(57)【要約】【課題】  糸状菌由来セルラーゼを用いたセルロース含有バイオマスの加水分解反応において、糸状菌由来セルラーゼの再利用性を高め、その使用量を削減すること。【解決手段】  以下の工程（１）および（２）を含むことを特徴とする、セルロース含有バイオマスからの糖液の製造方法。工程（１）：セルロース含有バイオマスの固形物重量に対して０．１〜５０重量％の範囲で澱粉原料の発酵残渣を含む条件下にて、糸状菌由来セルラーゼによるセルロース含有バイオマスの加水分解を行う工程、工程（２）：工程（１）の加水分解物を固液分離して得られた溶液成分を限外濾過膜に通じて濾過し、非透過液として糸状菌由来セルラーゼを回収し、透過液として糖液を得る工程。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程（１）および（２）を含むことを特徴とする、セルロース含有バイオマスからの糖液の製造方法。
工程（１）：セルロース含有バイオマスの固形物重量に対して０．１〜５０重量％の範囲で澱粉原料の発酵残渣を含む条件下にて、糸状菌由来セルラーゼによるセルロース含有バイオマスの加水分解を行う工程、
工程（２）：工程（１）の加水分解物を固液分離して得られた溶液成分を限外濾過膜に通じて濾過し、非透過液として糸状菌由来セルラーゼを回収し、透過液として糖液を得る工程。
【請求項２】
工程（１）の糸状菌由来セルラーゼが、セロビオハイドラーゼ、エンドグルカナーゼ、β−グルコシダーゼ、キシラナーゼおよびβ−キシロシダーゼからなる群より選ばれる１以上の酵素成分を含むことを特徴とする、請求項１に記載の糖液の製造方法。
【請求項３】
工程（１）の澱粉原料の発酵残渣がエタノール発酵後の蒸留残渣であることを特徴とする、請求項１または２に記載の糖液の製造方法。
【請求項４】
工程（１）において、セルロース含有バイオマスの希硫酸処理物または水熱処理物を加水分解することを特徴とする、請求項１から３のいずれかに記載の糖液の製造方法。
【請求項５】
工程（１）において、水溶性無機塩および／または極性有機溶媒を加水分解反応総量に対して０．１〜５重量％の濃度範囲で含むことを特徴とする、請求項１から４のいずれかに記載の糖液の製造方法。
【請求項６】
さらに以下の工程（３）および（４）を含むことを特徴とする、請求項１から５のいずれかに記載の糖液の製造方法。
工程（３）：工程（２）の固液分離により得られた加水分解残渣を、水溶性無機塩、アルカリ、極性有機溶媒からなる群より選ばれる１以上を含む洗浄水にて洗浄する工程、
工程（４）：工程（３）の洗浄物を固液分離して加水分解残渣と洗浄液に分離し、洗浄液に含まれる糸状菌由来セルラーゼ成分を回収する工程。
【請求項７】
前記請求項１から６のいずれかに記載の糖液の製造方法で得られた糖液を発酵原料として化学品を生産する能力を有する微生物を発酵培養することを特徴とする、化学品の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、セルロース含有バイオマスから糖液を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、特にエネルギー使用量および環境負荷が少なく、かつ糖収量が多い、酵素を使用したセルロース含有バイオマスの加水分解方法が広く検討されている。しかしながら、酵素を使用する方法の最大の欠点は、酵素費が高いという点である。こうした技術課題を解決するために加水分解に使用した酵素を回収再利用する方法が提案されているが、セルロース含有バイオマスを加水分解する際に生じる加水分解残渣に酵素が強く吸着するため、酵素の再利用性が低いということが課題となっている。
【０００３】
加水分解残渣に吸着した酵素を脱着し、酵素の回収率を高める方法としては、加水分解残渣をｐＨ８程度のアルカリ水溶液で洗浄する方法（非特許文献１）、セルロース含有バイオマスの加水分解物にノニオン性界面活性剤を添加する方法（特許文献１）などが知られている。一方、酵素の加水分解残渣への吸着を低減する方法としては、セルロース含有バイオマスの加水分解時、水溶性塩類を添加して反応液の電気伝導度を５〜２５ｍＳ／ｃｍに調整する方法（特許文献２）、セルロース含有バイオマスの固形物重量に対して１〜１０重量％の炭酸カルシウム粒子を添加する方法（特許文献３）などが知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開昭６３−８７９９４号公報
【特許文献２】特許第４９４７２２３号公報
【特許文献３】特開２０１２−１００６１７号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】D. E. Otterら、“Elution of Trichoderma reesei Cellulose from Cellulose by pH Adjustment with Sodium Hydroxide” Biotechnology Letters (1984) Vol.6、No.6、369-374
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上述したように、セルロース含有バイオマスの加水分解に用いた酵素を回収し、再利用することにより酵素の使用量を削減する試みが種々なされているが、酵素が加水分解残渣に強く吸着するためその回収率は低く、問題の解決には至っていない。
【０００７】
そこで本発明は、酵素の再利用性が高い方法で製造され、かつ、微生物を利用した化学品製造の発酵原料として利用しやすい糖液を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らが上記課題の解決のため鋭意検討した結果、糸状菌由来セルラーゼによるセルロース含有バイオマスの加水分解を、澱粉原料の発酵残渣の存在下で行うことにより、糸状菌由来セルラーゼの酵素成分を高い効率で回収することができるということを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は以下の［１］から［７］の構成を有する。
［１］以下の工程（１）および（２）を含むことを特徴とする、セルロース含有バイオマスからの糖液の製造方法。
工程（１）：セルロース含有バイオマスの固形物重量に対して０．１〜５０重量％の範囲で澱粉原料の発酵残渣を含む条件下にて、糸状菌由来セルラーゼによるセルロース含有バイオマスの加水分解を行う工程、
