(57)【要約】      （修正有）【課題】脂肪組織又は胎盤組織に由来する接着性細胞を使用して疾患を処置する方法の提供。【解決手段】虚血及び／又は結合組織の再生並びに／或いは修復を処置することにおける使用のための医薬品を製造するための、胎盤組織及び脂肪組織から選択される組織の接着性細胞の使用であって、二次元接着性細胞選択、及びそれに続く三次元マトリックス上での又はバイオリアクター中の三次元設定における接着性培養によって単離された接着性細胞、及びその使用。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
虚血を処置することにおける使用のための医薬品を製造するための、胎盤組織および脂肪組織からなる群から選択される組織の接着性細胞の使用であって、接着性細胞が、二次元接着性細胞選択、およびそれに続く三次元マトリックス上でのまたはバイオリアクター中の三次元設定における接着性培養によって単離されたものである、使用。
【請求項２】
虚血を処置することにおける使用のための表示を含む包装材を含む製造物であって、前記包装材により、胎盤組織および脂肪組織からなる群から選択される組織の接着性細胞の医薬的に効果的な量が包装され、接着性細胞が、二次元接着性細胞選択、およびそれに続く三次元マトリックス上でのまたはバイオリアクター中の三次元設定における接着性培養によって単離されたものである、製造物。
【請求項３】
前記接着性細胞は免疫反応を対象において抑制することができる、請求項１に記載の使用。
【請求項４】
前記接着性細胞の少なくとも１０％が増殖期にある、請求項１に記載の使用。
【請求項５】
前記虚血は末梢動脈疾患（ＰＡＤ）である、請求項１に記載の使用。
【請求項６】
前記末梢動脈疾患（ＰＡＤ）は虚血肢である、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
前記末梢動脈疾患（ＰＡＤ）は重症虚血肢（ＣＬＩ）である、請求項５に記載の使用。
【請求項８】
前記虚血は中枢神経系（ＣＮＳ）の虚血を含む、請求項１に記載の使用。
【請求項９】
前記虚血が、虚血性血管疾患、虚血性心臓疾患、虚血性脳疾患、虚血性腎臓疾患および虚血性胎盤からなる群から選択される、請求項１に記載の使用。
【請求項１０】
前記接着性培養が灌流下で行われる、請求項１に記載の使用。
【請求項１１】
前記バイオリアクターが、合成接着性材料を含む、請求項１に記載の使用。
【請求項１２】
前記接着性材料が、ポリエステルおよびポリプロピレンからなる群から選択される、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
前記接着性培養が少なくとも３日間にわたって行われる、請求項１に記載の使用。
【請求項１４】
前記接着性培養が、前記細胞の少なくとも１０％が増殖中になるまで行われる、請求項１に記載の使用。
【請求項１５】
前記接着性細胞は、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ２９およびＣＤ１０５からなる群から選択される細胞マーカーを発現する、請求項１に記載の使用。
【請求項１６】
前記接着性細胞は、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ４５、ＣＤ８０、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１９およびＣＤ７９からなる群から選択される細胞マーカーを発現しない、請求項１に記載の使用。
【請求項１７】
前記接着性細胞は、間質幹細胞表現型を含む細胞を含む、請求項１に記載の使用。
【請求項１８】
前記間質幹細胞表現型はＴ細胞抑制活性を含む、請求項１７に記載の使用。
【請求項１９】
前記接着性細胞は、胎盤からのものである、請求項１に記載の使用。
【請求項２０】
前記接着性細胞は、脂肪組織からのものである、請求項１に記載の使用。
【請求項２１】
前記医薬品の製造の前に、前記バイオアクターから前記接着性細胞を除去することをさらに含む、請求項１に記載の使用。
【請求項２２】
前記医薬品が同種医薬品である、請求項１に記載の使用。
【請求項２３】
前記医薬品が、数日間から数週間にわたる処置を伴う複数回の投与のためのものである、請求項１に記載の使用。
【請求項２４】
前記医薬品が、免疫抑制と共に投与されるためのものである、請求項１に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脂肪組織または胎盤組織に由来する接着性細胞を使用して疾患を処置する方法に関し、より具体的には、虚血、ならびに／あるいは、結合組織の再生および／または修復を必要とする医学的状態を、そのような接着性細胞を使用して処置する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発展し続ける医学界では、非常に多量の成体幹細胞が細胞移植および組織工学のためにますます求められている。加えて、成体幹細胞治療は、様々な状態を処置および治療するために、例えば、造血系障害、心臓疾患、パーキンソン病、アルツハイマー病、脳卒中、火傷、筋ジストロフィー、自己免疫障害、糖尿病および関節炎などを処置および治療するために途切れることなく発展し続けている。
【０００３】
近年では、かなりの活動が、損傷した器官（例えば、脳、心臓、骨および肝臓など）の組織修復を含む様々な医学的用途のための間葉系間質細胞（ＭＳＣ）の治療的可能性、および、骨髄移植（ＢＭＴ）の支持におけるその治療的可能性に集中している。ＭＳＣは、例えば、骨髄、脂肪組織、胎盤および血液から得られる不均一な細胞集団であり、様々な生物活性因子からの影響に依存して、異なるタイプの間葉系の成熟細胞（例えば、細網内皮細胞、線維芽細胞、脂肪細胞、骨形成性前駆体細胞）に分化することができる。したがって、ＭＳＣが、新しい組織（例えば、骨、軟骨および脂肪など）を傷害の修復または病的組織の置換のために作るための基礎として、また、遺伝的疾患および後天的疾患のための処置として再生医療において広範囲に研究されている［ＦｉｂｂｅおよびＮｏｏｒｔ、Ａｎｎ  ＮＹ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ（２００３）、９９６：２３５〜４４；Ｈｏｒｗｉｔｚ他、Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ（２００５）、７（５）：３９３〜５；ＺｉｍｍｅｔおよびＨａｒｅ、Ｂａｓｉｃ  Ｒｅｓ  Ｃａｒｄｉｏｌ（２００５）、１００（６）：４７１〜８１］。さらに、ＭＳＣの多能的能力、その容易な単離および培養、ならびに、その大きい潜在的なエクスビボ拡大能はＭＳＣを魅力のある治療ツールにしている［ＦｉｂｂｅおよびＮｏｏｒｔ、上掲；Ｍｉｎｇｕｅｌｌ他、Ｅｘｐ  Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ（Ｍａｙｗｏｏｄ）（２００１）、２２６（６）：５０７〜２０］。
【０００４】
胎盤由来のＭＳＣは、他の組織から単離されるＭＳＣに共通する多くのマーカー（例えば、ＣＤ１０５、ＣＤ７３、ＣＤ９０およびＣＤ２９）を示し、造血系細胞マーカー、内皮細胞マーカーおよび栄養膜特異的な細胞マーカーの発現を示さない。脂肪生成分化、骨形成分化および神経形成分化が、胎盤由来ＭＳＣを適切な条件のもとで培養した後で達成されている［Ｙｅｎ他、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ（２００５）、２３（１）：３〜９］。さらに、胎盤から単離され、インビトロ培養されたＭＳＣは、ＭＳＣと類似する様式で免疫特権を有することが明らかにされている。したがって、胎盤は、実験および臨床での様々な用途のためのＭＳＣの倫理的に議論の余地のない、容易に入手可能な供給源を提供する［Ｚｈａｎｇ他、Ｅｘｐ  Ｈｅｍａｔｏｌ（２００４）、３２（７）：６５７〜６４］。
【０００５】
本発明者らは、胎盤由来ＭＳＣを拡大するために好適な三次元（３Ｄ）培養条件を以前に考案している（ＰＣＴ出願番号ＩＬ２００７／０００３８０）（これはその全体において参照によって本明細書中にすべてが組み込まれる）。
【０００６】
ＭＳＣの主たる臨床的使用が下記にまとめられる。
【０００７】
虚血
末梢動脈疾患（ＰＡＤ）
末梢動脈疾患（ＰＡＤ）は、重篤な医学的合併症を引き起こし得る、四肢における血流を徐々に制限する慢性疾患である。この疾患は多くの場合、高血圧、心臓血管疾患、高脂血症、糖尿病、肥満および脳卒中を含む、他の臨床的状態に付随する。重症虚血肢（ＣＬＩ）が、慢性的な虚血により誘導される四肢における痛み、潰瘍、組織喪失または組織壊疽を有する患者を説明するために使用される。ＣＬＩは、血管手術または血管専門家による包括的処置を必要とするＰＡＤ患者の末期段階を表す。冠状動脈疾患および脳動脈疾患とは対照的に、末梢動脈疾患（ＰＡＤ）は依然として、重篤であり、かつ、患者数が極めて多いにもかかわらず、診断されることが希であり、したがって、処置されることが一層より少ない、正当に評価されていない状態である。結果として、ＣＬＩは、四肢の切断または死に至ることが多く、ＰＡＤ患者における死亡率が心筋梗塞および脳卒中の患者の死亡率を超えている。
【０００８】
虚血状態を処置するための試みでは、様々な成体幹細胞が使用されている。例えば、脂肪組織由来の間質細胞（ＡＤＳＣ）と、内皮細胞（ＥＣ）との共培養は、主にＶＥＧＦおよびＨＧＦの分泌により、ＥＣの生存性、遊走および管形成における著しい増大をもたらした。間質細胞が虚血マウスの後肢に移植された４週間後、血管形成スコアが改善された［Ｎａｋａｇａｍｉ他、Ｊ  Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂ（２００６）、１３（２）：７７〜８１］。Ｍｏｏｎ他［Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ（２００６）、１７：２７９〜９０］は、脂肪組織由来の始原体細胞（ＡＤＳＣ）により、四肢の虚血が免疫不全マウスにおいて処置され得るかを試験しており、レーザードップラー灌流指数における著しい増大をＡＤＳＣ移植群において明らかにしている。
【０００９】
加えて、臍帯血（ＵＣＢ）由来の間葉系幹細胞が、医学的処置および外科的治療を既に受けていたバーガー病の４名の男性に移植されたとき、虚血性休息痛が男性の冒された四肢から突然に消失した［Ｋｉｍ他、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ（２００６）、２４（６）：１６２０〜６］。そのうえ、満期胎盤の胎膜から単離されたヒト間葉系幹細胞（ＦＭｈＭＳＣ）の、梗塞を生じさせたラット心臓への移植では、増大した毛細管密度、左心室機能の正常化、および、瘢痕組織における著しい減少を伴い、このことが、幹細胞が酪酸およびレチノイン酸とのヒアルロナンの混合エステルにより前処理されたときに高まった［Ｖｅｎｔｕｒａ他（２００７）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２８２：１４２４３〜５２］。
