(57)【要約】【課題】  本発明の課題は、新規でヒドロキシラジカル及びスーパーオキシドラジカルの消去能を有する抗酸化剤を提供することである。【解決手段】  本発明は、天然でありかつ安全な植物ヒュウガナツの抽出物を有効成分とする抗酸化剤を提供する。ヒュウガナツ抽出物が、活性酸素であるヒドロキシラジカル及びスーパーオキシドラジカルを消去することによる抗酸化作用に基づくものである。  さらに、この抗酸化剤を含有する外用剤組成物もしくは医薬品組成物等を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒュウガナツ抽出物を有効成分とする抗酸化剤。
【請求項２】
ヒュウガナツ抽出物に含まれる水溶性成分を有効成分とする抗酸化剤。
【請求項３】
ヒュウガナツ抽出物によりゲル濾過クロマトグラフィーにて得られる分子量２，０００〜２００，０００の画分を有効成分とする抗酸化剤。
【請求項４】
ヒュウガナツ抽出物が、ヒュウガナツの果肉又は果皮に由来することを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の抗酸化剤。
【請求項５】
請求項１〜４に記載の抗酸化剤を含有する外用剤組成物。
【請求項６】
請求項１〜４に記載の抗酸化剤を含有する医薬品組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、活性酸素であるヒドロキシラジカル及びスーパーオキシドラジカルを消去することによる抗酸化剤、また、それを含む医薬品、医薬部外品、外用剤等の組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般的に、生体内に発生する活性酸素は、細胞に対してダメージを与えるため、生体内では抗酸化物質が、発生した活性酸素を分解し無害化するとされている。抗酸化物質（抗酸化作用を有する物質）にはビタミンC、ビタミンE等の種々の物質が知られているが、これらは以下の二つに大別される。（１）生体内において活性酸素、フリーラジカルの生成を抑制する物質、(２)
生体内に発生した活性酸素、フリーラジカルを補足・安定化し、連鎖反応を抑制する物質（非特許文献１）。
【０００３】
これまでに、天然物を由来とする抗酸化物質について、探索が進められている。一例を挙げると、ミカン科植物の持つ抗酸化作用が調べられた例として、オレンジの果皮、オオタポンカンの果皮が持つ抗酸化作用について明らかとなっている。また、種々のミカン科植物の果皮に含まれる抗酸化成分についても明らかとなっている（特許文献１）。
【０００４】
ところで、ミカン科植物の一つであるヒュウガナツは、宮崎県特産のミカン科植物であり、発明者らによりその抽出物が骨代謝改善機能を有することが明らかとなっている（特許文献２）。
【０００５】
特許文献２に開示されている骨代謝改善機能は、骨芽細胞や破骨細胞に対しての作用であり、活性酸素であるヒドロキシラジカル及びスーパーオキシドラジカルを消去するという抗酸化機能とは異なる機能である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開平０８−２５９９４５号公報
【特許文献２】特開２００６−００８６２５号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】バイオサイエンスＥＳＲ  １、桜井弘編、廣川書店、１９９５年。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
特許文献１で示されているように、従来、ヒュウガナツ果皮については、抗酸化活性が認められない又は活性が弱いとされていた。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
以上の知見より、発明者らは天然でありかつ安全な植物、特に、ヒュウガナツを開発のテーマとし鋭意検討を行った。
【発明の効果】
【００１０】
従来の知見では、抗酸化活性が無い又は弱いとされていたヒュウガナツであっても、その特定の抽出物が、ヒドロキシラジカル及びスーパーオキシドラジカルを消去する高い能力を有すること、すなわち、高い抗酸化作用を有することを見出し、本発明を完成するに至った。すなわち本発明は以下の発明を包含する。
【００１１】
（１）ヒュウガナツ抽出物を有効成分とする抗酸化剤。
（２）ヒュウガナツ抽出物に含まれる水溶性成分を有効成分とする抗酸化剤。
（３）ヒュウガナツ抽出物によりゲル濾過クロマトグラフィーにて得られる分子量２，０００〜２００，０００の画分を有効成分とする抗酸化剤。
（４）ヒュウガナツ抽出物が、ヒュウガナツの果肉又は果皮に由来することを特徴とする、上記（１）〜（３）のいずれかに記載の抗酸化剤。
（５）上記（１）〜（４）記載の抗酸化剤を含有する外用剤組成物。
（６）上記（１）〜（４）記載の抗酸化剤を含有する医薬品組成物。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ヒュウガナツ抽出物の抗酸化機能（ヒドロキシラジカル消去能、スーパーオキシドラジカル消去能）を二次元表示した図である。
