(57)【要約】【課題】本発明は、飲食品に適した安全性の高い塩味増強剤や塩味増強方法を提供することを目的とする。また、ｈＥＮａＣの活性化能を有するトリプトファン含有ペプチドの提供を目的とする。【解決手段】Ｔｒｐ−ＸあるいはＸ−Ｔｒｐのうち、少なくともいずれか一つのジペプチドを含有する塩味増強剤、ここでＸはＰｈｅ、Ｌｅｕ、Ｔｒｐ、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ，Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ｖａｌより選択されるアミノ酸を示す。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｔｒｐ−ＸあるいはＸ−Ｔｒｐのうち、少なくともいずれか一つのジペプチドを含有する塩味増強剤、ここでＸはＰｈｅ、Ｌｅｕ、Ｔｒｐ、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ，Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ｖａｌより選択されるアミノ酸を示す。
【請求項２】
請求項１に記載のジペプチドと飲食物とを混合する工程を含む飲食品の塩味を調節する方法
【請求項３】
請求項１に記載のジペプチドと飲食物を含有する飲食品
【請求項４】
請求項１に記載のジペプチドを含有するｈＥＮａＣの活性化剤
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
食塩（塩化ナトリウム：ＮａＣｌ）は、人間にとって必要不可欠な栄養成分で（Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉ．Ｎｕｔｒ．，２００９，４９，８４１−８５１：非特許文献１）、塩味を構成する代表的な成分である。一方で、食塩の過剰摂取は血圧上昇の一因であり、脳卒中や心臓疾患の原因と考えられている。食塩の過剰摂取による生活習慣病のリスク上昇を予防する観点から、厚生労働省は「日本人の食事摂取基準（２０１０年度版）：非特許文献２」において、成人における食塩の目標摂取量を男性で９ｇ未満／日、女性で７．５ｇ未満／日と設定している。また、ＷＨＯでは食塩摂取量を５ｇ未満／日を勧めている（Ｒｅｐｏｒｔ  ｏｆ  ａ  ＷＨＯ  Ｆｏｒｕｍ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ，５−７  Ｏｃｔｏｂｅｒ  ２００６，Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ，ＷＨＯ；Ｇｅｎｅｖａ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ，２００７．７：非特許文献３）。
【０００２】
しかしながら、平成２１年度国民栄養・健康調査（：非特許文献４）によれば成人の食塩摂取量は男性で１１．１ｇ／日、女性で９．６ｇ／日であり、目標値との隔たりがある。
このような観点から、食塩の摂取量を減らすことが強く求められているが、食品の味に対する役割は単に塩味を付与するだけではなく、苦味の抑制や甘味・旨味の増強など味の相互作用をももたらすことから（Ｆｏｏｄ  Ｑｕａｌ．Ｐｒｅｆ．，２００３，１４，  １１１−１２４：非特許文献５）、食塩の添加量を減らした減塩食品は、味がぼけてしまい呈味性が著しく低下するため、食塩摂取の抑制は進んでいない。
【０００３】
そこで、食塩代替品や塩味増強素材の探索が広く実施されてきた。食塩代替品としては、食塩（ＮａＣｌ）の一部をカリウム塩（ＫＣｌ）、マグネシウム塩（ＭｇＣｌ２）、あるいはアンモニウム塩（ＮＨ４Ｃｌ）で置き換える方法が知られている。しかしながら、これらは苦味・渋味・収斂味などを有することから食品の味質を著しく低下させるという欠点を有している。塩味ペプチドとしてオルニチルタウリン、オルニチル−β−アラニン、グリシルリジン等の塩基性アミノ酸からなるペプチド類（Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．，３２，Ｎｏ．５，１９８４：非特許文献６）なども報告されているが、その効果はわずかである。
