(57)【要約】      （修正有）【課題】特定の微生物の代謝産物であり、界面活性を有する糖脂質であるラムノリピッドを単離するためのプロセスの提供。【解決手段】ラムノリピッドを単離するためのプロセスであって、Ａ）少なくとも１種のラムノリピッドを含み、ｐＨが６未満である水性媒体を提供するプロセスステップ；Ｂ）多相系を得るために前記媒体を少なくとも１種の有機溶媒と接触させ、水相を分離するプロセスステップ；Ｃ）多相有機系を得るためにｐＨを６以上の値まで上昇させるプロセスステップ；Ｄ）ラムノリピッドで富化された有機相を分離するプロセスステップ；および、場合により、Ｅ）前記ラムノリピッドをさらに精製するプロセスステップとを含む、プロセス。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラムノリピッドを単離するためのプロセスであって、
Ａ）少なくとも１種のラムノリピッドを含み、ｐＨが６未満である水性媒体を提供するプロセスステップと、
Ｂ）多相系を得るために前記媒体を少なくとも１種の有機溶媒と接触させ、水相を分離するプロセスステップと、
Ｃ）多相有機系を得るためにｐＨを６以上の値まで上昇させるプロセスステップと、
Ｄ）ラムノリピッドで富化された有機相を分離するプロセスステップと、
Ｅ）場合により、前記ラムノリピッドをさらに精製するプロセスステップと
を含む、プロセス。
【請求項２】
プロセスステップＡ）における前記水性媒体が、全体でラムノリピッドを１０ｇ／ｌ〜３００ｇ／ｌ、特に５０ｇ／ｌ〜１５０ｇ／ｌ含むことを特徴とする、請求項１に記載のプロセス。
【請求項３】
プロセスステップＡ）における前記水性媒体のｐＨが２〜４．５、特に３．５〜４であることを特徴とする、請求項１または２に記載のプロセス。
【請求項４】
プロセスステップＢ）の前記有機溶媒または前記有機溶媒混合物が、０．１〜３０重量％、好ましくは０．５〜７重量％の量の水を溶解することができることを特徴とする、請求項１〜３の少なくとも一項に記載のプロセス。
【請求項５】
プロセスステップＢ）の前記少なくとも１種の有機溶媒が、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸イソプロピル、酢酸ブチル、酢酸イソアミル、ブタン−１−オール、ブタン−２−オールおよびジエチルエーテルから選択されることを特徴とする、請求項１〜４の少なくとも一項に記載のプロセス。
【請求項６】
水性媒体対有機溶媒または水性媒体対前記有機溶媒混合物の、これらを接触させる前の体積比が、０．２：１〜５：１、好ましくは２：１〜４：１、特に好ましくは２．９：１〜３．１：１であることを特徴とする、請求項１〜５の少なくとも一項に記載のプロセス。
【請求項７】
プロセスステップＣ）において、ｐＨを６．１〜９、好ましくは６．５〜８、特に好ましくは６．９〜７．１まで上昇させることを特徴とする、請求項１〜６の少なくとも一項に記載のプロセス。
【請求項８】
プロセスステップＣ）において、無機塩基、特に、アルカリ土類金属塩基、アルカリ金属塩基（好ましくは水性の）またはアンモニアを用いてｐＨを上昇させ、ＮａＯＨおよびＫＯＨが特に好ましいことを特徴とする、請求項１〜７の少なくとも一項に記載のプロセス。
【請求項９】
プロセスステップＢ）、Ｃ）およびＤ）が、１０〜５０℃、好ましくは１５〜３０℃、特に好ましくは１８〜２５℃の温度範囲で実施されることを特徴とする、請求項１〜８の少なくとも一項に記載のプロセス。
【請求項１０】
プロセスステップＥ）において、有機溶媒の少なくとも一部が蒸留によって前記ラムノリピッドから分離されることを特徴とする、請求項１〜９の少なくとも一項に記載のプロセス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ラムノリピッドを単離するためのプロセスに関する。
【背景技術】
【０００２】
先行技術
