(57)【要約】【課題】焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いた走査分子計数法により、目的の発光粒子を検出する際のノイズを低減する方法、及び当該方法を用いた標的粒子の検出方法の提供。【解決手段】共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いた走査分子計数法により検出する際のノイズを低減する方法であって、走査分子計数法の測定試料溶液に、検出対象である標的粒子と同じ極性の表面電荷を有し、かつ測定光に対して非発光性である、溶液中にて分散する非発光性粒子を含有させることを特徴とする、走査分子計数法におけるノイズ低減方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いた走査分子計数法により検出する際のノイズを低減する方法であって、
走査分子計数法の測定試料溶液に、検出対象である標的粒子と同じ極性の表面電荷を有し、かつ測定光に対して非発光性である、溶液中にて分散する非発光性粒子を含有させることを特徴とする、走査分子計数法におけるノイズ低減方法。
【請求項２】
溶液中にて分散しランダムに運動する標的粒子を検出する方法であって、
（ａ）発光プローブと結合した標的粒子と、前記標的粒子と同じ極性の表面電荷を有し、かつ測定光に対して非発光性である、溶液中にて分散する非発光性粒子とを含む測定試料溶液を調製する工程と、
（ｂ）前記工程（ａ）において調製された測定試料溶液中に存在する前記標的粒子の数を、
共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて、前記測定試料溶液内において前記光学系の光検出領域の位置を移動させながら、当該光検出領域からの光を検出し、
前記検出された光から、前記発光プローブと結合した標的粒子からの光信号を個別に検出して、前記標的粒子を個別に検出し、
前記個別に検出された標的粒子の数を計数して、前記光検出領域の位置の移動中に検出された前記標的粒子の数を計数することにより算出する工程と、
を有することを特徴とする標的粒子の検出方法。
【請求項３】
前記標的粒子の表面電荷が負である、請求項２に記載の標的粒子の検出方法。
【請求項４】
前記標的粒子が核酸である、請求項２又は３に記載の標的粒子の検出方法。
【請求項５】
前記非発光性粒子がポリスチレン粒子である、請求項２〜４のいずれか一項に記載の標的粒子の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、共焦点顕微鏡や多光子顕微鏡の光学系などの溶液中の微小領域からの光が検出可能な光学系を用いて、走査分子計数法により標的粒子を検出する際のノイズを低減する方法、及び当該方法を用いた標的粒子の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
最近、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系等の溶液中の微小領域からの光が検出可能な光学系を用いて、測定試料溶液内に於いて光の検出領域である微小領域の位置を移動させながら、当該微小領域内を横切る発光粒子（光を発する粒子）を個別に検出する新規な方式の光分析技術（走査分子計数法）が提案されている（例えば、特許文献１〜３参照。）。走査分子計数法は、具体的には、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて、測定試料溶液内において前記光学系の光検出領域の位置を移動させながら、当該光検出領域中の発光粒子から発せられる光を検出し、これにより、測定試料溶液中の発光粒子の一つ一つを個別に検出して、発光粒子のカウンティングや測定試料溶液中の発光粒子の濃度又は数密度に関する情報の取得を可能にする技術である。
【０００３】
走査分子計数法は、その光検出機構自体については、蛍光相関分光分析（Fluorescence Correlation Spectroscopy：ＦＣＳ）や蛍光強度分布分析(Fluorescence-Intensity Distribution Analysis：ＦＩＤＡ）等の光分析技術の場合と同様に、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光検出領域からの光を検出するよう構成されているため、ＦＩＤＡ等と同様に測定試料溶液の量は微量（例えば、数十μＬ程度）であってよく、また測定時間が短い。一方で、走査分子計数法においては、蛍光強度のゆらぎを算出するといった統計的処理を要するＦＩＤＡ等と異なり、このような統計的処理が実行されない。このため、走査分子計数法の光分析技術は、粒子の数密度又は濃度がＦＩＤＡ等の光分析技術に必要であったレベルよりも大幅に低い測定試料溶液に適用可能である。つまり、発光プローブによって標識された測定試料溶液中の標的粒子（観測対象粒子）を、走査分子計数法を利用して検出することにより、測定試料溶液中の標的粒子の濃度又は数密度が非常に低い場合であっても、標的粒子の状態又は特性を検出し解析することができる（例えば、特許文献４参照。）。
【０００４】
一方で、標的粒子を発光プローブで標識して検出する方法においては、測定試料溶液中に当該発光プローブ以外の発光粒子が含まれている場合には、当該発光粒子に由来するシグナルがノイズとなり、標的粒子を充分な精度で検出できないという問題がある。特に、生体試料には自家蛍光物質が含まれているものが多い。生体試料等の解析対象の試料を希釈して測定に用いることによって、当該試料から持ち込まれる発光性の夾雑物の量を低減させ、ノイズを抑えることができるが、標的粒子も希釈されてしまうため、検出感度が悪化してしまう。そこで、自家蛍光物質等の発光性の夾雑物によるノイズを低減して測定の信頼性を高めるために、予め生体試料を精製することが行われてきた。核酸を標的粒子とした場合には、例えば、特許文献５には、磁性粒子を用いた核酸回収方法により生体試料から核酸を抽出し、次いで抽出された核酸から、核酸増幅法といった一般的な分子生物学的手法を用いて、目的の核酸を検出する方法が開示されている。また、特許文献６には、血液を凝固させた後、得られた血清に対して核酸増幅処理を行うことにより、血液中に含まれていた核酸増幅反応に対する阻害物質を除去し、目的の核酸を増幅し、検出する方法が開示されている。その他、特許文献７には、血液を希釈後、加熱した後の試料に対して核酸増幅処理を行い、目的の核酸を検出する方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２０１１／１０８３６９号
