(57)【要約】      （修正有）【課題】グルタチオンの生産を向上させるように遺伝子が改変されている酵母を利用した、グルタチオンの製造法を提供する。【解決手段】グルタチオンペルオキシダーゼ、γ−グルタミルシステイン合成酵素および／またはグルタチオン合成酵素の発現が強化され、更にグルタチオンレダクターゼの発現が抑制された酵母を培養することを特徴とする、グルタチオンの製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルタチオンペルオキシダーゼの発現が強化された酵母を培養することを特徴とするグルタチオンの製造方法。
【請求項２】
グルタチオンペルオキシダーゼが、下記（ａ）〜（ｆ）：
（ａ）配列表の配列番号１〜３のいずれかに示すアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列表の配列番号１〜３のいずれかに示すアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｃ）配列表の配列番号１〜３のいずれかに示すアミノ酸配列と６０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｄ）配列表の配列番号４〜６のいずれかに示す塩基配列によりコードされるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｅ）配列表の配列番号４〜６のいずれかに示す塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなるタンパク質、および、
（ｆ）配列表の配列番号４〜６のいずれかに示す塩基配列において１もしくは複数個の塩基が置換、欠矢、挿入および／または付加されたＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなるタンパク質、
からなる群から選択される、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
酵母が、γ−グルタミルシステイン合成酵素および／またはグルタチオン合成酵素の発現が強化された酵母である、請求項１または２に記載の製造方法。
【請求項４】
γ−グルタミルシステイン合成酵素がＧＳＨ１でコードされる酵素である、請求項３に記載の製造方法。
【請求項５】
グルタチオン合成酵素がＧＳＨ２でコードされる酵素である、請求項３に記載の製造方法。
【請求項６】
酵母が、グルタチオンレダクターゼの発現が抑制された酵母である、請求項１〜５のいずれかに記載の製造方法。
【請求項７】
グルタチオンレダクターゼがＧＬＲ１でコードされる酵素である、請求項６に記載の製造方法。
【請求項８】
酵母が、サッカロマイセス属、キャンディダ属、またはピキア属の酵母である、請求項１〜７のいずれかに記載の製造方法。
【請求項９】
グルタチオンペルオキシダーゼ、並びに、γ−グルタミルシステイン合成酵素および／またはグルタチオン合成酵素の発現が強化された酵母。
【請求項１０】
グルタチオンレダクターゼの発現が抑制された請求項９に記載の酵母。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬品などの用途に用いられるグルタチオンの高生産株、及び該生産株を用いた生産方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
グルタチオンは、システイン、グルタミン酸、グリシンの３つのアミノ酸から成るペプチドで、人体だけでなく、他の動物や植物、微生物などの多くの生体内に存在し、活性酸素の消去作用、解毒作用、アミノ酸の代謝など、生体にとって重要な化合物である。そのため医薬品、食品、化粧品産業で注目されている。また、近年、酸化型グルタチオンに植物の生長を促進する効果があることなどの知見も得られるなど、農業を含めたさまざまな分野での用途が期待されている。
【０００３】
またグルタチオンは、現在工業的には、酵母を用いた発酵法により生産されている。グルタチオンは酵母の細胞内に蓄積されるため、実際には、酵母を培養し、その菌体中からグルタチオンを抽出する方法が広く用いられている。それ故に、これまで、グルタチオン生産に使用する酵母への突然変異処理（特許文献１〜３）やグルタチオンの合成に関与する酵素を遺伝子組換えにより導入すること（特許文献４〜８）、また、培地中にグルタチオンを構成する３種のアミノ酸であるＬ−グルタミン酸、Ｌ−システイン、グリシンを添加すること（特許文献９〜１２）により、培養菌体内のグルタチオン含量を向上させ生産性を改善させる試みがなされてきた。
【０００４】
しかしながら、更に工業的に安価なグルタチオンの製造には、より効率的にグルタチンを生産する酵母の取得が必要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開昭５９−１５１８９４号公報
【特許文献２】特開平０３−１８８７２号公報
【特許文献３】特開平１０−１９１９６３号公報
【特許文献４】特開昭６１−５２２９９号公報
【特許文献５】特開昭６２−２７５６８５号公報
【特許文献６】特開昭６３−１２９９８５号公報
【特許文献７】特開昭６４−５１０９８号公報
【特許文献８】特開平４−１７９４８４号公報
【特許文献９】特開昭４７−１６９９０号公報
【特許文献１０】特開昭４８−９２５７９号公報
【特許文献１１】特開昭５１−１３９６８６号公報
【特許文献１２】特開昭５３−９４０８９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、上記の技術背景の下に、グルタチオンの生産を向上させるように遺伝子が改変されている酵母、及び該酵母を利用したグルタチオンの製造法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上述の課題を解決すべく本発明者らが鋭意検討した結果、酵母においてグルタチオンペルオキシダーゼの発現を強化することにより、酸化型グルタチオンを含めたグルタチオンの菌体内の含量が増加することを見出した。また、グルタチオンペルオキシダーゼの発現が強化された株において、グルタチオンの生産に関与するγ−グルタミルシステイン合成酵素（ＧＳＨ１）および／またはグルタチオン合成酵素（ＧＳＨ２）の発現を強化させたところ、驚くべきことにグルタチオン生産に関して相乗的な増加が確認され、菌体内のグルタチオン含量（酸化型グルタチオン＋還元型グルタチオン）が大幅に増加することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
さらに、グルタチオンペルオキシダーゼの発現が強化された株において、グルタチオンレダクターゼの発現を抑制させることで、グルタチオンの生産を改善できることを確認した。
【０００９】
即ち、本発明は、グルタチオンペルオキシダーゼの発現が強化された酵母を培養することを特徴とするグルタチオンの製造方法に関する。
【００１０】
グルタチオンペルオキシダーゼが、下記（ａ）〜（ｆ）：
