(57)【要約】【課題】  投与後時間がたったときでも、腫瘍への集積性が高く、腫瘍から発せられる光音響信号強度が大きい化合物を提供することを目的とする。【解決手段】  ポリエチレングリコールと特定のシアニン系の化合物とが結合した化合物。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（Ｉ）乃至（ＩＶ）のいずれかで示される化合物。
Ａ−Ｌ１−（ＣＨ２）ｐ−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｍ−Ｏ−（ＣＨ２）ｑ−Ｌ２−Ａ’  （Ｉ）
Ａ−Ｌ１−（ＣＨ２）ｐ−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｍ−Ｏ−（ＣＨ２）ｑ−Ｌ２−Ｍ  （ＩＩ）
Ｎ−Ｌ１−（ＣＨ２）ｐ−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｍ−Ｏ−（ＣＨ２）ｑ−Ｌ２−Ａ（ＩＩＩ）
Ａ−Ｌ１−（ＣＨ２）ｐ−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｍ−Ｏ−Ｒ                    （ＩＶ）
式（Ｉ）において、Ａ、Ａ’はそれぞれ独立に下記式（ｉ）乃至式（ｖｉ）のいずれかを表し、下記式（ｉ）乃至（ｖｉ）の＊は式（Ｉ）のＬ１、Ｌ２に結合する。
式（Ｉ）において、Ｌ１、Ｌ２はそれぞれ独立に−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＯ−のいずれかであるか、または−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＯ−のいずれか１つ以上を含むリンカー部位である。ｐ、ｑはそれぞれ独立に１乃至５のいずれかの整数であり、ｍは１０以上２５００以下のいずれかの整数である。
式（ＩＩ）および式（ＩＩＩ）において、Ａは下記式（ｉ）乃至（ｖｉ）のいずれかを表し、下記式（ｉ）乃至（ｖｉ）の＊は式（ＩＩ）のＬ１または式（ＩＩＩ）のＬ２に結合する。
式（ＩＩ）および式（ＩＩＩ）において、Ｌ１、Ｌ２はそれぞれ独立に−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＯ−のいずれかであるか、またはそれぞれ独立に−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＯ−のいずれか１つ以上を含むリンカー部位である。ｐ、ｑはそれぞれ独立に１乃至５の整数であり、ｍは１０以上２５００以下の整数である。
式（ＩＩ）において、Ｌ２が−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−のいずれかであるとき、Ｍは水素原子であり、Ｌ２が−ＣＯ−のとき、Ｍは水酸基である。
式（ＩＩＩ）において、Ｌ１が−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−のいずれかであるとき、Ｎは水素原子であり、Ｌ１が−ＣＯ−のとき、Ｎは水酸基である。
式（ＩＶ）において、Ａは下記式（ｉ）乃至式（ｖｉ）のいずれかを表し、下記式（ｉ）乃至（ｖｉ）の＊は式（ＩＶ）のＬ１に結合する。
式（ＩＶ）において、Ｌ１は−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＯ−のいずれかであるか、またはそれぞれ独立に−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＯ−のいずれか１つ以上を含むリンカー部位である。ｐは１乃至５の整数であり、ｍは１０以上２５００以下の整数である。Ｒは水素原子、置換または無置換の炭素数１乃至５のアルキル基のいずれかである。
【化１】
2014185312.tif 000056
（ｉ）
【化２】
2014185312.tif 000057
（ｉｉ）
【化３】
2014185312.tif 000058
（ｉｉｉ）
【化４】
2014185312.tif 000059
（ｉｖ）
【化５】
2014185312.tif 000060
（ｖ）
【化６】
2014185312.tif 000061
（ｖｉ）
式（ｉ）乃至（ｖｉ）において、Ｚは水素原子、スルホン酸基、またはＺに結合したインドール環と共にベンズ［ｅ］インドール環、ベンズ［ｆ］インドール環、またはベンズ［ｇ］インドール環からなる環状芳香族環を形成し、さらに該環状芳香族環の水素原子は炭素数１乃至１０のアルキル基、炭素数１乃至１０のアルコキシ基、スルホン酸基で置換されていてもよい。
式（ｉ）乃至（ｖｉ）において、Ｒ１は、炭素数１乃至１０のアルキル基、−（ＣＨ２）ｂ−ＳＯ３−（ｂは１乃至１０のいずれかの整数）のいずれかである。Ｒ１がアルキル基である場合、ハロゲンイオン、または有機酸イオンが対イオンとして含まれていても良い。Ｒ２、Ｒ３はそれぞれ独立に、水素原子、炭素数１乃至１０のアルキル基、炭素数１乃至１０のアルコキシ基、−（ＣＨ２）ｂ−ＳＯ３−（ｂは１乃至１０のいずれかの整数）、−（ＣＨ２）ｂ−ＳＯ３Ｘ（ｂは１乃至１０の整数であり、Ｘはナトリウム、カリウム、アンモニウム、トリエチルアンモニウム、リジン、アルギニンのいずれかである）のいずれかである。
式（ｉ）および（ｉｉ）において、ａは１乃至１０のいずれかの整数である。
式（ｉ）乃至（ｖｉ）において、ｎは２または３である。式（ｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖｉ）において、Ｒ４は炭素数１乃至１０のアルキル基、−（ＣＨ２）ｂ−ＳＯ３Ｘ（ｂは１乃至１０の整数であり、Ｘはナトリウム、カリウム、アンモニウム、トリエチルアンモニウム、リジン、アルギニンのいずれかである）のいずれかである。
式（ｉｉｉ）および（ｉｖ）において、Ｌ３は置換または無置換の炭素数１乃至１０のアルキル基であり、カルボニル基、アミド基、エステル基、ピペラジル基で置換されていても良い。
式（ｖ）および（ｖｉ）において、Ｌ４は置換または無置換の炭素数１乃至１０のアルキル基であり、カルボニル基、アミド基、エステル基で置換されていても良い。
【請求項２】
前記式（Ｉ）乃至（ＩＶ）におけるｍが１００以上５００以下のいずれかの整数であることを特徴とする請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
前記式（Ｉ）におけるＡ、Ａ’がいずれも式（ｉ）で表されることを特徴とする請求項１または２に記載の化合物。
【請求項４】
前記式（ＩＶ）におけるＡが式（ｉ）で表されることを特徴とする請求項１または２に記載の化合物。
【請求項５】
前記式（ｉ）が、下記の式（ｉ−１）乃至（ｉ−６）のいずれかで表されることを特徴とする請求項１乃至４のいずれか一項に記載の化合物。
【化７】
2014185312.tif 000062
（ｉ−１）
【化８】
2014185312.tif 000063
（ｉ−２）
式（ｉ−２）において、Ｙ−はハロゲンイオン、または、有機酸イオンである。
【化９】
2014185312.tif 000064
（ｉ−３）
【化１０】
2014185312.tif 000065
（ｉ−４）
【化１１】
2014185312.tif 000066
（ｉ−５）
【化１２】
2014185312.tif 000067
（ｉ−６）
上記式（ｉ−３）乃至（ｉ−６）において、Ｘはナトリウム、カリウム、アンモニウム、トリエチルアンモニウム、リジン、アルギニンのいずれかである。
【請求項６】
前記式（ｉｉ）が、下記の式（ｉｉ−１）または（ｉｉ−２）で表されることを特徴とする請求項１乃至４のいずれか一項に記載の化合物。
【化１３】
2014185312.tif 000068
（ｉｉ−１）
【化１４】
2014185312.tif 000069
（ｉｉ−２）
上記式（ｉｉ−１）乃至（ｉｉ−２）において、Ｘはナトリウム、カリウム、アンモニウム、トリエチルアンモニウム、リジン、アルギニンのいずれかである。
【請求項７】
前記式（ｉｉｉ）が、下記の式（ｉｉｉ−１）または（ｉｉｉ−２）で表されることを特徴とする請求項１乃至４のいずれか一項に記載の化合物。
【化１５】
2014185312.tif 000070
（ｉｉｉ―１）
【化１６】
2014185312.tif 000071
（ｉｉｉ―２）
【請求項８】
前記式（ｉｖ）が、下記の式（ｉｖ−１）または（ｉｖ−２）で表されることを特徴とする請求項１乃至４のいずれか一項に記載の化合物。
【化１７】
2014185312.tif 000072
（ｉｖ−１）
【化１８】
2014185312.tif 000073
（ｉｖ―２）
上記式（ｉｖ−１）乃至（ｉｖ−２）において、Ｘはナトリウム、カリウム、アンモニウム、トリエチルアンモニウム、リジン、アルギニンのいずれかである。
【請求項９】
捕捉分子をさらに有することを特徴とする請求項１乃至８のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１０】
前記リンカー部位が捕捉分子であることを特徴とする請求項９に記載の化合物。
【請求項１１】
前記捕捉分子がポリペプチド、一本鎖抗体のいずれかであることを特徴とする請求項１０に記載の化合物。
【請求項１２】
前記Ｌ１、Ｌ２のうち１つ以上が下記式（ｘｉ）で表わされることを特徴とする請求項１乃至８のいずれか一項に記載の化合物。
【化１９】
2014185312.tif 000074
（ｘｉ）
式（ｘｉ）において、Ｌ５は、ポリペプチド、または一本鎖抗体であり、―ＮＨ―はポリペプチドまたは一本鎖抗体中のアミノ酸のアミノ基を介した結合を、−Ｓ−はポリペプチドまたは一本鎖抗体中のアミノ酸のチオール基を介した結合を表わす。Ｌ６はカルボニル基、アミド基、エステル基、ピペラジル基のいずれかで置換されていてもよい炭素数１乃至１０のアルキル鎖である。＊＊は前述の＊へ、＊＊＊は式（Ｉ）乃至（ＩＶ）のアルキル鎖側またはエチレングリコール鎖側に結合する。
