(57)【要約】【課題】高い親和性を有する抗カドヘリン抗体を提供すること。【解決手段】カドヘリンのカドヘリンドメイン１（ＥＣ１）またはカドヘリンドメイン２（ＥＣ２）を認識し、かつ抗原に対する５０％結合を与える抗体濃度であるＫｄ値が１０ｎＭ以下である、抗カドヘリン抗体。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
カドヘリンのカドヘリンドメイン１（ＥＣ１）またはカドヘリンドメイン２（ＥＣ２）を認識し、かつ抗原に対する５０％結合を与える抗体濃度であるＫｄ値が１０ｎＭ以下である、抗カドヘリン抗体。
【請求項２】
カドヘリンがＰ−カドヘリンである、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
Ｐ−カドヘリンまたはＰ−カドヘリンを発現する細胞を免疫原として投与した免疫動物から取得した抗体産生細胞が産生する抗体である、請求項１又は２に記載の抗体。
【請求項４】
Ｐ−カドヘリンが可溶型Ｐ−カドヘリンまたはその断片である、請求項３に記載の抗体。
【請求項５】
モノクローナル抗体である、請求項１から４の何れかに記載の抗体。
【請求項６】
モノクローナル抗体が、キメラ化抗体またはヒト化抗体である、請求項５に記載の抗体。
【請求項７】
抗体濃度１μｇ／ｍＬのときの抗体依存性細胞傷害活性が３０％未満である、請求項１から６の何れかに記載の抗体。
【請求項８】
受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−９９４、ＮＩＴＥ  ＡＰ−９９０、ＮＩＴＥ  ＡＰ−９９１、ＮＩＴＥ  ＡＰ−９８９、ＮＩＴＥ  ＡＰ−９９２、ＮＩＴＥ  ＡＰ−９８７、又はＮＩＴＥ  ＡＰ−９９３を有するハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体。
【請求項９】
請求項８に記載のモノクロナール抗体を改変して作られたキメラ抗体またはヒト化抗体。
【請求項１０】
請求項８に記載のモノクローナル抗体のVH及び／またはVL ドメインのアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるVH及び／またはVL ドメインを有する抗体またはその断片。
【請求項１１】
請求項５又は８に記載の抗体を産生するハイブリドーマ。
【請求項１２】
請求項１から１０の何れかに記載の抗体を含む、細胞傷害剤。
【請求項１３】
上記抗体に、細胞傷害性物質が結合している、請求項１２に記載の細胞傷害剤。
【請求項１４】
細胞傷害性物質が薬剤、トキシン、又は放射性物質である、請求項１３に記載の細胞傷害剤。
【請求項１５】
抗癌剤として使用される、請求項１２から１４の何れかに記載の細胞傷害剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カドヘリンの特定のドメインを認識し、かつカドヘリンに対する高い親和性を有する抗カドヘリン抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌は、死亡原因の上位を占める重要な疾患であるが、その治療ニーズはいまだ満たされていない。近年、従来の化学療法の正常細胞にもダメージを与えるという問題点を解決するために、癌細胞に特異的に発現する特定の分子を標的として薬剤を設計し治療を行う分子標的薬による癌治療が盛んに研究されている。
【０００３】
癌における分子治療薬の標的となりうる分子として、カドヘリンが挙げられる。カドヘリンは、カルシウム依存的に同種親和性の細胞接着に関与する分子として発見された膜タンパク質である（Ｙｏｓｈｉｄａ  ａｎｄ  Ｔａｋｅｉｃｈｉ,  Ｃｅｌｌ  ２８：２１７−２２４, １９８２）。相互にホモロジーが高い約１１０アミノ酸残基からなるカドヘリンリピート（ＥＣｓ）を持つタンパク質はカドヘリンスーパーファミリーと呼ばれ、１２０種類以上のタンパク質が存在し、多細胞構造の維持に重要な役割を果たしている。
【０００４】
癌細胞で発現が上昇する例が報告されており、正常組織と比較して癌組織でのカドヘリンの発現が高い癌細胞に対しては、カドヘリンを認識する抗体に放射性物質或いは抗癌剤を結合させた薬剤や、抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ：Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）を有する抗体を癌の治療に用いることが検討されている（ＷＯ２００２／０９７３９５号公報、ＷＯ２００７／１０２５２５号公報）。
【０００５】
カドヘリンスーパーファミリーに属するタンパク質は、その構造の特徴により１）古典的カドヘリン、２）デスモゾームカドヘリン、３）プロトカドヘリン、４）その他に大きく分類することができる。カドヘリンスーパーファミリーの主要なメンバーである古典的カドヘリンは相互にホモロジーが高い（図１）。すなわち、２量体を形成するとされている１回膜貫通型タンパク質で、細胞外領域にＥＣ１−ＥＣ５の５つのカドヘリンドメインと細胞内ドメインを持つ。古典的カドヘリンを介する細胞接着は同種細胞間での接着という特徴があり、細胞種により特異的に発現の状態が異なる同種のカドヘリン分子を細胞が相互に認識することによって行われる。Ｅ−カドヘリンはＥ−カドヘリンを認識して結合し、Ｐ−カドヘリンはＰ−カドヘリンを認識して結合するという機序で同種細胞相互が接着する（図２）。
【０００６】
カドヘリン相互の同種／異種の認識は細胞外ドメインのＮ端に位置するカドヘリンドメイン１（ＥＣ１）によるとされる（Ｎｏｓｅ  Ａ.  ｅｔ  ａｌ.,  Ｃｅｌｌ  ６１：１４７−１５５,  １９９０）。Ｋｌｉｎｇｅｌらは、ヒトＰ−カドヘリンのアミノ酸配列の第１位〜第２１３位（配列番号２）とヒトＥ−カドヘリンの対応する領域を入れ替えると、Ｅ−カドヘリンとは結合せず、Ｐ−カドヘリンと結合することを示している（Ｋｌｉｎｇｅｌ  Ｈ.  ｅｔ  ａｌ.,  Ｊ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １１３：２８２９−３６,  ２０００）。このように、Ｅ−カドヘリン、Ｐ−カドヘリンをはじめとする古典的カドヘリンは同一の機序で相互に結合すると考えられる。
【０００７】
近年、分子標的薬として多くの癌治療用の抗体医薬が実際に上市され、その多くは抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ：Ａｎｔｉｂｏｄｙーｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）を主な作用機序としている。しかしその薬効は必ずしも十分なものではなく、より強力な抗腫瘍効果を示す技術開発が進められている。
【０００８】
より強力な抗腫瘍効果を得る方法の一つとして、抗原に対する親和性の高い抗体を用いることにより、抗体の腫瘍への集積量を増加させ薬効をあげる方法がある。抗体を腫瘍に集積させるためには、高い親和性の抗体を得る必要がある。しかしながら、このような抗体を得る方法はかならずしも明らかではなかった。
【０００９】
一方、さらに別の方法としては、A：癌細胞への結合（集積）（抗体が担う）と、B:薬効（RIや薬物が担う）の２要素を分離することにより作製することが可能である。このような抗体医薬は、抗体が、Ｂ：ＲＩ、薬物、トキシン等により薬効を増強（武装）されていることから、ＡＲＭＥＤ抗体（武装された抗体）とよぶこと呼ぶ事ができる。ＡＲＭＥＤ抗体では、薬効はＲＩや薬剤、トキシン等が担い、抗体は腫瘍への集積の働きをすればよく、ＡＤＣＣ等の生理活性をもっていてもよいが、必ずしももたなくてもよいことになる。ＲＩや薬剤、毒素等をは、それぞれ、抗体に化学的手法（修飾）または、分子生物学的な手法により結合させる。
【００１０】
ＲＩ標識抗体は、ＡＲＭＥＤ抗体の一例であり、既に  ゼヴァリンR （富士フイルムＲＩファーマが販売）が悪性リンパ腫に対する抗体として実用化され非常に強い薬効が示されており、これに続くＲＩ標識抗体医薬の開発が望まれている。
【００１１】
また、抗体の抗腫瘍能を増強する別の有効な手段の一つとして、抗体と強力な毒性を有する薬剤（毒素）との連結があげられる。毒素はそれ単独で患者に投与すると、正常組織にも障害を及ぼし、有効な治療手段とはなり得ない。しかしながら、腫瘍細胞特異的な抗原と結合する抗体と連結する事により、正常な組織に悪影響を及ぼさず、腫瘍細胞のみ殺傷しえる能力を持つに至る。こうした薬剤は抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）と呼ばれる。即ち、毒素は抗体と結合している状態では何ら毒性を示さない。しかし、ある種の抗体は標的とする抗原に結合すると細胞内に取り込まれ、リソソームにて分解される。したがって、その種の抗体に毒素を結合する事で細胞内で抗体が分解される事で毒素が放出され、特定の細胞内部においてのみ毒性が発現され、その効果により細胞は殺傷される。
【００１２】
