(57)【要約】【課題】脂肪酸類の製造方法を提供する。【解決手段】藻類を培地で培養して得た培養物にアルコール又はアルコール以外の有機溶剤を添加し、得られた混合物を攪拌することにより、脂質をエステル交換又は加水分解する反応を行い、得られる反応物から脂肪酸エステル又は脂肪酸を採取することを特徴とする脂肪酸類の製造法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a)藻類を培地で培養して得た培養物に有機溶剤を添加して、得られた混合物を攪拌す
ることにより、脂質をエステル交換又は加水分解する反応を行い、
(b)上記反応物から、脂肪酸エステル又は脂肪酸を採取する
ことを特徴とする脂肪酸類の製造方法。
【請求項２】
前記有機溶剤がエタノールであり、脂肪酸エステルを採取することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記有機溶剤が、アセトン、クロロホルム、酢酸エチル、酢酸メチル、ヘキサン、ベンゼン、トルエン、ジクロロメタン、アセトニトリル、ジメチルエーテル、ジエチルエーテルであり、脂肪酸を採取することを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記混合物における有機溶剤の濃度が５％以上である、請求項１〜３のいずれか1項に
記載の方法。
【請求項５】
前記混合物における有機溶剤の濃度が６５％以下である、請求項１〜４のいずれか項に記載の方法。
【請求項６】
前記有機溶剤が、炭素数５以下の低級アルコールである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記有機溶剤が、炭素数６以上の高級アルコールである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記反応の温度が１０℃以上である、請求項１〜７のいずれか1項に記載の方法。
【請求項９】
前記反応の温度が６０℃以下である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記反応のpHが弱酸性から弱アルカリである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
脂肪酸エステル又は脂肪酸の採取が、前記反応物を有機溶剤処理することを含む請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記藻類が微細藻類である請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記藻類が緑色植物門に属する微細藻類である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記微細藻類が緑藻綱、トレボキシア藻綱、又はプラシノ藻綱に属する藻類である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記微細藻類が緑藻綱（Chlorophyceae）に属する藻類である、請求項１４に記載の方
法。
【請求項１６】
前記藻類が淡水性の緑藻鋼に属する微細藻類である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記藻類が海洋性の緑藻鋼に属する微細藻類であって、油脂を貯蔵物質として蓄積する微細藻類である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
Ｌ−アミノ酸の製造法であって、
a)請求項１及び３〜１７のいずれか１項に記載の方法により脂肪酸を調製し、
b)Ｌ−アミノ酸生産能を有する細菌を、a)の脂肪酸を含む培地に培養し、培養物中にＬ−アミノ酸を生成蓄積させ、
c)該培養物からＬ−アミノ酸を採取することを特徴とするＬ−アミノ酸の製造法
【請求項１９】
前記細菌が、腸内細菌科に属する細菌またはコリネ型細菌である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記腸内細菌科に属する細菌が、エシェリヒア・コリである、請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、藻類を用いた脂肪酸類の製造法に関する。脂肪酸類は、食品添加物、化学製品、化粧品、医薬品などの様々な分野に利用される。
【背景技術】
【０００２】
脂肪酸類には、動物、植物、魚類及び廃液油由来の油脂にアルコールと触媒を添加しエステル交換反応によって得られる脂肪酸エステルと油脂を加水分解して得られる脂肪酸などがある。これらのエステル交換反応としては、酸、アルカリ、金属類又はリパーゼ等の触媒を利用する方法が知られている。例えば、非特許文献１〜４に記載された方法を挙げることができる。一方、触媒を利用する方法以外には、超臨界法が用いられている。例えば、非特許文献５〜７に記載された方法を挙げることができる。上記のエステル交換反応の場合と同様に、脂肪酸の加水分解でも酸、アルカリ又はリパーゼなどの触媒を利用する場合と高温高圧処理による方法などが知られている。例えば、特許文献１−２に記載された方法を挙げることができる。
【０００３】
エステル交換反応や加水分解による脂肪酸類の工業生産においては、油脂として魚油、動物油、植物油、廃液油等が使用されている。脂肪酸エステルのエステル交換反応による製造法に用いる油脂源として、よく用いられるのは大豆やパームヤシ等の高等植物に由来する油脂である。これらは種子から圧搾又は溶剤抽出によって工業的に得ることが容易な油脂である。これに対して、微細藻類に含まれる油脂は、乾燥重量当たりでは、大豆やパーム油種子に匹敵する含量となるが、藻類の培養液当たりの乾燥藻体重量は、1%に満たない。藻体を分離し、脱水をして、細胞を破砕して油脂を取り出し、さらに精製する工程は煩雑かつ困難である。藻類から精製された油脂から、酸、アルカリ又はリパーゼを用いて脂肪酸エステル又は脂肪酸を生産すること(特許文献３〜４、非特許文献８〜９)は可能である。また、特許文献５〜７には、微細藻類にアルコールを添加し、油脂を細胞内で直接エステル交換するが、いずれの方法もエステル交換反応に酸やアルカリ触媒を必要とする。
【０００４】
代表的な組換え可能な藻類であるシネコシスティスは、アセチルCoAカルボキシラーゼ
、チオエステラーゼの発現によって大量に脂肪酸を生産することが可能であること（非特許文献１０）、及び、ジアシルグリセロールアセチルトランスフェラーゼの発現によってトリグリセリドを生産すること（特許文献８）が知られている。従って、シネコシスティスの油脂から、酸、アルカリ又はリパーゼなどの触媒を用いて脂肪酸エステルを生産することは容易である。また、外部から酸、アルカリ、リパーゼなどの触媒を添加せずに、触媒となる酵素を組換え技術によって発現し、脂肪酸エステルや脂肪酸を生成することが知られている。例えば、微細藻類に、ピルビン酸デカルボキシラーゼとアルコールデヒドロゲナーゼを発現し、エタノールを生産させ、エタノールアセチルトランスフェラーゼ又はエステル化する酵素を発現させ、細胞内で脂肪酸エステルを生産されている (特許文献９〜１０)。さらに、ロドコッカスにリパーゼを発現させ、細胞内の脂質から脂肪酸を生成
させることも行われている(特許文献１１)。これらの脂肪酸エステルや脂肪酸を調製する方法は、エステル化又は加水分解反応を触媒する遺伝子を発現させた遺伝子組み換えによるものであり、遺伝子組み換え技術を利用せずに、藻類細胞内で油脂から脂肪酸エステル又は脂肪酸を製造する方法は知られていない。
【０００５】
一般的に、藻類は、細胞膜の脂質や油脂の分解にリパーゼを利用している (非特許文献１１)。緑藻では、中温度と弱酸性の処理によって、細胞内の油脂が脂肪酸に分解される
ことが確認されている(特許文献１２)。また、珪藻においても、シリカ飢餓によるリパー
ゼ活性の増加と油脂から脂肪酸への分解が確認されている (非特許文献１２)。しかしな
がら、それらの細胞にアルコール類又はアルコール以外の有機溶剤を添加して藻類細胞中の油脂から脂肪酸エステル又は脂肪酸を生産することはこれまで報告はない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】日本特許出願公開２０１０１０６１０７号
【特許文献２】日本特許出願公開２００３１１３３９５号
【特許文献３】国際公開２０１０／０００４１６号
【特許文献４】国際公開２００９／ ０９３７０３号
【特許文献５】米国特許出願公開第２００８０２４１９０２号
【特許文献６】中国特許出願公開第１０１５８０８５７号
【特許文献７】米国特許出願公開第２００９０１５８６３８号
【特許文献８】米国特許出願公開第２０１０００８１１７８号
【特許文献９】国際公開２０１０／０１１７５４号
【特許文献１０】中国特許出願公開２０１１１０１８９２０９２号
【特許文献１１】国際公開２０１１/ ００８０５８号
【特許文献１２】国際公開２０１１/ ０１３７０７号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】U. Schuchardt. et al. 1998. J. Brazilian Chemical Society, 9(3), 199-210
【非特許文献２】H. Fukuda, A. kondo, H. Noda. 2001. J. Bioeng, 92, 405-416
【非特許文献３】T. Samukawa et al. 2000. J. Biosci and Bioeng, 90, 180-183
【非特許文献４】L.A. Nelson et al. 1996. J. Am. Oil Soc. Chem, 73, 1191-1195
【非特許文献５】S. Saka, D. Kusdiana. 2001. Fuel, 80, 225-231
【非特許文献６】D. Kusdiana, S. Saka. 2001. J. Chem. Eng. Japan, 34, 383-387
【非特許文献７】D. Kusdiana, S. Saka. 2001. Fuel, 80, 693-698
【非特許文献８】N. Nagle, P. Lemke. 1990. Applied Biochem and Biotech, 24, 355-361
【非特許文献９】A. Robles Medina et al. 1999. J. Biotech, 70, 379-391
【非特許文献１０】X. Liu et al. 2009. PNAS, 24, 1-6
【非特許文献１１】K. Hoehne-reitan et al. 2007. Aqua. Nutri, 13, 45-49
【非特許文献１２】N. Nagle et al. 1989. Energy from Biomass and wastes, 12,   1107-1115
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、より効率のよい脂肪酸類の製造法を提供するものであり、特には、従来、主として動物、植物、魚類及び廃液由来の油脂を基質として行われてきた酸又はアルカリ触媒を用いた脂肪酸類の製造法に対し、触媒の添加を必要としない、より安価な脂肪酸類の製造法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、藻類培養物にアルコール又はアルコール以外の有機溶剤を添加するだけで、酸又はアルカリを添加することなく、藻類細胞内で効率よく脂肪酸エステル又は脂肪酸を生産できることを見出した。この知見に基づき本発明は完成された。
【００１０】
本発明は以下のもの関する。
（１） （a）藻類を培地で培養して得た培養物に有機溶剤を添加して、得られた混合物を攪拌することにより、脂質をエステル交換又は加水分解する反応を行い、
（b）得られる反応物から脂肪酸エステル又は脂肪酸を採取する
ことを特徴とする脂肪酸類の製造法。
（２）前記有機溶剤がエタノールであり、脂肪酸エステルを採取することを特徴とする、上記に記載の方法。
（３）前記有機溶剤が、アセトン、クロロホルム、酢酸エチル、酢酸メチル、ヘキサン、ベンゼン、トルエン、ジクロロメタン、アセトニトリル、ジメチルエーテル、ジエチルエーテルであり、脂肪酸を採取することを特徴とする、上記に記載の方法。
（４）前記混合物における有機溶剤の濃度が5％以上である、上記に記載の方法。
（５）前記混合物における有機溶剤の濃度が60％以下である、上記に記載の方法。
（６）前記有機溶媒が、炭素数６以上の高級アルコールであることを特徴とする、上記に記載の方法。
（７）前記有機溶媒が、炭素数６以上の高級アルコールであることを特徴とする、上記に記載の方法。
（８）前記反応の温度が10℃以上である、上記に記載の方法。
（９）前記反応の温度が60℃以下である、上記に記載の方法。
（１０）前記反応のpHが弱酸性から弱アルカリである、上記に記載の方法。
（１１）脂肪酸エステル又は脂肪酸の採取が、上記反応物を有機溶剤処理することを含む、上記に記載の方法。
(１２) 前記藻類が微細藻類である、上記に記載の方法。
（１３）前記藻類が緑色植物門に属する微細藻類である、上記に記載の方法。
（１４） 前記藻類が緑藻綱、トレボキシア藻綱、又はプラシノ藻鋼に属する微細藻類で
ある、上記に記載の方法。
（１５）前記藻類が緑藻綱に属する微細藻類である、上記に記載の方法。
（１６）前記藻類が淡水性の緑藻鋼に属する微細藻類である、上記に記載の方法。
（１７）前記藻類が海洋性の緑藻鋼に属する微細藻類であって、油脂を貯蔵物質として蓄積する微細藻類である、上記に記載の方法。
（１８）Ｌ−アミノ酸の製造法であって、
a)上記に記載の方法により脂肪酸を調製し、
b)Ｌ−アミノ酸生産能を有する細菌を、a)の脂肪酸を含む培地に培養し、培養物中にＬ−アミノ酸を生成蓄積させ、
c)該培養物からＬ−アミノ酸を採取することを特徴とするＬ−アミノ酸の製造法。
（１９）前記細菌が、腸内細菌科に属する細菌またはコリネ型細菌である、上記に記載のアミノ酸製造方法。
（２０）前記腸内細菌科に属する細菌がエシェリヒア・コリである、上記に記載のアミノ酸製造方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、効率よく脂肪酸エステル又は脂肪酸が生産できる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】藻類のアルコール添加反応における温度条件の検討
【図２】藻類のアルコール添加反応におけるメタノール濃度の検討
【図３】藻類のアルコール添加反応におけるpH条件の検討
【図４】藻類のアルコール添加反応における反応時間の検討
【図５】藻類のアルコール添加反応の添加アルコールの検討（写真）
【図６】藻類のアルコール添加反応によって生成した脂肪酸メチルエステルの定性
【図７】緑藻類でのアルコール添加反応の実施
【図８】藻類のアルコール以外の有機溶剤添加反応による脂肪酸生成の確認
【図９】藻類の有機溶剤添加反応による脂肪酸生成の添加有機溶剤の検討（写真）
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１４】
＜１＞本発明で使用する藻類とその培養法
本発明における藻類（algae）は、どのようなものでも用いることが出来るが、油脂を
藻体内に蓄積する微細藻類であることが好ましい。
【００１５】
藻類（algae）とは、酸素発生型光合成を行う生物のうち、主に地上に生息するコケ植
物、シダ植物、種子植物を除いたものを全て指す。藻類には、原核生物であるシアノバクテリア（藍藻）（cyanobacteria）から、真核生物である灰色植物門 （Glaucophyta）、
紅色植物門（紅藻）（Rhodophyta）、緑色植物門 （Chlorophyta）、クリプト植物門（クリプト藻）（Cryptophyta）、ハプト植物門（ハプト藻）（Haptophyta）、不等毛植物門
（Heterokontophyta）、渦鞭毛植物門（渦鞭毛藻）（Dinophyta）、ユーグレナ植物門（Euglenophyta）、 クロララクニオン植物門（Chlorarachniophyta）に分類される様々な単細胞生物及び多細胞生物が含まれる。微細藻類は、これら藻類から多細胞生物である海藻類を除いた微視的な構造を持つ藻類を指す（バイオディバーシティ・シリーズ（3）藻類
の多様性と系統：千原光雄 編 裳華房（1999））。
【００１６】
藻類をはじめとする植物は、油脂を貯蔵物質として蓄積するものがあることが知られている（Chisti, Y. 2007. Biotechnol Adv. 25: 294-306）。このような藻類としては、緑色植物門や不等毛植物門に属するものが、よく知られている。緑色植物門の中では、緑藻綱（Chlorophyceae）に属する藻類が挙げられ、緑藻綱に属する藻類としては、クロレラ
・ミヌティッシマ(Chlorella minutissima)(Bhatnagar A, 2010 Appl Biochem Biotechnol. 161:523-36)、セネデスムス・オブリカス(Scenedesmus obliquus) (Shovon, M. et al. 2009. Appl Microbiol Biotechnol. 84:281-91)、ネオクロリス・オレオアバンダンス
（Neochloris oleoabundans）（Tornabene, T.G. et al. 1983. Enzyme and Microb. Technol. 5: 435-440）、ナノクロリス・エスピー（Nannochloris sp.）（Takagi, M. et al. 2000. Appl. Microbiol. Biotechnol. 54: 112-117）等を挙げることが出来る。不等毛植物門には黄金色藻綱（Chrysophyceae）、ディクチオカ藻綱（Dictyochophyceae）、ペ
ラゴ藻綱（Pelagophyceae）、ラフィド藻綱（Rhaphidophyceae）、珪藻綱（Bacillariophyceae）、褐藻綱（Phaeophyceae）、黄緑藻綱（Xanthophyceae）、真正眼点藻綱（Eustigmatophyceae）が分類されるが、よく用いられる珪藻綱に属する藻類としては、タラシオ
シラ・スードナナ（Thalassiosira pseudonana）（Tonon, T et al. 2002. Phytochemistry 61: 15-24）を挙げることが出来る。具体的にはクロレラ・ミヌティッシマとして、Chlorella minutissima UTEX 2314株、セネデスムス・オブリカスとして、具体的には、Scenedesmus obliquus UTEX393株、ネオクロリス・オレオアバンダンスとして、具体的には
、Neochloris oleoabundans UTEX 1185株、ナノクロリス・エスピーとしては、Nannochloris sp. UTEX LB 1999株、タラシオシラ・スードナナとしては、Thalassiosira pseudonana UTEX LB FD2株が挙げられる。これらの菌株は、テキサス大学藻類カルチャーコレクション（The University of Texas at Austin, The Culture Collection of Algae (UTEX),
University Station A6700, Austin, TX 78712-0183, USA）より入手することができる
。また、高機能性の脂肪酸であるEPA・DHA生産藻類として緑色植物門、不等毛植物門、紅色植物門、又はハプト植物門に属するものが、よく知られている。緑色植物門の中では、緑藻綱、プラシノ藻綱、トレボウクシア藻綱に属する藻類が挙げられ、よく知られる緑藻綱に属する藻類としてはクロレラ・ミヌティッシマ(Chlorella  minutissima)(Rema, V etal. 1998. JAOCS. 75: 393-397) 不等毛植物門には珪藻綱（Bacillariophyceae）、真正眼点藻綱（Eustigmatophyceae）に属する藻類が挙げられ、よく用いられる珪藻綱に属す
る藻類としてはタラシオシラ・スードナナ（Thalassiosira pseudonana）（Tonon, T et 
al. 2002. Phytochemistry 61: 15-24）、真正眼点藻綱（Eustigmatophyceae）にはナノ
クロロプシス・オクラータNannochloropsis oculataが挙げられる。特に本発明において
は、クロレラ属、セネデスムス属等の淡水性の緑藻が望ましい。
【００１７】
微細藻類の培養については多くの知見があり、Chlorella属、Arthrospira属（Spirulina）、あるいは、Dunaliella salinaなどは、食用として大規模な工業的な培養が行われている（Spolaore, P. et al. 2006. J. Biosci. Bioeng. 101: 87-96）。クラミドモナス
・レインハルディには、例えば、0.3×HSM培地（Oyama, Y. et al. 2006. Planta 224: 646-654）を用いることが出来るし、クロレラ・ケッサレリには、0.2×ガンボーグ培地（Izumo, A. et al. 2007. Plant Science 172: 1138-1147）などを用いることが出来る。クロレラ・ブルガリスには、BG-1１培地又はM8培地（Ramkumar、K.M et al. 1998. Biotech. Bioeng. 59: 605-611）などを用いることができる。ネオクロリス・オレオアバンダン
スやナノクロリス・エスピーは、modified NORO培地（Yamaberi, K. et al. 1998. J. Mar. Biotechnol. 6: 44-48; Takagi, M. et al. 2000. Appl. Microbiol. Biotechnol. 54: 112-117）やBold's Basal Medium（Tornabene, T. G. et al. 1983. Enzyme and Microb. Technol. 5: 435-440; Archibald, P. A. and Bold, H. C. 1970. Phytomorphology 20: 383-389）、ダイゴIMK培地(Ota, M. et al. 2009. Bioresource Technology. 100: 5237-5242)を用いて培養することが出来る。珪藻綱に属する藻類としては、タラシオシラ・スードナナには、F/2培地（Lie, C.-P. and Lin, L.-P. 2001. Bot. Bull. Acad. Sin. 42: 207-214）などを好適に用いることが出来る。また微細藻類の培養には、フォトバイオリアクターを用いることも出来（WO2003/094598号パンフレット）。
【００１８】
培養は、本培養の体積に対し、1-50%の前培養液を添加して行うことが通常である。初
発のpHは6-9の中性付近が好ましく、培養中はpH調整を行わないことが通常であるが、必
要に応じて調整してもよい。培養温度は、20-35℃が好ましく、特に28℃付近が一般的に
よく用いられる温度であるが、培養温度は、用いる藻類に適した温度であれば制限されない。培養液には、空気を吹き込むことが通常であり、通気量としては、1分間の培養液体
積当たりの通気量0.1-2vvm（volume per volume per minute）が通常には用いられる。さらにCO2を吹き込むことも、生育を早めるために行うことができ、通気量に対して、0.5-5%程度吹き込むのが好ましい。光の照射強度も微細藻類の種類によって、至適が異なるが
、1,000-30,000 lux程度が通常には用いられる。光源は、屋内では白色の蛍光灯を用いることが一般的であるが、これに制限されない。屋外にて太陽光で培養することも可能である。必要に応じて、培養液を適切な強度で撹拌、あるいは循環してもよい。また、藻類は、窒素源が枯渇すると油脂を藻体内に蓄積することが知られており（Thompson GA Jr. 1996. Biochim. Biophys. Acta 1302: 17-45）、窒素源の濃度をより制限した培地を本培養に用いることもできる。
【００１９】
本発明において藻類の培養物とは、藻体を含む培養液、培養液から回収した藻体を包含する。
【００２０】
藻体を培養液から回収する方法は、一般的な遠心分離や濾過、あるいは、凝集剤（flocculant）を用いた重力による沈降などの方法で可能である（Grima, E. M. et al. 2003. Biotechnol. Advances 20: 491-515）。
【００２１】
特に本発明においては、アルコール又はアルコール以外の有機溶剤を培養液に直接添加することもできるが、添加前に、藻類を遠心分離等で濃縮しておくことが好ましい。藻体の濃縮には、溶液成分を除去して、藻類の乾燥重量の溶液あたりの濃度として25g/L以上
、好ましくは250g/L以上にすること(遠心分離などの方法により培地から分離した藻体を
液体に懸濁して所望の濃度にすることを含む)、及び、沈殿させて藻体を培地から分離し
て用いることを含む。
【００２２】
＜２＞本発明の藻類の培養物を用いる反応方法と反応物
本発明においては、藻類の培養物に有機溶剤を添加して得られた混合物を攪拌することにより、脂質をエステル交換又は加水分解する反応を行い、その反応物から脂肪酸エステル又は脂肪酸を採取する。なお、本発明においては、脂肪酸エステル、脂肪酸をあわせて「脂肪酸類」と記載することがある。
【００２３】
