(57)【要約】    【課題】  本発明の目的は、メナキノン−７の製造において従来の技術である中温域での培養では雑菌が増殖してしまうことが懸念されるのに対し、高温域で増殖可能な細菌を用いることで他の細菌の増殖を抑制し、安定的に製造することである。    【解決手段】  高温菌の一種であるアノキシバチルス属微生物が高いメナキノン−７の発現率を有することを見出し、本菌を培養することで課題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アノキシバチルス属に分類される微生物を培養し、培養物中にメナキノン−７を生成させて得られる培養物を含むか、又は、該培養物から精製したメナキノン−７を含むことを特徴とする食品。
【請求項２】
骨粗鬆症の予防用又は治療用である、請求項１記載の食品。
【請求項３】
窒素源を少なくとも含む原料を用いてアノキシバチルス属に分類される微生物を培養し、培養物中にメナキノン−７を生成させることを特徴とするメナキノン−７の製造法。
【請求項４】
前記アノキシバチルス属に分類される微生物が、メナキノン−７を２４時間以内に培養液100mlあたり10μg以上生産する微生物である、請求項３記載の製造法。
【請求項５】
培養を５０℃以上の温度で行う、請求項３又は４に記載のメナキノン−７の製造法。
【請求項６】
培養物からさらにメナキノン−７を精製する、請求項３〜５の何れか１項記載のメナキノン−７の製造法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物の発酵によりメナキノン−７を製造する方法とこれにより得られるメナキノン−７を含む食品に関する。
【背景技術】
【０００２】
ビタミンＫは、脂溶性ビタミンの一種で、血液凝固や骨形成に関与する重要なビタミンである。自然界には植物にビタミンＫ１（フィロキノン）が、微生物等にビタミンＫ２（メナキノン）が存在し、ビタミンＫには骨粗鬆症の予防効果が期待できることや、新生児・乳児出血症がビタミンＫの欠乏から起きることなどから注目されている。
【０００３】
従来、ビタミンＫ２の一種であるメナキノン−７の製造は、高いメナキノン−７の含有率を有するバチルス・ズブチリス菌株が使用されてきた（特許文献１，２）。バチルス以外の細菌を用いた例として乳酸菌や大腸菌を用いた製造方法も知られている（特許文献３，４）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００２−３４５５４号公報
【特許文献２】特開平８−７３３９６号公報
【特許文献３】特開平１０−５６９５９号公報
【特許文献４】特開２０１１−１６０８０３号公報
【特許文献５】特開平６−１４１７８３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
特許文献１〜４に開示される微生物の培養に適した温度帯は、通常30〜45℃付近の中温域であり、50℃以上の高温域での培養には適さない。そのため、高温域での培養に適した微生物をメナキノン−７の製造に用いることができれば中温域での増殖が懸念される他の雑菌の増殖を抑制することが可能となりメナキノン−７を安定的に生産することができる。
【０００６】
本発明の目的は、メナキノン−７の製造において従来の技術である中温域での培養では雑菌が増殖してしまうことが懸念されるのに対し、高温域で増殖可能な細菌を用いることで他の細菌の増殖を抑制し、安定的に製造することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
前記課題を解決するために、本発明者は広範な種類の微生物を培養して鋭意検討を行った。そして、高温菌の一種であるアノキシバチルス属微生物が高いメナキノン−７の発現率を有することを見出し、本菌を培養することで課題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち本発明は
（１）アノキシバチルス属に分類される微生物を培養し、培養物中にメナキノン−７を生成させて得られる培養物を含むか、又は、該培養物から精製したメナキノン−７を含むことを特徴とする食品、
（２）骨粗鬆症の予防用又は治療用である、前記（１）記載の食品、
（３）窒素源を少なくとも含む原料を用いてアノキシバチルス属に分類される微生物を培養し、培養物中にメナキノン−７を生成させることを特徴とするメナキノン−７の製造法、
（４）前記アノキシバチルス属に分類される微生物が、メナキノン−７を２４時間以内に培養液100mlあたり10μg以上生産する微生物である、前記（３）記載の製造法、
（５）培養を５０℃以上の温度で行う、前記（３）又は（４）に記載のメナキノン−７の製造法、
（６）培養物からさらにメナキノン−７を精製する、前記（３）〜（５）の何れか１項に記載のメナキノン−７の製造法、
である。
【発明の効果】
【０００９】