ＡＤＣにおいては、抗体に結合している薬剤は血液中を循環し、標的とする腫瘍に集積し薬効をしめす。腫瘍部位以外での薬剤の放出（抗体からの離脱）は、副作用を生じる危険性があるため必ずしも好ましくはない。つまり、抗体に結合している薬剤は細胞内に取り込まれた後抗体から脱離する設計が好ましい。近年ジェネンテック社は、このような観点からトラスツズマブに毒素を結合した薬剤（T-DM１）を開発、臨床試験がすすめられ、非常に高い臨床効果を示している。
【００１３】
このような、抗体医薬、特にＡＤＣやＲＩＴ等の  ＡＲＭＥＤ抗体につまりADCにおいては、抗体は、標的となる癌に集積することが必要である。そのため、各抗原に対して、高い親和性を有する抗体を探し出すことはADC抗体医薬開発の上での大きな課題となってきている。
【００１４】
上記の通り、ＡＤＣにARMED抗体により癌を治療するというコンセプトは公知である。しかし、ドメイン構造とＰ−カドヘリンを含む古典的カドヘリンの機能との関連についての報告はあるが、親和性と古典的カドヘリンの構造との関連を示唆するものはない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】ＷＯ２００２／０９７３９５号公報
【特許文献２】ＷＯ２００７／１０２５２５号公報
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】Ｙｏｓｈｉｄａ  ａｎｄ  Ｔａｋｅｉｃｈｉ,  Ｃｅｌｌ  ２８：２１７−２２４,  １９８２
【非特許文献２】Ｎｏｓｅ  Ａ.  ｅｔ  ａｌ.,  Ｃｅｌｌ  ６１：１４７−１５５,  １９９０
【非特許文献３】Ｋｌｉｎｇｅｌ  Ｈ.  ｅｔ  ａｌ.,  Ｊ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １１３：２８２９−３６,  ２０００
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
本発明は、高い親和性を有する抗カドヘリン抗体を提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明者は上記課題を解決するために鋭意検討し、細胞表面に発現する抗原に対するＰ−カドヘリン抗体の親和性を測定したところ、親和性の高い群と低い群に分かれる傾向があることを見出した。そこで、各抗体が認識している領域により分類を行ったところ、親和性の高い抗体は、カドヘリンドメイン１（ＥＣ１）またはカドヘリンドメイン２（ＥＣ２）の何れかを高い確率で認識していることが判明した。
【００１９】
エピトープにより抗体の親和性が異なる要因の一つとして、抗体が結合する領域の空間的な制限が推定される。本発明はこれらの知見に基づいて完成した
【００２０】
即ち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１）  カドヘリンのカドヘリンドメイン１（ＥＣ１）またはカドヘリンドメイン２（ＥＣ２）を認識し、かつ抗原に対する５０％結合を与える抗体濃度であるＫｄ値が１０ｎＭ以下である、抗カドヘリン抗体。
（２）  カドヘリンがＰ−カドヘリンである、（１）に記載の抗体。
（３）  Ｐ−カドヘリンまたはＰ−カドヘリンを発現する細胞を免疫原として投与した免疫動物から取得した抗体産生細胞が産生する抗体である、（１）又は（２）に記載の抗体。
（４）  Ｐ−カドヘリンが可溶型Ｐ−カドヘリンまたはその断片である、（３）に記載の抗体。
（５）  モノクローナル抗体である、（１）から（４）の何れかに記載の抗体。
（６）  モノクローナル抗体が、キメラ化抗体またはヒト化抗体である、（５）に記載の抗体。
（７）  抗体濃度１μｇ／ｍＬのときの抗体依存性細胞傷害活性が３０％未満である、（１）から（６）の何れかに記載の抗体。
（８）  受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−９９４、ＮＩＴＥ  ＡＰ−９９０、ＮＩＴＥ  ＡＰ−９９１、ＮＩＴＥ  ＡＰ−９８９、ＮＩＴＥ  ＡＰ−９９２、ＮＩＴＥ  ＡＰ−９８７、又はＮＩＴＥ  ＡＰ−９９３を有するハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体。
（９）  （８）に記載のモノクロナール抗体を改変して作られたキメラ抗体またはヒト化抗体。
（１０）  （８）に記載のモノクローナル抗体のVH及び／またはVL ドメインのアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるVH及び／またはVL ドメインを有する抗体またはその断片。
（１１）  （５）又は（８）に記載の抗体を産生するハイブリドーマ。
（１２）  （１）から（１０）の何れかに記載の抗体を含む、細胞傷害剤。
（１３）  上記抗体に、細胞傷害性物質が結合している、（１２）に記載の細胞傷害剤。
（１４）  細胞傷害性物質が薬剤、トキシン、又は放射性物質である、（１３）に記載の細胞傷害剤
（１５）  抗癌剤として使用される、（１２）から（１４）の何れかに記載の細胞傷害剤。
【発明の効果】
【００２１】
本発明の抗カドヘリン抗体は、カドヘリンのカドヘリンドメイン１（ＥＣ１）またはカドヘリンドメイン２（ＥＣ２）の何れかを認識し、高い親和性を有することを特徴とする。高い親和性を発揮しうる抗体は、修飾抗体、改変抗体を作製するための材料として有用である。また、本発明の抗カドヘリン抗体に、例えば細胞内で毒性を発揮する薬剤を結合し、カドヘリンが発現する患者に投与することにより、高い抗癌作用の発揮が期待できる。即ち、本発明の抗カドヘリン抗体は、抗癌剤として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１は、Ｅ−カドヘリン（ＣＤＨ１）、Ｎ−カドヘリン（ＣＤＨ２）、Ｐ−カドヘリン（ＣＤＨ３）のシグナル及びプロペプチド配列を除いた成熟タンパク質の配列を示す。
【図２】図２は、古典的カドヘリンファミリーに属する分子の接着機序を示す。
【図３】図３は、ヒトＣＤＨ３強制発現細胞株と市販抗ヒトＣＤＨ３抗体を反応させたフローサイトメトリの結果を示す。Ａ：ＣＨＯ細胞ＣＤＨ３強制発現ＣＨＯ細胞、Ｂ：ＣＤＨ３強制発現ＣＨＯ細胞ＣＨＯ細胞。ａ：ａｎｔｉ−ＣＤＨ３抗体０.０１ｍｇ／ｍｌ、ｂ：ａｎｔｉ−ＣＤＨ３抗体０．１ｍｇ／ｍｌ、ｃ：ａｎｔｉ−ＣＤＨ３抗体１ｍｇ／ｍｌ
【図４】図４は、取得抗体３例と各細胞株との典型的なフローサイトメトリ結果を示す。Ａ：ＣＤＨ３強制発現ＣＨＯ細胞、Ｂ：ＣＨＯ細胞、Ｃ：肺がん由来細胞株ＮＣＩ−Ｈ３５８。ａ：ａｎｔｉ−ＣＤＨ３抗体０．０１ｍｇ／ｍｌ、ｂ：ａｎｔｉ−ＣＤＨ３抗体０．１ｍｇ／ｍｌ、ｃ：ａｎｔｉ−ＣＤＨ３抗体１ｍｇ／ｍｌ。
【図５】図５は、各抗体の親和性Kd (nM)の測定結果を示す。
【図６】図６は、ＣＤＨ３部分長タンパク質断片１から５のＣＤＨ３細胞外領域との対応を示す。
【図７】図７は、ＣＤＨ３部分長タンパク質の発現結果を示す。Ａ：断片１、Ｂ：断片２、Ｃ：断片３、Ｄ：断片４、Ｅ：断片５
【図８】図８は、ＣＤＨ３部分長タンパク質と各抗体のウェスタンブロット法による反応を示す。Ａ：断片１、Ｂ：断片２、Ｃ：断片３、Ｄ：断片４、Ｅ：断片５
【発明を実施するための形態】
【００２３】
以下、本発明について更に詳細に説明する。
本発明の抗体は、カドヘリンドメイン１（ＥＣ１）またはカドヘリンドメイン２（ＥＣ２）の何れかを認識し、高い親和性を有する抗カドヘリン抗体である。
【００２４】
本明細書においてＰ−カドヘリン、Ｅ−カドヘリンおよびＮ−カドヘリンのカドヘリンドメイン１（ＥＣ１）、カドヘリンドメイン２（ＥＣ２）、カドヘリンドメイン３（ＥＣ３）、カドヘリンドメイン４（ＥＣ４）、カドヘリンドメイン５（ＥＣ５）は、それぞれ次の領域を示す。また、他のカドヘリンの対応する領域は、Ｇｅｎｂａｎｋ等より得られる公知のカドヘリンタンパク質の配列を比較することによって決定することができる。配列の比較は公知のプログラム、例えばＣｌｕｓｔａｌＷ２（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ＪＤ  ｅｔ  ａｌ.,  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２２  （２２）：  ３６７３−３６８０、１９９４）またはＣｌｕｓｔａｌＸ２（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ＪＤ  ｅｔ  ａｌ.,  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２５  （２４）：  ４８７６−４８８２,  １９９７）などを用いて行うことが可能である。
【００２５】
・Ｐ−カドヘリン（ＣＤＨ３）
カドヘリンドメイン１（ＥＣ１）：配列番号２のアミノ酸配列の第１０８位〜第２３６位
カドヘリンドメイン２（ＥＣ２）：配列番号２のアミノ酸配列の第２３７位〜第３４８位
カドヘリンドメイン３（ＥＣ３）：配列番号２のアミノ酸配列の第３４９位〜第４６１位
カドヘリンドメイン４（ＥＣ４）：配列番号２のアミノ酸配列の第４６２位〜第５５０位
カドヘリンドメイン５（ＥＣ５）：配列番号２のアミノ酸配列の第５５１位〜第６５４位
