(57)【要約】【課題】結合体化糖抗原について、特に髄膜炎菌の糖の結合体について、分子サイズ、分子量および関連のパラメータを測定するための新規かつ改善された方法の提供。【解決手段】多重角光散乱光度法（ＳＥＣ−ＭＡＬＳ）による検出を有するＧＰＣ（ゲル透過クロマトグラフィー）およびサイズ除去クロマトグラフィーを使用して、糖結合体の分子サイズおよび分子量のそれぞれを正確に測定し得る。本発明は、（ａ）サンプル内の結合体化糖抗原の分子サイズを測定するためのプロセスであって、ＧＰＣによりサンプルを分析する工程を包含するプロセス、および（ｂ）サンプル内の結合体化糖抗原の分子量を測定するためのプロセスであって、ＳＥＣ−ＭＡＬＳによってサンプルを分析する工程を包含するプロセス、を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
組成物であって、以下：
血清型ＡのＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来の莢膜糖とキャリアタンパク質との結合体であって、該結合体の分子サイズが５７．１Å±２％であり、そして／または、該結合体の分子量が８８．５ｋＤａ±２％である、結合体、
血清型ＣのＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来の莢膜糖とキャリアタンパク質との結合体であって、該結合体の分子サイズが５７．０Å±２％であり、そして／または、該結合体の分子量が８５．２ｋＤａ±２％である、結合体、
血清型Ｗ１３５のＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来の莢膜糖とキャリアタンパク質との結合体であって、該結合体の分子サイズが６８．７Å±２％であり、そして／または、該結合体の分子量が１１０．１ｋＤａ±２％である、結合体、ならびに、
血清型ＹのＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来の莢膜糖とキャリアタンパク質との結合体であって、該結合体の分子サイズが６３．３Å±２％であり、そして／または、該結合体の分子量が８４．７ｋＤａ±２％である、結合体、
を含む、組成物。
【請求項２】
Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓに対するワクチンであって、
（ｉ）血清型ＡのＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来の莢膜糖とキャリアタンパク質との結合体であって、該結合体の分子サイズが５７．１Å±２％である、結合体；
（ｉｉ）血清型ＣのＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来の莢膜糖とキャリアタンパク質との結合体であって、該結合体の分子サイズが５７．０Å±２％である、結合体；
（ｉｉｉ）血清型Ｗ１３５のＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来の莢膜糖とキャリアタンパク質との結合体であって、該結合体の分子サイズが６８．７Å±２％である、結合体；
（ｉｖ）血清型ＹのＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来の莢膜糖とキャリアタンパク質との結合体であって、該結合体の分子サイズが６３．３Å±２％である、結合体；
を含む、ワクチン。
【請求項３】
Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓに対するワクチンであって、
（ｉ）血清型ＡのＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来の莢膜糖とキャリアタンパク質との結合体であって、該結合体の分子量が８８．５ｋＤａ±２％である、結合体；
（ｉｉ）血清型ＣのＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来の莢膜糖とキャリアタンパク質との結合体であって、該結合体の分子量が８５．２ｋＤａ±２％である、結合体；
（ｉｉｉ）血清型Ｗ１３５のＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来の莢膜糖とキャリアタンパク質との結合体であって、該結合体の分子量が１１０．１ｋＤａ±２％である、結合体；
（ｉｖ）血清型ＹのＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来の莢膜糖とキャリアタンパク質との結合体であって、該結合体の分子量が８４．７ｋＤａ±２％である、結合体；
を含む、ワクチン。
【請求項４】
本願明細書に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書中に記載される全ての文書は、その全体が参考として援用される。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、ワクチンの分析および品質管理の分野にあり、このワクチンとしてはキャリアと結合体化した細菌の莢膜糖が挙げられる。
【背景技術】
【０００３】
キャリアタンパク質と結合体化した莢膜糖抗原を含む免疫原は、当該分野で周知である。結合体化は、Ｔ細胞非依存性抗原をＴ細胞依存性抗原へと変換し、これによって記憶応答を増強させ、そして保護免疫を展開させることを可能にし、そしてプロトタイプの結合体化ワクチンは、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  ｂ型（Ｈｉｂ）に対するものであった［例えば、参考文献１（非特許文献１）の第１４章を参照のこと］。Ｈｉｂワクチン以降、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（髄膜炎菌）およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（肺炎球菌）に対して保護するための結合体化糖ワクチンが開発されている。ワクチンを結合体化する他の生物体は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ（群Ｂの連鎖球菌属）［２］（非特許文献２）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ［３］（非特許文献３）、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ［４］（非特許文献４）が有益である。