工程（２）：工程（１）の加水分解物を固液分離して得られた溶液成分を限外濾過膜に通じて濾過し、非透過液として糸状菌由来セルラーゼを回収し、透過液として糖液を得る工程。
［２］工程（１）の糸状菌由来セルラーゼが、セロビオハイドラーゼ、エンドグルカナーゼ、β−グルコシダーゼ、キシラナーゼおよびβ−キシロシダーゼからなる群より選ばれる１以上の酵素成分を含むことを特徴とする、［１］に記載の糖液の製造方法。
［３］工程（１）の澱粉原料の発酵残渣がエタノール発酵後の蒸留残渣であることを特徴とする、［１］または［２］に記載の糖液の製造方法。
［４］工程（１）において、セルロース含有バイオマスの希硫酸処理物または水熱処理物を加水分解することを特徴とする、［１］から［３］のいずれかに記載の糖液の製造方法。
［５］工程（１）において、水溶性無機塩および／または極性有機溶媒を加水分解反応総量に対して０．１〜５重量％の濃度範囲で含むことを特徴とする、［１］から［４］のいずれかに記載の糖液の製造方法。
［６］さらに以下の工程（３）および（４）を含むことを特徴とする、［１］から［５］のいずれかに記載の糖液の製造方法。
工程（３）：工程（２）の固液分離により得られた加水分解残渣を、水溶性無機塩、アルカリ、極性有機溶媒からなる群より選ばれる１以上を含む洗浄水にて洗浄する工程、
工程（４）：工程（３）の洗浄物を固液分離して加水分解残渣と洗浄液に分離し、洗浄液に含まれる糸状菌由来セルラーゼ成分を回収する工程。
［７］前記［１］から［６］のいずれかに記載の糖液の製造方法で得られた糖液を発酵原料として化学品を生産する能力を有する微生物を発酵培養することを特徴とする、化学品の製造方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、セルロース含有バイオマスの加水分解残渣への糸状菌由来セルラーゼの吸着を抑制することができ、特に結晶セルロースおよびセロビオースの分解に関与する酵素成分を高い効率で回収および／または再利用することができる。その結果、酵素のコストを低く抑えることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、本発明の糖液の製造方法の実施の形態を示した略図である。
【図２】図２は、本発明の糖液の製造方法において加水分解残渣の洗浄の実施の形態を示した略図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明を実施するための形態について工程ごとに説明する。
【００１３】
まず、本発明ではセルロース含有バイオマスの固形物重量に対して０．１〜５０重量％の範囲で澱粉原料の発酵残渣を含む条件下にて、糸状菌由来セルラーゼによるセルロース含有バイオマスの加水分解を行う（工程（１））。
【００１４】
セルロース含有バイオマスは、バガス、スイッチグラス、ネピアグラス、エリアンサス、コーンストーバー、ビートパルプ、綿実殻、パーム殻房、稲わら、麦わら、竹、笹、などの草本系バイオマス、あるいはシラカバ、ブナなどの樹木、廃建材などの木質系バイオマスを挙げることができる。セルロース含有バイオマスは糖から構成されるセルロースおよびヘミセルロースの他に、芳香族高分子であるリグニンなどを含有しているため、前処理を施すことにより酵素による加水分解効率を向上させることができる。セルロース含有バイオマスの前処理方法としては、酸処理、硫酸処理、希硫酸処理、アルカリ処理、苛性ソーダ処理、アンモニア処理、水熱処理、亜臨界水処理、微粉砕処理、蒸煮処理が挙げられるが、本発明の糖液の製造方法において最も酵素の再利用性が高いのは希硫酸処理物または水熱処理物を用いた場合であり、これらの前処理物を好ましく用いることができる。
【００１５】
本発明ではセルロース含有バイオマスの加水分解のために糸状菌由来セルラーゼを使用する。糸状菌としては、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、セルロモナス属（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）、クロストリジウム属（Ｃｈｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、フミコラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、アクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、イルペックス属（Ｉｒｐｅｘ）、ムコール属（Ｍｕｃｏｒ）、タラロマイセス属（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、などの微生物を挙げることができる。また、これら微生物に変異剤あるいは紫外線照射などで変異処理を施すことによりセルラーゼ生産性が向上した変異株由来のセルラーゼであってもよい。
【００１６】
糸状菌の中でもトリコデルマ属は、セルロースの加水分解において比活性の高い酵素成分を培養液中に大量に生産するため本発明において好ましく使用することができる。トリコデルマ属由来セルラーゼの具体例としては、トリコデルマ・リーセイＱＭ９４１４（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ  ＱＭ９４１４）、トリコデルマ・リーセイＱＭ９１２３（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ  ＱＭ９１２３）、トリコデルマ・リーセイＲｕｔＣ−３０（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ  ＲｕｔＣ−３０）、トリコデルマ・リーセイＰＣ３−７（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ  ＰＣ３−７）、トリコデルマ・リーセイＣＬ−８４７（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ  ＣＬ−８４７）、トリコデルマ・リーセイＭＣＧ７７（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ  ＭＣＧ７７）、トリコデルマ・リーセイＭＣＧ８０（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ  ＭＣＧ８０）、トリコデルマ・ビリデＱＭ９１２３（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ  ＱＭ９１２３）由来のセルラーゼが挙げられるが、中でもトリコデルマ・リーセイ由来セルラーゼがより好ましい。
