(57)【要約】 【課題】検出器で受光した複数の蛍光を容易に分離できる蛍光顕微鏡を提供する。【解決手段】試料に照射する複数の励起光を基準信号の周波数と同一周波数かつ前記基準信号の位相に対して所定の位相差でそれぞれ強度変調する励起光変調部と、複数の励起光により発生した複数の蛍光を検出する蛍光検出部と、蛍光検出部による検出信号から抽出された所定の周波数成分における位相と、基準信号の位相との関係から位相情報を生成する位相情報生成部と、蛍光検出部による検出信号から抽出された所定の周波数成分の振幅から振幅情報を生成する振幅情報生成部と、蛍光検出部による検出信号から周波数成分を除いた成分から成分情報を生成する成分情報生成部と、位相情報、振幅情報、及び成分情報に基づいて複数の蛍光のそれぞれの強度信号を算出する強度信号算出部と、を備える。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料に照射する複数の励起光を基準信号の周波数と同一周波数かつ前記基準信号の位相に対して所定の位相差でそれぞれ強度変調する励起光変調部と、
前記複数の励起光により発生した複数の蛍光を検出する蛍光検出部と、
前記蛍光検出部による検出信号から抽出された所定の周波数成分における位相と、前記基準信号の位相との関係から位相情報を生成する位相情報生成部と、
前記蛍光検出部による検出信号から抽出された所定の周波数成分の振幅から振幅情報を生成する振幅情報生成部と、
前記蛍光検出部による検出信号から前記周波数成分を除いた成分から成分情報を生成する成分情報生成部と、
前記位相情報、前記振幅情報、及び前記成分情報に基づいて前記複数の蛍光のそれぞれの強度信号を算出する強度信号算出部と、
を備える蛍光顕微鏡。
【請求項２】
前記複数の励起光を出力する光源を備える請求項１記載の蛍光顕微鏡。
【請求項３】
前記光源は、前記複数の励起光ごとに出力するように複数設けられる請求項２記載の蛍光顕微鏡。
【請求項４】
前記位相情報は、前記蛍光検出部による検出信号から抽出された所定の周波数成分における位相と前記基準信号の位相との位相差である請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の蛍光顕微鏡。
【請求項５】
前記励起光変調部は、前記複数の励起光の位相を調整する位相差調整部を備える請求項１〜４のいずれか１項に記載の蛍光顕微鏡。
【請求項６】
前記位相差調整部は、前記基準信号に対して前記複数の励起光の位相を調整する請求項５記載の蛍光顕微鏡。
【請求項７】
前記位相調整部は、前記複数の蛍光の位相が、互いに所定の位相差を有し、かつ前記基準信号の位相に対してそれぞれ所定の位相差になるように、前記複数の励起光の位相を調整する請求項６記載の蛍光顕微鏡。
【請求項８】
前記位相差調整部は、前記励起光の直流成分の強度及び交流成分の変調度をそれぞれ変化させることにより前記励起光の位相を調整する請求項６記載の蛍光顕微鏡。
【請求項９】
前記位相差調整部は、前記蛍光の発生及び検出の少なくとも一方に起因する位相遅延量に基づいて前記複数の励起光の位相を調整する請求項５〜請求項８のいずれか１項に記載の蛍光顕微鏡。
【請求項１０】
前記位相差調整部は、前記位相遅延量を記憶するための記憶部を備え、前記記憶部に記憶された前記位相遅延量に基づいて前記複数の励起光の位相差を調整する請求項９記載の蛍光顕微鏡。
【請求項１１】
前記記憶部は、前記複数の励起光を個別に出力したときの前記蛍光検出部による検出信号と前記励起光との位相差から算出された位相遅延量が記憶される請求項１０記載の蛍光顕微鏡。
【請求項１２】
前記蛍光検出部による検出信号として、前記検出信号における所定範囲の信号が用いられる請求項１１記載の蛍光顕微鏡。
【請求項１３】
前記蛍光検出部による検出信号と前記励起光との位相差として、平均位相差が用いられる請求項１１記載の蛍光顕微鏡。
【請求項１４】
前記蛍光検出部による検出信号として、前記検出信号における所定の信号強度の範囲の信号が用いられる請求項１１記載の蛍光顕微鏡。
【請求項１５】
前記励起光変調部は、前記複数の光源を第１光源から第ｎ光源とするとき、前記基準信号の位相を基準として、第1光源からの励起光の位相をδ１とし、第２光源からの励起光の位相を（２π／Ｎ＋δ２）とし、第３光源からの励起光の位相を（４π／Ｎ＋δ３）とし、第Ｎ光源からの励起光の位相を｛（ｎ−１）・２π／Ｎ＋δｎ｝（ただし、δ１、δ２、δ３，・・，δｎは光源の波長に対応した蛍光試薬からの蛍光信号の位相遅延に関する補正量）とする請求項３記載の蛍光顕微鏡。
【請求項１６】
複数の励起光を基準信号の周波数と同一周波数かつ前記基準信号の位相と同一位相で試料に照射する第１照射状態と、前記複数の励起光のうち少なくとも一つを除いて照射する第２照射状態とを指示する照射制御部と、
前記第１及び第２照射状態での前記励起光により発生した蛍光をそれぞれ検出する蛍光検出部と、
前記第１照射状態での前記蛍光検出部による第１検出信号と、前記第２照射状態での前記蛍光検出部による第２検出信号とに基づいて、前記第１検出信号から前記複数の蛍光のそれぞれの強度信号を算出する強度信号算出部と、
を備える蛍光顕微鏡。
【請求項１７】
試料に照射する複数の励起光を基準信号の周波数と同一周波数かつ前記基準信号の位相に対して所定の位相差でそれぞれ強度変調し、
前記複数の励起光により発生した複数の蛍光を検出し、
前記検出された信号から抽出された所定の周波数成分における位相と、前記基準信号の位相との関係から位相情報を生成し、
前記検出された信号から抽出された所定の周波数成分の振幅から振幅情報を生成し、
前記検出された信号から前記周波数成分を除いた成分から成分情報を生成し、
前記位相情報、前記振幅情報、及び前記成分情報に基づき前記複数の蛍光のそれぞれの強度信号を算出する蛍光検出方法。
【請求項１８】
基準信号の周波数と同一周波数かつ前記基準信号の位相に対して所定の位相差で強度変調された複数の励起光により発生した複数の蛍光を検出する蛍光検出部と、
前記蛍光検出部による検出信号から抽出された所定の周波数成分における位相と、前記検出信号の位相との関係から位相情報を生成する位相情報生成部と、
前記蛍光検出部による検出信号から抽出された所定の周波数成分の振幅から振幅情報を生成する振幅情報生成部と、
前記蛍光検出部による検出信号から前記周波数成分を除いた成分から成分情報を生成する成分情報生成部と、
前記位相情報、前記振幅情報、及び前記成分情報に基づき前記複数の蛍光のそれぞれの強度信号を算出する強度信号算出部と、
を備える蛍光検出ユニット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光顕微鏡、蛍光検出方法、及び蛍光検出ユニットに関する。
【背景技術】
【０００２】
蛍光試薬を励起させる励起光を試料に照射し、該蛍光試薬から発光する蛍光に基づいて画像を表示する従来技術としては、例えば特許文献１記載のものがある。このような従来技術において、複数の励起光を試料の蛍光試薬に同時に照射する場合、蛍光試薬から発光する蛍光を検出器で検出する際に光学フィルタで分離して、異なる検出器に導くのが一般的である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００５／０５２６６８号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
