(57)【要約】【課題】本発明の主な目的は、タンパク質、細胞等の被凍結物に対して優れた凍結変性抑制効果を奏し、該被凍結物の変性、機能低下、生存率低下等を効果的に抑制できる凍結変性抑制剤を提供することである。【解決手段】特定のアミン化合物には、格段に優れた凍結変性抑制効果があり、凍結保存に伴うタンパク質の変性や細胞の生存率の低下を効果的に抑制できる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（１）で表される化合物
【化１】
2014150777.tif 000026
［一般式（１）中、Ｒ１〜Ｒ３は、同一又は異なって、炭素数１〜８の直鎖又は分岐状のアルキル基、炭素数２〜８の直鎖又は分岐状のアルケニル基、炭素数２〜８の直鎖又は分岐状のアルキニル基、又は炭素数６〜８のアリール基（但し、これらの基は置換基で置換されていてもよい。）を示し、
Ｒ１及びＲ２は、互いに結合してＮ+と共に、Ｎ+以外の窒素原子、酸素原子又は硫黄原子を１つ以上含んでもよい３〜６環式の飽和又は不飽和のヘテロ環を形成してもよく（但し、該ヘテロ環は、置換基で置換されていてもよい）、或いは
Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、互いに結合してＮ+と共に、Ｎ+が二重結合を有する、Ｎ+以外の窒素原子、酸素原子又は硫黄原子を含んでもよい３〜６環式の不飽和のヘテロ環を形成してもよい（但し、該ヘテロ環は、置換基で置換されていてもよい）。
ｎは、０又は１〜１０の整数を示す。
Ａ１-は、アニオン性基を示す。
Ｒ１、Ｒ２及びＲ３の炭素数の合計値とｎとの和が５〜２９である。]、及び
一般式（２）で表される化合物
【化２】
2014150777.tif 000027
[一般式（２）中、Ｒ４〜Ｒ７は、同一又は異なって、同一又は異なって、炭素数１〜８の直鎖又は分岐状のアルキル基、炭素数２〜８の直鎖又は分岐状のアルケニル基、炭素数２〜８の直鎖又は分岐状のアルキニル基、又は炭素数６〜８のアリール基（但し、これらの基は置換基で置換されていてもよい。）を示し、
Ｒ４とＲ５、及び／又はＲ６とＲ７は、互いに結合してＮ+と共に、Ｎ+以外の窒素原子、酸素原子又は硫黄原子を１つ以上含んでもよい３〜６環式の飽和又は不飽和のヘテロ環を形成してもよい（但し、該ヘテロ環は、置換基で置換されていてもよい）。
ｍ及びｋは、同一又は異なって、０又は１〜１０の整数を示す。
ｌは、１〜５の整数を示す。
Ａ２-及びＡ３-は、同一又は異なって、アニオン性基を示す。
Ｒ４〜Ｒ７の炭素数の合計値と、ｍと、ｌと、ｋとの和が５〜２９である。]
よりなる群から選択される少なくとも１種のアミン化合物を含むことを特徴とする、
凍結変性抑制剤。
【請求項２】
前記一般式（１）において、Ｒ１〜Ｒ３が、同一又は異なって、炭素数２〜６の直鎖又は分岐状のアルキル基であり、且つｎが０又は１〜５の整数である、請求項１に記載の凍結変性抑制剤。
【請求項３】
前記一般式（２）において、Ｒ４〜Ｒ７が、同一又は異なって、炭素数１〜６の直鎖又は分岐状のアルキル基であり、ｍ及びｋが１〜５の整数であり、且つｌが１〜５の整数である、請求項１又は２に記載の凍結変性抑制剤。
【請求項４】
前記一般式（１）において、Ａ１-が、ＣＯＯ-、ＳＯ3-、ＳＯ2-、Ｏ-、Ｓ-、又はＨＰＯ4-である、請求項１〜３のいずれかに記載の凍結変性抑制剤。
【請求項５】
前記一般式（２）において、Ａ２-及びＡ３-が、同一又は異なって、ＣＯＯ-、ＳＯ3-、ＳＯ2-、Ｏ-、Ｓ-、又はＨＰＯ4-である、請求項１〜４のいずれかに記載の凍結変性抑制剤。
【請求項６】
前記アミン化合物が、一般式（１）で表される化合物であり、一般式（１）中、Ｒ２及びＲ３が、同一又は異なって、炭素数３又は４の直鎖状のアルキル基である、請求項１に記載の凍結変性抑制剤。
【請求項７】
一般式（１）中、ｎが１であり、且つＡ１-がＣＯＯ-である、請求項６に記載の凍結変性抑制剤。
【請求項８】
更に、前記アミン化合物以外の凍結変性抑制作用を示す化合物を含む、請求項１〜７のいずれかに記載の凍結変性抑制剤。
【請求項９】
タンパク質又は細胞の凍結変性抑制のために使用される、請求項１〜８のいずれかに記載の凍結変性抑制剤。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれかに記載の凍結変性抑制剤を含有することを特徴とする、凍結保存液。
【請求項１１】
タンパク質又は細胞と、請求項１〜９のいずれかに記載の凍結変性抑制剤とを含む凍結保存液を、凍結保存することを特徴とする、タンパク質又は細胞の凍結保存方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質、細胞等の被凍結物に対して優れた凍結変性抑制効果を奏し、被凍結物の変性、機能低下、生存率低下等を効果的に抑制できる凍結変性抑制剤に関する。また、本発明は、該凍結変性抑制剤を利用した凍結保存液及び凍結保存方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質は、酵素、抗体、受容体、細胞外マトリクス等として、種々の機能を担うものが知られており、食品、医薬品、化粧料等の含有成分、触媒、診断薬、バイオセンサー、試薬等の多岐にわたる用途で使用されている。このようなタンパク質の機能は、その高次構造に強く依存している。タンパク質の高次構造は、弱い分子間相互作用の均衡状態の中で成り立っており、その相互作用を阻害する加熱や凍結、ｐＨ変化、塩や溶媒のような有機分子添加などによって容易に崩壊し、その機能を失ってしまう。そのため、タンパク質の機能発現には、酵素の高次構造の安定性や変性抑制に関わる問題が常に立ちはだかっている。
【０００３】
タンパク質は、凍結乾燥に対して安定なものを除けば、溶液状態で保存されることが多い。タンパク質を溶液状態で保存するには、熱揺らぎによる変性を防ぐために、保存温度は通常−３０℃〜４℃に設定されている。熱揺らぎによる変性を防ぐ上で、凍結保存することが好ましいが、タンパク質を単に緩衝液中で凍結したのでは、凍結・解凍時にタンパク質のほぼ全てが変性し失活してしまうため、−３０℃で保存する場合でもグリセロールを５０重量％ほど添加し、不凍溶液中で保存されている。しかしながら、タンパク質は、溶液状態での保存は、たとえ低温に設定しても、長期間の保存では経時変化に伴う変性が不可避的に生じるため、本来、凍結状態での保存が望ましいといえる。
【０００４】
従来、タンパク質の安定な凍結保存を行う場合には、凍結・解凍時に生じる変性を抑制できる凍結変性抑制剤が添加されている。これまでに、凍結変性抑制剤として、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロール、トレハロース、Ｌ−エクトイン、グリシンベタイン、トリメチルアミン−Ｎ−オキシド、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン等が知られており、実用化されている。更に、無水コハク酸で６５％のアミノ基をカルボキシル化したε−ポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）が乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の凍結変性抑制剤として使用できること（非特許文献１参照）、１，３−β−グルカナーゼや牛血清アルブミン（ＢＳＡ）がＬＤＨの凍結変性抑制剤として使用できること（非特許文献２参照）、トリメチルグリシンを凍結変性抑制剤として使用できること（非特許文献３参照）、トリメチルアミン−Ｎ−オキシドを凍結変性抑制剤として使用できること（非特許文献４参照）、Ｅｒｗｉｎｉａ属又はＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ属に属する微生物が産生する物質を凍結変性抑制剤として使用できること（特許文献１参照）等も報告されている。
【０００５】
しかしながら、従来の凍結変性抑制剤では、凍結・解凍時のタンパク質の変性を抑制する効果が十分でなく、保存期間が長くなれば変性を生じさせたり、凍結解凍を繰り返し行うと変性が進行するという欠点があり、実際には、複数の凍結変性抑制剤を組み合わせたり、凍結変性抑制剤の添加量を増やして使用したり、少量ずつ分注して凍結回数を減らしたりしているのが実情である。このように凍結変性の抑制のみに注力し、複数の凍結変性抑制剤を組み合わせたり、使用する凍結変性抑制剤の添加量を増やすと、却って凍結変性抑制剤の添加に起因してタンパク質の変性を招くという問題を同時に抱えることにもなり得る。
【０００６】