【００１０】
脳卒中
脳卒中は世界中で主要な死亡原因の１つであり、脳卒中により、全死亡のおよそ９％が引き起こされ、医療費全体の約２％〜４％が費やされる。脳卒中の死亡率が、おそらくは脳卒中の危険因子（特に、高い血圧、糖尿病および喫煙）の改善された抑制のために先進国では絶えず低下しているが、脳卒中は依然として、永続的な損傷（例えば、組織損傷、神経学的損傷）を引き起こしている。
【００１１】
脳卒中のための新しい処置療法には、幹細胞治療が含まれる。幹細胞または始原体を、局所的であっても、または、静脈内経路を介してであっても、傷害を受けた部位に移植して、機能しない細胞に取って代わり、内因性の幹細胞または始原体細胞の増殖および／または分化を高め、かつ、必要な免疫調節因子を供給することが、細胞に基づく主たる戦略として意図されており、細胞に基づく主たる戦略としての立場である。脳卒中のための幹細胞／始原体細胞の潜在的供給源には、胎児神経幹細胞、胚性幹細胞、神経奇形腫細胞、臍帯血由来非造血系幹細胞、骨髄由来幹細胞および胎盤由来間葉系幹細胞が含まれる［Ａｎｄｒｅｓ他、Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ  Ｆｏｃｕｓ（２００８）、２４（３−４）：Ｅ１６］。
【００１２】
近年の研究において、Ｋｏｈ他［Ｋｏｈ他、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．（２００８）］は、移植されたヒト臍帯血由来間葉系幹細胞（ｈＵＣ−ＭＳＣ）の神経保護効果および神経保護機構を虚血性脳卒中ラットモデルにおいて調べた。インビトロでのニューロン分化が誘導された２０日後、ｈＵＣ−ＭＳＣはニューロンの形態学的特徴を示し、ニューロン細胞マーカーおよびニューロン因子（例えば、神経膠細胞系由来神経栄養因子、脳由来神経栄養因子）を発現した。さらに、免疫抑制された虚血性脳卒中ラットの損傷した半球へのｈＵＣ−ＭＳＣのインビボ移植は、コントロールラットと比較して、神経行動学的機能を改善し、梗塞体積を低下させた。移植の３週間後、ｈＵＣ−ＭＳＣが、損傷を受けた半球に存在し、かつ、ニューロン特異的マーカーを発現したが、それにもかかわらず、これらの細胞は、機能的に活性なニューロン細胞になっていなかった。
【００１３】
整形外科用途
様々な状態および病変が結合組織（例えば、骨、腱および靱帯）の再生および／または修復を必要とする。これらには、例えば、骨折、火傷、熱傷、深部創傷、変性骨、結合組織の喪失を伴う様々なガン（例えば、骨ガン、骨肉腫、骨転移）、および、関節軟骨欠損が含まれる。
【００１４】
骨治癒を高めるための自家ＢＭ−ＭＳＣの使用が動物およびヒトの様々な整形外科用途のために記載されており、そのような使用には、靱帯治癒のための骨髄の経皮注入（Ｃａｒｓｔａｎｊｃｎ他、２００６）、整形外科診療所における骨髄の自家移植片または同種移植片による骨欠損の処置（Ｈｏｒｗｉｔｚ他、１９９９；Ｈｏｒｗｉｔｚ他、２００２）、臨界サイズの骨欠損の再生で、イヌにおいて、ヒドロキシアパタイト−リン酸三カルシウムからなるセラミック円柱に負荷された同種骨髄ＭＳＣ［Ａｒｉｎｚｅｈ  ＴＬ他、Ｊ  Ｂｏｎｅ  Ｊｏｉｎｔ  Ｓｕｒｇ  Ａｍ（２００３）、８５−Ａ（１０）：１９２７〜３５］または自家骨髄ＭＳＣ［Ｂｒｕｄｅｒ  ＳＰ他、Ｊ  Ｂｏｎｅ  Ｊｏｉｎｔ  Ｓｕｒｇ  Ａｍ、１９９８（Ｊｕｌ）、８０（７）：９８５〜９６］を使用する再生、あるいは、ウサギにおいて同種末梢血由来ＭＳＣを使用する再生（Ｃｈａｏ他、２００６）、および、ヒヒにおいてＭＳＣ移植を使用する広範囲の骨形成（Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎ他、２００３）が含まれる。
【００１５】
ウマの整形外科分野において、ＢＭおよび脂肪を供給源とする間葉系幹細胞が、実験的には、軟骨下骨嚢胞の外科的処置、骨折修復［ＫｒａｕｓおよびＫｉｒｋｅｒ−Ｈｅａｄ、Ｖｅｔ  Ｓｕｒｇ（２００６）、３５（３）：２３２〜４２］および軟骨修復［Ｂｒｅｈｍ他、Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｃａｒｔｉｌａｇｅ（２００６）、１４（１２）：１２１４〜２６；Ｗｉｌｋｅ他、Ｊ  Ｏｒｔｈｏｐ  Ｒｅｓ（２００７）、２５（７）：９１３〜２５］のために使用されており、また、臨床的には、ウマにおける、酷使により誘導される腱の傷害の処置において使用されている。さらに、様々な異なる治療的取り組みが、ウマにおける提靱帯治癒を促進させるために使用されている（Ｈｅｒｔｈｅｌ、２００１）。Ｈｅｒｔｈｅｌ（２００１）は、自然の靱帯再生を刺激するための、自家幹細胞および関連する骨髄成分の病変部内注入を伴う、提靱帯治癒を容易にするための新規な生物学的取り組みを明らかにしている。
【００１６】
傷害を受けた腱についてのウサギモデルにおいて、ＭＳＣ処置された組織が、自然の修復された組織よりも強く、堅かったことが示された（Ｇｏｒｄｏｎ他、２００５）。加えて、腱のすき間への培養ＭＳＣの播種は、著しく改善された修復生体力学をもたらした（Ｙｏｕｎｇ他、１９９８；Ｏｓｉｒｉｓ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、ｗｗｗ．ｏｓｉｒｉｓ．ｃｏｍ）。
【００１７】
Ｏｓｉｒｉｓ社のＣｈｏｎｄｒｏｇｅｎ（成体間葉系幹細胞）が現在、安全性および効力を評価するために患者において試験されている。ＭＳＣ処置を受けた動物において、コントロール動物との比較では、手術により除かれた半月板組織が再生され、軟骨表面が保護され、かつ、緩和された関節損傷が認められた。これらの利益が、少なくとも１年間を通して動物モデルにおいて持続した（Ｏｓｉｒｉｓ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、ｗｗｗ．ｏｓｉｒｉｓ．ｃｏｍ）。
【発明の概要】
【００１８】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、虚血をその必要性のある対象において処置する方法が提供され、この場合、この方法は、胎盤組織および脂肪組織からなる群から選択される組織の接着性細胞の治療効果的な量を対象に投与し、それにより、虚血を対象において処置することを含む。
【００１９】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、結合組織の再生および／または修復を必要とする医学的状態をその必要性のある対象において処置する方法が提供され、この場合、この方法は、胎盤組織および脂肪組織からなる群から選択される組織の接着性細胞の治療効果的な量を対象に投与し、それにより、結合組織の再生および／または修復を必要とする医学的状態を対象において処置することを含む。
【００２０】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、虚血を処置するために特定される医薬品を製造するための、胎盤組織および脂肪組織からなる群から選択される組織の接着性細胞の使用が提供される。
【００２１】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、結合組織の再生および／または修復を必要とする医学的状態を処置するために特定される医薬品を製造するための、胎盤組織および脂肪組織からなる群から選択される組織の接着性細胞の使用が提供される。
【００２２】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、虚血を処置することにおける使用のための表示を含む包装材を含む製造物であって、包装材により、胎盤組織および脂肪組織からなる群から選択される組織の接着性細胞の医薬的に効果的な量が包装される製造物が提供される。
【００２３】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、結合組織の再生および／または修復を必要とする医学的状態を処置することにおける使用のための表示を含む包装材を含む製造物であって、包装材により、胎盤組織および脂肪組織からなる群から選択される組織の接着性細胞の医薬的に効果的な量が包装される製造物が提供される。
【００２４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、接着性細胞は免疫反応を対象において抑制することができる。
【００２５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、接着性細胞の少なくとも１０％が増殖期にある。
【００２６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、虚血は末梢動脈疾患（ＰＡＤ）である。
【００２７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、末梢動脈疾患（ＰＡＤ）は重症虚血肢（ＣＬＩ）である。
【００２８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、虚血は中枢神経系（ＣＮＳ）の虚血を含む。
【００２９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、虚血が、末梢動脈疾患、虚血性血管疾患、虚血性心臓疾患、虚血性脳疾患、虚血性腎臓疾患および虚血性胎盤からなる群から選択される。
【００３０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、接着性細胞は三次元（３Ｄ）培養から得られる。
【００３１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、三次元（３Ｄ）培養は３Ｄバイオリアクターを含む。
【００３２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、細胞を３Ｄ培養において培養することが灌流下で行われる。
【００３３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、三次元培養の培養条件が、ポリエステルおよびポリプロピレンからなる群から選択される接着性材料を含む。
【００３４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、細胞を培養することが少なくとも３日間にわたって行われる。
【００３５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、細胞を培養することが、細胞の少なくとも１０％が増殖中になるまで行われる。
【００３６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、接着性細胞は、ＣＤ３７、ＣＤ９０、ＣＤ２９およびＣＤ１０５からなる群から選択される陽性のマーカー発現を含む。
