(57)【要約】  【課題】過活動膀胱等の予防又は改善に有効なＴＲＰＶ４活性抑制剤の提供。  【解決手段】レスベラトロールを有効成分とするＴＲＰＶ４活性抑制剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
レスベラトロールを有効成分とするＴＲＰＶ４活性抑制剤。
【請求項２】
レスベラトロールを有効成分とする過活動膀胱の予防又は改善剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＴＲＰＶ４チャネルの活性化を抑制するＴＲＰＶ４活性抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＴＲＰＶ４は、カチオンチャネルの一過性受容器電位（ＴＲＰ）スーパーファミリーのメンバーであり、低浸透圧、温熱（２４℃＜）、アラキドン酸代謝物などにより活性化されることがわかっている（非特許文献１、２）。
【０００３】
ＴＲＰＶ４は、腎、肺、膀胱、心臓、皮膚、脳、消化管など幅広い組織で発現しており、異なった幅広い生理的役割を果たしていると考えられている。腎の遠位尿細管上皮細胞には特に強く発現しており、尿の浸透圧や流量を感知していると示唆されている（非特許文献３）。また消化管における低浸透圧を感知し、交感神経活動を亢進させる機能を持つことも示唆されている（非特許文献４）。
【０００４】
また最近、ＴＲＰＶ４チャネルは膀胱の機能に関与することが報告されている（非特許文献５）。すなわち、膀胱内側の膀胱上皮細胞に存在するＴＲＰＶ４やＴＲＰＶ１が存在し、尿が溜まって膀胱上皮細胞が伸展した場合に当該ＴＲＰＶチャネルを介して細胞内にカルシウムが流入し、これによってＡＴＰが細胞から放出され、膀胱の膨らみが神経に伝わることが明らかにされている。また、ＴＲＰＶ４欠損マウスを用いた検討で、ＴＲＰＶ４の排尿間隔に及ぼす影響はＴＲＰＶ１より大きいことが報告されている（非特許文献６）。
したがって、ＴＲＰＶ４の活性化を抑制することにより、尿意の増加及び排尿頻度の増加を特徴とする過活動膀胱に治療効果をもたらすと考えられる。
【０００５】
一方、レスベラトロールは、ブドウやその加工品であるワイン、ピーナッツ等に含まれるポリフェノール成分で、その食経験は豊富である。レスベラトロールは、抗癌作用（ 非特許文献７）や抗動脈硬化作用（非特許文献８）等の作用を示すほか、血清コレステロール低下作用（特許文献１）や、持久力向上作用（特許文献２）を有すること等が報告されている。
しかし、レスベラトロールがＴＲＰＶ４活性抑制作用を有することや過活動膀胱の予防及び改善に有用であることは知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００１−７２５８３号公報
【特許文献２】特開２００７−１４５８０９号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Guler AD. J. Neurosci. 22: 6408-6414 (2002)
【非特許文献２】Vriens J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106: 1626-1631 (2004)
【非特許文献３】Tian W. Am. J. Physiol. Renal. Physiol.287: F17-F24 (2004)
【非特許文献４】Gao F. Hypertension.  55: 1438-1443 (2010)
【非特許文献５】Nilius B. Physiol. Rev.  87: 165-217 (2007)
【非特許文献６】Gevaert T. J. Clin. Invest. 117: 3453-3462 (2007)
【非特許文献７】Science, vol. 275, No.5297, pp218-220, 1998
【非特許文献８】Cardiovasc Drug Rev, vol.22, No.3, pp169-188, 2004
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、過活動膀胱の予防又は改善に有効なＴＲＰＶ４活性抑制剤を提供することに関する。
【０００９】
