(57)【要約】【課題】幅広い生物種のＮｕｐ９８を認識する抗Ｎｕｐ９８モノクローナル抗体、特に、テトラヒメナ・サーモフィラのＭａｃＮｕｐ９８Ａを認識する抗Ｎｕｐ９８モノクローナル抗体を提供すること。【解決手段】テトラヒメナ・サーモフィラの大核ヌクレオポリンＭａｃＮｕｐ９８Ａのアミノ酸配列に存在するＧＬＦＧの少なくとも一部を含むエピトープに結合するモノクローナル抗体、好ましくはハイブリドーマ１３Ｃ２Ａｎｔｉ−Ｎｕｐ９８ ｈｙｂｒｉｄｏｍａ（受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１５５７）またはハイブリドーマ２１Ａ１０Ａｎｔｉ−Ｎｕｐ９８ ｈｙｂｒｉｄｏｍａ（受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１５５６）によって産生されるモノクローナル抗体。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
テトラヒメナ・サーモフィラの大核ヌクレオポリンＭａｃＮｕｐ９８Ａのアミノ酸配列（配列番号１）に存在するＧＬＦＧ（配列番号２）の少なくとも一部を含むエピトープに結合するモノクローナル抗体であって、ハイブリドーマ１３Ｃ２ Ａｎｔｉ−Ｎｕｐ９８ ｈｙｂｒｉｄｏｍａ（受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１５５７）またはハイブリドーマ２１Ａ１０ Ａｎｔｉ−Ｎｕｐ９８ ｈｙｂｒｉｄｏｍａ（受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１５５６）によって産生されるモノクローナル抗体。
【請求項２】
ハイブリドーマ１３Ｃ２ Ａｎｔｉ−Ｎｕｐ９８ ｈｙｂｒｉｄｏｍａ（受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１５５７）またはハイブリドーマ２１Ａ１０ Ａｎｔｉ−Ｎｕｐ９８ ｈｙｂｒｉｄｏｍａ（受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１５５６）。
【請求項３】
請求項１に記載のモノクローナル抗体の機能的断片。
【請求項４】
請求項１に記載のモノクローナル抗体の製造方法であって、請求項２に記載のハイブリドーマを増殖させる工程を含む製造方法。
【請求項５】
請求項１に記載のモノクローナル抗体の製造方法であって、請求項２に記載のハイブリドーマから該モノクローナル抗体をコードする遺伝子を単離し、該遺伝子を含む発現ベクターを構築し、該発現ベクターを宿主に導入して該モノクローナル抗体を発現させる工程を含む製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核膜孔タンパク質ヌクレオポリンの一つであるＮｕｐ９８を特異的に認識するモノクローナル抗体、該モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ、および該モノクローナル抗体の製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
真核細胞では、細胞核と細胞質とは核膜によって仕切られている。核膜（nuclear envelope）は、二枚の脂質二重層膜（lipid bilayer, membrane）、核ラミナ、および多数の核膜孔複合体（ＮＰＣ）から成る。ＮＰＣは、この二枚の膜（inner nuclear membrane, outer nuclear membrane）を貫くように形成された細胞構造で、核と細胞質の間の分子輸送を可能にする通路である。ＮＰＣは巨大なタンパク質複合体（酵母では約６０ＭＤａ、脊椎動物では１２５ＭＤａ）であり、ヌクレオポリン（Ｎｕｐ）と呼ばれる約３０種類の異なるタンパク質成分を含んでいる。
【０００３】
ヌクレオポリンのひとつであるＮｕｐ９８は、あらゆる真核生物の核膜孔に存在し、ｍＲＮＡの核外輸送および核タンパク質の核内輸送に関与する重要なタンパク質である。Ｎｕｐ９８のほとんどはＮＰＣに存在しているが、核の内部にもＮｕｐ９８が存在していることが知られている。核質内のＮｕｐ９８の機能は分かっていないが、遺伝子の発現に影響力を持つ可能性が考えられている。したがって、Ｎｕｐ９８は基礎生物学分野における重要な研究対象となっている、また、Ｎｕｐ９８の遺伝子に生じた変異は、急性白血病などの重篤な疾患を引き起すことが分かっており、病原遺伝子として病理学の対象としてもＮｕｐ９８は重要である。
【０００４】
