(57)【要約】【課題】ビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８（ＦＥＲＭ  Ｐ−１０６５７）を、迅速、簡便かつ特異的に検出できる、ビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８検出用オリゴヌクレオチド、該オリゴヌクレオチドを含むプライマーセット、ならびに、これらを利用するビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８の検出方法を提供することを課題とする。【解決手段】ビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８に特異的な特定の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを設計することにより、ビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８を特異的に検出する方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８（ＦＥＲＭ  Ｐ−１０６５７）検出および／または定量用オリゴヌクレオチドであって、配列表配列番号１〜４のいずれかに示される塩基配列またはそれと相補的な塩基配列を含む、前記オリゴヌクレオチド。
【請求項２】
ビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８（ＦＥＲＭ  Ｐ−１０６５７）検出および／または定量用キットであって、請求項１記載のいずれかのオリゴヌクレオチドを含む、前記キット。
【請求項３】
ビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８（ＦＥＲＭ  Ｐ−１０６５７）検出および／または定量用プライマーセットであって、
（ａ）配列表配列番号１に示される塩基配列からなるプライマーと、
（ｂ）配列番号２に示される塩基配列からなるプライマーとの組み合わせ、
または、
（ｃ）配列番号３に示される塩基配列からなるプライマーと、
（ｄ）配列番号４に示される塩基配列からなるプライマーとの組み合わせ、
である前記プライマーセット。
【請求項４】
ビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８（ＦＥＲＭ  Ｐ−１０６５７）の検出方法であって、
請求項１に記載のオリゴヌクレオチド、または、請求項３に記載のプライマーセットを用いる前記検出方法。
【請求項５】
ＰＣＲ法によりビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８（ＦＥＲＭ  Ｐ−１０６５７）を検出する、請求項４に記載の検出方法。
【請求項６】
ビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８（ＦＥＲＭ  Ｐ−１０６５７）の定量方法であって、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド、または、請求項３に記載のプライマーセットを用いる前記定量方法。
【請求項７】
定量的ＰＣＲ法によりビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８（ＦＥＲＭ  Ｐ−１０６５７）の菌数を定量するものである、請求項６に記載の定量方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロバイオティクスとして整腸作用や寿命延長効果など様々な効果を有するビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８（寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１０６５７、本明細書中において以下同じ）を検出するためのオリゴヌクレオチドに関する。特に、ビフィドバクテリウム属の他の菌種、ビフィドバクテリウム・ロンガムの他の菌株と区別して、特異的にビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８を検出することが可能なオリゴヌクレオチドに関する。
また、該オリゴヌクレオチドを含むプライマーセットおよび、これらを用いたビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８の検出方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８は、ヒト腸管細胞に高い親和性を有し、経口で投与した時、生存して腸管内に到達し、長期間腸管内に常在することが可能である。また、ビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８は、腸管に長く留まって腸内環境を整え、便通を改善することが知られている。さらに、ビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８は加齢に伴う代謝異常の予防や、糖尿病の合併症予防や改善など、様々な健康効果を有するプロバイオティクス乳酸菌である。
【０００３】
ビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８を含む発酵乳やチーズなどの食品において、プロバイオティクスとしてこれら菌株の菌数を確保することが重要である。また、ヒトやマウスなどの実験動物の腸内において、摂取したビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８を正確に識別し、菌数を把握することも、菌の有効性を評価する上で重要である。したがってビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８の菌数を迅速かつ簡便に測定することが求められる。
【０００４】
特にヒトの腸内には、ビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８と同属同種の乳酸菌ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）が高頻度で検出されることが報告されており、これらの菌株と摂取したビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８とを区別して検出、定量することが求められる。
【０００５】
従来、生物試料中や環境中の菌の同定は、菌を培養し、菌形やグラム染色などの形態観察、糖の発酵性や酵素活性などの生化学検査などにより行われてきた。しかし、これらの手法では、培養に時間がかかることや熟練の技術が要求されるなど、多くの問題があった。また近年、検出対象とする菌によって様々な選択培地が開発・販売されているが、同属同種の似た性質をもつ菌が混在する試料中で特定の菌株だけを特異的に検出できる培地を作ることは困難であった。
【０００６】
