(57)【要約】【課題】うなぎ由来のセラミド含有組成物及びその製造方法を提供する。【解決手段】うなぎの一部又は全部を抽出溶媒と接触させて抽出液を得て、前記抽出液から、中性脂肪、ステロールエステル、ワックスエステルなどの非極性脂質を除去した粗脂質液を得る。また、抽出溶媒がクロロホルム−メタノール混液やエタノールであることを特徴とする。また、うなぎの一部又は全部が、うなぎ頭部であることを特徴とする。さらに、本発明のうなぎ由来のセラミド含有組成物は、うなぎの一部又は全部を抽出溶媒と接触させて抽出液を得て、前記抽出液から、中性脂肪、ステロールエステル、ワックスエステルなどの非極性脂質を除去した粗脂質液を得ることを特徴とする。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
うなぎの一部又は全部を抽出溶媒と接触させて抽出液を得て、
前記抽出液から、中性脂肪、ステロールエステル、ワックスエステルなどの非極性脂質を除去した粗脂質液を得ることを特徴とするうなぎ由来のセラミドの製造方法。
【請求項２】
前記抽出溶媒がクロロホルム−メタノール混液であることを特徴とする請求項１に記載のセラミドの製造方法。
【請求項３】
前記抽出溶媒がエタノールであることを特徴とする請求項１に記載のセラミドの製造方法。
【請求項４】
前記うなぎの一部又は全部が、うなぎ頭部であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の製造方法。
【請求項５】
うなぎの一部又は全部を抽出溶媒と接触させて抽出液を得て、
前記抽出液から、中性脂肪、ステロールエステル、ワックスエステルなどの非極性脂質を除去した粗脂質液を得ることを特徴とするうなぎ由来のセラミド含有組成物。
【請求項６】
前記抽出溶媒がクロロホルム−メタノール混液であることを特徴とする請求項５に記載のうなぎ由来のセラミド含有組成物。
【請求項７】
前記抽出溶媒がエタノールであることを特徴とする請求項５に記載のうなぎ由来のセラミド含有組成物。
【請求項８】
前記うなぎの一部又は全部が、うなぎ頭部であることを特徴とする請求項５〜７のいずれかに記載のうなぎ由来のセラミド含有組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、うなぎ由来のセラミドの製造方法及びセラミド含有組成物に関する。より詳しくは、うなぎ頭部からのセラミドの製造方法及びセラミド含有組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、食用生物一個体のうち食用に具せず廃棄していた部分に含まれるサプリメントなどに利用できる有用な化合物を探索して、実用化につなげる試みが注目されている。例えば、うなぎの水産加工過程では多量の頭部、骨等が産業廃棄物として発生しており、その大部分は利用用途がなく経費をかけて廃棄処理が行われている。
これらうなぎの廃棄物には、例えばセラミドなどの各種有用成分が多様な濃度で含まれている事が知られている。
セラミドは、うなぎにおいて細胞膜に高い濃度で存在することが知られており、細胞膜においてセラミドはスフィンゴミエリンを構成する脂質の一つであり、また脂質二重層を構成することが知られている。
【０００３】
特許文献１には、魚介類からスフィンゴミエリン又はセラミド２−アミノエチルホスホン酸を抽出し、切断等の処理をすることを特徴とするセラミドの製造方法が記載されており、マダコのゆで汁を原料としたスフィンゴミエリン又はセラミド２−アミノエチルホスホン酸をホスホリパーゼＣにより分解するセラミドの製造方法が記載されている。
特許文献２には、腹足類、斧足類、又は頭足類の軟体部を原料とするスフィンゴ脂質の製造方法が開示されている。
しかしながら、これらはスフィンゴミエリン等由来のセラミドであり遊離型セラミドではないため、セラミドを得るためには、スフィンゴミエリン等を更に処理する必要がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開平７−２６５０８９号公報
