(57)【要約】【課題】抗癌活性及びDNAポリメラーゼ阻害活性を有する化合物を見出すと共に、同化合物を利用した新たな医薬組成物を提供することを解決すべき課題とした。【解決手段】土壌から分離したカビから、癌細胞増殖抑制活性及びDNAポリメラーゼ阻害活性を有する化合物を単離した。さらに、該化合物がマクロファージ増殖抑制活性を有することを確認した。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式（Ｉ）又は式（Ｖ）で表される化合物又はその薬学的に許容し得る塩。
【化１】
2014185108.tif 000010
【化２】
2014185108.tif 000011
（式中、Xは、OH、H、NH3、NO2、C1-C3アルキル基、C2-C4アルキニル基、又は、C2-C4アルケニル基から選択される）
【請求項２】
前記化合物が、5,8-ジヒドロキシ-6-メチル-7-(2-オキソプロピル)-2,3-ジヒドロナフタレン-1,4-ジオンである請求項１に記載の化合物又はその薬学的に許容し得る塩。
【請求項３】
前記化合物が、4,5,8-トリヒドロキシ-6-メチル-7-(2-オキソプロピル)-3,4-ジヒドロナフタレン-1(2H)-オンである前項１に記載の化合物又はその薬学的に許容し得る塩。
【請求項４】
請求項１に記載の化合物、請求項２に記載の化合物、5-ヒドロキシ-8-メトキシ-2,4-ジメチル-2,3-ジヒドロナフト[1,2-b]フラン-6,9-ジオン、3,5,6,9-テトラヒドロキシ-7-メトキシ-3-メチル-3,4,4a,5-テトラヒドロ-1H-ベンゾ[g]イソクロメン-10(10aH)-オン、又は、それらの薬学的に許容し得る塩を有効成分として含有する医薬組成物。
【請求項５】
請求項１に記載の化合物、請求項２に記載の化合物、5-ヒドロキシ-8-メトキシ-2,4-ジメチル-2,3-ジヒドロナフト[1,2-b]フラン-6,9-ジオン、3,5,6,9-テトラヒドロキシ-7-メトキシ-3-メチル-3,4,4a,5-テトラヒドロ-1H-ベンゾ[g]イソクロメン-10(10aH)-オン、又は、それらの薬学的に許容し得る塩を有効成分として含有する抗癌剤。
【請求項６】
請求項１に記載の化合物、請求項２に記載の化合物、5-ヒドロキシ-8-メトキシ-2,4-ジメチル-2,3-ジヒドロナフト[1,2-b]フラン-6,9-ジオン、3,5,6,9-テトラヒドロキシ-7-メトキシ-3-メチル-3,4,4a,5-テトラヒドロ-1H-ベンゾ[g]イソクロメン-10(10aH)-オン、又は、それらの薬学的に許容し得る塩を有効成分として含有するDNAポリメラーゼ阻害剤。
【請求項７】
請求項１に記載の化合物、請求項２に記載の化合物、5-ヒドロキシ-8-メトキシ-2,4-ジメチル-2,3-ジヒドロナフト[1,2-b]フラン-6,9-ジオン、3,5,6,9-テトラヒドロキシ-7-メトキシ-3-メチル-3,4,4a,5-テトラヒドロ-1H-ベンゾ[g]イソクロメン-10(10aH)-オン、又は、それらの薬学的に許容し得る塩を有効成分として含有する抗炎症剤、抗アレルギー剤又は抗リウマチ剤。
【請求項８】
請求項１に記載の化合物、請求項２に記載の化合物、5-ヒドロキシ-8-メトキシ-2,4-ジメチル-2,3-ジヒドロナフト[1,2-b]フラン-6,9-ジオン、3,5,6,9-テトラヒドロキシ-7-メトキシ-3-メチル-3,4,4a,5-テトラヒドロ-1H-ベンゾ[g]イソクロメン-10(10aH)-オン、又は、それらの薬学的に許容し得る塩を有効成分として含有する食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗癌活性、DNAポリメラーゼ阻害活性及び抗炎症活性を有する化合物に関する。
【背景技術】
【０００２】
（抗癌剤）
抗癌剤とは、悪性腫瘍に対して用いられる薬物の総称であり、アルキル化薬、代謝拮抗薬、抗癌性抗生物質、植物由来抗癌薬等が知られている。
現在、単独抗癌剤の多量投与でも効果がみられない患者には、異なる治療機序を持つ抗癌剤と併用投与することが知られている。よって、従来の抗癌剤とは異なる新たな抗癌剤の開発が望まれている。
【０００３】
（DNAポリメラーゼ）
真核生物のDNA合成酵素（DNAポリメラーゼ）は、これまでα、β、γ、δ、ε、ζ、η、θ、ι、κ、λ、μ、σ、TdT（ターミナル・デオキシヌクレオチジル・トランスフェラーゼ）及Rev1の15種類の分子種が知られている。
これらのDNAポリメラーゼは、細胞の増殖、分裂、分化等に関与している。例えば、α型はDNA複製、β型、λ型及びTdTは修復及び組換え、δ型及びε型は複製と修復、ζ〜κ型は修復を担っている。
【０００４】
（DNAポリメラーゼ阻害活性を有する化合物）
本発明者らの１人は、DNA複製型のDNAポリメラーゼα、δ、ε阻害剤には、ヒト由来癌細胞増殖抑制活性があることを報告している（参照：非特許文献１）。
