(57)【要約】【課題】潅流培養中のタンジェンシャルフロー濾過において、有用タンパク質の透過率が低下することなく、有用タンパク質を含む培養液から有用タンパク質を含む溶液を分離する濾過方法を提供すること。【解決手段】潅流培養において、濾過膜からの透過液の流量をモニタリング測定し、透過液の流量が、タンジェンシャルフロー濾過開始時の透過液の流量の少なくとも１０％以上である時点で、濾過膜を切り替える工程を含み、濾過開始１分後の透過液のタンパク質透過率をＸ１とし、膜交換時における透過液のタンパク質透過率をＸ２とするとき、下記の式（Ｉ）を満たす、Ｘ２≧０．９×Ｘ１    （Ｉ）  有用タンパク質を含む培養液から有用タンパク質を含む溶液を分離する濾過方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
潅流培養において、濾過膜からの透過液の流量をモニタリング測定し、
透過液の流量が、タンジェンシャルフロー濾過開始時の透過液の流量の少なくとも１０％以上である時点で、濾過膜を切り替える工程を含み、
濾過開始１分後の透過液のタンパク質透過率をＸ１とし、膜交換時における透過液のタンパク質透過率をＸ２とするとき、下記の式（Ｉ）を満たす、
Ｘ２≧０．９×Ｘ１    （Ｉ）
有用タンパク質を含む培養液から有用タンパク質を含む溶液を分離する濾過方法。
【請求項２】
潅流培養において、濾過膜からの透過液の圧力をモニタリング測定し、
透過液の流量を３ＬＭＨ以上に制御して、透過液側の圧力が０ｋＰａ以上である時点で濾過膜を切り替える工程、
を含み、
濾過開始１分後の透過液のタンパク質透過率をＸ１とし、膜交換時における透過液のタンパク質透過率をＸ２とするとき、下記の式（Ｉ）を満たす、
Ｘ２≧０．９×Ｘ１    （Ｉ）
有用タンパク質を含む培養液から有用タンパク質を含む溶液を分離する濾過方法。
【請求項３】
前記濾過膜として、総細胞数が１．０×Ｅ７ｃｅｌｌｓ／ｍＬである培養液の累積処理量が１００Ｌ／ｍ2となる時点における透過液のタンパク質透過率が、濾過開始１分後の透過液のタンパク質透過率の９０％以上であるものを用いる、請求項１または２に記載の濾過方法。
【請求項４】
前記濾過膜として、総細胞数が１．０×Ｅ７ｃｅｌｌｓ／ｍＬである培養液の累積処理量が３００Ｌ／ｍ2となる時点における透過液のタンパク質透過率が、濾過開始１分後の透過液のタンパク質透過率の９０％以上であるものを用いる、請求項１〜３の何れかに記載の濾過方法。
【請求項５】
前記濾過膜が、疎水性高分子とポリビニルピロリドンのブレンド物から管壁が構成されている多孔質中空糸膜である、請求項１〜４の何れかに記載の濾過方法。
【請求項６】
前記濾過膜の管壁を膜厚方向に３等分して３つの領域に分割したときに、前記濾過膜の外側面を含む外周領域のポリビニルピロリドンの含有割合が、前記濾過膜の内側面を含む内周領域のポリビニルピロリドンの含有割合より大きい、請求項１〜５の何れかに記載の濾過方法。
【請求項７】
前記濾過膜の内側面の平均孔径が、前記濾過膜の外側面の平均孔径より大きい多孔質中空糸膜である、請求項１〜６の何れかに記載の濾過方法。
【請求項８】
前記濾過膜が、内側面の平均孔径が１〜１００μｍ以下であり、緻密層を持たない、請求項１〜７の何れかに記載の濾過方法。
【請求項９】
前記管壁の膜厚が、３００μｍ以上１０００μｍ以下である、請求項５〜８の何れかに記載の濾過方法。
【請求項１０】
前記疎水性高分子が、ポリスルホンである、請求項５〜９の何れかに記載の濾過方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、潅流培養における有用タンパク質を含む培養液の濾過方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
細胞培養技術は、例えば、ウイルス、ワクチン、インターフェロンなどの抗ウイルス剤、およびホルモンなどのバイオ医薬品の製造にとって重要である。
更に近年、特定タンパク質などを標的とするモノクローナル抗体の生産は抗体産生細胞とミエローマによるハイブリドーマの培養によるものであり、高効率かつ安定的な生産および生産工程の簡素化などは工業的に重要なテーマである。
【０００３】
前記した有用物質の産生を目的とした工業的な細胞の培養法は、大きく分けて、付着培養法と、懸濁培養法（浮遊培養法）との２つの方式に分類されるが、培養法の方式は培養される細胞の特性によっていずれかに決められる。
【０００４】
