(57)【要約】【課題】患者から採取された血液細胞から、試験管内で樹状細胞又はその前駆細胞を増殖させて、前記免疫療法の最適数の樹状細胞を調製する技術を開発する。【解決手段】本発明の樹状細胞移植療法用医薬品組成物は、被検者から採取された血球細胞から単核球を分離するステップと、Ｔ細胞を前記単核球から除去するステップと、前記Ｔ細胞が除去された残りの細胞を、ＧＭ−ＣＳＦ及びＳＣＦを含む培地で培養するステップとを含む調製方法によって調製される樹状細胞を含む。前記調製方法は、前記Ｔ細胞が除去された残りの細胞を、ＧＭ−ＣＳＦ及びＳＣＦを含む培地で培養するステップを含む場合がある。本発明の樹状細胞移植療法用医薬品組成物は、がん又は感染症を治療するための場合がある。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検者から採取された血球細胞から単核球を分離するステップと、Ｔ細胞を前記単核球から除去するステップと、前記Ｔ細胞が除去された残りの細胞を、ＧＭ−ＣＳＦ及びＳＣＦを含む培地で培養するステップとを含む調製方法によって調製される樹状細胞を含むことを特徴とする、樹状細胞移植療法用医薬品組成物。
【請求項２】
前記Ｔ細胞を前記単核球から除去するステップは、ＣＤ３を表面に発現する細胞を除去することによって達成されることを特徴とする、請求項１に記載の樹状細胞移植療法用医薬品組成物。
【請求項３】
前記ＧＭ−ＣＳＦ及びＳＣＦを含む培地で培養するステップは、少なくとも３週間実行されることを特徴とする、請求項１又は２に記載の樹状細胞移植療法用医薬品組成物。
【請求項４】
前記ＧＭ−ＣＳＦ及びＳＣＦを含む培地で培養するステップは、少なくとも４週間実行され、その後、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４を含む培地に切り替えて培養するステップを含むことを特徴とする、請求項１ないし３のいずれか１つに記載の樹状細胞移植療法用医薬品組成物。
【請求項５】
前記血球細胞は、末梢血、臍帯血、骨髄及び／又はリンパ節から採取されることを特徴とする、請求項１ないし４のいずれか１つに記載の樹状細胞移植療法用医薬品組成物。
【請求項６】
前記血球細胞は末梢血からアフェレーシス法により採取されることを特徴とする、請求項５に記載の樹状細胞移植療法用医薬品組成物。
【請求項７】
がん又は感染症を治療するためであることを特徴とする、請求項１ないし６のいずれか１つに記載の樹状細胞移植療法用医薬品組成物。
【請求項８】
自己免疫疾患、アレルギー疾患又は１型糖尿病を治療するためであることを特徴とする、請求項８に記載の樹状細胞移植療法用医薬品組成物。
【請求項９】
請求項１ないし６のいずれか１つに記載の樹状細胞移植療法用医薬品組成物に含まれる樹状細胞と異なるＨＬＡ遺伝子型を有する患者に移植されることを特徴とする、請求項７又は８に記載の樹状細胞移植療法用医薬品組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、樹状細胞の培養方法と、該方法によって得られる樹状細胞を含む医薬品組成物とに関し、具体的には、患者から採取された末梢血から樹状細胞の前駆細胞を大量に選択的に増殖させる培養方法と、該方法によって調製される樹状細胞を含む医薬品組成物とに関する。
【背景技術】
【０００２】
樹状細胞は、抗原提示細胞として、獲得免疫及び自然免疫の両方を含む免疫系を刺激又は抑制することができる（非特許文献１）。そこで、がん、感染症、自己免疫疾患、アレルギー疾患等に関連する特定の抗原を提示させるように予め体外で処理された樹状細胞を患者に移植することによって、患者の免疫系を制御する、樹状細胞移植療法が試みられている（非特許文献２）。しかし、かかる樹状細胞移植療法には大量の樹状細胞が必要である。例えば、皮膚の腫瘍及び肺転移の実験動物モデル系を用いた研究によると、いずれのモデル系でも、移植する樹状細胞の１回投与の最適数は、実験動物の体重３０ｇあたり少なくとも１０６個であるとの結果が得られた（非特許文献３及び４）。これはヒトに換算すると、患者１人あたり１回投与で少なくとも約１０９個の樹状細胞に相当する。しかし臨床的には、１人の人間から回収できる樹状細胞は、アフェレーシスを行った場合でもせいぜい１０６ないし１０８個にすぎない。
【０００３】
１９９０年代に確立された樹状細胞の調製方法では、末梢血、臍帯血、リンパ節等に由来する単球が、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４の存在下で５ないし７日培養され、その後、微生物又はＴ細胞由来の因子、例えば、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＰＧＥ２等の向炎症性メディエーター等で刺激されて、Ｔ細胞刺激能を獲得した成熟樹状細胞が得られた（特許文献１ないし３）。その後、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４存在下で１日培養後に、前記向炎症性メディエーター存在下で１日培養するだけの促成調製方法が開発された（特許文献４）。しかし、これらの調製方法では、樹状細胞の前駆細胞から、樹状細胞に分化させるだけであって、樹状細胞の前駆細胞自体の数を実質的に増加させるわけではない。
