(57)【要約】      （修正有）【課題】バガス等のリグニンを含むバイオマスに含まれるリグニンに対して優れた分解作用を有する担子菌株、及び、同菌株を利用してリグニンを含むバイオマス資源を分解する方法を提供する。【解決手段】特定の塩基配列からなる18S rRNA遺伝子を有し、かつ、リグニン分解能を有するフレビア属に属する担子菌株、前記担子菌株を、リグニンを含むバイオマス資源の存在下で培養する、リグニンの分解方法、および前記リグニンを分解したバイオマス資源中のセルロースに糖化酵素を反応させて糖を生成させる糖液の製造方法。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子が配列番号１の塩基配列を有し、かつ、リグニン分解能を有するフレビア属に属する担子菌株。
【請求項２】
フレビア  エスピー．ＢＣ−１  ＡＪ８７２２（ＦＥＲＭ  Ｐ−２１９５１）、又はその変異株である、請求項１又は２に記載の担子菌株。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の担子菌株を、リグニンを含むバイオマス資源の存在下で培養する工程を含む、リグニンの分解方法。
【請求項４】
リグニンを含むバイオマス資源がサトウキビバガスである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
請求項３又は４に記載の方法によりリグニンを分解したバイオマス資源に糖化酵素を反応させて糖を生成させる、糖液の製造方法。
【請求項６】
糖化酵素がセルラーゼである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
請求項５又は６に記載の方法で製造された糖液又はその分画物を炭素源として含む培地で、目的物質を産生する微生物を培養し、目的物質を培養物中から採取する、目的物質の製造法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なリグニン分解性担子菌株、並びにその利用に関するものであり、詳しくは、バガス高分解環境であるバガス堆肥から分離した新規なリグニン分解性担子菌株、並びにその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
セルロースは、グルコースがβ−１,４−グリコシド結合でつながった高分子多糖である。従って、この結合を加水分解すれば、セルロースからグルコースが得られ、グルコースの供給源としてセルロースを有効に利用することができる。
【０００３】
しかし、セルロース系バイオマスは、キシランを主とするヘミセルロースやリグニンがセルロース繊維を取り巻いており、これらを除去することがセルラーゼによるセルロースの糖化効率を高めるために重要である。従来のセルロース系バイオマス糖化方法では、希硫酸などの化学物質による前処理により、リグニンやヘミセルロースを除去する試みが行われているが、こういった化学的前処理には、「糖の過分解が起こりやすい」、「ヘミセルロースを構成する糖類を利用することができない」、といった問題点がある。一方で、自然界においては、微生物の生産するマンガンペルオキシダーゼ、リグニンペルオキシダーゼ、ラッカーゼなどのリグニン分解酵素や、キシラナーゼ、グルカナーゼ、ペクチナーゼなどのヘミセルロース分解酵素がセルラーゼと共に作用することで、効率良くセルロース系バイオマスが分解されている。
【０００４】
一方、シイタケ、ヒラタケのような、白色腐朽菌に分類される担子菌は、リグニンを分解することが知られているが、リグニンを含むバイオマス資源の糖化酵素による糖化を促進するのに十分なリグニン分解活性を有する担子菌は知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００７−３７４６９
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Gary, F. L., Appl. Environ. Microbiol., 50(4), 859-867 (1985)
【非特許文献２】M. Taniguchi, H. Suzuki, D. Watanabe, K. Sakai, K. Hoshino, T. Tanaka., J. Biosic. Bioeng., 100, 637-643 (2005)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、バガス等のリグニンを含むバイオマス資源に含まれるリグニンに対して優れた分解作用を有する菌株を提供することを目的とする。更に、本発明は上記菌株を利用して、同方法を利用してリグニンを効率的に分解する方法、及びリグニンを分解したバイオマス資源を原料として有用物質を生産する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、上記課題を解決するために、サトウキビバガスと牛糞便を混合して発酵させたバガス堆肥中から、高いリグニン分解能を有する担子菌株を単離することに成功し、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は、以下のとおりである。
（１）１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子が配列番号１の塩基配列を有し、かつ、リグニン分解能を
有するフレビア属に属する担子菌株。
（２）フレビア  エスピー．ＢＣ−１  ＡＪ８７２２（ＦＥＲＭ  Ｐ−２１９５１）、又はその変異株である、前記担子菌株。
（３）前記担子菌株を、リグニンを含むバイオマス資源の存在下で培養する工程を含む、リグニンの分解方法。
（４）リグニンを含むバイオマス資源がサトウキビバガスである、前記方法。
（５）前記方法によりリグニンを分解したバイオマス資源に糖化酵素を反応させて糖を生成させる、糖液の製造方法。
（６）糖化酵素がセルラーゼである、前記糖液の製造方法。
（７）前記方法で製造された糖液又はその分画物を炭素源として含む培地で、目的物質を産生する微生物を培養し、目的物質を培養物中から採取する、目的物質の製造法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、サトウキビバガスのようなリグニンを含むバイオマス資源中のリグニンを分解することができる新規な担子菌株が提供される。同担子菌株を用いることにより、バイオマス資源の糖化酵素による糖化率を向上させることができる。本発明の方法により得られる糖液は、発酵法による目的物質の製造に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】各種担子菌によるリグニン分解を示す図。
【図２】各種担子菌によるバガス糖化前処理の糖化に対する効果を示す図。
【図３】本発明の担子菌株によるバガス糖化前処理の時間とバガス糖化率との関係を示す図。
【図４】本発明の担子菌株によるバガス糖化前処理における水の量とバガス糖化率との関係を示す図。
【図５】本発明の担子菌株によるバガス糖化前処理における担子菌接種量とバガス糖化率との関係を示す図。
【図６】本発明の担子菌株によるバガス糖化前処理の温度とバガス糖化率との関係を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
＜１＞本発明の担子菌株
本発明の担子菌株は、18S rRNA遺伝子が配列番号１の塩基配列を有し、かつ、リグニン分解能を有するフレビア属に属する担子菌株である。本発明の担子菌株には、フレビア  エスピー．（Phlebia sp.）BC-1 AJ8722と命名された菌株、及びその変異株が含まれる。フレビア  エスピー．（Phlebia sp.）BC-1 AJ8722株は、2010年4月16日に、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に受託番号FERM P-21951として寄託されている。同菌株は、PRB1Y-1株とも記載する。
【００１２】
変異株は、リグニン分解能を有する限り特に制限されず、自然変異株及び人為的な変異株の両方が含まれる。
【００１３】
PRB1Y-1株は、後記実施例に詳細に示すように、サトウキビバガスと牛糞便を混合して発酵させたバガス堆肥から、リグニンペルオキシダーゼ、マンガンペルオキシダーゼなどのリグニンの分解に関与する酵素によって脱色される色素であるリマゾール・ブリリアント・ブルー Rの脱色を指標として単離された株である。さらに、PRB1Y-1株は、リグニンを含む培地で培養したときに、リグニンの芳香環に由来する色を減少させることから、リグニン分解能を有することが確認された。
【００１４】
PRB1Y-1株は、18S rRNA遺伝子の塩基配列の相同性検索により、フレビア・ラディアータ（Phlebia radiata）と99.6 %、フレビア・ブレビスポラ（Phlebia brevispora）と99.3 %、フレビア・サブオクラシア（Phlebia subochracea）と98.9 %と、高い相同性が確認され、フレビア属に属すると同定された。PRB1Y-1株は、新規な種に属するか、又はフレビア・ラディアータ、フレビア・ブレビスポラ、又はフレビア・サブオクラシアに属する可能性がある。
【００１５】
PRB1Y-1株は、実施例に示すように、バガスの糖化酵素による糖化反応の前に、粉砕バガス上で培養することによって、糖化率を向上させ得ることが示された。リグニン分解能を有することが知られているシイタケ及びヒラタケについて、同様に粉砕バガスでの培養を行ったところ、シイタケは生育が認められず、ヒラタケは生育は認められたものの糖化酵素による糖化効率を上昇させる効果は認められなかった。PRB1Y-1株は、上記のようなバガス等のリグニンを含むセルロース系バイオマス資源の糖化前処理による、その後の糖化酵素による糖化率を向上させる作用を有していることによっても特徴付けられる。
【００１６】
PRB1Y-1株、又は同株と菌学的に同等の性質を有する担子菌株は、上記のように、バガス堆肥から、リグニン分解能、及び、バガスの糖化酵素による糖化率を向上させる能力を有する株を選択することによって、取得することができる。
【００１７】
＜２＞リグニンを含むバイオマス資源の分解方法、及び、糖液の製造方法
本発明の担子菌を、リグニンを含むバイオマス資源に反応させることにより、同リグニンを効率よく分解することができる。担子菌によるバイオマス資源の分解とは、バイオマス資源の糖化酵素による糖化率が、担子菌をバイオマス資源に作用させたときに、担子菌を作用させない場合に比べて向上する程度にバイオマス資源中のリグニンを分解することをいう。担子菌によるバイオマス資源の分解を、糖化前処理と記載することがある。
【００１８】
リグニンを含むバイオマス資源は、リグニンを含むものであれば特に制限されず、好ましくはリグニンを含むセルロース系バイオマス資源（リグノセルロース系バイオマス資源）が挙げられ、具体的にはサトウキヒバガス、イナワラ、モミガラ、ムギワラ、コーンストーバ、コーンコブ、オイル椰子空房、タピオカ繊維、ユーカリ、エリアンサス、ネピアグラス、廃木材、間伐材、オガクズ等が挙げられる
【００１９】
リグニンを含むバイオマス資源を担子菌により分解するためには、例えば、バイオマス資源存在下で担子菌を培養すればよい。具体的には、例えば、粉砕したバイオマス資源を水、緩衝液、又は液体培地等の水性媒体で懸濁させた懸濁液に担子菌を接種して培養する。
【００２０】
バイオマス資源は、処理効率を高めるために予め100-1000μmサイズに粉砕されていることが好ましい。この粉砕は、衝撃式粉砕器、ボールミル、振動ミル、カッターミル、ハンマーミル等の機械を用いて行うことが出来る。粉砕したバイオマス資源は、篩等を用いて分画してもよい。
【００２１】
バイオマス資源は、乾燥物でも、また湿潤物でもよいが、湿潤物であることが好ましい。水分は、バイオマス資源の乾燥重量に対し、例えば１〜１２倍、好ましくは３〜９倍である。
【００２２】
培養は、３０℃前後、例えば２０〜３５℃、好ましくは２５〜３０℃が好ましい。
【００２３】
培養時間は、接種量、培養温度、及び水分含量等によって適宜設定することができるが、例えば１〜６週間、好ましくは２〜３週間が好ましい。
【００２４】
バイオマス資源に接種する担子菌は、保存株をそのまま用いることもできるが、予め、適当な培地で培養しておくことが好ましい。培地は、液体培地でも固体培地でもよく、例えば、実施例に記載した1/2 PDA培地、及びPDB培地が挙げられる。培養温度は、前記と同様である。
【００２５】
接種量は、特に制限されない。
【００２６】
糖化前処理の諸条件は、予備実験を行う等して適宜設定することができる。
【００２７】
糖化前処理したバイオマス資源に糖化酵素を作用させることにより、糖液を得ることができる。糖化前処理したバイオマス資源は、殺菌してもよいし、そのままでもよい。
【００２８】
糖化酵素は、バイオマス資源から糖を生成させ得る酵素であれば特に制限されず、例えば、セルラーゼが挙げられる。セルラーゼは、(1→4)-β-グリコシド結合の加水分解に関与する酵素で、非結晶セルロースを分子内部から切断するエンドグルカナーゼ（EC3.2.1.4）、結晶セルロースの末端から分解し、セロビオースを遊離するエキソグルカナーゼ（セロビオヒドロラーゼ）（EC3.2.1.91）、及び、セロビオース及びセロオリゴ糖の末端からグルコースを生成するβ−グルコシダーゼ（EC3.2.1.21）がある。市販のセルラーゼは、前記活性を含むセルラーゼの混合物として販売されており、Aspergillus niger由来、Trichoderma reesei由来の酵素が利用される場合が多い。Novozymes社のCellic Ctec、Celluclast（Novozymes A/S）、Novozyme188（Novozymes A/S）、及びGenencor社のAccelleraseがコストパフォーマンスに優れ代表的な市販糖化酵素である。その他の市販酵素としては、明治製菓（株）のメイセラーゼなどが挙げられる。セルラーゼの活性測定は、Irwin et al. Biotechnol Bioeng. 42 (1993) 1002-1013を参考に測定できる。
【００２９】
また、糖化反応と同時に、又は糖化反応に先立って、糖化前処理を行ったバイオマス資源にヘミセルラーゼを作用させてもよい。ヘミセルラーゼは、ヘミセルロースに含まれるグリコシド結合の加水分解に関与する酵素の総称である。ヘミセルロースとは、陸上植物細胞の細胞壁を構成する多糖類のうち、セルロースとペクチン以外のものであり、ヘミセルロース成分にはキシランが多く含まれており、ヘミセルラーゼの主成分は、エンド-1,4-β-キシラナーゼ（EC 3.2.1.8）、及びβ-1,4-キシロシダーゼ（EC 3.2.1.37）等であるが、その他のグルコシド結合加水分解酵素も含まれている。市販のヘミセルラーゼとしては、Novozymes社のCellic Htecが挙げられる。Genencor社や天野エンザイム（株）などからも入手できる。また、ヘミセルラーゼの一種であるキシラナーゼを用いてもよい。
【００３０】
使用するセルラーゼ及びヘミセルラーゼは、各々１種でもよく、複数種であってもよい。
【００３１】
糖化反応は、公知の方法を用いることが出来る。糖化前処理したバイオマス資源を水性媒体中に懸濁し、糖化酵素、及び必要に応じてヘミセルラーゼ等の酵素を加え、攪拌しながら加温して、バイオマス資源を糖化することが出来る。この方法において、反応液のpHおよび温度は、酵素が失活しない範囲であればよく、一般的に常圧で反応を行う限り、温度は5-95℃、好ましくは25-60℃、pHは1-11好ましくは4-9の範囲でよい。例えば、セルラーゼとしてNovozymes社のCellic Ctecを用いる場合は、45〜50℃、pH5.0、酵素量は、1.5〜15% (g enzyme/g cellulose)が挙げられる。Celluclast、Novozyme188についても、これに準じた条件を採用できる。反応時間は、酵素量等により適宜設定することができる。
【００３２】
糖化反応の諸条件は、予備実験を行う等して適宜設定すればよい。
【００３３】
ヘミセルラーゼを用いる場合、ヘミセルラーゼと糖化酵素は、バイオマス資源に同時に作用させてもよく、ヘミセルラーゼを作用させた後にセルラーゼを作用させてもよい。反応中に、セルラーゼ及び／又はヘミセルラーゼを追添してもよい。
【００３４】
上記のようにしてバイオマス資源を分解、糖化すると、主としてグルコースが生成するが、キシロース、マンノース、アラビノース等の糖も生成する。得られた糖液は、用途に応じて、さらに化学反応又は酵素反応によって異性化又は分解させてもよい。
【００３５】
得られた糖液は、用途に応じて、そのまま使用することもできるし、水分を除去して乾燥物として使用することもできる。また、糖液中の成分は適宜分画して使用してもよい。分画物には、粗精製物及び精製物も含まれる。精製物としてはグルコースが挙げられる。
【００３６】
＜３＞目的物質の製造方法
前記方法により得られた糖液又はその分画物は、例えば、発酵法により目的物質の製造における炭素源として用いることができる。すなわち、本発明の目的物質の製造法は、前記方法で製造された糖液又はその分画物を炭素源として含む培地で、目的物質を産生する微生物を培養し、目的物質を培養物中から採取する、目的物質の製造法である。