【００１７】
糸状菌由来セルラーゼは、セルロースおよび／またはヘミセルロースを加水分解してグルコースやキシロースなどの単糖を生成する活性を有する酵素組成物であり、酵素成分としてセロビオハイドラーゼ、エンドグルカナーゼ、β−グルコシダーゼ、キシラナーゼおよびβ−キシロシダーゼからなる群から選択される１種以上を含むことが好ましい。例えばトリコデルマ・リーセイ由来セルラーゼの酵素成分としては、セロビオハイドラーゼＩ、セロビオハイドラーゼＩＩ、エンドグルカナーゼＩ、エンドグルカナーゼＩＩＩ、β−グルコシダーゼ、キシラナーゼ、β−キシロシダーゼ、などが例示され、こうした複数の酵素成分の協奏効果あるいは補完効果により効率的なセルロースおよび／またはヘミセルロースの加水分解を実施することができるため、本発明において好ましく使用される。
【００１８】
セロビオハイドラーゼは、セルロース鎖の加水分解によりセロビオースを放出する酵素の総称であり、ＥＣ番号：ＥＣ３．２．１．９１としてセロビオハイドラーゼに帰属される酵素群が記載されている。セロビオハイドラーゼＩはセルロース鎖の還元末端側から、セロビオハイドラーゼＩＩは非還元末端側から加水分解反応を開始する。
【００１９】
エンドグルカナーゼは、セルロース鎖の中央部分から加水分解することを特徴とする酵素の総称であり、ＥＣ番号：ＥＣ３．２．１．４としてエンドグルカナーゼに帰属される酵素群が記載されている。エンドグルカナーゼＩはトリコデルマ・リーセイ由来セルラーゼの生産するエンドグルカナーゼの中で最も多く発現しており、かつ広い基質特異性を有している。エンドグルカナーゼＩＩＩはセルロース結合モジュール（ＣＢＭ）を持たず分子量が小さいという特徴を有する。
【００２０】
β−グルコシダーゼとは、セロオリゴ糖あるいはセロビオースに作用することをと特徴とする酵素の総称であり、ＥＣ番号：ＥＣ３．２．１．２１としてβ−グルコシダーゼに帰属する酵素群が記載されている。
【００２１】
キシラナーゼとは、ヘミセルロースあるいは特にキシランに作用することを特徴とする酵素の総称であり、ＥＣ番号：ＥＣ３．２．１．８としてキシラナーゼに帰属される酵素群が記載されている。
【００２２】
β−キシロシダーゼとは、キシロオリゴ糖に作用することを特徴とする酵素の総称であり、ＥＣ番号：ＥＣ３．２．１．３７としてキシロシダーゼに帰属される酵素群が記載されている。
【００２３】
こうしたセルラーゼ成分は、ゲル濾過、イオン交換、二次元電気泳動などの公知手法により分離し、分離した成分のアミノ酸配列（Ｎ末端分析、Ｃ末端分析、質量分析）を行い、データベースとの比較により同定することができる。
【００２４】
また、糸状菌由来セルラーゼの酵素活性は、結晶セルロース分解活性、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）分解活性、セロビオース分解活性、キシラン分解活性、マンナン分解活性などといった多糖の加水分解活性によって評価することができる。結晶セルロース分解活性を示す主たる酵素は、セルロース末端部分から加水分解する特徴を有するセロビオハイドラーゼである。セロビオース分解活性を示す主たる酵素は、β−グルコシダーゼである。ＣＭＣ分解活性に関与する主たる酵素は、セロビオハイドラーゼ、エンドグルカナーゼである。キシラン分解活性を示す主たる酵素はキシラナーゼ、β−キシロシダーゼである。ここで“主たる”という意味は、最も分解に関与することが知られていることからの表現であり、これ以外の酵素成分もその分解に関与していることを意味している。
【００２５】
糸状菌は、培養液中にセルラーゼを産生するため、その培養液を粗酵素剤としてそのまま使用してもよいし、公知の方法で酵素群を精製し、製剤化したものを糸状菌由来セルラーゼ混合物として使用してもよい。糸状菌由来セルラーゼを精製し、製剤化したものとして使用する場合、プロテアーゼ阻害剤、分散剤、溶解促進剤、安定化剤など、酵素以外の物質を添加したものをセルラーゼ製剤として使用してもよい。なお、本発明ではこれらの中でも粗酵素物が好ましく使用される。粗酵素物は、糸状菌がセルラーゼを産生するよう調製した培地中で、任意の期間該微生物を培養した培養上清に由来する。使用する培地成分は特に限定されないが、セルラーゼの産生を促進するためにセルロースを添加した培地が一般的に使用できる。そして、粗酵素物として、培養液をそのまま、あるいはトリコデルマ菌体を除去したのみの培養上清が好ましく使用される。
【００２６】
粗酵素物中の各酵素成分の重量比は特に限定されるものではないが、例えば、トリコデルマ・リーセイ由来の培養液には、５０〜９５重量％のセロビオハイドラーゼが含まれており、残りの成分にエンドグルカナーゼ、β−グルコシダーゼなどが含まれている。また、トリコデルマ属の微生物は、強力なセルラーゼ成分を培養液中に生産する一方で、β−グルコシダーゼに関しては、その多くを細胞内あるいは細胞表層に保持しているため培養液中のβ−グルコシダーゼ活性は低い。そこで、粗酵素物に、さらに異種または同種のβ−グルコシダーゼを添加してもよい。異種のβ−グルコシダーゼとしては、アスペルギルス属由来のβ−グルコシダーゼが好ましく使用できる。アスペルギルス属由来のβ−グルコシダーゼとして、ノボザイム社より市販されているＮｏｖｏｚｙｍｅ１８８などを例示することができる。また、トリコデルマ属の微生物に遺伝子を導入し、その培養液中に産生されるよう遺伝子組み換えされたトリコデルマ属の微生物を培養し、β−グルコシダーゼ活性の向上した培養液を用いてもよい。
【００２７】
