(57)【要約】【課題】ＨＬＡ−Ａ*０２グループのタイピングを、アンビギュイティが少なく、かつ簡便に判定するための方法の提供。【解決手段】ＨＬＡ−Ａ*０２グループを判定する方法であって、被験者のゲノムＤＮＡ中の、ＨＬＡ遺伝子の開始コドンのＡ（アデニン）を第１番目として、（ａ）第２０８番目の塩基、（ｂ）第２２８番目の塩基、（ｃ）第２７４番目の塩基、（ｄ）第７２６番目の塩基、（ｅ）第７３９番目の塩基、及び（ｆ）第７８４番目の塩基からなる群より選択される１以上の塩基のタイピング結果に基づいて判定することを特徴とする、ＨＬＡ−Ａ*０２グループの判定方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＬＡ−Ａ*０２グループを判定する方法であって、
被験者のゲノムＤＮＡ中の、ＨＬＡ遺伝子の開始コドンのＡ（アデニン）を第１番目として、（ａ）第２０８番目の塩基、（ｂ）第２２８番目の塩基、（ｃ）第２７４番目の塩基、（ｄ）第７２６番目の塩基、（ｅ）第７３９番目の塩基、及び（ｆ）第７８４番目の塩基からなる群より選択される１以上の塩基のタイピング結果に基づいて判定することを特徴とする、ＨＬＡ−Ａ*０２グループの判定方法。
【請求項２】
前記被験者のＨＬＡ型がＨＬＡ−Ａ*０２：０１であるか否かを判定する、請求項１に記載のＨＬＡ−Ａ*０２グループの判定方法。
【請求項３】
少なくとも１のアリルにおいて、（ｂ）第２２８番目の塩基がＴ（チミン）であり、（ｅ）第７３９番目の塩基がＡ（アデニン）であり、さらに、（ａ）第２０８番目の塩基がＴ、又は（ｃ）第２７４番目の塩基がＡ、又は（ｄ）第７２６番目の塩基がＧ（グアニン）、又は（ｆ）第７８４番目の塩基がＡである場合に、前記被験者のＨＬＡ型はＨＬＡ−Ａ*０２：０１であると判定する、請求項２に記載のＨＬＡ−Ａ*０２グループの判定方法。
【請求項４】
前記被験者のＨＬＡ型がＨＬＡ−Ａ*０２：０６であるか否かを判定する、請求項１に記載のＨＬＡ−Ａ*０２グループの判定方法。
【請求項５】
少なくとも１のアリルにおいて、（ｂ）第２２８番目の塩基がＡであり、（ｅ）第７３９番目の塩基がＡであり、さらに、（ａ）第２０８番目の塩基がＴ、又は（ｃ）第２７４番目の塩基がＡ、又は（ｄ）第７２６番目の塩基がＧ、又は（ｆ）第７８４番目の塩基がＡである場合に、前記被験者のＨＬＡ型はＨＬＡ−Ａ*０２：０６であると判定する、請求項４に記載のＨＬＡ−Ａ*０２グループの判定方法。
【請求項６】
前記被験者のＨＬＡ型がＨＬＡ−Ａ*０２：０７であるか否かを判定する、請求項１に記載のＨＬＡ−Ａ*０２グループの判定方法。
【請求項７】
少なくとも１のアリルにおいて、（ｂ）第２２８番目の塩基がＴであり、（ｅ）第７３９番目の塩基がＧであり、さらに、（ａ）第２０８番目の塩基がＴ、又は（ｃ）第２７４番目の塩基がＡ、又は（ｄ）第７２６番目の塩基がＧ、又は（ｆ）第７８４番目の塩基がＡである場合に、前記被験者のＨＬＡ型はＨＬＡ−Ａ*０２：０７であると判定する、請求項６に記載のＨＬＡ−Ａ*０２グループの判定方法。
【請求項８】
前記（ａ）〜（ｆ）のいずれかの塩基のタイピングを、シークエンス解析又は一塩基検出方法により行う、請求項１〜７のいずれか一項に記載のＨＬＡ−Ａ*０２グループの判定方法。
【請求項９】
３’末端が配列番号３に示す塩基配列からなるプライマーと３’末端が配列番号４に示す塩基配列からなるプライマーを用いたポリメラーゼによる伸長反応により得られた伸長産物に対して前記（ａ）〜（ｃ）のいずれかの塩基のタイピングを行う、又は
３’末端が配列番号５に示す塩基配列からなるプライマーと３’末端が配列番号６に示す塩基配列からなるプライマーを用いたポリメラーゼによる伸長反応により得られた伸長産物に対して前記（ｄ）〜（ｆ）のいずれかの塩基のタイピングを行う、請求項１〜８のいずれか一項に記載のＨＬＡ−Ａ*０２グループの判定方法。
【請求項１０】
３’末端が配列番号７〜１０に示す塩基配列からなるプライマーを用いたポリメラーゼによる伸長反応を行い、伸長産物が得られた場合には、前記（ａ）第２０８番目の塩基がＴであり、前記（ｃ）第２７４番目の塩基がＡであり、前記（ｄ）第７２６番目の塩基がＧであり、前記（ｆ）第７８４番目の塩基がＡであるとタイピングし、さらに当該伸長産物に対して前記（ｂ）第２２８番目の塩基及び前記（ｅ）第７３９番目の塩基のタイピングを行う、請求項１〜８のいずれか一項に記載のＨＬＡ−Ａ*０２グループの判定方法。
【請求項１１】
３’末端が配列番号３〜１０のいずれかに示す塩基配列からなるＨＬＡ−Ａ*０２グループの判定用プライマーを少なくとも１つ含むことを特徴とするＨＬＡ−Ａ*０２グループの判定用キット。
【請求項１２】
３’末端が配列番号３に示す塩基配列からなるプライマーと、３’末端が配列番号４に示す塩基配列からなるプライマーと、３’末端が配列番号５に示す塩基配列からなるプライマーと、３’末端が配列番号６に示す塩基配列からなるプライマーとを含む、請求項１１に記載のＨＬＡ−Ａ*０２グループの判定用キット。
【請求項１３】
３’末端が配列番号７に示す塩基配列からなるプライマーと、３’末端が配列番号８に示す塩基配列からなるプライマーと、３’末端が配列番号９に示す塩基配列からなるプライマーと、３’末端が配列番号１０に示す塩基配列からなるプライマーとを含み、