複数の蛍光試薬から発光する蛍光を光学フィルタで分離して異なる検出器に導く場合、発生する蛍光の波長帯域が極めて接近、もしくは一部重なっているため、蛍光を完全に分離することは困難である。
【０００５】
本発明の態様は、検出器で受光した複数の蛍光を分離可能な蛍光顕微鏡、蛍光検出方法、及び蛍光検出ユニットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の第１態様によれば、試料に照射する複数の励起光を基準信号の周波数と同一周波数かつ前記基準信号の位相に対して所定の位相差でそれぞれ強度変調する励起光変調部と、前記複数の励起光により発生した複数の蛍光を検出する蛍光検出部と、前記蛍光検出部による検出信号から抽出された所定の周波数成分における位相と、前記基準信号の位相との関係から位相情報を生成する位相情報生成部と、前記蛍光検出部による検出信号から抽出された所定の周波数成分の振幅から振幅情報を生成する振幅情報生成部と、前記蛍光検出部による検出信号から前記周波数成分を除いた成分から成分情報を生成する成分情報生成部と、前記位相情報、前記振幅情報、及び前記成分情報に基づいて前記複数の蛍光のそれぞれの強度信号を算出する強度信号算出部と、を備える蛍光顕微鏡が提供される。
【０００７】
本発明の第２態様によれば、複数の励起光を基準信号の周波数と同一周波数かつ前記基準信号の位相と同一位相で試料に照射する第１照射状態と、前記複数の励起光のうち少なくとも一つを除いて照射する第２照射状態とを指示する照射制御部と、前記第１及び第２照射状態での前記励起光により発生した蛍光をそれぞれ検出する蛍光検出部と、前記第１照射状態での前記蛍光検出部による第１検出信号と、前記第２照射状態での前記蛍光検出部による第２検出信号とに基づいて、前記第１検出信号から前記複数の蛍光のそれぞれの強度信号を算出する強度信号算出部と、を備える蛍光顕微鏡が提供される。
【０００８】
本発明の第３態様によれば、試料に照射する複数の励起光を基準信号の周波数と同一周波数かつ前記基準信号の位相に対して所定の位相差でそれぞれ強度変調し、前記複数の励起光により発生した複数の蛍光を検出し、前記検出された信号から抽出された所定の周波数成分における位相と、前記基準信号の位相との関係から位相情報を生成し、前記検出された信号から抽出された所定の周波数成分の振幅から振幅情報を生成し、前記検出された信号から前記周波数成分を除いた成分から成分情報を生成し、前記位相情報、前記振幅情報、及び前記成分情報に基づき前記複数の蛍光のそれぞれの強度信号を算出する蛍光検出方法が提供される。
【０００９】
本発明の第４態様によれば、基準信号の周波数と同一周波数かつ前記基準信号の位相に対して所定の位相差で強度変調された複数の励起光により発生した複数の蛍光を検出する蛍光検出部と、前記蛍光検出部による検出信号から抽出された所定の周波数成分における位相と、前記検出信号の位相との関係から位相情報を生成する位相情報生成部と、前記蛍光検出部による検出信号から抽出された所定の周波数成分の振幅から振幅情報を生成する振幅情報生成部と、前記蛍光検出部による検出信号から前記周波数成分を除いた成分から成分情報を生成する成分情報生成部と、前記位相情報、前記振幅情報、及び前記成分情報に基づき前記複数の蛍光のそれぞれの強度信号を算出する強度信号算出部と、を備える蛍光検出ユニットが提供される。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の態様によれば、蛍光検出部で受光した複数の蛍光を演算により分離することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】第１実施形態に係る蛍光顕微鏡の一例を示す図である。
【図２】第１実施形態に係る蛍光顕微鏡を説明する図である。
【図３】第１実施形態に係る蛍光顕微鏡に用いる光学系の一例を示す図である。
【図４】検出信号と蛍光の強度信号とを示す図である。
【図５】検出信号と蛍光の強度信号とを示す図である。
【図６】検出信号と蛍光の強度信号とを示す図である。
【図７】検出信号と蛍光の強度信号とを示す図である。
【図８】励起光の励起スペクトルおよび前記励起光により発生する蛍光の蛍光スペクトルの一例を示す図である。
【図９】第２実施形態を説明する図である。
【図１０】実施形態に係る蛍光受光ユニットの一例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、実施形態について図面を参照しながら説明するが、この実施形態に限定されるものではない。
＜第１実施形態＞
第１実施形態について説明する。図１は、第１実施形態に係る蛍光顕微鏡を含む顕微鏡システムの一例を示している。顕微鏡システム１００は、試料ＳＰに照射される励起光により生じる蛍光の画像を取得する蛍光顕微鏡１と、蛍光顕微鏡１を制御するパーソナルコンピュータ１０１とを備えている。パーソナルコンピュータ１０１には、マウスやキーボードからなる入力装置１０２と、ＬＣＤ（Liquid Crystal Display）などからなる表示装置１０３とが接続される。パーソナルコンピュータ１０１は、内蔵するＣＰＵ(Central Processing Unit)がアプリケーションソフトウエア１０４を実行することにより、蛍光顕微鏡１によって取得された画像や、蛍光顕微鏡１の設定値をユーザに入力させるためのＧＵＩ（Graphical User Interface）などを表示装置１０３に表示させる。また、パーソナルコンピュータ１０１は、ユーザが入力装置１０２を操作することにより入力される設定値などに基づいて蛍光顕微鏡１を制御する。
【００１３】
蛍光顕微鏡１は、励起光変調部１０と、蛍光検出部２０と、位相情報生成部３０と、振幅情報生成部４０と、成分情報生成部５０と、強度信号算出部６０と、光源７０とを備える。
【００１４】
励起光変調部１０は、所定周波数の信号を出力する発振器１１と、複数の励起光（励起光ＥＸ１，励起光ＥＸ２，・・，励起光ＥＸｎ）の位相差を調整する位相差調整部１２と、変調回路１３−１，１３−２，・・，１３−ｎと、駆動回路１４−１，１４−２，・・，１４−ｎとを備える。励起光変調部１０は、後述する光源Ｌ１，光源Ｌ２，・・・，光源Ｌｎから試料ＳＰに照射する複数の励起光を同一周波数かつ所定の位相差で強度変調する。発振器１１は、基本正弦波を生成して位相差調整部１２に出力する。位相差調整部１２は、発振器１１からの基本正弦波の位相を励起光ごとに調整して、それぞれ変調回路１３−１等へ出力する。
【００１５】
なお、位相差調整部１２による調整は、複数の励起光のうちの１つの励起光に対して他の励起光の位相を調整することにより行う。例えば、発振器１１からの基本正弦波信号を用いて、励起光ＥＸ１はそのまま基本正弦波信号を用い、励起光ＥＸ２は１８０°位相回路等によって位相をπ遅らせる（進ませる）ように調整してもよい。また、励起光変調部１０は、光源７０の駆動を制御することに限定されない。例えば、光源７０から出射される励起光をそれぞれ光ファイバで試料ＳＰまで導き、この光ファイバの光路長を調整することにより励起光に位相差を与えるような励起光変調部であってもよい。
【００１６】
また、位相差調整部１２は、各励起光の位相の基準となる基本正弦波（以下、基準信号ｂという）を復調回路２３および位相情報生成部３０に出力する。
