(57)【要約】      （修正有）【課題】膵がんの治療のための改善された医薬組成物の提供。【解決手段】水不溶性で水膨張性のポリマーを含んでおり、放出可能な形態でポリマーと結合している微小球と、膵臓の腫瘍又は嚢胞の治療に使用される化学療法剤とを含み、微小球が、３７℃で水と平衡状態になったときに、ポリマーと水との総重量に基づいて少なくとも４０重量％の水を含み、ポリマーが、ｐＨ７でアニオン性に荷電され、そして、化学療法剤が、カチオン的に荷電されて、ポリマーと静電的に結合している医薬組成物。前記化学療法剤がアントラサイクリン系化合物又はカンプトテシン系化合物である医薬組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
水不溶性で水膨張性のポリマーを含んでおり、放出可能な形態で前記ポリマーと結合している微小球と、膵臓の腫瘍又は嚢胞の治療に使用される化学療法剤とを含み、
前記微小球が、３７℃で水と平衡状態になったときに、ポリマーと水との総重量に基づいて少なくとも４０重量％の水を含み、
前記ポリマーが、ｐＨ７でアニオン性に荷電され、そして、前記化学療法剤が、カチオン的に荷電されて、前記ポリマーと静電的に結合している、組成物。
【請求項２】
前記化学療法剤が、ミトキサントロン、又は、一般式ＩＶ：
【化１】
2014208661.tif 000013
で示されるアミン基を有するアントラサイクリン化合物である、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
前記アントラサイクリンがドキソルビシンである、請求項２記載の組成物。
【請求項４】
前記化学療法剤が、一般式Ｉ：
【化２】
2014208661.tif 000014
〔式中、
Ｒ1は、Ｈ、ハロゲン、ヒドロキシル、並びに、任意にヒドロキシル、アミン、アルコキシ、ハロゲン、アシル及びアシルオキシ基で置換されている低級（Ｃ1-6）アルキルから選択され；
Ａは、Ｃ（Ｏ）Ｏ又はＣＨ2であり；そして
Ｒは、ＮＲ2Ｒ3であり、式中、Ｒ2及びＲ3は、同一又は異なっていて、それぞれ、水素原子、置換若しくは非置換Ｃ1-4アルキル基、又は、置換若しくは非置換の炭素環式若しくは複素環式基を表すか、或いはＲ2及びＲ3は、それらが結合している窒素原子と一緒になって、−Ｏ−、−Ｓ−若しくは＞ＮＲ4が挿入されていてもよい、任意に置換されている複素環を形成し、ここで、Ｒ4は、水素原子、置換若しくは非置換Ｃ1-4アルキル基、又は、置換若しくは非置換フェニル基であり；
そして、式中、−Ａ−Ｒ基は、前記カンプトテシン化合物のＡ環の任意の位置に位置する炭素原子と結合しており、かつ、Ｒ1は、Ａ又はＢ環において置換されている〕
で示される化合物、または、その塩である、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記化学療法剤がイリノテカン、トポテカン又はそれらの誘導体の１つである、請求項４記載の組成物。
【請求項６】
前記化学療法剤が、一般式ＩＩ：
【化３】
2014208661.tif 000015
〔式中、
Ｒ20及びＲ23は、それぞれヒドロキシ若しくは水素であるか、又は一緒になってＣＨ2ＯＣＨ2であり；
Ｒ21及びＲ22のうちの一方はＨであり、他方はＣＨ2ＮＲ24Ｒ25であって、ここで、Ｒ23及びＲ24は、同一又は異なっていて、それぞれ水素原子、置換若しくは非置換Ｃ1-4アルキル基、又は、置換若しくは非置換の炭素環式若しくは複素環式基を表すか、或いはＲ23及びＲ24は、それらが結合している窒素原子と一緒になって、−Ｏ−、−Ｓ−若しくは＞ＮＲ4が挿入されていてもよい、任意に置換されている複素環を形成し、ここで、Ｒ4は、水素原子、置換若しくは非置換Ｃ1-4アルキル基、又は、置換若しくは非置換フェニル基である〕を有し、または、その塩若しくは第四級誘導体である、請求項１記載の組成物。
【請求項７】
前記化学療法剤が、０．１g/l未満の水溶性を有するラパマイシン類似体、そのエステル及び塩、並びに０．１g/l未満の水溶性を有するパクリタキセル類似体、そのエステル及び塩から選択される、請求項１記載の組成物。
【請求項８】
少なくとも２つの異なる化学療法剤を含む、請求項１〜７のいずれか１項記載の組成物。
【請求項９】
前記ポリマーが、アルギン酸塩、ポリビニルアルコール又は架橋ポリビニルアルコールである、請求項１〜８のいずれか１項記載の組成物。
【請求項１０】
前記ポリマーが、エチレン性基のラジカル重合によって、１分子あたり１より多いエチレン性不飽和ペンダント基を有するポリビニルアルコール（ＰＶＡ）マクロモノマーから形成される、請求項９記載の組成物。
【請求項１１】
前記マクロマーが、例えば、非イオン性モノマー、及び／又は、アニオン性モノマーを含むイオン性モノマーを含む、エチレン性不飽和モノマーと共重合される、請求項１０記載の組成物。
【請求項１２】
前記エチレン性不飽和モノマーが、一般式ＩＩＩ：
Ｙ1ＢＱ1      ＩＩＩ
〔式中、Ｙ1は、
【化４】
2014208661.tif 000016
ＣＨ2＝Ｃ（Ｒ10）−ＣＨ2−Ｏ−、ＣＨ2＝Ｃ（Ｒ10）−ＣＨ2ＯＣ（Ｏ）−、ＣＨ2＝Ｃ（Ｒ10）ＯＣ（Ｏ）−、ＣＨ2＝Ｃ（Ｒ10）−Ｏ−、ＣＨ2＝Ｃ（Ｒ10）ＣＨ2ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ11）−、Ｒ12ＯＯＣＣＲ10＝ＣＲ10Ｃ（Ｏ）−Ｏ−、Ｒ10ＣＨ＝ＣＨＣ（Ｏ）Ｏ−、Ｒ10ＣＨ＝Ｃ（ＣＯＯＲ12）ＣＨ2−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−、
【化５】
2014208661.tif 000017
から選択され、ここで、
Ｒ10は、水素又はＣ1〜Ｃ4アルキル基であり；
Ｒ11は、水素又はＣ1〜Ｃ4アルキル基であり；
Ｒ12は、水素又はＣ1-4アルキル基、又はＢＱ1であり、ここでＢ及びＱ1は、下記に定義されているとおりであり；
Ａ1は、−Ｏ−又は−ＮＲ11−であり；
Ｋ1は、これらの基（−（ＣＨ2）rＯＣ（Ｏ）−、−（ＣＨ2）rＣ（Ｏ）Ｏ−、−（ＣＨ2）rＯＣ（Ｏ）Ｏ−、−（ＣＨ2）rＮＲ13−、−（ＣＨ2）rＮＲ13Ｃ（Ｏ）−、−（ＣＨ2）rＣ（Ｏ）ＮＲ13−、−（ＣＨ2）rＮＲ13Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−（ＣＨ2）rＯＣ（Ｏ）ＮＲ13−、−（ＣＨ2）rＮＲ13Ｃ（Ｏ）ＮＲ13−（式中、基Ｒ13は同一又は異なっている）、−（ＣＨ2）rＯ−、若しくは、−（ＣＨ2）rＳＯ3−）、又は、任意にＢと組み合わされて、原子価結合であり、ここで、ｒは、１〜１２であり、Ｒ13は、水素又はＣ1〜Ｃ4アルキル基であり；
Ｂは、任意に、パーフルオロ化鎖までを含む１個以上のフッ素原子を含有する、直鎖若しくは分岐鎖のアルカンジイル、オキサアルキレン、アルカンジイルオキサアルカンジイル若しくはアルカンジイルオリゴ（オキサアルカンジイル）鎖であるか、又は、Ｑ1若しくはＹ1が、Ｂに結合している末端炭素原子を含有する場合、原子価結合であり；そして
Ｑ1は、アニオン性基である〕
を有するイオン性モノマーを含む、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
粘度調整剤、好ましくはアルギン酸塩を含む、請求項１〜１２のいずれか１項記載の組成物。
【請求項１４】
医薬組成物であり、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤を更に含む、請求項１〜１３のいずれか１項記載の組成物。
【請求項１５】
膵臓の腫瘍又は嚢胞の治療方法であって、請求項１〜１４のいずれか１項記載の微小球を含む組成物をヒト又は動物の身体に投与する工程を含み、前記治療において、前記化学療法剤が前記微小球から放出される方法。
【請求項１６】
前記治療において、前記組成物が、好ましくは超音波内視鏡（ＥＵＳ）の誘導下で、前記膵臓の腫瘍若しくは嚢胞の中に又はその周囲に注射される、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
一般式Ｉ:
【化５】
2014208661.tif 000018
〔式中、
Ｒ1は、Ｈ、ハロゲン、ヒドロキシル、並びに、任意にヒドロキシル、アミン、アルコキシ、ハロゲン、アシル及びアシルオキシ基で置換されている低級（Ｃ1-6）アルキルから選択され；
Ａは、Ｃ（Ｏ）Ｏ又はＣＨ2であり；そして
Ｒは、ＮＲ2Ｒ3であり、式中、Ｒ2及びＲ3は、同一又は異なっていて、それぞれ、水素原子、置換若しくは非置換Ｃ1-4アルキル基、又は、置換若しくは非置換の炭素環式若しくは複素環式基を表すか、或いはＲ2及びＲ3は、それらが結合している窒素原子と一緒になって、−Ｏ−、−Ｓ−若しくは＞ＮＲ4が挿入されていてもよい、任意に置換されている複素環を形成し、ここで、Ｒ4は、水素原子、置換若しくは非置換Ｃ1-4アルキル基又は置換若しくは非置換フェニル基であり；
そして、式中、−Ａ−Ｒ基は、前記カンプトテシン化合物のＡ環の任意の位置に位置する炭素原子と結合しており、かつ、Ｒ1は、Ａ又はＢ環において置換されている〕
で示される化学療法剤、または、その塩を含む、
膵臓の腫瘍又は嚢胞の治療に使用される組成物であって、
作用物質が、好ましくは超音波内視鏡（ＥＵＳ）の誘導下で、前記膵臓の腫瘍若しくは嚢胞の中に又はその周囲に注射される、組成物。
【請求項１８】
前記化学療法剤を含むアニオン性ポリマーマトリックスを含有する、請求項１７記載の組成物。
【請求項１９】
前記ポリマーマトリックスが、請求項１及び１０〜１３のいずれか１項に定義された特徴のいずれかを有する、請求項１８記載の組成物。
【請求項２０】
粘度調整剤を更に含む、請求項１７〜１９のいずれか１項記載の組成物。
【請求項２１】
医薬組成物であり、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤を更に含む、請求項１７〜２０のいずれか１項記載の組成物。
【請求項２２】
膵臓の腫瘍又は嚢胞の治療方法であって、請求項１７〜２１のいずれか１項記載の組成物を、好ましくは超音波内視鏡（ＥＵＳ）の誘導下で、前記腫瘍若しくは嚢胞の中に又はその周囲に注射する工程を含む方法。
【請求項２３】
一般式Ｉ:
【化６】
2014208661.tif 000019
〔式中、
Ｒ1は、Ｈ、ハロゲン、ヒドロキシル、並びに、任意にヒドロキシル、アミン、アルコキシ、ハロゲン、アシル及びアシルオキシ基で置換されている低級（Ｃ1-6）アルキルから選択され；
Ａは、Ｃ（Ｏ）Ｏ又はＣＨ2であり；そして
Ｒは、ＮＲ2Ｒ3であり、式中、Ｒ2及びＲ3は、同一又は異なっていて、それぞれ水素原子、置換若しくは非置換Ｃ1-4アルキル基又は置換若しくは非置換の炭素環式若しくは複素環式基を表すか、或いはＲ2及びＲ3は、それらが結合している窒素原子と一緒になって、−Ｏ−、−Ｓ−若しくは＞ＮＲ4が挿入されていてもよい、任意に置換されている複素環を形成し、ここで、Ｒ4は、水素原子、置換若しくは非置換Ｃ1-4アルキル基又は置換若しくは非置換フェニル基であり；