一方で、近年、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法によって特定の微生物を検出する方法が報告されている。これまでに実施されているＰＣＲ法による菌の識別法は、１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子や２３ＳリボソームＲＮＡ遺伝子などに由来する特定遺伝子領域を用いるものが多い。特に１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子は原核生物に普遍的に存在し、属および菌種間に共通な塩基配列があるため、１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列を基準株と比較して種を決定することができるなど、菌種の同定には有効である。しかしながら、この識別法についても同属同種の異株間の識別は困難であった。
【０００７】
近年、菌株の識別方法として、制限酵素によって切断した染色体ＤＮＡの電気泳動パターンの違いを識別するＲｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｌｅｎｇｔｈ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ（ＲＦＬＰ）法（非特許文献１）や、ランダムに設定した１０塩基程度のオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲ法を行い、増幅されたＰＣＲ産物の電気泳動パターンを比較するＲａｎｄｏｍ Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）法（非特許文献２）などが報告されている。
【０００８】
また、定量的ＰＣＲ法によって、ある特定の菌種を簡便に定量する方法も報告されている（特許文献１、２）。
【０００９】
なお、ＲＡＰＤ法によって得られた、ある特定の菌株に特異的なバンドの塩基配列を用いて該菌株を特異的に検出するプライマー（非特許文献３、４）や、ある菌株に多く含まれるＩＳ配列（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ、挿入塩基配列）を利用した特異的検出プライマー（特許文献３）などが報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開２００６−１４９４００号公報
【特許文献２】特開２００７−２０４２３号公報
【特許文献３】特開２００８−８６２８５号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】腸内細菌学雑誌、１９, １９３−１９８、２００５
【非特許文献２】Ｌｅｔｔｅｒｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ, ３５, ３７０−３７４、２００２
【非特許文献３】Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ, １２６, ２１０−２１５、２００８
【非特許文献４】Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ, １１０, ２０９−２１７、２０１０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
特許文献１、２には、定量的ＰＣＲ法によって、ある特定の菌を簡便に定量する方法が開示されているが、これらの方法も属や種レベルで菌数を定量するものであり、菌株レベルで菌数を定量する簡便な方法は開示されていない。
また、非特許文献１、２に開示されているＲＦＬＰ法やＲＡＰＤ法は、いずれも定量性がなく、ＲＦＬＰ法は、精度は高いが工程が複雑で時間がかかること、ＲＡＰＤ法は迅速な検出が可能であるが、使用する機器によって結果が異なることや再現性が劣るなどの問題がある。
さらに、非特許文献３、４および特許文献３の方法は、対象とする各菌株を特異的に検出するものであるが、ビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８に関する方法は開示されていない。
本発明は、ビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８を特異的に、迅速かつ簡便に検出できるビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８検出用オリゴヌクレオチド、該オリゴヌクレオチドを含むプライマーセットを提供することを目的とするものである。さらに、本発明は、これらを利用してビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８の検出方法、ビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８の定量方法を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記目的を達成するため、本発明者らは鋭意検討した結果、ビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８に特異的な塩基配列を見出し、これを含むオリゴヌクレオチドを設計した。そして、このオリゴヌクレオチドまたはこれらのオリゴヌクレオチドをプライマーとして組合せたプライマーセットを用いることでビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８を特異的に検出でき、また、定量できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１４】
すなわち本発明は、以下の（１）〜（７）に示される、ビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８検出用オリゴヌクレオチド、該オリゴヌクレオチドを含むプライマーセット、ビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８の検出方法に関する。
（１）ビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８（ＦＥＲＭ  Ｐ−１０６５７）検出および／または定量用オリゴヌクレオチドであって、配列表配列番号１〜４のいずれかに示される塩基配列またはそれと相補的な塩基配列を含む、前記オリゴヌクレオチド。
（２）ビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８（ＦＥＲＭ  Ｐ−１０６５７）検出および／または定量用キットであって、上記（１）に記載のいずれかのオリゴヌクレオチドを含む、前記キット。
（３）ビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８（ＦＥＲＭ  Ｐ−１０６５７）検出および／または定量用プライマーセットであって、
（ａ）配列表配列番号１に示される塩基配列からなるプライマーと、
（ｂ）配列番号２に示される塩基配列からなるプライマーとの組み合わせ、
または、
（ｃ）配列番号３に示される塩基配列からなるプライマーと、
（ｄ）配列番号４に示される塩基配列からなるプライマーとの組み合わせ、
である前記プライマーセット。
（４）ビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８（ＦＥＲＭ  Ｐ−１０６５７）の検出方法であって、
上記（１）に記載のオリゴヌクレオチド、または、上記（３）に記載のプライマーセットを用いる前記検出方法。
