(57)【要約】      （修正有）【課題】微生物燃料電池のみならず二次電池ないし微生物二次電池にも応用できる新規な素材、特に蓄放電可能な新規な素材を提供する。【解決手段】Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ属、Ｄｅｓｕｌｆｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ属、Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ属、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ門、Ｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｓｐｏｒｏｔａｌｅａ属、Ｇｅｏｓｉｎｕｓ属、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ属、Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ属、Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａｃｅａｅ科、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属、Ｐｓｙｃｈｒｏｓｉｎｕｓ属、Ａｎａｅｒｏｖｉｂｒｉｏ属、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ属、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｓｐｏｒａ属、及びＰｅｌｏｓｉｎｕｓ属から選択される少なくとも１つの微生物を、少なくともＦｅ３＋を含む電解質と有機物とを含む培地にて培養することによって得られる沈殿物を含む、蓄放電可能な物質。【選択図】図１８
2014064566.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
デスルホビブリオ（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ）属、デスルホトマクルム（Ｄｅｓｕｌｆｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ）属、オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）属、アクチノバクテリア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）門、バクテリウム（Ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、スポロタレア（Ｓｐｏｒｏｔａｌｅａ）属、ジェオシヌス（Ｇｅｏｓｉｎｕｓ）属、ファーミキューテス（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）属、セレノモナス（Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ）属、ベイヨネラ（Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａｃｅａｅ）科、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属、サイクロシヌス（Ｐｓｙｃｈｒｏｓｉｎｕｓ）属、アナエロビブリオ（Ａｎａｅｒｏｖｉｂｒｉｏ）属、（スポロミュサ）Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ属、プロピオニスポラ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｓｐｏｒａ）属、サクシニスピラ（Ｓｕｃｃｉｎｉｓｐｉｒａ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、オセアノバチルス（Ｏｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ブラキスピラ（Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ）属、アナエロスポラ（Ａｎａｅｒｏｓｐｏｒａ）属、アセトネマ（Ａｃｅｔｏｎｅｍａ）属、カルノコッカス（Ｃａｒｎｏｃｏｃｃｕｓ）属、トリココッカス（Ｔｒｉｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）属及びペロシヌス（Ｐｅｌｏｓｉｎｕｓ）属から選択される少なくとも１つの微生物を、少なくともＦｅ３＋を含む電解質と有機物とを含む培地にて培養することによって得られる沈殿物を含む、蓄放電可能な物質。
【請求項２】
前記微生物が、デスルホビブリオ・ブルガリス（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）、デスルホビブリオ・オリゼ（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｏｒｙｚａｅ）、デスルホトマクルム・ガットイデウム（Ｄｅｓｕｌｆｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ  ｇｕｔｔｏｉｄｅｕｍ）、バチルス・アイドリエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｉｄｒｉｅｎｓｉｓ）、オクロバクテリウム・アンスロピ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ａｎｔｈｒｏｐｉ）、クロストリジウム・セレレクレッセンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃｅｌｅｒｅｃｒｅｓｃｅｎｓ）、スポロタレア・プロピオーニカ（Ｓｐｏｒｏｔａｌｅａ  ｐｒｏｐｉｏｎｉｃａ）、スポロタレア・コロニカ（Ｓｐｏｒｏｔａｌｅａ  ｃｏｌｏｎｉｃａ）、サイクロシヌス・フェルメンタンス（Ｐｓｙｃｈｒｏｓｉｎｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）、ペロシヌス・フェルメンタンス（Ｐｅｌｏｓｉｎｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ、セレノモナス・ルミナンティウム（Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ  ｒｕｍｉｎａｎｔｉｕｍ）、セレノモナス・ラクティシフェクス（Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ  ｌａｃｔｉｃｉｆｅｘ）、クロストリジウム・ケルシコラム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｑｕｅｒｃｉｃｏｌｕｍ）、アナエロビブリオ・ブルキナベンシス（Ａｎａｅｒｏｖｉｂｒｉｏ  ｂｕｒｋｉｎａｂｅｎｓｉｓ）、アナエロビブリオ・グリセリニ（Ａｎａｅｒｏｖｉｂｒｉｏ  ｇｌｙｃｅｒｉｎｉ）、スポロミュサ・リザエ（Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ  ｒｈｉｚａｅ）、プロピオニスポラ・ヒッペイ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｓｐｏｒａ  ｈｉｐｐｅｉ）、アナエロミュサ・アシダミノフィラ（Ａｎａｅｒｏｍｕｓａ  ａｃｉｄａｍｉｎｏｐｈｉｌａ）、サクシニスピラ・モビリス（Ｓｕｃｃｉｎｉｓｐｉｒａ  ｍｏｂｉｌｉｓ）、デスルホビブリオ・ターミティディス（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｔｅｒｍｉｔｉｄｉｓ）、デスルホビブリオ・オキサミクス（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｏｘａｍｉｃｕｓ）、デスルホビブリオ・インテスティナリス（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）、デスルホビブリオ・デスルフリカンス（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｃａｎｓ）、デスルホビブリオ・フェアフィルデンシス（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｆａｉｒｆｉｅｌｄｅｎｓｉｓ）、プロピオニスポラ・ビブリオイデス（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｓｐｏｒａ  ｖｉｂｒｉｏｉｄｅｓ）、スポロミュサ・アシドボランス（Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ  ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓ）、アナエロスポラ・ホンコンゲンシス（Ａｎａｅｒｏｓｐｏｒａ  ｈｏｎｇｋｏｎｇｅｎｓｉｓ）、アセトネマ・ロングム（Ａｃｅｔｏｎｅｍａ  ｌｏｎｇｕｍ）、カルノコッカス・アラントイクス（Ｃａｒｎｏｃｏｃｃｕｓ  ａｌｌａｎｔｏｉｃｕｓ）、トリココッカス・コリンシイ（Ｔｒｉｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｏｌｌｉｎｉｓｉｉ）、並びに、バクテリウム（Ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＣＢＩＣ４５Ｉ１株及びその近縁の微生物から選択される少なくとも１つの微生物を含む、請求項１に記載の蓄放電可能な物質。
【請求項３】
前記電解質が、さらにＣａ２＋、Ｋ＋、Ｔｉ３＋、Ｎａ＋、Ｃｕ２＋、Ｍｇ２＋、ＰＯ４３−、Ｓｅ４＋、Ｎｉ２＋、Ｃｏ２＋、Ｍｎ２＋、Ｚｎ２＋、Ｍｏ６＋、Ｗ６＋及びＦｅ２＋から選択される少なくとも１つの電解質を含む、請求項１又は２に記載の蓄放電可能な物質。
【請求項４】
前記有機物が、乳酸、クエン酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、蟻酸、又はピルビン酸である有機酸及びこれらの塩、並びにグルコースから選択される少なくとも１つを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の蓄放電可能な物質。
【請求項５】
前記沈殿物が少なくとも鉄元素を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の蓄放電可能な物質。
【請求項６】
前記沈殿物が、さらにカルシウム、カリウム、炭素、チタン、ナトリウム、銅、マグネシウム、ケイ素、リン、フッ素、セレン、ニッケル、コバルト、モリブデン、タングステン及び酸素から選択される少なくとも１つの元素を含む、請求項５に記載の蓄放電可能な物質。
【請求項７】
前記沈殿物が微生物を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の蓄放電可能な物質。
【請求項８】
蓄放電物質として請求項１〜７のいずれか一項に記載の蓄放電可能な物質を含む、二次電池。
【請求項９】
電気化学セルの負極槽中に、電気産生微生物と有機物と請求項１〜７のいずれか一項に記載の蓄放電可能な物質とを含む、微生物二次電池。
【請求項１０】
前記負極槽において、前記蓄放電可能な物質の少なくとも一部が負極に接触している、請求項９に記載の微生物二次電池。
【請求項１１】
前記電気産生微生物は、ゲオバクター（Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ）属、シューワネラ（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ）属、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属、デスルホビブリオ（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ）属、デスルホトマクルム（Ｄｅｓｕｌｆｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ）属、オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）属、アクチノバクテリア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）門、バクテリウム（Ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、スポロタレア（Ｓｐｏｒｏｔａｌｅａ）属、ジェオシヌス（Ｇｅｏｓｉｎｕｓ）属、ファーミキューテス（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）属、セレノモナス（Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ）属、ベイロネラセアエ（Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａｃｅａｅ）科、サイクロシヌス（Ｐｓｙｃｈｒｏｓｉｎｕｓ）属、アナエロビブリオ（Ａｎａｅｒｏｖｉｂｒｉｏ）属、スポロミュサ（Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ）属、プロピオニスポラ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｓｐｏｒａ）属、サクシニスピラ（Ｓｕｃｃｉｎｉｓｐｉｒａ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、オセアノバチルス（Ｏｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ブラキスピラ（Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ）属、アナエロスポラ（Ａｎａｅｒｏｓｐｏｒａ）属、アセトネマ（Ａｃｅｔｏｎｅｍａ）属、カルノコッカス（Ｃａｒｎｏｃｏｃｃｕｓ）属、トリココッカス（Ｔｒｉｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）属及びペロシヌス（Ｐｅｌｏｓｉｎｕｓ）属から選択される少なくとも１つである、請求項９又は１０に記載の微生物二次電池。
【請求項１２】
デスルホビブリオ（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ）属、デスルホトマクルム（Ｄｅｓｕｌｆｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ）属、オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）属、アクチノバクテリア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）門、バクテリウム（Ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、スポロタレア（Ｓｐｏｒｏｔａｌｅａ）属、ジェオシヌス（Ｇｅｏｓｉｎｕｓ）属、ファーミキューテス（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）属、セレノモナス（Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ）属、ベイロネラセアエ（Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａｃｅａｅ）科、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属、サイクロシヌス（Ｐｓｙｃｈｒｏｓｉｎｕｓ）属、アナエロビブリオ（Ａｎａｅｒｏｖｉｂｒｉｏ）属、スポロミュサ（Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ）属、プロピオニスポラ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｓｐｏｒａ）属、サクシニスピラ（Ｓｕｃｃｉｎｉｓｐｉｒａ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、オセアノバチルス（Ｏｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ブラキスピラ（Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ）属、アナエロスポラ（Ａｎａｅｒｏｓｐｏｒａ）属、アセトネマ（Ａｃｅｔｏｎｅｍａ）属、カルノコッカス（Ｃａｒｎｏｃｏｃｃｕｓ）属、トリココッカス（Ｔｒｉｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）属及びペロシヌス（Ｐｅｌｏｓｉｎｕｓ）属から選択される少なくとも１つの微生物を、少なくともＦｅ３＋を含む電解質と有機物とを含む培地にて培養するステップと、
培地中に生成した沈殿物を分離するステップと
を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の蓄放電可能な物質を製造する方法。
【請求項１３】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の蓄放電可能な物質の製造、又は請求項１２に記載の方法における、デスルホビブリオ（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ）属、デスルホトマクルム（Ｄｅｓｕｌｆｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ）属、オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）属、アクチノバクテリア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）門、バクテリウム（Ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、スポロタレア（Ｓｐｏｒｏｔａｌｅａ）属、ジェオシヌス（Ｇｅｏｓｉｎｕｓ）属、ファーミキューテス（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）属、セレノモナス（Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ）属、ベイロネラセアエ（Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａｃｅａｅ）科、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属、サイクロシヌス（Ｐｓｙｃｈｒｏｓｉｎｕｓ）属、アナエロビブリオ（Ａｎａｅｒｏｖｉｂｒｉｏ）属、スポロミュサ（Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ）属、プロピオニスポラ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｓｐｏｒａ）属、サクシニスピラ（Ｓｕｃｃｉｎｉｓｐｉｒａ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、オセアノバチルス（Ｏｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ブラキスピラ（Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ）属、アナエロスポラ（Ａｎａｅｒｏｓｐｏｒａ）属、アセトネマ（Ａｃｅｔｏｎｅｍａ）属、カルノコッカス（Ｃａｒｎｏｃｏｃｃｕｓ）属、トリココッカス（Ｔｒｉｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）属及びペロシヌス（Ｐｅｌｏｓｉｎｕｓ）属から選択される微生物の使用方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蓄放電可能な物質並びにこれを用いた二次電池及び微生物二次電池に関し、特に、バイオミネラリゼーションによって得られた沈殿物を含む蓄放電可能な物質、並びに該物質を用いた二次電池及び微生物二次電池に関する。
【背景技術】
【０００２】
循環型低炭素化社会の構築において、廃棄物の有効利用及びクリーンエネルギーの創出は解決すべき大きな課題である。微生物による生物化学的変換機能を利用した微生物燃料電池は、有機性廃棄物から直接電気エネルギーを取り出せる装置として世界的に着目され、研究が推進されている。一方で、電流密度が極めて低く実用化には未だ至っていない。
【０００３】
この問題点を克服するためには、より良い電気生産微生物の探索や解析と同時に新しい素材の開発等が求められている。すなわち、燃料電池内の内部抵抗を低減し、かつスムーズに有機物から微生物そして電極へと電子が流れることが肝要である。
【０００４】