【請求項１３】
前記式（ｘｉ）における、Ｌ６が下記式（ｘｉｉ）で表わされることを特徴とする請求項１２に記載の化合物。
−（ＣＨ２）２−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−  （ｘｉｉ）
式（ｘｉｉ）において、エチレン基の炭素が前記式（ｘｉ）のマレイミド基の窒素と結合し、−ＮＨ−の窒素が前記式（ｘｉ）の＊＊＊と結合する。
【請求項１４】
請求項１乃至１３のいずれか一項に記載の化合物と、分散媒とを有することを特徴とする光イメージング用造影剤。
【請求項１５】
添加剤をさらに有することを特徴とする請求項１４に記載の光イメージング用造影剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、化合物、および、前記化合物を有する光音響イメージング用造影剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体内部の情報を可視化する装置の１つとして、光音響トモグラフィー（Ｐｈｏｔｏａｃｏｕｓｔｉｃ  ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ、以下ＰＡＴと略すことがある）装置が知られている。ＰＡＴ装置を用いる測定においては、被測定体に光を照射したときに被測定体内部で光を吸収した物質（光吸収体）が発する光音響信号の強度と発生時刻を測定することにより、被測定体内部の物質分布を演算した画像を得ることができる。
【０００３】
ここで、光吸収体としては、生体内で光を吸収して音響波を発するものであればいかなるものをも用いることができる。例えば人体内の血管や悪性腫瘍などを光吸収体とすることが可能である。その他にも、インドシアニングリーン（Ｉｎｄｏｃｙａｎｉｎｅ  Ｇｒｅｅｎ、以下ＩＣＧと略すことがある）などの分子を体内に投与し、造影剤として利用することもできる。ＩＣＧは、人体に照射した際の影響が少なくかつ生体への透過性が高い近赤外波長領域の光をよく吸収することから、ＰＡＴ装置における造影剤として好適に用いることができる。なお、本明細書において、ＩＣＧとは下記の構造で示される化合物を指す。
【０００４】
【化１】
2014185312.tif 000002
（１）
【０００５】
ただし、対イオンはＮａ＋でなくてもよく、Ｈ＋あるいはＫ＋など任意の対イオンをもちいることができる。
【０００６】
しかし、ＩＣＧは血中での半減期が数分程度と非常に短いことが知られている。
【０００７】
非特許文献１では、単独のＩＣＧを用いてラットの脳血管の光音響イメージングを行った例が報告されている。この報告によると、単独のＩＣＧを血中に投与してから数十分後に、光音響信号が血液と同じレベルにまで低下しており、投与した物質が投与後速やかに血中から消失することが示唆されている。
【０００８】
このように、単独のＩＣＧは血中に投与してから数十分後に血中から消失してしまうことから、投与後時間がたったときの腫瘍への集積性が低いと考えられる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｏｐｔｉｃｓ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，２９（７），７３０（２００４）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
そこで本発明では、投与後時間がたったときでも、腫瘍への集積性が高く、腫瘍から発せられる光音響信号強度が大きい、化合物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明に係る化合物は、下記式（Ｉ）乃至（ＩＶ）のいずれかで示されることを特徴とする。
Ａ−Ｌ１−（ＣＨ２）ｐ−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｍ−Ｏ−（ＣＨ２）ｑ−Ｌ２−Ａ’ （Ｉ）
Ａ−Ｌ１−（ＣＨ２）ｐ−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｍ−Ｏ−（ＣＨ２）ｑ−Ｌ２−Ｍ （ＩＩ）
Ｎ−Ｌ１−（ＣＨ２）ｐ−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｍ−Ｏ−（ＣＨ２）ｑ−Ｌ２−Ａ（ＩＩＩ）
Ａ−Ｌ１−（ＣＨ２）ｐ−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｍ−Ｏ−Ｒ                    （ＩＶ）
【００１２】
式（Ｉ）において、Ａ、Ａ’はそれぞれ独立に下記式（ｉ）乃至式（ｖｉ）のいずれかを表し、下記式（ｉ）乃至（ｖｉ）の＊は式（Ｉ）のＬ１、Ｌ２に結合する。
【００１３】
式（Ｉ）において、Ｌ１、Ｌ２はそれぞれ独立に−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＯ−のいずれかであるか、またはそれぞれ独立に−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＯ−のいずれか１つ以上を含むリンカー部位である。ｐ、ｑはそれぞれ独立に１乃至５の整数であり、ｍは１０以上２５００以下の整数である。
【００１４】
式（ＩＩ）および式（ＩＩＩ）において、Ａは下記式（ｉ）乃至（ｖｉ）のいずれかを表し、下記式（ｉ）乃至（ｖｉ）の＊は式（ＩＩ）のＬ１または式（ＩＩＩ）のＬ２に結合する。
【００１５】
式（ＩＩ）および式（ＩＩＩ）において、Ｌ１、Ｌ２はそれぞれ独立に−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＯ−のいずれかであるか、またはそれぞれ独立に−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＯ−のいずれか１つ以上を含むリンカー部位である。ｐ、ｑはそれぞれ独立に１乃至５の整数であり、ｍは１０以上２５００以下の整数である。
【００１６】
式（ＩＩ）において、Ｌ２が−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−のいずれかであるとき、Ｍは水素原子であり、Ｌ２が−ＣＯ−のとき、Ｍは水酸基である。
【００１７】
式（ＩＩＩ）において、Ｌ１が−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−のいずれかであるとき、Ｎは水素原子であり、Ｌ１が−ＣＯ−のとき、Ｎは水酸基である。
【００１８】
式（ＩＶ）において、Ａは下記式（ｉ）乃至式（ｖｉ）のいずれかを表し、下記式（ｉ）乃至（ｖｉ）の＊は式（ＩＶ）のＬ１に結合する。
【００１９】
式（ＩＶ）において、Ｌ１は−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＯ−のいずれかであるか、またはそれぞれ独立に−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＯ−のいずれか１つ以上を含むリンカー部位である。ｐは１乃至５の整数であり、ｍは１０以上２５００以下の整数である。Ｒは水素原子、置換または無置換の炭素数１乃至５のアルキル基のいずれかである。
【００２０】
【化２】
2014185312.tif 000003
（ｉ）
【００２１】
【化３】
2014185312.tif 000004
（ｉｉ）
【００２２】
【化４】
2014185312.tif 000005
（ｉｉｉ）
【００２３】
【化５】
2014185312.tif 000006
（ｉｖ）
【００２４】
【化６】
2014185312.tif 000007
（ｖ）
【００２５】
【化７】
2014185312.tif 000008
（ｖｉ）
【００２６】
式（ｉ）乃至式（ｖｉ）において、Ｚは水素原子、スルホン酸基、またはＺに結合したインドール環と共にベンズ［ｅ］インドール環、ベンズ［ｆ］インドール環、またはベンズ［ｇ］インドール環からなる環状芳香族環を形成し、さらに該環状芳香族環の水素原子は炭素数１乃至１０のアルキル基、炭素数１乃至１０のアルコキシ基、スルホン酸基で置換されていてもよい。
【００２７】
式（ｉ）乃至（ｖｉ）において、Ｒ１は、炭素数１乃至１０のアルキル基、−（ＣＨ２）ｂ−ＳＯ３−（ｂは１乃至１０の整数）のいずれかである。Ｒ１がアルキル基である場合、ハロゲンイオン、または有機酸イオンが対イオンとして含まれていても良い。
【００２８】
Ｒ２、Ｒ３はそれぞれ独立に、水素原子、炭素数１乃至１０のアルキル基、炭素数１乃至１０のアルコキシ基、−（ＣＨ２）ｂ−ＳＯ３−（ｂは１乃至１０の整数）、−（ＣＨ２）ｂ−ＳＯ３Ｘ（ｂは１乃至１０の整数であり、Ｘはナトリウム、カリウム、アンモニウム、トリエチルアンモニウム、リジン、アルギニンのいずれかである）のいずれかである。
式（ｉ）および（ｉｉ）において、ａは１乃至１０の整数である。
式（ｉ）乃至（ｖｉ）において、ｎは２または３である。
【００２９】
式（ｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖｉ）において、Ｒ４は炭素数１乃至１０のアルキル基、−（ＣＨ２）ｂ−ＳＯ３Ｘ（ｂは１乃至１０の整数であり、Ｘはナトリウム、カリウム、アンモニウム、トリエチルアンモニウム、リジン、アルギニンのいずれかである）のいずれかである。
【００３０】
式（ｉｉｉ）および（ｉｖ）において、Ｌ３は置換または無置換の炭素数１乃至１０のアルキル基であり、アルキル基の鎖の中にカルボニル基、アミド基、エステル基、ピペラジル基で置換されていても良い。
【００３１】
