(57)【要約】【課題】擬似便のマトリックス中に、測定されるべきヘモグロビンまたはトランスフェリンが捕捉されること無く、マトリックスから１００％便希釈液中に分散・溶解する擬似便組成が求められていた。【解決手段】擬似便素材として用いられる米粉などの粉体への吸着阻止剤としてゼラチンやコラーゲン、あるいはその分解物などを擬似便に含有させることにより、添加したヘモグロビンまたはトランスフェリンが１００％希釈液中に溶出させることが出来、測定が正確になる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
粉体に水溶液を浸潤させて作成するヘモグロビンまたはトランスフェリンを測定項目とする擬似便において、ゼラチン、コラーゲン、コラーゲンの分解物から選ばれる１つ以上を含有する事を特徴とする擬似便。
【請求項２】
粉体に水溶液を浸潤させて作成するヘモグロビン及び・またはトランスフェリン測定用擬似便を製造する際に、ゼラチン、コラーゲン、コラーゲンの分解物から選ばれる１つ以上を添加する事を特徴とする擬似便の製造法。
【請求項３】
請求項１のゼラチン、コラーゲン、コラーゲンの分解物が動物組織由来のゼラチン、コラーゲン、コラーゲンの分解物である擬似便。
【請求項４】
請求項１および請求項３の擬似便を使用して、便中ヘモグロビンまたはトランスフェリン項目の精度管理を行う方法。
【請求項５】
請求項３の動物由来のゼラチン、コラーゲン、コラーゲンの分解物が、牛骨または牛皮、豚骨、豚皮、魚鱗、魚骨由来である請求項３の擬似便。
【請求項６】
請求項５の疑似便を使用して、便中ヘモグロビンまたはトランスフェリン項目の精度管理を行う方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は大腸癌検診分野において、サーベイなどに使用される人工的な擬似便の組成、及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
便中ヘモグロビンや便中トランスフェリンは、大腸癌の健診に重要なスクリーニング検査になっている。しかし、この重要な健診項目については、まだ標準化が行われておらず、各施設の測定値がどうなっているのかがほとんど不明で、その状況を知るために行われる全国的な検査値のサーベイランス（以後サーベイという）も実質上行われていないのが現状である。この理由は実便検体中のヘモグロビンやトランスフェリンの安定性が極端に悪く、サーベイ用に実便検体を配布・保存する事が実質不可能である事が１つの要因であった。そのため、安定性については、便の実検体を使用する代わりに、米粉や小麦粉、ジャガイモデンプン、トウモロコシ粉、大豆蛋白等の粉体を主成分にし、ヘモグロビンまたはトランスフェリン及びその安定化剤を含む溶液を添加して人工的な擬似便を作成し、配布・保存に安定な擬似便を使用する事で、解決に供しようとする技術が出願されている。
しかし、擬似便でヘモグロビンまたはトランスフェリンを安定化させても、それだけでは標準化が可能になるわけではない。実際のヘモグロビンまたはトランスフェリンを測定する試薬や便を採取する採便器も標準化に大きなファクターである。図１は現在使用されている便を採取する採便器の使用方法を示している。採取された疑似便は希釈液が封入された希釈容器に入り、ここで分散され、ヘモグロビンまたはトランスフェリンは疑似便の中から出て溶解する。
具体的には、採便器で採取し、それを採便器に付随した希釈液が内封された希釈容器に挿入して擬似便を分散・溶解・希釈して、測定項目であるヘモグロビンまたはトランスフェリンを測定する訳であるが、従来の擬似便ではヘモグロビンまたはトランスフェリンの一部が不溶性の擬似便素材の粉のマトリックス中に補足されて１００％希釈液に回収されず、正確にヘモグロビンまたはトランスフェリンが測定できている訳ではなかった。さらに、測定試薬製造各社の採便器はそれぞれ異なっており、また希釈液もそれぞれに異なっているため、マトリックス中に補足されるヘモグロビンまたはトランスフェリン量もそれぞれに異なっていた。即ち、測定されるべきヘモグロビンまたはトランスフェリンがマトリックス補足により減少し、１００％正確に測定する事が出来なかった。これでは擬似便中のヘモグロビンまたはトランスフェリンを一定量含有させ、測定値をその量に統一させるべく行われるサーベイがこの様な擬似便では不完全なものになり、重要な大腸癌検診項目である便中ヘモグロビンまたはトランスフェリン測定の標準化を妨げていた。
