(57)【要約】      （修正有）【課題】Ｔヘルパー１７細胞（以下、Ｔｈ１７細胞と略称する）を抑制することにより、Ｔｈ１７細胞が関与する疾患の発症または症状の防止または治療を可能にする、副作用の少ない薬剤および方法の提供。【解決手段】ＡＴリッチインターラクティブドメイン５Ａ（ＡＴ  Ｒｉｃｈ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ  Ｄｏｍａｉｎ  ５Ａ、以下ＡＲＩＤ５Ａと略称する）またはＡＲＩＤ５Ａをコードする発現可能な核酸の、下記ａ）〜ｃ）からなる群より選択されるいずれか１の薬剤または組成物の製造における使用：ａ）Ｔｈ１７細胞分化抑制剤ｂ）インターロイキン−１７産生抑制剤、およびｃ）自己免疫疾患の治療用組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡＴリッチ  インターラクティブ  ドメイン５Ａ（ＡＴ  Ｒｉｃｈ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ  Ｄｏｍａｉｎ  ５Ａ、以下ＡＲＩＤ５Ａと略称する）またはＡＲＩＤ５Ａをコードする核酸の、下記ａ）〜ｃ）からなる群より選択されるいずれか１の薬剤または組成物の製造における使用：
ａ）Ｔヘルパー１７細胞（以下、Ｔｈ１７細胞と略称する）分化の抑制剤
ｂ）インターロイキン−１７（以下、ＩＬ−１７と略称する）産生の抑制剤、および
ｃ）自己免疫疾患の治療用組成物。
【請求項２】
前記核酸がベクターに担持されている核酸である、請求項１に記載のＡＲＩＤ５ＡまたはＡＲＩＤ５Ａをコードする核酸の使用。
【請求項３】
前記ＡＲＩＤ５Ａまたは前記核酸がそれぞれ配列番号２に記載の配列で表される蛋白質または配列番号１に記載の配列で表される核酸である、請求項１に記載のＡＲＩＤ５ＡまたはＡＲＩＤ５Ａをコードする核酸の使用。
【請求項４】
前記ＩＬ−１７がＩＬ−１７ＡおよびＩＬ−１７Ｆである、請求項１に記載のＡＲＩＤ５ＡまたはＡＲＩＤ５Ａをコードする核酸の使用。
【請求項５】
前記自己免疫疾患が関節リウマチである、請求項１に記載のＡＲＩＤ５ＡまたはＡＲＩＤ５Ａをコードする核酸の使用。
【請求項６】
ＡＲＩＤ５ＡまたはＡＲＩＤ５Ａをコードする核酸を含むＴｈ１７細胞分化抑制剤。
【請求項７】
ＡＲＩＤ５ＡまたはＡＲＩＤ５Ａをコードする核酸を含むＩＬ−１７産生抑制剤。
【請求項８】
ＡＲＩＤ５ＡまたはＡＲＩＤ５Ａをコードする核酸、および医薬担体を含む自己免疫疾患治療用組成物。
【請求項９】
ＡＲＩＤ５ＡまたはＡＲＩＤ５Ａをコードする核酸の、下記１）〜３）からなる群より選択されるいずれか１の用途における使用：
１）Ｔｈ１７細胞分化の抑制
２）ＩＬ−１７産生の抑制、および
３）自己免疫疾患の治療用組成物の製造。
【請求項１０】
前記核酸がベクターに担持されている核酸である、請求項９に記載のＡＲＩＤ５ＡまたはＡＲＩＤ５Ａをコードする核酸の使用。
【請求項１１】
前記ＡＲＩＤ５Ａまたは前記核酸がそれぞれ配列番号２に記載の配列で表される蛋白質または配列番号１に記載の配列で表される核酸である、請求項９に記載のＡＲＩＤ５ＡまたはＡＲＩＤ５Ａをコードする核酸の使用。
【請求項１２】
前記ＩＬ−１７がＩＬ−１７ＡおよびＩＬ−１７Ｆである、請求項９に記載のＡＲＩＤ５ＡまたはＡＲＩＤ５Ａをコードする核酸の使用。
【請求項１３】
前記自己免疫疾患が関節リウマチである、請求項９に記載のＡＲＩＤ５ＡまたはＡＲＩＤ５Ａをコードする核酸の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｔヘルパー１７細胞（以下、Ｔｈ１７細胞と略称することがある）分化抑制剤、インターロイキン−１７（以下、Ｉｌ−１７と略称することがある）産生抑制剤、および自己免疫疾患の治療用組成物に関する。より詳しくは本発明は、ＡＴリッチ  インターラクティブ  ドメイン５Ａ（ＡＴ  Ｒｉｃｈ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ  Ｄｏｍａｉｎ  ５Ａ、以下ＡＲＩＤ５Ａと略称する）またはＡＲＩＤ５Ａをコードする核酸の、Ｔｈ１７細胞分化抑制剤、インターロイキン−１７産生抑制剤、および自己免疫疾患の治療用組成物の製造における使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｔｈ１７細胞は、ヘルパーＴ細胞（以下、Ｔｈと略称することがある）サブセットの１つであり、ＩＬ−１７のファミリー分子であるＩＬ−１７ＡやＩＬ−１７Ｆ、ＩＬ−２１、およびＩＬ−２２等のサイトカインを産生し、ＲＯＲγｔと呼ばれる転写因子を発現する。ＲＯＲγｔはＴｈ１７細胞分化の支配的調節因子（ｍａｓｔｅｒ  ｒｅｇｕｌｔｏｒ）と考えられている。
【０００３】
Ｔｈ１７細胞の分化は、ＩＬ−６およびトランスフォーミング増殖因子−β１（以下、ＴＧＦ−β１と略称する）によりナイーブＣＤ４陽性Ｔ細胞から誘導され、ＩＬ−２３がその生存に関与している。ＩＬ−６はナイーブＣＤ４陽性Ｔ細胞でＳＴＡＴ３を活性化し、その結果、ナイーブＣＤ４陽性Ｔ細胞からのＴｈ１７細胞の分化に重要なＲＯＲγｔの発現を誘導する。一方、インターフェロン−γ（以下、ＩＦＮ−γと略称する）やＩＬ−４はＴｈ１７細胞分化に阻害的である。
【０００４】
ＩＬ−１７は炎症性サイトカインとして知られており、線維芽細胞や上皮細胞、血管内皮細胞、マクロファージ等種々の細胞に作用して、炎症性サイトカインやケモカイン、細胞接着因子等の種々の因子を誘導して炎症を誘導する。Ｔｈ１７細胞は、アレルギー応答や自己免疫、細胞外増殖性の細菌感染防御等で中心的な役割を果たしており、関節リウマチや硬化症等の自己免疫疾患、炎症性疾患、喘息、腸疾患等の様々な疾患に関与していることが明らかになってきている。
【０００５】
ＲＯＲγｔは、核内受容体であり、Ｔｈ１７細胞分化に不可欠な因子である。そのリガンドは不明であり、ゆえにオーファン受容体と認識されている。最近、２つのグループがＲＯＲγｔの阻害剤を見出だし、該阻害剤がＴｈ１７細胞分化を抑制すること、およびマウスの実験的脳脊髄炎の重症度を低下させたことを報告している。具体的には、ソルト（Ｓｏｌｔ  Ｌ．Ａ）らは、ＳＲ１００１と命名された合成リガンドがＲＯＲγｔとＲＯＲαのインバースアゴニストとして機能することを報告し、インビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）でＴｈ１７細胞分化を防止し、マウスの実験的脳脊髄炎を抑制することを示している（非特許文献１）。また、ホ（Ｈｕｈ  Ｊ．Ｒ．）らは、昆虫細胞を使ったレポーター系での化合物スクリーニングによって、強心配糖体のジゴキシンとそのさまざまな誘導体がＲＯＲγｔの転写活性を阻害することを明らかにし、そして、これらの化合物が、ＲＯＲγｔの転写活性阻害という機構を介して、マウスでＴｈ１７細胞分化を抑制し、マウスの実験的脳脊髄炎を抑制すること、またインビトロでヒトＴ細胞でのＩＬ−１７産生を阻害することを明らかにした（非特許文献２）。しかし、ＲＯＲγｔ誘導性のＩＬ−１７Ａ産生を抑制する内在性分子は同定されていない。
【０００６】
関節リウマチは関節滑膜の炎症により関節破壊と機能障害がおこる自己免疫疾患である。関節リウマチの病態にＴｈ１７細胞が深く関与していることが報告されている。一方、ＩＬ−６を標的とした抗ＩＬ−６受容体抗体（トシリズマブ）の関節リウマチに対する有効性が明らかとなり、関節リウマチの病態にＩＬ−６が関与することが明らかとなったが、トシリズマブの作用機序の詳細は依然不明である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００８−１１５１６９号公報。
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】ソルト（Ｓｏｌｔ  Ｌ．Ａ．）ら、「ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）」、２０１１年、第４７２巻、ｐ．４９１−４９６。
【非特許文献２】ホ（Ｈｕｈ  Ｊ．Ｒ．） ら、「ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）」、２０１１年、第４７２巻、ｐ．４８６−４９０。
