(57)【要約】【課題】セルラーゼ生産力の向上したトリコデルマ属に属する微生物の変異株、該変異株を用いたセルラーゼの製造方法、該変異株の作製方法を提供することを課題とする。【解決手段】本発明は、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属に属する微生物の変異株であって、野生型β−グルコシダーゼのアミノ酸配列において少なくとも１のアミノ酸残基が置換された変異株に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属に属する微生物の変異株であって、野生型β−グルコシダーゼのアミノ酸配列において少なくとも１のアミノ酸残基が置換された変異株。
【請求項２】
前記トリコデルマ属に属する微生物が、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、トリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ）、トリコデルマ・ロンジブラチアタム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）からなる群から選ばれる１である請求項１に記載の変異株。
【請求項３】
前記トリコデルマ属に属する微生物が、トリコデルマ・リーセイ株ＱＭ９４１４である請求項２に記載の変異株。
【請求項４】
野生型β−グルコシダーゼのアミノ酸配列が、配列番号１〜配列番号７のいずれか１に示されるアミノ酸配列である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の変異株。
【請求項５】
野生型β−グルコシダーゼのアミノ酸配列がトリコデルマ・リーセイ株ＱＭ９４１４のアミノ酸配列と少なくとも５０％以上の相同性を有する請求項１に記載の変異株。
【請求項６】
野生型β−グルコシダーゼのアミノ酸配列がトリコデルマ・リーセイ株ＱＭ９４１４のアミノ酸配列と少なくとも７０％以上の相同性を有する請求項５に記載の変異株。
【請求項７】
野生型β−グルコシダーゼのアミノ酸配列がトリコデルマ・リーセイ株ＱＭ９４１４のアミノ酸配列と少なくとも８０％以上の相同性を有する請求項５に記載の変異株。
【請求項８】
野生型βグルコシダーゼのアミノ酸配列のＮ末端から４０７〜４１１番目のアミノ酸において少なくとも１のアミノ酸が置換された請求項１〜７のいずれか１項に記載の変異株。
【請求項９】
アミノ酸残基の置換が、Ｄ４０７Ｐ、Ｇ４０８Ｗ、Ｖ４０９Ｆ、Ｎ４１０ＨおよびＶ４１０Ｆからなる群から選択された少なくとも１つを含む請求項１〜８のいずれか１項に記載の変異株。
【請求項１０】
アミノ酸残基の置換がＶ４０９Ｆである請求項９に記載の変異株。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の変異株を培養することにより、セルラーゼを生産することを特徴とするセルラーゼの生産方法。
【請求項１２】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の変異株が生産するセルラーゼでセルロース系バイオマスを糖化する工程を含む、セルロース系バイオマスからの等の製造方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法により得られた糖を発酵する工程を含むエタノールの製造方法。
【請求項１４】
トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属に属する微生物の変異株の作製方法であって、野生型β−グルコシダーゼのアミノ酸配列において少なくとも１のアミノ酸置換を導入する変異株の作製方法。
【請求項１５】
トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属に属する微生物の変異株の作製方法であって、野生型β−グルコシダーゼ遺伝子において１塩基置換を導入する変異株の作製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、セルラーゼの生産量が向上したトリコデルマ属に属する微生物の変異株、該変異株を用いたセルラーゼの製造方法、該微生物の作製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
食糧や飼料と競合しない、農業廃棄物または木材などのセルロース系バイオマスからエタノールなどの化学品を開発するために多くの試みがなされてきた。例えば、木材などを硫酸で糖化し、グルコースまたはキシロースなどの単糖類とした後に、該単糖類を酵母またはバクテリアで発酵させ、エタノールを得る方法が開発されてきた（非特許文献１〜３）。しかしながら、この方法には、使用した強酸を回収して再利用することが困難である点、または廃棄物処理する場合の環境性の点などにおいて問題があった。
【０００３】
そこで、より温和で環境に優しいバイオマスの糖化方法として、酵素を用いる方法も開発されてきた。該方法においては、一般的に、各種微生物が生産するセルラーゼまたはヘミセルラーゼが使用されている。セルラーゼは、種々の作用機作を有する酵素タンパク質から構成されている。
【０００４】
バイオマス中のセルロースに作用する酵素としては、非結晶性セルロースに作用してセルロース鎖に切れ目を入れるエンドグルカナーゼ（ＥＧ）、並びに結晶性および非結晶性のセルロース繊維の末端から、セロビオース単位で糖を切り出すセロビオースヒドロラーゼ（ＣＢＨ）がある。また、これらの酵素の作用により生成したセロビオースを加水分解してグルコースを生成するβ−グルコシダーゼ（ＢＧＬ）がある。一方、バイオマス構成成分であるヘミセルロースに作用するヘミセルラーゼとして、キシラナーゼやβ−キシロシダーゼなどがある。
【０００５】
セルロース系バイオマスの糖化酵素には、以上のような酵素などが含まれるが、実際には、これらの各酵素は、さらに、糖質加水分解酵素ファミリーにより分類される多数の成分から構成されており、非常に複雑である。
【０００６】
セルラーゼ生産菌としては、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属に属する微生物、例えば、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉまたはＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅが有名であり、工業的に使用されてきた（非特許文献４）。しかしながら、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属に属する菌株により生産されるセルラーゼを用いたバイオマス糖化に関する研究が進む中で、該セルラーゼの最大の欠点として、β−グルコシダーゼ活性が他の酵素活性（エンドグルカナーゼ活性、セロビオヒドロラーゼ活性など）に比べ相対的に低いことがわかった。これに伴い、β−グルコシダーゼ活性を強化した改良品として、Ｃｅｌｌｉｃ  ＣＴｅｃ、Ｃｅｌｌｉｃ  ＣＴｅｃ２（Ｎｏｖｏｚｙｍｅ社）およびＡｃｃｅｌｌｅｒａｓｅ１５００（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ社）が開発されている。
