(57)【要約】【課題】電子顕微鏡での観察に供することができる試料を作製するために、導電性基板上に試料を固定化する方法を提供する。【解決手段】導電性基板を少なくとも一方の電極として含む電極対に電圧を印加することによって、試料とは逆の電荷を有するイオンを導電性基板上に分散させ、上記イオンを介して試料を導電性基板上に固定化する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
電荷を有する試料を導電性基板上に固定化する、試料の固定化方法であって、
上記導電性基板を少なくとも一方の電極として含む電極対の間に、上記試料とは逆の電荷を有するイオンを含むイオン溶液を配置するイオン供給工程と、
上記電極対に電圧を印加することによって、上記試料とは逆の電荷を有するイオンを上記導電性基板上に誘引するとともに分散させるイオン分散工程と、
上記イオン溶液に含まれる溶媒を除去する第１溶媒除去工程と、
上記イオンが分散された上記導電性基板上に、上記試料を含む試料溶液を配置し、上記イオンを介して上記試料を上記導電性基板上に固定化する試料固定化工程と、
上記試料溶液に含まれる溶媒を除去する第２溶媒除去工程と、を含んでいることを特徴とする試料の固定化方法。
【請求項２】
上記導電性基板は、表面が原子レベルで平坦であることを特徴とする請求項１に記載の試料の固定化方法。
【請求項３】
上記導電性基板は、高配向性焼結グラファイトによって形成されていることを特徴とする請求項２に記載の試料の固定化方法。
【請求項４】
上記電極対は、１対の導電性基板からなることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の試料の固定化方法。
【請求項５】
上記イオン分散工程では、上記１対の導電性基板のうち、一方の導電性基板上に陽イオンを分散させ、もう一方の導電性基板上に陰イオンを分散させることを特徴とする請求項４に記載の試料の固定化方法。
【請求項６】
上記試料は、核酸、タンパク質またはナノ粒子であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の試料の固定化方法。
【請求項７】
上記試料は、５０塩基以下または５０塩基対以下の核酸であることを特徴とする請求項６に記載の試料の固定化方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、導電性基板上への試料の固定化方法に関する。より詳細には、例えば試料を電子顕微鏡で観察するための、導電性基板上への試料の固定化方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸、タンパク質等の生体高分子、ナノ粒子等の試料の分子レベルでの観察は、生物学、医学、薬学、農学、工学等の分野において注目を集めている。例えば、生体高分子の分子レベルでの観察が可能になれば、生体高分子の構造および挙動の理解、並びに生命現象の理解が進み、医療、創薬の分野にも応用することが可能になると考えられる。また、例えば、遺伝情報を担う重要な生体高分子として知られるＤＮＡは、近年、その自己集合化特性、塩基相補性および電気伝導特性の工学的応用について注目されている。
【０００３】
上記試料の分子レベルでの観察を行う方法の例として、顕微鏡を用いた方法が挙げられる。分子レベルでの観察への応用が試みられている顕微鏡としては原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）等が挙げられる。上記顕微鏡にて試料を観察するためには、試料を基板へ固定化することが重要である。
【０００４】
これまでに、基板への試料の固定化方法に関して多くの研究がなされており、例えばＤＮＡはマイカ（雲母）表面に自己集合化構造を形成しやすいことがわかっている。マイカ基板へのＤＮＡの固定化を容易にする方法として、非特許文献１には、光架橋剤を介してＤＮＡをマイカ基板へ固定化させる方法が記載されている。非特許文献１では、マイカ基板に固定化した試料をＡＦＭによって観察している。
【０００５】
非特許文献２では、ＨＯＰＧ基板と対向電極との間に電圧を印加することによって、ＨＯＰＧ基板上にＤＮＡを固定化する方法、および、ＡＦＭによる試料の観察結果が記載されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Shlyakhtenko, L. S. et. al.，Biophysical Journal 77, p.568-576, 1999.
