(57)【要約】【課題】  本発明は、試料の前処理を必要とせず、そして迅速に正確な測定値を得ることができる非トランスフェリン結合鉄の測定方法及び測定試薬を提供することにある。【解決手段】  本発明の非トランスフェリン結合鉄の測定試薬は、キレート物質、及びキレート発色剤を含有することを特徴とする。また、本発明の非トランスフェリン結合鉄の測定試薬の好ましい実施態様において、前記非トランスフェリン結合鉄が、体液、排泄物又は分泌物、生体又は生体関連物、のいずれかに含まれるトランスフェリン以外の鉄結合性物質に結合している鉄であることを特徴とする。また、本発明の非トランスフェリン結合鉄の測定試薬の好ましい実施態様において、前記鉄結合性物質が、血液、血清、血漿、尿、唾液、臓器、又は組織に含まれるものであることを特徴とする。【選択図】図1
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
キレート物質、及びキレート発色剤を含有することを特徴とする非トランスフェリン結合鉄の測定試薬。
【請求項２】
前記非トランスフェリン結合鉄が、体液、排泄物又は分泌物、生体又は生体関連物、のいずれかに含まれるトランスフェリン以外の鉄結合性物質に結合している鉄であることを特徴とする請求項１記載の測定試薬。
【請求項３】
前記鉄結合性物質が、血液、血清、血漿、尿、唾液、臓器、又は組織に含まれるものである請求項２記載の測定試薬。
【請求項４】
前記鉄結合性物質が、血液、血清、又は血漿に含まれるものである請求項２記載の測定試薬。
【請求項５】
前記鉄結合性物質が、生体に含まれるタンパク質（トランスフェリンを除く）、有機酸又は無機酸である請求項2記載の測定試薬。
【請求項６】
前記鉄結合性物質が、アルブミン又はクエン酸である請求項2記載の測定試薬。
【請求項７】
前記キレート物質含有液のｐＨが、ｐＨ７．４以上であることを特徴とする請求項１〜６項のいずれか1項に記載の測定試薬。
【請求項８】
前記キレート発色剤含有液のｐＨが、ｐＨ７．４以上であることを特徴とする請求項１〜７項のいずれか１項に記載の測定試薬。
【請求項９】
前記キレート発色剤が、２−ニトロソ−５−（Ｎ−プロピル−Ｎ−スルホプロピルアミノ）−フェノール、フェレン、フェロジン、又はバソフェナンスロリンからなる群から選択される少なくとも１種であることを特徴とする請求項１〜８項のいずれか1項に記載の測定試薬。
【請求項１０】
前記キレート物質が、キレート剤、有機酸又は無機酸であることを特徴とする請求項１〜９項のいずれか１項に記載の測定試薬。
【請求項１１】
第１試薬と第２試薬とを含有する非トランスフェリン結合鉄測定用キットであって、前記第１試薬がキレート剤、有機酸又は無機酸から選択されるキレート物質を含有し、前記第２試薬が２−ニトロソ−５−（Ｎ−プロピル−Ｎ−スルホプロピルアミノ）−フェノール、フェレン、フェロジン、又はバソフェナンスロリンからなる群から選択される少なくとも１種からなるキレート発色剤を含有することを特徴とする非トランスフェリン結合鉄測定用キット。
【請求項１２】
トランスフェリンを分離する工程を含まずに、前記試料中の非トランスフェリン結合鉄を測定することを特徴とする、非トランスフェリン結合鉄の測定方法。
【請求項１３】
前記試料と、キレート物質とを混合する工程と、得られた混合物と、キレート発色剤とを混合する工程と、鉄イオンが結合したキレート発色剤に由来するシグナルを測定することにより、非トランスフェリン結合鉄中の鉄の定量値を得る工程と、を含む請求項１２記載の測定方法。
【請求項１４】
非トランスフェリン結合鉄の測定を、ｐＨ７．４以上で行うことを特徴とする請求項１２又は１３記載の測定方法。
【請求項１５】
前記非トランスフェリン結合鉄が、体液、排泄物又は分泌物、生体又は生体関連物、に含まれるトランスフェリン以外の鉄結合性物質に結合している鉄であることを特徴とする請求項１２〜１４項のいずれか１項に記載の測定方法。
【請求項１６】
前記鉄結合性物質が、血液、血清、又は血漿に含まれるものである請求項１５記載の測定方法。
【請求項１７】
前記キレート発色剤が、２−ニトロソ−５−（Ｎ−プロピル−Ｎ−スルホプロピルアミノ）−フェノール、フェレン、フェロジン、又はバソフェナンスロリンからなる群から選択される少なくとも１種であることを特徴とする請求項１２〜１６項のいずれか1項に記載の測定方法。
【請求項１８】
前記キレート物質が、キレート剤、有機酸又は無機酸であることを特徴とする請求項１２〜１７項のいずれか１項に記載の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非トランスフェリン結合鉄の測定試薬、及び非トランスフェリン結合鉄の測定方法に関し、特に、トランスフェリンを分離する必要がない非トランスフェリン結合鉄の測定試薬、及び非トランスフェリン結合鉄の測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
鉄は生体内において必須微量元素である一方、鉄過剰な状態は臓器への鉄の沈着を促し、フリーラジカル産生を介した酸化ストレス及び臓器傷害の原因となることが知られている。
【０００３】
ところで、健常人においては、血清又は血漿中の鉄は全てトランスフェリンに結合して存在している。トランスフェリンに着目すると、トランスフェリンの約１／３が鉄と結合し、残りの約２／３は鉄と未結合の状態で存在する。
【０００４】
長期間の輸血や鉄剤投与によって鉄代謝のバランスが崩れると、トランスフェリンが鉄で過飽和になり、「トランスフェリン以外の鉄結合性物質（アルブミン又はクエン酸等）に結合した鉄」である「非トランスフェリン結合鉄」(ＮＴＢＩ:Ｎｏｎ−ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ  ｂｏｕｎｄ  ｉｒｏｎ)が出現する。
【０００５】
これまでの研究から、この非トランスフェリン結合鉄が酸化ストレスや細胞障害を惹起する本体である可能性が示されてきた。
【０００６】
従って、鉄の体内動態を詳細に把握する上で、血中の非トランスフェリン結合鉄のレベルは重要な指標となる。すなわち、長期間の輸血や鉄剤投与を受けている患者等においては、血中の非トランスフェリン結合鉄の測定が、過剰な鉄による臓器傷害の予防、診断及び治療のために大変重要である。
【０００７】
そこで、これまで、複数の研究グループにより血中の非トランスフェリン結合鉄を測定する方法が検討されてきたが、いずれも感度や特異性が充分でなく、非トランスフェリン結合鉄の挙動を正確に評価することができなかった。
【０００８】
そこで２０１１年、佐々木らによりｎｏｎ−ｍｅｔａｌ  ＨＰＬＣを用いた非トランスフェリン結合鉄の測定法が確立され、高感度かつ安定的に血中の非トランスフェリン結合鉄を測ることが可能になった（非特許文献１）。
【０００９】
また、高速液体クロマトグラフィー（以下、ＨＰＬＣ（Ｈｉｇｈ-Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｌｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）ともいう。）を用いた、鉄イオンに対してキレート能を有する新規な鉄キレート剤を用いた鉄イオンの定量方法も知られている（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】再公表特許公報ＷＯ２０１０／０３２４８９
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Sasaki etal. 、Molecular Medicine Reports 4: p913-918、2011、「Improved  quantification  for  non-transferrin-bound  iron  measurement  using  high-performance  liquid  chromatography  by reducing  iron  contamination」
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
しかしながら、ＨＰＬＣ法には、（１）試料の前処理（約２時間以上掛かる）が必要であり、（２）検体あたりの測定時間が長い（一つの検体を測定するのに約１０分間掛かる）、といった事情から、臨床検査の現場での「一度に多数の検体を迅速に測定する」というニーズにこたえられない側面があった。
【００１３】
前述した通り、前記のＨＰＬＣ法により、高感度かつ安定的に血中の非トランスフェリン結合鉄を測定することが可能になったものの、試料の前処理が必要であり、検体あたりの測定時間が長いという点を有し、非トランスフェリン結合鉄の測定に関しては、更なる改善が望まれていた。すなわち、長期間の輸血や鉄剤投与を受けている患者等における過剰な鉄による臓器傷害の予防、診断及び治療のため、非トランスフェリン結合鉄の測定の更なる改善が望まれていた。
【００１４】
そこで、上記問題点を解決すべく、本発明は、試料の前処理を必要とせず、そして迅速に正確な測定値を得ることができる非トランスフェリン結合鉄の測定方法及び測定試薬を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
上記目的を達成するために、本発明者は、非トランスフェリンの測定方法について、改めて鋭意検討を行った結果、本発明を見出すに至った。
【００１６】
すなわち、本発明の非トランスフェリン結合鉄の測定試薬は、キレート物質、及びキレート発色剤を含有することを特徴とする。
【００１７】
また、本発明の非トランスフェリン結合鉄の測定試薬の好ましい実施態様において、前記非トランスフェリン結合鉄が、体液、排泄物又は分泌物、生体又は生体関連物、のいずれかに含まれるトランスフェリン以外の鉄結合性物質に結合している鉄であることを特徴とする。
【００１８】
また、本発明の非トランスフェリン結合鉄の測定試薬の好ましい実施態様において、前記鉄結合性物質が、血液、血清、血漿、尿、唾液、臓器、又は組織に含まれるものであることを特徴とする。
【００１９】
また、本発明の非トランスフェリン結合鉄の測定試薬の好ましい実施態様において、前記鉄結合性物質が、血液、血清、又は血漿に含まれるものであることを特徴とする。
【００２０】
また、本発明の非トランスフェリン結合鉄の測定試薬の好ましい実施態様において、前記鉄結合性物質が、生体に含まれるタンパク質（トランスフェリンを除く）、有機酸又は無機酸であることを特徴とする。
【００２１】
また、本発明の非トランスフェリン結合鉄の測定試薬の好ましい実施態様において、前記鉄結合性物質が、アルブミン又はクエン酸であることを特徴とする。
【００２２】
また、本発明の非トランスフェリン結合鉄の測定試薬の好ましい実施態様において、前記キレート物質含有液のｐＨが、ｐＨ７．４以上であることを特徴とする。
【００２３】
また、本発明の非トランスフェリン結合鉄の測定試薬の好ましい実施態様において、前記キレート発色剤含有液のｐＨが、ｐＨ７．４以上であることを特徴とする。
【００２４】
また、本発明の非トランスフェリン結合鉄の測定試薬の好ましい実施態様において、前記キレート発色剤が、２−ニトロソ−５−（Ｎ−プロピル−Ｎ−スルホプロピルアミノ）−フェノール、フェレン、フェロジン、又はバソフェナンスロリンからなる群から選択される少なくとも１種であることを特徴とする。
【００２５】
また、本発明の非トランスフェリン結合鉄の測定試薬の好ましい実施態様において、前記キレート物質が、キレート剤、有機酸又は無機酸であることを特徴とする。
【００２６】
本発明の非トランスフェリン結合鉄測定用キットは、第１試薬と第２試薬とを含有する非トランスフェリン結合鉄測定用キットであって、前記第１試薬がキレート剤、有機酸又は無機酸から選択されるキレート物質を含有し、前記第２試薬が２−ニトロソ−５−（Ｎ−プロピル−Ｎ−スルホプロピルアミノ）−フェノール、フェレン、フェロジン、又はバソフェナンスロリンからなる群から選択される少なくとも１種からなるキレート発色剤を含有することを特徴とする。
【００２７】
本発明の非トランスフェリン結合鉄の測定方法は、トランスフェリンを分離する工程を含まずに、前記試料中の非トランスフェリン結合鉄を測定することを特徴とする。
【００２８】
また、本発明の非トランスフェリン結合鉄の測定方法の好ましい実施態様において、前記試料と、キレート物質とを混合する工程と、得られた混合物と、キレート発色剤とを混合する工程と、鉄イオンが結合したキレート発色剤に由来するシグナルを測定することにより、非トランスフェリン結合鉄中の鉄の定量値を得る工程と、を含むことを特徴とする。
【００２９】
また、本発明の非トランスフェリン結合鉄の測定方法の好ましい実施態様において、非トランスフェリン結合鉄の測定を、ｐＨ７．４以上で行うことを特徴とする。
【００３０】
また、本発明の非トランスフェリン結合鉄の測定方法の好ましい実施態様において、前記非トランスフェリン結合鉄が、体液、排泄物又は分泌物、生体又は生体関連物、に含まれるトランスフェリン以外の鉄結合性物質に結合している鉄であることを特徴とする。
【００３１】
また、本発明の非トランスフェリン結合鉄の測定方法の好ましい実施態様において、前記鉄結合性物質が、血液、血清、又は血漿に含まれるものであることを特徴とする。
【００３２】
また、本発明の非トランスフェリン結合鉄の測定方法の好ましい実施態様において、前記キレート発色剤が、２−ニトロソ−５−（Ｎ−プロピル−Ｎ−スルホプロピルアミノ）−フェノール、フェレン、フェロジン、又はバソフェナンスロリンからなる群から選択される少なくとも１種であることを特徴とする。
【００３３】
また、本発明の非トランスフェリン結合鉄の測定方法の好ましい実施態様において、前記キレート物質が、キレート剤、有機酸又は無機酸であることを特徴とする。
【発明の効果】
【００３４】
本発明の非トランスフェリン結合鉄の測定方法及び測定試薬によれば、繁雑な操作である試料の前処理を必要としないため、迅速かつ簡便に測定を行うことができるという有利な効果を奏する。また、本発明の非トランスフェリン結合鉄の測定方法及び測定試薬によれば、迅速に正確な非トランスフェリン結合鉄の測定値を得ることができるという有利な効果を奏する。ひいては、本発明の非トランスフェリン結合鉄の測定方法及び測定試薬により、長期間の輸血や鉄剤投与を受けている患者等における過剰な鉄による臓器傷害の予防、診断及び治療のための、迅速、簡便かつ正確な非トランスフェリン結合鉄の測定値の提供が可能になるという有利な効果を奏する。
【００３５】
本発明によれば、臓器障害を引き起こす生体内の過剰な鉄イオンのレベルを測定することができる非トランスフェリン結合鉄の測定方法及び測定試薬を提供することができるという有利な効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】図１は、本願発明の一実施態様による測定と、ＨＰＬＣ法による測定との相関性を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
本発明の非トランスフェリン結合鉄の測定試薬は、キレート物質、及びキレート発色剤を含有することを特徴とする。本発明において、非トランスフェリン結合鉄とは、トランスフェリン以外の鉄結合性物質に結合した鉄を意味する。前記非トランスフェリン結合鉄としては、特に限定はなく、トランスフェリン以外の鉄結合性物質に結合した鉄であればよい。鉄結合性物質とは、鉄に結合することができる物質のことであり、このような物質であれば特に限定はない。
【００３８】
トランスフェリン以外の鉄結合性物質とは、前記の鉄結合性物質であって、トランスフェリン以外の物質のことである。トランスフェリン以外の鉄結合性物質としては、例えば、血液、血清若しくは血漿などの体液、尿若しくは唾液などの排泄物若しくは分泌物、臓器、又は組織等の生体又は生体関連物等に含まれるトランスフェリン以外の鉄結合性物質を挙げることができる。なお、本発明において、鉄とは、２価又は３価等の鉄イオンをも含むものを意味する。
【００３９】
本発明において、本発明の測定試薬の測定対象となる試料は、非トランスフェリン結合鉄を含む可能性がある試料ということができる。試料として特に限定はないが、例えば、試料として、生体試料等を挙げることができる。例えば、生体試料としては、ヒト又は動物の血液、血清、血漿、尿、大便、髄液、唾液、汗、涙、腹水、羊水、脳等の臓器、毛髪や皮膚や爪や筋肉若しくは神経等の組織及び細胞等を挙げることができる。また、本発明の非トランスフェリン結合鉄の測定試薬の好ましい実施態様において、前記非トランスフェリン結合鉄が、体液、排泄物又は分泌物、生体又は生体関連物、のいずれかに含まれるトランスフェリン以外の鉄結合性物質に結合している鉄であることを特徴とする。好ましい実施態様において、前記鉄結合性物質が、血液、血清、血漿、尿、唾液、臓器、又は組織に含まれるものであることを特徴とする。また、本発明の非トランスフェリン結合鉄の測定試薬の好ましい実施態様において、前記鉄結合性物質が、生体内の過剰な鉄の測定に適しているという観点から、血液、血清、又は血漿に含まれるものであることを特徴とする。なお、本発明においては、試料は液体であることが好ましい。もし、非トランスフェリン結合鉄を含む試料が液体でない場合には、抽出処理又は可溶化処理等の前処理を公知の方法に従って行ない、非トランスフェリン結合鉄を液体中に含有させるようにしてもよい。
【００４０】
また、本発明の非トランスフェリン結合鉄の測定試薬の好ましい実施態様において、前記鉄結合性物質が、生体内に含まれるタンパク質（トランスフェリンを除く）、有機酸又は無機酸であることを特徴とする。好ましい実施態様において、前記鉄結合性物質が、アルブミン又はクエン酸であることを特徴とする。また、有機酸としては、例えば、クエン酸又はシュウ酸等を挙げることができる。この有機酸としては、特にクエン酸等を挙げることができる。また、無機酸としては、例えば、リン酸等を挙げることができる。
【００４１】
また、本発明において、キレート物質とは、鉄に配位結合することができ、これにより鉄と錯体を形成することが可能な物質のことをいう。キレート物質としては、特に限定はなく、鉄に配位結合することができ、これにより鉄と錯体を形成することが可能な物質であればよい。また、より的確な測定を行うという観点から、キレート物質は、鉄との結合の能力において、次の（ａ）〜（ｃ）の要件を満たすものが好ましい。（ａ）キレート物質は、トランスフェリンに結合している鉄とは結合しない。（ｂ）キレート物質は、トランスフェリン以外の鉄結合性物質に結合している鉄と結合する。（ｃ）キレート物質は、その結合している鉄がキレート発色剤に移動し、キレート発色剤がこの鉄と結合する。（a）については、後述する実施例において、鉄が結合したトランスフェリンであるホロトランスフェリンの溶液中の鉄を測定しており、当該鉄の値からキレート物質が、トランスフェリンに結合している鉄と結合していないことが分かる。また、（ｂ）については、後述する実施例において、キレート物質を使用しない場合のコントロールと比較して、キレート物質を使用する場合のデータと比較すれば、キレート物質が、トランスフェリン以外の鉄結合性物質に結合していた鉄と結合していることが分かる。また、（ｃ）については、後述する実施例において、非トランスフェリン結合鉄であるクエン酸結合鉄やアルブミン結合鉄の水溶液を試料とした場合の直線性のデータから、キレート物質が、当該キレート物質に結合している鉄がキレート発色剤に移動して、キレート発色剤がこの鉄と結合していることが分かる。