また、本発明者らの１人は、DNA修復・組換え型のDNAポリメラーゼλ阻害活性と起炎剤TPAで誘導したマウス耳抗炎症活性やLPSで炎症刺激を与えたマクロファージのTNF-α産生抑制活性には正の相関があることを報告している（参照：非特許文献２）。
特に、DNAポリメラーゼβは、多くの抗癌剤及び外因性アルキル化剤によるDNAの損傷塩基の修復に関与していることが知られている。すなわち、DNAポリメラーゼβ活性を選択的に阻害することができる化合物は、多くの抗癌剤及び外因性アルキル化剤の効果を維持、向上するだけでなく、単独の抗癌剤の有効成分となることもできる。
以上により、DNAポリメラーゼ阻害活性を有する化合物は、癌、エイズ等のウイルス疾患、免疫疾患の予防・治療に期待されている。
【０００５】
（DNAポリメラーゼ阻害剤）
DNAポリメラーゼの酵素活性を阻害するDNAポリメラーゼ阻害剤は、例えば、癌に対して癌細胞の増殖抑制活性を示し、エイズに対してHIV由来逆転写酵素に対する阻害活性を示し、また、免疫疾患に対して抗原に対する特異的抗体産生を抑制する免疫抑制活性を示すことが知られている。
DNAポリメラーゼ阻害活性を有する糖脂質が、制癌剤、HIV由来逆転写酵素阻害剤、免疫抑制剤として有用であることが報告されている（参照：特許文献１）。
現在、DNAポリメラーゼ阻害剤として、ジデオキシTTP（ddTTP）、N-メチルマレイミド、ブチルフェニル-dGTPなどが知られている。また植物由来の糖脂質であるスルホキノボシルアシルグリセリドにもDNA合成酵素阻害作用が見出されている（参照：特許文献１）。
【０００６】
また、本発明者らの１人は、DNAポリメラーゼ阻害剤を複数開発して報告している（参照：特許文献２〜４）。
【０００７】
しかし、報告されたDNAポリメラーゼ阻害剤の有効成分の構造は、本発明のDNAポリメラーゼ阻害剤の有効成分の構造とは明らかに異なる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Y.Mizushina(2009) Biosci. Biotechnol. Biochem. 73, 1239-1251
【非特許文献２】Y.Mizushina(2011) 日本栄養・食糧学会誌.64,377-384
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特平１１−１０６３９５
【特許文献２】特開２０１１−３７７３０
【特許文献３】特開２０１０−１２０８８２
【特許文献４】特開２００２−２２３７５０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、抗癌活性及びDNAポリメラーゼ阻害活性を有する化合物を見出すと共に、同化合物を利用した新たな医薬組成物（DNAポリメラーゼ阻害剤、抗癌剤、抗炎症剤、抗アレルギー剤、抗リウマチ剤）を提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題を解決するために、土壌から分離したカビから、抗癌活性を有する2つの新規化合物｛参照：本発明者の一人がSF265｛「5,8-ジヒドロキシ-6-メチル-7-(2-オキソプロピル)-2,3-ジヒドロナフタレン-1,4-ジオン」（5,8-dihydroxy-6-methyl-7-(2-oxopropyl)-2,3-dihydronaphthalene-1,4-dione）｝と命名した下記式（Ｉ）及びSF267｛「4,5,8-トリヒドロキシ-6-メチル-7-(2-オキソプロピル)-3,4-ジヒドロナフタレン-1(2H)-オン」（4,5,8-trihydroxy-6-methyl-7-(2-oxopropyl)-3,4-dihydronaphthalen-1(2H)-one）｝と命名した下記式（ＩＩ）｝並びに5-ヒドロキシ-8-メトキシ-2,4-ジメチル-2,3-ジヒドロナフト[1,2-b]フラン-6,9-ジオン{5-hydroxy-8-methoxy-2,4-dimethyl-2,3-dihydronaphtho[1,2-b]furan-6,9-dione、下記式（ＩＩＩ）、本明細書中では、「SF263」と称する場合がある｝及び3,5,6,9-テトラヒドロキシ-7-メトキシ-3-メチル-3,4,4a,5-テトラヒドロ-1H-ベンゾ[g]イソクロメン-10(10aH)-オン ｛3,5,6,9-tetrahydroxy-7-methoxy-3-methyl-3,4,4a,5-tetrahydro-1H-benzo[g]isochromen-10(10aH)-one、下記式（ＩＶ）、本明細書中では、「SF264」と称する場合がある｝を単離した。
さらに、本発明者らは、該化合物がDNAポリメラーゼ阻害活性、抗癌活性及び抗炎症活性を有することを確認した。
以上により、本発明を完成した。
【００１２】
