(57)【要約】      （修正有）【課題】エクジソン受容体複合体ベース遺伝子調節システムを改善する新規化合物の提供。【解決手段】下式で示されたジアシルヒドラジン・リガンド化合物。2014111634.tif 000142（ＸとＸ’は独立してＯ又はＳ、Ａは非置換又は置換フェニル及びベンゾ縮合ヘテロ環、Ｂは非置換又は置換フェニル、1-3窒素原子及び3-5核炭素原子を持つ非置換6員環ヘテロサイクル又は置換６員環ヘテロサイクル等、ＧはＨ又はＣＮ、Ｅは非置換又は置換アルキル、該置換アルキルはヒドロキシ；(C1-C6)アルコキシ；(C1-C6)アルカノイルオキシ(‐OCORa)；フォルミル；各アルキル・グループに独立に定まった数の炭素原子を持つ(C1-C6)トリアルキルシリルオキシ；‐C=N-OH;‐C=N-NHC(O)NH2；又は‐C=N-NHC(O)C(O)NH2等で置換）【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の一般式を持つ化合物であり、
【化１】
2014111634.tif 000134
ここでＸとＸ’は独立してＯ又はＳであり、
Aは非置換又は置換フェニルで、置換体は独立して１から５までのH;ハロ；ニトロ；シアノ；ヒドロキシ；アミノ(‐NRaRb)；アルキルアミノアルキル(‐(CH2)ｎNRaRb)；(C1-C6)アルキル；(C1-C6)ハロアルキル；(C1-C6)シアノアルキル；(C1-C6)ヒドロキシアルキル；(C1-C6)アルコキシ；フェノキシ；(C1-C6)ハロアルコキシ；(C1-C6)アルコキシ(C1-C6)アルキル；(C1-C6)アルケニルオキシ(C1-C6)アルキル；(C1-C6)アルコキシ(C1-C6)アルコキシ；(C1-C6)アルカノイルオキシ(C1-C6)アルキル；ハロ、シアノ、(C1-C4)アルキル、又は(C1-C4)アルコキシで選択的に置換した(C2-C6)アルケニル；ハロ又は(C1-C4)アルキルで選択的に置換した(C2-C6)アルキニル；フォルミル；カルボキシ；(C1-C6)アルキルカルボニル；(C1-C6)ハロアルキルカルボニル；ベンゾイル；(C1-C6)アルコキシカルボニル；(C1-C6)ハロアルコキシカルボニル；(C1-C6)アルカノイルオキシ(‐OCORa)；カルボキシアミド(‐CONRaRb)；アミド(‐N RaCORb)；アルコキシカルボニルアミノ(‐NRaCO2Rb)；アルキルアミノカルボニルアミノ(‐N RaCONRbRc)；メルカプト；(C1-C6)アルキルチオ；(C1-C6)アルキルスルホニル；(C1-C6)アルキルスルホニル(C1-C6)アルキル；(C1-C6)アルキルスルホキシド(‐S(O)Ra)；(C1-C6)アルキルスルホキシド(C1-C6)アルキル(‐(CH2)ｎS(O)Ra)；フルファミド(‐SO2NRaRb)；‐SO3H；又は非置換又は置換フェニルで、置換体は独立して１から3までのハロ、ニトロ、(C1-C6)アルコキシ、(C1-C6)アルキル、又はアミノ；あるいはフェニル環の隣接する2つの位置の１つ又は両方が置換される場合、付着している原子は、(‐OCH2O)、(‐OCH(CH3)O-)、(‐CH2CH2O-)、(‐OCH(CH3)CH2O -)、(‐S- CH=N -)、(‐CH2OCH2O‐)、(‐O(CH2)3‐)、(＝N-O-N=)、(‐C=CH-NH-)、(‐OCF2O-)、(‐N-CH=N-)、(‐CH2CH2O-)、及び(‐(CH2)4) からなるグループから選ばれた連結のフェニル結合末端を形成する場合があり、
Bは、
(a)非置換又は置換フェニルで、置換体は独立して１から５までのH; ハロ；ニトロ；シアノ；ヒドロキシ；アミノ(‐NRaRb)；アルキルアミノアルキル(‐(CH2)ｎNRaRb)；(C1-C6)アルキル；(C1-C6)ハロアルキル；(C1-C6)シアノアルキル；(C1-C6)ヒドロキシアルキル；(C1-C6)アルコキシ；フェノキシ；(C1-C6)ハロアルコキシ；(C1-C6)アルコキシ(C1-C6)アルキル；(C1-C6)アルケニルオキシ(C1-C6)アルキル；(C1-C6)アルコキシ(C1-C6)アルコキシ；(C1-C6)アルカノイルオキシ(C1-C6)アルキル；ハロ、シアノ、(C1-C4)アルキル、又は(C1-C4)アルコキシで選択的に置換した(C2-C6)アルケニル；ハロ又は (C1-C4)アルキルで選択的に置換した(C2-C6)アルキニル；フォルミル；カルボキシ；(C1-C6)アルキルカルボニル；(C1-C6)ハロアルキルカルボニル；ベンゾイル；(C1-C6)アルコキシカルボニル；(C1-C6)ハロアルコキシカルボニル；(C1-C6)アルカノイルオキシ(‐OCORa)；カルボキシアミド(‐CONRaRb)；アミド(‐N RaCORb)；アルコキシカルボニルアミノ (‐NRaCO2Rb)；アルキルアミノカルボニルアミノ(‐N RaCONRbRc)；メルカプト；(C1-C6)アルキルチオ；(C1-C6)アルキルスルホニル；(C1-C6)アルキルスルホニル(C1-C6)アルキル；(C1-C6)アルキルスルホキシド(‐S(O)Ra)；(C1-C6)アルキルスルホキシド(C1-C6)アルキル(‐(CH2)ｎS(O)Ra)；フルファミド(‐SO2NRaRb)；‐SO3H；又は非置換又は置換フェニルで、置換体は独立して１から3までのハロ、ニトロ、(C1-C6)アルコキシ、(C1-C6)アルキル、又はアミノ；あるいはフェニル環の隣接する2つの位置の１つ又は両方が置換される場合、付着している原子は、(‐OCH2O‐)、(‐OCH(CH3)O-)、(‐CH2CH2O-)、(‐OCH(CH3)CH2O -)、(‐S- CH=N -)、(‐CH2OCH2O‐)、(‐O(CH2)3‐)、(＝N-O-N=)、(‐C=CH-NH-)、(‐OCF2O-)、(‐NH-CH=N-)、(‐CH2CH2O-)、及び(‐(CH2)4‐)からなるグループから選ばれた連結のフェニル結合末端を形成する場合があり；
(ｂ)1-3窒素原子及び3-5核炭素原子を持つ非置換6員環ヘテロサイクル又は置換６員環ヘテロサイクルで、置換体は１から3までの同じ又は異なるハロ；ニトロ；ヒドロキシ；(C1-C6)アルキル；(C1-C6)アルコキシ；(C1-C6)チオアルコキシ；カルボキシ；(C1-C6)アルコキシカルボニル；(C1-C6)カルボキシアルキル；各アルキル・グループに独立に定まった数の炭素原子を持つ(C1-C6)アルコキシカルボニルアルキル；‐CONRaRb；アミノ；(C1-C6)アルキルアミノ；各アルキル・グループに独立に定まった数の炭素原子を持つ(C1-C6)ジアルキルアミノ；‐CF3を含むハロアルキル；‐C=N-NHC(O)NRaRb)；又は‐C=N-NHC(O)C(O)NRaRb)；あるいは
(ｃ)５−ベンズイミダゾリル；１−トリチル‐５−ベンズイミダゾリル；３−トリチル‐５−ベンズイミダゾリル；１H-インダゾール‐３‐イル；１‐トリチル‐１H‐インダゾール‐３‐イル；又は１‐(C1-C6)アルキル‐１H‐インドール‐2‐イル；  Eは非置換又は置換(C4-C10)側鎖アルキルであり、置換体は独立に1−4シアノ；ハロ；(C5-C6)シクロアルキル；フェニル；(C2-C3)アルケニル；ヒドロキシ；(C1-C6)アルコキシ；カルボキシ；(C1-C6)アルコキシカルボニル；(C1-C6)アルカノイルオキシ(‐OCORa)；フォルミル；各アルキル・グループに独立に定まった数の炭素原子を持つ(C1-C6)トリアルキルシリルオキシ；‐C=N-ORa；‐C=N-Rd；‐C=N-NHC(O)NRaRb；又は‐C=N-NHC(O)C(O) N RaRb；
ここで、Ra、Rb、及びRｃは独立にH、(C1-C6)アルキル、又はフェニルであり；Rdはヒドロキシ(C1-C6)アルキル；及びｎ＝1-4；そして
GはH又はCN；
もし、
１）Eが非置換又は置換(C4-C10)側鎖アルキルで、置換体が独立に1-4シアノ；ハロ；(C2-C3)アルケニル；カルボキシ；又は(C1-C6)アルコキシカルボニルの場合、
Bは、
(a)  少なくとも１つの‐C=N-NHC(O)NRaRb又は‐C=N-NHC(O)C(O)N RaRbグループを持つ置換フェニル；
(b)  少なくとも1つのハロアルキル・グループを持ち、1-3窒素原子及び3-5核炭素原子を有する置換６員環へテロサイクル；
又は
(c)  ５−ベンズイミダゾリル；１−トリチル‐５−ベンズイミダゾリル；３−トリチル‐５−ベンズイミダゾリル；１H-インダゾール‐３‐イル；１‐トリチル‐１H‐インダゾール‐３‐イル；又は１‐(C1-C6)アルキル‐１H‐インドール‐2‐イル；
ここで、Ra、Rbは独立にH、(C1-C6)アルキル、又はフェニルであり；あるいは
２）Eがフェニル、ヒドロキシ、(C1-C6)アルコキシ、又はフォルミルのうち少なくとも１つを有する置換(C4-C10)側鎖アルキルの場合、
Bは、
(a)  少なくとも１つのC=N-NHC(O)N RaRb又は‐C=N-NHC(O)C(O)N RaRbグループを持つ置換フェニル；
(b)  1-3窒素原子及び3-5核炭素原子を有する置換又は非置換の６員環へテロサイクル；又は
(ｃ)  ５−ベンズイミダゾリル；１−トリチル‐５−ベンズイミダゾリル；３−トリチル‐５−ベンズイミダゾリル；１H-インダゾール‐３‐イル；１‐トリチル‐１H‐インダゾール‐３‐イル；又は１‐(C1-C6)アルキル‐１H‐インドール‐2‐イル；
ここで、Ra、Rbは独立にH、(C1-C6)アルキル、又はフェニルである、
化合物
【請求項２】
請求項１に記載の化合物であり、XとX’がO、GはHである、化合物。
【請求項３】
請求項２に記載の化合物であり、
前記化合物は
3,5-ジメチル安息香酸N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-N-(2-ヒドロキシイミノ-1,1-ジメチル-エチル)-ヒドラジド、
酢酸2-[N-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジノ]-2-メチル-プロピルエステル、
2-エチル-3-メトキシ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(1-メチル-１H-インドール-2-カルボニル)-ヒドラジド、
3-(H2NC(O)NHN=CH)-5-メチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-(H2NC(O)C(O)NHN=CH)-5-メチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2-メトキシ-6-トリフルオロメチル-ニコチン酸N-tert-ブチル-N’-(3-メトキシ-2-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-メトキシ-2-メチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(1-メチル-オキソ-6-トリフルオロメチル-1,2-ジヒドロ-ピリジン-3-カルボニル)-ヒドラジド、
2-メトキシ-ニコチン酸N-(2,2-ジメチル-1-フェニル-プロピル)-N’-(4-エチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
１H-ベンゾイミダゾール-5-カルボン酸N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
1-(又は3-)トリチル-１H-ベンゾイミダゾール-5-カルボン酸N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
1H-インダゾール-3-カルボン酸N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
1-トリチル-1H-インダゾール-3-カルボン酸N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド
3,5-ジメチル安息香酸N-[2-(tert-ブチル-ジメチル-シラニルオキシ)-1,1-ジメチル-エチル]-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-N-[2-(2-ヒドロキシ-エチルイミノ)-1,1-ジメチル-エチル]ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N-[(H2NC(O)NHN=C)(CH3)2C-]-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、及び
3,5-ジメチル安息香酸N-[(H2NC(O)C(O)NHN=C)(CH3)2C-]-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
から構成されるグループから選らばれる、
化合物。
【請求項４】
宿主細胞に於いて標的遺伝子の発現を調節する方法であり、
前記宿主細胞は、
（i）トランスアクティベーション・ドメイン、
（ii）DNA結合ドメイン、及び
（iii）グループH核受容体リガンド結合ドメイン、
を含む、第1ポリペプチドをコード化する第1ポリヌクレオチドを含む第1遺伝子発現カセット、並びに
（i）前記DNA結合ドメインに結合できる応答要素、
（ii）前記トランスアクティベーション・ドメインにより活性化されるプロモーター、及び
（iii）前記標的遺伝子、
を含む、第2遺伝子発現カセットを含み、
前記方法は、前記宿主細胞と、
（１）以下の式の化合物、
【化２】
2014111634.tif 000135
ここでＸとＸ’は独立してＯ又はＳであり、
Aは非置換又は置換フェニルで、置換体は独立して１から５までのH;ハロ；ニトロ；シアノ；ヒドロキシ；アミノ(‐NRaRb)；アルキルアミノアルキル(‐(CH2)ｎNRaRb)；(C1-C6)アルキル；(C1-C6)ハロアルキル；(C1-C6)シアノアルキル；(C1-C6)ヒドロキシアルキル；(C1-C6)アルコキシ；フェノキシ；(C1-C6)ハロアルコキシ；(C1-C6)アルコキシ(C1-C6)アルキル；(C1-C6)アルケニルオキシ(C1-C6)アルキル；(C1-C6)アルコキシ(C1-C6)アルコキシ；(C1-C6)アルカノイルオキシ(C1-C6)アルキル；ハロ、シアノ、(C1-C4)アルキル、又は(C1-C4)アルコキシで選択的に置換した(C2-C6)アルケニル；ハロ又は(C1-C4)アルキルで選択的に置換した(C2-C6)アルキニル；フォルミル；カルボキシ；(C1-C6)アルキルカルボニル；(C1-C6)ハロアルキルカルボニル；ベンゾイル；(C1-C6)アルコキシカルボニル；(C1-C6)ハロアルコキシカルボニル；(C1-C6)アルカノイルオキシ(‐OCORa)；カルボキシアミド(‐CONRaRb)；アミド(‐N RaCORb)；アルコキシカルボニルアミノ(‐NRaCO2Rb)；アルキルアミノカルボニルアミノ(‐N RaCONRbRc)；メルカプト；(C1-C6)アルキルチオ；(C1-C6)アルキルスルホニル；(C1-C6)アルキルスルホニル(C1-C6)アルキル；(C1-C6)アルキルスルホキシド(‐S(O)Ra)；(C1-C6)アルキルスルホキシド(C1-C6)アルキル(‐(CH2)ｎS(O)Ra)；フルファミド(‐SO2NRaRb)；‐SO3H；又は非置換又は置換フェニルで、置換体は独立して１から3までのハロ、ニトロ、(C1-C6)アルコキシ、(C1-C6)アルキル、又はアミノ；あるいはフェニル環の隣接する2つの位置の１つ又は両方が置換される場合、付着している原子は、(‐OCH2O)、(‐OCH(CH3)O-)、(‐CH2CH2O-)、(‐OCH(CH3)CH2O -)、(‐S- CH=N -)、(‐CH2OCH2O‐)、(‐O(CH2)3‐)、(＝N-O-N=)、(‐C=CH-NH-)、(‐OCF2O-)、(‐N-CH=N-)、(‐CH2CH2O-)、及び(‐(CH2)4) からなるグループから選ばれた連結のフェニル結合末端を形成する場合があり、
Bは、
(a)非置換又は置換フェニルで、置換体は独立して１から５までのH; ハロ；ニトロ；シアノ；ヒドロキシ；アミノ(‐NRaRb)；アルキルアミノアルキル(‐(CH2)ｎNRaRb)；(C1-C6)アルキル；(C1-C6)ハロアルキル；(C1-C6)シアノアルキル；(C1-C6)ヒドロキシアルキル；(C1-C6)アルコキシ；フェノキシ；(C1-C6)ハロアルコキシ；(C1-C6)アルコキシ(C1-C6)アルキル；(C1-C6)アルケニルオキシ(C1-C6)アルキル；(C1-C6)アルコキシ(C1-C6)アルコキシ；(C1-C6)アルカノイルオキシ(C1-C6)アルキル；ハロ、シアノ、(C1-C4)アルキル、又は(C1-C4)アルコキシで選択的に置換した(C2-C6)アルケニル；ハロ又は (C1-C4)アルキルで選択的に置換した(C2-C6)アルキニル；フォルミル；カルボキシ；(C1-C6)アルキルカルボニル；(C1-C6)ハロアルキルカルボニル；ベンゾイル；(C1-C6)アルコキシカルボニル；(C1-C6)ハロアルコキシカルボニル；(C1-C6)アルカノイルオキシ(‐OCORa)；カルボキシアミド(‐CONRaRb)；アミド(‐N RaCORb)；アルコキシカルボニルアミノ (‐NRaCO2Rb)；アルキルアミノカルボニルアミノ(‐N RaCONRbRc)；メルカプト；(C1-C6)アルキルチオ；(C1-C6)アルキルスルホニル；(C1-C6)アルキルスルホニル(C1-C6)アルキル；(C1-C6)アルキルスルホキシド(‐S(O)Ra)；(C1-C6)アルキルスルホキシド(C1-C6)アルキル(‐(CH2)ｎS(O)Ra)；フルファミド(‐SO2NRaRb)；‐SO3H；又は非置換又は置換フェニルで、置換体は独立して１から3までのハロ、ニトロ、(C1-C6)アルコキシ、(C1-C6)アルキル、又はアミノ；あるいはフェニル環の隣接する2つの位置の１つ又は両方がC、N、O、又はSで置換される場合、これらの原子は、(‐OCH2O‐)、(‐OCH(CH3)O-)、(‐CH2CH2O -)、(‐OCH(CH3)CH2O-)、(‐S- CH=N -)、(‐CH2OCH2O‐)、(‐O(CH2)3‐)、(＝N-O-N=)、(‐C=CH-NH-)、(‐OCF2O-)、(‐NH-CH=N-)、(‐CH2CH2O-)、及び(‐(CH2)4‐)からなるグループから選ばれた連結のフェニル結合末端を形成する場合があり；
(ｂ)1-3窒素原子及び3-5核炭素原子を持つ非置換6員環ヘテロサイクル又は置換６員環ヘテロサイクルで、置換体は１から3までの同じ又は異なるハロ；ニトロ；ヒドロキシ；(C1-C6)アルキル；(C1-C6)アルコキシ；(C1-C6)チオアルコキシ；カルボキシ；(C1-C6)アルコキシカルボニル；(C1-C6)カルボキシアルキル；各アルキル・グループに独立に定まった数の炭素原子を持つ(C1-C6)アルコキシカルボニルアルキル；‐CONRaRb；アミノ；(C1-C6)アルキルアミノ；各アルキル・グループに独立に定まった数の炭素原子を持つ(C1-C6)ジアルキルアミノ；‐CF3を含むハロアルキル；‐C=N-NHC(O)NRaRb)；又は‐C=N-NHC(O)C(O)NRaRb)；あるいは
(ｃ)５−ベンズイミダゾリル；１−トリチル‐５−ベンズイミダゾリル；３−トリチル‐５−ベンズイミダゾリル；１H-インダゾール‐３‐イル；１‐トリチル‐１H‐インダゾール‐３‐イル；又は１‐(C1-C6)アルキル‐１H‐インドール‐2‐イル；  Eは非置換又は置換(C4-C10)側鎖アルキルであり、置換体は独立に1−4シアノ；ハロ；(C5-C6)シクロアルキル；フェニル；(C2-C3)アルケニル；ヒドロキシ；(C1-C6)アルコキシ；カルボキシ；(C1-C6)アルコキシカルボニル；(C1-C6)アルカノイルオキシ(‐OCORa)；フォルミル；各アルキル・グループに独立に定まった数の炭素原子を持つ(C1-C6)トリアルキルシリルオキシ；‐C=N-ORa；‐C=N-Rd；‐C=N-NHC(O)NRaRb；又は‐C=N-NHC(O)C(O) N RaRb；
ここで、Ra、Rb、及びRｃは独立にH、(C1-C6)アルキル、又はフェニルであり；Rdはヒドロキシ(C1-C6)アルキル；及びｎ＝1-4；そして
GはH又はCN；
もし、
Eが第三級の炭素を含む(C4-C6)アルキル、又は第三級の炭素を含むシアノ(C4-C5)アルキルである場合、
Bは、
(a)  置換フェニルで、置換体は独立して１から５までのH; ハロ；ニトロ；シアノ；ヒドロキシ；アミノ(‐NRaRb)；アルキルアミノアルキル(‐(CH2)ｎNRaRb)；(C1-C6)アルキル；(C1-C6)ハロアルキル；(C1-C6)シアノアルキル；(C1-C6)ヒドロキシアルキル；(C1-C6)アルコキシ；フェノキシ；(C1-C6)ハロアルコキシ；(C1-C6)アルコキシ(C1-C6)アルキル；(C1-C6)アルケニルオキシ(C1-C6)アルキル；(C1-C6)アルコキシ(C1-C6)アルコキシ；(C1-C6)アルカノイルオキシ(C1-C6)アルキル；ハロ、シアノ、(C1-C4)アルキル、又は(C1-C4)アルコキシで選択的に置換した(C2-C6)アルケニル；ハロ又は(C1-C4)アルキルで選択的に置換した(C2-C6)アルキニル；フォルミル；カルボキシ；(C1-C6)アルキルカルボニル；(C1-C6)ハロアルキルカルボニル；ベンゾイル；(C1-C6)アルコキシカルボニル；(C1-C6)ハロアルコキシカルボニル；(C1-C6)アルカノイルオキシ(‐OCORa)；カルボキシアミド(‐CONRaRb)；アミド(‐N RaCORb)；アルコキシカルボニルアミノ(‐NRaCO2Rb)；アルキルアミノカルボニルアミノ(‐N RaCONRbRc)；メルカプト；(C1-C6)アルキルチオ；(C1-C6)アルキルスルホニル；(C1-C6)アルキルスルホニル(C1-C6)アルキル；(C1-C6)アルキルスルホキシド(‐S(O)Ra)；(C1-C6)アルキルスルホキシド(C1-C6)アルキル(‐(CH2)ｎS(O)Ra)；フルファミド(‐SO2NRaRb)；‐SO3H；又は非置換又は置換フェニルで、置換体は独立して１から3までのハロ、ニトロ、(C1-C6)アルコキシ、(C1-C6)アルキル、又はアミノ；あるいはフェニル環の隣接する2つの位置の１つ又は両方が置換される場合、付着している原子は、(‐OCH2O‐)、(‐OCH(CH3)O-)、(‐CH2CH2O-)、(‐OCH(CH3)CH2O -)、(‐S- CH=N -)、(‐CH2OCH2O‐)、(‐O(CH2)3‐)、(＝N-O-N=)、(‐C=CH-NH-)、(‐OCF2O-)、(‐NH-CH=N-)、(‐CH2CH2O-)、及び(‐(CH2)4‐)からなるグループから選ばれた連結のフェニル結合末端を形成する場合があり、そして少なくとも１つのヒドロキシ、ニトロ、‐C=NOH、アセトキシ、カルボキシ、−S(O)CH3、−C=N-NHC(O)NRaRb、又は−C=N-NHC(O)C(O)NRaRbを持っており、あるいはフェニル環の隣接する2つの位置がOで置換され、これらの原子が連結(‐OCH2O)のフェニル結合末端を形成する場合があり、
(ｂ)1-3窒素原子及び3-5核炭素原子を持つ非置換6員環ヘテロサイクル又は置換６員環ヘテロサイクルで、置換体は１から3までの同じ又は異なるハロ；ニトロ；ヒドロキシ；(C1-C6)アルキル；(C1-C6)アルコキシ；(C1-C6)チオアルコキシ；カルボキシ；(C1-C6)アルコキシカルボニル；(C1-C6)カルボキシアルキル；各アルキル・グループに独立に定まった数の炭素原子を持つ(C1-C6)アルコキシカルボニルアルキル；‐CONRaRb；アミノ；(C1-C6)アルキルアミノ；各アルキル・グループに独立に定まった数の炭素原子を持つ(C1-C6)ジアルキルアミノ；‐CF3を含むハロアルキル；‐C=N-NHC(O)NRaRb)；又は‐C=N-NHC(O)C(O)NRaRb)；あるいは
(ｃ)５−ベンズイミダゾリル；１−トリチル‐５−ベンズイミダゾリル；３−トリチル‐５−ベンズイミダゾリル；１H-インダゾール‐３‐イル；１‐トリチル‐１H‐インダゾール‐３‐イル；又は１‐(C1-C6)アルキル‐１H‐インドール‐2‐イル；  ここで、Ra及びRbは独立にH、(C1-C6)アルキル、又はフェニルであり；あるいは、
(２)以下の化合物、
4-クロロ安息香酸N’-ベンゾイル-N”-tert-ブチル-ヒドラジド、
4-エチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(2-ニトロ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
4-メチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
4-エチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,5-ジクロロ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(2,6-ジフルオロ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-クロロ-2-メチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3-クロロ-ベンゾイル) -ヒドラジド、
2-クロロ-3-メトキシ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(2-クロロ-5-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-クロロ-2-メチル安息香酸N’-(4-ブロモ-3-メチル-ベンゾイル)-N’-tert-ブチル-ヒドラジド、
4-エチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(4-クロロ-3,5-ジメチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
4-エチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3-クロロ-4,5-ジメチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
4-メトキシ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(2-クロロ-4-フルオロ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
4-エチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3-クロロ-5-メチル-ベンゾイル) -ヒドラジド、
4-エチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(2-エチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
4-メトキシ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3,5-ジクロロ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
4-エチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(5-メチル-2-ニトロ-ベンゾイル) -ヒドラジド
4-シアノメチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-メチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(3-メトキシ-2-メチル-ベンゾイル) -ヒドラジド、
4-ブロモ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3,5-ジクロロ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2-メチル-3-ニトロ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2,3-ジメチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(2,5-ジメトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2,3-ジメチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(5-クロロ-2-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド
3,5-ジメチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(3-メトキシ-2-ニトロ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2,3-ジメチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3,5-ジメトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-クロロ-4-エチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
4-(1-ヒドロキシ-エチル)安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3,5-ジフロロ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-ジメチルアミノ-2-メチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3,5-ジクロロ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-アセチル-2-メチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
酢酸3-[N’-tert-ブチル-N’-(3,5-ジクロロ-ベンゾイル)-ヒドラジノカルボニル]-2-メチル-フェニルエステル、
3-ヨード-2-メチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-メトキシ-2-メチル安息香酸N’-(3-ブロモ-5-クロロ-ベンゾイル)-N’-tert-ブチル-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(3-イソプロポキシ-2-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-メトキシ-2-メチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(2-クロロ-ピリジン-3-カルボニル)-ヒドラジド、
3-メトキシ-2-メチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(2-メトキシ-5-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-メトキシ-2-メチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(2,5-ジフロロ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-メトキシ-2-メチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(2-エチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-メトキシ-2-メチル安息香酸N’-(3-ブロモ-5-メチル-ベンゾイル)-N’-tert-ブチル-ヒドラジド、
3-メトキシ-2-メチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3-メトキシ-5-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-メトキシ-2-メチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(4-クロロ-2-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2-メチル-3-トリフルオロメトキシ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-メトキシ-2-メチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3-メトキシ-4-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-メトキシ-4-メチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-メトキシ-2-メチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(2-メトキシ-4-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-メトキシ-2-メチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(2,6-ジクロロ-ピリジン-4-カルボニル)-ヒドラジド、
3-メトキシ-2-メチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(5-メチル-2-ニトロ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-メトキシ-2-メチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(4-クロロ-2-フルオロ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2-クロロ-4-フルオロ安息香酸N’-(ベンゾ[1,3]ジオキソール-5-カルボニル)-N-tert-ブチル-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-エチル-2-メチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(2,3-ジヒドロ-ベンゾフラン-5-カルボニル)-ヒドラジド、
3-メトキシ-2-メチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3,5-ジクロロ-4-フルオロ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
4-フルオロ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(4-メチル-ベンゾ[1,3]ジオキソール-5-カルボニル)-ヒドラジド、
2-メトキシ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(4-エチル-ベンゾ[1,3]ジオキソール-5-カルボニル)-ヒドラジド、
3,4-ジエチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
4-フルオロ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2-メトキシ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-メトキシ-2-メチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(4-フルオロ-2-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2-クロロ-6-メチルイソニコチン酸N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,5-ジメトキシ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2-ヨード-3-メトキシ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2-メトキシ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5,6,7,8-テトラヒドロ-ナフタレン-2-カルボニル)-ヒドラジド、
2-エチル-3-メトキシ安息香酸N’-(ベンゾ[1,3]ジオキソール-4-カルボニル)-N’-tert-ブチル-ヒドラジド、
4-エチル-2-フルオロ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(4-フルオロ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
ベンゾ[1,3]ジオキソール-5-カルボン酸N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
4-フルオロ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-メチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(2-メチル-ベンゾ[1,3]ジオキソール-5-カルボニル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(4-エチル-2-メチル-ベンゾ[1, 3]ジオキソール-5-カルボニル)-ヒドラジド、
3-メトキシ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-メチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(3-メチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N’-(5-ブロモ-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボニル)-N-tert-ブチル-ヒドラジド、
3-クロロ-5-メチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-エチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
3-メチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-エチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1, 4]ジオキシン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
2-メトキシ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-エチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
3-メトキシ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-エチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N’-(ベンゾチアゾール-6-カルボニル)-N-tert-ブチル-ヒドラジド、
4-クロロ-2-メトキシ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2-エチル-3-メトキシ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(2,5-ジメトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(6-メチル-ベンゾ[1,3]ジオキソール-5-カルボニル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N’-(4H-ベンゾ[1,3]ジオキシン-6-カルボニル)-N-tert-ブチル-ヒドラジド、
2-メトキシ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(8-メチル-4H-ベンゾ[1,3]ジオキシン-7-カルボニル)-ヒドラジド、
4-フルオロ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(8-エチル-4H-ベンゾ[1,3]ジオキシン-7-カルボニル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(6-クロロ-ベンゾ[1,3]ジオキソール-5-カルボニル)-ヒドラジド、
2,3,6-トリフルオロ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(2-クロロ-4-フルオロ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2-エチル-3-メトキシ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(2,6-ジフルオロ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-フルオロ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-ブロモ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル) -ヒドラジド、
2-エチル-3-メトキシ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(2-ニトロ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2,3-ジフルオロ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2-エチル-3-メトキシ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3,4,5-トリメトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-フルオロ-5-トリフルオロメチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-シアノ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル) -ヒドラジド、
2,4-ジクロロ-5-フルオロ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(3-メトキシ-2-ビニル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
安息香酸N-tert-ブチル-N’-(8-エチル-4H-ベンゾ[1,3]ジオキシン-7-カルボニル)-ヒドラジド、
2-[N-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジノ]-2-メチル-プロピオン酸エチルエステル、
2-エチル-3-メトキシ安息香酸N’-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-N’-(2-ヒドロキシ-1,1-ジメチル-エチル)-ヒドラジド、
2-エチル-3-メトキシ安息香酸N’-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-N’-(1,1-ジメチル-2-オキソ-エチル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-N-(2-メトキシ-1,1-ジメチル-エチル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-N-(2-ヒドロキシイミノ-1,1-ジメチル-エチル)-ヒドラジド、
2-アミノ-3-メトキシ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
酢酸3-[N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジノカルボニル]-5-メチル-ベンジルエステル、
酢酸2-[N-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジノ]-2-メチル-プロピルエステル、
3-ヒドロキシ-2-メチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(2,3,4-トリフルオロ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-ヒドロキシ-2-メチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3-クロロ-5-メトキシ-ピリジン-4-カルボニル)-ヒドラジド、
3-ヒドロキシ-2-メチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(2,6-ジクロロ-ピリジン-4-カルボニル)-ヒドラジド、
3-ヒドロキシ-2-メチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3-メトキシ-ピリジン-4-カルボニル)-ヒドラジド、
3-ヒドロキシ-2-メチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3,5-ジメトキシ-4-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2-メトキシ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-メチル-クロマン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
2,4-ジクロロ-5-フルオロ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2,4-ジクロロ-5-フルオロ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-メチル-クロマン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
2-フルオロ-5-メチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-メチル-クロマン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
5-メチル-クロマン-6-安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3,5-ジメトキシ-4-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2,5-ジフルオロ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-エチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
2,3,4-トリフルオロ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-エチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
2,3,4,5-テトラフルオロ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-エチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
4-フルオロ-3-トリフルオロメチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-エチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
2,6-ジクロロ-イソニコチン酸N-tert-ブチル-N’-(5-エチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
2-メトキシ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-エチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
2,4-ジクロロ-5-フルオロ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-エチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
4-クロロ-2-フルオロ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-エチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
酢酸3-[N’-tert-ブチル-N’-(3,5-ジメトキシ-4-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジノカルボニル]-2-メチル-フェニルエステル、
2-エチル-3-メトキシ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(5-クロロ-2-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
4-クロロ-2-メトキシ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(4-エチル-ベンゾ[1,3]ジオキソール-5-カルボニル)-ヒドラジド、
5-クロロ-2-メトキシ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-メチル-クロマン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
2-エチル-3-メトキシ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(5-メチル-2-ニトロ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2-エチル-3-メトキシ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(4-クロロ-2-ニトロ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2-エチル-3-メトキシ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(5-クロロ-2-ニトロ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
5-メチル-クロマン-6-カルボン酸N’-tert-ブチル-N’-(5-メチル-2-ニトロ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
ベンゾ[1,2,5]オキサジアゾール-5-カルボン酸N’-tert-ブチル-N’-(4-クロロ-2-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2-クロロ-5-ニトロ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(3-メトキシ-2-ビニル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
4-クロロ-2-メトキシ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(3-メトキシ-2-ビニル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2-エチル-3-メトキシ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(1-メチル-1H-インドール-2-カルボニル)-ヒドラジド、
3,5-ジメトキシ-4-メチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-エチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-クロロ-4H-ベンゾ[1,3]ジオキシン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
4-エチル-2-フルオロ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3-ニトロ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-メトキシ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(4-エチル-2-フルオロ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
5-クロロ-4H-ベンゾ[1,3]ジオキシン-6-カルボン酸N’-tert-ブチル-N’-(3,5-ジメトキシ-4-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
4-エチル-2-フルオロ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(2,6-ジクロロ-ピリジン-4-カルボニル)-ヒドラジド、
4-エチル-2-フルオロ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3,5-ジメトキシ-4-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
4-エチル-2-フルオロ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3,4,5-トリフルオロ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
4-エチル-2-フルオロ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
4-エチル-2-フルオロ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(2-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
4-エチル-2-フルオロ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(5-フルオロ-2-ニトロ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
4-エチル-2-フルオロ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-[5-メトキシ-2-(2,2, 2-トリフルオロ-エトキシ)-ベンゾイル]-ヒドラジド、
4-エチル-2-フルオロ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(2-クロロ-6-メチル-ピリジン-4-カルボニル)-ヒドラジド、
4-エチル-2-フルオロ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(2,6-ジメトキシ-ピリジン-3-カルボニル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(１H-インドール-6-カルボニル)-ヒドラジド、
2-エチル-3-メトキシ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(2-メタンスルフィニル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2,2-ジフルオロ-ベンゾ[1,3]ジオキソール-5-カルボンN’-tert-ブチル-N’-(2-ニトロ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(2,2-ジフルオロ-ベンゾ[1,3]ジオキソール-5-カルボニル)-ヒドラジド、
3-メトキシ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(2,2-ジフルオロ-ベンゾ[1,3]ジオキソール-5-カルボニル)-ヒドラジド、
3-ブロモ安息香酸N-(シアノ-ジメチル-メチル)-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,5-ジクロロ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(3-メトキシ-2-メトキシメチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-(ヒドロキシイミノ-メチル)-5-メチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-(H2NC(O)NHN=CH)-5-メチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-(H2NC(O)C(O)NHN=CH)-5-メチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2-エチル-3-メトキシ安息香酸N’-(シアノ-ジメチル-メチル)-N’-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2-エチル-3-メトキシ安息香酸N’-(シアノ-ジメチル-メチル)-N’-(3,5-ジメトキシ-4-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2-メトキシ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(8-エチル-4H-ベンゾ[1,3]ジオキシン-7-カルボニル)-ヒドラジド、
2,4,5-トリフルオロ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-メチル-クロマン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
3,4,5-トリフルオロ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-メチル-クロマン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
3-フルオロ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-メチル-クロマン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
3-トリフルオロメチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(4-エチル-ベンゾ[1,3]ジオキソール-5-カルボニル)-ヒドラジド、
4-フルオロ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-メチル-クロマン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
3,4-ジフルオロ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-メチル-クロマン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
3,5-ジフルオロ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-メチル-クロマン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
2,3,4,5-テトラフルオロ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-メチル-クロマン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
4-メチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(8-エチル-4H-ベンゾ[1,3]ジオキシン-7-カルボニル)-ヒドラジド、
酢酸4-[N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジノカルボニル]-2,6-ジメトキシ-フェニルエステル、
2-エチル-3-メトキシ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(4-ヒドロキシ-3,5-ジメトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
5-メチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボン酸N’-tert-ブチル-N’-(3,5-ジメトキシ-4-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
5-メチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボン酸N’-tert-ブチル-N’-(2,6-ジメトキシ-ピリジン-3-カルボニル)-ヒドラジド、
2,6-ジクロロ-イソニコチン酸N-tert-ブチル-N’-(5-メチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
3-フルオロ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-メチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
3-フルオロ-5-トリフルオロメチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-メチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
5-メチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボン酸N’--tert-ブチル-N’-(5-メチル-2-ニトロ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
5-メチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボン酸N’-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-N’-(1-エチル-2,2-ジメチル-プロピル)-ヒドラジド、
5-メチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボン酸N’-(3,5-ジメトキシ-4-メチル-ベンゾイル)-N’-(1-エチル-2,2-ジメチル-プロピル)-ヒドラジド、
5-メチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボン酸N’-(1-tert-ブチル-ブチル)-N’-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
5-メチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボン酸N’-(1-tert-ブチル-ブチル)-N’-(3,5-ジメトキシ-4-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
5-エチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボン酸N’-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-N’-(1-エチル-2,2-ジメチル-プロピル)-ヒドラジド、
5-エチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボン酸N’-(3,5-ジメトキシ-4-メチル-ベンゾイル)-N’-(1-エチル-2,2-ジメチル-プロピル)-ヒドラジド、
5-エチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボン酸N’-(1-tert-ブチル-ブチル)-N’-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
5-エチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボン酸N’-(1-tert-ブチル-ブチル)-N’-(3,5-ジメトキシ-4-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2-メトキシ-6-トリフルオロメチル-ニコチン酸N-tert-ブチル-N’-(3-メトキシ-2-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-メトキシ-2-メチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(1-メチル-2-オキソ-6-トリフルオロメチル-1,2-ジヒドロ-ピリジン-3-カルボニル)-ヒドラジド、
2,6-ジメトキシ-ピリミジン-4-カルボン酸N-tert-ブチル-N’-(3-メトキシ-2-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,6-ジメトキシ-ピリダジン-4-カルボン酸N-tert-ブチル-N’-(3-メトキシ-2-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,6-ジクロロ-ピリダジン-4-カルボン酸N-tert-ブチル-N’-(3-メトキシ-2-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
ピリダジン-4-安息香酸N-tert-ブチル-N’-(3-メトキシ-2-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
6-メトキシ-3-オキソ-2,3-ジヒドロ-ピリダジン-4-カルボン酸N-tert-ブチル-N’-(3-メトキシ-2-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、又はピリダジン位置異性体、              3,5-ジメチル安息香酸N-(1-エチル-2,2-ジメチル-プロピル)-N’-(3-メトキシ-2-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,5-ジメトキシ-4-メチル安息香酸N-(1-エチル-2,2-ジメチル-プロピル)-N’-(3-メトキシ-2-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N-(1-tert-ブチル-ブチル)-N’-(3-メトキシ-2-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,5-ジメトキシ-4-メチル安息香酸N-(1-tert-ブチル-ブチル)-N’-(3-メトキシ-2-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N-(1-エチル-2,2-ジメチル-プロピル)-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,5-ジメトキシ-4-メチル安息香酸N-(1-エチル-2,2-ジメチル-プロピル)-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N-(1-tert-ブチル-ブチル)-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,5-ジメトキシ-4-メチル安息香酸N-(1-tert-ブチル-ブチル)-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2,3-ジメチル安息香酸N’-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-N’-(1-エチル-2,2-ジメチル-プロピル)-ヒドラジド、
3-ヒドロキシ-2-メチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3-メトキシ-ピリジン-4-カルボニル)-ヒドラジド、
4-(1-ヒドロキシ-エチル)-安息香酸N’-(3,5-ビス-ヒドロキシメチル-ベンゾイル)-N’-tert-ブチル-ヒドラジド、
2-エチル-3-メトキシ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(2-メタンスルフィニル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
5-[N’-(4-アセチル-ベンゾイル)-N-tert-ブチル-ヒドラジノカルボニル] -イソフタル酸、
5-メチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボン酸N’-tert-ブチル-N’-(2,6-ジメトキシ-ピリジン-3-カルボニル)-ヒドラジド、
4-フルオロ-3-トリフルオロメチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-エチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
2-[N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジノカルボニル]-ベンゼンスルホン酸、
3,5-ジメチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-メチル-クロマン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
4-エチル安息香酸N’-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-N’-(1,2,2-トリメチル-プロピル)-ヒドラジド、
3-メチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-エチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1, 4]ジオキシン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
2,3-ジメチル安息香酸N’-ベンゾイル-N’-(1-エチル-ペンチル)-ヒドラジド、
2,3-ジメチル安息香酸N’-(1-エチル-2,2-ジメチル-プロピル)-N’-(3-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
5-メチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボン酸N’-tert-ブチル-N’-(4-ヒドロキシ-3,5-ジメトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-フルオロ-4H-ベンゾ[1,3]ジオキシン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
2-メタンスルフィニル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-メチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
5-メチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボン酸N’-(シアノ-ジメチル-メチル)-N’-(3,5-ジメトキシ-4-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
6-メチル-ピリジン-2-カルボン酸N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
5-メチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボン酸N’-tert-ブチル-N’-(3,5-ジメトキシ-4-メチル-2-ニトロ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
4-エチル安息香酸N’-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-N’-(1-エチル-2,2-ジメチル-プロピル)-ヒドラジド、
4-エチル安息香酸N’-(1-エチル-2,2-ジメチル-プロピル)-N’-(2-メトキシ-ピリジン-3-カルボニル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N-(1-tert-ブチル-ペンチル)-N’-(4-エチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,5-ジメトキシ-4-メチル安息香酸N-(1-tert-ブチル-ペンチル)-N’-(4-エチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2-メトキシ-ニコチン酸N-(1-tert-ブチル-ペンチル)-N’-(4-エチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N-(2,2-ジメチル-1-フェニル-プロピル)-N’-(4-エチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,5-ジメトキシ-4-メチル安息香酸N-(2,2-ジメチル-1-フェニル-プロピル)-N’-(4-エチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2-メトキシ-ニコチン酸N-(2,2-ジメチル-1-フェニル-プロピル)-N’-(4-エチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
1H-ベンゾイミダゾール-5-カルボン酸N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
1-(又は3-)トリチル-１H-ベンゾイミダゾール-5-カルボン酸N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
5-メチル-1-フェニル-1H-ピラゾール-3-カルボン酸N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-クロロ-6-メチルスルファニル-ピラジン-2-カルボン酸N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
1H-インダゾール-3-カルボン酸N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
1-トリチル-1H-インダゾール-3-カルボン酸N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
6-[N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジノカルボニル]-ニコチン酸メチルエステル、
ピラジン-2-カルボン酸N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N-[2-(tert-ブチル-ジメチル-シラニルオキシ)-1,1-ジメチル-エチル]-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-N-[2-(2-ヒドロキシ-エチルイミノ)-1,1-ジメチル-エチル]ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N-[(H2NC(O)NHN=C)(CH3)2C-]-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド
3,5-ジメチル安息香酸N-[(H2NC(O)C(O)NHN=C)(CH3)2C-]-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2-[N-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジノ]-2-メチル-プロピオン酸、
3,5-ジメチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(2-メタンスルフィニルメチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(2-メタンスルホニルメチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(2-ジメチルアミノメチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(2-メチルアミノメチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(3-メトキシ-2-メタンスルファニルメチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N’-(2-アリルオキシメチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-N-tert-ブチル-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N-(1-tert-ブチル-ペンチル)-N’-(3-メトキシ-2-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,5-ジメトキシ-4-メチル安息香酸N-(1-tert-ブチル-ペンチル)-N’-(3-メトキシ-2-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N’-(2-アセトキシオキシメチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-N-tert-ブチル-ヒドラジド、及び
5-メチル-ピラジン-2-カルボン酸N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド
から構成されるグループから選らばれる化合物、
とを、接触させることを含む、
方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法であり、
前記(1)の化合物は特定の式を持ち、そして、
XとX’はOで、
GはHで、そして、
Eは非置換又は置換(C7-C10)側鎖アルキルであり、置換体は独立に1−4シアノ；ハロ；(C5-C6)シクロアルキル；フェニル；(C2-C3)アルケニル；ヒドロキシ；(C1-C6)アルコキシ；カルボキシ；(C1-C6)アルコキシカルボニル；(C1-C6)アルカノイルオキシ(‐OCORa)；フォルミル；各アルキル・グループに独立に定まった数の炭素原子を持つ(C1-C6)トリアルキルシリルオキシ；‐C=N-ORa；‐C=N-Rd；‐C=N-NHC(O)NRaRb；又は‐C=N-NHC(O)C(O) N RaRb；
ここで、Ra、Rb、及びRｃは独立にH、(C1-C6)アルキル、又はフェニルであり；Rdはヒドロキシ(C1-C6)アルキルである、
方法。
【請求項６】
前記化合物が、
3,5-ジメチル安息香酸N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-N-(2-ヒドロキシイミノ-1,1-ジメチル-エチル)-ヒドラジド、
酢酸2-[N-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジノ]-2-メチル-プロピルエステル、
2-エチル-3-メトキシ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(1-メチル-１H-インドール-2-カルボニル)-ヒドラジド、
3-(H2NC(O)NHN=CH)-5-メチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-(H2NC(O)C(O)NHN=CH)-5-メチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2-メトキシ-6-トリフルオロメチル-ニコチン酸N-tert-ブチル-N’-(3-メトキシ-2-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-メトキシ-2-メチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(1-メチル-オキソ-6-トリフルオロメチル-1,2-ジヒドロ-ピリジン-3-カルボニル)-ヒドラジド、
2-メトキシ-ニコチン酸N-(2,2-ジメチル-1-フェニル-プロピル)-N’-(4-エチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
１H-ベンゾイミダゾール-5-カルボン酸N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
1-(又は3-)トリチル-１H-ベンゾイミダゾール-5-カルボン酸N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
1H-インダゾール-3-カルボン酸N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
1-トリチル-1H-インダゾール-3-カルボン酸N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N-[2-(tert-ブチル-ジメチル-シラニルオキシ)-1,1-ジメチル-エチル]-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-N-[2-(2-ヒドロキシ-エチルイミノ)-1,1-ジメチル-エチル]ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N-[(H2NC(O)NHN=C)(CH3)2C-]-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、及び
3,5-ジメチル安息香酸N-[(H2NC(O)C(O)NHN=C)(CH3)2C-]-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
から構成されるグループから選らばれる、
請求項５に記載の方法。
【請求項７】
対象の中で1つ又はそれ以上の外因性遺伝子の発現を調節する方法であり、
前記方法は、
(1)以下の式の化合物、
【化３】
2014111634.tif 000136
ここでＸとＸ’は独立してＯ又はＳであり、
Aは非置換又は置換フェニルで、置換体は独立して１から５までのH;ハロ；ニトロ；シアノ；ヒドロキシ；アミノ(‐NRaRb)；アルキルアミノアルキル(‐(CH2)ｎNRaRb)；(C1-C6)アルキル；(C1-C6)ハロアルキル；(C1-C6)シアノアルキル；(C1-C6)ヒドロキシアルキル；(C1-C6)アルコキシ；フェノキシ；(C1-C6)ハロアルコキシ；(C1-C6)アルコキシ(C1-C6)アルキル；(C1-C6)アルケニルオキシ(C1-C6)アルキル；(C1-C6)アルコキシ(C1-C6)アルコキシ；(C1-C6)アルカノイルオキシ(C1-C6)アルキル；ハロ、シアノ、(C1-C4)アルキル、又は(C1-C4)アルコキシで選択的に置換した(C2-C6)アルケニル；ハロ又は(C1-C4)アルキルで選択的に置換した(C2-C6)アルキニル；フォルミル；カルボキシ；(C1-C6)アルキルカルボニル；(C1-C6)ハロアルキルカルボニル；ベンゾイル；(C1-C6)アルコキシカルボニル；(C1-C6)ハロアルコキシカルボニル；(C1-C6)アルカノイルオキシ(‐OCORa)；カルボキシアミド(‐CONRaRb)；アミド(‐N RaCORb)；アルコキシカルボニルアミノ(‐NRaCO2Rb)；アルキルアミノカルボニルアミノ(‐N RaCONRbRc)；メルカプト；(C1-C6)アルキルチオ；(C1-C6)アルキルスルホニル；(C1-C6)アルキルスルホニル(C1-C6)アルキル；(C1-C6)アルキルスルホキシド(‐S(O)Ra)；(C1-C6)アルキルスルホキシド(C1-C6)アルキル(‐(CH2)ｎS(O)Ra)；フルファミド(‐SO2NRaRb)；‐SO3H；又は非置換又は置換フェニルで、置換体は独立して１から3までのハロ、ニトロ、(C1-C6)アルコキシ、(C1-C6)アルキル、又はアミノ；あるいはフェニル環の隣接する2つの位置の１つ又は両方が置換される場合、付着している原子は、(‐OCH2O)、(‐OCH(CH3)O-)、(‐CH2CH2O-)、(‐OCH(CH3)CH2O -)、(‐S- CH=N -)、(‐CH2OCH2O‐)、(‐O(CH2)3‐)、(＝N-O-N=)、(‐C=CH-NH-)、(‐OCF2O-)、(‐N-CH=N-)、(‐CH2CH2O-)、及び(‐(CH2)4) からなるグループから選ばれた連結のフェニル結合末端を形成する場合があり、
Bは、
(a)非置換又は置換フェニルで、置換体は独立して１から５までのH; ハロ；ニトロ；シアノ；ヒドロキシ；アミノ(‐NRaRb)；アルキルアミノアルキル(‐(CH2)ｎNRaRb)；(C1-C6)アルキル；(C1-C6)ハロアルキル；(C1-C6)シアノアルキル；(C1-C6)ヒドロキシアルキル；(C1-C6)アルコキシ；フェノキシ；(C1-C6)ハロアルコキシ；(C1-C6)アルコキシ(C1-C6)アルキル；(C1-C6)アルケニルオキシ(C1-C6)アルキル；(C1-C6)アルコキシ(C1-C6)アルコキシ；(C1-C6)アルカノイルオキシ(C1-C6)アルキル；ハロ、シアノ、(C1-C4)アルキル、又は(C1-C4)アルコキシで選択的に置換した(C2-C6)アルケニル；ハロ又は (C1-C4)アルキルで選択的に置換した(C2-C6)アルキニル；フォルミル；カルボキシ；(C1-C6)アルキルカルボニル；(C1-C6)ハロアルキルカルボニル；ベンゾイル；(C1-C6)アルコキシカルボニル；(C1-C6)ハロアルコキシカルボニル；(C1-C6)アルカノイルオキシ(‐OCORa)；カルボキシアミド(‐CONRaRb)；アミド(‐N RaCORb)；アルコキシカルボニルアミノ (‐NRaCO2Rb)；アルキルアミノカルボニルアミノ(‐N RaCONRbRc)；メルカプト；(C1-C6)アルキルチオ；(C1-C6)アルキルスルホニル；(C1-C6)アルキルスルホニル(C1-C6)アルキル；(C1-C6)アルキルスルホキシド(‐S(O)Ra)；(C1-C6)アルキルスルホキシド(C1-C6)アルキル(‐(CH2)ｎS(O)Ra)；フルファミド(‐SO2NRaRb)；‐SO3H；又は非置換又は置換フェニルで、置換体は独立して１から3までのハロ、ニトロ、(C1-C6)アルコキシ、(C1-C6)アルキル、又はアミノ；あるいはフェニル環の隣接する2つの位置の１つ又は両方がC、N、O、又はSで置換される場合、これらの原子は、(‐OCH2O‐)、(‐OCH(CH3)O-)、(‐CH2CH2O -)、(‐OCH(CH3)CH2O-)、(‐S- CH=N -)、(‐CH2OCH2O‐)、(‐O(CH2)3‐)、(＝N-O-N=)、(‐C=CH-NH-)、(‐OCF2O-)、(‐NH-CH=N-)、(‐CH2CH2O-)、及び(‐(CH2)4‐)からなるグループから選ばれた連結のフェニル結合末端を形成する場合があり；
(ｂ)1-3窒素原子及び3-5核炭素原子を持つ非置換6員環ヘテロサイクル又は置換６員環ヘテロサイクルで、置換体は１から3までの同じ又は異なるハロ；ニトロ；ヒドロキシ；(C1-C6)アルキル；(C1-C6)アルコキシ；(C1-C6)チオアルコキシ；カルボキシ；(C1-C6)アルコキシカルボニル；(C1-C6)カルボキシアルキル；各アルキル・グループに独立に定まった数の炭素原子を持つ(C1-C6)アルコキシカルボニルアルキル；‐CONRaRb；アミノ；(C1-C6)アルキルアミノ；各アルキル・グループに独立に定まった数の炭素原子を持つ(C1-C6)ジアルキルアミノ；‐CF3を含むハロアルキル；‐C=N-NHC(O)NRaRb)；又は‐C=N-NHC(O)C(O)NRaRb)；あるいは
(ｃ)５−ベンズイミダゾリル；１−トリチル‐５−ベンズイミダゾリル；３−トリチル‐５−ベンズイミダゾリル；１H-インダゾール‐３‐イル；１‐トリチル‐１H‐インダゾール‐３‐イル；又は１‐(C1-C6)アルキル‐１H‐インドール‐2‐イル；  Eは非置換又は置換(C4-C10)側鎖アルキルであり、置換体は独立に1−4シアノ；ハロ；(C5-C6)シクロアルキル；フェニル；(C2-C3)アルケニル；ヒドロキシ；(C1-C6)アルコキシ；カルボキシ；(C1-C6)アルコキシカルボニル；(C1-C6)アルカノイルオキシ(‐OCORa)；フォルミル；各アルキル・グループに独立に定まった数の炭素原子を持つ(C1-C6)トリアルキルシリルオキシ；‐C=N-ORa；‐C=N-Rd；‐C=N-NHC(O)NRaRb；又は‐C=N-NHC(O)C(O) N RaRb；
ここで、Ra、Rb、及びRｃは独立にH、(C1-C6)アルキル、又はフェニルであり；Rdはヒドロキシ(C1-C6)アルキル；及びｎ＝1-4；そして
GはH又はCN；
もし、
Eが第三級の炭素を含む(C4-C6)アルキル、又は第三級の炭素を含むシアノ(C4-C5)アルキルである場合、
Bは、
(a)  置換フェニルで、置換体は独立して１から５までのH; ハロ；ニトロ；シアノ；ヒドロキシ；アミノ(‐NRaRb)；アルキルアミノアルキル(‐(CH2)ｎNRaRb)；(C1-C6)アルキル；(C1-C6)ハロアルキル；(C1-C6)シアノアルキル；(C1-C6)ヒドロキシアルキル；(C1-C6)アルコキシ；フェノキシ；(C1-C6)ハロアルコキシ；(C1-C6)アルコキシ(C1-C6)アルキル；(C1-C6)アルケニルオキシ(C1-C6)アルキル；(C1-C6)アルコキシ(C1-C6)アルコキシ；(C1-C6)アルカノイルオキシ(C1-C6)アルキル；ハロ、シアノ、(C1-C4)アルキル、又は(C1-C4)アルコキシで選択的に置換した(C2-C6)アルケニル；ハロ又は(C1-C4)アルキルで選択的に置換した(C2-C6)アルキニル；フォルミル；カルボキシ；(C1-C6)アルキルカルボニル；(C1-C6)ハロアルキルカルボニル；ベンゾイル；(C1-C6)アルコキシカルボニル；(C1-C6)ハロアルコキシカルボニル；(C1-C6)アルカノイルオキシ(‐OCORa)；カルボキシアミド(‐CONRaRb)；アミド(‐N RaCORb)；アルコキシカルボニルアミノ(‐NRaCO2Rb)；アルキルアミノカルボニルアミノ(‐N RaCONRbRc)；メルカプト；(C1-C6)アルキルチオ；(C1-C6)アルキルスルホニル；(C1-C6)アルキルスルホニル(C1-C6)アルキル；(C1-C6)アルキルスルホキシド(‐S(O)Ra)；(C1-C6)アルキルスルホキシド(C1-C6)アルキル(‐(CH2)ｎS(O)Ra)；フルファミド(‐SO2NRaRb)；‐SO3H；又は非置換又は置換フェニルで、置換体は独立して１から3までのハロ、ニトロ、(C1-C6)アルコキシ、(C1-C6)アルキル、又はアミノ；あるいはフェニル環の隣接する2つの位置の１つ又は両方が置換される場合、付着している原子は、(‐OCH2O‐)、(‐OCH(CH3)O-)、(‐CH2CH2O-)、(‐OCH(CH3)CH2O -)、(‐S- CH=N -)、(‐CH2OCH2O‐)、(‐O(CH2)3‐)、(＝N-O-N=)、(‐C=CH-NH-)、(‐OCF2O-)、(‐NH-CH=N-)、(‐CH2CH2O-)、及び(‐(CH2)4‐)からなるグループから選ばれた連結のフェニル結合末端を形成する場合があり、そして少なくとも１つのヒドロキシ、ニトロ、‐C=NOH、アセトキシ、カルボキシ、−S(O)CH3、−C=N-NHC(O)NRaRb、又は−C=N-NHC(O)C(O)NRaRbを持っており、あるいはフェニル環の隣接する2つの位置がOで置換され、これらの原子が連結(‐OCH2O)のフェニル結合末端を形成する場合があり、