【特許文献２】国際公開第２０１１／１０８３７０号
【特許文献３】国際公開第２０１１／１０８３７１号
【特許文献４】国際公開第２０１２／０１４７７８号
【特許文献５】特許第２９６５１３１号公報
【特許文献６】特許第３５７５６３３号公報
【特許文献７】特開２００６−１８７２２１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
発光性夾雑物を分離除去する方法は、極めて複雑な作業工程が必要になる。また、フェムトモルレベルやアトモルレベルの測定においては、測定試料を調製する際に用いたカラム、フィルター、容器、分注用のチップ等の器具から新たな自家蛍光物質が混入する結果、夾雑物の分離除去操作を行うことによりかえってノイズが増大し、バックグラウンドレベルが上昇することがある。このように、走査分子計数法のように極めて高感度な測定方法においては、希釈や夾雑物の分離除去操作を行うことなく、ノイズを低減する方法が必要である。
【０００７】
本発明は、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いた走査分子計数法により、目的の発光粒子を検出する際のノイズを低減する方法、及び当該方法を用いた標的粒子の検出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、走査分子計数法の測定試料中に、検出対象分子以外の発光粒子（目的外発光粒子）を選択的に吸着する非発光性の粒子を含ませることにより、目的外発光粒子に由来するシグナルの検出が抑えられ、ノイズを低減させられることを見出し、本発明を完成させた。
【０００９】
（１）  本発明の第一の態様は、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いた走査分子計数法により検出する際のノイズを低減する方法であって、
走査分子計数法の測定試料溶液に、検出対象である標的粒子と同じ極性の表面電荷を有し、かつ測定光に対して非発光性である、溶液中にて分散する非発光性粒子を含有させることを特徴とする、走査分子計数法におけるノイズ低減方法である。
（２）  本発明の第二の態様は、溶液中にて分散しランダムに運動する標的粒子を検出する方法であって、
（ａ）発光プローブと結合した標的粒子と、前記標的粒子と同じ極性の表面電荷を有し、かつ測定光に対して非発光性である、溶液中にて分散する非発光性粒子とを含む測定試料溶液を調製する工程と、
（ｂ）前記工程（ａ）において調製された測定試料溶液中に存在する前記標的粒子の数を、
共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて、前記測定試料溶液内において前記光学系の光検出領域の位置を移動させながら、当該光検出領域からの光を検出し、
前記検出された光から、前記発光プローブと結合した標的粒子からの光信号を個別に検出して、前記標的粒子を個別に検出し、
前記個別に検出された標的粒子の数を計数して、前記光検出領域の位置の移動中に検出された前記標的粒子の数を計数することにより算出する工程と、
を有することを特徴とする標的粒子の検出方法である。
（３）  前記（２）の標的粒子の検出方法においては、前記標的粒子の表面電荷は負であることが好ましい。
（４）  前記（２）又は（３）の標的粒子の検出方法においては、前記標的粒子は核酸であることが好ましい。
（５）  前記（２）〜（４）のいずれかの標的粒子の検出方法においては、前記非発光性粒子はポリスチレン粒子であることが好ましい。
【発明の効果】
【００１０】
本発明に係る走査分子計数法におけるノイズ低減方法、及び当該ノイズ低減方法を利用した本発明に係る標的粒子の検出方法は、走査分子計数法における測定試料溶液中に、表面に、検出対象分子（標的粒子）よりも目的外発光粒子を選択的に吸着する非発光性粒子を含ませることにより、当該測定試料溶液中の目的外発光粒子が非発光性粒子表面に吸着する結果、目的外発光粒子に由来するシグナルの検出が抑えられ、ノイズを低減させることができる。当該ノイズ低減方法は、目的外発光粒子の分離除去操作をせず、測定試料溶液を測定容器から移すことなく、前記非発光性粒子を加えるだけでノイズを低減させることができるため、作業工程が少なく簡便であり、かつ器具等から新たな自家蛍光物質が混入するおそれもないという優れた方法である。また、標的粒子濃度を低下させてしまう希釈操作をせずにノイズ低減が可能であるため、当該ノイズ低減方法及び標的粒子の検出方法は、標的粒子が測定試料溶液中に極微量しか含まれていない場合に特に有効である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明に係る走査分子計数法におけるノイズ低減方法の概念図である。
【図２】実施例１において、各測定試料溶液の走査分子計数法による測定結果を示した図である。
【図３】実施例１において、各測定試料溶液のＦＩＤＡによる蛍光強度の測定結果を示した図である。
【図４】実施例２において、各測定試料溶液の走査分子計数法による測定結果を示した図である。
【図５】実施例３において、平均粒子径が０．４１μｍのポリスチレンビーズを５０ｆＭとなるように添加した測定試料溶液の、走査分子計数法により計数したピーク数のＣＶ値を示した図である。
【図６】実施例３において、平均粒子径が２．０μｍのポリスチレンビーズを５０ｆＭとなるように添加した測定試料溶液の、走査分子計数法により計数したピーク数のＣＶ値を示した図である。
【図７】実施例３において、平均粒子径が２．０μｍのポリスチレンビーズを５０ｆＭとなるように添加した測定試料溶液の、走査分子計数法により計数したピーク数のＣＶ値を示した図である。
【図８】実施例４において、各測定試料溶液の、走査分子計数法により計数したピーク数のＣＶ値を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
［走査分子計数法におけるノイズ低減方法］
本発明に係る走査分子計数法におけるノイズ低減方法（以下、「本発明に係るノイズ低減方法」）は、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いた走査分子計数法により検出する際のノイズを低減する方法であって、走査分子計数法の測定試料溶液（測定に供される試料溶液）に、検出対象である標的粒子と同じ極性の表面電荷を有し、かつ測定光に対して非発光性である、溶液中にて分散する非発光性粒子を含有させることを特徴とする。なお、以下、「検出対象である標的粒子と同じ極性の表面電荷を有し、かつ測定光に対して非発光性である、溶液中にて分散する非発光性粒子」を「吸着用粒子」ということがある。