式（ｖ）および（ｖｉ）において、Ｌ４は置換または無置換の炭素数１乃至１０のアルキル基であり、カルボニル基、アミド基、エステル基で置換されていても良い。
【発明の効果】
【００３２】
本発明に係る化合物によれば、ポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ、以下ＰＥＧと略すことがある）と、ＩＣＧなどのシアニン系の化合物とが共有結合した構造であるため、ＩＣＧを単独で生体に投与した場合に比べて、腫瘍への集積性が高く、腫瘍から発せられる光音響信号強度が大きい。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】本発明の実施例で光音響イメージングを行ったときの腫瘍移植マウスの光学写真。
【図２】本発明の実施例で行った光音響イメージングで得られた画像。
【図３】本発明の実施例で行った腫瘍集積性評価実験で得られた結果のグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
本発明の実施形態について説明する。本実施形態に係る化合物は、ＰＥＧに特定のシアニン系の色素が結合した構造を有し、ＰＥＧは該シアニン系の色素のインドール環に存在する窒素原子の置換基を介して結合している。本実施形態に係る化合物は具体的には下記式（Ｉ）乃至（ＩＶ）で示される化合物である。
Ａ−Ｌ１−（ＣＨ２）ｐ−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｍ−Ｏ−（ＣＨ２）ｑ−Ｌ２−Ａ’（Ｉ）
Ａ−Ｌ１−（ＣＨ２）ｐ−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｍ−Ｏ−（ＣＨ２）ｑ−Ｌ２−Ｍ （ＩＩ）
Ｎ−Ｌ１−（ＣＨ２）ｐ−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｍ−Ｏ−（ＣＨ２）ｑ−Ｌ２−Ａ（ＩＩＩ）
Ａ−Ｌ１−（ＣＨ２）ｐ−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｍ−Ｏ−Ｒ                    （ＩＶ）
【００３５】
式（Ｉ）において、Ａ、Ａ’はそれぞれ独立に下記式（ｉ）乃至式（ｖｉ）のいずれかを表し、下記式（ｉ）乃至（ｖｉ）の＊は式（Ｉ）のＬ１、Ｌ２に結合する。
【００３６】
式（Ｉ）において、Ｌ１、Ｌ２はそれぞれ独立に−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＯ−のいずれかであるか、またはそれぞれ独立に−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＯ−のいずれか１つ以上を含むリンカー部位である。ｐ、ｑはそれぞれ独立に１乃至５のいずれかの整数であり、ｍは１０以上２５００以下のいずれかの整数である。
【００３７】
式（ＩＩ）および式（ＩＩＩ）において、Ａは下記式（ｉ）乃至（ｖｉ）のいずれかを表し、下記式（ｉ）乃至（ｖｉ）の＊は式（ＩＩ）のＬ１または式（ＩＩＩ）のＬ２に結合する。
【００３８】
式（ＩＩ）および式（ＩＩＩ）において、Ｌ１、Ｌ２はそれぞれ独立に−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＯ−のいずれかであるか、またはそれぞれ独立に−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＯ−のいずれか１つ以上を含むリンカー部位である。ｐ、ｑはそれぞれ独立に１乃至５の整数であり、ｍは１０以上２５００以下の整数である。
【００３９】
式（ＩＩ）において、Ｌ２が−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−のいずれかであるとき、Ｍは水素原子であり、Ｌ２が−ＣＯ−のとき、Ｍは水酸基である。
【００４０】
式（ＩＩＩ）において、Ｌ１が−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−のいずれかであるとき、Ｎは水素原子であり、Ｌ１が−ＣＯ−のとき、Ｎは水酸基である。
【００４１】
式（ＩＶ）において、Ａは下記式（ｉ）乃至式（ｖｉ）のいずれかを表し、下記式（ｉ）乃至（ｖｉ）の＊は式（ＩＶ）のＬ１に結合する。
【００４２】
式（ＩＶ）において、Ｌ１は−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＯ−のいずれかであるか、またはそれぞれ独立に−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＯ−のいずれか１つ以上を含むリンカー部位である。ｐは１乃至５の整数であり、ｍは１０以上２５００以下の整数である。Ｒは水素原子、置換または無置換の炭素数１乃至５のアルキル基のいずれかである。
【００４３】
なお、本明細書において、＊は構造式中の
【００４４】
【化８】
2014185312.tif 000009
【００４５】
と同義である。
【００４６】
【化９】
2014185312.tif 000010
（ｉ）
【００４７】
【化１０】
2014185312.tif 000011
（ｉｉ）
【００４８】
【化１１】
2014185312.tif 000012
（ｉｉｉ）
【００４９】
【化１２】
2014185312.tif 000013
（ｉｖ）
【００５０】
【化１３】
2014185312.tif 000014
（ｖ）
【００５１】
【化１４】
2014185312.tif 000015
（ｖｉ）
【００５２】
式（ｉ）乃至（ｖｉ）において、Ｚは水素原子、スルホン酸基、またはＺに結合したインドール環と共にベンズ［ｅ］インドール環、ベンズ［ｆ］インドール環、またはベンズ［ｇ］インドール環からなる環状芳香族環を形成し、さらに該環状芳香族環の水素原子は炭素数１乃至１０のアルキル基、炭素数１乃至１０のアルコキシ基、スルホン酸基で置換されていてもよい。
【００５３】
式（ｉ）乃至（ｖｉ）において、Ｒ１は、炭素数１乃至１０のアルキル基、−（ＣＨ２）ｂ−ＳＯ３−（ｂは１乃至１０のいずれかの整数）のいずれかである。
【００５４】
Ｒ１がアルキル基である場合、塩化物イオン、臭化物イオン、ヨウ化物イオン等のハロゲンイオン、または酢酸イオン、酒石酸イオン、コハク酸イオン等の有機酸イオンが対イオンとして含まれていても良い。Ｒ２、Ｒ３はそれぞれ独立に、水素原子、炭素数１乃至１０のアルキル基、炭素数１乃至１０のアルコキシ基、−（ＣＨ２）ｂ−ＳＯ３−（ｂは１乃至１０のいずれかの整数）、−（ＣＨ２）ｂ−ＳＯ３Ｘ（ｂは１乃至１０の整数であり、Ｘはナトリウム、カリウム、アンモニウム、トリエチルアンモニウム、リジン、アルギニンのいずれかである）のいずれかである。
式（ｉ）および（ｉｉ）において、ａは１乃至１０のいずれかの整数である。
式（ｉ）乃至（ｖｉ）において、ｎは２または３である。
【００５５】
式（ｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖｉ）において、Ｒ４はそれぞれ独立に、炭素数１乃至１０のアルキル基、−（ＣＨ２）ｂ−ＳＯ３Ｘ（ｂは１乃至１０のいずれかの整数であり、Ｘはナトリウム、カリウム、アンモニウム、トリエチルアンモニウム、リジン、アルギニンのいずれかである）のいずれかである。
【００５６】
式（ｉｉｉ）および（ｉｖ）において、Ｌ３は任意の２価の基である。例えば、置換または無置換の炭素数１乃至１０のアルキル基であり、カルボニル基、アミド基、エステル基、ピペラジル基などで置換されていても良い。
【００５７】
式（ｖ）および（ｖｉ）において、Ｌ４は任意の２価の基である。例えば、置換または無置換の炭素数１乃至１０のアルキル基であり、カルボニル基、アミド基、エステル基などで置換されていても良い。
【００５８】
本実施形態に係る化合物において、式（Ｉ）乃至（ＩＶ）におけるｍは１００以上５００以下のいずれかの整数であることが好ましく、２００以上４００以下のいずれかの整数であることがさらに好ましい。
【００５９】
式（Ｉ）におけるＡ、Ａ’がいずれも式（ｉ）乃至（ｖｉ）の単独であってもよいし、（ｉ）乃至（ｖｉ）の組合せであってもよい。
【００６０】
式（Ｉ）におけるＬ１、Ｌ２がともに−ＮＨ−である場合、ＡとＬ１、Ａ’とＬ２の結合が強いため好ましい。
【００６１】
また、−Ｏ−である場合、本実施形態に係る化合物が血清などの水溶液中で分散性が高くなると考えられるため好ましい。
【００６２】
また、Ｌ１、Ｌ２はそれぞれ独立に−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＯ−のいずれか１つ以上を含むリンカー部位であってもよい。ここで、リンカー部位とは、式（Ｉ）乃至式（ＩＶ）におけるエチレングリコール鎖またはアルキル鎖と、ＡまたはＡ’とを結合させる機能を有する部位である。例えば、１，６−ＢｉｓｍａｌｅｉｍｉｄｏｈｅｘａｎｅやＳｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ｔｒａｎｓ−４−（Ｎ−Ｍａｌｅｉｍｉｄｙｌｍｅｔｈｙｌ）−Ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−１−Ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅなどの２官能性の化合物が挙げられる。別の例では、カルボニル基、アミド基、エステル基、ピペラジル基などを含んでなる炭素数１乃至１０のアルキル基を挙げることができる。更に別の例では任意の鎖長のポリペプチドを使用することもでき、該ポリペプチドが後述の捕捉分子であってもよい。ポリペプチドは、鎖の中のカルボニル基、アミノ基、チオール基のいずれかを使用して共有結合を形成することができる。例えば、Ｎ−ＰＥＧマレイミド基とチオール基は中性条件下、室温においてマレイミド−チオール結合を形成することができる。
