(57)【要約】【課題】ピンホールあるいはスリットで検出光量が制限される透過型の走査光学顕微鏡光学装置において、観察試料を走査せず、ビームを走査する方式を実現する。【解決手段】観察試料２０２を透過したビーム走査機構２６３からの走査光を反射板２１０上に集光し、再度、観察試料２０２に戻す。試料２０２から戻った光がさらにビーム走査機構２６３を帰還したのち、固定のピンホール２６５あるいはスリットで制限された光を光検出器１０４で検出する。【選択図】図１
2014048300.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
レーザ光源と、
前記レーザ光源から出射されたレーザ光を走査するビーム走査機構と、
観察試料を保持するステージと、
前記ステージに保持された観察試料に前記ビーム走査機構から出射したレーザ光を集光する対物レンズと、
前記ステージの光透過側に設けられた集光光学系と、
前記集光光学系の集光位置に配置された反射板と、
前記ビーム走査機構からの戻り光を集光する集光レンズと、
前記集光レンズの焦点位置に置かれた開口と、
前記開口を通った光を検出する光検出器と、
前記光検出器の信号を走査位置と対応付けて記憶する記憶部と、
前記記憶部に記憶された信号を表示する表示装置と、
を有することを特徴とする光学装置。
【請求項２】
請求項１に記載の光学装置において、
前記開口はピンホールあるいはスリットであることを特徴とする光学装置。
【請求項３】
請求項１に記載の光学装置において、
前記ビーム走査機構は２次元走査機構であることを特徴とする光学装置。
【請求項４】
請求項１に記載の光学装置において、
前記ビーム走査機構は３次元走査機構であることを特徴とする光学装置。
【請求項５】
請求項１に記載の光学装置において、
前記ビーム走査機構からの戻り光の一部を検出し焦点誤差を検出する光学系と、
前記集光光学系内のレンズあるいは前記反射板を光軸方向に駆動するアクチュエータとを有することを特徴とする光学装置。
【請求項６】
請求項１に記載の光学装置において、
前記開口としてスリットを用い、前記光検出器として分光器を用いたことを特徴とする光学装置。
【請求項７】
請求項６に記載の光学装置において、
前記ビーム走査機構からの戻り光に入射光の波長と異なる波長の光が含まれていることを特徴とする光学装置。
【請求項８】
請求項７に記載の光学装置において、
前記レーザ光源から出射されたレーザ光をポンプ光としてスーパーコンティニューム光を発生させる光学素子と、
前記ビーム走査機構からの戻り光の一部を検出し焦点誤差を検出する光学系と、
前記集光光学系内のレンズあるいは前記反射板を光軸方向に駆動するアクチュエータとを有し、
観察試料に照射する光として前記ポンプ光と前記スーパーコンティニューム光の一部のストークス光を照射し、
観察試料からのアンチストークス光を分光し、
前記焦点誤差を検出する光学系は前記ビーム走査機構からの戻り光に含まれる前記ポンプ光あるいはストークス光により焦点誤差信号を得ることを特徴とする光学装置。
【請求項９】
請求項８に記載の光学装置において、
参照光として前記スーパーコンティニューム光の一部を用い、位相ダイバーシティ法を使用することを特徴とする光学装置。
【請求項１０】
レーザ光源と、
前記レーザ光源から出射されたレーザ光を走査するビーム走査機構と、
観察試料を保持するステージと、
前記ステージに保持された観察試料に前記ビーム走査機構から出射したレーザ光を集光する第１の対物レンズと、
前記ステージの光透過側に設けられた第２の対物レンズと、
前記第２の対物レンズを通ったレーザ光を当該第２の対物レンズに戻す再帰反射板と、
前記ビーム走査機構からの戻り光を集光する集光レンズと、
前記集光レンズの焦点位置に置かれた開口と、
前記開口を通った光を検出する光検出器と、
前記光検出器の信号を走査位置と対応付けて記憶する記憶部と、
前記記憶部に記憶された信号を表示する表示装置と、
を有することを特徴とする光学装置。
【請求項１１】
請求項１０に記載の光学装置において、
前記開口はピンホールあるいはスリットであることを特徴とする光学装置。
【請求項１２】
請求項１０に記載の光学装置において、