【化１】
2014185108.tif 000002
【化２】
2014185108.tif 000003
【化３】
2014185108.tif 000004
【化４】
2014185108.tif 000005
【００１３】
すなわち、本発明は以下の通りである。
「１．以下の式（Ｉ）又は（Ｖ）で表される化合物又はその薬学的に許容し得る塩。
【化５】
2014185108.tif 000006
【化６】
2014185108.tif 000007
（式中、Xは、OH、H、NH3、NO2、C1-C3アルキル基、C2-C4アルキニル基、又は、C2-C4アルケニル基から選択される）
２．前記化合物が、5,8-ジヒドロキシ-6-メチル-7-(2-オキソプロピル)-2,3-ジヒドロナフタレン-1,4-ジオンである前項１に記載の化合物又はその薬学的に許容し得る塩。
３．前記化合物が、4,5,8-トリヒドロキシ-6-メチル-7-(2-オキソプロピル)-3,4-ジヒドロナフタレン-1(2H)-オンである前項１に記載の化合物又はその薬学的に許容し得る塩。
４．前項１に記載の化合物、前項２に記載の化合物、5-ヒドロキシ-8-メトキシ-2,4-ジメチル-2,3-ジヒドロナフト[1,2-b]フラン-6,9-ジオン、3,5,6,9-テトラヒドロキシ-7-メトキシ-3-メチル-3,4,4a,5-テトラヒドロ-1H-ベンゾ[g]イソクロメン-10(10aH)-オン、又は、それらの薬学的に許容し得る塩を有効成分として含有する医薬組成物。
５．前項１に記載の化合物、前項２に記載の化合物、5-ヒドロキシ-8-メトキシ-2,4-ジメチル-2,3-ジヒドロナフト[1,2-b]フラン-6,9-ジオン、3,5,6,9-テトラヒドロキシ-7-メトキシ-3-メチル-3,4,4a,5-テトラヒドロ-1H-ベンゾ[g]イソクロメン-10(10aH)-オン、又は、それらの薬学的に許容し得る塩を有効成分として含有する抗癌剤。
６．前項１に記載の化合物、前項２に記載の化合物、5-ヒドロキシ-8-メトキシ-2,4-ジメチル-2,3-ジヒドロナフト[1,2-b]フラン-6,9-ジオン、3,5,6,9-テトラヒドロキシ-7-メトキシ-3-メチル-3,4,4a,5-テトラヒドロ-1H-ベンゾ[g]イソクロメン-10(10aH)-オン、又は、それらの薬学的に許容し得る塩を有効成分として含有するDNAポリメラーゼ阻害剤。
７．前項１に記載の化合物、前項２に記載の化合物、5-ヒドロキシ-8-メトキシ-2,4-ジメチル-2,3-ジヒドロナフト[1,2-b]フラン-6,9-ジオン、3,5,6,9-テトラヒドロキシ-7-メトキシ-3-メチル-3,4,4a,5-テトラヒドロ-1H-ベンゾ[g]イソクロメン-10(10aH)-オン、又は、それらの薬学的に許容し得る塩を有効成分として含有する抗炎症剤、抗アレルギー剤又は抗リウマチ剤。
８．前項１に記載の化合物、前項２に記載の化合物、5-ヒドロキシ-8-メトキシ-2,4-ジメチル-2,3-ジヒドロナフト[1,2-b]フラン-6,9-ジオン、3,5,6,9-テトラヒドロキシ-7-メトキシ-3-メチル-3,4,4a,5-テトラヒドロ-1H-ベンゾ[g]イソクロメン-10(10aH)-オン、又は、それらの薬学的に許容し得る塩を有効成分として含有する食品。」
【発明の効果】
【００１４】
本発明の化合物は抗癌活性、DNAポリメラーゼ阻害活性及び抗炎症活性を有する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】SF263、SF264、SF265、SF267を示す構造式
【図２】SF265、SF267の1H-1H COSY及びにHMBC相関を示す構造式
【図３】SF265のNMRデータ（CDCl3中）
【図４】SF267のNMRデータ（CDCl3中）
【図５】SF263、SF264、SF265及びSF267の各100μMにおける哺乳類由来のDNA合成酵素阻害活性（グラフの棒が短いほど強い阻害活性を示す）
【図６】SF263、SF264、SF265、SF267のヒト大腸癌細胞・正常株（HCT116 cells, p53+/+）増殖抑制活性（グラフの棒が短いほど強い増殖抑制活性を示す）
【図７】SF263、SF264、SF265、SF267のヒト大腸癌細胞・p53欠損株（HCT116 cells, p53-/-）増殖抑制活性（グラフの棒が短いほど強い増殖抑制活性を示す）
【図８】SF265のヒト大腸癌細胞・正常株（HCT116 cells, p53+/+）増殖阻害曲線
【図９】SF263、SF264、SF265、SF267のマウス・マクロファージ（抗原提示細胞：RAW264.7 cells）増殖抑制活性（グラフの棒が短いほど強い増殖抑制活性を示す）
【発明を実施するための形態】
【００１６】
（本発明の化合物）
本発明の化合物は、下記の式（Ｉ）又は式（Ｖ）で表される化合物又はその薬学的に許容し得る塩に関する。