本発明において、藻類の培養物にアルコールを添加した場合には、脂質とアルコールのエステル交換反応による脂肪酸エステルの生成が、また、藻類の培養物にアルコール以外の有機溶剤を添加した場合には、脂質の加水分解による脂肪酸の生成が主に起こる。
【００２４】
本発明において、反応物とは、藻類の培養物にアルコール又はアルコール以外の有機溶剤を添加して得られる混合物を攪拌して、脂質をエステル交換又は加水分解する反応を行った反応液を意味する。反応物は、その後の脂肪酸エステル又は脂肪酸の採取を妨げない限り、反応液をさらに抽出もしくは分画及び／又は別の処理に付してもよい。本発明の反応物中には、脂肪酸エステルの他に副生物が生じるが、生成したグリセロールは、Ｌ-ア
ミノ酸生産能を有する細菌によるＬ−アミノ酸の生産や化成品に利用してもよい。
【００２５】
本発明において、アルコール又はアルコール以外の有機溶剤添加混合物を用いる反応における温度は、反応物中の脂肪酸エステル又は脂肪酸が増加するのに十分な温度であればよく、ここでの反応の温度の下限としては、通常には10℃以上、好ましくは15℃以上、さらに好ましくは20℃以上、上限としては、通常には60℃以下、好ましくは50℃以下、さらに好ましくは40℃以下である。
【００２６】
本発明においての反応は、上記藻類の培養方法で得られた培養物をそのまま反応させてもよいが、前述のように濃縮して用いてもよい。例えば、一旦遠心分離した後、沈殿した藻体を反応物として用いてもよい。
【００２７】
またアルコール又はアルコール以外の有機溶剤の添加前に、反応中のｐＨを酸性から弱アルカリに調整してもよく、通常には2.0〜11.0、好ましく3.0〜10.5、さらに好ましくは3.5〜9.0である。
【００２８】
処理前に添加するアルコール又はアルコール以外の有機溶剤の濃度は、少なくても５％以上、好ましくは１５％以上、さらに好ましくは２５％以上で反応させることが好ましい。また、上限として、通常６５％以下、好ましくは５５％、さらに好ましくは４５％以下であることが好ましい。
【００２９】
また、添加するアルコールとしては、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、ペンタノール、エチレングリコールなどの炭素数５以下の低級アルコール又はヘキサノール、ヘプタノール、オクタノール、ノナノール、デカノール、ウンデカノール、ドデカノール、トリデカノール、テトラデカノールなど炭素数６以上の高級アルコールを用いてもよい。
【００３０】
また、添加するアルコール以外の有機溶剤としては、アセトン、クロロホルム、酢酸エチル、酢酸メチル、ヘキサン、ベンゼン、トルエン、ジクロロメタン、アセトニトリル、ジメチルエーテル、ジエチルエーテルなどを用いてもよい。
【００３１】
本発明において、アルコール又はアルコール以外の有機溶剤の添加混合物を用いる反応の時間は、下限としては、通常少なくても１０分以上、好ましくは２０分以上、さらに好ましくは３０分以上、上限としては、通常１５時間以下、好ましくは１０時間以下、さら
に好ましくは５時間以下である。
【００３２】
撹拌の手段は、上記処理の効果が得られる限り、制限されず、旋回振盪による撹拌、ボルテックスミキサーによる渦流撹拌などが使用できる。アルコール又はアルコール以外の有機溶媒の水溶解度が低い場合には、十分な混合状態を維持するため、渦流撹拌などの強い撹拌手段を用いることが好ましい。
【００３３】
本発明における反応後の反応物から脂肪酸エステル又は脂肪酸を抽出する方法は、一般的な藻類から油脂を抽出する方法が適用可能であり、例えば、有機溶剤処理や超音波処理、ビーズ破砕処理、酸処理、アルカリ処理、酵素処理、水熱処理、超臨界処理、マイクロ波処理、電磁場処理、あるいは、圧搾処理などの方法があり、特に好ましくはBligh-Dyer法が使用できる（rapid method of total lipid extraction and purification. Can J Biochem Physiol 37:911-917）。細胞外に脂肪酸エステル又は脂肪酸を溶出させ、該溶出
物から脂肪酸エステル又は脂肪酸を採取する処理をすることが好ましい。
【００３４】
本発明において、触媒の添加を必要としない理由は、藻類の細胞中の非組換えのリパーゼによって、油脂、セラミド（ceramide）、リン脂質 (phospholipid)や糖脂質 (glycolipid)が外部より添加したアルコールとエステル交換反応又は加水分解するためと考えられる。
【００３５】
＜３＞本発明で使用する細菌
本発明において、上記方法により取得された脂肪酸は、Ｌ−アミノ酸発酵の炭素源として使用できる。本発明においては、Ｌ−アミノ酸生産には、Ｌ−アミノ酸生産能を有する細菌を使用することが出来る。
【００３６】
細菌としては、微細藻類により生産される脂肪酸からＬ-アミノ酸を効率よく製造し得
るものであれば特に制限されず、例えばエシェリヒア属、パントエア属、エンテロバクター属等の腸内細菌科に属する細菌、及び、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属に属するいわゆるコリネ型細菌等が挙げられるが、これらに制限されない。腸内細菌科に属する細菌は、好ましくは、エシェリヒア・コリである。
【００３７】
本発明におけるL−アミノ酸生産菌は、油脂の加水分解物や脂肪酸の資化能力を高める
ように改変されていても構わない。例えば、腸内細菌群に見出される脂肪酸代謝を調節するDNA結合能を有する転写因子FadRをコードする遺伝子の欠損などが挙げられる（DiRusso, C. C. et al. 1992. J. Biol. Chem. 267: 8685-8691; DiRusso, C. C. et al. 1993. Mol. Microbiol. 7: 311-322）。具体的には、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）のfadR遺伝子は、GenBank Accession No. U00096で登録されているエシェリヒア・コリMG1655株のゲノム配列上の塩基番号1,234,161〜1,234,880に位置し、GenBank accession No. AAC74271にて登録されているタンパク質をコードする遺伝子である。
【００３８】
油脂の加水分解物や脂肪酸の資化能力を高めるためにはさらにfadA、fadB、fadI、fadJ、fadL、fadE、fadDから選択される1種または2種以上の遺伝子の発現量を強化してもよい。
【００３９】
本発明における「fadL遺伝子」とは、腸内細菌群に見出される長鎖の脂肪酸の取り込み能を有する外膜のトランスポーターをコードする遺伝子を意味する（Kumar, G. B. and Black, P. N. 1993. J. Biol. Chem. 268: 15469-15476; Stenberg, F. et al. 2005. J. Biol. Chem. 280: 34409-34419）。FadLをコードする遺伝子としては、具体的には、エシェリヒア・コリのfadL遺伝子として、エシェリヒア・コリのゲノム配列（GenBank Accession No. U00096）の塩基番号2459322〜2460668に位置する遺伝子を例示することができる
。
【００４０】
本発明における「fadD遺伝子」とは、腸内細菌群に見出される長鎖の脂肪酸からfatty acyl-CoA を生成するfatty acyl-CoA synthetase活性を触媒すると同時に、内膜を通して取り込む酵素をコードする遺伝子を意味する（Dirusso, C. C. and Black, P. N. 2004. J. Biol. Chem. 279: 49563-49566; Schmelter, T. et al. 2004. J. Biol. Chem. 279: 24163-24170）。FadDをコードする遺伝子としては、具体的には、エシェリヒア・コリのfadD遺伝子として、エシェリヒア・コリのゲノム配列（GenBank Accession No. U00096）
の塩基番号1887770〜1886085（相補鎖）に位置する遺伝子を例示することができる。
【００４１】
本発明における「fadE遺伝子」とは、腸内細菌群に見出されるfatty acyl-CoA を酸化
するacyl-CoA dehydrogenase活性を触媒する酵素をコードする遺伝子を意味する（O'Brien, W. J. and Frerman, F. E. 1977. J. Bacteriol. 132: 532-540; Campbell, J. W. and Cronan, J. E. 2002. J. Bacteriol. 184: 3759-3764）。
【００４２】
FadEをコードする遺伝子としては、具体的には、エシェリヒア・コリのfadE遺伝子として、エシェリヒア・コリのゲノム配列（GenBank Accession No. U00096）の塩基番号243303〜240859（相補鎖）に位置する遺伝子を例示することができる。
【００４３】
本発明における「fadB遺伝子」とは、腸内細菌群に見出されるfatty acid oxidation complexのα componentであり、enoyl-CoA hydratase、3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase、3-hydroxyacyl-CoA epimerase、Δ3-cis-Δ2-trans-enoyl-CoA isomeraseの4つの活性
を触媒する酵素をコードする遺伝子を意味する（Pramanik, A. et al. 1979. J. Bacteriol. 137: 469-473; Yang, S. Y. and Schulz, H. 1983. J. Biol. Chem. 258: 9780-9785）。FadBをコードする遺伝子としては、具体的には、エシェリヒア・コリのfadB遺伝子として、エシェリヒア・コリのゲノム配列（GenBank Accession No. U00096）の塩基番号4028994〜4026805（相補鎖）に位置する遺伝子を例示することができる。
【００４４】
本発明における「fadA遺伝子」とは、腸内細菌群に見出されるfatty acid oxidation complexのβ componentであり、3-ketoacyl-CoA thiolase活性を触媒する酵素をコードす
る遺伝子を意味する（Pramanik, A. et al. 1979. J. Bacteriol. 137: 469-473）。FadAをコードする遺伝子としては、具体的には、エシェリヒア・コリのfadA遺伝子として、エシェリヒア・コリのゲノム配列（GenBank Accession No. U00096）の塩基番号4026795〜4025632（相補鎖）に位置する遺伝子を例示することができる。
【００４５】
腸内細菌群に見出されるfatty acid oxidation complexは、FadBとFadAが複合体を形成しており、遺伝子としてもfadBAオペロンを形成していることが知られている（Yang, S. Y. et al. 1990. J. Biol. Chem. 265: 10424-10429）。従って、fadBAオペロンとして、オペロン全体を増幅することも可能である。
【００４６】
本発明における「fadJ遺伝子」とは、fadB遺伝子と相同性を有し、嫌気条件と好気条件にて機能するfatty acid oxidation complexのα componentであり（Campbell, J. W. et
al. 2003. Mol. Microbiol. 47(3): 793-805）、enoyl-CoA hydratase、3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase、3-hydroxyacyl-CoA epimerase、Δ3-cis-Δ2-trans-enoyl-CoA isomeraseの4つの活性を触媒する酵素をコードする遺伝子を意味する（Pramanik, A. et al. 1979. J. Bacteriol. 137: 469-473; Yang, S. Y. and Schulz, H. 1983. J. Biol. Chem. 258: 9780-9785）。FadJをコードする遺伝子としては、具体的には、エシェリヒア・コリのfadJ遺伝子として、エシェリヒア・コリのゲノム配列（Genbank Accession No. U00096）の塩基番号2457181〜2455037（相補鎖）に位置する塩基配列を有する遺伝子を例示することができる。
【００４７】
本発明における「fadI遺伝子」とは、fadA遺伝子と相同性を有し、嫌気条件と好気条件にて機能するfatty acid oxidation complexのβ componentであり（Campbell, J. W. et
al. 2003. Mol. Microbiol. 47(3): 793-805）、3-ketoacyl-CoA thiolase活性を触媒する酵素をコードする遺伝子を意味する（Pramanik, A. et al. 1979. J. Bacteriol. 137:
469-473）。FadIをコードする遺伝子としては、具体的には、エシェリヒア・コリのfadI遺伝子として、エシェリヒア・コリのゲノム配列（Genbank Accession No. U00096）の塩基番号2458491〜2457181（相補鎖）に位置する塩基配列を有する遺伝子を例示することができる。
【００４８】
腸内細菌群に見出されるfatty acid oxidation complexは、FadJとFadIが複合体を形成しており、遺伝子としてもfadIJオペロンを形成していることが知られている（Yang, S. Y. et al. 1990. J. Biol. Chem. 265: 10424-10429）。従って、fadIJオペロンとして、オペロン全体を増幅することも可能である。
【００４９】
また、油脂の加水分解物や脂肪酸の資化能力は、cyoオペロン(cyoABCDE)の増強によっ
ても達成される。本発明における「cyoABCDE」とは、腸内細菌群に見出される末端酸化酵素の一つであるシトクロムbo型酸化酵素複合体（cytochrome bo terminal oxidase complex）の各サブユニットをコードする遺伝子群であり、cyoBがsubunit Iを、cyoAがsubunit
IIを、cyoCがsubunit IIIを、cyoDがsubunit IVを、cyoEがheme O synthase活性を触媒
する酵素をコードする遺伝子を意味する（Gennis, R. B. and Stewart, V. 1996. p. 217-261. In F. D.Neidhardt (ed.), Escherichia coli and Salmonella Cellular and Molecular Biology/Second Edition, American Society for Microbiology Press, Washington, D.C; Chepuri et al. 1990. J. Biol. Chem. 265: 11185-11192）。
【００５０】
cyoAをコードする遺伝子としては、具体的には、エシェリヒア・コリのcyoA遺伝子として、エシェリヒア・コリのゲノム配列（GenBank Accession No. U00096）の塩基番号450834〜449887（相補鎖）に位置する遺伝子を例示することができる。cyoBをコードする遺伝子としては、具体的には、エシェリヒア・コリのcyoB遺伝子として、エシェリヒア・コリのゲノム配列（GenBank Accession No. U00096）の塩基番号449865〜447874（相補鎖）に位置する遺伝子を例示することができる。cyoCをコードする遺伝子としては、具体的には、エシェリヒア・コリのcyoC遺伝子として、エシェリヒア・コリのゲノム配列（GenBank Accession No. U00096）の塩基番号447884〜447270（相補鎖）に位置する遺伝子を例示することができる。cyoDをコードする遺伝子としては、具体的には、エシェリヒア・コリのcyoD遺伝子として、エシェリヒア・コリのゲノム配列（GenBank Accession No. U00096）の塩基番号447270〜446941（相補鎖）に位置する遺伝子を例示することができる。cyoE遺伝子をコードする遺伝子としては、具体的には、エシェリヒア・コリのcyoE遺伝子として、エシェリヒア・コリのゲノム配列（GenBank Accession No. U00096）の塩基番号446929〜446039（相補鎖）に位置する遺伝子を例示することができる。
【００５１】
また、本発明の細菌は、ピルビン酸シンターゼ、または、ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキ
シドレダクターゼの活性が増大するように改変された菌株であってもよい（WO2009/031565号参照）。
【００５２】
本発明における「ピルビン酸シンターゼ」とは、アセチル-CoAとCO2からピルビン酸を
生成する下記の反応を、電子供与体存在下、例えばフェレドキシンあるいはフラボドキシン存在下で可逆的に触媒する酵素（EC 1.2.7.1）を意味する。ピルビン酸シンターゼは、ＰＳと略称されることもあり、ピルビン酸オキシドレダクターゼ、ピルビン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼ、ピルビン酸フラボドキシンオキシドレダクターゼ、または、ピルビン酸オキシドレダクターゼと命名されている場合もある。電子供与体としては、フ
ェレドキシンまたはフラボドキシンを用いることが出来る。
【００５３】
還元型フェレドキシン + アセチル-CoA + CO2 → 酸化型フェレドキシン + ピルビン酸 +
ＣｏＡ
【００５４】
ピルビン酸シンターゼの活性が増強されたことの確認は、増強前の微生物と、増強後の微生物より粗酵素液を調製し、そのピルビン酸シンターゼ活性を比較することにより達成される。ピルビン酸シンターゼの活性は、例えば、Yoonらの方法（Yoon, K. S. et al. 1997. Arch. Microbiol. 167: 275-279）に従って測定できる。例えば、電子受容体としての酸化型メチルビオロゲンとＣｏＡと粗酵素液を含む反応液にピルビン酸を添加した際に、ピルビン酸の脱炭酸反応によって増大する還元型メチルビオロゲンの量を分光学的に測定することによって、測定可能である。酵素活性１ユニット（U）は１分間あたり１μmolのメチルビオロゲンの還元量で表される。親株がピルビン酸シンターゼ活性を有している場合、親株と比較して、好ましくは1.5倍以上、より好ましくは2倍以上、さらに好ましくは3倍以上酵素活性が上昇していることが望ましい。また親株がピルビン酸シンターゼ活
性を有していない場合には、ピルビン酸シンターゼ遺伝子を導入することにより、ピルビン酸シンターゼが生成されていればよいが、酵素活性が測定できる程度に強化されていることが好ましく、好ましくは0.001U/mg（菌体タンパク質）以上、より好ましくは0.005U/mg以上、さらに好ましくは0.01U/mg以上が望ましい。ピルビン酸シンターゼは、酸素に対して感受性であり、一般的に活性発現や測定は困難であることも多い（Buckel, W.and Golding, B. T. 2006. Ann. Rev. of Microbiol. 60: 27-49）。したがって、酵素活性の測定に際しては、反応容器中の酸素濃度を低下させて酵素反応を行うことが好ましい。
【００５５】
ピルビン酸シンターゼをコードする遺伝子は、クロロビウム・テピダム(Chlorobium tepidum)、ハイドロジェノバクター・サーモファイラス（Hydrogenobacter thermophilus）等、還元的ＴＣＡサイクルを持つ細菌のピルビン酸シンターゼ遺伝子を利用することが可能である。また、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）をはじめとする、腸内細菌群に属する細菌由来のピルビン酸シンターゼ遺伝子を利用することも可能である。さらに、ピルビン酸シンターゼをコードする遺伝子は、メタノコッカス・マリパルディス（Methanococcus maripaludis）、メタノカルドコッカス・ジャナスチ（Methanocaldococcus jannaschii）、メタノサーモバクター・サーマトトロフィカス（Methanothermobacter thermautotrophicus）などの独立栄養性メタン生成古細菌（autotrophic methanogens）のピル
ビン酸シンターゼ遺伝子を利用することが可能である。
【００５６】
本発明における「ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼ」とは、アセチル-CoA
とCO2からピルビン酸を生成する下記の反応を、電子供与体存在下、例えばＮＡＤＰＨあ
るいはＮＡＤＨ存在下で可逆的に触媒する酵素（EC 1.2.1.15）を意味する。ピルビン酸
：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼは、ＰＮＯと略称されることもあり、ピルビン酸デヒ
ドロゲナーゼと命名されている場合もある。しかしながら、本発明において「ピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性」というときは、後述するように、ピルビン酸を酸化的に脱炭酸し、アセチル-CoAを生成する反応を触媒する活性であり、この反応を触媒するピルビン酸デヒドロゲナーゼ（PDH）は、ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼとは別の酵素である。ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼは、電子供与体としては、ＮＡＤＰ
ＨあるいはＮＡＤＨを用いることが出来る。
【００５７】
ＮＡＤＰＨ + アセチル-CoA + CO2 → ＮＡＤＰ+ + ピルビン酸 + CoA
【００５８】
ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼの活性が増強されたことの確認は、増強
前の微生物と、増強後の微生物より粗酵素液を調製し、そのピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキ
シドレダクターゼ活性を比較することにより達成される。ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシ
ドレダクターゼの活性は、例えば、Inuiらの方法（Inui, H. et al. 1987. J. Biol. Chem. 262: 9130-9135）に従って測定できる。例えば、電子受容体としての酸化型メチルビ
オロゲンとCoAと粗酵素液を含む反応液に、ピルビン酸を添加した際にピルビン酸の脱炭
酸反応によって増大する還元型メチルビオロゲンの量を分光学的に測定することによって、測定可能である。酵素活性１ユニット（U）は１分間あたり１μmolのメチルビオロゲンの還元量で表される。親株がピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼ活性を有して
いる場合、親株と比較して、好ましくは1.5倍以上、より好ましくは2倍以上、さらに好ましくは3倍以上酵素活性が上昇していることが望ましい。また親株がピルビン酸：ＮＡＤ
Ｐ+オキシドレダクターゼ活性を有していない場合には、ピルビン酸シンターゼ遺伝子を
入することにより、ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼが生成されていればよ
いが、酵素活性が測定できる程度に強化されていることが好ましく、好ましくは0.001U/mg（菌体タンパク質）以上、より好ましくは0.005U/mg以上、さらに好ましくは0.01U/mg以上が望ましい。ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼは、酸素に対して感受性で
あり、一般的に活性発現や測定は困難であることも多い（Inui, H. et al. 1987. J. Biol. Chem. 262: 9130-9135; Rotte, C. et al. 2001. Mol. Biol. Evol. 18: 710-720）。
【００５９】
ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼをコードする遺伝子は、光合成真核微生
物で原生動物にも分類されるユーグレナ・グラシリス（Euglena gracilis）のピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼ遺伝子（Nakazawa, M. et al. 2000. FEBS Lett. 479:
155-156）、原生生物クリプトスポルジウム・パルバム（Cryptosporidium parvum）のピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼ遺伝子（Rotte, C. et al. 2001. Mol. Biol.