(ｂ)1-3窒素原子及び3-5核炭素原子を持つ非置換6員環ヘテロサイクル又は置換６員環ヘテロサイクルで、置換体は１から3までの同じ又は異なるハロ；ニトロ；ヒドロキシ；(C1-C6)アルキル；(C1-C6)アルコキシ；(C1-C6)チオアルコキシ；カルボキシ；(C1-C6)アルコキシカルボニル；(C1-C6)カルボキシアルキル；各アルキル・グループに独立に定まった数の炭素原子を持つ(C1-C6)アルコキシカルボニルアルキル；‐CONRaRb；アミノ；(C1-C6)アルキルアミノ；各アルキル・グループに独立に定まった数の炭素原子を持つ(C1-C6)ジアルキルアミノ；‐CF3を含むハロアルキル；‐C=N-NHC(O)NRaRb)；又は‐C=N-NHC(O)C(O)NRaRb)；あるいは
(ｃ)５−ベンズイミダゾリル；１−トリチル‐５−ベンズイミダゾリル；３−トリチル‐５−ベンズイミダゾリル；１H-インダゾール‐３‐イル；１‐トリチル‐１H‐インダゾール‐３‐イル；又は１‐(C1-C6)アルキル‐１H‐インドール‐2‐イル；  ここで、Ra及びRbは独立にH、(C1-C6)アルキル、又はフェニルであり；あるいは、
(２)以下の化合物、
4-クロロ安息香酸N’-ベンゾイル-N”-tert-ブチル-ヒドラジド、
4-エチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(2-ニトロ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
4-メチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
4-エチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,5-ジクロロ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(2,6-ジフルオロ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-クロロ-2-メチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3-クロロ-ベンゾイル) -ヒドラジド、
2-クロロ-3-メトキシ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(2-クロロ-5-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-クロロ-2-メチル安息香酸N’-(4-ブロモ-3-メチル-ベンゾイル)-N’-tert-ブチル-ヒドラジド、
4-エチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(4-クロロ-3,5-ジメチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
4-エチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3-クロロ-4,5-ジメチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
4-メトキシ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(2-クロロ-4-フルオロ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
4-エチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3-クロロ-5-メチル-ベンゾイル) -ヒドラジド、
4-エチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(2-エチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
4-メトキシ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3,5-ジクロロ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
4-エチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(5-メチル-2-ニトロ-ベンゾイル) -ヒドラジド、
4-シアノメチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-メチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(3-メトキシ-2-メチル-ベンゾイル) -ヒドラジド、
4-ブロモ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3,5-ジクロロ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2-メチル-3-ニトロ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2,3-ジメチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(2,5-ジメトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2,3-ジメチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(5-クロロ-2-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(3-メトキシ-2-ニトロ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2,3-ジメチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3,5-ジメトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-クロロ-4-エチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
4-(1-ヒドロキシ-エチル)安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3,5-ジフロロ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-ジメチルアミノ-2-メチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3,5-ジクロロ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-アセチル-2-メチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
酢酸3-[N’-tert-ブチル-N’-(3,5-ジクロロ-ベンゾイル)-ヒドラジノカルボニル]-2-メチル-フェニルエステル、
3-ヨード-2-メチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-メトキシ-2-メチル安息香酸N’-(3-ブロモ-5-クロロ-ベンゾイル)-N’-tert-ブチル-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(3-イソプロポキシ-2-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-メトキシ-2-メチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(2-クロロ-ピリジン-3-カルボニル)-ヒドラジド、
3-メトキシ-2-メチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(2-メトキシ-5-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-メトキシ-2-メチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(2,5-ジフロロ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-メトキシ-2-メチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(2-エチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-メトキシ-2-メチル安息香酸N’-(3-ブロモ-5-メチル-ベンゾイル)-N’-tert-ブチル-ヒドラジド、
3-メトキシ-2-メチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3-メトキシ-5-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-メトキシ-2-メチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(4-クロロ-2-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2-メチル-3-トリフルオロメトキシ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-メトキシ-2-メチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3-メトキシ-4-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-メトキシ-4-メチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-メトキシ-2-メチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(2-メトキシ-4-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-メトキシ-2-メチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(2,6-ジクロロ-ピリジン-4-カルボニル)-ヒドラジド、
3-メトキシ-2-メチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(5-メチル-2-ニトロ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-メトキシ-2-メチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(4-クロロ-2-フルオロ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2-クロロ-4-フルオロ安息香酸N’-(ベンゾ[1,3]ジオキソール-5-カルボニル)-N-tert-ブチル-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-エチル-2-メチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(2,3-ジヒドロ-ベンゾフラン-5-カルボニル)-ヒドラジド、
3-メトキシ-2-メチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3,5-ジクロロ-4-フルオロ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
4-フルオロ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(4-メチル-ベンゾ[1,3]ジオキソール-5-カルボニル)-ヒドラジド、
2-メトキシ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(4-エチル-ベンゾ[1,3]ジオキソール-5-カルボニル)-ヒドラジド、
3,4-ジエチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
4-フルオロ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2-メトキシ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-メトキシ-2-メチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(4-フルオロ-2-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2-クロロ-6-メチルイソニコチン酸N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,5-ジメトキシ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2-ヨード-3-メトキシ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2-メトキシ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5,6,7,8-テトラヒドロ-ナフタレン-2-カルボニル)-ヒドラジド、
2-エチル-3-メトキシ安息香酸N’-(ベンゾ[1,3]ジオキソール-4-カルボニル)-N’-tert-ブチル-ヒドラジド、
4-エチル-2-フルオロ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(4-フルオロ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
ベンゾ[1,3]ジオキソール-5-カルボン酸N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
4-フルオロ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-メチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(2-メチル-ベンゾ[1,3]ジオキソール-5-カルボニル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(4-エチル-2-メチル-ベンゾ[1, 3]ジオキソール-5-カルボニル)-ヒドラジド、
3-メトキシ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-メチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(3-メチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N’-(5-ブロモ-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボニル)-N-tert-ブチル-ヒドラジド、
3-クロロ-5-メチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-エチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
3-メチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-エチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1, 4]ジオキシン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
2-メトキシ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-エチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
3-メトキシ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-エチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N’-(ベンゾチアゾール-6-カルボニル)-N-tert-ブチル-ヒドラジド、
4-クロロ-2-メトキシ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2-エチル-3-メトキシ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(2,5-ジメトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(6-メチル-ベンゾ[1,3]ジオキソール-5-カルボニル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N’-(4H-ベンゾ[1,3]ジオキシン-6-カルボニル)-N-tert-ブチル-ヒドラジド、
2-メトキシ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(8-メチル-4H-ベンゾ[1,3]ジオキシン-7-カルボニル)-ヒドラジド、
4-フルオロ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(8-エチル-4H-ベンゾ[1,3]ジオキシン-7-カルボニル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(6-クロロ-ベンゾ[1,3]ジオキソール-5-カルボニル)-ヒドラジド、
2,3,6-トリフルオロ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(2-クロロ-4-フルオロ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2-エチル-3-メトキシ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(2,6-ジフルオロ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-フルオロ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-ブロモ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル) -ヒドラジド、
2-エチル-3-メトキシ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(2-ニトロ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2,3-ジフルオロ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2-エチル-3-メトキシ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3,4,5-トリメトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-フルオロ-5-トリフルオロメチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-シアノ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル) -ヒドラジド、
2,4-ジクロロ-5-フルオロ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(3-メトキシ-2-ビニル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
安息香酸N-tert-ブチル-N’-(8-エチル-4H-ベンゾ[1,3]ジオキシン-7-カルボニル)-ヒドラジド、
2-[N-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジノ]-2-メチル-プロピオン酸エチルエステル、
2-エチル-3-メトキシ安息香酸N’-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-N’-(2-ヒドロキシ-1,1-ジメチル-エチル)-ヒドラジド、
2-エチル-3-メトキシ安息香酸N’-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-N’-(1,1-ジメチル-2-オキソ-エチル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-N-(2-メトキシ-1,1-ジメチル-エチル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-N-(2-ヒドロキシイミノ-1,1-ジメチル-エチル)-ヒドラジド、
2-アミノ-3-メトキシ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
酢酸3-[N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジノカルボニル]-5-メチル-ベンジルエステル、
酢酸2-[N-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジノ]-2-メチル-プロピルエステル、
3-ヒドロキシ-2-メチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(2,3,4-トリフルオロ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-ヒドロキシ-2-メチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3-クロロ-5-メトキシ-ピリジン-4-カルボニル)-ヒドラジド、
3-ヒドロキシ-2-メチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(2,6-ジクロロ-ピリジン-4-カルボニル)-ヒドラジド、
3-ヒドロキシ-2-メチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3-メトキシ-ピリジン-4-カルボニル)-ヒドラジド、
3-ヒドロキシ-2-メチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3,5-ジメトキシ-4-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2-メトキシ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-メチル-クロマン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
2,4-ジクロロ-5-フルオロ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2,4-ジクロロ-5-フルオロ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-メチル-クロマン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
2-フルオロ-5-メチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-メチル-クロマン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
5-メチル-クロマン-6-安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3,5-ジメトキシ-4-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2,5-ジフルオロ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-エチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
2,3,4-トリフルオロ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-エチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
2,3,4,5-テトラフルオロ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-エチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
4-フルオロ-3-トリフルオロメチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-エチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
2,6-ジクロロ-イソニコチン酸N-tert-ブチル-N’-(5-エチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
2-メトキシ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-エチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
2,4-ジクロロ-5-フルオロ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-エチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボニル)-ヒドラジド
4-クロロ-2-フルオロ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-エチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
酢酸3-[N’-tert-ブチル-N’-(3,5-ジメトキシ-4-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジノカルボニル]-2-メチル-フェニルエステル、
2-エチル-3-メトキシ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(5-クロロ-2-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
4-クロロ-2-メトキシ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(4-エチル-ベンゾ[1,3]ジオキソール-5-カルボニル)-ヒドラジド、
5-クロロ-2-メトキシ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-メチル-クロマン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
2-エチル-3-メトキシ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(5-メチル-2-ニトロ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2-エチル-3-メトキシ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(4-クロロ-2-ニトロ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2-エチル-3-メトキシ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(5-クロロ-2-ニトロ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
5-メチル-クロマン-6-カルボン酸N’-tert-ブチル-N’-(5-メチル-2-ニトロ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
ベンゾ[1,2,5]オキサジアゾール-5-カルボン酸N’-tert-ブチル-N’-(4-クロロ-2-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2-クロロ-5-ニトロ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(3-メトキシ-2-ビニル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
4-クロロ-2-メトキシ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(3-メトキシ-2-ビニル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2-エチル-3-メトキシ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(1-メチル-1H-インドール-2-カルボニル)-ヒドラジド、
3,5-ジメトキシ-4-メチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-エチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-クロロ-4H-ベンゾ[1,3]ジオキシン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
4-エチル-2-フルオロ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3-ニトロ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-メトキシ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(4-エチル-2-フルオロ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
5-クロロ-4H-ベンゾ[1,3]ジオキシン-6-カルボン酸N’-tert-ブチル-N’-(3,5-ジメトキシ-4-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
4-エチル-2-フルオロ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(2,6-ジクロロ-ピリジン-4-カルボニル)-ヒドラジド、
4-エチル-2-フルオロ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3,5-ジメトキシ-4-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
4-エチル-2-フルオロ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3,4,5-トリフルオロ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
4-エチル-2-フルオロ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
4-エチル-2-フルオロ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(2-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
4-エチル-2-フルオロ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(5-フルオロ-2-ニトロ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
4-エチル-2-フルオロ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-[5-メトキシ-2-(2,2, 2-トリフルオロ-エトキシ)-ベンゾイル]-ヒドラジド、
4-エチル-2-フルオロ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(2-クロロ-6-メチル-ピリジン-4-カルボニル)-ヒドラジド、
4-エチル-2-フルオロ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(2,6-ジメトキシ-ピリジン-3-カルボニル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(１H-インドール-6-カルボニル)-ヒドラジド、
2-エチル-3-メトキシ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(2-メタンスルフィニル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2,2-ジフルオロ-ベンゾ[1,3]ジオキソール-5-カルボンN’-tert-ブチル-N’-(2-ニトロ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(2,2-ジフルオロ-ベンゾ[1,3]ジオキソール-5-カルボニル)-ヒドラジド、
3-メトキシ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(2,2-ジフルオロ-ベンゾ[1,3]ジオキソール-5-カルボニル)-ヒドラジド、
3-ブロモ安息香酸N-(シアノ-ジメチル-メチル)-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,5-ジクロロ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(3-メトキシ-2-メトキシメチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-(ヒドロキシイミノ-メチル)-5-メチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-(H2NC(O)NHN=CH)-5-メチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-(H2NC(O)C(O)NHN=CH)-5-メチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2-エチル-3-メトキシ安息香酸N’-(シアノ-ジメチル-メチル)-N’-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2-エチル-3-メトキシ安息香酸N’-(シアノ-ジメチル-メチル)-N’-(3,5-ジメトキシ-4-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2-メトキシ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(8-エチル-4H-ベンゾ[1,3]ジオキシン-7-カルボニル)-ヒドラジド、
2,4,5-トリフルオロ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-メチル-クロマン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
3,4,5-トリフルオロ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-メチル-クロマン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
3-フルオロ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-メチル-クロマン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
3-トリフルオロメチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(4-エチル-ベンゾ[1,3]ジオキソール-5-カルボニル)-ヒドラジド、
4-フルオロ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-メチル-クロマン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
3,4-ジフルオロ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-メチル-クロマン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
3,5-ジフルオロ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-メチル-クロマン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
2,3,4,5-テトラフルオロ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-メチル-クロマン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
4-メチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(8-エチル-4H-ベンゾ[1,3]ジオキシン-7-カルボニル)-ヒドラジド、
酢酸4-[N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジノカルボニル]-2,6-ジメトキシ-フェニルエステル、
2-エチル-3-メトキシ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(4-ヒドロキシ-3,5-ジメトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
5-メチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボン酸N’-tert-ブチル-N’-(3,5-ジメトキシ-4-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
5-メチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボン酸N’-tert-ブチル-N’-(2,6-ジメトキシ-ピリジン-3-カルボニル)-ヒドラジド、
2,6-ジクロロ-イソニコチン酸N-tert-ブチル-N’-(5-メチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
3-フルオロ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-メチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
3-フルオロ-5-トリフルオロメチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-メチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
5-メチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボン酸N’--tert-ブチル-N’-(5-メチル-2-ニトロ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
5-メチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボン酸N’-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-N’-(1-エチル-2,2-ジメチル-プロピル)-ヒドラジド、
5-メチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボン酸N’-(3,5-ジメトキシ-4-メチル-ベンゾイル)-N’-(1-エチル-2,2-ジメチル-プロピル)-ヒドラジド、
5-メチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボン酸N’-(1-tert-ブチル-ブチル)-N’-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
5-メチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボン酸N’-(1-tert-ブチル-ブチル)-N’-(3,5-ジメトキシ-4-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
5-エチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボン酸N’-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-N’-(1-エチル-2,2-ジメチル-プロピル)-ヒドラジド、
5-エチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボン酸N’-(3,5-ジメトキシ-4-メチル-ベンゾイル)-N’-(1-エチル-2,2-ジメチル-プロピル)-ヒドラジド、
5-エチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボン酸N’-(1-tert-ブチル-ブチル)-N’-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
5-エチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボン酸N’-(1-tert-ブチル-ブチル)-N’-(3,5-ジメトキシ-4-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2-メトキシ-6-トリフルオロメチル-ニコチン酸N-tert-ブチル-N’-(3-メトキシ-2-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-メトキシ-2-メチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(1-メチル-2-オキソ-6-トリフルオロメチル-1,2-ジヒドロ-ピリジン-3-カルボニル)-ヒドラジド、
2,6-ジメトキシ-ピリミジン-4-カルボン酸N-tert-ブチル-N’-(3-メトキシ-2-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,6-ジメトキシ-ピリダジン-4-カルボン酸N-tert-ブチル-N’-(3-メトキシ-2-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,6-ジクロロ-ピリダジン-4-カルボン酸N-tert-ブチル-N’-(3-メトキシ-2-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
ピリダジン-4-安息香酸N-tert-ブチル-N’-(3-メトキシ-2-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
6-メトキシ-3-オキソ-2,3-ジヒドロ-ピリダジン-4-カルボン酸N-tert-ブチル-N’-(3-メトキシ-2-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、又はピリダジン位置異性体、              3,5-ジメチル安息香酸N-(1-エチル-2,2-ジメチル-プロピル)-N’-(3-メトキシ-2-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,5-ジメトキシ-4-メチル安息香酸N-(1-エチル-2,2-ジメチル-プロピル)-N’-(3-メトキシ-2-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N-(1-tert-ブチル-ブチル)-N’-(3-メトキシ-2-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,5-ジメトキシ-4-メチル安息香酸N-(1-tert-ブチル-ブチル)-N’-(3-メトキシ-2-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N-(1-エチル-2,2-ジメチル-プロピル)-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,5-ジメトキシ-4-メチル安息香酸N-(1-エチル-2,2-ジメチル-プロピル)-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N-(1-tert-ブチル-ブチル)-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,5-ジメトキシ-4-メチル安息香酸N-(1-tert-ブチル-ブチル)-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2,3-ジメチル安息香酸N’-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-N’-(1-エチル-2,2-ジメチル-プロピル)-ヒドラジド、
3-ヒドロキシ-2-メチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3-メトキシ-ピリジン-4-カルボニル)-ヒドラジド
4-(1-ヒドロキシ-エチル)-安息香酸N’-(3,5-ビス-ヒドロキシメチル-ベンゾイル)-N’-tert-ブチル-ヒドラジド、
2-エチル-3-メトキシ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(2-メタンスルフィニル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
5-[N’-(4-アセチル-ベンゾイル)-N-tert-ブチル-ヒドラジノカルボニル] -イソフタル酸、
5-メチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボン酸N’-tert-ブチル-N’-(2,6-ジメトキシ-ピリジン-3-カルボニル)-ヒドラジド、
4-フルオロ-3-トリフルオロメチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-エチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
2-[N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジノカルボニル]-ベンゼンスルホン酸、
3,5-ジメチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-メチル-クロマン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
4-エチル安息香酸N’-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-N’-(1,2,2-トリメチル-プロピル)-ヒドラジド、
3-メチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-エチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1, 4]ジオキシン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
2,3-ジメチル安息香酸N’-ベンゾイル-N’-(1-エチル-ペンチル)-ヒドラジド、
2,3-ジメチル安息香酸N’-(1-エチル-2,2-ジメチル-プロピル)-N’-(3-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
5-メチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボン酸N’-tert-ブチル-N’-(4-ヒドロキシ-3,5-ジメトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-フルオロ-4H-ベンゾ[1,3]ジオキシン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
2-メタンスルフィニル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-メチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
5-メチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボン酸N’-(シアノ-ジメチル-メチル)-N’-(3,5-ジメトキシ-4-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
6-メチル-ピリジン-2-カルボン酸N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
5-メチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボン酸N’-tert-ブチル-N’-(3,5-ジメトキシ-4-メチル-2-ニトロ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
4-エチル安息香酸N’-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-N’-(1-エチル-2,2-ジメチル-プロピル)-ヒドラジド、
4-エチル安息香酸N’-(1-エチル-2,2-ジメチル-プロピル)-N’-(2-メトキシ-ピリジン-3-カルボニル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N-(1-tert-ブチル-ペンチル)-N’-(4-エチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,5-ジメトキシ-4-メチル安息香酸N-(1-tert-ブチル-ペンチル)-N’-(4-エチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2-メトキシ-ニコチン酸N-(1-tert-ブチル-ペンチル)-N’-(4-エチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N-(2,2-ジメチル-1-フェニル-プロピル)-N’-(4-エチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,5-ジメトキシ-4-メチル安息香酸N-(2,2-ジメチル-1-フェニル-プロピル)-N’-(4-エチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2-メトキシ-ニコチン酸N-(2,2-ジメチル-1-フェニル-プロピル)-N’-(4-エチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
1H-ベンゾイミダゾール-5-カルボン酸N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
1-(又は3-)トリチル-１H-ベンゾイミダゾール-5-カルボン酸N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
5-メチル-1-フェニル-1H-ピラゾール-3-カルボン酸N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-クロロ-6-メチルスルファニル-ピラジン-2-カルボン酸N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
1H-インダゾール-3-カルボン酸N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
1-トリチル-1H-インダゾール-3-カルボン酸N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
6-[N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジノカルボニル]-ニコチン酸メチルエステル、
ピラジン-2-カルボン酸N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N-[2-(tert-ブチル-ジメチル-シラニルオキシ)-1,1-ジメチル-エチル]-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-N-[2-(2-ヒドロキシ-エチルイミノ)-1,1-ジメチル-エチル]ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N-[(H2NC(O)NHN=C)(CH3)2C-]-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N-[(H2NC(O)C(O)NHN=C)(CH3)2C-]-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2-[N-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジノ]-2-メチル-プロピオン酸、
3,5-ジメチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(2-メタンスルフィニルメチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(2-メタンスルホニルメチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(2-ジメチルアミノメチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(2-メチルアミノメチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(3-メトキシ-2-メタンスルファニルメチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N’-(2-アリルオキシメチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-N-tert-ブチル-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N-(1-tert-ブチル-ペンチル)-N’-(3-メトキシ-2-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,5-ジメトキシ-4-メチル安息香酸N-(1-tert-ブチル-ペンチル)-N’-(3-メトキシ-2-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N’-(2-アセトキシオキシメチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-N-tert-ブチル-ヒドラジド、及び
5-メチル-ピラジン-2-カルボン酸N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド
から構成されるグループから選らばれる化合物の有効量を対象に投与することを含む、
方法。
【請求項８】
対象の細胞内でエクジソン受容体複合体をリガンドに接触させて、遺伝子導入された対象の中で、内因性又は非相同性の遺伝子発現を調節する方法であり、
前記細胞は、リガンドと結合する時に、エクジソン受容体複合体のDNA結合配列をさらに含み、エクジソン受容体複合体/リガンド/DNA結合配列複合体は前記遺伝子の発現を誘導するものであり、前記リガンドは、、
(1)  以下の式の化合物で、
【化４】
2014111634.tif 000137
ここでＸとＸ’は独立してＯ又はＳであり、
Aは非置換又は置換フェニルで、置換体は独立して１から５までのH;ハロ；ニトロ；シアノ；ヒドロキシ；アミノ(‐NRaRb)；アルキルアミノアルキル(‐(CH2)ｎNRaRb)；(C1-C6)アルキル；(C1-C6)ハロアルキル；(C1-C6)シアノアルキル；(C1-C6)ヒドロキシアルキル；(C1-C6)アルコキシ；フェノキシ；(C1-C6)ハロアルコキシ；(C1-C6)アルコキシ(C1-C6)アルキル；(C1-C6)アルケニルオキシ(C1-C6)アルキル；(C1-C6)アルコキシ(C1-C6)アルコキシ；(C1-C6)アルカノイルオキシ(C1-C6)アルキル；ハロ、シアノ、(C1-C4)アルキル、又は(C1-C4)アルコキシで選択的に置換した(C2-C6)アルケニル；ハロ又は(C1-C4)アルキルで選択的に置換した(C2-C6)アルキニル；フォルミル；カルボキシ；(C1-C6)アルキルカルボニル；(C1-C6)ハロアルキルカルボニル；ベンゾイル；(C1-C6)アルコキシカルボニル；(C1-C6)ハロアルコキシカルボニル；(C1-C6)アルカノイルオキシ(‐OCORa)；カルボキシアミド(‐CONRaRb)；アミド(‐N RaCORb)；アルコキシカルボニルアミノ(‐NRaCO2Rb)；アルキルアミノカルボニルアミノ(‐N RaCONRbRc)；メルカプト；(C1-C6)アルキルチオ；(C1-C6)アルキルスルホニル；(C1-C6)アルキルスルホニル(C1-C6)アルキル；(C1-C6)アルキルスルホキシド(‐S(O)Ra)；(C1-C6)アルキルスルホキシド(C1-C6)アルキル(‐(CH2)ｎS(O)Ra)；フルファミド(‐SO2NRaRb)；‐SO3H；又は非置換又は置換フェニルで、置換体は独立して１から3までのハロ、ニトロ、(C1-C6)アルコキシ、(C1-C6)アルキル、又はアミノ；あるいはフェニル環の隣接する2つの位置の１つ又は両方が置換される場合、付着している原子は、(‐OCH2O)、(‐OCH(CH3)O-)、(‐CH2CH2O-)、(‐OCH(CH3)CH2O -)、(‐S- CH=N -)、(‐CH2OCH2O‐)、(‐O(CH2)3‐)、(＝N-O-N=)、(‐C=CH-NH-)、(‐OCF2O-)、(‐N-CH=N-)、(‐CH2CH2O-)、及び(‐(CH2)4) からなるグループから選ばれた連結のフェニル結合末端を形成する場合があり、
Bは、
(a)非置換又は置換フェニルで、置換体は独立して１から５までのH; ハロ；ニトロ；シアノ；ヒドロキシ；アミノ(‐NRaRb)；アルキルアミノアルキル(‐(CH2)ｎNRaRb)；(C1-C6)アルキル；(C1-C6)ハロアルキル；(C1-C6)シアノアルキル；(C1-C6)ヒドロキシアルキル；(C1-C6)アルコキシ；フェノキシ；(C1-C6)ハロアルコキシ；(C1-C6)アルコキシ(C1-C6)アルキル；(C1-C6)アルケニルオキシ(C1-C6)アルキル；(C1-C6)アルコキシ(C1-C6)アルコキシ；(C1-C6)アルカノイルオキシ(C1-C6)アルキル；ハロ、シアノ、(C1-C4)アルキル、又は(C1-C4)アルコキシで選択的に置換した(C2-C6)アルケニル；ハロ又は (C1-C4)アルキルで選択的に置換した(C2-C6)アルキニル；フォルミル；カルボキシ；(C1-C6)アルキルカルボニル；(C1-C6)ハロアルキルカルボニル；ベンゾイル；(C1-C6)アルコキシカルボニル；(C1-C6)ハロアルコキシカルボニル；(C1-C6)アルカノイルオキシ(‐OCORa)；カルボキシアミド(‐CONRaRb)；アミド(‐N RaCORb)；アルコキシカルボニルアミノ (‐NRaCO2Rb)；アルキルアミノカルボニルアミノ(‐N RaCONRbRc)；メルカプト；(C1-C6)アルキルチオ；(C1-C6)アルキルスルホニル；(C1-C6)アルキルスルホニル(C1-C6)アルキル；(C1-C6)アルキルスルホキシド(‐S(O)Ra)；(C1-C6)アルキルスルホキシド(C1-C6)アルキル(‐(CH2)ｎS(O)Ra)；フルファミド(‐SO2NRaRb)；‐SO3H；又は非置換又は置換フェニルで、置換体は独立して１から3までのハロ、ニトロ、(C1-C6)アルコキシ、(C1-C6)アルキル、又はアミノ；あるいはフェニル環の隣接する2つの位置の１つ又は両方がC、N、O、又はSで置換される場合、これらの原子は、(‐OCH2O‐)、(‐OCH(CH3)O-)、(‐CH2CH2O -)、(‐OCH(CH3)CH2O-)、(‐S- CH=N -)、(‐CH2OCH2O‐)、(‐O(CH2)3‐)、(＝N-O-N=)、(‐C=CH-NH-)、(‐OCF2O-)、(‐NH-CH=N-)、(‐CH2CH2O-)、及び(‐(CH2)4‐)からなるグループから選ばれた連結のフェニル結合末端を形成する場合があり；
(ｂ)1-3窒素原子及び3-5核炭素原子を持つ非置換6員環ヘテロサイクル又は置換６員環ヘテロサイクルで、置換体は１から3までの同じ又は異なるハロ；ニトロ；ヒドロキシ；(C1-C6)アルキル；(C1-C6)アルコキシ；(C1-C6)チオアルコキシ；カルボキシ；(C1-C6)アルコキシカルボニル；(C1-C6)カルボキシアルキル；各アルキル・グループに独立に定まった数の炭素原子を持つ(C1-C6)アルコキシカルボニルアルキル；‐CONRaRb；アミノ；(C1-C6)アルキルアミノ；各アルキル・グループに独立に定まった数の炭素原子を持つ(C1-C6)ジアルキルアミノ；‐CF3を含むハロアルキル；‐C=N-NHC(O)NRaRb)；又は‐C=N-NHC(O)C(O)NRaRb)；あるいは
(ｃ)５−ベンズイミダゾリル；１−トリチル‐５−ベンズイミダゾリル；３−トリチル‐５−ベンズイミダゾリル；１H-インダゾール‐３‐イル；１‐トリチル‐１H‐インダゾール‐３‐イル；又は１‐(C1-C6)アルキル‐１H‐インドール‐2‐イル；  Eは非置換又は置換(C4-C10)側鎖アルキルであり、置換体は独立に1−4シアノ；ハロ；(C5-C6)シクロアルキル；フェニル；(C2-C3)アルケニル；ヒドロキシ；(C1-C6)アルコキシ；カルボキシ；(C1-C6)アルコキシカルボニル；(C1-C6)アルカノイルオキシ(‐OCORa)；フォルミル；各アルキル・グループに独立に定まった数の炭素原子を持つ(C1-C6)トリアルキルシリルオキシ；‐C=N-ORa；‐C=N-Rd；‐C=N-NHC(O)NRaRb；又は‐C=N-NHC(O)C(O) N RaRb；
ここで、Ra、Rb、及びRｃは独立にH、(C1-C6)アルキル、又はフェニルであり；Rdはヒドロキシ(C1-C6)アルキル；及びｎ＝1-4；そして
GはH又はCN；
もし、
Eが第三級の炭素を含む(C4-C6)アルキル、又は第三級の炭素を含むシアノ(C4-C5)アルキルである場合、
Bは、
(a)  置換フェニルで、置換体は独立して１から５までのH; ハロ；ニトロ；シアノ；ヒドロキシ；アミノ(‐NRaRb)；アルキルアミノアルキル(‐(CH2)ｎNRaRb)；(C1-C6)アルキル；(C1-C6)ハロアルキル；(C1-C6)シアノアルキル；(C1-C6)ヒドロキシアルキル；(C1-C6)アルコキシ；フェノキシ；(C1-C6)ハロアルコキシ；(C1-C6)アルコキシ(C1-C6)アルキル；(C1-C6)アルケニルオキシ(C1-C6)アルキル；(C1-C6)アルコキシ(C1-C6)アルコキシ；(C1-C6)アルカノイルオキシ(C1-C6)アルキル；ハロ、シアノ、(C1-C4)アルキル、又は(C1-C4)アルコキシで選択的に置換した(C2-C6)アルケニル；ハロ又は(C1-C4)アルキルで選択的に置換した(C2-C6)アルキニル；フォルミル；カルボキシ；(C1-C6)アルキルカルボニル；(C1-C6)ハロアルキルカルボニル；ベンゾイル；(C1-C6)アルコキシカルボニル；(C1-C6)ハロアルコキシカルボニル；(C1-C6)アルカノイルオキシ(‐OCORa)；カルボキシアミド(‐CONRaRb)；アミド(‐N RaCORb)；アルコキシカルボニルアミノ(‐NRaCO2Rb)；アルキルアミノカルボニルアミノ(‐N RaCONRbRc)；メルカプト；(C1-C6)アルキルチオ；(C1-C6)アルキルスルホニル；(C1-C6)アルキルスルホニル(C1-C6)アルキル；(C1-C6)アルキルスルホキシド(‐S(O)Ra)；(C1-C6)アルキルスルホキシド(C1-C6)アルキル(‐(CH2)ｎS(O)Ra)；フルファミド(‐SO2NRaRb)；‐SO3H；又は非置換又は置換フェニルで、置換体は独立して１から3までのハロ、ニトロ、(C1-C6)アルコキシ、(C1-C6)アルキル、又はアミノ；あるいはフェニル環の隣接する2つの位置の１つ又は両方が置換される場合、付着している原子は、(‐OCH2O‐)、(‐OCH(CH3)O-)、(‐CH2CH2O-)、(‐OCH(CH3)CH2O -)、(‐S- CH=N -)、(‐CH2OCH2O‐)、(‐O(CH2)3‐)、(＝N-O-N=)、(‐C=CH-NH-)、(‐OCF2O-)、(‐NH-CH=N-)、(‐CH2CH2O-)、及び(‐(CH2)4‐)からなるグループから選ばれた連結のフェニル結合末端を形成する場合があり、そして少なくとも１つのヒドロキシ、ニトロ、‐C=NOH、アセトキシ、カルボキシ、−S(O)CH3、−C=N-NHC(O)NRaRb、又は−C=N-NHC(O)C(O)NRaRbを持っており、あるいはフェニル環の隣接する2つの位置がOで置換され、これらの原子が連結(‐OCH2O)のフェニル結合末端を形成する場合があり、
(ｂ)1-3窒素原子及び3-5核炭素原子を持つ非置換6員環ヘテロサイクル又は置換６員環ヘテロサイクルで、置換体は１から3までの同じ又は異なるハロ；ニトロ；ヒドロキシ；(C1-C6)アルキル；(C1-C6)アルコキシ；(C1-C6)チオアルコキシ；カルボキシ；(C1-C6)アルコキシカルボニル；(C1-C6)カルボキシアルキル；各アルキル・グループに独立に定まった数の炭素原子を持つ(C1-C6)アルコキシカルボニルアルキル；‐CONRaRb；アミノ；(C1-C6)アルキルアミノ；各アルキル・グループに独立に定まった数の炭素原子を持つ(C1-C6)ジアルキルアミノ；‐CF3を含むハロアルキル；‐C=N-NHC(O)NRaRb)；又は‐C=N-NHC(O)C(O)NRaRb)；あるいは
(ｃ)５−ベンズイミダゾリル；１−トリチル‐５−ベンズイミダゾリル；３−トリチル‐５−ベンズイミダゾリル；１H-インダゾール‐３‐イル；１‐トリチル‐１H‐インダゾール‐３‐イル；又は１‐(C1-C6)アルキル‐１H‐インドール‐2‐イル；  ここで、Ra及びRbは独立にH、(C1-C6)アルキル、又はフェニルであり；あるいは、
(２)  以下の化合物、
4-クロロ安息香酸N’-ベンゾイル-N”-tert-ブチル-ヒドラジド、
4-エチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(2-ニトロ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
4-メチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
4-エチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,5-ジクロロ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(2,6-ジフルオロ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-クロロ-2-メチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3-クロロ-ベンゾイル) -ヒドラジド、
2-クロロ-3-メトキシ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(2-クロロ-5-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-クロロ-2-メチル安息香酸N’-(4-ブロモ-3-メチル-ベンゾイル)-N’-tert-ブチル-ヒドラジド、
4-エチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(4-クロロ-3,5-ジメチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
4-エチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3-クロロ-4,5-ジメチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
4-メトキシ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(2-クロロ-4-フルオロ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
4-エチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3-クロロ-5-メチル-ベンゾイル) -ヒドラジド、
4-エチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(2-エチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
4-メトキシ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3,5-ジクロロ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
4-エチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(5-メチル-2-ニトロ-ベンゾイル) -ヒドラジド、
4-シアノメチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-メチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(3-メトキシ-2-メチル-ベンゾイル) -ヒドラジド、
4-ブロモ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3,5-ジクロロ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2-メチル-3-ニトロ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2,3-ジメチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(2,5-ジメトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド
2,3-ジメチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(5-クロロ-2-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(3-メトキシ-2-ニトロ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2,3-ジメチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3,5-ジメトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-クロロ-4-エチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
4-(1-ヒドロキシ-エチル)安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3,5-ジフロロ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-ジメチルアミノ-2-メチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3,5-ジクロロ-ベンゾイル)-ヒドラジド
3-アセチル-2-メチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
酢酸3-[N’-tert-ブチル-N’-(3,5-ジクロロ-ベンゾイル)-ヒドラジノカルボニル]-2-メチル-フェニルエステル、
3-ヨード-2-メチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-メトキシ-2-メチル安息香酸N’-(3-ブロモ-5-クロロ-ベンゾイル)-N’-tert-ブチル-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(3-イソプロポキシ-2-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-メトキシ-2-メチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(2-クロロ-ピリジン-3-カルボニル)-ヒドラジド、
3-メトキシ-2-メチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(2-メトキシ-5-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-メトキシ-2-メチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(2,5-ジフロロ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-メトキシ-2-メチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(2-エチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-メトキシ-2-メチル安息香酸N’-(3-ブロモ-5-メチル-ベンゾイル)-N’-tert-ブチル-ヒドラジド、
3-メトキシ-2-メチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3-メトキシ-5-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-メトキシ-2-メチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(4-クロロ-2-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2-メチル-3-トリフルオロメトキシ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-メトキシ-2-メチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3-メトキシ-4-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-メトキシ-4-メチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-メトキシ-2-メチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(2-メトキシ-4-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-メトキシ-2-メチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(2,6-ジクロロ-ピリジン-4-カルボニル)-ヒドラジド、
3-メトキシ-2-メチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(5-メチル-2-ニトロ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-メトキシ-2-メチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(4-クロロ-2-フルオロ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2-クロロ-4-フルオロ安息香酸N’-(ベンゾ[1,3]ジオキソール-5-カルボニル)-N-tert-ブチル-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-エチル-2-メチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(2,3-ジヒドロ-ベンゾフラン-5-カルボニル)-ヒドラジド、
3-メトキシ-2-メチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3,5-ジクロロ-4-フルオロ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
4-フルオロ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(4-メチル-ベンゾ[1,3]ジオキソール-5-カルボニル)-ヒドラジド
2-メトキシ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(4-エチル-ベンゾ[1,3]ジオキソール-5-カルボニル)-ヒドラジド、
3,4-ジエチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
4-フルオロ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド
2-メトキシ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-メトキシ-2-メチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(4-フルオロ-2-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2-クロロ-6-メチルイソニコチン酸N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,5-ジメトキシ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2-ヨード-3-メトキシ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2-メトキシ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5,6,7,8-テトラヒドロ-ナフタレン-2-カルボニル)-ヒドラジド、
2-エチル-3-メトキシ安息香酸N’-(ベンゾ[1,3]ジオキソール-4-カルボニル)-N’-tert-ブチル-ヒドラジド、
4-エチル-2-フルオロ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(4-フルオロ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
ベンゾ[1,3]ジオキソール-5-カルボン酸N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
4-フルオロ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-メチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(2-メチル-ベンゾ[1,3]ジオキソール-5-カルボニル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(4-エチル-2-メチル-ベンゾ[1, 3]ジオキソール-5-カルボニル)-ヒドラジド、
3-メトキシ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-メチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(3-メチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボニル)-ヒドラジド
3,5-ジメチル安息香酸N’-(5-ブロモ-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボニル)-N-tert-ブチル-ヒドラジド、
3-クロロ-5-メチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-エチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
3-メチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-エチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1, 4]ジオキシン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
2-メトキシ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-エチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
3-メトキシ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-エチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N’-(ベンゾチアゾール-6-カルボニル)-N-tert-ブチル-ヒドラジド、
4-クロロ-2-メトキシ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2-エチル-3-メトキシ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(2,5-ジメトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(6-メチル-ベンゾ[1,3]ジオキソール-5-カルボニル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N’-(4H-ベンゾ[1,3]ジオキシン-6-カルボニル)-N-tert-ブチル-ヒドラジド、
2-メトキシ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(8-メチル-4H-ベンゾ[1,3]ジオキシン-7-カルボニル)-ヒドラジド、
4-フルオロ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(8-エチル-4H-ベンゾ[1,3]ジオキシン-7-カルボニル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(6-クロロ-ベンゾ[1,3]ジオキソール-5-カルボニル)-ヒドラジド、
2,3,6-トリフルオロ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(2-クロロ-4-フルオロ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2-エチル-3-メトキシ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(2,6-ジフルオロ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-フルオロ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-ブロモ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル) -ヒドラジド、
2-エチル-3-メトキシ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(2-ニトロ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2,3-ジフルオロ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2-エチル-3-メトキシ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3,4,5-トリメトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-フルオロ-5-トリフルオロメチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-シアノ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル) -ヒドラジド、
2,4-ジクロロ-5-フルオロ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(3-メトキシ-2-ビニル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
安息香酸N-tert-ブチル-N’-(8-エチル-4H-ベンゾ[1,3]ジオキシン-7-カルボニル)-ヒドラジド、
2-[N-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジノ]-2-メチル-プロピオン酸エチルエステル、
2-エチル-3-メトキシ安息香酸N’-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-N’-(2-ヒドロキシ-1,1-ジメチル-エチル)-ヒドラジド、
2-エチル-3-メトキシ安息香酸N’-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-N’-(1,1-ジメチル-2-オキソ-エチル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-N-(2-メトキシ-1,1-ジメチル-エチル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-N-(2-ヒドロキシイミノ-1,1-ジメチル-エチル)-ヒドラジド、
2-アミノ-3-メトキシ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
酢酸3-[N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジノカルボニル]-5-メチル-ベンジルエステル、
酢酸2-[N-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジノ]-2-メチル-プロピルエステル、
3-ヒドロキシ-2-メチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(2,3,4-トリフルオロ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-ヒドロキシ-2-メチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3-クロロ-5-メトキシ-ピリジン-4-カルボニル)-ヒドラジド、
3-ヒドロキシ-2-メチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(2,6-ジクロロ-ピリジン-4-カルボニル)-ヒドラジド、
3-ヒドロキシ-2-メチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3-メトキシ-ピリジン-4-カルボニル)-ヒドラジド、
3-ヒドロキシ-2-メチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3,5-ジメトキシ-4-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2-メトキシ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-メチル-クロマン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
2,4-ジクロロ-5-フルオロ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2,4-ジクロロ-5-フルオロ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-メチル-クロマン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
2-フルオロ-5-メチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-メチル-クロマン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
5-メチル-クロマン-6-安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3,5-ジメトキシ-4-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2,5-ジフルオロ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-エチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
2,3,4-トリフルオロ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-エチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
2,3,4,5-テトラフルオロ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-エチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
