(57)【要約】【課題】機能性ポリペプチドの提供。【解決手段】本発明は、機能性ポリペプチド、特に、治療用ポリペプチド（例えば、ｓｃＦｖ）を提供し、これらのポリペプチドは、１つまたは複数の機能性部分（例えば、ＰＥＧ）または結合特異性（例えば、特定の結合特異性を示すアミノ酸配列）を付加することによって、迅速かつ特異的に機能性を付与され得るリンカー配列を含む。そのような機能性ポリペプチドは、非機能性ポリペプチドと比べて、薬物動態特性の改善（例えば、インビボにおける半減期、組織浸透および組織滞留時間の改善）を示すという点で好都合である。また、機能性ポリペプチドの迅速でかつ再現性のある生成のための方法も提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願明細書に記載された発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
この出願は、２００８年６月３０日に出願された米国仮特許出願番号第６１／０７６，７７５号（名称「Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｎｄ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  Ｆｏｒ  Ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ  Ｉｍｍｕｎｏｂｉｎｄｅｒｓ」）への優先権を主張し、上記米国仮特許出願の内容は、その全容が参照によって本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００２】
（背景情報）
治療用ポリペプチドの効能はしばしば、それらに固有の薬物動態特性によって大きく制限される。例えば、治療用抗体の場合、組織浸透、組織滞留（ｒｅｓｉｄｅｎｃｙ）および血清半減期に関する問題が頻繁に報告されている。治療用ポリペプチドの薬物動態特性を改善して、効能の改善および投与レジメンの低量化をもたらすことができる。治療用ポリペプチドの薬物動態特性を調節する現在の方法は典型的には、血清半減期の問題に対処することに制限されている。さらに、これらの方法には典型的に、既存のポリペプチドの、時間を要するかまたは非特異的な化学的変化が関与する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
したがって、当該分野では、アミノ酸を改変する迅速かつ特異的な手段を提供し、半減期に加えて、薬物動態パラメータにも対処する、治療用ポリペプチドの薬物動態特性を調節する改良された方法が求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
（発明の概要）
本発明は、機能性ポリペプチド、特に、治療用ポリペプチド（例えば、ｓｃＦｖ）を提供する。本発明のポリペプチドは、１つまたは複数の機能性部分（例えば、ＰＥＧ）および／または結合特異性（例えば、特定の結合特異性を示すアミノ酸配列）を付加することによって、迅速かつ特異的に機能性を付与され得るリンカー配列を含む。そのような機能性ポリペプチドは、非機能性ポリペプチドと比べて、薬物動態特性の改善（例えば、インビボにおける半減期、組織浸透および組織滞留時間の改善）を示すという点で好都合である。また、機能性ポリペプチドの迅速でかつ再現性のある生成のための方法も提供する。
【０００５】
したがって、１つの態様では、本発明は、イムノバインダー（ｉｍｍｕｎｏｂｉｎｄｅｒ）（例えば、ｓｃＦｖ）等、アミノ酸リンカーによって接続されている２つのドメインを含むポリペプチドを提供する。このリンカーは一般に、鎖内ジスルフィド結合を形成することができる２つのシステインを含み、これら２つのシステインが相互にジスルフィド結合すると、リンカー配列中のこれら２つのシステイン間のアミノ酸がループを形成する。特定の実施形態では、このリンカーは、配列番号１または２に記載の配列を含む。
【０００６】
特定の実施形態では、このリンカーは、ＰＫ変更因子（ＰＫ  ｍｏｄｉｆｉｅｒ）（例えば、ヒアルロン酸および血清アルブミン）等の標的分子に結合するループを含有する。標的分子に結合することによって、リンカーを含むポリペプチドの血清半減期、および／または組織内への浸透効能および／または特定の結合特異性が増強される。特定の実施形態では、このリンカーは、配列番号３または４に記載のアミノ酸配列を含む。好ましい実施形態では、このポリペプチドは、配列番号６または８に記載のアミノ酸配列を含む。
【０００７】
特定の実施形態では、このリンカー中の少なくとも１つのシステイン残基が機能性部分に共有結合している。特定の実施形態では、リンカー中の２つのシステイン残基が、同じ機能性部分に共有結合している。適切な機能性部分としては、例えば、ＰＥＧ、炭水化物分子およびヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）が挙げられる。ＰＥＧまたはＨＥＳ等の機能性部分がポリペプチドに共有結合すると、被験体内部においてそのようなポリペプチドの半減期が延長される。
【０００８】
別の態様では、本発明は、１つまたは複数の本発明のポリペプチドおよび薬学的に許容できる担体を含む組成物を提供する。
【０００９】
その他の態様では、本発明は、本発明のポリペプチドをコードする核酸分子（例えば、ベクター）、およびそのような核酸分子を含有する宿主細胞を提供する。
【００１０】
別の態様では、本発明は、機能性ポリペプチドを製造する方法を提供する。そのような方法は一般に、ペプチド配列のライブラリーを提供するステップと、そのライブラリーから、標的分子に結合する少なくとも１つのペプチド配列を同定するステップと、同定した少なくとも１つのペプチド配列を含むように、リンカー含有ポリペプチドのループ領域を改変するステップとを含む。所望のペプチド配列を、例えば、ファージディスプレイ、酵母ディスプレイまたはｍＲＮＡディスプレイを含めた、任意の当該分野で認識されている手段によって同定することができる。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
アミノ酸リンカーによって接続されている２つのドメインを含むポリペプチドであって、前記リンカーが、鎖内ジスルフィド結合を形成することができる２つのシステインを含み、前記２つのシステインが相互にジスルフィド結合すると、前記リンカー配列中の前記システイン間のアミノ酸がループを形成する、ポリペプチド。
（項目２）
前記リンカーが配列番号１に記載のアミノ酸配列を含む、項目１に記載のポリペプチド。
（項目３）
前記リンカーが配列番号２に記載のアミノ酸配列を含む、項目１に記載のポリペプチド。
（項目４）
前記ループが標的分子に結合する、前述の項目のいずれか一項に記載のポリペプチド。
（項目５）
前記標的分子がＰＫ変更因子である、項目５に記載のポリペプチド。
（項目６）
前記ＰＫ変更因子が血清アルブミンである、項目５に記載のポリペプチド。
（項目７）
前記ＰＫ変更因子がヒアルロン酸である、項目５に記載のポリペプチド。
（項目８）
前記リンカーが配列番号３に記載のアミノ酸配列を含む、項目１に記載のポリペプチド。
（項目９）
前記リンカーが配列番号４に記載のアミノ酸配列を含む、項目１に記載のポリペプチド。
（項目１０）
イムノバインダーである、前述の項目のいずれか一項に記載のポリペプチド。
（項目１１）
ｓｃＦｖである、項目１０に記載のポリペプチド。
（項目１２）
配列番号６または８に記載のアミノ酸配列を含む、項目１に記載のポリペプチド。
（項目１３）
前記リンカー中の少なくとも１つのシステイン残基が、機能性部分に共有結合している、前述の項目のいずれか一項に記載のポリペプチド。
（項目１４）
前記リンカー中の前記２つのシステイン残基が、同じ機能性部分に共有結合している、前述の項目のいずれか一項に記載のポリペプチド。
（項目１５）
前記機能性部分がＰＥＧである、項目１３または１４に記載のポリペプチド。
（項目１６）
前述の項目のいずれか一項に記載のポリペプチドおよび薬学的に許容できる担体を含む組成物。
（項目１７）
前述の項目のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする単離された核酸分子。
（項目１８）
項目１７に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
（項目１９）
項目１８に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
（項目２０）
機能性ポリペプチドを製造する方法であって、
（ａ）ペプチド配列のライブラリーを提供するステップと、
