(57)【要約】  【課題】酸素感知機構の異常によって起こる呼吸不全の改善又は治療に有効なＴＲＰＡ１活性化剤の提供。  【解決手段】ヘスペレチン、ナリンゲニン、ケルセチン、ルテオリン、フィセチン、ゲニステイン、ダイゼイン、イソリキリチゲニン、ブテイン、レスベラトロール及びそれらの配糖体から選ばれるポリフェノール類、又はセサミンを有効成分とするＴＲＰＡ１活性化剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘスペレチン、ナリンゲニン、ケルセチン、ルテオリン、フィセチン、ゲニステイン、ダイゼイン、イソリキリチゲニン、ブテイン、レスベラトロール及びそれらの配糖体から選ばれるポリフェノール類、又はセサミンを有効成分とするＴＲＰＡ１活性化剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＴＲＰＡ１チャネルの活性を亢進するＴＲＰＡ１活性化剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＴＲＰＡ１は、カチオンチャネルの一過性受容器電位（ＴＲＰ）スーパーファミリーのメンバーであり、脱分極、細胞内Ｃａ2+濃度上昇、ＡＩＴＣ（Allyl isothiocyanate;ワサビ・マスタードの成分）、ｐＨ、機械刺激、冷感など様々な刺激によって活性化させる（非特許文献１）。
【０００３】
ＴＲＰＡ１は、皮膚や粘膜の感覚神経に発現し、様々な刺激によりＴＲＰＡ１チャネルが活性化すると、痛みのシグナルが伝わると考えられており、ＴＰＲＡ１活性抑制剤により疼痛が抑制できるとの報告がある（特許文献１）。
【０００４】
最近、ＴＲＰＡ１チャネルが肺に発現し、肺での酸素センサーとして機能することが明らかとなった。すなわち、ＴＲＰＡ１チャネルは肺において体内に取り入れることができる酸素分圧を感知し、組織への酸素供給を厳密に制御しており、ＴＲＰＡ１を欠損したマウスにおいては、高濃度または低濃度の酸素吸入による迷走神経の活動と、それに伴う呼吸反射が著しく損なわれることが報告されている（非特許文献２）。
したがって、ＴＲＰＡ１を活性化することにより、酸素感知機構の異常によって起こる呼吸不全の予防、改善又は治療効果をもたらすと考えられる。
【０００５】
一方、天然のポリフェノール類は、多くの植物に含まれ、さまざまな生物学的活性を有することが知られている。例えば、ケルセチンに癌増殖抑制作用があること（特許文献２）、ヘスペレチンやナリンゲニン等にキサンチンオキシダーゼ阻害剤作用があること（特許文献３）、フィセチン、ルテオリン又はケルセチンに筋肉の糖取り込み促進作用があること（特許文献４）、クリシンやルテオリン等に炎症性サイトカイン産生抑制作用があること（特許文献５）、ゲニステインやダイゼインにＡＴＬ（成人Ｔ細胞白血病）細胞株の増殖抑制作用があること（特許文献６）、レスベラトロールに血清コレステロール低下作用（特許文献７）や、持久力向上作用（特許文献８）があること、イソリキリチゲニンにアディポネクチン産生増強作用（特許文献９）があること、ブテインに酵母の寿命延長作用（特許文献１０）があること等が報告されている。
また、セサミンは、ゴマに含まれる主要なリグナン化合物の一種で、抗酸化作用（特許文献１１）、抗疲労作用（特許文献１２）等があることが報告されている。
しかし、ヘスペレチン、ナリンゲニン、ケルセチン、ルテオリン、フィセチン、ゲニステイン、ダイゼイン、イソリキリチゲニン、ブテイン、レスベラトロール及びセサミンがＴＲＰＡ１活性亢進作用を有することや呼吸不全に有用であることは知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１２−６２３０４号公報
【特許文献２】特開２０１２−２５７２４号公報
【特許文献３】特開２０１０−５９１０４号公報
【特許文献４】特開２０１１−１４０４５７号公報
【特許文献５】特開２００８−２０８０５４号公報
【特許文献６】特開２００６−２１９３８４号公報
【特許文献７】特開２００１−７２５８３号公報
【特許文献８】特開２００７−１４５８０９号公報
【特許文献９】特開２００７−２６２０５０号公報
【特許文献１０】特表２００８−５２８５１０号公報
【特許文献１１】特開平０５−０５１３８８号公報
【特許文献１２】国際公開第２００８／１２６５８７号パンフレット