この課題を克服する一つの手段として、微生物と親和性の高い電極（バイオエレクトロード）を開発する必要がある。さらには、微生物による微弱な電気を蓄電できる素材やシステムが開発されれば、エネルギー問題の解決に大きく貢献し得る。
【０００５】
バイオエレクトロードに関しては、負極を修飾させ、電流密度の増加に成功した研究（非特許文献１及び２）、あるいはＦｅＳ系の化合物を添加することにより、有機物から微生物そして電極へとスムーズに電子が流れることにより電流密度の増加に成功した研究（特許文献１）が報告されている。
【０００６】
しかし、これらの研究では、電気が不要な時に貯める（蓄電）ことかつ必要な時に放電させることはできない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開２００９／１１９８４６号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Yong Zhao et al., Three-dimensional conductive nanowire networks formaximizing anode performance in microbial fuel cells. Chem. Eur. J. 16:4982-4985, 2010
【非特許文献２】Urania Michaelidou et al., Microbial communities and electrochemicalperformance of titanium-based anodic electrodes in a microbial fuel cell. Appl.Environ. Microbiol. 77:1069-1075, 2011
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、微生物燃料電池のみならず二次電池ないし微生物二次電池にも応用できる新規な素材、特に蓄放電可能な新規な素材の開発を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、微生物燃料電池に関する研究を行っている過程で、意外なことに特定の構造を有する微生物群集を培養して得られた黒色沈殿物が蓄放電能を有することを見出し、本発明の完成に至った。
【００１１】
本発明は、デスルホビブリオ（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ）属、デスルホトマクルム（Ｄｅｓｕｌｆｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ）属、オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）属、アクチノバクテリア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）門、バクテリウム（Ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、スポロタレア（Ｓｐｏｒｏｔａｌｅａ）属、ジェオシヌス（Ｇｅｏｓｉｎｕｓ）属、ファーミキューテス（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）属、セレノモナス（Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ）属、ベイロネラセアエ（Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａｃｅａｅ科、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属、サイクロシヌス（Ｐｓｙｃｈｒｏｓｉｎｕｓ）属、アナエロビブリオ（Ａｎａｅｒｏｖｉｂｒｉｏ）属、スポロミュサ（Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ）属、プロピオニスポラ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｓｐｏｒａ）属、サクシニスピラ（Ｓｕｃｃｉｎｉｓｐｉｒａ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、オセアノバチルス（Ｏｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ブラキスピラ（Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ）属、アナエロスポラ（Ａｎａｅｒｏｓｐｏｒａ）属、アセトネマ（Ａｃｅｔｏｎｅｍａ）属、カルノコッカス（Ｃａｒｎｏｃｏｃｃｕｓ）属、トリココッカス（Ｔｒｉｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）属及びペロシヌス（Ｐｅｌｏｓｉｎｕｓ）属から選択される少なくとも１つの微生物を、少なくともＦｅ３＋を含む電解質と有機物とを含む培地にて培養することによって得られる沈殿物を含む、蓄放電可能な物質を提供する。
【００１２】
上記微生物がデスルホビブリオ（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ）属、デスルホトマクルム（Ｄｅｓｕｌｆｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）属、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属、バクテリウム（Ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属及びトリココッカス（Ｔｒｉｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）属から選択される少なくとも１つの微生物を含むことが好ましい。
【００１３】
上記微生物が、デスルホビブリオ・ブルガリス（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）、デスルホビブリオ・オリゼ（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｏｒｙｚａｅ）、デスルホトマクルム・ガットイデウム（Ｄｅｓｕｌｆｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ  ｇｕｔｔｏｉｄｅｕｍ）、バチルス・アイドリエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｉｄｒｉｅｎｓｉｓ）、オクロバクテリウム・アンスロピ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ａｎｔｈｒｏｐｉ）、クロストリジウム・セレレクレッセンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃｅｌｅｒｅｃｒｅｓｃｅｎｓ）、スポロタレア・プロピオーニカ（Ｓｐｏｒｏｔａｌｅａ  ｐｒｏｐｉｏｎｉｃａ）、スポロタレア・コロニカ（Ｓｐｏｒｏｔａｌｅａ  ｃｏｌｏｎｉｃａ）、サイクロシヌス・フェルメンタンス（Ｐｓｙｃｈｒｏｓｉｎｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）、ペロシヌス・フェルメンタンス（Ｐｅｌｏｓｉｎｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ、セレノモナス・ルミナンティウム（Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ  ｒｕｍｉｎａｎｔｉｕｍ）、セレノモナス・ラクティシフェクス（Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ  ｌａｃｔｉｃｉｆｅｘ）、クロストリジウム・ケルシコラム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｑｕｅｒｃｉｃｏｌｕｍ）、アナエロビブリオ・ブルキナベンシス（Ａｎａｅｒｏｖｉｂｒｉｏ  ｂｕｒｋｉｎａｂｅｎｓｉｓ）、アナエロビブリオ・グリセリニ（Ａｎａｅｒｏｖｉｂｒｉｏ  ｇｌｙｃｅｒｉｎｉ）、スポロミュサ・リザエ（Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ  ｒｈｉｚａｅ）、プロピオニスポラ・ヒッペイ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｓｐｏｒａ  ｈｉｐｐｅｉ）、アナエロミュサ・アシダミノフィラ（Ａｎａｅｒｏｍｕｓａ  ａｃｉｄａｍｉｎｏｐｈｉｌａ）、サクシニスピラ・モビリス（Ｓｕｃｃｉｎｉｓｐｉｒａ  ｍｏｂｉｌｉｓ）、デスルホビブリオ・ターミティディス（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｔｅｒｍｉｔｉｄｉｓ）、デスルホビブリオ・オキサミクス（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｏｘａｍｉｃｕｓ）、デスルホビブリオ・インテスティナリス（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）、デスルホビブリオ・デスルフリカンス（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｃａｎｓ）、デスルホビブリオ・フェアフィルデンシス（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｆａｉｒｆｉｅｌｄｅｎｓｉｓ）、プロピオニスポラ・ビブリオイデス（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｓｐｏｒａ  ｖｉｂｒｉｏｉｄｅｓ）、スポロミュサ・アシドボランス（Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ  ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓ）、アナエロスポラ・ホンコンゲンシス（Ａｎａｅｒｏｓｐｏｒａ  ｈｏｎｇｋｏｎｇｅｎｓｉｓ）、アセトネマ・ロングム（Ａｃｅｔｏｎｅｍａ  ｌｏｎｇｕｍ）、カルノコッカス・アラントイクス（Ｃａｒｎｏｃｏｃｃｕｓ  ａｌｌａｎｔｏｉｃｕｓ）、トリココッカス・コリンシイ（Ｔｒｉｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｏｌｌｉｎｉｓｉｉ）、並びに、バクテリウム（Ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＣＢＩＣ４５Ｉ１株及びその近縁の微生物から選択される少なくとも１つの微生物を含むことが好ましく、デスルホビブリオ・ブルガリス（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）、デスルホビブリオ・オリゼ（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｏｒｙｚａｅ）、デスルホトマクルム・ガットイデウム（Ｄｅｓ��ｌｆｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ  ｇｕｔｔｏｉｄｅｕｍ）、バチルス・アイドリエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｉｄｒｉｅｎｓｉｓ）、オクロバクテリウム・アンスロピ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ａｎｔｈｒｏｐｉ）、クロストリジウム・セレレクレッセンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃｅｌｅｒｅｃｒｅｓｃｅｎｓ）、トリココッカス・コリンシイ（Ｔｒｉｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｏｌｌｉｎｉｓｉｉ）、並びに、バクテリウム（Ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＣＢＩＣ４５Ｉ１株及びその近縁の微生物から選択される少なくとも一つの微生物を含むことがより好ましい。上記電解質が、さらにＣａ２＋、Ｋ＋、Ｔｉ３＋、Ｎａ＋、Ｃｕ２＋、Ｍｇ２＋、ＰＯ４３−、Ｓｅ４＋、Ｎｉ２＋、Ｃｏ２＋、Ｍｎ２＋、Ｚｎ２＋、Ｍｏ６＋、Ｗ６＋及びＦｅ２＋から選択される少なくとも１つの電解質を含むことが好ましい。上記有機物が、乳酸、クエン酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、蟻酸、又はピルビン酸である有機酸及びこれらの塩、並びにグルコースから選択される少なくとも１つを含むことが好ましい。上記沈殿物が、少なくとも鉄元素を含むことが好ましい。上記沈殿物が、さらにカルシウム、カリウム、炭素、チタン、ナトリウム、銅、マグネシウム、ケイ素、リン、フッ素、セレン、ニッケル、コバルト、モリブデン、タングステン及び酸素から選択される少なくとも１つの元素を含むことが好ましい。さらに、上記沈殿物が微生物を含むことが好ましい。
【００１４】
本発明はまた、蓄放電物質として上記の蓄放電可能な物質を含む二次電池を提供する。
【００１５】
本発明はまた、電気化学セルの負極槽中に、電気産生微生物と有機物と上記の蓄放電可能な物質とを含む微生物二次電池を提供する。上記負極槽において、前記蓄放電可能な物質の少なくとも一部が負極に接触していることが好ましい。上記電気産生微生物は、ゲオバクター（Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ）属、シューワネラ（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ）属、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属、デスルホビブリオ（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ）属、デスルホトマクルム（Ｄｅｓｕｌｆｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ）属、オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）属、アクチノバクテリア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）門、バクテリウム（Ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、スポロタレア（Ｓｐｏｒｏｔａｌｅａ）属、ジェオシヌス（Ｇｅｏｓｉｎｕｓ）属、ファーミキューテス（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）属、セレノモナス（Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ）属、ベイロネラセアエ（Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａｃｅａｅ）科、サイクロシヌス（Ｐｓｙｃｈｒｏｓｉｎｕｓ）属、アナエロビブリオ（Ａｎａｅｒｏｖｉｂｒｉｏ）属、スポロミュサ（Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ）属、プロピオニスポラ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｓｐｏｒａ）属、サクシニスピラ（Ｓｕｃｃｉｎｉｓｐｉｒａ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、オセアノバチルス（Ｏｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ブラキスピラ（Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ）属、アナエロスポラ（Ａｎａｅｒｏｓｐｏｒａ）属、アセトネマ（Ａｃｅｔｏｎｅｍａ）属、カルノコッカス（Ｃａｒｎｏｃｏｃｃｕｓ）属、トリココッカス（Ｔｒｉｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）属及びペロシヌス（Ｐｅｌｏｓｉｎｕｓ）属から選択される少なくとも１つであることが好ましい。
【００１６】
本発明はまた、デスルホビブリオ（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ）属、デスルホトマクルム（Ｄｅｓｕｌｆｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ）属、オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）属、アクチノバクテリア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）門、バクテリウム（Ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、スポロタレア（Ｓｐｏｒｏｔａｌｅａ）属、ジェオシヌス（Ｇｅｏｓｉｎｕｓ）属、ファーミキューテス（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）属、セレノモナス（Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ）属、ベイロネラセアエ（Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａｃｅａｅ）科、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属、サイクロシヌス（Ｐｓｙｃｈｒｏｓｉｎｕｓ）属、アナエロビブリオ（Ａｎａｅｒｏｖｉｂｒｉｏ）属、スポロミュサ（Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ）属、プロピオニスポラ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｓｐｏｒａ）属、サクシニスピラ（Ｓｕｃｃｉｎｉｓｐｉｒａ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、オセアノバチルス（Ｏｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ブラキスピラ（Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ）属、アナエロスポラ（Ａｎａｅｒｏｓｐｏｒａ）属、アセトネマ（Ａｃｅｔｏｎｅｍａ）属、カルノコッカス（Ｃａｒｎｏｃｏｃｃｕｓ）属、トリココッカス（Ｔｒｉｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）属及びペロシヌス（Ｐｅｌｏｓｉｎｕｓ）属から選択される少なくとも１つの微生物を、少なくともＦｅ３＋を含む電解質と有機物とを含む培地にて培養するステップと、培地中に生成した沈殿物を分離するステップとを含む、上記の蓄放電可能な物質を製造する方法を提供する。
【００１７】
本発明はさらに、上記の蓄放電可能な物質の製造、又は上記の蓄放電可能な物質を製造する方法における、デスルホビブリオ（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ）属、デスルホトマクルム（Ｄｅｓｕｌｆｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ）属、オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）属、アクチノバクテリア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）門、バクテリウム（Ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、スポロタレア（Ｓｐｏｒｏｔａｌｅａ）属、ジェオシヌス（Ｇｅｏｓｉｎｕｓ）属、ファーミキューテス（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）属、セレノモナス（Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ）属、ベイロネラセアエ（Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａｃｅａｅ）科、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属、サイクロシヌス（Ｐｓｙｃｈｒｏｓｉｎｕｓ）属、アナエロビブリオ（Ａｎａｅｒｏｖｉｂｒｉｏ）属、スポロミュサ（Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ）属、プロピオニスポラ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｓｐｏｒａ）属、サクシニスピラ（Ｓｕｃｃｉｎｉｓｐｉｒａ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、オセアノバチルス（Ｏｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ブラキスピラ（Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ）属、アナエロスポラ（Ａｎａｅｒｏｓｐｏｒａ）属、アセトネマ（Ａｃｅｔｏｎｅｍａ）属、カルノコッカス（Ｃａｒｎｏｃｏｃｃｕｓ）属、トリココッカス（Ｔｒｉｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）属及びペロシヌス（Ｐｅｌｏｓｉｎｕｓ）属から選択される微生物の使用方法を提供する。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の蓄放電可能な物質は、電気を貯めて放出する（蓄電・放電）ことができる。また、この性質に基づき、繰り返し蓄電・放電できるため、蓄放電物質として二次電池に応用することが可能である。