一方、細胞についても、生殖医療、再生医療、細胞治療、物質生産等の様々な用途で使用されており、細胞の長期保存には凍結保存が採用されている。細胞の凍結保存でも、凍結による細胞の死滅を抑制するために、前記タンパク質の凍結保存の場合と同様の凍結変性抑制剤が使用されている。しかしながら、タンパク質の場合と同様に、従来の凍結変性抑制剤では、一定の凍結変性抑制効果が認められても、解凍後の細胞の生存率が低下するという欠点があり、細胞に対する凍結変性抑制効果を更に高める技術が求められている。
【０００７】
このような従来技術を背景として、タンパク質、細胞等の被凍結物に対して、優れた凍結変性抑制効果を奏する凍結変性抑制剤の開発が切望されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００１−１３９５９９号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】K. Matsumura et al., BIO INDUSTRY, 28 (No.5) 35-42 (2011)
【非特許文献２】O. Goni et al., phytochemistry, 72, 844-854 (2011)
【非特許文献３】K. Lippert et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 37, 61-65 (1992)
【非特許文献４】G. B. Strambini et al., Biochemistry, 47, 3322-3331 (2008)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、タンパク質、細胞等の被凍結物に対して優れた凍結変性抑制効果を奏し、該被凍結物の変性、機能低下、生存率低下等を効果的に抑制できる凍結変性抑制剤を提供することを目的とする。また、本発明は、該凍結変性抑制剤を利用した凍結保存液及び凍結保存方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、前記課題を解決すべく鋭意検討したところ、特定のアミン化合物には、格段に優れた凍結変性抑制効果があり、凍結保存に伴うタンパク質の変性や細胞の生存率の低下を効果的に抑制できることを見出した。本発明は、かかる知見に基づいて更に検討を重ねることにより完成したものである。
【００１２】
即ち、本発明は、下記に掲げる態様の発明を提供する。
項１．  一般式（１）で表される化合物
【化１】
2014150777.tif 000002
［一般式（１）中、Ｒ１〜Ｒ３は、同一又は異なって、炭素数１〜８の直鎖又は分岐状のアルキル基、炭素数２〜８の直鎖又は分岐状のアルケニル基、炭素数２〜８の直鎖又は分岐状のアルキニル基、又は炭素数６〜８のアリール基（但し、これらの基は置換基で置換されていてもよい。）を示し、
Ｒ１及びＲ２は、互いに結合してＮ+と共に、Ｎ+以外の窒素原子、酸素原子又は硫黄原子を１つ以上含んでもよい３〜６環式の飽和又は不飽和のヘテロ環を形成してもよく（但し、該ヘテロ環は、置換基で置換されていてもよい）、或いは
Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、互いに結合してＮ+と共に、Ｎ+が二重結合を有する、Ｎ+以外の窒素原子、酸素原子又は硫黄原子を含んでもよい３〜６環式の不飽和のヘテロ環を形成してもよい（但し、該ヘテロ環は、置換基で置換されていてもよい）。
ｎは、０又は１〜１０の整数を示す。
Ａ１-は、アニオン性基を示す。
Ｒ１、Ｒ２及びＲ３の炭素数の合計値とｎとの和が５〜２９である。]、及び
一般式（２）で表される化合物
【化２】
2014150777.tif 000003
[一般式（２）中、Ｒ４〜Ｒ７は、同一又は異なって、同一又は異なって、炭素数１〜８の直鎖又は分岐状のアルキル基、炭素数２〜８の直鎖又は分岐状のアルケニル基、炭素数２〜８の直鎖又は分岐状のアルキニル基、又は炭素数６〜８のアリール基（但し、これらの基は置換基で置換されていてもよい。）を示し、
Ｒ４とＲ５、及び／又はＲ６とＲ７は、互いに結合してＮ+と共に、Ｎ+以外の窒素原子、酸素原子又は硫黄原子を１つ以上含んでもよい３〜６環式の飽和又は不飽和のヘテロ環を形成してもよい（但し、該ヘテロ環は、置換基で置換されていてもよい）。
ｍ及びｋは、同一又は異なって、０又は１〜１０の整数を示す。
ｌは、１〜５の整数を示す。
Ａ２-及びＡ３-は、同一又は異なって、アニオン性基を示す。
Ｒ４〜Ｒ７の炭素数の合計値と、ｍと、ｌと、ｋとの和が５〜２９である。]
よりなる群から選択される少なくとも１種のアミン化合物を含むことを特徴とする、
凍結変性抑制剤。
項２．  前記一般式（１）において、Ｒ１〜Ｒ３が、同一又は異なって、炭素数２〜６の直鎖又は分岐状のアルキル基であり、且つｎが０又は１〜５の整数である、項１に記載の凍結変性抑制剤。
項３．  前記一般式（２）において、Ｒ４〜Ｒ７が、同一又は異なって、炭素数１〜６の直鎖又は分岐状のアルキル基であり、ｍ及びｋが１〜５の整数であり、且つｌが１〜５の整数である、項１又は２に記載の凍結変性抑制剤。
項４．  前記一般式（１）において、Ａ１-が、ＣＯＯ-、ＳＯ3-、ＳＯ2-、Ｏ-、Ｓ-、又はＨＰＯ4-である、項１〜３のいずれかに記載の凍結変性抑制剤。
項５．  前記一般式（２）において、Ａ２-及びＡ３-が、同一又は異なって、ＣＯＯ-、ＳＯ3-、ＳＯ2-、Ｏ-、Ｓ-、又はＨＰＯ4-である、項１〜４のいずれかに記載の凍結変性抑制剤。
項６．  前記アミン化合物が、一般式（１）で表される化合物であり、一般式（１）中、Ｒ２及びＲ３が、同一又は異なって、炭素数３又は４の直鎖状のアルキル基である、項１に記載の凍結変性抑制剤。
項７．  一般式（１）中、ｎが１であり、且つＡ１-がＣＯＯ-である、項６に記載の凍結変性抑制剤。
項８．  更に、前記アミン化合物以外の凍結変性抑制作用を示す化合物を含む、項１〜７のいずれかに記載の凍結変性抑制剤。
項９．  タンパク質又は細胞の凍結変性抑制のために使用される、項１〜８のいずれかに記載の凍結変性抑制剤。
項１０．  項１〜９のいずれかに記載の凍結変性抑制剤を含有することを特徴とする、凍結保存液。
項１１．  タンパク質又は細胞と、項１〜９のいずれかに記載の凍結変性抑制剤とを含む凍結保存液を、凍結保存することを特徴とする、タンパク質又は細胞の凍結保存方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の凍結変性抑制剤には、タンパク質や細胞等に対して優れた凍結変性抑制効果があり、凍結保存によるタンパク質の変性や細胞の生存率の低下等を効果的に抑制することができ、タンパク質や細胞等の安定な凍結保存に資することができる。更に、本発明の凍結変性抑制剤によれば、タンパク質の凍結・解凍を繰り返し行っても、タンパク質の活性を安定に維持することができ、タンパク質を使用する際の利便性を格段に高めることもできる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】参考試験例１において、凍結・解凍を１２回繰り返して行ったα−グルコシダーゼの活性比を測定した結果を示す図である。
【図２】参考試験例２において、既知の凍結変性抑制剤の存在下で、凍結・解凍を１２回繰り返して行ったα−グルコシダーゼの活性比を測定した結果を示す図である。
【図３】実施例１において、各種アミン化合物の存在下で、凍結・解凍を１２回繰り返して行ったα−グルコシダーゼの活性比を測定した結果を示す図である。
【図４】実施例２において、０〜１Ｍの濃度の各種アミン化合物の存在下で、凍結・解凍を１２回繰り返して行ったα−グルコシダーゼの活性比を測定した結果を示す図である。
【図５】実施例２において、０〜１０ｍＭの濃度の各種アミン化合物の存在下で、凍結・解凍を１２回繰り返して行ったα−グルコシダーゼの活性比を測定した結果を示す図である。
【図６】実施例３において、アミン化合物の存在下で、凍結・解凍を１００回繰り返して行ったα−グルコシダーゼの活性比を測定した結果を示す図である。
【図７】実施例４において、各種アミン化合物の存在下で、凍結・解凍を１２回繰り返して行ったα−グルコシダーゼの活性比を測定した結果を示す図である。
【図８】実施例５において、アミン化合物とジメチルスルホキシドの共存下で、凍結・解凍を１２回繰り返して行ったα−グルコシダーゼの活性比を測定した結果を示す図である。
【図９】実施例５において、アミン化合物とグリセロールの共存下で、凍結・解凍を１２回繰り返して行ったα−グルコシダーゼの活性比を測定した結果を示す図である。
【図１０】実施例６において、アミン化合物の存在下で、凍結・解凍を１２回繰り返して行ったアルカリフォスファターゼ、乳酸脱水素酵素、ペルオキシダーゼ、スルファターゼ及びβ−グルコシダーゼの活性比を測定した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明の凍結変性抑制剤は、特定のアミン化合物を含むことを特徴とする。以下、本発明の凍結変性抑制剤について、詳述する。