・Ｅ−カドヘリン（ＣＤＨ１）
カドヘリンドメイン１（ＥＣ１）：配列番号４のアミノ酸配列の第１５５位〜第２８３位
カドヘリンドメイン２（ＥＣ２）：配列番号４のアミノ酸配列の第２８４位〜第３９５位
カドヘリンドメイン３（ＥＣ３）：配列番号４のアミノ酸配列の第３９６位〜第５０７位
カドヘリンドメイン４（ＥＣ４）：配列番号４のアミノ酸配列の第５０８位〜第５９７位
カドヘリンドメイン５（ＥＣ５）：配列番号４のアミノ酸配列の第５９８位〜第７０４位
・Ｎ−カドヘリン（ＣＤＨ２）
カドヘリンドメイン１（ＥＣ１）：配列番号６のアミノ酸配列の第１６０位〜第２８８位
カドヘリンドメイン２（ＥＣ２）：配列番号６のアミノ酸配列の第２８９位〜第４０２位
カドヘリンドメイン３（ＥＣ３）：配列番号６のアミノ酸配列の第４０３位〜第５１８位
カドヘリンドメイン４（ＥＣ４）：配列番号６のアミノ酸配列の第５１９位〜第６０７位
カドヘリンドメイン５（ＥＣ５）：配列番号６のアミノ酸配列の第６０８位〜第７１９位
【００２６】
抗体の親和性は、公知の方法で測定することが可能である。抗体の親和性の測定方法としては、FACS、BIACORE,ELISA等の方法がある。細胞表面に対する抗体の親和性を測定するには、抗原が変性していないFACS法が望ましい。FACSによる抗体の親和性の測定方法は、抗体過剰の条件下で、蛍光強度飽和する点を求め、この１/２の蛍光強度を与える抗体濃度を測定すれば、これがKd値となる（Journal of Immunological Methods；318、147(2007)）。明細書の親和性に関するKd値は、実施例４における測定と同様の条件で測定した場合を意味する。具体的には以下の通りである。
【００２７】
抗ＣＤＨ３抗体の親和性の測定は、ＣＤＨ３が高発現であると確認されている癌細胞ＮＣＩ−Ｈ３５８株を用いたフローサイトメトリー法（ＢＤ社  ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ）で行った。すなわち、ＮＣＩ−Ｈ３５８細胞を２ｍＭ  ＥＤＴＡ−ＰＢＳで処理することにより培養プレートから剥離し、５×１０4〜２×１０5/ｍｌとなるようＦＡＣＳ溶液（１％ＢＳＡ  ＰＢＳ）に懸濁した。この細胞懸濁液を９６ウエルプレートに１００μl/ウエル播種し、抗体希釈系列（２００μｇ/ｍｌ〜０．１３ｎｇ/ｍｌ）１００μｌを添加後４℃で６０分間反応させ、ＦＡＣＳ溶液２００μＬ／ウェル）で３回洗浄した後、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８標識抗マウスＩｇＧ・ヤギＦ（ａｂ‘）２（インビトロジェン社）を加えて、４℃で６０分間反応させた。その後ＦＡＣＳ溶液で２回洗浄した後、フローサイトメトリを実施し、各ウエルの蛍光強度（ＧＥＯ  Ｍｅａｎ）を測定した。得られた抗体濃度と対応するＧＥＯ  Ｍｅａｎ値より、ＸＬｆｉｔ４．２．２（ＣＴＣラボラトリーシステムズ株式会社）にり、100%結合強度の1/2のGEO-MEAN(50%結合蛍光強度)を与える抗体濃度を算出しＫｄ値とした。
【００２８】
本明細書で言う「高い親和性」とは、上記方法で測定される「抗原に対する５０％結合を与える抗体濃度であるＫｄ値」が１０ｎＭ以下であることを意味し、好ましくは７ｎＭ以下であり、より好ましくは３ｎＭ以下であり、より好ましくは１ｎＭ以下であり、特に好ましくは０．６０ｎＭ以下である。
【００２９】
また、本発明の抗体の具体例としては、抗体濃度１μｇ／ｍＬのときの抗体依存性細胞傷害活性が３０％未満である抗体を挙げることができる。抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ活性）は、公知の方法で測定することが可能である。本明細書のＡＤＣＣ活性の数値は、実施例６における測定と同様の条件で測定した場合の抗体依存性細胞傷害活性を意味する。具体的には以下の通りである。
（１）エフェクター細胞の調製
Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ  Ｊｃｌマウス（８週齢、オス、日本クレア社）の大腿骨から骨髄細胞を採取し、１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地中で２ｘ１０6個／ｍＬに調製し、ヒトＩＬ−２（ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ社）５０ｎｇ／ｍＬ、マウスＧＭ−ＣＳＦ（ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ社）１０ｎｇ／ｍＬ存在下で６日間培養した。測定当日に細胞を回収し、１０％ＦＢＳ含有ＨＡＭ培地で洗浄後、エフェクター細胞溶液とした。
【００３０】
（２）標的細胞の調製
標的細胞として、全長ＣＤＨ３発現ＣＨＯ細胞（ＥＸＺ１５０１）を用いた。細胞をプレートから剥離後、１ｘ１０7個／ｍＬとなるように１０％ＦＢＳ含有ＨＡＭ培地に懸濁し、終濃度１５０ｕＣｉとなるように51Ｃｒを加え、５％炭酸ガスインキュベーター中３７℃で１．５時間培養した。この細胞を培地で２回洗浄後、１０％ＦＢＳ含有ＨＡＭ培地を加え、１ｘ１０4個／ウェルとなるように９６ウェルＵ底プレート（ＮＵＮＣ社）に播き、標的細胞とした。
【００３１】
（３）ＡＤＣＣ活性の測定
標的細胞にそれぞれ０．００１、０．０１、０．１、１μｇ／ｍＬ濃度に調製した抗体溶液を５０μＬ／ウェル分注した後、室温で１５分間インキュベーションし、次いでエフェクター細胞１００μＬ（１ｘ１０5細胞／ウェル）を分注し、炭酸ガスインキュベーター中で４時間培養する。培養上清を回収し、培養上清１００μＬ中の放射活性をシンチレーションカウンターで測定する。細胞傷害活性は以下の式で求めることができる。
細胞傷害活性（％）＝（Ａ−Ｃ）／（Ｂ−Ｃ）×１００
Ａ：各抗体添加ウェルの放射活性値（ｃｐｍ）
Ｂ：標的細胞に２％ＮＰ４０溶液１００μＬ、  １０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ培地５０μＬを添加したウェルの放射活性値（ｃｐｍ）
Ｃ：標的細胞にエフェクター細胞を含む１０％ＦＢＳ含有培地１５０μＬを加えたウェルの放射活性値（ｃｐｍ）
【００３２】
本発明の抗体が認識するカドヘリンの種類は古典的カドヘリンが望ましい。例としてＥ−カドヘリン、Ｎ−カドヘリン、Ｐ−カドヘリンを挙げる事ができるが、これに限定されるものではない。
【００３３】
本発明の抗体を作成するための抗原としては、カドヘリン又はその部分ペプチドを用いることができる。一例としては、可溶型ＣＤＨ３タンパク質などを用いることができるが、これに限定されるものではない。
【００３４】
本発明の抗体は、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい。本発明の抗体（ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体）は、種々の方法のいずれかによって製造することができる。このような抗体の製造法は当該分野で周知である[例えばＳａｍｂｒｏｏｋ,  Ｊ  ｅｔ  ａｌ.,  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ,  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）を参照]。この明細書では、“ モノクローナル抗体” は、ハイブリドーマ法で作られた抗体に限定されない。“ モノクローナル抗体” という用語は、単一のクローン（ 例えば真核生物、原核生物、ファージのクローン）に由来する抗体を意味し、どの方法で作ったかは問題とされない。本発明で役に立つモノクローナル抗体は、従来技術で知られている多彩な方法で調製することができる。方法としては、例えば、ハイブリドーマ法、組み換え法、ファージ提示法や、これらの組み合わせがある。としてその全体がこの明細書に組み込まれているものとする）。
【００３５】
（ａ）ポリクローナル抗体の作製
ポリクローナル抗体を作製するためには、カドヘリン又はその部分ペプチド（カドヘリンドメイン１（ＥＣ１）またはカドヘリンドメイン２（ＥＣ２）が好ましい）を抗原として、これを哺乳動物、例えばラット、マウス、ウサギなどに投与する。抗原の動物１匹当たりの投与量は、アジュバントを用いないときは０．１〜１００ｍｇであり、アジュバントを用いるときは１〜１００μｇである。アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）、フロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）、水酸化アルミニウムアジュバント等が挙げられる。免疫は、主として静脈内、皮下、腹腔内等に注入することにより行われる。また、免疫の間隔は特に限定されず、数日から数週間間隔、好ましくは２〜５週間間隔で、１〜１０回、好ましくは２〜５回免疫を行う。そして、最終の免疫日から６〜６０日後に、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ（Enzyme Linked Immunosorbent Assay）又は  ＥＩＡ（ｅｎｚｙｍｅ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ））、放射性免疫測定法（ＲＩＡ；ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏ  ａｓｓａｙ）等で抗体価を測定し、最大の抗体価を示した日に採血し、抗血清を得る。抗血清から抗体の精製が必要とされる場合は、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィーなどの公知の方法を適宜選択して、又はこれらを組み合わせることにより精製することができる。