【０００７】
また、トリコデルマ・リーセイのタンパク質生産量を向上させるため、転写調節因子やシグナル伝達因子などのタンパク質生産に関与している因子の高発現もしくは欠損が行われている（特許文献１〜３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第２０１１／１５１５１２号
【特許文献２】国際公開第２０１１／１５１５１３号
【特許文献３】国際公開第２０１１／１５１５１５号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｊｏｎａｔｈａｎ  Ｒ．  Ｍｉｅｌｅｎｚ，（２００１）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ｐ３２４−３２９
【非特許文献２】種田  大介、ＯＨＭ２００６年１１月号、オーム社、ｐ４２−４５
【非特許文献３】種田  大介、バイオリファイナリー技術の工業最前線、２００８年、シーエムシー出版、第２章３、濃硫酸法バイオエタノール製造プロセス
【非特許文献４】森川  康、セルロース利用技術の最先端、２００８年、シーエムシー出版、ｐ３６２−３７６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかしながら、トリコデルマ属に属する微生物のセルラーゼ生産量をもってしても不溶性固体基質のセルロース系バイオマスを完全糖化するにはさらなるセルラーゼ量が必要である。また、酵素生産コストの観点から、トリコデルマ属に属する微生物のセルラーゼ生産力の向上が望まれている。しかしながら、トリコデルマ属に属する微生物は複雑な発現制御および活性制御を受けており、従来技術を用いてその発現量を向上させることは困難であった。
【００１１】
したがって、本発明は、セルラーゼ生産力の向上したトリコデルマ属に属する微生物の変異株、該変異株を用いたセルラーゼの製造方法、該変異株の作製方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、トリコデルマ属に属する微生物の野生型β−グルコシダーゼに変異を導入することによって、得られた変異株は野生株に比べてセルラーゼの生産性が向上していることを見出し、本発明を完成させた。
【００１３】
すなわち、本発明は以下に示す通りである。
１．トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属に属する微生物の変異株であって、野生型β−グルコシダーゼのアミノ酸配列において少なくとも１のアミノ酸残基が置換された変異株。
２．前記トリコデルマ属に属する微生物が、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、トリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ）、トリコデルマ・ロンジブラチアタム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）からなる群から選ばれる１である前項１に記載の変異株。
３．前記トリコデルマ属に属する微生物が、トリコデルマ・リーセイ株ＱＭ９４１４である前項２に記載の変異株。
４．野生型β−グルコシダーゼのアミノ酸配列が、配列番号１〜配列番号７のいずれか１に示されるアミノ酸配列である、前項１〜３のいずれか１に記載の変異株。
５．野生型β−グルコシダーゼのアミノ酸配列がトリコデルマ・リーセイ株ＱＭ９４１４のアミノ酸配列と少なくとも５０％以上の相同性を有する前項１に記載の変異株。
６．野生型β−グルコシダーゼのアミノ酸配列がトリコデルマ・リーセイ株ＱＭ９４１４のアミノ酸配列と少なくとも７０％以上の相同性を有する前項５に記載の変異株。
７．野生型β−グルコシダーゼのアミノ酸配列がトリコデルマ・リーセイ株ＱＭ９４１４のアミノ酸配列と少なくとも８０％以上の相同性を有する前項５に記載の変異株。
８．野生型βグルコシダーゼのアミノ酸配列のＮ末端から４０７〜４１１番目のアミノ酸において少なくとも１のアミノ酸が置換された前項１〜７のいずれか１に記載の変異株。
９．アミノ酸残基の置換が、Ｄ４０７Ｐ、Ｇ４０８Ｗ、Ｖ４０９Ｆ、Ｎ４１０ＨおよびＶ４１０Ｆからなる群から選択された少なくとも１つを含む前項１〜８のいずれか１に記載の変異株。
１０．アミノ酸残基の置換がＶ４０９Ｆである前項９に記載の変異株。
１１．前項１〜１０のいずれか１に記載の変異株を培養することにより、セルラーゼを生産することを特徴とするセルラーゼの生産方法。
１２．前項１〜１０のいずれか１に記載の変異株が生産するセルラーゼでセルロース系バイオマスを糖化する工程を含む、セルロース系バイオマスからの等の製造方法。
１３．前項１２に記載の方法により得られた糖を発酵する工程を含むエタノールの製造方法。
１４．トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属に属する微生物の変異株の作製方法であって、野生型β−グルコシダーゼのアミノ酸配列において少なくとも１のアミノ酸置換を導入する変異株の作製方法。
１５．トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属に属する微生物の変異株の作製方法であって、野生型β−グルコシダーゼ遺伝子において１塩基置換を導入する変異株の作製方法。
【発明の効果】
【００１４】
本発明のトリコデルマ属に属する微生物の変異株は、野生型β−グルコシダーゼのアミノ酸配列において少なくとも１のアミノ酸置換が導入されていることにより、野生株に比べてセルラーゼの生産性が極めて向上している。該変異株を用いてセルラーゼを高生産し、該セルラーゼを用いてセルロース系バイオマスから得られた糖を発酵させることにより、効率的にエタノールを製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】トリコデルマ・リーセイのセルラーゼ誘導発現モデルを示す模式図である。
【図２】トリコデルマ・リーセイにおけるβ-グルコシダーゼ遺伝子の発現量を示す図である。
【図３】トリコデルマ・リーセイ株ＱＭ９４１４のβ−グルコシダーゼ（ｂｇｌ２）変異株およびトリコデルマ・リーセイ株ＱＭ９４１４のβ−グルコシダーゼ（ｂｇｌ２）破壊株の構築を示す図である。