【非特許文献３】ジョージェスク（Ｇｅｏｒｇｅｓｃｕ  Ｓ．Ｐ．）ら、「モレキュラー  エンドクリノロジー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ）」、２００５年、第１９巻、ｐ．２４９１−２５０１。
【非特許文献４】アマノ（Ａｍａｎｏ  Ｋ．）ら、「モレキュラー  バイオロジー  オブ  ザ  セル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ）」、２０１１年、第２２巻、ｐ．１３００。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
Ｔｈ１７細胞は、関節リウマチ等の自己免疫疾患、炎症性疾患、喘息、および腸疾患等の様々な疾患に関与することが知られており、該細胞の分化を抑制する化合物はこれら疾患の治療に効果を有すると期待できる。しかしながら、ＲＯＲγｔの機能抑制によりＴｈ１７細胞分化を抑制する化合物であるＳＲ１００１やジゴキシンは、合成化合物であるため非生理的であり、また循環器系等への副作用も懸念される。さらに、これら化合物はＩＬ−１７ＡのみならずＩＬ−２１およびＩＬ−２２の産生も抑制するため、ＩＬ−２１によるＴ細胞依存的な抗体産生誘導やＩＬ−２２による粘膜免疫防御等の生体防御に必須な機能の阻害による副作用も懸念され、臨床応用は困難と推測される。
【００１０】
本発明は、Ｔｈ１７細胞を抑制することにより、Ｔｈ１７細胞が関与する疾患の発症または症状の防止または治療を可能にする、副作用の少ない薬剤および方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、Ｔｈ１７細胞が関与することが報告されている関節リウマチに対して抗ＩＬ−６受容体抗体（トシリズマブ）の有効性が報告されていることに着目し、トシリズマブが著効した関節リウマチ症例においてトシリズマブの投与前後でＣＤ４陽性Ｔ細胞における遺伝子発現を網羅的に解析した。そして、トシリズマブ投与後に発現が有意に低下する遺伝子としてＡＲＩＤ５Ａを見出し、ＡＲＩＤ５Ａの発現がＴｈ１７細胞で亢進していること、ＡＲＩＤ５Ａの発現誘導はＳｔａｔ３依存的なこと、ＡＲＩＤ５ＡはＲＯＲγｔ誘導性ＩＬ−１７Ａ産生を抑制すること、ＡＲＩＤ５ＡはＩＬ−２１産生や制御性Ｔ（Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ、以下Ｔｒｅｇと略称することがある）細胞の分化は抑制しないこと、およびＡＲＩＤ５ＡはＲＯＲγｔに直接結合することを見出した。そしてこれら知見により、本発明を完成するに至った。
【００１２】
すなわち、本発明は、ＡＲＩＤ５ＡまたはＡＲＩＤ５Ａをコードする核酸の、下記ａ）〜ｃ）からなる群より選択されるいずれか１の薬剤または組成物の製造における使用に関する：
ａ）Ｔｈ１７細胞分化の抑制剤、
ｂ）ＩＬ−１７産生の抑制剤、および
ｃ）自己免疫疾患の治療用組成物。
【００１３】
また本発明は、ＡＲＩＤ５ＡまたはＡＲＩＤ５Ａをコードする核酸の、下記１）〜３）からなる群より選択されるいずれか１の用途における使用に関する：
１）Ｔｈ１７細胞分化の抑制、
２）ＩＬ−１７産生の抑制、および
３）自己免疫疾患の治療用組成物の製造。
【００１４】
さらに本発明は、前記核酸がベクターに担持されている核酸である、ＡＲＩＤ５ＡまたはＡＲＩＤ５Ａをコードする核酸の前記使用に関する。
【００１５】
さらにまた本発明は、前記ＡＲＩＤ５Ａまたは前記核酸がそれぞれ配列番号２に記載の配列で表される蛋白質または配列番号１に記載の配列で表される核酸である、ＡＲＩＤ５ＡまたはＡＲＩＤ５Ａをコードする核酸の前記使用に関する。
【００１６】
また本発明は、前記ＩＬ−１７がＩＬ−１７ＡおよびＩＬ−１７Ｆである、ＡＲＩＤ５ＡまたはＡＲＩＤ５Ａをコードする核酸の前記使用に関する。
【００１７】
さらに本発明は、前記自己免疫疾患が関節リウマチである、ＡＲＩＤ５ＡまたはＡＲＩＤ５Ａをコードする核酸の前記使用に関する。
【００１８】
さらにまた本発明は、ＡＲＩＤ５ＡまたはＡＲＩＤ５Ａをコードする核酸を含むＴｈ１７細胞分化抑制剤に関する。
【００１９】
また本発明は、ＡＲＩＤ５ＡまたはＡＲＩＤ５Ａをコードする核酸を含むＩＬ−１７産生抑制剤に関する。
【００２０】
さらに本発明は、ＡＲＩＤ５ＡまたはＡＲＩＤ５Ａをコードする核酸、および医薬担体を含む自己免疫疾患治療用組成物に関する。
【発明の効果】
【００２１】
本発明は、ＡＲＩＤ５ＡまたはＡＲＩＤ５Ａをコードする核酸の、下記ａ）〜ｃ）からなる群より選択されるいずれか１の薬剤または組成物の製造における使用に関する：
ａ）Ｔｈ１７細胞分化の抑制剤
ｂ）ＩＬ−１７産生の抑制剤、および
ｃ）自己免疫疾患の治療用組成物を提供できる。
【００２２】
本発明によれば、ＡＲＩＤ５ＡまたはＡＲＩＤ５Ａをコードする核酸の使用により、下記１）〜３）からなる群より選択されるいずれか１を実施することができる：
１）Ｔｈ１７細胞分化の抑制
２）ＩＬ−１７産生の抑制、および
３）自己免疫疾患の治療用組成物の製造。
【００２３】
また本発明により、ＡＲＩＤ５ＡまたはＡＲＩＤ５Ａをコードする核酸を含む、Ｔｈ１７細胞分化抑制剤およびＩＬ−１７産生抑制剤を提供することができる。さらに本発明により、ＡＲＩＤ５ＡまたはＡＲＩＤ５Ａをコードする核酸、および医薬担体を含む自己免疫疾患治療用組成物を提供することができる。
【００２４】
ＡＲＩＤ５Ａは、核内受容体であるＲＯＲγｔに直接結合して、Ｔｈ１７細胞分化を抑制し、それによりＩＬ−１７産生を抑制する。また、ＡＲＩＤ５Ａは、Ｔｈ１７細胞によるＩＬ−１７産生を抑制するが、ＩＬ−２１等のその他のサイトカインの産生や制御性Ｔ細胞の分化を抑制しないことから、Ｔ細胞依存的な抗体産生誘導や粘膜免疫防御等の生体防御に必須な機能を阻害することはなく、ゆえに副作用の少ない薬剤と考えることができる。
【００２５】
このように本発明により、Ｔｈ１７細胞が関与する疾患の発症または症状の防止または治療を可能にする、副作用の少ない薬剤および方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】ＡＲＩＤ５Ａの発現がＴｈ１７細胞分化誘導条件下で誘導されたことを示す図である。縦軸は相対発現量を示す。（実施例２）
【図２】ＡＲＩＤ５Ａの発現誘導はＳｔａｔ３欠損Ｔ細胞では認められなかったことを示す図である。縦軸は相対発現量を示す。（実施例３）
【図３】レトロウイルスによる緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）発現プラスミドｐＭＸ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰにＡＲＩＤ５Ａ遺伝子を組み込んだベクターｐＭＸ−ＡＲＩＤ５Ａ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰのプラスミドマップの模式図である。（実施例４）
【図４】ＡＲＩＤ５Ａの強制発現により、Ｔｈ１７細胞分化誘導条件下でＩＬ−１７Ａ産生が抑制されたが、一方ＩＬ−２１産生はむしろ増強されたことを示す図である。（実施例４）
【図５】ＡＲＩＤ５Ａの強制発現はＴｒｅｇ細胞の分化に影響しなかったことを示す図である。（実施例５）
【図６】ＲＯＲγｔ発現用ウイルスベクターであって、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）レトロウイルスベクターにＲＯＲγｔ遺伝子とＴｈｙ１．１遺伝子とを組み込んだベクターＭＳＣＶ−ｍｙｃ  ＲＯＲγｔ−ＩＲＥＳ−Ｔｈｙ１．１のプラスミドマップの模式図である。（実施例６）
【図７】ＡＲＩＤ５Ａの強制発現により、ＲＯＲγｔ強制発現によるＩＬ−１７Ａ産生増強は抑制されたが、ＲＯＲγｔ強制発現によるＩＬ−２１産生増強は抑制されなかったことを示す図である。（実施例６）
【図８】ＡＲＩＤ５Ａに標識タグであるＦｌａｇを付加したコンストラクトを組み込んだ発現ベクターｐｃＤＮＡ３−Ｆｌａｇ  ＡＲＩＤ５Ａの模式図である。（実施例７）