【０００４】
食塩味増強物質としては、例えばＬ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン酸との等モル混合物（米国特許第５１４５７０７号：特許文献１）、分子量５０，０００ダルトン以下のコラーゲンを加水分解して得られるペプチド（特開昭６３−３７６６号：特許文献２）、甘味蛋白質であるソーマチン（特開昭６３−１３７６５８号：特許文献３）、卵白の蛋白質、ゼラチン、大豆蛋白質、小麦蛋白質、コーン蛋白質、魚蛋白質、乳蛋白質または肉蛋白質等の蛋白質加水分解物（特開平７−２８９１９７号：特許文献４）、トレハロース（特開平１０−６６５４０号：特許文献５）、クエン酸生産能を有する黒麹菌で製麹した黒麹および黄麹菌で製麹した黄麹の混合物を消化分解して得られる分解液（特開平２−５３４５６号：特許文献６）、陽イオン性界面活性剤であるセチルピリジウム塩単体またはセチルピリジウム塩とアルギニン、リジン等の塩基性アミノ酸との混合物（特表平３−５０２５１７号：特許文献７）、炭素数３〜８の飽和脂肪酸モノカルボン酸（特開平５−１８４３２６号：特許文献８）、酵母エキス（特開２０００−３７１７０号：特許文献９）、蛋白質を加水分解処理及び脱アミド処理して得られるペプチド（国際公開第０１／０３９６１３号：特許文献１０）、塩基性アミノ酸とクエン酸とを反応させて生成する中和塩を主成分とする呈味改良剤（特開２００３−１４４０８８号：特許文献１１）等、数多くの方法が提案されている。
【０００５】
しかし、減塩効果、風味、経済性、安全性等の観点から考えると、未だ有効な技術、消費者のニーズにあった技術には到っておらず、食塩を低減しても食塩味および風味を損なわない安全で効果的な減塩技術が強く求められている。
口腔内に取り込まれた味物質は、舌の表面、咽頭、喉頭に分布する味蕾と呼ばれる器官で受容される。味蕾の中には基底細胞、支持細胞および味覚細胞という異なった種類の細胞があるが、この中で味を感じることができるのは味覚細胞で、さらに拡大すると、この味覚細胞の細胞膜表面に味認識の入り口である味覚受容体が発現している。味物質が味覚受容体によって感知されると、細胞内シグナル伝達を経て細胞膜の脱分極が引き起こされ、味細胞に投射している味神経に向けて神経伝達物質が放出される。味細胞から伝達されたシグナルは最終的に味認識の終着点である脳に到達し、味として認知される。塩味を強く感じさせるためには、この一連の流れのどこかで信号が増幅されればよいが、味認識の入り口である味覚受容体に作用する素材は本質的な塩味増強素材であることが予想される。  
【０００６】
近年の分子生物学やゲノミクスの進展により、味覚受容体が次々と発見され（Ｎａｔｕｒｅ  ２００６，４４４，２８８−２９４：非特許文献７）、これらの味覚受容体を発現させた培養細胞を用いた評価手法が開発されている。さらに本手法を用いることで、実際に甘味を増強する甘味増強素材（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，  ２０１０，１０７，４７４６−４７５１：非特許文献８）や、苦味を抑制するような苦味抑制素材（Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．，２０１０，２０，１１０４−１１０９：非特許文献９）が見出されている。以上の報告からも、塩味受容体に直接作用し、シグナルを増強するような素材も塩味増強素材になりうると考えることは妥当である。
【０００７】