そして、式中、−Ａ−Ｒ基は、カンプトテシン化合物のＡ環の任意の位置に位置する炭素原子と結合しており、かつ、Ｒ1は、Ａ又はＢ環において置換されている〕
で示される化学療法剤、または、その塩を含む、
ポリマーマトリックスを含む組成物であって、
膵臓の腫瘍又は嚢胞の治療に使用される組成物。
【請求項２４】
膵臓の腫瘍又は嚢胞の治療方法であって、請求項２３項記載の組成物を、好ましくは超音波内視鏡の誘導下で、前記腫瘍若しくは嚢胞の中に又はその周囲に注射する工程を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、膵がんの治療のための組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
膵癌は、米国では男性及び女性の両方において４番目に高い死因の癌である（非特許文献１を参照）。膵癌は、新たな症例の２．５％を占めているに過ぎない一方で、毎年の癌による死亡の６％に該当する（非特許文献２を参照）。その症状を有する患者の５％未満が、５年を超えて生存する（非特許文献１を参照）。局所進行性（悪性腫瘍のＴＮＭ分類のステージＩＩ、ＩＩＩ又はＩＶ）膵臓癌を有する患者が、観察又は併用化学療法のいずれかに無作為化された３つの臨床試験では、生存期間中央値は、観察群において平均３．５か月であり、化学療法群では平均４．５か月であった（非特許文献３−６を参照）。無作為化臨床試験における化学療法と外部ビーム放射線療法の組み合わせは１１．５か月までの生存中央値を（関連する毒性を伴って）生じた（非特許文献７−１０を参照）。最近、単一の作用物質としてゲムシタビンが５．７か月の生存中央値を示し、対照的に、５−フルオロウラシルは、４．４か月の生存中央値を示した（非特許文献１１を参照）。
【０００３】
膵癌の治療は、医者にとって依然として問題が多い。患者の１５％のみが切除可能な腫瘍を提示し、全身化学療法は、有効性が限定的である。全身治療に匹敵する副作用を引き起こすことなく腫瘍において高い局所薬剤濃度を達成するために、局所化学療法が代替的治療として導入され、検討された（非特許文献１２を参照）。近年、幾つかの技術が開発され、これらには、腹腔動脈注入法（ＣＡＩ）、微小球又は血液濾過法を用いるＣＡＩ、大動脈流れ停止法（ＡＳＦ）及び低酸素潅流分離法（ＩＨＰ）が含まれる。数人の著者が、反応率の改善及び生存平均期間の延長を報告したが、これらの結果は、他者により確認されていない。加えて、副作用の発生及び技術的合併症の率が、局所化学療法の際に高いことが報告されている。
【０００４】
超音波内視鏡（ＥＵＳ）は、内視鏡により向けられた超音波を使用して、胸部及び腹部の内臓又は腫瘍の画像を得る医学的手法である。薬剤又は物質の注射を、位置する腫瘍の周囲に導くために使用することができる。ＥＵＳ単独（９４％）は、膵臓病巣を検出するために、特に３cmより小さい場合に、ＣＴスキャン（６９％）及び磁気共鳴映像法（８３％）よりも感受性があることが示されている（非特許文献１３を参照）。ＥＵＳ誘導注射療法は、腫瘍を治療する方法として、化学療法剤、免疫調節物質、遺伝子治療及び放射性核種剤を少人数の患者に送達するために使用されてきた（非特許文献１４を参照）。２０００年の第１相試験は、ＥＵＳ誘導細針注射（ＦＮＩ）を使用して、細胞移植片を膵がんに送達し、４．２〜＞３６か月の範囲で全体的な生存中央値の１３．２か月を示した（非特許文献１５を参照）。ＥＵＳは、膵臓への５−フルオロウラシルの持続的送達のための腫瘍内乳酸ポリマーの移植を誘導するために使用されてきた。この研究は、イヌの膵臓において、化学療法ポリマーのＥＵＳ誘導移植の技術的実現性を実証した（非特許文献２２を参照）。
【０００５】
膵臓の嚢胞性腫瘍は、頻繁に検出され、良性から悪性にわたる広い病理範囲を包含する。嚢胞性腫瘍の相当な部分は、広範囲な診断評価の後でさえも組織学的に分類することができず、したがって、最終的に外科的な切除が必要になる。近年、ＥＵＳ誘導エタノール洗浄による嚢胞性腫瘍の完全な分解が、従来の研究において報告された。更なる研究において、膵臓の嚢胞性腫瘍のためのパクリタセキル注射を伴うＥＵＳ誘導エタノール洗浄（ＥＵＳ−ＥＰ）の安全性、実現可能性及びその後の反応が評価された（非特許文献１６を参照）。この研究によって、ＥＵＳ−ＥＰは、膵臓の嚢胞性腫瘍を治療する安全で実現可能な効果的方法であると思われる。
【０００６】
微小球の腫瘍内注射は、過去数年間知られており、問題が多いと考えられた。Mattssonら（非特許文献１４を参照）は、ミクロ炭化微小球を、２つの移植ラット腫瘍、１本の後ろ足の背部に移植した肝細胞癌及び肝臓に移植した腺癌に注射した。微小球は、不均一に分布し、多くの場合に凝集体で見出され、腫瘍内血管を充填するように思われた。この所見は、微小球注射後の腫瘍における血管抵抗の増加により部分的に説明され、微小球の反復注射を用いる技術は議論の余地があると思われた（非特許文献１７を参照）。アドリアマイシンを含有するアルブミン微小球による後の研究は、遊離薬剤の腫瘍内注射と比較して、肉腫ラットモデルにおいて有意な腫瘍反応を示した（非特許文献１８を参照）。腫瘍内遊離ミトキサントロン又はミトキサントロン担持アルブミン微小球の効能及び毒性は、ネズミ乳癌モデルを使用して別の研究において評価された（非特許文献１９を参照）。同じモデルにおいて、これら２つの療法の組み合わせも評価された。結果は、腫瘍内ミトキサントロンは、特に微小球調合剤において、生存の有意な改善及び全身毒性の有意な減少を示した。他の研究は、皮下又は筋肉内に移植された固形腫瘍の増殖を抑制する、注射用生分解性微小球放出カルボプラチン、ドキソルビシン又は５−フルオロウラシルの能力を強化した（非特許文献２０を参照）。ＭＡＴＢ−ＩＩＩ細胞の移植の７〜１０日後、ラットは、全身化学療法、腫瘍内ボーラス化学療法又は腫瘍中心若しくは腫瘍の外周界に沿った複数部位に化学療法微小球の注射を受けた。腫瘍の周界に沿ったカルボプラチン、ドキソルビシン又は５−フルオロウラシル微小球による単回治療は、腫瘍中心への直接的な注射に対して、腫瘍増殖の有意な用量関連抑制を生じた。ドキソルビシン担持微小球と５−フルオロウラシル担持微小球とをブレンドすること及びそれらを腫瘍に注射することにより達成された多剤併用は、いずれかの薬剤単独の持続的送達よりもさらに効能があった。
【０００７】
Liuらは、ネズミ乳癌モデルにおいて微小球からのドキソルビシン及び化学増感剤ベラパミルの送達の効果を調査した（非特許文献２１を参照）。初期インビトロ研究は、ＥＭＴ６ネズミ乳癌細胞において及びドキソルビシン選択性多剤耐性変種ＥＭＴ６／ＡＲ１．０において、ドキソルビシン及び〔（９９ｍ  Ｔｃ）〕セスタミビの両方の蓄積、その上、Ｐ−糖タンパク質基質の蓄積も増強するベラパミルの能力を確認した。処置を受けなかった群又はブランク微小球を受けた群と比較して、腫瘍増殖の小幅（３４％まで）の遅延があった。腫瘍内に投与された抗癌剤の制御放出微小球製剤は、高用量の薬剤を腫瘍に送達し、全身毒性がほとんどない効率的な方法であった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】http://pancan.org/About/pancreaticCancerStats.html
【非特許文献２】Ahmedin Jemal, DVM, PhD, Rebecca Siegel, MPH, Elizabeth Ward, PhD, Taylor Murray, Jiaquan Xu 及び Michael J. Thun, MD,MS. Cancer Statistics, 2007. CA Cancer J Clin 2007; 57: 43-66
【非特許文献３】Stephens J, Kuhn J, O'Brien J等. Surgical morbidity, mortality, and long-term survival in patients with peripancreatic cancer following pancreaticoduodenectomy. Am J Surg. 1997; 174: 600-604
【非特許文献４】Andersen JR, Friis-Mo"ller A, Hancke S, RO"der O, Steen J, Baden H. A controlled trial of combination chemotherapy with 5-FU and BCNU in pancreatic cancer. Scand J Gastroenterol 1981; 16: 973-5
【非特許文献５】Frey C, Twomey P, Keehn R, Elliott 0, Higgins G. Randomized study of 5-FU and CCNU in pancreatic cancer: report of the Veterans Administration Surgical Adjuvant Cancer Chemotherapy Study Group. Cancer 1981; 47: 27-31
【非特許文献６】Mallinson CN, Rake MO, Cocking JB, Fox CA, Cwynarski MT, Diffey BL等. Chemotherapy in pancreatic cancer: results of a controlled, prospective, randomised, multicentre trial. BMJ 1980; 281: 1589-91
【非特許文献７】Moertel CG, Frytak S, Hahn RG, O'Connell MJ, Reitemeier RJ, Rubin J等. Therapy of locally unresectable pancreatic carcinoma: a randomized comparison of high dose (6000 rads) radiation alone, moderate dose radiation (4000 rads 1 5-fluorouracil), and high dose radiation 1 5-fluorouracil: the Gastrointestinal Tumour Study Group. Cancer 1981; 48: 1705-1O
【非特許文献８】Gastrointestinal Tumour Study Group. Radiation therapy combined with Adriamycin or 5-fluorouracil for the treatment of locally unresectable pancreatic carcinoma. Cancer 1985; 56: 2563-8
【非特許文献９】Klaassen DJ, Maclntyre JM, Catton GE, Engstrom PF, Moertel CG. Treatment of locally unresectable cancer of the stomach and pancreas: a randomized comparison of 5-fluorouracil alone with radiation plus concurrent and maintenance 5-fluorouracil-an Eastern Cooperative Oncology Group study. J Clin Oncol 1985; 3: 373-8