【図２】ヒュウガナツ抽出物のゲル濾過クロマトグラフィーの分析チャート図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明において「ヒュウガナツ」とは、ミカン科ミカン属の植物であるヒュウガナツ（Ｃｉｔｒｕｓ  ｔａｍｕｒａｎａ  Ｈｏｏｒｔ．ｅｘ  Ｔａｎａｋａ）を意味する。本発明では、ヒュウガナツの果実、果皮、果肉、種子、種皮、ヘタを用いることができる。また、「ヒュウガナツ抽出物」とは、前記部位をそのまま又は粉砕した後、搾取又は溶媒で抽出したものである。本発明で用いるヒュウガナツ抽出物は、ヒュウガナツの果肉又は果皮に由来することが好ましい。
【００１４】
本発明で用いる各植物の抽出物を得るための抽出溶媒としては、水、メタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール、ブタノール、イソブタノール等の低級アルコールもしくは含水低級アルコール、プロピレングリコール、1,3-ブチレングリコール、1,2-ブチレングリコール、1,4-ブチレングリコール、1,5-ペンタンジオール、1,2-ペンタンジオール、1,3-ペンタンジオール、1,4-ペンタンジオール、1,3,5-ペンタントリオール、グリセリン、ポリエチレングリコール（分子量１００〜１０万）等の多価アルコールもしくは含水多価アルコール、アセトン、酢酸エチル、ジエチルエーテル、ジメチルエーテル、エチルメチルエーテル、ジオキサン、アセトニトリル、キシレン、ベンゼン、クロロホルム、四塩化炭素、フェノール、トルエン等の各種有機溶媒や、適宜規定度を調製した酸（塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、ギ酸、酢酸等）やアルカリ（水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、アンモニア等）の中から選ばれる１種又は２種以上の混液が挙げられ、特に水、エタノール及び1,3-ブチレングリコールから選ばれる１種又は２種以上を選択することが好ましい。但し、用途により溶媒の含有が好ましくない場合においては、水のみを使用するか、あるいは抽出後に溶媒を除去しやすい、揮発性の高い溶媒を用いて抽出を行い、溶媒除去後水等に溶解させるといった方法も可能である。
【００１５】
抽出方法については、用いる溶媒の温度又は、原料に対する溶媒の混合比もしくは抽出時間についても、種々の原料及び使用する溶媒に対してそれぞれを任意に設定することができる。溶媒の温度は−４℃から１００℃の範囲で任意に設定することができる。原料中に含まれる成分の安定性の観点から、１０℃付近〜４０℃付近の温度が好ましい。また、原料に対する溶媒の混合比は、例えば重量比で、原料：溶媒＝４：１〜１：１００の範囲内で任意に設定することができる。特に１：１〜１：２０の重量比率が好ましい。
【００１６】
本発明で用いるヒュウガナツ抽出物は、溶媒抽出後、さらに適宜精製操作を施すことも可能である。精製操作とは、酸（塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、有機酸等）又はアルカリ（水酸化ナトリウム、水酸化カルシウム、アンモニア等）添加による分解、微生物による発酵又は代謝変換、イオン交換樹脂や活性炭、珪藻土等による成分吸着、種々の分離モード（イオン交換、親水性吸着、疎水性吸着、サイズ除去、配位子交換、アフィニティー等）を有するクロマトグラフィーを用いた分画、濾紙やメンブランフィルター、限外濾過膜等を用いた濾過、加圧又は減圧、加温又は冷却、乾燥、ｐＨ調整、脱臭、脱色、長時間の静置保管等が例示できる。当業者であれば、これらの方法を任意に選択し、組み合わせた処理を行うことも可能である。
【００１７】
本発明の抗酸化剤又は、外用剤組成物もしくは医薬品組成物の形状としては、液状、固形状、粉末状、ペースト状等いずれの形状でも良い。当業者であれば、本発明を実施する上で最適な形状を任意に選択することができる。
【００１８】
本発明の抗酸化剤又は、外用剤組成物もしくは医薬品組成物の含有量は、効果が確認できる範囲であれば特に制限はない。一般的には、０．０１ｍｇ／ｇ〜２００ｍｇ／ｇ（分母は製剤重量を示す）の範囲に設定される。好ましくは、０，１ｍｇ／ｇ〜２０ｍｇ／ｇの範囲が良い。
【００１９】