懸濁培養によって細胞を培養する方法においては、例えば、スピナーフラスコなどの培養槽中に調整された撹拌機能を設け、撹拌機能として、マグネテインクスターラーまたは機械的に駆動されるシャフト上の羽根車などを用いた培養法が提案されている。しかし、この培養法においては、一定量の栄養分の中で培養されるため細胞の生長増殖は比較的低い密度で停止する。このような細胞の懸濁培養法において、細胞を大量に且つ高密度で培養するために一般に新しい培養液を培養槽中へ供給しつつ生育阻害物質を含んだ古い培養液を培養槽外へ排出しながら培養する方式が提案され、この方式は潅流培養方式と言われている（特許文献１を参照）。
【０００５】
潅流培養する上で重要なことは、懸濁液中の細胞と、古い培養液および産生された有用タンパク質とを長期にわたって効率よく分離し、古い培養液および有用タンパク質を培養槽外へ取り出し、培養槽内の細胞の生育環境を長期間最適条件下に維持し続けることである。
中空糸膜を使い長期にわたり分離を行う、すなわち膜汚染を防ぐ手段として、
例えば、特許文献２には、新鮮培地の供給を培養液の排出と逆転させる方法が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開昭６１−２５７１８１号公報
【特許文献２】特開平２−２００１７６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
潅流培養において、培養槽の培養液中の細胞と、古い培養液および産生された有用タンパク質とを分離するために、精密濾過（ＭＦ）相当の中空糸膜が好適に用いられるが、従来の濾過方法においては濾過経時における膜閉塞過程の中で有用タンパクの透過率が低下するという問題があった。そのため、膜交換時期を判断するために、工程中に有用タンパク質の透過率の分析を実施する必要があった。
【０００８】
本発明が解決しようとする課題は、潅流培養中のタンジェンシャルフロー濾過において、有用タンパク質の透過率が低下することなく、有用タンパク質を含む培養液から有用タンパク質を含む溶液を分離する濾過方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、前記課題を解決するために鋭意検討した結果、膜交換時期の判断を濾過挙動に依って行うことにより、有用タンパク質を含む培養液から有用タンパク質を含む溶液を分離する新たな濾過方法とすることができることを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）
潅流培養において、濾過膜からの透過液の流量をモニタリング測定し、
透過液の流量が、タンジェンシャルフロー濾過開始時の透過液の流量の少なくとも１０％以上である時点で、濾過膜を切り替える工程を含み、
濾過開始１分後の透過液のタンパク質透過率をＸ１とし、膜交換時における透過液のタンパク質透過率をＸ２とするとき、下記の式（Ｉ）を満たす、
Ｘ２≧０．９×Ｘ１    （Ｉ）
有用タンパク質を含む培養液から有用タンパク質を含む溶液を分離する濾過方法。
（２）
潅流培養において、濾過膜からの透過液の圧力をモニタリング測定し、
透過液の流量を３ＬＭＨ以上に制御して、透過液側の圧力が０ｋＰａ以上である時点で濾過膜を切り替える工程、
を含み、
濾過開始１分後の透過液のタンパク質透過率をＸ１とし、膜交換時における透過液のタンパク質透過率をＸ２とするとき、下記の式（Ｉ）を満たす、
Ｘ２≧０．９×Ｘ１    （Ｉ）
有用タンパク質を含む培養液から有用タンパク質を含む溶液を分離する濾過方法。
（３）
前記濾過膜として、総細胞数が１．０×Ｅ７ｃｅｌｌｓ／ｍＬである培養液の累積処理量が１００Ｌ／ｍ2となる時点における透過液のタンパク質透過率が、濾過開始１分後の透過液のタンパク質透過率の９０％以上であるものを用いる、（１）または（２）に記載の濾過方法。
（４）
前記濾過膜として、総細胞数が１．０×Ｅ７ｃｅｌｌｓ／ｍＬである培養液の累積処理量が３００Ｌ／ｍ2となる時点における透過液のタンパク質透過率が、濾過開始１分後の透過液のタンパク質透過率の９０％以上であるものを用いる、（１）〜（３）の何れかに記載の濾過方法。
（５）
前記濾過膜が、疎水性高分子とポリビニルピロリドンのブレンド物から管壁が構成されている多孔質中空糸膜である、（１）〜（４）の何れかに記載の濾過方法。
（６）
前記濾過膜の管壁を膜厚方向に３等分して３つの領域に分割したときに、前記濾過膜の外側面を含む外周領域のポリビニルピロリドンの含有割合が、前記濾過膜の内側面を含む内周領域のポリビニルピロリドンの含有割合より大きい、（１）〜（５）の何れかに記載の濾過方法。
（７）
前記濾過膜の内側面の平均孔径が、前記濾過膜の外側面の平均孔径より大きい多孔質中空糸膜である、（１）〜（６）の何れかに記載の濾過方法。
（８）