【００６３】
式（ｉ）及び式（ｉｉ）におけるａは２乃至６のいずれかの整数であることが好ましい。
【００６４】
式（ｉ）乃至式（ｖｉ）のＲ１、Ｒ２、Ｒ３におけるｂは２乃至６のいずれかの整数であることが好ましい。
【００６５】
式（ｉ）及び式（ｉｉ）におけるａおよび式（ｉ）乃至式（ｖｉ）のｂが、６以下である場合、疎水性が高くならないため、生体中において非特異吸着しにくい。
【００６６】
本実施形態において、上記式（ｉ）が、下記の式（ｉ−１）乃至（ｉ−６）のいずれかで表されることが好ましい。
【００６７】
【化１５】
2014185312.tif 000016
（ｉ−１）
【００６８】
【化１６】
2014185312.tif 000017
（ｉ−２）
【００６９】
式（ｉ−２）において、Ｙ−は塩化物イオン、臭化物イオン、ヨウ化物イオン等のハロゲンイオン、または酢酸イオン、酒石酸イオン、コハク酸イオン等の有機酸イオンのいずれかである。
【００７０】
【化１７】
2014185312.tif 000018
（ｉ−３）
【００７１】
【化１８】
2014185312.tif 000019
（ｉ−４）
【００７２】
【化１９】
2014185312.tif 000020
（ｉ−５）
【００７３】
【化２０】
2014185312.tif 000021
（ｉ−６）
【００７４】
本実施形態において、上記式（ｉｉ）が、下記の式（ｉｉ−１）または（ｉｉ−２）のいずれかで表されることが好ましい。
【００７５】
【化２１】
2014185312.tif 000022
（ｉｉ−１）
【００７６】
【化２２】
2014185312.tif 000023
（ｉｉ−２）
【００７７】
本実施形態において、上記式（ｉｉｉ）が、下記の式（ｉｉｉ−１）または（ｉｉｉ−２）のいずれかで表されることが好ましい。
【００７８】
【化２３】
2014185312.tif 000024
（ｉｉｉ―１）
【００７９】
【化２４】
2014185312.tif 000025
（ｉｉｉ―２）
【００８０】
本実施形態において、上記式（ｉｖ）が、下記の式（ｉｖ−１）または（ｉｖ−２）のいずれかで表されることが好ましい。
【００８１】
【化２５】
2014185312.tif 000026
（ｉｖ−１）
【００８２】
【化２６】
2014185312.tif 000027
（ｉｖ―２）
【００８３】
また、前記Ｌ１、Ｌ２のうち１つ以上が下記式（ｘｉ）で表わされることが好ましい。
【００８４】
【化２７】
2014185312.tif 000028
（ｘｉ）
【００８５】
式（ｘｉ）において、Ｌ５は、ポリペプチド、または一本鎖抗体であり、―ＮＨ―はポリペプチドまたは一本鎖抗体中のアミノ酸のアミノ基を介した結合を、−Ｓ−はポリペプチドまたは一本鎖抗体中のアミノ酸のチオール基を介した結合を表わす。Ｌ６はカルボニル基、アミド基、エステル基、ピペラジル基などを含む炭素数１乃至１０のアルキル鎖である。＊＊は前述の＊へ、＊＊＊は式（Ｉ）乃至（ＩＶ）のアルキル鎖側またはエチレングリコール鎖側に結合する。
【００８６】
なお、前記式（ｘｉ）における、Ｌ６が下記式（ｘｉｉ）で表わされることが好ましい。
−（ＣＨ２）２−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−      （ｘｉｉ）
ただし、式（ｘｉｉ）において、エチレン基の炭素が前記式（ｘｉ）のマレイミド基の窒素と結合し、−ＮＨ−の窒素が前記式（ｘｉ）の＊＊＊と結合する。すなわち、エチレン基側がマレイミド基の窒素原子へ結合し、アミド基側が＊＊＊へ結合する。
【００８７】
本実施形態に係る化合物は、さらに別の色素が結合していていてもよい。
【００８８】
また、本実施形態に係る化合物は、標的部位に特異的に結合する捕捉分子を有していてもよい。
【００８９】
（化合物の調製方法）
本実施形態における化合物は、ＰＥＧと特定のシアニン系の化合物とを、それぞれの官能基を介して公知のカップリング反応によって結合することによって調製する。例えば、特定のシアニン系の化合物の含窒素複素環に存在する窒素原子の置換基を介して、ＰＥＧと結合させる。アミノ基を有するＰＥＧのアミノ基と、特定のシアニン系の化合物が有するスルホコハク酸イミドエステル（Ｓｕｌｆｏ−ＯＳｕと略すことがある）を介して結合させることが好ましい。ＰＥＧと結合した特定のシアニン系の色素は、限外濾過法、サイズ排除カラムクロマトグラフィー法等の公知の精製法により洗浄、精製することができる。ＰＥＧと特定のシアニン系の化合物との結合は、上述のＰＥＧの有するアミノ基などの官能基と特定のシアニン系の化合物とで直接結合されていても良いし、種々の架橋材（クロスリンカー）を介してＰＥＧと特定のシアニン系の化合物とが結合されていても良い。
【００９０】
本実施形態に係る化合物は、分子量が１０００以上である、１つ以上のアミノ基を有するＰＥＧに、インドシアニングリーン−Ｎ−ブタン酸スルホコハク酸イミドエステル（ＩＣＧ−Ｓｕｌｆｏ−ＯＳｕ（登録商標）（同仁化学社製）を共有結合させて調製することが好ましい。
【００９１】
（ＰＥＧ）
本実施形態に係る化合物を調製するために用いるＰＥＧは、水溶性の高分子であり、タンパク質の血清半減期の増加や免疫原性の低下などの効果を奏する。ＰＥＧの分子量は、４００以上１０００００以下の範囲であることが好ましく、２００００以上であることがさらに好ましい。分子量が２００００以上であれば、ＥＰＲ（Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ）効果により、生体内の正常部位に比べて腫瘍部位により多くのＰＥＧを集積させることができると考えられる。また、分子量が２００００以上において腎臓からの排泄が抑制されるため、２００００未満の分子量のＰＥＧに比較して、血中滞留性が長くなることが期待できる。また、ＰＥＧの分子量が大きければ大きいほど、溶液粘性が大きいため、ＰＥＧの分子量は１０００００以下であることが好ましい。
【００９２】
本実施形態におけるＰＥＧは、特定のシアニン系の化合物と共有結合できる反応性の官能基をＰＥＧ１分子に少なくとも１つ以上有するものである。ここで反応性の官能基とは、結合させる色素の有する官能基によって適宜選択することができる。反応性官能基とは例えば、アミノ基、水酸基、チオール基、カルボニル基、スルフヒドリル基、エポキシ基、グリシジル基、Ｎ−サクシイミジルオキシ基、Ｎ−スルホサクシイミジルオキシ基、およびＮ−マレイミドアルキル基等であることが好ましい。
【００９３】
（特定のシアニン系の化合物）
本実施形態において、特定のシアニン系の化合物の構造は、例えば、下記式（Ｖ）で表される。
Ｂ−Ｂ’      （Ｖ）
【００９４】
式（Ｖ）において、Ｂは上記式（ｉ）または上記式（ｉｉ）を表す。
【００９５】
また、式（Ｖ）において、Ｂ’は下記式（ｖｉｉ）乃至（ｘ）のいずれかを表す。
【００９６】
【化２８】
2014185312.tif 000029
（ｖｉｉ）
【００９７】
【化２９】
2014185312.tif 000030
（ｖｉｉｉ）
【００９８】
【化３０】
2014185312.tif 000031
（ｉｘ）
【００９９】
【化３１】
2014185312.tif 000032
（ｘ）
【０１００】
上記式（Ｖ）の例として、下記式（２）で示される化合物（ＩＣＧ−Ｓｕｌｆｏ−ＯＳｕ（Ｄｏｊｉｎｄｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製、登録商標））、下記式（３）で示される化合物、下記式（４）示される化合物、下記式（５）で示される化合物、下記式（６）で示される化合物、下記式（７）で示される化合物、下記式（８）で示される化合物のいずれかであることが好ましい。
【０１０１】
【化３２】
2014185312.tif 000033
（２）
【０１０２】
【化３３】
2014185312.tif 000034
（３）
【０１０３】
【化３４】
2014185312.tif 000035
（４）
【０１０４】
【化３５】
2014185312.tif 000036
（５）
【０１０５】
【化３６】
2014185312.tif 000037
（６）
【０１０６】
【化３７】
2014185312.tif 000038
（７）
【０１０７】
【化３８】
2014185312.tif 000039
（８）
【０１０８】
（光イメージング用造影剤）
本実施形態に係る光イメージング用造影剤は、本実施形態に係る化合物と、分散媒とを有する。また、本実施形態に係る光イメージング用造影剤は、必要に応じて本実施形態に係る化合物の他に薬理上許容できる添加物、例えば血管拡張剤などを有していても良い。
【０１０９】
ここで分散媒は、本実施形態に係る化合物を分散させるための液状の物質であり、例えば生理食塩水、注射用蒸留水、リン酸緩衝生理食塩水、ブドウ糖水溶液などが挙げられる。本実施形態に係る光イメージング用造影剤は、上記本実施形態に係る化合物をこの分散媒に予め分散させておいてもよいし、本実施形態に係る粒子と分散媒とをキットにしておき、生体内に投与する前に粒子を分散媒に分散させて使用してもよい。
【０１１０】
本実施形態において光イメージングとは、光を照射することで、イメージング（画像化）することを意味する。すなわち、本実施形態に係る光イメージング用造影剤のうちＰＥＧ以外の部位に光が照射されることで、音響波や蛍光などを発する。発せられた音響波を検出することで光音響イメージングをすることができ、発せられた蛍光を検出することで蛍光イメージングをすることができる。なお、光音響イメージングは、光音響トモグラフィー（断層撮影法）を含む概念である。
【０１１１】
本実施形態に係る光イメージング用造影剤が蛍光イメージングに用いられる場合、蛍光イメージング用造影剤、光音響イメージングに用いられる場合、光音響イメージング用造影剤と呼ぶことがある。
