(57)【要約】      （修正有）【課題】炎症性腸疾患（ＩＢＤ）を治療するための５−アミノサリチル酸（５ＡＳＡ）を投与する方法を提供する。【解決手段】ジアゾ結合を介して共に共有結合している５ＡＳＡと反応性リン脂質との混合物、分子会合複合体または共有結合化合物であり得る５ＡＳＡとリン脂質との独特の組成物、および該組成物をＩＢＤの症状を治療するために投与する方法。リン脂質は大豆から誘導されたリン脂質成（ホスファチジルコリン）及びメサラミン、スルフォサラジン、オルサラジン、バルサラジド、またはそれらの混合物などを含有するものである。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
５−アミノサリチル酸（５ＡＳＡ）およびリン脂質またはリン脂質含有油を含む組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、その全体の内容が参照により本明細書に組み込まれる０７／１９／２００６（２００６年７月１９日）に出願された米国特許仮出願第６０／８３１８４３号に対する仮優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、例えば潰瘍性大腸炎など、を治療するための５−アミノサリチル酸（５ＡＳＡ）およびリン脂質を含む独特の製剤に関する。
【０００３】
本発明は、大腸炎または炎症性腸疾患（ＩＢＤ）による病変が存在する遠位の小腸および／または結腸内で、５ＡＳＡの抗炎症効能を高めるために５ＡＳＡを放出するように構成されている５ＡＳＡおよびリン脂質を含む独特の組成物に関する。ある実施形態において、該リン脂質組成物は、生体適合性の担体および／または樹脂中に約１５重量％〜約９５重量％のホスファチジルコリン（ＰＣ）を含んでいる。本発明は、また、本発明の組成物を製造し、経口で、経腸的におよび／または直腸に投与する方法にも関する。
【背景技術】
【０００４】
リン脂質および抗炎症性医薬品について、読者は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第４９１８０６３号、同第５０４３３２９号、同第４９５０６５６号、同第５０３２５８５号、同第５７６３４２２号、同第５９５５４５１号、およびＰＣＴ／ＵＳ第０１／５１６０５号に目を向けられたい。
【０００５】
炎症性腸疾患（ＩＢＤ）は、結腸および遠位の小腸に影響を及ぼす潰瘍性大腸炎およびクローン病を含む潰瘍性疾患の仲間である。これらの疾患は、胃腸出血、下痢、発熱、感染の発現により明らかとなり、最も進んだ場合、胃腸瘻孔形成は、穿孔および癌腫によって明らかとなる。５ＡＳＡは、ＩＢＤを持つ患者を扱うための医療に用いられてきたが、患者を寛解状態に保つその効果には限界があった。
【発明の要約】
【０００６】
５ＡＳＡは、効果的な治療ではあるが、ＩＢＤを治療する改良された効果を有し、患者を寛解状態に保つ５ＡＳＡに対する技術的必要性が存在する。
【０００７】
本発明は、リン脂質（ＰＬ）および５−アミノサリチル酸（５ＡＳＡ）を含む組成物を提供する。
【０００８】
本発明は、また、ダイズから誘導されたリン脂質成分およびメサラミン、スルファサラジン、オルサラジン、バルサラジド、またはそれらの混合物などの成分を含有する５−アミノサリチル酸（５ＡＳＡ）を含む組成物を提供する。該組成物は、また、遠位の腸内での５ＡＳＡ含有成分の放出を容易にするための樹脂（例えば、Ｅｕｄｒａｇｒｉｔ（登録商標）Ｓ）などのさらなる成分を含むことができる。
【０００９】
本発明は、また、ダイズから誘導されたホスファチジルコリン（ＰＣ）成分およびメサラミン、スルファサラジン、オルサラジン、バルサラジド、またはそれらの混合物などの成分を含有する５−アミノサリチル酸（５ＡＳＡ）を含み、該ＰＣおよび５ＡＳＡ含有成分が、遠位の腸内でその成分の放出を容易にする樹脂（例えば、Ｅｕｄｒａｇｒｉｔ（登録商標）Ｓ）に、取り囲まれているか、カプセル化されているか、または埋め込まれている組成物を提供する。
【００１０】
本発明は、５ＡＳＡ成分およびリン脂質成分を含む製剤を製造する方法を提供する。
【００１１】
本発明は、また、５ＡＳＡ成分とＰＣを強化したリン脂質成分とを含む製剤を製造する方法を提供する。
【００１２】
本発明は、５ＡＳＡ／ＰＬ製剤を、経口で、経腸的にまたは直腸に投与する方法を提供し、その投与は、単回投与、周期的投与、間欠投与、または何らかの投与プロトコールに従う投与（所定のスケジュールに従う、例えば、１日１回、１日２回などの投与）であり得る。