【００３７】
目的物質としては、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、ブタンジオール等のアルコールが挙げられる。その他、酢酸、乳酸、プロピオン酸、３−ヒドロキシプロピオン酸、コハク酸、クエン酸、アミノ酸、核酸が挙げられる。
【００３８】
特にＬ−アミノ酸としては、Ｌ−リジン、Ｌ−オルニチン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−シトルリン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−グリシン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−セリン、Ｌ−プロリン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−システイン、Ｌ−シスチン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン及びＬ−アスパラギンが挙げられる。
【００３９】
また、本発明のＬ−アミノ酸には上記アミノ酸を出発物質として得られるＬ−アミノ酸誘導体も含まれ、GABA、p-ヒドロキシ-D-フェニルグリシン、DOPA、コハク酸、リンゴ酸、ピルビン酸が挙げられる。
【００４０】
核酸としては、プリンヌクレオシド、プリンヌクレオチドなどが挙げられる。プリンヌクレオシドには、イノシン、キサントシン、グアノシン、アデノシンなどが含まれ、プリンヌクレオチドには、プリンヌクレオシドの５'−燐酸エステル、例えばイノシン酸（イノシン−５'−リン酸。以下「IMP」ともいう）、キサンチル酸（キサントシン−５'−リン酸。以下「XMP」ともいう）、グアニル酸（グアノシン−５'−モノリン酸。以下「GMP」ともいう）、アデニル酸（アデノシン−５'−モノリン酸。以下「AMP」ともいう）などが含まれる。また、本発明の核酸には、上記核酸を出発物質として得られる核酸誘導体も含まれ、Ara-U（ウラシルアラビノシド）、ZVA（Z-バラシクロビル）等が挙げられる。
本発明により製造される目的物質は、１種でもよく、２種又はそれ以上であってもよい。
【００４１】
＜３−１＞目的物質の製造に用いることが出来る微生物
目的物質の製造に用いる微生物は、上記方法で得られる糖、例えばグルコースを資化することができ、目的物質生産能を有し、液体培地で培養したときに培地又は微生物細胞中に目的物質を蓄積させることができる微生物であれば、特に制限されない。蓄積する目的物質の量は、培地から回収できる程度に蓄積できればいずれでもよい。
【００４２】
本発明に用いる微生物又はそれを育種するための親株としては、エシェリヒア属細菌、パントエア属細菌を代表とする腸内細菌科に属する微生物や、コリネ型細菌等を用いることができる。その他の腸内細菌科に属する微生物としては、エンテロバクター（Enterobacter）属、、クレブシエラ（Klebsiella）属、セラチア（Serratia）属、エルビニア（Erwinia）属、サルモネラ（Salmonella）属、モルガネラ（Morganella）属などのγ−プロテオバクテリアに属する腸内細菌が挙げられ、またその他の微生物としては、アリサイクロバチルス（Alicyclobacillus）属細菌、バチルス（Bacillus）属細菌、サッカロマイセス属やキャンディダ属等に属する酵母などが挙げられる。
【００４３】
エシェリヒア属細菌としては、ナイトハルトらの著書（Neidhardt,F.C.et.al., Escherichia coli and Salmonella Typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D.C.,1208, table 1）に挙げられるもの、例えばエシェリヒア・コリ等が利用できる。エシェリヒア・コリの野生株としては、例えばK12株又はその誘導体、エシェリヒア・コリ MG1655株（ATCC No.47076）、及びW3110株（ATCC No.27325）等が挙げられる。これらを入手するには、例えばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ATCC）より分譲を受けることができる（住所  ATCC, Address: P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, 1,United States of America）。すなわち、菌株毎に対応する登録番号が付与されており、この登録番号を利用して分譲を受けることができる。各菌株に対応する登録番号はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログに記載されている（http://www.atcc.org/参照）。
【００４４】
また、エンテロバクター属細菌としては、エンテロバクター・アグロメランス（Enterobacter agglomerans）、エンテロバクター・アエロゲネス(Enterobacter aerogenes)等、パントエア属細菌としてはパントエア・アナナティス（Pantoea ananatis）が挙げられる。尚、近年、エンテロバクター・アグロメランスは、16S rRNAの塩基配列解析などにより、パントエア・アグロメランス（Pantoea agglomerans）又はパントエア・アナナティス（Pantoea ananatis）、パントエア・スチューアルティ（Pantoea stewartii）等に再分類されているものがある。本発明においては、腸内細菌科に分類されるものであれば、エンテロバクター属又はパントエア属のいずれに属するものであってもよい。パントエア・アナナティスを遺伝子工学的手法を用いて育種する場合には、パントエア・アナナティスAJ13355株（FERM BP-6614）、AJ13356株（FERM BP-6615）、AJ13601株（FERM BP-7207）及びそれらの誘導体を用いることができる。これらの株は、分離された当時はエンテロバクター・アグロメランスと同定され、エンテロバクター・アグロメランスとして寄託されたが、上記のとおり、16S rRNAの塩基配列解析などにより、パントエア・アナナティスに再分類されている。
【００４５】
コリネ型細菌としては、バージーズ・マニュアル・オブ・デターミネイティブ・バクテリオロジー（Bergey's Manual of Determinative Bacteriology）第8版599頁（1974）に定義されている一群の微生物であり、好気性，グラム陽性，非抗酸性，胞子形成能を有しない桿菌に分類される微生物が利用できる。なお、コリネ型細菌は、従来ブレビバクテリウム属に分類されていたが現在はコリネバクテリウム属細菌として統合された細菌（Int.J. Syst. Bacteriol., 41, 255 (1991)）、及びコリネバクテリウム属と非常に近縁なブレビバクテリウム属細菌及びミクロバテリウム属細菌を含む。
【００４６】
このようなコリネ型細菌の例として以下のものが挙げられる。
コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム
コリネバクテリウム・アセトグルタミカム
コリネバクテリウム・アルカノリティカム
コリネバクテリウム・カルナエ
コリネバクテリウム・グルタミカム
コリネバクテリウム・リリウム
コリネバクテリウム・メラセコーラ
コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス（コリネバクテリウム・エフィシェンス）
コリネバクテリウム・ハーキュリス
ブレビバクテリウム・ディバリカタム
ブレビバクテリウム・フラバム
ブレビバクテリウム・インマリオフィラム
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム
ブレビバクテリウム・ロゼウム
ブレビバクテリウム・サッカロリティカム
ブレビバクテリウム・チオゲニタリス
コリネバクテリウム・アンモニアゲネス
ブレビバクテリウム・アルバム
ブレビバクテリウム・セリヌム
ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム
【００４７】
具体的には、下記のような菌株を例示することができる。
コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム ATCC13870
コリネバクテリウム・アセトグルタミカム ATCC15806
コリネバクテリウム・アルカノリティカム ATCC21511
コリネバクテリウム・カルナエ ATCC15991
コリネバクテリウム・グルタミカム ATCC13020, ATCC13032, ATCC13060
コリネバクテリウム・リリウム ATCC15990
コリネバクテリウム・メラセコーラ ATCC17965
コリネバクテリウム・エッフィシエンス AJ12340(FERM BP-1539)
コリネバクテリウム・ハーキュリス ATCC13868
ブレビバクテリウム・ディバリカタム ATCC14020
ブレビバクテリウム・フラバム ATCC13826, ATCC14067, AJ12418(FERM BP-2205)
ブレビバクテリウム・インマリオフィラム ATCC14068
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ATCC13869（コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13869）
ブレビバクテリウム・ロゼウム ATCC13825
ブレビバクテリウム・サッカロリティカム ATCC14066
ブレビバクテリウム・チオゲニタリス ATCC19240
コリネバクテリウム・アンモニアゲネス ATCC6871、ATCC6872
ブレビバクテリウム・アルバム ATCC15111
ブレビバクテリウム・セリヌム ATCC15112
ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム ATCC15354
【００４８】
これらを入手するには、例えばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（住所
P.O. Box 1549, Manassas, VA 2010812301  Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, United States of America）より分譲を受けることができる。また、AJ12340株は、1987年10月27日付けで通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（現独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター）（〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）にFERM BP-1539の受託番号でブダペスト条約に基づいて寄託されている。また、AJ12418株は、1989年１月５日付けで通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所にFERM BP-2205の受託番号でブダペスト条約に基づいて寄託されている。
【００４９】
バチルス属細菌を用いるときは、バチルス属細菌としては、バチルス・ズブチリス、バ
チルス・アミロリケファシエンス、バチルス・プミルス等が挙げられる。
バチルス・ズブチリスとしては、バチルス・ズブチリス168 Marburg（ATCC6051）、バチルス・ズブチリスPY79（Plasmid, 1984, 12, 1-9）等が、バチルス・アミロリケファシエンスとしては、バチルス・アミロリケファシエンスＴ（ATCC23842）、及びバチルス・アミロリケファシエンスＮ（ATCC23845）等が挙げられる。また、バチルス・プミルスとしては、バチルス・プミルス Gottheil No.3218（ATCC No.21005）（米国特許第3,616,206号）等が挙げられる。
【００５０】
以下、上述したような親株にＬ−アミノ酸又は核酸生産能を付与する方法について述べる。
Ｌ−アミノ酸生産能を付与するには、栄養要求性変異株、Ｌ−アミノ酸のアナログ耐性株又は代謝制御変異株の取得や、Ｌ−アミノ酸の生合成系酵素の発現が増強された組換え株の創製等、従来、コリネ型細菌又はエシェリヒア属細菌等のアミノ酸生産菌の育種に採用されてきた方法を適用することができる（アミノ酸発酵、（株）学会出版センター、1986年5月30日初版発行、第７７〜１００頁参照）。ここで、Ｌ−アミノ酸生産菌の育種において、付与される栄養要求性、アナログ耐性、代謝制御変異等の性質は、単独でもよく、２種又は３種以上であってもよい。また、発現が増強されるＬ−アミノ酸生合成系酵素も、単独であっても、２種又は３種以上であってもよい。さらに、栄養要求性、アナログ耐性、代謝制御変異等の性質の付与と、生合成系酵素の増強が組み合わされてもよい。
【００５１】
Ｌ−アミノ酸生産能を有する栄養要求性変異株、アナログ耐性株、又は代謝制御変異株を取得するには、親株又は野生株を通常の変異処理、すなわちＸ線や紫外線の照射、またはＮ-メチル-Ｎ'-ニトロ-Ｎ-ニトロソグアニジン等の変異剤処理などによって処理し、得られた変異株の中から、栄養要求性、アナログ耐性、又は代謝制御変異を示し、かつＬ−アミノ酸生産能を有するものを選択することによって得ることができる。
【００５２】
また、Ｌ−アミノ酸生産能の付与又は増強は、遺伝子組換えによって、酵素活性を増強することによっても行うことが出来る。酵素活性の増強は、例えば、Ｌ−アミノ酸の生合成に関与する酵素をコードする遺伝子の発現が増強するように細菌を改変する方法を挙げることができる。遺伝子の発現を増強するための方法としては、遺伝子を含むDNA断片を、適当なプラスミド、例えば微生物内でプラスミドの複製増殖機能を司る遺伝子を少なくとも含むプラスミドベクターに導入した増幅プラスミドを導入すること、または、これらの遺伝子を染色体上で接合、転移等により多コピー化すること、またこれらの遺伝子のプロモーター領域に変異を導入することにより達成することもできる（国際公開パンフレット第95/34672号参照）。
【００５３】
上記増幅プラスミドまたは染色体上に目的遺伝子を導入する場合、これらの遺伝子を発現させるためのプロモーターはコリネ型細菌において機能するものであればいかなるプロモーターであっても良く、用いる遺伝子自身のプロモーターであってもよいし、改変したものでもよい。コリネ型細菌で強力に機能するプロモーターを適宜選択することや、プロモーターの-35、-10領域をコンセンサス配列に近づけることによっても遺伝子の発現量の調節が可能である。以上のような、酵素遺伝子の発現を増強する方法は、国際公開第00/18935号パンフレット、欧州特許出願公開1010755号明細書等に記載されている。
【００５４】
以下、細菌にＬ−アミノ酸生産能を付与する方法、及びＬ−アミノ酸生産能が付与された細菌について例示する。
【００５５】
Ｌ−スレオニン生産菌
Ｌ−スレオニン生産能を有する微生物として好ましいものは、Ｌ−スレオニン生合成系酵素の１種又は２種以上の活性が増強された細菌が挙げられる。Ｌ−スレオニン生合成系
酵素としては、アスパルトキナーゼIII（lysC）、アスパルテートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（asd）、thrオペロンにコードされるアスパルトキナーゼI（thrA）、ホモセリンキナーゼ（thrB）、スレオニンシンターゼ（thrC）、アスパルテートアミノトランスフェラーゼ（アスパルテートトランスアミナーゼ）(aspC)が挙げられる。カッコ内は、その遺伝子の略記号である（以下の記載においても同様）。これらの酵素の中では、アスパルテートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、アスパルトキナーゼI、ホモセリンキナーゼ、アスパルテートアミノトランスフェラーゼ、及びスレオニンシンターゼが特に好ましい。Ｌ−スレオニン生合成系遺伝子は、スレオニン分解が抑制されたエシェリヒア属細菌に導入してもよい。スレオニン分解が抑制されたエシェリヒア属細菌としては、例えば、スレオニンデヒドロゲナーゼ活性が欠損したTDH6株（特開2001-346578号）等が挙げられる。
【００５６】
Ｌ−スレオニン生合成系酵素は、最終産物のＬ−スレオニンによって酵素活性が抑制される。従って、Ｌ−スレオニン生産菌を構築するためには、Ｌ−スレオニンによるフィードバック阻害を受けないようにＬ−スレオニン生合成系遺伝子を改変することが望ましい。また、上記thrA、thrB、thrC遺伝子は、スレオニンオペロンを構成しているが、スレオニンオペロンは、アテニュエーター構造を形成しており、スレオニンオペロンの発現は、培養液中のイソロイシン、スレオニンに阻害を受け、アテニュエーションにより発現が抑制される。この改変は、アテニュエーション領域のリーダー配列あるいは、アテニュエーターを除去することにより達成出来る（Lynn, S. P. et al. 1987. J. Mol. Biol. 194:59-69; 国際公開第02/26993号パンフレット; 国際公開第2005/049808号パンフレット参照）。