【非特許文献１０】Gastrointestinal Tumour Study Group. Treatment of locally unresectable carcinoma of the pancreas: comparison of combined-modality therapy chemotherapy plus radiotherapy to chemotherapy alone. J Natl Cancer Inst 1988; 80: 751-5
【非特許文献１１】Burris HA III, Moore MJ, Andersen J, Green MR, Rothenberg ML, Modiano MR等. Improvements in survival and clinical benefit with gemcitabine as first-line therapy for patients with advanced pancreas cancer: cancer: a randomized trial. J Clin Oncol 1997; 15: 2403-13
【非特許文献１２】Lorenz M, Heinrich S, Staib-Sebler E, Kohne CH, Wils J, Nordlinger B, Encke A. Regional chemotherapy in the treatment of advanced pancreatic cancer - is it relevant? Eur J Cancer. 2000 May; 36(8): 957-65
【非特許文献１３】Nirag C. Jhala, Darshana N. Jhal, David C. Chhieng, Mohamad A. Eloubeidi, Isam A. Eltoum, Isam A. Eltoum, (Am J Clin Pathol 120(3): 351-367, 2003)
【非特許文献１４】Anthony J. Dimarino, Jr., Anthony J. DiMarino, Stanley B. Benjamin Gastrointestinal Disease: An Endoscopic Approach, Published 2002: 1078 ISBN 1556425112
【非特許文献１５】Kenneth J. Chang, M.D., Phuong T. Nguyen, M.D., James A. Thompson, M.D., Thomas T. Kurosaki, M.S., Linda R. Casey, M.D., Edwin C. Leung, M.A., Gale A. Granger, Ph.D. Phase I clinical trial of allogeneic mixed lymphocyte culture (cytoimplant) delivered by endoscopic ultrasound-guided fine-needle injection in patients with advanced pancreatic carcinoma. Cancer, Volume 88, Issue 6, Pages 1325-1335
【非特許文献１６】Oh HC, Seo DW, Lee TY, Kim JY, Lee SS, Lee SS, Kim MH. New treatment for cystic tumours of the pancreas: EUS-guided ethanol lavage with paclitaxel injection. Gastrointest Endosc. 2008 Apr; 67(4): 636-42
【非特許文献１７】Mattsson J, Naredi P, Hafstrom L, Peterson HI. Intratumoural distribution of microspheres. Anticancer Res. 1986 Jul-Aug; 6(4): 563-6
【非特許文献１８】Gupta PK, Hung, CT, Lam FC, Application of regression analysis in the evaluation of tumour response following the administration of adriamycin as a solution or via albumin microspheres to the rat. J Pharm Sci. 1900; 79(7): 634-7
【非特許文献１９】Almond BA, Hadba AR, Freeman ST, Cuevas BJ, York AM, Detrisac CJ, Goldberg EP. Efficacy of mitoxantrone-loaded albumin microspheres for intratumoural chemotherapy of breast cancer. J Control Release. 2003 Aug 28; 91(1-2): 147-55
【非特許文献２０】Emerich DF, Snodgrass P, Lafreniere D, Dean RL, Salzberg H, Marsh J, Perdomo B, Arastu M, Winn SR, Bartus RT Sustained release chemotherapeutic microspheres provide superior efficacy over systemic therapy and local bolus infusions. Pharm Res. 2002 Jul; 19(7): 1052-60
【非特許文献２１】Liu Z, Ballinger JR, Rauth AM, Bendayan R, Wu XY. Delivery of an anticancer drug and a chemosensitizer to murine breast sarcoma by intratumoural injection of sulfopropyl dextran microspheres. J Pharm Pharmacol. 2003 Aug; 55(8): 1063-73
【非特許文献２２】Sun S等. EUS-guided interstitial chemotherapy in the pancreas Endoscopy 2007; 39: 530-534
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
膵がんの治療のための改善された組成物の提供が引き続き望まれている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の第１態様によると、水不溶性で水膨張性のポリマーを含んでおり、放出可能な形態でポリマーと結合している微小球と、膵臓の腫瘍又は嚢胞の治療に使用される化学療法剤とを含み、微小球が、３７℃で水と平衡状態になったときに、ポリマーと水との総重量に基づいて少なくとも４０重量％の水を含み、ポリマーが、ｐＨ７でアニオン性に荷電され、そして、化学療法剤が、カチオン的に荷電されて、ポリマーと静電的に結合している組成物が提供される。
【００１１】
本発明の第２態様によると、膵臓の腫瘍又は嚢胞を治療する方法であって、本発明の第１態様の組成物をヒト又は動物の身体に投与する工程を含み、治療において、化学療法剤が微小球から放出される方法が提供される。
【００１２】
本発明の第３態様によると、作用物質が、腫瘍若しくは嚢胞又はそれらの周囲に直接注射される、膵臓の腫瘍又は嚢胞の治療に使用される一般式Ｉ：
【化１】
2014208661.tif 000002
〔式中、
Ｒ1は、Ｈ、ハロゲン、ヒドロキシル、並びに、任意にヒドロキシル、アミン、アルコキシ、ハロゲン、アシル及びアシルオキシ基で置換されている低級（Ｃ1-6）アルキルから選択され；
Ａは、Ｃ（Ｏ）Ｏ又はＣＨ2であり；そして
Ｒは、ＮＲ2Ｒ3であり、式中、Ｒ2及びＲ3は、同一又は異なっていて、それぞれ、水素原子、置換若しくは非置換Ｃ1-4アルキル基、又は、置換若しくは非置換の炭素環式若しくは複素環式基を表すか、或いはＲ2及びＲ3は、それらが結合している窒素原子と一緒になって、−Ｏ−、−Ｓ−若しくは＞ＮＲ4が挿入されていてもよい、任意に置換されている複素環を形成し、ここで、Ｒ4は、水素原子、置換若しくは非置換Ｃ1-4アルキル基、又は、置換若しくは非置換フェニル基であり；
そして、式中、−Ａ−Ｒ基は、カンプトテシン化合物のＡ環の任意の位置に位置する炭素原子と結合しており、かつ、Ｒ1は、Ａ又はＢ環において置換されている〕で示される化学療法剤、または、その塩である化学療法剤を含む、組成物が提供される。
【００１３】
本発明の第４態様によると、膵臓の腫瘍又は嚢胞を治療する方法であって、本発明の第３態様の組成物を、腫瘍若しくは嚢胞又はそれらの周囲に注射する工程を含む方法が提供される。
【００１４】
本発明の第５態様によると、一般式Ｉ：
【化２】
2014208661.tif 000003
〔式中、
Ｒ1は、Ｈ、ハロゲン、ヒドロキシル、並びに、任意にヒドロキシル、アミン、アルコキシ、ハロゲン、アシル及びアシルオキシ基で置換されている低級（Ｃ1-6）アルキルから選択され；
Ａは、Ｃ（Ｏ）Ｏ又はＣＨ2であり；そして
Ｒは、ＮＲ2Ｒ3であり、式中、Ｒ2及びＲ3は、同一又は異なっていて、それぞれ、水素原子、置換若しくは非置換Ｃ1-4アルキル基、又は、置換若しくは非置換の炭素環式若しくは複素環式基を表すか、或いはＲ2及びＲ3は、それらが結合している窒素原子と一緒になって、−Ｏ−、−Ｓ−若しくは＞ＮＲ4が挿入されていてもよい、任意に置換されている複素環を形成し、ここで、Ｒ4は、水素原子、置換若しくは非置換Ｃ1-4アルキル基又は置換若しくは非置換フェニル基であり；
そして、式中、−Ａ−Ｒ基は、カンプトテシン化合物のＡ環の任意の位置に位置する炭素原子と結合しており、かつ、Ｒ1は、Ａ又はＢ環において置換されている〕で示される化学療法剤、または、その塩である化学療法剤を含む、
ポリマーマトリックスを含む組成物であって、膵臓の腫瘍又は嚢胞の治療における使用のための組成物が提供される。
【００１５】
本発明の第６態様によると、膵臓の腫瘍又は嚢胞を治療する方法であって、本発明の第５態様の組成物を、腫瘍若しくは嚢胞又はそれらの周囲に注射する工程を含む方法が提供される。
【００１６】
膵癌の治療は極めて困難であり、それは、この疾患が重要な構造に既に直接侵入している場合があり、多くの場合に化学療法及び放射線療法に耐性を示すか又は大部分の患者において診断時には転移しているからである。管理の選択肢は、外科的介入、放射線、化学療法、並びに疼痛及び栄養管理のような緩和ケア処置からなる。手術は、治癒的であると考慮される唯一の選択肢であるが、小型の腫瘍が膵臓に限定されている僅か１５〜２０％の患者において可能である。手術の選択肢それ自体は複雑であり、それは、膵臓が他の臓器に囲まれて到達するのを困難にし、更には、この臓器が非常に傷つきやすく、高度の注意を払って取り扱わなければならないからである。
【００１７】
本発明は、薬剤溶出系から化学療法剤の局所送達を提供する。本発明は、全身毒性を有意に低減しながら、高レベルの薬剤を腫瘍又は嚢胞の部位に局所的に送達することを可能にする。
【００１８】
超音波内視鏡誘導療法を本発明と組み合わせて使用することができる。これは、膵臓に到達する安全で正確な方法を提供する。持続時間にわたって病巣における高い局所薬剤濃度の利益を享受する（耐性機構を克服する可能性を提供する）潜在性を伴って、膵臓病巣を治療する化学療法ビーズの送達を誘導するために使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】２５mg/mLでトポテカンを担持したＰＶＡヒドロゲルビーズである。
【図２】３００〜５００mmのＰＶＡヒドロゲルビーズから２００mLのＰＢＳへのトポテカン及びイリノテカンの溶出である。
【図３】全担持量に対する割合としてのトポテカン及びイリノテカンの溶出である−３００〜５００mmのＰＶＡヒドロゲルビーズ、２００mLのＰＢＳ、周囲温度。
【図４】多様な濃度のイリノテカン及びトポテカンへの２４時間作用後のＰＳＮ１細胞の生存率である（ｎ＝７；±ＳＤ）。
【図５】多様な濃度のイリノテカン及びトポテカンへの４８時間作用後のＰＳＮ１細胞の生存率である（ｎ＝７；±ＳＤ）。
【図６】多様な濃度のイリノテカン及びトポテカンへの７２時間作用後のＰＳＮ１細胞の生存率である（ｎ＝７；±ＳＤ）。
【図７】ｉ）アルギン酸塩中のイリノテカンビーズ及びｉｉ）アルギン酸塩のみの直接注射の後の２５日間にわたる、ＰＳＮ１腫瘍移植片を有するヌードマウスの腫瘍サイズの変化である（平均±ＳＤ、ｎ＝３）。
【図８】ｉ）アルギン酸塩中のイリノテカンビーズ及びｉｉ）アルギン酸塩のみの直接注射の後の２５日間にわたる、ＰＳＮ１腫瘍移植片を有するヌードマウスの平均体重の変化である（平均±ＳＤ、ｎ＝３）。
【図９】１、２又は３つのイリノテカン担持ビーズへの２４、４８及び７２時間作用後のＰＳＮ１細胞の生存率である（平均±ＳＤ、ｎ＝７）。
【図１０】１つのラパマイシン、１つのイリノテカン、及び、１つのラパマイシンと１つのイリノテカンとの組み合わせのビーズへの、２４、４８及び７２時間作用後のＰＳＮ１細胞の生存率である（平均±ＳＤ、ｎ＝７）。
【図１１】ｉ）アルギン酸塩中のイリノテカンビーズ及びｉｉ）アルギン酸塩のみの直接注射の後の２５日間にわたる、ＰＳＮ１腫瘍移植片を有するヌードマウスの腫瘍サイズの変化である（平均±ＳＤ、ｎ＝３）。
【図１２】ｉ）アルギン酸塩中のイリノテカンビーズ及びｉｉ）アルギン酸塩のみの直接注射の後の２５日間にわたる、ＰＳＮ１腫瘍移植片を有するヌードマウスの平均体重の変化である（平均±ＳＤ、ｎ＝３）。
【図１３】Ａ）イリノテカン（−・３．３mg；−６．６mg）、Ｂ）トポテカン（−・・０．２mg；・・・０．４mg）で処置された雌ヌードマウスのＰＳＮ１皮下移植の腫瘍容量の変化である。
【図１４】アルギン酸塩中のイリノテカン又はトポテカンビーズの直接注射の後の６０日間にわたる、ＰＳＮ１腫瘍移植片を有するヌードマウスの平均体重の変化である（平均±ＳＤ、ｎ＝３）。
【図１５】実施例９の注射後のＣＴスキャンである。
【図１６】注射の周囲の膵臓組織における炎症の病理学的等級付けである。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
＝＝微小球＝＝
本発明に使用される微小球は、出願者の以前の出願−例えば、ＷＯ０４／０７１４９５、ＷＯ０６／０２７５６７及びＷＯ０８／１２８５８０を参照すること（特に参照例を参照すること）−に記載されている。しかし、直接の注射による、膵がんの治療における使用については、以前に記載されたことはない。
【００２１】
本発明の第１及び第２態様において、水膨張性ポリマーは、ｐＨ７でアニオン的に荷電されており、化学療法剤は、カチオン的に荷電されて、ポリマーと静電的に結合している。これらは、本発明の他の全ての態様の好ましい実施態様を形成する。
【００２２】
微小球を含むポリマーの変形可能な性質は、微小球を所望の部位へ直接注入する針による送達を可能にする。微小球は、分解性、非分解性でありうるか又は放射線治療と組み合わせた微小球治療を可能にする、放射線増感剤と組み合わせることもできる。
【００２３】
ポリマーは水不溶性物質である。活性剤がポリマーマトリックスの表面の浸食により実質的されうるように生分解性であることができるが、好ましくは、ポリマーは実質的に生安定性（すなわち、非生分解性）である。
【００２４】
ポリマーは水膨張性である。本発明における水膨張性ポリマーは、３７℃で水により膨張したとき、重量分析により測定すると、少なくとも４０重量％、好ましくは４０〜９９重量％、最も好ましくは７５〜９５重量％の範囲の平衡含水量を有する。
【００２５】
本発明の好ましい実施態様において、組成物は、液体担体中の水膨張性の水不溶性ポリマーの微小球の懸濁液の形態である。典型的には、微小球は、３７℃で水と平衡状態になったときに、１〜１０００μmの範囲、より好ましくは５０〜５００μmの範囲、最も好ましくは１００〜３００μmの範囲のサイズを有する。好ましくは、微小球は、形状が実質的に球形である。直径は、好ましくは、カチオン性荷電化学療法剤を担持させる前に、微小球のサイズを測定することによって決定される。微小球は、好ましくは実質的に球形であるが、回転楕円又は規則性のさらに低い形状であることができる。非球形微小球の直径は、その最大直径である。
【００２６】
一般に、ポリマーは共有架橋されているが、少なくとも部分的にイオン架橋されていることが、ポリマーにとって適している場合がある。
【００２７】
アルブミン、アルギン酸塩、ゼラチン、デンプン、キトサン又はコラーゲンのような天然供給源由来のポリマーを、本発明の一つの実施態様において使用することができる。アルギン酸塩が特に好ましい。アルギン酸塩微小球は、典型的には、高Ｇ又は高Ｍ含有量の超純粋アルギン酸塩から、特定の濃度のアルギン酸塩溶液を金属（例えば、カルシウム又はバリウム）イオンのゲル化浴の中に押し出すことにより調製される。本発明の使用に適したアルギン酸塩微小球を作製する方法は、ＷＯ０８／１２８５８０、特に実施例８〜１１に記載されている。
【００２８】
別の実施態様において、ポリマーは、エチレン性不飽和モノマーを二官能又はより多官能の架橋モノマーの存在下で重合することにより形成される。エチレン性不飽和モノマーには、イオン性（双性イオン性を含む）モノマーが含まれうる。
【００２９】
エタフィルコンＡに基づくコンタクトレンズに使用される、エチレングリコールジメタクリレート又はメチレンビスアクリルアミドのようなヒドロキシエチルメタクリレート、アクリル酸及び架橋モノマーのコポリマーを使用することができる。Ｎ−アクロイル−２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−プロパン−１，３−ジオール及びＮ，Ｎ−ビスアクリルアミドのコポリマーも使用することができる。
【００３０】
他のポリマーは、例えば、分離媒体又はイオン交換媒体として使用される種類の、イオン置換基との架橋スチレンポリマーである。
【００３１】
水膨張性の水不溶性マトリックスの形成に使用することができる別の種類のポリマーは、架橋ポリビニルアルコールである。ポリマーを、例えば、グルタルアルデヒドのようなアルデヒド型架橋剤を使用して架橋することができる。そのような生成物では、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）を、イオン性官能基含有化合物とヒドロキシル基との反応によりイオン性ペンダント基をもたらすことによって、イオン性にすることができる。ヒドロキシル基との反応に適した官能基の例は、カルボン酸若しくはその誘導体又はエステルを形成することができる他の酸性基のようなアクリル化剤である。
【００３２】
ポリビニルアルコールは、代替的には、高吸収性ポリマーとして使用される種類の、ビニルアルコールと、アルリル酸のようなアニオン性アクリルモノマーとのコポリマーであることができる。
【００３３】
本発明は、ポリマーマトリックスが、エチレン性基のラジカル重合により、１分子あたり１より多いエチレン性不飽和ペンダント基を有するポリビニルアルコールマクロマーから形成されるので、特に価値がある。好ましくは、ＰＶＡマクロマーは、例えば非イオン性モノマー及び／又はアニオン性モノマーを含むイオン性モノマーが含まれる、エチレン性不飽和モノマーと共重合される。
【００３４】
ＰＶＡマクロマーは、例えば、１０００〜５００，０００Ｄ、好ましくは１０，０００〜１００，０００Ｄの範囲のような適切な分子量のＰＶＡポリマーに、ビニルペンダント基又はアクリルペンダント基をもたらすことによって形成することができる。アクリルペンダント基は、例えば、アクリル酸又はメタクリル酸とＰＶＡとを反応させて、幾つかのヒドロキシル基の間にエステル結合を形成することによってもたらすことができる。ポリビニルアルコールと重合することができるビニル基を付与する他の方法は、例えば、ＵＳ４，９７８，７１３、並びに好ましくはＵＳ５，５０８，３１７及び５，５８３，１６３に記載されている。したがって、好ましいマクロマーは、（アルク）アクリルアミノアルキル部分が環状アセタール結合を介して結合しているポリビニルアルコールの主鎖を含む。実施例１は、一般名ネルフィコンＢとして知られているようなマクロマーの合成例を記載している。好ましくは、ＰＶＡマクロマーは、１分子あたり、約２〜２０個、例えば５〜１０個のエチレン性ペンダント基を有する。
【００３５】
ＰＶＡマクロマーが、イオン性モノマーを含むエチレン性不飽和モノマーと共重合される場合、イオン性モノマーは、好ましくは、一般式ＩＩＩ：
Ｙ1ＢＱ1      ＩＩＩ
〔式中、Ｙ1は、
【化３】
2014208661.tif 000004
ＣＨ2＝Ｃ（Ｒ10）−ＣＨ2−Ｏ−、ＣＨ2＝Ｃ（Ｒ10）−ＣＨ2ＯＣ（Ｏ）−、ＣＨ2＝Ｃ（Ｒ10）ＯＣ（Ｏ）−、ＣＨ2＝Ｃ（Ｒ10）−Ｏ−、ＣＨ2＝Ｃ（Ｒ10）ＣＨ2ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ11）−、Ｒ12ＯＯＣＣＲ10＝ＣＲ10Ｃ（Ｏ）−Ｏ−、Ｒ10ＣＨ＝ＣＨＣ（Ｏ）Ｏ−、Ｒ10ＣＨ＝Ｃ（ＣＯＯＲ12）ＣＨ2−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−、
【化４】
2014208661.tif 000005
から選択され、ここで、
Ｒ10は、水素又はＣ1〜Ｃ4アルキル基であり；
Ｒ11は、水素又はＣ1〜Ｃ4アルキル基であり；
