(57)【要約】      （修正有）【課題】慢性関節リウマチをより精確に診断するための、血管やリンパ管及び関節軟骨の基底膜や結合組織の構成タンパク、いわゆる細胞外マトリックスの分解に関与するマトリックスメタロプロテアーゼのサブグループに属するストロムライシン１をより高感度及びより正確に定量する方法の提供。【解決手段】ストロムライシン１に特異的に反応するモノクローナル抗体であって、ストロムライシン１を１μｇ当たり０．５１ｍＵのリジルエンドペプチダーゼでｐＨ８．５、３７℃、１５分間分解することにより生成したペプチドと反応性が低下する、モノクローナル抗体。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１の４２５番〜４３６番のアミノ酸配列からなるペプチドと特異的に反応し、かつ、ストロムライシン１と特異的に反応する、モノクローナル抗体。
【請求項２】
ストロムライシン１に特異的に反応するモノクローナル抗体であって、ストロムライシン１を１μｇ当たり０．５１ｍＵのリジルエンドペプチダーゼでｐＨ８．５、３７℃、１５分間分解することにより生成したペプチドと反応性が低下する、モノクローナル抗体。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のモノクローナル抗体を用いることを特徴とする、免疫染色法。
【請求項４】
請求項１又は２に記載のモノクローナル抗体を用いて、ストロムライシン１を定量することを特徴とする、ストロムライシン１の免疫学的測定法。
【請求項５】
ストロムライシン１に対する２種類以上のモノクローナル抗体を用いる免疫学的測定法であって、前記モノクローナル抗体のうちの少なくとも１種類が請求項１又は２に記載のモノクローナル抗体である、請求項４に記載の免疫学的測定法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ストロムライシン１と特異的に反応するモノクローナル抗体並びにそれを用いた免疫染色法及び免疫学的測定法に関する。
【背景技術】
【０００２】
血管やリンパ管及び関節軟骨の基底膜や結合組織の構成タンパク、いわゆる細胞外マトリックスの分解には、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰｓ）と総称される一群の酵素が関与している。ＭＭＰｓにはサブグループがあり、ストロムライシン１、２及び３は、ストロムライシン群のサブグループに属する。ストロムライシン１は、プロテオグリカナーゼあるいはＭＭＰ−３とも呼ばれ、各種のサイトカインあるいは各種の増殖因子等で刺激された線維芽細胞や腫瘍細胞で産生される物質である。生体内では、慢性関節リウマチ疾患患者の関節局所で産生されるほか、血液中あるいは関節液中に存在する（特許文献１）。従って、患者におけるストロムイシン１の定量が慢性関節リウマチの診断に利用されている。
【０００３】
また、ストロムライシン２（ＭＭＰ−１０）は、Ｍｕｌｌｅｒらにより遺伝子がクローニングされ、ストロムライシン１と同様な基質特異性を持つ（非特許文献１）。ストロムライシン３（ＭＭＰ−１１）はＢａｓｓｅｔらにより遺伝子がクローニングされ、癌の進行度に関連していると考えられている（非特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特公平８−５９２０号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｍｕｌｌｅｒら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２５３，１８７−１９２，１９８８
【非特許文献２】Ｂａｓｓｅｔら，Ｎａｔｕｒｅ，３４８，６９９−７０４，１９９０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ストロムライシン１、２及び３は、非常によく似たアミノ酸配列や基質特異性を持っており、ストロムライシン１に対する抗体を作製した場合、ストロムライシン２や３と交差反応する可能性が高い。上記特許文献１ではストロムライシン１に対するモノクローナル抗体が複数得られているが、それらの抗体が、ストロムライシン２や３と交差反応性を有する可能性がある。慢性関節リウマチをより精確に診断するためには、ストロムライシン１をより精度良く定量することが必要である。
【０００７】
そこで本発明は、ストロムライシン１をより高感度及びより正確に定量することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、配列番号１の４２５番〜４３６番のアミノ酸配列からなるペプチドと特異的に反応し、かつ、ストロムライシン１と特異的に反応する、モノクローナル抗体を提供する。上記モノクローナル抗体は、ストロムライシン２及びストロムライシン３と交差反応しないことが好ましい。配列番号１のアミノ酸配列はストロムライシン１のアミノ酸配列を表し、配列番号１の４２５番〜４３６番の配列からなるペプチドは、交差反応性に関与すると考えられる。
【０００９】
また、本発明は、ストロムライシン１に特異的に反応するモノクローナル抗体であって、ストロムライシン１を１μｇ当たり０．５１ｍＵのリジルエンドペプチダーゼでｐＨ８．５、３７℃、１５分間分解することにより生成したペプチドと反応性が低下する、モノクローナル抗体を提供する。上記モノクローナル抗体は、ストロムライシン２及びストロムライシン３と交差反応しないことが好ましい。リジルエンドペプチダーゼの分解により、反応性が低下するモノクローナル抗体は、ストロムライシン１タンパク質の高次構造を認識して反応する可能性がある。
【００１０】
本発明のモノクローナル抗体は、免疫染色法に用いることができる。本発明のモノクローナル抗体を用いた免疫染色法によれば、ストロムライシン１を特異的に可視化することができる。
【００１１】
本発明のモノクローナル抗体は、ストロムライシン１を定量する、ストロムライシン１の免疫学的測定法に使用できる。本発明のモノクローナル抗体を用いた免疫学的測定法によれば、ストロムライシン１を確度良く定量することができる。
【００１２】
上記免疫学的測定法は、１種類のモノクローナル抗体を用いる競合型イムノアッセイ、２種類のモノクローナル抗体を用いるサンドイッチ法を代表とするイムノアッセイ、及び２種類以上のモノクローナル抗体を用いる凝集法等による免疫測定法であって、２種類以上のモノクローナル抗体を用いる場合は、使用するモノクローナル抗体のうち少なくとも１種類を本発明のモノクローナル抗体とすることが好ましい。２種類以上のモノクローナル抗体を用いることで、ストロムライシン１に対する特異性がより高くなり、より正確にストロムライシン１を定量することができる。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、ストロムライシン１をより高感度及びより精確に定量することが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ストロムライシン１ペプチドを分画して得られた各画分のペプチドとモノクローナル抗体との反応性を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
一実施形態において、ストロムライシン２及びストロムライシン３と交差反応せず、ストロムライシン１と特異的に反応する、モノクローナル抗体を提供する。本発明のモノクローナル抗体は、ストロムライシン２及びストロムライシン３と交差反応しないため、試料中にストロムライシン２やストロムライシン３が含まれていても、ストロムライシン１のみと特異的に反応することができる。
【００１６】
上記モノクローナル抗体は、ストロムライシン２及びストロムライシン３に対する交差反応性がストロムライシン１に対する反応性の５％以下であることが好ましい。このようなモノクローナル抗体は、ストロムライシン１に対してより特異的である。
【００１７】
また、一実施形態において、配列番号１の一部のアミノ酸配列からなるペプチドと特異的に反応し、かつ、ストロムライシン１と特異的に反応するモノクローナル抗体であって、該アミノ酸配列は配列番号１の４２５番〜４３６番の配列を含み、該ペプチドの長さが１２〜２０アミノ酸残基である、モノクローナル抗体を提供する。上記モノクローナル抗体は、ストロムライシン２及びストロムライシン３と交差反応しないことが好ましい。配列番号１のアミノ酸配列はストロムライシン１のアミノ酸配列を表し、配列番号１の４２５番〜４３６番の配列からなるペプチドは、交差反応性に関与すると考えられる。
【００１８】
また、一実施形態において、ストロムライシン１と特異的に反応するモノクローナル抗体であって、ストロムライシン１をリジルエンドペプチダーゼで分解することによりストロムライシン１に対する反応性を消失する、モノクローナル抗体を提供する。上記モノクローナル抗体は、ストロムライシン２及びストロムライシン３と交差反応しないことが好ましい。リジルエンドペプチダーゼの分解により、反応性を消失するモノクローナル抗体は、ストロムライシン１タンパク質の高次構造を認識して反応する可能性がある。
【００１９】
上記モノクローナル抗体は、免疫染色法に用いることができる。本発明のストロムライシン２及びストロムライシン３と交差反応しないモノクローナル抗体を用いた免疫染色法によれば、試料中にストロムライシン２やストロムライシン３が含まれていてもそれらは染色されず、ストロムライシン１を特異的に可視化することができる。
【００２０】
上記モノクローナル抗体は、ストロムライシン１を定量する、ストロムライシン１の免疫学的測定法に使用できる。本発明のストロムライシン２及びストロムライシン３と交差反応しないモノクローナル抗体を用いた免疫学的測定法によれば、ストロムライシン２及びストロムライシン３が試料中に含まれていてもそれらは検出されないため、ストロムライシン１を確度良く定量することができる。
【００２１】
上記免疫学的測定法は、１種類のモノクローナル抗体を用いる競合型イムノアッセイ、２種類のモノクローナル抗体を用いるサンドイッチ法を代表とするイムノアッセイ、及び２種類以上のモノクローナル抗体を用いる凝集法等による免疫測定法であって、２種類以上のモノクローナル抗体を用いる場合は、使用するモノクローナル抗体のうち少なくとも１種類を本発明のモノクローナル抗体とすることが好ましい。２種類以上のモノクローナル抗体を用いることで、ストロムライシン１に対する特異性がより高くなり、より正確にストロムライシン１を定量することができる。
【００２２】
本発明で使用されるモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５，１９７５等により開示された、ミエローマ細胞を用いての細胞融合技術を利用して得られたモノクローナル抗体であってよい。本発明で使用されるモノクローナル抗体は、次のような工程で作製できる。
１．免疫原性抗原の調製
２．免疫原性抗原による動物の免疫
３．ミエローマ細胞（骨髄腫細胞）の調製
４．抗体産生細胞とミエローマ細胞の細胞融合
５．ハイブリドーマ（融合細胞）の選択及びモノクローン化
６．モノクローナル抗体の製造
７．ストロムライシン２及び３と交差反応しないモノクローナル抗体の選抜
【００２３】