【０００４】
全長の莢膜糖を使用するのではなく、加水分解工程後の所望のサイズのオリゴ糖フラグメントを選択することが可能であり［例えば、参考文献５（非特許文献５）］、そして中程度の鎖長のオリゴ糖を用いた結合体が、向上した免疫誘発［例えば、参考文献６および７］（非特許文献６および７）を提供することが報告されている。ヒトへの使用を承認されている、３つのＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ｃ結合体化ワクチンのうち、ＭｅｎｊｕｇａｔｅＴＭ［８］（非特許文献８）およびＭｅｎｉｎｇｉｔｅｃＴＭは、オリゴ糖に基づき、ＮｅｉｓＶａｃ−ＣＴＭは全長の多糖を使用する。
【０００５】
結合体がワクチン中に含まれる場合、製造および発売のための品質管理は一般にその結合体が規定の分子サイズおよび／または分子量を有すること、またこれらのパラメータがバッチ間で一貫していることを必要とする。分子サイズおよび分子量は、また、ワクチンの安定性をモニタリングするために使用され得る。なぜなら、結合体は時間の経過につれて凝集し得、サイズおよび分子量の増加を生じ得るからである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｖａｃｃｉｎｅｓ（Ｐｌｏｔｋｉｎら、編）第４版、ＩＳＢＮ：０７２１６９６８８０．
【非特許文献２】Ｂａｋｅｒら、Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ（２００３）１８８：６６−７３
【非特許文献３】Ｔｈｅｉｌａｃｋｅｒら、Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ（２００３）７１：３８７５−８４
【非特許文献４】Ａｎｏｎｙｍｏｕｓ  Ｄｒｕｇｓ  ＲＤ（２００３）４：３８３−５
【非特許文献５】Ｒａｖｅｎｓｃｒｏｆｔら、Ｖａｃｃｉｎｅ（１９９９）１７：２８０２−２８１６
【非特許文献６】Ｐａｏｌｅｔｔｉら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ（１９９２）８９：２０３−９
【非特許文献７】Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ｊ  ｌｍｍｕｎｏｌ（１９８６）１３７：１１８１−６
【非特許文献８】Ｊｏｎｅｓ、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇ  Ｄｒｕｇｓ（２００１）２：４７−４９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
結合体化糖抗原について、特に髄膜炎菌の糖の結合体について、分子サイズ、分子量および関連のパラメータを測定するための新規かつ改善された方法を提供することが、本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の開示）
本発明者らは、ゲル透過クロマトグラフィーおよびＳＥＣ−ＭＡＬＳ（重角光散乱光度法による検出を備えたサイズ排除クロマトグラフィー）を使用して、糖結合体の分子サイズおよび分子量をそれぞれ正確かつ信頼性高く測定し得ることを発見した。
【０００９】
従って、本発明は、サンプル内の結合体化糖抗原の分子サイズを測定するためのプロセスを提供し、このプロセスはゲル透過クロマトグラフィーによりサンプルを分析する工程を包含する。クロマトグラフィー分析の保持時間は、例えば、検量線との比較によって、粘度半径（ｖｉｓｃｏｓｉｔｙ  ｒａｄｉｕｓ（Ｒη））に変換され、これによって分子サイズの単純な計算を可能にする。サンプル中の結合体の平均分子サイズおよび／または分子サイズ分布は、この方法で容易に決定され得る。
【００１０】
本発明はまた、サンプル内の結合体化糖抗原の分子量を測定するためのプロセスを提供し、このプロセスはＳＥＣ−ＭＡＬＳによってサンプルを分析する工程を包含する。このＳＥＣ保持時間が、分子量へと変換され得る。サンプル中の結合体の平均分子量および／または分子量分布（多分散性）は、この方法で容易に決定され得る。参考文献９は、ＳＥＣ−ＭＡＬＳが以前に、結合体化前の骨髄球菌の糖および結合体化前の連鎖球菌の糖の測定に使用されたことを報告するが、結合体後のデータは報告されていない。
例えば、本願発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
サンプル内の結合体化糖抗原の分子サイズを測定するためのプロセスであって、ゲル透過クロマトグラフィーによりサンプルを分析する工程を包含する、プロセス。
（項目２）
サンプル内の結合体化糖抗原の分子量を測定するためのプロセスであって、ＳＥＣ−ＭＡＬＳによってサンプルを分析する工程を包含する、プロセス。
（項目３）
前記糖が細菌の莢膜糖である、項目１または２に記載のプロセス。
（項目４）
前記莢膜糖が、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清型Ａ、Ｃ、Ｗ１３５、またはＹに由来する、項目３に記載のプロセス。
（項目５）
前記糖がオリゴ糖である、項目４に記載のプロセス。
（項目６）
前記結合体がタンパク質キャリアを有する、項目１〜５のいずれか１項に記載のプロセス。
（項目７）
