(57)【要約】【課題】アキノノゲシ抽出物の新たな用途への使用を提供する。【解決手段】アキノノゲシ抽出物を有効成分とすることを特徴とするテストステロン５α−レダクターゼ阻害剤、ＶＥＧＦ発現促進剤、ＡＳＩＰ発現阻害剤、ＣＳＦ２発現促進剤及び育毛促進剤、並びに、アキノノゲシ抽出物を含有することを特徴とする毛髪につやを付与する組成物、毛髪にはりを付与する組成物、毛髪にコシを付与する組成物、毛髪をしなやかにする組成物及び毛髪の水分を保持する組成物である。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
アキノノゲシ抽出物を有効成分とすることを特徴とするテストステロン５α−レダクターゼ阻害剤。
【請求項２】
アキノノゲシ抽出物を有効成分とすることを特徴とするＶＥＧＦ発現促進剤。
【請求項３】
アキノノゲシ抽出物を有効成分とすることを特徴とするＡＳＩＰ発現阻害剤。
【請求項４】
アキノノゲシ抽出物を有効成分とすることを特徴とするＣＳＦ２発現促進剤。
【請求項５】
アキノノゲシ抽出物を有効成分とすることを特徴とする育毛促進剤。
【請求項６】
アキノノゲシ抽出物を含有することを特徴とする毛髪につやを付与する組成物。
【請求項７】
アキノノゲシ抽出物を含有することを特徴とする毛髪にはりを付与する組成物。
【請求項８】
アキノノゲシ抽出物を含有することを特徴とする毛髪にコシを付与する組成物。
【請求項９】
アキノノゲシ抽出物を含有することを特徴とする毛髪をしなやかにする組成物。
【請求項１０】
アキノノゲシ抽出物を含有することを特徴とする毛髪の水分を保持する組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アキノノゲシ抽出物の新規な用途に関し、特にはアキノノゲシ抽出物を有効成分とすることを特徴とするテストステロン５α−レダクターゼ阻害剤、ＶＥＧＦ発現促進剤、ＡＳＩＰ発現阻害剤、ＣＳＦ２発現促進剤及び育毛促進剤、並びに、アキノノゲシ抽出物を含有することを特徴とする毛髪につやを付与する組成物、毛髪にはりを付与する組成物、毛髪にコシを付与する組成物、毛髪をしなやかにする組成物及び毛髪の水分を保持する組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
毛髪は、成長期、退行期及び休止期から成る毛周期と呼ばれるヘアサイクルを繰り返している。そして、上記サイクルでは様々な細胞が作用しているが、該サイクルを制御する上で最も重要な役割を果たしているのが毛乳頭細胞である。毛乳頭細胞は、毛母細胞やその周囲に存在する細胞に対し、例えば毛髪を成長させたり、毛髪の成長を止めたりするような指令を出している。
【０００３】
このうち、毛乳頭細胞が、毛髪の成長を止めたり、毛髪を抜け落としたりする指令を出す場合、テストステロン５α−レダクターゼ（又は単に５α−レダクターゼと称する）を作用させることがある。５α−レダクターゼは、不活性型の男性ホルモン「テストステロン」を活性型の「ジヒドロテストステロン（ＤＨＴ）」に変換させる作用を有しており、５α−レダクターゼによって変換されたＤＨＴは、毛母細胞の分化（毛髪の成長）を阻害するため、毛根を萎縮させ、脱毛を促進させる。
【０００４】
なお、５α−レダクターゼには１型と２型の２種類があり、５α−レダクターゼ１型は、側頭部及び後頭部に多く存在している。一方、５α−レダクターゼ２型は、前頭部及び頭頂部に多く存在するため、この５α−レダクターゼ２型が、男性型脱毛症（ＡＧＡ）の主な原因ともなっている。これまで、５α−レダクターゼ２型の酵素活性を阻害する物質としてフィナステリドが知られており、ＡＧＡの治療薬として使用されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
このような状況下、本発明の目的は、５α−レダクターゼ２型（ＳＲＤ５Ａ２）の発現を阻害することができる新規のテストステロン５α−レダクターゼ阻害剤を提供することにある。また、本発明の他の目的は、アキノノゲシ抽出物の新たな用途への使用を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、上記目的を達成するために鋭意検討した結果、テストステロン５α−レダクターゼ阻害剤にアキノノゲシ抽出物を含有させることによって、５α−レダクターゼ２型の発現を阻害することができることを見出し、本発明を完成させるに至った。また、本発明者は、更に検討した結果、アキノノゲシ抽出物が育毛促進作用等の様々な作用を示すことも見出した。