１．免疫原性抗原の調製
抗原としては、例えば、正常ヒト皮膚線維芽細胞ＮＢ１ＲＧＢ（ＲＣＢ２２２）培養上清より、Ｏｂａｔａら，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，２１１，５９−７２，１９９２の方法に従い精製されて得られたストロムライシン１を用いることができる。こうして得られたストロムライシン１は、さらに免疫原性コンジュゲート等にしてもよいが、そのまま適当なアジュバントと混合して動物を免疫するのに使用できる。
【００２４】
また、ストロムライシン１は、それを断片化したものを適当な縮合剤を介して種々の担体タンパク質類と結合させてハプテン−タンパク質の免疫原性コンジュゲートとすることもできる。例えば、天然の細胞から分子クローニングにより得られたＤＮＡ配列又は既に知られたゲノム配列から、酵素を使用して又は化学合成によってＤＮＡ配列又は修飾ＤＮＡ配列を得て、それを微生物、動物、植物、若しくは昆虫等で発現させて得られたリコンビナント抗原として用いることができる。また、それらの情報を利用し、ペプチド化学合成法により得られた、ストロムライシン１に特異的なアミノ酸配列を含むペプチド又は改変ペプチドを用いることもできる。担体タンパク質類と結合させる場合は、担体タンパク質類をまず活性化することができる。こうした活性化にあたり活性化結合基を導入することが挙げられる。活性化結合基としては、（１）活性化エステルあるいは活性化カルボキシ基、例えばニトロフェニルエステル基、ペンタフルオロフェニルエステル基、１−ベンゾトリアゾールエステル基、Ｎ−スクシンイミドエステル基等、（２）活性化ジチオ基、例えば２−ピリジルジチオ基等が挙げられる。担体タンパク質類としては、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ），牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、卵白アルブミン、グロブリン、ポリリジン等のポリペプチド、細菌菌体成分、例えばＢＣＧ等が挙げられる。
【００２５】
２．免疫原性抗原による動物の免疫
動物を免疫するには、例えば村松繁ら編，実験生物学講座１４，免疫生物学，丸善株式会社，昭和６０年、日本生化学会編，続生化学実験講座５，免疫生化学研究法，東京化学同人，１９８６年、日本生化学会編，新生化学実験講座１２，分子免疫学ＩＩＩ，抗原・抗体・補体，東京化学同人，１９９２年等に記載の方法に準じて行うことができる。抗原と共に用いられるアジュバントとしては、例えばフロイント完全アジュバント、リビ（Ｒｉｂｉ）アジュバント、百日咳ワクチン、ＢＣＧ、リピッドＡ、リポソーム、水酸化アルミニウム、シリカ等が挙げられる。免疫は、例えばＢＡＬＢ／ｃ等のマウスをはじめとする動物を使用して行われる。抗原の投与量は、例えばマウスに対して約１〜４００μｇ／動物で、一般には宿主動物の腹腔内や皮下に注射し、以後１〜４週間おきに、好ましくは１〜２週間ごとに腹腔内、皮下、静脈内あるいは筋肉内に追加免疫を２〜１０回程度反復して行う。免疫用のマウスとしてはＢＡＬＢ／ｃ系マウスの他、ＢＡＬＢ／ｃ系マウスと他系マウスとのＦ１マウス等を用いることもできる。必要に応じ、抗体価測定系を調製し、抗体価を測定して動物免疫の程度を確認できる。
【００２６】
３．ミエローマ細胞（骨髄腫細胞）の調製
細胞融合に使用される無限増殖可能株（腫瘍細胞株）としては免疫グロブリンを産生しない細胞株から選ぶことができ、例えばＰ３−ＮＳ−１−Ａｇ４−１（ＮＳ−１、Ｋｏｈｌｅｒら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６，５１１〜５１９，１９７６）、ＳＰ２／０−Ａｇ１４（ＳＰ２、Ｓｈｕｌｍａｎら，Ｎａｔｕｒｅ，２７６，２６９〜２７０，１９７８）、マウスミエローマＭＯＰＣ−２１セルライン由来のＰ３−Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ１（Ｐ３Ｕ１、Ｙｅｌｔｏｎら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，８１，１〜７，１９７８）、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８（Ｘ６３、Ｋｏｈｌｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５〜４９７，１９７５）、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５３（６５３、Ｋｅａｒｎｅｙら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２３，１５４８〜１５５０，１９７９）等を用いることができる。８−アザグアニン耐性のマウスミエローマ細胞株はダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ培地）、ＲＰＭＩ−１６４
０培地等の細胞培地に、例えばペニシリン、アミカシン等の抗生物質、牛胎児血清（ＦＣＳ）等を加え、さらに８−アザグアニン（例えば５〜４５μｇ／ｍｌ）を加えた培地で継代されるが、細胞融合の２〜５日前に正常培地で継代して所要数の細胞株を用意することができる。また使用細胞株は、凍結保存株を約３７℃で完全に解凍したのちＲＰＭＩ−１６４０培地等の正常培地で３回以上洗浄後、正常培地で培養して所要数の細胞株を用意したものであってもよい。
【００２７】
４．抗体産生細胞とミエローマ細胞の細胞融合
上記２．の工程に従い免疫された動物、例えばマウスは最終免疫後、２〜５日後にその脾臓が摘出され、脾細胞懸濁液を得る。脾細胞の他、生体各所のリンパ節細胞を得て、それを細胞融合に使用することもできる。こうして得られた脾細胞懸濁液と上記３．の工程に従い得られたミエローマ細胞株を、例えば最小必須培地（ＭＥＭ培地）、ＤＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ−１６４０培地等の細胞培地中に置き、細胞融合剤、例えばポリエチレングリコールを添加する。細胞融合剤としては、この他各種当該分野で知られたものを用いることができ、例えば不活性化したセンダイウイルス（ＨＶＪ：Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｎｇ  ｖｉｒｕｓ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ）等が挙げられる。好ましくは、例えば３０〜６０％のポリエチレングリコールを０．５〜２ｍｌ加えることができる。そのようなポリエチレングリコールの分子量は１０００〜８０００であることが好ましく、さらに分子量が１０００〜４０００であることが好ましい。融合培地中でのポリエチレングリコールの濃度は、３０〜６０％となるようにすることが好ましい。必要に応じ、例えばジメチルスルホキシド等を少量加え、融合を促進することもできる。融合に使用する脾細胞（リンパ球）：ミエローマ細胞株の割合は、例えば１：１〜２０：１とすることが挙げられるが、より好ましくは４：１〜１０：１とすることができる。融合反応を１〜１０分間行い、次にＲＰＭＩ−１６４０培地等の細胞培地を加える。融合反応処理は複数回行うこともできる。融合反応処理後、遠心等により細胞を分離した後選択用培地に移す。
【００２８】
５．ハイブリドーマ（融合細胞）の選択及びモノクローン化
選択用培地としては、例えばヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含む、ＦＣＳ含有ＭＥＭ培地又はＲＰＭＩ−１６４０培地等の培地、いわゆるＨＡＴ培地が挙げられる。選択培地交換の方法は、一般的には培養プレートに分注した容量と当容量を翌日加え、その後１〜３日ごとにＨＡＴ培地で半量ずつ交換して行うことができるが、適宜これに変更を加えて行うこともできる。また融合後８〜１６日目には、アミノプテリンを除いた、いわゆるＨＴ培地で１〜４日ごとに培地交換をすることができる。フィーダーとして、例えばマウス胸腺細胞を使用することができ、それが好ましい場合がある。ハイブリドーマの増殖のさかんな培養ウェルの培養上清を、例えば放射免疫分析（ＲＩＡ）、酵素免疫分析（ＥＬＩＳＡ）、蛍光免疫分析（ＦＩＡ）等の測定系、又は蛍光惹起細胞分離装置（ＦＡＣＳ）等で、ストロムライシン１若しくはその断片ペプチド又は標識抗マウス抗体を用いて目的抗体を検出し、スクリーニングしたり分離したりする。次に、目的抗体を産生しているハイブリドーマをクローニングする。クローニングは、寒天培地中でコロニーをピックアップするか、あるいは限界希釈法により行うことができる。限界希釈法でクローニングすることがより好ましい。クローニングは複数回行うことが好ましい。
【００２９】
６．モノクローナル抗体の製造
得られたハイブリドーマ株は、ＦＣＳ含有ＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ−１６４０培地等の適当な増殖用培地中で培養し、その培地上清から所望のモノクローナル抗体を得ることが出来る。大量の抗体を得るためには、ハイブリドーマを腹水化することが挙げられる。この場合ミエローマ細胞由来の動物と同系の組織適合性動物の腹腔内に各ハイブリドーマを移植し、増殖させるか、例えばヌードマウス等に各ハイブリドーマを移植し、増殖させ、該動物の腹水中に産生されたモノクローナル抗体を回収して得ることが出来る。ハイブリドーマの移植に先立ち、プリスタン（２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン）等の鉱物油を腹腔内投与した後、ハイブリドーマを増殖させ、腹水を採取すればよい。腹水液はそのまま、あるいは従来公知の方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿法等の塩析、セファデックス等によるゲルろ過法、イオン交換クロマトグラフィー法、電気泳動法、透析、限外ろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、高速液体クロマトグラフィー法等により精製してモノクローナル抗体として用いることができる。好ましくは、モノクローナル抗体を含有する腹水は、硫安分画した後、ＤＥＡＥ−セファロースのような陰イオン交換ゲル及びプロテインＡカラムのようなアフィニティーカラム等で処理し、精製分離処理できる。特に好ましくは抗原又は抗原断片（例えば合成ペプチド、組換え抗原タンパク質あるいはペプチド等、抗体が特異的に認識する部位）を固定化したアフィニティークロマトグラフィー、プロテインＡを固定化したアフィニティークロマトグラフィー等が挙げられる。
【００３０】
７．ストロムライシン２及び３と交差反応しない抗体の選抜
６．で得られたストロムライシン１に対するモノクローナル抗体の中から、ストロムライシン２及びストロムライシン３と交差反応しない抗体を選抜する。選抜は、イムノアッセイ、例えば競合型イムノアッセイ又は非競合型イムノアッセイで行うことができ、ＲＩＡ、ＥＬＩＳＡ等を用いることができ、Ｂ−Ｆ分離を行ってもあるいは行わなくてもできる。好ましくは直接吸着法又はサンドイッチ法によるＥＬＩＳＡが挙げられる。アッセイは直接法でも間接法でもよい。また間接法の変法、例えばＰＡＰ法（ペルオキシダーゼ  アンチペルオキシダーゼ法）、ＡＢＣ法（アビジン  ビオチン  コンプレックス法）、プロテインＡ法等を用いることもできる。