加水分解反応の温度は、４０〜６０℃の範囲であることが好ましく、特にトリコデルマ属由来セルラーゼを使用する場合、４５〜５５℃の範囲であることがより好ましい。加水分解反応の時間は、２時間〜２００時間の範囲であることが好ましい。２時間未満であると、十分な糖生成が得られないことがある。一方で、２００時間を超えると酵素の失活が進み、回収酵素の再利用性に悪影響を及ぼすことがある。加水分解反応のｐＨは、４．０〜６．０の範囲であることが好ましい。糸状菌由来セルラーゼとしてトリコデルマ属由来セルラーゼを使用する場合、その反応最適ｐＨは５．０である。さらに、加水分解の過程でｐＨの変化が起きるため、反応液に緩衝液を添加する、あるいは酸やアルカリを用いて一定ｐＨを保持しながら実施することが好ましい。
【００２８】
加水分解反応におけるセルロース含有バイオマスの濃度は、１〜３０重量％の範囲が好ましい。セルロース含有バイオマスの濃度が低いと加水分解により生成する糖濃度が低く、発酵原料として利用しにくい場合がある。一方、濃度が高すぎるとハンドリングが困難になる。
【００２９】
本発明の糖液の製造方法では、糸状菌由来セルラーゼによるセルロース含有バイオマスの加水分解反応を澱粉原料の発酵残渣の存在下で実施する。澱粉原料の発酵残渣にはセルロース含有バイオマスの加水分解残渣に強く吸着する成分が含まれており、それにより加水分解残渣へのセルラーゼ成分の吸着を抑止することができ、セルラーゼ成分を高い効率で回収することができる。
【００３０】
澱粉原料とは、澱粉を豊富に含むものであれば特に限定されず、トウモロコシ、米、小麦、大麦、蕎麦、ジャガイモ、サツマイモ、ソルガム、キャッサバなどが例示される。澱粉原料を栄養源として微生物を生育させることにより、澱粉原料の発酵物が得られる。発酵に用いる微生物は特に限定されないが、乳酸菌、酵母などが挙げられる。発酵に用いる微生物が澱粉を栄養源にすることが難しい場合、アミラーゼを作用させる、あるいは酸性条件下で加熱することにより澱粉を糖化したものを用いることができる。
【００３１】
そして澱粉原料の発酵残渣とは、発酵物を固液分離して得られる固形物、あるいは発酵物を蒸留して得られる固形物を含んだ液体を指す。前者の具体例としては酒粕が挙げられる。後者は蒸留残渣と総称され、具体例としては焼酎粕、ウィスキー粕などが挙げられる。
【００３２】
また近年、再生可能エネルギー利用の観点からトウモロコシに代表される澱粉原料を用いたバイオエタノールの生産が積極的に行われている。そのためこれらの発酵残渣は供給量が多く、かつ安価に入手できることから、本発明においても好ましく用いることができる。蒸留残渣（ホールディスティレージ）の他、これを固液分離して得られる固形物（ウェットケーキ）や、これらを乾燥して得られる可溶性物質添加乾燥蒸留穀物残渣（ＤＤＧＳ）、乾燥蒸留穀物残渣（ＤＤＧ）などを発酵残渣として利用することができる。
【００３３】
澱粉原料の発酵残渣の構成成分としては、原料に由来するタンパク質、脂肪、食物繊維の他、発酵に用いた酵母や乳酸菌の菌体が挙げられる。例えば、上述のトウモロコシＤＤＧの場合、その製造方法によってばらつきはあるが、一般的には原料のトウモロコシに含まれる澱粉以外の成分が約３倍に濃縮され、さらに１０％前後の菌体が含まれる。
【００３４】
セルロース含有バイオマスの加水分解反応における澱粉原料の発酵残渣量（乾燥重量）は、加水分解に供するセルロース含有バイオマスの固形物重量に対して０．１〜５０重量％、好ましくは１〜２０重量％、さらに好ましくは５〜１０重量％の範囲で添加することが好ましい。澱粉原料の発酵残渣量が１重量％未満であると、場合によってはセルラーゼの加水分解残渣への吸着を防ぐ効果が十分に得られない。一方、発酵残渣量が２０重量％を超えると経済的に不利になる上、発酵残渣は固形物であるためセルロース含有バイオマスの加水分解の効率が悪くなることがある。
【００３５】
本発明は澱粉原料の発酵残渣の存在下でセルロース含有バイオマスを加水分解することを特徴とするが、より多くのセルラーゼ成分を回収および／または再利用するために、加水分解反応時にさらに水溶性無機塩および／または極性有機溶媒を添加してもよい。
【００３６】
水溶性無機塩は特に限定されないが、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、硫酸塩、アンモニウム塩、塩酸塩、リン酸塩、硝酸塩から選択される１種または２種以上を例示できる。より好ましい無機塩としては、水溶性の高い塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、硫酸水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、硫酸アンモニウム、塩化カリウム、塩化アンモニウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウムなどである。このうち最も好ましくは塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、硫酸アンモニウムであり、こうした無機塩を添加することにより、特にセロビオース分解活性に関わるセルラーゼ成分を多く回収することができる。
【００３７】
極性有機溶媒は特に限定されないが、２０℃の条件下で水に対し１０重量％以上の溶解度を示すもののことを指し、メタノール、エタノール、１−プロパノール、イソプロパノール、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、アセトン、アセトニトリル、エチレングリコール、グリセロールなどが例示される。中でも、結晶セルロース分解活性に関与するセルラーゼ成分の回収に効果的なエタノール、イソプロパノール、エチレングリコール、グリセロールが好ましい。
【００３８】
水溶性無機塩および／または極性有機溶媒の添加濃度は加水分解総量に対して０．１〜５重量％の範囲が好ましく、０．１〜３．５重量％の範囲がより好ましい。水溶性無機塩および／または極性有機溶媒の濃度が低すぎるとセルラーゼの回収効率が低いことがあり、また一方でこれらの濃度が高すぎるとセルラーゼの失活が促進され、セルロース含有バイオマスの加水分解効率が低下したり、セルラーゼの回収効率が低くなったりすることがある上に、経済的にも不利になる。
【００３９】
次に本発明では、セルロース含有バイオマスの加水分解反応を行った後、加水分解物を固液分離する。固液分離により得られる溶液成分には糸状菌由来セルラーゼ成分および糖成分が含まれ、糸状菌由来セルラーゼ成分と糖成分とは、限外濾過膜を用いた濾過によって分離する（工程（２））。
【００４０】