【０００４】
樹状細胞の移植による免疫療法の対象となる患者の中には、疾患そのものか、あるいは、他の治療法の副作用かが原因で、造血能力が弱っている場合が多い。特に、現状では免疫療法は他の治療法で効果がない場合に試みられることが多いため、他の治療法の副作用により、アフェレーシスを利用しても、有効な治療に必要な１０９個のオーダーの樹状細胞又はその前駆細胞を用意できないことが治験拡大の妨げとなっている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｌｉｐｓｃｏｍｂ、Ｍ．Ｆ．及びＭａｓｔｅｎ、Ｂ．Ｊ．、Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．、８２：９７−１３０（２００２）
【非特許文献２】Ｓｔｅｉｎｍａｎ、Ｒ．Ｍ．及びＢａｎｃｈｅｒｅａｕ、Ｊ．、Ｎａｔｕｒｅ、４４９：４１９−４２６（２００７）
【非特許文献３】Ｈａｒａｄａ，Ｙ．ら、ＰＬｏＳ  ＯＮＥ、４：ｅ６６７４（２００９）
【非特許文献４】Ｔａｔｓｕｔａ、Ｋ．ら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１６：２４０−２５１（２００９）
【非特許文献５】Ｃａｕｘ、Ｃ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、３６０：２５８−２６１（１９９２）
【非特許文献６】Ｒｏｍａｎｉ、Ｎ．Ｓ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１８０：８３−９３（１９９４）
【非特許文献７】Ｓａｌｌｕｓｔｏ、Ｆ．及びＬａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ、Ａ．、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７９：１１０９−１１１８（１９９４）
【非特許文献８】Ｄａｕｅｒ、Ｍ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１７０：４０６９−４０７６（２００３）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、患者から採取された血液細胞から、試験管内で樹状細胞又はその前駆細胞を増殖させて、前記免疫療法の最適数の樹状細胞を調製する技術を開発する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は樹状細胞の調製方法を提供する。本発明の樹状細胞の調製方法は、被検者から採取された血球細胞から単核球を分離するステップと、Ｔ細胞を前記単核球から除去するステップとを含む。
【０００８】
本発明の樹状細胞の調製方法において、前記Ｔ細胞を前記単核球から除去するステップは、ＣＤ３を発現する細胞を除去することによって達成される場合がある。
【０００９】
本発明の樹状細胞の調製方法は、前記Ｔ細胞が除去された残りの細胞を、ＧＭ−ＣＳＦ及びＳＣＦを含む培地で培養するステップを含む場合がある。
【００１０】
本発明の樹状細胞の調製方法において、前記ＧＭ−ＣＳＦ及びＳＣＦを含む培地で培養するステップは、少なくとも３週間実行され、その後、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４を含む培地に切り替えて培養するステップを含む場合がある。
【００１１】
本発明の樹状細胞の調製方法において、前記ＧＭ−ＣＳＦ及びＳＣＦを含む培地で培養するステップは、少なくとも４週間実行され、その後、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４を含む培地に切り替えて培養するステップを含む場合がある。
【００１２】
本発明の樹状細胞の調製方法において、前記血球細胞は、末梢血、臍帯血、骨髄及び／又はリンパ節から採取される場合がある。
【００１３】
本発明の樹状細胞の調製方法において、前記血球細胞は末梢血からアフェレーシス法により採取される場合がある。
【００１４】
本発明は、本発明の樹状細胞の調製方法によって調製される樹状細胞を含む、樹状細胞移植療法用医薬品組成物を提供する。
【００１５】
本発明の樹状細胞移植療法用医薬品組成物は、がん又は感染症を治療するための場合がある。
【００１６】
本発明の樹状細胞移植療法用医薬品組成物は、自己免疫疾患、アレルギー疾患又は１型糖尿病を治療するための場合がある。
【００１７】
本発明の樹状細胞移植療法用医薬品組成物は、本発明の調製方法によって調製される樹状細胞と異なるＨＬＡ遺伝子型を有する患者に移植される場合がある。
【００１８】
本発明は、本発明の方法によって調製される樹状細胞を患者に移植するステップを含む、患者の疾患の治療方法を提供する。
【００１９】
本発明の治療方法は、がん又は感染症を治療するための場合がある。
【００２０】
本発明の治療方法は、自己免疫疾患、アレルギー疾患又は１型糖尿病を治療するための場合がある。
【００２１】
本発明の治療方法は、本発明の調製方法によって調製される樹状細胞と異なるＨＬＡ遺伝子型を有する患者に移植するステップを含む場合がある。
【００２２】