塩味の受容機構については未だに不明な点も多いが、塩味受容体は２０１０年にアミロライド感受性の上皮チャネル（ＥＮａＣ：Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｎａ  Ｃｈａｎｎｅｌ）がα、β、およびγサブユニットからなる複合体でマウスやラットといったげっ歯類の低濃度の食塩、即ち嗜好性の食塩の感受に関与していることが報告されている（Ｎａｔｕｒｅ  ２０１０，４６４，２９７−３０１：非特許文献１０）。ヒト上皮ナトリウムチャネル（ｈＥＮａＣ）のα、β、およびγサブユニットに対するコードＤＮＡ（ｃＤＮＡ）もすでに単離、これらの遺伝子はクローニングされており（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１９９４，９１，２４７−２５１、およびＧｅｎｏｍｉｃｓ，１９９５，２８，５６０−５６５：非特許文献１１及び１２）、ヒトにおいても各サブユニットは全て機能的なナトリウムチャネルの形成に必要であると考えられている（Ｎａｔｕｒｅ，１９９４，３６７，４６３−４６７：非特許文献１３）。
【０００８】
そこで、ｈＥＮａＣのα、β、およびγサブユニットを発現させた培養細胞評価系を用いてｈＥＮａＣのを活性化する素材を探索すれば、その素材は塩味を増強させる可能性が高いと考えられ、培養細胞評価系を用いたＥＮａＣ活性化能を有する化合物の探索手法が構築され（特願２００６−５１８８９６および、特願２００９−５１９９１２：特許文献１２及び１３）、Ｓ３９６９というｈＥＮａＣを活性化させる化合物が見出されている（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２００８、２８３（１８）、１１９８１−１１９９４：非特許文献１４）。さらに、Ｓ３９６９の類縁化合物もｈＥＮａＣの活性化能を有し、さらに食塩と共存することによって食塩のヒトに対する塩味を増強する効果に優れることが発見されている（ＷＯ／２０１１／０１０７４８：特許文献１４）。しかしながら、上記のｈＥＮａＣを活性化する素材はいずれも天然には存在しない合成化合物であり、喫食に対する安全性についての検証はなされていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許第５１４５７０７号
【特許文献２】特開昭６３−３７６６号
【特許文献３】特開昭６３−１３７６５８号
【特許文献４】特開平７−２８９１９７号
【特許文献５】特開平１０−６６５４０号
【特許文献６】特開平２−５３４５６号
【特許文献７】特表平３−５０２５１７号
【特許文献８】特開平５−１８４３２６号
【特許文献９】特開２０００−３７１７０号
【特許文献１０】国際公開第０１／０３９６１３号
【特許文献１１】特開２００３−１４４０８８号
【特許文献１２】特願２００６−５１８８９６号
【特許文献１３】特願２００９−５１９９１２号
【特許文献１４】ＷＯ／２０１１／０１０７４８号
【非特許文献１】Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉ．Ｎｕｔｒ．，２００９，４９，８４１−８５１
【非特許文献２】日本人の食事摂取基準（２０１０年度版）
【非特許文献３】Ｒｅｐｏｒｔ  ｏｆ  ａ  ＷＨＯ  Ｆｏｒｕｍ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ，５−７  Ｏｃｔｏｂｅｒ  ２００６，Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ，ＷＨＯ；Ｇｅｎｅｖａ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ，２００７．７
【非特許文献４】平成２１年度国民栄養・健康調査
【非特許文献５】Ｆｏｏｄ  Ｑｕａｌ．Ｐｒｅｆ．，２００３，１４，  １１１−１２４
【非特許文献６】Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．，３２，Ｎｏ．５，１９８４
【非特許文献７】Ｎａｔｕｒｅ  ２００６，４４４，２８８−２９４
【非特許文献８】Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，  ２０１０，１０７，４７４６−４７５１
【非特許文献９】Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．，２０１０，２０，１１０４−１１０９
【非特許文献１０】Ｎａｔｕｒｅ  ２０１０，４６４，２９７−３０１
【非特許文献１１】Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１９９４，９１，２４７−２５１