4-フルオロ-3-トリフルオロメチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-エチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
2,6-ジクロロ-イソニコチン酸N-tert-ブチル-N’-(5-エチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
2-メトキシ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-エチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
2,4-ジクロロ-5-フルオロ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-エチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
4-クロロ-2-フルオロ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-エチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
酢酸3-[N’-tert-ブチル-N’-(3,5-ジメトキシ-4-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジノカルボニル]-2-メチル-フェニルエステル、
2-エチル-3-メトキシ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(5-クロロ-2-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
4-クロロ-2-メトキシ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(4-エチル-ベンゾ[1,3]ジオキソール-5-カルボニル)-ヒドラジド、
5-クロロ-2-メトキシ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-メチル-クロマン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
2-エチル-3-メトキシ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(5-メチル-2-ニトロ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2-エチル-3-メトキシ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(4-クロロ-2-ニトロ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2-エチル-3-メトキシ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(5-クロロ-2-ニトロ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
5-メチル-クロマン-6-カルボン酸N’-tert-ブチル-N’-(5-メチル-2-ニトロ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
ベンゾ[1,2,5]オキサジアゾール-5-カルボン酸N’-tert-ブチル-N’-(4-クロロ-2-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2-クロロ-5-ニトロ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(3-メトキシ-2-ビニル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
4-クロロ-2-メトキシ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(3-メトキシ-2-ビニル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2-エチル-3-メトキシ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(1-メチル-1H-インドール-2-カルボニル)-ヒドラジド、
3,5-ジメトキシ-4-メチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-エチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-クロロ-4H-ベンゾ[1,3]ジオキシン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
4-エチル-2-フルオロ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3-ニトロ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-メトキシ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(4-エチル-2-フルオロ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
5-クロロ-4H-ベンゾ[1,3]ジオキシン-6-カルボン酸N’-tert-ブチル-N’-(3,5-ジメトキシ-4-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
4-エチル-2-フルオロ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(2,6-ジクロロ-ピリジン-4-カルボニル)-ヒドラジド、
4-エチル-2-フルオロ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3,5-ジメトキシ-4-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
4-エチル-2-フルオロ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3,4,5-トリフルオロ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
4-エチル-2-フルオロ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
4-エチル-2-フルオロ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(2-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
4-エチル-2-フルオロ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(5-フルオロ-2-ニトロ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
4-エチル-2-フルオロ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-[5-メトキシ-2-(2,2, 2-トリフルオロ-エトキシ)-ベンゾイル]-ヒドラジド、
4-エチル-2-フルオロ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(2-クロロ-6-メチル-ピリジン-4-カルボニル)-ヒドラジド、
4-エチル-2-フルオロ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(2,6-ジメトキシ-ピリジン-3-カルボニル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(１H-インドール-6-カルボニル)-ヒドラジド、
2-エチル-3-メトキシ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(2-メタンスルフィニル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2,2-ジフルオロ-ベンゾ[1,3]ジオキソール-5-カルボンN’-tert-ブチル-N’-(2-ニトロ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(2,2-ジフルオロ-ベンゾ[1,3]ジオキソール-5-カルボニル)-ヒドラジド、
3-メトキシ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(2,2-ジフルオロ-ベンゾ[1,3]ジオキソール-5-カルボニル)-ヒドラジド、
3-ブロモ安息香酸N-(シアノ-ジメチル-メチル)-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,5-ジクロロ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(3-メトキシ-2-メトキシメチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-(ヒドロキシイミノ-メチル)-5-メチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-(H2NC(O)NHN=CH)-5-メチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-(H2NC(O)C(O)NHN=CH)-5-メチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2-エチル-3-メトキシ安息香酸N’-(シアノ-ジメチル-メチル)-N’-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2-エチル-3-メトキシ安息香酸N’-(シアノ-ジメチル-メチル)-N’-(3,5-ジメトキシ-4-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2-メトキシ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(8-エチル-4H-ベンゾ[1,3]ジオキシン-7-カルボニル)-ヒドラジド、
2,4,5-トリフルオロ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-メチル-クロマン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
3,4,5-トリフルオロ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-メチル-クロマン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
3-フルオロ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-メチル-クロマン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
3-トリフルオロメチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(4-エチル-ベンゾ[1,3]ジオキソール-5-カルボニル)-ヒドラジド、
4-フルオロ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-メチル-クロマン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
3,4-ジフルオロ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-メチル-クロマン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
3,5-ジフルオロ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-メチル-クロマン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
2,3,4,5-テトラフルオロ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-メチル-クロマン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
4-メチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(8-エチル-4H-ベンゾ[1,3]ジオキシン-7-カルボニル)-ヒドラジド、
酢酸4-[N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジノカルボニル]-2,6-ジメトキシ-フェニルエステル、
2-エチル-3-メトキシ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(4-ヒドロキシ-3,5-ジメトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
5-メチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボン酸N’-tert-ブチル-N’-(3,5-ジメトキシ-4-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
5-メチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボン酸N’-tert-ブチル-N’-(2,6-ジメトキシ-ピリジン-3-カルボニル)-ヒドラジド、
2,6-ジクロロ-イソニコチン酸N-tert-ブチル-N’-(5-メチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
3-フルオロ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-メチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
3-フルオロ-5-トリフルオロメチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-メチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
5-メチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボン酸N’--tert-ブチル-N’-(5-メチル-2-ニトロ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
5-メチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボン酸N’-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-N’-(1-エチル-2,2-ジメチル-プロピル)-ヒドラジド、
5-メチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボン酸N’-(3,5-ジメトキシ-4-メチル-ベンゾイル)-N’-(1-エチル-2,2-ジメチル-プロピル)-ヒドラジド、
5-メチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボン酸N’-(1-tert-ブチル-ブチル)-N’-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
5-メチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボン酸N’-(1-tert-ブチル-ブチル)-N’-(3,5-ジメトキシ-4-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
5-エチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボン酸N’-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-N’-(1-エチル-2,2-ジメチル-プロピル)-ヒドラジド、
5-エチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボン酸N’-(3,5-ジメトキシ-4-メチル-ベンゾイル)-N’-(1-エチル-2,2-ジメチル-プロピル)-ヒドラジド、
5-エチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボン酸N’-(1-tert-ブチル-ブチル)-N’-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
5-エチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボン酸N’-(1-tert-ブチル-ブチル)-N’-(3,5-ジメトキシ-4-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2-メトキシ-6-トリフルオロメチル-ニコチン酸N-tert-ブチル-N’-(3-メトキシ-2-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-メトキシ-2-メチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(1-メチル-2-オキソ-6-トリフルオロメチル-1,2-ジヒドロ-ピリジン-3-カルボニル)-ヒドラジド、
2,6-ジメトキシ-ピリミジン-4-カルボン酸N-tert-ブチル-N’-(3-メトキシ-2-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,6-ジメトキシ-ピリダジン-4-カルボン酸N-tert-ブチル-N’-(3-メトキシ-2-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,6-ジクロロ-ピリダジン-4-カルボン酸N-tert-ブチル-N’-(3-メトキシ-2-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
ピリダジン-4-安息香酸N-tert-ブチル-N’-(3-メトキシ-2-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
6-メトキシ-3-オキソ-2,3-ジヒドロ-ピリダジン-4-カルボン酸N-tert-ブチル-N’-(3-メトキシ-2-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、又はピリダジン位置異性体、
3,5-ジメチル安息香酸N-(1-エチル-2,2-ジメチル-プロピル)-N’-(3-メトキシ-2-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,5-ジメトキシ-4-メチル安息香酸N-(1-エチル-2,2-ジメチル-プロピル)-N’-(3-メトキシ-2-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N-(1-tert-ブチル-ブチル)-N’-(3-メトキシ-2-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,5-ジメトキシ-4-メチル安息香酸N-(1-tert-ブチル-ブチル)-N’-(3-メトキシ-2-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N-(1-エチル-2,2-ジメチル-プロピル)-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,5-ジメトキシ-4-メチル安息香酸N-(1-エチル-2,2-ジメチル-プロピル)-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N-(1-tert-ブチル-ブチル)-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,5-ジメトキシ-4-メチル安息香酸N-(1-tert-ブチル-ブチル)-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2,3-ジメチル安息香酸N’-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-N’-(1-エチル-2,2-ジメチル-プロピル)-ヒドラジド、
3-ヒドロキシ-2-メチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3-メトキシ-ピリジン-4-カルボニル)-ヒドラジド、
4-(1-ヒドロキシ-エチル)-安息香酸N’-(3,5-ビス-ヒドロキシメチル-ベンゾイル)-N’-tert-ブチル-ヒドラジド、
2-エチル-3-メトキシ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(2-メタンスルフィニル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
5-[N’-(4-アセチル-ベンゾイル)-N-tert-ブチル-ヒドラジノカルボニル] -イソフタル酸、
5-メチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボン酸N’-tert-ブチル-N’-(2,6-ジメトキシ-ピリジン-3-カルボニル)-ヒドラジド、
4-フルオロ-3-トリフルオロメチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-エチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
2-[N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジノカルボニル]-ベンゼンスルホン酸、
3,5-ジメチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-メチル-クロマン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
4-エチル安息香酸N’-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-N’-(1,2,2-トリメチル-プロピル)-ヒドラジド、
3-メチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-エチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1, 4]ジオキシン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
2,3-ジメチル安息香酸N’-ベンゾイル-N’-(1-エチル-ペンチル)-ヒドラジド、
2,3-ジメチル安息香酸N’-(1-エチル-2,2-ジメチル-プロピル)-N’-(3-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
5-メチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボン酸N’-tert-ブチル-N’-(4-ヒドロキシ-3,5-ジメトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-フルオロ-4H-ベンゾ[1,3]ジオキシン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
2-メタンスルフィニル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-メチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
5-メチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボン酸N’-(シアノ-ジメチル-メチル)-N’-(3,5-ジメトキシ-4-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
6-メチル-ピリジン-2-カルボン酸N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
5-メチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボン酸N’-tert-ブチル-N’-(3,5-ジメトキシ-4-メチル-2-ニトロ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
4-エチル安息香酸N’-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-N’-(1-エチル-2,2-ジメチル-プロピル)-ヒドラジド、
4-エチル安息香酸N’-(1-エチル-2,2-ジメチル-プロピル)-N’-(2-メトキシ-ピリジン-3-カルボニル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N-(1-tert-ブチル-ペンチル)-N’-(4-エチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,5-ジメトキシ-4-メチル安息香酸N-(1-tert-ブチル-ペンチル)-N’-(4-エチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2-メトキシ-ニコチン酸N-(1-tert-ブチル-ペンチル)-N’-(4-エチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N-(2,2-ジメチル-1-フェニル-プロピル)-N’-(4-エチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,5-ジメトキシ-4-メチル安息香酸N-(2,2-ジメチル-1-フェニル-プロピル)-N’-(4-エチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2-メトキシ-ニコチン酸N-(2,2-ジメチル-1-フェニル-プロピル)-N’-(4-エチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
1H-ベンゾイミダゾール-5-カルボン酸N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
1-(又は3-)トリチル-１H-ベンゾイミダゾール-5-カルボン酸N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
5-メチル-1-フェニル-1H-ピラゾール-3-カルボン酸N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-クロロ-6-メチルスルファニル-ピラジン-2-カルボン酸N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
1H-インダゾール-3-カルボン酸N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
1-トリチル-1H-インダゾール-3-カルボン酸N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
6-[N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジノカルボニル]-ニコチン酸メチルエステル、
ピラジン-2-カルボン酸N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N-[2-(tert-ブチル-ジメチル-シラニルオキシ)-1,1-ジメチル-エチル]-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-N-[2-(2-ヒドロキシ-エチルイミノ)-1,1-ジメチル-エチル]ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N-[(H2NC(O)NHN=C)(CH3)2C-]-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N-[(H2NC(O)C(O)NHN=C)(CH3)2C-]-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2-[N-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジノ]-2-メチル-プロピオン酸、
3,5-ジメチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(2-メタンスルフィニルメチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(2-メタンスルホニルメチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(2-ジメチルアミノメチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(2-メチルアミノメチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(3-メトキシ-2-メタンスルファニルメチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N’-(2-アリルオキシメチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-N-tert-ブチル-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N-(1-tert-ブチル-ペンチル)-N’-(3-メトキシ-2-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,5-ジメトキシ-4-メチル安息香酸N-(1-tert-ブチル-ペンチル)-N’-(3-メトキシ-2-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N’-(2-アセトキシオキシメチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-N-tert-ブチル-ヒドラジド、及び
5-メチル-ピラジン-2-カルボン酸N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
から構成されるグループから選らばれる化合物である、
方法。
【請求項９】
前記エクジソン受容体複合体はキメラ・エクジソン受容体複合体であり、前記DNAコンストラクトはプロモーターをさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
対象が植物である、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
対象が哺乳類である、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
宿主細胞の遺伝子の発現を調節する方法であって、
前記方法は、
a)  前記宿主細胞に、
i)  (a)  発現調節の対象となっている遺伝子に関連した応答要素を認識するDNA結合ドメイン、及び
(b)  エクジソン受容体リガンド結合ドメイン、
を含む、第1ハイブリッド・ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチド配列を含む、前記宿主細胞の中で発現させることができる第1遺伝子発現カセット、
ii)   (a)  トランスアクティベーション・ドメイン、及び
(b)  キメラ・レチノイドX受容体リガンド結合ドメイン、
を含む、第2ハイブリッド・ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチド配列を含む、前記宿主細胞の中で発現させることができる第2遺伝子発現カセット、並びに
iii)  (a)  第1ハイブリッド・ポリペプチドのDNA結合ドメインにより認識される応答エレメント、
(b)  第2ハイブリッド・ポリペプチドのトランスアクティベーション・ドメインが活性化するプロモーター、及び
(c)  発現調節の対象である遺伝子、
を含む、ポリヌクレオチド配列を含む、前記宿主細胞の中で発現させることができる第3遺伝子発現カセット、
を含む、遺伝子発現調節システムを導入するステップ、及び
ｂ）前記宿主細胞に、
（１）以下の式の化合物であり、
【化５】
2014111634.tif 000138
ここでＸとＸ’は独立してＯ又はＳであり、
Aは非置換又は置換フェニルで、置換体は独立して１から５までのH;ハロ；ニトロ；シアノ；ヒドロキシ；アミノ(‐NRaRb)；アルキルアミノアルキル(‐(CH2)ｎNRaRb)；(C1-C6)アルキル；(C1-C6)ハロアルキル；(C1-C6)シアノアルキル；(C1-C6)ヒドロキシアルキル；(C1-C6)アルコキシ；フェノキシ；(C1-C6)ハロアルコキシ；(C1-C6)アルコキシ(C1-C6)アルキル；(C1-C6)アルケニルオキシ(C1-C6)アルキル；(C1-C6)アルコキシ(C1-C6)アルコキシ；(C1-C6)アルカノイルオキシ(C1-C6)アルキル；ハロ、シアノ、(C1-C4)アルキル、又は(C1-C4)アルコキシで選択的に置換した(C2-C6)アルケニル；ハロ又は(C1-C4)アルキルで選択的に置換した(C2-C6)アルキニル；フォルミル；カルボキシ；(C1-C6)アルキルカルボニル；(C1-C6)ハロアルキルカルボニル；ベンゾイル；(C1-C6)アルコキシカルボニル；(C1-C6)ハロアルコキシカルボニル；(C1-C6)アルカノイルオキシ(‐OCORa)；カルボキシアミド(‐CONRaRb)；アミド(‐N RaCORb)；アルコキシカルボニルアミノ(‐NRaCO2Rb)；アルキルアミノカルボニルアミノ(‐N RaCONRbRc)；メルカプト；(C1-C6)アルキルチオ；(C1-C6)アルキルスルホニル；(C1-C6)アルキルスルホニル(C1-C6)アルキル；(C1-C6)アルキルスルホキシド(‐S(O)Ra)；(C1-C6)アルキルスルホキシド(C1-C6)アルキル(‐(CH2)ｎS(O)Ra)；フルファミド(‐SO2NRaRb)；‐SO3H；又は非置換又は置換フェニルで、置換体は独立して１から3までのハロ、ニトロ、(C1-C6)アルコキシ、(C1-C6)アルキル、又はアミノ；あるいはフェニル環の隣接する2つの位置の１つ又は両方が置換される場合、付着している原子は、(‐OCH2O)、(‐OCH(CH3)O-)、(‐CH2CH2O-)、(‐OCH(CH3)CH2O -)、(‐S- CH=N -)、(‐CH2OCH2O‐)、(‐O(CH2)3‐)、(＝N-O-N=)、(‐C=CH-NH-)、(‐OCF2O-)、(‐N-CH=N-)、(‐CH2CH2O-)、及び(‐(CH2)4) からなるグループから選ばれた連結のフェニル結合末端を形成する場合があり、
Bは、
(a)非置換又は置換フェニルで、置換体は独立して１から５までのH;ハロ；ニトロ；シアノ；ヒドロキシ；アミノ(‐NRaRb)；アルキルアミノアルキル(‐(CH2)ｎNRaRb)；(C1-C6)アルキル；(C1-C6)ハロアルキル；(C1-C6)シアノアルキル；(C1-C6)ヒドロキシアルキル；(C1-C6)アルコキシ；フェノキシ；(C1-C6)ハロアルコキシ；(C1-C6)アルコキシ(C1-C6)アルキル；(C1-C6)アルケニルオキシ(C1-C6)アルキル；(C1-C6)アルコキシ(C1-C6)アルコキシ；(C1-C6)アルカノイルオキシ(C1-C6)アルキル；ハロ、シアノ、(C1-C4)アルキル、又は(C1-C4)アルコキシで選択的に置換した(C2-C6)アルケニル；ハロ又は (C1-C4)アルキルで選択的に置換した(C2-C6)アルキニル；フォルミル；カルボキシ；(C1-C6)アルキルカルボニル；(C1-C6)ハロアルキルカルボニル；ベンゾイル；(C1-C6)アルコキシカルボニル；(C1-C6)ハロアルコキシカルボニル；(C1-C6)アルカノイルオキシ(‐OCORa)；カルボキシアミド(‐CONRaRb)；アミド(‐N RaCORb)；アルコキシカルボニルアミノ (‐NRaCO2Rb)；アルキルアミノカルボニルアミノ(‐N RaCONRbRc)；メルカプト；(C1-C6)アルキルチオ；(C1-C6)アルキルスルホニル；(C1-C6)アルキルスルホニル(C1-C6)アルキル；(C1-C6)アルキルスルホキシド(‐S(O)Ra)；(C1-C6)アルキルスルホキシド(C1-C6)アルキル(‐(CH2)ｎS(O)Ra)；フルファミド(‐SO2NRaRb)；‐SO3H；又は非置換又は置換フェニルで、置換体は独立して１から3までのハロ、ニトロ、(C1-C6)アルコキシ、(C1-C6)アルキル、又はアミノ；あるいはフェニル環の隣接する2つの位置の１つ又は両方がC、N、O、又はSで置換される場合、これらの原子は、(‐OCH2O‐)、(‐OCH(CH3)O-)、(‐CH2CH2O -)、(‐OCH(CH3)CH2O-)、(‐S- CH=N -)、(‐CH2OCH2O‐)、(‐O(CH2)3‐)、(＝N-O-N=)、(‐C=CH-NH-)、(‐OCF2O-)、(‐NH-CH=N-)、(‐CH2CH2O-)、及び(‐(CH2)4‐)からなるグループから選ばれた連結のフェニル結合末端を形成する場合があり；
(ｂ)1-3窒素原子及び3-5核炭素原子を持つ非置換6員環ヘテロサイクル又は置換６員環ヘテロサイクルで、置換体は１から3までの同じ又は異なるハロ；ニトロ；ヒドロキシ；(C1-C6)アルキル；(C1-C6)アルコキシ；(C1-C6)チオアルコキシ；カルボキシ；(C1-C6)アルコキシカルボニル；(C1-C6)カルボキシアルキル；各アルキル・グループに独立に定まった数の炭素原子を持つ(C1-C6)アルコキシカルボニルアルキル；‐CONRaRb；アミノ；(C1-C6)アルキルアミノ；各アルキル・グループに独立に定まった数の炭素原子を持つ(C1-C6)ジアルキルアミノ；‐CF3を含むハロアルキル；‐C=N-NHC(O)NRaRb)；又は‐C=N-NHC(O)C(O)NRaRb)；あるいは
(ｃ)５−ベンズイミダゾリル；１−トリチル‐５−ベンズイミダゾリル；３−トリチル‐５−ベンズイミダゾリル；１H-インダゾール‐３‐イル；１‐トリチル‐１H‐インダゾール‐３‐イル；又は１‐(C1-C6)アルキル‐１H‐インドール‐2‐イル；  Eは非置換又は置換(C4-C10)側鎖アルキルであり、置換体は独立に1−4シアノ；ハロ；(C5-C6)シクロアルキル；フェニル；(C2-C3)アルケニル；ヒドロキシ；(C1-C6)アルコキシ；カルボキシ；(C1-C6)アルコキシカルボニル；(C1-C6)アルカノイルオキシ(‐OCORa)；フォルミル；各アルキル・グループに独立に定まった数の炭素原子を持つ(C1-C6)トリアルキルシリルオキシ；‐C=N-ORa；‐C=N-Rd；‐C=N-NHC(O)NRaRb；又は‐C=N-NHC(O)C(O) N RaRb；
ここで、Ra、Rb、及びRｃは独立にH、(C1-C6)アルキル、又はフェニルであり；Rdはヒドロキシ(C1-C6)アルキル；及びｎ＝1-4；そして
GはH又はCN；
もし、
Eが第三級の炭素を含む(C4-C6)アルキル、又は第三級の炭素を含むシアノ(C4-C5)アルキルである場合、
Bは、
(a)  置換フェニルで、置換体は独立して１から５までのH;ハロ；ニトロ；シアノ；ヒドロキシ；アミノ(‐NRaRb)；アルキルアミノアルキル(‐(CH2)ｎNRaRb)；(C1-C6)アルキル；(C1-C6)ハロアルキル；(C1-C6)シアノアルキル；(C1-C6)ヒドロキシアルキル；(C1-C6)アルコキシ；フェノキシ；(C1-C6)ハロアルコキシ；(C1-C6)アルコキシ(C1-C6)アルキル；(C1-C6)アルケニルオキシ(C1-C6)アルキル；(C1-C6)アルコキシ(C1-C6)アルコキシ；(C1-C6)アルカノイルオキシ(C1-C6)アルキル；ハロ、シアノ、(C1-C4)アルキル、又は(C1-C4)アルコキシで選択的に置換した(C2-C6)アルケニル；ハロ又は(C1-C4)アルキルで選択的に置換した(C2-C6)アルキニル；フォルミル；カルボキシ；(C1-C6)アルキルカルボニル；(C1-C6)ハロアルキルカルボニル；ベンゾイル；(C1-C6)アルコキシカルボニル；(C1-C6)ハロアルコキシカルボニル；(C1-C6)アルカノイルオキシ(‐OCORa)；カルボキシアミド(‐CONRaRb)；アミド(‐N RaCORb)；アルコキシカルボニルアミノ(‐NRaCO2Rb)；アルキルアミノカルボニルアミノ(‐N RaCONRbRc)；メルカプト；(C1-C6)アルキルチオ；(C1-C6)アルキルスルホニル；(C1-C6)アルキルスルホニル(C1-C6)アルキル；(C1-C6)アルキルスルホキシド(‐S(O)Ra)；(C1-C6)アルキルスルホキシド(C1-C6)アルキル(‐(CH2)ｎS(O)Ra)；フルファミド(‐SO2NRaRb)；‐SO3H；又は非置換又は置換フェニルで、置換体は独立して１から3までのハロ、ニトロ、(C1-C6)アルコキシ、(C1-C6)アルキル、又はアミノ；あるいはフェニル環の隣接する2つの位置の１つ又は両方が置換される場合、付着している原子は、(‐OCH2O‐)、(‐OCH(CH3)O-)、(‐CH2CH2O-)、(‐OCH(CH3)CH2O -)、(‐S- CH=N -)、(‐CH2OCH2O‐)、(‐O(CH2)3‐)、(＝N-O-N=)、(‐C=CH-NH-)、(‐OCF2O-)、(‐NH-CH=N-)、(‐CH2CH2O-)、及び(‐(CH2)4‐)からなるグループから選ばれた連結のフェニル結合末端を形成する場合があり、そして少なくとも１つのヒドロキシ、ニトロ、‐C=NOH、アセトキシ、カルボキシ、−S(O)CH3、−C=N-NHC(O)NRaRb、又は−C=N-NHC(O)C(O)NRaRbを持っており、あるいはフェニル環の隣接する2つの位置がOで置換され、これらの原子が連結(‐OCH2O)のフェニル結合末端を形成する場合があり、
(ｂ)1-3窒素原子及び3-5核炭素原子を持つ非置換6員環ヘテロサイクル又は置換６員環ヘテロサイクルで、置換体は１から3までの同じ又は異なるハロ；ニトロ；ヒドロキシ；(C1-C6)アルキル；(C1-C6)アルコキシ；(C1-C6)チオアルコキシ；カルボキシ；(C1-C6)アルコキシカルボニル；(C1-C6)カルボキシアルキル；各アルキル・グループに独立に定まった数の炭素原子を持つ(C1-C6)アルコキシカルボニルアルキル；‐CONRaRb；アミノ；(C1-C6)アルキルアミノ；各アルキル・グループに独立に定まった数の炭素原子を持つ(C1-C6)ジアルキルアミノ；‐CF3を含むハロアルキル；‐C=N-NHC(O)NRaRb)；又は‐C=N-NHC(O)C(O)NRaRb)；あるいは
(ｃ)５−ベンズイミダゾリル；１−トリチル‐５−ベンズイミダゾリル；３−トリチル‐５−ベンズイミダゾリル；１H-インダゾール‐３‐イル；１‐トリチル‐１H‐インダゾール‐３‐イル；又は１‐(C1-C6)アルキル‐１H‐インドール‐2‐イル；  ここで、Ra及びRbは独立にH、(C1-C6)アルキル、又はフェニルであり；あるいは、
(２)  以下の化合物、
4-クロロ安息香酸N’-ベンゾイル-N”-tert-ブチル-ヒドラジド、
4-エチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(2-ニトロ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
4-メチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
4-エチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,5-ジクロロ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(2,6-ジフルオロ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-クロロ-2-メチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3-クロロ-ベンゾイル) -ヒドラジド、
2-クロロ-3-メトキシ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(2-クロロ-5-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-クロロ-2-メチル安息香酸N’-(4-ブロモ-3-メチル-ベンゾイル)-N’-tert-ブチル-ヒドラジド、
4-エチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(4-クロロ-3,5-ジメチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
4-エチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3-クロロ-4,5-ジメチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
4-メトキシ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(2-クロロ-4-フルオロ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
4-エチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3-クロロ-5-メチル-ベンゾイル) -ヒドラジド、
4-エチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(2-エチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
4-メトキシ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3,5-ジクロロ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
4-エチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(5-メチル-2-ニトロ-ベンゾイル) -ヒドラジド、
4-シアノメチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-メチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(3-メトキシ-2-メチル-ベンゾイル) -ヒドラジド、
4-ブロモ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3,5-ジクロロ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2-メチル-3-ニトロ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2,3-ジメチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(2,5-ジメトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2,3-ジメチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(5-クロロ-2-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(3-メトキシ-2-ニトロ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2,3-ジメチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3,5-ジメトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-クロロ-4-エチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
4-(1-ヒドロキシ-エチル)安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3,5-ジフロロ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-ジメチルアミノ-2-メチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3,5-ジクロロ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-アセチル-2-メチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
酢酸3-[N’-tert-ブチル-N’-(3,5-ジクロロ-ベンゾイル)-ヒドラジノカルボニル]-2-メチル-フェニルエステル、
3-ヨード-2-メチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-メトキシ-2-メチル安息香酸N’-(3-ブロモ-5-クロロ-ベンゾイル)-N’-tert-ブチル-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(3-イソプロポキシ-2-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-メトキシ-2-メチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(2-クロロ-ピリジン-3-カルボニル)-ヒドラジド、
3-メトキシ-2-メチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(2-メトキシ-5-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド
3-メトキシ-2-メチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(2,5-ジフロロ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-メトキシ-2-メチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(2-エチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-メトキシ-2-メチル安息香酸N’-(3-ブロモ-5-メチル-ベンゾイル)-N’-tert-ブチル-ヒドラジド、
3-メトキシ-2-メチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3-メトキシ-5-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-メトキシ-2-メチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(4-クロロ-2-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2-メチル-3-トリフルオロメトキシ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-メトキシ-2-メチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3-メトキシ-4-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-メトキシ-4-メチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-メトキシ-2-メチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(2-メトキシ-4-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-メトキシ-2-メチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(2,6-ジクロロ-ピリジン-4-カルボニル)-ヒドラジド、
3-メトキシ-2-メチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(5-メチル-2-ニトロ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-メトキシ-2-メチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(4-クロロ-2-フルオロ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2-クロロ-4-フルオロ安息香酸N’-(ベンゾ[1,3]ジオキソール-5-カルボニル)-N-tert-ブチル-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-エチル-2-メチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(2,3-ジヒドロ-ベンゾフラン-5-カルボニル)-ヒドラジド、
3-メトキシ-2-メチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3,5-ジクロロ-4-フルオロ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
4-フルオロ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(4-メチル-ベンゾ[1,3]ジオキソール-5-カルボニル)-ヒドラジド、
2-メトキシ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(4-エチル-ベンゾ[1,3]ジオキソール-5-カルボニル)-ヒドラジド、
3,4-ジエチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
4-フルオロ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2-メトキシ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-メトキシ-2-メチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(4-フルオロ-2-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2-クロロ-6-メチルイソニコチン酸N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,5-ジメトキシ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2-ヨード-3-メトキシ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2-メトキシ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5,6,7,8-テトラヒドロ-ナフタレン-2-カルボニル)-ヒドラジド、
2-エチル-3-メトキシ安息香酸N’-(ベンゾ[1,3]ジオキソール-4-カルボニル)-N’-tert-ブチル-ヒドラジド、
4-エチル-2-フルオロ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(4-フルオロ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
ベンゾ[1,3]ジオキソール-5-カルボン酸N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
4-フルオロ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-メチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(2-メチル-ベンゾ[1,3]ジオキソール-5-カルボニル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(4-エチル-2-メチル-ベンゾ[1, 3]ジオキソール-5-カルボニル)-ヒドラジド、
3-メトキシ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-メチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(3-メチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N’-(5-ブロモ-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボニル)-N-tert-ブチル-ヒドラジド、
3-クロロ-5-メチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-エチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
3-メチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-エチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1, 4]ジオキシン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
2-メトキシ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-エチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
3-メトキシ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-エチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N’-(ベンゾチアゾール-6-カルボニル)-N-tert-ブチル-ヒドラジド、
4-クロロ-2-メトキシ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2-エチル-3-メトキシ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(2,5-ジメトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(6-メチル-ベンゾ[1,3]ジオキソール-5-カルボニル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N’-(4H-ベンゾ[1,3]ジオキシン-6-カルボニル)-N-tert-ブチル-ヒドラジド、
2-メトキシ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(8-メチル-4H-ベンゾ[1,3]ジオキシン-7-カルボニル)-ヒドラジド、
4-フルオロ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(8-エチル-4H-ベンゾ[1,3]ジオキシン-7-カルボニル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(6-クロロ-ベンゾ[1,3]ジオキソール-5-カルボニル)-ヒドラジド、
2,3,6-トリフルオロ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(2-クロロ-4-フルオロ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2-エチル-3-メトキシ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(2,6-ジフルオロ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-フルオロ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-ブロモ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル) -ヒドラジド、
2-エチル-3-メトキシ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(2-ニトロ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2,3-ジフルオロ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド
2-エチル-3-メトキシ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3,4,5-トリメトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-フルオロ-5-トリフルオロメチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-シアノ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル) -ヒドラジド、
2,4-ジクロロ-5-フルオロ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(3-メトキシ-2-ビニル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
安息香酸N-tert-ブチル-N’-(8-エチル-4H-ベンゾ[1,3]ジオキシン-7-カルボニル)-ヒドラジド、
2-[N-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジノ]-2-メチル-プロピオン酸エチルエステル、
2-エチル-3-メトキシ安息香酸N’-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-N’-(2-ヒドロキシ-1,1-ジメチル-エチル)-ヒドラジド、
2-エチル-3-メトキシ安息香酸N’-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-N’-(1,1-ジメチル-2-オキソ-エチル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-N-(2-メトキシ-1,1-ジメチル-エチル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-N-(2-ヒドロキシイミノ-1,1-ジメチル-エチル)-ヒドラジド、
2-アミノ-3-メトキシ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
酢酸3-[N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジノカルボニル]-5-メチル-ベンジルエステル、
酢酸2-[N-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジノ]-2-メチル-プロピルエステル、
3-ヒドロキシ-2-メチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(2,3,4-トリフルオロ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-ヒドロキシ-2-メチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3-クロロ-5-メトキシ-ピリジン-4-カルボニル)-ヒドラジド、
3-ヒドロキシ-2-メチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(2,6-ジクロロ-ピリジン-4-カルボニル)-ヒドラジド、
3-ヒドロキシ-2-メチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3-メトキシ-ピリジン-4-カルボニル)-ヒドラジド、
3-ヒドロキシ-2-メチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3,5-ジメトキシ-4-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2-メトキシ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-メチル-クロマン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
2,4-ジクロロ-5-フルオロ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2,4-ジクロロ-5-フルオロ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-メチル-クロマン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
2-フルオロ-5-メチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-メチル-クロマン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
5-メチル-クロマン-6-安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3,5-ジメトキシ-4-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2,5-ジフルオロ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-エチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
2,3,4-トリフルオロ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-エチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
2,3,4,5-テトラフルオロ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-エチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
4-フルオロ-3-トリフルオロメチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-エチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
2,6-ジクロロ-イソニコチン酸N-tert-ブチル-N’-(5-エチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
2-メトキシ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-エチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
2,4-ジクロロ-5-フルオロ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-エチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
4-クロロ-2-フルオロ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-エチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
酢酸3-[N’-tert-ブチル-N’-(3,5-ジメトキシ-4-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジノカルボニル]-2-メチル-フェニルエステル、
2-エチル-3-メトキシ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(5-クロロ-2-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
4-クロロ-2-メトキシ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(4-エチル-ベンゾ[1,3]ジオキソール-5-カルボニル)-ヒドラジド、
5-クロロ-2-メトキシ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-メチル-クロマン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
2-エチル-3-メトキシ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(5-メチル-2-ニトロ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2-エチル-3-メトキシ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(4-クロロ-2-ニトロ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2-エチル-3-メトキシ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(5-クロロ-2-ニトロ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
5-メチル-クロマン-6-カルボン酸N’-tert-ブチル-N’-(5-メチル-2-ニトロ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
ベンゾ[1,2,5]オキサジアゾール-5-カルボン酸N’-tert-ブチル-N’-(4-クロロ-2-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2-クロロ-5-ニトロ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(3-メトキシ-2-ビニル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
4-クロロ-2-メトキシ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(3-メトキシ-2-ビニル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2-エチル-3-メトキシ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(1-メチル-1H-インドール-2-カルボニル)-ヒドラジド、
3,5-ジメトキシ-4-メチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-エチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-クロロ-4H-ベンゾ[1,3]ジオキシン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
4-エチル-2-フルオロ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3-ニトロ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-メトキシ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(4-エチル-2-フルオロ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
5-クロロ-4H-ベンゾ[1,3]ジオキシン-6-カルボン酸N’-tert-ブチル-N’-(3,5-ジメトキシ-4-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
4-エチル-2-フルオロ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(2,6-ジクロロ-ピリジン-4-カルボニル)-ヒドラジド、
4-エチル-2-フルオロ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3,5-ジメトキシ-4-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
4-エチル-2-フルオロ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3,4,5-トリフルオロ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
4-エチル-2-フルオロ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
4-エチル-2-フルオロ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(2-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
4-エチル-2-フルオロ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(5-フルオロ-2-ニトロ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
4-エチル-2-フルオロ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-[5-メトキシ-2-(2,2, 2-トリフルオロ-エトキシ)-ベンゾイル]-ヒドラジド、
4-エチル-2-フルオロ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(2-クロロ-6-メチル-ピリジン-4-カルボニル)-ヒドラジド、
4-エチル-2-フルオロ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(2,6-ジメトキシ-ピリジン-3-カルボニル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(１H-インドール-6-カルボニル)-ヒドラジド、
2-エチル-3-メトキシ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(2-メタンスルフィニル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2,2-ジフルオロ-ベンゾ[1,3]ジオキソール-5-カルボンN’-tert-ブチル-N’-(2-ニトロ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(2,2-ジフルオロ-ベンゾ[1,3]ジオキソール-5-カルボニル)-ヒドラジド、
3-メトキシ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(2,2-ジフルオロ-ベンゾ[1,3]ジオキソール-5-カルボニル)-ヒドラジド、
3-ブロモ安息香酸N-(シアノ-ジメチル-メチル)-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,5-ジクロロ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(3-メトキシ-2-メトキシメチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-(ヒドロキシイミノ-メチル)-5-メチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-(H2NC(O)NHN=CH)-5-メチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-(H2NC(O)C(O)NHN=CH)-5-メチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2-エチル-3-メトキシ安息香酸N’-(シアノ-ジメチル-メチル)-N’-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2-エチル-3-メトキシ安息香酸N’-(シアノ-ジメチル-メチル)-N’-(3,5-ジメトキシ-4-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2-メトキシ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(8-エチル-4H-ベンゾ[1,3]ジオキシン-7-カルボニル)-ヒドラジド、
2,4,5-トリフルオロ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-メチル-クロマン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
3,4,5-トリフルオロ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-メチル-クロマン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
3-フルオロ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-メチル-クロマン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
3-トリフルオロメチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(4-エチル-ベンゾ[1,3]ジオキソール-5-カルボニル)-ヒドラジド、
4-フルオロ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-メチル-クロマン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
3,4-ジフルオロ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-メチル-クロマン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
3,5-ジフルオロ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-メチル-クロマン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
2,3,4,5-テトラフルオロ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-メチル-クロマン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
4-メチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(8-エチル-4H-ベンゾ[1,3]ジオキシン-7-カルボニル)-ヒドラジド、
酢酸4-[N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジノカルボニル]-2,6-ジメトキシ-フェニルエステル、
2-エチル-3-メトキシ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(4-ヒドロキシ-3,5-ジメトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
5-メチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボン酸N’-tert-ブチル-N’-(3,5-ジメトキシ-4-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
5-メチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボン酸N’-tert-ブチル-N’-(2,6-ジメトキシ-ピリジン-3-カルボニル)-ヒドラジド、
2,6-ジクロロ-イソニコチン酸N-tert-ブチル-N’-(5-メチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
3-フルオロ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-メチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
3-フルオロ-5-トリフルオロメチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-メチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
5-メチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボン酸N’--tert-ブチル-N’-(5-メチル-2-ニトロ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
5-メチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボン酸N’-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-N’-(1-エチル-2,2-ジメチル-プロピル)-ヒドラジド、
5-メチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボン酸N’-(3,5-ジメトキシ-4-メチル-ベンゾイル)-N’-(1-エチル-2,2-ジメチル-プロピル)-ヒドラジド、
5-メチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボン酸N’-(1-tert-ブチル-ブチル)-N’-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
5-メチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボン酸N’-(1-tert-ブチル-ブチル)-N’-(3,5-ジメトキシ-4-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
5-エチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボン酸N’-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-N’-(1-エチル-2,2-ジメチル-プロピル)-ヒドラジド、
5-エチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボン酸N’-(3,5-ジメトキシ-4-メチル-ベンゾイル)-N’-(1-エチル-2,2-ジメチル-プロピル)-ヒドラジド、
5-エチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボン酸N’-(1-tert-ブチル-ブチル)-N’-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
5-エチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボン酸N’-(1-tert-ブチル-ブチル)-N’-(3,5-ジメトキシ-4-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2-メトキシ-6-トリフルオロメチル-ニコチン酸N-tert-ブチル-N’-(3-メトキシ-2-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-メトキシ-2-メチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(1-メチル-2-オキソ-6-トリフルオロメチル-1,2-ジヒドロ-ピリジン-3-カルボニル)-ヒドラジド、
2,6-ジメトキシ-ピリミジン-4-カルボン酸N-tert-ブチル-N’-(3-メトキシ-2-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,6-ジメトキシ-ピリダジン-4-カルボン酸N-tert-ブチル-N’-(3-メトキシ-2-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,6-ジクロロ-ピリダジン-4-カルボン酸N-tert-ブチル-N’-(3-メトキシ-2-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
ピリダジン-4-安息香酸N-tert-ブチル-N’-(3-メトキシ-2-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
6-メトキシ-3-オキソ-2,3-ジヒドロ-ピリダジン-4-カルボン酸N-tert-ブチル-N’-(3-メトキシ-2-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、又はピリダジン位置異性体、              3,5-ジメチル安息香酸N-(1-エチル-2,2-ジメチル-プロピル)-N’-(3-メトキシ-2-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,5-ジメトキシ-4-メチル安息香酸N-(1-エチル-2,2-ジメチル-プロピル)-N’-(3-メトキシ-2-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N-(1-tert-ブチル-ブチル)-N’-(3-メトキシ-2-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,5-ジメトキシ-4-メチル安息香酸N-(1-tert-ブチル-ブチル)-N’-(3-メトキシ-2-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N-(1-エチル-2,2-ジメチル-プロピル)-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,5-ジメトキシ-4-メチル安息香酸N-(1-エチル-2,2-ジメチル-プロピル)-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N-(1-tert-ブチル-ブチル)-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,5-ジメトキシ-4-メチル安息香酸N-(1-tert-ブチル-ブチル)-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2,3-ジメチル安息香酸N’-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-N’-(1-エチル-2,2-ジメチル-プロピル)-ヒドラジド、
3-ヒドロキシ-2-メチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3-メトキシ-ピリジン-4-カルボニル)-ヒドラジド、
4-(1-ヒドロキシ-エチル)-安息香酸N’-(3,5-ビス-ヒドロキシメチル-ベンゾイル)-N’-tert-ブチル-ヒドラジド、
2-エチル-3-メトキシ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(2-メタンスルフィニル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
5-[N’-(4-アセチル-ベンゾイル)-N-tert-ブチル-ヒドラジノカルボニル] -イソフタル酸、
5-メチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボン酸N’-tert-ブチル-N’-(2,6-ジメトキシ-ピリジン-3-カルボニル)-ヒドラジド、
4-フルオロ-3-トリフルオロメチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-エチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
2-[N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジノカルボニル]-ベンゼンスルホン酸、
3,5-ジメチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-メチル-クロマン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
4-エチル安息香酸N’-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-N’-(1,2,2-トリメチル-プロピル)-ヒドラジド、
3-メチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-エチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1, 4]ジオキシン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
2,3-ジメチル安息香酸N’-ベンゾイル-N’-(1-エチル-ペンチル)-ヒドラジド、
2,3-ジメチル安息香酸N’-(1-エチル-2,2-ジメチル-プロピル)-N’-(3-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
5-メチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボン酸N’-tert-ブチル-N’-(4-ヒドロキシ-3,5-ジメトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-フルオロ-4H-ベンゾ[1,3]ジオキシン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
2-メタンスルフィニル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-メチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