前記タンパク質キャリアがＣＲＭ１９７またはジフテリア毒素である、項目６に記載のプロセス。
（項目８）
血清型ＡのＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来の莢膜糖の結合体を含む組成物であって、該結合体の分子サイズが５７．１Å±２０％であり、そして／または該結合体の分子量が８８．５ｋＤａ±２０％である、組成物。
（項目９）
血清型ＣのＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来の莢膜糖の結合体を含む組成物であって、該結合体の分子サイズが５７．０Å±２０％であり、そして／または該結合体の分子量が８５．２ｋＤａ±２０％である、組成物。
（項目１０）
血清型Ｗ１３５のＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来の莢膜糖の結合体を含む組成物であって、該結合体の分子サイズが６８．７Å±２０％であり、そして／または該結合体の分子量が１１０．１ｋＤａ±２０％である、組成物。
（項目１１）
血清型ＹのＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来の莢膜糖の結合体を含む組成物であって、該結合体の分子サイズが６３．３Å±２０％であり、そして／または該結合体の分子量が８４．７ｋＤａ±２０％である、組成物。
（項目１２）
項目８〜１１に記載される前記結合体のうちの２つ以上を含む、組成物。
（項目１３）
２つのバッチのワクチンであって、ここで：
（ａ）両方のバッチのワクチンは：
（ｉ）血清型ＡのＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来の莢膜糖の結合体；
（ｉｉ）血清型ＣのＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来の莢膜糖の結合体；
（ｉｉｉ）血清型Ｗ１３５のＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来の莢膜糖の結合体；
（ｉｖ）血清型ＹのＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来の莢膜糖の結合体；
を含み；
（ｂ）第一バッチの血清型Ａの糖の分子サイズがＡ１であり、第二バッチの血清型Ａの糖の分子サイズがＡ２であり；
（ｃ）該第一バッチの血清型Ｃの糖の分子サイズがＣ１であり、該第二バッチの血清型Ｃの糖は分子サイズがＣ２であり；
（ｄ）該第一バッチの血清型Ｗ１３５の糖の分子サイズがＷ１であり、該第二バッチの血清型Ｗ１３５の糖は分子サイズがＷ２であり；
（ｅ）該第一バッチの血清型Ｙの糖の分子サイズがＹ１であり、該第二バッチの血清型Ｙの糖は分子サイズがＹ２であり；
（ｆ）Ａ１／Ａ２の比率、Ｃ１／Ｃ２の比率、Ｗ１／Ｗ２の比率、およびＹ１／Ｙ１の比率が各々、０．９０〜１．１０の間である、
ワクチン。
（項目１４）
２つのバッチのワクチンであって、ここで：
（ａ）両方のバッチのワクチンは：
（ｉ）血清型ＡのＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来の莢膜糖の結合体；
（ｉｉ）血清型ＣのＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来の莢膜糖の結合体；
（ｉｉｉ）血清型Ｗ１３５のＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来の莢膜糖の結合体；
（ｉｖ）血清型ＹのＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来の莢膜糖の結合体；
を含み；
（ｂ）第一バッチの血清型Ａの糖の分子量がＡ１であり、第二バッチの血清型Ａの糖の分子量がＡ２であり；
（ｃ）該第一バッチの血清型Ｃの糖の分子量がＣ１であり、該第二バッチの血清型Ｃの糖の分子量がＣ２であり；
（ｄ）該第一バッチの血清型Ｗ１３５の糖の分子量がＷ１であり、該第二バッチの血清型Ｗ１３５の糖の分子量がＷ２であり；
（ｅ）該第一バッチの血清型Ｙの糖の分子量がＹ１であり、該第二バッチの血清型Ｙの糖の分子量がＹ２であり；
（ｆ）Ａ１／Ａ２の比率、Ｃ１／Ｃ２の比率、Ｗ１／Ｗ２の比率、およびＹ１／Ｙ１の比率が各々、０．９０〜１．１０の間である、
ワクチン。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、既知の水力学的サイズの６種のデキストランの較正曲線を示す。
【図２】図２は、血清型Ａ、血清型Ｃ、血清型Ｗ１３５および血清型Ｙ由来のＣＲＭ１９７結合体のＨＰＧＰＣ分析を示す。
【図３】図３は、血清型Ａ、血清型Ｃ、血清型Ｗ１３５および血清型Ｙ由来のＣＲＭ１９７結合体のＨＰＧＰＣ分析を示す。
【図４】図４は、血清型Ａ、血清型Ｃ、血清型Ｗ１３５および血清型Ｙ由来のＣＲＭ１９７結合体のＨＰＧＰＣ分析を示す。
【図５】図５は、血清型Ａ、血清型Ｃ、血清型Ｗ１３５および血清型Ｙ由来のＣＲＭ１９７結合体のＨＰＧＰＣ分析を示す。
【図６】図６は、図７および図８のｄｎ／ｄｃ較正に対する、既知濃度の調整した出力電圧を示す。
【図７】図６は、図７および図８のｄｎ／ｄｃ較正に対する、既知濃度の調整した出力電圧を示す。
【図８】図６は、図７および図８のｄｎ／ｄｃ較正に対する、既知濃度の調整した出力電圧を示す。
【図９】図９は、ＳＥＣ−ＭＡＬＳからのＤｅｂｙｅプロットを示す。
【図１０】図１０は、ＲＩシグナルおよび９０°ＭＡＬＳシグナルの重ね合わせを示す。
【図１１】図１１は、血清型Ａ、血清型Ｃ、血清型Ｗｌ３５および血清型Ｙ由来のＣＲＭ１９７結合体に関するＳＥＣ−ＭＡＬＳによる分子量分析を示す。
【図１２】図１２は、血清型Ａ、血清型Ｃ、血清型Ｗｌ３５および血清型Ｙ由来のＣＲＭ１９７結合体に関するＳＥＣ−ＭＡＬＳによる分子量分析を示す。
【図１３】図１３は、血清型Ａ、血清型Ｃ、血清型Ｗｌ３５および血清型Ｙ由来のＣＲＭ１９７結合体に関するＳＥＣ−ＭＡＬＳによる分子量分析を示す。