前記ビーム走査機構は２次元走査機構であることを特徴とする光学装置。
【請求項１３】
請求項１０に記載の光学装置において、
前記ビーム走査機構は３次元走査機構であることを特徴とする光学装置。
【請求項１４】
請求項１０に記載の光学装置において、
前記ビーム走査機構からの戻り光の一部を検出し焦点誤差を検出する光学系と、
前記第２の対物レンズを光軸方向に駆動するアクチュエータとを有することを特徴とする光学装置。
【請求項１５】
請求項１０に記載の光学装置において、
前記開口としてスリットを用い、前記光検出器として分光器を用いたことを特徴とする光学装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は光学的な空間分解能を要する光学装置に関し、特に光ビームを観察試料に絞り込み、光ビームの観察試料に対する照射位置を相対的に変化させて応答信号を取得する光学装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
走査光学顕微鏡では、回折限界まで光を微小スポット状に絞り込み、観察試料上で走査する。そして観察試料からの光は検出器で検出される。広い検出器で観察試料からの光を検出する場合は従来の光学顕微鏡と同じ分解能になることが知られている。ここで云うところの従来の光学顕微鏡は広い範囲を照明し、照明された物体による像を対物レンズを介して結像するものである。観察試料へ絞り込まれた光の応答光をピンホールを通して検出することで、分解能が向上することが知られている（非特許文献１）。これは共焦点走査光学顕微鏡として市販されている。
【０００３】
共焦点走査光学顕微鏡での走査方法には、二通りある。一つは観察試料を直接集光スポットに対して移動させる方法である。この方法は、光学系の設計が簡単であり、光スポットに発生する光学収差が小さい、走査範囲が広い、等の長所を有する。しかし、短所としては、走査時間の短時間化が困難である、液体中にある軟らかい観察試料が走査により振動してしまう、等がある。もう一つの走査方法は、観察試料を固定して、光スポットを走査するタイプのものである。この方式は走査速度を速くでき、液体中の軟らかい観察試料に対しても対応可能である。欠点は走査光学系が複雑になることである。
【０００４】
図１１に、反射タイプの共焦点走査光学顕微鏡の光学系を示す。走査方式は光ビームを走査するタイプのものである。レーザ光源１０１から出射したレーザ光はレンズ２６１と２０８によりコリメートされ、ハーフミラー２６２で反射された後、入射ビーム３０２として２６３の２次元走査機構に入射する。２次元走査機構は、たとえば２枚のガルバノミラーで構成される。２次元走査機構２６３から出射する光ビームの光軸に対する角度は走査のために変化し、たとえば出射光３００のように斜めに出射する。２次元走査機構２６３からの出射光は対物レンズ２０１に入射後、観察試料２０２に微小なスポットとして絞り込まれる。この微小な光スポット状のレーザ光３０１は観察試料２０２で反射され、対物レンズ２０１に戻る。対物レンズ２０１から２次元走査機構２６３に戻るレーザ光の光軸に対する角度は入射時と同じになっている。このため、戻っていくレーザ光は入射光と同じ光路を２次元走査機構内部でたどり、２次元走査機構から出ていくときは、固定された入射ビーム３０２と同じ光路の光となる。観察試料からの反射レーザ光はハーフミラー２６２を透過し、集光レンズ２６４でピンホール２６５上に集光され、その透過光が光検出器１０４で検出される。ピンホール２６５上でのレーザ光の集光位置はビームの走査にも拘わらず変位しないので、観察試料からの検出強度は走査の影響を受けないことになる。１０９は電子装置であり、検出信号の取り込みと走査位置の制御を行う。検出信号は画像として表示装置１１０に表示される。
【０００５】