限外濾過膜を用いた糸状菌由来セルラーゼ成分と糖成分の分離においては、その分画分子量は、単糖であるグルコース（分子量１８０）やキシロース（分子量１５０）を透過でき、糸状菌由来セルラーゼを阻止できるものであれば限定されない。具体的には分画分子量５００〜５０，０００の範囲であればよく、酵素反応に阻害的作用を示す夾雑物質を酵素と分離するという観点から、より好ましくは分画分子量５，０００〜５０，０００の範囲であり、さらに好ましくは分画分子量１０，０００〜３０，０００の範囲である。
【００４１】
限外濾過膜の素材としては、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、ポリスルホン（ＰＳ）、ポリアクリロニトリル（ＰＡＮ）、ポリフッ化ビニルデン（ＰＶＤＦ）、再生セルロース、セルロース、セルロースエステル、スルホン化ポリスルホン、スルホン化ポリエーテルスルホン、ポリオレフィン、ポリビニルアルコール、ポリメチルメタクリレート、ポリ４フッ化エチレンなどを使用することができるが、再生セルロース、セルロース、セルロースエステルはセルラーゼによる分解を受けるため、ＰＥＳ、ＰＶＤＦなどの合成高分子を素材とした限外濾過膜を使用することが好ましい。
【００４２】
限外濾過膜の濾過方式として、デッドエンド濾過、クロスフロー濾過があるが、膜ファウリング抑制の観点から、クロスフロー濾過であることが好ましい。また使用する限外濾過膜の膜形態としては、平膜型、スパイラル型、チューブラー型、中空糸型など適宜の形態のものが使用できる。具体的には、ＤＥＳＡＬ社のＧ−５タイプ、Ｇ−１０タイプ、Ｇ−２０タイプ、Ｇ−５０タイプ、ＰＷタイプ、ＨＷＳＵＦタイプ、ＫＯＣＨ社のＨＦＭ−１８０，ＨＦＭ−１８３、ＨＦＭ−２５１、ＨＦＭ−３００、ＨＦＫ−１３１、ＨＦＫ−３２８、ＭＰＴ−Ｕ２０、ＭＰＳ−Ｕ２０Ｐ、ＭＰＳ−Ｕ２０Ｓ、Ｓｙｎｄｅｒ社のＳＰＥ１、ＳＰＥ３、ＳＰＥ５、ＳＰＥ１０、ＳＰＥ３０、ＳＰＶ５、ＳＰＶ５０、ＳＯＷ３０、旭化成株式会社製のマイクローザ（登録商標）ＵＦシリーズの分画分子量３，０００から１０，０００に相当するもの、日東電工株式会社製のＮＴＲ７４１０、ＮＴＲ７４５０などが挙げられる。
【００４３】
また、より多くのセルラーゼ成分を回収および／または再利用するために、工程（２）においてセルロース含有バイオマスの加水分解物を固液分離した後、得られた加水分解残渣を洗浄することにより加水分解残渣に吸着したセルラーゼ成分を回収することもできる（工程（３））。
【００４４】
加水分解残渣の洗浄とは、加水分解残渣を任意の洗浄水に浸漬することを指す。加水分解残渣の洗浄水は特に限定されないが、水溶性無機塩、アルカリ、極性有機溶媒からなる群より選ばれる１以上を含むものを好ましく使用することができる。
【００４５】
加水分解残渣の洗浄水に添加する水溶性無機塩の種類は特に限定されないが、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、硫酸塩、アンモニウム塩、塩酸塩、リン酸塩、硝酸塩から選択される１種または２種以上を例示できる。水溶性が高いという観点から、より好ましい無機塩は、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、硫酸水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、硫酸アンモニウム、塩化カリウム、塩化アンモニウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウムである。さらに好ましくは塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、硫酸アンモニウムであり、これらの水溶性無機塩を加水分解残渣の洗浄水に添加することにより、特にセロビオース分解活性、キシラン分解活性に関与するセルラーゼ成分を多く回収することができる。
【００４６】
水溶性無機塩の添加濃度は０．０５〜５重量％の範囲が好ましい。水溶性無機塩の濃度が低すぎるとセルラーゼの回収効率が低いことがある。また一方で水溶性無機塩の濃度が高すぎるとセルラーゼの失活が促進されることがあり、さらに経済的にも不利になる。
【００４７】
加水分解残渣の洗浄水に添加するアルカリは、水に溶解した際に７よりも高いｐＨを示す物質であれば特に限定されないが、アルカリ金属あるいはアルカリ土類金属の水酸化物、アンモニア、アミン、アルカリ金属の炭酸塩、アルカリ金属のリン酸塩から選択される１種または２種以上を例示できる。水によく溶け、少量で所望のｐＨに調整できるという観点から、より好ましいアルカリとして、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、アンモニア、炭酸ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸三ナトリウムなどを使用することができる。さらに好ましくは、少量でｐＨを調整できる水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウムなどを使用することができる。これらのアルカリを含む洗浄水を用いることにより結晶セルロース分解活性およびセロビオース分解活性に関与するセルラーゼ成分を多く回収することができる。
【００４８】
アルカリの添加量は、洗浄水のｐＨが７．５〜１０．０になる範囲が好ましい。洗浄水のｐＨが７．５よりも低いとセルラーゼ成分の回収効率が低い場合がある。一方、洗浄水のｐＨが１０．０よりも高いとセルラーゼ成分の失活が促進され、回収効率が低下する場合がある。
【００４９】
加水分解残渣の洗浄水に添加する極性有機溶媒は特に限定されないが、２０℃の条件下で水に対し１０重量％以上の溶解度を示すもののことを指し、メタノール、エタノール、１−プロパノール、イソプロパノール、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、アセトン、アセトニトリル、エチレングリコール、グリセロールなどが例示される。中でも、結晶セルロース分解活性に関与する成分の回収に効果的なエタノール、イソプロパノール、エチレングリコール、グリセロールが好ましい。
【００５０】
