(57)【要約】  【課題】過活動膀胱等の膀胱障害の予防又は改善に有効なＴＲＰＶ４活性抑制剤の提供。  【解決手段】イソラムネチン、カテキン、ヘスペレチン、ケルセチン、ルテオリン、フィセチン、クリシン、ゲニステイン及びそれらの配糖体から選ばれるフラボノイド類を有効成分とするＴＲＰＶ４活性抑制剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
イソラムネチン、カテキン、ヘスペレチン、ケルセチン、ルテオリン、フィセチン、クリシン、ゲニステイン及びそれらの配糖体から選ばれるフラボノイド類を有効成分とするＴＲＰＶ４活性抑制剤。
【請求項２】
イソラムネチン、カテキン、ヘスペレチン、ケルセチン、ルテオリン、フィセチン、クリシン、ゲニステイン及びそれらの配糖体から選ばれるフラボノイド類を有効成分とする過活動膀胱の予防又は改善剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＴＲＰＶ４チャネルの活性化を抑制するＴＲＰＶ４活性抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＴＲＰＶ４は、カチオンチャネルの一過性受容器電位（ＴＲＰ）スーパーファミリーのメンバーであり、低浸透圧、温熱（２４℃＜）、アラキドン酸代謝物などにより活性化されることがわかっている（非特許文献１、２）。
【０００３】
ＴＲＰＶ４は、腎、肺、膀胱、心臓、皮膚、脳、消化管など幅広い組織で発現しており、異なった幅広い生理的役割を果たしていると考えられている。腎の遠位尿細管上皮細胞には特に強く発現しており、尿の浸透圧や流量を感知していると示唆されている（非特許文献３）。また消化管における低浸透圧を感知し、交感神経活動を亢進させる機能を持つことも示唆されている（非特許文献４）。
【０００４】
また最近、ＴＲＰＶ４チャネルは膀胱の機能に関与することが報告されている（非特許文献５）。すなわち、膀胱内側の膀胱上皮細胞に存在するＴＲＰＶ４やＴＲＰＶ１が存在し、尿が溜まって膀胱上皮細胞が伸展した場合に当該ＴＲＰＶチャネルを介して細胞内にカルシウムが流入し、これによってＡＴＰが細胞から放出され、膀胱の膨らみが神経に伝わることが明らかにされている。また、ＴＲＰＶ４欠損マウスを用いた検討で、ＴＲＰＶ４の排尿間隔に及ぼす影響はＴＲＰＶ１より大きいことが報告されている（非特許文献６）。
したがって、ＴＲＰＶ４の活性化を抑制することにより、尿意の増加及び排尿頻度の増加を特徴とする過活動膀胱に治療効果をもたらすと考えられる。
【０００５】
一方、フラボノイドは、茶、リンゴ、ブドウや豆類等の各種植物体に含まれており、抗酸化作用をはじめとする様々な生理効果を有することから、近年、医薬品や食品への配合素材として利用されている。例えば、最近では、イソラムネチンやケルセチンに癌増殖抑制作用があること（特許文献１）、ヘスペレチンにキサンチンオキシダーゼ阻害剤作用があること（特許文献２）、フィセチン、ルテオリン又はケルセチンに筋肉の糖取り込み促進作用があること（特許文献３）、クリシンやルテオリン等に炎症性サイトカイン産生抑制作用があること（特許文献４）、ゲニステインに線溶亢進作用があること（特許文献５）、カテキンに体脂肪燃焼作用があること（特許文献６）等が報告されている。
しかし、イソラムネチン、カテキン、ヘスペレチン、ケルセチン、ルテオリン、フィセチン、クリシン及びゲニステインがＴＲＰＶ４活性抑制作用を有することや過活動膀胱の予防及び改善に有用であることは知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１２−２５７２４号公報
【特許文献２】特開２０１０−５９１０４号公報
【特許文献３】特開２０１１−１４０４５７号公報
【特許文献４】特開２００８−２０８０５４号公報
【特許文献５】特開２００８−８１４６４号公報
【特許文献６】特開２００６−７７０２６号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Guler AD. J. Neurosci. 22: 6408-6414 (2002)
【非特許文献２】Vriens J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106: 1626-1631 (2004)
【非特許文献３】Tian W. Am. J. Physiol. Renal. Physiol.287: F17-F24 (2004)
【非特許文献４】Gao F. Hypertension.  55: 1438-1443 (2010)