【００３１】
例えば、直接吸着法によるＥＬＩＳＡでは、一定濃度のストロムライシン１を抗原として固相化させる。固相は、後に示す担体を好適に使用することができる。固相化後、抗原抗体反応及び酵素反応に関与しないタンパク質を固相に吸着させてブロッキングすることが好ましい。次に、ストロムライシン１に対するモノクローナル抗体を固相に接触させて、抗原抗体反応を行う。モノクローナル抗体は、酵素で標識されていてもいなくてもよい。反応しなかった余分な抗体は固相を洗浄して除去することができる。モノクローナル抗体に酵素を標識した場合は、酵素の基質を加え、酵素反応の生成物の量を測定する。モノクローナル抗体に酵素を標識していない場合は、モノクローナル抗体と特異的に反応する、酵素で標識済みの抗体（二次抗体）をモノクローナル抗体に作用させる。モノクローナル抗体に結合していない二次抗体を除去し、酵素の基質を加え、酵素反応の生成物の量を測定する。酵素反応生成物の量はストロムライシン１に対する反応性に比例する。
【００３２】
次に、ストロムライシン２及びストロムライシン３各々を抗原として、上記直接吸着法によるＥＬＩＳＡを実施する。酵素反応の生成物の量を測定する。酵素反応生成物の量は各抗原に対する反応性に比例するので、ストロムライシン１を用いたときの酵素反応生成物の量に対する、ストロムライシン２及び３各々を用いたときの酵素反応生成物の量を各々に対する交差反応性とする。ストロムライシン２及び３に対する交差反応性をそれぞれ測定し、両方に交差反応しないモノクローナル抗体を選抜する。
【００３３】
上記直接吸着法のＥＬＩＳＡによるアッセイ以外にも、例えば、サンドイッチ法のＥＬＩＳＡによっても、本発明の、ストロムライシン２及びストロムライシン３と交差反応せずにストロムライシン１と特異的に反応するモノクローナル抗体を選抜することができる。サンドイッチ法では、２種類のストロムライシン１に対する抗体を用いる。その一方を、６．で得られたストロムライシン１に対するモノクローナル抗体とし、もう一方をストロムライシンと特異的に反応することが既知のモノクローナル抗体とする。ストロムライシンと特異的に反応することが既知のモノクローナル抗体としては、例えば、上記特許文献１に記載の、ストロムライシン１に対するモノクローナル抗体を用いることができる。一方のモノクローナル抗体を固相化する。固相化後、抗原抗体反応及び酵素反応に関与しないタンパク質を固相に吸着させてブロッキングすることが好ましい。次に、抗原として一定濃度のストロムライシン１及びもう一方のモノクローナル抗体を加え、抗原抗体反応を行う。モノクローナル抗体は、酵素等で標識されていてよい。反応しなかった余分な抗体は固相を洗浄して除去することができる。酵素の基質を加え、酵素反応の生成物の量を測定する。酵素反応生成物の量はストロムライシン１に対する反応性に比例する。
【００３４】
次に、ストロムライシン２及びストロムライシン３各々を抗原として、上記サンドイッチ法によるＥＬＩＳＡを実施する。酵素反応の生成物の量を測定する。酵素反応生成物の量は各抗原に対する反応性に比例するので、ストロムライシン１を用いたときの酵素反応生成物の量に対する、ストロムライシン２及び３各々を用いたときの酵素反応生成物の量を各々に対する交差反応性とする。ストロムライシン２及び３に対する交差反応性をそれぞれ測定し、両方に交差反応しないモノクローナル抗体を選抜する。
【００３５】
なお、本明細書でいう抗原と「特異的に反応する」又は「反応性を示す」とは、直接法又はサンドイッチ法のいずれかのＥＬＩＳＡによる抗原抗体反応を行なった場合に、例えば、室温で１時間以上又は４℃で一晩抗原抗体反応を行ない、固相を洗浄後、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）等の発色剤を用いて酵素標識による発色反応を行ない、その後硫酸により発色反応を停止するという測定条件下で、Ａ４５０（一次抗体が０ｎｇ／ｍｌのときとの差）が０．０５以上であることをいう。好ましくは、Ａ４５０が０．０８以上であり、より好ましくは０．１以上である。また、本明細書でいう「ストロムライシン２に対する交差反応性」とは、モノクローナル抗体の、ストロムライシン１に対する反応性を１００％としたときのストロムライシン２に対する反応性の大きさのことをいう。「ストロムライシン３に対する交差反応性」も同様とする。交差反応性の大きさは、上記直接吸着法又はサンドイッチ法によるＥＬＩＳＡのどちらによって測定してもよい。本明細書でいう「交差反応しない」とは、直接吸着法又はサンドイッチ法のいずれかのＥＬＩＳＡによって測定した交差反応性が５％以下のときのことをいう。好ましくは、サンドイッチ法によって測定した交差反応性が５％以下である。本発明のモノクローナル抗体のストロムライシン２及び３に対する交差反応性は好ましくは２．４％以下であり、より好ましくは１．３％以下である。
【００３６】
８．ストロムライシン１の反応部位の特定
上記のようにして得られた、ストロムライシン１と特異的に反応し、ストロムライシン２及びストロムライシン３と交差反応しないモノクローナル抗体は、ストロムライシン１の特定の反応部位と反応する。このような反応部位を同定し、この反応部位と反応するモノクローナル抗体を１．〜６．で説明した方法で作製することにより、作製されたモノクローナル抗体の交差反応性を調節することが可能となる。反応部位は、以下のようにして同定することができる。酵素によってストロムライシン１をペプチドに分解する。得られたペプチドをクロマトグラフィー等従来公知の方法によって分画し、７．で得られたモノクローナル抗体と各画分のペプチドとを反応させれば、反応性の高い画分にストロムライシン１の反応部位であるペプチドが含まれている。該反応性の高い画分に含まれるペプチドは、従来公知の方法を用いてさらに精製することができ、公知のアミノ酸配列分析法により、反応部位のアミノ酸配列を決定することができる。
【００３７】
９．ストロムライシン１の一部からなるペプチドと反応性を示すモノクローナル抗体の選抜
また、本発明は、配列番号１の一部のアミノ酸配列からなるペプチドと特異的に反応し、かつ、ストロムライシン１と特異的に反応するモノクローナル抗体であって、該アミノ酸配列は配列番号１の４２５番〜４３６番の配列を含み、該ペプチドの長さが１２〜２０アミノ酸残基である、モノクローナル抗体を提供する。配列番号１のアミノ酸配列はストロムライシン１タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号１の４２５番〜４３６番の配列からなるペプチドは交差反応性に関与すると考えられる。上記モノクローナル抗体は、６．で得られたストロムライシン１に対するモノクローナル抗体の中から、配列番号１の４２５番〜４３６番の配列からなるペプチドと反応性を示すモノクローナル抗体を選抜することによって得ることができる。選抜は、７．で示したアッセイ法によってすることができ、例えば、７．に示した直接吸着法によるＥＬＩＳＡにおいて、ストロムライシン１の代わりに配列番号１の４２５番〜４３６番の配列からなるペプチドを抗原として用いればよい。上記モノクローナル抗体は、ストロムライシン２及びストロムライシン３と交差反応しないことが好ましい。ストロムライシン２及びストロムライシン３と交差反応しないモノクローナル抗体は、７．に示す方法により選抜することができる。
【００３８】
１０．ストロムライシン１の分解により反応性を消失するモノクローナル抗体の選抜
また、本発明はストロムライシン１に特異的に反応するモノクローナル抗体であって、ストロムライシン１をリジルエンドペプチダーゼで分解することによりストロムライシン１に対する反応性を消失する、モノクローナル抗体を提供する。このようなモノクローナル抗体は、ストロムライシン１タンパク質の二次構造又は三次構造等の立体構造を認識するモノクローナル抗体である。「ストロムライシン１を分解することによりストロムライシン１に対する反応性を消失する」とは、ストロムライシン１分解後の反応性が分解前の反応性より低いことをいう。このようなモノクローナル抗体は、６．で得られたストロムライシン１に対するモノクローナル抗体の中から、以下のようにして選抜することによって得ることができる。酵素によってストロムライシン１をペプチドに分解する。ストロムライシン１と特異的に反応するモノクローナル抗体の、ストロムライシン１に対する反応性を、分解前と分解後で比較し、ストロムライシン１分解後の反応性が分解前の反応性より低いモノクローナル抗体を選抜する。分解後の反応性がより低いものほど、ストロムライシン１の一次構造によらず、ストロムライシン１の立体構造を認識してストロムライシン１と反応するモノクローナル抗体である。好ましくは、分解前のストロムライシン１に対する反応性を１００％としたとき、分解後の反応性が１０％以下である。反応性は７．に示す方法により直接吸着法又はサンドイッチ法のいずれかのＥＬＩＳＡによって測定することができ、好ましくは、直接吸着法のＥＬＩＳＡによって測定した分解後の反応性が分解前の反応性の１０％以下である。より好ましくは、８．０％以下であり、さらに好ましくは７．３％以下である。
【００３９】
こうして得られたモノクローナル抗体は、市販のアイソタイプ特異的抗マウスＩｇ抗体、例えばアイソタイプ特異的ウサギ抗マウスＩｇ抗体等を用いてその抗体構成鎖の重鎖及び軽鎖のタイプについて調べることができる。
【００４０】
得られたモノクローナル抗体をコードする塩基配列を決定し、遺伝子組換え技術により抗体を作製することも可能である。さらにこれら抗体をトリプシン、パパイン、ペプシン等の酵素により処理して、場合により還元して得られるＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２といった抗体フラグメントにして使用してもよい。標識する抗体としては、ＩｇＧ画分、例えば抗体含有物を硫安分画した後、ＤＥＡＥ−セファロースのような陰イオン交換ゲルで処理して得られるＩｇＧ画分等、更にはペプシン消化後還元して得られる特異的結合部Ｆａｂ’等を用いることができる。これらの場合の標識の例としては、下記するように酵素（ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼあるいはβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ等）、化学物質、蛍光物質あるいは放射性同位元素等がある。
【００４１】
本発明の、ストロムライシン２及び３と交差反応せず、ストロムライシン１と特異的に反応するモノクローナル抗体を利用して、免疫染色法を行うことができる。本発明の免疫染色法は、本発明のモノクローナル抗体と試料中の抗原とを反応させ抗原抗体複合体を形成させる工程、及び、該抗原抗体複合体を可視化する工程とからなる。抗原抗体複合体は、抗体に予め標識を付与し、抗原抗体反応の後に標識を変化させ、その変化を信号として検知し、可視化することができる。本発明の免疫染色法は、抗原に直接反応する抗体（一次抗体）を標識する直接法でもよいし、標識していない一次抗体を認識する別の抗体（二次抗体）を標識する間接法でもよい。また間接法の変法、例えばＰＡＰ法（ペルオキシダーゼ  アンチペルオキシダーゼ法）、ＡＢＣ法（アビジン  ビオチン  コンプレックス法）、プロテインＡ法等を用いることもできる。また、試料を電気泳動し、電気泳動したものを膜に転移させ、その膜を免疫染色することもできる。本発明のモノクローナル抗体を用いた免疫染色法によれば、試料中にストロムライシン２やストロムライシン３が混在していても、ストロムライシン１のみから特異的に信号が検出され、ストロムライシン１の存在及び局在を可視化できる。また、本発明のモノクローナル抗体を利用して、免疫細胞染色又は免疫組織染色も行うことができる。