【００３６】
（ｂ）モノクローナル抗体の作製
モノクローナル抗体を作製するためには、先ず、カドヘリン又はその部分ペプチドであるカドヘリンドメイン１（ＥＣ１）またはカドヘリンドメイン２（ＥＣ２）を抗原として、哺乳動物、例えばラット、マウス、ウサギなどに投与する。抗原の動物１匹当たりの投与量は、アジュバントを用いないときは０．１〜１００ｍｇであり、アジュバントを用いるときは１〜１００μｇである。アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）、フロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）、水酸化アルミニウムアジュバント等が挙げられる。免疫は、主として静脈内、皮下、腹腔内に注入することにより行われる。また、免疫の間隔は特に限定されず、数日から数週間間隔、好ましくは２〜５週間間隔で、１〜１０回、好ましくは２〜５回免疫を行う。そして、最終の免疫日から１〜６０日後、好ましくは１〜１４日後に抗体産生細胞を採集する。抗体産生細胞としては、脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血細胞等が挙げられるが、脾臓細胞又は局所リンパ節細胞が好ましい。
【００３７】
細胞融合ハイブリドーマを得るため、抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合を行う。抗体産生細胞と融合させるミエローマ細胞として、マウスなどの動物の一般に入手可能な株化細胞を使用することができる。使用する細胞株としては、薬剤選択性を有し、未融合の状態ではＨＡＴ選択培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジンを含む）で生存できず、抗体産生細胞と融合した状態でのみ生存できる性質を有するものが好ましい。ミエローマ細胞としては、例えば  Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ．８．Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）、ＮＳ−１などのマウスミエローマ細胞株が挙げられる。
【００３８】
次に、上記ミエローマ細胞と抗体産生細胞とを細胞融合させる。細胞融合は、血清を含まないＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ−１６４０培地などの動物細胞培養用培地中で、１×１０6〜１×１０7個／ｍｌの抗体産生細胞と２×１０5〜２×１０6個／ｍｌのミエローマ細胞とを混合し（抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞比５：１が好ましい）、細胞融合促進剤存在のもとで融合反応を行う。細胞融合促進剤として、平均分子量１０００〜６０００ダルトンのポリエチレングリコール等を使用することができる。また、電気刺激（例えばエレクトロポレーション）を利用した市販の細胞融合装置を用いて抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させることもできる。
【００３９】
細胞融合処理後の細胞から目的とするハイブリドーマを選別する。その方法として、細胞懸濁液を例えばウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ−１６４０培地などで適当に希釈後、マイクロタイタープレート上に３×１０5個／ｗｅｌｌ程度まき、各ウエルに選択培地を加え、以後適当に選択培地を交換して培養を行う。その結果、選択培地で培養開始後、１４日前後から生育してくる細胞をハイブリドーマとして得ることができる。
【００４０】
次に、増殖してきたハイブリドーマの培養上清中に、目的とする抗体が存在するか否かをスクリーニングする。ハイブリドーマのスクリーニングは、通常の方法に従えばよく、特に限定されるものではない。例えば、ハイブリドーマとして生育したウエルに含まれる培養上清の一部を採集し、酵素免疫測定法、放射性免疫測定法等によって、カドヘリンのカドヘリンドメイン１（ＥＣ１）またはカドヘリンドメイン２（ＥＣ２）と結合する抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングすることができる。融合細胞のクローニングは、限界希釈法等により行い、最終的にモノクローナル抗体産生細胞であるハイブリドーマを樹立することができる。
【００４１】
樹立したハイブリドーマからモノクローナル抗体を採取する方法として、通常の細胞培養法又は腹水採取法等を採用することができる。細胞培養法においては、ハイブリドーマを１０％ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ−１６４０培地、MEM培地又は無血清培地等の動物細胞培養培地中で、通常の培養条件（例えば３７℃、５％  ＣＯ2濃度）で７〜１４日間培養し、その培養上清から抗体を取得する。
【００４２】
腹水採取法の場合は、ミエローマ細胞由来の哺乳動物と同種系動物の腹腔内にハイブリドーマを約１×１０7個投与し、ハイブリドーマを大量に増殖させる。そして、１〜２週間後に腹水を採集する。上記抗体の採取方法において抗体の精製が必要とされる場合は、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィーなどの公知の方法を適宜選択して、又はこれらを組み合わせることにより精製することができる。
【００４３】
本発明の抗体の種類は特に制限されず、マウス抗体、ヒト抗体、ラット抗体、ウサギ抗体、ヒツジ抗体、ラクダ抗体、トリ抗体等や、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体等の何れでもよい。遺伝子組換え型抗体は、既知の方法を用いて製造することができる。キメラ抗体は、ヒト以外の哺乳動物、例えば、マウス抗体の重鎖、軽鎖の可変領域とヒト抗体の重鎖、軽鎖の定常領域からなる抗体であり、マウス抗体の可変領域をコードするＤＮＡをヒト抗体の定常領域をコードするＤＮＡと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得ることができる。ヒト化抗体は、ヒト以外の哺乳動物、たとえばマウス抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）をヒト抗体の相補性決定領域へ移植したものであり、その一般的な遺伝子組換え手法も知られている。具体的には、マウス抗体のＣＤＲとヒト抗体  のフレームワーク領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｒｅｇｉｏｎ；ＦＲ）を連結するように設計したＤＮＡ配列を、末端部にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドからＰＣＲ法により合成する。得られたＤＮＡをヒト抗体  定常領域をコードするＤＮＡと連結し、次いで発現ベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させることにより得られる（ＥＰ２３９４００号公報、国際公開ＷＯ９６／０２５７６号公報など）。
【００４４】
また、別のヒト化、キメラ化抗体の作製の手法としては例えば、C D Rと枠組構造残基の相互作用をモデル化して抗原が結合する上で重要な枠組構造残基を同定し、配列を比較して特定の位置にある通常とは異なる枠組構造残基を同定するという方法がある。例えばQ u e e n他、アメリカ合衆国特許第5 , 5 3 0 , 1 0 1号、第5 , 5 8 5 , 0 8 9号、第5 , 6 9 3 , 7 6 1号、第5 , 6 9 3 , 7 6 2号、第6 , 1 8 0 , 3 7 0号を参照のこと（それぞれの特許は、参考としてその全体がこの明細書に組み込まれているものとする）。抗体は従来技術で知られている多彩な方法でヒト化することができる。例えばC D Rグラフティング（ヨーロッパ特許第2 3 9 , 4 0 0号； P C T公開公報W O 9 1 / 0 9 9 6 7； アメリカ合衆国特許第5 , 2 2 5 , 5 3 9号、第5 , 5 3 0 , 1 0 1号、第5 , 5 8 5 , 0 8 9号）、ベニアリングまたはリサーフェシング（ ヨーロッパ特許第5 9 2 , 1 0 6号、第5 1 9 , 5 9 6号； P a d l a n、M o l . I m m u n o l .、第2 8巻、4 8 9〜 4 9 8ページ、19 9 1年； S t u d n i c k a他、P r o t . E n g .、第7巻、8 0 5〜 8 1 4ページ、1 9 9 4年； R o g u s k a他、P r o c . N a t l . A c a d . S c i .、第9 1巻、9 6 9〜 9 7 3ページ、1 9 9 4年） 、鎖シャッフリング（ アメリカ合衆国特許第5 , 5 6 5 , 3 3 2号）。また、キメラ化抗体の作製方法はMolecularBiotechnology  26,39(2004),Journalof Immunologica lMethods 125, 191(1989)に記載されている。なおこれら文献は、参考としてその全体がこの明細書に組み込まれているものとする。