【非特許文献５】Nilius B. Physiol. Rev.  87: 165-217 (2007)
【非特許文献６】Gevaert T. J. Clin. Invest. 117: 3453-3462 (2007)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、過活動膀胱の予防又は改善に有効なＴＲＰＶ４活性抑制剤を提供することに関する。
【０００９】
本発明者らは、ＴＲＰＶ４の活性を抑制する素材について検討したところ、レスベラトロールにＴＲＰＶ４の活性化を効果的に抑制する作用があることを見出した。
【００１０】
すなわち本発明は、イソラムネチン、カテキン、ヘスペレチン、ケルセチン、ルテオリン、フィセチン、クリシン、ゲニステイン及びそれらの配糖体から選ばれるフラボノイド類を有効成分とするＴＲＰＶ４活性抑制剤に係るものである。
また本発明は、イソラムネチン、カテキン、ヘスペレチン、ケルセチン、ルテオリン、フィセチン、クリシン、ゲニステイン及びそれらの配糖体から選ばれるフラボノイド類を有効成分とする過活動膀胱の予防又は改善剤に係るものである。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のＴＲＰＶ４活性抑制剤は、ＴＲＰＶ４の活性化を効果的に抑制するという作用を有する。したがって、本発明のＴＲＰＶ４活性抑制剤は、ＴＲＰＶ４チャネルが活性化されることによって生じる症状や疾患を改善するために有用である。具体的には、過活動膀胱（尿意切迫感、頻尿、切迫性尿失禁）の予防又は改善することが可能である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明のフラボノイド類は、イソラムネチン（Isorhamnetin）、カテキン（Catechin）、ヘスペレチン（Hesperetin）、ケルセチン（Quercetin)、ルテオリン（Luteolin）、フィセチン（Fisetin)、クリシン（Chrysin) 、ゲニステイン（Genistein)及びこれらの配糖体を、其々単独で用いることもできるし、あるいは、２種以上を組み合わせて用いることもできる。
なお、上記フラボノイド類は、立体異性体又はそれらの混合物の何れを用いることもできる。また、上記フラボノイド類は、水和物又は溶媒和物を形成していてもよい。
【００１３】
本発明におけるフラボノイド類は、化学合成によって、又はこれらを含有する天然物から抽出して精製することによって、調製することができる。あるいは、市販品を用いてもよい。
また、当該フラボノイド類を含有する植物、各種食品の抽出物や部分精製物、加工品を用いてもよく、当該抽出物や部分精製物、加工品から単離した各フラボノイド類を用いることもできる。
【００１４】
フラボノイド配糖体は、生体内では酵素的に加水分解されてフラボノイドを生じるので、本発明においては、当該配糖体も遊離のフラボノイドと同様に用いられる。ここで、配糖体を構成する糖としては、例えば、グルコース、フコース、ガラクトース、６−デオキシグルコース、ラムノース等が挙げられる。フラボノイド配糖体としては、具体的には、例えばケルセチン配糖体であるルチン、ケルシトリン、イソケルシトリン、ヘスペレチンの配糖体であるヘスペリジン、ゲニステインの配糖体であるゲニスチン等が挙げられる。
【００１５】
本発明のフラボノイド類は、後記実施例に示すように、ＴＲＰＶ４刺激物質（アゴニスト）と共に、ＴＲＰＶ４を形質導入した細胞（ＴＲＰＶ４発現細胞）に接触させた場合に、ＴＲＰＶ４刺激物質による細胞内の陽イオン量の流入を抑制するというＴＲＰＶ４活性抑制作用を有する（実施例）。
【００１６】
ここで、「ＴＲＰＶ４の活性抑制」とは、受容体であるＴＲＰＶ４の活性を抑制すること、具体的には例えばＴＲＰＶ４刺激物質がＴＲＰＶ４に結合することによって発現する活性、例えばイオン流束の調節能（例えば、細胞外から細胞内へのカルシウムイオン、ナトリウムイオンなどの陽イオンの輸送能など）、膜電位の調節能（例えば、電流の発生能など）を抑制或いは阻害することを云う。
【００１７】
ＴＲＰＶ４は、膀胱内側の膀胱上皮細胞に存在し、尿が溜まって膀胱上皮細胞が伸びた場合に当該ＴＲＰＶチャネルを介して細胞内にカルシウムが取り込まれ、これによってＡＴＰが細胞表面から放出され、膀胱の膨らみが神経に伝わることが明らかにされている（前記非特許文献５）。したがって、ＴＲＰＶ４の活性を抑制することにより、尿意の増加及び排尿頻度の増加を特徴とする、過活動膀胱に治療効果をもたらすと考えられる。