【非特許文献１２】Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，１９９５，２８，５６０−５６５
【非特許文献１３】Ｎａｔｕｒｅ，１９９４，３６７，４６３−４６７
【非特許文献１４】Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２００８、２８３（１８）、１１９８１−１１９９４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、飲食品に適した安全性の高い塩味増強剤や塩味増強方法を提供することを目的とする。また、ｈＥＮａＣの活性化能を有するトリプトファン含有ペプチドの提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
発明者らは鋭意研究を行う中で、食経験があり、安全性が高い構成アミノ酸として少なくとも１つトリプトファン（Ｔｒｐ）を含有するジペプチドがｈＥＮａＣの活性化作用を有すること、及び食塩と共存することによって食塩の塩味を増強する効果に優れることを見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は下記の発明を包含する：
項１、Ｔｒｐ−ＸあるいはＸ−Ｔｒｐのうち、少なくともいずれか一つのジペプチドを含有する塩味増強剤、ここでＸはＰｈｅ、Ｌｅｕ、Ｔｒｐ、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ，Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ｖａｌより選択されるアミノ酸を示す。
項２、請求項１に記載のジペプチドと飲食物とを混合する工程を含む飲食品の塩味を調節する方法。
項３、請求項１に記載のジペプチドと飲食物を含有する飲食品。
項４、請求項１に記載のジペプチドを含有するｈＥＮａＣの活性化剤。
である。
【発明の効果】
【００１２】
本発明のＴｒｐ含有ジペプチド（Ｔｒｐ−ＸあるいはＸ−Ｔｒｐ）は、ｈＥＮａＣの活性化能を有し、食塩と共存することで塩味を増強する効果を有する。よって、本発明の塩味増強剤を用いることにより、減塩食品における塩味の低減感が改善され、食塩の使用量を減量することが可能となる。また、本発明のＴｒｐ含有ジペプチドは、天然食品素材中に存在するジペプチドで、長い食経験を有する素材中に含まれるジペプチドであることから安全性は極めて高いと考えられる。
したがって、ナトリウムの摂取量を制限される高血圧患者、心臓血管疾患患者、腎臓病患者等の食事制限を受けている患者や生活習慣病予防の観点から減塩食を摂取している健常人に対して、減塩食を提供するために有用であると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】実施例１における、膜電位色素法を用いたｈＥＮａＣ活性化能の測定例を示す。
【図２】実施例２における、電気生理学的手法によるｈＥＮａＣ活性化能の測定例を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は、構成アミノ酸として少なくとも１つトリプトファンを有するジペプチドを有効成分として含有する塩味増強剤に関する。
本発明において構成アミノ酸として少なくとも１つトリプトファンを含有するジペプチドとはトリプトファン−アミノ酸（Ｔｒｐ−Ｘ）、又はアミノ酸−トリプトファン（Ｘ−Ｔｒｐ）のいずれかのジペプチドのことをさす。これらジペプチドの中で、Ｔｒｐ−Ａｌａ、Ｔｒｐ−Ａｒｇ、Ｔｒｐ−Ａｓｎ、Ｔｒｐ−Ａｓｐ、Ｔｒｐ−Ｃｙｓ，Ｔｒｐ−Ｇｌｎ、Ｔｒｐ−Ｇｌｙ、Ｔｒｐ−Ｈｉｓ、Ｔｒｐ−Ｉｌｅ、Ｔｒｐ−Ｌｅｕ、Ｔｒｐ−Ｌｙｓ、Ｔｒｐ−Ｍｅｔ、Ｔｒｐ−Ｐｈｅ、Ｔｒｐ−Ｐｒｏ、Ｔｒｐ−Ｓｅｒ、Ｔｒｐ−Ｔｈｒ、Ｔｒｐ−Ｔｒｐ、Ｔｒｐ−Ｔｙｒ、Ｔｒｐ−Ｖａｌ、Ａｌａ−Ｔｒｐ、Ｉｌｅ−Ｔｒｐ、Ｌｅｕ−Ｔｒｐ、Ｌｙｓ−Ｔｒｐ、Ｐｈｅ−Ｔｒｐ、Ｔｙｒ−Ｔｒｐから選ばれるジペプチドに効果が認められ、さらに好ましくはＴｒｐ−Ｌｅｕ、Ｔｒｐ−Ｔｒｐ、Ｔｒｐ−Ｐｈｅ、Ｔｒｐ−Ｃｙｓ、Ｔｒｐ−Ｍｅｔ、Ｉｌｅ−Ｔｒｐに特に強い効果が認められる。