したがって、幅広い生物種のＮｕｐ９８を認識するモノクローナル抗体は、基礎研究から病理学的研究までに適用できる汎用性の高い研究ツールとなり得る。しかしながら、従来の抗Ｎｕｐ９８抗体は、幅広い生物種のＮｕｐ９８を認識することができず、また抗原の検出力にも課題があった。例えば、ヒト由来の抗原から作製された抗Ｎｕｐ９８抗体である市販の２Ｈ１０モノクローナル抗体は、ヒト、マウス、ラットのＮｕｐ９８は検出できるが（非特許文献１）、テトラヒメナ・サーモフィラの大核に存在するＮｕｐ９８（ＭａｃＮｕｐ９８Ａ）を認識することはできなかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Fukuhara T et al., Specific monoclonal antibody against thenuclear pore complex protein, nup98. Hybridoma 24: 244-247 (2005)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、幅広い生物種のＮｕｐ９８を認識する抗Ｎｕｐ９８モノクローナル抗体、特に、テトラヒメナ・サーモフィラのＭａｃＮｕｐ９８Ａを認識する抗Ｎｕｐ９８モノクローナル抗体を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、上記課題を解決するために、以下の各発明を包含する。
［１］テトラヒメナ・サーモフィラの大核ヌクレオポリンＭａｃＮｕｐ９８Ａのアミノ酸配列（配列番号１）に存在するＧＬＦＧ（配列番号２）の少なくとも一部を含むエピトープに結合するモノクローナル抗体。
［２］ハイブリドーマ１３Ｃ２ Ａｎｔｉ−Ｎｕｐ９８ ｈｙｂｒｉｄｏｍａ（受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１５５７）またはハイブリドーマ２１Ａ１０ Ａｎｔｉ−Ｎｕｐ９８ ｈｙｂｒｉｄｏｍａ（受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１５５６）によって産生される前記［１］に記載のモノクローナル抗体。
［３］ハイブリドーマ１３Ｃ２ Ａｎｔｉ−Ｎｕｐ９８ ｈｙｂｒｉｄｏｍａ（受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１５５７）またはハイブリドーマ２１Ａ１０ Ａｎｔｉ−Ｎｕｐ９８ ｈｙｂｒｉｄｏｍａ（受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１５５６）。
［４］前記［１］に記載のモノクローナル抗体の機能的断片。
［５］前記［１］に記載のモノクローナル抗体の製造方法であって、前記［２］に記載のハイブリドーマを増殖させる工程を含む製造方法。
［６］前記［１］に記載のモノクローナル抗体の製造方法であって、前記［２］に記載のハイブリドーマから該モノクローナル抗体をコードする遺伝子を単離し、該遺伝子を含む発現ベクターを構築し、該発現ベクターを宿主に導入して該モノクローナル抗体を発現させる工程を含む製造方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、テトラヒメナ・サーモフィラのＭａｃＮｕｐ９８Ａを認識でき、同時にヒト、出芽酵母、分裂酵母等の幅広い生物種のＮｕｐ９８を認識できる抗Ｎｕｐ９８モノクローナル抗体、当該モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ、および当該モノクローナル抗体の製造方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】本発明の抗Ｎｕｐ９８モノクローナル抗体のテトラヒメナ・サーモフィラＭａｃＮｕｐ９８Ａに対する結合能を検討した結果を示す図であり、（Ａ）は間接免疫蛍光染色の結果を示し、（Ｂ）はウエスタンブロッティングの結果を示す図である。
【図２】（Ａ）はテトラヒメナ・サーモフィラのＭａｃＮｕｐ９８Ａのアミノ酸配列（配列番号１、全１１０５残基）の第１位〜第７００位のアミノ酸配列における抗原ペプチド（ペプチド１，２）およびマスキング実験に用いたオリゴペプチド（ＭＰ１〜３）の位置を示す図であり、（Ｂ）はエピトープマスキング実験の結果を示す図である。
【図３】ペプチドアレイを用いたエピトープマッピングの結果を示す図である。
【図４】本発明の抗Ｎｕｐ９８モノクローナル抗体のヒトＮｕｐ９８に対する結合能をＨｅＬａ細胞を用いて検討した結果を示す図であり、（Ａ）は間接免疫蛍光染色の結果を示し、（Ｂ）はウエスタンブロッティングの結果を示す図である。
【図５】本発明の抗Ｎｕｐ９８モノクローナル抗体の分裂酵母Ｎｕｐ９８ホモログに対する結合能をシゾサッカロミセス・ポンベ野生株ＡＹ１６０−１４Ｄを用いて検討した結果を示す図であり、（Ａ）は間接免疫蛍光染色の結果を示し、（Ｂ）はウエスタンブロッティングの結果を示す図である。
【図６】本発明の抗Ｎｕｐ９８モノクローナル抗体の出芽酵母Ｎｕｐ９８ホモログに対する結合能をサッカロミセス・セレビシエ野生株ＹＰＨ４９９を用いて検討した結果を示す図であり、（Ａ）は間接免疫蛍光染色の結果を示し、（Ｂ）はウエスタンブロッティングの結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明は、テトラヒメナ・サーモフィラの大核ヌクレオポリンＭａｃＮｕｐ９８Ａのアミノ酸配列（配列番号１、ACCESION No. BAI76949）に存在するＧＬＦＧ（配列番号２）の少なくとも一部を含むエピトープに結合するモノクローナル抗体を提供する。好ましくは、ハイブリドーマ１３Ｃ２ Ａｎｔｉ−Ｎｕｐ９８ ｈｙｂｒｉｄｏｍａ（受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１５５７）またはハイブリドーマ２１Ａ１０ Ａｎｔｉ−Ｎｕｐ９８ ｈｙｂｒｉｄｏｍａ（受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１５５６）によって産生されるモノクローナル抗体である。ハイブリドーマ１３Ｃ２ Ａｎｔｉ−Ｎｕｐ９８ ｈｙｂｒｉｄｏｍａ（受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１５５７）が産生するモノクローナル抗体は、ＦＧｘｘＮ（ｘは任意のアミノ酸残基）をエピトープとして認識し、ハイブリドーマ２１Ａ１０ Ａｎｔｉ−Ｎｕｐ９８ ｈｙｂｒｉｄｏｍａ（受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１５５６）は、ＧＬＦをエピトープとして認識することが確認されている。