【００１３】
本発明及び本願明細書において、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系の「光検出領域」とは、それらの顕微鏡において光が検出される微小領域であり、対物レンズから照明光が与えられる場合には、その照明光が集光された領域に相当する。なお、かかる領域は、共焦点顕微鏡においては、特に対物レンズとピンホールとの位置関係により確定される。
【００１４】
本発明及び本願明細書において、発光粒子は、蛍光、りん光、化学発光、生物発光、光散乱等により光を発する粒子を意味する。また、非発光性とは、蛍光、りん光、化学発光、生物発光、光散乱等による光を発しない性質を意味する。
【００１５】
本発明に係るノイズ低減方法は、検出対象の発光粒子を、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いた走査分子計数法により検出する際のノイズを低減する方法である。
走査分子計数法では、溶液中に分散又は溶解した粒子の各々を個別に検出する。得られた情報を用いて、定量的に、粒子のカウンティングや測定試料溶液中の粒子の濃度又は数密度の算定又は濃度又は数密度に関する情報の取得が可能となる（特許文献１〜４参照。）。すなわち、走査分子計数法によれば、光検出領域を通過する粒子と検出された光信号とを１対１に対応させて粒子を一つずつ検出するので、溶液中に分散してランダムに運動する粒子のカウンティングが可能となり、従前に比して、精度よく測定試料溶液中の粒子の濃度又は数密度を決定することが可能となる。例えば、溶液中にて分散しランダムに運動する検出対象の分子（標的粒子）を発光プローブで標識し、標的粒子と結合した発光プローブの検出を走査分子計数法により行い、発光プローブが発する光によって測定試料溶液中の標的粒子を個別に検出しその数を計数して標的粒子濃度を決定する場合には、測定試料溶液の標的粒子の濃度が、蛍光分光光度計やプレートリーダーにより計測された蛍光強度に基づいて決定可能な濃度よりも更に低い濃度であっても、標的粒子を検出可能である。
【００１６】
走査分子計数法の特徴は、分子を１つ１つ検出して数える点にある。そのため、溶液中で複数の発光分子が会合している場合、この会合体は１つの粒子として検出される。この特徴を利用し、検出対象分子との親和性が低く、ノイズ源となる目的外発光粒子との親和性が高い吸着用粒子を添加し、当該吸着用粒子の表面に複数の目的外発光粒子を吸着させて１の粒子にまとめることにより、目的外発光粒子を溶液中から除去することなく、走査分子計数法により検出される目的外発光粒子に由来するシグナル数を低減させることができる。
【００１７】
図１に、本発明に係るノイズ低減方法の概念図を示す。図中、左図は、吸着用粒子４が含まれていない測定試料溶液中を表し、右図は、左図の測定試料溶液に吸着用粒子４を含ませたものを表す。例えば、発光プローブ２と結合した標的粒子１が１分子と、目的外発光粒子３が３分子存在している溶液中（左図）に、１分子の吸着用粒子４を添加すると、吸着用粒子４の表面に３分子の目的外発光粒子３が吸着する（右図）。この結果、走査分子計数法では、吸着用粒子４添加前（右図）は、３分子の目的外発光粒子３はそれぞれ独立に検出されるが、吸着用粒子４添加後（左図）では、３分子の目的外発光粒子３と１分子の吸着用粒子４がまとめて１分子として検出される。この場合、吸着用粒子４添加により、理論上はノイズが１／３となる。
【００１８】
本発明において用いられる吸着用粒子は、測定光（走査分子計数法による測定の際に、発光粒子を検出するために測定試料溶液に照射される光）に対して非発光性である。すなわち、測定光を照射した場合に発光しない粒子であればよく、測定光以外の波長の光を照射した場合に蛍光等を発する粒子であってもよい。ノイズをより低減可能であることから、本発明において用いられる吸着用粒子は、４００〜７００ｎｍの範囲内において発光しない粒子であることが好ましい。
【００１９】
本発明において用いられる吸着用粒子は、検出対象である標的粒子と同じ極性の表面電荷を有する。標的粒子の表面電荷が負である場合には、表面電荷が負である吸着用粒子を用いる。また、標的粒子の表面電荷が正である場合には、表面電荷が正である吸着用粒子を用いる。吸着用粒子は、標的粒子と同じ極性の表面電荷を有しているため、標的粒子は吸着せず、標的粒子と異なる極性の表面電荷を有する目的外発光粒子を選択的に吸着する。
【００２０】
多くの場合、測定試料溶液中に含まれている目的外発光粒子は、具体的に特定されておらず、様々な種類のものが含まれている。そこで、標的粒子は、様々な分子を吸着可能なものであることが好ましい。例えば、蛍光団は疎水性のものが多いため、多くの自家蛍光物質は、疎水性部位を有していると考えられる。そこで、標的粒子が親水性である場合には、吸着用粒子は、粒子表面が疎水性であるものが好ましい。粒子表面が疎水性であることにより、親水性の標的粒子は吸着せず、様々な目的外発光粒子を効率よく吸着できる。
【００２１】
本発明において用いられる吸着用粒子は、表面電荷が検出対象である標的粒子と同じ極性となればよく、当該技術分野で用いられている粒子の中から、所望の極性の表面電荷を有するものを適宜選択して用いることができる。当該粒子としては、具体的には、金コロイド粒子等の金属微粒子、シリカ粒子等の無機粒子；ポリスチレン粒子(ラテックスビーズ)、ポリメチルメタクリエート粒子、ポリエチレン粒子、ポリ塩化ビニル粒子、ポリアミド粒子、ポリアクリレート粒子、ポリウレタン粒子等の樹脂粒子が挙げられる。これらの粒子の表面電位は、溶液の液温、ｐＨ、界面活性剤等の添加剤により変化する。そこで、測定試料溶液の温度やｐＨ、添加剤の種類等を適宜調整することによって、これらの粒子の表面電位が標的粒子と同じ極性をもつように調整し得る。表面電荷は、個々の粒子の特性に依存する。例えば、シリカ粒子はｐＨ４．０以上、アルミナ粒子はｐＨ９．０以上、ポリスチレン粒子はｐＨ３．０以上で負に帯電している。これに対して、金コロイド粒子は常に負に帯電している。また、吸着用粒子の表面電荷が負になる条件は、吸着用粒子のゼータ電位を測定することにより実験的に決定することができる。吸着用粒子表面に解離基が存在する場合には、当該解離基が塩基性であれば、溶液のｐＨを等電点より下げれば正に帯電し、当該解離基が酸性であればｐＨを等電点より上げれば負に帯電する。
【００２２】