【００３７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、接着性細胞は、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ４５、ＣＤ８０、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ３４およびＣＤ７９からなる群から選択される陰性のマーカー発現を含む。
【００３８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、接着性細胞は、本質的には本明細書中で記載されるような発現プロフィルを含む。
【００３９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、接着性細胞は、間質幹細胞表現型を含む細胞を含む。
【００４０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、間質幹細胞表現型はＴ細胞抑制活性を含む。
【００４１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、結合組織は、腱、骨および／または靱帯を含む。
【００４２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、結合組織の再生および／または修復を必要とする医学的状態が、骨折、骨ガン、熱傷、関節軟骨欠損および深部創傷からなる群から選択される。
【００４３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、医学的状態が、軟骨下骨嚢胞、骨折、骨粗鬆症、変形性関節炎、変性骨、骨ガン、軟骨損傷、関節軟骨欠損、変性椎間板疾患、骨形成不全症（ＯＩ）、火傷、熱傷、深部創傷、遅れた創傷治癒、傷害を受けた腱、および、傷害を受けた靱帯からなる群から選択される。
【００４４】
別途定義されない限り、本明細書中で使用されるすべての技術的用語および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書中に記載される方法および材料と類似または同等である方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができるが、好適な方法および材料が下記に記載される。矛盾する場合には、定義を含めて、本特許明細書が優先する。加えて、材料、方法および実施例は例示にすぎず、限定であることは意図されない。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
本明細書では本発明を単に例示し図面を参照して説明する。特に詳細に図面を参照して、示されている詳細が例示として本発明の好ましい実施形態を例示考察することだけを目的としており、本発明の原理や概念の側面の最も有用でかつ容易に理解される説明であると考えられるものを提供するために提示していることを強調するものである。この点について、本発明を基本的に理解するのに必要である以上に詳細に本発明の構造の詳細は示さないが、図面について行う説明によって本発明のいくつもの形態を実施する方法は当業者には明らかになるであろう。
【００４６】
【図１Ａ−Ｇ】図１Ａ〜Ｇは、３Ｄ担体を含有するバイオリアクターシステムにおいて作製される骨様微小環境を示す。図１Ａ〜Ｂは、天然骨（図１Ａ）と、骨の微小環境を模倣する、接着性細胞を播種した７日後のＰｌｕｒｉＸ（商標）３Ｄ担体の構造（図１Ｂ）との比較を示す電子顕微鏡写真である。図１Ｃ〜Ｆは、骨髄から作製される接着性細胞が播種されたＰｌｕｒｉＸ（商標）３Ｄマトリックスを播種後２０日で示す電子顕微鏡写真（図１Ｃ〜Ｄ、それぞれ１５０倍および２５０倍に拡大）および播種後４０日で示す電子顕微鏡写真（図１Ｅ〜Ｆ、それぞれ３５０倍および５００倍に拡大）である。図１Ｇは、個々の部分を数字で定義したＰｌｕｒｉｘ３Ｄプラグフローバイオリアクターの略図である：培養培地リザーバー（１）、ガス混合物供給（２）、フィルター（３）、注入点（４）、３Ｄ担体が設置されるカラム（５）、流量モニター（６）、流量バルブ（６ａ）、分離用容器（７）、細胞成長分析計（８）、蠕動ポンプ（９）、サンプル採取点（１０）、溶存Ｏ２測定電極（１１）、ｐＨ測定電極（１２）、制御システム（１３）、新鮮な成長培地（１４）、使用後の成長培地（１５）。
【００４７】
【図２】図２は、バイオリアクターシステム内の３Ｄ成長条件で成長させた、胎盤由来の接着性細胞の異なる製造ロット（ロット５〜８）を示すグラフである。接着性細胞（２×１０６個）を１００００〜１５０００細胞／担体の密度でバイオリアクターに播種した。１２日間の培養の後、３Ｄ接着性細胞は１５００００〜２５００００細胞／担体の密度、すなわち、１５０個の担体を含有するバイオリアクターにおいて２２．５〜３７．５×１０６個に達した。
【００４８】
【図３Ａ−Ｂ】図３Ａ〜Ｂは、従来の２Ｄ培養条件で培養された胎盤細胞における膜マーカー（明紫色）に対して比較されたときの、胎盤由来の３Ｄ接着性細胞における発現した膜マーカー（暗紫色）の発現レベルにおける差を示す棒グラフである。接着性細胞をフラスコ（２Ｄ）において４〜６週間成長させ、または、ポリスチレン担体（３Ｄ）でバイオリアクターシステムにおいて２〜３週間成長させた。細胞をフラスコまたは担体のいずれかから集めた後、細胞をインキュベートし、接着性細胞に特徴的な膜マーカー（図３Ａ）または造血細胞に特徴的な膜マーカー（図３Ｂ）を認識するモノクローナル抗体（ＭＡｂ）のパネルに結合させた。３Ｄ培養の接着性細胞において発現されるＭＳＣ膜マーカーと比較して、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ７３およびＣＤ２９の膜マーカーについて示されるように、２Ｄ培養の細胞におけるＭＳＣ膜マーカーが著しく高く発現することに留意すべきである。特に、２Ｄ培養の細胞における８７％に対して、ＣＤ１０５は３Ｄ培養の細胞において５６％の発現を示した（図３Ａ）。２Ｄおよび３Ｄ培養両者の接着性細胞は造血系の膜マーカーを何ら発現しなかった（図３Ｂ）。
【００４９】
【図４Ａ】図４Ａは、２Ｄおよび３Ｄ条件のもとで培養された、胎盤から作製される接着性細胞、または、そのような接着性細胞の馴化培地におけるタンパク質レベルの比較を示す棒グラフである。図４Ａは、２Ｄおよび３Ｄ培養接着性細胞の馴化培地においてＥＬＩＳＡによって分析されたときの、１×１０６細胞／ｍｌについて正規化されたＦｌｔ−３リガンドのレベルをｐｇ／ｍｌ単位で示す。結果は３回の独立した実験のうちの１つを表す。タンパク質サンプルを、２Ｄ条件下で成長させた接着性細胞（白色棒）、および、３Ｄ条件下で成長させた接着性細胞（灰色棒）から採取した。図は２つの反復実験の１つを表す。２Ｄおよび３Ｄ培養条件の細胞および馴化培地でのいくつかのタンパク質の発現レベルにおける差に留意すべきである。
【００５０】
【図４Ｂ】図４Ｂは、２Ｄおよび３Ｄ条件のもとで培養された、胎盤から作製される接着性細胞、または、そのような接着性細胞の馴化培地におけるタンパク質レベルの比較を示す棒グラフである。図４Ｂは、２Ｄおよび３Ｄ培養接着性細胞の馴化培地においてＥＬＩＳＡによって分析されたときの、１×１０６細胞／ｍｌについて正規化されたＩＬ−６のレベルをｐｇ／ｍｌ単位で示す。結果は３回の独立した実験のうちの１つを表す。タンパク質サンプルを、２Ｄ条件下で成長させた接着性細胞（白色棒）、および、３Ｄ条件下で成長させた接着性細胞（灰色棒）から採取した。図は２つの反復実験の１つを表す。２Ｄおよび３Ｄ培養条件の細胞および馴化培地でのいくつかのタンパク質の発現レベルにおける差に留意すべきである。
【００５１】
【図４Ｃ】図４Ｃは、２Ｄおよび３Ｄ条件のもとで培養された、胎盤から作製される接着性細胞、または、そのような接着性細胞の馴化培地におけるタンパク質レベルの比較を示す棒グラフである。図４Ｃは、２Ｄおよび３Ｄ培養接着性細胞の馴化培地においてＥＬＩＳＡによって分析されたときの、１×１０６細胞／ｍｌについて正規化されたＳＣＦのレベルをｐｇ／ｍｌ単位で示す。結果は３回の独立した実験のうちの１つを表す。タンパク質サンプルを、２Ｄ条件下で成長させた接着性細胞（白色棒）、および、３Ｄ条件下で成長させた接着性細胞（灰色棒）から採取した。図は２つの反復実験の１つを表す。２Ｄおよび３Ｄ培養条件の細胞および馴化培地でのいくつかのタンパク質の発現レベルにおける差に留意すべきである。
【００５２】
【図４Ｄ】図４Ｄは、２Ｄおよび３Ｄ条件のもとで培養された、胎盤から作製される接着性細胞、または、そのような接着性細胞の馴化培地におけるタンパク質レベルの比較を示す棒グラフである。図４Ｄは、両者間で比較される、ｉＴＲＡＱ試薬により標識されたタンパク質サンプルを用いた質量分析法によって分析されたときの、種々の細胞タンパク質の発現レベルを示す。タンパク質サンプルを、２Ｄ条件下で成長させた接着性細胞（白色棒）、および、３Ｄ条件下で成長させた接着性細胞（灰色棒）から採取した。図は２つの反復実験の１つを表す。２Ｄおよび３Ｄ培養条件の細胞および馴化培地でのいくつかのタンパク質の発現レベルにおける差に留意すべきである。
【００５３】
【図５Ａ−Ｄ】図５Ａ〜Ｄは、骨芽細胞への胎盤由来３Ｄ接着性細胞のインビトロ分化能を示す顕微鏡写真である。ヒトの胎盤由来接着性細胞を、骨形成誘導培地（１０％のＦＣＳ、１００ｎＭのデキサメタゾン、０．０５ｍＭのアスコルビン酸２−リン酸、１０ｍＭのＢ−グリセロリン酸を含有するＤＭＥＭ）で３週間の期間、培養した。図５Ａ〜Ｂは、アリザリンレッドＳ染色によって示されるように、石灰化したマトリックスを発現する細胞を示す。図５Ｃ〜Ｄは、骨形成誘導培地により処理されず、線維芽細胞様の表現型を維持したコントロール細胞を示し、石灰化を表していない。
【００５４】
【図６】図６は、移植後３．５週間で化学療法（連続した２週間にわたる２５ｍｇ／ｋｇのブスルファンの腹腔内注入）により処置されたＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスの骨髄（ＢＭ）において検出されるヒトＣＤ４５＋細胞の割合を示すグラフである。単核の臍帯血由来細胞から精製されたＣＤ３４＋細胞（１０００００個）だけを移植し（５匹のマウス、ａ）、または、２Ｄ条件で培養された０．５×１０６個の胎盤由来の接着性細胞（２Ｄ接着性細胞）と同時移植し（２匹のマウス、ｂ）、または、ｐｌｕｒｉＸ（商標）バイオリアクターにおいて３Ｄ条件で培養された胎盤由来の接着性細胞（３Ｄ接着性細胞）と同時移植した（５匹のマウス、ｃ）。その後、ＢＭをマウスの大腿骨および脛骨から回収した。ＢＭにおけるヒト細胞をフローサイトメトリーによって検出した。ＣＤ４５を発現するヒト細胞の割合を、細胞を抗ヒトＣＤ４５−ＦＩＴＣとインキュベートすることによって求めた。ＨＳＣだけにより処置されたマウス（ａ）におけるヒト細胞の割合と比較して、２Ｄ接着性細胞が同時移植されたマウス（ｂ）、同様にまた、３Ｄ接着性細胞が同時移植されたマウス（ｃ）の骨髄におけるヒト細胞（ｈＣＤ４５＋）の割合がより高いことに留意すべきである。３Ｄ接着性細胞培養細胞により処置されたマウスにおいて、２Ｄ接着性細胞培養細胞により処置されたマウスと比較してより大きい生着が認められ、このことは、３Ｄ培養の接着性細胞に特有なより大きい治療上の利点を示している。