（ｂ）前記ライブラリーから、標的分子に結合する少なくとも１つのペプチド配列を同定するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）で同定した少なくとも１つのペプチド配列を含むように、リンカー含有ポリペプチドのループ領域を改変して、それによって、機能性ポリペプチドを製造するステップと
を含む、方法。
（項目２１）
前記同定ステップが、ファージディスプレイ、酵母ディスプレイまたはｍＲＮＡディスプレイを使用して実施される、項目２０に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、種々に処理したＥＳＢＡ１０５分子（レーン３〜１０）のＳＤＳ  ｐａｇｅである。レーン１：マーカー；レーン２：特定せず；レーン３：ＤＴＴを用いて還元したＥＳＢＡ１０５分子；レーン４：還元し、透析したＥＳＢＡ１０５分子；レーン５：還元し、システインをペグ化したＥＳＢＡ１０５分子；レーン６：システインをペグ化し、透析したＥＳＢＡ１０５分子；レーン７：対照；レーン８：リジンをペグ化したＥＳＢＡ１０５分子；レーン９：リジン（Ｌａｙｓｉｎｅ）をペグ化し、透析したＥＳＢＡ１０５分子；レーン１０：対照。ＰＥＧの分子サイズは、およそ０．７ｋＤａ／ＰＥＧであった。
【図２】図２は、（Ａ）システインをペグ化したＥＳＢＡ１０５および（Ｂ）リジンをペグ化したＥＳＢＡ１０５のＴＮＦアルファ結合活性のＥＬＩＳＡ分析を示すグラフである。Ａ：ＥＣ５０は、ＥＳＢＡ１０５については、０．９８３３であり、還元したＥＳＢＡ１０５については、１．２９１であり、Ｃｙｓペグ化ＥＳＢＡ１０５については、１．１６４であった。Ｒ２は、ＥＳＢＡ１０５については、０．９８１４であり、還元したＥＳＢＡ１０５については、０．９８９１であり、Ｃｙｓペグ化ＥＳＢＡ１０５については、０．９８５７であった。Ｂ：ＥＣ５０は、ＥＳＢＡ１０５については、０．８０７３であり、Ｌｙｓペグ化ＥＳＢＡ１０５については、１．３２６であった。Ｒ２は、ＥＳＢＡ１０５については、０．９８７０であり、ペグ化ＥＳＢＡ１０５については、０．９６４０であった。
【図３】図３は、（ａ）未改変、酸化状態のＥＳＢＡ１０５−ＳＳ−リンカー、（ｂ）単官能性のペグ化試薬１を使用して、ペグ化したＥＳＢＡ１０５−ＳＳ−リンカー（ＥＳＢＡ１０５−Ｓ２−ＰＥＧ２）、および（ｃ）二官能性ペグ化試薬２を使用して、ペグ化したＥＳＢＡ１０５−ＳＳ−リンカー（ＥＳＢＡ１０５−Ｓ２−ＰＥＧ）を示す模式図である。
【図４】図４は、（Ａ）ＥＳＢＡ１０５およびＥＳＢＡ１０５−ＳＳ−リンカーのＴＮＦアルファ結合活性のＥＬＩＳＡ分析を示すグラフ、（Ｂ）種々の処理に供したＥＳＢＡ１０５のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル、ならびに（Ｃ）ＥＳＢＡ１０５およびＥＳＢＡ１０５−ＳＳ−リンカーのペグ化の程度を、ウサギ抗ＰＥＧ抗体を使用して評価したウエスタンブロットである。図４（Ｂ）：レーン１：還元＋透析＋濃縮を行ったＥＳＢＡ１０５  ＳＳリンカー；レーン２：還元＋透析を行ったＥＳＢＡ１０５  ＳＳリンカー；レーン３：還元＋ペグ化を行ったＥＳＢＡ１０５  ＳＳリンカー；レーン４：還元＋ペグ化＋透析を行ったＥＳＢＡ１０５  ＳＳリンカー；レーン５：ＥＳＢＡ１０５  ＳＳリンカー。
【図５】図５は、ファージディスプレイのための、バクテリオファージ２の表面上におけるｓｃＦｖ分子１のペプチドループの提示を示す模式図である（ｓｃＦｖ分子およびファージは、原寸に比例しない）。表示の場合では、ループが、標的分子３、例として、血清アルブミン（半減期の延長）、ＦｃＲｘ（胎盤への輸送）、ムチン（上皮滞留時間の延長）、インテグリン（ＲＧＤペプチド）、補体、接着結合タンパク質等と相互作用することができるか多量体化できる７つのアミノ酸を含む。
【図６】図６は、ＥＳＢＡ１０５およびシステインをペグ化したＥＳＢＡ１０５−ＳＳ−リンカーのＴＮＦアルファ結合活性のＥＬＩＳＡ分析を示すグラフである。ＥＣ５０は、ＥＳＢＡ１０５については、０．９９８０であり、ペグ化ＳＳリンカーを有するＥＳＢＡ１０５については、１．１８１であった。Ｒ２は、ＥＳＢＡ１０５については、０．９３９７であり、ペグ化ＳＳリンカーを有するＥＳＢＡ１０５については、０．９８５１であった。
【図７】図７ａは、ＥＳＢＡ９０３のＶＥＧＦの結合動態を示すグラフである。フィット：１：１の結合；ｋａ（１／Ｍ秒）：７．６８Ｅ＋５；ｋｄ（１／秒）：４．３１０Ｅ−５；ＫＤ（Ｍ）：５．６０８Ｅ−１１。図７ｂは、ＥＳＢＡ９０３−Ｐｅｐ１の結合動態を示すグラフである。フィット：１：１の結合；ｋａ（１／Ｍ秒）：１．１３３Ｅ＋６；ｋｄ（１／秒）：５．０２６Ｅ−５。７ａおよび７ｂの両方について、Ｘ軸の値は秒であり、Ｙ軸の値は共鳴単位（ＲＵ）である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
（詳細な説明）
（定義）
ポリペプチドに関する「ドメイン」という用語は、当該分野で認識されている意味をとり、個別の単位の三次構造を指す。ドメインの例としては、これらに限定されないが、抗体のＶＨドメインまたはＶＬドメイン、フィブロネクチンのドメインおよびアンキリン反復ドメインが挙げられる。
【００１３】
「リンカー」という用語は、２つのドメインを連結する直鎖のアミノ酸配列を指す。本発明のリンカーを、ドメインに遺伝子的および／または化学的に融合させることができる。特定の実施形態では、リンカーはループを含有する。
【００１４】
「ループ」という用語は、リンカー内部の鎖内ジスルフィド結合によって形成される環状のアミノ酸配列を指す。
【００１５】
「ポリエチレングリコール」または「ＰＥＧ」という用語は、化学式ＨＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｈを有する直鎖または分枝の中性ポリエーテル、およびその反応性誘導体を指す。反応性のＰＥＧ誘導体は、当該分野では周知であり、それらとしては、限定されないが、メチル−ＰＥＯ１２−マレイミド結合ＰＥＧ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカーボネート結合ＰＥＧ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルプロピオネート結合ＰＥＧ、ｐ−ニトロフェニル−カーボネート結合ＰＥＧ、ベンゾトリアゾール−カーボネート結合ＰＥＧ、およびアルデヒド結合ＰＥＧが挙げられる。特定の実施形態では、アミノ反応性のＰＥＧ誘導体は、ジスルフィド結合と特異的に反応することができるビス−スルホン結合ＰＥＧである（例えば、Ｂｒｏｃｃｈｉｎｉら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、２００６年：１巻（５号）、２４１頁を参照されたい）。適切なＰＥＧ分子は、０．５ｋＤａ〜５０ｋＤａの間の分子サイズの分子である。
【００１６】
「標的分子」という用語は、本発明のポリペプチドのループ領域が特異的に結合する任意の分子を指す。標的分子として、例えば、糖、タンパク質および脂質が挙げられる。
【００１７】
「機能性部分」という用語は、追加の機能性を、それが結合する分子に付与する生物学的または化学的な実体（例えば、ＰＥＧ分子、１つまたは複数の炭水化物分子またはヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ））を指す。
【００１８】
「ＰＫ変更因子」という用語は、タンパク質の薬物動態プロファイルを、そのタンパク質に結合して変化させる任意の分子を指す。ＰＫ変更因子は典型的には、被験体（例えば、患者）内に存在する、天然の内在性分子であるが、必ずしもそうであるとは限らない。被験体内部のそのようなＰＫ変更因子の局在および存在量は、生理的な場合もあれば、または病的な場合もある（例えば、がん細胞表面上または炎症部位における過剰発現）。適切なＰＫ変更因子としては、例えば、ヒアルロン酸、コラーゲンＩＩ型、血清アルブミン、抗体のＦｃ受容体（例えば、ＦｃＲｘ）、抗体のＦｃ領域、ムチン、インテグリン、接着結合タンパク質、トランスフェリンおよび補体因子が挙げられる。
【００１９】
ポリペプチドのアミノ酸配列に関する「改変」または「改変する」という用語は、ポリペプチド配列内へのアミノ酸の付加、またはポリペプチド配列中の既存のアミノ酸の置換の両方を指す。ポリペプチドを改変するのに適したアミノ酸は、すべての公知の天然アミノ酸、非天然アミノ酸、およびそれらの機能性誘導体を含む（例えば、全容が参照により本明細書に援用される米国特許第７，０４５，３３７号および同第７，０８３，９７０号を参照されたい）。
【００２０】