【非特許文献２】Oliveira Brett, A. M. and Chiorcea Paquim, A.-M.，Bioelectrochemistry 66，p.117-124，2005.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ＡＦＭでは、高さ方向（換言すれば、試料を固定化している基板の表面に対して略垂直な方向）の情報を評価できるが、ＳＥＭでは、横方向（換言すれば、試料を固定化している基板の表面に対して略平行な方向）の情報を評価できる。ＳＥＭは、基板表面に電子線を当てることによって、ＡＦＭよりも広範囲のデータを短時間に取得することができるという点で優れている。
【０００８】
しかしながら、上記従来の技術は、ＳＥＭ等の電子顕微鏡での観察に供することができる試料を作製するための、導電性基板上に効率よく試料を固定化する方法を実現できないという問題点を有している。
【０００９】
具体的には、ＳＥＭでは、試料表面の帯電を防ぐため、導電性基板に試料を固定化する必要がある。上述した非特許文献１に記載の技術ではマイカ基板を用いているが、マイカ基板は導電性を有していないため、電子顕微鏡による試料の観察が不可能であるという問題点を有していた。
【００１０】
また、導電性基板の表面が帯電している場合、電荷を有する試料を導電性基板上に固定化させることは困難である。例えば、導電性基板として知られている高配向性焼結グラファイト（ＨＯＰＧ）は表面が負に帯電しており、またＤＮＡもリン酸基が負に帯電しているため、互いに反発し合い、ＨＯＰＧ基板上にＤＮＡを固定化することはできなかった。上述した非特許文献２において使用されているＤＮＡは仔ウシの胸腺に由来するものであり、比較的長鎖のＤＮＡであると考えられる。非特許文献２に記載の技術は、基板上にＤＮＡを付着させる技術ではあるが、短鎖のＤＮＡをつなぎ合わせながら基板上に吸着させて自己集合化構造を形成させることを目的としたものではない。従って、非特許文献２に記載の技術では、ＤＮＡが自己集合化構造を形成する程度まで効率よく固定化することはできないという問題点を有していた。
【００１１】
本発明は、上記従来の問題点に鑑みてなされたものであって、その目的は電子顕微鏡での観察に供することができる試料を作製するために、導電性基板上に効率よく試料を固定化する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記の課題を解決するために、本発明に係る試料の固定化方法は、電荷を有する試料を導電性基板上に固定化する、試料の固定化方法であって、上記導電性基板を少なくとも一方の電極として含む電極対の間に、上記試料とは逆の電荷を有するイオンを含むイオン溶液を配置するイオン供給工程と、上記電極対に電圧を印加することによって、上記試料とは逆の電荷を有するイオンを上記導電性基板上に誘引するとともに分散させるイオン分散工程と、上記イオン溶液に含まれる溶媒を除去する第１溶媒除去工程と、上記イオンが分散された上記導電性基板上に、上記試料を含む試料溶液を配置し、上記イオンを介して上記試料を上記導電性基板上に固定化する試料固定化工程と、上記試料溶液に含まれる溶媒を除去する第２溶媒除去工程と、を含んでいることを特徴としている。
【００１３】
上記構成によれば、電極対に電圧を印加することによって、試料とは逆の電荷を有するイオンを導電性基板上に均一に分散させることができる。よって、電荷を有する試料を、当該試料とは逆の電荷を有するイオンを介することによって、均一に導電性基板に固定化することができる。また、上記構成によれば、導電性基板上に試料を固定することができるため、電子顕微鏡を用いて試料を観察することができる。さらに、上記構成によれば、導電性基板上に試料を自己集合化させて固定化することができる。
【００１４】
本発明に係る試料の固定化方法では、上記導電性基板は、表面が原子レベルで平坦であることが好ましい。
【００１５】
上記構成によれば、導電性基板の表面の凹凸が少ないので、試料の観察を行う場合に、試料と基板とを明確に区別することができる。
【００１６】
本発明に係る試料の固定化方法では、上記導電性基板は、高配向性焼結グラファイトによって形成されていることが好ましい。
【００１７】
高配向性焼結グラファイト（ＨＯＰＧ）は炭素原子からなり、当該炭素原子間の距離が非常に小さいため、原子レベルで平坦である。よって、上記構成によれば、試料を固定化した場合に、試料と基板とを明確に区別することができる。
