ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  １、ｒｕｎｔ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ２、ｒｕｎｔ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ３、ｓｙｎｄｅｃａｎ  ３、ＳＦＦＶ  ｐｒｏｖｉｒａｌ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  １、ｓｏｎｉｃ  ｈｅｄｇｅｈｏｇ、ＭＡＤ  ｈｏｍｏｌｏｇ  １  （Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）、ＭＡＤ  ｈｏｍｏｌｏｇ  ２  （Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）、ＭＡＤ  ｈｏｍｏｌｏｇ  ３  （Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）、ＭＡＤ  ｈｏｍｏｌｏｇ  ４  （Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）、ＭＡＤ  ｈｏｍ
ｏｌｏｇ  ５  （Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）、ＭＡＤ  ｈｏｍｏｌｏｇ  ６  （Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）、ＭＡＤ  ｈｏｍｏｌｏｇ  ７  （Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）、ＭＡＤ  ｈｏｍｏｌｏｇ  ９  （Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）、ｓｃｌｅｒｏｓｔｉｎ、ＳＲＹ−ｂｏｘ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｇｅｎｅ  ５、ＳＲＹ−ｂｏｘ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｇｅｎｅ  ６、ＳＲＹ−ｂｏｘ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｇｅｎｅ  ９、ｔｒａｎｓ−ａｃｔｉｎｇ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ３、Ｓｐ７  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ７、ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ａｃｉｄｉｃ  ｃｙｓｔｅｉｎｅ  ｒｉｃｈ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ、ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎ  １、Ｒｏｕｓ  ｓａｒｃｏｍａ  ｏｎｃｏｇｅｎｅ、ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｂｅｔａ  １、ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｂｅｔａ  ２、ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｂｅｔａ  ３、ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｂｅｔａ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｉ、ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｂｅｔａ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＩＩ、ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ７  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ  ｍｅｍｂｅｒ  ４、ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ、ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ  ｍｅｍｂｅｒ  １１ａ、ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ  ｍｅｍｂｅｒ  １ａ、ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ  ｍｅｍｂｅｒ  １ｂ、ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  （ｌｉｇａｎｄ）  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ  ｍｅｍｂｅｒ  １１、ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ  ｍｅｍｂｅｒ  １１ｂ  （ｏｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ）、ＴＮＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｆａｃｔｏｒ  ６、ｖｅｒｓｉｃａｎ、ｖｉｔａｍｉｎ  Ｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  Ａ、ｗｉｎｇｌｅｓｓ−ｒｅｌａｔｅｄ  ＭＭＴＶ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｓｉｔｅ  ３Ａ、ｗｉｎｇｌｅｓｓ−ｒｅｌａｔｅｄ  ＭＭＴＶ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｓｉｔｅ  ４、ｗｉｎｇｌｅｓｓ−ｒｅｌａｔｅｄ  ＭＭＴＶ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｓｉｔｅ  ５Ａ、ｗｉｎｇｌｅｓｓ−ｒｅｌａｔｅｄ  ＭＭＴＶ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｓｉｔｅ  ５Ｂ、ｗｉｎｇｌｅｓｓ−ｒｅｌａｔｅｄ  ＭＭＴＶ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｓｉｔｅ  ６、ｗｉｎｇｌｅｓｓ−ｒｅｌａｔｅｄ  ＭＭＴＶ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｓｉｔｅ  ７Ａ、ｗｉｎｇｌｅｓｓ−ｒｅｌａｔｅｄ  ＭＭＴＶ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｓｉｔｅ  ７Ｂ、ｓｅｍａ  ｄｏｍａｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｄｏｍａｉｎ  （Ｉｇ）  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｄｏｍａｉｎ  （ＴＭ）  ａｎｄ  ｓｈｏｒｔ  ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｄｏｍａｉｎ（ｓｅｍａｐｈｏｒｉｎ）  ４Ｄ
【００１８】
遺伝子の具体的な遺伝子名、及びＧｅｎＢａｎｋ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／  から取得可能）のＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ（アクセッション番号）は表１〜表６に示される。
【００１９】
【表１】
2014230493.tif 000002
【００２０】
【表２】
2014230493.tif 000003
【００２１】
【表３】
2014230493.tif 000004
【００２２】
【表４】
2014230493.tif 000005
【００２３】
【表５】
2014230493.tif 000006
【００２４】
【表６】
2014230493.tif 000007
例えば、破骨細胞であれば破骨細胞特異的インテグリン（１１１番：ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ａｌｐｈａ  Ｖ、１１２番：ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ｂｅｔａ  ３）、分化誘導・転写因子（７１番：ｃ−Ｆｏｓ、７２番：ＦｏｓＢ、７３番：Ｆｒａ−１、１３５番：ＮＦＡＴ２、１４６番：Ｐｒｄｍ１、１５９番：Ｓｆｐｉ１、１８８番：Ｔｎｆｓｆ１１、１９０番：ＴＲＡＦ６）、骨吸収、酸分泌等酵素、細胞骨格シグナル（２番：Ａｃｐ５、１５番：Ｖ−ＡＴＰａｓｅ、３１番：ＣＬＣＮ７、１２４番：ＭＭＰ−１４、１５４番：ＲｈｏＡ）が挙げられる。