【００１９】
本発明の蓄放電可能な物質はまた、微生物との相性がよいため、微生物燃料電池に添加することもできる。この場合、微生物燃料電池において電流の発生しない誘導期において電流を補うだけでなく、さらに発電期においても蓄放電能に基づき、電流密度を増加させることができる。したがって、本発明の蓄放電可能な物質を用いた、実用化できる微生物燃料電池の実現が期待される。
【００２０】
本発明の蓄放電可能な物質はさらに、微生物二次電池への応用も期待される。これまでの微生物燃料電池は、発電と放電とは同時に行われるが、本発明の蓄放電可能な物質を用いれば、発電と放電とを別々に行うことができ、すなわち、微生物二次電池を実現することができる。この場合、まず本発明の蓄放電可能な物質の存在下、微生物を培養し発電した電気を蓄放電可能な物質に蓄積させ、次に必要なときに正極と負極とを連結し放電させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】微生物培養物のＰＣＲ−ＤＧＧＥによる構造解析の結果を示す図である。
【図２】黒色沈殿物Ａタイプ  サンプル１の元素マップを示す図である。
【図３】黒色沈殿物Ａタイプ  サンプル１の電子顕微鏡像（Ａ）、スペクトル（Ｂ）、及び元素定量結果（Ｃ）を示す図である。
【図４】黒色沈殿物Ａタイプ  サンプル２の元素マップを示す図である。
【図５】黒色沈殿物Ａタイプ  サンプル２の一部拡大１の電子顕微鏡像（Ａ）、スペクトル（Ｂ）、及び元素定量結果（Ｃ）を示す図である。
【図６】黒色沈殿物Ａタイプ  サンプル２の一部拡大２の電子顕微鏡像（Ａ）、スペクトル（Ｂ）、及び元素定量結果（Ｃ）を示す図である。
【図７】黒色沈殿物Ａタイプ  サンプル２の一部拡大１及び一部拡大２の電子顕微鏡像（Ａ）、及び図５と図６とで示したスペクトルの差異（Ｂ）を示す図である。
【図８】黒色沈殿物Ｃタイプ  サンプル１の元素マップを示す図である。
【図９】黒色沈殿物Ｃタイプ  サンプル１の電子顕微鏡像（Ａ）、スペクトル（Ｂ）、及び元素定量結果（Ｃ）を示す図である。
【図１０】黒色沈殿物Ｃタイプ  サンプル２の元素マップを示す図である。
【図１１】黒色沈殿物Ｃタイプ  サンプル２−１の電子顕微鏡像（Ａ）、スペクトル（Ｂ）、及び元素定量結果（Ｃ）を示す図である。
【図１２】黒色沈殿物Ｃタイプ  サンプル２−２の電子顕微鏡像（Ａ）、スペクトル（Ｂ）、及び元素定量結果（Ｃ）を示す図である。
【図１３】黒色沈殿物Ｃタイプ  サンプル２−１及びサンプル２−２の電子顕微鏡像（Ａ）、及び図１１と図１２とで示したスペクトルの差異（Ｂ）を示す図である。
【図１４】黒色沈殿物Ｄタイプ  サンプル１の元素マップを示す図である。
【図１５】黒色沈殿物Ｄタイプ  サンプル１の電子顕微鏡像（Ａ）、スペクトル（Ｂ）、及び元素定量結果（Ｃ）を示す図である。
【図１６】コントロールの元素マップを示す図である。
【図１７】コントロールの電子顕微鏡像（Ａ）、スペクトル（Ｂ）、及び元素定量結果（Ｃ）を示す図である。
【図１８】黒色沈殿物Ａ〜Ｄタイプの電流密度の測定結果を示す図である。ＡとＢは縦軸のスケールが異なるものを示す。
【図１９】実施例５の黒色沈殿物Ａタイプの電子顕微鏡像を示す図である。Ａ〜Ｃは倍率が異なるものを示す。
【図２０】未滅菌と滅菌処理した実施例５の黒色沈殿物の電流密度の測定結果を示す図である。
【図２１】１Ｌ培養瓶で黒色沈殿物質が生成した様子を示す図である。左の瓶は撹拌直後、右の瓶は３０分静置後の様子を示す。
【図２２】黒色沈殿物質の共焦点レーザー顕微鏡像を示す図である。（Ａ）はＡタイプ、（Ｂ）はＤタイプの黒色沈殿物質の共焦点レーザー顕微鏡像を示す。
【図２３】微生物含有黒色物質、オートクレーブ処理した黒色物質及び培地のみのサイクリックボルタモグラムを示す図である。
【図２４】微生物含有黒色物質の放電時の電流密度を異なる外部抵抗条件下で経時的に測定した結果を示す図である。
【図２５】微生物含有黒色物質の放電及び蓄電時の電流密度を経時的に測定した結果を示す図である。
【図２６】（Ａ）はオートクレーブ処理した黒色物質の放電及び蓄電時の電流密度を経時的に測定した結果を示す図である。（Ｂ）は（Ａ）の一部を拡大して示した図である。
【図２７】黒色沈殿物質生成培養物中の微生物の群集構造解析結果を示す図である。
【図２８】各分離菌株で生成した沈殿物質の放電時の電力密度を経時的に測定した結果を示す図である。
【図２９】（Ａ）は培養液のｐＨと沈殿物質生成の関係を示す図である。（Ｂ）は培養液のｐＨ変化を経日的に測定した結果を示す図である。（Ｃ）は培養液の硫酸イオン濃度変化を経日的に測定した結果を示す図である。
【図３０】培養液のｐＨが６．３及び７．０の場合に生成した沈殿物質の放電時の電力密度を経時的に測定した結果を示す図である。
【図３１】微生物燃料電池に黒色物質を添加した系及び添加しなかった系の電力密度を経日的に測定した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明で使用する微生物は、例えば、川底泥、湖底泥、海底泥、沼底泥、土壌等の環境由来の試料や活性汚泥等を以下のように処理することで取得することができる。まず、環境由来の試料又は活性汚泥等を微生物燃料電池の負極槽に添加し電流生産が確認された後に、負極溶液あるいは負電極を適当に希釈し、ロールチューブ法あるいは６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ法を用いて複数の微生物コロニーを得る。この際、培養条件としては、例えば、嫌気条件下、２５℃で２００日程度培養することができる。そして、得られた複数の微生物コロニーを、Ｆｅ３＋を含む電解質と有機物とを含む培地にて培養し、培養物中、沈殿物質を生成する微生物コロニーを分離する。分離した微生物コロニーに含まれる微生物を、本発明の微生物として使用できる。なお、培地中のＦｅ３＋の濃度が０．１ｍＭとなるように調製してもよい。また、微生物コロニーが沈殿物質を生成するか否かは、例えば、培養してから１４日以上経過後、沈殿物質が生成するか観察することで判断してもよい。
【００２３】
本発明の蓄放電可能な物質は、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ属、Ｄｅｓｕｌｆｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ属、Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ属、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ門、Ｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｓｐｏｒｏｔａｌｅａ属、Ｇｅｏｓｉｎｕｓ属、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ属、Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ属、Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａｃｅａｅ科、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属、Ｐｓｙｃｈｒｏｓｉｎｕｓ属、Ａｎａｅｒｏｖｉｂｒｉｏ属、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ属、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｓｐｏｒａ属、Ｓｕｃｃｉｎｉｓｐｉｒａ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｏｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ属、Ａｎａｅｒｏｓｐｏｒａ属、Ａｃｅｔｏｎｅｍａ属、Ｃａｒｎｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｔｒｉｃｈｏｃｏｃｃｕｓ属及びＰｅｌｏｓｉｎｕｓ属から選択される少なくとも１つの微生物を、少なくともＦｅ３＋を含む電解質と有機物とを含む培地にて培養することによって得られる沈殿物を含むものである。
【００２４】
用いられる微生物は、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ属、Ｄｅｓｕｌｆｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ属、Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ属、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ門、Ｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｓｐｏｒｏｔａｌｅａ属、Ｇｅｏｓｉｎｕｓ属、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ属、Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ属、Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａｃｅａｅ科、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属、Ｐｓｙｃｈｒｏｓｉｎｕｓ属、Ａｎａｅｒｏｖｉｂｒｉｏ属、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ属、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｓｐｏｒａ属、Ｓｕｃｃｉｎｉｓｐｉｒａ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｏｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ属、Ａｎａｅｒｏｓｐｏｒａ属、Ａｃｅｔｏｎｅｍａ属、Ｃａｒｎｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｔｒｉｃｈｏｃｏｃｃｕｓ属及びＰｅｌｏｓｉｎｕｓ属から選択される少なくとも１つの微生物である。例えば、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｖｕｌｇａｒｉｓ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｏｒｙｚａｅ、Ｄｅｓｕｌｆｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ  ｇｕｔｔｏｉｄｅｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｉｄｒｉｅｎｓｉｓ、Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ａｎｔｈｒｏｐｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｕｍ  ｃｅｌｅｒｅｃｒｅｓｃｅｎｓ、Ｓｐｏｒｏｔａｌｅａ  ｐｒｏｐｉｏｎｉｃａ、Ｓｐｏｒｏｔａｌｅａ  ｃｏｌｏｎｉｃａ、Ｐｓｙｃｈｒｏｓｉｎｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ、Ｐｅｌｏｓｉｎｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ、Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ  ｒｕｍｉｎａｎｔｉｕｍ、Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ  ｌａｃｔｉｃｉｆｅｘ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｑｕｅｒｃｉｃｏｌｕｍ、Ａｎａｅｒｏｖｉｂｒｉｏ  ｂｕｒｋｉｎａｂｅｎｓｉｓ、Ａｎａｅｒｏｖｉｂｒｉｏ  ｇｌｙｃｅｒｉｎｉ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ  ｒｈｉｚａｅ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｓｐｏｒａ  ｈｉｐｐｅｉ、Ａｎａｅｒｏｍｕｓａ  ａｃｉｄａｍｉｎｏｐｈｉｌａ、Ｓｕｃｃｉｎｉｓｐｉｒａ  ｍｏｂｉｌｉｓ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｖｕｌｇａｒｉｓ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｔｅｒｍｉｔｉｄｉｓ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｏｘａｍｉｃｕｓ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｏｒｙｚａｅ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｃａｎｓ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｆａｉｒｆｉｅｌｄｅｎｓｉｓ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｓｐｏｒａ  ｖｉｂｒｉｏｉｄｅｓ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ  ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓ、Ａｎａｅｒｏｓｐｏｒａ  ｈｏｎｇｋｏｎｇｅｎｓｉｓ、Ａｃｅｔｏｎｅｍａ  ｌｏｎｇｕｍ、Ｃａｒｎｏｃｏｃｃｕｓ  ａｌｌａｎｔｏｉｃｕｓＴｒｉｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｏｌｌｉｎｉｓｉｉ、並びに、Ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ＣＢＩＣ４５Ｉ１株及びその近縁の微生物等が挙げられる。これらの微生物を使用した場合、本発明の蓄放電可能な物質（所望の沈殿物）を得ることができる。微生物が上記から選択される１種であってもよく、複数種の微生物群集であってもよい。また、他の微生物を含んでもよい。複数種の微生物群集であることが好ましい。
【００２５】
培地に含まれる電解質としては、少なくともＦｅ３＋を含むものである。Ｆｅ３＋は、沈殿物の形成及び蓄放電能に重要であると考えられる。また、必須ではないがＣａ２＋、Ｋ＋、Ｔｉ３＋、Ｎａ＋、Ｃｕ２＋、Ｍｇ２＋、ＰＯ４３−、Ｓｅ４＋、Ｎｉ２＋、Ｃｏ２＋、Ｍｎ２＋、Ｚｎ２＋、Ｍｏ６＋、Ｗ６＋及びＦｅ２＋から選択される少なくとも１つの電解質を含んでもよい。さらに、上記微生物の培養に使用し得る電解質、すなわち、上記微生物の成長を促進する又は生存を妨げない電解質を含んでもよい。ＰＯ４３−は場合によってＨＰＯ４２−やＨ２ＰＯ４−の形態で存在し得る。
【００２６】
有機物としては、微生物に電子を提供でき得るものであれば、特に限定されない。例えば、微生物燃料電池の有機物源として通常利用される活性汚泥、糞尿、植物等の有機性廃棄物が挙げられる。また、電気生産効率を高めるため、低分子有機物、例えば、乳酸、クエン酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、蟻酸、又はピルビン酸である有機酸及びこれらの塩、並びにグルコースから選択される少なくとも１つを含むことが好ましい。さらに、グルコース以外に、例えば、フルクトース、スクロース、マルトース等の低分子糖類も好ましく用いられる。
【００２７】
得られる沈殿物は、少なくとも鉄元素を含む。数種類の沈殿物を分析した結果、鉄元素が蓄放電能に寄与していると考えられる。沈殿物はまた必須ではないが、さらにカルシウム、カリウム、炭素、チタン、ナトリウム、銅、マグネシウム、ケイ素、リン、フッ素、セレン、ニッケル、コバルト、モリブデン、タングステン及び酸素から選択される少なくとも１つの元素を含んでもよい。これらの元素も蓄放電能に関与している可能性がある。また、沈殿物は培養された微生物も含まれ得る。含まれる微生物が生菌または死骸のいずれでもあり得、また、沈殿物の表面に付着しているか沈殿物の内部に包含されるかのいずれの形態でも存在し得る。
【００２８】
微生物の種類又は微生物群集の構造によって、得られる沈殿物に含まれる元素や組成、さらにその蓄放電能が異なり得る。有機物を電子供与体とし金属を電子受容体とする微生物の嫌気的呼吸の下で、複数の微生物の近接に伴い金属イオン同士も近接し、生物化学的反応に基づき無機化合物が形成される。この無機化合物を核とし、周囲の他の無機化合物や微生物を巻き込んで沈殿が形成されると推測される。この状態の沈殿物において、電子移動が沈殿物の中（閉鎖状態）で生じており、よって沈殿物に電気が貯められ、これが蓄電のメカニズムと推測される。この沈殿物が電子を流しやすい場（電極）に接触すると、蓄えられていた電子が放出（放電）されると考えられる。一旦貯められた電気は、中に閉じ込められた微生物の存在にかかわらず、放電できると考えられる。また、放電した後沈殿物には、電子を貯められる容量（キャパシティー）があるため、再蓄電（再充電）においても微生物の存在に依存しないと予測される。ただし、微生物が生存している場合、例えば有機性廃棄物を処理しながら蓄電することが可能と考えられる。
【００２９】
上記培養は、一般的な嫌気性微生物の培養方法にしたがって行えばよく、特に限定されない。例えば、Ｎ２：ＣＯ２（８０：２０）の混合ガスで十分に脱気し、かつヘッドスペースを同じ混合ガスで置換した嫌気性の培地を用い、約２５℃にて静置条件で培養する。培地の組成は上記電解質以外に、一般的な嫌気培養に使われる培地成分を含んでもよい。充分に電気が貯められた沈殿物を得るために、１〜９０日間又はこれ以上の日数、好ましくは３〜６０日間行われることが好ましい。
【００３０】
上記蓄放電可能な物質は、上記沈殿物以外に、他の蓄放電性物質や賦形剤、フィラー、バインダーなど他の物質を含んでもよい。沈殿物は、そのまま無定形状態で含まれてもよく、粉末や粒状体、成形体に加工してもよい。蓄電可能な物質は、蓄放電物質として二次電池に応用することができる。また、微生物燃料電池の発電効率（電流密度）を高めるために、負極槽への添加剤又は負極の一部として使用することができる。さらに、微生物二次電池への応用も期待される。
【００３１】
本発明の二次電池は、本発明の蓄放電可能な物質を蓄放電物質として含むものである。二次電池の構造は一般的に知られているものでよく、例えば箱形、円筒状やボタン型等を基調とするもので、導電性の正極と負極とを備えるものであればよい。正極としては、カーボングラファイトや導電性物質等又はそれらに白金を担持したもの等からなるものが挙げられ、負極としてはカーボングラファイトや他の導電性物質等からなるものが挙げられる。また、電池パックは、形成し易いステンレスあるいはラミネート等に密封されてもよい。蓄放電可能な物質は、粉末、粒状体、又は成形体の状態で二次電池に充填されてもよく、二次電池における使用形態は、湿式又は乾式であり得る。使用量は二次電池の構造に準じ、負極槽への充填が望ましい。二次電池は、蓄放電可能な物質の蓄放電性に基づき、繰り返し充電・放電することができる。
【００３２】
本発明の微生物二次電池は、電気化学セルの負極槽中に、電気産生微生物と有機物と本発明の蓄放電可能な物質とを含むものである。微生物二次電池の構造は、一般的な微生物燃料電池に準じる。例えば、箱形や円筒状を基調とし、導電性の正極と負極とを備え、負極槽中に電気産生微生物と有機物と蓄放電可能な物質が添加されている、電気化学セルが挙げられる。正極及び負極は上記二次電池に準じる。また、微生物を培養するための液体培地が必要である。蓄放電可能な物質は、使用形態が湿式であり、使用量は構造に準じる。湿式かつ蓄電を行うためには、電気化学セルにガス排出口を設けることが好ましい。メンテナンスのために、電子供与体や新鮮な培地を供給できるようにすることが好ましく、そのための供給口及び排液口を有することが好ましい。微生物二次電池は、蓄放電可能な物質の蓄放電性に基づき、発電と放電とを別々に行うことができ、かつ、繰り返し蓄電・放電することができる。