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】生化学 81: 962-983 (2009)
【非特許文献２】Nat Chem Biol 7:701-711(2011).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、酸素感知機構の異常によって起こる呼吸不全の予防、改善又は治療に有効なＴＲＰＡ１活性化剤を提供することに関する。
【０００９】
本発明者らは、ＴＲＰＡ１を活性化する素材について検討したところ、特定のポリフェノール類及びセサミンにＴＲＰＡ１を効果的に活性化する作用があることを見出した。
【００１０】
すなわち本発明は、ヘスペレチン、ナリンゲニン、ケルセチン、ルテオリン、フィセチン、ゲニステイン、ダイゼイン、イソリキリチゲニン、ブテイン、レスベラトロール及びそれらの配糖体から選ばれるポリフェノール類、又はセサミンを有効成分とするＴＲＰＡ１活性化剤に係るものである。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のＴＲＰＡ１活性化剤は、ＴＲＰＡ１を活性化する作用を有する。したがって、本発明のＴＲＰＡ１活性化剤は、ＴＲＰＡ１チャネルの活性低下に起因して生ずる症状や疾患、例えば酸素感知機構が低下することによって起こる呼吸不全の予防、改善又は治療に有用である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明のポリフェノール類は、ヘスペレチン（Hesperetin）、ナリンゲニン(Naringenin)、ケルセチン（Quercetin)、ルテオリン（Luteolin）、フィセチン（Fisetin)、ゲニステイン（Genistein)、ダイゼイン（Daidzein）、イソリキリチゲニン(Isoliquiritigenin）、ブテイン(Butein)、レスベラトロール（resveratrol）及びこれらの配糖体から選ばれるものであり、其々単独で用いることもできるし、あるいは、２種以上を組み合わせて用いることもできる。
なお、上記ポリフェノール類は、立体異性体又はそれらの混合物の何れを用いることもできる。また、上記ポリフェノール類は、水和物又は溶媒和物を形成していてもよい。
【００１３】
本発明におけるポリフェノール類は何れも公知であり、化学合成によって、又はこれらを含有する天然物から抽出して精製することによって、調製することができる（Naczk M. J. Chromatogr. A  1054, 95-111, (2004)）。あるいは、市販品を用いてもよい。
また、当該ポリフェノール類を含有する植物、各種食品の抽出物や部分精製物、加工品を用いてもよく、当該抽出物や部分精製物、加工品から単離した各ポリフェノール類を用いることもできる。
【００１４】
ポリフェノール配糖体は、生体内では酵素的に加水分解されてポリフェノールを生じるので、本発明においては、当該配糖体も遊離のポリフェノールと同様に用いられる。ここで、配糖体を構成する糖としては、例えば、グルコース、フコース、ガラクトース、６−デオキシグルコース、ラムノース等が挙げられる。ポリフェノール配糖体としては、具体的には、例えばヘスペレチン配糖体であるヘスペリジン、ナリンゲニン配糖体であるナリンギン、ケルセチン配糖体であるルチン、ケルシトリン、ゲニステイン配糖体であるゲニスチン、ダイゼイン配糖体であるダイジン等が挙げられる。
【００１５】
セサミンは、通常、ゴマ油から公知の方法（例えば、特開平４−９３３１号公報）によって抽出したセサミン抽出物、セサミン濃縮物等を用いることができ、市販の精製品を用いてもよい。
【００１６】
本発明のポリフェノール類及びセサミンは、後記実施例に示すように、ＴＲＰＡ１を形質導入した細胞（ＴＲＰＡ１発現細胞）に接触させた場合に、当該細胞内の陽イオン量の流入を促進するというＴＲＰＡ１活性化作用を有する（実施例）。
ＴＲＰＡ１チャネルは肺に発現し、肺での酸素センサーとして機能する。すなわち、ＴＲＰＡ１チャネルは肺において体内に取り入れることができる酸素分圧を感知し、組織への酸素供給を厳密に制御しており、ＴＲＰＡ１の活性が低下すると酸素感知機構が正常に機能せず、酸素濃度の変化に対する呼吸反射が損なわれる（非特許文献２）。したがって、ＴＲＰＡ１を活性化することにより、酸素感知機構の異常によって起こる呼吸不全の予防、改善又は治療が可能であると考えられる。