【００１８】
本発明に係る試料の固定化方法では、上記電極対は、１対の導電性基板からなることが好ましい。
【００１９】
上記構成によれば、一方の導電性基板をカソードとし、もう一方の導電性基板をアノードとすることができる。よって、カソード側の導電性基板には陽イオンを、アノード側の導電性基板には陰イオンを誘引することができる。
【００２０】
本発明に係る試料の固定化方法では、上記イオン分散工程では、上記１対の導電性基板のうち、一方の導電性基板上に陽イオンを分散させ、もう一方の導電性基板上に陰イオンを分散させることが好ましい。
【００２１】
上記構成によれば、表面に陽イオンが分散した導電性基板と表面に陰イオンが分散した導電性基板とを同時に作製することができる。すなわち、負に帯電した試料を固定化するための導電性基板と正に帯電した試料を固定化するための導電性基板とを同時に提供することができる。
【００２２】
本発明に係る試料の固定化方法では、上記試料は、核酸、タンパク質またはナノ粒子であることが好ましい。
【００２３】
上記構成によれば、核酸、タンパク質またはナノ粒子を導電性基板上に自己集合化させることができ、当該核酸、タンパク質またはナノ粒子の自己集合化構造を電子顕微鏡にて観察することができる。
【００２４】
本発明に係る試料の固定化方法では、上記試料は、５０塩基以下または５０塩基対以下の核酸であることが好ましい。
【００２５】
上記構成によれば、試料の取扱いが容易である。また上記構成によれば、核酸を基板上で自己集合化させることができ、核酸の自己集合化構造を電子顕微鏡によって観察することが容易となる。
【００２６】
さらに、５０塩基以下または５０塩基対以下の核酸を導電性基板上に自己集合化させることによって、微細な網目状の構造を形成することができる。
【発明の効果】
【００２７】
本発明の試料の固定化方法は、電荷を有する試料を導電性基板上に固定化する、試料の固定化方法であるため、走査型電子顕微鏡による観察に供することが可能な試料を提供することができるという効果を奏する。
【００２８】
また、本発明の試料の固定化方法は、上記導電性基板を少なくとも一方の電極として含む電極対の間に、試料とは逆の電荷を有するイオンを含むイオン溶液を配置するイオン供給工程と、上記電極対に電圧を印加することによって、上記試料とは逆の電荷を有するイオンを上記導電性基板上に誘引するとともに分散させるイオン分散工程とを含んでいるため、導電性基板上に上記イオンを均一に分散させることができるという効果を奏する。
【００２９】
さらに、本発明の試料の固定化方法は、上記イオンが分散された上記導電性基板上に、上記試料を含む試料溶液を配置し、上記イオンを介して上記試料を上記導電性基板上に固定化する試料固定化工程を含んでいるため、電荷を有する試料を、上記イオンを介することによって、均一に導電性基板に固定化することができるという効果を奏する。
【００３０】
また、本発明の試料の固定化方法は、上記導電性基板上に試料を自己集合化させた状態で固定化することができるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】本発明の一実施形態に係る試料の固定化方法を実施するための装置の概略図である。
【図２】本発明の一実施形態に係る試料の固定化方法において用いられる導電性基板の外観を示す図である。
【図３】本発明の一実施形態に係る試料の固定化方法において用いられる導電性基板の概略図である。
【図４】本発明の実施例で用いたＨＯＰＧ基板のＡＦＭ画像である。
【図５】図５の（ａ）および（ｂ）は本発明の実施例で用いたＨＯＰＧ基板のＡＦＭ画像である。図５の（ｃ）は、図５の（ｂ）中の断面ＡＢにおける断面図である。
【図６】本発明の実施例１における、ＨＯＰＧ基板上に固定化されたＤＮＡの画像である。図６の（ａ）および（ｂ）はＡＦＭ画像である。図６の（ｃ）および（ｄ）はＦＥ−ＳＥＭ画像である。
【図７】図７の（ａ）および（ｂ）は本発明の実施例１における、ＨＯＰＧ基板上に固定化されたＤＮＡのＡＦＭ画像である。図７の（ｃ）は、図７の（ａ）中の断面ＡＢにおける断面図である。
【図８】図８の（ａ）および（ｂ）は本発明の実施例２における、ＨＯＰＧ基板上に固定化されたＤＮＡのＡＦＭ画像である。図８の（ｃ）は、図８の（ａ）中の断面ＡＢにおける断面図である。