ラムノリピッドは界面活性を有する糖脂質であり、特定の微生物の代謝生産物である。最もよく知られているラムノリピッド生産菌はおそらく緑膿菌（シュードモナス・エルギノーサ（Pseudomonas aeruginosa））であろう。
【０００３】
ラムノリピッドは特定の表面活性、例えば高い起泡力等を有しており、その非常に幅広い技術的応用に関心が寄せられている。
【０００４】
これらは再生可能原料を主原料とする発酵を用いて温和な条件下で調製することができ、この点が、時代の大きな流れである「持続可能性」および「グリーンケミストリー」の概念にうまく合致していることから、近年、ラムノリピッドへの関心は着実に高まってきている。
【０００５】
しかし、これまでラムノリピッドは少量が高額で市販されていたに過ぎず、また、例えばボディケア製品や家庭用洗浄剤といった市場の狭い用途に通常使用されている化学合成界面活性剤くらいしか競合できるものがなかった。高額である理由の１つは、特に、夾雑物である副成分を多く含む発酵培養液から発酵生産物を後処理（work-up）することの難しさにある。こうした副成分には、反応が未完結の親油性および両親媒性基質（例えば、トリグリセリドおよび部分グリセリドに加えて脂肪酸も）、親油性および両親媒性の細胞構成物質（例えば、細胞膜のリン脂質）ならびに発酵時の泡制御に使用される消泡剤（例えば、シリコーン系、植物油系またはポリエーテル系のもの）が含まれる。
【０００６】
特に消泡剤が含まれるとその後の使用に支障があるが、ラムノリピッドが両親媒性の性質を有しているため、消泡剤をラムノリピッドから分離するのは容易ではない。多くの場合、この起泡阻害成分以外にも、例えばタンパク質や微生物産生多糖といった親水性の発酵副産物は最終製品中で他の理由（微生物の安定性や毒性等）から問題を起こす可能性があるので分離しなければならない。最後に、マーケティングの観点からは、界面活性剤溶液を可能な限り高濃度の形態にすることが必要となるため、後処理において水性ＲＬ溶液を高濃度にすることも必要である。環境面からは、活性物質１ｋｇ当たりの燃料消費量を確実に可能な限り少なくするために、生産物と一緒に輸送される水の量を可能な限り減らすべきである。発酵により達成することができる生産物の濃度は比較的低く、これまで文献で知られている中で濃度が１００ｇ／ｌを超えたものはない。
【０００７】
文献には、多くの場合は異なる形態（例えば、モノ−およびジ−ラムノリピッド）の混合物であるラムノリピッドを精製する方法および上述の不純物からこれらを分離する方法が数多く開示されている。
【０００８】
発酵を行う際に、処理に高度な技術が必要とされる様々な方法、例えば、膜濾過、イオン交換体への吸着、泡沫分離等を用いることによって、ある程度の精製が可能になるが、これらの処理ステップでは、親水性不純物も疎水性不純物も十分な程度まで分離することができない。さらに、ＲＬの精製において費用効率が高くなるように工業規模で使用する研究はなされておらず、従来の化学合成界面活性剤と製造コスト面で競合できるようにするにはコストが高くなり過ぎる傾向にある。このことは現在利用可能なクロマトグラフィー処理にも当然当てはまる。
【０００９】
Sarachatら（２０１０）は、発酵培養液を平均的な極性を有する有機溶媒または溶媒混合物、例えば、酢酸エチル、クロロホルム−メタノール、クロロホルム−エタノール、ジクロロメタン等を用いて酸性条件で抽出することについて記載しており、ここではまず最初に親油性成分が同時抽出される。ラムノリピッドは冷却に伴い沈殿し、さらに第２ステップにおいて、無極性溶媒、例えばヘキサンやクロロホルム等を徐々に添加することにより精製される。
【００１０】