【００１７】
【化７】
2014185108.tif 000008
【化８】
2014185108.tif 000009
【００１８】
なお、上記の式中、Xは、OH、H、NH3、NO2、C1-C3アルキル基、C2-C4アルキニル基、又は、C2-C4アルケニル基から選択される。
【００１９】
式（Ｖ）で表される化合物において、好ましくは、XがOHである化合物SF267である。
【００２０】
（薬学的に許容し得る塩）
本発明における「その薬学的に許容し得る塩」の塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩；アンモニウム塩；１級、２級又は３級アミンの塩；４級アンモニウム塩；アミノ酸塩などが挙げられる。なお、式（Ｉ）及び式（Ｖ）で表される化合物又はその薬学的に許容し得る塩は、水等の溶媒和物であってもよい。
【００２１】
（本発明の化合物の単離・精製）
式（Ｉ）、式（ＩＩ）、式（ＩＩＩ）及び式（ＩＶ）で表される化合物は、土壌（長野県長野市で採取）から分離したカビを培養して得られる培養物から単離・精製することができる。具体的には、該カビをPDB培地（ポテトデキストロース液体培地）で静置培養し、培養液から菌体を除去して得られる濾液を溶媒で抽出する。
抽出溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール等のアルコール類、１，３−ブチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール等のグリコール類、酢酸エチル、酢酸ブチル等のエステル類、エチルエーテル、プロピルエーテル、イソプロピルエーテル，テトラヒドロフラン、ジオキサン等のエーテル類、塩化メチレン、クロロホルム等のハロゲン化炭化水素等の極性有機溶媒；ヘキサン、シクロヘキサン、石油エーテル等の無極性有機溶媒等を用いることができるこれらの溶媒を単独で又は２種以上の混合溶媒として用いることもできる。
【００２２】
上記方法によって抽出物を得た後、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、クロロホルム、酢酸エチル、トルエン、ヘキサン、ベンゼン等の有機溶媒を１種又は２種以上用いた溶媒分画操作によって、得られた抽出液から活性画分を分取することができる。
更に、アルミナカラムクロマトグラフィーやシリカゲルクロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等の適当な分離精製手段を１種若しくは２種以上組み合わせて精製することもできる。
【００２３】
（本発明の化合物の用途）
本発明の式（Ｉ）〜（Ｖ）で表される化合物（「本発明の化合物」と称する場合もある）は、DNAポリメラーゼ阻害活性、癌細胞増殖抑制活性及びマクロファージ増殖抑制活性を有することから、医薬品への利用が可能である。
例えば、DNAポリメラーゼ阻害剤、抗癌剤、さらには抗炎症剤、抗アレルギー剤、抗リウマチ剤等の医薬組成物として有用である。
加えて、本発明の化合物は、さらに、医薬品開発過程におけるリード化合物として利用することもできる。
なお、ヒトと他の哺乳類のDNAポリメラーゼの構造は殆ど同じであるため、本発明のDNAポリメラーゼ阻害剤は、ヒト以外の哺乳類由来のDNAポリメラーゼ阻害剤としても利用可能である。
【００２４】
（本発明の化合物を含む医薬組成物）
本発明の化合物を有効成分とする医薬組成物（DNAポリメラーゼ阻害剤、抗癌剤、抗炎症剤、抗アレルギー剤、抗リウマチ剤等）は、単独又は自体公知の担体と共に医薬組成物となし、動物及びヒトに投与することができる。
医薬組成物の剤形としては特に制限されるものではなく必要に応じて適宜選択すればよいが、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤等の経口剤、注射剤、坐剤等の非経口剤が挙げられ、好適には非経口剤を挙げることができる。
【００２５】
非経口剤の医薬組成物の場合には、患者の年齢、体重、疾患の程度により異なるが、通常、成人で本発明の化合物の重量として1日あたり1〜200mgの静注、点滴静注、皮下注射、筋肉注射が適当である。この非経口投与剤は常法に従って製造され、希釈剤として一般に注射用蒸留水、生理食塩水、ブドウ糖水溶液、注射用植物油、ゴマ油、ラッカセイ油、大豆油、トウモロコシ油、プロピレングリコール等を用いることができる。
【００２６】
（本発明の化合物を含む食用組成物）
本発明の化合物は、医薬品への利用以外に、食品への利用が可能である。例えば、飲食品へ添加・配合することにより抗癌効果、抗発癌効果、抗炎症効果、抗アレルギー効果、抗リウマチ効果等をもった食用組成物（例えば、健康食品等）として利用することも可能である。
【００２７】
（本発明の化合物の特性）