【００１６】
本明細書において、「凍結変性抑制剤」とは、タンパク質、細胞等の被凍結物を凍結保存する際に、凍結時、凍結保存中、及び解凍時に、該被凍結物の変性、機能低下、生存率低下等を抑制し、該被凍結物の保存安定性を高めるために、該被凍結物と共存させる添加剤を意味する。
【００１７】
アミン化合物
本発明の凍結変性抑制剤において、有効成分として使用可能なアミン化合物の一つとして、下記一般式（１）で表される化合物が挙げられる。
【化３】
2014150777.tif 000004
【００１８】
一般式（１）中、Ｒ１〜Ｒ３は、同一又は異なって、炭素数１〜８の直鎖又は分岐状のアルキル基、炭素数２〜８の直鎖又は分岐状のアルキル基、炭素数２〜８の直鎖又は分岐状のアルケニル基、又は炭素数２〜８の直鎖又は分岐状のアルキニル基、又は炭素数６〜８のアリール基であり得る。Ｒ１〜Ｒ３を構成するアルキル基、アルケニル基、又はアルキニル基は、直鎖状又は分岐状のいずれであってもよいが、好ましくは直鎖状が挙げられる。また、Ｒ１〜Ｒ３を構成するアルキル基、アルケニル基、又はアルキニル基の炭素数については、アルキル基の場合は１〜８、或いはアルケニル基又はアルキニル基の場合は２〜８の範囲内で、且つ後述する一般式（１）が満たすべき全炭素数を勘案して適宜設定されるが、好ましくは２〜６、更に好ましくは２〜５、特に好ましくは３又は４が挙げられる。また、Ｒ１〜Ｒ３を構成するアリール基としては、具体的には、フェニル基、ベンジル基、トリル基、キシリル基が挙げられる。
【００１９】
また、Ｒ１〜Ｒ３を構成するアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、又はアリール基は、置換基で置換されていてもよい。当該置換基としては、特に制限されないが、例えば、水酸基、アミノ基、カルボキシル基、スルホ基、リン酸基、アルコキシル基、ハロゲン原子等が挙げられる。置換基として用いられるハロゲン原子としては、具体的には、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等が挙げられる。また、置換基としてアルコキシル基を有する場合、当該アルコキシル基の炭素数としては、例えば１〜７、好ましくは１〜５、更に好ましくは１〜３、特に好ましくは１又は２が挙げられる。Ｒ１〜Ｒ３を構成するアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、又はアリール基が置換基で置換されている場合、その置換基の数については、特に制限されないが、通常１〜３個、好ましくは１又は２個、更に好ましくは１個が挙げられる。
【００２０】
また、一般式（１）中、Ｒ１及びＲ２は、互いに結合してＮ+と共に、Ｎ+以外の窒素原子、酸素原子又は硫黄原子を１つ以上含んでもよい３〜６環式の飽和又は不飽和のヘテロ環を形成してもよい。該飽和又は不飽和のヘテロ環の環員数として、好ましくは５又は６が挙げられる。Ｒ１とＲ２がＮ+と共に形成する飽和又は不飽和のヘテロ環としては、具体的には、モルホリン環、ピペリジン環、ピロリジン環、ピペラジン環等が挙げられる。
【００２１】
また、前記飽和又は不飽和のヘテロ環は、置換基を有していてもよい。置換基としては、例えば、アルキル基、アルコキシル基、水酸基、アミノ基、カルボキシル基、スルホ基、リン酸基、ハロゲン原子等が挙げられる。置換基として用いられるアルキル基としては、具体的には、炭素数１〜６の直鎖又は分岐状のアルキル基、好ましくは炭素数１〜５の直鎖又は分岐状のアルキル基、更に好ましくは炭素数１〜３の直鎖又は分岐状のアルキル基、特に好ましくは炭素数１又は２のアルキル基が挙げられる。また、置換基として用いられるアルコキシル基アルコキシル基としては、具体的には、炭素数１〜６の直鎖又は分岐状のアルコキシル基、好ましくは炭素数１〜５の直鎖又は分岐状のアルコキシル基、更に好ましくは炭素数１〜３の直鎖又は分岐状のアルコキシル基、特に好ましくは炭素数１又は２のアルコキシル基が挙げられる。置換基として用いられるハロゲン原子としては、具体的には、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等が挙げられる。前記飽和又は不飽和のヘテロ環が置換基を有する場合、その置換基の数としては、飽和又は不飽和のヘテロ環の環員数等に応じて異なるが、通常１〜３個、好ましくは１又は２個、更に好ましくは１個が挙げられる。
【００２２】
更に、一般式（１）中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、互いに結合してＮ+と共に、Ｎ+が二重結合を有する、Ｎ+以外の窒素原子、酸素原子又は硫黄原子を含んでもよい３〜６環式の不飽和のヘテロ環を形成してもよい。該不飽和のヘテロ環の環員数として、好ましくは５又は６、更に好ましくは５が挙げられる。Ｒ１、Ｒ２及びＲ３がＮ+と共に形成する、Ｎ+が二重結合を有する不飽和のヘテロ環としては、具体的には、イミダゾール環、ピリジン環、ピリミジン環、ピリダジン環、トリアジン環、キノリン環、イソキノリン環、キノキサリン環、キナゾリン環、シンノリン環、プリン環、プテリン環、プテリジン環、ベンゾイミダゾール環、フラビン環、アクリジン環等が挙げられる。当該不飽和のヘテロ環は、置換基を有していてもよく、当該置換基の種類及び数は、Ｒ１及びＲ２が互いに結合して形成される飽和又は不飽和のヘテロ環の場合と同様である。
【００２３】
一般式（１）中、ｎは、０又は１〜１０の整数、好ましくは０又は１〜５の整数を示す。
【００２４】
また、一般式（１）において、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３の炭素数の合計値とｎとの和（以下、「Ａ１-以外の全炭素数」と表記することがある）が５〜２９である。Ａ１-以外の全炭素数として前記範囲を充足させることにより、一般式（１）で表される化合物が所望の嵩高さを備え、優れた凍結変性抑制効果を奏することが可能になる。より一層凍結変性抑制効果を高めるという観点から、該Ａ１-以外の全炭素数が、好ましくは７〜２１、更に好ましくは１０〜１９、更に好ましくは１０〜１３が挙げられる。
【００２５】
一般式（１）において、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３とｎの組み合わせ態様については、前述する全炭素数の範囲を充足することを限度として特に制限されないが、好適な態様として以下の(I)〜(VI)が挙げられる：
(I)  Ｒ１〜Ｒ３がメチル基であり、且つｎが２〜１０の整数、好ましくは３〜５の整数、更に好ましくは５である；
(II)  Ｒ１〜Ｒ３が炭素数２〜６の直鎖又は分岐状のアルキル基、好ましくは炭素数２〜５の直鎖又は分岐状のアルキル基、更に好ましくは炭素数３又は４の直鎖又は分岐状のアルキル基、特に好ましくは炭素数３又は４の直鎖状のアルキル基であり、且つｎが０又は１〜１０の整数、好ましくは０又は１〜５の整数、更に好ましくは０又は１である；
(III)  Ｒ１及びＲ３が炭素数１又は２のアルキル基、好ましくはメチル基であり、Ｒ２は置換基が１個置換している炭素数２〜４の直鎖又は分岐状のアルキル基、好ましくは末端に水酸基が１個置換しているエチル基であり、且つｎが１〜１０の整数、好ましくは１〜５の整数、更に好ましくは１である；
(IV)  Ｒ２及びＲ３が、置換基が１個置換している炭素数２〜４の直鎖又は分岐状のアルキル基、好ましくは末端に水酸基が１個置換しているエチル基であり、Ｒ１が炭素数１又は２のアルキル基、好ましくはメチル基であり、且つｎが１〜１０の整数、好ましくは１〜５の整数、更に好ましくは１である；
(V)  Ｒ１及びＲ２が互いに結合してＮ+と共に、Ｎ+以外の窒素原子、酸素原子又は硫黄原子を１つ以上含んでもよい５又は６環式の飽和又は不飽和のヘテロ環、好ましくはＲ１及びＲ２が互いに結合してＮ+と共にモルホリン環又はピペリジン環を形成しており、Ｒ３が炭素数１〜８の直鎖又は分岐状のアルキル基、好ましくはメチル基であり、且つｎが１〜１０の整数、好ましくは１〜３の整数、更に好ましくは１である；
(VI)  Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、互いに結合してＮ+と共に、Ｎ+が二重結合を有する、Ｎ+以外の窒素原子、酸素原子又は硫黄原子を含んでもよい５又は６環式の不飽和のヘテロ環（該ヘテロ環は置換基、好ましくは炭素数１〜３の直鎖又は分岐状のアルキル基、更に好ましくは炭素数１又は２のアルキル基、特に好ましくはメチル基が１〜３個置換していてもよい）、好ましくはＲ１、Ｒ２及びＲ３は、互いに結合してＮ+と共に、イミダゾール環又はピリジン環（該環にはメチル基が１〜３個置換していてもよい）形成しており、且つｎが１〜１０の整数、好ましくは１〜３の整数、更に好ましくは１である。
【００２６】