【００４２】
本発明のモノクローナル抗体は、免疫学的測定法に利用することができる。本発明の免疫学的測定法は、本発明のモノクローナル抗体と試料中の抗原とを反応させて抗原抗体複合体を形成させる工程、形成された抗原抗体複合体を検知する工程、及び、検知された抗原抗体複合体の量から試料中の抗原の量を測定する工程とからなる。抗原抗体複合体は、抗原抗体複合体の濁度として検知することができ、また、抗体に予め標識を付与し、抗原抗体反応の後に標識を変化させ、その変化を信号として検知することができる。免疫学的測定法は、イムノアッセイ、例えば競合型イムノアッセイ又は非競合型イムノアッセイで行うことができ、ＲＩＡ、ＥＬＩＳＡ、凝集法、比濁法、イムノクロマト法、ウェスタンブロット法等を用いることができ、Ｂ−Ｆ分離を行ってもあるいは行わないでもできる。免疫学的測定法は抗原に直接反応する抗体（一次抗体）を標識する直接法でもよいし、標識していない一次抗体を認識する別の抗体（二次抗体）を標識する間接法でもよい。また間接法の変法、例えばＰＡＰ法（ペルオキシダーゼ  アンチペルオキシダーゼ法）、ＡＢＣ法（アビジン  ビオチン  コンプレックス法）、プロテインＡ法等を用いることもできる。
【００４３】
上記直接法による競合型イムノアッセイに用いるモノクローナル抗体として、本発明のモノクローナル抗体を用いる。サンドイッチ法で２種類のモノクローナル抗体を用いる場合は、少なくとも一方を本発明のモノクローナル抗体とする。もう一方は、ストロムライシン１を認識する抗体であれば特に限定されない。種類が異なるのであれば、２種類とも本発明の、ストロムライシン２及び３と交差反応せず、ストロムライシン１と特異的に反応するモノクローナル抗体を用いてもよい。また、上記２種類のモノクローナル抗体のうちの一方を標識物で標識された可溶性の抗体とし、もう一方を固相化抗体としてもよい。凝集法等による免疫測定法で用いる２種類以上のモノクローナル抗体のうち、少なくとも１種類を本発明のモノクローナル抗体とする。種類が異なるのであれば、全て本発明のモノクローナル抗体を用いてもよい。また、少なくとも１種類が本発明のモノクローナル抗体であれば、３種類以上の抗体を使用してもよい。
【００４４】
上記免疫学的測定法では、例えば、既知の濃度のストロムライシン１を含む標準液を用いて濃度標準曲線を作成し、その濃度標準曲線から、試料中のストロムライシン１の濃度を測定し、ストロムライシン１の定量をすることができる。本発明の免疫学的測定法によれば、試料中にストロムライシン２又はストロムライシン３が混在していてもそれらを検出せず、ストロムライシン１を特異的に定量することができる。
【００４５】
本発明の免疫染色法及び免疫学的測定法では、酵素等で標識したモノクローナル抗体と、担体に結合された抗体とを順次反応させることもできるし、同時に反応させることもできる。また、本発明のモノクローナル抗体を酵素等で標識して、免疫染色用試薬又は免疫学的測定用試薬としてもよい。凝集法においては、抗原及び２種類以上の非標識モノクローナル抗体を同時又は順次反応させることができる。抗体及び試料を加える順序は選ばれた担体系の型により異なる。担体は例えば、後述するものの中から適宜選定できる。感作されたプラスチック等のビーズを用いた場合には、酵素等で標識したモノクローナル抗体を、測定すべき物質を含む検体試料と共に適当な試験管中に一緒に入れ、その後該感作されたプラスチック等のビーズを加えることにより反応を行うことができる。反応にあたっては至適ｐＨ、例えばｐＨ約４〜９に保つように適当な緩衝液中で行うことができる。特に適切な緩衝剤としては、例えばアセテート緩衝剤、クエン酸塩緩衝剤、フォスフェート緩衝剤、トリス緩衝剤、トリエタノールアミン緩衝剤、ボレート緩衝剤、グリシン緩衝剤、炭酸塩緩衝剤、トリス−塩酸緩衝剤等が挙げられる。緩衝剤は互いに任意の割合で混合して用いることができる。抗原抗体反応は約０℃〜６０℃の間の温度で行うことが好ましい。
【００４６】
本発明の免疫染色法及び免疫学的測定法において、本発明のモノクローナル抗体、その他の抗体、及び抗原とのインキュベーション処理は、平衡に達するまで行うことができるが、抗原抗体反応の平衡が達成されるよりもずっと早い時点で反応を止めることができ、液相又は固相のいずれかにおける濁度や酵素等の標識の存在の程度を測ることができる。測定操作は、自動化された測定装置を用いて行うことが可能であり、比色計、ルミネセンスディテクター、ホトディテクター等を使用して、濁度や、基質が酵素の作用で変換されて生ずる信号を検知して測定することもできる。抗原抗体反応においては、それぞれ用いられる試薬、測定すべき物質、さらには酵素等の標識を安定化したり、抗原抗体反応自体を安定化するように適切な手段を講じたりすることができる。さらに、非特異的な反応を除去し、阻害的に働く影響を減らしたり、あるいは測定反応を活性化したりするため、タンパク質、安定化剤、界面活性化剤、キレート化剤等をインキュベーション溶液中に加えることもできる。当該分野で普通に採用されているか、あるいは当業者に知られている、非特異的結合反応を防ぐためのブロッキング処理を施してもよく、例えば、哺乳動物等の正常血清タンパク質、アルブミン、スキムミルク、乳発酵物質、コラーゲン、ゼラチン等で処理することができる。非特異的結合反応を防ぐ目的である限り、それらの方法は特に限定されず用いることが出来る。例えば洗浄、撹拌、振とう、ろ過あるいは抗原の予備抽出等は、特定の状況のもとで適宜採用される。特定の試薬、緩衝液等の濃度、温度あるいはインキュベーション処理時間等のその他の測定条件は、試料中の抗原の濃度、試料の性質等の要素に従い変えることができる。当業者は通常の実験法を用いながら、各測定に対して有効な最適の条件を適宜選定して、測定を行うことが出来る。
【００４７】
抗原あるいは抗体を固相化できる多くの担体が知られており、本発明ではそれらから適宜選んで用いることができる。特に好適に使用されるものとしては、例えばガラス、例えば活性化ガラス、多孔質ガラス、シリカゲル、シリカ−アルミナ、アルミナ、磁化鉄、磁化合金等の無機材料、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリフッ化ビニリデン、ポリ酢酸ビニル、ポリメタクリレート、ポリスチレン、スチレン−ブタジエン共重合体、ポリアクリルアミド、架橋ポリアクリルアミド、スチレン−メタクリレート共重合体、ポリグリシジルメタクリレート、アクロレイン−エチレングリコールジメタクリレート共重合体等、架橋化アルブミン、コラーゲン、ゼラチン、デキストラン、アガロース、架橋アガロース、セルロース、微結晶セルロース、カルボキシメチルセルロース、セルロースアセテート等の天然又は変成セルロース、架橋デキストラン、ナイロン等のポリアミド、ポリウレタン、ポリエポキシ樹脂等の有機高分子物質、さらにそれらを乳化重合して得られたもの、細胞、赤血球等で、必要に応じ、シランカップリング剤等で官能性基を導入してあるものが挙げられる。
【００４８】
さらに、ろ紙、ビーズ、試験容器の内壁、例えば試験管、タイタープレート、タイターウェル、ガラスセル、合成樹脂製セル等の合成材料からなるセル、ガラス棒、合成材料からなる棒、末端を太くしたりあるいは細くしたりした棒、末端に丸い突起をつけたりあるいは扁平な突起をつけた棒、薄板状にした棒等の固体物質（物体）の表面等が挙げられる。これら担体へは、抗体を結合させることができ、好ましくは本発明で得られるストロムライシン１に対し特異的に結合するモノクローナル抗体を結合させることができる。担体とこれら抗原抗体反応に関与するものとの結合は、吸着等の物理的な手法、あるいは縮合剤等を用いたり、活性化されたもの等を用いたりする化学的な方法、さらには相互の化学的な結合反応を利用した手法等により行うことが出来る。
【００４９】
標識としては、酵素、酵素基質、酵素インヒビター、補欠分子類、補酵素、酵素前駆体、アポ酵素、蛍光物質、色素物質、化学ルミネッセンス化合物、発光物質、発色物質、磁気物質、金属粒子、例えば金コロイド等、放射性物質等を挙げることができる。酵素としては、脱水素酵素、還元酵素、酸化酵素等の酸化還元酵素、例えばアミノ基、カルボキシル基、メチル基、アシル基、リン酸基等を転移するのを触媒する転移酵素、例えばエステル結合、グリコシド結合、エーテル結合、ペプチド結合等を加水分解する加水分解酵素、リアーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ等を挙げることができる。酵素は複数の酵素を複合的に用いて検知に利用することもできる。例えば酵素的サイクリングを利用することもできる。
【００５０】
代表的な酵素標識としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）等のペルオキシダーゼ、大腸菌β−Ｄ−ガラクトシダーゼ等のガラクトシダーゼ、マレエートデヒドロゲナーゼ、グルコース−６−フォスフェートデヒドロゲナーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコアミラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、カタラーゼ、ウシ小腸アルカリホスファターゼ、大腸菌アルカリホスファターゼ等のアルカリホスファターゼ等が挙げられる。アルカリホスファターゼを用いた場合、４−メチルウンベリフェリルフォスフェート等のウンベリフェロン誘導体、ニトロフェニルホスフェート等のリン酸化フェノール誘導体、ＮＡＤＰを利用した酵素的サイクリング系、ルシフェリン誘導体、ジオキセタン誘導体等の基質を使用したりして、生ずる蛍光、発光等により測定できる。ルシフェリン、ルシフェラーゼ系を利用したりすることもできる。カタラーゼを用いた場合、過酸化水素と反応して酸素を生成するので、その酸素を電極等で検知することもできる。電極としてはガラス電極、難溶性塩膜を用いるイオン電極、液膜型電極、高分子膜電極等であることもできる。酵素標識は、ビオチン標識体と酵素標識アビジン（ストレプトアビジン）に置き換えることも可能である。標識は、複数の異なった種類の標識を使用することもできる。こうした場合、複数の測定を連続的に、あるいは非連続的に、そして同時にあるいは別々に行うことを可能にすることもできる。
【００５１】
標識を検知するための信号の形成に、４−ヒドロキシフェニル酢酸、１，２−フェニレンジアミン、テトラメチルベンジジン等と西洋ワサビペルオキシダーゼ、ウンベリフェリルガラクトシド、ニトロフェニルガラクトシド等とβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ等の酵素試薬の組み合わせも利用でき、ヒドロキノン、ヒドロキシベンゾキノン、ヒドロキシアントラキノン等のキノール化合物、リポ酸、グルタチオン等のチオール化合物、フェノール誘導体、フェロセン誘導体等を酵素等の作用により形成しうる化合物が使用できる。