【図９】ＡＲＩＤ５ＡがＲＯＲγｔと直接結合したことを示す図である。当該結合は、Ｆｌａｇ−ＡＲＩＤ５Ａとｍｙｃ−ＲＯＲγｔとを発現させた細胞を用い、抗Ｆｌａｇ抗体（図中α−Ｆｌａｇと記載）による免疫沈降（図中ＩＰと記載）後、抗ｍｙｃ抗体（図中α−ｍｙｃと記載）によるウエスタンブロッティング（図中ＷＢと記載）を行って検出した。（実施例７）
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本発明の一つの実施形態について詳細に説明するとすれば、以下のとおりである。なお、本発明はこれに限られたものではない。
【００２８】
本発明は、ＡＲＩＤ５ＡまたはＡＲＩＤ５Ａをコードする核酸の、下記ａ）〜ｃ）からなる群より選択されるいずれか１の薬剤または組成物の製造における使用に関する：
ａ）Ｔｈ１７細胞分化の抑制剤、
ｂ）ＩＬ−１７産生の抑制剤、および
ｃ）自己免疫疾患の治療用組成物。
【００２９】
本発明はまた、ＡＲＩＤ５ＡまたはＡＲＩＤ５Ａをコードする核酸の、下記１）〜３）からなる群より選択されるいずれか１の用途における使用に関する：
１）Ｔｈ１７細胞分化の抑制、
２）ＩＬ−１７産生の抑制、および
３）自己免疫疾患の治療用組成物の製造。
【００３０】
本発明により、ＡＲＩＤ５ＡまたはＡＲＩＤ５Ａをコードする核酸を含む、Ｔｈ１７細胞分化抑制剤およびＩＬ−１７産生抑制剤を提供することができる。また本発明により、ＡＲＩＤ５ＡまたはＡＲＩＤ５Ａをコードする核酸、および医薬担体を含む自己免疫疾患治療用組成物を提供することができる。
【００３１】
ＡＲＩＤ５Ａは、核内受容体であるＲＯＲγｔに直接結合し、細胞のＩＬ−１７Ａ産生を抑制することを、本発明において初めて明らかにした生体内分子である。ＡＲＩＤ５ＡはＴｈ１７細胞で発現が亢進しており、その発現誘導はＳｔａｔ３依存的である。ＡＲＩＤ５は、ＡＴリッチ  インターラクティブ  ドメインを有するＤＮＡ結合蛋白質であり、ヒトおよびマウスにおいて血球系細胞に高発現していることが知られている。今までに、ヒトＡＲＩＤ５Ａがエストロゲン受容体と結合し、その活性を抑制することが報告されている（非特許文献３）。また、マウスにおいてＡＲＩＤ５Ａが軟骨細胞特異的な遺伝子発現を誘導することが報告されている（非特許文献４）。しかしながら、ＡＲＩＤ５ＡとＲＯＲγｔが結合すること、およびＡＲＩＤ５ＡがＲＯＲγ誘導性ＩＬ−１７Ａ産生を抑制することについては報告されていない。
【００３２】
ＩＬ−１７は、炎症性サイトカインとして知られており、相同性のある６つのファミリー分子が見出されている。ファミリー分子のうちＩＬ−１７Ａは単にＩＬ−１７と称されることがあるが、本明細書においてはＩＬ−１７はファミリー分子の総称をいう。
【００３３】
Ｔｈ１７細胞は、ＩＬ−１７ＡやＩＬ−１７Ｆ、ＩＬ−２１、およびＩＬ−２２等のサイトカインを産生し、ＲＯＲγｔと呼ばれる転写因子を発現する。ＲＯＲγｔはＴｈ１７細胞分化の支配的調節因子と考えられている。Ｔｈ１７細胞の分化は、その前駆細胞、例えばナイーブＣＤ４陽性Ｔ細胞から、ＩＬ−６およびＴＧＦ−β１の存在下で誘導される。ナイーブＣＤ４陽性Ｔ細胞をＩＬ−６およびＴＧＦ−β１の存在下で培養すると、ＲＯＲγｔの発現が誘導され、そしてＴｈ１７細胞に分化する。
【００３４】
ＡＲＩＤ５Ａは、ＲＯＲγｔ誘導性ＩＬ−１７Ａ産生を抑制するが、ＩＬ−２１の産生や制御性Ｔ細胞の分化を抑制しない。このことから、ＡＲＩＤ５ＡはＩＬ−１７Ａ産生抑制に対する特異性が高く安全性に優れると考えることができる。
【００３５】
本発明において、ＡＲＩＤ５ＡまたはＡＲＩＤ５Ａをコードする核酸のいずれも使用できるが、ＡＲＩＤ５Ａが結合するＲＯＲγｔは核内受容体であるため、ＡＲＩＤ５Ａを核内でＲＯＲγｔに作用させてその効果をエキソビボ（ｅｘｏ  ｖｉｖｏ）またはインビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）で得るためには、好ましくはＡＲＩＤ５Ａをコードする核酸が使用される。
【００３６】
用語「核酸」は、ポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドと同じ意味で使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリマーをいう。特定の核酸配列の範囲には、その相補配列を包含する。用語「核酸」はまた、遺伝子、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、およびポリヌクレオチドと互換可能に使用される。
【００３７】
ＡＲＩＤ５Ａをコードする核酸として、例えば、配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡおよび配列番号３に記載の塩基配列で表されるＤＮＡを例示できる。配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡは、ヒトＤＮＡ（ＧｅｎｅＩＤ：１０８６５）であり、配列番号２に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質をコードする。配列番号３に記載の塩基配列で表されるＤＮＡは、マウスＤＮＡ（ＧｅｎｅＩＤ：２１４８５５）であり、配列番号４に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質をコードする。
【００３８】
ＲＯＲγｔをコードする核酸として、例えば、配列番号５に記載の塩基配列で表されるＤＮＡおよび配列番号７に記載の塩基配列で表されるＤＮＡを例示できる。配列番号５に記載の塩基配列で表されるＤＮＡは、ヒトＤＮＡ（ＧｅｎｅＩＤ：６０９７）であり、配列番号６に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質をコードする。配列番号７に記載の塩基配列で表されるＤＮＡは、マウスＤＮＡ（ＧｅｎｅＩＤ：１９８８５）であり、配列番号８に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質をコードする。
【００３９】
蛋白質および核酸は、例示したものに限定されず、例示した蛋白質および核酸と配列相同性を有するものであって、かつ該蛋白質の生物学的機能と同質の機能を有する蛋白質および該蛋白質をコードする核酸である限りにおいて、それらの変異体を用いることも可能である。
【００４０】
用語「配列相同性」とは、２つの核酸または２つの蛋白質間の配列の同一性および類似性をいう。配列相同性の決定は、比較対象の配列の領域にわたって、最適な状態にアラインメントされた２つの配列を比較することにより決定される。２つの配列のアライメントは、自体公知の方法を使用して実施できる。配列相同性は、通常、塩基配列またはアミノ酸配列の全体で５０％以上、好ましくは少なくとも７０％であることが適当である。より好ましくは７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、または９５％以上であることが適当である。
【００４１】
変異体として、例えば、１個若しくは数個、あるいは複数個のアミノ酸残基またはヌクレオチドが、欠失、置換、挿入、または付加等により変異されたＡＲＩＤ５ＡおよびＡＲＩＤ５Ａをコードする核酸を挙げることができる。アミノ酸残基またはヌクレオチドの変異部位の数は特に限定されないが、例えば１〜１００個、好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１０個、さらにより好ましくは１個〜３個、より好ましくは、１個である。
【００４２】
変異を有する核酸や蛋白質は、天然に存在するものであってよく、また天然由来の遺伝子に基づいて変異を導入して得たものであってもよい。変異を導入する手段は自体公知であり、例えば、部位特異的変異導入法、遺伝子相同組換え法、プライマー伸長法またはポリメラーゼ連鎖反応（以下、ＰＣＲと略称する）等を単独でまたは適宜組合せて使用できる。例えば成書に記載の方法（サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編、「モレキュラークローニング，ア  ラボラトリーマニュアル  第２版」、１９８９年、コールドスプリングハーバーラボラトリー；村松正實編、「ラボマニュアル遺伝子工学」、１９８８年、丸善株式会社）に準じて、あるいはそれらの方法を改変して実施することができ、ウルマーの技術（ウルマー（Ｕｌｍｅｒ，Ｋ．Ｍ．）、「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、１９８３年、第２１９巻、ｐ．６６６−６７１）を利用することもできる。