【００４２】
このようなキレート物質としては、例えば、キレート剤、有機酸又は無機酸等を挙げることができる。キレート剤としては、例えば、ニトリロ三酢酸(ＮＴＡ)、Ｎ−(２−ヒドロキシエチル)イミノ二酢酸(ＨＩＤＡ)、ビシン(Ｂｉｃｉｎｅ)、 イミノジ酢酸(ＩＤＡ)、エチレンジアミン二プロピオン酸(ＥＤＤＰ)、若しくはビス−トリス−プロパン(Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ−Ｐｒｏｐａｎｅ)など、又はこれらの塩等を挙げることができる。また、有機酸としては、例えば、クエン酸、マロン酸、マレイン酸、コハク酸、又はグルコン酸等を挙げることができる。有機酸としては、非トランスフェリン結合鉄の測定により適しているという観点から、特にクエン酸等を挙げることができる。また、この無機酸としては、例えば、リン酸等を挙げることができる。
【００４３】
本発明において、キレート物質としては、キレート剤又は有機酸が好ましく、非トランスフェリン結合鉄の測定により適しているという観点から、キレート剤がより好ましい。
【００４４】
そして、本発明のキレート物質としては、このキレート剤においては、ニトリロ三酢酸(ＮＴＡ)、Ｎ−(２−ヒドロキシエチル)イミノ二酢酸(ＨＩＤＡ)又はビシン(Ｂｉｃｉｎｅ)が好ましく、ニトリロ三酢酸(ＮＴＡ)又はＮ−(２−ヒドロキシエチル)イミノ二酢酸(ＨＩＤＡ) がより好ましく、非トランスフェリン結合鉄の測定により適しているという観点から、ニトリロ三酢酸(ＮＴＡ)が特に好ましい。
【００４５】
本発明において、キレート物質を使用又は含有させる濃度は、特に限定はなく適宜定めればよいが、例えば、試料、キレート物質及びキレート発色剤を混合した最終反応液において、このキレート物質の濃度は、非トランスフェリン結合鉄と結合するのに十分な量を存在させるという観点から、０．０１ｍＭ以上であることが好ましく、０．０５ｍＭ以上であることがより好ましく、０．１ｍＭ以上であることが特に好ましい。
【００４６】
また、キレート物質を使用又は含有させる濃度は、例えば、試料、キレート物質及びキレート発色剤を混合した最終反応液において、キレート物質がトランスフェリンに結合している鉄と結合しないこと、そしてキレート物質がキレート発色剤の発色に干渉しないことが好ましいという観点から、２０ｍＭ以下であることが好ましく、２ｍＭ以下であることがより好ましく、１ｍＭ以下であることが特に好ましい。なお、本発明においては、測定試薬には、最終反応液において前記の濃度になるようにキレート物質を含有させることが好ましい。
【００４７】
また、キレート物質の安定度定数という観点からすれば、使用可能な又は好ましいキレート物質の安定度定数は次の通りとなる。すなわち、ＮＴＡの安定度定数が１５．８７、ＨＩＤＡの安定度定数が１１．６４であることから、キレート物質の安定度定数は、１１以上であり、１６以下とすることが好ましい。
【００４８】
本発明において、キレート発色剤とは、鉄に配位結合し、鉄と錯体を形成することができ、この鉄との結合によって何らかのシグナルを生成又は変化させることができる物質のことをいう。従って、このキレート発色剤に由来するシグナルを測定することにより、このキレート発色剤に結合した鉄の量、すなわち定量値を得ることができる。このシグナルとしては、例えば、紫外部、可視部若しくは赤外部の吸光度若しくは透過率、蛍光強度、又は発光強度等を挙げることができる。
【００４９】
本発明において、キレート発色剤としては、特に限定はなく、鉄との結合によって何らかのシグナルを生成又は変化させることができる物質であればよい。キレート発色剤は、より的確な測定を行うという観点から、鉄との結合の能力において、次の（ａ）及び（ｂ）の要件を満たすものが好ましい。（ａ）キレート発色剤は、トランスフェリンに結合している鉄と結合しない。（ｂ）キレート発色剤は、キレート物質に結合している鉄と結合する。
【００５０】
本発明において、キレート発色剤としては、例えば、鉄に対するキレート発色剤として知られている、２−ニトロソ−５−（Ｎ−プロピル−Ｎ−スルホプロピルアミノ）−フェノール〔ＮｉｔｒｏｓｏＰＳＡＰ〕、フェレン〔Ｆｅｒｒｅｎ〕、フェロジン〔Ｆｅｒｒｏｚｉｎｅ〕、又はバソフェナンスロリン〔Ｂａｔｈｏｐｈｅｎａｎｔｈｒｏｒｉｎｅ〕等を挙げることができる。キレート発色剤としては、非トランスフェリン結合鉄の測定により適しているという観点から、２−ニトロソ−５−（Ｎ−プロピル−Ｎ−スルホプロピルアミノ）−フェノール、フェレン、又はフェロジンが好ましく、２−ニトロソ−５−（Ｎ−プロピル−Ｎ−スルホプロピルアミノ）−フェノールがより好ましい。
【００５１】
本発明において、キレート発色剤を使用又は含有させる濃度は、特に限定はなく適宜定めればよいが、例えば、試料、キレート物質及びキレート発色剤を混合した最終反応液において、このキレート発色剤の濃度は、非トランスフェリン結合鉄の測定に必要な測定領域を確保するという観点から、２０μＭ以上であることが好ましく、１００μＭ以上であることがより好ましく、２００μＭ以上であることが特に好ましい。また、このキレート発色剤を使用又は含有させる濃度は、例えば、試料、キレート物質及びキレート発色剤を混合した最終反応液において、キレート発色剤の溶解度を勘案すると、２００ｍＭ以下であることが好ましく、２０ｍＭ以下であることがより好ましく、２ｍＭ以下であることが特に好ましい。なお、本発明においては、測定試薬には、最終反応液において前記の濃度になるようにキレート発色剤を含有させることが好ましい。
【００５２】
また、２−ニトロソ−５−（Ｎ−プロピル−Ｎ−スルホプロピルアミノ）−フェノール〔ＮｉｔｒｏｓｏＰＳＡＰ〕の場合、非トランスフェリン結合鉄の測定により適しているという観点から、５０μM〜５ｍMが好ましく、１００μM〜１０００μMがさらに好ましい。フェレン〔Ｆｅｒｒｅｎ〕の場合、非トランスフェリン結合鉄の測定により適しているという観点から、２．５ｍM〜５０ｍMが好ましく、５ｍM〜２０ｍMがさらに好ましい。フェロジン〔Ｆｅｒｒｏｚｉｎｅ〕の場合、非トランスフェリン結合鉄の測定により適しているという観点から、２．５ｍM〜５０ｍMが好ましく、５ｍM〜２０ｍMがさらに好ましい。
【００５３】
本発明において用いるｐＨは、非トランスフェリン結合鉄を正確に測定することができるものであればよい。すなわち、トランスフェリン以外の鉄結合性物質に結合していた鉄をキレート物質に移し、そしてキレート物質に結合した鉄をキレート発色剤に移し、そしてこの鉄が結合したキレート発色剤に由来するシグナルを測定するのに適したｐＨを選び、用いればよい。
【００５４】
また、本発明の非トランスフェリン結合鉄の測定試薬の好ましい実施態様において、前記キレート物質含有液のｐＨが、ｐＨ７．４以上であることを特徴とする。本発明において、キレート物質がトランスフェリンに結合している鉄と結合しないことが好ましいという観点から、前記のキレート物質を含有する溶液（試薬）のｐＨは、ｐＨ７．４（２０℃）以上であることが好ましく、ｐＨ７．８（２０℃）以上であることがより好ましく、ｐＨ８．０（２０℃）以上であることが特に好ましい。また、前記のキレート物質を含有する溶液（試薬）のｐＨは、非トランスフェリン結合鉄とキレート物質との反応性の観点から、ｐＨ９．０（２０℃）以下であることが好ましく、ｐＨ８．６（２０℃）以下であることがより好ましい。
【００５５】
また、本発明の非トランスフェリン結合鉄の測定試薬の好ましい実施態様において、前記キレート発色剤含有液のｐＨが、ｐＨ７．４以上であることを特徴とする。本発明において、前記のキレート発色剤を含有する溶液（試薬）のｐＨは、キレート発色剤がトランスフェリンに結合している鉄と結合しないことが好ましいという観点から、ｐＨ７．４（２０℃）以上であることが好ましく、ｐＨ７．８（２０℃）以上であることがより好ましく、ｐＨ８．０（２０℃）以上であることが特に好ましい。また、前記のキレート発色剤を含有する溶液（試薬）のｐＨは、キレート発色剤と鉄との反応性、及びキレート発色剤の発色の感度の観点から、ｐＨ９．０（２０℃）以下であることが好ましく、ｐＨ８．６（２０℃）以下であることがより好ましい。
【００５６】
また、本発明において、最終反応液のｐＨについては、以下の通りである。試料、キレート物質及びキレート発色剤を混合した最終反応液のｐＨは、キレート発色剤がトランスフェリンに結合している鉄と結合しないことが好ましい等の観点から、ｐＨ７．４（２０℃）以上であることが好ましく、ｐＨ７．８（２０℃）以上であることがより好ましく、ｐＨ８．０（２０℃）以上であることが特に好ましい。また、前記の最終反応液のｐＨは、キレート発色剤と鉄との反応性、及びキレート発色剤の発色の感度等の観点から、ｐＨ９．０（２０℃）以下であることが好ましく、ｐＨ８．６（２０℃）以下であることがより好ましい。
【００５７】
なお、本発明においては、測定試薬は、最終反応液において前記のｐＨとなるようなｐＨとしておくことが好ましい。
【００５８】
本発明の非トランスフェリン結合鉄測定用キットは、第１試薬と第２試薬とを含有する非トランスフェリン結合鉄測定用キットであって、前記第１試薬がキレート剤、有機酸又は無機酸から選択されるキレート物質を含有し、前記第２試薬が２−ニトロソ−５−（Ｎ−プロピル−Ｎ−スルホプロピルアミノ）−フェノール、フェレン、フェロジン、又はバソフェナンスロリンからなる群から選択される少なくとも１種からなるキレート発色剤を含有することを特徴とする。「キレート剤」、「有機酸」、「無機酸」、「キレート物質」等については、上述の本発明の測定試薬の説明をそのまま参照、引用することができる。また、「２−ニトロソ−５−（Ｎ−プロピル−Ｎ−スルホプロピルアミノ）−フェノール」、「フェレン」、「フェロジン」、「バソフェナンスロリン」、「キレート発色剤」等についても、上述の本発明の測定試薬の説明をそのまま参照、引用することができる。
【００５９】
また、上述の本発明の測定試薬、及びキットについては、緩衝剤、その他の成分を含むことができる。以下説明する。
【００６０】
本発明の測定試薬及びキットにおいては、緩衝剤を、キレート物質を含有する溶液（試薬）、キレート発色剤を含有する溶液（試薬）、又は最終反応液（試料、キレート物質及びキレート発色剤を混合したもの）に含有させることができる。
【００６１】
上述のｐＨの説明において記載したｐＨに、キレート物質を含有する溶液（試薬）、キレート発色剤を含有する溶液（試薬）、及び最終反応液をそれぞれ設定することができるように、これらのｐＨ域において緩衝能を有する緩衝剤を、緩衝能を有する濃度において、キレート物質を含有する溶液（試薬）、キレート発色剤を含有する溶液（試薬）、又は最終反応液に含有させることが好ましい。このような緩衝剤としては、例えば、ＭＥＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓプロパン、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、ＭＯＰＳＯ、ＭＯＰＳ、ＢＥＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＴＡＰＳＯ、ＰＯＰＳＯ、ＨＥＰＰＳＯ、ＥＰＰＳ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、Ｂｉｃｉｎｅ、ＴＡＰＳ、ＣＨＥＳ、リン酸、リン酸塩、ホウ酸、ホウ酸塩、グリシン、グリシルグリシン、イミダゾール、又はトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン〔Ｔｒｉｓ〕等を挙げることができる。この緩衝剤としては、一連の測定反応に干渉しないことが好ましいという観点から、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン又はＴＡＰＳが好ましく、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンがより好ましい。
【００６２】
上述の本発明の測定試薬、及びキットについては、その他の成分を含むことができる。すなわち、本発明においては、キレート物質を含有する溶液（試薬）、キレート発色剤を含有する溶液（試薬）、又は最終反応液（試料、キレート物質及びキレート発色剤を混合したもの）に、前記の成分の他に、以下の成分、すなわち、（１）還元剤、及び／又は（２）その他の成分等を含有させることができる。
【００６３】
（１）還元剤
本発明の測定試薬及びキットにおいては、キレート物質を含有する溶液（試薬）、キレート発色剤を含有する溶液（試薬）、又は最終反応液（試料、キレート物質及びキレート発色剤を混合したもの）に、還元剤又は還元剤を生成することができる物質を含有させてもよい。例えば、血液中の鉄は３価の鉄イオンであるので、前記のキレート発色剤が２価の鉄イオンとの結合によってシグナルを生成又は変化させるものである場合は、試料に由来する鉄（非トランスフェリン結合鉄）を還元剤により３価イオンから２価イオンに還元して、キレート発色剤と反応させる必要がある。この還元剤としては、例えば、Ｌ−アスコルビン酸、塩酸ヒドロキシルアミン、チオグリコール酸、ハイドロキノン、ハイドロサルファイト、又は亜硫酸塩、二亜硫酸塩等を挙げることができる。
【００６４】
また、還元剤を生成することができる物質として、例えば、Ｌ−アスコルビン酸のリン酸エステル等を挙げることができる。このＬ−アスコルビン酸のリン酸エステルは、アルカリ性ホスファターゼを作用させることにより加水分解され、Ｌ−アスコルビン酸を生成する。
【００６５】
本発明の測定試薬及びキットにおいて、この還元剤又は還元剤を生成することができる物質を使用又は含有させる濃度は、特に限定はなく適宜定めればよいが、例えば、試料、キレート物質及びキレート発色剤を混合した最終反応液において、この還元剤又は還元剤を生成することができる物質の濃度は、試料に由来する鉄（非トランスフェリン結合鉄）を３価イオンから２価イオンに還元するのに十分な量を存在させるという観点から、１μＭ以上であることが好ましく、１ｍＭ以上であることがより好ましく、５ｍＭ以上であることが特に好ましい。また、この還元剤又は還元剤を生成することができる物質を使用又は含有させる濃度は、例えば、試料、キレート物質及びキレート発色剤を混合した最終反応液において、必要以上の濃度で存在させることはコスト的にマイナスであるという観点から、５００ｍＭ以下であることが好ましく、２５０ｍＭ以下であることがより好ましく、５０ｍＭ以下であることが特に好ましい。なお、本発明においては、測定試薬には、最終反応液において前記の濃度になるように還元剤又は還元剤を生成することができる物質を含有させることが好ましい。
【００６６】
（２）その他の成分
本発明の測定試薬及びキットにおいては、更に、他の酵素；他の酵素の基質；他の補酵素；他のイオン若しくはこれを含む塩；アルブミン若しくはカゼインなどのタンパク質；非イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、両性界面活性剤若しくは陽イオン性界面活性剤などの界面活性化物質；アジ化ナトリウム、抗生物質若しくは合成抗菌剤などの防腐剤；他の糖類若しくは高分子化合物などの安定化剤；活性化剤；試料中に含まれる測定妨害物質の消去若しくは影響の抑制に関わる物質；又は他の試薬成分等を、適宜必要に応じて、キレート物質を含有する溶液（試薬）、キレート発色剤を含有する溶液（試薬）、又は最終反応液に含有させることができる。なお、これらを含ませる際の濃度は特に限定されるものではないが、これらのそれぞれの成分の役割を果たすのに十分な量を存在させるという観点から、０．００１〜１０％（ｗ／ｖ）が好ましく、特に０．０１〜５％（ｗ／ｖ）が好ましい。
【００６７】
また、前記の各界面活性剤の具体例としては、例えば、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、デカグリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンフィトステロール、フィトスタノール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンヒマシ油、硬化ヒマシ油若しくはポリオキシエチレンラノリンなどの非イオン性界面活性剤；酢酸ベタインなどの両性界面活性剤；又は、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩若しくはポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸塩などの陰イオン性界面活性剤等を挙げることができる。
【００６８】
本発明の非トランスフェリン結合鉄の測定試薬は、終点法（エンドポイント法）により測定を行うものであってもよく、又は反応速度法（レート法）により測定を行うものであってもよく、適宜選択すればよい。本発明の測定試薬においては、終点法（エンドポイント法）により測定を行うものが好ましい。また、この本発明の測定試薬は、一段階のステップにより測定を行う１ステップ法（１試薬法）のものであってもよく、又は二段階若しくはそれ以上の多段階のステップにより測定を行う多ステップ法（多試薬法）のものであってもよく、適宜選択すればよい。
【００６９】
本発明の測定試薬においては、多ステップ法（多試薬法）のものが好ましい。本発明の測定試薬においては、二段階のステップにより測定を行う二ステップ法（２試薬法）のものがより好ましい。
【００７０】
この二ステップ法（２試薬法）において、先に試料と混合する第１試薬と、この混合液に添加し混合する第２試薬の２試薬からなる場合、キレート物質は第１試薬に含有させることが好ましく、キレート発色剤は第２試薬に含有させることが好ましい。この本発明の測定試薬において、その測定は、用手法により行うものであってもよく、又は自動分析装置等の装置を用いて行うものであってもよい。
【００７１】
また、この本発明の測定試薬は、その構成試薬の全て又は一部が液状試薬であってよい。また、この本発明の測定試薬は、そのもの単独にて、販売し、又は試料中の非トランスフェリン結合鉄の測定に使用することができる。また、この本発明の測定試薬は、前記した測定試薬以外のその他の試薬と組み合わせて、販売し、又は非トランスフェリン結合鉄の測定に使用することもできる。
【００７２】
前記した測定試薬以外のその他の試薬としては、例えば、緩衝液、試料希釈液、試薬希釈液、校正（キャリブレーション）を行うための物質を含有する試薬、又は精度管理を行うための物質を含有する試薬等を挙げることができる。
【００７３】
また、この本発明の測定試薬は、第１試薬及び第２試薬、又はその他の試薬等の複数の構成試薬からなる測定試薬キットであってもよい。
【００７４】
次に、本発明の非トランスフェリン結合鉄の測定方法について説明する。本発明の非トランスフェリン結合鉄の測定方法は、トランスフェリンを分離する工程を含まずに、前記試料中の非トランスフェリン結合鉄を測定することを特徴とする。「非トランスフェリン結合鉄」、「試料」等については、上述の本発明の測定試薬及びキットにおいて説明したものを、本発明の測定方法において、そのまま参照、引用することができる。
【００７５】
本発明において、トランスフェリンを分離する工程とは、トランスフェリンを、除タンパク処理、遠心分離処理、限外ろ過処理、及びクロマトグラフィー等により、非トランスフェリン結合鉄又はこれに由来する鉄から分離する工程をいう。従来の非トランスフェリン結合鉄の測定においては、このトランスフェリンを分離する工程が必要であった。