【図９】図９の（ａ）は本発明の比較例１における、ＨＯＰＧ基板上に固定化されたＤＮＡのＡＦＭ画像である。図９の（ｂ）は、図９の（ａ）中の矢印における断面図である。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
以下、本発明の実施の形態の一例について詳細に説明するが、本発明は、これらに限定されない。
【００３３】
＜導電性基板＞
電子顕微鏡を用いて試料を観察するためには、導電性基板上に試料を固定化する必要がある。本実施の形態の試料の固定化方法は、電子顕微鏡による観察に供するプレパラートの作製に利用することができるが、勿論、当該目的に限定されない。
【００３４】
なお、本明細書において用いられる電子顕微鏡の種類としては、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）が好ましく、中でも電界放出形走査電子顕微鏡（ＦＥ−ＳＥＭ）を好適に使用できる。
【００３５】
本発明において、導電性基板は、導電性（電気伝導性）を有する基板であれば特に限定されるものではなく、基板自体が導電性を有する材料で形成されていてもよく、導電性を有する材料が混合されているために導電性を有している基板であってもよい。また、導電性を有する材料によってコーティングされた基板であってもよい。
【００３６】
導電性基板の例としては、例えば、金属（例えば、金、銀、銅またはアルミニウム等）によって形成またはコーティングされている基板や、グラファイト（例えば、高配向性焼結グラファイト（ＨＯＰＧ））によって形成またはコーティングされている基板等が挙げられる。
【００３７】
上記導電性基板は、原子レベルで平坦（atomic flat）であることが好ましい。なお、本明細書において「原子レベルで平坦」とは、基板表面の少なくとも１０００×１０００ｎｍ２の領域において、最も低い点から最も高い点までの高さが２ｎｍ以下であることを意味する。なお、「原子レベルで平坦」であるか否かは、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）によって判定することが可能である。
【００３８】
導電性基板が「原子レベルで平坦」であれば、導電性基板の表面の凹凸が少ないので、試料の観察を行う場合に、試料と基板とを明確に区別することができる。また、導電性基板が「原子レベルで平坦」であれば、導電性基板の表面の凹凸が少ないので、導電性基板上に効率良く試料を固定化できるとともに、試料を効率よく自己集合化させることができる。
【００３９】
本発明において、「固定化」とは、試料の少なくとも一部が導電性基板上に安定して固定されている状態を指す。例えばＤＮＡ等の生体高分子では、基板上に自己集合化構造を形成することが知られている。なお、本明細書において「自己集合化」とは、分子間に様々な相互作用が働いた結果、自発的に分子が集合し、特定の構造を形成することを意味する。上記相互作用には、原子間の静電相互作用、分子間力、溶媒から受ける熱搖動力等が包含される。特にＤＮＡでは自己集合化した結果、網目状の構造を形成することが知られており、本願では当該構造を「ネットワーク構造」とも呼ぶ。
【００４０】
上記導電性基板は、ＨＯＰＧによって形成またはコーティングされている基板であることが特に好ましい。ＨＯＰＧは炭素原子からなり、当該炭素原子間の距離が非常に小さいため、原子レベルで平坦な表面を実現できる。よって、上記構成によれば、試料を固定化した場合に、試料と基板とをより明確に区別することができる。
【００４１】
＜固定化される試料＞
本発明において、固定化される試料は観察の対象となる試料であって、電荷を有する試料である。
【００４２】
本発明において「電荷を有する試料」とは、少なくとも一部が帯電している試料である。具体的に、上記試料は、少なくとも一部が、正または負の何れかに帯電している試料であってもよい。また、上記試料は、一部が正に帯電し、別の一部が負に帯電している試料であってもよい。この場合には、試料全体として見たときに、試料が正または負の何れか一方に偏って帯電していればよい。
【００４３】
上記試料には例えば核酸、タンパク質等の生体高分子、ナノ粒子等が挙げられる。上記構成によれば、核酸、タンパク質またはナノ粒子を導電性基板上に自己集合化させることができ、当該核酸、タンパク質またはナノ粒子の自己集合化構造を電子顕微鏡にて観察することができる。核酸としては特に限定されず、ＤＮＡであってもよく、ＲＮＡであってもよい。また、核酸は、一本鎖であってもよいし、二本鎖であってもよい。ナノ粒子としては、金属クラスタ等が挙げられる。