【００４５】
キメラ化、ヒト化抗体のアミノ酸配列は、寄託ハイブリドーマの発現するcDNAに由来するVh 又は  Ｖl 領域のアミノ酸配列と100%同一であることも好ましいが、遺伝子工学的な改変により、90%以上同一である配列を有する抗体であることも好ましい。ヒト化、キメラ化の過程で抗原の結合を改善することを目的とした残基置換の調整は従来から行われている。このような、配列を一部改変した抗体は、基本的にはもとのハイブリドーマに由来する抗体と考えられるからである。
【００４６】
遺伝子工学的な手法を用いる、キメラ化抗体や、ヒト化抗体の作成方法は既に既知のものである。つまり、確認された基となるモノクローナル抗体のVh、VL配列を、遺伝子工学的に改変したのち、通常の方法により、キメラ化またはヒト化する。
【００４７】
また、ヒト抗体の取得方法も知られている。例えば、ヒトリンパ球をｉｎ  ｖｉｔｒｏで所望の抗原または所望の抗原を発現する細胞で感作し、感作リンパ球をヒトミエローマ細胞、例えばＵ２６６と融合させ、抗原への結合活性を有する所望のヒト抗体  を得ることもできる（特公平１−５９８７８参照）。また、ヒト抗体  遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物を所望の抗原で免疫することで所望のヒト抗体を取得することができる（ＷＯ９３／１２２２７,  ＷＯ９２／０３９１８，ＷＯ９４／０２６０２,  ＷＯ９４／２５５８５，ＷＯ９６／３４０９６,  ＷＯ９６／３３７３５参照）。さらに、ヒト抗体ライブラリーを用いて、パンニングによりヒト抗体を取得する技術も知られている。例えば、ヒト抗体  の可変領域を一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）としてファージディスプレイ法によりファージの表面に発現させ、抗原に結合するファージを選択することができる。選択されたファージの遺伝子を解析すれば、抗原に結合するヒト抗体の可変領域をコードするＤＮＡ配列を決定することができる。抗原に結合するｓｃＦｖのＤＮＡ配列が明らかになれば、当該配列から適当な発現ベクターを作製し、ヒト抗体 を取得することができる。これらの方法は既に周知であり、ＷＯ９２／０１０４７, ＷＯ９２／２０７９１, ＷＯ９３／０６２１３, ＷＯ９３／１１２３６, ＷＯ９３／１９１７２, ＷＯ９５／０１４３８, ＷＯ９５／１５３８８を参考にすることができる。
【００４８】
また、これらの抗体 は、カドヘリンドメイン１（ＥＣ１）またはカドヘリンドメイン２（ＥＣ２）を認識し、親和性が高い抗体であるという特性を失わない限り、一価抗体、二価抗体、多価抗体のいずれでもよく、抗体断片（フラグメント）等の低分子化抗体 や抗体の修飾物などであってもよい。また、抗体断片や低分子化抗体、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆｖ、ＳｃＦｖ（ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ Ｆｖ）、ＤｉａｂｏｄｙなどにＦｃ部分を融合しＡＤＣＣ活性を付加したものでもよい。このような抗体を得るには、これら抗体をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させればよい。
【００４９】
抗体の修飾物として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の各種分子と結合した抗体を使用することもできる。特に薬剤結合抗体 は有用である。このような抗体修飾物は、得られた抗体 に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。なお、抗体の修飾方法は当業者に公知である。
【００５０】
本発明の抗体は、高い親和性を示すことから、毒素を結合し細胞傷害剤として使用することができる。本発明の細胞傷害剤は、例えばカドヘリンを発現している癌細胞と接触させることにより癌細胞を傷害することができる。
【００５１】
本発明における抗体の好ましい態様としては抗体に薬剤等の細胞傷害性物質を結合した、いわゆるＡＤＣをあげることができる。
【００５２】
本発明で用いられる薬剤の例としては例えば  デュオカルマイシン、デュオカルマイシンのアナログ及び誘導剤、ＣＣ−１０６５、ＣＢＩを主成分とするデュオカルマイシンアナログ、ＭＣＢＩを主成分とするデュオカルマイシンアナログ、ＣＣＢＩを主成分とするデュオカルマイシンアナログ、ドキソルビシン、ドキソルビシンコンジュゲート、モルフォリノ−ドキソルビシン、シアノモルフォリノ−ドキソルビシン、ドラスタチン、ドレスタチン−１０、コンブレタスタチン、カリケアミシン、マイタンシン、マイタンシンアナログ、ＤＭ１，ＤＭ２，ＤＭ３，ＤＭ４、ＤＭＩ、アウリスタチンＥ、アウリスタチンＥＢ（ＡＥＢ）、アウリスタチンＥＦＰ（ＡＥＦＰ）、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、５−ベンゾイルバレリン酸ＡＥエステル（ＡＥＶＢ）、チューブリシン、ジソラゾール、エポシロン、パクリタキセル、ドセタキセル、ＳＮ−３８、トポテカン、リゾキシン、エキノマイシン、コルヒチン、ビンブラスチン、ビンデシン、エストラムスチン、セマドチン、エリューテロビン、メトトレキサート、メトプテリン、ジクロロメトトレキサート、５−フルオロウラシル、６−メルカプトプリン、シトシンアラビノシド、メルファラン、リューロシン、リューロシダイン、アクチノマイシン、ダウノルビシン、ダウノルビシンコンジュゲート、マイトマイシンＣ、マイトマイシンＡ、カルミノマイシン、アミノプテリン、タリソマイシン、ポドフィロトキシン、ポドフィロトキシン誘導体、エトポシド、エトポシドリン酸塩、ビンクリスチン、タキソール、タキソテールレチノイン酸、酪酸、Ｎ8−アセチルスペルミジン並びにカンプトセシン等をあげることができるが、これだけに限定されるわけではない。
【００５３】
本発明におけるＡＤＣにおける、前記の薬剤と抗体との結合は公知の方法をにより作製できる。抗体と薬剤は、それら自身が有する連結基などを介して直接結合されてもよいし、また、リンカーやなどの他の物質を介して間接的に結合されてもよい。
【００５４】
薬剤が直接結合される場合の連結基は、例えばＳＨ基を用いたジスルフィド結合やマレイミドを介する結合が挙げられる。例えば、抗体のＦｃ領域の分子内ジスルフィド結合と、薬剤のジスルフィド結合を還元して、両者をジスルフィド結合にて結合する。また、マレイミドを介する方法もある。また別の方法として、抗体内にシステインを遺伝子工学的に導入する方法もある。
【００５５】
抗体と薬剤を、他の物質（リンカー）を介して間接的に結合することも可能である。リンカーには、抗体または薬剤または両方と反応する官能基を１または２種類以上有することが望ましい。官能基の例としてはアミノ基、カルボキシル基、メルカプト基、,マレイミド基、ピリジニル基等をあげることができる。また、このリンカーはペプチドリンカーであってもよい。薬剤と抗体との結合方法に関しては、例えば、Cancer Research ;68 (22) 9280（2008）、Nature Biotechnology;26(8) 925（2008）、Bio Conjugate Chemistry;19、1673 (2008)、Cancer Research ;68 (15) 6300（2008）、又は特表2008-516896号公報などに記載の方法に準じて行うことができる。
【００５６】
本発明の別の実施形態としては、抗体に毒素、トキシンを化学的または遺伝子工学的に結合した、いわゆるイムノトキシンをあげることができる。
【００５７】
本発明で用いられるトキシンとしては、例えば、次のものを挙げることができる。ジフテリアトキシンＡ鎖、シュードモナスエンドトキシン、リシン鎖；無糖鎖リシンＡ鎖ゲロニン（Ｇｅｌｏｎｉｎ）サポリン（Ｓａｐｏｒｉｎ）等をあげることができる。
【００５８】
本発明の抗体の別の実施態様としては、本発明の抗体と放射性物質とを結合したいわゆるＲＩ標識抗体をあげることができる。
【００５９】