【００１８】
したがって、本発明のフラボノイド類は、ＴＲＰＶ４活性抑制のため、或いは過活動膀胱の予防又は改善のために使用することができる。当該使用は、ヒト若しくは非ヒト動物、又はそれらに由来する検体における使用であり得、また治療的使用であっても非治療的使用であってもよい。ここで、「非治療的」とは、医療行為、すなわち治療による人体への処理行為を含まない概念である。
【００１９】
また、本発明のフラボノイド類は、ＴＲＰＶ４活性抑制剤、過活動膀胱の予防又は改善剤（以下、ＴＲＰＶ４活性抑制剤等）として使用することができ、さらにこれらの剤を製造するために使用することができる。
【００２０】
当該ＴＲＰＶ４活性抑制剤等は、それ自体、ＴＲＰＶ４活性抑制、過活動膀胱の予防又は改善効果を発揮する、ヒト若しくは動物用の医薬品、医薬部外品又は食品であってもよく、又は当該医薬品、医薬部外品等に配合して使用される素材又は製剤であってもよい。このとき、当該ＴＲＰＶ４活性抑制剤等には、本発明のフラボノイド類を単独で、又はこれ以外に、必要に応じて、後述の配合すべき対象物において許容される担体等を配合してもよい。なお、当該製剤は配合すべき対象物に応じて常法により製造することができる。
また、食品としては、ＴＲＰＶ４活性抑制、過活動膀胱の予防又は改善等の生理機能をコンセプトとし、必要に応じてその旨を表示した飲食品、機能性飲食品、病者用飲食品、特定保健用食品等を包含する。
【００２１】
尚、本発明において、「過活動膀胱」とは、尿意切迫感を必須とした症状症候群であり、通常は頻尿と夜間頻尿を伴うものである。
【００２２】
上記医薬品（医薬部外品も含む）の剤形は、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤、静脈内注射、筋肉注射剤、坐剤、吸入剤、経皮吸収剤、点眼剤、点鼻剤、湿布剤、パップ剤、軟膏、ローション、クリーム、口腔用製剤等の何れでもよく、投与形態も、経口投与（内用）、非経口投与（外用、注射）の何れであってもよい。
このような種々の剤型の医薬製剤は、本発明のフラボノイド類を単独で、又は他の薬学的に許容される賦形剤、結合剤、増量剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、嬌味剤、香料、被膜剤、担体、希釈剤等を適宜組み合わせることにより調製することができる。
【００２３】
好ましい投与形態は経口投与であり、この場合、製剤中の本発明のフラボノイド類の含有量は、通常０．０１質量％以上、好ましくは０．１質量％以上、より好ましくは０．０１質量％以上であり、そして２０質量％以下、好ましくは１０質量％以下、より好ましくは５質量％以下である。例えば、０．０１〜２０質量％、好ましくは０．１〜１０質量％、より好ましくは０．０１〜５質量％が挙げられる。
【００２４】
上記食品の形態は、固形、半固形又は液状であり得、例えば、パン類、ケーキ類、麺類、菓子類、ゼリー類、冷凍食品、アイスクリーム類、乳製品、飲料等の各種食品の他、上述した経口投与製剤と同様の形態（錠剤、カプセル剤、シロップ等）が挙げられる。
種々の形態の食品は、本発明のフラボノイド類を単独で、又は他の食品材料や、溶剤、軟化剤、油、乳化剤、防腐剤、香科、安定剤、着色剤、酸化防止剤、保湿剤、増粘剤等を適宜組み合わせることにより調製することができる。当該食品中の本発明のフラボノイド類の含有量（抽出物の乾燥物換算）は、通常０．００１質量％以上、好ましくは０．００５質量％以上、より好ましくは０．０１質量％以上であり、そして、１０質量％以下、好ましくは５質量％以下、より好ましくは１質量％以下である。例えば、０．００１〜１０質量％、好ましくは０．００５〜５質量％、より好ましく０．０１〜１質量％が挙げられる。
【００２５】
本発明のＴＲＰＶ４活性抑制剤等の投与量又は摂取量は、対象者の状態、体重、性別、年齢又はその他の要因に従って変動し得るが、経口投与又は摂取の場合成人１人当たり、本発明のフラボノイド類として、１日あたり通常０．１ｍｇ以上、好ましくは１ｍｇ以上、より好ましくは５ｍｇ以上であり、そして１０００ｍｇ以下、好ましくは５００ｍｇ以下、より好ましくは３００ｍｇ以下である。例えば、０．１ｍｇ〜１０００ｍｇ、好ましくは１ｍｇ〜５００ｍｇ、より好ましくは５ｍｇ〜３００ｍｇが挙げられる。また、上記製剤は、任意の投与計画に従って投与又は摂取され得るが、１日１回〜数回に分けて投与又は摂取することが好ましい。
【００２６】