本発明に寄れば、高温下でも増殖可能で、かつメナキノン−７を生成しうる微生物を選択して培養することにより、雑菌の増殖を抑制しつつ安定的に大量のメナキノン−７の製造が可能となる。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明のメナキノン−７の製造法は、アノキシバチルス属に分類される微生物を培養し、培養物中にメナキノン−７を生成させることを特徴とする。以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。
【００１１】
（培養原料）
本発明において、微生物を培養するための原料は、通常微生物の培養に必要な窒素源や炭素源を含むものであれば特に限定されない。窒素源としてはタンパク質やタンパク質加水分解物、アミノ酸、アンモニア、硫酸アンモニウムや塩化アンモニウム等のアンモニウム塩、硝酸塩、尿素等を含有させることができる。タンパク質としては動物性、植物性の何れを問わず使用することができ、例えば市販の乳タンパク質、小麦タンパク質、大豆タンパク質、コラーゲンや、これらの加水分解物などを用いることができる。また、これらのタンパク質を含む乳原料や小麦、大豆などの天然原料を用いることもできる。なお培地成分として一般に使用されるコーンスティープリカー、ポリペプトン、ペプトン、酵母エキス、小麦ふすま等も使用することができる。
本発明では、培養原料として窒素源の他に炭素源、無機塩、ビタミン類も適宜含めることができる。炭素源としては、グルコース、シュークロース等の糖類、有機酸、ｎ−パラフィン等を使用することができる。無機塩としては、カルシウム塩、マグネシウム塩、鉄塩、マンガン塩、リン酸塩、重炭酸塩等を使用することができる。
【００１２】
（アノキシバチルス属微生物）
本発明のメナキノン−７の製造において培養に使用する微生物としてはアノキシバチルス属微生物を用いることが重要である。かかる属に分類される微生物は高温下でも増殖が可能であり、かつメナキノン−７を産生する能力を有することを本発明者らは見出したものである。アノキシバチルス属の中でもメナキノン−７産生能力の高い菌種を選択することが望ましい。当業者は適宜産生能の高い菌種、さらには菌株を培養試験によりスクリーニングして用いることができる。
【００１３】
アノキシバチルス属の具体的な菌種としては、例えばアノキシバチルス・アミロリティカス、アノキシバチルス・アイデレンシス、アノキシバチルス・ボグロベンシス、アノキシバチルス・カルディプロテオリティカス、アノキシバチルス・コンタミナンス、アノキシバチルス・エリュアネンシス、アノキシバチルス・フラビサーマス、アノキシバチルス・フラビサーマス・サブスピーシーズ・フラビサーマス、アノキシバチルス・フラビサーマス・サブスピーシーズ・ユナネンシス、アノキシバチルス・ゴネンシス、アノキシバチルス・カムチャツケンシス、アノキシバチルス・ケスタンボレンシス、アノキシバチルス・モンゴリエンシス、アノキシバチルス・プシュチネンシス、アノキシバチルス・プシュチノエンシス、アノキシバチルス・ルピエンシス、アノキシバチルス・サラバトリエンシス、アノキシバチルス・テンチョンエンシス、アノキシバチルス・テピダマンス、アノキシバチルス・サーマラム、アノキシバチルス・ボイノスキエンシスなどが挙げられ、製造者はこれらの市販の菌種を入手して使用することができる。
特に、メナキノン−７を２４時間以内に培養液100mlあたり10μg以上生産するものを選択して使用することが好ましい。そのスクリーニング方法としては、例えば試験菌株を10cfu/mlになるようにトリプチケース・ソイブロス液体培地（ベクトン・ディッキントン社製）に接種し、５５℃で２４時間培養したときの培養液100ml中のメナキノン−７の含量を測定する方法で行うことができる。そのような好ましい菌種としては例えばアノキシバチルス・フラビサームス、アノキシバチルス・コンタミナンスを使用できる。
【００１４】
一般のバチルス属微生物を含む多くの微生物の最適増殖温度域が30〜45℃であるのに対し、アノキシバチルス属のような高温菌の最適増殖温度域は50〜70℃である。30〜45℃では多くの微生物が活発に増殖可能なため、培養中に雑菌が増殖してしまう可能性があるが、高温域では他の微生物が増殖しにくいため純化培養に適している。
【００１５】
（培養温度）
したがって、アノキシバチルス属微生物は、50℃以上の高温環境下で培養することが雑菌の増殖を抑制しつつメナキノン−７を製造するのに適している。より好ましくは55℃以上の高温域で培養することが好ましい。また培養温度の上限は微生物が死滅しない常識的な範囲とすればよく、通常は80℃以下、好ましくは70℃以下、より好ましくは60℃以下で培養することで効率良く増殖させることができる。また、増殖に必要な倍化時間が15分〜30分程度と非常に短いため（参考文献１：The formation of thermophilic spores during the manufacture of whole milk powder : SCOTT et al., Int. J. Dairy Tech., 60 (2), p109-117 (2007)）、本菌のみを効率良く純化培養させるのに適している。