5-メチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボン酸N’-(シアノ-ジメチル-メチル)-N’-(3,5-ジメトキシ-4-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
6-メチル-ピリジン-2-カルボン酸N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
5-メチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボン酸N’-tert-ブチル-N’-(3,5-ジメトキシ-4-メチル-2-ニトロ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
4-エチル安息香酸N’-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-N’-(1-エチル-2,2-ジメチル-プロピル)-ヒドラジド、
4-エチル安息香酸N’-(1-エチル-2,2-ジメチル-プロピル)-N’-(2-メトキシ-ピリジン-3-カルボニル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N-(1-tert-ブチル-ペンチル)-N’-(4-エチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,5-ジメトキシ-4-メチル安息香酸N-(1-tert-ブチル-ペンチル)-N’-(4-エチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2-メトキシ-ニコチン酸N-(1-tert-ブチル-ペンチル)-N’-(4-エチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N-(2,2-ジメチル-1-フェニル-プロピル)-N’-(4-エチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,5-ジメトキシ-4-メチル安息香酸N-(2,2-ジメチル-1-フェニル-プロピル)-N’-(4-エチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2-メトキシ-ニコチン酸N-(2,2-ジメチル-1-フェニル-プロピル)-N’-(4-エチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
1H-ベンゾイミダゾール-5-カルボン酸N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
1-(又は3-)トリチル-１H-ベンゾイミダゾール-5-カルボン酸N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
5-メチル-1-フェニル-1H-ピラゾール-3-カルボン酸N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-クロロ-6-メチルスルファニル-ピラジン-2-カルボン酸N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
1H-インダゾール-3-カルボン酸N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
1-トリチル-1H-インダゾール-3-カルボン酸N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
6-[N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジノカルボニル]-ニコチン酸メチルエステル、
ピラジン-2-カルボン酸N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N-[2-(tert-ブチル-ジメチル-シラニルオキシ)-1,1-ジメチル-エチル]-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-N-[2-(2-ヒドロキシ-エチルイミノ)-1,1-ジメチル-エチル]ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N-[(H2NC(O)NHN=C)(CH3)2C-]-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N-[(H2NC(O)C(O)NHN=C)(CH3)2C-]-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2-[N-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジノ]-2-メチル-プロピオン酸、
3,5-ジメチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(2-メタンスルフィニルメチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(2-メタンスルホニルメチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(2-ジメチルアミノメチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(2-メチルアミノメチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(3-メトキシ-2-メタンスルファニルメチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N’-(2-アリルオキシメチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-N-tert-ブチル-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N-(1-tert-ブチル-ペンチル)-N’-(3-メトキシ-2-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,5-ジメトキシ-4-メチル安息香酸N-(1-tert-ブチル-ペンチル)-N’-(3-メトキシ-2-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N’-(2-アセトキシオキシメチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-N-tert-ブチル-ヒドラジド、及び
5-メチル-ピラジン-2-カルボン酸N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
から構成されるグループから選らばれる化合物を導入するステップを含む、
方法。
【請求項１３】
ポリペプチド生産方法であって、
前記方法は、
a)   （１）以下の式の化合物、
【化６】
2014111634.tif 000139
ここでＸとＸ’は独立してＯ又はＳであり、
Aは非置換又は置換フェニルで、置換体は独立して１から５までのH;ハロ；ニトロ；シアノ；ヒドロキシ；アミノ(‐NRaRb)；アルキルアミノアルキル(‐(CH2)ｎNRaRb)；(C1-C6)アルキル；(C1-C6)ハロアルキル；(C1-C6)シアノアルキル；(C1-C6)ヒドロキシアルキル；(C1-C6)アルコキシ；フェノキシ；(C1-C6)ハロアルコキシ；(C1-C6)アルコキシ(C1-C6)アルキル；(C1-C6)アルケニルオキシ(C1-C6)アルキル；(C1-C6)アルコキシ(C1-C6)アルコキシ；(C1-C6)アルカノイルオキシ(C1-C6)アルキル；ハロ、シアノ、(C1-C4)アルキル、又は(C1-C4)アルコキシで選択的に置換した(C2-C6)アルケニル；ハロ又は(C1-C4)アルキルで選択的に置換した(C2-C6)アルキニル；フォルミル；カルボキシ；(C1-C6)アルキルカルボニル；(C1-C6)ハロアルキルカルボニル；ベンゾイル；(C1-C6)アルコキシカルボニル；(C1-C6)ハロアルコキシカルボニル；(C1-C6)アルカノイルオキシ(‐OCORa)；カルボキシアミド(‐CONRaRb)；アミド(‐N RaCORb)；アルコキシカルボニルアミノ(‐NRaCO2Rb)；アルキルアミノカルボニルアミノ(‐N RaCONRbRc)；メルカプト；(C1-C6)アルキルチオ；(C1-C6)アルキルスルホニル；(C1-C6)アルキルスルホニル(C1-C6)アルキル；(C1-C6)アルキルスルホキシド(‐S(O)Ra)；(C1-C6)アルキルスルホキシド(C1-C6)アルキル(‐(CH2)ｎS(O)Ra)；フルファミド(‐SO2NRaRb)；‐SO3H；又は非置換又は置換フェニルで、置換体は独立して１から3までのハロ、ニトロ、(C1-C6)アルコキシ、(C1-C6)アルキル、又はアミノ；あるいはフェニル環の隣接する2つの位置の１つ又は両方が置換される場合、付着している原子は、(‐OCH2O)、(‐OCH(CH3)O-)、(‐CH2CH2O-)、(‐OCH(CH3)CH2O -)、(‐S- CH=N -)、(‐CH2OCH2O‐)、(‐O(CH2)3‐)、(＝N-O-N=)、(‐C=CH-NH-)、(‐OCF2O-)、(‐N-CH=N-)、(‐CH2CH2O-)、及び(‐(CH2)4) からなるグループから選ばれた連結のフェニル結合末端を形成する場合があり、
Bは、
(a)非置換又は置換フェニルで、置換体は独立して１から５までのH; ハロ；ニトロ；シアノ；ヒドロキシ；アミノ(‐NRaRb)；アルキルアミノアルキル(‐(CH2)ｎNRaRb)；(C1-C6)アルキル；(C1-C6)ハロアルキル；(C1-C6)シアノアルキル；(C1-C6)ヒドロキシアルキル；(C1-C6)アルコキシ；フェノキシ；(C1-C6)ハロアルコキシ；(C1-C6)アルコキシ(C1-C6)アルキル；(C1-C6)アルケニルオキシ(C1-C6)アルキル；(C1-C6)アルコキシ(C1-C6)アルコキシ；(C1-C6)アルカノイルオキシ(C1-C6)アルキル；ハロ、シアノ、(C1-C4)アルキル、又は(C1-C4)アルコキシで選択的に置換した(C2-C6)アルケニル；ハロ又は (C1-C4)アルキルで選択的に置換した(C2-C6)アルキニル；フォルミル；カルボキシ；(C1-C6)アルキルカルボニル；(C1-C6)ハロアルキルカルボニル；ベンゾイル；(C1-C6)アルコキシカルボニル；(C1-C6)ハロアルコキシカルボニル；(C1-C6)アルカノイルオキシ(‐OCORa)；カルボキシアミド(‐CONRaRb)；アミド(‐N RaCORb)；アルコキシカルボニルアミノ (‐NRaCO2Rb)；アルキルアミノカルボニルアミノ(‐N RaCONRbRc)；メルカプト；(C1-C6)アルキルチオ；(C1-C6)アルキルスルホニル；(C1-C6)アルキルスルホニル(C1-C6)アルキル；(C1-C6)アルキルスルホキシド(‐S(O)Ra)；(C1-C6)アルキルスルホキシド(C1-C6)アルキル(‐(CH2)ｎS(O)Ra)；フルファミド(‐SO2NRaRb)；‐SO3H；又は非置換又は置換フェニルで、置換体は独立して１から3までのハロ、ニトロ、(C1-C6)アルコキシ、(C1-C6)アルキル、又はアミノ；あるいはフェニル環の隣接する2つの位置の１つ又は両方がC、N、O、又はSで置換される場合、これらの原子は、(‐OCH2O‐)、(‐OCH(CH3)O-)、(‐CH2CH2O -)、(‐OCH(CH3)CH2O-)、(‐S- CH=N -)、(‐CH2OCH2O‐)、(‐O(CH2)3‐)、(＝N-O-N=)、(‐C=CH-NH-)、(‐OCF2O-)、(‐NH-CH=N-)、(‐CH2CH2O-)、及び(‐(CH2)4‐)からなるグループから選ばれた連結のフェニル結合末端を形成する場合があり；
(ｂ)1-3窒素原子及び3-5核炭素原子を持つ非置換6員環ヘテロサイクル又は置換６員環ヘテロサイクルで、置換体は１から3までの同じ又は異なるハロ；ニトロ；ヒドロキシ；(C1-C6)アルキル；(C1-C6)アルコキシ；(C1-C6)チオアルコキシ；カルボキシ；(C1-C6)アルコキシカルボニル；(C1-C6)カルボキシアルキル；各アルキル・グループに独立に定まった数の炭素原子を持つ(C1-C6)アルコキシカルボニルアルキル；‐CONRaRb；アミノ；(C1-C6)アルキルアミノ；各アルキル・グループに独立に定まった数の炭素原子を持つ(C1-C6)ジアルキルアミノ；‐CF3を含むハロアルキル；‐C=N-NHC(O)NRaRb)；又は‐C=N-NHC(O)C(O)NRaRb)；あるいは
(ｃ)５−ベンズイミダゾリル；１−トリチル‐５−ベンズイミダゾリル；３−トリチル‐５−ベンズイミダゾリル；１H-インダゾール‐３‐イル；１‐トリチル‐１H‐インダゾール‐３‐イル；又は１‐(C1-C6)アルキル‐１H‐インドール‐2‐イル；  Eは非置換又は置換(C4-C10)側鎖アルキルであり、置換体は独立に1−4シアノ；ハロ；(C5-C6)シクロアルキル；フェニル；(C2-C3)アルケニル；ヒドロキシ；(C1-C6)アルコキシ；カルボキシ；(C1-C6)アルコキシカルボニル；(C1-C6)アルカノイルオキシ(‐OCORa)；フォルミル；各アルキル・グループに独立に定まった数の炭素原子を持つ(C1-C6)トリアルキルシリルオキシ；‐C=N-ORa；‐C=N-Rd；‐C=N-NHC(O)NRaRb；又は‐C=N-NHC(O)C(O) N RaRb；
ここで、Ra、Rb、及びRｃは独立にH、(C1-C6)アルキル、又はフェニルであり；Rdはヒドロキシ(C1-C6)アルキル；及びｎ＝1-4；そして
GはH又はCN；
もし、
Eが第三級の炭素を含む(C4-C6)アルキル、又は第三級の炭素を含むシアノ(C4-C5)アルキルである場合、
Bは、
(a)  置換フェニルで、置換体は独立して１から５までのH; ハロ；ニトロ；シアノ；ヒドロキシ；アミノ(‐NRaRb)；アルキルアミノアルキル(‐(CH2)ｎNRaRb)；(C1-C6)アルキル；(C1-C6)ハロアルキル；(C1-C6)シアノアルキル；(C1-C6)ヒドロキシアルキル；(C1-C6)アルコキシ；フェノキシ；(C1-C6)ハロアルコキシ；(C1-C6)アルコキシ(C1-C6)アルキル；(C1-C6)アルケニルオキシ(C1-C6)アルキル；(C1-C6)アルコキシ(C1-C6)アルコキシ；(C1-C6)アルカノイルオキシ(C1-C6)アルキル；ハロ、シアノ、(C1-C4)アルキル、又は(C1-C4)アルコキシで選択的に置換した(C2-C6)アルケニル；ハロ又は(C1-C4)アルキルで選択的に置換した(C2-C6)アルキニル；フォルミル；カルボキシ；(C1-C6)アルキルカルボニル；(C1-C6)ハロアルキルカルボニル；ベンゾイル；(C1-C6)アルコキシカルボニル；(C1-C6)ハロアルコキシカルボニル；(C1-C6)アルカノイルオキシ(‐OCORa)；カルボキシアミド(‐CONRaRb)；アミド(‐N RaCORb)；アルコキシカルボニルアミノ(‐NRaCO2Rb)；アルキルアミノカルボニルアミノ(‐N RaCONRbRc)；メルカプト；(C1-C6)アルキルチオ；(C1-C6)アルキルスルホニル；(C1-C6)アルキルスルホニル(C1-C6)アルキル；(C1-C6)アルキルスルホキシド(‐S(O)Ra)；(C1-C6)アルキルスルホキシド(C1-C6)アルキル(‐(CH2)ｎS(O)Ra)；フルファミド(‐SO2NRaRb)；‐SO3H；又は非置換又は置換フェニルで、置換体は独立して１から3までのハロ、ニトロ、(C1-C6)アルコキシ、(C1-C6)アルキル、又はアミノ；あるいはフェニル環の隣接する2つの位置の１つ又は両方が置換される場合、付着している原子は、(‐OCH2O‐)、(‐OCH(CH3)O-)、(‐CH2CH2O-)、(‐OCH(CH3)CH2O -)、(‐S- CH=N -)、(‐CH2OCH2O‐)、(‐O(CH2)3‐)、(＝N-O-N=)、(‐C=CH-NH-)、(‐OCF2O-)、(‐NH-CH=N-)、(‐CH2CH2O-)、及び(‐(CH2)4‐)からなるグループから選ばれた連結のフェニル結合末端を形成する場合があり、そして少なくとも１つのヒドロキシ、ニトロ、‐C=NOH、アセトキシ、カルボキシ、−S(O)CH3、−C=N-NHC(O)NRaRb、又は−C=N-NHC(O)C(O)NRaRbを持っており、あるいはフェニル環の隣接する2つの位置がOで置換され、これらの原子が連結(‐OCH2O)のフェニル結合末端を形成する場合があり、
(ｂ)1-3窒素原子及び3-5核炭素原子を持つ非置換6員環ヘテロサイクル又は置換６員環ヘテロサイクルで、置換体は１から3までの同じ又は異なるハロ；ニトロ；ヒドロキシ；(C1-C6)アルキル；(C1-C6)アルコキシ；(C1-C6)チオアルコキシ；カルボキシ；(C1-C6)アルコキシカルボニル；(C1-C6)カルボキシアルキル；各アルキル・グループに独立に定まった数の炭素原子を持つ(C1-C6)アルコキシカルボニルアルキル；‐CONRaRb；アミノ；(C1-C6)アルキルアミノ；各アルキル・グループに独立に定まった数の炭素原子を持つ(C1-C6)ジアルキルアミノ；‐CF3を含むハロアルキル；‐C=N-NHC(O)NRaRb)；又は‐C=N-NHC(O)C(O)NRaRb)；あるいは
(ｃ)５−ベンズイミダゾリル；１−トリチル‐５−ベンズイミダゾリル；３−トリチル‐５−ベンズイミダゾリル；１H-インダゾール‐３‐イル；１‐トリチル‐１H‐インダゾール‐３‐イル；又は１‐(C1-C6)アルキル‐１H‐インドール‐2‐イル；  ここで、Ra及びRbは独立にH、(C1-C6)アルキル、又はフェニルであり；あるいは、
(２)  以下の化合物、
4-クロロ安息香酸N’-ベンゾイル-N”-tert-ブチル-ヒドラジド、
4-エチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(2-ニトロ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
4-メチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
4-エチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,5-ジクロロ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(2,6-ジフルオロ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-クロロ-2-メチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3-クロロ-ベンゾイル) -ヒドラジド、
2-クロロ-3-メトキシ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(2-クロロ-5-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-クロロ-2-メチル安息香酸N’-(4-ブロモ-3-メチル-ベンゾイル)-N’-tert-ブチル-ヒドラジド、
4-エチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(4-クロロ-3,5-ジメチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
4-エチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3-クロロ-4,5-ジメチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
4-メトキシ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(2-クロロ-4-フルオロ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
4-エチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3-クロロ-5-メチル-ベンゾイル) -ヒドラジド、
4-エチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(2-エチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
4-メトキシ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3,5-ジクロロ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
4-エチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(5-メチル-2-ニトロ-ベンゾイル) -ヒドラジド、
4-シアノメチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-メチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(3-メトキシ-2-メチル-ベンゾイル) -ヒドラジド、
4-ブロモ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3,5-ジクロロ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2-メチル-3-ニトロ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2,3-ジメチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(2,5-ジメトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2,3-ジメチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(5-クロロ-2-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(3-メトキシ-2-ニトロ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2,3-ジメチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3,5-ジメトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-クロロ-4-エチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
4-(1-ヒドロキシ-エチル)安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3,5-ジフロロ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-ジメチルアミノ-2-メチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3,5-ジクロロ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-アセチル-2-メチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
酢酸3-[N’-tert-ブチル-N’-(3,5-ジクロロ-ベンゾイル)-ヒドラジノカルボニル]-2-メチル-フェニルエステル、
3-ヨード-2-メチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-メトキシ-2-メチル安息香酸N’-(3-ブロモ-5-クロロ-ベンゾイル)-N’-tert-ブチル-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(3-イソプロポキシ-2-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-メトキシ-2-メチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(2-クロロ-ピリジン-3-カルボニル)-ヒドラジド、
3-メトキシ-2-メチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(2-メトキシ-5-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-メトキシ-2-メチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(2,5-ジフロロ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-メトキシ-2-メチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(2-エチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-メトキシ-2-メチル安息香酸N’-(3-ブロモ-5-メチル-ベンゾイル)-N’-tert-ブチル-ヒドラジド、
3-メトキシ-2-メチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3-メトキシ-5-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-メトキシ-2-メチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(4-クロロ-2-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2-メチル-3-トリフルオロメトキシ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-メトキシ-2-メチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3-メトキシ-4-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-メトキシ-4-メチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-メトキシ-2-メチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(2-メトキシ-4-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-メトキシ-2-メチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(2,6-ジクロロ-ピリジン-4-カルボニル)-ヒドラジド、
3-メトキシ-2-メチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(5-メチル-2-ニトロ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-メトキシ-2-メチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(4-クロロ-2-フルオロ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2-クロロ-4-フルオロ安息香酸N’-(ベンゾ[1,3]ジオキソール-5-カルボニル)-N-tert-ブチル-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-エチル-2-メチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(2,3-ジヒドロ-ベンゾフラン-5-カルボニル)-ヒドラジド、
3-メトキシ-2-メチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3,5-ジクロロ-4-フルオロ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
4-フルオロ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(4-メチル-ベンゾ[1,3]ジオキソール-5-カルボニル)-ヒドラジド、
2-メトキシ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(4-エチル-ベンゾ[1,3]ジオキソール-5-カルボニル)-ヒドラジド、
3,4-ジエチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
4-フルオロ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2-メトキシ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-メトキシ-2-メチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(4-フルオロ-2-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2-クロロ-6-メチルイソニコチン酸N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,5-ジメトキシ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2-ヨード-3-メトキシ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2-メトキシ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5,6,7,8-テトラヒドロ-ナフタレン-2-カルボニル)-ヒドラジド、
2-エチル-3-メトキシ安息香酸N’-(ベンゾ[1,3]ジオキソール-4-カルボニル)-N’-tert-ブチル-ヒドラジド、
4-エチル-2-フルオロ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(4-フルオロ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
ベンゾ[1,3]ジオキソール-5-カルボン酸N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
4-フルオロ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-メチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(2-メチル-ベンゾ[1,3]ジオキソール-5-カルボニル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(4-エチル-2-メチル-ベンゾ[1, 3]ジオキソール-5-カルボニル)-ヒドラジド、
3-メトキシ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-メチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(3-メチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N’-(5-ブロモ-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボニル)-N-tert-ブチル-ヒドラジド、
3-クロロ-5-メチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-エチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
3-メチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-エチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1, 4]ジオキシン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
2-メトキシ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-エチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
3-メトキシ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-エチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N’-(ベンゾチアゾール-6-カルボニル)-N-tert-ブチル-ヒドラジド、
4-クロロ-2-メトキシ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2-エチル-3-メトキシ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(2,5-ジメトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(6-メチル-ベンゾ[1,3]ジオキソール-5-カルボニル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N’-(4H-ベンゾ[1,3]ジオキシン-6-カルボニル)-N-tert-ブチル-ヒドラジド、
2-メトキシ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(8-メチル-4H-ベンゾ[1,3]ジオキシン-7-カルボニル)-ヒドラジド、
4-フルオロ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(8-エチル-4H-ベンゾ[1,3]ジオキシン-7-カルボニル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(6-クロロ-ベンゾ[1,3]ジオキソール-5-カルボニル)-ヒドラジド、
2,3,6-トリフルオロ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(2-クロロ-4-フルオロ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2-エチル-3-メトキシ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(2,6-ジフルオロ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-フルオロ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-ブロモ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル) -ヒドラジド、
2-エチル-3-メトキシ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(2-ニトロ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2,3-ジフルオロ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2-エチル-3-メトキシ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3,4,5-トリメトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-フルオロ-5-トリフルオロメチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-シアノ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル) -ヒドラジド、
2,4-ジクロロ-5-フルオロ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(3-メトキシ-2-ビニル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
安息香酸N-tert-ブチル-N’-(8-エチル-4H-ベンゾ[1,3]ジオキシン-7-カルボニル)-ヒドラジド、
2-[N-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジノ]-2-メチル-プロピオン酸エチルエステル、
2-エチル-3-メトキシ安息香酸N’-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-N’-(2-ヒドロキシ-1,1-ジメチル-エチル)-ヒドラジド、
2-エチル-3-メトキシ安息香酸N’-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-N’-(1,1-ジメチル-2-オキソ-エチル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-N-(2-メトキシ-1,1-ジメチル-エチル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-N-(2-ヒドロキシイミノ-1,1-ジメチル-エチル)-ヒドラジド、
2-アミノ-3-メトキシ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
酢酸3-[N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジノカルボニル]-5-メチル-ベンジルエステル、
酢酸2-[N-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジノ]-2-メチル-プロピルエステル、
3-ヒドロキシ-2-メチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(2,3,4-トリフルオロ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-ヒドロキシ-2-メチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3-クロロ-5-メトキシ-ピリジン-4-カルボニル)-ヒドラジド、
3-ヒドロキシ-2-メチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(2,6-ジクロロ-ピリジン-4-カルボニル)-ヒドラジド、
3-ヒドロキシ-2-メチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3-メトキシ-ピリジン-4-カルボニル)-ヒドラジド、
3-ヒドロキシ-2-メチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3,5-ジメトキシ-4-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2-メトキシ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-メチル-クロマン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
2,4-ジクロロ-5-フルオロ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2,4-ジクロロ-5-フルオロ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-メチル-クロマン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
2-フルオロ-5-メチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-メチル-クロマン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
5-メチル-クロマン-6-安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3,5-ジメトキシ-4-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2,5-ジフルオロ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-エチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
2,3,4-トリフルオロ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-エチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
2,3,4,5-テトラフルオロ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-エチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
4-フルオロ-3-トリフルオロメチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-エチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
2,6-ジクロロ-イソニコチン酸N-tert-ブチル-N’-(5-エチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
2-メトキシ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-エチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
2,4-ジクロロ-5-フルオロ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-エチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
4-クロロ-2-フルオロ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-エチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
酢酸3-[N’-tert-ブチル-N’-(3,5-ジメトキシ-4-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジノカルボニル]-2-メチル-フェニルエステル、
2-エチル-3-メトキシ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(5-クロロ-2-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
4-クロロ-2-メトキシ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(4-エチル-ベンゾ[1,3]ジオキソール-5-カルボニル)-ヒドラジド、
5-クロロ-2-メトキシ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-メチル-クロマン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
2-エチル-3-メトキシ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(5-メチル-2-ニトロ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2-エチル-3-メトキシ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(4-クロロ-2-ニトロ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2-エチル-3-メトキシ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(5-クロロ-2-ニトロ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
5-メチル-クロマン-6-カルボン酸N’-tert-ブチル-N’-(5-メチル-2-ニトロ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
ベンゾ[1,2,5]オキサジアゾール-5-カルボン酸N’-tert-ブチル-N’-(4-クロロ-2-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2-クロロ-5-ニトロ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(3-メトキシ-2-ビニル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
4-クロロ-2-メトキシ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(3-メトキシ-2-ビニル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2-エチル-3-メトキシ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(1-メチル-1H-インドール-2-カルボニル)-ヒドラジド、
3,5-ジメトキシ-4-メチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-エチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-クロロ-4H-ベンゾ[1,3]ジオキシン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
4-エチル-2-フルオロ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3-ニトロ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-メトキシ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(4-エチル-2-フルオロ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
5-クロロ-4H-ベンゾ[1,3]ジオキシン-6-カルボン酸N’-tert-ブチル-N’-(3,5-ジメトキシ-4-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
4-エチル-2-フルオロ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(2,6-ジクロロ-ピリジン-4-カルボニル)-ヒドラジド、
4-エチル-2-フルオロ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3,5-ジメトキシ-4-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
4-エチル-2-フルオロ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3,4,5-トリフルオロ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
4-エチル-2-フルオロ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
4-エチル-2-フルオロ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(2-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
4-エチル-2-フルオロ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(5-フルオロ-2-ニトロ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
4-エチル-2-フルオロ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-[5-メトキシ-2-(2,2, 2-トリフルオロ-エトキシ)-ベンゾイル]-ヒドラジド、
4-エチル-2-フルオロ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(2-クロロ-6-メチル-ピリジン-4-カルボニル)-ヒドラジド、
4-エチル-2-フルオロ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(2,6-ジメトキシ-ピリジン-3-カルボニル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(１H-インドール-6-カルボニル)-ヒドラジド、
2-エチル-3-メトキシ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(2-メタンスルフィニル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2,2-ジフルオロ-ベンゾ[1,3]ジオキソール-5-カルボンN’-tert-ブチル-N’-(2-ニトロ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(2,2-ジフルオロ-ベンゾ[1,3]ジオキソール-5-カルボニル)-ヒドラジド、
3-メトキシ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(2,2-ジフルオロ-ベンゾ[1,3]ジオキソール-5-カルボニル)-ヒドラジド、
3-ブロモ安息香酸N-(シアノ-ジメチル-メチル)-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,5-ジクロロ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(3-メトキシ-2-メトキシメチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-(ヒドロキシイミノ-メチル)-5-メチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-(H2NC(O)NHN=CH)-5-メチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-(H2NC(O)C(O)NHN=CH)-5-メチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2-エチル-3-メトキシ安息香酸N’-(シアノ-ジメチル-メチル)-N’-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2-エチル-3-メトキシ安息香酸N’-(シアノ-ジメチル-メチル)-N’-(3,5-ジメトキシ-4-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2-メトキシ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(8-エチル-4H-ベンゾ[1,3]ジオキシン-7-カルボニル)-ヒドラジド、
2,4,5-トリフルオロ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-メチル-クロマン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
3,4,5-トリフルオロ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-メチル-クロマン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
3-フルオロ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-メチル-クロマン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
3-トリフルオロメチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(4-エチル-ベンゾ[1,3]ジオキソール-5-カルボニル)-ヒドラジド、
4-フルオロ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-メチル-クロマン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
3,4-ジフルオロ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-メチル-クロマン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
3,5-ジフルオロ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-メチル-クロマン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
2,3,4,5-テトラフルオロ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-メチル-クロマン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
4-メチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(8-エチル-4H-ベンゾ[1,3]ジオキシン-7-カルボニル)-ヒドラジド、
酢酸4-[N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジノカルボニル]-2,6-ジメトキシ-フェニルエステル、
2-エチル-3-メトキシ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(4-ヒドロキシ-3,5-ジメトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
5-メチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボン酸N’-tert-ブチル-N’-(3,5-ジメトキシ-4-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
5-メチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボン酸N’-tert-ブチル-N’-(2,6-ジメトキシ-ピリジン-3-カルボニル)-ヒドラジド、
2,6-ジクロロ-イソニコチン酸N-tert-ブチル-N’-(5-メチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
3-フルオロ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-メチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
3-フルオロ-5-トリフルオロメチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-メチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
5-メチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボン酸N’--tert-ブチル-N’-(5-メチル-2-ニトロ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
5-メチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボン酸N’-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-N’-(1-エチル-2,2-ジメチル-プロピル)-ヒドラジド、
5-メチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボン酸N’-(3,5-ジメトキシ-4-メチル-ベンゾイル)-N’-(1-エチル-2,2-ジメチル-プロピル)-ヒドラジド、
5-メチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボン酸N’-(1-tert-ブチル-ブチル)-N’-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
5-メチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボン酸N’-(1-tert-ブチル-ブチル)-N’-(3,5-ジメトキシ-4-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
5-エチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボン酸N’-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-N’-(1-エチル-2,2-ジメチル-プロピル)-ヒドラジド、
5-エチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボン酸N’-(3,5-ジメトキシ-4-メチル-ベンゾイル)-N’-(1-エチル-2,2-ジメチル-プロピル)-ヒドラジド、
5-エチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボン酸N’-(1-tert-ブチル-ブチル)-N’-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
5-エチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボン酸N’-(1-tert-ブチル-ブチル)-N’-(3,5-ジメトキシ-4-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2-メトキシ-6-トリフルオロメチル-ニコチン酸N-tert-ブチル-N’-(3-メトキシ-2-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-メトキシ-2-メチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(1-メチル-2-オキソ-6-トリフルオロメチル-1,2-ジヒドロ-ピリジン-3-カルボニル)-ヒドラジド、
2,6-ジメトキシ-ピリミジン-4-カルボン酸N-tert-ブチル-N’-(3-メトキシ-2-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,6-ジメトキシ-ピリダジン-4-カルボン酸N-tert-ブチル-N’-(3-メトキシ-2-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,6-ジクロロ-ピリダジン-4-カルボン酸N-tert-ブチル-N’-(3-メトキシ-2-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
ピリダジン-4-安息香酸N-tert-ブチル-N’-(3-メトキシ-2-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
6-メトキシ-3-オキソ-2,3-ジヒドロ-ピリダジン-4-カルボン酸N-tert-ブチル-N’-(3-メトキシ-2-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、又はピリダジン位置異性体、              3,5-ジメチル安息香酸N-(1-エチル-2,2-ジメチル-プロピル)-N’-(3-メトキシ-2-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,5-ジメトキシ-4-メチル安息香酸N-(1-エチル-2,2-ジメチル-プロピル)-N’-(3-メトキシ-2-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N-(1-tert-ブチル-ブチル)-N’-(3-メトキシ-2-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,5-ジメトキシ-4-メチル安息香酸N-(1-tert-ブチル-ブチル)-N’-(3-メトキシ-2-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N-(1-エチル-2,2-ジメチル-プロピル)-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,5-ジメトキシ-4-メチル安息香酸N-(1-エチル-2,2-ジメチル-プロピル)-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N-(1-tert-ブチル-ブチル)-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,5-ジメトキシ-4-メチル安息香酸N-(1-tert-ブチル-ブチル)-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2,3-ジメチル安息香酸N’-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-N’-(1-エチル-2,2-ジメチル-プロピル)-ヒドラジド、
3-ヒドロキシ-2-メチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3-メトキシ-ピリジン-4-カルボニル)-ヒドラジド、
4-(1-ヒドロキシ-エチル)-安息香酸N’-(3,5-ビス-ヒドロキシメチル-ベンゾイル)-N’-tert-ブチル-ヒドラジド、
2-エチル-3-メトキシ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(2-メタンスルフィニル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
5-[N’-(4-アセチル-ベンゾイル)-N-tert-ブチル-ヒドラジノカルボニル] -イソフタル酸、
5-メチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボン酸N’-tert-ブチル-N’-(2,6-ジメトキシ-ピリジン-3-カルボニル)-ヒドラジド、
4-フルオロ-3-トリフルオロメチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-エチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
2-[N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジノカルボニル]-ベンゼンスルホン酸、
3,5-ジメチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-メチル-クロマン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
4-エチル安息香酸N’-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-N’-(1,2,2-トリメチル-プロピル)-ヒドラジド、
3-メチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-エチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1, 4]ジオキシン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
2,3-ジメチル安息香酸N’-ベンゾイル-N’-(1-エチル-ペンチル)-ヒドラジド、
2,3-ジメチル安息香酸N’-(1-エチル-2,2-ジメチル-プロピル)-N’-(3-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
5-メチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボン酸N’-tert-ブチル-N’-(4-ヒドロキシ-3,5-ジメトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-フルオロ-4H-ベンゾ[1,3]ジオキシン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
2-メタンスルフィニル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-メチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボニル)-ヒドラジド、
5-メチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボン酸N’-(シアノ-ジメチル-メチル)-N’-(3,5-ジメトキシ-4-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
6-メチル-ピリジン-2-カルボン酸N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
5-メチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボン酸N’-tert-ブチル-N’-(3,5-ジメトキシ-4-メチル-2-ニトロ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
4-エチル安息香酸N’-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-N’-(1-エチル-2,2-ジメチル-プロピル)-ヒドラジド、
4-エチル安息香酸N’-(1-エチル-2,2-ジメチル-プロピル)-N’-(2-メトキシ-ピリジン-3-カルボニル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N-(1-tert-ブチル-ペンチル)-N’-(4-エチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,5-ジメトキシ-4-メチル安息香酸N-(1-tert-ブチル-ペンチル)-N’-(4-エチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2-メトキシ-ニコチン酸N-(1-tert-ブチル-ペンチル)-N’-(4-エチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N-(2,2-ジメチル-1-フェニル-プロピル)-N’-(4-エチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,5-ジメトキシ-4-メチル安息香酸N-(2,2-ジメチル-1-フェニル-プロピル)-N’-(4-エチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2-メトキシ-ニコチン酸N-(2,2-ジメチル-1-フェニル-プロピル)-N’-(4-エチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
1H-ベンゾイミダゾール-5-カルボン酸N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
1-(又は3-)トリチル-１H-ベンゾイミダゾール-5-カルボン酸N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
5-メチル-1-フェニル-1H-ピラゾール-3-カルボン酸N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3-クロロ-6-メチルスルファニル-ピラジン-2-カルボン酸N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
1H-インダゾール-3-カルボン酸N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
1-トリチル-1H-インダゾール-3-カルボン酸N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
6-[N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジノカルボニル]-ニコチン酸メチルエステル、
ピラジン-2-カルボン酸N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N-[2-(tert-ブチル-ジメチル-シラニルオキシ)-1,1-ジメチル-エチル]-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-N-[2-(2-ヒドロキシ-エチルイミノ)-1,1-ジメチル-エチル]ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N-[(H2NC(O)NHN=C)(CH3)2C-]-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N-[(H2NC(O)C(O)NHN=C)(CH3)2C-]-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
2-[N-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジノ]-2-メチル-プロピオン酸、
3,5-ジメチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(2-メタンスルフィニルメチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(2-メタンスルホニルメチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(2-ジメチルアミノメチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(2-メチルアミノメチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(3-メトキシ-2-メタンスルファニルメチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N’-(2-アリルオキシメチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-N-tert-ブチル-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N-(1-tert-ブチル-ペンチル)-N’-(3-メトキシ-2-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,5-ジメトキシ-4-メチル安息香酸N-(1-tert-ブチル-ペンチル)-N’-(3-メトキシ-2-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド、
3,5-ジメチル安息香酸N’-(2-アセトキシオキシメチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-N-tert-ブチル-ヒドラジド、及び
5-メチル-ピラジン-2-カルボン酸N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド、
から構成されるグループから選択される化合物に接触させても実質的に無反応である細胞を選択するステップ、
ｂ）細胞に、
１）i)  ポリペプチドをコード化する外因性遺伝子、及び
ii)  応答要素、
を含むDNAコンストラクトで、前記遺伝子が前記応答要素のコントロール下にあるもの、並びに
２）i)  DNA結合ドメイン、
ii)  リガンド結合ドメイン、及び
iii)  トランスアクティベーション・ドメイン、
を含むエクジソン受容体複合体を導入するステップ、及び
ｃ）細胞とリガンドとを、接触させるステップ、を含む、
方法。
【請求項１４】
以下のステップからなる式(IV)の化合物の調製方法であり、
(i)  NaH、KH、あるいはアミドMNRaRbから選ばれる塩基と式(I)の化合物を反応させて生成物IIを得るステップで、ここでMはリチウム、ナトリウム、又はカリウムで、Ra及びRbは独立に(C1-C6)アルキル又はフェニルであり、
【化７】
2014111634.tif 000140
(ii)  ステップ(i)の生成物(II)と式（III）の化合物との反応で、Rは３から５までの同じ又は異なるクロロ、フルオロ、又はトリフルオロメチルで置換したフェニルであり；
【化８】
2014111634.tif 000141
ここで、
A及びBは独立に、
(a)  非置換又は置換フェニルで、置換体は独立して１から５までのH; ハロ；ニトロ；シアノ；アミノ(‐NRaRb)；アルキルアミノアルキル(‐(CH2)ｎNRaRb)；(C1-C6)アルキル；(C1-C6)ハロアルキル；(C1-C6)シアノアルキル；(C1-C6)アルコキシ；フェノキシ；(C1-C6)ハロアルコキシ；(C1-C6)アルコキシ(C1-C6)アルキル；(C1-C6)アルケニルオキシ(C1-C6)アルキル；(C1-C6)アルコキシ(C1-C6)アルコキシ；ハロ、シアノ、(C1-C4)アルキル、又は(C1-C4)アルコキシで選択的に置換した(C2-C6)アルケニル；ハロ又は (C1-C4)アルキルで選択的に置換した(C2-C6)アルキニル；フォルミル；(C1-C6)ハロアルキルカルボニル；ベンゾイル；(C1-C6)アルコキシカルボニル；(C1-C6)ハロアルコキシカルボニル；(C1-C6)アルカノイルオキシ(‐OCORa)；カルボキシアミド(‐CONRaRb)；アミド(‐N RaCORb)；アルコキシカルボニルアミノ(‐N(CH2)ｎCO2Rb)；アルキルアミノカルボニルアミノ(‐N(CH2)ｎCONRbRc)；(C1-C6)アルキルチオ；フルファミド(‐SO2NRaRb)；又は非置換又は置換フェニルで、置換体は独立して１から3までのハロ、ニトロ、(C1-C6)アルコキシ、(C1-C6)アルキル、又は(‐NRaRb)；あるいはフェニル環の隣接する2つの位置の１つ又は両方が置換される場合、付着している原子は、(‐OCH2O‐)、(‐OCH(CH3)O-)、(‐CH2CH2O-)、(‐OCH(CH3)CH2O -)、(‐S- CH=N -)、(‐CH2OCH2O‐)、(‐O(CH2)3‐)、(＝NH-O-N=)、(‐C=CH-NH-)、(‐OCF2O-)、(‐N-CH=N-)、(‐CH2CH2O-)、及び(‐(CH2)4‐)からなるグループから選ばれた連結のフェニル結合末端を形成する場合があり；
あるいは、
(ｂ)  1-3窒素原子を持つ非置換5又は6員環ヘテロサイクル又は置換5又は６員環ヘテロサイクルで、置換体は１から4までの同じ又は異なるハロ；ニトロ；(C1-C6)アルキル；(C1-C6)アルケニル；(C1-C6)アルコキシ；(C1-C6)チオアルコキシ；(C1-C6)アルコキシカルボニル；(C1-C6)カルボキシアルキル；‐CONRaRb；アミノ(‐NRaRb)；‐CF3を含むハロアルキル；トリアルキルシリル(-SiRaRb Rｃ)；トリチル(C(Ph)3)；あるいは非置換又は置換のフェニルで、置換体は独立に１から3までのハロ、ニトロ、(C1-C6)アルコキシ、(C1-C6)アルキル、又は(‐NRaRb)；あるいは２つの隣接する位置が置換される場合、これらの位置はベンゾ環融合を形成する場合があり、そして、
Eはフェニル、あるいは非置換又は置換(C1-C10)直鎖又は側鎖のアルキルで、置換体は独立に1-4シアノ；ハロ；(C5-C6)シクロアルキル；フェニル；(C2-C3)アルケニル；(C1-C6)アルコキシ；(C1-C6)アルコキシカルボニル；(C1-C6)アルカノイルオキシ(-OCORa)；フォルミル；各アルキル・グループに独立に所定の炭素数を持っている(C1-C6)トリアルキルシリルオキシ；又は‐C=N-ORaで、
ここで、Ra、Rｂ、及びRｃは独立に(C1-C4)アルキル又はフェニルで、ｎ＝1-4である、方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願】
【０００１】
本出願は、2003年2月28日に提出された米国仮出願番号60/455,741への優先権を請求する。
【発明の分野】
【０００２】
[0001]本発明は生物工学または遺伝子工学の分野に関係している。特に、本発明は遺伝子の発現分野に関係している。更に具体的には、本発明は天然及び突然変異の核受容体用の非ステロイド・リガンド、核受容体ベースの誘導性遺伝子発現に於けるその使用、そしてこういうリガンド及び誘導性発現システムを使って宿主細胞内で遺伝子の発現を調節する方法に関係している。
【発明の背景】
【０００３】
[0002]本出願には種々の出版物が引用されており、その明細は全て参照として編入されている。しかし、参照の引用があったとしても、そういう参照が現在のアプリケーションに「従来の技術」として利用可能であると解釈されるべきではない。
【０００４】
[0003]遺伝子工学の分野では、遺伝子発現の正確なコントロールは、発育や他の生理学的プロセスの研究、操作、及びコントロールにとって貴重な道具である。遺伝子発現は、蛋白質間の特異的な数多くの相互作用を含む複雑な生物学的プロセスである。遺伝子発現が活性化され、蛋白質合成の第1段階に必要なRNAの生産が行なわれるには、転写アクティベーターが、遺伝子転写をコントロールするプロモーターの近くに運ばれなければならない。普通、転写アクティベーター自身、遺伝子のプロモーター部位のDNA結合サイトに結合する少なくとも１つのDNA結合ドメインを持つ蛋白質と関係している。従って、遺伝子の発現が起きるには、DNA結合ドメインとDNA結合ドメインから適切な距離にあるトランスアクティベーション・ドメインを含む蛋白質が、遺伝子のプロモーター部位の正確な位置に運ばれなければならない。
【０００５】
[0004]従来の遺伝子導入方法は、設計された導入遺伝子の発現を行なうために、細胞タイプの特異的なプロモーターを利用する。導入遺伝子を含むDNAコンストラクトは、宿主のゲノムにまず取り込まれる。転写アクティベーターによる刺激があると、所定の細胞タイプで導入遺伝子の発現が起きる。
【０００６】
[0005]細胞内にある外来性の遺伝子の発現を規制する別の方法は、誘導性プロモーターを通して行われる。そういう誘導性プロモーターの使用例には、PR1-aプロモーター、原核生物のレプレッサー・オペレーター・システム、免疫抑制イミュノフィリン・システム、ステロイド・ホルモン受容体システムのようなより高度な真核生物の転写活性化システムなどが含まれ、以下で説明される。
【０００７】
[0006]タバコから得られるPR1-aプロモーターは、病原体の攻撃後、全身性の獲得抵抗反応時に誘導される。PR1-aプロモーターの使用は、内因性の物質、そして病原体、UV-B照射、汚染物などの外的要因に反応する場合が多いので、制限される場合がある。熱ショック、インターフェロン、そして重金属により誘導されるプロモーター・ベースの遺伝子調節システムについては報告がある(ワーン (Wurn) 等、1986、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 5414-5418; アーンハイター(Arnheiter) 等、1990、細胞 (Cell) 62: 51-61; フィルマス (Filmus) 等、1992、核酸研究 (NucleicAcids Research)20:27550-27560)。しかし、こういうシステムは、標的ではない遺伝子の発現に影響を及ぼすので限界がある。
【０００８】
[0007]原核生物のレプレッサー・オペレーター・システムは、バクテリアのレプレッサー蛋白質とそれが結合するユニークなオペレーターDNA配列を利用する。大腸菌(Escherichia coli) から得られるテトラサイクリン (“Tet”) と乳糖 (“Lac”) のレプレッサー・オペレーター・システムは、遺伝子発現をコントロールするために植物と動物で使用されている。Tetシステムでは、テトラサイクリンがTetＲレプレッサー蛋白質に結合し、その結果構造上の変化が生じ、オペレーターからレプレッサー蛋白質を放出し、それが原因で転写が起きる。Lacシステムでは、乳糖あるいはイソプロピル-b-D-チオガラクトシドのような合成類似体の存在に反応して、lacオペロンが活性化される。こういうシステムの使用は、残念ながら、リガンドすなわちテトラサイクリンと乳糖の化学的不安定性、毒性、天然の存在、あるいは誘導または抑制には比較的高いレベルの量が要求されるなどの理由により制限されている。
【０００９】
[0008]FK506、ラパマイシン、シクロスポリンＡなどの免疫抑制分子は、イミュノフィリンFKBP12、シクロフィリンなどに結合できる。この情報を基に、2つの蛋白質のそれぞれにFK506を配置するか、１つにFK506を配置し別の１つにシクロスポリンを配置する事により、2つの蛋白質を組み合わせる戦略が考案された。FK506(FK1012) の合成ホモ２量体、あるいはFK506とシクロスポリンの融合から得られる化合物 (FKCsA) が、これらの分子の２量体化を誘導するのに使用できる(スペンサー (Spencer) 等、1993、サイエンス (Science) 262:1019-24; ベルショー (Belshaw) 等、1996、Proc.Natl. Acad. Sci. USA 93:4604-7)。FKBP12と融合するGal4 DNA結合ドメイン、シクロフィリンと融合するVP16アクティベーター・ドメイン、そしてFKCsAは、プロモーターを含むGal4結合サイトのコントロールの下に、ヘテロ２量体化とレポーター遺伝子の活性化を示すのに使用された。このシステムは、残念ながら、副作用をもたらす可能性のある免疫抑制剤を含んでおり、従って哺乳類の遺伝子スイッチ・アプリケーションの使用には限界がある。
【００１０】
[0009]ステロイド・ホルモン受容体システムのようなより高度な真核生物の転写活性化システムも利用されている。ステロイド・ホルモン受容体は核受容体の上科のメンバーであり、脊椎動物および無脊椎動物の細胞に見出される。残念ながら、遺伝子発現を規制するために受容体を活性化するステロイド系化合物の使用は、それが天然の生物学的経路の他の多くにも関係しているので、特に植物と哺乳類に於いては制限されている。そういう困難を乗り越えるため、昆虫のエクジソン受容体(EcR) を使う代替システムが開発された。
【００１１】
[0010]昆虫の成長、脱皮、発達は、エクジソン・ステロイド・ホルモン(脱皮ホルモン)と幼若ホルモンにより調節されている (ダディアラ (Dhadialla) 等1998、Annu.Rev. Entomol. 43:545-569)。昆虫のエクジソンの分子標的は、少なくともエクジソン受容体(EcR) とウルトラスパイラクル蛋白質 (USP) で構成される。EcRは、シグネチャーDNA、リガンド結合ドメイン、そして活性化ドメインで特徴付けられる核ステロイド受容体の上科のメンバーである(コエル (Koelle) 等、1991、細胞 (Cell)、67:59-77)。EcR受容体は、ポナステロンＡやムリステロンＡ等の数多くのステロイド化合物に反応する。最近、エクジステロイド作用活性を持つ非ステロイド化合物が発表されており、ローム・アンド・ハース・カンパニー(Rohm and Haas Company) が全世界で市販している農薬、テブフェノジドやメトキシフェノジドもその中に含まれる (国際特許出願番号PCT/EP96/00686および米国特許5,530,028を参照の事)。両類似体は、他の有機体に対し一際優れて安全である。
【００１２】
[0011]昆虫のエクジソン受容体(EcR) は哺乳類のRXRに相当する昆虫の相同体であるウルトラスパイラクル (Ultraspiracle)(USP) とヘテロ２量体を形成し、エクジステロイド及びエクジソン受容体応答要素と結合し、エクジソン反応遺伝子の転写を活性化する。EcR/USP/リガンド複合体は、昆虫の発育及び繁殖期間中重要な役割を演じる。EcRはステロイド・ホルモン上科のメンバーで、５つの調節ドメイン、すなわちA/B(トランスアクティベーション)、Ｃ（ＤＮＡ結合、ヘテロ２量体化）、Ｄ（ヒンジ、ヘテロ２量体化）、Ｅ（リガンド結合、ヘテロ２量体化及びトランスアクティベーション）、そしてＦ（トランスアクティベーション）ドメインを有している。これらのドメインのいくつか、例えばA/B、Ｃ，そしてＥは、他の蛋白質と結合してもその機能を維持している。
【００１３】
[0012]厳格に調節された誘導性遺伝子発現システム、すなわち「遺伝子スイッチ」は、遺伝子療法、細胞内に於ける大量の蛋白質生産、細胞ベースの高処理量スクリーニング・アッセイ、機能ゲノミックス、遺伝子導入植物や動物の特徴の調節など種々のアプリケーションに有益である。
【００１４】
[0013]EcRベースの遺伝子スイッチの最初のバージョンは、ショウジョウバエ(Drosophila melanogaster) のEcR (DmEcR) とハツカネズミ (Mus musculus) のRXR (MmRXR) を使い、これらの受容体が、ポナステロンＡステロイドの存在の下に、哺乳類の細胞株と遺伝子導入マウスのレポーター遺伝子をトランスアクティベートする事を示した(クリストファーソン (Christopherson) K. S.、マーク (Mark) M. R.、バジャ (Baja) J. V.、ゴドウィスキー(Godowski) P. J. 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89: 6314-6318; ノー(No) D.、ヤオ(Yao) T. P.、エバンス (Evance) R. M.、1996、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93:3346-3351)。  後に、サー (Suhr) 等は、1998、Proc.Natl. Acad. Sci. 95：7999−8004に於いて、エクジソン作用薬であるテブフェノジドが、外因性のヘテロ２量体パートナーの不在下に、蚕(Bombyx mori) のEcR (BmEcR) を通し、哺乳類の細胞に於いてレポーター遺伝子のトランスアクティベーション・レベルを高める事を示した。
【００１５】
[0014]国際特許出願番号PCT/US97/05330(WO97/38117) 及び PCT/US99/08381 (WO99/58155) は、外因性遺伝子の発現の調節方法を開示したが、それによると、外因性遺伝子とエクジソン応答要素を含むDNAコンストラクトがエクジソン受容体を含む第2のDNAコンストラクトによって活性化され、第2のDNAコンストラクトはそのリガンドの存在下に、できればサイレント・パートナーとして活動できる受容体の存在下に、エクジソン応答要素と結合し、遺伝子発現を誘導する。選択されたエクジソン受容体は、ショウジョウバエ(Drosophila melanogaster) から単離された。普通、そういうシステムが最適活性化を提供するには、サイレント・パートナー、できればレチノイドＸ受容体(RXR) の存在を必要とする。哺乳類の細胞では、昆虫のエクジソン受容体 (EcR) はレチノイドＸ受容体 (RXR) とヘテロ２量体を形成し、リガンド依存的に標的遺伝子の発現を調節する。国際特許出願番号PCT/US98/14215(WO 99/02683) は、蚕蛾 (Bombyxmori) から単離されたエクジソン受容体が、外因性の２量体パートナーの必要性なしに、哺乳類システムで機能する事を明らかにした。
【００１６】
[0015]米国特許番号6,265,173Ｂ1は、受容体のステロイド／サイロイド上科の種々のメンバーが、ショウジョウバエ(Drosophila melanogaster) のウルトラスパイラクル受容体(USP) あるいは遺伝子発現システムで使用されるUSPの２量体化ドメインを少なくとも含むその断片と結合できる事を明らかにした。米国特許番号5,880,333は、ショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)のEcRと植物で使用されるウルトラスパイラクル (USP)ヘテロ２量体システムについて、トランスアクティベーション・ドメインとDNAドメインが２つの異なるハイブリッド蛋白質の上に配置されている事を明らかにした。残念ながら、こういうUSPベースのシステムは、動物細胞の構成要素であり、従ってレポーター遺伝子発現の調節には有効ではない。
【００１７】
[0016]こういうケースでは、トランスアクティベーション・ドメインとDNAドメイン(国際特許出願番号PCT/US98/14215では天然のEcRとして、国際特許出願番号PCT/US97/05330では修正されたEcRとして) は単一の分子に取り込まれ、他のヘテロ２量体パートナー、つまりUSPかRXRが天然の状態で使われていた。
【００１８】
[0017]上述のEcRベースの遺伝子制御システムの欠点は、リガンドの不在下ではかなりの背景活動がある事、そしてこういうシステムは植物と動物の両方には適用できない事などが含まれる(米国特許番号5,880,333を参照の事）。従って、業界では、植物と動物の両方で外因性の遺伝子の発現を正確に調節できる改善されたEcRベースのシステムが必要とされている。そういう改善されたシステムは、遺伝子療法、大量の蛋白質及び抗体の生産、細胞ベースの高処理量スクリーニング・アッセイ、機能ゲノミックス、遺伝子導入動物の特徴の調節などのアプリケーションに有益である。遺伝子療法のようなある種のアプリケーションでは、合成非ステロイド・リガンドに良く反応する誘導性遺伝子発現システムを持ち、それと同時に天然のステロイドには反応しない事が望ましい。従って、改善されたシステムは、比較的安価で、直ぐ入手可能で、宿主にとって毒性の低いリガンドに依存する、単純でコンパクトなものが、生物学的システムの調節には有効である。
【００１９】
[0018]トランスアクティベーションとDNA結合ドメインが２つの異なる蛋白質上に配置され、それによって互いに分離されているエクジソン受容体ベースの誘導性遺伝子発現システムでリガンドの不在下に背景活動が大幅に縮小され、リガンドの存在下に背景活動を超える活動が大幅に上昇した事が最近報告されている(出願中PCT/US01/09050、参照のためその全体をこの出願に取り入れる)。この２つのハイブリッド・システムは、出願PCT/US97/05330及びPCT/US98/14215で開示された2つのシステムと比べて、大幅に改善された誘導性の遺伝子発現調節システムである。２つのハイブリッド・システムは、相互作用する２つの蛋白質の能力を利用して、転写活性化ドメインをDNA結合ドメインとの関係でより望ましい位置に移動させており、その結果、DNA結合ドメインが遺伝子のDNA結合サイトに結合すると、トランスアクティベーション・ドメインはより効果的にプロモーターを活性化する。簡単に言えば、２つのハイブリッド遺伝子発現システムには２つの遺伝子発現カセット、すなわち核受容体ポリペプチドと融合するDNA結合ドメインのコード化、及び異なる核受容体ポリペプチドと融合するトランスアクティベーション・ドメインのコード化が含まれている。リガンドの存在下で、第1のポリペプチドと第2のポリペプチドの相互作用により、DNA結合ドメインがトランスアクティベーション・ドメインに効率的に繋ぎ止められる。DNA結合ドメインとアクティベーション・ドメインは2つの異なる分子上にあるのだから、リガンド不在下の背景活動は大幅に縮小される。