放射性物質としては、癌治療薬として用いる場合には細胞傷害性放射性金属が好ましく、癌診断薬として用いる場合には細胞非傷害性放射性金属であるのが好ましい。また、ヨウド１２３（１２３Ｉ）、ヨウド１３１（Ｉ１３１）を使用する方法もある。
【００６０】
このような細胞傷害性放射性金属としては、例えばイットリウム９０（９０Ｙ）、レニウム１８６（１８６Ｒｅ）、レニウム１８８（１８８Ｒｅ）、銅６７（６７Ｃｕ）、鉄５９（５９Ｆｅ）、ストロンチウム８９（８９Ｓｒ）、金１９８（１９８Ａｕ）、水銀２０３（２０３Ｈｇ）、鉛２１２（２１２Ｐｂ）、ジスプロシウム１６５（１６５Ｄｙ）、ルテニウム１０３（１０３Ｒｕ）、ビスマス２１２（２１２Ｂｉ）、ビスマス２１３（２１３Ｂｉ）、ホルミウム１６６（１６６Ｈｏ）、サマリウム１５３（１５３Ｓｍ）、ルテチウム１７７（１７７Ｌｕ）などを挙げることができる。
【００６１】
これらの放射性金属の中でも、９０Ｙ、１５３Ｓｍ、１７７Ｌｕが、半減期、放射線エネルギー、容易な標識反応、標識率、錯体の安定性等の点から好ましい。
【００６２】
一方、診断薬に用いる細胞非傷害性放射性金属としては、テクネシウム９９ｍ（９９ｍＴｃ）、インジウム１１１（１１１Ｉｎ）、インジウム１１３ｍ（１１３ｍＩｎ）、ガリウム６７（６７Ｇａ）、ガリウム６８（６８Ｇａ）、タリウム２０１（２０１Ｔｌ）、クロム５１（５１Ｃｒ）、コバルト５７（５７Ｃｏ）、コバルト５８（５８Ｃｏ）、コバルト６０（６０Ｃｏ）、ストロンチウム８５（８５Ｓｒ）、水銀１９７（１９７Ｈｇ）、銅６４（６４Ｃｕ）が好適に用いられるが、これに限定されるものではない。
【００６３】
これらの放射性金属元素を本発明の抗体に結合させるには、該抗体に金属キレート試薬を反応させ、これに放射性金属元素を反応させて錯体とするのが好ましい。このようにして得られた修飾抗体は、放射性金属元素が金属キレート試薬を介して本発明の抗体に結合している。
【００６４】
このような錯体形成に用いられる金属キレート試薬の例としては、例えば（１）８−ヒドロキシキノリン、８−アセトキシキノリン、８−ヒドロキシキナルジン、硫酸オキシキノリン、Ｏ−アセチルオキシン、Ｏ−ベンゾイルオキシン、Ｏ−ｐ−ニトロベンゾイルオキシン、キノリン骨格を有するキノロン系化合物であるノルフロキサシン、オフロキサシン、エノキサシン、シプロフロキサシン、ロメフロキサシン、トスフロキサシン、フレロキサシン、スパルフロキサシン等のキノリン誘導体；（２）クロラニル酸、アルミノン、チオ尿素、ピロガロール、クペロン、ビスムチオール（ＩＩ）、ガロイル没食子酸、チオリド、２−メルカプトベンゾチアゾール、テトラフェニルアルソニウムクロライド等の化合物；（３）エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）およびこれらに類似した骨格を有するジヒドロキシエチルグリシン、ジアミノプロパノール四酢酸、エチレンジアミン二酢酸、エチレンジアミン二プロピオン酸塩酸塩、ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸、エチレンジアミンテトラキス（メチレンホスホン酸）、グリコールエーテルジアミン四酢酸、ヘキサメチレンジアミン四酢酸、ヒドロキシエチルイミノ二酢酸、イミノ二酢酸、ジアミノプロパン四酢酸、ニトリロ三酢酸、ニトリロ三プロピオン酸、ニトリロトリス（メチレンスルホン酸）三ナトリウム塩、トリエチレンテトラミン六酢酸、メチルＤＴＰＡ、シクロヘキシルＤＴＰＡ、アミノベンジルＥＤＴＡ、イソチオシアノベンジルＥＤＴＡ、イソチオシアノベンジルＤＴＰＡ、メチルイソチオシアノベンジルＤＴＰＡ、シクロヘキシルイソチオシアノベンジルＤＴＰＡ、マレイミドプロピルアミドベンジルＥＤＴＡ、マレイミドペンチルアミドベンジルＥＤＴＡ、マレイミドデシルアミドベンジルＥＤＴＡ、マレイミドペンチルアミドベンジルＤＴＰＡ、マレイミドデシルアミドベンジルＥＤＴＡ、マレイミドデシルアミドベンジルＤＴＰＡ；（４）１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸（ＤＯＴＡ）、１，４，７−トリアザシクロノナン−１，４，７−三酢酸（ＮＯＴＡ）、１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン−１，４，８，１１−四酢酸（ＴＥＴＡ）、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン（Ｃｙｃｌｅｎ）、１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン（Ｃｙｃｌａｍ）、イソチオシアノベンジルＤＯＴＡ、イソチオシアノベンジルＮＯＴＡ等が挙げられる。
【００６５】
これらの金属キレート試薬のうち、イソチオシアノベンジルＤＯＴＡ、メチルイソチオシアノベンジルＤＴＰＡ、シクロヘキシルイソチオシアノベンジルＤＴＰＡが金属キレートの容易な抗体への導入反応、標識率、錯体の安定性等の点で好ましい。
【００６６】
本発明の抗体への放射性金属元素の結合は、当業者であれば常法に従って行うことができる。例えば本発明の抗体に金属キレート試薬を反応させ、予め標識前駆体を調製しておき、次いで放射性金属元素を反応させることにより行うことができる。
【００６７】
本発明の細胞傷害剤には、本発明の抗体（所望により細胞傷害性物質、トキシン、又は放射性物質が結合していてもよい）の他に、必要に応じて薬学的に許容される担体、賦形剤、希釈剤などを適宜含有させることができる。本発明の細胞傷害剤としては、例えば注射剤として製剤することができる。本発明の細胞傷害剤の投与量は、患者の症状の程度、年令及び体重、投与方法などに依存し、有効成分である抗体の重量としては通常、約１０ｎｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲である。
【００６８】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【００６９】
実施例１  ＣＤＨ３発現ＣＨＯ細胞株の樹立
抗ＣＤＨ３抗体スクリーニング用細胞株を得るため、全長ＣＤＨ３を発現するＣＨＯ細胞の樹立を行った。
（１）ＣＤＨ３遺伝子発現ベクターの作製
配列番号１に示す全長ヒトＣＤＨ３ＤＮＡを哺乳類発現ベクターｐＥＦ４／ｍｙｃ−ＨｉｓＢ（インビトロジェン社）へ挿入するため、２種類の制限酵素ＫｐｎＩ（タカラバイオ社）及びＸｂａＩ（タカラバイオ社）で３７℃、１時間処理した後、同じくＫｐｎＩ及びＸｂａＩで処理したｐＥＦ４／ｍｙｃ−ＨｉｓＢへＴ４ ＤＮＡリガーゼ（プロメガ社）により常法に従って挿入し、発現ベクターｐＥＦ４―ＣＤＨ３―ｍｙｃ−Ｈｉｓを得た。
【００７０】
（２）ＣＤＨ３安定発現株の取得
ＦｕＧＥＮＥ（登録商標）６トランスフェクション試薬（ロシュ・ダイアグノスティックス社）のプロトコールに準じ、トランスフェクション前日に径１０ｃｍディッシュに８×１０5細胞のＣＨＯ細胞を播種し一晩培養後、８μｇの発現ベクターｐＥＦ４―ＣＤＨ３―ｍｙｃ−Ｈｉｓと１６μＬのＦｕＧＥＮＥ６試薬を４００μＬの無血清ＲＰＭＩ１６４０培地（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社）に混合し１５分間室温放置後、細胞培養液に加えトランスフェクションを行った。トランスフェクション翌々日に選択試薬（Ｚｅｏｃｉｎ（登録商標））を用いて限界希釈法にてクローニングを行った。
【００７１】
ＣＤＨ３全長発現ＣＨＯのクローン選抜は、抗ｃ−Ｍｙｃモノクローナル抗体（ＳＡＮＴＡ  ＣＲＵＺ  ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ社）を用いたウェスタンブロット法により行い、その結果、発現量が高く、かつ増殖が良好なＣＤＨ３全長発現ＣＨＯ細胞株（ＥＸＺ１５０１）を得た。この細胞株と市販抗ＣＤＨ３抗体（Ｒ＆Ｄ  ＳＹＳＴＥＭＳ社）のフローサイトメーターによる測定結果を図３に示す。
【００７２】
実施例２ 可溶型ＣＤＨ３抗原の作製
抗ＣＤＨ３抗体作製の免疫原とするため、Ｃ末端膜貫通領域以降を欠損させた可溶型ＣＤＨ３（ｓＣＤＨ３）タンパク質を作製した。
（１）可溶型ＣＤＨ３抗原発現ベクターの作製
ＣＤＨ３全長ｃＤＮＡをテンプレートとして、ＣＤＨ３細胞外領域に相当する部分（配列番号２の１−６５４に相当、以下ｓＣＤＨ３ｃＤＮＡ）を増幅するように設計されたフォワードプライマー （配列番号７：ＣＧＣＧＧＴＡＣＣＡＴＧＧＧＧＣＴＣＣＣＴＣＧＴ、（ｈＣＤＨ３ＦｕｌｌＦＷ））とリバースプライマー （配列番号８：ＣＣＧＴＣＴＡＧＡＴＡＡＣＣＴＣＣＣＴＴＣＣＡＧＧＧＴＣＣ、（ｈＣＤＨ３ＳｏｌｂＲＶ））を用いてＰＣＲ反応を行った。反応にはＫＯＤ−Ｐｌｕｓ（東洋紡社）を用い、９４℃−１５秒、５５℃−３０秒、６８℃−９０秒、３０サイクルの反応条件で行った。
【００７３】
その後、アガロースゲル電気泳動で目的サイズである約２．０ｋｂｐのバンドを含むゲル断片を切り出し、ＱＩＡ（登録商標）クイックゲル抽出キット（キアゲン社）を用いて、目的のｓＣＤＨ３ｃＤＮＡを得た。
【００７４】
