(57)【要約】【課題】ローダミン標識されたオリゴヌクレオチドを合成するために有用な試薬の提供。【解決手段】本開示は、合成オリゴヌクレオチドを、ローダミン染料、または、ローダミン染料を含む染料ネットワークによって標識するために用いることが可能な試薬を提供する。本開示は、適切な波長の入射光によって照射されると蛍光を発するローダミン染料を含む標識によって、合成オリゴヌクレオチドを標識するのに有用な試薬を提供する。この標識は、単一のローダミン染料を含むことが可能であるが、あるいは、複数の染料の少なくとも一つがローダミン染料である、染料ネットワークを含むことが可能である。これらの試薬は、オリゴヌクレオチドの段階的合成の際、合成オリゴヌクレオチドを直接ローダミン含有標識によって標識するのに使用することが可能であり、このため、ローダミン染料によって標識されるオリゴヌクレオチドを得るために必要な操作工程が低減される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願明細書に記載された発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
１．関連出願への相互参照
この出願は、米国特許法§１１９（ｅ）の下、２００６年３月３１日に出願された仮出願第６０／７８７，７７７号（この開示は、その全体が参考として本明細書に援用される）に対する利益を主張する。
【背景技術】
【０００２】
２．背景
蛍光染料の、検出標識としての使用は、分子生物学、細胞生物学、および分子遺伝学において広く行われている。例えば、蛍光標識オリゴヌクレオチドの使用は、現在、種々の異なるアッセイにおいて広く使用されている。そのようなアッセイとして、例えば、ポリヌクレオチド配列決定、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、核酸アレイにおけるハイブリダイゼーションアッセイ、蛍光偏光実験、および核酸増幅アッセイ、例えば、蛍光プローブおよび／またはプライマーによって行われるポリメラーゼ連鎖増幅アッセイなどのアッセイが挙げられる。
【０００３】
いくつかの蛍光標識は、蛍光ホスホロアミダイト試薬を用いインサイチュに合成される、新生または完成オリゴヌクレオチド鎖に対し付着させることが可能である。例えば、蛍光ホスホロアミダイト試薬は市販されている（例えば、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＶＡの２００６年製品カタログを参照されたい）。この試薬では、フルオレセイン環の３’−、および６’−環外酸素原子が、副反応を阻止するために、ピバロイル基によって保護される。これらの基によるフルオレセイン環の修飾は、閉されたスピロラクトン形の３−位置にカルボン酸基を保持し、該カルボン酸塩からの、ホスホロアミダイト基に対するプロトン供与を阻止する。もしもプロトン供与が起こると、このホスホロアミダイト基は有力な脱離基に変換されることになり、この試薬の分解を招くことになる。このフルオレセイン環はさらに、いずれも核酸塩基の保護基を除去し、合成オリゴヌクレオチドを合成樹脂から切り離すための標準法である、新生オリゴヌクレオチドを酸化するために用いられる条件、およびアンモニア水による処理に対して安定である。
【０００４】
残念ながら、多くのローダミン染料は、その蛍光特性に対し否定的な影響を及ぼす、合成オリゴヌクレオチドの酸化、および脱保護／切り離しのために一般的に使用される試薬で処理されると、化学的修飾に対して感受性を持つ。そのため、ローダミン染料は、一般に、合成、脱保護、および合成樹脂からの切り離し後にオリゴヌクレオチドに付着される。これは、追加の工程および手間を加えることになり、ローダミン標識オリゴヌクレオチドの全体合成においてより大きなコストおよび不便の原因となる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記およびその他の限界のために、最近は、ホスホロアミダイト試薬として僅かに二つのローダミン染料しか市販されていない、すなわち、テトラメチルローダミン（”ＴＡＭＲＡ”）、およびローダミンＸ（”ＲＯＸ”）である。固相化学合成の際に、異なる膨大な数のローダミン染料によるオリゴヌクレオチドの標識化を可能とするさらに新たな試薬が得られるならば、それは望ましいであろう。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
３．概要
一局面において、本開示は、適切な波長の入射光によって照射されると蛍光を発するローダミン染料を含む標識によって、合成オリゴヌクレオチドを標識するのに有用な試薬を提供する。この標識は、単一のローダミン染料を含むことが可能であるが、あるいは、複数の染料の少なくとも一つがローダミン染料である、染料ネットワークを含むことが可能である。これらの試薬は、オリゴヌクレオチドの段階的合成の際、合成オリゴヌクレオチドを直接ローダミン含有標識によって標識するのに使用することが可能であり、このため、ローダミン染料によって標識されるオリゴヌクレオチドを得るために必要な操作工程が低減される。さらに、標識が、段階合成の際、直接オリゴヌクレオチドに付着されるので、標識オリゴヌクレオチドからの、未結合標識の、ＨＰＬＣ分離−これは、現在行われている、ローダミンＮＨＳエステルなどの、合成後ローダミン標識試薬を用いる場合には必要となる−が不要になる。
【０００７】
これらの試薬は、オリゴヌクレオチドを、その３’末端、その５’末端、および／または、一つ以上の内部位置において標識するのに使用することが可能である。その標識は、オリゴヌクレオチドの末端ヒドロキシル（単数または複数）、オリゴヌクレオチドを含む一つ以上の核酸塩基に付着させることが可能であり、あるいは、オリゴヌクレオチド鎖を含む二つのヌクレオチドの間に配置することも可能である。したがって、この試薬は、非ヌクレオシド性合成試薬（例えば、図３および５を参照）、ヌクレオシド性合成試薬（例えば、図４および６を参照）、および／またはヌクレオシド性固相支持体（例えば、図８を参照）の形状を取ることが可能である。
【０００８】
この合成試薬は、一般に、標識部分、リン酸エステル前駆体（”ＰＥＰ”）基、および、リン酸エステル前駆体基を標識部分に連結する、任意のリンカーを含む。リン酸エステル前駆体基は、一般に、オリゴヌクレオチドの段階的合成に使用されると、任意の脱保護および／または酸化の後、ヌクレオチド間リン酸エステル結合を最終的に生成する官能基を含む。ヌクレオチド間リン酸エステル結合を合成するために好適な、いくつかの種類の化学および官能基が、従来技術において既知であり、例として挙げるので限定のためではないが、例えば、ホスホロアミダイトＰＥＰ基を利用する亜リン酸トリエステル（例えば、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、１９６９，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．９１：３３５０−３３５５；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、１９７５，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．９７：３２７８；Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ  ＆  Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，１９８１，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０３：３１８５；Ｂｅａｕｃａｇｅ  ＆  Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，１９８１，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．２２：１８５９を参照）、２−クロロフェニル−、または２，５−ジクロロフェニル−リン酸ＰＥＰ基（例えば、Ｓｐｒｏａｔ  ＆  Ｇａｉｔ，“Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｏｌｉｇｏｎｕｋｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒ  Ｍｅｔｈｏｄ”）」  Ｉｎ：  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｇａｉｔ，Ｅｄ．，１９８４，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，ｐａｇｅｓ  ８３−１１５を参照）、Ｈ−リン酸ＰＥＰ基を利用するＨ−リン酸化学（例えば、Ｇａｒｅｇｇら、１９８５，Ｃｈｅｍ．Ｓｃｒ．２５：２８０−２８２；Ｇａｒｅｇｇら、１９８６，Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔ．２７：４０５１−４０５４；Ｇａｒｅｇｇら、１９８６，Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔ．２７：４０５５−４０５８；Ｇａｒｅｇｇら、１９８６，Ｃｈｅｍ．Ｓｃｒ．２６：５９−６２；Ｆｒｏｅｈｌｅｒ  ＆  Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ，１９８６，Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔ．２７：４６９−４７２；Ｆｒｏｅｈｌｅｒら、１９８６，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：５３９９−５４０７を参照）が挙げられる。これら各種のＰＥＰ基の外、後に発見されたＰＥＰ基も、本明細書に記載される合成試薬の、リン酸エステル前駆体基を含むことが可能である。ＰＥＰ基の特定名は、結果の成否を決める因子ではなく、標識オリゴヌクレオチドを合成するために望ましい化学に依存する。ある実施態様では、リン酸エステル前駆体基は、フォルスフォロアミダイト基を含む。
【０００９】
標識部分とリン酸エステル前駆体基を連結する任意のリンカーは、この標識オリゴヌクレオチドの合成のために用いられる合成条件に対して安定なものである限り、原子または官能基同士の、事実上任意の組み合わせを含むことが可能である。リンカーは、指定の特性、例えば、所望の条件下で分断される能力を持つように設計することが可能である。
【００１０】
合成試薬はさらに、ヌクレオシド、または他の基または成分がそれに対して付着することが可能な、一つ以上の合成ハンドルを任意に含んでもよい。この合成ハンドルは、標識オリゴヌクレオチドの段階的合成時に選択的に除去することが可能な保護基を含み、そのため、樹脂からの切り離し前に、成分の、合成オリゴヌクレオチドに対する付着を可能としてもよいし、あるいはそれとは別に、合成ハンドルは、脱保護、および／または、合成オリゴヌクレオチドの合成樹脂からの切り離しのために使用される条件に対して安定な保護基を含み、そのため、合成、脱保護、および合成樹脂からの切り離しの後、合成標識オリゴヌクレオチドに対する成分の付着を可能としてもよい。一つを超える合成ハンドルを含む、合成試薬を含む合成ハンドル同士は、同じであっても、異なっていてもよい。
【００１１】
ある実施態様では、合成試薬は、式−ＯＲｅの保護されたヒドロキシルを含む、単一合成ハンドルを任意に含む。ここで、Ｒｅは酸に不安定な保護基を表す。
【００１２】
この合成ハンドルは、標識部分に結合させることも可能であるし、あるいは、標識部分とリン酸エステル前駆体基を連結する任意のリンカーの中に含めることも可能である。式−ＯＲｅの合成ハンドルが、任意のリンカーに含まれる実施態様は、その性質が、非ヌクレオシド性であってもよいし、あるいは、ヌクレオシド性であってもよい。後者の場合、リンカーはヌクレオシドを含み、合成ハンドルには、ヌクレオシドの糖成分のヒドロキシル基、通常、ヌクレオシド糖成分の５’−ヒドキシル基が与えられる。リンカーが合成ハンドルを含む、非ヌクレオシド性合成試薬の、特異的、非限定的実施態様が、図５に示される。リンカーが合成ハンドルを含む、ヌクレオシド性合成試薬の、特異的、非限定的実施態様が、図６に示される。
【００１３】
固相支持試薬は、一般に、標識部分、Ｒｅは上に定義された通りである、式−ＯＲｅの合成ハンドル、固相支持体、および、標識部分および合成ハンドルを、固相支持体に連結するリンカーを含む。合成ハンドルは、ヌクレオシドモノマー試薬がそれに対して結合することが可能な基を提供する。固相支持試薬は、同じであっても、異なってもよい、さらに別の、一つ以上の合成ハンドルを任意に含むことが可能である。
【００１４】
それぞれが適切な官能基を含むか、または、適切な官能基を含むように誘導体形成することが可能なオリゴヌクレオチドの固相合成において固相支持体として使用するのに好適な材料については、広く各種のものが従来技術において知られ、例えば、ただしこれらに限定されないが、孔調節ガラス（ＣＰＧ）、ポリスチレン、および各種グラフトコポリマーが挙げられる。これら各種材料は全て、本明細書に記載される固相支持試薬における固相支持体として使用するのに好適である。
【００１５】
固相支持体の形状は、決定的重要性を持たない。ほぼ任意の形状の利用が可能である。例えば、固相支持体は、球形、不規則形状のビーズ、立方体、直方体、円筒形、円筒管、または場合によってはシート状であってもよい。固相支持体は、多孔性であってもよいし、非多孔性であってもよい。ある実施態様では、固相支持体は、ＣＰＧ、またはポリスチレンビーズである。ある実施態様では、固相支持体は、ＣＰＧ、またはポリスチレンビーズである。
【００１６】
標識部分と合成ハンドルを、固相支持体に連結するリンカーは、オリゴヌクレオチドの固相合成のために通常用いられる合成条件に対して安定なものである限り、原子または官能基同士の、事実上任意の組み合わせを含むことが可能であって、その構造は、直線状、分枝状、または環状であってもよいし、あるいは、直線、分枝、および／または環状構造同士の任意の組み合わせを含むことが可能である。リンカーは、指定の特性、例えば、所望の条件下に切断可能とされる能力を持つように設計することが可能である。ある実施態様では、リンカーは、指定の条件下で切断されて、試薬の残余部分から、固相支持体の放出を可能とする結合を含む。例えば、リンカーは、オリゴヌクレオチド合成条件下では安定であるが、合成オリゴヌクレオチドを脱保護するために使用される条件（例えば、水酸化アンモニウムにおける５５℃または室温でのインキュベーション）に対しては不安定となる結合を含むことが可能である。このような特異的に切断可能な結合は、従来技術において周知であり、例えば、ただしこれらに限定されないが、エステル類、炭酸エステル類、ジイソプロピルシロキシエーテル類、リン酸エステル修飾体などが挙げられる。
【００１７】
合成試薬に関して前述したように、固相支持試薬のリンカーは、合成ハンドルを含むことが可能であり、その性質は、ヌクレオシド性、または非ヌクレオシド性であることが可能である。非ヌクレオシド性固相支持試薬の、特異的、非限定的実施態様が、図７に示される。ヌクレオシド性固相支持試薬の、特異的、非限定的実施態様が、図８に示される。
【００１８】
本明細書に記載される合成および固相支持試薬の標識部分は、ローダミン染料を含む。ローダミン染料の３’−、および６’−位置における環外窒素原子は、一次または二次アミンに含まれるように未置換であるか、または一置換され、さらに保護基によって置換される（３’−および６’−位置において一次または二次アミン基を有する、未保護ローダミン染料を、本明細書では「ＮＨ−ローダミン」と呼び、３’−および６’−位置において保護基を有するローダミン染料を、本明細書では「Ｎ−保護ＮＨ−ローダミン」と呼ぶ）。
【００１９】
保護基は、標識オリゴヌクレオチドを合成するために通常用いられる合成条件、例えば、オリゴヌクレオチドの固相合成に通常用いられるトリエステル化学条件に対して安定なものである限り、事実上任意の、特異的除去が可能な基であってもよい。アミド、例えば、カルボキサミド、スルフォナミド、フォスフォラミドなどを形成する基によって、ＮＨ−ローダミンの３’−および６’−二次または一次アミンを保護することによって、Ｎ−保護ＮＨ−ローダミンが、閉鎖されたラクトン形で存在することが可能とされ、そのため、ローダミンが、合成後操作または精製を要することなく、オリゴヌクレオチドの段階的合成において使用が可能とされることが発見された。実験実施例で証明されるように、Ｎ−保護ＮＨ−ローダミンを含むホスホロアミダイト試薬は、オリゴヌクレオチドの段階的合成に一般的に使用される溶媒に可溶であり、複数ラウンドのＤＭＴ脱保護、結合、酸化、およびキャップ形成に対してばかりでなく、濃縮水酸化アンモニウムによる処理、すなわち、任意の環外アミン保護基を脱保護し、合成樹脂から合成オリゴヌクレオチドを切り離すために一般的に使用される条件に対しても安定である。
【００２０】
この保護基は、不安定で、合成された標識オリゴヌクレオチドの核酸塩基保護基を除去するために使用される条件下で除去可能であってもよいし、あるいはそれとは別に、この保護基は、これらの条件には安定であるが、他の条件に対しては不安定であってもよい。多くの場合、合成された標識オリゴヌクレオチドの核酸塩基保護基を除去するため、および／または、合成樹脂から標識された合成オリゴヌクレオチドを切り離すために使用される条件に対して不安定である保護基を利用することが望ましいようである。
【００２１】
ある実施態様では、保護基は、式−Ｃ（Ｏ）Ｒ１０のアシル基である。この式において、Ｒ１０は、低級アルキル、メチル、Ｘ、−ＯＲｂ、シアノ、またはニトロ基によって任意に一置換される、低級アルキル、メチル、−ＣＸ３、−ＣＨＸ２、−ＣＨ２Ｘ、−ＣＨ２−ＯＲｂ、およびフェニルから選ばれ、ここで、Ｒｂは、低級アルキル、ピリジル、およびフェニルから選ばれ、各Ｘは、ハロ基、通常はフルオロ、クロロ、またはブロモである。ある特定の、非限定的実施態様では、Ｒ１０は、ｔ−ブチル、またはトリフルオロメチルである。
【００２２】
標識部分はさらに、別の保護された蛍光担体を含み、そのため、Ｎ−保護ＮＨ−ローダミン染料が、より大きなエネルギー転移染料ネットワークの一員とされてもよい。このようなエネルギー転移染料ネットワークは、従来技術で周知であり、分光特性が適合されるか、または、相互の相対的距離が調整される複数の蛍光担体の組み合わせを含み、そのため、ネットワークの中の一蛍光担体が、適切な波長の入射光によって励起されると、ネットワークの別の蛍光担体にその励起エネルギーを転移し、これが、次に、その励起エネルギーを、ネットワークのさらに別の蛍光担体に転移し、この過程を繰り返し、ネットワークの最後の受容蛍光担体による蛍光がもたらされる。このようなネットワークは、長いＳｔｏｋｅｓシフトを持つ標識を生ずる。このようなネットワークでは、ネットワークの別の蛍光担体に励起を転移する、または供与する蛍光担体を、「ドナー」と呼ぶ。別の蛍光担体、およびそれに対するフルオレセイン試薬から励起エネルギーを受容する、またはアクセプトする蛍光担体は、「アクセプター」と呼ばれる。二つの染料しか含まない染料ネットワークでは、通常、一方の染料は、ドナーとして活動し、他方は、アクセプターとして活動する。三つ以上の、異なる染料を含む染料ネットワークでは、少なくとも一つの染料は、ドナーおよびアクセプターの両方として活動する。
【００２３】
二つ、三つ、四つ、場合によってはさらに多くの染料を含むエネルギー転移染料ネットワークが従来技術で周知である（例えば、ＵＳ２００６／０５７５６５を参照）。これらのネットワークで使用され、固相合成オリゴヌクレオチドにおける使用のために好適に保護することが可能な染料であれば、いずれのものでも本明細書に記載される標識部分に含めることが可能である。
【００２４】
本明細書に記載される合成および固相支持試薬のある実施態様では、標識部分はさらに、Ｎ−保護ＮＨ−ローダミンに対し適切に保護されたドナーを含む。脱保護されると、これらのドナーは、その励起エネルギーを、このＮＨ−ローダミンに転移し、そのため、ＮＨ−ローダミンは、ドナーの励起と同時に蛍光を発射する。
【００２５】
本明細書に記載される合成および固相支持試薬のある実施態様では、標識部分はさらに、Ｎ−保護ＮＨ−ローダミンに対し適切に保護されたアクセプターを含む。脱保護されると、これらのアクセプターは、ドナーＮＨ−ローダミンから、その励起エネルギーを受容し、そのため、このアクセプターは、ドナーＮＨ−ローダミンの励起と同時に蛍光を発する。
【００２６】
ドナーまたはアクセプターの性質は、該標識部分を含むＮＨ−ローダミンの性質に依存する。広範囲のローダミン染料においてドナーとして活動することが可能な蛍光担体の例は、従来技術において周知である。このようなドナーの非限定的例としては、キサンテン染料（例えば、フルオレセイン、ローダミン、およびロドール）、ピレン染料、クマリン染料（例えば、ヒドロキシおよびアミノクマリン）、シアニン染料、フタロシアニン染料、およびランテニド複合体が挙げられる。ローダミン染料においてアクセプターとして活動することが可能な蛍光担体の例も従来技術で周知である。このようなアクセプターの非限定的例としては、ローダミン染料、およびシアニン染料が挙げられる。オリゴヌクレオチドを合成するために用いられる合成条件、例えば、オリゴヌクレオチドの固相合成に通常用いられる亜リン酸トリエステル化学条件下における使用のために適切に保護することが可能なものであれば、これららの染料のいずれのものも、本明細書に記載される合成および固相支持試薬においてドナーまたはアクセプターとして使用することが可能である。
【００２７】
エネルギーが、ドナーからアクセプターに転移される機序は決定的に重要ではない。このようなドナー−アクセプターペアが動作可能となるために必要なのは、アクセプターが、ドナーの励起に反応して蛍光を発することだけである。
【００２８】
標識部分はさらに、非蛍光的アクセプターを含んでもよい。このような非蛍光的アクセプターは、該標識部分を含むＮＨ−ローダミン、またはその他の蛍光染料（単数または複数）の蛍光の全体または一部を消光させるために使用することが可能である。本明細書に記載されるＮＨ−ローダミンなどのローダミン染料の消光剤として活動することが可能な、そのような非蛍光成分の例としては、例えば、ただしこれらに限定されないが、ＷＯ０１／８６００１に記載される各種非蛍光消光剤、および、ＵＳ２００５／０１６４２２５に記載される各種非蛍光消光剤が挙げられる。なお、これらの開示を、引用により本明細書に含める。
【００２９】
ある実施態様では、標識部分はさらに、本明細書で記載される、Ｎ−保護ＮＨ−ローダミン染料を含むドナー染料、または、フルオレセイン染料であって、その環外３’−および６’−酸素原子が、オリゴヌクレオチド合成条件、例えば、オリゴヌクレオチドの固相合成に通常用いられる亜リン酸トリエステル化学条件に対しては安定であるが、合成オリゴヌクレオチドを脱保護するために用いられる条件に対して不安定な保護基によって保護されるフルオレセイン染料を含む。好適な保護基は、従来技術で周知であり、例えば、ただしこれらに限定されないが、アシル基カルボン酸塩およびカルバミン酸塩が挙げられる。３’−および６’−環外酸素原子において保護基を含むフルオレセイン染料を、本明細書では「Ｏ−保護フルオレセイン」と呼ぶ。ある特異的、非限定的実施態様では、Ｏ−保護フルオレセインにおける保護基は、アシル基である。
【００３０】
Ｎ−保護ＮＨ−ローダミン、またはＯ−保護フルオレセインドナー染料、およびＮ−保護ＮＨ−ローダミンアクセプター染料は、互いに様々な方向性において、直接またはリンカーを介して結合することが可能である。ある実施態様では、ドナーは、Ｎ−保護ＮＨ−ローダミンアクセプターの２’−、２’’−、４’−、５’−、７’−、７’’−、５−、または６−位置に対し、その２’−、２’’−、４’−、５’−、７’−、７’’−、５−、または６−位置を通じて、任意にリンカーの助けを借りて結合される。ある実施態様では、ドナーおよびアクセプターは、後の節においてさらに詳細に記載されるように、頭部対頭部、頭部対尾部、尾部対尾部、または側部対側部の方向性において相互に結合される。
【００３１】