【０１１２】
本実施形態に係る光イメージング用造影剤は、ＥＰＲ効果を利用することで、生体内に投与したときに、生体内の正常部位に比べて腫瘍部位により多く集積させることができる。その結果、本実施形態に係る光イメージング用造影剤を生体内に投与した後、生体に光を照射して、生体からの音響波を検出するときに、腫瘍部位から発せられる音響波を正常部位から発せられる音響波よりも大きくすることができる。
【０１１３】
また、本実施形態に係る光イメージング用造影剤はリンパ節の造影に用いることもできる。さらに、センチネルリンパ節の造影剤に用いることが特に好ましい。これは色素単独と比べてもサイズが大きいためにセンチネルリンパ節により留まりやすく集積性が向上されることが期待されるからである。
【０１１４】
（捕捉分子）
本実施形態における捕捉分子とは、腫瘍などの標的部位に特異的に結合する物質、標的部位の周辺に存在する物質に特異的に結合する物質などであり、生体分子や医薬品等の化学物質などから任意に選択することができる。具体的には、抗体、抗体フラグメント、一本鎖抗体などの人工抗体、酵素、生物活性ペプチド、グリコペプチド、糖鎖、脂質、分子認識化合物などが挙げられる。これらの物質は単独で用いることもできるし、あるいは複数を組み合わせて用いることもできる。捕捉分子が化学結合された本実施形態に係る化合物を用いることで、標的部位の特異的な検出、標的物質の動態、局在、薬効、代謝等の追跡を行うことができる。
【０１１５】
（添加剤）
本実施形態に係る光イメージング用造影剤は、凍結乾燥時に使用する添加剤を含んでいてもよい。添加剤の一例としてグルコース、ラクトース、マンニトール、ポリエチレングリコール、グリシン、塩化ナトリウム、リン酸水素ナトリウムが挙げられる。添加剤は１種類のみを用いても、複数種類を併用してもよい。
【０１１６】
（光音響イメージング方法）
生体内に投与された本実施形態に係る化合物を、光音響イメージング装置を用いて検出する方法について説明する。本実施形態に係る化合物を検出する方法は以下の（ａ）、（ｂ）の工程を有する。但し、本実施形態に係る光音響イメージング方法は、以下に示す工程以外の工程を含んでいても良い。
（ａ）本実施形態に係る化合物が投与された検体に６００ｎｍ乃至１３００ｎｍの波長領域の光を照射する工程
（ｂ）前記検体内に存在する前記化合物から発生する音響波を検出する工程
【０１１７】
また、本実施形態に係る化合物は、前記（ｂ）で得られた音響波の波長、位相および時間情報等から空間的な光音響信号強度分布を再構成する工程を有していてもよい。なお、前記（ｂ）の工程で得られた光音響信号の波長、位相および時間情報を基に３次元的な画像再構成を行うことができる。画像再構成によって得られるデータは光音響信号の強度分布の位置情報が把握できるものであればどのような形態を取っても構わない。例えば３次元空間上に光音響信号強度が表現されるようなもの構わないし、２次元平面上に光音響信号強度に表現されるようなものでも構わない。また、同一の観察対象に対して異なる撮像方法で情報を取得し、それらの情報と光音響の強度分布の位置的な対応関係を取得することも可能である。
【０１１８】
上記（ａ）の工程において、経口投与や注射等の方法によって本実施形態に係る化合物を投与された検体を用いることができる。
【０１１９】
また、上記（ｂ）の工程において、検体に照射する光を発生させる装置、本実施形態に係る化合物から発せられる光音響信号を検出する装置は特に限定されない。
【０１２０】
上記（ｂ）の工程において検体に光を照射する光源としては、前記検体に対し６００ｎｍ乃至１３００ｎｍの範囲から選択される少なくとも１つの波長のレーザーパルス光を照射させることのできるものであれば限定されない。レーザーパルス光を照射する装置として、例えば、チタンサファイアレーザー（ＬＴ−２２１１−ＰＣ、Ｌｏｔｉｓ社製））、ＯＰＯレーザー（ＬＴ−２２１４  ＯＰＯ、Ｌｏｔｉｓ社製）、アレキサンドライトレーザーが挙げられる。
【０１２１】
音響波を検出する装置は特に制限されず種々のものを用いることが可能である。例えば、市販の光音響イメージング装置（Ｎｅｘｕｓ１２８，Ｅｎｄｒａ  Ｉｎｃ．）を用いて行うことができる。
【０１２２】
本実施形態に係る化合物を用いたイメージング方法は、上記（ａ）、（ｂ）の工程を経ることで腫瘍、リンパ節あるいは血管などの目的とする部位を造影することができる。
【実施例】
【０１２３】
以下、実施例を用いて更に詳細に本発明を説明するが、本発明は、これらの実施例に限定されるものではない。なお以下でＭｗは分子量を表す。本実施例において調製した各サンプル、Ｍ５ｋ−ＩＣＧ、Ｍ１０ｋ−ＩＣＧ、Ｍ２０ｋ−ＩＣＧ、Ｍ３０ｋ−ＩＣＧ、Ｍ４０ｋ−ＩＣＧの代表的な構造は式（Ｐ１）、あるいは式（Ｉ−１）で表され、ポリエチレングリコールの分子量がそれぞれ５ｋ、１０ｋ、２０ｋ、３０ｋ、４０ｋである。ＤＥ−２００ＰＡの構造は式（ＩＩ）で表され、ポリエチレングリコールの分子量が２０ｋである。
【０１２４】
【化３９】
2014185312.tif 000040
【０１２５】
【化４０】
2014185312.tif 000041
【０１２６】
【化４１】
2014185312.tif 000042
【０１２７】
【化４２】
2014185312.tif 000043
【０１２８】
（実施例１）から（実施例４）
（特定のシアニン系の化合物とＰＥＧとの化合物１）
本実施例において特定のシアニン系の化合物はＩＣＧ−Ｓｕｌｆｏ−ＯＳｕ（Ｄｏｊｉｎｄｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）を用いた。ＩＣＧ−Ｓｕｌｆｏ−ＯＳｕ  １ｍｇ（１．２５マイクロモル）をＤＭＳＯ  １００マイクロリットルで溶解させた。一方で、１．５ｍＬプラスチックチューブにＰＥＧを秤量し、５０ｍＭ  カーボネートバッファー（ｐＨ９．０）で各種のＰＥＧを溶解させ、ＮＨ２濃度を０．６２５ｍＭとした。ここで用いた各種のＰＥＧ誘導体は、モノアミン直鎖状ＭＥ−０５０ＥＡ（日油社製，Ｍｗ５０００）、モノアミン直鎖状ＭＥ−１００ＥＡ（日油社製，Ｍｗ１００００）、モノアミン直鎖状ＭＥ−２００ＥＡ（日油社製，Ｍｗ２００００）、ジアミン直鎖状ＤＥ−２００ＰＡ（日油社製，Ｍｗ２００００）である。以上を表１にまとめた。
【０１２９】
【表１】
2014185312.tif 000044
【０１３０】
上記で用いたＭＥ−０５０ＥＡ、ＭＥ−１００ＥＡ、ＭＥ−２００ＥＡの構造は下記式（ｐ１）で表され、それぞれ分子量が５ｋ、１０ｋ、２０ｋである。
ＣＨ３Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２      （ｐ１）
なお、本明細書においてｋは１０００を表し、例えば５ｋは５０００である。
【０１３１】
上記で用いたＤＥ−２００ＰＡの構造は下記式（ｐ２）で表され、分子量が２０ｋである。
Ｘ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｘ      （ｐ２）
上記式（ｐ２）においてＸは
ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２
で表される。
【０１３２】
ＰＥＧのカーボネートバッファー溶液（４００マイクロリットル）に、ＩＣＧ−Ｓｕｌｆｏ−ＯＳｕのＤＭＳＯ溶液２０マイクロリットル（［ＩＣＧ−Ｓｕｌｆｏ−ＯＳｕ］＝０．２５マイクロモル）を加えた。ＩＣＧ−Ｓｕｌｆｏ−ＯＳｕとＰＥＧの反応比１で反応させた。ＩＣＧ−Ｓｕｌｆｏ−ＯＳｕの反応時の濃度は０．６ｍＭとした。遮光下、室温で２４時間回転かくはんした後、０．２２μｍシリンジフィルターで反応溶液をろ過し、特定のシアニン系の色素とＰＥＧとが共有結合したものを得た。これらは４度、遮光下で保存した。
【０１３３】
以後、モノアミン直鎖状ＭＥ−０５０ＥＡ、モノアミン直鎖状ＭＥ−１００ＥＡ、モノアミン直鎖状ＭＥ−２００ＥＡ、ジアミン直鎖状ＤＥ−２００ＰＡ、とＩＣＧ−Ｓｕｌｆｏ−ＯＳｕとが共有結合したものを、表２に示すように、それぞれ、Ｍ５ｋ−ＩＣＧ、Ｍ１０ｋ−ＩＣＧ、Ｍ２０ｋ−ＩＣＧ、Ｄ２０ｋ−ＩＣＧ２と略す。同様にして、ＩＣＧ−Ｓｕｌｆｏ−ＯＳｕとグリシンとをモル比１：１で反応させたもの（以下ではＩＣＧ−Ｇｌｙと略す）を合成し、対照サンプルとした（表２）。
【０１３４】
なお、モノアミン直鎖状とは、直鎖状のＰＥＧ１分子あたり１つのアミノ基を有することを意味し、ジアミン直鎖状とは、直鎖状のＰＥＧ１分子あたり２つのアミノ基を有することを意味する。アミノ基の数はＩＣＧ−Ｓｕｌｆｏ−ＯＳｕが結合できる数と同じである。
【０１３５】
【表２】
2014185312.tif 000045
【０１３６】
（吸光度の測定）
Ｍ５ｋ−ＩＣＧ、Ｍ１０ｋ−ＩＣＧ、Ｍ２０ｋ−ＩＣＧ、Ｄ２０ｋ−ＩＣＧ２、ＩＣＧ−Ｇｌｙの溶液の吸光度測定を行った。５０ｍＭ  ４−（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ（ＨＥＰＥＳ）溶液で希釈し、７００ｎｍ，７８５ｎｍにおける吸光度を測定した。７００ｎｍの吸収は、会合状態にある色素の吸収であり、一方、７８５ｎｍは単量体として存在する色素の吸収である。したがって７００ｎｍと７８５ｎｍの吸収比（７００／７８５と略す）は、色素の会合状態の指標となり、この値が大きいほど色素同士が会合している割合が高いと考えられる。反応液の７８５ｎｍの吸光度は、前記７８５ｎｍの吸光度と希釈率を掛けることで算出した。その反応液の７８５ｎｍの吸光度を、色素のモル吸収係数である１．２ｘ１０５  （Ｍ−１ｘｃｍ−１）で割ることで、反応液の色素濃度を算出した。表３に吸光度の測定の結果を示す。
【０１３７】