【００５２】
蛍光物質又は化学ルミネッセンス化合物としては、フルオレセインイソチオシアネート、例えばローダミンＢイソチオシアネート、テトラメチルローダミンイソチオシアネート等のローダミン誘導体、ダンシルクロリド、ダンシルフルオリド、フルオレスカミン、フィコビリプロテイン、アクリジニウム塩、ルミフェリン、ルシフェラーゼ、エクォリン等のルミノール、イミダゾール、シュウ酸エステル、希土類キレート化合物、クマリン誘導体等が挙げられる。標識するには、チオール基とマレイミド基の反応、ピリジルジスルフィド基とチオール基の反応、アミノ基とアルデヒド基の反応等を利用して行うことができ、公知の方法あるいは当該分野の当業者が容易になしうる方法、さらにはそれらを修飾した方法の中から適宜選択して適用できる。また免疫原性コンジュゲート作製に使用されることのできる縮合剤、担体との結合に使用されることのできる縮合剤等を用いることができる。
【００５３】
縮合剤としては、例えばグルタルアルデヒド、ヘキサメチレンジイソシアネート、ヘキサメチレンジイソチオシアネート、Ｎ，Ｎ’−ポリメチレンビスヨードアセトアミド、Ｎ，Ｎ’−エチレンビスマレイミド、エチレングリコールビススクシニミジルスクシネート、ビスジアゾベンジジン、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド、スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、Ｎ−スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、Ｎ−スルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、Ｎ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート、Ｎ−スクシンイミジル４−（１−マレイミドフェニル）ブチレート、Ｎ−（ε−マレイミドカプロイルオキシ）コハク酸イミド（ＥＭＣＳ）、イミノチオラン、Ｓ−アセチルメルカプトコハク酸無水物、メチル−３−（４’−ジチオピリジル）プロピオンイミデート、メチル−４−メルカプトブチリルイミデート、メチル−３−メルカプトプロピオンイミデート、Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルメルカプトアセテートが挙げられる。
【００５４】
本発明の免疫学的測定方法の対象となる試料としては、あらゆる形態の溶液やコロイド溶液等が挙げられるが、好ましくは生物由来の流体試料、例えば血液、血漿、血清、関節液、脳脊髄液、唾液、羊水、尿、その他の体液、細胞培養液、組織培養液、生検検体、例えば細胞、組織、臓器、腫瘍組織等が挙げられる。上記試料は患者における慢性関節リウマチの検出のために用いることができる。特に好ましくは血漿、血清、関節液等が挙げられる。本発明のモノクローナル抗体を用いた免疫染色法では、生検検体、例えば細胞、組織、臓器、腫瘍組織が好適に用いられる。上記試料に対し、本発明のモノクローナル抗体を慢性関節リウマチのマーカーとして使用し、免疫細胞染色法や免疫組織染色法を行うことができる。上記試料は染色前に必要に応じ固定化することができる。固定化には当該分野で広く使用されているものあるいはそれから誘導されたものを使用できる。例えばペリオデイト−リジン−パラホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、ブアン、ホルマリン、パラホルムアルデヒド、ザンボニー、アクロレイン等が使用できる。またパラフィン等で固定化することもできる。
【００５５】
本発明はまた、本発明のモノクローナル抗体を含むことを特徴とする、免疫学的測定用試薬を提供する。上記免疫学的測定用試薬によれば、簡便かつ感度よく、ストロムライシン１を特異的に検出することができる。また、上記試薬は患者における慢性関節リウマチの検出のために用いることができる。
【００５６】
本発明はさらに、本発明の免疫染色法又は免疫学的測定法で用いられる前述の物質を１又はそれ以上を充填した１又はそれ以上の容器を含む、医薬又は臨床検査分野あるいは分析測定分野で許容されるパック及びキットにも関する。パック及びキットには、このような（単一あるいは複数の）容器と一緒に、医薬、検査薬又は生物学的産物の製造、使用又は販売を規制する政府機関により指示された形態の注意書（文書）であって、ヒトに関連した製品の製造、使用又は販売に関する該政府機関の承認を示している注意書（添付文書）が添付されていてよい。測定試薬又はキットを本発明の免疫染色法又は免疫学的測定法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて、本発明の測定対象物質あるいはそれと実質的に同等な活性を有する物質に関連した測定系を構築すればよい。
【実施例】
【００５７】
以下、実施例により、本発明によるモノクローナル抗体及びその製造方法並びに該モノクローナル抗体を用いた免疫染色法、さらに該モノクローナル抗体を用いてストロムライシン１を免疫学的に定量する方法について具体的に説明する。ただし、本発明はこれらの例示に限定されるものではない。
【００５８】
（実施例１  抗原及び標準品の作製）
以下のように、Ｏｂａｔａら，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，２１１，５９−７２，１９９２に記載の方法に従って、正常ヒト皮膚線維芽細胞ＮＢ１ＲＧＢ（ＲＣＢ２２２）培養上清より、ストロムライシン１を精製した。ＮＢ１ＲＧＢ細胞を、１０％ウシ胎児血清、１４ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１．４ｇ／ｌ  ＮａＨＣＯ３含有ＲＩＴＣ８０−７基礎培地（ｐＨ７．２）中、５％ＣＯ２存在下、３７℃でコンフルエントまで培養した。細胞を１００ｍｌのＲＩＴＣ８０−７基礎培地で洗浄後、２ｇ／ｌラクトアルブミン水解物及び１００００Ｕ／ｌインターロイキン１α含有無血清ＲＩＴＣ８０−７基礎培地３００ｍｌ中で培養し、その上清を回収した。
【００５９】
上記上清を、セファロース４Ｂカラムに供した。このセファロース４Ｂカラムには、ストロムライシン１に対するモノクローナル抗体５５−３Ｇ３（国際寄託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−３７４４、寄託日：平成３年６月１２日、寄託機関：独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター、茨城県つくば市東１−１−１  つくばセンター中央第６）を、マニュアル記載の操作法に従ってＣＮＢｒ−活性化セファロース（ＧＥヘルスケア社）に予め結合させたものが充填してある。上清を供したカラムを０．１Ｍ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２及び５ｇ／ｌ  ＣＨＡＰＳ含有３０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄し、カラムに結合したタンパク質を３Ｍ  ＫＳＣＮで溶出した。次に、０．４Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＣａＣｌ２及び０．５ｇ／ｌ  Ｂｒｉｊ  ３５含有５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したセファデックスＧ−２５カラム（ＧＥヘルスケア社）に、上記溶出液を供した。ボイドボリューム画分を集め、セファデックスＧ−２５カラムを平衡化したのと同じ緩衝液で平衡化したコンカナバリンＡ−セファロースカラム（ＧＥヘルスケア社）に供し、カラムに結合しなかったタンパク質を集めた。最後に、ウルトロゲルＡｃＡ４４カラム（ＰＡＬＬ社）に、コンカナバリンＡカラムに結合しなかったタンパク質画分を供し、クロマト分画した。
【００６０】
タンパク質の純度は、ドデシル硫酸ポリアクリルアミドゲル電気泳動により確認した。精製した酵素は均一であり、分子量５７ｋＤａを示した。この精製酵素を抗原及び標準品とした。ストロムライシン２はＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製のものを、ストロムライシン３はＡｂｃａｍ社製のものを標準品として使用した。
【００６１】
（実施例２  モノクローナル抗体の調製）
以下のように、Ｏｂａｔａら，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，２１１，５９−７２，１９９２に記載の方法に従って、実施例１で精製したストロムライシン１を抗原としてモノクローナル抗体を調製した。
【００６２】
（ａ）ストロムライシン１による動物の免疫
実施例１に記載の方法により調製したストロムライシン１を４４．６μｇ、等重量のフロイント完全アジュバントと共に６週齢ＢＡＬＢ／ｃ雌マウス２匹に腹腔内投与し初回免疫とした。その後１９日目に０．４ＭＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＣａＣｌ２及び０．５ｇ／ｌ  Ｂｒｉｊ３５含有５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解した４０．４μｇのストロムライシン１で追加免疫した。最終免疫として５５日目に４３．２μｇのストロムライシン１で免疫した。最終免疫から３日後にマウス脾臓を取り出し脾臓細胞を調製した。
【００６３】
（ｂ）抗体産生細胞とミエローマ細胞の細胞融合
以下の材料及び方法を用いた。
ＲＰＭＩ  １６４０培地：ＲＰＭＩ  １６４０（ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製）に２４ｍＭ重炭酸ナトリウム、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、５０Ｕ／ｍｌペニシリンＧカリウム、５０μｇ／ｍｌ硫酸ストレプトマイシン及び１００μｇ／ｍｌ硫酸アミカシンを加え、ドライアイスでｐＨを７．２にし、０．２２μｍミリポアフィルターで除菌ろ過した。
ＮＳ−１培地：上記ＲＰＭＩ−１６４０培地に除菌ろ過したＦＢＳ（ＪＲＨＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製）を１５％（ｖ／ｖ）の濃度に加える。
ＰＥＧ４０００溶液：ＲＰＭＩ−１６４０培地にポリエチレングリコール４０００（ＰＥＧ４０００，Ｍｅｒｃｋ  ａｎｄ  ＣＯ．，Ｉｎｃ．製）５０％（ｗ／ｗ）無血清溶液を調製した。
【００６４】