【００５７】
スレオニンオペロンの上流には、固有のプロモーターが存在するが、非天然のプロモーターに置換してもよいし（国際公開第98/04715号パンフレット参照）、スレオニン生合成関与遺伝子の発現がラムダファージのリプレッサーおよびプロモーターにより支配されるようなスレオニンオペロンを構築してもよい。（欧州特許第0593792号明細書参照）また、Ｌ−スレオニンによるフィードバック阻害を受けないように細菌を改変するために、α-amino-β-hydroxyvaleric acid （AHV）に耐性な菌株を選抜することも可能である。
【００５８】
このようにＬ−スレオニンによるフィ-ドバック阻害を受けないように改変されたスレオニンオペロンは、宿主内でコピー数が上昇しているか、あるいは強力なプロモーターに連結し、発現量が向上していることが好ましい。コピー数の上昇は、プラスミドによる増幅の他、トランスポゾン、Mu-ファージ等でゲノム上にスレオニンオペロンを転移させることによっても達成出来る。
【００５９】
Ｌ−スレオニン生合成系酵素以外にも、解糖系、TCA回路、呼吸鎖に関する遺伝子や遺伝子の発現を制御する遺伝子、糖の取り込み遺伝子を強化することも好適である。これらのＬ−スレオニン生産に効果がある遺伝子としては、トランスヒドロナーゼ（pntAB）遺伝子（欧州特許733712号明細書）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子（pepC）(国際公開第95/06114号パンフレット)、ホスホエノールピルビン酸シンターゼ遺伝子（pps）(欧州特許第877090号明細書)、コリネ型細菌あるいはバチルス属細菌のピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子（国際公開第99/18228号パンフレット、欧州出願公開第1092776号明細書）が挙げられる。
【００６０】
また、Ｌ−スレオニンに耐性を付与する遺伝子、Ｌ−ホモセリンに耐性を付与する遺伝子の発現を強化することや、宿主にＬ−スレオニン耐性、Ｌ−ホモセリン耐性を付与することも好適である。耐性を付与する遺伝子としては、rhtA遺伝子(Livshits, V. A. et al. 2003. Res. Microbiol. 154:123-135)、rhtB遺伝子（欧州特許出願公開第0994190号明細書）、rhtC遺伝子（欧州特許出願公開第1013765号明細書）、yfiK、yeaS遺伝子（欧州
特許出願公開第1016710号明細書）が挙げられる。また宿主にＬ−スレオニン耐性を付与する方法は、欧州特許出願公開第0994190号明細書や、国際公開第90/04636号パンフレット記載の方法を参照出来る。
【００６１】
Ｌ−スレオニン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、E. coli TDH-6/pVIC40 (VKPM B-3996) (米国特許第5,175,107号、米国特許第5,705,371号)、E. coli 472T23/pYN7 (ATCC 98081) (米国特許第5,631,157号)、E. coli NRRL-21593 (米国特許第5,939,307号)、E. coli FERM BP-3756 (米国特許第5,474,918号)、E. coli FERM BP-3519及びFERM BP-3520 (米国特許第5,376,538号)、E. coli MG442 (Gusyatiner et al., 1978. Genetika (in Russian), 14: 947-956)、E. coli VL643及びVL2055 (欧州特許出願公開第1149911号)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６２】
TDH-6株はthrC遺伝子を欠損し、スクロース資化性であり、また、そのilvA遺伝子がリーキー(leaky)変異を有する。この株はまた、rhtA遺伝子に、高濃度のスレオニンまたはホモセリンに対する耐性を付与する変異を有する。B-3996株は、RSF1010由来ベクターに、変異thrA遺伝子を含むthrA*BCオペロンを挿入したプラスミドpVIC40を保持する。この変異thrA遺伝子は、スレオニンによるフィードバック阻害が実質的に解除されたアスパルトキナーゼホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードする。B-3996株は、1987年11月19日、オールユニオン・サイエンティフィック・センター・オブ・アンチビオティクス(Nagatinskaya Street 3-A, 117105 Moscow, Russia)に、受託番号RIA 1867で寄託されている。この株は、また、1987年4月7日、ロシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオルガニズムズ(VKPM) (1 Dorozhny proezd., 1 Moscow 117545, Russia) に、受託番号B-3996で寄託されている。
【００６３】
E. coli VKPM B-5318 (EP 0593792B)も、Ｌ−スレオニン生産菌又はそれを誘導するための親株として使用できる。B-5318株は、イソロイシン非要求性であり、プラスミドpVIC40中のスレオニンオペロンの制御領域が、温度感受性ラムダファージC1リプレッサー及びPRプロモーターにより置換されている。VKPM B-5318は、1990年5月3日、ロシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオルガニズムズ(VKPM)(1 Dorozhny proezd., 1 Moscow 117545, Russia) に、受託番号VKPM B-5318で国際寄託されている。
【００６４】
エシェリヒア・コリのアスパルトキナーゼホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードするthrA遺伝子はGenBank Accession No. U00096で登録されているエシェリヒア・コリMG1655株のゲノム配列上の塩基番号337〜2,799に位置し、GenBank accession No. AAC73113にて登録されているタンパク質をコードする遺伝子である。エシェリヒア・コリのホモセリンキナーゼをコードするthrB遺伝子はGenBank Accession No. U00096で登録されているエシェリヒア・コリMG1655株のゲノム配列上の塩基番号2,801〜3,733に位置し、GenBank accession No. AAC73114にて登録されているタンパク質をコードする遺伝子である。エシェリヒア・コリのスレオニンシンターゼをコードするthrC遺伝子はGenBank Accession No. U00096で登録されているエシェリヒア・コリMG1655株のゲノム配列上の塩基番号3,734〜5,020に位置し、GenBank accession No. AAC73115にて登録されているタンパク質をコードする遺伝子である。これら3つの遺伝子は、リーダーペプチドをコードするthrL遺伝子の下流に、thrLABCからなるスレオニンオペロンとしてコードされている。スレオニンオペロンの発現を増大させるには、転写に影響するアテニュエーター領域を、好ましくは、オペロンから除去することが有効である(国際公開第2005/049808号、国際公開第2003/097839号)。
【００６５】
スレオニンによるフィードバック阻害に耐性のアスパルトキナーゼホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードする変異thrA遺伝子、ならびに、thrB遺伝子及びthrC遺伝子は、スレ
オニン生産株E. coli VKPM B-3996に存在する周知のプラスミドpVIC40から一つのオペロンとして取得できる。プラスミドpVIC40の詳細は、米国特許第5,705,371号に記載されている。
【００６６】
rhtA遺伝子は、ホモセリン及びスレオニンに耐性を与える遺伝子（rht: resistant to threonine/homoserine）として取得されたGenBank Accession No. U00096で登録されているエシェリヒア・コリMG1655株のゲノム配列上の塩基番号848,433〜849,320（相補鎖）に位置し、GenBank accession No. AAC73900にて登録されているタンパク質をコードする遺伝子である。また、rthAの発現を向上させるrhtA23変異が、ATG開始コドンに対して-1位のG→A置換であることが判明している(Livshits, V. A. et al. 2003. Res Microbiol. 154:123-135、欧州特許出願公開第1013765号)。
【００６７】
エシェリヒア・コリのasd遺伝子はGenBank Accession No. U00096で登録されているエシェリヒア・コリMG1655株のゲノム配列上の塩基番号3,571,798〜 3,572,901（相補鎖）に位置し、GenBank accession No. AAC76458にて登録されているタンパク質をコードする遺伝子である。遺伝子の塩基配列に基づいて作製されたプライマーを用いるPCRにより得ることができる(White, T. J. et al. 1989. Trends Genet. 5: 185-189.参照)。他の微生物のasd遺伝子も同様に得ることができる。
【００６８】
また、エシェリヒア・コリのaspC遺伝子はGenBank Accession No. U00096で登録されているエシェリヒア・コリMG1655株のゲノム配列上の塩基番号983,742〜984,932（相補鎖）に位置し、GenBank accession No. AAC74014にて登録されているタンパク質をコードする遺伝子であり、PCRにより得ることができる。他の微生物のaspC遺伝子も同様に得ることができる。
【００６９】
Ｌ−リジン生産菌
以下、Ｌ−リジン生産菌及びその構築方法を例として示す。
例えば、Ｌ−リジン生産能を有する株としては、Ｌ−リジンアナログ耐性株又は代謝制御変異株が挙げられる。Ｌ−リジンアナログの例としては、オキサリジン、リジンヒドロキサメート、Ｓ−（２−アミノエチル）−Ｌ−システイン（以下、「AEC」と略記することがある。）、γ−メチルリジン、α−クロロカプロラクタムなどが挙げられるが、これらに限定されない。これらのリジンアナログに対して耐性を有する変異株は、腸内細菌科に属する細菌やコリネ型細菌を通常の人工変異処理に付すことによって得ることができる。Ｌ−リジン生産菌として具体的には、エシェリヒア・コリAJ11442株（FERM BP-1543、NRRL B-12185；特開昭56-18596号公報及び米国特許第4346170号明細書参照）、エシェリヒア・コリ VL611株（特開2000-189180号公報）等が挙げられる。また、エシェリヒア・コリのＬ−リジン生産菌として、WC196株（国際公開第96/17930号パンフレット参照）を用いることも出来る。
【００７０】
また、Ｌ−リジン生合成系の酵素活性を上昇させることによっても、Ｌ−リジン生産菌を構築することが出来る。これらの酵素活性の上昇は、酵素をコードする遺伝子のコピー数を細胞内で上昇させること、または発現調節配列を改変することによって達成できる。
【００７１】
遺伝子の発現を増強するための改変は、例えば、遺伝子組換え技術を利用して、細胞中の遺伝子のコピー数を高めることによって行うことができる。例えばgapA遺伝子を含むDNA断片を、宿主細菌で機能するベクター、好ましくはマルチコピー型のベクターと連結して組換えDNAを作製し、これを細菌に導入して形質転換すればよい。
【００７２】
遺伝子のコピー数を高めることは、上述のような遺伝子を細菌のゲノムDNA上に多コピー存在させることによっても達成できる。細菌のゲノムDNA上に遺伝子を多コピーで導入
するには、ゲノムDNA上に多コピー存在する配列を標的に利用して相同組換えにより行う。ゲノムDNA上に多コピー存在する配列としては、レペティティブDNA、転移因子の端部に存在するインバーテッド・リピートが利用できる。また、ゲノム上に存在するgapA遺伝子の横に、それぞれの遺伝子をタンデムに連結させてもよいし、ゲノム上の不要な遺伝子上に重複して組み込んでもよい。これらの遺伝子導入は、温度感受性ベクターを用いて、あるいはintegrationベクターを用いて達成することが出来る。
【００７３】
あるいは、特開平2-109985号公報に開示されているように、遺伝子をトランスポゾンに搭載してこれを転移させてゲノムDNA上に多コピー導入することも可能である。ゲノム上に遺伝子が転移したことの確認は、遺伝子の一部をプローブとして、サザンハイブリダイゼーションを行うことによって確認出来る。
【００７４】
さらに、遺伝子の発現の増強は、上記した遺伝子コピー数の増幅以外に、国際公開00/18935号パンフレットに記載した方法で、ゲノムDNA上またはプラスミド上の遺伝子の各々のプロモーター等の発現調節配列を強力なものに置換することや、各遺伝子の−35、−10領域をコンセンサス配列に近づけること、遺伝子の発現を上昇させるようなレギュレーターを増幅すること、又は、遺伝子の発現を低下させるようなレギュレーターを欠失または弱化させることによっても達成される。例えば、lacプロモーター、trpプロモーター、trcプロモーター、tacプロモーター、araBAプロモーター、ラムダファージのPRプロモーター、PLプロモーター、tetプロモーター、T7プロモーター、φ10プロモーター等が強力なプロモーターとして知られている。また、gapA遺伝子のプロモーター領域、SD領域に塩基置換等を導入し、より強力なものに改変することも可能である。プロモーターの強度の評価法および強力なプロモーターの例は、Goldsteinらの論文（Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev. 1995. 1:105-128）等に記載されている。さらに、リボソーム結合部位（RBS）と開始コドンとの間のスペーサー、特に開始コドンのすぐ上流の配列における数個のヌクレオチドの置換がmRNAの翻訳効率に非常に影響を及ぼすことが知られており、これらを改変することも可能である。遺伝子のプロモーター等の発現調節領域は、プロモーター検索ベクターやGENETYX等の遺伝子解析ソフトを用いて決定することも出来る。これらのプロモーター置換または改変により遺伝子の発現が強化される。発現調節配列の置換は、例えば温度感受性プラスミドを用いた方法や、Redドリブンインテグレーション法(WO2005/010175)を使用することが出来る。
【００７５】
Ｌ−リジン生合成系酵素をコードする遺伝子としては、ジヒドロジピコリン酸合成酵素遺伝子（dapA）、アスパルトキナーゼ遺伝子(lysC)、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ遺伝子(dapB)、ジアミノピメリン酸脱炭酸酵素遺伝子(lysA)、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子(ddh)（以上、国際公開第96/40934号パンフレット）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子(ppc) （特開昭60-87788号公報）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子(aspC)（特公平6-102028号公報）、ジアミノピメリン酸エピメラーゼ遺伝子(dapF)（特開2003-135066号公報）、アスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵素遺伝子（asd）(国際公開第00/61723号パンフレット)等のジアミノピメリン酸経路の酵素の遺伝子、あるいはホモアコニット酸ヒドラターゼ遺伝子（特開2000-157276号公報）等のアミノアジピン酸経路の酵素等の遺伝子が挙げられる。また、親株は、エネルギー効率に関与する遺伝子(cyo) (EP 1170376 A)、ニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼをコードする遺伝子(pntAB) (米国特許第5,830,716号)、Ｌ−リジン排出活性を有するタンパク質をコードするybjE遺伝子(WO2005/073390)、グルタミン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子(gdhA)( Valle F. et al. 1983. Gene 23:199-209)、または、これらの任意の組み合わせの遺伝子の発現レベルが増大していてもよい。カッコ内は、それらの遺伝子の略記号である。