極性有機溶媒の添加濃度は、０．０５〜５重量％の範囲が好ましい。極性有機溶媒の濃度が低すぎるとセルラーゼの回収効率が低いことがある。また一方で極性有機溶媒の濃度が高すぎるとセルラーゼの失活が促進されることがあり、さらに経済的にも不利になる。
【００５１】
加水分解残渣の洗浄は、２５〜５０℃の範囲で行うことが好ましい。温度が低すぎるとセルラーゼの回収効率が十分でない場合がある。また、温度が高すぎるとセルラーゼ成分が失活し、回収効率が低下する場合がある。
【００５２】
前述したように水溶性無機塩、アルカリ、極性有機溶媒はそれぞれ異なるセルラーゼ成分の回収に効果を発揮するため、これらを２種以上含む洗浄水を用いてもよいし、異なる組成の洗浄水を用いて加水分解残渣の洗浄を独立して複数回行ってもよい。任意のセルラーゼ成分の回収に適した洗浄液を用いることにより、回収効率を高めることができる。
【００５３】
加水分解残渣の洗浄物は固液分離により加水分解残渣と洗浄液に分離し、工程（２）と同様に限外濾過膜を用いた濾過によりセルラーゼ成分を回収および／または再利用することができる（工程（４））。
【００５４】
その他、本発明により得られた糖液を、さらに糖濃度を高める濃縮処理を行ってもよい。濃縮処理は、蒸発濃縮、減圧濃縮、膜濃縮などを例示することができるが、エネルギー使用量が少なく、糖液に含まれる発酵阻害物質を分離することが可能なＷＯ２０１０／０６７７８５号に記載される、ナノ濾過膜および／または逆浸透膜に通じて濾過する方法により、糖成分が濃縮された濃縮糖液を得ることができる。
【００５５】
本発明により得られた糖液を発酵原料として化学品を生産する能力を有する微生物を生育させることで、各種化学品を製造することができる。ここでいう発酵原料として微生物を生育させるとは、糖液に含まれる糖成分あるいはアミノ源を微生物の栄養素として利用し、微生物の増殖、生育維持を行うことを意味している。化学品の具体例としては、アルコール、有機酸、アミノ酸、核酸など発酵工業において大量生産されている物質を挙げることができる。こうした化学品は、糖液中の糖成分を炭素源として、その代謝の過程において生体内外に化学品として蓄積生産する。微生物によって生産可能な化学品の具体例として、エタノール、１，３−プロパンジオール、１，４−ブタンジオール、グリセロールなどのアルコール、酢酸、乳酸、ピルビン酸、コハク酸、リンゴ酸、イタコン酸、クエン酸などの有機酸、イノシン、グアノシンなどのヌクレオシド、イノシン酸、グアニル酸などのヌクレオチド、カダベリンなどのアミン化合物を挙げることができる。さらに、本発明の糖液は、酵素、抗生物質、組換えタンパク質などの生産に適用することも可能である。こうした化学品の製造に使用する微生物に関しては、目的の化学品を効率的に生産可能な微生物であればよく、大腸菌、酵母、糸状菌、担子菌などの微生物を使用することができる。
【実施例】
【００５６】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。ただし、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００５７】
（参考例１）セルロース含有バイオマスの調製
１．セルロース含有バイオマスの希硫酸処理
セルロース含有バイオマス（コーンコブ）を硫酸１％水溶液に浸し、１５０℃で３０分オートクレーブ（日東高圧製）にて処理した。処理後、固液分離を行い、溶液成分（以下、希硫酸処理液）と処理バイオマス成分（以下、希硫酸処理物）に分離した。希硫酸処理物は、純水で洗浄して硫酸を洗い流したものを以下の実施例に使用した。
【００５８】
２．セルロース含有バイオマスの水熱処理
セルロース含有バイオマス（稲わら）を水に浸し、撹拌しながら１８０℃で２０分間オートクレーブ処理（日東高圧製）した。その際の圧力は１０ＭＰａであった。処理後、固液分離を行い、溶液成分（以下、水熱処理液）と処理バイオマス成分（以下、水熱処理物）に分離した。
【００５９】
（参考例２）糖濃度の測定
グルコース濃度の測定にはグルコースＣＩＩ−テストワコー（和光純薬製）を、キシロース濃度の測定には、Ｄ−ＸＹＬＯＳＥ  ＡＳＳＡＹ  ＫＩＴ（Ｍｅｇａｚｙｍｅ製）を用いた。
【００６０】
（参考例３）トリコデルマ属由来セルラーゼの調製
トリコデルマ属由来セルラーゼは以下の方法で調製した。
【００６１】
［前培養］
コーンスティープリカー５％（ｗ／ｖ）、グルコース２％（ｗ／ｖ）、酒石酸アンモニウム０．３７％（ｗ／ｖ）、硫酸アンモニウム０．１４％（ｗ／ｖ）、リン酸二水素カリウム０．１４％（ｗ／ｖ）、塩化カルシウム二水和物０．０３％（ｗ／ｖ）、硫酸マグネシウム七水和物０．０３％（ｗ／ｖ）、塩化亜鉛０．０２％（ｗ／ｖ）、塩化鉄（ＩＩＩ）六水和物０．０１％（ｗ／ｖ）、硫酸銅（ＩＩ）五水和物０．００４％（ｗ／ｖ）、塩化マンガン四水和物０．０００８％（ｗ／ｖ）、ホウ酸０．０００６％（ｗ／ｖ）、七モリブデン酸六アンモニウム四水和物０．０２６％（ｗ／ｖ）となるよう蒸留水に溶解し、１００ｍＬを５００ｍＬ容バッフル付き三角フラスコに入れ１２１℃で１５分間オートクレーブ滅菌した。放冷後、これとは別にそれぞれ１２１℃で１５分間オートクレーブ滅菌したＰＥ−ＭとＴｗｅｅｎ８０をそれぞれ０．０１％（ｗ／ｖ）となるよう添加した。この前培養培地にトリコデルマ・リーセイＰＣ３−７を１×１０５個／ｍＬになるよう植菌し、２８℃、１８０ｒｐｍにて７２時間振とう培養し、前培養液とした（振とう装置：ＴＡＩＴＥＣ製  ＢＩＯ−ＳＨＡＫＥＲ  ＢＲ−４０ＬＦ）。
【００６２】
［本培養］
コーンスティープリカー５％（ｗ／ｖ）、グルコース２％（ｗ／ｖ）、セルロース（アビセル）１０％（ｗ／ｖ）、酒石酸アンモニウム０．３７％（ｗ／ｖ）、硫酸アンモニウム０．１４％（ｗ／ｖ）、リン酸二水素カリウム０．２％（ｗ／ｖ）、塩化カルシウム二水和物０．０３％（ｗ／ｖ）、硫酸マグネシウム七水和物０．０３％（ｗ／ｖ）、塩化亜鉛０．０２％（ｗ／ｖ）、塩化鉄（ＩＩＩ）六水和物０．０１％（ｗ／ｖ）、硫酸銅（ＩＩ）五水和物０．００４％（ｗ／ｖ）、塩化マンガン四水和物０．０００８％（ｗ／ｖ）、ホウ酸０．００６％（ｗ／ｖ）、七モリブデン酸六アンモニウム四水和物０．００２６％（ｗ／ｖ）となるよう蒸留水に溶解し、２．５Ｌを５Ｌ容ジャーファーメンター（ＡＢＬＥ製  ＤＰＣ−２Ａ）に入れ、１２１℃で１５分間オートクレーブ滅菌した。放冷後、これとは別にそれぞれ１２１℃で１５分間オートクレーブ滅菌したＰＥ−ＭとＴｗｅｅｎ８０をそれぞれ０．０１％（ｗ／ｖ）となるよう添加し、前記の方法にて得た前培養液を２５０ｍＬ接種した。その後、２８℃、３００ｒｐｍ、通気量１ｖｖｍにて８７時間培養を行った。得られた培養液をそのまま粗酵素液として以下実施例に使用した。