【００７６】
しかし、本発明においては、試料からトランスフェリンを分離する工程を必要とせず、このトランスフェリンを分離する工程がなくとも、非トランスフェリン結合鉄を正確に測定することが可能となった。このように、本発明は、トランスフェリンを分離する工程を含まないものであるため、試料の前処理等によりトランスフェリンを分離する工程がなく、これによって、従来の非トランスフェリン結合鉄の測定に比較し、迅速、かつ簡便に非トランスフェリン結合鉄の測定が可能となった。
【００７７】
また、本発明の非トランスフェリン結合鉄の測定方法の好ましい実施態様において、前記試料と、キレート物質とを混合する工程と、得られた混合物と、キレート発色剤とを混合する工程と、鉄イオンが結合したキレート発色剤に由来するシグナルを測定することにより、非トランスフェリン結合鉄中の鉄の定量値を得る工程と、を含むことを特徴とする。「試料」、「キレート物質」、「キレート発色剤」等については、上述の本発明の測定試薬及びキットにおいて説明したものを、本発明の測定方法において、そのまま参照、引用することができる。シグナルとしては、例えば、紫外部、可視部若しくは赤外部の吸光度若しくは透過率、蛍光強度、又は発光強度等を挙げることができる。
【００７８】
また、本発明の非トランスフェリン結合鉄の測定方法の好ましい実施態様において、非トランスフェリン結合鉄の測定を、トランスフェリンに結合している鉄にキレート物質やキレート発色剤が結合しないことが好ましい等の観点から、ｐＨ７．４以上、好ましくは、ｐＨ７．８以上、より好ましくはｐＨ８．０以上で行うことができる。
【００７９】
また、本発明の非トランスフェリン結合鉄の測定方法の好ましい実施態様において、前記非トランスフェリン結合鉄が、体液、排泄物又は分泌物、生体又は生体関連物、に含まれるトランスフェリン以外の鉄結合性物質に結合している鉄であることを特徴とする。「非トランスフェリン結合鉄」、「トランスフェリン以外の鉄結合性物質に結合している鉄」、「鉄結合性物質」等の説明については、上述の本発明の測定試薬及びキットにおいて説明したものを、本発明の測定方法において、そのまま参照、引用することができる。本発明の好ましい実施態様において、前記鉄結合性物質が、血液、血清、又は血漿に含まれるものである。
【００８０】
また、本発明の非トランスフェリン結合鉄の測定方法の好ましい実施態様において、前記キレート発色剤が、２−ニトロソ−５−（Ｎ−プロピル−Ｎ−スルホプロピルアミノ）−フェノール、フェレン、フェロジン、又はバソフェナンスロリンからなる群から選択される少なくとも１種であることを特徴とする。「キレート発色剤」等の説明については、上述の本発明の測定試薬及びキットにおいて説明したものを、本発明の測定方法において、そのまま参照、引用することができる。
【００８１】
また、本発明の好ましい実施態様において、前記キレート物質が、キレート剤、有機酸又は無機酸であることを特徴とする。「キレート物質」、「キレート剤」、「有機酸」、「無機酸」等の説明については、上述の本発明の測定試薬及びキットにおいて説明したものを、本発明の測定方法において、そのまま参照、引用することができる。
【００８２】
また、本発明の測定方法においても、上述した、本発明の測定試薬、及びキットの説明において、説明したその他の成分を用いて、測定することができる。すなわち、本発明においては、キレート物質を含有する溶液（試薬）、キレート発色剤を含有する溶液（試薬）、又は最終反応液（試料、キレート物質及びキレート発色剤を混合したもの）に、前記の成分の他に、上述の成分、（１）還元剤、及び／又は（２）その他の成分等を含有させて、測定することも可能である。
【００８３】
本発明の非トランスフェリン結合鉄の測定方法により非トランスフェリン結合鉄の測定を行う場合、測定は終点法（エンドポイント法）又は反応速度法（レート法）等の方法を適宜選択して測定を行えばよい。本発明の測定方法においては、測定感度をより多く得ることができるという観点から、終点法（エンドポイント法）により測定を行うものが好ましい。また、この測定は、一段階のステップにより行う１ステップ法（１試薬法）、又は二段階若しくはそれ以上の多段階のステップにより行う多ステップ法（多試薬法）を適宜選択して測定を行えばよい。本発明の測定方法においては、測定反応にかかわる成分を分けることによってその保存安定性が向上し、そして測定反応を分けることにより測定の正確性が高まるため好ましいという観点から、多ステップ法（多試薬法）のものが好ましい。本発明の測定方法においては、二段階のステップにより測定を行う二ステップ法（２試薬法）のものがより好ましい。
【００８４】
この二ステップ法（２試薬法）において、先に試料と混合する第１試薬と、この混合液に添加し混合する第２試薬の２試薬からなる場合、キレート物質は第１試薬に含有させることが好ましく、キレート発色剤は第２試薬に含有させることが好ましい。
【００８５】
また、本発明の測定方法において、鉄イオンが結合したキレート発色剤に由来するシグナルを測定することにより、非トランスフェリン結合鉄の定量値を得ることにおいて、前記シグナルの測定が、鉄が結合したキレート発色剤の発色を光学的に測定するものである場合、この生成した色素を光学的に測定する際の測定波長は、使用したキレート発色剤に応じた適当な波長を適宜選択して使用することができる。なお、この場合、一波長法でもよく、又は二波長法でもよい。
【００８６】
また、本発明の測定方法において、測定反応時の温度は、３０℃又は３７℃等測定反応が進行しかつ測定反応に係わる反応成分が熱により失活、変性又は変質しない範囲内の温度を設定すればよい。また、本発明の測定方法において、測定反応の開始方法は、反応成分を加えることにより行う方法、又は試料を加えることにより行う方法等のいずれの方法でもよい。測定は、用手法により行ってもよく、又は自動分析装置等の装置を用いて行ってもよい。
【実施例】
【００８７】
ここで、本発明における試料中の非トランスフェリン結合鉄の測定の一実施態様を以下に説明するが、本発明は、下記の実施例に限定して解釈されるものではない。また、本発明の要旨を逸脱することなく、適宜変更することが可能であることは言うまでもない。
【実施例１】
【００８８】
（ａ）測定試薬の調製
下記の各成分の一定量をそれぞれ純水に溶解し、ｐＨを一定のｐＨに調整することにより、非トランスフェリン結合鉄測定試薬の第１試薬及び第２試薬を各々調製した。
【００８９】
（ｉ）第１試薬
・ニトリロ三酢酸(ＮＴＡ)
・トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン〔Ｔｒｉｓ〕  （ｐＨ８．０）
【００９０】
（ｉｉ）第２試薬
・２−ニトロソ−５−（Ｎ−プロピル−Ｎ−スルホプロピルアミノ）−フェノール〔ＮｉｔｒｏｓｏＰＳＡＰ〕
・Ｌ−アスコルビン酸
・トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン〔Ｔｒｉｓ〕  （ｐＨ８．０）
【００９１】
（ｂ）試料
ヒトの血清を試料として用いた。
【００９２】
（ｃ）測定
（ｉ）第１段階
前記の試料と前記の第１試薬を混合して、混合液を調製する。
この混合する試料及び第１試薬それぞれの量は、第２試薬の量、試料に含まれる非トランスフェリン結合鉄の濃度、キレート発色剤の吸光係数等、測定波長、使用する分析装置の仕様等、並びに他の条件に応じて適宜決めればよい。なお、一般的には、例えば、試料の量は０．５〜１００μＬ、第１試薬の量は２０〜１、０００μＬの範囲のもの等とすることが好ましい。
【００９３】
この混合液の調製後、インキュベートを行う。このインキュベートの時間は、特に制限はないのであるが、通常は２０分以内であることが好ましく、１０分以内であることがより好ましく、５分以内であることが特に好ましい。また、インキュベートする際の温度は、前記の混合液が凍結する温度より上の温度であればよい。なお、一般的に測定反応時の温度は、高い程、反応速度が高くなるので好ましい。
【００９４】
しかし、温度が高すぎると反応に係わる成分が変性、失活してしまうことがあるので、インキュベートする際の温度は、測定反応に係わる成分が変性、失活する温度未満の温度とする必要がある。このインキュベートする際の温度は、通常は２〜７０℃であるが、２０〜３７℃が好ましく、３０〜３７℃がより好ましい。
【００９５】
この試料と第１試薬の混合液の調製及びインキュベートにより、試料に含まれていた非トランスフェリン結合鉄と、第１試薬に含まれる試薬成分のキレート物質とが接触し、トランスフェリン以外の鉄結合性物質に結合していた鉄がトランスフェリン以外の鉄結合性物質からキレート物質に移り、非トランスフェリン結合鉄がキレート物質に結合する。
【００９６】
（ｉｉ）第２段階
前記の第１段階で調製した「試料と第１試薬の混合液」に、第２試薬を混合する。これを最終反応液とする。
【００９７】
この混合する第２試薬の量は、試料の量、第１試薬の量、試料に含まれる非トランスフェリン結合鉄の濃度、キレート発色剤の吸光係数等、測定波長、使用する分析装置の仕様等、並びに他の条件に応じて適宜決めればよい。なお、一般的には、例えば、第２試薬の量は１０〜１、０００μＬの範囲のもの等とすることが好ましい。この最終反応液の調製後、インキュベートを行う。
【００９８】
このインキュベートの時間は、特に制限はないのであるが、通常は２０分以内であることが好ましく、１０分以内であることがより好ましく、５分以内であることが特に好ましい。また、インキュベートする際の温度は、前記の最終反応液が凍結する温度より上の温度であればよい。なお、一般的に測定反応時の温度は、高い程、反応速度が高くなるので好ましい。
【００９９】
しかし、温度が高すぎると測定反応に係わる成分が変性、失活してしまうので、インキュベートする際の温度は、測定反応に係わる成分が変性、失活する温度未満の温度とする必要がある。このインキュベートする際の温度は、通常は２〜７０℃であるが、２０〜３７℃が好ましく、３０〜３７℃がより好ましい。
【０１００】
この最終反応液の調製及びインキュベートにより、前記の第１段階における測定反応に引き続き、この第２段階における測定反応が開始し、試料に含まれていた非トランスフェリン結合鉄の測定反応が進められる。
【０１０１】
すなわち、非トランスフェリン結合鉄を結合したキレート物質と、第２試薬に含まれる試薬成分のキレート発色剤とが接触し、キレート物質に結合していた鉄（非トランスフェリン結合鉄）がキレート物質からキレート発色剤に移り、鉄（非トランスフェリン結合鉄）がキレート発色剤に結合する。
【０１０２】
次に、鉄（非トランスフェリン結合鉄）が結合したキレート発色剤に由来するシグナルを測定する。例えば、最終反応液の吸光度（又は透過率）等を測定する。なお、シグナルの測定が鉄が結合したキレート発色剤の発色を光学的に測定するものである場合、この吸光度（又は透過率）の測定は、一つの波長においてのみ行う一波長法でもよく、又は二つの波長においてそれぞれ行う二波長法でもよく、適宜選択して行えばよい。また、吸光度（又は透過率）の測定を行う波長についても、そのキレート発色剤の吸収波長に応じて、適宜選択すればよい。
【０１０３】
そして、吸光度（若しくは透過率）の測定は、終点法（エンドポイント法）又は反応速度法（レート法）等の方法を適宜選択して行えばよい。なお、測定した吸光度（若しくは透過率）又は吸光度（若しくは透過率）の変化量より、試料に含まれていた非トランスフェリン結合鉄の濃度を算出することは、キレート発色剤の発色のモル吸光係数を基に測定した吸光度（若しくは透過率）より算出する方法、又は濃度が分かっている鉄（標準物質）の吸光度（若しくは透過率）と対比して算出する方法等の方法を適宜選択して行えばよい。また、本発明においては、試料を測定して得た吸光度（若しくは透過率）より試薬盲検（試薬ブランク）を差し引いて、試料に含まれていた非トランスフェリン結合鉄の濃度を算出することが好ましい。
【０１０４】
なお、非トランスフェリン結合鉄の測定の操作は、測定者自身が用手法により行ってもよいし、又は自動分析装置等の装置を使用して行ってもよい。また、非トランスフェリン結合鉄の測定に使用する測定試薬が、第１試薬、第２試薬、及び他の試薬（一つ又は二つ以上の試薬）よりなる場合、すなわち３以上の試薬よりなる場合は、これらの試薬を使用して測定を行うのに必要な数の段階（必要に応じ２段階又は３段階以上の段階）を経て測定反応を行わせ、非トランスフェリン結合鉄の測定を行えばよい。
【実施例２】
【０１０５】
まず、本発明の測定試薬、及び測定方法を評価するために、現在最も信頼されている佐々木らのHPLC法による測定と比較して、相関性及び正確性を調べた。
【０１０６】
Ｉ．ＨＰＬＣ法による非トランスフェリン結合鉄の測定
ＨＰＬＣ法による測定は、Sasaki  et  al.、Molecular  Medicine  Reports 4:  p913-918、2011に記載の、「Improved  quantification  for  non-transferrin-bound  iron  measurement     using  high-performance  liquid  chromatography  by  reducing  iron  contamination」に準じて行った。
【０１０７】
１．装置
使用した装置の機種名等は以下の通りである。すなわち、本実施例において、データ取得に用いたＨＰＬＣ装置〔デガッサー、ポンプ、オートサンプラー、カラムオーブン、検出器〕のメーカー名及び機種名は以下の通りである：
・Waters  2796  Bioseparations  Module 
(デガッサー・ポンプ・オートサンプラー・カラムオーブン)
・Waters  2998  Photodiode  Array  Detector
（検出器）
【０１０８】
２．試料
次の（１）〜（４）の４種類のヒト血清試料を試料として用いた。
（１）  ヒト血清試料−１
（２）  ヒト血清試料−２
（３）  ヒト血清試料−３
（４）  ヒト血清試料−４
【０１０９】
３．試料の測定
前記２．試料の各試料について、前記１．装置の各装置よりなるＨＰＬＣシステムを用いて、非トランスフェリン結合鉄の測定を行った。
なお、この前記１．装置の各装置よりなるＨＰＬＣシステムは、「移動相溶液」−「デガッサー」−「ポンプ」−「オートサンプラー」−「カラムオーブン」−「ＵＶ検出器」−「廃液」の通りつながっている。
【０１１０】
（１）  前記２．試料の各試料の４５０μＬを、５ｍＭのＮａ3［Ｃｏ（ＣＯ3）3］・３Ｈ2Ｏの５０μＬと混合し、各試料に含まれる鉄が結合していないトランスフェリンの鉄結合部位をブロックした。
次に、これを３７℃で１時間、インキュベーションした。
その後、この２２５μＬを分取してＡ液とした。
また、別に２２５μＬを分取してＢ液とした。
【０１１１】
（２）  前記のＡ液に８０ｍＭのニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）の水溶液の２５μＬを加え、室温で３０分間インキュベーションした。
次に、これを、アミコン  ウルトラ−０．５ｍＬ  ３０ｋを用いて、３０ＫＤａのフィルターユニットで遠心ろ過（１４，０００ｇ、３０分間、２０℃）を行った。
このろ液（トランスフェリン等を含むタンパク質が除去されている）をＨＰＬＣ用のサンプルバイアルに分注した。
次に、このサンプルバイアルに分注したろ液の２０μＬを、前記１．装置の各装置よりなるＨＰＬＣシステムのオートサンプラーより、ＨＰＬＣシステムに注入した。
なお、このＨＰＬＣシステムの移動相は、キレート発色剤である１−プロピル−２−メチル−３−ヒドロキシ−４（１Ｈ）−ピリジノン塩酸塩〔ＣＰ２２〕、鉄を除去した純水、アセトニトリル、及びＭＯＰＳ緩衝剤よりなるものであり、フィルターろ過し、脱気処理を行ったものを用いた。
このＨＰＬＣ法での測定においては、オートサンプラーより注入された試料に含まれる非トランスフェリン結合鉄が、カラム中で前記のキレート発色剤（ＣＰ２２）と反応して発色し、このキレート発色剤（ＣＰ２２）の発色をＵＶ検出器で検出する。
このような操作及び処理により、前記のＡ液の測定値（「測定値Ａ」）を得た。
【０１１２】
（３）  前記のＢ液に鉄を除去した純水の２５μＬを加え、室温で３０分間インキュベーションした。
次に、これを、アミコン  ウルトラ−０．５ｍＬ  ３０ｋを用いて、３０ＫＤａのフィルターユニットで遠心ろ過（１４，０００ｇ、３０分間、２０℃）を行った。
このろ液（トランスフェリン等を含むタンパク質が除去されている）をＨＰＬＣ用のサンプルバイアルに分注した。
次に、このサンプルバイアルに分注したろ液の２０μＬを、前記１．装置の各装置よりなるＨＰＬＣシステムのオートサンプラーより、ＨＰＬＣシステムに注入した。
なお、このＨＰＬＣシステムの移動相は、キレート発色剤である１−プロピル−２−メチル−３−ヒドロキシ−４（１Ｈ）−ピリジノン塩酸塩〔ＣＰ２２〕、鉄を除去した純水、アセトニトリル、及びＭＯＰＳ緩衝剤よりなるものであり、フィルターろ過し、脱気処理を行ったものを用いた。
このＨＰＬＣ法での測定においては、オートサンプラーより注入された試料に含まれる非トランスフェリン結合鉄が、カラム中で前記のキレート発色剤（ＣＰ２２）と反応して発色し、このキレート発色剤（ＣＰ２２）の発色をＵＶ検出器で検出する。
このような操作及び処理により、前記のＢ液の測定値（「測定値Ｂ」）〔ブランク〕を得た。
【０１１３】
（４）  前記の「測定値Ａ」から「測定値Ｂ」を差し引くことで、各試料の非トランスフェリン結合鉄の濃度の測定値を得た。
【０１１４】
この測定結果を、図１に示した。（図１は、本願発明の一実施態様による測定と、ＨＰＬＣ法による測定との相関性を示す図である。）
【０１１５】
ＩＩ．本発明の測定試薬及び測定方法による非トランスフェリン結合鉄の測定
１．測定試薬
非トランスフェリン結合鉄測定試薬は下記の通り調製した。
（ａ）第１試薬
第１試薬〔ＮＴＡ０．１ｍＭ；ｐＨ８．０〕の調製
後述の実施例３の１．測定試薬の（ａ）第１試薬の（６）第１試薬〔ＮＴＡ０．１ｍＭ；ｐＨ８．０〕の調製の項に記載された通りに調製を行い、第１試薬〔ＮＴＡ０．１ｍＭ；ｐＨ８．０〕を調製した。
【０１１６】
（ｂ）第２試薬
第２試薬〔ＮｉｔｒｏｓｏＰＳＡＰ；ｐＨ８．０〕
後述の実施例３の１．測定試薬の（ｂ）第２試薬の（２）第２試薬〔ｐＨ８．０〕の調製の項に記載された通りに調製を行い、第２試薬〔ＮｉｔｒｏｓｏＰＳＡＰ；ｐＨ８．０〕を調製した。
【０１１７】
２．試料
前記のＩ．ＨＰＬＣ法による非トランスフェリン結合鉄の測定の２．試料の（１）ヒト血清試料−１〜（４）ヒト血清試料−４の４種類のヒト血清試料を、本発明の測定においても同じく試料として用いた。
【０１１８】
３．試料の測定
前記２．試料の各試料について、前記１．測定試薬の第１試薬、及び（ｂ）第２試薬の第２試薬をそれぞれ組み合わせて用いて、非トランスフェリン結合鉄の測定を行った。
この各試料の非トランスフェリン結合鉄の測定は、下の事項を除いては、後述の実施例３の３．試料の測定の項の記載と同様にして行い、各試料の非トランスフェリン結合鉄の濃度の測定値を得た。
【０１１９】
・  日立７７００形自動分析装置（株式会社日立ハイテクノロジーズ；日本国）を使用して測定を行った。
・  実施例３の３．試料の測定の（２）の項において、１６ポイント（第１試薬添加後２７０．０９３秒）の吸光度を主波長７５０ｎｍ、副波長６００ｎｍにて測定して、この１６ポイントにおける吸光度を得た〔「測光１」〕。（試料ブランクの吸光度の測定）