【０００３】
従来、ヘモグロビンまたはトランスフェリンがその不安定性のために、安定性を向上させる試みは多くなされてきたが、本発明のように、添加したヘモグロビンまたはトランスフェリンを粉のマトリックス中に補足されない様にし、希釈液中に１００％溶出させて測定する試薬系に取り入れる様な試み、即ち添加回収率を１００％にする試みは行われた事が無い。具体的には粉体マトリックスにヘモグロビンまたはトランスフェリンを添加し、それを希釈溶液中にすべて分散溶解させて回収するという面から擬似便組成、または希釈液を検討したことが無く、そのような作用を持つ物の例は知られていない。
この様な状況では、採便器の異なる全社を含めたサーベイデータのまとまりは望めない状況であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開平１１−２４２０２７号
【特許文献２】特開２００３−１８５６５４号
【特許文献３】特願２０１２−１８５９６２号
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｒｅｓ．ｖｏｌ．１５  ｓｕｐｐｌ．２    １８−２３；１９９４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
擬似便のマトリックスからヘモグロビンまたはトランスフェリンが１００％希釈液中に分散溶解する擬似便組成が求められていた。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明者は種々検討の結果、意外にも吸着阻止剤としてエンザイムイムノアッセイなどで良く使用される牛血清アルブミンでは、むしろ逆に擬似便素材にヘモグロビンまたはトランスフェリンを吸着させてマトリックス中に留め、回収率を悪くする作用を有していることが判明した一方、意外にもゼラチンやコラーゲン、あるいはその分解物などが回収率を１００％希釈液中溶出させる作用を保つことが判り、本発明を完成した。
【０００８】
ゼラチンの溶液は、温度によってゲル状になったり流動性のあるゾル状になったりする事で知られており、通常これをエンザイムイムノアッセイの吸着防止に使用することはその取り扱いの難しさから行われてこなかった。また、エンザイムイムノアッセイの場合の吸着相手はスチレンなどのプラスチック類であるが、疑似便の場合は米粉などセルロースが主体の天然物であり、エンザイムイムノアッセイの場合の技術的な知見は利用できないし、検討が行われた事もない。
【０００９】
発明者は、本目的のために、吸着防止効果の指標として以下の方法で回収率を算出する方法を考えた。即ち、試験管に擬似便素材である粉体の一定量（１ｇとする）に、回収率を求めたい添加物と共に既知量のヘモグロビンまたはトランスフェリンを含有した溶液（ヘモグロビンまたはトランスフェリン濃度をＡとする）を適量（ＢｍLとする）添加して擬似便様のペーストをいったん作成する。１時間放置後、試験管に精製水を一定量（２ｍLとする）追加添加してヘモグロビンまたはトランスフェリンを溶液中に溶出させ、遠心分離後に上清のヘモグロビンまたはトランスフェリンを測定（濃度をＣとする）して回収率を算出する方法である。なお、擬似便素材の粉体自身が溶液中の一部水分のみを吸着・結合してしまい、これが再溶出出来ない固定化水分となる事も考えなければならない。この固定化水分量（Ｄとする）はヘモグロビンまたはトランスフェリンを溶解している液から除外されるため、計算は次の式にて概算計算される。
【数１】
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【発明の効果】
【００１０】