【図４】トリコデルマ・リーセイ株ＱＭ９４１４、ｂｇｌ２変異株、ｂｇｌ２破壊株の培養上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した結果を示す電気泳動写真である。
【図５】トリコデルマ・リーセイ株ＱＭ９４１４、ｂｇｌ２変異株、ｂｇｌ２破壊株の培養上清における分解活性を測定した結果を示す図である。
【図６】トリコデルマ・リーセイ株ＱＭ９４１４、ｂｇｌ２変異株、ｂｇｌ２破壊株の培養上清におけるタンパク質濃度を測定した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明は、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属に属する微生物の変異株であって、野生型β−グルコシダーゼのアミノ酸配列において少なくとも１のアミノ酸置換が導入された変異株を提供する。
【００１７】
トリコデルマ属に属する微生物とは、糸状菌のなかでトリコデルマ属に分類される全ての微生物を包含する。トリコデルマ属に属する微生物は、従来公知のトリコデルマ属に属する微生物の野生株でもよいし、当該野生株から派生した変異株でもよいし、ＵＶ照射またはニトロソ化合物処理等の変異原処理により突然変異が導入された株であってもよい。
【００１８】
トリコデルマ属に属する微生物としては、例えば、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ａｇｇｒｅｓｓｉｖｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ａｔｒｏｖｉｒｉｄｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ａｓｐｅｒｅｌｌｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ａｕｒｅｏｖｉｒｉｄｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ａｕｓｔｒｏｋｏｎｉｎｇｉｉ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｂｒｅｖｉｃｏｍｐａｃｔｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｃａｎｄｉｄｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｃａｒｉｂｂａｅｕｍ  ｖａｒ．ａｅｑｕａｔｏｒｉａｌｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｃａｒｉｂｂａｅｕｍ  ｖａｒ．Ｃａｒｉｂｂａｅｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｃａｔｏｐｔｒｏｎ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｃｒｅｍｅｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｃｅｒａｍｉｃｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｃｅｒｉｎｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｃｈｌｏｒｏｓｐｏｒｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｃｈｒｏｍｏｓｐｅｒｍｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｃｉｎｎａｍｏｍｅｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｃｉｔｒｉｎｏｖｉｒｉｄｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｃｒａｓｓｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｃｒｅｍｅｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｄｉｎｇｌｅｙｅａｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｄｏｒｏｔｈｅａｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｅｆｆｕｓｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｅｒｉｎａｃｅｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｅｓｔｏｎｉｃｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｆｅｒｔｉｌｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｇｅｌａｔｉｎｏｓｕｓ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｇｈａｎｅｎｓｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｍａｔｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｒｚｉａｎｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈｅｌｉｃｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｉｎｔｒｉｃａｔｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｋｏｎｉｌａｎｇｂｒａ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｋｏｎｉｎｇｉｉ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｋｏｎｉｎｇｉｐｏｓｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｌｏｎｇｉｐｉｌｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｍｉｎｕｔｉｓｐｏｒｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｏｂｌｏｎｇｉｓｐｏｒｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｏｖａｌｉｓｐｏｒｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｐｅｔｅｒｓｅｎｉｉ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｐｈｙｌｌｏｓｔａｈｙｄｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｐｉｌｕｌｉｆｅｒｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｐｌｅｕｒｏｔｉｃｏｌａ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｐｌｅｕｒｏｔｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｐｏｌｙｓｐｏｒｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｐｓｅｕｄｏｋｏｎｉｎｇｉｉ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｐｕｂｅｓｃｅｎｓ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｏｇｅｒｓｏｎｉｉ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｏｓｓｉｃｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｓａｔｕｒｎｉｓｐｏｒｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｓｉｎｕｏｓｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｓｐ．ＭＡ  ３６４２、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｓｐ．ＰＰＲＩ  ３５５９、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｓｐｉｒａｌｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｓｔｒａｍｉｎｅｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｓｔｒｉｇｏｓｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｓｔｒｏｍａｔｉｃｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｓｕｒｒｏｔｕｎｄｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｔａｉｗａｎｅｎｓｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｔｈａｉｌａｎｄｃｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｔｈｅｌｅｐｈｏｒｕｃｏｌｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｔｈｅｏｂｒｏｍｉｃｏｌａ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｔｏｍｅｎｔｏｓｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｅｌｕｔｉｎｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｅｎｓ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅおよびＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅｓｃｅｎｓが挙げられる。これらの中でも、セルラーゼの分泌生産能の観点から、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、トリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ）、トリコデルマ・アトロビリデ、またはトリコデルマ・ロンジブラチアタム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）が好ましく、トリコデルマ・リーセイがより好ましい。
【００１９】
トリコデルマ・リーセイとしては、例えば、トリコデルマ・リーセイ株ＱＭ９４１４、トリコデルマ・リーセイ株ＱＭ６ａが挙げられる。
【００２０】
野生型β−グルコシダーゼとしては、菌体内β−グルコシダーゼと分泌型（菌体外）β−グルコシダーゼが挙げられるが、菌体内β−グルコシダーゼであることが好ましい。菌体内β−グルコシダーゼとしては、例えば、トリコデルマ・リーセイの菌体内β−グルコシダーゼとして、ＢＧＬＩＩ（またはＣｅｌ１Ａと呼ばれる）、Ｃｅｌ１ｂ、Ｃｅｌ３ｃ、Ｃｅｌ３ｄ、Ｃｅｌ３ｈが挙げられ、これらの中でもＢＧＬＩＩが好ましい。
【００２１】
トリコデルマ属に属する微生物であるトリコデルマ・リーセイは、図１に示すように、セルロースを認識し、菌体外で構成的に生産されているセルラーゼ（菌体外β−グルコシダーゼ）によって、セロビオース（２糖）を中心とする可溶性のセロオリゴ糖を生産する。該セロオリゴ糖は菌体内に取り込まれ、ソフォロース等の誘導物質が生産され、該誘導物質により菌体外のセルラーゼが大量に生産されると推定されている（図１）。
【００２２】
トリコデルマ・リーセイは菌体内において５種のβ−グルコシダーゼ［ＢＧＬＩＩ（またはＣｅｌ１Ａと呼ばれる）、Ｃｅｌ１ｂ、Ｃｅｌ３ｃ、Ｃｅｌ３ｄ、Ｃｅｌ３ｈ］を生産している。図２に示すように、これらの菌体内β−グルコシダーゼの中でもβーグルコシダーゼＩＩ（ＢＧＬＩＩ）は、他のβ−グルコシダーゼよりも菌体内における発現量が多い。
【００２３】
したがってβーグルコシダーゼＩＩ（ＢＧＬＩＩ）は、セロビオースの分解、すなわち菌体の生育に関与する極めて重要な酵素と推定されており、そのような酵素は通常アミノ酸変異の導入対象とされない。このような状況において、本発明において、菌体内βーグルコシダーゼＩＩにアミノ酸置換を導入することにより、セルロース系バイオマスの酵素糖化に重要な菌体外酵素の生産量が増大することを見出したが、この結果は予測し得ない結果である。
【００２４】
野生型βグルコシダーゼのアミノ酸配列としては、例えば、配列番号１〜配列番号７に示されるアミノ酸配列を挙げることができる。
【００２５】
配列番号１に示されるβ−グルコシダーゼはトリコデルマ・リーセイ株ＱＭ９４１４（ＡＴＣＣ２６９２１）由来のβ−グルコシダーゼのアミノ酸配列である。
【００２６】