脾臓細胞と８−アザグアニン耐性ミエローマ細胞ＳＰ２（ＳＰ２／０−Ａｇ１４）との融合は、Ｏｉら，Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，３５１−３７１，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．，１９８０の方法に準じて行った。（ａ）で調製した脾臓細胞（生細胞率１００％）とミエローマ細胞（生細胞率１００％）とを５：１の割合で融合した。脾臓細胞とミエローマ細胞をそれぞれ前記ＲＰＭＩ−１６４０培地で洗浄した。次に、それぞれ同じ培地に懸濁させた脾臓細胞３．２×１０８個とミエローマ細胞６．４×１０７個を混合した。次に、１０００ｒ．ｐ．ｍ．で１０分間の遠心分離により細胞を沈殿させ上清を完全に吸引除去した。沈殿した細胞に３７℃に加温したＰＥＧ４０００溶液２．１ｍｌを穏やかに攪拌しながら１分間で滴下し、１分間攪拌し細胞を再懸濁、分散させた。次に３７℃に加温したＲＰＭＩ−１６４０培地４．２ｍｌを２分間で滴下した。同培地１４．７ｍｌを２〜３分間で常に攪拌しながら滴下し、細胞を分散させた。これを１０００ｒ．ｐ．ｍ．で７分間遠心分離し上清を完全に吸引除去した。次にこの沈殿細胞に３７℃に加温したＮＳ−１培地２１ｍｌを速やかに加え、大きい細胞塊を注意深くピペッティングで分散させた。さらに同培地４２ｍｌを加えて希釈しポリスチレン製９６穴マイクロウェル（岩城硝子製）にウェルあたり６×１０５個／０．１ｍｌの細胞を加えた。このマイクロウェルを７％ＣＯ２／９３％空気中で温度３７℃、湿度１００％下で培養した。
【００６５】
（ｃ）選択培地によるハイブリドーマの選択的増殖
使用する培地は以下のとおりである。
ＨＡＴ培地：前記実施例２（ｂ）で述べたＮＳ−１培地にさらにヒポキサンチン（１００μＭ）、アミノプテリン（０．４μＭ）及びチミジン（１６μＭ）を加えた。
ＨＴ培地：アミノプテリンを除去した以外は上記ＨＡＴ培地と同一組成のものである。
【００６６】
前記（ｂ）の培養開始後翌日（１日目）、細胞にピペットでＨＡＴ培地２滴（約０．１ｍｌ）を加えた。２、３、５及び８日目に培地の半分（約０．１ｍｌ）を新しいＨＡＴ培地で置き換えた。１１日目にハイブリドーマの充分な生育が観察された全ウェルについて、以下（ｄ）に記載のＥＬＩＳＡにより陽性ウェルを調べた。
【００６７】
（ｄ）細胞融合直後のＥＬＩＳＡによる抗ストロムライシン１抗体産生ハイブリドーマの選択
以下のようにして、直接吸着法によるＥＬＩＳＡを行った。９６穴マイクロウェルプレート（Ｎｕｎｃ社）に１００ｎｇ／ウェルになるように０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で希釈したストロムライシン１を抗原としてコートした。４℃で一晩以上放置後、コーティング液を吸引し、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ（ｐＨ７．２）でマイクロウェルプレートを洗浄した。確認したいハイブリドーマの培養上清（一次抗体）を１００μｌ／ウェル加えて、室温で約１時間インキュベート（静置）した。洗浄後、二次抗体としてヤギ抗マウスＩｇ（Ｇ＋Ｍ＋Ａ）ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ−ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）（ＣＡＰＰＥＬ社）をブロッキング液で１／１００００に希釈したものを１００μｌ／ウェル加え、室温で約１時間インキュベート（静置）した。洗浄後、基質である過酸化水素とテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を１００μｌ／ウェル加え、室温で約２０分反応させ、１Ｍ硫酸を１００μｌ／ウェル加えて反応を停止させ、マイクロプレートリーダー（ＴＯＳＯＨ、ＭＰＲ  Ａ４）にて測定波長４５０ｎｍでの吸光度を測定した。ストロムライシン１との反応が陽性を示した１６ウェルについて、細胞の凍結及び復元を実施し、限界希釈法によるクローニングを実施した。
【００６８】
（ｅ）クローニング
以下の材料及び方法を用いた。
ＲＰＭＩ  １６４０培地−（２）：ＲＰＭＩ１６４０  ＭＥＤＩＵＭ（ＳＩＧＭＡ  Ｒ８７５８）５００ｍｌ（１本）に、ＦＯＥＴＡＬ  ＢＯＶＩＮＥ  ＳＥＲＵＭ  （ＳＩＧＭＡ  Ｆ９４２３）５０ｍｌ、ＰＥＮＩＣＩＬＬＩＮ−ＳＴＲＥＰＴＯＭＹＣＩＮ  ＳＯＬＵＴＩＯＮ（ＳＩＧＭＡ  Ｐ０７８１）２．５ｍｌを添加した。
ＢｒｉＣｌｏｎｅ含有ＲＰＭＩ  １６４０培地；ＲＰＭＩ  １６４０培地−（２）にＢｒｉＣｌｏｎｅ（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｍｅｄｉｕｍ）（ＮＩＣＢ社製）を５％になるように添加した。
【００６９】
凍結細胞をＲＰＭＩ  １６４０培地−（２）中に復元させ、ＢｒｉＣｌｏｎｅ含有ＲＰＭＩ  １６４０培地を用いて、９６穴マイクロウェルの３６ウェル、３６ウェル及び２４ウェルにウェル当りそれぞれ５個、１個及び０．５個のハイブリドーマを加えた。５日目に全ウェルに約０．１ｍｌのＲＰＭＩ  １６４０培地−（２）を追加した。クローニング開始後、１１日目から１４日目でハイブリドーマの充分な生育が認められ、それらについて下記（ｆ）に記すＥＬＩＳＡを行った。テストした全ウェルが陽性でない場合、抗体陽性ウェル中のコロニー数を確認し、ウェル中に１コロニー（ない場合はできるだけコロニー数の少ないウェル）を１〜３個選び、再クローニングを行った。その結果、表１に示すように、ストロムライシン１に対するモノクローナル抗体産生細胞を１２クローン得た。
【００７０】
（ｆ）クローニング時のＥＬＩＳＡによる抗ストロムライシン１抗体産生ハイブリドーマの選択
以下のようにして、直接吸着法によるＥＬＩＳＡを行った。直接吸着法によるＥＬＩＳＡでは、９６穴マイクロウェルプレート（Ｎｕｎｃ社）に５０ｎｇ／ウェルになるように０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で希釈したストロムライシン１を抗原としてコートした。４℃で一晩以上放置後、コーティング液を吸引し、２００μｌ／ウェルのブロッキング液（１％ＢＳＡ及び０．１Ｍ  ＮａＣｌ含有０．０１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．０）を用い、室温で１時間以上ブロッキングを行った。０．１％Ｔｗｅｅｎ２０及び０．１Ｍ  ＮａＣｌ含有０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）でマイクロウェルプレートを洗浄後、確認したいハイブリドーマの培養上清（一次抗体）を１００μｌ／ウェル加えて、室温で約１時間インキュベート（静置）した。洗浄後、二次抗体としてヤギ抗マウスＩｇ（Ｇ＋Ｍ＋Ａ）ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ−ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）（ＣＡＰＰＥＬ社）をブロッキング液で１／３０００に希釈したものを１００μｌ／ウェル加え、室温で約１時間インキュベート（静置）した。洗浄後、ＴＭＢ  Ｏｎｅ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ＨＲＰ  Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  （ＢｉｏＦＸ社，  Ｐｒｏｄｕｃｔ＃  ＴＭＢＷ−１０００−０１）を１００μｌ／ウェル加え、室温で約５〜１０分反応させた。１Ｍ硫酸を１００μｌ／ウェル加えて反応を停止させ、マイクロプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ  ＳＰＥＣＴＲＡ）にて測定波長４５０ｎｍでの吸光度を測定した。
【００７１】
（実施例３  モノクローナル抗体のサブクラスの同定）
実施例２（ｄ）記載のＥＬＩＳＡに従って、以下のようにモノクローナル抗体のサブクラスを同定した。実施例２（ｄ）に記載の、ストロムライシン１をコートした９６穴マイクロウェルのブロッキングまでの操作を行った。０．１％Ｔｗｅｅｎ２０及び０．１Ｍ  ＮａＣｌ含有０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄後、各モノクローナル抗体産生ハイブリドーマの培養上清を１００μｌ／ウェル加え、室温で約１時間インキュベート（静置）した。洗浄後、アイソタイプ特異的ウサギ抗マウスＩｇ抗体（Ｍｏｕｓｅ  ＭｏｎｏＡｂ−ＩＤ  Ｋｉｔ、Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を５０μｌ／ウェル加え、室温で約１時間インキュベート（静置）した。更に洗浄後、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体をブロッキング液で１／５０に希釈した溶液を５０μｌ／ウェル加え、室温で約１時間インキュベート（静置）した。洗浄後、ＴＭＢ  Ｏｎｅ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ＨＲＰ  Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  （ＢｉｏＦＸ社、Ｐｒｏｄｕｃｔ＃ＴＭＢＷ−１０００−０１）を１００μｌ／ウェル加えて発色させ、１Ｍ硫酸を１００μｌ／ウェル加えて反応を停止させ、測定波長４５０ｎｍでの吸光度を測定した。その結果、表１に示すように、得られたモノクローナル抗体は、γ１／κが４個、γ２ｂ／κが３個、μ／κが４個、α／κが１個であった。
【００７２】
【表１】
2014111604.tif 000002
【００７３】
（実施例４  培養上清を用いたストロムライシン２及び３との反応性）
実施例２で得られた１２種類のモノクローナル抗体産生ハイブリドーマの培養上清に対し、抗原としてストロムライシン１の代わりにストロムライシン２又はストロムライシン３を用いて、実施例２（ｄ）の方法に従ってＥＬＩＳＡを行った。ストロムライシン１の吸光値を１００％としたときの、ストロムライシン２及び３の吸光値の割合を表２に示す。２９６−２９Ｃ１、２９６−１２Ｈ８、２９６−７Ｂ１０の３クローンの抗体は、同培養上清のストロムライシン１に対する反応性を１００％とすると、ストロムライシン２に対しての反応性が１％であり、ストロムライシン２と交差反応しなかった。それ以外のクローンの抗体は、ストロムライシン２に対しての反応性が１０％〜３３７％であり、ストロムライシン２との交差反応性が認められた。また、ストロムライシン３に対する反応性は０％〜６％であり、交差反応しないものがほとんどであった。
【００７４】
（実施例５  免疫染色）