Evol. 18: 710-720）の他、珪藻タラシオシラ・スードナナ（Tharassiosira pseudonana）にも相同な遺伝子が存在することが知られている（Ctrnacta, V. et al. 2006. J. Eukaryot. Microbiol. 53: 225-231）。
【００６０】
具体的には、ユーグレナ・グラシリス（Euglena gracilis）のピルビン酸：ＮＡＤＰ+
オキシドレダクターゼ遺伝子が利用できる（GenBank Accession No. AB021127）。
【００６１】
本発明の微生物は、ピルビン酸シンターゼの活性に必要な電子供与体の酸化型を還元型にリサイクルする活性が、親株、例えば野生株や非改変株と比べて増大するように改変することによって、ピルビン酸シンターゼの活性が増大するように改変された微生物でもよい。電子供与体の酸化型を還元型にリサイクルする活性としては、フェレドキシン-ＮＡ
ＤＰ+レダクターゼ活性を挙げることができる。また、電子供与体のリサイクル活性の増
強に加えて、ピルビン酸シンターゼ活性が増大するように改変することによって、ピルビン酸シンターゼの活性が増大するように改変された微生物でもよい。なお、上記親株は、本来内在的に電子供与体のリサイクル活性をコードする遺伝子を有しているものであってもよいし、本来は電子供与体のリサイクル活性を有さないが、当該活性をコードする遺伝子を導入することにより活性が付与され、L−アミノ酸生産能が向上するものであっても
よい。
【００６２】
「フェレドキシン-ＮＡＤＰ+レダクターゼ」とは、以下の反応を可逆的に触媒する酵素（EC 1.18.1.2）をいう。
【００６３】
還元型フェレドキシン + NADP+ → 酸化型フェレドキシン + NADPH + H+
【００６４】
本反応は、可逆反応であり、ＮＡＤＰＨと酸化型フェレドキシン存在下で、還元型フェレドキシンを産生することが可能である。フェレドキシンはフラボドキシンと代替可能でありフラボドキシン-ＮＡＤＰ+レダクターゼと命名されているものも同等の機能を有する。フェレドキシン-ＮＡＤＰ+レダクターゼは微生物から高等生物まで幅広く存在が確認されており（Carrillo, N. and Ceccarelli, E. A. 2003. Eur. J. Biochem. 270: 1900-1915
; Ceccarelli, E. A. et al. 2004. Biochim. Biophys. Acta. 1698: 155-165参照）、フェレドキシン-ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼ、ＮＡＤＰＨ-フェレドキシンオキシドレ
ダクターゼと命名されているものもある。
【００６５】
フェレドキシン-ＮＡＤＰ+レダクターゼの活性が増強されたことの確認は、改変前の微生物と、改変後の微生物より粗酵素液を調製し、そのフェレドキシン-ＮＡＤＰ+レダクターゼ活性を比較することにより達成される。フェレドキシン-ＮＡＤＰ+レダクターゼの活性は、例えば、Blaschkowskiらの方法（Blaschkowski, H. P. et al. 1982. Eur. J. Biochem. 123: 563-569）に従って測定できる。例えば、基質としてフェレドキシンを用い、減少するNADPH量を分光学的に測定することによって測定可能である。酵素活性１ユニッ
ト（U）は１分間あたり１μmolのNADPHの酸化量で表される。親株がフェレドキシン-ＮＡＤＰ+レダクターゼ活性を有している場合、親株の活性が十分高ければ、増強する必要は
ないが、親株と比較して、好ましくは1.5倍以上、より好ましくは2倍以上、さらに好ましくは3倍以上酵素活性が上昇していることが望ましい。
【００６６】
フェレドキシン-ＮＡＤＰ+レダクターゼをコードする遺伝子は、多くの生物種で見出されており、目的のL−アミノ酸生産株中で活性を有するものであれば使用することが可能
である。エシェリヒア・コリではフラボドキシン-ＮＡＤＰ+レダクターゼとしてfpr遺伝
子が同定されている（Bianchi, V. et al. 1993. J. Bacteriol. 175:1590-1595）。また、シュードモナス・プチダ(Psuedomonas putida)には、ＮＡＤＰＨ-プチダレドキシンレ
ダクターゼ（Putidaredoxin reductase）遺伝子とプチダレドキシン（Putidaredoxin）遺伝子がオペロンとして存在することが知られている(Koga, H. et al. 1989. J. Biochem.
(Tokyo) 106: 831-836）。
【００６７】
エシェリヒア・コリのフラボドキシン-ＮＡＤＰ+レダクターゼとしては、エシェリヒア・コリK-12株のゲノム配列（GenBank Accession No. U00096）の塩基番号4111749〜4112495（相補鎖）に位置する、fpr遺伝子を例示することができる。また、コリネバクテリウ
ム・グルタミカムのゲノム配列（GenBank Accession No. BA00036）の塩基番号2526234〜2527211にフェレドキシン-ＮＡＤＰ+レダクターゼ遺伝子が見出されている（GenBank Accession No. BAB99777）。
【００６８】
ピルビン酸シンターゼの活性には、フェレドキシン又はフラボドキシンが電子供与体として存在することが必要である。従って、フェレドキシン又はフラボドキシンの産生能が向上するように改変することによって、ピルビン酸シンターゼの活性が増大するように改変された微生物であってもよい。
【００６９】
また、ピルビン酸シンターゼ活性、又は、フラボドキシン-ＮＡＤＰ+レダクターゼ及びピルビン酸シンターゼ活性が増強するように改変することに加えて、フェレドキシン又はフラボドキシンの産生能が向上するように改変してもよい。
【００７０】
本発明における「フェレドキシン」とは、非ヘム鉄原子（Fe）と、硫黄原子を含み、4Fe-4S、3Fe-4S、あるいは、2Fe-2Sクラスターと呼ばれる鉄-硫黄クラスターを結合したタ
ンパク質で1電子の伝達体として機能するものを指す。「フラボドキシン」とはFMN（Flavin-mononucleotide）を補欠分子属として含む1あるいは2電子の伝達体として機能するも
のタンパク質を指す。フェレドキシンとフラボドキシンについては、McLeanらの文献に記載されている（McLean, K. J. et al. 2005. Biochem. Soc. Trans. 33: 796-801）。
【００７１】
なお、改変に用いる親株は、本来内在的にフェレドキシン又はフラボドキシンをコードする遺伝子を有しているものであってもよいし、本来はフェレドキシン又はフラボドキシン遺伝子を有さないが、フェレドキシン又はフラボドキシン遺伝子を導入することにより
活性が付与され、L−アミノ酸生産能が向上するものであってもよい。
【００７２】
また、フェレドキシン又はフラボドキシンの産生能が親株、例えば野生株や非改変株と比べて向上していることの確認は、SDS-PAGEや二次元電気泳動あるいは、抗体を用いたウェスタンブロットによって検出することが出来る（Sambrook, J. et al. 1989. Molecular Cloning A Laboratory Manual/Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York）。生産量については、野生株あるいは非改変株と比較して、向上していれ
ばいずれでもよいが、例えば野生株、非改変株と比べて1.5倍以上、より好ましくは2倍以上、さらに好ましくは3倍以上上昇していることが望ましい。
【００７３】
フェレドキシン及びフラボドキシンの活性は、適切な酸化還元反応系に加えることで測定することが可能である。例えば、Boyerらにより、産生されたフェレドキシンをフェレ
ドキシン-ＮＡＤＰ+レダクターゼにより還元し、生じた還元型フェレドキシンによるチトクロームCの還元を定量する方法が開示されている（Boyer, M. E. et al. 2006. Biotechnol. Bioeng. 94: 128-138）。また、フラボドキシンの活性は、フラボドキシン-ＮＡＤ
Ｐ+レダクターゼを用いることで、同じ方法で測定が可能である。
【００７４】
フェレドキシン、又はフラボドキシンをコードする遺伝子は、広く分布しており、コードされるフェレドキシン又はフラボドキシンがピルビン酸シンターゼと電子供与体再生系が利用可能なものであれば、どのようなものでも用いることができる。例えば、エシェリヒア・コリには、2Fe-2Sクラスターを有するフェレドキシンをコードする遺伝子としてfdx遺伝子が存在し（Ta, D. T. and Vickery, L. E. 1992. J. Biol. Chem. 267:11120-11125）、4Fe-4Sクラスターを有するフェレドキシン遺伝子としてyfhL遺伝子が予想されている。また、フラボドキシン遺伝子としては、fldA遺伝子（Osborne, C. et al. 1991. J. Bacteriol. 173: 1729-1737）とfldB遺伝子（Gaudu, P. and Weiss, B. 2000. J. Bacteriol. 182:1788-1793）の存在が知られている。コリネバクテリウム・グルタミカムのゲノム配列（GenBank Accession No. BA00036）においては、塩基番号562643〜562963番に複
数のフェレドキシン遺伝子fdx（GenBank Accession No. BAB97942）及び塩基番号1148953〜1149270番にfer（GenBank Accession No. BAB98495）が見出されている。また、クロロビウム・テピダムにおいては、多くのフェレドキシン遺伝子が存在するが、ピルビン酸シンターゼの電子受容体となる4Fe-4S型のフェレドキシン遺伝子としてフェレドキシンＩ及びフェレドキシンIIが同定されている（Yoon, K. S. et al. 2001. J. Biol. Chem. 276:
44027-44036）。ハイドロジェノバクター・サーモファイラス等、還元的ＴＣＡサイクルを持つ細菌由来のフェレドキシン遺伝子あるいはフラボドキシン遺伝子を用いることもできる。
【００７５】
具体的には、エシェリヒア・コリのフェレドキシン遺伝子として、エシェリヒア・コリK-12株のゲノム配列（GenBank Accession No. U00096）の塩基番号2654770〜2655105番（相補鎖）に位置するfdx遺伝子、及び塩基番号2697685〜2697945番に位置するyfhL遺伝子
を例示することができる。
【００７６】
本発明におけるL-アミノ酸生産菌は、グリセロール代謝に関与する遺伝子が改変されていてもよい。
【００７７】
グリセロール代謝に関与する遺伝子としては、グリセロールの資化性を高めるために、glpR遺伝子（EP1715056）の発現が弱化されているか、glpA、glpB、glpC、glpD、glpE、glpF、glpG、glpK、glpQ、glpT、glpX、tpiA、gldA、dhaK、dhaL、dhaM、dhaR、fsa及びtalC遺伝子等のグリセロール代謝遺伝子（EP1715055A）の発現が強化されていてもよい。
【００７８】
特にグリセロール資化性を高めるために、グリセロールデヒドロゲナーゼ遺伝子（gldA
）とPEP依存型ジハイドロキシアセトンキナーゼ遺伝子(dhaKLM)遺伝子あるいはATP依存型ジハイドロキシアセトンキナーゼ遺伝子(dak)を組み合わせて強化することことが好まし
い。さらには、フルクトース−６−リン酸アルドラーゼ（fsaB）の発現が強化されていてもよい（WO2008/102861）。
【００７９】
また、グリセロールキナーゼ(glpK)においては、フルクトース-1,6-リン酸によるフィ
ードバック阻害が解除された脱感作型glpK遺伝子を用いることが好ましい。（WO2008/081959,WO2008/107277）
【００８０】
腸内細菌科は、エシェリヒア、エンテロバクター、エルビニア、クレブシエラ、パントエア、フォトルハブドゥス、プロビデンシア、サルモネラ、セラチア、シゲラ、モルガネラ、イェルシニア等の属に属する細菌を含む。特に、NCBI (National Center for Biotechnology Information)のデータベース(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?id=91347)で用いられている分類法により腸内細菌科に分類されている細菌が好ましい。
【００８１】
本発明において使用することができるエシェリヒア属に属する細菌は、特に制限されないが、例えば、ナイトハルトらの著書（Neidhardt, F. C. Ed. 1996. Escherichia coli and Salmonella: Cellular and Molecular Biology/Second Edition pp. 2477-2483. Table 1. American Society for Microbiology Press, Washington, D.C.）に記述されてい
る系統のものが含まれる。具体的には、プロトタイプの野生株K-12株由来のエシェリヒア・コリ W3110 （ATCC 27325）、エシェリヒア・コリ MG1655 (ATCC 47076)等が挙げられ
る。
【００８２】
これらの菌株は、例えばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（住所 P.O. Box 1549 Manassas, VA 20108, United States of America）より分譲を受けることが出
来る。すなわち各菌株に対応する登録番号が付与されており、この登録番号を利用して分譲を受けることが出来る。各菌株に対応する登録番号は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログに記載されている。以下のATCC番号が記載された菌株についても同様である。
【００８３】
パントエア属に属する細菌とは、当該細菌が微生物学の専門家に知られている分類により、パントエア属に分類されていることを意味する。エンテロバクター・アグロメランスのある種のものは、最近、16S rRNAの塩基配列分析等に基づき、パントエア・アグロメランス、パントエア・アナナティス、パントエア・ステワルティイその他に再分類された(Int. J. Syst. Bacteriol. 1993. 43: 162-173)。本発明において、パントエア属に属する細菌には、このようにパントエア属に再分類された細菌も含まれる。
【００８４】
パントエア属細菌の代表的な菌株として、パントエア・アナナティス（Pantoea ananatis）、パントエア・スチューアルティ（Pantoea stewartii）パントエア・アグロメラン
ス、パントエア・シトレア（Pantoea citrea）が挙げられる。具体的には、下記の菌株が挙げられる。
【００８５】
パントエア・アナナティスAJ13355株（FERM BP-6614）(欧州特許出願公開0952221号明
細書)
パントエア・アナナティスAJ13356株（FERM BP-6615）(欧州特許出願公開0952221号明
細書)
【００８６】
尚、これらの菌株は、欧州特許出願公開0952221号明細書にはエンテロバクター・アグ
ロメランスとして記載されているが、現在では、上記のとおり、16S rRNAの塩基配列解析
などにより、パントエア・アナナティスに再分類されている。
【００８７】
エンテロバクター属細菌としては、エンテロバクター・アグロメランス（Enterobacter
agglomerans）、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）等が挙げられる。具体的には、欧州特許出願公開952221号明細書に例示された菌株を使用することが出来る。エンテロバクター属の代表的な株として、エンテロバクター・アグロメランスATCC12287株が挙げられる。
【００８８】
エルビニア属細菌としては、エルビニア・アミロボーラ、エルビニア・カロトボーラが挙げられ、クレブシエラ属細菌としては、クレブシエラ・プランティコーラが挙げられる。具体的には、下記の菌株が挙げられる。
【００８９】
エルビニア・アミロボーラ  ATCC15580株
エルビニア・カロトボーラ  ATCC15713株
クレブシエラ・プランティコーラAJ13399株（FERM BP-6600）(欧州特許出願公開955368号明細書)
クレブシエラ・プランティコーラAJ13410株（FERM BP-6617）(欧州特許出願公開955368号明細書)
【００９０】
本発明において、「コリネ型細菌」とは、従来ブレビバクテリウム属に分類されていたが、現在コリネバクテリウム属に分類された細菌も含み（Liebl, W. et al. 1991. Int. J. Syst. Bacteriol., 41:255-260）、またコリネバクテリウム属と非常に近縁なブレビ
バクテリウム属細菌を含む。このようなコリネ型細菌の例として以下のものが挙げられる。
【００９１】
コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム
コリネバクテリウム・アセトグルタミカム
コリネバクテリウム・アルカノリティカム
コリネバクテリウム・カルナエ
コリネバクテリウム・グルタミカム
コリネバクテリウム・リリウム
コリネバクテリウム・メラセコーラ
コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス (コリネバクテリウム・エフィシエンス)
コリネバクテリウム・ハーキュリス
ブレビバクテリウム・ディバリカタム
ブレビバクテリウム・フラバム
ブレビバクテリウム・インマリオフィラム
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（コリネバクテリウム・グルタミカム）
ブレビバクテリウム・ロゼウム
ブレビバクテリウム・サッカロリティカム
ブレビバクテリウム・チオゲニタリス
コリネバクテリウム・アンモニアゲネス
ブレビバクテリウム・アルバム
ブレビバクテリウム・セリヌム
ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム
【００９２】
具体的には、下記のような菌株を例示することができる。
コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム ATCC13870
コリネバクテリウム・アセトグルタミカム ATCC15806
コリネバクテリウム・アルカノリティカム ATCC21511
コリネバクテリウム・カルナエ ATCC15991
コリネバクテリウム・グルタミカム ATCC13020, ATCC13032, ATCC13060
コリネバクテリウム・リリウム ATCC15990
コリネバクテリウム・メラセコーラ ATCC17965
コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス AJ12340(FERM BP-1539)
コリネバクテリウム・ハーキュリス ATCC13868
ブレビバクテリウム・ディバリカタム ATCC14020
ブレビバクテリウム・フラバム ATCC13826, ATCC14067
ブレビバクテリウム・インマリオフィラム ATCC14068
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ATCC13869（コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13869）
ブレビバクテリウム・ロゼウム ATCC13825
ブレビバクテリウム・サッカロリティカム ATCC14066
ブレビバクテリウム・チオゲニタリス ATCC19240
コリネバクテリウム・アンモニアゲネス ATCC6871、ATCC6872
ブレビバクテリウム・アルバム ATCC15111
ブレビバクテリウム・セリヌム ATCC15112
ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム ATCC15354
【００９３】
本発明において、アミノ酸生産能を有する細菌とは、培地に培養したとき、Ｌ-アミノ
酸を生産し、培地中に分泌する能力を有する細菌をいう。また、好ましくは、目的とするＬ-アミノ酸を好ましくは0.5g/L以上、より好ましくは1.0g/L以上の量を培地に蓄積させ
ることができる細菌をいう。Ｌ-アミノ酸は、Ｌ-アラニン、Ｌ-アルギニン、Ｌ-アスパラギン、Ｌ-アスパラギン酸、Ｌ-システイン、Ｌ-グルタミン酸、Ｌ-グルタミン、グリシン、Ｌ-ヒスチジン、Ｌ-イソロイシン、Ｌ-ロイシン、Ｌ-リジン、Ｌ-メチオニン、Ｌ-フェニルアラニン、Ｌ-プロリン、Ｌ-セリン、Ｌ-スレオニン、Ｌ-トリプトファン、Ｌ-チロ
シン及びＬ-バリンを含む。特に、Ｌ-スレオニン、Ｌ-リジン及びＬ-グルタミン酸が好ましい。
【００９４】
以下、前記のような細菌にＬ-アミノ酸生産能を付与する方法、又は前記のような細菌
にＬ-アミノ酸生産能を増強する方法について述べる。
【００９５】
Ｌ-アミノ酸生産能を付与するには、栄養要求性変異株、Ｌ-アミノ酸のアナログ耐性株又は代謝制御変異株の取得や、Ｌ-アミノ酸の生合成系酵素の発現が増強された組換え株
の創製等、従来、コリネ型細菌又はエシェリヒア属細菌等のアミノ酸生産菌の育種に採用されてきた方法を適用することができる（アミノ酸発酵、（株）学会出版センター、1986年5月30日初版発行、第７７〜１００頁参照）。ここで、Ｌ-アミノ酸生産菌の育種において、付与される栄養要求性、アナログ耐性、代謝制御変異等の性質は、単独でもよく、２種又は３種以上であってもよい。また、発現が増強されるＬ-アミノ酸生合成系酵素も、
単独であっても、２種又は３種以上であってもよい。さらに、栄養要求性、アナログ耐性、代謝制御変異等の性質の付与と、生合成系酵素の増強が組み合わされてもよい。
【００９６】
Ｌ-アミノ酸生産能を有する栄養要求性変異株、アナログ耐性株、又は代謝制御変異株
を取得するには、親株又は野生株を通常の変異処理、すなわちＸ線や紫外線の照射、またはＮ-メチル-Ｎ'-ニトロ-Ｎ-ニトロソグアニジン等の変異剤処理などによって処理し、得られた変異株の中から、栄養要求性、アナログ耐性、又は代謝制御変異を示し、かつＬ-
アミノ酸生産能を有するものを選択することによって得ることができる。
【００９７】
また、Ｌ-アミノ酸生産能の付与又は増強は、遺伝子組換えによって、酵素活性を増強
することによっても行うことが出来る。酵素活性の増強は、例えば、Ｌ-アミノ酸の生合