ＩＣＧ−Ｇｌｙは反応中に緑色の沈殿物が確認され、一方で、Ｍ５ｋ−ＩＣＧ、Ｍ１０ｋ−ＩＣＧ、Ｍ２０ｋ−ＩＣＧ、Ｄ２０ｋ−ＩＣＧ２の４種は反応中に沈殿物は確認されず、水中で良好な分散性を示すことが明らかとなった。色素単独では水中では不安定であるが、ＰＥＧと共有結合させることで色素の安定性が向上することが示された。
【０１３８】
【表３】
2014185312.tif 000046
【０１３９】
（腫瘍集積性の評価）
上記で調製した化合物の腫瘍集積性を確認するために、Ｎ８７細胞株を移植した腫瘍移植マウスに対して、Ｍ５ｋ−ＩＣＧ、Ｍ１０ｋ−ＩＣＧ、Ｍ２０ｋ−ＩＣＧ、Ｄ２０ｋ−ＩＣＧ２、ＩＣＧ−Ｇｌｙを尾静脈に投与した。投与量は色素量として１３ｎｍｏｌとした。投与２４時間後にマウスを炭酸ガスで安楽死させた後、Ｎ８７腫瘍組織を摘出した。腫瘍組織をプラスチックチューブに移し、腫瘍組織の重量に対し１．２５倍量の１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００水溶液を添加し、プラスチックペッスルを用いてホモジネートした。次いで、腫瘍組織重量の２０．２５倍量のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を加えた。ＩＶＩＳ（登録商標）Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ  ２００  Ｓｅｒｉｅｓ（Ｃａｌｉｐｅｒ社製）を用いて、プラスチックチューブの状態で、ホモジネート溶液の蛍光強度を測定することで腫瘍組織中の色素量を定量した。腫瘍組織の単位重量あたりの、投与量（色素１３ｎｍｏｌ）に対する腫瘍組織への色素移行率（％  ｉｎｊｅｃｔｅｄ  ｄｏｓｅ：％ＩＤと略す）を、化合物の腫瘍集積量（％ＩＤ／ｇ）として、表４に示した。
【０１４０】
その結果、対照であるＩＣＧ−Ｇｌｙの腫瘍集積性は、０．６％ＩＤ／ｇであったが、Ｍ５ｋ−ＩＣＧ、Ｍ１０ｋ−ＩＣＧ、Ｍ２０ｋ−ＩＣＧ、Ｄ２０ｋ−ＩＣＧ２では、１．１、１．４、５．２ならびに７．０％ＩＤ／ｇとなり、分子量増大とともに腫瘍集積性が増加した。これは分子量増大にともない分子サイズが大きくなり、それらの腎排泄が抑制された結果と思われる。さらに、分子量２００００であるＭ２０ｋ−ＩＣＧ、Ｄ２０ｋ−ＩＣＧ２を比べると、モノアミン直鎖状に比べ、ジアミン直鎖状（ＰＥＧの両末端に色素を結合させた化合物）の方が腫瘍集積性が高かった。ジアミン直鎖状ＰＥＧでは、ＰＥＧ分子あたりの色素数が多い結果、色素を介したＰＥＧ分子鎖内あるいは分子鎖同士の疎水性会合により、色素の安定性が向上していること、あるいはみかけの分子サイズが変化していることなどにより腫瘍集積性が増加したと考えられる。前記（吸光度の測定）でわかった結果と同様に、色素単独に比べ、ＰＥＧと共有結合させることで腫瘍集積性が高いことが示され、腫瘍集積性に対するＰＥＧ分子量とＰＥＧの形態は重要なパラメーターであることが示された。
【０１４１】
【表４】
2014185312.tif 000047
【０１４２】
（腫瘍部位における光音響イメージング）
腫瘍造影能を確認するために、（腫瘍集積性の評価）で行った方法と同様に、Ｎ８７細胞株を移植した腫瘍移植マウスに対して、Ｍ２０ｋ−ＩＣＧを尾静脈に投与した。投与量は色素量として６５ｎｍｏｌとした。投与５分後および投与２０時間後での光音響イメージング（照射レーザー波長７８５ｎｍ）を実施した。図１には光音響イメージング時のマウスの光学写真を示しており、麻酔下のマウス（図中のｍ）の設置している像である。図中のＦＯＶがマウス皮下移植された腫瘍部（図中のＴ）であり、光音響イメージングを行っている観察領域（２ｃｍｘ２ｃｍｘ２ｃｍ）である。そして図２には腫瘍部での光音響イメージング結果および表５には投与前の光音響強度を１とした場合の腫瘍部での光音響強度比をそれぞれ示す。図中、白い点線はマウスの輪郭を示す図２および表５から明らかなように、腫瘍部での光音響信号強度は投与直後（５分後）に大きく上昇し、投与２０時間後においても光音響信号が保持されており、投与前に比べ２．６倍の光音響信号を確認できた。このことから本発明の実施例に係る化合物を用いて腫瘍部位の光音響イメージング画像が得られることが確認された。
【０１４３】
【表５】
2014185312.tif 000048
【０１４４】
（標識体の調製）
ＰＥＧのＨＥＰＥＳ溶液（ｐＨ７．１）に、ＩＣＧ−Ｓｕｌｆｏ−ＯＳｕのＤＭＳＯ溶液を加えた。ＩＣＧ−Ｓｕｌｆｏ−ＯＳｕとＰＥＧの反応モル比は３：１で反応させた。反応時のＩＣＧ−Ｓｕｌｆｏ−ＯＳｕの反応時の濃度は０．６ｍＭとした。遮光下、室温で２４時間回転かくはんした後、０．２２μｍシリンジフィルターで反応溶液をろ過し、特定のシアニン系の色素とＰＥＧとが共有結合した水溶液を得た。前記反応によりＰＥＧと結合した近赤外有機色素は、限外濾過法、サイズ排除クロマトグラフィー法等の公知の精製法により洗浄・精製することができる。
【０１４５】
実施例１と同様にして、ＩＣＧ−Ｓｕｌｆｏ−ＯＳｕとグリシンとを反応させたもの（以下ではＩＣＧ−Ｇｌｙと略す）を合成したものおよびＩＣＧ水溶液（（財）日本公定書協会製）を対照サンプルとした。上記のサンプルを用いて、分子量および構造違いによる血中滞留性および腫瘍集積性を評価した。
【０１４６】
（実施例５）から（実施例１０）
近赤外有機色素には前述のＩＣＧ−Ｓｕｌｆｏ−ＯＳｕを用いた。ＩＣＧ−Ｓｕｌｆｏ−ＯＳｕ  １ｍｇ（１．２５マイクロモル）をＤＭＳＯ  １００マイクロリットルで溶解させた。一方で、１．５ｍＬプラスチックチューブにＰＥＧを秤量した。５０ｍＭカーボネートバッファー（ｐＨ９．０）で各種のＰＥＧを溶解させ、ＮＨ２濃度を１．２５ｍＭとした。ここで用いた各種のＰＥＧは、モノアミン直鎖状ＭＥ−５０ＥＡ（日油社製，Ｍｗ５０００）、モノアミン直鎖状ＭＥ−１００ＥＡ（日油社製，Ｍｗ１００００）、モノアミン直鎖状ＭＥ−２００ＥＡ（日油社製，Ｍｗ２００００）、モノアミン直鎖状ＭＥ−３００ＥＡ（日油社製，Ｍｗ３００００）、モノアミン直鎖状ＭＥ−４００ＥＡ（日油社製，Ｍｗ４００００）、ジアミン直鎖状ＤＥ−２００ＰＡ（日油社製，Ｍｗ２００００）である。近赤外有機色素とＰＥＧとの共有結合体はＮＨ２濃度を２倍にした以外は実施例１と同様の手順で作製した。表６に本実施例で用いたサンプルを示す。
【０１４７】
【表６】
2014185312.tif 000049
【０１４８】
（マウス体表での光音響計測）
上記で調製した化合物の体内動態を確認するために、ヌードマウスに対してＭ５ｋ−ＩＣＧ、Ｍ１０ｋ−ＩＣＧ、Ｍ２０ｋ−ＩＣＧ、Ｍ３０ｋ−ＩＣＧを投与してマウス背中の体表面の光音響計測を実施した。本実施例の計測領域はマウスの主要臓器の光音響信号の影響が少ないと思われる領域から選択した。そのために本実施例で背中の領域から得られる光音響信号は血中に存在する化合物の動態に近しいと考えている。投与前、投与６０分後、投与１８０分後にそれぞれ実施し、投与前の光音響信号強度に対する相対光音響強度として算出した。照射レーザー波長を７９７ｎｍとしてそれぞれの光音響強度をまとめた結果を表７に示す。ＰＥＧの分子量が１０ｋを超える化合物は投与６０分後においても投与前に比べて２倍以上の高い光音響信号が得られた。以上の結果から１０ｋ以上の分子量のＰＥＧを結合した化合物は非特許文献１に比べても高い血中滞留性を示す光音響用造影剤であることが示唆された。
【０１４９】
【表７】
2014185312.tif 000050
【０１５０】
（化合物の体内動態）
上記で調製した化合物の血中滞留性および腫瘍集積性を確認するために、Ｃｏｌｏｎ２６細胞株を移植した腫瘍移植マウスに対して、Ｍ５ｋ−ＩＣＧ、Ｍ１０ｋ−ＩＣＧ、Ｍ２０ｋ−ＩＣＧ、Ｍ３０ｋ−ＩＣＧ、Ｍ４０ｋ−ＩＣＧ、Ｄ２０ｋ−ＩＣＧ２を尾静脈に投与した。投与量は色素量として１３ｎｍｏｌとした。
【０１５１】
（血液滞留性評価方法）
投与２４時間後のマウスから血液を採取し、プラスチックチューブ内で血液、１％ＴｒｉｒｏｎＸ−１００水溶液、ＤＭＳＯを容量比２：９：９で混合した。ＩＶＩＳ（登録商標）  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ  ２００  Ｓｅｒｉｅｓ（Ｃａｌｉｐｅｒ社製）を用いて、プラスチックチューブの状態で、蛍光強度を測定することで血液中の色素量を定量した。血液の単位重量あたりの、投与量（色素１３ｎｍｏｌ）に対する血液への色素移行率（％  ｉｎｊｅｃｔｅｄ  ｄｏｓｅ：％ＩＤと略す）を、化合物の血中滞留性（％ＩＤ）として、表８に示した。この結果、ＰＥＧの分子量に大きくなるにしたがって血液残存量が増加している傾向が確認された。
【０１５２】
（化合物の腫瘍集積性）
Ｃｏｌｏｎ２６細胞株を移植した腫瘍移植マウスに対して、化合物を尾静脈に投与した。投与量は色素量として１３ｎｍｏｌとした。採血後のマウスを炭酸ガスで安楽死させた後、Ｃｏｌｏｎ２６腫瘍組織を摘出した。摘出した腫瘍塊は実施例１に記載の方法で腫瘍集積性評価を行った結果を表８に示す。その結果、ＰＥＧの分子量が大きくなるにしたがって腫瘍集積性が向上していることが示された。
【０１５３】
【表８】
2014185312.tif 000051
【０１５４】
（腫瘍部位における光音響イメージング）
腫瘍造影能を確認するために（腫瘍集積性の評価）で行なった方法と同様にＣｏｌｏｎ２６細胞株を移植した腫瘍移植マウスに対して、色素量として２６ｎｍｏｌを尾静脈から投与して光音響イメージングを実施した。さらに、ＩＣＧ−Ｓｕｌｆｏ−ＯＳｕとグリシンとをモル比１：１０で反応させたもの（以下ではＩＣＧ−Ｇｌｙと略す）を合成し、対照サンプルとした。光音響イメージングは投与１時間後に実施し、対照であるＩＣＧ−Ｇｌｙの光音響信号強度に対する相対光音響強度として算出した。照射レーザー波長は７９７ｎｍとした。
【０１５５】
【表９】
2014185312.tif 000052
【０１５６】