配列番号２は、トリコデルマ  ロンジブラチアタム由来のβ−グルコシダーゼのアミノ酸配列である。配列番号３は、トリコデルマ  ヴァイレンス由来のβ−グルコシダーゼのアミノ酸配列である。配列番号４は、トリコデルマ  アトロビリデ由来のβ−グルコシダーゼのアミノ酸配列である。配列番号５は、トリコデルマ  ハージャナム由来のβ−グルコシダーゼのアミノ酸配列である。配列番号６は、トリコデルマ  ビリデ由来のβ−グルコシダーゼのアミノ酸配列である。配列番号７は、トリコデルマ  ハージャナム由来のβ−グルコシダーゼのアミノ酸配列である。
【００２７】
なお、これら各β−グルコシダーゼ間のアミノ酸配列における同一性（相同性）は、配列番号１および配列番号２の間で９１％、配列番号１および配列番号３の間で９０％、配列番号１および配列番号４の間で８９％、配列番号１および配列番号５の間で８７％、配列番号１および配列番号６の間で８６％、配列番号１および配列番号７の間で８６％である。
【００２８】
本発明の変異株において、野生型β−グルコシダーゼのアミノ酸配列としては、トリコデルマ・リーセイ株ＱＭ９４１４のβ−グルコシダーゼのアミノ酸配列（配列番号１）において１つ以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつβ−グルコシダーゼの機能を有するポリペプチド、並びに配列番号１で示されるアミノ酸配列と好ましくは５０％以上、より好ましくは６０％以上、さらに好ましくは７０％以上、よりさらに好ましくは８０％以上、特に好ましくは９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、最も好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％および９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつβ−グルコシダーゼの機能を有するポリペプチドも包含される。特にトリコデルマ・リーセイ株ＱＭ９４１４のβ−グルコシダーゼとともにアライメントが可能であるものが好ましい。
【００２９】
本発明の変異株は、野生型β−グルコシダーゼのアミノ酸配列のＮ末端から好ましくは２〜４５３番目のアミノ酸、より好ましくは３８０〜４４０番目のアミノ酸、さらに好ましくは４００〜４１６番目のアミノ酸、特に好ましくは４０７〜４１１番目のアミノ酸に少なくとも１のアミノ酸残基の置換が導入されていることが好ましく、４０９番目のアミノ酸残基が置換されていることが最も好ましい。
【００３０】
アミノ酸残基の置換の具体例としてとしては、例えば、Ｖ４０９Ｆ／Ｐ／Ｗ、Ａ４０９Ｆ／Ｐ／Ｗ、Ｃ４０９Ｆ／Ｐ／Ｗの置換が好ましく、Ｖ４０９Ｆ／Ｐ／Ｗがより好ましく、Ｖ４０９Ｆがさらに好ましい。なお、本発明の変異株のセルラーゼ生産性に実質的な悪影響を与えない限り、前述の置換に加えて、必要に応じて、１ないし数個の他のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を含むことができる。
【００３１】
本発明において、アミノ酸残基の置換を定義するために用いる命名法は、置換前のアミノ酸およびその位置、並びに置換後のアミノ酸によって同定される。すなわち、「Ｖ数字Ｆ」は〔数字〕番目のＶがＦに置換されたことを示し、スラッシュで区切られた置換後のアミノ酸は、そのいずれのアミノ酸に置換されたものを示す。すなわち、「Ｖ数字Ｆ／Ｔ」は〔数字〕番目のＶがＦまたはＴに置換された変異を示す。
【００３２】
本発明の変異株は、相同組換えによる遺伝子ターゲッティング等の当該技術分野において公知の任意の方法［例えば、Ｄａｎ  Ｂｕｒｋｅら（大矢禎一ら訳）酵母遺伝子実験マニュアル、丸善株式会社平成１４年１２月１０日発行；Ｚｉｎｎｉａ  Ｒａｈｍａｎら、Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（２００９）８２、ｐ８９９−９０８］などに記載される方法に従って行うことができる。
【００３３】
具体例として、相同組換えによる遺伝子ターゲッティングの方法について具体的に説明する。相同組換えによる遺伝子ターゲッティングは以下の（１）〜（４）の手順により行う。
（１）大腸菌プラスミドベクターにトリコデルマ属に属する微生物の野生型β−グルコシダーゼ遺伝子（ｂｇｌ）の上流領域および下流領域をクローニングし、目的とする領域に変異を導入する。
プラスミドを大腸菌に形質転換する方法としては、遺伝子工学の分野で慣用されている方法を用いることができ、その方法としては、例えばモレキュラー・クローニング第２版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（１９８９）に記載されている方法があげられる。
大腸菌プラスミドベクターとしては、例えば、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ(R)ＩＩ、ｐＴ７ＢｌｕｅＴ、ｐＡＧ、ｐＵＣ等が挙げられる。野生型β−グルコシダーゼ遺伝子への目的とする領域への変異の導入は、例えば、ストラタジーン社製のＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  ＩＩ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ等を用いて行うことができる。変異としては、少なくとも１塩基以上の置換が好ましく、より好ましくは１塩基置換である。
（２）（１）で得られた変異を導入したｂｇｌをクローニングした大腸菌プラスミドベクターにトリコデルマ属に属する微生物を形質転換する際の選択マーカー遺伝子を導入する。
選択マーカー遺伝子としては、例えば、ハイグロマイシン、ゼオシン、カナマイシン、クロラムフェニコールまたはＧ４１８等の薬剤に耐性を付与する遺伝子、およびウラシル合成酵素、ロイシン合成酵素、アデニン合成酵素またはリシン合成酵素等の栄養要求性を相補する遺伝子が挙げられる。
（３）制限酵素処理によってプラスミドから「ｂｇｌ上流領域−変異型ｂｇｌ−ｂｇｌ下流領域−選択マーカー−ｂｇｌ下流領域」の断片を切り出す。
（４）切り出した断片を用いてトリコデルマ属に属する微生物の形質転換を行い、野生型β−グルコシダーゼのアミノ酸配列において少なくとも１のアミノ酸残基が置換された変異株を得る。
【００３４】
このようにして作製された変異株は、優れたセルラーゼ生産性を示す。セルラーゼを生産させるための変異株の培養は、当業者において、通常用いられる培養条件で実施することができる。
【００３５】
培養に用いる糖源としては、各種セルロース、例えば、アビセル、濾紙粉末、セルロースを含むバイオマスなどが、窒素源としては、例えば、ポリペプトン、肉汁、ＣＳＬ、大豆かすなどが用いられる。
【００３６】
その他、この培地には目的とするセルラーゼを生産する上で必要とされる成分を添加することができる。さらに、各種キシラン成分を培地に添加することで、キシラナーゼを増産することも可能である。