ヘキサンやクロロホルム等の毒性的に許容できない石油系無極性溶媒を添加し、冷却による晶析ステップを必要とするこのプロセスは明らかに不利である。このようなプロセスはやはりコストがより高く、処理および安全対策に高度な技術を要する上に、持続可能なグリーンケミストリーの趣旨から見ても理想から外れている。しかも、この種のプロセスに由来する製品に環境認証（ecological certification）を認めず販売を許可しない規制要件が現時点で既に存在する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は、先行技術の欠点の少なくとも１つを克服することができるラムノリピッドを精製するためのプロセスを提供することにあった。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
発明の説明
驚くべきことに、以下に記載するプロセスが本発明の目的を達成できることが見出された。
【００１３】
したがって本発明は、本特許請求の範囲において特許請求するラムノリピッドを単離するためのプロセスを提供する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によるプロセスの利点は、溶媒の使用量がより少ないことにある。
【００１５】
さらなる利点は、使用される溶媒が毒性および安全性という観点で許容されることにある。
【００１６】
さらなる利点は、持続可能性を有する供給源に由来する溶媒を使用できることにある。
【００１７】
さらなる利点は、本発明によるプロセスは、エネルギー的に好ましい温度で実施できることにある。
【００１８】
本発明によるプロセスのさらなる利点は、簡素な技術設備を用いて実施できることにある。
【００１９】
本発明によるプロセスのさらなる利点は、非常に短い時間で多量の生産物を精製／濃縮できることにある。
【００２０】
本発明によるプロセスのさらなる利点は、濃縮および精製された生産物が固体として得られるのではなく液相として得られるため、さらなる処理が技術的に容易になることにある。こうして生成した高度に濃縮された溶液は、処理が完了した最終製品となる。
【００２１】
本発明によるプロセスのさらなる利点は、発酵培養液の後処理だけでなく、既にある程度精製されたラムノリピッドの後処理にも適していることにある。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明によるラムノリピッドを単離するためのプロセスは、
Ａ）少なくとも１種のラムノリピッドを含み、ｐＨが６未満、特に５未満である水性媒体を提供するプロセスステップと、
Ｂ）多相系を得るためにこの媒体を少なくとも１種の有機溶媒と接触させ、水相を分離するプロセスステップと、
Ｃ）多相有機系を得るためにｐＨ値を６以上に上昇させるプロセスステップと、
Ｄ）ラムノリピッドで富化された有機相を分離するプロセスステップと、
Ｅ）場合によりラムノリピッドをさらに精製するプロセスステップと
を含む。
【００２３】
本発明に関連する「ラムノリピッド（rhamnolipids）」という語は、特に、一般式（Ｉ）：
【化１】
2014111595.tif 000002
（式中、
ｍは、２、１または０、特に１または０であり、
ｎは、１または０、特に１であり、
Ｒ１およびＲ２は、互いに独立に、２〜２４個、好ましくは５〜１３個の炭素原子を有する同一であっても異なっていてもよい有機基、特に、場合により分岐の、場合により置換された、特にヒドロキシ置換された、場合により不飽和の、特に場合によりモノ不飽和、ジ不飽和またはトリ不飽和のアルキル基であり、好ましくは、ペンテニル、ヘプテニル、ノネニル、ウンデセニルおよびトリデセニルおよび（ＣＨ２）ｏ−ＣＨ３（式中、ｏは１〜２３、好ましくは４〜１２である）からなる群から選択される）の化合物またはその塩を意味するものと理解される。
【００２４】
本発明に関連する「ｐＨ」とは、ＩＳＯ  ４３１９（１９７７）に準拠し、校正されたｐＨ電極を用いて、対応する物質を５分間撹拌した後に２５℃で測定した値として定義される。
【００２５】
本発明に関連する「水性媒体」という語は、対象の組成物全体を基準として水を少なくとも５重量％含む組成物を意味するものと理解される。
【００２６】
別段の定めがない限り、ここに記載する百分率（％）はすべて質量百分率である。
【００２７】