・  実施例３の３．試料の測定の（３）の項において、第１試薬添加後２７９．０００秒目に、第２試薬の５０μＬを添加し、３７℃で反応させた。
・  実施例３の３．試料の測定の（４）の項において、３４ポイント（第１試薬添加後５８７．４２６秒）の吸光度を主波長７５０ｎｍ、副波長６００ｎｍにて測定して、この３４ポイントの吸光度を得た〔「測光２」〕。（試料中に含まれていた非トランスフェリン結合鉄の濃度に応じた吸光度の測定）
【０１２０】
４．測定結果
この結果を、図１に示す。図１は、本願発明の一実施態様による測定と、ＨＰＬＣ法による測定との相関性を示す図である。
本発明の測定による定量値（縦軸；μＭ）をｙとし、ＨＰＬＣ法の測定による定量値（横軸；μＭ）をｘとしたとき、相関の回帰式はｙ＝１．０４ｘ−０．１であり、相関係数（ｒ）は０．９５４６であった。
図１から明らかなように、信頼性が非常に高いＨＰＬＣ法による測定方法との高い相関性が認められ、そして、これにより本発明により得られる非トランスフェリン結合鉄の定量値が正確なものであることが確かめられた。
【実施例３】
【０１２１】
次に、キレート物質及びｐＨを変えて非トランスフェリン結合鉄の測定を行った。
【０１２２】
１．測定試薬
非トランスフェリン結合鉄測定試薬は下記の通り調製した。
（ａ）第１試薬
（１）第１試薬〔ニトリロ三酢酸(以下、ＮＴＡともいう。)０ｍＭ；ｐＨ７．４〕の調製
下記の試薬成分を記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ７．４（２０℃）に調整して、キレート物質を含有せず、かつｐＨがｐＨ７．４（２０℃）である第１試薬〔ＮＴＡ０ｍＭ；ｐＨ７．４〕を調製した。
試薬成分：
・トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン  〔Ｔｒｉｓ〕  ＜緩衝剤＞    ２０ｍＭ
【０１２３】
（２）第１試薬〔ＮＴＡ０．１ｍＭ；ｐＨ７．４〕の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ７．４（２０℃）に調整して、第１試薬〔ＮＴＡ０．１ｍＭ；ｐＨ７．４〕を調製した。
試薬成分：
・ニトリロ三酢酸  〔ＮＴＡ〕  ＜キレート物質＞    ０．１ｍＭ
・トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン  〔Ｔｒｉｓ〕  ＜緩衝剤＞    ２０ｍＭ
【０１２４】
（３）第１試薬〔ＮＴＡ０．５ｍＭ；ｐＨ７．４〕の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ７．４（２０℃）に調整して、第１試薬〔ＮＴＡ０．５ｍＭ；ｐＨ７．４〕を調製した。
試薬成分：
・ニトリロ三酢酸  〔ＮＴＡ〕  ＜キレート物質＞    ０．５ｍＭ
・トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン  〔Ｔｒｉｓ〕  ＜緩衝剤＞    ２０ｍＭ
【０１２５】
（４）第１試薬〔ＮＴＡ１ｍＭ；ｐＨ７．４〕の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ７．４（２０℃）に調整して、第１試薬〔ＮＴＡ１ｍＭ；ｐＨ７．４〕を調製した。
試薬成分：
・ニトリロ三酢酸  〔ＮＴＡ〕  ＜キレート物質＞    １．０ｍＭ
・トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン  〔Ｔｒｉｓ〕  ＜緩衝剤＞    ２０ｍＭ
【０１２６】
（５）第１試薬〔ＮＴＡ０ｍＭ；ｐＨ８．０〕の調製
下記の試薬成分を記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ８．０（２０℃）に調整して、キレート物質を含有せず、かつｐＨがｐＨ８．０（２０℃）である第１試薬〔ＮＴＡ０ｍＭ；ｐＨ８．０〕を調製した。
試薬成分：
・トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン  〔Ｔｒｉｓ〕  ＜緩衝剤＞    ２０ｍＭ
【０１２７】
（６）第１試薬〔ＮＴＡ０．１ｍＭ；ｐＨ８．０〕の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ８．０（２０℃）に調整して、第１試薬〔ＮＴＡ０．１ｍＭ；ｐＨ８．０〕を調製した。
試薬成分：
・ニトリロ三酢酸  〔ＮＴＡ〕  ＜キレート物質＞    ０．１ｍＭ
・トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン  〔Ｔｒｉｓ〕  ＜緩衝剤＞    ２０ｍＭ
【０１２８】
（７）第１試薬〔ＮＴＡ０．５ｍＭ；ｐＨ８．０〕の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ８．０（２０℃）に調整して、第１試薬〔ＮＴＡ０．５ｍＭ；ｐＨ８．０〕を調製した。
試薬成分：
・ニトリロ三酢酸  〔ＮＴＡ〕  ＜キレート物質＞    ０．５ｍＭ
・トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン  〔Ｔｒｉｓ〕  ＜緩衝剤＞    ２０ｍＭ
【０１２９】
（８）第１試薬〔ＮＴＡ１ｍＭ；ｐＨ８．０〕の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ８．０（２０℃）に調整して、第１試薬〔ＮＴＡ１ｍＭ；ｐＨ８．０〕を調製した。
試薬成分：
・ニトリロ三酢酸  〔ＮＴＡ〕  ＜キレート物質＞    １．０ｍＭ
・トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン  〔Ｔｒｉｓ〕  ＜緩衝剤＞    ２０ｍＭ
【０１３０】
（９）第１試薬〔ＮＴＡ０ｍＭ；ｐＨ８．６〕の調製
下記の試薬成分を記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ８．６（２０℃）に調整して、キレート物質を含有せず、かつｐＨがｐＨ８．６（２０℃）である第１試薬〔ＮＴＡ０ｍＭ；ｐＨ８．６〕を調製した。
試薬成分：
・トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン  〔Ｔｒｉｓ〕  ＜緩衝剤＞    ２０ｍＭ
【０１３１】
（１０）第１試薬〔ＮＴＡ０．１ｍＭ；ｐＨ８．６〕の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ８．６（２０℃）に調整して、第１試薬〔ＮＴＡ０．１ｍＭ；ｐＨ８．６〕を調製した。
試薬成分：
・ニトリロ三酢酸  〔ＮＴＡ〕  ＜キレート物質＞    ０．１ｍＭ
・トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン  〔Ｔｒｉｓ〕  ＜緩衝剤＞    ２０ｍＭ
【０１３２】
（１１）第１試薬〔ＮＴＡ０．５ｍＭ；ｐＨ８．６〕の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ８．６（２０℃）に調整して、第１試薬〔ＮＴＡ０．５ｍＭ；ｐＨ８．６〕を調製した。
試薬成分：
・ニトリロ三酢酸  〔ＮＴＡ〕  ＜キレート物質＞    ０．５ｍＭ
・トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン  〔Ｔｒｉｓ〕  ＜緩衝剤＞    ２０ｍＭ
【０１３３】
（１２）第１試薬〔ＮＴＡ１ｍＭ；ｐＨ８．６〕の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ８．６（２０℃）に調整して、第１試薬〔ＮＴＡ１ｍＭ；ｐＨ８．６〕を調製した。
試薬成分：
ニトリロ三酢酸  〔ＮＴＡ〕  ＜キレート物質＞    １．０ｍＭ
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン  〔Ｔｒｉｓ〕  ＜緩衝剤＞    ２０ｍＭ
【０１３４】
（１３）第１試薬〔ＨＩＤＡ０ｍＭ；ｐＨ７．４〕の調製
下記の試薬成分を記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ７．４（２０℃）に調整して、キレート物質を含有せず、かつｐＨがｐＨ７．４（２０℃）である第１試薬〔ＨＩＤＡ０ｍＭ；ｐＨ７．４〕を調製した。
試薬成分：
・トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン  〔Ｔｒｉｓ〕  ＜緩衝剤＞    ２０ｍＭ
【０１３５】
（１４）第１試薬〔Ｎ−(２−ヒドロキシエチル)イミノ二酢酸(以下、ＨＩＤＡともいう。)０．１ｍＭ；ｐＨ７．４〕の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ７．４（２０℃）に調整して、第１試薬〔ＨＩＤＡ０．１ｍＭ；ｐＨ７．４〕を調製した。
試薬成分：
・Ｎ−(２−ヒドロキシエチル)イミノ二酢酸  〔ＨＩＤＡ〕  ＜キレート物質＞    ０．１ｍＭ
・トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン  〔Ｔｒｉｓ〕  ＜緩衝剤＞    ２０ｍＭ
【０１３６】
（１５）第１試薬〔ＨＩＤＡ０．５ｍＭ；ｐＨ７．４〕の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ７．４（２０℃）に調整して、第１試薬〔ＨＩＤＡ０．５ｍＭ；ｐＨ７．４〕を調製した。
試薬成分：
・Ｎ−(２−ヒドロキシエチル)イミノ二酢酸  〔ＨＩＤＡ〕  ＜キレート物質＞    ０．５ｍＭ
・トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン  〔Ｔｒｉｓ〕  ＜緩衝剤＞    ２０ｍＭ
【０１３７】
（１６）第１試薬〔ＨＩＤＡ１ｍＭ；ｐＨ７．４〕の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ７．４（２０℃）に調整して、第１試薬〔ＨＩＤＡ１ｍＭ；ｐＨ７．４〕を調製した。
試薬成分：
・Ｎ−(２−ヒドロキシエチル)イミノ二酢酸  〔ＨＩＤＡ〕  ＜キレート物質＞    １．０ｍＭ
・トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン  〔Ｔｒｉｓ〕  ＜緩衝剤＞    ２０ｍＭ
【０１３８】
（１７）第１試薬〔ＨＩＤＡ０ｍＭ；ｐＨ８．０〕の調製
下記の試薬成分を記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ８．０（２０℃）に調整して、キレート物質を含有せず、かつｐＨがｐＨ８．０（２０℃）である第１試薬〔ＨＩＤＡ０ｍＭ；ｐＨ８．０〕を調製した。
試薬成分：
・トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン  〔Ｔｒｉｓ〕  ＜緩衝剤＞    ２０ｍＭ
【０１３９】
（１８）第１試薬〔ＨＩＤＡ０．１ｍＭ；ｐＨ８．０〕の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ８．０（２０℃）に調整して、第１試薬〔ＨＩＤＡ０．１ｍＭ；ｐＨ８．０〕を調製した。
試薬成分：
・Ｎ−(２−ヒドロキシエチル)イミノ二酢酸  〔ＨＩＤＡ〕  ＜キレート物質＞    ０．１ｍＭ
・トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン  〔Ｔｒｉｓ〕  ＜緩衝剤＞    ２０ｍＭ
【０１４０】
（１９）第１試薬〔ＨＩＤＡ０．５ｍＭ；ｐＨ８．０〕の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ８．０（２０℃）に調整して、第１試薬〔ＨＩＤＡ０．５ｍＭ；ｐＨ８．０〕を調製した。
試薬成分：
・Ｎ−(２−ヒドロキシエチル)イミノ二酢酸  〔ＨＩＤＡ〕  ＜キレート物質＞    ０．５ｍＭ
・トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン  〔Ｔｒｉｓ〕  ＜緩衝剤＞    ２０ｍＭ
【０１４１】
（２０）第１試薬〔ＨＩＤＡ１ｍＭ；ｐＨ８．０〕の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ８．０（２０℃）に調整して、第１試薬〔ＨＩＤＡ１ｍＭ；ｐＨ８．０〕を調製した。
試薬成分：
・Ｎ−(２−ヒドロキシエチル)イミノ二酢酸  〔ＨＩＤＡ〕  ＜キレート物質＞    １．０ｍＭ
・トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン  〔Ｔｒｉｓ〕  ＜緩衝剤＞    ２０ｍＭ
【０１４２】
（２１）第１試薬〔ＨＩＤＡ０ｍＭ；ｐＨ８．６〕の調製
下記の試薬成分を記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ８．６（２０℃）に調整して、キレート物質を含有せず、かつｐＨがｐＨ８．６（２０℃）である第１試薬〔ＨＩＤＡ０ｍＭ；ｐＨ８．６〕を調製した。
試薬成分：
・トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン  〔Ｔｒｉｓ〕  ＜緩衝剤＞    ２０ｍＭ
【０１４３】
（２２）第１試薬〔ＨＩＤＡ０．１ｍＭ；ｐＨ８．６〕の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ８．６（２０℃）に調整して、第１試薬〔ＨＩＤＡ０．１ｍＭ；ｐＨ８．６〕を調製した。
試薬成分：
・Ｎ−(２−ヒドロキシエチル)イミノ二酢酸  〔ＨＩＤＡ〕  ＜キレート物質＞    ０．１ｍＭ
・トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン  〔Ｔｒｉｓ〕  ＜緩衝剤＞    ２０ｍＭ
【０１４４】
（２３）第１試薬〔ＨＩＤＡ０．５ｍＭ；ｐＨ８．６〕の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ８．６（２０℃）に調整して、第１試薬〔ＨＩＤＡ０．５ｍＭ；ｐＨ８．６〕を調製した。
試薬成分：
・Ｎ−(２−ヒドロキシエチル)イミノ二酢酸  〔ＨＩＤＡ〕  ＜キレート物質＞    ０．５ｍＭ
・トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン  〔Ｔｒｉｓ〕  ＜緩衝剤＞    ２０ｍＭ
【０１４５】
（２４）第１試薬〔ＨＩＤＡ１ｍＭ；ｐＨ８．６〕の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ８．６（２０℃）に調整して、第１試薬〔ＨＩＤＡ１ｍＭ；ｐＨ８．６〕を調製した。
試薬成分：
・Ｎ−(２−ヒドロキシエチル)イミノ二酢酸  〔ＨＩＤＡ〕  ＜キレート物質＞    １．０ｍＭ
・トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン  〔Ｔｒｉｓ〕  ＜緩衝剤＞    ２０ｍＭ
【０１４６】
（２５）第１試薬〔ビシン０ｍＭ；ｐＨ７．４〕の調製
下記の試薬成分を記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ７．４（２０℃）に調整して、キレート物質を含有せず、かつｐＨがｐＨ７．４（２０℃）である第１試薬〔ビシン０ｍＭ；ｐＨ７．４〕を調製した。
試薬成分：
・トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン  〔Ｔｒｉｓ〕  ＜緩衝剤＞    ２０ｍＭ
【０１４７】
（２６）第１試薬〔ビシン１ｍＭ；ｐＨ７．４〕の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ７．４（２０℃）に調整して、第１試薬〔ビシン１ｍＭ；ｐＨ７．４〕を調製した。
試薬成分：
・ビシン  〔Ｂｉｃｉｎｅ〕  ＜キレート物質＞    １．０ｍＭ
・トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン  〔Ｔｒｉｓ〕  ＜緩衝剤＞    ２０ｍＭ
【０１４８】
（２７）第１試薬〔ビシン５ｍＭ；ｐＨ７．４〕の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ７．４（２０℃）に調整して、第１試薬〔ビシン５ｍＭ；ｐＨ７．４〕を調製した。
試薬成分：
・ビシン  〔Ｂｉｃｉｎｅ〕  ＜キレート物質＞    ５．０ｍＭ
・トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン  〔Ｔｒｉｓ〕  ＜緩衝剤＞    ２０ｍＭ
【０１４９】
（２８）第１試薬〔ビシン１０ｍＭ；ｐＨ７．４〕の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ７．４（２０℃）に調整して、第１試薬〔ビシン１０ｍＭ；ｐＨ７．４〕を調製した。
試薬成分：
・ビシン  〔Ｂｉｃｉｎｅ〕  ＜キレート物質＞    １０．０ｍＭ
・トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン  〔Ｔｒｉｓ〕  ＜緩衝剤＞    ２０ｍＭ
【０１５０】
（２９）第１試薬〔ビシン０ｍＭ；ｐＨ８．０〕の調製
下記の試薬成分を記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ８．０（２０℃）に調整して、キレート物質を含有せず、かつｐＨがｐＨ８．０（２０℃）である第１試薬〔ビシン０ｍＭ；ｐＨ８．０〕を調製した。
試薬成分：
・トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン  〔Ｔｒｉｓ〕  ＜緩衝剤＞    ２０ｍＭ
【０１５１】
（３０）第１試薬〔ビシン１ｍＭ；ｐＨ８．０〕の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ８．０（２０℃）に調整して、第１試薬〔ビシン１ｍＭ；ｐＨ８．０〕を調製した。
試薬成分：
・ビシン  〔Ｂｉｃｉｎｅ〕  ＜キレート物質＞    １．０ｍＭ
・トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン  〔Ｔｒｉｓ〕  ＜緩衝剤＞    ２０ｍＭ
【０１５２】
（３１）第１試薬〔ビシン５ｍＭ；ｐＨ８．０〕の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ８．０（２０℃）に調整して、第１試薬〔ビシン５ｍＭ；ｐＨ８．０〕を調製した。
試薬成分：
・ビシン  〔Ｂｉｃｉｎｅ〕  ＜キレート物質＞    ５．０ｍＭ
・トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン  〔Ｔｒｉｓ〕  ＜緩衝剤＞    ２０ｍＭ
【０１５３】
（３２）第１試薬〔ビシン１０ｍＭ；ｐＨ８．０〕の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ８．０（２０℃）に調整して、第１試薬〔ビシン１０ｍＭ；ｐＨ８．０〕を調製した。
試薬成分：
・ビシン  〔Ｂｉｃｉｎｅ〕  ＜キレート物質＞    １０．０ｍＭ
・トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン  〔Ｔｒｉｓ〕  ＜緩衝剤＞    ２０ｍＭ
【０１５４】
（３３）第１試薬〔ビシン０ｍＭ；ｐＨ８．６〕の調製
下記の試薬成分を記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ８．６（２０℃）に調整して、キレート物質を含有せず、かつｐＨがｐＨ８．６（２０℃）である第１試薬〔ビシン０ｍＭ；ｐＨ８．６〕を調製した。
試薬成分：
・トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン  〔Ｔｒｉｓ〕  ＜緩衝剤＞    ２０ｍＭ
【０１５５】
（３４）第１試薬〔ビシン１．０ｍＭ；ｐＨ８．６〕の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ８．６（２０℃）に調整して、第１試薬〔ビシン１．０ｍＭ；ｐＨ８．６〕を調製した。
試薬成分：
・ビシン  〔Ｂｉｃｉｎｅ〕  ＜キレート物質＞    １．０ｍＭ
・トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン  〔Ｔｒｉｓ〕  ＜緩衝剤＞    ２０ｍＭ
【０１５６】
（３５）第１試薬〔ビシン５．０ｍＭ；ｐＨ８．６〕の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ８．６（２０℃）に調整して、第１試薬〔ビシン５．０ｍＭ；ｐＨ８．６〕を調製した。
試薬成分：
・ビシン  〔Ｂｉｃｉｎｅ〕  ＜キレート物質＞    ５．０ｍＭ
・トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン  〔Ｔｒｉｓ〕  ＜緩衝剤＞    ２０ｍＭ
【０１５７】
（３６）第１試薬〔ビシン１０ｍＭ；ｐＨ８．６〕の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ８．６（２０℃）に調整して、第１試薬〔ビシン１０ｍＭ；ｐＨ８．６〕を調製した。
試薬成分：
・ビシン  〔Ｂｉｃｉｎｅ〕  ＜キレート物質＞    １０ｍＭ
・トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン  〔Ｔｒｉｓ〕  ＜緩衝剤＞    ２０ｍＭ
【０１５８】
（ｂ）第２試薬
（１）第２試薬〔ｐＨ７．４〕の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ７．４（２０℃）に調整して、第２試薬〔ｐＨ７．４〕を調製した。
試薬成分：
・２−ニトロソ−５−（Ｎ−プロピル−Ｎ−スルホプロピルアミノ）−フェノール  〔ＮｉｔｒｏｓｏＰＳＡＰ〕  ＜キレート発色剤＞    ５００μＭ
・Ｌ−アスコルビン酸  ＜還元剤＞    ０．２４％
・トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン  〔Ｔｒｉｓ〕  ＜緩衝剤＞    ２０ｍＭ
【０１５９】
（２）第２試薬〔ｐＨ８．０〕の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ８．０（２０℃）に調整して、第２試薬〔ｐＨ８．０〕を調製した。
試薬成分：
・２−ニトロソ−５−（Ｎ−プロピル−Ｎ−スルホプロピルアミノ）−フェノール  〔ＮｉｔｒｏｓｏＰＳＡＰ〕  ＜キレート発色剤＞    ５００μＭ
・Ｌ−アスコルビン酸  ＜還元剤＞    ０．２４％
・トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン  〔Ｔｒｉｓ〕  ＜緩衝剤＞    ２０ｍＭ
【０１６０】
（３）第２試薬〔ｐＨ８．６〕の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ８．６（２０℃）に調整して、第２試薬〔ｐＨ８．６〕を調製した。
試薬成分：
・２−ニトロソ−５−（Ｎ−プロピル−Ｎ−スルホプロピルアミノ）−フェノール  〔ＮｉｔｒｏｓｏＰＳＡＰ〕  ＜キレート発色剤＞    ５００μＭ
・Ｌ−アスコルビン酸  ＜還元剤＞    ０．２４％
・トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン  〔Ｔｒｉｓ〕  ＜緩衝剤＞    ２０ｍＭ
【０１６１】
２．試料
（１）試料〔アルブミン結合鉄〕の調製
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を５％（ｗ／ｖ）の濃度になるように純水に溶解し、試料〔アルブミン結合鉄〕を調製した。なお、市販の鉄の測定試薬（キット）の「クイックオート  ネオ  Ｆｅ」（株式会社シノテスト；日本国）により、この試料〔アルブミン結合鉄〕の鉄濃度、すなわちこの試料〔アルブミン結合鉄〕中のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に結合している鉄の濃度を測定した。
〔この「クイックオート  ネオ  Ｆｅ」を用いた場合、試料に含まれる全ての鉄（トランスフェリン結合鉄及び非トランスフェリン結合鉄等）を測定することができる。〕  
なお、このウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）は、「クイックジェルＳＰ」（株式会社ヘレナ研究所；日本国）を用いてタンパク分画電気泳動を行って、このウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）にβ分画、すなわちトランスフェリン等が存在しないことを確認している。
【０１６２】
（２）試料〔クエン酸結合鉄〕の調製
クエン酸鉄〔クエン酸第二鉄〕の適量を純水に溶解し、試料〔クエン酸結合鉄〕を調製した。なお、市販の鉄の測定試薬（キット）の「クイックオート  ネオ  Ｆｅ」（株式会社シノテスト；日本国）により、この試料〔クエン酸結合鉄〕の鉄濃度、すなわちこの試料〔クエン酸結合鉄〕中のクエン酸に結合している鉄の濃度を測定した。
〔前記の通り、この「クイックオート  ネオ  Ｆｅ」を用いた場合、試料に含まれる全ての鉄（トランスフェリン結合鉄及び非トランスフェリン結合鉄等）を測定することができる。〕  
【０１６３】
（３）試料〔トランスフェリン結合鉄〕の調製
鉄が結合しているトランスフェリンであるホロトランスフェリンを１ｇ／Ｌの濃度になるように純水に溶解し、ホロトランスフェリン水溶液を調製した。このホロトランスフェリン水溶液を、限外ろ過（限外ろ過分子量：３０ＫＤａ）した。市販の鉄の測定試薬（キット）の「クイックオート  ネオ  Ｆｅ」（株式会社シノテスト；日本国）により、この限外ろ過のろ液の鉄濃度を測定したところ、０μｇ／ｄＬであった。すなわち、前記の限外ろ過のろ液の鉄濃度が０μｇ／ｄＬであったとの測定結果より、前記のホロトランスフェリン水溶液中の鉄は、全てトランスフェリンに結合していることが確かめられた。前記の限外ろ過を行う前の前記ホロトランスフェリン水溶液を、鉄が結合しているトランスフェリンを含有する試料である、試料〔トランスフェリン結合鉄〕とした。
【０１６４】
３．試料の測定
次に、本発明の非トランスフェリン結合鉄の測定試薬及び測定方法による試料の測定について説明する。
前記２．試料における、各試料の非トランスフェリン結合鉄の測定は、汎用自動分析装置ＴＢＡ−１２０ＦＲ（東芝メディカルシステムズ株式会社；日本国）を使用して行った。
【０１６５】
（１）  前記２.試料(以下、前記２ともいう。)の（１）〜（３）の試料の各々において、当該試料の１５μＬに、前記１．測定試薬(以下、前記１ともいう。)の（ａ）の（１）の第１試薬〔ＮＴＡ０ｍＭ；ｐＨ７．４〕の１５０μＬを添加し、３７℃で反応させた。
【０１６６】
（２）  次に、１４ポイント（第１試薬添加後２４４．３９秒）の吸光度及び１６ポイント（第１試薬添加後２８０．４６秒）の吸光度それぞれを主波長７４６ｎｍ、副波長６００ｎｍにて測定して、この１４ポイントの吸光度及び１６ポイントの吸光度の平均値を算出した〔「測光１」〕。（試料ブランクの吸光度の測定）
【０１６７】
（３）  次に、１６ポイント（第１試薬添加後２８０．４６秒）から１７ポイント（第１試薬添加後２９８．４９秒）の間に、前記１の（ｂ）の（１）の第２試薬〔ｐＨ７．４〕の５０μＬを添加し、３７℃で反応させた。
【０１６８】
（４）  次に、３１ポイント（第１試薬添加後５５０．９８秒）の吸光度及び３３ポイント（第１試薬添加後５８７．０５秒）の吸光度それぞれを主波長７４６ｎｍ、副波長６００ｎｍにて測定して、この３１ポイントの吸光度及び３３ポイントの吸光度の平均値を算出した〔「測光２」〕。（試料中に含まれていた非トランスフェリン結合鉄の濃度に応じた吸光度の測定）
【０１６９】
（５）  次に、試料中に含まれていた非トランスフェリン結合鉄の濃度の測定値を次の通り求めた。
すなわち、前記２の（１）〜（３）の各試料毎に、前記（４）において測定した吸光度の平均値（「測光２」）から、前記（２）において測定した吸光度の平均値（「測光１」）を差し引いて、吸光度差の値を求めた。
【０１７０】
次に、その鉄の濃度が分かっている標準試料（既知濃度のクエン酸第二鉄水溶液）について、前記の（１）〜（４）の通りに測定を行い、前記（４）において測定した吸光度の平均値（「測光２」）から前記（２）において測定した吸光度の平均値（「測光１」）を差し引いて吸光度差の値を求め、この標準試料の吸光度差の値と前記の各試料における吸光度差の値とを対比し、比例計算を行うことにより、試料〔アルブミン結合鉄〕、試料〔クエン酸結合鉄〕、及び試料〔トランスフェリン結合鉄〕の各試料の非トランスフェリン結合鉄の濃度の測定値を得た。後述の表１の（ａ）に結果を示す。
【０１７１】
（６）  また、前記（１）において、前記１の（ａ）の（１）の第１試薬〔ＮＴＡ０ｍＭ；ｐＨ７．４〕に替えて、前記１の（ａ）の（２）の第１試薬〔ＮＴＡ０．１ｍＭ；ｐＨ７．４〕を用いること以外は、前記（１）〜（５）の通りに操作を行い、試料〔アルブミン結合鉄〕、試料〔クエン酸結合鉄〕、及び試料〔トランスフェリン結合鉄〕の各試料の非トランスフェリン結合鉄の濃度の測定値を得た。後述の表１の（a）に結果を示す。
【０１７２】
（７）  また、前記（１）において、前記１の（ａ）の（１）の第１試薬〔ＮＴＡ０ｍＭ；ｐＨ７．４〕に替えて、前記１の（ａ）の（３）の第１試薬〔ＮＴＡ０．５ｍＭ；ｐＨ７．４〕を用いること以外は、前記（１）〜（５）の通りに操作を行い、試料〔アルブミン結合鉄〕、試料〔クエン酸結合鉄〕、及び試料〔トランスフェリン結合鉄〕の各試料の非トランスフェリン結合鉄の濃度の測定値を得た。後述の表１の（a）に結果を示す。
【０１７３】
（８）  また、前記（１）において、前記１の（ａ）の（１）の第１試薬〔ＮＴＡ０ｍＭ；ｐＨ７．４〕に替えて、前記１の（ａ）の（４）の第１試薬〔ＮＴＡ１ｍＭ；ｐＨ７．４〕を用いること以外は、前記（１）〜（５）の通りに操作を行い、試料〔アルブミン結合鉄〕、試料〔クエン酸結合鉄〕、及び試料〔トランスフェリン結合鉄〕の各試料の非トランスフェリン結合鉄の濃度の測定値を得た。後述の表１の（a）に結果を示す。
【０１７４】
（９）  また、前記（１）において、前記１の（ａ）の（１）の第１試薬〔ＮＴＡ０ｍＭ；ｐＨ７．４〕に替えて、前記１の（ａ）の（５）の第１試薬〔ＮＴＡ０ｍＭ；ｐＨ８．０〕を用いること、及び、前記１の（ｂ）の（１）の第２試薬〔ｐＨ７．４〕に替えて、前記１の（ｂ）の（２）の第２試薬〔ｐＨ８．０〕を用いること以外は、前記（１）〜（５）の通りに操作を行い、試料〔アルブミン結合鉄〕、試料〔クエン酸結合鉄〕、及び試料〔トランスフェリン結合鉄〕の各試料の非トランスフェリン結合鉄の濃度の測定値を得た。後述の表１の（ｂ）に結果を示す。
【０１７５】
（１０）  また、前記（１）において、前記１の（ａ）の（１）の第１試薬〔ＮＴＡ０ｍＭ；ｐＨ７．４〕に替えて、前記１の（ａ）の（６）の第１試薬〔ＮＴＡ０．１ｍＭ；ｐＨ８．０〕を用いること、及び、前記１の（ｂ）の（１）の第２試薬〔ｐＨ７．４〕に替えて、前記１の（ｂ）の（２）の第２試薬〔ｐＨ８．０〕を用いること以外は、前記（１）〜（５）の通りに操作を行い、試料〔アルブミン結合鉄〕、試料〔クエン酸結合鉄〕、及び試料〔トランスフェリン結合鉄〕の各試料の非トランスフェリン結合鉄の濃度の測定値を得た。後述の表１の（ｂ）に結果を示す。
【０１７６】
（１１）  また、前記（１）において、前記１の（ａ）の（１）の第１試薬〔ＮＴＡ０ｍＭ；ｐＨ７．４〕に替えて、前記１の（ａ）の（７）の第１試薬〔ＮＴＡ０．５ｍＭ；ｐＨ８．０〕を用いること、及び、前記１の（ｂ）の（１）の第２試薬〔ｐＨ７．４〕に替えて、前記１の（ｂ）の（２）の第２試薬〔ｐＨ８．０〕を用いること以外は、前記（１）〜（５）の通りに操作を行い、試料〔アルブミン結合鉄〕、試料〔クエン酸結合鉄〕、及び試料〔トランスフェリン結合鉄〕の各試料の非トランスフェリン結合鉄の濃度の測定値を得た。後述の表１の（ｂ）に結果を示す。
【０１７７】
（１２）  また、前記（１）において、前記１の（ａ）の（１）の第１試薬〔ＮＴＡ０ｍＭ；ｐＨ７．４〕に替えて、前記１の（ａ）の（８）の第１試薬〔ＮＴＡ１ｍＭ；ｐＨ８．０〕を用いること、及び、前記１の（ｂ）の（１）の第２試薬〔ｐＨ７．４〕に替えて、前記１の（ｂ）の（２）の第２試薬〔ｐＨ８．０〕を用いること以外は、前記（１）〜（５）の通りに操作を行い、試料〔アルブミン結合鉄〕、試料〔クエン酸結合鉄〕、及び試料〔トランスフェリン結合鉄〕の各試料の非トランスフェリン結合鉄の濃度の測定値を得た。後述の表１の（ｂ）に結果を示す。
【０１７８】
（１３）  また、前記（１）において、前記１の（ａ）の（１）の第１試薬〔ＮＴＡ０ｍＭ；ｐＨ７．４〕に替えて、前記１の（ａ）の（９）の第１試薬〔ＮＴＡ０ｍＭ；ｐＨ８．６〕を用いること、及び、前記１の（ｂ）の（１）の第２試薬〔ｐＨ７．４〕に替えて、前記１の（ｂ）の（３）の第２試薬〔ｐＨ８．６〕を用いること以外は、前記（１）〜（５）の通りに操作を行い、試料〔アルブミン結合鉄〕、試料〔クエン酸結合鉄〕、及び試料〔トランスフェリン結合鉄〕の各試料の非トランスフェリン結合鉄の濃度の測定値を得た。後述の表１の（ｃ）に結果を示す。
【０１７９】
（１４）  また、前記（１）において、前記１の（ａ）の（１）の第１試薬〔ＮＴＡ０ｍＭ；ｐＨ７．４〕に替えて、前記１の（ａ）の（１０）の第１試薬〔ＮＴＡ０．１ｍＭ；ｐＨ８．６〕を用いること、及び、前記１の（ｂ）の（１）の第２試薬〔ｐＨ７．４〕に替えて、前記１の（ｂ）の（３）の第２試薬〔ｐＨ８．６〕を用いること以外は、前記（１）〜（５）の通りに操作を行い、試料〔アルブミン結合鉄〕、試料〔クエン酸結合鉄〕、及び試料〔トランスフェリン結合鉄〕の各試料の非トランスフェリン結合鉄の濃度の測定値を得た。後述の表１の（ｃ）に結果を示す。
【０１８０】
（１５）  また、前記（１）において、前記１の（ａ）の（１）の第１試薬〔ＮＴＡ０ｍＭ；ｐＨ７．４〕に替えて、前記１の（ａ）の（１１）の第１試薬〔ＮＴＡ０．５ｍＭ；ｐＨ８．６〕を用いること、及び、前記１の（ｂ）の（１）の第２試薬〔ｐＨ７．４〕に替えて、前記１の（ｂ）の（３）の第２試薬〔ｐＨ８．６〕を用いること以外は、前記（１）〜（５）の通りに操作を行い、試料〔アルブミン結合鉄〕、試料〔クエン酸結合鉄〕、及び試料〔トランスフェリン結合鉄〕の各試料の非トランスフェリン結合鉄の濃度の測定値を得た。後述の表１の（ｃ）に結果を示す。
【０１８１】
（１６）  また、前記（１）において、前記１の（ａ）の（１）の第１試薬〔ＮＴＡ０ｍＭ；ｐＨ７．４〕に替えて、前記１の（ａ）の（１２）の第１試薬〔ＮＴＡ１ｍＭ；ｐＨ８．６〕を用いること、及び、前記１の（ｂ）の（１）の第２試薬〔ｐＨ７．４〕に替えて、前記１の（ｂ）の（３）の第２試薬〔ｐＨ８．６〕を用いること以外は、前記（１）〜（５）の通りに操作を行い、試料〔アルブミン結合鉄〕、試料〔クエン酸結合鉄〕、及び試料〔トランスフェリン結合鉄〕の各試料の非トランスフェリン結合鉄の濃度の測定値を得た。後述の表１の（ｃ）に結果を示す。
【０１８２】
（１７）  また、前記（１）において、前記１の（ａ）の（１）の第１試薬〔ＮＴＡ０ｍＭ；ｐＨ７．４〕に替えて、前記１の（ａ）の（１３）の第１試薬〔ＨＩＤＡ０ｍＭ；ｐＨ７．４〕を用いること以外は、前記（１）〜（５）の通りに操作を行い、試料〔アルブミン結合鉄〕、試料〔クエン酸結合鉄〕、及び試料〔トランスフェリン結合鉄〕の各試料の非トランスフェリン結合鉄の濃度の測定値を得た。後述の表２の（a）に結果を示す。
【０１８３】
（１８）  また、前記（１）において、前記１の（ａ）の（１）の第１試薬〔ＮＴＡ０ｍＭ；ｐＨ７．４〕に替えて、前記１の（ａ）の（１４）の第１試薬〔ＨＩＤＡ０．１ｍＭ；ｐＨ７．４〕を用いること以外は、前記（１）〜（５）の通りに操作を行い、試料〔アルブミン結合鉄〕、試料〔クエン酸結合鉄〕、及び試料〔トランスフェリン結合鉄〕の各試料の非トランスフェリン結合鉄の濃度の測定値を得た。後述の表２の（a）に結果を示す。
【０１８４】
（１９）  また、前記（１）において、前記１の（ａ）の（１）の第１試薬〔ＮＴＡ０ｍＭ；ｐＨ７．４〕に替えて、前記１の（ａ）の（１５）の第１試薬〔ＨＩＤＡ０．５ｍＭ；ｐＨ７．４〕を用いること以外は、前記（１）〜（５）の通りに操作を行い、試料〔アルブミン結合鉄〕、試料〔クエン酸結合鉄〕、及び試料〔トランスフェリン結合鉄〕の各試料の非トランスフェリン結合鉄の濃度の測定値を得た。後述の表２の（a）に結果を示す。
【０１８５】
（２０）  また、前記（１）において、前記１の（ａ）の（１）の第１試薬〔ＮＴＡ０ｍＭ；ｐＨ７．４〕に替えて、前記１の（ａ）の（１６）の第１試薬〔ＨＩＤＡ１ｍＭ；ｐＨ７．４〕を用いること以外は、前記（１）〜（５）の通りに操作を行い、試料〔アルブミン結合鉄〕、試料〔クエン酸結合鉄〕、及び試料〔トランスフェリン結合鉄〕の各試料の非トランスフェリン結合鉄の濃度の測定値を得た。後述の表２の（a）に結果を示す。
【０１８６】
（２１）  また、前記（１）において、前記１の（ａ）の（１）の第１試薬〔ＮＴＡ０ｍＭ；ｐＨ７．４〕に替えて、前記１の（ａ）の（１７）の第１試薬〔ＨＩＤＡ０ｍＭ；ｐＨ８．０〕を用いること、及び、前記１の（ｂ）の（１）の第２試薬〔ｐＨ７．４〕に替えて、前記１の（ｂ）の（２）の第２試薬〔ｐＨ８．０〕を用いること以外は、前記（１）〜（５）の通りに操作を行い、試料〔アルブミン結合鉄〕、試料〔クエン酸結合鉄〕、及び試料〔トランスフェリン結合鉄〕の各試料の非トランスフェリン結合鉄の濃度の測定値を得た。後述の表２の（b）に結果を示す。
【０１８７】
（２２）  また、前記（１）において、前記１の（ａ）の（１）の第１試薬〔ＮＴＡ０ｍＭ；ｐＨ７．４〕に替えて、前記１の（ａ）の（１８）の第１試薬〔ＨＩＤＡ０．１ｍＭ；ｐＨ８．０〕を用いること、及び、前記１の（ｂ）の（１）の第２試薬〔ｐＨ７．４〕に替えて、前記１の（ｂ）の（２）の第２試薬〔ｐＨ８．０〕を用いること以外は、前記（１）〜（５）の通りに操作を行い、試料〔アルブミン結合鉄〕、試料〔クエン酸結合鉄〕、及び試料〔トランスフェリン結合鉄〕の各試料の非トランスフェリン結合鉄の濃度の測定値を得た。後述の表２の（b）に結果を示す。
【０１８８】