成に関与する酵素をコードする遺伝子の発現が増強するように細菌を改変する方法を挙げることができる。遺伝子の発現を増強するための方法としては、遺伝子を含むDNA断片を
、適当なプラスミド、例えば微生物内でプラスミドの複製増殖機能を司る遺伝子を少なくとも含むプラスミドベクターに導入した増幅プラスミドを導入すること、または、これらの遺伝子を染色体上で接合、転移等により多コピー化すること、またこれらの遺伝子のプロモーター領域に変異を導入することにより達成することもできる（国際公開パンフレット第95/34672号参照）。
【００９８】
上記増幅プラスミドまたは染色体上に目的遺伝子を導入する場合、これらの遺伝子を発現させるためのプロモーターはコリネ型細菌において機能するものであればいかなるプロモーターであっても良く、用いる遺伝子自身のプロモーターであってもよいし、改変したものでもよい。コリネ型細菌で強力に機能するプロモーターを適宜選択することや、プロモーターの-35、-10領域をコンセンサス配列に近づけることによっても遺伝子の発現量の調節が可能である。以上のような、酵素遺伝子の発現を増強する方法は、国際公開第00/18935号パンフレット、欧州特許出願公開1010755号明細書等に記載されている。
【００９９】
以下、細菌にＬ-アミノ酸生産能を付与する方法、及びＬ-アミノ酸生産能が付与された細菌について例示する。
【０１００】
Ｌ-スレオニン生産菌
Ｌ-スレオニン生産能を有する微生物として好ましいものは、Ｌ-スレオニン生合成系酵素の１種又は２種以上の活性が増強された細菌が挙げられる。Ｌ-スレオニン生合成系酵
素としては、アスパルトキナーゼIII（lysC）、アスパルテートセミアルデヒドデヒドロ
ゲナーゼ（asd）、thrオペロンにコードされるアスパルトキナーゼI（thrA）、ホモセリ
ンキナーゼ（thrB）、スレオニンシンターゼ（thrC）、アスパルテートアミノトランスフェラーゼ（アスパルテートトランスアミナーゼ）(aspC)が挙げられる。カッコ内は、その遺伝子の略記号である（以下の記載においても同様）。これらの酵素の中では、アスパルテートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、アスパルトキナーゼI、ホモセリンキナーゼ、
アスパルテートアミノトランスフェラーゼ、及びスレオニンシンターゼが特に好ましい。Ｌ-スレオニン生合成系遺伝子は、スレオニン分解が抑制されたエシェリヒア属細菌に導
入してもよい。スレオニン分解が抑制されたエシェリヒア属細菌としては、例えば、スレオニンデヒドロゲナーゼ活性が欠損したTDH6株（特開2001-346578号）等が挙げられる。
【０１０１】
Ｌ-スレオニン生合成系酵素は、最終産物のＬ-スレオニンによって酵素活性が抑制される。従って、Ｌ-スレオニン生産菌を構築するためには、Ｌ-スレオニンによるフィードバック阻害を受けないようにＬ-スレオニン生合成系遺伝子を改変することが望ましい。ま
た、上記thrA、thrB、thrC遺伝子は、スレオニンオペロンを構成しているが、スレオニンオペロンは、アテニュエーター構造を形成しており、スレオニンオペロンの発現は、培養液中のイソロイシン、スレオニンに阻害を受け、アテニュエーションにより発現が抑制される。この改変は、アテニュエーション領域のリーダー配列あるいは、アテニュエーターを除去することにより達成出来る（Lynn, S. P. et al. 1987. J. Mol. Biol. 194:59-69; 国際公開第02/26993号パンフレット; 国際公開第2005/049808号パンフレット参照）。
【０１０２】
スレオニンオペロンの上流には、固有のプロモーターが存在するが、非天然のプロモーターに置換してもよいし（国際公開第98/04715号パンフレット参照）、スレオニン生合成関与遺伝子の発現がラムダファージのリプレッサーおよびプロモーターにより支配されるようなスレオニンオペロンを構築してもよい。（欧州特許第0593792号明細書参照）また
、Ｌ-スレオニンによるフィードバック阻害を受けないように細菌を改変するために、α-amino-β-hydroxyvaleric acid （AHV）に耐性な菌株を選抜することも可能である。
【０１０３】
このようにＬ-スレオニンによるフィ-ドバック阻害を受けないように改変されたスレオニンオペロンは、宿主内でコピー数が上昇しているか、あるいは強力なプロモーターに連結し、発現量が向上していることが好ましい。コピー数の上昇は、プラスミドによる増幅の他、トランスポゾン、Mu-ファージ等でゲノム上にスレオニンオペロンを転移させるこ
とによっても達成出来る。
【０１０４】
Ｌ-スレオニン生合成系酵素以外にも、解糖系、TCA回路、呼吸鎖に関する遺伝子や遺伝子の発現を制御する遺伝子、糖の取り込み遺伝子を強化することも好適である。これらのＬ-スレオニン生産に効果がある遺伝子としては、トランスヒドロナーゼ（pntAB）遺伝子（欧州特許733712号明細書）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子（pepC）(国際公開第95/06114号パンフレット)、ホスホエノールピルビン酸シンターゼ遺伝子（pps）(欧州特許第877090号明細書)、コリネ型細菌あるいはバチルス属細菌のピルビン酸
カルボキシラーゼ遺伝子（国際公開第99/18228号パンフレット、欧州出願公開第1092776
号明細書）が挙げられる。
【０１０５】
また、Ｌ-スレオニンに耐性を付与する遺伝子、Ｌ-ホモセリンに耐性を付与する遺伝子の発現を強化することや、宿主にＬ-スレオニン耐性、Ｌ-ホモセリン耐性を付与することも好適である。耐性を付与する遺伝子としては、rhtA遺伝子(Livshits, V. A. et al. 2003. Res. Microbiol. 154:123-135)、rhtB遺伝子（欧州特許出願公開第0994190号明細書
）、rhtC遺伝子（欧州特許出願公開第1013765号明細書）、yfiK、yeaS遺伝子（欧州特許
出願公開第1016710号明細書）が挙げられる。また宿主にＬ-スレオニン耐性を付与する方法は、欧州特許出願公開第0994190号明細書や、国際公開第90/04636号パンフレット記載
の方法を参照出来る。
【０１０６】
Ｌ-スレオニン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、E. coli TDH-6/pVIC40 (VKPM B-3996) (米国特許第5,175,107号、米国特許第5,705,371号)、E. coli 472T23/pYN7 (ATCC 98081) (米国特許第5,631,157号)、E. coli NRRL-21593 (米国特許第5,939,307号)、E. coli FERM BP-3756 (米国特許第5,474,918号)、E. coli FERM BP-3519及びFERM BP-3520 (米国特許第5,376,538号)、E. coli MG442 (Gusyatiner et al., 1978. Genetika (in Russian), 14: 947-956)、E. coli VL643及びVL2055 (欧州特許出願公開第1149911号)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０７】
TDH-6株はthrC遺伝子を欠損し、スクロース資化性であり、また、そのilvA遺伝子がリ
ーキー(leaky)変異を有する。この株はまた、rhtA遺伝子に、高濃度のスレオニンまたは
ホモセリンに対する耐性を付与する変異を有する。B-3996株は、RSF1010由来ベクターに
、変異thrA遺伝子を含むthrA*BCオペロンを挿入したプラスミドpVIC40を保持する。この
変異thrA遺伝子は、スレオニンによるフィードバック阻害が実質的に解除されたアスパルトキナーゼホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードする。B-3996株は、1987年11月19日、オールユニオン・サイエンティフィック・センター・オブ・アンチビオティクス(Nagatinskaya Street 3-A, 117105 Moscow, Russia)に、受託番号RIA 1867で寄託されている。この株は、また、1987年4月7日、ロシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオルガニズムズ(VKPM) (1 Dorozhny proezd., 1 Moscow 117545, Russia) に、受託番号B-3996で寄託されている。
【０１０８】
E. coli VKPM B-5318 (EP 0593792B)も、Ｌ-スレオニン生産菌又はそれを誘導するための親株として使用できる。B-5318株は、イソロイシン非要求性であり、プラスミドpVIC40中のスレオニンオペロンの制御領域が、温度感受性ラムダファージC1リプレッサー及びPRプロモーターにより置換されている。VKPM B-5318は、1990年5月3日、ロシアン・ナショ
ナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオルガニズムズ(VKPM)(1 Dorozhny proezd., 1 Moscow 117545, Russia) に、受託番号VKPM B-5318で国際寄託されてい
る。
【０１０９】
エシェリヒア・コリのアスパルトキナーゼホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードするthrA遺伝子はGenBank Accession No. U00096で登録されているエシェリヒア・コリMG1655株のゲノム配列上の塩基番号337〜2,799に位置し、GenBank accession No. AAC73113にて登録されているタンパク質をコードする遺伝子である。エシェリヒア・コリのホモセリンキナーゼをコードするthrB遺伝子はGenBank Accession No. U00096で登録されているエシェリヒア・コリMG1655株のゲノム配列上の塩基番号2,801〜3,733に位置し、GenBank accession No. AAC73114にて登録されているタンパク質をコードする遺伝子である。エシェリヒア・コリのスレオニンシンターゼをコードするthrC遺伝子はGenBank Accession No. U00096で登録されているエシェリヒア・コリMG1655株のゲノム配列上の塩基番号3,734〜5,020に位置し、GenBank accession No. AAC73115にて登録されているタンパク質をコードする遺伝子である。これら3つの遺伝子は、リーダーペプチドをコードするthrL遺伝子の下
流に、thrLABCからなるスレオニンオペロンとしてコードされている。スレオニンオペロ
ンの発現を増大させるには、転写に影響するアテニュエーター領域を、好ましくは、オペロンから除去することが有効である(国際公開第2005/049808号、国際公開第2003/097839
号)。
【０１１０】
スレオニンによるフィードバック阻害に耐性のアスパルトキナーゼホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードする変異thrA遺伝子、ならびに、thrB遺伝子及びthrC遺伝子は、スレオニン生産株E. coli VKPM B-3996に存在する周知のプラスミドpVIC40から一つのオペロ
ンとして取得できる。プラスミドpVIC40の詳細は、米国特許第5,705,371号に記載されて
いる。
【０１１１】
rhtA遺伝子は、ホモセリン及びスレオニンに耐性を与える遺伝子（rht: resistant to threonine/homoserine）として取得されたGenBank Accession No. U00096で登録されているエシェリヒア・コリMG1655株のゲノム配列上の塩基番号848,433〜849,320（相補鎖）に位置し、GenBank accession No. AAC73900にて登録されているタンパク質をコードする遺伝子である。また、rthAの発現を向上させるrhtA23変異が、ATG開始コドンに対して-1位
のG→A置換であることが判明している(Livshits, V. A. et al. 2003. Res Microbiol. 154:123-135、欧州特許出願公開第1013765号)。
【０１１２】
エシェリヒア・コリのasd遺伝子はGenBank Accession No. U00096で登録されているエ
シェリヒア・コリMG1655株のゲノム配列上の塩基番号3,571,798〜 3,572,901（相補鎖）
に位置し、GenBank accession No. AAC76458にて登録されているタンパク質をコードする遺伝子である。遺伝子の塩基配列に基づいて作製されたプライマーを用いるPCRにより得
ることができる(White, T. J. et al. 1989. Trends Genet. 5: 185-189.参照)。他の微
生物のasd遺伝子も同様に得ることができる。
【０１１３】
また、エシェリヒア・コリのaspC遺伝子はGenBank Accession No. U00096で登録されているエシェリヒア・コリMG1655株のゲノム配列上の塩基番号983,742〜984,932（相補鎖）に位置し、GenBank accession No. AAC74014にて登録されているタンパク質をコードする遺伝子であり、PCRにより得ることができる。他の微生物のaspC遺伝子も同様に得ること
ができる。
【０１１４】
Ｌ-リジン生産菌
以下、Ｌ−リジン生産菌及びその構築方法を例として示す。
例えば、Ｌ−リジン生産能を有する株としては、Ｌ−リジンアナログ耐性株又は代謝制御変異株が挙げられる。Ｌ−リジンアナログの例としては、オキサリジン、リジンヒドロキサメート、Ｓ−（２−アミノエチル）−Ｌ−システイン（以下、「AEC」と略記するこ
とがある。）、γ−メチルリジン、α−クロロカプロラクタムなどが挙げられるが、これらに限定されない。これらのリジンアナログに対して耐性を有する変異株は、腸内細菌科に属する細菌やコリネ型細菌を通常の人工変異処理に付すことによって得ることができる。Ｌ−リジン生産菌として具体的には、エシェリヒア・コリAJ11442株（FERM BP-1543、NRRL B-12185；特開昭56-18596号公報及び米国特許第4346170号明細書参照）、エシェリヒア・コリ VL611株（特開2000-189180号公報）等が挙げられる。また、エシェリヒア・コ
リのＬ−リジン生産菌として、WC196株（国際公開第96/17930号パンフレット参照）を用
いることも出来る。
【０１１５】
また、Ｌ−リジン生合成系の酵素活性を上昇させることによっても、Ｌ−リジン生産菌を構築することが出来る。これらの酵素活性の上昇は、酵素をコードする遺伝子のコピー数を細胞内で上昇させること、または発現調節配列を改変することによって達成できる。
【０１１６】
遺伝子の発現を増強するための改変は、例えば、遺伝子組換え技術を利用して、細胞中の遺伝子のコピー数を高めることによって行うことができる。例えばgapA遺伝子を含むDNA断片を、宿主細菌で機能するベクター、好ましくはマルチコピー型のベクターと連結し
て組換えDNAを作製し、これを細菌に導入して形質転換すればよい。
【０１１７】
遺伝子のコピー数を高めることは、上述のような遺伝子を細菌のゲノムDNA上に多コピ
ー存在させることによっても達成できる。細菌のゲノムDNA上に遺伝子を多コピーで導入
するには、ゲノムDNA上に多コピー存在する配列を標的に利用して相同組換えにより行う
。ゲノムDNA上に多コピー存在する配列としては、レペティティブDNA、転移因子の端部に存在するインバーテッド・リピートが利用できる。また、ゲノム上に存在するgapA遺伝子の横に、それぞれの遺伝子をタンデムに連結させてもよいし、ゲノム上の不要な遺伝子上に重複して組み込んでもよい。これらの遺伝子導入は、温度感受性ベクターを用いて、あるいはintegrationベクターを用いて達成することが出来る。
【０１１８】
あるいは、特開平2-109985号公報に開示されているように、遺伝子をトランスポゾンに搭載してこれを転移させてゲノムDNA上に多コピー導入することも可能である。ゲノム上
に遺伝子が転移したことの確認は、遺伝子の一部をプローブとして、サザンハイブリダイゼーションを行うことによって確認出来る。
【０１１９】
さらに、遺伝子の発現の増強は、上記した遺伝子コピー数の増幅以外に、国際公開00/18935号パンフレットに記載した方法で、ゲノムDNA上またはプラスミド上の遺伝子の各々
のプロモーター等の発現調節配列を強力なものに置換することや、各遺伝子の−35、−10領域をコンセンサス配列に近づけること、遺伝子の発現を上昇させるようなレギュレーターを増幅すること、又は、遺伝子の発現を低下させるようなレギュレーターを欠失または弱化させることによっても達成される。例えば、lacプロモーター、trpプロモーター、trcプロモーター、tacプロモーター、araBAプロモーター、ラムダファージのPRプロモータ
ー、PLプロモーター、tetプロモーター、T7プロモーター、φ10プロモーター等が強力な
プロモーターとして知られている。また、gapA遺伝子のプロモーター領域、SD領域に塩基置換等を導入し、より強力なものに改変することも可能である。プロモーターの強度の評価法および強力なプロモーターの例は、Goldsteinらの論文（Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev. 1995. 1:105-128）等に記載されている。さら
に、リボソーム結合部位（RBS）と開始コドンとの間のスペーサー、特に開始コドンのす
ぐ上流の配列における数個のヌクレオチドの置換がmRNAの翻訳効率に非常に影響を及ぼすことが知られており、これらを改変することも可能である。遺伝子のプロモーター等の発現調節領域は、プロモーター検索ベクターやGENETYX等の遺伝子解析ソフトを用いて決定
することも出来る。これらのプロモーター置換または改変により遺伝子の発現が強化される。発現調節配列の置換は、例えば温度感受性プラスミドを用いた方法や、Redドリブン
インテグレーション法(WO2005/010175)を使用することが出来る。
【０１２０】
Ｌ−リジン生合成系酵素をコードする遺伝子としては、ジヒドロジピコリン酸合成酵素遺伝子（dapA）、アスパルトキナーゼ遺伝子(lysC)、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ遺伝子(dapB)、ジアミノピメリン酸脱炭酸酵素遺伝子(lysA)、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子(ddh)（以上、国際公開第96/40934号パンフレット）、ホスホエノール
ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子(ppc) （特開昭60-87788号公報）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子(aspC)（特公平6-102028号公報）、ジアミノピメリン酸エピメラーゼ遺伝子(dapF)（特開2003-135066号公報）、アスパラギン酸セミアルデヒド脱
水素酵素遺伝子（asd）(国際公開第00/61723号パンフレット)等のジアミノピメリン酸経
路の酵素の遺伝子、あるいはホモアコニット酸ヒドラターゼ遺伝子（特開2000-157276号
公報）等のアミノアジピン酸経路の酵素等の遺伝子が挙げられる。また、親株は、エネルギー効率に関与する遺伝子(cyo) (EP 1170376 A)、ニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼをコードする遺伝子(pntAB) (米国特許第5,830,716号)、Ｌ−リジン排出
活性を有するタンパク質をコードするybjE遺伝子(WO2005/073390)、グルタミン酸デヒド
ロゲナーゼをコードする遺伝子(gdhA)( Valle F. et al. 1983. Gene 23:199-209)、または、これらの任意の組み合わせの遺伝子の発現レベルが増大していてもよい。カッコ内は、それらの遺伝子の略記号である。
【０１２１】
エシェリヒア・コリ由来の野生型ジヒドロジピコリン酸合成酵素はＬ−リジンによるフィードバック阻害を受けることが知られており、エシェリヒア・コリ由来の野生型アスパルトキナーゼはＬ−リジンによる抑制及びフィードバック阻害を受けることが知られている。したがって、dapA遺伝子及びlysC遺伝子を用いる場合、これらの遺伝子は、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害を受けない変異型遺伝子であることが好ましい。
【０１２２】
Ｌ−リジンによるフィードバック阻害を受けない変異型ジヒドロジピコリン酸合成酵素をコードするDNAとしては、118位のヒスチジン残基がチロシン残基に置換された配列を有するタンパク質をコードするDNAが挙げられる。また、Ｌ−リジンによるフィードバック
阻害を受けない変異型アスパルトキナーゼをコードするDNAとしては、352位のスレオニン残基がイソロイシン残基に置換、323位のグリシン残基がアスパラギン残基に置換、318位のメチオニンがイソロイシンに置換された配列を有するAKIIIをコードするDNAが挙げられる（これらの変異体については米国特許第5661012号及び第6040160号明細書参照）。変異型DNAはPCRなどによる部位特異的変異法により取得することができる。
【０１２３】
なお、変異型変異型ジヒドロジピコリン酸合成酵素をコードする変異型dapA及び変異型アスパルトキナーゼをコードする変異型lysCを含むプラスミドとして、広宿主域プラスミドRSFD80、pCAB1、pCABD2が知られている（米国特許第6040160号明細書）。同プラスミドで形質転換されたエシェリヒア・コリ JM109株（米国特許第6040160号明細書）は、AJ12396と命名され、同株は1993年10月28日に通産省工業技術院生命工学工業技術研究所（現 
独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター）に受託番号FERM P-13936として寄託され、1994年11月1日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、FERM BP-4859の受託番号のもとで寄託されている。RSFD80は、AJ12396株から、公知の方法によって取得することができる。
【０１２４】