【００１５】
ジペプチドは合成品でも、天然物から抽出、精製したものでもよい。例えば、Ｔｒｐ−Ｌｅｕについては、豆腐を紅麹で発酵させた食品である「豆腐よう」から単離、精製することが可能であると考えられる（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６７（６），１２７８−１２８３，２００３）。また、蛋白質を蛋白質分解酵素で分解して、精製して用いることもできる。例えば、Ｔｒｐ−Ｔｒｐについては卵白リゾチームから、Ｔｒｐ−Ｐｈｅについてはβ―コングリシニンのαサブユニットを酵素処理、精製することで得ることが可能であると考えられる。これらはひとつの種類のジペプチドを高度に精製したものでも複数のジペプチドの混合物でもよく、また、アミノ酸やトリペプチドを含む状態で用いてもよい。添加する食品に応じて、添加量を少なくする必要があれば、高度に精製すればよく、ジペプチド以外の成分の味や風味が影響しないような食品に用いる場合には、純度の低いものでよい。
【００１６】
本発明のジペプチドを含有する塩味増強剤は単独で食塩含有飲食品に添加することで塩味増強作用を示すが、さらにグアニジニル化合物、もしくはその塩を併用することでその効果は向上する。このとき、用いるグアニジニル化合物としては特にアルギニンが好ましい。アルギニンおよびその塩は市販のもの、あるいは常法により合成、精製されたものいずれを用いるも可能である。添加する量としては、ジペプチド１重量部に対し０．００５〜４００重量部、特に０．０５〜１００重量部で添加するのが好ましい。
【００１７】
また、これらの化合物を添加した場合、ｐＨがアルカリに傾くため、pＨの調節をするのがよい。ｐＨの調整は適当な酸、好ましくはクエン酸、酢酸、乳酸、コハク酸、フマル酸、リン酸、リンゴ酸、リン酸、グルコン酸、硫酸、特に好ましくは塩酸を用いて調整すれば良い。
【００１８】
さらに塩化カリウムや塩化マグネシウムなどの無機塩を組み合わせても良い。これらは市販の物を用いれば良く、添加量としてはジペプチド１重量部に対し、０．００５〜１０００重量部、特に０．１〜２００重量部で添加するのが好ましい。
【００１９】
また本発明は、本発明塩味増強剤を用いた塩味の増強方法も意図している。前記方法により得られた本発明塩味増強剤を、食塩を含有する飲食品に添加することにより、その食品の塩味を増強することができる。添加する目安としては、添加する食品によるが、本発明のジペプチドを食品中に０．００１〜０．５重量％、アルギニンあるいはその塩を０．０１〜１．０重量％を配合することで約２５％の、また、これに塩化カリウムもしくは塩化マグネシウムを０．１〜１．０重量％程度添加することで、約５０％の減塩が可能となる。これを目安に希望する減塩の程度によって本発明の塩味増強剤の量を調整することで、減塩飲食品を得ることが可能になる。本発明の塩味増強方法では、従来の手法の問題点であった苦味や渋味の付与はほとんど見られず良質の塩味増強を達成することが可能である。
【００２０】
食品への使用は広く適応することが可能であり、その一例としてラーメン、うどん、そば、ポタージュ、コンソメ、ブイヨン、味噌汁、お吸い物などのスープ、ラーメン、うどん、そば、焼きそば、パスタなどの麺類やパン類、醤油、味噌、ドレッシングなどの食品用調味料、あるいはスナック菓子のシーズニングパウダーなどが挙げられる。
以下に本発明の実施例を記載するが、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。
【実施例】
【００２１】
以下、本発明について実施例を挙げて具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。実施例では市販のジペプチド（ＴＲＰ−ＸあるいはＸ−Ｔｒｐ）を使用しているが、自ら合成したあるいは酵素分解により得られたものを精製したジペプチドを使用してもよい。
【実施例１】
【００２２】
─膜電位色素法を用いたｈＥＮａＣ活性化作用の評価─