「イムノバインダー」という用語は、抗体の抗原結合部位の全部または一部、例えば、重鎖可変ドメインおよび／または軽鎖可変ドメインの全部または一部を含有する分子を指し、したがって、イムノバインダーは、標的抗原を特異的に認識する。イムノバインダーの非限定的な例としては、完全長の免疫グロブリン分子およびｓｃＦｖ、さらに、これらに限定されないが、（ｉ）Ｆａｂ断片、すなわち、ＶＬドメイン、ＶＨドメイン、ＣＬドメインおよびＣＨ１ドメインからなる一価の断片；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、すなわち、ヒンジ領域においてジスルフィド架橋によって連結されている２つのＦａｂ断片を含む二価の断片；（ｉｉｉ）本質的には、ヒンジ領域の一部を有するＦａｂであるＦａｂ’断片（Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｐａｕｌ編、第３版、１９９３年）を参照されたい）；（ｉｖ）ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｖ）抗体の単腕（ｓｉｎｇｌｅ  ａｒｍ）のＶＬドメインおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片；ならびに（ｖｉｉ）単一の可変ドメインを含有する重鎖可変領域および２つの定常ドメインであるナノボディを含めた、抗体断片が挙げられる。
【００２１】
本明細書で使用する場合、「抗体」という用語は、「免疫グロブリン」の同義語である。本発明による抗体は、免疫グロブリン全体であってもよく、または免疫グロブリンの少なくとも１つの可変ドメインを含むそれらの断片、例として、単一の可変ドメイン、Ｆｖ（Ｓｋｅｒｒａ  Ａ．およびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ，  Ａ．（１９８８年）Ｓｃｉｅｎｃｅ
２４０巻：１０３８〜４１頁）、ｓｃＦｖ（Ｂｉｒｄ，  Ｒ．Ｅ．  ら（１９８８年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２巻：４２３〜２６頁；Ｈｕｓｔｏｎ，  Ｊ．Ｓ．ら（１９８８年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５巻：５８７９〜８３頁）、Ｆａｂ、（Ｆａｂ’）２、もしくは当業者に周知のその他の断片であってもよい。
【００２２】
「単鎖抗体」または「ｓｃＦｖ」という用語は、リンカーによって接続されている抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）および抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む分子を指す。そのようなｓｃＦｖ分子は、一般的な構造：ＮＨ２−ＶＬ−リンカー−ＶＨ−ＣＯＯＨまたはＮＨ２−ＶＨ−リンカー−ＶＬ−ＣＯＯＨを有し得る。
【００２３】
本明細書で使用する場合、「機能特性」という用語は、ポリペプチド（例えば、イムノバインダー）の特性であり、それらとして、限定されないが、安定性（例えば、熱安定性）、溶解性（例えば、インビボおよび細胞培養における溶解性）、ならびに抗原結合親和性が挙げられる。
【００２４】
「特異的結合」、「選択的結合」、「選択的に結合する」および「特異的に結合する」という用語は、抗体が所定の抗原上のエピトープに結合することを指す。典型的には抗体は、約１０−７Ｍ未満、例として、約１０−８Ｍ未満、１０−９Ｍ未満または１０−１０Ｍ未満の親和性（ＫＤ）で結合する。
【００２５】
「核酸分子」という用語は、ＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子を指す。核酸分子は、一本鎖であってもまたは二本鎖であってもよいが、好ましくは、二本鎖ＤＮＡである。核酸は、別の核酸配列と機能的関係に置かれた場合、「作動可能に連結」されている。例えば、プロモーターまたはエンハンサーが配列の転写に影響を及ぼす場合には、それはコード配列に作動可能に連結されている。
【００２６】
「ベクター」という用語は、それが連結されている別の核酸を輸送することができる核酸分子を指す。ベクターの１つの型が「プラスミド」であり、これは、その中に追加のＤＮＡセグメントをライゲーション（ｌｉｇａｔｅ）することができる環状の二本鎖ＤＮＡのループを指す。ベクターの別の型はウイルスベクターであり、追加のＤＮＡセグメントをウイルスゲノム内にライゲーションすることができる。特定のベクターは、それらのベクターが導入されている宿主細胞中で自律的に複製することができる（例えば、細菌の複製開始点を有する細菌ベクター、およびエピソーム性哺乳動物ベクター）。その他のベクター（例えば、非エピソーム性哺乳動物ベクター）を、宿主細胞中に導入して宿主細胞のゲノム内に組み込むことができ、それによって、それらのベクターは宿主ゲノムと一緒に複製される。
【００２７】
「宿主細胞」という用語は、発現ベクターが導入されている細胞を指す。宿主細胞は、細菌、微生物、植物または動物の細胞を含み得る。細菌は、形質転換に対して感受性であり、これらとしては、腸内細菌科のメンバー、例として、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｉｌまたはＳａｌｍｏｎｅｌｌａの菌株；バチルス科、例として、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ；肺炎球菌；連鎖球菌、およびＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅが挙げられる。適切な微生物としては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓが挙げられる。適切な動物宿主細胞系としては、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣細胞系）およびＮＳ０細胞が挙げられる。
【００２８】
別段の定義がない限り、本明細書で使用するすべての科学技術用語は、本発明が属する分野の一般的な業者が通常理解する意味と同じ意味を有する。本明細書に記載するものに類似のまたはそれらと同等な方法および材料を、本発明を実施または試験する際に使用することができるが、適切な方法および材料を以下に記載する。対立が生じた場合には、定義を含めた、本明細書が優先する。さらに、材料、方法および実施例は、例証のためのものであり、本発明を限定するとは意図されない。
【００２９】
本発明の種々の態様を、以下のサブセクションにおいてさらに詳細に記載する。種々の実施形態を随意に組み合わせることができることを理解すべきである。
【００３０】
（ポリペプチドリンカー）
１つの態様では、本発明は、２つのドメインを含むポリペプチドを提供し、これらのドメインは、アミノ酸リンカーによってつながれており、このリンカーは、鎖内ジスルフィド結合を形成することができる２つのシステイン残基を含有する。そのようなリンカーは、機能性部分（例えば、ＰＥＧ）の部位特異的付加、および／またはこのポリペプチドへの、１つもしくは複数の結合親和性の付加を可能にする点で特に好都合である。本発明のリンカーを、好ましくは、遺伝子工学によって遺伝子的に、あるドメインにつなぎ、より好ましくは２つのドメイン間につなぎ、それによって、それらを連結して、単一のポリペプチドを形成する。あるいは、アミノ酸をつなぐための任意の当該分野で認識されている化学反応を使用して、本発明のリンカーをあるドメインに化学的につなぐこともできる。任意の当該分野で認識されている化学反応によって、機能性部分をこのリンカーに接続することができる。好ましくは、機能性部分は、このリンカー中に存在する１つまたは複数のシステインに接続されている。
【００３１】
特定の実施形態では、このアミノ酸リンカーは、一般式：（Ｘ）ａ−Ｃ−（Ｘ）ｂ−Ｃ−（Ｘ）ｃ［式中、Ｃは、システインであり；Ｘは、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、およびそれらの化学的誘導体を含めた、任意のアミノ酸であり；かつａ、ｂおよびｃは、アミノ酸の数に対応し、任意の自然数であってよい］で示される。好ましくは、ａおよびｃは、１〜２５の間の数であり、ｂは、３〜２５０の間の数である。より好ましくは、ａおよびｃは、１〜２０の間の数であり、ｂは、３〜１００の間の数である。
【００３２】
１つの実施形態では、このリンカーは、ループ形成領域Ｘｂ中にペプチド配列を含む。前記の場合、ｂは、好ましくは、３〜３０個のアミノ酸のうちの任意の数、すなわち、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０である。最も好ましくは、ｂは、７または１２である。好ましくは、ループ形成領域Ｘｂは、システイン残基を含まない。
【００３３】