【００４４】
上記試料は、５０塩基以下の核酸であってもよいし、５０塩基対以下の核酸であってもよい。上記構成によれば、試料の取扱いが容易である。また上記構成によれば、核酸を基板上で自己集合化させることができるため、核酸の自己集合化構造を電子顕微鏡によって観察することが容易となる。
【００４５】
さらに、５０塩基以下または５０塩基対以下の核酸を導電性基板上に自己集合化させることによって、ナノメートルサイズの微細な網目状の構造を形成することができる。当該網目状の構造は、これまで半導体技術では極めて困難とされてきた数ナノメートルの構造物を基板表面に構築するために利用できると考えられる。
【００４６】
＜イオン供給工程＞
本発明に係る試料の固定化方法は、上記導電性基板を少なくとも一方の電極として含む電極対の間に、上記試料とは逆の電荷を有するイオンを含むイオン溶液を配置するイオン供給工程を含んでいる。
【００４７】
本発明において「イオン溶液」とは、イオンを含んでいる溶液を指し、例えば電解質を溶媒に溶解させて作製すればよい。
【００４８】
上記イオン溶液に含まれるイオンは、固定化の対象である試料とは逆の電荷を有するイオンであればよく、特に限定されるものではない。例えば試料が負に帯電している場合は、当該イオンは陽イオンであればよく、例えばＭｇ２＋、Ｃａ２＋等の二価の金属イオン、Ｎａ＋、Ｋ＋等の一価の金属イオンが好適に用いられる。一方、試料が正に帯電している場合は、当該イオンは陰イオンであればよく、例えばＣｌ−等が好適に用いられる。
【００４９】
上記イオン溶液を構成する溶媒は極性溶媒であれば特に限定されないが、水であることが好ましい。上記構成によれば、取り扱いが容易である。また、上記溶媒は特に超純水であることが好ましい。上記構成によれば、不純物による影響を排除できる。
【００５０】
上記イオン溶液は、少なくとも固定化の対象である試料とは逆の電荷を有するイオンを含んでいれば良く、当該イオンとは異なる電荷を有するイオンを同時に含んでいても良い。
【００５１】
上記イオン溶液としては、例えばＭｇＣｌ２水溶液、ＣａＣｌ２水溶液が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５２】
＜イオン分散工程＞
本発明に係る試料の固定化方法は、上記電極対に電圧を印加することによって、上記試料とは逆の電荷を有するイオンを上記導電性基板上に誘引するとともに分散させるイオン分散工程を含んでいる。
【００５３】
導電性基板は、例えば表面を洗浄した場合や劈開した場合に帯電する。例えば、ＨＯＰＧの表面は負に帯電する。また、生体高分子およびナノ粒子も水溶液中では帯電していることが多く、例えばＤＮＡはリン酸基が負に帯電している。そのため、ＨＯＰＧとＤＮＡとは反発し合い、ＨＯＰＧ上にＤＮＡを固定化することは困難である。しかし、本発明に係る試料の固定化方法は、導電性基板上に、試料とは逆の電荷を有するイオンを分散させるため、導電性基板表面と同一の電荷を有する試料であっても、当該試料とは逆の電荷を有するイオンを介することによって、導電性基板に固定化することができる。
【００５４】
本発明において、「イオンを分散させる」とは、イオンが導電性基板の表面上に均一に広がった状態にすることを指す。
【００５５】
上記イオン分散工程では、イオンを導電性基板上に分散させるために、導電性基板を少なくとも一方の電極として含む電極対に電圧を印加し、上記試料とは逆の電荷を有するイオンを上記導電性基板上に誘引する。上記構成によれば、上記試料とは逆の電荷を有するイオンを上記導電性基板上に均一に分散させることができる。よって、上記イオンを介して試料を導電性基板上に均一に固定化することができる。
【００５６】
具体的には、導電性基板をアノード側に用いれば、導電性基板上に陰イオンを誘引することができる。そして、当該陰イオンを誘引した導電性基板上には、更なる工程を経て、正の電荷を有する試料が固定化されることになる。一方、導電性基板をカソード側に用いれば、導電性基板上に陽イオンを誘引することができる。そして、当該陽イオンを誘引した導電性基板上には、更なる工程を経て、負の電荷を有する試料が固定化されることになる。
【００５７】