【０００７】
即ち、本発明のテストステロン５α−レダクターゼ阻害剤は、アキノノゲシ抽出物を有効成分とすることを特徴とする。
【０００８】
また、本発明のＶＥＧＦ発現促進剤、ＡＳＩＰ発現阻害剤、ＣＳＦ２発現促進剤及び育毛促進剤は、アキノノゲシ抽出物を有効成分とすることを特徴とし、更に、本発明の毛髪につやを付与する組成物、毛髪にはりを付与する組成物、毛髪にコシを付与する組成物、毛髪をしなやかにする組成物及び毛髪の水分を保持する組成物は、アキノノゲシ抽出物を含有することを特徴とする。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のテストステロン５α−レダクターゼ阻害剤によれば、アキノノゲシ抽出物を有効成分とすることによって、５α−レダクターゼ２型の発現を阻害することができるテストステロン５α−レダクターゼ阻害剤を提供することができる。
【００１０】
また、アキノノゲシ抽出物を有効成分とすることによって、ＶＥＧＦの発現を促進することができるＶＥＧＦ発現促進剤、ＡＳＩＰの発現を阻害することができるＡＳＩＰ発現阻害剤、ＣＳＦ２の発現を促進することができるＣＳＦ２発現促進剤及び育毛促進作用に優れる育毛促進剤を提供することができる。
【００１１】
更に、アキノノゲシ抽出物を含有させることによって、毛髪につや・はり・コシを付与し、毛髪をしなやかにし、毛髪の水分を保持することもできる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】育毛スコア評価の結果を示す図である。＊＊はｐ＜０．０１を示し、＊はｐ＜０．０５を示し、これらの場合、コントロール群と比較して有意差がある（Ｗｉｌｃｏｘｏｎの順位和検定）。
【図２】コントロール群に属するマウス背部の試験０日目の写真である。
【図３】コントロール群に属するマウス背部の試験２９日目の写真である。
【図４】アキノノゲシ抽出物０．３％群に属するマウス背部の試験０日目の写真である。
【図５】アキノノゲシ抽出物０．３％群に属するマウス背部の試験２９日目の写真である。
【図６】アキノノゲシ抽出物３％群に属するマウス背部の試験０日目の写真である。
【図７】アキノノゲシ抽出物３％群に属するマウス背部の試験２９日目の写真である。
【図８】毛乳頭細胞におけるＣＳＦ２の相対的発現量を示す図である。(ｎ＝３，ｍｅａｎ±Ｓ.Ｄ.  ＊：ｐ＜０．０５）
【図９】毛乳頭細胞におけるＳＲＤ５Ａ２の相対的発現量を示す図である。(ｎ＝３，ｍｅａｎ±Ｓ.Ｄ.  ＊：ｐ＜０．０５）
【図１０】毛乳頭細胞におけるＡＳＩＰの相対的発現量を示す図である。(ｎ＝３，ｍｅａｎ±Ｓ.Ｄ.  ＊：ｐ＜０．０５）
【図１１】毛乳頭細胞におけるＶＥＧＦの相対的発現量を示す図である。(ｎ＝３，ｍｅａｎ±Ｓ.Ｄ.  ＊：ｐ＜０．０５）
【発明を実施するための形態】
【００１３】
＜本発明のテストステロン５α−レダクターゼ阻害剤＞
以下に、本発明を詳細に説明する。本発明のテストステロン５α−レダクターゼ阻害剤は、アキノノゲシ抽出物を有効成分とすることを特徴とし、５α−レダクターゼ２型の発現を阻害することができる。
【００１４】
本発明のテストステロン５α−レダクターゼ阻害剤において、アキノノゲシ抽出物は、５α−レダクターゼ２型の発現を阻害できると共に、コロニー刺激因子２（ＣＳＦ２）の発現を促進することができる。コロニー刺激因子２（ＣＳＦ２）は、顆粒球単球コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）としても知られ、造血幹細胞から好中球等の白血球への分化を促進するサイトカインの一種である。そして、ＣＳＦ２は、皮膚において表皮角化細胞から分泌され、メラノサイトを刺激し、メラニンの合成を促進する。従って、本発明のテストステロン５α−レダクターゼ阻害剤がアキノノゲシ抽出物を有効成分とする場合、脱毛症を予防又は治療しつつ、白髪の発生を抑えることができる。
【００１５】
アキノノゲシ（Lactuca indica）は、キク科アキノノゲシ属の植物であり、本発明において、アキノノゲシ抽出物は、アキノノゲシの全草から調製できるため、アキノノゲシの抽出部位としては、例えば、全草、葉、茎、根、花、種子等が用いられる。
【００１６】