Ｒ12は、水素又はＣ1-4アルキル基、又はＢＱ1であり、ここでＢ及びＱ1は、下記に定義されているとおりであり；
Ａ1は、−Ｏ−又は−ＮＲ11−であり；
Ｋ1は、これらの基（−（ＣＨ2）rＯＣ（Ｏ）−、−（ＣＨ2）rＣ（Ｏ）Ｏ−、−（ＣＨ2）rＯＣ（Ｏ）Ｏ−、−（ＣＨ2）rＮＲ13−、−（ＣＨ2）rＮＲ13Ｃ（Ｏ）−、−（ＣＨ2）rＣ（Ｏ）ＮＲ13−、−（ＣＨ2）rＮＲ13Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−（ＣＨ2）rＯＣ（Ｏ）ＮＲ13−、−（ＣＨ2）rＮＲ13Ｃ（Ｏ）ＮＲ13−（ここで基Ｒ13は同一又は異なっている）、−（ＣＨ2）rＯ−、若しくは、−（ＣＨ2）rＳＯ3−）、又は、任意にＢと組み合わされて、原子価結合であり、ここで、ｒは、１〜１２であり、Ｒ13は、水素又はＣ1〜Ｃ4アルキル基であり；
Ｂは、任意に、パーフルオロ化鎖までを含む１個以上のフッ素原子を含有する、直鎖若しくは分岐鎖のアルカンジイル、オキサアルキレン、アルカンジイルオキサアルカンジイル若しくはアルカンジイルオリゴ（オキサアルカンジイル）鎖であるか、又はＱ1若しくはＹ1が、Ｂに結合している末端炭素原子を含有する場合、原子価結合であり；そして
Ｑ1は、イオン性基である〕
を有する。
【００３６】
アニオン性基Ｑ1を含むような化合物が、好ましく含まれる。
【００３７】
アニオン性基Ｑ1は、例えば、カルボン酸塩、炭酸塩、スルホン酸塩、硫酸塩、硝酸塩、ホスホン酸塩又はリン酸塩基であることができる。モノマーを遊離酸として又は塩形態で重合することができる。好ましくは、共役酸のｐＫaは５未満である。
【００３８】
適切なカチオン性基Ｑ1は、好ましくは基Ｎ+Ｒ143、Ｐ+Ｒ153又はＳ+Ｒ152であり、ここで、基Ｒ14は、同一又は異なっていて、それぞれ水素、Ｃ1-4アルキル又はアリール（好ましくはフェニル）であるか、或いは２つの基Ｒ14は、それらが結合しているヘテロ原子と一緒になって、５〜７個の原子を含有する飽和又は不飽和複素環を形成する。基Ｒ15は、それぞれ、ＯＲ14又はＲ14である。好ましくは、カチオン性基は、永久的にカチオン性であり、すなわちＲ14は、それぞれ水素以外である。好ましくは、カチオン性基ＱはＮ+Ｒ143であり、ここでＲ14は、それぞれＣ1-4アルキル、好ましくはメチルである。
【００３９】
双性イオン性基Ｑ1は、例えばアニオン性電荷の１つの二価中心及びカチオン性電荷の１つの一価中心を有する若しくはその逆を有することによるか、又はカチオン性電荷の２つの中心及びアニオン性電荷の１つの中心を有する若しくはその逆を有することによって、全体的な電荷を有することができる。しかし、好ましくは、双性イオンは、全体的な電荷を有さず、最も好ましくは、一価カチオン性電荷の１つの中心及び一価アニオン性電荷の１つの中心を有する。
【００４０】
本発明においてＱとして使用することができる双性イオン性基の例は、ＷＯ−Ａ−００２９４８１に開示されている。
【００４１】
例えば、エチレン性不飽和モノマーが双性イオン性モノマーを含む場合、このことは、粒子の親水性、潤滑性、生体適合性及び／又は血液適合性を増大することができる。適切な双性イオン性モノマーは、本発明者の先行公報ＷＯ−Ａ−９２０７８８５、ＷＯ−Ａ−９４１６７４８、ＷＯ−Ａ−９４１６７４９及びＷＯ−Ａ−９５２０４０７に記載されている。好ましくは、双性イオン性モノマーは、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）である。
【００４２】
一般式Ｉのモノマーにおいて、好ましくは、Ｙ1はＣＨ2＝ＣＲ10ＣＯＡ1−基であり、ここで、Ｒ10は、Ｈ又はメチル、好ましくはメチルであり、そしてＡ1は、好ましくはＮＨである。Ｂは、好ましくは、炭素原子１〜１２個、好ましくは２〜６個のアルカンジイル基である。そのようなモノマーは、アクリルモノマーである。
【００４３】
エチレン性不飽和モノマーに、希釈剤モノマー、例えば非イオン性モノマーを含めることができる。そのようなモノマーを酸性基のｐＫaを制御するため、生成物の親水性又は疎水性を制御するため、ポリマーに疎水性領域をもたらすため、又は単に不活性希釈剤として作用するために有用でありうる。非イオン性希釈剤モノマーの例は、例えば、アルキル（アルク）アクリレート及び（アルク）アクリルアミドであり、特に、炭素原子１〜１２個のアルキル基を有するような化合物、ヒドロキシ及びジ−ヒドロキシ置換アルキル（アルク）アクリレート及び−（アルク）アクリルアミド、ビニルラクタム、スチレン、並びに他の芳香族モノマーである。
【００４４】
ポリマーマトリックスにおいて、アニオンのレベルは、好ましくは０．１〜１０meq g-1の範囲、好ましくは少なくとも１．０meq g-1である。好ましいアニオンは、硫酸塩、スルホン酸塩、リン酸塩及びホスホン酸塩のように、強酸から誘導される。
【００４５】
ＰＶＡマクロマーを他のエチレン性不飽和モノマーと共重合する場合、ＰＶＡマクロマーと他のモノマーの重量比は、好ましくは５０：１〜１：５の範囲、より好ましくは２０：１〜１：２の範囲である。エチレン性不飽和モノマーにおいて、アニオン性モノマーは、好ましくは、１０〜１００mol％の範囲、好ましくは少なくとも２５mol％の量で存在する。
【００４６】
架橋ポリマーは、例えば、連続不混和性担体の分散相においてエチレン性不飽和モノマーの液滴を重合することによって、微粒子形態のままで形成することができる。このことは、ポリビニルアルコールマクロマーに基づく重合にとって特に適している。膨張しているときに、所望のサイズを有する微小球を生成するのに適している油中水重合の例は、知られている。例えば、ＵＳ４，２２４，４２７は、水溶性モノマーを、懸濁剤の存在下で連続溶媒相に分散することによる、直径が５mmまでの均一球形ビーズ（微小球）を形成する方法を記載する。予め形成された分散体重合液滴の架橋を使用することもできる。予め形成された分散体液滴ポリマーの架橋を使用することもできる。安定剤及び界面活性剤が存在して、分散相粒子のサイズに制御をもたらすことができる。重合及び／又は架橋した後、架橋微小球を、既知の方法で回収し、洗浄し、場合により滅菌する。好ましくは、微小球は、水性液体で膨張し、サイズに従って分類される。
【００４７】
カチオン性荷電化学療法剤（本明細書以降、「活性剤」又は「薬剤」とも呼ぶ）は、活性剤の制御放出を一定期間にわたって可能にするように、好ましくはポリマーと結合している。この期間は、数分間から数週間、好ましくは少なくとも数日間まで、好ましくは７２時間までであることができる。活性剤は、ポリマーに静電結合している。ポリマーにおけるアニオン性基の存在は、カチオン性荷電活性剤の放出の制御を可能にする。
【００４８】
本発明において、薬剤はポリマーマトリックスに共有結合していないことが重要である。
【００４９】
活性剤を、多様な技術によりポリマーマトリックスに組み込むことができる。一つの方法において、活性剤をポリマーの前駆体と、例えばモノマー若しくはマクロマー混合物、又は架橋性ポリマー及び架橋剤の混合物と、重合又は架橋の前に混合することができる。あるいは、活性剤を架橋した後にポリマーに担持させることができる。例えば、乾燥微粒子ポリマーを、好ましくは水又はエタノールのようなアルコール中の活性剤の溶液で膨張させ、続いて任意に非吸収作用物質を除去する及び／又は溶媒を蒸発することができる。アルコールのような有機溶媒又はより好ましくは水中の活性剤の溶液を、微小球の移動床に噴霧し、それによって薬剤を微小球の本体に吸収させ、同時に溶媒を除去する。最も好都合には、水のような連続液体ビヒクル中に懸濁した膨張微小球を、薬剤のアルコール水溶液と、一定期間にわたって単に接触させ、それにより薬剤を微小球の本体に吸収させることが可能であることが見出された。微小球に薬剤を固着させる技術は、担持レベルを増大することができ、例えば、担持懸濁液のｐＨを活性剤が比較的不溶性の形態になる値にシフトすることによる沈殿である。続いて膨張ビヒクルを除去することができるか、又は都合良くは生成物の一部として微小球に保持させることができる。膨張微小球を、スラリーの形態の、すなわち膨張微小球の外側に水を全く又はあまり有することなく、膨張形態で使用することができる。あるいは、微小球の懸濁液を残留薬剤担持溶液から取り出し、乾燥医薬系生成物に用いる伝統的な技術のいずれかにより微小球を乾燥することができる。これには、室温若しくは高温又は減圧下若しくは真空下での空気乾燥、伝統的な凍結乾燥、大気圧凍結乾燥、超臨界液の溶液促進分散（ＳＥＤＳ）が含まれるが、これらに限定されない。あるいは、薬剤担持微小球は、一連の工程において水と入れ替えるために有機溶媒を使用し、続いてより揮発性の有機溶媒を蒸発させて脱水することができる。薬剤にとって非溶解性である溶媒を選択するべきである。
【００５０】
簡潔には、典型的な伝統的凍結乾燥方法は、以下のように進行する：試料を等分して、部分共栓ガラスバイアルに入れ、凍結乾燥機の冷却した温度制御棚に置く。棚の温度を下げ、試料を凍結して、均一の規定温度にした。完全に凍結した後、乾燥機の圧力を規定圧力に下げて、一次乾燥を開始する。一次乾燥の間に、水蒸気が昇華により凍結物質から漸進的に除去され、一方、棚温度は、一定の低温に制御されている。二次乾燥を、棚温度の増加及びチャンバ圧の更なる低減により開始し、これにより、半乾燥物質に吸収されていた水を、残留含水量が所望のレベルに減少するまで除去できる。バイアルを、必要であれば保護環境下、その場で密閉することができる。
【００５１】
大気圧凍結乾燥は、非常に乾燥した空気を、凍結生成物を覆って急速に循環することにより達成される。伝導的な凍結乾燥方法と比較して、真空を用いない凍結乾燥は、幾つかの利点を有する。循環乾燥ガスは、風の強い日に洗濯物が素早く乾くのと同じ方法で、凍結試料からの改善された熱伝達及び物質移動を提供する。この領域の作用は、大部分、食品生産に関し、揮発性芳香族化合物の保持の増加が観察されており、生物学的製剤の乾燥におけるこの潜在的な利益は、未だに特定されていない。特に興味深いことは、大気噴霧乾燥方法を使用することによって、ケーキの代わりに微細の自由流動粉末が得られるという事実である。サブミクロンの直径を有する粒子を得ることができ、これは、摩砕によって一般的に得ることができるものよりも１０倍小さい。高表面積を有する粒状の性質は、容易に再水和されうる生成物をもたらし、現在、吸入及び経皮用途に必要とされる微小球のサイズに対する微調整は不可能であるが、この領域において潜在性がある。
【００５２】
組成物を、投与の直前に、ポリマー及び化学療法剤（活性剤）から作製することができるが、組成物は予め形成されていることが好ましい。乾燥ポリマー活性剤微小球を、使用直前に水和することができる。あるいは、提供される組成物は完全に配合されていることができ、好ましくは吸収又は吸着活性化合物と、吸収水、例えば生理食塩水及び超粒子状液、例えば食塩水とを有するポリマー微小球を含む。
【００５３】