ストロムライシン１及び２の各抗原をｃ−ＰＡＧＥＬ（アトー社）でそれぞれ電気泳動に供した後、Ｓｅｑｕｉ−Ｂｌｏｔ  ＰＶＤＦ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（厚さ０．２μｍ）（Ｂｉｏ  Ｒａｄ社）にトランスファーを行った。ＳＤＳを除去するために０．１％Ｔｗｅｅｎ２０及び０．１Ｍ  ＮａＣｌ含有０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で、トランスファーした膜を洗浄した。さらに、１％ＢＳＡ及び０．１Ｍ  ＮａＣｌ含有０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）でブロッキングを行った。この膜を、得られた１２種類のモノクローナル抗体産生ハイブリドーマの培養上清中で、４〜８℃で一晩静置した。膜を洗浄後、２次抗体反応として、ヤギ抗マウスＩｇ（Ｇ＋Ｍ＋Ａ）ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ−ＰＯＤ（ＣＡＰＰＥＬ社）をブロッキング液で１／３０００に希釈した溶液中で、室温で約２時間振とうした。膜を洗浄後、基質である過酸化水素とジアミノベンジジン（ＤＡＢ）を加えて発色を行った。結果を表２に示す。２９６−２９Ｃ１、２９６−１２Ｈ８、２９６−７Ｂ１０の３クローンの抗体は、ストロムライシン１との反応が認められたが、ストロムライシン２との反応が認められなかった。２９６−２１Ｃ４、２９６−２１Ｆ３、２９６−２１Ｅ４、２９６−３３Ｆ３、２９６−３３Ｅ４、２９６−２３Ａ８、２９６−２４Ｃ８、２９６−３０Ｃ１２、２９６−３１Ａ４の９クローンの抗体は、ストロムライシン１との反応が認められたが、ストロムライシン２とも反応が認められた。
【００７５】
【表２】
2014111604.tif 000003
【００７６】
（実施例６  モノクローナル抗体の精製）
表１に示すクローンのうち、２９６−２１Ｃ４、２９６−２９Ｃ１、２９６−１２Ｈ８、２９６−７Ｂ１０、２９６−３３Ｆ３及び２９６−２３Ａ８を選択し、抗体精製を行った。２９６−２１Ｃ４、２９６−２９Ｃ１、２９６−１２Ｈ８、２９６−７Ｂ１０の４種類については、細胞を増殖させ、その細胞をＢａｌｂ／ｃマウス５匹の腹腔内に投与し、腹水を採取した。採取した腹水は、硫酸アンモニウム（硫安）分画を行い、ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィーにより抗体を精製した。２９６−３３Ｆ３については、細胞を増殖させ、その細胞をＢａｌｂ／ｃマウス５匹の腹腔内に投与し、腹水を採取した。採取した腹水を、硫安分画により抗体を精製した。２９６−２３Ａ８については、細胞を増殖させ、増殖後、培地を無血清培地（Ｅ−ＲＤＦ培地）に交換し、約１ｌの培養上清を回収した。回収した培養上清より、硫安分画により抗体を精製した。
【００７７】
（実施例７  精製抗体を用いたストロムライシン２及び３との反応性）
実施例２（ｄ）の方法に従って、ＥＬＩＳＡにより、実施例６で精製した抗体のストロムライシン２及び３に対する交差反応性を調べた。一次抗体として精製抗体を１００ｎｇ／ウェル用い、測定波長４５０ｎｍでの吸光度を測定した。Ａ４５０（一次抗体が０ｎｇ／ｍｌのときとの差）を表３に示す。
【００７８】
【表３】
2014111604.tif 000004
【００７９】
２９６−２９Ｃ１、２９６−１２Ｈ８、２９６−７Ｂ１０の３クローンの抗体はストロムライシン２と交差反応しなかった。２９６−３３Ｆ３、２９６−２３Ａ８、２９６−２１Ｃ４の順に抗体のストロムライシン２に対する交差反応性が強く認められた。公知のモノクローナル抗体５５−２Ａ４（国際寄託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−３７４３、寄託日：平成３年６月１２日、寄託機関：独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター、茨城県つくば市東１−１−１  つくばセンター中央第６）は、ストロムライシン２に対する交差反応性が８５．１％と高く、ストロムライシン１に対する公知のモノクローナル抗体の中にストロムライシン２と交差反応性を示すものがあることが確認された。ストロムライシン３に対しては、どのクローンの抗体もほとんど反応性が認められなかった。
【００８０】
（実施例８  ストロムライシン１の免疫学的測定）
サンドイッチ法のＥＬＩＳＡによる免疫学的測定により、ストロムライシン１の定量を行った。９６穴マイクロウェルプレート（Ｎｕｎｃ社）に、実施例６で得られた精製抗体１００μｇ／ｍｌ含有０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を１００μｌ／ウェル加え、４℃で１６時間静置した。抗体溶液を除き、１％ＢＳＡ、０．１Ｍ  ＮａＣｌ及び１０ｍＭ  ＥＤＴＡ含有０．０１Ｍ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を３００μｌ／ウェル加え、４℃で一晩以上ブロッキングを行い、抗体結合ウェルとした。使用時にウェルを０．１％Ｔｗｅｅｎ２０及び０．１Ｍ  ＮａＣｌ含有０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）（以下、「洗浄液」という）で洗浄した。
【００８１】
標準品ストロムライシン１を１０００、２５０、６２．５、１５．６ｎｇ／ｍｌに、また標準品ストロムライシン２及びストロムライシン３を２００００、５０００、１２５０、３１３、７８ｎｇ／ｍｌになるように、１％ＢＳＡ及び０．１Ｍ  ＮａＣｌ含有０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）（以下、「アッセイｂｕｆｆｅｒ」という）で希釈して標準液とし、ビニルプレートに２０μｌ取った。試料として、ヒト血清も同様にビニルプレートに２０μｌ取った。
【００８２】
一方、Ｏｂａｔａら，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，２１１，５９−７２，１９９２に記載の方法に従って、５５−２Ａ４のモノクローナル抗体をＨＲＰ（ロシュ  ダイアグノスティックス社）で標識した。標識抗体をアッセイｂｕｆｆｅｒで１．３μｇ／ｍｌになるように希釈し、標準液又は試料を加えたウェルに１００μｌずつ加えた。上記ウェルから１００μｌを抗体結合ウェルに加えて、４℃で１６時間インキュベート（静置）した。洗浄液で抗体結合ウェルを３回洗浄後、ＴＭＢ  Ｏｎｅ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ＨＲＰ  Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＢｉｏＦＸ社）を１００μｌ／ウェル加え、２５℃で２０分間反応させ、１Ｍ硫酸を１００μｌ／ウェル加えて反応を停止させ、マイクロプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ  ＳＰＥＣＴＲＡ）にて測定波長４５０ｎｍでの吸光度を測定した。各抗体を用いたときのＡ４５０（標識抗体が０ｎｇ／ｍｌのときとの差）をストロムライシン１については表４に、ストロムライシン２については表５に、血清については表６に示す。
【００８３】
【表４】
2014111604.tif 000005
【００８４】
【表５】
2014111604.tif 000006
【００８５】
【表６】
2014111604.tif 000007
【００８６】
選択した各精製抗体で、ストロムライシン１の濃度の標準曲線を描くことができた。しかし、２９６−２１Ｃ４及び２９６−３３Ｆ３の抗体を用いた場合、他の抗体を用いた場合に比べ吸光度が低く、これらの抗体のストロムライシン１分子上の結合部位が、標識抗体に使用した５５−２Ａ４のストロムライシン１分子上の結合部位と同じであるか、又は５５−２Ａ４のストロムライシン１分子上の結合部位と近いために、反応性が低いと考えられた。どの抗体も、ストロムライシン１に対する反応性と比較して、ストロムライシン２に対する反応性が低かった（表４及び５）。ストロムライシン２を用いたときの吸光度を各濃度について両対数グラフにプロットし、１０００ｎｇ／ｍｌのときの吸光度を算出し、ストロムライシン１の１０００ｎｇ／ｍｌのときの吸光度と比較した（表７）。
【００８７】
【表７】
2014111604.tif 000008
【００８８】
１０００ｎｇ／ｍｌにおける、ストロムライシン２に対する反応性は、ストロムライシン１に対する反応性の０．５％〜２６．９％であり、２９６−２１Ｃ４の抗体で最も大きな交差反応性を示した。交差反応性が５％以下を許容範囲とすると、２９６−２１Ｃ４及び２９６−３３Ｆ３の抗体は、サンドイッチ法によるＥＬＩＳＡでのストロムライシン１の免疫学的測定に使用できないと考えられた。直接吸着法によるＥＬＩＳＡで、ストロムライシン２に対する交差反応性が１７．１％であった２９６−２３Ａ８の抗体の場合、サンドイッチ法によるＥＬＩＳＡでは２．４％と許容範囲に入っており、サンドイッチ法によるＥＬＩＳＡでの免疫学的測定に使用できると考えられた。２９６−２９Ｃ１、２９６−１２Ｈ８、２９６−７Ｂ１０の抗体は、ストロムライシン２に対する交差反応性が低く、サンドイッチ法によるＥＬＩＳＡでの免疫学的測定に使用可能と考えられた。一方、血清を試料として用いた場合、２９６−２１Ｃ４、２９６−３３Ｆ３、２９６−７Ｂ１０の抗体では血清に対する反応が認められなかった。また、２９６−１２Ｈ８の抗体は、２９６−２９Ｃ１や２９６−２３Ａ８の抗体と比べ、血清に対する反応性が低かった。２９６−２９Ｃ１（国際寄託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１９９、寄託日：平成２０年１２月１９日、寄託機関：独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター、茨城県つくば市東１−１−１  つくばセンター中央第６）や２９６−２３Ａ８（国際寄託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１９８、寄託日：平成２０年１２月１９日、寄託機関：独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター、茨城県つくば市東１−１−１  つくばセンター中央第６）の抗体は、血清に対しても反応性がよく、血清中のストロムライシン１の免疫学的測定に利用できると考えられる。
【００８９】
（実施例９  ストロムライシン１上の反応部位の解析）
以下のようにして、実施例６で得られた精製モノクローナル抗体について、ストロムライシン１分子上の反応部位の解析を行った。
【００９０】
（ａ）ストロムライシン１の分解
エッペンドルフチューブに、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）３４μｌ及び５１μｇ（１７μｌ）のストロムライシン１を加えた。さらにリジルエンドペプチダーゼ２６．１ｍＵ（１７μｌ）を加え、反応を開始した。反応は３７℃、１５分間行なった。反応後、反応液（分解液）をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供したところ、リジルエンドペプチダーゼのバンドは確認されたが、ストロムライシン１のバンドは認められず、充分分解されたことが示された。
【００９１】
（ｂ）分解後のストロムライシン１に対するモノクローナル抗体の反応性