【００５５】
【図７Ａ−Ｂ】図７Ａ〜Ｂは、脂肪組織由来の接着性細胞が同時移植された場合のＣＤ３４＋細胞（図７Ｂ）と比較した、ＣＤ３４＋細胞のみが移植されたマウス（図７Ａ）におけるヒト移植片のＣＤ４５＋細胞のＦＡＣＳ分析である。ヒトＣＤ３４＋だけにより処置されたマウス（７Ｂ、約１２％）と比較して、脂肪組織由来の接着性細胞が同時移植されたマウスにおけるヒト造血集団（ｈＣＤ４５＋）の割合が著しく高い（７Ａ、約２９％）ことに留意すべきである。
【００５６】
【図８Ａ】図８Ａは、ヒト臍帯血単核細胞（ＣＢ）と、等量の放射線照射（３０００Ｒａｄ）された臍帯血細胞（ｉＣＢ）、ヒト末梢血由来単球（ＰＢＭＣ）、２Ｄ培養（２Ｄ）もしくは３Ｄ培養（３Ｄ）の胎盤由来の接着性細胞、または、ＰＢＭＣ、および２Ｄおよび３Ｄ培養の胎盤由来の接着性細胞の混合物（ＰＢＭＣ＋２ＤおよびＰＢＭＣ＋３Ｄ）との間で行われた混合リンパ球反応を示すグラフである。ＣＢ細胞集団のサイズが、培養の最後の１８時間の期間中に測定された（ＣＰＭ単位で測定される）３Ｈ−チミジン取り込みによって表される。刺激されたＣＢ細胞増殖が上昇するので、免疫応答のレベルがより大きくなる。接着性細胞とインキュベートされた細胞によって示される免疫応答レベルがより低くなること、および、特に、接着性細胞と同時インキュベートされたときにＰＢＭＣに対するＣＢ免疫応答が低下することに留意すべきである。３回の反復がそれぞれの反応について行われた。
【００５７】
【図８Ｂ】図８Ｂは、Ｃｅｌｌｉｇｅｎ（商標）による胎盤由来の３Ｄ接着性細胞（ＰＬＸ−Ｃ細胞と称される）の作製を示す流れ図である。
【００５８】
【図８Ｃ】図８Ｃは、Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社のウエブサイトから改作された、Ｃｅｌｌｉｇｅｎ（商標）バイオリアクター槽およびポートの略図である。
【００５９】
【図９Ａ】図９Ａは、Ｃｅｌｌｉｇｅｎによって作製される３Ｄ接着性細胞（ＰＬＸ−Ｃと称される）の細胞周期分析を示す。細胞を７０％ＥｔＯＨにおいて一晩固定処理し、遠心分離し、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）溶液に再懸濁し、その後、ＦＡＣＳによって分析した。
【００６０】
【図９Ｂ】図９Ｂは、Ｐｌｕｒｉｘによって作製される３Ｄ接着性細胞（ＰＬＸと称される）の細胞周期分析を示す。細胞を７０％ＥｔＯＨにおいて一晩固定処理し、遠心分離し、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）溶液に再懸濁し、その後、ＦＡＣＳによって分析した。
【００６１】
【図１０Ａ−Ｃ】図１０Ａ−Ｃは、内皮に典型的なマーカーのＰＬＸ−Ｃ表面での発現ではなく、線維芽細胞に典型的なマーカーのＰＬＸ−Ｃ表面での発現を示す。図１０Ａは内皮マーカーＣＤ３１の陰性の発現を示し、図１０Ｂは内皮マーカーＫＤＲの陰性の発現を示し、図１０Ｃはヒト線維芽細胞マーカー（Ｄ７−ＦＩＢ）の陽性の発現を示す。イソ型ＩｇＧ１（ＦＩＴＣ）についての赤色ヒストグラムは陰性コントロールを表し、一方、青色ヒストグラムは、陽性に染色された細胞を表すことに留意すること。
【００６２】
【図１１Ａ−Ｄ】図１１Ａ−Ｄは、ＰＬＸ−Ｃ細胞表面における刺激分子および共刺激分子の発現を示す。図１１ＡはＣＤ８０のＰＬＸ−Ｃ発現を示し、図１１ＢはＣＤ８６のＰＬＸ−Ｃ発現を示し、図１１ＣはＣＤ４０のＰＬＸ−Ｃ発現を示し、図１１ＤはＨＬＡ−Ａ／Ｂ／ＣのＰＬＸ−Ｃ発現を示す。陰性コントロールが、関連したイソ型蛍光分子により調製された。赤色ヒストグラムは細胞のＰＬＸ−Ｃマーカー発現集団を示し、青色ヒストグラムは細胞の骨髄（ＢＭ）マーカー発現集団を示し、緑色ヒストグラムは細胞の単核細胞（ＭＮＣ）マーカー発現集団を示すことに留意すること。
【００６３】
【図１２Ａ−Ｂ】図１２Ａは、ＰＬＸ−Ｃによるリンパ球増殖の阻害を示す。図１２Ａは、２×１０５個の末梢血（ＰＢ）由来ＭＮＣ（ドナーＡ）が等量の放射線照射（３０００Ｒａｄ）されたＰＢ由来ＭＮＣ（ドナーＢ）により刺激され、その後、増大する量のＰＬＸ−Ｃ細胞が培養物に加えられたことにより行われたＭＬＲ試験を示す。各群の３つの反復反応物が９６ウエルプレートに播種された。増殖速度が［３Ｈ］チミジン取り込みによって測定された。図１２Ｂは、ＣｏｎＡ（１．５ｍｇ／ｍｌ）により刺激された末梢血（ＰＢ）由来ＭＮＣを示す。増大する量のＰＬＸ−Ｃ細胞が培養物に加えられた。各群の３つの反復反応物が９６ウエルプレートに播種された。増殖速度が［３Ｈ］チミジン取り込みによって測定された。
【００６４】
【図１３Ａ−Ｂ】図１３Ａ−Ｂは、末梢血細胞との共培養の後での前炎症性サイトカイン分泌および抗炎症性サイトカイン分泌のＰＬＸ−Ｃ調節を示す。図１３Ａ〜図１３Ｂは、ＣｏｎＡにより刺激される（末梢血から単離された）ヒト由来ＭＮＣをＰＬＸ−Ｃと共培養した後でのＩＦＮγの分泌（図１３Ａ）およびＴＮＦαの分泌（図１３Ｂ）を示す。
【００６５】
【図１３Ｃ】図１３Ｃは、末梢血細胞との共培養の後での前炎症性サイトカイン分泌および抗炎症性サイトカイン分泌のＰＬＸ−Ｃ調節を示す。図１３Ｃは、ＬＰＳにより刺激される（末梢血から単離された）ヒト由来ＭＮＣをＰＬＸ−Ｃと共培養した後でのＩＦＮγ、ＴＮＦαおよびＩＬ−１０の分泌を示す。上清が集められ、ＥＬＩＳＡを使用するサイトカイン分析に供された。
【００６６】
【図１４】図１４は、ＰＬＸ−Ｃ細胞に感染させるために使用されたルシフェラーゼ発現ベクターを示す。ＯｍｉｃｓＬｉｎｋから得られる発現ベクターＬｖ３３をこの場合には使用した。ルシフェラーゼ遺伝子がＯＲＦ内にクローン化された。
【００６７】
【図１５】図１５は、感染ＰＬＸ−Ｃ細胞による高いルシフェラーゼ発現を示す。細胞にルシフェラーゼ発現ベクターを感染させ、細胞を感染後４８時間でＩＶＩＳシステムによって可視化した。様々な細胞が高いレベルのルシフェラーゼ発現を示したことに留意すること。
【００６８】
【図１６Ａ−Ｂ】図１６Ａ−Ｂは、ＳＣＩＤ／Ｂｅｉｇｅマウスへの２×１０６個のルシフェラーゼ発現ＰＬＸ−Ｃ細胞の注射を示す。１匹のマウスがＩＭ注射され、１匹のマウスがＩＶ注射された。注射を受けたマウスを、ＰＬＸ−Ｃのインビボ生体分布を評価するためにＩＶＩＳシステムを使用してモニターした。１日目のＩＶＩＳ結果（図１６Ａ）および４日目のＩＶＩＳ結果（図１６Ｂ）が示される。
【００６９】
【図１６Ｃ−Ｄ】図１６Ｃ−Ｄは、ＳＣＩＤ／Ｂｅｉｇｅマウスへの２×１０６個のルシフェラーゼ発現ＰＬＸ−Ｃ細胞の注射を示す。１匹のマウスがＩＭ注射され、１匹のマウスがＩＶ注射された。注射を受けたマウスを、ＰＬＸ−Ｃのインビボ生体分布を評価するためにＩＶＩＳシステムを使用してモニターした。６日目のＩＶＩＳ結果（図１６Ｃ）および２２日目のＩＶＩＳ結果（図１６Ｄ）が示される。
【００７０】
【図１７】図１７は、本発明の接着性細胞（ＰＬＸ−Ｃと称される）により処置されたマウスの腰および足における増大した灌流を示すグラフである。図はマウスの腰および足における灌流パーセントのメジアンを示す。腰および足での血流を、手術後０日目、６日目、９日目、１４日目および２１日目に両側から非接触レーザードップラーを使用して測定した（示されるのは、２１日目における測定結果である）。結果が、実験期間中の正常な肢における血流に対する虚血肢における血流の比率として表される。
【００７１】
【図１８】図１８は、肢機能および虚血性損傷のインビボ評価を示すグラフである。虚血肢の損なわれた使用の半定量的評価を、下記のスコアシステムを使用して連続的に行った：３＝足の引きずり、２＝引きずりがないが、足底屈もない、１＝足底屈、および、０＝足指を曲げて、尾の穏やかな牽引に抵抗する。
【００７２】
【図１９Ａ−Ｃ】図１９Ａ−Ｃは、ＰＬＸ−Ｃ処置の後での増大した毛細管密度を示す。図１９Ａは、ＰＢＳにより処置されたマウスにおける毛細管密度を示し、図１９Ｂは、ＰＬＸ−Ｃ細胞により処置されたマウスにおける毛細管密度を示し、図１９Ｃは、筋肉細胞あたりの毛細管の数を示す棒グラフである。増大した毛細管密度が、特異的な毛細管染色によって明らかにされるように、誘導された肢虚血の後、コントロールマウスにおいてではなく、ＰＬＸ−Ｃ処置マウスにおいて認められたことに留意すること。
【００７３】
【図２０Ａ−Ｂ】２０Ａ−Ｂは、ＰＬＸ−Ｃ投与の後での低下した酸化ストレスおよび内皮炎症を示す。図２０Ａは、酸化ストレスを示す棒グラフであり（ニトロチロシン染色）、図２０Ｂは、内皮炎症を示す棒グラフである（ＶＣＡＭ評価）。低下した酸化ストレスおよび内皮炎症が、ＰＬＸ−Ｃにより処置されたマウスにおいて認められることに留意すること。
【発明を実施するための形態】
【００７４】
本発明は、いくつかの実施形態において、組織における血管形成を、胎盤組織または脂肪組織の接着性細胞を使用して増大させる方法、ならびに、虚血、あるいは、結合組織の再生および／または修復を必要とする医学的状態を、胎盤組織または脂肪組織の接着性細胞を使用して処置する方法に関する。
【００７５】
本発明の原理および作用が、図面および付随する説明を参照してより十分に理解されることができる。
【００７６】
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳しく説明する前に、本発明は、その適用において、下記の説明において示される細部、または、実施例によって例示される細部に限定されないことを理解しなければならない。本発明は他の実施形態が可能であり、または、様々な方法で実施または実行される。また、本明細書中で用いられる表現法および用語法は記述のためであって、限定であると見なしてはならないことを理解しなければならない。
【００７７】
本発明を実施に移しているとき、本発明者らは、胎盤組織または脂肪組織から得られる接着性細胞が、組織における血管形成を増大させることにおいて、また、虚血、ならびに、結合組織の再生および／または修復を必要とする医学的状態を処置することにおいて非常に効率的であることを発見している。
【００７８】
本明細書中下記において、また、下記の実施例の節の実施例１〜実施例８において例示されるように、本発明者らは、間質幹細胞の性質を含む脂肪由来接着性細胞および胎盤由来接着性細胞を拡大することができた。それに従って拡大された細胞は、接着アッセイおよび再集団化アッセイによって立証されるように、凍結保存後、生存可能であることが見出された（実施例１を参照のこと）。胎盤由来接着性細胞のフローサイトメトリー分析では、全く異なったマーカー発現プロフィルが明らかにされた（図３Ａ〜図３Ｂを参照のこと）。下記の実施例の節の実施例６においてさらに示されるように、胎盤由来接着性細胞の移植は、動脈結紮を受けたマウス（虚血後肢モデル）の腰および足における血流を著しく誘導し（図１７）、肢の機能を著しく改善し（図１８）、毛細管密度を増大させ（図１９Ａ〜図１９Ｃ）、また、酸化ストレスおよび内皮炎症を低下させた（図２０Ａ〜図２０Ｂ）。