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は不活化した１０％ ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、３７℃、５％ ＣＯ２存在下で培養した。ｈＥＮａＣα, ｈＥＮａＣβ, ｈＥＮａＣγの各サブユニットを１：１：１の比率でＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＬＴＸ＋Ｐｌｕｓ  ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて一過的に導入した。
【００２３】
プラスミドの導入量や手法については、商品マニュアルに準じた。遺伝子導入６時間後に、上述の細胞を９６−ｗｅｌｌ  ｂｌａｃｋ、ｃｌｅａｒ−ｂｏｔｔｏｍｅｄ  ＣｅｌｌＢＩＮＤ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｌａte（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃ．）に翌日あるいは翌々日に細胞がコンフルエントの状態のようになるように希釈して１００μｌずつ撒きなおし、１２−４０時間３７℃、５％ＣＯ２存在下で培養した。ＤＭＥＭ培地を除去、アッセイ用バッファー（１３０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ｇｌｕｃｏｓｅ、５ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、ａｎｄ  １．２ｍＭ  ＭｇＣｌ２  ｉｎ  １０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４；以下ＨＥＰＥＳバッファー）でリンスしたのち５０μｌのＨＥＰＥＳバッファーで満たし、これにＨＥＰＥＳバッファーで溶解した膜電位感受性色素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｋｉｔ  Ｂｌｕｅ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｉｎｃ．）を５０μｌ負荷した。なお、膜電位感受性色素の濃度は商品マニュアルに準じた。２７℃にて１０−６０分間遮光下静置した後、Ｆｌｅｘ  Ｓｔａｔｉｏｎ  ３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｉｎｃ．）にて、蛍光強度（励起：５３０ｎｍ、検出：５６５ｎｍ、カットオフ：５５０ｎｍ）を２秒ごと２７℃で観測、観測開始から２０秒後に２倍濃度のＨＥＰＥＳバッファーで溶解した試料溶液を１００μｌ添加し、さらに１００秒間蛍光をモニターした。試料溶液添加８０秒後の蛍光強度と試料溶液添加前の蛍光強度の差をΔＲＦＵ（ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｕｎｉｔｓ）とした。
【００２４】
なお、ｈＥＮａＣα、ｈＥＮａＣβ、ｈＥＮａＣγの発現プラスミドは、Ｏｐｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓより下表に示すｃＤＮＡを購入、ＰＣＲによるコード領域の増幅した後、ｐＥＡＫ１０発現ベクターの表１に示す挿入サイトへライゲーションすることで作製した。表１にｈＥＮａＣの各サブユニットの配列情報を示す。
【００２５】
【表１】
2014079213.tif 000003
【００２６】
Ｔｒｐ−Ｘ、Ｘ−Ｔｒｐ型のジペプチドについて膜電位色素法を用いたｈＥＮａＣの活性化効果を評価した測定例を図１に、また結果を表２に示す。陰性対象としてはＨＥＰＥＳバッファーを、陽性対象としてはＳ３９６９をＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００８，２８３（１８），１１９８１−１１９９４に記載の方法に準じ合成して使用した。サンプルの濃度は終濃度がＳ３９６９は１μＭ、ジペプチドが１ｍＭとした。そのため、Ｓ３９６９については２μＭ、ジペプチドは２ｍＭになるようにＨＥＰＥＳバッファーで溶解し、サンプルを準備した。ＨＥＰＥＳバッファーに溶解しづらい化合物については１００ｍＭのＤＭＳＯ溶解液をまず作成し、ＨＥＰＥＳバッファーで希釈して作成した。ＲＦＵ値の変化値が大きい評価サンプルほどｈＥＮａＣの活性化効果が高いといえる。図１に膜電位色素法を用いたｈＥＮａＣ活性化効果の測定例を示す。また、表２に膜電位色素法を用いたｈＥＮａＣ活性化効果を示す。