（２３）  また、前記（１）において、前記１の（ａ）の（１）の第１試薬〔ＮＴＡ０ｍＭ；ｐＨ７．４〕に替えて、前記１の（ａ）の（１９）の第１試薬〔ＨＩＤＡ０．５ｍＭ；ｐＨ８．０〕を用いること、及び、前記１の（ｂ）の（１）の第２試薬〔ｐＨ７．４〕に替えて、前記１の（ｂ）の（２）の第２試薬〔ｐＨ８．０〕を用いること以外は、前記（１）〜（５）の通りに操作を行い、試料〔アルブミン結合鉄〕、試料〔クエン酸結合鉄〕、及び試料〔トランスフェリン結合鉄〕の各試料の非トランスフェリン結合鉄の濃度の測定値を得た。後述の表２の（b）に結果を示す。
【０１８９】
（２４）  また、前記（１）において、前記１の（ａ）の（１）の第１試薬〔ＮＴＡ０ｍＭ；ｐＨ７．４〕に替えて、前記１の（ａ）の（２０）の第１試薬〔ＨＩＤＡ１ｍＭ；ｐＨ８．０〕を用いること、及び、前記１の（ｂ）の（１）の第２試薬〔ｐＨ７．４〕に替えて、前記１の（ｂ）の（２）の第２試薬〔ｐＨ８．０〕を用いること以外は、前記（１）〜（５）の通りに操作を行い、試料〔アルブミン結合鉄〕、試料〔クエン酸結合鉄〕、及び試料〔トランスフェリン結合鉄〕の各試料の非トランスフェリン結合鉄の濃度の測定値を得た。後述の表２の（b）に結果を示す。
【０１９０】
（２５）  また、前記（１）において、前記１の（ａ）の（１）の第１試薬〔ＮＴＡ０ｍＭ；ｐＨ７．４〕に替えて、前記１の（ａ）の（２１）の第１試薬〔ＨＩＤＡ０ｍＭ；ｐＨ８．６〕を用いること、及び、前記１の（ｂ）の（１）の第２試薬〔ｐＨ７．４〕に替えて、前記１の（ｂ）の（３）の第２試薬〔ｐＨ８．６〕を用いること以外は、前記（１）〜（５）の通りに操作を行い、試料〔アルブミン結合鉄〕、試料〔クエン酸結合鉄〕、及び試料〔トランスフェリン結合鉄〕の各試料の非トランスフェリン結合鉄の濃度の測定値を得た。後述の表２の（c）に結果を示す。
【０１９１】
（２６）  また、前記（１）において、前記１の（ａ）の（１）の第１試薬〔ＮＴＡ０ｍＭ；ｐＨ７．４〕に替えて、前記１の（ａ）の（２２）の第１試薬〔ＨＩＤＡ０．１ｍＭ；ｐＨ８．６〕を用いること、及び、前記１の（ｂ）の（１）の第２試薬〔ｐＨ７．４〕に替えて、前記１の（ｂ）の（３）の第２試薬〔ｐＨ８．６〕を用いること以外は、前記（１）〜（５）の通りに操作を行い、試料〔アルブミン結合鉄〕、試料〔クエン酸結合鉄〕、及び試料〔トランスフェリン結合鉄〕の各試料の非トランスフェリン結合鉄の濃度の測定値を得た。後述の表２の（c）に結果を示す。
【０１９２】
（２７）  また、前記（１）において、前記１の（ａ）の（１）の第１試薬〔ＮＴＡ０ｍＭ；ｐＨ７．４〕に替えて、前記１の（ａ）の（２３）の第１試薬〔ＨＩＤＡ０．５ｍＭ；ｐＨ８．６〕を用いること、及び、前記１の（ｂ）の（１）の第２試薬〔ｐＨ７．４〕に替えて、前記１の（ｂ）の（３）の第２試薬〔ｐＨ８．６〕を用いること以外は、前記（１）〜（５）の通りに操作を行い、試料〔アルブミン結合鉄〕、試料〔クエン酸結合鉄〕、及び試料〔トランスフェリン結合鉄〕の各試料の非トランスフェリン結合鉄の濃度の測定値を得た。後述の表２の（c）に結果を示す。
【０１９３】
（２８）  また、前記（１）において、前記１の（ａ）の（１）の第１試薬〔ＮＴＡ０ｍＭ；ｐＨ７．４〕に替えて、前記１の（ａ）の（２４）の第１試薬〔ＨＩＤＡ１ｍＭ；ｐＨ８．６〕を用いること、及び、前記１の（ｂ）の（１）の第２試薬〔ｐＨ７．４〕に替えて、前記１の（ｂ）の（３）の第２試薬〔ｐＨ８．６〕を用いること以外は、前記（１）〜（５）の通りに操作を行い、試料〔アルブミン結合鉄〕、試料〔クエン酸結合鉄〕、及び試料〔トランスフェリン結合鉄〕の各試料の非トランスフェリン結合鉄の濃度の測定値を得た。後述の表２の（c）に結果を示す。
【０１９４】
（２９）  また、前記（１）において、前記１の（ａ）の（１）の第１試薬〔ＮＴＡ０ｍＭ；ｐＨ７．４〕に替えて、前記１の（ａ）の（２５）の第１試薬〔ビシン０ｍＭ；ｐＨ７．４〕を用いること以外は、前記（１）〜（５）の通りに操作を行い、試料〔アルブミン結合鉄〕、試料〔クエン酸結合鉄〕、及び試料〔トランスフェリン結合鉄〕の各試料の非トランスフェリン結合鉄の濃度の測定値を得た。後述の表３の（a）に結果を示す。
【０１９５】
（３０）  また、前記（１）において、前記１の（ａ）の（１）の第１試薬〔ＮＴＡ０ｍＭ；ｐＨ７．４〕に替えて、前記１の（ａ）の（２６）の第１試薬〔ビシン１ｍＭ；ｐＨ７．４〕を用いること以外は、前記（１）〜（５）の通りに操作を行い、試料〔アルブミン結合鉄〕、試料〔クエン酸結合鉄〕、及び試料〔トランスフェリン結合鉄〕の各試料の非トランスフェリン結合鉄の濃度の測定値を得た。後述の表３の（a）に結果を示す。
【０１９６】
（３１）  また、前記（１）において、前記１の（ａ）の（１）の第１試薬〔ＮＴＡ０ｍＭ；ｐＨ７．４〕に替えて、前記１の（ａ）の（２７）の第１試薬〔ビシン５ｍＭ；ｐＨ７．４〕を用いること以外は、前記（１）〜（５）の通りに操作を行い、試料〔アルブミン結合鉄〕、試料〔クエン酸結合鉄〕、及び試料〔トランスフェリン結合鉄〕の各試料の非トランスフェリン結合鉄の濃度の測定値を得た。後述の表３の（a）に結果を示す。
【０１９７】
（３２）  また、前記（１）において、前記１の（ａ）の（１）の第１試薬〔ＮＴＡ０ｍＭ；ｐＨ７．４〕に替えて、前記１の（ａ）の（２８）の第１試薬〔ビシン１０ｍＭ；ｐＨ７．４〕を用いること以外は、前記（１）〜（５）の通りに操作を行い、試料〔アルブミン結合鉄〕、試料〔クエン酸結合鉄〕、及び試料〔トランスフェリン結合鉄〕の各試料の非トランスフェリン結合鉄の濃度の測定値を得た。後述の表３の（a）に結果を示す。
【０１９８】
（３３）  また、前記（１）において、前記１の（ａ）の（１）の第１試薬〔ＮＴＡ０ｍＭ；ｐＨ７．４〕に替えて、前記１の（ａ）の（２９）の第１試薬〔ビシン０ｍＭ；ｐＨ８．０〕を用いること、及び、前記１の（ｂ）の（１）の第２試薬〔ｐＨ７．４〕に替えて、前記１の（ｂ）の（２）の第２試薬〔ｐＨ８．０〕を用いること以外は、前記（１）〜（５）の通りに操作を行い、試料〔アルブミン結合鉄〕、試料〔クエン酸結合鉄〕、及び試料〔トランスフェリン結合鉄〕の各試料の非トランスフェリン結合鉄の濃度の測定値を得た。後述の表３の（ｂ）に結果を示す。
【０１９９】
（３４）  また、前記（１）において、前記１の（ａ）の（１）の第１試薬〔ＮＴＡ０ｍＭ；ｐＨ７．４〕に替えて、前記１の（ａ）の（３０）の第１試薬〔ビシン１ｍＭ；ｐＨ８．０〕を用いること、及び、前記１の（ｂ）の（１）の第２試薬〔ｐＨ７．４〕に替えて、前記１の（ｂ）の（２）の第２試薬〔ｐＨ８．０〕を用いること以外は、前記（１）〜（５）の通りに操作を行い、試料〔アルブミン結合鉄〕、試料〔クエン酸結合鉄〕、及び試料〔トランスフェリン結合鉄〕の各試料の非トランスフェリン結合鉄の濃度の測定値を得た。後述の表３の（ｂ）に結果を示す。
【０２００】
（３５）  また、前記（１）において、前記１の（ａ）の（１）の第１試薬〔ＮＴＡ０ｍＭ；ｐＨ７．４〕に替えて、前記１の（ａ）の（３１）の第１試薬〔ビシン５ｍＭ；ｐＨ８．０〕を用いること、及び、前記１の（ｂ）の（１）の第２試薬〔ｐＨ７．４〕に替えて、前記１の（ｂ）の（２）の第２試薬〔ｐＨ８．０〕を用いること以外は、前記（１）〜（５）の通りに操作を行い、試料〔アルブミン結合鉄〕、試料〔クエン酸結合鉄〕、及び試料〔トランスフェリン結合鉄〕の各試料の非トランスフェリン結合鉄の濃度の測定値を得た。後述の表３の（ｂ）に結果を示す。
【０２０１】
（３６）  また、前記（１）において、前記１の（ａ）の（１）の第１試薬〔ＮＴＡ０ｍＭ；ｐＨ７．４〕に替えて、前記１の（ａ）の（３２）の第１試薬〔ビシン１０ｍＭ；ｐＨ８．０〕を用いること、及び、前記１の（ｂ）の（１）の第２試薬〔ｐＨ７．４〕に替えて、前記１の（ｂ）の（２）の第２試薬〔ｐＨ８．０〕を用いること以外は、前記（１）〜（５）の通りに操作を行い、試料〔アルブミン結合鉄〕、試料〔クエン酸結合鉄〕、及び試料〔トランスフェリン結合鉄〕の各試料の非トランスフェリン結合鉄の濃度の測定値を得た。後述の表３の（ｂ）に結果を示す。
【０２０２】
（３７）  また、前記（１）において、前記１の（ａ）の（１）の第１試薬〔ＮＴＡ０ｍＭ；ｐＨ７．４〕に替えて、前記１の（ａ）の（３３）の第１試薬〔ビシン０ｍＭ；ｐＨ８．６〕を用いること、及び、前記１の（ｂ）の（１）の第２試薬〔ｐＨ７．４〕に替えて、前記１の（ｂ）の（３）の第２試薬〔ｐＨ８．６〕を用いること以外は、前記（１）〜（５）の通りに操作を行い、試料〔アルブミン結合鉄〕、試料〔クエン酸結合鉄〕、及び試料〔トランスフェリン結合鉄〕の各試料の非トランスフェリン結合鉄の濃度の測定値を得た。後述の表３の（ｃ）に結果を示す。
【０２０３】
（３８）  また、前記（１）において、前記１の（ａ）の（１）の第１試薬〔ＮＴＡ０ｍＭ；ｐＨ７．４〕に替えて、前記１の（ａ）の（３４）の第１試薬〔ビシン１ｍＭ；ｐＨ８．６〕を用いること、及び、前記１の（ｂ）の（１）の第２試薬〔ｐＨ７．４〕に替えて、前記１の（ｂ）の（３）の第２試薬〔ｐＨ８．６〕を用いること以外は、前記（１）〜（５）の通りに操作を行い、試料〔アルブミン結合鉄〕、試料〔クエン酸結合鉄〕、及び試料〔トランスフェリン結合鉄〕の各試料の非トランスフェリン結合鉄の濃度の測定値を得た。（後述の表３の（ｃ）に結果を示す。
【０２０４】
（３９）  また、前記（１）において、前記１の（ａ）の（１）の第１試薬〔ＮＴＡ０ｍＭ；ｐＨ７．４〕に替えて、前記１の（ａ）の（３５）の第１試薬〔ビシン５ｍＭ；ｐＨ８．６〕を用いること、及び、前記１の（ｂ）の（１）の第２試薬〔ｐＨ７．４〕に替えて、前記１の（ｂ）の（３）の第２試薬〔ｐＨ８．６〕を用いること以外は、前記（１）〜（５）の通りに操作を行い、試料〔アルブミン結合鉄〕、試料〔クエン酸結合鉄〕、及び試料〔トランスフェリン結合鉄〕の各試料の非トランスフェリン結合鉄の濃度の測定値を得た。後述の表３の（ｃ）に結果を示す。
【０２０５】
（４０）  また、前記（１）において、前記１の（ａ）の（１）の第１試薬〔ＮＴＡ０ｍＭ；ｐＨ７．４〕に替えて、前記１の（ａ）の（３６）の第１試薬〔ビシン１０ｍＭ；ｐＨ８．６〕を用いること、及び、前記１の（ｂ）の（１）の第２試薬〔ｐＨ７．４〕に替えて、前記１の（ｂ）の（３）の第２試薬〔ｐＨ８．６〕を用いること以外は、前記（１）〜（５）の通りに操作を行い、試料〔アルブミン結合鉄〕、試料〔クエン酸結合鉄〕、及び試料〔トランスフェリン結合鉄〕の各試料の非トランスフェリン結合鉄の濃度の測定値を得た。後述の表３の（ｃ）に結果を示す。
【０２０６】
４．測定結果
前記３．試料の測定（以下、前記３ともいう。）において各試料の非トランスフェリン結合鉄の濃度の測定を行って得られた結果を、表１から表３に示した。各表中、試料〔アルブミン結合鉄〕、試料〔クエン酸結合鉄〕については、それぞれクイックオートネオFeにて鉄含有量を測定し、目標値とした。
【０２０７】
また、試料〔トランスフェリン結合鉄〕については、1g/Lの水溶液を調製した。３０Kd限外ろ過のろ液をクイックオートネオFeにて測定し、鉄含有量が０であることを確認した。すなわち、試料〔トランスフェリン結合鉄〕中の鉄は全てトランスフェリンに結合したものであるといえる。
【０２０８】
これらの表１〜３において、横の欄に前記の通り測定を行った各試料を示した。
【０２０９】
なお、これらの表１〜３において、横の欄に各試料毎に示した「目標値」（μｇ／ｄＬ）は、次の通りである。
【０２１０】
試料が試料〔アルブミン結合鉄〕である場合は、市販の鉄の測定試薬（キット）の「クイックオート  ネオ  Ｆｅ」（株式会社シノテスト；日本国）により、この試料〔アルブミン結合鉄〕の鉄濃度、すなわちこの試料〔アルブミン結合鉄〕中のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に結合している鉄の濃度を測定して得た値を、非トランスフェリン結合鉄濃度測定の「目標値」（μｇ／ｄＬ）として示した。
【０２１１】
また、試料が試料〔クエン酸結合鉄〕である場合は、市販の鉄の測定試薬（キット）の「クイックオート  ネオ  Ｆｅ」（株式会社シノテスト；日本国）により、この試料〔クエン酸結合鉄〕の鉄濃度、すなわちこの試料〔クエン酸結合鉄〕中のクエン酸に結合している鉄の濃度を測定して得た値を、非トランスフェリン結合鉄濃度測定の「目標値」（μｇ／ｄＬ）として示した。
【０２１２】
また、試料が試料〔トランスフェリン結合鉄〕である場合であるが、前記の通り試料〔トランスフェリン結合鉄〕のホロトランスフェリン水溶液中の鉄は、全てトランスフェリンに結合していることが確かめられている。
【０２１３】
すなわち、試料〔トランスフェリン結合鉄〕のホロトランスフェリン水溶液中に非トランスフェリン結合鉄は存在せず、非トランスフェリン結合鉄の濃度は、０μｇ／ｄＬであることが確かめられている。
【０２１４】
よって、この試料〔トランスフェリン結合鉄〕の非トランスフェリン結合鉄濃度測定の「目標値」（μｇ／ｄＬ）を０μｇ／ｄＬとして示した。
【０２１５】
また、これら表１〜３において、縦の欄は、前記の測定に用いた各第１試薬中のそれぞれのキレート物質の濃度（ｍＭ）を示す。
【０２１６】
そして、これら表１〜３の各欄において示した値は、前記の通り測定を行った各試料の非トランスフェリン結合鉄の濃度の定量値（μｇ／ｄＬ）を示す。
【０２１７】
表1は、種々のキレート安定度定数を有するキレート物質を用いて測定を行った結果を示す。いずれもｐHを８．０（キレート物質含有液と、キレート発色剤含有液の両方をｐＨ８．０に調整。）に調整して測定を行った。また、この時用いたキレート発色剤等は、NitorosoPSAP及びアスコルビン酸であった。
【０２１８】
表１は、キレート物質としてＮＴＡを用いて測定を行った結果を示す。
【０２１９】
【表１】
2014048211.tif 000003
【０２２０】
表１中、（ａ）がｐＨ７．４、（ｂ）がｐＨ８．０、（ｃ）がｐＨ８．６、にそれぞれ調整している。その結果、いずれも良好な結果を示した。
【０２２１】
また、表２は、キレート物質としてＨＩＤＡを用いて測定を行った結果を示す。
【０２２２】
【表２】
2014048211.tif 000004
【０２２３】
表２中、（ａ）がｐＨ７．４、（ｂ）がｐＨ８．０、（ｃ）がｐＨ８．６、にそれぞれ調整している。その結果、いずれも良好な結果を示した。
【０２２４】
また、表３は、キレート物質としてＢｉｃｉｎｅを用いて測定を行った結果を示す。
【０２２５】
【表３】
2014048211.tif 000005
【０２２６】
表３中、（ａ）がｐＨ７．４、（ｂ）がｐＨ８．０、（ｃ）がｐＨ８．６、にそれぞれ調整している。その結果、いずれも良好な結果を示した。
【０２２７】
（１）上記表１から３に示す結果より、本発明における非トランスフェリン結合鉄の測定、すなわち、キレート物質及びキレート発色剤を用いる測定においては、試料が試料〔アルブミン結合鉄〕及び試料〔クエン酸結合鉄〕のいずれにおいても、前記の「目標値」と同一又は近い非トランスフェリン結合鉄の定量値が得られており、つまり、アルブミンに結合する鉄、又はクエン酸に結合する鉄の非トランスフェリン結合鉄を測定できていることが分かる。
【０２２８】
（２）  これに対して、第１試薬がキレート物質を含有しない（０ｍＭ）場合、すなわち測定にキレート物質を用いない場合には、試料が試料〔アルブミン結合鉄〕及び試料〔クエン酸結合鉄〕のいずれにおいても、非トランスフェリン結合鉄の定量値が前記の「目標値」よりもかなり低くなってしまう。
【０２２９】
（３）  また、本発明における非トランスフェリン結合鉄の測定においては、試料〔トランスフェリン結合鉄〕のトランスフェリンに結合した鉄を測定していないか又はきわめてわずかにしか測定していないことが分かる。
【０２３０】
（４）  すなわち、本発明における非トランスフェリン結合鉄の測定においては、トランスフェリンに結合した鉄を測り込むことなく、非トランスフェリン結合鉄を測定することができることが確かめられた。
【実施例４】
【０２３１】
次に、キレート物質の濃度を更に変えて非トランスフェリン結合鉄の測定を行った。
【０２３２】
１．測定試薬
非トランスフェリン結合鉄測定試薬は下記の通り調製した。
（ａ）第１試薬
（１）第１試薬〔ＮＴＡ０ｍＭ；ｐＨ８．６〕の調製
下記の試薬成分を記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ８．６（２０℃）に調整して、キレート物質を含有せず、かつｐＨがｐＨ８．６（２０℃）である第１試薬〔ＮＴＡ０ｍＭ；ｐＨ８．６〕を調製した。
試薬成分：
・トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン  〔Ｔｒｉｓ〕  ＜緩衝剤＞    ２０ｍＭ
【０２３３】
（２）第１試薬〔ＮＴＡ２ｍＭ；ｐＨ８．６〕の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ８．６（２０℃）に調整して、第１試薬〔ＮＴＡ２ｍＭ；ｐＨ８．６〕を調製した。
試薬成分：
・ニトリロ三酢酸  〔ＮＴＡ〕  ＜キレート物質＞    ２．０ｍＭ
・トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン  〔Ｔｒｉｓ〕  ＜緩衝剤＞    ２０ｍＭ
【０２３４】
（３）第１試薬〔ＨＩＤＡ０ｍＭ；ｐＨ８．６〕の調製
下記の試薬成分を記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ８．６（２０℃）に調整して、キレート物質を含有せず、かつｐＨがｐＨ８．６（２０℃）である第１試薬〔ＨＩＤＡ０ｍＭ；ｐＨ８．６〕を調製した。
試薬成分：
・トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン  〔Ｔｒｉｓ〕  ＜緩衝剤＞    ２０ｍＭ
【０２３５】
（４）第１試薬〔ＨＩＤＡ２ｍＭ；ｐＨ８．６〕の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ８．６（２０℃）に調整して、第１試薬〔ＨＩＤＡ２ｍＭ；ｐＨ８．６〕を調製した。
試薬成分：
・Ｎ−(２−ヒドロキシエチル)イミノ二酢酸  〔ＨＩＤＡ〕  ＜キレート物質＞    ２．０ｍＭ
・トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン  〔Ｔｒｉｓ〕  ＜緩衝剤＞    ２０ｍＭ
【０２３６】
（５）第１試薬〔ビシン０ｍＭ；ｐＨ８．６〕の調製
下記の試薬成分を記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ８．６（２０℃）に調整して、キレート物質を含有せず、かつｐＨがｐＨ８．６（２０℃）である第１試薬〔ビシン０ｍＭ；ｐＨ８．６〕を調製した。
試薬成分：
・トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン  〔Ｔｒｉｓ〕  ＜緩衝剤＞    ２０ｍＭ
【０２３７】
（６）第１試薬〔ビシン２０ｍＭ；ｐＨ８．６〕の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ８．６（２０℃）に調整して、第１試薬〔ビシン２０ｍＭ；ｐＨ８．６〕を調製した。
試薬成分：
・ビシン  〔Ｂｉｃｉｎｅ〕  ＜キレート物質＞    ２０．０ｍＭ
・トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン  〔Ｔｒｉｓ〕  ＜緩衝剤＞    ２０ｍＭ
【０２３８】
（ｂ）第２試薬
第２試薬〔ｐＨ８．６〕
前記の実施例３の１．測定試薬の（ｂ）第２試薬の（３）第２試薬〔ｐＨ８．６〕の調製の項に記載された通りに調製を行い、第２試薬〔ｐＨ８．６〕を調製した。
【０２３９】
２．試料
（１）試料〔アルブミン結合鉄〕の調製