上記アキノノゲシ抽出物は、通常、アキノノゲシの抽出部位を水及び／又は有機溶媒で抽出して得られる。ここで、アキノノゲシの抽出部位の形態としては、例えば、切り取ったままの生のもの、それを細かく切ったもの、乾燥させたもの、乾燥させて細かく切ったり粉砕したもの等が用いられるが、これらに限定されるものではなく本発明の効果を損なわない範囲でその他の形態のものも用いることができる。また、水を用いる場合には温水、または熱水が好ましい。一方、抽出に用いる有機溶媒としては、例えば、エタノール、メタノール、イソプロパノール、１，３−ブチレングリコール等のアルコール、ヘキサン、ヘプタン、シクロヘキサン等の炭化水素、酢酸エチル等のエステル、アセトン等のケトン等が挙げられる。これらの抽出溶媒は、単独で用いてもよいし、組み合わせて用いてもよい。特に、エタノール、メタノール又はこれらの混合溶媒が好ましい。なお、アキノノゲシ抽出部位（Ａ）と抽出溶媒（Ｂ）の質量比（Ａ／Ｂ）は、特に限定されるものではないが、１／５〜１／５０の範囲が好ましい。
【００１７】
また、アキノノゲシからの抽出には、アキノノゲシの抽出部位を抽出溶媒に浸漬させる手段やアキノノゲシの抽出部位を抽出溶媒と共に加熱還流する手段等が用いられる。抽出温度については、特に限定されず、通常常温（約１５〜２５℃）から常圧下での溶媒の沸点までの範囲で行われる。なお、抽出時間については、特に限定されず任意の時間で行われるが、１〜７２時間の範囲であることが好ましく、１２〜４８時間の範囲であることが更に好ましく、１５〜３６時間の範囲であることが一層好ましく、１８〜３０時間の範囲であることが特に好ましい。溶媒で抽出した後は、抽出液から抽出残査等の固形物をろ過、遠心分離等の方法で除去し、その後、抽出溶媒を除去することにより抽出物が得られる。
【００１８】
本発明のテストステロン５α−レダクターゼ阻害剤において、上記アキノノゲシ抽出物の含有量は、ＳＲＤ５Ａ２の発現を阻害し且つＣＳＦ２の発現を促進する作用を発揮させる観点から、０．０１〜５００質量ｐｐｍであることが好ましい。なお、本発明において、アキノノゲシ抽出物の含有量は、アキノノゲシからの抽出物を凍結乾燥又は減圧濃縮乾燥した乾燥物の質量を基準にして求められる。
【００１９】
なお、本発明のテストステロン５α−レダクターゼ阻害剤は、５α−レダクターゼ２型の発現を阻害できるため、男性型脱毛症の予防又は治療に有用であるが、コロニー刺激因子２（ＣＳＦ２）の発現を促進できるため、抗白髪剤としても使用できる。また、本発明のテストステロン５α−レダクターゼ阻害剤は、座瘡、前立腺肥大症等の男性ホルモンが関与する疾患の予防又は治療にも有用である。
【００２０】
＜本発明のＣＳＦ２促進剤＞
本発明のＣＳＦ２（コロニー刺激因子２）発現促進剤は、アキノノゲシ抽出物を有効成分とすることを特徴とする。上述したように、アキノノゲシ抽出物は、コロニー刺激因子２（ＣＳＦ２）の発現を促進できるため、ＣＳＦ２（コロニー刺激因子２）発現促進剤への使用に好適である。なお、本発明のＣＳＦ２促進剤に用いるアキノノゲシ抽出物は、本発明のテストステロン５α−レダクターゼ阻害剤において説明したものと同一である。
本発明のＣＳＦ２発現促進剤において、上記アキノノゲシ抽出物の含有量は、ＣＳＦ２の発現を促進する作用を発揮させる観点から、１０〜５０μｇ／ｍｌであることが好ましい。
【００２１】
＜本発明のＶＥＧＦ発現促進剤＞
本発明のＶＥＧＦ発現促進剤は、アキノノゲシ抽出物を有効成分とすることを特徴とする。本発明者は、アキノノゲシ抽出物がＶＥＧＦ発現促進作用を示すことを見出した。よって、アキノノゲシ抽出物はＶＥＧＦ発現促進剤への使用に好適である。なお、本発明のＶＥＧＦ発現促進剤に用いるアキノノゲシ抽出物は、本発明のテストステロン５α−レダクターゼ阻害剤において説明したものと同一である。
なお、ＶＥＧＦとは、血管内皮細胞増殖因子（Ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）である。
本発明のＶＥＧＦ発現促進剤において、上記アキノノゲシ抽出物の含有量は、ＶＥＧＦの発現を促進する作用を発揮させる観点から、１０〜５０μｇ／ｍｌであることが好ましい。
【００２２】
＜本発明のＡＳＩＰ発現阻害剤＞
本発明のＡＳＩＰ発現阻害剤は、アキノノゲシ抽出物を有効成分とすることを特徴とする。本発明者は、アキノノゲシ抽出物がＡＳＩＰ発現阻害作用を示すことを見出した。よって、アキノノゲシ抽出物はＡＳＩＰ発現阻害剤への使用に好適である。なお、本発明のＡＳＩＰ発現阻害剤に用いるアキノノゲシ抽出物は、本発明のテストステロン５α−レダクターゼ阻害剤において説明したものと同一である。