被験者のゲノムＤＮＡを鋳型とした前記４種のプライマーを用いたポリメラーゼによる伸長反応により、伸長産物が得られた場合に、前記被験者の（ａ）第２０８番目の塩基がＴであり、（ｃ）第２７４番目の塩基がＡであり、（ｄ）第７２６番目の塩基がＧであり、（ｆ）第７８４番目の塩基がＡであるとタイピングし、かつ当該伸長産物について（ｂ）第２２８番目の塩基及び（ｅ）第７３９番目の塩基をタイピングするために用いられる、請求項１１に記載のＨＬＡ−Ａ*０２グループの判定用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＨＬＡ型がＨＬＡ−Ａ*０２グループか否かを判定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＨＬＡ（Ｈｕｍａｎ  Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ａｎｔｉｇｅｎ）は、第６染色体短腕部に存在するＭＨＣ(Ｍａｊｏｒ  Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  Ｃｏｍｐｌｅｘ) 領域にコードされた遺伝子群の遺伝子産物である。ＨＬＡは非常に多様性に富んでおり、特に造血幹細胞の移植や輸血等の医療現場においては、ＨＬＡの適合度を向上させることが重要である。このため、できるだけ少ない労力で正確なＨＬＡタイピングを行うことが、医療現場で要求されている。
【０００３】
ＨＬＡタイピングの方法は、血清学的タイピング方法とＤＮＡタイピング方法とに大別される。ＤＮＡタイピング方法では、血清学的タイピング方法と比較して詳細にＨＬＡ型を特定できる。但し、ＤＮＡタイピングの方法でも、ＤＮＡタイピング結果では判別出来ないアリルが２種類以上存在し、正確にＨＬＡ型を特定することができない、というアンビギュイティ（Ａｍｂｉｇｕｉｔｙ）の問題が生じる場合がある。
【０００４】
例えば、特許文献１には、ＨＬＡ−Ａ抗原のサブタイプ（型）を遺伝子レベルでタイピングする方法が開示されている。具体的には、ＨＬＡ−Ａ対立遺伝子（アリル）を特定のグループに分類し、各グループのＨＬＡ−Ａアリルを特異的に増幅可能なプライマーを用いてＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物に対してＲＦＬＰ法、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法、ＳＳＯＰ法、ＰＣＲ−ＳＳＯＰ法、ＰＣＲ−ＳＳＰ法又はＰＣＲ−ＳＳＣＰ法を行うことにより、ＨＬＡ−Ａ型をタイピングする。当該方法のように多段階のアッセイによって、アンビギュイティを解消し、ＨＬＡ−Ａ型を詳細にタイピングできることが期待されるが、多大な労力を有する、という問題がある。
【０００５】
また、ＨＬＡ型の分布は人種によって異なっている。日本赤十字社の中央骨髄データセンターによる骨髄提供希望登録者２６３０１６人のＨＬＡ型遺伝子頻度のタイピング結果（２０１２年１０月４日現在）における、上位４３位までのアリルタイプとその遺伝子頻度を表１に、ＨＬＡ−Ａ*０２グループの遺伝子頻度を表２に、それぞれ示す（非特許文献１参照。）。表１及び２に示すように、日本人では、ＨＬＡ−Ａ型のうちＨＬＡ−Ａ*０２グループの遺伝子頻度は、２４．３８５％と高い。この中でも頻度の高いＨＬＡ−Ａ*０２：０１型、ＨＬＡ−Ａ*０２：０６型、ＨＬＡ−Ａ*０２：０７型を区別してタイピングできることが求められる。
【０００６】
【表１】
2014150767.tif 000002
【０００７】
【表２】
2014150767.tif 000003
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開平１１−２１６０００号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】“ＨＬＡ−Ａ遺伝子頻度” ［ｏｎ ｌｉｎｅ］、日本赤十字社の中央骨髄データセンター、［平成２４年１０月０４日検索］、インターネット<URL: http://www.bmdc.jrc.or.jp/GF-A.pdf>
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、ＨＬＡ−Ａ*０２グループのタイピングを、アンビギュイティが少なく、かつ簡便に判定するための方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、ＨＬＡ遺伝子の開始コドンのＡ（アデニン）を第１番目として、（ａ）第２０８番目の塩基、（ｂ）第２２８番目の塩基、（ｃ）第２７４番目の塩基、（ｄ）第７２６番目の塩基、（ｅ）第７３９番目の塩基、及び（ｆ）第７８４番目の塩基からなる群より選択される１以上の塩基のタイピング結果に基づくことにより、非常に少ない工程で、アンビギュイティを充分に少なくして高精度に、ＨＬＡ−Ａ*０２グループのアリルを判定できることを見出し、本発明を完成させた。
【００１２】
すなわち、本発明に係るＨＬＡ−Ａ*０２グループを判定する方法及びＨＬＡ−Ａ*０２グループの判定用キットは、下記（１）〜（１０）である。
（１）  ＨＬＡ−Ａ*０２グループを判定する方法であって、
被験者のゲノムＤＮＡ中の、ＨＬＡ遺伝子の開始コドンのＡ（アデニン）を第１番目として、（ａ）第２０８番目の塩基、（ｂ）第２２８番目の塩基、（ｃ）第２７４番目の塩基、（ｄ）第７２６番目の塩基、（ｅ）第７３９番目の塩基、及び（ｆ）第７８４番目の塩基からなる群より選択される１以上の塩基のタイピング結果に基づいて判定することを特徴とする、ＨＬＡ−Ａ*０２グループの判定方法。