本発明において用いられる吸着用粒子としては、ポリスチレン粒子が特に好ましい。ポリスチレン粒子は、非特異的に様々な分子が表面に吸着する。従来は、ポリスチレン粒子は特定の分子を吸着するために用いられていたため、界面活性剤を添加したり、表面を樹脂でコーティングすることによって非特異吸着を抑制することが行われていた。これに対して本願発明では、このポリスチレン粒子の非特異的吸着を、走査分子計数法により検出する際のノイズを低減するための好ましい性質として積極的に利用している。
【００２３】
例えば、ｐＨ３．０以上の溶液中では、ポリスチレン粒子表面の電位は負になる。そこで、標的粒子が核酸等の表面電荷が負である粒子の場合には、測定試料溶液をｐＨ３．０以上に調整することにより、ポリスチレン粒子を、表面電荷が負である吸着用粒子として用いることができる。
【００２４】
本発明において用いられる吸着用粒子は、溶液中にて分散する粒子である。測定時に溶液中に分散可能であればよく、自然沈降する粒子であってもよい。溶液中にて分散する粒子であれば、目的外発光粒子と遭遇する確率が高く、より多くの目的外発光粒子を表面に吸着し得るため、ノイズ低減効果が高い。さらに、走査分子計数法による測定への影響も小さい。吸着用粒子の大きさは、その材質にもよるが、例えば、平均粒子径が２．５μｍ以下であることが好ましく、１μｍ以下であることがより好ましく、１００ｎｍ以下であることがさらに好ましく、５０ｎｍ以下であることがよりさらに好ましい。
【００２５】
本発明に係るノイズ低減方法は、具体的には、検出対象の発光粒子と前記吸着用粒子を含む測定試料溶液を調製し、これを走査分子計数法により測定する。このように、測定試料溶液を測定容器から移すことなく、吸着用粒子を加えるだけで、目的外発光粒子によるシグナルを低減させることができる。
【００２６】
測定試料溶液を調製する際の溶媒としては、後記の標的粒子の検出方法で挙げたものと同様のものを用いることができる。当該測定試料溶液を調製する方法としては、溶媒に、検出対象の発光粒子と前記吸着用粒子をそれぞれ添加してもよく、溶媒に吸着用粒子を分散させたスラリーを、走査分子計数法による測定の前に検出対象の発光粒子を含む溶液に添加してもよく、予め乾燥した状態の吸着用粒子を入れておいた測定容器に、検出対象の発光粒子を含む溶液を添加して吸着用粒子を分散させてもよい。
【００２７】
また、検出対象の発光粒子と前記吸着用粒子を含む測定試料溶液は、走査分子計数法による測定の前に、インキュベートしてもよい。これにより、測定試料溶液中の目的外発光粒子を効率よく吸着用粒子に吸着させることができる。インキュベート時間は、測定試料溶液の容量、添加した吸着用粒子の量等を考慮して適宜調整され、例えば、５〜６０分間インキュベートしてもよい。インキュベート中には、吸着用粒子が測定試料溶液中に均一に分散するよう、適宜振とう処理をすることも好ましい。
【００２８】
測定試料溶液に添加する前記吸着用粒子の量は、検出対象の発光粒子の量と同程度か、もしくはやや少ないほうが好ましい。吸着用粒子１分子当たりに、多数の目的外発光粒子を吸着させやすく、ノイズ低減効果がより高められるためである。前記吸着用粒子の量が多すぎる場合には、吸着用粒子１分子当たりに吸着する目的外発光粒子の数が少なくなり、ノイズ低減効果が弱くなるおそれがある。
【００２９】
［標的粒子の検出方法］
本発明に係る標的粒子の検出方法は、前記の本発明に係るノイズ低減方法を利用して、走査分子計数法により非発光性の標的粒子を検出する方法である。これにより、標的粒子と共に持ち込まれた、又は測定試料溶液の調製の過程で混入した目的外発光粒子が存在している場合であっても、希釈処理や標的粒子の精製処理等を行わずとも、目的外発光粒子由来のノイズを低減させ、標的粒子の検出精度を高めることができる。
【００３０】
具体的には、本発明に係る標的粒子の検出方法は、溶液中にて分散しランダムに運動する標的粒子を検出する方法であって、下記工程（ａ）及び（ｂ）を有することを特徴とする。
（ａ）発光プローブと結合した標的粒子と、前記標的粒子と同じ極性の表面電荷を有し、かつ測定光に対して非発光性である、溶液中にて分散する非発光性粒子（吸着用粒子）とを含む測定試料溶液を調製する工程と、
（ｂ）前記工程（ａ）において調製された測定試料溶液中に存在する前記標的粒子の数を、
共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて、前記測定試料溶液内において前記光学系の光検出領域の位置を移動させながら、当該光検出領域からの光を検出し、
前記検出された光から、前記発光プローブと結合した標的粒子からの光信号を個別に検出して、前記標的粒子を個別に検出し、
前記個別に検出された標的粒子の数を計数して、前記光検出領域の位置の移動中に検出された前記標的粒子の数を計数することにより算出する工程。
【００３１】
なお、本発明及び本願明細書において、「溶液中に分散しランダムに運動する粒子」とは、溶液中に分散又は溶解した原子、分子又はそれらの凝集体などの粒子（発光するもの又は発光しないもののいずれであってもよい。）であって、基板などに固定されず、溶液中を自由にブラウン運動している粒子を意味する。
【００３２】
本発明の検出方法の検出の対象である標的粒子は、溶液中に分散しランダムに運動する粒子であれば、任意のものであってよく、特に限定されるものではない。例えば、タンパク質、ペプチド、核酸、核酸類似物質、脂質、糖鎖、アミノ酸若しくはこれらの凝集体などの生体分子、ウイルス、細胞などの粒子状の生物学的な対象物、又は非生物学的な粒子（例えば、原子、分子、ミセル、金属コロイド等など）等が挙げられる。核酸は、ＤＮＡであってもよく、ＲＮＡであってもよく、ｃＤＮＡのように人工的に増幅させたものであってもよい。核酸類似物質としては、ＤＮＡやＲＮＡのような天然型ヌクレオチド（天然に存在するヌクレオチド）の側鎖等がアミノ基等の官能基により修飾されたものや、タンパク質や低分子化合物等で標識されたもの等が挙げられる。より具体的には、例えば、Ｂｒｉｄｇｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ（ＢＮＡ）や、天然型ヌクレオチドの４’位酸素原子が硫黄原子に置換されているヌクレオチド、天然型リボヌクレオチドの２’位水酸基がメトキシ基に置換されているヌクレオチドやＨｅｘｉｔｏｌ  Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ（ＨＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）等が挙げられる。
【００３３】