染料同士を連結する任意のリンカーは、オリゴヌクレオチド合成条件、例えば、オリゴヌクレオチドの固相合成に通常用いられる亜リン酸トリエステル化学条件に対して安定である原子および／または官能基である限り、事実上全ての組み合わせを含んでもよい。原子および／または官能基の組み合わせは、リンカーの特性および／または長さが望み通りとなるように注文に合わせて選択することが可能である。エネルギー転移染料ネットワーク利用という観点において、フルオレセインおよびローダミン染料を相互に結合するのに有用なリンカーは種々のものがあり、それらは従来技術において既知である（例えば、ＵＳ２００６／０５７５６５、米国特許第７，０１５，０００号、米国特許第６，６２７，７４８号、米国特許第６，５４４，７４４号、米国特許第６，１７７，２４７号、米国特許６，１５０，１０７号、米国特許第６，０２８，１９０号、米国特許５，９５８，１８０号、米国特許第５，８６９，２５５号、米国特許第５，８５３，９９２号、米国特許５，８１４，４５４号、米国特許第５，８０４，３８６号、米国特許第５，７２８，５２８号、米国特許第５，７０７，８０４号、および米国特許第５，６８８，６４８号を参照されたい、なおこれらの開示を、引用により本明細書に含める）。これらのリンカーは全て、本明細書に記載される試薬において、Ｏ−保護フルオレセインをＮ−保護ＮＨ−ローダミンに結合するために使用することが可能である。ある実施態様では、リンカーは、その性質が剛性であり、長さが約８から１６Aである。
【００３２】
標識部分、リン酸エステル前駆体基、および合成試薬の任意の合成ハンドル、および、標識部分、固相支持体、および固相支持試薬の合成ハンドルは、各種基および成分が、それぞれの機能を実行する能力を妨げない限り、どのような方式、方向性で相互に結合させることも可能である。標識部分は、通常、該標識部分を構成する複数の染料のうちの一つの官能基に結合されるリンカーを通じて、特定の試薬を含む、他の成分または基の一つに結合されるか、またはそれとは別に、染料ネットワークの二つ以上の染料を連結するリンカーに結合される。標識部分が、単一のＮ−保護ＮＨ−ローダミン蛍光担体しか含まない実施態様では、該標識部分は、ＮＨ−ローダミン環に対し、該ＮＨ−ローダミン環の、閉じた、スピロラクトン形で存在する能力を妨げない限り、該環の任意の位置を介して試薬と結合することが可能である。適切な位置としては、例えば、ただしこれらに限定されないが、環外窒素原子に隣接する炭素原子、または、フェニル成分上の原子、例えばローダミン染料の２’−、２’’−、４’−、５’−、７’−、７’’−、５−、または６−位置が挙げられる。ある実施態様では、標識部分は、Ｎ−保護ＮＨ−ローダミン染料の５−、または６−位置を介して試薬の基または成分に結合される。
【００３３】
標識部分が染料ネットワークを含む実施態様では、標識部分は、試薬の所望の機能を妨げない、ネットワークを構成する染料の内の任意の一つの任意の位置を介して試薬の任意の基または成分に対し、または、ネットワークの二つ以上の染料を連結するリンカーに対し連結されてもよい。標識部分が、Ｎ−保護ＮＨ−ローダミンアクセプターの外に、Ｏ−保護フルオレセインまたはＮ−保護ＮＨ−ローダミンドナーを含む、ある特定実施態様では、ドナーまたはアクセプターにおける任意の利用可能な位置、例えば、ドナーまたはアクセプターの２’−、２’’−、４’−、５’−、７’−、７’’−、５−、または６−位置において、標識部分を、試薬の基または成分に連結させることが可能である。ある実施態様では、標識部分は、ドナーまたはアクセプターの５−または６−位置を介して、試薬の基または成分に連結される。
【００３４】
ある実施態様では、標識部分はドナーと、Ｎ−保護ＮＨ−ローダミンアクセプターを連結するリンカーを介して、試薬の基または成分に連結される。
【００３５】
別の局面では、本開示は、本明細書に記載される試薬の合成に有用な中間分子、本明細書に記載される試薬の製造法、本明細書に記載される試薬によって標識される化合物、例えば、標識オリゴまたはポリヌクレオチド、および、様々な背景における標識化合物の使用法を提供する。本開示の種々の局面の全てが、下記にさらに詳細に記述される。
例えば、本願発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
オリゴヌクレオチドを標識するのに有用な試薬であって、Ｎ−保護ＮＨ−ローダミン部分を含む標識部分を含む、試薬。
（項目２）
リン酸エステル前駆体基をさらに含む、項目１に記載の試薬。
（項目３）
構造式（ＶＩＩ）：
（ＶＩＩ）  ＬＭ−Ｌ−ＰＥＰ
による化合物であって、ここで、ＬＭは、前記標識部分を表し、ＰＥＰは、前記リン酸エステル前駆体基を表し、Ｌは、該リン酸エステル前駆体基に該標識部分を連結する、任意のリンカーを表す化合物である、項目２に記載の試薬。
（項目４）
Ｌが、−Ｚ−（ＣＨ２）３−６−Ｏ−、−Ｚ−（ＣＨ２）ａ−［（Ａｒ）ｂ−（ＣＨ２）ａ］ｃ−Ｏ−、−Ｚ−（ＣＨ２）ａ−［Ｃ≡Ｃ−（ＣＨ２）ａ］ｃ−Ｏ−、−Ｚ−（ＣＨ２）ａ−［Ｃ≡Ｃ−（Ａｒ）ｂ］ｃ−（ＣＨ２）ａ−Ｏ−、−Ｚ−（ＣＨ２）ｄ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−［（ＣＨ２）ａ−（Ａｒ）−（ＣＨ２）ａ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ］ｃ−（ＣＨ２）ｄ−Ｏ−、および−Ｚ−［ＣＨ２（ＣＨ２）ｅＯ］ｆ−ＣＨ２（ＣＨ２）ｅＯ−から選ばれ、
ここで、
Ｚは、他とは独立して、官能基Ｆｚによって与えられる連結を表し；
各ａは、他とは独立して、０から４の範囲の整数を表し；
各ｂは、他とは独立して、１から２の範囲の整数を表し；
各ｃは、他とは独立して、１から５の範囲の整数を表し；
各ｄは、他とは独立して、１から１０の範囲の整数を表し；
各ｅは、他とは独立して、１から４の範囲の整数を表し；
各ｆは、他とは独立して、１から１０の範囲の整数を表し；かつ、
各Ａｒは、他とは独立して、任意に置換される単環または多環のシクロアルキレン、シクロヘテロアルキネン、アリーレン、またはヘテロアリーレン基を表す、
、項目３に記載の試薬。
（項目５）
各Ａｒが、他とは独立して、シクロヘキサン、ピペラジン、ベンゼン、ナフタレン、フェノール、フラン、ピリジン、ピペリジン、イミダゾール、ピロリジン、またはオキサジゾールから得られる基である、項目４に記載の試薬。
（項目６）
構造式（ＶＩＩ．１）：
【化１】
2014079254.tif 000002
による化合物であって、
ここで、Ｂは、適切に保護される核酸塩基を表し、Ｌ２は、標識部分ＬＭに核酸塩基Ｂを連結するリンカーを表す化合物である、項目３に記載の試薬。
（項目７）
前記核酸塩基が、アデニン、７−デアザグアニン、グアニン、７−デアザグアニン、シトシン、ウラシル、チミン、イノシン、キサンテン、およびヒポキサンテンから選ばれる、項目６に記載の試薬。
（項目８）
Ｂが、ＡｉＢｕ、ＡＰａｃ、ＣＡｃ、ＧｉＰｒ−Ｐａｃ、Ｔ、およびＵから選ばれる、項目７に記載の試薬。
（項目９）
Ｌ２が、−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ２−ＮＨ−、−Ｃ≡Ｃ−Ｃ（Ｏ）−、−ＣＨ＝ＣＨ−ＮＨ−、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）１−６−ＮＨ−、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）１−６−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ≡ＣＨ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−［Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２］０−６−ＮＨ−、−Ｃ≡Ｃ−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−［Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２］０−６−ＮＨ−、−Ｃ≡Ｃ−（Ａｒ）１−２−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−［Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２］０−６−ＮＨ−、−Ｃ≡Ｃ−（Ａｒ）１−２−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−［Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２］０−６−ＮＨ−、および−Ｃ≡Ｃ−（Ａｒ）１−２−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−［Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２］０−６−ＮＨ−から選ばれ、ここで、Ａｒは項目４に定義した通りである、、項目６に記載の試薬。
（項目１０）
−Ｂ−Ｌ２−が、下記：
【化２】
2014079254.tif 000003
から選ばれる、項目６に記載の試薬。
（項目１１）
適切に保護される合成ハンドルをさらに含む、項目２に記載の試薬。
（項目１２）
構造式（ＶＩＩＩ）：
（ＶＩＩＩ）  ＲｅＯ−Ｌ−ＬＭ−Ｌ−ＰＥＰ
による化合物であって、ここで、Ｒｅは、酸不安定保護基を表し、各Ｌは、他とは独立して、任意のリンカーを表し、ＬＭは、前記標識部分を表し、かつ、ＰＥＰは、前記リン酸エステル前駆体基を表す化合物である、項目１１に記載の試薬。
（項目１３）
構造式（ＩＸ）：
【化３】
2014079254.tif 000004
による化合物であって、ここで、ＬＭは、前記標識部分を表し、Ｌはリンカーを表し、Ｒｅは、酸不安定保護基を表し、かつ、ＰＥＰは、前記リン酸エステル前駆体基を表す化合物である、項目１１に記載の試薬。
（項目１４）
構造式（ＩＸ．１）：
【化４】
2014079254.tif 000005
による化合物であって、ここで、−Ｚ−は、官能基Ｆｚによって与えられる連結の一部を表し、同じであっても、異なっていてもよい、Ｓｐ１、Ｓｐ２、およびＳｐ３は、それぞれ、スペーサー成分を表し、かつ、Ｇは、ＣＨ、Ｎ、または、アリーレン、フェニレン、ヘテロアリーレン、低級シクロアルキレン、シクロヘキシレン、および／または低級シクロヘテロアルキレンを含む基を表す化合物である、項目１３に記載の試薬。
（項目１５）
Ｓｐ１、Ｓｐ２、およびＳｐ３が、それぞれ互いに独立に、１から１０個の炭素原子を含むアルキレン鎖、−（ＣＨ２）ａ−［（Ａｒ）ｂ−（ＣＨ２）ａ］ｃ−、−（ＣＨ２）ａ−［Ｃ≡Ｃ−（ＣＨ２）ａ］ｃ−、−（ＣＨ２）ａ−［Ｃ≡Ｃ−（Ａｒ）ｂ］ｃ−（ＣＨ２）ａ−、−（ＣＨ２）ｄ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−［（ＣＨ２）ａ−（Ａｒ）−（ＣＨ２）ａ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ］ｃ−（ＣＨ２）ｄ−、および、−［ＣＨ２（ＣＨ２）ｅＯ］ｆ−ＣＨ２（ＣＨ２）−から選ばれ、ここで、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、およびＡｒは、項目４に定義した通りである、項目１４に記載の試薬。
（項目１６）
構造式（ＩＸ．２）、（ＩＸ．３）、（ＩＸ．４）、または（ＩＸ．５）：
【化５】
2014079254.tif 000006
による化合物であって、ここで、Ｂは適切に保護される核酸塩基を表し、Ｌ２は、核酸塩基Ｂに標識部分ＬＭを連結するリンカーを表し、構造（ＩＸ．４）において、Ｒ１１は、保護基を表す化合物である、項目１３に記載の試薬。
（項目１７）
前記核酸塩基が、アデニン、７−デアザグアニン、グアニン、７−デアザグアニン、シトシン、ウラシル、チミン、イノシン、キサンテン、およびヒポキサンテンから選ばれる、項目１６に記載の試薬。
（項目１８）
Ｂが、ＡｉＢｕ、ＡＰａｃ、ＣＡｃ、ＧｉＰｒ−Ｐａｃ、Ｔ、およびＵから選ばれる、項目１７に記載の試薬。
（項目１９）
Ｌ２が、−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ２−ＮＨ−、−Ｃ≡Ｃ−Ｃ（Ｏ）−、−ＣＨ＝ＣＨ−ＮＨ−、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）１−６−ＮＨ−、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）１−６−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ≡ＣＨ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−［Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２］０−６−ＮＨ−、−Ｃ≡Ｃ−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−［Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２］０−６−ＮＨ−、−Ｃ≡Ｃ−（Ａｒ）１−２−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−［Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２］０−６−ＮＨ−、−Ｃ≡Ｃ−（Ａｒ）１−２−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−［Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２］０−６−ＮＨ−、および−Ｃ≡Ｃ−（Ａｒ）１−２−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−［Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２］０−６−ＮＨ−から選ばれ、ここで、Ａｒは項目４に定義した通りである、項目１６に記載の試薬。
（項目２０）
−Ｂ−Ｌ２−が、下記：
【化６】
2014079254.tif 000007
から選ばれる、項目１６に記載の試薬。
（項目２１）
前記リン酸エステル前駆体基が、ホスホロアミダイト基およびＨ−ホスホネート基を含む、項目２−２０のいずれか１項に記載の試薬。
（項目２２）
前記リン酸エステル前駆体基が、式（Ｐ．１）：
【化７】
2014079254.tif 000008
のホスホロアミダイトを含み、ここで、
Ｒ２０は、１から１０個の炭素原子を含む、直鎖、分枝、または環状の、飽和または不飽和のアルキル、２−シアノエチル、６から１０個の環炭素原子を含むアリール、および、６から１０個の環炭素原子、および１から１０個のアルキレン炭素原子を含むアリールアルキルから選ばれ；および、
Ｒ２１およびＲ２２は、それぞれ互いに独立に、１から１０個の炭素原子を含む、直鎖、分枝、または環状の、飽和または不飽和のアルキル、６から１０個の環炭素原子を含むアリール、および、６から１０個の環炭素原子、および１から１０個のアルキレン炭素原子を含むアリールアルキルから選ばれるか、またはそれとは別に、Ｒ２１およびＲ２２は、それらが結合する窒素原子と一緒になって、５から６個の環原子を含む、飽和または不飽和環を形成し、該環原子のうちの一つまたは二つは、図示された窒素原子に加えて、Ｏ、Ｎ、およびＳから選ばれるヘテロ原子であってもよい、
項目２１に記載の試薬。
（項目２３）
Ｒ２０が、ベータ−シアノエチルであり、Ｒ２１およびＲ２２が、それぞれ、イソプロピルである、項目２２に記載の試薬。
（項目２４）
固相支持体、および、適切に保護される合成ハンドルをさらに含む、項目１に記載の試薬。
（項目２５）
構造式（Ｘ）：
【化８】
2014079254.tif 000009
による化合物であって、ここで、ＬＭは前記標識部分を表し、Ｌは、任意に選択的に切断可能なリンカーを表し、Ｒｅは、酸不安定な保護基を表す化合物である、項目２１に記載の試薬。
（項目２６）
構造式（ＸＩ．１）：
【化９】
2014079254.tif 000010
による化合物であって、ここで、Ｚ、Ｇ、Ｓｐ１、Ｓｐ２、およびＲｅは、先に項目１４に定義した通りであり、Ｓｐ４は、選択的に切断可能なスペーサー成分を表す化合物である、項目２５に記載の試薬。
（項目２７）
Ｓｐ１およびＳｐ２が、それぞれ互いに独立に、１から１０個の炭素原子を含むアルキレン鎖、−（ＣＨ２）ａ−［（Ａｒ）ｂ−（ＣＨ２）ａ］ｃ−、−（ＣＨ２）ａ−［Ｃ≡Ｃ−（ＣＨ２）ａ］ｃ−、−（ＣＨ２）ａ−［Ｃ≡Ｃ−（Ａｒ）ｂ］ｃ−（ＣＨ２）ａ−、−（ＣＨ２）ｄ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−［（ＣＨ２）ａ−（Ａｒ）−（ＣＨ２）ａ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ］ｃ−（ＣＨ２）ｄ−、および、−［ＣＨ２（ＣＨ２）ｅＯ］ｆ−ＣＨ２（ＣＨ２）−から選ばれ、ここで、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、およびＡｒは、項目４に定義した通りであり、かつＳｐ４がエステル結合を含む、項目２６に記載の試薬。
（項目２８）
構造式（Ｘ．２）、（Ｘ．３）、（Ｘ．４）、または（Ｘ．５）：
【化１０】
2014079254.tif 000011
による化合物であって、ここで、Ｂ、Ｌ２、およびＲ１１が、先に項目１６において定義した通りである化合物である、項目２５に記載の試薬。
（項目２９）
前記核酸塩基が、アデニン、７−デアザグアニン、グアニン、７−デアザグアニン、シトシン、ウラシル、チミン、イノシン、キサンテン、およびヒポキサンテンから選ばれる、項目２８に記載の試薬。
（項目３０）
Ｂが、ＡｉＢｕ、ＡＰａｃ、ＣＡｃ、ＧｉＰｒ−Ｐａｃ、Ｔ、およびＵから選ばれる、項目２８に記載の試薬。
（項目３１）
Ｌ２が、−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ２−ＮＨ−、−Ｃ≡Ｃ−Ｃ（Ｏ）−、−ＣＨ＝ＣＨ−ＮＨ−、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）１−６−ＮＨ−、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）１−６−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ≡ＣＨ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−［Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２］０−６−ＮＨ−、−Ｃ≡Ｃ−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−［Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２］０−６−ＮＨ−、−Ｃ≡Ｃ−（Ａｒ）１−２−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−［Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２］０−６−ＮＨ−、−Ｃ≡Ｃ−（Ａｒ）１−２−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−［Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２］０−６−ＮＨ−、および−Ｃ≡Ｃ−（Ａｒ）１−２−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−［Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２］０−６−ＮＨ−から選ばれ、ここで、Ａｒは項目４に定義した通りである、項目２８に記載の試薬。
（項目３２）
−Ｂ−Ｌ２−が、下記：
【化１１】
2014079254.tif 000012
から選ばれる、項目２８に記載の試薬。
（項目３３）
Ｒｅが４’，４’’−ジメトキシトリチルである、項目１１−３２のいずれか１項に記載の試薬。
（項目３４）
前記Ｎ−保護ＮＨ−ローダミン部分が、構造式（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、または（ＩＩＩｃ）：
【化１２】
2014079254.tif 000013
から選ばれる構造を含み、ここで：
Ｒ’は、Ｒ３’および水素から選ばれ；
Ｒ’’は、Ｒ６’および水素から選ばれ；
Ｒ９は、アシル保護基であり；
Ｒ１’、Ｒ２’、Ｒ２’’、Ｒ４’、Ｒ４’’、Ｒ５’、Ｒ５’’、Ｒ７’、Ｒ７’’、Ｒ８’、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、およびＲ７は、単独で占める場合、それぞれ、互いに独立に、水素、低級アルキル、（Ｃ６−Ｃ１４）アリール、（Ｃ７−Ｃ２０）アリールアルキル、５−１４員ヘテロアリール、６−２０員ヘテロアリールアルキル、−Ｒｂ、および−（ＣＨ２）ｘ−Ｒｂから選ばれ、ここでｘは、１から１０の範囲の整数であり、Ｒｂは、−Ｘ、−ＯＨ、−ＯＲａ、−ＳＨ、−ＳＲａ、−ＮＨ２、−ＮＨＲａ、−ＮＲｃＲｃ、−Ｎ＋ＲｃＲｃＲｃ、ペルハロ低級アルキル、トリハロメチル、トリフルオロメチル、−Ｂ（ＯＨ）３、−Ｂ（ＯＲａ）３、−Ｂ（ＯＨ）Ｏ−、−Ｂ（ＯＲａ）２Ｏ−、−Ｂ（ＯＨ）（Ｏ−）２、−Ｂ（ＯＲａ）（Ｏ−）２、−Ｐ（ＯＨ）２、−Ｐ（ＯＨ）Ｏ−、−Ｐ（ＯＲａ）２、−Ｐ（ＯＲａ）Ｏ−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）Ｏ−、−Ｐ（Ｏ）（Ｏ−）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲａ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲａ）Ｏ−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）（ＯＲａ）、−ＯＰ（ＯＨ）２、−ＯＰ（ＯＨ）Ｏ−、−ＯＰ（ＯＲａ）２、−ＯＰ（ＯＲａ）Ｏ−、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）２、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）Ｏ−、−ＯＰ（Ｏ）（Ｏ−）２、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＲａ）２、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＲａ）Ｏ−、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＲａ）（ＯＨ）、−Ｓ（Ｏ）２Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２ＯＨ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒａ、−Ｃ（Ｏ）Ｈ、−Ｃ（Ｏ）Ｒａ、−Ｃ（Ｓ）Ｘ、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＲａ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲｃＲｃ、−Ｃ（Ｓ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＲａ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲｃＲｃ、−Ｃ（ＮＨ）ＮＨ２、−Ｃ（ＮＨ）ＮＨＲａ、および−Ｃ（ＮＨ）ＮＲｃＲｃから選ばれ、ここで、Ｘはハロであり、各Ｒａは、他と独立に、低級アルキル、（Ｃ６−Ｃ１４）アリール、（Ｃ７−Ｃ２０）アリールアルキル、５−１４員ヘテロアリール、および６−２０員ヘテロアリールアルキルから選ばれ、各Ｒｃは、他と独立に、Ｒａであるか、またはそれとは別に、同じ窒素原子に結合する二つのＲｃは、その窒素原子と一緒になって、５−８員の飽和または未飽和の環であって、通常、Ｏ、Ｎ、およびＳから選ばれる、同じまたは異なる環ヘテロ原子のうちの一つ以上を任意に含んでよい環を形成し、