【００１１】
ハイブリドーマ１３Ｃ２ Ａｎｔｉ−Ｎｕｐ９８ ｈｙｂｒｉｄｏｍａは、受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１５５７として、２１Ａ１０ Ａｎｔｉ−Ｎｕｐ９８ ｈｙｂｒｉｄｏｍａは受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１５５６として、それぞれ独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８（郵便番号２９２−０８１８））に寄託済みである（受託日：２０１３年３月１日）。これらのハイブリドーマも本発明に含まれる。
【００１２】
本発明には、上記本発明のモノクローナル抗体の機能的断片が含まれる。本発明における機能的断片は、上記本発明の抗体の一部分（部分断片）であって、テトラヒメナ・サーモフィラの大核ヌクレオポリンＭａｃＮｕｐ９８Ａのアミノ酸配列（配列番号１）に存在するＧＬＦＧ（配列番号２）の少なくとも一部を含むエピトープに結合する機能を維持しているものであればいかなるものでもよい。具体的には、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆｖ、ｓｃＦｖなどが挙げられる。
【００１３】
本発明のモノクローナル抗体は、公知の方法により製造することができる。例えば、ハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体、または、遺伝子組換え技術を用いて産生させる組換え抗体として製造することができる。モノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、例えば、テトラヒメナ・サーモフィラの大核ヌクレオポリンＭａｃＮｕｐ９８Ａを感作抗原として通常の免疫方法に従って哺乳動物を免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、目的のモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを取得することができる。
【００１４】
抗体取得の感作抗原としては、テトラヒメナ・サーモフィラの大核ヌクレオポリンＭａｃＮｕｐ９８Ａの全長タンパク質またはＧＬＦＧを含む部分断片であればよい。ＭａｃＮｕｐ９８Ａの全長タンパク質またはＧＬＦＧを含む部分断片は、公知の遺伝子組換え技術を用いて組換えタンパク質として作製することができる。また、部分断片は化学合成により作製することができる。
【００１５】
感作抗原で免疫される哺乳動物は、特に限定されるものではないが、細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく、例えば、マウス、ラット、ハムスター等のげっ歯類、ウサギ、サル等が使用される。抗原と、フロイントの完全もしくは不完全アジュバント、またはカリミョウバンのような助剤とを混合し、免疫原として動物に免疫する。免疫原の投与方法は、皮下注射、腹腔内注射、静脈内注射、皮内注射、筋肉内注射、足蹠注射などから適宜選択される。免疫は、一回または適当な間隔で（好ましくは３日間から１週間間隔で）複数回繰返し行うことができる。その後、免疫した動物の血清中の抗原に対する抗体価を測定し、抗体価が十分高くなった動物を抗体産生細胞の供給源として用いれば、以後の操作の効果を高めることができる。一般的には、最終免疫後３〜５日後の動物由来の抗体産生細胞を、後の細胞融合に用いることが好ましい。抗体価の測定法としては、放射性同位元素免疫定量法（ＲＩＡ法）、固相酵素免疫定量法（ＥＬＩＳＡ法）、蛍光抗体法、受身血球凝集反応法など種々の公知技術を用いることができる。
【００１６】