本発明の第３態様において、直接注射による膵がんの治療のための一般式Ｉの化学療法剤を含む組成物が提供される。好ましくは、作用物質は、本発明の第５態様のように、ポリマーマトリックスの中にある。ポリマーマトリックスのポリマーは、好ましくは水不溶性物質である。表面から薬剤を放出するポリマーマトリックスの浸食により薬剤を実質的に放出できるように、生分解性でありうるが、好ましくは、ポリマーは実質的に生安定性（すなわち、非生分解性）である。好ましくは、ポリマーマトリックスは、本発明の第５態様のように、微小球の形態である。
【００５４】
ポリマーは水膨張性である。本発明に有用な水膨張性ポリマーは、３７℃で水により膨張したとき、重量分析により測定すると、４０〜９９重量％、好ましくは７５〜９５重量％の範囲の平衡含水量を有する。
【００５５】
一般に、ポリマーは共有架橋されているが、少なくとも部分的にイオン架橋されている又は疎水的に架橋されていることが、ポリマーにとって適している場合がある。幾つかの実施態様において、アルブミン、アルギン酸塩、ゼラチン、デンプン、キトサン又はコラーゲンのような天然供給源から誘導されるポリマーを使用することが適している場合があり、これらは全て塞栓性作用物質として使用されてきた。他の実施態様において、ポリマーは、天然に生じるポリマー又はその誘導体を実質的に含有しない。好ましくは、エチレン性不飽和モノマーを二官能又はより多官能の架橋モノマーの存在下で重合することにより形成される。エチレン性不飽和モノマーには、イオン性（双性イオン性を含む）モノマーが含まれうる。
【００５６】
投与される組成物中の活性剤のレベルは、好ましくは、組成物１mlあたり０．１〜５００mg、好ましくは、１mlあたり１０〜１００mgの範囲である。好ましくは、治療は、１〜５回繰り返され、それぞれの用量において、投与される活性剤の量は、１mlあたり０．１〜１００mg、好ましくは１mlあたり１０〜１００mgの範囲である。通常の治療において投与される組成物の量は、１〜６mlの範囲である。投与される活性剤の１用量あたりの総量は、好ましくは１０〜１００mg、より好ましくは５０〜２５０mgの範囲である。下記の実施例で示される放出データに基づいて、本発明者は、これは腫瘍に対する治療有効濃度を示し、有意なレベルの細胞内送達が生じるはずであり、それにより治療効果が達成されると考える。活性剤投与に関する有害な副作用は回避されるはずである。
【００５７】
そのような薬剤を微小球に組み込む方法は、ＷＯ２００７／０９０８９７に詳細に説明されている。
【００５８】
化学療法剤
本発明の第１態様において、任意のカチオン性荷電化学療法剤を使用することができる。作用物質は、細胞毒性であることができる。細胞毒性剤は、細胞に対して直接的に毒性があるものであり、その生殖又は増殖を防止する。適切な細胞毒性剤は、例えば、ドキソルビシン及ミトキサントロン、並びにＷＯ０４０７１４９５に開示されている他の化合物のようなアントラサイクリン化合物、トポテカン及びイリノテカン、並びにＷＯ２００６０２７５６７に記載されている誘導体のようなカンプトテシン化合物である。
【００５９】
本発明の第１態様において使用される化学療法剤（活性剤）は、カチオン的に荷電され、膵がんに対して治療上活性である任意の化合物であることができる。  上記に定義された微小球は、カチオン性荷電化学療法剤を、イオン交換機構を介して放出し、それにより、膵がんへカチオン性荷電化学療法剤を制御送達するデポー剤として作用する。
【００６０】
化学療法剤は、プロドラッグであることができ、すなわち、インビボで活性化されて活性剤を形成する化合物であることができる。化学療法剤は、代替的には放射線増感剤であることができる。例えば、ドキソルビシンは放射線増感剤である。放射線増感剤は、組織、特に腫瘍細胞の放射線感受性を増加する化合物である。
【００６１】
適切なカチオン的に荷電されている化合物は、ドキソルビシン及びＷＯ０４０７１４９５に開示されているアミン基を有する他のアントラサイクリン化合物又はミトキサントロン、ＷＯ２００６０２７５６７に記載されているイリノテカンのようなカチオン性カンプトテシン誘導体（これらの内容は参照として本明細書に組み込まれる）又はトポテカンである。
【００６２】
本発明の一つの実施態様において、２つ以上の化学療法剤が膵がんの治療に使用される。この場合、試験される薬剤の組み合わせは、個別の粒子を含み、それぞれ薬剤のうちの１つが担持されているか又はそれぞれの粒子には両方の薬剤を一緒に担持することができる。微小球に共担持する方法は、出願者の同時係属出願ＰＣＴ／ＧＢ２００８／０５０７２２に提示されている。
【００６３】
第１作用物質はカチオン的に荷電されているが、第２作用物質は、その必要がない。一方の作用物質は細胞毒性であるべきであり、他方は、腫瘍治療において細胞毒性化合物に対して相補的な活性を有するべきである。そのような組み合わせは、ＰＣＴ／ＧＢ２００８／０５０７２２に詳細に記載されている。
【００６４】
第２作用物質として組み合わせに使用されるのに適した薬剤には、タキサン、白金に基づいた新生物作用物質、５−ＦＵのような代謝拮抗物質、メルカプトプリン、カペシタビン、アクチノマイシンＤのような他の細胞毒性抗生物質、並びにビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン及びビノレルビンを含むビンカアルカロイドである。化学療法薬の例には、シタラビン、ゲムシタビン、シクロホスファミド、フルダラビン、クロラムブシル、ブスルファン、ミトキサントロン、レチノイド、アナグレリドなども挙げられる。
【００６５】
第２作用物質として組み合わせに使用することができる細胞毒性又は細胞増殖抑制化合物の一つの部類は、ｍＴＯＲを標的にするラパマイシン及びラパマイシン類似体を含む。そのような化合物には、シロリムス、テムシロリムス、エベロリムス、バイオリムス、ＡＢＴ−５７８及びＡＰ２３５７３が含まれる。ＷＯ−Ａ−２００３０２２８０７（この内容は参照として本明細書に組み込まれる）に記載されているラパマイシン類似体の範囲内に包含される化合物のいずれかを、ラパマイシン類似体として使用することができる。
【００６６】
組み合わせに使用される化学療法剤は、疎水性であることができる。本発明は、抗腫瘍特性及び水において低い溶解性を有する薬剤と、水混和性有機溶媒において高い水溶性を有する薬剤とを含む組み合わせを配合することに有用性が見出されている。パクリタセキルと、１０ｇ/l未満の室温での水における溶解性を有する誘導体とを含む組み合わせ、ラパマイシンと、１０ｇ/l未満の室温での水における溶解性を有する誘導体とを含む組み合わせ、メトトレキセートと、１０ｇ/l未満の水溶性の幾つかのテカンとを含む組み合わせを、本発明において使用することができる。これらの化合物は、全て、水混和性溶媒と水の室温での溶解度比の少なくとも１０：１、好ましくは少なくとも１００：１、１０６：１まで、さらには例えば１０３：１超を有する。
【００６７】
ベラパミル及びＰＧＰインヒビターは、多くの場合、カチオン性荷電化学療法剤と一緒に本発明において併用療法に使用される。
【００６８】
細胞毒性剤がラパマイシン又はラパマイシン誘導体／類似体である場合、他の作用物質は、一つの好ましい実施態様では、ドキソルビシン又はＷＯ０４０７１４９５に記載されているアミン基を有する他のアントラサイクリン化合物である。
【００６９】
作用質がカンプトテシン誘導体を含む場合、上記に記載された一般式Ｉの化合物のようなカチオン性置換基を有する誘導体の使用が特に効果的である。好ましくは、−Ａ−Ｒ基は、カンプトテシン化合物のＡ環の９、１０又は１１位のいずれかに位置する炭素原子と結合している。
【００７０】
一つの実施態様において、カンプトテシン誘導体は、式ＩＡ：
【化５】
2014208661.tif 000006
〔式中、
Ｒ1は、Ｈ、任意にヒドロキシル、アミン、アルコキシ、ハロゲン、アシル若しくはアシルオキシ基で置換されている低級（Ｃ1-6）アルキル、又はハロゲンであり；そして
Ｒは、ＮＲ2Ｒ3であり、式中、Ｒ2及びＲ3は、同一又は異なっていて、それぞれ、水素原子、置換若しくは非置換Ｃ1-4アルキル基、又は、置換若しくは非置換の炭素環式若しくは複素環式基を表すか、或いはＲ2及びＲ3は、それらが結合している窒素原子と一緒になって、−Ｏ−、−Ｓ−若しくは＞ＮＲ4が挿入されていてもよい、任意に置換されている複素環を形成し、ここで、Ｒ4は、水素原子、置換若しくは非置換Ｃ1-4アルキル基又は置換若しくは非置換フェニル基であり；
そして、式中、−Ｏ−ＣＯ−Ｒ基は、カンプトテシン化合物のＡ環の９、１０又は１１位のいずれかに位置する炭素原子と結合している〕を有し、その塩が含まれる。
【００７１】
−Ｏ−ＣＯ−Ｒ基は、１０位で結合していることが好ましい。
【００７２】
Ｒ1は、好ましくはＣ1-4アルキル、最も好ましくはエチルであり、そしてｍは、好ましくは１である。
【００７３】
ハロゲン原子Ｒは、例えば、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩ、好ましくはＦ又はＣｌである。Ｒ1〜Ｒ4は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル及びｔ−ブチル、好ましくはメチルであることができる。
【００７４】
Ｒ及びＲ1の置換基は、好ましくは、ハロゲン原子、ヒドロキシ、Ｃ1-4アルコキシ、フェノキシ、ＣＯＯＲ6、ＳＯ3Ｒ6及びＰＯ3（Ｒ6）2、アリール、下記：
【化６】
2014208661.tif 000007
ＮＲ8Ｒ9及びＣＯＮＲ8Ｒ9、ＱＡＯＲ5、ＱＡＮＲ8Ｒ9及びＱＡＱＲ5から選択され、ここで、Ｒ5は、Ｃ1-4アルキル又はアリールであり；Ｒ6は、水素、ハロゲン、Ｃ1-4アルキル又はＣ1-4アルコキシであり；Ｒ7は、水素、ハロゲン又はＣ1-4アルキルであり；Ｒ8及びＲ9は、同一又は異なっていて、それぞれＨ又はＣ1-4アルキルであるか、或いはＲ8及びＲ9は、共にＣ3-6アルカンジイルを表し；
Ｑは、ＯＣＯ又は−ＣＯＯ−であり、そしてＡは、Ｃ2-4アルカンジイルである。
【００７５】
好ましくは、Ｒは、ＮＲ2Ｒ3であり、ここでＲ2及びＲ3は、窒素原子と一緒になって、５又は６員環、好ましくは任意に置換基を有する飽和環を形成する。置換基は、好ましくは−ＮＲ8Ｒ9である。そのような置換基において、Ｒ8及びＲ9は好ましくは共にＣ4-5アルカンジイルである。そのような基は、塩基性であり、ｐＨ７でカチオン的に荷電される傾向がある。最も好ましくは、Ｒは、下記：
【化７】
2014208661.tif 000008
である。
【００７６】
適切な化合物の別のファミリーは、一般式ＩＩ：
【化８】
2014208661.tif 000009
〔式中、
Ｒ20及びＲ23は、それぞれヒドロキシ若しくは水素であるか、又は一緒になってＣＨ2ＯＣＨ2であり；
Ｒ21及びＲ22のうちの一方はＨであり、他方はＣＨ2ＮＲ24Ｒ25であり、ここで、Ｒ23及びＲ24は、同一又は異なっていて、それぞれ水素原子、置換若しくは非置換Ｃ1-4アルキル基又は置換若しくは非置換の炭素環式若しくは複素環式基を表すか、或いはＲ23及びＲ24は、それらが結合している窒素原子と一緒になって、−Ｏ−、−Ｓ−若しくは＞ＮＲ4が挿入されていてもよい、任意に置換されている複素環を形成し、Ｒ4は、水素原子、置換若しくは非置換Ｃ1-4アルキル基又は置換若しくは非置換フェニル基である〕を有し、その塩及び第四級誘導体が含まれる。この主張に適した化合物の一つの例は、トポテカンであり、ここで、Ｒ20はヒドロキシであり、Ｒ22及びＲ23は水素であり、Ｒ21はＣＨ2ＮＲ24Ｒ25であり、そしてＲ24及びＲ25は両方ともメチルである。