【００７６】
エシェリヒア・コリ由来の野生型ジヒドロジピコリン酸合成酵素はＬ−リジンによるフ
ィードバック阻害を受けることが知られており、エシェリヒア・コリ由来の野生型アスパルトキナーゼはＬ−リジンによる抑制及びフィードバック阻害を受けることが知られている。したがって、dapA遺伝子及びlysC遺伝子を用いる場合、これらの遺伝子は、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害を受けない変異型遺伝子であることが好ましい。
【００７７】
Ｌ−リジンによるフィードバック阻害を受けない変異型ジヒドロジピコリン酸合成酵素をコードするDNAとしては、118位のヒスチジン残基がチロシン残基に置換された配列を有するタンパク質をコードするDNAが挙げられる。また、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害を受けない変異型アスパルトキナーゼをコードするDNAとしては、352位のスレオニン残基がイソロイシン残基に置換、323位のグリシン残基がアスパラギン残基に置換、318位のメチオニンがイソロイシンに置換された配列を有するAKIIIをコードするDNAが挙げられる（これらの変異体については米国特許第5661012号及び第6040160号明細書参照）。変異型DNAはPCRなどによる部位特異的変異法により取得することができる。
【００７８】
なお、変異型変異型ジヒドロジピコリン酸合成酵素をコードする変異型dapA及び変異型アスパルトキナーゼをコードする変異型lysCを含むプラスミドとして、広宿主域プラスミドRSFD80、pCAB1、pCABD2が知られている（米国特許第6040160号明細書）。同プラスミドで形質転換されたエシェリヒア・コリ JM109株（米国特許第6040160号明細書）は、AJ12396と命名され、同株は1993年10月28日に通産省工業技術院生命工学工業技術研究所（現 独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター）に受託番号FERM P-13936として寄託され、1994年11月1日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、FERM BP-4859の受託番号のもとで寄託されている。RSFD80は、AJ12396株から、公知の方法によって取得することができる。
【００７９】
Ｌ−リジン生産において、このような酵素としては、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、リジンデカルボキシラーゼ（cadA, ldcC）、マリックエンザイム等があり、該酵素の活性が低下または欠損した株は国際公開第WO95/23864号、第WO96/17930号パンフレット、第WO2005/010175号パンフレットなどに記載されている。
【００８０】
リジンデカルボキシラーゼ活性を低下または欠損させるためには、リジンデカルボキシラーゼをコードするcadA遺伝子とldcC遺伝子の両方の発現を低下させることが好ましい。両遺伝子の発現低下は、WO2006/078039号パンフレットに記載の方法に従って行うことができる。
【００８１】
これらの酵素活性を低下あるいは欠損させる方法としては、通常の変異処理法又は遺伝子組換え技術によって、ゲノム上の上記酵素の遺伝子に、細胞中の当該酵素の活性が低下または欠損するような変異を導入すればよい。このような変異の導入は、例えば、遺伝子組換えによって、ゲノム上の酵素をコードする遺伝子を欠損させたり、プロモーターやシャインダルガルノ（SD）配列等の発現調節配列を改変したりすることなどによって達成される。また、ゲノム上の酵素をコードする領域にアミノ酸置換（ミスセンス変異）を導入すること、また終始コドンを導入すること（ナンセンス変異）、一〜二塩基付加・欠失するフレームシフト変異を導入すること、遺伝子の一部分、あるいは全領域を欠失させることによっても達成出来る（Wang, J. P. et al. 2006. J. Agric. Food Chem. 54: 9405-9410; Winkler, W. C. 2005. Curr. Opin. Chem. Biol. 9: 594-602; Qiu, Z. and Goodman, M. F. 1997. J. Biol. Chem. 272: 8611-8617; Wente, S. R. and Schachman, H. K. 1991. J. Biol. Chem. 266: 20833-20839）。また、コード領域の全体又は一部が欠失したような変異酵素をコードする遺伝子を構築し、相同組換えなどによって、該遺伝子でゲノム上の正常遺伝子を置換すること、又はトランスポゾン、IS因子を該遺伝子に導入することによっても酵素活性を低下または欠損させることができる。
【００８２】
例えば、上記の酵素の活性を低下または欠損させるような変異を遺伝子組換えにより導入する為には、以下のような方法が用いられる。目的遺伝子の部分配列を改変し、正常に機能する酵素を産生しないようにした変異型遺伝子を作製し、該遺伝子を含むＤＮＡで腸内細菌科に属する細菌に形質転換し、変異型遺伝子とゲノム上の遺伝子で組換えを起こさせることにより、ゲノム上の目的遺伝子を変異型に置換することが出来る。このような相同組換えを利用した遺伝子置換は、「Redドリブンインテグレーション(Red-driven integration)」と呼ばれる方法（Datsenko, K. A, and Wanner, B. L. 2000. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97:6640-6645）、Redドリブンインテグレーション法とλファージ由来の切り出しシステム（Cho, E. H., Gumport, R. I., Gardner, J. F. J. 2002. Bacteriol.
184: 5200-5203）とを組合わせた方法（WO2005/010175号参照）等の直鎖状ＤＮＡを用いる方法や、温度感受性複製起点を含むプラスミドを用いる方法などがある（米国特許第6303383号; 特開平05-007491号公報）。また、上述のような相同組換えを利用した遺伝子置換による部位特異的変異導入は、宿主上で複製能力を持たないプラスミドを用いても行うことが出来る。
【００８３】
好ましいＬ−リジン生産菌として、エシェリヒア・コリWC196ΔcadAΔldcC/pCABD2が挙げられる（WO2006/078039）。この菌株は、WC196株より、リジンデカルボキシラーゼをコードするcadA及びldcC遺伝子を破壊し、リジン生合成系遺伝子を含むプラスミドpCABD2（米国特許第6,040,160号）を導入することにより構築した株である。WC196株は、E. coli K-12に由来するW3110株から取得された株で、352位のスレオニンをイソロイシンに置換することによりＬ−リジンによるフィードバック阻害が解除されたアスパルトキナーゼIIIをコードする変異型lysC遺伝子（米国特許第5,661,012号）でW3110株の染色体上の野生型lysC遺伝子を置き換えた後、AEC耐性を付与することにより育種された（米国特許第5,827,698号）。WC196株は、Escherichia coli AJ13069と命名され、1994年12月6日、工業技術院生命工学工業技術研究所（現 独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に受託番号FERM P-14690として寄託され、1995年9月29日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-5252が付与されている(米国特許第5,827,698号)。WC196ΔcadAΔldcC自体も、好ましいＬ−リジン生産菌である。WC196ΔcadAΔldcCは、AJ110692と命名され、2008年10月7日独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に国際寄託され、受託番号FERM BP-11027が付与されている。
【００８４】
pCABD2は、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が解除された変異を有するエシェリヒア・コリ由来のジヒドロジピコリン酸合成酵素（DDPS）をコードする変異型dapA遺伝子と、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が解除された変異を有するエシェリヒア・コリ由来のアスパルトキナーゼIIIをコードする変異型lysC遺伝子と、エシェリヒア・コリ由来のジヒドロジピコリン酸レダクターゼをコードするdapB遺伝子と、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム由来ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼをコードするddh遺伝子を含んでいる（国際公開第WO95/16042、WO01/53459号パンフレット）。
【００８５】
上記のようなＬ−リジン生合成に関与する酵素の遺伝子発現を増強する手法、酵素活性を低下させる方法は、その他のＬ−アミノ酸生合成酵素をコードする遺伝子についても同様に適用することができる。
【００８６】
Ｌ−リジン生産能を有するコリネ型細菌としては、AEC耐性変異株（ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ11082（NRRL B-11470）株など：特公昭56-1914号公報、特公昭56-1915号公報、特公昭57-14157号公報、特公昭57-14158号公報、特公昭57-30474号公報、特公昭58-10075号公報、特公昭59-4993号公報、特公昭61-35840号公報、特公昭62-24074号公報、特公昭62-36673号公報、特公平5-11958号公報、特公平7-112437号公報、特公
平7-112438号公報参照）；その生育にＬ−ホモセリン等のアミノ酸を必要とする変異株（特公昭48-28078号公報、特公昭56-6499号公報参照）；AECに耐性を示し、更にＬ−ロイシン、Ｌ−ホモセリン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリン等のアミノ酸を要求する変異株（米国特許第3708395号及び第3825472号明細書参照）；ＤＬ−α-アミノ-ε-カプロラクタム、α-アミノ-ラウリルラクタム、アスパラギン酸-アナログ、スルファ剤、キノイド、Ｎ-ラウロイルロイシンに耐性を示すＬ−リジン生産変異株；オキザロ酢酸脱炭酸酵素（デカルボキシラーゼ）または呼吸系酵素阻害剤の耐性を示すＬ−リジン生産変異株（特開昭50-53588号公報、特開昭50-31093号公報、特開昭52-102498号公報、特開昭53-9394号公報、特開昭53-86089号公報、特開昭55-9783号公報、特開昭55-9759号公報、特開昭56-32995号公報、特開昭56-39778号公報、特公昭53-43591号公報、特公昭53-1833号公報）；イノシトールまたは酢酸を要求するＬ−リジン生産変異株（特開昭55-9784号公報、特開昭56-8692号公報）；フルオロピルビン酸または34℃以上の温度に対して感受性を示すＬ−リジン生産変異株（特開昭55-9783号公報、特開昭53-86090号公報）；エチレングリコールに耐性を示し、Ｌ−リジンを生産するブレビバクテリウム属またはコリネバクテリウム属の生産変異株（米国特許第4411997号明細書）などが挙げられる。
【００８７】
Ｌ−システイン生産菌
Ｌ−システイン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、フィードバック阻害耐性のセリンアセチルトランスフェラーゼをコードする異なるcysEアレルで形質転換されたE. coli JM15(米国特許第6,218,168号、ロシア特許出願第2003121601号)、細胞に毒性の物質を排出するのに適したタンパク質をコードする過剰発現遺伝子を有するE. coli W3110 (米国特許第5,972,663号)、システインデスルフォヒドラーゼ活性が低下したE. coli株 (特開平11-155571号)、cysB遺伝子によりコードされる正のシステインレギュロンの転写制御因子の活性が上昇したE. coli W3110 (国際公開第0127307号)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８８】
Ｌ−ロイシン生産菌
Ｌ−ロイシン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、ロイシン耐性のE. coil株 (例えば、57株 (VKPM B-7386, 米国特許第6,124,121号))またはβ-２-チエニルアラニン、３-ヒドロキシロイシン、４-アザロイシン、5,5,5-トリフルオロロイシンなどのロイシンアナログ耐性のE. coli株(特公昭62-34397号及び特開平8-70879号)、国際公開第96/06926号に記載された遺伝子工学的方法で得られたE. coli株、E. coli H-9068 (特開平8-70879号)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８９】
本発明に用いる細菌は、Ｌ−ロイシン生合成に関与する遺伝子の１種以上の発現が増大されることにより改良されていてもよい。このような遺伝子の例としては、好ましくはＬ−ロイシンによるフィードバック阻害が解除されたイソプロピルマレートシンターゼをコードする変異leuA遺伝子(米国特許第6,403,342号)に代表される、leuABCDオペロンの遺伝子が挙げられる。さらに、本発明に用いる細菌は、細菌の細胞からＬ−アミノ酸を排出するタンパク質をコードする遺伝子の１種以上の発現が増大されることにより改良されていてもよい。このような遺伝子の例としては、b2682遺伝子及びb2683遺伝子(ygaZH遺伝子) (欧州特許出願公開第1239041号)が挙げられる。
【００９０】
コリネ型細菌のＬ−イソロイシン生産菌としては、分岐鎖アミノ酸排出タンパク質をコードするbrnE遺伝子を増幅したコリネ型細菌（特開2001-169788）、Ｌ−リジン生産菌とのプロトプラスト融合によりＬ−イソロイシン生産能を付与したコリネ型細菌（特開昭62-74293）、ホモセリンデヒドロゲナーゼを強化したコリネ型細菌（特開昭62-91193）、スレオニンハイドロキサメート耐性株（特開昭62-195293）、α-ケトマロン耐性株（特開昭61-15695）、メチルリジン耐性株（特開昭61-15696）が挙げられる。
【００９１】
Ｌ−ヒスチジン生産菌
Ｌ−ヒスチジン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、E. coli 24株 (VKPM B-5945、ロシア特許第2003677号)、E. coli 80株 (VKPM B-7270、ロシア特許第2119536号)、E. coli NRRL B-12116 - B12121 (米国特許第4,388,405号)、E. coli H-9342 (FERM BP-6675)及びH-9343 (FERM BP-6676) (米国特許第6,344,347号)、E. coli H-9341 (FERM BP-6674) (欧州特許出願公開第1085087号)、E. coli AI80/pFM201 (米国特許第6,258,554号)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９２】
Ｌ−ヒスチジン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、Ｌ−ヒスチジン生合成系酵素をコードする遺伝子の１種以上の発現が増大した株も挙げられる。かかる遺伝子の例としては、ATPフォスフォリボシルトランスフェラーゼ遺伝子(hisG)、フォスフォリボシルAMPサイクロヒドロラーゼ遺伝子(hisI)、フォスフォリボシル-ATPピロフォスフォヒドロラーゼ遺伝子(hisI)、フォスフォリボシルフォルミミノ-5-アミノイミダゾールカルボキサミドリボタイドイソメラーゼ遺伝子(hisA)、アミドトランスフェラーゼ遺伝子(hisH)、ヒスチジノールフォスフェイトアミノトランスフェラーゼ遺伝子(hisC)、ヒスチジノールフォスファターゼ遺伝子(hisB)、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ遺伝子(hisD)などが挙げられる。
【００９３】
hisG及びhisBHAFIにコードされるＬ−ヒスチジン生合成系酵素はＬ−ヒスチジンにより阻害されることが知られており、従って、Ｌ−ヒスチジン生産能は、ATPフォスフォリボシルトランスフェラーゼ遺伝子(hisG)にフィードバック阻害への耐性を付与する変異を導入することにより効率的に増大させることができる(ロシア特許第2003677号及び第2119536号)。
【００９４】