本発明者らは、ＴＲＰＶ４の活性を抑制する素材について検討したところ、レスベラトロールにＴＲＰＶ４の活性化を効果的に抑制する作用があることを見出した。
【００１０】
すなわち本発明は、レスベラトロールを有効成分とするＴＲＰＶ４活性抑制剤に係るものである。
また本発明は、レスベラトロールを有効成分とする過活動膀胱の予防又は改善剤に係るものである。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のＴＲＰＶ４活性抑制剤は、ＴＲＰＶ４の活性化を効果的に抑制するという作用を有する。したがって、本発明のＴＲＰＶ４活性抑制剤は、ＴＲＰＶ４チャネルが活性化されることによって生じる症状や疾患を改善するために有用である。具体的には、過活動膀胱（尿意切迫感、頻尿、切迫性尿失禁）の予防又は改善することが可能である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明のレスベラトロール（Resveratrol)は、3,4',5-Trihydroxy-stilbeneを意味し、ｔｒａｎｓ−レスベラトロール、ｃｉｓ−レスベラトロール及びそれらの混合物が包含される。本発明においてはこれらの化合物のうち、少なくとも一種が使用される。また、本発明のレスベラトロールは、配糖体（Piceid等）であっても良い。
【００１３】
本発明におけるレスベラトロールとしては、有機化学的又は微生物を用いて合成した高純度品の他、ブドウや落花生、ピーナッツ、及びイタドリ等のタデ科植物等のレスベラトロールを含有する天然物から抽出し、適宜精製した精製品を用いることができる。
また、レスベラトロールを含有する植物、微生物、各種食品の抽出物や部分精製物、加工品を用いてもよく、当該抽出物や部分精製物、加工品から単離したレスベラトロールを用いることもできる。
【００１４】
ここで、天然物としてはブドウ、イタドリが好適に挙げられる。
ブドウは、ヨーロッパブドウ（Vitis vinifera）とアメリカブドウ（Vitis labrusca）に分類することができ、そのいずれでもよいが、ヨーロッパブドウが好ましい。ブドウの種類としては、具体的にはデラウエア、巨峰、甲州、ピオーネ、マスカット、シュナンブラン、グレナッシュ、マタロ、ミュラーテュルガウ、トレッビアーノ、ベリーＡ、カベルネソービニオン、メルロー、ピノノアール、カベルネフラン、シラー、シャルドネ、ソービニヨンブラン、セミヨン、ガメイ、リースリング、アリゴテ、ミュスカデル、ソーヴィニョン、フォルブランシュ、ミュスカデ、シュナン、グロロー、ピノー・ドーニス、ピノ・ムニエ、ゲヴュルツトラミネール、ピノ・グリ、シルヴァネール、プールサール、サヴァニャン、ジャケール、モンドーズ、ルーセット、カリニャン、サンソー、クレレット、グルナッシュ・ノワール、ムルヴェードル、ユニ・ブラン、ニエルチオ、スキアカレッロ、ヴェルマンチノ、マルサンヌ、ルーサンヌ、ヴィオニエ、ブールブーラン、マカブー、モーザック、タナ、コロンバール、ラン・ドヴ・レル、マルベック、プティ・マンセン、グロ・マンセン、プティ・ヴェルド、サンジョヴェーゼ、ナビオロ、バーベラ、ドルチェット、カリニェナ、ガルナーチャ、モナストレル、テンプラニーニョ等が挙げられる。
【００１５】
ブドウ抽出物としては、ブドウ果実、ブドウ葉又はブドウに由来する物からの抽出物等が挙げられ、ブドウ葉抽出物の場合には特に赤ブドウ葉抽出物が好ましく、ヨーロッパブドウ(Foliae Vitis vinifera L.)の赤ブドウ葉抽出物が特に好ましい。ブドウに由来する物としては、例えばブドウジュース、ワイン、ジュースやワイン製造時の残渣、ジュースやワイン濃縮物等が挙げられる。
抽出は、例えば、レスベラトロールがブドウの果皮や葉に多く含まれていることから、当該部位を、水や熱水、アルコール水、有機溶剤等を用いて抽出する一般的な抽出方法が採用できる。
上記抽出に用いられる有機溶剤としては、エタノール等のアルコールが好ましく、特にエタノールが好ましい。
【００１６】
また、イタドリは、根に多くのレスベラトロールを含むことから、当該部位を上記と同様な一般的な抽出方法により得られるイタドリ抽出物を用いるのが好ましい。
【００１７】