本発明の技術的範囲は、添付する特許請求の範囲の記載に基づいて定められる。本発明の趣旨を逸脱しないことを条件として、本発明の変更、例えば、本発明の構成要件の追加、削除及び置換を行うことができる。
【００２３】
本発明の樹状細胞又はその前駆細胞の出所は、末梢血と骨髄とリンパ節と臍帯血とを含むが、これらに限定されない組織の場合がある。本発明の樹状細胞又はその前駆細胞は末梢血から調製されることが好ましい。しかし、胚性幹細胞、成体幹細胞及び人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞から生成される造血幹細胞から調製されてもかまわない。
【００２４】
本発明の樹状細胞又はその前駆細胞は、樹状細胞移植療法の患者自身か、患者と同じ遺伝子型を有する人間かに由来する場合がある。代替的には、前記免疫療法の有効性を損なわないことを条件として、患者と異なる遺伝子型を有する人間に由来する場合がある。
【００２５】
本発明の樹状細胞を用意するためには、本技術分野の専門家に知られたさまざまな手順を用いることができる。例えば末梢血から白血球を分離する際には、Ｆｉｃｏｌｌ比重遠心法を用いることができる。前記白血球からＴ細胞を分離除去する際には、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から販売されるＤｙｎａｌ社製Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標）や、ミルテニーバイオテック社のＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（商標）を含むがこれらに限定されない免疫磁気ビーズを用いて、細胞表面抗原ＣＤ３を発現する細胞を分離除去することができる。
【００２６】
本発明の方法において、Ｔ細胞を除去するのは、単にリンパ球を除去して濃縮するのではない。本明細書の実施例に示すとおり、本発明のＧＭ−ＣＳＦ及びＳＣＦを含むサイトカインカクテルが添加された培地で単核球を培養すると、樹状細胞自体が増殖するよりもＴ細胞の増殖促進が著しく、樹状細胞が非常に希釈されてしまう。これは樹状細胞がＴ細胞と相互作用するが、樹状細胞自体の増殖及び／又は分化が妨げられるためと考えられる。そこで、樹状細胞が不必要にＴ細胞と相互作用しないように、Ｔ細胞を除去するのである。
【００２７】
本発明の方法において、Ｔ細胞を前記単核球から除去するステップは、Ｔ細胞に発現するが、樹状細胞又はその前駆細胞では発現しないいかなる細胞マーカーを用いて行われてもかまわない。好ましい細胞マーカーは、ＣＤ３か、ＣＤ４及びＣＤ８の組合せかである。また、Ｔ細胞を除去するには、前記細胞マーカーが細胞表面マーカーの場合には、磁気ビーズその他の固相に固定された、当該細胞表面マーカーに対する抗体その他の特異的結合パートナーを用いて、前記単核球の細胞集団から分離される場合がある。あるいは、フロー・サイトメトリー法その他の免疫学的分離手段が用いられる場合がある。また、Ｔ細胞に対する特異的結合パートナーを利用して、Ｔ細胞だけを選択的に傷害又は死滅させる場合がある。なお、前記Ｔ細胞を前記単核球から除去するステップは、他の単核球の細胞タイプ、例えば、Ｂ細胞及び／又はＮＫ細胞をＴ細胞とともに除去するステップであってもかまわない。
【００２８】
得られた細胞を培養するための培地としては、ＩＭＤＭ培地の他、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ−１６４０、Ｘ−ＶＩＶＯ１５培地を含むが、これらに限らない、血液系細胞の増殖に適する培地が用いられる。これらの培地には、ウシ胎仔血清が添加される場合がある。ウシ胎仔血清の濃度は５ないし２０％の場合があり、１０％がより好ましい。代替策として、ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ社その他から入手可能なヒトＡＢ型血清や、日本赤十字社から入手可能な献血ヒト血清アルブミンが添加される場合がある。ヒトＡＢ型血清は０ないし１５％の濃度で添加されることが好ましく、献血ヒト血清アルブミンは０ないし１０％の濃度で添加されることが好ましい。
【００２９】
前記培地には、ＧＭ−ＣＳＦ及びＳＣＦを含むが、これら以外のサイトカインを含まないサイトカインカクテルか、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４を含むが、ＳＣＦを含まないサイトカインカクテルかが添加される。これらのサイトカインは、ヒトのアミノ酸配列を有することが好ましく、安全上、組換えＤＮＡ技術で生産されることが好ましい。ＧＭ−ＣＳＦの濃度は、１ないし５００ｎｇ／ｍＬ、１ないし２００ｎｇ／ｍＬ又は１ないし１００ｍｇ／ｍＬの範囲で用いられる場合があり、より好ましくは、２ないし３００ｎｇ／ｍＬ、５ないし２００ｎｇ／ｍＬ、１０ないし１５０ｎｇ／ｍＬ、２０ないし１２０ｎｇ／ｍＬ又は３０ないし１００ｎｇ／ｍＬの範囲で用いられる。ＳＣＦ又はＩＬ−４の濃度は、０．５ないし５００ｎｇ／ｍＬ、０．５ないし１００ｎｇ／ｍＬ又は０．５ないし５０ｎｇ／ｍＬの範囲で用いられる場合があり、より好ましくは、１ないし３００ｎｇ／ｍＬ、２ないし２００ｎｇ／ｍＬ、５ないし１００ｎｇ／ｍＬ、１０ないし７０ｎｇ／ｍＬ、２０ないし６０ｎｇ／ｍＬ又は２５ないし５０ｎｇ／ｍＬの範囲で用いられる。