なお、ＡＳＩＰとは、アグチシグナルタンパク質（ａｇｏｕｔｉ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）であり、毛包で作られるパラクリンシグナル分子である。毛包のメラノサイトでユーメラニンと拮抗してフェオメラニンを合成する。
本発明のＡＳＩＰ発現阻害剤において、上記アキノノゲシ抽出物の含有量は、ＡＳＩＰの発現を阻害する作用を発揮させる観点から、０．４〜５０μｇ／ｍｌであることが好ましい。
【００２３】
＜本発明の育毛促進剤＞
本発明の育毛促進剤は、アキノノゲシ抽出物を有効成分とすることを特徴とする。本発明者は、アキノノゲシ抽出物が育毛促進作用を示すことを見出した。よって、アキノノゲシ抽出物は育毛促進剤への使用に好適である。なお、本発明の育毛促進剤に用いるアキノノゲシ抽出物は、本発明のテストステロン５α−レダクターゼ阻害剤において説明したものと同一である。
本発明の育毛促進剤において、上記アキノノゲシ抽出物の含有量は、育毛促進作用を向上させる観点から、０．０００１質量％以上含有していれば良く、０．０００１〜１０質量％であることが好ましく、０．０００５〜８質量％であることがより好ましく、０．０００５〜５質量％であることが特に好ましい。
【００２４】
＜本発明の毛髪につやを付与する組成物、毛髪にはりを付与する組成物、毛髪にコシを付与する組成物、毛髪をしなやかにする組成物及び毛髪の水分を保持する組成物＞
本発明の毛髪につやを付与する組成物、毛髪にはりを付与する組成物、毛髪にコシを付与する組成物、毛髪をしなやかにする組成物及び毛髪の水分を保持する組成物は、アキノノゲシ抽出物を含有することを特徴とし、好ましくはアキノノゲシ抽出物を有効成分とする。本発明者は、アキノノゲシ抽出物を含有することによって、毛髪につや・はり・コシを付与し、毛髪をしなやかにし、毛髪の水分を保持することができることを見出した。よって、アキノノゲシ抽出物はこれらの効果を目的とする組成物への使用に好適である。なお、これら組成物に用いるアキノノゲシ抽出物は、本発明のテストステロン５α−レダクターゼ阻害剤において説明したものと同一である。
これら組成物中におけるアキノノゲシ抽出物の含有量は、０．０００１質量％以上含有していれば良く、０．０００１〜１０質量％であることが好ましく、０．０００５〜８質量％であることがより好ましく、０．０００５〜５質量％であることが特に好ましい。
【００２５】
本発明のテストステロン５α−レダクターゼ阻害剤、ＶＥＧＦ発現促進剤、ＡＳＩＰ発現阻害剤、ＣＳＦ２発現促進剤、育毛促進剤、毛髪につやを付与する組成物、毛髪にはりを付与する組成物、毛髪にコシを付与する組成物、毛髪をしなやかにする組成物及び毛髪の水分を保持する組成物には、アキノノゲシ抽出物の他、食品、化粧品及び医薬品業界で通常使用される配合剤、例えば、賦形剤、防湿剤、防腐剤、強化剤、増粘剤、乳化剤、酸化防止剤、甘味料、酸味料、調味料、着色料、香料、美白剤、保湿剤、油性成分、紫外線吸収剤、界面活性剤、アルコール類、粉末成分、色剤、水性成分、水、各種皮膚栄養剤等を目的に応じて適宜配合することができる。これら配合剤としては、市販品を好適に使用することができる。
【００２６】
本発明のテストステロン５α−レダクターゼ阻害剤、ＶＥＧＦ発現促進剤、ＡＳＩＰ発現阻害剤、ＣＳＦ２発現促進剤、育毛促進剤、毛髪につやを付与する組成物、毛髪にはりを付与する組成物、毛髪にコシを付与する組成物、毛髪をしなやかにする組成物及び毛髪の水分を保持する組成物は、アキノノゲシ抽出物と、必要に応じて適宜選択した各種配合剤とを混合することにより調製できる。
【００２７】
本発明のテストステロン５α−レダクターゼ阻害剤、ＶＥＧＦ発現促進剤、ＡＳＩＰ発現阻害剤、ＣＳＦ２発現促進剤、育毛促進剤、毛髪につやを付与する組成物、毛髪にはりを付与する組成物、毛髪にコシを付与する組成物、毛髪をしなやかにする組成物及び毛髪の水分を保持する組成物は、溶液、分散液、乳液、軟膏、クリーム、ゲル、エアゾール、パック等の皮膚外用剤の形態で使用されることが好ましく、頭皮外用剤の形態で使用されることが特に好ましい。また、これらはシャンプーやリンス等の頭髪化粧品としても好適に使用できる。
【００２８】
また、上述のようなアキノノゲシ抽出物の作用から、医薬部外品としての様々な用途が期待され、特に、育毛や、薄毛及び脱毛（例えば病後・産後の脱毛）の予防、毛生促進、発毛促毛、養毛等の効能効果が期待できる。
【実施例】
【００２９】
以下に、実施例を挙げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明は下記の実施例に何ら限定されるものではない。