本発明者の一人は、DNAポリメラーゼ阻害活性、抗炎症活性及び抗発癌活性の間には互いに関連性が認められることを確認している。
したがって、本発明の化合物をリードとして、DNAポリメラーゼに対する阻害活性を調べることにより、抗癌剤又は抗炎症剤の候補化合物の効率的なスクリーニングができる。本発明は、このようなスクリーニング方法も含まれる。なお、本スクリーニング方法において、DNAポリメラーゼに対する阻害活性を調べる方法は自体公知の方法を採用することができる。
【００２８】
以下、実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００２９】
（SF263、SF264、SF265、SF267の単離、精製及び構造決定）
長野県長野市から採取した土壌から分離したカビよりSF263、SF264、SF265及びSF267を単離、精製した。そして、SF263、SF264、SF265及びSF267の構造を決定した。詳細は、以下の通りである。
【００３０】
（１）菌株の単離
長野県長野市にて採取した土壌（砂）を滅菌水で懸濁した。該懸濁液をPDA培地プレート（ポテトデキストロース寒天培地プレート）に滴下し、該プレートを28 ℃で培養した。生育した菌株をPDA培地に植菌し、単一の菌株になるまで植え継いだ。
【００３１】
（２）SF263、SF264、SF265、SF267の精製
上記（１）で単離した菌株を1 L×4のPDB培地（ポテトデキストロース液体培地）を入れた4個の2 L三角フラスコで21日間、暗所で静置培養した。本菌株を培養した培養液はガーゼを用いて菌体を除去した。得られた濾液を塩化メチレン（CH2Cl2）で抽出し、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を留去し、粗抽出物を得た。この粗抽出物はシリカゲルを担体とし、展開溶媒としてクロロホルム-メタノール（100:0→10:1）を用いたカラムクロマトグラフィーによって7つのフラクション（Fr.1〜Fr.7）に分画した。
Fr.1は、シリカゲルを担体とし、展開溶媒としてトルエン-酢酸エチル（20:1→5:1）を用いたカラムクロマトグラフィーによって、8つのフラクション（Fr.1-1〜Fr.1-8）に分画した。
Fr.1-3は、シリカゲルを担体とし、展開溶媒としてヘキサン-酢酸エチル（30:1→10:1）を用いたカラムクロマトグラフィーによって、8つのフラクション（Fr.1-3-1〜Fr.1-3-8）に分画した。Fr.1-3-7から赤褐色の油状物としてSF265を得た。
Fr.1-7は、シリカゲルを担体とし、展開溶媒としてヘキサン-酢酸エチル（6:1→3:1）を用いたカラムクロマトグラフィーによって、3つのフラクション（Fr.1-7-1〜Fr.1-7-3）に分画した。Fr.1-7-2から赤色の粉末としてSF263を得た。
Fr.1-7-1は、シリカゲルを担体とし、展開溶媒としてヘキサン-酢酸エチル（5:1→3:1）を用いたカラムクロマトグラフィーによって、4つのフラクション（Fr.1-7-1-1〜Fr.1-7-1-4）に分画した。Fr.1-7-1-2から薄橙色の粉末としてSF264を得た。
Fr. 4は、シリカゲルを担体とし、展開溶媒としてトルエン-酢酸エチル（12:1→3:1）を用いたカラムクロマトグラフィーによって、11個のフラクション（Fr.4-1〜Fr.4-11）に分画した。Fr.4-3から茶褐色の油状物としてSF267を得た。
【００３２】
（３）SF263、SF264、SF265、SF267の構造決定
化合物SF263、SF264、SF265、SF267は、HR-ESIMS、1H-NMR、13C-NMR、1H-1H COSY、HMBC、HMQCによって構造決定した。
図１には、SF263、SF264、SF265、SF267の構造並びに炭素番号を示す構造式を示す。
図２には、SF265、SF267の1H-1H COSY並びにHMBC相関を示した。
図３には、CDCl3で測定したSF265の1H-NMR、13C-NMRデータを示した。
図４には、CDCl3で測定したSF267の1H-NMR、13C-NMRデータを示した。
【００３３】
（３−１）SF263の構造解析結果
構造解析の結果、SF263は、公知化合物である5-ヒドロキシ-8-メトキシ-2,4-ジメチル-2,3-ジヒドロナフト[1,2-b]フラン-6,9-ジオン｛5-hydroxy-8-methoxy-2,4-dimethyl-2,3-dihydronaphtho[1,2-b]furan-6,9-dion｝であることを特定した。
【００３４】
（３−２）SF264の構造解析結果
構造解析の結果、SF264は、公知化合物である3,5,6,9-テトラヒドロキシ-7-メトキシ-3-メチル-3,4,4a,5-テトラヒドロ-1H-ベンゾ[g]イソクロメン-10(10aH)-オン｛3,5,6,9-tetrahydroxy-7-methoxy-3-methyl-3,4,4a,5-tetrahydro-1H-benzo[g]isochromen-10(10aH)-one｝であることを特定した。