共焦点走査光学顕微鏡の透過タイプの光学系を図１２に示す。この場合は、観察試料を走査する方式が採用される。レーザ光源１０１から出射したレーザ光はレンズ２６１及び２０８でコリメートされ、ハーフミラー２６２で反射された後、対物レンズ２０１に入射し、観察試料２０２上に絞り込まれる。観察試料２０２を透過したレーザ光は、対物レンズ２０１の開口数に近い特性の対物レンズ２０７と集光レンズ２０５によりピンホール２６５上に絞り込まれる。ピンホール２６５を透過したレーザ光は光検出器１０４で検出され、電子装置１０９で取り込まれる。走査は観察試料２０２を移動させることで行う。すなわち、電子装置１０９は観察試料２０２と一体となったステージ２００の位置をアクチュエータ１０２で移動させ、制御する。前述のように、生物細胞等を観察する場合は、ステージ２００をゆっくり移動させるか、あるいはステージ２００に対して固定したホルダーに細胞を固定する技術が必要となる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】T. Wilson, and C. Sheppard：Theory and Practice of Scanning Optical Microscopy：Academic Press, London (1984)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
透過型の走査光学顕微鏡においては、観察試料を直接走査する場合が多いが、液体中にある観察試料を対象とするときは、走査速度を上げることができない。走査速度を上げると観察試料が揺れる、移動するなどの不都合が生じ、光学分解能の低下が生じる。また、培養細胞を生きた状態で観察する場合は、細胞を生かすための温度コントロール装置等が観察試料を移動させるステージに付随しており、ステージを移動させるのが好ましくない場合もありうる。
【０００８】
たとえば、図１２の透過タイプの共焦点光学顕微鏡において、観察試料２０２を固定して光ビームスポットを２次元走査機構により走査したとすると、ピンホール２６５上での光の集光位置が走査とともに移動することになる。したがって、ピンホールを透過して検出される光量は観察試料の濃淡とは関係なく走査と同期して増減することになり、問題が生じる。
【０００９】
本発明の課題は、共焦点光学顕微鏡のみならず、ピンホールやスリット等の開口が配置された検出光学系を有する透過タイプの走査光学顕微鏡において、観察試料は固定し、光ビームを走査する場合に、安定した検出信号を得ることが可能な光学系を実現することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明による光学装置は、レーザ光源と、レーザ光源から出射されたレーザ光を走査するビーム走査機構と、観察試料を保持するステージと、ステージに保持された観察試料にビーム走査機構から出射したレーザ光を集光する対物レンズと、ステージの光透過側に設けられた集光光学系と、集光光学系の集光位置に配置された反射板と、ビーム走査機構からの戻り光を集光する集光レンズと、集光レンズの焦点位置に置かれた開口と、開口を通った光を検出する光検出器と、光検出器の信号を走査位置と対応付けて記憶する記憶部と、記憶部に記憶された信号を表示する表示装置と、を有する。
【００１１】
また、本発明による光学装置は、レーザ光源と、レーザ光源から出射されたレーザ光を走査するビーム走査機構と、観察試料を保持するステージと、ステージに保持された観察試料にビーム走査機構から出射したレーザ光を集光する第１の対物レンズと、ステージの光透過側に設けられた第２の対物レンズと、第２の対物レンズを通ったレーザ光を当該第２の対物レンズに戻す再帰反射板と、ビーム走査機構からの戻り光を集光する集光レンズと、集光レンズの焦点位置に置かれた開口と、開口を通った光を検出する光検出器と、光検出器の信号を走査位置と対応付けて記憶する記憶部と、記憶部に記憶された信号を表示する表示装置と、を有する。
【００１２】
ビーム走査機構は２次元走査機構とすることもできるし、３次元走査機構とすることもできる。
また、集光光学系からの集光スポット位置が反射板の位置と常時一致するように集光光学系内のレンズ位置あるいは反射板の位置を光軸方向で移動させるアクチュエータ、あるいは第２の対物レンズを通ったレーザ光が平行光として再帰反射板に入射するように第２の対物レンズの位置を光軸方向に移動させるアクチュエータと、走査光学系から出射する戻り光の一部を取り出し焦点誤差を検出するための検出器と、焦点誤差信号でアクチュエータを駆動するフィードバック回路を備えてもよい。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によると、透過型の走査光学顕微鏡において観察試料を固定できるので、液中の軟らかい物体（たとえば生物細胞）の画像データを高速で取得できるようになる。これにより、３次元的な画像データの取得時間の短縮を図ることができる。