リジルエンドペプチダーゼによる分解後のストロムライシン１に対する抗体の反応性を直接吸着法のＥＬＩＳＡにより調べた。（ａ）で得られたストロムライシン１の分解液に９３２μｌの０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を加えた液の一部を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で１／１００（ストロムライシン１濃度に換算して５１０ｎｇ／ｍｌ）に希釈後、９６穴マイクロウェルに１００μｌを加え、４℃で一晩静置してコーティングした。コントロールとして、５１μｇ／ｍｌの分解前のストロムライシン１を同様に５１０ｎｇ／ｍｌになるように希釈してコーティングした。コーティング後、１％ＢＳＡ及び０．１Ｍ  ＮａＣｌ含有０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）（アッセイｂｕｆｆｅｒ）３００μｌを加え、一晩静置した。使用時にウェルを０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０及び０．１Ｍ  ＮａＣｌ含有０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）（洗浄液）で洗浄した。
【００９２】
一次抗体として、表８に示すモノクローナル抗体を１０μｇ／ｍｌになるようアッセイｂｕｆｆｅｒで希釈し、分解後ストロムライシン１又は分解前ストロムライシン１が結合したウェルに各１００μｌ／ウェル加えて、２５℃で１時間インキュベート（静置）した。洗浄液でウェルを洗浄後、二次抗体としてヤギ抗マウスＩｇ（Ｇ＋Ｍ＋Ａ）ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ−ＰＯＤ（ＣＡＰＰＥＬ社、Ｃａｔ＃５５５５６）をアッセイｂｕｆｆｅｒで１／１０００に希釈したものを１００μｌ／ウェル加え、２５℃で４０分間インキュベート（静置）した。洗浄液でウェルを洗浄後、発色剤を１００μｌ／ウェル加え、２５℃で１５分間反応させ、１Ｍ硫酸を１００μｌ／ウェル加えて反応を停止させ、マイクロプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ  ＳＰＥＣＴＲＡ）にて測定波長４５０ｎｍでの吸光度を測定した。Ａ４５０（一次抗体が０ｎｇ／ｍｌのときとの差）及び分解前の反応性に対する分解後の反応性（％）を表８に示す。
結果を表８に示す。
【００９３】
【表８】
2014111604.tif 000009
【００９４】
２９６−３３Ｆ３及び２９６−１２Ｈ８は、リジルエンドペプチダーゼによるストロムライシン１の分解により、その反応性がほとんど消失した。したがって、リジルエンドペプチダーゼによる分解物には反応しないことから、これらの抗体は、スロトムライシン１タンパク質の二次構造及び三次構造等の立体的な構造を認識すると考えられる。また、２９６−２１Ｃ４及び２９６−２９Ｃ１は、分解後のストロムライシン１に対する反応性が残存しているものの、分解前に比べて大きく低下した。また、２９６−２３Ａ８及び２９６−７Ｂ１０は、分解後も高い割合で分解前のストロムライシン１に対する反応性が残存していた。５５−２Ａ４については、分解後も分解前のストロムライシン１に対する反応性の８０％の反応性が残った。それぞれの抗体で、リジルエンドペプチダーゼによる分解後の反応性が低下することから、少なくとも高次構造を認識していることが示唆された。
【００９５】
（ｃ）ストロムライシン１ペプチドのＦＰＬＣによる分画
上記反応液に９３２μｌの０．１％ＴＦＡを加え、９５０μｌをＦＰＬＣ（Ｆａｓｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、ＡＫＴＡ  ｅｘｐｌｏｒｅｒ、ＧＥヘルスケア社）に供するサンプルとした。カラムはＣ１８Ｓｅｐｈａｓｉｌ  ｐｅｐｔｉｄｅを用い、溶出は０．１％ＴＦＡ（Ａ液）と、８０％アセトニトリルを含む０．１％ＴＦＡ（Ｂ液）とを用いて、２０カラム容量でＢ液が１００％となるようにした。サンプルアプライ後、６ｍｌのＡ液でカラムを洗浄（１ｍｌ／画分）し、その後Ａ液とＢ液のグラジエント溶液約３３．２ｍｌで溶出（０．５ｍｌ／画分）した。フラクションはサンプルアプライ後からＡ１とし、洗浄、溶出画分を連続して採取した。画分はＡ１〜Ａ１２、Ｂ１〜Ｂ１２というように、１２画分ずつ番号付けした。
【００９６】
（ｄ）ＦＰＬＣ画分に対するモノクローナル抗体の反応性
各ＦＰＬＣ画分に対するモノクローナル抗体の反応性を直接吸着法のＥＬＩＳＡにより調べた。９６穴マイクロウェルプレート（Ｎｕｎｃ社）に各ＦＰＬＣ画分の１０倍希釈溶液１００μｌ（０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で希釈）を加え、４℃で一晩静置した。各ウェルの液を除去し、アッセイｂｕｆｆｅｒを３００μｌ／ウェル加え、４℃で一晩ブロッキングを行いペプチド結合ウェルとした。使用時にウェルを洗浄液で洗浄した。次に、２９６−２９Ｃ１及び２９６−７Ｂ１０を１０μｇ／ｍｌになるようアッセイｂｕｆｆｅｒで希釈し、ペプチド結合ウェルに各１００μｌ／ｗｅｌｌ加えて、２５℃で１時間インキュベート（静置）した。洗浄液でウェルを洗浄後、二次抗体としてヤギ抗マウスＩｇ（Ｇ＋Ｍ＋Ａ）ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ−ＰＯＤ（ＣＡＰＰＥＬ社、Ｃａｔ＃５５５５６）をアッセイｂｕｆｆｅｒで１／３０００に希釈したものを１００μｌ／ウェル加え、２５℃で４０分間インキュベート（静置）した。洗浄後、発色剤を１００μｌ／ウェル加え、２５℃で１５分間反応し、１Ｍ硫酸を１００μｌ／ウェル加えて反応を停止させ、マイクロプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ  ＳＰＥＣＴＲＡ）にて測定波長４５０ｎｍでの吸光度を測定した。各画分の吸光度のグラフを図１に示す。２９６−２９Ｃ１及び２９６−７Ｂ１０は、ＦＰＬＣ画分Ｃ１０及びＤ９（以下それぞれ「Ｆｒ．Ｃ１０」及び「Ｆｒ．Ｄ９」という）と反応性を示した。２つの画分に反応のピークが認められることから、リジルエンドペプチダーゼの部分分解により、２つの画分に同一の配列が含まれている可能性がある。
【００９７】
（ｅ）Ｆｒ．Ｃ１０のＮ末端アミノ酸配列の同定
２９６−２９Ｃ１及び２９６−７Ｂ１０が反応したＦＰＬＣ画分のうち、Ｆｒ．Ｄ９は測定波長２３０ｎｍの吸光度が高い第１及び第２のピークの後に続く画分であり、ペプチドの分離が充分ではないと考えられたため、比較的シャープなピークであったＦｒ．Ｃ１０のＮ末端アミノ酸配列分析を行った。Ｎ末端アミノ酸配列分析は、アプロサイエンスへ外注し、Ｅｄｍａｎ分解法により行なわれた。Ｆｒ．Ｃ１０を５０μｌ使用し、Ｎ末端５残基の測定をしたが、各サイクルで複数のアミノ酸が検出され、配列の確定には至らなかった。そこで、検出されたいくつかアミノ酸の中から、検出量および配列等からそのペプチド配列を推定した。その結果、ＱＩＡＥＤである配列が候補に挙げられた。各アミノ酸の検出量は約９ｐｍｏｌであった。ストロムライシン１の全アミノ酸配列（配列番号１）から候補ペプチド配列を照合し、Ｆｒ．Ｃ１０に含まれるペプチドを推定した。ペプチドは、ＱＩＡＥＤＦＰＧＩＤＳＫ（配列番号１の４２５番〜４３６番）であることが推定された。ストロムライシン２の全アミノ酸配列（配列番号２）の中で上記ペプチド配列に相応するアミノ酸配列は、ＬＩＡＤＤＦＰＧＶＥＰＫ（配列番号２の４２４番〜４３５番）であり、１２個のアミノ酸中７個（５８％）のアミノ酸が一致していた。
【００９８】
（ｆ）ストロムライシン１ペプチドとモノクローナル抗体との反応性
ペプチドＱＩＡＥＤＦＰＧＩＤＳＫを合成し、モノクローナル抗体との反応性を調べた。ペプチドの合成はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社に外注し、９５．１５％の純度で８ｍｇのペプチドを得た。測定分子量は１３１８．４０であり、理論分子量１３１９．４５とほぼ一致していた。このペプチドを０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で５００ｎｇ／ｍｌになるよう希釈後、９６穴マイクロウェルに１００μｌを加え、４℃で一晩静置してコーティングした。洗浄液で洗浄後、表９に示す各モノクローナル抗体をアッセイｂｕｆｆｅｒで６．３μｇ／ｍｌに希釈し、ペプチドをコーティングしたウェルに１００μｌ／ウェルずつ加えて、２５℃で１時間インキュベート（静置）した。後の操作は実施例９（ｂ）に記載の方法と同様に行った。本実施例で得られたペプチドを抗原としたときのＡ４５０（一次抗体が０ｎｇ／ｍｌのときとの差）を表９に示す。
【００９９】
【表９】
2014111604.tif 000010
【０１００】
表９より、ストロムライシン１ペプチドＱＩＡＥＤＦＰＧＩＤＳＫに対して、２９６−２９Ｃ１は反応性を示したが、２９６−７Ｂ１０は反応性が低かった。Ｆｒ．Ｃ１０のＮ末端アミノ酸配列分析の結果から、Ｆｒ．Ｃ１０に含まれるペプチドのアミノ酸配列を推定し合成したが、Ｆｒ．Ｃ１０には多数のペプチドが混在しており、ストロムライシン１ペプチドＱＩＡＥＤＦＰＧＩＤＳＫは、２９６−７Ｂ１０が反応するペプチドではなかったことが示された。その他、このペプチドには、２９６−２１Ｃ４、２９６−２３Ａ８及び５５−２Ａ４が反応性を示したが、これらのモノクローナル抗体はストロムライシン２との交差反応性が認められることから、交差反応性の有無は、このペプチドとその他別のペプチドや構造が関与していることが示唆された。
【受託番号】
【０１０１】
マウス由来単クローン性抗ヒトストロムライシン抗体産生ハイブリドーマ５５−３Ｇ３（国際寄託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−３７４４、寄託日：平成３年６月１２日、寄託機関：独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター、茨城県つくば市東１−１−１  つくばセンター中央第６）
マウス由来単クローン性抗ヒトストロムライシン抗体産生ハイブリドーマ５５−２Ａ４（国際寄託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−３７４３、寄託日：平成３年６月１２日、寄託機関：独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター、茨城県つくば市東１−１−１  つくばセンター中央第６）
マウス由来単クローン性抗ヒトストロムライシン１抗体産生ハイブリドーマ２９６−２９Ｃ１（国際寄託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１９９、寄託日：平成２０年１２月１９日、寄託機関：独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター、茨城県つくば市東１−１−１  つくばセンター中央第６）
マウス由来単クローン性抗ヒトストロムライシン１抗体産生ハイブリドーマ２９６−２３Ａ８（国際寄託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１９８、寄託日：平成２０年１２月１９日、寄託機関：独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター、茨城県つくば市東１−１−１  つくばセンター中央第６）
【図１】
2014111604.tif 000011
【配列表】
2014111604000001.app