【００３０】
＜＜毛乳頭細胞の賦活活性及び毛乳頭細胞内における遺伝子発現量の変化＞＞
１．材料、サンプル調製及び試験方法
１−１．被験物質
株式会社坂本バイオ社製アキノノゲシ抽出物を用いた。なお、該アキノノゲシ抽出物は、中国産アキノノゲシ全草の乾燥原体１２．６ｋｇを１０倍の質量の９９％エタノールを用いて常温で２４時間抽出し、その後、ろ過及び濃縮を行うことにより調製されたものである（収量：０．２２ｋｇ）。
【００３１】
１−２．細胞
東洋紡株式会社より入手したＣＥＬＬ  ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮ社製ヒト毛乳頭細胞（ＨＦＤＰＣ，カタログＮｏ．６０２−０５ａ，ロットＮｏ．１７１０，白人４０歳女性由来）を使用した。
【００３２】
１−３．試薬及び器具等
（ｉ）毛乳頭細胞増殖培地（以下、ＰＣＧＭと略す）（東洋紡社製）
（ｉｉ）リン酸緩衝生理食塩水（以下、ＰＢＳと略す）（Ｓｉｇｍａ社製）
（ｉｉｉ）トリプシンＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ社製）
（ｉｖ）コラーゲンコート溶液（東洋紡社製）
（ｖ）ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）
（ｖｉ）３７℃ＣＯ２インキュベーター（ＥＳＰＥＣ社製）
（ｖｉｉ）プレートリーダー（ＶＡＲＩＯＳＫＡＮ，Ｔｈｅｒｍｏ  ｅｌｅｃｔｒｏｎ社製）
（ｖｉｉｉ）７５ｃｍ２培養フラスコ（以下、Ｔ７５フラスコと称す）（ＩＷＡＫＩ社製）
（ｉｘ）６ウェル培養プレート（ＩＷＡＫＩ社製）
（ｘ）９６ウェル培養プレート（ＩＷＡＫＩ社製）
（ｘｉ）顕微鏡（ＯＬＹＭＰＵＳ社製，ＩＸ−７０）
【００３３】
１−４．サンプル調製
ＰＣＧＭにアキノノゲシ抽出物（被験物質）を１０ｍｇ/ｍＬとなるように懸濁させ、その後、０．２μｍフィルターで処理し、ＰＣＧＭで段階希釈して試験に供した。
【００３４】
１−５．試験方法
１−５−１．細胞の準備
（ｉ）Ｔ７５フラスコ、６ウェル培養プレート、９６ウェル培養プレートにコラーゲンコート溶液をそれぞれ１ｍｌ、０．５ｍｌ、５０μｌ入れ、２時間静置させた。
（ｉｉ）コラーゲンコート溶液を除去し、ＰＢＳで２回洗浄し、上記フラスコ及びプレートを密封した後、使用するまで冷蔵庫で保管した。
（ｉｉｉ）コラーゲンコートしたＴ７５フラスコに、ＨＦＤＰＣ（Ｐ５）を播種し、これを３７℃の５％ＣＯ２インキュベーター内で４日間培養した。
（ｉｖ）上記Ｔ７５フラスコをＰＢＳで洗浄した後、ＨＦＤＰＣをトリプシン処理により浮遊させ、１．２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞懸濁液を作製し、次いで、コラーゲンコートした６ウェル培養プレート、９６ウェル培養プレートに、該細胞懸濁液をそれぞれ１ｍｌ、０．１ｍｌ入れ、３７℃の５％ＣＯ２インキュベーター内で一晩培養した。
【００３５】
１−５−２．細胞賦活活性の測定
（ｉ）上記「１−５−１．細胞の準備」に従い、９６ウェル培養プレートで培養されたＨＦＤＰＣの培地を除去し、その後、ＰＢＳで２回洗浄した。
（ｉｉ）上記「１−４．サンプル調製」に従い調製されたアキノノゲシ抽出物の濃度が３００、１００、３３、１１、３．７μｇ／ｍｌであるサンプルを９６ウェル培養プレート中のＨＦＤＰＣに添加した。
（ｉｉｉ）２４時間の培養後、９６ウェル培養プレートをＰＢＳで２回洗浄した。
（ｉｖ）無血清ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）（シグマアルドリッチ社製）で３０倍の体積に希釈したＣｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８溶液（同仁化学研究所社製）を９６ウェル培養プレートに１００μｌ／ウェル添加した。
（ｖ）３７℃の５％ＣＯ２インキュベーター内に静置させ、適度に発色させた後、４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。
（ｖｉ）得られたデータを基に、下記式に従い、コントロールに対する割合（％コントロール）を算出した。
％コントロール＝［（データサンプル−データブランク）／（データコントロール−データブランク）］×１００
【００３６】
１−５−３．細胞の回収、ＲＮＡの抽出