【００３５】
（３−３）SF265の構造解析結果
○SF265のスペクトルデータは以下の通りである。
HR ESIMS m/z 285.0720 [M+Na]+（calcd for 285.0733）
○SF265のNMRデータ解析結果は以下の通りである。
SF265は、HR-ESIMSから分子式C14H14O5を持つことが示された。C-1（δ 201.3）及びC-4 （δ 201.5）の化学シフト値から二つのケトン基の存在が示唆された。さらに、図３に示す1H及び13C-NMRスペクトラ、及びH-2、H-3からC-1、C-4、C-4a、C-8aへのHMBC相関よりジヒドロナフトキノンの構造を有することが示唆された。また、C-10 （δ 204.3）の化学シフト値、及びH-11からC-9、C-10へのHMBC相関からアセトニル基の存在が示唆された。ジヒドロナフトキノンの置換基の位置は主にHMBC実験によって決定された。H-9からC-6、C-7、C-8へのHMBC相関よりアセトニル基は7位で結合すると決定した。メチルプロトン（δ 2.22）からC-5、C-6、C-7へのHMBC相関よりメチル基は6位で結合すると決定した。また、ヒドロキシプロトン（δ 12.47）からC-4a、C-5、C-6へのHMBC相関、及びヒドロキシプロトン（δ 12.51）からC-7、C-8、C-8aへのHMBC相関よりヒドロキシ基は5位と8位に結合していると決定した。
以上より、SF265を5,8-ジヒドロキシ-6-メチル-7-(2-オキソプロピル)-2,3-ジヒドロナフタレン-1,4-ジオン{5,8-dihydroxy-6-methyl-7-(2-oxopropyl)-2,3-dihydronaphthalene-1,4-dione}であると決定した。
【００３６】
（３−４）SF267の構造解析結果
○SF267のスペクトルデータは以下の通りである。
HR ESIMS m/z 287.0881 [M+Na]+（calcd for 287.0889）
○SF267のNMRデータ解析結果は以下の通りである。
SF267は、HR-ESIMSから分子式C14H16O5を持つことが示された。図４に示す1H及び13C-NMRスペクトラより、SF267はSF265と類似した構造を有しており、C-4においてのみ異なっていることが示唆された。SF265においてC-4（δ 201.5）の13Cシグナルが、SF267ではC-4（δ 68.4）に置換されていた。さらに、SF267においてH-4（δ 5.18）が観測された。このことは、HR-ESIMSの結果とも一致し、C-4アルコールの存在を示唆している。
以上より、SF267を4,5,8-トリヒドロキシ-6-メチル-7-(2-オキソプロピル)-3,4-ジヒドロナフタレン-1(2H)-オン{4,5,8-trihydroxy-6-methyl-7-(2-oxopropyl)-3,4-dihydronaphthalen-1(2H)-one}であると決定した。
【実施例２】
【００３７】
（DNAポリメラーゼアッセイ）
本発明の化合物（SF263、SF264、SF265、SF267）が、DNAポリメラーゼ活性を阻害するかどうかを確認した。詳細は、以下の通りである。
【００３８】
哺乳類由来の高活性を有するDNAポリメラーゼは、文献「J. Nat. Prod. 75 (2012) p135-141」に記載の方法に準じて精製した。DNAポリメラーゼα、βに対する標準DNAポリメラーゼ基質溶液は、文献「Biochim. Biophys. Acta 1308(1996) p256-262」及び「Biochim.Biophys. Acta 1336 (1997) p509-521」に記載の方法に準じて作製した。DNAポリメラーゼκは、DNAポリメラーゼαと同じ方法により作製した。
DNAポリメラーゼ反応に関し、活性化DNA（例えば、ウシデオキシリボヌクレアーゼI処理済仔ウシ胸腺DNA）及び４つのdNTPs（[3H]-dTTPを含む）は、それぞれ、DNA鋳型プライマー基質及びヌクレオチド基質に使用した。
本化合物であるSF263、SF264、SF265及びSF267は、それぞれ、DMSOで溶解し、そして、30秒間超音波処理した。超音波処理後の4μLサンプルを、pH7.5の50mM Tris-HCl｛1mMジチオスレイトール、50%グリセロール（by vol）及び1mM EDTAを含む｝中の各酵素（0.05units）16μLと混合し、0℃、10分間保存した。そして、各化合物を含む溶液8μLをDNAポリメラーゼ酵素液16μLと混合し、37℃、60分間保温した。そして、本混合液（各化合物-酵素液）の各8μL量を、DNAポリメラーゼ酵素液16μLと混合し、37℃、60分間保温した。阻害物質を含まない活性を100％に設定し、各阻害物質濃度による相対的な活性を測定した。DNAポリメラーゼ活性の１単位は、37℃、60分間及び通常の反応条件下｛参照文献：Biochim. Biophys. Acta 1308 (1996) p256-262、Biochim. Biophys. Acta 1336 (1997) p509-521｝において、1nmol dNTP（特に、dTTP）が合成DNA鋳型プライマーに触媒作用により取り込まれる酵素の量として設定した。