【特許文献２】特開２００５−００２３２４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、従来、うなぎの水産加工過程において、多量の頭部が産業廃棄物として発生しており、その大部分は利用用途がなく経費をかけて廃棄処理が行われていることに鑑みて、これらうなぎの廃棄物から、セラミドを効率よく抽出することができるうなぎ由来のセラミドの製造方法を提供することを目的とする。
また、本発明の他の目的は、前記製造方法を用いて安全で安心なうなぎ由来のセラミド組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（１）本発明のうなぎ由来のセラミドの製造方法は、うなぎの一部又は全部を抽出溶媒と接触させて抽出液を得て、
前記抽出液から、中性脂肪、ステロールエステル、ワックスエステルなどの非極性脂質を除去した粗脂質液を得ることを特徴とする。
（２）本発明のうなぎ由来のセラミドの製造方法は、前記（１）において、抽出溶媒がクロロホルム−メタノール混液であることを特徴とする。
（３）本発明のうなぎ由来のセラミドの製造方法は、前記（１）において、抽出溶媒がエタノールであることを特徴とする。
（４）本発明のうなぎ由来のセラミドの製造方法は、前記（１）〜（３）のいずれかにおいて、前記うなぎの一部又は全部が、うなぎ頭部であることを特徴とする。
（５）本発明のうなぎ由来のセラミド含有組成物は、うなぎの一部又は全部を抽出溶媒と接触させて抽出液を得て、前記抽出液から、中性脂肪、ステロールエステル、ワックスエステルなどの非極性脂質を除去した粗脂質液を得ることを特徴とする。
（６）本発明のうなぎ由来のセラミド含有組成物は、前記（５）において、前記抽出溶媒がクロロホルム−メタノール混液であることを特徴とする。
（７）本発明のうなぎ由来のセラミド含有組成物は、前記（５）において、
前記抽出溶媒がエタノールであることを特徴とする。
（８）本発明のうなぎ由来のセラミド含有組成物は、前記（５）〜（７）のいずれかにおいて、前記うなぎの一部又は全部が、うなぎ頭部であることを特徴とする。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】うなぎ頭部脂質の薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）分析による概観を示した図である。
【図２】（ａ）はＨＰＬＣ／ＭＳシステムによるうなぎ頭部セラミドの質量分析であり、サンプル３に含まれる物質を高速液体クロマトグラフィー／質量分析（ＨＰＬＣ／ＭＳシステム）により分析した結果を示すグラフであり、（ｂ）は各ｍ／ｚ値の分子種のクロマトグラムを示すイオンクロマトグラムである。
【図３】質量分析計内に微量導入したヘリウムガスにセラミドイオンをぶつけて分解して構成成分の分析をするタンデムマススペクトルと呼ばれる方法で分析した結果を示すグラフである。
【図４】うなぎ頭部のセラミド（Ｃｅｒ（ＡＳ））の検出結果である。
【図５】（ａ）はうなぎ頭部セラミドＣ４０の２本鎖の化学構造を示す図であり、（ｂ）は１本鎖の組み合わせの内訳を示す図である。
【図６】うなぎ頭部Ｃｅｒ（ＮＳ）のオンラインタンデム質量分析による構造の同定を示す図である。
【図７】うなぎ頭部で検出したセラミドについてまとめた図である。
【図８】うなぎ頭部１個あたりのセラミドＣｅｒ（ＮＳ）の含有量を示したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本発明の製造方法においては、前記のうなぎの一部（例えば頭部）又は全部を用い、
まず所望のセラミドの含有量が低い部位を、完全にまたは一部除去することが出来る。
除去の方法としてはナイフ等の硬いものを用いて除去する方法があげられるがこれに限定されない。
【０００９】
本発明のうなぎ由来のセラミドの製造方法においては、うなぎの一部又は全部を抽出溶媒と接触させて抽出液を得て、前記抽出液から、中性脂肪、ステロールエステル、ワックスエステルなどの非極性脂質を除去した粗脂質液を得ることを特徴とする。この粗脂質液にはうなぎ由来のセラミドが多量に含有されている。