【００７７】
組成物は、従来の放射線不透剤又は染料のような画像化剤を含むことができる。導入される組成物は、他の治療活性剤と混合することもできる、又は他の活性剤と組み合わせるが、別々に導入することができる。
【００７８】
膵がんの治療に使用される組成物は、典型的には、吸収された活性剤を含有する膨張微小球の水性懸濁液である。上記に考察された追加の作用物質のいずれかを送達する前に、懸濁液を混合することが望ましい。あるいは又は追加的に、微小球をこれらの追加の作用物質のいずれかで予め担持させることができる。
【００７９】
＝＝治療＝＝
本発明を、膵臓の腫瘍（膵がん）又は嚢胞を治療するために使用することができる。腫瘍は、癌性又は良性であってもよい。嚢胞は、膵臓の頭部、体部及び尾部内の液体の集合である。幾つかの嚢胞は良性である。しかし、他は、癌性又は前癌性であり、本発明は両方を治療するために使用することができる。
【００８０】
腫瘍又は嚢胞を治療するために、組成物は、典型的には、腫瘍又は嚢胞の近辺に注射される。近辺とは、腫瘍若しくは嚢胞に直接注射すること又は腫瘍若しくは嚢胞の周辺／周界に注射することを意味する。注射部位は、代替的には、腫瘍又は嚢胞の周界の外側にあってもよいが、化学療法剤が腫瘍又は嚢胞の増殖に影響を及ぼすことができるように十分に近接しているべきである。
【００８１】
通常、組成物は膵臓に直接注射されるだろう。しかし、状況によって、組成物を、膵臓の外側であるが、化学療法剤が腫瘍又は嚢胞の増殖を妨げることができるように十分に近くに注射してもよい。
【００８２】
好ましくは、膵臓の腫瘍又は嚢胞を治療するために、組成物は膵臓に注射され、典型的には、針を使用して膵臓に直接注射される。典型的には、組成物は、腫瘍又は嚢胞の周辺の辺縁の周りに注射される。
【００８３】
このように組成物を注射することによって、化学療法剤が標的の位置において制御された方法で放出される。このことは、より少ない用量を使用することができ、それにより全身毒性に関連する問題が限定的になることを意味する。
【００８４】
超音波内視鏡（ＥＵＳ）は、腫瘍を可視化し、化学療法剤の注射を腫瘍に導くために、治療において使用することができる。ＥＵＳは、通常、エコー内視鏡をヒト又は動物の被験者の食道に挿入し、これを近位胃まで通すことを伴う。その後、典型的には、本発明の組成物を、適当なゲージを有する針の内腔に挿入し、これを内視鏡装置に装着する。針は、連続超音波誘導によって胃壁を貫通し、膵臓の中まで押し通してもよい。それから組成物を針から押し出して、組織に注入する。そして装置を身体から取り外す。
【００８５】
組織に注射したとき、微小球は組織内圧により押し出される傾向がある。この問題を克服するために、導入される組成物は、付加的に粘度調整剤を含んでもよい。粘度調整剤は、組成物の粘度を増加させるだろう。粘度調整剤は、例えば、アルギン酸塩、カルボキシセルロース又はＰＶＰのような生分解性ポリマーであってもよい。アルギン酸塩が粘度調整剤として使用される場合、アルギン酸塩は、好都合なことに、いったん注入されると、周囲組織に拡散しているカルシウムイオンとの架橋によりゲルを形成する。
【００８６】
粘度調整剤として、超高純度で高分子量のアルギン酸塩を使用するのが好ましい。膵臓への異物の注射は炎症を引き起こし、膵炎につながる可能性がある。アルギン酸塩は、良好な生体適合性を示すため、炎症性反応は限定的である。
【００８７】
典型的には、アルギン酸塩は、３００kDaを超える、より典型的には５００kDaを超える、最も典型的には８００kDaを超える分子量を有する。Phycomer E01は、粘度調整剤として作用し得るルギン酸塩の適切な例である。
【００８８】
本発明において治療される被験者は、一般に哺乳類であり、好ましくはヒトである。
【実施例】
【００８９】
以下の実施例において本発明を更に説明する。幾つかの結果を、添付の図面で示し、実施例においてより詳細に記載している。
【００９０】
参照例：微小球の調製方法の概説
微小球は、ＷＯ２００４／０７１４９５に記載されている方法により、「低ＡＭＰＳ」又は「高ＡＭＰＳ」生成物として合成する。「高ＡＭＰＳ」生成物を以下の実施例に使用する。簡潔には、アセタール結合エチレン性不飽和基を有するポリビニルアルコールマクロマーと２−アクリルアミド−２−メチル−プロパンスルホネートとの重量比約１：１の水性混合物を、酢酸酪酸セルロース安定剤を含有する酢酸ブチルの連続相に撹拌機を用いて懸濁し、レドックス開始剤を使用してラジカル重合して、ビーズを形成し、それを洗浄し、乾燥し、後の実施例で使用する１００〜３００μmの画分を含むサイズ画分にふるい分けする。微小球の平衡含水量は、９４〜９５重量％である。
【００９１】
実施例１：イリノテカン担持ＰＶＡヒドロゲルビーズの調製
イリノテカン担持スルホン酸修飾ＰＶＡヒドロゲル微小球は、ＷＯ２００６／０２７５６７に詳述されているように調製した（イリノテカンの担持及び塞栓形成ビーズからの溶出については実施例１を参照すること）。薬剤担持ビーズを、凍結乾燥して（ＷＯ２００６／０２７５６７の実施例５を参照すること）水を除去し、ガンマ線照射を使用して滅菌した。
【００９２】
実施例２：トポテカン担持ＰＶＡヒドロゲルビーズの調製
トポテカン担持スルホン酸変性ＰＶＡヒドロゲル微小球は、２２．７３mgのトポテカン（Dabur Pharma Ltdの黄色粉末）を用意し、５mLの水に溶解して、４．５５mg/mLの溶液を作製することによって調製した。４．３９mLのこの溶液を１mLのＰＶＡヒドロゲルビーズスラリー（サイズ範囲５００〜７００μm）と混合すると、溶液は黄色から無色に変わり、青色ビーズは１時間以内に緑色に変わった。図１は、緑色である担持ＰＶＡヒドロゲルビーズの画像を示す。担持溶液における残留薬剤の涸渇測定によると、推定薬剤担持は１９．８mgであり、担持効率は９９．２％である。担持ビーズのサイズは４９２±４２μmであり、５００〜７００μm範囲の未担持ＰＶＡヒドロゲルビーズの約６００μmと比較して、減少している。
【００９３】
実施例３：イリノテカンＰＶＡヒドロゲルビーズ及びトポテカンＰＶＡヒドロゲルビーズの溶出の比較
１mLのＰＶＡヒドロゲルビーズを、３mLの１５．４６mg/mLトポテカン溶液と３時間ローラー混合した。担持量は、PE Lamda 25 UVを３８４nmで使用する涸渇法によりビーズ1MLあたり３８．７mg（２度実施の平均）と測定した。担持ビーズを、担持溶液から分離し、２００mLのＰＢＳと周囲温度でローラー混合した。特定の時点で、少量の溶液を取り、濃度決定するための３８４nmにおけるＵＶ測定のために希釈した。溶出プロフィールを図２及び３に示し、実施例１に概説された同様の方法を使用して調製されたイリノテカン担持ビーズと比較した。
【００９４】
実施例４：ＰＳＮ１（悪性ヒト膵癌）細胞株に対するイリノテカン及びトポテカンの細胞毒性
２０，０００個のＰＳＮ１細胞を９６ウエルプレートに播種し、一晩放置してウエル表面に接着させた。薬剤溶液を、細胞培地により１０００μg/mlから１×１０-8μg/mlまで連続的に希釈した。培地を細胞から除去し、各濃度２００μlを細胞に加え（ｎ＝７）、ブランクの対照には２００μlの培地を加えた（ｎ＝１２）。２４、４８及び７２時間後、細胞をＰＢＳ（×３）で洗浄し、１００μlの培地を加えた。ＭＴＳアッセイは、２０μlのＭＴＳ溶液を各ウエルに加え、２時間インキュベートする（３７℃、５％ＣＯ2）ことにより行なった。各ウエルの４９０nmでの吸光度は、Biotekプレート読み取り機を使用して決定した。細胞生存率は、対照群に対する割合として計算した（全ての試料から、培地及びＭＴＳ溶液ブランク吸光度値を差し引いた）。
【００９５】
イリノテカン及びトポテカンは、両方とも、ＰＳＮ１細胞の生存率を低減した。イリノテカンは、細胞生存率の５０％減少に達するのに、全ての時点においてトポテカンよりも高い用量を必要とした（表１）。
【００９６】
【表１】
2014208661.tif 000010
表１：２４、４８及び７２時間でのトポテカンとイリノテカンの推定ＩＣ５０値
【００９７】
２４時間作用させた後、トポテカンは、１μg/mlで細胞生存率が低減し始めたが、一方、イリノテカンは、濃度が１００μg/mlになるまで低減しなかった（図４）。４８時間後、トポテカンは０．１μg/mlで活性（約８０％の細胞生存率）を示し始めたが、一方、イリノテカンは、１０μg/mlで細胞生存率が低下した（図５）。７２時間後、イリノテカンは、およそ５０μg/mlで効果を示し始めた（図６）。対照的にトポテカンは１×１０-7μg/mlの低さで活性を示したが、８０％を下回る細胞生存率の低下は、細胞が０．０１μg/mlの濃度にされるまで達成されなかった（図６）。トポテカンは、ＰＳＮ１細胞生存率を、イリノテカンより強力に低下させた。より低い濃度（＜１μg/ml）では、イリノテカンは、７２時間後さえ、細胞生存率に対して有害な作用を示さなかった。トポテカンは、２４及び４８時間後に細胞毒性効果を示さなかった幾つかの濃度において、７２時間ではその効果を示した。
【００９８】
実施例５：ヌードマウスのヒト悪性膵癌異種移植片へのイリノテカン担持ビーズのインビボ直接注射
前処置：１０7個のＰＳＮ−１細胞（細胞株）を、皮下移植のために、インビトロでの継代から調製した。マウスを予定された処置に対して無作為化した。
麻酔：なし
臨床手順：腫瘍が触知可能（２〜３mm）になったとき、イリノテカンビーズ／アルギン酸塩混合物を皮下で増殖している腫瘍（これは腫瘍細胞注射の５日後に生じた）の近くに注射した。
【００９９】
注射の前に、凍結乾燥した滅菌イリノテカンビーズを、３mlのアルギン酸塩溶液（ＡＳ−０２１）を添加することにより水和した。アルギン酸塩中で確実にビーズを均一に分布させるため、試料をvortex mixerで混合した。送達される総容量は、マウス１匹あたり１００μl（アルギン酸塩溶液及びビーズ）であった。イリノテカンビーズは、３．２mgのイリノテカンを含有した。毒性を測るものとして、各マウスの体重を、毎週２回決定した。
【０１００】
イリノテカン担持ビーズを注射したマウスは、対照群と比較したとき、全ての時点で腫瘍容量の低減効果を示した（図７）。腫瘍サイズは１４日目まで減少し続け、それから腫瘍容量は（おそらく、全ての薬剤がビーズから溶出したために）増加し始めた。イリノテカン処置マウスの体重は、２０ｇから２５ｇに増加した。このことは毒性がない指標として使用することができる（図８）。体重の減少は２１〜２５日目に生じた（毒性の指標）。このことは、体重減少がイリノテカンによる処置の１１日後には生じていないので、腫瘍増殖に起因するようである。イリノテカン処置マウスを、腫瘍がマウスの総体重の１０％を超えたので２５日の時点後に安楽死させた。
【０１０１】
実施例６：イリノテカン及びラパマイシ薬剤溶出ビーズのインビトロにおける細胞毒性