（ａ）配列表の配列番号１〜３のいずれかに示すアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列表の配列番号１〜３のいずれかに示すアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｃ）配列表の配列番号１〜３のいずれかに示すアミノ酸配列と６０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｄ）配列表の配列番号４〜６のいずれかに示す塩基配列によりコードされるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｅ）配列表の配列番号４〜６のいずれかに示す塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなるタンパク質、および、
（ｆ）配列表の配列番号４〜６のいずれかに示す塩基配列において１もしくは複数個の塩基が置換、欠矢、挿入および／または付加されたＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなるタンパク質、
からなる群から選択されることが好ましい。
【００１１】
酵母が、γ−グルタミルシステイン合成酵素および／またはグルタチオン合成酵素の発現が強化された酵母であることが好ましい。
【００１２】
γ−グルタミルシステイン合成酵素がＧＳＨ１でコードされる酵素であることが好ましい。
【００１３】
グルタチオン合成酵素がＧＳＨ２でコードされる酵素であることが好ましい。
【００１４】
酵母が、グルタチオンレダクターゼの発現が抑制された酵母であることが好ましい。
【００１５】
グルタチオンレダクターゼがＧＬＲ１でコードされる酵素であることが好ましい。
【００１６】
酵母が、サッカロマイセス属、キャンディダ属、またはピキア属の酵母であることが好ましい。
【００１７】
また、本発明は、グルタチオンペルオキシダーゼ、並びに、γ−グルタミルシステイン合成酵素および／またはグルタチオン合成酵素の発現が強化された酵母に関する。
【００１８】
グルタチオンレダクターゼの発現が抑制されていることが好ましい。
【発明の効果】
【００１９】
本発明の方法によれば、グルタチオン生産効率を改善することができ、さらに、生産される総グルタチオン中の、酸化型グルタチオンの割合を増大させることが可能となる。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、グルタチオン産生能を有する微生物の特定のタンパク質の発現が強化、または発現が抑制された変異微生物によるグルタチオンの製造方法である。本発明において、グルタチオン高生産のために発現を強化されるタンパク質は、グルタチオンペルオキシダーゼである。さらに、γ−グルタミルシステイン合成酵素（ＧＳＨ１）および／またはグルタチオン合成酵素（ＧＳＨ２）の発現が強化されることが好ましい。また、グルタチオン高生産のためにグルタチオンレダクターゼの発現が抑制されることが好ましい。
【００２１】
タンパク質をコードする遺伝子を過剰発現する方法は当業者に周知であり、例えば、当該タンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡをベクターＤＮＡにクローニングした発現ベクターなどを用いて強発現させる方法や、酵母ゲノムに当該遺伝子を組込んでコピー数を増加させること、当該遺伝子のものより強力なプロモーターの制御下に配置すること、当該遺伝子の発現を制御しているプロモーターに突然変異を導入すること等によって行うことができる。
【００２２】
また、エチルメタンスルフォン酸、ニトロソグアニジン、或いはＵＶ照射、放射線照射等、通常変異操作に使われる変異誘発処理によっても当該タンパク質をコードする遺伝子を過剰発現する酵母を得ることは可能である。
【００２３】
本明細書において、タンパク質の発現が抑制されるとは、当該タンパク質をコードする遺伝子をゲノムから欠損させること、当該タンパク質をコードする遺伝子の発現を阻害すること、当該タンパク質の活性を低下させることを含む意味である。
【００２４】
より詳細に、特定のタンパク質をコードする遺伝子を欠損させる方法としては、特に限定されないが、相同組換えにより目的の遺伝子を別の遺伝子に置換する方法（例えば特開２００２−２０９５７４号参照）、トランスポゾンを用いて目的の遺伝子を破壊する方法（例えば特開２００５−３２８７６９号参照）、栄養要求性を解除する選択マーカーを利用した目的遺伝子の破壊方法（例えば再表０１／０１４５２２号参照）などを挙げることができる。また、遺伝子を欠損させる場合には、当該遺伝子の全長を欠損させても良いし、部分的に欠損させてもよい。また、酵素活性ドメイン、制御ドメインへの点突然変異の導入により機能を欠損させてもよい。
【００２５】
また、特定のタンパク質をコードする遺伝子の発現を阻害する方法としては、特に限定されないが、当該遺伝子の発現を制御しているプロモーターを欠損させる方法、当該遺伝子の発現を制御しているプロモーターを発現誘導型プロモーターに置換する方法、当該遺伝子の発現を制御しているプロモーターに突然変異を導入する方法、ＲＮＡ干渉を利用して当該遺伝子の転写産物を分解する方法、及びアンチセンスＲＮＡを利用して当該遺伝子の翻訳を阻害する方法を挙げることができる。
【００２６】
さらに、特定のタンパク質の活性を低下させる方法としては、当該タンパク質をコードする遺伝子に変異を導入することにより機能を低下または欠損させることを挙げることができる。また、当該タンパク質に特異的に結合して活性を抑制する機能を有する物質を作用させる方法を挙げることができる。当該物質としては、当該タンパク質の機能を阻害できる抗体や阻害物質を挙げることができる。
【００２７】
タンパク質をコードする遺伝子へ変異を導入する方法は当業者に周知であり、遺伝子操作的手法や、エチルメタンスルフォン酸、ニトロソグアニジン、或いはＵＶ照射、放射線照射等、通常変異操作に使われる変異誘発処理によって行うことができる。
【００２８】
グルタチオンペルオキシダーゼ酵素は、生体内において脂質過酸化物の除去に関与する酵素のひとつである。生物の組織内には様々な原因により脂質過酸化物が生じる。この脂質過酸化物が分解されて生じる活性酵素の増加が、動脈硬化、糖尿病などのいわゆる生活習慣病や、白内障など老化に関わる疾患に関与している。生体内には活性酵素を分解、除去する酵素系が各種存在しているが、グルタチオンペルオキシダーゼ酵素はその中のひとつであり、式１の反応を触媒する酵素である。
【００２９】
【化１】
2014064472.tif 000002
【００３０】
グルタチオンペルオキシダーゼ酵素は活性酸素生成のもととなる脂質過酸化物を還元、除去する働きを有しており、該反応においては水素供与体として還元型グルタチオンを必要とする（渡部烈・平塚明：蛋白質核酸酵素（臨時増刊）−活性酸素・生物での生成、消去、作用の分子機構、３３、２９４９〜２９５６頁（１９８８）参照）。 
【００３１】