前記濾過膜が、内側面の平均孔径が１〜１００μｍ以下であり、緻密層を持たない、（１）〜（７）の何れかに記載の濾過方法。
（９）
前記管壁の膜厚が、３００μｍ以上１０００μｍ以下である、（５）〜（８）の何れかに記載の濾過方法。
（１０）
前記疎水性高分子が、ポリスルホンである、（５）〜（９）の何れかに記載の濾過方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、潅流培養中のタンジェンシャルフロー濾過において、有用タンパク質の透過率が低下することなく、有用タンパク質を含む培養液から有用タンパク質を含む溶液を分離する濾過方法を提供することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明を実施するための形態（以下、「本実施形態」という。）について詳細に説明する。なお、本発明は、以下の実施形態に限定されるものではなく、その要旨の範囲内で種々変形して実施することができる。
【００１２】
本実施形態は、潅流培養において、有用タンパク質を含む培養液から有用タンパク質を含む溶液を分離する濾過方法である。
本実施形態の一の態様として、
潅流培養において、濾過膜からの透過液の流量をモニタリング測定し、
透過液の流量が、タンジェンシャルフロー濾過開始時の透過液の流量の少なくとも１０％以上である時点で、濾過膜を切り替える工程を含み、
濾過開始１分後の透過液のタンパク質透過率をＸ１とし、膜交換時における透過液のタンパク質透過率をＸ２とするとき、下記の式（Ｉ）を満たす、
Ｘ２≧０．９×Ｘ１    （Ｉ）
有用タンパク質を含む培養液から有用タンパク質を含む溶液を分離する濾過方法、である。
また、本実施形態の別の態様として、
潅流培養において、濾過膜からの透過液の圧力をモニタリング測定し、
透過液の流量を３ＬＭＨ以上に制御して、透過液側の圧力が０ｋＰａ以上である時点で濾過膜を切り替える工程、
を含み、
濾過開始１分後の透過液のタンパク質透過率をＸ１とし、膜交換時における透過液のタンパク質透過率をＸ２とするとき、下記の式（Ｉ）を満たす、
Ｘ２≧０．９×Ｘ１    （Ｉ）
有用タンパク質を含む培養液から有用タンパク質を含む溶液を分離する濾過方法、である。
【００１３】
本実施形態において、有用タンパク質は、医薬品として利用されるもので、具体的には、ホルモン、サイトカイン、成長因子、酵素、血漿タンパク、ウイルス様粒子などが挙げられ、有用タンパク質産生細胞を培養することにより得るものである。好適には、有用タンパク質産生細胞により生合成され培養液中に放出される。
有用タンパク質産生細胞とは、有用タンパク質を細胞内のタンパク合成反応を利用して生産する細胞の事を言い、具体的には、大腸菌、ＣＨＯ細胞等などが挙げられる。
【００１４】
本実施形態において、潅流培養とは、有用タンパク質を効率よく産生するために有用タンパク質産生細胞の培養に対して新しい培養液を培養槽内に供給しつつ、古い培養液および産生した有用タンパク質を培養槽外へタンジェンシャルフロー濾過により濾過膜を透過させて排出・回収し、培養槽内の有用タンパク質産生細胞の成育環境を最適条件下に維持しながら長期で高密度培養行う培養方法のことである。
本実施形態における潅流培養は、具体的には、少なくとも、以下の各工程により行われる。潅流培養において、以下の各工程は、以下記載順番通りに必ずしも行われる必要はなく、適宜、培養槽内の有用タンパク質産生細胞の成育環境を最適条件下に維持しながら長期で高密度培養を行えるように各工程は設定される。また、以下の工程以外の工程が含まれていてもよい。
Ａ．培養槽中の培養液中で有用タンパク質産生細胞が、有用タンパク質を産生する工程、
Ｂ．培養槽から濾過膜に培養液を送液する工程、
Ｃ．培養液を濾過膜でタンジェンシャルフロー濾過する工程、
Ｄ．タンジェンシャルフロー濾過において濾過膜を透過せずに残った培養液を、培養槽に返液する工程、
Ｅ．培養槽に新鮮培地の供給を継続的に行う工程。
潅流培養は、濾過膜を備える清澄濾過装置と、培養槽とを用いることにより実施することができるが、培養槽には、濾過膜へ培養液を送液する流出口、濾過膜内を通過した培養液を培養槽に戻す流入口、培養槽内の培養液をサンプリングする流出口、新鮮培地を供給する流入口を設けることができる。
本実施形態においては、培養液中の有用タンパク質産生細胞と、古い培養液および産生された有用タンパク質とを長期にわたって効率よく分離するために、濾過膜を用いてタンジェンシャルフロー濾過を行うが、清澄濾過装置に備えられる濾過膜には、培養層からの培養液を濾過膜に送液する流入口、濾過膜内を通過した培養液を培養層に戻す流出口、濾過膜内をタンジェンシャルフロー濾過により透過し、古い培養液および産生された有用タンパク質とを含む透過液の流出口を設けることができる。