Ｌ−リジン生産において、このような酵素としては、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、リジンデカルボキシラーゼ（cadA, ldcC）、マリックエンザイム等があり、該酵素の活性が低下または欠損した株は国際公開第WO95/23864号、第WO96/17930号パンフレット、第WO2005/010175号パンフレットなどに記載されている。
【０１２５】
リジンデカルボキシラーゼ活性を低下または欠損させるためには、リジンデカルボキシ
ラーゼをコードするcadA遺伝子とldcC遺伝子の両方の発現を低下させることが好ましい。両遺伝子の発現低下は、WO2006/078039号パンフレットに記載の方法に従って行うことが
できる。
【０１２６】
これらの酵素活性を低下あるいは欠損させる方法としては、通常の変異処理法又は遺伝子組換え技術によって、ゲノム上の上記酵素の遺伝子に、細胞中の当該酵素の活性が低下または欠損するような変異を導入すればよい。このような変異の導入は、例えば、遺伝子組換えによって、ゲノム上の酵素をコードする遺伝子を欠損させたり、プロモーターやシャインダルガルノ（SD）配列等の発現調節配列を改変したりすることなどによって達成される。また、ゲノム上の酵素をコードする領域にアミノ酸置換（ミスセンス変異）を導入すること、また終始コドンを導入すること（ナンセンス変異）、一〜二塩基付加・欠失するフレームシフト変異を導入すること、遺伝子の一部分、あるいは全領域を欠失させることによっても達成出来る（Wang, J. P. et al. 2006. J. Agric. Food Chem. 54: 9405-9410; Winkler, W. C. 2005. Curr. Opin. Chem. Biol. 9: 594-602; Qiu, Z. and Goodman, M. F. 1997. J. Biol. Chem. 272: 8611-8617; Wente, S. R. and Schachman, H. K. 1991. J. Biol. Chem. 266: 20833-20839）。また、コード領域の全体又は一部が欠失し
たような変異酵素をコードする遺伝子を構築し、相同組換えなどによって、該遺伝子でゲノム上の正常遺伝子を置換すること、又はトランスポゾン、IS因子を該遺伝子に導入することによっても酵素活性を低下または欠損させることができる。
【０１２７】
例えば、上記の酵素の活性を低下または欠損させるような変異を遺伝子組換えにより導入する為には、以下のような方法が用いられる。目的遺伝子の部分配列を改変し、正常に機能する酵素を産生しないようにした変異型遺伝子を作製し、該遺伝子を含むＤＮＡで腸内細菌科に属する細菌に形質転換し、変異型遺伝子とゲノム上の遺伝子で組換えを起こさせることにより、ゲノム上の目的遺伝子を変異型に置換することが出来る。このような相同組換えを利用した遺伝子置換は、「Redドリブンインテグレーション(Red-driven integration)」と呼ばれる方法（Datsenko, K. A, and Wanner, B. L. 2000. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97:6640-6645）、Redドリブンインテグレーション法とλファージ由来の切り出しシステム（Cho, E. H., Gumport, R. I., Gardner, J. F. J. 2002. Bacteriol.
184: 5200-5203）とを組合わせた方法（WO2005/010175号参照）等の直鎖状ＤＮＡを用いる方法や、温度感受性複製起点を含むプラスミドを用いる方法などがある（米国特許第6303383号; 特開平05-007491号公報）。また、上述のような相同組換えを利用した遺伝子置換による部位特異的変異導入は、宿主上で複製能力を持たないプラスミドを用いても行うことが出来る。
【０１２８】
好ましいＬ−リジン生産菌として、エシェリヒア・コリWC196ΔcadAΔldcC/pCABD2が挙げられる（WO2006/078039）。この菌株は、WC196株より、リジンデカルボキシラーゼをコードするcadA及びldcC遺伝子を破壊し、リジン生合成系遺伝子を含むプラスミドpCABD2（米国特許第6,040,160号）を導入することにより構築した株である。WC196株は、E.coli K-12に由来するW3110株から取得された株で、352位のスレオニンをイソロイシンに置換す
ることによりＬ−リジンによるフィードバック阻害が解除されたアスパルトキナーゼIII
をコードする変異型lysC遺伝子（米国特許第5,661,012号）でW3110株の染色体上の野生型lysC遺伝子を置き換えた後、AEC耐性を付与することにより育種された（米国特許第5,827,698号）。WC196株は、Escherichia coli AJ13069と命名され、1994年12月6日、工業技術院生命工学工業技術研究所（現 独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センタ
ー、〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に受託番号FERM P-14690として寄託され、1995年9月29日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受
託番号FERM BP-5252が付与されている(米国特許第5,827,698号)。WC196ΔcadAΔldcC自体も、好ましいＬ−リジン生産菌である。WC196ΔcadAΔldcCは、AJ110692と命名され、2008年10月7日、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（〒305-8566 日
本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に国際寄託され、受託番号FERM BP-11027が付与されている。
【０１２９】
pCABD2は、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が解除された変異を有するエシェリヒア・コリ由来のジヒドロジピコリン酸合成酵素（DDPS）をコードする変異型dapA遺伝子と、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が解除された変異を有するエシェリヒア・コリ由来のアスパルトキナーゼIIIをコードする変異型lysC遺伝子と、エシェリヒア・コリ由来
のジヒドロジピコリン酸レダクターゼをコードするdapB遺伝子と、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム由来ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼをコードするddh遺伝子
を含んでいる（国際公開第WO95/16042、WO01/53459号パンフレット）。
【０１３０】
上記のようなＬ-リジン生合成に関与する酵素の遺伝子発現を増強する手法、酵素活性
を低下させる方法は、その他のＬ-アミノ酸生合成酵素をコードする遺伝子についても同
様に適用することができる。
【０１３１】
Ｌ-リジン生産能を有するコリネ型細菌としては、AEC耐性変異株（ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ11082（NRRL B-11470）株など：特公昭56-1914号公報、特公昭56-1915号公報、特公昭57-14157号公報、特公昭57-14158号公報、特公昭57-30474号公報
、特公昭58-10075号公報、特公昭59-4993号公報、特公昭61-35840号公報、特公昭62-24074号公報、特公昭62-36673号公報、特公平5-11958号公報、特公平7-112437号公報、特公平7-112438号公報参照）；その生育にＬ-ホモセリン等のアミノ酸を必要とする変異株（特
公昭48-28078号公報、特公昭56-6499号公報参照）；AECに耐性を示し、更にＬ-ロイシン
、Ｌ-ホモセリン、Ｌ-プロリン、Ｌ-セリン、Ｌ-アルギニン、Ｌ-アラニン、Ｌ-バリン等のアミノ酸を要求する変異株（米国特許第3708395号及び第3825472号明細書参照）；ＤＬ-α-アミノ-ε-カプロラクタム、α-アミノ-ラウリルラクタム、アスパラギン酸-アナロ
グ、スルファ剤、キノイド、Ｎ-ラウロイルロイシンに耐性を示すＬ-リジン生産変異株；オキザロ酢酸脱炭酸酵素（デカルボキシラーゼ）または呼吸系酵素阻害剤の耐性を示すＬ-リジン生産変異株（特開昭50-53588号公報、特開昭50-31093号公報、特開昭52-102498号公報、特開昭53-9394号公報、特開昭53-86089号公報、特開昭55-9783号公報、特開昭55-9759号公報、特開昭56-32995号公報、特開昭56-39778号公報、特公昭53-43591号公報、特
公昭53-1833号公報）；イノシトールまたは酢酸を要求するＬ-リジン生産変異株（特開昭55-9784号公報、特開昭56-8692号公報）；フルオロピルビン酸または34℃以上の温度に対して感受性を示すＬ-リジン生産変異株（特開昭55-9783号公報、特開昭53-86090号公報）；エチレングリコールに耐性を示し、Ｌ-リジンを生産するブレビバクテリウム属または
コリネバクテリウム属の生産変異株（米国特許第4411997号明細書）などが挙げられる。
【０１３２】
Ｌ-システイン生産菌
Ｌ-システイン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、フィードバック阻
害耐性のセリンアセチルトランスフェラーゼをコードする異なるcysEアレルで形質転換されたE. coli JM15(米国特許第6,218,168号、ロシア特許出願第2003121601号)、細胞に毒
性の物質を排出するのに適したタンパク質をコードする過剰発現遺伝子を有するE. coli W3110 (米国特許第5,972,663号)、システインデスルフォヒドラーゼ活性が低下したE. coli株 (特開平11-155571号)、cysB遺伝子によりコードされる正のシステインレギュロンの転写制御因子の活性が上昇したE. coli W3110 (国際公開第0127307号)などのエシェリヒ
ア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３３】
Ｌ-ロイシン生産菌
Ｌ-ロイシン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、ロイシン耐性のE. coil株 (例えば、57株 (VKPM B-7386, 米国特許第6,124,121号))またはβ-２-チエニルアラニン、３-ヒドロキシロイシン、４-アザロイシン、5,5,5-トリフルオロロイシンなどのロ
イシンアナログ耐性のE. coli株(特公昭62-34397号及び特開平8-70879号)、国際公開第96/06926号に記載された遺伝子工学的方法で得られたE. coli株、E. coli H-9068 (特開平8-70879号)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３４】
本発明に用いる細菌は、Ｌ-ロイシン生合成に関与する遺伝子の１種以上の発現が増大
されることにより改良されていてもよい。このような遺伝子の例としては、好ましくはＬ-ロイシンによるフィードバック阻害が解除されたイソプロピルマレートシンターゼをコ
ードする変異leuA遺伝子(米国特許第6,403,342号)に代表される、leuABCDオペロンの遺伝子が挙げられる。さらに、本発明に用いる細菌は、細菌の細胞からＬ-アミノ酸を排出す
るタンパク質をコードする遺伝子の１種以上の発現が増大されることにより改良されていてもよい。このような遺伝子の例としては、b2682遺伝子及びb2683遺伝子(ygaZH遺伝子) (欧州特許出願公開第1239041号)が挙げられる。
【０１３５】
コリネ型細菌のＬ-イソロイシン生産菌としては、分岐鎖アミノ酸排出タンパク質をコ
ードするbrnE遺伝子を増幅したコリネ型細菌（特開2001-169788）、Ｌ-リジン生産菌とのプロトプラスト融合によりＬ-イソロイシン生産能を付与したコリネ型細菌（特開昭62-74293）、ホモセリンデヒドロゲナーゼを強化したコリネ型細菌（特開昭62-91193）、スレ
オニンハイドロキサメート耐性株（特開昭62-195293）、α-ケトマロン耐性株（特開昭61-15695）、メチルリジン耐性株（特開昭61-15696）が挙げられる。
【０１３６】
Ｌ-ヒスチジン生産菌
Ｌ-ヒスチジン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、E. coli 24株 (VKPM B-5945、ロシア特許第2003677号)、E. coli 80株 (VKPM B-7270、ロシア特許第2119536号)、E. coli NRRL B-12116 - B12121 (米国特許第4,388,405号)、E. coli H-9342 (FERM
BP-6675)及びH-9343 (FERM BP-6676) (米国特許第6,344,347号)、E. coli H-9341 (FERM
BP-6674) (欧州特許出願公開第1085087号)、E. coli AI80/pFM201 (米国特許第6,258,554号)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３７】
Ｌ-ヒスチジン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、Ｌ-ヒスチジン生合成系酵素をコードする遺伝子の１種以上の発現が増大した株も挙げられる。かかる遺伝子の例としては、ATPフォスフォリボシルトランスフェラーゼ遺伝子(hisG)、フォスフォリ
ボシルAMPサイクロヒドロラーゼ遺伝子(hisI)、フォスフォリボシル-ATPピロフォスフォ
ヒドロラーゼ遺伝子(hisI)、フォスフォリボシルフォルミミノ-5-アミノイミダゾールカ
ルボキサミドリボタイドイソメラーゼ遺伝子(hisA)、アミドトランスフェラーゼ遺伝子(hisH)、ヒスチジノールフォスフェイトアミノトランスフェラーゼ遺伝子(hisC)、ヒスチジノールフォスファターゼ遺伝子(hisB)、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ遺伝子(hisD)などが挙げられる。
【０１３８】
hisG及びhisBHAFIにコードされるＬ-ヒスチジン生合成系酵素はＬ-ヒスチジンにより阻害されることが知られており、従って、Ｌ-ヒスチジン生産能は、ATPフォスフォリボシルトランスフェラーゼ遺伝子(hisG)にフィードバック阻害への耐性を付与する変異を導入することにより効率的に増大させることができる(ロシア特許第2003677号及び第2119536号)。
【０１３９】
Ｌ-ヒスチジン生産能を有する株の具体例としては、Ｌ-ヒスチジン生合成系酵素をコードするDNAを保持するベクターを導入したE. coli FERM-P 5038及び5048 (特開昭56-005099号)、アミノ酸輸送の遺伝子を導入したE. coli株(欧州特許出願公開第1016710号)、スルファグアニジン、DL-1,2,4-トリアゾール-3-アラニン及びストレプトマイシンに対する耐性を付与したE. coli 80株(VKPM B-7270, ロシア特許第2119536号)などが挙げられる。
【０１４０】
Ｌ-グルタミン酸生産菌
Ｌ-グルタミン酸生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、E. coli VL334thrC+ (EP 1172433)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。E. coli VL334 (VKPM B-1641)は、thrC遺伝子及びilvA遺伝子に変異を有するＬ-イソロイシン及びＬ-スレオニン要求性株である(米国特許第4,278,765号)。thrC遺伝子の野生型アレルは、野生型E. coli K-12株 (VKPM B-7)の細胞で増殖したバクテリオファージP1
を用いる一般的形質導入法により導入された。この結果、Ｌ-イソロイシン要求性のＬ-グルタミン酸生産菌VL334thrC+ (VKPM B-8961) が得られた。
【０１４１】
Ｌ-グルタミン酸生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、Ｌ-グルタミン酸生合成系酵素１種又は２種以上の活性が増強された株が挙げられるが、これらに限定されない。かかる遺伝子の例としては、グルタメートデヒドロゲナーゼ（gdhA）、グルタミンシンテターゼ(glnA)、グルタメートシンテターゼ(gltAB)、イソシトレートデヒドロゲナ
ーゼ(icdA)、アコニテートヒドラターゼ(acnA, acnB)、クエン酸シンターゼ(gltA)、メチルクエン酸シンターゼ（prpC）、フォスフォエノールピルベートカルボシラーゼ(ppc)、
ピルベートデヒドロゲナーゼ(aceEF, lpdA)、ピルベートキナーゼ(pykA, pykF)、フォス
フォエノールピルベートシンターゼ(ppsA)、エノラーゼ(eno)、フォスフォグリセロムタ
ーゼ(pgmA, pgmI)、フォスフォグリセレートキナーゼ(pgk)、グリセルアルデヒド-3-フォスフェートデヒドロゲナーゼ(gapA)、トリオースフォスフェートイソメラーゼ(tpiA)、フルクトースビスフォスフェートアルドラーゼ(fbp)、フォスフォフルクトキナーゼ（pfkA,
pfkB）、グルコースフォスフェートイソメラーゼ(pgi)などが挙げられる。これらの酵素の中では、グルタメートデヒドロゲナーゼ、クエン酸シンターゼ、フォスフォエノールピルベートカルボキシラーゼ、及びメチルクエン酸シンターゼが好ましい。
【０１４２】
シトレートシンテターゼ遺伝子、フォスフォエノールピルベートカルボキシラーゼ遺伝子、及び／またはグルタメートデヒドロゲナーゼ遺伝子の発現が増大するように改変された株の例としては、欧州特許出願公開第1078989号、欧州特許出願公開第955368号及び欧
州特許出願公開第952221号に開示されたものが挙げられる。
【０１４３】
Ｌ-グルタミン酸生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、Ｌ-グルタミン酸の生合成経路から分岐してＬ-グルタミン酸以外の化合物の合成を触媒する酵素の活性が
低下または欠損している株も挙げられる。このような酵素の例としては、イソシトレートリアーゼ(aceA)、α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ(sucA)、フォスフォトランスア
セチラーゼ(pta)、アセテートキナーゼ(ack)、アセトヒドロキシ酸シンターゼ(ilvG)、アセトラクテートシンターゼ(ilvI)、フォルメートアセチルトランスフェラーゼ(pfl)、ラ
クテートデヒドロゲナーゼ(ldh)、グルタメートデカルボキシラーゼ(gadAB)などが挙げられる。α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ活性が欠損した、または、α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ活性が低下したエシェリヒア属に属する細菌、及び、それらの取得方法は米国特許第5,378,616 号及び第5,573,945号に記載されている。
【０１４４】
具体例としては下記のものが挙げられる。
E. coli W3110sucA::Kmr
E. coli AJ12624 (FERM BP-3853)
E. coli AJ12628 (FERM BP-3854)
E. coli AJ12949 (FERM BP-4881)
【０１４５】
E. coli W3110sucA::Kmr は、E. coli W3110のα-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ
遺伝子（以下、「sucA遺伝子」ともいう）を破壊することにより得られた株である。この株は、α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼを完全に欠損している。
【０１４６】
また、α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ活性が低下したコリネ型細菌としては、
例えば、以下の株が挙げられる。
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムL30-2株（特開2006-340603号明細書）
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムΔS株（国際公開95/34672号パンフレット）
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ12821(FERM BP-4172；フランス特許公報9401748号明細書参照)
ブレビバクテリウム・フラバムAJ12822 (FERM BP-4173；フランス特許公報9401748号明細書)
コリネバクテリウム・グルタミカムAJ12823(FERM BP-4174；フランス特許公報9401748号
明細書)
コリネバクテリウム・グルタミカムL30-2株（特開2006-340603号）
【０１４７】
Ｌ-グルタミン酸生産菌の他の例としては、エシェリヒア属に属し、アスパラギン酸代
謝拮抗物質に耐性を有するものが挙げられる。これらの株は、α-ケトグルタレートデヒ
ドロゲナーゼを欠損していてもよく、例えば、E. coli AJ13199 (FERM BP-5807) (米国特許第5,908,768号)、さらにＬ-グルタミン酸分解能が低下したFFRM P-12379(米国特許第5,393,671号); AJ13138 (FERM BP-5565) (米国特許第6,110,714号)などが挙げられる。
【０１４８】
パントエア・アナナティスのＬ-グルタミン酸生産菌の例としては、パントエア・アナ
ナティスAJ13355株が挙げられる。同株は、静岡県磐田市の土壌から、低pHでＬ-グルタミン酸及び炭素源を含む培地で増殖できる株として分離された株である。パントエア・アナナティスAJ13355は、1998年2月19日に、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（住所  〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に、受託番号FERM P-16644として寄託され、1999年1月11日にブダペスト条約に基づく国際寄託