特定の実施形態では、このリンカーは、折畳まれているポリペプチドのドメインを含む。一般式：（Ｘ）ａ−Ｃ−（Ｘ）ｂ−Ｃ−（Ｘ）ｃ中、ｂは、好ましくは、３０〜２５０の間の数、例えば、５０〜２００、１００〜２００、１２５〜２２５、７５〜２２５、１２５〜２２５、例として、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０または２５０である。示した範囲内の任意の自然数が、本明細書において開示されていることが理解されるべきである。したがって、このアミノ酸リンカーは、一般式（Ｘ）ａ−Ｃ−ドメイン−Ｃ−（Ｘ）ｂ［式中、Ｃは、システインであり；Ｘは、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、およびそれらの化学的誘導体を含めた、任意のアミノ酸であり；ドメインは、上記で定義したドメインであり；かつａ、ｂは、アミノ酸の数に対応し、任意の自然数であってよい］で示される。
【００３４】
特定の実施形態では、このアミノ酸リンカーは、一般式：（Ｘ）ｎ＝３〜１５−Ｃ−（Ｘ）ｎ＝３〜５０−Ｃ−（Ｘ）ｎ＝３〜１５（表１の配列番号１）［式中、Ｃは、システインであり；Ｘは、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、およびそれらの化学的誘導体を含めた、任意のアミノ酸であり；かつｎは、アミノ酸の数である］で示される。このリンカー中のシステイン残基が、非還元条件下で鎖内ジスルフィド結合を形成することができるのであれば、このリンカーの各領域中のアミノ酸残基の数は、このリンカーが結合しているポリペプチドの構造に従って変化してよい。さらに、このリンカーの長さおよび配列は、このリンカーが一部をなすポリペプチドの１つまたは複数の機能特性を実質的に損なわないような長さおよび配列でなければならない。特定の実施形態では、このアミノ酸リンカーは、配列番号２、３および４のうちの任意の１つに記載のアミノ酸配列を含む（表１を参照されたい）。
【００３５】
ｓｃＦｖ、特に、非常に安定かつ可溶性であるｓｃＦｖ、例として、その内容が参照により本明細書に援用されるＷＯ０９／００００９８に記載されているものにおいて、本発明のリンカーは、ＶＨドメインとＶＬドメインとをつなぐのに特によく適している。本発明のリンカーを含む例示的なｓｃＦｖポリペプチドのアミノ配列を、配列番号６および８に記載する（表１を参照されたい）。
【００３６】
（ポリペプチド）
本発明は、機能性ポリペプチド、特に、治療用ポリペプチド（例えば、ｓｃＦｖ）を提供する。本発明のポリペプチドは、１つまたは複数の機能性部分（例えば、ＰＥＧ）および／または結合特異性（例えば、特定の結合特異性を示すアミノ酸配列）を付加することによって、迅速かつ特異的に機能性を付与され得るリンカー配列を含む。
【００３７】
これらに限定されないが、免疫グロブリンのドメイン（例えば、ＶＨドメインまたはＶＬドメイン）を含むポリペプチドを含めて、任意のポリペプチドに、本発明の方法および組成物を使用して機能性を付与することができる。特定の実施形態では、このポリペプチドは、イムノバインダー（例えば、ｓｃＦｖ）である。
【００３８】
好ましい実施形態では、本発明のポリペプチドは、一般式：ドメイン１−（Ｘ）ａ−Ｃ−（Ｘ）ｂ−Ｃ−（Ｘ）ｃ−ドメイン２［式中、Ｃは、システインであり；ドメイン１およびドメイン２は、上記で定義したドメインであり；Ｘは、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、およびそれらの化学的誘導体を含めた、任意のアミノ酸であり；かつａ、ｂおよびｃは、アミノ酸の数である］で示される。好ましくは、ドメイン１およびドメイン２はそれぞれ、ＶＨドメインおよびＶＬドメイン、またはＶＬドメインおよびＶＨドメインである。
【００３９】
（機能性部分のリンカーへの付加）
本発明のリンカーは、非還元条件下で鎖内ジスルフィド結合を形成する少なくとも２つのシステイン残基を含有する（図３を参照されたい）。このジスルフィド結合によって、機能性部分（例えば、ＰＥＧ）を、本明細書に記載する方法を使用してリンカーに部位特異的に付加することが可能となる。具体的には、このジスルフィド結合中のシステイン残基を機能性部分（例えば、ＰＥＧ）に共有結合させることができる。露出しているシステインによって、はるかに良好な定方向のペグ化が可能になるので、ＰＥＧ付加部位に関して不均質な集団をしばしばもたらす、従来のＰＥＧ付加部位を上回る製造上の利点が達成される。単官能性反応基を含有する機能性部分を利用する場合、この機能性部分が、単一のシステイン残基に連結される。しかし、ジスルフィド結合に特異的である二官能性反応基を含有する機能性部分を利用する場合には、この機能性部分は、鎖内ジスルフィド結合の両方のシステイン残基に連結される。そのような二官能性試薬は、当該分野では周知であり、それらとしては、ビス−スルホンが挙げられる（例えば、Ｂｒｏｃｃｈｉｎｉら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、２００６年：１巻（５号）２４１頁を参照されたい）。
【００４０】
特定の実施形態では、本発明は、配列番号２、３、４、６および８に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供し（表１を参照されたい）、このリンカー中の少なくとも１つのシステイン残基を、機能性部分（例えば、ＰＥＧ）に共有結合させる。その他の実施形態では、本発明は、配列番号２、３、４、６および８に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供し（表１を参照されたい）、このリンカー中の両方のシステイン残基を、二官能性反応基（例えば、ビス−スルホン）を使用して同じ機能性部分（例えば、ＰＥＧ）に共有結合させる。
【００４１】
（ループに対する機能性の付与）
本発明のリンカー中のシステイン残基によって鎖内ジスルフィド結合を形成させて、これらシステイン残基間のリンカーのアミノ酸配列を環化して、ループを形成する（図３および５を参照されたい）。このループ構造は、この構造を改変して、１つまたは複数の特定の結合特異性を示すアミノ酸配列を含ませ、したがって、追加の機能性を、このループが一部をなすポリペプチドに付加することができる点で特に好都合である。
【００４２】
このループの配列は、例えば、任意の標的分子に対する結合特異性を示すことができる。適切な標的分子としては、これらに限定されないが、ＰＫ変更因子、例として、ヒアルロン酸、血清アルブミン、インテグリン、抗体のＦｃ領域、トランスフェリン等が挙げられる。例えば、血清アルブミンへの結合によって、このポリペプチドの半減期が延長される。ＦｃＲｘへの結合によって、このポリペプチドの胎盤内への輸送が改善され、一方、ムチンへの結合によって、上皮内における滞留時間が延長される。抗原に対して特異性を示すイムノバインダーの場合、特定の実施形態では、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間のループ領域を、抗原に結合するように操作し得、したがって、このイムノバインダーの親和性を改善することができる。別の実施形態では、標的分子は、ポリペプチド自体である。換言すると、このループによって、このポリペプチドに、二量体、三量体またはそれより高次の多量体を構築させる多量体化の機能をもたらすことができる。多量体は、単量体と比較して、より強力なアビディティーを示す。さらに、多量体によって、架橋結合が可能になり、これには、例えば、細胞表面上における受容体の活性化が最終的に続く。別の実施形態では、標的分子は、そのリンカーにおいて相補性を示すループを提示する別のイムノバインダーである。すなわち、これら２つの分子のループが相互に結合するが、これらのループは、同一であってもまたは異なってもよい。これによって、二重特異性または多重特異性のイムノバインダーの複合体の形成が可能になる。二重特異性または多重特異性の複合体によって、分子または細胞を、別の細胞または分子にリクルートすることが可能となる。例えば、Ｔ細胞をがん細胞にリクルートして、がん細胞を死滅させる（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６９巻、４９４１頁）。
【００４３】
所望の標的分子に対して結合特異性を示す任意の短いアミノ酸配列を、本発明のループ内に導入することができる。好ましい実施形態では、このループ配列は、５〜１５個のアミノ酸からなり（すなわち、一般式（Ｘ）ａ−Ｃ−（Ｘ）ｂ−Ｃ−（Ｘ）ｃ中、ｂは、５〜１５であり）、システインは含有しない。ループ内に組み込むことができる適切なアミノ酸配列としては、これらに限定されないが、ヒアルロン酸結合性ペプチド（例えば、表１の配列番号４の残基１２〜２３を含むペプチド）、およびインテグリン結合性ペプチド（例えば、ＲＧＤペプチド）が挙げられる。