【００４３】
変異体としてさらに、ＡＲＩＤ５ＡおよびＡＲＩＤ５Ａをコードする核酸の断片を用いることも可能である。このような断片は、全長蛋白質の生物学的機能と同質の機能を有する断片および該断片をコードする核酸断片である限りにおいてどのような断片であってもよい。特に、ＲＯＲγｔとの結合活性を有する断片、および該断片をコードする核酸断片が好ましい。ＡＲＩＤ５Ａの断片の長さは、好ましくは１００個以上、さらに好ましくは１３０個以上、さらに好ましくは１５０個、最も好ましくは１６０個以上の連続するアミノ酸残基から構成される長さである。また、ＡＲＩＤ５Ａをコードする核酸の断片長さは、好ましくは３００個以上、さらに好ましくは３９０個以上、さらに好ましくは４５０個、最も好ましくは４８０個以上の連続するヌクレオチドから構成される長さである。ＡＲＩＤ５Ａの断片はＡＲＩＤ５Ａを適当なペプチダーゼを使用して切断することにより取得できる。
【００４４】
用語「生物学的機能と同質の機能」とは、例えば生理学的または薬理学的に、その性質が定性的に同じであることを意味し、機能の程度等の定量的要素は異なっていてもよい。ＡＲＩＤ５Ａの生物学的機能と同質の機能として、ＲＯＲγｔに直接結合する活性、およびＲＯＲγｔ誘導性ＩＬ−１７産生を抑制する活性、例えばＲＯＲγｔ誘導性Ｔｈ１７分化誘導を抑制する活性を例示できる。ＡＲＩＤ５ＡのＲＯＲγｔとの結合活性は、自体公知の蛋白質結合解析法を用いて測定できる。例えば後述する実施例に記載したように、２つの蛋白質を接触させた後、一方の蛋白質を検出し得る抗体で免疫沈降を行った後、他方の蛋白質を検出し得る抗体でウェスタンブロッティングを行うことにより蛋白質結合を検出できる。ＡＲＩＤ５ＡのＲＯＲγｔ誘導性ＩＬ−１７産生を抑制する活性は、例えば後述する実施例に記載したように、ナイーブＣＤ４陽性Ｔ細胞をＴｈ１７細胞誘導条件下でＴｈ１７細胞を刺激し得る適当な抗原あるいは抗体を添加して培養し、ＡＲＩＤ５Ａを強制発現させてさらに培養した後に、培養液中に産生されたＩＬ−１７を定量することにより測定できる。また、かかる方法でのＩＬ−１７の定量により、ＡＲＩＤ５ＡのＲＯＲγｔ誘導性Ｔｈ１７分化誘導を抑制する活性を測定することができる。
【００４５】
核酸および蛋白質はヒト由来の核酸および蛋白質であることが好ましいが、該ヒト由来の核酸および蛋白質生物学的機能と同質の機能を有し、かつ構造的相同性を有する哺乳動物由来の核酸および蛋白質、例えばマウス、ウマ、ヒツジ、ウシ、イヌ、サル、ネコ、クマ、ラットまたはウサギ等の核酸および蛋白質であることができる。
【００４６】
用語「Ｔｈ１７細胞分化抑制剤」とは、Ｔｈ１７細胞の前駆細胞、例えばナイーブＣＤ４陽性Ｔ細胞からのＴｈ１７細胞の分化を阻害する薬剤、または分化の程度を低下させる薬剤をいう。より詳しくは、ＲＯＲγｔ誘導性Ｔｈ１７細胞分化を阻害する薬剤、または分化の程度を低下させる薬剤をいう。ＲＯＲγｔ誘導性Ｔｈ１７細胞分化とは、ナイーブＣＤ４陽性Ｔ細胞からＲＯＲγｔ発現によりＴｈ１７細胞へ分化することをいう。
【００４７】
用語「ＩＬ−１７産生の抑制剤」とは、Ｔｈ１７細胞のＩＬ−１７産生を阻害する薬剤、または産生の程度を低下させる薬剤をいう。より詳しくは、ＲＯＲγｔ誘導性ＩＬ−１７産生を阻害する薬剤、または産生の程度を低下させる薬剤をいう。ＲＯＲγｔ誘導性ＩＬ−１７産生とは、ＲＯＲγｔ発現によりナイーブＣＤ４陽性Ｔ細胞から分化したＴｈ１７細胞によるＩＬ−１７の産生、好ましくはＩＬ−１７Ａの産生、およびＲＯＲγｔを発現しているＴｈ１７細胞によるＩＬ−１７の産生、好ましくはＩＬ−１７Ａの産生をいう。
【００４８】
自己免疫疾患の治療用組成物とは、自己免疫疾患の症状を軽減する医薬組成物をいう。自己免疫疾患とは、本来異物（非自己）に対しての防御反応として現れるはずの免疫機能が不良となり、自己の正常な細胞や組織に対して過剰に反応して傷害することにより症状をきたす疾患の総称をいう。本発明に係る治療用組成物が有効な自己免疫疾患として、Ｔｈ１７細胞やＩＬ−１７が関与する自己免疫疾患を挙げることができる。具体的には、関節リウマチ、多発性硬化症、潰瘍性大腸炎やクローン病等の炎症性腸疾患、および全身性エリテマトーデスを例示でき、より好ましくは関節リウマチを挙げることができる。
【００４９】
関節リウマチは滑膜の炎症による関節破壊と機能障害を主体とする原因不明の疾患である。関節リウマチ症例の末梢血ではＩＬ−１７産生細胞の増加が報告されており、Ｔｈ１７細胞がその病態に関与していることが示唆されている。関節リウマチにおいて、ＩＬ−１７はマクロファージや樹状細胞に作用してそれらからの炎症性サイトカイン、例えばＩＬ−１、ＴＮＦ（腫瘍壊死因子）、ＩＬ−６、およびＣＲＰ（Ｃ反応性蛋白質）の産生を誘導し、炎症を引き起こす。また、軟骨細胞に作用して、該細胞からのＭＭＰ（マトリックスメタロプロテアーゼ）産生を誘導し、軟骨破壊を引き起こす。さらに、骨芽細胞に作用して、該細胞からのＲＡＮＫＬ（ＮＦ−κＢ活性化受容体リガンド）やＭＭＰの産生を誘導し、骨びらんを引き起こす。このように、関節リウマチの病態には、Ｔｈ１７細胞および該細胞が産生するＩＬ−１７が関与している。
【００５０】
ＡＲＩＤ５Ａは、トシリズマブが著効した関節リウマチ症例のＣＤ４陽性Ｔ細胞のＤＮＡアレイ解析から抽出された分子であり、関節リウマチ等の自己免疫疾患の病態への関与が示唆される。後述する実施例に示した知見から、ＡＲＩＤ５ＡはＳｔａｔ３依存的に発現が誘導され、ＲＯＲγｔ誘導性Ｔｈ１７細胞分化を抑制することにより、Ｔｈ１７細胞分化に対するブレーキとして機能していることが推測できる。したがって、ＡＲＩＤ５Ａにより、またはＡＲＩＤ５ＡよるＲＯＲγｔ機能の抑制により、Ｔｈ１７細胞が病態に関与する関節リウマチ等の自己免疫疾患の治療が可能になると考えることができる。
【００５１】
本発明に係る核酸を有効成分として含有する薬剤および組成物は、標的細胞に対して導入した場合、細胞内でＡＲＩＤ５Ａが生産され、それにより、ＲＯＲγｔ誘導性ＩＬ−１７Ａ産生を抑制するという効果を発揮する。
【００５２】
ＡＲＩＤ５Ａをコードする核酸の取得は、上記塩基配列の情報に基づき、公知の遺伝子工学的手法（サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編、「モレキュラークローニング，ア  ラボラトリーマニュアル  第２版」、１９８９年、コールドスプリングハーバーラボラトリー；村松正實編、「ラボマニュアル遺伝子工学」、１９８８年、丸善株式会社等を参照）により容易に実施できる。
【００５３】
ＡＲＩＤ５Ａをコードする核酸の取得は、具体的には、該核酸の発現が確認されている適当な起源から、常法に従ってｃＤＮＡライブラリーを調製し、該ｃＤＮＡライブラリーから、該核酸に特有の適当なプローブやプライマーを使用して所望のクローンを選択することにより実施できる。ｃＤＮＡの起源として、ＡＲＩＤ５Ａをコードする核酸の発現が確認されている各種の細胞や組織、またはこれらに由来する培養細胞等、例えば血球系細胞を例示できる。起源からの全ＲＮＡの分離、ｍＲＮＡの分離や精製、ｃＤＮＡの取得とそのクローニング等はいずれも常法に従って実施できる。また、市販のｃＤＮＡライブラリーを使用することもできる。ｃＤＮＡライブラリーから所望のクローンを選択する方法も特に制限されず、慣用の方法を利用できる。例えば、目的の核酸配列に選択的にハイブリダイゼーションするプローブやプライマー等を使用して所望のクローンを選択できる。具体的には、目的の核酸配列に選択的にハイブリダイゼーションするプローブを使用するプラークハイブリダイゼーション法、コロニーハイブリダイゼーション法等やこれらを組合せた方法等を例示できる。ここで使用されるプローブとして、上記塩基配列の情報に基づいて化学合成したポリヌクレオチド等を一般的に使用できる。ｃＤＮＡライブラリーからの所望のクローンの選択は、例えば公知の蛋白質発現系を利用して各クローンについて所望の核酸の発現確認を行い、さらに該核酸にコードされる蛋白質の機能を指標にして実施できる。蛋白質発現系として、自体公知の発現系がいずれも利用できるが、無細胞蛋白質発現系の利用が簡便である（マディン（Ｍａｄｉｎ，Ｋ．）ら、「プロシーディングス  オブ  ザ  ナショナル  アカデミー  オブ  サイエンシズ  オブ  ザ  ユナイテッド  ステーツ  オブ  アメリカ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ）」、２０００年、第９７巻、ｐ．５５９−５６４）。