（２）  前記被験者のＨＬＡ型がＨＬＡ−Ａ*０２：０１であるか否かを判定する、前記（１）のＨＬＡ−Ａ*０２グループの判定方法。
（３）  少なくとも１のアリルにおいて、（ｂ）第２２８番目の塩基がＴ（チミン）であり、（ｅ）第７３９番目の塩基がＡ（アデニン）であり、さらに、（ａ）第２０８番目の塩基がＴ、又は（ｃ）第２７４番目の塩基がＡ、又は（ｄ）第７２６番目の塩基がＧ（グアニン）、又は（ｆ）第７８４番目の塩基がＡである場合に、前記被験者のＨＬＡ型はＨＬＡ−Ａ*０２：０１であると判定する、前記（２）のＨＬＡ−Ａ*０２グループの判定方法。
（４）  前記被験者のＨＬＡ型がＨＬＡ−Ａ*０２：０６であるか否かを判定する、前記（１）のＨＬＡ−Ａ*０２グループの判定方法。
（５）  少なくとも１のアリルにおいて、（ｂ）第２２８番目の塩基がＡであり、（ｅ）第７３９番目の塩基がＡであり、さらに、（ａ）第２０８番目の塩基がＴ、又は（ｃ）第２７４番目の塩基がＡ、又は（ｄ）第７２６番目の塩基がＧ、又は（ｆ）第７８４番目の塩基がＡである場合に、前記被験者のＨＬＡ型はＨＬＡ−Ａ*０２：０６であると判定する、前記（４）のＨＬＡ−Ａ*０２グループの判定方法。
（６）  前記被験者のＨＬＡ型がＨＬＡ−Ａ*０２：０７であるか否かを判定する、前記（１）のＨＬＡ−Ａ*０２グループの判定方法。
（７）  少なくとも１のアリルにおいて、（ｂ）第２２８番目の塩基がＴであり、（ｅ）第７３９番目の塩基がＧであり、さらに、（ａ）第２０８番目の塩基がＴ、又は（ｃ）第２７４番目の塩基がＡ、又は（ｄ）第７２６番目の塩基がＧ、又は（ｆ）第７８４番目の塩基がＡである場合に、前記被験者のＨＬＡ型はＨＬＡ−Ａ*０２：０７であると判定する、前記（６）のＨＬＡ−Ａ*０２グループの判定方法。
（８）  前記（ａ）〜（ｆ）のいずれかの塩基のタイピングを、シークエンス解析又は一塩基検出方法により行う、前記（１）〜（７）のいずれかのＨＬＡ−Ａ*０２グループの判定方法。
（９）  ３’末端が配列番号３に示す塩基配列からなるプライマーと３’末端が配列番号４に示す塩基配列からなるプライマーを用いたポリメラーゼによる伸長反応により得られた伸長産物に対して前記（ａ）〜（ｃ）のいずれかの塩基のタイピングを行う、又は３’末端が配列番号５に示す塩基配列からなるプライマーと３’末端が配列番号６に示す塩基配列からなるプライマーを用いたポリメラーゼによる伸長反応により得られた伸長産物に対して前記（ｄ）〜（ｆ）のいずれかの塩基のタイピングを行う、前記（１）〜（８）のいずれかのＨＬＡ−Ａ*０２グループの判定方法。
（１０）  ３’末端が配列番号７〜１０に示す塩基配列からなるプライマーを用いたポリメラーゼによる伸長反応を行い、伸長産物が得られた場合には、前記（ａ）第２０８番目の塩基がＴであり、前記（ｃ）第２７４番目の塩基がＡであり、前記（ｄ）第７２６番目の塩基がＧであり、前記（ｆ）第７８４番目の塩基がＡであるとタイピングし、さらに当該伸長産物に対して前記（ｂ）第２２８番目の塩基及び前記（ｅ）第７３９番目の塩基のタイピングを行う、前記（１）〜（８）のいずれかのＨＬＡ−Ａ*０２グループの判定方法。
（１１）  ３’末端が配列番号３〜１０に示す塩基配列からなるＨＬＡ−Ａ*０２グループの判定用プライマーを少なくとも１つ含むことを特徴とするＨＬＡ−Ａ*０２グループの判定用キット。
（１２）  ３’末端が配列番号３に示す塩基配列からなるプライマーと、３’末端が配列番号４に示す塩基配列からなるプライマーと、３’末端が配列番号５に示す塩基配列からなるプライマーと、３’末端が配列番号６に示す塩基配列からなるプライマーとを含む、前記（１１）のＨＬＡ−Ａ*０２グループの判定用キット。
（１３）  ３’末端が配列番号７に示す塩基配列からなるプライマーと、３’末端が配列番号８に示す塩基配列からなるプライマーと、３’末端が配列番号９に示す塩基配列からなるプライマーと、３’末端が配列番号１０に示す塩基配列からなるプライマーとを含み、被験者のゲノムＤＮＡを鋳型とした前記４種のプライマーを用いたポリメラーゼによる伸長反応により、伸長産物が得られた場合に、前記被験者の（ａ）第２０８番目の塩基がＴであり、（ｃ）第２７４番目の塩基がＡであり、（ｄ）第７２６番目の塩基がＧであり、（ｆ）第７８４番目の塩基がＡであるとタイピングし、かつ当該伸長産物について（ｂ）第２２８番目の塩基及び（ｅ）第７３９番目の塩基をタイピングするために用いられる、前記（１１）のＨＬＡ−Ａ*０２グループの判定用キット。
【発明の効果】
【００１３】
本発明に係るＨＬＡ−Ａ*０２グループの判定方法により、ＨＬＡ−Ａ*０２グループのタイピングを精度よくかつより簡便に判定することができる。本発明に係るＨＬＡ−Ａ*０２グループの判定方法は、特に日本人において遺伝子頻度の高いＨＬＡ−Ａ*０２グループのアリルを高精度に判定できるため、被験者が日本人である場合の判定に特に好適である。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１Ａ】ＨＬＡ−Ａ*０２：０１遺伝子のゲノムＤＮＡの塩基配列中、ＨＬＡ遺伝子の開始コドンのＡを第１番目として、−３００番目の塩基から６００番目の塩基までを示した図である。
【図１Ｂ】ＨＬＡ−Ａ*０２：０１遺伝子のゲノムＤＮＡの塩基配列中、ＨＬＡ遺伝子の開始コドンのＡを第１番目として、６０１番目の塩基から１５００番目の塩基までを示した図である。
