(57)【要約】      （修正有）【課題】非線形効果を用いずに、径偏光および方位偏光ビームの重ね合わせによって差引ビームのふたつの強度分布の外側が一致する差引イメージングの方法を提供する。【解決手段】強度分布の異なる第一および第二の照明スポットの両者または試料のいずれかを走査し、第一の照明スポットで得られた画像と第二の照明スポットで得られた画像の差を試料の画像とするイメージングの方法において、第一の照明スポットは、少なくとも光軸上に強度を有し、第二の照明スポットは、少なくとも光軸を中心に凹型の強度分布を有し、光軸付近以外の部分で、第一および第二の照明スポットの強度分布、あるいは第一および第二の照明スポットの照明光学系と検出光学系とを含めた点像分布関数が一致している。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
強度分布の異なる第一および第二の照明スポットの両者または試料のいずれかを走査し、第一の照明スポットで得られた画像と第二の照明スポットで得られた画像の差を試料の画像とするイメージングの方法において、前記第一の照明スポットは、少なくとも光軸上に強度を有し、前記第二の照明スポットは、少なくとも光軸を中心に凹型の強度分布を有し、さらに、光軸付近以外の部分で、前記第一および第二の照明スポットの強度分布、あるいは前記第一および第二の照明スポットの照明光学系と検出光学系とを含めた点像分布関数が一致していることを特徴とするイメージングの方法。
【請求項２】
前記第一の照明スポットは、径偏光ビームと方位偏光ビームの重ね合わせであることを特徴とする請求項１に記載のイメージングの方法。
【請求項３】
前記第一の照明スポットは、別々に作製した径偏光ビームおよび方位偏光ビームの両者を重ね合わせること、あるいは、径偏光ビームまたは方位偏光ビームの一方を偏光変換して径偏光ビームおよび方位偏光ビームの両者を重ね合わせることを特徴とする請求項１または２記載のイメージングの方法。
【請求項４】
前記第一の照明スポットを形成する径偏光ビームと方位偏光ビームは、横モードが低次または高次であることを特徴とする請求項１、２または３記載のイメージングの方法。
【請求項５】
前記第二の照明スポットを形成する光ビームは、光軸上で位相特異点または偏光特異点を有する光ビームであることを特徴とする請求項１，２，３または４記載のイメージングの方法。
【請求項６】
前記検出光学系は、共焦点光学系であることを特徴とする請求項１、２，３，４または５記載のイメージングの方法。
【請求項７】
前記第一および第二の照明スポットを形成する光ビームの波長は同じまたは異なっていることを特徴とする請求項１、２、３、４、５または６記載のイメージングの方法。
【請求項８】
前記光ビームは連続波またはパルス波であることを特徴とする請求項１、２、３、４、５、６または７記載のイメージングの方法。
【請求項９】
観測する測定試料は無機物または有機物であることを特徴とする請求項１，２，３，４，５、６、７または８記載のイメージングの方法。
【請求項１０】
使用するレンズが乾燥系、油浸系、水浸系あるいは固浸（ソリッドイマージョン）系のいずれかであることを特徴とする請求項１、２、３、４、５、６、７、８または９記載のイメージングの方法。
【請求項１１】
前記第一および第二の照明スポットと、対物レンズ、試料を保持する機構、前記第一および第二の照明スポットまたは試料を空間的に走査する機構、光検出器、光検出器の信号を画像化する機構および画像を表示する表示機から構成され、請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０記載のイメージングの方法を用いることを特徴とする顕微鏡。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、強度分布の異なる複数の光スポットを用いて画像を取得するイメージングの方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
試料の２次元ないし３次元情報を得るために、レーザービームを集光して得られる微小光スポットを試料に照射・走査し、その反射、散乱、発光などを検出することにより、試料情報を画像化する方法が、従来より利用されている。ここで、高い空間分解能を得るためには、光スポットの径が小さいほど望ましい。
【０００３】
これまでに、入射するレーザービームの強度や偏光などの分布を変えることによってより小さなスポット径を得る方法が報告されている（例えば、非特許文献１及び２を参照）が、回折限界を超えることは厳密には不可能である。
【０００４】
さらに空間分解能を改善するためには、飽和現象を含めた非線形効果や利用することが有効である(例えば、非特許文献３を参照)が、励起光強度を強くする必要があるため、試料が損傷を受けてしまう。
【０００５】
そこで、非線形効果が現れない低出力の複数の照明光を用いて空間分解能を向上する方法が報告されている(例えば、非特許文献４および５を参照)。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】T.Grosjean and D. Courjon, “Smallestfocal spots”, Opt. Commun. 272, 314-319 (2007)