一方、グルタチオンレダクターゼとは、式２の、酸化型グルタチオンをＮＡＤＰＨを利用して還元する反応を触媒する酵素である。
【００３２】
【化２】
2014064472.tif 000003
【００３３】
（１）グルタチオンペルオキシダーゼ
本発明におけるグルタチオンペルオキシダーゼは還元型グルタチオンを利用して、例えば過酸化水素や脂質ヒドロペルオキシドを還元し、水やヒドロキシ型脂質を生成する活性を有していれば良く、特に限定されないが、例えば、以下の（ａ）〜（ｆ）：
（ａ）配列表の配列番号１〜３のいずれかに示すアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列表の配列番号１〜３のいずれかに示すアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｃ）配列表の配列番号１〜３のいずれかに示すアミノ酸配列と６０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｄ）配列表の配列番号４〜６のいずれかに示す塩基配列によりコードされるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｅ）配列表の配列番号４〜６のいずれかに示す塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなるタンパク質、および、
（ｆ）配列表の配列番号４〜６のいずれかに示す塩基配列において１もしくは複数個の塩基が置換、欠矢、挿入および／または付加されたＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなるタンパク質、
のいずれかであることが好ましい。
【００３４】
配列表の配列番号１〜３のいずれかに示すアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質は、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．，  １９８９）」等に記載の公知の方法に準じて調製することができ、グルタチオンペルオキシダーゼ活性を有する限り上記タンパク質に包含される。
【００３５】
置換、挿入、欠失および／または付加により改変されたアミノ酸配列としては、１種類のタイプ（例えば置換）の改変のみを含むものであっても良いし、２種以上の改変（例えば、置換と挿入）を含んでいても良い。また、置換の場合には、置換するアミノ酸は、置換前のアミノ酸と類似の性質を有するアミノ酸（同族アミノ酸）であることが好ましい。ここでは、以下に挙げる各群の同一群内のアミノ酸を同族アミノ酸とする。
（第１群：中性非極性アミノ酸）Ｇｌｙ，Ａｌａ，Ｖａｌ，Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，Ｍｅｔ，Ｃｙｓ，Ｐｒｏ，Ｐｈｅ
（第２群：中性極性アミノ酸）Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｇｌｎ，Ａｓｎ，Ｔｒｐ，Ｔｙｒ
（第３群：酸性アミノ酸）Ｇｌｕ，Ａｓｐ
（第４群：塩基性アミノ酸）Ｈｉｓ，Ｌｙｓ，Ａｒｇ。
【００３６】
上記の複数個のアミノ酸とは、例えば、６０個、好ましくは２０個、より好ましくは１５個、さらに好ましくは１０個、さらにより好ましくは５個、４個、３個、特に好ましくは２個以下のアミノ酸を意味する。
【００３７】
配列表の配列番号１〜３のいずれかに示したアミノ酸配列との配列同一性は、６０％以上が好ましいが、７０％以上がより好ましく、８０％以上がさらに好ましく、８５％以上がさらにより好ましく、９０％以上が特に好ましく、９５％以上が最も好ましい。
【００３８】
アミノ酸配列の配列同一性は、配列表の配列番号１〜３のいずれかに示したアミノ酸配列と評価したいアミノ酸配列とを比較し、両方の配列でアミノ酸が一致した位置の数を比較総アミノ酸数で除して、さらに１００を乗じた値で表される。
【００３９】
グルタチオンペルオキシダーゼ活性を有する限り、配列番号１〜３のいずれかに記載のアミノ酸配列に、付加的なアミノ酸配列を結合することができる。また、他のタンパク質との融合タンパク質とすることもできる。また、グルタチオンのペルオキシダーゼ活性を有する限り、ペプチド断片であってもよい。
【００４０】
配列表４〜６のいずれかに示す塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとは、配列表の配列番号４〜６のいずれかに示す塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡをプローブとして、ストリンジェントな条件下にコロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法、あるいはサザンハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡを意味する。
【００４１】
ハイブリダイゼーションは、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，  ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ  （Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８９）」等に記載されている方法に準じて行うことができる。ここで、ストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡとは、例えば、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより取得できるＤＮＡを挙げることができる。好ましくは６５℃で１倍濃度のＳＳＣ溶液で洗浄、より好ましくは６５℃で０．５倍濃度のＳＳＣ溶液で洗浄、さらに好ましくは６５℃で０．２倍濃度のＳＳＣ溶液で洗浄、最も好ましくは６５℃で０．１倍濃度のＳＳＣ溶液で洗浄することにより取得できるＤＮＡである。
【００４２】
以上のようにハイブリダイゼーション条件を記載したが、ハイブリダイゼーション条件はこれらの条件に特に制限されない。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度や塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで最適なストリンジェンシーを実現することが可能である。
【００４３】
上記の条件にてハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、配列番号４〜６のいずれかに示されるＤＮＡとの配列同一性が７０％以上、好ましくは７４％以上、より好ましくは７９％以上、さらに好ましくは８５％以上、さらにより好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上のＤＮＡを挙げることができる。
【００４４】