【図１Ｃ】ＨＬＡ−Ａ*０２：０１遺伝子のゲノムＤＮＡの塩基配列中、ＨＬＡ遺伝子の開始コドンのＡを第１番目として、１５０１番目の塩基から２４００番目の塩基までを示した図である。
【図１Ｄ】ＨＬＡ−Ａ*０２：０１遺伝子のゲノムＤＮＡの塩基配列中、ＨＬＡ遺伝子の開始コドンのＡを第１番目として、２４０１番目の塩基から３５１７番目の塩基までを示した図である。
【図２】ＨＬＡ−Ａ*０２：０１遺伝子のゲノムＤＮＡの第２エキソン中の第２０８番目の塩基（図中、「（ａ）」）及びその付近、第２２８番目の塩基（図中、「（ｂ）」）及びその付近、第２７４番目の塩基（図中、「（ｃ）」）及びその付近、第７２６番目の塩基（図中、「（ｄ）」）及びその付近、第７３９番目の塩基（図中、「（ｅ）」）及びその付近、第７８４番目の塩基（図中、「（ｆ）」）及びその付近の各アリルの塩基配列を示した図である。
【図３】（ａ）〜（ｆ）の塩基のタイピング方法の一態様を模式的に示した図である。
【図４】（ａ）〜（ｆ）の塩基のタイピング方法の一態様を模式的に示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明及び本願明細書において、「塩基をタイピングする」とは、当該塩基が、Ａ（アデニン）であるか、Ｇ（グアニン）であるか、Ｃ（シトシン）であるか。Ｔ（チミン）であるかを特定することを意味する。
【００１６】
本発明に係るＨＬＡ−Ａ*０２グループの判定方法（以下、「本発明の判定方法」ということがある。）は、ＨＬＡ−Ａ*０２グループのアリルを判定する方法であって、被験者のゲノムＤＮＡ中の、ＨＬＡ遺伝子の開始コドンのＡを第１番目として、（ａ）第２０８番目の塩基、（ｂ）第２２８番目の塩基、（ｃ）第２７４番目の塩基、（ｄ）第７２６番目の塩基、（ｅ）第７３９番目の塩基、及び（ｆ）第７８４番目の塩基からなる群より選択される１以上の塩基のタイピング結果に基づいて判定することを特徴とする。
【００１７】
図１に、ＨＬＡ−Ａ*０２：０１遺伝子のゲノムＤＮＡの塩基配列（配列番号１）を示す。図１Ａ〜Ｄ中、四角で囲われた領域がコーディング領域であり、各塩基の番号は、ＨＬＡ−Ａ*０２：０１遺伝子の開始コドンのＡを第１番目として振られている。第２０８番目の塩基（Ｔ）、第２２８番目の塩基（Ｔ）、第２７４番目の塩基（Ａ）、第７２６番目の塩基（Ｇ）、第７３９番目の塩基（Ａ）、第７８４番目の塩基（Ａ）は、網掛けしている。また、配列番号２に、ＨＬＡ−Ａ*０２：０１遺伝子のコーディング領域の塩基配列と対応するアミノ酸配列を示す。
【００１８】
これらの塩基は、いずれも第２エキソン及び第３エキソンに存在する。図２に、第２エキソン中の第２０８番目の塩基（図中、「（ａ）」）及びその付近、第２２８番目の塩基（図中、「（ｂ）」）及びその付近、第２７４番目の塩基（図中、「（ｃ）」）及びその付近、第３エキソン中の第７２６番目の塩基（図中、「（ｄ）」）及びその付近、第７３９番目の塩基（図中、「（ｅ）」）及びその付近、第７８４番目の塩基（図中、「（ｆ）」）及びその付近の各アリルの塩基配列を示す。図中の各アリルの塩基において、「−」はＨＬＡ−Ａ*０２：０１と相同な（同種の）塩基であることを示す。
【００１９】
ＨＬＡ−Ａのアリルの多くは、複数の多型の組み合わせに係るものであるため、アリル中の他のアリルと異なる部位（多型部位）の一部分のみをタイピングした場合には、複数のアリルを互いに判別することが難しい。ある特定のアリルの判定を目的とする検査を行う場合、アンビギュイティが発生していると、実際には目的のアリルではないアリルであっても、当該目的のアリルである、と判定されてしまう（偽陽性）。アンビギュイティを全て解消することによりこの偽陽性の問題を解消し得るが、アンビギュイティを全て解消するためには非常に多数の塩基をタイピングする必要があり、検査コストが過大となる。つまり、ＨＬＡ判定方法を臨床検査等の医療現場に適用するためには、検査精度とコストのバランスを図ることが重要となる。
【００２０】
本発明の判定方法では、ＨＬＡ−Ａ*０２グループを判定するために、遺伝子頻度を加味してアンビギュイティによる偽陽性の発生確率をできるだけ小さくし、かつタイピングすべき塩基の数も最小限にするように、タイピングに用いる塩基を特定している。つまり、本発明の判定方法は、ＨＬＡ−Ａ*０２グループの判定精度が高く、かつ検査コストの点からも優れているため、臨床検査等にも好適である。
【００２１】
各アリルの日本人における遺伝子頻度及び前記（ａ）〜（ｆ）の塩基を表３に示す。被験者の少なくとも１のアリルにおいて、これらの塩基がいずれもＨＬＡ−Ａ*０２：０１と同じである場合、すなわち、（ａ）第２０８番目の塩基がＴであり、（ｂ）第２２８番目の塩基がＴであり、（ｃ）第２７４番目の塩基Ａであり、（ｄ）第７２６番目の塩基がＧであり、（ｅ）第７３９番目の塩基がＡであり、（ｆ）第７８４番目の塩基がＡである場合には、前記被験者のＨＬＡ型はＨＬＡ−Ａ*０２：０１であると判定される。同様に、被験者の少なくとも１のアリルにおいて、これらの塩基がいずれもＨＬＡ−Ａ*０２：０６又はＨＬＡ−Ａ*０２：０７と同じである場合、前記被験者のＨＬＡ型はＨＬＡ−Ａ*０２：０６又はＨＬＡ−Ａ*０２：０７であると判定される。
【００２２】
【表３】
2014150767.tif 000004
【００２３】