（５）ＰＣＲ法によりビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８（ＦＥＲＭ  Ｐ−１０６５７）を検出する、上記（４）に記載の検出方法。
（６）ビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８（ＦＥＲＭ  Ｐ−１０６５７）の定量方法であって、
上記（１）に記載のオリゴヌクレオチド、または、上記（３）に記載のプライマーセットを用いる前記定量方法。
（７）定量的ＰＣＲ法によりビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８（ＦＥＲＭ  Ｐ−１０６５７）の菌数を定量するものである、上記（６）に記載の定量方法。
【発明の効果】
【００１５】
本発明により、ビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８（ＦＥＲＭ  Ｐ−１０６５７）を迅速かつ簡便に検出することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明のプライマーセットを用いたＰＣＲ法によって得られた、各ビフィドバクテリウム・ロンガム（１０株）のＤＮＡの増幅産物を電気泳動で確認した結果を示した図である（実施例２）。（１−１）は、配列番号１のプライマーと配列番号２のプライマーとの組み合わせによる結果を示し、（１−２）は、配列番号３のプライマーと配列番号４のプライマーとの組み合わせによる結果を示す。各レーンに供したビフィドバクテリウム・ロンガムの株名は以下のとおりである。レーン１：ＪＣＭ１２１７Ｔ、レーン２：ＪＣＭ７０５２、レーン３：ＦＥＲＭ  Ｐ−６５４８、レーン４：ＳＢＴ０４８６、レーン５：ＳＢＴ０４９１、レーン６：ＳＢＴ０５７７、レーン７：ＳＢＴ０７０７、レーン８：ＳＢＴ０７３７、レーン９：ＳＢＴ０７４０、レーン１０：ＳＢＴ２９２８（ＦＥＲＭ  Ｐ−１０６５７）
【図２】本発明のプライマーセットを用いたＰＣＲ法によって得られた、マウスの糞便から抽出したＤＮＡの増幅産物を電気泳動で確認した結果を示した図である（実施例３）。左図は、配列番号１のプライマーと配列番号２のプライマーとの組み合わせによる結果を示し、右図は、配列番号３のプライマーと配列番号４のプライマーとの組み合わせによる結果を示す。各レーンに供したサンプルは以下のとおりである。Ａ：ビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８を投与したマウスの糞便から抽出したＤＮＡ、Ｂ：ビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８を投与しなかったマウスの糞便から抽出したＤＮＡ
【図３】本発明のプライマーセットを用いたＰＣＲ法によって得られた、ヒトの糞便から抽出したＤＮＡの増幅産物を電気泳動で確認した結果を示した図である（実施例４）。（３−１）は、配列番号１のプライマーと配列番号２のプライマーとの組み合わせによる結果を示し、（３−２）は、配列番号３のプライマーと配列番号４のプライマーとの組み合わせによる結果を示す。各レーンに供したサンプルは以下のとおりである。Ａ：ビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８を投与する前の被験者Ａの糞便から抽出したＤＮＡ、Ｂ：ビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８を投与する前の被験者Ｂの糞便から抽出したＤＮＡ、Ｃ：ビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８を投与する前の被験者Ｃの糞便から抽出したＤＮＡ、Ａ’：ビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８を投与した後の被験者Ａの糞便から抽出したＤＮＡ、Ｂ’：ビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８を投与した後の被験者Ｂの糞便から抽出したＤＮＡ、Ｃ’：ビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８を投与した後の被験者Ｃの糞便から抽出したＤＮＡ
【図４】本発明のプライマーセットを用いた定量的ＰＣＲ法によって、ヒトの糞便中におけるビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８の菌数を測定した結果を示した図である（実施例５）。サンプルＡ，Ｂ，Ｃ、Ａ’、Ｂ’、Ｃ’は図３に同じである。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明のビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８（ＦＥＲＭ  Ｐ−１０６５７）検出および／または定量用オリゴヌクレオチドは、これらのビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８（ＦＥＲＭ  Ｐ−１０６５７）に近縁の菌株を認識することなく、ビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８（ＦＥＲＭ  Ｐ−１０６５７）を特異的に認識し、ビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８（ＦＥＲＭ  Ｐ−１０６５７）を特異的にし、定量できるオリゴヌクレオチドとなる。
【００１８】
上記のヌクレオチドは、例えば、以下の方法により設計できる。
まず、ビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８とビフィドバクテリウム・ロンガムの基準株ＪＣＭ１２１７Ｔの全ゲノム配列(Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＣＰ０１５０６７)を比較し、ビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８の有するＤＮＡのうちビフィズス菌の基準株ＪＣＭ１２１７Ｔにはない配列部分を抽出する。これらの配列とその周辺の配列でいくつかオリゴヌクレオチドを作成した。通常のＰＣＲ条件で増幅可能であること、他の領域では増幅断片が生じない配列であることに加え、定量的ＰＣＲにも適用可能な８０〜５５０ｂｐの長さの増幅領域を増幅可能で、かつ、Ｔｍ値が５５〜６５℃の範囲内になるようなヌクレオチドの設計を行う。
【００１９】
上記の設計により得られたオリゴヌクレオチドの配列はＤＤＢＪ(ＤＮＡ Ｄａｔａ   Ｂａｎｋ ｏｆ Ｊａｐａｎ)でＢＬＡＳＴ検索する。ビフィドバクテリウム・ロンガムの同菌種他菌株、例えば独立行政法人理化学研究所の公開菌株であるビフィドバクテリウム・ロンガムＪＣＭ１２１７Ｔ、ＪＣＭ７０５２など、を用いたＰＣＲ法によってオリゴヌクレオチドの特異性、つまりビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８（ＦＥＲＭ  Ｐ−１０６５７）でのみ特異的に検出されることを確認することにより選択される。
【００２０】