に移管され、受託番号FERM BP-6614が付与されている。尚、同株は、分離された当時はエンテロバクター・アグロメランス（Enterobacter agglomerans）と同定され、エンテロバクター・アグロメランスAJ13355として寄託されたが、近年16S rRNAの塩基配列解析など
により、パントエア・アナナティス（Pantoea ananatis）に再分類されている。
【０１４９】
また、パントエア・アナナティスのＬ-グルタミン酸生産菌として、α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ（αKGDH）活性が欠損した、または、αKGDH活性が低下したパントエア属に属する細菌が挙げられる。このような株としては、AJ13355株のαKGDH-E1サブユニット遺伝子（sucA）を欠損させたAJ13356(米国特許第6,331,419号)、及びAJ13355株から
粘液質低生産変異株として選択されたSC17株由来のsucA遺伝子欠損株であるSC17sucA(米
国特許第6,596,517号)がある。AJ13356は、1998年2月19日、工業技術院生命工学工業技術研究所（現 独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に受託番号FERM P-16645として寄託され
、1999年1月11日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-6616
が付与されている。AJ13355及びAJ13356は、上記寄託機関にEnterobacter agglomeransとして寄託されているが、本明細書では、Pantoea ananatisとして記載する。また、SC17sucA株は、ブライベートナンバーAJ417が付与され、2004年2月26日に上記の産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号FERM BP-08646として寄託されている。
【０１５０】
さらに、パントエア・アナナティスのＬ-グルタミン酸生産菌として、SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB株、AJ13601株、NP106株、及びNA1株が挙げられる。SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB株は、SC17sucA株に、エシェリヒア・コリ由来のクエン酸シンターゼ遺伝子（gltA）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子（ppsA）、およびグルタメートデヒドロゲナーゼ遺伝子（gdhA）を含むプラスミドRSFCPG、並びに、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム由来のクエン酸シンターゼ遺伝子（gltA）を含むプラスミドpSTVCBを導入して得た株である。AJ13601株は、このSC17sucA/RSFCPG+pSTVCB株から低pH下で高濃度のＬ-グ
ルタミン酸に耐性を示す株として選択された株である。また、NP106株は、AJ13601株からプラスミドRSFCPG+pSTVCBを脱落させた株である。AJ13601株は、1999年8月18日に、独立
行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（〒305-8566 日本国茨城県つくば
市東１丁目１番地１ 中央第６）に受託番号FERM P-17516として寄託され、2000年7月6日
にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-7207が付与されている。
【０１５１】
さらにコリネ型細菌にＬ-グルタミン酸生産能を付与する方法として、メカノセンシテ
ィブチャンネル（mechanosensitive channel）をコードするyggB遺伝子を増幅する方法（国際公開WO2006/070944号）、コード領域内に変異を導入した変異型yggB遺伝子を導入す
る方法を用いることも可能である。yggB遺伝子は、GenBank Accession No. NC_003450で
登録されているコリネバクテリウム・グルタミカム ATCC 13032株のゲノム配列上の塩基
番号1,337,692〜1,336,091（相補鎖）に位置し、NCgl1221とも呼ばれるGenBank accession No. NP_600492にて登録されている膜タンパク質をコードする遺伝子である。
【０１５２】
Ｌ-グルタミン酸生産能を付与または増強する別の方法として、有機酸アナログや呼吸
阻害剤などへの耐性を付与する方法や細胞壁合成阻害剤に対する感受性を付与する方法も挙げられる。例えば、モノフルオロ酢酸耐性を付与する方法（特開昭50-113209）、アデ
ニン耐性またはチミン耐性を付与する方法（特開昭57-065198）、ウレアーゼを弱化させ
る方法（特開昭52-038088）、マロン酸耐性を付与する方法（特開昭52-038088）、ベンゾピロンまたはナフトキノン類への耐性を付与する方法（特開昭56-1889）、HOQNO耐性を付与する方法（特開昭56-140895）、α-ケトマロン酸耐性を付与する方法（特開昭57-2689
）、グアニジン耐性を付与する方法（特開昭56-35981）、ペニシリンに対する感受性を付与する方法（特開平4-88994）などが挙げられる。
【０１５３】
このような耐性菌の具体例としては、下記のような菌株が挙げられる。
ブレビバクテリウム・フラバムAJ3949  (FERM BP-2632：特開昭50-113209参照)
コリネバクテリウム・グルタミカムAJ11628 (FERM P-5736；特開昭57-065198参照)
ブレビバクテリウム・フラバムAJ11355(FERM P-5007；特開昭56-1889号公報参照)
コリネバクテリウム・グルタミカムAJ11368(FERM P-5020；特開昭56-1889号公報参照)
ブレビバクテリウム・フラバムAJ11217(FERM P-4318；特開昭57-2689号公報参照)
コリネバクテリウム・グルタミカムAJ11218(FERM P-4319；特開昭57-2689号公報参照)
ブレビバクテリウム・フラバムAJ11564(FERM P-5472；特開昭56-140895公報参照)
ブレビバクテリウム・フラバムAJ11439(FERM P-5136；特開昭56-35981号公報参照)
コリネバクテリウム・グルタミカムH7684(FERM BP-3004；特開平04-88994号公報参照)
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ11426（FERM P-5123；特開平56-048890号
公報参照）
コリネバクテリウム・グルタミカムAJ11440（FERM P-5137；特開平56-048890号公報参照
）
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ11796（FERM P-6402；特開平58-158192号
公報参照）
【０１５４】
Ｌ-フェニルアラニン生産菌
Ｌ-フェニルアラニン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、コリスミ酸
ムターゼ-プレフェン酸デヒドロゲナーゼ及びチロシンリプレッサーを欠損したE. coli AJ12739 (tyrA::Tn10, tyrR) (VKPM B-8197)(国際公開03/044191号)、フィードバック阻害が解除されたコリスミ酸ムターゼ-プレフェン酸デヒドラターゼをコードする変異型pheA34遺伝子を保持するE. coli HW1089 (ATCC 55371) (米国特許第 5,354,672号)、E. coli MWEC101-b (KR8903681)、E. coli NRRL B-12141, NRRL B-12145, NRRL B-12146及びNRRL B-12147 (米国特許第4,407,952号)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これ
らに限定されない。また、親株として、フィードバック阻害が解除されたコリスミ酸ムターゼ-プレフェン酸デヒドラターゼをコードする遺伝子を保持するE. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHAB] (FERM BP-3566)、E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHAD] (FERM BP-12659)、E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHATerm] (FERM BP-12662)及びAJ 12604と命名されたE. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pBR-aroG4, pACMAB] (FERM BP-3579)も使用できる(EP 488424 B1)。さらに、yedA遺伝子またはyddG遺伝子にコードされるタンパク質の活性が増大したエシェリヒア属に属するＬ-フェニルアラニン生産菌も使用できる(米国特許出願公開2003/0148473号及び2003/0157667、国際公開03/044192号)。
【０１５５】
コリネ型細菌のフェニルアラニン生産菌としては、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼまたはピルビン酸キナーゼ活性が低下したコリネバクテリウム・グルタミカBPS-13株 (FERM BP-1777, K77 (FERM BP-2062) 及び K78 (FERM BP-2063)（欧州特許公開公報331145号、特開平 02-303495号）、チロシン要求性株（特開平05-049489）等を使用する
ことができる。
【０１５６】
また、フェニルアラニン生産菌としては、副生物を細胞内に取り込むように改変すること、例えば、Ｌ-トリプトファンの取り込み遺伝子tnaB, mtrや、Ｌ-チロシンの取り込み
遺伝子であるtyrPの発現量を向上させることによっても、効率よくＬ-フェニルアラニン
を生産する菌株を取得することができる（EP1484410）。
【０１５７】
Ｌ-トリプトファン生産菌
Ｌ-トリプトファン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、変異trpS遺伝
子によりコードされるトリプトファニル-tRNAシンテターゼが欠損したE. coli JP4735/pMU3028 (DSM10122)及びJP6015/pMU91 (DSM10123) (米国特許第5,756,345号)、セリンによ
るフィードバック阻害を受けないフォスフォグリセリレートデヒドロゲナーゼをコードするserAアレル及びトリプトファンによるフィードバック阻害を受けないアントラニレートシンターゼをコードするtrpEアレルを有するE. coli SV164 (pGH5) (米国特許第6,180,373号)、トリプトファナーゼが欠損したE. coli AGX17 (pGX44) (NRRL B-12263)及びAGX6(pGX50)aroP (NRRL B-12264) (米国特許第4,371,614号)、フォスフォエノールピルビン酸生産能が増大したE. coli AGX17/pGX50,pACKG4-pps (WO9708333, 米国特許第6,319,696号)
などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。yedA遺伝子またはyddG遺伝子にコードされるタンパク質の活性が増大したエシェリヒア属に属するＬ-
トリプトファン生産菌も使用できる(米国特許出願公開2003/0148473及び2003/0157667)。
【０１５８】
Ｌ-トリプトファン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、アントラニレ
ートシンターゼ(trpE)、フォスフォグリセレートデヒドロゲナーゼ(serA)、３-デオキシ-Ｄ-アラビノヘプツロン酸-７-リン酸シンターゼ(aroG)、３-デヒドロキネートシンターゼ(aroB)、シキミ酸デヒドロゲナーゼ(aroE)、シキミ酸キナーゼ(aroL)、５-エノール酸ピ
ルビルシキミ酸３-リン酸シンターゼ(aroA)、コリスミ酸シンターゼ(aroC)、プレフェン
酸デヒドラターゼ、コリスミ酸ムターゼ及び、トリプトファンシンターゼ(trpAB)から選
ばれる１種又は２種以上の酵素の活性が増強された株も挙げられる。プレフェン酸デヒドラターゼ及びコリスミ酸ムターゼは、２機能酵素（chorismate mutase/prephenate dehydrogenase (CM/PDH) ）としてpheA遺伝子によってコードされている。これらの酵素の中では、フォスフォグリセレートデヒドロゲナーゼ、３-デオキシ-Ｄ-アラビノヘプツロン酸-７-リン酸シンターゼ、３-デヒドロキネートシンターゼ、シキミ酸デヒドラターゼ、シキミ酸キナーゼ、５-エノール酸ピルビルシキミ酸３-リン酸シンターゼ、コリスミ酸シンターゼ、プレフェン酸デヒドラターゼ、コリスミン酸ムターゼ-プレフェン酸デヒドロゲナ
ーゼが特に好ましい。アントラニレートシンターゼ及びフォスフォグリセレートデヒドロゲナーゼは共にＬ-トリプトファン及びＬ-セリンによるフィードバック阻害を受けるので、フィードバック阻害を解除する変異をこれらの酵素に導入してもよい。このような変異
を有する株の具体例としては、脱感作型アントラニレートシンターゼを保持するE. coli SV164、及び、フィードバック阻害が解除されたフォスフォグリセレートデヒドロゲナー
ゼをコードする変異serA遺伝子を含むプラスミドpGH5 (国際公開94/08031号)をE. coli SV164に導入することにより得られた形質転換株が挙げられる。
【０１５９】
Ｌ-トリプトファン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、阻害解除型ア
ントラニレートシンターゼをコードする遺伝子を含むトリプトファンオペロンが導入された株(特開昭57-71397号, 特開昭62-244382号, 米国特許第4,371,614号)も挙げられる。さらに、トリプトファンオペロン(trpBA)中のトリプトファンシンターゼをコードする遺伝
子の発現を増大させることによりＬ-トリプトファン生産能を付与してもよい。トリプト
ファンシンターゼは、それぞれtrpA及びtrpB遺伝子によりコードされるα及びβサブユニットからなる。さらに、イソシトレートリアーゼ-マレートシンターゼオペロンの発現を
増大させることによりＬ-トリプトファン生産能を改良してもよい(国際公開2005/103275
号)。
【０１６０】
コリネ型細菌としてはサルフアグアニジンに耐性株であるコリネバクテリウム・グルタミクムAJ12118（FERM BP-478 特許01681002号）、トリプトファンオペロンが導入された
コリネ型細菌（特開昭63240794号公報）、コリネ型細菌由来のシキミ酸キナーゼをコードする遺伝子を導入したコリネ型細菌（特開01994749号公報）を用いることができる。
【０１６１】
Ｌ-プロリン生産菌
Ｌ-プロリン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、ilvA遺伝子が欠損し
、Ｌ-プロリンを生産できるE. coli 702ilvA (VKPM B-8012) (欧州特許公開公報1,172,433号)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６２】
本発明に用いる細菌は、Ｌ-プロリン生合成に関与する遺伝子の一種以上の発現を増大
することにより改良してもよい。Ｌ-プロリン生産菌に好ましい遺伝子の例としては、Ｌ-プロリンによるフィードバック阻害が解除されたグルタメートキナーゼをコードするproB遺伝子(ドイツ特許第3127361号)が挙げられる。さらに、本発明に用いる細菌は、細菌の
細胞からＬ-アミノ酸を排出するタンパク質をコードする遺伝子の一種以上の発現が増大
することにより改良してもよい。このような遺伝子としては、b2682 遺伝子及びb2683遺
伝子(ygaZH遺伝子) (欧州特許公開公報1,239,041号)が挙げられる。
【０１６３】
Ｌ-プロリン生産能を有するエシェリヒア属に属する細菌の例としては、NRRL B-12403
及びNRRL B-12404 (英国特許第2075056号)、VKPM B-8012 (ロシア特許出願2000124295)、ドイツ特許第3127361号に記載のプラスミド変異体、Bloom F.R. et al (The 15th Miami winter symposium, 1983, p.34)に記載のプラスミド変異体などのE. coli 株が挙げられ
る。
【０１６４】
Ｌ-アルギニン生産菌
Ｌ-アルギニン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、E. coli 237株 (VKPM B-7925) (米国特許出願公開2002/058315号)、及び、変異N-アセチルグルタメートシンターゼを保持するその誘導株(ロシア特許出願第2,001,112,869号)、E. coli 382株 (VKPM
B-7926) (欧州特許公開公報1,170,358号)、N-アセチルグルタメートシンテターゼをコードするargA遺伝子が導入されたアルギニン生産株(欧州特許公開公報1,170,361号)などの
エシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６５】
Ｌ-アルギニン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、Ｌ-アルギニン生合成系酵素をコードする遺伝子の１種以上の発現が増大した株も挙げられる。かかる遺伝子の例としては、N-アセチルグルタミルフォスフェートレダクターゼ遺伝子(argC)、オルニ
チンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子(argJ)、N-アセチルグルタメートキナーゼ遺伝子(argB)、アセチルオルニチントランスアミナーゼ遺伝子(argD)、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ遺伝子(argF)、アルギノコハク酸シンテターゼ遺伝子(argG)、アルギノコハク酸リアーゼ遺伝子(argH)、カルバモイルフォスフェートシンテターゼ遺伝子(carAB)が挙げられる。
【０１６６】
Ｌ-バリン生産菌
Ｌ-バリン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、ilvGMEDAオペロンを過
剰発現するように改変された株(米国特許第5,998,178号)が挙げられるが、これらに限定
されない。アテニュエーションに必要なilvGMEDAオペロンの領域を除去し、生産されるＬ-バリンによりオペロンの発現が減衰しないようにすることが好ましい。さらに、オペロ
ンのilvA遺伝子が破壊され、スレオニンデアミナーゼ活性が減少することが好ましい。
Ｌ-バリン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、アミノアシルt-RNAシンテターゼの変異を有する変異株(米国特許第5,658,766号)も挙げられる。例えば、イソロ
イシンtRNAシンテターゼをコードするileS 遺伝子に変異を有するE. coli VL1970が使用
できる。E. coli VL1970は、1988年6月24日、ロシアン・ナショナル・コレクション・オ
ブ・インダストリアル・マイクロオルガニズムズ(VKPM) (1 Dorozhny proezd., 1 Moscow
117545, Russia)に、受託番号VKPM B-4411で寄託されている。
【０１６７】
さらに、生育にリポ酸を要求する、及び／または、H+-ATPaseを欠失している変異株(国際公開96/06926号)を親株として用いることができる。
【０１６８】
コリネ型細菌のＬ-バリン生産菌としては、例えば、Ｌ-バリン酸生合成に関与する酵素をコードする遺伝子の発現が増強するように改変した菌株を挙げることができる。Ｌ-バ
リン酸生合成に関与する酵素としては、例えば、ilvBNCオペロンによりコードされる酵素、すなわちilvBNによりコードされるアセトヒドロキシ酸シンターゼやivlCによりコード
されるイソメロリダクターゼ(国際公開00/50624号)が挙げられる。尚、ilvBNCオペロンは、Ｌ-バリン及び/又はＬ-イソロイシン及び/又はＬ-ロイシンによるオペロンの発現調節
を受けるので、生成するＬ-バリンによる発現抑制を解除するためにアテニュエーション
を解除することが望ましい。
【０１６９】
Ｌ-バリン生産能を有するコリネ型細菌としては、Ｌ-バリン産生を減少させる物質代謝経路に関与する、少なくとも１種の酵素の活性を低下あるいは欠損させることにより行ってもよい。例えば、Ｌ-ロイシン合成に関与するスレオニンデヒドラターゼやD-パントセ
ナート合成に関与する酵素の活性を低下させることが考えられる（国際公開00/50624号）。
【０１７０】
Ｌ-バリン生産能を付与する別の方法として、アミノ酸アナログなどへの耐性を付与す
る方法も挙げられる。
【０１７１】
例えば、Ｌ-イソロイシンおよびＬ-メチオニン要求性，ならびにＤ-リボ-ス，プリンリボヌクレオシドまたはピリミジンリボヌクレオシドに耐性を有し，かつＬ-バリン生産能
を有する変異株（FERM P-1841、FERM P-29、特公昭53-025034） や、ポリケトイド類に耐性を有する変異株(FERM P-1763、FERM P-1764、特公平06-065314) 、更には酢酸を唯一の炭素源とする培地でＬ-バリン耐性を示し、且つグルコースを唯一の炭素源とする培地で
ピルビン酸アナログ(フルオロピルビン酸等)に感受性を有する変異株（FERM BP-3006、FERM BP-3007、特許3006929号）が挙げられる。
【０１７２】
Ｌ-イソロイシン生産菌
Ｌ-イソロイシン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、６-ジメチルアミ
ノプリンに耐性を有する変異株(特開平5-304969号)、チアイソロイシン、イソロイシンヒドロキサメートなどのイソロイシンアナログに耐性を有する変異株、さらにDL-エチオニ
ン及び／またはアルギニンヒドロキサメートに耐性を有する変異株(特開平5-130882号).