なお、前記（ａ）〜（ｆ）の塩基はＨＬＡ−Ａ*０２：０１、ＨＬＡ−Ａ*０２：０６、及びＨＬＡ−Ａ*０２：０７を特徴づける塩基であり、タイピング結果によって、ＨＬＡ−Ａ型のうちのアリル頻度が０．００１％以下で存在するアリルとＨＬＡ−Ａ*０２：０１、ＨＬＡ−Ａ*０２：０６、又はＨＬＡ−Ａ*０２：０７とを区別できる塩基である。そこで、ＨＬＡ遺伝子中の前記（ａ）〜（ｆ）の塩基以外のＨＬＡ−Ａ*０２：０１、ＨＬＡ−Ａ*０２：０６、又はＨＬＡ−Ａ*０２：０７を特徴づける塩基のタイピング結果、特にアリル頻度が０．００１％以下で存在するその他ＨＬＡ−ＡグループのアリルとＨＬＡ−Ａ*０２：０１、ＨＬＡ−Ａ*０２：０６、及びＨＬＡ−Ａ*０２：０７とを区別できる塩基のタイピング結果に基づくことによっても、被験者のＨＬＡ型がＨＬＡ−Ａ*０２：０１か否か、ＨＬＡ−Ａ*０２：０６か否か、又はＨＬＡ−Ａ*０２：０７か否かを判定できる。
【００２４】
本発明の判定方法においては、被験者のＨＬＡ型がＨＬＡ−Ａ*０２：０１であるか否かを判定することが好ましい。ＨＬＡ−Ａ*０２：０１の判定基準としては、少なくとも１のアリルにおいて、（ｂ）第２２８番目の塩基がＴであり、（ｅ）第７３９番目の塩基がＡであり、さらに、（ａ）第２０８番目の塩基がＴ、又は（ｃ）第２７４番目の塩基がＡ、又は（ｄ）第７２６番目の塩基がＧ、又は（ｆ）第７８４番目の塩基がＡである場合に、前記被験者のＨＬＡ型はＨＬＡ−Ａ*０２：０１であると判定することが好ましい。当該判定基準により、ＨＬＡ−Ａ*０２：０１をアンビギュイティが少なく、高精度に判定することができる。
【００２５】
被験者のゲノムＤＮＡに含まれるＨＬＡ遺伝子中の前記（ａ）〜（ｆ）の塩基をタイピングし、得られたタイピング結果について当該被験者のＨＬＡ−Ａ型を前記ＨＬＡ−Ａ*０２：０１の判定基準に基づいて判定した場合の判定結果と、実際の遺伝子型とを、遺伝子頻度と共に表４及び５に示す。表４及び５中、「ＨＬＡ−」欄はアリルタイプ（ＨＬＡ−Ａ型）を示し、「タイプ」欄の「＋」はＨＬＡ−Ａ*０２：０１のアリルを含むゲノムＤＮＡを、「−」はＨＬＡ−Ａ*０２：０１のアリルを含まないゲノムＤＮＡを示す。「判定基準」欄の「＋」は被験者のゲノムＤＮＡがＨＬＡ−Ａ*０２：０１を含むと判定することを、「−」は被験者のゲノムＤＮＡがＨＬＡ−Ａ*０２：０１を含まないと判定することを示す。さらに、「タイプ」欄と「判定」欄が一致する場合に「正誤」欄を「○」とし、不一致の場合に「×」とした。「遺伝子頻度」は、各アリルの遺伝子頻度の積とした。表４及び５に示すように、前記ＨＬＡ−Ａ*０２：０１の判定基準により、アレルがＡ＊０２：０６とＡ＊０１：０１／０３：０１である被験者を除き、被験者のゲノムＤＮＡがＨＬＡ−Ａ*０２：０１を含むか否かを高精度に判断することができる。
【００２６】
【表４】
2014150767.tif 000005
【００２７】
【表５】
2014150767.tif 000006
【００２８】
本発明の判定方法においては、被験者のＨＬＡ型がＨＬＡ−Ａ*０２：０６であるか否かを判定することが好ましい。ＨＬＡ−Ａ*０２：０６の判定基準としては、少なくとも１のアリルにおいて、（ｂ）第２２８番目の塩基がＡであり、（ｅ）第７３９番目の塩基がＡであり、さらに、（ａ）第２０８番目の塩基がＴ、又は（ｃ）第２７４番目の塩基がＡ、又は（ｄ）第７２６番目の塩基がＧ、又は（ｆ）第７８４番目の塩基がＡである場合に、前記被験者のＨＬＡ型はＨＬＡ−Ａ*０２：０６であると判定することが好ましい。当該判定基準により、ＨＬＡ−Ａ*０２：０６をアンビギュイティが少なく、高精度に判定することができる。
【００２９】
被験者のゲノムＤＮＡに含まれるＨＬＡ遺伝子中の前記（ａ）〜（ｆ）の塩基をタイピングし、得られたタイピング結果について当該被験者のＨＬＡ−Ａ型を前記ＨＬＡ−Ａ*０２：０６の判定基準に基づいて判定した場合の判定結果と、実際の遺伝子型とを、遺伝子頻度と共に表６及び７に示す。表６及び７中、「ＨＬＡ−」欄、「タイプ」欄、「判定基準」欄、「正誤」欄、及び「遺伝子頻度」欄は、表４と同様である。表６及び７に示すように、前記ＨＬＡ−Ａ*０２：０６の判定基準により、アレルがＡ＊０２：０１とＡ＊１１：０１である被験者を除き、被験者のゲノムＤＮＡがＨＬＡ−Ａ*０２：０６を含むか否かを高精度に判断することができる。
【００３０】
【表６】
2014150767.tif 000007
【００３１】
【表７】
2014150767.tif 000008
【００３２】
本発明の判定方法においては、被験者のＨＬＡ型がＨＬＡ−Ａ*０２：０７であるか否かを判定することが好ましい。ＨＬＡ−Ａ*０２：０７の判定基準としては、少なくとも１のアリルにおいて、（ｂ）第２２８番目の塩基がＴであり、（ｅ）第７３９番目の塩基がＧであり、さらに、（ａ）第２０８番目の塩基がＴ、又は（ｃ）第２７４番目の塩基がＡ、又は（ｄ）第７２６番目の塩基がＧ、又は（ｆ）第７８４番目の塩基がＡである場合に、前記被験者のＨＬＡ型はＨＬＡ−Ａ*０２：０７であると判定することが好ましい。当該判定基準により、ＨＬＡ−Ａ*０２：０７をアンビギュイティが少なく、高精度に判定することができる。
【００３３】
被験者のゲノムＤＮＡに含まれるＨＬＡ遺伝子中の前記（ａ）〜（ｆ）の塩基をタイピングし、得られたタイピング結果について当該被験者のＨＬＡ−Ａ型を前記ＨＬＡ−Ａ*０２：０７の判定基準に基づいて判定した場合の判定結果と、実際の遺伝子型とを、遺伝子頻度と共に表８及び９に示す。表８及び９中、「ＨＬＡ−」欄、「タイプ」欄、「判定基準」欄、「正誤」欄、及び「遺伝子頻度」欄は、表４と同様である。表８及び９に示すように、前記ＨＬＡ−Ａ*０２：０７の判定基準により、被験者のゲノムＤＮＡがＨＬＡ−Ａ*０２：０７を含むか否かを高精度に判断することができる。