培養層と、清澄濾過装置とは、必要に応じて送液手段により適宜接続される。
潅流培養を行うために、モニタリングするための圧力計、重量計、各種ポンプなども適宜設けられる。
【００１５】
本実施の形態の濾過方法は、潅流培養において、すなわち、有用タンパク質産生細胞の培養を継続しながら濾過をする際に好適に用いられる濾過方法であるが、培養終了後に行う濾過として行ってもよく、また、濾過を行う間、培養を継続して行っていてもよい。その場合、
Ｂ．培養槽から濾過膜に培養液を送液する工程、
Ｃ．培養液を濾過膜でタンジェンシャルフロー濾過する工程、
Ｄ．タンジェンシャルフロー濾過において濾過膜を透過せずに残った培養液を、培養槽に返液する工程、
Ｅ．培養槽に新鮮培地の供給を継続的に行う工程、とが行われ、Ｅ工程は、適宜供給する新鮮培地の量を減量することにより、濾過を終了させることができる。
【００１６】
本実施形態において、タンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）は、適宜公知の方法により実施することができる。
【００１７】
本実施形態の濾過方法においては、透過液の流量低下、もしくは、透過液の流量を一定以上とした時の透過液側の圧力低下を検出することによって、膜交換の時期を判断する。
【００１８】
透過液の流量低下で検出する場合、透過液の流量が、濾過開始時の透過液の流量の少なくとも１０％以上の任意の時点で、濾過を中止し、濾過膜を切り替える必要がある。この場合、特に、透過液の流量は制御されていないことが好適である。透過液の流量が１０％未満になっても、濾過を続けると、目的物である有用タンパク質の濾過膜透過率が低下する可能性があるため好ましくない。１０％以上の時点で、濾過を中止し、濾過膜を切り替えることが好ましく、１２％以上の時点がより好ましい。
本実施形態において、濾過開始時とは、濾過を行っていない濾過膜を用いて濾過を開始した時点か、濾過膜を再生して再度濾過を行う前の濾過膜を用いて濾過を開始した時点のことである。
濾過開始時の透過液の流量の少なくとも１０％以上の時点で、濾過膜を切り替えることにより、潅流培養を継続して行うことができる。また、従来技術においては、有用タンパク質の透過率の分析を実施して濾過膜の切り替え時期を確認する必要があったが、本実施形態の濾過方法においては、有用タンパク質の透過率の分析をせずとも、単に、透過液の流量を測定することにより、濾過膜の切り替え時期を判断することができるため、有用タンパク質の透過率の分析工程を省略でき、工程を簡略化できるとともに、コストダウンを達成することができる。また、濾過膜の交換の際に生じるコンタミネーションのリスクをも低減することができるという利点を有する。
透過液の流量低下を検出するためには、濾過膜からの透過液の流量をモニタリング測定することにより行うことができるが、透過液の流量を直接測定したり、時間当たりの重量として測定することができる。
【００１９】
透過液の流量を制御せずに濾過膜の切り替え時期を決定するには、透過液の流量の少なくとも１０％以上の時点で、透過膜を切り替えることができるが、透過液の流量を一定以上とし、透過液側の圧力低下を検出することによっても濾過膜の切り替え時期を決定することができる。このとき、透過液の流量を一定以上となるように制御して、透過液側の圧力低下をモニタリングする。透過液の流量を制御する方法は何れの方法を用いてもよいが、例えば、透過液側にポンプを設置して透過液の流量を一定にすることなどが挙げられる。本発明においては、透過液流量を３ＬＭＨ（ＬＭＨは透過流速の単位として一般に用いられている単位（［Ｌ／ｍ2／Ｈｒ］）を示す。）以上に制御して、透過液側の圧力が０ｋＰａ以上の任意の時点で濾過を中止し、濾過膜を切り替える必要がある。透過液側の圧力が、０ｋＰａ未満になると、目的物である有用タンパク質の濾過膜透過率が低下するため好ましくない。
透過液側の圧力が０ｋＰａ以上の時点で、濾過膜を切り替えることにより、潅流培養を継続して行うことができる。また、従来技術においては、有用タンパク質の透過率の分析を実施して濾過膜の切り替え時期を確認する必要があったが、本実施形態の濾過方法においては、有用タンパク質の透過率の分析をせずとも、単に、透過液流量を３ＬＭＨ以上に制御して、透過液側の圧力を測定することにより、濾過膜の切り替え時期を判断することができるため、有用タンパク質の透過率の分析工程を省略でき、工程を簡略化できるとともに、コストダウンを達成することができる。また、濾過膜の交換の際に生じるコンタミネーションのリスクをも低減することができるという利点を有する。