【００６３】
（参考例４）セルラーゼ活性測定方法
セルラーゼ活性は、１）結晶セルロース分解活性、２）セロビオース分解活性、３）キシラン分解活性、の３種について以下の手順で測定評価した。
【００６４】
１）結晶セルロース分解活性
５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．２）に、１重量％になるよう結晶セルロース（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  ｍｉｃｒｏｃｒｙｓｔａｒｉｎｅ、Ｍｅｒｋ製）を懸濁したものを基質溶液とした。５００μＬの基質溶液に酵素液５μＬを添加し、５０℃で回転混和しながら反応させた。反応時間は３０分間を基本とし、酵素活性の高さに応じて最大６０分まで適宜延長した。反応後、チューブを遠心分離し、その上清成分のグルコース濃度を測定した。グルコース濃度は、参考例２に記載の方法で測定した。上記反応系にて１分間に１μｍｏｌのグルコースを生成する酵素量を１Ｕと定義し、活性値（Ｕ／ｍＬ）を下記式に従って算出した。
結晶セルロース分解活性（Ｕ／ｍＬ）＝グルコース濃度（ｇ／Ｌ）×１０００×５０５（μＬ）／（１８０．１６×反応時間（分）×５（μＬ））。
【００６５】
２）セロビオース分解活性
５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．２）に、１５ｍＭとなるようＤ（＋）−セロビオース（和光純薬製）を溶解したものを基質溶液とした。５００μＬの基質溶液に酵素液５μＬを添加し、５０℃で回転混和しながら反応させた。反応時間は１０分間を基本とし、酵素活性の高さに応じて最大３０分まで適宜延長した。反応後、チューブを遠心分離し、その上清成分のグルコース濃度を測定した。グルコース濃度は、参考例２に記載の方法で測定した。上記反応系にて１分間に１μｍｏｌのグルコースを生成する酵素量を１Ｕと定義し、活性値（Ｕ／ｍＬ）を下記式に従って算出した。
セロビオース分解活性（Ｕ／ｍＬ）＝グルコース濃度（ｇ／Ｌ）×１０００×５０５（μＬ）／（１８０．１６×反応時間（分）×５（μＬ））。
【００６６】
３）キシラン分解活性
５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．２）に、１重量％になるようキシラン（Ｘｙｌａｎ  ｆｒｏｍ  Ｂｉｒｃｈ  ｗｏｏｄ、Ｆｌｕｋａ社製）を懸濁したものを基質溶液とした。分注した５００μＬの基質溶液に酵素液５μＬを添加し、５０℃で回転混和しながら反応させた。反応時間は３０分間を基本とし、酵素活性の高さに応じて最大６０分まで適宜延長した。反応後、チューブを遠心分離し、その上清成分のキシロース濃度を測定した。キシロース濃度は、参考例２に記載の方法で測定した。上記反応系にて１分間に１μｍｏｌのキシロースを生成する酵素量を１Ｕと定義し、活性値（Ｕ／ｍＬ）を下記式に従って算出した。
キシラン分解活性（Ｕ／ｍＬ）＝キシロース濃度（ｇ／Ｌ）×１０００×５０５（μＬ）／（１５０．１３×反応時間（分）×５（μＬ））。
【００６７】
（比較例１）セルロース含有バイオマス加水分解物からのセルラーゼの回収
比較例として、澱粉原料の発酵残渣を含まないセルロース含有バイオマス加水分解物からセルラーゼを回収した場合の回収セルラーゼの活性について以下に示す。
【００６８】
（工程１：セルロース含有バイオマスの加水分解）
セルロース含有バイオマスの希硫酸処理物および水熱処理物を各１ｇずつ、５０ｍＬ容遠沈管に秤量し、セルロース含有バイオマスの終濃度が１０重量％となるよう超純水を加えた。５０℃で１時間、ハイブリダイゼーションローテーター（日伸理化製  ＳＮ−０６ＢＮ）を用いて回転混和した後、希釈硫酸あるいは希釈苛性ソーダを用いてｐＨを５．０〜６．０の範囲に調整した。本組成物にトリコデルマ属由来セルラーゼ５．６ｍｇを添加し、引き続きハイブリダイゼーションローテーターを用いて５０℃で２４時間回転混和した。
【００６９】
（工程２：糸状菌由来セルラーゼ成分と糖液の分離）
工程１の加水分解物を遠心分離（８，０００Ｇ、１０分間）にて固液分離し、上清７ｇと加水分解残渣３ｇを得た。加水分解残渣を約７ｍＬの超純水で再度懸濁し、遠心分離（８，０００Ｇ、１０分間）にて洗浄液７ｇと加水分解残渣３ｇに固液分離した。加水分解物の上清と洗浄液は、合一して分画分子量１０，０００の限外濾過膜（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ｓｔｅｄｉｍ  ｂｉｏｔｅｃｈ製  ＶＩＶＡＳＰＩＮ  ２０  材質：ＰＥＳ）を用いて濾過した。非透過側が１ｍＬ以下になるまで８，０００Ｇにて遠心濾過した後、脱塩のため非透過液に超純水を加えて１０倍以上に希釈し、再度非透過側が１ｍＬ以下になるまで８，０００Ｇにて遠心濾過を行った。得られた非透過液を回収酵素液とし、参考例４に従って活性測定を行った。
【００７０】
（比較例２）タンパク質の添加効果
比較例１の工程１において、セルロース含有バイオマスの希硫酸処理物および水熱処理物の加水分解時、トウモロコシの主要タンパク質であるＺｅｉｎ（生化学用、和光純薬製）をバイオマスの固形物重量に対して１０％量添加した。その他は比較例１と同様の方法にて回収酵素液を得、参考例４に従って活性測定を行った。
【００７１】
（比較例３）菌体の添加効果
比較例１の工程１において、セルロース含有バイオマスの希硫酸処理物および水熱処理物の加水分解時、酵母（サッカロマイセス・セレビシエ  ＯＣ−２株）の菌体をバイオマスの固形物重量に対して１０％量添加した。
【００７２】
酵母は、ＹＰＤ培地（酵母エキス１％、ペプトン２％、グルコース２％）に植菌し、３０℃、１２０ｒｐｍで２４時間培養を行った。培養液を遠心分離（８，０００Ｇ、１０分間）により得たペレットを酵母菌体として使用した。
【００７３】
酵母菌体を添加する他は比較例１と同様の方法にて回収酵素液を得、参考例４に従って活性測定を行った。
【００７４】
（実施例１）澱粉原料の発酵残渣の添加効果