上記した以外の、課題、構成及び効果は、以下の実施形態の説明により明らかにされる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明による光学装置の光学系の一例を示す概略図。
【図２】デフォーカス検出のための４分割検出器を示す模式図。
【図３】本発明による３次元走査可能な光学装置の光学系一例を示す概略図。
【図４】本発明によるCARSを検出する光学装置の光学系の一例を示す概略図。
【図５】パルスレーザ光の周波数スペクトルを示す図。
【図６】スーパーコンティニューム光の周波数スペクトルを示す図。
【図７】ストークス光として使用されるスーパーコンティニューム光の低周波数領域の周波数スペクトルを示す図。
【図８】本発明によるCARSを検出する光学装置の光学系の一例を示す概略図。
【図９】参照光として使用されるスーパーコンティニューム光の高周波数領域の周波数スペクトルを示す図。
【図１０】本発明による光学装置の光学系の一例を示す概略図。
【図１１】反射タイプの共焦点光学顕微鏡の光学系を示す図。
【図１２】透過タイプの共焦点光学顕微鏡の光学系を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明の光学装置を実施するための形態を、図を用いて説明する。
【００１６】
［実施例１］
図１は、本発明による光学装置の光学系の一例を示す概略図である。本実施例は、ビーム走査をする透過タイプの共焦点走査光学顕微鏡である。
【００１７】
レーザ光源１０１は、パルスレーザでも連続発振レーザでも使用可能である。レーザ光源１０１から出射したレーザ光はS偏光状態とし、レンズ２６１、２０８でコリメートされる。S偏光状態の入射レーザ光は、偏光ビームスプリッタ２７０で反射されて、２次元走査機構２６３に入射する。２次元走査機構２６３は、たとえば２枚のガルバノミラーで構成される。２次元走査機構２６３により光軸に対する角度が変化するようになった光ビームは対物レンズ２０１に入射し、観察試料２０２を微小スポットで照射する。観察試料２０２はステージ２００に設置されているが、ステージ２００は走査の役割は持たず、主に観察試料２０２の位置合わせのために使用される。観察試料２０２を透過したレーザ光は、対物レンズ２０７と２０５により反射板２１０上に絞り込まれる。本実施例の反射板２１０は平面鏡である。途中、対物レンズ２０７、２０５の間にはλ／４板２０４が設置されており、反射板２１０への光の偏光状態を円偏光とする。
【００１８】
反射板２１０による反射光は円偏光状態が反転し、レンズ２０５へ戻り、λ／４板２０４を再度通過する。この時点でレーザ光の偏光状態はｐ偏光となる。対物レンズ２０７の開口数は対物レンズ２０１と同等のものを使用しており、再びレーザ光は観察試料２０２に絞り込まれる。スポット位置は対物レンズで最初に観察試料に絞り込んだ位置と同じになっている。この関係は、ビームの走査位置が変化しても保たれる。したがって、戻るレーザ光の光路は光軸との角度も含めて、観察試料への入射光と同じものとなり、２次元走査機構２６３から偏光ビームスプリッタ２７０へ戻るレーザ光の光軸は、走査とは関係なく固定されたものとなる。そのレーザ光はｐ偏光となっているため、偏光ビームスプリッタ２７０を透過し、ハーフミラー２６９により一部の光が反射される。この反射光は反射板２１０が常に焦点位置にあるように制御するために使用される。
【００１９】
本実施例で採用した焦点位置制御方法は非点収差法である。２０３は集光レンズであり、２０９はシリンドリカルレンズである。最小錯乱円の位置に光検出器１１１が配置されている。図２は、光検出器１１１の感度領域を示す模式図である。光検出器１１１は４分割された感度領域を有しており、照射レーザ光は最小錯乱円８１１の状態で検出器を照射している。それぞれの検出器からの電気信号をA、B、C、Dとする。これらの信号を使用して、電子回路１１２では、焦点位置制御信号AFを生成する。制御信号AFは