このｓＣＤＨ３ｃＤＮＡを発現用ベクターｐＥＦ４／ｍｙｃ−ＨｉｓＢへ挿入するために、２種類の制限酵素ＫｐｎＩ及びＸｂａＩで処理した後、同じくＫｐｎＩ及びＸｂａＩで処理したｐＥＦ４／ｍｙｃ−ＨｉｓＢにＴ４  ＤＮＡリガーゼを用いて常法に従い挿入し、発現ベクターｐＥＦ４−ｓＣＤＨ３−ｍｙｃ−Ｈｉｓを得た。
【００７５】
（２）可溶型ＣＤＨ３タンパク質の発現
ＦｕＧＥＮＥ６トランスフェクション試薬のプロトコールに準じ、トランスフェクション前日に径１０ｃｍディッシュに８×１０5 個のＣＨＯ細胞を播種し一晩培養後、８μｇの発現ベクターｐＥＦ４−ｓＣＤＨ３−ｍｙｃ−Ｈｉｓと１６μＬのＦｕＧＥＮＥ６試薬を４００μＬの無血清ＲＰＭＩ１６４０培地に混合、１５分間室温放置後、細胞培養液に加えトランスフェクションを行った。トランスフェクション翌々日に選択試薬（Ｚｅｏｃｉｎ）を用いて限界希釈法にてクローニングを行った。
【００７６】
可溶型ＣＤＨ３発現ＣＨＯ細胞の選抜は、抗ｃ−Ｍｙｃモノクローナル抗体（ＳＡＮＴＡ  ＣＲＵＺ  ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ社）を用いたウェスタンブロット法で行った。培養上清中への分泌量が多く増殖が良好な細胞株を選択した結果、可溶型ＣＤＨ３発現ＣＨＯ細胞株（ＥＸＺ１７０２）が得られた。選択された可溶型ＣＤＨ３発現ＣＨＯ細胞株（ＥＸＺ１７０２）は、培養面積１，５００ｃｍ2のローラーボトル３本を用い、ローラーボトル１本あたり無血清培地ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭ−ＩＩ（インビトロジェン社）３３３ｍＬにて７２時間培養を行い、培養上清を回収した。得られた培養上清からＨｉｓＴｒａｐ（登録商標）ＨＰカラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）によるアフィニティークロマトグラフィーとＳｕｐｅｒｄｅｘ（登録商標）２００ｐｇカラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）によるゲル濾過クロマトグラフィーにより可溶型ＣＤＨ３タンパク質を得た。
【００７７】
実施例３  抗ＣＤＨ３モノクローナル抗体の作製
（１）可溶型ＣＤＨ３タンパク質を免疫原としたモノクローナル抗体の作製
生理食塩水に溶解した５０μｇの可溶型ＣＤＨ３タンパク質とＴｉｔｅｒ−ＭＡＸ  Ｇｏｌｄ（登録商標）（タイターマックス社）を等量混合し、ＭＲＬ／ｌｐｒマウス（日本エスエルシー株式会社）の腹腔内および皮下に注射する事により初回免疫を行った。２回目以降の免疫は同様に調製した２５μｇタンパク質量相当の可溶型ＣＤＨ３タンパク質とＴｉｔｅｒ−ＭＡＸ  Ｇｏｌｄを混合して腹腔内および皮下に注射することにより実施した。最終免疫から３日後にマウスから脾臓細胞を無菌的に調製し、常法に従って、ポリエチレングリコール法によりマウスミエローマ細胞ＳＰ２／Ｏ−Ａｇ１４あるいはＰ３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５３との細胞融合を行った。
【００７８】
（２）抗ＣＤＨ３抗体産生ハイブリドーマの選抜
抗ＣＤＨ３抗体の選抜は、全長ＣＤＨ３を発現するＣＨＯ細胞株（ＥＸＺ１５０１）を用いたフローサイトメトリで行った。
【００７９】
すなわち、全長ＣＤＨ３を発現するＣＨＯ細胞株（ＥＸＺ１５０１）を２ｍＭ  ＥＤＴＡ−ＰＢＳで処理することで培養プレートから剥離後、１×１０6個／ｍＬとなるようにＦＡＣＳ溶液に懸濁した。この細胞懸濁液を５０μＬ／ウェルとなるように９６ウェルプレートに播種し、ハイブリドーマ培養上清を加えて４℃で６０分間反応させ、ＦＡＣＳ溶液（２００μＬ／ウェル）で２回洗浄した後、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８標識抗マウスＩｇＧ・ヤギＦ（ａｂ‘）2（インビトロジェン社）を加えて、４℃で３０分間反応させた。その後ＦＡＣＳ溶液で２回洗浄した後、フローサイトメトリを実施し、ＣＤＨ３発現ＣＨＯ細胞にて強い反応が認められるハイブリドーマを選抜した。
【００８０】
当該ハイブリドーマより得られた抗体と、ＣＤＨ３発現ＣＨＯ細胞（ＥＸＺ１５０１）、親株であるＣＨＯ細胞及びＣＤＨ３が高発現であると確認されている癌細胞ＮＣＩ−Ｈ３５８との典型的な反応結果を図４に示す。選抜したハイブリドーマ全てが、ＣＤＨ３発現ＣＨＯ細胞（ＥＸＺ１５０１）およびＮＣＩ−Ｈ３５８と反応し、ＣＨＯ細胞とは反応しないことを確認した。
【００８１】
実施例４  抗体Kd値の測定
抗体の親和性の測定方法としては、FACS、BIACORE,ELISA等の方法がある。細胞表面に対する抗体の親和性を測定するには、抗原が変性していないFACS法が望ましい。FACSによる抗体の親和性の測定方法は、抗体過剰の条件下で、蛍光強度飽和する点を求め、このの１/２の蛍光強度を与える抗体濃度を測定すれば、これがKd値となる（参考文献：Journal of Immunological Methods；318、147(2007)）
【００８２】
抗ＣＤＨ３抗体の親和性の測定は、ＣＤＨ３が高発現であると確認されている癌細胞ＮＣＩ−Ｈ３５８株を用いたフローサイトメトリー法（ＢＤ社  ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ）で行った。
すなわち、ＮＣＩ−Ｈ３５８細胞を２ｍＭ  ＥＤＴＡ−ＰＢＳで処理することにより培養プレートから剥離し、５×１０４〜２×１０５/ｍｌとなるようＦＡＣＳ溶液（１％ＢＳＡ  ＰＢＳ）に懸濁した。この細胞懸濁液を９６ウエルプレートに１００μl/ウエル播種し、抗体希釈系列（２００μｇ/ｍｌ〜０．１３ｎｇ/ｍｌ）１００μｌを添加後４℃で６０分間反応させ、ＦＡＣＳ溶液２００μＬ／ウェル）で３回洗浄した後、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８標識抗マウスＩｇＧ・ヤギＦ（ａｂ‘）２（インビトロジェン社）を加えて、４℃で６０分間反応させた。その後ＦＡＣＳ溶液で２回洗浄した後、フローサイトメトリを実施し、各ウエルの蛍光強度（ＧＥＯ  Ｍｅａｎ）を測定した。
【００８３】
得られた抗体濃度と対応するＧＥＯ  Ｍｅａｎ値より、ＸＬｆｉｔ４．２．２（ＣＴＣラボラトリーシステムズ株式会社）にり、100%結合強度の1/2のGEO-MEAN(50%結合蛍光強度)を与える抗体濃度を算出しＫｄ値とした。得られた結果を、図５及び表１に示す。
【００８４】
【表１】
2014015396.tif 000002
【００８５】
実施例５ ＣＤＨ３部分長発現タンパク質による抗ＣＤＨ３モノクローナル抗体のエピトープ分類
得られた抗ＣＤＨ３抗体のエピトープ分類は、ＣＤＨ３部分配列発現物とのウェスタンブロット法により行った。ＣＤＨ３部分配列発現物は各断片間で十分に配列が重複するように断片１から５を設計した（図６）。
【００８６】
（１）ＣＤＨ３部分長タンパク質の発現ベクターの作製
実施例１の全長ＣＤＨ３ｃＤＮＡをテンプレートとし、後述のプライマーセットを用いてＰＣＲ反応を行った。この反応にはｉＰｒｏｏｆ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡポリメラーゼ（バイオラッド社）を用い、条件は９８℃−１０秒、６０℃−１０秒、７２℃−３０秒、３５サイクルで行なった。アガロースゲル電気泳動により目的のサイズに近いバンドを含むゲルを切り出し、ＱＩＡ（登録商標）クイックゲル抽出キットを用いて、目的のＣＤＨ３ｃＤＮＡ断片を得た。
【００８７】
このＣＤＨ３断片を大腸菌発現ベクターｐＣｏｌｄ（登録商標）ＴＦ（タカラバイオ社）へ挿入するために、２種類の制限酵素ＫｐｎＩ及びＸｂａＩで処理した後、同じくＫｐｎＩ及びＸｂａＩで処理したｐＣｏｌｄＴＦにＴ４  ＤＮＡリガーゼを用いて常法に従い挿入し、各断片を発現するための発現ベクターを得た。
以下のプライマーセットを用いてＰＣＲ反応を行い各断片を得た。
【００８８】
断片１（配列番号２の１０８位−２３６位）
フォワードプライマー：ＴＡＴＧＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＧＡＴＴＧＧＧＴＧＧＴＴＧＣＴＣＣＡＡＴＡＴＣＴＧ（配列番号：９）
リバースプライマー：ＡＧＡＴＴＡＣＣＴＡＴＣＴＡＧＡＣＴＡＣＴＧＣＡＴＣＡＣＡＧＡＡＧＴＡＣＣＴＧＧＴＡＧＧ（配列番号：１０）
【００８９】
断片２（配列番号２の１３２位−３４８位）
フォワードプライマー：ＴＡＴＧＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＡＡＧＴＣＴＡＡＴＡＡＡＧＡＴＡＧＡＧＡＣＡＣＣＡＡＧ（配列番号：１１）
リバースプライマー：ＡＧＡＴＴＡＣＣＴＡＴＣＴＡＧＡＣＴＡＣＣＴＣＴＧＣＡＣＣＴＣＡＴＧＧＣＣＣＡＣＴＧＣＡＴＴＣＴＣＡ（配列番号：１２）
【００９０】
断片３（配列番号２の２３７位−４６１位）
フォワードプライマー：ＴＡＴＧＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＧＴＧＡＣＡＧＣＣＡＣＧＧＡＴＧＡＧＧＡＴＧＡＴＧ（配列番号：１３）