本発明の検出方法における標的粒子としては、核酸分子又は核酸類似物質であることが好ましい。核酸分子又は核酸類似物質としては、２本鎖核酸分子であってもよく、１本鎖核酸分子であってもよい。具体的には、例えば、動物や植物の染色体や、細菌やウイルスの遺伝子に存在する塩基配列を有する核酸分子、人工的に設計された塩基配列を有する核酸分子が挙げられる。中でも、標的粒子として、例えば、マイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ＰＣＲ増幅等による合成ＤＮＡ、ＲＮＡから逆転写酵素を用いて合成されたｃＤＮＡ等が好ましく、マイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ等の生体試料から抽出され、必要に応じて精製された核酸分子がより好ましい。生体試料中には多種多様な自家蛍光物質が含まれており、生体試料から抽出された核酸分子には、生体試料由来の自家蛍光物質が混入しているが、本発明に係る標的粒子の検出方法では、これらの自家蛍光物質に由来するノイズを簡便に低減させることができるためである。
【００３４】
また、本発明において用いられる発光プローブは、標的粒子と、特異的又は非特異的に結合又は吸着する物質であって、共焦点顕微鏡や多光子顕微鏡の光学系を用いた場合に検出可能な光を発するものであれば、特に限定されるものではない。例えば、標的粒子と特異的又は非特異的に結合又は吸着する物質に、発光物質を結合させたものであってもよい。発光物質としては、典型的には蛍光物質であるが、りん光、化学発光、生物発光、光散乱等により光を発する物質であってもよい。蛍光物質としては、特定の波長の光を放射することにより蛍光を放出する物質であれば特に限定されるものではなく、ＦＣＳやＦＩＤＡ、走査分子計数法による測定等で使用されている蛍光色素の中から適宜選択して用いることができる。
【００３５】
また、本発明において用いられる発光プローブは、標的粒子と直接結合するものであってもよく、他の物質を用いて間接的に結合するものであってもよい。例えば、標的粒子が核酸分子又は核酸類似物質である場合には、標的粒子と直接結合する発光プローブとしては、標的粒子とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドに蛍光物質等の発光物質を結合させたもの、蛍光物質等の発光物質を結合させた核酸結合性タンパク質、核酸に結合する色素分子等が挙げられる。当該オリゴヌクレオチドとしては、ＤＮＡであってもよく、ＲＮＡであってもよく、ｃＤＮＡのように、人工的に増幅させたものであってもよく、天然の核酸塩基と同様にヌクレオチド鎖や塩基対を形成することが可能な核酸類似物質を一部又は全部に含むものであってもよい。また、標的粒子がタンパク質である場合には、標的粒子と直接結合する発光プローブとしては、標的粒子に対する抗原若しくは抗体、標的粒子に対するリガンド若しくはレセプターを、蛍光物質等の発光物質で標識したものを用いることができる。なお、核酸やタンパク質等の標的粒子と特異的又は非特異的に結合又は吸着する物質への発光物質の結合は、常法により行うことができる。
【００３６】
本発明において用いられる発光プローブは、標的粒子と非特異的に結合等するものであってもよいが、標的粒子の検出・定量の精度の点からは、特異的に結合等するものであることが好ましい。なお、標的粒子と特異的に結合する発光プローブとしては、物理的又は化学的性質が標的粒子と類似した他の物質に対する結合よりも、標的粒子と優先的に結合するものであればよく、標的粒子以外の物質と全く結合しないものである必要はない。例えば、標的粒子が核酸分子である場合には、発光プローブとして用いる発光物質で標識したオリゴヌクレオチドは、当該標的粒子の部分塩基配列と完全に相補的な塩基配列を有していてもよく、当該標的粒子の部分塩基配列と１〜数塩基のミスマッチを有する塩基配列を有していてもよい。
【００３７】
具体的には、工程（ａ）は、発光プローブと結合した標的粒子と、前記吸着用粒子とを、適当な溶媒に添加して、両者を含む測定試料溶液を調製する。該溶媒は、標的粒子及び発光プローブを損なわず、かつ前記吸着用粒子の表面電荷を、標的粒子の表面電荷と同じ極性に調整し得る溶媒であれば、特に限定されるものではない。典型的には水溶液であるが、ホルムアミド等の有機溶媒その他の任意の液体であってもよい。具体的には、該溶媒は、当該技術分野において一般的に用いられているバッファーの中から、適宜選択して用いることができる。該バッファーとして、例えば、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４）等のリン酸バッファーやトリスバッファー等がある。標的粒子の表面電荷が負であり、前記吸着用粒子がポリスチレン粒子の場合には、当該溶媒は、ｐＨ３．０以上のリン酸バッファーやトリスバッファーが好ましく、中性付近のリン酸バッファーやトリスバッファーがより好ましい。
【００３８】
工程（ａ）においては、溶媒に、発光プローブと、標的粒子と、前記吸着用粒子とをそれぞれ添加した後、当該溶液中で発光プローブと標的粒子とを結合させてもよい。また、溶媒に、発光プローブと標的粒子とを添加し、当該溶液中で発光プローブと標的粒子とを結合させた後に、当該溶液に前記吸着用粒子を添加してもよい。
【００３９】
標的粒子と発光プローブを同じ溶液中に共存させるだけで、両者を結合させることができる場合には、両者を含む溶液を調製した後、必要に応じて所定時間当該溶液をインキュベートするだけで、当該溶液中で、標的粒子と発光プローブとを結合させることができる。
【００４０】
一方で、標的粒子や発光プローブが２本鎖構造の核酸分子又は核酸類似物質である場合には、溶液中の核酸分子等を変性させた後、両者を会合させることが好ましい。なお、「核酸分子又は核酸類似物質を変性させる」とは、塩基対を解離させることを意味する。例えば、２本鎖核酸分子を１本鎖核酸分子とすることを意味する。なお、発光プローブがＰＮＡ等の核酸類似物質を含むオリゴヌクレオチドである場合、標的粒子が２本鎖核酸分子であったとしても、特段の変性処理を行わずとも、当該発光プローブと標的粒子とを結合させることができる場合がある。
【００４１】
変性処理としては、高温処理による変性（熱変性）又は低塩濃度処理による変性等が挙げられる。中でも、蛍光物質等の発光物質への影響が比較的小さく、操作が簡便であるため、熱変性を行うことが好ましい。具体的には、熱変性は、当該溶液を高温処理をすることにより、当該溶液中の核酸分子等を変性することができる。一般的には、ＤＮＡで９０℃、ＲＮＡでは７０℃で数秒間から２分間程度、保温することによって変性させることができるが、標的粒子の塩基の長さ等により変性する温度は千差万別であり、変性することが可能であれば、この温度に限定するものではない。一方、低塩濃度処理による変性は、例えば、精製水等により希釈することによって、当該溶液の塩濃度が十分に低くなるように調整することによって行うことができる。