また、一般式（１）中、Ａ１-は、アニオン性基を示す。アニオン性基としては、具体的には、ＣＯＯ-、ＳＯ3-、ＳＯ2-、Ｏ-、Ｓ-、ＨＰＯ4-等が挙げられる。これらの中でも、好ましくはＣＯＯ-、ＳＯ3-、Ｏ-が挙げられる。
【００２７】
一般式（１）において、Ａ-とｎの組み合わせ態様については、特に制限されないが、好適な一例として、Ａ１-がＣＯＯ-の場合であればｎが１〜１０の整数、好ましくは１〜５の整数、Ａ１-がＳＯ3-の場合であればｎが１〜４の整数、好ましくは３又は４、更に好ましくは３、Ａ１-がＯ-の場合であればｎが０の組み合わせが挙げられる。
【００２８】
一般式（１）で表される化合物の内、より一層優れた凍結変性抑制効果を奏するという観点から、好ましい化合物の具体例として以下のものが挙げられる。
(i)  Ｒ１〜３がメチル基であり、ｎが２〜１０の整数、好ましくは３〜５の整数、更に好ましくは５であり、且つＡ１-がＣＯＯ-である；
(ii)  Ｒ１〜３が炭素数２〜６の直鎖又は分岐状のアルキル基、好ましくは炭素数３又は４の直鎖状のアルキル基であり、ｎが１〜１０の整数、好ましくは１〜５の整数、更に好ましくは１であり、且つＡ１-がＣＯＯ-である；
(iii)  Ｒ１及びＲ３が炭素数１又は２のアルキル基、好ましくはメチル基であり、Ｒ２は置換基が１個置換している炭素数２〜４の直鎖又は分岐状のアルキル基、好ましくは末端に水酸基が１個置換しているエチル基であり、ｎが１〜１０の整数、好ましくは１〜５の整数、更に好ましくは１であり、且つＡ１-がＣＯＯ-である；
(iv)  Ｒ２及びＲ３は置換基が１個置換している炭素数２〜４の直鎖又は分岐状のアルキル基、好ましくは末端に水酸基が１個置換しているエチル基であり、Ｒ１が炭素数１又は２のアルキル基、好ましくはメチル基であり、ｎが１〜１０の整数、好ましくは１〜３の整数、更に好ましくは１であり、且つＡ１-がＣＯＯ-である；
(v)  Ｒ１及びＲ２が互いに結合してＮ+と共に、Ｎ+以外の窒素原子、酸素原子又は硫黄原子を１つ以上含んでもよい５又は６環式の飽和又は不飽和のヘテロ環、好ましくはＲ１及びＲ２が互いに結合してＮ+と共にモルホリン環又はピペリジン環を形成しており、Ｒ３が炭素数１〜４の直鎖又は分岐状のアルキル基、好ましくはメチル基であり、ｎが１〜１０の整数、好ましくは１〜５の整数、更に好ましくは１であり、且つＡ１-がＣＯＯ-である；
(vi)  Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、互いに結合してＮ+と共に、Ｎ+が二重結合を有する、Ｎ+以外の窒素原子、酸素原子又は硫黄原子を含んでもよい５又は６環式の不飽和のヘテロ環（該ヘテロ環は置換基、好ましくは炭素数１〜３の直鎖又は分岐状のアルキル基、更に好ましくは炭素数１又は２のアルキル基、特に好ましくはメチル基が１〜３個置換していてもよい）、好ましくはＲ１、Ｒ２及びＲ３は、互いに結合してＮ+と共に、イミダゾール環又はピリジン環（該環にはメチル基が１〜３個置換していてもよい）形成しており、ｎが１〜１０の整数、好ましくは１〜３の整数、更に好ましくは１であり、且つＡ１-がＣＯＯ-である；
(vii)  Ｒ１〜３が炭素数２〜４の直鎖又は分岐状のアルキル基、好ましくは炭素数３又は４の直鎖状のアルキル基であり、ｎが１〜４の整数、好ましくは３であり、且つＡ１-がＳＯ3-である；
(viii)  Ｒ１〜３が炭素数２〜６の直鎖又は分岐状のアルキル基、好ましくは炭素数３又は４の直鎖状のアルキル基であり、ｎが０であり、且つＡ１-がＯ-である；
【００２９】
一般式（１）で表される化合物は、公知の合成方法に従って製造でき、例えば特開2009-96766号公報、特開2010-220607号公報等に記載の方法で製造することができる。
【００３０】
また、本発明の凍結変性抑制剤において、有効成分として使用可能なアミン化合物の他の例として、下記一般式（２）で表される化合物が挙げられる。
【化４】
2014150777.tif 000005
【００３１】
一般式（２）中、Ｒ４〜Ｒ７は、同一又は異なって、炭素数１〜８の直鎖又は分岐状のアルキル基、炭素数２〜８の直鎖又は分岐状のアルキル基、炭素数２〜８の直鎖又は分岐状のアルケニル基、又は炭素数２〜８の直鎖又は分岐状のアルキニル基、又は炭素数６〜８のアリール基であり得る。Ｒ４〜Ｒ７を構成するアルキル基、アルケニル基、又はアルキニル基は、直鎖状又は分岐状のいずれであってもよいが、好ましくは直鎖状が挙げられる。また、Ｒ４〜Ｒ７を構成するアルキル基、アルケニル基、又はアルキニル基の炭素数については、アルキル基の場合は１〜８、或いはアルケニル基又はアルキニル基の場合は２〜８の範囲内で、且つ後述する一般式（１）が満たすべき全炭素数を勘案して適宜設定されるが、好ましくは２〜６、更に好ましくは２〜５、特に好ましくは３又は４が挙げられる。また、Ｒ４〜Ｒ７を構成するアリール基としては、具体的には、フェニル基、ベンジル基、トリル基、キシリル基が挙げられる。
【００３２】
また、Ｒ１〜Ｒ３を構成するアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、又はアリール基は、置換基で置換されていてもよい。当該置換基の種類及び数は、前記Ｒ１〜Ｒ３を構成するアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、又はアリール基の場合と同様である。
【００３３】
また、一般式（２）中、Ｒ４とＲ５、及び／又はＲ６とＲ７は、互いに結合してＮ+と共に、Ｎ+以外の窒素原子、酸素原子又は硫黄原子を１つ以上含んでもよい３〜６環式の飽和又は不飽和のヘテロ環を形成してもよい。該飽和又は不飽和のヘテロ環の環員数として、好ましくは５又は６が挙げられる。Ｒ４とＲ５、及び／又はＲ６とＲ７が、Ｎ+と共に形成する飽和又は不飽和のヘテロ環としては、具体的には、モルホリン環、ピペリジン環、ピロリジン環、ピペラジン環等が挙げられる。また、当該飽和又は不飽和のヘテロ環は、置換基を有していてもよく、当該置換基の種類及び数は、前記一般式（１）中のＲ１及びＲ２が互いに結合して形成される飽和又は不飽和のヘテロ環の場合と同様である。
【００３４】
一般式（２）中、ｍ及びｋは、同一又は異なって、０又は１〜１０の整数を示す。ｍ及びｋとして、好ましくは０又は１〜５の整数、好ましくは１〜３、更に好ましくは１が挙げられる。
【００３５】
一般式（２）中、ｌは、１〜５の整数を示す。ｌとして、好ましくは１〜３の整数、更に好ましくは２が挙げられる。
【００３６】
また、一般式（２）において、Ｒ４〜Ｒ７の炭素数の合計値と、ｍと、ｌと、ｋとの和（以下、「Ａ２-及びＡ３-以外の全炭素数」と表記することがある）が５〜２９である。Ａ２-及びＡ３-以外の全炭素数として前記範囲を充足させることにより、一般式（２）で表される化合物が所望の嵩高さを備え、優れた凍結変性抑制効果を奏することが可能になる。より一層凍結変性抑制効果を高めるという観点から、該Ａ２-及びＡ３-以外の全炭素数が、好ましくは６〜１９、更に好ましくは６〜１６、更に好ましくは６〜１０が挙げられる。
【００３７】
一般式（２）において、Ｒ４〜Ｒ７と、ｍと、ｌと、ｋの組み合わせ態様については、前述する全炭素数の範囲を充足することを限度として特に制限されないが、好適な態様として、Ｒ４〜Ｒ７が炭素数１〜６の直鎖又は分岐状のアルキル基、好ましくは炭素数１〜３の直鎖又は分岐状のアルキル基、更に好ましくは炭素数１又は２のアルキル基、特に好ましくはメチル基であり、ｍ及びｋが１〜５の整数、好ましくは１〜３、更に好ましくは１であり、ｌが１〜５の整数、好ましくは１〜３の整数、特に好ましくは２が挙げられる。
【００３８】
また、一般式（２）中、Ａ２-及びＡ３-は、同一又は異なって、アニオン性基を示す。Ａ２-及びＡ３-として、具体的には、ＣＯＯ-、ＳＯ3-、ＳＯ2-、Ｏ-、Ｓ-、ＨＰＯ4-等が挙げられる。これらの中でも、好ましくはＣＯＯ-、ＳＯ3-、Ｏ-、更に好ましくはＣＯＯ-が挙げられる。
【００３９】
一般式（２）で表される化合物は、公知の合成方法に従って製造でき、例えば特開2009-96766号公報、特開2010-220607号公報、後述する製造例等に記載の方法で製造することができる。
【００４０】
本発明の凍結変性抑制剤では、前記一般式（１）で表される化合物、及び前記一般式（２）で表される化合物の中で、１種の化合物を単独で使用してもよく、また２種以上の化合物を組み合わせて使用してもよい。
【００４１】
前記一般式（１）で表される化合物、及び前記一般式（２）で表される化合物の中でも、水に対する溶解性が良好であり、しかも特に優れた凍結変性抑制効果を奏するものとして、好ましくは一般式（１）で表される化合物が挙げられ、更に好ましくは、一般式（１）において、Ｒ１〜Ｒ３が炭素数２〜６の直鎖又は分岐状のアルキル基、好ましくは炭素数３又は４の直鎖状のアルキル基であり、ｎが１〜５の整数、好ましくは１であり、且つＡ-がＣＯＯ-である化合物が挙げられる。