本発明のビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８検出用オリゴヌクレオチドは、ビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８のＤＮＡに特異的な塩基配列を含み、試料などに含まれるビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８を特異的に検出できるオリゴヌクレオチドのことをいう。
ここで、ビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８のＤＮＡに特異的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとは、ビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８のＤＮＡを特異的に認識し得る塩基配列からなるオリゴヌクレオチドのことをいい、このようなオリゴヌクレオチドとして、ビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８のＤＮＡに特異的に含まれる塩基配列またはこれらと実質的に相同な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。
【００２１】
前記実質的に相同な塩基配列としては、例えば、ビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８のＤＮＡに含まれる特異的な塩基配列と８０％以上の同一性を有する塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、８５％以上の同一性を有する塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、９０％以上の同一性を有する塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、９５％以上の同一性を有する塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであって、ビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８のＤＮＡを特異的に認識し得る塩基配列からなるオリゴヌクレオチドなどがあげられる。これらのオリゴヌクレオチドが、試料中のビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８を特異的に認識し得る程度の相同性を有していればよく、共存する菌株によっては、オリゴヌクレオチドの配列が数塩基程度異なっていてもＰＣＲ条件などを変えることによって特異性を示せれば、本発明のオリゴヌクレオチドに含まれる。
【００２２】
このような、ビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８のＤＮＡに特異的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとして、具体的には、配列表配列番号１〜４に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドがあげられる。また、これらの塩基配列に相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドなども含まれる。
また、これらの塩基配列と実質的に相同性を有する配列としては、上述のとおり、配列表配列番号１〜４に示される配列と８０％以上の同一性を有する塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、８５％以上の同一性を有する塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、９０％以上の同一性を有する塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、９５％以上の同一性を有する塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであって、ビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８のＤＮＡを特異的に認識し得る塩基配列からなるオリゴヌクレオチドなどがあげられる。
本発明のビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８検出用オリゴヌクレオチドは、このような配列表配列番号１〜４に示される塩基配列を一つ以上含むオリゴヌクレオチドであればよく、配列表配列番号１と配列番号２の組み合わせ、もしくは配列番号３と配列番号４の組み合わせからなるオリゴヌクレオチドでもよい。
本発明のビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８検出および／または定量用オリゴヌクレオチドは、独自に設計し合成したものであってもよく、ＤＮＡ合成業者に合成を委託したものであってもよい。
【００２３】
本発明のビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８検出用オリゴヌクレオチドは、試料などに含まれるビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８の検出のためのいずれの方法にも使用できるオリゴヌクレオチドであることが好ましい。
例えば、ビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８由来のＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ法や、定量的ＰＣＲ法に使用することができ、また、ＦＩＳＨ法やサザンハイブリダイゼーション、ドットハイブリダイゼーションにおいてプローブなどとして使用できるオリゴヌクレオチドであることが好ましい。
【００２４】
本発明の検出には、ビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８の存在の有無を調べる定性的な検出のほか、ＳＢＴ２９２８の存在量を定量的に調べるような定量的な検出（測定）の意味も含まれる。したがって、本明細書において、「検出」または「定量」という用語は、特に断りのない限り、検出対象であるビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８の存在の証明および／または定量も含めて広義に解釈するものとする。
【００２５】
本発明のビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８の検出に用いる試料としては、ビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８が存在し得る試料であればいずれのものであってもよい。例えば、乳酸菌の混合培養物やヨーグルトやチーズなどの乳酸菌を含む食品、マウスやラットなどの実験動物やヒトの糞便などを挙げることができる。
【００２６】
これらの試料から核酸を抽出する方法は、例えば、Ｌｙｓｏｚｙｍｅなどの酵素やビーズなどで物理的に細胞を破壊して抽出する方法、また極東製薬工業株式会社のＭＯＲＡ−ＥＸＴＲＡＣＴなどの市販の抽出キットを使用することもでき、特に限定されるものではない。
【００２７】