表８、表９の結果から腫瘍光音響イメージングにおいて化合物は対照サンプルに比べて高い腫瘍集積性が示され、ＰＥＧの分子量および構造が重要なパラメーターであることが示された。
【０１５７】
（実施例１１）から（実施例１２）
（特定のシアニン系の化合物とＰＥＧとの化合物２）
（標識体の作製）
本実施例において特定のシアニン系の化合物は式７および式８に記載の化合物を用いた。特定のシアニン系の色素はＢｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ６  （１９９８）  ２１７９―２１８４（以下、非特許文献２とする）に記載の方法で作製したものを用いた。色素１ｍｇ（１．２５マイクロモル）をＤＭＳＯ  １００マイクロリットルで溶解させた。一方で、ＰＥＧを秤量しクロロホルムとメタノールの混合溶媒（容積比９：１）でＰＥＧを溶解させ、ＮＨ２濃度を０．６２５ｍＭとした。実施例１１で作製した化合物の化学構造式は式（Ｉ−２）、実施例１２で作製した化合物の化学構造式は式（Ｉ−３）にそれぞれ示した通りである。本実施例で用いたＰＥＧ誘導体は、モノアミン直鎖状ＭＥ−２００ＥＡ（日油社製，Ｍｗ２００００）を用いた。本実施例で式７から得られるＰＥＧ化合物は式Ｉ−３、式８から得られるＰＥＧ化合物は式Ｉ−２でそれぞれ記載されるものである。
【０１５８】
色素とＰＥＧの反応モル比２で反応させた。色素の反応時の濃度は０．６ｍＭとした。遮光下、室温で２４時間回転撹拌した後に溶媒を留去し、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液中に再分散させた。その結果、式７に記載の化合物は単独では水中で分散させることができないものの、式Ｉ−３に記載のようにＰＥＧと共有結合を形成することにより水中での分散が可能となることが明らかとなった。続いて０．２２μｍシリンジフィルターで反応溶液をろ過し、特定のシアニン系の色素とＰＥＧとが共有結合した化合物を得た。作製後は４度、遮光下で保存した。
【０１５９】
（体内動態評価）
ＢＡＬＢ／ｃ  Ｓｌｃ−ｎｕ／ｎｕマウスにＣｏｌｏｎ２６細胞を皮下に移植した腫瘍マウスモデルに対して得られたＰＥＧ化合物を、１００マイクロリットル（色素量として１３ｎｍｏｌ）静脈注射した。投与２４時間後のＣｏｌｏｎ２６細胞塊および血液中の集積性を実施例１２中に記載の方法で評価した。その結果をまとめたものを表１０に示す。特定のシアニン系の色素はＰＥＧとの共有結合により水中で分散性を獲得し、これを体内に投与した際に腫瘍集積性を示すことを確認した。
【０１６０】
【表１０】
2014185312.tif 000053
【０１６１】
（捕捉分子を有するＰＥＧ）
（一本鎖抗体ｈｕ４Ｄ５−８ｓｃＦｖの調製）
ＨＥＲ２へ結合するＩｇＧの可変領域の遺伝子配列（ｈｕ４Ｄ５−８）を基に、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）をコードする遺伝子ｈｕ４Ｄ５−８ｓｃＦｖを作製した。まずｈｕ４Ｄ５−８のＶＬ、ＶＨ遺伝子をペプチド（ＧＧＧＧＳ）３をコードするｃＤＮＡで連結したｃＤＮＡを作製した。５’末端には制限酵素ＮｃｏＩ  を、３’末端には制限酵素ＮｏｔＩの認識サイトを導入した。以下に塩基配列を示す。
配列番号１：
5’-CCATGGATATCCAGATGACCCAGTCCCCGAGCTCCCTGTCCGCCTCTGTGGGCGATAGGGTCACCATCACCTGCCGTGCCAGTCAGGATGTGAATACTGCTGTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGAAAAGCTCCGAAACTACTGATTTACTCGGCATCCTTCCTCTACTCTGGAGTCCCTTCTCGCTTCTCTGGATCCAGATCTGGGACGGATTTCACTCTGACCATCAGCAGTCTGCAGCCGGAAGACTTCGCAACTTATTACTGTCAGCAACATTATACTACTCCTCCCACGTTCGGACAGGGTACCAAGGTGGAGATCAAAGGCGGTGGTGGCAGCGGTGGCGGTGGCAGCGGCGGTGGCGGTAGCGAGGTTCAGCTGGTGGAGTCTGGCGGTGGCCTGGTGCAGCCAGGGGGCTCACTCCGTTTGTCCTGTGCAGCTTCTGGCTTCAACATTAAAGACACCTATATACACTGGGTGCGTCAGGCCCCGGGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGCAAGGATTTATCCTACGAATGGTTATACTAGATATGCCGATAGCGTCAAGGGCCGTTTCACTATAAGCGCAGACACATCCAAAAACACAGCCTACCTGCAGATGAACAGCCTGCGTGCTGAGGACACTGCCGTCTATTATTGTTCTAGATGGGGAGGGGACGGCTTCTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCGGCGGCCGC-3’
（制限酵素の認識サイトを下線で示す。）
【０１６２】
上記遺伝子断片ｈｕ４Ｄ５−８ｓｃＦｖをプラスミドｐＥＴ−２２ｂ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ社）のＴ７／ｌａｃプロモーターの下流に挿入した。具体的には、制限酵素ＮｃｏＩとＮｏｔＩで消化処理したｐＥＴ−２２ｂ（＋）に、上記のｃＤＮＡをライゲーションする。
【０１６３】
この発現プラスミドを大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３））に形質転換し、発現用菌株を得た。得られた菌株をＬＢ−Ａｍｐ培地４ｍｌで一晩前培養後、全量を２５０ｍｌの２ｘＹＴ培地に添加し、２８度、１２０ｒｐｍで８時間振とう培養した。その後、終濃度１ｍＭでＩＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ（−）−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を添加し、２８度で一晩培養した。培養した大腸菌を８０００ｘｇ、３０分、４度で遠心分離し、その上清の培養液を回収した。得られた培養液の６０％重量の硫酸アンモニウムを添加し、塩析によりタンパク質を沈殿させた。塩析操作した溶液を一晩４度で静置後、８０００ｘｇ、３０分、４度で遠心分離することで沈殿物を回収した。得られた沈殿物を２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ／５００  ｍＭ  ＮａＣｌバッファーに溶解し、１Ｌの同バッファーへ透析した。透析後のタンパク質溶液を、Ｈｉｓ・Ｂｉｎｄ（登録商標）Ｒｅｓｉｎ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）を充てんしたカラムへ添加し、Ｎｉイオンを介した金属キレートアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。精製したｈｕ４Ｄ５−８ｓｃＦｖは、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりシングルバンドを示し分子量は約２８ｋＤａであることを確認した。以下に調製された抗体のアミノ酸配列を示す。以後、ｈｕ４Ｄ５−８ｓｃＦｖをｓｃＦｖと略す。
配列番号２：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSAAALEHHHHHHGGC
（ＰＥＧへのｓｃＦｖの修飾）
【０１６４】
前述の通り調製したｓｃＦｖを５ｍＭ  ＥＤＴＡを含むリン酸バッファー（２．６８ｍＭ  ＫＣｌ／１３７ｍＭ  ＮａＣｌ／１．４７ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４／１ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４／５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）にバッファー置換後、１０倍モル量のトリ（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）によって、２５度で約２時間、還元処理した。
【０１６５】
一方で、１．５ｍＬプラスチックチューブにモノマレイミド直鎖状ＭＥ−４００ＭＡ（日油社製、ＭＷ４００００）を秤量した。ＥＤＴＡを含まないリン酸バッファーで１７．９μＭとなるよう希釈し、前記還元処理したｓｃＦｖと混合し、２５度で１５時間以上反応させた。仕込みの反応モル比（ｓｃＦｖ／ＰＥＧ）は、１でおこなった。ここで「仕込み」とは反応系に加えられた、という意味であり、「仕込みの反応モル比」とは、反応系に加えられたｓｃＦｖとＰＥＧのモル濃度比のことをいう。次いで、ＩＣＧ−Ｓｕｌｆｏ−ＯＳｕのＤＭＳＯ溶液（１２．５ｍＭ）と、前記ｓｃＦｖとＰＥＧの混合溶液とを混合し、２５度で２時間反応させた。仕込みの反応モル比（ＩＣＧ−Ｓｕｌｆｏ−ＯＳｕ／ｓｃＦｖ）は、３でおこなった。この溶液をフィルターろ過（ポアサイズ１．２μｍ）した後、３０ｋＤａのポアサイズのアミコンウルトラ−４（日本ミリポア社）を用いた限外ろ過によりＰＥＧへ結合しなかったｓｃＦｖを除去して、ＩＣＧおよびｓｃＦｖが修飾されたＰＥＧを得た。得られたこの化合物をｓｃＦｖ−  ＰＥＧ４０と略す。
【０１６６】
（ＰＥＧへのＡｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標）の修飾）