【００４４】
ループ内に組み込むのに適した、所望の標的分子に対する結合特異性を示す新しいペプチドを、例えば、ファージディスプレイ、酵母ディスプレイおよびｍＲＮＡディスプレイ等の当該分野で認識されている手段によって同定することができる。そのようなディスプレイ系が、当該分野では周知である（例えば、参照により本明細書に援用される米国特許第６６２５８５５８号、同第６６９９６５８号および同第７１１８８７９号を参照されたい）。例として、ファージディスプレイによるスクリーニングを実施するために、このリンカーの２つのシステインによって形成されているループを、ファージのカプシドタンパク質に融合させて、ファージ表面上に提示させることができる（模式図については、図５を参照されたい）。このループ配列は、理想的には、５〜１５個の間のアミノ酸を含み、ループを形成するのに必要なシステイン以外のシステインは含有しない。スクリーニングするために、このループ配列を無作為化して、ループ配列のライブラリーを提供する。適切なファージライブラリー、例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂからジスルフィド拘束（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ−ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ）ヘプタペプチド（Ｐｈ．Ｄ．−Ｃ７Ｃ）ライブラリーが市販されている。そのようなファージのスクリーニングのための標的分子としては、例えば、ＰＫ変更因子、例として、コラーゲンＩＩ型、アルブミン、抗体のＦｃ領域、抗体のＦｃ受容体（例えば、ＦｃＲｘ）、ムチン、インテグリン、接着結合タンパク質および補体因子が挙げられる。
【００４５】
（改変ポリペプチド）
それに加えてまたは代わって、本発明のポリペプチドを、このリンカー領域の外側の１つまたは複数のアミノ酸残基において機能性部分（例えば、ＰＥＧ）に共有結合させることもできる。１つまたは複数のこのポリペプチドの機能特性を実質的に損なうことのない任意のアミノ酸残基、例えば、表面に露出しているリジン残基およびシステイン残基を利用することができる。所望により、ポリペプチドを（付加または置換により）改変して、機能性部分への連結に適した追加の反応性のアミノ酸を導入することができる。特定の実施形態では、ポリペプチドを改変して、少なくとも一対のシステイン残基を含有させ、少なくとも一対のこれらのシステイン残基は成熟したポリペプチド中で鎖内ジスルフィド結合を形成する。機能性部分を、単官能性反応基を使用して、単一の反応性の残基（例えば、システイン）に連結してもよく、または二官能性のジスルフィド結合に特異的な反応基（例えば、ビス−スルホン）を使用して、２つの、ジスルフィド結合システインに連結してもよい。
【００４６】
したがって、１つの実施形態では、本発明は、配列番号５に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供し、Ｌｙｓ４０、Ｌｙｓ４３、Ｌｙｓ４６、Ｌｙｓ１０７、Ｌｙｓ１７６、Ｌｙｓ１９７およびＬｙｓ２０８からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基が、機能性部分（例えば、ＰＥＧ）に共有結合している。
【００４７】
別の実施形態では、本発明は、配列番号５に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供し、Ｃ２４−Ｃ８９およびＣ１５４−Ｃ２２８からなる群より選択される少なくとも一対のシステイン残基が、同じ機能性部分（例えば、ＰＥＧ）に共有結合している。
【００４８】
別の実施形態では、本発明は、配列番号６に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供し、Ｃｙｓ１２３およびＣｙｓ１３６からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基が、機能性部分（例えば、ＰＥＧ）に共有結合している。
【００４９】
別の実施形態では、本発明は、配列番号６に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供し、一対のシステイン残基Ｃｙｓ１２３−Ｃｙｓ１３６が、同じ機能性部分（例えば、ＰＥＧ）に共有結合している。
【００５０】
別の実施形態では、本発明は、配列番号７に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供し、Ｌｙｓ４４、Ｌｙｓ４７、Ｌｙｓ１０５、Ｌｙｓ１０９、Ｌｙｓ１４２、Ｌｙｓ１４３、Ｌｙｓ１４９、Ｌｙｓ１７３、Ｌｙｓ１９３およびＬｙｓ１９５からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基が、機能性部分（例えば、ＰＥＧ）に共有結合している。
【００５１】
別の実施形態では、本発明は、配列番号７に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供し、Ｃｙｓ２５−Ｃｙｓ９０およびＣｙｓ１５２−Ｃｙｓ２２６からなる群より選択される少なくとも一対のシステイン残基が、同じ機能性部分（例えば、ＰＥＧ）に共有結合している。
【００５２】
別の実施形態では、本発明は、配列番号８に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供し、Ｃｙｓ１２１およびＣｙｓ１２９からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基が、機能性部分（例えば、ＰＥＧ）に共有結合している。
【００５３】
別の実施形態では、本発明は、配列番号８に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供し、一対のシステイン残基Ｃｙｓ１２１−Ｃｙｓ１２９が、同じ機能性部分（例えば、ＰＥＧ）に共有結合している。
【００５４】
別の実施形態では、本発明は、配列番号５、６、７または８に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供し、このポリペプチドは改変されて、少なくとも１つの反応性のアミノ酸（例えば、システインまたはリジン）を含有する。そのような反応性のアミノ酸を、機能性部分（例えば、ＰＥＧ）に共有結合させることができる。
【００５５】
別の実施形態では、本発明は、配列番号５、６、７または８に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供し、このポリペプチドは改変されて、少なくとも一対のシステイン残基を含有し、少なくとも一対のシステイン残基は、成熟したポリペプチド中で鎖内ジスルフィド結合を形成することができる。特定の実施形態では、少なくとも一対のシステイン残基を、二官能性反応基（例えば、ビス−スルホン）を使用して同じ機能性部分（例えば、ＰＥＧ）に共有結合させる。
【００５６】
当該分野で公知のごとく、ＰＥＧを結合させることによって、バイオ医薬品（ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）の特定の特徴が改善するが、それらの機能は変化せず、したがって、それらの治療効果が増強される。例示的な効果は、（ｉ）溶解性の増強、安定性の改善、吸収の持続および／もしくは連続的な生物薬学的作用による薬物動態の改善；（ｉｉ）治療有効量および／もしくは投薬頻度を減少させる循環時間の増加；ならびに／または（ｉｉｉ）例えば、安全性プロファイルの改善、免疫原性の低下、抗原性の低下および／もしくはタンパク質分解の低下に起因する毒性の減少である。
【００５７】
（ポリペプチドの組成物および処方物）
本発明の別の態様は、本発明のポリペプチド（例えば、ＳｃＦｖ）の組成物の薬学的処方物に関する。そのような処方物は典型的には、このポリペプチド（例えば、ＳｃＦｖ）の組成物および薬学的に許容できる担体を含む。本明細書で使用する場合、「薬学的に許容できる担体」は、生理学的に適合性である、任意かつ全ての溶媒、分散媒、被覆剤、抗細菌剤および抗真菌剤、等張化剤および吸収遅延剤等を含む。好ましくは、担体は、例えば、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、（例えば、眼、皮膚もしくは上皮層への）局所投与、吸入による投与、非経口投与、脊髄投与または上皮投与（例えば、注射または注入による）に適している。投与経路に応じて、これらのポリペプチド（例えば、ＳｃＦｖ）を、材料中に被覆して、化合物を不活性化する恐れがある酸の作用およびその他の天然の条件から、化合物を保護することができる。
【００５８】