本発明のビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８検出用キットとは、ビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８検出用オリゴヌクレオチドを１つ以上含み、試料などに含まれるビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８を検出するためのキット、定量するためのキット、または検出および定量するためのキットのことをいう。
該キットには、ビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８検出用オリゴヌクレオチドを含み他のいずれか１つ以上の構成品を含むものであればよく、例えば、ビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８の検出に必要な試薬、他の株、種、属を検出するための試薬、ＰＣＲ用試薬（耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ）、緩衝液、説明書などが挙げられる。
【００２８】
本発明のビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８検出用プライマーセットとは、試料などに含まれるビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８を検出するためのプライマーを２以上含むセットのことをいう。
本発明のプライマーとしては、前記のビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８のＤＮＡに特異的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドが用いられ、具体的には配列表配列番号１〜４に示されるオリゴヌクレオチドが挙げられる。組み合わせとしては、（ａ）配列表配列番号１に示される塩基配列からなるプライマーと、（ｂ）配列番号２に示される塩基配列からなるプライマーとの組み合わせ、または、（ｃ）配列番号３に示される塩基配列からなるプライマーと、（ｄ）配列番号４に示される塩基配列からなるプライマーとの組み合わせ、が挙げられる。
このようなプライマーのバリエーションとしては、プライマーの反応条件にもよるが、配列表配列番号１〜４に示される塩基配列からなるプライマーそのもの以外にも、配列表配列番号１〜４に示される塩基配列の３’末端側の連続する１５塩基を３’末端に含む３０塩基以下のプライマー、配列表配列番号１〜４に示される塩基配列そのものを３’末端に含む３０塩基以下のプライマーも好ましく用いられる。
したがって、以上を整理すれば、本発明のプライマーセットとしては、以下の〔１〕〜〔６〕が挙げられる。
〔１〕（ａ）配列表配列番号１における３’末端側の連続する１５塩基を３’末端に含む３０塩基以下のプライマーと、
（ｂ）配列表配列番号２における３’末端側の連続する１５塩基を３’末端に含む３０塩基以下のプライマーとの組み合わせ、
〔２〕（ｃ）配列表配列番号３における３’末端側の連続する１５塩基を３’末端に含む３０塩基以下のプライマーと、
（ｄ）配列表配列番号４における３’末端側の連続する１５塩基を３’末端に含む３０塩基以下のプライマーとの組み合わせ、
〔３〕（ａ）配列表配列番号１の塩基配列を３’末端に含む３０塩基以下のプライマーと、
（ｂ）配列表配列番号２の塩基配列を３’末端に含む３０塩基以下のプライマーとの組み合わせ、
〔４〕（ｃ）配列表配列番号３の塩基配列を３’末端に含む３０塩基以下のプライマーと、
（ｄ）配列表配列番号４の塩基配列を３’末端に含む３０塩基以下のプライマーとの組み合わせ、
〔５〕（ａ）配列表配列番号１に示される塩基配列からなるプライマーと、
（ｂ）配列番号２に示される塩基配列からなるプライマーとの組み合わせ、
〔６〕（ｃ）配列番号３に示される塩基配列からなるプライマーと、
（ｄ）配列番号４に示される塩基配列からなるプライマーとの組み合わせ。
【００２９】
本発明のビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８の検出方法は、本発明のビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８検出用オリゴヌクレオチドを用いて行う検出方法、ビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８検出用プライマーセットを用いて行う検出方法であれば、従来知られるいずれの検出方法を用いても良い。
このような検出方法として、ＰＣＲ法、ＦＩＳＨ法、サザンハイブリダイゼーションやドットハイブリダイゼーションなどをあげることができる。
このうち、ＰＣＲ法によるビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８の検出方法では、本発明のビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８検出および／または定量用オリゴヌクレオチドを用いる以外は、通常用いられるいずれのＰＣＲ試薬および機器を使用することも可能であり、特に限定されるものではない。
ＰＣＲ反応条件については、使用する試薬や装置などに応じて、適宜設定すればよいが、例えば、９４℃５分変性後、９４℃３０秒、６０℃３０秒、７２℃５０秒で４０サイクル、最後に７２℃７分反応させるなどがあげられる。このＰＣＲ反応条件は、ＰＣＲ法に関する基本的な知識を有していれば、試料などに応じて調整することは容易に行えるため、特に限定されるものではない。
【００３０】
また、ＰＣＲ法によって得られたビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８のＤＮＡの増幅産物は、通常用いられるＰＣＲ産物の確認方法で確認することができる。例えば、アガロースゲルなどにＰＣＲ反応サンプルおよび所定のサイズマーカーをアプライして一定時間ゲル電気泳動を行い、電気泳動後のゲルをエチジウムブロマイドなどの染色液で染色した後、ＵＶ照射などでＰＣＲ法での増幅産物の有無および断片サイズを確認することができる。
【００３１】
本発明のビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８の定量方法は、本発明のビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８検出用オリゴヌクレオチドを用いて行う定量方法、またはビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８検出用プライマーセットを用いて行う定量方法であれば、従来から知られるいずれの方法を用いても良い。
このような定量方法として、定量的ＰＣＲ法などをあげることができる。
定量的ＰＣＲ法によるビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８の定量方法では、本発明のビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８用オリゴヌクレオチドを用いる以外は、通常用いられる定量的ＰＣＲ用の試薬および機器を使用することも可能であり、特に限定されるものではない。