レスベラトロールは、後記実施例に示すように、ＴＲＰＶ４刺激物質（アゴニスト）と共に、ＴＲＰＶ４を形質導入した細胞（ＴＲＰＶ４発現細胞）に接触させた場合に、ＴＲＰＶ４刺激物質による細胞内の陽イオン量の流入を抑制するというＴＲＰＶ４活性抑制作用を有する（実施例）。
【００１８】
ここで、「ＴＲＰＶ４の活性抑制」とは、受容体であるＴＲＰＶ４の活性を抑制すること、具体的には例えばＴＲＰＶ４刺激物質がＴＲＰＶ４に結合することによって発現する活性、例えばイオン流束の調節能（例えば、細胞外から細胞内へのカルシウムイオン、ナトリウムイオンなどの陽イオンの輸送能など）、膜電位の調節能（例えば、電流の発生能など）を抑制或いは阻害することを云う。
【００１９】
ＴＲＰＶ４は、膀胱内側の膀胱上皮細胞に存在し、尿が溜まって膀胱上皮細胞が伸びた場合に当該ＴＲＰＶチャネルを介して細胞内にカルシウムが取り込まれ、これによってＡＴＰが細胞表面から放出され、膀胱の膨らみが神経に伝わることが明らかにされている（前記非特許文献５）。したがって、ＴＲＰＶ４の活性を抑制することにより、尿意の増加及び排尿頻度の増加を特徴とする、過活動膀胱に治療効果をもたらすと考えられる。
【００２０】
したがって、レスベラトロールは、ＴＲＰＶ４活性抑制のため、或いは過活動膀胱の予防又は改善のために使用することができる。当該使用は、ヒト若しくは非ヒト動物、又はそれらに由来する検体における使用であり得、また治療的使用であっても非治療的使用であってもよい。ここで、「非治療的」とは、医療行為、すなわち治療による人体への処理行為を含まない概念である。
【００２１】
また、レスベラトロールは、ＴＲＰＶ４活性抑制剤、過活動膀胱の予防又は改善剤（以下、ＴＲＰＶ４活性抑制剤等）として使用することができ、さらにこれらの剤を製造するために使用することができる。
【００２２】
当該ＴＲＰＶ４活性抑制剤等は、それ自体、ＴＲＰＶ４活性抑制、過活動膀胱の予防又は改善効果を発揮する、ヒト若しくは動物用の医薬品、医薬部外品又は食品であってもよく、又は当該医薬品、医薬部外品等に配合して使用される素材又は製剤であってもよい。このとき、当該ＴＲＰＶ４活性抑制剤等には、レスベラトロールを単独で、又はこれ以外に、必要に応じて、後述の配合すべき対象物において許容される担体等を配合してもよい。なお、当該製剤は配合すべき対象物に応じて常法により製造することができる。
また、食品としては、ＴＲＰＶ４活性抑制、過活動膀胱の予防又は改善等の生理機能をコンセプトとし、必要に応じてその旨を表示した飲食品、機能性飲食品、病者用飲食品、特定保健用食品等を包含する。
【００２３】
尚、本発明において、「過活動膀胱」とは、尿意切迫感を必須とした症状症候群であり、通常は頻尿と夜間頻尿を伴うものである。
【００２４】
上記医薬品（医薬部外品も含む）の剤形は、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤、静脈内注射、筋肉注射剤、坐剤、吸入剤、経皮吸収剤、点眼剤、点鼻剤、湿布剤、パップ剤、軟膏、ローション、クリーム、口腔用製剤等の何れでもよく、投与形態も、経口投与（内用）、非経口投与（外用、注射）の何れであってもよい。
このような種々の剤型の医薬製剤は、レスベラトロールを単独で、又は他の薬学的に許容される賦形剤、結合剤、増量剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、嬌味剤、香料、被膜剤、担体、希釈剤等を適宜組み合わせることにより調製することができる。
【００２５】
好ましい投与形態は経口投与であり、この場合、製剤中のレスベラトロールの含有量は、通常０．０１質量％以上、好ましくは０．１質量％以上、より好ましくは０．５質量％以上であり、そして２０質量％以下、好ましくは１０質量％以下、より好ましくは５質量％以下である。例えば、０．０１〜２０質量％、好ましくは０．１〜１０質量％、より好ましくは０．５〜５質量％が挙げられる。
【００２６】
上記食品の形態は、固形、半固形又は液状であり得、例えば、パン類、ケーキ類、麺類、菓子類、ゼリー類、冷凍食品、アイスクリーム類、乳製品、飲料等の各種食品の他、上述した経口投与製剤と同様の形態（錠剤、カプセル剤、シロップ等）が挙げられる。