透過液の圧力を検出するためには、圧力計などを用いて、濾過膜からの透過液の圧力をモニタリング測定することにより行うことができる。
【００２０】
本実施形態の濾過方法は、濾過の経過によってもタンパク質透過率の低下を一定以下に維持できることを特徴とするものであり、濾過開始１分後の透過液のタンパク質透過率をＸ１とし、膜交換時の透過液のタンパク質透過率をＸ２とするとき、下記の式（Ｉ）を満たすものである。
Ｘ２≧０．９×Ｘ１    （Ｉ）
【００２１】
本実施形態において、式（Ｉ）を満たすには、濾過膜として、長期間タンパク質透過率が低下しない多孔質中空糸膜を用いることが好ましい。多孔質中空糸膜は、低圧での濾過が可能であり、有用タンパク質産生細胞へのダメージが少ないため、潅流培養における濾過工程に好適である。特に、濾過の経過によって膜が閉塞する過程でタンパク質の透過率が低下せず、長期間タンパク質透過率を維持できる多孔質中空糸膜を用いることで、タンパク質濃度分析を実施せずに、濾過膜の交換の時期を判断することができる。
【００２２】
濾過膜は、疎水性高分子と、親水性高分子であるポリビニルピロリドンのブレンド物から管壁が構成されている多孔質中空糸膜であることが好ましい。多孔質中空糸膜に、疎水性高分子を使用することで、適度な機械的強度を持たせることができ、潅流培養のような長期使用にも耐える耐久性を持たせることができるため好適である。また、親水性高分子であるポリビニルピロリドンを適正量含有させたブレンド物から管壁が構成されていることにより、破砕した細胞、抗体等の疎水性物質粒子の吸着による膜汚染や、各種医薬品の精製工程において有用タンパク質の回収率の低下を防止することができる。
【００２３】
濾過膜のポリビニルピロリドン含有量は、多孔質中空糸膜の総質量を基準としたとき、０．２質量％以上３質量％以下であることが好ましい。０．２質量％以上であることにより、疎水性物質等の吸着による汚染による膜孔内の閉塞を防止することができ、３質量％以下であることにより、機械的強度を保つことができ、親水性高分子の膨潤による膜孔の閉塞を防止し濾過抵抗が大きくなるのを防ぐことができる。
【００２４】
濾過膜は、管壁を膜厚方向に３等分して３つの領域に分割したときに、外側面を含む外周領域のポリビニルピロリドンの含有割合が、内側面を含む内周領域のポリビニルピロリドンの含有割合より大きいものを用いることが好ましい。これは、濾過工程中、内周領域においては膜孔より小さい疎水性物質等の粒子を保持することでデプス濾過の効果を発揮することができ、一方外周領域においては疎水性物質の粒子の吸着による膜孔への閉塞を防止することができるためである。
【００２５】
濾過膜は、内側面の平均孔径が外側面の平均孔径より大きい多孔質中空糸膜であることが好ましい。これは、内側面の孔では疎水性物質等を膜孔内部に保持してデプス濾過の効果を果たし、外側面では濾過時の疎水性物質等の分画効果を果たすためである。
【００２６】
濾過膜に含まれるポリビニルピロリドンは、多孔質中空糸膜の製造に好適な溶液粘度とすることができる観点で、重量平均分子量が４０００００以上８０００００以下のものであることが好ましい。
【００２７】
濾過膜は、内側面の平均孔径が１μｍ以上１００μｍ以下のものが好ましく、また、緻密層を持たない多孔質中空糸膜であることが好ましい。本明細書において、緻密層とは一般的に用いられる意味を示しており、顕微鏡で観察した際に明確に区別できる緻密な構造を有する層であり、例えば、孔径が２０μｍ未満の孔からなる層である。内側面の膜孔の役割は疎水性物質等を膜孔内部に保持してデプス濾過の効果を果たすことだが、内側面の平均孔径が１μｍ以上１００μｍ以下であり、緻密層を持たない多孔質中空糸膜である場合、タンジェンシャルフロー濾過工程中にこの膜孔に対して疎水性物質等の保持と除去が常に繰り返される。このことにより、ある特定物質の蓄積による高濃度層の生成が防がれ、この高濃度層による浸透性の低下に起因するその特定物質、すなわちここでは目的タンパク質の透過率の低下を防ぐことができる。平均孔径が１μｍ以上であることにより、膜面への堆積による膜孔の閉塞を防止することができ、１００μｍ以下であることにより、多孔質中空糸膜の強度を適正な範囲とすることができる。
【００２８】
濾過膜は、孔径５０μｍ以上の孔を少なくとも５０％以上有するものであることが好ましい。潅流培養時に使用する濾過膜は長期間での使用と高い透過処理量が必要とされる。孔径５０μｍ以上の孔が５０％以上であることにより、膜内部の除去物を保持可能であり、デプス濾過の効果を十分に得ることができる。
【００２９】