本発明において「電極対」とは対になった電極であり、つまり２個の電極が１組となった電極である。本発明においては、電極対は導電性基板を少なくとも一方の電極として含んでいればよい。導電性基板と対をなす、もう一方の電極は電極として機能するものであれば特に材料、形状等は限定されない。勿論、電極対を形成する電極の両方が導電性基板であってもよい。
【００５８】
上記イオン分散工程では、電極対として上記導電性基板を２枚使用し、当該１対の導電性基板の間に電圧を印加することが好ましい。上記構成によれば一方の導電性基板には陰イオンを、もう一方の導電性基板には陽イオンを誘引することができる。
【００５９】
すなわち、１対の導電性基板の間に陰イオンを含んでいる溶液を配置した場合、アノード側の導電性基板に陰イオンが誘引される。その結果、表面に陰イオンが分散した導電性基板を作製することができる。同様に、１対の導電性基板の間に陽イオンを含んでいる溶液を配置した場合、カソード側の導電性基板に陽イオンが誘引される。その結果、表面に陽イオンが分散した導電性基板を作製することができる。
【００６０】
また、上記イオン分散工程は、１対の上記導電性基板のうち、一方の導電性基板上に陽イオンを分散させるとともに、もう一方の導電性基板上に陰イオンを分散させる構成であってもよい。
【００６１】
すなわち、１対の導電性基板の間に、陽イオンと陰イオンとの両方を含んでいるイオン溶液を配置して電圧を印加し、アノード側の導電性基板に陰イオンを分散させるとともに、カソード側の導電性基板に陽イオンを分散させる構成であってもよい。上記構成によれば、表面に陽イオンが分散した導電性基板と表面に陰イオンが分散した導電性基板とを同時に作製することができる。つまり、負に帯電した試料を固定化するための導電性基板と正に帯電した試料を固定化するための導電性基板とを同時に提供することができる。
【００６２】
導電性基板に電圧を印加する方法としては、特に限定されないが、例えば図１に示すような装置を用いればよい。具体的には、２枚の導電性基板１をさらに良好な導電性を有する材料３に固定し、図１に示す装置内に配置する。当該装置には電源４およびオン／オフスイッチ５が接続されている。向かい合わせて配置した２枚の導電性基板１の間にイオン溶液２を配置し、当該２枚の導電性基板１からなる電極対に電圧を印加する。
【００６３】
本発明に係る導電性基板は、例えば図２のように固定されてもよい。図２に示される導電性基板１は、良好な導電性を有する材料３上に固定されている。良好な導電性を有する材料３としては、例えば真鍮基板を好適に用いることができる。また、良好な導電性を有する材料と導電性基板とを接着する材料にも導電性を有する材料を用いることが好ましく、銀ペーストを用いて固定することが好ましい。上記構成によれば、効率よく電圧を印加することができる。
【００６４】
電圧を印加した後、導電性基板を図１に示す装置から取り外すと、図３に示すような状態になる。すなわち、カソード側の導電性基板１上には陽イオンを含んでいる溶液２１が付着しており、アノード側の導電性基板１には陰イオンを含んでいる溶液２２が付着している。
【００６５】
＜第１溶媒除去工程＞
本発明に係る試料の固定化方法は、上記イオン溶液に含まれる溶媒を除去する第１溶媒除去工程を含んでいる。上記構成によれば、表面にイオンが吸着している導電性基板を作製することができる。
【００６６】
溶媒を除去する方法や条件は特に限定されない。例えば、溶媒を除去する温度としては試料が凍結しない温度であればよく、３０℃〜１００℃であってもよく、０℃〜１５℃であってもよい。より、効率的に試料を固定化（自己集合化）させるという観点からは、上記温度のなかでは、１５℃〜３０℃であることが好ましいといえる。また、溶媒を除去する時間としては、特に限定されないが、より、効率的に試料を固定化（自己集合化）させるという観点からは、２４時間程度であることが好ましいといえる。
【００６７】
溶媒を除去する方法や条件としては、例えば、自然乾燥させることが好ましく、特に保存容器内に一晩安置して自然乾燥させることが好ましいといえる。
【００６８】
＜試料固定化工程＞
本発明に係る試料の固定化方法は、上記イオンが分散された上記導電性基板上に、上記試料を含む試料溶液を配置し、上記イオンを介して上記試料を上記導電性基板上に固定化する試料固定化工程を含んでいる。
【００６９】
上記構成によれば、上記イオン分散工程において分散させたイオンが陽イオンであれば、負に帯電した試料を導電性基板上に固定化することができる。一方、分散させたイオンが陰イオンであれば、正に帯電した試料を導電性基板上に固定化することができる。