リバースプライマー：ＡＧＡＴＴＡＣＣＴＡＴＣＴＡＧＡＣＴＡＧＡＣＡＣＡＣＡＣＡＧＧＣＴＣＣＣＣＡＧＴＧ（配列番号：１４）
【００９１】
断片４（配列番号２の３４９位−５５０位）
フォワードプライマー：ＴＡＴＧＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＴＧＡＣＧＧＴＣＡＣＴＧＡＴＣＴＧＧＡＣＧ（配列番号：１５）
リバースプライマー：ＡＧＡＴＴＡＣＣＴＡＴＣＴＡＧＡＣＴＡＧＧＧＣＴＣＡＧＧＧＡＣＴＧＧＧＣＣＡＴＧＧＴＣＡＴＴＧ（配列番号：１６）
【００９２】
断片５（配列番号２の４６２位−６５４位）
フォワードプライマー：ＴＡＴＧＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＴＡＣＡＣＴＧＣＡＧＡＡＧＡＣＣＣＴＧＡＣＡＡＧＧ（配列番号：１７）
リバースプライマー：ＡＧＡＴＴＡＣＣＴＡＴＣＴＡＧＡＣＴＡＡＣＣＴＣＣＣＴＴＣＣＡＧＧＧＴＣＣＡＧＧＧＣＡＧＧＴＴＴＣＧ（配列番号：１８）
【００９３】
（２）ＣＤＨ３部分長タンパク質の発現
（１）のＣＤＨ３断片の発現ベクターを使用して、常法により大腸菌Ｒｏｓｓｅｔｔａ（登録商標）２（メルク社）を形質転換し、ＬＢ培地中で培養。６００ｎｍの吸光値が０．４となった段階で、３０分間氷冷し、イソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）濃度を０．５ｍＭとし、２０℃で１８時間培養後、回収した。
【００９４】
ＣＤＨ３部分長タンパク質の発現は、大腸菌培養液を電気泳動後、抗Ｐｅｎｔａ−Ｈｉｓ抗体（キアゲン社）によるウェスタンブロット法を実施し、予想された位置にバンドが存在する事で確認した。
即ち、上述した大腸菌培養液量の１／１０量に相当する泳動緩衝液を加え、還元条件下５−２０％グラジエントゲル（バイオラッド社）にチャージして電気泳動後、イモビロン（登録商標）Ｐ（ミリポア社）に転写した。転写膜は、ＴＢＳ−Ｔ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、ＴＢＳ）で軽く洗った後、４０％ＢＳＡ入りＴＢＳで１時間振とう後、１０％ブロックエース（登録商標）（雪印乳業社）入りＴＢＳ−Ｔで希釈した各抗ＣＤＨ３抗体を加え１時間振とうした。ＴＢＳ−Ｔで洗った後１０％ブロックエース入りＴＢＳ−Ｔで希釈したＨＲＰ−抗マウスＩｇＧ抗体（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）で１時間振とう後、ＴＢＳ−Ｔで洗った。発色はメーカーの解説書に従い、ＥＣＬ（登録商標）−Ｐｌｕｓ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）を用いて、Ｘ線フィルムＲＸ−ｕ（富士フイルム社）にて検出した。得られた結果を図７に示す。
【００９５】
（３）ＣＤＨ３部分配列発現物を用いた抗体エピトープ分類
上述の各ＣＤＨ３部分長タンパク質を発現させた大腸菌溶解物を還元条件下、５−２０％グラジエントゲル（バイオラッド社）にチャージして電気泳動後、ブロッティング装置（バイオラッド社）を用いて、イモビロンＰ（ミリポア社）に転写した。転写膜は、ＴＢＳ−Ｔ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、ＴＢＳ）で軽く洗った後、４０％ＢＳＡ入りＴＢＳで１時間振とう後、短冊状に等間隔で切断し、１０％ブロックエース入りＴＢＳ−Ｔで希釈した各抗ＣＤＨ３抗体を加え１時間振とうした。ＴＢＳ−Ｔで洗った後１０％ブロックエース入りＴＢＳ−Ｔで希釈したＨＲＰ−抗マウスＩｇＧ抗体（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）で１時間振とう後、ＴＢＳ−Ｔで洗った。発色はメーカーの解説書に従い、ＥＣＬ−Ｐｌｕｓ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）を用いて、Ｘ線Ｆｉｌｍ  ＲＸ−ｕ（富士フイルム社）にて検出した。得られた結果を表２及び図８に示す。
【００９６】
各ＣＤＨ３部分長タンパク質との反応性により、各抗体が認識する領域を決定した（表２）。
配列番号２で示されるＣＤＨ３配列上の各抗体が認識する領域との対応関係を以下に示す。
【００９７】
ＥＣ１：１０８位―２３６位
ＥＣ２：２３７位―３４８位
ＥＣ３：３４９位―４６１位
ＥＣ４：４６２位―５５０位
ＥＣ５：５５１位―６５４位
【００９８】
【表２】
2014015396.tif 000003
【００９９】
実施例６  抗ＣＤＨ３抗体の抗体依存性細胞傷害 （ＡＤＣＣ） 活性の測定
ＡＤＣＣ活性の測定は、放射性ラベルした標的細胞にエフェクター細胞存在下、抗体を作用させ、その遊離放射活性を測定する方法によった。
（１）エフェクター細胞の調製
Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ  Ｊｃｌマウス（８週齢、オス、日本クレア社）の大腿骨から骨髄細胞を採取し、１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地中で２ｘ１０6個／ｍＬに調製し、ヒトＩＬ−２（ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ社）５０ｎｇ／ｍＬ、マウスＧＭ−ＣＳＦ（ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ社）１０ｎｇ／ｍＬ存在下で６日間培養した。測定当日に細胞を回収し、１０％ＦＢＳ含有ＨＡＭ培地で洗浄後、エフェクター細胞溶液とした。
【０１００】
（２）標的細胞の調製
標的細胞として、全長ＣＤＨ３発現ＣＨＯ細胞（ＥＸＺ１５０１）を用いた。細胞をプレートから剥離後、１ｘ１０7個／ｍＬとなるように１０％ＦＢＳ含有ＨＡＭ培地に懸濁し、終濃度）１５０ｕＣｉとなるように51Ｃｒを加え、５％炭酸ガスインキュベーター中３７℃で１．５時間培養した。この細胞を培地で２回洗浄後、１０％ＦＢＳ含有ＨＡＭ培地を加え、１ｘ１０4個／ウェルとなるように９６ウェルＵ底プレート（ＮＵＮＣ社）に播き、標的細胞とした。
【０１０１】
（３）ＡＤＣＣ活性の測定
標的細胞にそれぞれ０．００１、０．０１、０．１、１μｇ／ｍＬ濃度になるよう調製した抗体溶液を５０μＬ／ウェル分注した後、室温で１５分間インキュベートした。次いで、エフェクター細胞１００μＬ（１ｘ１０5細胞／ウェル）を分注し、炭酸ガスインキュベーター中で４時間培養した。培養上清を回収し、培養上清１００μＬ中の放射活性をシンチレーションカウンターで測定した。
【０１０２】
このとき、細胞傷害活性は以下の式で求めた。
細胞傷害活性（％）＝（Ａ−Ｃ）／（Ｂ−Ｃ）×１００
Ａ：各抗体添加ウェルの放射活性値（ｃｐｍ）
Ｂ：標的細胞に２％ＮＰ４０溶液１００μＬ、 １０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ培地５０μＬを添加したウェルの放射活性値（ｃｐｍ）
Ｃ：標的細胞にエフェクター細胞を含む１０％ＦＢＳ含有培地１５０μＬを加えたウェルの放射活性値（ｃｐｍ）
【０１０３】
試験は３重に測定し、その平均値から細胞傷害活性（％）を算出した。
抗体濃度が１ ｕｇ／ｍＬの時の細胞傷害活性が３０％以上の場合はＳ、３０％未満の場合はＷとして判定した。
試験結果を表３に示す。
【０１０４】
【表３】
2014015396.tif 000004
【０１０５】
抗体PPAＴ-055-27、PPAＴ-055-21、PPAＴ-055-24、PPAＴ-055-09、PPAＴ-055-25、PPAＴ-055-02、PPAＴ-055-26を産生するハイブリドーマPPAＴ-055-27、PPAＴ-055-21、PPAＴ-055-24、PPAＴ-055-09、PPAＴ-055-25、PPAＴ-055-02、PPAＴ-055-26は、２０１０年１０月１５日に独立行政法人 製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター(郵便番号２９２−０８１８  日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８)に受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−９９４、ＮＩＴＥ  ＡＰ−９９０、ＮＩＴＥ  ＡＰ−９９１、ＮＩＴＥ  ＡＰ−９８９、ＮＩＴＥ  ＡＰ−９９２、ＮＩＴＥ  ＡＰ−９８７、及びＮＩＴＥ  ＡＰ−９９３として寄託されている。
【図１】
2014015396.tif 000005
【図２】
2014015396.tif 000006
【図３】
2014015396.tif 000007
【図４】
2014015396.tif 000008
【図５】
2014015396.tif 000009
【図６】
2014015396.tif 000010
【図７】
2014015396.tif 000011
【図８】
2014015396.tif 000012
【配列表】
2014015396000001.app