または、それとは別に、Ｒ１’およびＲ２’、またはＲ７’およびＲ８’は、それらが結合する炭素原子と一緒に合わされて、任意に置換される（Ｃ６−Ｃ１４）アリール架橋を形成するか、および／または、Ｒ４’およびＲ４’’、および／またはＲ５’およびＲ５’’は、それらが結合する炭素原子と一緒に合わされてベンゾ基を形成し；
Ｒ３’およびＲ６’は、単独で占める場合、それぞれ、互いに独立に、低級アルキル、（Ｃ６−Ｃ１４）アリール、（Ｃ７−Ｃ２０）アリールアルキル、５−１４員ヘテロアリール、および６−２０員ヘテロアリールアルキルから選ばれ、または、それとは別に、構造式（ＩＩＩａ）の化合物におけるＲ３’およびＲ２’、またはＲ４’および／またはＲ６’、およびＲ５’またはＲ７’、構造式（ＩＩＩｂ）の化合物におけるＲ３’およびＲ２’、またはＲ４’および／またはＲ６’、およびＲ５’またはＲ７’’、または、構造式（ＩＩＩｃ）の化合物におけるＲ３’およびＲ２’、またはＲ４’および／またはＲ６’、およびＲ５’またはＲ７’’は、その結合する原子と一緒に合わされて、同じか、または異なる低級アルキル、ベンゾ、またはピリド基のうちの一つ以上によって任意に置換される、５−または６−員の、飽和または不飽和環を形成し、
ただし、構造式（ＩＩＩａ）の化合物におけるＲ２’、Ｒ４’、Ｒ５’、Ｒ７’、Ｒ５、またはＲ６のうちの少なくとも一つ、構造式（ＩＩＩｂ）の化合物におけるＲ２’、Ｒ４’、Ｒ５’、Ｒ７’’、Ｒ５、またはＲ６のうちの少なくとも一つ、構造式（ＩＩＩｃ）の化合物におけるＲ２’’、Ｒ４’、Ｒ５’、Ｒ７’’、Ｒ５、またはＲ６のうちの少なくとも一つが、式−Ｙ−の基を含み、Ｙは、官能基Ｆｙによって与えられる連結の一部を表す、
、項目１−３３のいずれか１項に記載の試薬。
（項目３５）
前記Ｎ−保護ＮＨ−ローダミン部分が、構造式（ＩＩＩａ．１）、（ＩＩＩａ．２）、（ＩＩＩｂ．１）、（ＩＩＩｂ．２）、（ＩＩＩｃ．１）、および（ＩＩＩｃ．２）：  
【化１３】
2014079254.tif 000014
から選ばれる構造を含み、
ここで、Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ１’、Ｒ２’、Ｒ２’’、Ｒ３’、Ｒ４’、Ｒ４’’、Ｒ５’、Ｒ５’’、Ｒ６’、Ｒ７’、Ｒ７’’、Ｒ８’、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ９、およびＹは、先に項目３４において定義された通りである、項目３４に記載の試薬。
（項目３６）
前記Ｎ−保護ＮＨ−ローダミン部分が、下記：
（ｉ）Ｙは、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｓ−、および−ＮＨ−から選ばれ；
（ｉｉ）  Ｒ４およびＲ７は、それぞれ、クロロであり；
（ｉｉｉ）  Ｒ１’およびＲ８’は、それぞれ、水素であり；
（ｉｖ）  Ｒ１’およびＲ２’、または、Ｒ７’およびＲ８’は、一緒に合わされてベンゾ基を形成し；
（ｖ）  Ｒ２’およびＲ７’は、それぞれ、水素または低級アルキルであり；
（ｖｉ）  Ｒ’はＲ３’であり、かつ、Ｒ’’はＲ６’であり；
（ｖｉｉ）  Ｒ’はＲ３’であり、Ｒ’’はＲ６’であり、かつ、Ｒ３’およびＲ６’は、隣接炭素原子における置換基と一緒に合わされて、−ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−、−Ｃ（ＣＨ３）２ＣＨ＝Ｃ（ＣＨ３）−、−Ｃ（ＣＨ３）２ＣＨ＝ＣＨ−、−ＣＨ２−Ｃ（ＣＨ３）２−、および
【化１４】
2014079254.tif 000015
から選ばれる基を形成する、
から選ばれる一つ以上の適用可能な特徴を有する、項目３４または３５に記載の試薬。（項目３７）
Ｒ９が、式−Ｃ（Ｏ）Ｒ１０のアリール基であり、ここで、Ｒ１０は、水素、低級アルキル、メチル、−ＣＸ３、−ＣＨＸ２、−ＣＨ２Ｘ、−ＣＨ２−ＯＲｄ、および、低級アルキル、メチル、−Ｘ、−ＯＲｄ、シアノ、またはニトロ基によって任意に一置換されるフェニルから選ばれ、ここで、Ｒｄは、低級アルキル、フェニル、およびピリジルから選ばれ、各Ｘは、ハロ基、通常はフルオロ、またはクロロである、項目３１−３４に記載の試薬。
（項目３８）
Ｒ１０が、メチルおよびトリフルオロメチルから選ばれる、項目３７に記載の試薬。
（項目３９）
前記標識部分が、前記Ｎ−保護ＮＨ−ローダミン部分に対するドナーおよび／またはアクセプター部分をさらに含む、項目１−３８のいずれか１項に記載の試薬。
（項目４０）
前記標識部分が、前記Ｎ−保護ＮＨ−ローダミン部分に対するドナー部分をさらに含む、項目１−３８のいずれか１項に記載の試薬。
（項目４１）
前記ドナー部分が、Ｎ−保護ＮＨ−ローダミン部分またはＯ−保護フルオレセイン部分を含む、項目４０に記載の試薬。
（項目４２）
前記ドナー部分の２’−、２’’−、４’−、５’−、７’−、７’’−、５−、または６−位置が、前記Ｎ−保護ＮＨ−ローダミン部分の２’−、２’’−、４’−、５’−、７’−、７’’−、５−、または６−位置に連結される、項目４１に記載の試薬。
（項目４３）
前記ドナー部分と前記Ｎ−保護ＮＨ−ローダミン部分が、頭部対頭部方向において連結される、項目４２に記載の試薬。
（項目４４）
前記ドナー部分と前記Ｎ−保護ＮＨ−ローダミン部分が、頭部対尾部方向において連結される、項目４２に記載の試薬。
（項目４５）
前記ドナー部分と前記Ｎ−保護ＮＨ−ローダミン部分が、尾部対尾部方向において連結される、項目４２に記載の試薬。
（項目４６）
前記ドナー部分と前記Ｎ−保護ＮＨ−ローダミン部分が、側部対側部方向において連結される、項目４２に記載の試薬。
（項目４７）
前記ドナー部分と前記Ｎ−保護ＮＨ−ローダミン部分が、側部対頭部方向において連結される、項目４２に記載の試薬。
（項目４８）
前記ドナー部分と前記Ｎ−保護ＮＨ−ローダミン部分が、側部対尾部方向において連結される、項目４２に記載の試薬。
（項目４９）
前記標識部分が、構造式（ＶＩ）：
（ＶＩ）  Ａ−Ｚ１−Ｓｐ−Ｚ２−Ｄ
を含み、ここで、Ａは、前記Ｎ−保護ＮＨ−ローダミン部分を表し、Ｄは、前記ドナー部分を表し、同じであっても、異なっていてもよいＺ１およびＺ２は、官能基Ｆｚを含む連結部分によって提供される連結の一部を表し、かつ、Ｓｐは、スペーサー成分を表す、項目４２に記載の試薬。
（項目５０）
Ａが、以下の構造式Ａ．１、Ａ．２、Ａ．３、Ａ．４、Ａ．５、およびＡ．６から選ばれ、Ｄが、以下の構造式Ｄ．１、Ｄ．２、Ｄ．３、Ｄ．４、Ｄ．５、およびＤ．６から選ばれるか、または、Ａが、以下の構造式Ａ．７、Ａ．８、Ａ．９、Ａ．１０、Ａ．１１、およびＡ．１２から選ばれ、Ｄが、以下の構造式Ｄ．７、Ｄ．８、Ｄ．９、Ｄ．１０、Ｄ．１１、およびＤ．１２から選ばれ：
【化１５】
2014079254.tif 000016
【化１６】
2014079254.tif 000017
【化１７】
2014079254.tif 000018
【化１８】
2014079254.tif 000019
ここで：
Ｅ１は、−ＮＨＲ９、−ＮＲ３’Ｒ９、および−ＯＲ９ｂから選ばれ；
Ｅ２は、−ＮＨＲ９、−ＮＲ６’Ｒ９、および−ＯＲ９ｂから選ばれ；
Ｒ９ｂは、Ｒ９であり；
Ｙ１ａ、Ｙ１ｂ、Ｙ２ａ、Ｙ２ｂ、Ｙ３ａ、およびＹ３ｂは、それぞれ互いに独立に、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨ−、−Ｃ（Ｏ）−、および−Ｓ（Ｏ）２−から選ばれ；および、
Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ１’、Ｒ２’、Ｒ２’’、Ｒ３’、Ｒ４’、Ｒ４’’、Ｒ５’、Ｒ５’’、Ｒ６’、Ｒ７’、Ｒ７’’、Ｒ８’、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、およびＲ９は、先に項目３４において定義した通りであり、ただし、Ｅ１およびＥ２が−ＯＲ９ｂである場合、Ｒ１’およびＲ２’、および／またはＲ７’およびＲ８’は、それらが結合する炭素原子のみと一緒に合わされて、任意に置換される（Ｃ６−Ｃ１４）アリール架橋を形成する、
、項目４９に記載の試薬。
（項目５１）
構造式Ａ．１−Ａ．１２および／またはＤ．１−Ｄ．１２が、下記の特徴：
（ｉ）Ｙ１ａ、Ｙ２ａ、およびＹ３ａは、それぞれ互いに独立に、−Ｃ（Ｏ）−および−Ｓ（Ｏ）２−から選ばれ；
（ｉｉ）Ｙ１ｂ、Ｙ２ｂ、およびＹ３ｂは、−ＮＨであり；
（ｉｉｉ）Ｒ４およびＲ７は、それぞれクロロであり；
（ｉｖ）  Ｒ１’およびＲ８’は、それぞれ水素であり；
（ｖ）  Ｒ１’およびＲ２’、またはＲ７’およびＲ８’は、一緒に合わされてベンゾ基を形成し；
（ｖｉ）Ｒ２’およびＲ７’は、それぞれ、水素または低級アルキルであり；
（ｖｉｉ）Ｒ’はＲ３’であり、Ｒ’’はＲ６’であり；および、
（ｖｉｉｉ）Ｒ’はＲ３’であり、Ｒ’’はＲ６’であり、かつ、Ｒ３’およびＲ６’は、隣接炭素原子における置換基と一緒に合わされて、−ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−、−Ｃ（ＣＨ３）２ＣＨ＝Ｃ（ＣＨ３）−、−Ｃ（ＣＨ３）２ＣＨ＝ＣＨ−、−ＣＨ２−Ｃ（ＣＨ３）２−、および
【化１９】
2014079254.tif 000020
から選ばれる基を形成する、
から選ばれる、一つ以上の適用可能な特徴を有する、項目５０に記載の試薬。
（項目５２）
Ｙ１ａ、Ｙ２ａ、およびＹ３ａは−ＮＨであり；Ｙ１ｂ、Ｙ２ｂ、およびＹ３ｂは、−Ｃ（Ｏ）−および−Ｓ（Ｏ）２−から選ばれ；Ｚ１は−Ｃ（Ｏ）−および−Ｓ（Ｏ）２−から選ばれ；Ｚ２は−ＮＨ−であり、かつ、Ｓｐは、−（ＣＨ２）ａ−［（Ａｒ）ｂ−（ＣＨ２）ａ］ｃ−、−（ＣＨ２）ａ−［Ｃ≡Ｃ−（ＣＨ２）ａ］ｃ−、−（ＣＨ２）ａ−［Ｃ≡Ｃ−（Ａｒ）ｂ］ｃ−（ＣＨ２）ａ−、−（ＣＨ２）ｄ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−［（ＣＨ２）ａ−（Ａｒ）−（ＣＨ２）ａ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ］ｃ−（ＣＨ２）ｄ−、および−［ＣＨ２（ＣＨ２）ｅＯ］ｆ−ＣＨ２（ＣＨ２）−から選ばれ、ここで、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、およびＡｒは、先に項目４に定義した通りである、項目５０に記載の試薬。
（項目５３）
構造式Ｄ．１−Ｄ．１２において、Ｒ１’およびＲ２’および／またはＲ７’およびＲ８’が、それらの結合する炭素原子と一緒に合わされてベンゾ基を形成する、項目５０−５２に記載の試薬。
（項目５４）
Ｅ１およびＥ２が、それぞれ、−ＯＲ９ｂである、項目５０−５３に記載の試薬。
（項目５５）
Ｒ９ｂは、Ｒ１０ｂが低級アルキルである、式−Ｃ（Ｏ）Ｒ１０ｂのアリール基である、項目５４に記載の試薬。
（項目５６）
Ｒ１０ｂがｔ−ブチルである、項目５５に記載の試薬。
（項目５７）
Ｒ９が、式−Ｃ（Ｏ）Ｒ１０のアリール基であり、ここで、Ｒ１０は、水素、低級アルキル、メチル、−ＣＸ３、−ＣＨＸ２、−ＣＨ２Ｘ、−ＣＨ２−ＯＲｄ、および、低級アルキル、メチル、−Ｘ、−ＯＲｄ、シアノ、またはニトロ基によって任意に一置換されるフェニルから選ばれ、ここで、Ｒｄは、低級アルキル、フェニル、およびピリジルから選ばれ、各Ｘは、ハロ基、通常はフルオロ、またはクロロである、項目５０−５６に記載の試薬。
（項目５８）
Ｒ１０が、メチルおよびトリフルオロメチルから選ばれる、項目５７に記載の試薬。
（項目５９）
Ｎ−保護ＮＨ−ローダミン部分を含む標識部分を含むオリゴヌクレオチド。
（項目６０）
前記Ｎ−保護ＮＨ−ローダミン部分が、項目３１−５８のいずれか１項に記載の構造を含む、項目５９に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目６１）
前記標識部分が、前記オリゴヌクレオチドの３’−、または５’−ヒドロキシルに連結される、項目５９に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目６２）
前記標識部分が、前記オリゴヌクレオチドの核酸塩基に連結される、項目５９に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目６３）
前記オリゴヌクレオチドが、固相支持体に結合される、項目５９に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目６４）
前記オリゴヌクレオチドが、前記Ｎ−保護ＮＨ−ローダミン部分のドナーおよび／またはアクセプター部分によってさらに標識される、項目５９に記載のオリゴヌクレオチド。（項目６５）
前記オリゴヌクレオチドが、クエンチャー部分によってさらに標識される、項目５９に記載のヌクレオチド。
（項目６６）
前記オリゴヌクレオチドが、小溝結合部分によってさらに標識される、項目５９に記載のオリゴヌクレオチド。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１Ａ】図１Ａは、本明細書に記載される試薬の中に組み込むことが可能な、親ＮＨ−ローダミン染料の例示の実施態様を示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、本明細書に記載される試薬の中に組み込むことが可能な、親ＮＨ−ローダミン染料の例示の実施態様を示す。
【図１Ｃ】図１Ｃは、ＮＨ−ローダミンに対するドナーとして活動することが可能であり、かつ、標識部分が染料ネットワークを構成する実施態様において本明細書に記載される試薬の中に組み込むことが可能な、親フルオレセイン染料の例示実施態様を示す。
【図２】図２は、本明細書に記載される試薬を構成する異なる種々の成分を相互に連結するために使用することが可能な例示のリンカーを示す。
【図３Ａ】図３Ａは、合成ハンドルを含まない、ヌクレオシド性合成試薬の例示実施態様を示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、合成ハンドルを含まない、ヌクレオシド性合成試薬の例示実施態様を示す。
【図４】図４は、合成ハンドルを含まない、非ヌクレオシド性合成試薬の例示実施態様を示す。
【図５】図５は、合成ハンドルを含む、非ヌクレオシド性合成試薬の例示実施態様を示す。
【図６】図６は、合成ハンドルを含む、ヌクレオシド性合成試薬の例示実施態様を示す。
【図７】図７は、非ヌクレオシド性固相支持試薬の例示実施態様を示す。
【図８Ａ】図８Ａは、ヌクレオシド性固相支持試薬の例示実施態様を示す。
【図８Ｂ】図８Ｂは、ヌクレオシド性固相支持試薬の例示実施態様を示す。
【図９Ａ】図９Ａは、５’−ヒドロキシルにおいてＮＨ−ローダミンによって標識されるオリゴヌクレオチドを合成するための、合成試薬の特異的実施態様の使用を示す。
【図９Ｂ】図９Ｂは、５’−ヒドロキシルにおいてＮＨ−ローダミンによって標識されるオリゴヌクレオチドを合成するための、合成試薬の特異的実施態様の使用を示す。
【図９Ｃ】図９Ｃは、５’−ヒドロキシルにおいてＮＨ−ローダミンによって標識されるオリゴヌクレオチドを合成するための、合成試薬の特異的実施態様の使用を示す。
【図９Ｄ】図９Ｄは、５’−ヒドロキシルにおいてＮＨ−ローダミンによって標識されるオリゴヌクレオチドを合成するための、合成試薬の特異的実施態様の使用を示す。
【図１０Ａ】図１０Ａは、その３−ヒドロキシルにおいてエネルギー転移染料によって標識されるオリゴヌクレオチドを合成するための、合成試薬の特異的実施態様の使用を示す。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、その３−ヒドロキシルにおいてエネルギー転移染料によって標識されるオリゴヌクレオチドを合成するための、合成試薬の特異的実施態様の使用を示す。
【図１０Ｃ】図１０Ｃは、その３−ヒドロキシルにおいてエネルギー転移染料によって標識されるオリゴヌクレオチドを合成するための、合成試薬の特異的実施態様の使用を示す。
【図１１Ａ】図１１Ａは、その５’−ヒドロキシルにおいてエネルギー転移染料によって標識されるオリゴヌクレオチドをインサイチュ合成するための、合成試薬の特異的実施態様の使用を示す。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、その５’−ヒドロキシルにおいてエネルギー転移染料によって標識されるオリゴヌクレオチドをインサイチュ合成するための、合成試薬の特異的実施態様の使用を示す。
【図１１Ｃ】図１１Ｃは、その５’−ヒドロキシルにおいてエネルギー転移染料によって標識されるオリゴヌクレオチドをインサイチュ合成するための、合成試薬の特異的実施態様の使用を示す。
【図１１Ｄ】図１１Ｄは、その５’−ヒドロキシルにおいてエネルギー転移染料によって標識されるオリゴヌクレオチドをインサイチュ合成するための、合成試薬の特異的実施態様の使用を示す。
【図１２Ａ】図１２Ａは、その５’−末端においてエネルギー転移染料によって標識されるオリゴヌクレオチドをインサイチュ合成するための、合成試薬の特異的実施態様の使用を示す。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、その５’−末端においてエネルギー転移染料によって標識されるオリゴヌクレオチドをインサイチュ合成するための、合成試薬の特異的実施態様の使用を示す。
【図１２Ｃ】図１２Ｃは、その５’−末端においてエネルギー転移染料によって標識されるオリゴヌクレオチドをインサイチュ合成するための、合成試薬の特異的実施態様の使用を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
５．詳細な説明
前述の一般的説明、および後述の詳細な説明は、共に、例示と説明のためのみのものであって、本明細書に記載される組成物および方法を限定することを意図するものではないことを理解しなければならない。本開示において、「または」の使用は、別様に言明しない限り、「および／または」を意味する。同様に、「複数対象を含む」、「単数対象を含む」、「含む」、「単数対象を包含する」、「複数対象を包含する」、および「包含する」という用言は、限定的であることを意図するものではない。
【００３８】
５．１  定義
本明細書で用いる場合、下記の用語および語句は、下記の意味を持つことが意図される。
【００３９】
「アルキル」は、それ自体、または別の置換基の一部として、親アルカン、アルケン、またはアルキンの単一炭素原子から１個の水素原子が除去されることによって得られる、表示の炭素原子数（すなわち、Ｃ１−Ｃ６は、１から６個の炭素原子を意味する）を有する、飽和または不飽和、分枝または直鎖または環状の、一価の炭化水素ラジカルを指す。典型的アルキル基としては、例えば、ただしこれらに限定されないが、メチル；エチル類、例えば、エタニル、エテニル、エチニル；プロピル類、例えば、プロパン−１−イル、プロパン−２−イル、シクロプロパン−１−イル、プロプ−１−エン−１−イル、プロプ−１−エン−２−イル、プロプ−２−エン−１−イル、シクロプロプ−１−エン−１−イル；シクロプロプ−２−エン−１−イル、プロプ−１−イン−１−イル、プロプ−２−イン−１−イルなど；ブチル類、例えば、ブタン−１−イル、ブタン−２−イル、２−メチル−プロパン−１−イル、２−メチル−プロパン−２−イル、シクロブタン−１−イル、ブト−１−エン−１−イル、ブト−１−エン−２−イル、２−メチル−プロプ−１−エン−１−イル、ブト−２−エン−１−イル、ブト−２−エン−２−イル、ブタ−１，３−ジエン−１−イル、ブタ−１，３−ジエン−２−イル、シクロブト−１−エン−１−イル、シクロブト−１−エン−３−イル、シクロブタ−１，３−ジエン−１−イル、ブト−１−イン−１−イル、ブト−１−イン−３−イル、ブト−３−イン−１−イルなどが挙げられる。特定の飽和レベルが意図される場合は、下に定義されるように、「アルカニル」、「アルケニル」、および／または「アルキニル」などの名称が用いられる。本明細書で用いる場合、「低級アルキル」とは、（Ｃ１−Ｃ８）アルキルを意味する。
【００４０】
「アルカニル」は、それ自体、または別の置換基の一部として、親アルカンの単一炭素原子から１個の水素原子が除去されることによって得られる、飽和した、分枝、直鎖または環状のアルキルを指す。典型的アルカニル基としては、例えば、ただしこれらに限定されないが、メタニル；エタニル；プロパニル類、例えば、プロパン−１−イル、プロパン−２−イル（イソプロピル）、シクロプロパン−１−イルなど；ブタニル類、例えば、ブタン−１−イル、ブタン−２−イル（ｓｅｃ−ブチル）、２−メチル−プロパン−１−イル（イソブチル）、２−メチル−プロパン−２−イル（ｔ−ブチル）、シクロブタン−１−イルなどが挙げられる。本明細書で用いる場合、「低級アルカニル」とは、（Ｃ１−Ｃ８）アルカニルを意味する。
【００４１】
「アルケニル」は、それ自体、または別の置換基の一部として、親アルケンの単一炭素原子から１個の水素原子が除去されることによって得られる、少なくとも一つの炭素−炭素二重結合を有する、不飽和の、分枝、直鎖または環状のアルキルを指す。この基は、二重結合（単数または複数）の周囲に、ｃｉｓまたはｔｒａｎｓ立体配座として存在してもよい。典型的アルケニル基としては、例えば、ただしこれらに限定されないが、エテニル；プロペニル類、例えば、プロプ−１−エン−１−イル、プロプ−１−エン−２−イル、プロプ−２−エン−１−イル、プロプ−２−エン−２−イル、シクロプロプ−１−エン−１−イル；シクロプロプ−２−エン−１−イル；ブテニル類、例えば、ブト−１−エン−１−イル、ブト−１−エン−２−イル、２−メチル−プロプ−１−エン−１−イル、ブト−２−エン−１−イル、ブト−２−エン−２−イル、ブタ−１，３−ジエン−１−イル、ブタ−１，３−ジエン−２−イル、シクロブト−１−エン−１−イル、シクロブト−１−エン−３−イル、シクロブタ−１，３−ジエン−１−イルなどが挙げられる。本明細書で用いる場合、「低級アルケニル」とは、（Ｃ１−Ｃ８）アルケニルを意味する。
【００４２】
「アルキニル」は、それ自体、または別の置換基の一部として、親アルキンの単一炭素原子から１個の水素原子が除去されることによって得られる、少なくとも一つの炭素−炭素三重結合を有する、不飽和の、分枝、直鎖または環状のアルキルを指す。典型的アルキニル基としては、例えば、ただしこれらに限定されないが、エチニル；プロピニル類、例えば、プロプ−１−イン−１−イル、プロプ−２−イン−１−イルなど；ブチニル類、例えば、ブト−１−イン−１−イル、ブト−１−イン−３−イル、ブト−３−イン−１−イルなどが挙げられる。本明細書で用いる場合、「低級アルキニル」とは、（Ｃ２−Ｃ８）アルキニルを意味する。
【００４３】
「アルキルジイル」は、それ自体、または別の置換基の一部として、親アルカン、アルケン、またはアルキンの単一炭素原子から１個の水素原子が除去されることによって得られるか、または、親アルカン、アルケン、またはアルキンの単一炭素原子から２個の水素原子が除去されることによって得られる、表示の炭素原子数（すなわち、Ｃ１−Ｃ６は、１から６個の炭素原子を意味する）を有する、飽和または不飽和の、分枝、直鎖または環状の、二価の炭化水素基を指す。この二つの、一価のラジカル中心、または、この二価のラジカル中心の各結合手は、同じまたは異なる原子と結合腕を形成することが可能である。典型的アルキジル基としては、例えば、ただしこれらに限定されないが、メタンジイル；エチルジイル類、例えば、エタン−１，１−ジイル、エタン−１，２−ジイル、エテン−１，１−ジイル、エテン−１，２−ジイル；プロピルジイル類、例えば、プロパン−１，１−ジイル、プロパン−１，２−ジイル、プロパン−２，２−ジイル、プロパン−１，３−ジイル、シクロプロパン−１，１−ジイル、シクロプロパン−１，２−ジイル、プロプ−１−エン−１，１−ジイル、プロプ−１−エン−１，２−ジイル、プロプ−２−エン−１，２−ジイル、プロプ−１−エン−１，３−ジイル、シクロプロプ−１−エン−１，２−ジイル、シクロプロプ−２−エン−１，２−ジイル、シクロプロプ−２−エン−１，１−ジイル、プロプ−１−イン−１，３−ジイルなど；ブチルジイル類、例えば、ブタン−１，１−ジイル、ブタン−１，２−ジイル、ブタン−１，３−ジイル、ブタン−１，４−ジイル、ブタン−２，２−ジイル、２−メチル−プロパン−１，１−ジイル、２−メチル−プロパン−１，２−ジイル、シクロブタン−１，１−ジイル；シクロブタン−１，２−ジイル、シクロブタン−１，３−ジイル、ブト−１−エン−１，１−ジイル、ブト−１−エン−１，２−ジイル、ブト−１−エン−１，３−ジイル、ブト−１−エン−１，４−ジイル、２−メチル−プロプ−１−エン−１，１−ジイル、２−メタニリデン−プロパン−１，１−ジイル、ブタ−１，３−ジエン−１，１−ジイル、ブタ−１，３−ジエン−１，２−ジイル、ブタ−１，３−ジエン−１，３−ジイル、ブタ−１，３−ジエン−１，４−ジイル、シクロブト−１−エン−１，２−ジイル、シクロブト−１−エン−１，３−ジイル、シクロブト−２−エン−１，２−ジイル、シクロブタ−１，３−ジエン−１，２−ジイル、シクロブタ−１，３−ジエン−１，３−ジイル、ブト−１−イン−１，３−ジイル、ブト−１−イン−１，４−ジイル、ブタ−１，３−ジイン−１，４−ジイルなどが挙げられる。特定の飽和レベルが意図される場合、アルカニルジイル、アルケニルジイル、および／またはアルキニルジイルという名称が用いられる。ある実施態様では、アルキジル基は、（Ｃ１−Ｃ８）アルキジルである。特定の実施態様は、ラジカル中心が、末端炭素にある、飽和、非環状アルカニルジイル基、例えば、メタンジイル（メタノ）；エタン−１，２−ジイル（エタノ）；プロパン−１，３−ジイル（プロパノ）；ブタン−１，４−ジイル（ブタノ）（これらは、下記に定義するように、アルキレノとも呼ばれる）などを含む。本明細書で用いる場合、「低級アルキル」とは、（Ｃ１−Ｃ８）アルキルジイルを意味する。