【００３７】
これら菌株の培養には、振とう培養、撹拌培養、撹拌振とう培養、静置培養、連続培養など、様々な培養方式を採用しうるが、好ましくは、振とう培養または撹拌培養である。培養温度は、通常、２０℃〜３５℃、好ましくは２５℃〜３１℃であり、培養時間は、通常、４〜１０日、好ましくは４〜９日である。
【００３８】
こうして変異株に産生させたセルラーゼを変異株の菌体外から回収することができる。セルラーゼは、細胞溶解物又は培地の上清サンプルを直接、当該技術分野で知られているドデシルナトリウム硫酸ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）及びウェスタンブロッティングで解析することにより測定できる。
【００３９】
細胞培養中に生産されたセルラーゼは培地の中で分泌され、例えば、細胞培地から不要な成分を取り除くことにより精製または分離される。セルラーゼの精製方法としては、例えば、アフィニティクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカ上またはＤＥＡＥなどの陽イオン交換クロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、硫酸アンモニウム沈殿法およびゲルろ過法等が挙げられる。これらの方法は単独でまたは組み合わせて使用できる。
【００４０】
本発明の変異株に産生させたセルラーゼを用いて、セルロース系バイオマスを糖化することができる。セルロース系バイオマスとしては、草本植物であっても、木本植物であってもよく、また、それらの加工物や廃棄物であってもよい。
【００４１】
草本植物としては、例えば、イネ、エリアンサス、ムギ、サトウキビ、ヨシ、ススキ、トウモロコシ、ソルガム、ネピアグラス、スイッチグラスおよびミスカンサスなどが挙げられるが、これらに制限されない。
【００４２】
木本植物としては、例えば、スギ類、ユーカリ、ヒノキ、マツ類、米ツガ、ポプラ、シラカバ、ヤナギ、クヌギ、ナラ類、カシ、シイ、ブナ、アカシア、タケ、ササ、アブラヤシおよびサゴヤシなどが挙げられるが、これらに制限されない。
【００４３】
一般的に、バイオマスは、そのままの形では、セルラーゼによる糖化を受け難い。このため、セルラーゼによる糖化を行う前に、セルロース系バイオマスを、酵素による糖化を受けやすい形態へと変化させるための処理を行うことが好ましい。
【００４４】
セルロース系バイオマスの前処理方法としては、特に制限はないが、例えば、メカノケミカル粉砕法、水熱処理、アルカリ処理［例えば、苛性ソーダ（ＮａＯＨ）、ＫＯＨ、Ｃａ（ＯＨ）２、Ｎａ２ＳＯ３、ＮａＨＣＯ３、ＮａＨＳＯ３、Ｍｇ（ＨＳＯ３）２、Ｃａ（ＨＳＯ３）２、アンモニア類（ＮＨ３、ＮＨ４ＯＨ）など］、希硫酸処理、水蒸気爆砕処理、ソルボリシス処理および微生物処理、並びにこれらの複合処理が挙げられる。
【００４５】
このような前処理を行うことにより、原料バイオマス中に存在するセルロースが、処理方法や処理条件に依存して、固形分残渣側に残存したり、加水分解されて可溶化画分に移行したりする。
【００４６】
前処理方法や条件の設定により、セルロースを加水分解し、オリゴ糖あるいは単糖として可溶化画分に回収する方法も検討されているが、一般的に前処理条件が過酷になると、バイオマス中の各種成分が過分解を受け、その結果として、酢酸、蟻酸、フルフラール、ヒドロキシメチルフルフラール、リグニン分解物などのアルコール発酵工程における阻害物質を生成し、好ましくない。
【００４７】
従って、バイオマス中のセルロースを構成する糖分を糖化液中に高収率で単糖として回収するためには、前処理による固形分残渣側にできるだけセルロースを残すことと、および残したセルロースができるだけ酵素による糖化を受けやすい形態とすること、のバランスをとることが好ましい。
【００４８】
このようにして原料バイオマスを前処理した後、ろ過、遠心分離などにより固液分離し、前処理固形物とろ液を得る。ここで、原料バイオマスおよび前処理固形物中のセルロースを定量分析する方法としては種々の方法を採用できるが、世界的に標準処方として使用される米国ＮＲＥＬ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｎｅｗａｂｌｅ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）のＬａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ（ＬＡＰ）  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｌｉｇｎｉｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｍａｓｓに準拠した方法が好適である。
【００４９】
前記方法は、原料バイオマス、および前処理固形物を硫酸で加水分解した後に、これらサンプルに含まれるグルコース、キシロース、マンノース、ガラクトースなどの構成糖の含量をＨＰＬＣ法で分析定量し含有率を求める方法である。この方法において、求められたグルコースは、セルロースに由来するもの、それ以外のキシロース、マンノース、ガラクトースなどの成分はヘミセルロースに由来のものとみなして各々の含有率を求める。
【００５０】
こうして前処理したセルロース系バイオマスを、本発明の変異株から産生されたセルラーゼにより糖化する場合の条件は、次の通りである。基質濃度は、通常、１〜２０（ｗ／ｖ）％、好ましくは、５〜１０（ｗ／ｖ）％程度である。ｐＨは、通常、３〜９、好ましくは、４〜６の範囲である。温度は、１０〜８０℃、好ましくは、４０〜６０℃である。酵素濃度は、バイオマス前処理物の乾物重量当りのタンパク質量基準で、１〜２０ｍｇ／ｇ−バイオマス重量、好ましくは１〜１０ｍｇ／ｇ−バイオマス重量である。
【００５１】
これら条件下、例えば、振とう、または静置で、糖化反応を進行させることができる。また、この糖化反応において、雑菌汚染を防止する目的でアジ化ナトリウムなどの殺菌剤を添加することもできる。この際は、後の糖化液の発酵工程に悪影響を及ぼさない化合物と濃度を選択することが好ましい。糖化率は、糖化液中の生成物を各種還元糖定量法やＨＰＬＣ法で分析することにより求めることができる。
【００５２】
こうして得られた糖化液を発酵させることにより、エタノールを製造することができる。糖化液からのエタノールの製造は、一般的な方法を適用することができる。エタノールの製造に用いる微生物としては、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ属、Ｐｉｃｈｉａ属、Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属、およびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属に属する微生物が挙げられるが、これらに制限されない。