【００５４】
核酸の取得にはその他、ＰＣＲ（ウルマー（Ｕｌｍｅｒ，Ｋ．Ｍ．）、「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、１９８３年、第２１９巻、ｐ．６６６−６７１；エールリッヒ（Ｅｈｒｌｉｃｈ，Ｈ．Ａ．）編、「ＰＣＲテクノロジー，ＤＮＡ増幅の原理と応用」、１９８９年、ストックトンプレス；サイキ（Ｓａｉｋｉ，Ｒ．Ｋ．）ら、「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、１９８５年、第２３０巻、ｐ．１３５０−１３５４））によるＤＮＡ／ＲＮＡ増幅法が好適に利用できる。ｃＤＮＡライブラリーから全長のｃＤＮＡが得られ難いような場合には、ＲＡＣＥ法（「実験医学」、１９９４年、第１２巻、第６号、ｐ．６１５−６１８）、特に５´−ＲＡＣＥ法（フローマン（Ｆｒｏｈｍａｎ，Ｍ．Ａ．）ら、「プロシーディングス  オブ  ザ  ナショナル  アカデミー  オブ  サイエンシズ  オブ  ザ  ユナイテッド  ステーツ  オブ  アメリカ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ）」、１９８８年、第８５巻、第２３号、ｐ．８９９８−９００２）等の採用が好適である。ＰＣＲに使用するプライマーは、核酸の塩基配列情報に基づいて適宜設計でき、常法に従って合成により取得できる。増幅させた核酸断片の単離精製は常法により実施できる。例えばゲル電気泳動法等により核酸断片の単離精製を実施できる。
【００５５】
核酸の塩基配列の決定は、常法、例えばジデオキシ法（「プロシーディングス  オブ  ザ  ナショナル  アカデミー  オブ  サイエンシズ  オブ  ザ  ユナイテッド  ステーツ  オブ  アメリカ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ）」、１９７７年、第７４巻、ｐ．５４６３−５４６７）やマキサム−ギルバート法（「メソッズ  イン  エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）」、１９８０年、第６５巻、ｐ．４９９−５６０）等により、また簡便には市販のシーケンスキット等を使用して実施できる。
【００５６】
ＡＲＩＤ５Ａの取得は、一般的な化学合成法による製造により実施できる。例えば、蛋白質の化学合成方法として、固相合成方法や液相合成方法等が知られているがいずれを使用することもできる。このような蛋白質合成法は、より詳しくは、アミノ酸配列情報に基づいて、各アミノ酸を１個ずつ逐次結合させて鎖を延長させていくいわゆるステップワイズエロンゲーション法と、アミノ酸数個からなるフラグメントを予め合成し、次いで各フラグメントをカップリング反応させるフラグメントコンデンセーション法とを包含し、本蛋白質の合成は、そのいずれによっても実施できる。上記蛋白質合成において使用される縮合法も、常法に従うことができ、例えば、アジド法、混合酸無水物法、ＤＣＣ法、活性エステル法、酸化還元法、ＤＰＰＡ（ジフェニルホスホリルアジド）法、ＤＣＣ＋添加物（１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、Ｎ−ヒドロキシサクシンアミド、Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミド等）法、ウッドワード法等を例示できる。化学合成により得られた蛋白質は、さらに上記のような慣用の各種精製方法に従って、適宜精製を実施できる。
【００５７】
ＡＲＩＤ５Ａの取得はまた、ＡＲＩＤ５Ａをコードする核酸の塩基配列情報に基づいて一般的遺伝子工学的手法（サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編、「モレキュラークローニング，ア  ラボラトリーマニュアル  第２版」、１９８９年、コールドスプリングハーバーラボラトリー；村松正實編、「ラボマニュアル遺伝子工学」、１９８８年、丸善株式会社；ウルマー（Ｕｌｍｅｒ，Ｋ．Ｍ．）、「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、１９８３年、第２１９巻、ｐ．６６６−６７１；エールリッヒ（Ｅｈｒｌｉｃｈ，Ｈ．Ａ．）編、「ＰＣＲテクノロジー，ＤＮＡ増幅の原理と応用」、１９８９年、ストックトンプレス等を参照）により実施できる。例えば、ＡＲＩＤ５Ａをコードする核酸を使用し、公知の遺伝子工学的手法によりその発現を誘導することにより取得できる。
【００５８】
具体的には例えば、ＡＲＩＤ５Ａをコードする核酸を含むベクターＤＮＡをトランスフェクションした形質転換体を培養し、次いで得られる培養物から目的とする蛋白質を回収することによりＡＲＩＤ５Ａを製造できる。形質転換体の培養は、各々の宿主に最適な自体公知の培養条件および培養方法で実施できる。培養は、形質転換体により発現される本蛋白質自体またはその機能を指標にして実施できる。あるいは、宿主中または宿主外に産生された本蛋白質自体またはその蛋白質量を指標にして培養してもよく、培地中の形質転換体量を指標にして継代培養またはバッチ培養を行ってもよい。目的とする蛋白質が形質転換体の細胞内あるいは細胞膜上に発現する場合には、形質転換体を破砕して目的とする蛋白質を抽出する。また、目的とする蛋白質が形質転換体外に分泌される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離処理等により形質転換体を除去した培養液を使用する。
【００５９】
ＡＲＩＤ５Ａをコードする核酸を含む組換えベクターの取得は、該核酸を適当なベクターＤＮＡに挿入することにより実施できる。組換えベクターは、該核酸が組込まれている組換えベクターである限りにおいて、いずれの組換えベクターであってもよい。
【００６０】
ベクターＤＮＡは宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、宿主の種類および使用目的により適宜選択される。ベクターＤＮＡは、天然に存在するものを抽出したもののほか、複製に必要な部分以外のＤＮＡの部分が一部欠落しているものでもよい。代表的なものとして、プラスミド、バクテリオファージおよびウイルス由来のベクターＤＮＡを例示できる。プラスミドＤＮＡとして、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミド、酵母由来のプラスミド等を例示できる。バクテリオファージＤＮＡとして、λファージ等を例示できる。ウイルス由来のベクターＤＮＡとして、例えばレトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、パポバウイルス、ＳＶ４０、鶏痘ウイルス、および仮性狂犬病ウイルス等の動物ウイルス由来のベクター、あるいはバキュロウイルス等の昆虫ウイルス由来のベクターを例示できる。その他、トランスポゾン由来、挿入エレメント由来、酵母染色体エレメント由来のベクターＤＮＡ等を例示できる。あるいは、これらを組合せて作成したベクターＤＮＡ、例えばプラスミドおよびバクテリオファージの遺伝学的エレメントを組合せて作成したベクターＤＮＡ（コスミドやファージミド等）を例示できる。また、目的により発現ベクターやクローニングベクター等、いずれを使用することもできる。
【００６１】