ＤＮＡの配列同一性（％）とは、対比される２つのＤＮＡを最適に整列させ、核酸塩基(例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、またはＩ)が両方の配列で一致した位置の数を比較塩基総数で除し、そして、この結果に１００を乗じた数値で表される。
【００４５】
ＤＮＡの配列同一性は、例えば、以下の配列分析用ツールを用いて算出し得る：ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ（Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｍａｎｕａｌ  ｆｏｒ  Ｔｈｅ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ，  Ｖｅｒｓｉｏｎ８，  １９９４年９月，  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，  ５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ  Ｍｅｄｉｓｏｎ，  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，  ＵＳＡ  ５３７１１；  Ｒｉｃｅ，  Ｐ．（１９９６）  Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｍａｎｕａｌ  ｆｏｒ  ＥＧＣＧ  Ｐａｃｋａｇｅ，  Ｐｅｔｅｒ  Ｒｉｃｅ，  Ｔｈｅ  Ｓａｎｇｅｒ  Ｃｅｎｔｒｅ，  Ｈｉｎｘｔｏｎ  Ｈａｌｌ，  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，  ＣＢ１０  １ＲＱ，  Ｅｎｇｌａｎｄ）、および、ｔｈｅ．ｅ．ｘＰＡＳｙ  Ｗｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  Ｗｅｂ分子生物学用サーバー（Ｇｅｎｅｖａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  ａｎｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｖａ，  Ｇｅｎｅｖａ，  Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）。 
【００４６】
ここで、配列表の配列番号４〜６のいずれかに示す塩基配列において１もしくは複数個の塩基が置換、欠矢、挿入および／または付加されたＤＮＡとは、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．，１９８９）」等に記載の公知の方法に準じて調製することができる。
【００４７】
置換、挿入、欠失および／または付加により改変された塩基配列としては、１種類のタイプ（例えば置換）の改変のみを含むものであっても良いし、２種類以上の改変（例えば、置換と挿入）を含んでいても良い。
【００４８】
上記の記載の複数個の塩基とは例えば１５０個、好ましくは１００個、より好ましくは５０個、さらに好ましくは２０個、さらにより好ましくは１０個、５個、４ 個、３個、または２個以下の塩基、を意味する。
【００４９】
本発明におけるグルタチオンペルオキシダーゼとしては、上記タンパク質のうち、配列番号１で示されるグルタチオンペルオキシダーゼ１（ＧＰＸ１）、配列番号２で示されるグルタチオンペルオキシダーゼ２（ＧＰＸ２）、又は配列番号３で示されるグルタチオンペルオキシダーゼ３（ＧＰＸ３）が好ましい。これらの酵素は非特許文献（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｖｏｌ. ２７４, ｐｐ. ２７００２−２７００９）に記載されている。
【００５０】
（２）γ−グルタミルシステイン合成酵素
本発明におけるγ−グルタミルシステイン合成酵素としては、
［ａ］配列表の配列番号７に示すアミノ酸配列を有するタンパク質、
［ｂ］配列表の配列番号７に示すアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつγ−グルタミルシステインシンターゼ活性を有するタンパク質、および
［ｃ］配列表の配列番号７に示すアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有し、かつγ−グルタミルシステインシンターゼ活性を有するタンパク質、を挙げることができる。
【００５１】
上記において、１以上のアミノ酸残基が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつγ−グルタミルシステインシンターゼ活性を有するタンパク質は、上記（１）と同様の方法によって得られ、同様の数のアミノ酸残基が欠失、置換または付加したアミノ酸配列を有するタンパク質を挙げることができる。欠失、置換または付加が許容されるアミノ酸残基の位置、種類などは、上記（１）と同様である。
【００５２】
また、γ−グルタミルシステイン合成酵素としては、配列番号７で表されるアミノ酸配列との配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上であるアミノ酸配列からなるタンパク質であり、かつγ−グルタミルシステインシンターゼ活性を有するタンパク質を挙げることができる。アミノ酸配列や塩基配列の配列同一性は、上記（１）と同義である。
【００５３】
配列番号７で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなるタンパク質が、γ−グルタミルシステインシンターゼ活性を有するタンパク質であることを確認する手段としては、例えばＤＮＡ組換え法を用いて活性を確認したいタンパク質を発現する形質転換体を作製し、該形質転換体を用いて該タンパク質を製造した後、該タンパク質、ならびにＬ−グルタミン酸およびＬ−システインを水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にγ−グルタミルシステインが生成、蓄積するか否かをＨＰＬＣ等により分析する方法を挙げることができる。
【００５４】
本発明におけるγ−グルタミルシステイン合成酵素としては、上記タンパク質のうち、配列番号７で示されるＧＳＨ１が好ましい。
【００５５】
（３）グルタチオン合成酵素
本発明におけるグルタチオン合成酵素としては、
［ａ］配列表の配列番号８に示すアミノ酸配列を有するタンパク質、
［ｂ］配列表の配列番号８に示すアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつグルタチオンシンターゼ活性を有するタンパク質、および
［ｃ］配列表の配列番号８に示すアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有し、かつグルタチオンシンターゼ活性を有するタンパク質、を挙げることができる。
【００５６】