【００５３】
糖をエタノールに変換するための代謝系に関連する遺伝子を組み込んだ微生物あるいはこれらの変異株を利用することも可能である。糖化液に、これら微生物を植菌して培養することにより、エタノールを製造することが可能である。
【００５４】
用いる糖化液は、糖濃度が３〜１５％で、ｐＨは３〜７が好ましい。培養温度は、２０〜４０℃が好ましい。エタノール発酵は、回分法でも連続法でも行うことが可能である。エタノール発酵は、上記のセルロース系バイオマスの糖化反応と同時に行うことができる（並行複発酵）。この場合は、糖化反応の条件とエタノール発酵の条件を組みあわせ、全体として生産性が最も高くなる糖濃度、温度、ｐＨなどの条件が適宜選択すればよい。
【実施例】
【００５５】
［実施例１］
図３に示すように、トリコデルマ・リーセイ株ＱＭ９４１４のｂｇｌ２変異株およびｂｇｌ２破壊株を作製した。
（１）ｂｇｌ２変異遺伝子を含むベクターの作製
トリコデルマ・リーセイＱＭ９４１４株由来のβ−グルコシダーゼ遺伝子（ｂｇｌ２）（配列番号８）およびその上流領域と下流領域を含む染色体ＤＮＡ（配列番号９）をプラスミドベクターｐＵＣ１１８に挿入した。得られたプラスミドベクターを鋳型として、下記に記載するオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ＰＣＲ法により、ｂｇｌ２の５’末端から１２９８番目の塩基Ｇを塩基Ｔに置換し、１塩基変異を導入してｂｇｌ２変異遺伝子を作製した。該変異はＱＭ９４１４のβ−グルコシダーゼ（ＢＧＬＩＩ）（配列番号１）のＮ末から４０９番目のアミノ酸であるＶをＦに置換する変異である。得られたｂｇｌ２変異遺伝子を含むＤＮＡ断片の塩基配列について配列決定を行い、ＰＣＲエラーがないことを確認した。塩基配列の決定には、ＣＥＱＴＭ２０００ＸＬ  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＢＥＣＫＭＡＮ  ＣＯＵＬＴＥＲ社）を使用し、操作の詳細は、付属の取扱説明書に従った。
【００５６】
ｂｇｌ２変異導入用（センスプライマー）：
５’−ggacgggttcaacgtcaaggggtactttgcctg−３’（配列番号１０）
ｂｇｌ２変異導入用（アンチセンスプライマー）：
５’−acgttgaacccgtccagctccacggcggtaacc−３’（配列番号１１）
【００５７】
ＤＮＡ断片を増幅するためのＰＣＲの反応条件は、９８℃１０秒、５０℃１５秒、７２℃５分２０秒の３段階の反応を１サイクルとし、これを３０サイクル繰り返した。ＰＣＲには、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）  ＨＳ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社）を使用した。また、変異導入のためのＰＣＲの反応条件は９８℃１０秒、５５℃５秒、７２℃４５秒の３段階の反応を１サイクルとし、これを３０サイクル繰り返した。
【００５８】
（２）選択マーカー遺伝子の導入
選択マーカー遺伝子であるトリコデルマ・リーセイ由来のｐｙｒ４およびその上流領域と下流領域を含むプラスミドｐＵｐｙｒ４をＳａｌＩ処理することによりｐｙｒ４を切り出した。その後（１）でクローニングしたｂｇｌ２変異遺伝子を含むＤＮＡ断片のｂｇｌ２下流領域の制限酵素サイトＡｐａＩにｐｙｒ４を挿入した。塩基配列の決定には、ＣＥＱＴＭ２０００ＸＬ  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＢＥＣＫＭＡＮ  ＣＯＵＬＴＥＲ社）を使用し、操作の詳細は、付属の取扱説明書に従った。
【００５９】
（３）ｂｇｌ２破壊遺伝子を含むベクターの作製
トリコデルマ・リーセイ株ＱＭ９４１４のβ−グルコシダーゼ遺伝子（ｂｇｌ２）（配列番号８）およびその上流領域と下流領域を含む染色体ＤＮＡ（配列番号９）をプラスミドベクターｐＵＣ１１８に挿入した。得られたプラスミドについて、ｂｇｌ２遺伝子内およびｂｇｌ２下流領域に存在する制限酵素サイトＸｈｏＩの間に上記（２）で得られた選択マーカーｐｙｒ４を挿入した。
【００６０】
（４）Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉの形質転換
構築したベクターを、それぞれＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ  ＱＭ９４１４株（ＷＴ、野生株）にプロトプラストＰＥＧ法により導入した。形質転換体をアセトアミド資化能用選択培地で選抜した。培地の組成は次の通りとした。
【００６１】
２０ｍｇ／ｍＬ  グルコース、１Ｍ  ソルビトール、２％  ａｇａｒ、１５ｍｇ／ｍＬ  ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ５．５）、０．６ｍｇ／ｍＬ  ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、１２．５ｍＭ  ＣｓＣｌ２、０．６ｍｇ／ｍＬ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１０ｍＭ  Ａｃｅｔａｍｉｄｅ、５μｇ／ｍＬ  ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１．６μｇ／ｍＬ  ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ、１．４μｇ／ｍＬ  ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２μｇ／ｍＬ  ＣｏＣｌ２
【００６２】
得られた形質転換体の染色体上のｂｇｌ２配座に（１）、（２）および（３）で構築したｂｇｌ２遺伝子変異ベクターおよびｂｇｌ２遺伝子破壊別ベクターが相同的に組み込まれていることを確認するために、下記に記載するオリゴヌクレオチドプライマーを用いてコロニーＰＣＲを行い、正しいＤＮＡ増幅を示した株を形質転換体とした。また、ｂｇｌ２遺伝子変異株については染色体上のｂｇｌ２遺伝子に変異が導入されているかどうかを確認するためにダイレクトシークエンシングを行った。
【００６３】
得られた形質転換体のβ−グルコシダーゼ（ＢＧＬＩＩ）の発現を確認するために、胞子１０７個を、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ用液体培地５０ｍＬを含む３００ｍＬ容三角フラスコに植菌した。培地の組成は次の通りとした。