【００２５】
特徴的な発現パターンとしては、例えば、破骨細胞、骨芽細胞、軟骨細胞の分化後分子マーカーのすべての発現量を合計し、この合計値でそれぞれの細胞種の分化後分子マーカーの合計値の比率を算出したとき、破骨細胞の分化後分子マーカーの比率が９０％以上、その他の細胞の分化後分子マーカーの比率が５％以下という発現パターンが好ましい。
【００２６】
また軟骨細胞であれば、軟骨の分化後の細胞外マトリクス、軟骨特異的コラーゲンやプロテオグリカン（１番：Ａｃａｎ、３２番：Ｃｏｌ１０ａ１、３４番：Ｃｏｌ２ａ１、３７番：Ｃｏｌ９ａ１、３８番：Ｃｏｍｐ、８４番：Ｈｓｐｇ２、１５８番：Ｓｄｃ３、１９１番：Ｖｃａｎ）軟骨形成関連酵素（４１番：Ｃｓｇａｌｎａｃｔ１、４２番：Ｃｓｇａｌｎａｃｔ２）、アグリカン分解酵素（９番：Ａｄａｍｔｓ５）、軟骨基質分解酵素（８５番：Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｄａｓｅ  １、８６番：Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｄａｓｅ  ２）、分化誘導・転写因子・サイトカイン関連（６２番：ＦＧＦ１８、７６番：Ｆｒｉｚｚｌｅｄ（Ｆｚｄ１）、１５５番：Ｒｕｎｘ１、１７０番：Ｓｏｘ５、１７１番：Ｓｏｘ６）が挙げられる。
【００２７】
特徴的な発現パターンとしては、例えば、破骨細胞、骨芽細胞、軟骨細胞の分化後分子マーカーのすべての発現量を合計し、この合計値でそれぞれの細胞種の分化後分子マーカーの合計値の比率を算出したとき、軟骨細胞の分化後分子マーカーの比率が７０％以上、その他の細胞の分化後分子マーカーの比率が２５％以下という発現パターンが好ましい。
【００２８】
最後に骨芽細胞であれば、細胞外マトリクス・骨基質タンパク（１６番：Ｂｇｌａｐ、１７番：Ｂｇｌａｐ−ｒｓ１、１８版：Ｂｇｎ、３３番：Ｃｏｌ１ａ１、３５番：Ｃｏｌ３ａ１、３６番：Ｃｏｌ６ａ１、７０番：Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ  、８７番：Ｉｂｓｐ、１２０番：Ｍｇｐ、１７５番：Ｓｐａｒｃ、１７６番：Ｓｐｐ１）、骨芽細胞分化促進（１０番：Ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ、１１番：Ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  １、１４番：Ａｔｆ４、７８番：Ｇｌｉ１、７９番：Ｇｌｉ２）、骨芽細胞分化調節・誘導に関わる分子（２７番：Ｃｂｆｂ、４４番：Ｃｔｎｎｂ１、５１番：Ｄｋｋ１、７７番：Ｇｊａ１、８８番：Ｉｄ１、８９番：Ｉｄ２、１３３番：Ｍｙｏｄ１、１４３番：Ｐｈｏｓｐｈｏ１、１４７番：Ｐｔｃｈ１、１５３番：Ｒｕｎｘ３、１５６番：Ｒｕｎｘ２、１７３番：Ｓｐ３、１７４番：Ｓｐ７（Ｏｓｔｅｒｉｘ））などを挙げることができる。
【００２９】
特徴的な発現パターンとしては、例えば、破骨細胞、骨芽細胞、軟骨細胞の分化後分子マーカーのすべての発現量を合計し、この合計値でそれぞれの細胞種の分化後分子マーカーの合計値の比率を算出したとき、骨芽細胞の分化後分子マーカーの比率が８５％以上、その他の細胞の分化後分子マーカーの比率が１０％以下という発現パターンが好ましい。
【００３０】
これらの遺伝子は分化後の細胞において特徴的な発現パターンを示すと推定されるが、識別方法の選び方によっては、ここで挙げた遺伝子群のみに限定されるものではない。
【００３１】
＜２．マーカー＞
マーカーとは、特定の細胞集団を特徴づける目印であって、その細胞集団が持つ機能に由来するタンパク質やタンパク質を発現するために転写されているｍＲＮＡ（遺伝子マーカー）である。
ここで、遺伝子、前記遺伝子が転写するＲＮＡ、前記遺伝子もしくはＲＮＡの核酸配列のうち少なくとも連続した３０塩基以上の部分配列を含むオリゴヌクレオチド、前記遺伝子、前記遺伝子が転写するＲＮＡ、前記遺伝子もしくはＲＮＡの核酸配列のうち少なくとも連続した３０塩基以上の部分配列を含むポリヌクレオチド、のいずれかを含むものを分別マーカーという。
分別マーカーとは細胞集団間でマーカーの差異を比較した際、特に差異が大きい遺伝子マーカーである。