本発明の薬学的化合物は、１つまたは複数の薬学的に許容できる塩を含むことができる。「薬学的に許容できる塩」とは、親化合物の所望の生物学的な活性を保持し、任意の望まれない毒物学的作用をもたらさない塩を指す（例えば、Ｂｅｒｇｅ，  Ｓ．  Ｍ．ら（１９７７年）Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｓｃｉ．  ６６巻：１〜１９頁を参照されたい）。そのような塩の例としては、酸付加塩および塩基付加塩が挙げられる。酸付加塩としては、無毒性の無機酸、例として、塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、亜リン酸等、ならびに無毒性の有機酸、例として、脂肪族のモノカルボン酸およびジカルボン酸、フェニル置換アルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香族酸、脂肪族および芳香族のスルホン酸等に由来するものが挙げられる。塩基付加塩としては、アルカリ土類金属、例として、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム等、および無毒性の有機アミン、例として、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、プロカイン等に由来するものが挙げられる。
【００５９】
また、本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容できる抗酸化剤も含むことができる。薬学的に許容できる抗酸化剤の例としては、（１）水溶性抗酸化剤、例として、アスコルビン酸、システイン塩酸塩、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム等；（２）油溶性抗酸化剤、例として、アスコルビン酸パルミテート、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、プロピルガレート、アルファ−トコフェロール等；および（３）金属キレート剤、例として、クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸等が挙げられる。
【００６０】
本発明の薬学的組成物中で利用することができる適切な水性および非水性の担体の例としては、水、エタノール、ポリオール（例として、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等）およびそれらの適切な混合物、オリーブ油等の植物油、ならびにオレイン酸エチル等の注射可能有機エステルが挙げられる。例えば、レシチン等の被覆材料を使用することによって、分散物の場合には必要な粒子サイズを維持することによって、および界面活性剤を使用することによって、適切な流動性を維持することができる。
【００６１】
また、これらの組成物は、保存剤、加湿薬、乳化剤および分散化剤等のアジュバントも含有することができる。微生物の存在の阻止を、上記の滅菌手順、ならびに種々の抗細菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸等を含めることの両方によって確実にすることができる。また、等張化剤、例として、糖、塩化ナトリウム等を、この組成物中に含めることが望ましい場合がある。さらに、注射可能な薬学的形態の吸収の延長を、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン等の吸収を遅延させる薬剤を含めることによってもたらすこともできる。
【００６２】
薬学的に許容できる担体は、無菌の水溶液または分散物、および無菌の注射可能溶液または分散物を用時調製するための無菌の粉末を含む。薬学的に活性な物質のための、そのような媒質および薬剤の使用は、当該分野では公知である。任意の従来の媒質または薬剤がこの活性化合物に適合する限り、本発明の薬学的組成物におけるその使用を企図する。また、追加の活性化合物を、この組成物中に組み込むこともできる。
【００６３】
治療用組成物は典型的には、製造および保管の条件下で無菌かつ安定でなければならない。この組成物を、溶液、マイクロエマルジョン、リポソーム、または高い薬物濃度に適したその他の秩序構造として処方することができる。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコール等）ならびにそれらの適切な混合物を含有する溶媒または分散媒であってよい。例えば、レシチン等の被覆材料を使用することによって、分散物の場合には必要な粒子サイズを維持することによって、および界面活性剤を使用することによって、適切な流動性を維持することができる。多くの場合、この組成物中に、等張化剤、例えば、糖、マンニトール、ソルビトール等のポリアルコール、または塩化ナトリウムを含めることが好ましい。注射可能組成物の吸収の延長を、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸塩およびゼラチンを組成物中に含めることによってもたらすことができる。
【００６４】
適切な溶媒中に、必要量の活性化合物を、必要に応じて、上記に列挙した成分のうちの１つまたはそれらの組み合わせと共に組み込み、続いて、精密ろ過により滅菌することによって、無菌の注射可能溶液を調製することができる。一般に、活性化合物を、基礎分散媒および上記に列挙したものからの必要なその他の成分を含有する無菌のビヒクル中に組み込むことによって、分散物を調製する。無菌の注射可能溶液を調製するための無菌の粉末の場合、調製の好ましい方法は、活性成分に任意の追加の所望の成分を加えた溶液を先に無菌ろ過し、それから粉末を得る真空乾燥および凍結乾燥（ｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｙｉｎｇ）（凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ））である。
【００６５】
単回投薬形態を生成するための、担体材料と組み合わせることができる活性成分の量は、処置される被験体および特定の投与様式に応じて変化させる。単回投薬形態を生成するための、担体材料と組み合わせることができる活性成分の量は一般に、治療効果をもたらす組成物の量である。一般に、１００パーセント中、この量は、約０．０１パーセント〜約９９パーセントの活性成分、好ましくは、約０．１パーセント〜約７０パーセント、最も好ましくは、約１パーセント〜約３０パーセントの、薬学的に許容できる担体と組み合わせた活性成分の範囲である。
【００６６】
投薬レジメンを調節して、最適な所望の応答（例えば、治療に対する応答）をもたらす。例えば、単回のボーラスを投与してもよく、用量をいくつかに分けて長時間にわたり投与してもよく、または治療状況の緊急性の指標に従って、用量を比例的に低下もしくは増加させてもよい。投与を容易にし、投与量を一様にするために、非経口用組成物を投薬単位形態として処方することは特に好都合である。本明細書で使用する場合、投薬単位形態とは、処置される被験体のための統一された投与量として適している物理的に個別の単位を指し、各単位は、必要な薬学的担体を伴って所望の治療効果をもたらすように計算された、所定の分量の活性化合物を含有する。本発明の投薬単位形態についての仕様は、（ａ）活性化合物の独特の特徴および達成すべき特定の治療効果、ならびに（ｂ）個体において感受性を処置するためのそのような活性化合物を作り上げる技術に内在する制限によって定まり、それらに直接依存する。
【００６７】
【表１−１】
2014111670.tif 000002
【００６８】
【表１−２】
2014111670.tif 000003
【実施例】
【００６９】
（例証）
本開示を、以下の実施例によってさらに例証するが、これらの実施例を、本発明をさらに限定するものであると解釈すべきではない。本出願の全体を通して引用するすべての図、参考文献、特許および公開されている特許出願の内容は、その全容が参照により本明細書に明示的に援用される。
【００７０】