ここで、基準信号ｂをより高精度に生成するためには、基準信号ｂの周波数よりもより高い周波数の信号を元に生成するに必要がある。  
変調回路１３−１等は、位相差調整部１２からの出力（強度変調信号ｃ１、ｃ２、・・・、ｃｎ）に基づいて所定の位相に強度変調を行い、駆動回路１４−１等へそれぞれ出力する。駆動回路１４−１等は、励起光ＥＸ１等が変調回路１３−１等で強度変調された位相で出射するように、それぞれ光源Ｌ１等を駆動する。なお、位相差調整部１２は、後述する第２実施形態および第３実施形態に用いる場合には、位相遅延量を記憶するための記憶部１２ａを備える。
【００１７】
蛍光検出部２０は、励起光により発生した蛍光を検出する光検出器２１と、光検出器２１からの出力を電流・電圧変換する電流・電圧変換回路２２と、電流・電圧変換回路２２を経た光検出器２１の出力を復調して検出信号を出力する復調回路２３とを備える。光検出器２１は、例えば光電子増倍管が用いられる。図１では、光検出器２１として単一の光検出器を用いているが、複数（例えば光源の数と等しいＮ個）の光検出器を用いてもよい。なお、光源７０として２個の光源（光源Ｌ１、光源Ｌ２）を用いる場合、光検出器２１は、それらの光源から照射された励起光ＥＸ１、励起光ＥＸ２により発生する２つの蛍光（蛍光ＥＭ１、蛍光ＥＭ２）を合わせた光強度を検出する。従って、蛍光検出部２０からの出力信号である検出信号は、蛍光ＥＭ１及び蛍光ＥＭ２の強度信号の合成出力となる。
【００１８】
位相情報生成部３０は、後述する電圧増幅回路４２から入力される蛍光検出部２０による検出信号から抽出された周波数成分（基準信号ｂと同一周波数成分）の位相と、励起光変調部１０の位相差調整部１２から入力される基準信号ｂの位相とに基づいて位相情報を生成する。この位相情報は強度信号算出部６０に入力される。例えば、基準信号ｂの位相と検出信号から抽出された周波数成分の位相との位相差（位相差０、位相差π等）が生成される。
ただし、位相差は位相角（π、２π等）で表す以外に、時間（０μｓ、３０μｓ等）で表してもよい。
また、基準信号ｂの位相と複数の励起光のうちのいずれか１つの位相を一致させた場合（位相差０）には、その励起光の位相を基準にして、他の励起光の位相を設定してもよいので、基準信号ｂの位相には、基準となる励起光の位相も含まれる。
【００１９】
図２は図１に示す第１実施形態の蛍光顕微鏡において、２個の光源を用いた場合を説明する図であり、図１と同一または同等の構成部分については同一符号を付けて説明を省略または簡略する。図２に示すように、励起光ＥＸ１および励起光ＥＸ２を試料ＳＰに照射したときに蛍光ＥＭ１および蛍光ＥＭ２が発生した場合、位相情報生成部３０によって生成される位相情報の一例を挙げると、「位相情報：基準信号ｂの位相と蛍光検出部２０による検出信号の位相とは同位相（位相差＝０）、基準信号ｂの位相と蛍光検出部２０による検出信号の位相とは逆位相（位相差＝π）」である。
【００２０】
振幅情報生成部４０は、ハイパスフィルタ４１と、電圧増幅回路４２と、ＡＤ変換回路４３とを備える。ハイパスフィルタ４１は、蛍光検出部２０から出力された検出信号から周波数成分（基準信号ｂと同一の周波数成分）を抽出する。電圧増幅回路４２は、ハイパスフィルタ４１で抽出された周波数成分に対して電圧増幅した後にＡＤ変換回路４３および位相情報生成部３０へ出力する。ＡＤ変換回路４３は、電圧増幅された周波数成分をデジタル化し、蛍光検出部２０による検出信号の振幅情報（周波数成分における振幅の情報）として強度信号算出部６０へ出力する。なお、この振幅情報は、画素クロック生成回路１２０が生成した画素クロックに基づくタイミングで強度信号算出部６０に入力される。
【００２１】
成分情報生成部５０は、ローパスフィルタ５１と、電圧増幅回路５２と、ＡＤ変換回路５３とを備える。ローパスフィルタ５１は、蛍光検出部２０から出力された検出信号から周波数成分を除いた成分（主として直流成分であり、以下、直流成分という。）を抽出する。電圧増幅回路５２は、ローパスフィルタ５１で抽出された直流成分に対して電圧増幅した後にＡＤ変換回路５３へ出力する。ＡＤ変換回路５３は、電圧増幅された直流成分をデジタル化し、蛍光検出部２０による検出信号の成分情報（検出信号から周波数成分を除いた成分の情報は、主として直流成分の情報である。光源Ｌ１，光源Ｌ２，・・・，光源Ｌｎからの出力を１００％変調する場合であっても直流成分は検出信号に含まれる。）として強度信号算出部６０へ出力する。なお、この成分情報は、振幅情報と同様に、画素クロック生成回路１２０が生成した画素クロックに基づくタイミングで強度信号算出部６０に入力される。
【００２２】
強度信号算出部６０は、位相情報生成部３０から入力された位相情報と、振幅情報生成部４０から入力された振幅情報（交流成分）と、成分情報生成部５０から入力された成分情報（直流成分）とに基づいて、複数の蛍光のそれぞれの強度信号を算出する。なお、強度信号算出部６０により複数の蛍光のそれぞれの強度信号を算出する基本原理については後述する。
また、基準信号ｂの位相を基準として、複数の光源Ｌ１等からの複数の励起光ＥＸ１等の位相を調整する際に、予備的な試料観察、直前の試料観察で取得した検出信号を用いて強度信号算出部６０で算出された複数の蛍光ＥＭ１等のそれぞれの強度信号に基づいて、位相補正信号ａを算出し、その位相補正信号ａを補正値として光源の強度変調を行う位相をさらに精密に調整してもよい。
このような位相補正信号ａは、標本等の観察対象が変化しなければ同じ値が使用できるので、一旦算出した後は、強度信号算出部６０に備える不図示の記憶部や、位相差調整部１２の記憶部１２ａに格納しておいて、光源Ｌ１等を駆動する際に適宜用いてもよい。
【００２３】
光源７０は、複数の励起光（励起光ＥＸ１，励起光ＥＸ２，・・，励起光ＥＸｎ）を出力するものであり、複数の励起光ごとに出力するようにＮ個の光源Ｌ１，光源Ｌ２，・・・，光源Ｌｎを備える。各光源Ｌ１等は、それぞれの駆動回路１４−１等により駆動して励起光ＥＸ１を出射する。このとき、各励起光ＥＸ１等の位相は、それぞれの変調回路１３−１等により設定されている。なお、光源７０は複数の光源に限定されるものではなく、単一の光源を用いてもよい。例えば、広帯域の単一光源から出力される励起光を強度変調可能な素子（例えば、ＡＯＴＦ：Acousto-Optic Tunable Filter）を用いて、波長の異なる複数の励起光に分割して所定の位相差で出力してもよい。なお、本実施形態では、光源７０として変調回路および駆動回路を含まないものを用いているが、駆動回路および変調回路を含むものを用いてもよい。光源７０が変調回路等を備える場合は、励起光変調部１０は、変調回路１３−１等や駆動回路１４−１等を備える必要がない。
【００２４】
蛍光顕微鏡１は、光学系１１０を備える。光学系１１０は、光路分割、光路合成および走査を行うことにより、光源Ｌ１等から出射された同一周波数の複数の励起光ＥＸ１等を所定の位相差で試料ＳＰに照射するとともに、照射された励起光ＥＸ１等に応じて生じた蛍光ＥＭ１等を蛍光検出部２０に導く。光学系１１０としては、例えば特開平１１−１８３８０６号公報に開示されているコンフォーカル顕微鏡（図３参照）の構成要素の一部を用いることができる。
【００２５】