【００２７】
【表２】
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【００２８】
有意差検定は一元配置分散分析(ANOVA)にて検定を行った後、ダネット法による多重解析により検定した。Ｔｒｐ−Ｃｙｓ、Ｔｒｐ−Ｌｅｕ、Ｔｒｐ−Ｐｈｅ、Ｔｒｐ−Ｔｒｐ、Ｉｌｅ−Ｔｒｐ、Ｐｈｅ−Ｔｒｐ、Ｔｙｒ−Ｔｒｐには統計学的な有意差が認められた。また、他のジペプチドにおいても統計学的有意差は認められなかったものの、ｈＥＮａＣを活性化している傾向が認められた。
【実施例２】
【００２９】
─電気生理学的手法によるｈＥＮａＣ活性化作用の評価─
電気生理学的手法はアフリカツメガエルの卵母細胞にｈＥＮａＣα、ｈＥＮａＣβ、  ｈＥＮａＣγサブユニットのｃＲＮＡを等量ずつ混合したものをマイクロインジェクションしたｈＥＮａＣαβγ発現卵母細胞を用い、ジペプチド添加に伴う電流値変化を二電極膜電位固定法により観測する手法を用いた。アフリカツメガエルの卵母細胞採取、卵母細胞へのｃＲＮＡのマイクロインジェクション、二電極膜電位固定法による電流値測定は文献（中村元直、清水孝雄著：アフリカツメガエル卵母細胞の実験、実験医学  Ｖｏｌ．１１、Ｎｏ．３、２２４−２３２（１９９３））に記載の方法に準じた。ｈＥＮａＣα、ｈＥＮａＣβ、ｈＥＮａＣγのサブユニットの遺伝子配列は実施例１の表１に示した通りである。
【００３０】
アフリカツメガエルの卵母細胞にｈＥＮａＣα、ｈＥＮａＣβ、ｈＥＮａＣγサブユニットのｃＲＮＡを等量ずつ混合したものを適量マイクロインジェクションし、ＭＢＳバッファー（８８ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＫＣｌ、２．４ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、０．３ｍＭ  Ｃａ（ＮＯ３）２・４Ｈ２Ｏ、０．４１ｍＭ  ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．８２ｍＭ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、ｉｎ  １５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．６）中、１０μＭアミロライド存在下、１２から７２時間１６℃で培養した。電流測定装置（Ｗａｒｎｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製、Ｏｏｃｙｔｅ  Ｃｌａｍｐ  ＯＣ−７２５Ｃ）に卵母細胞をセットし、電極を挿入して−６０ｍＶに電圧をクランプし電流値を測定した。電流値測定の際のバッファーは、ＮＤ９６（９６ｍＭ  ＮａＣｌ、２．５ｍＭＫＣｌ、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２  ｉｎ  ５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．５）を使用した。電流測定装置の卵母細胞をセット・電流値を測定する灌流槽の容積は１００μｌであり、そこへ２５μｌの評価化合物を溶解したＮＤ９６溶液を添加した時の電流変化を測定することでＥＮａＣの活性化能を評価した。そのため、評価化合物は終濃度の５倍の濃度になるようにＮＤ９６に溶解し準備した。溶解度が低い場合は、まず１００ｍＭになるようにまずＤＭＳＯに溶解したのち、終濃度の５倍の濃度になるようにＮＤ９６で希釈して用いた。また、測定装置の灌流槽はＮＤ９６で灌流（２ｍｌ／ｍｉｎ．）することで、添加した試料溶液を洗い流せるようにした。二電極電位固定法の実施例を表３に示す。また、二電極電位固定法によるｈＥＮａＣ活性化効果の測定例を図２に示す。