【００１３】
本発明は、本発明の組成物をＩＢＤ損傷部位に直接投与して炎症を軽減し、同時に、（１）その損傷の潰瘍化を減少もしくは防止し、（２）その損傷のさらなる潰瘍化を減少もしくは防止し、（３）その損傷の潰瘍化を減少もしくは治癒し、（４）あるいは遠位の腸と関連する疎水性膜および／または層の完全性を維持することによってＩＢＤの患者を治療する方法を提供する。
【００１４】
本発明は、類似の要素には同じ番号が付いている添付の説明図と一緒に以下の詳細な説明を参照することによってよりよく理解することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】４日間にわたって濃度が増加する（０％〜４％）デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）を含有する飲用水をマウスにあてがうことによってもたらされる単位長さ当りの増加した結腸組織重量によって示された結腸炎症の増加を示すグラフを描く図である。
【図２】４日間にわたる飲用水中のＤＳＳ濃度の増加が、糞便中ヘモグロビン濃度によって測定された用量依存性のマウスの胃腸出血の増加を引き起こすことを描く図である。
【図３】５ＡＳＡ単独（１００ｍｇ／体重ｋｇ）またはそれぞれ３５％、５３％または７５％のＰＣを含有する３つの異なるダイズＰＣ製剤、Ｐ３５、Ｐ５３またはＰ７５と１：１の重量基準で組み合わせた５ＡＳＡを含有する食物をマウスが食べる飼料消費を示す図である。Ｓａｌ／Ｓａｌの標識のある１グループを除くすべてが大腸炎を引き起こす３％ＤＳＳを含有する水を飲むアクセスを有した。
【図４】実験食を給餌され、大腸炎を引き起こす飲用水中の３％ＤＳＳをあてがわれたマウスにおける単位長さ当りの結腸組織重量の増加によって示される結腸炎症の変化を示す図である。
【図５】実験食を給餌され、大腸炎を引き起こす飲用水中の３％ＤＳＳをあてがわれたマウスにおける糞便中の失血の変化を示す図である。
【図６】実験食を給餌され、大腸炎を引き起こす飲用水中の３％ＤＳＳをあてがわれたマウスにおける結腸ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）の変化を示す図である。
【図７】実験食を給餌され、大腸炎を引き起こす飲用水中の３％ＤＳＳをあてがわれたマウスにおける０（正常）から４（粘膜腺状構造の完全欠損）までの点数を用いた結腸の粘膜組織像の変化を示す図である。
【図８】スプラーグ・ドーリー雄ラットにおけるＤＳＳ誘発大腸炎後の６日間の回復期間中の、生理食塩水、５ＡＳＡおよび２つのＰＣ：５ＡＳＡ製剤に対するヘマトクリットのレベルの変化を描く図である。
【図９】スプラーグ・ドーリー雄ラットにおけるＤＳＳ誘発大腸炎後の６日間の回復期間中の、生理食塩水、５ＡＳＡおよび２つのＰＣ：５ＡＳＡ製剤に対する糞便中の失血の変化を描く図である。
【図１０】スプラーグ・ドーリー雄ラットにおけるＤＳＳ誘発大腸炎後の６日間の回復期間中の、生理食塩水、５ＡＳＡおよび２つのＰＣ：５ＡＳＡ製剤に対する結腸組織浮腫の変化を描く図である。
【図１１】スプラーグ・ドーリー雄ラットにおけるＤＳＳ誘発大腸炎後の６日間の回復期間中の、生理食塩水、５ＡＳＡおよび２つのＰＣ：５ＡＳＡ製剤に対する結腸ＭＰＯ活性の変化を描く図である。
【図１２】スプラーグ・ドーリー雄ラットにおけるＤＳＳ誘発大腸炎後の６日間の回復期間中の、生理食塩水、５ＡＳＡおよび２つのＰＣ：５ＡＳＡ製剤に対する結腸粘膜下層の固有層における炎症細胞の数の変化を描く図である。
【図１３】スプラーグ・ドーリー雄ラットにおけるＤＳＳ誘発大腸炎後の６日間の回復期間中の、生理食塩水、５ＡＳＡおよび２つのＰＣ：５ＡＳＡ製剤に対する組織学的に査定した結腸粘膜障害の変化を描く図である。
【図１４】スプラーグ・ドーリー雄ラットにおけるＤＳＳ誘発大腸炎後の回復期間中の、飲用水中のＤＳＳを含まない生理食塩水と、飲用水中のＤＳＳを含む生理食塩水、５ＡＳＡおよびＰＣ：５ＡＳＡ製剤に対する単位長さ当りの結腸組織重量の変化を示す図である。
【図１５】スプラーグ・ドーリー雄ラットにおけるＤＳＳ誘発大腸炎後の回復期間中の、飲用水中のＤＳＳを含まない生理食塩水と、飲用水中のＤＳＳを含む生理食塩水、５ＡＳＡおよびＰＣ：５ＡＳＡ製剤に対する結腸ＭＰＯ活性の変化を描く図である。
【図１６】スプラーグ・ドーリー雄ラットにおけるＤＳＳ誘発大腸炎後の回復期間中の、飲用水中のＤＳＳを含まない生理食塩水と、飲用水中のＤＳＳを含む生理食塩水、５ＡＳＡおよびＰＣ：５ＡＳＡ製剤に対する結腸接触角の変化を描く図である。