（ｉ）上記「１−５−１．細胞の準備」に従い、６ウェル培養プレートで培養された毛乳頭細胞をＰＢＳで２回洗浄し、上記「１−４．サンプル調製」に従い調製されたアキノノゲシ抽出物の濃度が３．７μｇ／ｍｌであるサンプルを６ウェル培養プレートに添加し、２４時間培養した。
（ｉｉ）培養後、６ウェル培養プレートを氷冷したＰＢＳで２回洗浄し、その後、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔに付属の細胞溶解バッファーを加えた。次いで、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔの説明書に従い、ＲＮＡの抽出を行った。
（ｉｉｉ）抽出後、速やかに液体窒素に浸けて凍結させ、ディープフリーザーにて保管した。
【００３７】
１−５−４．マイクロアレイ
ミルテニーバイオテク社でマイクロアレイ解析を行った。
【００３８】
１−６．結果の解析
マイクロアレイ解析の結果から、毛乳頭細胞で発現している遺伝子を抽出し、その遺伝子の発現量の変化を検討した。
【００３９】
２．結果及び考察
２−１．細胞賦活作用
マイクロアレイ解析を行う際のアキノノゲシ抽出物の濃度を決定するため、様々な濃度のアキノノゲシ抽出物による毛乳頭細胞の賦活活性を調べた。各濃度のアキノノゲシ抽出物を含有するサンプルを添加した際の毛乳頭細胞の賦活活性を表１に示す。細胞賦活活性の最も大きい濃度が３．７μｇ／ｍｌであったため、マイクロアレイ解析での濃度を３．７μｇ／ｍｌにした。
【００４０】
【表１】
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【００４１】
２−２．マイクロアレイ解析
マイクロアレイの結果より、アキノノゲシ抽出物により処理された毛乳頭細胞内における遺伝子の発現量の変化を解析したところ、アキノノゲシ抽出物により処理された毛乳頭細胞では、ＳＲＤ５Ａ２の倍率変化（フォールド・チェンジ）が−３．４８を示しており、ＳＲＤ５Ａ２の発現量を低減することが分かった。また、ＣＳＦ２の倍率変化は、２．７４を示しており、アキノノゲシ抽出物により処理された毛乳頭細胞では、ＣＳＦ２の発現量が増加することが分かった。
【００４２】
（参考文献）
１．Stenn K. S. and Paus R, Control of hair follicle cycling, 2001, Physiol. Rev.,81, 449-494.（毛周期の総説に関する文献）
２．板見智, 男性型脱毛の発症メカニズムと治療戦略, 2004, 炎症・再生, 24, 118-120（男性型脱毛症の総説に関する文献）
３．Costin G. E. & Hearing V.J., Human skin pigmentation melanocytes modulate skin color in response to stress. 2007, FASEB J., 21, 976-994.（メラニン合成の総説に関する文献）
【００４３】
＜＜マウス被毛に対するアキノノゲシ抽出物の育毛促進作用の評価＞＞
１．被験物質
株式会社坂本バイオ社製アキノノゲシ抽出物を用いた。なお、該アキノノゲシ抽出物は、中国産アキノノゲシ全草の乾燥原体１２．６ｋｇを１０倍の質量の９９％エタノールを用いて常温で２４時間抽出し、その後、ろ過及び濃縮を行うことにより調製されたものである（収量：０．２２ｋｇ）。
【００４４】
２．試験内容
１）実験動物
（１）供与動物
日本エスエルシー株式会社において生産された雄性マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系）を用いた。
（２）入手時週齢及び動物数
７週齢の雄性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系マウスを２５匹入荷した。
（３）試験開始時週齢
８週齢
【００４５】
２）動物飼育管理
（１）飼育方法
（ｉ）飼育環境
馴化期間
飼育期間：６日間
照明時間：１２時間（８：００〜２０：００）
ケージ：ポリカーボネイト製平底ケージ（Ｗ１８２×Ｄ２６０×Ｈ１２８ｍｍ）
床敷：木材チップ
収容：１ケージに２〜３匹収容した。
試験期間
飼育期間：３０日間
照明時間：１２時間（８：００〜２０：００）
ケージ：ポリカーボネイト製平底ケージ（Ｗ１８２×Ｄ２６０×Ｈ１２８ｍｍ）
床敷：木材チップ
収容：１ケージに２〜３匹収容した。
（ｉｉ）動物の群分け
馴化期間終了後、健常な動物を体重がほぼ均一となるように各群に分け、試験に供した。
（２）飼料