【００４４】
「アルキレン」は、それ自体、または別の置換基の一部として、直鎖または分枝親アルカン、アルケン、またはアルキンの、２個の末端炭素原子のそれぞれから、１個の水素原子が除去されることによって得られるか、または、親シクロアルキルの、２個の異なる環原子のそれぞれから１個の水素原子が除去されることによって得られる、２個の末端一価ラジカル中心を有する、直鎖、飽和または不飽和のアルキルジイル基を指す。ある特定のアルキレンにおける二重結合または三重結合の位置は、もしもある場合は、角型括弧において示される。典型的アルキレン基としては、例えば、ただしこれらに限定されないが、メチレン（メタノ）；エチレン類、例えば、エタノ、エテノ、エチノ；プロピレン類、例えば、プロパノ、プロプ［１］エノ、プロパ［１，２］ジエノ、プロプ［１］イノなど；ブチレン類、例えば、ブタノ、ブト［１］エノ、ブト［２］エノ、ブタ［１，３］ジエノ、ブト［１］イノ、ブト［２］イノ、ブタ［１，３］ジイノなどが挙げられる。特定の飽和レベルが意図される場合、アルカノ、アルケノ、および／またはアルキノという名称が用いられる。ある実施態様では、アルキレン基は、（Ｃ１−Ｃ８）または（Ｃ１−Ｃ３）アルキレンである。特定実施態様は、直鎖の、飽和アルカノ基、例えば、メタノ、エタノ、プロパノ、ブタノなどを含む。本明細書で用いる場合、「低級アルキル」とは、（Ｃ１−Ｃ８）アルキレンを意味する。
【００４５】
「ヘテロアルキル」、「ヘテロアルカニル」、「ヘテロアルケニル」、「ヘテロアルキニル」、「ヘテロアルキルジイル」、および「ヘテロアルキレン」は、それ自体、または別の置換基の一部として、炭素原子の一つ以上が、独立に、同じ、または異なるヘテロ原子、またはヘテロ原子基によって置換される、それぞれ、アルキル、アルカニル、アルケニル、アルキニル、アルキルジイル、およびアルキレン基を指す。炭素原子を置換することが可能な、典型的ヘテロ原子および／またはヘテロ原子基としては、例えば、ただしこれらに限定されないが、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓ−Ｏ−、−ＮＲ’−、−ＰＨ−、−Ｓ（Ｏ）−、−ＳＯ２−、−Ｓ（Ｏ）ＮＲ’−、−ＳＯ２ＮＲ’−など、およびそれらの組み合わせが挙げられる。ここで、Ｒ’は、水素か、または置換基、例えば、（Ｃ１−Ｃ８）アルキル、（Ｃ６−Ｃ１４）アリール、または（Ｃ７−Ｃ２０）アリールアルキルである。
【００４６】
「シクロアルキル」および「ヘテロシクロアルキル」は、それ自体、または別の置換基の一部として、それぞれ、「アルキル」および「ヘテロアルキル」基の環状形を指す。ヘテロアルキル基では、ヘテロ原子は、分子の残余部分に付着する位置を占めることが可能である。典型的シクロアルキル基としては、例えば、ただしこれらに限定されないが、シクロプロピル；シクロブチル類、例えば、シクロブタニル、およびシクロブテニル；シクロペンチル類、例えば、シクロペンタニル、およびシクロペンテニル；シクロヘキシル類、例えば、シクロヘキサニル、およびシクロヘキセニルなどが挙げられる。典型的ヘテロシクロアルキル基としては、例えば、ただしこれらに限定されないが、テトラヒドロフラニル（例えば、テトラヒドロフラン−２−イル、テトラヒドロフラン−３−イルなど）、ピペリジニル（例えば、ピペリジン−１−イル、ピペリジン−２−イルなど）、モルフォリニル（例えば、モルフォリン−３−イル、モルフォリン−４−イルなど）、ピペラジニル（例えば、ピペラジン−１−イル、ピペラジン−２−イルなど）などが挙げられる。
【００４７】
「親芳香族環系」とは、共役π電子システムを有する、不飽和の単環または多環システムを指す。「親芳香族環系」の定義の中に指定されて含まれるのは、環のうちの一つ以上が芳香族であり、かつ、環のうちの一つ以上が、飽和か不飽和である、融合環システムであって、例えば、フルオレン、インダン、インデン、フェナレン、テトラヒドロナフタレンなどである。典型的親芳香族環系としては、例えば、ただしこれらに限定されないが、アセアントリレン、アセナフチレン、アセフェナントリレン、アントラセン、アズレン、ベンゼン、クリセン、コロネン、フルオランテン、フルオレン、ヘキサセン、ヘキサフェン、ヘキサレン、インダセン、ｓ−インダセン、インダン、インデン、ナフタレン、オクタセン、オクタフェン、オクタレン、オバレン、ペンタセン、ペンタレン、ペンタフェン、ペリレン、フェナレン、フェナントレン、ピセン、プレイアデン、ピレン、ピラントレン、ルビセン、テトラヒドロナフタレン、トリフェニレン、トリナフタレンなどが挙げられる。
【００４８】
「アリール」は、それ自体、または別の置換基の一部として、親芳香族環系の単一炭素原子から１個の水素原子が除去されることによって得られる、表示の炭素原子数（すなわち、Ｃ６−Ｃ１４は、６から１４個の炭素原子を意味する）を有する、一価の芳香族炭化水素基を指す。典型的アリール基としては、例えば、ただしこれらに限定されないが、アセアントリレン、アセナフチレン、アセフェナントリレン、アントラセン、アズレン、ベンゼン、クリセン、コロネン、フルオロアンテン、フルオレン、ヘキサセン、ヘキサフェン、ヘキサレン、ａｓ−インダセン、ｓ−インダセン、インダン、インデン、ナフタレン、オクタセン、オクタフェン、オクタレン、オバレン、ペンタセン、ペンタレン、ペンタフェン、ペリレン、フェナレン、フェナントレン、ピセン、プレイアデン、ピレン、ピラントレン、ルビセン、トリフェニレン、トリナフタレンなどの外、その、種々のヒドロ異性形が挙げられる。指定の例示アリールとして、フェニルおよびナフチルが挙げられる。
【００４９】
「アリールアルキル」は、それ自体、または別の置換基の一部として、炭素原子に、ある実施態様では、末端、またはｓｐ３炭素原子に結合する水素原子のうちの一つが、アリール基によって置換される非環状アルキル基を指す。典型的アリールアルキル基としては、例えば、ただしこれらに限定されないが、ベンジル、２−フェニルエタン−１−イル、２−フェニルエテン−１−イル、ナフチルメチル、２−ナフチルエタン−１−イル、２−ナフチルエテン−１−イル、ナフトベンジル、２−ナフトフェニルエタン−１−イルなどが挙げられる。ある指定の飽和度を有するアルキル成分が望まれる場合、アリールアルカニル、アリールアルケニル、および／またはアリールアルキニルという名称が用いられる。ある定められた数の炭素原子、例えば、（Ｃ７−Ｃ２０）が言及される場合、その数字は、該アリールアルキル基を構成する炭素原子の全数を指す。
【００５０】
「親ヘテロ芳香族環系」は、一つ以上の炭素原子が、それぞれ独立に、同じか、または異なるヘテロ原子基によって置換される親芳香族環系を指す。炭素原子を置換する、典型的ヘテロ原子、またはヘテロ原子基としては、例えば、ただしこれらに限定されないが、Ｎ、ＮＨ、Ｐ、Ｏ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、ＳＯ２、Ｓｉなどが挙げられる。具体的に「親ヘテロ芳香族環系」の定義の中に含まれるものは、環のうちの一つ以上が芳香族であり、環のうちの一つ以上が飽和または不飽和である、融合環システム、例えば、ベンゾジオキサン、ベンゾフラン、クロマン、クロメン、インドール、インドリン、キサンテンなどである。さらに、「親ヘテロ芳香族環系」の定義の中に含まれるものは、一般的置換基を含む、認知済みの環、例えば、ベンゾピロン、および１−メチル−１，２，３，４−テトラゾルである。典型的親ヘテロ原子環システムとしては、例えば、ただしこれらに限定されないが、アクリジン、ベンジミダゾール、ベンジソキサゾール、ベンゾジオキサン、ベンゾジオキソール、ベンゾフラン、ベンゾピロン、ベンゾチアジアゾール、ベンゾチアゾール、ベンゾトリアゾール、ベンゾキサキン、ベンゾキサゾール、ベンゾキサゾリン、カルバゾール、β−カルボリン、クロマン、クロメン、シノリン、フラン、イミダゾール、インダゾール、インドール、インドリン、インドリジン、イソベンゾフラン、イソクロメン、イソインドール、イソインドリン、イソインドリン、イソキノリン、イソチアゾール、イソキサゾール、ナフチリジン、オキサジアゾール、オキサゾール、ペリミジン、フェナントリジン、フェナントロリン、フェナジン、フタラジン、プテリジン、プリン、ピラン、ピラジン、ピラゾール、ピリダジン、ピリジン、ピリミジン、ピロール、ピロリジン、キナゾリン、キノリン、キノリジン、キノキサリン、テトラゾール、チアジアゾール、チアゾール、チオフェン、トリアゾール、キサンテンなどが挙げられる。
【００５１】
「ヘテロアリール」は、それ自体、または別の置換基の一部として、親ヘテロ芳香族環系の単一原子から１個の水素原子が除去されることによって得られる、表示の数の環原子（例えば、「５−１４員」とは、５から１４個の環原子を意味する）を有する、一価のヘテロ芳香基を指す。典型的ヘテロアリール基としては、例えば、ただしこれらに限定されないが、アクリジン、ベンジミダゾール、ベンズイソキサゾール、ベンゾジオキサン、ベンゾジアキソール、ベンゾフラン、ベンゾピロン、ベンゾチアジアゾール、ベンゾチアゾール、ベンゾトリアゾール、ベンゾキサジン、ベンゾキサゾール、ベンゾキサゾリン、カルバゾール、β−カルボリン、クロマン、クロメン、シノリン、フラン、イミダゾール、インダゾール、インドール、インドリン、インドリジン、イソベンゾフラン、イソクロメン、イソインドール、イソインドリン、イソキノリン、イソチアゾール、イソキサゾール、ナフチリジン、オキサジアゾール、オキサゾール、ペリミジン、フェナントリジン、フェナントロリン、フェナジン、フタラジン、プテリジン、プリン、ピラン、ピラジン、ピラゾール、ピリダジン、ピリジン、ピリミジン、ピロール、ピロリジン、キナゾリン、キノリン、キノリジン、キノキサリン、テトラゾール、チアジアゾール、チアゾール、チオフェン、トリアゾール、キサンテンなどの外、その、種々のヒドロ異性形が挙げられる。
【００５２】
「ヘテロアリールアルキル」は、それ自体、または別の置換基の一部として、炭素原子に、ある実施態様では、末端、またはｓｐ３炭素原子に結合する水素原子のうちの一つが、ヘテロアリール基によって置換される非環状アルキル基を指す。ある指定の飽和度を有するアルキル成分が意図される場合、ヘテロアリールアルカニル、ヘテロアリールアルケニル、および／またはヘテロアリールアルキニルという名称が用いられる。ある定められた数の原子、例えば、６−２０員のヘテロアリールアルキルが言及される場合、その数字は、該アリールアルキル基を構成する原子の全数を指す。
【００５３】
「ハロアルキル」は、それ自体、または別の置換基の一部として、水素原子のうちの一つ以上が、ハロゲンによって置換されるアルキル基を指す。したがって、「ハロアルキル」という用語は、モノハロアルキル類、ジハロアルキル類、トリハロアルキル類など、過ハロアルキル類までを含めることが意図される。例えば、「（Ｃ１−Ｃ２）ハロアルキル」という表現は、フルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、１−フルオロエチル、１，１−ジフルオロエチル、１，２−ジフルオロエチル、１，１，１−トリフルオロエチル、パーフルオロエチルなどを含む。
【００５４】
上に定義した基は、さらに別の周知の置換基を創出するために一般に用いられる、接頭語および／または接尾語を含んでもよい。具体的、非限定的例として、「アルキルオキシ」および／または「アルコキシ」は、式−ＯＲ’’の基を指し、「アルキルアミン」は、式−ＮＨＲ’’の基を指し、「ジアルキルアミン」は、式−ＮＲ’’Ｒ’’の基を指し、ここで、各Ｒ’’は、アルキルである。
【００５５】
５．２  例示実施態様
本開示は、ローダミン染料を含む標識部分を担持するオリゴヌクレオチドを化学的に合成するために使用することが可能な試薬を提供する。従来、一部は、オリゴヌクレオチドの段階的化学合成において一般的に用いられる合成および／または脱保護条件に対して安定なローダミン含有合成試薬の入手の難しさのために、ローダミン標識オリゴヌクレオチドを化学的に合成することが困難であった。現在、アセチル基などの塩基不安定な保護基でＮＨ−ローダミン染料の環外アミン基を保護することによって、オリゴヌクレオチドの固相合成に一般的に用いられる化学的合成および脱保護条件に対して安定なＮ−保護ＮＨ−ローダミン染料が得られることが発見された。その結果、ローダミン染料を含む標識部分で標識したオリゴヌクレオチドを合成するために使用される試薬の中に、Ｎ−保護ＮＨ−ローダミンを組み込むことが可能となり、そのため、標識を合成後に付着させる必要が回避される。標識は合成時に付着されるので、得られる標識オリゴヌクレオチドは、ＨＰＬＣを使用することなく使用に備えて精製することが可能である。
【００５６】
この試薬は、オリゴヌクレオチドの、段階的固相合成に関して周知の、試薬および化学の各種特性を利用し、オリゴヌクレオチド鎖の段階的固相合成時、ヒドロキシル基に付着することが可能な合成試薬の形を取ることも可能であるし、あるいは、ヌクレオシドホスホロアミダイト試薬、および／または、任意の他の試薬などのヌクレオシドモノマー試薬が、合成オリゴヌクレオチドを生成するために、段階的に結合される固相支持試薬の形をとることが可能である。
【００５７】
合成および固相支持体試薬は、ヌクレオシド成分を含むことが可能であるという意味で、その性質がヌクレオシド性であってもよいし、あるいは、性質が非ヌクレオシド性であってもよい。
【００５８】
本明細書に記載される試薬は全て、Ｎ−保護ＮＨ−ローダミン染料または成分を含む、標識部分を含む。このＮ−保護ＮＨ−ローダミン染料は、標識部分を構成する唯一の染料であってもよいし、あるいは、より大きな染料ネットワークを構成する二つ以上の染料のうちの一つであってもよい。固相支持試薬はさらに、固相支持体、および、追加の基がそれに結合することが可能な、一つ以上の合成ハンドルを含む。合成試薬はさらに、該試薬を、一次ヒドロキシル基に結合させるのに有用なリン酸エステル前駆体基を含み、かつ、任意に一つ以上の合成ハンドルを含んでもよい。これらの試薬を構成する、各種成分および基は、それぞれの機能を実行することを可能とする限り、いずれの方式、方向性で互いに結合させることも可能である。それらは、成分に含まれる結合基を介して相互に結合されてもよいし、あるいは、リンカーの助けを借りて相互に結合されてもよい。
【００５９】
本明細書に記載される試薬を構成する、各種成分、基、およびリンカーは、より詳細に下記に記載される。
【００６０】
５．３  リンカーおよび結合基
本明細書に記載される試薬を構成する、各種の基および成分は、通常、リンカーによって互いに接続される。いずれのものであれ、ある特定のリンカーとして何を選ぶかは、一部は、互いに連結される成分の内容に依存する。一般に、リンカーは、標識オリゴヌクレオチドの合成のために用いられる合成条件、例えば、亜リン酸トリエステル法によってオリゴヌクレオチドを合成するために一般的に用いられる条件に対して安定なものである限り、原子または官能基同士の、事実上任意の組み合わせを含むことが可能な、スペーサ成分を含み、その構造は直線状、分枝状、または環状であってもよく、あるいは、直線、分枝、および／または環状構造の組み合わせを含んでもよい。このスペーサー成分は、モノマー性であってもよいし、あるいは、ポリマー性の領域であっても、ポリマー性領域を含んでもよい。スペーサー成分は、特定の性質、例えば、特定条件下に分断される能力、または、特定の、剛性度、屈曲度、疎水度、および／または親水度を持つように設計されてもよい。
【００６１】
下記にさらに詳細に記載されるように、本明細書に記載される試薬の多くの実施態様は、合成素子を指定の方式で縮合し所望の試薬を生成することによって合成される。各合成素子は、通常、所望の結合を形成するのに好適な、一つ以上の連結基を含む。一般に、連結基は、別の官能基Ｆｚと反応することが可能であるか、または、活性化されると該別の官能基と反応することが可能となり共有結合Ｙ−Ｚを生成する、官能基Ｆｙを含む。ここで、Ｙは、Ｆｙによって寄与される結合部分を表し、Ｚは、Ｆｚによって寄与される結合部分を表す。このような基ＦｙおよびＦｚは、本明細書では、「相補的官能基」と呼ばれる。
【００６２】
互いに共有的結合を形成することが可能な相補的官能基ペアは、従来技術で周知される。ある実施態様では、ＦｙまたはＦｚの一方が求核基を含み、ＦｙまたはＦｚの他方が求電子基を含む。各種合成条件およびその他の条件に対して安定な結合（または、適切に活性化されると結合を形成するか、または形成することが可能な、その前駆体）を形成するために有用な、相補的求核基および求電子基は、従来技術で周知である。本明細書に記載される各種試薬において結合を実行するために使用することが可能な、適切な相補的求核および求電子基の例、および、それらによって形成される結合が、下記の表１に示される。
【００６３】
【表１−１】
2014079254.tif 000021
【００６４】
【表１−２】
2014079254.tif 000022
＊従来技術で理解される活性化エステルは、一般に−Ｃ（Ｏ）Ωを有し、式中Ωは、優れた脱離基（例えば、オシキスクシニミジル、オキシスルフォスクシニミジル、１−オキシベンゾトリアゾリルなど）である。
＊＊アジ化アシルは再編成されてイソシアネートとなることが可能である。
【００６５】
したがって、リンカーは、一般に式ＬＧ−Ｓｐ−ＬＧによって記述することが可能であり、式中、各ＬＧは、他方に対して独立に、結合基を表し、Ｓｐは、スペーサー成分を表す。ある実施態様では、リンカー合成素子は、式ＦＺ−Ｓｐ−ＦＺによって記述することが可能であり、各ＦＺは、他方に対して独立に、前述のような、相補的求核または求電子官能基ペアの一員を表す。特異的実施態様では、各ＦＺは、他方に対して独立に、上の第１表に挙げた基から選ばれる。この種のリンカー合成素子は、式−Ｚ−Ｓｐ−Ｚ−のリンカー成分を形成する。式中、各Ｚは、他方に対して独立に、前述の結合の一部を表す。
【００６６】
本明細書に記載される試薬において指定の基および成分を互いに連結するために好適な特異的リンカーは、該試薬の例示実施態様に関連してさらに詳細に後述される。本明細書の記載される試薬を含む様々な基および成分をお互いに連結するために使用され得るリンカーの非制限例示実施態様は図２において示される、Ｚ１およびＺ２はそれぞれ、互いに独立に、前述の官能基ＦＺによって担当される結合の一部を表し、Ｋは、−ＣＨおよび−Ｎ−から選ばれる。図２に描かれるリンカーのある特異的実施態様では、Ｚ１またはＺ２の一方は−ＮＨであり、他方は、−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、および−Ｓ（Ｏ）２−から選ばれる。
【００６７】
５．４  標識部分
本明細書に記載される試薬は全て、環外アミン基において、特異的性質を有する保護基によって保護されるＮＨ−ローダミン染料を含む標識部分を含む。一般に、ローダミン染料は、四つの主要な特性によって特徴づけられる。すなわち、（１）親キサンテン環；（２）環外アミン置換基；（３）環外イミニウム置換基；および（４）オルト位置においてカルボキシル基によって置換されるフェニル基である。環外アミンおよび／またはイミニウム基は、通常、親キサンテン環のＣ３およびＣ６炭素原子に配置される。もっとも、親キサンテン環が、Ｃ３およびＣ４炭素、および／またはＣ５およびＣ６炭素に融合するベンゾ基を含む「拡張型」ローダミンも知られている。これらの拡張型ローダミンでは、特徴的環外アミンおよびイミニウム基は、拡張型キサンテン環の対応位置に配置される。
【００６８】
カルボキシル置換フェニル基が、親キサンテン環のＣ９炭素に付着される。オルトカルボキシル置換基があるために、ローダミン染料は、二つの異なる形態として存在することが可能である。すなわち、（１）開放型、酸性形および（２）閉鎖型、ラクトン形である。いかなる動作理論によって拘束されることも意図するものではないが、本明細書に記載される例示のＮ−保護ＮＨ−ローダミン染料のＮＭＲスペクトラムは、染料のスピロラクトン形と一致するので、本明細書に記載される試薬の標識部分を構成するＮ−保護ＮＨ−ローダミン染料は、閉鎖型スピロラクトン形を取ると考えられる。したがって、各種ローダミンは、その未保護形も含めて、本明細書では、閉鎖型スピロラクトン形として描かれる。しかしながら、これは、単に便利のためだけであり、本明細書に記載される試薬を、染料のラクトン形に限定することを意図するものではない。
【００６９】
閉鎖型スピロラクトン形では、親キサンテン環のＡおよびＣ環は、芳香族性であり、Ｃ３’およびＣ６’置換基は共にアミンである。本明細書に記載される標識部分に含まれるローダミン染料の環外アミン基は、これらのアミン基が一次または二次アミンとなるように、未置換であるか、一置換される。このようなローダミン染料は、本明細書では「ＮＨ−ローダミン」と呼ばれる。したがって、本明細書で用いる「ＮＨ−ローダミン」は、一般に、下記の親ＮＨ−ローダミン環構造のうちの一つを含む。
【００７０】
【化２０】
2014079254.tif 000023
上に示した親ＮＨ−ローダミン環では、ローダミン染料の閉鎖型スピロラクトン形について通常使用される番号付け通則にならって採用した任意の番号付け通則を用いて、種々の炭素原子に番号を付してある。この番号付けシステムは、ただ便利のためだけに使用するのであって、いかなる意味でも限定的であることを意図しない。
【００７１】
構造式（Ｉａ）、（Ｉｂ）、および（Ｉｃ）の親ＮＨ−ローダミン環では、Ｒ３’およびＲ６’は、環外アミンを置換する水素または置換基を表す。このＲ３’および／またはＲ６’置換基は、同じであっても異なっていてもよく、置換または未置換の、アルキル、アリール、またはアリールアルキル基を含んでもよい。それとは別に、Ｒ３’および／またはＲ６’は、隣接炭素原子に架橋される置換基を含み、そのため、図示の窒素原子が、５−または６−環原子を含む環の中に含まれるようになってもよい。その環は、飽和していても、または未飽和であってもよく、環原子のうちの一つ以上が置換されていてもよい。環原子（単複）が置換される場合、置換基は、通常、互いに独立に、低級アルキル、Ｃ６−Ｃ１０アリール、およびＣ７−Ｃ１６アリールアルキル基から選ばれる。それとは別に、二つの隣接環原子は、アリール架橋、例えば、ベンゾまたはナフト基の中に含まれてもよい。Ｒ３’および／またはＲ６’基が水素または低級アルキルであるか、または、隣接炭素原子と共に任意に置換される環の中に含まれる、構造式（Ｉａ）による、親ＮＨ−ローダミン環を含むローダミン染料の、非限定的例示実施態様が、図１Ａに示される。Ｒ３’およびＲ６’基が水素または低級アルキルであるか、または、隣接炭素原子と共に任意に置換される環の中に含まれる、構造式（Ｉｃ）による、親ＮＨ−ローダミン環を含むローダミン染料の、非限定的例示実施態様が、図１Ｂに示される。
【００７２】
構造式（Ｉａ）、（Ｉｂ）、および（Ｉｃ）による親ＮＨ−ローダミン環の位置Ｃ１’、Ｃ２’、Ｃ２’’、Ｃ４’、Ｃ４’’、Ｃ５’、Ｃ５’’、Ｃ７’、Ｃ７’’、およびＣ８’は、互いに独立に、置換基によって置換されてもよい。これらの位置においてローダミン染料を置換するのに有用な基は、従来技術において周知であり、例えば、米国特許第４，６２２，４００号、米国特許第５，７５０，４０９号、米国特許第５，８４７，１６２号、米国特許第６，０１７，７１２号、米国特許第６，０８０，８５２号、米国特許第６，１８４，３７９号、および米国特許第６，２４８，８８４号に記載される。なお、これらの開示を引用により本明細書に含める。これらの置換基は全て、本明細書に記載される親ＮＨ−ローダミン環を置換するために使用することが可能である。
【００７３】
