(57)【要約】      （修正有）【課題】胆汁酸結合能を有し、更には、ミセルへのコレステロールの溶解を抑制することにより血清コレステロール低下作用を有する新規な植物由来のタンパク質を提供する。【解決手段】上記課題を解決するための方法は以下の通りである。（１）米ぬか由来の胆汁酸結合タンパク質を有効成分とする胆汁酸結合剤において、前記タンパク質は重量平均分子量が２２〜３１ｋＤａの範囲内であることを特徴とする胆汁酸結合剤。（２）米ぬか由来の胆汁酸結合タンパク質を有効成分とする胆汁酸結合剤において、前記タンパク質は重量平均分子量が３７〜５５ｋＤａの範囲内であることを特徴とする胆汁酸結合剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
米ぬか由来の胆汁酸結合タンパク質を有効成分とする胆汁酸結合剤において、前記タンパク質は重量平均分子量が２２〜３１ｋＤａの範囲内であることを特徴とする胆汁酸結合剤。
【請求項２】
米ぬか由来の胆汁酸結合タンパク質を有効成分とする胆汁酸結合剤において、前記タンパク質は重量平均分子量が３７〜５５ｋＤａの範囲内であることを特徴とする胆汁酸結合剤。
【請求項３】
米ぬか由来の胆汁酸結合タンパク質を有効成分とするコレステロールミセルの溶解抑制剤において、前記タンパク質は重量平均分子量が２２〜３１ｋＤａの範囲内であることを特徴とするコレステロールミセルの溶解抑制剤。
【請求項４】
米ぬか由来の胆汁酸結合タンパク質を有効成分とするコレステロールミセルの溶解抑制剤において、前記タンパク質は重量平均分子量が３７〜５５ｋＤａの範囲内であるであることを特徴とするコレステロールミセルの溶解抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、胆汁酸結合能を有する米ぬか由来のタンパク質を有効成分とする胆汁酸結合剤及び血清コレステロール量低減剤、並びに、当該タンパク質を用いた血清コレステロール量を低下させる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来から、米糠は、脂質、タンパク質、食物繊維のほか、ビタミンやミネラルも豊富な貴重な植物性資源である。わが国においては年間約９０万ｔの米糠が発生しており、米糠を原料として生産されているこめ油は、日本国内における貴重な国産植物性油脂である。
【０００３】
米糠からこめ油を抽出した残渣が脱脂米糠であるが、この脱脂米糠中には、前述に挙げた有効成分のうち脂質以外の成分が含まれている。この脱脂米糠は食品素材や培養基として、あるいは食品添加物、医薬品、化粧品等の原料としての利用について古くから様々な試みがなされてきた。現在、脱脂米糠を原料として、イノシトールやフィチン酸が医薬品や化粧品原料、食品添加物として、工業的に大量生産されている。しかしタンパク質やビタミン等については脱脂米糠を原料として生産等が行われていない。
【０００４】
一方、世界保健機関（ＷＨＯ）の統計では、世界の死因の第１位は、動脈硬化症等の心臓血管疾患である。血液中のＬＤＬ−コレステロール濃度が過剰に高いことが動脈硬化症の主因と考えられており、コレステロール代謝を改善するためのより効果的な医薬品や機能性食品の開発が強く求められている。コレステロール代謝の改善にかかわる要素の一つとして胆汁酸結合能が挙げられる。
【０００５】
ここで、胆汁酸結合タンパク質を得る方法として、例えば、コール酸を結合させた担体を充填させたカラムを胆汁酸結合アフィニティーカラム（胆汁酸結合能を有する成分に対するアフィニティーカラム）として用い、血清アルブミンを単離する方法（例えば、非特許文献１参照。）や、胆汁酸結合アフィニティーカラムを用いて、大豆タンパク質の中から胆汁酸結合能を有するタンパク質を単離・同定する方法（例えば、非特許文献２及び３参照。）等が開示されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】パッチンソン（Pattinson）、他２名、ジャーナル・オブ・クロマトグラフィー（Journal of Chromatography）、１９８０年、第１８７巻、第４０９〜４１２ページ。
【非特許文献２】マキノ（Makino）、他４名、アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー（Agricultural and Biological Chemistry）、１９８８年、第５２巻、第８０３〜８０９ページ。