免疫された哺乳動物から得られる抗体産生細胞と融合する親細胞には、通常哺乳動物のミエローマ細胞が用いられる。ミエローマ細胞としては、公知の細胞株を好適に用いることができるが、一般的にはマウスから得られた株化細胞、例えば８−アザグアニン耐性マウスミエローマ株Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８Ｕ.１（Ｐ３−Ｕ１）（Yelton, D.E. et al., Current Topics in Microbiology and Immunology, 81, 1-7（1978））、Ｐ３／ＮＳＩ／１−Ａｇ４−１（ＮＳ−１）（Kohler, G. et al., European J. Immunology, 6, 511-519 （1976））、Ｓｐ２／Ｏ−Ａｇ１４（ＳＰ−２）（Shulman, M. et al., Nature, 276, 269-270（1978））、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３（６５３）（Kearney, J. F. et al., J. Immunology, 123, 1548-1550（1979））、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８（Ｘ６３）（Horibata, K. and Harris, A. W. Nature, 256, 495-497 （1975））などを用いることが好ましい。
【００１７】
抗体産生細胞は、形質細胞、およびその前駆細胞であるリンパ球であり、これは個体のいずれの部位から得てもよく、一般には脾、リンパ節、骨髄、扁桃、末梢血、またはこれらを適宜組み合わせたもの等から得ることができるが、脾細胞が最も一般的に用いられる。最終免疫後、所定の抗体価が得られたマウスから抗体産生細胞が存在する部位、例えば脾臓を摘出し、抗体産生細胞である脾細胞を調製する。この脾細胞とミエローマ細胞とを融合させる手段として現在最も一般的に行われているのは、ポリエチレングリコールを用いる方法である。この方法は、例えば以下の手順で行うことができる。
【００１８】
脾細胞とミエローマとを無血清培地（例えばＤＭＥＭ）、またはＰＢＳでよく洗浄し、脾細胞とミエローマの細胞数の比が５：１〜１０：１程度になるように混合し、遠心分離する。上清を除去し、沈澱した細胞群をよくほぐした後、撹拌しながら１ｍｌの５０％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール（分子量１０００〜４０００）を含む無血清培地を滴下する。その後、１０ｍｌの無血清培地をゆっくりと加えた後遠心分離する。再び上清を捨て、沈澱した細胞を適量のヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン（ＨＡＴ）液およびヒトインターロイキン−２（ＩＬ−２）を含む正常培地（ＨＡＴ培地）中に懸濁して培養用プレートの各ウェルに分注し、５％炭酸ガス存在下、３７℃で２週間程度培養する。途中適宜ＨＡＴ培地を補う。
【００１９】
ミエローマ細胞が８−アザグアニン耐性株、すなわちヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）欠損株である場合、融合しなかったミエローマ細胞およびミエローマ細胞どうしの融合細胞は、ＨＡＴ培地中では生存できない。また、融合しなかった抗体産生細胞および抗体産生細胞同士の融合細胞は増殖できない。したがって、ＨＡＴ培地での培養を続けることによって、抗体産生細胞とミエローマ細胞とのハイブリドーマのみが増殖し、結果的にハイブリドーマを選択することができる。コロニー状に生育してきたハイブリドーマについて、培地をＨＡＴ培地からアミノプテリンを除いた培地（ＨＴ培地）に変更する。以後、培養上清の一部を採取し、例えば、ＥＬＩＳＡ法によりＭａｃＮｕｐ９８Ａのアミノ酸配列に存在するＧＬＦＧを含むオリゴペプチドに対する抗体価を測定する。
【００２０】
抗体価測定により、ＭａｃＮｕｐ９８Ａのアミノ酸配列に存在するＧＬＦＧを含むオリゴペプチドを特異的に認識することが確認されたハイブリドーマを別のプレートに移しクローニングを行う。クローニング法としては、限界希釈法、軟寒天法、マイクロマニュピレーターによる方法、セルソーターによる方法などが挙げられるが、限界希釈法が簡便であり、よく用いられる。例えば限界希釈法によるクローニングを２〜４回繰返し、安定して抗体価の認められたハイブリドーマを選択し、産生されるモノクローナル抗体のエピトープを確認する。エピトープの同定は、例えば後述する実施例３に準じて行うことができる。
【００２１】
本発明の抗体を産生するハイブリドーマが選択できれば、培地を正常培地に換えて培養する。大量培養は、大型培養瓶を用いた回転培養またはスピナー培養で行うことができる。大量培養により得られる上清を、ゲル濾過カラム等、当業者に周知の方法を用いて精製することにより、本発明の抗体を得ることができる。また、同系統のマウスもしくはＮｕ／Ｎｕマウス、ラット、モルモット、ハムスターまたはウサギ等の腹腔内で当該ハイブリドーマを増殖させることにより、本発明の抗体を大量含む腹水を得ることができ、これを精製して本発明の抗体を得ることができる。
本発明の抗体を産生するハイブリドーマから抗体遺伝子をクローニングし、適当なベクターに組み込んで、このベクターを宿主に導入して組換え抗体を製造することも可能である（例えば、Vandamme, A. M. et al., Eur. J. Biochem.（1990）192, 767-775, 1990参照）。
【００２２】
本発明のモノクローナル抗体は、ヒトから単細胞真核生物のテトラヒメナまで幅広い生物のＮｕｐ９８によく保存されているＧＬＦＧの少なくとも一部を含むエピトープに結合することから、テトラヒメナ・サーモフィラのＭａｃＮｕｐ９８Ａを認識できるだけでなく、幅広い生物種のＮｕｐ９８を認識できると考えられる。本発明者らは、少なくともヒトＮｕｐ９８、分裂酵母のＮｕｐ９８ホモログ、出芽酵母のＮｕｐ９８ホモログを認識できることが確認している。