分別マーカーは、間葉系幹細胞からの、破骨細胞、骨芽細胞又は軟骨細胞のいずれかへの分化状態を、識別するものである。
【００３２】
分別マーカーの測定は、これにハイブリダイズダイゼーションできるプローブを用いて遺伝子発現量を測定することで可能である。特に多数の分別マーカーをまとめて検出するためには、複数のプローブを固定化して遺伝子発現量を測定できるＤＮＡマイクロアレイを用いることが有効である。
【００３３】
２種以上の遺伝子である分別マーカー群とは、前述の「分化識別用遺伝子群」から選択される少なくとも２種以上の遺伝子である分別マーカー群のことである。実験や検査が成功したか否かを判断できるようにするため、分類する種類に加えてポジティブコントロール、ネガティブコントロールを含めた種類を揃えておくことが好ましい。
【００３４】
＜３．細胞分化評価用オリゴヌクレオチドプローブ＞
これら遺伝子の発現を特異的に検出することのできるプローブを設計する。ＤＮＡ断片としては、３０〜７０個の塩基が好ましく、６５個の塩基が特に好ましい。ポジティブコントロール及びネガティブコントロールを含めた全ての遺伝子に対するキャプチャープローブは、鎖長６５塩基の合成オリゴヌクレオチドで、融解温度（Ｔｍ）はほぼ同一であり、標的遺伝子のｍＲＮＡの３’末端側より１、５００塩基以内の領域に特異的に結合するように、専用ソフトウェアを用いて設計したものである。設計したオリゴヌクレオチドプローブの配列を表１〜表６に示す。表１〜表６に記載の遺伝子にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつこれらの遺伝子のｍＲＮＡを検出し得る機能を有するＤＮＡ断片も、本発明の細胞分化評価用オリゴヌクレオチドプローブとして用いることができる。
【００３５】
ハイブリダイゼーション法の詳細な手順については、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄ．（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  （１９８９）等を適宜参照することができる。
「ストリンジェントな条件」とは、ハイブリダイゼーション時の条件であって、バッファーの塩濃度が９７．５〜３９０ｍＭ、温度が３７〜８０℃、好ましくは塩濃度が９７．５〜２００ｍＭ、温度が５０〜７０℃の条件を意味する。具体的には、例えば１９５ｍＭで６５℃等の条件を挙げることができる。さらに、このような塩濃度や温度等の条件に加えて、プローブ濃度、プローブの長さ、反応時間等の諸条件も考慮し、条件を適宜設定することができる。
上記条件を満たすＤＮＡ断片としては、表１〜表６記載の遺伝子をコードする塩基配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有する塩基配列であることが好ましく、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、特の好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の同一性を有するものである。
上記の同一性の数値は、配列解析ソフトウェアであるＤＮＡＳＩＳ（株式会社日立ソリューションズ）を用いて、例えば、マキシマムマッチング法のコマンドを実行することにより求められる。その際のパラメータは、デフォルトの設定（初期設定）とする。
【００３６】
また、細胞分化評価用オリゴヌクレオチドプローブとしてのＤＮＡ断片は、数個の塩基に付加、挿入、欠損又は置換等の変異が生じた塩基配列も、それが本発明のプローブとしての機能を有する限り、本発明のプローブに含まれる。なお、付加、挿入、欠損又は置換される塩基の個数は、ＤＮＡ断片の全塩基数が３０〜７０の場合は、５個以下、好ましくは３個以下、特に好ましくは２個以下である。
なお、上記のＤＮＡ断片は、細胞の識別に関わる遺伝子のｍＲＮＡを検出し得る機能を有するＤＮＡ断片であることが重要である。
【００３７】
本発明の細胞分化評価用オリゴヌクレオチドプローブは、細胞の識別の評価に特に関連性が深い遺伝子群と、特異的に結合する（ハイブリダイズする）ものである。このように特異的に結合することにより、細胞の識別の評価関連遺伝子のｍＲＮＡの検出ができ、細胞の分化状態を簡便に評価することができる。
【００３８】
細胞分化評価用オリゴヌクレオチドプローブの作製方法は、特に限定はされないが、公知の各種ＤＮＡ合成機を用いて得る方法等が挙げられる。これら細胞分化評価用オリゴヌクレオチドプローブを用いて特定の遺伝子発現を検出しうる方法としてリアルタイムＰＣＲ、シークエンス法、マイクロアレイ法等用いることができるが、以下にマイクロアレイ法を一例に挙げてより詳細を説明する。