【非特許文献３】ミナミ（Minami）、他３名、アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー（Agricultural and Biological Chemistry）、１９９０年、第５４巻、第５１１〜５１７ページ。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
このような、背景の下、本発明者は、米ぬか由来のタンパク質、特に所定の分子量を有するタンパク質について胆汁酸結合能を有し、更には、ミセルへのコレステロールの溶解を抑制することにより血清コレステロール低下作用を有することを見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、胆汁酸結合能を有し、更には、ミセルへのコレステロールの溶解を抑制することにより血清コレステロール低下作用を有する新規な植物由来のタンパク質を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決するための本発明の特徴は以下の通りである。
（１）米ぬか由来の胆汁酸結合タンパク質を有効成分とする胆汁酸結合剤において、前記タンパク質は重量平均分子量が２２〜３１ｋＤａの範囲内であることを特徴とする胆汁酸結合剤。
（２）米ぬか由来の胆汁酸結合タンパク質を有効成分とする胆汁酸結合剤において、前記タンパク質は重量平均分子量が３７〜５５ｋＤａの範囲内であることを特徴とする胆汁酸結合剤。
（３）米ぬか由来の胆汁酸結合タンパク質を有効成分とするコレステロールミセルの溶解抑制剤において、前記タンパク質は重量平均分子量が２２〜３１ｋＤａの範囲内であることを特徴とするコレステロールミセルの溶解抑制剤。
（４）米ぬか由来の胆汁酸結合タンパク質を有効成分とするコレステロールミセルの溶解抑制剤において、前記タンパク質は重量平均分子量が３７〜５５ｋＤａの範囲内であることを特徴とするコレステロールミセルの溶解抑制剤。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】参考例１において、胆汁酸結合アフィニティーカラムを用いたカラムクロマトグラフィーによって、ＢＳＡ溶液及びＯｖａｌｂｕｍｉｎ溶液を分画し、各画分の移動度と２８０ｎｍの吸光度との関係を示したチャート図である。
【図２】実施例１において、胆汁酸結合アフィニティーカラムを用いたカラムクロマトグラフィーによって、米由来タンパク質溶液を分画し、各画分の移動度と２８０ｎｍの吸光度との関係を示したチャート図である。
【図３】実施例１において、胆汁酸結合アフィニティーカラムを用いたカラムクロマトグラフィーによって、米由来タンパク質溶液を分画し、得られた分画物を１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥした結果、得られたＣＢＢ染色像を示した図である。
【図４】米由来タンパク質胆汁酸結合能試験により算出された各分子と結合した胆汁酸の割合を示した図である。
【図５】米由来タンパク質におけるミセルへのコレステロールの溶解割合を示した図である。
【図６】ラットへの米由来タンパク質の経口投与実験の概要を示した図である。
【図７】ラットへの米由来タンパク質における経口投与実験における各ラット群の血清総コレステロール量を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の胆汁酸結合剤は、米ぬか由来の胆汁酸結合タンパク質を有効成分とすることを特徴とする。
即ち、後記実施例において示すように、胆汁酸結合アフィニティーカラムを用いて、米ぬか由来のタンパク質からから単離・同定された胆汁酸結合タンパク質を有効成分とするものである。
【００１１】
上記胆汁酸結合タンパク質は米ぬかに含まれているタンパク質全体の3.5％を占めるタンパク質である。
更に、上記タンパク質は２つ存在し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでは、１つは分子量約２２〜３１ｋＤａの範囲内に検出され、また、もう1つは分子量約３７〜５５ｋＤａの範囲内に検出された。以下、これらのタンパク質を、「本発明の米ぬか由来胆汁酸結合タンパク質」と総称することがある。