ある実施態様では、置換基は、互いに独立に、低級アルキル、（Ｃ６−Ｃ１４）アリール、（Ｃ７−Ｃ２０）アリールアルキル、５−１４員ヘテロアリール、６−２０員ヘテロアリールアルキル、−Ｒｂ、および、−（ＣＨ２）ｘ−Ｒｂで、式中、ｘは１から１０の範囲の整数で、Ｒｂは、−Ｘ、−ＯＨ、−ＯＲａ、−ＳＨ、−ＳＲａ、−ＮＨ２、−ＮＨＲａ、−ＮＲｃＲｃ、−Ｎ＋ＲｃＲｃＲｃ、ペルハロ低級アルキル、トリハロメチル、トリフルオロメチル、−Ｂ（ＯＨ）３、−Ｂ（ＯＲａ）３、−Ｂ（ＯＨ）Ｏ−、−Ｂ（ＯＲａ）２Ｏ−、−Ｂ（ＯＨ）（Ｏ−）２、−Ｂ（ＯＲａ）（Ｏ−）２、−Ｐ（ＯＨ）２、−Ｐ（ＯＨ）Ｏ−、−Ｐ（ＯＲａ）２、−Ｐ（ＯＲａ）Ｏ−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）Ｏ−、−Ｐ（Ｏ）（Ｏ−）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲａ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲａ）Ｏ−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）（ＯＲａ）、−ＯＰ（ＯＨ）２、−ＯＰ（ＯＨ）Ｏ−、−ＯＰ（ＯＲａ）２、−ＯＰ（ＯＲａ）Ｏ−、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）２、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）Ｏ−、−ＯＰ（Ｏ）（Ｏ−）２、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＲａ）２、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＲａ）Ｏ−、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＲａ）（ＯＨ）、−Ｓ（Ｏ）２Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２ＯＨ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒａ、−Ｃ（Ｏ）Ｈ、−Ｃ（Ｏ）Ｒａ、−Ｃ（Ｓ）Ｘ、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＲａ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲｃＲｃ、−Ｃ（Ｓ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＲａ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲｃＲｃ、−Ｃ（ＮＨ）ＮＨ２、−Ｃ（ＮＨ）ＮＨＲａ、および−Ｃ（ＮＨ）ＮＲｃＲｃから選ばれ、ここで、Ｘはハロであり（好ましくは、フルオロ、またはクロロであり）、各Ｒａは、他と独立に、低級アルキル、（Ｃ６−Ｃ１４）アリール、（Ｃ７−Ｃ２０）アリールアルキル、５−１４員ヘテロアリール、および６−２０員ヘテロアリールアルキルから選ばれ、各Ｒｃは、他と独立に、Ｒａであるか、またはそれとは別に、同じ窒素原子に結合する二つのＲｃは、その窒素原子と一緒になって、５−８員の飽和または未飽和の環であって、通常、Ｏ、Ｎ、およびＳから選ばれる、同じまたは異なる環ヘテロ原子のうちの一つ以上を任意に含んでよい環を形成してもよい。
【００７４】
それとは別に、Ｃ１’およびＣ２’置換基、Ｃ７’およびＣ８’置換基、Ｃ５’およびＣ５’’置換基、および／またはＣ４’およびＣ４’’置換基は、Ｃ１’およびＣ２’置換基、およびＣ７’およびＣ８’置換基が、アリール架橋に同時に含まれない限り、一緒に合わされて、置換または未置換のアリール架橋、例えば、ベンゾ架橋を形成することが可能である。
【００７５】
一般に、Ｃ１’、Ｃ２’、Ｃ２’’、Ｃ４’、Ｃ４’’、Ｃ５’、Ｃ５’’、Ｃ７’、Ｃ７’’、およびＣ８’を置換するために用いられる基は、ローダミン染料の反応停止を促進してはならない。ただし、ある実施態様では、反応停止性置換基が望ましい場合がある。ローダミン染料の反応を停止する傾向のある置換基としては、カルボニル、カルボキシレート、重金属、ニトロ、ブロモ、およびイオドが挙げられる。Ｒ３’および／またはＲ６’に配置されるフェニル基も、反応停止を招く傾向がある。
【００７６】
さらに、構造式（Ｉａ）、（Ｉｂ）、および（Ｉｃ）の、親ＮＨ−ローダミン環の位置Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、およびＣ７の炭素原子は、互いに独立に、任意の置換基を含んでもよい。これらの置換基は、前述の種々の置換基の中から選ぶことが可能である。ある実施態様では、位置Ｃ４およびＣ７の炭素原子がクロロ基によって置換され、そのため、親ＮＨ−ローダミン染料は、ＮＨ−４，７−ジクロロローダミン染料となる。
【００７７】
本明細書に記載される試薬の標識部分の中に含めることが可能な、構造式（Ｉａ）、（Ｉｂ）、および（Ｉｃ）による親ＮＨ−ローダミン環を含むローダミン染料は、莫大な数のものが従来技術で知られており、例えば、米国特許第６，２４８，８８４号、米国特許第６，１１１，１１６号、米国特許第６，０８０，８５２号、米国特許第６，０５１，７１９号、米国特許第６，０２５，５０５号、米国特許第６，０１７，７１２号、米国特許第５，９３６，０８７号、米国特許第５，８４７，１６２号、米国特許第５，８４０，９９９号、米国特許第５，７５０，４０９号、米国特許第５，３６６，８６０号、米国特許第５，２３１，１９１号、米国特許第５，２２７，４８７号、ＷＯ９７／３６９６０；ＷＯ９９／２７０２０；Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０：２４７１−２４８３；Ａｒｄｅｎ−Ｊａｃｏｂ，“Ｎｅｕｅ  Ｌａｎｗｅｌｌｉｇｅ  Ｘａｎｔｈｅｎ−Ｆａｒｂｓｔｏｆｆｅ  ｆｕｅｒ  Ｆｌｕｏｒｅｓｚｅｎｚｓｏｎｄｅｎ  ｕｎｄ  Ｆａｒｂｓｔｏｆｆ  Ｌａｕｅｒ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ，１９９３；Ｓａｕｅｒら、１９９５，Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ５：２４７−２６１；Ｌｅｅら、１９９７，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：２８１６−２８２２；および  Ｒｏｓｅｎｂｌｕｍら、１９９７，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：４５００−４５０４に記載される。なお、これらの開示を引用により本明細書に含める。これらの参考文献の中に記載されるもので、環外アミンが、本明細書に記載されるような一次または二次アミン、もしくは上記ＮＨ−ローダミン染料の４，７−ジクロロ類似体である染料は、いずれのものであっても、本明細書に記載される試薬の標識部分の中に含めることが可能である。
【００７８】
標識部分の中に含まれる場合、親ＮＨ−ローダミン環の環外アミンは、指定の特性を有する保護基によって保護される。このように保護されたＮＨ−ローダミンを、本明細書では、「Ｎ−保護ＮＨ−ローダミン」と呼ぶ。構造式（Ｉａ）、（Ｉｂ）、および（Ｉｃ）の、親ＮＨ−ローダミン環に対応するＮ−保護ＮＨ−ローダミンは、下記に、構造式（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、および（ＩＩｃ）として示される。
【００７９】
【化２１】
2014079254.tif 000024
構造式（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、および（ＩＩｃ）において、Ｒ’は水素またはＲ３’であり、Ｒ’’は水素またはＲ６’であり、Ｒ３’およびＲ６’は、上の構造式（Ｉａ）、（Ｉｂ）、および（Ｉｃ）で定義した通りであり、Ｒ９は保護基を表す。このＮ−保護ＮＨ−ローダミンは、構造式（Ｉａ）、（Ｉｂ）、および（Ｉｃ）による親ＮＨ−ローダミン環に関連して前述したように、位置Ｃ１’、Ｃ２’、Ｃ２’’、Ｃ４’、Ｃ４’’、Ｃ５’、Ｃ５’’、Ｃ７’、Ｃ７’’、Ｃ８’、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、およびＣ７の一つ以上において置換基を含むことが可能である。
【００８０】
本明細書に記載される試薬は、標識オリゴヌクレオチドを化学的に合成するために使用するのであるから、オリゴヌクレオチドを合成するために使用される有機合成条件に対して安定な保護基Ｒ９を使用しなければならない。前述したように、アミドとして、例えば、カルボキサミド、スルフォナミド、または、フォスフォルアミドとしてアミンを保護する保護基Ｒ９は、保護ＮＨ−ローダミンを、閉鎖型ラクトン形に「ロック」し、そうすることによって本明細書に記載される試薬の安定性を確保すると考えられる。必要とされるわけではないが、合成オリゴヌクレオチドの核酸塩基の環外アミンを保護する基を除去するために用いられる条件下では不安定になる保護基Ｒ９を利用すると便利である。その場合、全ての保護基を単一工程で除去することが可能となるからである。
【００８１】
オリゴヌクレオチドを合成し、合成オリゴヌクレオチドを脱保護するために用いられる条件は、従来技術で周知であり、例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．Ｉ，Ｂｅａｎｃａｇｅら、Ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，２００２の、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓに記載される。なお、この開示を引用により本明細書に含める。簡単に言うと、ホスホロアミダイト試薬を用いる合成法は、複数回の：（ｉ）遊離ヒドロキシルを開放するためのＤＭＴ脱保護、これは、ジクロロメタンに溶解した、２．５％または３％ジーまたはトリクロロ酢酸による処理によって実現が可能であり；（ｉｉ）この遊離ヒドロキシルに対する、ヌクレオシド、または他のホスホロアミダイト試薬の結合、これは、０．４５Ｍまたは０．５Ｍのテトラゾールを含むアセトニトリル中で実行することが可能であり；（ｉｉｉ）酸化、これは、Ｉ２／２，６−ルチジン／Ｈ２Ｏによる処理によって実行することが可能であり；および、キャップ形成、これは、テトラヒドロフランに溶解した６．５％無水酢酸による処理、次いで、ＴＨＦに溶解した、１０％  １−メチルイミダゾール（ＮＭＩ）による処理によって実行することが可能である。
【００８２】
合成における種々の工程を実行するための、他の条件も既知であり、使用されている。例えば、ホスホロアミダイト結合は、０．２５Ｍ  ５−エチルチオ−１Ｈ−テトラゾール、０．２５Ｍ  ４，５−ジシアノイミダゾール（ＤＣＩ）、または０．２５Ｍ  ５−ベンジルチオ−１Ｈ−テトラゾール（ＢＴＴ）を含むアセトニトリル中で実行することが可能である。酸化は、ＴＨＦ／Ｈ２Ｏ／ピリジン（７：２：１）に溶解した、０．１Ｍ、０．０５Ｍ、または０．０２Ｍ  Ｉ２において実行することが可能である。キャップ形成は、ＴＨＦ／ルチジン／無水酢酸により処理、次いでＴＨＦに溶解した１６％  ＮＭＩによる処理；ＴＨＦに溶解した６．５％  ＤＭＡＰによる処理、次いで、ＴＨＦに溶解した１０％  Ｍｅｌｍによる処理、または、ＴＨＦに溶解した１０％  Ｍｅｌｍによる処理、次いで、ＴＨＦに溶解した１６％  Ｍｅｌｍによる処理によって実行することが可能である。
【００８３】
合成試薬からの保護基の除去および切断は、通常、濃縮水酸化アンモニウムによる６０℃で１−１２時間の処理によって与えられる。ただし、より穏やかな条件下で、例えば、濃縮水酸化アンモニウムによる室温で４−１７時間の処理、またはメタノールに溶解した０．０５Ｍ炭酸カリウムによる処理、または、Ｈ２Ｏ／ＥｔＯＨに溶解した２５％  ｔ−ブチルアミンによる処理で除去することが可能な基によって保護される、ヌクレオシドホスホロアミダイト試薬も既知であり、使用される。
【００８４】
当業者であれば、特定の合成および脱保護および／または切断条件下で使用するのに好適な特性を持つ保護基を選択することは容易に可能であろう。多種多様なアミン保護基が、例えば、Ｇｒｅｅｎ  ＆  Ｗｕｔｓ，“Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  Ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，”  ３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，１９９９  （以後”Ｇｒｅｅｎ  ＆  Ｗｕｔｓ”と呼ぶ）の、例えば、３０９−４０５ページに教示される。当業者であれば、Ｇｒｅｅｎ  ＆  Ｗｕｔｓにおいて教示されるものの中から適正な特性を有するＲ９を選択することは容易に可能である。
【００８５】
ある実施態様では、保護基Ｒ９は、式−Ｃ（Ｏ）Ｒ１０のアシル基である。この式において、Ｒ１０は、水素、低級アルキル、メチル、−ＣＸ３、−ＣＨＸ２、−ＣＨ２Ｘ、−ＣＨ２−ＯＲｄ、および、低級アルキル、メチル、−Ｘ、−ＯＲｄ、シアノ、またはニトロ基によって任意に一置換されるフェニルから選ばれ、ここで、Ｒｄは、低級アルキル、フェニル、およびピリジルから選ばれ、各Ｘは、ハロ基、通常フルオロ、またはクロロである。ある実施態様では、Ｒ１０は、メチルである。ある実施態様では、Ｒ１０は、トリフルオロメチルである。
【００８６】
−Ｃ（Ｏ）Ｒ１０によって定義されるようなアシル保護基は、種々の塩基性条件下、例えば、従来技術で周知の、「塩基性不安定な」ホスホロアミダイト試薬によって合成されたオリゴから保護基を除去するために用いられる穏やかな条件を含む条件下に除去することが可能である。使用が可能な例示の条件は上に具体的に記述された。
【００８７】
後の節により詳細に記載されるように、標識部分を含むＮ−保護ＮＨ−ローダミン部分は、他の基または成分に連結されてもよい。例えば、Ｎ−保護ＮＨ−ローダミンは、標識部分を含む別の染料、リン酸エステル前駆体基、リンカー、合成ハンドル、反応停止基、塩基ペア相互作用を安定化するように働く成分（例えば、介在染料、または小溝（ｍｉｎｏｒ  ｇｒｏｏｖｅ）結合分子）に対して連結されてもよい。このような結合は、通常、試薬を合成するために使用されるＮ−保護ＮＨ−ローダミン合成素子に付着する連結基ＬＧ（リンカーと関連して上述した）を介して実行される。
【００８８】
連結基ＬＧは、利用可能ならば、Ｎ−保護ＮＨ−ローダミン合成素子のいずれの炭素原子に対しても、または、それら炭素原子のうちの一つに付着する置換基に対し付着することが可能である。連結基の位置は、一部は、そのＮ−保護ＮＨ−ローダミン合成素子が付着する基または成分に依存する。ある実施態様では、連結基は、Ｎ−保護ＮＨ−ローダミン合成素子のＣ２’、Ｃ２’’、Ｃ４’、Ｃ５’、Ｃ７’、Ｃ７’’、Ｃ５、またはＣ６位置に付着する。ある特定の実施態様では、連結基は、Ｃ４’、Ｃ５’、Ｃ５、またはＣ６位置において付着する。
【００８９】
Ｎ−保護ＮＨ−ローダミン合成素子は、単一連結基ＬＧを含んでもよいし、または、一つを超える連結基ＬＧを含んでもよい。一つを超える連結基を用いる実施態様では、それらの連結基は、同じであってもよいし、異なっていてもよい。互いに異なる複数の連結基ＬＧを含む、Ｎ−保護ＮＨ−ローダミンシステムは、直交座標化学を用い、親ＮＨ−ローダミンの異なる位置に異なる基または成分を付着させてもよい。
【００９０】
連結基を何にするかは、ある場合には、親ＮＨ−ローダミン環におけるその位置に依存する。連結基ＬＧが、親ＮＨ−ローダミン環のＣ４’−またはＣ５’−位置に付着する、ある実施態様では、連結基ＬＧは、式−（ＣＨ２）ｎ−Ｆｙの基である。この式において、ｎは、０から１０の範囲の整数であり、Ｆｙは前述の通りである。ある特定の実施態様では、ｎが１であり、Ｆｙは−ＮＨ２である。
【００９１】
連結基ＬＧが、親ＮＨ−ローダミン環の５−または６−位置に付着する、ある実施態様では、連結基ＬＧは、式−（ＣＨ２）ｎ−Ｃ（Ｏ）ＯＲｆであり、式中、Ｒｆは、水素および優れた脱離基から選ばれ、ｎは前に定義した通りである。ある特異的実施態様では、連結基ＬＧは、ＮＨＳエステルを含む。ある特定実施態様では、ｎは０であり、ＲｆはＮＨＳである。
【００９２】
ある実施態様では、本明細書に記載される各種試薬の標識部分を含む、Ｎ−保護ＮＨ−ローダミンは、下記の構造式（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、または（ＩＩＩｃ）によって記述される。
【００９３】
【化２２】
2014079254.tif 000025
ここで：
Ｒ’は、Ｒ３’および水素から選ばれ；
Ｒ’’は、Ｒ６’および水素から選ばれ；
Ｒ９は、任意に式−Ｃ（Ｏ）Ｒ１０のアシル保護基であり、式中Ｒ１０は上に定義した通りであり；
Ｒ１’、Ｒ２’、Ｒ２’’、Ｒ４’、Ｒ４’’、Ｒ５’、Ｒ５’’、Ｒ７’、Ｒ７’’、およびＲ８’は、単独で占める場合、それぞれ、互いに独立に、水素、低級アルキル、（Ｃ６−Ｃ１４）アリール、（Ｃ７−Ｃ２０）アリールアルキル、５−１４員ヘテロアリール、６−２０員ヘテロアリールアルキル、−Ｒｂ、および−（ＣＨ２）ｘ−Ｒｂから選ばれ、ここでｘおよびＲｂは上に定義した通りであり、または、それとは別に、Ｒ１’およびＲ２’、またはＲ７’およびＲ８’は、それらが結合する炭素原子と一緒に合わされて、ベンゾ基を形成するか、および／または、Ｒ４’およびＲ４’’、および／またはＲ５’およびＲ５’’は、それらが結合する炭素原子と一緒に合わされてベンゾ基を形成し；
Ｒ３’およびＲ６’は、単独で占める場合、それぞれ、互いに独立に、低級アルキル、（Ｃ６−Ｃ１４）アリール、（Ｃ７−Ｃ２０）アリールアルキル、５−１４員ヘテロアリール、および６−２０員ヘテロアリールアルキルから選ばれ、または、それとは別に、構造式（ＩＩＩａ）の化合物におけるＲ３’およびＲ２’、またはＲ４’および／またはＲ６’、およびＲ５’またはＲ７’、構造式（ＩＩＩｂ）の化合物におけるＲ３’およびＲ２’、またはＲ４’および／またはＲ６’、およびＲ５’またはＲ７’’、または、構造式（ＩＩＩｃ）の化合物におけるＲ３’およびＲ２’’、またはＲ４’および／またはＲ６’、およびＲ５’またはＲ７’’は、その結合する原子と一緒に合わされて、１から４個のヘテロ原子（通常、Ｏ、Ｎ、およびＳから選ばれる）を任意に含んでもよく、かつ、同じか、または異なる低級アルキル、ベンゾ、またはピリド基のうちの一つ以上によって任意に置換される、５−または６−員の、飽和または不飽和環を形成し；および、
Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、およびＲ７は、それぞれ、互いに独立に、水素、低級アルキル、（Ｃ６−Ｃ１４）アリール、（Ｃ７−Ｃ２０）アリールアルキル、６−１４員ヘテロアリール、７−２０員ヘテロアリールアルキル、−Ｒｂ、および−（ＣＨ２）ｘ−Ｒｂから選ばれ、ここでｘおよびＲｂは上に定義した通りであり、
ただし、構造式（ＩＩＩａ）の化合物におけるＲ２’、Ｒ４’、Ｒ５’、Ｒ７’、Ｒ５、またはＲ６のうちの少なくとも一つ、構造式（ＩＩＩｂ）の化合物におけるＲ２’、Ｒ４’、Ｒ５’、Ｒ７’’、Ｒ５、またはＲ６のうちの少なくとも一つ、構造式（ＩＩＩｃ）の化合物におけるＲ２’’、Ｒ４’、Ｒ５’、Ｒ７’’、Ｒ５、またはＲ６のうちの少なくとも一つが、式−Ｙ−の基を含み、Ｙは、前述の官能基Ｆｙを含む連結基によって与えられる結合の一部を表す。
【００９４】
ある実施態様では、本明細書に記載される各種試薬の標識部分を含むＮ−保護ＮＨ−ローダミンは、４，７−ジクロロＲ６Ｇ（５−および／または６−異性形）、および／または、構造式（ＩＩＩａ）によって記載されるローダミンであって、そこにおいて：
Ｒ’およびＲ’’がそれぞれエチルであり；
Ｒ１’、Ｒ４’、Ｒ５’、およびＲ６’がそれぞれ水素であり；
Ｒ２’、およびＲ７’がそれぞれメチルであり、
Ｒ４、およびＲ７がそれぞれクロロであり、
Ｒ５、またはＲ６の内の一方が水素で、他方が−Ｃ（Ｏ）−である
ローダミンを排除する。
【００９５】
ある実施態様では、構造式（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、および（ＩＩＩｃ）による、Ｎ−保護ＮＨ−ローダミン部分は、それぞれ、下記の構造式（ＩＩＩａ．１）、（ＩＩＩａ．２）、（ＩＩＩｂ．１）、（ＩＩＩｂ．２）、（ＩＩＩｃ．１）、および（ＩＩＩｃ．２）によって定義される成分から選ばれる：
【００９６】
【化２３】
2014079254.tif 000026
ここで、Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ１’、Ｒ２’、Ｒ２’’、Ｒ３’、Ｒ４’、Ｒ４’’、Ｒ５’、Ｒ５’’、Ｒ６’、Ｒ７’、Ｒ７’’、Ｒ８’、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ９、およびＹは、構造式（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、および（ＩＩＩｃ）に関して以前に定義された通りである。
【００９７】
構造式（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩａ．１）、（ＩＩＩａ．２）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＩＩｂ．１）、（ＩＩＩｂ．２）、（ＩＩＩｃ）、（ＩＩＩｃ．１）、および（ＩＩＩｃ．２）によって定義される成分の、特異的例示の実施態様は、下記から選ばれる一つ以上の適用可能な特徴を有する構造を含む、すなわち：
（ｉ）Ｙは、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｓ−、および−ＮＨ−から選ばれ；
（ｉｉ）  Ｒ４およびＲ７は、それぞれ、クロロであり；
（ｉｉｉ）  Ｒ１’およびＲ８’は、それぞれ、水素であり；
（ｉｖ）  Ｒ１’およびＲ２’、または、Ｒ７’およびＲ８’は、一緒に合わされてベンゾ基を形成し；
（ｖ）  Ｒ２’およびＲ７’は、それぞれ、水素または低級アルキルであり；
（ｖｉ）  Ｒ’はＲ３’であり、かつ、Ｒ’’はＲ６’であり；
（ｖｉｉ）  Ｒ’はＲ３’であり、Ｒ’’はＲ６’であり、かつ、Ｒ３’およびＲ６’は、隣接炭素原子における置換基と一緒に合わされて、−ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−、−Ｃ（ＣＨ３）２ＣＨ＝Ｃ（ＣＨ３）−、−Ｃ（ＣＨ３）２ＣＨ＝ＣＨ−、−ＣＨ２−Ｃ（ＣＨ３）２−、および
【００９８】
【化２４】
2014079254.tif 000027
から選ばれる基を形成する。
【００９９】
前述したように、標識部分は、さらに、一つ以上の染料を含み、そのため、Ｎ−保護ＮＨ−ローダミン染料が、一旦脱保護された場合、より大きなエネルギー転移染料ネットワークの一員となるようにされてもよい。このようなエネルギー転移染料ネットワークは、従来技術で周知であり、分光特性が適合されるか、または、相互の相対的距離が調整される複数の蛍光染料の組み合わせを含み、そのため、ネットワークの中の一蛍光染料が、適切な波長の入射光によって励起されると、ネットワークの別の蛍光染料にその励起エネルギーを転移し、これが、次に、その励起エネルギーを、ネットワークのさらに別の蛍光担体に転移し、この過程を繰り返し、ネットワークの最後の受容蛍光染料による蛍光がもたらされる。染料ネットワークは、長いＳｔｏｋｅｓシフトを持つ標識部分を生ずる。このようなネットワークでは、ネットワークの別の蛍光担体に励起を転移する、または供与する蛍光担体を、「ドナー」と呼ぶ。別の蛍光担体から励起エネルギーを受容する、またはアクセプトする蛍光担体は、「アクセプター」と呼ばれる。二つの蛍光染料しか含まない染料ネットワークでは、通常、一方の染料は、ドナーとして活動し、他方は、アクセプターとして活動する。三つ以上の染料を含む染料ネットワークでは、少なくとも一つの染料は、ドナーおよびアクセプターの両方として活動する。染料ネットワークがどのように働くのかの原理、および、そのようなネットワークを創製するために適切な、個々の染料の選択および連結のための基準は、周知であり、例えば、Ｈｕｎｇら、１９９７，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５２：７８−８８に記載される。