図３は、光学系１１０の具体的な構成を示している。この光学系１１０は、光分割装置１１１と、スキャナモジュール１１２と、リレーレンズ１１３と、対物光学系１１４と、ステージ１１５と、蛍光選択装置１１６と、集光レンズ１１７と、ピンホールモジュール１１８などを備える。光分割装置１１１は、光源７０から試料ＳＰに照射する励起光ＥＸ１等と試料ＳＰから発生する蛍光ＥＭ１等とを分離する。スキャナモジュール１１２は、励起光ＥＸ１等を試料ＳＰに対して２次元的に走査するための走査装置である。リレーレンズ１１３は、励起光ＥＸ１等を試料ＳＰに導く。対物光学系１１４は、励起光ＥＸ１等を試料ＳＰ位置に集光する。ステージ１１５は、試料ＳＰを支持して３次元に移動させる。蛍光選択装置１１６は、光分割装置１１１を透過した蛍光ＥＭ１等からノイズ光を除去する。集光レンズ１１７は、蛍光選択装置１１６を通過した蛍光ＥＭ１等を集光する。ピンホールモジュール１１８は、共焦点効果を生じさせるための開口部材である。
【００２６】
光源７０から出射された励起光ＥＸ１等は、光分割装置１１１により試料ＳＰへ向けて反射され、スキャナモジュール１１２及びリレーレンズ１１３、対物光学系１１４を介して試料ＳＰに照射される。なお、励起光ＥＸ１等は、スキャナモジュール１１２により試料ＳＰの全部または一部に対して走査される。励起光ＥＸ１等により試料ＳＰから生じた蛍光ＥＭ１等は、対物光学系１１４及びリレーレンズ１１３、スキャナモジュール１１２を通り、光分割装置１１１を透過する。そして、蛍光ＥＭ１等は、蛍光選択装置１１６によってノイズ光を除去された後に、集光レンズ１１７によって集光されてスキャナモジュール１１２を通過し、蛍光検出部２０に入射する。なお、光学系１１０において、光分割装置１１１及びスキャナモジュール１１２、対物光学系１１４、蛍光選択装置１１６等は、それぞれ図示しない制御装置によって制御される。この制御装置は、図１に示すパーソナルコンピュータ１０１を用いてもよい。
【００２７】
また、蛍光顕微鏡１としては、レーザ走査共焦点蛍光顕微鏡として構成されているが、これに限定されるものではない。また、共焦点蛍光顕微鏡に限定されるものでもない。また、蛍光顕微鏡１として光源７０を備えたものとしているが、これに限定されず、光源７０を搭載していない蛍光顕微鏡であってもよい。光源７０を搭載しない蛍光顕微鏡にあっては、励起光変調部１０が変調回路１３−１等や駆動回路１４−１等を備えるか否かは任意であり、使用する光源において変調回路等の有無によって適宜変更される。
【００２８】
続いて、蛍光の強度信号を算出する基本原理について説明する。説明の単純化のため、複数の蛍光は、対応する励起光の照射に対して位相遅れが無いと仮定して、複数の蛍光が基準信号ｂに対してそれぞれ位相差０、πで発生するように、複数の励起光は、基準信号ｂに対してそれぞれ位相差０、πに設定されるとともに、蛍光効率（すなわち、励起光の強度に対する蛍光強度の比率）が同一の場合を例に説明を行う。すなわち、図４〜図７は、試料ＳＰに照射する２つの励起光ＥＸ１，ＥＸ２を基準信号ｂと同一周波数、同一強度、位相差π（基準信号ｂに対する励起光ＥＸ１の位相差を０、基準信号ｂに対する励起光ＥＸ２の位相差をπとする）で強度変調した場合、励起光ＥＸ１，ＥＸ２によって生じた蛍光ＥＭ１，ＥＭ２のそれぞれ（基準信号ｂに対する蛍光ＥＭ１の位相差０、基準信号ｂに対する蛍光ＥＭ２の位相差π）と、蛍光検出部２０により検出された合成出力を示すグラフ図である。なお、図４〜図７において、縦軸は信号強度を示し、横軸は時間を示す。図４は、蛍光ＥＭ１，ＥＭ２が、平均強度及び振幅が同一で逆位相の場合を示しており、この場合は蛍光検出部２０からの合成出力（検出信号）として直流成分のみが検出される。従って、この検出信号から蛍光ＥＭ１の強度信号と、蛍光ＥＭ２の強度信号とが、逆位相の同一波形であることが分かるため、蛍光ＥＭ１及び蛍光ＥＭ２の強度信号が同一であったことが分かる。また、蛍光ＥＭ１及び蛍光ＥＭ２の強度信号は、検出信号の半分である。
【００２９】
図５は、蛍光ＥＭ１，ＥＭ２におけるそれぞれの強度信号の平均値（平均強度）が同一であり、逆位相（基準信号ｂに対する蛍光ＥＭ１の位相差０、基準信号ｂに対する蛍光ＥＭ２の位相差π）でかつ振幅が異なる場合を示しており、この場合は蛍光検出部２０からの合成出力（検出信号）として図５に示すような交流成分が検出される。この交流成分を見ると、その位相が蛍光ＥＭ１と同相（蛍光ＥＭ２と逆相、基準信号ｂと同相）になっている。これは、蛍光ＥＭ１の強度信号の周波数成分における振幅が蛍光ＥＭ２のそれよりも大きいことを表している。従って、この合成出力（検出信号）から蛍光ＥＭ１の強度信号（正弦信号の最大値）が蛍光ＥＭ２の強度信号（正弦信号の最大値）より大きく、かつその差（強度差）が蛍光ＥＭ１と蛍光ＥＭ２の検出信号の振幅であることが分かる。合成出力（検出信号）の直流成分（すなわち、正弦波信号の中心位置）の大きさは、蛍光ＥＭ１、ＥＭ２の直流成分の和を表している。
【００３０】
図６は、図５と同様に、蛍光ＥＭ１，ＥＭ２におけるそれぞれの信号強度の平均値（平均強度）が同一であり、逆位相（基準信号ｂに対する蛍光ＥＭ１の位相差０、基準信号ｂに対する蛍光ＥＭ２の位相差π）でかつ振幅が異なる場合を示しており、この場合は蛍光検出部２０からの合成出力として図６に示すような交流成分が検出される。この交流成分を見ると、その位相が蛍光ＥＭ１と逆相（蛍光ＥＭ２と同相、基準信号ｂと逆相）になっている。これは、蛍光ＥＭ２の強度信号の周波数成分における振幅が蛍光ＥＭ１のそれよりも大きいことを表している。従って、この合成出力（検出信号）から蛍光ＥＭ２の強度信号（正弦信号の最大値）が蛍光ＥＭ１の強度信号（正弦信号の最大値）より大きく、かつその差（強度差）が蛍光ＥＭ１と蛍光ＥＭ２の合成出力（検出信号）の振幅であることが分かる。合成出力（検出信号）の直流成分（すなわち、正弦波信号の中心位置）の大きさは、蛍光ＥＭ１、ＥＭ２の直流成分の和を表している。
【００３１】
図７は、蛍光ＥＭ１，ＥＭ２におけるそれぞれの信号強度の平均値（平均強度）が異なり、逆位相（基準信号ｂに対する蛍光ＥＭ１の位相差０、基準信号ｂに対する蛍光ＥＭ２の位相差π）でかつ振幅が異なる場合を示しており、この場合は蛍光検出部２０からの合成出力として図７に示すような交流成分が検出される。この交流成分を見ると、その位相が蛍光ＥＭ１と同相（蛍光ＥＭ２と逆相、基準信号ｂと同相）になっている。これは、蛍光ＥＭ１の強度信号の周波数成分における振幅が蛍光ＥＭ２のそれよりも大きいことを表している。従って、この合成出力（検出信号）から蛍光ＥＭ１の強度信号（正弦信号の最大値）が蛍光ＥＭ２の強度信号（正弦信号の最大値）より大きく、かつ、その差（強度差）が蛍光ＥＭ１と蛍光ＥＭ２の検出信号の振幅であることが分かる。合成出力（検出信号）の直流成分（すなわち、正弦波信号の中心位置）の大きさは、蛍光ＥＭ１、ＥＭ２の直流成分の和を表している。
以上より、複数の励起光のそれぞれの位相差を基準信号ｂに対して０、πに設定することにより、予め、複数の蛍光は、基準信号ｂに対してそれぞれ位相差０、πで発生するようにしているので、検出信号の位相と基準信号ｂの位相とが同相か、逆相か（合成出力（検出信号）の位相と基準信号ｂの位相との位相差）で、蛍光ＥＭ１、ＥＭ２のどちらの振幅が大きいかが分かり、さらに検出信号の振幅が蛍光ＥＭ１、ＥＭ２の振幅の差を表し、合成出力（検出信号）の強度の平均値（平均強度）が蛍光ＥＭ１、ＥＭ２の直流成分の和を表すことが分かる。