【００２０】
[0019]2ハイブリッド・システムは、ポナステロンＡ（PonA）やムリステロンＡ（MurA）のようなステロイド系リガンドと比べて、ジアシルヒドラジンなどの非ステロイド系リガンドの方により優れた感受性を提供する。更に、EcR遺伝子スイッチに基づくトランスアクティベーションは細胞株依存の場合が多いので、スイッチング・システムをアプリケーション毎に調節し、最大のトランスアクティベーション能力を得るのは容易な事である。更に、非改良RXRをスイッチング・パートナーとして使う時RXRの過発現が生じやすいが、2ハイブリッド・システムはそれが原因で起きる副作用のいくつかを回避できる。好ましいハイブリッド・システムでは、EcR又はRXRの天然DNA結合ドメイン及びトランスアクティベーション・ドメインが排除され、その結果、そういうハイブリッド分子が細胞内に存在する他のステロイド・ホルモン受容体と相互作用を起こすチャンスが少なくなり、副作用の減少が促進される。
【００２１】
[0020]エクジソン受容体ベース遺伝子調節システムの改善により、種々のアプリケーションへのその使用が増大し、ひいては現在よりも活性の高いリガンドへの需要が上昇する。米国特許6,258,603B1 (及びそこで引用されている特許)はジベンゾイルヒドラジン・リガンドを開示しているが、異なる構造と物理化学的性質を持つ追加リガンドの必要性が存在する。我々は新規のジアシルヒドラジン・リガンドを発見した。この化合物は、導入遺伝子の発現調節能力について今まで記述された事も証明された事もなかった。
【発明の概要】
【００２２】
[0021]本発明は、核受容体ベースの誘導性遺伝子発現システムに使われる非ステロイド系リガンド、及び核受容体ベースの誘導性遺伝子発現システムを持つそういうリガンドを使って宿主細胞内の遺伝子発現を調節する方法に関係している。
【００２３】
[0022]出願者の発明は、本発明のリガンドを持つ遺伝子発現調節システムを使って、宿主細胞で遺伝子発現を調節する方法にも関係している。特に、出願者の発明は、次のようなステップを含めて宿主細胞で遺伝子発現を調節する方法を提供する：ａ）本発明による遺伝子発現調節システムを宿主細胞に導入；ｂ）ｉ）遺伝子発現調節システムの第1ハイブリッド・ポリペプチドからのDNA結合ドメインと結合するドメインを含む応答要素；ii）遺伝子発現調節システムの第2ハイブリッド・ポリペプチドのトランスアクティベーション・ドメインにより活性化されるプロモーター；そしてiii）発現が調節の対象となっている遺伝子からなる遺伝子発現カセットを宿主細胞に導入；ｃ）リガンドを宿主細胞へ導入。リガンドを宿主細胞へ導入する事により、遺伝子の発現が調節される。出願者の発明は、遺伝子発現調節システムの第1ハイブリッド・ポリペプチドからのDNA結合ドメインと結合するドメインを含む応答要素、それを含む遺伝子発現カセット、それを含む宿主細胞内で、遺伝子の発現を調節する方法；遺伝子発現調節システムの第2ハイブリッド・ポリペプチドのトランスアクティベーション・ドメインによって活性化されるプロモーター；そして発現が調節の対象となっている遺伝子も提供する。方法は次のステップで構成される：ａ）本発明による遺伝子発現調節システムを宿主細胞に導入；ｂ）リガンドを宿主細胞へ導入。ここで、リガンドを宿主細胞へ導入する事により、遺伝子の発現が調節される。
【発明の詳細説明】
【００２４】
[0024]出願者の発明は、宿主細胞内で関心のある遺伝子の発現を調節するのに役立つエクジソン受容体ベースの誘導性遺伝子発現システム用リガンドを提供する。特に好ましい実施例では、背景遺伝子発現のレベルが縮小し、非ステロイド系リガンドのサブマイクロモル濃度に反応する誘導性遺伝子発現システムを出願者の発明は提供する。従って、出願者による新規のリガンド、誘導性遺伝子発現システム、そして宿主内の遺伝子発現を調節する方法に於けるその使用は、現在利用可能な誘導性発現システムの限界を乗り越えるものであり、腕のいい熟練工に遺伝子発現をコントロールする効果的な手段を提供する。
【００２５】
[0025]本発明は、遺伝子療法、大量の蛋白質及び抗体の生産、細胞ベースの高処理量スクリーニング・アッセイ、機能ゲノミックス、プロテオミクス、メタボロミクス、遺伝子導入有機体の特徴の調節など遺伝子発現のコントロールが望まれるアプリケーションに有益である。出願者の発明の有利な点は、遺伝子発現を調節する手段、及びユーザーの要件に合った発現レベルに調節する手段を提供する事である。
【００２６】
[0026]本発明は、以下の一般式の化合物に関係する。
【化１】
2014111634.tif 000002
【００２７】
[0027]ここで、ＸとＸ’は独立してＯ又はＳである；
【００２８】
[0028]Aは非置換又は置換フェニルで、置換体は独立して１から５までのH;ハロ；ニトロ；シアノ；ヒドロキシ；アミノ(‐NRaRb)；アルキルアミノアルキル(‐(CH2)ｎNRaRb)；(C1-C6)アルキル；(C1-C6)ハロアルキル；(C1-C6)シアノアルキル；(C1-C6)ヒドロキシアルキル；(C1-C6)アルコキシ；フェノキシ；(C1-C6)ハロアルコキシ；(C1-C6)アルコキシ(C1-C6)アルキル；(C1-C6)アルケニルオキシ(C1-C6)アルキル；(C1-C6)アルコキシ(C1-C6)アルコキシ；(C1-C6)アルカノイルオキシ(C1-C6)アルキル；ハロ、シアノ、(C1-C4)アルキル、又は(C1-C4)アルコキシで選択的に置換した(C2-C6)アルケニル；ハロ又は(C1-C4)アルキルで選択的に置換した(C2-C6)アルキニル；フォルミル；カルボキシ；(C1-C6)アルキルカルボニル；(C1-C6)ハロアルキルカルボニル；ベンゾイル；(C1-C6)アルコキシカルボニル；(C1-C6)ハロアルコキシカルボニル；(C1-C6)アルカノイルオキシ(‐OCORa)；カルボキシアミド(‐CONRaRb)；アミド(‐N RaCORb)；アルコキシカルボニルアミノ(‐NRaCO2Rb)；アルキルアミノカルボニルアミノ(‐N RaCONRbRc)；メルカプト；(C1-C6)アルキルチオ；(C1-C6)アルキルスルホニル；(C1-C6)アルキルスルホニル(C1-C6)アルキル；(C1-C6)アルキルスルホキシド(‐S(O)Ra)；(C1-C6)アルキルスルホキシド(C1-C6)アルキル(‐(CH2)ｎS(O)Ra)；フルファミド(‐SO2NRaRb)；‐SO3H；又は非置換又は置換フェニルで、置換体は独立して１から3までのハロ、ニトロ、(C1-C6)アルコキシ、(C1-C6)アルキル、又はアミノ；あるいはフェニル環の隣接する2つの位置の１つ又は両方が置換される場合、付着している原子は、(‐OCH2O)、(‐OCH(CH3)O-)、(‐CH2CH2O-)、(‐OCH(CH3)CH2O -)、(‐S- CH=N -)、(‐CH2OCH2O‐)、(‐O(CH2)3‐)、(＝N-O-N=)、(‐C=CH-NH-)、(‐OCF2O-)、(‐N-CH=N-)、(‐CH2CH2O-)、及び(‐(CH2)4) からなるグループから選ばれた連結のフェニル結合末端を形成する場合があり、
【００２９】
[0029]Bは、
(a) 非置換又は置換フェニルで、置換体は独立して１から５までのH;ハロ；ニトロ；シアノ；ヒドロキシ；アミノ(‐NRaRb)；アルキルアミノアルキル(‐(CH2)ｎNRaRb)；(C1-C6)アルキル；(C1-C6)ハロアルキル；(C1-C6)シアノアルキル；(C1-C6)ヒドロキシアルキル；(C1-C6)アルコキシ；フェノキシ；(C1-C6)ハロアルコキシ；(C1-C6)アルコキシ(C1-C6)アルキル；(C1-C6)アルケニルオキシ(C1-C6)アルキル；(C1-C6)アルコキシ(C1-C6)アルコキシ；(C1-C6)アルカノイルオキシ(C1-C6)アルキル；ハロ、シアノ、(C1-C4)アルキル、又は(C1-C4)アルコキシで選択的に置換した(C2-C6)アルケニル；ハロ又は(C1-C4)アルキルで選択的に置換した(C2-C6)アルキニル；フォルミル；カルボキシ；(C1-C6)アルキルカルボニル；(C1-C6)ハロアルキルカルボニル；ベンゾイル；(C1-C6)アルコキシカルボニル；(C1-C6)ハロアルコキシカルボニル；(C1-C6)アルカノイルオキシ(‐OCORa)；カルボキシアミド(‐CONRaRb)；アミド(‐N RaCORb)；アルコキシカルボニルアミノ(‐NRaCO2Rb)；アルキルアミノカルボニルアミノ(‐N RaCONRbRc)；メルカプト；(C1-C6)アルキルチオ；(C1-C6)アルキルスルホニル；(C1-C6)アルキルスルホニル(C1-C6)アルキル；(C1-C6)アルキルスルホキシド(‐S(O)Ra)；(C1-C6)アルキルスルホキシド(C1-C6)アルキル(‐(CH2)ｎS(O)Ra)；フルファミド(‐SO2NRaRb)；‐SO3H；又は非置換又は置換フェニルで、置換体は独立して１から3までのハロ、ニトロ、(C1-C6)アルコキシ、(C1-C6)アルキル、又はアミノ；あるいはフェニル環の隣接する2つの位置の１つ又は両方が置換される場合、付着している原子は、(‐OCH2O-)、(‐OCH(CH3)O-)、(‐CH2CH2O-)、(‐OCH(CH3)CH2O -)、(‐S- CH=N -)、(‐CH2OCH2O‐)、(‐O(CH2)3‐)、(＝N-O-N=)、(‐C=CH-NH-)、(‐OCF2O-)、(‐NH-CH=N-)、(‐CH2CH2O-)、及び(‐(CH2)4‐) からなるグループから選ばれた連結のフェニル結合末端を形成する場合があり；
(ｂ)1-3窒素原子及び3-5核炭素原子を持つ非置換6員環ヘテロサイクル又は置換６員環ヘテロサイクルで、置換体は１から3までの同じ又は異なるハロ；ニトロ；ヒドロキシ；(C1-C6)アルキル；(C1-C6)アルコキシ；(C1-C6)チオアルコキシ；カルボキシ；(C1-C6)アルコキシカルボニル；(C1-C6)カルボキシアルキル；各アルキル・グループに独立に定まった数の炭素原子を持つ(C1-C6)アルコキシカルボニルアルキル；‐CONRaRb；アミノ；(C1-C6)アルキルアミノ；各アルキル・グループに独立に定まった数の炭素原子を持つ(C1-C6)ジアルキルアミノ；‐CF3を含むハロアルキル；‐C=N-NHC(O)NRaRb)；又は‐C=N-NHC(O)C(O)NRaRb)；あるいは
(ｃ) ５−ベンズイミダゾリル；１−トリチル‐５−ベンズイミダゾリル；３−トリチル‐５−ベンズイミダゾリル；１H-インダゾール‐３‐イル；１‐トリチル‐１H‐インダゾール‐３‐イル；又は１‐(C1-C6)アルキル‐１H‐インドール‐2‐イル；
【００３０】
[0030]Eは非置換又は置換(C4-C10)側鎖アルキルであり、置換体は独立に1−4シアノ；ハロ；(C5-C6)シクロアルキル；フェニル；(C2-C3)アルケニル；ヒドロキシ；(C1-C6)アルコキシ；カルボキシ；(C1-C6)アルコキシカルボニル；(C1-C6)アルカノイルオキシ(‐OCORa)；フォルミル；各アルキル・グループに独立に定まった数の炭素原子を持つ(C1-C6)トリアルキルシリルオキシ；‐C=N-ORa；‐C=N-Rd；‐C=N-NHC(O)NRaRb；又は‐C=N-NHC(O) C(O)N RaRb；
【００３１】
[0031]ここで、Ra、Rb、及びRｃは独立にH、(C1-C6)アルキル、又はフェニルであり；Rdはヒドロキシ(C1-C6)アルキル；及びｎ＝1-4；そして
【００３２】
[0032]GはH又はCN；
【００３３】
[0033]もし、
１）Eが非置換又は置換(C4-C10)側鎖アルキルで、置換体が独立に1-4シアノ；ハロ；(C2-C3)アルケニル；カルボキシ；又は(C1-C6)アルコキシカルボニルの場合、
Bは、
(a)  少なくとも１つの‐C=N-NHC(O)NRaRb又は‐C=N-NHC(O)C(O)N RaRbグループを持つ置換フェニル；
(b)  少なくとも１つのハロアルキル・グループを持ち、1-3窒素原子及び3-5核炭素原子を有する置換６員環へテロサイクル；
又は
(c)  ５−ベンズイミダゾリル；１−トリチル‐５−ベンズイミダゾリル；３−トリチル‐５−ベンズイミダゾリル；１H-インダゾール‐３‐イル；１‐トリチル‐１H‐インダゾール‐３‐イル；又は１‐(C1-C6)アルキル‐１H‐インドール‐2‐イル；
ここで、Ra、Rbは独立にH、(C1-C6)アルキル、又はフェニルであり；あるいは
２）Eがフェニル、ヒドロキシ、(C1-C6)アルコキシ、又はフォルミルのうち少なくとも１つを有する置換(C4-C10)側鎖アルキルの場合、
Bは、
(a)   少なくとも１つの‐C=N-NHC(O)NRaRb又は‐C=N-NHC(O)C(O)N RaRbグループを持つ置換フェニル；
(b)  1-3窒素原子及び3-5核炭素原子を有する置換又は非置換の６員環へテロサイクル；又は
(ｃ)  ５−ベンズイミダゾリル；１−トリチル‐５−ベンズイミダゾリル；３−トリチル‐５−ベンズイミダゾリル；１H-インダゾール‐３‐イル；１‐トリチル‐１H‐インダゾール‐３‐イル；又は１‐(C1-C6)アルキル‐１H‐インドール‐2‐イル；
【００３４】
[0034]ここで、Ra、Rbは独立にH、(C1-C6)アルキル、又はフェニルである。
【００３５】
[0035]一般式の化合物は、X及びX’がOでGがHである事が望ましい。
【００３６】
[0036]本発明の化合物は、以下の場合が最も望ましい：
【化２】
2014111634.tif 000003
【表１】
2014111634.tif 000004
【表２】
2014111634.tif 000005
【表３】
2014111634.tif 000006
【表４】
2014111634.tif 000007
【表５】
2014111634.tif 000008
【表６】
2014111634.tif 000009
【表７】
2014111634.tif 000010
【表８】
2014111634.tif 000011
【００３７】
[0037]本発明の一般式の化合物はいくつかのステレオジェニック炭素原子を含んでいる場合があるので、たとえ立体中心が明示されたとしても、鏡像異性体、ジアステレオマー、立体異性体、あるいはその混合物として存在する。
【００３８】
[0038]本発明は式(IV)の化合物の調製方法にも関係しており、それには以下のステップが含まれる。
(i)  NaH、KH、あるいはアミドMNRaRbから選ばれる塩基と式(I)の化合物を反応させて生成物IIを得るステップで、ここでMはリチウム、ナトリウム、又はカリウムで、Ra及びRbは独立に(C1-C6)アルキル又はフェニルであり、
【化３】
2014111634.tif 000012
(ii)  ステップ(i)の生成物(II)と式（III）の化合物との反応で、Rは３から５までの同じ又は異なるクロロ、フルオロ、又はトリフルオロメチルで置換したフェニルであり；
【化４】
2014111634.tif 000013
ここで、
A及びBは独立に、
(a)  非置換又は置換フェニルで、置換体は独立して１から５までのH; ハロ；ニトロ；シアノ；アミノ(‐NRaRb)；アルキルアミノアルキル(‐(CH2)ｎNRaRb)；(C1-C6)アルキル；(C1-C6)ハロアルキル；(C1-C6)シアノアルキル；(C1-C6)アルコキシ；フェノキシ；(C1-C6)ハロアルコキシ；(C1-C6)アルコキシ(C1-C6)アルキル；(C1-C6)アルケニルオキシ(C1-C6)アルキル；(C1-C6)アルコキシ(C1-C6)アルコキシ；ハロ、シアノ、(C1-C4)アルキル、又は(C1-C4)アルコキシで選択的に置換した(C2-C6)アルケニル；ハロ又は(C1-C4)アルキルで選択的に置換した(C2-C6)アルキニル；フォルミル；(C1-C6)ハロアルキルカルボニル；ベンゾイル；(C1-C6)アルコキシカルボニル；(C1-C6)ハロアルコキシカルボニル；(C1-C6)アルカノイルオキシ(‐OCORa)；カルボキシアミド(‐CONRaRb)；アミド(‐N RaCORb)；アルコキシカルボニルアミノ(‐N(CH2)ｎCO2Rb)；アルキルアミノカルボニルアミノ(‐N(CH2)ｎCONRbRc)；(C1-C6)アルキルチオ；フルファミド(‐SO2NRaRb)；又は非置換又は置換フェニルで、置換体は独立して１から3までのハロ、ニトロ、(C1-C6)アルコキシ、(C1-C6)アルキル、又は(‐NRaRb)；あるいはフェニル環の隣接する2つの位置の１つ又は両方が置換される場合、付着している原子は、(‐OCH2O‐)、(‐OCH(CH3)O-)、(‐CH2CH2O-)、(‐OCH(CH3)CH2O -)、(‐S- CH=N -)、(‐CH2OCH2O‐)、(‐O(CH2)3‐)、(＝N-O-N=)、(‐C=CH-NH-)、(‐OCF2O-)、(‐NH-CH=N-)、(‐CH2CH2O-)、及(‐(CH2)4‐)からなるグループから選ばれた連結のフェニル結合末端を形成する場合があり；あるいは
(ｂ)  1-3窒素原子を持つ非置換5又は6員環ヘテロサイクル又は置換5又は６員環ヘテロサイクルで、置換体は１から4までの同じ又は異なるハロ；ニトロ；(C1-C6)アルキル；(C1-C6)アルケニル；(C1-C6)アルコキシ；(C1-C6)チオアルコキシ；(C1-C6)アルコ
キシカルボニル；(C1-C6)カルボキシアルキル；‐CONRaRb；アミノ(‐NRaRb)；‐CF3を含むハロアルキル；トリアルキルシリル(-SiRaRb Rｃ)；トリチル(C(Ph)3)；あるいは非置換又は置換のフェニルで、置換体は独立に１から3までのハロ、ニトロ、(C1-C6)アルコキシ、(C1-C6)アルキル、又は(‐NRaRb)；あるいは２つの隣接する位置が置換される場合、これらの位置はベンゾ環融合を形成する場合があり、そして
Eはフェニル、あるいは非置換又は置換(C1-C10)直鎖又は側鎖のアルキルで、置換体は独立に1-4シアノ；ハロ；(C5-C6)シクロアルキル；フェニル；(C2-C3)アルケニル；(C1-C6)アルコキシ；(C1-C6)アルコキシカルボニル；(C1-C6)アルカノイルオキシ(-OCORa)；フォルミル；各アルキル・グループに独立に所定の炭素数を持っている(C1-C6)トリアルキルシリルオキシ；又は‐C=N-ORaで、
ここで、Ra、Rｂ、及びRｃは独立に(C1-C4)アルキル又はフェニルで、ｎ＝1-4である。
【００３９】
定義
【００４０】
[0039]Ｒｘグループが明記されており、ｘが文字a- g を表しており、同じＲｘグループが (C1-C3)のようなアルキル・グループの鎖の長さで明記されている場合は、明記されている鎖の長さはＲｘがアルキルの場合だけを言及しているのであり、ＲｘがＨやアリールのようなアルキルではないグループの場合とは関係がない。
【００４１】
[0040]「アルキル」と言う用語は、側鎖及び直鎖両方ののアルキル・グループを含む。典型的なアルキル・グループは、例えば、メチル、エチル、ｎ‐プロピル、イソプロピル、ｎ‐ブチル、第二級ブチル、イソブチル、第三級ブチル、ｎ‐ペンチル、イソペンチル、ｎ‐へキシル、ｎ‐へプチル、イソオクチル、ノニル、デシルなどである。
【００４２】
[0041]「ハロ」と言う用語は、フルオロ、クロロ、ブロモ、あるいはヨードである。
【００４３】
[0042]「ハロアルキル」と言う用語は、1つ又はそれ以上のハロ・グループで置換されたアルキル・グループを言い、例えば、クロロメチル、2‐ブロモエチル、3‐ヨードプロピル、トリフルオロメチル、パーフルオロプロピルなどである。
【００４４】
[0043]「シクロアルキル」と言う用語は、アルキル、ヒドロキシ、ハロなどで選択的に置換された環式脂肪族構造を言い、例えば、シクロプロピル、メチルシクロプロピル、シクロブチル、２‐ヒドロキシシクロペンチル、シクロへキシル、４‐クロロシクロヘキシルなどである。
【００４５】
[0044]「ヒドロキシアルキル」と言う用語は、1つ又はそれ以上のヒドロキシ・グループにより置換されたアルキル・グループを言い、例えば、ヒドロキシメチル、2,3‐ジヒドロキシブチルなどである。
【００４６】
[0045]「アルキルスルホニル」と言う用語は、アルキル・グループで置換されたスルホニル部分を言い、例えば、メシル、ｎ‐プロピルスルホニルなどである。
【００４７】
[0046]「アルケニル」と言う用語は、１つ又は２つのエチレン結合を持つ直鎖又は側鎖のエチレン的に不飽和の炭化水素グループを言い、例えば、ビニル、アリル、１‐ブテニル、２‐ブテニル、イソプロペニル、２‐ペンテニルなどである。
【００４８】
[0047]「ハロアルケニル」と言う用語は、1つ又はそれ以上のハロ・グループで置換されたアルケニル・グループを言う。
【００４９】
[0048]「アルキニル」と言う用語は、１つ又は２つのアセチレン結合を持つ直鎖又は側鎖の不飽和炭化水素グループで、例えば、エチニル、プロパルギルなどである。
【００５０】
[0049]「アルキルカルボニル」と言う用語は、アルキルケト機能を言い、例えば、アセチル、ｎ‐ブチリルなどである。
【００５１】
[0050]「ヘテロサイクリル」又は「ヘテロサイクル」と言う用語は、1つ、２つ、あるいは３つのヘテロ原子を含む置換された又は置換されていない、飽和、部分的不飽和、あるいは不飽和の５乃至６員環を言い、１つ又は２つのヘテロ原子が酸素、窒素、硫黄を含むグループから独立に選択されているのが望ましい。ヘテロサイクリルには、例えば、ピリジル、チエニル、フリル、ピリミジニル、ピラジニル、キノリニル、ピロリル、インドリル、テトラヒドロフリル、ピロリジニル、ピペリジニル、テトラヒドロピラニル、モルフォリニル、ピペラジニル、ジオキソラニル、ジオキサニルなどがある。
【００５２】
[0051]「アルコキシ」と言う用語は、末端の酸素原子に結合した側鎖及び直鎖のアルキル・グループを言う。典型的なアルコキシ・グループには、例えば、メトキシ、エトキシ、ｎ‐プロポキシ、イソプロポキシ、第三級ブトキシなどがある。
【００５３】
[0052]「ハロアルコキシ」と言う用語は、1つ又はそれ以上のハロ・グループで置換されたアルコキシ・グループを言い、例えば、クロロメトキシ、トリフルオロメトキシ、ジフルオロメトキシ、パーフルオロイソブトキシなどがある。
【００５４】
[0053]「アルキルチオ」と言う用語は、末端の硫黄原子に結合する側鎖及び直鎖のアルキル・グループを言い、例えば、メチルチオなどがある。
【００５５】
[0051]「ハロアルキルチオ」と言う用語は、1つ又はそれ以上のハロ・グループで置換されたアルキルチオ・グループを言い、例えば、トリフルオロメチルチオなどがある。
【００５６】
[0052]「アルコキシアルキル」と言う用語は、アルコキシ・グループで置換されたアルキル・グループを言い、例えば、イソプロポキシメチルなどがある。
【００５７】
[0053]「シリカゲル・クロマトグラフィー」と言う用語は、精製方法を意味し、ガラス、プラスチック、又は金属製のシリンダーにシリカゲル又は化学的に修飾されたシリカゲルを詰めた縦的カラムの上部に、関心のある化学物質を濃縮サンプルとして適用する事、及びそういうカラムから溶媒又は混合溶媒と共に出てくる溶出を言う。
【００５８】
[0054]「フラッシュ・クロマトグラフィー」と言う用語は、通常10乃至50psiの範囲で空気、アルゴン、又は窒素圧の下に行なわれるシリカゲル・クロマトグラフィーを言う。
【００５９】
[0055]「グラジエント・クロマトグラフィー」と言う用語は、混合溶媒の構成を連続的に変化させる事により化学物質をカラムから溶出させるシリカゲル・クロマトグラフィーを言う。
【００６０】
[0056]「Rf」と言う用語は、薄層クロマトグラフィーに使用される用語で、関心のある化学物質が溶出溶媒の動きの距離と比較して薄層クロマトグラフィーのプレート上を移動する分距離を言う。
【００６１】
[0057]「パール・水素添加装置(Parrhydrogenator) 又はパール・シェーカー (Parr shaker)」と言う用語は、イリノイ州モリン(Moline, IL) にあるパール・インスツルメント・カンパニー(ParrInstrument Company) から入手可能な装置を言い、関心のある化学物質を含む溶液を反応ガスの加圧雰囲気の下に、懸濁した固体触媒と激しく混合する操作を簡便化するために設計されたものである。ガスは通常水素を使い、触媒は細かい木炭粒子の上に置かれたパラジウム、プラチナ、あるいはその酸化物である。
【００６２】
[0058]「デス‐マーチン(Dess-Mrtin) 試薬」と言う用語は、アクロス・オーガニックス／フィッシャー・サイエンティフィック・カンパニー (AcrosOrganics/Fisher Scientific Company) L.L.C.から入手可能な (1,1,1‐トリアセトキシ)−1,1−ジヒドロ−1,2−ベンジオドキソール‐３(１Ｈ)‐オンのジクロロメタン溶液を言う。
【００６３】
[0059]「PS-NMM」と言う用語は、カリフォルニア州サンカーロス(San Carlos, CA) のアーゴノート・テクノロジーズ (Argonaut Technologies)から入手可能なSO2NH(CH2)3-モルフォリンの機能を向上させたポリスチレン樹脂である。
【００６４】
[0060]「AP-NCO」と言う用語は、カリフォルニア州サンカーロス(San Carlos, CA) のアーゴノート・テクノロジーズ (ArgonautTechnologies) から入手可能な機能を向上させたイソシアンテ樹脂を言う。
【００６５】
[0061]「APトリサミン」と言う用語は、カリフォルニア州サンカーロス(San Carlos, CA) のアーゴノート・テクノロジーズ (ArgonautTechnologies) から入手可能なポリスチレンCH2NHCH2CH2NH(CH2CH2NH2)2樹脂を言う。
【００６６】
[0062]本発明の目的で使われる「分離された」と言う用語は、最初の環境(天然に存在する環境) から除かれた生物学的物質 (核酸又は蛋白質)を意味する。例えば、植物や動物の中に天然の状態で存在するポリヌクレオチドは分離されていないが、天然に存在する隣接した核酸から分離されたポリヌクレオチドは「分離された」と見なされる。「精製された」と言う用語は、他の化合物の存在が全くない完全に純粋な状態の存在を言うのではない。むしろ相対的な意味で使われる。
【００６７】
[0063]ポリヌクレオチドは最初の物質又は天然の物質を精製した後は、少なくとも1桁、望ましくは２乃至3桁、更に望ましくは４乃至5桁の割合で「精製された」状態にある。
【００６８】
[0064]「核酸」は、ヌクレオチドと呼ばれる共有結合のサブユニットで構成される重合化合物である。核酸にはポリリボ核酸(RNA) とポリデオキシリボ核酸 (DNA) が含まれる。両方とも一本鎖か二本鎖である。DNAには、これだけに限定されるものではないが、cDNA、 ゲノムDNA、プラスミドDNA、合成DNA、半合成DNAなどがある。DNAは直線の場合も、環状の場合も、高次コイルの場合もある。
【００６９】
[0065]「核酸分子」は、リボヌクレオシド(アデノシン、グアノシン、ウリジン、あるいシチジン；RNA分子)、又はデオキシリボヌクレオシド(デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン、あるいデオキシシチジン；DNA分子)のリン酸エステル重合体、あるいはホスホロチオアートやチオエステルのようなそのリン酸エステル類似体を言い、一本鎖の場合と二本鎖のヘリックスの場合がある。二本鎖のDNA-DNA、DNA-RNA、そしてRNA-RNAヘリックスも可能である。核酸分子と言う用語、特にDNA又はRNAは、分子の一次構造と二次構造のみを言うのであり、特定の三次構造に限定されるものではない。従ってこの用語には、特に、直線又は環状のDNA分子(例えば制限断片)、プラスミド、そして染色体の中に含まれる二本鎖のDNAも含まれる。特定の二本鎖DNA分子の構造を語る場合は、本出願に於いては、転写されていないDNA鎖(すなわちmRNAと相同の配列を持つ鎖) に沿って５’から３’の方向のみに配列を記述する通常の方法に従って、配列が記述される。「組み換えDNA分子」は、分子生物学的操作を受けたDNA分子である。
【００７０】
[0066]「断片」と言う用語は、標準核酸と比べて縮小した長さのヌクレオチド配列であり、共通部分に関しては標準核酸と同一のヌクレオチド配列を含んでいる。本発明によるそういう核酸の断片は、より大きいポリヌクレオチドの一部として適切な場所に含まれているかもしれない。そういう断片は様々な長さのオリゴヌクレオチドを含んでおり、本発明による核酸の連続ヌクレオチドとしては少なくとも６、８、９、10、12、15、18、20、21、22、23、24、25、30、39、40、42、45、48、50、51、54、57、60、63、66、70、75、78、80、90、100、105、120、135、150、200、300、500、720、900、1000、あるいは1500がある。
【００７１】
[0067]本出願で使用される「分離された核酸断片」と言う用語は、一本鎖又は二本鎖のRNA又はDNAの事を言い、選択的に合成、非天然、あるいは変更されたヌクレオチド塩基も含む。DNA重合体の形で分離された核酸断片は、ｃDNA、ゲノムDNA、あるいは合成DNAの1つ又はそれ以上の断片で構成される場合もある。
【００７２】
[0068]「遺伝子」とはポリペプチドをコード化しているヌクレオチドの集りの事であり、ｃDNA及びゲノムDNA核酸も含まれる。「遺伝子」とは特定の蛋白質又はポリペプチドを発現する核酸の断片の事でもあり、これにはコード化配列の前部(５’非コード化配列)と後部 (３’ 非コード化配列) の調節配列も含まれる。「天然の遺伝子」とは、自らの調節配列を有する天然に見出される遺伝子の事である。「キメラ遺伝子」とは、天然の遺伝子ではない遺伝子の事であり、天然には見出されない調節および／またはコード化配列を含んでいる。従って、キメラ遺伝子は異なる源から来ている調節配列及びコード化配列を含んでいる場合もあるし、同じ源から来ているが天然に見出されるのとは異なる方法で並べられた調節配列及びコード化配列を含んでいる場合もある。キメラ遺伝子は異なる源から来ているコード化配列、および／または異なる源から来ている調節配列を含む場合もある。「内因性遺伝子」とは、有機体のゲノムに生来存在する天然の遺伝子の事である。「外来性の」遺伝子又は「非相同」遺伝子とは宿主の有機体には通常見出されないが、遺伝子移入により宿主の有機体に導入された遺伝子の事である。外来性遺伝子には、非天然の有機体又はキメラ遺伝子に挿入された天然の遺伝子を含む場合もある。「導入遺伝子」とは、形質転換の方法によりゲノムに導入された遺伝子の事である。
【００７３】
[0069]「非相同」DNAとは、細胞又は細胞の染色体サイトに天然には存在しないDNAを意味する。非相同DNAには、細胞にとって外来性の遺伝子を含めるのが望ましい。
【００７４】
[0070]「ゲノム」と言う用語は、染色体、並びにミトコンドリア、葉緑体、そしてウィルスのDNA又はRNAも含む。
【００７５】
[0071]核酸分子は、適切な温度条件と溶液のイオン強度の下に、核酸分子の一本鎖と別の核酸分子とをアニールするならば、ｃDNA、ゲノムDNA、RNAのような別の核酸分子と「ハイブリッドする事が可能」である(サムブルック (Sambrook) 等、1989、後出を参照の事)。ハイブリダイゼーションと洗浄条件は良く知られており、例証も行なわれている。サムブルック(Sambrook)、J.、フリッチュ(Fritsch)、E.F.、マニアティス(Maniatis)分子クローニング：実験室マニュアル(Molecular Clonind)、第2版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス (Cold SpringHarborLaboratory Press)、コールド・スプリング・ハーバー (Cold SpringHarbor) (1989)、特に第11章及び表11.1 (参照として本出願にその全体を取り入れる)。温度とイオン強度の条件が、ハイブリダイゼーションの「厳密さ」を決定する。
【００７６】
[0072]関連性の少ない有機体の相同配列のように中程度にしか類似性のない断片のスクリーニングから、密接に関連した有機体の機能酵素を複製する遺伝子のように極めて類似の断片のスクリーニングまで、厳密さの条件を調節する事が可能である。相同核酸の予備スクリーニングには、Tm55°に対応する厳密さの低いハイブリダイゼーション条件が使用される。例えば5 xSSC、0.1％ SDS、0.25％ミルク、ホルムアミドなし、又は30％ホルムアミド、5x SSC、0.5％ SDS。中程度の厳密さのハイブリダイゼーション条件は、より高いTmに対応する。例えば、40％ホルムアミドと５ｘ又は６ｘSCC。高度の厳密さのハイブリダイゼーション条件は、最高のTmに対応する。例えば、50％ホルムアミド、５ｘ又は６ｘSCC。
【００７７】
[0073]ハイブリダイゼーションの厳密さ次第では塩基間にミスマッチが起きる可能性はあるけれども、２つの核酸に相補的な配列が含まれている事をハイブリダイゼーションは要求している。「相補的」と言う用語は、互いにハイブリダイゼーションが可能なヌクレオチド塩基間の関係を述べる時に使用される。例えば、DNAに関して言えば、アデノシンはチミンに相補的であり、シトシンはグアニンに相補的である。従って、本発明は、本出願で開示あるいは使用された完全な配列並びに実質的に類似の核酸配列に相補的な分離核酸断片も含んでいる。
【００７８】
[0074]本発明の特定の実施例に於いては、Tm55°のハイブリダイゼーション・ステップを含むハイブリダイゼーション条件と上述の条件を利用する事により、ポリヌクレオチドが検出される。望ましい実施例ではTmは60℃、更に望ましい実施例ではTmは63℃、更に望ましい実施例ではTmは65℃である。
【００７９】
[0075]ハイブリダイゼーション後の洗浄も厳密さの条件を決定する。望ましい条件のセットでは一連の洗浄が行なわれ、まず６XSSC、0.5％SDS、室温で15分を条件に開始され、次に２X SSC、0.5％SDS、45℃で30分繰り返し、更に0.2X SSC、0.5％SDS、50℃で30分を2度繰り返す。更に望ましい厳密な条件のセットでは、より高い温度が使用される。洗浄は上述と同じであるが、最後の0.2XSSC、0.5％SDS、50℃で30分を2度の際の温度が60℃に上げられる。別の望ましい厳密な条件のセットでは、最後の2回の洗浄を、0.１X SSC、0.１％SDS、65℃で行なう。ハイブリダイゼーションの厳密さ次第では塩基間にミスマッチが起きる可能性はあるけれども、２つの核酸に相補的な配列が含まれている事をハイブリダイゼーションは要求している。
【００８０】
[0076]核酸のハイブリダイゼーションにとって適切な厳密さは核酸の長さと相補性の程度次第であり、業界ではよく知られている変数である。２つのヌクレオチド配列間の類似性又は相同性の程度が大きければ大きいほど、そういう配列を持つ核酸のハイブリッドに関しては、Tmの値は大きい。核酸ハイブリダイゼーションの相対的安定性(高いTmに対応) は、次の順番で減少する：RNA:RNA、DNA: RNA、そしてDNA:DNA。ヌクレオチドの長さが100を超えるハイブリッドに関して、Tm計算のための公式が導かれた(サムブルック (Sambrook) 等、前出、9.50−0.51を参照の事)。より短い核酸つまりオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションに関しては、ミスマッチの位置は更に重要であり、オリゴヌクレオチドの長さが特異性を決定する(サムブルック (Sambrook) 等、前出、11.7−11.8を参照の事)。
【００８１】
[0077]本発明の特定の実施例に於いては、500ｍＭ未満の塩、少なくとも37℃、洗浄ステップでは2XSSPEと63℃のハイブリダイゼーション・ステップを含むハイブリダイゼーション条件を利用する事により、ポリヌクレオチドが検出される。望ましい実施例では、ハイブリダイゼーションの条件は200ｍＭ未満の塩と少なくとも37℃のハイブリダイゼーション・ステップを含む。更に望ましい実施例では、ハイブリダイゼーションの条件は、ハイブリダイゼーションと洗浄ステップの両方で2XSSPEと63℃を含んでいる。
【００８２】
[0078]ある実施例では、ハイブリッドが可能な核酸の長さは少なくとも10ヌクレオチド程度である。ハイブリッドが可能な核酸の最低の長さは少なくとも15ヌクレオチド程度であるのが望ましい。更に望ましいのは、少なくとも20ヌクレオチド程度である。最も望ましいのは少なくとも30ヌクレオチドである。更に、優れた熟練工は、温度と洗浄溶液の塩分濃度がプローブの長さなどの要因に従って必要に応じて調節可能である事を認識している。
【００８３】
[0079]「プローブ」と言うのは、相補的な一本鎖の標的核酸と塩基対を組んで二本鎖の分子を形成する事のできる一本鎖の核酸分子の事である。
【００８４】
[0080]「オリゴヌクレオチド」と言うのは、本出願で用いられている場合、ゲノムDNA分子、ｃDNA分子、プラスミドDNA、あるいはmRNA分子とハイブリッドを形成できる一般に少なくとも18のヌクレオチドからなる核酸の事である。オリゴヌクレオチドは、例えば32Ｐヌクレオチド、あるいはビオチンなどの標識と共有結合するヌクレオチドで標識化が可能である。標識されたオリゴヌクレオチドは、核酸の存在を検出するプローブとして使用できる。オリゴヌクレオチド(その一つ又は両方とも標識可能)は、核酸の全体又は断片をクローン化するため、あるいは核酸の存在を検出するため、PCRプライマーとして利用する事も可能である。オリゴヌクレオチドは、DNA分子と三重ヘリックスを形成するのにも利用できる。一般に、オリゴヌクレオチドは合成されるが、核酸シンセサイザで合成するのが望ましい。従って、オリゴヌクレオチドは、チオエステル結合のように天然では生じないホスホエステル類似体結合で生成可能である。
【００８５】
[0081]「プライマー」は、標的核酸配列とハイブリッドを形成し、適切な条件下で、DNA合成の出発点となる二本鎖の核酸部位を形成するオリゴヌクレオチドである。こういうプライマーはポリメラーゼ連鎖反応で使用可能である。
【００８６】
[0082]「ポリメラーゼ連鎖反応」は略してPCRと呼ばれ、特定の核酸配列を酵素的に増殖させるインビトロ方法である。PCRは温度サイクルの一連の繰り返しであり、各サイクルは次の3段階を含んでいる：テンプレートの核酸を変性させ標的分子の鎖を分離；  一本鎖のPCRオリゴヌクレオチド・プライマーをテンプレートの核酸にアニール；アニールされたプライマーをDNAポリメラーゼで増殖。PCRは標的分子の存在を検出する手段を提供するし、定量又は半定量条件下では、核酸のスターティング・プール内で標的分子の相対量を決定する手段も提供する。
【００８７】
[0083]逆転写ポリメラーゼ連鎖反応は略してRT-PCRと呼ばれ、RNA分子から標的のｃDNA分子を酵素的に生産し、その後、その標的ｃDNA分子内で特定の核酸配列を酵素的に増殖させるインビトロの方法である。RT-PCRは標的分子の存在を検出する手段を提供するし、定量又は半定量条件下では、核酸のスターティング・プール内で標的分子の相対量を決定する手段も提供する。
【００８８】
[0084]DNA「コード化配列」は、適切な調節配列のコントロール下に置かれた時、細胞のインビトロ又はインビボでポリペプチドに転写及び翻訳される2本鎖のDNA配列の事である。「適切な調節配列」と言うのは、コード化配列の上流(５’非コード化配列)、内部、又は下流(３’非コード化配列)に位置し、転写、RNA処理又は安定性、関連コード化配列の翻訳などに影響を及ぼすヌクレオチド配列の事である。調節配列には、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニレーション認識配列、RNA処理サイト、エフェクター結合サイト、ステムループ構造などが含まれる。コード化配列の境界は、５’(アミノ)末端の開始コドン及び３’(カルボキシル)末端の翻訳停止コドンによって決定される。コード化配列には、これだけに限定されるものではないが、原核生物の配列、mRNAからのcDNA、ゲノムDNA配列、更に合成DNA配列なども含まれる。コード化配列が真核生物の細胞での発現である場合、ポリアデニレーション・シグナル及び翻訳終了配列は、通常コード化配列の３’に存在する。
【００８９】
[0085]「オープンリーディングフレーム」はORFと略され、DNA、ｃDNA、又はRNAの核酸配列の長さを意味し、ATGやAUGのような翻訳開始シグナル又は開始コドンと終始コドンを含んでおり、ポリペプチド配列に翻訳される可能性もある。
【００９０】
[0086]「ヘッド・トゥ・ヘッド」と言う用語は、本出願では、2つのポリヌクレオチドの互いの方向関係を記述する目的で使用される。１つのポリヌクレオチドのコード化鎖の５’末端がもう１つのポリヌクレオチドのコード化鎖の５’末端の隣にあり、１つのポリヌクレオチドの転写の方向がもう1方のポリヌクレオチドの５’末端から遠ざかる方向に進む場合、２つのポリヌクレオチドはヘッド・トゥ・ヘッドの関係にあると言う。「ヘッド・トゥ・ヘッド」と言う用語は(５’)-トゥ-(５’)と略され、記号(→←)や(３’←５’５’→３’)によっても表される。
【００９１】
[0087]「テール・トゥ・テール」と言う用語は、本出願では、2つのポリヌクレオチドの互いの方向関係を記述する目的で使用される。１つのポリヌクレオチドのコード化鎖の３’末端がもう１つのポリヌクレオチドのコード化鎖の３’末端の隣にあり、１つのポリヌクレオチドの転写の方向がもう1方のポリヌクレオチドから互いに近づく方向に進む場合、２つのポリヌクレオチドはテール・トゥ・テールの関係にあると言う。「テール・トゥ・テール」と言う用語は(３’)-トゥ-(３’)と略され、記号(→←)や(５’→３’３’←５’)によっても表される。
【００９２】
[0088]「ヘッド・トゥ・テール」と言う用語は、本出願では、2つのポリヌクレオチドの互いの方向関係を記述する目的で使用される。１つのポリヌクレオチドのコード化鎖の５’末端がもう１つのポリヌクレオチドのコード化鎖の３’末端の隣にあり、１つのポリヌクレオチドの転写の方向がもう1方のポリヌクレオチドと同じ方向である場合、２つのポリヌクレオチドはヘッド・トゥ・テールの関係にあると言う。「ヘッド・トゥ・テール」と言う用語は(５’)-トゥ-(３’)と略され、記号(→→)や(５’→３’５’→３)によっても表される。
【００９３】
[0089]「下流」と言う用語は、標準ヌクレオチド配列の３’に位置しているヌクレオチド配列を意味している。特に、下流ヌクレオチド配列は、通常、転写の開始点の後に来る配列に関係している。例えば、遺伝子の翻訳開始コドンは、転写開始サイトの下流に位置している。
【００９４】
[0090]「上流」と言う用語は、標準ヌクレオチド配列の５’に位置しているヌクレオチド配列を意味している。特に、上流ヌクレオチド配列は、通常、コード化配列又は転写の開始点の５’側に位置している。例えば、ほとんどのプロモーターが転写の開始サイトの上流に位置している。
【００９５】
[0091]「制限エンドヌクレアーゼ」及び「制限酵素」と言う用語は、二本鎖のDNA内で特定のヌクレオチド配列を結合したり切断したりする酵素を意味する。
【００９６】
[0092]「相同組み換え」は外来性のDNA配列を別のDNA分子に挿入する事を意味する。例えば、染色体へのベクターの挿入である。相同組み換えのために、ベクターが特定の染色体サイトを標的にするのが望ましい。特定の相同組み換えを行なうには、ベクターは染色体の配列に対して十分長い相同体の部位を持っているべきで、そうして初めて、染色体へのベクターの相補的結合と取り込みが可能となる。相同体の部位が長ければ長いほど、そして配列の類似性が高ければ高いほど、相同組み換えの効率は高くなる。
【００９７】
[0093]業界で知られているいくつかの方法が、本発明に基づくポリヌクレオチドの増殖に使用できる。適切な宿主システムと成長条件さえ確立されれば、組み換え発現ベクターを繁殖させ大量に準備する事ができる。本出願に述べられているように、使用可能な発現ベクターには、これだけに限定されるものではないが、次のベクター又はその誘導体が含まれる：ワクシニアウィルスやアデノウィルスのようなヒトや動物のウィルス、バキュロウィルスのような昆虫のウィルス、酵母ベクター、バクテリオファージ・ベクター(例えばλファージ)、プラスミド及びコスミドDNAベクター、その他諸々。
【００９８】
[0094]「ベクター」は、核酸をクローン化する、および／または宿主細胞に移入する手段の事である。ベクターは別のDNA断片が結合し、結合した断片の複製を可能にするレプリコンでもあり得る。「レプリコン」は、インビボでDNAの複製を自動的に行なう、つまり自らのコントロールで複製可能な遺伝子要素である(例えば、プラスミド、ファージ、コスミド、染色体、ウィルス等)。「ベクター」と言う用語には、インビトロ、エクスビボ、又はインビボで細胞に核酸を導入するウィルス的及び非ウィルス的手段の両方が含まれる。業界で知られている数多くのベクターが、核酸を操作し、応答要素及びプロモーターを遺伝子等に取り入れるのに利用できる。可能性のあるベクターとしては、例えば、プラスミドやウィルスで、その中にはλ誘導体のようなバクテリオファージ、pBR322やpUCプラスミド誘導体ようなプラスミド、あるいはブルースクリプト・ベクターなども含まれる。例えば、応答要素やプロモーターに対応するDNA断片の挿入は、相補的粘着端末を有する選ばれたベクターに適切なDNA断片を結合させる事によっても達成できる。あるいは、DNA分子の末端を酵素的に修正する事も可能であるし、あるいはDNA末端にヌクレオチド配列(リンカー)を結合させる事によりどのサイトでも作成可能である。こういうベクターは、選択可能マーカー遺伝子を含むように加工し、ゲノムにマーカーを取り入れた細胞を選択できるようにする事も可能である。そういうマーカーは、そのマーカーによってコード化された蛋白質を取り入れ発現する宿主細胞の同定および／または選択を可能にする。
【００９９】
[0095]ウィルス・ベクター、特にレトロウィルス・ベクターは、細胞及び生きた動物に遺伝子を移入する様々なアプリケーションに広く利用されている。使用可能なウィルス・ベクターには、これだけに限定されるものではないが、レトロウィルス、アデノ関連ウィルス、ポックスウィルス、バキュロウィルス、ワクシニアウィルス、単純ヘルペスウィルス、エプスタイン‐バーウィルス、アデノウィルス、ジミニウィルス、カリモウィルスなどのベクターである。非ウィルス・ベクターには、プラスミド、リポソーム、電気的にチャージされた脂質(シトフェクチン)、DNA蛋白質複合体、バイオポリマーなどが含まれる。ベクターには、核酸以外にも、1つ又はそれ以上の調節部位、および／または核酸移入の結果を選択、測定、モニターする(移入された組織、発現の持続期間など)場合に役立つ選択可能なマーカーも含まれる。
【０１００】
[0096]「プラスミド」と言う用語は、細胞の中心的代謝の一部ではない遺伝子を運んでいるエキストラな染色体要素を意味し、通常は環状の二本鎖DNA分子の形で存在している。そういう要素は、1本鎖又は2本鎖のDNAやRNA(直線、環状、高次コイル) の配列、ゲノム統合配列、ファージ、又はヌクレオチドなどをその源に関係なく全て自動的に複製しているのかもしれない。そこでは数多くのヌクレオチド配列が組み合わされ、組み換えられて、ユニークな構造となり、プロモーター断片及び選択された遺伝子生成物のDNA配列を適切な3’の未翻訳配列とともに細胞へ導入する事が可能となっている。
【０１０１】
[0097]「クローニング・ベクター」とは「レプリコン」の事であり、連続的に複製を行なう核酸、好ましくはDNAの単位の長さで、プラスミド、ファージ、コスミドのような複製源を含んでおり、それに別の核酸断片が結合する事により結合した断片の複製が行なわれる。クローニング・ベクターは、１つの細胞タイプで複製を行い、別の細胞タイプで発現できるかもしれない(シャトル・ベクター)。
【０１０２】
[0098]ベクターは、形質移入、エレクトロポレーション、ミクロインジェクション、形質導入、細胞融合、DEAEデキストラン、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション(リソソーム融合)、遺伝子銃の使用、DNAベクター・トランスポーターなど業界で知られている方法を使って望ましい宿主細胞に導入が可能である(例えば、ウー (Wu) 等、1992、J. Biol. Chem. 267:963-967; ウー (Wu) 及びウー (Wu)、1988、J.Biol.Chem.263：14621−14624；及びハートマット (Hartmut) 等、カナダ特許出願番号2,012,311、出願1990年3月15日を参照の事)。
【０１０３】
[0099]本発明によるポリペプチドは、リポフェクションによってインビボ導入が可能である。過去10年間、インビトロで核酸を被包し形質移入するのにリポソームが益々多く利用されている。リポソーム媒介形質移入に伴う困難と危険を克服するために考案された合成カチオン性脂質が、マーカーをコード化する遺伝子のインビボ形質移入用として、リポソームを準備するとき使用可能である(フェルグナー (Felgener) 等、1987、PNAS 84:7413; マッキー (Mackey) 等、1988、Proc.Natl. Acad.Sci. U.S.A. 85:8027-8031; 及びアルマー (Ulmer) 等、1993、サイエンス (Science) 259:1745-1748)。カチオン性脂質の使用は、負にチャージされた核酸の被包を促進し、同時に、負にチャージされた細胞膜との融合も促進する(フェルグナー (Felgener) 及びリンゴルド (Ringold)、1989、サイエンス (Science) 337：387-388)。特に有益な脂質化合物及び核酸移入の構成については、国際特許公告WO95/18863及びWO96/17823、そして米国特許番号5,459,127に記されている。外因性の遺伝子をインビボで特定の器官に導入するリポフェクションには使用上の利点がある。リポソームを特定の細胞に分子標的するのも利点の一つである。特定の細胞タイプに形質移入する場合、明らかに、膵臓、肝臓、腎臓、脳など細胞異質性の組織が特に望ましい。脂質は標的目的のため、他の分子に化学的に結合する(マッキー (Mackey) 等、1988、前出)。標的となったペプチド、例えばホルモンや神経伝達物質、抗体などの蛋白質、あるいは非ペプチド分子は、リポソームと化学的に結合可能である。
【０１０４】
[00100]他の分子もインビボで核酸の形質移入を促進するのに有効である。カチオン性オリゴペプチド(例えばWO95/21931)、DNA結合蛋白質から導かれるペプチド (例えばWO96/25508)、カチオン性ポリマー (例えばWO95/21931) などである。
【０１０５】
[00101]ベクターをインビボで裸のDNAプラスミドとして導入するのも可能である(米国特許5,693,622、5,589,466、及び5,580,859を参照の事)。受容体媒介のDNA導入方法も利用できる(キュリエル(Curiel) 等、1992、Hum. Gene Ther.3:147-154; 及びウー (Wu) 及びウー (Wu)、1987、J.Biol. Chem. 262: 4429-4432)。
【０１０６】
[00102]「形質移入」と言う用語は、細胞による外因性又は非相同性RNA又はDNAの摂取を意味する。外因性又は非相同性RNA又はDNAが細胞内に導入される事により、細胞は「形質移入」される。形質移入されたRNA又はDNAが表現型の変化を経験すると、細胞は外因性又は非相同性RNA又はDNAによって「形質転換」された事になる。形質転換されたRNA又はDNAは染色体のDNAに統合(共有結合)され細胞のゲノムを構成するようになる。
【０１０７】
[00103]「形質転換」は、核酸断片が宿主有機体に移入され、遺伝的に安定した形質になった事を意味する。形質転換された核酸断片を含む宿主有機体は、「形質導入された」、「組み換えが行なわれた」、あるいは「形質転換された」有機体と呼ばれる。
【０１０８】
[00104]「遺伝子部位」と言う用語は、ポリペプチドをコード化する遺伝子を含む核酸分子又はヌクレオチドの部位を意味する。
【０１０９】
[00105]本発明のポリペプチドを含む組み換えベクターは、増殖又は発現が求められている宿主細胞に複製の源、すなわちマーカー又は選択可能なマーカーを1つ又はそれ以上含んでいる場合がある。
【０１１０】
[00106]「選択可能なマーカー」と言う用語は、抗生物質や化学物質への抵抗遺伝子のような同定因子を意味する。マーカー遺伝子の効果、すなわち抗生物質への抵抗、除草剤への抵抗、比色マーカー、酵素、蛍光マーカーなどに基づいて選択可能である。その効果は、関心のある核酸の遺伝形質を追跡、および／または関心のある核酸を受け継いだ細胞や有機体を同定するのに使用される。業界で知られ使用されている選択可能マーカーの例は次の通りである：アンピシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ヒグロマイシン、ビアラホス除草剤、スルホンアミドなどに抵抗を与える遺伝子、表現型のマーカーとして使われる遺伝子、すなわちアンソシアニン調節遺伝子、イソペンタニル転移酵素遺伝子など。
【０１１１】
[00107]「レポーター遺伝子」とは、同定因子をコード化する核酸の事で、その因子はレポーター遺伝子の効果(その効果は関心のある核酸の遺伝形質の追跡に用いられる)に基づいて同定可能で、関心のある核酸を受け継いだ細胞や有機体を同定、および／または遺伝子発現の誘導又は転写を測定するのに使用される。業界で知られ用いられているレポーター遺伝子の例は、ルシフェラーゼ(Luc)、緑蛍光蛋白質 (GFP)、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ (CAT)、βガラクトシダーゼ(LacZ)、βグルクロニダーゼ(Gus)などである。選択可能マーカーもレポーター遺伝子と見なす事ができる。
【０１１２】
[00108]「プロモーター」とは、コード化配列又は機能RNAの発現をコントロールできるDNA配列を意味する。一般に、コード化配列はプロモーター配列の３’側に存在する。プロモーターはその全体を天然の遺伝子から導く事もできるし、天然の異なるプロモーターから導かれる異なる要素で構成することも、更には合成DNAを含む事も可能である。プロモーターは色々な組織や細胞タイプに応じて、あるいは発育の段階に応じて、あるいは様々な環境や生理学的条件に応じて直接遺伝子を発現できる事は、業界の熟練工には良く知られている。ほとんどの時間にほとんどの細胞タイプで遺伝子の発現を起こしているプロモーターは一般に「構成プロモーター」と呼ばれる。特定の細胞タイプで遺伝子の発現を起こしているプロモーターは一般に「細胞特異的プロモーター」又は「組織特異的プロモーター」と呼ばれる。特定の発育段階又は細胞分化の段階で遺伝子の発現を起こしているプロモーターは一般に「発達特異的プロモーター」又は「細胞分化特異的プロモーター」と呼ばれる。薬品、生物学的分子、化学物質、リガンド、光などプロモーターを誘導するものに晒された、あるいはそういうもので細胞を処理した後に遺伝子発現を誘導されるプロモーターは一般に「誘導性プロモーター」又は「調節可能プロモーター」と呼ばれる。ほとんどの場合、調節配列の正確な境界線は完全には明確化できないのであるから、異なる長さのDNA断片が同じプロモーター活性を持っている場合もある。
【０１１３】
[00109]「プロモーター配列」とは、細胞のRNAポリメラーゼに結合し下流(３’方向)のコード化配列の転写を開始できるDNA調節部位の事である。本発明を明確にする目的で言えば、プロモーター配列は転写開始サイトにより３’末端に束ねられ、検出可能なレベルで転写を開始するのに必要な最低数の塩基又は要素を含むように上流(５’方向)に伸びている。プロモーター配列内には、転写開始サイト(例えばヌクレアーゼS1でマッピングする事により明確にされる)、及びRNAポリメラーゼの結合に責任のある蛋白質結合ドメイン (コンセンサス配列)がある。
【０１１４】
[00110]コード化配列は、RNAポリメラーゼがそのコード化配列をｍRNAに転写するとき細胞の転写及び翻訳コントロール配列の「コントロール下」にあり、その後(コード化配列にイントロンが含まれているならば)trans-RNAのスプライシングが起き、コード化配列によりコード化された蛋白質へ翻訳される。
【０１１５】
[00111]「転写及び翻訳コントロール配列」とはプロモーター、エンハンサー、ターミネーターなどのDNA調節配列で、宿主細胞でコード化配列の発現を提供する。真核生物の細胞では、ポリアデニレーション・シグナルはコントロール配列である。
【０１１６】
[00112]「応答要素」と言う用語は、最初のキメラ遺伝子のDNA結合ドメインとの相互作用を通してプロモーターに応答を与える1つ又はそれ以上のシス作用性DNA要素を意味する。DNA要素は配列面でパリンドローム(完全又は不完全)である場合もあるし、様々な数のヌクレオチドで分離された配列モチーフ又はハーフサイトで構成される場合もある。ハーフサイトは類似あるいは同一である場合もあるし、直接の繰り返し又は逆からの繰り返しとして配列されていたり、又は単一の場合も隣のハーフサイトと連続した多量体として存在する場合もある。応答要素は、それを取り込む細胞や有機体の性質次第ではあるが、異なる有機体から分離された最小プロモーターを含む場合もある。最初のハイブリッド蛋白質のDNA結合ドメインは、リガンドの存在下あるいは不在下に、応答要素のDNA配列と結合し、この応答要素の規制の下に、下流の遺伝子の転写を開始又は抑制する。天然のエクジソン受容体の応答要素のDNA配列の例としては次を参照の事：RRGG/TTCANTGAC/ACYY (チャーバス (Cherbas) L. 等、(1991)、Genes Dev.5, 120-131 を参照の事)；AGGTCAN(n)AGGTCA, ここでＮ(n)は1つ又はそれ以上のスペーサー・ヌクレオチドであり得る(ダビノ (D’Avino) PP., 等、(1995)、Mol. Cell. Endocrinol.113, 1-9 )；及びGGGTTGAATGAATTT(アントニウスキー (Antoniewski) C. 等、(1994)、Mol. Cell Biol. 14, 4465-4474を参照の事)。
【０１１７】
[00113]「実施可能なリンク」と言う用語は、1つの機能が他の機能により影響を受けるような形で、核酸配列が単一の核酸断片と関連している事を意味する。例えば、プロモーターがあるコード化配列の発現に影響を及ぼす事ができる(すなわちそのコード化配列はそのプロモーターの転写コントロール下にある)ならば、そのプロモーターはそのコード化配列と実施可能なリンクで結ばれている。コード化配列が、センス又はアンチセンス方向で調節配列に実施可能なリンクで結ばれている場合もある。
【０１１８】
[00114]「発現」と言う用語は、本出願で使用される限り、核酸又はポリヌクレオチドから導かれるセンス(mRNA)又はアンチセンスRNAの安定した蓄積及び転写を意味する。発現はmRNAを蛋白質又はポリペプチドに翻訳する意味もある。
【０１１９】
[00115]「カセット」、「発現カセット」、及び「遺伝子発現カセット」と言う用語は、特定の制限サイトで、あるいは相同組み換えによって、核酸又はポリヌクレオチドに挿入する事のできるDNA断片を意味する。DNA断片には関心のあるポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドも含まれ、カセット及び制限サイトは、転写及び翻訳のための適切なリーディングフレームでカセットの挿入が行なわれるのを確証できるように設計される。「形質転換カセット」とは、関心のあるポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドを含み、特定の宿主細胞の形質転換を簡便化するポリヌクレオチドに加えていくつかの要素を持っている特定のベクターを意味する。本発明のカセット、発現カセット、遺伝子発現カセット、及び形質転換カセットは、宿主細胞に於いて関心あるポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドの発現を向上させる要素を含んでいる場合もある。こういう要素には、これだけに限定されるものではないが、プロモーター、最小プロモーター、エンハンサー、応答要素、ターミネーター配列、ポリアデニレーション配列などが含まれる。
【０１２０】
[00116]「遺伝子スイッチ」と言う用語は、本発明の目的に於いては、プロモーターに関連している応答要素、及び応答要素及びプロモーターを取り込んでいる遺伝子の発現を1つ又はそれ以上のリガンドの存在下に調節するEcRベースのシステムを組み合わせたものである。
【０１２１】
[00117]「調節」と言う用語は、核酸又は遺伝子の発現を誘導、減少、あるいは阻止する事を意味し、それは、それぞれ蛋白質又はポリペプチド生産の誘導、減少、あるいは阻止に繋がる。
【０１２２】
[00118]本発明によるプラスミド又はベクターは、宿主細胞に於いて遺伝子の発現を促進するのに適した少なくとも１つのプロモーターを含む場合もある。「発現ベクター」と言う用語は、宿主への形質転換の後、挿入された核酸配列の発現を可能にするように設計されたベクター、プラスミド、あるいは媒体を意味する。クローン遺伝子すなわち挿入された核酸配列は、普通、プロモーター、最小プロモーター、エンハンサーなどのコントロール要素のコントロール下に置かれる。望ましい宿主細胞に於いて核酸の発現を促進するのに役立つ開始コントロール部位又はプロモーターは数多く存在し、業界の熟練工には良く知られている。遺伝子を駆動する事のできるプロモーターであるならば、本発明にとってほとんど全て適しており、その中には、これだけに限定されるものではないが、次のものが含まれる：ウィルス・プロモーター、細菌プロモーター、動物プロモーター、哺乳類プロモーター、合成プロモーター、構成プロモーター、組織特異的プロモーター、発達特異的プロモーター、誘導性プロモーター、光調節プロモーター；CYC1,HIS3, GAL1, GAL4, GAL10, ADH1, PGK, PHO5, GAPDH, ADCI, TRP1,URA3, LEU2, ENO,TPI,  アルカリ性ホスファターゼ・プロモーター(サッカロミセス属 (Saccharomyces) の発現に有効)；AOX1プロモーター (ピチア属(Pichia)の発現に有効)；βラクタマーゼ、lac, ara, tet, trp, lPL, iPR, T7, tac, 及びtrcプロモーター(大腸菌(Escherichia coli)の発現に有効)；光調節、種特異的、花粉特異的、子宮特異的、病原又は病気関連、カリフラワー・モザイクウィルス35Ｓ、CMV35S 最小、キャッサバ・ベイン・モザイクウィルス (CsVMV)、クロロフィルa/b 結合蛋白、リブロース1,5‐リン酸二水素カルボキシラーゼ、発芽特異的、根特異的、キチナーゼ、ストレス誘導性、イネツングロ桿状ウィルス、植物スーパー・プロモーター、ジャガイモ・ロイシン・アミノペプチダーゼ、硝酸リダクターゼ、マンノピン・シンターゼ、ノパリン・シンターゼ、ユビキチン、ゼイン蛋白、及びアンソシアニン・プロモーター；業界で知られている動物及び哺乳類のプロモーターには、これだけに限定されるものではないが、次のものが含まれる。SV40初期 (SV40e) プロモーター部位、ラウス肉腫ウィルス(ＲＳＶ)の３’末端の長い繰り返しに含まれるプロモーター、Ｅ１Ａのプロモーター又はアデノウィルス(Ａｄ)の主要後期プロモーター(ＭＬＰ)、サイトメガロウィルス(ＣＭＶ)前期プロモーター、単純ヘルペスウィルス(ＨＳＶ)チミジンキナーゼ(ＴＫ)プロモーター、バキュロウィルスIE1プロモーター、延長因子1アルファ(EF１) プロモーター、ホスホグリセレートキナーゼ(ＰＧＫ) プロモーター、ユビキトン(Ubc)プロモーター、アルブミン・プロモーター、マウス・メタロチオネイン‐Ｌプロモーター及び転写コントロール部位の調節配列、ユビキタス・プロモーター(HPRT、ビメンチン、αアクチン、チューブリン等)、中間径フィラメント(デスミン、ニューロフィラメント、ケラチン、GFAP等)、治療遺伝子のプロモーター（MDR、CFTR又は第VIII因子タイプ等）、病原又は病気関連のプロモーター、及び組織特異性を示し、膵臓の腺房細胞で活性なエラスターゼＩ遺伝子コントロール部位など、遺伝子導入動物で利用されるプロモーター；膵臓のベータ細胞で活性なインシュリン遺伝子��ントロール部位、リンパ細胞で活性なイミュノグロブリン遺伝子コントロール部位、精巣、乳房、リンパ腺、そしてマスト細胞で活性なマウスの乳房腫瘍ウィルス・コントロール部位；アルブミン遺伝子、肝臓で活性なApoAI及びApo AIIコントロール部位、肝臓で活性なアルファ・フェトプロテイン遺伝子コントロール部位、肝臓で活性なアルファ1‐アンチトリプシン遺伝子コントロール部位、骨髄細胞で活性なベータ‐グロビン遺伝子コントロール部位、脳の乏突起神経膠細胞で活性なミエリン塩基性蛋白質遺伝子コントロール部位、骨格細胞で活性なミオシン軽鎖‐2遺伝子コントロール部位、視床下部で活性な生殖腺刺激ホルモン放出ホルモン遺伝子コントロール部位、ピルベート・キナーゼ・プロモーター、ヴィリン・プロモーター、腸蛋白質に結合する脂肪酸のプロモーター、平滑筋細胞αアクチンのプロモーター等。更に、こういう発現配列はエンハンサーや調節配列などを追加する事により調節可能である。
【０１２３】
[00119] 本発明の実施例で使用されるエンハンサーには、これだけに限定されるものではないが、ＳＶ40エンハンサー、サイトメガロウィルス(ＣＭＶ)エンハンサー、延長因子１(EF１)エンハンサー、酵母エンハンサー、ウィルス遺伝子エンハンサーなどが含まれる。
【０１２４】
[00120]終了コントロール部位すなわちターミネーター又はポリアデニレーション配列も、望ましい宿主に本来備わっているウィルス遺伝子から得る事が可能である。終了サイトは不必要ではあるが、含めた方が最も望ましい。本発明の望ましい実施例では、終了コントロール部位は合成配列、合成ポリアデニレーション・シグナル、ＳＶ40後期ポリアデニレーション・シグナル、ＳＶ40ポリアデニレーション・シグナル、ウシの成長ホルモン(ＢＧＨ)ポリアデニレーション・シグナル、ウィルス・ターミネーター配列などから取得又はそれで構成する事も可能である。
【０１２５】
[00121]「３’非コード化配列」又は「３’非翻訳部位(ＵＴＲ)」と言う用語は、コード化配列の下流(３’)に位置しているＤＮＡを意味し、ポリアデニレーション[poly (A)]認識配列及びmRNA処理や遺伝子発現に影響を及ぼす事のできる調節シグナルをコード化している他の配列を含める事も可能である。ポリアデニレーション・シグナルは、mRNA前駆体の３’末端にポリアデニル酸を加える時、それに影響を及ぼすのが特徴である。
【０１２６】
[00122]「調節部位」とは、第2の核酸配列の発現を調節している核酸配列の事である。調節部位には、特定の核酸の発現に本来責任を有している配列(相同部位)を含めても良いし、あるいは異なる蛋白質の発現や合成蛋白質の発現にさえ責任を持っている異なる源の配列(非相同部位)を含める事も可能である。特に配列は、原核生物、真核生物、またはウィルス遺伝子の配列、あるいは特異的または非特異的、誘導的または非誘導的方法で、遺伝子の転写を刺激または抑制する誘導配列であっても良い。調節部位には、複製の源、RNAスプライシング・サイト、プロモーター、エンハンサー、転写終了配列、及びポリペプチドを標的細胞の分泌経路へ導く信号配列なども含まれる。
【０１２７】
[00123]「非相同源」からの調節部位は、発現された核酸とは生来関連性のない調節部位である。非相同調節部位に含まれるのは、異なる種からの調節部位、異なる遺伝子からの調節部位、ハイブリッド調節配列、天然には生じないが業界の通常の技術を持った人によって設計される調節部位などである。
【０１２８】
[00124]「ＲＮＡトランスクリプト」とは、ＤＮＡ配列をＲＮＡポリメラーゼが触媒作用により転写した生成物のことである。ＲＮＡトランスクリプトがＤＮＡ配列の完全な相補的コピーであるならば、それは第一次トランスクリプトと呼ばれる、あるいは第一次トランスクリプトの転写後処理によって得られたＲＮＡ配列であり、その場合は成熟ＲＮＡと呼ばれる。「メッセンジャーＲＮＡ」とは、イントロンを持たず、細胞によって蛋白質に翻訳可能なＲＮＡの事である。「ｃＤＮＡ」とは、ｍＲＮＡに相補的でｍＲＮＡによって導かれる2本鎖のＤＮＡを言う。「センス」ＲＮＡとは、ｍＲＮＡを含むＲＮＡトランスクリプトであり、従って細胞によって蛋白質に翻訳可能なものである。「アンチセンスＲＮＡ」とは、第一次標的トランスクリプト又はｍＲＮＡの全体又は一部に相補的であり、標的遺伝子の発現を阻止するＲＮＡトランスクリプトの事である。アンチセンスＲＮＡの相補性は、特定の遺伝子トランスクリプトすなわち５’非コード化配列、３’非コード化配列、あるいはコード化配列の一部であっても良い。「機能ＲＮＡ」とは、アンチセンスＲＮＡ，リボソームＲＮＡ，又は翻訳されていないが細胞プロセスに影響を与える他のＲＮＡの事である。
【０１２９】
[00125]「ポリペプチド」とは、共有結合したアミノ酸残基を持つ重合化合物の事である。アミノ酸の一般構造は以下の通りである。
【化５】
2014111634.tif 000014
【０１３０】
[00126]アミノ酸は側鎖Ｒを基に７つのグループに分類される。(１)脂肪族側鎖、(２)ヒドロキシ(ＯＨ)グループを含む側鎖、（３）硫黄原子を含む側鎖、(４) 酸又はアミド基を含む側鎖、(５) 塩基グループを含む側鎖、(６) 芳香環を含む側鎖、そして(７)プロリンつまり側鎖がアミノ基と結合しているイミノ酸。本発明のポリペプチドは、少なくとも14のアミノ酸を含むのが好ましい。
【０１３１】
[00127]「蛋白質」は生きた細胞で構造的又は機能的役割を演ずるポリペプチドである。
【０１３２】
[00128]「分離されたポリペプチド」又は「分離された蛋白質」とは、天然の状態では通常関係している化合物(例えば、他の蛋白質やポリペプチド、核酸、炭水化物、脂質など)から実質的に自由な状態にあるポリペプチド又は蛋白質である。「分離された」と言う用語は、他の化合物との人工的又は合成的な混合物や生物活性に干渉しない不純物の存在を除外するものではない。不純物は、不完全な精製、安定剤の添加、又は薬学的に許容可能な調節時の混合の故に存在する場合がある。
【０１３３】
[00129]「置換突然変異ポリペプチド」又は「置換突然変異」とは、少なくとも１つの野生型又は天然のアミノ酸をその野生型又は天然のアミノ酸とは異なるアミノ酸で置換したものを含む突然変異ポリペプチドの事である。置換突然変異ポリペプチドは１つだけの野生型又は天然のアミノ酸置換体を含む場合もあり、その場合は「点突然変異」又は「単一点突然変異」と呼ばれる。反対に、野生型又は天然のアミノ酸を2つ又はそれ以上をその野生型又は天然のアミノ酸とは異なる2つ又はそれ以上のアミノ酸で置換する場合も含まれる。本発明によれば、置換突然変異を含むグループＨ核受容体リガンド結合ドメイン・ポリペプチドは、少なくとも１つの野生型又は天然のアミノ酸をその野生型又は天然のグループＨ核受容体リガンド結合ドメイン・ポリペプチドとは異なるアミノ酸で置換したものを含んでいる。
【０１３４】
[00130]野生型又は天然のアミノ酸を2つ又はそれ以上をその野生型又は天然のアミノ酸とは異なる2つ又はそれ以上のアミノ酸で置換する場合は、置換で削除されたの同じ数の野生型又は天然のアミノ酸で置換する場合もある。すなわち２つの野生型又は天然のアミノ酸を２つの非野生型又は非天然のアミノ酸で置換する。あるいは置換で削除されたのは同じ数ではない野生型又は天然のアミノ酸で置換する場合もある。すなわち２つの野生型アミノ酸を１つの非野生型アミノ酸で置換(置換＋削除突然変異)、あるいは２つの野生型アミノ酸を３つの非野生型アミノ酸で置換する(置換＋挿入突然変異)。
【０１３５】
[00131]置換突然変異は略式の命名方法を使って表記する事ができ、アミノ酸の残基と標準ポリペプチド配列内で置換された数、そして新しく置換されたアミノ酸残基を示す事ができる。例えば、ポリペプチドの20番目のアミノ酸残基が置換される置換突然変異の場合、「ｘ20ｚ」と表記できる。ここで「ｘ」は置換されたアミノ酸、「20」はアミノ酸残基の位置又はポリペプチド内の数、そして「ｚ」は新しく置換されたアミノ酸である。従って、相互交換的に「Ｅ20Ａ」又は「Ｇlu20Ala」と表記される置換突然変異では、突然変異にはグルタミン酸(通常「Ｅ」又は「Ｇlu」と表記) の代わりにアラニン残基 (通常「Ａ」又は「Ala」と表記) が含まれている事を示している。
【０１３６】
[00132]置換突然変異は、業界で知られている突然変異誘発技術を使って実行可能である。それには、これだけに限定されるものではないが、インビトロ部位特異的変異(ハッチンソン (Hutchinson), C, 等、1987、J. Biol. Chem. 253: 6551; ゾラー (Zoller) 及びスミス(Smith)、1984、オリファント (Oliphant) 等、1986、遺伝子 (Gene) 44: 177; ハッチンソン (Hutchinson) 等、1986, Proc. Natl. Acad. Sci.U.S.A. 83: 710)、TAB(登録商標)リンカー(ファーマシア(Pharmacia))の使用、制限エンドヌクレアーゼ消化／断片削除及び置換、PCRベース／オレゴヌクレオチド特異的変異などである。部位特異的変異ではPCRベースの技術が望ましい(ヒグチ (Higuchi)、1989、「ＤＮＡ工作のためのPCR使用」、PCRテクノロジー：DNA増殖のための原理及び応用、Ｈ．アーリッヒ (Erlich)版、ストックトン・プレス (Stockton Press)、第6章、61−70ページを参照の事)。
【０１３７】
[00133]本発明によるポリペプチドの「断片」とは、アミノ酸配列が標準ポリペプチドのそれより短く、そういう標準ポリペプチド全体の中に同一のアミノ酸配列を含んでいるポリペプチドを意味する。そういう断片は、適切であれば、より大きいポリペプチドの中に含める事もできる。本発明によるポリペプチドのそういう断片は、少なくとも２，３，４，５，６，８、10、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、25、26、30、35、40、45、50、100、200、240、又は300の長さのアミノ酸を持つ場合がある。
【０１３８】
[00134]ポリペプチド又は蛋白質の「突然変異株」とは、ポリペプチド又は蛋白質から導かれ、そういうポリペプチド又は蛋白質の生物学的性質を少なくとも１つは保持している類似体、断片、誘導体、あるいは突然変異体である。ポリペプチド又は蛋白質の様々な突然変異株が天然には存在している。そういう突然変異株は蛋白質の構造遺伝子コード化のヌクレオチド配列が異なる事を特徴とする対立形質の変異である場合もあるし、ディファレンシャル・スプライシング又は翻訳後の修飾が関係している場合もある。優秀な熟練工なら、1つ又は複数のアミノ酸を置換、削除、追加、又は補充した突然変異株を作る事ができる。こういう突然変異株には、特に、次のようなものが含まれる：(ａ)1つ又はそれ以上のアミノ酸残基が同類又は非同類のアミノ酸で置換されている突然変異株、(ｂ)ポリペプチド又は蛋白質に1つ又はそれ以上のアミノ酸残基が追加された突然変異株、（ｃ）1つ又はそれ以上のアミノ酸残基が置換基を有している突然変異株、及び（ｄ）ポリペプチド又は蛋白質が血清アルブミンのような他のポリペプチドと結合した突然変異株。こういう突然変異株を入手する技術は、遺伝子的(抑制、削除、突然変異など)、化学的、及び酵素学的技術も含めて、業界の通常の技術を持つ人には良く知られている。突然変異株のポリペプチドは少なくとも14ほどのアミノ酸を含んでいるのが望ましい。
【０１３９】
[00135]「非相同蛋白質」とは、細胞内で天然に生産されない蛋白質を意味する。
【０１４０】
[00136]「成熟蛋白質」とは、翻訳後処理されたポリペプチド、すなわち第一次翻訳生成物に存在するプリペプチド及びプロペプチドが除かれたポリペプチドを言う。「前駆体」蛋白質とは、ｍＲＮＡの翻訳の第一次生成物、すなわちプリペプチド及びプロペプチドがまだ存在しているものを言う。プリペプチド及びプロペプチドは存在するが、細胞内局在シグナルに限定されるものではない。
【０１４１】
[00137]「シグナル・ペプチド」と言う用語は、成熟蛋白質の分泌前のアミノ末端ポリペプチドを意味する。シグナル・ペプチドは分離されるので、成熟蛋白質には存在しない。シグナル・ペプチドは、分泌された蛋白質を細胞膜を通して指示し移動させる機能を有する。
【０１４２】
[00138]「シグナル配列」は蛋白質のコード化配列の初めに含まれており、細胞表面で発現する。この配列はシグナル・ペプチドをコード化し(Ｎ末端から成熟ポリペプチドへ)、ポリペプチドの移動を宿主細胞に指示する。「トランスローケーション・シグナル配列」と言う用語は、本出願では、こういう種類のシグナル配列を意味するのに使用される。トランスローケーション・シグナル配列は、真核生物及び原核生物に天然に存在する様々な蛋白質に関連して見出され、両タイプの有機体で機能している場合が多い。
【０１４３】
[00139]「相同性」と言う用語は、２つのポリヌクレオチド又は２つのポリペプチド間の存在割合に言及している。1つの成分ともう1つの成分の配列の対応は業界で知られている技術で決定可能である。例えば、相同性は２つのポリペプチド分子間の配列情報を直接比較する事により決定できる。配列情報を並べ手元のコンピュータープログラムを利用する。あるいは、相同部位間で安定したデュプレックスを形成し、次に1本鎖の特異的ヌクレアーゼで消化し、消化された断片のサイズを決めると言う条件の下に、ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションを行なう事によっても相同性は決定できる。
【０１４４】
[00140]「相同の」と言う用語は、本出願で使用される場合、文法的にも綴りの異体の面からも、上科(例えばイミュノグロブリン上科)からの蛋白質を含む「進化的に共通の源」を有している蛋白質と、異なる種から来ている相同蛋白質(例えばミオシンの軽鎖など)の関係について言及している(リエック (Reeck) 等、1987、細胞 (Cell) 50: 667)。そういう蛋白質(及びコード化遺伝子)は、高い配列の類似性に示されるように、配列の相同性を有している。しかし、一般的な使用方法、そして本アプリケーションでは、「相同の」と言う用語は、「極めて」のような副詞で修飾された場合、配列の類似性に言及しているのであり、進化的に共通の源を意味しているのではない。
【０１４５】
[00141]従って、「配列の類似性」は、あらゆる文法的意味からも、進化的に共通の源を持つあるいは持たないかもしれない核酸又は蛋白質のアミノ酸配列間の同一性及び対応の度合いについて言及している。
【０１４６】
[00142]特定の実施例において、２つのＤＮＡが、そのＤＮＡの配列の一定の長さに関して、ヌクレオチドの少なくとも50％程度(望ましくは少なくとも75％程度、最も望ましくは少なくとも90又は95％程度)マッチしている場合は、「実質的に相同」あるいは「実質的に類似している」と言える。実質的に相同な配列は、配列データ銀行で入手可能な標準のソフト使って、あるいはサザン・ハイブリダイゼーション実験をそのシステムが定義する厳格な条件の下に行なって比較すれば同定可能である。適切なハイブリダイゼーション条件の定義は、業界の熟練者には良く知られている。例えば、サムブルック(Sambrook)等、1989、前出を参照の事。
【０１４７】
[00143]「実質的に類似」と言う用語は、本出願で使用される場合、1つ又はそれ以上のヌクレオチドの塩基の変化が1つ又はそれ以上のアミノ酸の置換に結果したとしても、そのＤＮＡ配列でコード化されている蛋白質の機能的性質には影響が及ばないような核酸断片の事を意味する。「実質的に類似」と言う用語は、1つ又はそれ以上のヌクレオチドの塩基の変化が、アンチセンス又はコサプレッション技術による遺伝子発現の変化を仲介する核酸断片能力に影響を及ぼさない場合、そういう核酸断片の事も意味する。更に「実質的に類似」と言う用語は、1つ又はそれ以上のヌクレオチドの塩基の削除又は挿入を行なっても、その結果のトランスクリプトの機能的性質には実質的な影響を及ぼさないような本発明の核酸断片の修飾にも言及している。従って、本発明は、特定の模範的な配列だけでなくそれ以上の内容を含んでいる事は了解済みである。提案されている各修飾は、コード化された生物活性の保持の決定同様、業界の技術者には良く知られている事である。
【０１４８】
[00144]更に、業界の熟練工は、本発明が扱う実質的に類似の配列が、本出願で例証されている配列に関して、厳しい条件(0.1X SSC, 0.1% SDS, 65℃、及び2X SSC, 0.1% SDS、その後0.1X SSC, 0.1% SDSで洗浄) の下にハイブリダイゼーションを行なう能力によっても決定される事を認識している。本発明による実質的に類似の核酸断片とは、本出願で報告されている核酸断片のＤＮＡ配列と比べて、ＤＮＡ配列が少なくとも70％同一である核酸断片の事である。本発明による望ましい実質的に類似の核酸断片とは、本出願で報告されている核酸断片のＤＮＡ配列と比べて、ＤＮＡ配列が少なくとも80％同一である核酸断片の事である。更に望ましい核酸断片は、本出願で報告されている核酸断片のＤＮＡ配列と少なくとも90％同一である事である。更に望ましいのは、本出願で報告されている核酸断片のＤＮＡ配列に少なくとも95％同一の核酸断片である。
【０１４９】
[00145]アミノ酸の約40％を超える値が同一で、60％を超える値が類似(機能的に同一)である場合、その2つのアミノ酸配列は「実質的に相同」あるいは「実質的に類似」である。望ましいのは、類似又は相同の配列を、例えばGCG (ジェネティックス・コンピューター・グループ(Genetics ComputerGroup)、GCGパッケージのプログラム・マニュアル、ウィスコンシン州マジソン (Madiosn,Wisconsin)) パイルアップ・プログラムを使った配列により確認する事である。
【０１５０】
[00146]「対応する」と言う用語は、類似又は相同の配列である事を意味している。類似性又は相同性の測定の比較対象となっている分子と正確な位置が同じであるか異なっているかには関係しない。核酸又はアミノ酸配列の整合にはスペースも含まれる場合がある。従って、「対応する」と言う用語は、配列の類似性を言うのであって、アミノ酸残基又はヌクレオチド塩基の数を言うのではない。
【０１５１】
[00147]アミノ酸又はヌクレオチド配列の「実質的部分」には、業界の熟練工により配列を手動で評価するか、BLAST(ベーシック・ローカル・アラインメント・サーチ・ツール (BasicLocal Alignment Sequence Tool)、アルチュル(Altschul), S. F.等、(1993) J. Mol. Biol. 215: 403-410; 更にwww.ncbi.nlm.gov/BLAST/も参照の事）のようなアルゴリズムを使ったコンピューター自動化配列比較および同定によってポリペプチドのアミノ酸配列又は遺伝子のヌクレオチド配列を推定的に確認するに当たり、そう言うポリペプチドや遺伝子が十分量含まれている。一般的に、あるポリペプタイド又は核酸配列が既知の蛋白質又は遺伝子に相同であると推定的に同定するには、10あるいはそれ以上の隣接アミノ酸又は30あるいはそれ以上のヌクレオチドが必要である。更に、ヌクレオチド配列に関しては、遺伝子同定(例えば、サザン・ハイブリダイゼーション) 及び分離 (例えば、細菌のコロニーやバクテリオファージのプラクのインサイチュー・ハイブリダイゼーション)の配列依存方法に於いて、20−30の隣接ヌクレオチドを含む遺伝子特異的オリゴヌクレオチド・プローブが使用される。更に、12−15塩基の短いリゴヌクレオチドも、PCRの増殖プライマーとして使用し、そのプライマーを含む特定の核酸断片を得る事ができる。従って、ヌクレオチド配列の「実質的部分」は、核酸断片を同定および／または分離するのに十分な量の配列を含んでいる。
【０１５２】
[00148]「パーセント・アイデンティティ」と言う用語は、業界で知られている通り、配列の比較により決定される2つ又はそれ以上のポリペプチド配列、あるいは2つ又はそれ以上のポリヌクレオチド配列の間の関係を意味する。業界では、「アイデンティティ」と言うのは、配列ストリング間のマッチングにより決定されるポリペプチド、あるいは場合によってはポリヌクレオチド配列間の配列関係の度合いと言う意味も含んでいる。「アイデンティティ」及び「類似性」は、これだけに限定されるものではないが、次のような既知の方法により直ぐに計算できる：コンピューター分子生物学  (レスク(Lesk), A.M., 版)、オックスフォード大学プレス (Oxford University Press)、ニューヨーク(1988)；バイオコンピューティング：インフォーマティックス及びゲノム・プロジェクト(スミス (Smith), D.W., 版)、アカデミック・プレス (Academic Press)、ニューヨーク(1993)；配列データのコンピューター分析。パートＩ（グリフィン(Griffin),A.M., 及びグリフィン (Griffin), H.G. 版）フマナ・プレス (Humana Press)、ニュージャージー(1994)；分子生物学に於ける配列分析（フォン・へインジ (von Heinje), G., 版）、アカデミック・プレス(1987)；及び配列分析プライマー (グリブスコフ (Gribskov),M., 及びデベロー (Devereux), J., 版)、ストックトン・プレス (Stockton Press)、ニューヨーク(1991)。アイデンティティを決定する望ましい方法は、試験される配列間で最高のマッチングを与えるように設計されている。アイデンティティ及び類似性を決定する方法は、公的に入手可能なコンピューター・プログラムにより体系化されている。配列アラインメント及びパーセント・アイデンティティの計算は、LASERGENEバイオインフォーマティックス・コンピューティング・スイートのメガリン(Megalign)プログラム (DNASTAR Inc., ウィスコンシン州マジソン (Madiosn, WI)) を使っても実行できる。配列の複数アラインメントは、デフォルト・パラメーター(GAP PENALTY=10, GAP LENGTH PENALTY=10) 付きクラスタル(Clustal) アラインメント法 (ヒギンズ及シャープ(Higgins and Sharp) (1989) CABIOS, 5:151-153) を使って実行可能である。クラスタル (Clustal) 方法を使ったペヤ毎のアラインメントのデフォルト・パラメーターは、次から選択可能である：KTUPLE1, GAP PENALTY=3, WINDOW=5 及びDIAGONALSSAVED=5
【０１５３】
[00149]「配列分析ソフト」と言うのは、ヌクレオチド又はアミノ酸配列の分析に有益なあらゆるコンピューター・アルゴリズム又はソフトを意味する。「配列分析ソフト」は商業的にも入手可能だし、自分で独立にも開発できる。典型的な配列分析ソフトには、これだけに限定されるものではないが、GCGスイート・オブ・プログラム(ウィスコンシン・パッケージ版9.0、ジェネティック・コンピューター・グループ (Genetics ComputerGroup)、ウィスコンシン州マジソン(Madison, WI)), BLASTP, BLASTN,BLASTX (アルチュル (Altschul) 等, J.Mol. Biol. 215:403-410 (1990) 及び DNASTAR (DNASTAR, Inc.米国ウィスコンシン州マジソン、サウス・パーク・ストリート1228番、郵便番号WI53715 (1228 S. Park St. Madison, WI 53715 USA) などがある。本発明のアプリケーションに於いては、分析に配列分析ソフトが使用される場合は、特に説明がない限り、分析結果は参照されたプログラムの「デフォルト値」に基づいている事は了解済みである。本出願に関する限り、「デフォルト値」とは、ソフトを最初に初期化した時ローディングされた値又はパラメーターのセットを意味する。
【０１５４】
[00150]「合成遺伝子」は、業界の熟練工には良く知られている方法を使って、化学的に合成されたオリゴヌクレオチドの基礎単位から組み立てる事ができる。こういう基礎単位は、結合されアニールされて遺伝子断片となり、それから酵素的に組み立てられて全遺伝子が作られる。「化学的に合成」というのは、ＤＮＡの配列に関しては、ヌクレオチドの成分がインビトロで組み立てられる事を意味する。手動によるＤＮＡの化学合成は既に確立済みの方法を使って達成できるし、商業的に入手可能な機械を使って自動化学合成も可能である。従って、宿主細胞のコドンバイアスを反映するヌクレオチド配列の最適化を基に、遺伝子を調節して、遺伝子発現を最適化させる事が可能である。コドン・ユーセージが宿主の好むコドンの方向にバイアスされているならば、熟練工は遺伝子発現成功の可能性を喜ぶだろう。好ましいコドンの決定は、配列情報が入手可能な宿主細胞から得られる遺伝子の調査に基づいて行なえる。
【０１５５】
[00151]本出願に於いては、次のような条件の時、2つ又はそれ以上の個別に実行可能な遺伝子調節システムは「直交している」と言われる；(ａ)選定された濃度で、各リガンドを使って、各所定のシステムを調節した結果、そのシステムの遺伝子の発現が大幅に変更した場合；そして(ｂ)変化が、調節の同時性又は連続性とは無関係に、細胞、組織、又は有機体で同時に実行可能な他の全てのシステムの発現の変化よりも統計的に大幅に異なっている場合。個別に実行可能な各遺伝子調節システムの調節により、細胞、組織、又は有機体で実行可能な他の全てのシステムよりも、少なくとも2倍遺伝子発現が変化するのが望ましい。更に望ましいのは、その変化が少なくとも5倍大きい事である。更に望ましいのは、その変化が少なくとも10倍大きい事である。更に望ましいのは、その変化が少なくとも100倍大きい事である。更に望ましいのは、その変化が少なくとも500倍大きい事である。理想的には、選定された濃度で、各リガンドを使って、各所定のシステムを調節した結果、そのシステムの遺伝子の発現が大幅に変更し、しかも細胞、組織、又は有機体で同時に実行可能な他の全てのシステムの重要な発現の変化が全くない事である。そういう場合に、複数の誘導性遺伝子調節システムは「完全に直交的である」と言われる。同時出願中の米国出願09/965,697(参照としてその全体を本出願に取り入れる)に述べられているように、本発明は、直交的リガンド及び直交的受容体ベースの遺伝子発現システムの調査にとって有益である。
【０１５６】
[00152]「調節」と言う用語は、所定のリガンド受容体複合体が、外来性遺伝子のトランスアクティベーションを誘発または抑制することのできる能力を意味している。
【０１５７】
[00153]「外因性の遺伝子」と言う用語は、対象にとって外来性の遺伝子を意味する。つまり形質転換プロセスを通して対象に導入された遺伝子の事である。すなわち内因性の変異遺伝子の未変異バージョン又は内因性の未変異遺伝子の変異バージョンである。形質転換の方法は本発明にとって余り重要ではない。業界で知られている方法で、対象にとって適切なものであればどの方法でも良い。例えば、遺伝子導入植物は、形質変換された細胞を再分化させる事により得られる。形質転換方法に関する文献が数多く知られている。例えば、アグロバクテリウム(Agrobacterium tumefaciens) 又はそのＴ１プラスミドを使ったアグロインフェクション、エレクトロポレーション、植物細胞及びプロトプラストのマイクロインジェクション、マイクロプロジェクタイル形質転換などである。動物細胞の形質転換及びそういう形質転換された細胞を遺伝子導入動物内で再生させる方法についても、相補的な技術が知られている。外因性の遺伝子は天然でも合成でも良いし、ＤＮＡやＲＮＡの形で対象に導入され、逆転写酵素のような方法でＤＮＡ中間体を通して機能する治療遺伝子でも可能である。そういう遺伝子は標的細胞に導入できる。対象に直接導入しても良いし、形質転換された細胞を対象に移入する間接的な導入方法でも良い。「治療遺伝子」と言う用語は、有益な機能を宿主細胞に与え発現させる遺伝子を意味する。治療遺伝子は、天然では宿主細胞には見出されない。
【０１５８】