【００１７】
したがって、本発明のポリフェノール類及びセサミンは、呼吸不全の予防、改善又は治療を主目的として、ＴＲＰＡ１活性化のために使用することができる。当該使用は、ヒト若しくは非ヒト動物、又はそれらに由来する検体における使用であり得、また治療的使用であっても非治療的使用であってもよい。ここで、「非治療的」とは、医療行為、すなわち治療による人体への処理行為を含まない概念である。
また、本発明のポリフェノール類及びセサミンは、ＴＲＰＡ１活性化剤として使用することができ、さらに当該ＴＲＰＡ１活性化剤を製造するために使用することができる。
【００１８】
ここで、「ＴＲＰＡ１の活性化」とは、受容体であるＴＲＰＡ１に対してアゴニスト活性を示すこと、具体的にはＴＲＰＡ１に結合することによって発現する活性、例えばイオン流束の調節能（例えば、細胞外から細胞内へのカルシウムイオン、ナトリウムイオンなどの陽イオンの輸送能など）、膜電位の調節能（例えば、電流の発生能など）を促進することを云う。
【００１９】
当該ＴＲＰＡ１活性化剤は、それ自体、ＴＲＰＡ１活性化効果、或いは呼吸不全の予防、改善又は治療効果を発揮する、ヒト若しくは動物用の医薬品、医薬部外品又は食品であってもよく、又は当該医薬品、医薬部外品等に配合して使用される素材又は製剤であってもよい。このとき、当該ＴＲＰＡ１活性化剤には、本発明のポリフェノール類又はセサミンを単独で、又はこれ以外に、必要に応じて、後述の配合すべき対象物において許容される担体等を配合してもよい。なお、当該製剤は配合すべき対象物に応じて常法により製造することができる。
また、食品としては、ＴＲＰＡ１活性化、或いは呼吸不全の予防、改善又は治療をコンセプトとし、必要に応じてその旨を表示した飲食品、機能性飲食品、病者用飲食品、特定保健用食品等を包含する。
【００２０】
尚、本発明において、「呼吸不全」とは、呼吸機能障害のため動脈血ガス（酸素と 二酸化炭素）が異常値を示し，そのために正常な機能を営むことができない状態をいう。
【００２１】
上記医薬品（医薬部外品も含む）の剤形は、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤、静脈内注射、筋肉注射剤、坐剤、吸入剤、経皮吸収剤、点眼剤、点鼻剤、湿布剤、パップ剤、軟膏、ローション、クリーム、口腔用製剤等の何れでもよく、投与形態も、経口投与（内用）、非経口投与（外用、注射）の何れであってもよい。
このような種々の剤型の医薬製剤は、本発明のポリフェノール類又はセサミンを単独で、又は他の薬学的に許容される賦形剤、結合剤、増量剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、嬌味剤、香料、被膜剤、担体、希釈剤等を適宜組み合わせることにより調製することができる。
【００２２】
好ましい投与形態は経口投与であり、この場合、製剤中の本発明のポリフェノール類又はセサミンの含有量は、通常０．０１質量％以上、好ましくは０．１質量％以上、より好ましくは０．０１質量％以上であり、そして２０質量％以下、好ましくは１０質量％以下、より好ましくは５質量％以下である。例えば、０．０１〜２０質量％、好ましくは０．１〜１０質量％、より好ましくは０．０１〜５質量％が挙げられる。
【００２３】
上記食品の形態は、固形、半固形又は液状であり得、例えば、パン類、ケーキ類、麺類、菓子類、ゼリー類、冷凍食品、アイスクリーム類、乳製品、飲料等の各種食品の他、上述した経口投与製剤と同様の形態（錠剤、カプセル剤、シロップ等）が挙げられる。
種々の形態の食品は、本発明のポリフェノール類又はセサミンを単独で、又は他の食品材料や、溶剤、軟化剤、油、乳化剤、防腐剤、香科、安定剤、着色剤、酸化防止剤、保湿剤、増粘剤等を適宜組み合わせることにより調製することができる。当該食品中の本発明のポリフェノール類又はセサミンの含有量（抽出物の乾燥物換算）は、通常０．００１質量％以上、好ましくは０．００５質量％以上、より好ましくは０．０１質量％以上であり、そして１０質量％以下、好ましくは５質量％以下、より好ましくは１質量％以下である。例えば、０．００１〜１０質量％、好ましくは０．００５〜５質量％、より好ましく０．０１〜１質量％が挙げられる。