【００３２】
次に、蛍光の強度信号の算出原理を数式に基づいて説明する。
[２つの励起光を用いる場合]
２つの励起光（励起光ＥＸ１、励起光ＥＸ２）の発光波長をそれぞれλａ、λｂとし、励起光ＥＸ１および励起光ＥＸ２を基準信号ｂと同一周波数かつ基準信号ｂに対してそれぞれ所定の位相差（例えば、励起光ＥＸ１との位相差を０、励起光ＥＸ２との位相差をπとする）であって、互いに所定の位相差（例えば、励起光ＥＸ１に対する励起光ＥＸ２の位相差をπとする）で強度変調すると、励起光ＥＸ１および励起光ＥＸ２によりそれぞれ発生する蛍光ＥＭ１および蛍光ＥＭ２が蛍光検出部２０に入力される。蛍光検出部２０において電気信号に変換された後の蛍光ＥＭ１、蛍光ＥＭ２の強度信号の強度をそれぞれＳａ、Ｓｂとし、蛍光ＥＭ１、蛍光ＥＭ２は励起光の照射に対し位相遅れが無いものと仮定すると、Ｓａ、Ｓｂは、基準信号ｂに対してそれぞれ所定の位相差（蛍光ＥＭ１との位相差を０、蛍光ＥＭ２との位相差をπとする）を持ち、蛍光検出部２０の合成出力（検出信号）に対し０およびπの位相差を持つ。また、合成出力（検出信号）は、基準信号ｂに対して所定の位相差（０またはπ）を持つ。すなわち、Ｓａ、Ｓｂはそれぞれ、式（１）、（２）で表すことができる。
Ｓａ＝Ｊａ・｛１＋Ｋａ・ｃｏｓ（θ）｝……（１）
Ｓｂ＝Ｊｂ・｛１＋Ｋｂ・ｃｏｓ（θ＋π）｝……（２）
ただし、Ｊａ、Ｊｂは蛍光検出部２０の蛍光波長による感度係数および蛍光強度により決定される信号強度を表し、Ｋａ、Ｋｂは変調度（変調度１は１００％変調に対応する）を表す。
【００３３】
蛍光検出部２０において検出される蛍光ＥＭ１、蛍光ＥＭ２の強度信号の強度Ｓａ、Ｓｂは合成されて出力されるため、蛍光検出部２０の合成出力（検出信号）の値をＳとすると、Ｓは式（３）で表すことができる。
Ｓ＝Ｓａ＋Ｓｂ＝Ｊａ＋Ｊａ・Ｋａ・ｃｏｓ（θ）
＋Ｊｂ＋Ｊｂ・Ｋｂ・ｃｏｓ（θ＋π）……（３）
ｃｏｓ（θ＋π）＝−ｃｏｓ（θ）より、式（３）は式（４）となる。
Ｓ＝Ｊａ＋Ｊｂ＋（Ｊａ・Ｋａ−
Ｊｂ・Ｋｂ）・ｃｏｓ（θ）……（４）
式（４）において、（Ｊａ＋Ｊｂ）はＳの直流成分の大きさを表し、（Ｊａ・Ｋａ−
Ｊｂ・Ｋｂ）はＳの交流成分の振幅を表す。
このとき、（Ｊａ＋Ｊｂ）および（Ｊａ・Ｋａ−
Ｊｂ・Ｋｂ）はそれぞれ、ＡＤ変換回路５３およびＡＤ変換回路４３において生成される成分情報および振幅情報であるため、それぞれをα、βとおくと、α、βはそれぞれ式（５）、（６）で表すことができる。
Ｊａ＋Ｊｂ＝α……（５）
Ｊａ・Ｋａ−
Ｊｂ・Ｋｂ＝β……（６）
式（６）において、変調度Ｋａ、Ｋｂは既知であるため、式（５）、（６）は２変数の一次式であることから、式（５）、（６）の２変数の一次式を解くことにより、Ｊａ、Ｊｂを決定することができる。したがって、ＡＤ変換回路５３およびＡＤ変換回路４３においてそれぞれ成分情報αおよび振幅情報βを生成して強度信号算出部６０に出力することにより、強度信号算出部６０において、励起光ＥＸ１により発生する蛍光ＥＭ１の強度信号および励起光ＥＸ２により発生する蛍光ＥＭ２の強度信号を算出することができる。
【００３４】
[３つの励起光を用いる場合]
３つの励起光（励起光ＥＸ１、励起光ＥＸ２、励起光ＥＸ３）の発光波長をそれぞれλ１、λ２、λ３とし、励起光ＥＸ１、励起光ＥＸ２、励起光ＥＸ３を基準信号ｂと同一周波数かつ基準信号ｂに対してそれぞれ所定の位相差（例えば、励起光ＥＸ１との位相差を０、励起光ＥＸ２との位相差を２π／３、励起光ＥＸ３との位相差を４π／３とする）であって、互いに所定の位相差（例えば、励起光ＥＸ１に対する励起光ＥＸ２、励起光ＥＸ３の位相差をそれぞれ２π／３、４π／３とする）で強度変調すると、励起光ＥＸ１、励起光ＥＸ２、励起光ＥＸ３によりそれぞれ発生する蛍光ＥＭ１、蛍光ＥＭ２、蛍光ＥＭ３が蛍光検出部２０に入力される。蛍光検出部２０において電気信号に変換された後の蛍光ＥＭ１、蛍光ＥＭ２、蛍光ＥＭ３の強度信号の強度をそれぞれＳａ、Ｓｂ、Ｓｃとし、蛍光ＥＭ１、蛍光ＥＭ２、蛍光ＥＭ３は励起光の照射に対し位相遅れが無いものと仮定すると、Ｓａ、Ｓｂ、Ｓｃは、基準信号ｂに対してそれぞれ所定の位相差（蛍光ＥＭ１との位相差を０、蛍光ＥＭ２との位相差を２π／３、蛍光ＥＭ３との位相差を４π／３とする）を持ち、それぞれ、蛍光検出部２０の合成出力（検出信号）に対し０、２π／３、４π／３の位相差を持つ。また、合成出力（検出信号）は、基準信号ｂに対して所定の位相差（０、２π／３、４π／３のいずれか１つ）を持つ。すなわち、Ｓａ、Ｓｂ、Ｓｃはそれぞれ、式（７）、（８）、（９）で表すことができる。
Ｓａ＝Ｊａ・｛１＋Ｋａ・ｃｏｓ（θ）｝……（７）
Ｓｂ＝Ｊｂ・｛１＋Ｋｂ・ｃｏｓ（θ＋２π／３）｝……（８）
Ｓｃ＝Ｊｃ・｛１＋Ｋｃ・ｃｏｓ（θ＋４π／３）｝……（９）
ただし、Ｊａ、Ｊｂ、Ｊｃは蛍光検出部２７の蛍光波長による感度係数および蛍光強度により決定される信号強度を表し、Ｋａ、Ｋｂ、Ｋｃは変調度（変調度１は１００％変調に対応する）を表す。
【００３５】
蛍光検出部２０において検出される蛍光ＥＭ１、蛍光ＥＭ２、蛍光ＥＭ３の信号強度Ｓａ、Ｓｂ、Ｓｃは合成されて出力されるため、蛍光検出部２７の合成出力（検出信号）の値をＳとすると、Ｓは式（１０）で表すことができる。
Ｓ＝Ｓａ＋Ｓｂ＋Ｓｃ
＝Ｊａ・｛１＋Ｋａ・ｃｏｓ（θ）｝
＋Ｊｂ・｛１＋Ｋｂ・ｃｏｓ（θ＋２π／３）｝
＋Ｊｃ・｛１＋Ｋｃ・ｃｏｓ（θ＋４π／３）｝
＝Ｊａ＋Ｊｂ＋Ｊｃ
＋Ｊａ・Ｋａ・ｃｏｓ（θ）
＋Ｊｂ・Ｋｂ・ｃｏｓ（θ）・ｃｏｓ（２π／３）
−ｓｉｎ（θ）・ｓｉｎ（２π／３）
＋Ｊｃ・Ｋｃ・ｃｏｓ（θ）・ｃｏｓ（４π／３）
−ｓｉｎ（θ）・ｓｉｎ（４π／３）
＝Ｊａ＋Ｊｂ＋Ｊｃ
＋Ｊａ・Ｋａ・ｃｏｓ（θ）
＋Ｊｂ・Ｋｂ・｛−（１／２）ｃｏｓ（θ）
−（√３／２）ｓｉｎ（θ）｝
＋Ｊｃ・Ｋｃ・｛−（１／２）ｃｏｓ（θ）
−（−√３／２）ｓｉｎ（θ）｝
＝Ｊａ＋Ｊｂ＋Ｊｃ
＋｛Ｊａ・Ｋａ−（１／２）Ｊｂ・Ｋｂ
−（１／２）Ｊｃ・Ｋｃ｝・ｃｏｓ（θ）
−（√３／２）・（Ｊｂ・Ｋｂ−Ｊｃ・Ｋｃ）・ｓｉｎ（θ）
＝Ｊａ＋Ｊｂ＋Ｊｃ＋Ｊｐ・ｃｏｓ（θ＋δ）……（１０）
ここで、Ｊｐ、ｔａｎδは、それぞれ式（１１）、（１２）で表すことができる。
Ｊｐ＝√[｛Ｊａ・Ｋａ−（１／２）Ｊｂ・Ｋｂ−（１／２）Ｊｃ・Ｋｃ｝２        
＋｛（√３／２）・（Ｊｂ・Ｋｂ−Ｊｃ・Ｋｃ）｝２］……（１１）
ｔａｎδ＝｛（√３／２）・（Ｊｂ・Ｋｂ−Ｊｃ・Ｋｃ）／
｛Ｊａ・Ｋａ−（１／２）Ｊｂ・Ｋｂ−（１／２）Ｊｃ・Ｋｃ｝……（１２）
一方、蛍光検出部２０の合成出力（検出信号）Ｓは、単一周波数成分の信号を合成したものなので、式（１３）で表すことができる。
Ｓ＝Ａｃｏｓ（θ＋δ）＋Ｂ……（１３）
ここで、Ａ、Ｂは式（１４）、（１５）で表すことができる。
Ａ＝√[｛Ｊａ・Ｋａ−（１／２）Ｊｂ・Ｋｂ−（１／２）Ｊｃ・Ｋｃ｝２  
＋｛（√３／２）・（Ｊｂ・Ｋｂ−Ｊｃ・Ｋｃ）｝２］……（１４）
Ｂ＝Ｊａ＋Ｊｂ＋Ｊｃ……（１５）