【００７９】
したがって、本発明の１つの局面によれば、組織における血管形成を増大させる方法が提供される。この方法は、組織を、胎盤組織および脂肪組織からなる群から選択される組織の接着性細胞と接触させ、それにより、組織における血管形成を増大させることによって行われる。
【００８０】
本明細書中で使用される表現「組織における血管形成を増大させる」は、新しい毛細血管を組織において生成するプロセスを増大させること（誘導すること、アップレギュレーションすること）を示す。
【００８１】
本明細書中で使用される表現「接着性細胞」は、足場依存的で、すなわち、インビトロで成長するために表面への付着を必要とする細胞の均一集団または不均一集団を示す。
【００８２】
本明細書中で使用される表現「脂肪組織」は、脂肪細胞（ｆａｔ  ｃｅｌｌ、ａｄｉｐｏｃｙｔｅ）を含む結合組織を示す。
【００８３】
本明細書中で使用される用語「胎盤組織」は、子宮壁の内側を覆い、妊娠期間中は胎児を包む、胎児が臍帯によって結び付けられる哺乳動物の雌性器官の任意の部分を示す。出産後、胎盤は排出される（これは分娩後胎盤と呼ばれる）。例示的な実施形態では、胎盤は胎盤全体を示す。
【００８４】
胎盤組織または脂肪組織に由来する接着性細胞を、二次元または三次元の培養条件を使用して増殖させることができる。
【００８５】
接着性細胞を２Ｄ培養において増殖させるための条件が、本明細書中下記において、また、下記の実施例の節においてさらに記載される。
【００８６】
本明細書中で使用される表現「三次元培養」は、細胞成長との適合性を有し、同時に、細胞が２層以上の層で成長することを可能にする条件に細胞が配置される培養を示す。生きている生物（または組織）における細胞のインシトゥー環境が三次元構造にあることが十分に理解される。細胞が他の細胞によって取り囲まれる。細胞が、様々な局所的微小環境の確立を可能にする細胞外マトリックスのナノスケール繊維の複雑なネットワークで保持される。それらの細胞外リガンドが、基底膜への結合だけでなく、様々な血管およびリンパ管への接近もまた媒介する。酸素、ホルモンおよび栄養分が細胞に運ばれ、老廃物が運び去られる。本発明の三次元培養における条件は、下記においてさらに例示されるように、そのような環境を模倣するために設計される。
【００８７】
三次元培養の条件は、接着性細胞の拡大を可能にするような条件であることが理解される。
【００８８】
本明細書中で使用される用語「拡大する」および用語「拡大」は、細胞および最終的には細胞成長の、実質的に分化がない維持、すなわち、細胞集団の増大（例えば、少なくとも２倍）で、そのような増大に随伴する分化がないことを示す。
【００８９】
本明細書中で使用される用語「維持する」および用語「維持」は、実質的に分化がない細胞更新、すなわち、実質的に定常的な細胞集団で、そのような定常性に随伴する分化がないことを示す。
【００９０】
述べられたように、本発明のこの局面の接着性細胞は脂肪組織または胎盤組織から取り出される。
【００９１】
胎盤の細胞を満期または早産の胎盤から得ることができる。胎盤は、好ましくは、胎盤が完全に放血されると集められる。胎盤は、好ましくは、残存する細胞を除くために十分な期間にわたって灌流される。本明細書中で使用される用語「灌流する」または用語「灌流」は、流体を器官または組織に浴びせるか、または通すという行為を示す。胎盤組織は任意の哺乳動物に由来し得る。例えば、胎盤組織はヒト由来である。胎盤組織の好ましい供給源は分娩後の胎盤（例えば、１〜６時間）に由来する。しかしながら、胎盤組織もしくは胎盤細胞の供給源、または、胎盤組織を単離する方法は本発明にとって重要でない。
【００９２】
胎盤由来の接着性細胞を胎盤の胎児部分（すなわち、羊膜または胎盤の内側部分、実施例１参照）および母体部分（すなわち、基底脱落膜および壁側脱落膜）の両方から得ることができる。組織試料は生理学的緩衝液［例えば、リン酸塩緩衝化生理的食塩水（ＰＢＳ）またはハンクス緩衝液］で洗浄される。単細胞懸濁物が、組織を消化酵素により処理すること（下記参照）、または／および、組織部分を細かく刻み、ナイロンフィルターに通すことによって、あるいは、洗浄媒体とともに穏やかなピペッティングすること（Ｆａｌｃｏｎ、Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）によって作製される。
【００９３】
脂肪組織由来の接着性細胞を、当業者に知られている様々な方法によって単離することができる。例えば、そのような方法が米国特許第６１５３４３２号に記載されている。脂肪組織は、大網／内臓部位、乳房部位、性腺部位または他の脂肪組織部位に由来し得る。脂肪組織の一つの供給源は大網脂肪である。ヒトでは、脂肪は典型的には脂肪吸引によって単離される。
【００９４】
脂肪組織からの単離された接着性細胞は、組織を消化酵素（例えば、コラゲナーゼ、トリプシンおよび／またはジスパーゼなど）、および／または、効果的な濃度のヒアルロニダーゼもしくはＤＮＡｓｅ、および、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）により、２５℃〜５０℃の間での温度で１０分〜３時間にわたって処理することによって取り出すことができる。その後、細胞は２０ミクロン〜１ｍｍの間のナイロンまたはチーズクロスのメッシュフィルターに通すことができる。その後、細胞は直接に媒体での分画遠心法に供されるか、あるいは、ＦｉｃｏｌｌまたはＰｅｒｃｏｌｌまたは他の微粒子の勾配による分画遠心法に供される。細胞は１００〜３０００ｘｇの間での速度において１分〜１時間にわたって４〜５０℃の間の温度で遠心分離される（米国特許第７０７８２３０号参照）。
【００９５】
胎盤組織または脂肪組織に由来する接着性細胞に加えて、本発明ではまた、（本明細書中下記においてさらに記載されるように）間質幹細胞表現型によって特徴づけられる他の細胞供給源からの接着性細胞の使用が想定される。接着性細胞を回収することができる組織供給源には、臍帯血、毛嚢［例えば、米国特許出願第２００６０１７２３０４号に記載されるように］、精巣［例えば、Ｇｕａｎ  Ｋ．ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、２００６（４月２７日）、４４０（７０８８）：１１９９〜２０３に記載されるように］、ヒト嗅粘膜［例えば、Ｍａｒｓｈａｌｌ，ＣＴ．ｅｔ  ａｌ．、Ｈｉｓｔｏｌ  Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌ、２００６（Ｊｕｎ）、２１（６）：６３３〜４３に記載されるように］、胚性卵黄嚢［例えば、Ｇｅｉｊｓｅｎ  Ｎ、Ｎａｔｕｒｅ、２００４（１月８日）、４２７（６９７０）：１４８〜５４に記載されるように］および羊水［Ｐｉｅｔｅｒｎｅｌｌａｅｔ  ａｌ．（２００４）、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ、２２：１３３８〜１３４５］が含まれるが、これらに限定されない。これらはすべて、間葉系幹細胞を含むことが知られている。これらの組織供給源からの接着性細胞は、細胞を接着性の表面で培養する。従って、接着性細胞を最初の集団における他の細胞から単離することによって単離することができる。
【００９６】
起源（例えば、胎盤組織または脂肪組織）にかかわらず、細胞の回収は、好ましくは、無菌条件下で行われる。単離された細胞が得られると、単離された細胞は、接着性細胞をそれにより単離するために接着性材料（例えば、表面として構成される接着性材料）に接着させることができる。培養は、実施例の節の実施例４に記載のように２Ｄ条件下で行われることができ、細胞は、３Ｄ条件にさらに移されることができる。
【００９７】
本明細書中で使用される「接着性材料」は、細胞を表面に保持することができる化学的構造（例えば、荷電を帯びた表面露出基）を有する細胞非毒性（すなわち、生物学的に適合した）材料の合成物、天然物、または、それらの組合せを示す。
【００９８】
本発明のこの態様に従って使用することができる接着性材料の例には、ポリエステル、ポリプロピレン、ポリアルキレン、ポリフルオロクロロエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ポリスルホン、酢酸セルロース、ガラス繊維、セラミック粒子、マトリゲル、細胞外マトリックス成分（例えば、フィブロネクチン、コンドロネクチン、ラミニン）、コラーゲン、ポリＬ乳酸および不活性金属繊維が含まれるが、これらに限定されない。
【００９９】
間質幹細胞についての精製または富化のさらなる工程を、この分野では広く知られている方法を使用して、（例えば、本明細書中下記にさらに記載するように、間質幹細胞マーカーの発現を使用するＦＡＣＳなどによって）行うことができる。
【０１００】
本発明に従って培養することにおいて有用な基礎培地の限定されない例には、培地１９９、ＣＭＲＬ１４１５、ＣＭＲＬ１９６９、ＣＭＲＬ１０６６、ＮＣＴＣ１３５、ＭＢ７５２６１、ＭＡＢ８７１３、ＤＭ１４５、ウイリアムズＧ、ノイマン＆タイテル、ヒグチ、ＭＣＤＢ３０１、ＭＣＤＢ２０２、ＭＣＤＢ５０１、ＭＣＤＢ４０１、ＭＣＤＢ４１１、ＭＣＤＢ１５３をはじめとして、数多くの中で、最少必須培地イーグル、ＡＤＣ−１、ＬＰＭ（ウシ血清アルブミン非含有）、Ｆ１０（ＨＡＭ）、Ｆ１２（ＨＡＭ）、ＤＣＣＭ１、ＤＣＣＭ２、ＲＰＭＩ１６４０、ＢＧＪ培地（フィトン・ジャクソン改変を含む培地および含まない培地）、基礎培地イーグル（ＢＭＥ、アール塩基礎の添加を伴う培地）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ−血清非含有）、ヤマネ、ＩＭＥＭ−２０、グラスゴー改変イーグル培地（ＧＭＥＭ）、ライボビッツＬ−１５培地、マッコイ５Ａ培地、培地Ｍ１９９（Ｍ１９９Ｅ、アール塩基礎を伴う）、培地Ｍ１９９（Ｍ１９９Ｈ、ハンクス塩基礎を伴う）、最少必須培地イーグル（ＭＥＭ−Ｅ、アール塩基礎を伴う）、最少必須培地イーグル（ＭＥＭ−Ｈ、ハンクス塩基礎を伴う）、および、最少必須培地イーグル（ＭＥＭ−ＮＡＡ、非必須アミノ酸を伴う）が含まれる。本発明において使用される好適な培地はＤＭＥＭである。これらの培地および他の有用な培地を、とりわけ、ＧＩＢＣＯ（Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、Ｎ．Ｙ．、米国）およびＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ（Ｂｅｔ  ＨａＥｍｅｋ、イスラエル）から入手することができる。これらの培地のいくつかが、Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｂ．ＪａｋｏｂｙおよびＩｒａ  Ｈ．Ｐａｓｔａｎによって編集され、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．によって発行されるＭｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（第ＬＶＩＩＩ巻、“Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ“、６２頁〜７２頁）に要約される。