本発明のモノクローナル抗体は、免疫染色やウエスタンブロッティングにおいて、従来市販されている抗体より検出力が高いので、基礎生物学における研究ツールとして非常に有用である。
【実施例】
【００２３】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２４】
〔実施例１：抗Ｎｕｐ９８モノクローナル抗体の作製〕
テトラヒメナ・サーモフィラの大核ヌクレオポリンＭａｃＮｕｐ９８Ａのアミノ酸配列（配列番号１）に含まれる以下の２種類のペプチドを、ペプチド合成機を用いて合成した。
ペプチド１：MFGNTGGGGLFGNTQTQQTGGGLFGQPQQ（配列番号３）
ペプチド２：SNPTQGGGLFGAANPGLGG（配列番号４）
ペプチド１は配列番号１の第１位〜第２９位であり、ペプチド２は配列番号１の第６４６位〜第６６４位である。いずれのペプチドもＣ末端にシステインを付加したものを合成し、このシステインを介してキーホールリンペットヘモシアニンと結合させた。２種類のペプチドを混合し、５０μｇペプチド／１００μＬ／投与の投与量でフロイント完全アジュバントと共にマウスの脚部皮下に投与した。投与は３週間間隔で２回行った。
【００２５】
最終投与の３日後にマウスから脾臓を採取し脾細胞を調製した。得られた脾細胞とマウスミエローマ細胞（p3X63Ag8.653）とを、ポリエチレングリコール法にて細胞融合し、ＨＡＴ培地で培養して融合細胞を選択した。一次スクリーニングは、ＥＬＩＳＡ法にて行った。すなわち、各５０ｎｇ／ｗｅｌｌのペプチド１およびペプチド２を結合したＢＳＡでコーティングされた９６ウェルプレート（ペプチド１およびペプチド２を結合したＢＳＡ溶液（１μｇ／ｍＬ）をそれぞれ５０μＬずつウェルに添加）を用いてＥＬＩＳＡを行った。陽性クローンについて二次スクリーニングを行った。二次スクリーニングでは、テトラヒメナ・サーモフィラ細胞の間接免疫蛍光染色を行い、蛍光シグナルが細胞の大核表面に現れるものを選択した。二次スクリーニングで選択したクローンを、限界希釈法でサブクローニングし、ＥＬＩＳＡで確認して抗Ｎｕｐ９８モノクローナル抗体を得た。得られた抗Ｎｕｐ９８モノクローナル抗体について、アイソタイピングキット（AbD Serotec社製）を用いてアイソタイプを決定した。
【００２６】
最終的に２クローンのハイブリドーマを選択し、１３Ｃ２ Ａｎｔｉ−Ｎｕｐ９８ ｈｙｂｒｉｄｏｍａおよび２１Ａ１０ Ａｎｔｉ−Ｎｕｐ９８ ｈｙｂｒｉｄｏｍａと名付けた。１３Ｃ２および２１Ａ１０のアイソタイプはいずれもＩｇＧ１であった。１３Ｃ２ Ａｎｔｉ−Ｎｕｐ９８ ｈｙｂｒｉｄｏｍａは、受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１５５７として、２１Ａ１０ Ａｎｔｉ−Ｎｕｐ９８ ｈｙｂｒｉｄｏｍａは受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１５５６として、それぞれ独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８（郵便番号２９２−０８１８））に寄託済みである（受託日：２０１３年３月１日）。
【００２７】
モノクローナル抗体を濃縮するために、ＧＩＴ培地（和光純薬）を用いてハイブリドーマを増殖させ、培養液を回収して、最終濃度が５５％となるように硫安を添加した。生じた沈殿物を遠心分離によって回収し、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）に溶解し、１００ｋＤａカットオフフィルター（メルクミリポア）を通した遠心分離により脱塩した。以下、１３Ｃ２ Ａｎｔｉ−Ｎｕｐ９８ ｈｙｂｒｉｄｏｍａが産生したモノクローナル抗体を１３Ｃ２と称し、２１Ａ１０ Ａｎｔｉ−Ｎｕｐ９８ ｈｙｂｒｉｄｏｍａが産生したモノクローナル抗体を２１Ａ１０と称する。
【００２８】
〔実施例２：抗Ｎｕｐ９８モノクローナル抗体１３Ｃ２および２１Ａ１０のテトラヒメナ・サーモフィラＭａｃＮｕｐ９８Ａに対する結合能〕
（１）実験材料
テトラヒメナ・サーモフィラＩｎｂｒｅｄ Ｂ ｓｔｒａｉｎ ＣＵ４２７細胞（野生型の表現型）をテトラヒメナストックセンターから入手し、１．５％のプロテオースペプトン（BD Difco）、０．５％酵母抽出物および０．５％Ｄ−グルコースを含む培地をプラスチックディッシュに浅く入れ、３０℃で振盪または撹拌せずに維持した。
【００２９】
（２）間接免疫蛍光染色