【００３０】
本明細書において、あるサイトカインが含まれない培地とは、正常血清中の当該サイトカインの濃度を著しく超えない範囲、すなわち、正常血清中の濃度の３倍、２倍又は１倍以下であることが好ましく、１／２、１／３又は１／５以下であることがより好ましい。あるいは、当該サイトカインの濃度が０の場合の樹状細胞又はその前駆細胞の挙動と実質的に同じ挙動をすることを条件として、５０ｎｇ／ｍＬ、４０ｎｇ／ｍＬ、３０ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、３ｎｇ／ｍＬ又は１ｎｇ／ｍＬ以下であることを指す。
【００３１】
本発明の方法では、ＧＭ−ＣＳＦ及びＳＣＦを含む培地で増殖した樹状細胞の前駆細胞は、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４を含む培地に切り替えることによって樹状細胞のサブセットの変更が可能になる。ここで、ＧＭ−ＣＳＦ及びＳＣＦを含む培地で増殖する細胞は、いつでもＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４によって樹状細胞に分化するように決定された細胞である。したがって、ＧＭ−ＣＳＦ及びＳＣＦを含む培地からＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４を含む培地への切り替えは、培養開始後どの時点で行ってもかまわない。しかし、本発明の目的は樹状細胞を大量に調製することであるから、ＧＭ−ＣＳＦ及びＳＣＦを含む培地で培養する期間が長いほどより多くの樹状細胞が得られるので有利である。一方、培養期間が短いと、より多くの患者について樹状細胞移植療法を実施することができるので、有用である。実際には、実施例１に示すとおり、ＧＭ−ＣＳＦ及びＳＣＦを含む培地での培養開始から３週間後まではＣＤ１１ｃ陽性細胞はどんどん増加するが、４週間後になると、増殖速度が低下する。そこで、より大量の樹状細胞を得ることと、より短期間に樹状細胞を得ることとの折り合いをつけるのは、ＧＭ−ＣＳＦ及びＳＣＦを含む培地での増殖が、治療効果に必要な樹状細胞の細胞数（約１０９個）を達成できるとき、又は、増殖速度が低下して、これ以上ＧＭ−ＣＳＦ及びＳＣＦを含む培地で培養しても樹状細胞の前駆細胞があまり増えない状態となるときである。したがって、ＧＭ−ＣＳＦ及びＳＣＦを含む培地からＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４を含む培地への切り替えは、治療効果に必要な樹状細胞の細胞数まで増殖することを条件として、培養開始後いつ行ってもかまわない。しかし、ＧＭ−ＣＳＦ及びＳＣＦを含む培地での増殖速度が落ち始める３週間後以降であることが好ましく、ＧＭ−ＣＳＦ及びＳＣＦを含む培地での増殖がほぼ止まる４週間後であることがより好ましい。
【００３２】
増殖刺激された細胞は５ないし７％ＣＯ２存在下３７°Ｃで培養される場合がある。細胞は５×１０５個／ｍＬの濃度で播種され、２ないし４日後に培地交換され、新たな培地に２．５×１０５個／ｍＬないし１×１０６個／ｍＬの濃度で播種される場合がある。好ましい播種濃度は５×１０５個／ｍＬである。総数１×１０８個以上の大量培養の場合には、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社のＷＡＶＥ  Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ  ２／１０（商標）のような装置が用いられる場合がある。
【００３３】
本発明の方法において、採取された末梢血から分離された単核球は凍結保存される場合がある。また、ＣＤ３発現細胞が除去された後で、残った単球細胞が凍結保存される場合がある。血球細胞の凍結及び解凍は当業者に周知のいかなる方法を用いてもかまわない。細胞の凍結には、株式会社リンフォテック製のバンバンカー（商標）その他の市販の細胞凍結保存液が用いられる場合がある。
【００３４】
本発明の方法で調製された樹状細胞は、ＯＫ−４３２、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＰＧＥ２等の向炎症性メディエーター等で刺激されて、Ｔ細胞刺激能を獲得した後に、患者に移植される場合がある。癌の治療のためには、それぞれのがんに特異的に発現する抗原で刺激される場合がある。例えば、前立腺癌、非小細胞肺がん及び高リスクメラノーマでは、それぞれ、前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）、腫瘍抗原ＭＡＧＥ−Ａ３及び癌精巣抗原ＮＹ−ＥＳＯ−１で刺激される場合がある。単一の癌に対する治療のために、複数の癌特異的抗原でそれぞれ単独に刺激された樹状細胞を組み合わせたり、あるいは、複数の癌特異的抗原で同時に刺激された樹状細胞を用いたりする場合もある。
【００３５】
本発明の樹状細胞を含む医薬品組成物は、本発明の方法で調製された樹状細胞とともに、他の療法のための薬剤、例えば、化学療法剤、放射線療法剤が配合される場合がある。かかる薬剤には、ＣＤＤＰ、ＴＳ−１、Ｇｅｍｚａｒ等の癌細胞の増殖を抑制する薬剤や、ＩＬ−１２ｐ７０、ＰＧＥ２等の癌細胞を攻撃する細胞傷害性Ｔ細胞の活性を増強する因子の組換えタンパク質や、ＩＬ−１０等の前記細胞傷害性Ｔ細胞の活性を抑制する因子に対する阻害剤、例えば、抗体、短鎖干渉ＲＮＡ等が含まれるが、これらに限定されない。