用語「発現ベクター」は、構造遺伝子およびその発現を調節するプロモーターに加えて種々の調節エレメントが宿主の細胞中で作動可能に連結された核酸配列をいう。用語「作動可能に連結された」とは、所望の核酸配列の発現（作動）がある調節エレメントの制御下に配置されることをいう。プロモーターが遺伝子に作動可能に連結されるためには、通常、その遺伝子のすぐ上流にプロモーターが配置されるが、必ずしも隣接して配置される必要はない。調節エレメントは、好ましくは、ターミネーター、薬剤耐性遺伝子のような選択マーカーおよび、エンハンサーを含み得る。発現ベクターの種類および使用される調節エレメントの種類は、該発現ベクターが導入される細胞が由来する生物種に応じて適当なものを選択して使用する。
【００６２】
ベクターには、目的遺伝子の機能が発揮されるように遺伝子を組込むことが必要であり、少なくとも目的遺伝子配列とプロモーターとをその構成要素とする。これら要素に加えて、所望によりさらに、複製そして制御に関する情報を担持した遺伝子配列、例えば、リボソーム結合配列、ターミネーター、シグナル配列、エンハンサー等のシスエレメント、スプライシングシグナル、および選択マーカー等から選択した１つまたは複数の遺伝子配列を自体公知の方法により組合せてベクターＤＮＡに組込むことができる。選択マーカーとして、例えばジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等を例示できる。
【００６３】
ベクターＤＮＡに目的遺伝子配列を組込む方法は、自体公知の方法を適用できる。例えば、目的遺伝子配列を適当な制限酵素により処理して特定部位で切断し、次いで同様に処理したベクターＤＮＡと混合し、リガーゼによって再結合する方法が使用される。あるいは、目的遺伝子配列に適当なリンカーをライゲーションし、これを目的に適したベクターのマルチクローニングサイトへ挿入することによっても、所望の組換えベクターが得られる。
【００６４】
ＡＲＩＤ５Ａをコードする核酸を組み込んだベクターＤＮＡを宿主に導入することにより、形質転換体が得られる。ベクターＤＮＡとして発現ベクターを使用すれば、本ＤＮＡの発現を実施でき、さらに該ＤＮＡによりコードされる蛋白質を製造できる。該形質転換体には、本ＤＮＡ以外の所望の遺伝子を組込んだベクターＤＮＡの１つまたは２つ以上をさらに導入することもできる。
【００６５】
宿主として、原核生物および真核生物のいずれも使用できる。原核生物として、例えば大腸菌（エシェリヒアコリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ））等のエシェリヒア属、枯草菌等のバシラス属、シュードモナスプチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）等のシュードモナス属、リゾビウムメリロティ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｌｉｌｏｔｉ）等のリゾビウム属に属する細菌を例示できる。真核生物として、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセスポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）等の酵母、Ｓｆ９やＳｆ２１等の昆虫細胞、あるいはサル腎由来細胞（ＣＯＳ細胞、Ｖｅｒｏ細胞）、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、マウスＬ細胞、ラットＧＨ３細胞、ヒトＦＬ細胞や２９３ＥＢＮＡ細胞、アフリカツメガエル卵母細胞等の動物細胞を例示できる。好ましくは動物細胞を使用する。
【００６６】
ベクターＤＮＡの宿主細胞への導入は、自体公知の手段が応用でき、例えば成書に記載されている標準的な方法（サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編、「モレキュラークローニング，ア  ラボラトリーマニュアル  第２版」、１９８９年、コールドスプリングハーバーラボラトリー）により実施できる。より好ましい方法として、遺伝子の安定性を考慮するならば染色体内へのインテグレート法が挙げられるが、簡便には核外遺伝子を利用した自律複製系を使用できる。具体的な方法として、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、マイクロインジェクション、陽イオン脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、スクレープ負荷（ｓｃｒａｐｅ  ｌｏａｄｉｎｇ）、バリスティック導入（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ  ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）および感染等が挙げられる。
【００６７】
本発明に係る治療用組成物は、上記核酸、組換えベクター、または蛋白質のうち少なくともいずれか１つを有効成分としてその有効量含む医薬となしてもよいが、通常は、１種または２種以上の医薬担体を使用して医薬組成物を製造することが好ましい。
【００６８】
本発明に係る医薬製剤中に含まれる有効成分の量は、広範囲から適宜選択されるが、通常約０．００００１〜７０重量％、好ましくは０．０００１〜５重量％程度の範囲とするのが適当である。
【００６９】
医薬用担体は、製剤の使用形態に応じて通常使用される、充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、滑沢剤、希釈剤および賦形剤を例示できる。これらは得られる製剤の投与形態に応じて適宜選択して使用される。より具体的には、水、医薬的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール、ラクトースを例示できる。これらは、本薬剤の剤形に応じて適宜１種類または２種類以上を組み合わせて使用される。その他、安定化剤、殺菌剤、緩衝剤、等張化剤、キレート剤、界面活性剤、およびｐＨ調整剤等を適宜使用することもできる。安定化剤は、例えばヒト血清アルブミンや通常のＬ−アミノ酸、糖類、セルロース誘導体を例示できる。Ｌ−アミノ酸は、特に限定はなく、例えばグリシン、システイン、グルタミン酸等のいずれでもよい。糖類も特に限定はなく、例えばグルコース、マンノース、ガラクトース、果糖等の単糖類、マンニトール、イノシトール、キシリトール等の糖アルコール、ショ糖、マルトース、乳糖等の二糖類、デキストラン、ヒドロキシプロピルスターチ、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸等の多糖類等およびそれらの誘導体等のいずれでもよい。セルロース誘導体も特に限定はなく、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム等のいずれでもよい。界面活性剤も特に限定はなく、イオン性界面活性剤および非イオン性界面活性剤のいずれも使用できる。界面活性剤には、例えばポリオキシエチレングリコールソルビタンアルキルエステル系、ポリオキシエチレンアルキルエーテル系、ソルビタンモノアシルエステル系、脂肪酸グリセリド系等が包含される。緩衝剤は、ホウ酸、リン酸、酢酸、クエン酸、ε−アミノカプロン酸、グルタミン酸および／またはそれらに対応する塩（例えばそれらのナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ金属塩やアルカリ土類金属塩）を例示できる。等張化剤は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、糖類、グリセリンを例示できる。キレート剤は、例えばエデト酸ナトリウム、クエン酸を例示できる。
【００７０】
治療用組成物の用量範囲は特に限定されず、含有される成分の有効性、投与形態、投与経路、疾患の種類、対象の性質（体重、年齢、病状および他の医薬の使用の有無等）、および担当医師の判断等応じて適宜選択される。一般的には適当な用量は、例えば対象の体重１ｋｇあたり約０．０１μｇ〜１００ｍｇ程度、好ましくは約０．１μｇ〜１ｍｇ程度の範囲であることが好ましい。しかしながら、当該分野においてよく知られた最適化のための一般的な常套的実験を用いてこれらの用量の変更を行うことができる。上記投与量は１日１回乃至数回に分けて投与することができる。
【００７１】
本発明に係る治療用組成物を投与するときには、該治療用組成物を単独で使用してもよく、あるいは治療に必要な他の化合物または医薬と共に使用してもよい。