【００１２】
さらに、本発明においては、本発明の米ぬか由来胆汁酸結合タンパク質が有する胆汁酸結合能を損なわない限り、本発明の米ぬか由来胆汁酸結合タンパク質中の１〜数個のアミノ酸を欠失、置換若しくは付加させてもよい。このようなアミノ酸を付加等させたタンパク質も、本発明の胆汁酸結合剤の有効成分とすることができる。例えば、本発明の米ぬか由来胆汁酸結合タンパク質のＮ末端やＣ末端にそれぞれ、１〜１０個、好ましくは１〜５個のアミノ酸を付加することができる。本発明の米ぬか由来胆汁酸結合タンパク質のＮ末端やＣ末端に付加させるアミノ酸配列としては、例えば、Ｈｉｓタグ等の通常、リコンビナントタンパク質の生成に用いられるタグ配列等が挙げられる。
【００１３】
本発明の本発明の米ぬか由来胆汁酸結合タンパク質は、胆汁酸結合能に加えて、コレステロールミセルの溶解低下作用と、血清コレステロール量低下作用とを有する。すなわち、本発明の本発明の米ぬか由来胆汁酸結合タンパク質は、コレステロールミセルの溶解抑制剤及び血清コレステロール量低下剤の有効成分として好適である。なお、本発明の米ぬか由来胆汁酸結合タンパク質の１〜数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつコレステロールミセルの溶解抑制能や血清コレステロール量低下能を有するタンパク質も、本発明の米ぬか由来胆汁酸結合タンパク質と同様にコレステロールミセルの溶解抑制剤及び血清コレステロール量低下剤の有効成分として好適である。
【００１４】
食事由来のコレステロールは、レシチン、脂肪酸、胆汁酸等とミセルを形成し、水溶性となり、非撹拌水層（ＵＷＬ）を通過し、小腸から吸収される。このような小腸におけるコレステロール吸収メカニズムから、本発明の本発明の米ぬか由来胆汁酸結合タンパク質は、小腸内において、胆汁酸と結合することにより、コレステロールのミセル形成を抑制する結果、コレステロールの吸収を抑制すると推察される。
【００１５】
本発明の胆汁酸結合剤、コレステロールミセルの溶解抑制剤、及び血清コレステロール量低下剤（以下、胆汁酸結合剤等）の有効成分である本発明の米ぬか由来胆汁酸結合タンパク質は、米ぬかから精製されたものが好ましい。例えば、本発明の米ぬかタンパク質溶液を胆汁酸結合アフィニティークロマトグラフィーによって分画し、本発明の米ぬか由来胆汁酸結合タンパク質を含有する画分を回収する。この回収された画分を、本発明の胆汁酸結合剤等の有効成分とすることができる。また、米ぬかタンパク質溶液をゲル濾過クロマトグラフィーによって分画し、本発明の米ぬか由来胆汁酸結合タンパク質を含有する画分を回収する。これらの回収された画分を、本発明の胆汁酸結合剤等の有効成分とすることもできる。
【００１６】
本発明の胆汁酸結合剤等は、医薬品やサプリメント等の飲食品として単独で摂取されてもよく、他の飲食用組成物や医薬用組成物と同様に、飲食品や医薬品への添加剤として用いることもできる。
【００１７】
本発明の胆汁酸結合剤等の剤型は、特に限定されるものではない。例えば、ソフトカプセル剤、ハードカプセル剤、錠剤、顆粒剤、散剤、液剤、軟膏剤、クリーム剤、ゲル剤等であってもよい。培養細胞等へ用いられる場合には、乾燥粉末や、水や緩衝液等の適当な溶液に溶解させた液剤であることが好ましい。一方、生物個体へ用いられる場合には、経口投与に適した剤型であることが好ましく、腸溶剤であることがより好ましい。
【００１８】
本発明の胆汁酸結合剤等に含まれる米ぬか由来胆汁酸結合タンパク質は、１種類のみであってもよく、２種類以上を組み合わせてもよい。また、これらの胆汁酸結合剤等に含まれる米ぬか由来胆汁酸結合タンパク質の量は、該米ぬか由来胆汁酸結合タンパク質の胆汁酸結合能、コレステロールミセル溶解抑制能、又は血清コレステロール低下能が発揮され得る量であれば、特に限定されるものではなく、米ぬか由来胆汁酸結合タンパク質の種類や、剤型等を考慮して、適宜決定することができる。
【００１９】