【図１４】図１４は、血清型Ａ、血清型Ｃ、血清型Ｗｌ３５および血清型Ｙ由来のＣＲＭ１９７結合体に関するＳＥＣ−ＭＡＬＳによる分子量分析を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
（糖）
本発明は、結合体化糖抗原に関するパラメータの測定を可能にする。この糖抗原は、代表的に、細菌の莢膜糖であり、例えば、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（血清型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｗ１３５、またはＹ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（血清型４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆまたは２３Ｆ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ（型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩまたはＶＩＩＩ）、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（型分け可能な（ｔｙｐｅａｂｌｅ）株：ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅまたはｆ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、などに由来する。他の糖分析物としては、グルカン（例えば、真菌性グルカン（例えば、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓにおけるグルカン））、および真菌性莢膜糖（例えば、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ由来の莢膜糖）が挙げられる。本発明は、血清型Ａ、Ｃ、Ｗ１３５およびＹのＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの莢膜糖由来の莢膜糖を分析するのに特に有用である。
【００１３】
Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清型Ａの莢膜は、（αｌ→６）結合したＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミン−１−ホスフェートのホモポリマーであり、これはＣ３位およびＣ４位に部分的にＯ−アセチル化を有する。Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清型Ｂの莢膜は、（α２→８）結合したシアル酸のホモポリマーである。Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清型Ｃの莢膜糖は、（α２→９）結合したシアル酸（Ｎ−アセチルノイラミン酸、すなわち’ΝｅｕΝＡｃ’）のホモポリマーであり、これは７位および／または８位において可変性のＯ−アセチル化を有する。Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清型Ｗ１３５の糖は、シアル酸−ガラクトースの二糖単位［→４）−Ｄ−Νｅｕｐ５Ａｃ（７／９ＯＡｃ）−α−（２→６）−Ｄ−Ｇａｌ−α−（ｌ→］からなるポリマーであり、これはシアル酸の７位と９位とに可変性のＯ−アセチル化を有する［１０］。Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清型Ｙの糖は、血清型Ｗ１３５の糖と類似であるが、二糖の反復単位がガラクトースの代わりにグルコースを含むこと［→４）−Ｄ−Νｅｕｐ５Ａｃ（７／９ＯＡｃ）−α−（２→６）−Ｄ−Ｇｌｃ−α−（ｌ→］を除く。Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  ｂ型の莢膜糖は、リボース、リビトールおよびリン酸のポリマー［’ＰＲＰ’、（ポリ−３−β−Ｄ−リボース−（ｌ，ｌ）−Ｄ−リビトール−５−リン酸）］である。
【００１４】
他の好ましい糖抗原は、真核細胞の糖（例えば、真菌の糖、植物の糖、ヒトの糖（例えば、癌抗原）など）である。他の好ましい糖は、リポポリ多糖およびリポオリゴ糖である。
【００１５】
糖抗原は、天然に見られるような形態であり得るか、または誘導形態であり得、例えば、化学的改変および／または脱重合に供されている糖である。本発明は、莢膜多糖のオリゴ糖断片を分析するのに特に有用である。天然の多糖は、一般的に、少なくとも重合度２０（例えば、２０、３０、４０、５０、６０またはそれ以上）を有し、そしてこれらは脱重合（例えば、加水分解）によって、（例えば、２０未満の重合度を有する）オリゴ糖断片へと変換され得る。
【００１６】
糖の化学的加水分解は、一般に、当該分野で標準的な条件下での酸または塩基のいずれかを用いた処理を含む。莢膜糖をその成分の単糖へと脱重合するための条件は、当該分野で公知である。血清型Ｗｌ３５およびＹの糖に対して、加水分解は好ましい。ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）を用いた酸加水分解は、血清型Ｃ、Ｗ１３５およびＹの全ての加水分解のために使用され得、血清型Ｃに対しては、シアル酸の分解を避けるためにわずかにより低いインキュベーション温度（１００℃よりも９０℃）が好ましい。代表的なＴＦＡ処置は、最終濃度２ＭまでのＴＦＡの添加、続いて９０℃〜１００℃に９０分間加熱する工程を包含する。血清型Ｃの糖は、全体的な糖内容物分析のため、１００ｍＭのＨＣｌを用いた８０℃で２時間の処理により加水分解され得る［１１］。他の代表的な加水分解条件は、高温（例えば、７０℃〜８０℃）においてミリモル濃度の弱酸（例えば、酢酸）を含む。