比較例１の工程１において、セルロース含有バイオマスの希硫酸処理物および水熱処理物の加水分解時、トウモロコシ原料の乾燥蒸留穀物残渣（ＤＤＧ）（ハイプロテインコーンＤＤＧＳ、ウィルバー・エリス製）あるいは酒粕（白鶴特撰酒粕、白鶴酒造製）を、その固形物重量がバイオマスの固形物重量に対して１０％量となるよう添加した。その他は比較例１と同様の方法にて回収酵素液を得、参考例４に従って活性測定を行った。比較例１〜３、および実施例１の結果について、比較例１における酵素活性を基準（１．０）とし、相対活性を表１にまとめた。トウモロコシＤＤＧを添加することにより、結晶セルロース分解活性およびセロビオース分解活性に関与するセルラーゼ成分の回収量が増加した。
【００７５】
【表１】
2014064563.tif 000003
【００７６】
（実施例２）澱粉原料の発酵残渣の添加量の影響
実施例１において、トウモロコシＤＤＧをバイオマスの固形物重量に対して１、５、１０、３０％量添加した。その他は比較例１と同様の方法にて回収酵素液を得、参考例４に従って活性測定を行った。比較例１における酵素活性を基準（１．０）とし、相対活性を表２にまとめた。試験区の全ての水準でセルラーゼ成分の回収量が増加し、トウモロコシ原料の蒸留残渣の添加量が多いほど高い効果が得られた。
【００７７】
【表２】
2014064563.tif 000004
【００７８】
（比較例４）水溶性無機塩を含むセルロース含有バイオマス加水分解物からのセルラーゼの回収
比較例１の工程１において、セルロース含有バイオマスの希硫酸処理物の加水分解時に塩化ナトリウムをそれぞれ対液０．１、１、５重量％となるよう添加した。その他は比較例１と同様の方法にて回収酵素液を得、参考例４に従って活性測定を行った。
【００７９】
（実施例３）澱粉原料の発酵残渣および水溶性無機塩の添加効果
実施例１において、セルロース含有バイオマスの希硫酸処理物の加水分解時にトウモロコシＤＤＧをバイオマスの固形物重量に対して５％量添加し、さらに、塩化ナトリウムを反応液の重量に対し、それぞれ０．１、０．５、１、３．５、５重量％になるよう添加した。その他は比較例１と同様の方法にて回収酵素液を得、参考例４に従って活性測定を行った。比較例４および実施例３の結果について、比較例１における酵素活性を基準（１．０）とし、相対活性を表３にまとめた。トウモロコシＤＤＧに加え、水溶性無機塩である塩化ナトリウムをさらに添加することにより、セロビオース分解活性に関与するセルラーゼ成分の回収量が飛躍的に増加した。
【００８０】
【表３】
2014064563.tif 000005
【００８１】
（実施例４）澱粉原料の発酵残渣との組み合わせにおける水溶性無機塩の種類の影響
実施例３において、塩化ナトリウムに代えて塩化カリウム、塩化マグネシウム、硫酸アンモニウムを用い、その添加濃度は対液１重量％とした。その他は比較例１と同様の方法にて回収酵素液を得、参考例４に従って活性測定を行った。比較例１における酵素活性を基準（１．０）とし、相対活性を表４にまとめた。いずれの水溶性無機塩を用いてもセルラーゼ成分の回収量はほとんど変わらなかった。
【００８２】
【表４】
2014064563.tif 000006
【００８３】
（実施例５）澱粉原料の発酵残渣および極性有機溶媒の添加効果
実施例１において、セルロース含有バイオマスの希硫酸処理物の加水分解反応時、トウモロコシＤＤＧをバイオマスの固形物重量に対して５％量添加し、さらに、エチレングリコールを反応液の重量に対しそれぞれ０．１、０．５、１、３．５、５重量％になるよう添加した。その他は比較例１と同様の方法にて回収酵素液を得、参考例４に従って活性測定を行った。比較例１における酵素活性を基準（１．０）とし、相対活性を表５にまとめた。トウモロコシＤＤＧに加え、極性有機溶媒であるエチレングリコールをさらに添加することにより、結晶セルロース分解活性およびセロビオース分解活性に関与するセルラーゼ成分の回収量が増加した。
【００８４】
【表５】
2014064563.tif 000007
【００８５】
（実施例６）澱粉原料の発酵残渣との組み合わせにおける極性有機溶媒の種類の影響
実施例５において、エチレングリコールに代えてエタノール、イソプロパノール、グリセロールを用い、その添加濃度は１重量％とした。その他は比較例１と同様の方法にて回収酵素液を得、参考例４に従って活性測定を行った。比較例１における酵素活性を基準（１．０）とし、相対活性を表６にまとめた。いずれの極性有機溶媒を用いてもセルラーゼ成分の回収量はほとんど変わらなかった。
【００８６】
【表６】
2014064563.tif 000008
【００８７】
（実施例７）水溶性無機塩およびアルカリを含む洗浄水による加水分解残渣の洗浄効果
セルロース含有バイオマス希硫酸処理物の固形物重量の５％量のトウモロコシＤＤＧを含む条件下で加水分解反応を実施し、加水分解物を遠心分離（８，０００Ｇ、１０分間）することにより上清７ｇと加水分解残渣３ｇに分離した。加水分解残渣には洗浄水として約７ｇの２重量％の塩化ナトリウム水溶液を加えて懸濁した。上記の懸濁物にさらに希釈苛性ソーダを加えてｐＨ７．５に調整し、ハイブリダイゼーションローテーターを用いて２５℃で１時間回転混和した後に遠心分離（８，０００Ｇ、１０分間）することにより洗浄液７ｇと加水分解残渣３ｇに分離した。上清および洗浄液を合一し、比較例１と同様の方法にて回収酵素液を得、参考例４に従って活性測定を行った。
【００８８】
（実施例８）極性有機溶媒を含む洗浄水による加水分解残渣の洗浄効果
実施例７において、加水分解残渣の洗浄水として２重量％の塩化ナトリウム水溶液の代わりに１重量％のグリセロール水溶液を用い、５０℃で１時間回転混和した。その他は実施例７と同様の方法にて回収酵素液を得、参考例４に従って活性測定を行った。比較例１における酵素活性を基準（１．０）とし、実施例７および実施例８の結果を相対活性として表７にまとめた。水溶性無機塩、アルカリ、極性有機溶媒のいずれか１種以上を含む洗浄水を用いて加水分解残渣の洗浄を行うことにより、セルラーゼ成分の回収量が増加した。
【００８９】
【表７】
2014064563.tif 000009
【産業上の利用可能性】
【００９０】
本発明で得られる糖液は、種々の発酵産物の糖原料として使用することができる。
【図１】
2014064563.tif 000010
【図２】
2014064563.tif 000011