式（１２）〜式（１５）において、変調度Ｋａ、Ｋｂ、Ｋｃは既知であり、Ａ、Ｂはそれぞれ、ＡＤ変換回路４３およびＡＤ変換回路４３において生成される振幅情報および成分情報であり、δは位相情報生成部３０において生成される位相情報であるため、ＡＤ変換回路５３、ＡＤ変換回路４３および位相情報生成部３０においてそれぞれ成分情報Ｂ、振幅情報Ａおよび位相情報βを生成して強度信号算出部６０に出力することにより、強度信号算出部６０において、蛍光ＥＭ１〜ＥＭ３の信号強度Ｊａ，Ｊｂ，Ｊｃを算出することができる。
【００３６】
[４つの励起光を用いる場合]
まず、４つのうちの２つの励起光ＥＸ１，ＥＸ２を試料ＳＰに照射して、蛍光ＥＭ１，ＥＭ２の信号強度Ｊａ，Ｊｂを、上述した「２つの励起光を用いる場合」の手法により算出する。次いで、４つのうちの残りの２つの励起光ＥＸ３，ＥＸ４を試料ＳＰに照射して、同様に「２つの励起光を用いる場合」の手法により、蛍光ＥＭ３，ＥＭ４の強度信号Ｊｃ，Ｊｄを算出する。これにより、４つの蛍光ＥＸ１〜ＥＸ４のそれぞれの強度信号Ｊａ〜Ｊｄを算出することができる。なお、この手法に代えて、次の方法により算出可能である。まず、４つのうちの３つの励起光ＥＸ１〜ＥＸ３を試料ＳＰに照射して、蛍光ＥＭ１〜ＥＭ３の信号強度Ｊａ，Ｊｂ，Ｊｃを、上述した「３つの励起光を用いる場合」の手法により算出する。次いで、４つのうちの残りの１つの励起光ＥＸ４を試料ＳＰに照射して、蛍光ＥＭ４の強度信号Ｊｄを算出してもよい。
【００３７】
[５つ以上の励起光を用いる場合]
上述した「２つの励起光を用いる場合」および「３つの励起光を用いる場合」を組み合わせて、２つの励起光ごとまたは３つの励起光ごとに蛍光の強度信号を算出すれば、５つ以上の励起光を用いた場合であっても、各励起光により発生する蛍光の強度信号をそれぞれ算出することができる。
【００３８】
以上説明したように、本実施形態の蛍光顕微鏡によれば、位相情報生成部３０による位相情報と、振幅情報生成部４０による振幅情報と、成分情報生成部５０による成分情報に基づいて、強度信号算出部６０が複数の蛍光ＥＭ１等のそれぞれの強度信号を算出するので、蛍光検出部２０で受光した複数の蛍光を容易に分離することができる。従って、蛍光ＥＭ１等ごとの画像を容易かつ確実に取得することができる。なお、強度信号算出部６０によって算出されたそれぞれの蛍光ＥＭ１等の強度信号は、強度信号算出部６０からパーソナルコンピュータ１０１に出力される。パーソナルコンピュータ１０１は、アプリケーションソフトウエア１０４を実行することにより、蛍光顕微鏡１によって取得されたそれぞれの蛍光ＥＭ１等の画像（二次元画像）を表示装置１０３に個別に表示させる。
【００３９】
図８は、励起光の励起スペクトル、及びこの励起光により発生する蛍光の蛍光スペクトルの一例を示す図である。図８において、ＹＦＰ（ＥＸ）は黄色蛍光タンパク質の励起スペクトルを示し、ＹＦＰ（ＥＭ）は黄色蛍光タンパク質の蛍光スペクトルを示し、ｅＧＦＰ（ＥＸ）は緑色蛍光タンパク質の励起スペクトルを示し、ｅＧＦＰ（ＥＭ）は緑色蛍光タンパク質の蛍光スペクトルを示している。なお、図８では、横軸は波長（ｎｍ）、縦軸は蛍光強度である。一般的に、蛍光スペクトルは励起スペクトルに対し高波長側にシフトする傾向がある。また、図８の２つの蛍光スペクトルは波長５００ｎｍ近傍で重複部分が生じている。従って、このような蛍光スペクトルになる２つの蛍光を、例えば従来技術のような、光学フィルタで分離して異なる検出器に導く方式の場合、それぞれの検出器に他の蛍光を取り込むことになり、各検出器の検出信号に誤差を多く含んだものとなる。
【００４０】
第１実施形態に係る蛍光顕微鏡１は、蛍光検出部２０によって複数の蛍光ＥＭ１等をまとめて受光し、その検出信号から計算式を用いてそれぞれの蛍光の強度信号Ｊａ等を算出するため、強度信号に含まれる誤差を小さくすることができる。また、第１実施形態の蛍光顕微鏡１によれば、１つの光検出器を用いているため、蛍光顕微鏡の製造コストを低減するとともに、蛍光顕微鏡の構成を簡略化することができる。また、第１実施形態の蛍光顕微鏡１によれば、複数の蛍光を光学的に分離するための高価な分光器を用いる必要がないので、低コストで蛍光顕微鏡を製造することができる。
【００４１】
＜第２実施形態＞
次に、第２実施形態について説明する。以下の説明において、第１実施形態と同一または同等の構成部分については同一符号を付けて、説明を省略または簡略化する。第１実施形態において、それぞれの蛍光ＥＭ１等の強度信号Ｊａ等を算出する基本原理を成立させるためには、複数の励起光ＥＸ１等を所定の位相差（例えば位相差π）で強度変調して試料ＳＰに照射したときに、複数の励起光により発生するそれぞれの蛍光ＥＭ１等が励起光ＥＸ１等と同様の位相差になることが前提となる。ところが、実際には、蛍光試薬と蛍光試薬が標識されている生物標本（細胞）に依存して、励起光を試料に照射してから蛍光が発生するまでには遅延が生じ、この遅延量は励起光ごとに異なる（励起光を試料に照射してから蛍光発光が生じるまでの時間に違いがある）。その結果、複数の励起光を所定の位相差で強度変調して試料に照射したとしても、これら励起光によって発生する蛍光は、励起光と異なる位相差となってしまう。さらに、光検出器２１やその後の信号伝達系が蛍光波長による感度差を有している場合も、検出信号に含まれている複数の蛍光の強度信号の位相差は、複数の励起光における位相差からずれた状態となっている。このような状態では、第１実施形態で説明したように、検出信号から複数の蛍光の強度信号を分離することが算出できない。
【００４２】
第２実施形態では、複数の励起光により発生するそれぞれの蛍光が、互いの位相差が所望の値であって、基準信号ｂに対する位相差が所望の値となるように、励起光変調部１０の位相差調整部１２において、複数の励起光の位相差を任意に調整するものである。これにより、第１実施形態で説明した基本原理を適用可能となり、それぞれの蛍光の信号強度が算出可能となる。
【００４３】
複数の励起光ＥＸ１等の位相差の調整は、図１に示す位相差調整部１２の記憶部１２ａに記憶された位相遅延量に基づいて行われる。記憶部１２ａに記憶された位相遅延量は、励起光ＥＸ１等の位相に対して、この励起光ＥＸ１等を照射したときに試薬から発生する蛍光の位相遅延量のデータが励起光ごとに格納される。ただし、格納されるデータは、これに限定されない。例えば、基準となる蛍光の位相に対して、それぞれの蛍光がどの程度位相が遅れるかといった位相遅延量のデータを用いてもよい。また、光検出器２１やその後の信号伝達系が蛍光波長による感度差を有している場合は、基準となる蛍光の位相に対して、それぞれの蛍光がどの程度位相が遅れるかといった位相遅延量のデータも記憶部１２ａに格納される。すなわち、特定の蛍光に対しては、蛍光発生に基づく位相遅延量と蛍光検出に基づく位相遅延量との双方が加算されて励起光の位相が調整される。
【００４４】
このような蛍光発生に基づく位相遅延量や蛍光検出に基づく位相遅延量は、既知の場合はそれぞれのデータを記憶部１２ａに格納することで特定の励起光に対しての位相調整が行われる。蛍光発生に基づく位相遅延量等が未知の場合は、次のようにして位相遅延量のデータを取得する。先ず、複数の励起光ＥＸ１〜ＥＸｎのうちの１つ（例えば励起光ＥＸ１）のみを出力して、蛍光検出部２０による検出信号と励起光ＥＸ１との位相差から位相遅延量を算出する。次に、励起光ＥＸ２のみを出力して、同様に蛍光検出部２０による検出信号と励起光ＥＸ２との位相差から位相遅延量を算出する。この作業を繰り返すことにより、励起光ＥＸ１〜ＥＸｎのそれぞれに関する位相遅延量が算出され、記憶部１２ａに格納される。このように算出された位相遅延量には、蛍光発生に基づく位相遅延量と蛍光検出に基づく位相遅延量とが合算されたデータとなっている。