【００１０】
用いる抽出溶媒としては、メタノール、エタノール、含水エタノール、ブタノール、t-ブタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール、その他のアルコール類、クロロホルム、ジクロロメタン、ジクロロエタン、トリクロロエタン、その他のハロゲン系炭化水素、アセトン、酢酸エチル、エーテル、ヘキサン等が用いられるが、これらに限定されない。これらは単独で用いてもよいし、複数を混合して用いてもよい。
特にクロロホルム−メタノール混液がセラミドを高濃度に溶解することができるので好ましい。人体への害がない溶媒を抽出溶媒とするという観点からは、エタノール等を溶媒として用いることも好ましい。
また、非極性脂質を除去した粗脂質液を得る方法としては、前記抽出溶媒を用いることもできるが、セラミドの有効に分離するためには非極性脂質を逆相シリカ樹脂に吸着させて除去することが好ましい。
【００１１】
本発明のうなぎ由来のセラミド含有組成物は、医薬品、医療用具、化粧料、食品などの多方面に利用することが可能である。
セラミドが皮膚の細胞間に存在する成分であるとの観点からは、保湿を目的として使用される製品に配合されることが好ましい。
また、セラミドが皮膚のバリア機能を向上させるという観点からは、敏感肌用化粧品に配合することもまた好ましい。
本発明のうなぎ由来のセラミド含有組成物は、その配合可能な成分としては、化粧品、医薬部外品や浴用剤で一般に使用される基剤や薬剤などが挙げられ、それらと共に、当業者に公知の手法を用いて任意の形態の製品とすることが出来る。
【実施例】
【００１２】
以下、本発明のうなぎ由来のセラミドの製造方法について、図面を用いて詳細に説明する。
図１は、うなぎ由来の脂質を薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）分析によって概観した結果を示した図である。図１においては、うなぎ頭部一個（約１５グラム）を破砕後、タロロホルム／メタノールを用いない低毒性溶媒（例えば、エタノール、ブタノール、ｔ−ブタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール、アセトンなどが挙げられる）で脂質を取り出す抽出処理をしたものを、
薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）分析法によって、シリカゲルという微粒子を薄く塗りつけたガラス板の上で脂質を分けて、うなぎ頭部脂質の種類や量を調べた。
【００１３】
図１に示すように、その下方に示す「１」は溶媒での１回目抽出液（サンプル１）であり、「２」は１回目抽出をしたうなぎ頭部からの２回目抽出液（サンプル２）であり、「３」はサンプル１から中性脂肪（ＴＧ）等を除去した抽出液（サンプル３）である。なお、サンプル２は、１回目のサンプル１より脂質濃度が低いので３．８倍多い容量を塗布した。
また、サンプル３は、中性脂肪、ステロールエステル、ワックスエステルなどの非極性脂質を、シリカ樹脂に吸着させる逆相シリカ樹脂吸着法を用いて除去したもの（粗脂質液という）をサンプル１と同量だけ塗布したものである。
【００１４】
サンプル１及びサンプル２では、抽出液のごく少量をＴＬＣプレートの端から２ｃｍくらいのところに小さく細い帯状に塗りつけ乾燥させた後に、溶媒が底に１ｃｍくらいの高さまで入った蓋付ビンにサンプルを塗った側を下にして入れて立てかけおいた。
脂質は、底の溶媒が徐々にＴＬＣプレートのシリカゲルの中に染み込んでいき、シリカゲルに付着する力が弱い脂質ほど染み込んできた溶媒に速く溶け出しＴＬＣプレート上を上方に進行するので、図１に示すような上下方向において分離したバンド状の模様となる。
これらのバンドはＴＬＣプレートを取り出し乾燥後、酸液中において加熱すると炭化して可視化させることができる。
【００１５】
このようなうなぎ頭部からの脂質の抽出においては、サンプル１に大方の脂質が含まれており、サンプル２に含まれる脂質量は少ない。よって、サンプル２のＴＬＣプレートへの塗布量は、容量にしてサンプル１の３．８倍とした。