【００４２】
その他の含有成分
本発明の凍結変性抑制剤は、前記アミン化合物以外に、必要に応じて、凍結変性抑制作用を示す他の化合物を含んでもよい。前記アミン化合物と凍結変性抑制作用を示す化合物を組み合わせて使用することにより、凍結変性抑制効果をより一層向上させることができる。このような凍結変性抑制作用を示す化合物としては、具体的には、ジメチルスルホキシド、グリセロール、エタノール、ホルムアミド、トレハロース、Ｌ−エクトイン、Ｌ−ヒドロキシエクトイン、グリシンベタイン、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、牛血清アルブミン、トリメチルグリシン、トリメチルアミン−Ｎ−オキシド等が挙げられる。これらの中でも、好ましくはジメチルスルホキシド、グリセロールが挙げられる。これらの化合物は、１種単独で使用してもよく、また２種以上を組み合わせて使用してもよい。
【００４３】
本発明の凍結変性抑制剤が、凍結変性抑制作用を示す他の化合物を含有する場合、その含有量については、特に制限されないが、例えば、凍結変性抑制作用を示す他の化合物の濃度が、添加される凍結保存液中で０．００００１〜１０Ｍ、好ましくは０．００１〜５Ｍ、更に好ましくは０．０１〜３Ｍとなるように適宜設定すればよい。
【００４４】
使用方法
本発明の凍結変性抑制剤は、凍結保存において、凍結時、凍結保存中、及び／又は解凍時に、変性、機能低下、生存率低下等が生じる被凍結物の凍結保存の安定性を向上させるために使用される。本発明の凍結変性抑制剤の適用対象となる被凍結物としては、好まししくは、タンパク質、及び細胞が挙げられる。タンパク質としては、例えば、酵素、抗体、構造タンパク質、輸送タンパク質、貯蔵タンパク質、その他生理活性タンパク質等が挙げられる。また、細胞としては、動物細胞、植物細胞、微生物等のいずれであってもよいが、好ましくは動物細胞が挙げられる。動物細胞としては、具体的には、繊維芽細胞、間葉系幹細胞、生殖細胞、受精卵、胚等の生体から単離された細胞；生物組織から得られる株化されていない細胞；培養細胞；膵ランゲルハンス島等の細胞集合体、組織又は組織片等が挙げられる。
【００４５】
本発明の凍結変性抑制剤は、凍結保存液に添加し、被凍結物と共存させた状態で凍結保存することにより使用される。凍結保存液とは、被凍結物を凍結保存するための溶液であり、基剤として、通常、水が含まれている。
【００４６】
本発明の凍結変性抑制剤の凍結保存液への添加量については、使用する前記第４級アンモニウム化合物の種類、被凍結物の種類等によって異なり、一律に規定することはできないが、例えば前記アミン化合物の濃度換算で０．０１〜３０００ｍＭが挙げられる。
【００４７】
より具体的には、アミン化合物の構造別の凍結保存液への添加量の目安については、以下の通りである。
Ａ１-がＣＯＯ-又はＯ-であり、Ａ１-以外の全炭素数が５〜８である一般式（１）で表される化合物の場合、或いはＡ２-及びＡ３-がＣＯＯ-又はＯ-であり、Ａ２-及びＡ３-以外の全炭素数が５〜８である一般式（２）で表される化合物の場合：該アミン化合物の濃度換算で０．１〜３０００ｍＭ、好ましくは０．５〜１０００ｍＭ。
Ａ１-がＣＯＯ-又はＯ-であり、Ａ１-以外の全炭素数が９〜１１である一般式（１）で表される化合物の場合、或いはＡ２-及びＡ３-がＣＯＯ-又はＯ-であり、Ａ２-及びＡ３-以外の全炭素数が９〜１１である一般式（２）で表される化合物の場合：該アミン化合物の濃度換算で５０〜２０００ｍＭ、好ましくは３００〜１５００ｍＭ、更に特に好ましくは５００〜１０００ｍＭ。
Ａ１-がＣＯＯ-又はＯ-であり、Ａ１-以外の全炭素数が１２〜１４である一般式（１）で表される化合物の場合、或いはＡ２-及びＡ３-がＣＯＯ-又はＯ-であり、Ａ２-及びＡ３-以外の全炭素数が１２〜１４である一般式（２）で表される化合物の場合：該アミン化合物の濃度換算で５〜２０００ｍＭ、好ましくは２５〜２０００ｍＭ、更に好ましくは５０〜１０００ｍＭ。
Ａ１-がＣＯＯ-又はＯ-であり、Ａ１-以外の全炭素数が１５〜１７である一般式（１）で表される化合物の場合、或いはＡ２-及びＡ３-がＣＯＯ-又はＯ-であり、Ａ２-及びＡ３-以外の全炭素数が１５〜１７である一般式（２）で表される化合物の場合：該アミン化合物の濃度換算で０．１〜３００ｍＭ、好ましくは０．５〜３００ｍＭ、更に好ましくは１０〜１００ｍＭ。
Ａ１-がＣＯＯ-又はＯ-であり、Ａ１-以外の全炭素数が１８〜２９である一般式（１）で表される化合物の場合、或いはＡ２-及びＡ３-がＣＯＯ-又はＯ-であり、Ａ２-及びＡ３-以外の全炭素数が１８〜２９である一般式（２）で表される化合物の場合：該アミン化合物の濃度換算で０．１〜１０ｍＭ、好ましくは０．５〜１０ｍＭ、更に好ましくは０．５〜１ｍＭ。
Ａ１-がＳＯ3-又はＳＯ2-であり、Ａ１-以外の全炭素数が５〜９である一般式（１）で表される化合物の場合、或いはＡ２-及びＡ３-がＳＯ3-又はＳＯ2-あり、Ａ２-及びＡ３-以外の全炭素数が５〜９である一般式（２）で表される化合物の場合：該アミン化合物の濃度換算で０．１〜３０００ｍＭ、好ましくは０．５〜１０００ｍＭ。
Ａ１-がＳＯ3-又はＳＯ2-であり、Ａ１-以外の全炭素数が１０〜１２である一般式（１）で表される化合物の場合、或いはＡ２-及びＡ３-がＳＯ3-又はＳＯ2-あり、Ａ２-及びＡ３-以外の全炭素数が１０〜１２である一般式（２）で表される化合物の場合：該アミン化合物の濃度換算で５０〜２０００ｍＭ、好ましくは３００〜１５００ｍＭ。
Ａ１-がＳＯ3-又はＳＯ2-であり、Ａ１-以外の全炭素数が１３〜１５である一般式（１）で表される化合物の場合、或いはＡ２-及びＡ３-がＳＯ3-又はＳＯ2-あり、Ａ２-及びＡ３-以外の全炭素数が１３〜１５である一般式（２）で表される化合物の場合：該アミン化合物の濃度換算で５〜２０００ｍＭ、好ましくは２５〜２０００ｍＭ。
Ａ１-がＳＯ3-又はＳＯ2-であり、Ａ１-以外の全炭素数が１６〜１８である一般式（１）で表される化合物の場合、或いはＡ２-及びＡ３-がＳＯ3-又はＳＯ2-あり、Ａ２-及びＡ３-以外の全炭素数が１６〜１８である一般式（２）で表される化合物の場合：該アミン化合物の濃度換算で０．１〜３００ｍＭ、好ましくは０．５〜３００ｍＭ。
Ａ１-がＳＯ3-又はＳＯ2-であり、Ａ１-以外の全炭素数が１９〜２９である一般式（１）で表される化合物の場合、或いはＡ２-及びＡ３-がＳＯ3-又はＳＯ2-あり、Ａ２-及びＡ３-以外の全炭素数が１９〜２９である一般式（２）で表される化合物の場合：該アミン化合物の濃度換算で０．１〜１０ｍＭ、好ましくは０．５〜１０ｍＭ。
【００４８】
凍結保存液には、本発明の凍結変性抑制剤、及び水以外に、必要に応じて、緩衝剤、ｐＨ調整剤、等張化剤、血清、増粘剤、糖類等の添加剤が含まれていてもよい。このような添加剤の種類や量は、被凍結物の種類等に応じて適宜設定される。
【００４９】
また、凍結保存液は、必要に応じて、滅菌することができる。滅菌方法としては、例えば、濾過滅菌、高圧蒸気滅菌、紫外線滅菌、電子線滅菌、γ線滅菌等が挙げられる。
【００５０】
本発明の凍結変性抑制剤が添加された凍結保存液に、被凍結物を入れて、必要に応じて、混合した後に、凍結することにより凍結保存がなされる。凍結保存液中の被凍結物の添加量については、被凍結物の種類に応じて適宜設定されるが、例えば、被凍結物がタンパク質の場合であれば１ｐｇ／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍＬ、被凍結物が細胞の場合であれば１０2〜１０10ｃｅｌｌｓ／ｍｌが挙げられる。
【００５１】
本発明の凍結変性抑制剤を用いた凍結保存において、凍結保存時の温度についても、通常の凍結保存と同様に設定される。例えば、被凍結物がタンパク質の場合であれば−３０〜４℃、被凍結物が細胞の場合であれば−２００〜−２０℃が挙げられる。
【実施例】
【００５２】
以下、実施例を挙げて、本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
製造例１：各種アミン化合物の製造
以下に示すアミン化合物１〜１６を合成した。
【化５】
2014150777.tif 000006
【００５３】
アミン化合物１〜９、及び１６の合成
アミン化合物１〜５、８、９、１６については、特開２００９−９６７６６号公報に記載の方法に従って合成した。また、アミン化合物６及び７については、特願２０１１−１９７４３２号公報に記載の方法に従って合成した。
【００５４】
アミン化合物１０の合成
３００ｍｌのナス型フラスコにピリジン５０ｇ（０．６３ｍｏｌ）を加え、酢酸エチル１００ ｍｌに溶解させた。窒素気流下、室温で撹拌しながら、ブロモ酢酸エチル２５ｍｌ（０．２３ ｍｏｌ）をゆっくりと滴下した。滴下終了後、さらに３日室温で撹拌を続けた。３日後、生成した沈殿を濾取した後、減圧乾燥し、淡桃色固体（前駆体）を得た。