【非特許文献２】Y.Kozawa and S. Sato, “Sharperfocal spot formed by higher-order radially polarized laser beams”, J. Opt. Soc. Am. A 24, 1793-1798 (2007)
【非特許文献３】藤田克昌, “超解像顕微鏡の進展”,生物物理 50, 174-179 (2010)
【非特許文献４】M.G. L. Gustafsson, “Surpassingthe lateral resolution limit by a factor of two using structuredillumination microscopy,” J. Microsc. 198, 82-87 (2000)
【非特許文献５】O. Haeberie, andB. Simon, “Saturated structured confocal microscopy with theoreticallyunlimited resolution,” Opt. Commun. 282, 3657-3664 (2009)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
視野全体を２本のコヒーレントビームで照明して試料上に縞状の光格子を作製する構造化照明法（例えば非特許文献４を参照）では、ひとつのビームで形成される光スポットよりも高い空間周波数が一次元方向には実現されるが、画像情報を得るために、光格子の位置の移動および照射方向を変えて、多数のデータを得る必要がある。さらに、収集したデータを計算によって再構成することで最終的に試料の画像を得るため、データの取得と計算に時間を要する。従って、時間的に早く変化する現象の観察には十分対応できない。
【０００８】
一方、単峰性および凹型の強度分布を持つ光ビームを用いて得られるふたつの画像の差引をすることによって、凹型強度分布の中心近傍の暗い部分からの情報を抽出する差引法（例えば非特許文献５を参照）では、画像取得は短時間で終えるものの、ふたつの強度分布の外側部分が一致しないため、分解能があまり改善しない。そのため、非線形効果を利用して凹型強度分布の内側部分を狭くすることで分解能を改善しているが、再び強い励起光が必要となる。
【０００９】
光軸上に位相あるいは偏光特異点を持つ光ビームによって得られる強度分布は、光軸近傍の強度が低い凹型であり、この暗い部分の幅が狭いため、差引型イメージングにおける差引ビームの強度分布として好ましい。
【００１０】
光軸に対し偏光分布が、それぞれ放射状および周回状である径偏光（あるいはラジアル偏光）および方位偏光（あるいはアジマス偏光）は、ベクトルビームの一種である。
【００１１】
径偏光および方位偏光の電場ベクトルは互いに直交しているため、両者の干渉は発生せず、両者を重ね合わせて得られる強度分布は、それぞれの強度分布の和である。
【００１２】
径偏光ビームを強く集光した場合の強度分布は、0次および1次の第一種ベッセル関数を含んだ積分で表されるのに対して、方位偏光ビームの場合は、1次の第一種ベッセル関数を含んだ積分で表される。0次の第一種ベッセル関数は中央にピークを持つのに対して、1次の第一種ベッセル関数は中央付近で強度がゼロとなる凹型の強度分布を持っている。従って、径偏光ビームと方位偏光ビームのを重ね合わせたビームを強く集光した場合の焦点付近での強度分布の外側部分は、方位偏光ビームの場合の強度分布の外側部分と近い分布となる。径偏光ビームと方位偏光ビームの重ね合わせの割合を適切に選択することによって、外側部分の一致度が最も高いビームを作製することができる。
【００１３】
そこで本発明は、径偏光および方位偏光ビームの重ね合わせによって差引ビームのふたつの強度分布の外側が一致する差引イメージングの方法と、本方法を用いた顕微鏡を提供することを目的とする。これによって、飽和効果を用いずに試料の損傷がなく、かつ、高い空間分解能をもつイメージングの方法と顕微鏡を簡便に実現することができる。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明では、差引ビームの強度分布の外側部分の分布と一致する照明スポットは、ベクトルビームによって作製される。
【００１５】
本発明の一つの側面によれば、イメージングの方法が提供される。このイメージングの方法は、強度分布の異なる第一および第二の照明スポットの両者または試料のいずれかを走査し、第一の照明スポットで得られた画像と第二の照明スポットで得られた画像の差を試料の画像とする。
第一の照明スポットは、少なくとも光軸上に強度を有し、第二の照明スポットは、少なくとも光軸を中心に凹型の強度分布を有する。さらに、光軸付近以外の部分で、第一および第二の照明スポットの強度分布あるいは検出光学系を通過した後の点像分布関数が一致している。
【００１６】
第一の照明スポットは、径偏光ビームと方位偏光ビームの重ね合わせであることが好ましい。
【００１７】
第一の照明スポットを形成する径偏光ビームと方位偏光ビームは、横モードが低次または高次でも良い。
【００１８】
第二の照明スポットを形成する光ビームは、光軸上で位相特異点または偏光特異点を有する光ビームであることが好ましい。
【００１９】
検出光学系は、共焦点光学系であることが好ましい。
【００２０】
第一および第二の照明スポットを形成する光ビームの波長は同じまたは異なっていても良い。
【００２１】