【図１７】スプラーグ・ドーリー雄ラットにおけるＤＳＳ誘発大腸炎後の回復期間中の、飲用水中のＤＳＳを含まない生理食塩水と、飲用水中のＤＳＳを含む生理食塩水、５ＡＳＡおよびＰＣ：５ＡＳＡ製剤に対するヘマトクリットのレベルの変化を描く図である。
【図１８】スプラーグ・ドーリー雄ラットにおけるＤＳＳ誘発大腸炎後の回復期間中の、飲用水中のＤＳＳを含まない生理食塩水と、飲用水中のＤＳＳを含む生理食塩水、５ＡＳＡおよびＰＣ：５ＡＳＡ製剤に対する糞便中のヘモグロビンの変化を描く図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明者は、５−アミノサリチル酸（５ＡＳＡ）および５ＡＳＡ系医薬品とリン脂質の組成物が、げっ歯類大腸炎モデルを用いてげっ歯類における大腸炎を減少する改良された活性を有することを見出した。特定の実施形態において、そのリン脂質はダイズおよびその他のソースから誘導されたリン脂質である。他の実施形態において、そのリン脂質はホスファチジルコリン（ＰＣ）またはホスファチジルコリンの誘導体中で強化されたリン脂質である。これらの５ＡＳＡ／ＰＣ製剤は、胃腸炎、潰瘍、出血および炎症性腸疾患（ＩＢＤ）と関連するその他の症状、ならびにそれと関連する続発症の下痢、発熱および疼痛の治療または改善のために経口で、経腸的にまたは直腸に（浣腸）投与することができる。５ＡＳＡおよびリン脂質を含有する本発明の組成物は、５ＡＳＡの抗炎症性の利点を高め、ＩＢＤで減弱化した病気に侵された粘膜の疎水性バリア性を強固にする。
【００１７】
本発明は、リン脂質、特定の実施形態においてはホスファチジルコリン（ＰＣ）中で強化されたリン脂質と、５ＡＳＡ、または５ＡＳＡを含む医薬品製剤とを含むＩＢＤの治療のための組成物を調製する方法に関する。これらの製剤は、５ＡＳＡを含有する粉末（例えば、メサラミン、スルファサラジン、オルサラジン、バルサラジド、もしくはそれらの混合物）または活性５ＡＳＡにジアゾ結合を介して共有結合しているより大きな分子を取り、単純にそれをリン脂質と混合することによって調製することができる。特定の実施形態において、その５ＡＳＡ含有成分は、油性リン脂質成分、例えばＰＣを含有するダイズレシチン油、Ｐｈｏｓｐｈａｌ３５ＳＢ（Ｐ３５）などと単に混合する。一般に、５ＡＳＡ対リン脂質の重量比は、約１：１０と約１０：１の間である。特定の実施形態において、その重量比は、約１：５と約５：１の間である。別の実施形態において、その重量比は、約２：１と約１：２の間である。さらに別の実施形態において、その重量比は、約１：１である。
【００１８】
いくつかの実施形態において、該組成物は、該成分を製剤の処方を容易にするために混合して一緒に加熱することによって調製する。別の方法は、リン脂質と５ＡＳＡをリン脂質中で５ＡＳＡが融解するための十分な温度まで一般に良好な混合と共に加熱して、５ＡＳＡとリン脂質の間の分子レベルでの緻密な混合および会合複合体の形成を可能にする。その方法は、酸化的劣化のない５ＡＳＡ／リン脂質会合複合体の形成を促進するために空気の存在しない高温の溶媒または生体適合性の油中で行うことができる。その製剤を製造する別の方法は、５ＡＳＡを含む水性製剤を作製し、次にその溶液をＰＣの乾燥脂質のフィルムを被覆した容器に加え、それを次に激しく混合するか、ボルテックスするか、超音波処理するか、または撹拌の他の手段にかけて５ＡＳＡ／ＰＣの脂質懸濁液を作製するものである。もう１つの方法は、５ＡＳＡとリン脂質を、その両方の材料を溶解する溶媒中で溶解するものである。その溶液を加熱するかまたは加熱しないで混合し、次いでその溶媒を蒸発させる。その得られた物質は、次に粉砕し、遠位の腸内で遅延放出するように樹脂でカプセル化することができる。
【００１９】
５ＡＳＡとリン脂質（ＰＬ）を組み合わせるさらに別の方法は、ジアゾ結合をもたらす標準的な技術を用いて、それらの分子を５ＡＳＡのアミノ基と反応性リン脂質（ＰＬ）、例えばホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルセリンまたはその他の反応性リン脂質の間でジアゾ結合を介して共有結合させるものである。その他の５ＡＳＡ前駆物質、例えばスルファサラジン、オサラジン（ｏｓａｌａｚｉｎｅ）、およびバサラジド（ｂａｓａｌａｚｉｄｅ）などと同じように結腸中の細菌酵素は、ジアゾ結合を加水分解して５ＡＳＡと反応性ＰＬ例えばＰＥなどを遊離させる。その解放された５ＡＳＡは、次にその意図された治療効果をもたらすことができ、一方解放されたリン脂質は、遠位の腸の病気に侵された粘膜の疎水性バリアを維持もしくは修復し、炎症を阻止し、治癒を促進する助けをする。