本発明の胆汁酸結合剤等は、本発明の米ぬか由来胆汁酸結合タンパク質のみからなるものであってもよく、その他の成分を含有するものであってもよい。その他の成分としては、本発明の米ぬか由来胆汁酸結合タンパク質の活性を損なわない限り、どのような成分であってもよく、例えば、本発明の米ぬか由来胆汁酸結合タンパク質以外の米ぬか由来の成分を含有していてもよく、胆汁酸結合能や血清コレステロール低下能を有する機能性ペプチドを含有していてもよい。その他にも、本発明の胆汁酸結合剤等は、例えば、賦型剤、結合剤、界面活性剤、酸化防止剤、ｐＨ調整剤、崩壊剤、滑沢剤、防腐剤、殺菌剤、着色剤、矯味矯臭剤等の、医薬品や飲食品に添加される成分を含有することができる。
【００２０】
本発明の胆汁酸結合剤等の製造方法は、含有される本発明の本発明の米ぬか由来胆汁酸結合タンパク質の活性を損なわない方法であれば特に限定されるものではなく、通常、機能性タンパク質を含有する飲食用組成物又は医薬用組成物を製造する場合に使用される方法を用いて製造することができる。
【００２１】
本発明の胆汁酸結合剤等の投与量は、米ぬか由来胆汁酸結合タンパク質の胆汁酸結合等の活性が発揮され得る量であれば、特に限定されるものではなく、米ぬか由来胆汁酸結合タンパク質の種類、対象とする細胞の種類や状態、剤形、投与方法等を考慮して適宜決定することができる。例えば、培養細胞等の生物個体外の細胞へ用いる場合には、本発明の胆汁酸結合剤又はコレステロールミセル溶解抑制剤を、培養液中の米ぬか由来胆汁酸結合タンパク質の含有量が５ｍｇ〜１００mｇ／ｍＬとなるように培養液へ添加することができる。
【００２２】
生物個体に摂取させる場合には、本発明の胆汁酸結合剤等の摂取量は、該米ぬか由来胆汁酸結合タンパク質の胆汁酸結合等の活性が発揮され得る量であれば、特に限定されるものではなく、摂取する人や動物の体重、年齢、性別、剤型等により適宜決定することができる。例えば、米ぬか由来胆汁酸結合タンパク質の一日当たりの摂取量が５０ｍｇ〜５００mｇ／ｋｇ体重となるように、１度に又は数回に分けて摂取させることが好ましい。
【００２３】
本発明の胆汁酸結合剤等は、経口摂取することにより、生体内において、胆汁酸と結合し、さらに、食事として摂取されたコレステロールのミセルの溶解性を低下させる結果、血清コレステロール量を低減させる。このため、本発明の胆汁酸結合剤等は、高コレステロール血症や動脈硬化症等の、血清中のコレステロール量が過剰となることに起因する疾患の治療や予防に好適である。
【００２４】
本発明の血清コレステロール量を低下させる方法（以下、血清コレステロール量低下方法）は、本発明の米ぬか由来胆汁酸結合タンパク質からなる群より選択される１種以上を経口摂取することを特徴とする。米ぬか由来胆汁酸結合タンパク質を経口摂取させる生物は、小腸や胆管等の組織を有する動物であれば特に限定されるものではなく、ヒトであってもよく、マウス、ラット、イヌ、ネコ、サル、ウシ等のヒト以外の動物であってもよい。
【００２５】
以下、本発明の実施例を説明する。
［参考例１］
＜胆汁酸結合アフィニティーカラムの作製＞
胆汁酸結合アフィニティーカラムは、カルボジイミドをスペーサーとして、コール酸をカラム担体であるＥＡＨ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂに結合させることにより作製した。胆汁酸結合アフィニティーカラムの調製方法は、Ｐａｔｔｉｎｓｏｎらの方法（非特許文献１）に準じて行った。
具体的には、まず、ＥＡＨ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ担体５０ｍＬ容量に対し、６２５ｍＬの胆汁酸溶液（スペーサーとして３３．４ｍＭ １−ｅｔｈｙｌ−３−（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ
ＨＣｌと３．７ｍＭのコール酸を含む５０％エタノール溶液）をｐＨ６．４で１６時間反応させ、担体にコール酸を結合させた。その後、カラムに非吸着の過剰なコール酸溶液を０．５Ｍ
ＮａＣｌを含む５０％エタノールで洗浄したものを充填することにより、胆汁酸結合アフィニティーカラム（カラムのベッド容量：５０ｍＬ）を作製した。なお、カラムは使用前に０．０２％ＮａＮ３溶液にて平衡化した。
【００２６】
＜胆汁酸結合アフィニティーカラムによる分画＞
次いで、作製されたカラムが、実際に胆汁酸結合能を有する化合物に対するアフィニティーを備えているかどうかを、ＢＳＡとＯｖａｌｂｕｍｉｎをアプライすることにより、確認した。カラムからの溶出条件は、マキノらの方法（非特許文献２）に準じて行った。