濾過膜は、外側面に０．１μｍ以上１μｍ未満の多孔質中空糸膜であることが好ましい。孔径が０．１μｍ以上であることにより、濾過抵抗や濾過に要する圧力の上昇による細胞に対するダメージを防止することができる。孔径が１μｍ以下であることにより、十分な分画性を得ることができる。
【００３０】
管壁の膜厚が３００μｍ以上１０００μｍ以下の多孔質中空糸膜であることが好ましく、３５０μｍ以上８００μｍ以下であることがより好ましい。膜厚が３００μｍ以上であることにより、膜内部の除去物を保持可能であり、デプス濾過の効果を十分に得ることができる。また、適当な濾過速度を維持することができる。膜厚が１０００μｍ以下であることにより、モジュールあたりの有効な断面積を維持し、濾過性能を優れたものとすることができる。
【００３１】
濾過膜が、下記の式（ＩＩ）を満たすものであることが好ましい。
Ｃout／Ｃin≧２    （ＩＩ）
［式（ＩＩ）中、Ｃoutはポリビニルピロリドンの前記外周領域における含有割合を示し、Ｃinはポリビニルピロリドンの前記内周領域における含有割合を示す。］
親水性高分子がこのような分布を示す多孔質中空糸膜は、内周領域における、デプス濾過の効果と、外周領域における、除去物の吸着による膜孔の閉塞防止効果とに一層優れる。
【００３２】
濾過膜は、内径が１０００μｍ以上２０００μｍ以下の多孔質中空糸膜であることが好ましい。潅流培養においては高密度の細胞懸濁液となるため１０００μｍ以上であることにより、中空糸の入り口が凝集した懸濁物質による閉塞を防止し、また、２０００μｍ以下であることにより、モジュールあたりの有効な断面積を維持し、濾過性能を優れたものとすることができる。
【００３３】
本実施形態において、疎水性高分子は、ポリスルホンを含むものが好ましい。この疎水性高分子であれば、多孔質中空糸膜が温度変化や圧力変化に対する強度に一層優れ、高い濾過性能を発現することができる。
【００３４】
本実施形態に用いる濾過膜としては、総細胞数が１．０×Ｅ７ｃｅｌｌｓ／ｍＬである培養液の累積処理量が１００Ｌ／ｍ2となる時点における透過液のタンパク質透過率が、タンジェンシャルフロー濾過開始１分後の透過液のタンパク質透過率の９０％以上であるものを用いることが好ましく、さらには、前記培養液の累積処理量が３００Ｌ／ｍ2となる時点における透過液のタンパク質透過率が、濾過開始１分後の透過液のタンパク質透過率の９０％以上であるものを用いることがより好ましい。
【００３５】
本実施形態において、上記のような濾過膜の一例示として、下記の実施例で用いられる濾過膜などがある。また、本実施形態においては、国際公開第２０１０／０３５７９３号公報に記載される濾過膜を用いることもできる。各測定方法も、国際公開２０１０／０３５７９３号公報に準じて測定することができる。なお、タンジェンシャルフロー濾過を国際公開２０１０／０３５７９３号公報に準じて行うこともできる。
【実施例】
【００３６】
以下、本実施形態を実施例および比較例に基づいてより具体的に説明するが、本実施形態は以下の実施例のみに限定されるものではない。なお、本実施形態に用いられる測定方法は以下のとおりである。
【００３７】
（１）内側面孔径の測定、ならびに、最小孔径層の位置および緻密層の有無の確認
凍結乾燥した多孔質中空糸膜の内側面を、電子顕微鏡（株式会社キーエンス製、ＶＥ−９８００）を用いて１視野において１０個以上の孔が観測可能な倍率で観察した。得られた顕微鏡写真における細孔を円形近似処理し、その面積から求めた直径を内側面孔径とした。
凍結乾燥した多孔質中空糸膜の断面を内側面側から外側面側へ向かって連続して顕微鏡観察し、断面孔径が最小になる層（最小孔径層）の位置を確認した。
また、多孔質中空糸膜の最内面の構造を顕微鏡観察し、緻密層の有無を確認した。
【００３８】
（２）最小孔径層の孔径決定法
ポリスチレンラテックス粒子（ＪＳＲ株式会社製、ＳＩＺＥ  ＳＴＡＮＤＡＲＤ  ＰＡＲＴＩＣＬＥＳ）を、０．５質量％のドデシル硫酸ナトリウム水溶液（和光純薬工業株式会社製）に、粒子濃度が０．０１質量％になるように分散させ、ラテックス粒子分散液を調整した。
多孔質中空糸膜を用いてラテックス粒子分散液の濾過を行い、濾過前後のラテックス粒子の濃度変化を測定した。この測定を、０．１μｍから約０．１μｍ刻みでラテックス粒子径を変えながら行いラテックス粒子の阻止曲線を作成した。この阻止曲線から、９８％透過阻止可能な粒子径を読み取り、その径を最小孔径層の孔径（阻止孔径）とした。
「（１）最小孔径層の位置の確認」により、外周領域に最小孔径層があることが確認できたとき、「（２）最小孔径層の孔径決定法」により決定される最小孔径層の孔径（阻止孔径）は、外周領域の阻止孔径である。