が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、スレオニンデアミナーゼ、アセトヒドロキシ酸シンターゼなどのＬ-イソロイシン生合成に関与するタンパク質をコードする遺
伝子で形質転換された組換え株もまた親株として使用できる(特開平2-458号, FR 0356739, 及び米国特許第5,998,178号)。
【０１７３】
コリネ型細菌のＬ-イソロイシン生産菌としては、分岐鎖アミノ酸排出タンパク質をコ
ードするbrnE遺伝子を増幅したコリネ型細菌（特開2001-169788）、Ｌ-リジン生産菌とのプロトプラスト融合によりＬ-イソロイシン生産能を付与したコリネ型細菌（特開昭62-74293）、ホモセリンデヒドロゲナーゼを強化したコリネ型細菌（特開昭62-91193）、スレ
オニンハイドロキサメート耐性株（特開昭62-195293）、α-ケトマロン耐性株（特開昭61-15695）、メチルリジン耐性株（特開昭61-15696）が挙げられる。
【０１７４】
Ｌ-メチオニン生産菌
Ｌ-メチオニン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、Ｌ-スレオニン要求株、ノルロイシンに耐性を有する変異株が挙げられるが、これらに限定されない(特開2000-139471号)。さらに、メチオニンリプレッサーを欠損した株や、ホモセリントランスサ
クシニラーゼ、シスタチオニンγ-シンテースなどのＬ-メチオニン生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子で形質転換された組換え株もまた親株として使用できる(特開2000-139471号)。
【０１７５】
遺伝子組換えにより、上記のＬ-アミノ酸生産菌を育種する場合、使用する遺伝子は、
上述した遺伝子情報を持つ遺伝子や、公知の配列を有する遺伝子に限られず、コードされるタンパク質の機能が損なわれない限り、その遺伝子のホモログや人為的な改変体等、保存的変異を有する遺伝子も使用することができる。すなわち、公知のタンパク質のアミノ酸配列において、１若しくは数個の位置での１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加等を含む配列を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。
【０１７６】
ここで、「１若しくは数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置やアミノ酸残基の種類によっても異なるが、具体的には好ましくは1〜20個、より好まし
くは1〜10個、さらに好ましくは1〜5個を意味する。また、保存的変異とは、置換部位が
芳香族アミノ酸である場合には、Phe、Trp、Tyr間で、置換部位が疎水性アミノ酸である
場合には、Leu、Ile、Val間で、極性アミノ酸である場合には、Gln、Asn間で、塩基性ア
ミノ酸である場合には、Lys、Arg、His間で、酸性アミノ酸である場合には、Asp、Glu間
で、ヒドロキシル基を持つアミノ酸である場合には、Ser、Thr間でお互いに置換する変異である。保存的変異の代表的なものは、保存的置換であり、保存的置換とみなされる置換としては、具体的には、AlaからSer又はThrへの置換、ArgからGln、His又はLysへの置換
、AsnからGlu、Gln、Lys、His又はAspへの置換、AspからAsn、Glu又はGlnへの置換、Cys
からSer又はAlaへの置換、GlnからAsn、Glu、Lys、His、Asp又はArgへの置換、GluからGly、Asn、Gln、Lys又はAspへの置換、GlyからProへの置換、HisからAsn、Lys、Gln、Arg又はTyrへの置換、IleからLeu、Met、Val又はPheへの置換、LeuからIle、Met、Val又はPhe
への置換、LysからAsn、Glu、Gln、His又はArgへの置換、MetからIle、Leu、Val又はPhe
への置換、PheからTrp、Tyr、Met、Ile又はLeuへの置換、SerからThr又はAlaへの置換、ThrからSer又はAlaへの置換、TrpからPhe又はTyrへの置換、TyrからHis、Phe又はTrpへの
置換、及び、ValからMet、Ile又はLeuへの置換が挙げられる。また、上記のようなアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、または逆位等には、遺伝子が由来する微生物の個体差、種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（mutant又はvariant）によって生じるもの
も含まれる。このような遺伝子は、例えば、部位特異的変異法によって、コードされるタ
ンパク質の特定の部位のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入または付加を含むように公知の遺伝子の塩基配列を改変することによって取得することができる。
【０１７７】
さらに、上記のような保存的変異を有する遺伝子は、コードされるアミノ酸配列全体に対して、80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、特に好ましくは97%以上の相同性を有し、かつ、野生型タンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。
【０１７８】
また、遺伝子の配列におけるそれぞれのコドンは、遺伝子が導入される宿主で使用しやすいコドンに置換したものでもよい。
【０１７９】
保存的変異を有する遺伝子は、変異剤処理等、通常変異処理に用いられる方法によって取得されたものであってもよい。
【０１８０】
また、遺伝子は、公知の遺伝子配列の相補配列又はその相補配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、公知の遺伝子産物と同等の機能を有するタンパク質をコードするDNAであってもよい。ここで、「ストリンジェントな条件
」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。一例を示せば、相同性が高いDNA同士、例えば80%以上、好ましくは90%
以上、より好ましくは95%以上、特に好ましくは97%以上の相同性を有するDNA同士がハイ
ブリダイズし、それより相同性が低いDNA同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通
常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である60℃、1×SSC、0.1% SDS、好ましくは、0.1×SSC、0.1% SDS、さらに好ましくは、68℃、0.1×SSC、0.1% SDSに相当する塩濃度、温度で、１回、より好ましくは２〜３回洗浄する条件が挙げられる。
【０１８１】
プローブとしては、遺伝子の相補配列の一部を用いることもできる。そのようなプローブは、公知の遺伝子配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、これらの塩基配列を含むDNA断片を鋳型とするPCRによって作製することができる。例えば、プローブとして、300 bp程度の長さのDNA断片を用いる場合には、ハイブリダイゼーション
の洗浄の条件は、50℃、2×SSC、0.1% SDSが挙げられる。
【０１８２】
＜３＞Ｌ-アミノ酸の製造法
本発明のＬ-アミノ酸の製造法は、本発明の脂肪酸類の製造方法により脂肪酸を調製し
、L−アミノ酸生産能を有する細菌を該脂肪酸を含む培地で培養し、培養物中にL-アミノ
酸を生産蓄積させ、該培養物からL-アミノ酸を採取することを特徴とする製造法である。
【０１８３】
培地に含まれる脂肪酸は、通常には、Ｌ−アミノ酸発酵の炭素源として使用される。「炭素源として」とは、細菌の増殖及びＬ-アミノ酸の製造において、菌体成分及びＬ-アミノ酸を構成する炭素の供給源として実質的に寄与し得ることを意味する。
【０１８４】
本発明の方法は、回分培養（batch culture）、流加培養（Fed-batch culture）、連続培養法（continuous culture）のいずれも用いることができ、培地中の中温処理物は初発培地に含まれていてもよいし、流加培地に含まれていてもよいし、これらの両方に含まれていてもよい。
【０１８５】
流加培養とは、培養容器に培地を連続的または間欠的に流加し、培養終了時までその培地を容器から抜き取らない培養方法をいう。また連続培養とは、培養容器に培地を連続的または間欠的に流加するとともに容器から培地（通常、流加する培地と等量）を抜き取る方法をいう。また、初発培地とは、流加培養または連続培養において流加培地を流加させる前の回分培養（batch培養）に用いる培地（培養開始時の培地）のことを意味し、流加
培地とは流加培養または連続培養を行う際に発酵槽に供給する培地を意味する。また、回分培養（batch培養）とは、一回毎に新たな培地を用意し、そこへ株を植えて収穫まで培
地を加えない方法を意味する。
【０１８６】
使用する脂肪酸は、Ｌ-アミノ酸を製造するのに適した濃度であればどのような濃度で
用いてもかまわない。通常には、０．０１〜１０ｗ／ｖ％、好ましくは０．０２〜５ｗ／ｖ％、さらに好ましくは０．０５〜２ｗ／ｖ％程度培地に含有させることが望ましい。炭素源として脂肪酸は、単独で用いることも出来るし、グルコース、フラクトース、スクロース、廃糖蜜、澱粉加水分解物などの他の炭素源と組み合わせて用いることも出来る。この場合、脂肪酸と他の炭素源は任意の比率で混合することが可能であるが、炭素源中の微細藻類により生産される有機物の比率は、１０重量％以上、より好ましくは５０重量％以上、より好ましくは７０重量％であることが望ましい。他の炭素源として好ましいのは、グルコース、フラクトース、スクロース、ラクトース、ガラクトース、廃糖蜜、澱粉加水分解物やバイオマスの加水分解により得られた糖液などの糖類、エタノール、グリセロールなどのアルコール類、フマール酸、クエン酸、コハク酸等の有機酸類である。  本発明においては、Byg-Dye法等で調整した残渣に脂肪酸が存在するが、上清に存在するグリセ
ロールも炭素源として使用してもよい。
【０１８７】
使用する培地は、脂肪酸を含むこと以外は、微生物を用いたＬ-アミノ酸の発酵生産に
おいて従来より用いられてきた培地を用いることができる。すなわち、炭素源に加えて、窒素源、無機イオン及び必要に応じその他の有機成分を含有する通常の培地を用いることができる。ここで、窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、ウレア等の無機アンモニウム塩または硝酸塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガス、アンモニア水等を用いることができる。また、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、麦芽エキス、コーンスティープリカー、大豆加水分解物等も利用できる。培地中にこれらの窒素源が１種のみ含まれていてもよいし、２種以上含んでいてもよい。これらの窒素源は、初発培地にも流加培地にも用いることができる。また、初発培地、流加培地とも、同じ窒素源を用いてもよいし、流加培地の窒素源を初発培地と異なるものを使用してもよい。
【０１８８】
本発明の培地には、炭素源、窒素源の他にリン酸源、硫黄源が含まれていることが好ましい。リン酸源としては、リン酸2水素カリウム、リン酸水素2カリウム、ピロリン酸などのリン酸ポリマー等が利用出来る。また、硫黄源とは、硫黄原子を含んでいるものであればいずれでもよいが、硫酸塩、チオ硫酸塩、亜硫酸塩等の硫酸塩、システイン、シスチン、グルタチオン等の含硫アミノ酸が望ましく、なかでも硫酸アンモニウムが望ましい。
【０１８９】
また、培地には、上記成分の他に、増殖促進因子（増殖促進効果を持つ栄養素）が含まれていてもよい。増殖促進因子とは、微量金属類、アミノ酸、ビタミン、核酸、更にこれらのものを含有するペプトン、カザミノ酸、酵母エキス、大豆たん白分解物等が使用できる。微量金属類としては、鉄、マンガン、マグネシウム、カルシウム等が挙げられ、ビタミンとしては、ビタミンB1、ビタミンB2、ビタミンB6、ニコチン酸、ニコチン酸アミド、ビタミンB12等が挙げられる。これらの増殖促進因子は初発培地に含まれていてもよいし
、流加培地に含まれていてもよい。
【０１９０】
また、培地には、生育にアミノ酸などを要求する栄養要求性変異株を使用する場合には要求される栄養素を補添することが好ましい。特に本発明に用いることができるＬ-リジ
ン生産菌は、後述のようにＬ-リジン生合成経路が強化されており、Ｌ-リジン分解能が弱化されているものが多いので、Ｌ-スレオニン、Ｌ-ホモセリン、Ｌ-イソロイシン、Ｌ-メチオニンから選ばれる１種又は２種以上を添加することが望ましい。初発培地と流加培地は、培地組成が同じであってもよく、異なっていてもよい。また、初発培地と流加培地は
、硫黄濃度が同じであってもよく、異なっていてもよい。さらには、流加培地の流加が多段階で行われる場合、各々の流加培地の組成は同じであってもよく、異なっていてもよい。
【０１９１】
なお、本発明で用いる培地は、炭素源、窒素源、及び必要に応じてその他の成分を含む培地であれば、天然培地、合成培地のいずれでもよい。
【０１９２】
培養は好気的条件下で１〜７日間実施するのがよく、培養温度は２０℃〜４５℃、好ましくは２４℃〜４５℃、特に好ましくは３３〜４２℃で培養することが好ましい。培養は通気培養が好ましく、酸素濃度は、飽和濃度に対して５〜５０％に、望ましくは１０％程度に調節して行うことが好ましい。また、培養中のｐＨは５〜９が好ましい。尚、ｐＨ調整には無機あるいは有機の酸性あるいはアルカリ性物質、例えば炭酸カルシウム、アンモニアガス、アンモニア水等を使用することができる。
【０１９３】
上記のような条件下で、好ましくは１０時間〜１２０時間程度培養することにより、培養液中に著量のＬ-アミノ酸が蓄積される。蓄積されるＬ-アミノ酸の濃度は培地又は菌体から採取、回収できる濃度であればいずれでもよいが、好ましくは１ｇ／Ｌ以上、より好ましくは５０ｇ／Ｌ以上、さらに好ましくは１００ｇ／Ｌ以上である。
【０１９４】
また、Ｌ−リジン等の塩基性アミノ酸を製造する際には、培養中のｐＨが６．５〜９．０、培養終了時の培地のｐＨが７．２〜９．０となるように制御し、発酵中の発酵槽内圧力が正となるように制御する、あるいは、炭酸ガスもしくは炭酸ガスを含む混合ガスを培地に供給して、培地中の重炭酸イオン及び／又は炭酸イオンが少なくとも２ｇ／Ｌ２０ｍＭ以上存在する培養期があるようにし、前記重炭酸イオン及び／又は炭酸イオンを塩基性アミノ酸を主とするカチオンのカウンタイオンとする方法で発酵し、目的の塩基性アミノ酸を回収する方法で製造を行ってもよい（特開2002-65287、US2002-0025564A、EP 1813677A）。
【０１９５】
また、L-グルタミン酸発酵においては、Ｌ-グルタミン酸が析出するような条件に調整
された液体培地を用いて、培地中にＬ-グルタミン酸を析出させながら培養を行うことも
出来る。Ｌ-グルタミン酸が析出する条件としては、例えば、ｐＨ５．０〜４．０、好ま
しくはｐＨ４．５〜４．０、さらに好ましくはｐＨ４．３〜４．０、特に好ましくはｐＨ４．０を挙げることができる。（欧州特許出願公開第1078989号明細書）
【０１９６】
培養液からのＬ-アミノ酸の回収は通常イオン交換樹脂法、沈殿法その他の公知の方法
を組み合わせることにより実施できる。なお、菌体内にＬ-アミノ酸が蓄積する場合には
、例えば菌体を超音波などにより破砕し、遠心分離によって菌体を除去して得られる上清からイオン交換樹脂法などによって、Ｌ-アミノ酸を回収することができる。回収される
Ｌ-アミノ酸は、フリー体のＬ-アミノ酸であっても、硫酸塩、塩酸塩、炭酸塩、アンモニウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩を含む塩であってもよい。
【０１９７】
また、本発明において採取されるL-アミノ酸は、目的とするL-アミノ酸以外に微生物菌体、培地成分、水分、及び微生物の代謝副産物を含んでいてもよい。採取されたL-アミノ酸の純度は、50％以上、好ましくは85％以上、特に好ましくは95%以上である (US5,431,933, JP1214636B, US4,956,471, US4,777,051, US4946654, US5,840358, US6,238,714, US2005/0025878)。
【実施例】
【０１９８】
以下、実施例にて、本発明を更に具体的に説明する。本実施例には、テキサス大学藻類カルチャーコレクション（The University of Texas at Austin, The Culture Collectio
n of Algae (UTEX), 1 University Station A6700, Austin, TX 78712-0183, USA）より
入手したChlorella kessleri 11h株（UTEX 263）、Chlorella kessleri UTEX398
、Chlorella sorokiniana UTEX1230、Scenedesmus dimorphus UTEX417、Scenedesmus obliquus UTEX B2630、Nannochloris sp UTEX LB1999、Nannochloris oculata UTEX LB1998
、Neochloris oleoabundans UTEX1185、Dunaliella tertiolecta UTEX LB999を用いた。
【０１９９】
＜実施例１＞微細藻類 Chlorella kessleri 11h株のメディウムビン培養
Chlorella kessleri 11h株を、800mLの0.2×ガンボーグB5培地（日本製薬）を入れた1000mL容メディウムビンにて30℃、光強度7,000 lux（TOMY社製培養装置CL-301）、400mL/minで空気と3% CO2の混合ガスを吹き込みながら、7日間培養し、これを前培養液とした。
尚、光源には、蛍光灯からの白色光を用いた。0.2×ガンボーグB5 培地800mLを入れた1000mL容メディウムビンに、前培養液16mLを添加し、培養温度30℃、光強度7,000 luxにて、400 mL/minで空気と3% CO2の混合ガスを吹き込みながら、14日間培養を行った。
【０２００】
(0.2×ガンボーグB5培地)
KNO3              500 mg/L
MgSO4・7H2O        50 mg/L
NaH2PO4・H2O       30 mg/L
CaCl2・2H2O        30 mg/L
（NH4）2SO4        26.8 mg/L