＜４．細胞分化状態評価用ＤＮＡマイクロアレイ＞
ＤＮＡマイクロアレイについて、その支持体の形態は、限定はされず、平板、棒状、ビーズ等のいずれの形態も使用できる。支持体として、平板を使用する場合は、その平板上に、所定の間隔をもって、所定のプローブを種類毎に固定することができる（スポッティング法等；Ｓｃｉｅｎｃｅ２７０、４６７−４７０（１９９５）等参照）。また、平板上の特定の位置で、所定のプローブを種類毎に逐次合成していくこともできる（フォトリソグラフィー法等；Ｓｃｉｅｎｃｅ２５１、７６７−７７３（１９９１）等参照）。他の好ましい支持体の形態としては、中空繊維を使用するものが挙げられる。支持体として中空繊維を使用する場合は、所定のプローブを種類毎に各中空繊維に固定し、すべての中空繊維を集束させ固定した後、繊維の長手方向で切断を繰り返すことにより得られるＤＮＡマイクロアレイが好ましく例示できる。このＤＮＡマイクロアレイは、貫通孔基板に核酸を固定化したタイプのものと説明することができ、いわゆる「貫通孔型マイクロアレイ」とも言われる（特許第３５１０８８２号公報等を参照）。
【００３９】
支持体へのプローブの固定方法は、限定はされず、どのような結合様式でもよい。支持体に直接固定することに限定はされず、例えば、予め支持体をポリリジン等のポリマーでコーティング処理し、処理後の支持体にプローブを固定することもできる。さらに、支持体として中空繊維等の管状体を使用する場合は、管状体にゲル状物を保持させ、そのゲル状物にプローブを固定することもできる。当該貫通孔型マイクロアレイとしては、例えば、三菱レイヨン社製のＤＮＡマイクロアレイ（Ｇｅｎｏｐａｌ（登録商標））等が好ましく挙げられる。
【００４０】
＜５．評価方法＞
本発明の細胞分化評価用オリゴヌクレオチドプローブ又は細胞分化状態評価用ＤＮＡマイクロアレイを用いた細胞の分化状態の評価方法は、一例としては次の（１）〜（３）の工程を含む評価方法である。（１）評価対象となる間葉系幹細胞を分化誘導させる工程、（２）誘導後、核酸を抽出する工程、（３）（２）で抽出した評価対象核酸について発現データを収集する工程、工程（４）工程（３）におけるデータ用いて識別評価を行う工程。
【００４１】
工程（１）評価対象となる間葉系幹細胞を分化誘導させる工程
ここで、評価対象とは生体そのものであってもよいが、より好ましくは細胞由来のものである。例えば、破骨細胞に分化可能なＲＡＷ２６４．７細胞株、軟骨細胞に分化可能なＡＴＤＣ５細胞株、骨芽細胞に分化可能なＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞株等を挙げることができる。
【００４２】
分化誘導させる方法は、ＭＣＳＦ、ＴＧＦβ、ＢＭＰ−２等を含有する培地で培養細胞を培養する方法などが考えられるが、特にこれに限定されるものではない。
工程（２）誘導後、核酸を抽出する工程
核酸（核酸増幅産物）の抽出方法は特に限定はされないが、例えば、実験動物由来の臓器・組織、もしくは培養細胞から、カラム等を用いて転写産物を含む核酸を分離、場合により分離後増幅することにより得ることが出来る。
工程（３）（２）で抽出した評価対象核酸について発現データを収集する工程
評価対象から調製した核酸（核酸増幅産物）を細胞分化評価用オリゴヌクレオチドプローブ等に接触させ、ハイブリダイズした転写産物を検出する。
【００４３】
なお、接触とは、具体的には、上記の核酸（核酸増幅産物）をハイブリダイゼーション用の溶液と混合させ、この溶液（ハイブリダイゼーション溶液）を細胞分化評価用オリゴヌクレオチドプローブに結合（ハイブリダイズ）させることを言う。
【００４４】
ハイブリダイゼーション溶液と細胞分化評価用オリゴヌクレオチドプローブとの接触、すなわちハイブリダイゼーション反応は、当該溶液中の核酸が当該オリゴヌクレオチドプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るよう、反応条件（緩衝液の種類、ｐＨ、温度など）を適宜設定して行うことができる。なお、ここで言う「ストリンジェントな条件」とは、ハイブリダイゼーション時の条件であって、バッファーの塩濃度が９７．５〜３９０ｍＭ、温度が３７〜８０℃、好ましくは塩濃度が９７．５〜２００ｍＭ、温度が５０〜７０℃の条件を意味する。具体的には、例えば１９５ｍＭで６５℃等の条件を挙げることができる。
【００４５】