【０１００】
染料ネットワークを構成する、本明細書に記載される標識部分では、Ｎ−保護ＮＨ−ローダミン染料は、脱保護されると、ネットワークを構成する他の染料の機能、所望の事象、および蛍光波長に応じて、ドナーまたはアクセプターとして、またはドナーおよびアクセプターの両方として活動する。ＮＨ−ローダミン染料のためにドナーおよび／またはアクセプターとして使用するのに好適な染料は、膨大な数のものが既知であるが、例えば、ただし限定されないが、キサンテン染料（例えば、フルオレセイン、ローダミン、およびロードル染料）、ピレン染料、クマリン染料（例えば、ヒドロキシ−、およびアミノ−クマリン）、シアニン染料、フタロシアニン染料、およびランテニド複合体が挙げられる。エネルギー転移染料ネットワークにおいて利用が可能な染料の非限定的例が、Ｈｕｎｇら、１９９６，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３８：１６５−１７０；Ｍｅｄｉｎｔｚら、２００４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０１（２６）：９６１２−９６１７；米国特許第５，８００，９９６号；Ｓｕｃｈａｋｅｒら、２００３，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ，Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ＆  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ２２：１４４３−１４４５；米国特許第６，３５８，６８４号；Ｍａｊｕｍｄａｒら、２００５，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３５１：１１２３−１１４５；Ｄｉｅｔｒｉｃｈら、２００２，Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８２（３）：２１１−２３１；Ｔｓｕｊｉら、２００１，Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｊ．８１（１）：５０１−５１５；Ｄｉｃｋｓｏｎら、１９９５，Ｊ．Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２７（１）：３−１９；および  Ｋｕｍａｒら、２００４，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１：２５１−２７４に記載される。なお、これらの開示を引用により本明細書に含める。本明細書に記載される原理にしたがって適切に保護することが可能な染料は、いずれのものであっても、染料ネットワークを構成する標識部分のドナーおよびアクセプター染料として使用することが可能である。ある実施態様では、ネットワークを構成するドナーおよび／またはアクセプター染料のうちの一つ以上は、本明細書に記載されるＮ−保護ＮＨ−ローダミン染料であってもよい。染料ネットワークを形成するために、ドナーおよび／またはアクセプター染料をローダミン染料に付着させるための特定位置、および、そのような染料を付着させるために有用な特定結合およびリンカーは、従来技術において周知である。具体的例が、例えば、米国特許第６，８１１，９７９号、米国特許第６，００８，３７９号、米国特許第５，９４５，５２６号、米国特許第５，８６３，７２７号、および米国特許第５，８００，９９６号に記載される。なお、これらの開示を引用により本明細書に含める。
【０１０１】
ある実施態様では、ドナーおよびアクセプター染料を連結するリンカーは、米国特許第６，８１１，９７９号に記載されるような陰イオンリンカーである。なお、この開示を引用により本明細書に含める（例えば、コラム１７、２５行からコラム１８、３７行まで、および図１−１７を参照）。
【０１０２】
本明細書に記載される試薬のある実施態様では、標識部分は、ＮＨ−ローダミン染料のためのドナー染料を含む。ある実施態様では、ドナー染料は、フルオレセインまたはローダミン染料、例えば、本明細書に記載されるＮＨ−ローダミン染料のうちの一つである。ある特定実施態様では、ドナー染料は、フルオレセイン染料である。フルオレセイン染料は、親キサンテン環の３−および６−位置（構造式（Ｉａ）、（Ｉｂ）、および（Ｉｃ）のＮＨ−ローダミン環の３’−および６’−位置に対応する）がヒドロキシル基によって置換されることを除き、ローダミン染料と構造的に近似する。ローダミン同様、フルオレセインも、拡張型環構造であって、親のキサンテン環の位置Ｃ３およびＣ４および／またはＣ５およびＣ６の炭素原子が、ベンゾ基などのアリール架橋に含まれる構造を持つことも可能である。したがって、フルオレセインは、一般に、下記の構造式（ＩＶａ）、（ＩＶｂ）、および（ＩＶｃ）による化合物を含む：
【０１０３】
【化２５】
2014079254.tif 000028
ＮＨ−ローダミン同様、構造式（ＩＶａ）、（ＩＶｂ）、および（ＩＶｃ）のフルオレセイン環の位置Ｃ１’、Ｃ２’、Ｃ２’’、Ｃ４’、Ｃ４’’、Ｃ５’、Ｃ５’’、Ｃ７’、Ｃ７’’、Ｃ８’、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、およびＣ７における炭素は、種々の異なる置換基、例えば、ＮＨ−ローダミンに関して前述したものによって置換されてもよい。
【０１０４】
本明細書に記載される標識部分に含まれる場合、Ｃ３’およびＣ６’位置におけるヒドロキシルは、前述のＮＨ−ローダミンの環外アミンを保護する基と、一般的に同様の特性を持つ保護基によって保護しなければならない。したがって、特定実施態様では、保護基は、
オリゴヌクレオチドを合成するために用いられる条件、例えば、亜リン酸トリエステル法による、オリゴヌクレオチド合成および酸化に用いられる条件に対しては安定であるが、合成オリゴヌクレオチドの脱保護および／または、合成樹脂からの合成オリゴヌクレオチドの切り離しのために通常用いられる条件、例えば、室温または５５℃での濃縮水酸化アンモニウムにおけるインキュベーションに対しては不安定である。
【０１０５】
適切な特性を持つ保護基は、莫大な数のものが従来技術では既知であるが、例えば、ただし限定されないが、Ｎ−保護ＮＨ−ローダミン染料に関連して前述したアシル基が挙げられる。ある特定実施態様では、保護基は、−Ｃ（Ｏ）−Ｒ１０を有し、Ｒ１０は前に定義した通りである。ある実施態様では、Ｒ１０はｔ−ブチルである。Ｃ３’およびＣ６’の環外ヒドロキシルが保護基を含むフルオレセインを、本明細書では、「Ｏ−保護フルオレセイン」と呼ぶ。それぞれ、構造式（ＩＶａ）、（ＩＶｂ）、および（ＩＶｃ）のフルオレセインに対応する、Ｏ−保護フルオレセインを、下記の構造式（Ｖａ）、（Ｖｂ）、および（Ｖｃ）として示す：
【０１０６】
【化２６】
2014079254.tif 000029
ここで、Ｒ９は保護基を表す。
【０１０７】
適切に保護され、ＮＨ−ローダミン部分に対するドナーとして使用するために標識部分の中に組み込むことが可能なフルオレセイン染料については、莫大な数の種々のものが従来技術で知られる。具体的な例示の蛍光染料が、例えば、米国特許第６，２２１，６０４号、米国特許第６，００８，３７９号、米国特許第５，８４０，９９９号、米国特許第５，７５０，４０９号、米国特許第５，６５４，４４１号、米国特許第５，１８８，９３４号、米国特許第５，０６６，５８０号、米国特許第４，４８１，１３６号、米国特許第４，４３９，３５６号、ＷＯ９９／１６８３２；およびＥＰ  ０  ０５０  ６８４に記載される。なお、これらの開示を引用により本明細書に含める。当業者であれば、特異的ＮＨ−ローダミンに対するドーナーとして使用するのに好適な分光特性を有するフルオレセインを選ぶことは可能であろう。本明細書に記載される試薬の標識部分の中に組み込んでもよい親フルオレセイン染料の特異的実施態様が図１Ｃに示される。
【０１０８】
ドナー、およびＮ−保護ＮＨ−ローダミンアクセプターは、様々な方向性において、直接に、またはリンカーを介して、互いに連結させることが可能である。ドナーが、Ｏ−保護フルオレセイン、またはＮ−保護ＮＨ−ローダミンである、ある実施態様では、ドナーは、２’−、２’’−、４’−、５’−、７’−、７’’−、５−、または６−位置を介して、Ｎ−保護ＮＨ−ローダミンアクセプターの２’−、２’’−、４’−、５’−、７’−、７’’−、５−、または６−位置に連結される。
【０１０９】
特異的例示の結合方向性を下記の表２に示す。
【０１１０】
【表２】
2014079254.tif 000030
表２のドナー−アクセプター染料ネットワークのような、染料ネットワークを含む標識部分は、利用可能な任意の位置において試薬の残余部に連結させることが可能である。ある実施態様では、頭部対頭部連結アクセプター／ドナーペアを含む標識部分は、ドナーまたはアクセプター部分の５−または６−位置を介して試薬の残余部に付着される。ある実施態様では、頭部対尾部連結アクセプター／ドナーペアを含む標識部分は、ドナーまたはアクセプター部分の、利用可能な４’−、５’−、５−、または６−位置を介して試薬の残余部に付着される。ある実施態様では、尾部対尾部連結アクセプター／ドナーペアを含む標識部分は、ドナーまたはアクセプターの、利用可能な４’−、または５’−位置を介して試薬の残余部に付着される。ある実施態様では、側部対側部連結アクセプター／ドナーペアを含む標識部分は、ドナーまたはアクセプターの、４’−、５’−、５−、または６−位置を介して試薬の残余部に付着される。ある実施態様では、側部対頭部連結アクセプター／ドナーペアを含む標識部分は、ドナーまたはアクセプターの、４’−、５’−、５−、または６−位置を介して試薬の残余部に付着される。ある実施態様では、側部対尾部連結アクセプター／ドナーペアを含む標識部分は、ドナーまたはアクセプターの、利用可能な４’−、５’−、５−、または６−位置を介して試薬の残余部に付着される。
【０１１１】
その方向性によらず、Ｏ−保護フルオレセイン、またはＮ−保護ＮＨ−ローダミンドナー、およびＮ−保護ＮＨ−ローダミンアクセプターは、通常、リンカーを介して互いに連結される。このようなドナーおよびアクセプター染料は、性質が剛性で、比較的長い、例えば、長さが約１２−２０Aの範囲（本明細書で用いる、リンカーの「長さ」とは、連結
される成分間の、最短の連続経路を定義する化学結合の長さの合計を計算することによって定量される、連結される成分間の距離を指す）のリンカーを介して連結するのが有利であることが以前に見出されている。いずれの動作理論によっても、それに拘束されることを意図するものではないが、ドナーとアクセプターを、その発色団を互いに接触させることなく互いにごく近傍に保持する傾向を持つリンカーは、優れて効率的なエネルギー転移を実現すると考えられる。この点で、リンカーの剛性および長さは結合パラメータである。一般に、短いリンカーほど（例えば、約５から１２Aの長さを持つリンカー）、程度の
高い剛性を含まなければならない。長いリンカーほど（例えば、約１５から３０Aの範囲
の長さを持つリンカー）、程度の低い剛性を含むことが可能であり、場合によっては剛性を含まないことも可能である。短い、無剛性（柔軟性）リンカーは避けなければならない。
【０１１２】
剛性は、結合手の周囲の回転角が制限される基を使用することによって、例えば、二重および／または三重結合を含む、アリーレンまたはヘテロアリーレン成分、および／またはアルキレン成分を使用することによって実現することが可能である。エネルギー転移染料利用という観点においてローダミンおよびフルオレセイン染料を連結するのに有用な、各種リンカーは、従来技術で既知であり、例えば、米国特許第５，８００，９９６号に記載される。この開示を引用により本明細書に含める。本明細書に記載される標識部分において、Ｏ−保護フルオレセイン、またはＮ−保護ＮＨ−ローダミンドナーを、Ｎ−保護ＮＨ−ローダミンアクセプターに連結させるのに有用なリンカーの特異的例として、例えば、ただし限定されないが、下式の基が挙げられる：
（Ｌ．１）  −Ｚ−（ＣＨ２）ａ−［（Ａｒ）ｂ−（ＣＨ２）ａ］ｃ−Ｚ−；
（Ｌ．２）  −Ｚ−（ＣＨ２）ａ−［Ｃ≡Ｃ−（ＣＨ２）ａ］ｃ−Ｚ−；
（Ｌ．３）  −Ｚ−（ＣＨ２）ａ−［Ｃ≡Ｃ−（Ａｒ）ｂ］ｃ−（ＣＨ２）ａ−Ｚ−；
（Ｌ．４）  −Ｚ−（ＣＨ２）ａ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−［（ＣＨ２）ａ−（Ａｒ）−（ＣＨ２）ａ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ］ｃ−（ＣＨ２）ａ−Ｚ−；および、
（Ｌ．５）−Ｚ−［ＣＨ２（ＣＨ２）ｅＯ］−ＣＨ２（ＣＨ２）ｅＯ−。
【０１１３】
ここで、Ｚは、前述のように、他とは独立して、連結基Ｆｚの担当する結合部分を表し；各ａは、他とは独立して、０から４の範囲の整数を表し；各ｂは、他とは独立して、１から２の範囲の整数を表し；各ｃは、他とは独立して、１から５の範囲の整数を表し；各ｄは、他とは独立して、１から１０の範囲の整数を表し；各ｅは、他とは独立して、１から４の範囲の整数を表し；各ｆは、他とは独立して、１から１０の範囲の整数を表し；かつ、各Ａｒは、他とは独立して、任意に置換される単環または多環のシクロアルキレン、シクロヘテロアルキネン、アリーレン、またはヘテロアリーレン基を表す。Ａｒの非限定的例示の実施態様としては、前述したような、低級シクロアルカン、低級シクロヘテロアルカン、親芳香族環系、および親ヘテロ芳香族環系由来の基が挙げられる。Ａｒの、特異的、非限定的例示実施態様としては、シクロヘキサン、ピペラジン、ベンゼン、ナフタレン、フェノール、フラン、ピリジン、ピペリジン、イミダゾール、ピロリジン、およびオキサジゾールが挙げられる。リンカーの、特異的、非限定的例示実施態様が、図２に示される。図２において、Ｚ１およびＺ２は、前述のように、互いに独立に、連結基Ｆｚの担当する結合部分を表し、Ｋは、−ＣＨおよび−Ｎ−から選ばれる。図２に示すリンカーのある特定実施態様では、Ｚ１またはＺ２の一方は−ＮＨ−であり、他方は、−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、および−Ｓ（Ｏ）２−から選ばれる。
【０１１４】
ある実施態様では、ドナーおよびアクセプター染料を連結するリンカーは、米国特許第６，８１１，９７９号に記載されるように、陰イオンリンカーである。なお、この開示を引用により本明細書に含める（例えば、コラム１７、２５行からコラム１８、３７行まで、および図１−１７を参照）。好適な陰イオンリンカーの、特異的、非限定的、例示の実施態様は、上の式（Ｌ．１）から（Ｌ．４）のリンカーを含む。この式において、一つ以上のＡｒ基が、例えば、約ｐＨ７から約ｐＨ９の範囲のｐＨにおいて使用される条件下で、陰性電荷を有する、一つ以上の置換基によって置換される。好適な置換基の、特異的、非限定的例として、リン酸エステル、硫酸エステル、スルフォン酸エステル、およびカルボン酸エステルが挙げられる。
【０１１５】
ある実施態様では、標識部分は、式（ＶＩ）：
（ＶＩ）  Ａ−Ｚ１−Ｓｐ−Ｚ２−Ｄ
ここで、Ａは、Ｎ−保護ＮＨ−ローダミンアクセプターを表し、Ｄは、ドナー、例えば、Ｎ−保護ＮＨ−ローダミン、またはＯ−保護フルオレセインドナーを表し、Ｚ１およびＺ２は、前述したように、官能基Ｆｚを含む連結部分によって提供される結合部分を表し、Ｓｐは、前述したようにスペーサー成分を表す。ある特定実施態様では、Ａは、下記に示す、構造式Ａ．１、Ａ．２、Ａ．３、Ａ．４、Ａ．５、およびＡ．６から選ばれ、Ｄは、構造式Ｄ．１、Ｄ．２、Ｄ．３、Ｄ．４、Ｄ．５、およびＤ．６から選ばれる。ある特定実施態様では、Ａは、下記に示す、構造式Ａ．７、Ａ．８、Ａ．９、Ａ．１０、Ａ．１１、およびＡ．１２から選ばれ、Ｄは、構造式Ｄ．７、Ｄ．８、Ｄ．９、Ｄ．１０、Ｄ．１１、およびＤ．１２から選ばれる。
【０１１６】
【化２７】
2014079254.tif 000031
【０１１７】
【化２８】
2014079254.tif 000032
【０１１８】
【化２９】
2014079254.tif 000033
【０１１９】
【化３０】
2014079254.tif 000034
構造式Ａ．１−Ａ．１２およびＤ．１−Ｄ．１２において：
Ｅ１は、−ＮＨＲ９、−ＮＲ３’Ｒ９、および−ＯＲ９ｂから選ばれ；
Ｅ２は、−ＮＨＲ９、−ＮＲ６’Ｒ９、および−ＯＲ９ｂから選ばれ；
Ｒ９ｂは、Ｒ９であり；
Ｙ１ａ、Ｙ１ｂ、Ｙ２ａ、Ｙ２ｂ、Ｙ３ａ、およびＹ３ｂは、それぞれ互いに独立に、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨ−、−Ｃ（Ｏ）−、および−Ｓ（Ｏ）２−から選ばれ；および、
Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ１’、Ｒ２’、Ｒ２’’、Ｒ３’、Ｒ４’、Ｒ４’’、Ｒ５’、Ｒ５’’、Ｒ６’、Ｒ７’、Ｒ７’’、Ｒ８’、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、およびＲ７は、構造式（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、および（ＩＩＩｃ）に関して以前に定義した通りであり、ただし、Ｅ１およびＥ２が−ＯＲ９ｂである場合、Ｒ１’およびＲ２’、およびＲ７’およびＲ８’は、同時にベンゾおよび／またはピリド基を含む。
【０１２０】
構造式（ＶＩ）による標識部分の、ある特定の実施態様では、Ｙ１ａ、Ｙ２ａ、およびＹ３ａは−ＮＨ−であり；Ｙ１ｂ、Ｙ２ｂ、およびＹ３ｂは、−Ｃ（Ｏ）−および−Ｓ（Ｏ）２−から選ばれ；Ｚ１は−Ｃ（Ｏ）−および−Ｓ（Ｏ）２−から選ばれ；Ｚ２は−ＮＨ−であり、かつ、Ｓｐは、下記：
（Ｓｐ．１）  −（ＣＨ２）ａ−［（Ａｒ）ｂ−（ＣＨ２）ａ］ｃ−；
（Ｓｐ．２）  −（ＣＨ２）ａ−［Ｃ≡Ｃ−（ＣＨ２）ａ］ｃ−；
（Ｓｐ．３）  −（ＣＨ２）ａ−［Ｃ≡Ｃ−（Ａｒ）ｂ］ｃ−（ＣＨ２）ａ−；
（Ｓｐ．４）  −（ＣＨ２）ａ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−［（ＣＨ２）ａ−（Ａｒ）−（ＣＨ２）ａ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ］ｃ−（ＣＨ２）ａ−；および、
（Ｓｐ．５）  −［ＣＨ２（ＣＨ２）ｅＯ］ｆ−ＣＨ２（ＣＨ２）−、ここで、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、およびＡｒは、以前に定義した通りである。
【０１２１】
構造式（ＶＩ）による標識部分のある特定実施態様では、Ｒ９は、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、およびＣ（Ｏ）ＣＦ３から選ばれ、Ｒ９ａは、−Ｃ（Ｏ）Ｃ（ＣＨ３）３である。
【０１２２】
５．５  リン酸エステル前駆体基
本明細書に記載される試薬の、多くの実施態様が、リン酸エステル前駆体基（“ＰＥＰ”）を含む。標識オリゴヌクレオチドを合成するために段階的合成を用いる場合、ＰＥＰは、新生の合成オリゴヌクレオチドの５’−ヒドロキシル基であってもよい、利用可能な任意のヒドロキシル基に結合され、最終的に、任意の必要な酸化および／または脱保護工程の後、合成オリゴヌクレオチドに標識部分を連結する結合に貢献する。形成される結合は、従来技術で知られるように、リン酸エステル結合か、または、修飾されたリン酸エステル結合である。
【０１２３】
一次ヒドロキシル基に試薬を結合させ、リン酸エステル結合、または修飾されたリン酸エステル結合を生成するのに好適な基は、様々のものが従来技術において周知である。特異的実施例としては、例えば、ただし限定するものではないが、ホスホロアミダイト基（例えば、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、１９６９，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．９１：３３５０−３３５５；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、１９７５  Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．９７：３２７８；Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ  ＆  Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，１９８１，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０３：３１８５；Ｂｅａｕｃａｇｅ  ＆  Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，１９８１，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．２２：  １８５９を参照されたい、なお、これらの開示を引用により本明細書に含める）、２−クロロフェニル−、または２，５−ジクロロフェニル−フォスフェート基（例えば、Ｓｐｒｏａｔ  ＆  Ｇａｉｔ，“Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒ  Ｍｅｔｈｏｄ，”  Ｉｎ：  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｇａｉｔ，Ｅｄ．，１９８４，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，ｐａｇｅｓ  ８３−１１５を参照）（なお、これらの開示を引用により本明細書に含める）、およびＨ−ホスホネート基（例えば、Ｇａｒｅｇｇら、１９８５，Ｃｈｅｍ．Ｓｃｒ．２５：２８０−２８２；Ｇａｒｅｇｇら、１９８６，Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔ．２７：４０５１−４０５４；Ｇａｒｅｇｇら、１９８６，Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔ．２７：４０５５−４０５８；Ｇａｒｅｇｇら、１９８６，Ｃｈｅｍ．Ｓｃｒ．２６：５９−６２；Ｆｒｏｅｈｌｅｒ  ＆  Ｍａｔｅｕｃｃｉ，１９８６，Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔ．２７：４６９−４７２；Ｆｒｏｅｈｌｅｒら、１９８６，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１４：５３９９−５４０７を参照されたい、なお、これらの開示を引用により本明細書に含める）が挙げられる。ある特定実施態様では、ＰＥＰは、下式（Ｐ．１）のホスホロアミダイト基である：
【０１２４】
【化３１】
2014079254.tif 000035
ここで、
Ｒ２０は、１から１０個の炭素原子を含む、直鎖、分枝、または環状の、飽和または不飽和のアルキル、２−シアノエチル、６から１０個の環炭素原子を含むアリール、および、６から１０個の環炭素原子、および１から１０個のアルキレン炭素原子を含むアリールアルキルから選ばれ；および、
Ｒ２１およびＲ２２は、それぞれ互いに独立に、１から１０個の炭素原子を含む、直鎖、分枝、または環状の、飽和または不飽和のアルキル、６から１０個の環炭素原子を含むアリール、および、６から１０個の環炭素原子、および１から１０個のアルキレン炭素原子を含むアリールアルキルから選ばれるか、またはそれとは別に、Ｒ２１およびＲ２２は、それらが結合する窒素原子と一緒になって、５から６個の環原子を含む、飽和または不飽和環を形成する。該環原子のうちの一つまたは二つは、図示された窒素原子に加えて、Ｏ、Ｎ、およびＳから選ばれるヘテロ原子であってもよい。
【０１２５】
ある特定実施態様では、Ｒ２０は２−シアノエチルであり、Ｒ２１およびＲ２２は、それぞれ、イソプロピルである。
【０１２６】
５．６  合成ハンドル
本明細書に記載される試薬の多くの実施態様は、適切な脱保護後、要すれば、合成標識オリゴヌクレオチドに対し追加の基または成分を付着させるために使用することが可能な部位を提供する、一つ以上の合成ハンドルを含む。これらの基は、標識オリゴヌクレオチド合成の進行時に合成ハンドルに付着させることが可能であるし、あるいはそれとは別に、合成ハンドルが、合成後、脱保護されて、追加の基または成分の付着が可能とされる官能基を顕すようにすることが可能である。例えば、合成ハンドルは、標識オリゴヌクレオチドの合成を実行するのに用いられる条件に対しては安定な保護基によって保護される、一次アミン基を含むことも可能である。合成後、合成オリゴヌクレオチド上の、他の各種保護基の除去と同時に、またはそれとは別に、この保護基を除去することによって、それに対して追加の基および／または成分を付着させることが可能な一次アミノ基が得られる。