Na2-EDTA           7.46 mg/L
FeSO4・7H2O         5.56 mg/L
MnSO4・H2O          2 mg/L
H3BO3               0.6 mg/L
ZnSO4・7H2O         0.4 mg/L
KI                 0.15 mg/L
Na2MoO2・2H2O       0.05 mg/L
CuSO4・5H2O         0.005 mg/L
CoCl2・6H2O         0.005 mg/L
120℃ 15分          オートクレーブ殺菌
【０２０１】
＜実施例２＞藻類のアルコール添加反応における温度条件の検討
実施例１で得られた培養液を遠心分離し、その沈殿物に滅菌水を加え、１倍懸濁液を調製した。その1mlの懸濁液を1.5ml容量のエッペンチューブに入れ、再度遠心分離し、得られた沈殿物に200μlの30％メタノール水溶液を加えた後、懸濁した。それらの懸濁液を5
℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃の各温度、1,000rpmの旋回振盪で2hrインキュベートして、エステル交換反応を行った。得られたサンプルから脂質
をBligh-Dyer法に従って有機溶剤抽出を行い、脂肪酸メチルエステルの測定を行った。それらの測定結果を図１に示した。5℃、10℃及び15℃の低温度と45℃及び50℃の高温度で
は、脂肪酸エステルの収率が低い傾向であるが、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃及び45℃の比較的温和な条件では高い脂肪酸エステルの収率が確認された。
【０２０２】
＜実施例３＞藻類のアルコール添加反応におけるメタノール濃度の検討
実施例１で得られた培養液を遠心分離し、その沈殿物に滅菌水を加え、１倍懸濁液を調製した。その1mlの懸濁液を1.5ml容量のエッペンチューブに入れ、再度遠心分離し、得られた沈殿物に200μlの5%、10%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%の各濃度のメ
タノール水溶液を加えた後、懸濁した。それらの懸濁液を35℃、1,000rpmの旋回振盪で2hrインキュベートとして、エステル交換反応を行った。得られたサンプルから脂質をBligh-Dyer法に従って有機溶剤抽出を行い、脂肪酸メチルエステルの測定を行った。それらの
測定結果を図２に示した。5%、10%及び20%の低濃度メタノール溶液と 50%及び55%の高濃
度メタノール溶液では、脂肪酸エステルの収率が低い傾向であるが、25%、30%、35%、40%及び45%のメタノール添加濃度では高い脂肪酸エステルの収率が確認された。
【０２０３】
＜実施例４＞藻類のアルコール添加反応におけるpH条件の検討
実施例１で得られた培養液を遠心分離し、その沈殿物に滅菌水を加え、１倍懸濁液を調製した。その懸濁液に１N HCl溶液又は１N NaCl溶液を加えて、pH3.0、pH4.5、pH6.0、pH7.5、pH9.0、pH10.5、pH11.5に調整した後、それぞれの懸濁液1mlを1.5ml容量のエッペンチューブに入れ、再度遠心分離し、各pH上清と沈殿物に分画した。それぞれの沈殿物に先ほど分画した各pHの上清液140μl加えた後、60μlのメタノールを加えて、懸濁し30%メタノール溶液を調製した。それらの懸濁液を30℃、1,000rpmの旋回振盪で1hrインキュベー
トとして、エステル交換反応を行った。得られたサンプルから脂質をBligh-Dyer法に従って有機溶剤抽出を行い、脂肪酸メチルエステルの測定を行った。それらの測定結果を図３に示した。pH3.0の酸性及びpH10.5以上のアルカリ領域では、脂肪酸エステルの収率が低
い傾向であるが、pH4.5、pH6.0、pH7.5、pH9.0の弱酸性から弱アルカリ領域では高い脂肪酸エステルの収率を示した。その中でもpH4.5の弱酸性条件が最も高い脂肪酸エステル収
率であった。
【０２０４】
＜実施例５＞藻類のアルコール添加反応における反応時間の検討
実施例１で得られた培養液を遠心分離し、その沈殿物に滅菌水を加え、１倍懸濁液を調製した。その1mlの懸濁液を1.5ml容量のエッペンチューブに入れ、再度遠心分離し、得られた沈殿物に200μlの30%メタノール水溶液を加えた後、懸濁した。それらの懸濁液を30
℃、1,000rpmの旋回振盪で0.5hr、1.0hr、2.0hr、3.0hr、4.0hr、5.0hrの各時間インキュベートとして、エステル交換反応を行った。得られたサンプルから脂質をBligh-Dyer法に従って有機溶剤抽出を行い、脂肪酸メチルエステルの測定を行った。それらの測定結果を図４に示した。0.5hr、1.0hr、2.0hrの時間の経過と伴に脂肪酸メチルエステル生産の収
率が増加し、2.0hr以降はほぼ一定の脂肪酸メチルエステル生産の収率を示した。
【０２０５】
＜実施例６＞藻類のアルコール添加反応の添加アルコールの検討
実施例１で得られた培養液1mlを1.5ml容量のエッペンチューブに入れ、遠心分離し、その沈殿物に140μlの滅菌水を加え、懸濁した。その懸濁液に60μlの滅菌水、メタノール
、エタノール、イソプロパノール、ブタノールを加え、反応液を30%のアルコール溶液に
なるように調製した。それらの懸濁液を25℃、5hrボルテックスミキサー上で攪拌し、エ
ステル交換反応を行った。得られたサンプルから脂質をBligh-Dyer法に従って有機溶剤抽出を行い、脂肪酸アルコールエステルの定性をTLCにて行った。それらの測定結果を図５
に示した。未処理及び100%の滅菌水場合では、エステル交換反応の基質となるトリグリセリドのスポットが確認され、脂肪酸アルコールエステルのスポットは確認されなかった。一方で、30%メタノール溶液を添加した場合と同様に、30%エタノール溶液、30% イソプロパノール溶液、30%ブタノール溶液でも、それぞれのアルコール種に対応した脂肪酸エチ
ルエステル、脂肪酸イソプロピルエステル、脂肪酸ブチルエステルのスポットが確認された。
【０２０６】
＜実施例７＞微細藻類 Chlorella kessleri 11h株の６穴プレート培養
Chlorella kessleri 11h株を、5mLの0.2×ガンボーグB5培地（日本製薬）を各ウェルに入れた6穴プレートにて25℃、光強度7,000 luxの日照条件（TOMY社製培養装置CL-301）、庫内CO2濃度を1%として、10日間培養し、これを前培養液とした。尚、光源には、蛍光灯
からの白色光を用い、日照条件は、0 Luxから7,000 Luxまで1時間かけて上昇させ、7,000
Luxで11hr保持させた後、7,000 Luxから0 Luxまで1時間かけて減少させ、0Luxで11hr保
持させるサイクルを利用した。5mLの0.2×ガンボーグB5培地（日本製薬）を各ウェルに入れた6穴プレートにて、前培養液0.1mLを添加し、同条件にて10日間培養を行った。
【０２０７】
(0.2×ガンボーグB5培地)
KNO3              500 mg/L
MgSO4・7H2O        50 mg/L
NaH2PO4・H2O       30 mg/L
CaCl2・2H2O        30 mg/L
（NH4）2SO4        26.8 mg/L
Na2-EDTA           7.46 mg/L
FeSO4・7H2O         5.56 mg/L
MnSO4・H2O          2 mg/L
H3BO3               0.6 mg/L
ZnSO4・7H2O         0.4 mg/L
KI                 0.15 mg/L
Na2MoO2・2H2O       0.05 mg/L
CuSO4・5H2O         0.005 mg/L
CoCl2・6H2O         0.005 mg/L
120℃ 15分          オートクレーブ殺菌
【０２０８】
＜実施例８＞  藻類のアルコール添加反応によって生成した脂肪酸メチルエステルの定性
実施例７で得られた培養液1mlを1.5ml容量のエッペンチューブに入れ、遠心分離し、その沈殿物に200μlの30%メタノール溶液を加え、懸濁した。その懸濁液を30℃、1,000rpm
の旋回振盪で4hrインキュベートし、エステル交換反応を行った。得られたサンプルから
脂質をBligh-Dyer法に従って有機溶剤抽出を行い、脂肪酸メチルエステルの定性を行った。それらの測定結果を図６に示した。主成分として、a-リノレン酸メチルエステル、リノール酸メチルエステル、オレイン酸メチルエステル、パルミチン酸メチルエステル、ステアリン酸メチルエステルが確認された。それ以外の微量成分として、パルミトレイン酸メチルエステル、ミリスチン酸メチルエステルが確認された。
【０２０９】
＜実施例９＞ 緑藻類の培養
緑藻類は、Dunaliella tertiolecta UTEX LB999、Nannochloris oculata UTEX LB1998
、Nannochloris sp. UTEX LB1999、Neochloris oleoabundans UTEX 1185、Scenedesmus obliquus UTEX B2630、Scenedesmus dimorphus UTEX417、Chlorella kessleri UTEX 398、Chlorella kessleri 11h、Chlorella sorokiniana UTEX 1230を用いた。Dunaliella tertiolecta UTEX LB999、Nannochloris oculata UTEX LB1998及びNannochloris sp. UTEX LB1999の3株には海洋性ダイゴIMK培地、Scenedesmus obliquus UTEX B2630、Scenedesmus dimorphus UTEX417及びChlorella sorokiniana UTEX 1230の3株にはBG-11培地、Chlorella
kessleri UTEX 398及びChlorella kessleri 11hの2株には0.2×ガンボーグ培地、Neochloris oleoabundans UTEX1185にはModified Bold 3N培地を用いて、以下の条件にて培養を行った。緑藻類は、5mLの各培地を6穴プレートにて25℃、光強度7,000 luxの日照条件（TOMY社製培養装置CL-301）、庫内CO2濃度を1%として、10日間培養し、これを前培養液とした。尚、光源には、蛍光灯からの白色光を用い、日照条件は、0 Luxから7,000 Luxまで1
時間かけて上昇させ、7,000 Luxで11hr保持させた後、7,000 Luxから0 Luxまで1時間かけて減少させ、0Luxで11hr保持させるサイクルを利用した。5mLの各培地を入れた6穴プレートに、前培養液を0.1mL又は0.25mL添加し、同条件にて10日間培養を行った。
【０２１０】
(Modified Bold 3N培地)
NaNO3              750 mg/L
MgSO4・7H2O         75 mg/L
KH2PO4             175 mg/L
K2HPO4              75 mg/L
CaCl2・2H2O         25 mg/L
NaCl               25 mg/L
Na2EDTA・2H2O        4.5 mg/L
FeCl3・6H2O          0.582 mg/L
MnCl2・4H2O          0.246 mg/L
ZnCl2               0.03 mg/L
CoCl2・6H2O          0.012 mg/L
Na2MoO4・2H2O        0.024 mg/L
HEPES               0.036 mg/L
Thiamine            1.1 mg/L
Biotin              0.025 mg/L
VitaminB12           0.12 mg/L
CaCO3               0.2 mg/L
Green house soil    0.2 tsp/L
pH6.2に調整後、120℃ 15分          オートクレーブ殺菌
【０２１１】
(海洋性ダイゴIMK培地)
NaNO3               200 mg/L
Na2HPO4               1.4 mg/L
K2HPO4                5 mg/L
NH4Cl                 2.68 mg/L
Fe-EDTA               5.2 mg/L
Mn-EDTA               0.332 mg/L
Na2-EDTA             37.2 mg/L
ZnSO4・7H2O            0.023 mg/L
CoSO4・7H2O            0.014 mg/L
Na2MoO4・2H2O          0.0073 mg/L
CuSO4・5H2O            0.0025 mg/L
H2SeO3                0.0017 mg/L
Thiamin-HCl          0.2 mg/L
Biotin               0.0015 mg/L
Vitamin B12           0.0015 mg/L
MnCl2・4H2O            0.18 mg/L
ダイゴ人工海水SP    36 g/L
1N KOHにてpH8.0に調整後、120℃にて10分 オートクレーブ殺菌
【０２１２】
(0.2×ガンボーグB5培地)
KNO3             500 mg/L
MgSO4・7H2O        50 mg/L
NaH2PO4・H2O       30 mg/L
CaCl2・2H2O        30 mg/L
（NH4）2SO4        26.8 mg/L
Na2-EDTA           7.46 mg/L
FeSO4・7H2O         5.56 mg/L
MnSO4・H2O          2 mg/L
H3BO3               0.6 mg/L
ZnSO4・7H2O         0.4 mg/L
KI                 0.15 mg/L
Na2MoO2・2H2O       0.05 mg/L
CuSO4・5H2O         0.005 mg/L
CoCl2・6H2O         0.005 mg/L
120℃ 15分          オートクレーブ殺菌
【０２１３】
(BG-11 培地)
NaNO3            1500 mg/L
MgSO4・7H2O         7.5 mg/L
K2HPO4             40 mg/L
CaCl2・2H2O        36 mg/L
クエン酸・H2O       6 mg/L
Na2EDTA・2H2O       1 mg/L
クエン酸第二鉄アンモニウム   6 mg/L
Na2CO3              20 mg/L
MnCl2・4H2O          1.81 mg/L
ZnSO4・7H2O          0.22 mg/L
Co(NO3)2・6H2O       0.0494 mg/L
Na2MoO4・2H2O        0.39 mg/L
CuSO4・5H2O          0.079 mg/L
H3BO3                2.86 mg/L
1N KOHでpH7.2に調整後、120℃、10min
【０２１４】
＜実施例１０＞  緑藻類でのアルコール添加反応の実施
実施例９で得られた培養液1mlを1.5ml容量のエッペンチューブに入れ、遠心分離し、その沈殿物に200μlの30%メタノール溶液を加え、懸濁した。その懸濁液を30℃、1,000rpm
の旋回振盪で4hrインキュベートし、エステル交換反応を行った。得られたサンプルから
脂質をBligh-Dyer法に従って有機溶剤抽出を行い、脂肪酸メチルエステルの定性を行った。それらの測定結果を図７に示した。Chlorella属やScenedesmus属の淡水性緑藻では、脂肪酸メチルエステル生産の収率が比較的高い傾向を示した。その一方で、Nannochloris属、Neochloris属及びDunaliella属などの海水性緑藻では、Nannochloris sp. UTEX1999で
は比較的高い脂肪酸メチルエステル生産の収率であるが、同属のNannochloris oculata UTEX1998やDunaliella属の一株では全く生産が確認されなかった。
【０２１５】
＜実施例１１＞  藻類のアルコール以外の有機溶剤添加反応による脂肪酸生成の確認
実施例１で得られた培養液1mlを1.5ml容量のエッペンチューブに入れ、遠心分離し、その沈殿物に200μlの10%、20%、30%の各濃度のアセトン水溶液を加えた後、懸濁した。そ
れらの懸濁液を25℃、5hrボルテックスミキサー上で攪拌し、脂質の加水分解を行った。
得られたサンプルから脂質をBligh-Dyer法に従って有機溶剤抽出を行い、脂肪酸の定性をTLCにて行った。それらの測定結果を図８に示した。10%のアセトン溶液では、脂肪酸生成は全く確認されないが、20%と30%のアセトン溶液の濃度では、高い脂肪酸生成の収率が確認された。
【０２１６】
＜実施例１２＞  藻類の有機溶剤添加反応による脂肪酸生成の添加有機溶剤の検討
実施例１で得られた培養液1mlを1.5ml容量のエッペンチューブに入れ、遠心分離し、その沈殿物に140μlの滅菌水を加え、懸濁した。その懸濁液に60μlの滅菌水、アセトン、トルエン、クロロホルム、ジエチルエーテル、ヘキサンを加え、反応液を30%の溶剤溶液又は溶剤混合液になるように調製した。それらの懸濁液を25℃、5hrボルテックスミキサー上で攪拌し、脂質の加水分解を行った。得られたサンプルから脂質をBligh-Dyer法に従って有機溶剤抽出を行い、脂肪酸の定性をTLCにて行った。それらの結果を、図９に示した。未処理及び100%の滅菌水場合では、加水分解の基質になるトリグリセリドのスポットが確認され、脂肪酸のスポットは確認されなかった。一方で、30%アセトン溶液を添加した場合と同様に、30%トルエン混合液、30%クロロホルム混合液、30%ジエチルエーテル混合液、30%ヘキサン混合液でも、トリグリセリドのスポットの減少と脂肪酸のスポットの出現が確認された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図５】
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【図９】
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