前記の実施例３の２．試料の（１）試料〔アルブミン結合鉄〕の調製の項に記載された通りに調製を行い、試料〔アルブミン結合鉄〕を調製した。
【０２４０】
（２）試料〔クエン酸結合鉄〕の調製
前記の実施例３の２．試料の（２）試料〔クエン酸結合鉄〕の調製の項に記載された通りに調製を行い、試料〔クエン酸結合鉄〕を調製した。
【０２４１】
（３）試料〔トランスフェリン結合鉄〕の調製
前記の実施例３の２．試料の（３）試料〔トランスフェリン結合鉄〕の調製の項に記載された通りに調製を行い、試料〔トランスフェリン結合鉄〕を調製した。
【０２４２】
３．試料の測定
前記２．試料の各試料について、前記１．測定試薬の（ａ）第１試薬の（１）〜（６）の各々の第１試薬、及び（ｂ）第２試薬の第２試薬〔ｐＨ８．６〕を用いて、非トランスフェリン結合鉄の測定を行った。
この各試料の非トランスフェリン結合鉄の測定は、前記の実施例３の３．試料の測定の項の記載と同様にして行い、各試料の非トランスフェリン結合鉄の濃度の測定値を得た。
【０２４３】
４．測定結果
前記３．試料の測定において各試料の非トランスフェリン結合鉄の濃度の測定を行って得られた結果を、表４に示した。
【０２４４】
【表４】
2014048211.tif 000006
【０２４５】
この表４における表示等については、前記の実施例３の４．測定結果の項に記載されている通りである。
【０２４６】
表４中、（ａ）がＮＴＡ、（ｂ）がＨＩＤＡ、（ｃ）がビシン、をそれぞれキレート物質として第１試薬に含有させているものである。その結果、いずれも良好な結果を示した。
【０２４７】
（１）上記表４に示す結果より、本発明における非トランスフェリン結合鉄の測定、すなわち、キレート物質及びキレート発色剤を用いる測定においては、試料が試料〔アルブミン結合鉄〕及び試料〔クエン酸結合鉄〕のいずれにおいても、前記の「目標値」と同一又は近い非トランスフェリン結合鉄の定量値が得られており、つまり、アルブミンに結合する鉄、又はクエン酸に結合する鉄の非トランスフェリン結合鉄を測定できていることが分かる。
【０２４８】
（２）  これに対して、第１試薬がキレート物質を含有しない（０ｍＭ）場合、すなわち測定にキレート物質を用いない場合には、試料が試料〔アルブミン結合鉄〕及び試料〔クエン酸結合鉄〕のいずれにおいても、非トランスフェリン結合鉄の定量値が前記の「目標値」よりもかなり低くなってしまう。
【０２４９】
（３）  また、本発明における非トランスフェリン結合鉄の測定においては、試料〔トランスフェリン結合鉄〕のトランスフェリンに結合した鉄を測定していないか又はきわめてわずかにしか測定していないことが分かる。
【０２５０】
（４）  すなわち、本発明における非トランスフェリン結合鉄の測定においては、トランスフェリンに結合した鉄を測り込むことなく、非トランスフェリン結合鉄を測定することができることが確かめられた。
【実施例５】
【０２５１】
次に、ｐＨを更に変えて非トランスフェリン結合鉄の測定を行った。
【０２５２】
１．測定試薬
非トランスフェリン結合鉄測定試薬は下記の通り調製した。
（ａ）第１試薬
（１）第１試薬〔ＮＴＡ０ｍＭ；ｐＨ７．８〕の調製
下記の試薬成分を記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ７．８（２０℃）に調整して、キレート物質を含有せず、かつｐＨがｐＨ７．８（２０℃）である第１試薬〔ＮＴＡ０ｍＭ；ｐＨ７．８〕を調製した。
試薬成分：
・トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン  〔Ｔｒｉｓ〕  ＜緩衝剤＞    ２０ｍＭ
【０２５３】
（２）第１試薬〔ＮＴＡ０．１ｍＭ；ｐＨ７．８〕の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ７．８（２０℃）に調整して、第１試薬〔ＮＴＡ０．１ｍＭ；ｐＨ７．８〕を調製した。
試薬成分：
・ニトリロ三酢酸  〔ＮＴＡ〕  ＜キレート物質＞    ０．１ｍＭ
・トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン  〔Ｔｒｉｓ〕  ＜緩衝剤＞    ２０ｍＭ
【０２５４】
（３）第１試薬〔ＮＴＡ０．５ｍＭ；ｐＨ７．８〕の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ７．８（２０℃）に調整して、第１試薬〔ＮＴＡ０．５ｍＭ；ｐＨ７．８〕を調製した。
試薬成分：
・ニトリロ三酢酸  〔ＮＴＡ〕  ＜キレート物質＞    ０．５ｍＭ
・トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン  〔Ｔｒｉｓ〕  ＜緩衝剤＞    ２０ｍＭ
【０２５５】
（４）第１試薬〔ＮＴＡ１ｍＭ；ｐＨ７．８〕の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ７．８（２０℃）に調整して、第１試薬〔ＮＴＡ１ｍＭ；ｐＨ７．８〕を調製した。
試薬成分：
・ニトリロ三酢酸  〔ＮＴＡ〕  ＜キレート物質＞    １．０ｍＭ
・トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン  〔Ｔｒｉｓ〕  ＜緩衝剤＞    ２０ｍＭ
【０２５６】
（５）第１試薬〔ＮＴＡ０ｍＭ；ｐＨ７．９〕の調製
下記の試薬成分を記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ７．９（２０℃）に調整して、キレート物質を含有せず、かつｐＨがｐＨ７．９（２０℃）である第１試薬〔ＮＴＡ０ｍＭ；ｐＨ７．９〕を調製した。
試薬成分：
・トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン  〔Ｔｒｉｓ〕  ＜緩衝剤＞    ２０ｍＭ
【０２５７】
（６）第１試薬〔ＮＴＡ０．１ｍＭ；ｐＨ７．９〕の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ７．９（２０℃）に調整して、第１試薬〔ＮＴＡ０．１ｍＭ；ｐＨ７．９〕を調製した。
試薬成分：
・ニトリロ三酢酸  〔ＮＴＡ〕  ＜キレート物質＞    ０．１ｍＭ
・トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン  〔Ｔｒｉｓ〕  ＜緩衝剤＞    ２０ｍＭ
【０２５８】
（７）第１試薬〔ＮＴＡ０．５ｍＭ；ｐＨ７．９〕の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ７．９（２０℃）に調整して、第１試薬〔ＮＴＡ０．５ｍＭ；ｐＨ７．９〕を調製した。
試薬成分：
・ニトリロ三酢酸  〔ＮＴＡ〕  ＜キレート物質＞    ０．５ｍＭ
・トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン  〔Ｔｒｉｓ〕  ＜緩衝剤＞    ２０ｍＭ
【０２５９】
（８）第１試薬〔ＮＴＡ１ｍＭ；ｐＨ７．９〕の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ７．９（２０℃）に調整して、第１試薬〔ＮＴＡ１ｍＭ；ｐＨ７．９〕を調製した。
試薬成分：
・ニトリロ三酢酸  〔ＮＴＡ〕  ＜キレート物質＞    １．０ｍＭ
・トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン  〔Ｔｒｉｓ〕  ＜緩衝剤＞    ２０ｍＭ
【０２６０】
（９）第１試薬〔ＮＴＡ０ｍＭ；ｐＨ８．０〕の調製
下記の試薬成分を記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ８．０（２０℃）に調整して、キレート物質を含有せず、かつｐＨがｐＨ８．０（２０℃）である第１試薬〔ＮＴＡ０ｍＭ；ｐＨ８．０〕を調製した。
試薬成分：
・トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン  〔Ｔｒｉｓ〕  ＜緩衝剤＞    ２０ｍＭ
【０２６１】
（１０）第１試薬〔ＮＴＡ０．１ｍＭ；ｐＨ８．０〕の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ８．０（２０℃）に調整して、第１試薬〔ＮＴＡ０．１ｍＭ；ｐＨ８．０〕を調製した。
試薬成分：
・ニトリロ三酢酸  〔ＮＴＡ〕  ＜キレート物質＞    ０．１ｍＭ
・トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン  〔Ｔｒｉｓ〕  ＜緩衝剤＞    ２０ｍＭ
【０２６２】
（１１）第１試薬〔ＮＴＡ０．５ｍＭ；ｐＨ８．０〕の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ８．０（２０℃）に調整して、第１試薬〔ＮＴＡ０．５ｍＭ；ｐＨ８．０〕を調製した。
試薬成分：
・ニトリロ三酢酸  〔ＮＴＡ〕  ＜キレート物質＞    ０．５ｍＭ
・トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン  〔Ｔｒｉｓ〕  ＜緩衝剤＞    ２０ｍＭ
【０２６３】
（１２）第１試薬〔ＮＴＡ１ｍＭ；ｐＨ８．０〕の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ８．０（２０℃）に調整して、第１試薬〔ＮＴＡ１ｍＭ；ｐＨ８．０〕を調製した。
試薬成分：
・ニトリロ三酢酸  〔ＮＴＡ〕  ＜キレート物質＞    １．０ｍＭ
・トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン  〔Ｔｒｉｓ〕  ＜緩衝剤＞    ２０ｍＭ
【０２６４】
（ｂ）第２試薬
（１）第２試薬〔ｐＨ７．８〕の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ７．８（２０℃）に調整して、第２試薬〔ｐＨ７．８〕を調製した。
試薬成分：
・２−ニトロソ−５−（Ｎ−プロピル−Ｎ−スルホプロピルアミノ）−フェノール  〔ＮｉｔｒｏｓｏＰＳＡＰ〕  ＜キレート発色剤＞    ５００μＭ
・Ｌ−アスコルビン酸  ＜還元剤＞    ０．２４％
・トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン  〔Ｔｒｉｓ〕  ＜緩衝剤＞    ２０ｍＭ
【０２６５】
（２）第２試薬〔ｐＨ７．９〕の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ７．９（２０℃）に調整して、第２試薬〔ｐＨ７．９〕を調製した。
試薬成分：
・２−ニトロソ−５−（Ｎ−プロピル−Ｎ−スルホプロピルアミノ）−フェノール  〔ＮｉｔｒｏｓｏＰＳＡＰ〕  ＜キレート発色剤＞    ５００μＭ
・Ｌ−アスコルビン酸  ＜還元剤＞    ０．２４％
・トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン  〔Ｔｒｉｓ〕  ＜緩衝剤＞    ２０ｍＭ
【０２６６】
（３）第２試薬〔ｐＨ８．０〕の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ８．０（２０℃）に調整して、第２試薬〔ｐＨ８．０〕を調製した。
試薬成分：
・２−ニトロソ−５−（Ｎ−プロピル−Ｎ−スルホプロピルアミノ）−フェノール  〔ＮｉｔｒｏｓｏＰＳＡＰ〕  ＜キレート発色剤＞    ５００μＭ
・Ｌ−アスコルビン酸  ＜還元剤＞    ０．２４％
・トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン  〔Ｔｒｉｓ〕  ＜緩衝剤＞    ２０ｍＭ
【０２６７】
２．試料
（１）試料〔アルブミン結合鉄〕の調製
前記の実施例３の２．試料の（１）試料〔アルブミン結合鉄〕の調製の項に記載された通りに調製を行い、試料〔アルブミン結合鉄〕を調製した。
【０２６８】
（２）試料〔クエン酸結合鉄〕の調製
前記の実施例３の２．試料の（２）試料〔クエン酸結合鉄〕の調製の項に記載された通りに調製を行い、試料〔クエン酸結合鉄〕を調製した。
【０２６９】
（３）試料〔トランスフェリン結合鉄〕の調製
前記の実施例３の２．試料の（３）試料〔トランスフェリン結合鉄〕の調製の項に記載された通りに調製を行い、試料〔トランスフェリン結合鉄〕を調製した。
【０２７０】
３．試料の測定
前記２．試料の各試料について、前記１．測定試薬の（ａ）第１試薬の（１）〜（１２）の各々の第１試薬、及び（ｂ）第２試薬の（１）〜（３）の各々の第２試薬を用いて、非トランスフェリン結合鉄の測定を行った。（なお、第１試薬と第２試薬は、それぞれ同じｐＨのものを組み合わせて用いた。）
この各試料の非トランスフェリン結合鉄の測定は、前記の実施例３の３．試料の測定の項の記載と同様にして行い、各試料の非トランスフェリン結合鉄の濃度の測定値を得た。
【０２７１】
４．測定結果
前記３．試料の測定において各試料の非トランスフェリン結合鉄の濃度の測定を行って得られた結果を、表５に示した。
【０２７２】
【表５】
2014048211.tif 000007
【０２７３】
この表５における表示等については、前記の実施例３の４．測定結果の項に記載されている通りである。
【０２７４】
表５中、（ａ）がｐＨ７．８、（ｂ）がｐＨ７．９、（ｃ）がｐＨ８．０、にそれぞれ調整している。その結果、いずれも良好な結果を示した。
【０２７５】
（１）上記表５に示す結果より、本発明における非トランスフェリン結合鉄の測定、すなわち、キレート物質及びキレート発色剤を用いる測定においては、試料が試料〔アルブミン結合鉄〕及び試料〔クエン酸結合鉄〕のいずれにおいても、前記の「目標値」と同一又は近い非トランスフェリン結合鉄の定量値が得られており、つまり、アルブミンに結合する鉄、又はクエン酸に結合する鉄の非トランスフェリン結合鉄を測定できていることが分かる。
【０２７６】
（２）  これに対して、第１試薬がキレート物質を含有しない（０ｍＭ）場合、すなわち測定にキレート物質を用いない場合には、試料が試料〔アルブミン結合鉄〕及び試料〔クエン酸結合鉄〕のいずれにおいても、非トランスフェリン結合鉄の定量値が前記の「目標値」よりも低くなってしまう。
【０２７７】
（３）  また、本発明における非トランスフェリン結合鉄の測定においては、試料〔トランスフェリン結合鉄〕のトランスフェリンに結合した鉄を測定していないか又はきわめてわずかにしか測定していないことが分かる。
【０２７８】
（４）  すなわち、本発明における非トランスフェリン結合鉄の測定においては、トランスフェリンに結合した鉄を測り込むことなく、非トランスフェリン結合鉄を測定することができることが確かめられた。
【実施例６】
【０２７９】
次に、キレート発色剤を変えて非トランスフェリン結合鉄の測定を行った。
【０２８０】
１．測定試薬
非トランスフェリン結合鉄測定試薬は下記の通り調製した。
（ａ）第１試薬
（１）第１試薬〔ＮＴＡ０ｍＭ；ｐＨ７．４〕の調製
前記の実施例３の１．測定試薬の（ａ）第１試薬の（１）第１試薬〔ＮＴＡ０ｍＭ；ｐＨ７．４〕の調製の項に記載された通りに調製を行い、第１試薬〔ＮＴＡ０ｍＭ；ｐＨ７．４〕を調製した。
【０２８１】
（２）第１試薬〔ＮＴＡ０．１ｍＭ；ｐＨ７．４〕の調製
前記の実施例３の１．測定試薬の（ａ）第１試薬の（２）第１試薬〔ＮＴＡ０．１ｍＭ；ｐＨ７．４〕の調製の項に記載された通りに調製を行い、第１試薬〔ＮＴＡ０．１ｍＭ；ｐＨ７．４〕を調製した。
【０２８２】
（３）第１試薬〔ＮＴＡ０．５ｍＭ；ｐＨ７．４〕の調製
前記の実施例３の１．測定試薬の（ａ）第１試薬の（３）第１試薬〔ＮＴＡ０．５ｍＭ；ｐＨ７．４〕の調製の項に記載された通りに調製を行い、第１試薬〔ＮＴＡ０．５ｍＭ；ｐＨ７．４〕を調製した。
【０２８３】
（４）第１試薬〔ＮＴＡ１ｍＭ；ｐＨ７．４〕の調製
前記の実施例３の１．測定試薬の（ａ）第１試薬の（４）第１試薬〔ＮＴＡ１ｍＭ；ｐＨ７．４〕の調製の項に記載された通りに調製を行い、第１試薬〔ＮＴＡ１ｍＭ；ｐＨ７．４〕を調製した。
【０２８４】
（５）第１試薬〔ＮＴＡ０ｍＭ；ｐＨ８．０〕の調製
前記の実施例３の１．測定試薬の（ａ）第１試薬の（５）第１試薬〔ＮＴＡ０ｍＭ；ｐＨ８．０〕の調製の項に記載された通りに調製を行い、第１試薬〔ＮＴＡ０ｍＭ；ｐＨ８．０〕を調製した。
【０２８５】
（６）第１試薬〔ＮＴＡ０．１ｍＭ；ｐＨ８．０〕の調製
前記の実施例３の１．測定試薬の（ａ）第１試薬の（６）第１試薬〔ＮＴＡ０．１ｍＭ；ｐＨ８．０〕の調製の項に記載された通りに調製を行い、第１試薬〔ＮＴＡ０．１ｍＭ；ｐＨ８．０〕を調製した。
【０２８６】
（７）第１試薬〔ＮＴＡ０．５ｍＭ；ｐＨ８．０〕の調製
前記の実施例３の１．測定試薬の（ａ）第１試薬の（７）第１試薬〔ＮＴＡ０．５ｍＭ；ｐＨ８．０〕の調製の項に記載された通りに調製を行い、第１試薬〔ＮＴＡ０．５ｍＭ；ｐＨ８．０〕を調製した。
【０２８７】
（８）第１試薬〔ＮＴＡ１ｍＭ；ｐＨ８．０〕の調製
前記の実施例３の１．測定試薬の（ａ）第１試薬の（８）第１試薬〔ＮＴＡ１ｍＭ；ｐＨ８．０〕の調製の項に記載された通りに調製を行い、第１試薬〔ＮＴＡ１ｍＭ；ｐＨ８．０〕を調製した。
【０２８８】
（９）第１試薬〔ＮＴＡ０ｍＭ；ｐＨ８．６〕の調製
前記の実施例３の１．測定試薬の（ａ）第１試薬の（９）第１試薬〔ＮＴＡ０ｍＭ；ｐＨ８．６〕の調製の項に記載された通りに調製を行い、第１試薬〔ＮＴＡ０ｍＭ；ｐＨ８．６〕を調製した。
【０２８９】
（１０）第１試薬〔ＮＴＡ０．１ｍＭ；ｐＨ８．６〕の調製
前記の実施例３の１．測定試薬の（ａ）第１試薬の（１０）第１試薬〔ＮＴＡ０．１ｍＭ；ｐＨ８．６〕の調製の項に記載された通りに調製を行い、第１試薬〔ＮＴＡ０．１ｍＭ；ｐＨ８．６〕を調製した。
【０２９０】
（１１）第１試薬〔ＮＴＡ０．５ｍＭ；ｐＨ８．６〕の調製
前記の実施例３の１．測定試薬の（ａ）第１試薬の（１１）第１試薬〔ＮＴＡ０．５ｍＭ；ｐＨ８．６〕の調製の項に記載された通りに調製を行い、第１試薬〔ＮＴＡ０．５ｍＭ；ｐＨ８．６〕を調製した。
【０２９１】
（１２）第１試薬〔ＮＴＡ１ｍＭ；ｐＨ８．６〕の調製
前記の実施例３の１．測定試薬の（ａ）第１試薬の（１２）第１試薬〔ＮＴＡ１ｍＭ；ｐＨ８．６〕の調製の項に記載された通りに調製を行い、第１試薬〔ＮＴＡ１ｍＭ；ｐＨ８．６〕を調製した。
【０２９２】
（ｂ）第２試薬
（１）第２試薬〔ＮｉｔｒｏｓｏＰＳＡＰ；ｐＨ７．４〕
前記の実施例３の１．測定試薬の（ｂ）第２試薬の（１）第２試薬〔ｐＨ７．４〕の調製の項に記載された通りに調製を行い、第２試薬〔ＮｉｔｒｏｓｏＰＳＡＰ；ｐＨ７．４〕を調製した。
【０２９３】
（２）第２試薬〔ＮｉｔｒｏｓｏＰＳＡＰ；ｐＨ８．０〕
前記の実施例３の１．測定試薬の（ｂ）第２試薬の（２）第２試薬〔ｐＨ８．０〕の調製の項に記載された通りに調製を行い、第２試薬〔ＮｉｔｒｏｓｏＰＳＡＰ；ｐＨ８．０〕を調製した。
【０２９４】
（３）第２試薬〔ＮｉｔｒｏｓｏＰＳＡＰ；ｐＨ８．６〕
前記の実施例３の１．測定試薬の（ｂ）第２試薬の（３）第２試薬〔ｐＨ８．６〕の調製の項に記載された通りに調製を行い、第２試薬〔ＮｉｔｒｏｓｏＰＳＡＰ；ｐＨ８．６〕を調製した。
【０２９５】
（４）第２試薬〔フェレン；ｐＨ７．４〕の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ７．４（２０℃）に調整して、第２試薬〔フェレン；ｐＨ７．４〕を調製した。
試薬成分：