本発明によれば、本発明によるプロセスにおいて、プロセスステップＡ）における水性媒体が全体でラムノリピッドを１０ｇ／ｌ〜３００ｇ／ｌ、特に５０ｇ／ｌ〜１５０ｇ／ｌ含む（リットルで示す値は水性媒体全体を対象とする）ことが好ましい。
【００２８】
本発明によるプロセスにおいては、プロセスステップＡ）における水性媒体は、特に好ましくは、無細胞または細胞含有発酵培養液であり、好ましくは無細胞発酵培養液である。
【００２９】
特に、本発明によるプロセスは、プロセスステップＡ）における水性媒体のｐＨが２〜４．５、特に３．５〜４であることを特徴とする。これに関連するｐＨは、有利には、酸、特に好ましくはＨＣｌ、Ｈ２ＳＯ４、硝酸、リン酸、炭酸から選択される無機酸、特にＨＣｌを用いて調整することができる。
【００３０】
本発明によるプロセスは、プロセスステップＤ）に付した後のラムノリピッドが富化された有機相中に特定量の水が存在すると有利であり、その場合、有機溶媒を単純に除去（例えば留去によって）することにより、高度に濃縮された水性ラムノリピッド画分を得ることができるという技術的効果がある。したがって、本発明による好ましいプロセスは、プロセスステップＢ）の有機溶媒または有機溶媒混合物が０．１〜３０重量％、好ましくは０．５〜７重量％の量の水（重量百分率は、有機溶媒および水の総量に対する）を溶解することができることを特徴とする。
【００３１】
プロセスステップＢ）に好ましい有機溶媒は、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸イソプロピル、酢酸ブチル、酢酸イソアミル、ブタン−１−オール、ブタン−２−オールおよびジエチルエーテルから選択され、酢酸エチルが特に好ましい。
【００３２】
本発明によれば、好ましくは、本発明によるプロセスにおいて、接触させる前の２０℃における水性媒体対有機溶媒または水性媒体対有機溶媒混合物の体積比は、０．２：１〜５：１、好ましくは２：１〜４：１、特に好ましくは２．９：１〜３．１：１である。
【００３３】
本発明によるプロセスの好ましい実施形態は、プロセスステップＣ）において、ｐＨを６．１〜９、好ましくは６．５〜８、特に好ましくは６．９〜７．１に上昇させることを特徴とする。
【００３４】
本発明によれば、本発明によるプロセスのプロセスステップＣ）におけるｐＨの上昇には、無機塩基、特に、アルカリ土類金属塩基、アルカリ金属塩基（好ましくは水性の）またはアンモニアを用いることが好ましく、ＮａＯＨおよびＫＯＨを用いることが特に好ましい。
【００３５】
本発明によるプロセスの１つの利点は、その大部分が周囲温度で実施できることにあり、したがって、好ましくは、プロセスステップＢ）、Ｃ）およびＤ）は、１０〜５０℃、好ましくは１５〜３０℃、特に好ましくは１８〜２５℃の範囲の温度で実施される。
【００３６】
プロセスステップＥ）において、ラムノリピッドは必要に応じてさらに精製することができる。本発明によるプロセスの好ましい実施形態は、プロセスステップＥ）において、もし有機溶媒が存在する場合は少なくとも一部を蒸発させることによってラムノリピッドから分離することを特徴とする。これに関連して、有機溶媒の蒸発は高温で減圧下に実施することが好ましい。特に、０．０１〜１バール、好ましくは０．１５〜０．３バールの圧力範囲を２０〜８０℃、好ましくは４０〜６０℃の温度と組み合わせると有利であることが判明している。
【００３７】
本発明によるプロセスは、もし消泡剤が存在する場合は、特に有機相から回収することを含むさらなるプロセスステップＦ）を含むことができる。その場合、有利にはこれを後段の発酵で再利用することができる。
【００３８】
以下に列挙する実施例は本発明を例示により説明するものであって、本発明を実施例で特定した実施形態に限定することを意図するものではなく、本出願の範囲は明細書本文および特許請求の範囲全体により定められる。
【実施例】
【００３９】
実施例