【０１０１】
培地には、例えば、血清（例えば、ウシまたは他の種の胎児血清など）、ならびに、場合により、または、代替として、ピコグラム／ｍｌ〜ミリグラム／ｍｌの間の濃度での増殖因子、ビタミン（例えば、アスコルビン酸）、サイトカイン、塩（例えば、Ｂ−グリセロリン酸）、ステロイド（例えば、デキサメタソン）、およびホルモン（例えば、成長ホルモン、エリスロポイエチン、トロンボポイエチン、インターロイキン３、インターロイキン６、インターロイキン７、マクロファージコロニー刺激因子、ｃ−ｋｉｔリガンド／幹細胞因子、オステオプロテゲリンリガンド、インスリン、インスリン様増殖因子、上皮増殖因子、線維芽細胞増殖因子、神経成長因子、毛様体神経栄養因子、血小板由来増殖因子および骨形態形成タンパク質）などを補充することができる。
【０１０２】
さらなる成分が培養培地に加えられ得ることがさらに認識される。そのような成分は、抗生物質、抗真菌剤、アルブミン、アミノ酸、および、細胞の培養のためにこの分野で知られている他の成分であり得る。加えて、様々な成分を、必要とされるときには分化プロセスを強化するために加えることができる（さらには下記参照）。
【０１０３】
本発明の接着性細胞がヒト対象に投与される場合に備えて、細胞および培養培地（例えば、上記で記載される培地添加物を伴う培養培地）は実質的に異物非含有でなければならず、すなわち、何らかの動物由来混入物（例えば、マイコプラズマ）を有してはならないことが理解される。例えば、培養培地には、血清代替物、ヒト血清、および／または、合成もしくは組換え産生された因子を補充することができる。
【０１０４】
述べられたように、接着性細胞が得られると、接着性細胞は二次元環境または三次元環境に継代することができる（下記の実施例の節の実施例１および実施例４を参照のこと）。だが、細胞は、（本明細書中上記で述べられたように）、単離直後に３Ｄ形態のマトリックスに移され得るか、または、代替として、二次元条件の後で三次元環境に継代され得ることが理解される。
【０１０５】
したがって、本発明のこの局面の接着性材料は３Ｄ培養のために構成され、それにより、組織（例えば、胎盤）の構造基盤を模倣するように細胞の接着のための利用可能な付着表面を実質的に増大させる生育マトリックスを提供する。
【０１０６】
高規模産生のために、培養を３Ｄバイオリアクターで行うことができる。
【０１０７】
そのようなバイオリアクターの例には、プラグフローバイオリアクター、連続撹拌型タンクバイオリアクター、定常床バイオリアクター、ＣｅｌｌｉＧｅｎ  Ｐｌｕｓ（登録商標）バイオリアクターシステム（Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ＮＢＳ））またはＢＩＯＦＬＯ３１０バイオリアクターシステム（Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ＮＢＳ））が含まれるが、これらに限定されない。
【０１０８】
実施例の節の実施例４において示されるように、Ｃｅｌｌｉｇｅｎバイオリアクターでは、接着性細胞を、制御された条件（例えば、ｐＨ、温度および酸素レベル）のもと、一定の細胞成長培地灌流により３Ｄ拡大することができる。さらに、細胞培養は、グルコース、乳酸、グルタミン、グルタミン酸およびアンモニウムの濃度レベルについて直接的にモニターすることができる。接着性細胞のグルコース消費速度および乳酸形成速度は、細胞成長速度を測定すること、および、回収時期を決定することを可能にする。
【０１０９】
本発明とともに使用され得る他の３Ｄバイオリアクターには、下記のバイオリアクターが含まれるが、これらに限定されない：時定数定常状態をリアクター内で維持するために、培養培地がバイオリアクターに連続的に供給され、生成物が連続的に抜き取られる連続撹拌槽型バイオリアクター。繊維状床バスケットを有する撹拌槽型バイオリアクターを、例えば、Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏ．（Ｅｄｉｓｏｎ、ＮＪ）から入手することができる。定常床バイオリアクター、エアーリフトバイオリアクター（このバイオリアクターでは、空気が、典型的には、中央通気管の底部に供給され、気泡を形成しながら上に流れ、排気ガスをカラムの上部から放出する）、ポリアクティブ発泡体を有する細胞播種灌流バイオリアクター［Ｗｅｎｄｔ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ、８４：２０５〜２１４（２００３）に記載されるようなバイオリアクター］、ラジアルフロー灌流バイオリアクターにおける管状のポリＬ−乳酸（ＰＬＬＡ）の多孔性足場［Ｋｉｔａｇａｗａｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、９３（５）：９４７〜９５４（２００６）に記載されるようなバイオリアクター］。本発明に従って使用することができる他のバイオリアクターが、米国特許第６２７７１５１号、同第６１９７５７５号、同第６１３９５７８号、同第６１３２４６３号、同第５９０２７４１号および同第５６２９１８６号に記載される。
【０１１０】
細胞の播種が好ましくは、播種時において１０００００細胞／ｍｍ〜１５０００００細胞／ｍｍで行われる。合計で１５０±３０×１０６個の細胞が播種される１つの例示的な実施形態において、３〜５×１０６細胞／ｇ担体が播種されるか、または、０．０１５〜０．１×１０６細胞／ｍｌが播種される。
【０１１１】
細胞は、制御されない分化および老化を避けながら、細胞の少なくとも約１０％が増殖中であるときに回収することができる。
【０１１２】
培養することが、少なくとも２日間、３日間、４日間、５日間、１０日間、２０日間、１ヶ月間程度、または、一層より長い期間にわたって行われる。バイオリアクターにおける培養はこの期間を延ばすことができることが理解される。３Ｄ培養における接着性細胞の培養は培養培地の連続流通のもとで行うことができる。継代培養もまた、細胞数を増大させるために行うことができる。培養培地が、培養条件を延ばし、また、培養条件を改善するために取り替えられ得ることが理解される。
【０１１３】
本発明のいくつかの実施形態の接着性細胞は、（Ｓ期およびＧ２／Ｍ期をＦＡＣＳモニタリングすることによってアッセイされ得るように）少なくとも約１０％、２８％、３０％、５０％、８０％またはそれ以上の増殖性細胞を含む。
【０１１４】
本発明のいくつかの実施形態の接着性細胞は、好ましくは、少なくとも１つの「間質幹細胞表現型」を含むことができる。
【０１１５】
本明細書中で使用される「間質幹細胞表現型」は、骨髄由来の間質幹細胞（すなわち、間葉系幹細胞）に典型的な構造的表現型または機能的表現型を示す。
【０１１６】
本明細書中で使用される表現「幹細胞」は、最終分化していない細胞を示す。
【０１１７】
従って、例えば、細胞は紡錘体形状を有することができる。代替として、または、加えて、細胞は、間質幹細胞に典型的な１つのマーカーまたは一連のマーカー（例えば、表面マーカー）を発現することができる。間質幹細胞表面マーカー（陽性および陰性）の例には、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２９＋、ＣＤ４４＋、ＣＤ７３＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ３−、ＣＤ４−、ＣＤ３４−、ＣＤ４５−、ＣＤ８０−、ＣＤ１９−、ＣＤ５−、ＣＤ２０−、ＣＤ１１Ｂ−、ＣＤ１４−、ＣＤ１９−、ＣＤ７９−、ＨＬＡ−ＤＲ−およびＦＭＣ７−が含まれるが、これらに限定されない。他の間質幹細胞マーカーには、チロシンヒドロキシナーゼ、ネスチンおよびＨ−ＮＦが含まれるが、これらに限定されない。
【０１１８】
本発明の教示に従って作製される胎盤組織の接着性細胞は、本質的には下記の実施例の節の実施例４において記載されるような遺伝子発現プロフィルを有する。
【０１１９】
間質幹細胞に典型的な機能的表現型の例には、Ｔ細胞抑制活性（これはＴ細胞を刺激せず、逆に、Ｔ細胞を抑制する）、造血幹細胞支持活性、ならびに、脂肪生成性分化、肝性分化、骨形成性分化および神経性分化が含まれるが、これらに限定されない。
【０１２０】
これらの構造的特徴または機能的特徴はどれも、本発明の細胞を適格とするために使用することができる（下記の実施例の節の実施例１〜２参照）。
【０１２１】
本発明の教示に従って作製された細胞の集団は、実施例の節の実施例１において示されるような特異なタンパク質発現プロフィルを特徴とする。従って、例えば、発明の教示に従って作製された胎盤組織または脂肪組織の接着性細胞は、高いレベルの選択された因子を発現および／または分泌することができる。例えば、そのような細胞は、ＳＣＦ、Ｆｌｔ−３、Ｈ２Ａヒストンファミリー（Ｈ２ＡＦ）またはアルデヒドデヒドロゲナーゼＸ（ＡＬＤＨ  Ｘ）を、２Ｄ培養で成長させられた胎盤組織または脂肪組織の接着性細胞によって発現または分泌されるレベルよりも少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、または、好ましくは１２倍大きく発現または分泌する。加えて、または、代替として、本発明の細胞の集団は、ＩＬ−６、真核細胞翻訳伸長因子（ＥＥＥＦ２）、レチクロカルビン３、ＥＦ−ハンドカルシウム結合ドメイン（ＲＣＮ２）またはカルポニン１塩基性平滑筋（ＣＮＮ１）を、２Ｄ培養で成長させた胎盤組織または脂肪組織の接着性細胞によって発現または分泌されるレベルよりも少なくとも２倍、３倍または５倍大きいレベルで分泌または発現する。加えて、または、代替として、本発明の細胞の集団は、２Ｄ培養の細胞に対して比較されたとき、様々な他のタンパク質発現レベルがより低いことを特徴とする。従って、例えば、２Ｄ培養で成長させられた胎盤組織または脂肪組織の接着性細胞によって発現または分泌されるヘテロ核リボヌクレオタンパク質Ｈ１（Ｈｎｒｐｈ１）、ＣＤ４４抗原イソ型２前駆体、３−ホスホアデノシン５−ホスホスルフェートシンターゼ２イソ型ａ（Ｐａｐｓｓ２）またはリボソームタンパク質Ｌ７ａ（ｒｐＬ７ａ）の発現レベルの０．６、０．５、０．２５または０．１２５未満を分泌または発現する。
【０１２２】
下記の実施例の節の実施例３〜実施例４において示されるように、接着性細胞、具体的には、３Ｄ接着性細胞は、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイにおいてヒト臍帯血単核細胞の免疫反応を抑制すること、したがって、臨床において優先的に使用され得る生物学的活性（例えば、Ｔ細胞抑制活性、造血幹細胞支持活性）を示すことが見出された。
【０１２３】
本発明の１つの実施形態によれば、本発明の接着性細胞は、免疫反応を対象において抑制することができる。
【０１２４】