【００７０】
上記試料溶液は試料を含んでいる溶液である。試料溶液に含まれる溶媒は極性溶媒であれば特に限定されないが、水であることが好ましい。上記構成によれば、取り扱いが容易である。また、上記溶媒は特に超純水であることが好ましい。上記構成によれば、不純物による影響を排除できる。
【００７１】
上記試料固定化工程では、試料溶液を導電性基板上に配置した後、放置することが好ましい。上記構成によれば試料を十分に導電性基板上に固定化することができる。また、試料がＤＮＡであれば、発達した自己集合化構造を形成させることができる。
【００７２】
ただし、試料溶液配置後の放置時間はイオン溶液の濃度との関係で調節されることが好ましい。イオン溶液の濃度が１００μｍｏｌ／ｌ以上である場合、放置時間は２０分以下であることが好ましい。また、イオン溶液の濃度が４０μｍｏｌ／ｌ以下である場合、放置時間は６０分以上であることが好ましい。
【００７３】
＜第２溶媒除去工程＞
本発明に係る試料の固定化方法では、上記試料溶液に含まれる溶媒を除去する第２溶媒除去工程を含んでいる。上記構成によれば、イオンを介して表面に試料が固定化されている導電性基板を作製することができる。
【００７４】
溶媒を除去する方法や条件は特に限定されない。例えば、溶媒を除去する温度としては、０℃〜１５℃であってもよく、１５℃〜３０℃であってもよい。より効率的に試料を固定化（自己集合化）させるという観点からは、上記温度のなかでは、１５℃〜３０℃であることが好ましいといえる。特に、試料がＤＮＡである場合は、人の体温を大きく上回る温度では分解される可能性がある。また、溶媒を除去する時間は、上記試料溶液の濃度に応じて調節すればよい。より効率的に試料を固定化（自己集合化）させるという観点からは、上記時間は、２０分〜６０分であることが好ましいといえる。
【００７５】
溶媒を除去する方法や条件としては、例えば、自然乾燥させることが好ましい。
【実施例】
【００７６】
以下に本発明の実施例を説明するが、本発明の趣旨を逸脱しない限り、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。なお、説明の便宜上、図面中で同じ機能を有する部材については、同じ符号を付記する。
【００７７】
〔試料の固定化〕
まず、図２に示すように、導電性基板１を良好な導電性を有する材料３へ固定した。本実施例では、導電性基板１としてＨＯＰＧ基板を用い、良好な導電性を有する材料３として真鍮基板を用いた。ＨＯＰＧ基板と真鍮基板とは銀ペーストを用いて接着した。その後、ＨＯＰＧ基板の表面に存在する埃の除去を行い、原子レベルで平らな表面を出すためにメンディングテープを用いてＨＯＰＧ基板を劈開した。劈開したＨＯＰＧ基板の表面のＡＦＭ画像を図４に示す。図４に見られる模様は炭素原子の作る六員環によるものであると考えられる。
【００７８】
次に、図１に示す装置に２枚のＨＯＰＧ基板を固定し、当該２枚のＨＯＰＧ基板の間にイオン溶液２としてＭｇＣｌ２水溶液を滴下した。図１の装置によってＨＯＰＧ基板に対して電圧を１時間印加した後、２枚のＨＯＰＧ基板を引き離すと、図３に示すような状態になった。ここで、カソード側のＨＯＰＧ基板には陽イオンとしてＭｇ２＋を含んでいる溶液が付着しており、アノード側のＨＯＰＧ基板には陰イオンとしてＣｌ−を含んでいる溶液が付着している。
【００７９】
当該ＨＯＰＧ基板を一晩自然乾燥させて、水分を除去した。Ｍｇ２＋を分散させたＨＯＰＧ基板の表面のＡＦＭ画像を図５に示す。図５の（ａ）は、ＨＯＰＧ基板の表面の５．０×５．０μｍ２の領域を示しており、図５の（ｂ）は、ＨＯＰＧ基板の表面の５．０×５．０μｍ２の領域を示している。図５の（ｃ）は、図５の（ｂ）のＡ−Ｂ間の断面図を示している。なお、図５の（ｃ）において多数の凹凸が見られるが、以下の実施例では、原子レベルで平坦であると見なせる領域において、ＤＮＡによる自己集合化構造が形成されているかどうかを確認した。
【００８０】
上記のＭｇ２＋が分散しているＨＯＰＧ基板にＤＮＡ水溶液を滴下して放置した後、水分を除去し、ＡＦＭまたはＳＥＭによる観察を行った。当該ＤＮＡ水溶液は、ｐｏｌｙ（ｄＡ）とｐｏｌｙ（ｄＴ）とが二重らせん構造を形成している５０ｂｐのＤＮＡ断片を０．５μｍｏｌ／ｌの濃度で超純水に溶解させたものである。以下の実施例および比較例には、当該ＤＮＡ水溶液を２時間攪拌した後、低温（１５℃〜３０℃）で一晩放置したものを使用した。
【００８１】
〔実施例１〕