本発明のＴＲＰＶ４活性抑制剤等の投与又は摂取対象者としては、それを必要としている者であれば特に限定されないが、ＴＲＰＶ４活性抑制及び過活動膀胱及び間質性膀胱炎から選ばれる膀胱障害の予防又は改善を図ることができることから、特に、尿意切迫感があるヒト、頻尿又は尿漏れのあるヒトへの投与又は摂取が有効である。
【００２７】
上述した実施形態に関し、本発明においては以下の態様が開示される。
＜１＞イソラムネチン、カテキン、ヘスペレチン、ケルセチン、ルテオリン、フィセチン、クリシン、ゲニステイン及びそれらの配糖体から選ばれるフラボノイド類を有効成分とするＴＲＰＶ４活性抑制剤。
＜２＞イソラムネチン、カテキン、ヘスペレチン、ケルセチン、ルテオリン、フィセチン、クリシン、ゲニステイン及びそれらの配糖体から選ばれるフラボノイド類を有効成分とする過活動膀胱の予防又は改善剤。
【００２８】
＜３＞ＴＲＰＶ４活性抑制剤を製造するための、イソラムネチン、カテキン、ヘスペレチン、ケルセチン、ルテオリン、フィセチン、クリシン、ゲニステイン及びそれらの配糖体から選ばれるフラボノイド類の使用。
＜４＞過活動膀胱の予防又は改善剤を製造するための、イソラムネチン、カテキン、ヘスペレチン、ケルセチン、ルテオリン、フィセチン、クリシン、ゲニステイン及びそれらの配糖体から選ばれるフラボノイド類の使用。
＜５＞ＴＲＰＶ４活性抑制に使用するためのイソラムネチン、カテキン、ヘスペレチン、ケルセチン、ルテオリン、フィセチン、クリシン、ゲニステイン及びそれらの配糖体から選ばれるフラボノイド類。
＜６＞過活動膀胱の予防又は改善に使用するためのイソラムネチン、カテキン、ヘスペレチン、ケルセチン、ルテオリン、フィセチン、クリシン、ゲニステイン及びそれらの配糖体から選ばれるフラボノイド類。
＜７＞イソラムネチン、カテキン、ヘスペレチン、ケルセチン、ルテオリン、フィセチン、クリシン、ゲニステイン及びそれらの配糖体から選ばれるフラボノイド類を、それらを必要とする対象に投与又は摂取するＴＲＰＶ４活性抑制方法。
＜８＞イソラムネチン、カテキン、ヘスペレチン、ケルセチン、ルテオリン、フィセチン、クリシン、ゲニステイン及びそれらの配糖体から選ばれるフラボノイド類を、それらを必要とする対象に投与又は摂取する過活動膀胱の予防又は改善方法。
＜９＞非治療的な方法である前記＜７＞〜＜８＞の方法。
【実施例】
【００２９】
参考例１  ヒトＴＲＰＶ４遺伝子発現ベクターの作製
ヒト十二指腸由来細胞株であるＨｕｔｕ−８０細胞(American Type Culture Collectionより購入)から抽出したｔｏｔａｌＲＮＡを逆転写して得られたｃＤＮＡを鋳型にして、公開されているヒトＴＲＰＶ４遺伝子配列を参考に合成した、下記に示す塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットを用いて、下記の条件下でポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。
【００３０】
＜プライマーセット＞
フォワードプライマー；5’-CACCATGGCGGATTCCAGCGAAGGCCC-3’：配列番号１
リバースプライマー；5’-CTAGAGCGGGGCGTCATCAGTCC-3’：配列番号２
【００３１】
＜ＰＣＲ条件＞
a) PCR溶液組成
cDNA(Template)                                    15μl
5x PrimeStar GXL Buffer                           10μl
dNTPs mixture (2.5mM)                              4μl
PrimeStar GXL DNA Polymerase (タカラバイオ)        1μl
Forward Primer (10μM)                             1μl
Reverse Primer (10μM)                             1μl
Water                                             18μl
b) 温度とサイクル条件
95℃       2min 
↓
98℃      10sec    33 cycles
70℃       2min 
【００３２】
得られたＰＣＲ産物をＨｉｇｈ  Ｐｕｒｅ  ＰＣＲ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ロッシュ）用いて精製した。精製したＰＣＲ産物と、ｐｃＤＮＡ３．１  Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ  ＴＯＰＯ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｋｉｔ（インビトロジェン社）を用いて、発現用ベクターを作製した。