本明細書中で使用される表現「免疫反応を対象において抑制する」は、抗原（例えば、外来細胞またはその一部）に応答して対象において生じる免疫反応を低下させるか、または阻害することを示す。接着性細胞によって抑制され得る免疫応答には、体液性免疫応答および細胞性免疫応答が含まれ、これらは、抗体およびＴリンパ球（Ｔ細胞の増殖）による病原体抗原の特異的な認識をそれぞれ伴う。
【０１２５】
本発明の１つの実施形態によれば、本発明の接着性細胞は、二次元（２Ｄ）培養で成長させられた胎盤組織または脂肪組織の接着性細胞の免疫抑制活性よりも大きい免疫抑制活性によって特徴づけられる。
【０１２６】
本発明の１つの実施形態によれば、そのような免疫抑制活性は、Ｔ細胞増殖における低下を含む。
【０１２７】
本明細書中上記で述べられたように、また、下記の実施例の節の実施例６において記載されるように、本発明の接着性細胞はインビボでの血管形成（例えば、腰および足における血流）を誘導し、動脈結紮を受けた動物の肢機能を著しく改善し、毛細管密度を増大させ、また、酸化ストレスおよび内皮炎症を低下させた。さらに、下記の実施例の節の実施例７において詳しく記載されるように、本発明の接着性細胞は、脳卒中からの回復をラットモデルにおいて著しく改善した。
【０１２８】
したがって、本発明の別の局面によれば、虚血をその必要性のある対象において処置する方法が提供される。この方法は、本発明の接着性細胞の治療効果的な量を対象に投与し、それにより、虚血を対象において処置することによって行われる。
【０１２９】
用語「虚血」は、本明細書中で使用される場合、不十分な血管形成によって特徴づけられるか、または、不十分な血管形成に関連する何らかの病理（疾患、状態、症候群または障害）を示す。例には、末梢動脈疾患（ＰＡＤ）（例えば、肢虚血および重症虚血肢（ＣＬＩ）など）、虚血性心臓疾患、虚血性脳疾患（例えば、脳卒中）、遅れた創傷治癒、遅れた潰瘍治癒、生殖関連障害、動脈硬化、虚血性血管疾患、虚血性心臓疾患、心筋梗塞、冠状動脈疾患（ＣＡＤ）、アテローム動脈硬化性心臓血管疾患、左主冠状動脈疾患、動脈閉塞性疾患、末梢虚血、末梢血管疾患、腎臓の血管疾患、末梢動脈疾患、肢虚血、下肢虚血、脳虚血、脳血管疾患、網膜症、腎修復、再構築障害、フォンヒッペル・リンダウ症候群、遺伝性出血性毛細管拡張症、虚血性血管疾患、バーガー病、虚血性腎臓疾患および虚血性胎盤が含まれるが、これらに限定されない。
【０１３０】
本明細書中で使用される用語「処置する」は、病理（例えば、虚血）の発達を阻害するか、もしくは停止させること、および／または、病理の軽減、寛解もしくは退行を生じさせることを示す。当業者は、様々な方法論およびアッセイが、病理の発達を評価するために使用され得ること、また、同様に、様々な方法論およびアッセイが、病理の軽減、寛解もしくは退行を評価するために使用されるかもしれないことを理解する。用語「処置する」はまた、病理に関連する症状を緩和または軽減することを示す場合がある。
【０１３１】
本明細書中で使用される表現「その必要性のある対象」は、任意の対象（例えば、哺乳動物）を示し、例えば、病理と診断されるか、または病理に苦しむヒト対象などを示す。
【０１３２】
本明細書中上記で述べられたように、また、下記の実施例の節の実施例８において記載されるように、本発明者らは、本発明の接着性細胞が結合組織の再生および／または修復を可能にすることを見出している。
【０１３３】
したがって、本発明のさらにさらなる局面によれば、結合組織の再生および／または修復を必要とする医学的状態をその必要性のある対象において処置する方法が提供される。この方法は、本発明の接着性細胞の治療効果的な量を対象に投与することによって行われる。
【０１３４】
表現「結合組織」は、コラーゲンの線維、弾性繊維（例えば、筋肉および血管の間およびそれらの回りの弾性繊維）および単純な細胞を含む支持用骨格組織を示す。結合組織の例には、密性結合組織（例えば、靱帯、腱、歯周靱帯）、輪紋状結合組織（例えば、タンパク質性繊維（例えば、コラーゲンおよびエラスチンなど）を伴う輪紋状結合組織）、網様結合組織、脂肪組織、血液、骨、軟骨、皮膚、椎間板、歯髄、象牙質、歯肉、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）形成細胞、疎性結合組織および平滑筋細胞が含まれるが、これらに限定されない。
【０１３５】
本明細書中で使用される表現「結合組織の再生および／または修復を必要とする医学的状態」は、結合組織の損傷（すなわち、機能しない組織、ガン性または前ガン性の組織、破壊された組織、破砕された組織、線維症性組織または虚血性組織）または喪失（例えば、外傷、感染性疾患および遺伝的疾患の後での喪失）によって特徴づけられる何らかの病理を示す。そのような病理の限定されない例には、骨折、骨ガン（例えば、骨肉腫、骨ガン転移）、熱傷、関節軟骨欠損および深部創傷が含まれる。
【０１３６】
表現「対象に投与する」は、本発明の細胞を標的組織に導入することを示す。細胞はレシピエントに由来し得るか、あるいは、同種ドナーまたは異種ドナーに由来し得る。この表現はまた、対象への本発明の細胞の「移植（ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）」、「細胞置換」または「移植（ｇｒａｆｔｉｎｇ）」を包含する。
【０１３７】
対象は、ヒトまたは飼育されている様々な動物（これらには、ウマ（すなわち、ウマ科動物）、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ネコ、ラクダ、アルパカ、ラマおよびヤクが含まれるが、これらに限定されない）を含めて、結合組織の再生および／または修復の必要性のある任意の哺乳動物であり得る。
【０１３８】
本発明の教示の１つの実施形態によれば、本発明の接着性細胞は、（上記で言及されたように）、軟骨下骨嚢胞、骨折、骨粗鬆症、変形性関節炎、変性骨、結合組織の喪失を伴う様々なガン（例えば、骨ガン、骨肉腫、骨転移）、軟骨損傷、関節軟骨欠損、変性椎間板疾患、骨形成不全症（ＯＩ）、火傷、熱傷、深部創傷、遅れた創傷治癒、傷害を受けた靱帯、および、傷害を受けた腱（例えば、その必要性のあるウマおよび他の対象における、酷使により誘導される腱の傷害）を含めて、様々な状態を処置するために使用することができる。
【０１３９】
本発明のこの態様に従って投与することができる細胞には、二次元環境または三次元環境で培養され得る上記の接着性細胞、ならびに、その接着性細胞の間葉系および非間葉系の部分的に分化した誘導体または最終分化した誘導体が含まれる。
【０１４０】
系列特異的な細胞を本発明の間質幹細胞から誘導する様々な方法がこの分野では広く知られている。例えば、米国特許第５４８６３５９号、同第５９４２２２５号、同第５７３６３９６号、同第５９０８７８４号および同第５９０２７４１号参照。
【０１４１】
細胞は未感作であるか、または、目的とする系列を誘導するように遺伝子操作され得る（米国特許出願公開第２００３０２１９４２３号参照）。
【０１４２】
細胞および培地は、新鮮な調製物または凍結（例えば、冷凍保存）された調製物の自己供給源または非自己供給源（すなわち、同種または異種）のものであり得る。
【０１４３】
医学的状態に依存して、対象には、さらなる化学的薬物（例えば、免疫調節、化学療法など）または細胞が投与され得る。
【０１４４】
非自己細胞は、身体に投与されたとき、免疫反応を誘導する可能性があるので、いくつかの取り組みが、非自己細胞の拒絶の可能性を軽減するために開発されている。これらには、レシピエントの免疫系を抑制すること、または、非自己細胞を、移植前に、免疫隔離する半透膜でカプセル化することのいずれかが含まれる。
【０１４５】
カプセル化技術は一般には、小さい球状賦形剤を伴うマイクロカプセル化）およびより大きいフラットシート膜および中空繊維膜を伴うマクロカプセル化に分類される（Ｕｌｕｄａｇ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．、“Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌ  ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ．”、Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ、２０００、４２：２９〜６４）。
【０１４６】
マイクロカプセルを調製する様々な方法がこの分野では知られており、これらには、例えば、Ｌｕ  ＭＺｅｔ  ａｌ．  “Ｃｅｌｌ  ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａｌｇｉｎａｔｅ  ａｎｄ  ａｌｐｈａ−  ｐｈｅｎｏｘｙｃｉｎｎａｍｙｌｉｄｅｎｅ−ａｃｅｔｙｌａｔｅｄ  ｐｏｌｙ（ａｌｌｙｌａｍｉｎｅ）．“、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ、２０００、７０：４７９〜８３）、Ｃｈａｎｇ  ＴＭおよびＰｒａｋａｓｈ  Ｓ”Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ  ｆｏｒ  ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｎｚｙｍｅｓ，  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ．“、Ｍｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２００１、１７：２４９〜６０）、および、Ｌｕ  ＭＺｅｔ  ａｌ．”Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｃｅｌｌ  ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ  ｕｓｉｎｇ  ｐｈｏｔｏｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｐｏｌｙ（ａｌｌｙｌａｍｉｎｅ  ａｌｐｈａ−ｃｙａｎｏｃｉｎｎａｍｙｌｉｄｅｎｅａｃｅｔａｔｅ）．”、Ｊ  Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌ、２０００、１７：２４５〜５１）によって開示される方法が含まれる。
【０１４７】
例えば、マイクロカプセルが、修飾コラーゲンを、メタクリル酸２−ヒドロキシエチル（ＨＥＭＡ）、メタクリル酸（ＭＡＡ）およびメタクリル酸メチル（ＭＭＡ）のターポリマー外皮により複合体化し、これにより、２〜５μｍのカプセル厚さを生じさせることによって調製される。そのようなマイクロカプセルはさらに、負荷電の滑らかな表面を与えるために、また、血漿タンパク質の吸収を最小限に抑えるために、２〜５μｍのさらなるターポリマー外皮によりカプセル化することができる（Ｃｈｉａ，Ｓ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．、“Ｍｕｌｔｉ−ｌａｙｅｒｅｄ  ｍｉｃｒｏｃａｐｓｕｌｅｓ  ｆｏｒ  ｃｅｌｌ  ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ“、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、２００２、２３：８４９〜５６）。