【００２４】
本発明のＴＲＰＡ１活性化剤の投与量又は摂取量は、対象者の状態、体重、性別年齢又はその他の要因に従って変動し得るが、経口投与又は摂取の場合成人１人当たり、本発明のポリフェノール類又はセサミンとして、１日あたり通常０．１ｍｇ以上、好ましくは１ｍｇ以上、より好ましくは５ｍｇ以上であり、そして１０００ｍｇ以下、好ましくは５００ｍｇ以下、より好ましくは３００ｍｇ以下である。例えば、０．１ｍｇ〜１０００ｍｇ、好ましくは１ｍｇ〜５００ｍｇ、より好ましくは５ｍｇ〜３００ｍｇが挙げられる。また、上記製剤は、任意の投与計画に従って投与又は摂取され得るが、１日１回〜数回に分けて投与又は摂取することが好ましい。
【００２５】
本発明のＴＲＰＡ１活性化剤の投与又は摂取対象者としては、それを必要としている者であれば特に限定されないが、ＴＲＰＡ１活性化、呼吸不全の予防、改善又は治療を図ることができることから、特に、慢性呼吸不全があるヒトへの投与又は摂取が有効である。
【００２６】
上述した実施形態に関し、本発明においては以下の態様が開示される。
＜１＞ヘスペレチン、ナリンゲニン、ケルセチン、ルテオリン、フィセチン、ゲニステイン、ダイゼイン、イソリキリチゲニン、ブテイン、レスベラトロール及びそれらの配糖体から選ばれるポリフェノール類、又はセサミンを有効成分とするＴＲＰＡ１活性化剤。
＜２＞ＴＲＰＡ１活性化剤を製造するための、ヘスペレチン、ナリンゲニン、ケルセチン、ルテオリン、フィセチン、ゲニステイン、ダイゼイン、イソリキリチゲニン、ブテイン、レスベラトロール及びそれらの配糖体から選ばれるポリフェノール類、又はセサミンの使用。
＜３＞ＴＲＰＡ１活性化に使用するためのヘスペレチン、ナリンゲニン、ケルセチン、ルテオリン、フィセチン、ゲニステイン、ダイゼイン、イソリキリチゲニン、ブテイン、レスベラトロール及びそれらの配糖体から選ばれるポリフェノール類、又はセサミン。
＜４＞ヘスペレチン、ナリンゲニン、ケルセチン、ルテオリン、フィセチン、ゲニステイン、ダイゼイン、イソリキリチゲニン、ブテイン、レスベラトロール及びそれらの配糖体から選ばれるポリフェノール類、又はセサミンを、それらを必要とする対象に投与又は摂取するＴＲＰＡ１活性化方法。
【実施例】
【００２７】
参考例１  ヒトＴＲＰＡ１遺伝子発現ベクターの作製
ヒト小腸ｔｏｔａｌＲＮＡ（BioChain社）を逆転写して得られたｃＤＮＡを鋳型にして、公開されているヒトＴＲＰＡ１遺伝子配列を参考に合成した、下記に示す塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットを用いて、下記の条件下でポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。
【００２８】
＜プライマーセット＞
フォワードプライマー；5’- CACCATGAAGCGCAGCCTGAGGAAGATGTG-3’：配列番号１
リバースプライマー  ；5’- GAGGAGCTAAGGCTCAAGATGGTGTG-3’    ：配列番号２
【００２９】
＜ＰＣＲ条件＞
ＰＣＲ条件
ａ）ＰＣＲ溶液組成
cDNA(Template)                                     15μl
5x PrimeStar GXL Buffer                            10μl
dNTPs mixture (2.5mM)                               4μl
PrimeStar GXL DNA Polymerase (タカラバイオ)         1μl
Forward Primer (10μM)                              1μl
Reverse Primer (10μM)                              1μl
Water                                              18μl
ｂ）温度とサイクル条件
95℃       2min 
↓
98℃      10sec    33 cycles
70℃       3min 
【００３０】