【００１７】
本発明は、異なる長さの種々の糖（例えば、同じ親の糖の異なる断片）を含む結合体サンプルを用いた使用に特に有用である。
【００１８】
（結合体）
分析されるべき糖抗原は、キャリアと結合体化される。Ｔ細胞非依存性の抗原からＴ細胞依存性の抗原へと糖を変換することによってその糖の免疫原性を増大させ、これによって免疫記憶を刺激する（ｐｒｉｍｅ）ことを可能にするため、共有結合性の結合体化が使用される。結合体化は、小児用ワクチンに特に有用であり、そしてこの結合体化は周知技術である（例えば、参考文献１２〜２１に概説される）。糖はキャリアに直接連結され得る［２２、２３］が、リンカーまたはスペーサー（例えば、脂肪酸、β−プロピオンアミド［２４］、ニトロフェニル−エチルアミン［２５］、ハロアシルハライド［２６］、グリコシド結合［２７］、６−アミノカプロン酸［２８］、ＡＤＨ［２９］、Ｃ４〜Ｃ１２部分［３０］、など）が一般に使用される。
【００１９】
結合体における代表的なキャリアタンパク質は、細菌毒素またはトキソイド（例えば、ジフテリア毒素または破傷風毒素）である。ＣＲＭ１９７ジフテリア毒素誘導体［３１−３３］は、ＭｅｎｊｕｇａｔｅＴＭおよびＭｅｎｉｎｇｉｔｅｃＴＭにおけるキャリアタンパク質であり、一方、破傷風毒素は、ＮｅｉｓＶａｃＴＭにおいて使用される。ジフテリア毒素は、ＭｅｎａｃｔｒａＴＭにおけるキャリアとして使用される。ＣＲＭｌ９７は、ＰｒｅｖｎａｒＴＭにおけるキャリアタンパク質である。他の公知のキャリアタンパク質としては、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの外膜タンパク質［３４］、合成ペプチド［３５、３６］、熱ショックタンパク質［３７、３８］、百日咳タンパク質［３９、４０］、サイトカイン［４１］、リンホカイン［４１］、ホルモン［４１］、増殖因子［４１］、種々の病原体由来抗原に由来する複数のヒトＣＤ４＋  Ｔ細胞エピトープを含む人工タンパク質［４２］、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ由来のタンパク質Ｄ［４３、４４］、肺炎球菌表面タンパク質ＰｓｐＡ［４５］、鉄取り込みタンパク質［４６］、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ由来の毒素Ａまたは毒素Ｂ［４７］、などが挙げられる。組成物は、例えば、キャリア抑制の危険性を低減させるため、１つより多くのタンパク質を使用し得、そして単独のキャリアタンパク質が１つより多くの糖抗原を保持し得る［４８］。結合体は一般に、１：５（すなわちタンパク質過剰）〜５：１（すなわち糖過剰）の間の糖タンパク質比率（ｗ／ｗ）を有する。組成物は、結合体に付加した遊離のキャリアタンパク質を含み得る［４９］。
【００２０】
本発明は、連鎖球菌の糖（血清型Ａ、Ｃ、Ｗ１３５およびＹ）とＣＲＭ１９７キャリアとの結合体を分析するのに特に適している。このような結合体は、参考文献５０〜５３に開示される方法により調製され得る。好ましい結合体は、参考文献５１に従い調製されたもの、すなわちＣＲＭ１９７キャリアと脂肪酸リンカーとを有するオリゴ糖断片である。
【００２１】
（ゲル透過クロマトグラフィー）
ゲル透過クロマトグラフィー（ＧＰＣ）は、周知の標準的な技術である。本発明は、一般に、ＨＰＧＰＣ（高性能ＧＰＣ）を使用する。このＧＰＣ技術は、サンプル中の結合体の水力学的サイズ（混合物中の平均サイズおよび／またはサイズ分布）を決定するため、本発明に従って使用される。
【００２２】
ＧＰＣカラムにおける保持時間は、標準的な技術によって粘度半径（Ｒη）に変換され得る。代表的に、カラムにおける保持時間は公知の分子サイズの標準品に対して決定され、これによってこれら２つのパラメータの相関を可能にする。次いで、結合体の分子サイズは、カラムにおける保持時間から推測され得る。例えば、既知の分子サイズのデキストランを使用したカラムの検量、およびそれらの保持時間は、三次多項式を使用して粘度半径と相関され得る［５４、５５］。この粘度半径は、その分子の形状が保持に対して有する効果を説明するために、固有粘度および分子量を使用する。
【００２３】
不均一混合物において、ＧＰＣ技術は、混合物中の平均分子サイズおよび／または分子サイズ分布の両方を決定するために使用され得る。
【００２４】
（ＳＥＣ−ＭＡＬＳ）
サイズ除去クロマトグラフィー（ＳＥＣ）は、周知技術である。分離の結果は、重角光散乱（ＭＡＬＳ）光度法および示差屈折率検出法により分析され得る。この方法は、流速および固定相などのクロマトグラフィーのパラメータとは無関係に、そして分子量の検量の必要なしに、分子量の分布情報および水力学半径（分子サイズ）を、ポリマーの確認および他の物理的パラメータを提供する［９］。分子量の検量を必要とせずに、ＭＡＬＳによる分子量の決定は、目的のポリマーに関して、目的の溶媒中の目的の波長および温度における特定の屈折率（ｄｎ／ｄｃ）を予め決定することに基づく。
【００２５】
このようにしてＳＥＣ−ＭＡＬＳは、結合体の分子量を決定するために使用され得る。サンプルの分子量は、代表的なＤｅｂｙｅプロットから観察される場合のＳＥＣピークの各々の部分（ｓｌｉｃｅ）において決定され、分子量はこのプロットの切片（ｉｎｔｅｒｃｅｐｔ）から決定される［５６−５８］。濃度に比例する屈折率シグナル、ならびに濃度および分子量に比例する９０°ＭＡＬＳシグナルは、分子量分布を決定するために重ね合わされ得る。
【００２６】
不均一混合物において、ＳＥＣ−ＭＡＬＳ技術は、混合物中の平均分子量および／または分子量分布（多分散性）の両方を決定するために使用され得る。
【００２７】
（結合体組成物）
本発明は、血清型ＡのＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来の莢膜糖の結合体を含む組成物を提供する。ここで、その結合体の分子サイズは５７．１Åであり、そして／またはその結合体の分子量は８８．５ｋＤａである。本組成物はまた、血清型ＡのＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来の莢膜糖の結合体を含み得、ここでその結合体の分子量は１９０ｋＤａである。