【００３９】
（３）多孔質中空糸膜の内径、外径および膜厚の測定
多孔質中空糸膜を円管状に薄くきりそれを光学顕微鏡（株式会社キーエンス製、ＶＨ６１００）で観察し、多孔質中空糸膜の内径（μｍ）、外径（μｍ）を測定した。得られた内径、外径から下記の式（ＩＩ）を用いて膜厚を算出した。
膜厚（μｍ）＝（外径−内径）／２    （ＩＩ）
【００４０】
（４）タンパク質透過率の測定
濾過工程中の透過液および培養液のタンパク質濃度をＥＬＩＳＡ法で定量分析を行った。
タンパク質透過率については下記の式（ＩＩＩ）を用いて算出した。
タンパク質透過率Ｘ＝（透過液のタンパク質濃度）／（透過液をサンプリングした際の培養液のタンパク質濃度）×１００    （ＩＩＩ）
【００４１】
（５）細胞生存率の測定
濾過終了時の培養液をサンプリングして、細胞数自動計測装置（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製  ＣＹＴＯＲＥＣＯＮ）を使用して細胞生存率を測定した。
【００４２】
（実施例１）
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を無血清培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社  ＣＤ  ｏｐｔｉ  ＣＨＯ  ＡＧＴ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ２ＭＥ）で培養して、ＣＨＯ細胞懸濁液を得た。
あらかじめオートクレーブ滅菌した１２Ｌ容量の細胞培養槽に４．５Ｌの新鮮無血清培地を送入し、さらに、ヒト免疫グロブリンＧを培養液に対して０．５ｍｇ／ｍＬの濃度で添加して、５×Ｅ５ｃｅｌｌｓ／ｍＬのＣＨＯ細胞懸濁液を１Ｌ送入し培養を開始した。その後、総細胞数が１．０×Ｅ７ｃｅｌｌｓ／ｍＬに増殖したことを確認した後に、濾過を開始した。
培養槽には培養槽から多孔質中空糸膜へ培養液を送液する流出口、多孔質中空糸膜内を通過して培養槽に戻る流入口、培養槽内の培養液をサンプリングする流出口、新鮮培地を供給する流入口を設けた。
ペリスタックポンプにより培養槽から多孔質中空糸膜（旭化成メディカル社製、ＢｉｏＯｐｔｉｍａｌ  ＭＦ−ＳＬ０００５、阻止孔径０．４μｍ）への送液を行い、タンジェンシャルフロー濾過を行った。送液量はずり速度２９００ｓ-1となるように設定した。また、培養槽内に上限液面計（レベルセンサー）を設置して濾過で抜き出された培養液と同量、新鮮培地が供給できるようにした。膜交換時期を透過液量低下で判断するため、多孔質中空糸膜の透過液流出口を開放し透過液量を随時測定できるように重量計を設置した。
透過液量が濾過開始時の１０％となった時点で膜交換を実施したところ、タンパク質透過率は９９．５％となった。透過液量が濾過開始時の透過液量の１０％時でもタンパク質透過率は上記式（Ｉ）を満たしており、透過液量が濾過開始時の透過液量の１０％時の膜交換が有効であることが明らかになった。
３００Ｌ/ｍ2の培養液を処理するには膜交換なしで濾過時間２２０分で行えることがわかった。濾過終了時の細胞生存率は９３．２％であった。
【００４３】
（実施例２）
透過液量が濾過開始時の５０％となった時点で膜交換を実施した以外は、実施例１と同様にして濾過を行った。
累積処理量が１１５Ｌ／ｍ2となった時点で透過液量が濾過開始時の５０％となったため膜交換を実施した。その時のタンパク質透過率は９９．７％であり膜交換実施後に再度濾過を行い、累積処理量が２１５Ｌ／ｍ2となった時点で透過液量が濾過開始時の５０％となったため再び膜交換を実施した。その時のタンパク質透過率は９９．８％であった。
３００Ｌ／ｍ2の培養液を処理するには膜交換を２回実施し濾過時間６０分で行えることがわかった。濾過終了時の細胞生存率は９４．５％であった。
【００４４】
（比較例１）
多孔質中空糸膜として、ＳＰＥＣＴＲＵＭ社製Ｍｉｄｉｃｒｏｓｓ  Ｘ２５Ｅ−３０１−０２Ｎ（阻止孔径０．５μｍ）を使用した以外は、実施例１と同様にして濾過を行った。
透過液量が濾過開始時の透過液量の５０％および１０％時にはタンパク質透過率は式（１）を満たせず、透過液量では膜交換のタイミングが分からないことが明らかになった。そこで、透過液量が７４．２Ｌ/ｍ2ごとに膜交換を行った。膜交換時のタンパク質透過率は１回目が７４．８％、２回目６５．２％、３回目が６０．１％、４回目が５５．４％であった。
３００Ｌ／ｍ2の培養液を処理するには膜交換４回実施する必要があり、また、濾過時間も４８０分かかった。濾過終了時の細胞生存率は８９．２％であった。
【００４５】
（比較例２）