第一および第二の照明スポットを形成する光ビームは連続波またはパルス波でも良い。
【００２２】
観測する測定試料は無機物または有機物でもよい。
【００２３】
使用するレンズは、乾燥系、油浸系、水浸系あるいは固浸系のいずれでも良い。
【発明の効果】
【００２４】
本発明に係るイメージングの方法によれば、単独の照明スポットを用いる場合よりも高い空間分解能を有するという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】本発明の実施の形態のイメージングの方法の、ベクトルビームとして代表的な（ａ）径偏光ビーム、（ｂ）方位偏光ビームのビーム断面での偏光分布を示す分布図である。
【図２】本発明の実施の形態の照明スポットの焦点面での強度分布を示す分布図である。点線および破線は、それぞれ第一および第二照明スポットの強度分布を示している。また、実線は第一照明スポットから第二照明スポットの強度分布を差し引いた結果を示している。
【図３】本発明の実施の形態の照明スポットの共焦点光学系を通過した点像分布関数を示す分布図である。点線および破線は、それぞれ第一および第二照明スポットの強度分布を示している。また、実線は第一照明スポットから第二照明スポットの強度分布を差し引いた結果を示している。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本発明の実施の形態のイメージングの方法において使用する代表的なベクトルビームのビーム断面での偏光と強度分布を図１に示す。図１（ａ）は直線偏光が放射状に分布した径偏光ビーム、図１（ｂ）は方位角方向に分布した方位偏光ビームである。強度分布はドーナツ状であり、光軸上では強度はゼロである。
【００２７】
径偏光ビームあるいは方位偏光ビームは、例えば、光学軸の向きが異なる複数の扇形に分割された２分の１波長板を通すことによって得る。あるいは、偏光選択能を有する光学素子を含んだレーザー共振器から直接得る。この径偏光ビームあるいは方位偏光ビームを、光学軸の向きの異なる２枚の２分の１波長板を通す際に、その光学軸の相対的な角度を変えることによって、径偏光ビームと方位偏光ビームの重ね合わせの割合が異なるベクトルビームを得る。
【００２８】
第一および第二の照明スポットを形成する光ビームの波長が同じ場合は、イメージングに用いる光源および光学素子は同じでよく、装置が簡便となる。
【００２９】
照明スポットの強度分布は、光の波長に比例して伸縮するので、第一あるいは第二の照明スポットを作製する光の波長を変えると、光軸付近以外の部分での、第一および第二の照明スポットの強度分布の一致度を向上することができる。ただし、イメージングに用いる全ての光学素子の分散が問題とならない範囲に限られる。
【００３０】
照明スポットを形成する光ビームがピコ秒あるいはフェムト秒である場合は、熱による試料の損傷が発生することなく多光子吸収などの非線形光学効果を観測することができる。この場合、照明光学系の点像分布関数は非線形光学効果の次数に応じて変化するので、光軸付近以外の部分での、第一および第二の照明スポットの強度分布の一致度を向上することができる。
【００３１】
照明スポットを形成する光ビームが連続波の場合は、第一および第二の照明スポットを走査して得られる画像間の差引を行うことで高い空間分解能を持つ１、２または３次元画像を得ることができる。光ビームがパルスの場合は、試料からの発光の時間変化に関する情報を加えた、４次元までの画像を得ることができる。
【実施例１】
【００３２】
図２において第二の照明スポットは図１（ｂ）のドーナツ状方位偏光ビームによって作製された。焦点面においてもドーナツ状の強度分布を維持し、内側の暗い部分の幅は１３１ｎｍである。第一の照明スポットは図１に示した径偏光ビームと方位偏光ビームを重ね合わせて得られたもので、外側の強度分布が第一の照明スポットのそれとほぼ同じ分布となっている。第一および第二の照明スポットの強度分布の差引が図２において実線で示されている。第一および第二の照明スポットの外側部分の不一致は、この曲線の外側のサイドローブとして現れているが、そのピーク値は中央ピークの値と比較して１０％以下であるので、イメージングにはほとんど影響を及ぼさない。中央ピークの幅は１４９ｎｍであり、同じ条件でガウスビームを集光した場合の２００ｎｍよりも小さくなっており、空間分解能が向上することを意味している。
【実施例２】
【００３３】
図３において、光検出系にＡｉｒｙ単位が０．５のピンホールを用いた共焦点光学系を用いた場合の照明系を含んだ光学系全体の点像分布関数を示した。ここで第一の照明スポットは６重リングの強度分布を持つ径偏光ビームと方位偏光ビームの重ね合わせであり、第二の照明スポットは６重リングの方位偏光ビームを用いた。第二の照明スポットを用いた場合に対する点像分布関数の内側の暗い部分の幅は、９２ｎｍである。第一および第二の照明スポットを用いた場合に対する点像分布関数の外側の強度分布は、第一の実施例に比較してさらに一致度が向上している上に、実線で示したその差引の中央のピークの幅は１２０ｎｍであり、一段と空間分解能が改善している。
【図１】
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【図２】
2014106432.tif 000004
【図３】
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