【００３６】
本発明の医薬品組成物は、医薬品として許容される担体を含む場合がある。生細胞を懸濁することができるいずれかの溶液、例えば、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、培地、血清等が代表例である。また、樹状細胞をワクチンとして使用する場合には、免疫原性を増強するために、サイトカイン、細菌毒素、結核菌菌体成分等の免疫促進剤や、ミョウバン、フロイントアジュバントその他のアジュバント剤を含むが、これらに限定されない、免疫原性増強剤を本発明の医薬品組成物は含む場合がある。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１Ａ】末梢血から分離された単核球をＧＭ／ＳＣＦ培地で１週間培養後、ＣＤ３及びＣＤ１１ｃに対する抗体で２重染色しフロー・サイトメトリー法で解析した結果図。
【図１Ｂ】末梢血から分離された単核球をＧＭ／ＩＬ−４培地で１週間培養後、ＣＤ３及びＣＤ１１ｃに対する抗体で２重染色しフロー・サイトメトリー法で解析した結果図。
【図２Ａ】末梢血から分離された単核球をＧＭ／ＳＣＦ培地で２週間培養後、ＣＤ３及びＣＤ１１ｃに対する抗体で２重染色しフロー・サイトメトリー法で解析した結果図。
【図２Ｂ】末梢血から分離された単核球をＧＭ／ＩＬ−４培地で２週間培養後、ＣＤ３及びＣＤ１１ｃに対する抗体で２重染色しフロー・サイトメトリー法で解析した結果図。
【図３Ａ】末梢血から分離された単核球をＧＭ／ＳＣＦ培地で２週間培養後、ＣＤ１１ｃ陰性細胞のみをゲーティングして、ＣＤ３に対する抗体で染色しフロー・サイトメトリーで解析した結果図。
【図３Ｂ】末梢血から分離された単核球をＧＭ／ＩＬ−４培地で２週間培養後、ＣＤ１１ｃ陰性細胞のみをゲーティングして、ＣＤ３に対する抗体で染色しフロー・サイトメトリーで解析した結果図。
【図４】末梢血中の単核球からＣＤ３発現細胞を除去した残りの細胞を培養した場合（実線）と、ＣＤ３発現細胞を除去しないで単核球集団をそのまま培養した場合（破線）とにおける、ＣＤ１１ｃ陽性細胞数の増殖曲線
【図５Ａ】末梢血から分離された単核球からＣＤ３陽性細胞を除去した後、ＧＭ／ＳＣＦ培地で４週間、さらに、ＧＭ／ＩＬ−４培地で１週間培養後、ＣＣＲ５に対する抗体で染色しフロー・サイトメトリーで解析した結果図。
【図５Ｂ】末梢血から分離された単核球からＣＤ３陽性細胞を除去した後、ＧＭ／ＳＣＦ培地で５週間培養後、ＣＣＲ５に対する抗体で染色しフロー・サイトメトリーで解析した結果図。
【図６Ａ】末梢血から分離された単核球からＣＤ３陽性細胞を除去した後、ＧＭ／ＳＣＦ培地で４週間、さらに、ＧＭ／ＩＬ−４培地で１週間培養後、ＣＣＲ７に対する抗体で染色しフロー・サイトメトリーで解析した結果図。
【図６Ｂ】末梢血から分離された単核球からＣＤ３陽性細胞を除去した後、ＧＭ／ＳＣＦ培地で５週間培養後、ＣＣＲ７に対する抗体で染色しフロー・サイトメトリーで解析した結果図。
【図７Ａ】末梢血から分離された単核球からＣＤ３陽性細胞を除去した後、ＧＭ／ＳＣＦ培地で４週間、さらに、ＧＭ／ＩＬ−４培地で１週間培養後、ＣＤ４０に対する抗体で染色しフロー・サイトメトリーで解析した結果図。
【図７Ｂ】末梢血から分離された単核球からＣＤ３陽性細胞を除去した後、ＧＭ／ＳＣＦ培地で５週間培養後、ＣＤ４０に対する抗体で染色しフロー・サイトメトリーで解析した結果図。
【図８Ａ】末梢血から分離された単核球からＣＤ３陽性細胞を除去した後、ＧＭ／ＳＣＦ培地で４週間、さらに、ＧＭ／ＩＬ−４培地で１週間培養後、ＣＤ５４に対する抗体で染色しフロー・サイトメトリーで解析した結果図。
【図８Ｂ】末梢血から分離された単核球からＣＤ３陽性細胞を除去した後、ＧＭ／ＳＣＦ培地で５週間培養後、ＣＤ５４に対する抗体で染色しフロー・サイトメトリーで解析した結果図。
【図９Ａ】末梢血から分離された単核球からＣＤ３陽性細胞を除去した後、ＧＭ／ＳＣＦ培地で４週間、さらに、ＧＭ／ＩＬ−４培地で１週間培養後、ＣＤ８０に対する抗体で染色しフロー・サイトメトリーで解析した結果図。
【図９Ｂ】末梢血から分離された単核球からＣＤ３陽性細胞を除去した後、ＧＭ／ＳＣＦ培地で５週間培養後、ＣＤ８０に対する抗体で染色しフロー・サイトメトリーで解析した結果図。
【図１０Ａ】末梢血から分離された単核球からＣＤ３陽性細胞を除去した後、ＧＭ／ＳＣＦ培地で４週間、さらに、ＧＭ／ＩＬ−４培地で１週間培養後、ＣＤ８３に対する抗体で染色しフロー・サイトメトリーで解析した結果図。
【図１０Ｂ】末梢血から分離された単核球からＣＤ３陽性細胞を除去した後、ＧＭ／ＳＣＦ培地で５週間培養後、ＣＤ８３に対する抗体で染色しフロー・サイトメトリーで解析した結果図。
【図１１Ａ】末梢血から分離された単核球からＣＤ３陽性細胞を除去した後、ＧＭ／ＳＣＦ培地で４週間、さらに、ＧＭ／ＩＬ−４培地で１週間培養後、ＣＤ８６に対する抗体で染色しフロー・サイトメトリーで解析した結果図。
【図１１Ｂ】末梢血から分離された単核球からＣＤ３陽性細胞を除去した後、ＧＭ／ＳＣＦ培地で５週間培養後、ＣＤ８６に対する抗体で染色しフロー・サイトメトリーで解析した結果図。