上記において、１以上のアミノ酸残基が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつグルタチオンシンターゼ活性を有するタンパク質は、上記（１）と同様の方法によって得られ、同様の数のアミノ酸残基が欠失、置換または付加したアミノ酸配列を有するタンパク質を挙げることができる。欠失、置換または付加が許容されるアミノ酸残基の位置、種類などは、上記（１）と同様である。
【００５７】
また、グルタチオン合成酵素としては、配列番号８で表されるアミノ酸配列との配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上であるアミノ酸配列からなるタンパク質であり、かつグルタチオンシンターゼ活性を有するタンパク質を挙げることができる。アミノ酸配列や塩基配列の配列同一性は、上記（１）と同義である。
【００５８】
配列番号８で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなるタンパク質が、グルタチオンシンターゼ活性を有するタンパク質であることを確認する手段としては、例えばＤＮＡ組換え法を用いて活性を確認したいタンパク質を発現する形質転換体を作製し、該形質転換体を用いて該タンパク質を製造した後、該タンパク質、ならびにγ−グルタミルシステインおよびグリシンを水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にグルタチオンが生成、蓄積するか否かをＨＰＬＣ等により分析する方法を挙げることができる。
【００５９】
本発明におけるグルタチオン合成酵素としては、配列番号８で示されるＧＳＨ２が好ましい。
【００６０】
（４）グルタチオンレダクターゼ
本発明におけるグルタチオンレダクターゼとしては、
［ａ］配列表の配列番号９に示すアミノ酸配列を有するタンパク質、
［ｂ］配列表の配列番号９に示すアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、グルタチオンレダクターゼ活性を有するタンパク質、および
［ｃ］配列表の配列番号９に示すアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有し、かつグルタチオンレダクターゼ活性を有するタンパク質、を挙げることができる。
【００６１】
上記において、１以上のアミノ酸残基が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつグルタチオンレダクターゼ活性を有するタンパク質は、上記（１）と同様の方法によって得られ、同様の数のアミノ酸残基が欠失、置換または付加したアミノ酸配列を有するタンパク質を挙げることができる。欠失、置換または付加が許容されるアミノ酸残基の位置、種類などは、上記（１）と同様である。
【００６２】
また、グルタチオンレダクターゼに関わるタンパク質としては、配列番号９で表されるアミノ酸配列との配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上であるアミノ酸配列からなるタンパク質であり、かつグルタチオンレダクターゼ活性を有するタンパク質を挙げることができる。アミノ酸配列や塩基配列の配列同一性は、上記（１）と同義である。
【００６３】
配列番号９で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなるタンパク質が、グルタチオンレダクターゼ活性を有するタンパク質であることを確認する手段としては、例えばＤＮＡ組換え法を用いて活性を確認したいタンパク質を発現する形質転換体を作製し、該形質転換体を用いて該タンパク質を製造した後、該タンパク質、ならびに酸化型グルタチオン、ＮＡＤＰＨを水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中に還元型グルタチオンまたはＮＡＤＰが生成、蓄積するか否かをＨＰＬＣ等により分析する方法を挙げることができる。
【００６４】
本発明におけるグルタチオンレダクターゼとしては、上記タンパク質のうち、配列番号９で示されるＧＬＲ１が好ましい。
【００６５】
（５）グルタチオン生産酵母
本発明の酵母は、グルタチオン生産能を有する酵母であれば、特に制限はなく、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロマイセス・カールスベルゲンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃａｒｌｅｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）、サッカロマイセス・フラギリス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ）、サッカロマイセス・ルーキシー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｕｘｉｉ）などのサッカロマイセス属、キャンディダ・ユーティリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｕｔｉｌｉｓ）、キャンディダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）などのキャンディダ属、シゾサッカロマオセス・ポンべ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）などのシゾサッカロミセス属、トルロプシス・バーサティリス（Ｔｏｌｕｒｏｐｓｉｓ  ｖｅｒｓａｔｉｌｉｓ）、トルロプシス・ペトロフィラム（Ｔｏｌｕｒｏｐｓｉｓ  ｐｅｔｒｏｐｈｉｌｕｍ）などのトルロプシス属、その他（Ｐｉｃｈｉａ）属、ブレタノマイセス（Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ）属、マイコトルラ（Ｍｙｃｏｔｏｒｕｌａ）属、ロードトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属、ハンゼニュラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属、エンドマイセス（Ｅｎｄｏｍｙｃｅｓ）属などの酵母が挙げられる。
【００６６】
中でも、サッカロマイセス属、キャンディダ属、またはピキア属の酵母が好ましく、サッカロマイセス属のサッカロマイセス・セレビシエ、キャンディダ属のキャンディダ・ユーティリスがより好ましい。
【００６７】
（６）グルタチオンの製造方法
本発明のグルタチオンの製造方法において、酵母の培養は通常の微生物の培養と同様に行えばよい。すなわち炭素源、窒素源、無機物その他の栄養等を含有しておれば、合成培地、半合成培地、天然（複合）培地のいずれも使用可能である。
【００６８】