本発明および発明者が先に出願した特許（特願２０１２―１８５９６２）の方法によって作成される一定量のヘモグロビンまたはトランスフェリンを添加した擬似便を使用してサーベイを行ったり、精度管理を行う事により、市販の便ヘモグロビンまたはトランスフェリン測定用の採便器、測定試薬の標準化が可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は疑似便を市販採便器の一つを使用して、疑似便を採取する工程を図示したものである。Ａは採便器の中に装備している採便棒である。Ｂは希釈液を保持している希釈容器である。Ｃは採便棒を希釈容器の入り口に差し込む際に、入り口によって擦り取られた疑似便を示している。Ｄはヘモグロビンなどの分析装置の検体採取ノズルである。１は採便器の採便棒を外した状態である。２は採便棒を使って疑似便を採取した様子である。３は希釈容器の入り口から希釈容器の内部に採便棒を差し入れた様子であり、入り口の狭さが疑似便を擦りきって、一応一定量の疑似便が希釈液中に分散溶解する様子を示している。擦りきられて残った疑似便は容器の外側に残っている。４は疑似便が希釈容器の中の希釈液に溶解した様子を示している。５は容器を逆さまにして背後から分析装置の検体採取のノズルが注入された様子を示している。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
添加するゼラチンやコラーゲンとしては、主として動物の組織由来のものが好適であるが、その分解物も使用できる。例示すれば、牛骨、牛皮、豚骨、豚皮、魚鱗、魚皮などから作られるもので、市販の食用のゼラチンでもよい。その他、これらを酵素などで低分子に分解したものも好適に使用できる。これらを含有させる濃度としては、０．０１ｇ／Ｌ〜５０ｇ／Ｌで効果は見られるが、好適には０．１〜１０ｇ／Ｌが良く、溶解させた溶液の粘度やゲルになる温度を鑑みて使用するのがよい。また一般的には分解されて低分子になったコラーゲンほど良く水に溶解する。
【００１３】
従来の擬似便を作成する方法としては、米粉など粉体の擬似便素材にヘモグロビンまたはトランスフェリンを溶解した溶液を添加して便の物理的な性状にする方法が行われるが、本発明では添加するヘモグロビンまたはトランスフェリンを溶解した溶液にゼラチンなどを添加していったん溶液とし、それを粉体素材と混ぜる場合と、米粉等の粉体にゼラチンやコラーゲンを溶解した液を添加・混合して均質化し、その後濾過して粉体を分離し、さらに乾燥させる処理を施して粉体をあらかじめ前処理し、最終的にヘモグロビンまたはトランスフェリンを溶解した溶液と混合する場合とがあり、どちらでも可能である。また、（特願２０１２―１８５９６２）に示された検出可能なグリセロールなどの第３の物質を添加した溶液に、本発明のゼラチンやコラーゲンまたはその分解物を添加して擬似便を作成することも可能である。また、ヘモグロビンまたはトランスフェリンを安定化させる物質として添加する糖類やアジ化ナトリウム、ＥＤＴＡ―Ｆｅ、ＳＨ基を持つようなＮ−アセチルシステインなども添加することも良い。
【実施例１】
【００１４】
５０ｍＭのＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．５）１００ｍＬに牛皮由来ゼラチン（和光純薬製）５００ｍｇ、スクロース５００ｍｇ、アジ化ナトリウム１００ｍｇを溶解して、処理液を作成した。次に市販上用粉（豆平（株）製）３０ｇに上記処理液９０ｍＬを添加していったんスパーテルで撹拌して均一にし、室温１時間放置後グラスフィルターにて濾過し、そのまま真空乾燥機中で１昼夜減圧乾燥した。
一方対照として、牛皮由来ゼラチンの代わりに牛血清アルブミン５００ｍｇ、と牛皮由来ゼラチンなし、の２種類の対照処理液を作成し、上記と同様に処理して合計３種類の処理済み上用粉を作成した。
【実施例２】
【００１５】
５ｇ／Ｌの塩化ナトリウムを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に人ヘモグロビンＡ０（シグマアルドリッチ社製）を０．２ｍｇ／ｍＬとなるように溶解した溶液（溶液Ａとする。）を準備した。試験管に実施例１の３種類の処理済み上用粉それぞれを１ｇずつを取り、これに溶液Ａを１．１ｍＬずつ添加した。スパーテルで均一になるよう良く撹拌したところ、ペースト状の３種類の擬似便が作成された。擬似便１：無添加、擬似便２：牛皮由来ゼラチン添加、擬似便３：牛血清アルブミン添加とする。