Ｌ−ヒスチジン生産能を有する株の具体例としては、Ｌ−ヒスチジン生合成系酵素をコードするDNAを保持するベクターを導入したE. coli FERM-P 5038及び5048 (特開昭56-005099号)、アミノ酸輸送の遺伝子を導入したE. coli株(欧州特許出願公開第1016710号)、スルファグアニジン、DL-1,2,4-トリアゾール-3-アラニン及びストレプトマイシンに対する耐性を付与したE. coli 80株(VKPM B-7270, ロシア特許第2119536号)などが挙げられる。
【００９５】
Ｌ−グルタミン酸生産菌
Ｌ−グルタミン酸生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、E. coli VL334thrC＋ (EP 1172433)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。E. coli VL334 (VKPM B-1641)は、thrC遺伝子及びilvA遺伝子に変異を有するＬ−イソロイシン及びＬ−スレオニン要求性株である(米国特許第4,278,765号)。thrC遺伝子の野生型アレルは、野生型E. coli K-12株 (VKPM B-7)の細胞で増殖したバクテリオファージP1を用いる一般的形質導入法により導入された。この結果、Ｌ−イソロイシン要求性のＬ−グルタミン酸生産菌VL334thrC＋ (VKPM B-8961) が得られた。
【００９６】
Ｌ−グルタミン酸生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、Ｌ−グルタミン酸生合成系酵素１種又は２種以上の活性が増強された株が挙げられるが、これらに限定されない。かかる遺伝子の例としては、グルタメートデヒドロゲナーゼ（gdhA）、グルタミンシンテターゼ(glnA)、グルタメートシンテターゼ(gltAB)、イソシトレートデヒドロゲナーゼ(icdA)、アコニテートヒドラターゼ(acnA, acnB)、クエン酸シンターゼ(gltA)、メチルクエン酸シンターゼ（prpC）、フォスフォエノールピルベートカルボシラーゼ(ppc)、ピルベートデヒドロゲナーゼ(aceEF, lpdA)、ピルベートキナーゼ(pykA, pykF)、フォスフォエノールピルベートシンターゼ(ppsA)、エノラーゼ(eno)、フォスフォグリセロムターゼ(pgmA, pgmI)、フォスフォグリセレートキナーゼ(pgk)、グリセルアルデヒド-3-フォスフェートデヒドロゲナーゼ(gapA)、トリオースフォスフェートイソメラーゼ(tpiA)、
フルクトースビスフォスフェートアルドラーゼ(fbp)、フォスフォフルクトキナーゼ（pfkA, pfkB）、グルコースフォスフェートイソメラーゼ(pgi)などが挙げられる。これらの酵素の中では、グルタメートデヒドロゲナーゼ、クエン酸シンターゼ、フォスフォエノールピルベートカルボキシラーゼ、及びメチルクエン酸シンターゼが好ましい。
【００９７】
シトレートシンテターゼ遺伝子、フォスフォエノールピルベートカルボキシラーゼ遺伝子、及び／またはグルタメートデヒドロゲナーゼ遺伝子の発現が増大するように改変された株の例としては、欧州特許出願公開第1078989号、欧州特許出願公開第955368号及び欧州特許出願公開第952221号に開示されたものが挙げられる。
【００９８】
Ｌ−グルタミン酸生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、Ｌ−グルタミン酸の生合成経路から分岐してＬ−グルタミン酸以外の化合物の合成を触媒する酵素の活性が低下または欠損している株も挙げられる。このような酵素の例としては、イソシトレートリアーゼ(aceA)、α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ(sucA)、フォスフォトランスアセチラーゼ(pta)、アセテートキナーゼ(ack)、アセトヒドロキシ酸シンターゼ(ilvG)、アセトラクテートシンターゼ(ilvI)、フォルメートアセチルトランスフェラーゼ(pfl)、ラクテートデヒドロゲナーゼ(ldh)、グルタメートデカルボキシラーゼ(gadAB)などが挙げられる。α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ活性が欠損した、または、α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ活性が低下したエシェリヒア属に属する細菌、及び、それらの取得方法は米国特許第5,378,616 号及び第5,573,945号に記載されている。
【００９９】
具体例としては下記のものが挙げられる。
E. coli W3110sucA::Kmr
E. coli AJ12624 (FERM BP-3853)
E. coli AJ12628 (FERM BP-3854)
E. coli AJ12949 (FERM BP-4881)
【０１００】
E. coli W3110sucA::Kmr は、E. coli W3110のα-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ遺伝子（以下、「sucA遺伝子」ともいう）を破壊することにより得られた株である。この株は、α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼを完全に欠損している。
【０１０１】
また、α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ活性が低下したコリネ型細菌としては、例えば、以下の株が挙げられる。
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムL30-2株（特開2006-340603号明細書）
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムΔS株（国際公開95/34672号パンフレット）
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ12821(FERM BP-4172；フランス特許公報9401748号明細書参照)
ブレビバクテリウム・フラバムAJ12822 (FERM BP-4173；フランス特許公報9401748号明細書)
コリネバクテリウム・グルタミカムAJ12823(FERM BP-4174；フランス特許公報9401748号明細書)
コリネバクテリウム・グルタミカムL30-2株（特開2006-340603号）
【０１０２】
Ｌ−グルタミン酸生産菌の他の例としては、エシェリヒア属に属し、アスパラギン酸代謝拮抗物質に耐性を有するものが挙げられる。これらの株は、α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼを欠損していてもよく、例えば、E. coli AJ13199 (FERM BP-5807) (米国特許第5,908,768号)、さらにＬ−グルタミン酸分解能が低下したFFRM P-12379(米国特許第5,393,671号); AJ13138 (FERM BP-5565) (米国特許第6,110,714号)などが挙げられる。
【０１０３】
パントエア・アナナティスのＬ−グルタミン酸生産菌の例としては、パントエア・アナ
ナティスAJ13355株が挙げられる。同株は、静岡県磐田市の土壌から、低pHでＬ−グルタミン酸及び炭素源を含む培地で増殖できる株として分離された株である。パントエア・アナナティスAJ13355は、1998年2月19日に、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（住所  〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に、受託番号FERM P-16644として寄託され、1999年1月11日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-6614が付与されている。尚、同株は、分離された当時はエンテロバクター・アグロメランス（Enterobacter agglomerans）と同定され、エンテロバクター・アグロメランスAJ13355として寄託されたが、近年16S rRNAの塩基配列解析などにより、パントエア・アナナティス（Pantoea ananatis）に再分類されている。
【０１０４】
また、パントエア・アナナティスのＬ−グルタミン酸生産菌として、α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ（αKGDH）活性が欠損した、または、αKGDH活性が低下したパントエア属に属する細菌が挙げられる。このような株としては、AJ13355株のαKGDH-E1サブユニット遺伝子（sucA）を欠損させたAJ13356(米国特許第6,331,419号)、及びAJ13355株から粘液質低生産変異株として選択されたSC17株由来のsucA遺伝子欠損株であるSC17sucA(米国特許第6,596,517号)がある。AJ13356は、1998年2月19日、工業技術院生命工学工業技術研究所（現 独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に受託番号FERM P-16645として寄託され、1999年1月11日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-6616が付与されている。AJ13355及びAJ13356は、上記寄託機関にEnterobacter agglomeransとして寄託されているが、本明細書では、Pantoea ananatisとして記載する。また、SC17sucA株は、ブライベートナンバーAJ417が付与され、2004年2月26日に上記の産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号FERM BP-08646として寄託されている。
【０１０５】
さらに、パントエア・アナナティスのＬ−グルタミン酸生産菌として、SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB株、AJ13601株、NP106株、及びNA1株が挙げられる。SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB株は、SC17sucA株に、エシェリヒア・コリ由来のクエン酸シンターゼ遺伝子（gltA）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子（ppsA）、およびグルタメートデヒドロゲナーゼ遺伝子（gdhA）を含むプラスミドRSFCPG、並びに、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム由来のクエン酸シンターゼ遺伝子（gltA）を含むプラスミドpSTVCBを導入して得た株である。AJ13601株は、このSC17sucA/RSFCPG+pSTVCB株から低pH下で高濃度のＬ−グルタミン酸に耐性を示す株として選択された株である。また、NP106株は、AJ13601株からプラスミドRSFCPG+pSTVCBを脱落させた株である。AJ13601株は、1999年8月18日に、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に受託番号FERM P-17516として寄託され、2000年7月6日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-7207が付与されている。
【０１０６】
さらにコリネ型細菌にＬ−グルタミン酸生産能を付与する方法として、メカノセンシティブチャンネル（mechanosensitive channel）をコードするyggB遺伝子を増幅する方法（国際公開WO2006/070944号）、コード領域内に変異を導入した変異型yggB遺伝子を導入する方法を用いることも可能である。yggB遺伝子は、GenBank Accession No. NC_003450で登録されているコリネバクテリウム・グルタミカム ATCC 13032株のゲノム配列上の塩基番号1,337,692〜1,336,091（相補鎖）に位置し、NCgl1221とも呼ばれるGenBank accession No. NP_600492にて登録されている膜タンパク質をコードする遺伝子である。
【０１０７】
Ｌ−グルタミン酸生産能を付与または増強する別の方法として、有機酸アナログや呼吸阻害剤などへの耐性を付与する方法や細胞壁合成阻害剤に対する感受性を付与する方法も挙げられる。例えば、モノフルオロ酢酸耐性を付与する方法（特開昭50-113209）、アデニン耐性またはチミン耐性を付与する方法（特開昭57-065198）、ウレアーゼを弱化させ
る方法（特開昭52-038088）、マロン酸耐性を付与する方法（特開昭52-038088）、ベンゾピロンまたはナフトキノン類への耐性を付与する方法（特開昭56-1889）、HOQNO耐性を付与する方法（特開昭56-140895）、α-ケトマロン酸耐性を付与する方法（特開昭57-2689）、グアニジン耐性を付与する方法（特開昭56-35981）、ペニシリンに対する感受性を付与する方法（特開平4-88994）などが挙げられる。
このような耐性菌の具体例としては、下記のような菌株が挙げられる。
ブレビバクテリウム・フラバムAJ3949  (FERM BP-2632：特開昭50-113209参照)
コリネバクテリウム・グルタミカムAJ11628 (FERM P-5736；特開昭57-065198参照)
ブレビバクテリウム・フラバムAJ11355(FERM P-5007；特開昭56-1889号公報参照)
コリネバクテリウム・グルタミカムAJ11368(FERM P-5020；特開昭56-1889号公報参照)
ブレビバクテリウム・フラバムAJ11217(FERM P-4318；特開昭57-2689号公報参照)
コリネバクテリウム・グルタミカムAJ11218(FERM P-4319；特開昭57-2689号公報参照)
ブレビバクテリウム・フラバムAJ11564(FERM P-5472；特開昭56-140895公報参照)
ブレビバクテリウム・フラバムAJ11439(FERM P-5136；特開昭56-35981号公報参照)
コリネバクテリウム・グルタミカムH7684(FERM BP-3004；特開平04-88994号公報参照)
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ11426（FERM P-5123；特開平56-048890号公報参照）
コリネバクテリウム・グルタミカムAJ11440（FERM P-5137；特開平56-048890号公報参照）
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ11796（FERM P-6402；特開平58-158192号公報参照）
【０１０８】
Ｌ−フェニルアラニン生産菌
Ｌ−フェニルアラニン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、コリスミ酸ムターゼ-プレフェン酸デヒドロゲナーゼ及びチロシンリプレッサーを欠損したE. coli AJ12739 (tyrA::Tn10, tyrR) (VKPM B-8197)(国際公開03/044191号)、フィードバック阻害が解除されたコリスミ酸ムターゼ-プレフェン酸デヒドラターゼをコードする変異型pheA34遺伝子を保持するE. coli HW1089 (ATCC 55371) (米国特許第 5,354,672号)、E. coli MWEC101-b (KR8903681)、E. coli NRRL B-12141, NRRL B-12145, NRRL B-12146及びNRRL B-12147 (米国特許第4,407,952号)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。また、親株として、フィードバック阻害が解除されたコリスミ酸ムターゼ-プレフェン酸デヒドラターゼをコードする遺伝子を保持するE. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHAB] (FERM BP-3566)、E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHAD] (FERM BP-12659)、E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHATerm] (FERM BP-12662)及びAJ 12604と命名されたE. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pBR-aroG4, pACMAB] (FERM BP-3579)も使用できる(EP 488424 B1)。さらに、yedA遺伝子またはyddG遺伝子にコードされるタンパク質の活性が増大したエシェリヒア属に属するＬ−フェニルアラニン生産菌も使用できる(米国特許出願公開2003/0148473号及び2003/0157667、国際公開03/044192号)。
【０１０９】