馴化期間開始から試験期間終了まで、ＭＦ固形飼料（オリエンタル酵母工業株式会社）を自由に摂取させた。
（３）飲水
飲水は水道水を用いた。馴化期間開始から試験期間終了まで自由に摂取させた。
【００４６】
３）試験概要
馴化期間終了後の雄性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系マウスを体重値に基づいて群分けした。マウス背面全体の毛をバリカン及びシェイバーを用いて除毛し、その翌日から除毛した背部に被験物質を２９日間塗布した。
【００４７】
４）被験物質の投与方法
（１）投与経路
経皮（塗布）
（２）群構成
【表２】
2014185148.tif 000004
【００４８】
５）被験物質懸濁液の調製方法及び投与方法
（１）被験物質懸濁液の調製方法
７０体積％エタノールを溶媒として用いた。始めに純エタノールに溶解させた後に蒸留水を加え、よく混合し、表２に示される被験物質懸濁液を調製した。
（２）被験物質懸濁液の投与方法
マウス背面に除毛処理を施し、皮膚を露出させた部位にマイクロピペットを用いて被験物質懸濁液を２００μＬ滴下した。ミクロスパーテルを用いて塗布した。
【００４９】
６）マウス背部の除毛方法
ジエチルエーテル麻酔下でバリカン及びシェイバーを用いて背部全体を除毛した。
【００５０】
７）検査方法
（１）体重
動物用電子天秤にて、動物入荷日及び試験開始日（群分け時）に体重を測定した。
（２）育毛スコア評価（目視・写真判定）
試験開始日（０日目）、試験開始後８日目、１５日目、２２日目及び２９日目に、被験物質懸濁液塗布前のマウス背部全体を写真撮影した。写真を用いてマウス背部を観察し、育毛状態（生えている面積）を目視により確認し、下表に基づいて６段階で評価した。評価は客観性を持たせるために３人のスコアの平均を最終評価とした。
【表３】
2014185148.tif 000005
【００５１】
３．統計処理
得られた数値は、各群で平均値を算出した。また、コントロール群と他の群との２群間について、Ｍａｎｎ−ＷｈｉｔｎｙのＵ検定（Ｗｉｌｃｏｘｏｎの順位和検定）を行った。有意水準は、危険率５％及び１％とした。
【００５２】
４．結果
育毛スコア評価の結果を図１に示す。また、各群に属するマウスに関して、試験０週目（０日目）及び試験４週目（２９日目）の背部の写真を図２〜７に示す。
アキノノゲシ抽出物３％群においては、試験２週目（１５日目）、試験３週目（２２日目）及び試験４週目（２９日目）の育毛スコアが、コントロール群と比較して有意に高い値を示した。
結果から、アキノノゲシ抽出物による育毛促進作用が示唆された。
【００５３】
＜＜アキノノゲシ抽出物が育毛・抗白髪関連遺伝子に及ぼす影響＞＞
１．アキノノゲシ抽出物
上述した「毛乳頭細胞の賦活活性及び毛乳頭細胞内における遺伝子発現量の変化」の「１−１．被験物質」に記載されるアキノノゲシ抽出物を用いた。
【００５４】
２．細胞
上述した「毛乳頭細胞の賦活活性及び毛乳頭細胞内における遺伝子発現量の変化」の「１−２．細胞」に記載されるヒト毛乳頭細胞を用いた。
【００５５】
３．試薬及び器具等
上述した「毛乳頭細胞の賦活活性及び毛乳頭細胞内における遺伝子発現量の変化」の「１−３．試薬及び器具等」に記載される試薬及び器具等を用いた。
【００５６】
４．被験物質調製
アキノノゲシ抽出物を１０ｍｇ／ｍＬとなるようにジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中に溶解し、これをＰＣＧＭで２００倍に希釈し、ＤＭＳＯ濃度０．５体積％及びアキノノゲシ抽出物濃度５０μｇ／ｍＬの被験物質を調製した。同様に、アキノノゲシ抽出物の濃度が１０、２、０．４μｇ／ｍＬである被験物質（ＤＭＳＯ濃度０．５体積％）も調製した。
【００５７】
５．試験方法
５−１．細胞培養
（ｉ）７５ｃｍ２フラスコに７．５ｍＬのコラーゲンコート溶液を入れ、フラスコ培養面全体に該溶液が広がるようにフラスコを静かに揺らした。
（ｉｉ）室温で約１時間静置後、コラーゲンコート溶液を吸引除去し、７．５ｍＬのＰＢＳで２回洗浄を行った。
（ｉｉｉ）３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で、コラーゲンコートした７５ｃｍ２フラスコを用いて、ＨＦＤＰＣをＰＣＧＭにより培養した。
（ｉｖ）トリプシン処理により浮遊させた細胞を、フラスコと同様にコラーゲンコート（コラーゲンコート溶液１ｍＬ／ｗｅｌｌ、ＰＢＳ洗浄１ｍＬ／ｗｅｌｌ）した６ウェルプレートの各ウェルに１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように播種した。