炭素源としてはグルコース、グリセロール、フラクトース、シュクロース、マルトース、マンノース、マニトール、キシロース、ガラクトース、デンプン、デンプン加水分解物液、糖蜜などの種々の炭水化物原料が使用できる。またピルビン酸、酢酸、乳酸などの各種有機酸、アスパラギン酸、アラニンなどの各種アミノ酸類も使用可能である。
【００６９】
窒素源としてはアンモニアあるいは塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、酢酸アンモニウムなどの各種の無機および有機アンモニウム塩類、あるいは尿素その他の窒素含有化合物ならびにペプトン、ＮＺアミン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカー、カゼイン加水分解物、フィシュミールあるいはその消化物、脱脂大豆あるいはその消化物や加水分解物などの窒素性有機物質あるいはアスパラギン酸、グルタミン酸、スレオニンなどの各種アミノ酸が使用可能である。
【００７０】
更に無機物としてはリン酸第一水素カリウム、リン酸第二水素カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、炭酸カルシウムなどが使用できる。
【００７１】
培養は振とう培養、通気攪拌深部培養などの好気的培養条件下で実施する。培養時ｐＨは、好ましくは３．０〜８．０、より好ましくは４．０〜６．０、最も好ましくは５．０に制御される。ｐＨ制御の中和剤としてはアンモニア水、水酸化ナトリウム、炭酸アンモニウムなどが使用可能である。好気的培養時の培地への空気供給量は、培地１Ｌに対し、好ましくは０．２Ｌ／分以上、より好ましくは０．５Ｌ／分以上、さらに好ましくは１Ｌ／分以上である。また、総容量２Ｌのジャーファーメンターを使用して培養する場合、好気的培養条件としては上記通気量に加え、攪拌数は好ましくは２００ｒｐｍ以上、より好ましくは３００ｒｐｍ以上、さらに好ましくは４００ｒｐｍ以上である。また、培養時の温度は、２０〜４５℃、好ましくは２５〜３５℃、最も好ましくは２８〜３２℃である。培地中への初期細胞濃度（仕込み濃度）は酵母の種類、培地組成などにより異なるが、初発濁度（ＯＤ６００）は好ましくは０．０１〜２．０、より好ましくは０．０２〜１．０、さらに好ましくは０．１〜０．４である。
【００７２】
培養方法として、グルコースなどの上記炭素源に関しては培養初期に一括に仕込んで培養する回分方式、培養期間を通じて少しずつ添加する半回分方式のいずれの方式も適用可能であるが、本発明者らの検討結果によれば、使用する微生物にもよるが、半回分方式の方が増殖速度が向上し、最終菌濃度もより高位となり、菌体内のグルタチオン合成関連酵素の活性も高まるので好ましい。半回分方式でグルコースなどの炭素源の流加速度を決定する指標としては、培養液の濁度、酸素消費速度、二酸化炭素発生速度、ｐＨ調整用中和剤の消費量などが有効利用でき、使用する酵母に合わせて適切な指標を選び、その変化に対応させて炭素源の流加速度を変化させることにより、酵母培養の最適化が図れ、最終菌濃度およびグルタチオン合成関連酵素の活性向上、その結果グルタチオンの生産性向上が実現できる。
【００７３】
本発明の製造方法により、高濃度のグルタチオンを菌体内に含有する培養液が得られる。その培養液から濾過や遠心分離操作により菌体を分離することができ、菌体から、熱水抽出、アルカリ抽出法、酵素分解法、自己消化法、物理的な破砕操作などによりグルタチオンを抽出することができる。さらにグルタチオンを精製することによりグルタチオンを高度に含有する分画や、グルタチオン粉末を得ることができる。また、培養液に直接、上記の抽出操作や破砕操作を行うことにより、菌体中のグルタチオンを培地中に抽出し、さらに精製することによりグルタチオンを高度に含有する分画や、グルタチオン粉末を得ることができる。
【実施例】
【００７４】
［製造例１］ＧＰＸ１の発現を強化した株（ＧＰＸ１強化株）の作製
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＹＰＨ４９９株のゲノムＤＮＡをテンプレートとし、プライマーとして、５’−ＧＧＣＣＧＴＣＧＡＣＡＴＧＡＣＣＡＣＡＴＣＴＴＴＴＴＡＴＧＡＴＴＴＡＧＡＡＴＣ−３’（配列番号１０）および５’−ＧＧＣＣＧＧＡＴＣＣＴＣＡＴＴＴＡＣＴＴＡＡＣＡＧＧＣＴＴＴＧＧＡＴＴＴＣＴＴＧＧ−３’(配列番号１１)を用いてＰＣＲ増幅を行い、増幅物をＳａｌＩおよびＢａｍＨＩで消化して、グルタチオンペルオキシダーゼ１（ＧＰＸ１）遺伝子ＳａｌＩ−ＢａｍＨＩ断片を得た。この断片を非特許文献（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（２００９）１４５：７０１−７０８）に記載のｐＧＫ４０５のＳａｌＩ−ＢａｍＨＩ消化部位に連結し、ＧＰＸ１発現プラスミドｐＧＫ４０５−ＧＰＸ１を得た。得られたプラスミドｐＧＫ４０５−ＧＰＸ１を制限酵素ＥｃｏＲＶで消化した。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＹＰＨ４９９株を宿主酵母株とし、形質転換を行い、形質転換体ＹＰＨ４９９／ＧＰＸ１株を得た。
【００７５】
［製造例２］ＧＰＸ３の発現を強化した株（ＧＰＸ３強化株）の作製
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＹＰＨ４９９株のゲノムＤＮＡをテンプレートとし、プライマーとして、５’−ＧＧＣＣＧＴＣＧＡＣＡＴＧＴＣＡＧＡＡＴＴＣＴＡＴＡＡＧＣＴＡＧＣ−３’（配列番号１２）および５’−ＧＧＣＣＧＧＡＴＣＣＣＴＡＴＴＣＣＡＣＣＴＣＴＴＴＣＡＡＡＡＧＴＴＣ−３’（配列番号１３)を用いてＰＣＲ増幅を行い、増幅物をＳａｌＩおよびＢａｍＨＩで消化して、グルタチオンペルオキシダーゼ３（ＧＰＸ３）遺伝子ＳａｌＩ−ＢａｍＨI断片を得た。この断片を非特許文献（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（２００９）１４５：７０１−７０８）に記載のｐＧＫ４０５のＳａｌＩ−ＢａｍＨＩ消化部位に連結し、ＧＰＸ３発現プラスミドｐＧＫ４０５−ＧＰＸ３を得た。得られたプラスミドｐＧＫ４０５−ＧＰＸ３を制限酵素ＥｃｏＲＶで消化した。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＹＰＨ４９９株を宿主酵母株とし、形質転換を行い、形質転換体ＹＰＨ４９９／ＧＰＸ３株を得た。
【００７６】
［製造例３］ＧＳＨ１およびＧＳＨ２の発現を強化した株（ＧＳＨ１強化＋ＧＳＨ２強化株）の作製
非特許文献（Ｈａｒａ  ＫＹ，  Ｋｉｒｉｙａｍａ  Ｋ，  Ｉｎａｇａｋｉ  Ａ，  Ｎａｋａｙａｍａ  Ｈ，  Ｋｏｎｄｏ  Ａ．  （２０１２）  Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓｕｌｆａｔｅ  ａｓｓｉｍｉｌａｔｉｏｎ  ｐａｔｈｗａｙ  ｏｆ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ．  Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，９４（５）：１３１３−９）に記載の方法で、ＧＳＨ１およびＧＳＨ２を強化したＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＹＰＨ４９９／ＧＳＨ１、ＧＳＨ２株を得た。