コリネ型細菌のフェニルアラニン生産菌としては、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼまたはピルビン酸キナーゼ活性が低下したコリネバクテリウム・グルタミカBPS-13株 (FERM BP-1777, K77 (FERM BP-2062) 及び K78 (FERM BP-2063)（欧州特許公開公報331145号、特開平 02-303495号）、チロシン要求性株（特開平05-049489）等を使用することができる。
【０１１０】
また、フェニルアラニン生産菌としては、副生物を細胞内に取り込むように改変すること、例えば、Ｌ−トリプトファンの取り込み遺伝子tnaB, mtrや、Ｌ−チロシンの取り込み遺伝子であるtyrPの発現量を向上させることによっても、効率よくＬ−フェニルアラニンを生産する菌株を取得することができる（EP1484410）。
【０１１１】
Ｌ−トリプトファン生産菌
Ｌ−トリプトファン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、変異trpS遺伝子によりコードされるトリプトファニル-tRNAシンテターゼが欠損したE. coli JP4735/pMU3028 (DSM10122)及びJP6015/pMU91 (DSM10123) (米国特許第5,756,345号)、セリンによるフィードバック阻害を受けないフォスフォグリセリレートデヒドロゲナーゼをコードするserAアレル及びトリプトファンによるフィードバック阻害を受けないアントラニレートシンターゼをコードするtrpEアレルを有するE. coli SV164 (pGH5) (米国特許第6,180,373号)、トリプトファナーゼが欠損したE. coli AGX17 (pGX44) (NRRL B-12263)及びAGX6(pGX50)aroP (NRRL B-12264) (米国特許第4,371,614号)、フォスフォエノールピルビン酸生産能が増大したE. coli AGX17/pGX50,pACKG4-pps (WO9708333, 米国特許第6,319,696号)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。yedA遺伝子またはyddG遺伝子にコードされるタンパク質の活性が増大したエシェリヒア属に属するＬ−トリプトファン生産菌も使用できる(米国特許出願公開2003/0148473及び2003/0157667)。
【０１１２】
Ｌ−トリプトファン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、アントラニレートシンターゼ(trpE)、フォスフォグリセレートデヒドロゲナーゼ(serA)、３-デオキシ-Ｄ-アラビノヘプツロン酸-７-リン酸シンターゼ(aroG)、３-デヒドロキネートシンターゼ(aroB)、シキミ酸デヒドロゲナーゼ(aroE)、シキミ酸キナーゼ(aroL)、５-エノール酸ピルビルシキミ酸３-リン酸シンターゼ(aroA)、コリスミ酸シンターゼ(aroC)、プレフェン酸デヒドラターゼ、コリスミ酸ムターゼ及び、トリプトファンシンターゼ(trpAB)から選ばれる１種又は２種以上の酵素の活性が増強された株も挙げられる。プレフェン酸デヒドラターゼ及びコリスミ酸ムターゼは、２機能酵素（chorismate mutase/prephenate dehydrogenase (CM/PDH) ）としてpheA遺伝子によってコードされている。これらの酵素の中では、フォスフォグリセレートデヒドロゲナーゼ、３-デオキシ-Ｄ-アラビノヘプツロン酸-７-リン酸シンターゼ、３-デヒドロキネートシンターゼ、シキミ酸デヒドラターゼ、シキミ酸キナーゼ、５-エノール酸ピルビルシキミ酸３-リン酸シンターゼ、コリスミ酸シンターゼ、プレフェン酸デヒドラターゼ、コリスミン酸ムターゼ-プレフェン酸デヒドロゲナーゼが特に好ましい。アントラニレートシンターゼ及びフォスフォグリセレートデヒドロゲナーゼは共にＬ−トリプトファン及びＬ−セリンによるフィードバック阻害を受けるので、フィードバック阻害を解除する変異をこれらの酵素に導入してもよい。このような変異を有する株の具体例としては、脱感作型アントラニレートシンターゼを保持するE. coli SV164、及び、フィードバック阻害が解除されたフォスフォグリセレートデヒドロゲナーゼをコードする変異serA遺伝子を含むプラスミドpGH5 (国際公開94/08031号)をE. coli
SV164に導入することにより得られた形質転換株が挙げられる。
【０１１３】
Ｌ−トリプトファン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、阻害解除型アントラニレートシンターゼをコードする遺伝子を含むトリプトファンオペロンが導入された株(特開昭57-71397号, 特開昭62-244382号, 米国特許第4,371,614号)も挙げられる。さらに、トリプトファンオペロン(trpBA)中のトリプトファンシンターゼをコードする遺伝子の発現を増大させることによりＬ−トリプトファン生産能を付与してもよい。トリプトファンシンターゼは、それぞれtrpA及びtrpB遺伝子によりコードされるα及びβサブユニットからなる。さらに、イソシトレートリアーゼ-マレートシンターゼオペロンの発現を増大させることによりＬ−トリプトファン生産能を改良してもよい(国際公開2005/103275号)。
【０１１４】
コリネ型細菌としてはサルフアグアニジンに耐性株であるコリネバクテリウム・グルタミクムAJ12118（FERM BP-478  特許01681002号）、トリプトファンオペロンが導入されたコリネ型細菌（特開昭63240794号公報）、コリネ型細菌由来のシキミ酸キナーゼをコードする遺伝子を導入したコリネ型細菌（特開01994749号公報）を用いることができる。
【０１１５】
Ｌ−プロリン生産菌
Ｌ−プロリン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、ilvA遺伝子が欠損し、Ｌ−プロリンを生産できるE. coli 702ilvA (VKPM B-8012) (欧州特許公開公報1,172,433号)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１６】
本発明に用いる細菌は、Ｌ−プロリン生合成に関与する遺伝子の一種以上の発現を増大することにより改良してもよい。Ｌ−プロリン生産菌に好ましい遺伝子の例としては、Ｌ−プロリンによるフィードバック阻害が解除されたグルタメートキナーゼをコードするproB遺伝子(ドイツ特許第3127361号)が挙げられる。さらに、本発明に用いる細菌は、細菌の細胞からＬ−アミノ酸を排出するタンパク質をコードする遺伝子の一種以上の発現が増大することにより改良してもよい。このような遺伝子としては、b2682 遺伝子及びb2683遺伝子(ygaZH遺伝子) (欧州特許公開公報1,239,041号)が挙げられる。
【０１１７】
Ｌ−プロリン生産能を有するエシェリヒア属に属する細菌の例としては、NRRL B-12403及びNRRL B-12404 (英国特許第2075056号)、VKPM B-8012 (ロシア特許出願2000124295)、ドイツ特許第3127361号に記載のプラスミド変異体、Bloom F.R. et al (The 15th Miami winter symposium, 1983, p.34)に記載のプラスミド変異体などのE. coli 株が挙げられる。
【０１１８】
Ｌ−アルギニン生産菌
Ｌ−アルギニン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、E. coli 237株 (VKPM B-7925) (米国特許出願公開2002/058315号)、及び、変異N-アセチルグルタメートシンターゼを保持するその誘導株(ロシア特許出願第2,001,112,869号)、E. coli 382株 (VKPM B-7926) (欧州特許公開公報1,170,358号)、N-アセチルグルタメートシンテターゼをコードするargA遺伝子が導入されたアルギニン生産株(欧州特許公開公報1,170,361号)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１９】
Ｌ−アルギニン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、Ｌ−アルギニン生合成系酵素をコードする遺伝子の１種以上の発現が増大した株も挙げられる。かかる遺伝子の例としては、N-アセチルグルタミルフォスフェートレダクターゼ遺伝子(argC)、オルニチンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子(argJ)、N-アセチルグルタメートキナーゼ遺伝子(argB)、アセチルオルニチントランスアミナーゼ遺伝子(argD)、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ遺伝子(argF)、アルギノコハク酸シンテターゼ遺伝子(argG)、アルギノコハク酸リアーゼ遺伝子(argH)、カルバモイルフォスフェートシンテターゼ遺伝子(carAB)が挙げられる。
【０１２０】
Ｌ−バリン生産菌
Ｌ−バリン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、ilvGMEDAオペロンを過剰発現するように改変された株(米国特許第5,998,178号)が挙げられるが、これらに限定されない。アテニュエーションに必要なilvGMEDAオペロンの領域を除去し、生産されるＬ−バリンによりオペロンの発現が減衰しないようにすることが好ましい。さらに、オペロンのilvA遺伝子が破壊され、スレオニンデアミナーゼ活性が減少することが好ましい。
Ｌ−バリン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、アミノアシルt-RNAシンテターゼの変異を有する変異株(米国特許第5,658,766号)も挙げられる。例えば、イソロイシンtRNAシンテターゼをコードするileS 遺伝子に変異を有するE. coli VL1970が使用できる。E. coli VL1970は、1988年6月24日、ロシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオルガニズムズ(VKPM) (1 Dorozhny proezd., 1 Moscow 117545, Russia)に、受託番号VKPM B-4411で寄託されている。
さらに、生育にリポ酸を要求する、及び／または、H+-ATPaseを欠失している変異株(国際公開96/06926号)を親株として用いることができる。
【０１２１】
コリネ型細菌のＬ−バリン生産菌としては、例えば、Ｌ−バリン酸生合成に関与する酵素をコードする遺伝子の発現が増強するように改変した菌株を挙げることができる。Ｌ−バリン酸生合成に関与する酵素としては、例えば、ilvBNCオペロンによりコードされる酵素、すなわちilvBNによりコードされるアセトヒドロキシ酸シンターゼやivlCによりコードされるイソメロリダクターゼ(国際公開00/50624号)が挙げられる。尚、ilvBNCオペロンは、Ｌ−バリン及び/又はＬ−イソロイシン及び/又はＬ−ロイシンによるオペロンの発現調節を受けるので、生成するＬ−バリンによる発現抑制を解除するためにアテニュエーションを解除することが望ましい。
【０１２２】
Ｌ−バリン生産能を有するコリネ型細菌としては、Ｌ−バリン産生を減少させる物質代謝経路に関与する、少なくとも１種の酵素の活性を低下あるいは欠損させることにより行ってもよい。例えば、Ｌ−ロイシン合成に関与するスレオニンデヒドラターゼやD-パントセナート合成に関与する酵素の活性を低下させることが考えられる（国際公開00/50624号）。
【０１２３】
Ｌ−バリン生産能を付与する別の方法として、アミノ酸アナログなどへの耐性を付与する方法も挙げられる。
例えば、Ｌ−イソロイシンおよびＬ−メチオニン要求性，ならびにＤ-リボ-ス，プリンリボヌクレオシドまたはピリミジンリボヌクレオシドに耐性を有し，かつＬ−バリン生産能を有する変異株（FERM P-1841、FERM P-29、特公昭53-025034） や、ポリケトイド類に耐性を有する変異株(FERM P-1763、FERM P-1764、特公平06-065314) 、更には酢酸を唯一の炭素源とする培地でＬ−バリン耐性を示し、且つグルコースを唯一の炭素源とする培地でピルビン酸アナログ(フルオロピルビン酸等)に感受性を有する変異株（FERM BP-3006、FERM BP-3007、特許3006929号）が挙げられる。
【０１２４】
Ｌ−イソロイシン生産菌
Ｌ−イソロイシン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、６-ジメチルアミノプリンに耐性を有する変異株(特開平5-304969号)、チアイソロイシン、イソロイシンヒドロキサメートなどのイソロイシンアナログに耐性を有する変異株、さらにDL-エチオニン及び／またはアルギニンヒドロキサメートに耐性を有する変異株(特開平5-130882号).が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、スレオニンデアミナーゼ、アセトヒドロキシ酸シンターゼなどのＬ−イソロイシン生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子で形質転換された組換え株もまた親株として使用できる(特開平2-458号, FR 0356739, 及び米国特許第5,998,178号)。
【０１２５】
コリネ型細菌のＬ−イソロイシン生産菌としては、分岐鎖アミノ酸排出タンパク質をコードするbrnE遺伝子を増幅したコリネ型細菌（特開2001-169788）、Ｌ−リジン生産菌とのプロトプラスト融合によりＬ−イソロイシン生産能を付与したコリネ型細菌（特開昭62-74293）、ホモセリンデヒドロゲナーゼを強化したコリネ型細菌（特開昭62-91193）、スレオニンハイドロキサメート耐性株（特開昭62-195293）、α-ケトマロン耐性株（特開昭61-15695）、メチルリジン耐性株（特開昭61-15696）が挙げられる。
【０１２６】
Ｌ−メチオニン生産菌
Ｌ−メチオニン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、Ｌ−スレオニン要求株、ノルロイシンに耐性を有する変異株が挙げられるが、これらに限定されない(特開2000-139471号)。さらに、メチオニンリプレッサーを欠損した株や、ホモセリントランスサクシニラーゼ、シスタチオニンγ-シンテースなどのＬ−メチオニン生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子で形質転換された組換え株もまた親株として使用できる(特開2000-139471号)。
【０１２７】
次に、微生物に核酸生産能を付与する方法と核酸生産菌について例示する。
核酸生産能を有する細菌微生物は、上記のような細菌微生物に、例えば、プリンヌクレオシド要求性、又はさらにプリンアナログ等の薬剤に対する耐性を付与することにより、取得することが出来る（特公昭３８−２３０９９、特公昭５４−１７０３３、特公昭５５−４５１９９、特公昭５７−１４１６０、特公昭５７−４１９１５、特公昭５９−４２８９５参照）。例えば、栄養要求性及び薬剤耐性を持つバチルス属細菌は、Ｎ-メチル-Ｎ'-ニトロ-Ｎ-ニトロソグアニジン（NTG）、またはＥＭＳ(エタンメタンスルフォネート)等の通常の変異処理に用いられている変異剤による処理によって取得することが出来る。
【０１２８】
プリンヌクレオシドを生産するバチルス属細菌としては、以下のものが挙げられる。
バチルス属に属するイノシン生産株の具体例として、バチルス・ズブチリスKMBS16株を使用することができる。同菌株は、プリンオペロンリプレッサーをコードするpurR遺伝子の欠損（purR::spc）、スクシニル−ＡＭＰシンターゼをコードするpurA遺伝子の欠損（purA::erm）、およびプリンヌクレオシドホスホリラーゼをコードするdeoD遺伝子の欠損（deoD::kan）が導入された、既知のバチルス・ズブチリスtrpC2株（168 Marburg）の誘導体である（特開2004-242610、US2004166575A1）。また、バチルス・ズブチリス菌株AJ3772（FERM P-2555）（特開昭62-014794）等を使用することもできる。
【０１２９】
グアノシン生産能を有するバチルス属細菌としては、ＩＭＰ脱水素酵素の活性が上昇したバチルス属細菌（特開平3-58787）、プリンアナログ耐性又はデコイニン耐性遺伝子が組み込まれているベクターをアデニン要求性変異株に導入したバチルス属細菌（特公平4-28357）等が挙げられる。
【０１３０】
またプリンヌクレオチドを生産するバチルス属細菌としては、以下のものが挙げられる。