ＭｇＣｌ２水溶液の濃度を４０μｍｏｌ／ｌ、電圧を２Ｖ、ＤＮＡ水溶液を滴下してから水分を除去するまでの放置時間を６０分として試料をＨＯＰＧ基板上に固定化した。当該試料のＡＦＭおよびＦＥ−ＳＥＭ（日立、Ｓ−５０００Ｌ）による観察結果を図６に示す。
【００８２】
図６の（ａ）および（ｂ）はＡＦＭによる観察結果であり、図６の（ａ）は、ＨＯＰＧ基板の表面の２．０×２．０μｍ２の領域を示しており、図６の（ｂ）は、ＨＯＰＧ基板の表面の５．０×５．０μｍ２の領域を示している。図６の（ｃ）および（ｄ）はＳＥＭによる観察結果であり、図６の（ｃ）は、ＨＯＰＧ基板の表面の２．０×２．０μｍ２の領域を示しており、図６の（ｄ）は、ＨＯＰＧ基板の表面の５．０×５．０μｍ２の領域を示している。
【００８３】
図６の（ａ）〜（ｄ）から、ＨＯＰＧ基板の表面にはＤＮＡが固定化されており、ＤＮＡが自己集合化構造（ネットワーク構造）を形成していることがわかる。また、ＡＦＭはもちろんのこと、ＳＥＭにおいても当該試料を観察可能であり、鮮明な画像を得ることができた。
【００８４】
上記試料の高さ方向の情報を包含している、ＡＦＭによる観察結果を図７に示す。図７の（ａ）は、図６の（ａ）と同一の領域を示しており、図７の（ｂ）は、ＨＯＰＧ基板の表面の２．０×２．０μｍ２の領域を示している。図７の（ｃ）は、図７の（ａ）のＡ−Ｂ間の断面図を示している。
【００８５】
図７においても、ＨＯＰＧ基板上にＤＮＡが固定化されており、当該ＤＮＡによって鮮明なネットワーク構造が形成されていることがわかる。２本鎖ＤＮＡの構造を略円筒と考えた場合、当該円筒の横断面の直径は約２ｎｍである。実施例１の場合は、図７の（ｃ）に示す通り、自己集合化構造の高さが約２ｎｍであることから、ＨＯＰＧ基板上に２本鎖ＤＮＡの単層の自己集合化構造が形成されていることがわかる。
【００８６】
〔実施例２〕
ＭｇＣｌ２水溶液の濃度を１００μｍｏｌ／ｌ、電圧を２Ｖ、ＤＮＡ水溶液を滴下してから水分を除去するまでの放置時間を２０分として試料をＨＯＰＧ基板上に固定化した。なお、ＨＯＰＧ基板上に固定化された試料の高さ方向の情報を得るため、観察にはＡＦＭを用いた。
【００８７】
ＡＦＭによる観察結果を図８に示す。図８の（ａ）は、ＨＯＰＧ基板の表面の１．０×１．０μｍ２の領域を示しており、図８の（ｂ）は、ＨＯＰＧ基板の表面の９００×９００ｎｍ２の領域を示している。実施例２においてもＨＯＰＧ基板上にＤＮＡが固定化されており、当該ＤＮＡによって鮮明なネットワーク構造が形成されていることがわかる。
【００８８】
また、実施例１と実施例２とを比較すると、実施例２では、ＤＮＡの自己集合化構造が一様に広がるまでの時間がより短縮されることが明らかとなった。これは、ＭｇＣｌ２水溶液の濃度が濃い場合、ＤＮＡ一分子に対する基板表面近傍のＭｇ２＋の個数が増加し、ＤＮＡの吸着が促進されるためであると考えられる。
【００８９】
〔比較例１〕
ＨＯＰＧ基板の間にＭｇＣｌ２水溶液を配置せずに、ＤＮＡ水溶液を直接ＨＯＰＧ基板上に配置し、電圧を印加した。上記の点以外は上述の〔試料の固定化〕に示した手順に従って実験を行った。なお、ＨＯＰＧ基板上に固定化された試料の高さ方向の情報を得るため、観察にはＡＦＭを用いた。
【００９０】
ＡＦＭによる観察結果を図９に示す。図９の（ａ）は、ＨＯＰＧ基板の表面の２．０×２．０μｍ２の領域を示しており、図９の（ｂ）は、図９の（ａ）中の矢印における断面図を示している。
【００９１】
図９の（ｂ）に示す通り、自己集合化構造の高さが平均して５〜６ｎｍであり、実施例１および２のようなＤＮＡの単層の自己集合化構造は形成されていないことがわかる。
【００９２】
本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【産業上の利用可能性】
【００９３】
本発明は、例えば生物学、医学、薬学、農学、工学等の分野において、電子顕微鏡による生体高分子およびナノ粒子の観察に好適に利用することができる。
【符号の説明】
【００９４】
１  導電性基板
２  イオン溶液
３  良好な導電性を有する材料
４  電源
５  オン／オフスイッチ
２１  陽イオンを含んでいる溶液
２２  陰イオンを含んでいる溶液
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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