種々の形態の食品は、レスベラトロールを単独で、又は他の食品材料や、溶剤、軟化剤、油、乳化剤、防腐剤、香科、安定剤、着色剤、酸化防止剤、保湿剤、増粘剤等を適宜組み合わせることにより調製することができる。当該食品中のレスベラトロールの含有量（抽出物の乾燥物換算）は、通常０．００１質量％以上、好ましくは０．００５質量％以上、より好ましくは０．０１質量％以上であり、そして、１０質量％以下、好ましくは５質量％以下、より好ましくは１質量％以下である。例えば、０．００１〜１０質量％、好ましくは０．００５〜５質量％、より好ましく０．０１〜１質量％が挙げられる。
【００２７】
本発明のＴＲＰＶ４活性抑制剤等の投与量又は摂取量は、対象者の状態、体重、性別、年齢又はその他の要因に従って変動し得るが、経口投与又は摂取の場合成人１人当たり、レスベラトロールとして、１日あたり通常０．１ｍｇ以上、好ましくは１ｍｇ以上、より好ましくは５ｍｇ以上であり、そして１０００ｍｇ以下、好ましくは５００ｍｇ以下、より好ましくは２００ｍｇ以下である。例えば、０．１ｍｇ〜１０００ｍｇ、好ましくは１ｍｇ〜５００ｍｇ、より好ましくは５ｍｇ〜２００ｍｇが挙げられる。また、上記製剤は、任意の投与計画に従って投与又は摂取され得るが、１日１回〜数回に分けて投与又は摂取することが好ましい。
【００２８】
本発明のＴＲＰＶ４活性抑制剤等の投与又は摂取対象者としては、それを必要としている者であれば特に限定されないが、ＴＲＰＶ４活性抑制及び過活動膀胱の予防又は改善を図ることができることから、特に、尿意切迫感があるヒト、頻尿又は尿漏れのあるヒトへの投与又は摂取が有効である。
【００２９】
上述した実施形態に関し、本発明においては以下の態様が開示される。
＜１＞レスベラトロールを有効成分とするＴＲＰＶ４活性抑制剤。
＜２＞レスベラトロールを有効成分とする過活動膀胱の予防又は改善剤。
【００３０】
＜３＞ＴＲＰＶ４活性抑制剤を製造するための、レスベラトロールの使用。
＜４＞過活動膀胱の予防又は改善剤を製造するための、レスベラトロールの使用。
＜５＞ＴＲＰＶ４活性抑制に使用するためのレスベラトロール。
＜６＞過活動膀胱の予防又は改善に使用するためのレスベラトロール。
＜７＞レスベラトロールを、それらを必要とする対象に投与又は摂取するＴＲＰＶ４活性抑制方法。
＜８＞レスベラトロールを、それらを必要とする対象に投与又は摂取する過活動膀胱の予防又は改善方法。
＜９＞非治療的な方法である前記＜７＞〜＜８＞の方法。
【実施例】
【００３１】
参考例１  ヒトＴＲＰＶ４遺伝子発現ベクターの作製
ヒト十二指腸由来細胞株であるＨｕｔｕ−８０細胞(American Type Culture Collectionより購入)から抽出したｔｏｔａｌＲＮＡを逆転写して得られたｃＤＮＡを鋳型にして、公開されているヒトＴＲＰＶ４遺伝子配列を参考に合成した、下記に示す塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットを用いて、下記の条件下でポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。
【００３２】
＜プライマーセット＞
フォワードプライマー；5’-CACCATGGCGGATTCCAGCGAAGGCCC-3’：配列番号１
リバースプライマー；5’-CTAGAGCGGGGCGTCATCAGTCC-3’：配列番号２
【００３３】
＜ＰＣＲ条件＞
a) PCR溶液組成
cDNA(Template)                                    15μl
5x PrimeStar GXL Buffer                           10μl
dNTPs mixture (2.5mM)                              4μl
PrimeStar GXL DNA Polymerase (タカラバイオ)        1μl
Forward Primer (10uM)                              1μl
Reverse Primer (10uM)                              1μl
Water                                             18μl
b) 温度とサイクル条件
95℃       2min 
↓
98℃      10sec    33 cycles