ＨＥＲ２へ結合するＡｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標）溶液（Ａｆｆｉｂｏｄｙ社製）へ、終濃度２０ｍＭとなるようジチオスレイトール（ＤＴＴ）溶液を添加し、遮光下で２５度で２時間、還元処理した。次いで、ＰＤ−１０カラム（ＧＥヘルスケア社製）を用いて、反応溶液からＤＴＴを除去した。次いで、１．５ｍＬプラスチックチューブに、モノマレイミド直鎖状ＭＥ−２００ＭＡ（日油社製、ＭＷ２００００）または、モノマレイミド直鎖状ＭＥ−４００ＭＡ（日油社製、ＭＷ４００００）を秤量した。秤量したＰＥＧを、ＥＤＴＡを含まないリン酸バッファーで各１４３μＭとなるよう希釈し、前記還元処理したＡｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標）と混合し、２５度で１５時間以上反応させた。仕込みの反応モル比（Ａｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標）／ＰＥＧ）は、１でおこなった。次いで、ＩＣＧ−Ｓｕｌｆｏ−ＯＳｕのＤＭＳＯ溶液（１２．５ｍＭ）と、前記Ａｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標）とＰＥＧの混合溶液とを混合し、２５度で２時間反応させた。仕込みの反応モル比（ＩＣＧ−Ｓｕｌｆｏ−ＯＳｕ／Ａｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標））は、１でおこなった。この溶液をフィルターろ過（ポアサイズ１．２μｍ）した後、１０ｋＤａのポアサイズのアミコンウルトラ−４（日本ミリポア社）を用いた限外ろ過によりＰＥＧへ結合しなかったＡｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標）を除去して、ＩＣＧおよびＡｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標）が修飾されたＰＥＧを得た。得られたこの化合物のうち、ＭＥ−２００ＭＡを使用したものをＡｆ−ＰＥＧ２０、ＭＥ−４００ＭＡを使用したものをＡｆ−  ＰＥＧ４０と略す。
【０１６７】
（ＰＥＧへのペプチドの修飾）
ＨＥＲ２への結合性が確認されているペプチド配列のカルボキシル末端に６アミノ酸を付与したペプチドを合成した（配列番号３）。このペプチド配列のカルボキシル末端に存在するシステイン残基はマレイミド基と反応し、共有結合を形成することができる。
配列番号３：
MARSGLGGKGSC
【０１６８】
１．５ｍＬプラスチックチューブに、モノマレイミド直鎖状ＭＥ−２００ＭＡ（日油社製、ＭＷ２００００）または、モノマレイミド直鎖状ＭＥ−４００ＭＡ（日油社製、ＭＷ４００００）を秤量した。秤量したＰＥＧを、ＥＤＴＡを含まないリン酸バッファーで各１．５７ｍＭとなるよう希釈し、前述のペプチド溶液と混合し、２５度で１５時間以上反応させた。仕込みの反応モル比（ペプチド／ＰＥＧ）は、１でおこなった。次いで、ＩＣＧ−Ｓｕｌｆｏ−ＯＳｕのＤＭＳＯ溶液（１２．５ｍＭ）と、前記ペプチドとＰＥＧの混合溶液とを混合し、２５度で２時間反応させた。仕込みの反応モル比（ＩＣＧ−Ｓｕｌｆｏ−ＯＳｕ／ペプチド）は、１でおこなった。この溶液をフィルターろ過（ポアサイズ１．２μｍ）した後、１０ｋＤａのポアサイズのアミコンウルトラ−４（日本ミリポア社）を用いた限外ろ過によりＰＥＧへ結合しなかったペプチドを除去して、ＩＣＧおよびペプチドが修飾されたＰＥＧを得た。得られたこの化合物のうち、ＭＥ−２００ＭＡを使用したものをｐｅ−ＰＥＧ２０、ＭＥ−４００ＭＡを使用したものをｐｅ−  ＰＥＧ４０と略す。
【０１６９】
（捕捉分子を有するＰＥＧのＨＥＲ２結合性評価）
捕捉分子を有するＰＥＧについて表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）によって、標的分子であるＨＥＲ２に対する結合性を評価した。ＳＰＲはＰｒｏｔｅｏｎ（登録商標）ＸＰＲ３６（バイオラッドラボラトリーズ社製）を用いて測定した。Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｈｕｍａｎ  ＥｒｂＢ２／Ｆｃ  Ｃｈｉｍｅｒａ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を酢酸バッファー（ｐＨ５．０）に溶解させ、ＧＬＭセンサーチップ表面のカルボキシル基へのアミンカップリングにより固定化した。固定化量は、約３０００ＲＵ（Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｕｎｉｔ）であった。次に、捕捉分子を有するＰＥＧを０．００５％のＴｗｅｅｎ２０を含むリン酸バッファー（ｐＨ７．４）で種々の濃度へ希釈した後、流速５０マイクロリットル／分でフローセルへ注入した。測定時間は、注入時間（結合）１２０秒、注入停止後経過時間（解離）１２０秒であった。結合速度論解析実験においては、１：１ラングミュアフィッティングモデルを用いてセンサーグラムを分析した。算出された結合解離定数（ＫＤ）を表１１にまとめた。いずれのサンプルでもＨＥＲ２に対する結合性が確認され、特にｓｃＦｖ−ＰＥＧ４０および、Ａｆ−ＰＥＧ２０、Ａｆ−ＰＥＧ４０では強い結合性が確認できた。
【０１７０】
【表１１】
2014185312.tif 000054
【０１７１】
（捕捉分子を有するＰＥＧの腫瘍集積性評価）
腫瘍集積性の評価においては、雌の非近交系ＢＡＬＢ／ｃ  Ｓｌｃ−ｎｕ／ｎｕマウス（購入時６週齢）（日本エスエルシー株式会社）を用いた。マウスに担癌させる前の１週間、標準的な食餌、寝床を用い、自由に食餌および飲料水を摂取できる環境下でマウスを順応させた。イメージング実験の約１週間前に１ｘ１０６個のＣｏｌｏｎ２６マウス大腸癌細胞（理化学研究所）を、マウスの右肩および右腿に、１ｘ１０６個のＨＥＲ２遺伝子を人工的に導入したＣｏｌｏｎ２６マウス大腸癌細胞をマウスの左肩および左腿にそれぞれ皮下注射した。実験時までに、腫瘍は全て定着しており、マウスの体重は１７〜２２ｇであった。担癌させたマウスに捕捉分子を有するＰＥＧまたは、Ｄ２０ｋ−ＩＣＧ２を、２００マイクロリットル（ＩＣＧとして１３ｎｍｏｌ）を静脈注射した。投与２４時間後にマウスを炭酸ガスで安楽死させた後、癌組織をそれぞれ摘出した。癌組織をプラスチックチューブに移し、癌組織の重量に対し１．２５倍量の１％ＴｒｉｔｏｎＸ―１００水溶液を添加し、プラスチックペッスルを用いてホモジネートした。次いで、癌組織重量の２０．２５倍量のＤＭＳＯを加えて、腫瘍組織中の色素抽出液を調製した。一方で、捕捉分子を有するＰＥＧを投与していない担癌させたマウスから癌組織を摘出した。癌組織をプラスチックチューブに移し、癌組織の重量に対し１．２５倍量の１％ＴｒｉｔｏｎＸ―１００水溶液を添加し、プラスチックペッスルを用いてホモジネートすることで、癌組織のＴｒｉｔｏｎＸ―１００溶液を調製した。次いで、既知濃度の捕捉分子を有するＰＥＧ溶液を、前記癌組織のＴｒｉｔｏｎＸ―１００溶液で種々の濃度へ希釈し、この希釈溶液に対し、２０．２５倍量のＤＭＳＯを加えて検量用標準液を調製した。ＩＶＩＳ（登録商標）Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ  ２００  Ｓｅｒｉｅｓ（ＸＥＮＯＧＥＮ）を用いて、プラスチックチューブの状態で、腫瘍組織中の色素抽出液および検量用標準液の蛍光強度を測定することで癌組織中の色素量を定量した。
【０１７２】
前記腫瘍集積性評価において、２４時間後にマウスを炭酸ガスで安楽死させる直前に、尾静脈から血液を採取した。採取した血液をプラスチックチューブに移し、血液の体積に対し４．５倍量の１％ＴｒｉｔｏｎＸ―１００水溶液を添加した。次いで、血液の体積の４．５倍量のＤＭＳＯを加えて、血液溶解液を作製した。ＩＶＩＳ（登録商標）Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ  ２００  Ｓｅｒｉｅｓ（ＸＥＮＯＧＥＮ）を用いて、プラスチックチューブの状態で、血液溶解液の蛍光強度を測定した。一方で、既知の濃度の粒子溶液を、１％ＴｒｉｔｏｎＸ―１００水溶液で種々の濃度に希釈し、希釈した粒子溶液と、同量の未投与マウスから採取した血液とを混合した。次いで、血液の体積に対し、前述の希釈した粒子溶液と合わせて４．５倍量となるよう１％ＴｒｉｔｏｎＸ―１００水溶液を添加した。次いで、血液の体積の４．５倍量のＤＭＳＯを添加して検量線用血液粒子溶液を作製した。採取した血液サンプルと同様に、蛍光強度を測定し検量線を作成した。次に、血液溶解液の蛍光強度、作成した検量線を用いて、血中濃度を算出した。算出されたそれぞれの血中濃度を全投与量で除することで、投与量あたりの血液中の存在量の割合（％ＩＤ）を算出した。
【０１７３】
腫瘍集積性の結果および血液中の存在量の結果を図３にまとめた。Ｃｏｌｏｎ２６マウス大腸癌細胞へ集積した量を白、ＨＥＲ２遺伝子を人工的に導入したＣｏｌｏｎ２６マウス大腸癌細胞へ集積した量を黒、投与量あたりの血液中の存在量の割合を灰色で表わした。
【０１７４】
捕捉分子を有するＰＥＧはいずれもＤ２０ｋ−ＩＣＧ２に比較して腫瘍集積量が低下する傾向がみられたが、Ａｆ−ＰＥＧ４０は遜色ない腫瘍集積性と血液中存在量が確認できた。更にＣｏｌｏｎ２６マウス大腸癌細胞へ集積した量に対するＨＥＲ２遺伝子を人工的に導入したＣｏｌｏｎ２６マウス大腸癌細胞へ集積した量を算出し、表１２にまとめた。捕捉分子を有するＰＥＧはいずれもＤ２０ｋ−ＩＣＧ２に比較して、ＨＥＲ２遺伝子を人工的に導入したＣｏｌｏｎ２６マウス大腸癌細胞へ多く集積しており、捕捉分子によるＨＥＲ２結合性の効果を確認した。
【０１７５】
【表１２】
2014185312.tif 000055
【図３】
2014185312.tif 000075
【図１】
2014185312.tif 000076
【図２】
2014185312.tif 000077
【配列表】
2014185312000001.app