【００３４】
【表８】
2014150767.tif 000009
【００３５】
【表９】
2014150767.tif 000010
【００３６】
本発明の判定方法に供される核酸サンプルとしては、被験者のゲノムＤＮＡの前記（ａ）〜（ｆ）の少なくともいずれかの塩基を含む領域、好ましくは少なくとも前記（ｂ）及び（ｅ）の塩基を含む領域、より好ましくは前記（ａ）〜（ｆ）の全塩基を含む領域の塩基配列が反映されている核酸が含まれていればよい。当該核酸としては、被験者由来のゲノムＤＮＡであってもよく、ｍＲＮＡであってもよい。ｍＲＮＡ中の各塩基のタイピングは、ｍＲＮＡを直接タイピングしてもよく、ｍＲＮＡから逆転写反応により合成されたｃＤＮＡを用いて行ってもよい。被験者由来のゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡは、被験者から採取された生体試料から抽出・精製された核酸であってもよく、精製前の核酸であってもよい。さらに、被験者由来のゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡ中の前記（ａ）〜（ｆ）の少なくともいずれかの塩基を含む領域、好ましくは少なくとも前記（ｂ）及び（ｅ）の塩基を含む領域、より好ましくは前記（ａ）〜（ｆ）の全塩基を含む領域をＰＣＲ等により増幅して得られた増幅産物であってもよい。
【００３７】
本発明の判定方法において、前記（ａ）〜（ｆ）の塩基のタイピング方法は特に限定されるものではなく、サンガー法を基礎とするシークエンス解析法であってもよく、一塩基検出方法であってもよい。一塩基検出方法としては、遺伝子の変異や多型の検出等において用いられる公知の各種手法、例えば、ＰＣＲ−ＳＳＯ(ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ)法、ＰＣＲ−ＳＳＰ（ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  プライマー)法や、それらを改変した方法等を用いることができる。ＰＣＲ−ＳＳＯ法は、特定のアリルと特異的にハイブリダイズするプローブ（アリル特異的プローブ）を用いて、当該プローブとの会合体形成の有無によりタイピングする方法である。ＰＣＲ−ＳＳＰ法は、特定のアリルと特異的にハイブリダイズするプライマー（アリル特異的プローブ）を用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物の有無によりタイピング出する方法である。これらを改変した方法としては、例えば、インベーダー法やＴａｑｍａｎプローブ法、ＱＰｒｏｂｅ法、Ｓｃｏｒｐｉｏｎ−ＡＲＭＳ法等が挙げられる。検出感度に優れているため、蛍光を利用して検出する方法であることが好ましく、検出感度及び精度に優れているため、インベーダー法やＴａｑｍａｎプローブ法、ＱＰｒｏｂｅ法、Ｓｃｏｒｐｉｏｎ−ＡＲＭＳ法等のように、特定のアリルを認識するプローブやプライマーを用いる方法であることが好ましい。前記（ａ）〜（ｆ）の塩基のタイピングに用いられるプローブやプライマーは、例えば、塩基配列１に基づき、常法により設計し、合成することができる。
【００３８】
シークエンス解析法によりタイピングする場合、例えば、図３に示すように、被験者から抽出されたゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡ（以下、単に「ゲノムＤＮＡ」ということがある。）を鋳型として、前記（ｂ）の塩基を挟む領域を増幅するＰＣＲプライマー（図３中、プライマー−１及びプライマー−２）を用いてＰＣＲを行い、得られた増幅産物の塩基配列を解析することによって、前記（ａ）〜（ｃ）の塩基をタイピングすることができる。同様に、前記（ｅ）の塩基を挟む領域を増幅するＰＣＲプライマー（図３中、プライマー−３及びプライマー−４）を用いてＰＣＲを行い、得られた増幅産物の塩基配列を解析することによって、前記（ｄ）〜（ｆ）の塩基をタイピングすることができる。なお、前記（ｂ）及び（ｅ）の塩基のみをシークエンス解析法によりタイピングする場合には、前記（ａ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｆ）の塩基は含まず、かつ前記（ｂ）及び（ｅ）の塩基を含む領域を増幅するＰＣＲプライマーを用いてＰＣＲを行い、得られた増幅産物の塩基配列を解析してもよい。
【００３９】
プライマー−１〜−４としては、前記（ａ）〜（ｆ）の各塩基を含む目的の領域を増幅し得るプライマーであれば特に限定されるものではない。一例としては、３’末端が表１０に示す塩基配列（配列番号３〜６）からなるプライマーが挙げられ、表１０に示す塩基配列からなるプライマーが好ましい。３’末端が配列番号３に示す塩基配列からなるプライマーと３’末端が配列番号４に示す塩基配列からなるプライマーを用いたポリメラーゼによる伸長反応により得られた伸長産物に対して塩基配列を解析することによって、前記（ａ）〜（ｃ）のいずれかの塩基のタイピングを行うことができる。また、３’末端が配列番号５に示す塩基配列からなるプライマーと３’末端が配列番号６に示す塩基配列からなるプライマーを用いたポリメラーゼによる伸長反応により得られた伸長産物に対して塩基配列を解析することによって、前記（ｄ）〜（ｆ）のいずれかの塩基のタイピングを行うことができる。