【００４２】
必要に応じて変性させた後、前記溶液中の標的粒子と発光プローブを会合させて、発光プローブと結合した標的粒子を形成する。熱変性を行った場合には、高温処理後、当該溶液の温度を、標的粒子と発光プローブとが特異的にハイブリダイズできる温度（特異的会合条件）にまで低下させることにより、当該溶液中の両者を適宜会合させることができる。好ましくは、両者を含む溶液の温度を、発光プローブ中の標的粒子と相補的な塩基配列を有する領域のＴｍ値±３℃の温度程度まで低下させる。また、低塩濃度処理による変性を行った場合には、塩溶液を添加する等により、当該溶液の塩濃度を、標的粒子と発光プローブとが特異的にハイブリダイズできる濃度にまで上昇させることによって、当該溶液中の両者を適宜会合させることができる。
【００４３】
なお、２本の１本鎖核酸分子が特異的にハイブリダイズできる温度は、両者からなる会合体の融解曲線から求めることができる。融解曲線は、例えば、両者のみを含有する溶液の温度を、高温から低温へと変化させ、当該溶液の吸光度や蛍光強度を測定することにより求めることができる。得られた融解曲線から、変性した２本の１本鎖核酸分子が会合体を形成し始めた温度から、ほぼ全てが会合体となった温度までの範囲の温度を、両者が特異的にハイブリダイズできる温度とすることができる。温度に代えて、溶液中の塩濃度を低濃度から高濃度への変化させることによっても、同様にして融解曲線を決定し、２本の１本鎖核酸分子が特異的にハイブリダイズできる濃度を求めることができる。
【００４４】
このように、特異的会合条件は、標的粒子や発光プローブの種類ごとに異なり、実験的に決定されるものであるが、一般にはＴｍ値（融解温度）で代用することができる。例えば、汎用されているプライマー／プローブ設計ソフトウェア等を用いることにより、発光プローブの塩基配列情報から、標的粒子とハイブリダイズする領域のＴｍ値（２本鎖ＤＮＡの５０％が１本鎖ＤＮＡに解離する温度）を算出することができる。温度がＴｍ値近傍の値である条件、例えばＴｍ値±３℃程度である条件を、特異的会合条件とすることができる。算出されたＴｍ値近傍において実験的に融解曲線を求めることにより、より詳細に特異的会合条件を決定することもできる。
【００４５】
また、非特異的なハイブリダイゼーションを抑制するために、発光プローブと結合した標的粒子を形成させる際に、前記溶液の温度を比較的ゆっくりと低下させることが好ましい。例えば、前記溶液の温度を７０℃以上にして核酸分子を変性させた後、当該溶液の液温を、０．０５℃／秒以上の降温速度で低下させることができる。
【００４６】
また、非特異的なハイブリダイゼーションを抑制するために、予め前記溶液中に、界面活性剤、ホルムアミド、ジメチルスルホキシド、又は尿素等を添加しておくことも好ましい。これらの化合物は、１種のみを添加してもよく、２種類以上を組み合わせて添加してもよい。これらの化合物を添加しておくことにより、比較的低い温度環境下において、非特異的なハイブリダイゼーションを起こりにくくすることができる。
【００４７】
次いで、工程（ｂ）として、工程（ａ）において調製された測定試料溶液中に存在する前記標的粒子の数を、走査分子計数法により算出する。具体的には、まず、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて、前記測定試料溶液内において前記光学系の光検出領域の位置を移動させながら、当該光検出領域からの光を検出し、前記検出された光から、前記発光プローブと結合した標的粒子からの光信号を個別に検出して、前記標的粒子を個別に検出する。次いで、前記個別に検出された標的粒子の数を計数して、前記光検出領域の位置の移動中に検出された前記標的粒子の数を計数することにより算出する。つまり、本発明の検出方法においては、標的粒子に結合した発光プローブが検出されることによって、標的粒子が間接的に検出される。
【００４８】
測定試料溶液中の発光プローブは、その分光特性に最適な波長の光を照射し、当該発光プローブから発される光の光学的特性を検出することにより検出できる。なお、「発光プローブの光学的特性を検出する」とは、当該発光プローブから発される特定の波長の光シグナルを検出することを意味する。当該光シグナルとしては、蛍光強度や蛍光偏光等がある。
【００４９】
発光プローブと吸着用粒子とを予めキット化することにより、本発明に係る標的粒子の検出方法をより簡便に実施することができる。当該キットには、測定試料溶液の調製に用いる溶媒や、操作手順が記載された使用説明書等を含めることもできる。
【００５０】
例えば、標的粒子が核酸分子又は核酸類似物質であり、標的粒子とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドに蛍光物質を結合させた蛍光プローブを発光プローブとする場合、当該蛍光プローブと、ポリスチレン粒子等の表面電荷が負であり、溶液中にて分散する非発光性粒子とを一のキットにすることができる。このような核酸検出用キットにおいては、ｐＨ３．０以上のバッファーをさらに含むことが好ましい。
【実施例】
【００５１】
次に実施例等を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例等に限定されるものではない。
【００５２】
［実施例１］
ポリスチレン粒子を吸着用粒子として用い、ポリスチレン粒子の存在下で走査分子計数法とＦＩＤＡによって、発光プローブと結合した標的粒子を検出し、各測定法における、ノイズに対するポリスチレン粒子の影響を観察した。
発光プローブで標識された標的粒子としては、配列番号１で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの５’末端にＡＴＴＯ（登録商標）６３３が付加された蛍光標識核酸Ａ（シグマジェノシス社に合成を依頼。）を用い、目的外発光粒子としては、ＡＴＴＯ（登録商標）６３３（製品番号：０４５０７、シグマアルドリッチ社製）（以下、蛍光色素Ａ）を用いた。ポリスチレン粒子としては、平均粒子径が０．４１μｍの市販のポリスチレンビーズ（製品名：ＰＰ−０５−１０、ｓｐｈｅｒｏｔｅｃｈ社製）を用いた。
【００５３】
【表１】
2014048098.tif 000003
【００５４】
＜測定試料溶液の調製＞
トリスバッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．０５容量％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）を用いて、５００ｆＭの蛍光色素Ａのみを含む溶液と、５００ｆＭの蛍光標識核酸Ａのみを含む溶液と、５００ｆＭの蛍光標識核酸Ａ及び５００ｆＭの蛍光色素Ａを含む溶液とを、それぞれ２本ずつ用意した。２本のうち１本は、そのまま測定試料溶液とした。残る各１本には、それぞれに、２００ｆＭのポリスチレンビーズを添加し、測定試料溶液とした。ポリスチレンビーズを添加した３本の測定試料溶液については、ポリスチレンビーズ添加後に、当該測定試料溶液を、室温で１０００ｒｐｍ、１５分間振とうし、蛍光色素Ａをポリスチレンビーズに吸着させた。また、ネガティブコントロールとして、トリスバッファーのみ溶液（測定試料溶液ＮＣ）も調製した。各測定試料溶液に含まれているものを表２に示す。
【００５５】
【表２】
2014048098.tif 000004
【００５６】
＜走査分子計数法による測定＞
計測においては、光分析装置として、共焦点蛍光顕微鏡の光学系とフォトンカウンティングシステムを備えた１分子蛍光測定装置ＭＦ２０（オリンパス株式会社）を用い、上記の各測定試料溶液について、時系列のフォトンカウントデータを取得した。具体的には、６３３ｎｍのレーザ光（レーザパワー：３００μＷ）で励起を行い、回転速度６，０００ｒｐｍ（走査速度：５ｍｍ／秒）で光学系を走査し、光子検出部の出力を取り出し、ＢＩＮ ＴＩＭＥを１０μ秒とし、測定時間は２０秒間として、得られた光子の時系列データを解析した。検出側のフィルターには、６６０ｎｍから７００ｎｍを透過するバンドパスフィルターを用いた。
【００５７】
＜光子の時系列データの解析＞
測定によって得られた光子の時系列データを、スムージング（Ｓａｖｉｎｚｋｙ−Ｇｏｌａｙ法で、１３点で５回繰り返し）を行い、スムージングデータを微分してピーク部分を切り出した。切り出されたピーク部分をガウス関数でフィッティングし、フィッティングされたピーク強度が、１光子／１０μ秒以上、ピーク幅が２０〜２００μ秒の範囲で、相関係数が０．９５以上である領域を、分子の信号としてカウントした。
【００５８】
＜ＦＩＤＡの測定＞
走査分子計数法による測定で用いた測定試料溶液１〜６及びＮＣについて、ＦＩＤＡにより蛍光強度を測定した。蛍光強度の測定は、１分子蛍光測定装置ＭＦ２０（オリンパス株式会社）を用いて行った。具体的には、６３３ｎｍのレーザ光（レーザパワー：３００μＷ）で励起を行い、回転速度６，０００ｒｐｍで測定時間は２０秒間として、蛍光輝度を計測した。検出側のフィルターには、６６０ｎｍから７００ｎｍを透過するバンドパスフィルターを用いた。
【００５９】
＜結果＞
走査分子計数法による測定結果を図２に示す。等モル量の蛍光色素が含まれている測定試料溶液１と２からは、ほぼ同数のピークが得られ、蛍光色素Ａと蛍光標識核酸Ａの両方を含む測定試料溶液３からは、測定試料溶液１及び２のほぼ倍のピークが検出された。これに対して、蛍光色素Ａにポリスチレンビーズを入れた測定試料溶液４では、蛍光色素Ａは等量であるにもかかわらず、測定試料溶液１の約６６％のピークしか検出されなかった。一方で、蛍光標識核酸Ａにポリスチレンビーズを入れた測定試料溶液５では、ポリスチレンビーズを添加していない測定試料溶液２とほぼ同数のピークが得られた。蛍光色素Ａと蛍光標識核酸Ａの両方にポリスチレンビーズを入れた測定試料溶液６では、ポリスチレンビーズを添加していない測定試料溶液３よりもピーク数が減少しており、これは、測定試料溶液４と５の結果から、蛍光色素Ａに由来するピーク数が減少したためと推察された。これらの結果から、標的粒子が核酸である場合に、ｐＨが中性付近の溶液中でポリスチレンビーズを共存させることにより、自家蛍光物質に由来するピークを低減させられることが明らかである。
【００６０】
蛍光強度の測定結果を図３に示す。各測定試料溶液の蛍光輝度値から、測定試料ＮＣの蛍光輝度値をバックグラウンドとして差し引いたものが、蛍光色素Ａ又は蛍光標識核酸Ａに由来する蛍光強度といえる。この結果、等モル量の蛍光色素が含まれている測定試料溶液１と２の蛍光強度はほぼ同等であり、蛍光色素Ａと蛍光標識核酸Ａの両方を含む測定試料溶液３の蛍光強度は、測定試料溶液１及び２よりも大きかった。また、ポリスチレンビーズを入れた測定試料溶液４〜６の蛍光強度は、それぞれ、ポリスチレンビーズを入れなかった測定試料溶液１〜３とほぼ同等であった。これらの結果から、ポリスチレンビーズの添加によっては、測定試料溶液の蛍光強度は影響を受けないことが確認された。
【００６１】
［実施例２］
標的粒子検出に対する、測定試料溶液中の目的外発光物質の濃度の影響を調べた。
発光プローブで標識された標的粒子としては、実施例１で用いた蛍光標識核酸Ａを用い、ポリスチレン粒子は、実施例１同様に平均粒子径が０．４１μｍの市販のポリスチレンビーズ（製品名：ＰＰ−０５−１０、ｓｐｈｅｒｏｔｅｃｈ社製）を用いた。目的外発光粒子としては、ＡＴＴＯ（登録商標）６４７Ｎ（シグマアルドリッチ社製）（以下、蛍光色素Ｂ）を用いた。
トリスバッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．０５容量％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）を用いて、５００ｆＭの蛍光標識核酸Ａと、０、１０、５０、１００、１５０、又は２００ｆＭの蛍光色素Ｂとを含む溶液を、それぞれ２本ずつ用意した。２本のうち１本は、そのまま測定試料溶液とした。残る各１本には、それぞれに、５０ｆＭのポリスチレンビーズを添加し、測定試料溶液とした。ポリスチレンビーズを添加した測定試料溶液については、ポリスチレンビーズ添加後に、当該測定試料溶液を、室温で１０００ｒｐｍ、１５分間振とうし、蛍光色素Ｂをポリスチレンビーズに吸着させた。
【００６２】
各測定試料溶液について、実施例１と同様にして、走査分子計数法により光子の時系列データを取得し、これを解析することによって、ピーク数を計数した。測定結果を図４に示す。この結果、ポリスチレンビーズを添加した測定試料溶液（図４中、「ビーズ（＋）」）では、蛍光色素Ｂの濃度が０〜１５０ｆＭの範囲内では検出されたピーク数に変動は見られなかった。これに対して、ポリスチレンビーズを添加しなかった測定試料溶液（図４中、「ビーズ（−）」）では、蛍光色素Ｂの濃度が１０〜２００ｆＭの範囲内で、蛍光色素Ｂの濃度依存的に検出されるピーク数が上昇した。これらの結果から、ポリスチレンビーズ等の吸着用粒子を含ませることにより、測定試料溶液中の目的外発光物質によるノイズを顕著に低減させられることが明らかである。特に、生体試料では、自家蛍光物質は個々のサンプルごとに濃度が異なるため、検出対象分子（標的粒子）の測定精度を悪化させてしまうが、本発明に係るノイズ低減方法や標的粒子の検出方法のように、吸着用粒子に自家蛍光物質を吸着させて１つの粒子として計測することにより、自家蛍光物質に由来するピーク数の変動を抑制することが可能である。