【図１２Ａ】末梢血から分離された単核球からＣＤ３陽性細胞を除去した後、ＧＭ／ＳＣＦ培地で４週間、さらに、ＧＭ／ＩＬ−４培地で１週間培養後、ＨＬＡ−ＡＢＣに対する抗体で染色しフロー・サイトメトリーで解析した結果図。
【図１２Ｂ】末梢血から分離された単核球からＣＤ３陽性細胞を除去した後、ＧＭ／ＳＣＦ培地で５週間培養後、ＨＬＡ−ＡＢＣに対する抗体で染色しフロー・サイトメトリーで解析した結果図。
【図１３Ａ】末梢血から分離された単核球からＣＤ３陽性細胞を除去した後、ＧＭ／ＳＣＦ培地で４週間、さらに、ＧＭ／ＩＬ−４培地で１週間培養後、ＨＬＡ−ＤＲに対する抗体で染色しフロー・サイトメトリーで解析した結果図。
【図１３Ｂ】末梢血から分離された単核球からＣＤ３陽性細胞を除去した後、ＧＭ／ＳＣＦ培地で５週間培養後、ＨＬＡ−ＤＲに対する抗体で染色しフロー・サイトメトリーで解析した結果図。
【図１４】末梢血から分離された単核球からＣＤ３陽性細胞を除去した後、ＧＭ／ＳＣＦ培地で４週間、さらに、ＧＭ／ＩＬ−４培地で１週間の培養条件（ＧＭ／ＩＬ−４、白）か、ＧＭ／ＳＣＦ培地で５週間の培養条件（ＧＭ／ＳＣＦ、黒）かで培養後、それぞれの細胞表面マーカーで染色したフロー・サイトメトリー解析結果の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を比較したグラフ。
【図１５Ａ】末梢血から分離された単核球からＣＤ３陽性細胞を除去した後、ＧＭ／ＳＣＦ培地で４週間、さらに、ＧＭ／ＩＬ−４培地で１週間の培養条件（Ｇ４）か、ＧＭ／ＳＣＦ培地で５週間の培養条件（ＧＳ）かで培養後、ＯＫ４３２で刺激して２日間に培地中に放出されたＩＬ−１ｂの濃度を比較したグラフ。
【図１５Ｂ】末梢血から分離された単核球からＣＤ３陽性細胞を除去した後、ＧＭ／ＳＣＦ培地で４週間、さらに、ＧＭ／ＩＬ−４培地で１週間の培養条件（Ｇ４）か、ＧＭ／ＳＣＦ培地で５週間の培養条件（ＧＳ）かで培養後、ＯＫ４３２で刺激して２日間に培地中に放出されたＩＬ−６の濃度を比較したグラフ。
【図１５Ｃ】末梢血から分離された単核球からＣＤ３陽性細胞を除去した後、ＧＭ／ＳＣＦ培地で４週間、さらに、ＧＭ／ＩＬ−４培地で１週間の培養条件（Ｇ４）か、ＧＭ／ＳＣＦ培地で５週間の培養条件（ＧＳ）かで培養後、ＯＫ４３２で刺激して２日間に培地中に放出されたＩＬ−８の濃度を比較したグラフ。
【図１５Ｄ】末梢血から分離された単核球からＣＤ３陽性細胞を除去した後、ＧＭ／ＳＣＦ培地で４週間、さらに、ＧＭ／ＩＬ−４培地で１週間の培養条件（Ｇ４）か、ＧＭ／ＳＣＦ培地で５週間の培養条件（ＧＳ）かで培養後、ＯＫ４３２で刺激して２日間に培地中に放出されたＩＬ−１０の濃度を比較したグラフ。
【図１５Ｅ】末梢血から分離された単核球からＣＤ３陽性細胞を除去した後、ＧＭ／ＳＣＦ培地で４週間、さらに、ＧＭ／ＩＬ−４培地で１週間の培養条件（Ｇ４）か、ＧＭ／ＳＣＦ培地で５週間の培養条件（ＧＳ）かで培養後、ＯＫ４３２で刺激して２日間に培地中に放出されたＩＬ−１２ｐ７０の濃度を比較したグラフ。
【図１５Ｆ】末梢血から分離された単核球からＣＤ３陽性細胞を除去した後、ＧＭ／ＳＣＦ培地で４週間、さらに、ＧＭ／ＩＬ−４培地で１週間の培養条件（Ｇ４）か、ＧＭ／ＳＣＦ培地で５週間の培養条件（ＧＳ）かで培養後、ＯＫ４３２で刺激して２日間に培地中に放出されたＴＮＦ−αの濃度を比較したグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
以下に説明する本発明の実施例は例示のみを目的とし、本発明の技術的範囲を限定するものではない。本発明の技術的範囲は特許請求の範囲の記載によってのみ限定される。本発明の趣旨を逸脱しないことを条件として、本発明の変更、例えば、本発明の構成要件の追加、削除及び置換を行うことができる。
【実施例１】
【００３９】
末梢血からの採血
健康なボランティア被検者から末梢血が採取された。本実験は、九州大学医系地区部局臨床研究倫理審査委員会の承認（承認日：平成22年３月１２日）を得て実施され、前記ボランティア被検者からは書面による同意が得られている。採血には、２２〜２３Ｇ針を取り付けた真空採血管（ＴＥＲＵＭＯ  ベノジェクトＩＩ  ＥＤＴＡ−２Ｎａ）が用いられた。
【００４０】
末梢血からの単核球の分離
得られた血液は、常温に保たれた希釈液（１ｍＭ  ＥＤＴＡ及び２％ウシ胎仔血清が添加されたＰＢＳ）で２倍希釈され、各遠心管に、希釈血２０ないし３５ｍＬが、１０ないし１５ｍＬのＦｉｃｏｌｌ  Ｐａｑｕｅ（比重１．０７７）に重層された。遠心は、５８０×ｇ、室温で２０分間行われ、ブレーキをかけずに停止された。遠心上清（血漿部分）は数ｍＬを残して除去され、中間層が回収された。遠心管１ないし２本から回収された前記中間層が１本の新たな遠心管に集められ、前記希釈液により体積が５０ｍＬに調整された。２回目の遠心は、４２０×ｇ、室温、５分間又は１５分間の条件で行われた。上清は除去され、ペレットが、前記希釈液３０ｍＬに懸濁された。３回目の遠心は、２５０×ｇ、室温１０分間の条件で行われた。上清は除去され、ペレットは、細胞濃度が１×１０７個／ｍＬになるように、２ｍＭ  ＥＤＴＡと、０．１％ＢＳＡとが添加されたＰＢＳに懸濁された（以下、「単核球懸濁液」という。）。
【００４１】
ＣＤ３発現細胞の除去