得られたＰＣＲ産物をHigh Pure PCR Product Purification Kit（ロッシュ）用いて精製した。精製したＰＣＲ産物と、pcDNA3.1  Directional TOPO Expression Kit（インビトロジェン社）を用いて、発現用ベクターを作製した。
【００３１】
実施例１  ヒトＴＲＰＡ１発現細胞の作製と細胞内Ｃａ2+流入活性の測定
１０％牛胎児血清を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（インビトロジェン）を用いてＨＥＫ２９３細胞（American  Type  Culture  Collectionより購入）の培養を行った。ＨＥＫ２９３細胞をＴ−７５細胞培養用フラスコに５×１０5ｃｅｌｌｓ／Ｆｌａｓｋで播種した。培養３日後、ヒトＴＲＰＡ１発現ベクター（８μｇ）をTransIT-293（Mirus）を用いて細胞にトランスフェクションし１日培養した。Detachin（Genlantis）で細胞をはがし96well Optical bottom plate（Nunc）に１０％牛胎児血清を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で１．５×１０4ｃｅｌｌｓ／９０μｌ／ｗｅｌｌの細胞密度で播き、さらに１日培養した。
細胞内Ｃａ2+流入活性の測定はCalcium Kit II- fluo 4(DOJINDO)を用いて行った。fluo4-AM を含有したLoading bufferを上記の細胞に９０μｌ／ｗｅｌｌ添加し、３７℃で１時間インキュベートした後、３７℃でＦＤＳＳ３０００（浜松ホトニクス）により蛍光強度（励起波長；４８８ｎｍ，蛍光波長；５２４ｎｍ）を２秒毎に測定した。測定開始３０秒後に以下に示す検体を含有する溶液（検体；終濃度の１０倍濃度）を２０μｌ／ｗｅｌｌ添加し、３００秒まで２秒毎に蛍光強度変化を測定した。
検体のＴＲＰＡ１活性化率は次式により算出した。
【００３２】
（数１）
活性化率(%)=[1-〔(FmaxC1／F0C1−Fmax／F0)/(FmaxC1／F0C1−FmaxC2／F0C2)〕]×100 
Fmax  ；検体を添加したウェルの蛍光強度最大値
FmaxC1；ＡＩＴＣ（終濃度10μM）を添加したウェルの蛍光強度最大値
FmaxC2； DMSOのみを添加したウェルの蛍光強度最大値
F0  ；測定開始直後の検体を添加したウェルの蛍光強度
F0C1；測定開始直後のＡＩＴＣ（終濃度10μM）を添加したウェルの蛍光強度
F0C2；測定開始直後のDMSOのみを添加したウェルの蛍光強度
【００３３】
＜検体＞
アリルイソチオシアネート(AITC)(和光純薬, ＴＲＰＡ１作動薬)、レスベラトロール（和光純薬）、ヘスペレチン(シグマ)、ナリンゲニン(東京化成)、ケルセチン２水和物（ナカライテスク）、ルテオリン（LKT）、フィセチン(INDOFINE)、ゲニステイン(東京化成)、セサミン（東京化成)、ダイゼイン（東京化成）、イソリキリチゲニン(東京化成)、ブテイン(東京化成)、クリシン（関東化学）、イソラムネチン（シグマ）、グリシテイン（和光純薬）、ガランギン（ExtraSynthesis）を、それぞれジメチルスルオキシド(DMSO)（ナカライテスク）で溶解し、使用した。
【００３４】
ＴＲＰＡ１活性化剤の標品であるＡＩＴＣ（終濃度１０μＭ）の活性化率を１００％、コントロールであるＤＭＳＯの活性化率を０％とした時、コントロールに対する検体の活性化率をＤｕｎｎｅｔにより検定した。結果を表１に示す。
表１より、レスベラトロール（１０，３０，１００μＭ）、ヘスペレチン（３０，１００μＭ）、ナリンゲニン（３０，１００μＭ）、ケルセチン（１０，３０，１００μＭ）、ルテオリン（３０，１００μＭ）、フィセチン（３０，１００ｕＭ）、セサミン（３０，１００ｕＭ）、ゲニステイン（３，１０，３０μＭ）、ダイゼイン（３，１０，３０μＭ）、イソリキリチゲニン（１，３，１０μＭ）、ブテイン（１，３，１０μＭ）は各濃度においてコントロール（ＤＭＳＯ）に比べて、有意にＴＲＰＡ１を活性化させた。一方、同じポリフェノールでもグリシテイン、クリシン、イソラムネチン、ガランギンは１００μＭの濃度においてもＴＲＰＡ１活性化作用が認められなかった。
【００３５】
【表１】
2014024810.tif 000002
【配列表】
2014024810000001.app