【００２８】
本発明は、血清型ＣのＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来の莢膜糖の結合体を含む組成物を提供する。ここで、その結合体の分子サイズは５７．０Åであり、そして／またはその結合体の分子量は８５．２ｋＤａである。
【００２９】
本発明は、血清型Ｗ１３５のＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来の莢膜糖の結合体を含む組成物を提供する。ここで、その結合体の分子サイズは６８．７Åであり、そして／またはその結合体の分子量は１１０．１ｋＤａである。本組成物はまた、血清型Ｗ１３５のＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来の莢膜糖の結合体を含み得、その結合体の分子量は３４７ｋＤａである。
【００３０】
本発明は、血清型ＹのＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来の莢膜糖の結合体を含む組成物を提供する。ここで、その結合体の分子サイズは６３．３Åであり、そして／またはその結合体の分子量は８４．７ｋＤａである。本組成物はまた、血清型ＹのＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来の莢膜糖の結合体を含み得、ここでその結合体の分子量は４８６ｋＤａである。
【００３１】
分子サイズおよび分子量に関する上記の値は単一の数量（ｆｉｇｕｒｅ）として示されるが、本発明は、これらの数量が±２０％、±１５％、±１０％、±５％、±２％などである結合体に及ぶ。
【００３２】
本発明はまた、上記の血清型Ａの結合体、血清型Ｃの結合体、血清型Ｗ１３５の結合体、および血清型Ｙの結合体のうちの２つ以上（例えば、２つ、３つまたは４つ）を含む組成物を提供する。
【００３３】
本発明はまた、多価結合体ワクチンを調製するための方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）本発明の方法を使用して２つ以上の結合体を分析する工程、および（ｂ）これら分析された結合体を組合わせて多価ワクチンを形成する工程。
【００３４】
本発明はまた、多価結合体ワクチンを調製するための方法を提供し、この方法は、本発明の方法を使用して分析されている２つ以上の結合体を混合する工程を包含する。
【００３５】
（混合糖）
本発明は、莢膜糖の結合体を含む組成物における分析を可能にする。一般的に、本発明は１つの型の結合体（すなわち、同じキャリアに繋がれた、同じ莢膜糖に由来する糖）を含むサンプルに対して使用される。従って、多価結合体ワクチン（例えば、ＭｅｎａｃｔｒａＴＭ、ＰｒｅｖｎａｒＴＭ）に関して、本発明は一般的に、最終的な多価産物を作製するために組み合わされる前の個々の結合体において使用され、その結合体自身の最終産物において使用されるのではない。しかしながら、２つの結合体が著しく異なる分子サイズおよび分子量を有する場合、並行した分析は真っ直ぐである。
【００３６】
（保存中の安定性）
本発明は、保存の間の結合体の安定性をモニタリングするために使用され得る。従って、本発明の方法は、同じ物質由来のサンプルについて時間ｔ１およびｔ２において実施され得る。そして分析の結果が比較され得る。分子量および／または分子サイズの有意な変化は、そのワクチンが完全には安定でないことを示す。従って、本発明は、安定なワクチンを選択し、そして不安定なワクチンを却下するために使用され得る。
【００３７】
（非結合体成分）
組成物中の結合体を分析することだけでなく、本発明のプロセスは他の成分または他の特性（例えば、浸透圧、ｐＨ、個々の糖または結合体の重合度、タンパク質（特にキャリアタンパク質に関する）含量、アルミニウム含量、界面活性剤含量、保存剤含量、など）の分析を含み得る。
【００３８】
本発明は、ワクチン組成物を調製するための方法を提供し、この方法は、本発明に従い結合体の分子量および／または分子サイズの分析の工程、およびその組成物のｐＨ測定の工程、必要に応じてその後、その組成物のｐＨを所望の値（例えば、６〜８の間、または約７）に調整する工程、を包含する。
【００３９】
本発明はまた、ワクチン組成物を調製するための方法を提供し、この方法は、（ａ）上記されたような１つ以上の結合体を提供する工程；（ｂ）この結合体（単数または複数）をバルクのワクチンへと処方する工程；（ｃ）ｐＨおよび／または他の特性に関してこのバルクワクチンを分析する工程；およびそのバルクワクチンが医療使用に受容可能であることを工程（ｃ）からの結果が示す場合、（ｄ）このバルクからヒト使用のためにワクチンを包装する工程、を包含する。工程（ｃ）は、最小の糖濃度の評価、非結合体化糖：結合体化糖の比率の評価、などを含み得る。工程（ｄ）は、単位投与形態または多用量投与形態（例えば、バイアルまたはシリンジ）へと包装する工程を包含し得る。代表的なヒトの注射用量は、０．５ｍｌの容量を有する。
【００４０】
本発明は、ワクチン組成物を調製するための方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含する：
（ａ）上記されたような１つ以上の結合体を提供する工程；および（ｂ）この結合体化糖と１つ以上のさらなる抗原とを混合する工程、であって、この１つ以上のさらなる抗原としては、以下である：
−血清型ＣのＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来の莢膜糖抗原。
−血清型ＡのＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来の莢膜糖抗原。