AF＝（A+C）−（B+D）
のように表されるものである。制御信号AFは、フィードバック信号としてアクチュエータ１０２に加えられ、反射板２１０上に焦点が合うようになっている。本実施例では非点収差法による焦点制御を行ったが、ナイフエッジ法等の他の焦点制御方法を使用してもよい。
【００２０】
ハーフミラー２６９の透過レーザ光、すなわち２次元走査機構２６３からの戻り光はレンズ２７１でピンホール２６５上に絞り込まれ、光検出器１０４で検出される。検出された信号は電子装置１０９で処理される。２次元走査機構の走査位置の制御は電子装置１０９で行われ、電子装置１０９には光検出器１０４からの検出信号が走査位置と関連付けられて記憶される。記憶された信号は画像として画像表示装置１１０に表示される。
【００２１】
なお、本実施例では光の使用効率を向上するために、偏光ビームスプリッタ等を使用しているが、ハーフビームスプリッタを使用しても、本発明の目的は実現可能である。
【００２２】
［実施例２］
図３に、本発明に基づく第２の光学装置の例を示す。本実施例の光学装置では、実施例１の光学装置にz方向走査機構２６６が付加されている。
【００２３】
２次元走査機構２６３からの出射レーザ光はｚ方向走査機構２６６に入射する。ｚ方向走査機構２６６は２枚のレンズ２６７、２６８及びアクチュエータ１０３で構成されている。電子装置１０９の指令で動作するアクチュエータ１０３は、光軸方向すなわちｚ軸方向でレンズ２６７の位置を変化させることにより、ビームスポットのｚ方向の走査を実現する。レンズ間隔を変えることで対物レンズ２０１への入射光の広がり角が変わり、対物レンズ２０１からの出射光の最小スポット位置がｚ方向で変化する。これに伴い反射板２１０への最小スポット位置もｚ方向に変化する。この焦点ずれは光検出器１１１で感知され、フィードバック信号が電子回路１１２で生成され、アクチュエータ１０２に加えられる。これにより、アクチュエータ１０２はレンズ２０５を合焦点位置に移動させるので、反射板２１０における焦点誤差は小さくなるように修正される。これにより３次元方向にビーム走査を行っても、ピンホール２６５上での観察試料からのレーザ光の位置は光軸方向も含めて常にピンホールに固定されており、検出信号に走査による擾乱は発生しない。
【００２４】
［実施例３］
本発明をマルチプレックスCARS走査顕微鏡に適用した実施例を図４に示す。マルチプレックスCARS走査顕微鏡の詳細は、例えばM. Okuno, and et al, Opt. Lett., Vol. 33, PP. 923-925(2008)に記載されている。
【００２５】
CARSはCoherent Anti-Stokes Raman Scatteringの略であり、コヒーレント反ストークスラマン散乱と訳される。CARS光を検出する測定方式は、生物細胞の非侵襲での観察が可能であり、かつ分子の振動状態の情報を得ることができるので、生体物質の種類の推定が可能である。CARS光は生体試料では透過方向に強く発生する場合が多いので、検出は透過側で行われる。また、マルチプレックスCARS走査顕微鏡では、CARS光を分光するために、スリットを有する分光器が必要となる。このような事情から、透過タイプとなるマルチプレックスCARS走査顕微鏡では、走査によってCARS光をスリットからはずさないために、観察試料を走査する方式が採用されている。
【００２６】
本実施例では観察試料自体の走査は行わず、ビームを走査することになる。
パルスレーザ光源１４１は、図５のスペクトルで示す中心波長ωPのレーザ光１６１を出射する。出射レーザ光の偏光方向はｐ偏光であり、ビームスプリッタ２５１で２つのビームに分けられる。ビームスプリッタ２５１を透過したビームは、偏波面保存フォトニック結晶ファイバ１４２に入射する。入射光はＳＣ光（スーパーコンティニューム光）と呼ばれる図６のスペクトル１６２に示すような光に変換される。ここではフォトニック結晶ファイバによりＳＣ光を得ているが、分散フラット／減少ファイバ、双方向テーパファイバ等の他の手段でＳＣ光を得ることも可能である。ＳＣ光は励起光周波数ωPを含んだ広い波長範囲に及び、コヒーレントな性質は保持されている。このＳＣ光は、ローパスフィルター２７６により周波数ωPより低い周波数の光が透過する。すなわち、このローパスフィルターを、図７に示す低い周波数の領域１６３の光が透過する。ローパスフィルター２７６の透過光はミラー２５９で反射され、ブロードバンドの周波数ωSTのストークス光として使用される。ストークス光はレンズ２６１と２０８でコリメートされ、ストークス光の波長範囲を反射するダイクロイックミラー２７３で反射される。