【００４０】
【表１０】
2014150767.tif 000011
【００４１】
また、塩基のタイピングは、シークエンス解析法と一塩基検出方法とを組み合わせて行ってもよい。例えば、前記（ａ）〜（ｆ）の塩基のいずれかを、ＨＬＡ−Ａ*０２グループのアリルと特異的にハイブリダイズするプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物の有無によりタイピングし、残る塩基をシークエンス解析によりタイピングしてもよい。
【００４２】
なお、「ある特定のアリルに特異的にハイブリダイズするプライマー」には、標的とするアリルと完全に相補的な塩基配列を有するプライマーに限定されず、その他のアリルよりも標的とするアリルに優先的にハイブリダイズするプライマーであればよく、標的とするアリルとハイブリダイズする領域内に１〜数塩基のミスマッチ塩基を含んでいてもよい。
【００４３】
本発明の判定方法において、被験者のアレルがＨＬＡ−Ａ*０２：０１又はＨＬＡ−Ａ*０２：０６又はＨＬＡ−Ａ*０２：０７を含むか否かを判定する場合には、例えば、前記（ａ）〜（ｆ）の塩基のいずれかを、ＨＬＡ−Ａ*０２：０１と特異的にハイブリダイズするプライマーセット（ＨＬＡ−Ａ*０２：０１特異的プライマー）、又はＨＬＡ−Ａ*０２：０６と特異的にハイブリダイズするプライマーセット（ＨＬＡ−Ａ*０２：０６特異的プライマー）、ＨＬＡ−Ａ*０２：０１と特異的にハイブリダイズするプライマーセット（ＨＬＡ−Ａ*０２：０１特異的プライマー）を用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物の有無によりタイピングし、残る塩基をシークエンス解析によりタイピングしてもよい。
【００４４】
例えば、図４に示すように、被験者から抽出されたゲノムＤＮＡを鋳型として、前記（ａ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｆ）の４塩基を含む領域に特異的にハイブリダイズするプライマー（図４中、プライマー−５〜−８）を用いて、ＰＣＲ等のポリメラーゼによる伸長反応を行い、ＰＣＲ産物の有無を調べ、かつ当該ＰＣＲ産物の塩基配列を解析することによって、前記（ａ）、（ｃ）、（ｄ）、及び（ｆ）の塩基をタイピングすることができる。前記（ｂ）及び（ｅ）の塩基のタイピングは、図３と同様にして実施することができる。
【００４５】
図３に示すタイピング方法の場合には、ゲノムＤＮＡに含まれているＨＬＡ遺伝子の多くのアリルが鋳型となってＰＣＲ産物が得られる。このため、ＨＬＡ遺伝子がヘテロタイプの場合、前記（ａ）〜（ｆ）の塩基は、タイピング方法によっては、２種類の塩基がタイピングされる場合があり、前記（ａ）〜（ｆ）のタイピング結果を用いても誤判定になる場合がある。これに対して、図４に示すタイピング方法のように、（ａ）の塩基を含む領域と、（ｃ）の塩基を含む領域と、（ｄ）の塩基を含む領域と、（ｆ）の塩基を含む領域とをプライマーで識別したうえで、（ｂ）及び（ｅ）の塩基をシークエンス解析法等によりタイピングした場合には、（ａ）〜（ｆ）の全ての塩基を総合した結果が得られる。すなわち、ＨＬＡ−Ａ*０２を含むグループに特異的なプライマーを用いて増幅する場合には、ゲノムＤＮＡがＨＬＡ−Ａ*０２のグループを含むヘテロタイプであった場合でも、（ｂ）及び（ｅ）の塩基の検出のみにより、ＨＬＡ−Ａ*０２グループのタイピングを、図３のタイピング方法よりも精度よくかつより簡便に判定できる。
【００４６】
プライマー−５〜−８としては、前記（ａ）、（ｃ）、（ｄ）、又は（ｆ）の４塩基の少なくとも１塩基を含む領域に特異的にハイブリダイズし得るプライマーであれば特に限定されるものではない。ＨＬＡ−Ａ*０２グループ特異的プライマーとして用いられるものとしては、一例としては、３’末端が表１１に示す塩基配列（配列番号７〜１０）からなるプライマーが挙げられ、表１１に示す塩基配列からなるプライマーが好ましい。表１１に示すプライマー−５〜−８も、プライマー−１〜−４と同様に、前記（ｂ）及び（ｅ）の塩基をタイピングするためのＨＬＡ−Ａ*０２のグループ特異的プライマーとして用いることができる。
【００４７】
【表１１】
2014150767.tif 000012
【００４８】
３’末端が表１１に示す塩基配列（配列番号７〜１０）からなるプライマーを用いてＰＣＲ等のポリメラーゼによる伸長反応を行い、伸長産物が得られた場合には、鋳型とした被験者のゲノムＤＮＡは、前記（ａ）の塩基がＴであり、前記（ｃ）の塩基がＡであり、前記（ｄ）の塩基がＧであり、前記（ｆ）の塩基がＡである。そこで、当該伸長産物に対する前記（ｂ）及び（ｅ）の塩基のタイピング結果により、表１２に示した判定とすることができる。
【００４９】
【表１２】
2014150767.tif 000013
【００５０】
前記（ａ）〜（ｆ）の塩基のタイピングに用いられるプローブやプライマーをキット化することにより、本発明の判定方法をより簡便に行うことができる。例えば、図３に示すプライマー−１〜−４を組み合わせたものをＨＬＡ−Ａ*０２グループ判定用キットとすることができる。また、プライマー−１とプライマー−２を少なくとも含むキットや、プライマー−３とプライマー−４を少なくとも含むキットでもよい。本発明においては、ＨＬＡ−Ａ*０２グループ特異的プライマーであるプライマー−５〜−８を含むＨＬＡ−Ａ*０２グループ判定用キットとすることが好ましい。ＨＬＡ−Ａ*０２グループ特異的プライマーを含むキットは、ＨＬＡ−Ａ*０２：０１、ＨＬＡ−Ａ*０２：０６、又はＨＬＡ−Ａ*０２：０７であるか否かの判定に好適に用いられる。