−血清型ＢのＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来のタンパク質抗原。
−Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ｂのミクロ微小胞［５９］、「天然のＯＭＶ」［６０］、小疱（ｂｌｅｂ）または外膜小胞（ｖｅｓｉｃｌｅ）［例えば、参考文献６１〜６６、など］の調製物。
−Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  ｂ型由来の糖抗原。
−Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来の抗原（例えば、多価結合体化糖抗原［例えば、引用文献６７〜６９］）。
−Ａ型肝炎ウイルス由来の抗原（例えば、不活性化ウイルス［引用文献７０、７１］）。−Ｂ型肝炎ウイルス由来の抗原（例えば、表面抗原および／またはコア抗原［例えば、７１、７２］。
−Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ由来の抗原（例えば、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ由来の百日咳毒素（ＰＴ）および糸状ヘマグルチニン（ＦＨＡ）、また必要に応じてペルタクチンおよび／または凝集原２および凝集原３［例えば、参考文献７３および７４］と組み合わされる。細胞性百日咳抗原が使用され得る。
−ジフテリア抗原（例えば、ジフテリア毒素［例えば、参考文献７５の第３章］、例えばＣＲＭ１９７変異体［例えば、７６］。
−破傷風抗原（例えば、破傷風毒素［例えば、参考文献７５の第４章］。
−ポリオ抗原［例えば、参考文献７７、７８］、（例えば、ＩＰＶ）。
【００４１】
このような抗原は、アルミニウム塩アジュバント（例えば、水酸化物またはリン酸塩）に吸収され得る。好ましくは、任意のさらなる糖抗原が結合体として含まれる。
【００４２】
本発明の結合体は、アルミニウム塩アジュバント（例えば、水酸化物またはリン酸塩）に同様に吸収されてもよいし、またはその結合体は吸収されなくてよい（例えば、溶液中に遊離していてよい）。
【００４３】
（バッチ間の一貫性）
本発明のプロセスは信頼でき、一貫しており、従って異なるバッチの結合体の有効な比較を可能にする。従って、異なるバッチの結合体が調製され得、アッセイされ得、そして結合体ワクチンの調製における販売および使用のため、一貫性のあるバッチが選択され得、一方、逸脱したバッチは棄却され得る。
【００４４】
本発明は、２つのバッチのワクチンを提供し、ここで：（ａ）両方のバッチのワクチンは：（ｉ）血清型ＡのＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来の莢膜糖の結合体；（ｉｉ）血清型ＣのＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来の莢膜糖の結合体；（ｉｉｉ）血清型Ｗ１３５のＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来の莢膜糖の結合体；（ｉｖ）血清型ＹのＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来の莢膜糖の結合体を含み；（ｂ）第一バッチ中の血清型Ａの糖の分子サイズはＡ１であり、第二バッチ中の血清型Ａの糖の分子サイズはＡ２である；（ｃ）第一バッチ中の血清型Ｃの糖の分子サイズはＣ１であり、第二バッチ中の血清型Ｃの糖の分子サイズはＣ２である；（ｄ）第一バッチ中の血清型Ｗ１３５の糖の分子サイズはＷ１であり、第二バッチ中の血清型Ｗ１３５の糖の分子サイズはＷ２である；（ｅ）第一バッチ中の血清型Ｙの糖の分子サイズはＹ１であり、第二バッチ中の血清型Ｙの糖の分子サイズはＹ２である；（ｆ）Ａ１／Ａ２の比、Ｃ１／Ｃ２の比、Ｗ１／Ｗ２の比およびＹ１／Ｙ２の比は各々０．９０〜１．１０の間であり、好ましくは各々０．９５〜１．０５の間である。
【００４５】
本発明は、２つのバッチのワクチンを提供し、ここで：（ａ）両方のバッチのワクチンは、以下を含む：（ｉ）血清型ＡのＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来の莢膜糖の結合体；（ｉｉ）血清型ＣのＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来の莢膜糖の結合体；（ｉｉｉ）血清型Ｗ１３５のＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来の莢膜糖の結合体；（ｉｖ）血清型ＹのＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来の莢膜糖の結合体；ｂ）第一バッチ中の血清型Ａの糖の分子量はＡ１であり、第二バッチ中の血清型Ａの糖の分子量はＡ２である；（ｃ）第一バッチ中の血清型Ｃの糖の分子量はＣ１であり、第二バッチ中の血清型Ｃの糖の分子量はＣ２である；（ｄ）第一バッチ中の血清型Ｗ１３５の糖の分子量はＷ１であり、第二バッチ中の血清型Ｗ１３５の糖の分子量はＷ２である；（ｅ）第一バッチ中の血清型Ｙの糖の分子量はＹ１であり、第二バッチ中の血清型Ｙの糖の分子量はＹ２である；（ｆ）Ａ１／Ａ２の比、Ｃ１／Ｃ２の比、Ｗ１／Ｗ２の比およびＹ１／Ｙ２の比は、各々０．９０〜１．１０の間であり、好ましくは各々０．９５〜１．０５の間である。
【００４６】
（ｆ）において特定された比は、比較される各々のバッチ由来の単独のサンプルに基づき得るが、代表的には各々のバッチの複数のサンプル由来の平均の値（例えば、平均値）に基づき得る。従って、これら２つのバッチは、複数回のサンプリングに供され得、そして各々のサンプルは、複数の測定（Ａ１、Ａ２、Ｃ１、Ｃ２、Ｗ１、Ｗ２、Ｙ１およびＹ２）に供され得、次いで各々のバッチに対する平均が計算され得、そしてこの平均を使用して必要な比を計算し得る。
【００４７】