洗浄後、オリゴヌクレオチドプローブに結合した核酸の標識を検出できる装置により、スポットごとに検出強度を測定する。蛍光標識化された核酸を結合させた場合、又は核酸を結合後に蛍光標識化した場合は、各種蛍光検出装置（例えば、三菱レイヨン社製の冷却ＣＣＤ式蛍光検出装置など）を使用して蛍光強度を測定することができる。得られた検出結果（蛍光強度）は、公知の処理方法により、ターゲットとなる各種遺伝子の発現量を数値化することが出来る。その後、この数値を発現データとして収集する。
【００４６】
工程（４）工程（３）におけるデータをもとに識別評価を行う工程
工程（３）で得られたデータをもとにあらかじめ設定しておいた手法を用いて細胞の分化状態を判定することができる。例えば、表１〜表６記載の細胞分化評価用オリゴヌクレオチドプローブを搭載した細胞分化状態評価用ＤＮＡマイクロアレイを作製し、破骨細胞に分化可能なＲＡＷ２６４．７細胞株、軟骨細胞に分化可能なＡＴＤＣ５細胞株、骨芽細胞に分化可能なＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞株の遺伝子発現データを比較し、有意に変動した遺伝子を変動の大きいものから順位付けして遺伝子群を選抜し、細胞の識別に有用な遺伝子群、またはプローブを見出す。その後、識別のための指標数値をそれらの遺伝子群やプローブに割り当て判定基準を設定しておく。その後、未知のサンプルについて取得した遺伝子の発現の情報をそれらと比較することにより細胞を識別することができる。
【００４７】
また、別の例としては、２種以上の分別マーカーの発現量に基づいて、相関係数、クラスター分析、多次元尺度法、主成分分析、因子分析、数量化ＩＩＩ類、数量化ＩＶ類、自己組織化マップ、ネットワークの推定（ブーリアンネットワーク、ベイジアンネットワーク）などを用いることができる。
【００４８】
例えば、スピアマン相関係数を使用した識別方法では、あらかじめ設定しておいた各種分化後の細胞の基準値に対して、相関係数値が、０．６以上、好ましくは０．８以上、さらに好ましくは０．９以上であった時に、被検細胞が特定の分化段階の細胞であったと識別される等、必要に応じて適切な方法を設定することができる。
【００４９】
以下に、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例】
【００５０】
１．細胞分化状態評価用ＤＮＡマイクロアレイの製造
間葉系幹細胞から破骨細胞、骨芽細胞、軟骨細胞へ分化に特に関連性が深い遺伝子、２０２遺伝子を選択し、これらの遺伝子の発現を特異的に検出するキャプチャープローブ（細胞分化評価用オリゴヌクレオチドプローブ）を搭載した細胞分化状態評価用ＤＮＡマイクロアレイ（貫通孔型オリゴヌクレオチドマイクロアレイ（ＧｅｎｏｐａｌＴＭ）、三菱レイヨン社製）を作製した。
ポジティブコントロール及びネガティブコントロールを含めた全ての遺伝子に対する細胞分化評価用オリゴヌクレオチドプローブは、鎖長６５塩基の合成オリゴヌクレオチドで、融解温度（Ｔｍ）はほぼ同一であり、標的遺伝子のｍＲＮＡの３’末端側より１、５００塩基以内の領域に特異的に結合するように、専用ソフトウェアを用いて設計したものである。設計した細胞分化評価用オリゴヌクレオチドプローブの配列を表１〜表６に示した。
【００５１】
２．サンプルの調製
２−１．細胞の培養と分化
間葉系幹細胞として、破骨細胞に分化可能なＲＡＷ２６４．７細胞株、軟骨細胞に分化可能なＡＴＤＣ５細胞株、骨芽細胞に分化可能なＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞株をもちいた。
以下のi〜ｖｉの細胞を当業者により知られる方法によって培養し、ii、ｉｖ、ｖｉに関しては分化誘導を行った。
【００５２】
ｉ）ＲＡＷ２６４．７：４日培養（αＭＥＭ培地）
ii）ＲＡＷ２６４．７：ＲＡＮＫＬ  （１００  ｎｇ／ｍｌ）  ４日培養（αＭＥＭ培地）
ｉｉｉ）ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞株：７日培養（αＭＥＭ培地）
ｉｖ）ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞株：ＢＭＰ−２  （２００  ｎｇ／ｍｌ）  ７日培養（αＭＥＭ培地）
ｖ）培養マウス前軟骨細胞ＡＴＤＣ５細胞株（αＭＥＭ培地）
ｖｉ）培養マウス前軟骨細胞ＡＴＤＣ５細胞株をＩＴＳ  （インスリン・トランスフェリン・セレナイト）存在下で２週間培養（αＭＥＭ培地）
【００５３】
２−２．サンプル細胞からのｔｏｔａｌ  ＲＮＡの回収