抗ＣＤ３抗体が固定化された磁気ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  ＣＤ３）は、０．１％ＢＳＡが添加されたＰＢＳで１回洗浄された後、前記単核球懸濁液に細胞１０７個あたり５０μＬが添加された。前記ビーズを含む単核球懸濁液は、４°Ｃで３０分間ローテータにて攪拌された。その後、前記磁気ビーズは磁石によって前記懸濁液から分離され、ＣＤ３を表面に発現する細胞が除去された。
【００４２】
ＣＤ３発現細胞が除去された細胞集団の培養
前記懸濁液に残った細胞（以下、「ＣＤ３−細胞」という。）は、１００ｎｇ／ｍＬの組換えヒトＧＭ−ＣＳＦと、５０ｎｇ／ｍＬの組換えヒトＳＣＦと、１０％ウシ胎仔血清と、抗生物質（ペニシリンＧ１００単位／ｍＬ、硫酸ストレプトマイシン１００μｇ／ｍＬ）とが添加されたＩＭＤＭ（以下、「ＧＭ／ＳＣＦ培地」という。）で５×１０５個／ｍＬになるように希釈され、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）を含む生体適合性ポリマーでコーティングされた６ウェルプレート（リピジュアコートプレート（登録商標）、日油株式会社）で培養された。
【００４３】
ＣＤ３発現細胞を含む単核球集団の培養
対照実験として、ＣＤ３発現細胞を含む単核球集団が培養された。前記単核球懸濁液２００μＬ（２×１０６個）が４００ないし８００×ｇ、５分間の条件で遠心され、得られたペレットが前記ＧＭ／ＳＣＦ培地３ｍＬに懸濁され、ＣＤ３−細胞の培養に用いられるのと同じＭＰＣポリマーでコーティングされた６ウェルプレートで培養された。
【００４４】
培地交換
培地交換は３ないし４日ごとに行われた。細胞が回収され、４００×ｇ、５分間の遠心により培地が除去され、ペレットの細胞が、２．５ないし５×１０５個／ｍＬの濃度になるように前記ＧＭ／ＳＣＦ培地に懸濁され、ＭＰＣポリマーでコーティングされた新たな６ウェルプレートで培養された。
【００４５】
培養中の細胞のモニタリング
培養開始から１週間ごとに、当業者に周知の試薬、装置及び手順に従って、細胞数の計測の他、細胞表面マーカーＣＤ３、ＣＤ１１ｃ及びＣＤ１４の発現がフロー・サイトメトリー法で解析された。
【００４６】
結果
図１Ａ及び２Ａは、末梢血から分離された単核球をＧＭ／ＳＣＦ培地で、それぞれ１及び２週間培養後、ＣＤ３及びＣＤ１１ｃに対する抗体で２重染色しフロー・サイトメトリー法で解析した結果図である。図１Ｂ及び２Ｂは、末梢血から分離された単核球をＧＭ／ＩＬ−４培地で１及び２週間培養後、ＣＤ３及びＣＤ１１ｃに対する抗体で２重染色しフロー・サイトメトリー法で解析した結果図である。図１Ａの条件では、ＣＤ１１ｃ陽性かつＣＤ３陰性の細胞は２７．９％、ＣＤ１１陰性かつＣＤ３陽性の細胞は４４．２９％であったが、図１Ｂの条件では、それぞれ、１０．６６％及び５５．３１％であった。これに対し、図２Ａの条件では、ＣＤ１１ｃ陽性かつＣＤ３陰性の細胞は５．１６％、ＣＤ１１陰性かつＣＤ３陽性の細胞は７５．３１％であったが、図１Ｂの条件では、それぞれ、２．３２％及び７４．２９％であった。ＣＤ１１ｃ陽性かつＣＤ３陰性の細胞は、樹状細胞又はその前駆細胞である。これらの結果から明らかなとおり、ＧＭ／ＳＣＦ培地のほうがＧＭ／ＩＬ−４培地よりも樹状細胞又はその前駆細胞の割合が高くなった。しかし、いずれの培地でも、１週間より２週間のほうが樹状細胞又はその前駆細胞の割合が急激に下がり、逆にＣＤ１１陰性かつＣＤ３陽性の細胞の割合は非常に高くなった。ＣＤ３陽性の細胞はＴ細胞であり、試験管内でも樹状細胞はＴ細胞と相互作用してＴ細胞を刺激できることが知られている。そこで、これらの結果から、Ｔ細胞が共存すると、樹状細胞はＴ細胞を刺激するが、樹状細胞自体の増殖及び／又は分化が妨げられた可能性がある。実際に、図３Ａ及びＢの結果から、ＣＤ１１ｃ陰性の細胞のうち図３Ａでは８７．０７％、図３Ｂでは８８．２７％と、約９割がＣＤ３陽性、すなわち、Ｔ細胞系列の細胞であった。そこで、培養開始前に末梢血由来の単核球からＴ細胞を除去することで、Ｔ細胞との相互作用に煩わされることなく樹状細胞自体の増殖及び分化に専念させることができるのではないか、との発想が得られた。
【００４７】
図４は、末梢血中の単核球からＣＤ３−細胞を培養した場合（実線）と、ＣＤ３発現細胞を除去しないで単核球集団をそのまま培養した場合（破線）とにおける、ＣＤ１１ｃ陽性細胞数の増殖曲線である。いずれの場合も、３人の被検者から採取された末梢血１ｍＬあたりのＣＤ１１ｃ陽性細胞の数が、培養開始時と、１週間後、２週間後、・・・、５週間後の時点での全細胞数と、それぞれの時点でのＣＤ１１ｃ陽性細胞の割合との積として算出された。末梢血中の単核球からＣＤ３発現細胞を除去した残りの細胞を培養した場合には、培養開始から４週間後までＣＤ１１ｃ陽性細胞の数が増加し続け、５週間後には極大に達する。この間、３週間後までは増加速度も上昇し続けるが、３週間後を過ぎると増加速度は低下し、４週間後から５週間後までの間は増加はあまりみられない。ＣＤ１１ｃ陽性細胞の割合も、培養開始時に約２０％であったのに、培養４週間後には９５％を超えていた。これに対し、ＣＤ３発現細胞を除去しないで単核球集団をそのまま培養した場合には、培養開始時からＣＤ１１ｃ陽性細胞の数の増加は全く認められず、図１Ａ及び２Ａで示されたのと同様に、２週間後には著しく減少してしまった。これらの結果から、ＣＤ３発現細胞、すなわち、Ｔ細胞を除去したうえで前記ＧＭ／ＳＣＦ培地で培養することにより、ほぼ樹状細胞だけを選択的に１０倍ないし１００倍に増幅できることが示された。