例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のＰｏｗｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘなど市販の試薬を用いることができる。またあらかじめ菌数を測定してから抽出を行ったビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８のＤＮＡを段階希釈して検量線を作成しておくことにより、サンプル中の未知のビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８の菌数を測定することもできる。
【００３２】
本発明のビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８検出用プライマーにより、例えば、ＰＣＲ法によって増幅産物が確認された場合、ビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８であることが同定できる。またヨーグルトやチーズなどの食品や糞便など、複数の菌株が共存する試料中であれば、サンプル中にビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８が存在していることが判別できる。さらに定量的ＰＣＲ法を行うことにより、サンプル中のビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８の菌数も定量可能である。
【００３３】
したがって本発明のビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８検出用オリゴヌクレオチドを用いることにより、ビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８を容易に判別することができる。また、ビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８の菌体または同菌体を含む飲食品などを工業的に製造するに際し、菌数の測定や発酵状態の管理を容易に行うことができる。さらに、本発明のオリゴヌクレオチドを用いることにより、実験動物やヒトの腸内における当該菌数を把握することができる。
本発明は、通常のＰＣＲ法によって、ビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８の検出、定量が可能であるため、特殊な技術を必要とせず、分析の精度および再現性がよい。また、ビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８のＤＮＡの特定の塩基配列部分をターゲットとして検出を行うため、生菌だけでなく、死菌も含めたビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８の検出、定量が可能となる。
【００３４】
以下に、本発明の実施例などをあげて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例】
【００３５】
［実施例１］
ビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８（ＦＥＲＭ  Ｐ−１０６５７）検出用オリゴヌクレオチドの設計
以下の方法により、ビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８検出用オリゴヌクレオチドを設計した。
ビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８のゲノム配列とビフィドバクテリウム・ロンガムの基準株のゲノム配列(Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＣ_０１５０６７)を比較し、ビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８の有するゲノム配列のうちビフィドバクテリウム・ロンガムの基準株にはないゲノム配列部分の塩基配列を抽出した。これらの塩基配列と、その周辺の配列との間でいくつかオリゴヌクレオチドを設計した。
これらのオリゴヌクレオチドは、通常のＰＣＲ条件で増幅可能であること、他のゲノム配列の領域では増幅断片が生じない塩基配列であることに加え、定量的ＰＣＲ法にも適用可能な８０〜５５０ｂｐの長さの領域を増幅でき、かつ、Ｔｍ値が５５〜６５℃の範囲内になるように設計した。
設計した各オリゴヌクレオチドの塩基配列をＤＤＢＪ(ＤＮＡ Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ ｏｆ Ｊａｐａｎ)でＢＬＡＳＴ検索し、設計したオリゴヌクレオチドが、ビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８以外のビフィドバクテリウム・ロンガムの他の菌株や近縁のビフィドバクテリウム属の基準株と相同性の高い塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを除いた。
【００３６】
このように設計された本発明のビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８検出用オリゴヌクレオチドは、表１に示される、配列表配列番号１〜４のいずれか一種以上の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドである。また、これらの塩基配列と実質的に相同な塩基配列を含むオリゴヌクレオチドも、本発明のビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８検出用オリゴヌクレオチドとなる。
表１に示される配列番号１〜４の一種以上の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを用いることによって、ビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８以外の菌株を検出せず、ＳＢＴ２９２８株のみを特異的に検出することができた。
【００３７】
【表１】
2014064543.tif 000002
【００３８】
［実施例２］
ビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８の検出
１．供試菌株および培養条件
１）ビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８（ＦＥＲＭ  Ｐ−１０６５７）
ビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８をＧＡＭ＋０．１％グルコース液体培地で３７℃、１６時間嫌気培養し、培養菌体を得た。
２）近縁株
ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）に属するビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８の近縁株である、次の（１）〜（９）の９菌株について、それぞれＧＡＭ＋０．１％グルコース液体培地で３７℃、１６時間嫌気培養し、培養菌体を得た。