【００６３】
［実施例３］
目的外発光物質として、実施例２で用いた蛍光色素Ｂ又はＢＳＡ（製品番号：Ａ７９０６）、を含む測定試料溶液中で、実施例１で用いた蛍光標識核酸Ａを走査分子計数法により検出した。
トリスバッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．０５容量％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）を用いて、５００ｆＭの蛍光標識核酸Ａと、５０、１００、１５０、若しくは２００ｆＭの蛍光色素Ｂ、又は０．０１、０．０５、０．１５、若しくは０．２質量％のＢＳＡを含む溶液を、それぞれ４本ずつ用意した。また、前記トリスバッファーを用いて、５００ｆＭの蛍光標識核酸Ａのみを含む溶液も４本用意した。各溶液の４本のうち１本は、そのまま測定試料溶液とした。残る各３本には、それぞれに、５０ｆＭのポリスチレンビーズ（平均粒子径：０．４１μｍ、製品名：ＰＰ−０５−１０、ｓｐｈｅｒｏｔｅｃｈ社製）、２００ｆＭのポリスチレンビーズ（平均粒子径：０．４１μｍ、製品名：ＰＰ−０５−１０、ｓｐｈｅｒｏｔｅｃｈ社製）、又は５０ｆＭのポリスチレンビーズ（平均粒子径：２．０μｍ、製品名：ＰＰ−２０−１０、ｓｐｈｅｒｏｔｅｃｈ社製）を添加し、測定試料溶液とした。ポリスチレンビーズを添加した測定試料溶液については、ポリスチレンビーズ添加後に、当該測定試料溶液を、室温で１０００ｒｐｍ、１５分間振とうさせた。
【００６４】
各測定試料溶液について、実施例１と同様にして、走査分子計数法により光子の時系列データを取得し、これを解析することによって、ピーク数を計数し、変動係数ＣＶ値（標準偏差／平均値×１００）を算出した。平均粒子径が０．４１μｍのポリスチレンビーズを５０ｆＭとなるように添加した測定試料溶液のＣＶ値（％）を図５に、平均粒子径が０．４１μｍのポリスチレンビーズを２００ｆＭとなるように添加した測定試料溶液のＣＶ値を図６に、平均粒子径が２．０μｍのポリスチレンビーズを５０ｆＭとなるように添加した測定試料溶液のＣＶ値を図７に、それぞれ示す。この結果、図５に示すように、添加したポリスチレンビーズの平均粒子径や添加量にかかわらず、蛍光色素ＢとＢＳＡのいずれにおいても、ポリスチレンビーズ無添加の場合よりもポリスチレンビーズを添加した場合のほうがＣＶ値は低下しており、ノイズが低減され、測定精度が高められたことが確認された。つまり、吸着用粒子を添加することによるノイズを低減して測定精度が高める効果が幅広く確認された。また、ＢＳＡにおいて、ポリスチレンビーズの平均粒子径が２．０μｍよりも０．４１μｍのほうがＣＶ値はより低下していたことから、吸着用粒子は比較的小さいほうが、より高いノイズ低減効果が得られると考えられた。これは、粒子が小さければ、おそらくは溶液での分散性が高く、より多くの目的外発光粒子と遭遇し得るためと推察される。同じくＢＳＡにおいて、ポリスチレンビーズの濃度が２００ｆＭよりも５０ｆＭのほうがＣＶ値はより低下していたことから、吸着用粒子の濃度が比較的低いほうが、より高いノイズ低減効果が得られると考えられた。これは、吸着用粒子の濃度が低いほうが、吸着用粒子１分子当たりが吸着する目的外発光物質の量が多くなるためと推察される。つまり、本発明に係るノイズ低減方法及び標的粒子の検出方法において、より充分なノイズ低減効果を得るためには、吸着用粒子の平均粒子径をより小さくしたり、吸着用粒子の濃度をより低くすればよいことがわかった。
【００６５】
［実施例４］
ラット血清を含む測定試料溶液中で、実施例１で用いた蛍光標識核酸Ａを走査分子計数法により検出した。
トリスバッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．０５容量％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）を用いて、５００ｆＭの蛍光標識核酸Ａと、最終希釈倍率が１／２０００、１／１０００、１／５００、１／２５０、若しくは１／１００倍となるラット血清とを含む溶液を、それぞれ２本ずつ用意した。また、前記トリスバッファーを用いて、５００ｆＭの蛍光標識核酸Ａのみを含む溶液も２本用意した。各溶液の２本のうち１本は、そのまま測定試料溶液とした。残る各１本には、それぞれに、５０ｆＭのポリスチレンビーズ（平均粒子径：０．４１μｍ、製品名：ＰＰ−０５−１０、ｓｐｈｅｒｏｔｅｃｈ社製）を添加し、測定試料溶液とした。ポリスチレンビーズを添加した測定試料溶液については、ポリスチレンビーズ添加後に、当該測定試料溶液を、室温で１０００ｒｐｍ、１５分間振とうさせた。
【００６６】
各測定試料溶液について、実施例１と同様にして、走査分子計数法により光子の時系列データを取得し、これを解析することによって、ピーク数を計数し、変動係数ＣＶ値を算出した。各測定試料溶液のＣＶ値を図８に示す。この結果、ポリスチレンビーズ無添加の場合よりもポリスチレンビーズを添加した場合のほうがＣＶ値は低下しており、ラット血清を含む測定試料溶液においても、吸着用粒子を添加することによる、ノイズを低減して測定精度が高める効果が確認された。ラット血清中には多種多様な自家蛍光物質が含まれていると考えられるにもかかわらず、ノイズ低減効果が得られたことから、本発明に係るノイズ低減方法及び標的粒子の検出方法において、吸着用粒子の種類や大きさ、濃度を適切に調製することにより、生体試料中に含まれる多種多様な自家蛍光物質によるノイズも低減させられることが明らかである。
【産業上の利用可能性】
【００６７】
本発明に係るノイズ低減方法、及びこれを用いた標的粒子の検出方法により、自家蛍光物質等の目的外発光粒子を含む溶液中においても、溶液中にて分散しランダムに運動する粒子を走査分子計数法により、高感度かつ簡便に検出することができるため、これらの方法は、試料中の粒子、特に極微量にしか含まれていない粒子を検出又は定量解析するような生化学、分子生物学、臨床検査等の分野で利用が可能である。
【符号の説明】
【００６８】
１…標的粒子、２…発光プローブ、３…目的外発光粒子、４…吸着用粒子。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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