【００２０】
今までの前臨床試験は、ＰＣなどのリン脂質は５ＡＳＡの大腸炎を治療する効能を高めることを示している。
【００２１】
適当な試薬
本発明において使用するための適当なリン脂質としては、一般式：
【００２２】
【化１】
2014015478.tif 000002
（式中、Ｒ１およびＲ２は、８個から３２個までの範囲の炭素原子の飽和および／または不飽和の置換基であり、ここで１つまたは複数の炭素原子は、酸素原子、硫黄原子、窒素原子、またはその他の主要な基元素、例えばＢ、Ｃ、Ｓｉ、Ｐ、Ｓ、Ｇｅ、およびＧａなどによって置換されていてもよく、Ｒ３はＨまたはＣＨ３であり、ＸはＨまたはＣＯＯＨであり、Ｒ４は＝ＯまたはＨ２である）
のリン脂質、当該一般式の双性イオン性リン脂質の混合物および組合せが非限定で挙げられる。
【００２３】
式（ＩＩ）の双性イオン性リン脂質の例としては、非限定で、ホスファチジルコリン類、例えばホスファチジルコリン（ＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、その他のジ飽和ホスファチジルコリン類または不飽和ホスファチジルコリン類、ホスファチジルエタノールアミン類、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリンスフィンゴミエリンもしくはその他のセラミド類、またはさまざまなその他の双性イオン性リン脂質、リン脂質含有油、例えばω−３脂肪酸を強化したマリン油および／または魚油、ダイズから誘導されたレシチン油など、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、ジリノレオイルホスファチジルコリン（ＤＬＬ−ＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ダイズホスファチジルコリン（Ｓｏｙ−ＰＣもしくはＰＣｓ）、卵ホスファチジルコリン（Ｅｇｇ−ＰＣもしくはＰＣＥ）などが挙げられる。飽和リン脂質のＤＰＰＣにおいて、その飽和脂肪族置換基Ｒ１とＲ２は、ＣＨ３−（ＣＨ２）１４であり、Ｒ３はＣＨ３であり、ＸはＨである。不飽和リン脂質のＤＬＬ−ＰＣにおいて、Ｒ１とＲ２は、ＣＨ３−（ＣＨ２）４−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−（ＣＨ２）７であり、Ｒ３はＣＨ３であり、ＸはＨである。不飽和リン脂質の混合物であるＥｇｇ−ＰＣにおいて、Ｒ１は、飽和脂肪族置換基（例えばパルミチン酸またはステアリン酸）を主として含み、Ｒ２は、主として不飽和脂肪族置換基（例えばオレイン酸またはアラキドン酸）である。Ｓｏｙ−ＰＣにおいては、それは飽和リン脂質（パルミチン酸およびステアリン酸）に加えて不飽和リン脂質の混合物（オレイン酸、リノール酸およびリノレン酸）である。海産動物（例えばオキアミ、サケ）に由来するＰＣにおいてそのＲ１およびＲ２基は、ω−３脂肪酸類：エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）およびドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）を構成することができる。好ましい双性イオン性リン脂質としては、非限定で、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ホスファチジルコリン、またはそれらの混合物が挙げられる。
【実施例】
【００２４】
組成物の調製
約３５重量％のホスファチジルコリン（ＰＣ）を含有するダイズレシチン油のＰｈｏｓａｌ  ３５  ＳＢを、ガラスのビーカーに入れ、それに５ＡＳＡ（または５ＡＳＡを含有する医薬品）を、約４０℃の中熱下で撹拌しながら１：１の重量比が得られるまで加えた。得られた油性製剤をｐＨ感受性のポリマー、例えばＭｕｌｔｉＳａｌ（商標）、またはＥｕｄｒａｇｒｉｔ（登録商標）−Ｓで被覆し、５ＡＳＡ／ＰＣ組成物のポリマーでカプセル化した微粒子を形成した。これらのカプセル化した微粒子は、５ＡＳＡおよびＰＣが、ｐＨが７以上でそのポリマー被覆が劣化する遠位の腸に薬物が到達したときのみに放出されるように形成されている。この製剤を次に評価のためマウスまたはラットの餌に加えた。そのマウスまたはラットに大腸炎を引き起こすためのそれらの飲用水中に含めた３％のデキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）溶液をあてがった。