イノシン酸生産菌としては、バチルス・ズブチリスのフォスファターゼ活性が弱化したイノシン生産株が報告されている（Uchida, K. et al., Agr. Biol. Chem., 1961, 25, 804-805、Fujimoto, M. Uchida, K., Agr. Biol. Chem., 1965, 29, 249-259）。グアニル酸生産菌としては、アデニン要求性を有しさらにデコイニンまたはメチオニンスルフォキシドに耐性を有し、かつ５'−グアニル酸（グアノシン−５'−モノリン酸、以下「GMP」ともいう）生産能を有するバチルス属の変異株が挙げられる（特公昭５６−１２４３８号公報）。
【０１３１】
また、キサンチル酸生産菌は、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Corynebacterium ammmoniagenes）を中心とするコリネ型細菌の育種に用いたられる方法を使用して構築することができる。例えば、PRPP amidotransferaseを強化株（特開平8-168383）、脂肪族アミノ酸耐性株（特開平4-262790）、デヒドロプロリン耐性株（韓国特許公開公報2003-56490）を取得することによって、キサンチル酸生産菌を構築することができる。
【０１３２】
また、プリン系物質生産能を有するバチルス属細菌を育種する方法として、以下の方法が挙げられる。プリンヌクレオシド及びプリンヌクレオチドに共通のプリン生合成に関与する酵素、すなわちプリン生合成酵素の細胞内での活性を上昇させる方法が挙げられる。該酵素の細胞内での活性は、バチルス属細菌の非改変株、例えば野生型のバチルス属細菌よりも上昇させることが好ましい。「活性が上昇する」とは、例えば、細胞当たりの酵素分子の数が増加した場合や、酵素分子当たりの比活性が上昇した場合などが該当する。例えば、前記酵素の遺伝子の発現量を上昇させることにより活性を上昇させることができる。前記プリン生合成に関与する酵素としては、たとえばホスホリボシルピロリン酸アミドトランスフェラーゼ、ホスホリボシルピロリン酸シンセターゼ（PRPP synthetase  [EC:2.7.6.1]）などが挙げられる
【０１３３】
ペントースリン酸系に取り込まれたグルコースなどの糖源が代謝により生成したカタボライトの一部は、リブロース−５−リン酸を経由して、リボース−５−リン酸となる。生合成されたリボース−５−リン酸より、プリンヌクレオシド、ヒスチジン、およびトリプトファン生合成の不可欠な前駆物質であるホスホリボシルピロリン酸（ＰＲＰＰ）が生成される。具体的には、リボース−５−リン酸は、ホスホリボシルピロリン酸シンセターゼによりＰＲＰＰに転換される。したがって、ホスホリボシルピロリン酸シンセターゼの活性が上昇するように改変することにより、バチルス属細菌にプリン系物質生産能を付与又は増強することができる。
【０１３４】
「ホスホリボシルピロリン酸シンセターゼの活性が上昇する」とは、ホスホリボシルピロリン酸シンセターゼの活性が野生株又は親株等の非改変株に対して増加していることをいう。ホスホリボシルピロリン酸シンセターゼの活性は例えば、Switzer等の方法（Methods Enzymol., 1978, 51, 3-11）、Roth等の方法（Methods Enzymol., 1978, 51, 12-17）により、測定することができる。ホスホリボシルピロリン酸シンセターゼの活性が上昇したバチルス属細菌は、例えば、特開2004-242610号公報に記載の方法と同様にして、プラスミドを用いる方法や染色体上に組込む方法などにより、ホスホリボシルピロリン酸シンセターゼをコードする遺伝子をバチルス属細菌で高発現させることにより作製することができる。
【０１３５】
一方、プリンヌクレオシド、ヒスチジン、およびトリプトファン生合成に不可欠な前駆物質であるPRPPが生成されると、その一部は、プリン生合成に関与する酵素群によりプリンヌクレオチド、プリンヌクレオシドへと変換される。そのような酵素群をコードする遺伝子としては、バチルス・ズブチリスのプリンオペロン、具体的にはpurEKB-purC(orf)QLF-purMNH(J)-purDオペロンの遺伝子（Ebbole DJ and Zalkin H, J. Biol. Chem., 1987, 262, 17, 8274-87）（現在では、purEKBCSQLFMNHDとも呼ばれる：Bacillus subtilis and
Its Closest Relatives, Editor in Chief: A.L. Sonenshein, ASM Press, Washington D.C., 2002。GenBank Accession No.NC_000964）、およびエシェリヒア・コリのpurレギュロンの遺伝子（Escherichia and Salmonella, Second Edition, Editor in Chief: F.C. Neidhardt, ASM Press, Washington D.C., 1996）が例示される。
【０１３６】
したがって、これらの遺伝子の発現を増強することにより、プリン系物質生産能を付与又は増強することもできる。なお、本発明に用いることが出来るプリンオペロン遺伝子はこれらのものには限定されず、他の微生物や動植物由来の遺伝子も利用することも出来る。
【０１３７】
プリンオペロンの発現量を増大させる方法としては、プラスミドを用いる方法や染色体上に組込む方法などにより、プリンオペロン遺伝子をバチルス属細菌で高発現させる方法が挙げられる。
【０１３８】
プリンオペロンの発現量を増大させる第２の方法として、プリンオペロン固有のプロモーターをより強力なプロモーターに置換することや、固有のプロモーターの-35、-10領域をコンセンサス配列に置換することが挙げられる。
【０１３９】
例えば、バチルス・ズブチリス（B. subtilis 168 Marburg株; ATCC6051）では、プリンオペロンの-35配列はコンセンサス配列（TTGACA）であるが、-10配列はTAAGATであり、コンセンサス配列TATAATとは異なっている（Ebbole, D. J. and H. Zalikn, J. Biol. Chem., 1987, 262, 8274-8287）。したがって、-10配列（TAAGAT）をコンセンサス配列にすること、あるいはコンセンサス配列に近づけ、TATAAT、またはTATGAT、もしくはTAAAATとなるように改変することで、プリンオペロンの転写活性を上昇させることができる。なお
、プロモーター配列の置換は、下記の遺伝子置換と同様の方法で行うことが出来る。
【０１４０】
プリンオペロンの発現量を増大させる第３の方法として、プリンオペロンのリプレッサーの発現量を低下させる方法も挙げられる（USP6,284,495号）。「プリンオペロンのリプレッサーの発現」とは、プリンオペロン遺伝子の転写、及び転写産物の翻訳の両方を含む。また、「発現量を低下させる」とは、発現量が、非改変株、例えば野生型のバチルス属細菌における発現量よりも低いこと、及び、発現が実質的に消失していることを含む。
【０１４１】
プリンペオペロンのリプレッサー（プリンリプレッサー）の発現量を低下させるためには、例えば、バチルス属細菌を紫外線照射またはＮＴＧもしくはＥＭＳ等の通常変異処理に用いられている変異剤によって処理し、プリンリプレッサーの発現量が低下した変異株を選択する方法を採用することができる。
【０１４２】
また、プリンリプレッサーの発現量が低下したバチルス属細菌は、変異処理の他に、例えば、遺伝子組換え法を用いた相同組換え法（Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory press (1972); Matsuyama, S. and Mizushima, S., J. Bacteriol., 1985, 162, 1196-1202）により、染色体上のプリンリプレッサーをコードする遺伝子（purR；GenBank Accession NC_000964（コード領域は塩基番号54439〜55293）を、正常に機能しない遺伝子（以下、「破壊型遺伝子」ということがある）で置換することによって得ることができる。
【０１４３】
さらに、プリン系物質の細胞内への取り込みを弱化することによっても、プリン系物質生産能を強化することができる。例えば、プリンヌクレオシドの細胞内へ取り込みは、プリンヌクレオシドの細胞内への取り込みに関与する反応を遮断することによって弱化することができる。上記プリンヌクレオシドの細胞内への取り込みに関与する反応は、たとえばヌクレオシドパーミアーゼに触媒される反応である。
【０１４４】
さらに、プリンヌクレオシドを製造する場合には、プリンヌクレオシド生産能を増強させるためにプリン系物質を分解する酵素の活性を低下させてもよい。このような酵素として、例えば、プリンヌクレオシドホスホリラーゼが挙げられる。
【０１４５】
PRPPから、プリン生合成に関与する酵素群により生合成されたプリンヌクレオチドは、脱リン酸化されて、プリンヌクレオシドに変換される。プリンヌクレオシドを効率的に蓄積せしめるためには、プリンヌクレオシドを更に分解してヒポキサンチン等とするプリンヌクレオシドホスホリラーゼの活性を低下させることが好ましい。すなわち、イノシンをはじめとするプリンヌクレオシドを基質とするプリンヌクレオシドホスホリラーゼを弱化、あるいは欠損させるように改変することが望ましい。
【０１４６】
プリンヌクレオシドホスホリラーゼ活性の低下は、具体的には、バチルス属細菌でプリンヌクレオシドホスホリラーゼをコードするdeoD遺伝子とpupG遺伝子を破壊することによって達成することができる。本発明のバチルス属細菌は、上記のようなdeoD遺伝子とpupG遺伝子を単独、または同時に破壊するように改変されたものであってもよい。deoD遺伝子、pupG遺伝子は、例えばバチルス属由来の遺伝子（deoD;GenBank Accession No. NC_000964(コード領域は2134672-2135370), pupG;GenBank Accession No. NC_000964(コード領域は2445610-2446422)が利用できる。
【０１４７】
また、プリン系物質生産能を増強させるために、サクシニル−AMPシンターゼの活性を低下させてもよい。サクシニル−AMPシンターゼをコードする遺伝子としては、purA遺伝子が挙げられる。purA遺伝子としては、例えば、GenBank Accession No. NC_000964（コード領域は相補鎖の塩基番号4153460-4155749）で登録されている塩基配列を有するもの
が挙げられる。
【０１４８】
さらに、プリン系物質生産能を増強させるために、イノシンモノリン酸（IMP）脱水素酵素の活性を低下させてもよい。ＩＭＰ脱水素酵素をコードする遺伝子としては、guaB遺伝子が挙げられる。guaB遺伝子としては、例えば、GenBank Accession No.NC_000964(コード領域は15913-17376)で登録されている塩基配列を有するものが挙げられる。
【０１４９】
また、プリン系物質生産能を増強させる方法として、プリン系物質を排出する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を増幅することが考えられる。このような遺伝子が増幅された細菌としては、例えば、rhtA遺伝子を増幅したバチルス属細菌が挙げられる（特開2003-219876）。
【０１５０】
遺伝子組換えにより、上記のＬ−アミノ酸生産菌を育種する場合、使用する遺伝子は、上述した遺伝子情報を持つ遺伝子や、公知の配列を有する遺伝子に限られず、保存的バリアント、すなわちコードされるタンパク質の機能が損なわれない限り、その遺伝子のホモログや人為的な改変体等、保存的変異を有する遺伝子も使用することができる。すなわち、公知のタンパク質のアミノ酸配列において、１若しくは数個の位置での１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加等を含む配列を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。保存的バリアント等については、前記のキシラナーゼ及びそれをコードする遺伝子について記載したのと同様である。
【０１５１】
＜３−２＞目的物質の製造における微生物の培養
本発明の方法により製造された糖液又はその分画物（以下、併せて「糖」と記載することがある。）を炭素源として、目的物質生産能を有する微生物を培養し、培地又は微生物細胞から目的物質を採取する。
炭素源として上記糖を用いること以外は、通常の発酵法と同様の方法を用いることができる。
【０１５２】
本発明の方法は、回分培養（batch culture）、流加培養（Fed-batch culture）、連続培養法（continuous culture）のいずれも用いることができ、本発明により得られる糖は、初発培地に含まれていてもよいし、流加培地に含まれていてもよいし、これらの両方に含まれていてもよい。
【０１５３】
流加培養とは、培養容器に培地を連続的または間欠的に流加し、培養終了時までその培地を容器から抜き取らない培養方法をいう。また連続培養とは、培養容器に培地を連続的または間欠的に流加するとともに容器から培地（通常、流加する培地と等量）を抜き取る方法をいう。また、初発培地とは、流加培養または連続培養において流加培地を流加させる前の回分培養（batch培養）に用いる培地（培養開始時の培地）のことを意味し、流加培地とは流加培養または連続培養を行う際に発酵槽に供給する培地を意味する。また、回分培養（batch培養）とは、一回毎に新たな培地を用意し、そこへ株を植えて収穫まで培地を加えない方法を意味する。
【０１５４】
糖は、目的物質を製造するのに適した濃度であればどのような濃度で用いてもかまわない。培地中の糖濃度としては、、好ましくは0.05w/v%〜50w/v%程度、より好ましくは0.1w/v%〜40w/v%程度、特に好ましくは0.2w/v%〜20w/v%程度培地に含有させる。本発明の方法により製造される糖は、単独で用いることも出来るし、他の方法で得られたグルコース、あるいは、フラクトース、スクロース、廃糖蜜、澱粉加水分解物などの他の炭素源と組み合わせて用いることも出来る。この場合、本発明の方法により得られる糖と他の炭素源は任意の比率で混合することが可能である。他の炭素源として好ましいのは、フラクトース、スクロース、ラクトース、ガラクトース、廃糖蜜、澱粉加水分解物や、他のバイオマス
の加水分解により得られた糖液などの糖類、エタノール、グリセロールなどのアルコール類、フマール酸、クエン酸、コハク酸等の有機酸類である。
【０１５５】
使用する培地は、炭素源として本発明の方法により得られる糖を用いる以外は、微生物を用いたＬ−アミノ酸の発酵生産において従来より用いられてきた培地を用いることができる。すなわち、炭素源に加えて、窒素源、無機イオン及び必要に応じその他の有機成分を含有する通常の培地を用いることができる。ここで、窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、ウレア等の無機アンモニウム塩または硝酸塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガス、アンモニア水等を用いることができる。また、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、麦芽エキス、コーンスティープリカー、大豆加水分解物等も利用できる。培地中にこれらの窒素源が１種のみ含まれていてもよいし、２種以上含んでいてもよい。これらの窒素源は、初発培地にも流加培地にも用いることができる。また、初発培地、流加培地とも、同じ窒素源を用いてもよいし、流加培地の窒素源を初発培地と異なるものを使用してもよい。
【０１５６】
培地には、炭素源、窒素源の他にリン酸源、硫黄源が含まれていることが好ましい。リン酸源としては、リン酸２水素カリウム、リン酸水素２カリウム、ピロリン酸などのリン酸ポリマー等が利用出来る。また、硫黄源とは、硫黄原子を含んでいるものであればいずれでもよいが、硫酸塩、チオ硫酸塩、亜硫酸塩等の硫酸塩、システイン、シスチン、グルタチオン等の含硫アミノ酸が望ましく、なかでも硫酸アンモニウムが望ましい。
【０１５７】
また、培地には、上記成分の他に、増殖促進因子（増殖促進効果を持つ栄養素）が含まれていてもよい。増殖促進因子とは、微量金属類、アミノ酸、ビタミン、核酸、更にこれらのものを含有するペプトン、カザミノ酸、酵母エキス、大豆たん白分解物等が使用できる。微量金属類としては、鉄、マンガン、マグネシウム、カルシウム等が挙げられ、ビタミンとしては、ビタミンB1、ビタミンB2、ビタミンB6、ニコチン酸、ニコチン酸アミド、ビタミンB12等が挙げられる。これらの増殖促進因子は初発培地に含まれていてもよいし、流加培地に含まれていてもよい。
【０１５８】
また、培地には、生育にアミノ酸などを要求する栄養要求性変異株を使用する場合には要求される栄養素を補添することが好ましい。特に本発明に用いることができるＬ−リジン生産菌は、後述のようにＬ−リジン生合成経路が強化されており、Ｌ−リジン分解能が弱化されているものが多いので、Ｌ−スレオニン、Ｌ−ホモセリン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−メチオニンから選ばれる１種又は２種以上を添加することが望ましい。初発培地と流加培地は、培地組成が同じであってもよく、異なっていてもよい。また、初発培地と流加培地は、硫黄濃度が同じであってもよく、異なっていてもよい。さらには、流加培地の流加が多段階で行われる場合、各々の流加培地の組成は同じであってもよく、異なっていてもよい。