【００３３】
蓄放電可能な物質は、粉末、粒状体、又は成形体の状態で負極槽に充填されてもよい。負極槽において、蓄放電可能な物質から放出する電子が負極にスムーズに流れるように、蓄放電可能な物質の少なくとも一部を負極に接触させることが好ましい。蓄放電可能な物質は、自重で培地の中で沈殿となるため、負極と接触させるためには、負極を負極槽の底部に設けることが好ましい。また、蓄放電可能な物質と負極との接触状態をより堅固にするために、蓄放電可能な物質の少なくとも一部を負極に接着させるか、負極と一体成型にする等の方法によって負極に固定してもよい。
【００３４】
上記微生物二次電池において使用し得る電気産生微生物は、特に限定されないが、Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ属、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ属、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ属、Ｄｅｓｕｌｆｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ属、Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ属、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ門、Ｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｓｐｏｒｏｔａｌｅａ属、Ｇｅｏｓｉｎｕｓ属、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ属、Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ属、Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａｃｅａｅ科、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属、Ｐｓｙｃｈｒｏｓｉｎｕｓ属、Ａｎａｅｒｏｖｉｂｒｉｏ属、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ属、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｓｐｏｒａ属、Ｓｕｃｃｉｎｉｓｐｉｒａ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｏｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ属、Ａｎａｅｒｏｓｐｏｒａ属、Ａｃｅｔｏｎｅｍａ属、Ｃａｒｎｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｔｒｉｃｈｏｃｏｃｃｕｓ属及びＰｅｌｏｓｉｎｕｓ属から選択される少なくとも１つであることが好ましい。例えば、Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ  ｓｕｌｆｕｒｒｅｄｕｃｅｎｓ，  Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ  ｌｏｖｌｅｙ、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓ，  Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｌｏｉｃｈｉｃａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｖｕｌｇａｒｉｓ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｏｒｙｚａｅ、Ｄｅｓｕｌｆｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ  ｇｕｔｔｏｉｄｅｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｉｄｒｉｅｎｓｉｓ、Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ａｎｔｈｒｏｐｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃｅｌｅｒｅｃｒｅｓｃｅｎｓ、Ｓｐｏｒｏｔａｌｅａ  ｐｒｏｐｉｏｎｉｃａ、Ｓｐｏｒｏｔａｌｅａ  ｃｏｌｏｎｉｃａ、Ｐｓｙｃｈｒｏｓｉｎｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ、Ｐｅｌｏｓｉｎｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ、Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ  ｒｕｍｉｎａｎｔｉｕｍ、Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ  ｌａｃｔｉｃｉｆｅｘ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｑｕｅｒｃｉｃｏｌｕｍ、Ａｎａｅｒｏｖｉｂｒｉｏ  ｂｕｒｋｉｎａｂｅｎｓｉｓ、Ａｎａｅｒｏｖｉｂｒｉｏ  ｇｌｙｃｅｒｉｎｉ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ  ｒｈｉｚａｅ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｓｐｏｒａ  ｈｉｐｐｅｉ、Ａｎａｅｒｏｍｕｓａ  ａｃｉｄａｍｉｎｏｐｈｉｌａ、Ｓｕｃｃｉｎｉｓｐｉｒａ  ｍｏｂｉｌｉｓ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｖｕｌｇａｒｉｓ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｔｅｒｍｉｔｉｄｉｓ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｏｘａｍｉｃｕｓ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｏｒｙｚａｅ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｃａｎｓ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｆａｉｒｆｉｅｌｄｅｎｓｉｓ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｓｐｏｒａ  ｖｉｂｒｉｏｉｄｅｓ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ  ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓ、Ａｎａｅｒｏｓｐｏｒａ  ｈｏｎｇｋｏｎｇｅｎｓｉｓ、Ａｃｅｔｏｎｅｍａ  ｌｏｎｇｕｍ、Ｃａｒｎｏｃｏｃｃｕｓ  ａｌｌａｎｔｏｉｃｕｓ、Ｔｒｉｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｏｌｌｉｎｉｓｉｉ、並びに、Ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ＣＢＩＣ４５Ｉ１株及びその近縁の微生物等が挙げられる。上記電気産生微生物は、上述した沈殿物質を生成する微生物と同じであってもよい。
【００３５】
微生物二次電池の他に、微生物燃料電池の発電効率を高めるために、蓄放電可能な物質を負極槽に添加する使用形態も考えられる。この場合、発電と放電とを同時に行ってもよく。蓄放電可能な物質の蓄放電能に基づき、産生した電子の流れをスムーズにでき、これによって電流密度を増加させることができる。
【００３６】
本発明の蓄放電可能な物質を製造する方法は、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ属、Ｄｅｓｕｌｆｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ属、Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ属、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ門、Ｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｓｐｏｒｏｔａｌｅａ属、Ｇｅｏｓｉｎｕｓ属、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ属、Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ属、Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａｃｅａｅ科、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属、Ｐｓｙｃｈｒｏｓｉｎｕｓ属、Ａｎａｅｒｏｖｉｂｒｉｏ属、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ属、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｓｐｏｒａ属、Ｓｕｃｃｉｎｉｓｐｉｒａ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｏｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ属、Ａｎａｅｒｏｓｐｏｒａ属、Ａｃｅｔｏｎｅｍａ属、Ｃａｒｎｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｔｒｉｃｈｏｃｏｃｃｕｓ属及びＰｅｌｏｓｉｎｕｓ属から選択される少なくとも１つの微生物を、少なくともＦｅ３＋を含む電解質と有機物とを含む培地にて培養するステップと、培地中に生成した沈殿物を分離するステップとを含む。微生物、電解質を含む培地及び培養方法は上述のとおりである。
【００３７】
沈殿物を分離する方法は、特に限定されない。例えば、遠心分離機によって分離する。また、分離した沈殿物をアルコール脱水や、減圧乾燥等によって乾燥させてもよい。沈殿物の保存条件は特に限定しないが、含まれる微生物の生存が望ましい場合、微生物の生存できる環境、例えば４℃〜２５℃の温度で保存することが好ましい。
【００３８】
以下、実施例を挙げて、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００３９】
（実施例１  蓄放電可能な物質（黒色沈殿物）の作製）
空気正極型微生物燃料電池を用い、面積４ｃｍ２の０．５ｍｇ白金担持カーボンペーパーを正極とし、面積４０ｃｍ２のカーボングラファイトを負極とし、正極と負極との間の外部抵抗として１０Ωを設置した。微生物の接種源として、日本国静岡県浜松市に位置する佐鳴湖底泥０．４ｇを微生物燃料電池の負極槽に添加し電流生産が確認された後に、負極溶液あるいは負電極を適当に希釈した。加圧培養試験管（三紳工業社製）にて下記の培地を用いて２５℃培養し、培養１９７日目にロールチューブ法を用いて複数の微生物コロニーを得た。
【００４０】
＜培地＞
ＫＨ２ＰＯ４                                  ０．５ｇ
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ                          ０．２０ｇ
ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ                          ０．１５ｇ
ＮＨ４Ｃｌ                                  ０．５ｇ
ＮａＨＣＯ３                                ２．５ｇ
クエン酸鉄（ＩＩＩ）                        ０．５ｍｍｏｌ
ＳＬ８ストック液（×１０００）              １．０ｍＬ
Ｓｅ／Ｗストック液（×１０００）            １．０ｍＬ
ビタミンミックスストック液（×１００）    １０．０ｍＬ
乳酸ナトリウム                            ２０ｍｍｏｌ
Ｆｅ（ＩＩＩ）ＥＤＴＡ                      ０．１ｍｍｏｌ
１％クエン酸チタン溶液                    １０．０ｍＬ
Ｇｅｌｌａｎ  Ｇｕｍ                      １７ｇ
精製水                                      適量      ／１Ｌ、ｐＨ  ７．５
＜ＳＬ８ストック液（×１０００）＞
ＥＤＴＡ  ２Ｎａ          ５．２ｇ
ＦｅＣｌ２・６Ｈ２Ｏ        １．４９ｇ
Ｈ３ＢＯ３                  ０．０６１ｇ
ＣｏＣｌ２                  ０．１９ｇ
ＺｎＣｌ２                  ０．０６８ｇ
ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ        ０．０９８ｇ
Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ      ０．０３６ｇ
ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ          ０．０３ｇ
ＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏ          ０．０１７ｇ      ／１Ｌ
＜Ｓｅ／Ｗストック液（×１０００）＞
Ｎａ２ＳｅＯ３                ６ｍｇ
Ｎａ２ＷＯ４  ２Ｈ２Ｏ     ８  ｍｇ      ／１Ｌ
＜ビタミンミックスストック液（×１００）＞
ｐ−アミノ安息香酸塩                ２０ｍｇ
ビオチン                              ５ｍｇ
ニコチン酸                          ５０ｍｇ
パントテン酸                        ２５ｍｇ
ピリドキシン                        ７５ｍｇ
チアミン                            ５０ｍｇ
コバラミン                          ５０ｍｇ      ／１Ｌ
【００４１】
得られた複数のコロニーをそれぞれ、Ｆｅ（ＩＩＩ）の濃度が０．１ｍＭとなるようにクエン酸鉄（ＩＩＩ）を添加した下記の培地に接種し、培養を行った。培養１４日目より、黒色沈殿物が生成する培養物と生成しない培養物が観察された。この黒色沈殿物を培養物から分離し、後に蓄放電能を有することが確認された。
【００４２】
ＫＨ２ＰＯ４                                  ０．５ｇ
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ                          ０．２０ｇ
ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ                          ０．１５ｇ
ＮＨ４Ｃｌ                                  ０．５ｇ
ＮａＨＣＯ３                                ２．５ｇ
１％クエン酸チタン溶液                    １０．０ｍＬ
クエン酸鉄（ＩＩＩ）                        ０．５ｍｍｏｌ
ＳＬ８ストック液（×１０００）              １．０ｍＬ
Ｓｅ／Ｗストック液（×１０００）            １．０ｍＬ
ビタミンミックスストック液（×１００）    １０．０ｍＬ
乳酸ナトリウム                            ２０ｍｍｏｌ
精製水                                      適量      ／１Ｌ、ｐＨ  ７．５
【００４３】
（実施例２  異なる微生物培養物由来の黒色沈殿物）
実施例１で得られた９つの微生物コロニーを直接接種して得られた直接培養物、及び直接培養物の１つを接種源として植継いで得られた４つの継代培養物について、フェノール／クロロフォルム抽出法によって微生物のゲノムＤＮＡを抽出した。その後、ＰＣＲ−ＤＧＧＥ法（Ｇ．Ｍｕｙｚｅｒら、Ｕｉｔｔｅｒｌｉｎｄｅｎ  Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９９３，Ｖｏｌ５９，ｐ６９５−７００）により１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を標的とした微生物群集構造解析を行った。ＰＣＲは、Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅとしてＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ（アプライドバイオシステムズ社製）を用い、プライマーは、上記論文に準じ、変性温度９４℃、アニーリング温度は５５℃、伸長反応７２℃で各反応時間は１分とし、３６サイクルの増幅を実施した。電気泳動ゲルの濃度勾配は３５％〜５５％であり、１０％アクリルアミドゲルを用いた。泳動条件は６０℃、８０Ｖで１２時間行った。
【００４４】
ＰＣＲ−ＤＧＧＥの結果は図１に示す。レーン１〜９は直接培養物であり、レーン１〜４は黒色沈殿物が生成した培養物、レーン５〜９は黒色沈殿物が生成しなかった培養物である。レーン１０〜１３は、レーン２の直接培養物の継代培養物であり、いずれも黒色沈殿物が生成した。
【００４５】
図１から、沈殿物非生成培養物であるレーン５〜９における特異的なバンド、例えばＰｅｌｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ  ｓｐ．に近縁の微生物を示すバンドは、沈殿物生成培養物であるレーン１〜４及び１０〜１３では検出されなかった。一方、沈殿物生成培養物における特異的なバンド、例えばバンド（１）及び（２）は、沈殿物非生成培養物において観察されなかった。このことから、沈殿生成培養物と沈殿非生成培養物とは、微生物群集構造が異なること、また、沈殿生成培養物において優占菌であるバンド（１）及び（２）を特徴とする微生物は黒色沈殿物の生成に関与していることが示唆された。なお、いずれの培養物においても、高電気生産微生物として知られているＳｈｅｗａｎｅｌｌａ属やＧｅｏｂａｃｔｅｒ属の細菌が確認されなかった。本実施例の培養物において、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ属及びＧｅｏｂａｃｔｅｒ属は少なくとも優占菌ではないことが示唆された。
【００４６】
また、レーン１０〜１３の培養物は、同一の親培養物（レーン２）に由来するにも関わらず、互いに異なる微生物群集構造を示した。さらに、レーン１０〜１３の黒色沈殿物も異なる形状を呈していた。このことから、黒色沈殿物の生成に複数の微生物種が関与していることが示唆された。また、培養物中の優占菌の種類や量によって得られる黒色沈殿物の組成が異なることも予想される。
【００４７】
さらに、バンド（１）及び（２）を特徴とする微生物を特定するため、以下の実験を行った。バンド（１）及び（２）をそれぞれゲルから切り出し、ゲルからＤＮＡをＴＥ緩衝溶液で抽出し、エタノールにより精製後、ＤＮＡ水溶液を調製した。このＤＮＡを鋳型として、Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅとしてＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて、ＰＣＲ（変性９４℃、アニーリング５５℃、伸長７２℃、各反応時間１分、サイクル数２５回）を実施した。得られたＰＣＲ産物をクローニングし、Ｄｙｅ−ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ法により解析した。１つのサンプルに対して５個以上解析し、全てが同一であることを確認した。得られたバンド（１）及び（２）の塩基配列は以下に示す。
【００４８】
バンド（１）の塩基配列（配列番号１）
ＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＡＧＴＧＧＧＧＡＡＴＣＴＴＣＣＧＣＡＡＴＧＧＡＣＧＡＡＡＧＴＣＴＧＡＣＧＧＡＧＣＡＡＣＧＣＣＧＣＧＴＧＡＧＴＧＡＡＧＡＡＧＧＴＴＴＴＣＧＧＡＴＣＧＴＡＡＡＡＣＴＣＴＧＴＴＴＴＣＡＧＧＧＡＣＧＡＡＴＧＴＧＣＴＧＴＴＴＧＴＡＡＡＴＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣＡＡＴＧＡＣＧＧＴＡＣＣＴＧＡＣＡＡＧＡＡＡＧＣＣＡＣＧＧＣＴＡＡＣＴＡＣＧＴＧ
【００４９】
バンド（２）の塩基配列（配列番号２）
ＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＡＧＴＧＧＧＧＡＡＴＡＴＴＧＣＧＣＡＡＴＧＧＧＣＴＡＡＡＧＣＣＴＧＡＣＧＣＡＧＣＧＡＣＧＣＣＧＣＧＴＧＡＧＧＧＡＴＧＡＡＧＧＴＣＣＴＣＧＧＡＴＣＧＴＡＡＡＣＣＴＣＴＧＴＣＡＧＧＡＧＧＧＡＡＧＡＡＣＣＧＣＣＡＣＧＧＴＧＣＴＡＡＴＣＡＧＣＣＧＴＧＧＴＣＴＧＡＣＧＧＴＡＣＣＴＣＣＡＡＡＧＧＡＡＧＣＡＣＣＧＧＣＴＡＡＣＴＣＣＧＴＧ
【００５０】
得られた塩基配列に基づき、Ｂｌａｓｔ（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／ｂｌａｓｔ／ｂｌａｓｔｎ？ｌａｎｇ＝ｊａ）を用いて近縁微生物を１００個検索した。検索結果を以下にて示す。
【００５１】
バンド（１）の塩基配列に基づく検索結果
Score    E
Sequences producing significant alignments:                        (bits) Value
FN689723|FN689723.1 Sporotalea propionica partial 16S rRNA gene,...   287 1e-74
FN689722|FN689722.1 Sporotalea propionica partial 16S rRNA gene,...   287 1e-74
EF469692|EF469692.1 Geosinus sp. 803 16S small subunit ribosomal...   287 1e-74
EF469683|EF469683.1 Geosinus sp. 790 16S small subunit ribosomal...   287 1e-74
AM258974|AM258974.1 Sporotalea propionica partial 16S rRNAgene,...   287  1e-74
AB425279|AB425279.1 Sporotalea colonica gene for 16S rRNA,parti...   287  1e-74
DQ833371|DQ833371.1 Firmicutes bacterium BD7-2 16S ribosomalRNA...   280  2e-72
AM258975|AM258975.1 Sporotalea propionica partial 16S rRNAgene,...   280  2e-72
EU215386|EU215386.1 Pelosinus sp. UFO1 16S ribosomal RNApseudog...   272  6e-70
EF469680|EF469680.1 Geosinus sp. 785 16S small subunitribosomal...   272  6e-70
DQ833370|DQ833370.1 Firmicutes bacterium BD7-3 16S ribosomalRNA...   272  6e-70
DQ295866|DQ295866.1 Pelosinus sp. UFO1 16S ribosomal RNA gene,p...  272  6e-70
HM768898|HM768898.1 Pelosinus sp. BXM 16S ribosomal RNA gene,pa...   264  1e-67
DQ767882|DQ767882.1 Veillonellaceae bacterium FCF9B 16Sribosoma...   256  4e-65
DQ767881|DQ767881.1 Psychrosinus fermentans strain FCF9 16Sribo...   256  4e-65
DQ145536|DQ145536.1 Pelosinus fermentans strain R7 16Sribosomal...   256  4e-65
DQ833372|DQ833372.1 Firmicutes bacterium BD7-1 16S ribosomalRNA...   236  3e-59
EU728739|EU728739.1 Selenomonas sp. DJF_CR90 16S ribosomal RNAg...   224  1e-55
HM000123|HM000123.1 Selenomonas ruminantium strain CLRI1 16Srib...   216  3e-53
HE582766|HE582766.1 Selenomonas lacticifex partial 16S rRNAgene...   216  3e-53
HE582765|HE582765.1 Selenomonas lacticifex partial 16S rRNAgene...   216  3e-53
EF112197|EF112197.1 Selenomonas ruminantium strain 65 16Sriboso...   216  3e-53
DQ186901|DQ186901.1 Selenomonas ruminantium strain 19 16Sriboso...   216  3e-53
AY685142|AY685142.1 Selenomonas ruminantium isolate M40 16Sribo...   216  3e-53
AJ010962|AJ010962.1 Clostridium quercicolum 16S rRNA gene,strai...   216  3e-53
AJ010961|AJ010961.1 Anaerovibrio burkinabensis DSM 6283(T), 16S...   216  3e-53
AF373024|AF373024.1 Selenomonas lacticifex strain DSM20757 16Sr...   216  3e-53
AY661932|AY661932.1 Bacterium M-1 small subunit ribosomal RNAge...   214  1e-52
M59110|M59110.1 Clostridium quercicolum 16S ribosomalRNA.            210  2e-51
HE582767|HE582767.1 Selenomonas lacticifex partial 16S rRNAgene...   208  7e-51
AM158322|AM158322.1 Sporomusa rhizae partial 16S rRNA gene,type...   208  7e-51
AJ508927|AJ508927.1 Propionispora hippei partial 16S rRNA gene,...   208  7e-51
AF071415|AF071415.1 Anaeromusa acidaminophila 16S ribosomal RNA...   208  7e-51
AY661933|AY661933.1 Bacterium M-4 small subunit ribosomal RNAge...   202  5e-49
HM755724|HM755724.2 Clostridium sp. SW001 16S ribosomal RNA gene...   200 2e-48
DQ205191|DQ205191.1 Low G+C Gram-positive bacterium TR1 cloneMB...   200  2e-48
AY442820|AY442820.1 Bacterium YE56 16S ribosomal RNA gene,parti...   200  2e-48
AJ508928|AJ508928.1 Propionispora hippei partial 16S rRNA gene,...   200  2e-48
AJ010960|AJ010960.1 Anaerovibrio glycerini DSM 5192(T), 16SrRNA...   200  2e-48
Y17763|Y17763.1 Sporomusa sp. DR1/8 16S ribosomal DNA,partial.       194  1e-46
AJ006980|AJ006980.1 Succinispira mobilis 16S rRNAgene.              192  4e-46
AF150722|AF150722.1 Elbe River snow isolate SeqSRB5 16Sribosoma...   192  4e-46
FJ897478|FJ897478.1 Bacillus sp. NII-78 16S ribosomal RNA gene,...   190  2e-45
JQ388735|JQ388735.1 Bacillus sp. J2044/1-A 16S ribosomal RNAgen...   188  7e-45
JQ259336|JQ259336.1 Bacillaceae bacterium 'ARUP UnID 140'strain...   188  7e-45
JF893466|JF893466.1 Bacillus sp. NIOC16 16S ribosomal RNA gene,...   188  7e-45
JF893460|JF893460.1 Bacillus sp. NIOC10 16S ribosomal RNA gene,...   188  7e-45
HE577175|HE577175.1 Jeotgalibacillus sp. WS 4628 partial 16SrRN...   188  7e-45
GU339270|GU339270.1 Glacial ice bacterium EH41 16S ribosomalRNA...   188  7e-45
GU339248|GU339248.1 Glacial ice bacterium EH18 16S ribosomalRNA...   188  7e-45
GQ162111|GQ162111.1 Oceanobacillus sp. Sj-1 16S ribosomal RNAge...   188  7e-45
FN435845|FN435845.1 Bacillus sp. VM2T partial 16S rRNA gene,str...   188  7e-45
FM992841|FM992841.1 Firmicutes bacterium M71_S54 partial 16SrRN...   188  7e-45
FM992816|FM992816.1 Firmicutes bacterium M71_D119 partial 16SrR...   188  7e-45
FM875882|FM875882.1 Bacillaceae bacterium B2-147 partial 16SrRN...   188  7e-45
FJ809934|FJ809934.1 Bacillus sp. AER315-13 16S ribosomal RNAgen...   188  7e-45
EU817570|EU817570.1 Oceanobacillus sp. CHL-21 16S ribosomal RNA...   188  7e-45
EU571191|EU571191.1 Bacillus sp. 25-3 16S ribosomal RNA gene,pa...   188  7e-45
EU571188|EU571188.1 Bacillus sp. 23-9 16S ribosomal RNA gene, pa...   188 7e-45
EU221363|EU221363.1 Bacillus badius strain B2S2 16S ribosomal RN...  188  7e-45
EF503543|EF503543.1 Bacillus sp. HPC957 16S ribosomal RNA gene,...   188  7e-45
EF392690|EF392690.1 Bacillus sp. SL1213 16S ribosomal RNA gene,...   188  7e-45
EF379274|EF379274.1 Bacillus sp. SL213 16S ribosomal RNA gene,p...   188  7e-45
DQ350833|DQ350833.1 Empedobacter brevis strain N1 16S ribosomal...   188  7e-45
DQ280367|DQ280367.1 Bacillus kribbensis strain BT080 16Sribosom...   188  7e-45
AY756053|AY756053.1 Unidentified bacterium VCT113 16S ribosomal...   188  7e-45
AY756051|AY756051.1 Unidentified bacterium VCT106 16S ribosomal...   188  7e-45
AY211152|AY211152.1 Bacillus sp. 'Mali 58' 16S ribosomal RNAgen...   188  7e-45
AY211142|AY211142.1 Bacillus sp. 'Mali 48' 16S ribosomal RNAgen...   188  7e-45
AY211106|AY211106.1 Bacillus sp. 'Mali 12' 16S ribosomal RNAgen...   188  7e-45
AM950309|AM950309.1 Bacillus sp. DS10 HS-2008 partial 16S rRNAg...   188  7e-45
AF479347|AF479347.1 Glacial ice bacterium G200-N5 16S ribosomal...   188  7e-45
AF354665|AF354665.1 Bacillus sp. UM14 16S ribosomal RNA gene,pa...   188  7e-45
AF227844|AF227844.2 Bacillus sp. 76992 16S ribosomal RNA gene,p...   188  7e-45
AB682203|AB682203.1 Bacillus sp. NBRC 104470 gene for 16S rRNA,...   188  7e-45
AB425362|AB425362.1 Bacillus sp. S207 gene for 16S rRNA,partial...   188  7e-45
AB210962|AB210962.1 Low G+C Gram-positive bacterium SSCT76 gene...   188  7e-45
AJ279802|AJ279802.1 Propionispora vibrioides 16S rRNA gene, isol...  186  3e-44
AJ279798|AJ279798.1 Sporomusa acidovorans 16S rRNA gene, strain...   186  3e-44
Y17760|Y17760.1 Sporomusa sp. DR6 16S ribosomal DNA,partial.         184  1e-43
EF060193|EF060193.1 Sporomusa sp. An4 16S ribosomal RNA gene,pa...   184  1e-43
AY372052|AY372052.1 Anaerospora hongkongensis 16S ribosomal RNA...   184  1e-43
AJ279800|AJ279800.1 Sporomusa ovata 16S rRNA gene, strain DSM26...   184  1e-43
AJ010964|AJ010964.1 Acetonema longum DSM 6540(T), 16S rRNAgene.      184  1e-43
X87150|X87150.1 L.pasteurii 16S rRNAgene.                           182  4e-43
M98448|M98448.1 Carnococcus allantoicus small ribosomal subunit...   182  4e-43
JQ771693|JQ771693.1 Trichococcus collinsii isolate DGGE band M1...   182  4e-43
JQ659562|JQ659562.1 Bacillus sp. R1-310 16S ribosomal RNA gene,...   182  4e-43
JQ322864|JQ322864.1 Trichococcus sp. UA-G042 16S ribosomal RNAg...   182  4e-43
JN873156|JN873156.1 Trichococcus sp. KOPRI80187 16S ribosomalRN...   182  4e-43
JN873155|JN873155.1 Trichococcus sp. KOPRI80159 16S ribosomalRN...   182  4e-43
JN873154|JN873154.1 Trichococcus sp. KOPRI80185 16S ribosomalRN...   182  4e-43
JN873153|JN873153.1 Trichococcus sp. KOPRI80183 16S ribosomalRN...   182  4e-43
JN873152|JN873152.1 Trichococcus sp. KOPRI80179 16S ribosomalRN...   182  4e-43
JN873151|JN873151.1 Trichococcus sp. KOPRI80176 16S ribosomalRN...   182  4e-43
JN873150|JN873150.1 Trichococcus sp. KOPRI80175 16S ribosomalRN...   182  4e-43
JN873149|JN873149.1 Trichococcus sp. KOPRI80173 16S ribosomal RN...  182  4e-43
JN873148|JN873148.1 Trichococcus sp. KOPRI80165 16S ribosomalRN...   182  4e-43
JF505984|JF505984.1 Trichococcus flocculiformis strain KNUC9050...   182  4e-43
JF505981|JF505981.1 Trichococcus flocculiformis strain KNUC9047...   182  4e-43
【００５２】
バンド（２）塩基配列に基づく検索結果
Score    E
Sequences producing significant alignments:                        (bits) Value
X86689|X86689.1 Desulfovibrio 16S rRNA gene.                         333  2e-88
EU937733|EU937733.1 Desulfovibrio sp. M1 16S ribosomal RNAgene,...   333  2e-88
DQ826728|DQ826728.1 Desulfovibrio vulgaris subsp. vulgaris 16Sr...   333  2e-88
DQ517283|DQ517283.1 Desulfovibrio vulgaris strain Lac3 16Sribos...   333  2e-88
CP002297|CP002297.1 Desulfovibrio vulgaris RCH1, completegenome.     333  2e-88
CP000527|CP000527.1 Desulfovibrio vulgaris DP4, completegenome.      333  2e-88
AY548773|AY548773.1 Desulfovibrio sp. PL35L1 16S ribosomal RNAg...   333  2e-88
AY362360|AY362360.1 Desulfovibrio vulgaris strain I5 16S ribosom...  333  2e-88
AF418179|AF418179.1 Desulfovibrio vulgaris DSM 644 16Sribosomal...   333  2e-88
AE017285|AE017285.1 Desulfovibrio vulgaris subsp. vulgaris str....   333  2e-88
AB294142|AB294142.1 Desulfovibrio vulgaris gene for 16S rRNA, pa...  333  2e-88
AB252583|AB252583.1 Desulfovibrio vulgaris gene for 16S rRNA,pa...   333  2e-88