【００１６】
図１の分析結果から分かるように、うなぎ頭部には大量の中性脂肪（いわゆる脂身）が含まれていることが分かるが、これらの中性脂肪はセラミドの正確な分析を阻害するので、サンプル３ではこの中性脂肪等を除く処理（シリカ樹脂に吸着させる逆相シリカ樹脂吸着法）をして粗脂質液を得た。
サンプル３の結果から、微量のため可視化されにくいセラミド（Ｃｅｒ（ＮＳ））が視認できていることが分かる。
【００１７】
図２（ａ）は、ＨＰＬＣ／ＭＳシステムによるうなぎ頭部セラミドの質量分析であり、上記処理（逆相シリカ樹脂吸着法）したサンプル３（粗脂質液）に含まれる物質を高速液体クロマトグラフィー／質量分析（ＨＰＬＣ／ＭＳシステム）により分析した結果を示すグラフである。縦軸の強度（％）が大きいほどセラミド分子量が多いことを示す。
【００１８】
図２（ａ）から分かるように、２本鎖の長さ（炭素数）の和が４０（スフィンゴシンが１６で脂肪酸が２４）のものがもっとも多く（６２０．５２）、２本鎖の長さ（炭素数）の和が３２，３４，３８，４２の長さのものも検出できた。
また、図２（ａ）は、うなぎ頭部のセラミド（Ｃｅｒ（ＮＳ））の正イオンマススペクトルを示しており、ｍ／ｚ（質量電荷比）＝５１０，５３８，６２０，６４８の４つの分子種を主成分として検出している。
なお、ｍ／ｚ（質量電荷比）＝６０２のイオンは、ｍ／ｚ＝６２０のイオンから水が解離した（−１８）イオンである。
【００１９】
図２（ｂ）は、各ｍ／ｚ値の分子種のクロマトグラムを示すイオンクロマトグラムであり、それぞれの分子種が特異的に溶出される時間を解析できる。
上記４つの分子種は、総炭素数（Ｃ）にすると、それぞれ３２，３４，４０，４２に対応し、図２（ｂ）ではそれらの強度を示しているが、Ｃ４０の分子種がもっとも多いことが分かる。すなわち、ＨＰＬＣ／ＭＳシステムでは、順相クロマトグラフイーを用いているので、炭素数が多い分子種ほど極性が低くなり早く溶出される傾向が認められる。このＨＰＬＣ／ＭＳシステムでは、セラミドの正イオンはプロトン型［Ｍ＋Ｈ］＋としてイオン化し、負イオンは溶媒中のギ酸の付加体［Ｍ＋ＨＣＯＯ］−としてイオン化するので［Ｍ＋Ｈ］＋より４４大きいｍ／ｚ値になる。
【００２０】
ＨＰＬＣ／ＭＳシステムでは、上記ＴＬＣ分析で用いたよりも細かい球状をしたシリカゲルを、細いステンレス管に詰めたカラムを用いてセラミドと他の脂質とを分けた。このカラムを、細い管でポンプとサンプル注入装置につなぎ、ポンプから適当な溶媒を流すようにした。
ステンレス管の容量に比べて極少量の抽出液を注入装置から注入すると、シリカゲルに付着する力が弱い脂質ほど先に流れ出てくるので、この流れ出てきた液を細い管で質量分析計に導きセラミドの化学構造を分析した。
セラミドは、炭素、水素、酸素、窒素の４原子からなる分子であり、炭素が連なった２本の鎖がつながった構造をしている。一方の鎖をスフィンゴイド塩基といい、他方を脂肪酸という。
原子はそれぞれ決まった値の質量を持っているので、ＨＰＬＣ／ＭＳシステムによりセラミド分子の質量を決定できる。
【００２１】
実際にはセラミドの正や負のイオンしか測定できないが、測定値から分子の質量が分かる。さらに、注入装置内で２本鎖のつながり部分を切断し１本鎖ずつに分解して、それぞれの長さと細かい構造の違いを解析した。
その結果、うなぎ頭部から抽出したセラミド分子には、人型のスフィンゴシン（Ｓ）が主に見られ、長さ（炭素数）１６のものが主であった。さらに、人で最も多い長さ（炭素数）１８のものもかなりの量存在していたことが分かった。
【００２２】
図４は、うなぎ頭部のセラミド（Ｃｅｒ（ＡＳ））の検出結果を示している。その量は微量であり十分にタンデムマス分析の結果が得られていないが、溶出時間と正負イオンのｍ／ｚ値の関係から、正イオンでｍ／ｚ＝６６６と負イオンでｍ／ｚ＝７１０を示す化合物（Ｃ４２のＣｅｒ（ＡＳ）と考えらえる）や、Ｃ４０のＣｅｒ（ＡＳ）分子種も検出した。
【００２３】
なお、Ｃｅｒ（ＮＳ）とは、スフィンゴシンと水酸化されていない脂肪酸からなる動物組織に普遍的に存在するセラミドであり、その構造式は図６、図７に示す。