・フェレン  〔Ｆｅｒｒｅｎ〕  ＜キレート発色剤＞    ２０ｍＭ
・Ｌ−アスコルビン酸  ＜還元剤＞    ０．２４％
・トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン  〔Ｔｒｉｓ〕  ＜緩衝剤＞    ２０ｍＭ
【０２９６】
（５）第２試薬〔フェレン；ｐＨ８．０〕の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ８．０（２０℃）に調整して、第２試薬〔フェレン；ｐＨ８．０〕を調製した。
試薬成分：
・フェレン  〔Ｆｅｒｒｅｎ〕  ＜キレート発色剤＞    ２０ｍＭ
・Ｌ−アスコルビン酸  ＜還元剤＞    ０．２４％
・トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン  〔Ｔｒｉｓ〕  ＜緩衝剤＞    ２０ｍＭ
【０２９７】
（６）第２試薬〔フェレン；ｐＨ８．６〕の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ８．６（２０℃）に調整して、第２試薬〔フェレン；ｐＨ８．６〕を調製した。
試薬成分：
・フェレン  〔Ｆｅｒｒｅｎ〕  ＜キレート発色剤＞    ２０ｍＭ
・Ｌ−アスコルビン酸  ＜還元剤＞    ０．２４％
・トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン  〔Ｔｒｉｓ〕  ＜緩衝剤＞    ２０ｍＭ
【０２９８】
（７）第２試薬〔フェロジン；ｐＨ７．４〕の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ７．４（２０℃）に調整して、第２試薬〔フェロジン；ｐＨ７．４〕を調製した。
試薬成分：
・フェロジン  〔Ｆｅｒｒｏｚｉｎｅ〕  ＜キレート発色剤＞    ２０ｍＭ
・Ｌ−アスコルビン酸  ＜還元剤＞    ０．２４％
・トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン  〔Ｔｒｉｓ〕  ＜緩衝剤＞    ２０ｍＭ
【０２９９】
（８）第２試薬〔フェロジン；ｐＨ８．０〕の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ８．０（２０℃）に調整して、第２試薬〔フェロジン；ｐＨ８．０〕を調製した。
試薬成分：
・フェロジン  〔Ｆｅｒｒｏｚｉｎｅ〕  ＜キレート発色剤＞    ２０ｍＭ
・Ｌ−アスコルビン酸  ＜還元剤＞    ０．２４％
・トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン  〔Ｔｒｉｓ〕  ＜緩衝剤＞    ２０ｍＭ
【０３００】
（９）第２試薬〔フェロジン；ｐＨ８．６〕の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ８．６（２０℃）に調整して、第２試薬〔フェロジン；ｐＨ８．６〕を調製した。
試薬成分：
・フェロジン  〔Ｆｅｒｒｏｚｉｎｅ〕  ＜キレート発色剤＞    ２０ｍＭ
・Ｌ−アスコルビン酸  ＜還元剤＞    ０．２４％
・トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン  〔Ｔｒｉｓ〕  ＜緩衝剤＞    ２０ｍＭ
【０３０１】
２．試料
（１）試料〔アルブミン結合鉄〕の調製
前記の実施例３の２．試料の（１）試料〔アルブミン結合鉄〕の調製の項に記載された通りに調製を行い、試料〔アルブミン結合鉄〕を調製した。
【０３０２】
（２）試料〔クエン酸結合鉄〕の調製
前記の実施例３の２．試料の（２）試料〔クエン酸結合鉄〕の調製の項に記載された通りに調製を行い、試料〔クエン酸結合鉄〕を調製した。
【０３０３】
（３）試料〔トランスフェリン結合鉄〕の調製
前記の実施例３の２．試料の（３）試料〔トランスフェリン結合鉄〕の調製の項に記載された通りに調製を行い、試料〔トランスフェリン結合鉄〕を調製した。
【０３０４】
３．試料の測定
前記２．試料の各試料について、前記１．測定試薬の（ａ）第１試薬の（１）〜（１２）の各々の第１試薬、及び（ｂ）第２試薬の（１）〜（９）の各々の第２試薬をそれぞれ組み合わせて用いて、非トランスフェリン結合鉄の測定を行った。（なお、第１試薬と第２試薬は、それぞれ同じｐＨのものを組み合わせて用いた。）
この各試料の非トランスフェリン結合鉄の測定は、前記の実施例３の３．試料の測定の項の記載と同様にして行い、各試料の非トランスフェリン結合鉄の濃度の測定値を得た。
【０３０５】
４．測定結果
前記３．試料の測定において各試料の非トランスフェリン結合鉄の濃度の測定を行って得られた結果を、表６に示した。
【０３０６】
【表６】
2014048211.tif 000008
【０３０７】
この表６における表示等については、前記の実施例３の４．測定結果の項に記載されている通りである。
【０３０８】
表６中、（ａ）が２−ニトロソ−５−（Ｎ−プロピル−Ｎ−スルホプロピルアミノ）−フェノール〔ＮｉｔｒｏｓｏＰＳＡＰ〕、（ｂ）がフェレン、（ｃ）がフェロジン、をそれぞれキレート発色剤として第２試薬に含有させているものである。その結果、いずれも良好な結果を示した。
【０３０９】
（１）上記表６に示す結果より、本発明における非トランスフェリン結合鉄の測定、すなわち、キレート物質及びキレート発色剤を用いる測定においては、試料が試料〔アルブミン結合鉄〕及び試料〔クエン酸結合鉄〕のいずれにおいても、前記の「目標値」と同一又は近い非トランスフェリン結合鉄の定量値が得られており、つまり、アルブミンに結合する鉄、又はクエン酸に結合する鉄の非トランスフェリン結合鉄を測定できていることが分かる。
【０３１０】
（２）  これに対して、第１試薬がキレート物質を含有しない（０ｍＭ）場合、すなわち測定にキレート物質を用いない場合には、試料が試料〔アルブミン結合鉄〕及び試料〔クエン酸結合鉄〕のいずれにおいても、非トランスフェリン結合鉄の定量値が前記の「目標値」よりもかなり低くなってしまう。
【０３１１】
（３）  また、本発明における非トランスフェリン結合鉄の測定においては、試料〔トランスフェリン結合鉄〕のトランスフェリンに結合した鉄を測定していないか又はきわめてわずかにしか測定していないことが分かる。
【０３１２】
（４）  すなわち、本発明における非トランスフェリン結合鉄の測定においては、トランスフェリンに結合した鉄を測り込むことなく、非トランスフェリン結合鉄を測定することができることが確かめられた。
【実施例７】
【０３１３】
次に、各キレート発色剤を用いる場合に、キレート物質の濃度を変えて非トランスフェリン結合鉄の測定を行った。
【０３１４】
１．測定試薬
非トランスフェリン結合鉄測定試薬は下記の通り調製した。
（ａ）第１試薬
【０３１５】
（１）第１試薬〔ＮＴＡ０ｍＭ；ｐＨ８．６〕の調製
前記の実施例３の１．測定試薬の（ａ）第１試薬の（９）第１試薬〔ＮＴＡ０ｍＭ；ｐＨ８．６〕の調製の項に記載された通りに調製を行い、第１試薬〔ＮＴＡ０ｍＭ；ｐＨ８．６〕を調製した。
【０３１６】
（２）第１試薬〔ＮＴＡ２ｍＭ；ｐＨ８．６〕の調製
前記の実施例４の１．測定試薬の（ａ）第１試薬の（２）第１試薬〔ＮＴＡ２ｍＭ；ｐＨ８．６〕の調製の項に記載された通りに調製を行い、第１試薬〔ＮＴＡ２ｍＭ；ｐＨ８．６〕を調製した。
【０３１７】
（ｂ）第２試薬
（１）第２試薬〔ＮｉｔｒｏｓｏＰＳＡＰ；ｐＨ８．６〕
前記の実施例３の１．測定試薬の（ｂ）第２試薬の（３）第２試薬〔ｐＨ８．６〕の調製の項に記載された通りに調製を行い、第２試薬〔ＮｉｔｒｏｓｏＰＳＡＰ；ｐＨ８．６〕を調製した。
【０３１８】
（２）第２試薬〔フェレン；ｐＨ８．６〕の調製
前記の実施例６の１．測定試薬の（ｂ）第２試薬の（６）第２試薬〔フェレン；ｐＨ８．６〕の調製の項に記載された通りに調製を行い、第２試薬〔フェレン；ｐＨ８．６〕を調製した。
【０３１９】
（３）第２試薬〔フェロジン；ｐＨ８．６〕の調製
前記の実施例６の１．測定試薬の（ｂ）第２試薬の（９）第２試薬〔フェロジン；ｐＨ８．６〕の調製の項に記載された通りに調製を行い、第２試薬〔フェロジン；ｐＨ８．６〕を調製した。
【０３２０】
２．試料
（１）試料〔アルブミン結合鉄〕の調製
前記の実施例３の２．試料の（１）試料〔アルブミン結合鉄〕の調製の項に記載された通りに調製を行い、試料〔アルブミン結合鉄〕を調製した。
【０３２１】
（２）試料〔クエン酸結合鉄〕の調製
前記の実施例３の２．試料の（２）試料〔クエン酸結合鉄〕の調製の項に記載された通りに調製を行い、試料〔クエン酸結合鉄〕を調製した。
【０３２２】
（３）試料〔トランスフェリン結合鉄〕の調製
前記の実施例３の２．試料の（３）試料〔トランスフェリン結合鉄〕の調製の項に記載された通りに調製を行い、試料〔トランスフェリン結合鉄〕を調製した。
【０３２３】
３．試料の測定
前記２．試料の各試料について、前記１．測定試薬の（ａ）第１試薬の（１）〜（２）の各々の第１試薬、及び（ｂ）第２試薬の（１）〜（３）の各々の第２試薬をそれぞれ組み合わせて用いて、非トランスフェリン結合鉄の測定を行った。
この各試料の非トランスフェリン結合鉄の測定は、前記の実施例３の３．試料の測定の項の記載と同様にして行い、各試料の非トランスフェリン結合鉄の濃度の測定値を得た。
【０３２４】
４．測定結果
前記３．試料の測定において各試料の非トランスフェリン結合鉄の濃度の測定を行って得られた結果を、表７に示した。
【０３２５】
【表７】
2014048211.tif 000009
【０３２６】
この表７における表示等については、前記の実施例３の４．測定結果の項に記載されている通りである。
【０３２７】
表７中、（ａ）が２−ニトロソ−５−（Ｎ−プロピル−Ｎ−スルホプロピルアミノ）−フェノール〔ＮｉｔｒｏｓｏＰＳＡＰ〕、（ｂ）がフェレン、（ｃ）がフェロジン、をそれぞれキレート発色剤として第２試薬に含有させているものである。その結果、いずれも良好な結果を示した。
【０３２８】
（１）上記表７に示す結果より、本発明における非トランスフェリン結合鉄の測定、すなわち、キレート物質及びキレート発色剤を用いる測定においては、試料が試料〔アルブミン結合鉄〕及び試料〔クエン酸結合鉄〕のいずれにおいても、前記の「目標値」と同一又は近い非トランスフェリン結合鉄の定量値が得られており、つまり、アルブミンに結合する鉄、又はクエン酸に結合する鉄の非トランスフェリン結合鉄を測定できていることが分かる。
【０３２９】
（２）  これに対して、第１試薬がキレート物質を含有しない（０ｍＭ）場合、すなわち測定にキレート物質を用いない場合には、試料が試料〔アルブミン結合鉄〕及び試料〔クエン酸結合鉄〕のいずれにおいても、非トランスフェリン結合鉄の定量値が前記の「目標値」よりもかなり低くなってしまう。
【０３３０】
（３）  また、本発明における非トランスフェリン結合鉄の測定においては、試料〔トランスフェリン結合鉄〕のトランスフェリンに結合した鉄を測定していないか又はきわめてわずかにしか測定していないことが分かる。
【０３３１】
（４）  すなわち、本発明における非トランスフェリン結合鉄の測定においては、トランスフェリンに結合した鉄を測り込むことなく、非トランスフェリン結合鉄を測定することができることが確かめられた。
【実施例８】
【０３３２】
次に、アルブミン結合鉄、及びクエン酸結合鉄の各希釈試料について、非トランスフェリン結合鉄の測定の希釈直線性の確認を行った。
【０３３３】
１．測定試薬
非トランスフェリン結合鉄測定試薬は下記の通り調製した。
（ａ）第１試薬
第１試薬〔ＮＴＡ０．１ｍＭ；ｐＨ８．０〕の調製
前記の実施例３の１．測定試薬の（ａ）第１試薬の（６）第１試薬〔ＮＴＡ０．１ｍＭ；ｐＨ８．０〕の調製の項に記載された通りに調製を行い、第１試薬〔ＮＴＡ０．１ｍＭ；ｐＨ８．０〕を調製した。
【０３３４】
（ｂ）第２試薬
第２試薬〔ＮｉｔｒｏｓｏＰＳＡＰ；ｐＨ８．０〕
前記の実施例３の１．測定試薬の（ｂ）第２試薬の（２）第２試薬〔ｐＨ８．０〕の調製の項に記載された通りに調製を行い、第２試薬〔ＮｉｔｒｏｓｏＰＳＡＰ；ｐＨ８．０〕を調製した。
【０３３５】
２．試料
（１）アルブミン結合鉄の希釈試料の調製
（ａ）  ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を純水に溶解して、ウシ血清アルブミン水溶液を調製した。（なお、このウシ血清アルブミンについて、前記の通り、「クイックジェルＳＰ」を用いたタンパク分画電気泳動で、トランスフェリンを含まないことを確認した。）
これを、前記の「クイックオートネオ  Ｆｅ」で測定したところ、鉄の濃度、すなわちこのアルブミン結合鉄の濃度は５．６μｇ／ｄＬであった。
更に、これを純水で１／２に希釈してアルブミン結合鉄の濃度が２．８μｇ／ｄＬの試料を調製した。
また、純水をアルブミン結合鉄の濃度０μｇ／ｄＬの試料とした。
これにより、アルブミン結合鉄の濃度が次の通りの３種類の試料を調製した。
・  ０μｇ／ｄＬ
・  ２．８μｇ／ｄＬ
・  ５．６μｇ／ｄＬ
【０３３６】
（ｂ）  ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を純水に溶解して、ウシ血清アルブミン水溶液を調製した。（なお、このウシ血清アルブミンについて、前記の通り、「クイックジェルＳＰ」を用いたタンパク分画電気泳動で、トランスフェリンを含まないことを確認した。）
これを、前記の「クイックオートネオ  Ｆｅ」で測定したところ、鉄の濃度、すなわちこのアルブミン結合鉄の濃度は１４．３μｇ／ｄＬであった。
更に、これを純水で１／２に希釈してアルブミン結合鉄の濃度が７．２μｇ／ｄＬの試料を調製した。
また、純水をアルブミン結合鉄の濃度０μｇ／ｄＬの試料とした。
これにより、アルブミン結合鉄の濃度が次の通りの３種類の試料を調製した。
・  ０μｇ／ｄＬ
・  ７．２μｇ／ｄＬ
・  １４．３μｇ／ｄＬ
【０３３７】
（２）クエン酸結合鉄の希釈試料の調製
クエン酸鉄〔クエン酸第二鉄〕を純水に溶解して、クエン酸水溶液を調製した。これを、前記の「クイックオートネオ  Ｆｅ」で測定したところ、鉄の濃度、すなわちこのクエン酸結合鉄の濃度は１９．６μｇ／ｄＬであった。
更に、これを純水で、１／２、１／４、１／８、及び１／１６にそれぞれ希釈して試料を調製した。
また、純水をクエン酸結合鉄の濃度０μｇ／ｄＬの試料とした。
これにより、クエン酸結合鉄の濃度が次の通りの６種類の試料を調製した。
・  ０μｇ／ｄＬ
・  １．２μｇ／ｄＬ
・  ２．５μｇ／ｄＬ
・  ４．９μｇ／ｄＬ
・  ９．８μｇ／ｄＬ
・  １９．６μｇ／ｄＬ
【０３３８】
３．試料の測定
前記２．試料の各試料について、前記１．測定試薬の第１試薬、及び（ｂ）第２試薬の第２試薬をそれぞれ組み合わせて用いて、非トランスフェリン結合鉄の測定を行った。
この各試料の非トランスフェリン結合鉄の測定は、前記の実施例３の３．試料の測定の項の記載と同様にして行い、各試料の非トランスフェリン結合鉄の濃度の測定値を得た。
なお、この測定は、同一の試料について、１０回繰り返して行った。（１０重測定）
【０３３９】
４．測定結果
前記３．試料の測定において各試料の非トランスフェリン結合鉄の濃度の測定を行って得られた結果を、表８に示した。
【０３４０】
【表８】
2014048211.tif 000010
【０３４１】
この表８における表示等については、前記の実施例３の４．測定結果の項に記載されている通りである。
【０３４２】
表８中、（ａ）がアルブミン結合鉄の希釈試料の（ａ）を、（ｂ）がアルブミン結合鉄の希釈試料の（ｂ）を、そして（ｃ）がクエン酸結合鉄の希釈試料を測定した結果である。（それぞれ、１０回の測定の平均値を算出し、これを示した。）
その結果、いずれも良好な結果を示した。
【０３４３】
（１）上記表８に示す結果より、本発明における非トランスフェリン結合鉄の測定、すなわち、キレート物質及びキレート発色剤を用いる測定においては、試料がアルブミン結合鉄及びクエン酸結合鉄のいずれにおいても、各希釈試料の定量値（実測値）は前記の正しい非トランスフェリン結合鉄濃度である理論値と同一又は近い値であり、つまり、アルブミンに結合する鉄、又はクエン酸に結合する鉄の非トランスフェリン結合鉄を広い濃度範囲にわたって正確に測定できていることが分かる。
（２）本発明における非トランスフェリン結合鉄の測定においては、希釈した試料により確かめた直線性が良好であり、広い濃度範囲にわたって正確に測定できることが確認できた。
【実施例９】
【０３４４】
次に、ヒト血清に鉄を添加した試料について、非トランスフェリン結合鉄を測定し、添加回収試験を行った。
【０３４５】
１．測定試薬
非トランスフェリン結合鉄測定試薬は下記の通り調製した。
（ａ）第１試薬
第１試薬〔ＮＴＡ０．１ｍＭ；ｐＨ８．０〕の調製
前記の実施例３の１．測定試薬の（ａ）第１試薬の（６）第１試薬〔ＮＴＡ０．１ｍＭ；ｐＨ８．０〕の調製の項に記載された通りに調製を行い、第１試薬〔ＮＴＡ０．１ｍＭ；ｐＨ８．０〕を調製した。
【０３４６】
（ｂ）第２試薬
第２試薬〔ＮｉｔｒｏｓｏＰＳＡＰ；ｐＨ８．０〕
前記の実施例３の１．測定試薬の（ｂ）第２試薬の（２）第２試薬〔ｐＨ８．０〕の調製の項に記載された通りに調製を行い、第２試薬〔ＮｉｔｒｏｓｏＰＳＡＰ；ｐＨ８．０〕を調製した。
【０３４７】
２．試料
鉄添加血清試料
まず、ヒト血清を用意した。
このヒト血清に鉄を添加して、このヒト血清のトランスフェリンを鉄で飽和させて、トランスフェリンが全て鉄と結合している状態とした。
そして、この鉄添加後のヒト血清の非トランスフェリン結合鉄濃度を測定したところ、２９．０μｇ／ｄＬであった。
次に、このヒト血清に、その鉄濃度が１３．４μｇ／ｄＬ増加するように鉄を添加し、鉄添加血清試料を調製した。
なお、この鉄添加血清試料においては、トランスフェリンが全て鉄と結合し飽和しているものに、鉄を添加したので、この鉄濃度の増加分（１３．４μｇ／ｄＬ）は、全て非トランスフェリン結合鉄の増加分となる。
【０３４８】
３．試料の測定
前記２．試料の試料について、前記１．測定試薬の第１試薬、及び（ｂ）第２試薬の第２試薬をそれぞれ組み合わせて用いて、非トランスフェリン結合鉄の測定を行った。
この試料の非トランスフェリン結合鉄の測定は、前記の実施例３の３．試料の測定の項の記載と同様にして行い、この試料の非トランスフェリン結合鉄の濃度の測定値を得た。
【０３４９】
４．測定結果
前記３．試料の測定において鉄添加血清試料の非トランスフェリン結合鉄の濃度の測定を行って得られた結果であるが、定量値は４１．４．μｇ／ｄＬであった。
つまり、鉄添加前の非トランスフェリン結合鉄の濃度の定量値２９．０μｇ／ｄＬとの差（増加量）は、１２．４μｇ／ｄＬであった。
よって、鉄濃度の増加分の実測値１２．４μｇ／ｄＬを鉄濃度の増加分の理論値１３．４μｇ／ｄＬで除した値（回収率）は、９３％であった。
すなわち、この鉄添加血清試料における回収率は、９３％と良好なものであった。
このことより、本発明における非トランスフェリン結合鉄の測定、すなわち、キレート物質及びキレート発色剤を用いる測定においては、試料が複雑な組成よりなる生体試料の血清であっても、これらの組成物の干渉を受けることなく、正確な測定が行えることが確かめられた。
【産業上の利用可能性】
【０３５０】
本発明は、臨床検査、臨床病理学及び医学などの生命科学分野、並びに分析化学などの化学分野等において有用なものであり、広範な分野に渡って利用価値を有する。
【図１】
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