各々のバッチ（またはロット）のワクチンは、別個に調製されている。例えば、２つの異なるバッチは、同じバルクの単独の結合体についての別個の混合によってか、または別個に調製されたバルクの単独の結合体の混合によって作製され得る。同じバルク混合物の異なるサンプルは、異なるバッチにならない。なぜならこれらのサンプルは、異なる結合体の混合物を調製する場合に起こる差異から生じるバッチ間の変動に供されないからである。
【００４８】
（一般則）
用語「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」ならびに「構成すること（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」を包含する。例えば、Ｘを「含む」組成物は、主としてＸから構成されてよく、またはいくらかの付加物（例えば、Ｘ＋Ｙ）を含んでよい。
【００４９】
単語「実質的に（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ）」とは、「完全に（ｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙ）」を退けない。例えば、Ｙを「実質的に含まない」組成物は、Ｙを完全に含まなくてよい。必要な場合、語「実質的に」は本発明の定義から省略され得る。
【００５０】
数値ｘと関係した用語「約（ａｂｏｕｔ）」は、例えば、ｘ±１０％を意味する。
【実施例】
【００５１】
（発明の実施の形態）
血清型Ａ、血清型Ｃ、血清型Ｗ１３５および血清型Ｙの髄膜炎菌由来のオリゴ糖のＣＲＭ１９７結合体は、参考文献５１に一般に記載されるように調製した。これらの結合体の各々を、本発明に従ってＨＰＧＰＣおよびＳＥＣ−ＭＡＬＳによって分析した。
【００５２】
（ＨＰＧＰＣ分析）
糖結合体ワクチンは、一般的に、複数の部位においてタンパク質キャリアと結合された、異なる長さの糖の範囲を有する糖形態のアレイから構成される。ＨＰＧＰＣを使用して、水力学的サイズおよびサイズ分布を決定することによって、分子サイズに関して髄膜炎糖結合体を特徴決定した。
【００５３】
較正には、６種のデキストランのセットを使用し、水力学的サイズは１７Å〜１１５Åに及んだ。標準品のＨＰＧＰＣ分析は、図１に示される。標準の分子量および計算した分子量は以下のとおりである：
【００５４】
【表１】
2014111654.tif 000002
デキストラン分析を使用し、三次多項式を使用して、粘度半径（Ｒη）とＧＰＣ保持時間とを関連付けた［５４、５５］：Ｒη（Å単位）＝（１０８）（３０Ｍｐ［η］／（π×６．０２３×１０２３））１／３
ここで、Ｍｐ＝頂部のＭｗ、および［η］＝固有粘度（ｄＬ／ｇ単位）。
【００５５】
結合体の粘度半径を、この式から計算した。この式は、固有粘度およびＭｗを使用して、分子の形状が保持の際に有する効果を説明する。
【００５６】
個々の結合体の分析は、図２〜図５に示される。水力学的サイズを以下のように計算した：
【００５７】
【表２】
2014111654.tif 000003
分析のための実施例条件として、５０μｌの注入容量中の血清群Ａの結合体を、ＴＳＫ−Ｇｅｌ  Ｇ４０００ＳＷ（３００×７．５ｍｍ内径）に対して０．１Ｍ  リン酸ナトリウム／０．２Ｍ  硫酸アンモニウムの移動相（ｐＨ７．０）を用いて分析した。流速は、０．５ｍｌ／分だった。Ｗａｔｅｒｓ  ４１０屈折率（ｒｅｆａｃｔｉｏｎ  ｉｎｄｅｘ）検出器を使用した。
【００５８】
（ＳＥＣ−ＭＡＬＳ分析）
ＳＥＣ−ＭＡＬＳ分析の前に、分析条件の下で結合体の屈折率（ｄｎ／ｄｃ）を決定した。設定濃度に対する実施例の電圧出力を図６に示す。この出力は、図７および図８に示される標準曲線へと導いた。計算値は以下のとおりである：
【００５９】
【表３】
2014111654.tif 000004
ＳＥＣ−ＭＡＬＳによってこれらの結合体を分析した。図９の代表的なＤｅｂｙｅプロットから分かるように、ＳＥＣピークの各々のデータ部分（ｓｌｉｃｅ）におけるサンプルのモル質量を決定した。モル質量を、プロットの切片（ｉｎｔｅｒｃｅｐｔ）から決定した［５６−５８］。濃度に比例するＲＩシグナル（青）と、濃度およびモル質量に比例する９０°ＭＡＬＳ検出器（赤）とを、重ね合わせ得る（図１０）。
【００６０】
モル質量（モルあたりのグラム）の分析を、図１１〜図１４に示す。ＭｅｎＡ糖結合体、ＭｅｎＷ１３５糖結合体およびＭｅｎＹ糖結合体は、より高いＭＷに関する低濃度の段部（ｓｈｏｕｌｄｅｒ）を有する主要なピークを有するが、ＭｅｎＣ結合体はより均一な物質の単独のピークを有することを、この分析は示す。
【００６１】
これらのピークの分析結果（ｋＤａ単位でのＭＷ；Ｍｗ／Ｍｎでの多分散性）は以下のとおりである：
【００６２】
【表４】
2014111654.tif 000005
本発明は例示によってのみ記載されており、本発明の範囲および精神の中に在るままに改変がなされ得ることが理解される。
【００６３】
【表５】
2014111654.tif 000006
【００６４】
【表６】
2014111654.tif 000007
【図１】
2014111654.tif 000008
【図２】
2014111654.tif 000009
【図３】
2014111654.tif 000010
【図４】
2014111654.tif 000011
【図５】
2014111654.tif 000012
【図６】
2014111654.tif 000013
【図７】
2014111654.tif 000014
【図８】
2014111654.tif 000015
【図９】
2014111654.tif 000016
【図１０】
2014111654.tif 000017
【図１１】
2014111654.tif 000018
【図１２】
2014111654.tif 000019
【図１３】
2014111654.tif 000020
【図１４】
2014111654.tif 000021
【外国語明細書】
2014111654000001.pdf