【０１５９】
なお、本発明で用いる培地は、炭素源、窒素源、及び必要に応じてその他の成分を含む培地であれば、天然培地、合成培地のいずれでもよい。
【０１６０】
培養は好気的条件下で1〜7日間実施するのがよく、培養温度は20℃〜45℃、好ましくは24℃〜45℃、特に好ましくは33〜42℃で培養することが好ましい。培養は通気培養が好ましく、酸素濃度は、飽和濃度に対して5〜50%に、望ましくは10%程度に調節して行うことが好ましい。また、培養中のpHは5〜9が好ましい。尚、pH調整には無機あるいは有機の酸性あるいはアルカリ性物質、例えば炭酸カルシウム、アンモニアガス、アンモニア水等を使用することができる。
【０１６１】
上記のような条件下で、好ましくは10時間〜120時間程度培養することにより、培養液
中に著量の目的物質が蓄積される。
【０１６２】
また、Ｌ−リジン等の塩基性アミノ酸を製造する際には、培養中のpHが6.5〜9.0、培養終了時の培地のpHが7.2〜9.0となるように制御し、発酵中の発酵槽内圧力が正となるように制御する、あるいは、炭酸ガスもしくは炭酸ガスを含む混合ガスを培地に供給して、培地中の重炭酸イオン及び／又は炭酸イオンが少なくとも2g/L以上存在する培養期があるようにし、前記重炭酸イオン及び／又は炭酸イオンを塩基性アミノ酸を主とするカチオンのカウンタイオンとする方法で発酵し、目的の塩基性アミノ酸を回収する方法で製造を行ってもよい（特開2002-65287、US2002-0025564A、EP1813677A）。
【０１６３】
また、Ｌ−グルタミン酸発酵においては、Ｌ−グルタミン酸が析出するような条件に調整された液体培地を用いて、培地中にＬ−グルタミン酸を析出させながら培養を行うことも出来る。Ｌ−グルタミン酸が析出する条件としては、例えば、pH5.0〜4.0、好ましくはpH4.5〜4.0、さらに好ましくはpH4.3〜4.0、特に好ましくはpH4.0を挙げることができる。（欧州特許出願公開第1078989号明細書）
【０１６４】
培養液からの目的物質の回収は通常イオン交換樹脂法、沈殿法その他の公知の方法を組み合わせることにより実施できる。なお、菌体内に目的物質が蓄積する場合には、例えば菌体を超音波などにより破砕し、遠心分離によって菌体を除去して得られる上清からイオン交換樹脂法などによって、目的物質を回収することができる。目的物質がアミノ酸又は核酸の場合は、回収される目的物質は、フリー体であっても、硫酸塩、塩酸塩、炭酸塩、アンモニウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩を含む塩であってもよい。
【０１６５】
また、本発明において採取される目的物質は、目的物質以外に微生物菌体、培地成分、水分、及び微生物の代謝副産物を含んでいてもよい。採取された目的物質の純度は、50%以上、好ましくは85%以上、特に好ましくは95%以上である  （US5,431,933, JP1214636B,
US4,956,471, US4,777,051, US4946654, US5,840358, US6,238,714, US2005/0025878）。
【実施例】
【０１６６】
以下、実施例により、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこの実施例により限定されるものではない。
【０１６７】
〔実施例１〕担子菌株の分離
（１）バガス堆肥の採取
サトウキビバガスと牛糞便を混合し、発酵させたバガス堆肥を、畜産農家より取得した。このバガス堆肥には、発酵期間が異なる複数のサンプルがある。
【０１６８】
（２）リグニン分解能を持つ担子菌株の分離
上記バガス堆肥より、リマゾール・ブリリアント・ブルー R (Sigma Aldrich社製。 以下、「RBBR」と略す)の分解を指標に、リグニン分解活性を持つ菌株の分離を試みた。RBBRは青色を呈する色素化合物であり、リグニンペルオキシダーゼ、マンガンペルオキシダーゼなどのリグニンの分解に関与する酵素を産生する菌は、RBBRを脱色できることが報告されている（紙パルプ技術協会誌：50, 1806-1815 (1996)）。
【０１６９】
ポテトデキストロース培地（Potato dextrose broth、Becton Dickinson社製）とバクトアガー（Bact Agar、Becton Dickinson社製）を用いて作製した1/2ポテトデキストロース寒天培地（1/2 PDA培地）にクロラムフェニコール（和光純薬社製。0.1 g/L）とベノミル（Sigma Aldrich社製）及びRBBR（0.3 g/L）を添加したものを、分離用培地として用いた。
【０１７０】
バガス堆肥の適当量のサンプルを0.9 % NaCl溶液に懸濁して分離用培地に塗布し、25℃で培養を行った。培養中に随時、それらの培地を観察したところ、糸状菌が非常に旺盛に生育して培地表面に広がる様子が見られたため、RBBR分解ハローの形成有無に関わらず、担子菌様のコロニーと判断したもの全てを、新しい分離用培地に植え継ぐ作業を繰り返し行なった。以上の分離操作を繰り返し行った結果、RBBRの脱色によるハローを形成する株を1株見出し、PRB1Y-1株と命名した。
【０１７１】
〔実施例２〕PRB1Y-1株の持つリグニン分解能の確認
1/2 PDA培地に生育させたPRB1Y-1のコロニー外縁をストローで打ち抜いたアガーディスク１個を、10 ml ポテトデキストロース培地(PDB)に植菌し、25℃で1週間振とう培養を行った。培養後の培養液1ml を、0.5 % リグニンおよび0.1 % 硫酸アンモニアを含む10mlのPDBに接種して25℃で1週間振とう培養した後に、遠心培養上清の吸光度（480 nm及び275 nm）を測定した。また、比較対象としてリグニン分解能が知られているヒラタケ及びシイタケについても同様の試験を行った。その結果を図１に示す。比較対象と同様に、PRB1Y-1株はリグニンに由来する培地の色（480 nm）を脱色し、リグニンの芳香環に由来する275
nmの吸光度を減少させることが示され、本株がリグニン分解能を持つことが示された。
【０１７２】
〔実施例３〕PRB1Y-1株の同定
UltraCleanＴＭ Soil DNA Isolation Kit（MO BIO Laboratories社製）を用いてPRB1Y-1株のゲノムDNAを調製した。調製したゲノムDNAを鋳型として、プライマー E21fおよびE1775r（表２、配列番号２、１０）を用いたPCR反応（96℃ 10秒、[96℃ 30秒、50℃ 30秒、72℃ 1.5分]を25サイクル、72℃ 5分30秒）を行い、18S rRNA遺伝子配列のほぼ全域（約1.8 kbp）を増幅した。PCR反応にはExTaq DNAポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用い、H２O 38.8μl、 10×バッファー 5μl、 dNTPs 4μl、 ExTaq DNA ポリメラーゼ0.2μl、 20pmol/μlの各プライマー 0.5μl、 鋳型DNA溶液 1μl、 総量50 μlとなる反応液組成で行った。反応後、Montage PCR（Millipore社製）を用いてPCR産物を精製した。
【０１７３】
次に、上記PCR産物を鋳型として、E21f（配列番号２）、E565f（配列番号３）、E895f（配列番号４）、E1332f（配列番号５）、 E565r（配列番号６）、E895r（配列番号７）、E1123r（配列番号８）、E1332r（配列番号９）、およびE1775r（配列番号１０）のプライマーを用いて、BigDyeR Terminators v1.1 Cycle Sequencing Kit（Applied Biosystems社製）によりシーケンス反応を行った。反応後の溶液をSephadex G-50 Superfine（GE Healthcare社製）を用いて精製し、シークエンサー（ABI3130xl、Applied Biosystems社）により、18S rRNA遺伝子の配列決定を行った。
【０１７４】
決定した配列について、blastn（NCBI、http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）を用いて相同性検索を行った結果を表１に示す。PRB1Y-1株は、Phlebia radiataと99.6 %、Phlebia brevisporaと99.3 %、Phlebia subochraceaと98.9 %と、高い相同性が確認された。このことから、本菌株はPhelabia属に属する担子菌であることが明らかとなった。Phlebia属は、リグニンを分解する能力を有する白色腐朽菌であり、微生物を用いて汚染された土壌や水環境を浄化することが知られている（特許文献２）。本菌株もリグニン分解能を有する白色腐朽菌であり、バガス堆肥中のリグニン分解に関与していると考えられた。
【０１７５】
【表１】
2014064493.tif 000003
【０１７６】
バガス堆肥から分離されたリグニン分解能を持つPhelabia属担子菌株PRB1Y-1は、Phlebia sp. BC-1 AJ8722と命名された。Phlebia sp. BC-1 AJ8722は2010年4月16日に、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に寄託され、各々受託番号FERM P-21951が付与されている。
【０１７７】
〔実施例４〕PRB1Y-1株によるバガス糖化前処理効果の検討
（１）粉砕バガス試料の調製
サトウキビバガス粉砕は、以下の条件で行った。
【０１７８】
乾燥：天日乾燥
粉砕委託先：(株)奈良機械製作所
粉砕機：奈良式自由粉砕機Ｍ−４型
粉砕条件：回転速度=5500/min, スクリーン：ダイヤスクリーン0.9mm
篩がけ：目開き0.15mmと0.355mの篩を用い、0.15-0.355mmのバガスを回収し、試験に用いた。
【０１７９】
（２）バガス糖化前処理
300 ml三角フラスコに5 gの粉砕バガスを量り取り、5 mlの蒸留水を添加しオートクレーブ（121℃、20分）殺菌した。1/2 PDA培地を用いて25℃で１週間培養したPRB1Y-1株のコロニー外縁をストローで打ち抜いたアガーディスク２個を、上記の殺菌した粉砕バガスに接種し、25℃で3週間処理を行った。また、比較対象として、担子菌処理を行なわない試験区、PRB1Y-1と同様の方法で、ヒラタケまたはシイタケによる処理を行なった試験区を設け、同様の操作を行なった。また、各試験区はN=3で試験を行なった。処理後に反応を停止させるためにオートクレーブ（121℃、20分）した後に、処理済みバガスを50℃で9日間乾燥させた。
【０１８０】
（３）乾燥後の試料0.1 gを10 mlガラスバイアル瓶に量り取り、4.5 mlの50 mM酢酸バッファー(pH 5)を添加し、オートクレーブ(121℃、20分)を行った。その後、糖化酵素として、0.0286 g/ml Celluclast（Novozymes社製）および0.0066 g/ml Novozyme188（Novozymes社製）を含む酵素溶液を500μl添加した。ブチルゴム栓とアルミキャップで密栓後、振とう（60 rpm）しながら50℃で4日間反応させた。
【０１８１】
反応後の溶液を回収し、遠心上清（14000 rpm、15分、4℃）を回収した後、上清中に遊離したグルコースの濃度をバイオテックアナライザー AS-310 (サクラエスアイ社製)で測定し、バガスに含有されるセルロース中のグルコース成分量に対する遊離グルコース量の割合を糖化率として求めた。セルロース中のグルコース成分量は、セルロースを硫酸により加水分解し、生じたグルコースを測定した。
【０１８２】
その結果、図２に示すように、PRB1Y-1処理を行なった試験区では、担子菌処理を行な
わなかった試験区に対して、16%のバガス糖化率向上効果が認められた。一方で、白色腐朽菌であるシイタケによる処理を行なった試験区では、バガス表面でのシイタケの生育を確認することができなかった。また、ヒラタケによる処理を行なった試験区では、バガス表面でのヒラタケの生育を確認できたが、バガスの糖化率向上効果は認められなかった。これらのことから、バガス堆肥より分離したPRB1Y-1は、他の白色腐朽菌株より優れたバガス糖化前処理効果を有していることが示された。
【０１８３】
〔実施例５〕PRB1Y-1株を用いたバガス糖化前処理による糖化率向上効果の経時変化
実施例４と同様の方法を用いてPRB1Y-1によるバガス糖化前処理日数を検討した。糖化前処理は、１、２、３、４、又は５週間行い、実施例４と同様の方法で処理後の試料の糖化率を測定した。各試験区はN=3で試験を行った。その結果、図３に示すように、糖化率は前処理５週間目まで経時的に向上し続けた。
【０１８４】
〔実施例６〕PRB1Y-1株を用いたバガス糖化前処理条件の検討
PRB1Y-1株を用いたバガス糖化前処理の時間を短縮するために、処理条件の検討を行った。
（１）添加水量の検討
PRB1Y-1株を用いたバガス糖化前処理における添加水量の影響を検討した。0.1 gの粉砕バガスを10 mlガラスバイアルへ量り取り、0.1、 0.3、 0.6、 0.9、 1.2、又は2.1 mlの蒸留水を添加し、オートクレーブ （121℃、20分）殺菌を行なった。1/2 PDA培地を用いて25℃で１週間培養したPRB1Y-1株のコロニー外縁をストローで打ち抜いたアガーディスク１個を、殺菌した粉砕バガスに接種し、25℃で1、2、又は3週間処理を行った。処理後に反応を停止させるためにオートクレーブ（121℃、20分）した後に、処理済みバガスを50℃で3日間乾燥させた。
【０１８５】
乾燥後の試料を用いて、実施例４と同様の方法で酵素糖化を行い、バガス糖化率を求めた。各試験区はN=３で試験を行った。その結果を図４に示す。添加水量が0.3 ml以上、または、0.9 ml以下の条件では、PRB1Y-1処理を行わなかった試験区に比べて糖化率が向上することが分かった。なかでも、添加水量0.6 mlの条件では、3週間の前処理時間で糖化率が19%向上した。また、添加水量が0.1、1.2、及び2.1mlの条件では糖化率の低下が認められた。以上のことから、PRB1Y-1株を用いたバガス前処理では、添加水量がバガス糖化率に大きな影響を与え、バガス重量の３〜９倍程度の添加水量が適していることが示された。
【０１８６】
（２）PRB1Y-1接種量の検討
PRB1Y-1株を用いたバガス糖化前処理におけるPRB1Y-1接種量の影響を検討した。0.1 gの粉砕バガスを10 mlガラスバイアルへ量り取り、0.6 mlの蒸留水を添加しオートクレーブ （121℃、20分）殺菌を行なった。1/2 PDA培地を用いて25℃で１週間培養したPRB1Y-1株のコロニー外縁をストローで打ち抜いたアガーディスク１、3、又は5個を、殺菌した粉砕バガスに接種し、25℃で1週間処理を行った。処理後に反応を停止させるためにオートクレーブ（121℃、20分）した後に、処理済みバガスを50℃で3日間乾燥させた。乾燥後の試料を用いて、実施例４と同様の方法で酵素糖化を行い、バガス糖化率を求めた。各試験区はN=３で試験を行った。
【０１８７】
その結果を図５に示す。本試験ではPRB1Y-1の接種量による糖化率向上効果の違いは認められなかったことから、アガーディスク１個で、バガスに対して充分量のPRB1Y-1菌体が接種されていると考えられる。
【０１８８】
（３）処理温度の検討
PRB1Y-1株を用いたバガス糖化前処理における処理温度の影響を検討した。0.1 gの粉砕
バガスを10 mlガラスバイアルへ量り取り、0.6 mlの蒸留水を添加しオートクレーブ（121℃、20分）殺菌を行なった。1/2 PDA培地を用いて25℃で１週間培養したPRB1Y-1株のコロニー外縁をストローで打ち抜いたアガーディスク１個を、殺菌した粉砕バガスに接種し、20、25、又は30℃で1、2、又は3週間処理を行った。処理後に反応を停止させるためにオートクレーブ（121℃、20分）した後に、処理済みバガスを50℃で3日間乾燥させた。乾燥後の試料を用いて、実施例４と同様の方法で酵素糖化を行い、バガス糖化率を求めた。各試験区はN=３で試験を行った。
【０１８９】
その結果、温度依存的に前処理効果が向上することが示された（図６）。特に、30℃でPRB1Y-1処理を行った場合、2週間で糖化率向上効果が約18%に達し、3週間では約20%となった。また、事前の検討でPRB1Y-1株は35℃で生育できないことを確認していることから、PRB1Y-1処理の最適温度は30℃前後であると考えられた。
【図１】
2014064493.tif 000004
【図２】
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【図５】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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【配列表】
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