AB237496|AB237496.1 Desulfovibrio vulgaris gene for 16S rRNA,pa...   325  5e-86
AY548758|AY548758.1 Desulfovibrio sp. SA1 16S ribosomal RNAgene...   319  3e-84
AF131234|AF131234.1 Desulfovibrio sp. 'Bendigo A' 16S ribosomal...   309  3e-81
EU937737|EU937737.1 Desulfovibrio sp. MD-4 16S ribosomal RNAgen...   303  2e-79
HM754210|HM754210.1 Desulfovibrio sp. GY2 clone 4 16S ribosomal...   293  2e-76
HM754209|HM754209.1 Desulfovibrio sp. GY2 clone 3 16S ribosomal...   293  2e-76
HM754208|HM754208.1 Desulfovibrio sp. GY2 clone 2 16S ribosomal...   293  2e-76
HM754207|HM754207.1 Desulfovibrio sp. GY2 clone 1 16S ribosomal...   293  2e-76
Z24450|Z24450.1 D.longreachii ribosomal RNA.                         293  2e-76
Y12255|Y12255.1 Desulfovibrio termitidis 16S rRNA gene, strainK...   293  2e-76
X93147|X93147.1 Desulfovibrio sp. 16S ribosomal RNA (strainKH2).     293  2e-76
X87409|X87409.1 D.termitidis DNA for 16S ribosomalRNA.              293  2e-76
JN314423|JN314423.1 Desulfovibrio sp. BDNE1 16S ribosomal RNAge...   293  2e-76
DQ122124|DQ122124.1 Desulfovibrio vulgaris subsp. oxamicusstrai...   293  2e-76
CP001197|CP001197.1 Desulfovibrio vulgaris str. 'Miyazaki F',co...   293  2e-76
AY928661|AY928661.1 Desulfovibrio sp. A1 16S ribosomal RNAgene,...   293  2e-76
AY770382|AY770382.1 Desulfovibrio sp. A2 16S ribosomal RNAgene,...   293  2e-76
AY570691|AY570691.1 Desulfovibrio sp. Bsl2 16S ribosomal RNAgen...   293  2e-76
AY059411|AY059411.1 Desulfovibrio sp. R2 16S ribosomal RNAgene,...   293  2e-76
AJ295679|AJ295679.1 Desulfovibrio sp. JG5 partial 16S rRNAgene.      293  2e-76
AJ295678|AJ295678.1 Desulfovibrio sp. JG1 partial 16S rRNAgene.      293  2e-76
AJ295677|AJ295677.1 Desulfovibrio oxamicus partial 16S rRNAgene...   293  2e-76
AJ295670|AJ295670.1 Desulfovibrio sp. IrT-JG1-58 partial 16SrRN...   293  2e-76
AJ295669|AJ295669.1 Desulfovibrio sp. IrT-JG1-71 partial 16S rRN...  293  2e-76
AF273083|AF273083.1 Desulfovibrio oryzae 16S ribosomal RNAgene,...   293  2e-76
M34399|M34399.1 D.vulgaris 16S ribosomal rRNA.                       291  6e-76
GQ324626|GQ324626.1 Desulfovibrio vulgaris strain TERIMIC151216...   291  6e-76
M98496|M98496.1 Desulfovibrio sp. PT-2 16S ribosomal RNA gene,c...   287  1e-74
AY664595|AY664595.1 Desulfovibrio termitidis isolate PETROMICB0...   285  4e-74
HQ022824|HQ022824.1 Desulfovibrio sp. J01 16S ribosomal RNAgene...   278  1e-71
AY928662|AY928662.1 Desulfovibrio sp. A4 16S ribosomal RNAgene,...   272  6e-70
AB298729|AB298729.1 Desulfovibrionaceae bacterium WN022 genefor...   264  1e-67
AY928231|AY928231.1 Bacterium S9552 16S ribosomal RNA gene,part...   262  6e-67
AY554146|AY554146.1 Desulfovibrio sp. LNB2 16S ribosomal RNAgen...   262  6e-67
AF056091|AF056091.1 Desulfovibrio sp. UNSW3caefatS 16Sribosomal...   254  1e-64
EU882409|EU882409.1 Desulfovibrio vulgaris 16S ribosomal RNAgen...   250  2e-63
Y12254|Y12254.1 Desulfovibrio intestinalis 16S rRNA gene, strain...   238 8e-60
Y12253|Y12253.1 Desulfovibrio intestinalis 16S rRNA gene,strain...   238  8e-60
JQ608096|JQ608096.1 Bacterium NLAE-zl-c390 16S ribosomal RNAgen...   238  8e-60
JQ607874|JQ607874.1 Bacterium NLAE-zl-C135 16S ribosomal RNAgen...   238  8e-60
JQ607812|JQ607812.1 Bacterium NLAE-zl-C69 16S ribosomal RNAgene...   238  8e-60
JQ607796|JQ607796.1 Bacterium NLAE-zl-C55 16S ribosomal RNAgene...   238  8e-60
JQ607393|JQ607393.1 Bacterium NLAE-zl-P74 16S ribosomal RNAgene...   238  8e-60
JQ607389|JQ607389.1 Bacterium NLAE-zl-P73 16S ribosomal RNAgene...   238  8e-60
JQ607383|JQ607383.1 Bacterium NLAE-zl-P72 16S ribosomal RNAgene...   238  8e-60
JQ606989|JQ606989.1 Bacterium NLAE-zl-P434 16S ribosomal RNAgen...   238  8e-60
FR733678|FR733678.1 Desulfovibrio simplex partial 16S rRNAgene,...   238  8e-60
FJ815444|FJ815444.1 Desulfovibrio sp. G11 16S ribosomal RNAgene...   238  8e-60
CP001358|CP001358.1 Desulfovibrio desulfuricans subsp. desulfuri...  238  8e-60
AY548772|AY548772.1 Desulfovibrio sp. RPf35E1 16S ribosomal RNA...   238  8e-60
AJ295680|AJ295680.1 Desulfovibrio intestinalis partial 16S rRNA...   238  8e-60
AF192154|AF192154.1 Desulfovibrio desulfuricans subsp.desulfuri...   238  8e-60
AB603520|AB603520.1 Desulfovibrio simplex gene for 16S rRNA,par...   238  8e-60
JQ607803|JQ607803.1 Bacterium NLAE-zl-C56 16S ribosomal RNAgene...   234  1e-58
JQ608116|JQ608116.1 Bacterium NLAE-zl-C412 16S ribosomal RNAgen...   232  5e-58
EU882412|EU882412.1 Desulfovibrio termitidis 16S ribosomal RNA g...  232  5e-58
JQ608159|JQ608159.1 Bacterium NLAE-zl-C456 16S ribosomal RNAgen...   230  2e-57
JQ608141|JQ608141.1 Bacterium NLAE-zl-C437 16S ribosomal RNAgen...   230  2e-57
JQ608105|JQ608105.1 Bacterium NLAE-zl-C400 16S ribosomal RNAgen...   230  2e-57
EU980605|EU980605.1 Desulfovibrio desulfuricans strain Ser-116S...   230  2e-57
DQ526427|DQ526427.1 Desulfovibrio desulfuricans strain EFX-DES1...   230  2e-57
AJ630285|AJ630285.1 Desulfovibrio intestinalis partial 16S rRNA...   230  2e-57
AF150723|AF150723.1 Elbe River snow isolate SRB4neu 16Sribosoma...   230  2e-57
JQ608146|JQ608146.1 Bacterium NLAE-zl-C443 16S ribosomal RNAgen...   228  8e-57
M80617|M80617.1 Desulfovibrio sp. 16S ribosomal RNAfragment.         224  1e-55
JQ608252|JQ608252.1 Bacterium NLAE-zl-C552 16S ribosomal RNAgen...   224  1e-55
FJ655841|FJ655841.1 Desulfovibrio desulfuricans isolate S15 16S...   224  1e-55
AJ415573|AJ415573.1 Desulfovibrio desulfuricans partial 16SrRNA...   224  1e-55
JX232355|JX232355.1 Brachyspira sp. NSH-25 16S ribosomal RNAgen...   222  5e-55
X93148|X93148.1 Desulfovibrio sp. 16S ribosomal RNA (strainKRS2).    222  5e-55
X93146|X93146.1 Desulfovibrio sp. 16S ribosomal RNA (strainKRS1).    222  5e-55
U42221|U42221.1 Desulfovibrio fairfieldensis 16S ribosomal RNAg...   222  5e-55
M34113|M34113.1 D.desulfuricans 16S ribosomal RNAgene.              222  5e-55
JQ608320|JQ608320.1 Bacterium NLAE-zl-C467 16S ribosomal RNAgen...   222  5e-55
GU585444|GU585444.1 Bacterium E51 16S ribosomal RNA gene, partia...  222  5e-55
FJ873799|FJ873799.1 Desulfovibrio desulfuricans strain SRB-2216...   222  5e-55
EU980606|EU980606.1 Desulfovibrio desulfuricans strain Ser-2 16S...  222  5e-55
DQ517287|DQ517287.1 Desulfovibrio desulfuricans strain 734 16Sr...   222  5e-55
DQ450463|DQ450463.1 Desulfovibrio desulfuricans isolate SRB1616...   222  5e-55
DQ417602|DQ417602.1 Desulfovibrio desulfuricans strain DM18 16S...   222  5e-55
DQ092636|DQ092636.1 Desulfovibrio desulfuricans strain F28-116S...   222  5e-55
AY554145|AY554145.1 Desulfovibrio sp. LNB1 16S ribosomal RNAgen...   222  5e-55
AY532164|AY532164.1 Desulfovibrio sp. ZIRB-2 small subunitribos...   222  5e-55
AF354664|AF354664.1 Desulfovibrio desulfuricans 16S ribosomalRN...   222  5e-55
AF192153|AF192153.1 Desulfovibrio desulfuricans subsp.desulfuri...   222  5e-55
JQ607872|JQ607872.1 Bacterium NLAE-zl-C133 16S ribosomal RNAgen...   218  8e-54
U60095|U60095.1 Desulfovibrio sp. IC1 16S ribosomal RNA gene,pa...   216  3e-53
JQ608158|JQ608158.1 Bacterium NLAE-zl-C455 16S ribosomal RNAgen...   214  1e-52
【００５３】
上記結果から、沈殿物を産生する微生物は、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ属、Ｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｓｐｏｒｏｔａｌｅａ属、Ｇｅｏｓｉｎｕｓ属、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ属、Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ属、Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａｃｅａｅ科、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属、Ｐｓｙｃｈｒｏｓｉｎｕｓ属、Ａｎａｅｒｏｖｉｂｒｉｏ属、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ属、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｓｐｏｒａ属、Ｓｕｃｃｉｎｉｓｐｉｒａ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｏｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ属、Ａｎａｅｒｏｓｐｏｒａ属、Ａｃｅｔｏｎｅｍａ属、Ｃａｒｎｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｔｒｉｃｈｏｃｏｃｃｕｓ属及びＰｅｌｏｓｉｎｕｓ属から選択される少なくとも１つの微生物と推測され、さらに、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｖｕｌｇａｒｉｓ、Ｓｐｏｒｏｔａｌｅａ  ｐｒｏｐｉｏｎｉｃａ、Ｓｐｏｒｏｔａｌｅａ  ｃｏｌｏｎｉｃａ、Ｐｓｙｃｈｒｏｓｉｎｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ、Ｐｅｌｏｓｉｎｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ、Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ  ｒｕｍｉｎａｎｔｉｕｍ、Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ  ｌａｃｔｉｃｉｆｅｘ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｑｕｅｒｃｉｃｏｌｕｍ、Ａｎａｅｒｏｖｉｂｒｉｏ  ｂｕｒｋｉｎａｂｅｎｓｉｓ、Ａｎａｅｒｏｖｉｂｒｉｏ  ｇｌｙｃｅｒｉｎｉ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ  ｒｈｉｚａｅ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｓｐｏｒａ  ｈｉｐｐｅｉ、Ａｎａｅｒｏｍｕｓａ  ａｃｉｄａｍｉｎｏｐｈｉｌａ、Ｓｕｃｃｉｎｉｓｐｉｒａ  ｍｏｂｉｌｉｓ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｖｕｌｇａｒｉｓ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｔｅｒｍｉｔｉｄｉｓ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｏｘａｍｉｃｕｓ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｏｒｙｚａｅ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｃａｎｓ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｆａｉｒｆｉｅｌｄｅｎｓｉｓ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｓｐｏｒａ  ｖｉｂｒｉｏｉｄｅｓ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ  ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓ、Ａｎａｅｒｏｓｐｏｒａ  ｈｏｎｇｋｏｎｇｅｎｓｉｓ、Ａｃｅｔｏｎｅｍａ  ｌｏｎｇｕｍ、Ｃａｒｎｏｃｏｃｃｕｓ  ａｌｌａｎｔｏｉｃｕｓ及びＴｒｉｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｏｌｌｉｎｉｓｉｉから選択される少なくとも１つの微生物を含むと推測される。
【００５４】
（実施例３  黒色沈殿物の元素分析）
実施例２で得られた４つの継代培養物（レーン１０〜１３）によって生成された黒色沈殿物（以下、それぞれ黒色沈殿物タイプＡ、タイプＢ、タイプＣ及びタイプＤという）について元素分析を行った。また、コントロールとして、実施例１において微生物を含む湖底泥を添加しないで得られた沈殿物を用いた。
【００５５】
まず、１ｍＬ培養物について１５，０００ｇで４分の遠心分離を行い、培養上清を静かに抜き取ることにより黒色沈殿物を回収した。回収された沈殿物をエタノールによる脱水処理を行った。具体的には、沈殿物を１０％、２５％、３０％、５０％、７５％、９５％及び１００％のエタノール水溶液に、順番にそれぞれ１５分間浸漬を２回ずつ行った。