【００１６】
（その他の各種培養条件）
培養は好気的条件、微好気的条件、嫌気的条件など目的の微生物が増殖する条件で行うことが好ましい。培養時のpHは６〜９が好適である。
培養方法は特に限定されず、一般的に知られている液体培養や平板培養などの公知の方法を用いると良いが、トリプチケース・ソイブロス液体培地（ベクトン・ディッキントン社製）等の大豆由来成分を含むものが使用できる。
培養工程において用いられるアノキシバチラス属細菌は予備培養しておくこともできる。予備培養後は菌液をそのまま加えるか、菌体を遠心分離やフィルターを用いて回収し工程中に加えることができる。
培養工程における初期菌数は、１０の１乗〜１０の６乗cfu/ml、好ましくは１０の３乗〜１０の５乗cfu/mlあればより効率的に発酵させることができる。
前記条件下で例えば４〜２４時間、好ましくは４〜１２時間程度培養するとメナキノン−７が培養物中に生成されるので、生成量が最大になった時点、例えばアノキシバチラス属細菌が１０の６乗〜１０の８乗cfu/ml程度まで十分増殖した時点で培養を停止すればよい。
【００１７】
得られた培養物は必要であれば加熱殺菌を行い、培養物をそのまま回収し、必要により乾燥や濃縮するなどして加工し、得られたメナキノン−７含有発酵物を添加した食品又は食品素材、あるいは薬剤を製造することができる。また、培養物からメナキノン−７を抽出、分離等によりさらに精製し、得られたメナキノン−７含有抽出物を添加した食品又は食品素材、あるいは薬剤とすることもできる。なお、ここでいう食品には飲料も包含される。これらの食品や食品素材、あるいは薬剤は、メナキノン−７で知られている生理機能の用途、例えば骨粗鬆症、動脈硬化等の予防用又は治療用、あるいは抗酸化用として用いることができる。
【００１８】
なお、培養物からのメナキノン−７の抽出方法は、培養物に対して最も効果的な方法を選択すればよく、特に限定されるものではない。例えばメタノールやエタノール等の有機溶剤を用いて抽出し、メナキノン−７含有素材を得ることができる。また必要により有機溶剤による分配抽出やカラムクロマトグラフィーなどを行ってさらにメナキノン−７含量を高純度に精製したメナキノン−７含有素材を得ることができる。また培養物から菌体そのものを回収し、乾燥することでも高濃度のメナキノン−７含有素材として回収できる。
【実施例】
【００１９】
次に実施例によって本発明についてより詳しく説明する。なお、以下の実施例においてメナキノン−７含量の測定は佐藤らの方法（参考文献２）に従って実施した。
参考文献２: Production of Menaquinone (Vitamin K2)-7 by Bacillus subtilis (2001) J.B.B., 91(1) 16-20
【００２０】
■実施例１
アノキシバチルス・フラビサーマス（NBRC 15317）、アノキシバチラス・コンタミナンス（DSM 15866）の２種をそれぞれ１０cfu/mlになるようにトリプチケース・ソイブロス液体培地（ベクトン・ディッキントン社製）に接種し、５５℃で培養して定常期（１０の８乗cfu/ml）まで十分増殖させた後、産生されたメナキノン−７の含量を測定した。両者のメナキノン−７産生量は30μg/100mlおよび25μg/100mlであった。
【００２１】
■実施例２
アノキシバチルス・フラビサーマス（NBRC 15317）を１０cfu/mlになるようにトリプチケース・ソイブロス液体培地（ベクトン・ディッキントン社製）に接種し、５５℃で6.5時間培養した（最終菌数：１０の７乗cfu/ml）。アノキシバチルス・フラビサーマスは短時間でメナキノン−７を蓄積し、その含量は13μg/100mlであった。
【００２２】
■比較例１
バチルス・ズブチリス（NBRC 3013）を１０cfu/mlになるようにトリプチケース・ソイブロス液体培地（ベクトン・ディッキントン社製）に接種し、４０℃で6.5時間培養した（最終菌数：１０の５乗cfu/ml）。蓄積されたメナキノン−７含量は３μg/100mlと低いレベルであった。
【００２３】
■実施例３
標準菌株アノキシバチルス・フラビサーマス（NBRC 15317）をトリプチケース・ソイブロス液体培地（ベクトン・ディッキントン社製）を用いて５５℃で前培養した。次に培養原料として、市販の粉末状大豆タンパク「フジプロＲ」（不二製油(株)製）100gを水900mlに分散させた。得られた大豆タンパク質溶液に前培養液を１０の３乗cfu/mlの濃度になるよう接種した。５５℃で８時間培養した後（最終菌数：１０の８乗cfu/ml）、加熱殺菌して培養物を得た。得られた培養物のメナキノン−７含量は固形分100gあたり300μgであった。