まず、作製された胆汁酸結合アフィニティーカラムに、１．５ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ溶液又はＯｖａｌｂｕｍｉｎ溶液をアプライした。次に、当該カラムに第１次洗浄液（０．５Ｍ
ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）を通し、当該カラム中の担体に吸着していなかった物質を洗浄除去した。次いで、当該カラムに、溶出液（０．５％Ｓｏｄｉｕｍ
ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）を通し、コール酸と結合したタンパク質、すなわち胆汁酸結合能を有するタンパク質を溶出した。最後に、当該カラムに、第２次洗浄液（８Ｍ
ｕｒｅａ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）を通し、当該カラムに非特異的に結合した物質を溶出した。
【００２７】
各画分の移動度と２８０ｎｍの吸光度との関係を図１に示す。図１中、「（１）」が第１次洗浄液の画分であり、「（２）」が溶出液の画分であり、「（３）」が第２次洗浄液の画分である。この結果、Ｏｖａｌｂｕｍｉｎは第１次洗浄液の画分に溶出されており、ＢＳＡは溶出液の画分に溶出されていた。これらの結果から、作製された胆汁酸結合アフィニティーカラムは、非特許文献２に記載されている胆汁酸結合アフィニティーカラム同様に、Ｏｖａｌｂｕｍｉｎは吸着せず、ＢＳＡを吸着することが確認された。
【００２８】
［実施例１］
＜胆汁酸結合アフィニティーカラムによる米ぬか由来タンパク質の分画＞
参考例１で作製された胆汁酸結合アフィニティーカラムを用いて、米ぬか由来タンパク質の分画を行い、胆汁酸結合能を有するタンパク質を単離・精製した。この胆汁酸結合アフィニティーカラムを用いた米ぬか由来胆汁酸結合タンパク質の単離精製は、これまで報告が無く、非常に効率的な精製法である。
尚、米ぬか由来タンパク質として、オリザ油化株式会社製のオリザプロティンＰ７０を使用した。
【００２９】
次いで、参考例１で作製された胆汁酸結合アフィニティーカラムに、米ぬか由来タンパク質溶液をアプライした後、参考例１と同様にして、第１次洗浄液、溶出液、第２次洗浄液を順次当該カラムにアプライした。各画分の移動度と２８０ｎｍの吸光度との関係を図２に示す
さらに、溶出液により溶出された画分（図２中の四角で囲まれた部分、以下、「画分Ａ」）を回収した。
【００３０】
＜胆汁酸結合アフィニティーカラムにより単離・精製された米ぬか由来胆汁酸結合タンパク質の同定＞
胆汁酸結合アフィニティーカラムにより単離・精製された米ぬか由来胆汁酸結合タンパク質の同定を行った。まず、画分ＡをAmicon Ultra-15 Ultracel-3k（Millipore）を用いて、脱塩・濃縮した。脱塩・濃縮液を回収し、脱塩・濃縮画分Ａを調製した。次いで、この脱塩・濃縮画分Ａを４〜１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、含まれているタンパク質を分離した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を図３に示す。図３中、レーンには約２２〜５５ｋＤａの範囲内に主要な２本のバンド（図３中、Ｎｏ．(1)、Ｎｏ．(2)）が検出された。この結果から、脱塩・濃縮画分Ａ溶液には、胆汁酸と結合する主要な２種類の米ぬか由来タンパク質が含まれていたことが明らかである。
【００３１】
各バンドをＳＤＳ−ＰＡＧＥのゲルから切り出し、還元アルキル化した後、トリプシン処理によりＩｎ−ｇｅｌ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎを行った。その後、ゲルより抽出したペプチド断片を脱塩精製して、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳにて質量分析を行った。この結果、図３中、バンドＮｏ．１はMW：37〜55kDa、バンドＮｏ．２はMW：22〜31kDaであることが分かった。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果、得られたＣＢＢ染色像を画像解析（Ｉｍａｇｅ Ｊ分析）したところ、これら２種のタンパク質の割合は、Ｎｏ.(1)が40.4％、Ｎｏ．２が37.8％であった。