培地を取り除き、細胞をＰＢＳで洗浄した。その後、１ウェルあたり１ｍＬのＱＩＡＺＯＬ（キアゲン社）を加え、セルスクレイパーで細胞を回収した。全量を滅菌済みの１．５ｍＬチューブに加えてヴォルテックスミキサーでよく混合した。次いで、２００μＬのクロロホルムを加えてヴォルテックスミキサーでよく混合した。その後、室温で５分間静置した。次に、１３０００ｒｐｍ、４℃で１５分間遠心分離し、水層を新しい１．５ｍＬチューブに回収した。回収した液に同量のイソプロパノールを加えてよく混合した後、室温で５分間静置した。さらに、１３０００ｒｐｍ、４℃で１５分間遠心分離し、上清を取り除いた。その後、１ｍＬの７０％エタノールを加えてよく混合した後、１３０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離し、上清を取り除いた。得られた沈殿を室温で５分間風乾させた。風乾後、沈殿にヌクレアーゼフリー水３０μＬを加えてピペッティングでよく混合した。吸光度計を用いて、２６０ｎｍにおける吸光度を測定し、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ濃度を定量した。また２１００Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ社）で電気泳動を行い、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡが分解していないかどうかを確かめた。＜結果＞
ＲＩＮ値はｉ）９．８、ｉｉ）９．８、ｉｉｉ）９．８、ｉｖ）９．９、ｖ）９．８、ｖｉ）９．１
濃度はｉ）１６０６ｎｇ／μＬ、ｉｉ）９６７ｎｇ／μＬ、ｉｉｉ）４３９ｎｇ／μＬ、ｉｖ）５１１ｎｇ／μＬ、ｖ）３０１ｎｇ／μＬ、ｖｉ）１３１２ｎｇ／μＬであった。
【００５４】
２−３．ｔｏｔａｌ  ＲＮＡからのａＲＮＡ合成
i〜ｖｉのＴｏｔａｌ  ＲＮＡを用いてＢｉｏｔｉｎ標識ａＲＮＡを調製し、これを１．で製造した細胞分化状態評価用ＤＮＡマイクロアレイにハイブリダイゼーションさせる被験試料とした。Ｂｉｏｔｉｎ標識ａＲＮＡの調製はＭｅｓｓａｇｅ  ＡｍｐＩＩ  Ｂｉｏｔｉｎ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｋｉｔ  （Ａｍｂｉｏｎ社製）を用いて、所定の方法に従って実施した。ａＲＮＡの取得量はｉ）１１６μｇ、ｉｉ）１２１．２μｇ、ｉｉｉ）１２６μｇ、ｉｖ）１３４．４μｇ、ｖ）１０５．２μｇ、ｖｉ）９５．６μｇであった。
【００５５】
３．細胞分化状態評価用ＤＮＡマイクロアレイによるアッセイ
前述のビオチン標識済みａＲＮＡ５μｇを、キットに付属の５×Ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒを用いて９４℃にて７分３０秒加熱し、断片化した。断片化したビオチン標識ａＲＮＡ溶液を、最終的な組成が０．１２Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／０．１２Ｍ  ＮａＣｌ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０となるように各種試薬を添加した。これを１５０μｌのハイブリダイゼーションサンプルとした。ハイブリダイゼーション反応は、６５℃で１６時間行った。反応後のＤＮＡマイクロアレイは、洗浄バッファー溶液（０．１２Ｍ  ＴＮＴ溶液）を用いて６５℃で２０分間の洗浄を２回行い、最後に０．１２Ｍ  ＴＮ溶液で６５℃、１０分間洗浄した。
０．１２Ｍ  ＴＮＴ溶液は以下のように調製した。
１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  １２０ｍｌ
１Ｍ  ＮａＣｌ  １２０ｍｌ
０．５％Ｔｗｅｅｎ２０  １００ｍｌ
蒸留水で  １０００ｍｌにメスアップ。
０．１２Ｍ  ＴＮ溶液は以下のように調製した。
１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  １２０ｍｌ
１Ｍ  ＮａＣｌ  １２０ｍｌ
蒸留水で１０００ｍｌにメスアップ。
【００５６】
次に、細胞分化評価用オリゴヌクレオチドプローブに結合した核酸の蛍光標識を行った。蛍光標識は、あらかじめ蒸留水によって１ｍｇ／ｍｌに溶解したＣｙ５−Ｓｔｒｅｐｔａｖｄｉｎ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を１／５００に蒸留水で希釈した溶液５ｍｌに、細胞分化状態評価用ＤＮＡマイクロアレイを室温で３０分間浸漬させることで行った。浸漬後のＤＮＡマイクロアレイは５ｍｌの０．１２Ｍ  ＴＮＴ溶液によって５分間、４回洗浄に供した。