５℃１時間放置後、それぞれの試験管に２ｍＬの精製水を添加・撹拌した後、時々試験管ミキサーで撹拌しながらさらに１時間５℃で放置し、最後に遠心分離器で３０００ｒｐｍ、５分間遠心して上清を得た。
上清中のヘモグロビン濃度は以下の測定試薬および手順にて測定した。
ヘモグロビンの測定試薬組成は表１の通りである。
【表１】
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【００１６】
ヘモグロビンの測定手順は、上記上清５０μＬに測定試薬３ｍＬを添加して撹拌し、３７℃１５分間加温した後、６６６ｎｍの吸光度を測定した。ヘモグロビン濃度の計算は、別途ヘモグロビンの標準液として実施例１の人ヘモグロビンＡ０を１００μｇ／ｍＬに溶解したものを用意し、同様に測定操作を行って比較した。なお、計算式にあるＢは１．１ｍＬ、上用粉のＤは別途測定し、０．４３ｍＬであり、Ａ測定値は溶液Ａを３倍希釈して測定後、結果を３倍した。
回収率は数式１によって計算し、結果を表２に示す。
擬似便に添加するものが、従来のアルブミンや、無添加の場合より良好な結果が得られた。
【表２】
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【実施例３】
【００１７】
実施例２の溶液Ａの一部に牛骨由来のゼラチン（和光純薬製）を５ｍｇ／ｍＬになるように添加してＡ´溶液を作成した。２本の試験管に無処理の上用粉１ｇを取り、これにＡおよびＡ´溶液をそれぞれ１．１ｍＬずつ添加した。スパーテルで均一になるよう良く撹拌して２種類の擬似便を作成した。
５℃１時間放置後、それぞれの試験管に２ｍＬの精製水を添加・撹拌した後、時々試験管ミキサーで撹拌しながらさらに１時間５℃で放置し、最後に遠心分離器で３０００ｒｐｍ、５分間遠心して上清を得た。実施例２と同様に操作して、それぞれの回収率を計算した。結果を表２に示す。
なお、実施例３の場合の計算式１に相当するＢは１．１ｍＬ、Ｄは別途測定し、０．４３ｍＬ、Ａ測定値は溶液ＡおよびＡ´液を３倍希釈して測定後、結果を３倍した。
実施例２の場合とほぼ同じように、ヘモグロビンを含有する溶液に直接ゼラチンを使用した場合においても９８％以上の回収率が得られた。また一方ゼラチンを使用しない場合には９０％前後の回収率であった。
【表３】
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【実施例４】
【００１８】
実施例２のゼラチンの代わりに、ゼラチンの分解物であるニッピコラーゲン１００（ニッピコラーゲン化粧品（株）製）を使用して、実施例２と同様に実験したところ、ほぼ同様な結果を得た。
【実施例５】
【００１９】
実施例２の溶液Ａにグリセロール（和光純薬（株）製）を１０％添加したものを溶液Ａの代わりに使用して、実施例３と同様に実験したところ、ほぼ同様な結果を得た。また、この擬似便は、一部採取した擬似便の量をグリセロール濃度の測定によって推量可能であった。
【産業上の利用可能性】
【００２０】
本発明によって、疑似便素材内部へのヘモグロビンやトランスフェリンが補足されない状況が完成するために、どの会社の採便システムを持ってきても理論通りの添加ヘモグロビンおよびトランスフェリンが回収される様になり、便中ヘモグロビンおよびトランスフェリン項目の全国的なサーベイが出来るようになり、標準化も可能になる。
【符号の説明】
【００２１】
図１に用いられている符号は次の通りである。
Ａ    採便棒
Ｂ    希釈容器
Ｃ    擦りきられ、口に残った疑似便
Ｄ    ヘモグロビン測定器の検体ノズル
１は採便器の採便棒を外した状態。
２は採便棒を使って疑似便を採取した様子。
３は希釈容器の入り口から希釈容器の内部に採便棒を差し入れた様子。
４は疑似便が希釈容器の中の希釈液に溶解した様子。
５は容器を逆さまにして背後から分析装置の検体採取のノズルが注入された様子。
【図１】
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