【００３２】
＜放射性タウロコール酸を用いた胆汁酸結合試験＞
オリザプロティンＰ７０の胆汁酸結合能の評価を、放射性タウロコール酸を用いた方法で行った。対照（コントロール）としてカゼインをそれぞれ用いた。具体的には、タウロコール酸含有リン酸緩衝液（５０ｍＭ
タウロコール酸、１００ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．４）中に、コレスチラミン、カゼイン、オリザプロティンＰ７０を凍結乾燥させたものを、それぞれ５〜１００ｍｇ／ｍＬとなるように添加したものを反応溶液とした。これらの反応溶液を３７℃で２時間インキュベートした後、室温で７２時間透析した。透析膜外液に含まれている総胆汁酸量を測定することにより、透析膜内液に含まれている（すなわち、各分子と結合した）胆汁酸の割合を算出した。
Taurocholic acid （
SIGMA 社製 ）を0.1 M Tris-HCl緩衝液
（pH 7.4）に溶解し、最終濃度が2
nCi/mlとなるように [14C] - Taurocholic
acid（Amersham LIFE SCIENCE、Tauro
[carbonyl-14C] cholic acid、sodium salt）を加え、撹拌した。タンパク質濃度が5、10、
20、 40、 60、80、100
mg/mlとなるように、カゼイン（対照）及びオリザプロテインP70（米ぬかタンパク質）をそれぞれ秤取した15mlチューブに、先に調製した0.1mMタウロコール酸溶液をそれぞれ加え、撹拌後、振とうインキュベート（37℃、2
時間）し、超遠心分離（15,000 rpm.、37℃、15
分間）した。その後、上清の[14C] - Taurocholic acidを液体シンチレーションカウンターによって測定した。算出された各分子と結合した胆汁酸の割合を図４に示す。この結果、胆汁酸結合能はネガティブコントロール群のカゼイン（１７％）と比較し、オリザプロティンＰ７０は６０％であった。
【００３３】
［実施例３］
＜コレステロールミセル溶解性試験＞
オリザプロティンＰ７０のコレステロールミセル溶解抑制能を測定した。
また、ネガティブコントロールとしてカゼインを用いた。
【００３４】
まず、最終濃度が３．７ｋＢｑ／ｍＬ（２．１Ｇｂｑ／ｍｍｏｌ，ＮＥＮ）となるように［４−１４Ｃ］コレステロール／クロロホルム（Ｐｅｒｋｉｎ
Ｅｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）を、０．１mＭとなるようにコレステロール（片山化学工業社製）／クロロホルムを、１ｍＭとなるようにＯｌｅｉｃ
ａｃｉｄ（ＳＩＧＭＡ社製）／クロロホルムを、０．５ｍＭとなるようにＭｏｎｏ ｏｌｅｏｙｌ−ｒａｃ−Ｇｌｙｃｅｒｏｌ（ＳＩＧＭＡ社製）／クロロホルムを、０．６ｍＭとなるようにＬ−α−ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ（ＳＩＧＭＡ社製）／クロロホルムを２０ｍＬ容量のガラスバイアルに分取し、よく混合した後、窒素ガスを吹き付け乾固させた。その後、得られた乾固物を、６．６ｍＭのＴａｕｒｏｃｈｏｌｉｃ
ａｃｉｄ（ＳＩＧＭＡ社製）及び１３２ｍＭ ＮａＣｌを含む１５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解させた。ボルテックミキサーで２分間攪拌した後、超音波処理（２５Ｗ、ｏｕｔｐｕｔ
６、３分間）し、その後３７℃で２４時間振とうしながらインキュベートすることにより、［１４Ｃ］−コレステロールミセル溶液を調製した。
【００３５】
コレステロールミセル溶解性試験は、具体的には、［１４Ｃ］−コレステロールミセル溶液に、最終濃度が１０ｍｇ／ｍＬとなるようにカゼイン、オリザプロティンＰ８０を添加したものを反応溶液とした。各反応溶液をボルテックミキサーで２分間攪拌した後、超音波処理（２５Ｗ、ｏｕｔｐｕｔ
６、３分間）し、３７℃で１時間インキュベートした後、３８０μＬを３７℃、１００，０００×ｇで1時間遠心分離を行い、上清を回収した。回収された上清５０μＬに、乳化シンチレーターを１０ｍＬ加えて、液体シンチレーションカウンターにより、上清中の［１４Ｃ］−コレステロールを測定した。上清中には、水溶液中に安定して溶解しているコレステロールミセルが存在する。このため、反応溶液に予め添加した［１４Ｃ］−コレステロール量に対する上清中の［１４Ｃ］−コレステロール量の割合から、水溶液中に安定して溶解しているコレステロールミセルの割合が算出できる。