間接免疫蛍光染色を行うために、Ｉｗａｍｏｔｏら（Iwamoto M. et al., Curr Biol 2009;19:843‐847.）に記載に従い、テトラヒメナ・サーモフィラ細胞を冷メタノール（−３０℃）で３０分間固定した。ＰＢＳで洗浄した後、固定試料を１％ＢＳＡで２時間、室温でブロッキングした。１３Ｃ２および２１Ａ１０は、０．５μｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳで希釈した。市販の抗Ｎｕｐ９８ラットモノクローナル抗体２Ｈ１０も同様に０．５μｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳで希釈した。ブロッキング試料を一夜４℃、一次抗体で処理した。１３Ｃ２および２１Ａ１０の二次抗体には、Ａｌｅｘａ４８８標識抗マウスＩｇＧ抗体を、２Ｈ１０の二次抗体には、Ａｌｅｘａ４８８標識抗ラットＩｇＧ抗体を、それぞれ４μｇ／ｍＬで用いた。最後に、ＤＮＡをＤＡＰＩ（4',6-diamidino-2-phenylindole）で染色した。各処理の後、試料をＰＢＳで３回洗浄してから次の処理に供した。ＤｅｌｔａＶｉｓｉｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ ｓｙｓｔｅｍ（Applied Precision）でコントロールされたオリンパス蛍光顕微鏡（IX-70）を用いて蛍光画像を得た。
【００３０】
（３）ウエスタンブロッティング
テトラヒメナ・サーモフィラ細胞を冷メタノール（−３０℃）で３０分間固定し、０．１Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ６．８）で洗浄した。固定細胞をＳＤＳサンプルバッファー（２％ＳＤＳ、１０％グリセロール、０．０２５％ブロモフェノールブルー、６０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ６．８）中で超音波処理により溶解した。ジチオスレイトール（ＤＴＴ）を、試料に最終濃度が２０ｍＭとなるように添加し、７０℃で１５分間加熱した。試料を１０％アクリルアミドゲル（０．１３％ビス−アクリルアミドで作製）にロードし、３０ｍＡでＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。
【００３１】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥの後、０．８ｍＡ／ｃｍ２で２時間の条件でセミドライブロッティング装置を用いてタンパク質をＰＶＤＦ膜に転写した。転写後の膜を、５％スキムミルク（溶媒は０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）を含むＰＢＳ、以下ＰＢＳ−Ｔ）を用いて、３時間室温でブロッキングした。続いて、膜を１％スキムミルクを含んだＰＢＳで０．４μｇ／ｍＬに希釈したモノクローナル抗体（１３Ｃ２、２１Ａ１０および２Ｈ１０）で、一晩４℃でインキュベートした。膜の洗浄（ＰＢＳ−Ｔで１０分間）を３回行い、０．４μｇ／ｍＬに希釈したＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体（Ｃａｐｐｅｌ社、１３Ｃ２、２１Ａ１０用）またはＨＲＰ標識抗ラットＩｇＧ抗体（Ｃａｐｐｅｌ社、２Ｈ１０用）で、２時間室温でインキュベートした。次に、膜をイムノスター試薬（登録商標、和光純薬）で１分間インキュベートし、化学発光シグナルをイメージアナライザーによって検出した。
【００３２】
（４）結果
結果を図１（Ａ）、（Ｂ）に示した。（Ａ）は間接免疫蛍光染色の結果、（Ｂ）はウエスタンブロッティングの結果である。（Ａ）の上段はモノクローナル抗体による染色画像、中段はＤＡＰＩによる染色画像、下段は上段と中段の合成画像である。図１（Ａ）から明らかなように、１３Ｃ２および２１Ａ１０はテトラヒメナ・サーモフィラの大核を染色した。一方、従来の２Ｈ１０はテトラヒメナ・サーモフィラの大核を染色しなかった。また、図１（Ｂ）から明らかなように、１３Ｃ２および２１Ａ１０はテトラヒメナ・サーモフィラのＭａｃＮｕｐ９８Ａ（図１（Ｂ）の矢頭の位置）を検出したが、従来の２Ｈ１０はＭａｃＮｕｐ９８Ａを検出しなかった。なお、図１（Ｂ）の菱形およびアスタリスクは未確認タンパク質である。
【００３３】
〔実施例３：エピトープ解析〕
（１）エピトープマスキング実験
ハイブリドーマの培養上清を抗体フラクションとして用いた。合成オリゴペプチドＧＧＧＧＬＦＧＮＴＱ（ＭＰ１、配列番号５）、ＴＧＧＧＬＦＧＱＰＱ（ＭＰ２、配列番号６）またはＱＧＧＧＬＦＧＡＡＮ（ＭＰ３、配列番号７）のそれぞれの等量と混合し、ＰＢＳに１ｍｇ／ｍＬで溶解し、その後、室温で３０分間インキュベートした。これらのアミノ酸配列は、免疫に用いたペプチド１およびペプチド２の中に存在するＧＬＦＧ周辺の配列から選択した。３０分間のインキュベーション後、混合液をＰＢＳで５倍に希釈し、固定およびブロッキングされたテトラヒメナ・サーモフィラ細胞に適用した。二次抗体には、Ａｌｅｘａ４８８標識抗マウスＩｇＧ抗体を用いた。
【００３４】
図２（Ａ）に、テトラヒメナ・サーモフィラのＭａｃＮｕｐ９８Ａのアミノ酸配列（配列番号１、全１１０５残基）の第１位〜第７００位のアミノ酸配列を示し、実施例１においてマウスの免疫に用いたペプチド１およびペプチド２の位置、およびマスキングに用いた合成オリゴペプチド（ＭＰ１〜３）の位置を示した。
エピトープマスキング実験を図２（Ｂ）に示した。図２（Ｂ）中、Ｗ／Ｏ ｐｅｐｔｉｄｅはマスキングなしを表す。図２（Ｂ）からわかるように、１３Ｃ２はＭＰ１およびＭＰ２により部分的にマスキングされ、ＭＰ３により完全にマスキングされた。この結果から、１３Ｃ２のエピトープは共通配列ＧＬＦＧの外側に存在することが示唆された。一方、２１Ａ１０はＭＰ１〜３のいずれを用いても完全にマスキングされた。この結果は、２１Ａ１０のエピトープはＭＰ１〜３に共通のＧＧＧＬＦＧ（配列番号８）の内部に存在することが示唆された。