【００２７】
一方、ビームスプリッタ２５１で反射されたポンプ光として使用される中心周波数ωPのレーザ光は、さらにミラー２５２と光路差調整のためのミラー群２５３、２５４、２５５、２５６、２６０で反射された後、レンズ２７８と２７９でコリメートされる。ポンプ光はハーフミラー２８０で反射され、ダイクロイックミラー２７３に入射し、二つのレーザ光（ポンプ光とストークス光）は同軸光となる。同軸光はダイクロイックミラー２８１（ポンプ光とストークス光を透過）を透過し、２次元走査機構２６３に入射する。
【００２８】
ポンプ光とストークス光は対物レンズ２０１でステージ２００上の観察試料２０２に絞り込まれる。観察試料で発生した周波数ωAS =2ωP -ωSTのCARS光は、ポンプ光、ストークス光と一緒に透過方向に出ていき、対物レンズ２０７と２０５により反射板２１０上に絞り込まれる。対物レンズ２０７と２０５の間にあるのはハイパスフィルターの役割をするダイクロイックミラー２７５であり、最初の観察試料透過時に発生したCARS光を除去する。
【００２９】
反射板２１０で反射されたポンプ光とストークス光は同じ光路を戻り、観察試料２０２から再度CARS光を発生させる。ポンプ光、ストークス光、CARS光は２次元走査機構２６３を戻り、ダイクロイックミラー２８１でCARS光のみが反射される。CARS光はレンズ２７４で分光器１４３のスリット２７２上に集光され、分光される。分光データは電子装置１０９で処理され、表示装置１１０で表示される。電子装置１０９ではマキシマムエントロピィー法によりCARS光の非共鳴成分が除去される。ダイクロイックミラー２８１を透過するCASR光以外の光のうち、次のダイクロイックミラー２７３ではポンプ光だけが透過する。ポンプ光はハーフミラー２８０を透過し、レンズ２０３とシリンドリカルレンズ２０９で４分割の感度領域を有する光検出器１１１上に絞り込まれ、最小錯乱円の位置で検出される。この信号は電子回路１１２で処理され、焦点誤差信号としてアクチュエータ１０２を制御する。
【００３０】
ダイクロイックミラー２７５は最初に発生するCARS光を除去するものであるが、CARS光が観察試料を照射しても、分光データに問題が生じない場合は取り除くことが可能である。
【００３１】
［実施例４］
本実施例は、実施例３で示したマルチプレックスCARS走査光学顕微鏡において、位相ダイバーシティ法を用いたホモダイン検出法を実現する実施例である。
【００３２】
図８は、本実施例の光学装置の概略図である。パルスレーザ光源１４１、フォトニック結晶ファイバ１４２は、実施例３と同様の特性を有する。フォトニック結晶ファイバ１４２からのｐ偏光のＳＣ光は、ダイクロイックミラー２５７により２分割される。反射光は図９のスペクトル形状１６４を有するＳＣ光であり、透過光は図７に示したスペクトル１６３を有している。スペクトル１６４はアンチストークス光の波長領域になっており、ホモダイン検出の参照光として使用される。
【００３３】
ダイクロイックミラー２５７を透過した波長領域のＳＣ光は、ミラー２５９で反射された後、レンズ２６１、２０８でコリメートされ、ダイクロイックミラー２７３で反射される。このＳＣ光はCARS発生のためのストークス光として使用される。CARS光発生のためのポンプ光はハーフミラー２８０で反射され、ストークス光と同軸のｐ偏光となり、２次元走査機構２６３に入射する。２次元走査機構２６３からの出射光は対物レンズ２０１で観察試料２０２上に絞り込まれるが、さらに透過光がレンズ２０７、２０５で反射板２１０上に絞り込まれる。反射板２１０からのレンズ群を戻った反射光は再び観察試料２０２を照射し、主に透過方向にCARS光を発生させる。対物レンズ２０１及び２次元走査機構２６３を戻ったポンプ光、ストークス光、CARS光の中で、CARS光はダイクロイックミラー２８１、ミラー２８２で反射された後、検光子２８３をｐ偏光成分だけが透過する。ｐ偏光のCARS光は、ミラー２８４により反射されてハーフビームスプリッタ２１３に入射する。