【００５５】
得られた前駆体を蒸留水４０ｍｌに溶解させた。その溶液を陰イオン交換カラム（アンバーライト：商標登録ＩＲＡ−４０２、ローム  アンド  ハース社製）を充填したカラムに通した。溶離液をエバポレーターで減圧濃縮し、５酸化２リンの共存下、減圧乾燥し、白色固体となったアミン化合物１０を得た（１８．９ ｇ、６０％）。得られたアミン化合物１０について、ＡＴＲ−ＩＲ、1Ｈ  ＮＭＲ及びＥＳＩ−ＭＳにより分析した結果を表１〜３に示す。
【００５６】
【表１】
2014150777.tif 000007
【００５７】
【表２】
2014150777.tif 000008
【００５８】
【表３】
2014150777.tif 000009
【００５９】
アミン化合物１１の合成
３００ｍｌのナス型フラスコにＮ−メチルイミダゾール５０ｇ（０．６１ｍｏｌ）を加え、酢酸エチル１００ｍｌに溶解させた。窒素気流下、室温で撹拌しながら、ブロモ酢酸エチル２５ｍｌ（０．２３ ｍｏｌ）をゆっくりと滴下した。滴下終了後、さらに３日室温で撹拌を続けた。３日後、生成した沈殿を濾取した後、減圧乾燥し、淡桃色固体（前駆体）を得た。
【００６０】
得られた前駆体を蒸留水５０ｍｌに溶解させた。その溶液を陰イオン交換カラム（アンバーライト：商標登録ＩＲＡ−４０２、ローム  アンド  ハース社製）を充填したカラムに通した。溶離液をエバポレーターで減圧濃縮し、５酸化２リンの共存下、減圧乾燥し、白色固体となったアミン化合物１１を得た（２３．５ｇ、７３％）。得られたアミン化合物１１について、ＡＴＲ−ＩＲ、1Ｈ  ＮＭＲ及びＥＳＩ−ＭＳにより分析した結果を表４〜６に示す。
【００６１】
【表４】
2014150777.tif 000010
【００６２】
【表５】
2014150777.tif 000011
【００６３】
【表６】
2014150777.tif 000012
【００６４】
アミン化合物１２の合成
３００ｍｌのナス型フラスコにＮ，Ｎ−ジメチルアミノエタノール３０．０ｍｌ（３ｍｏｌ）を加え、酢酸エチル６０ｍｌに溶解させた。窒素気流下、室温で撹拌しながら、ブロモ酢酸エチル２２．２ｍｌ（０．２０ ｍｏｌ）をゆっくりと滴下した。滴下終了後、さらに１日室温で撹拌を続けた。1日後、生成した沈殿を濾取した後、減圧乾燥し、白色固体（前駆体）を得た。
【００６５】
得られた前駆体を蒸留水３７ ｍｌに溶解させた。その溶液を陰イオン交換カラム（アンバーライト：商標登録ＩＲＡ−４０２、ローム  アンド  ハース社製）を充填したカラムに通した。溶離液をエバポレーターで減圧濃縮し、５酸化２リンの共存下、減圧乾燥し、白色固体となったアミン化合物１２を得た（２６．８ｇ、９１％）。得られたアミン化合物１２について、ＡＴＲ−ＩＲ、1Ｈ  ＮＭＲ及びＥＳＩ−ＭＳにより分析した結果を表７〜９に示す。
【００６６】
【表７】
2014150777.tif 000013
【００６７】
【表８】
2014150777.tif 000014
【００６８】
【表９】
2014150777.tif 000015
【００６９】
アミン化合物１３の合成
２００ｍｌのナス型フラスコにＮ−メチルジエタノールアミン２２．９ ｍｌ（０．２ｍｏｌ）を加え、酢酸エチル５０ｍｌに溶解させた。窒素気流下、室温で撹拌しながらブロモ酢酸エチル１４．４ｍｌ（０．１３ ｍｏｌ）をゆっくりと滴下した。滴下終了後、１日間室温で撹拌を続けた。1日後、生成した沈殿を濾取した後、減圧乾燥して白色固体（前駆体）を得た。
【００７０】
得られた前駆体を蒸留水２７ ｍｌに溶解した。この溶液を陰イオン交換カラム（アンバーライト：商標登録ＩＲＡ−４０２、ローム  アンド  ハース社製）を充填したカラムに通した。溶離液をエバポレーターで減圧濃縮し、５酸化２リンの共存下、減圧乾燥し、白色固体であるアミン化合物１３を得た（２１．３ｇ、７２％）。得られたアミン化合物１３について、ＡＴＲ−ＩＲ、1Ｈ  ＮＭＲ及びＥＳＩ−ＭＳにより分析した結果を表１０〜１２に示す。
【００７１】
【表１０】
2014150777.tif 000016
【００７２】
【表１１】
2014150777.tif 000017
【００７３】
【表１２】
2014150777.tif 000018
【００７４】
アミン化合物１４の合成
３００ｍｌのナス型フラスコにトリブチルアミン５０．０ｍｌ（０．２１ｍｏｌ）を加え、酢酸エチル５０ｍｌに溶解させた。窒素気流下、室温で撹拌しながらプロパンサルトン１７．８ｍｌ（０．１０ ｍｏｌ）をゆっくりと滴下した。滴下終了後、７日間室温で撹拌を続けた。７日後、生成した沈殿を濾取した後、減圧乾燥して白色固体を得た（１８．７ｇ、６１％）。得られたアミン化合物１４について、ＡＴＲ−ＩＲ、1Ｈ−ＮＭＲ及びＥＳＩ−ＭＳにより分析した結果を表１３〜１５に示す。
【００７５】
【表１３】
2014150777.tif 000019
【００７６】
【表１４】
2014150777.tif 000020
【００７７】
【表１５】
2014150777.tif 000021
【００７８】
アミン化合物１５の合成
１００ｍｌの三ツ口フラスコに、トリブチルアミン１．００g（０．５０ ｍｏｌ）を加え、酢酸３．２ｍｌに溶解させた。窒素気流下、撹拌しながら３０％過酸化水素水０．５ｍｌ加え、８５℃で加熱攪拌を行った。３時間後、３０％過酸化水素水０．３５ｍｌ追加し、そのまま５日間反応を続けた。５日後、反応溶液から溶媒を減圧留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(シリカゲル、クロロホルム→クロロホルム：メタノール＝２０：１)により精製し薄黄色固体（０．８３ｇ、７６％）。得られたアミン化合物１５について、ＡＴＲ−ＩＲ、1Ｈ  ＮＭＲ及びＥＳＩ−ＭＳにより分析した結果を表１６〜１８に示す。
【００７９】
【表１６】
2014150777.tif 000022
【００８０】
【表１７】
2014150777.tif 000023
【００８１】
【表１８】
2014150777.tif 000024
【００８２】
製造例２：比較用のアミン化合物の製造
比較のために、以下に示すトリメチルグリシン（Ｎ，Ｎ，Ｎ-トリ-メチルグリシネート）（型番０２３−１０８６２、和光純薬製）及びトリメチルアミン−Ｎ−オキシド（型番３５３−２６０２２、和光純薬製）についても、市販品から取得した。
【化６】
2014150777.tif 000025
【００８３】
参考試験例１：α−グルコシダーゼの凍結・解凍に伴う残存活性
酵素は凍結・解凍を繰り返すことによって変性し、その活性を失うことが知られている。本参考試験例１では、α−グルコシダーゼ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来）（型番Ｇ３６５１-２５０ｕｎ、シグマアルドリッチ製）を用いて、凍結・解凍によって酵素活性がどのように変化するか検討した。
【００８４】
先ず、５．０ｍｇのα−グルコシダーゼ（粉末）を計り取り、１００ｍＭのリン酸緩衝溶液１ｍＬに溶解させ、５．０ｍｇ／ｍＬの酵素ストック溶液を調製した。
【００８５】
０．５ｍＬのプラスチックチューブに、前記酵素ストック溶液を０．５μＬ加え、総量が１００μＬになるように１００ｍＭのリン酸緩衝溶液（ｐＨ７．０）を加えることにより、酵素凍結保存液を調製した。この酵素凍結保存液を用いて、以下に記す凍結・解凍実験を行った。
【００８６】
酵素凍結保存液の凍結は、液体窒素中にチューブを浸し、３０秒〜１分程度静置し、酵素溶液を完全に凍結させることにより行った。また、酵素ストック溶液の解凍は、凍結状態の酵素ストック溶液が入ったチューブをサーマルサイクラー（アステック社製、ＰＣ−８１８）に入れ、２５℃で３分間静置し、溶液を完全に解凍させ、液温を２５℃にすることにより行った。この凍結・解凍を１２回繰り返し行った。
【００８７】
α−グルコシダーゼの酵素活性は、α−ｐ−ニトロフェニル−Ｄ−グルコピラノシド（型番３２５-３４６７１、和光純薬製）を用いた加水分解反応における反応速度比（活性比）（凍結・解凍後の反応速度／凍結・解凍前の反応速度）から算出した。
【００８８】
基質であるα−ｐ−ニトロフェニル−Ｄ−グルコピラノシドは３５０ｎｍに極大吸収波長を持つが、α−グルコシダーゼによってグルコースとｐ−ニトロフェノールに加水分解されると、ｐＨ７．０においてはｐ−ニトロフェノールは水酸基のプロトンが解離してｐ−ニトロフェノラートとなる。結果として、極大吸収波長は長波へシフトし、４０５ｎｍの吸光度が上昇する。４０５ｎｍのｐ−ニトロフェノラートのモル吸光係数（ｐＨ７．０、３７℃）である１１２００Ｍ-1ｃｍ-1を利用すれば、加水分解によって生成するｐ−ニトロフェノールの濃度を見積もることができ、反応速度を算出することができる。
【００８９】