【０１２７】
オリゴヌクレオチド合成に使用するのに好適な保護基によって保護される反応基については、様々の異なるものが従来技術で既知であり、例えば、ただし限定されないが、アミノ基（例えば、トリフルオロアセチル、または４−モノメトキシトリチル基によって保護される）、ヒドロキシル基（例えば、４，４’−ジメトキシトリチル基によって保護される）、チオール基（例えば、トリチルまたはアルキルチオール基によって保護される）、およびアルデヒド基（例えば、アセタール保護基によって保護される）が挙げられる。これらの保護される反応基は全て、本明細書に記載される試薬の合成ハンドルを含むことが可能である。
【０１２８】
ある実施態様では、合成ハンドルは、式−ＯＲｅの保護された一次ヒドロキシルを含む。ここで、Ｒｅは、オリゴヌクレオチド合成時に選択的に除去することが可能な、酸に不安定な保護基を表す。オリゴヌクレオチド合成の観点から一次ヒドロキシル基を保護するために好適な、酸不安定な保護基は従来技術で既知であり、例えば、ただし限定されないが、トリフェニルメチル（トリチル）、４−モノメトキシトリチル、４，４’−ジメトキシトリチル、４，４’，４’’−トリメトキシトリチル、ビス（ｐ−アニシル）フェニルメチル、ナフチルジフェニルメチル、ｐ−（ｐ’−ブロモフェナシクロキシ）フェニルジフェニルメチル、９−アントリル、９−（９−フェニル）キサンフェニル、および９−（９−フェニル−１０−オキソ）アントリルが挙げられる。これらの基は全て、弱酸による処理、例えば、ジクロロメタンに溶解した２．５％または３％のジまたはトリクロロ酸による処理によって除去することが可能である。前述の酸不安定保護基によって一次ヒドロキシル基を保護する方法は、周知である。
【０１２９】
５．７  固相支持体
本明細書に記載される試薬の多くの実施態様は、他の成分および／または基が付着する固相支持体を含む。この固相支持体は、通常、他の成分の付着のために好適な連結基を担うリンカーが付着する、アミノまたはヒドロキシル基などの官能基によって活性化される。
【０１３０】
各種成分およびリンカーの付着のために好適な官能基によって活性化させることが可能な種々の材料は、官能基を含めるために該材料を活性化するための方法同様、従来技術で既知であり、例えば、調節孔ガラス、ポリスチレン、およびグラフトコポリマーが挙げられる。これらの材料のいずれも、本明細書に記載される試薬において固相支持体として使用することが可能である。
【０１３１】
５．８  末端ヒドロキシル標識のために有用な合成試薬
本明細書に記載される合成試薬のある実施態様は、下記の構造式（ＶＩＩ）によって記述される：
（ＶＩＩ）  ＬＭ−Ｌ−ＰＥＰ
ここで、ＬＭは、本明細書に記載される標識部分を表し、Ｌは、本明細書に記載される任意のリンカーを表し、ＰＥＰは、本明細書に記載されるリン酸エステル前駆体基を表す。この試薬は、さらに別の基または成分、例えば、合成ハンドルを含むことが可能である。ある実施態様では、合成試薬は、標識部分およびＰＥＰ基を含み、別の成分または基を含まない。このような合成試薬は、オリゴヌクレオチドの段階的合成時、ヒドロキシル基に結合させることが可能であり、何よりも、合成オリゴヌクレオチドの末端ヒドロキシル基、通常は５’−ヒドロキシルであるが、に、標識部分を付着させるのに有用である。
【０１３２】
ＰＥＰ基は、直接標識部分に付着させることが可能であるが、リンカーを介して標識部分に付着させてもよい。ＰＥＰ基が直接標識部分に付着される実施態様では、ＰＥＰ基は、一般に、一次ヒドロキシル基に対して好適な結合試薬によって分子に対して連結されるので、標識部分は、一次ヒドロキシル基を含む置換基を含んでいなければならない。ＰＥＰ基が、リンカーを介して標識部分に連結される実施態様では、リンカー合成素子は、標識部分合成素子の連結基と連結を形成するのに好適な連結基、および、ＰＥＰ基に対する付着に好適な一次ヒドロキシル基を含まなければならない。好適なリンカー合成素子としては、例えば、ただし限定されないが、式Ｆｚ−Ｓｐ−ＯＨの合成素子が挙げられる。式中、Ｆｚは、標識部分合成素子の官能基に対して相補的な官能基であり、Ｓｐは、スペーサー成分である。このスペーサー成分は、標識オリゴヌクレオチドの合成および脱保護に使用される条件に対して安定な原子および／または官能基である限り、それらの任意の組み合わせを含むことが可能である。非限定的例示リンカーが、図２に示される。図においてＺ２はＯである。ある実施態様では、Ｓｐは、１から１０個の鎖原子を含む、任意に置換されるアルキレン鎖である。ある特定実施態様では、Ｓｐは、１から９個の炭素鎖原子を含む、未置換のアルキレン鎖である。
【０１３３】
ある実施態様では、合成試薬は、構造式（ＶＩＩ）による化合物であり、式中：
ＬＭは、上に特異的に明らかにした標識部分実施態様のうちの一つであり；
Ｌは、−Ｚ−（ＣＨ２）３−６−Ｏ−、−Ｚ−（ＣＨ２）ａ−［（Ａｒ）ｂ−（ＣＨ２）ａ］ｃ−Ｏ−、−Ｚ−（ＣＨ２）ａ−［Ｃ≡Ｃ−（ＣＨ２）ａ］ｃ−Ｏ−、−Ｚ−（ＣＨ２）ａ−［Ｃ≡Ｃ−（Ａｒ）ｂ］ｃ−（ＣＨ２）ａ−Ｏ−、−Ｚ−（ＣＨ２）ｄ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−［（ＣＨ２）ａ−（Ａｒ）−（ＣＨ２）ａ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ］ｃ−（ＣＨ２）ｄ−Ｏ−、−Ｚ−［ＣＨ２（ＣＨ２）ｅＯ］ｆ−ＣＨ２（ＣＨ２）ｅＯ−、および、Ｚ２がＯである、図２に示すリンカーの一つから選ばれ；および、
ＰＥＰは、ホスホロアミダイト基、例えば、前述の構造式Ｐ．１のホスホロアミダイト基である。ある実施態様では、リンカーＬにおけるＺは−ＮＨ−である。
【０１３４】
ある実施態様では、構造式（ＶＩＩ）による合成試薬におけるリンカーは、該合成試薬がヌクレオシド性となるように、ヌクレオシドを含む。ある実施態様では、ヌクレオシド性合成試薬は、構造式（ＶＩＩ．１）による化合物である：
【０１３５】
【化３２】
2014079254.tif 000036
ここで、ＰＥＰは、リン酸エステル前駆体基を表し、Ｂは核酸塩基を表し、ＬＭは、標識部分を表し、かつ、Ｌ２は、リンカーＬＭに核酸塩基Ｂを連結するリンカーを表す。核酸塩基ＢおよびリンカーＬの特性および性質は、下記にさらに詳細に記載される。構造式（ＶＩＩ．１）による、非限定的、例示のヌクレオシド性合成試薬が、図４に示される。
【０１３６】
ＰＥＰ基が、任意のリンカーを介して標識部分に連結される合成試薬実施態様を合成するための例示スキームが、下記のスキーム（Ｉ）に示される。このスキームにおいて、各種基Ｒ、Ｆｙ、Ｆｚ、Ｙ、Ｚ、およびＳｐは、以前に定義した通りである。
【０１３７】
【化３３】
2014079254.tif 000037
スキーム（Ｉ）において、官能基Ｆｙを含む連結基を含む、親ＮＨ−ローダミン合成素子１００は、無水物１０１によってアセチル化されて、Ｎ−アセチル保護ＮＨ−ローダミン合成素子１０２を生成する。次に、合成素子１０２は、リンカー合成素子１０３に結合して、化合物１０４を生成する。Ｆｙの内容に応じて、合成素子１０２は、結合の前に活性化を要求する場合がある。例えば、Ｆｙがカルボキシル基である場合、結合前に、ＮＨＳエステルなどのエステルとして活性化することが可能である。化合物１０４では、−Ｙ−Ｚは、相補的官能基ＦｙおよびＦｚによって形成される連結を表す。この式において、前述のように、Ｙは、Ｆｙの担当する部分、Ｚは、Ｆｚの担当する部分を表す。次に、化合物１０４は、図示の特定実施態様ではフォスフィンである、ＰＥＰ合成素子１０５と反応させられ、ホスホロアミダイト合成試薬１０６を生成する。
【０１３８】
５．９  内部または３’−末端標識に有用な合成試薬
本明細書に記載される合成試薬は、追加の基および／または成分の付着のために有用な、一つ以上の合成ハンドルを任意に含んでもよい。前述のように、Ｒｅが酸不安定な保護基を表す、式−ＯＲｅの合成ハンドルを含む合成試薬は、追加のヌクレオチドが付着することが可能な、一次ヒドロキシル基を与える。その結果、この合成ハンドルを含む合成試薬は、５’−ヒドロキシル、３’−ヒドロキシル、または、一つ以上の内部位置において、合成オリゴヌクレオチドを標識するために使用することが可能である。これら合成試薬はさらに、互いに結合することも、または、他のホスホロアミダイト標識試薬に結合することも可能であり、そのため複数の標識部分を含むオリゴヌクレオチドの合成が可能となる。
【０１３９】
合成試薬を構成する、標識部分、ＰＥＰ基、および合成ハンドル−ＯＲｅは、それぞれの機能の実行を可能とするものであれば、いずれの方式および／または方向性で一緒に連結することも可能である。特定実施例として、ＰＥＰ基および合成ハンドルは、それぞれ、任意にリンカーを介して標識部分に連結させることが可能である。ある実施態様では、このような合成試薬は、構造式（ＶＩＩＩ）による化合物である：
（ＶＩＩＩ）  ＲｅＯ−Ｌ−ＬＭ−Ｌ−ＰＥＰ
ここで、Ｌは、他方に対して独立に、任意のリンカーを表し、ＬＭは、標識部分を表し、かつ、ＰＥＰは、リン酸エステル前駆体基を表す。好適な保護基Ｒｅ、リンカーＬ、標識部分ＬＭ、およびリン酸エステル前駆体基の非限定的例としては、上に具体的に例示したものが挙げられる。
【０１４０】
別の特定実施例として、ＰＥＰ基および合成ハンドル−ＯＲｅは、標識部分に付着する、分枝鎖リンカーに付着されてもよい。ある実施態様では、このような合成試薬は、構造式（ＩＸ）による化合物である：
【０１４１】
【化３４】
2014079254.tif 000038
ここで、Ｌはリンカーを表し、ＬＭは標識部分を表し、かつ、ＰＥＰは、リン酸エステル前駆体基を表す。
【０１４２】
ある特定実施態様では、構造式（ＩＸ）による合成試薬は、構造式（ＩＸ．１）による化合物である：
【０１４３】
【化３５】
2014079254.tif 000039
ここで、ＬＭは標識部分を表し、−Ｚ−は、リンカーの官能基Ｆｚによって与えられる連結の一部を表し、同じであっても、異なっていてもよい、Ｓｐ１、Ｓｐ２、およびＳｐ３は、それぞれ、スペーサー成分を表し、Ｇは、ＣＨ、Ｎ、または、アリーレン、フェニレン、ヘテロアリーレン、低級シクロアルキレン、シクロヘキシレン、および／または低級シクロヘテロアルキレンを含む基を表し、かつ、ＰＥＰは、リン酸エステル前駆体基を表す。ある実施態様では、ＬＭは、上に具体的に例示した標識部分のうちの一つであり、Ｓｐ１、Ｓｐ２、およびＳｐ３は、それぞれ互いに独立に、１から９個の炭素原子を含むアルキレン鎖、Ｓｐ．１、Ｓｐ．２、Ｓｐ．３、Ｓｐ．４、およびＳｐ．５（上に定義）から選ばれ、および／または、ＰＥＰは、上述の構造式Ｐ．１によるホスホロアミダイト基である。構造式（ＩＸ．１）による例示合成試薬の、非限定的特定実施態様が、図３および４に示される。
【０１４４】
ある実施態様では、合成ハンドル−ＯＲｅはヌクレオシドによって供給され、そのため、合成試薬はヌクレオシド性となる。このようなヌクレオシド性合成試薬では、標識部分は、通常、リンカーを介してヌクレオシドの核酸塩基に連結され、標識オリゴヌクレオチド合成のために使用される条件下に反応性を帯びる環外官能基、例えば、環外アミンがある場合、それは、いずれのものであれ、保護される。
【０１４５】
このヌクレオシドは、オリゴヌクレオチド合成における使用のために適切に保護することが可能であれば、いずれのヌクレオシドであってもよく、２’−デオキシリボース糖成分、３’−デオキシリボース糖成分（２’−５’ヌクレオチド間連結を含む標識オリゴヌクレオチドの合成に有用である）、適切に保護されたリボース成分、これらリボース成分の内の任意の成分の置換体、または、場合によっては非リボース糖成分を含んでもよい。
【０１４６】
ある実施態様では、このヌクレオシド性合成試薬は、構造式（ＩＸ．２）、（ＩＸ．３）、（ＩＸ．４）、および（ＩＸ．５）による化合物である：
【０１４７】
【化３６】
2014079254.tif 000040
ここで、ＬＭは標識部分を表し、Ｂは適切に保護された核酸塩基を表し、Ｌ２は、核酸塩基に標識部分を連結するリンカーを表し、Ｒｅは、酸不安定な保護基を表し、ＰＥＰは、リン酸エステル前駆体基を表し、Ｏは酸素原子であり、かつ、構造式（ＩＸ．４）では、Ｒ１１は、２’−ヒドロキシル保護基を表す。
【０１４８】
構造式（ＶＩＩ．１）、（ＩＸ．２）、（ＩＸ．３）、（ＩＸ．４）、および（ＩＸ．５）による合成試薬では、核酸塩基Ｂは、オリゴヌクレオチドの中に組み込むのに有用である限り、事実上いずれのヘテロ環であってもよい。例えば、核酸塩基は、遺伝学的コード担持プリン（アデニンまたはグアニン）のうちの一つ、遺伝学的コード担持ピリミジン（シトシン、ウラシル、またはチミン）のうちの一つ、遺伝学的コード担持プリンおよび／またはピリミジンの類縁体および／または誘導体（例えば、７−デアザアデニン、７−デアザグアニン、５−メチルシトシン）、非遺伝学的コード担持プリンおよび／またはピリミジン（例えば、イノシン、キサンテン、およびヒポキサンテン）、または他のタイプのヘテロ環のうちの一つであってもよい。オリゴヌクレオチドの中に組み込むのに有用なヘテロサイクルは多様なものが従来技術で既知であり、例えば、Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆａｓｍａｎ，Ｅｄ．，１９８９，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  （例えば、３８５−３９３ページ、および、その中に引用される文献を参照）に記載される。なお、この開示を、引用により本明細書に含める。これら各種ヘテロ環の全ての外、後に発見されるものも、本明細書に記載されるヌクレオシド性合成試薬の中に含めることが可能である。
【０１４９】
構造式（ＶＩＩ．１）、（ＩＸ．２）、（ＩＸ．３）、（ＩＸ．４）、および（ＩＸ．５）による合成試薬において、Ｂがプリンである場合、図示の糖成分は、通常、該プリンのＮ９位置に付着し、Ｂがピリミジンの場合、図示の糖成分は、通常、該ピリミジンのＮ１位置に付着する。他の核酸塩基の付着部位は、当業者には明白であろう。
【０１５０】
核酸塩基上の環外アミン、または他の反応基（単複）は、標識オリゴヌクレオチド合成に使用される合成条件に対して安定な保護基によって保護される。オリゴヌクレオチド合成の観点からヌクレオシド核酸塩基の環外アミン基の保護に好適な基は、これら保護されるヌクレオシドの調製法同様、様々のものが従来技術で既知である。
【０１５１】
例えば、アデニンの環外アミンを保護するために使用される基としては、ベンジオール（Ｂｚ）、フェノキシアセチル（Ｐａｃ）、およびイソブチル（ｉＢｕ）が挙げられる。シトシンの環外アミンを保護するために使用される基としては、アセチル（Ａｃ）およびＢｚが挙げられる。グアニンの環外アミンを保護するために使用される基としては、ｉＢｕ、ジメチルフォルムアミド（Ｄｍｆ）、および４−イソプロピル−フェノキシアセチル（ｉＰｒ−Ｐａｃ）が挙げられる。これらの保護基は全て、水酸化アンモニウムによる５５−６５℃、２−３時間の処理によって除去することが可能である。しかしながら、これらの保護基のあるものは、より穏やかな条件下に除去される。例えば、ＡｉＢｕ、ＡＰａｃ、ＣＡｃ、およびＧｉＰｒ−Ｐａｃからの保護基の切り離しは、水酸化アンモニウムによる室温で４−１７時間の処理、またはメタノールに溶解した０．０５Ｍ炭酸カリウムによる処理、またはＨ２Ｏ／ＥｔＯＨに溶解した２５％  ｔ−ブチルアミンによる処理によって実行することが可能である。本明細書に記載される試薬を構成するＮＨ−ローダミンのあるもの、および／または他の染料は、他の保護基によって必要とされる、より過激な脱保護条件に対して安定でない可能性があるので、これらの比較的おだやかな脱保護条件下に除去することが可能な保護基を利用するヌクレオシド性試薬が好ましい。
【０１５２】
核酸塩基Ｂに標識部分ＬＭを連結するリンカーＬ２は、核酸塩基の任意の位置に付着してよい。ある実施態様では、Ｂがプリンである場合、リンカーは、該プリンの８−位置に付着し、Ｂが７−デアザプリンである場合、リンカーは、該７−デアザプリンの７−位置に付着し、Ｂがピリミジンである場合、リンカーは、該ピリミジンの５−位置に付着する。
【０１５３】
ある実施態様では、核酸塩基にＬＭを付着させるために有用なリンカーＬ２は、アセチレン性、またはアルケン性アミノ連結、例えば、−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ２−ＮＨ−、−Ｃ≡Ｃ−Ｃ（Ｏ）−、−ＣＨ＝ＣＨ−ＮＨ−、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）１−６−ＮＨ−、および−ＣＨ＝ＣＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）１−６−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−から選ばれる連結、プロパルジル−１−エトキシアミノ連結、例えば、式−Ｃ≡ＣＨ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−［Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２］０−６−ＮＨ−を有する連結、または、剛性連結、例えば、−Ｃ≡Ｃ−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−［Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２］０−６−ＮＨ−、−Ｃ≡Ｃ−（Ａｒ）１−２−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−［Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２］０−６−ＮＨ−、−Ｃ≡Ｃ−（Ａｒ）１−２−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−［Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２］０−６−ＮＨ−、および−Ｃ≡Ｃ−（Ａｒ）１−２−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−［Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２］０−６−ＮＨ−から選ばれる連結を含む。ここで、Ａｒは上に定義した通りである。
【０１５４】
ある実施態様では、プリン核酸塩基にＬＭを付着させるために有用なリンカーＬ２は、アルキルアミン、例えば、式−ＮＨ−（ＣＨ２）１−６−ＮＨ−の連結である。
【０１５５】
ある実施態様では、プリンまたはピリミジン核酸塩基にＬＭを付着させるために有用なリンカーＬ２は、米国特許第６，８１１，９７９号に記載の陰イオンリンカーである。なお、この開示を引用により本明細書に含める（例えば、コラム１７、２５行からコラム１８、３７行の開示、および図１−１７を参照）。
【０１５６】
本明細書に記載される試薬に組み込むのに好適な、前述のものと同様の、リンカーと共に誘導体形成されるヌクレオシドを合成する方法は、例えば、Ｈｏｂｂｓら、１９８９，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５４：３４２０；Ｈｏｂｂｓらに付与された米国特許第５，１５１，５０７号；Ｋｈａｎらに付与された米国特許第５，９８４，６４８号；およびＫｈａｎらに付与された米国特許第５，８２１，３５６号に記載される。なお、これらの開示を引用により本明細書に含める。誘導体形成ヌクレオシドは、下記にさらに詳細に説明するように、ヌクレオシド合成試薬を合成するための合成素子として使用することが可能である。
【０１５７】
本明細書に記載されるヌクレオシド性試薬を含んでもよい、リンカー誘導体形成核酸塩基の特定例示実施態様を下記に図示する：
【０１５８】
【化３７】
2014079254.tif 000041
ヌクレオシド性合成試薬は、下記のスキーム（ＩＩ）に示すように、リンカー誘導体形成ヌクレオシド合成素子から調製することが可能である：
【０１５９】
【化３８】
2014079254.tif 000042
スキーム（ＩＩ）において、リンカー誘導体形成ヌクレオシド合成素子１１０は、スキームでは例示の塩化物試薬ＲｅＣｌと共に示される、５’−ヒドロキシル基において酸不安定基によって保護される。Ｒｅは上に定義した通りである。塩基で処理してトリフルオロアセチル保護基を除去すると、合成素子１１２が得られる。合成素子１１２の、標識部分合成素子１０２との反応によって（上のスキーム（Ｉ）では、ＰＥＰ合成素子１０５による処理後、図示の、この特定実施態様では、フォスフィン（上のスキーム（Ｉ）参照）である）、ヌクレオシド性合成試薬１１４が得られる。上に示した各種合成工程を実行するための特異的条件は、周知である。合成ハンドル、例えば、式−ＯＲｅの合成ハンドルを含む、非ヌクレオシド性合成試薬は、スキーム（ＩＩ）の常識的な応用によって調製することが可能である。
【０１６０】
５．１０  固相支持試薬
本明細書に記載される試薬の多くの実施態様は、固相支持体を含む。このような試薬は、一般に、固相支持体、本明細書に記載の標識部分、および合成ハンドルを含むが、さらに追加の基または成分、例えば、追加の標識部分、クエンチャー（ｑｕｅｎｃｈｅｒ）部分、特に、オリゴヌクレオチド二重体を安定化するために有用な合成ハンドルおよび／または基、例えば、塩基ペア間に介在する仲介因子（介在因子）、および、二重小溝に結合する因子（小溝結合、またはＭＧＢ介在因子）を含んでもよい。固相支持体、標識部分、合成ハンドル、および任意に追加される成分は、それぞれの機能を実行する能力を妨げない限り、どのような方式、方向性で相互に連結させてもよい。
【０１６１】
ある実施態様では、固相支持体は、リンカーを介して試薬の残余部に付着される。固相支持体を、試薬の残余部に付着させるリンカーは、通常、指定の条件下で選択的に切断することが可能な連結を含み、そのため、合成後、この合成された標識オリゴヌクレオチドは、固相支持体から解放させることが可能である。ある実施態様では、連結は、合成標識オリゴヌクレオチドを脱保護するために使用される条件に対して不安定であり、そのため、該ヌクレオチドは、単一工程において、脱保護され、かつ、固相支持体から切り離される。このようなリンカーは、通常、エステル結合を含むが、他の結合、例えば、炭酸エステル、ジイソプロピルシロキシエーテル、修飾されたリン酸エステルなどを含んでもよい。
【０１６２】
オリゴヌクレオチド合成の観点から有用な、選択的切断が可能なリンカーは、固相支持体をこのようなリンカーと共に誘導体形成する方法と同様、莫大なものがあり、それらは従来技術で既知である。これらの様々なリンカーのすべては本発明に記載の固相支持試薬に使用するために適用される。合成オリゴヌクレオチドを脱保護するために用いられる塩基性条件下で切断が可能な例示のリンカーを含む、固相支持試薬の非限定的例が、図７に示される。
【０１６３】
合成試薬同様、固相支持試薬も、非ヌクレオシド性、またはヌクレオシド性であってもよい。非ヌクレオシド性固相試薬の例示実施態様は、構造式（Ｘ）による試薬を含む：
【０１６４】
【化３９】
2014079254.tif 000043
ここで、ＬＭは標識部分を表し、Ｌは、任意に選択的に切断可能なリンカーを表し、−ＯＲｅは、合成ハンドルを表す。Ｒｅは、前述した通り、酸不安定な保護基である。
【０１６５】
ある実施態様では、構造式（Ｘ）の固相支持試薬は、構造式（Ｘ．１）による非ヌクレオシド試薬である：
【０１６６】
【化４０】
2014079254.tif 000044
ここで、Ｚ、ＬＭ、Ｇ、Ｓｐ１、Ｓｐ２、およびＲｅは、構造式（ＩＸ．１）に関連して上に定義した通りであり、Ｓｐ４は、選択的に切断可能なスペーサー成分を表す。ある実施態様では、選択的に切断可能なスペーサー成分Ｓｐ４は、エステル結合を含む。
【０１６７】
ある実施態様では、構造式（Ｘ）の固相支持合成試薬は、構造式（Ｘ．２）、（Ｘ．３）、（Ｘ．４）、または（Ｘ．５）によるヌクレオシド試薬である：
【０１６８】
【化４１】
2014079254.tif 000045