【００３４】
ｐ偏光の高周波領域のＳＣ光（参照光）はレンズ２５８と２０６でコリメートされ、偏光ビームスプリッタ２１６とλ／４板の効果を有するフレネルロム波長板２１７を透過し、ミラー２１８でフレネルロム波長板２１７に戻される。ミラー２１８は光路長の調整に使用されている。フレネルロム波長板２１７透過したレーザ光はｓ偏光になっており、偏光ビームスプリッタ２１６で反射され、ビームスプリッタ２１３に向かう。
【００３５】
ハーフビームスプリッタ２１３には偏光方向の異なる光が両方向から入射することになり、それぞれの光は２方向に分割され、２方向に干渉光が出射する。CARS光の電場の絶対値の検出のために位相ダイバーシティ検出という既知の方法を用いた干渉計測を行う。ωはスペクトル周波数である。紙面上でハーフビームスプリッタ２１３の右方向に出射してくる干渉光には光学軸が２２．５度傾いたλ／２板の効果を有するフレネルロム波長板２２１が設置されており、集光レンズ２１５で焦点位置に置かれた分光器のスリット上に集光される。分光器前の光路中には偏光ビームスプリッタ２２３が設置されており、ｓ方向とｐ方向の成分に干渉光を分解し、それぞれを分光器１０６と分光器１０８で検出する。
【００３６】
ここで、観察試料を焦点面の光軸上にある点物体とし、観察試料からのCARS光の複素振幅、参照光の複素振幅はそれぞれEAS(ω)、ELOであるものとする。分光器１０６と分光器１０８のそれぞれの波長での差動信号をIC(ω)としたとき、
IC(ω)＝α｜EAS(ω)｜・｜ELO｜ cosΦ(ω)
と表わすことができる。αは信号増幅や分光器効率等を含む係数であり、Φ(ω)は観察試料からのCARS光と参照光との位相差である。
【００３７】
また、紙面上でハーフビームスプリッタ２１３の上方向に出射する干渉光には光学軸が４５度傾いたλ／４板の効果を有するフレネルロム波長板２２２が挿入されている。集光レンズ２１４で集光された干渉光は分光器１０５及び１０７のスリットを通して検出される。途中に設置されている偏光ビームスプリッタ２２４によりｓ偏光とp偏光に分離した後に、それぞれの分光器で検出される。
【００３８】
ここで分光器１０５と１０７のそれぞれの波長での差動信号をIS(ω)としたとき、
IS(ω)＝α｜EAS (ω)｜・｜ELO｜ sinΦ(ω)
のように表わされる。IC(ω)及びIS(ω)では干渉成分のみが検出されている。電子装置１０９では、
I(ω)＝√（IC２＋IS２）＝α｜EAS(ω)｜・｜ELO｜               (1)
で示す計算を行うと同時に、位相差Φ(ω)の計算を行う。I(ω)は観察試料のCARS光振幅と参照光の振幅に比例した形となる。このため、波長依存性のない｜ELO｜を大きくすることにより、｜EAS(ω)｜を増幅した形のI(ω)を得ることが可能となる。一般的にはSC光のスペクトルは平坦ではないので、より正確なスペクトルI(ω)を得るためには、SC光の振幅スペクトルを使用した補正を行う必要がある。
【００３９】
次に、非共鳴成分だけのCARS光を発生する参照サンプルを使用することで、共鳴項で生ずる位相差θS(ω)を求める。これにより共鳴項の複素成分[I(ω) sinθS(ω)]の抽出を行う。処理をしない生のCARSスペクトルは非共鳴項の影響を受け、通常のラマンスペクトルと異なる形をしているので、これまで蓄積されたラマンスペクトルの知見を利用できないが、[I(ω) sinθS(ω)]はラマンスペクトルと同等なので、従来のスペクトルの知見を利用できる。
【００４０】
分光器における検出器はCCD等を使用する。１１０は表示装置であり、観察試料２０２の走査位置と表示位置の対応をつけた表示がなされる。特定分子の分子振動に特徴的な周波数位置ωpでの[I(ωp) sinθS(ωp)]の強度分布を表示することで、その分子の分布を知ることができる。
【００４１】