加水分解速度の測定は、酵素反応溶液（１００ｍＭ  リン酸緩衝溶液（ｐＨ７．０）、２．０ｍＭ  α−ｐ−ニトロフェニル−Ｄ−グルコピラノシド、１．２５×１０-4ｍｇ／ｍＬ  α−グルコシダーゼ）を用いて、３７℃で行った。
【００９０】
凍結・解凍回数とその際の活性比を図１に示す。図１より、α−グルコシダーゼの活性は、凍結変性抑制剤非存在下では、凍結・解凍を繰り返す毎と急激に低下していくことが明らかとなった。その活性低下の程度は、凍結・解凍を３回繰り返した酵素凍結保存液の活性比は０.４３まで低下し、６回では０.２５、９回では０.１４、１２回凍結・解凍後は０．０９にまで活性比が低下していた。
【００９１】
参考試験例２：既知の凍結変性抑制剤を用いたα−グルコシダーゼの凍結変性抑制効果
従来、凍結変性抑制剤として、グリセロール、ホルムアミド、トリメチルグリシンが知られており、これらのα−グルコシダーゼに対する凍結変性抑制効果を評価した。具体的には、０．５ｍＬのプラスチックチューブに、前記参考試験例１で準備した酵素ストック溶液を０．５μＬ、グリセロール、ホルムアミド、又はトリメチルグリシンが終濃度で１Ｍとなるように加え、総量が１００μＬになるようにリン酸緩衝溶液を加え、酵素凍結保存液を調製した。この酵素凍結保存液を用いて、前記参考試験例１と同様の条件で凍結・解凍を１２回繰り返し、α−グルコシダーゼの活性比を測定した。また、コントロールとして、凍結変性抑制剤を添加しない条件でも、同様に試験を行った。
【００９２】
得られた結果を図２に示す。その結果、グリセロール、ホルムアミド、又はトリメチルグリシンを加えるとα−グルコシダーゼの凍結変性が幾分か抑制されることが確認された。但し、これらの凍結変性抑制剤を用いても、５０％以上の活性は凍結変性によって失われてしまっていた。
【００９３】
実施例１：一般式（１）及び（２）のアミン化合物を添加した場合の凍結変性抑制効果
アミン化合物１〜５、８〜１３及び１６について、α−グルコシダーゼに対する凍結変性抑制効果を評価した。具体的には、０．５ｍＬのプラスチックチューブに、前記参考試験例１で準備した酵素ストック溶液を０．５μＬ、各アミン化合物が終濃度で１Ｍとなるように加え、総量が１００μＬになるようにリン酸緩衝溶液を加え、酵素凍結保存液を調製した。この酵素凍結保存液を、前記参考試験例１と同様の条件で凍結・解凍を１２回繰り返し、α−グルコシダーゼの活性比を測定した。また、比較のため、トリメチルグリシンが終濃度で１Ｍとなるように添加した条件でも、同様に試験を行った。更に、コントロールとして、凍結変性抑制剤を添加しない条件でも、同様に試験を行った。
【００９４】
得られた結果を図３に示す。この結果から、アミン化合物１及び２を添加した場合には、トリメチルグリシンよりもα−グルコシダーゼの活性比が高かったことから、カチオンとアニオン間のスペーサー長が長いほど凍結変性抑制効果が強く現れる傾向があることが明らかとなった。また、アミン化合物３〜５を添加した場合の結果から、アンモニウム基に導入されるアルキル基の鎖長が長くなるに伴って、凍結変性抑制効果が強くなる傾向があることも確認された。特に、アンモニウム基に導入されたアルキル基の炭素数が３又は４である場合（アミン化合物４及び５）は、凍結変性抑制効果が卓越していることも、本試験結果から明らかとなった。
【００９５】
また、アミン化合物８〜１３を添加した場合でも、α−グルコシダーゼの活性比が高かったことから、アンモニウム基が環を形成していても、また、水酸基のような官能基が導入されていても所望の嵩高さ（Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３のアルキル鎖長に該当）を備えていれば、優れた凍結変性抑制効果を示すことが確認された。
【００９６】
更に、アミン化合物１６では、α−グルコシダーゼの活性比が０．９を超えていたことから、分子内にベタイン構造を２つ有するアミン化合物は、凍結変性抑制効果が卓越していることも明らかとなった。
【００９７】
実施例２：一般式（１）のアミン化合物の添加濃度と凍結変性抑制効果の相関
アミン化合物４〜７を用いて、添加濃度とα−グルコシダーゼに対する凍結変性抑制効果の関係について評価した。具体的には、０．５ｍＬのプラスチックチューブに、前記参考試験例１で準備した酵素ストック溶液を０．５μＬ、各アミン化合物が終濃度で０〜１Ｍとなるように加え、総量が１００μＬになるようにリン酸緩衝溶液を加え、酵素凍結保存液を調製した。この酵素凍結保存液を用いて、前記参考試験例１と同様の条件で凍結・解凍を１２回繰り返し、α−グルコシダーゼの活性比を測定した。
【００９８】
アミン化合物を０〜１Ｍの範囲で添加した場合の結果を図４に、アミン化合物を０〜１０ｍＭの範囲における拡大図を図５に示す。
【００９９】
３つのブチル基を有するアミン化合物５について注目すると、０．０５ｍＭ以上の添加濃度であれば、アミン化合物５を添加しなかった場合に比して明らかな凍結変性抑制効果が認められ、添加濃度が上昇するにつれてその効果は高くなっていた。そして、２５〜１０００ｍＭの濃度範囲では、１２回の凍結・解凍を繰り返しても変性はほとんど起こらないことが明らかとなった。また、３つのプロピル基を有するアミン化合物４は、０．５ｍＭ以上の添加濃度であれば、アミン化合物４を添加しなかった場合に比して明らかな凍結変性抑制効果が認められ、１０００ｍＭにかけて徐々にその効果は高まっていた。一方で、３つのペンチルプロピル基を有するアミン化合物６は、５００ｍＭ以下、特に１００ｍＭの添加濃度付近では９５％の残存活性を保持していた。また特筆すべきは、アミン化合物６は、アミン化合物５よりも低濃度で高い活性比を示した点である。これは３つのヘキシル基を有するアミン化合物７でより顕著となり、アミン化合物７はわずか１ｍＭの添加濃度で活性比０．９５を示した。
【０１００】
実施例３：一般式（１）のアミン化合物を用いて場合の凍結・解凍回数上昇と凍結変性抑制効果の相関
アミン化合物５を用いて、凍結・解凍回数を１００回まで上昇させた場合のα−グルコシダーゼに対する凍結変性抑制効果について評価した。具体的には、０．５ｍＬのプラスチックチューブに、前記参考試験例１で準備した酵素ストック溶液を０．５μＬ、各アミン化合物が終濃度で３００Ｍとなるように加え、総量が１００μＬになるようにリン酸緩衝溶液を加え、酵素凍結保存液を調製した。この酵素凍結保存液を用いて、前記参考試験例１と同様の条件で凍結・解凍を１００回繰り返し、α−グルコシダーゼの活性比を測定した。また、コントロールとして、凍結変性抑制剤を添加しない条件でも、同様に試験を行った。
【０１０１】
得られた結果を図６に示す。図６から分かるように、凍結変性抑制剤非存在下の場合、凍結・解凍を２０〜５０回程度繰り返すと、α−グルコシダーゼの活性は完全に失われてしまうが、アミン化合物５を添加した場合では、１００回の凍結・解凍を繰り返しても０．９５以上の活性比を保持していた。この結果は、アミン化合物５は、既存の凍結変性抑制剤と比較しても、飛躍的に高い凍結変性抑制効果があることを示している。
【０１０２】
実施例４：一般式（１）のアミン化合物におけるアニオン性基の種類の検討
アミン化合物におけるアニオン性基の種類が凍結変性抑制効果に及ぼす影響を検討するために、アニオン性基としてＳＯ3-又はＯ-を有するアミン化合物１４及び１５を用いて、α−グルコシダーゼに対する凍結変性抑制効果について評価した。具体的には、０．５ｍＬのプラスチックチューブに、前記参考試験例１で準備した酵素ストック溶液を０．５μＬ、各アミン化合物が終濃度で３００ｍＭとなるように加え、更に総量が１００μＬになるようにリン酸緩衝溶液を加えることにより、酵素凍結保存液を調製した。この酵素凍結保存液を用いて、前記参考試験例１と同様の条件で凍結・解凍を１２回繰り返し、α−グルコシダーゼの活性比を測定した。また、比較のために、トリメチルグリシン又はトリメチルアミン−Ｎ−オキシドを終濃度で３００ｍＭとなるように添加した条件でも、同様に試験を行った。更に、コントロールとして、凍結変性抑制剤を添加しない条件でも、同様に試験を行った。
【０１０３】
得られた結果を図７に示す。図７には、アニオン性基としてＣＯＯ-を有するアミン化合物５を同条件（３００ｍＭの終濃度で添加）で試験した結果も併せて示す。この結果から、アミン化合物１４及び１５は、アミン化合物５と同等の優れた凍結変性抑制効果を有していることが確認され、アミン化合物におけるアニオン性官能基の種類はとりわけ重要ではないことが示唆された。
【０１０４】
実施例５：一般式（１）のアミン化合物と、凍結変性抑制作用を示す他の化合物との併用の検討