【００３６】
ミセルへのコレステロールの溶解割合を図５に示す。各試験区は、Ｄｕｎｃａｎ’ｓ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｒａｎｇｅ
ｔｅｓｔによりｐ＜０．０５で統計学的な有意差検定処理した。その結果、ネガティブコントロール群のカゼイン（９６％）と比較し、米ぬか由来タンパク質（ＲＢ）は１５％であり、有意に低下していた。すなわち、オリザプロティンＰ８０はコレステロールミセル溶解抑制能を有することが明らかである。
【００３７】
［実施例４］
＜ラットへの混餌投与試験＞
高コレステロール血症のモデルとして、食餌性高コレステロール血症を誘導するため、0.5％コレステロール摂取ラットを用いた。対照群は20%カゼインに0.5％コレステロールを混餌した飼料を自由摂取させた。試験群である米ぬかタンパク質摂取群は、15%カゼインに0.5％コレステロールを混餌した飼料を自由摂取させた。これらの食餌で21日間飼育し、血清コレステロールに与える影響を調べた。米ぬか由来タンパク質は、オリザプロティンＰ７０（オリザ油化株式会社製）を用いた。図６に示すように、実験期間の21日間コレステロールを含む食餌を与えた。20日目に絶食開始し、18時間絶食後、21日目に心臓採血によりラットを屠殺した。採取された血液を用いて、血清コレステロールを測定した。さらに解剖し、肝臓重量を測定した。その他の具体的な実験条件は以下の通りである。
【００３８】
実験群：５週齢のＷｉｓｔａｒ系雄ラット（９０〜１１０ｇ）
実験群数：ｎ＝９ 
投与開始時間：ＡＭ８：００
試験飼育期間：２１日間（予備飼育３日間）
絶食時間：１８時間
実験サンプル：カゼイン又は米ぬかタンパク質（オリザプロティンＰ７０：オリザ油化株式会社製）
実験群：対照群（20％カゼイン）、米ぬか群（１５％カゼイン＋５％米ぬかタンパク質）
食餌組成：２０％タンパク質、５％ラード、コーン油１％、セルロース５％、ミネラル３．５％、ビタミン１％、０．５％コレステロール、コール酸ナトリウム０．２５％、塩化コリン０．２％、食餌全体が１００％になるように、スクロースとスターチ＝１：２で混合。
【００３９】
血清は、３０００ｒｐｍ、１５分間の遠心分離により調製した。血清コレステロールの定量は酵素法、具体的には市販のキット（コレステロールＥ−テストワコー；和光純薬工業社製））を用いて測定した。同様にして、ＨＤＬ−コレステロールはＨＤＬ−コレステロールＥ−テストワコー（和光純薬工業社製）を用いて測定した。ＬＤＬ＋ＶＬＤＬ−コレステロールは計算により求めた。
【００４０】
血清総コレステロール量の結果を図７に示す。なお、数値は、１群９匹の平均±標準誤差とし、実験結果の統計的分析には、Ｄｕｎｃａｎ’ｓ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｒａｎｇｅ ｔｅｓｔとＳｔｕｄｅnｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔを用いた。
図７のように、血清総コレステロール量は、カゼインナトリウム（Ｃ）投与群よりもオリザプロティンＰ７０（ＲＢ）群のほうが、血清総コレステロール量が有意に低下することを見出した。これらの結果から、オリザプロティンＰ７０を混餌投与することにより、血清総コレステロール量を低下させられることが明らかである。
【産業上の利用可能性】
【００４１】
本発明の胆汁酸結合剤は、米ぬか由来の胆汁酸結合剤を経口服用することにより、血清コレステロール量を安全に低下させることができる。このため、本発明の胆汁酸結合剤等は、特に高コレステロール血症や動脈硬化症の治療や予防のための医薬や機能性食品等の有効成分として利用が可能である。
【図６】
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【図７】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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