２次元走査機構２６３へ戻った光の中でCARS光以外はダイクロイックミラー２８１を透過し、ダイクロイックミラー２７３ではポンプ光のみ透過する。ポンプ光はハーフミラー２８０を透過し、レンズ２０３、シリンドリカルレンズ２０９で４分割光検出器１１１に絞り込まれる。検出された信号は電子回路１１２で処理され、フォーカス誤差信号としてアクチュエータ１０２にフィードバックされる。これにより反射板２１０は焦点位置に保たれる。
【００４２】
本実施例ではアクチュエータ１０２はレンズ２０５を駆動する構成になっているが、反射板２１０あるいは対物レンズ２０７を駆動してもよい。特に、反射板２１０は軽量化が可能なので、小型のアクチュエータでの対応が可能である。
【００４３】
［実施例５］
図１０は、本発明による光学装置の他の実施例を示す概略図である。ここでは実施例１と同じビームを走査する透過タイプの共焦点走査光学顕微鏡を実現している。
【００４４】
実施例１との光学的な差異は、実施例１で使用していた偏光ビームスプリッタ２７０に代えて通常のビームスプリッタ２８７を用いたこと、及び観察試料２０２を透過したレーザ光を処理する光学系にある。
【００４５】
観察試料２０２を透過したレーザ光は対物レンズ２０７で平行光にされ、再帰反射板としてのコーナーキューブ２８５に向かう。コーナーキューブは入射光を同じ入射方向に戻す性質があるので、２次元走査機構２６３によってレーザ光を走査することで観察試料２０２上での照射位置が変化しても、対物レンズ２０７を通して、同じ走査位置に再度集光可能である。このことより、実施例１と同様に、ピンホール２６５上での観察試料からのレーザ光は静止しており、レーザ走査の影響は検出信号に影響しない。なお、対物レンズ２０７はアクチュエータで光軸方向に駆動することが可能になっており、常にコーナーキューブに平行光が入射するように制御されている。
【００４６】
ここでは、再帰反射板としてコーナーキューブを用いた例を示したが、入射した光を、入射角度にかかわらず再び入射した方向へ反射して戻す性質を有していれば他の部材を用いても構わない。
【００４７】
なお、本発明は上記した実施例に限定されるものではなく、様々な変形例が含まれる。例えば、上記した実施例は本発明を分かりやすく説明するために詳細に説明したものであり、必ずしも説明した全ての構成を備えるものに限定されるものではない。また、ある実施例の構成の一部を他の実施例の構成に置き換えることが可能であり、また、ある実施例の構成に他の実施例の構成を加えることも可能である。また、各実施例の構成の一部について、他の構成の追加・削除・置換をすることが可能である。例えば、実施例２〜４において、反射板２１０を実施例５で説明した再帰反射板２８５に置き換え、対物レンズ２０７、２０５を実施例５のような対物レンズ２０７に置き換えることが可能である。
【産業上の利用可能性】
【００４８】
本発明によれば、信号を検出する検出器の前に検出光を制限するピンホールあるいはスリット等の開口が存在する走査型の透過光学顕微鏡に適用可能である。このような顕微鏡としては、透過タイプの共焦点顕微鏡、マルチプレックスCARS走査顕微鏡等がある。
【符号の説明】
【００４９】
１０１  レーザ光源
１０２、１０３  アクチュエータ
１０４  光検出器
１０５、１０６、１０７、１０８  分光器
１０９  電子装置
１１０  表示装置
１１１  光検出器
１１２  電子回路
１４１  パルスレーザ光源
１４２  フォトニック結晶ファイバ
１４３  分光器
２０１  対物レンズ
２０２  観察試料
２０３  集光レンズ
２０５  レンズ
２０７  対物レンズ
２０９  シリンドリカルレンズ
２１０  反射板
２１３  ビームスプリッタ
２１４  集光レンズ
２１６  偏光ビームスプリッタ
２１７  フレネルロム波長板
２１８  ミラー
２２１  フレネルロム波長板
２２２  フレネルロム波長板
２２３  偏光ビームスプリッタ
２２４  偏光ビームスプリッタ
２６３  ２次元走査機構
２６５  ピンホ−ル
２６６  ｚ方向走査機構
２７２  スリット
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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