[00154]「エクジソン受容体複合体」と言う用語は、ステロイド受容体ファミリーの2つのメンバー、つまりエクジソン受容体(EcR) 及びウルトラスパラクル (USP) 蛋白質からなるヘテロ2量体蛋白質複合体を意味する (ヤオ (Yao), T. P., 等(1993) ネーチャー(Nature) 366, 476-479; ヤオ (Yao), T. P., 等 (1992) 細胞 (Cell) 71, 63-72を参照の事)。機能的なエクジステロイド受容体複合体には、イミュノフィリンのような追加の蛋白質が含まれる場合もある。転写因子として知られている蛋白質のステロイド受容体ファミリーの追加メンバー(例えばDHR38,betaFTZ-1, あるいはその他の昆虫相同体)も、EcRおよび／またはUSPにとっては、リガンド依存又は非依存のパートナーとなる場合がある。エクジソン受容体複合体はエクジソン受容体蛋白質のヘテロ２量体、及びウルトラスパイラクル、レチノイン酸‐Ｘ‐受容体(ＲＸＲ) 蛋白質の脊椎動物相同体でもあり得る。エクジソン受容体蛋白質又はUSPのホモ2量体複合体も、ある状況下では機能する場合もある。
【０１５９】
[00155]エクジステロイド受容体複合体は、活性なエクジステロイド又は複合体の蛋白質の1つ(EcRも含まれるが、複合体の他の蛋白質が除外されるわけではない) に結合した非ステロイド・リガンドによっても活性化される。
【０１６０】
[00156]エクジソン受容体複合体はステロイド受容体上科のメンバーである蛋白質を含んでいる。そのメンバーは全て、アミノ末端トランスアクティベーション・ドメイン、ＤＮＡ結合ドメイン(ＤＢＤ)、そしてヒンジ部位で分けられているリガンド結合ドメイン(ＬＢＤ)の存在を特徴としている。そのファミリーのメンバーの中には、ＬＢＤのカルボキシ末端側に、別のトランスアクティベーション・ドメインを持っているのもある。ＤＢＤの特徴は２つのシステイン亜鉛フィンガーの存在であり、その間にＰボックスとＤボックスの２つのアミノ酸モチーフがあり、それがエクジソン応答要素に特異性を与えている。こういうドメインは、天然でも、修飾されたものでも、非相同受容体蛋白質の異なるドメインからなるキメラであっても良い。
【０１６１】
[00157]外因性の遺伝子、応答要素、及びエクジソン受容体複合体で構成されるＤＮＡ配列は、始原細菌、大腸菌(Escherichia coli) や枯草菌 (Bacillus subtilis) のような原核生物の細胞、他のエンテロバクテリア、あるいは植物や動物のような真核生物の細胞に導入できる。しかし、遺伝子により発現される蛋白質の多くは、バクテリアでは不正確に処理されるので、真核生物の細胞の方が望ましい。細胞は単細胞でも良いし、多細胞の有機体でも良い。外因性遺伝子、応答要素、及び受容体複合体のヌクレオチド配列は、ＲＮＡ分子としても導入できる。タバコモザイクウィルスのように機能性のウィルスＲＮＡである方が望ましい。真核生物の中では、脊椎動物の方が望ましい。エクジソン受容体用の本発明のリガンドに反応を与える分子が脊椎動物には天然に欠如しているからである。従って、本発明のリガンドには脊椎動物は敏感ではない。つまり本発明のリガンドは、形質転換された細胞あるいは有機体全体に、無視できるほどの生理学的その他の影響しか及ぼさない。従って、細胞は、リガンドの存在によって実質的に全く影響を蒙らないで、希望の生成物を成長・発現できる。
【０１６２】
[00158]「対象」と言う用語は、天然のままの植物、動物、あるいは植物又は動物の細胞を意味する。対象が真菌や酵母でもリガンドは同様に機能すると期待されている。対象が天然のままの動物である場合、脊椎動物であるのが望ましい。最も望ましいのは哺乳類である。
【０１６３】
[00159]本発明のリガンドは、外因性遺伝子と結合した応答要素と更に結合したエクジソン受容体複合体と共に使用されると、外因性遺伝子の発現を外的に一時的に規制する手段を提供する。種々の成分が互いに結合する順序、すなわちリガンドと受容体複合体、そして受容体複合体と応答要素などの順序は余り重要ではない。通常、外因性遺伝子発現の調節は、エクジソン受容体複合体が特定のコントロール又は調節ＤＮＡ要素に結合する事により、その反応として生じる。エクジソン受容体蛋白質は、ステロイド受容体ファミリーの他の全メンバー同様、トランスアクティベーション・ドメイン、ＤＮＡ結合ドメイン、そしてリガンド結合ドメインの少なくとも3つのドメインを有している。この受容体は、ステロイド受容体ファミリーのサブセット同様、ヘテロ２量体化の特性に責任のある余り良く知られていない部位を持っている。ＵＳＰ又はＲＸＲとのヘテロ２量体化の後、リガンドがエクジソン受容体蛋白質のリガンド結合ドメインと結合する事により、ヘテロ２量体蛋白質のＤＮＡ結合ドメインが、活性化された形で、応答要素に結合し、その結果、外因性遺伝子の発現又は抑制が行なわれる。この機構は、リガンドがEcRかUSPに結合し、その結果活性なホモ２量体複合体 (例えばEcR+EcR又はUSP+USP)が形成される可能性を排除するものではない。1つ又はそれ以上の受容体ドメインが異種で、キメラの遺伝子スイッチを作る方が望ましい。通常、3つのドメインのうち1つ又はそれ以上が異なる源から選ばれ、従って、トランスアクティベーション活動、リガンドの相補的結合、そして特定の応答要素の認識の面で、キメラ受容体は選ばれた宿主細胞又は有機体の中で最適化される。更に、応答要素自体が修飾されたり、酵母のGAL-4蛋白質(サドウスキー(Sadowski) 等 (1988) ネーチャー(Nature), 355, 563-564)あるいは大腸菌 (E. coli) のLexA蛋白質のような他のＤＮＡ結合蛋白質ドメインの応答要素で置き換えられたりして、キメラ・エクジソン受容体複合体の調節を行なう。キメラ・システムの別の有利な点は、期待の最終結果に従って、外因性遺伝子の駆動に使われるプロモーターの選択が可能になる事である。そういう二重のコントロールは、発現のタイミングと発現が起きる細胞が共にコントロールできるので、遺伝子療法の分野、特に細胞毒の蛋白質が生産される場合は重要である。「プロモーター」と言う用語は、ＲＮＡポリメラーゼによって認識される特定のヌクレオチド配列を意味する。その配列は、適切な条件下に転写が開始されるサイトである。適切なプロモーターと結合している外因性の遺伝子が対象の細胞に導入されると、外因性の遺伝子の発現は本発明のリガンドの存在によりコントロールされる。プロモーターは構成的にあるいは誘導的に規制される、あるいは組織特異的である(すなわち特定の細胞タイプだけで発現される)、あるいは有機体のある発育段階に特異的である。
【０１６４】
[00160]本発明の別の面は、対象の1つ又はそれ以上の外因性遺伝子の発現を調節する方法であり、それには効果的な量、つまり本発明の化合物を含むリガンドの望ましい遺伝子発現又は抑制を行なう適切な量を対象に投与する事も含まれる。対象の細胞は以下を含む。
ａ）エクジソン受容体複合体に含まれるもの：
１）ＤＮＡ結合ドメイン
２）リガンドのための結合ドメイン
３）トランスアクティベーション・ドメイン
ｂ）ＤＮＡコンストラクトに含まれるもの
１）外因性遺伝子
２）応答要素
ここで外因性遺伝子は応答要素のコントロール下にあり、リガンドの存在下でＤＮＡ結合ドメインと応答要素と結合する事により、遺伝子の活性化又は抑制が起きる。
【０１６５】
[00161]本発明が関係している別の面は、遺伝子を導入された対象で、内因性又は非相同性の遺伝子発現を調節する方法である。それには本発明の化合物を含むリガンドを対象の細胞内でエクジソン受容体に接触させる事も含まれる。細胞はエクジソン受容体のためにＤＮＡ結合配列を含んでおり、エクジソン受容体‐リガンド‐ＤＮＡ結合配列の複合体が遺伝子の発現を誘発する。
【０１６６】
[00162]本発明の第4の面は、ポリペプチドを生産する方法で、それには以下のステップが含まれる。
ａ）本発明の化合物を含むリガンドと接触しても殆ど何も感じない細胞を選択
ｂ）細胞への導入
１）ＤＮＡコンストラクトに含まれるもの
i)ポリペプチドをコード化している外因性遺伝子
ii)応答要素
ここで、遺伝子は応答要素のコントロール下にある。
２）エクジソン受容体複合体に含まれるもの：
i）ＤＮＡ結合ドメイン
ii）リガンドのための結合ドメイン
iii）トランスアクティベーション・ドメイン
ｃ）細胞をリガンドに接触させる。
【０１６７】
[00163]細胞によるポリペプチド生産を一時的にコントロールする利点同様、ポリペプチドの発現が短期間に限定されていると言う意味で、ポリペプチドの蓄積が細胞に害を与えるような場合には、本発明のこの面は更に利点となる。外因性遺伝子が治療遺伝子の場合、こういうコントロールは特に重要である。治療遺伝子は、ある必要な機能をコントロールするポリペプチドを生産するように要求されるかもしれない。例えば、糖尿病患者のインシュリン生産などである。害を与える又は致命傷を与える蛋白質を生産するのにも使用できる。例えば癌細胞にとって致命的なものである。こういうコントロールは、遺伝子導入植物に見られるように、生産された蛋白質の量が生長や生殖の代謝に害を及ぼすような場合にも重要である。
【０１６８】
[00164]様々なポリペプチドをコード化する数多くのゲノム及びｃＤＮＡ核酸配列が、業界では知られている。本発明のリガンドが役に立つ外因性の遺伝物質には、関心のある生物活性蛋白質をコード化する遺伝子も含まれる。例えば、細胞から放出される分泌性蛋白質、有毒物質を無毒物質に代謝する酵素、不活性な物質を活性な物質にする酵素、調節蛋白質、細胞表面受容体などである。有益な遺伝子には次のようなものをコード化する遺伝子が含まれる：血液凝固因子、インシュリンのようなホルモン、副甲状腺ホルモン、黄体ホルモン放出因子、アルファ及びベータ精インヒビン、ヒト成長ホルモン；欠乏すると異常な状態が発生する酵素などの蛋白質をコード化する遺伝子；インターフェロン、顆粒細胞マクロファージ・コロニー刺激因子、コロニー刺激因子‐１、腫瘍壊死因子、エリスロポイエチンのようなサイトカイン又はリンフォカインをコード化する遺伝子；アルファ1‐アンチトリプシンのような阻害物質をコード化する遺伝子、ジフテリア及びコレラの毒のように薬として機能する物質をコード化する遺伝子などである。更に、有益な遺伝子には、癌治療や遺伝子疾患の治療なども含まれる。業界の熟練工は、既知の遺伝子のほとんど全てについて核酸配列情報が入手可能であり、核酸分子を公的な保管所、配列を公表している機関から直接入手する事もできるし、そういう分子を作成する方法も利用可能である。
【０１６９】
[00165]遺伝子治療について言えば、本出願で記述されているリガンドは、製薬的に容認できる担体、例えば液体、懸濁液、錠剤、カプセル、軟膏、エリキシル、注射可能物質などと一緒に摂取できる。製薬的な調剤はリガンドを重量比で0.01％から99％まで含む事ができる。特定の製薬的な調剤に使われるリガンドの量は、有効な摂取量、つまり望ましい遺伝子の発現または抑制に必要な量である。
【０１７０】
[00166]製薬的な製剤を投与する経路には、経口、直腸、局所(皮膚、頬、舌下も含む)、膣、非経口(皮下、筋肉内、静脈、皮内、クモ膜下、硬膜外も含む)、および経鼻胃管による。望ましい投与経路は、治療状態にもよるし、患者の状態などの種々の条件によっても異なっている事は、業界の熟練工には良く知られている。
【０１７１】
[00167]本出願で記述されているリガンドは、他の製薬学的に活性な化合物と一緒に投与する事も可能である。本出願で記述されているリガンドと一緒に使用する製薬学的に活性な化合物は、ひどい副作用を避けるように、そして化合物間の望ましくない相互作用を避けるように選択されなければならない事は、業界の熟練工には良く知られている。リガンドと一緒に使用できる製薬学的に活性な化合物は、例えば、エイズのための化学療法薬、アミノ酸誘導体、鎮痛薬、麻酔薬、肛門直腸製品、制酸薬及び抗膨満薬、抗生物質、抗凝血薬、解毒剤、抗繊維素溶解薬、アンチヒスタミン、抗炎症薬、抗腫瘍薬、駆虫薬、抗原虫薬、防腐薬、抗痙攣薬、抗コリン作動薬、抗ウイルス薬、食欲抑制剤、関節炎の薬、生体反応調節物質、骨代謝調節薬、腸排泄薬、心臓血管薬、中枢神経刺激薬、脳代謝エンハンサー、耳垢溶解薬、コリンエステラーゼ阻害剤、風邪及び咳用の製剤、コロニー刺激因子、避妊薬、細胞保護薬、歯科用製剤、脱臭剤、皮膚薬、解毒薬、糖尿病の薬、診断用薬、下痢用の薬、ドーパミン受容体作用薬、電解質、酵素及び消化促進薬、麦角製剤、妊娠薬、繊維補助食品、抗真菌薬、乳汁露出阻害薬、胃酸分泌阻害薬、胃腸運動賦活薬、ゴナドトロピン阻害薬、髪成長刺激薬、造血薬、痔の薬、止血薬、ヒスタミンＨ２受容体拮抗薬、ホルモン、高血糖薬、高血脂薬、免疫抑制薬、下剤、抗ライ菌薬、白血球搬出補助薬、肺表面活性剤、片頭痛用製剤、粘液溶解薬、筋弛緩拮抗薬、筋弛緩薬、麻薬拮抗薬、鼻内噴霧、吐き気用薬ヌクレオシド類似体、栄養補助食品、骨粗鬆症用製剤、子宮収縮薬、副交感神経遮断薬、副交感神経様作用薬、パーキンソン病の薬、ペニシリン補助薬、リン脂質、血小板阻害薬、ポルフィリア症の薬、プロスタグランジン類似体、プロスタグランジン、プロトンポンプ阻害薬、掻痒薬向精神性、キノロン、呼吸器刺激薬、唾液刺激薬、塩代用品、硬化剤、皮膚のけが用製剤、喫煙停止補助薬、スルホンアミド、交感神経遮断薬、血栓崩壊薬、トゥレット症候群用薬、腫瘍用製剤、肺結核用製剤、尿酸排泄薬、尿道用の薬、子宮収縮薬、子宮弛緩薬、膣用製剤、めまい用の薬、ビタミンＤ類似体、医療画像造影剤。ある場合には、リガンドを医薬品を使った治療の補助薬として使う事もできる。例えば、特定の薬を代謝する酵素があれば、それを生産する遺伝子を遮断するなど。
【０１７２】
[00168]上述の応用の他に、農業面の応用に関しても、本発明のリガンドはバチルスチューリンゲンシス(Bacillus thuringiensis) (Bt) 毒のような殺虫性のある蛋白質の発現をコントロールするのにも使用できる。そういう発現は組織又は植物特異的であるかもしれない。更に、特に植物害虫のコントロールが必要な場合、1つ又はそれ以上の農薬を本出願で述べられているリガンドと組み合わせ、例えば農薬を個別で使う場合よりも全体量が少なくて済むなど、追加の利点と効果を提供する事ができる。農薬と混合する場合、含まれる各成分の割合は、収穫物、害虫、および／または雑草との関係で相対的な効率および望ましい適用率などを考慮する事によって決定される。農薬の混合は、単独で使用する場合よりも活性の幅が広がる等の利点が提供される事を業界の熟練工は良く知っている。本出願で記述されているリガンドと組み合わされて使用できる農薬には、抗真菌薬、除草剤、殺虫剤、そして殺菌剤が含まれる。
【０１７３】
[00169]本出願で記述されているリガンドは、大量水圧スプレー、少量スプレー、空気ブラスト、空中スプレーなど従来から一般的に使用されている方法によって、水溶性のスプレーとして、植物の葉に適用できる。希釈度および適用率は、用いる道具のタイプ、望ましい適用方法と頻度、そしてリガンドの適用率によって異なる。スプレー・タンクに追加の補助剤を加えるのが望ましい。そういう補助剤に含まれるのは、表面活性剤、分散剤、浸潤剤、展着剤、泡消剤、乳化剤、その他類似の物質で、マカッチョン(McCutcheon) の乳化剤及び洗浄剤、マカッチョン (McCutcheon) の乳化剤及び洗浄剤／機能的物質、そしてマカッチョン(McCutcheon) の機能的物質に記述されており、全てＭＣパブリッシング・カンパニー (MC Publishing Company) (ニュージャージー)のマカッチョン部門 (McCutcheon Division) により年一度出版されている。リガンドは適用する前に肥料あるいは肥料性の物質と混合しても良い。リガンドと固形の肥料性物質は混合機で混合しても良いし、肥料と一緒にして顆粒状にしても良い。肥料の相対的な割合は、収穫物及び処理される雑草に適した量を使用する。本出願で記述されているリガンドは、一般に肥料の組成の5％から50％を含む。肥料は、こういう組成によって、望ましい植物の生長を促進できると同時に、遺伝子の発現もコントロールできる。
【０１７４】
宿主細胞及び本発明のヒト以外の有機体
【０１７５】
[00170]本上述の如く、本発明の遺伝子発現調節システムのリガンドは、宿主細胞の遺伝子発現を調節するのにも使用できる。遺伝子導入宿主細胞の発現は、関心のある種々の遺伝子の発現にとって有益である。本発明は、原核生物及び真核生物の宿主細胞に於いて、遺伝子発現調節のためにリガンドを提供する。遺伝子導入宿主細胞の発現は、関心のある種々のポリペプチドの発現にとって有益である。その中には、これだけに限定されるものではないが、ワクチンのように植物内で生産される抗原、アルファ・アミラーゼ、フィターゼ、グルカン、キシランスのような酵素、昆虫、線虫、真菌、バクテリア、ウィルス、及び非生物的ストレスに対して抵抗性のある遺伝子、抗原、ニュートラスティカル、医薬品、ビタミン、アミノ酸含有量、除草剤抵抗、寒さ、旱魃、及び熱抵抗を調節する遺伝子、産業生成物、油、蛋白質、炭水化物、抗酸化物、男性避妊植物、花、燃料、他の出力、治療用ポリペプチド、経路中間物；既に宿主に存在する経路を調節して、今まで宿主を使っても不可能だった新しい生成物を合成；細胞ベースのアッセイ；機能的ゲノミックス・アッセイ、バイオ治療蛋白質の生産、プロモーター・アッセイなどである。更に、遺伝子製品は、宿主の成長と収穫を高める、あるいは代替生長モードを可能にすると言う意味で有益である。
【０１７６】
[00171]従って、本発明は、本発明に従って分離された宿主細胞で、遺伝子の発現を調節するためにリガンドを提供する。宿主細胞はバクテリアの細胞、真菌の細胞、線虫の細胞、昆虫の細胞、魚の細胞、植物細胞、鳥の細胞、動物細胞、あるいは哺乳類の細胞であっても良い。更に別の実施例では、本発明は宿主細胞の遺伝子発現を調節するリガンドに関係しているが、そこでは核受容体リガンド結合ドメインをコード化するポリヌクレオチドの発現に於いて、置換突然変異を含む発現を許す条件下で上述の宿主細胞を培地で培養し、培地から置換突然変異を含む核受容体リガンド結合ドメインを分離する方法が用いられる。
【０１７７】
[00172]特定の実施例では、分離される宿主細胞は、原核生物の宿主細胞あるいは真核生物の宿主細胞である。別の特定の実施例では、分離される宿主細胞は、無脊椎動物の宿主細胞あるいは脊椎動物の宿主細胞である。宿主細胞は、バクテリアの細胞、真菌の細胞、酵母の細胞、線虫の細胞、昆虫の細胞、魚の細胞、植物細胞、鳥の細胞、動物細胞、あるいは哺乳類の細胞からなるグループの中から選択されるのが望ましい。更に望ましいのは、宿主細胞は、酵母の細胞、線虫の細胞、昆虫の細胞、植物細胞、ゼブラダニオの細胞、鶏の細胞、ハムスターの細胞、マウスの細胞、ラットの細胞、ラビットの細胞、ネコの細胞、イヌの細胞、ウシ属の細胞、ヤギの細胞、雌牛の細胞、ブタの細胞、ウマの細胞、ヒツジの細胞、猿類の細胞、サルの細胞、チンパンジーの細胞、あるいはヒトの細胞である。望ましい宿主細胞の例としては、これだけに限定されるものではないが、アスペルギラス（Aspergillus）、トリコデルマ (Trichoderma)、サッカロマイセス（Saccharomyces）、ピチア (Pichia)、カンディダ(Candida)、ハンセヌラ (Hansenula) のような真菌又は酵母の種、シネコシスティス (Synechocystis)、シネココッカス(Synechococcus)、サルモネラ (Salmonella)、バチルス (Bacillus)、アシネトバクター (Acinetobacter)、ロードコッカス(Rhodococcus)、ストレプトマイセス (Streptomyces)、大腸菌 (Escherichia)、スードモナス (Pseudomonas)、メチロモナス(Methylomonas)、メチロバクター (Methylobacter)、アルカリゲネス (Alcaligenes)、シネコシスティス(Synechocystis)、アナバエナ (Anabaena)、チオバチルス (Thiobacillus)、メタノバクテリウム(Methanobacterium)、クレブシエラ (Klebsiella) 属の中の細菌種；リンゴ、シロイスナズナ(Arabidopsis)、トウジンヒエ、バナナ、大麦、インゲン豆、蕪、ブラックグラム、ヒヨコマメ、チリ、胡瓜、茄子、ソラマメ、トウモロコシ、メロン、キビ、ヤエナリ、オート麦、オクラ、キビ属(Panicum)、パパイヤ、ピーナッツ、エンドウ、胡椒、リュウキュウ豆、パイナップル、インゲン豆 (Phaseolus)、ジャガイモ、南瓜、米、モロコシ属、大豆、スクウォッシュ、サトウキビ、砂糖大根、向日葵、薩摩芋、茶、トマト、タバコ、西瓜、及び小麦からなるグループの中から選ばれる植物種；動物；及び哺乳類の宿主細胞。
【０１７８】
[00173]ある特定の実施例では、宿主細胞は、サッカロマイセス（Saccharomyces）、ピチア (Pichia)、カンディダ (Candida) 宿主細胞からなるグループから選ばれた酵母細胞である。
【０１７９】
[00174]別の特定の実施例では、宿主細胞は、Caenorhabduselegans線虫細胞である。
【０１８０】
[00175]別の特定の実施例では、宿主細胞は昆虫の細胞である。
【０１８１】
[00176]別の特定の実施例では、宿主細胞は、リンゴ、シロイスナズナ(Arabidopsis)、トウジンヒエ、バナナ、大麦、インゲン豆、蕪、ブラックグラム、ヒヨコマメ、チリ、胡瓜、茄子、ソラマメ、トウモロコシ、メロン、キビ、ヤエナリ、オート麦、オクラ、キビ属(Panicum)、パパイヤ、ピーナッツ、エンドウ、胡椒、リュウキュウ豆、パイナップル、インゲン豆 (Phaseolus)、ジャガイモ、南瓜、米、モロコシ属、大豆、スクウォッシュ、サトウキビ、砂糖大根、向日葵、薩摩芋、茶、トマト、タバコ、西瓜、及び小麦細胞からなるグループの中から選ばれる植物細胞である。
【０１８２】
[00177]別の特定の実施例では、宿主細胞はゼブラダニオの細胞である。
【０１８３】
[00178]別の特定の実施例では、宿主細胞は鶏の細胞である。
【０１８４】
[00179]別の特定の実施例では、宿主細胞は、ハムスターの細胞、マウスの細胞、ラットの細胞、ラビットの細胞、ネコの細胞、イヌの細胞、ウシ属の細胞、ヤギの細胞、雌牛の細胞、ブタの細胞、ウマの細胞、ヒツジの細胞、サルの細胞、チンパンジーの細胞、あるいはヒトの細胞からなるグループの中から選ばれた哺乳類の細胞である。
【０１８５】
[00180]宿主細胞の形質転換は業界では良く知られており、種々の方法で達成可能である。その中には、これだけに限定されるものではないが、エレクトロポレーション、ウィルス感染、プラスミド／ベクター形質移入、非ウィルス・ベクター媒介形質移入、アグロバクテリウム(Agrobacterium) 媒介の形質転換、高速粒子衝撃などが含まれる。望ましい遺伝子生成物の発現には、適切な条件下に行なわれる形質転換された宿主細胞の培養、及び形質転換された遺伝子の発現誘導も含まれる。原核生物及び真核生物の細胞に於ける培養条件と遺伝子発現プロトコールは、業界では良く知られている(実施例の一般方法のセクションを参照の事)。遺伝子生成物に特有のプロトコルに従って、細胞の収穫と遺伝子生成物の分離を行う事ができる。
【０１８６】
[00181]更に、挿入されたポリヌクレオチドの発現を調節する、あるいは特定の望ましい方法でポリペプチド生成物を修飾及び処理する宿主細胞を選択する事もできる。蛋白質の翻訳と翻訳後の処理及び修飾(例えば糖鎖形成やシグナル配列などの開裂) は、宿主細胞毎に特徴的で特有のメカニズムが存在する。発現された外来性蛋白質の望ましい修飾及び処理には、適切な細胞株又は宿主システムを選択できる。例えば、バクテリア・システムの発現は、グリコシル化されていないコア蛋白質生成物を生産するのに利用できる。しかし、バクテリアで発現されたポリペプチドは適切には折り畳まれていない。酵母の発現はグルコシル化された生成物を生産する。真核生物の細胞の発現は、「天然の」糖鎖形成及び非相同蛋白質の折り畳みの可能性を高める。更に、哺乳類の細胞の発現は、ポリペプチド活性の再構成又は構成のツールを提供できる。更に、ベクター／宿主発現システム毎に、蛋白質分解・開裂などの処理反応に及ぼす影響の程度は異なっている。本発明は、本発明に従って分離される宿主細胞を含むヒト以外の有機体にも関係している。特定の実施例では、ヒト以外の有機体は原核生物の有機体あるいは真核生物の有機体である。別の特定の実施例では、ヒト以外の有機体は無脊椎動物の有機体あるいは脊椎動物の有機体である。
【０１８７】
[00182]ヒト以外の有機体は、バクテリア、真菌、酵母、線虫、昆虫、魚、植物、鳥、動物、及び哺乳類からなるグループから選択されるのが望ましい。更に望ましいのは、ヒト以外の有機体が酵母、線虫、昆虫、植物、ゼブラダニオ、鶏、ハムスター、マウス、ラット、ラビット、ネコ、イヌ、ウシ属、ヤギ、雌牛、ブタ、ウマ、ヒツジ、猿類、サル、又はチンパンジーである。
【０１８８】
[00183]特定の実施例では、ヒト以外の有機体は、サッカロマイセス（Saccharomyces）、ピチア (Pichia)、カンディダ (Candida) からなるグループから選ばれる酵母細胞である。
【０１８９】
[00184]別の特定の実施例では、ヒト以外の有機体はCaenorhabduselegans線虫細胞である。
【０１９０】
[00185]別の特定の実施例では、ヒト以外の有機体は、リンゴ、シロイスナズナ(Arabidopsis)、トウジンヒエ、バナナ、大麦、インゲン豆、蕪、ブラックグラム、ヒヨコマメ、チリ、胡瓜、茄子、ソラマメ、トウモロコシ、メロン、キビ、ヤエナリ、オート麦、オクラ、キビ属(Panicum)、パパイヤ、ピーナッツ、エンドウ、胡椒、リュウキュウ豆、パイナップル、インゲン豆 (Phaseolus)、ジャガイモ、南瓜、米、モロコシ属、大豆、スクウォッシュ、サトウキビ、砂糖大根、向日葵、薩摩芋、茶、トマト、タバコ、西瓜、及び小麦からなるグループの中から選ばれる植物である。
【０１９１】
[00186]別の特定の実施例では、ヒト以外の有機体はハツカネズミ族(Musmusculus) である。
【０１９２】
本発明の遺伝子発現調節システム
【０１９３】
[00187]本発明は、エクジソン受容体ベースの誘導性遺伝子発現システムに役立つリガンドのグループに関係している。本出願で述べられているように、新規なグループのリガンドは、原核生物と真核生物の両方の宿主細胞に於いて、改良された誘導性遺伝子発現システムを提供する。従って、本発明は、遺伝子の発現を調節するのに役立つリガンドに関係している。特に、本発明は、グループＨ核受容体リガンド結合ドメインを含むポリペプチドをコード化するポリヌクレオチド、そのポリヌクレオチドを含む宿主細胞内で発現が可能な少なくとも1つの遺伝子発現カセットを含む遺伝子発現調節システム、そのシステムをトランスアクティベートする能力を持つリガンドに関係している。グループＨ核受容体リガンド結合は、エクジソン受容体、ユビキタス受容体、オーファン受容体１、NER-1、ステロイド・ホルモン核受容体１、レチノイドＸ受容体相互作用蛋白質15、肝臓Ｘ受容体β、ステロイド・ホルモン受容体様蛋白質、肝臓Ｘ受容体、肝臓Ｘ受容体α、受容体相互作用蛋白質14、及びファルネソール受容体から来ているのが望ましい。更に望ましいのは、グループＨ核受容体リガンド結合ドメインが、エクジソン受容体から来ているものである。
【０１９４】
[00188]特定の実施例では、遺伝子発現調節システムには、発現の調節が行なわれる遺伝子と関係する応答要素、それを認識するＤＮＡ結合ドメインとトランスアクティベーション・ドメインを含むポリペプチド、それをコード化しているポリヌクレオチド、並びに置換変異体を含むグループＨ核受容体結合ドメイン、それを含む遺伝子発現カセットが含まれる。更に、遺伝子発現調節システムには、以下を含む第2の遺伝子発現カセットを含めても良い：ｉ）第1遺伝子発現カセットのコード化されたポリペプチドのＤＮＡ結合ドメインによって認識される応答要素；ii)第1遺伝子発現カセットのコード化されたポリペプチドのトランスアクティベーション・ドメインにより活性化されるプロモーター;  及び iii) 発現が調節される遺伝子。
【０１９５】
[00189]別の特定の実施例では、遺伝子発現調節システムには、ａ）発現の調節が行なわれる遺伝子と関係する応答要素、それを認識するＤＮＡ結合ドメインとトランスアクティベーション・ドメインを含むポリペプチド、それをコード化しているポリヌクレオチド、並びに置換変異体を含むグループＨ核受容体結合ドメイン、及びｂ）脊椎動物レチノイドＸ受容体リガンド結合ドメイン、無脊椎動物レチノイドＸ受容体リガンド結合ドメイン、ウルトラスパイラクル蛋白質リガンド結合ドメイン、及び2つのポリペプチド断片を含むキメラリガンド結合ドメイン(ここで第1のポリペプチド断片は、脊椎動物レチノイドＸ受容体リガンド結合ドメイン、無脊椎動物レチノイドＸ受容体リガンド結合ドメイン、又はウルトラスパイラクル蛋白質リガンド結合ドメインから来ており、第2のポリペプチド断片は、別の脊椎動物レチノイドＸ受容体リガンド結合ドメイン、無脊椎動物レチノイドＸ受容体リガンド結合ドメイン、又はウルトラスパイラクル蛋白質リガンド結合ドメインから来ている)からなるグループから選ばれた第2の核受容体リガンド結合ドメイン、それを含む遺伝子発現カセットが含まれる。更に、遺伝子発現調節システムには、以下を含む第2の遺伝子発現カセットを含めても良い：ｉ）第1遺伝子発現カセットのコード化されたポリペプチドのＤＮＡ結合ドメインによって認識される応答要素；ii)第1遺伝子発現カセットのコード化されたポリペプチドのトランスアクティベーション・ドメインにより活性化されるプロモーター;  及び iii) 発現が調節される遺伝子。
【０１９６】
[00190]別の特定の実施例では、遺伝子発現調節システムには、発現の調節が行なわれる遺伝子と関係する応答要素、それを認識するＤＮＡ結合ドメイン及び核受容体リガンド結合ドメインを含む第1のポリペプチド、それをコード化しているポリヌクレオチド、それを含む第1の遺伝子発現カセット、そしてトランスアクティベーション・ドメイン及び核受容体リガンド結合ドメインを含む第2のポリペプチド、それをコード化しているポリヌクレオチド、それを含む第2の遺伝子発現カセットが含まれる。ここで核受容体リガンド結合ドメインの１つは、置換変異体を含むグループＨ核受容体リガンド結合ドメインである。望ましい実施例では、第1のポリペプチドはトランスアクティベーション・ドメインから実質的にフリーであり、第2のポリペプチドはＤＮＡ結合ドメインから実質的にフリーである。本発明目的では、「実質的にフリー」と言うのは、問題の蛋白質が、問題のドメインに関して、活性化又は活性化の抑制を提供するほどには十分な配列を含んでいない事を意味する。更に、遺伝子発現調節システムには、以下を含む第３の遺伝子発現カセットを含めても良い：ｉ）第1遺伝子発現カセットのコード化されたポリペプチドのＤＮＡ結合ドメインによって認識される応答要素；ii)第２遺伝子発現カセットの第2のポリペプチドのトランスアクティベーション・ドメインにより活性化されるプロモーター;  及び iii) 発現が調節される遺伝子。
【０１９７】
[00191]１つの核受容体リガンド結合ドメインだけが置換変異体を含むグループＨリガンド結合ドメインである場合、もう１つの核受容体リガンド結合ドメインは、置換変異体を含むグループＨリガンド結合ドメインと２量体を形成する他の核受容体から来ても良い。例えば、置換変異体を含むグループＨ核受容体リガンド結合ドメインが置換変異体を含むエクジソン受容体リガンド結合ドメインである場合は、もう１つの核受容体リガンド結合ドメイン(「パートナー」)は、エクジソン受容体、脊椎動物レチノイドＸ受容体(ＲＸＲ)、無脊椎動物ＲＸＲ、ウルトラスパイラクル(ＵＳＰ)、あるいは脊椎動物ＲＸＲ、無脊椎動物ＲＸＲ、及びＵＳＰからなるグループから選ばれる少なくとも2つの異なる核受容体リガンド結合ドメイン・ポリペプチド断片を含むキメラ核受容体から来ても良い(同時出願中の PCT/US01/ 09050、PCT/US02/05235及びPCT/US02/05706を参照の事。参照としてその全体を本出願に取り入れる)。「パートナー」の核受容体リガンド結合ドメインには、トランケーション変異体、遺伝子欠損変異体、置換変異体、その他の修飾を含めても良い。
【０１９８】
[00192]脊椎動物ＲＸＲリガンド結合ドメインは、ヒト(Homosapiens)、マウス (Mus musculus)、ラット(Rattus norvegicus)、鶏 (Gallus gallus)、ブタ(Sus scrofa domestica)、蛙 (Xenopus laevis)、ゼブラダニオ (Danio rerio)、ホヤ(Polyandrocarpa misakiensis)、又はクラゲ (Trepedalia cysophora) から来るのが望ましい。
【０１９９】
[00193]無脊椎動物ＲＸＲリガンド結合ドメインは、バッタ(Locustamigratoria) ウルトラスパイラクル・ポリペプチド (LmUSP)、マダニ (Amblyomma americanun) RXR 類似体１(AmaRXR1)、マダニ ( Amblyomma americanun) RXR 類似体２ (AmaRXR2)、シオマネキ (Celucapugilator) RXR 類似体 (CpRXR)、カブトムシ (Tenebrio molitor) RXR 類似体、ミツバチ(Apismellifera) RXR 類似体 (AmRXR)、アリマキ (Myzuz persicae) RXR 類似体 (MpRXR)、あるいは非双翅類／非鱗翅類RXR 類似体から来るのが望ましい。
【０２００】
[00194]キメラRXRリガンド結合ドメインは、脊椎動物種ＲＸＲポリペプチド断片、無脊椎動物種ＲＸＲポリペプチド断片、及び非双翅類／非鱗翅類無脊椎動物種RXR 類似体ポリペプチド断片からなるグループから選ばれた少なくとも２つのポリペプチド断片を含むのが望ましい。本発明で使用されるキメラRXRリガンド結合ドメインは、少なくとも2種類の種ＲＸＲポリペプチド断片を含んでいても良いし、種が同じ場合は、その種ＲＸＲポリペプチド断片の2つ又はそれ以上の異なるアイソフォームでも良い。
【０２０１】
[00195]望ましい実施例では、キメラRXRリガンド結合ドメインは、少なくとも１つの椎動物種ＲＸＲポリペプチド断片、及び１つの無脊椎動物種ＲＸＲポリペプチド断片を含んでいる。
【０２０２】
[00196]更に望ましい実施例では、キメラRXRリガンド結合ドメインは、少なくとも１つの椎動物種ＲＸＲポリペプチド断片、及び１つの非双翅類／非鱗翅類無脊椎動物種ＲＸＲポリペプチド断片を含んでいる。
【０２０３】
[00197]特定の実施例では、発現が調節される遺伝子が宿主細胞と相同の遺伝子である。別の特定の実施例では、発現が調節される遺伝子が宿主細胞と非相同の遺伝子である。
【０２０４】
[00198]以下に説明されるように、本発明で使用されるリガンドは、遺伝子と結合している応答要素、それと結合している核受容体のリガンド結合ドメインと組み合わされる時、その遺伝子の発現を外的に一時的に調節する手段を提供する。結合メカニズム又は本発明の種々の要素が互いに結合し合う順序、例えば、リガンドとリガンドの結合ドメイン、ＤＮＡ結合ドメインと応答要素、トランスアクティベーション・ドメインとプロモーターなどの結合順序は余り重要ではない。
【０２０５】
[00199]特定の実施例では、グループＨ核受容体のリガンド結合ドメイン、及びその核受容体リガンド結合ドメイン・パートナーとリガンドの結合は、遺伝子の発現又は抑制を可能にする。このメカニズムは、リガンドがグループＨ核受容体(GHNR) 又はそのパートナーと結合し、活性のホモ２量体複合体を形成(例えば、GHNR+GHNR、あるいはパートナー＋パートナー) する可能性を排除するものではない。1つ又はそれ以上の受容体ドメインが異種で、ハイブリッドの遺伝子スイッチを作る方が望ましい。通常、ＤＢＤ，ＬＢＤ，そしてトランスアクティベーション・ドメインの3つのドメインのうち1つ又はそれ以上が異なる源から選ばれ、従って、トランスアクティベーション活動、リガンドの相補的結合、そして特定の応答要素の認識の面で、ハイブリッド遺伝子及びその結果のハイブリッド蛋白質は、選ばれた宿主細胞又は有機体の中で最適化される。更に、応答要素自体が修飾されたり、酵母のGAL-4蛋白質(サドウスキー(Sadowski) 等 (1988) ネーチャー(Nature), 355, 563-564) あるいは大腸菌 (Escherichiacoli) のLexA蛋白質、あるいは特定の相互作用を行なうように設計、修飾、及び選択された蛋白質との標的相互作用に特異的な合成応答要素 (例えば、キム(Kim) 等(1997), Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 94: 3616-3620を参照の事)のような他のＤＮＡ結合蛋白質ドメインの応答要素で置き換えられたりして、ハイブリッド受容体の調節を行なう。２つのハイブリッド・システムの別の有利な点は、期待の最終結果に従って、遺伝子発現の駆動に使われるプロモーターの選択が可能になる事である。そういう二重のコントロールは、発現のタイミングと発現が起きる細胞が共にコントロールできるので、遺伝子療法の分野、特に細胞毒の蛋白質が生産される場合は重要である。適切なプロモーターと結合している遺伝子が対象の細胞に導入されると、外因性の遺伝子の発現は本発明のリガンドの存在によりコントロールされる。プロモーターは構成的にあるいは誘導的に規制される、あるいは組織特異的である(すなわち特定の細胞タイプだけで発現される)、あるいは有機体のある発育段階に特異的である。
【０２０６】
[00200]エクジソン受容体は核受容体上科のメンバーで、サブファミリー1グループＨ(本出願では「グループＨ核受容体」と呼ばれる) に分類される。各グループのメンバーは、Ｅ（リガンド結合）ドメインで40−60％のアミノ酸アイデンティティを共有する(ラウデット (Laudet) 等、核受容体サブファミリーのための統一命名システム、1999；細胞 (Cell) 97: 161-163)。核受容体サブファミリー1グループＨには、エクジソン受容体の他にも次のようなものがある：ユビキタス受容体(UR)、オーファン受容体１ (OR-1)、ステロイド・ホルモン核受容体１ (NER-1)、レチノイドＸ受容体相互作用蛋白質15 (RIP-15)、肝臓Ｘ受容体β(LXRβ)、ステロイド・ホルモン受容体様蛋白質 (RLD-1)、肝臓Ｘ受容体 (LXR)、肝臓Ｘ受容体α (LXRα)、ファルネソイド受容体 (FXR)、受容体相互作用蛋白質14(RIP-14)、及びファルネソール受容体 (HRR-1)。
【０２０７】
[00201]特に、本出願で述べられているのは、置換変異を含むグループＨ核受容体リガンド結合ドメインからなる遺伝子発現調節システムにとって有益な新規のリガンドである。この遺伝子発現システムは、トランスアクティベーション・ドメイン、ＤＮＡ結合ドメイン、及びリガンド結合ドメインが１つのコード化されたポリペプチド上に載っている「単一スイッチ」ベースの遺伝子発現システムであっても良い。あるいは、遺伝子発現調節システムは、トランスアクティベーション・ドメインとＤＮＡ結合ドメインが２つの異なるコード化されたポリペプチド上に載っている「二重スイッチ」ベース又は「2ハイブリッド」ベースの遺伝子発現調節システムであっても良い。
【０２０８】
[00202]本発明のエクジソン受容体ベースの遺伝子発現調節システムは、ヘテロ２量体でもホモ２量体でも良い。機能的EcR複合体とは、一般に、ステロイド受容体ファミリーの2つのメンバー、すなわち種々の昆虫から得られるエクジソン受容体蛋白質、及びウルトラスパイラクル(ＵＳＰ)蛋白質、又はＵＳＰの脊椎動物相同体であるレチノイドＸ受容体蛋白質で構成されるヘテロ２量体蛋白質複合体を意味する(ヤオ (Yao), 等 (1993) ネーチャー (Nature) 366, 476-479; ヤオ (Yao), 等 (1992) 細胞 (Cell)71, 63-72を参照の事)。しかし以下に詳細に記述するように、複合体はホモ２量体であっても良い。機能的エクジソン受容体複合体は、イミュノフィリンなどの追加の蛋白質を含む事もできる。転写因子として知られる蛋白質のステロイド受容体ファミリーの追加メンバー(DHR38又はベータFTZ-１等)は、EcR、USP、および／またはRXRのリガンド依存又は非依存パートナーであっても良い。更に、コアクティベーター(あるいはアダプター又はメディエイター)として一般的に知られる蛋白質などの共同因子も要求される場合がある。こういう蛋白質はＤＮＡに配列特異的に結合する事も塩基の転写に関係する事もない。こういう蛋白質は、アクティベーターのＤＮＡ結合を刺激するなど種々のメカニズムを通し、クロマチン構造に影響を与えたり、アクティベーター開始複合相互作用を仲介したりする事により、転写の活性化に影響を及ぼしている。こういうコアクティベーターには、RIP140、TIF1、RAP46/Bag-1、ARA70、SRC-1/NCoA-1、TIF2/GRIP/NCoA-2、ACTR/AIB1/RAC3/pCIP、プロミスキュアス・コアクティベーターＣ応答要素Ｂ結合蛋白質、CBP/p300などがある(グラス(Glass)等、Curr. Opin. Cell Biol. 9: 222-232, 1997を参照の事)。更に、リガンド不在のとき転写活性を効果的に阻害するため、コレプレッサーとして一般に知られる(又レプレッサー、サイレンサー、又はサイレンシング・メディエイターとしても知られる)蛋白質共同因子が要求される場合もある。こういうコレプレッサーはリガンドのないエクジソン受容体と相互作用を起こし、応答要素の活性を和らげる。最近の証拠によれば、リガンドとの結合は受容体の構造を変え、それがコレプレッサーの放出と上述のコアクティベーターの呼び出しに繋がり、その結果、活性を和らげる働きが廃止される。コレプレッサーにはN-CoR及びSMRTも含まれる(ホルウィッツ (Horwitz) 等Mol Endocrinol. 10: 1167-1177,1996) を参照の事)。こういう共同因子は細胞や有機体内の内因性の場合もあれば、遺伝子導入のように外部から加えて規制状態又は無規制状態で発現させる場合もある。エクジソン受容体蛋白質USP又はRXRのホモ２量体複合体も、ある環境の下では機能する場合がある。
【０２０９】
[00203]エクジソン受容体複合体は、普通、核受容体上科のメンバーである蛋白質を含んでおり、その上科の全メンバーの特徴は、アミノ末端トランスアクティベーション・ドメイン、ＤＮＡ結合ドメイン(DBD)、そしてヒンジ部位でDBDから分離されているリガンド結合ドメイン(LBD)の存在である。本出願で使用する場合、「ＤＮＡ結合ドメイン」は、ＤＮＡ結合蛋白質の最小ポリペプチド配列をＤＮＡ結合蛋白質の全長に亘って含んでいる。ＤＮＡ結合ドメインが特定の応答要素と関係する限りはそうである。核受容体上科のメンバーは4つ又は5つのドメイン(Ａ／Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ)、そしてあるメンバーではＦの存在によっても特徴付けられている(米国特許4,981,784及びエバンス (Evans), サイエンス (Science) 240：889-895(1988)を参照の事)。「Ａ／Ｂ」ドメインはトランスアクティベーション・ドメインに対応し、「Ｃ」はＤＮＡ結合ドメインに対応し、「Ｄ」はヒンジ部位に対応する。そして「Ｅ」はリガンド結合ドメインに対応する。ファミリーのあるメンバーは、「Ｆ」に対応するLBDのカルボキシ末端側に、別のトランスアクティベーション・ドメインを持っている。
【０２１０】
[00204]ＤＢＤの特徴は２つのシステイン亜鉛フィンガーの存在であり、その間にＰボックスとＤボックスの２つのアミノ酸モチーフがあり、それがエクジソン応答要素に特異性を与えている。こういうドメインは、天然でも、修飾されたものでも、非相同受容体蛋白質の異なるドメインからなるキメラであっても良い。EcR受容体は、ステロイド受容体ファミリーのサブセット同様、ヘテロ２量体化の特性に責任のある余り良く知られていない部位を持っている。核受容体のドメインは天然ではモジュール方式であるので、LBD、DBD、そしてトランスアクティベーション・ドメインは相互交換可能であるかもしれない。
【０２１１】
[00205]遺伝子スイッチ・システムは、エクジソン受容体複合体から構成要素を取り込むことが知られている。しかしこういう既知のシステムでは、EcRが使われる時、同じ分子上にある天然又は修飾ＤＮＡ結合ドメイン及びトランスアクティベーション・ドメインにそれは関係している。ＵＳＰ又はＲＸＲは静かなパートナーとして普通使われる。以前に証明された事であるが、ＤＮＡ結合ドメインとトランスアクティベーション・ドメインが同じ分子上にある場合は、リガンドの不在下に背景活動が活発になるが、ＤＮＡ結合ドメインとトランスアクティベーション・ドメインが異なる分子、つまりヘテロ２量体又はヘモ２量体複合体の2つのパートナーのそれぞれの分子上にある場合は、そういう活動は大幅に減少する。
【０２１２】
本発明の遺伝子発現の調節方法
【０２１３】
[00206]本発明は、本発明による遺伝子発現調節システムを使って、宿主細胞で遺伝子発現を調節する方法にも関係している。特に、本発明は、次のようなステップを含めて宿主細胞で遺伝子発現を調節する方法を提供する：ａ）本発明による遺伝子発現調節システムを宿主細胞に導入；ｂ）宿主細胞にリガンドを導入；ここで調節される遺伝子は次のものを含む遺伝子発現カセットの構成要素である：ｉ）遺伝子発現調節システムのDNA結合ドメインにより認識されるドメインを含む応答要素；ii）遺伝子発現調節システムのトランスアクティベーション・ドメインにより活性化されるプロモーター；そしてiii）発現が調節の対象となっている遺伝子。リガンドを宿主細胞へ導入する事により、遺伝子の発現が調節される。
【０２１４】
[00207]本発明は、次のようなステップを含めて宿主細胞で遺伝子発現を調節する方法も提供する：ａ）本発明による遺伝子発現調節システムを宿主細胞に導入；ｂ）宿主細胞に本発明による遺伝子発現カセットを導入；ここで遺伝子発現カセットは次の内容を含む：ｉ）遺伝子発現調節システムのDNA結合ドメインにより認識されるドメインを含む応答要素；ii）遺伝子発現調節システムのトランスアクティベーション・ドメインにより活性化されるプロモーター；そしてiii）発現が調節の対象となっている遺伝子；ｃ）リガンドを宿主細胞へ導入。リガンドを宿主細胞へ導入する事により、遺伝子の発現が調節される。
【０２１５】
[00208]本発明は、遺伝子発現調節システムの第1ハイブリッド・ポリペプチドからのDNA結合ドメインに結合するドメインを含む応答要素、それを含む遺伝子発現カセット、それを含む宿主細胞内で、遺伝子の発現を調節する方法；遺伝子発現調節システムの第2ハイブリッド・ポリペプチドのトランスアクティベーション・ドメインによって活性化されるプロモーター；そして発現が調節の対象となっている遺伝子も提供する。方法は次のステップで構成される：ａ）本発明による遺伝子発現調節システムを宿主細胞に導入；ｂ）リガンドを宿主細胞へ導入。ここで、リガンドを宿主細胞へ導入する事により、遺伝子の発現が調節される。
【０２１６】
[00209]本発明で記述されている方法を使って、宿主細胞内で発現が求められている遺伝子は、内因性の場合も外因性の場合もある。望ましい遺伝子又は蛋白質の核酸又はアミノ酸配列情報は、公的にアクセス可能な多くのデータベースで入手できる。例えば、GENBANK,EMBL, Swiss-Prot, PIR、あるいは多くの生物学関連の雑誌などである。従って、業界の熟練工は、既知のほとんど全ての遺伝子に関して核酸配列情報を入手可能である。そういう情報を使って、本出願で記述される方法で遺伝子発現カセットに対象の遺伝子を挿入するためのコンストラクトを構築できる。
【０２１７】
[00210]本出願で説明されている方法を使って、宿主細胞内で発現が求められている遺伝子の例は、これだけに限定されるものではないが、次の内容を含む：ワクチンのように植物内で生産される抗原、アルファ・アミラーゼ、フィターゼ、グルカン、キシランスのような酵素、昆虫、線虫、真菌、バクテリア、ウィルス、及び非生物的ストレスに対して抵抗性のある遺伝子、ニュートラスティカル、医薬品、ビタミン、アミノ酸含量、除草剤抵抗、寒さ、旱魃、及び熱抵抗を調節する遺伝子、産業生成物、油、蛋白質、炭水化物、抗酸化物、男性避妊植物、花、燃料、他の出力；健康状態、病気、障害、機能不全、遺伝的疾患などの治療に使う事のできる遺伝子でコード化された治療学的に好ましいポリペプチドや生成物で、例えば、モノクローナル抗体、酵素、蛋白質分解酵素、サイトカイン、インターフェロン、インシュリン、エリスロポイエチン、凝血因子、その他血液因子や成分など、遺伝子療法のためのウィルス・ベクター、ワクチン用のウィルス、医薬品発見の標的、機能的ゲノミックス、プロテオミックス分析及び応用などである。
【０２１８】
遺伝子発現／転写の測定
【０２１９】
[00211]本発明の方法の有効な測定方法の1つは、細胞の転写状態の測定であり、それにはＲＮＡ、望ましくはｍＲＮＡのアイデンティティ及び発生量も含まれる。こういう測定は、既に存在しているいくつかの遺伝子発現技術を使ってｃＤＮＡの発生量を測定する事により行なえる。
【０２２０】
[00212]核酸アレイ技術はｍＲＮＡ配列の差の決定に有効な技術である。こういう技術には、例えば、オリゴヌクレオチド・チップやＤＮＡマイクロアレイなども含まれる。こういう技術は様々な遺伝子又はＤＮＡに対応するＤＮＡ断片又はオリゴヌクレオチドに依存しており、材料は固体の支持体に固定され、細胞、組織、又は全有機体から抽出された全ｍＲＮＡプールを使って準備したプローブにハイブリダイズされ、それからｃＤＮＡに変換される。オリゴヌクレオチド・チップは、写真石版術を使って基質上に合成されたオリゴヌクレオチドのアレイである。1700までの遺伝子を分析可能なチップが作られている。ＤＮＡマイクロアレイはＤＮＡサンプルのアレイで、普通PCRの生成物で、顕微鏡スライド上にロボットを使って印刷される。各遺伝子は全長又は部分的長さの標的ＤＮＡ配列によって分析される。現在では10,000遺伝子までのマイクロアレイが商業的に生産されている。この２つの技術の主な違いは、オリゴヌクレオチド・チップは普通25-merのオリゴヌクレオチドを使って短いＤＮＡ分子の細分化を行なうが、もっと大きいＤＮＡ標的を使うマイクロアレイでは、約1000の塩基対が扱われ、複雑なＤＮＡ混合物の細分化の面でより高度の感度を提供できる。
【０２２１】
[00213]本発明の方法の有効な別の測定方法は、業界で良く知られているプロセスを使って、細胞に存在する構成蛋白質の発生量を測定する事により、細胞の翻訳状態を決定する方法である。
【０２２２】
[00214]種々の生理学的機能に関連した遺伝子の同定を行いたい場合は、アッセイが行なわれ、次のような機能の変化が測定される：細胞の成長、アポプトシス、老化、分化、付着、特定の分子への結合、別の細胞への結合、細胞の組織化、器官形成、細胞内輸送、輸送の簡便化、エネルギー変換、代謝、筋形成、神経形成、および／または造血など。
【０２２３】
[00215]更に、本発明を使って遺伝子発現調節を測定するのに、選択可能マーカー又はレポーター遺伝子を使う事もできる。
【０２２４】
[00216]遺伝子発現生成物を検出する他の方法は業界では良く知られており、例えば、サザン・ブロッティング法(DNA検出)、ドット・オア・スロット・ブロッティング法 (DNA, RNA)、ノーザン・ブロッティング法 (RNA)、RT-PCR (RNA)、ウェスターン・ブロッティング法(ポリペプチド検出)、ELISA (ポリペプチド)分析などがある。
【０２２５】
[00217]ある場合には、核酸配列の量を増殖させる必要がある。いくつかの適切な方法があるが、それを1つ又はそれ以上使えば実現可能である。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、リガーゼ連鎖反応応 ( LCR)、核酸増幅同定検査 (SDA)、転写ベース増殖などがある。PCRは既に知られている技術に従って実行される。例えば、核酸のサンプルは熱に安定なDNAポリメラーゼの存在の下、ハイブリダイゼーションを行なう条件で処理される。1組のオリゴヌクレオチド・プライマーが使われ、１つのプライマーは検出されるべき特定の配列の1本鎖(テンプレート)にハイブリダイゼーションを行なう。プライマーはハイブリッドされる特定の配列のテンプレート鎖に十分相補的である。各プライマーの拡張生成物が合成され、それは核酸テンプレート鎖に相補的である。各プライマーから合成された拡張生成物は、同じプライマーを使って拡張生成物を更に合成するためのテンプレートとしても機能できる。拡張生成物の合成が十分な回数行なわれたら、上述の方法でサンプルを分析し、検出されるべき配列が存在するかどうか評価する。
【０２２６】
[00218]本発明は、本発明の例として提供される以下の制限なしの実施例を参照する事により、更に良く理解できるかもしれない。
【０２２７】
［実施例］
一般的方法
【０２２８】
[00219]本出願で使用される標準の組み換えＤＮＡ及び分子クローニング技術は業界では良く知られており、次のような記述がある：サムブルック(Sambrook), J.、フリッチュ (Fritsch), E.F.、及びマニアティス (Maniatis), T.、分子クローニング：実験室マニュアル；コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス(Cold Spring Harbor Laboratory Press)：コールド・スプリング・ハーバー (Cold Spring Harbor)、ニューヨーク(1989)、(マニアティス (Maniatis)) 及びT.J.シルヘイビー (Silhavy)、M.L.ベンナン(Benna)、及びL.W.エンクイスト(Enquist)、遺伝子融合の実験、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー(Cold Spring Harbor Laboratory)、コールド・スプリング・ハーバー(ColdSpring Harbor)、ニューヨーク (1984)、及びアウスベル (Ausubel), F.M., 等、分子生物学に於ける現在のプロトコール、グリーン・パブリッシング・アソシエーション(Greene Publishing Assoc.) 及びワイリー・インターサイエンス(Wiley-Interscience) (1987)。
【０２２９】
[00220]細菌培養の維持と生長に適した材料及び方法は業界では良く知られている。以下の実施例で使用されるのに適した技術は、次に見出される：一般細菌学の方法マニュアル (フィリップ・ゲハート (Phillipp Gerhardt)、R. G. E. マレイ (Murray)、ラルフN.コスティロウ (Ralph N.Costilow)、ユージンW.ネスター (Eugene W. Nester)、ウィリスA.ウッド (Willis A. Wood)、ノエルR.クリーグ(Noel R. Krieg) 及びG.ブリッグス・フィリップス (Briggs Phillips) 版)、マイクロバイオロジー米国協会 (AmericanSociety forMicrobiology)、ワシントンＤＣ(1994)、あるいはトーマスD.ブロック (Thomas D. Brock)、バイオテクノロジー：産業用マイクロバイオロジーのテキスト、第2版、シナウア・アソシエーツ・インク(Sinauer Associates, Inc.)、マサチューセッツ州サンダーランド(Sunderland, MA) (1989)。宿主細胞の生長及び維持に用いられる試薬、制限酵素、及び材料は全て、別の表記がない限り、アルドリック・ケミカルス(Aldrich Chemicals) (ウィスコンシン州ミルウォーキー(Milwaukee, WI))、DIFCOラボラトリーズ(Laboratories)(ミシガン州デトロイト (Detroit, MI))、GIBCO/BRL(メリーランド州ガイサースバーグ (Gaithersburg, MD))、あるいはシグマ・ケミカル・カンパニー (Sigma Chemical Company) (ミズリー州セントルイス(St.Louis, MO)) から入手した。
【０２３０】
[00221]遺伝子配列の操作は、ジェネティックス・コンピューター・グループ・インク(Genetics Computer Group, Inc.) (ウィスコンシン・パッケージ9.0版、ジェネティックス・コンピューター・グループ(GeneticsComputerGroup) (GCG)、ウィスコンシン州マジソン (Madison, WI)) から入手可能なプログラムを使って行なわれた。GCGプログラムの「Pileup」が使われる時は、ギャップ作成デフォルト値12及びギョップ拡張デフォルト値14が使用される。GCGの「Gap」又は「Bestfit」プログラムが使われる時は、デフォルト・ギャップ作成ペナルティ50及びデフォルト・ギャップ拡張ペナルティ３が使用される。いずれの場合も、GCGプログラムのパラメーターが指示されていない場合は、他のGCGプログラムを含めて、デフォルト値が使用される。
【０２３１】
[00222]略語の意味は次の通りである：「ｈ」は時間、「min」は分、「sec」は秒、「ｄ」は日、「μＬ」はマイクロリットル、「ｍＬ」はミリリットル、「Ｌ」はリットル、「μＭ」マイクロモル−、「ｍＭ」はミリモル−、「Ｍ」はモル−、「mol」は−モル、「mmol」は−ミリモル、「μg」はマイクログラム、「ｍｇ」はミリグラム、「Ａ」はアデニン又はアデノシン、「Ｔ」はチミン又はチミジン、「Ｇ」はグアニン又はグアノシン、「Ｃ」はシチジン又はシトシン、「xg」は重力を掛ける、「nt」はヌクレオチド、「aa」はアミノ酸、「bp」は塩基対、「kb」はキロベース、「ｋ」はキロ、「μ」はマイクロ、「℃」は摂氏の温度、「Ｃ」は化学式の中では摂氏、「ＴＨＦ」はテトラヒドロフラン、「ＤＭＥ」はジメトキシエタン、「ＤＭＦ」はジメチルフォルムアミド、「ＮＭＲ」は核磁気共鳴、「psi」は平方インチ当たりのポンド、及び「ＴＬＣ」は薄層クロマトグラフィーを意味する。
【０２３２】
実施例１：化合物の調製
【０２３３】
[00223]本発明の化合物は、以下のような合成経路に従って製造できる。
【０２３４】
1.1 3,5-ジメチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(4-エチル-2-フルオロ-ベンゾイル)-ヒドラジド(RG-101523)の調製
【化６】
2014111634.tif 000015
【０２３５】
[00224]３ネックの２L丸底フラスコに、300ｍLの乾燥塩化メチレンに溶解した173.71g(1. 0mol、97％)の2-アミノ-2-メチル-1-プロパノールを加えた。フラスコには磁気撹拌棒と温度計を付け、ドライアイス/アセトン浴槽に置き、0℃に冷却した。反応温度を５℃未満に維持しながら、分離漏斗から300ｍLの塩化メチレンに溶解した4-エチルベンゾイル塩化物(168.5g、1.0mol)溶液を徐々に加えた。混合物は室温で一夜撹拌した。固体のプロパノール・アミンHClを濾過・除去し、濾塊は塩化メチレンで洗浄した。合わせた塩化メチレン抽出物は回転式蒸発装置で部分的に濃縮してから、直接次のステップで使用した。最初のステップで生成した中間体のアミド溶液は氷の浴槽で冷やし、DMF(0.5ｍL)を加えた。反応温度を0-5℃に保ちながら、50mLの塩化メチレンに溶かした125g(1.04mol)のSOCl2を添加速度をコントロールしながら分離漏斗から滴下した。反応物は室温で更に2-3時間撹拌した。反応混合物は氷の浴槽で冷やし、25％のNaOHを加えて水溶液層をアルカリ性(ｐH=11-12)にした。混合物は大型の分離漏斗へ移し、塩化メチレン層を分離し、水溶液層はクロロホルムで2回抽出した。合わせた有機層を乾燥し、蒸発させると、201gの黄色い粘性のある油である2-(4-エチル-フェニル)-4,4-ジメチル-4,5-ジヒドロ-オキサゾールが得られた。1HNMR (CDCl3, 300 MHz), δ(ppm): 7.8 (d, 2H), 7.2 (d, 2H), 4.088 (s,2H), 2.68 (q, 2H), 1.375 (s, 6H),1.24 (t, 3H).
【化７】
2014111634.tif 000016
【０２３６】
[00225]4-エチルフェニルオキサゾリン(2.03g、10mmol)を60℃の真空オーブンで2-3時間乾燥し、50ｍLの乾燥THFに溶解し、温度計、窒素取り入れ口、そして磁気撹拌棒の付いた300ｍLの丸底フラスコに移した。混合物は窒素中、ドライアイス/アセトン浴槽で‐70℃に冷却した。ブチル・リチウム・ヘキサン溶液(7.5ｍL、0.012mmol)を2度に分けて加え、2時間かけて‐25℃まで温めた。混合物は再び‐65℃に冷やし、N-フルオロベンゼンスルホンイミド(3.79g、0.012mmol)を3度に分けて加えた。混合物は室温まで温め、一夜撹拌した。反応混合物には100ｍLの飽和NH4Clを加え、エチルエーテル洗浄液と一緒に分離漏斗へ移した。25％のNaOHを徐々に加え、水溶液層がｐH=10になるまで混合した。水溶液層はエーテルで抽出し、そのエーテルは少量の水で洗浄した。エーテル抽出物はMgSO4上で乾燥し、蒸発させると、茶色の油である2.51ｇの2-(2-フルオロ-4-エチル-フェニル)-4,4-ジメチル-4,5-ジヒドロ-オキサゾールが得られた。第2の実験では、70％(最高)のフッ素化が達成され、反応物の構成比はオキサゾリン：BuLi：N-フルオロベンゼンスルホンイミド＝１：1.5：1.5であった。1HNMR(300 MHz, CDCl3) δ (ppm): 7.0 (d, 2H), 7.78 (t, 1H), 4.1 (s,2H), 2.7(q, 2H), 1.39 (s, 6H), 1.2 (t, 3H).
【化８】
2014111634.tif 000017
【０２３７】
[00226]DMSO(４ｍL)とCH3I(２ｍL)を丸底フラスコ内のオキサゾリン2.31gに加え、混合物を室温で一夜撹拌した。ヨウ化メチルを回転式蒸発装置を用い真空中で除去した。KOH水溶液(35ｍLの水に4.4ｇ)を加え、混合物を8時間還流した。反応混合物と洗浄水は分離漏斗へ移し、中性成分はクロロホルム抽出で除去した。水溶液の混合物は６NHClでｐH1-2になるまで酸性化し、エーテルで抽出した。エーテル抽出物はMgSO4上で乾燥し、蒸発させると、1.2ｇの白色固体である２-フルオロ-4-エチル安息香酸と4-エチル安息香酸が得られた。混合生成物はKOHに溶解し、ｐH＝７になるよう２NHClで調製した。混合物は激しく撹拌し、ｐHメーターで慎重にモニターしながら、0.1N HClでｐH=5に酸性化した。4-エチル安息香酸がまず沈殿したので、それをワットマン濾紙＃541で濾過し、0.1NHClでｐH=4.9まで酸性化を続け、ｐH=4.3になるまで0.1ずつ上げていき、0.1上がる毎にワットマン濾紙＃541で固形物を濾過した。最終的に、混合物はｐH=2.5まで酸性化し、濾過した。酸性度が上がる毎に沈殿物に含まれる２-フルオロ-4-エチル安息香酸の量は増えていき、最後の２つの画分には98-100％の目的の生成物が含まれていた。残りの水溶液層をエーテルで抽出すると、２-フルオロ-4-エチル安息香酸が更に回収された。生成物は空気乾燥した。真空オーブンでの乾燥は、揮発性の故に、生成物を大量に損失するからである。1HNMR (300 MHz, CDCl3) δ =7.95 (t, 1H), 7.1 (d, 1H), 7.0 (d, 1H),2.71 (q, 2H), 1.27 (t, 3H). 4-エチル安息香酸：1H NMR (CDCl3)δ(ppm): 8.1 (d, 2H), 7.3 (t, 2H), 2. 71 (q, 2H), 1.27 (t, 3H)
【化９】
2014111634.tif 000018
【０２３８】
[00227]1.31g(1.3mmol)の塩化チオニル、1滴のDMF、そして1.0ｇ(5.95mmol)の酸を撹拌しながら30ｍLのトルエンに加えた。混合物は4時間還流した。その後、トルエンと未反応の塩化チオニルは蒸留で除去した。その結果生じた２-フルオロ-4-エチルベンゾイル塩化物は、精製せずに使用した。
【化１０】
2014111634.tif 000019
【０２３９】
[00228]0.150gの3,5-ジメチル安息香酸N-tert-ブチル-ヒドラジド(１当量、0.68mmol)、及び0.110ｍL(1.2当量、0.77mmol)の２-フルオロ-4-エチルベンゾイル塩化物を秤量し、1オンスの小瓶に入れた。小さい撹拌棒を入れ、その後２mLの塩化メチレンを加えた。混合物はヒドラゾンが溶解するまで撹拌した。撹拌を止め、2ｍLの１M炭酸カリウム(K2CO3)溶液を加えた。混合物は一夜撹拌した。その後、１ｍLの水と１ｍLの塩化メチレンを加えた。水溶液層は除去し、有機層を１Mの炭酸カリウム溶液で2度洗浄した。有機層は除去し、硫化マグネシウム上で乾燥した。有機層は塩基アルミナ・パッドを通して濾過し、溶媒は除去した。生成物である3,5-ジメチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(2-フルオロ-4-エチルベンゾイル)-ヒドラジドは、エーテル：ヘキサン(１：１)を使って粉砕法で精製した。1HNMR (300 MHz, CDCl3) δ(ppm): 7.7 (m, 2H), 7.6 (t, 1H),7.0 (m, 3H),2.6 (q, 2H), 2.3 (s, 3H), 2.1 (s, 6H), 1.5 (s, 9H), 1.1 (t, 3H).
【０２４０】
1.2    5-クロロ-4H-ベンゾ[1,3]ジオキシン-6-カルボン酸の調製
【化１１】
2014111634.tif 000020
【０２４１】
[00229]5-クロロと7-クロロ異性体をシリカゲル・カートリッジ・クロマトグラフィーで分離した。混合物をCHCl3/CH3OHに溶解し、大型カートリッジの上部に加えた。5-クロロ異性体がエーテル：ヘキサン(2：3)で溶出し、7-クロロ異性体はエーテル：ヘキサン(3： 2)で溶出を開始し、ニート・エーテルで溶出を完了した。1HNMR (DMSO-d6, 300 MHz)δ(ppm): 7.75(d, 1H), 6.95 (d, 1H), 5.3 (s, 2H), 4.9 (s, 2H).
【０２４２】
1.3    2-フルオロ-4-ヒドロキシ安息香酸の調製
【化１２】
2014111634.tif 000021
【０２４３】
[00230]160ｍLの水に溶解した2-フルオロ-4-ヒドロキシベンゾニトリル(20.00g、145.9mmol)溶液を撹拌しながら、5％の水酸化ナトリウム水溶液(40.00g、500.0mmol)を加えた。混合物は加熱し4時間還流してから、室温まで冷やし、氷冷した濃塩酸に注ぎ、エーテルで抽出した。生成物は飽和重炭酸ナトリウム水溶液で抽出し、エーテル層は廃棄した。水溶液抽出物は濃塩酸で酸性化し、エーテルで抽出した。有機抽出物を硫酸マグネシウム上で乾燥し、濾過し、蒸発させると、白色固体である2-フルオロ-4-ヒドロキシ安息香酸(22.90g)が得られた。収率100％。1HNMR(300 MHz, CD3COCD3) δ (ppm): 9.80 (b, 1H), 7. 87 (t,1H),6.77 (dd, 1H), 6.66 (dd, 1H).  19F-NMR(300 MHz, CD3COCD3)δ (ppm): -108.13 (s, デカップリング)。2-フルオロ-4-ヒドロキシベンゾニトリル:1H-NMR (300 MHz,CD3COCD3) δ (ppm): 7.61 (t,1H), 6.81 (m, 2H), 5.80 (b,1H).  19F-NMR(300 MHz, CD3COCD3) δ(ppm):-108.82 (s, デカップリング)
【０２４４】
1.4    5-フルオロ-4H-ベンゾ[1,3]ジオキシン-6-カルボン酸、メチルエステル及び6-フルオロ-4H-ベンゾ[1,3]ジオキシン-7-カルボン酸、メチルエステルの調製
【化１３】
2014111634.tif 000022
【０２４５】
[00231]1.6gのメチル-2-フルオロ-4-ヒドロキシ-安息香酸塩(7.54mmol)、0.157gのp-トルエンスルホン酸(0.9mmol)、50ｍLのトルエン、そして1.2gのパラホルムアルデヒド(40mmol)を混合し、3時間還流した。その後、TLC(酢酸エチル：CH2Cl2＝1：1)により、出発物質の不在が示された。時々反応を冷却し、反応フラスコの壁から未反応のパラホルムアルデヒドを掻き落とす必要がある。反応フラスコは排気装置を使って換気した。混合物を濾過し固体のパラホルムアルデヒドを除去した後、その固体は100ｍLのトルエンで2度洗浄した。トルエン洗浄液は濾液と合わせた。有機溶液は75ｍLの５％NaOH水溶液で3度洗浄した。有機層に50ｍLのメタノールを加え、溶媒を回転式蒸発装置で除去すると、粘度の高いシロップ状の物質が得られたが、それは次第に少々粘着性のある白色の固体となった。陽子及び19FNMRにより、２つの異性体が約7：3の割合で存在する事が示された。この異性体は、シリカゲル・カラムクロマトグラフィーを使って慎重に行なえば、ヘキサン-85％ヘキサン/15％エーテルのグラジエント法で分離が可能である。目的の3,4メチレンジオキシ-2-フルオロ安息香酸メチルエステルがまず白色固体として溶出した。1HNMR (CDCl3, 300 MHz)δ(ppm): 3.85 (s, 3H), 4.85 (s, 2H), 5.20 (s,2H), 6.60 (d, 1H), 7.80 (t,1H).  19FNMR (ppm, CDCl3) -115 (s); Rf = 0.4 (1:1 CH2Cl2:EtOAc).
【０２４６】
[00232]4,5-メチレンジオキシ異性体もその後白色固体として溶出した。1HNMR (CDCl3, 300 MHz)δ(ppm): 3.90 (s, 3H), 4.85 (s, 2H), 5.25 (s,2H), 6.65 (d, 1H), 7.60 (d,1H).  19FNMR (ppm, CDCl3) -108 (s). ); Rf = 0.32(1:1 CH2Cl2: EtOAc).
【０２４７】
1.5    5-フルオロ-4H-ベンゾ[1,3]ジオキシン-6-カルボン酸、及び6-フルオロ-4H-ベンゾ[1,3]ジオキシン-7-カルボン酸の調製
【化１４】
2014111634.tif 000023
【０２４８】
[00233]5-フルオロ-4H-ベンゾ[1,3]ジオキシン-6-カルボン酸メチルエステル(2.02g)、水(１ｍL)、メタノール(20ｍL)、そして水酸化ナトリウム(１ｍLの50％NaOH溶液)を冷却器及び磁気撹拌棒の付いたフラスコに加えた。撹拌を開始し、混合物を2時間還流した。この時点で、TLC(CH2Cl2：酢酸エチル＝1：1)は、出発物質であるエステルが存在していない事を示していた。溶媒を除去すると、白色の固体が残った。その固体を水に入れ、水の層を50ｍLのエーテルで3度洗浄した。水溶液の層は希塩酸で酸性化すると、白色の沈殿物が生じた。この白色の固体を焼結ガラス製の濾過用漏斗に集め、脱イオン化した水で良く洗浄した。この固体は、真空下60℃で一夜乾燥し、精製しないで次の反応に使用した。
【０２４９】
1.6    5-フルオロ-4H-ベンゾ[1,3]ジオキシン-6-カルボン酸N’-tert-ブチル-ヒドラジド、及び5-フルオロ-4H-[1,3]ジオキシン-7-カルボン酸N-tert-ブチル-N’-(5-フルオロ-4H-ベンゾ[1,3]ジオキシン-6-カルボニル)-ヒドラジドの調製
【化１５】
2014111634.tif 000024
【０２５０】
[00234]1.6gの5-フルオロ-4H-ベンゾ[1,3]ジオキシン-6-カルボン酸(8.1mmol)、30ｍLのトルエン、そしてDMF1滴を磁気撹拌棒、スクラッパ、そして冷却器の付いた100ｍLフラスコに入れた。0.59ｍLの塩化チオニル(0.96g、9.7mmol)を加え、混合物を加熱し、4時間還流を続けた。その後、混合物を僅かばかり冷やし、冷却器を蒸留装置に置き換えた。過剰の塩化チオニルは蒸留で除去した。混合物は20℃に冷やし、回転式蒸発装置を使ってトルエンを除いた。注：トルエン除去の際は注意が必要。温度が27℃を超えると、真空下で、5-フルオロ-4H-ベンゾ[1,3]ジオキシン-6-カルボニル塩化物の蒸留が始まる。50％NaOH(0.648g、8.1mmol)を３ｍLの水に溶解し、磁気撹拌棒及び試薬添加用のゴム製隔壁の付いた反応フラスコに加えた。1.00g(8.1mmol)のtert-ブチルヒドラジンHClを加えた。混合物は室温で5分撹拌してから‐5℃に冷やした。5-フルオロ-4H-ベンゾ[1,3]ジオキシン-6-カルボニル塩化物(8.1mmol)を25ｍLのジクロロメタンに溶解し、３ｍLの水に溶かした0.648g(8.1mmol)の50％NaOH(第2部分)と一緒に加えた。添加中、反応温度は‐2℃未満に維持した。混合物は‐5℃乃至‐2℃で30分撹拌した。その後、混合物を室温まで温め、30分撹拌した。50ｍLのジクロロメタンと50ｍLの水を反応混合物に加えた。有機層はMgSO4上で乾燥し、濾過した。溶媒を除去すると、2.4gの黄色いシロップが得られた。NMR分析によれば、目的生成物の約85％であると思われた。精製された生成物である5-フルオロ-4H-ベンゾ[1,3]ジオキシン-6-カルボン酸N’-tert-ブチル-ヒドラジドは、4：１ジクロロメタン/酢酸エチル・グラジエント法を使ったシリカゲル・カラムクロマトグラフィーを慎重に行なうことにより、淡黄色の固体として単離された。1HNMR (CDCl3, 300 MHz)δ(ppm): 0.85 (s, 9H), 4.58, (s, 2H), 4.90 (s,2H), 6.40 (d, 1H), 7.50 (t, 1H)and 7.70 (br s, 1H).  19F NMR (CDCl3), δ ppm: (s, ‐190,s)。Rf = 0.35(1：1 CH2Cl2：酢酸エチル)
【０２５１】
1.7    2-ブロモメチル-3-メトキシ-安息香酸メチルエステルの調製
【化１６】
2014111634.tif 000025
【０２５２】
[00235]２Lの３ネック丸底フラスコに75ｇ(0.42mmol)の2-メチル-3-メトキシメチル安息香酸塩、500ｍLのCCl4、80.1g(0.45mol)のNBS、そして1gのAIBNを加えた。混合物は撹拌し、2時間徐々に還流した。反応混合物は冷却し、約600ｍLのCH2Cl2と500ｍLの水を加えた。混合物は撹拌して浮かんでいる固形物を溶解し、２Lの分離漏斗へ移し振盪した。有機層は分離し、水の層をCH2Cl2で抽出した。水溶液の層は廃棄し、有機層を400-500ｍLの水で抽出しNBSを除去した(注：サクシンイミドの溶解度は1g/3gの水、NBSの溶解度は1.47g/100mLの水)。水抽出を繰り返し、有機層はMgSO4と木炭上で乾燥し、溶媒は2度蒸発させ、メチル-3-メトキシ-2-ブロモメチル安息香酸塩を得た。TLC：RF＝0.58、単一のスポット(1:1酢酸エチル：ヘキサン)。1HNMR (CDCl3, 300 MHz)δ(ppm): 7.5 (d, 1H), 7.3 (t, 1H), 7.05 (d, 1H),5.06 (s, 2H), 3.94 (s, 3H), 3.93(s, 3H).
【０２５３】
1.8    4-メトキシ-3H-イソベンゾフラン-1-オン
【化１７】
2014111634.tif 000026
【０２５４】
[00236]500ｍLの丸底フラスコに15.15ｇ(0.0585mol)の2-ブロモメチル,3-メトキシメチル安息香酸塩、29.3g(0.293mol)のCaCO3、150ｍLのジオキサン、そして150ｍLの水を加えた。フラスコは油の浴槽に入れ、混合物は撹拌しながら85℃で3.5乃至4時間加熱した。CaCO3は濾過・除去し、酢酸エチルと水で洗浄した。濾液に酢酸エチル(200ｍL)と水(50ｍL)を加え、混合物は分離漏斗で振盪した。水の層は酢酸エチル(50ｍL)で2度抽出した。酢酸エチル抽出物は一緒にし、水で1度抽出し、MgSO4上で乾燥し、蒸発させた。その結果、9. 2ｇの白色結晶である7-メトキシベンゾールアクトンが得られた(収率95％)。1HNMR (CDCl3, 300 MHz) δ(ppm): 7.5 (m, 2H), 7.1 (m, 1H), 5.26 (s,2H), 3.93 (s, 3H).  TLC: Rf =0.46 (１：１EtOAC：ヘキサン)。
【０２５５】
1.9    2-シアノメチル-3-メトキシ安息香酸の調製
【化１８】
2014111634.tif 000027
【０２５６】
[00237]500ｍLの３ネック丸底フラスコに10ｇ(61.75mmol)の2-ブロモメチル,3-メトキシメチル安息香酸塩、4.0ｇ(81.6mmol)のNaCN、0.30ｇ(2mmol)のNaI、100ｍLのCH3CN、そして50ｍLのDMFを加えた。反応混合物は加熱し、10時間還流した。沈殿物(NaBr)は濾過・除去し、溶液は蒸発装置で濃縮した。300ｍLの水と200ｍLのエーテルを加え、分離漏斗で振盪した。水の層は100ｍLのエーテルで2度抽出した。エーテル画分をMgSO4上で乾燥し、濃縮すると、メチル-3-メトキシ-2-シアノメチル安息香酸塩が得られた(収率95-100％)。このエステル(0.053mmol、10.51ｇ)を100ｍLのCH3OH中で激しく撹拌した。Ba(OH)2H2O(0.079mmol、10.51g)を加え、混合物を室温で一夜撹拌した。CH3OHは回転式蒸発装置で除去した。150ｍLの水、200ｍLのCH2Cl2、そして50ｍLの６NHClを加え、フラスコ内で撹拌し、残渣を全て溶解した。混合物は分離漏斗へ移し、６N HClでｐH=1-2まで酸性化した。CH2Cl2層は分離し、水溶液の層を50ｍLのCH2Cl2で2度抽出した。CH2Cl2抽出物は一緒にし、MgSO4及び木炭上で乾燥し、濾過し、蒸発させると、8.8ｇの白色の固体である2-シアノメチル-3-メトキシ安息香酸が得られた(87％)。
【０２５７】
[00238]メチル-3-メトキシ-2-シアノメチル安息香酸塩：1HNMR (CDCl3, 300 MHz) δ(ppm): 7.6 (d, 1H), 7.4 (t, 1H),7.1 (d, 1H),4.18 (s, 2H), 3.94 (s, 3H), 3.926 (s, 3H). TLC (１：１酢酸エチル：ヘキサン) 0.55
【０２５８】
[00239]2-シアノメチル-3-メトキシ安息香酸：1HNMR (300 Mhz, CDCl3) δ(ppm): 7.55 (d, 1H), 7.45 (t, 1H), 7.3 (d,1H), 4.121 (d, 2H), 3.91, (s, 3H).TLC (１：１酢酸エチル：ヘキサン)、Rf0.36条線
【０２５９】
1.10    3-メトキシ-2-メチルスルファニルメチル-安息香酸、及びペンタフルオロフェニル-2-(メチルチオメチル)-3-メトキシ安息香酸塩の調製
【化１９】
2014111634.tif 000028
【０２６０】
[00240]メチル-2-ブロモメチル-3-メトキシ安息香酸塩を1.02当量のナトリウム・メチルメルカプチドと一緒に、メタノール中、室温で撹拌した。GC分析に基づけば30分後に反応は完了した。混合物は水に注ぎ、酢酸エチルで2度抽出した。合わせた有機層を真空処理(ストリッピング)すると、メチル2-(メチルチオメチル)-3-メトキシ安息香酸塩が淡黄色の油として残った(収率約86％)。GC：DB-5、30分、フィルム：0.25um,tinit =1.00 T=120-280C@20C/min; Rt = 6:30area%=98.  1H NMR (CDCl3, 300MHz) δ(ppm): 7.46 (d,1H), 7.26 (t, 1H), 7.03 (d, 1H), 4.18 (s, 1H), 3.90 (s,2H), 3.89 (s, 3H), 2.04(s, 3H)。
【０２６１】
[00241]メチル2-(メチルチオメチル)-3-メトキシ安息香酸塩を10％の水溶性メタノールに溶解した1.5当量のNaOHと一緒に、1.5時間加熱・還流した。溶液は過剰の10％硫酸に滴下した。沈殿物は濾過し、空気乾燥すると、収率約92％で2-(メチルチオメチル)-3-メトキシ安息香酸が得られた。TLC(２：１酢酸エチル：ヘキサン)は、単一スポット(Rf0.50)を示していた。
【０２６２】
[00242]2-(メチルチオメチル)-3-メトキシ安息香酸を酢酸エチルに溶解し、1.1当量のペンタフルオロフェノール/1.1当量のジシクロヘキシカルボジイミドの酢酸エチル溶液に加えた。1時間後、混合物を濾過し、母液は真空処理(ストリッピング)した。黄色の油状残渣はヘキサンを使って結晶化し、生成物であるペンタフルオロフェニル2-(メチルチオメチル)-3-メトキシ安息香酸塩を得た。収率100％。TLC(２：１酢酸エチル：ヘキサン)は、単一スポット(Rf0.58)を示していた。
【０２６３】
1.11    3-メトキシ-2-メトキシメチル安息香酸の調製
【化２０】
2014111634.tif 000029
【０２６４】
[00243]50ｍLのCH3OHに溶解した10.1ｇ(0.039mol)のメチル2-ブロモメチル-3-メトキシ安息香酸塩を入れた100ｍLのフラスコに、19ｇのNaOMe25％重量(4.74ｇ、0.087mol)溶液を加えた。反応物は室温で2時間撹拌し、回転式蒸発装置で蒸発させてCH3OHを除去した。約200ｍLの水を残渣に加え、その結果得られた溶液をCHCl3で抽出した。CHCl3抽出物を乾燥し、蒸発させると、6.27ｇの粗メチル3-メトキシ-2-メトキシメチル安息香酸塩を得た(収率77％)。1HNMR (CDCl3, 300 MHz) δ(ppm): 7-7.4 (複数, 3H), 4.783 (s, 2H), 3.897(s, 3H),3.864 (s, 3H), 3.37 (s, 3H). 6.27ｇのメチル3-メトキシ-2-メトキシメチル安息香酸塩を20％のKOH水溶液(34gの溶液中6.7ｇ、0.12mol)と一緒に、油の浴槽中、50℃で4-5時間、次に室温で16時間撹拌した。反応混合物は３NHClでｐH2まで酸性化し、CH2Cl2で抽出した。CHCl3抽出物を乾燥し、蒸発させると、5.35ｇの3-メトキシ-2-メトキシメチル安息香酸が得られた(収率92％)。1HNMR (CDCl3, 300 MHz) δ(ppm): 7.65 (1H, d), 7.40 (t, 1H), 7.10 (d,1H), 4.83 (s, 2H), 3.88 (s, 3H),3.46 (s, 3H)
【０２６５】
1.12    N’-t-ブチル-3-メトキシ-2-メトキシメチルフェニルヒドラジドの調製
【化２１】
2014111634.tif 000030
【０２６６】
[00244]丸底フラスコに入った4.30ｇ(0.0219m)の3-メトキシ-2-メトキシメチル安息香酸の50ｍL酢酸エチル溶液に、8.88ｇのペンタフルオロフェニル・フェノール50％重量溶液、次に21.91ｍLのDCC溶液(0.0219ｍ)を加えた。室温で2時間撹拌後、TLCは、目的のペンタフルオロフェニル・エステル生成物のスポットをRf＝0.64(１：１酢酸エチル：ヘキサン)に、出発物質である酸のスポットをRf=0.39に示していた。
【０２６７】
[00245]少量の酢酸エチル(30ｍL)と茶匙量の無水MgSO4を加え、濾過してDCC及びDCUを除去した。濾液を蒸発させると、9.4gの生成物が得られた。1HNMR (CDCl3, 300 MHz) δ (ppm): 3.39 (s, 3H), 3.90 (s,3H), 4.81 (s,2H).  出発物質のNMR分析は次のスペクトルを示していた：1H NMR (CDCl3, 300 MHz)δ(ppm):4.83 (s, 2H), 3.88 (s, 3H), 3.4 (s, 3H).
【０２６８】
[00246]残りのDCC及びDCUはシリカゲル・カラムクロマトグラフィーで除去した。生成物は6及び8％の酢酸エチル/ヘキサン画分で溶出した。収量7.08ｇには、ある量のDCC及びDCUが含まれていた。7.08ｇ(0.02mol)のペンタフルオロフェニル・エステルを含む60ｍLのCH2Cl2溶液を3.67ｇ(0.029mol)のt-ブチルヒドラジン、及び12gのK2CO3を含む60ｍLの水と一緒に、室温で一夜撹拌した。60ｍLのCH2Cl2と50ｍLの水を加え、分離漏斗で振盪した。有機層をMgSO4上で乾燥し、蒸発させると、5.6ｇのt-ブチルヒドラジドが得られた。1HNMR (CDCl3, 300 MHz) δ (ppm): 7.4 (d, 2H). 7.0 (t, 1H),4.627 (s,2H), 3.874 (s, 3H), 3.465 (s, 3H),1.184 (s, 9H)。TLC：(1：1酢酸エチル：ヘキサン)、Rf=0.16。生成物はヘキサンを使った粉砕法で更に精製可能である。
【０２６９】
1.13    3-メトキシ-2-メトキシメチル安息香酸の調製
【化２２】
2014111634.tif 000031
【０２７０】
[00247]1.0g(0.0061mol)のラクトンを20ｍLの7.5％NaOH及び20ｍLのCH3OHと一緒に、7時間還流させた。メタノールは回転式蒸発装置で除去した。ディーンスタークを設定し、トルエン中で還流させて水を共沸で除去した。トルエンは真空除去し、残渣は真空オーブンで乾燥した。1HNMR (DMSO, 300 MHz) δ (ppm): 3.74(s, 3H), 4.47 (s, 2H), 6.9 (d, 1H), 7.1 (t,1H), 7.2 (d, 1H).
【０２７１】
[00248]カルボン酸ナトリウムを15ｍLのDMFに溶解し、次にCH3I(0.87ｇ、0.0061mol)を加え、混合物を室温で一夜撹拌した。反応を鎮めるため、50ｍLの飽和NH4CLを加えた。250ｍLの水(この時点で溶液は塩基性)を加え、エーテルで抽出して中性及び塩基性の物質を除去した。残りの水溶液は３NHClでｐH=2まで酸性化し、目的のカルボン酸をエーテルで抽出した。エーテル抽出物を乾燥し、蒸発させると、0.55ｇの3-メトキシ-2-ヒドロキシメチル安息香酸塩(ナトリウム塩)と3-メトキシ-2-メトキシメチル安息香酸が得られた。1HNMR (CDCl3, 300 MHz) δ (ppm): 3.456 (s, 3H), 3.884 (s,3H), 4.832(s, 2H), 7.1 (d, 1H), 7.4 (t, 1H), 7.6 (d, 1H).
【０２７２】
1.14    2-アリルオキシメチル-3-メトキシ安息香酸の調製
【化２３】
2014111634.tif 000032
【０２７３】
[00249]1.0ｇ(0.005mol)の3-メトキシ-2-ヒドロキシメチル安息香酸ナトリウム塩を1.68ｇ(0.01mol)のヨウ化アリル及び50ｍLのジオキサンと一緒に200ｍLのフラスコに入れ、2時間還流した。混合物は室温で一夜撹拌した。水を加え、5％のNaOH水溶液でｐH=10-11にし、混合物をエーテルで抽出した。エーテルを蒸発させると、ジアリル生成物が得られた (0.34ｇ)。１HNMRは、芳香族の陽子の他に、複雑なアリル・シグナルを示していた。水溶液を３N HCLで酸性化し、100ｍLのエーテルで2度抽出すると、3-メトキシ-2-アリルオキシ安息香酸とアリル3-メトキシ-2-アリルオキシ安息香酸塩が得られた(0.34ｇ)。1HNMR (CDCl3, 300 MHz) δ (ppm): 3.879 (s, 3H), 4.11 (d,2H), 5.3 (q,2H), 5.9-6.0 (m, 1H)。TLC：(1：1酢酸エチル：ヘキサン)：ジアリル、Rf0.60．モノアリル、Rf0.31、条線。
【０２７４】
1.15    メチル-3-メトキシ-2-アリルオキシメチル安息香酸塩の調製
【化２４】
2014111634.tif 000033
【０２７５】
[00250]25ｍLの丸底フラスコに、0.96ｇ(0.0165mol)のアリルアルコールと３ｍLのDMFを加えた。氷の浴槽でフラスコを冷やしながら、磁気撹拌しつつ、0.80ｇの60％分散NaH(0. 020ｍ、0.48ｇ)を加えた。反応混合物は室温で45分撹拌した。フラスコは氷の浴槽へ置き、２ｇのDMF及び3.89ｇ(0.015ｍ)のメチル2-ブロモメチル-3-メトキシ安息香酸塩を少量ずつ加えた。反応物は室温で4-5時間撹拌した。反応物は150ｍLのエチルエーテル及び50ｍLの水と一緒に分離漏斗へ移した。反応混合物を振盪し、エーテル層を分離し、水の層はもう一度50ｍLのエーテルで抽出した。エーテル層を水(20ｍL)で抽出し、MgSO4上で乾燥し、濃縮すると、2.7ｇの淡黄色の油が得られた(収率76％)。1HNMR(CDCL3, 300 MHz)δ (ppm): 7.3 - 7.0 (m, 3H), 5.9 - 6.0 (m, 1H),5.1 -5.3 (2d, 2H), 4.8 (d, 2H), 4.02 (d, 2H), 3.90 (s, 3H), 3.88 (s, 3H).  TLC(1：1酢酸エチル：ヘキサン)、Rf0.58.
【０２７６】
1.16    2-アリルオキシメチル-3-メトキシ安息香酸の調製
【化２５】
2014111634.tif 000034
【０２７７】
[00251]5.40ｇ(0.0229ｍ)の3-メトキシ-2-アリルオキシメチル安息香酸塩の入った200ｍLの丸底フラスコに、40ｍLのメチルアルコールを加えた。磁気撹拌しながら、6.50ｇ(0.034ｍ)の水酸化バリウム一水和物を加えた。反応物は水浴中、45℃で4時間撹拌した。反応フラスコは回転式蒸発装置へ移し、メタノールを真空除去した。フラスコ内の残渣に150ｍLの水を加え、残渣の大半が溶解するまで混合物を撹拌した。反応混合物は、水(50-100ｍL)と一緒に大型ビーカーへ移した。反応混合物は塩析を行い、100ｍLの酢酸エチルで3度抽出した。酢酸エチル抽出物を乾燥し、蒸発させると、4.38ｇの粘着性のある生成物、2-アリルオキシメチル-3-メトキシ安息香酸が得られた(収率98％)。1HNMR(CDCL3, 300 MHz) δ(ppm): 7.55 (d, 1H), 7.40 (t, 1H), 7.1 (d,1H), 6.0- 5.9 (m, 1H), 5.4 - 5. 2 (2d, 2H), 4.87 (d, 2H), 4.10 (d, 2H), 3.878(s,3H).  TLC (1：1酢酸エチル：ヘキサン)  Rf0.38。
【０２７８】
1.17    ペンタフルオロフェニル-2-アリルオキシメチル-3-メトキシ安息香酸塩の調製
【化２６】
2014111634.tif 000035
【０２７９】
[00252]200ｍLの丸底フラスコに、6.6ｇ(0.0297mol)の2-アリルオキシメチル-3-メトキシ安息香酸と40ｍLの酢酸エチルを加えた。撹拌しながら、24.05ｇの25％ペンタフルオロフェノール(6.01ｇ、0.0327mol)酢酸エチル溶液を加えた。反応フラスコを水浴中に入れ、撹拌しながら、DCC(6.2ｇ、0.030mol)を少しずつ加えた。撹拌は室温で一夜継続した。反応物はワットマン濾紙＃541で2度濾過し、DCU沈殿物を除去した。酢酸エチル溶液を濃縮すると、12.8ｇ(収率110％)が得られ、DCCとDCUの存在を示していた。この点は、Rf値0.72の他に極性の劣る化合物の存在を示すTLC(1：1酢酸エチル：ヘキサン)により確認された(I2染色法は約85％の純度を示していた)。1H NMR(CDCl3, 300 MHz) δ(ppm):7.7 (d, 1H), 7.45 (t, 1H), 7.15 (d, 1H), 6.0- 5.9 (m, 1H), 5.3 - 5.1 (2d, 2H),4.88 - 4. 83 (d, 2H), 4.06 (d, 2H), 3.90 (s,3H).
【０２８０】
1.18    2-アリルオキシメチル-3-メトキシ安息香酸N’-tert-ブチル-ヒドラジドの調製
【化２７】
2014111634.tif 000036
【０２８１】
[00253]18.9ｇ(0.048ｍ)のペンタフルオロフェニル・エステルを含む50ｍLのCH2Cl2溶液の入った丸底フラスコに、9.1ｇ(0.73m)のt-ブチルヒドラジンHCl、次に20.16ｇ(0.146m)のK2CO3を含む50ｍLの水溶液を加えた。混合物を室温で24時間撹拌した。50ｍLの水を加え、CH2Cl2層を分離し、水の層を100ｍLのCH2Cl2で2度抽出した。CH2Cl2画分をMgSO4上で乾燥し、濃縮すると、9.75ｇのN-2-アリルオキシメチル-3-メトキシフェニル-N’-t-ブチルヒドラジドが得られた。1HNMR (CDCl3, 300 MHz) δ (ppm): 1.151 (s, 9H), 3.87 (s,3H), 4.12 (d,2H), 4.68 (s, 2H), 5.15-5.35 (q, 2H), 5.19 (m, 1H), 7.0 (t, 1H),7.4 (d,2H).  TLC：(1：1酢酸エチル：ヘキサン)  Rf=0.25.