70℃       2min 
【００３４】
得られたＰＣＲ産物をＨｉｇｈ  Ｐｕｒｅ  ＰＣＲ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ロッシュ）用いて精製した。精製したＰＣＲ産物と、ｐｃＤＮＡ３．１  Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ  ＴＯＰＯ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｋｉｔ（インビトロジェン社）を用いて、発現用ベクターを作製した。
【００３５】
実施例１  ヒトＴＲＰＶ４発現細胞の作製と細胞内Ｃａ2+流入活性の測定
１０％牛胎児血清を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（インビトロジェン）を用いてＨＥＫ２９３細胞（American  Type  Culture  Collectionより購入）の培養を行った。ＨＥＫ２９３細胞をＴ−７５細胞培養用フラスコに５×１０5ｃｅｌｌｓ／Ｆｌａｓｋで播種した。培養３日後、参考例１で作製したヒトＴＲＰＶ４発現ベクター（８μｇ）をＴｒａｎｓＩＴ−２９３（Ｍｉｒｕｓ）を用いて細胞にトランスフェクションし１日培養した。Ｄｅｔａｃｈｉｎ（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ）で細胞をはがし９６ｗｅｌｌ  Ｏｐｔｉｃａｌ  ｂｏｔｔｏｍ  ｐｌａｔｅ  （Ｎｕｎｃ）に１０％牛胎児血清を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で１．５×１０4ｃｅｌｌｓ／９０μｌ／ｗｅｌｌの細胞密度で播き、さらに１日培養した。
【００３６】
細胞内Ｃａ2+流入活性の測定はＣａｌｃｉｕｍ  Ｋｉｔ  ＩＩ−  ｆｌｕｏ  ４（ＤＯＪＩＮＤＯ）を用いて行った。ｆｌｕｏ４−ＡＭ  を含有したＬｏａｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒを上記の細胞に９０μｌ／ｗｅｌｌ添加し、３７℃で１時間インキュベートした後、３７℃で蛍光プレートリーダーＦＤＳＳ３０００（浜松ホトニクス）により蛍光強度（励起波長；４８８ｎｍ，蛍光波長；５２４ｎｍ）を２秒毎に測定した。測定開始３０秒後にＴＲＰＶ４作動薬であるＧＳＫ１０１６７９０ａ（Sigma社）と、以下に示す検体を含有する溶液（ＧＳＫ１０１６７９０ａ；５０ｎＭ（終濃度５ｎＭ）、検体；終濃度の１０倍濃度）を２０μｌ／ｗｅｌｌ添加し、３００秒まで２秒毎に蛍光強度変化を測定した。
【００３７】
＜検体＞
レスベラトロール（和光純薬）、RN-1734(CAS Number: 946387-07-1、Vincent et al, Biochem.Biophys.Res.Comms. 389 490 (2009).； Sigma,)、をジメチルスルオキシド(DMSO)（ナカライテスク）で溶解し、使用した。
【００３８】
また、検体のＴＲＰＶ４活性の阻害率は次式により算出した。
（数１）
阻害率(%)=〔 (F300C1／F0C1−F300／F0)/(F300C1／F0C1−F300C2／F0C2) 〕x 100 
F300  ;測定開始300秒後のGSK1016790aと検体を添加したウェルの蛍光強度
F300C1;測定開始300秒後のGSK1016790aとDMSOを添加したウェルの蛍光強度
F300C2;測定開始300秒後のDMSOのみを添加したウェルの蛍光強度
F0    ;測定開始直後のGSK1016790aと検体を添加したウェルの蛍光強度
F0C1  ;測定開始直後のGSK1016790aとDMSOを添加したウェルの蛍光強度
F0C2  ;測定開始直後のDMSOのみを添加したウェルの蛍光強度
【００３９】
＜検定方法・結果＞
コントロールであるＤＭＳＯの阻害率を０％とした時、コントロールに対する検体の阻害率をＤｕｎｎｅｔにより検定した。結果を表１に示す。
表１より、レスベラトロールは、ＴＲＰＶ４阻害剤として公知のＲＮ−１７３４と同様、用量依存的にＴＲＰＶ４活性を有意に阻害した。
【００４０】
【表１】
2014024808.tif 000002
【配列表】
2014024808000001.app