【００７７】
［製造例４］ＧＳＨ１およびＧＳＨ２の発現を強化し、さらにＧＰＸ１の発現を強化した株（ＧＳＨ１強化＋ＧＳＨ２強化＋ＧＰＸ１強化株）の作製
製造例１に記載のプラスミドｐＧＫ４０５−ＧＰＸ１を制限酵素ＥｃｏＲＶで消化した。当該消化物により、製造例３に記載のＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＹＰＨ４９９／ＧＳＨ１、ＧＳＨ２株を宿主酵母株として形質転換を行い、形質転換体ＹＰＨ４９９／ＧＳＨ１、ＧＳＨ２、ＧＰＸ１株を得た。
【００７８】
［製造例５］ＧＳＨ１およびＧＳＨ２の発現を強化し、さらにＧＰＸ３の発現を強化した株（ＧＳＨ１強化＋ＧＳＨ２強化＋ＧＰＸ３強化株）の作製
製造例２に記載のプラスミドｐＧＫ４０５−ＧＰＸ３を制限酵素ＥｃｏＲＶで消化した。当該消化物により、製造例３に記載のＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＹＰＨ４９９／ＧＳＨ１、ＧＳＨ２株を宿主酵母株として形質転換を行い、形質転換体ＹＰＨ４９９／ＧＳＨ１、ＧＳＨ２、ＧＰＸ３株を得た。
【００７９】
［製造例６］ＧＬＲ１遺伝子破壊株の作製
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＹＰＨ４９９株のゲノム配列のうち、ＧＬＲ１をコードしている遺伝子配列の上流領域５０塩基と相同な配列およびＨＩＳ３遺伝子の開始コドンから２５塩基と相同な配列を結合させたＤＮＡ（ＤＮＡ−ＦＨ）５’−ＴＴＴＣＣＴＴＣＡＴＡＴＧＴＡＴＡＴＡＴＡＴＣＴＡＴＴＴＡＣＡＴＡＴＴＡＧＴＴＴＡＣＡＧＡＡＣＴＴＴＡＡＴＴＣＣＣＧＴＴＴＴＡＡＧＡＧＣＴＴＧＧＴＧＡ−３’（配列番号１４）を合成した。一方で、ＧＬＲ１遺伝子配列の下流領域５０塩基と相同な配列およびＨＩＳ３遺伝子の終始コドンから２５塩基と相同な配列を結合させたＤＮＡ（ＤＮＡ−ＲＨ）５’−ＴＡＣＡＡＡＡＧＴＣＣＡＧＴＡＴＡＧＣＡＡＣＡＧＣＡＧＡＴＴＧＧＡＣＧＴＣＴＡＧＴＴＴＣＧＴＴＧＣＴＧＡＴＣＣＧＴＣＧＡＧＴＴＣＡＡＧＡＧＡＡＡＡＡＡ−３’（配列番号１５）を合成した。次に、ＨＩＳ３遺伝子を含むプラスミドをテンプレートとし、ＤＮＡ−ＦＨおよびＤＮＡ−ＲＨをプライマーとして、ＰＣＲ増幅を行い、増幅されたＤＮＡを酢酸リチウム法にてＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＹＰＨ４９９株に導入した。ＧＬＲ１遺伝子とＨＩＳ３遺伝子が組み換わった目的の遺伝子組み換え株は、ヒスチジンを含まない選択培地プレートにて、コロニーを形成させることで選抜することができる。この結果、組換え酵母ＹＰＨ４９９／ΔＧＬＲ１株を得た。
【００８０】
［製造例７］ＧＳＨ１、ＧＳＨ２およびＧＰＸ１の発現を強化し、ＧＬＲ１遺伝子を破壊した株（ＧＳＨ１強化＋ＧＳＨ２強化＋ＧＰＸ１強化＋ＧＬＲ１破壊株）の作製
製造例１に記載のプラスミドｐＧＫ４０５−ＧＰＸ１を制限酵素ＥｃｏＲＶで消化した。当該消化産物により、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＹＰＨ４９９／ΔＧＬＲ１、ＧＳＨ１、ＧＳＨ２株を宿主酵母株として形質転換を行い、形質転換体ＹＰＨ４９９／ΔＧＬＲ１、ＧＳＨ１、ＧＳＨ２、ＧＰＸ１株を得た。
【００８１】
［製造例８］ＧＳＨ１、ＧＳＨ２およびＧＰＸ３の発現を強化し、ＧＬＲ１遺伝子を破壊した株（ＧＳＨ１強化＋ＧＳＨ２強化＋ＧＰＸ３強化＋ＧＬＲ１破壊株）の作製
製造例２に記載のプラスミドｐＧＫ４０５−ＧＰＸ３を制限酵素ＥｃｏＲＶで消化した。当該消化産物により、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＹＰＨ４９９／ΔＧＬＲ１、ＧＳＨ１、ＧＳＨ２株を宿主酵母株として形質転換を行い、形質転換体ＹＰＨ４９９／ΔＧＬＲ１、ＧＳＨ１、ＧＳＨ２、ＧＰＸ３株を得た。
【００８２】
［実施例１］ＧＰＸ１の発現を強化した株およびＧＰＸ３の発現を強化した株によるグルタチオンの生産
製造例１と製造例２で取得した、ＧＰＸ１、またはＧＰＸ３遺伝子の発現を強化した組換え酵母ＹＰＨ４９９／ＧＰＸ１、またはＹＰＨ４９９／ＧＰＸ３をＳＤ培地（６．７ｇ／Ｌ  Ｙｅａｓｔ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ  ｗ／ｏ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）、２０ｇ／Ｌ  グルコース）５ｍｌで３０℃、１６〜２４時間振盪することにより種母培養を行った。
【００８３】
次にＹＰＤ培地（１０ｇ／Ｌ酵母エキストラクト（Ｄｉｆｃｏ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）、２０ｇ／Ｌポリペプトン（和光純薬工業（株）製）、２０ｇ／Ｌグルコース（ナカライテスク（株）製））２０ｍｌを含むバッフル付き三角フラスコにＯＤ６００＝０．０３となるよう植菌し、３０℃、攪拌１５０ｒｐｍの条件で２４時間培養を行い、培養液を１ｍｌ回収した。
【００８４】
遠心分離して集めた菌体を滅菌水にて２度洗い、９５℃で３分間熱処理することで、菌体内のグルタチオンを溶出した。２５℃、２００００×ｇにて５分間遠心し、上清のグルタチオン濃度をＨＰＬＣ法にて分析し、培地あたりのグルタチオン濃度を決定した。菌体濃度は６００ｎｍの吸光度を測定することにより求めた。乾燥菌体重量は、培養液を８０℃で１２時間以上静置した後に重量を測定し、予め秤量した容器の重量を差し引くことで求めた。グルタチオン濃度を菌体濃度で除することでグルタチオンの、乾燥菌体当たりにおける重量（グルタチオン含量）を算出した。
【００８５】
［比較例１］親株（ＹＰＨ４９９株）によるグルタチオンの生産
酵母として、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＹＰＨ４９９／ＨＩＳ３株を使用した以外は実施例１と同様の方法で培養を行い、グルタチオンの乾燥菌体当たりにおける重量を算出した。結果を表１に示す。
【００８６】
【表１】
2014064472.tif 000004
【００８７】
表１からわかるように、ＧＰＸ１またはＧＰＸ３遺伝子の発現を強化することにより、酸化型グルタチオン含量が増加し、総グルタチオン（還元型グルタチオン＋酸化型グルタチオン）含量も向上した。
【００８８】
［実施例２］ＧＳＨ１およびＧＳＨ２の発現を強化し、さらにＧＰＸ１の発現を強化した株によるグルタチオンの生産