【００３５】
（２）ペプチドアレイを用いたエピトープマッピング
合成ペプチドアレイ膜はＪＰＴ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社から購入した。ＭＰ−１、ＭＰ−２およびＭＰ−３に基づいて、１０残基からなる連続するオリゴペプチドをデザインし、５ｎｍｏｌの各オリゴペプチドがスポットに共有結合されている合成ペプチドアレイ膜を用いた。ペプチドアレイ膜を数秒間メタノール処理し、ＰＢＳで３回洗浄した。５％スキムミルクを含んだＰＢＳで３時間ブロッキングし、次にブロッキング液で５倍に希釈したハイブリドーマの培養上清で３時間処理した。ＰＢＳで３回洗浄した後、二次抗体（ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体、Ｃａｐｐｅｌ社）で２時間インキュベーションした。すべての作業は室温で行った。実施例２のウエスタンブロッティングの検出と同様の方法で、イメージアナライザーを用いてシグナルを検出した。
【００３６】
図３に結果を示した。上段が１３Ｃ２の結果であり、下段が２１Ａ１０の結果である。図３からわかるように、１３Ｃ２は配列ＦＧＡＡＮ（配列番号９）を共通に持つスポットに反応した。この５つのアミノ酸残基のうち５番目のＮが強い認識に必須である。それは、スポット５のＮを持たないＴＱＧＧＧＬＦＧＡＡ（配列番号１０）をほとんど認識していないからである。１３Ｃ２がヒトおよび酵母のＮｕｐ９８を認識できたこと、およびヒトおよび酵母のＮｕｐ９８にはＦＧＡＡＮはないが、ＦＧｘｘＮ（ｘは任意のアミノ酸残基）があることから、１３Ｃ２のエピトープはＦＧｘｘＮ（ｘは任意のアミノ酸残基）であると決定した。
一方、２１Ａ１０はＧＬＦを有するすべてのスポットに反応した。この結果は、上記エピトープマスキング実験の結果とよく一致しており、２１Ａ１０のエピトープはＧＬＦであると決定した。
【００３７】
〔実施例４：抗Ｎｕｐ９８モノクローナル抗体１３Ｃ２および２１Ａ１０のヒトＮｕｐ９８に対する結合能〕
（１）実験材料
ＨｅＬａ細胞は理研バイオリソースセンターから入手し、Ｈａｒａｇｕｃｈｉらの方法（Haraguchi T. et al., J Cell Sci 2000;113:779‐794.）に従い、１０％子牛血清を含むＤＭＥ培地（Gibco）を用いて３７℃、５％ＣＯ２環境下で維持した。
【００３８】
（２）間接免疫蛍光染色
ＨｅＬａ細胞は、ガラス底培養皿（MatTek）で２日間培養した後、上記Ｈａｒａｇｕｃｈｉらの方法に従い、冷メタノール（−３０℃）で３０分間固定した。以後の操作は、実施例２と同様に行った。
【００３９】
（３）ウエスタンブロッティング
セルスクレーパーを用いてＨｅＬａ細胞を培養皿から剥がし、低速遠心で細胞を集めた。ＰＢＳで洗浄後、細胞をＳＤＳサンプルバッファー中で超音波処理により溶解した。以後の操作は、実施例２と同様に行った。
【００４０】
（４）結果
結果を図４（Ａ）、（Ｂ）に示した。（Ａ）は間接免疫蛍光染色の結果、（Ｂ）はウエスタンブロッティングの結果である。（Ａ）の上段はモノクローナル抗体による染色画像、中段はＤＡＰＩによる染色画像、下段は上段と中段の合成画像である。図４（Ａ）から明らかなように、１３Ｃ２、２１Ａ１０および２Ｈ１０は、いずれもＨｅＬａ細胞の核表面を染色した。２１Ａ１０は、従来抗ヒトＮｕｐ９８抗体として使用されている２Ｈ１０よりも核表面の染色が強く、かつ、バックグラウンドが低かった。
また、図４（Ｂ）から明らかなように、１３Ｃ２は約９５ｋＤａのバンドを検出した。２Ｈ１０も同様に約９５ｋＤａのバンドを検出したことから、１３Ｃ２はウエスタンブロッティングによりヒトＮｕｐ９８を認識することが示された。１３Ｃ２によるヒトＮｕｐ９８の検出力は、従来使用されている２Ｈ１０より高かった。２１Ａ１０は、いずれのタンパク質とも反応しなかった。
これらの結果から、ＨｅＬａ細胞において、１３Ｃ２はウエスタンブロッティング用のモノクローナル抗体として適しており、２１Ａ１０は間接免疫蛍光染色用のモノクローナル抗体として適していることが示された。
【００４１】
〔実施例５：抗Ｎｕｐ９８モノクローナル抗体１３Ｃ２および２１Ａ１０の分裂酵母Ｎｕｐ９８ホモログに対する結合能〕
（１）実験材料
分裂酵母としてシゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombeと記す）野生株ＡＹ１６０−１４Ｄを使用した。シゾサッカロミセス・ポンベはＮｕｐ９８のホモログを発現し、当該ホモログはＮ末端側にＧＬＦＧ配列を有することが知られている（Tange Y. et al., J Cell Sci 2002;115:4375‐4385、Iwamoto M. et al., Genes Cells 2010;15:661‐669、Asakawa H. et al., Curr Biol 2010;20:1919‐1925.）。培地にはＹＥＳ培地を用いた。
【００４２】
（２）間接免疫蛍光染色