実施例１：抽出およびｐＨによって誘導する相分離を用いたラムノリピッド／脂肪酸混合物からのラムノリピッドの分離および濃縮
次に説明する精製および濃縮に使用する出発物質として、発酵生産されたラムノリピッドの粗精製物を用いた。これは、様々なラムノリピッドを約５０％と、様々な脂肪酸に類する不純物（発酵基質によって導入されたものまたは発酵中に副生成物として生成したもののいずれか）を約２０％とから構成されるものであった。これらは主としてＣ１０ヒドロキシ脂肪酸およびこれらの二量体ならびにモノ不飽和Ｃ１２脂肪酸である。各調製ステップ毎に不純物を検出するために、特にこの目的専用に開発された薄層クロマトグラフィー法を用いた。ラムノリピッドの精製は、ＲＬ濃度を５０ｇ／ｌとした水溶液から開始した。水溶液中の脂肪酸の割合は２０ｇ／ｌとなった。
【００４０】
発酵培養液およびある程度精製された粗精製物はタンパク質を含むことが多く、これは抽出後の相分離を阻害し、多量の中間相を生成させてしまう。ほとんどの場合、これに付随して生成物すなわち収量の損失も起こる。これを防ぐために、まず最初に市販のプロテアーゼ製剤（alkalase，novozymes）を６０℃、ｐＨ＝７で１重量％添加することによりタンパク質を加水分解した。その結果として、その後の抽出がかなり簡素化された。ラムノリピッドを抽出するために濃ＨＣｌを用いて水溶液のｐＨを４．０に調整した。次いで同量の酢酸エチルで抽出を行った。抽出は上首尾に進行し、続いて、室温（２５℃）において分離漏斗内で速やかかつ確実に相分離した。
【００４１】
このステップにおいて既に親水性不純物が水相に残留していた。より親油性が高い不純物および存在するラムノリピッドのほぼ１００％が有機相中に溶解していた。
【００４２】
ラムノリピッドを含有する有機相を分離して、さらに処理した。濃度５０％のＫＯＨ（水溶液）を添加し、溶液のｐＨを７に調整した。このｐＨ範囲で溶液が急速に濁り始め、さらなる有機相が生成したことを示唆していた。この有機相は室温（２５℃）において分液漏斗内で速やかに難なく再び分離した。ラムノリピッドの大部分が下相に富化され、親油性不純物の大部分は上相に残留していた。
【００４３】
結果として、ラムノリピッドがかなり高濃度で得られただけでなく、それと同時に、ラムノリピッドの効果的な精製も達成された。ラムノリピッドを含む下相を分離した後、０．２バール、６０℃で単純に蒸留することにより有機溶媒を除去した。
【００４４】
得られたラムノリピッド画分の濃度は５００ｇ／ｌであった。
【００４５】
純度は８０％であった。これは、濃度１０倍、精製倍率（purification factor）１．６に相当し、全収率は９５％である。
【００４６】
処理が完了した最終生成物は夾雑物を含む出発溶液よりも適用性がはるかに高い。特に、結果として起泡性が改善されている。このことはSITAからの泡試験機（Ｒ−２０００）を用いて分析した。精製物の泡立ちの速さ（foam formation kinetics）ははるかに速く、達成された泡量も同様にはるかに高かった。
【００４７】
実施例２：抽出およびｐＨによって誘導する相分離を用いたラムノリピッド／消泡剤混合物からのラムノリピッドの分離および濃縮
Jeneil Biosurfactantsから市販されているラムノリピッド混合物（ＪＢＲ  ５０５）を使用して、ラムノリピッド溶液から消泡剤を分離した。
【００４８】
濃度５０ｇ／ｌの水溶液から出発してラムノリピッドの精製を行った。シリコーンを含む消泡剤であるDOW Corning 1500を最終濃度が２０ｇ／ｌとなるように添加した。
【００４９】
ラムノリピッドを抽出するために濃ＨＣｌを用いて水溶液のｐＨを４．０に調整した。次いで同量の酢酸エチルを用いて抽出を行った。抽出は上首尾に進行し、続いて、室温（２５℃）において分液漏斗内で速やかかつ確実に相分離した。
【００５０】
このステップにおいて親水性の不純物は既に水相中に残留していた。より親油性の高い不純物および存在するラムノリピッドのほぼ１００％は有機相中に溶解していた。 