一般に、本発明の実施に際しては、別段の記載がない限り、化学、分子生物学、組換えＤＮＡ技術および免疫学（特に、例えば、免疫グロブリンの技術）の従来の技法を利用する。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９年）；Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、５１０頁、Ｐａｕｌ，  Ｓ．、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒ（１９９６年）；Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｓｅｒｉｅｓ、１６９頁）、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ編、Ｉｒｌ  Ｐｒ（１９９６年）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｈａｒｌｏｗら、Ｃ．Ｓ．Ｈ．Ｌ．  Ｐｒｅｓｓ，  Ｐｕｂ．（１９９９年）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９９２年）を参照されたい。また、例えば、Ｐｏｌｙｔｈｅｒｉｃｓ、ＵＳ６８０３４３８；ＥＰ１７０１７４１Ａ２；ＥＰ１６４８５１８Ａ２；ＷＯ０５０６５７１２Ａ２；ＷＯ０５００７１９７Ａ２；ＥＰ１４９６９４１Ａ１；ＥＰ１２２２２１７Ｂ１；ＥＰ１２１００９３Ａ４；ＥＰ１４６１３６９Ａ２；ＷＯ０３０８９０１０Ａ１；ＷＯ０３０５９９７３Ａ２；およびＥＰ１２１００９３Ａ１；Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ、ＵＳ２００７００９２９４０Ａ１およびＥＰ１２４０３３７Ｂ１；ならびにＥＳＢＡ  Ｔｅｃｈ、Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．６０／８９９，９０７およびＷＯ０３０９７６９７Ａ２も参照されたい。
【００７１】
（ＥＳＢＡ１０５のペグ化）
メチル−ＰＥＯ１２−マレイミド（Ｍａｌｅｍｉｄｅ）（Ｐｉｅｒｃｅ）、すなわち、スルフヒドリル反応性ペグ化試薬を使用して、ＥＳＢＡ１０５（配列番号７）およびＥＳＢＡ１０５−ＳＳ−リンカー（配列番号８）中のスルフヒドリル基を改変した。ＥＳＢＡ１０５は、その側鎖の硫黄原子がジスルフィド結合として対をなして存在するシステイン残基を含有するので、メチル−ＰＥＯ１２−マレイミドを用いるペグ化のための標的として働く、これらのスルフヒドリル基を露出させるために、これらのジスルフィド結合を還元することが必要である。ＥＳＢＡ１０５およびＥＳＢＡ１０５−ＳＳ−リンカーのペグ化を、ＰＥＧの供給元（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ：Ｐｉｅｒｃｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）の推奨に従って実施した。手短に述べると、およそ２ｍｇのＥＳＢＡ１０５を、２０ｍＭ  ＤＴＴの存在下、４℃で３０分間インキュベーションすることによって、ジスルフィド結合を還元した。ＤＴＴを除去するために、還元したＥＳＢＡ１０５を、ＰＢＳ（ｐＨ６．５）に対して、Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ  Ｄｉａｌｙｓｉｓカセット（Ｐｉｅｒｃｅ；カットオフ：７０００Ｄａ）を使用して透析した。透析および濃縮した後、２ｍｇ／ｍｌのタンパク質を、２０倍モル過剰なメチル−ＰＥＯ１２−マレイミドと４℃で一晩インキュベーションすることによってペグ化した。標識化タンパク質を、反応していないメチル−ＰＥＯ１２−マレイミドから、Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ  Ｄｉａｌｙｓｉｓカセット（Ｐｉｅｒｃｅ；カットオフ：７０００Ｄａ）を使用する透析によって精製した。
【００７２】
（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
ＳＤＳ−ＰＡＧＥを、非還元条件下で、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから市販されているＢｉｓ−Ｔｒｉｓ電気泳動システムを使用して、供給元の推奨に従って実施した。５μｇのタンパク質試料を、プレキャスト１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル上に添加した。このゲルを、クマシー試薬（０．１％（ｗ／ｖ）クマシーＧ２５０、１０％氷酢酸、５０％エタノール）を使用して１５分間染色した。脱染は、１０％（ｖ／ｖ）酢酸を使用して行った。
【００７３】
（ペグ化を確認するためのウエスタンブロット分析）
１、１０および１００ｎｇのペグ化ＥＳＢＡ１０５−ＳＳ−リンカーを、プレキャスト１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル上に添加した。試料を、ニトロセルロース膜上にブロットし、ＰＥＧ部分を、ウサギモノクローナル抗ＰＥＧ抗体（Ｅｐｉｔｏｍｉｃｓ）を用いて検出した。一次抗体とのインキュベーション後、膜を、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合体化ヤギ抗ウサギポリクローナル抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）とインキュベートした。抗体の、膜への特異的結合を、化学発光検出システム（Ｐｉｅｒｃｅ）によって検出した。
【００７４】
（ペグ化ＥＳＢＡ１０５の、ヒトＴＮＦアルファに対する結合を確認するための直接ＥＬＩＳＡ）
ＥＳＢＡ１０５およびその誘導体の結合を、直接ＥＬＩＳＡによって評価した。ヒトＴＮＦアルファ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ  ＥＣ  Ｌｔｄ）を、９６ウエルのマイクロタイタープレート上にコートし、次いで、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を使用してブロックした。ＥＳＢＡ１０５およびＥＳＢＡ１０５誘導体を、５０ｎＭ、１２．５ｎＭ、３．１３ｎＭ、１．５６ｎＭ、０．７８ｎＭ、０．３９ｎＭ、０．２０ｎＭ、０．１０ｎＭおよび０．０５ｎＭの濃度で試験した。それに続いて、ビオチン化ウサギポリクローナル抗ＥＳＢＡ１０５抗体（ＡＫ３Ａ、ＥＳＢＡＴｅｃｈにおいて生成した）、ストレプトアビジンポリＨＲＰ、および発色基質（ＰＯＤ）を添加することによって、ＥＳＢＡ１０５およびその誘導体の、ヒトＴＮＦアルファに対する結合を可視化した。この反応の産物を、分光計を使用して４５０ｎＭにおける光学密度（ＯＤ）を測定することによって検出した。データを、４パラメータロジスティック曲線へのフィットを使用して分析し、ＥＣ５０値を、ｓｃＦｖの用量−応答曲線から計算した。
【００７５】
（ＥＳＢＡ９０３およびリンカー中にＰｅｐ１を有するＥＳＢＡ９０３の表面プラズモン共鳴分析）
結合親和性を測定するために、ＢＩＡｃｏｒｅＴＭ−Ｔ１００を用いる表面プラズモン共鳴の測定を利用した。これらの実験では、精製Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｉｌ発現組換えヒトＶＥＧＦ１６５（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ  ＥＣ  Ｌｔｄ）を使用した。カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ４、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩およびＮ−ヒドロキシスクシンイミドを用いて、供給元の指示に従って活性化した。ヒトＶＥＧＦ１６５を、ＣＭ４センサーチップ上の４つの異なるフローセルのうちの１つに、標準的なアミンカップリングの手順を使用してカップリングさせた。カップリングおよびブロッキングの後に固定化ｈＶＥＧＦ１６５分子を用いて得られた応答範囲は、およそ１２０〜１４０応答単位（ＲＵ）であった。各チップの第４のフローセルを、ブロッキング前にタンパク質を固定化しない以外は同様に処理し、このフローセルを、インラインの参照として使用した。ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（０．０１Ｍ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．００５％界面活性剤Ｐ２０）中の種々の濃度の抗ＶＥＧＦ  ｓｃＦｖ（２０ｎＭ、１０ｎＭ、５ｎＭ、２．５ｎＭ、１．２５ｎＭ、０．６３ｎＭ、０．３１ｎＭおよび０．１６ｎＭ）を、フローセル中に、３０μｌ／分の流速で５分間注入した。ＣＭ４チップ上のＶＥＧＦからの抗ＶＥＧＦ  ｓｃＦｖの解離を、２５℃で１０分間進行させた。インライン参照セルについて補正し、これに続いて、緩衝液試料を減じて、センサーグラムを、各抗ＶＥＧＦ  ｓｃＦｖ試料について得た。見かけの解離速度定数（ｋｄ）、見かけの結合速度定数（ｋａ）、および見かけの解離平衡定数（ＫＤ）を、ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｔ１００  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｖｅｒｓｉｏｎ  １．１を用いて、一対一ラングミュア結合モデル（ｏｎｅ−ｔｏ−ｏｎｅ  Ｌａｎｇｍｕｉｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｍｏｄｅｌ）を使用して計算した。