【００５１】
また、Ａ−Ａ*０２グループ判定用キットには、被験者から採取された生体試料から核酸を抽出・精製するための試薬や器具等を含ませることも好ましい。
【実施例】
【００５２】
以下、実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００５３】
［実施例１］
ＨＬＡ−Ａ型が［Ａ＊０２：０１／Ａ＊１１：０１］のヘテロタイプ、［Ａ＊０２：０７／Ａ＊０２：０６］のヘテロタイプ、及び［Ａ＊０２：０１／Ａ＊０３：０１］のヘテロタイプである被験者から採取された生体試料から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として、表１０に示すプライマー−１及びプライマー−２を用いたＰＣＲと、プライマー−３及びプライマー−４を用いたＰＣＲとを行い、各ＰＣＲ産物についてシークエンス解析した。
シークエンス解析の結果、及び得られたタイピング結果に基づいて判定した結果を表１３に示す。表中、「判定」欄の「＋」はゲノムＤＮＡがＨＬＡ−Ａ*０２：０１、ＨＬＡ−Ａ*０２：０６、又はＨＬＡ−Ａ*０２：０７を含むという判定を、「−」はゲノムＤＮＡがＨＬＡ−Ａ*０２：０１、ＨＬＡ−Ａ*０２：０６、及びＨＬＡ−Ａ*０２：０７を含まないという判定を、それぞれ示す。この結果、［Ａ＊０２：０７／Ａ＊０２：０６］のヘテロタイプ、及び［Ａ＊０２：０１／Ａ＊０３：０１］のヘテロタイプはいずれも正確に判定された。一方で［Ａ＊０２：０１／Ａ＊１１：０１］のヘテロタイプは、想定どおり、偽陽性となった。
【００５４】
【表１３】
2014150767.tif 000014
【００５５】
［実施例２］
プライマー−１〜−４に代えて表１１に示すプライマー−５〜−８を用いた以外は、実施例１と同様にして、ＨＬＡ−Ａ型が［Ａ＊０２：０１／Ａ＊１１：０１］のヘテロタイプ、［Ａ＊０２：０７／Ａ＊０２：０６］のヘテロタイプ、及び［Ａ＊０２：０１／Ａ＊０３：０１］のヘテロタイプである被験者から採取された生体試料から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲを行った。この結果、いずれのゲノムＤＮＡを鋳型とした場合でも、プライマー−５及びプライマー−６を用いたＰＣＲとプライマー−７及びプライマー−８を用いたＰＣＲによってそれぞれＰＣＲ産物が得られた。つまり、いずれのゲノムＤＮＡにおいても、（ａ）の塩基がＴであり、（ｃ）の塩基がＡであり、（ｄ）の塩基がＧであり、（ｆ）の塩基がＡであることがわかった。各ＰＣＲ産物についてシークエンス解析したところ、表１４に示すように、実施例１と同様の判定結果となった。但し、［Ａ＊０２：０１／Ａ＊１１：０１］のヘテロタイプ由来のゲノムＤＮＡを用いた場合には、実施例１では（ｂ）の塩基はＴとＡの２種類がタイピングされたが、本実施例では（ｂ）の塩基はＴの１種類のみタイピングされ、（ｅ）の塩基は本実施例と同様にＡの１種類のみタイピングされた。
【００５６】
【表１４】
2014150767.tif 000015
【００５７】
［比較例１］
ＨＬＡ型が未知である血液試料（検体Ａ〜Ｆ）をサンプルとして、株式会社エスアールエルによりＳＢＴ（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−Ｂａｓｅｄ  Ｔｙｐｉｎｇ）法を用いてＨＬＡ型の検出を行った。検出結果を表１５に示す。
【００５８】
［実施例３］
比較例１で用いた血液試料（検体Ａ〜Ｆ）をサンプルとして、当該血液試料から精製されたＤＮＡについて、実施例２と同様の方法でＨＬＡ型の検出を行った。検出結果を表１５に示す。表１５中、「（ｂ）」欄及び「（ｅ）」欄の「−」は、ＰＣＲ産物が得られなかったことを意味する。
【００５９】
【表１５】
2014150767.tif 000016
【００６０】
この結果、ＳＢＴ法と実施例２と同様の方法のいずれによっても、検体ＤのみがＨＬＡ−Ａ*０２：０１を含むと判定され、検体ＥのみがＨＬＡ−Ａ*０２：０６を含むと判定され、検体ＦのみがＨＬＡ−Ａ*０２：０７を含むと判定された。つまり、本発明の判定方法により、正しくＨＬＡ−Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０６、及びＨＬＡ−Ａ＊０２：０７を検出できることが証明された。
【産業上の利用可能性】
【００６１】
本発明の判定方法により、ＨＬＡ−Ａ*０２グループのタイピングを精度よくかつより簡便に判定できることから、臨床用遺伝子診断事業等の分野、特に細胞又は臓器移植のためのＨＬＡ型判定において利用が可能である。
【図１Ａ】
2014150767.tif 000017
【図１Ｂ】
2014150767.tif 000018
【図１Ｃ】
2014150767.tif 000019
【図１Ｄ】
2014150767.tif 000020
【図２】
2014150767.tif 000021
【図３】
2014150767.tif 000022
【図４】
2014150767.tif 000023
【配列表】
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