【００４５】
このとき、励起光ＥＸ１等の波形の変動や、蛍光検出部２０による検出信号の波形の変動が生じると位相差の算出値が変動してデータ取得が難しいことも考えられる。このような場合は、蛍光検出部２０による検出信号と励起光ＥＸ１等との位相差を算出する際、所定範囲の信号を用いて両者の位相差を算出してもよい。所定範囲としては、検出信号や励起光を特定の時間範囲で切り取って比較する場合や、それぞれ数個分の波長を切り取って比較する場合などがある。これにより、位相差の算出を容易にして位相遅延量の精度を向上できる。また、励起光ＥＸ１等と検出信号との位相差が波長ごとに（時間の経過とともに）変動する場合があり、複数の波長をサンプリングしてそれぞれの位相差から平均位相差を求めてもよい。これにより、位相差変動の誤差が平均化されるので位相遅延量の精度を向上できる。
【００４６】
また、蛍光検出部２０による検出信号の出力が変動する場合がある。例えば微弱な信号を用いても正確な波形を捉えることが難しく、位相差の算出値に誤差を多く含んでしまう。従って。検出信号のうち、所定の信号強度を持った波形を用いて位相差を算出してもよい。所定の信号強度としては、例えば、他の蛍光を検出したときの平均の信号強度などが用いられる。
【００４７】
なお、励起光ＥＸ１等の位相差を調整するため、記憶部１２ａには位相遅延量のデータを格納しているが、これに代えて、位相差自体を補正量のデータとして用いてもよい。この場合、記憶部１２ａには、励起光ＥＸ１等ごとにπに関する補正量のデータが格納される。なお、補正量のデータが未知の場合は、位相遅延量のデータと同様に上述の方法により取得される。
【００４８】
また、補正量としては、励起光によって発生する蛍光に対する補正量としてもよい。そのような補正量が記憶部１２ａに格納されている場合、励起光変調部１０の位相差調整部１２では、各励起光ＥＸ１等の位相を次のように調整して所定の位相差を実現する。先ず、複数の光源を第１光源から第ｎ光源とするとき、基準信号ｂの位相を基準として、第１光源Ｌ１からの励起光ＥＸ１の位相を（０＋δ１）とし、第２光源Ｌ２からの励起光ＥＸ２の位相を（２π／Ｎ＋δ２）とし、第３光源Ｌ３からの励起光ＥＸ３の位相を（４π／Ｎ＋δ１）とし、以下同様にして、第ｎ光源Ｌｎからの励起光ＥＸｎの位相を｛（ｎ−１）・２π／Ｎ＋δｎ｝とする。ただし、δ１、δ２、・・、δｎは光源Ｌ１，Ｌ２，Ｌ３，・・，Ｌｎの波長に対応した蛍光試薬からの蛍光信号の位相遅延に関する補正量であり、Ｎは、光源Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、・・・、Ｌｎの総数である。
【００４９】
このように調整された励起光ＥＸ１〜ＥＸｎを試料ＳＰに照射すると、蛍光検出部２０による検出信号における各蛍光ＥＭ１〜ＥＭｎの位相は次のようになる。２つの光源Ｌ１、Ｌ２を用いる場合、基準信号ｂの位相を基準として、第１光源Ｌ１からの励起光ＥＸ１により発生した蛍光ＥＭ１の位相は、補正量δ１によって補正されて０となり、第２光源Ｌ２からの励起光ＥＸ２により発生した蛍光ＥＭ２の位相は、補正量δ２によって補正されて２π／２＝πとなり、蛍光ＥＭ１と蛍光ＥＭ２との位相差はπとなる。また、３つの光源Ｌ１〜Ｌ３を用いる場合、基準信号ｂの位相を基準として、第１光源Ｌ１からの励起光ＥＸ１により発生した蛍光ＥＭ１の位相は、補正量δ１によって補正されて０となり、第２光源Ｌ２からの励起光ＥＸ２により発生した蛍光ＥＭ２の位相は補正量δ２によって補正されて２π／３となり、第３光源Ｌ３からの励起光ＥＸ３により発生した蛍光ＥＭ３の位相は補正量δ３によって補正されて４π／３となる。
【００５０】
また、４つの光源Ｌ１〜Ｌ４を用いる場合、基準信号ｂの位相を基準として、第１光源Ｌ１からの励起光ＥＸ１により発生した蛍光ＥＭ１の位相は、補正量δ１によって補正されて０となり、第２光源Ｌ２からの励起光ＥＸ２により発生した蛍光ＥＭ２の位相は補正量δ２によって補正されて２π／４＝π／２となり、第３光源Ｌ３からの励起光ＥＸ３により発生した蛍光ＥＭ３の位相は補正量δ３によって補正されて４π／４＝π／となり、第４光源Ｌ４からの励起光ＥＸ４により発生した蛍光ＥＭ４の位相は補正量δ４によって補正されて６π／４＝３π／２となるため、基準信号ｂに対する蛍光ＥＭ１，蛍光ＥＭ２，ＥＭ３，ＥＭ４の位相差は０、π／２、π、３π／２となる。このように、複数の励起光に補正量が加えられることにより、試料ＳＰから発生する蛍光信号の位相遅延が解消される。従って、複数（Ｎ個）の蛍光の位相差は２π／Ｎとなるから、強度信号算出部６０において蛍光の強度信号を容易に算出できる。
【００５１】
図９は、複数の励起光ＥＸ１，ＥＸ２，・・・，ＥＸｎの基準信号ｂに対する位相差を、強度信号算出部６０にて生成された位相補正信号ａ（位相補正信号ａは光源毎に異なる値となるため、図９中では、光源別にａ１，ａ２，・・・，ａｎと分けて記述している）に基づいて、微調整制御する振幅変調器の一例を示す図である。振幅変調器１４０は、例えば図１に示す蛍光顕微鏡１の励起光変調部１０の位相差調整部１２に含まれて構成されている。図９に示す振幅変調器１４０は、基準信号ｂを異なる出力比率で分配する信号分配器１４２−１，１４２−２，・・・，１４２−ｎと、９０°位相回路１４３−１，１４３−２，・・・，１４３−ｎと加算器１４４−１，１４４−２，・・・，１４４−ｎと、可変ゲインアンプ１４５−１，１４５−２，・・・，１４５−ｎと、位相差微調整信号生成部１４１−１，１４１−２，・・・，１４１−ｎとを備える。
【００５２】
光源が２つの場合について説明する。振幅変調器１４０は、位相差調整部１２内の固定位相回路１４０−１、１４０−２において、基準信号ｂに対する設定値（位相差０、π）と位相遅延に関する補正量（δ１、δ２）に基づいて、所定の位相差を付与して作成された信号ｂ１（基準信号ｂに対する位相差０＋δ１）、信号ｂ２（基準信号ｂに対する位相差π＋δ２）が入力される。
信号ｂ１は、位相補正信号ａ１に基づいて位相差微調整信号生成部１４１−１から出力される信号によって、信号分配器１４２−１において、所定の振幅比で分配され、９０°位相回路１４３−１，加算器１４４−１に入力される。
信号ｂ２は、位相補正信号ａ２に基づいて位相差微調整信号生成部１４１−２から出力される信号によって、信号分配器１４２−２において、所定の振幅比で分配され、９０°位相回路１４３−２、加算器１４４−２に入力される。
加算器１４４−１は、信号ｂ１と同相の信号と、９０°位相回路１４３−１を経由した信号を加算するため、９０°位相回路を経由した信号と位相回路を経由しない信号の強度比率に応じて、出力位相が、信号ｂ１から更に微調整された位相の信号ｃ１となる。
同様に、加算器１４４−２は、信号ｂ２と同相の信号と、９０°位相回路１４３−２を経由した信号を加算するため、９０°位相回路を経由した信号と位相回路を経由しない信号の強度比率に応じて、出力位相が、信号ｂ２から更に微調整された位相の信号ｃ２となる。信号ｃ１、ｃ２は具体的には、前述した励起光の強度変調信号である。
可変ゲインアンプ１４５−１，１４５−２は、最終出力を所定の値に調整するためのものであり、位相差微調整信号生成部１４１−１，１４１−２からの出力に基づいて制御される。