また、Ｃｅｒ（ＡＳ）はスフィンゴシンと水酸化脂肪酸からなる。通常は水酸基はアルファ位に存在する。
【００２４】
図５（ａ）は、うなぎ頭部セラミドＣ４０の２本鎖の化学構造を示す図である。一方の鎖は人型のスフィンゴシン（Ｓ）で、長さ（炭素数）１６が主であるが、人の主成分である１８もかなり含まれる。他方の鎖の脂肪酸（Ｆ）は、炭素数：二重結合数（炭素と炭素が２本の結合結ばれている箇所の数）で示した。二重結合の位置は今回の測定で決めたものではなく、人で普通に見られる位置（ω９）を示した。
また、１本鎖の組み合わせの内訳を図５（ｂ）に示す。
【００２５】
図６は、質量分析計内に微量導入したヘリウムガスにセラミドイオンをぶつけて分解して構成成分の分析をするタンデムマススペクトルと呼ばれる方法で分析した結果を示すグラフであり、うなぎ頭部Ｃｅｒ（ＮＳ）のオンラインタンデム質量分析による構造の同定を示す。
Ａでは、うなぎ頭部Ｃｅｒ（ＮＳ）の構造を示しており、プロトン付加型の正イオンは、ヘリウムイオンとの衝突により、スフィンゴシンのアミノ基が脂肪酸側の炭素と形成するＮ−Ｃ結合およぴスフィンゴシン側の炭素と形成するＮ−Ｃ結合が解離すると、それぞれスフィンゴシンイオン（Ｓ）と脂肪酸アミドイオン（Ｆ）が形成される様子を示す。
Ｓは順次脱水してＳ’とＳ’’が形成される。
スフィンゴシンは４位に二重結合を有することから、すぐに３位のＯＨが脱離するので、
Ｓイオンは観察されず、微量のＳ’イオンと豊富なＳ’’イオンが形成されるので、スフィンゴシンの同定に用いる。
Ｓ’’イオンのｍ／ｚ値とＦイオンのｍ／ｚ値が、元の分子種のｍ／ｚ値と矛盾無ければ構造を確実に同定することができる。
【００２６】
また、Ｂに示すように、うなぎ頭部Ｃｅｒ（ＮＳ）には、一般型の炭素数Ｃ１８のスフィンゴシンとＣ１６のスフィンゴシンが含まれていることが分かる。さらに、微量ではあるが、Ｃ１８で４位以外に二重結合のあるｄｉｅｎｉｎｅも存在することが分かる。これは、人血清や脳にも検出されるものである。
【００２７】
図７は．うなぎ頭部で検出したセラミドについてまとめたものである。なお、Ｃｅｒ（ＡＳ）についてはタンデムマススペクトルでさらに確認する必要がある。
【００２８】
図８は、上記分析の結果、うなぎ頭部１個あたりのセラミドＣｅｒ（ＮＳ）の含有量を示したグラフである。すなわち、抽出脂質液に、決まった量のうなぎ頭部にはほとんど含まれないセラミドを基準として混ぜて測定して、図２に見られるようなうなぎ頭部セラミドの各ピークの高さと基準セラミドのピークの高さを比較してセラミド含有量を算出した。
このセラミド含有量を算出方法においては、抽出脂質液に内部標準としてオレイン酸を含有するＣｅｒ（ＮＳ）Ｃ１８：１を添加して、サンプル１全量２５０ｍｌに存在するＣｅｒ（ＮＳ）量を計算した。
内部標準は脂質抽出後に添加したので、抽出中のロスなどを無視しており、ＴＬＣ分析ではサンプル２の脂質量はかなり少ないので、その中のＣｅｒ（ＮＳ）量も無視している。
したがって、セラミド含有量の算出は、少なめに評価していることになるが、少なくともうなぎ頭部１個あたり０．７ｍｇのスフィンゴシン型のセラミドが含まれている。そのうち、Ｃ４０のセラミドが５０％以上を占めていた。
【００２９】
以前は、スフィンゴシンは炭素数Ｃ１８以外はあまり無いと考えられていたが、人やマウスでも、Ｃ１６、Ｃ１７、Ｃ１９、Ｃ２０などのスフィンゴシンが検出されているので、炭素数のバラエティは普遍的なことと考えられる。ただ、うなぎの場合は、動物よりＣ１６の比率が高いとはいえる。
【産業上の利用可能性】
【００３０】
狂牛病の危険性から人型のスフィンゴシンを含むセラミドの供給源としての牛皮が利用できなくなり、高純度の人型のスフィンゴシンを含むセラミドの商業利用が高コストになっているので、本発明のうなぎ由来のセラミドの製造方法によって、うなぎ由来のセラミドを製造することは、産業上の利用可能性が極めて高いと云える。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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