ＰＳＮ１細胞を、適切な細胞培地により１００，０００細胞ｍｌ-1の濃度に希釈した。８チャンネルマルチウエルピペットを使用して、２００μlの細胞溶液を、滅菌平底９６ウエルプレート（Cellstar（登録商標）、655180）の各ウエルに加え、２０，０００個の細胞を２００の培地に播種し、インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ2）の中に２０時間静置した。２０時間後、細胞培地を除去し、新たな培地に代えた。
【０１０２】
新たな培地（２００μl）をウエルに加えた。予め担持させたイリノテカン（３０mg/ml）又はラパマイシン（２０mg/ml）微小球を、５μlに設定したピペットを使用して、滅菌Ｈ2Ｏ中の微小球のプールから注意深く数えてウエルに入れた。ラパマイシンビーズは、ＷＯ２００７／０９０８９７の実施例２に詳述されたように調製した。分析した試料は、ウエル１つあたり１〜３個のイリノテカンビーズであった（図９を参照すること）。組み合わせ処理では、ウエルは、１個のラパマイシンと１個のイリノテカンのビーズを一緒に含有し、これをイリノテカン単独及びラパマイシンビーズ単独と比較した。微小球のピペット操作は、ウエル中の培地の量を確かに増加したので、対応する量を後で除去した。例えば、３個の微小球をピペットにより１つのウエルに移動した場合、終了時に１５μlを除去した。微小球を添加すると、ウエルを必要に応じて２４、４８又は７２時間インキュベートした。
【０１０３】
所定の時点で、培地（微小球を有する又は有さない）を除去し、細胞を２００μlのＰＢＳで３回洗浄して、あらゆる残留薬剤又は微小球を除去した。細胞培地（１００μl）をウエルに加え、続いて２０μlのＭＴＳ溶液（Promega, UK）を加えた。細胞を２時間インキュベート（３７℃、５％ＣＯ2）し、穏やかに撹拌した後でBiotekプレートリーダーを使用して４９０nmで吸光度を記録した。培地のみ及び未処置細胞の吸光度を対照とした。
【０１０４】
細胞生存率を以下の式を使用して計算した：
2014208661.tif 000011
式１：細胞生存率の計算
【０１０５】
イリノテカン担持ビーズは、４８及び７２時間の溶出後にＰＳＮ１細胞の生存率を減少させた（図９）。ウエル１つあたりのビーズの数は、生存細胞の量に影響を与え、より多くのビーズは細胞死の増加に繋がった。２４時間後に細胞毒性は見られず、代わりに、細胞数は（存在するビーズの数によって）５〜３０％増加した。２４時間後の細胞増殖は、ストレス誘導性細胞生存機構に起因する可能性がある。
【０１０６】
組み合わせて使用した場合、イリノテカン及びラパマイシンは、４８又は７２時間後でいずれかの薬剤単独と比較して、有意に（ｔ−検定ｐ＜０．０１）細胞生存率を減少させた。（図１０）。
【０１０７】
実施例７：ヌードマウスのヒト悪性膵癌異種移植片へのドキソルビシン担持ビーズのインビボにおける直接注射
前処置：１０7個のＰＳＮ−１細胞（細胞株）を、皮下移植のためにインビトロでの継代から調製した。マウスを予定された処置に対して無作為化した。
麻酔：なし
臨床手順：腫瘍が触知可能（２〜３mm）になったとき、ドキソルビシンビーズ／アルギン酸塩混合物を皮下増殖腫瘍（これは腫瘍細胞注射の５日後に生じた）の近くに注射した。
【０１０８】
注射の前に、凍結乾燥した滅菌ドキソルビシンＰＶＡヒドロゲルビーズ（Ｄｏｘ  ＰＶＡ）を、３mlのアルギン酸塩溶液（ＡＳ−０２１）の添加により水和した。微小球へのドキソルビシンの担持については、ＷＯ２００４／０７１４９５の実施例２を、高ＡＭＰＳ担持についての実施例５と合わせて参照すること。アルギン酸塩中で確実にビーズを均一に分布させるため、試料をvortex mixerで混合した。送達される総容量は、マウス１匹あたり１００μl（アルギン酸塩溶液及びビーズ）であった。ドキソルビシンビーズは、２．５mgのドキソルビシンを含有した。毒性を測るものとして、各マウスの体重を、毎週２回決定した。アルギン酸塩ビーズにもまた、ドキソルビシンを担持させ（Ｄｏｘ−Ａｌｇ）、希釈して、ＰＶＡヒドロゲルの例と同じ容量のビーズを得た。ビーズは、ＷＯ０８／１２８５８０の実施例８〜１１に記載された手順に従って調製した。これらのビーズを、未担持アルギン酸塩ビーズと一緒にＤＯＸ担持アルギン酸塩ビーズのスラリーに注入した。未担持ビーズは、確実に希釈がアルギン酸塩溶液中のＤＯＸ担持ＤＣビーズと同じになるように、混合物に加えた。
【０１０９】
両方の種類のドキソルビシン担持ビーズを注射したマウスは、対照群と比較したとき、全ての時点で腫瘍容量の低減効果を示した（図１１）。腫瘍サイズは１８日目まで減少し続け、その後、腫瘍容量は（おそらく、全ての薬剤がビーズから溶出したために）増加し始めた。ドキソルビシン処置マウスの体重は、２０ｇから２５ｇに増加した。このことは毒性がない指標として使用できる（図１２）。体重の減少は２１〜２５日目に生じた（毒性の指標）。このことは、体重減少がドキソルビシンによる処置の１１日後に起こっていないことから、腫瘍増殖のためであるようだ。ドキソルビシンビーズで処置したマウスは、２５日後の時点で、腫瘍がマウスの総体重の１０％を超えたのでに安楽死させた。
【０１１０】
実施例８：ヌードマウスのヒト悪性膵癌異種移植片へのイリノテカン又はトポテカン担持ビーズのインビボにおける直接（反復）注射
前処置：ＰＳＮ−１腫瘍片（ヒト悪性膵癌）を皮下移植のためにインビボでの継代から調製した。マウスを予定された処置に対して無作為化した。
麻酔：なし
臨床手順：６日後、腫瘍は触知可能（２〜３mm）になり、ＤＥＢ／アルギン酸塩混合物を、皮下増殖腫瘍の近くに注射した。注射の前に、全ての凍結乾燥した滅菌薬剤溶出ビーズ（ＤＥＢ）を、３mlのアルギン酸塩溶液の添加により、投与日に水和した。
【０１１１】
注射量及び薬剤の担持量を表２に示す。反復注射は、平均腫瘍サイズが前の時点よりも２０％以上大きくなった時に行った。反復注射は、Ｂ群では２２及び３６日、Ｃ群では１９日、Ｄ群では１９及び２７日、Ｅ群では１９、２７及び３６日に実施した。
【０１１２】
１週間に２回、各マウスの体重及び腫瘍サイズを決定し、記録した。
【０１１３】
【表２】
2014208661.tif 000012
表２：マウス異種移植片実験における群の情報
【０１１４】
結果：ＰＳＮ１腫瘍の増殖は、ヌードマウスにおいて、アルギン酸塩と共に皮下投与したトポテカン及びイリノテカンＤＥＢにより阻害された（図１３）。両方の場合における対照（−−）は、アルギン酸塩溶液中の未担持ビーズであった。反復注射は、３．３mgのイリノテカン（２２及び３６日）、６．６mgのイリノテカン（１９日）、０．４mgのトポテカン（１９及び２７日）及び０．２mgのトポテカン（１９、２７及び３６日）で行った。（ｎ＝３平均±最大／最小）。
【０１１５】
各濃度（０．４及び０．２mg）のトポテカンは、腫瘍容量の低減効果を示した。イリノテカン処置は、腫瘍サイズの低減について、試験したトポテカン処置と同等か又はより良好であった。
【０１１６】
対照マウスは、腫瘍が大きな腫瘍容量に達した時に、腫瘍誘発性悪液質に起因して、重篤な体重減少を示した。この毒性の測定に基づいて、全ての群は、有意な体重減少を示さなかった。このことは、処置に対して十分耐性があることを示している（図１４）。
【０１１７】
イリノテカンと比較して、トポテカンが細胞毒性効果を誘発するために必要である用量は、はるかに低い。ここで試験した全ての試料では、イリノテカン用量が高い群は、腫瘍移植後の５７日間の最大の生存能力を示した。この群の２匹のマウスは、有意な腫瘍縮小を示し、１匹は４７日後に＞９９％の縮小を示し、５７日後でも再増殖の兆候を示さなかった。群の中でのゆらぎは、注射部位の不統一のためなのかもしれない。高用量イリノテカン処置において、１９日後に腫瘍サイズの増加を観察することができる。これは、薬剤耐性又は不十分な薬剤に起因する可能性がある。２回目の注射後の腫瘍サイズの低減は、増殖がビーズからイリノテカンが完全に溶出してしまったためであり、薬剤耐性のためではないことを示している（図１３）。
【０１１８】
実施例９：ブタモデルにおけるアルギン酸塩中のイリノテカン担持ビーズの超音波内視鏡誘導注射
超音波内視鏡検査（ＥＵＳ）：ＥＵＳは、内視鏡により方向付けられる超音波を使用して、胸部及び腹部の内臓又は腫瘍の画像を得る医学的手法である。
手順：全てのブタにおいて、ＥＵＳスコープ（直径１３mm）を、麻酔をかけたブタの食道に口腔を介して挿入し、近位胃まで通した。イリノテカンＤＥＢ／アルギン酸塩混合物を、膵臓への直接注射のために調製した。異なる用量のイリノテカンを注射するため、より量の多い複数量のイリノテカンビーズを、アルギン酸塩溶液に混合し、懸濁した。イリノテカン濃度は、５０〜３００mgの範囲であった（ｎ＝１〜２）。対照ブタには、２mlのアルギン酸塩溶液に懸濁した２mLの未担持ＤＥＢを注射した。膵臓に、ＥＵＳとカテーテル（食塩水で湿潤済）の誘導下で１９ケージ針を刺入した。必要量のイリノテカンＤＥＢを含有するアルギン酸塩溶液の４mLの容量を、膵臓に注射した。ＣＴスキャンを、処置の後に実施した。全てのブタを処置後７日間モニターした。動物は、７日目の終わりに屍検を受けた。膵臓組織を、組織病理学検査及び肉眼病変により分析した。屍検では、注射部位の平均直径は、２５．４±４．２（２０〜３０）mmであった。
【０１１９】
微小球の注射の後、ＥＵＳによって、膵臓内高エコー域病巣をはっきりと可視化した。ＣＴ走査において、注射部位は、膵臓の尾部の低密度領域として現れた（図１５を参照すること）。
【０１２０】
ブタは、イリノテカンの３００mgの用量まで、臨床、放射線又は肉眼病理学によって膵炎又は腹内感染の臨床兆候を示さなかった。
【０１２１】
組織病理学検査によって、異物巨細胞反応及びビーズ周辺の肉芽組織の存在が確認された。対照及び薬剤溶出ビーズ群の両方において、これらの領域を囲む軽度の炎症が存在した。炎症の程度は、ビーズがイリノテカンを含有する又は含有しないにかかわらず同様であった（図１６）。
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１６】
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【図１】
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【図１５】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年7月3日(2014.7.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
水不溶性で水膨張性のポリマーを含んでおり、放出可能な形態で前記ポリマーと結合している微小球と、膵臓の腫瘍又は嚢胞の治療に使用される化学療法剤とを含み、
前記微小球が、３７℃で水と平衡状態になったときに、ポリマーと水との総重量に基づいて少なくとも４０重量％の水を含み、
前記ポリマーが、ｐＨ７でアニオン性に荷電され、そして、前記化学療法剤が、カチオン的に荷電されて、前記ポリマーと静電的に結合している、組成物。
【外国語明細書】
2014208661000001.pdf