【００３１】
【表３】
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【００３２】
アミロライドによる効果：Ａと評価サンプルによる効果：Ｂの比から求めるＥＮａＣ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ により数値化、一元配置分散分析(ANOVA)にて検定を行った後、ダネット法による多重解析により有意差検定した。表４に電気生理学的手法によるｈＥＮａＣ活性化効果を示す。
【００３３】
【表４】
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【００３４】
表４に示すように、特にＴｒｐ−Ｌｅｕ、Ｔｒｐ−Ｔｒｐ、Ｔｒｐ−Ｐｈｅ、Ｔｒｐ−Ｃｙｓ、Ｔｒｐ−Ｍｅｔ、Ｉｌｅ−Ｔｒｐについては有意なＥＮａＣの活性化能を有することが確認された。また、これらの化合物群は下記実施例３および４に記載の方法に従って塩味増強効果を有することを確認することができた。
【実施例３】
【００３５】
─官能評価による塩味増強効果の評価─
１．チキンスープを用いた評価
実施例２において効果の高いｈＥＮａＣ活性化能を示したＴｒｐ−Ｌｅｕ、Ｔｒｐ−Ｔｒｐ、Ｔｒｐ−Ｐｈｅ、これに加えてアルギニン塩酸塩＋Ｔｒｐ−Ｐｈｅについて、官能試験により塩味増強効果の有無を調べた。試験溶液には市販のチキンブイヨンスープの濃縮品（チキンブイヨンＥ−Ａ、アリアケジャパン株式会社製）を沸騰水で５倍希釈した後、精製塩を加え、塩分濃度を０．５％に調整したものを用いた。この０．５％食塩含有チキンスープをコントロールとし、これに対し、ジペプチドは０．０２％、アルギニン塩酸塩については０．１％を溶解させコントロール溶液との２点比較により塩味が増強されているかを検証した。コントロールに対し、大幅に塩味が増強したものを＋＋＋、増強したものを＋＋、わずかに増強したものを＋、変わらないものを−で表した。
表５にチキンスープを用いた塩味増強効果について示す。
【００３６】
【表５】
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【００３７】
表５の結果から、本発明品はｈＥＮａＣの活性化能のみならず塩味の増強効果をも有することがわかる。また、アルギニン塩酸塩と混合することでその効果は増大することも認められた。
【００３８】
２．即席麺用うどんスープを用いた評価
実施例３の結果から、アルギニン塩酸塩＋Ｔｒｐ−Ｐｈｅ添加群がもっとも塩味増強効果に優れていたので、この配合を用いることでどれだけの減塩が可能であるか即席麺用うどんスープを用いて評価した。なお、即席麺用うどんスープは表６に示すとおり調合し、１０００ｍｌの熱湯に溶解して評価した。表６に粉末うどんスープ配合について示す。
【００３９】
【表６】
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【００４０】
コントロール配合、減塩配合を１０００ｍｌ熱湯で溶解したスープの塩分濃度を定量したところ、それぞれ１．０４％（Ｗ／Ｖ）、０．７９％（Ｗ／Ｖ）であった。このことから、減塩配合配合スープはコントロール配合スープを２５％減塩したものであるといえる。
減塩配合スープにアルギニン塩酸塩およびＴｒｐ−Ｐｈｅを表７に示す量となるように添加し、Ａｒｇ−ＨＣｌ＋Ｔｒｐ−Ｐｈｅ添加試験区をした。評価は力価が強いものは＋＋、やや強いものは＋、弱いものは−とした。結果を表７に示す。
【００４１】
【表７】
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【００４２】
表７に示すとおり、減塩した配合にＴｒｐ−Ｐｈｅおよびアルギニン塩酸塩を添加することで２５％の減塩が可能であり、従来の減塩手法においては付随する異味、異臭は認められなかった。
【図１】
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【図２】
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