【００５１】
ラムノリピッドを含有する有機相を分離して、さらに処理した。濃度５０％のＫＯＨ（水溶液）を添加して、溶液のｐＨを７に調整した。このｐＨ範囲で溶液が急速に濁り始め、さらなる有機相が生成したことを示唆していた。この有機相は室温（２５℃）において分液漏斗内で速やかに難なく再び分離し、ラムノリピッドが主として下相に富化され、親油性不純物の大部分および消泡剤のほぼ１００％が上相に残留していた。
【００５２】
結果として、ラムノリピッドの精製および高度な濃縮と同時に消泡剤の効果的な分離も達成された。消泡剤が分離されたことは定量１Ｈ  ＮＭＲ分析を用いることにより実証された。実際、ポリジメチルシロキサン消泡剤に典型的な化学シフトが約−０．１ｐｐｍのシグナルはラムノリピッドを含有する下相からはもはや検出することができなかったが、その替わり、酢酸エチルの上相からはかなり検出された。ラムノリピッドを含有する下相を分離した後、０．２バール、６０℃で単純な蒸留を行うことにより有機溶媒を除去した。
【００５３】
結果として得られたラムノリピッド画分の濃度は４５０ｇ／ｌであった。
【００５４】
純度は７５％であった。これは、濃度９倍、精製倍率１．５に相当し、全収率は９０％である。
【００５５】
処理が完了した最終生成物は未精製の出発溶液よりはるかに適用性が高い。
【００５６】
実施例３：ラムノリピッドおよび消泡剤を含む発酵培養液からのラムノリピッドの分離および濃縮
ラムノリピッド生合成遺伝子であるＲｈｌＡ、ＲｈｌＢおよびＲｈｌＣを組み込んだシュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）菌株を用いて発酵を行う。国際公開第２０１２０１３５５４Ａ１号に記載されているように振盪フラスコで前培養を行う。本培養にも同様に無機塩培地（Ｍ９）を使用する。２リットル容の発酵槽でグルコースをフィードしながら炭素源制限条件下で発酵を行う。グルコースのフィードは溶存酸素のシグナルを参照しながら行う。撹拌機の回転速度によって溶存酸素の飽和度が２０％となるように調整する。ｐＨ電極を使用し、ＮＨ４ＳＯ４を添加することによりｐＨを７に調整する。発酵培養液が過度に起泡するのを防ぐために、ある条件では、シリコーン含有消泡剤DOW Corning 1500を計量添加し、他の条件では、ヒマワリ油を計量添加する。発酵は４日間実施し、乾燥生物量（biodry mass）を１５ｇ／ｌとする。ラムノリピッドの濃度をＨＰＬＣで確認すると９．８ｇ／ｌとなる。発酵終了後に得られる培養液は、DOW Corning 1500消泡剤を使用した場合もヒマワリ油を使用した場合も強い起泡傾向は認められない。１００００ｇで遠心分離することにより細胞を分離した後、ｐＨ＝４に酸性化することによってラムノリピッドを沈殿させ、ラムノリピッドを含む下相を分離し、ｐＨ＝４で数回水洗する。得られた生成物にＮａＯＨを添加することにより再びｐＨ＝７に調整すると、沈殿していたラムノリピッドが再び溶解する。こうして得られた生成物の適用性は好ましくないものである。ＳＩＴＡ測定から解析された泡立ちの速さおよび達成された総泡量は十分ではない。これとは対照的に、本明細書において特許請求されるプロセスにより得られる生成物は、並外れた適用性を示し、特に起泡性が非常に高い。
【００５７】
ここで、上述の実施例と同様に抽出ステップおよびそれに続く濃縮を実施する。これは、細胞を含む発酵培養液から直接行うことも、細胞を分離した後に行うこともできる。細胞を分離しない場合は、相分離の進行は大幅に遅くなり、細胞および生産物を含む中間相が形成され、その結果として収量は低下するが、純度および適用性には影響はない。DOW Corning 1500消泡剤およびヒマワリ油は、結果として得られる生成物の１Ｈ−ＮＭＲにおいて依然として微量を検出し得る。その大部分は上層の有機相に残存しており、溶媒を除去した後、場合により、さらなる発酵に利用することができる。
【外国語明細書】
2014111595000001.pdf