外用剤組成物としては、各種の外用製剤類（ヒト用のみならず動物用に使用する製剤も含む）全般において利用できる。具体的には、アンプル、カプセル、丸剤、錠剤、粉末、下流、固形、液体、ゲル、気泡、エマルジョン、シート、ミスト、スプレー剤等の利用上の適当な形態がある。これらを、１）医薬品類、２）医薬部外品類、３）局所用又は全身用の皮膚用化粧品類（例えば、化粧水、乳液、クリーム、軟膏、ローション、オイル、パック等の基礎化粧料、洗顔料や皮膚洗浄料、マッサージ用剤、クレンジング用剤、除毛剤、脱毛剤、ひげ剃り処理料、アフターシェーブローション、プレシェーブローション、シェービングクリーム、ファンデーション、口紅、頬紅、アイシャドウ、アイライナー、マスカラ等のメークアップ化粧料、香水類、美爪剤、微爪エナメル、微爪エナメル除去剤、パップ剤、プラスター剤、テープ剤、シート剤、貼付剤、エアゾール剤等）、４）頭皮・頭髪に適用する薬用又は／及び化粧用の製剤類（例えば、シャンプー剤、リンス剤、ヘアートリートメント剤、プレヘアートリートメント剤、パーマネント液、染毛料、整髪料、ヘアートニック剤、育毛・養毛料、パップ剤、プラスター剤、テープ剤、シート剤、貼付剤、エアゾール剤等）、５）浴湯に投じて使用する浴用剤、６)その他、腋臭防止剤や消臭剤、防臭剤、制汗剤、衛生用品、衛生綿類、ウエットティシュ、歯磨き類、口中清涼剤、含嗽剤、食器洗浄剤等にも使用することができる。
【００２０】
医薬品の製剤としては、例えば、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等の固形剤、溶液剤、懸濁剤、乳剤等の液剤、凍結乾燥製剤等が挙げられ、これらの製剤は製剤上の常套手段により調製することができる。上記の医薬用無毒性担体としては、例えば、グルコース、乳糖、ショ糖、澱粉、マンニトール、デキストリン、脂肪酸グリセリド、ポリエチレングルコール、ヒドロキシエチルデンプン、エチレングリコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、アミノ酸、ゼラチン、アルブミン、水、生理食塩水等が挙げられる。又、必要に応じて、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、結合剤、等張化剤等の慣用の添加剤を適宜添加することもできる。
【００２１】
なお、本発明の抗酸化剤、外用剤組成物もしくは医薬品組成物には、必須な有効成分である本発明のヒュウガナツ抽出物の他、本発明の効果を損なわない範囲内で、当業者が一般に利用する成分や添加剤を任意に選択・併用して製造することができ、更に多種の機能性を付加することが可能である。製剤中における含有量は、特に限定されないが、通常０．０００１〜５０％の濃度範囲が好ましい。
【００２２】
以下に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらになんら制約されるものではない。
【実施例】
【００２３】
（製造例１）
ヒュウガナツの果肉及び果皮100ｇを精製水（約１０〜６０℃）にて約３０分間抽出し、濾過して抽出液（固形分約２．０％〜５．０％）を約２ｋｇ得る。
【００２４】
（製造例２）
ヒュウガナツの果肉及び果皮１００ｇを３０％エタノールにて約３０分間抽出し、濾過して抽出液（固形分約２．０％〜５．０％）を約２ｋｇ得る。
【００２５】
（試験１）活性酸素種消去能
スピントラッピングＥＳＲ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｓｐｉｎ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）法により、ヒドロキシラジカル及びスーパーオキシドラジカルの消去能を計測した。スピンストラッピングＥＳＲ法は、寿命が短い、飽和しやすい等の理由により計測の困難なフリーラジカル種を準安定ラジカルに変化させて計測する技術であるため、ヒドロキシラジカル及びスーパーオキシドラジカルの状態を知るのに最適な手法である（非特許文献１や「活性酸素・フリーラジカル」Ｖｏｌ．１〜６、メディカルレビュー社（１９９０〜１９９５）等を参照）。
フリーラジカル消去能は、スピンアダクトのＥＳＲ信号が抗酸化物質によって減少する度合いにより評価することができる。通常、スピンアダクトのＥＳＲ信号強度が、抗酸化物質濃度がゼロのときの強度の１／２になる抗酸化物質濃度ＩＤ５０（Ｍｅｄｉａｎ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  Ｄｏｓｅ）を評価パラメータとする。
【００２６】
１）ヒドロキシラジカルの消去能
上記製造例１で得られたヒュウガナツ抽出液を終濃度：０．３３％に調整したものを試験に供した。電子スピン共鳴装置は、JES-TE-100型ＸバンドESR装置（日本電子株式会社製）を使用した。スピントラップ剤は、5,5-ジメチル-1-ピロリン-N-オキシド（DMPO）（同仁化学研究所製）を使用した。結果を図１に示す。ここでは、比較例として、抗酸化作用の知られている既知の物質を同様の手法により測定した。
【００２７】
図１の通り、本発明のヒュウガナツ抽出物は、ＩＤｈ５０（ｍｇ／ｍＬ）＝２．３±０．３であった。このことは、ヒュウガナツ抽出物がヒドロキシラジカルの消去能を有することを意味する。ヒュウガナツ抽出物は、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、コンドロイチン硫酸（Ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ  ｓｕｌｆａｔｅ）と同程度の強いヒドロキシラジカルの消去能を有することが確認できた。なお、本発明の製造例１で得られたヒュウガナツ抽出物は、精製水による抽出液であり、水溶性成分に抗酸化作用を有することが確認できる。