【００２５】
上記の油性製剤に対する別法は、５ＡＳＡまたは５ＡＳＡを含有する医薬品を水中または適当な水溶液中に懸濁させるものである。その水溶液は次に乾燥したＰＣの脂質フィルムを被覆した第２の容器に加える。得られた混合物を、次に激しい混合、ボルテキシング、超音波処理またはその他の撹拌の手段にかけて、経口、経腸または直腸（浣腸）投与用の水性脂質懸濁液を形成する。
【００２６】
げっ歯類大腸炎モデルのＣ５７ＢＬ／６マウスを用いる実施例
４つのＣ５７ＢＬ／６マウスのグループを、異なる量のそれらの飲用水中のデキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）に４日間さらした。そのマウスを次に安楽死させ、マウスの各グループについて長さ当りの結腸組織の重量測定を行った。ここで図１について言及すると、ＤＳＳ処理は、長さ当りの増加した結腸組織の重量により判断して大腸の炎症または浮腫をもたらし、ここで３％ＤＳＳが重量対長さの計測において最大の増加を示した。
【００２７】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスのグループを、異なる量のそれらの飲用水中のデキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）に４日間さらした。４日の期間の終わりにマウスの糞便中ヘモグロビンの測定を行った。ここで図２について言及すると、ＤＳＳ処理は、それらの飲料中のＤＳＳの濃度の増加に伴い糞便中ヘモグロビンの増加をもたらし、４％ＤＳＳが、最高の糞便中ヘモグロビンを示した。
【００２８】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスのグループを、異なる食物にさらし、それらの毎日の飼料消費量（グラム／日）を、４日間にわたって測定した。グループ１は、対照のグループを表し、ＤＳＳを含まない生理食塩水および５ＡＳＡを含有する製剤は何も含まない普通の餌を受けた。グループ２は、ＤＳＳ対照を表し、３％ＤＳＳを含む生理食塩水および５ＡＳＡを含有する製剤は何も含まない普通の餌を受けた。グループ３は、５ＡＳＡ治療グループを表し、３％ＤＳＳを含む生理食塩水および５ＡＳＡをＭｕｌｔｉＳａｌ（商標）でカプセル化した微粒子を含む食物を受けた。グループ４から６は、５ＡＳＡを３つの油性５ＡＳＡ／ＰＣ製剤と比較するために設計されている。グループ４は、５ＡＳＡ／Ｐ３５（５ＡＳＡと約３５重量％のＰＣを含有する油性ダイズレシチン製品のＰｈｏｓｐｈａｌ（登録商標）３５ＳＢの１：１の重量比）で治療するグループを表し、３％ＤＳＳを含む生理食塩水および５ＡＳＡ／Ｐ３５をＭｕｌｔｉＳａｌ（商標）でカプセル化した微粒子を含む食物を受けた。グループ５は、５ＡＳＡ／Ｐ３５（５ＡＳＡと約５３重量％のＰＣを含有する油性ダイズレシチン製品のＰｈｏｓａｌ（登録商標）５３ＭＣＴの１：１の重量比）で治療するグループを表し、３％ＤＳＳを含む生理食塩水および５ＡＳＡ／Ｐ５３をＭｕｌｔｉＳａｌ（商標）でカプセル化した微粒子を含む食物を受けた。グループ６は、５ＡＳＡ／Ｐ３５（５ＡＳＡと約７５重量％のＰＣを含有する油性ダイズレシチン製品のＰｈｏｓａｌ（登録商標）７５ＳＡの１：１の重量比）で治療するグループを表し、３％ＤＳＳを含む生理食塩水および５ＡＳＡ／Ｐ７５をＭｕｌｔｉＳａｌ（商標）でカプセル化した微粒子を含む食物を受けた。ここで図３について言及すると、マウスの餌の消費（グラム／日）を、上記の食物にあてはめた。前の３つの棒は、餌の中に５ＡＳＡの存在しないものと存在するものにおける正常なマウスの給餌パターンを明らかにし、一方後の３つの棒は、５ＡＳＡ／ＰＣ製剤の存在するものにおけるマウスの給餌パターンを表す。図３は、活性物質がマウスの食事のパターンに有意に影響しなかったことを示している。
【００２９】
誘発した大腸炎の治療について５ＡＳＡと５ＡＳＡ：ＰＬ製剤を比較するマウスのデータ