【００３９】
（本発明の化合物のDNAポリメラーゼアッセイの結果）
本発明の化合物のDNAポリメラーゼアッセイの結果を図５に示す。
図５から明らかなように、SF265は、DNAポリメラーゼα、β、κ活性をすべて阻害することを確認した。また、SF265は、本発明のすべての化合物の中で最もDNAポリメラーゼ活性を阻害した。
以上により、本発明の化合物を有効成分とする医薬組成物は、DNAポリメラーゼ活性阻害剤とすることができる。
【実施例３】
【００４０】
（癌細胞増殖抑制活性の確認及びSF265のLD50値の測定）
本発明の化合物（SF263、SF264、SF265、SF267）が癌抑制遺伝子p53の有無による癌細胞増殖抑制活性を有するかどうかを確認した。さらには、SF265のLD50値を測定した。詳細は、以下の通りである。
【００４１】
（癌細胞増殖抑制活性の測定）
本実施例に用いた細胞は、ヒト大腸癌由来HCT116細胞である。より詳しくは、野生型p53(HCT116 p53+/+)及び同系p53欠失型(HCT116p53-/-)を使用した。培地としては、McCoy's 5A培地｛牛胎児血清10％、ペニシリン（100units/mL）及びストレプトマイシン（100mg/mL）を添加している｝を用いた。SF263、SF264、SF265、SF267は水に難溶であるため、一度DMSO（ジメチルスルホキシド）に溶解し、そのものを上記の培地に溶かした。なお、培地内に存在するDMSOの終濃度は、すべての試験区で1％以下になっており、本実施例で用いた細胞の増殖の抑制にDMSOが関わる可能性は否定できる。培養は、96穴マイクロプレートで行った。各ウェルに3.0×105個の細胞を植え込み、１つの試験濃度に対し５ウェルずつ与えた。またポジティブコントロールとして、培地に1％のDMSOを含むものを用いた。培養は、5％CO2インキュベーターにて37℃で行った。
前記添加後は、5％CO2インキュベーター内、37℃で24時間培養し、各試験区の細胞生存率の判定を行った。生存率の判定は、文献｛「RapidColorimetric Assay for Cellular Growth and Surviva1:Application toProliferation and Cytotoxicity Assays」、TimMosmann, J. Immunol. Methods、65巻、55頁（1983）｝に記載されているMTTアッセイ法を用いた。即ち、上記２４時間後テトラゾリウム塩MTTを添加し、更に４時間培養した。生細胞による還元を経て生産するホルマザン量を生細胞に比例するとみなし、570nmの光学密度（O.D.）で定量した。
細胞生存率は下記式により算出した。
細胞生存率（％） = 試験区のO.D.［570nm］／対照区のO.D.［570nm］
得られた結果は５ウェルの平均である。
【００４２】
（癌細胞増殖抑制活性の測定結果）
癌細胞増殖抑制活性の測定結果を図６及び図７に示す。図６及び図７の結果から明らかなように、SF263、SF264、SF265及びSF267は、p53発現の有無に関わらずヒト大腸癌細胞（HCT116）の増殖を抑制した。さらに、100μMで50％以上細胞増殖を抑制する物質は有効であると考えており、SF263、SF264、SF265及びSF267はいずれも100μMで50％以上の増殖抑制を示した。SF265が最も高い増殖抑制効果を示した。
加えて、SF263、SF264、SF265及びSF267は、p53発現の有無に関わらずヒト大腸癌細胞の増殖を抑制できることにより、p53発現は該化合物の大腸癌細胞の増殖抑制効果に影響を与えないことを確認した。
さらに、本発明の化合物は、HCT116細胞のp53正常株及びp53欠失株の両方で強い増殖抑制を示した。一般的に、癌細胞はp53異常となっているため、p53欠損株においても癌細胞増殖抑制活性があれば抗癌剤としての実用化が期待できる。
以上により、SF263、SF264、SF265及びSF267は、DNAポリメラーゼ活性阻害効果だけではなく、癌細胞増殖抑制効果も有する。これにより、SF263、SF264、SF265及びSF267を有効成分とする医薬組成物は、DNAポリメラーゼ活性阻害剤だけでなく抗癌剤とすることができる。
【００４３】
（SF265のLD50値の測定）