【０２８２】
1.19    3,5-ジメチル安息香酸N’-(2-アリルオキシメチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-N-tert-ブチル-ヒドラジド(RG-115003)の調製
【化２８】
2014111634.tif 000037
【０２８３】
[00254]２ｇ(0.0068mol)の2-アリルオキシメチル-3-メトキシ安息香酸N’-tert-ブチル-ヒドラジドを溶解した15ｍLのCH2Cl2を含むフラスコに、1.27ｇ(0.0075mol)の3.5-ジメチルベンゾイル塩化物を含む10ｍLのCH2Cl2溶液と2.84ｇのK2CO3(0.02mol)を含む30ｍLの水溶液を加えた。混合物は室温で24時間撹拌した。反応混合物は希釈し、分割し、有機層は乾燥して溶媒を真空除去した。生成物はシリカゲル・カラムクロマトグラフィーで精製した。25％の酢酸エチル：ヘキサン画分で溶出すると、2.40ｇの精製された3,5-ジメチル安息香酸N’-(2-アリルオキシメチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-N-tert-ブチル-ヒドラジドが得られた。1HNMR (CDCl3, 300 MHz) δ (ppm): 7.2 (t, 1H,) 7.1 (s, 1H),7.05 (d,2H), 6.95 (m, 2H), 5.9 (m, 1H), 5.2-5.3 (q, 2H), 4.5 (d, 2H), 3.9 (m,2H), 3.80(s, 3H), 2.245 (s, 6H), 1.547 (s, 9H).
【０２８４】
1.20    3,5-ジメチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(2-ヒドロキシメチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド(RG-115371)の調製
【化２９】
2014111634.tif 000038
【０２８５】
[00255]1.57ｇのアリル・エーテルを50ｍLのCH3OHに溶解した。600mgのPd/C及び20滴の1％HClO4/H2Oを加え、4時間還流した。CH2Cl2(70ｍL)と茶匙一杯の無水MgSO4を加え、濾過
した。濾液を蒸発乾固すると、1.62ｇの粗ベンジルアルコールが得られた。生成物をシリカゲル・カラムクロマトグラフィーで精製した。50-60％の酢酸エチル/ヘキサンで溶出すると、1.25ｇの白色固体である3,5-ジメチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(2-ヒドロキシメチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジドが得られた。1HNMR (CDCl3, 300 MHz)δ(ppm): 7.1 (t, 1H), 7.05 (s, 2H), 6.98 (s,1H), 6.9 (d, 1H), 6.5 (d, 1H), 4.2(q, 2H), 3.79 (s, 3H), 2.23 (s, 6H), 1.57(s, 9H).  TLC (1：1酢酸エチル：ヘキサン)  Rf=0.20.
【０２８６】
1.21    3,5-ジメチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(2-クロロメチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド(RG-115490)の調製
【化３０】
2014111634.tif 000039
【０２８７】
[00256]50ｍLの丸底フラスコに、400mg(0.00315mol)の塩化オキサリルと５ｍLのCH2Cl2を加えた。混合物は撹拌し、アセトン/ドライアイス浴槽で‐70℃に冷却した。616-620mg(0.0079mol)のDMSOを含む５ｍLのCH2Cl2溶液を徐々に加え、‐70℃で30分間撹拌した。405mg(0.00105mol)のRG-115371を含む４ｍLのCH2Cl2溶液を加え、‐70℃で30分間撹拌した。ドライアイスの浴槽を除き、混合物を30分かけて室温まで温めた。混合物は再び‐70℃まで冷却し、1.60ｇ(0.158mol)のトリエチルアミンを加えてから、室温まで温めた。反応を鎮めるため６ｍLの水を加えた。CH2Cl2をフラスコに加え、合計100ｍLのCH2Cl2と一緒に分離漏斗へ移した。50ｍLの水を加え、水溶液の層はもう一度CH2Cl2で抽出した。CH2Cl2抽出物は希(0.05‐0.1N)HCl/H2Oで抽出し、Et3NとDMSOを除去した。CH2Cl2抽出物を乾燥し、濃縮すると、約0.44ｇの生成物が得られた。TLC：Rf=0.47。生成物はシリカゲル・カラムクロマトグラフィーを使い、35−40%の酢酸エチル・ヘキサン溶液で溶出すれば精製できる。1HNMR (CDCl3, 300 MHz)δ(ppm): 8.0 (s, 1H), 6.9-7.2 (t,s,s,d, 5H),6.35 (d, 1H), 4.5 (d, 1H), 4.1 (d,1H), 3.85 (s, 3H), 2.28 (s, 6H), 1.59 (s,9H).
【０２８８】
1.22    3,5-ジメチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(2-ヨードメチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジドの調製
【化３１】
2014111634.tif 000040
【０２８９】
[00257]400mgのRG-115490を含む50ｍLのフラスコに、10ｍLのCH3CN、１ｍLのDMF、そして100mgのNaIを加えた。混合物は4時間還流した。反応物は、分離漏斗に入っている250ｍLのエーテル及び75ｍLの水に注いだ。混合物は激しく振盪し、エーテル層を約50ｍLの水で抽出した。エーテル抽出物はMgSO4及び木炭上で乾燥し、濾過し、溶媒を除去すると、250mgの黄色の固体が得られた。TLCRf＝0.50 (1：1酢酸エチル：ヘキサン)。1H NMR (CDCl3, 300 MHz)δ(ppm):6.9-7.3 (m, 6H), 6.3 (d, 1H), 4.3 (d, 1H), 4.2 (d, 1H), 3.88 (s, 3H),2.28 (s,6H), 1.62 (s, 9H)
【０２９０】
1.23    3,5-ジメチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(2-メチルアミノメチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジドの調製
【化３２】
2014111634.tif 000041
【０２９１】
[00258]300mgのRG-115490を15ｍLのジオキサン(99.8％無水、アルドリッチ(Aldrich))に溶解した溶液を含む小さいフラスコに、CH3NH2ジオキサン溶液(４当量)を加えた。反応物は2時間還流した。溶媒はrotovap上で除去し、CH2Cl2に再度溶解し、濾過し、CH2Cl2可溶物質を濃縮した。メチルアミンは、カラムクロマトグラフィーを使い、まず酢酸エチルで溶出し、次に0.2%のトリエチルアミンを含む4：1酢酸エチル：ヘキサンをカラムに流した後、約0.2％のトリエチルアミンを含む9：1酢酸エチル：メタノールで溶出する事により得られた。生成物の全収量は183mg。TLC：Rf0.23(1：1酢酸エチル：ヘキサン＋トリエチルアミン)。1H NMR (CDCl3, 300 MHz),δ(ppm): 7.3-6.9 (m, 6H), 3.80 (s, 3H), 3.6 (d, 1H), 2.8 (d, 1H), 2.4 (s,3H),2.28 (s, 6H), 1.59 (s, 9H).
【０２９２】
1.24    3,5-ジメチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(2-ジメチルアミノメチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド(RG-115079)の調製
【化３３】
2014111634.tif 000042
【０２９３】
[00259]250mg(0.0006mol)のRG-115490を20ｍLの小瓶に加えた。更に３ｍLのTHF及び0.31ｍLの２Mジメチルアミン/THF溶液(アルドリッチ(Aldrich))を加えた。混合物は室温で4時間撹拌した。溶媒はrotovap上で除去し、固体は室温で撹拌しながら、ヘキサンで細かく砕いた。3,5-ジメチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(2-ジメチルアミノメチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド：1HNMR (CDCl3, 300 MHz) δ (ppm): 7.1-6.9 (m, 6H), 3.93 (s,3H), 2.68(s, 3H), 2.54 (s, 3H), 2.24 (s, 6H), 1.61 (s, 9H).
【０２９４】
1.25    3,5-ジメチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(2-アセトキシメチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド(RG-115225)の調製
【化３４】
2014111634.tif 000043
【０２９５】
[00260]200mgのRG-115371を含む４ｍLの無水CH2Cl2の入った20ｍLの小瓶に、200mgのEt3Nと10mgのCH3COClを加えた。混合物は室温で一夜撹拌した。TLCは反応が未完了である事
を示していた。100ｍgの塩化アセチルと適量のピリジンを加え、1時間還流した。反応混合物はCH2Cl2に注ぎ、希釈したK2CO3水溶液、次に希塩酸水溶液で抽出した。CH2Cl2抽出物を乾燥し、濃縮すると、粗酢酸塩が得られた。物質はシリカゲル・カラムクロマトグラフィーを使い、1：1酢酸エチル：ヘキサンで溶出する事により精製した。1HNMR (CDCl3, 300 MHz)δ(ppm): 7.3-6.9 (m, 6H), 6.4 (d, 1H), 4.8 (d,1H), 4.6 (d, 1H), 3.795 (s, 3H),2.3 (s, 6H), 2.03 (s, 3H), 1.58 (s, 9H).
【０２９６】
1.26    2-メタンスルフィニルメチル-3-メトキシ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-ヒドラジド(RG-115172)の調製
【化３５】
2014111634.tif 000044
【０２９７】
[00261]3-メトキシ-2-メチルスルファニルメチル安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-ヒドラジドのCH2Cl2溶液を1.0当量のｍ-クロロ過安息香酸と一緒に、室温で撹拌した。反応は5分以内に完了し、TLCで確認された。反応混合物は飽和NaHCO3で洗浄し、有機層を真空処理(ストリッピング)した。残渣は1-2ｍLの1：1エーテル：ヘキサンと混ぜ、溶液はピペットで除き、生成物を真空乾燥した。
【０２９８】
1.27    2-メタンスルホニルメチル-3-メトキシ安息香酸N’-tert-ブチル-N’-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-ヒドラジド(RG-115408)の調製
【化３６】
2014111634.tif 000045
【０２９９】
[00262]RG-115172を二塩化エチレンに溶解した。1.2当量のｍ-クロロ過安息香酸を加え、混合物を加熱・還流した。反応は、混合物が還流を始める時までに完了していた。溶液は、周囲の温度まで冷却した後、飽和NaHCO3で洗浄した。有機層は真空処理(ストリッピング)した。残渣は1-2ｍLのエーテルと混合し、溶液はピペットで除き、生成物を真空乾燥した。
【０３００】
1.28    2,4,6-トリメチル-ピリジン-1-オキシドの調製
【化３７】
2014111634.tif 000046
【０３０１】
[00263]磁気撹拌装置と温度計を付けた500ｍLの丸底フラスコに、36.7ｇ(164mmol)の77％３-クロロ過安息香酸(アルドリッチ(Aldrich))と200ｍLの塩化メチレンを加えた。このスラリー状の物質は5℃に冷やし、温度を5−10℃に維持しながら、16.6ｇ(137mmol)のコリジン(アルドリッチ(Aldrich))を50ｍLの塩化メチレンに溶解した溶液を30分かけて加えた。混合物は1時間かけて室温まで温めてから、一夜撹拌した。粗反応混合物は200ｇの塩基アルミナを含むビーカーに徐々に移した。その時混合物の温度が僅かに上昇した。混合物は撹拌し、濾過し、アルミナは300ｍLの2：1CHCl3：CH3OHと混合した。溶媒は回転式蒸発装置を使い、室温で除去した。アルミナをエーテルで洗浄し、溶媒を除くと、24.7ｇの透明な液体となり、それはやがて白色ワックス状の固体となった。ある種の塩が存在しているので、収量は僅かに高目であった。TLC(メタノール展開のシリカゲル)は、小さいスポット(Rf=0.55)の他に単一の大きいスポット(Rf=0.45)を示していた。大きいスポットは目的のN-オキシドであった。1HNMR (CDCl3, 300 MHz) δ(ppm): 6.96 (s), 2.51 9(s) and2.28 (s).  小さいスポットは出発物質であるコリジンに対応している。1HNMR (CDCl3, 300 MHz) δ (ppm): 6.78 (s), 2.48 (s) and2.26 (s).
【０３０２】
1.29    (4,6-ジメチル-ピリジン-2-イル)-メタノールの調製
【化３８】
2014111634.tif 000047
【０３０３】
[00264]窒素雰囲気中、分子ふるい上で乾燥させた200ｍLの塩化メチレンに18.1ｇ(137mmol)のコリジンN-オキシドを溶解した。混合物は5℃に冷やした。トリフルオロ無水酢酸(71.9ｇ、49.8ml、343mmol)を少しずつ滴下し、反応混合物を5−10℃に維持した。トリフルオロ無水酢酸を加えた後、混合物は室温まで温め、それから室温で一夜撹拌した。その後のTLC(逆相、メタノール/水、7：3)により、出発物質であるN-オキシドが不在である事が示された。溶媒を除去すると、黄色のワックス状の固体である酢酸塩生成物が得られた。1HNMR (CDCl3, 300 MHz) δ(ppm): 2.5 (s, 3H), 2.8 (s, 3H), 5.65 (s,2H), and 7.45 (m, 2H).  混合物は氷の浴槽で冷やし、10％のKOHメタノール溶液100ｍLを加えた。溶液のｐHをチェックし、もし溶液が塩基性であれば、追加のKOHを加えて溶液を塩基性にした。溶液は10−15℃で30分撹拌し、室温で更に6時間撹拌した。溶媒を除去すると、7.4ｇの黄色-茶色のシロップが得られた。アルコール生成物は、シリカゲル・クロマトグラフィーを使い酢酸エチル/クロロホルム(4：1)で注意して溶出すれば、精製可能である。TLC： Rfは、メタノール/酢酸エチル(1：1)で展開したシリカゲルで0.55であった。1HNMR (CDCl3, 300 MHz)δ(ppm): 6.67 (s, 2H), 4.67 (s, 2H), 2.50 (s,3H) and 2.31 (s, 3H).殆どの場合、粗アルコールは、以後の酸化反応にそのまま使用可能なほど十分精製されている。
【０３０４】
1.30    4,6-ジメチル-2-ピリジンカルボン酸の調製
【化３９】
2014111634.tif 000048
【０３０５】
[00265]4,6-ジメチル-2-ピリジンメタノール(7.5ｇ、29.2mmol)を100ｍLの水に加え、0-5℃で撹拌した。温度を5-10℃に維持しながら、5.3ｇ(32.1mmol)の過マンガン酸カリウムの100ｍL水溶液を30分かけて少しずつ加えた。その結果、黒色の固体が生じた。混合物は更に30分、5-10℃で撹拌し、それから室温で30分間撹拌した。混合物は濾過し、二酸化マンガンをメタノールで洗浄した。メタノール洗浄液は水抽出物と合わせ、溶媒は除去した。その結果生じた黄褐色の固体は水に再び溶解し、クロロホルムで洗浄した。水の層は分離し、水を除去すると、5.4ｇの4,6-ジメチル-2-ピリジンカルボン酸が得られた。生成物はHPLC/MSで特徴が表れた。
【０３０６】
1.31    ピラジン-2-カルボン酸N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド(RG-115550)の調製
【化４０】
2014111634.tif 000049
【０３０７】
[00266]20ｍLの小瓶を使い、0.120ｇ(0.003mol)のNaHを６ｍLのDMFと混ぜた混合物を撹拌し、それに0.238ｇ(0.001mol)の2-エチル-3-メトキシ安息香酸N’-tert-ブチル-ヒドラジドを徐々に加えた。反応物は室温で1時間撹拌した。0.278ｇ(0.001mol)のペンタフルオロフェニル・エステル(ママ)・ピラジン-2-カルボン酸ペンタフルオロフェニル・エステルのDMF溶液２ｍLを徐々に加えた。反応物は24時間撹拌した。反応物は、酢酸エチルを使い、100ｍLの水と100ｍLのエチルエーテルの入った分離漏斗に移した。反応混合物は振盪し、有機層をMgSO4上で乾燥し、濃縮乾固すると、ピラジン-2-カルボン酸N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジドが得られた。１HNMR (CDCl3、300MHｚ)δ(ppm)：(注：ヒドラジドとNaHの反応比率が1：3の場合、最高(100％)の収率が得られる。それ以下、例えば1：2の場合の収率は70％である。DMFはDMSOより優れた溶媒である)。反応の進行度合いは、１HNMRの−OCH3シグナルの強度を調べる事によりモニターした。1H NMR. 1H NMR(300 MHz, CDCl3) δppm: 9.05 (, 1H), 8.6 (s,1H), 8.45 (s, 1H), 8.4 (s, 1H), 7.1(t, 1H), 6.9 (d, 1H), 6.45 (d, 1H), 3.8 (s,3H), 2.4 (m, 1H), 1.95 (m, 1H),1.62 (s, 9H), 0.95 (t, 3H).ピラジン-2-カルボン酸ペンタフルオロフェニル・エステル：1H NMR (300MHz, CDCl3) δ ppm: 9.49 (s, 1H), 8.95 (d, 1H), 8.87 (d,1H).
【表９】
2014111634.tif 000050
【表１０】
2014111634.tif 000051
【０３０８】
1.32    1H-インダゾール-3-カルボン酸N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド(RG-115723)の調製
【化４１】
2014111634.tif 000052
【０３０９】
[00267]10ｍLの丸底フラスコに、0.328ｇ(0.001mol)のインダゾール-3-カルボン酸ペンタフルオロフェニル・エステル、0.244ｇ(0.001mol)のトリフェニルメタン、0.227ｇ(0.001mol)の2,3-ジクロロ‐5,6-ジシアノ‐1,4-ベンゾキノン、及び４ｍLの乾燥トルエンを加えた。反応混合物は7-8時間還流した。反応混合物は酢酸エチルで分離漏斗に洗い込み、水(20ｍL)で洗浄した。有機層を乾燥し、濃縮すると、0.45ｇの1-トリチル-1H-インダゾール-3-カルボン酸ペンタフルオロフェニル・エステルが得られた。NMRは生成物の存在を示していたが、TLCは出発物質であるペンタフルオロフェニル・エステル(Rf57)と生成物(Rf70)の存在を示していた。生成物はシリカゲル・カラムクロマトグラフィーを使い、5％の酢酸エチル/ヘキサンで溶出する事により精製した。精製された生成物0.30ｇを得た。1HNMR (CDCl3, 300 MHz) δ (ppm): 8.2 (d, 1H), 7.4-7.0 (m,17H), 6.52(d, 1H).
【化４２】
2014111634.tif 000053
【０３１０】
[00268]0.17ｇ(0.16mmol)の1-トリチル-1H-インダゾール-3-カルボン酸ペンタフルオロフェニル・エステルのCH2Cl2溶液３ｍLを、2％のTFAと1％の水を含む100ｍLのフラスコに、20ｍLのCH2Cl2と一緒に加えた。反応物は室温で90分撹拌した。TLCは50％の反応を示していた。更に15ｍLのTFA-H2O-CH2Cl2を加え、1時間撹拌を継続した。反応物は分離漏斗に移し、約0.5MのK2CO3/H2Oで洗浄した。CH2Cl2層を乾燥し濃縮すると、粗1H-インダゾール-3-カルボン酸N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド(0.15ｇ)が得られた。TLC：生成物、Rf＝0.33；出発物質、Rf=0.68。生成物はシリカゲル・カラムクロマトグラフィーを使い、45％の酢酸エチル/ヘキサンで溶出する事により精製した。1HNMR (CDCl3, 300 MHz) δ(ppm): 8.6 (s, 1H), 8.2 (s, 1H), 7.4-7.2 (m,3H), 7.1 (t, 1H), 6.9 (d, 1H), 6.7(d, 1H), 3.80 (s, 3H), 2.4 (m, 1H), 2.0 (m,1H), 1.652 (s, 9H), 0.85 (t, 3H).
【０３１１】
1.33    3H-ベンゾイミダゾール-5-カルボン酸N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド(RG-115718)の調製
【化４３】
2014111634.tif 000054
【０３１２】
[00269]約120mgの3-トリチル-3H-ベンゾイミダゾール-5-カルボン酸N-tert-ブチル-N’- (2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジドを35ｍLのCH3OHに溶解し、氷酢酸2滴と0.20ｇのPd/Cと一緒に水素添加瓶に加えた。水素添加は、瓶を6時間振盪し、その後16時間水素圧の下に置く事により行った。Pd/Cは濾過して除去し、メタノールは蒸発装置を使って除去した。残渣はCH2Cl2と一緒に撹拌し、CH2Cl2はデカントで除去した。CH2Cl2を蒸発させると、固体生成物が得られ、NMRでトリフェニルメタンと同定された。残渣は希KOH/H2Oと一緒に撹拌し、酢酸エチルで抽出した。酢酸エチルを乾燥し、回転式蒸発装置で濃縮すると、生成物である3H-ベンゾイミダゾール-5-カルボン酸N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジドを得た。生成物のNMR分析は、メトキシ・グループとt-ブチル・グループの吸収が、出発物質の3.77と1.59に対し、3.69及び1.61で起きている事を示していた。
【０３１３】
1.34    N’-2-エチル-3-メトキシベンゾイル-N-tert-ブチル-N-(N-メチルインドール-2-カルボニル)-ヒドラジドの調製
【０３１４】
[00270]N’-2-エチル-3-メトキシベンゾイル-N-t-ブチル・ヒドラジド(150mg、0.6mmol)を２ｍLのDMFに溶解した。それにｔ-ブトキシド・カリウム(80mg、0.7mmol)を加え、5分間磁気を使って撹拌した。N-メチルインドール-2-カルボン酸ペンタフルオロフェニル・エステルを加え、混合物を100℃に加熱した。3時間後、TLCが示すように、反応は完了した。混合物は周囲の温度まで冷やし、10ｍLの水に注いだ。塩化メチレンによる2度の抽出物を合わせ、蒸発させた。残渣は約２ｍLの1：1エチルエーテル：ヘキサンと混合した。母液はピペットで除去し、残渣は真空乾燥した。生成物は黄褐色の固体で、重量は140mgであった。LCMS分析は構造を確定し、精製度(UV検出)が91％であると推定した(収率52％)。
【０３１５】
1.35    2,6-ジメトキシ-ニコチン酸N-tert-ブチル-N’-(5-メチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ [1,4]ジオキシン-6-カルボニル)-ヒドラジド(RG-115517)の調製
【化４４】
2014111634.tif 000055
【０３１６】
[00271]2.0ｇ(10.92mmol)の2,6-ジメトキシイソニコチン酸を100ｍLのトルエンに溶解し、1滴のジメチルフォルムアミドを加えた。1.55ｇ(13.1 mmol、0.98ｍL)の塩化チオニルを加え、溶液を4時間還流した。トルエンと過剰の塩化チオニルは真空除去し、2,6-ジメトキシイソニコチノイル塩化物は精製なしで使用した。
【化４５】
2014111634.tif 000056
【０３１７】
[00272]撹拌棒の付いた1オンスの小瓶に１ｍLの１MK2CO3を加えた。0.250ｇ(1.2 mmol)の5-メチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボン酸N’-tert-ブチル-ヒドラジドを２ｍLの塩化メチレンに溶解し、その水溶液に加えた。2,6-ジメチルイソニコチノイル塩化物を加え、混合物は室温で一夜撹拌した。水溶液の層を除き、有機層を２ｍLの１MK2CO3溶液、次に2ｍLの水で2度洗浄した。水の層を除き、有機層をMgSO4上で乾燥した。有機層を濾過し、除去した。生成物である2,6-ジメトキシ-ニコチン酸N-tert-ブチル-N’-(5-メチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボニル)-ヒドラジドは、1：1エーテル：ヘキサンを使った粉砕法、あるいは’クロマトグラフィーで精製した。1HNMR (CDCl3, 300 MHz)δ(ppm): 1.6 (s, 9H), 1.9 (s, 3H), 3.9(s s, 6H),4.2 (m, 4H), 6. 2 (m, 1H), 6.7(d, 1H), 7.7 (d, 1H), 8.3 (m, 1H).
【０３１８】
1.36    4-ヒドロキシ-3,5-ジメトキシ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-メチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボニル)-ヒドラジド(RG-115009)の調製
【化４６】
2014111634.tif 000057
【０３１９】
[00273]4-アセトキシ-3,5-ジメトキシ安息香酸(1.45ｇ)を３ｍLのジメトキシエタン中の塩化チオニル(0.86ｇ)と一緒に加熱した。1.5時間後、混合物を真空処理(ストリッピング)すると、1.6ｇの4-アセトキシ-3,5-ジメトキシ-ベンゾイル塩化物が油として残った。1HNMR (CDCl3, 300 MHz) δ(ppm): 2.26 (s, 3H), 3.89 (s, 9H), 7.34 (s,2H).
【化４７】
2014111634.tif 000058
【０３２０】
[00274]4-アセトキシ-3,5-ジメトキシ-ベンゾイル塩化物(250mg)と5-メチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボン酸N’-tert-ブチル-ヒドラジド(204mg)を３ｍLのジクロロメタンに溶解し、1.5ｍLの１M炭酸ナトリウム水溶液と一緒に、周囲の温度で撹拌した。2時間後、層を分離し、有機層を蒸発させた。固体の残渣を1：1エーテル：ヘキサンで洗浄すると、360mgの酢酸4-[N-tert-ブチル-N’-(5-メチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボニル)-ヒドラジノカルボニル]-2,6-ジメトキシ-フェニルエステルが残った。1HNMR (CDCl3, 300 MHz) δ (ppm): 1.60 (m, 15H), 2.06 (s,3H), 2.32 (s,3H), 3.77 (s, 6H), 4.2 (m, 4H), 6.08 (d, 1H), 6.63 (d, 1H), 6.74(s, 2H).
【化４８】
2014111634.tif 000059
【０３２１】
[00275]酢酸4-[N-tert-ブチル-N’-(5-メチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボニル)-ヒドラジノカルボニル]-2,6-ジメトキシ-フェニルエステル(300mg)を28％の水性アンモニア(750mg)を含むメタノールに溶解した。混合物は周囲の温度で、週末中撹拌した。沈殿物を濾過すると、110mgの白色固体である4-ヒドロキシ-3,5-ジメトキシ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-メチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボニル) -ヒドラジドが得られた。1HNMR (CDCl3, 300 MHz) δ (ppm): 1.59 (s, 15H), 2.02 (s,3H), 3.85 (s,6H), 4.21 (m, 4H), 5.6-5.7 (broad s, 1H), 6.22 (d, 1H), 6.58 (d,1H), 6.81 (s,2H).
【０３２２】
1.37    化合物RG-115613及びRG-115429の調製
【化４９】
2014111634.tif 000060
【０３２３】
[00276]2.50ｇ(10mmol)の2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル-N’-tert-ブチル-ヒドラジドを含む100ｍLの丸底フラスコに、15ｍLの塩化メチレン、2.60ｇ(10.5mmol)の3-ブロモメチル-5-メチルベンゾイル塩化物の塩化メチレン溶液５ｍL、そして2.76ｇ(20 mmol)の炭酸カリウム水溶液15ｍLを加えた。反応混合物は室温で一夜撹拌し、20ｍLの塩化メチレンで希釈してから分離漏斗へ移した。塩化メチレン層を分離、乾燥し、溶媒を真空除去した。粗生成物をカラムクロマトグラフィーで精製して、4.01ｇのN-(3-ブロモメチル-5-メチル-ベンゾイル)-N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)ヒドラジドを得た(収率87％)。1HNMR (CDCL3, 300 MHz)δ(ppm): 7.41 (s, 1H), 7.1 (m, 3H), 7.02 (t,1H), 6082 (d, 1H), 6.08 (d, 1H),4.41 (s, 2H), 3.78 (s, 3H), 2.4 (m, 1H), 2.31(s, 3H), 2.25 (m, 1H), 1.60 (s,9H), 1.01 (t, 3H).
【化５０】
2014111634.tif 000061
【０３２４】
[00277]250ｍLの丸底フラスコに入った4.00ｇ(8.68mmol)のN-(3-ブロモメチル-5-メチル-ベンゾイル)-N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)ヒドラジドに、40ｍLのジオキサン、40ｍLの水、そして4.34ｇの炭酸カルシウムを加えた。反応フラスコは85℃の油の浴槽に入れ、反応物は18時間加熱・撹拌した。反応混合物を冷やし、酢酸エチルと一緒に大型フラスコへ移した。ジオキサンの大半は蒸発していた。反応混合物は約100ｍLの酢酸エチルと一緒に振盪し、濾過した。酢酸エチル層は分離し、水溶液の層を酢酸エチルで2度抽出した。酢酸エチル抽出物を乾燥し、蒸発させると、2.07ｇのN-(3-ヒドロキシメチル-5-メチル-ベンゾイル)-N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンジル(ママ))ヒドラジドが得られた(収率60％)。1HNMR(300 MHz, CDCl3) δ(ppm): 7.78 (s, 1H), 7.1-7.4 (3s, 3H), 6.96(t,1H), 6.8 (d, 1H), 6.08 (d, 1H), 4.53 (s, 2H), 3.77 (s, 3H), 2.35 (m, 1H),2.32(s, 3H), 2.2 (m, 1H), 1.60 (s, 9H), 0.96 (t, 3H).
【化５１】
2014111634.tif 000062
【０３２５】
[00278]250ｍLの丸底フラスコに入った2.00ｇ(5.02mmol)のN-(3-ヒドロキシメチル-5-メチル-ベンゾイル)-N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)ヒドラジドに、100ｍLの塩化メチレンと1.16ｇのクロロクロム酸ピリジニウムを加えた。反応混合物は約1時間還流した。その時点で、TLC(1:1酢酸エチル：ヘキサン)は生成物の形成を示していた(Rf=0.5)。反応混合物は約20ｍLに濃縮し、シリカゲル・クロマトグラフィーを使い、30-35％の酢酸エチル・ヘキサン溶液で溶出すると、1.75ｇ(88％)の3-フォルミル-5-メチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジドが白色固体として得られた。1HNMR (300 MHz, CDCl3)δ(ppm): 9.93 (s, 1H), 7.6-7.8 (3s, 3H), 7.0 (t,1H), 6.82 (d, 1H), 6.19 (d, 1H),3.77 (s, 3H), 2.42 (s, 3H), 2.3 (m, 1H), 2.0(m, 1H), 1.62 (s, 9H), 0.90 (t, 3H).
【化５２】
2014111634.tif 000063
【０３２６】
[00279]20ｍLの小瓶に入った100mg(0.25mmol)のN-(3-フォルミル-5-メチル-ベンゾイル) -N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジドに、２ｍLのメタノール、112ｍgのセミカルバジドHCl、0.2ｇのトリエチルアミン、そして1滴の氷酢酸を加えた。反応混合物は50℃に調節したホットプレート上で約3時間、それから室温で48時間、磁気を使って撹拌した。溶媒は窒素流で蒸発させ、その結果得られた残渣は20ｍLのクロロフホルムに溶解し、希塩酸で抽出した。クロロホルム抽出物は乾燥し、溶媒は真空除去し、残渣を60℃の真空オーブンで乾燥した。残渣は冷却し、ヘキサンで細かく砕くと、N-(3-フォルミル-5-メチル-ベンゾイル)-N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジドのセミカルバジドが81mg得られた。1HNMR (300 MHz, CDCl3) δ(ppm): 8.9 (broad s, 1H), 8.6 (broad s, 1H),7.3-7.5 (3s, 3H), 7.03 (t, 1H), 6.8(d, 1H), 6.38 (d, 1H), 3.76 (s, 3H), 3.26(d, 1H), 2.4 (s, 3H), 1.95 (m, 1H),1.57 (s, 9H), 0.95 (t, 3H).
【化５３】
2014111634.tif 000064
【０３２７】
[00280]20ｍLの小瓶に入った100mg(0.25mmol)のN-(3-フォルミル-5-メチル-ベンゾイル) -N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジドに、２ｍLのメタノール、103mgのオキサミック・ヒドラジドHCL、そして1滴の氷酢酸を加えた。反応混合物は50℃に調節したホットプレート上で約3時間、それから室温で48時間、磁気撹拌した。溶媒は窒素流で蒸発させ、その結果得られた残渣は60℃の真空オーブンで乾燥した。残渣は冷却し、ヘキサンで細かく砕くと、N-(3-フォルミル-5-メチル-ベンゾイル)-N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジドのオキサミック・ヒドラゾンが70mg得られた。1HNMR (300MHz, DMSO-d6) δ(ppm): 8.5 (s, 1H), 8.6 (d, 1H),7.9 (d, 1H),7.55 (s, 1H), 7.5 (s, 1H), 7.3 (s, 1H), 7.0 (t, 1H), 6.95 (d, 1H),3.73 (s, 3H), 2.2 (m, 1H), 2.35 (s, 3H), 1.95 (m, 1H), 1.51 (s, 9H), 0.80 (t,3H).
【０３２８】
1.38    3,5-ジクロロ-4-フルオロ安息香酸の調製
【０３２９】
[00281](N-(3-メトキシ-2-メチルベンゾイル)-N’-(3,5-ジクロロ-4-フルオロベンゾイル)-N’-tert-ブチルヒドラジンは、米国特許5,530,028に従って調製できる。要するに、実施例8の生成物と3,5-ジクロロ-4-フルオロベンゾイル塩化物は実施例9に従って調製し、その結果、(N-(3-メトキシ-2-メチルベンゾイル)-N’-(3,5-ジクロロ-4-フルオロベンゾイル)-N’-tert-ブチルヒドラジンを生成できる。
【化５４】
2014111634.tif 000065
【０３３０】
[00282]3,5-ジクロロ-4-フルオロベンゾイル塩化物は、次の方法で調製可能である：10％NaOH水溶液トラップを通したチッソパージ付き丸底フラスコに、3,5-ジクロロ-4-フルオロベンゾ三フッ化物(5.00ｇ、21.46mmol、アルドリッチ(Aldrich))、濃硫酸(4.30ｇ、42.92mmol)、そして最後にクロロスルホン酸(5.15g、43.78 mmol)を加えた。反応物は直ちに泡立ちを開始した。泡立ちが治まった後、混合物を80℃で1時間加熱し、室温まで冷やし、それから撹拌している氷水に注意して加える。これを塩化メチレンで2度抽出した。合わせた抽出物は水と塩水で洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥し、濾過し、蒸発させると、白色の固体(21.9ｇ)である3,5-ジクロロ-4-フルオロ安息香酸が得られた。収率49％。1H-NMR(CD3COCD3, 300MHz) δ(ppm): 7.95 (d, 2H).
【化５５】
2014111634.tif 000066
【０３３１】
[00283]3,5-ジクロロ-4-フルオロ安息香酸を１当量を超える塩化チオニル、及び1滴のDMFニートと一緒に又はCHCL3の溶液として、還流した。溶媒と揮発性の副産物を真空除去すると、3,5-ジクロロ-4-フルオロベンゾイル塩化物が得られた。
【０３３２】
1.39    3,5-ジメトキシ-4-メチル-2-ニトロ安息香酸N-t-ブチル-N’-(5-メチル-ベンゾ-1,4-ジオキサン-6-カルボニル)-ヒドラジド(RG-115609)の調製
【化５６】
2014111634.tif 000067
【０３３３】
[00284]3,5-ジメトキシ-4-メチル安息香酸を2.7当量の無水酢酸及び0.05モル当量の濃硫酸ジクロロメタン溶液と一緒にして、スラリー状にした。10℃に冷やした後、温度を15℃未満に維持しながら、1.05当量の70％硝酸を滴下した。30分後、混合物を水に注ぎ、酢酸エチルで2度抽出した。合わせた有機層は、密度の高いスラリー状になるまで、濃縮した。スラリーは濾過し、固体は氷冷ジクロロメタンで洗浄した。更に母液を濃縮すると、2番目の収穫物が得られた。3,5-ジメトキシ-4-メチル-2-ニトロ安息香酸の全収率は約80％であった。1HNMR:(acetone-d6, 300 MHz) δ(ppm): 7.34 (s, 1H), 4.00 (s, 3H), 3.85 (s, 3H),2.23 (s,3H).
【化５７】
2014111634.tif 000068
【０３３４】
[00285]周囲の温度で、反応が完了するまで、3,5-ジメトキシ-4-メチル-2-ニトロ安息香酸を1.1当量の塩化チオニルと一緒に、ジメトキシエタン中で撹拌した。溶媒と過剰の塩化チオニルは大気圧下で蒸留し、残渣はジクロロメタンに溶解した。この溶液を１M炭酸カリウム水溶液と5-メチルベンゾ-1,4-ジオキサン-6-安息香酸 N’-t-ブチル-ヒドラジドの混合物のジクロロメタン溶液に加えた。3時間後、水とジクロロメタンを加えた。有機層を除去し、真空処理(ストリッピング)した。残渣を1：1(重量比)エーテル：ヘキサンで細かく砕くと、3,5-ジメトキシ-4-メチル-2-ニトロ安息香酸Ｎ-ｔ-ブチル-N’-(5-メチルベンゾ-1,4-ジオキサン-6-カルボニル)-ヒドラジドが得られた(収率約94％)。TLC(1：1酢酸エチル：ヘキサン)は、単一スポット(Rf0.53)を示していた。1HNMR: (CDCl3, 300 MHz) δ(ppm): 7.84 (s, 1H), 7.02 (t, 1H), 6.86 (d,1H), 6.82 (s, 1H), 6.11 (s, 1H),3.90 (m, 4H), 3.79 (s, 6H), 2.16 (s, 3H), 1.60(s, 9H).
【０３３５】
1.40    3,5-ジメチル安息香酸N’-(2,3-ジメチル-ベンゾイル)-N-(1-エチル-2,2-ジメチル-プロピル)-ヒドラジド(RG-103309)の調製
【化５８】
2014111634.tif 000069
【０３３６】
[00286]t-ブチルカルバジン酸塩(35.15ｇ、266mmol)と200ｍLのCH2Cl2を丸底フラスコに加えた。350ｍLの水に溶解した炭酸カリウム(55.2ｇ、0.4モル)をそのフラスコに加え、混合物を氷で冷却しながら15分間撹拌した。約200ｍLのCH2Cl2に入った2,3ジメチルベンゾイル塩化物(44.9ｇ、266mmol)を500ｍLの分離漏斗から30分かけて滴下した。反応物は一夜撹拌し、反応混合物は１Lの分離漏斗に注ぎ、CH2Cl2層を分離した。次に150ｍLの水を加え、混合物は150ｍLのCHCl3で2度抽出した。合わせた有機層は100ｍLの水、それから１NHCl(250ｍL)で逆抽出し、ヒドラジドを除いた。有機層を乾燥し、木炭と一緒に撹拌し、溶媒を真空除去すると、明るい黄褐色の固体(71.5ｇ)であるN’-(2,3-ジメチル-ベンゾイル)-ヒドラジンカルボン酸-tert-ブチルエステルを得た。1HNMR (300 MHz, CHCl3)δ(ppm):7.7 (br, 1H), 7.22 (m, 2H), 7.1 (t,1H), 7.85 (br, 1H), 2.35 (s, 3H), 2. 3 (s,3H), 1.5 (s, 9H).
【化５９】
2014111634.tif 000070
【０３３７】
[00287]N’-(2,3-ジメチル-ベンゾイル)-ヒドラジンカルボン酸-tert-ブチルエステル(70.3ｇ、266モル)を500ｍLの丸底フラスコに入れた。徐々に撹拌しながら、200ｍLのトリフルオロ酢酸(296ｇ、2.6モル)を徐々に加えると、ガスが激しく発生した。反応混合物を室温で2時間撹拌した。混合物に水(約100ｍL)を徐々に加えた。徐々に撹拌しながら(ガスの発生)、２Lビーカーに入っている１Lの冷却２MK2CO3溶液に混合物を徐々に加えた。約200ｍLの10％NaOH溶液と250ｍLのCH2Cl2を加えた。反応混合物は大型の分離漏斗に移し、徐々に振盪した(ガスの発生)。水溶液の層はCHCl3で抽出し、抽出物を乾燥し、蒸発させると、白色の固体が得られた。それを50℃の真空オーブンで乾燥すると、31.72ｇ(収率73％)の2,3-ジメチル安息香酸ヒドラジドを得た。1HNMR (CDCl3, 300 MHz) δ(ppm): 7-7.3 (m, 4H), 4.00 (br s,2H), 2.271(s, 6H).
【化６０】
2014111634.tif 000071
【０３３８】
[00288]200ｍLの丸底フラスコを使って、7.90ｇ(48mmol)の2,3-ジメチル安息香酸ヒドラジドを60ｍLのメタノールに溶解し、3滴の氷酢酸を加えた。反応混合物に6.00ｇ(52.6mmol)の2,2-ジメチルペンタン-3-オンを加え、反応物を室温で24時間撹拌した。生成物であるヒドラゾンは単離されなかったが、直接還元を行った。反応混合物に氷酢酸(10ｍL)とシアノボロハイドライド・ナトリウム(3.2ｇ、50.95mmol)を加え、室温で24時間撹拌した。約50ｍLの10％NaOH水溶液を加え、CH3OHの大半を回転式蒸発装置で除去した。反応物は水(100ｍL)で希釈し、生成物をCH2Cl2で抽出した。有機層を乾燥し、蒸発させると、11.87ｇ(94％)の2,3-ジメチル安息香酸N’-(1-エチル-2,2-ジメチル-プロピル)-ヒドラジドが得られた。1HNMR (500 MHz, CDCl3)δ(ππμ) 7.0-7.3 (m, 4H), 2.32 (s, 3H), 2.296 (s,3H), 1.7 (m, 1H), 1.3 (m, 1H),1.16 (t, 3H, 0.979 (s, 9H). TLC：Rf=0.57 (1:1酢酸エチル：ヘキサン)は90％以上精製されている事を示していた。更に精製する場合は、シリカゲル・クロマトグラフィーを使い、20％の酢酸エチル・ヘキサン溶液で溶出する。
【化６１】
2014111634.tif 000072
【０３３９】
[00289]2,3-ジメチル安息香酸N’-(1-エチル-2,2-ジメチル-プロピル)-ヒドラジド(0.59ｇ、2.25mmol)を小型丸底フラスコに入った15ｍLのCH2Cl2に溶解した。K2CO3水溶液(150ｍLの水に0.70ｇ)を加えた。10ｍLのCH2Cl2に溶解した3,5-ジメチルベンゾイル塩化物(0. 45ｇ、2.7mmol)を加え、反応混合物は室温で24時間撹拌した。反応混合物を分離漏斗へ移
し、CH2Cl2で抽出した。(別の実験では、弱NaOHで洗浄し、過剰の酸と酸塩化物を除去した)。抽出物を乾燥し、蒸発させると、約1gの白色の固体が得られた。これをシリカゲル・クロマトグラフィーで精製した。15％の酢酸エチル・ヘキサン溶液で溶出すると、精製された生成物である3,5-ジメチル安息香酸N’-(2,3-ジメチル-ベンゾイル)-N-(1-エチル-2,2-ジメチル-プロピル)-ヒドラジドを得た(0.62g、70％)。1HNMR (500 MHz, CDCl3) δ＝(ppm):6.95-7.4 (m, 7H), 4.61 (m, 1H),2.2-2.4 (multiple s, 9H), 1.81 (s, 3H), 1.6-1.8(m, 2H), 1.3 (br t, 3H), 1.08(multiple br s, 9H).
【０３４０】
1.41    3,5-ジメチル安息香酸N-(1-エチル-2,2-ジメチル-プロピル)-N’-(3-メトキシ-2-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド(RG-115819)の調製
【化６２】
2014111634.tif 000073
【０３４１】
[00290]10.34ｇ(57.5mmol)の3-メトキシ-2-メチル安息香酸ヒドラジド(ロットCPO10925)を100ｍLのメタノールに溶解し、撹拌した。9.80ｇ(86.3 mmol)の2,2-ジメチル-3-ペンタノン、次に3滴の氷酢酸を加えた。混合物を48時間撹拌した。粗混合物はｐH=3にした。3. 84ｇ(61.2mmol)のNaCVBH3を加えた。スラリー状の物質を室温で一夜撹拌し、それからメタノールを除去した。100ｍLの10％NaOHと100ｍLの塩化メチレンを加えた。混合物は振盪し、塩化メチレン層は除去した。水溶液の層を75ｍLの塩化メチレンで2度洗浄した。塩化メチレン層は一緒にして乾燥した。溶媒を除去すると、目的生成物である淡黄色の液体が得られた。この生成物は、10％のPd/Cでヒドラジドを還元しても得られた。精製は、シリカゲル・カラムクロマトグラフィーを使い、3：2ヘキサン：エーテルで溶出する事により行なった。1HNMR (CDCl3, 300 MHz)δ(ppm): 1.0 (s, 9 H), 1.1 (t, 3H) 1.2 (m, 1H), 1.5 (m 2H), 2.1 (s, 3H), 3.8,(s, 3H), 4.9 (br s, 1H), 6.6 (d, 1H), 7.0-7.2 (m,2H). TLC：Rf＝0.45 (1：1ヘキサン：エーテル)。
【化６３】
2014111634.tif 000074
【０３４２】
[00291]6.2ｇ(22.1、22.1mmol)の3-メトキシ-2-メチル安息香酸(1-エチル-2,2-ジメチル-プロピル)-ヒドラジドを35ｍLの酢酸エチルに溶解し、0℃に冷やした。74ｍLの１N K2CO3水溶液を加え、混合物を撹拌した。5.6ｇ(33.6mmol)の3,5-ジメチルベンゾイル塩化物を40ｍLの酢酸エチルに溶解し、この溶液を15分かけてヒドラジド混合物に加えた。混合物を室温まで温め、一夜撹拌した。水溶液の層は除き、有機層を75ｍLの１NK2CO3水溶液、次に100ｍLの水で洗浄した。水の層は除き、有機層を乾燥し、除去すると、オフホワイトの固体が得られた。この物質を25ｍLの1：1ヘキサン：エーテルで3度粉砕すると、98.7％精製された最終生成物を得た。1HNMR (CDCl3, 300 MHz) δ(ppm): 0.7-1.5 (m, 15H), 2.1 (s, 9H), 3.7 (s,3H), 6.8-7.1, (m, 6H),:TLC：Rf=0.62 (1：1ヘキサン：エーテル)。
【０３４３】
1.42    3,5-ジメトキシ-4-メチル安息香酸N-(1-エチル-2,2-ジメチル-プロピル)-N’-(3-メトキシ-2-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド(RG-115820)の調製
【化６４】
2014111634.tif 000075
【０３４４】
[00292]20ｍLの小瓶に、161mg(0.75ｍｍol)の3,5-ジメトキシ-4-メチルベンゾイル塩化物、5ｍLの3-メトキシ-2-メチル安息香酸N’-(1-エチル-2,2-ジメチル-プロピル)-ヒドラジド溶液、そして1.5ｍLの25％K2CO3水溶液を加えた。反応混合物は室温で24時間撹拌した。反応混合物をCH2Cl2を使って分離漏斗へ移し、希NaHCO3水溶液と一緒に振盪した。有機層を乾燥、濃縮し、シリカ・クロマトグラフィーを使い、25％の酢酸エチル/ヘキサンで溶出すると、100mgの精製された生成物である3,5-ジメトキシ-4-メチル安息香酸N-(1-エチル-2,2-ジメチル-プロピル)-N’-(3-メトキシ-2-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジドを得た。1HNMR (CDCl3, 300 MHz)δ(ppm): 6.6-7.2 (m, 4H), 6.25 (d, 1H), 4.6 (d,1H), 3.8-3.95 (br s, 9H), 2.1 (brs, 3H), 1.9 (s, 3H), 1.6 (br, 2H), 1.3 (m,3H), 0.9-1.2 (br d, 9H).
【０３４５】
1.43    2,2-ジメチル-ヘプタン-3-オールの調製
【化６５】
2014111634.tif 000076
【０３４６】
[00293]600ｍLのTHFに溶解した20ｇ(0.232mol)のpivaldehydeを磁気撹拌棒、温度計、ゴム製ストッパーの付いた２Lの3ネック丸底フラスコに加えた。容器を窒素下に保った。反応混合物はドライアイス/アセトンの浴槽で‐65℃に冷却した。温度を‐55℃未満に保ちながら、112ｍL(0.279mol)の2.5MBuLiヘキサン溶液を20ｍLのガラス製シリンジで５ｍLずつ徐々に加えた。反応物は‐60℃で1時間撹拌してから、1時間かけて‐5℃まで温めた。反応物は再度‐60℃まで冷却し、温度を‐50℃未満に維持しながら、NH4Cl/H2O溶液で徐々に鎮めていった。100ｍLの水を加え、反応物を室温まで温めた。THFは、油が観察されるまで、25℃の浴槽で回転式蒸発装置を使って除去した。生成物はエチルエーテルで抽出し、エーテルを乾燥し、注意して蒸発させると、31.0ｇの2,2-ジメチル-ヘプタン-3-オールが得られた。この物質は以後の酸化反応に直接使用した。1HNMR (CDCl3, 500 MHz) δ(ppm): 3.2 (m, 1H), 1.2-1.7 (m,3H), 0.93 (m,3H), 0.89 (s, 9H).
【０３４７】
1.44    2,2-ジメチル-ヘプタン-3-オンの調製
【化６６】
2014111634.tif 000077
【０３４８】
[00294]磁気撹拌棒付きの500ｍL丸底フラスコを使って、2,2-ジメチル-ヘプタン-3-オールを350ｍLのCH2Cl2に溶解した。フラスコは氷で部分的に冷却した。激しく撹拌しながら、76.6ｇ(0.355mol)のクロロクロム酸ピリジニウムを加えた。反応物は黒色に変わり、僅かに温度が上昇した。反応混合物は室温で24時間撹拌した。溶液は黒色の沈殿物からデカントで除き、沈殿物はヘキサンで洗浄した。有機抽出物は一緒にし、直接シリカゲル・クロマトグラフィーを使用した。(注：還元された未反応のクロム化合物をトラップし、除去できたのはシリカだけだった)。CH2Cl2/ヘキサン、次に10％の酢酸エチル/ヘキサン画分で溶出すると、生成物である2,2-ジメチル-ヘプタン-3-オンが29.19ｇ得られた。収率88％。1HNMR(CDCl3, 500 MHz) δ(ppm): 2.48 (t, 2H), 1.54 (m, 2H), 1.28 (m,2H), 1.13 (s, 9H), 0.90 (m, 3H).
【０３４９】
1.45    3-メトキシ-2-メチル安息香酸N’-(1-tert-ブチル-ペンチル)-ヒドラジドの調製
【化６７】
2014111634.tif 000078
【０３５０】
[00295]2.84ｇ(20ｍｍol)の2,2-ジメチル-ヘプタン-3-オン、3.60ｇ(20ｍｍol)の2-メチル,3-メトキシ安息香酸ヒドラジド、20滴の氷酢酸、そして40ｍLの100％エチルアルコールを4時間還流し、それから室温で24時間撹拌した。TLCは、僅か35％の反応である事を示していた。従って、反応混合物を更に6時間還流した。TLCは、約80％の反応である事を示した(TLCRf=0.57、出発物質のヒドラジド、Rf=0.08 、1:1酢酸エチル：ヘキサン)。反応混合物に3.5ｍLの氷酢酸と1.89ｇ(30ｍｍol)のNaCNBH3を加えた。混合物を室温で2時間撹拌し、1時間還流した。50ｍLの水を加え、反応混合物が塩基性を示すまで、15％NaOHを加えた。アルコールの大半を回転式蒸発装置で除去し、生成物をCHCl3で抽出すると、4.28ｇの粗物質が得られた。TLCは、RF0.54に生成物であるヒドラジドの存在を示していた(1: 1酢酸エチル：ヘキサン)。シリカ・グラジエント・クロマトグラフィーで精製した。25-40％の酢酸エチル/ヘキサン画分で溶出すると3.03gの生成物が得られた。55℃の真空オーブンで乾燥し、揮発性物質を除去すると、2.69gの3-メトキシ-2-メチル安息香酸N’-(1-tert-ブチル-ペンチル)-ヒドラジドが得られた。1HNMR (CDCl3, 500 MHz)δ(ppm): 7.2 (t, 1H), 7.05 (br, 1H[NH]), 6.9 (m,2H), 4.9 (br, 1H), 3.84 (s, 3H),2.5 (m, 1H), 2.3 (s, 3H), 1.2-1.8 (m, 6H),0.97 (s, 9H), 0.92 (t, 3H). 
【化６８】
2014111634.tif 000079
【０３５１】
[00296]250ｍLのフラスコで、17.85ｇ(90.98ｍｍol)の4-メトキシベンジル・カルバジン酸塩を50ｍLのCH2Cl2に溶解し、氷水で冷却した。80ｍLの水に溶解した21.42ｇ(155ｍｍol)の炭酸カリウムを加えた。反応混合物を氷の浴槽で撹拌しながら、17.0ｇ(79.95ｍｍol)の5-メチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボニル塩化物のCH2Cl2溶液60ｍLを徐々に加えた。反応混合物は室温で一夜撹拌し、それから200ｍLのCH2Cl2と200ｍLの水で分離漏斗へ移した。振盪後、浮かんでいる白い沈殿物を濾過・除去し、水で洗浄し、真空オーブンで乾燥すると、29.1ｇのN’-(5-メチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボニル)ヒドラジン安息香酸4-メトキシ-ベンジルエステルが得られた。CH2Cl2溶液を乾燥し、濃縮すると、5.19ｇの残渣が得られた。残渣には、最初の酸塩化物である4-メトキシベンジル・カルバジン酸塩と生成物がいくらか含まれていた。TLCRf=0.38(条線1:1酢酸エチル：ヘキサン)。1H NMR (CDCl3, 300 MHz)δ(ppm): 7.4 - 6.7 (m, 6H), 5.139 (s 2H), 4.279 (s 4H), 3.81 (s, 3H), 2.303(s,3H).
【化６９】
2014111634.tif 000080
【０３５２】
[00297]500ｍLのフラスコで、18.6ｇ(0.0499ｍｍol)のN’-(5-メチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボニル)ヒドラジン安息香酸4-メトキシ-ベンジルエステル、72ｍLの濃塩酸、そして108ｍLのジオキサンを混合した。フラスコは80℃の油浴に入れ、2時間機械的に撹拌した。反応混合物は氷水で冷やし、氷水に注いでから、分離漏斗へ移した。この反応混合物‐水溶液は150ｍLのCH2Cl2で2度抽出し、酸と中性物質(出発物質)を除去した。水溶液の層は20％のNaOH溶液で塩基性(pH12)にし、150ｍLの酢酸エチルで4度抽出した。酢酸エチル抽出物をMgSO4上で乾燥し、濃縮すると、4.5ｇの5-メチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボン酸ヒドラジドが得られた。1HNMR (CDCL3, 300 MHz)δ(ppm): 7.0 (s, 1H), 6.85(d, 1H), 6.74 (d, 1H),4.28 (m, 4H), 2.781 (s, 3H).
【０３５３】
1.46    5-メチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボン酸N’-(1-エチル-2, 2-ジメチル-プロピル)-ヒドラジドの調製
【化７０】
2014111634.tif 000081
【０３５４】
[00298]0.86ｇ(4.1ｍｍol)の5-メチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボン酸ヒドラジド、1.14ｇ(10ｍｍol)の2,2-ジメチル-ペンタン-3-オン、30ｍLのエチルアルコール、そして20滴の氷酢酸を6時間還流した。TLCは、約60％が5-メチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボン酸(1-エチル-2,2-ジメチル-プロピリデン)-ヒドラジドに変わっている事を示していた(Rf=0.40、1:1酢酸エチル：ヘキサン)。反応混合物は冷却し、３ｍLの氷酢酸、次に0.63ｇ(10ｍｍol)のシアノボロハイドライド・ナトリウムを加え、反応物は室温で3時間撹拌した。アルコールの大半は回転式蒸発装置で除去した。30ｍLの水を加え、反応混合物が塩基性を示すまで、10％のNaOH/H2Oを加えた。混合物は酢酸エチルで何度も抽出した。酢酸エチル抽出物を乾燥し、蒸発させると、1.2ｇの粗物質が得られた。生成物は、シリカゲル・カラムクロマトグラフィーを使い、20-30％の酢酸エチル/ヘキサンで溶出する事により精製した。約0.46ｇの精製された5-メチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボン酸N’-(1-エチル-2,2-ジメチル-プロピル)-ヒドラジドが得られた。TLC：Rf=0.46(1:1酢酸エチル：ヘキサン)。1H NMR(CDCl3, 500 MHz) δ (ppm): 7.1 (br,1H[NH]), 6.85 (d, 1H), 6.71 (d,1H), 4.8 (br, 1H), 4.29 (m, 2H), 4.25 (m, 2H),2.4 (m, 1H), 2.29 (s, 3H), 1.7(m, 1H), 1.3 (m, 1H), 1.15 (t, 3H), 0.98 (s,9H).
【０３５５】
1.47    RG-115858,3,5-ジメチル安息香酸N’-(5-エチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボニル)-N-(1-エチル-2,2-ジメチル-プロピル)-ヒドラジドの調製
【化７１】
2014111634.tif 000082
【０３５６】
[00299]250ｍLの丸底フラスコを使い、2.38ｇ(18ｍｍol)のt-ブチル・カルバジン酸塩を50ｍLのCH2Cl2に溶解し、０℃に冷やした。K2CO3水溶液を調製し(4.15ｇK2CO3/35ｍLの水
)、反応混合物に加え、反応混合物は再び0℃に冷やした。3.63ｇ(ｍｍol)の5-エチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボニル塩化物を40ｍLのCH2Cl2に溶解し、分離
漏斗から15分かけて滴下した。反応混合物は室温で3日間撹拌した。反応混合物はCH2Cl2と水を使って分離漏斗へ移した。水の層はCH2Cl2で十分に抽出した。CH2Cl2抽出物は0.5NHClで抽出し、乾燥し、蒸発させた。残渣を真空オーブンで更に乾燥すると、5.15ｇの黄褐色の固体であるN’-(5-エチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボニル)-ヒドラジン安息香酸tert-ブチルエステルが得られた。TLC(1:1酢酸エチル：ヘキサン)はRf=0.43に単一のスポットを示し、NMRは極めて精製された生成物である事を示していた。1H NMR(CDCl3, 500 MHz) δ (ppm): 7.5 (br, 1H), 7.0 (br,1H), 6.75 (d, 2H),4.28 (br, 4H), 2.76 (m, 2H), 1.5 (s, 9H), 1.18 (t, 3H).
【化７２】
2014111634.tif 000083
【０３５７】
[00300]5.15ｇ(16ｍｍol)のN’-(5-エチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボニル)-ヒドラジン安息香酸tert-ブチルエステルを200ｍLの丸底フラスコに入れた。約20ｍLのトリフルオロ酢酸を加え、反応混合物を室温で24時間撹拌した。約40ｍLの水を加え、撹拌しながら、酸が中和されるまで(ｐH〜14)、10％の冷NaOH/H2Oを徐々に加えた。反応混合物は分離漏斗へ移し、徐々に振盪しながら、酢酸エチルで抽出した(注意：ガスの発生)。酢酸エチル抽出物を乾燥し、蒸発させると、粘着性のある黄色の半固体が得られた。この物質を50℃の真空オーブンに約1時間入れると、4.62ｇの5-エチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボン酸ヒドラジドが得られた。T-Boc開裂はニート・トリフルオロ酢酸を使うと最も効率が良かった。補助溶媒の使用は、収率を必ず極端に下げる結果となった。1HNMR (CDCl3, 500 MHz) δ(ppm): 7.0 (br, 1H), 6.83 (m, 1H), 6.71 (m,1H), 4.28 (br s, 4H), 2.76 (m, 2H),1.6 (br, 2H), 1.17 (t, 3H).
【化７３】
2014111634.tif 000084
【０３５８】
[00301]1.12ｇ(5.1ｍｍol)の5-エチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボン酸ヒドラジド、1.37ｇ(12ｍｍol)の2,2-ジメチルペンタノン-3、30ｍLのエタノール、そして20滴の氷酢酸を6時間還流し、5-エチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボン酸(1-エチル-2,2-ジメチル-プロピリデン)-ヒドラジドを生成し、それをそのまま使用した。冷やした反応混合物に３ｍLの氷酢酸と0.63g(10ｍｍol)のNaCNRH3を加えた。反応物は室温で24時間撹拌した。25ｍLの水を加え、アルコールの大半は回転式蒸発装置で除去した。次に、反応混合物が塩基性になるまで、10％のNaOH/H2Oを加えた。生成物は酢酸エチルで抽出し、それを乾燥し、蒸発させると、1.61ｇの残渣が残った。精製された5-エチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボン酸N’-(1-エチル-2,2-ジメチル-プロピル)-ヒドラジドは、シリカゲル・カラムクロマトグラフィーを使い、25％の酢酸エチル/ヘキサンで溶出して得た(約0.77ｇ)。TLC：Rf＝0.53、1:1酢酸エチル：ヘキサン)。1HNMR (CDCl3, 500 MHz) δ (ppm): 7.1 (br s, 1H), 6.8 (d,1H), 6.7 (d,1H), 4.27 (m, 4H), 2.8 (m, 2H), 2.4 (m, 1H), 1.7 (m, 1H), 1.3 (m,1H), 1.2 (t,3H), 1.15 (t, 3H), 0.97 (s, 9H).
【化７４】
2014111634.tif 000085
【０３５９】
[00302]0.214ｇ(0.70ｍｍol)の5-エチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボン酸N’-(1-エチル-2,2-ジメチル-プロピル)-ヒドラジド、151mg(0.9ｍｍol)の3,5-ジメチルベンゾイル塩化物、7ｍLの25％のK2CO3/H2O、そして７ｍLのCH2Cl2を20ｍLの小瓶
に加え、室温で24時間撹拌した。反応混合物は分離漏斗へ移し、希NaHCO3とCH2Cl2を加えた。CH2Cl2層は分離し、水の層をCH2Cl2で2度抽出した。CH2Cl2抽出物をMgSO4上で乾燥し、蒸発させると、0.59ｇの白色の残渣を得た。カラムクロマトグラフィーを使い、15ｍLの20％酢酸エチル/ヘキサンで溶出すると、約350mgの3,5-ジメチル安息香酸N’-(5-エチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボニル)-N-(1-エチル-2,2-ジメチル-プロピル)-ヒドラジドが得られた(TLC：Rf＝0.56、1:1酢酸エチル：ヘキサンにより、95％精製)。1HNMR (CDCl3, 500 MHz) δ(ppm): 7.05 (s, 1H), 7.0 (s, 2H),6.6 (d, 1H),6. 27 (d, 1H), 4.65 (d, 1H), 4.25 (s, 4H), 2.9 (m, 1H), 2.3 (s,6H), 2.0 (m, 1H),1. 55-1.7 (m, 2H), 1.25 (m, 3H), 0.9-1.2 (3s, 9H), 0.9 (t, 3H).
【０３６０】
[00303]以下の化合物は同様の方法で調製した。
【０３６１】
[00304]3,5-ジメトキシ-4-メチル安息香酸N-(1-tert-ブチル-ブチル)-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド。TLC：Rf＝0.45、3：2(ヘキサン：アセトン)。
【０３６２】
[00305]RG-115851、3,5-ジメチル安息香酸N-(1-tert-ブチル-ペンチル)-N’-(3-メトキシ-2-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド。1HNMR (CDCl3, 500 MHz), δ (ppm): 7.7 (s, 1H), 7.22, 7.1 (2br s, 1H),7.08 (s, 2H), 7.0 (s, 1H), 6.87 (m, 1H), 6.28 (m, 1H), 4.7 (m, 1H),3.78 (s,3H), 2.28 (s, 6H), 1.8 (s, 3H), 1.3-1.6 (br m, 6H), 1.2, 1.1 ,0.95 (3s,9H),0.95 (m, 3H); TLC：Rf＝0.56(1:1酢酸エチル：ヘキサン)。
【０３６３】
[00306]RG-115852、3,5-ジメトキシ-4-メチル安息香酸N-(1-tert-ブチル-ペンチル)-N’-(3-メトキシ-2-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド。1HNMR(CDCl3, 500 MHz), δ (ppm): 7.05 (t, 1H), 7.0 (s, 1H), 6.85 (d,1H),6.65 (s, 2H), 6.25 (d, 1H), 4.7 (d, 1H), 3.89 (s, 3H), 3.78 (s, 6H), 2.10(s,3H), 1.86 (s, 3H), 1.3-1.6 (br m, 6H), 1.06, 0.99 (2s, 9H), 0.94 (t, 3H);TLC：Rf＝0.55 (1:1酢酸エチル：ヘキサン)。
【０３６４】
[00307]3,5-ジメチル安息香酸N-(1-エチル-2,2-ジメチル-プロピル)-N’-(5-メチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボニル)-ヒドラジド。1HNMR (CDCl3, 500 MHz),δ(ppm):7.05 (s, 2H), 7.0 (s, 1H), 6.6 (d, 1H), 6.3 (d, 1H), 4.6 (d, 1H), 4.25(m, 4H),2.25 (s, 6H), 1.85 (s, 3H), 1.5-1.8 (br, 2H), 1.3 (t, 3H), 1.0-1.2 (2s,9H); TLC：Rf＝0.52(1:1酢酸エチル：ヘキサン)。
【０３６５】
[00308]3,5-ジメトキシ-4-メチル安息香酸N-(1-エチル-2,2-ジメチル-プロピル)-N’-(5-メチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボニル)-ヒドラジド。1HNMR (CDCl3, 500 MHz),δ(ppm): 6.8 (br s, 1H), 6.62 (s, 1H), 6.6 (d, 1H), 6.27 (d, 1H), 4.6 (d,1H),4.25 (m, 4H), 3.84, 3.78 (2s, 6H), 2.1 (s, 3H), 1.87 (s, 3H), 1.6 (br, 2H),1.3(t, 3H), 0.9-1.2 (m, 9H); TLC：Rf＝0.45 (1:1酢酸エチル：ヘキサン)。
【０３６６】
[00309]3,5-ジメチル安息香酸N-(1-tert-ブチル-ブチル)-N’-(5-メチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボニル)-ヒドラジド。1HNMR(CDCl3, 500 MHz), δ(ppm): 7.05 (s, 2H), 7.0 (s, 1H), 6.6 (d,1H), 6.3(d, 1H), 4.7 (d, 1H), 4.2 (m, 4H), 2.3 (s, 6H), 1.8 (s, 3H), 1.3-1.7(br m, 4H),1.1, 1.15 (2s, 9H), 0.95 (t, 3H).