前の実施例は、３％のデキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）を含有する生理食塩水を含む飲用水がマウスに大腸炎型の障害を引き起こすことができることを示している。だから今や、マウスの大腸炎型障害の治療において、５ＡＳＡ：ＰＬ製剤を５ＡＳＡと比較することができる。マウスのグループに３％のＤＳＳを含有する生理食塩水を含む飲用水を４日間にわたってあてがい、大腸炎型障害を誘発させ、次いで本発明の組成物により治療した。治療組成物の効果は、単位長さ当りの結腸組織重量を測定することによって判定した。ここで図４について言及すると、一定の長さ当り増加した結腸組織の重量によって測定される結腸の炎症は、ＤＳＳ無しで治療されるマウスで通常の食物のグループと共に、生理食塩水、５ＡＳＡ、５ＡＳＡ：Ｐ３５、５ＡＳＡ：Ｐ５３および５ＡＳＡ：Ｐ７５をＤＳＳと組み合わせ、マウスにそれらの食物に入れて投与して治療したとき部分的な逆転を示した。そのデータは、３つの５ＡＳＡ：ＰＬ製剤が、長さに対して増加した結腸組織重量により測定した組織炎症の逆転において５ＡＳＡ単独より優れていることを示した。
【００３０】
マウスのグループに、３％のＤＳＳを含有する生理食塩水を含む飲用水を４日間あてがい、大腸炎型の障害を誘発させ、次いで本発明の組成物により治療した。糞便中の増加したヘモグロビン含量によって示される血液の発生を測定して５ＡＳＡ対５ＡＳＡ：ＰＬ製剤の効果を判定した。ここで図５について言及すると、マウスの糞便中のヘモグロビン含量は、５ＡＳＡ：Ｐ３５製剤および５ＡＳＡ：Ｐ７５を含有する食物をあてがわれたマウスについては生理食塩水／ＤＳＳおよび５ＡＳＡ／ＤＳＳと比較して著しく減少した。
【００３１】
マウスのグループに、３％のＤＳＳを含有する生理食塩水を含む飲用水を４日間あてがい、大腸炎型の障害を誘発させ、次いで本発明の組成物により治療した。増加した組織ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）活性により示される結腸の炎症を、生理食塩水、５ＡＳＡおよび５ＡＳＡ：ＰＣ３５の効果を判定するために測定した。ここで図６について言及すると、５ＡＳＡ：Ｐ３５製剤を含有する食物をあてがわれたマウスについては結腸の炎症が減少した。
【００３２】
マウスのグループに、３％のＤＳＳを含有する生理食塩水を含む飲用水を４日間あてがい、大腸炎型の障害を誘発させ、次いで本発明の組成物により治療した。結腸粘膜を、光学顕微鏡により検分し、０が正常な結腸粘膜を表し、４が結腸の腺状構造の全損失を表す採点法を用いて組織学的に採点した。ここで図７について言及すると、５ＡＳＡ／Ｐ３５製剤は、５ＡＳＡ：Ｐ３５を含有する食物をあてがわれたマウスにおいて、結腸粘膜に対する顕微鏡下の損傷を著しく減少した。
【００３３】
げっ歯類のデータは、投与された製剤がリン脂質を含むとき遠位の腸における５ＡＳＡの効果の明白な増大をはっきりと示している。
【００３４】
誘発した大腸炎の治療について５ＡＳＡと５ＡＳＡ：ＰＬ製剤を比較するラットのデータ
ラットに４％のデキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）を含有する飲用水を５日と２０時間にわたってあてがって大腸炎を誘発させた後、それらを通常の飲用水に戻した。その動物に、次いでその後の６日間１日２回、（ａ）生理食塩水（ＤＳＳ対照）、（ｂ）１００ｍｇ／ｋｇの用量の５ＡＳＡ、（ｃ）１：１の重量比の５ＡＳＡとＰｈｏｓａｌ３５ＳＢ（油性製剤）、または（ｄ）１：２の重量比の５ＡＳＡとＰｈｏｓｐｈｏｌｉｐｏｎ９０Ｇ（水性脂質懸濁液）を５ＡＳＡの用量と同じ１日２回の１００ｍｇ／ｋｇで、胃内に投与した。製剤（ｃ）と（ｄ）は、ホスファチジルコリン（ＰＣ）が会合した５ＡＳＡ製剤であり、ＰＣと５ＡＳＡとが分子レベルで会合している。これらの処理は、５ＡＳＡと２つの異なるＰＣ：５ＡＳＡ製剤の効果を比較するために策定されている。
【００３５】
１日、３日および６日目に、生化学的および組織学的分析をして結腸の炎症および胃腸出血を査定するために、ラットを安楽死させ、結腸組織、血液および糞便を集めた。ラットの別のグループはＤＳＳを与えずに「正常対照」として扱った。
【００３６】
ここで図８について言及すると、６日の回復期間の間のヘマトクリットの変化は、安楽死させたラットから測定した。ヘマトクリットのレベルの変化は、６日の回復期間中のグループの間の貧血および内（胃腸）出血の間接的推定を表す。ＤＳＳにさらした後のすべてのグループでヘマトクリットのレベルの＜１０％の少量の減少がＤＳＳ無しまたは「正常対照」のヘマトクリットのレベルと比較して見られたが、試験グループの間でのこのパラメータの著しい違いは６日の回復期間中はなかったことが分かる。
【００３７】
糞便ヘモグロビンの変化が図９に示されている。糞便の血液は、試験グループの殆どにおいて回復期間の初日に検出されており（正常対照の値に対して）、５ＡＳＡ±９０Ｇが糞便出血を減少する薬効を有した可能性のあることを見ることができる。