【００５３】
光源が３つ以上の場合も、光源が２つの場合と同様である。なお、以下の説明では光源がｎ個の場合としているが、ｎ個は２個も含む意味で用いている。
光源がｎ個の場合について説明する。光源ごとに位相補正信号ａ１〜ａｎが強度信号算出部６０にて生成される。振幅変調器１４０は、固定位相回路１４０−１〜１４０−ｎにおいて、基準信号ｂに対する設定値（位相差）と位相遅延に関する補正量に基づいて、所定の位相差を付与して作成された信号ｂ１〜ｂｎが入力される。例えば、光源が３つの場合、基準信号ｂに対する設定値（位相差０、２π／３、４π／３）と位相遅延に関する補正量（δ１、δ２、δ３）に基づいて、基準信号ｂに対して位相差０＋δ１とした信号ｂ１、基準信号ｂに対して位相差２π／３＋δ２とした信号ｂ２、及び基準信号ｂに対して位相差４π／３＋δ３とした信号ｂ３が入力される。
信号ｂ１〜ｂｎは、位相補正信号ａ１〜ａｎに基づいて位相差微調整信号生成部１４１−１〜１４１−ｎから出力される信号によって、信号分配器１４２−１〜１４２−ｎにおいて、所定の振幅比で分配され、９０°位相回路１４３−１〜１４３−ｎ、加算器１４４−１〜１４４−ｎにそれぞれ入力される。加算器１４４−１〜１４４−ｎは、信号ｂ１〜ｂｎと同相の信号と、９０°位相回路１４３−１〜１４３−ｎを経由した信号をそれぞれの強度比率に応じて加算する。従って、それぞれの出力位相は、信号ｂ１〜ｂｎから更に微調整された位相の強度変調信号ｃ１〜ｃｎとなる。
可変ゲインアンプ１４５−１〜１４５−ｎは、最終出力を所定の値に調整するためのものであり、位相差微調整信号生成部１４１−１〜１４１−ｎからの出力に基づいて制御される。
なお、９０°位相回路１４３−１〜１４３−ｎは便宜上９０°としたが、０、１８０°の倍数、これら以外の任意の位相のものが使用できる。
【００５４】
＜第３実施形態＞
次に、第３実施形態について説明する。以下の説明において、上述の実施形態と同一または同等の構成部分については同一符号を付けて、説明を省略または簡略化する。第３実施形態では、図１に示すように、強度信号算出部６０に備える照射制御部６０ａからの指示に基づいて、位相差調整部１２は、複数の光源Ｌ１に対して基準信号ｂの周波数と同一周波数かつ基準信号ｂの位相と同一位相で励起光ＥＸ１〜ＥＸｎの全てを試料ＳＰに照射する第１照射状態と、励起光ＥＸ１〜ＥＸｎのうち少なくとも一つを除いて照射する第２照射状態とを行う。蛍光検出部２０は、第１照射状態および第２照射状態での励起光ＥＸ１等により発生した蛍光ＥＭ１等をそれぞれ検出し、第１照射状態で検出した第１検出信号と、第２照射状態で検出した第２検出信号とを出力する。これら第１検出信号及び第２検出信号に基づいて、強度信号算出部６０は、特定の蛍光の強度信号を算出する。
【００５５】
例えば、３つの励起光ＥＸ１，ＥＸ２，ＥＸ３を用いる場合、第１照射状態として全ての励起光ＥＸ１〜ＥＸ３を試料ＳＰに照射したときの蛍光検出部２０の合成出力（第１検出信号）をＳとし、蛍光ＥＭ１，ＥＭ２，ＥＭ３の信号成分をＳ１，Ｓ２，Ｓ３とすると、Ｓ＝Ｓ１＋Ｓ２＋Ｓ３で表される。一方、第２照射状態として、励起光ＥＸ１を除外して励起光ＥＸ２，ＥＸ３を試料ＳＰに照射したときの蛍光検出部２０の合成出力（第２検出信号）をＳ（２，３）とすると、Ｓ（２，３）＝Ｓ２＋Ｓ３であるため、Ｓ１＝Ｓ−Ｓ（２，３）の演算を行うことにより、蛍光ＥＭ１の信号成分Ｓ１が算出される。
【００５６】
また、第２照射状態として励起光ＥＸ２を除外して励起光ＥＸ１，ＥＸ３を試料ＳＰに照射したときの蛍光検出部２０の合成出力（第２検出信号）をＳ（１，３）とすると、Ｓ（１，３）＝Ｓ１＋Ｓ３であるため、Ｓ２＝Ｓ−Ｓ（１，３）の演算を行うことにより、蛍光ＥＭ２の信号成分Ｓ２が算出される。同様に、第２照射状態として励起光ＥＸ１，ＥＸ２を試料ＳＰに照射したときの合成出力（第２検出信号）Ｓ（１，２）から、Ｓ３＝Ｓ−Ｓ（１，２）の演算により、蛍光ＥＭ３の信号成分Ｓ３が算出される。なお、第２照射状態として、１つの励起光を除外することに代えて、複数の励起光（励起光ＥＸ１及びＥＸ２）を除外して照射してもよい。このように、第１及び第２検出信号に基づいて演算を行うことにより、特定の蛍光の強度信号を容易に算出でき、蛍光検出部２０で受光した複数の蛍光を分離することができる。
【００５７】
＜蛍光受光ユニット＞
次に、実施形態に係る蛍光受光ユニットについて説明する。以下の説明において、上述の実施形態と同一または同等の構成部分については同一符号を付けて、説明を省略または簡略化する。図１０に示すように、蛍光受光ユニット２００は、蛍光検出部２０と、位相情報生成部３０と、振幅情報生成部４０と、成分情報生成部５０と、強度信号算出部６０とを備える。この蛍光受光ユニット２００は、蛍光検出部２０等を単一または複数の筐体に収容したものであり、蛍光顕微鏡を構成する光学系１１０や光源ユニット（光源７０及び励起光変調部１０）から分離可能なユニットである。なお、蛍光検出部２０は、光学系１１０の蛍光受光部分（図２参照）に配置できるように、ユニットの筐体から取り外し可能とすることができる。
【００５８】
また、蛍光受光ユニット２００は、励起光変調部１０から送られる基準信号ｂを蛍光検出部２０へ入力するための入力部や、同じく基準信号ｂを位相情報生成部３０へ入力するための入力部、さらには強度信号算出部６０から励起光変調部１０へ位相補正信号ａを出力するための出力部を備えている。なお、強度信号算出部６０は、外部のパーソナルコンピュータ１０１に接続するための接続端子等を備える点は、第１実施形態の蛍光顕微鏡１と同様である。
【００５９】
なお、この蛍光受光ユニット２００において、複数の蛍光ＥＭ１等を蛍光検出部２０により検出し、蛍光ＥＭ１等ごとの強度信号を算出する手順は、上述した第１〜第３実施形態と同様である。また、蛍光受光ユニットとして、励起光変調部１０及び光源７０の一方または双方を備えてもよい。このように、本実施形態に係る蛍光受光ユニット２００によれば、複数の蛍光ＥＭ１等を蛍光ごとの信号強度に容易に分離することができる。さらに、蛍光受光ユニット２００は、既存の蛍光顕微鏡に対して、蛍光検出部２０を光学系に配置するとともに、光源ユニットを制御することで容易に利用可能となり、汎用性の高めることができる。
【００６０】
以上の実施形態は、上述した説明に限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲において種々の変更が可能である。また、上述した実施形態では、励起光変調部１０により試料に照射する複数の励起光として正弦波の励起光ＥＸ１等を例示したが、これに限定されるものではなく、矩形波など他の波形の励起光を用いてもよい。
【符号の説明】
【００６１】
ＥＭ１，ＥＭ２〜ＥＭｎ…蛍光、ＥＸ１，ＥＸ２〜ＥＸｎ…励起光、Ｌ１，Ｌ２〜Ｌｎ…光源、ＳＰ…試料、１…蛍光顕微鏡、１０…励起光変調部、１２…位相差調整部、１２ａ…記憶部、２０…蛍光検出部、３０…位相情報生成部、４０…振幅情報生成部、５０…成分情報生成部、６０…強度信号算出部、６０ａ…照射制御部、２００…蛍光検出ユニット
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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