Ｃｙ５標識後の細胞分化状態評価用ＤＮＡマイクロアレイは、検出器（型番ＭＢ−Ｖ１  横河電機社製）を用い、０秒から４０秒の複数の露光時間で蛍光を検出し、スポットそれぞれにおいて、当該スポット中に飽和画素を含まない画像のうち、最長の露光時間の画像を用い、単位時間あたりに換算した蛍光シグナル強度として数値化した。数値化したデータを収集し、引き続きデータ解析を実施した。
【００５７】
４．発現解析データの取得とチップ間データの補正
以下のようにして解析を実施した。
【００５８】
（１）検出した蛍光強度の生データからブランクスポット（プローブを搭載していないスポット）の中央値を差し引き、シグナル強度とした。またブランクスポットの標準偏差を算出した。
（２）内部コントロール遺伝子を表４記載の１１４番の遺伝子：Ｒｐｌｐ０とした。比較するチップ間でＲｐｌｐ０のシグナル強度が最大のチップを選択し、チップ間でのＲｐｌｐ０のシグナル強度比を算出してチップ間の補正係数とした。各チップのスポットのシグナル強度に補正係数を乗算しシグナル強度の補正を行った。
５．分化識別遺伝子群の選択
補正後のデータを用いて、コントロール遺伝子（Ｒｐｌｐ０）を除いた遺伝子について、遺伝子ごとにｉ）〜ｖｉ）のサンプルの発現量を比較し、破骨細胞の遺伝子マーカーとしてｉｉ）のサンプルで最も発現量が大きい遺伝子、骨芽細胞の遺伝子マーカーとしてｉｖ）のサンプルで最も発現量が大きい遺伝子、軟骨細胞のマーカーとしてｖｉ）のサンプルで最も発現量が大きい遺伝子をリストアップした。
さらにリストアップした遺伝子を発現量の大きい順番に並べなおした。これを表７〜表９に示した。
破骨細胞マーカー候補
【００５９】
【表７】
2014230493.tif 000008
【００６０】
骨芽細胞マーカー候補
【００６１】
【表８】
2014230493.tif 000009
【００６２】
軟骨細胞マーカー候補
【００６３】
【表９】
2014230493.tif 000010
表７〜表９中の各グループの中で発現量の高いものから上位１２遺伝子を、各細胞の分化識別用分別マーカーとして設定した。
【００６４】
＜破骨細胞の分別マーカー＞
Ａｃｐ５、Ａｃｔｂ、Ｃｔｓｋ、Ｃｓｆ１ｒ、Ｉｔｇａｖ、Ｍｍｐ９、Ｓｆｐｉ１、Ｆｏｓｌ２、Ｔｇｆｂｒ１、Ｔｍ７ｓｆ４、Ｆｏｓ、Ｐｄｇｆｂ
＜骨芽細胞の分別マーカー＞
Ｓｐａｒｃ、Ｂｇｎ、Ｃｏｌ１ａ１、Ｐｏｓｔｎ、Ｉｂｓｐ、Ａｌｐｌ、Ｍｍｐ１４、Ｂｇｌａｐ、Ｃｏｌ６ａ１、Ｇｊａ１、Ｃｔｎｎｂ１、Ｃｏｌ３ａ１
＜軟骨細胞の分別マーカー＞
Ｆｎ１、Ｃｏｌ１０ａ１、Ｒｈｏａ、Ｂｍｐ４、Ｃｂｆｂ、Ｓｄｃ３、Ｐｔｈ１ｒ、Ａｄｉｐｏｒ１、Ｖｅｇｆａ、Ｃｏｌ２ａ１、Ｃｙｐ２７ｂ１、Ｔｎｆｒｓｆ１１ｂ
【００６５】
６．細胞での識別評価
上述の分別マーカーを用いて識別評価を行った。
＜モデルサンプル＞
・骨芽細胞に分化しているモデルサンプル
マウス初代培養骨芽細胞を７日間、ＢＭＰ−２（２００  ｎｇ／ｍｌ）存在下で培養した細胞
・破骨細胞に分化しているモデルサンプル
マウス骨髄細胞をＭ−ＣＳＦ（５０  ｎｇ／ｍｌ）、  ＴＧＦ−ｂ（１  ｎｇ／ｍｌ）、  ＲＡＮＫＬ  （５０  ｎｇ／ｍｌ）存在下で４日間培養した細胞
・軟骨細胞に分化しているモデルサンプル
摘出したマウス肋軟骨細胞を摘出し、そのまま維持培養した細胞
２−２記載の方法と同様にＴｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出し、細胞分化状態評価用ＤＮＡマイクロアレイにハイブリダイズして検出し、バックグラウンドを減算した後、チップ間補正し、各サンプルの発現量を取得した。その後、この発現量の値をもとに各遺伝子の発現量の合計値を算出した（表１０）。
その結果、骨芽細胞モデルサンプルは骨芽細胞に識別され、破骨細胞モデルサンプルは破骨細胞に識別され、軟骨細胞モデルサンプルは軟骨細胞に識別された。
従来技術では、例えば３種類（骨芽細胞識別用、破骨細胞識別用及び軟骨細胞識別用）の識別を行う実験を行わなければならなかったが、本発明では一度の実験により、３種類共に簡便に分化を識別できることが示された。
【００６６】
マーカー合計値からの識別結果
【００６７】
【表１０】
2014230493.tif 000011
【配列表フリーテキスト】
【００６８】
配列番号１〜２０３：合成ＤＮＡ
【配列表】
2014230493000001.app