【００５６】
脱水処理した沈殿物をエネルギー分散型Ｘ線分析装置（Ｍｉｎｉｓｃｏｐｅ  ＴＭ３０００、日立製作所社製）を用いて、形状観察及び元素分析を行った。スペクトルの収集時間は５０．０秒であり、加速電圧が１５．０ｋＶであった。
【００５７】
分析結果は図２〜１７に示す。電子顕微鏡写真から、黒色沈殿物は平たい多角形を呈していることが分かった。一方、微生物未接種下で生じた沈殿物（コントロール）は、粒子状を呈していることが分かった。また元素分析の結果から、黒色沈殿物には、炭素、酸素、フッ素、ナトリウム、マグネシウム、ケイ素、リン、硫黄、カリウム、カルシウム、チタン、鉄及びセレン等多数の元素が含まれており、培地中の成分が反映されたと考えられる。一方、コントロールの沈殿物にも多数の元素が含まれており、蓄放電能を有する黒色沈殿物とは大きな差異は認められなかった。この結果から、蓄放電能を有する黒色沈殿物は、所定の微生物が存在する場合にのみ得られるものであると示唆された。しかし、そのメカニズムはまだ解明されていない。
【００５８】
（実施例４  黒色沈殿物の蓄放電能）
幅０．５ｃｍ、縦横２ｃｍ×２ｃｍの負極槽内に、０．５×０．５×２．０ｃｍのカーボングラファイトを負極として設置した。その中に、培養３２日目で回収した黒色沈殿物懸濁液タイプＡ〜Ｄ（約０．１５ｍｇ；濃度：５０ｍｇ／Ｌ）を添加した後、負極と正極を外部抵抗５１０Ωで連結し、データロガ（ｍｉｄｉ  ＬＯＧＧＥＲ、ＧＬ２００Ａ、グラフテック株式会社製）で電圧を５分間隔で測定した。対照として、微生物未接種のコントロールを用いた。また、活性汚泥及び終濃度２０ｍＭの乳酸水溶液を添加した系も設定した。測定した電圧を用い、オームの法則（Ｖ＝ＲＩ）に従って電流値を求めた。
【００５９】
結果は図１８に示す。図１８から、微生物として活性汚泥及び有機物として乳酸を添加した系では、通常の微生物燃料電池の場合と同様に、誘導期を経てから電流の産生が確認された。これに対して、微生物及び有機物が添加されていない黒色沈殿物の系においては、負極と正極が連結された直後（０時間）に電流の発生が認められた。このことから、黒色沈殿物には電気が蓄積されていること、そして、蓄積された電気を放出できること、すなわち、黒色沈殿物が蓄電放電能を有することが示唆された。また、図１８から黒色沈殿物のタイプによって蓄放電能に差があり、タイプＡが最も高い蓄放電能を有することが分かった。微生物群集構造が異なると、黒色沈殿物の形状は異なり、また、蓄放電能にも差があることから、微生物種の組み合せ及びそれぞれの存在量が黒色沈殿物の組成及び放蓄電能力に影響すると推測される。これに対して、コントロールの沈殿物において蓄電・放電能が認められなかった。これは恐らく、コントロールの沈殿物には、微生物が介在していないためと推測される。このことからも、黒色沈殿物による蓄放電能は微生物と無機物との相互作用によるものであると推測される。
【００６０】
（実施例５  黒色沈殿物における微生物の有無及び微生物による蓄放電能への影響）
黒色沈殿物における微生物の有無及び微生物による蓄放電能への影響を調べるため、培養８９日目で回収した黒色沈殿物懸濁液タイプＡについて分析した。まず、微生物の有無を確認するため、電子顕微鏡により観察した。結果は図１９に示す。また、１２１℃にて、１．１気圧下で１５分間オートクレーブにて滅菌処理した沈殿物タイプＡと沈殿物タイプＡの放電能（電流密度）も測定した。結果は図２０に示す。
【００６１】
図１９からは、黒色沈殿物の表面に微生物が付着していることが分かった。図２０からは、滅菌処理と未滅菌とでは、沈殿物の放電能力に大きな差異は認められなかった。実施例４（図１８）の結果と比べて、放電時間が短かったが、これは恐らく実施例５の沈殿物は培養日数が長いため、沈殿物に蓄積された電子は微生物に消費されてしまったと推測される。
【００６２】
上記の結果から、所定の微生物は沈殿物の蓄電に関与しており、放電そのものには関与していないと推測される。沈殿物表面に付着している又は沈殿物の中に取り込まれている微生物によって発生した電子は、沈殿物に蓄電されると考えられる。沈殿物を２次電池に応用する場合、微生物は必ずしも必要ではないが、含んだほうがよりよいと考えられる。微生物が存在しない場合は、純粋に物理化学的再充電となり、エネルギーが必要となるが、微生物が存在していれば、有機廃棄物の処理とエネルギーの蓄積とを同時に行えるからである。
【００６３】
（実施例６  黒色物質の酸化還元電位特性の解析）
（１）黒色物質の回収
黒色物質を以下のようにして回収した。なお、以下の操作は遠心分離を除いて全て嫌気チャンバー内で行った。
培養してから２４日経過した黒色物質生成培養物の上清を滅菌したピペットである程度除去した後、黒色物質が均一になるように撹拌し、２０ｍＬずつ６本の遠沈管に分注した。遠沈管を２０００×ｇで５分間遠心分離した。上清を除去し、新鮮な培地（作製法は後述）を遠沈管１本につき２０ｍＬ加え懸濁した。その後、６本のサンプルのうち、２本ずつを１本にまとめ、計３本とした。そして、さらに遠沈管を２０００×ｇで５分間遠心分離した。上清を除去し、新鮮な培地を遠沈管１本につき２０ｍＬ加え、懸濁し、さらに遠沈管を２０００×ｇで５分間遠心分離する作業を２回行った。
上清を除去し、新鮮な培地を遠沈管１本につき１０ｍＬ加え懸濁した後、１本にまとめた。
【００６４】
上記の黒色物質の懸濁に用いた新鮮な培地は以下のようにして作製した。
表１に示した溶液１を４０ｍＬのバイアル瓶に添加し、ブチルゴム栓及びアルミキャップで密閉した。これを超音波（超音波洗浄機、ソノクリーナーＤ５０、株式会社カイジョー製）存在下で気泡が出なくなるまで減圧脱気し、Ｎ２／ＣＯ２ガスで５分間バブリングした。この操作を２回行った。
オートクレーブした後、表１に示す溶液２をフィルター（Ｍｉｌｌｅｘ−ＬＧ  ＬＨシリンジフィルター０．２μｍ、ミリポア社製）でろ過しながら添加した。
【００６５】
【表１】
2014064566.tif 000003
【００６６】
【表２】
2014064566.tif 000004
【００６７】
【表３】
2014064566.tif 000005
【００６８】
【表４】
2014064566.tif 000006
【００６９】
（２）乾燥重量の測定
一本の遠沈管に回収した黒色物質を均一に撹拌した後、滅菌したシリンジを用いて１ｍＬ回収し、以下の方法により、乾燥重量を測定した。
あらかじめ空の１．５ｍＬ容エッペンドルフチューブの重さを、精密天秤を用いて測定した。重量を測定した空の１．５ｍＬ容エッペンドルフチューブに黒色物質を含む培地を１ｍＬ投入し、２００００×ｇ、４℃で５分間遠心分離した。上清を除去し、１００％エタノールを１．０ｍＬ投入し、懸濁し、２００００×ｇ、４℃で５分間遠心分離した。上清を除去し、ｄＨ２Ｏを１．０ｍＬ投入し、懸濁し、２００００×ｇ、４℃で５分間遠心分離した。上清を完全に除去し、７０℃で１２時間乾燥させた。乾燥後、直ちにデシケーターに移動させ、精密天秤を用いて重量を測定した。乾燥重量が３７．６ｍｇ／ｍＬであることを確認した。
【００７０】
（３）サイクリックボルタンメトリー（ＣＶ）曲線解析
上記黒色物質を含む培養物を、参照電極に黒色物質が接触しないようにするため、乾燥重量が６ｍｇ／ｍＬになるよう調整してから、７．６ｍＬを微生物燃料電池（Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｆｕｅｌ  Ｃｅｌｌｓ；以下、ＭＦＣということがある）の負極槽に投入した。ＭＦＣの構成を表５に示す。ＭＦＣ本体（負極槽体積７．６ｍＬ）、正電極のカーボンペーパー（２２ｍｍ×２２ｍｍ、実反応面積：０．７９ｃｍ２）、負電極のＩＴＯガラス電極（実反応面積：３．８ｃｍ２）及びプロトン交換膜のＮａｆｉｏｎ  １１７（２４ｍｍ×２４ｍｍ、実反応面積：０．７９ｃｍ２、デュポン社製）を嫌気チャンバー内に移した。黒色物質を含む培地をＭＦＣの負極槽内に充填し、正電極、負電極及びプロトン交換膜を設置し、ＭＦＣを嫌気チャンバーから取り出した。１０００Ωの外部抵抗で正極と負極を連結した。
【００７１】
【表５】
2014064566.tif 000007
【００７２】
上記ＭＦＣを用いて、オートマチックポラリゼーションシステム（ＨＳＶ−１１０、北斗電工株式会社製）を使用してＣＶ曲線解析を実施した。ＣＶ曲線の測定条件を表６に示す。
【００７３】
【表６】
2014064566.tif 000008
【００７４】
同様の実験を、黒色物質を含有した培養物をオートクレーブして滅菌処理した系に対しても行った。また、培地のみの系についても同様の条件でＣＶ曲線を測定した。
【００７５】
図２３は、微生物含有黒色物質、オートクレーブ処理黒色物質及び培地のみのサイクリックボルタモグラムを示したものである。図２３の縦軸は電流密度（ｍＡ／ｇ）を、横軸は標準水素電極（ＳＨＥ）に対する電位を表す。なお、図２３は、Ａｇ／ＡｇＣｌ電極を参照電極として測定した電位を、標準水素電極に対する電位に補正して示したものである。培地のみのサイクリックボルタモグラムでは酸化還元ピークが観察されなかった。他方、微生物含有黒色物質及びオートクレーブ処理黒色物質のサイクリックボルタモグラムでは、いずれも酸化還元ピークが観察された。このことから、微生物含有黒色物質及びオートクレーブ処理黒色物質は、いずれも電子を授受する能力を有し、電子運搬体として使用できることが分かった。
【００７６】
（実施例７  黒色物質の放電能力測定実験）
（１）乾燥重量測定
黒色物質を含む培養物を均一に撹拌し、滅菌したシリンジを用いて黒色物質を１ｍＬ回収し、乾燥重量を測定した。乾燥重量の測定方法は実施例６で記載したのと同様の方法で行った。測定の結果、乾燥重量は０．５５７９ｍｇ／ｍＬであった。
【００７７】
（２）ＭＦＣの構築及び放電能力測定
上記培養物を外部抵抗の異なるＭＦＣに投入し、その電流値をモニタリングした。表７にＭＦＣの構成を示す。
【００７８】
【表７】
2014064566.tif 000009
【００７９】
（２−１）負電極の前処理
ドラフト内でカーボングラファイトシートを適当な大きさで切断し、９５％エタノール溶液に３０分浸した後に蒸留水で十分に濯いだ。その後、０．１Ｍ  ＨＣｌに撹拌しながら一晩浸漬した。さらに、蒸留水で十分に洗浄した後、７０℃で２日間乾燥後、カーボングラファイトを２５ｍｍ×１０ｍｍ×５ｍｍに切断した。その後、嫌気的処理のために表１の溶液２を除いた培地に負電極を浸し、超音波存在下で１時間の脱気と１０分間のＮ２／ＣＯ２ガスによるバブリングを２回繰り返し、オートクレーブ処理をした。
【００８０】
（２−２）プロトン交換膜の前処理
Ｎａｆｉｏｎ  １１７を３％Ｈ２Ｏ２溶液中で１時間煮沸した後にイオン交換水でよく濯いだ。次に、１Ｍ  Ｈ２ＳＯ４溶液中で１時間煮沸し、イオン交換水でよく濯いだ。その後、イオン交換水中で保存した。
【００８１】
（２−３）ＭＦＣの構築及び放電能力測定
負極槽（２５ｍｍ×２５ｍｍ×１０ｍｍ）、正電極（２２ｍｍ×２２ｍｍ、実反応面積：１０ｍｍ×１０ｍｍ）、前処理を行った負電極（２５ｍｍ×１０ｍｍ×５ｍｍ）及びプロトン交換膜（２４ｍｍ×２４ｍｍ、実反応面積：１０ｍｍ×１０ｍｍ）を嫌気チャンバー内に移した。黒色物質を含む培地をＭＦＣの負極槽内に充填し、直径５ｍｍ（内径４ｍｍ）×１０ｍｍシリコンキャップ（アズワン株式会社製）で塞ぎ、ＲＴＶゴム（信越化学工業株式会社製）で完全に密封した。プロトン交換膜及び正電極を設置し、ＭＦＣを嫌気チャンバーから取り出した。７種の外部抵抗で正極と負極を連結し、電圧測定器（ｍｉｄｉ  ＬＯＧＧＥＲ  ＧＬ８２０、グラフテック株式会社製）に接続し、１０秒おきに電圧を測定した。オームの式Ｖ＝ＲＩ及び乾燥重量から、電力密度を算出した。
【００８２】
図２４は、微生物含有黒色物質の放電実験を外部抵抗の値を変化させて行った結果を示す。図中の縦軸は電力密度（Ｗ／ｋｇ）を、横軸は時間（分）を表す。いずれの場合も、負極と正極が連結された直後に電流の発生が認められた。このことから、微生物含有黒色物質には電気が蓄積されていることに加え、放電能力があることが確認された。
【００８３】
（実施例８  微生物含有黒色物質の畜放電能力測定実験）
実施例７に記載したＭＦＣの負極槽内に黒色物質を含む培養物を投入し、黒色物質の畜放電能力を確認した。表８に示す測定条件で黒色物質の畜放電を行った。畜放電にはポテンショスタット／ガルバノスタット（ＨＡ−１５１Ｂ、北斗電工株式会社製）を使用した。
【００８４】
【表８】
2014064566.tif 000010
【００８５】
図２５は、表８に示す測定条件下、微生物含有黒色物質の放電及び蓄電時の電流密度変化を経時的に測定した結果を示した図である。図中、Ｄは放電期間を、Ｃは蓄電期間をそれぞれ示す。Ｄ０は微生物含有黒色物質それ自体の放電を示す。Ｃ１では−０．２Ｖで１０分間、Ｃ２では−０．２Ｖで２０分間、Ｃ３では−０．４Ｖで１０分間、Ｃ４では−０．４Ｖで２０分間、Ｃ５では−０．４Ｖで３０分間及びＣ６では酢酸４．５ｍＭ存在下で３時間培養、の条件でそれぞれ蓄電を行った。Ｄ１〜Ｄ６はＣ１〜Ｃ６の蓄電後の放電をそれぞれ示す。図中の縦軸は電流密度（ｍＡ／ｍ２）を、横軸は時間（時）を表す。
【００８６】
上記畜放電実験から、微生物含有黒色物質は、放電後に蓄電することで再度放電を行えることが確認された。また、Ｃ６とＤ６から、黒色物質を含有する培養物を、酢酸４．５ｍＭ存在下で３時間培養することで、黒色物質に電子が蓄えられ、再度放電することが確認された。上記結果から、微生物含有黒色物質は畜放電能力を有し、二次電池に応用可能であることが示唆された。また、微生物含有黒色物質は微生物によって発生した電子を蓄電することができるため、微生物の有機廃棄物の処理によって生じたエネルギーの蓄積を媒介する物質として使用可能であることが示唆された。
【００８７】
（実施例９  微生物非含有黒色物質の畜放電能力測定実験）
実施例８と同様の実験を、黒色物質を含む培養物をオートクレーブして滅菌処理した系に対しても行った。その測定条件を表９に示す。
【００８８】
【表９】
2014064566.tif 000011
【００８９】
図２６は表９に示す測定条件下、オートクレーブで滅菌処理した黒色物質の放電及び蓄電時の電流密度変化を経時的に測定した結果を示した図である。図中、Ｄは放電期間を、Ｃは蓄電期間をそれぞれ示す。Ｄ０はオートクレーブ処理した黒色物質それ自体の放電を示す。Ｃ１では−０．２Ｖで２０分間及びＣ２では−０．４Ｖで３０分間、の条件でそれぞれ蓄電を行った。Ｄ１及びＤ２は、それぞれ蓄電後の放電を示す。縦軸は電流密度（ｍＡ／ｍ２）を、横軸は時間（時）を表わす。
【００９０】
上記畜放電実験から、オートクレーブで滅菌処理した黒色物質が、畜放電能力を有することが確認された。また、黒色物質は微生物が存在していなくても電気的な蓄電が可能であり、黒色物質自体が畜放電能力を有することが確認された。
【００９１】
（実施例１０  微生物群集構造解析）
(１）ＤＮＡ抽出
黒色物質を含む培養液を回収し、ＤＮＡ抽出を行った。その手順を以下に示す。
黒色沈殿物質を生成した培養液から黒色沈殿物質懸濁液を１．０ｍＬ採取し、１．５ｍＬ容エッペンドルフチューブに分注した。これを、２０００×ｇ、４℃で１０分間遠心分離し、上清のみを新しい１．５ｍＬ容エッペンドルフチューブに取り分けた。これにＴＥ  ｂｕｆｆｅｒを２８０μＬ添加し完全に懸濁した。この懸濁液に２０％ＳＤＳを３０μＬ添加し再懸濁した。−８０℃での冷却を１５分、６５℃で５分間の保温を３回繰り返した。２０ｍｇ／ｍＬ  プロテイナーゼＫを１０μＬ添加した後、３７℃で一晩保温した。５ＭのＮａＣｌ溶液を５０μＬ添加し混合した。この混合液に１０％ＣＴＡＢ／０．７Ｍ  ＮａＣｌ溶液を４０μＬ添加した後、６５℃で１０分間保温し、氷上に移動させた。以後の操作は氷上で行った。この溶液に冷えたＴＥ飽和フェノールを３５０μＬ添加し、十分に懸濁した後、２００００×ｇ、４℃で８分間遠心分離し、上清のみを新しい１．５ｍＬ容エッペンドルフチューブに確保した。そのエッペンドルフチューブに冷えたクロロホルムを３５０μＬ添加し、十分に懸濁した後、２００００×ｇ、４℃で５分間遠心分離し、上清のみ新しいエッペンドルフチューブに確保した。３Ｍの酢酸ナトリウム（ＣＨ３ＣＯＯＮａ）溶液（ｐＨ５．２）を上清の１／１０量添加し懸濁した。−２０℃で冷却された１００％２−プロパノールを静かに溶液と等量添加し、ゆっくりと界面を揺らしながら懸濁し、−８０℃で３０分間静置した。その後、２００００×ｇ、４℃で３０分間遠心分離し、上清を取り除いた。−２０℃で冷却された７０％エタノールを４００μＬ添加し、２００００×ｇ、４℃で２０分間遠心分離し、上清を完全に除去した。−２０℃で冷却された１００％エタノールを１８０μＬ添加し、２００００×ｇ、４℃で２０分間遠心分離し、上清を完全に除去した。真空デシケーターで沈殿物中のエタノールを完全に除去した。蒸留水（ｄＨ２Ｏ）を５０μＬ添加し、これをＤＮＡ溶液とした。
【００９２】
（２）ライゲーション
精製されたＤＮＡを鋳型とし、ポリメラーゼとしてＫＯＤ  ＦＸ（東洋紡社製）を用いてＰＣＲを行った。プライマーには９ｒｅｖ（５’−ＡＡＧＧＡＧＧＴＧＡＴＣＣＡＧＣＣ−３’：配列番号３）及びｐｒｏＲ（５’−ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ−３’：配列番号４）を用いて表１０に示す反応組成及び表１１の条件下、ＰＣＲ反応によりＤＮＡを増幅した。
【００９３】
【表１０】
2014064566.tif 000012
【００９４】
【表１１】
2014064566.tif 000013
【００９５】
増幅した１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を含んだＰＣＲ産物９μＬと１０×Ａ−ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  Ｍｉｘ（Ｔａｒｇｅｔ  ＣｌｏｎｅＴＭ−Ｐｌｕｓ−、東洋紡社製）１μＬを混合し６０℃、３０分間反応させ３末端にアデニン付加させた。アデニン付加させたＰＣＲ産物をｐＴＡ２ベクターにライゲーションさせるために、表１２の組成に調節し、室温で３０分間反応させた。
【００９６】
【表１２】
2014064566.tif 000014
【００９７】
１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を挿入したｐＴＡ２ベクター１０μＬとコンピテントセル（Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｈｉｇｈ  ＤＨ５α、東洋紡社製）１００μＬを混合し、氷上で３０分間反応させた後、４２℃で３０秒ヒートショックし形質転換させ、氷上で２分間冷却した。これにＳＯＣ培地を９００μＬ加え、３７℃で１時間振盪培養した。培養したサンプルを、２０ｍｇ／ｍＬ  ５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ、和光純薬工業株式会社）１００μＬ及び０．２ｇ／ｍＬ  イソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ、和光純薬工業株式会社）５０μＬを表面に塗布した２５μｇ／ｍＬ  アンピシリン（和光純薬工業株式会社）入りＬＢ寒天培地に、１００μＬずつ接種し３７℃で１６時間静置培養した。ＬＢ培地の組成を表１３に示す。
【００９８】
【表１３】
2014064566.tif 000015
【００９９】
ＬＢ寒天培地上に形成した白色コロニーを、滅菌したつまようじでアンピシリン入りＴＢ培地（表１４）へ接種した。接種されたＴＢ培地を３７℃、１６時間振盪培養した。培地が懸濁したのを確認し、プライマーセット（ｐＴＡ２−ｆ：ＴＣＧＡＧＧＴＣＧＡＣＧＧＴＡＴＣ（配列番号５）及びｐＴＡ２−ｒ：ＣＧＣＴＣＴＡＧＡＡＣＴＡＧＴＧＧＡＴＣ（配列番号６）を用いて表１０及び表１１の条件でＤｉｒｅｃｔ  ＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ産物を１．５％アガロースゲルで１００Ｖ、３０分間の条件で分子量１００ｂｐ  Ｌａｄｄａｒ（株式会社カーク製）と共に電気泳動した。ＵＶトランスイルミネーターで目的遺伝子が存在しているか確認し、確認したサンプルを１．５ｍＬ容エッペンドルフチューブに移し、２００００×ｇ、４℃で１０分間遠心分離し、菌体ペレットを取得した。
【０１００】
【表１４】
2014064566.tif 000016
【０１０１】
（３）プラスミドＤＮＡ溶液の抽出
上記菌体ペレットから目的のプラスミドＤＮＡをＷｉｚａｒｄ  Ｐｌｕｓ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社製）を用いて抽出した。表１５に示す各溶液を調製した。菌体ペレットの入った１．５ｍＬ容のエッペンドルフチューブに表１５のＣｅｌｌ  Ｒｅｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎを２００μＬ加え、完全に懸濁した。これにＲＮａｓｅを１μＬ加え混合した。さらに、表１５のＣｅｌｌ  Ｌｙｓｉｓ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎを２００μＬ混合した後、表１５のＮｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎを２００μＬ混合した。上記混合液を、１００００×ｇ、２０℃で５分間遠心分離した。遠心分離後、中間層のみを新しいエッペンドルフチューブに移しＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｉｎを８００μＬ加え、３分間静置した。Ｍｉｎｉｃｏｌｕｍｎ（プロメガ社製）を取り付けた５ｍＬシリンジ（テルモ株式会社製）で押し出し、カラムにＤＮＡを吸着した粒子をトラップさせた。カラムを洗浄するために表１５のＣｏｌｕｍｎ  Ｗａｓｈ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎを２ｍＬシリンジで押し出した。Ｍｉｎｉｃｏｌｕｍｎを１．５ｍＬ容のエッペンドルフチューブに移し、１００００×ｇ、２０℃で２分間遠心分離した。Ｍｉｎｉｃｏｌｕｍｎを新しい１．５ｍＬ容のエッペンドルフチューブに移し７０℃の蒸留水を５０μＬ加え、１００００×ｇ、２０℃で３０秒間遠心分離し、目的遺伝子を挿入したプラスミドＤＮＡ溶液を取得した。