【０３６７】
[00310]3,5-ジメトキシ-4-メチル安息香酸N-(1-tert-ブチル-ブチル)-N’-(5-メチル-2, 3-ジヒドロベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボニル)-ヒドラジド。1HNMR (CDCl3, 500 MHz), δ(ppm): 6.75 (br s, 1H), 6.62 (s, 1H), 6.6 (d,1H), 6.25 (d, 1H), 4.7 (t, 1H),4.25 (m, 4H), 3.78, 3.84 (2s, 6H), 2.85 (br,1H), 2.37 (m, 1H), 2.07 (s, 3H),1.86 (s, 3H), 1.3-1.7 (br m, 4H),
【０３６８】
[00311]3,5-ジメトキシ-4-メチル安息香酸N’-(5-エチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボニル)-N-(1-エチル-2,2-ジメチル-プロピル)-ヒドラジド。1HNMR (CDCl3, 500 MHz),δ(ppm): 6.8 (br s, 1h), 6.65 (s, 1H), 6.6 (d,1H), 6.25 (d, 1H), 4.6 (d, 1H),4.25 (2s, 4H), 3.79-3.84 (2s, 6H), 2.9 (br,1H), 2.35 (br, 1H), 2.1 (s, 3H),1.3-1.9 (br m, 2H), 1.3 (t, 3H), 1.1-1.3 (m,9H), 0.94 (t, 3H); TLC Rf = 0.48(1:1酢酸エチル：ヘキサン)。
【０３６９】
[00312]3,5-ジメチル安息香酸N-(1-tert-ブチル-ブチル)-N’-(5-エチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボニル)-ヒドラジド。1HNMR(CDCl3, 500 MHz), δ(ppm): 7.05 (s, 2H), 7.0 (s, 1H), 6.59 (d,1H),6.18 (d, 1H), 4.7 (d, 1H), 4.27, 4.25 (s, 4H), 2.85 (m, 1H), 2.3 (s, 6H),2.1(m, 1H), 1.3-1.8 (br m, 4H), 1.1, 1.15 (2s, 9H), 0.95 (t, 6H); TLC Rf =0.53(1:1酢酸エチル：ヘキサン)。
【０３７０】
[00313]3,5-ジメトキシ-4-メチル安息香酸N-(1-tert-ブチル-ブチル)-N’-(5-エチル-2, 3-ジヒドロベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボニル)-ヒドラジド。1HNMR (CDCl3, 500 MHz), δ(ppm): 6.75 (br s, 1H), 6.62 (s, 1H), 6.6(d, 1H), 6.2 (d, 1H), 4.7 (m, 1H),4.25 (br m, 4H), 3.84, 3.78 (2s, 6H), 2.4(m, 1H), 1.95 (m, 1H), 2.1 (s, 3H), 1.2-1.8(br m, 4H), 1.1-0.95 (m, 9H), 0.95(m, 6H). TLC: 0.54 (1:1酢酸エチル：ヘキサン)；TLC：Rf＝0.54 (1:1酢酸エチル：ヘキサン)。
【０３７１】
1.48    RG-115665の調製
【化７５】
2014111634.tif 000086
【０３７２】
[00314]カルバジン酸ベンジル(25ｇ、0.15mol)を丸底フラスコ内のDMF50ｍLに溶解した。溶液は95-100℃に加熱した。２つの分離した追加漏斗から、エチル２-ブロモイソブチレート(58.5ｇ、0.3mol)とピリジン(29.7ｇ、0.375 mol、30ｍL)を別々に、しかも同時に、30-120分かけて滴下した。反応の完了に必要であれば、加熱を継続した。反応はTLC(30％の酢酸エチル・ヘキサン溶液、I2視覚化)でモニターした。混合物は冷却してから、氷水に注いだ。水溶液の混合物はエチルエーテルで抽出し、溶媒は真空除去した。2-(N’-ベンジルオキシカルボニル-ヒドラジノ)-2-メチル-プロピオン酸エチルエステルが単離された。シリカゲル・クロマトグラフィーを使っても良い。1HNMR (300 MHz, CDCl3) δ(ppm): 7.36(br s, 5H), 6.6 (br s, 1H), 5.15(br s, 2H), 4.2 (q, 2H), 1.3 (s,6H), 1.25 (t, 3H). １H NMR分析だけでは、反応の進行度合いを確認するのは不十分である。
【化７６】
2014111634.tif 000087
【０３７３】
[00315]2-(N’-ベンジルオキシカルボニル-ヒドラジノ)-2-メチル-プロピオン酸エチルエステル(28ｇ、0.1mol)を50ｍLのCH2Cl2に溶解し、氷で冷却した。20.7ｇのK2CO3を含む水溶液30ｍLを加えた。温度を0-5℃に維持しながら、3,5-ジメチルベンゾイル塩化物(17ｇ、0.1mol)のCH2Cl2溶液50ｍLを1時間かけて滴下した。混合物を氷の浴槽上で1時間、それから室温で一夜撹拌した。TLCは反応が完了した事を示していた。水溶液の層は分離漏斗に入れて除去し、有機層を水、それから塩水で洗浄し、MgSO4上で乾燥した。溶媒は回転式蒸発装置で除去した。残渣はヘキサンでスラリー状にし、濾過し、それから空気乾燥した。2-[N’-ベンジルオキシカルボニル-N-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-ヒドラジノ]-2-メチル-プロピオン酸エチルエステルが、白色固体として得られた。TLCは単一のスポットを示していた。1HNMR (300 MHz, CDCl3) δ(ppm): 7.4 (s, 1H), 7.3 (m, 3H), 7.15 (m,2H), 7.1 (s, 2H), 7.0 (s, 1H), 5.2 (d,1H), 5.0 (d, 1H), 4.2 (m, 2H), 2.25 (s,6H), 1.78 (s, 3H), 1.64 (s, 3H), 1.28(t, 3H).
【化７７】
2014111634.tif 000088
【０３７４】
[00316]500ｍLの丸底フラスコに、20.62ｇ(0.05mol)の2-[N’-ベンジルオキシカルボニル-N-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-ヒドラジノ]-2-メチル-プロピオン酸メチルエステルと200ｍLの乾燥TMFを加えた。混合物は撹拌し、フラスコはドライアイスで冷却し、それから室温で撹拌しながら、0.87ｇ(0.04mol)のLiBH4を加えた。反応混合物は冷蔵庫に入れ、更にLiBH4を加え(1.3ｇ)、反応物を2日間冷蔵庫に保管した。反応混合物を室温にまで温め、100ｍLのエーテルを加え、全混合物を分離漏斗に入っている150ｍLの水に徐々に注いだ。泡立ちが治まった後、混合物を激しく振り、それから徐々に振盪した。エーテル層を分離し、水の層を100ｍLのEt2Oで2度抽出した。全エーテル抽出物を水で抽出し、塩水で洗浄し、蒸発させると、20.04ｇの生成物が得られた。生成物はクロマトグラフィーで精製した。生成物を30-35％の酢酸エチル/ヘキサンで溶出すると、11.6ｇのN’-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-N’-(2-ヒドロキシ-1,1-ジメチル-エチル)-ヒドラジンカルボン酸ベンジルエステル、1HNMR (CDCl3, 300 MHz) δ(ppm): 7.3-6.9 (3s, 8H), 5.1 (d, 1H), 4. 9 (d,1H), 4.1 (d, 1H), 4.1 (d, 1H),3.6 (d, 1H), 2.25 (s, 6H), 1.48 (s, 3H), 1.41(s, 3H),及び４ｇの未反応の出発物質を得た。
【化７８】
2014111634.tif 000089
【０３７５】
[00317]丸底フラスコに4.00ｇ(0.0108mol)のN’-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-N’-(2-ヒドロキシ-1,1-ジメチル-エチル)-ヒドラジンカルボン酸ベンジルエステル、3.27ｇ(0.048mol)のイミダゾール、そして20ｍLのDMFを加えた。フラスコは氷の浴槽で冷やし、それから温度を25℃未満に維持しながら、4.08ｇ(0.027mol)のt-ブチル,ジメチルシリル塩化物を徐々に加えた。氷の浴槽を除き、反応物を室温で一夜撹拌した。反応混合物は200ｍLの水に注ぎ、100ｍLのエーテルで3度抽出した。エーテル抽出物を水で洗浄し、MgSO4上で乾燥し、濃縮すると、7.12ｇの生成物を得た。生成物はカラムクロマトグラフィーで精製した。生成物を20-100％のCH2Cl2/ヘキサンで溶出すると、5.13ｇのN’-[2-(tert-ブチル-ジメチル-シラニルオキシ)-1,1-ジメチル-エチル]-N’-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-ヒドラジンカルボン酸ベンジルエステルが得られた。1H NMR (CDCl3,300 MHz) δ (ppm): 7.3-6.7 (m, 8H), 5.0 (s,2H), 4.1 (d, 1H), 3.4 (d, 1H), 2.15(d, 6H), 1.54 (d, 3H),1.25 (d, 3H), 0.82 (s,9H), 0.01 (s, 6H).
【化７９】
2014111634.tif 000090
【０３７６】
[00318]200ｍLの丸底フラスコに、4.62ｇ(0.0095mol)のN’-[2-(tert-ブチル-ジメチル-シラニルオキシ)-1,1-ジメチル-エチル]-N’-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-ヒドラジンカルボン酸ベンジルエステル、100ｍLの乾燥CH2Cl2、2.5ｇのEt3N、そして1.66ｇ(0.0143mol)のEt3SiHを加えた。反応混合物は氷の浴槽で冷やしてから、100ｍｇの酢酸パラジウムを3度に分け、30分かけて加えた。反応物は室温まで温めた。TLCは、生成物がない事、出発物質(20％の酢酸エチル/ヘキサン、Rf4.3)だけである事を示していたので、熱線銃で徐々に温め、それから室温で30分撹拌した。TLCは生成物の存在を示していた(20％の酢酸エチル/ヘキサン、Rf0.43)。
【０３７７】
[00319]反応混合物を適量のMgSO4と一緒に撹拌し、濾過した。濾塊はCH2Cl2で洗浄した。全CH2Cl2画分を飽和NH4Cl、それから水と一緒に振盪した。CH2Cl2層を乾燥し、蒸発させると、3.78ｇの3,5-ジメチル安息香酸N-[2-(tert-ブチル-ジメチル-シラニルオキシ)-1,1-ジメチル-エチル]-ヒドラジドを得た。生成物はカラムクロマトグラフィーを使い、5-10％の酢酸エチル/ヘキサンで溶出する事により精製した。生成物の画分は一緒にし、濃縮し、温かい(50℃)真空オーブンに入れると、2.96gの3,5-ジメチル安息香酸N-[2-(tert-ブチル-ジメチル-シラニルオキシ)-1,1-ジメチル-エチル]-ヒドラジドが得られた。1HNMR (CDCl3, 300 MHz) δ (ppm):7.0 (s, 2H), 6.9 (s, 1H), 3.80 (s,2H), 2.23 (s, 6H), 1.40 (s, 6H), 0.82 (s,9H), 0.08 (s, 6H).
【化８０】
2014111634.tif 000091
【０３７８】
[00320]250ｍLの丸底フラスコに、3.71ｇ(0.010mol)の3,5-ジメチル安息香酸N-[2-(tert-ブチル-ジメチル-シラニルオキシ)-1,1-ジメチル-エチル]-ヒドラジド、及び50ｍLのCH2Cl2を加えた。2.11ｇ(0.106mol)の2-エチル-3-メトキシベンゾイル塩化物とK2CO3水溶液(20ｍLの水に4.15ｇ)を加えた。反応混合物は室温で一夜撹拌した。反応混合物は分離漏斗へ移し、水溶液の層を50ｍLのCH2Cl2で2度抽出した。有機層を乾燥し、濃縮すると、5.52ｇのシロップ状の生成物が得られた。更に精製するため、生成物をヘプタンで粉砕し、混合物を冷凍庫に入れ、それから黄色の溶液をデカントで破棄するか、あるいはより望ましい方法として、冷やしたブフナー・フィルターで1-2時間急速濾過する事により、白色固体である2-エチル-3-メトキシ安息香酸N’-[2-(tert-ブチル-ジメチル-シラニルオキシ)- 1,1-ジメチル-エチル]-N’-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-ヒドラジド(2.9ｇ)を得た。1HNMR (CDCl3, 300 MHz) δ(ppm): 7.0-6.8 (m, 5H), 6.2 (d, 1H), 4.1 (d, 1H), 3.69 (s, 3H), 3.5 (d,1H),2.19 (s, 6H), 1.62 (s, 3H), 1.40 (s, 3H), 0.9 (t, 3H), 0.76 (s, 9H). 
【化８１】
2014111634.tif 000092
【０３７９】
[00321]2.78ｇ(0.00526mol)の2-エチル-3-メトキシ安息香酸N’-[2-(tert-ブチル-ジメチル-シラニルオキシ)-1,1-ジメチル-エチル]-N’-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-ヒドラジドを24ｍLのTHFに溶解した。混合物を氷の浴槽で冷却し、6.0ｍL(0.006mol)の1Mテトラブチル・アンモニウム・フッ化物のTHF溶液を加えた。反応物は室温で5-6時間撹拌し、それから100ｍLのEt2Oを加え、反応混合物を分離漏斗に入っている氷水に注いだ。水溶液の層は更に25ｍLのEt2Oで2度抽出し、全エーテル層を乾燥し、濃縮した。生成物のTLCは、ある出発物質の下部に新しい生成物(Rf0.20)の存在を示していた。生成物は、クロマトグラフィーを使って精製した。40-50％の酢酸エチル/ヘキサンで溶出して、1.42ｇの精製された3,5-ジメチル安息香酸N’-[1-(2-エチル-3-メトキシ-フェニル)-ビニル]-N-(2-ヒドロキシ-1,1-ジメチル-エチル)-ヒドラジドを得た(収率67％)。TLC：Rf=0.20。1HNMR(CDCl3, 300 MHz) δ(ppm): 7.1 - 6.8 (m, 5H), 6.0 (d, 1H), 4.3 (d,1H), 3.78 (s, 3H), 3.5 (d 1H),2.4 (d, 1H) 2.29(s, 6H), 2.2 (d, H), 1.56 (s,3H), 1.45 (s, 3H), 1.00 (t, 3H).
【化８２】
2014111634.tif 000093
【０３８０】
[00322]1.09ｇ(0.0027mol)の3,5-ジメチル安息香酸N’-[1-(2-エチル-3-メトキシ-フェニル)-ビニル]-N-(2-ヒドロキシ-1,1-ジメチル-エチル)-ヒドラジドを100ｍLのCH2Cl2に溶解し、1.80ｇ(0.0082mol)のクロロクロム酸ピリジニウムを加えた。反応混合物は2時間還流した。冷却後、全反応混合物をシリカ・クロマトグラフィーのカラム上に注ぎ、生成物である3,5-ジメチル安息香酸N-(1,1-ジメチル-2-オキソ-エチル)-N’-[1-(2-エチル-3-メトキシ-フェニル)-ビニル]-ヒドラジドを得た。白色の結晶性固体(1.04ｇ)は、30-35％の酢酸エチル/ヘキサンで溶出した。TLCは高純度を示していた(>95％)、Rf=0.46(1：1酢酸エチル：ヘキサン)。1H NMR(CDCl3, 300 MHz) δ(ppm): 9.6 (s,1H), 7.15 (s, 2H), 7.1 (m, 2H), 6.9(d, 1H), 6.3 (d, 1H), 3.806 (s, 3H), 2.304(s, 6H), 2.2-2.4 (m, 2H), 1.576 (s,3H), 1.429 (s, 3H), 1.01 (t, 3H).
【化８３】
2014111634.tif 000094
【０３８１】
[00323]20ｍLの小瓶に、55mgの3,5-ジメチル安息香酸N’-[1-(2-エチル-3-メトキシ-フェニル)-ビニル]-N-(2-ヒドロキシ-1,1-ジメチル-エチル)-ヒドラジド、２ｍLのCH2Cl2、そして200mgのEt3Nを加えた。反応混合物は撹拌し、それから17mgの塩化アセチルを加えた。室温で2時間撹拌後、反応物を40℃で30分間温めた。冷却後、更にCH2Cl2を加え、それから分離漏斗へ移し、希K2CO3と一緒に振盪した。CH2Cl2層はMgSO4で乾燥した。TLCはRf38に主なスポットを示していた。生成物はクロマトグラフィーで精製した。溶出には30％の酢酸エチル・ヘキサン溶液を用いた。その結果、約40mgの酢酸2-{N-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-N’-[1-(2-エチル-3-メトキシ-フェニル)-ビニル]-ヒドラジノ}-2-メチル-プロピルエステルが得られた。1HNMR (CDCl3, 300 MHz) δ(ppm): 7.1 - 6.8 (m, 6H), 6.1 (d, 1H), 4.7 -4.4(q, 2H), 3.79(s, 3H), 2.29 (s,6H), 2.12 (s, 3H), 1.75 (s, 3H), 1.49 (s,3H), 0.98 (t, 3H).
【化８４】
2014111634.tif 000095
【０３８２】
[00324]1.5ｇ(0.0036mol、純度80％)の2-[N’-ベンジルオキシカルボニル-N-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-ヒドラジノ]-2-メチル-プロピオン酸エチルエステルの入ったフラスコに、20ｍLの乾燥CH2Cl2、1.5ｍLのEt3N、そして1.27ｇ(0.010mol)のEt3SiHを加えた。撹拌しながら、全量0.010ｇのPd(OAc)2を少しずつ加え、反応物を室温で2時間撹拌した。Pd生成物の濾過及び除去を助けるため、この反応混合物に100ｍLのCH2Cl2と適量のMgSO4を加えた。CH2Cl2溶液を飽和NH4CLと一緒に振盪し、CH2Cl2を乾燥し、蒸発させると、1.61ｇの2-[N-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-ヒドラジノ]-2-メチル-プロピオン酸エチルエステルが得られた。生成物はクロマトグラフィーで精製した。溶出には21-24％の酢酸エチル・ヘキサン溶液を用いた。1HNMR (CDCl3, 300 MHz) δ (ppm): 7.045 (s 2H), 7.0(s 1H),4.4(s, 2H),2.324(s 6H), 2.236(s 3H), 1.487(s, 6H). 
【化８５】
2014111634.tif 000096
【０３８３】
[00325]1.6ｇ(0.0057mol)の2-[N-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-ヒドラジノ]-2-メチル-プロピオン酸エチルエステルのCH2Cl2溶液30ｍLを含むフラスコに、3.5ｇのEt3Nと1.20ｇ(0.0060mol)の2-エチル-3-メトキシベンゾイル塩化物を加えた。反応混合物は3時間還流し、それから蒸発乾固した。残渣は100ｍLのCH2Cl2に再度溶解し、50ｍLの希K2CO3水溶液で2度抽出した。CH2Cl2抽出物は乾燥し、蒸発させると残渣が残った。これを6％のEt2Oヘキサン溶液で細かく砕いた。白色の固体である2-[N-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジノ]-2-メチル-プロピオン酸エチルエステルを濾過し、温かい(50℃)真空オーブンで乾燥した。TLC：生成物、Rf=0.40、出発物質、Rf=0.35、1:1酢酸エチル：ヘキサン。1HNMR (CDCl3, 300 MHz) δ (ppm): 7.70 (s 1H), 7.2 - 6.8(m-5H), 6.2 (d 1H), 4.2 (q 2H), 3.801 (s 3H), 2.4(q 2H), 2.291 (s 6H), 1.882 (s3H), 1.557 (s 3H), 1.291 (t, 3H), 1.036 (t, 3H).
【化８６】
2014111634.tif 000097
【０３８４】
[00326]2-[N-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジノ]-2-メチル-プロピオン酸は、2-エチル-3-メトキシ-安息香酸N’-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-N’-(1,1-ジメチル-2-オキソ-エチル)-ヒドロジドをKMｎO4で酸化する事により調製した。対応するエステルは、40％のNaOH/CH3OH又は50％のNaOH+EtOH水溶液で還流しても、上述の酸には鹸化されなかった。
【化８７】
2014111634.tif 000098
【０３８５】
[00327]50mg(0.000126mol)の2-エチル-3-メトキシ安息香酸N’-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-N’-(1,1-ジメチル-2-オキソ-エチル)-ヒドラジドを秤量し、20ｍLの小瓶に入れた。0.5ｍLのCH3OHに溶解した20mgのヒドロキシルアミンHClを加えた。40mgのトリエチルアミンを加え、反応混合物を室温で一夜撹拌した。反応混合物はN2を使って濃縮乾固し、５ｍLのCH2Cl2と５ｍLの0.1NHCl/H2Oに再度溶解した。CH2Cl2層を分離した。TLCは、生成物である2-エチル-3-メトキシ安息香酸N’-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-N’-(2-ヒドロキシイミノ-1,1-ジメチル-エチル)-ヒドラジドのRfが0.27(1:1酢酸エチル：ヘキサン)で、純度が約85％である事を示していた。1H NMR (CDCl3, 300MHz)δ(ppm): 7.1-6.8 (m, 5H), 6.2 (d, 1H), 3.79 (s, 3H), 2.29 (s, 6H), 1.76 (s,3H),1.65 (s, 3H), 0.98 (t, 3H).
【化８８】
2014111634.tif 000099
【０３８６】
[00328]50mgの2-エチル-3-メトキシ安息香酸N’-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-N’-(1,1-ジメチル-2-オキソ-エチル)-ヒドラジド、40mgのセミカルバジド、40mgのEt3N、そして２ｍLのCH3OHを2時間還流し、濃縮乾固し、CH2Cl2に再度溶解し、(0.5N)HClで希釈した。CH2Cl2抽出物を乾燥し、蒸発させると、2-エチル-3-メトキシ安息香酸N’-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-N’-(1,1-ジメチル-2-オキソ-エチル)-ヒドラジドのセミカルバジドが得られた。1H NMR (CDCl3,300 MHz)δ(ppm): 7.4-6.8(m, 5H), 6.2 (d, 1H), 3.767 (s, 3H), 2.203 (s, 6H),1.717 (s,3H), 1.474 (s, 3H), 0.913 (t, 3H).
【化８９】
2014111634.tif 000100
【０３８７】
[00329]50mgの2-エチル-3-メトキシ安息香酸N’-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-N’-(1,1-ジメチル-2-オキソ-エチル)-ヒドラジド・アルデヒド、２ｍLのCH3OH、CH3OHと26mgのオキサミック・ヒドラジドを含む0.5%氷酢酸溶液0.5ｍL、そして40mgのEt3Nを2時間還流した。溶媒は蒸発装置上で除去し、残渣はCH2Cl2と水で再度溶解した。CH2Cl2抽出物を乾燥し、蒸発させた。TLCは生成物である2-エチル-3-メトキシ安息香酸N’-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-N’-(1,1-ジメチル-2-オキソ-エチル)-ヒドラジドのオキサミック・カルバジドの存在を示していた(Rf=0.50)。一方、出発物質であるアルデヒドのRfは0.74であった(100％酢酸エチル)。1HNMR (CDCl3, 300 MHz) δ(ppm): 8.1 (s 1H), 7.1-6.8 (m, 6H), 6.1 (d, 1H), 3.667 (s, 3H), 2.3 (m,1H),2.19 (s, 6H), 2.00 (m, 1H), 1.581 (s, 3H), 1.511 (s, 3H), 0.802 (t, 3H).
【化９０】
2014111634.tif 000101
【０３８８】
[00330]50ｍLの2-エチル-3-メトキシ安息香酸N’-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-N’-(1,1-ジメチル-2-オキソ-エチル)-ヒドラジドを45ｇのアミノエタノールのCH3OH溶液２ｍLと一緒に、20ｍLのフラスコへ加え、2時間還流した。冷却後、CH3OHを蒸発装置で除去し、残渣をクロマトグラフィーで精製した。生成物である3,5-ジメチル安息香酸N’-[1-(2-エチル-3-メトキシ-フェニル)-ビニル]-N-(2-ヒドロキシメトキシイミノ-1,1-ジメチル-エチル)-ヒドラジドが、40％の酢酸エチル/ヘキサンで溶出された。1HNMR (CDCl3, 300 MHz) δ(ppm): 7.2-6.9 (m, 5H), 4.1 (m,2H), 3.83 (s,3H), 3.7 (m, 2H), 2.75 (m, 2H), 2, 338 (s, 6H), 1.36 (s, 3H),1.21-1.87 (m,6H).
【化９１】
2014111634.tif 000102
【０３８９】
[00331]0.94ｇ(0.002mol)のメチルエーテルN’-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-N’-(2-メトキシ-1,1-ジメチル-エチル)-ヒドラジン・カルボン酸ベンジル・エステルの入ったフラスコに、10ｍLのCH2Cl2、0.87ｇのEt3SiH、0.10ｇの酢酸パラジウム、そして１gのEt3Nを加えた。反応混合物は室温で10時間以上撹拌した。更にCH2Cl2を加え(10-20ｍL)、混合物は濾過してパラジウムを除去した。茶色のCH2Cl2溶液をMgSO4及び木炭で処理し、濾過し、蒸発させた。その結果、0.87ｇの赤い油状の固体を得た。TLCは、生成物の存在を示していた(Rf=0.44、1:1酢酸エチル：ヘキサン)。生成物はクロマトグラフィーで精製した。19-20％の酢酸エチル/ヘキサンで溶出すると、401mg(80％)の3,5-ジメチル安息香酸N-(2-メトキシ-1,1-ジメチル-エチル)-ヒドラジド生成物が得られた。1HNMR (CDCl3, 300 MHz)δ(ppm): 7.1 (s, 2H), 7.0 (s, 1H), 3.682 (s, 2H), 3.377 (s, 3H), 2.319 (s, 6H),1.495 (s, 3H).
【化９２】
2014111634.tif 000103
【０３９０】
[00332]90mgの3,5-ジメチル安息香酸N-(2-メトキシ-1,1-ジメチル-エチル)-ヒドラジド1462(0.00036)(ママ)の入った20ｍLの小瓶に、２ｍLのCH2Cl2、145mg(0.00072mol)の2-エチル-3-メトキシベンゾイル塩化物、そして0.5K2CO3水溶液３ｍLを加えた。反応物は室温で一夜撹拌した。反応混合物は10ｍLのK2CO3及び50ｍLのCH2Cl2と一緒に、分離漏斗へ移した。CH2Cl2抽出物は乾燥し、蒸発乾固した。生成物である2-エチル-3-メトキシ安息香酸N’-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-N’-(2-メトキシ-1,1-ジメチル-エチル)-ヒドラジドは、クロマトグラフィーで精製した。25％の酢酸エチル・ヘキサン溶液で溶出すると、105mgの生成物が得られた。TLC：Rf=0.44(1:1酢酸エチル：ヘキサン)。1HNMR(CDCl3, 300 MHz) δ(ppm): 7.8 (s, 1H), 7.1-6.8 (m, 5H), 6.2 (d,1H),4.0 (d, 1H), 3.84 (d, 1H), 3.77 (s, 3H), 3.387 (s, 3H), 2.27 (s, 6H),2.4-2.1(m, 2H), 1.728 (s, 3H), 1.503 (s, 3H) 0.98 (t 3H).
【０３９１】
1.49    化合物RG-101494の調製
【０３９２】
[00333]N-(5-エチル-1,4-ベンゾジオキサン-6-カルボニル)-N’-(tert-ブチル)-N’-(3-クロロ-5-メチルベンゾイル)ヒドラジンは、米国特許番号5,530,028に従って調製できる。要するに、実施例17の生成物は、実施例5の方法、その後実施例8の方法で処理する。その結果生じる生成物は、実施例９の方法に従い、3-メチル-5-クロロベンゾイル塩化物で処理する[K.ノエベナゲル(Knoevenagel),Chemische Berichte 28：2045(1895)；スルートメーカース (Slootmaekers), P. J., ベルビアルスト(Verbeerst),R., Bull. Soc. Chm. Belg. 77：273-285(1968)]。
【０３９３】
1.50    化合物RG-102240の調製
【０３９４】
[00334]N-(3-メトキシ-2-エチルベンゾイル)-N’-(3,5-ジメチルベンゾイル)-N’-tert-ブチルヒドラジンは、米国特許番号5,530,028の実施例12に従って調製できる。
【０３９５】
1.51    化合物RG-102317の調製
【０３９６】
[00335]N-(5-メチル-1,4-ベンゾジオキサン-6-カルボニル)-N’-(tert-ブチル)-N’-(3, 5-ジメチルベンゾイル)ヒドラジンは、米国特許番号5,530,021の実施例3に従って調製できる。
【０３９７】
1.52    化合物RG-115092の調製
【０３９８】
[00336]N-(5-メチル-1,4-ベンゾジオキサン-6-カルボニル)-N’-(2-シアノ-2-プロピル) -N’-(3,5-ジメトキシ-4-メチルベンゾイル)ヒドラジンは、米国特許番号5,117,057の実施例802及び809に直接類似の方法で調製できるが、N-5-メチル-1,4-ベンゾジオキサン-6-カルボヒドラジン(調製に関しては、米国特許番号5,530,021の実施例２を参照)、及び3,5-メトキシ-4-メチルベンゾイル塩化物を使用。
【０３９９】
1.53    化合物RG-115575の調製
【０４００】
[00337]3,4,5-トリフルオロ安息香酸N-tert-ブチル-N’-(5-メチル-クロマン-6-カルボニル)-ヒドラジンは、米国特許番号5,530,021の実施例11に類似の方法で調製できるが、3,4,5-トリフルオロベンゾイル塩化物を使用。
【０４０１】
1.54    化合物RG-115637の調製
【０４０２】
[00338]5-メチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボン酸N’-tert-ブチル-N’-(3,5-ジメトキシ-4-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジドは、米国特許番号5,530,021の実施例3に類似の方法で調製できるが、3,5-ジメトキシ-4-メチル-ベンゾイル塩化物を使用。
【０４０３】
実施例２：物理的特性及び移動特性の決定
【０４０４】
2.1    LC logPの決定(実験的)
【０４０５】
[00339]logP標準セット(実験的にlogPが知られている化合物；表３を参照)の各々、及び各試験化合物のために1000ppm溶液が調製する。液体クロマトグラフィーの保持時間(RT)は、以下の条件を使って、各物質について測定される。線形方程式は、RTとlogPとの関係から導かれ、logP標準のデータから展開される。試験化合物のlogPは、logP/保持時間の方程式から計算される。
【表１１】
2014111634.tif 000104
【０４０６】
2.2    C logPの決定
【０４０７】
[00340]C logPは、業界の技術者に知られている標準の計算方法により計算できる。QSARの探求：化学及び生物学に於ける基礎及び応用(ExploringQSAR：Fundamentals and Applications in Chemistry and Biology)、コーウィン・ハンシュ(CorwinHansch)、アルベリー・レオ(Albery Leo)、米国化学協会(American Chemical Society)、ワシントンDC、1995。
【０４０８】
2.3    水溶解度の決定
【０４０９】
[00341]水溶液は以下の方法で3重に調製される：メタノール又はDMSO中の物質の10,000ppm溶液(200μlのメタノールに溶解した2,000μgの固体)50μlを１/8オンス又はそれより小さい磁気撹拌装置付き小瓶中の脱イオン水１ｍLに加える。周囲の温度で、一夜撹拌を継続する。スラリーはルアーチップ型シリンジに入れる。内容物は、新しい13mm0.2μMのアクロディスク・フィルター(タフリン又はグラスファイバー)を通して、オートサンプラー瓶に移す。較正標準溶液の調製：10,000ppm溶液の希釈は、10、5、１、0.5、及び0.2ppmで調製した。大半のジアシルヒドラジンの水溶解性はこの濃度範囲に該当する。更に溶解性の高い物質に関しても、サンプルの希釈は、較正範囲を増大するよりもこの範囲の方が望ましい。非線形的なレスポンスにより、較正曲線が余り役に立たなくなるからである。しかし、溶解度の極めて低い化合物に関しては、較正標準の範囲の変更が要求される。
【０４１０】
[00342]次にサンプルのクロマトグラフィーを行なった。大半のジアシルヒドラジンでは、以下のような条件が測定に適切であった。他のカラムやグラジエントも適宜代替可能である。
【表１２】
2014111634.tif 000105
【０４１１】
[00343]試験サンプルの分析は次のように行なった：溶解性試験は各々2重に分析される。適切な分析方法ならばどれでも容認できるが、結果は、SIM(単一イオン・モニタリング)を使ったエレクトロスプレイ負イオンモードで、LC/MSのマイクロマス・プラットフォームIIにより入手した。標準曲線は、標準物質の重複注入により得られる。基質の濃度は、濃度とレスポンスに関係する式の計算から決定される。
【０４１２】
2.4    細胞浸透係数
【０４１３】
[00344]細胞浸透係数の決定方法は、業界の技術者には良く知られている。MI-QSAR：膜相互関係QSAR分析を用いた有機分子のCaco-2細胞浸透係数の予測(PredictingCaco-2 CellPermeation Coefficients of Organic Molecules usingMembrane-Interaction QSRAnalysis)。クルカルニ、アミット(Kulkarni, Amit)；ハン、イー(Han, Yi)；ホプフィンガー (Hopfinger),A. J.；化学情報及びコンピューター・サイエンス・ジャーナル (Journal of Chemical Information and ComputerScience) (2002)4 2：331-342。表２は、本発明の化合物の物理的特性及び移動特性を表している。
【表１３】
2014111634.tif 000106
【表１４】
2014111634.tif 000107
【０４１４】
2.5    水溶液の溶解度
【０４１５】
[00345]平衡溶解度はｐH7.4の水緩衝液中で測定される。緩衝液は、NaH2PO4の0.07M溶液のｐHを10NNaOHでｐH7.4に調節する事により調製した。緩衝液は0.15のイオン強度を有している。≧１mg/ml混合物にするため、少なくとも1mgの粉末を１ｍLの緩衝液と組み合わせた。サンプルは2時間以上振盪し、室温で一夜放置した。次にサンプルは、そのサンプルで初めて飽和される0.45μmナイロン製シリンジ・フィルターで濾過した。濾液は連続2度サンプルとして使用した。濾液はHPLCでアッセイを行い、メタノール調製の標準物質と比較した。
【表１５】
2014111634.tif 000108
【０４１６】
2.6    分配係数
【０４１７】
[00346]水飽和1‐オクタノールとｐH7.4緩衝液間の分配係数Log(D)が、試験化合物に関して決定された。緩衝液はセクション2で記述された方法で調製した。0.60ｍLのオクタノールと0.60ｍLの緩衝液を含む小瓶に、室温で、10ｍMのDMSO保存液のうち12μlを導入した。内部コントロールとして、100μMの最終濃度に、テストステロンも加えた。溶液は60分間撹拌し、10,000rpmで10分間遠心分離した。有機層と水溶液の層は分離した。有機層の連続希釈を50％のメタノールで行なった(但し、第1回目の希釈は100％のメタノールで行なった)。水溶液の層の連続希釈はｐH7.4の緩衝液で行なった。希釈サンプルは、化合物及びテストステロンに関して、LC/MSでアッセイを行なった。ピーク領域レスポンスの割合を対数計算し、Log(D)を得た。テストステロンの通常のLog(D)は3.0-3.3である。
【表１６】
2014111634.tif 000109
【０４１８】
2.7    二方向性透過度、CACO-2
【０４１９】
[00347]12のウェルを持つコスター・トランスウェル(CostarTranswell)プレートに於いて、コラーゲンで覆ったミクロポアのポリカーボネート膜に集まるように、Caco-2単層を成長させた。プレートとその検定の詳細は以下に示してある。透過性アッセイ用の緩衝液は、10ｍMHEPESと15ｍMグルコースを含む平衡塩ハンク溶液(Hank’s Balanced SaltSolution)で、ｐH7.0±0.2である。投与溶液の濃度は、アッセイ緩衝液中10μMであった。各時間点、すなわち1及び2時間毎に、200μLを受け器室から取り、新鮮なアッセイ緩衝液で置き換えた。細胞には先端側(AからB)あるいは基底外側(BからA)で投与し、５％のCO2及び90％の相対湿度の条件下、37℃で培養した。測定は2度ずつ行なった。重要な実験パラメーターは以下に示してある。無細胞(ブランク)膜は、非特異的結合、及び化合物が装置を自由に拡散する度合いを測定する目的で調査した。ルシファー・イエローの流れ(フラックス)も、フラックス期間中に細胞の単層に損傷がない事を確認するため、試験化合物に投与後、各単層毎に測定した。
【０４２０】
[00348]サンプルは全て、エレクトロスプレイ・イオン化を使ってLC/MSでアッセイした。通常のLC/MS条件は以下の通りである。
【表１７】
2014111634.tif 000110
【表１８】
2014111634.tif 000111
見掛けの透過度、PaPP、回収％は以下の方法で計算された：
Papp=  (dCr /dt) x Vr/(A x C0)      (1)
回収％=100 x((Vr x Crfinal) + (Vdx Cdfinal))/(Vdx C0)       (2)
ここで、
ｄCr/dtは受け器室の蓄積濃度対時間(単位：Ms-1)
Vrは受け器室の容積(単位：cm3)
Vdはドナー室の容積(単位：cm3)
Aは細胞単層の面積(12ウェル・トランスウェルに関しては1.13cm2)
Coは投与溶液の濃度(単位：M)
Crfinalは培養期間終了時点の受け器蓄積濃度(単位：M)
Cdfinalは培養期間終了時点のドナー蓄積濃度(単位：M)
【表１９】
2014111634.tif 000112
【表２０】
2014111634.tif 000113
【０４２１】
実施例３：化合物の生物学的試験
【０４２２】
[00349]本発明のリガンドは、遺伝子療法、関心のある蛋白質の宿主内での発現、遺伝子導入された有機体の生産、細胞ベースのアッセイなど種々の応用に有効である。
【０４２３】
27-63アッセイ
遺伝子発現カセット
【０４２４】
[00350]GAL4DBD (1-147) - CfEcR(DEF)/VP16AD - βRXREF - LmUSPEF：ハマキガ科のガの幼虫であるChoristoneurafumiferana EcR(CfEcR-DEF; SEQ ID NO: 1) の野生型D, E,及びFドメインはGAL4 DNA結合ドメイン(Gal4DBD1=147;SEQ ID NO: 2) と融合させ、ホスホグリセレート・キナーゼ・プロモーター (PGK; SEQ IDNO: 3) のコントロール下に置かれた。ヒトRXRβ(HsRXRβ-EF；SEQID NO:４のヌクレオチド1−465)のEFドメインのへリックス１から8まで、及びバッタLocusta migratoriaウルトラスパイラクル蛋白質(LmUSP-EF;SEQ ID NO: 5のヌクレオチド403−630)のEFドメインのヘリックス9から12までは、VP16 (VP16AD; SEQID NO: 6)のトランスアクティベーション・ドメインと融合し、延長因子１αプロモーター (EF-1α; SEQ ID NO: 7) のコントロール下に置かれた。５つのコンセンサスGAL4応答要素結合サイト(5XGAL4RE; SEQ ID NO: 8を含むGAL4REの５つのコピーを含む)は合成TATA最小プロモーターと融合し、ルシフェラーゼ・レポーター遺伝子(SEQID NO:10)の上流に置かれた。
【０４２５】
安定細胞株
【０４２６】
[00351]CHO細胞は、単一のプラスミド上で偏在的に活性な細胞プロモーター(PGK及びEF-1α)がコントロールするGAL4DBD(1-147)CfEcR(DEF)及びVP16ADβRXREF-LmUSPEFの転写カセットで一時的に形質移入された。安定的に形質移入された細胞は、ゼオシン(Zeocin)耐性により選択された。個別に分離されたCHO細胞のクローンは、GAL4REルシフェラーゼ・レポーター(ｐFR Luc)で一時的に形質移入された。27-63のクローンが、ハイグロマイシンを使って選択された。
【０４２７】
リガンド処理
【０４２８】
[00352]細胞はトリプシン化され、2.5ｘ10４細胞 ｍLの濃度に希釈された。100μLの細胞懸濁液が96ウェル・プレートの各ウェルに置かれ、５％CO2の下、37℃で24時間培養された。リガンド株の溶液はDMSOで調製され、全ての処理で300倍に希釈された。用量応答試験は、33μMから0.01μMの８つの濃度で構成された。
【０４２９】
レポーター遺伝子アッセイ
【０４３０】
[00353]ルシフェラーゼ・レポーター遺伝子発現は、プロメガ(Promega)のブライト-グロ・ルシフェラーゼ・アッセイ・システム(Bright-GloTMLuciferaseAssay System)を使った細胞処理の48時間後に測定された。発光は、ダイネックス (Dynex) MLXのミクロタイター・プレート・ルミノメーターを使って、室温で検出された。
【０４３１】
Z3アッセイ
安定細胞株
【０４３２】
[00354]サール(Suhr),S. T., ギル(Gil), E. B., セヌート(Senut), M. C., ゲイジ(Gage), F. H. (1998) Proc. Natil.Sci. USA 95, 7999-804に述べられているように、Dr. F. ゲイジ(Gage)は、CVBEと６XEcREを含む安定的に形質転換した細胞集団を提供した。HEK-293とも呼ばれるヒトの293腎臓細胞は、まずスイッチ・コンストラクトCVBE、その後レポーター・コンストラクト６XEcRELac Zをコード化するレトロウィルス・ベクターで連続的に感染させた。スイッチ・コンストラクトは、VP16トランスアクティベーション・ドメイン(VBE)のフレーム及び下流に挿入された蚕(Bombyx mori) EcR (BE) (Iatrou)のアミノ酸26-546をコード化する配列を含んでいた。合成ATG開始コドンは、サイトメガロウィルス(CVBE)の即初期プロモーターのコントロール下に置かれ、長い末端リピート(LTR)の横に配置された。レポーター・コンストラクトは、LacZの上流に置かれ、両側にLTR配列(６XEcRE)を有するエクジソン応答要素(EcRE)結合部位を6コピー含んでいた。
【０４３３】
[00355]希釈クローニングを使い個々のクローンを分離した。クローンは、450ug/ｍLG418及び100ng/ｍLのピューロマイシンを使って選定した。個々のクローンは、試験リガンドの存在及び不在への反応に基づいて評価した。クローンZ3は、スクリーニング及びSAR目的で選定された。
【０４３４】
[00356]CVBEと６XEcRELacZで安定的に形質転換したヒトの293腎臓細胞は、10FBS (ライフ・テクノロジーズ(Life Technologies、26140-087)、450ゴムG418(ミーディエイツ(Mediates)、30-234-CR)、そして100ゲノム・プロミシング(シグマ(Sigma)、P-7255)を含む最低必須培地(MinimumEssential Medium)(ミーディエイツ(Mediates)、10-010-CV)に、5％のCO2を含む大気の下、37℃で保存し、75％に達した時点で二次培養を行なった。
【０４３５】
リガンド処理
【０４３６】
[00357]Z3細胞をウェル当たり2.5X103細胞濃度で96ウェル組織培養プレートに接種し、5％CO2下、37℃で24時間培養した。リガンドの保存溶液はDMSOで調製した。リガンドの保存溶液は培地で100倍に希釈し、この希釈したリガンド溶液(33μM)のうち50μLを細胞に加えた。DMSOの最終濃度はコントロールも処理の場合も0.03％に維持した。
【０４３７】
レポーター遺伝子アッセイ
【０４３８】
[00358]レポーター遺伝子発現は細胞処理の48時間後に評価し、βガラクトシダーゼ活性はトロピックス(Tropix)のGalScreenTM生物発光レポーター遺伝子アッセイ・システム(GSY1000)を使って測定した。誘導倍数活性は、リガンド処理細胞の相対発光量(RLU)をDMSO処理細胞のRLUで割る事により算出した。発光は、ダイネックス(Dynex)MLXマイクロタイタ・プレート光度計を使って、室温で検出した。
【０４３９】
[00359]スイッチ・コンストラクトCVBEとレポーター・コンストラクト６XEcRELacZの概念図は図1に示してある。両コンストラクトの両側には長い末端リピートがあり、G418とピューロマイシンは選択可能なマーカーであり、CMVはサイトメガロウィルス・プロモーターで、VBEはVP16トランスアクティベーション・ドメインの下流に挿入された蚕(Bombyx mori) EcRのアミノ酸26-546をコード化する配列であり、６XEcREはエクジソン応答要素の６つのコピーで、lacZはレポーター酵素βガラクトシダーゼをコード化している。
【０４４０】
13B3アッセイ
遺伝子発現カセット
【０４４１】
[00360]GAL4DBD - CfEcR(DEF)/VP16AD - MmRXRE：ハマキガ科のガの幼虫であるChoristoneura fumiferana EcR(CfEcR-DEF; SEQ ID NO: 1) の野生型D, E, 及びFドメインはGAL4DNA結合ドメイン (Gal4DBD1=147; SEQID NO: 2) と融合させ、ｐMベクター(PT3119-5、クロンテク(Clontech)、カリフォルニア州パロアルト(Palo Alto, CA))のSV40eプロモーターのコントロール下に置いた。ハツカネズミ(Musmusculus) RXR (MmRXR-DE；SEQ ID NO: 11) はVP16 (VP16AD；SEQ ID NO: 6)のトランスアクティベーション・ドメインと融合させ、ｐVP16ベクター(PT3127-5、クロンテク(Clontech)、カリフォルニア州パロアルト(PaloAlto, CA))のSV40eプロモーターのコントロール下に置いた。
【０４４２】
安定細胞株
【０４４３】
[00361]CHO細胞は、GAL4DBD-CfEcR(DEF)、及びSV40eプロモーターによりコントロールされるVP16AD-MmRXRE用の転写カセットで一時的に形質移入された。安定的に形質移入された細胞はヒグロマイシンを使って選択した。個別に分離されたCHO細胞のクローンは、GAL4REルシフェラーゼ・レポーター(ｐFR Luc、ストラタジーン(Stratagene)、カリフォルニア州ラホラ(La Jolla, CA))で一時的に形質移入された。13B3クローンはゼオシン(Zeocin)を使って選択した。
【０４４４】
リガンド処理
【０４４５】
[00362]細胞はトリプシン化され、2.5ｘ10４細胞 ｍLの濃度に希釈された。100μLの細胞懸濁液が96ウェル・プレートの各ウェルに置かれ、５％CO2の下、37℃で24時間培養された。リガンド株の溶液はDMSOで調製され、全ての処理で300倍に希釈された。用量応答試験は、33μMから0.01μMの８つの濃度で構成された。
【０４４６】
レポーター遺伝子アッセイ
【０４４７】
[00363]ルシフェラーゼ・レポーター遺伝子発現は、プロメガ(Promega)のブライト-グロ・ルシフェラーゼ・アッセイ・システム(Bright-GloTMLuciferaseAssay System)を使った細胞処理の48時間後に測定された。発光は、ダイネックス (Dynex) MLXのミクロタイター・プレート・ルミノメーターを使って、室温で検出された。
【０４４８】
[00364]アッセイの結果は表７及び8に示してある。各アッセイは2つのウェルで行い、その値を平均した。誘導倍数はリガンド処理細胞の相対発光量(RLU)をDMSO処理細胞のRLUで割る事により算出した。EC50sは、３パラメーター算定モデルを使って、用量応答データから計算された。相対最大FIは、ある濃度で観察されるGSTM-Eリガンド(3,5-ジメチル安息香酸N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド)の最大誘導倍数に対するその濃度で観測される試験リガンド(本発明の実施例)の最大誘導倍数として決定された。
【表２１】
2014111634.tif 000114
【表２２】
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【表２３】
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【表２４】
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【表２５】
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【表２６】
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【表２７】
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【表２８】
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【表２９】
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【表３０】
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【表３１】
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【表３２】
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【表３３】
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【表３４】
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【表３５】
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【表３６】
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【表３７】
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【０４４９】
実施例４：化合物の生物学的(インビボ)試験
【０４５０】
[00365]本出願者のリガンドは、遺伝子療法、関心のある蛋白質の宿主内での発現、遺伝子導入された有機体の生産、細胞ベースのアッセイなど種々の応用に有効である。本発明の種々のリガンドを持ったレポーター酵素のインビボ誘導は、遺伝子スイッチを含むC57BL/6マウス・モデル・システムで評価された。
【０４５１】
遺伝子発現カセット
【０４５２】
[00366]ハマキガ科のガの幼虫であるChoristoneurafumiferanaEcR (CfEcR-DEF; SEQ ID NO: 1) の野生型D, E, 及びFドメインを変異させ[V107 (gtt) →1107 (att)及びY127 (tac) → E127 (gag)]、GAL4 DNA結合ドメイン (Gal4DBD1=147; SEQ ID NO:2) と融合させた。ヒトRXRβ(HsRXRβ-EF；SEQ ID NO:４のヌクレオチド1−465)のEFドメインのへリックス１から8まで、及びバッタLocustamigratoriaウルトラスパイラクル蛋白質 (LmUSP-EF;SEQ ID NO: 5のヌクレオチド403−630)のEFドメインのヘリックス9から12までは、VP16 (VP16AD; SEQ ID NO: 6)のトランスアクティベーション・ドメインと融合させた。そのドメインはレポーター遺伝子ヒト分泌アルカリ性ホスファターゼ(SEAP、SEQID NO: 12)を調節するが、６ｘGAL4応答要素(SEQ ID NO: 13)及びトランスサイレチン・プロモーター(SEQ ID NO: 14)のコントロール下に置かれた。遺伝子スイッチの各要素は、異なるプラスミド上に置かれた。受容体発現はCMVプロモーター(SEQID NO: 15)のコントロール下に置かれた。誘導性はリガンドの存在下に発現したレポーター蛋白質の量により評価した。
【０４５３】
遺伝子スイッチのエレクトロポレーション
【０４５４】
[00367]マウス血清に於けるSEAPの発現の評価は、遺伝子スイッチをエレクトロポレーションでマウスの大腿四頭筋へ挿入した後行った。マウスの麻酔にはケタミン(100mg/ml)とキシラジン(20mg/ml)の混合液２μl/gを使った。麻酔後、毛を剃り、2x50μLポリグルタミン酸(12mg/ml)中のDNAベクターを筋肉に注射し、電極導電ゲルを塗り、電極(口径：1cmｘ1cm；モデル384)を後脚に設定した。筋肉は200V/cm及び20ミリ秒/パルスの条件下、1秒間隔で8度電気穿孔した。パルスの半分を与えた後、横電場方向を逆転させた。エレクトロポレーションは、BTXモレキュラー・デリバリー・システム(BTXMolecular DeliverySystem)のECM830エレクトロポレーターを使った。
【０４５５】
リガンド処理
【０４５６】
[00368]ある実験では、遺伝子スイッチのエレクトロポレーションの3日後に、DMSO50μLに溶かした2.6μmolのリガンドをマウスの腹膜内に注射した(IP)。別の実験では、リガンド濃度を26nmol/DMSO50μ/マウスに減らした。SEAP発現はリガンド投与の2-11日後に評価した。食事は、2gのリガンドを20ｍLのアセトンに溶解し、それをプリナ・ミルズ(PurinaMills)製のLabDiet 5010オートクレーブ可能食事1kgに加えた。ホバート(Hobart)ミキサーで良く混合し、クロスブレンド(CrossBlend)ミキサーで更に15分間混合した。マウスには1日、2日、又は3日間、無制限に食事が与えられた。値は全て4匹のマウスの平均値である。ベクターだけ、つまりリガンドなしで処理されたマウスの血清中SEAPは0-11ng/mL血清であった。
【０４５７】
レポーター・アッセイ
【０４５８】
[00369]マウスの血清は血液の遠心分離により得た。血液はガラス製の毛細管チューブを使い、RetroorbitalBleeding法により採取した。SEAPの定量は、クロンテク・グレート・エスケープ(Clontech Great Escape)化学発光キットを使い、クロンテク(Clontech)のSEAP標準と比較する事により決定した。
【０４５９】
[00370]表９：変異エクジソン受容体ベースの遺伝子スイッチのリガンド媒介誘導に関するインビボ評価。マウス血清中のSEAP発現の評価は、遺伝子発現カセットをエレクトロポレーションでマウスの大腿四頭筋に挿入した後行った。リガンド2.6μmolのIP注射は、エレクトロポレーションの3日後に行った。SEAP発現はリガンド投与の2-11日後に評価した。各用量グループは4匹のマウスで構成されていた。GSTM-Eリガンド誘導の割合は、4匹のマウスのSEAP発現を平均し、それをGSTM-Eリガンドで誘導されるSEAP発現の平均値で割り、それに100を掛ける事により決定した。
【０４６０】
[00371]表10：低濃度のリガンドを持つ遺伝子スイッチ発現の誘導。マウス血清中のSEAP発現の評価は、遺伝子発現カセットをエレクトロポレーションでマウスの大腿四頭筋に挿入した後行った。リガンド26nmol又は130nmolGSTM-EリガンドのIP注射は、エレクトロポレーションの3日後に行った。SEAP発現はリガンド投与の2-7日後に評価した。値は4匹のマウスの平均値である。
【０４６１】
[00372]表11：げっ歯類の餌に投与されたGSTM-Eリガンド又はRG-103309によるC57BL/6マウスのSEAP誘導。マウス血清中のSEAP発現の評価は、遺伝子発現カセットをエレクトロポレーションでマウスの大腿四頭筋に挿入した後行った。GSTM-Eリガンド又はRG-103309は、エレクトロポレーションの3日後、餌(２g/kg)に混ぜてマウスに与えた。マウスには1日、2日、又は3日間、無制限に食事が与えられた。一定間隔毎に、リガンド処理した餌を除き、未処理の餌をマウスに与えた。値は4匹のマウスの平均値である。
【表３８】
2014111634.tif 000131
【表３９】
2014111634.tif 000132
【表４０】
2014111634.tif 000133
【０４６２】
[00373]更に、業界の通常の技術を持っている人なら予測できる事であるが、本出願で開示されているリガンドは、グループH及びグループB核受容体に基づく遺伝子発現システムを使って、上述の種々の細胞タイプで、遺伝子発現の調節も行なう。
【図面の簡単な説明】
【０４６３】
【図１】スイッチ・コンストラクトCVBEとレポーター・コンストラクト６XEcRE LacZの概念図である。スイッチ・コンストラクトCVBE及びレポーター・コンストラクト６XEｃRELac Z。両コンストラクトの側面には、長い末端リピートが位置している。G418とピューロマイシンは選択可能マーカー、CMVはサイトメガロウィルス・プロモーターであり、VBEはVP16トランスアクティベーション・ドメインの下流に挿入された蚕(Bombyxmori) のアミノ酸26−546のコード化配列である。６X EｃREはエクジソン応答要素の６つのコピーであり、lac Zはレポーター酵素βガラクトシダーゼをコード化している。
【図１】
2014111634.tif 000143
【配列表】
2014111634000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成26年2月6日(2014.2.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の一般式を持つ化合物であり、
【化１】
2014111634.tif 000144
ここでＸとＸ’は独立してＯ又はＳであり、
Aは非置換又は置換フェニルで、置換体は独立して１から５までのH;ハロ；ニトロ；シアノ；ヒドロキシ；アミノ(‐NRaRb)；アルキルアミノアルキル(‐(CH2)ｎNRaRb)；(C1-C6)アルキル；(C1-C6)ハロアルキル；(C1-C6)シアノアルキル；(C1-C6)ヒドロキシアルキル；(C1-C6)アルコキシ；フェノキシ；(C1-C6)ハロアルコキシ；(C1-C6)アルコキシ(C1-C6)アルキル；(C1-C6)アルケニルオキシ(C1-C6)アルキル；(C1-C6)アルコキシ(C1-C6)アルコキシ；(C1-C6)アルカノイルオキシ(C1-C6)アルキル；ハロ、シアノ、(C1-C4)アルキル、又は(C1-C4)アルコキシで選択的に置換した(C2-C6)アルケニル；ハロ又は(C1-C4)アルキルで選択的に置換した(C2-C6)アルキニル；フォルミル；カルボキシ；(C1-C6)アルキルカルボニル；(C1-C6)ハロアルキルカルボニル；ベンゾイル；(C1-C6)アルコキシカルボニル；(C1-C6)ハロアルコキシカルボニル；(C1-C6)アルカノイルオキシ(‐OCORa)；カルボキシアミド(‐CONRaRb)；アミド(‐N RaCORb)；アルコキシカルボニルアミノ(‐NRaCO2Rb)；アルキルアミノカルボニルアミノ(‐N RaCONRbRc)；メルカプト；(C1-C6)アルキルチオ；(C1-C6)アルキルスルホニル；(C1-C6)アルキルスルホニル(C1-C6)アルキル；(C1-C6)アルキルスルホキシド(‐S(O)Ra)；(C1-C6)アルキルスルホキシド(C1-C6)アルキル(‐(CH2)ｎS(O)Ra)；フルファミド(‐SO2NRaRb)；‐SO3H；又は非置換又は置換フェニルで、置換体は独立して１から3までのハロ、ニトロ、(C1-C6)アルコキシ、(C1-C6)アルキル、又はアミノ；あるいはフェニル環の隣接する2つの位置の１つ又は両方が置換される場合、付着している原子は、(‐OCH2O)、(‐OCH(CH3)O-)、(‐CH2CH2O -)、(‐OCH(CH3)CH2O -)、(‐S- CH=N -)、(‐CH2OCH2O‐)、(‐O(CH2)3‐)、(＝N-O-N=)、(‐C=CH-NH-)、(‐OCF2O-)、(‐N-CH=N-)、(‐CH2CH2O-)、及び(‐(CH2)4) からなるグループから選ばれた連結のフェニル結合末端を形成する場合があり、
Bは、
(a)非置換又は置換フェニルで、置換体は独立して１から５までのH; ハロ；ニトロ；シアノ；ヒドロキシ；アミノ(‐NRaRb)；アルキルアミノアルキル(‐(CH2)ｎNRaRb)；(C1-C6)アルキル；(C1-C6)ハロアルキル；(C1-C6)シアノアルキル；(C1-C6)ヒドロキシアルキル；(C1-C6)アルコキシ；フェノキシ；(C1-C6)ハロアルコキシ；(C1-C6)アルコキシ(C1-C6)アルキル；(C1-C6)アルケニルオキシ(C1-C6)アルキル；(C1-C6)アルコキシ(C1-C6)アルコキシ；(C1-C6)アルカノイルオキシ(C1-C6)アルキル；ハロ、シアノ、(C1-C4)アルキル、又は(C1-C4)アルコキシで選択的に置換した(C2-C6)アルケニル；ハロ又は (C1-C4)アルキルで選択的に置換した(C2-C6)アルキニル；フォルミル；カルボキシ；(C1-C6)アルキルカルボニル；(C1-C6)ハロアルキルカルボニル；ベンゾイル；(C1-C6)アルコキシカルボニル；(C1-C6)ハロアルコキシカルボニル；(C1-C6)アルカノイルオキシ(‐OCORa)；カルボキシアミド(‐CONRaRb)；アミド(‐N RaCORb)；アルコキシカルボニルアミノ (‐NRaCO2Rb)；アルキルアミノカルボニルアミノ(‐N RaCONRbRc)；メルカプト；(C1-C6)アルキルチオ；(C1-C6)アルキルスルホニル；(C1-C6)アルキルスルホニル(C1-C6)アルキル；(C1-C6)アルキルスルホキシド(‐S(O)Ra)；(C1-C6)アルキルスルホキシド(C1-C6)アルキル(‐(CH2)ｎS(O)Ra)；フルファミド(‐SO2NRaRb)；‐SO3H；又は非置換又は置換フェニルで、置換体は独立して１から3までのハロ、ニトロ、(C1-C6)アルコキシ、(C1-C6)アルキル、又はアミノ；あるいはフェニル環の隣接する2つの位置の１つ又は両方が置換される場合、付着している原子は、(‐OCH2O‐)、(‐OCH(CH3)O-)、(‐CH2CH2O -)、(‐OCH(CH3)CH2O -)、(‐S- CH=N -)、(‐CH2OCH2O‐)、(‐O(CH2)3‐)、(＝N-O-N=)、(‐C=CH-NH-)、(‐OCF2O-)、(‐NH-CH=N-)、(‐CH2CH2O-)、及び(‐(CH2)4‐)からなるグループから選ばれた連結のフェニル結合末端を形成する場合があり；
(ｂ)1-3窒素原子及び3-5核炭素原子を持つ非置換6員環ヘテロサイクル又は置換６員環ヘテロサイクルで、置換体は１から3までの同じ又は異なるハロ；ニトロ；ヒドロキシ；(C1-C6)アルキル；(C1-C6)アルコキシ；(C1-C6)チオアルコキシ；カルボキシ；(C1-C6)アルコキシカルボニル；(C1-C6)カルボキシアルキル；各アルキル・グループに独立に定まった数の炭素原子を持つ(C1-C6)アルコキシカルボニルアルキル；‐CONRaRb；アミノ；(C1-C6)アルキルアミノ；各アルキル・グループに独立に定まった数の炭素原子を持つ(C1-C6)ジアルキルアミノ；‐CF3を含むハロアルキル；‐C=N-NHC(O)NRaRb)；又は‐C=N-NHC(O)C(O)NRaRb)；あるいは
(ｃ)５−ベンズイミダゾリル；１−トリチル‐５−ベンズイミダゾリル；３−トリチル‐５−ベンズイミダゾリル；１H-インダゾール‐３‐イル；１‐トリチル‐１H‐インダゾール‐３‐イル；又は１‐(C1-C6)アルキル‐１H‐インドール‐2‐イル；  Eは非置換又は置換(C4-C10)側鎖アルキルであり、置換体は独立に1−4シアノ；ハロ；(C5-C6)シクロアルキル；フェニル；(C2-C3)アルケニル；ヒドロキシ；(C1-C6)アルコキシ；カルボキシ；(C1-C6)アルコキシカルボニル；(C1-C6)アルカノイルオキシ(‐OCORa)；フォルミル；各アルキル・グループに独立に定まった数の炭素原子を持つ(C1-C6)トリアルキルシリルオキシ；‐C=N-ORa；‐C=N-Rd；‐C=N-NHC(O)NRaRb；又は‐C=N-NHC(O)C(O) N RaRb；
ここで、Ra、Rb、及びRｃは独立にH、(C1-C6)アルキル、又はフェニルであり；Rdはヒドロキシ(C1-C6)アルキル；及びｎ＝1-4；そして
GはH又はCN；
もし、
１）Eが非置換又は置換(C4-C10)側鎖アルキルで、置換体が独立に1-4シアノ；ハロ；(C2-C3)アルケニル；カルボキシ；又は(C1-C6)アルコキシカルボニルの場合、
Bは、
(a)  少なくとも１つの‐C=N-NHC(O)NRaRb又は‐C=N-NHC(O)C(O)N RaRbグループを持つ置換フェニル；
(b)  少なくとも1つのハロアルキル・グループを持ち、1-3窒素原子及び3-5核炭素原子を有する置換６員環へテロサイクル；
又は
(c)  ５−ベンズイミダゾリル；１−トリチル‐５−ベンズイミダゾリル；３−トリチル‐５−ベンズイミダゾリル；１H-インダゾール‐３‐イル；１‐トリチル‐１H‐インダゾール‐３‐イル；又は１‐(C1-C6)アルキル‐１H‐インドール‐2‐イル；
ここで、Ra、Rbは独立にH、(C1-C6)アルキル、又はフェニルであり；あるいは
２）Eがフェニル、ヒドロキシ、(C1-C6)アルコキシ、又はフォルミルのうち少なくとも１つを有する置換(C4-C10)側鎖アルキルの場合、
Bは、
(a)  少なくとも１つのC=N-NHC(O)N RaRb又は‐C=N-NHC(O)C(O)N RaRbグループを持つ置換フェニル；
(b)  1-3窒素原子及び3-5核炭素原子を有する置換又は非置換の６員環へテロサイクル；又は
(ｃ)  ５−ベンズイミダゾリル；１−トリチル‐５−ベンズイミダゾリル；３−トリチル‐５−ベンズイミダゾリル；１H-インダゾール‐３‐イル；１‐トリチル‐１H‐インダゾール‐３‐イル；又は１‐(C1-C6)アルキル‐１H‐インドール‐2‐イル；
ここで、Ra、Rbは独立にH、(C1-C6)アルキル、又はフェニルである、
化合物。
【外国語明細書】
2014111634000001.pdf