１％  Ａｖｉｃｅｌ、０．１４％  （ＮＨ４）２ＳＯ４、０．２％  ＫＨ２ＰＯ４、０．０３％  ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．０３％  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．１％  Ｂａｃｔｏ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｏｎ、０．０５％  Ｂａｃｔｏ  Ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ、０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ８０、０．１％  Ｔｒａｃｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ、５０ｍＭ  酒石酸緩衝液（ｐＨ４．０）
【００６４】
なお、Ｔｒａｃｅ  ｅｌｅｍｅｎｔの組成は次の通りとした。
６ｍｇ  Ｈ３ＢＯ３、２６ｍｇ  （ＮＨ４）６ＭＯ７Ｏ２４・４Ｈ２Ｏ、１００ｍｇ  ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、４０ｍｇ、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、８ｍｇ  ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、２００ｍｇ  ＺｎＣｌ２を蒸留水で１００ｍｌにメスアップしたもの。
【００６５】
２２０ｒｐｍ、２８℃で３日間培養した培養液を濾過することによって菌糸を回収し、マルチビーズショッカー（安井機械社製）を用いてジルコニアビーズ存在下にて４℃で２０００ｒｐｍ、３０秒の処理を５回繰り返した（インターバル１分）。得られた菌体破砕液を４℃で遠心分離して得られた上清を無細胞抽出液とした。無細胞抽出液のＢＧＬ２活性をセロビオース分解活性として形質転換体では活性が失われていることを確認した。セロビオース分解活性は、Ｓｉｇｍａ社のセロビオースを用い、基質濃度２１ｍＭ、ｐＨ６．０、３０分の反応により生成したグルコースを和光純薬社製のグルコースキットテストワコーによって検出することによって行った。
【００６６】
［実施例２］
Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ  ＱＭ９４１４株（ＷＴ）と実施例１で作製した、ＱＭ９４１４  ｂｇｌ２変異株およびＱＭ９４１４  ｂｇｌ２破壊株のそれぞれの胞子１０７個をＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ用液体培地（１％  Ａｖｉｃｅｌ）５０ｍＬを含む３００ｍＬ三角フラスコに植菌した。２２０ｒｐｍ、２８℃で７日間培養後、培養液を３０００ｒｐｍ、１５分遠心し、分離した培養上清をさらに、Ｍｉｒａｃｌｏｔｈ（コスモバイオ社）にて濾過し、得られた濾液を酵素液として使用した。得られた酵素液２０μＬをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供したものが図４である。
【００６７】
得られた酵素液について、ＣＭＣ分解活性（ＣＭＣａｓｅ活性）を測定した。ＣＭＣ分解活性は、Ｓｉｇｍａ社のカルボキシメチルセルロース（Ｌｏｗ  ｖｉｓｃｏｓｉｔｙ）を用い、基質濃度１（ｗ／ｖ）％、ｐＨ５．０、５０℃、１５分間の反応により生成した還元糖を酸化銅の還元を用いる定量法（ソモジーネルソン法）でグルコースを標準にして定量し測定した。また、タンパク質量は、Ｂｉｏ−ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｉｎｃ．のＱｕｉｃｋ  Ｓｔａｒｔ  Ｂｒａｄｆｏｒｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  キットによりＢｏｖｉｎｅ  Ｇａｍｍａ  Ｇｌｏｂｕｌｉｎを標準として定量した。これらの酵素活性の値とタンパク質量を図５および図６に示す。
【００６８】
図４に示すように、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉＱＭ９４１４  ｂｇｌ２変異株は、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉＱＭ９４１４株（ＷＴ）と比較して各タンパク質バンドの強度が強いことがわかった。
【００６９】
また、図５に示すように、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉＱＭ９４１４  ｂｇｌ２変異株は、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉＱＭ９４１４株（ＷＴ）と比較して、ＣＭＣ分解活性が１．５倍以上と非常に高く、さらにタンパク質生産量も１．５倍以上増強されていることから、セルラーゼ酵素タンパク質の生産性が顕著に向上していることが明らかとなった。
【００７０】
各配列番号の配列は以下の通りである。
配列番号１：トリコデルマ  リーセイ由来ＢＧＬ  ＩＩのアミノ酸配列
配列番号２：トリコデルマ  ロンジブラチアタム由来のβ−グルコシダーゼのアミノ酸配列
配列番号３：トリコデルマ  ヴァイレンス由来のβ−グルコシダーゼのアミノ酸配列
配列番号４：トリコデルマ  アトロビリデ由来のβ−グルコシダーゼのアミノ酸配列
配列番号５：トリコデルマ  ハージャナム由来のβ−グルコシダーゼのアミノ酸配列
配列番号６：トリコデルマ  ビリデ由来のβ−グルコシダーゼのアミノ酸配列
配列番号７：トリコデルマ  ハージャナム由来のβ−グルコシダーゼのアミノ酸配列
配列番号８：トリコデルマ・リーセイＱＭ９４１４株由来のβ−グルコシダーゼ遺伝子（ｂｇｌ２）の塩基配列
配列番号９：トリコデルマ・リーセイＱＭ９４１４株由来のβ−グルコシダーゼ遺伝子（ｂｇｌ２）およびその上流、下流領域の塩基配列
配列番号１０：ｂｇｌ２変異導入用センスプライマーの塩基配列
配列番号１１：ｂｇｌ２変異導入用アンチセンスプライマーの塩基配列
【産業上の利用可能性】
【００７１】
本発明の変異株はこれまでの株と同等の栄養源においてセルラーゼの生産性が高められており産業上非常に有用である。また、該変異株を宿主としてセルラーゼ遺伝子プロモーターを用いた異種タンパク質の高発現化が期待できるという点で非常に有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図６】
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【図４】
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【配列表】
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