【０１０２】
【表１５】
2014064566.tif 000017
【０１０３】
（４）制限酵素処理
プラスミドＤＮＡに目的のＤＮＡ配列が挿入されていることを以下の方法で確認した。
ｐＴＡ２  Ｖｅｃｔｏｒ内のＤＮＡ挿入箇所の両端に存在する配列（ｆ：５’ＧＡＡＴＴＣ及びｒ：３’ＣＴＴＡＡＧ）を特異的に認識し切断する酵素ＥｃｏＲＩ（タカラバイオ株式会社）で処理し、電気泳動することで目的の遺伝子が挿入されていることを確認した。表１６の溶液を用意し、恒温槽で３７℃、１時間反応させ、得られた反応液を電気泳動した。
【０１０４】
【表１６】
2014064566.tif 000018
【０１０５】
制限酵素処理によって目的遺伝子の挿入が確認されたプラスミドＤＮＡ溶液の吸光度を、吸光光度計（ＵＶ−１８００、島津製作所製）を用いて２００ｎｍ〜３００ｎｍの範囲で測定し、得られた２６０ｎｍにおける吸光度から以下の式によってＤＮＡ濃度を算出した。
式
ＤＮＡ（ｎｇ／μＬ）＝ＯＤ２６０ｎｍ×５０（ｎｇ／μＬ）
得られた結果から、塩基配列解読のためにサンプルを表１７のように調製した。なお、塩基配列解読のために、３００〜６００ｎｇのプラスミドＤＮＡが必要であるため、上記式から求めた濃度の結果を基に、３００〜６００ｎｇに収まるよう、プラスミドＤＮＡ溶液量（Ｘμｌ）を決定した。
【０１０６】
【表１７】
2014064566.tif 000019
【０１０７】
９６ｗｅｌｌプレート（グライナーバイオワン社製）に１サンプル毎に分注し、８０×１４０ｍｍアルミシール（グライナーバイオワン社製）で蓋をした状態で株式会社グライナージャパンに解析を依頼した。解読されたデータはソフトウェアＢｉｏｅｄｉｔを用いて塩基配列データを目視で確認し、信頼可能な塩基配列（配列番号７〜５６）を用いてＢｌａｓｔ解析を行った。
【０１０８】
図２７は黒色物質を生成した培養物中の微生物を群集構造解析した結果を示す。円グラフ内の数字（％）は全体に対する割合を示し、微生物名横の数字（％）は相同性を示す。上記で解読された配列と相同性のある配列をＢｌａｓｔ解析した結果、配列番号７〜２５はＯｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ａｎｔｈｒｏｐｉの１６Ｓ  ｒＲＮＡと、配列番号２６〜４０はＢａｃｔｅｒｉｕｍ１６Ｓ  ｒＲＮＡと、配列番号４１〜４９はＤｅｓｕｌｆｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ  ｇｕｔｔｏｉｄｅｕｍの１６Ｓ  ｒＲＮＡと、配列番号５０〜５５はＤｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｓｐ．の１６Ｓ  ｒＲＮＡとそれぞれ９９％の相同性を有することが確認された。また、解読された配列である配列番号５６はＡｃｔｉｎｏｂａｃｕｌｕｍの１６Ｓ  ｒＲＮＡと９６％の相同性を有することが確認された。このことから、少なくとも上記の微生物の１つが黒色物質の生成に関与していることが推測される。ただ、これ以外の微生物が黒色物質生成及びその促進に関与している可能性もある。
【０１０９】
（実施例１１  畜放電能を有する物質の生成に関与する微生物の分離）
微生物の分離を６−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ法（Kohei Nakamura et al. 2011. Microbes Environ. 26(4) p 301-306. “Asix-well plate method: less laborious and effective method for cultivation ofobligate anaerobic microorganisms”.）に準じて行った。
【０１１０】
（１）６−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ法
試験管に表１８の後入れ試薬を除く嫌気性培地を９ｍｌずつ分注したものを７本用意し、超音波存在下で１０分間脱気し、８分間Ｎ２／ＣＯ２バブリングをする操作を２回繰り返した。これをオートクレーブ処理後、クリーンベンチ内で表１８の後入れ試薬を添加した。黒色物質を生成した培養物１ｍＬを９ｍＬの培地に接種することで１０倍希釈した。その希釈溶液を十分に撹拌した後、同様に１ｍＬを９ｍＬの培地に接種し、１００倍希釈とした。同様にして１０７倍希釈溶液まで作製した。これらを嫌気チャンバー内に移し、６−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ（ＺＥＬＬＫＵＬＴＵＲ  ＴＥＳＴ  ＰＬＡＴＥ、ＴＰＰ社製）に１０２〜１０７倍希釈溶液をそれぞれ１ｗｅｌｌに０．１ｍＬずつ入れた。
表１８の培地にゲランガムを０．４５％（０．２７ｇ−ゲランガム／６０ｍＬ−培地）になるように入れ、超音波存在下で１０分脱気し、８分  Ｎ２／ＣＯ２バブリングを２回繰り返した。これをオートクレーブした直後に嫌気チャンバー内に入れ、上記６−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅの１ｗｅｌｌに１０ｍＬずつ添加した。
ゲルが固まるのを待ち、６−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ及びアネロパウチ・ケンキ（三菱ガス化学工業株式会社製）２つとを、パウチ袋（Ｗ１５０×Ｌ３３０ｍｍ、三菱ガス化学株式会社製）に入れ、密閉した。これを暗所２５℃の条件下静置し、培養した。
【０１１１】
【表１８】
2014064566.tif 000020
【０１１２】
（２）微生物の同定
培養された微生物からフェノール／クロロホルム抽出法によってＤＮＡを抽出し、プライマーとしてｐｒｏＲ及び９ｒｅｖ（表１９）を用いて１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を標的としたＰＣＲを行った（表２０）。ＰＣＲ産物１００μＬ及びブロモフェノールブルー（ＢＰＢ）１０μＬを電気泳動し、得られたＤＮＡ断片を以下のように、Ｗｉｚａｒｄ  ＳＶ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ  Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社製）のプロトコールにのっとり、精製した。
【０１１３】
【表１９】
2014064566.tif 000021
【０１１４】
【表２０】
2014064566.tif 000022
【０１１５】
上記電気泳動後、カッターナイフを用いて目的のバンドを切り出した。表２１のＭｅｍｂｒａｎｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎをゲルスライス１０ｍｇに対して、１０ｍＬ添加し、転倒混和により混合し、これを６０℃で１０分間反応させた。上記混合液をＳＶ  Ｍｉｎｉｃｏｌｕｍｎに分注した後、Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｔｕｂｅにこのＳＶ  Ｍｉｎｉｃｏｌｕｍｎを挿入し、調製したゲル溶解液を添加後、室温で１分間反応させた。ＳＶ  Ｍｉｎｉｃｏｌｕｍｎ  ａｓｓｅｍｂｌｙを１６０００×ｇ、１分間で遠心分離後、ＳＶ  Ｍｉｎｉｃｏｌｕｍｎを取り外し、Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｔｕｂｅ内の液体を除去し、再度Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｔｕｂｅにＳＶ  Ｍｉｎｉｃｏｌｕｍｎを挿入した。表２１のＭｅｍｂｒａｎｅ  Ｗａｓｈ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ５００μＬをＳＶ  Ｍｉｎｉｃｏｌｕｍｎに添加し、ＳＶ  Ｍｉｎｉｃｏｌｕｍｎ  ａｓｓｅｍｂｌｙを１６０００×ｇ、５分間遠心分離後、Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｔｕｂｅの中の液体を除去した。表２１のＭｅｍｂｒａｎｅ  Ｗａｓｈ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎを５００μＬ添加し、１６０００×ｇ、５分間遠心分離した。ＳＶ  Ｍｉｎｉｃｏｌｕｍｎを新しい１．５ｍＬエッペンドルフチューブに移し、Ｎｕｃｌｅａｓｅ−Ｆｒｅｅ  Ｗａｔｅｒ  ５０μＬを添加した。１分間室温で反応させ、１６０００×ｇ、１分間で遠心分離した。ＳＶ  Ｍｉｎｉｃｏｌｕｍｎを破棄し、チューブ内のＤＮＡを保存した。
【０１１６】
【表２１】
2014064566.tif 000023
【０１１７】
上記で取得したＤＮＡをさらにカラムを使った以下の方法により精製した。
Ｍｉｃｒｏｓｐｉｎ  Ｓ−４００  ＨＲ  ｃｏｌｕｍｎｓ（アマルシャムファルマシアバイオテク社製）を逆さまにし、中のレジンを完全に懸濁した。蓋を少し緩め、カラム下部を折り取り、エッペンドルフチューブにのせて、３０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。新しいエッペンドルフチューブにカラムを載せ、蓋を外した。レジンの中央にＰＣＲ産物として保存した上記ＤＮＡをゆっくり滴下し、２〜３分間静置した。３０００ｒｐｍで９０秒間遠心し、エッペンドルフチューブの底に濾液があることを確認し、カラムを破棄した。
【０１１８】
精製されたＤＮＡ溶液の吸光度を、吸光光度計（ＵＶ−１８００、島津製作所製）を用いて２００〜３００ｎｍの範囲で測定し、次式によりＤＮＡ濃度を算出した。
式
ＤＮＡ（ｎｇ／μＬ）＝ＯＤ２６０ｎｍ×５０（ｎｇ／μＬ）
１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の全長を読むため、それぞれの単離菌株につき、２７Ｆ、５１８Ｒ、８００Ｒ及び１４９２Ｒ（表１９）のプライマーを用いて解析した。株式会社グライナージャパンに解析を委託し、解読されたデータからＢｌａｓｔ解析を行った。
【０１１９】
表２２に各分離菌株についてＢｌａｓｔ解析を行った結果を示す。分離菌株ＨＭ１１１（配列番号６１）はＤｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｓｐ．と９９％の相同性を有することが確認された。ＨＭ２１１（配列番号６２）はＢａｃｉｌｌｕｓ  ｉｄｒｉｅｎｓｉｓと９９％の相同性を有することが確認された。また、分離菌株ＨＭ２１３（配列番号６３〜６８）は、Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｃｙｔｉｓｉ及びＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃｅｌｅｒｅｃｒｅｓｃｅｎｓと、９７％以上の相同性を有することが確認され、ＨＭ２１３には上記微生物が混合して存在することが示唆された。分離菌株ＨＭ４１１（配列番号６９〜７３）は、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｉｍｏｎａｓ  ｐａｌｕｄｉｃｏｌａ及びＯｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｃｙｔｉｓｉと、９７％以上の相同性を有することが確認され、ＨＭ４１１には上記微生物が混合して存在することが示唆された。分離菌株ＨＭ５１１（配列番号７４〜７９）は、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐａｌｕｓｔｒｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．及びＯｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｃｙｔｉｓｉと、９７％以上の相同性を有することが確認され、ＨＭ５１１には上記微生物が混合して存在することが示唆された。分離菌株ＨＭＷ（配列番号８０〜８５）は、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｍｏｎａｓ  ｐａｌｕｄｉｃｏｌａ、Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｃｙｔｉｓｉ、Ｄｅｓｕｌｆｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ  ｇｕｔｔｏｉｄｅｕｍ及びＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃｅｌｅｒｅｃｒｅｓｃｅｎｓと、９７％以上の相同性を有することが確認され、ＨＭＷには上記微生物が混合して存在することが示唆された。また、生成した沈殿物の形状及び色は分離菌株ごとに異なっていた。
【０１２０】
【表２２】
2014064566.tif 000024
【０１２１】
（実施例１２  各分離菌株で生成した沈殿物質の放電実験）
実施例１１の各分離菌株によって生成された沈殿物質の放電能力を確認するために、空気正極型ＭＦＣを構築した。負極槽容量６．２５ｍＬ、正電極として２２ｍｍ×２２ｍｍ  ０．５ｍｇ／ｃｍ２  白金担持カーボンペーパー（ＴＧＰ−Ｈ−０６０、東レ株式会社製）、プロトン交換膜として２４ｍｍ×２４ｍｍ  Ｎａｆｉｏｎ  １１７（デュポン社製）、負電極として２５ｍｍ×１０ｍｍ×５ｍｍ  カーボングラファイト（綜合カーボン株式会社製）に接続し、外部抵抗５１０Ωを介して正電極と接続した。白金線と正極カーボンペーパーの接続には電子顕微鏡用銀ペースト（シルベスト  Ｐ−２５５  日新ＥＭ株式会社製）を使用した。
【０１２２】
（１）負電極の前処理
ドラフト内でカーボングラファイトシートを適当な大きさで切断し、９５％エタノール溶液に３０分浸した後に蒸留水で十分に濯いだ。その後、０．１Ｍ  ＨＣｌに撹拌しながら一晩浸漬した。さらに、蒸留水で十分に洗浄した後、７０℃で２日間乾燥後、カーボングラファイトを２５ｍｍ×１０ｍｍ×５ｍｍに切断した。その後、嫌気的処理のために表１８の後入れ試薬を除いた培地に負電極を浸し、超音波存在下で１時間の脱気と１０分間のＮ２／ＣＯ２ガスによるバブリングを２回繰り返し、オートクレーブ処理をした。
【０１２３】
（２）Ｎａｆｉｏｎ  １１７の前処理
Ｎａｆｉｏｎ１１７を３％Ｈ２Ｏ２溶液中で１時間煮沸した後にイオン交換水でよく濯いだ。次に、１Ｍ  Ｈ２ＳＯ４溶液中で１時間煮沸し、イオン交換水でよく濯いだ。その後、イオン交換水中で保存した。
【０１２４】
（３）ＭＦＣの組立
ＭＦＣ本体（外枠：４０ｍｍ×４０ｍｍ×２０ｍｍ、負極槽：２５ｍｍ×２５ｍｍ×１０ｍｍ）、正電極（２２ｍｍ×２２ｍｍ、実反応面積：１０ｍｍ×１０ｍｍ）、前処理を行った負電極（２５ｍｍ×１０ｍｍ×５ｍｍ）及びプロトン交換膜（２４ｍｍ×２４ｍｍ、実反応面積：１０ｍｍ×１０ｍｍ）を嫌気チャンバー内で組み立てた。黒色物質を含む培養物をＭＦＣ内に充填し、直径５ｍｍ（内径４ｍｍ）×１０ｍｍシリコンキャップ（アズワン社製）で塞ぎ、ＲＴＶゴム（信越化学工業株式会社）で完全に密封した。１０Ωの外部抵抗で正極と負極を連結し、電圧測定器（ｍｉｄｉ  ＬＯＧＧＥＲ  ＧＬ８２０、グラフテック株式会社製）に接続し、１０秒おきに電圧を測定した。
【０１２５】
（４）黒色物質の重量測定
空のエッペンドルフチューブを、８０℃で一晩加熱乾燥し、電子天秤（ＸＡ２０４  ＤｅｌｔａＲａｎｇｅ、メトラートレド社製）を用いて重量を測定した。そのエッペンドルフチューブに黒色物質を含む培養物を採取し、２００００×ｇ、４℃で５分間遠心分離し、上清を除去した。その後、黒色物質の塩を洗浄するために、蒸留水を添加し懸濁し、再度同様の条件で遠心分離を行い、上清を除去した。これを３回繰り返した。上清を除去した沈殿物を８０℃で一晩加熱乾燥し、電子天秤を用いて重量を測定した。
【０１２６】
（５）データの算出
測定した電圧をオームの法則（Ｖ＝ＲＩ）に従って電流値へ変換し、ＭＦＣ負電極表面積（０．０００８５ｍ２）及び乾燥重量に対する電力密度を算出した。
【０１２７】
図２８は各分離菌株で生成した沈殿物質の放電時の電力密度変化を経時的に測定したものである。表２２のＨＭ１１１、ＨＭ２１３、ＨＭ５１１及びＨＭＷの分離菌株で生成した沈殿物質はいずれも放電能力を有することが確認された。
【０１２８】
（実施例１３  沈殿物質生成に及ぼすｐＨの影響）
ｐＨを割り振った培地を作製するために、クエン酸−クエン酸ナトリウムをバッファーとして用いた培地を作製した。表１のＮａＨＣＯ３をクエン酸  １０ｍＭ（１．９２１２ｇ／Ｌ）に変更した培地（溶液１）を作製した。同様に表１のＮａＨＣＯ３をクエン酸ナトリウム二水和物  １０ｍＭ（２．９４１ｇ／Ｌ）に変更した培地（溶液２）を作製した。溶液１と溶液２を混合し、ｐＨをそれぞれ３．５、４．５、５．５及び６．３に調整した。また、コントロールとして表１の培地を作製した。溶液１を超音波存在下で１０分脱気し、８分間のＮ２／ＣＯ２バブリングを２回繰り返し、オートクレーブ処理後、表１の溶液２を添加した。作製された培地にサンプル（１Ｌ培養系２代目、Ｄａｙ  ２５）を８０ｍＬの培地に対して１ｍＬ接種した。
【０１２９】
図２９（Ａ）は、培養液のｐＨと沈殿物質生成との関係を示す。培養液のｐＨは左からそれぞれ３．５、４．５、５．５、６．３及び７．０に調整して、培養液のｐＨが沈殿物質の生成に与える影響を調べた。培養液のｐＨが７．０（コントロール）の場合には、１日目から黒色物質が生成した。これに対して、培養液のｐＨが６．３の場合には、４日目に培養液が白く濁り、５日目に白色物質が生成した。他方、培養液のｐＨが３．５、４．５及び５．５の場合には、沈殿物質が生成しなかった。
【０１３０】
図２９（Ｂ）は、培養液のｐＨ変化を経日的に測定した結果を示す図である。図２９（Ｃ）は培養液中の硫酸イオン濃度変化を経日的に測定した結果を示す図である。なお、硫酸イオン濃度はイオンクロマトグラフ法で測定して求めた。培養液のｐＨが５．５以下の場合は、日が経っても硫酸イオン濃度に変化は見られなかった。他方、培養液のｐＨが６．３及び７．０の場合は、硫酸イオン濃度が、日が経つにつれて減少することが分かった。
【０１３１】
（実施例１４  異なるｐＨ下で生成した沈殿物質の放電実験）
培養液のｐＨが６．３及び７．０とした場合に生成した沈殿物質の放電実験を実施例１２と同様の方法で行った。
【０１３２】
図３０は、異なるｐＨ下で生成した沈殿物質の放電時の電力密度を経時的に測定した結果を示す図である。図中の縦軸は電力密度（Ｗ／ｋｇ）を、横軸は時間（分）を表す。培養液のｐＨを７．０とした場合に生成した沈殿物質のみならず、培養液のｐＨを６．３とした場合に生成した沈殿物質も放電能力を有することが確認された。
【０１３３】
（実施例１５  黒色物質が微生物燃料電池の発電効率に及ぼす影響）
燃料電池負極槽（３６ｍＬ）に０．５ｃｍ角のカーボングラファイトを１６５個封入した。プロトン交換膜としてＮａｆｉｏｎ  １１７、正極には白金担持（０．５ｍｇ−Ｐｔ／ｃｍ２）カーボンペーパーを用い、負極と正極を外部抵抗１０Ωで連結した。電子供与体として乳酸を２０ｍＭとなるように添加した。接種源として一方のＭＦＣに水田土壌０．４ｇを添加し、他方には黒色物質培養物（タイプＡ培養物）を２．０ｍＬ添加した。電圧を５分間隔でモニタリングした。
【０１３４】
図３１は、黒色物質培養物を添加した系と添加しなかった系の電力密度変化を経日的に測定した結果を示す。図３１中、黒色物質培養物を添加しなかった系の電力密度を１０倍にして表示した。黒色物質培養物を添加した系では、添加しなかった系に比べて微生物燃料電池の発電効率が約８０〜１００倍向上することが分かった。黒色物質の存在により発電効率が向上する理由として、黒色物質が微生物から電極への電子の授受を媒介することで、微生物から電極への電子の流れを容易にし、電子移動の効率を上昇させていることが考えられる。
【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図３０】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２９】
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【図３１】
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【配列表】
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