【００３８】
結腸の炎症および損傷を多数の生化学的および組織学的指標を測定することによって評価した。最初に、組織浮腫を組織の湿重量／単位長さを測定することによって評価した。図１０に示されているこれらの結果は、腸管浮腫が生理食塩水処理した対照においてＤＳＳ後３日に最大であり、この炎症性変化は５ＡＳＡによって減少（顕著ではない）し、２つのＰＣ−［５ＡＳＡ］製剤により治療したラットにおいてさらに減少（顕著に）したことを明示している。ＤＳＳ後６日のこのパラメータのグループ間には、９０Ｇと組み合わせた５ＡＳＡにより処置した動物が炎症のリバウンド発症を有するいくつかの徴候があったものの顕著な差はなかった。
【００３９】
組織中への好中球浸潤の生化学的マーカーの結腸ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）活性を、炎症のもう１つのマーカーとして測定した。図１１に示した結果は、３日目に減少を示す５ＡＳＡによる上記のものと似てはいるが一層劇的に変化し、ＰＣ−［５ＡＳＡ］製剤は両方とも殆ど検知できないレベルまでＭＰＯ活性をさらに減少することを明示している。ＭＰＯ活性は、９０Ｇと組み合わせた５ＡＳＡにより処置したグループ以外のすべてのグループで６日までに正常対照のレベルに戻った。
【００４０】
組織の組織構造を、損傷および炎症のしるしに対して採点（目隠し状態で）した。炎症を評価するために、われわれは結腸粘膜下層の固有層中の炎症細胞の数を１（正常）から４（非常に炎症が起きている）までの採点法を用いて採点した。図１２に示されているこれらの結果は、５ＡＳＡで処置したラットが減少した数の炎症細胞を持ち、５ＡＳＡ／Ｐ３５が３日後および６日後に比較できるほどのまたはより優れた抗炎症活性を示し、この場合も同様に５ＡＳＡと組み合わせた９０Ｇは、６日後には炎症のリバウンドを起こすことを示している。
【００４１】
結腸粘膜損傷を評価するため、０＝正常な粘膜、１＝表面損傷、２＝中間の腺領域に伸びる損傷、３＝深い腺領域に伸びる損傷、４＝漿膜（筋肉）層に伸びる損傷、の組織学的採点法を用いた。図１３は、粘膜損傷が、すべてのグループにおいてＤＳＳ後１日目には増加し、３日目までに５ＡＳＡ±ＰＣにより処置したラットで回復し、５ＡＳＡ／Ｐ３５が、９０Ｇより一貫性のある粘膜保護の証拠を示したことを示している。
【００４２】
結論
上の一連の実験で使用したプロトコールは、実験的に（ＤＳＳ）誘発した大腸炎の回復を促進するための５ＡＳＡおよびＰＣ−５ＡＳＡ製剤の治療効果を評価する非常に有用なげっ歯類モデルシステムであることが分かる。興味深いことに、炎症は大腸炎誘発剤のＤＳＳの使用中止後最初の３日間は前進し、６日までに治まる。多数の生化学的および組織学的マーカーを用いると、１００ｍｇ／ｋｇの用量の５ＡＳＡは、生理食塩水で処置した対照の値と比較して、結腸の炎症およびＤＳＳ後３日の組織損傷を著しく減少させるようである。油性５ＡＳＡ／Ｐ３５ＳＢ製剤は、炎症の４つのマーカーのうちの２つにおいて大腸炎からの回復のさらなる改善を示した（５ＡＳＡ単独と対比）。対照的に、５ＡＳＡ／９０Ｇ製剤は、ＤＳＳ後６日目に起こる炎症のリバウンドを伴う二相性効果を有した。上記のモデルシステムを使用するこの回復実験が、当該ＰＣ−５ＡＳＡ試験製剤が、５ＡＳＡ単独と比較して、抗炎症効果のよりはっきりした説得力のある増強を実証することができるか否かを決定するために、５ＡＳＡのより低い効果の少ない用量（１日に２回５０ｍｇ／ｋｇ）を用いて繰り返すこと、およびわれわれの活動を油性の５ＡＳＡ／Ｐ３５製剤に集中することが推奨される。
【００４３】
誘発した大腸炎の治療についての５ＡＳＡと５ＡＳＡ：ＰＬ製剤とを比較するラットのデータ
以下の実験は、４％のデキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）をラットの飲用水に５日を超えて（５日と２０時間）加えることによって誘発させた大腸炎を受けさせ、次いで正常な飲用水に戻したラットを治療する中で、５ＡＳＡ対５ＡＳＡ：ＰＣ製剤の効果の比較をするために設計した。そのラットはそのとき、ＰＬ成分無しまたは有りの５ＡＳＡにより、この実験では前に検討したものより低い用量（５０ｍｇ／ｋｇ、１日２回）で、ＤＳＳ誘発大腸炎後３日間にわたる処置をした。
【００４４】