ここで、ＬＭ、Ｒｅ、Ｂ、Ｌ２は、構造式（Ｘ．２）、（Ｘ．３）、（Ｘ．４）、および／または（Ｘ．５）について以前に定義した通りであり、Ｒ１１は、構造式（ＩＸ．４）について以前に定義した通りであり、かつ、Ｓｐ４は、前述の通り、選択的に切断が可能なスペーサー成分を表し、これは、ある実施態様では、エステル結合である。
【０１６９】
５．１１  追加の例示実施態様
本開示を通じて記載される、各種成分、基、およびリンカーの特定実施態様は、本明細書に記載される試薬の全てに含めることが可能であることを理解しなければならない。さらに、各種の特異的実施態様は、互いに、任意の組み合わせで、あたかもその特異的組み合わせが具体的に明示されるかのように組み合わせることが可能である。特異的例として、本明細書に記載される標識部分ＬＭの特異的実施態様の内の任意の一つを、本明細書に記載される、非ヌクレオシド性およびヌクレオシド性固相支持体および合成試薬の、特異的に例示される実施態様のいずれかの中に含めることが可能である。もう一つの特異的例として、リン酸エステル前駆体基ＰＥＰの特異的実施態様の内の任意の一つ、例えば、上記の構造式（Ｐ．１）のホスホロアミダイト基を、本明細書に記載される合成試薬の内の任意の一つの中に含めることが可能である。
【０１７０】
５．１２  試薬の使用
本明細書に記載される各種試薬は、直接合成樹脂の上で、ローダミン染料によって標識されるオリゴヌクレオチドを合成するための、オリゴヌクレオチドの段階的合成において使用することが可能である。したがって、これら各種試薬は、合成後の手間のかかる修飾を要することなく、無数の異なるローダミンによってオリゴヌクレオチドを合成的に標識する能力を利用可能とする。ＮＨローダミン染料によって標識されたオリゴヌクレオチドを合成するための、例示の合成試薬の使用が、図９に示される。
【０１７１】
熟練した当業者には理解されるように、ドナー、アクセプター、または場合によっては、ＮＨ−ローダミン染料の反応停止因子として活動することが可能なホスホロアミダイトの利用が可能であるために、本明細書に記載される試薬は、エネルギー転移染料および／またはＮＨ−ローダミン反応停止染料ペアによって標識されるオリゴヌクレオチドの、インサイチュ合成を可能とする。本明細書に記載される試薬によって実現される万能性を示す、ＮＨ−ローダミン−フルオレセインエネルギー転移染料ペアによって標識されるオリゴヌクレオチドの例示合成が、図１０および１１に例示される。本明細書に記載される試薬は、事実上全てのＮＨ−ローダミン染料の、固相支持試薬および／または合成試薬における包含を可能にするので、特異的応用のために調整される分光特性を有する、エネルギー転移染料ペアによって標識されるオリゴヌクレオチドを、合成後の修飾を要することなく、好都合にもインサイチュ合成することが可能である。さらに、無数の異なるエネルギー転移染料ペアによって標識されるオリゴヌクレオチドを、特異的染料ペアを含む合成試薬の製造を要することなく、個々のモノマー試薬から合成することが可能である。介在性リンカー成分の添加の下に、または添加を要することなく、染料ペアの各メンバーを、段階的に新生オリゴヌクレオチドに付着させることが可能である。
【０１７２】
図９を参照すると、支持体結合合成ヌクレオチド２００は、その５’−ヒドロキシルを保護するＤＭＴ基を除去するために酸で処理され、５’−脱保護、支持体結合オリゴヌクレオチド２０２を生成する。Ｎ−保護ＮＨ−ローダミンホスホロアミダイト試薬２０４の結合、次いで酸化によって、支持体結合、ＮＨ−ローダミン標識オリゴヌクレオチド２０６が生成される。全ての保護基を除去し、かつ、固相支持体（樹脂）からこの合成オリゴヌクレオチドを切り離すために、濃縮水酸化アンモニウムによって処理すると、ＮＨ−ローダミン染料によって標識されるオリゴヌクレオチド２０８が生成される。
【０１７３】
図１０を参照すると、標識部分として、保護されたＮＨ−ローダミン−フルオレセインエネルギー転移染料ペアを含む、固相支持試薬２１０は、３合成サイクルを経過して、標識支持体結合オリゴヌクレオチド２１２を生成することが可能である。固相支持体から切り離されると、脱保護された、標識オリゴヌクレオチド２１４が得られる。
【０１７４】
図１１Ａを参照すると、新生の、支持体結合オリゴヌクレオチド２２０は、該オリゴヌクレオチド２２０の５’−ヒドロキシルに対し、Ｎ−保護ＮＨ−ローダミンホスホロアミダイト合成試薬２２２を結合することによって、インサイチュ合成されたＮＨ−ローダミン−フルオレセインによって標識することが可能であり、この産物は、酸化後、ＮＨ−ローダミン標識オリゴヌクレオチド２２４を生成する。ＤＭＴ基の除去後、Ｏ−保護ホスホロアミダイト（図示の特定実施例では、ＦＡＭ−ホスホロアミダイトである）を結合させると、標識された、支持体結合オリゴヌクレオチド２２６が生成される。切り離しおよび脱保護によって、ＮＨ−ローダミン−ＦＡＭエネルギー転移染料ペアによって標識される、オリゴヌクレオチド２２８が生成される。
【０１７５】
このドナーおよびアクセプター染料を連結する結合手の長さおよび特徴も、ホスホロアミダイトリンカー試薬を用いることによって操作することが可能である。この局面は、図１１Ｂに示される。この図では、リンカーホスホロアミダイト２３０は、ローダミン標識オリゴヌクレオチド２２５に結合され、試薬２３２を生成する。ＦＡＭ−ホスホロアミダイトによる結合、次いで、酸化、脱保護、および切り離しによって、オリゴヌクレオチド２３４が得られる。これは、ＮＨ−ローダミン−ＦＡＭエネルギー転移染料ペアによって標識される。リンカーホスホロアミダイト２３０において、”Ｓｐ”は、以前に定義した通りのスペーサである。例えば、”Ｓｐ”は、以前に定義した、（Ｓｐ．１）、（Ｓｐ．２）、（Ｓｐ．３）、（Ｓｐ．４）、または（Ｓｐ．５）を表してもよい。
【０１７６】
図１１Ｂに示すスキームでは、ＮＨ−ローダミンとＦＡＭ染料を連結するリンカーの長さおよび特性は、ＦＡＭ−ホスホロアミダイトによる結合の前に、試薬２３２に対し、さらに別のリンカーホスホロアミダイトを結合することによって調整することが可能である。これらのリンカーホスホロアミダイトは、同じであってもよく、または、異なっていてもよい。このようにして、ドナーおよびアクセプターの外に、該ドナーおよびアクセプターを連結するリンカーも存在する、エネルギー転移染料ペアによって標識されるオリゴヌクレオチドは、特定の目的に合せ、簡単にインサイチュ合成することが可能である。
【０１７７】
図１１Ａおよび１１Ｂは、特異的な、Ｎ−保護ＮＨ−ローダミン試薬の使用を例示するが、当業者であれば、ＦＡＭに対するアクセプターとして活動するものであれば、いずれのＮ−保護ＮＨ−ローダミン試薬であっても使用が可能であることを理解するであろう。さらに、他の種類のホスホロアミダイト染料の使用が可能であるように、他のＯ−保護フルオレセインの使用も可能である。染料はモノマーとして添加されるので、エネルギー転移染料標識の数は、それらを合成するのに必要なホスホロアミダイト試薬の数よりも大きい。例えば、９種の異なるエネルギー転移染料ペアによって標識されるオリゴヌクレオチドは、三つの異なるＮ−保護ＮＨ−ローダミンホスホロアミダイト試薬（試薬Ａ、Ｂ、およびＣ）、および、三つの異なるＯ−保護フルオレセインホスホロアミダイト試薬（試薬１、２、および３）によって合成することが可能である：オリゴ−Ａ１、オリゴ−Ａ２、オリゴ−Ａ３、オリゴ−Ｂ１、オリゴ−Ｂ２、オリゴ−Ｂ３、オリゴ−Ｃ１、オリゴ−Ｃ２、およびオリゴ−Ｃ３。
【実施例】
【０１７８】
（実施例１）
Ｎ−保護ＮＨ−ローダミンホスホロアミダイト合成試薬の合成
Ｃ５−、またはＣ６−位置にカルボキシル置換基を含む、親ＮＨ−ローダミン染料を、米国特許第４，６２２，４００号、米国特許第５，７５０，４０９号、米国特許第５，８４７，１６２号、米国特許第６，０１７，７１２号、米国特許第６，０８０，８５２号、米国特許第６，１８４，３７９号、または米国特許第６，２４８，８８４号に記載されるように合成した。次に、この親ＮＨ−ローダミン染料を、環外アミンにおいて、アセチル、またはトリフルオロアセチ保護基によって保護し、得られたＮ−保護ＮＨ−ローダミン染料を、対応するＮＨＳエステル誘導体を介してヒドロキシル−アミド誘導体に変換し、このヒドロキシル官能基を、標準手順を用いて、ホスホロアミダイトに変換した。全体的スキームを下記に示す。
【０１７９】
【化４２】
2014079254.tif 000046
アセチル基による保護  ＮＨ−ローダミン酸６（モノＴＥＡ塩、１．６７６  ｍｍｏｌ）を、ＤＣＭ（４０  ｍＬ）およびＴＥＡ（３．６７  ｍＬ）に縣濁した。無水酢酸（３．１３  ｍＬ）を加え、この反応混合物を室温で３日間攪拌した。Ｈ２Ｏ（１０  ｍＬ）を加え、攪拌を３０分続けた。この混合物をＤＣＭ（２００  ｍＬ）で希釈し、ＮａＨＣＯ３液（２００  ｍＬ  ×  ２）で洗浄し、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、ろ過し、蒸発した。残渣をシリカ（溶出液として、ＭｅＯＨ／ＥｔＯＡｃ／ＤＣＭの、５：２０：７５から２０：２０：６０の勾配を使用）によるフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。適切な分画を分留したところ、８８１  ｍｇ（８７％）の、無色の、ラクトン化ビスアセチルＮ−保護ＮＨ−ローダミン染料８が得られた。
【０１８０】
トリフルオロアセチル基による保護  ＮＨ−ローダミン酸６（モノＴＥＡ塩、１．５  ｇ，２．４０２  ｍｍｏｌ）を、ＤＣＭ（３０  ｍＬ）およびＴＥＡ（６．６９６  ｍＬ）に縣濁した。この縣濁液を０℃に冷却し、無水酢酸（２．０  ｍＬ）をシリンジを用いて滴下した。添加完了後、この反応混合物を室温で１０分攪拌した（かつ、染料粒子を粉砕するために超音波処理した）。得られた褐色液を留去し、ＤＣＭ（５０  ｍＬ）に再度溶解し、５％  ＨＣｌ（４０  ｍＬ）と共に室温で１時間攪拌した。この反応混合物を分離漏斗に移し、二つの層を分離した。ＤＣＭ層を塩水（４０  ｍＬ）にて洗浄し、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、ろ過し、蒸発した。残渣を、ＭｅＣＮ（２ｘ）と共に蒸発させたところ、１．７９  ｇの、未精製の、Ｎ−保護ＮＨ−ローダミン染料７が得られた。
【０１８１】
Ｎ−保護ＮＨ−ローダミンＮＨＳエステルの合成  ＤＣＭ（２０  ｍＬ）に溶解した、ビス−アセチル染料８（５８８  ｍｇ，０．９６８  ｍｍｏｌ）およびＮＨＳ  （３３４
ｍｇ，２．９０４  ｍｍｏｌ）の溶液に、ＤＣＣ  （５９９  ｍｇ，２．９０４  ｍｍｏｌ）を加えた。この反応混合物を室温で２時間攪拌し、次いで、反応混合物をろ過した。ろ液を、ＤＣＭ（８０  ｍＬ）で希釈し、Ｈ２Ｏ（５０  ｍＬ  ｘ  ２）で洗浄し、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、ろ過し、蒸発した。残渣をシリカ（溶出液として、ＡｃＯＨ／ＭｅＯＨ／ＥｔＯＡｃ／ＤＣＭの、１：１：２０：７８から１：５：２０：７４の勾配を使用）によるフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。適切な分画を分留したところ、６８０  ｍｇ（１００％）の、ビスアセチルＮ−保護ＮＨ−ローダミンＮＨＳエステル１０が得られた。
【０１８２】
ビスアセチルＮ−保護ＮＨ−ローダミンＮＨＳエステル１０、ビス−ＴＦＡ  Ｎ−保護ＮＨ−ローダミン染料７（０．３２２  ｍｍｏｌ）に関する前述の手順にしたがって、ビス−ＴＦＡ  Ｎ−保護ＮＨ−ローダミンＮＨＳエステル９を、８０−９０％収率で得た。
【０１８３】
Ｎ−保護ＮＨ−ローダミンホスホロアミダイトの合成  ＮＨＳエステル９（０．４  ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（８  ｍＬ）に溶解した。攪拌下、この液に、６−アミノ−１−ヘキサノール／ＤＩＰＥＡ／ＤＣＭ（５６  ｍｇ／０．０７  ｍＬ／２  ｍＬ）を加えた。この反応物を室温で３０分攪拌した。固体副産物をろ過除去し、ろ液を、シリカ（溶出液として、ＥｔＯＡｃ／ＤＣＭの、３０％から６０％の勾配を使用）によるフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。適切な分画を分留したところ、０．３４４  ｍｍｏｌ（８６％）の、ビスＴＦＡ−ヘキサノールアミドローダミン染料１１が得られた。
【０１８４】
ＮＨＳエステル１０は、同様手順を用いてビス−アセチル−ヘキサノールアミドＮＨ−ローダミン染料１２に変換した。
【０１８５】
ＤＣＭ（１０  ｍＬ）に溶解した、ビスＴＦＡ−ヘキサノールアミドローダミン染料１１（０．３３８  ｍｍｏｌ）および２−シアノエチルＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイト（０．２１４  ｍＬ，０．６７４  ｍｍｏｌ，２当量）の溶液に、テトラゾールアミン（４  ｍｇ）を一度に加えた。この混合物を室温で２０時間攪拌した。揮発物質を蒸発させて除去し、残渣を、ＤＣＭ／ヘキサンによる３回の沈殿によって精製した。固体産物を減圧乾燥したところ、０．２５６  ｍｍｏｌ（７６％）のビス−ＴＦＡ−Ｎ−保護ＮＨ−ローダミン染料ホスホロアミダイト１３が得られた。
【０１８６】
同様にして、ビス−アセチル染料１２をホスホロアミダイト１４に変換した。
【０１８７】
（実施例２）
ヘテロダイマー染料ネットワークの合成
Ｎ−保護ＮＨ−ローダミンに連結したＯ−保護フルオレセインを含む染料ネットワークを、下記に示すようにして合成した：
【０１８８】
【化４３】
2014079254.tif 000047
ビス−アセチルＮ−保護ＮＨ−ローダミンＮＨＳエステル１６（３２４  ｍｇ，０．４６０  ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（８  ｍＬ）およびＤＩＰＥＡ（０．３  ｍＬ）の溶液に溶解した。フルオレセイン誘導体１７（２３９  ｍｇ，０．３２  ｍｍｏｌ、米国特許第５，８００，９９６号に記載される通りに合成）を加え、反応混合物を、室温で１時間攪拌した。この混合液を蒸発させ、次いで、ＭｅＯＨ（２  ｘ）と共に蒸発させた。残渣を１０％  ＭｅＯＨ／ＤＣＭ（１００  ｍＬ）に溶解し、塩水（１００  ｍＬ）で洗浄した。水層を、１０％  ＭｅＯＨ／ＤＣＭ（５０  ｍＬ  ｘ  ３）で抽出し、合わせた有機層を乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、ろ過し、蒸発した。残渣をシリカ（溶出液として、ＭｅＯＨ／ＤＣＭの、１０％から３０％の勾配を使用）によるフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。適切な分画を分留したところ、２７０  ｍｇ（６３％）の、ヘテロダイマー染料ネットワーク１９（ＤＩＰＥＡ塩として）が得られた。
【０１８９】
対応する、ビス−ＴＦＡ保護染料ネットワーク１８が、同様の手順によって合成された。
【０１９０】
（実施例３）
ヘテロダイマー染料ネットワークホスホロアミダイトの合成
標識部分としてヘテロダイマー染料ネットワークを含むホスホロアミダイト合成試薬は、下記に示すように合成された：
【０１９１】
【化４４】
2014079254.tif 000048
ＤＣＭ（１０  ｍＬ）に溶解した、ヘテロダイマー染料ネットワーク１９（０．１７３
ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（１．０２８  ｍＬ）、および無水ピバル酸（０．７０２  ｍＬ）の混合物を、室温で１日攪拌した。Ｈ２Ｏ（４０  ｍＬ）を加え、攪拌を１時間続けた。この反応混合物をＤＣＭ（５０  ｍＬ）で希釈し、Ｈ２Ｏで洗浄した。水層をＤＣＭ（４０  ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層を乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、ろ過し、蒸発した。残渣をシリカ（溶出液として、ＭｅＯＨ  ／ＤＣＭの、３％から１５％の勾配を使用）によるフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。適切な分画を分留したところ、０．１４５  ｍｍｏｌ（８４％）の、ビス−アセチルビス−ピバロイルヘテロダイマー染料誘導体２１（ＤＩＰＥＡ塩として）が得られた。
【０１９２】
染料誘導体２１（０．１４６  ｍｍｏｌ）を、ＤＩＰＥＡ（０．２  ｍＬ）とＤＣＭ（８  ｍＬ）の溶液に縣濁した。固体のＮ−ヒドロキシスクシニミドテトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（８８  ｍｇ）を加え、この反応物を室温で１時間攪拌した。６−アミノ−１−ヘキサノール（５１  ｍｇ）を加え、攪拌を１時間続けた。この反応混合物をろ過し、ろ液をＤＣＭ（５０  ｍＬ）で希釈した。このＤＣＭ液を塩水（４０  ｍＬ）で洗浄し、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、ろ過し、蒸発した。残渣をシリカゲル（溶出液として、ＭｅＯＨ：ＥｔＯＡｃ：ＤＣＭの、５：２０：７５から１５：２０：６５の勾配を使用）によるフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。適切な分画を分留したところ、０．１２４  ｍｍｏｌ（８５％）の、染料ヘキサノールアミド誘導体２３（ＤＩＰＥＡ塩として）が得られた。
【０１９３】
染料誘導体２３（９１  ｍｇ，０．０５７  ｍｍｏｌ）、およびテトラゾールアミン（２  ｍｇ）を、ＤＣＭ（５  ｍＬ）に溶解した。２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロアミダイト（ＣＥジアミダイト）（０．０４  ｍＬ）を加え、この反応物を室温で１６時間攪拌した。反応混合物を、ＴＥＡ：ＥｔＯＡｃ：ＤＣＭ
（３：２０：７７，３  ｍＬ）の溶液で希釈し、シリカゲルクロマトグラフィー（溶出液として、ＴＥＡ：ＭｅＯＨ：ＥｔＯＡｃ：ＤＣＭの、３：０：２０：７７から３：５：２０：７２の勾配を使用）によって精製した。適切な分画を分留し、ＤＣＭ／ヘキサンによって沈殿させたところ、７５  ｍｇ（７４％）のヘテロダイマー染料ホスホロアミダイト２５が得られた。
【０１９４】
（実施例４）
任意の合成ハンドルを含む、非ヌクレオシド性ホスホロアミダイト合成試薬の合成
式−ＯＲｅの、任意の合成ハンドルを含む、非ヌクレオシド性ホスホロアミダイト合成試薬を、下記に示すように合成した：
【０１９５】
【化４５】
2014079254.tif 000049
ビス−ＴＦＡ誘導体９（１．３５４  ｍｍｏｌ）を、ＤＣＭ（３０  ｍＬ）に溶解したＤＩＰＥＡ（０．２３６  ｍＬ）の溶液に溶解した。攪拌下、この溶液に、リンカー合成素子２９およびＤＣＭ（０．０６０９  ｇ，１．３５５  ｍｍｏｌ、Ｎｅｌｓｏｎら、１９９２，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０：６２５３−６２５９の記載の通りに合成した）を加え、攪拌を、室温で２時間続けた。ＥｔＯＡｃを加え、混合物をシリカカラムに負荷した。ＥｔＯＡｃ：ＤＣＭの５：９５から１：５勾配使用の溶出によって純粋産物を単離した。適切な分画を分留したところ、１．２５  ｇ（８０％）のビス−ＴＦＡ−ローダミン−ヒドロキシアミン３０が得られた。
【０１９６】
ビス−ＴＦＡ−ローダミン−ヒドロキシアミド３０（１．０８１  ｍｍｏｌ）およびテトラゾールアミン（１８．５  ｍｇ）をＤＣＭ（３５  ｍＬ）に溶解して溶液とした。ＣＥジアミダイトを加え（０．６８５  ｍＬ）、この反応物を、室温で１８時間攪拌した。溶媒を、減圧留去し、残渣をＤＣＭ／ヘキサン（３  ｘ）で沈殿させたところ、１．０８１  ｍｍｏｌ（１００％）の純粋ビス−ＴＦＡ−ローダミンＤＭＴホスホロアミダイト３１が得られた。
【０１９７】
（実施例５）
標識オリゴヌクレオチドの固相合成
Ｎ−保護ＮＨ−ローダミンホスホロアミダイト合成試薬によって標識されたオリゴヌクレオチドを、ＡＢ３９００自動式ＤＮＡ合成機において標準動作条件を用いポリスチレン固相支持体の上で合成した。Ｎ−保護ＮＨ−ローダミンホスホロアミダイトは、結合反応用のアセトニトリル溶媒に対して可溶であり、Ｎ−保護ＮＨ−ローダミン染料アダクトは、繰り返しの合成サイクルに対して安定であった。合成サイクルは、ヌクレオチド間リン酸結合を生成するために、ジクロロ酢酸によるＤＭＴの除去、ヌクレオシドホスホロアミダイトモノマーの添加、無水酢酸によるキャップ形成、および、ヨウ素による酸化を用いた。さらに、このクラスのＮＨ−ローダミンは、合成された標識オリゴヌクレオチドを脱保護し、それを固相支持体から切り離すために用いられる条件（水酸化アンモニウムによる６０℃、１２時間の処理）にたいしても安定であることが判明した。この標識オリゴヌクレオチドを合成するために用いられた全体スキームを下記に示す：
【０１９８】
【化４６】
2014079254.tif 000050
このプロセスによって、ＴＦＡ−ローダミンＤＭＴホスホロアミダイト３１は、支持体結合オリゴヌクレオチドの５’−ヒドロキシルに結合して、亜リン酸中間体３２を生成する。フルオレセインホスホロアミダイト（Ｇｌｅｎｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を、中間体３２の遊離ヒドロキシルに結合させた。得られた標識オリゴを酸化し、濃縮水酸化アンモニウム、６０℃、１−２時間によって支持体から切り離し、アセトニトリル／水で洗浄し、減圧乾燥したところ、標識オリゴヌクレオチド３３が得られた。オリゴ３３を、標準的酢酸ナトリウム／ＥｔＯＨ沈殿プロトコールを用いて再沈殿させた。標識オリゴ３３は、９０％を超える純度、８５％を超える収率で得られ（０．２  ｕＭの支持体から１７０，０００  ｐＭ）、それ以上精製することなく用いた。
【０１９９】
（実施例６）
この合成試薬によって合成された標識オリゴヌクレオチドは、優れた分光特性を示す
ＮＨ−ローダミン、またはＮＨ−ローダミン−フルオレセイン染料ペアによって標識されたポリ（ｄＴ）１０オリゴヌクレオチドを、上に示すようにして合成した。切り離し後、蛍光スペクトラムを記録した。合成した標識オリゴは全て、優れた蛍光特性を示した。
【０２００】
理解を助けるために、発明内容をやや詳細に記述したが、付属の特許請求の範囲内においていくつかの変更および改変の実行が可能であることは明白であろう。したがって、記述の実施態様は、例示と見なすべきであって、限定的と考えてはならず、本明細書に記載される発明の各種局面は、本明細書で示した詳細のみに限定されてはならない。
【０２０１】
本開示を通じて引用された文献および特許の参照は皆、全ての目的のために引用により本出願に含められる。
【図１Ａ】
2014079254.tif 000051
【図１Ｂ】
2014079254.tif 000052
【図１Ｃ】
2014079254.tif 000053
【図２】
2014079254.tif 000054
【図３Ａ】
2014079254.tif 000055
【図３Ｂ】
2014079254.tif 000056
【図４】
2014079254.tif 000057
【図５】
2014079254.tif 000058
【図６】
2014079254.tif 000059
【図７】
2014079254.tif 000060
【図８Ａ】
2014079254.tif 000061
【図８Ｂ】
2014079254.tif 000062
【図９Ａ】
2014079254.tif 000063
【図９Ｂ】
2014079254.tif 000064
【図９Ｃ】
2014079254.tif 000065
【図９Ｄ】
2014079254.tif 000066
【図１０Ａ】
2014079254.tif 000067
【図１０Ｂ】
2014079254.tif 000068
【図１０Ｃ】
2014079254.tif 000069
【図１１Ａ】
2014079254.tif 000070
【図１１Ｂ】
2014079254.tif 000071
【図１１Ｃ】
2014079254.tif 000072
【図１１Ｄ】
2014079254.tif 000073
【図１２Ａ】
2014079254.tif 000074
【図１２Ｂ】
2014079254.tif 000075
【図１２Ｃ】
2014079254.tif 000076
【外国語明細書】
2014079254000001.pdf