上記に示した培地に、各濃度のSF265を溶解した。ただし、SF265は水に難溶であるため、一度DMSO（ジメチルスルホキシド）に溶解し、そのものを上記の培地に溶かした。なお、培地内に存在するDMSOの終濃度は、すべての試験区で1％以下になっており、本実施例で用いた細胞の増殖の抑制にDMSOが関わる可能性は否定できる。培養は、96穴マイクロプレートで行った。各ウェルに3.0×105個の細胞を植え込み、１つの試験濃度に対し５ウェルずつ与えた。またポジティブコントロールとして、培地に1％のDMSOを含むものを用いた。
SF265添加後は、5％CO2インキュベーター内、37℃で24時間培養し、各試験区の細胞生存率の判定を行った。生存率の判定は、文献｛「RapidColorimetric Assay for Cellular Growth and Surviva1: Application toProliferation and Cytotoxicity Assays」、Tim Mosmann, J. Immunol. Methods、65巻、55頁（1983）｝に記載されているMTTアッセイ法を用いた。即ち、上記24時間後テトラゾリウム塩MTTを添加し、更に4時間培養した。生細胞による還元を経て生産するホルマザン量を生細胞に比例するとみなし、570nmの光学密度（O.D.）で定量した。なお、細胞生存率は、前記方法と同様に行った。
【００４４】
（SF265のLD50値の測定結果）
培養細胞増殖抑制活性の測定結果を図８に示す。図８の結果から、SF265 のHCT116細胞の50％増殖抑制濃度（LD50値）は0.46μMであることを確認した。
以上により、SF265は、非常に低い濃度で癌細胞の増殖を抑制できることを確認した。
【実施例４】
【００４５】
（マクロファージ増殖抑制活性の確認）
本発明の化合物（SF263、SF264、SF265、SF267）のマクロファージ増殖抑制活性を以下の方法で測定した。
【００４６】
（マクロファージ増殖抑制活性の測定）
本実施例に用いた細胞は、マウス・マクロファージ細胞（RAW264.7 cells）である。培地としてはRPMI1640培地｛日水製薬（株）製｝に、牛胎児血清10％（v/v）を添加したものを用いた。培養は、5％CO2インキュベーターにて37℃で行った。
【００４７】
1μM、10μM 又は100μMのSF263、SF264、SF265及びSF267を、上記に示した培地に溶解した。ただし、SF263、SF264、SF265及びSF267は水に難溶であるため、一度DMSO（ジメチルスルホキシド）に溶解し、そのものを上記の培地に溶かした。なお、培地内に存在するDMSOの終濃度は、すべての試験区で1％以下になっており、本実施例で用いたマクロファージ細胞の増殖の抑制にDMSOが関わる可能性は否定できる。培養は、96穴マイクロプレートで行った。各ウェルに3.0×105個の細胞を植え込み、１つの試験濃度に対し５ウェルずつ与えた。またポジティブコントロールとして、培地に1％のDMSOを含むものを用いた。
【００４８】
SF263、SF264、SF265及びSF267添加後は、5％CO2インキュベーター内、37℃で24時間培養し、各試験区の細胞生存率の判定を行った。生存率の判定は、文献｛「RapidColorimetric Assay for Cellular Growth and Surviva1: Application to Proliferationand Cytotoxicity Assays」、Tim Mosmann, J. Immunol. Methods、65巻、55頁（1983）｝に記載されているMTTアッセイ法を用いた。即ち、上記24時間後テトラゾリウム塩MTTを添加し、更に4時間培養した。生細胞による還元を経て生産するホルマザン量を生細胞に比例するとみなし、570nmの光学密度（O.D.）で定量した。なお、細胞生存率は、実施例３に記載の方法と同様に行った。
【００４９】
（マクロファージ増殖抑制活性の測定結果）
マクロファージ増殖抑制活性の測定結果を図９に示す。図９の結果から明らかなように、SF263、SF264、SF265及びSF267はマウス・マクロファージ細胞の増殖を抑制した。さらに、SF265は、SF263、SF264及びSF267と比較して、非常に高いマウス・マクロファージ細胞の増殖抑制効果を示した。
以上により、本発明の化合物がマクロファージ増殖抑制活性を持つことを確認した。これにより、本発明の化合物が抗炎症剤、抗アレルギー剤、抗リウマチ剤に利用できる。
【産業上の利用可能性】
【００５０】
新規なDNAポリメラーゼ阻害剤、抗癌剤及び抗炎症剤を提供することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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