【００７２】
投与経路は、全身投与または局所投与のいずれも選択できる。この場合、疾患、症状等に応じた適当な投与経路を選択する。例えば、非経口経路として、通常の静脈内投与、動脈内投与の他、皮下、皮内、筋肉内等への投与が挙げられる。あるいは経口経路で投与できる。さらに、経粘膜投与または経皮投与も実施できる。
【００７３】
投与形態は、各種の形態が目的に応じて選択できる。その代表的なものは、錠剤、丸剤、散剤、粉末剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤等の固体投与形態や、水溶液製剤、エタノール溶液製剤、懸濁剤、脂肪乳剤、リポソーム製剤、シクロデキストリン等の包接体、シロップ、エリキシル等の液剤投与形態が含まれる。これらは更に投与経路に応じて経口剤、非経口剤（点滴剤、注射剤）、経鼻剤、吸入剤、経膣剤、坐剤、舌下剤、点眼剤、点耳剤、軟膏剤、クリーム剤、経皮吸収剤、経粘膜吸収剤等に分類され、それぞれ通常の方法に従い、調合、成形、調製することができる。
【００７４】
本発明に係る治療用組成物を遺伝子治療剤として使用する場合は、その投与には公知の方法が利用でき、その投与形態は、非ウイルスベクターを用いるトランスフェクション法と、ウイルスベクターを用いるトランスフェクション法の二つに大別される。非ウイルスベクターを用いるトランスフェクション法では、慣用の遺伝子発現ベクターにＡＲＩＤ５Ａをコードする核酸を組込んだ組換え発現ベクターを用い、リン酸−カルシウム共沈法や微小ガラス管を用いたＤＮＡの直接注入法などにより、細胞に該発現ベクターを導入するできる。組織への導入法としては、内包型リポソーム（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｔｙｐｅ  ｌｉｐｏｓｏｍｅ）による遺伝子導入法、静電気型リポソーム（ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ  ｔｙｐｅ  ｌｉｐｏｓｏｍｅ）による遺伝子導入法、ＨＶＪ−リポソーム法、改良型ＨＶＪ−リポソーム法（ＨＶＪ−ＡＶＥ  リポソーム法）、受容体介在性遺伝子導入法、パーティクル銃で担体（金属粒子）とともにＤＮＡ分子を細胞に移入する方法、ｎａｋｅｄ−ＤＮＡの直接導入法、正電荷ポリマーによる導入法等の方法を例示できる。ウイルスベクターを使用するトランスフェクション法においては、発現ベクターとして、好ましくはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター等のＤＮＡウイルスベクター、あるいはＲＮＡウイルスベクターを使用する。より具体的には、例えば、無毒化したレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイルス、センダイウイルス、ＳＶ４０、免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）等のＤＮＡウイルスまたはＲＮＡウイルスを使用する。これらウイルスベクターを用いることにより効率良い投与が可能である。さらに、ウイルスベクターを用いるトランスフェクション法においても、該ベクターをリポソームに封入して、そのリポソームを投与する方法が推奨される。
【００７５】
遺伝子治療剤は、一般的には、注射剤、点滴剤、あるいはリポソーム製剤として調製することが好ましい。遺伝子治療剤が、遺伝子が導入された細胞を含む形態に調製される場合は、該細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）、リンゲル液、細胞内組成液用注射剤中に配合した形態等に調製することもできる。また、プロタミン等の遺伝子導入効率を高める物質と共に投与されるような形態に調製することもできる。遺伝子治療剤として使用する場合、本医薬組成物は、１日に１回または数回に分けて投与でき、また、１日から数週間の間隔で間歇的に投与できる。投与の方法は、一般的な遺伝子治療法で使用されている方法に従って実施できる。
【００７６】
以下、実施例を用いて本発明を詳細に説明するが、本発明に係る技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。本実施例は、インフォームドコンセントを行って患者の意思を確認した後に実施したものである。
【実施例１】
【００７７】
Ｔｈ１７細胞が関与することが報告されている関節リウマチに対して抗ＩＬ−６受容体抗体（トシリズマブ）の有効性が報告されている。ＩＬ−６は、ＴＧＦ−β１の存在下でナイーブＣＤ４陽性Ｔ細胞からのＴｈ１７細胞の分化を誘導すること、および、ナイーブＣＤ４陽性Ｔ細胞からのＴｈ１７細胞の分化に重要なＲＯＲγｔの発現を誘導することが知られている。ＩＬ−６は、細胞内シグナル伝達経路を介してＳＴＡＴ３を活性化する。ＳＴＡＴ３は、シグナル伝達性転写活性化因子（Ｓｉｇｎａｌ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ  ａｎｄ  Ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ、ＳＴＡＴ）ファミリーに属する転写因子である。トシリズマブはＩＬ−６によるＳＴＡＴ３の活性化を阻害し、ＳＴＡＴ３活性化による遺伝子発現を阻害する。このことから、トシリズマブ処理により、様々な遺伝子の発現に変動が生じ、そのような遺伝子がＩＬ−６によるＴｈ１７細胞の分化誘導や関節リウマチに関与すると考えることができる。
【００７８】
そこで、トシリズマブが著効した関節リウマチ症例においてトシリズマブの投与前後でＣＤ４陽性Ｔ細胞における遺伝子発現を網羅的に解析した。具体的には、トシリズマブを投与予定の関節リウマチ患者を選択し、トシリズマブが著効した関節リウマチ患者６例を解析の対象とした。トシリズマブ投与前と投与後３ヶ月に末梢血を採取し、ヒューマン  ＣＤ４＋  Ｔ細胞  アイソレーション  キット  ＩＩ（ｈｕｍａｎ  ＣＤ４＋  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ＩＩ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社製）を用いてＣＤ４陽性Ｔ細胞を分離した。ＣＤ４陽性Ｔ細胞の純度はフローサイトメトリーで確認し、９５％以上であった。純化された末梢血ＣＤ４陽性Ｔ細胞からＲＮＡを抽出し、ＤＮＡマイクロアレイ解析を行った。ＤＮＡマイクロアレイ解析は、ヒューマン  ホール  ゲノム４×４４Ｋ  フォーマット（Ｈｕｍａｎ  Ｗｈｏｌｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  ４×４４Ｋ  ｆｏｒｍａｔ、Ａｇｉｌｅｎｔ社製）を使用して実施した。投与前および投与後３ヶ月の遺伝子発現を比較し、倍率変化（ｆｏｌｄ  ｃｈａｎｇｅ）＞１．５かつ有意差ｐ＜０．０５の条件下で、ＷＡＤ法により発現変動遺伝子のランキングを行い、ランキング上位の遺伝子を抽出した。
【００７９】
結果を表１に示す。トシリズマブが著効した関節リウマチ患者由来の末梢血ＣＤ４陽性  Ｔ細胞で発現変動が観察された遺伝子のほとんどは発現が低下していた。
【００８０】
【表１】
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【実施例２】
【００８１】
実施例１で得られた結果から、Ｔ細胞分化に関する報告のないＡＲＩＤ５Ａに注目し、さらなる解析を行った。具体的には、野生型マウスの脾臓からナイーブＣＤ４陽性Ｔ細胞を、ナイーブ  ＣＤ４＋  Ｔ細胞  アイソレーション  キット  ＩＩ（Ｎａｉｖｅ  ＣＤ４＋  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ＩＩ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社製）を用いて純化し、Ｔｈ０およびＴｈ１７の各条件下で抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体で刺激した。ここで、Ｔｈ０条件下とは、外因性サイトカイン非添加の条件下であって、Ｔ細胞が分化しない条件下を意味する。Ｔｈ１７条件下とは、ＩＬ−６およびＴＧＦ−β添加の条件下であって、ナイーブＣＤ４陽性Ｔ細胞からＴｈ１７細胞が分化する条件下を意味する。またこれら条件下のほかに、ＩＬ−６のみ添加する条件下で同様の刺激を行った。培養２４時間後、７２時間後、および１２０時間後に細胞を回収し、ＲＮＡを抽出後、ｃＤＮＡを合成し、ＡＲＩＤ５Ａの発現を定量的ＰＣＲで解析した。ＲＮＡ抽出、ｃＤＮＡ合成、および定量的ＰＣＲは、常法に従って実施した。