分裂酵母は４％ホルムアルデヒドで１０分間固定し、０．６ｍｇ／ｍＬのＺｙｍｏｌｙａｓｅ１００Ｔ（ナカライテスク）で３６℃７０分間処理して、Ｈａｇａｎらの方法（Hagan I. et al., J Cell Biol 1995;129:1033‐1047.）に従い、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で１分間透過処理した。以後の操作は、実施例２と同様に行った。
【００４３】
（３）ウエスタンブロッティング
分裂酵母は１ｍＭのＰＭＳＦ（phenylmethanesulfonyl fluoride）を含有するＹＥＳ培地を用いて、抽出物調製前５分間培養した。４Ｍ尿素、２．５％ＳＤＳ、０．０５ｍＭ ＥＤＴＡを含む１００ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ６．８）に細胞を懸濁し、マルチビーズショッカー（登録商標、安井器械）を用いてガラスビーズで細胞を破壊した。試料を遠心分離し、上清を全細胞抽出物として使用した。
【００４４】
（４）結果
結果を図５（Ａ）、（Ｂ）に示した。（Ａ）は間接免疫蛍光染色の結果、（Ｂ）はウエスタンブロッティングの結果である。（Ａ）の上段はモノクローナル抗体による染色画像、中段はＤＡＰＩによる染色画像、下段は上段と中段の合成画像である。図５（Ａ）から明らかなように、１３Ｃ２、２１Ａ１０および２Ｈ１０は、いずれも分裂酵母の核表面を染色し、同様の点状のパターンを示した。
また、図５（Ｂ）から明らかなように、１３Ｃ２、２１Ａ１０および２Ｈ１０はいずれも約１１０ｋＤａのバンド（Ｎｕｐ９８遺伝子産物）を検出した。
【００４５】
〔実施例６：抗Ｎｕｐ９８モノクローナル抗体１３Ｃ２および２１Ａ１０の出芽酵母Ｎｕｐ９８ホモログに対する結合能〕
（１）実験材料
出芽酵母としてサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）野生株ＹＰＨ４９９を使用した。シゾサッカロミセス・ポンベはＮｕｐ９８のホモログであるＮｕｐ１１６、Ｎｕｐ１００およびＮｕｐ１４５Ｎを発現し、当該ホモログはＮ末端側にＧＬＦＧ配列を有することが知られている（Wente SR and Blobel G, J Cell Biol 1994;125:955‐969、Fabre E. et al., Cell 1994;78:275‐289.）。培地にはＹＰＤＡ培地（Clontech）を用いた。
【００４６】
（２）間接免疫蛍光染色
出芽酵母は４％ホルムアルデヒドで１０分間固定し、４％ホルムアルデヒドおよび１０％メタノールを含有する０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８）で、室温で３０分間固定し、０．１ｍｇ／ｍＬのＺｙｍｏｌｙａｓｅ１００Ｔ（ナカライテスク）および０．５ｍｇ／ｍＬのｌｙｓｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ（Sigma Aldlich）を含むＰＥＭＳ緩衝液（100 mM PIPES, 1 mM EGTA, 1 mM magnesium chloride, 1.2 M sorbitol）で、室温で３０分間処理した。１０００ｒｐｍ、１分間の条件でサイトプロ（Wescor Inc.）を用いて、細胞をポリ−Ｌ−リジンコーティングしたカバースリップ上に載せ、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含むＰＥＭＳ緩衝液で１分間透過処理した。以後の操作は、実施例２と同様に行った。
【００４７】
（３）ウエスタンブロッティング
出芽酵母は１ｍＭのＰＭＳＦ（phenylmethanesulfonyl fluoride）を含有するＹＰＤＡ培地を用いて、抽出物調製前５分間培養した。４Ｍ尿素、２．５％ＳＤＳ、０．０５ｍＭ ＥＤＴＡを含む１００ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ６．８）に細胞を懸濁し、マルチビーズショッカー（登録商標、安井器械）を用いてガラスビーズで細胞を破壊した。試料を遠心分離し、上清を全細胞抽出物として使用した。
【００４８】
（４）結果
結果を図６（Ａ）、（Ｂ）に示した。（Ａ）は間接免疫蛍光染色の結果、（Ｂ）はウエスタンブロッティングの結果である。（Ａ）の上段はモノクローナル抗体による染色画像、中段はＤＡＰＩによる染色画像、下段は上段と中段の合成画像である。図５（Ａ）から明らかなように、１３Ｃ２、２１Ａ１０および２Ｈ１０は、いずれも出芽酵母の核表面を染色し、典型的なヌクレオポリン染色パターンを示した。
また、図５（Ｂ）より、１３Ｃ２、２１Ａ１０および２Ｈ１０は、いずれもＮｕｐ１１６（１１６ｋＤａ）およびＮｕｐ１４５Ｎ（６５ｋＤａ）を検出した。１３Ｃ２と２Ｈ１０は、Ｎｕｐ１００（１００ｋＤａ）を検出した。２１Ａ１０と２Ｈ１０は、５７ｋＤａおよび４９ｋＤａの２つのバンド（Ｎｕｐ５７およびＮｕｐ４９に該当すると考えられる）をさらに検出した。１３Ｃ２はさらに２種類の未確認タンパク質（図中アスタリスク）を検出した。
【００４９】
なお本発明は上述した各実施形態および実施例に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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