３２匹の健康な雄のラットをこの調査では使用した。プロトコール、仕入先、性徴、および体重に関して似ているラットを連続的に４つのグループに分けた。グループ１は、ＤＳＳが添加されていない飲用水を与えた。グループ２〜４は、４％ＤＳＳを含有する飲用水を６日間にわたって受けた。６日目に、グループ２は、１ｍＬの生理食塩水を１日２回胃内に受けた。グループ３は、５ＡＳＡ（５０ｍｇ／Ｋｇ）を１日２回胃内に受けた。グループ４は、これまで５ＡＳＡ：ＰＣと称していた５ＡＳＡ（５０ｍｇ／Ｋｇ）：Ｐｈｏｓａｌ３５ＳＢ：ＭＣＴ油（１：１：０．３）を１日２回胃内に受けた（ただし、ＭＣＴは、中鎖トリグリセリドである）。
【００４５】
９日目にラットを安楽死させ、以下を測定した：（ａ）ヘマトクリット、（ｂ）糞便のヘモグロビン、（ｃ）結腸の重量／長さ、（ｄ）結腸のミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）、（ｅ）結腸表面の疎水性および（ｆ）結腸組織像。
【００４６】
この調査においては、ラットは通常の飲用水（グループ１）または４％ＤＳＳを含有する水をあてがわれ、次いで、胃内に、生理食塩水（グループ２）、１日２回５０ｍｇ／ｋｇの用量での５ＡＳＡ（グループ３）、または５ＡＳＡ：ＰＣ（１：１重量比のＰ３５ＳＢ）（グループ４）を３日間胃内に投与され、その時点で次の変化が見られた。
【００４７】
ここで図１４について言及すると、結腸の重量／長さのデータが示されている。この粘膜の浮腫の測定は、ＤＳＳ生理食塩水で処置したグループ（グループ２）を絶対的対照（ＤＳＳ無し、グループ１）と比較すると顕著な増加を明示した。このＤＳＳで誘発した粘膜の浮腫は、１日２回５０ｍｇ／ｋｇの用量の５ＡＳＡ（グループ３）により部分的に逆転し、５ＡＳＡ：ＰＣのグループ（グループ４）においては完全に逆転し、グループ４のラット対グループ２および３のラットの間では著しい違いが見られたが、グループ１のラットに対しては見られなかった。
【００４８】
ここで図１５について言及すると、ＭＰＯタンパク質のデータが示されている。この炎症の生化学的測定は、上で概要を述べたものと同様のパターンを示し、ＤＳＳは、対照のグループ１（ＤＳＳ無し）に対してＭＰＯ活性の著しい増加を誘発し、この炎症は５ＡＳＡおよび５ＡＳＡ：ＰＣによってそれぞれ部分的および完全に逆転した。著しい違い（ｐ＜０．０５）がグループ４のラット対グループ２および３のラットの間で見られたが、グループ１のラットに対しては見られなかった。
【００４９】
ここで図１６について言及すると、結腸接触角の分析データが示されている。多分この表面の性質は、ＤＳＳ誘発大腸炎後の３日間によって完全に回復したために、グループ間での結腸粘膜表面の疎水性の違いは見られなかった。
【００５０】
ここで図１７について言及すると、ヘマトクリットのデータが示されている。胃腸出血によるこの貧血の量は、実験グループのＤＳＳによる処置対対照（ＤＳＳ無し）の間で著しく異なることはなかったが、著しく高かった５ＡＳＡ：ＰＣ（グループ４）を投与したものを除いて、ＤＳＳで処置したグループにおいて低い傾向があった。
【００５１】
ここで図１８について言及すると、糞便のヘモグロビンのデータが示されている。活性胃腸出血のこの直接的な量は、対照（ＤＳＳ無し）グループ（グループ１）と対比して生理食塩水で処置したＤＳＳのグループ（グループ２）においては増加することを明らかにした。このＤＳＳに誘発された胃腸糞便失血の増加は、５ＡＳＡの投与により部分的に逆転し、５ＡＳＡ：ＰＣの投与によって完全に逆転した。著しい違い（ｐ＜０．０５）がグループ４対グループ２および３の間で見られたが、グループ１に対しては見られなかった。
【００５２】
ＤＳＳは、ＤＳＳ後３日でまだ明らかであるラットにおける結腸の炎症および出血を生じる。５０ｍｇ／ｋｇの用量で１日２回胃内に投与した５ＡＳＡ単独は、ＤＳＳに誘発された大腸炎からの組織の回復を促進し、胃腸出血を減少させる。ＰＣ−５ＡＳＡは、活性５ＡＳＡを同じ用量で胃内に投与したとき、胃腸出血の形跡が殆どまたは全くないＤＳＳに誘発された大腸炎からの粘膜の完全な回復を引き起こした。
【００５３】
本明細書に引用されているすべての参考文献は、参照により援用される。本発明は、その好ましい実施形態に関して開示してきたが、この説明を読むことにより当業者であれば上記およびこの後請求される本発明の範囲および精神から逸脱しない変化および修正を引き起こすことができることを理解できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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