（ｖ）ＣＯ２インキュベーター内で２４時間前培養した。
（ｖｉ）各ウェルより培地を除去した後、アキノノゲシ抽出物の濃度が０．４、２、１０、５０μｇ／ｍＬである被験物質を２ｍＬ添加し、ＣＯ２インキュベーター内で２４時間培養した（Ｎ＝３）。なお、コントロールには、アキノノゲシ抽出物を含有しない０．５体積％ＤＭＳＯ含有ＰＣＧＭを添加した。
【００５８】
５−２．ＲＮＡの回収、ｃＤＮＡの合成及び遺伝子発現量の測定
培養後、培養上清を除去し、ＲＮｅaｓｙ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製)を用いて、毛乳頭細胞からＲＮＡを回収し、次いで、ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｋｉｔ(ＱＩＡＧＥＮ社製)を用いて、回収したＲＮＡからｃＤＮＡを合成する。得られたｃＤＮＡを用いて、各遺伝子のｍＲＮＡ発現量を測定する。
【００５９】
６．結果
結果を図８〜１１に示す。図８は毛乳頭細胞におけるＣＳＦ２の相対的発現量を示し、図９は毛乳頭細胞におけるＳＲＤ５Ａ２の相対的発現量を示し、図１０は毛乳頭細胞におけるＡＳＩＰの相対的発現量を示し、図１１は毛乳頭細胞におけるＶＥＧＦの相対的発現量を示す。なお、図８〜１１において、縦軸は、各遺伝子の相対的発現量を示し、横軸の濃度は、培地中に含まれるアキノノゲシ抽出物の濃度（単位：μｇ／ｍＬ）を示す。
【００６０】
図８中、０．４μｇ／ｍｌでの相対的発現量は０．８４であり、２μｇ／ｍｌでの相対的発現量は０．７２であり、１０μｇ／ｍｌでの相対的発現量は１．６３であり、５０μｇ／ｍｌでの相対的発現量は６．３９である。図９中、０．４μｇ／ｍｌでの相対的発現量は０．６３であり、２μｇ／ｍｌでの相対的発現量は０．６７であり、１０μｇ／ｍｌでの相対的発現量は０．８０であり、５０μｇ／ｍｌでの相対的発現量は０．４６である。図１０中、０．４μｇ／ｍｌでの相対的発現量は０．８７であり、２μｇ／ｍｌでの相対的発現量は０．９１であり、１０μｇ／ｍｌでの相対的発現量は０．６０であり、５０μｇ／ｍｌでの相対的発現量は０．４０である。図１１中、０．４μｇ／ｍｌでの相対的発現量は０．８８であり、２μｇ／ｍｌでの相対的発現量は０．８８であり、１０μｇ／ｍｌでの相対的発現量は１．０８であり、５０μｇ／ｍｌでの相対的発現量は１．６１である。
【００６１】
＜＜アキノノゲシ抽出物が毛髪に及ぼす影響＞＞
１．アキノノゲシ抽出物
上述した「毛乳頭細胞の賦活活性及び毛乳頭細胞内における遺伝子発現量の変化」の「１−１．被験物質」に記載されるアキノノゲシ抽出物を用いた。
【００６２】
２．アキノノゲシ抽出物を含有する組成物の調製
表４に記載の処方に従い、アキノノゲシ抽出物を含有する組成物を調製した。具体的には、界面活性剤を溶解した水相に、エタノールとセバシン酸ジエチルにアキノノゲシエキスを溶解した油相を加え、撹拌・乳化した後、増粘剤と中和剤を添加した。
【００６３】
【表４】
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【００６４】
上記で得られた組成物を１日２回、頭皮及び毛髪に使用し、使用者４人に使用前後の毛髪の変化についてアンケートを実施し、使用前の毛髪の状態を３として、５段階で評価した（表５）。４人の平均値を算出し、使用前後の評価結果とした（表６）。
【００６５】
【表５】
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【００６６】
【表６】
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【００６７】
表６より、アキノノゲシ抽出物を含有する組成物を用いることで、つや、はり、コシのあるしなやかな毛髪になることがわかった。また、毛髪のパサつきを押さえる効果があり、毛髪の水分を保持することができることがわかった。また、２ヶ月間継続して使用した結果においては、毛髪のつや、毛髪のコシ、毛髪のパサつきのなさは高い平均値を維持しており、継続して使用することで、特に毛髪の水分量を保持でき、パサつきのない毛髪を維持できることがわかった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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