製造例４で取得した、ＧＳＨ１遺伝子およびＧＳＨ２遺伝子の発現を強化し、更にグルタチオンペルオキシダーゼ活性を強化させたＹＰＨ４９９／ＧＳＨ１、ＧＳＨ２、ＧＰＸ１株を０．５μｇ／Ｌ  ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｎ  Ａを含むＳＤ培地（６．７ｇ／Ｌ  Ｙｅａｓｔ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ  ｗ／ｏ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）、２０ｇ／Ｌ  グルコース）５ｍｌで３０℃、１６〜２４時間振盪することにより種母培養を行った。
【００８９】
次にＹＰＤ培地（１０ｇ／Ｌ酵母エキストラクト（Ｄｉｆｃｏ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）、２０ｇ／Ｌポリペプトン（和光純薬工業（株）製）、２０ｇ／Ｌグルコース（ナカライテスク（株）製））２０ｍｌを含むバッフル付き三角フラスコにＯＤ６００＝０．０３となるよう植菌し、３０℃、攪拌１５０ｒｐｍの条件で２４時間培養を行い、菌体内のグルタチオン含量を実施例１に記載の方法で測定した。結果を表２に示す。
【００９０】
［比較例２］ＧＳＨ１およびＧＳＨ２の発現を強化した株によるグルタチオンの生産
酵母として、製造例３で取得した、ＧＳＨ１遺伝子およびＧＳＨ２遺伝子の発現を強化し、グルタチオンの合成活性を向上させた組換え酵母ＹＰＨ４９９／ＧＳＨ１、ＧＳＨ２株を使用した以外は、実施例２と同様の方法で培養を行い、菌体内のグルタチオン含量を測定した。結果を、比較例１の結果と合わせて、表２に示す。
【００９１】
【表２】
2014064472.tif 000005
【００９２】
表２からわかるように、ＧＳＨ１遺伝子およびＧＳＨ２遺伝子の発現を強化し、グルタチオンの合成活性を向上させることでも、菌体当たりのグルタチオン含量は向上するが、さらにＧＰＸ１遺伝子の発現を強化することでグルタチオン含量が飛躍的に向上した。
【００９３】
［実施例３］ＧＳＨ１およびＧＳＨ２の発現を強化し、さらにＧＰＸ３の発現を強化した株によるグルタチオンの生産
【００９４】
製造例５で取得したＧＳＨ１遺伝子およびＧＳＨ２遺伝子の発現を強化し、更にグルタチオンペルオキシダーゼ活性を強化させたＹＰＨ４９９／ＧＳＨ１、ＧＳＨ２、ＧＰＸ３株を０．５μｇ／Ｌ  ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｎ  Ａを含むＳＤ培地（６．７ｇ／Ｌ  Ｙｅａｓｔ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ  ｗ／ｏ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）、２０ｇ／Ｌ  グルコース）５ｍｌで３０℃、１６〜２４時間振盪することにより種母培養を行った。
【００９５】
次にＹＰＤ培地（１０ｇ／Ｌ酵母エキストラクト（Ｄｉｆｃｏ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）、２０ｇ／Ｌポリペプトン（和光純薬工業（株）製）、２０ｇ／Ｌグルコース（ナカライテスク（株）製））２０ｍｌを含むバッフル付き三角フラスコにＯＤ６００＝０．０３となるよう植菌し、３０℃、攪拌１５０ｒｐｍの条件で２４時間培養を行い、菌体内のグルタチオン含量を実施例１に記載の方法で測定した。結果を、比較例１及び２の結果と合わせて、表３に示す。
【００９６】
【表３】
2014064472.tif 000006
【００９７】
表３からわかるように、ＧＳＨ１遺伝子およびＧＳＨ２遺伝子の発現を強化し、グルタチオンの合成活性を向上させることでも、培地中の総グルタチオン含量は向上するが、さらにＧＰＸ３遺伝子の発現を強化することでグルタチオン含量が飛躍的に向上した。
【００９８】
［実施例４］ＧＳＨ１、ＧＳＨ２およびＧＰＸ１の発現を強化し、ＧＬＲ１遺伝子を破壊した株によるグルタチオンの生産
製造例７で取得した、ＧＬＲ１遺伝子を破壊し、ＧＳＨ１遺伝子、ＧＳＨ２遺伝子、ＧＰＸ１遺伝子の発現を強化したＹＰＨ４９９／ΔＧＬＲ１、ＧＳＨ１、ＧＳＨ２、ＧＰＸ１株を０．５μｇ/Ｌ  ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｎ  Ａを含むＳＤ培地（６．７ｇ／Ｌ  Ｙｅａｓｔ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ  ｗ／ｏ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）、２０ｇ／Ｌ  グルコース）５ｍｌで３０℃、１６〜２４時間振盪することにより種母培養を行った。
【００９９】
次にＹＰＤ培地（１０ｇ／Ｌ酵母エキストラクト（Ｄｉｆｃｏ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）、２０ｇ／Ｌポリペプトン（和光純薬工業（株）製）、２０ｇ／Ｌグルコース（ナカライテスク（株）製））２０ｍｌを含むバッフル付き三角フラスコにＯＤ６００＝０．０３となるよう植菌し、３０℃、攪拌１５０ｒｐｍの条件で２４時間培養を行い、菌体内のグルタチオン含量を実施例１に記載の方法で測定した。結果を、実施例２の結果と合わせて、表４に示す。
【０１００】
【表４】
2014064472.tif 000007
【０１０１】
表４からわかるように、ＧＬＲ１遺伝子を破壊することで、グルタチオン含量はさらに向上した。
【０１０２】
［実施例５］ＧＳＨ１、ＧＳＨ２およびＧＰＸ３の発現を強化し、ＧＬＲ１遺伝子を破壊した株によるグルタチオンの生産
製造例８で取得したＧＬＲ１遺伝子を破壊し、ＧＳＨ１遺伝子、ＧＳＨ２遺伝子、ＧＰＸ３遺伝子の発現を強化したＹＰＨ４９９／ΔＧＬＲ１、ＧＳＨ１、ＧＳＨ２、ＧＰＸ３株を０．５μｇ/Ｌ  ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｎ  Ａを含むＳＤ培地（６．７ｇ／Ｌ  Ｙｅａｓｔ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ  ｗ／ｏ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）、２０ｇ／Ｌ  グルコース）５ｍｌで３０℃、１６〜２４時間振盪することにより種母培養を行った。
【０１０３】
次にＹＰＤ培地（１０ｇ／Ｌ酵母エキストラクト（Ｄｉｆｃｏ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）、２０ｇ／Ｌポリペプトン（和光純薬工業（株）製）、２０ｇ／Ｌグルコース（ナカライテスク（株）製））２０ｍｌを含むバッフル付き三角フラスコにＯＤ６００＝０．０３となるよう植菌し、３０℃、攪拌１５０ｒｐｍの条件で２４時間培養を行い、菌体内のグルタチオン含量を実施例１に記載の方法で測定した。結果を、実施例３の結果と合わせて、表５に示す。
【０１０４】
【表５】
2014064472.tif 000008
【０１０５】
表５からわかるように、ＧＬＲ１遺伝子を破壊することで、グルタチオン含量はさらに向上した。
【配列表】
2014064472000001.app