【００３３】
実施例１  ヒトＴＲＰＶ４発現細胞の作製と細胞内Ｃａ2+流入活性の測定
１０％牛胎児血清を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（インビトロジェン）を用いてＨＥＫ２９３細胞（American  Type  Culture  Collectionより購入）の培養を行った。ＨＥＫ２９３細胞をＴ−７５細胞培養用フラスコに５×１０5ｃｅｌｌｓ／Ｆｌａｓｋで播種した。培養３日後、参考例１で作製したヒトＴＲＰＶ４発現ベクター（８μｇ）をＴｒａｎｓＩＴ−２９３（Ｍｉｒｕｓ）を用いて細胞にトランスフェクションし１日培養した。Ｄｅｔａｃｈｉｎ（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ）で細胞をはがし９６ｗｅｌｌ  Ｏｐｔｉｃａｌ  ｂｏｔｔｏｍ  ｐｌａｔｅ  （Ｎｕｎｃ）に１０％牛胎児血清を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で１．５×１０4ｃｅｌｌｓ／９０μｌ／ｗｅｌｌの細胞密度で播き、さらに１日培養した。
【００３４】
細胞内Ｃａ2+流入活性の測定はＣａｌｃｉｕｍ  Ｋｉｔ  ＩＩ−  ｆｌｕｏ  ４（ＤＯＪＩＮＤＯ）を用いて行った。ｆｌｕｏ４−ＡＭ  を含有したＬｏａｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒを上記の細胞に９０μｌ／ｗｅｌｌ添加し、３７℃で１時間インキュベートした後、３７℃で蛍光プレートリーダーＦＤＳＳ３０００（浜松ホトニクス）により蛍光強度（励起波長；４８８ｎｍ，蛍光波長；５２４ｎｍ）を２秒毎に測定した。測定開始３０秒後にＴＲＰＶ４作動薬であるＧＳＫ１０１６７９０ａ（Sigma社）と、以下に示す検体を含有する溶液（ＧＳＫ１０１６７９０ａ；５０ｎＭ（終濃度５ｎＭ）、検体；終濃度の１０倍濃度）を２０μｌ／ｗｅｌｌ添加し、３００秒まで２秒毎に蛍光強度変化を測定した。
【００３５】
＜検体＞
GSK1016790a(Sigma, TRPV4作動薬)、イソラムネチン(Sigma)、カテキン(東京化成)、ヘスペレチン(Sigma)、ケルセチン２水和物（ナカライテスク）、ルテオリン（LKT）、フィセチン(INDOFINE)、クリシン（関東化学）、ゲニステイン(東京化成)、エピガロカテキンガレート(Sigma)、セサミン（東京化成)、 RN-1734(CAS Number: 946387-07-1、Vincent et al, Biochem.Biophys.Res.Comms. 389 490 (2009).； Sigma,)、をジメチルスルオキシド(DMSO)（ナカライテスク）で溶解し、使用した。
【００３６】
また、検体のＴＲＰＶ４活性の阻害率は次式により算出した。
（数１）
阻害率(%)=〔 (F300C1／F0C1−F300／F0)/(F300C1／F0C1−F300C2／F0C2) 〕x 100 
F300  ;測定開始300秒後のGSK1016790aと検体を添加したウェルの蛍光強度
F300C1;測定開始300秒後のGSK1016790aとDMSOを添加したウェルの蛍光強度
F300C2;測定開始300秒後のDMSOのみを添加したウェルの蛍光強度
F0    ;測定開始直後のGSK1016790aと検体を添加したウェルの蛍光強度
F0C1  ;測定開始直後のGSK1016790aとDMSOを添加したウェルの蛍光強度
F0C2  ;測定開始直後のDMSOのみを添加したウェルの蛍光強度
【００３７】
＜検定方法・結果＞
コントロールであるＤＭＳＯの阻害率を０％とした時、コントロールに対する検体の阻害率をＤｕｎｎｅｔにより検定した。結果を表１に示す。
表１より、イソラムネチン、カテキン、ヘスペレチン、ケルセチン、ルテオリン、フィセチン、クリシン及びゲニステイインは、ＴＲＰＶ４阻害剤として公知のRN-1734と同様、濃度依存的にＴＲＰＶ４活性を有意に阻害した。それに対して、フラボノイドの１つであるエピガロカテキンガレートやゴマリグナンの１つであるセサミンではＴＲＰＶ４阻害活性は認められなかった。
【００３８】
【表１】
2014024809.tif 000002
【配列表】
2014024809000001.app