【００８２】
図１に示すように、ＡＲＩＤ５ＡはＴｈ１７細胞分化誘導条件下で発現が誘導された。また、ＩＬ−６添加条件下でもＡＲＩＤ５Ａ発現が誘導されたが、Ｔｈ１７細胞分化誘導条件下での発現と比較して誘導程度は低かった。
【実施例３】
【００８３】
ＡＲＩＤ５Ａの発現へのＳｔａｔ３の関与を検討した。まず、野生型マウス、およびＣＤ４陽性Ｔ細胞においてＳｔａｔ３の発現を欠く遺伝子改変マウスから脾臓を摘出し、脾臓からナイーブＣＤ４陽性Ｔ細胞を実験２に記載した方法と同様の方法で純化および培養を行った。ただし、ＩＬ−６のみ添加する条件下での培養は行わず、その代わりＩＬ−２１のみを添加する条件下での培養を加えた。培養７２時間後に、ＡＲＩＤ５Ａの発現を定量的ＰＣＲにて解析した。
【００８４】
図２に示すように、ＡＲＩＤ５Ａの発現誘導はＳｔａｔ３欠損Ｔ細胞では認められなかった。このことから、ＡＲＩＤ５Ａの発現にはＳｔａｔ３が関与することが明らかになった。
【００８５】
実施例２および３の結果から、ＡＲＩＤ５ＡはＴｈ１７細胞分化誘導条件、およびＩＬ−６添加条件にて、Ｓｔａｔ３依存的に発現が誘導されることが判明した。
【実施例４】
【００８６】
ＡＲＩＤ５Ａの発現がもたらす効果について検討した。まず、野生型マウスの脾臓からナイーブＣＤ４陽性Ｔ細胞を純化し、Ｔｈ０、Ｔｈ１７、ＩＬ−６添加の各条件下で抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体で刺激した。刺激２４時間後にレトロウイルスを用いてＡＲＩＤ５Ａを強制発現させ、その影響を解析した。レトロウイルスベクターは、レトロウイルスによる緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）発現プラスミドｐＭＸ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰにＡＲＩＤ５Ａ遺伝子を組み込んだベクターｐＭＸ−ＡＲＩＤ５Ａ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ（図３）を用いた。コントロールとして、ＡＲＩＤ５Ａ遺伝子を組み込んでいないベクターｐＭＸ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰを用いた。ＧＦＰ陽性細胞におけるＩＬ−１７ＡとＩＬ−２１の産生をフローサイトメトリーを用いた細胞内サイトカイン染色にて解析した。
【００８７】
図４に示すように、ＡＲＩＤ５ＡはＴｈ１７細胞分化誘導条件下でＩＬ−１７Ａ産生を抑制したが、一方ＩＬ−２１産生は増強した。
【実施例５】
【００８８】
ＡＲＩＤ５Ａの発現がＴｒｅｇ細胞の誘導に関与するかどうかを検討した。Ｔｒｅｇ細胞は、Ｔ細胞サブセットの１つであり、免疫寛容に関与することが知られている。Ｔｒｅｇ細胞は、ＴＧＦ−βの存在下における抗原刺激によりナイーブＣＤ４陽性Ｔ細胞から分化するが、その分化や免疫制御機能は転写因子であるＦｏｘｐ３の発現により調節されている。そのため、Ｆｏｘｐ３はＴｒｅｇ細胞の特異的分子マーカーとして利用されている。
【００８９】
具体的にはまず、実験４と同様に、ＣＤ４陽性Ｔ細胞をＴｈ０、Ｔｈ１７、Ｔｒｅｇの各条件下で抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体で刺激し、レトロウイルスを用いてＡＲＩＤ５Ａを強制発現させた。そして、ＧＦＰ陽性細胞について、Ｔｒｅｇ細胞のマーカーである転写因子Ｆｏｘｐ３の発現をフローサイトメトリーを用いた細胞内染色にて解析した。Ｔｒｅｇ条件下とは、ＴＧＦ−βのみを添加する条件下で、Ｔｒｅｇ細胞が誘導される条件下を意味する。
【００９０】
図５に示すように、ＡＲＩＤ５ＡはＴｒｅｇ細胞の分化には影響しないことが判明した。
【実施例６】
【００９１】
実験４と同様に、ＣＤ４陽性Ｔ細胞をＴｈ０条件下で抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体で刺激し、レトロウイルスを用いてＡＲＩＤ５ＡおよびＲＯＲγｔを強制発現させた。ＡＲＩＤ５Ａ発現用ウイルスベクターには、実施例４で使用したベクターと同じベクターｐＭＸ−ＡＲＩＤ５Ａ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰを用いた。また、ＲＯＲγｔ発現用ウイルスベクターは、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）レトロウイルスベクターにＲＯＲγｔ遺伝子とＴｈｙ１．１遺伝子とを組み込んだベクターＭＳＣＶ−ｍｙｃ  ＲＯＲγｔ−ＩＲＥＳ−Ｔｈｙ１．１（図６）を用いた。コントロールとして、ＡＲＩＤ５Ａ遺伝子を組み込んでいないベクターｐＭＸ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ、およびＲＯＲγｔ遺伝子を組み込んでいないベクターＭＳＣＶ−ＩＲＥＳ−Ｔｈｙ１．１を用いた。ＧＦＰ陽性Ｔｈｙ１．１陽性細胞におけるＩＬ−１７ＡとＩＬ−２１の発現をフローサイトメトリーを用いた細胞内サイトカイン染色にて解析した。
【００９２】
図７に示すように、ＲＯＲγｔ強制発現によりＩＬ−１７ＡおよびＩＬ−２１の産生が増強され、さらにＡＲＩＤ５Ａの強制発現により、ＲＯＲγｔ発現によるＩＬ−１７Ａ産生増強が抑制された。一方、ＲＯＲγｔ強制発現によるＩＬ−２１産生増強は、ＡＲＩＤ５Ａの強制発現により抑制されなかった。
【００９３】
この結果から、ＡＲＩＤ５Ａは、ＲＯＲγｔによるＴｈ１７細胞分化を抑制すること、ＲＯＲγｔ誘導性ＩＬ−１７Ａ産生増強を抑制すること、およびＲＯＲγｔ誘導性ＩＬ−２１産生増強には影響しない、またはさらに増強することが判明した。
【実施例７】
【００９４】
ＡＲＩＤ５ＡとＲＯＲγｔとの相互作用について検討した。ＡＲＩＤ５ＡとＲＯＲγｔにそれぞれ標識タグであるＦｌａｇとｍｙｃを付加したコンストラクトを作成し、それぞれ別の発現ベクターに組み込み、両発現ベクターを２９３Ｔ細胞に導入した。ＡＲＩＤ５Ａ発現用ベクターｐｃＤＮＡ３−ＦｌａｇＡＲＩＤ５Ａのプラスミドマップを図８に示し、ＲＯＲγｔ発現用ベクターＭＳＣＶ−ｍｙｃ  ＲＯＲγｔ−ＩＲＥＳ−Ｔｈｙ１．１のプラスミドマップを図６に示す。次いで、抗Ｆｌａｇ抗体で免疫沈降した後に抗ｍｙｃ抗体でウエスタンブロッティングを行った。
【００９５】
図９に示すように、ＡＲＩＤ５ＡとＲＯＲγｔは直接結合することが判明した。
【００９６】
上記実施例１〜７の結果から、ＡＲＩＤ５ＡはＳｔａｔ３依存的に発現が誘導され、ＲＯＲγｔによるＴｈ１７細胞の分化誘導を抑制することより、Ｔｈ１７細胞分化に対するブレーキとして機能していることが推測できる。したがって、ＡＲＩＤ５Ａ、またはＡＲＩＤ５ＡよるＲＯＲγｔ機能の抑制により、Ｔｈ１７細胞が病態に関与する関節リウマチ等の自己免疫疾患の治療が可能になると考えることができる。
【産業上の利用可能性】
【００９７】
本発明は、Ｔｈ１７細胞の分化および該細胞からのＩＬ−１７産生を抑制することができるため、Ｔｈ１７やＩＬ−１７が関与する疾患、例えば関節リウマチ等の自己免疫疾患の治療等に利用できる。
【配列表フリーテキスト】
【００９８】
配列番号１：ヒトＡＲＩＤ５Ａ（配列番号２）をコードするＤＮＡ
配列番号３：マウスＡＲＩＤ５Ａ（配列番号４）をコードするＤＮＡ
配列番号５：ヒトＲＯＲγｔ（配列番号６）をコードするＤＮＡ
配列番号７：マウスＲＯＲγｔ（配列番号８）をコードするＤＮＡ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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