アミン化合物と他の凍結変性抑制剤を併用した場合の凍結変性抑制効果に及ぼす影響を検討するために、一例として、アミン化合物６とジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）の併用、又はアミン化合物６とグリセロールの併用について、α−グルコシダーゼに対する凍結変性抑制効果について評価した。具体的には、０．５ｍＬのプラスチックチューブに、前記参考試験例１で準備した酵素ストック溶液を０．５μＬ加え、更にアミン化合物６を終濃度で０．１ｍＭ又は１ｍＭ、ＤＭＳＯを１Ｍ、グリセロールを終濃度で１Ｍ、アミン化合物６を終濃度で０．１ｍＭ且つＤＭＳＯを終濃度で１Ｍ、又はアミン化合物６を終濃度で０．１ｍＭ且つグリセロールを終濃度で１Ｍとなるように添加し、最後に、総量が１００μＬになるようにリン酸緩衝溶液を加え、酵素凍結保存液を調製した。この酵素凍結保存液を用いて、前記参考試験例１と同様の条件で凍結・解凍を１２回繰り返し、α−グルコシダーゼの活性比を測定した。また、コントロールとして、凍結変性抑制剤を添加しない条件でも、同様に試験を行った。
【０１０５】
得られた結果を図８及び９に示す。この結果から、アミン化合物６（０．１ｍＭ又は１ｍＭ）とグリセロール又はＤＭＳＯ（１Ｍ）を併用すると、アミン化合物６単独、ＤＭＳＯ単独、又はグリセロール単独の場合と比較して、凍結変性抑制効果が向上し得ることが明らかとなった。即ち、本結果から、本発明の凍結変性抑制剤は、凍結変性抑制作用を示す他の化合物と併用しても使用できることが確認された。
【０１０６】
実施例６：一般式（１）のアミン化合物のα−グルコシダーゼ以外の酵素に対する凍結変性抑制効果
アミン化合物が、α−グルコシダーゼ以外の酵素に対する凍結変性抑制効果を検討するために、アミン化合物５を用いて、乳酸脱水素酵素、アルカリフォスファターゼ、ぺルオキシダーゼ、スルファターゼ及びβ−グルコシダーゼに対する凍結変性抑制効果について、以下の方法で評価した。
【０１０７】
＜アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）＞
５．０ｍｇの乳酸脱水素酵素（Ｃａｌｆ  ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ由来）（型番３０９-５０９７１、和光純薬製）（液体）を計り取り、１００ｍＭのトリス緩衝溶液１ｍＬに溶解させ、５．０ｍｇ／ｍＬの酵素ストック溶液を調製した。０．５ｍＬのプラスチックチューブに、前記酵素ストック溶液を０．５μＬ、アミン化合物５が終濃度で３００ｍＭとなるように加え、更に総量が１００μＬになるように１０００ｍＭのトリス緩衝溶液を加え、酵素凍結保存液を調製した。この酵素凍結保存液を用いて、前記参考試験例１と同様の条件で凍結・解凍を１２回繰り返し、アルカリフォスファターゼの活性比（凍結・解凍後の加水分解速度／凍結・解凍前の加水分解速度）を測定した。また、コントロールとして、アミン化合物５を添加しない条件でも、同様に試験を行った。なお、アルカリフォスファターゼの加水分解速度の測定は、酵素反応溶液（１００ｍＭ  トリス酸緩衝溶液（ｐＨ７．５）、２．０ｍＭ  α−ｐ−ニトロフェニル−Ｄ−グルコピラノシド、２．５×１０-4ｍｇ／ｍＬ  アルカリフォスファターゼ）を用いて３７℃で行った。
【０１０８】
＜乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）＞
５．０ｍｇの乳酸脱水素酵素（Ｃｈｉｃｋｅｎ ｈｅａｒｔ由来）（型番３０５-５１４３１、和光純薬製）（粉末）を計り取り、８０ｍＭのトリス緩衝溶液１ｍＬに溶解させ、５．０ｍｇ／ｍＬの酵素ストック溶液を調製した。０．５ｍＬのプラスチックチューブに、前記酵素ストック溶液を５．０μＬ加え、アミン化合物５が終濃度で３００ｍＭとなるように加え、更に総量が１００μＬになるように８０ｍＭのトリス緩衝溶液を加え、酵素凍結保存液を調製した。この酵素凍結保存液を用いて、前記参考試験例１と同様の条件で凍結・解凍を１２回繰り返し、乳酸脱水素酵素の活性比を測定した。また、コントロールとして、アミン化合物５を添加しない条件でも、同様に試験を行った。なお、乳酸脱水素酵素の酵素活性は、ＮＡＤＨ（型番３０５-５０４５１、和光純薬製）とピルビン酸（型番１６２-０５５５３、和光純薬製）を用いた酸化還元反応における反応速度比（活性比）（凍結・解凍後の反応速度／凍結・解凍前の反応速度）から算出した。ＮＡＤＨは２６０ｎｍと３４０ｎｍに極大吸収波長を持ち、乳酸脱水素酵素によってＮＡＤＨとピルビン酸からＮＡＤ+と乳酸に酸化還元される。ＮＡＤ+は３４０ｎｍの波長を吸収しないため、３４０ｎｍのＮＡＤＨのモル吸光係数ε（ｐＨ７．０、３７℃）である６０１９Ｍ-1ｃｍ-1を利用すれば、酸化反応によって生成するＮＡＤ+の濃度を見積もることができ、反応速度を算出することができる。  酸化還元反応の測定は、酵素反応溶液（８０ｍＭ  トリス酸緩衝溶液（ｐＨ７．５）、１．５ｍＭ  ＮＡＤＨ、２.０ｍＭ  ピルビン酸、１．２５×１０-3ｍｇ／ｍＬ  乳酸脱水素酵素）を用いて、３７℃で行った。
【０１０９】
＜ぺルオキシダーゼ（ＨＲＰ）＞
５．０ｍｇのぺルオキシダーゼ（西洋わさび由来）（型番１６５-１０７９３、和光純薬製）（粉末）を計り取り、１００ｍＭの酢酸緩衝溶液（ｐＨ４．２）１ｍＬに溶解させ、５．０ｍｇ／ｍＬの酵素ストック溶液を調製した。０．５ｍＬのプラスチックチューブに、前記酵素ストック溶液を０．５μＬ、アミン化合物５が終濃度で３００ｍＭとなるように加え、更に総量が１００μＬになるように１００ｍＭの酢酸緩衝溶液を加え、酵素凍結保存液を調製した。この酵素凍結保存液を用いて、前記参考試験例１と同様の条件で凍結・解凍を１２回繰り返し、ぺルオキシダーゼの活性比（凍結・解凍後の加水分解速度／凍結・解凍前の加水分解速度）を測定した。また、コントロールとして、アミン化合物５を添加しない条件でも、同様に試験を行った。なお、ぺルオキシダーゼの加水分解速度の測定は、酵素反応溶液（１０ｍＭ  酢酸緩衝溶液（ｐＨ４．２）、０．２ｍＭ  ＡＢＴＳ、２０ｍＭ  Ｈ2Ｏ2、５．０×１０-6ｍｇ／ｍＬ  ぺルオキシダーゼ）を用いて３７℃で行った。※モル吸光係数２５０００Ｍ-1ｃｍ-1
【０１１０】
＜スルファターゼ＞
５．０ｍｇのスルファターゼ（Ｈｅｌｉｘ  ｐｏｍａｔｉａ由来）（型番Ｓ９６２６−１０ＫＵ、ＳＩＧＭＡ）（粉末）を計り取り、１００ｍＭのリン酸緩衝溶液１ｍＬに溶解させ、５．０ｍｇ／ｍＬの酵素ストック溶液を調製した。０．５ｍＬのプラスチックチューブに、前記酵素ストック溶液を０．５μＬ、アミン化合物５が終濃度で３００ｍＭとなるように加え、更に総量が１００μＬになるように１００ｍＭのリン酸緩衝溶液を加え、酵素凍結保存液を調製した。この酵素凍結保存液を用いて、前記参考試験例１と同様の条件で凍結・解凍を１２回繰り返し、スルファターゼの活性比（凍結・解凍後の加水分解速度／凍結・解凍前の加水分解速度）を測定した。また、コントロールとして、アミン化合物５を添加しない条件でも、同様に試験を行った。なお、スルファターゼの加水分解速度の測定は、酵素反応溶液（１００ｍＭ  リン酸緩衝溶液（ｐＨ７．０）、２．０ｍＭ  Ｐｏｔｔａｓｉｕｍ  ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌｓｕｌｆａｔｅ、８．３×１０-3ｍｇ／ｍＬ  スルファターゼ）を用いて３７℃で行った。
【０１１１】
＜β−グルコシダーゼ＞
５．０ｍｇのβ−グルコシダーゼ（Ａｌｍｏｎｄ由来）（型番４６３６１００３、オリエンタル酵母）（粉末）を計り取り、１００ｍＭのリン酸緩衝溶液１ｍＬに溶解させ、５．０ｍｇ／ｍＬの酵素ストック溶液を調製した。０．５ｍＬのプラスチックチューブに、前記酵素ストック溶液を０．５μＬ、アミン化合物５が終濃度で３００ｍＭとなるように加え、更に総量が１００μＬになるように１００ｍＭのリン酸緩衝溶液を加え、酵素凍結保存液を調製した。この酵素凍結保存液を用いて、前記参考試験例１と同様の条件で凍結・解凍を１２回繰り返し、β−グルコシダーゼの活性比（凍結・解凍後の加水分解速度／凍結・解凍前の加水分解速度）を測定した。また、コントロールとして、アミン化合物５を添加しない条件でも、同様に試験を行った。なお、β−グルコシダーゼの加水分解速度の測定は、酵素反応溶液（１００ｍＭ  リン酸緩衝溶液（ｐＨ７．０）、２．０ｍＭ  β−ｐ−ニトロフェニル−Ｄ−グルコピラノシド、１．０×１０-3ｍｇ／ｍＬ  β−グルコシダーゼ）を用いて３７℃で行った。
【０１１２】
得られた結果を図１０に示す。この結果から、アミン化合物５を添加した場合では、乳酸脱水素酵素、アルカリフォスファターゼ、ぺルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、β−グルコシダーゼ及びスルファターゼに対しても高い活性比を維持しており、被凍結物の種類によらず、各種タンパク質に対して優れた凍結変性抑制効果を奏することが明らかとなった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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