（１）〜（３）の菌株は、特許寄託株もしくは菌株の分譲機関である独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンター微生物材料開発室より入手した。菌株名の最後に「Ｔ」とつくものは、Ｔｙｐｅ  Ｓｔｒａｉｎ（基準株）であることを示している。（４）〜（９）の菌株は、当社で健康なヒトの糞便より分離して保有している由来の異なるビフィドバクテリウム・ロンガムの菌株である。
（１）ＪＣＭ１２１７Ｔ、（２）ＪＣＭ７０５２、（３）ＦＥＲＭ  Ｐ−６５４８、（４）ＳＢＴ０４８６（５）ＳＢＴ０４９１、（６）ＳＢＴ０５７７、（７）ＳＢＴ０７０７、（８）ＳＢＴ０７３７、（９）ＳＢＴ０７４０
【００３９】
２．ＤＮＡ抽出およびＰＣＲ法による検出
上記１．の各菌株の培養菌体からＬｙｓｏｚｙｍｅ−ＳＤＳ法によりＤＮＡを抽出し、それぞれ鋳型ＤＮＡとして本発明の配列番号１と配列番号２との組み合わせ、または配列番号３と配列番号４との組み合わせからなるオリゴヌクレオチドを用いて、ＰＣＲ法を行った。
ＰＣＲ反応液は、０．５μＭ プライマー（フォワードプライマー/リバースプライマー）、鋳型ＤＮＡ１μｌと、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ＥＤＴＡ ｂｕｆｆｅｒ(ｐＨ８．５)、Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、２００μＭ ｄＮＴＰ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2となるように入れ、滅菌水で全量を２０μｌにした。
ＰＣＲ反応は、９４℃５分変性後、９４℃３０秒、 ６０℃３０秒、 ７２℃３０秒で４０サイクル、最後に７２℃５分反応を行った。ＰＣＲ反応後、２％のアガロースゲルを用いて電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色によりＰＣＲ法で増幅した特異的なバンドを検出した。
【００４０】
ＰＣＲ法による増幅産物の確認結果を図１に示した。その結果、ビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８由来の試料についてのみバンドが検出され（レーン１０）、前記(１）〜（９）に示したＳＢＴ２９２８以外のビフィドバクテリウム・ロンガム９株についてはバンドが検出されなかった（レーン１〜レーン９）。
したがって、本発明の配列番号１と配列番号２との組み合わせ、または配列番号３と配列番号４との組み合わせからなるオリゴヌクレオチドは、同属同種のビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８以外の菌株を検出せず、ＳＢＴ２９２８株のみを特異的に検出できることが示された。
【００４１】
［実施例３］
マウスの腸内におけるビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８（ＦＥＲＭ  Ｐ−１０６５７）の検出
４週齢雄性Ｓｅｎｅｓｃｅｎｅ−Ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ  Ｍｏｕｓｅ（ＳＡＭ）Ｐ８系マウスに、ビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８を含むＡＩＮ−９３Ｍ組成に準じた飼料を２週間自由摂取させた後、マウスの新鮮な糞便よりＤＮＡを抽出した（Ａ）。また、比較として、ビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８を含まない飼料を２週間自由摂取させたマウスの新鮮な糞便よりＤＮＡを抽出した（Ｂ）。
これらを鋳型ＤＮＡとして、配列番号１と配列番号２との組み合わせまたは配列番号３と配列番号４との組み合わせからなるオリゴヌクレオチドを用いて、実施例２と同様にＰＣＲ法を行った。
【００４２】
ＰＣＲ法による増幅産物の確認結果を図２に示した。
その結果、図２に示されるように、ビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８を投与したマウス（レーンＡ）においてはバンドが検出され、ＳＢＴ２９２８を投与していないマウス（レーンＢ）においてはバンドが検出されなかった。ＳＢＴ２９２８がマウスの腸内に到達し、マウスの腸内に存在することを確認できた。
【００４３】
［実施例４］
ヒトの腸内におけるビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８（ＦＥＲＭ  Ｐ−１０６５７）の検出
健康な成人３名（被験者Ａ、被験者Ｂ、被験者Ｃ）にビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８含有ヨーグルト１００ｇを３日間摂取させた。その摂取前後の糞便からＤＮＡをそれぞれ抽出し、鋳型ＤＮＡとした。なお、ビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８含有ヨーグルトの摂取前に、少なくとも３週間以上ビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８を含む食品を摂取していない人を被験者とした。また、配列番号１と配列番号２との組み合わせ、または配列番号３と配列番号４との組み合わせからなるオリゴヌクレオチドを用いて、実施例２と同様にＰＣＲ法を行った。
【００４４】
ＰＣＲ法による増幅産物の確認結果を図３に示した。
その結果、図３に示されるように、いずれの被験者においても、ビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８を含むヨーグルトを摂取した後でのみバンドが検出され（レーンＡ’、Ｂ’、Ｃ’）、前記ヨーグルトを摂取する前ではバンドが検出されなかった（レーンＡ、Ｂ、Ｃ）。通常、ヒト腸内には、他のビフィドバクテリウム・ロンガムをはじめとする他の乳酸菌も存在するところ、本発明の菌株特異的なオリゴヌクレオチドにより、ＳＢＴ２９２８がヒトの腸内に到達し、ヒトの腸内に存在することを確認できた。
【００４５】
したがって、本実施例４の結果および、上記実施例１〜３の結果より、表１に示した配列番号１に記載のオリゴヌクレオチドをフォワードプライマー、配列番号２に記載のオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとして組み合わせたプライマーセットまたは配列番号３に記載のオリゴヌクレオチドをフォワードプライマー、配列番号４に記載のオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとして組み合わせたプライマーセットを用いることによりビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８を特異的に検出できることが確認できた。
【００４６】
［実施例５］
ビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８（ＦＥＲＭ  Ｐ−１０６５７）の定量（定量的ＰＣＲ法）
実施例４と同様の方法により、健康な成人３名（被験者Ａ、被験者Ｂ、被験者Ｃ）にビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８含有ヨーグルト１００ｇを３日間摂取させた。その摂取前後の糞便からＤＮＡをそれぞれ抽出し、鋳型ＤＮＡとした。定量的ＰＣＲ法により、ヒト腸内のＳＢＴ２９２８の菌数を定量した。配列番号１に記載のオリゴヌクレオチドをフォワードプライマー、配列番号２に記載のオリゴヌクレオチドをリバースプライマーまたは配列番号３に記載のオリゴヌクレオチドをフォワードプライマー、配列番号４に記載のオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとして組み合わせた。