多孔質中空糸膜として、ＧＥヘルスケア社製  Ｓｔａｒｔ  ＡＸＭ  ＣＦＰ−４−Ｅ−２Ｕ（阻止孔径０．４５μｍ）を使用した以外は、実施例１と同様にして濾過を行った。
透過液量が濾過開始時の透過液量の５０％および１０％時にはタンパク質透過率は式（Ｉ）を満たせず、透過液量では膜交換のタイミングが分からないことが明らかになった。そこで、透過液量が７０．９Ｌ/ｍ2ごとに膜交換を行った。膜交換時のタンパク質透過率は１回目が７９．７％、２回目７７．５％、３回目が７１．５％、４回目が６６．３％であった。
３００Ｌ／ｍ2の培養液を処理するには膜交換４回実施する必要があり、また、濾過時間も４８０分かかった。濾過終了時の細胞生存率は８７．５％であった。
【００４６】
（実施例３）
膜交換時期を圧力低下で判断するため、多孔質中空糸膜の透過液流出口に、重量計に代えて、圧力計およびポンプを取り付け、総細胞数が５×Ｅ５ｃｅｌｌｓ／ｍＬに増殖したことを確認した後に濾過を開始した以外は、実施例１と同様にして濾過を行い、１４ＬＭＨの一定速度で透過させた。
透過液側の圧力が０ｋＰａになった時点で膜交換を実施したところ、タンパク質透過率は９８．２％となった。透過液側の圧力が０ｋＰａ時でもタンパク質透過率は式（Ｉ）を満たしており０ｋＰａ以上の任意の時点での膜交換が有効であることが明らかになった。
１０００Ｌ/ｍ2の培養液を処理するには膜交換なしで行えることがわかった。濾過終了時の細胞生存率は９２．３％であった。
【００４７】
（比較例３）
多孔質中空糸膜として、ＳＰＥＣＴＲＵＭ社製Ｍｉｄｉｃｒｏｓｓ  Ｘ３２Ｅ−３０１−０２Ｎ（阻止孔径０．２μｍ）を使用した以外は、実施例３と同様にして濾過を行った。
透過液側の圧力が０ｋＰａの時にタンパク質透過率が９０％を下回るため式（Ｉ）を満たせなくなり、膜交換のタイミングを透過液側の圧力で判断することができないことが明らかになった。そこで、透過液量が３０４Ｌ/ｍ2ごとに膜交換を行った。膜交換時のタンパク質透過率は１回目が６２．３％、２回目６０．５％、３回目が６０．２％であった。
１０００Ｌ/ｍ2の培養液を処理するには膜交換３回実施する必要があった。濾過終了時の細胞生存率は８７．５％であった。
【００４８】
（比較例４）
多孔質中空糸膜として、ＳＰＥＣＴＲＵＭ社製Ｍｉｄｉｃｒｏｓｓ  Ｘ２５Ｅ−３０１−０２Ｎ（阻止孔径０．５μｍ）を使用した以外は、実施例３と同様にして濾過を行った。
透過液側の圧力が０ｋＰａの時にタンパク質透過率が９０％を下回るため式（Ｉ）を満たせなくなり、膜交換のタイミングを透過液側の圧力で判断することができないことが明らかになった。そこで、透過液量が４００Ｌ/ｍ2ごとに膜交換を行った。膜交換時のタンパク質透過率は１回目が７６．２％、２回目７０．５％であった。
１０００Ｌ/ｍ2の培養液を処理するには膜交換２回実施する必要があった。濾過終了時の細胞生存率は７４．２％であった。
【００４９】
（比較例５）
多孔質中空糸膜として、ＧＥヘルスケア社製  Ｓｔａｒｔ  ＡＸＭ  ＣＦＰ−２−Ｅ−２Ｕ（阻止孔径０．２μｍ）を使用した以外は、実施例３と同様にして濾過を行った。
透過液側の圧力が０ｋＰａの時にタンパク質透過率が９０％を下回るため式（Ｉ）を満たせなくなり、膜交換のタイミングを透過液側の圧力で判断することができないことが明らかになった。そこで、透過液量が３１１Ｌ/ｍ2ごとに膜交換を行った。膜交換時のタンパク質透過率は１回目が６６．５％、２回目６３．１％、３回目が６１．８％であった。
１０００Ｌ/ｍ2の培養液を処理するには膜交換３回実施する必要があった。濾過終了時の細胞生存率は８５．６％であった。
【００５０】
（比較例６）
多孔質中空糸膜として、ＧＥヘルスケア社製  Ｓｔａｒｔ  ＡＸＭ  ＣＦＰ−４−Ｅ−２Ｕ（阻止孔径０．４５μｍ）を使用した以外は、実施例３と同様にして濾過を行った。
透過液側の圧力が０ｋＰａの時にタンパク透過率が９０％を下回るため式（Ｉ）を満たせなくなり、膜交換のタイミングを透過液側の圧力で判断することができないことが明らかになった。そこで、透過液量が４０８Ｌ/ｍ2ごとに膜交換を行った。膜交換時のタンパク質透過率は１回目が８０．６％、２回目７５．３％であった。
１０００Ｌ/ｍ2の培養液を処理するには膜交換２回実施する必要があった。濾過終了時の細胞生存率は７７．５％であった。
【００５１】
【表１】
2014024824.tif 000002
【００５２】
【表２】
2014024824.tif 000003
【産業上の利用可能性】
【００５３】
本発明は、潅流培養において、透過液のタンパク質濃度分析によらずに濾過膜の劣化を検出できることを特徴とする、有用タンパク質濾過方法を提供する。