【００２８】
２）スーパーオキシドラジカルの消去能
上記１）のヒドロキシラジカル消去能の試験と同様に、製造例１で得られたヒュウガナツ抽出液を終濃度：０．３３％に調整したものを試験に供した。電子スピン共鳴装置は、JES-TE-100型ＸバンドESR装置（日本電子株式会社製）を使用した。スピントラップ剤は、5-(2,2-ジメチル-1,3-プロポキシシクロフォスフォリル)-5-メチル-1-ピロリン-N-オキシド（CYPMPO）（三国製薬工業株式会社製）を使用した。結果を図１に示す。ここでは、比較例として、抗酸化作用の知られている既知の物質を同様の手法により測定した。
【００２９】
図１の通り、本発明のヒュウガナツ抽出物は、ＩＤｓ５０（ｍｇ／ｍＬ）＝０．０７２±０．０１６であった。このことは、ヒュウガナツ抽出物がスーパーオキシドラジカルの消去能を有することを意味する。ヒュウガナツ抽出物は、グルタチオン（ＧＳＨ）と同程度の強いスーパーオキシドラジカルの消去能を有することが確認できた。なお、本発明の製造例１で得られたヒュウガナツ抽出物は、精製水による抽出液であり、水溶性成分に抗酸化作用を有することが確認できる。
【００３０】
３）まとめ
ヒュウガナツ抽出物、特にその水溶性成分は、ヒドロキシルラジカル消去能のみならず、高いスーパーオキシドラジカル消去能を有することが明らかとなった。したがって、ヒュウガナツ抽出物は高い抗酸化能を有し、優れた抗酸化剤として利用することができる。
【００３１】
（試験２）分子量の測定
上記の製造例１で得られたヒュウガナツ抽出物をエタノールにて脱脂した。脱脂したヒュウガナツ抽出液を精製水で１時間撹拌抽出し、得られた抽出液をゲル濾過クロマトグラフィー用担体のＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５  Ｃｏａｒｓｅ（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社）で分画した。結果を図２に示す。
【００３２】
図２の通り、得られた分布曲線の保持時間は１５〜２２分の範囲にあり、かつ、ピークを示す保持時間は１６．１分と２１．４分であった。検量線から、製造例１で得られたヒュウガナツ抽出物は分子量の範囲は２．０×１０３〜２．０×１０５であり、ピークを示す分子量は９．０×１０４と２．７×１０３にあることが確認できた。すなわち、ヒュウガナツ抽出物に含まれる水溶性成分の分子量範囲は、２０００〜２０万の範囲にあることがわかった。
【００３３】
（処方例）外用剤組成物（抗酸化剤）の製造
本発明による様々な剤形の製剤を製造した。以下にその処方例を示すが、各処方例は各製品の製造における常法により製造したもので良く、配合量のみを示した。本発明はこれらに限定されるわけではない。
【００３４】
（処方例１）乳液
重量％
１．スクワラン                                        5.0
２．オリーブ油                                       5.0
３．ホホバ油                                5.0
４．セタノール                                     
1.5
５．グリセリンモノステアレート                    2.0
６．ポリオキシエチレン（２０）セチルエーテル  3.0
７．ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレート   2.0
８．1,3-ブチレングリコール                                 
1.0
９．グリセリン                                                   2.0
１０．リンゴ酸ナトリウム                                     1.0
１１．製造例１のヒュウガナツ抽出液                     5.0
１２．防腐剤（パラオキシ安息香酸エステル）          適量
１３．香料                                                       適量
１４．精製水                                                    残余
【産業上の利用可能性】
【００３５】
本発明は、ヒュウガナツ抽出物を有効成分とする抗酸化剤、さらに、この抗酸化剤を含有する外用剤組成物もしくは医薬品組成物等を提供することができる。
【図１】
2014024781.tif 000002
【図２】
2014024781.tif 000003