【００７６】
（ｓｃＦｖのクローニングおよび発現）
本明細書において記載し、特徴付けたｓｃＦｖは、以下に従って産生した。場合によっては、種々のｓｃＦｖをコードするＤＮＡ配列を、サービスの提供元Ｅｎｔｅｌｅｃｈｏｎ  ＧｍｂＨ（ｗｗｗ．ｅｎｔｅｌｅｃｈｏｎ．ｃｏｍ）において新規に合成した。得られたＤＮＡ挿入物を、細菌発現ベクターｐＧＭＰ００２中に、ｓｃＦｖ  ＤＮＡ配列の５’末端および３’末端においてそれぞれ導入したＮｃｏＩ制限酵素認識部位およびＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素認識部位を介してクローニングした。場合によっては、改変リンカーを、最先端の方法により、それぞれのアミノ酸分子をコードするアニールさせた相補性を示すオリゴとして、それらをＶＨドメインとＶＬドメインとの間の適切な制限酵素認識部位内にクローニングすることによって導入した。その他の場合には、点変異を、ＶＨドメインおよび／またはＶＬドメイン内に、最先端のアセンブリＰＣＲの方法を使用して導入した。ＧＭＰ００２のクローニングが、ＷＯ２００８００６２３５の実施例１に記載されている。ｓｃＦｖの産生は、参照により本明細書に援用されるＷＯ０８／００６２３５の実施例１のＥＳＢＡ１０５についての記載に従って実施した。
【００７７】
（実施例１）
（ＥＳＢＡ１０５およびＥＳＢＡ１０５−ＳＳ−リンカーのペグ化）
ＥＳＢＡ１０５（配列番号７）は、ヒトＴＮＦアルファに特異的に結合し、それを阻害する単鎖の抗体である（例えば、参照により本明細書に援用されるＷＯ０６／１３１０１３を参照されたい）。ＥＳＢＡ１０５−ＳＳ−リンカー（配列番号８）は、ＥＳＢＡ１０５の改変体であり、リンカーが、ＳＳ−リンカー（配列番号３）で置換されている。
【００７８】
ＥＳＢＡ１０５、ＤＴＴを用いて還元したＥＳＢＡ１０５、還元し、システインのペグ化に供したＥＳＢＡ１０５、および還元し、システインのペグ化に供し、それに続いて透析したＥＳＢＡ１０５を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。このタンパク質をペグ化すると、およそ４ｋＤａの分子量の増加が予想される。「還元したＥＳＢＡ１０５」および「還元し、システインのペグ化を行ったＥＳＢＡ１０５」は、ＥＳＢＡ１０５と比較して若干高い位置に移動する。ｃｙｓペグ化ＥＳＢＡ１０５を透析すると、このタンパク質は、ＥＳＢＡ１０５と同じ位置に移動し、このことから、このタンパク質のシフトは、ペグ化に起因するのではなく、むしろ、透析中にスルフヒドリル基の酸化によって再度形成されるジスルフィド結合の還元に起因することが示唆される。これらのデータから、ＥＳＢＡ１０５の還元された分子内システイン（ＳＨ）は、ＰＥＧ−ＮＨＳに対して、低い到達性を示すことが示されている。ＥＳＢＡ１０５中の分子内システインのスルフヒドリル基とは対照的に、図１のレーン６および７に示すように、一級アミン（Ｎ末端のリジン残基）はＰＥＧ−ＮＨＳにとって到達可能である。
【００７９】
上に記載したように異なって処理したＥＳＢＡ１０５調製物の活性を、ＥＬＩＳＡ実験において評価した。図２に示すＥＬＩＳＡ分析は、還元状態のＥＳＢＡ１０５は、酸化状態のＥＳＢＡ１０５と同程度に活性であることを示している。ｃｙｓペグ化ＥＳＢＡ１０５は、ＥＳＢＡ１０５と比較して、結合活性の若干の喪失を示すに過ぎない。しかし、図１に示すように、ＥＳＢＡ１０５中の鎖内ジスルフィドのペグ化の程度は低い。Ｌｙｓペグ化は良好であり、ヒトＴＮＦアルファに対する結合活性の軽微な喪失のみ有した。
【００８０】
本発明の目的の１つは、ｃｙｓペグ化に対して感受性であるｓｃＦｖ抗体を提供することであった。第１のステップでは、非ペグ化ＥＳＢＡ１０５−ＳＳ−リンカー分子が、ＥＳＢＡ１０５と比較して、依然として活性であるかどうかを調べた。このことが、図４Ａに示すように、ＥＬＩＳＡアッセイによって確認された時点で、ＥＳＢＡ１０５−ＳＳ−リンカーをｃｙｓペグ化に供した。良好なｃｙｓペグ化について試験するために、ＥＳＢＡ１０５−ＳＳ−リンカー、還元したＥＳＢＡ１０５−ＳＳ−リンカー、還元し、ｃｙｓペグ化したＥＳＢＡ１０５−ＳＳ−リンカー、およびｃｙｓペグ化し、透析に供したＥＳＢＡ１０５−ＳＳ−リンカーを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した（図４Ｂを参照されたい）。ペグ化ＥＳＢＡ１０５−ＳＳ−リンカーは、ＥＳＢＡ１０５−ＳＳ−リンカーと比較して、より高い位置に移動し、このことから、ＥＳＢＡ１０５−ＳＳ−リンカーの良好なペグ化が示されている。ＥＳＢＡ１０５−ＳＳ−リンカーのペグ化を、ウエスタンブロット分析により、ウサギ抗ＰＥＧモノクローナル抗体を使用して確認した（図４Ｃを参照されたい）。１００ｎｇ／ｍｌペグ化ＥＳＢＡ１０５−ＳＳ−リンカーを使用して、予想されたサイズにおけるシグナルを検出した。さらに、図６に示すように、ＥＬＩＳＡアッセイによって、ｃｙｓペグ化ＥＳＢＡ１０５−ＳＳ−リンカーは、裸のＥＳＢＡ１０５と比較して、ほとんど完全な活性を示すことも確認されている。
【００８１】
単一特異性の反応基を有するＰＥＧを使用する、ＥＳＢＡ１０５ＳＳ−リンカーの従来のｃｙｓペグ化を、図３（中央）に模式的に示す。また、ｃｙｓペグ化の代替の方法も、図３（右）に示す。この後者の方法は、二官能性反応基に結合させたＰＥＧを利用し（ＰＥＧ分子を左端に有する水平にした「Ｔ」として模式的に示す）、これによって、ＰＥＧ分子の、タンパク質中のジスルフィド結合の両方のシステイン残基への接続が可能になる。そのようなリンカーの技術が、Ｓｈａｕｎａｋら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２００６年、２巻、３１２頁；Ｂｒｏｃｃｈｉｎｉら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、２００６年：１巻（５号）、２４１頁、およびＷＯ０５／００７１９７によって記載されている。
【００８２】
（実施例２）
（ＳＳ−リンカー内への結合活性の導入）
本発明の第２の適用は、追加の結合特異性をポリペプチド（例えば、ｓｃＦｖ）内に導入することである。この実施例では、ファージディスプレイによる選択中に、ヒアルロン酸に結合することが同定されたＰｅｐ−１ペプチド（Ｍｕｍｍｅｒｔら、Ｊ．  Ｅｘｐ．
Ｍｅｄ．  ２０００年、１９２巻、７６９頁）を、ＳＳリンカーのループ領域内に導入して、ＳＳ  Ｐｅｐ１リンカー（配列番号４）を得た。このＳＳ  Ｐｅｐ１リンカーを、ｓｃＦｖ  ＥＳＢＡ９０３に導入して、ＥＳＢＡ９０３  ＳＳ  Ｐｅｐ１リンカーを産生した（時に、ＥＳＢＡ９０３−Ｐｅｐ１とも呼ばれる；配列番号６）。図７に示す表面プラズモン共鳴の結果が実証するように、そのループ中にＰｅｐ１の１２アミノ酸長のペプチドを提示するＥＳＢＡ９０３−Ｐｅｐ１は、その標的（ＶＥＧＦ）に対して、未改変のＥＳＢＡ９０３（配列番号５）と同じく良好に結合し、したがって、依然として十分な機能を示す（測定したＫｄ値はそれぞれ、４．４３６Ｅ−１１Ｍおよび５．６０８Ｅ−１１Ｍであった）。ＥＳＢＡ９０３−Ｐｅｐ１を、裸のＥＳＢＡ９０３と比較して、ヒアルロン酸が存在する部位、例えば、硝子体または関節等に適用した場合に、局所半減期が延長するように設計した。
【００８３】
（等価物）
当業者であれば、本明細書に記載する本発明の特定の実施形態に対する多くの等価物を認識するか、または日常的な実験のみを使用して、それらを究明することが可能である。そのような等価物は、以下の特許請求の範囲によって包含されることを意図する。
【化１】
2014111670.tif 000004
【化２】
2014111670.tif 000005
【化３】
2014111670.tif 000006
【化４】
2014111670.tif 000007
【化５】
2014111670.tif 000008
【化６】
2014111670.tif 000009
【図１】
2014111670.tif 000010
【図２】
2014111670.tif 000011
【図３】
2014111670.tif 000012
【図５】
2014111670.tif 000013
【図６】
2014111670.tif 000014
【図７】
2014111670.tif 000015
【図４】
2014111670.tif 000016
【配列表】
2014111670000001.app
【外国語明細書】
2014111670000001.pdf