【００４７】
定量的ＰＣＲ法は、Ａｐｐｌｉｅｄ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＶｉｉＡ ＴＭ７ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）を用いた。ＰＣＲ反応液は、Ｐｏｗｅｒ ＳＹＢＲ(登録商標) Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用い、鋳型ＤＮＡ １μｌを入れ、プライマー（フォワードプライマー/リバースプライマー）が各最終濃度０．２５μＭとなるように滅菌水で全量を２０μlにした。
ＰＣＲ反応は、９４℃１０分で変性後、９４℃２０秒, ６０℃２０秒, ７２℃５０秒で４０サイクル行った。
検量線は、ＳＢＴ２９２８のＤＮＡをＰＣＲ反応液あたり１０1〜１０6個（大便１ｇあたり１０6〜１０11個）の菌数になるよう段階希釈したものを用いて作成した。またＰＣＲ反応後、０．２℃／ｓの温度勾配で６０℃〜９５℃まで解離曲線解析を行い、反応の特異性を確認した。
【００４８】
上記の定量的ＰＣＲ法を行った結果、ＰＣＲ反応液あたりビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８の菌数が１０1〜１０6個の範囲で検量線が作成できた。検量線の傾きは−３．７５、Ｒ2＞０．９９だったため、増幅効率および定量性に問題がないことが確認できた。配列表配列番号３に記載のオリゴヌクレオチドをフォワードプライマー、配列番号４に記載のオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとした定量的ＰＣＲ法を行った結果、ＰＣＲ反応液あたりビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８の菌数が１０2〜１０6個の範囲で検量線が作成できた。検量線の傾きは−４．７５で増幅効率は低いことが示唆されたが、Ｒ2＞０．９８かつ非特異的なＰＣＲ産物が生じないため、ＰＣＲ反応液あたり１０2〜１０6個の範囲で定量可能であると判断した。
電気泳動の結果より非特異的な増幅産物はみられなかった。したがって、これらの結果より、本発明のオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットを用いることによって、ビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８の菌数が定量可能であることが確認できた。
【００４９】
定量的ＰＣＲ法により測定したヒト腸内のビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８の菌数を図４に示す。図４より、配列番号１に記載のオリゴヌクレオチドをフォワードプライマー、配列番号２に記載のオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとして定量的ＰＣＲ法を行った結果、ＳＢＴ２９２８を投与したヒトの腸内には、糞便１ｇあたり２．０〜３．０×１０8個程度のＳＢＴ２９２８が存在することがわかった（Ａ’、Ｂ’、Ｃ’）。
また、配列番号３に記載のオリゴヌクレオチドをフォワードプライマー、配列番号４記載のオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとして定量的ＰＣＲ法を行った結果、上記と同様に、ＳＢＴ２９２８を投与したヒトの腸内には、糞便１ｇあたり２．０〜３．６×１０8個程度のビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８が存在することが確認できた（Ａ’、Ｂ’、Ｃ’）。
【００５０】
［実施例６］
本発明の検出用キットによるビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８（ＦＥＲＭ  Ｐ−１０６５７）の検出
以下の構成品からなるビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８検出および／または定量用キットを作成した。
（１）プライマーセット
配列番号１と配列番号２との組み合わせ、または配列番号３と配列番号４との組み合わせからなるオリゴヌクレオチド（各０．２５〜０．５μＭ）
（２）耐熱性ポリメラーゼおよびＰＣＲ試薬を含む緩衝液
Ｇｏ  Ｔａｑ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（２００ｍＭ  ｄＮＴＰ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  Ｂｕｆｆｅｒ  ｐＨ８．５を含む）（Ｐｒｏｍｅｇａ社）
もしくは、Ｐｏｗｅｒ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）
（３）水（ヌクレアーゼが含まれないもの（Ｎｕｃｌｅａｓｅ−Ｆｒｅｅ  Ｗａｔｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社））
【００５１】
上記の検出および／または定量用キットを用いＰＣＲ法による増幅産物を２％アガロースゲル電気泳動に供した結果を図１〜図３に示す。
【産業上の利用可能性】
【００５２】
本発明の、ビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８検出用オリゴヌクレオチドを用いることにより、プロバイオティクス飲食品などに含まれるビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８を迅速かつ簡便に検出し、また、定量することも可能となる。
また、この飲食品を摂取したヒトなどの体内におけるビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８の有無や菌体数を調べることにより、ビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８による効果を予測することが可能となる。
【受託番号】
【００５３】
［寄託生物材料への言及］
（１）Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ  ＳＢＴ２９２８
イ  当該生物材料を寄託した寄託機関の名称及び住所
独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター
日本国茨城県つくば市東１丁目１番１中央第６（郵便番号３０５−８５６６）
ロ  イの寄託機関に生物材料を寄託した日付
平成元年４月１３日
ハ  イの寄託機関が寄託について付した受託番号
ＦＥＲＭ  Ｐ−１０６５７
【図４】
2014064543.tif 000003
【図１】
2014064543.tif 000004
【図２】
2014064543.tif 000005
【図３】
2014064543.tif 000006
【配列表】
2014064543000001.app