【実施例２】
【００４８】
培地の切り替えによる樹状細胞の成熟
実施例１のプロトコールに従って、ＣＤ３−細胞が前記ＧＭ／ＳＣＦ培地で４週間培養された後、樹状細胞の前駆細胞を樹状細胞に分化させるために、培地が切り替えられた。新しい培地は、１００ｎｇ／ｍＬの組換えヒトＧＭ−ＣＳＦと、５０ｎｇ／ｍＬの組換えヒトＩＬ−４と、１０％ウシ胎仔血清と、抗生物質（ペニシリンＧ１００単位／ｍＬ、硫酸ストレプトマイシン１００μｇ／ｍＬ）とが添加されたＩＭＤＭ（以下、「ＧＭ／ＩＬ−４培地」という。）で、培養開始から４週間後に、ＧＭ／ＳＣＦ培地からＧＭ／ＩＬ−４培地に切り替えられ、さらに１週間培養された。対照実験では、ＣＤ３−細胞は、４週間後に培地を切り替えないで、５週間連続してＧＭ／ＳＣＦ培地で培養された。
【００４９】
樹状細胞分化マーカーの検討
培養開始から５週間後に、それぞれの実験条件で培養された細胞が、常法に従うフロー・サイトメトリー法による解析に供された。用いられた細胞表面マーカーは、ＣＣＲ５、ＣＣＲ７、ＣＤ４０、ＣＤ５４、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＨＬ−ＡＢＣ及びＨＬＡ−ＤＲであった。また、ＯＫ−４３２による刺激への応答を検討するために、前記５週間の培養後の細胞は、１×１０６個／ｍＬの濃度で、０．５ＫＥ／ｍＬのＯＫ−４３２が添加されたＩＭＤＭに懸濁され、さらに４８時間培養された。その後、ＩＬ−１ｂ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ７０及びＴＮＦ−αの各サイトカインの産生量が測定された。
【００５０】
図５Ａないし１３Ｂに、各細胞表面マーカーごとのフロー・サイトメトリー解析結果を比較したグラフを示す。また、図１４に、各細胞表面マーカーのフロー・サイトメトリー解析結果の平均蛍光強度（ＭＦＩ）の測定値を示す。これらの図において「ＧＭ／ＩＬ−４」は、培養開始から４週間後に、ＧＭ／ＳＣＦ培地からＧＭ／ＩＬ−４培地に切り替えられ、さらに１週間培養された、本発明の方法で調製された細胞での解析結果を表す。「ＧＭ／ＳＣＦ」は、５週間連続してＧＭ／ＳＣＦ培地で培養された、対照実験の細胞での解析結果を表す。図２から明らかなとおり、ＣＤ８３及びＣＤ８６については、本発明の方法で調製された細胞のほうが、対照実験の細胞より強く発現していた。ＣＤ８３及びＣＤ８６は、樹状細胞が分化すると発現が増大することが知られている。また、樹状細胞が抗原提示細胞として機能する際に、抗原の断片と複合体を形成するＨＬＡ分子も、本発明の方法で調製された細胞のほうが、対照実験の細胞より強く発現していた。つまり、これらの図から明らかなとおり、本発明の方法で調製された細胞は、樹状細胞としての分化マーカーを発現し、抗原提示細胞としての機能を備えていることが示された。
【００５１】
図１５ＡないしＦは、本発明の方法で調製された樹状細胞のＴ細胞刺激能を示すグラフである。図１５ＡないしＦにおいて、「Ｇ４」は、培養開始から４週間後に、ＧＭ／ＳＣＦ培地からＧＭ／ＩＬ−４培地に切り替えられ、さらに１週間培養された、本発明の方法で調製された細胞での解析結果を表す。「ＧＳ」は、５週間連続してＧＭ／ＳＣＦ培地で培養された、対照実験の細胞での解析結果を表す。図１５ＡないしＦから明らかなとおり、ＩＬ−１２ｐ７０は本発明の方法で調製された細胞だけで発現し、逆に、ＩＬ−１ｂ、ＩＬ−６及びＩＬ−８は対照実験の細胞だけで発現していた。このことから、ＯＫ−４３２による刺激に対する応答能力の点からも、本発明の方法で調製された細胞は成熟した樹状細胞であることが証明された。
【００５２】
末梢血中の単核球からＣＤ３発現細胞を除去した残りの細胞を培養した場合には、ＣＤ１１ｃ陽性細胞は５週間で１０ないし１００倍に増殖したが、ＣＤ３発現細胞を除去しなかった場合には、ＣＤ１１ｃ陽性細胞は全く増殖が認められず、むしろ、１週間後には数分の１、２週間後には１０分の１と減少していった。図１から明らかなとおり、末梢血由来の単核球からＣＤ３発現細胞を除去することによって、ＣＤ１１ｃ陽性細胞を大量に増殖させることができた。また本発明の方法で調製された細胞は、実施例２の実験結果で証明されたとおり、生体から回収されたばかりの樹状細胞と同じ能力を有する。現在採用されている樹状細胞の調製方法では、促成法で２日、通常法でも５ないし７日しか培養されないため、ＣＤ１１ｃ陽性細胞の数は試験管内では増加せず、むしろ５分の１程度に減少することが知られている。これに対し、本発明の方法によれば、１０倍ないし１００倍に増加させることができるので、本発明の方法は非常に有用である。
【図４】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１５Ｅ】
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【図１５Ｆ】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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