【０１４８】
他のマイクロカプセルはアルギン酸塩（海洋多糖類）（Ｓａｍｂａｎｉｓ，Ａ、“Ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ  ｉｓｌｅｔｓ  ｉｎ  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．“、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌ．Ｔｈｅｒ．、２００３、５：６６５〜８）またはその誘導体に基づく。例えば、マイクロカプセルを、塩化カルシウムの存在下における、ポリカチオンのポリ（メチレン−ｃｏ−グアニジン）塩酸塩との、ポリアニオンのアルギン酸ナトリウムおよびセルロース硫酸ナトリウムの間での多電解質複合体化によって調製することができる。
【０１４９】
細胞のカプセル化は、より小さいカプセルが使用されるときには改善されることが理解される。従って、カプセルサイズが１ｍｍ〜４００μｍに減少したとき、カプセル化細胞の品質管理、機械的安定性、拡散特性およびインビトロ活性が改善された（Ｃａｎａｐｌｅ  Ｌ．ｅｔ  ａｌ．、“Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｓｉｚｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ．“、Ｊ  Ｂｉｏｍａｔｅｒ  Ｓｃｉ  Ｐｏｌｙｍ  Ｅｄ、２００２、１３：７８３〜９６）。そのうえ、７ｎｍもの小さい十分に制御された細孔サイズ、目的に合わせて調節された表面化学および精密な微小構造を有するナノ多孔性バイオカプセルは、細胞のための微小環境を首尾良く免疫隔離することが見出された（Ｗｉｌｌｉａｍｓ  Ｄ、”Ｓｍａｌｌ  ｉｓ  ｂｅａｕｔｉｆｕｌ：  ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅ  ａｎｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｉｎ  ｍｅｄｉｃａｌ  ｄｅｖｉｃｅｓ．”、Ｍｅｄ  Ｄｅｖｉｃｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌ、１９９９、１０：６〜９；Ｄｅｓａｉ，Ｔ．Ａ．、“Ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｆｏｒ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ．“、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ、２００２、２：６３３〜４６）。
【０１５０】
免疫抑制剤の例には、メトトレキサート、シクロホスファミド、シクロスポリン、シクロスポリンＡ、クロロキン、ヒドロキシクロロキン、スルファサラジン（スルファサラゾピリン）、金塩、Ｄ−ペニシラミン、レフルノミド、アザチオプリン、アナキンラ、インフリキシマブ（ＲＥＭＩＣＡＤＥ）、エタネルセプト、ＴＮＦ．アルファ．遮断剤、炎症性サイトカインを標的とする生物学的製剤、および、非ステロイド抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）が含まれるが、これらに限定されない。ＮＳＡＩＤの例には、アセチルサリチル酸、サリチル酸コリンマグネシウム、ジフルニサル、サリチル酸マグネシウム、サルサラート、サリチル酸ナトリウム、ジクロフェナク、エトドラク、フェノプロフェン、フルルビプロフェン、インドメタシン、ケトプロフェン、ケトロラク、メクロフェナマート、ナプロキセン、ナブメトン、フェニルブタゾン、ピロキシカム、スリンダク、トルメチン、アセトアミノフェン、イブプロフェン、Ｃｏｘ−２阻害剤およびトラマドールが含まれるが、これらに限定されない。
【０１５１】
本明細書中に記載される方法のいずれかにおいて、細胞または培地はそれ自体で投与することができ、または、好ましくは、医薬的に許容され得る担体をさらに含む医薬組成物の一部として投与することができる。
【０１５２】
本明細書中で使用される「医薬組成物」は、本発明の接着性細胞（即ち、三次元培養から得られる、胎盤組織および脂肪組織からなる群から選択される組織の接着性細胞）と、他の化学的成分（例えば、医薬的に好適な担体および賦形剤）との調製物を示す。医薬組成物の目的は、対象に対する化合物の投与を容易にすることである。
【０１５３】
以降、用語「医薬的に許容され得る担体」は、対象に対する著しい刺激を生じさせず、かつ、投与された化合物の生物学的活性および生物学的性質を阻害しない担体または希釈剤を示す。担体の非限定的な例には、プロピレングリコール、生理食塩水、エマルジョンおよび有機溶媒と水の混合物がある。
【０１５４】
本明細書中において、用語「賦形剤」は、化合物の投与をさらに容易にするために医薬組成物に添加される不活性な物質を示す。賦形剤の非限定的な例には、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖およびタイプのデンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油およびポリエチレングリコールが含まれる。
【０１５５】
本発明の好ましい実施形態によれば、医薬用担体は塩類の水溶液である。
【０１５６】
薬物の配合および投与のための様々な技術が“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、最新版）（これは参考として本明細書中に組み込まれる）に見出され得る。
【０１５７】
医薬組成物を（本明細書中上記に詳述されるように）全身的な方法で投与することができる。あるいは、例えば、患者の組織領域に直接的に医薬組成物の注射をすることによって、局所的に医薬組成物を投与することができる。
【０１５８】
本発明の医薬組成物は、この分野で十分に知られている様々なプロセスによって、例えば、混合、溶解、造粒、糖衣錠作製、研和、乳化、カプセル化、包括化または凍結乾燥の従来のプロセスによって製造することができる。
【０１５９】
本発明に従って使用するための医薬組成物は活性な化合物を医薬として使用可能な製剤にする加工を容易にする賦形剤および補助剤を含む一つ以上の医薬的に許容され得る担体を使用して従来のように配合されてもよい。適切な配合は選択された投与経路に依存する。
【０１６０】
注射の場合、医薬組成物の有効成分は、水溶液において、好ましくは生理学的に適合し得る、緩衝液（例えば、ハンクス溶液、リンゲル溶液、生理学的な食塩水緩衝液、または凍結培地含有凍結保存物など）において配合することができる。経粘膜投与の場合、浸透剤が配合において使用される。そのような浸透剤はこの分野では一般に知られている。
【０１６１】
本発明の方法において使用される任意の調製物について、治療効果的な量または用量は、最初はインビトロでアッセイおよび細胞培養アッセイから推定することができる。好ましくは、用量は所望の濃度または滴定量を得るために動物モデルにおいて配合される。そのような情報は、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定するために使用することができる。
【０１６２】
本明細書中に記載される有効成分の毒性および治療効力は、細胞培養または実験動物における、インビトロで標準的な薬学的手法によって、決定されることができる。
【０１６３】
これらのインビトロでの細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータは、ヒトにおける使用に対する投薬量範囲を決定するために使用することができる。投薬量は、用いられる投薬形態および利用される投与経路に依存して変化し得る。正確な配合、投与経路および投薬量は、患者の状態を考慮して個々の医師によって選ぶことができる（Ｆｉｎｇｌ他、（１９７５）「Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」，Ｃｈ．１ｐ．１参照）。例えば、パーキンソン病の患者は、処置に対する肯定反応を示す改善された運動機能について症候的に監視されることができる。
【０１６４】
注射の場合、医薬組成物の有効成分は、水溶液において、好ましくは生理学的に適合し得る、緩衝液（例えば、ハンクス溶液、リンゲル溶液、または生理学的な食塩水緩衝液など）において配合することができる。
【０１６５】
投薬量および投薬間隔は、移植された細胞による神経伝達物質の合成を効果的に制御するために十分である有効成分のレベルまで個々に調節することができる。所望の効果を達成するために必要な投薬量は、個体の特徴、および、投与経路に依存する。検出アッセイを、血漿中濃度を決定するために使用することができる。
【０１６６】
処置される状態の重篤度および応答性に依存して、投薬は単回投与であることも複数回投与であることも可能であり、処置の経過が、数日から数週間まで、あるいは、疾患状態の縮小が達成されるまで続く。
【０１６７】
投与される組成物の量は、当然のことではあるが、処置されている対象、苦痛の重篤度、投与様式、主治医の判断などに依存する。投薬量および投与のタイミングは、個々に変化する状態の慎重かつ継続的な監視に対応する。例えば、処置されているパーキンソン病の患者は、監視している徴候に基づいて、疾患の症状を緩和するのに十分な量の細胞を投与されるだろう。
【０１６８】
靱帯傷害についてのモデルには、間葉系幹細胞を使用する前十字靱帯再建のウサギモデル［Ｊｉｔ−Ｋｈｅｎｇ他、Ａｒｔｈｒｏｓｃｏｐｙ（２００４）、２０（９）：８９９〜９１０］、長期間の生体再吸収性足場を前十字靱帯修復のために使用するためのヤギモデル［Ａｌｔｍａｎ他、Ｊ  Ａｍ  Ａｃａｄ  Ｏｒｔｈｏｐ  Ｓｕｒｇ（２００８）、１６（４）：１７７〜１８７］が含まれるが、これらに限定されない。腱修復についてのモデルには、腱の自家間葉系幹細胞媒介修復のための成体ニュージーランド白ウサギモデル［Ａｗａｄ他、Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ（１９９９）、５（３）：２６７〜７７］が含まれるが、これに限定されない。骨修復についてのモデルが、例えば、間葉系幹細胞を骨修復のために操作することを記載する、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ（２００５）、１８３〜２０６に記載された。
【０１６９】
移植の後、本発明の細胞は好ましくは、治療効果が観察されるように、疾患領域においてある期間（例えば、約１ヶ月）にわたって生存する。
【０１７０】
適合し得る医薬用担体に配合された本発明の調製物を含む組成物はまた、適応される状態を処置するために、調製され、適切な容器に入れられ、かつ表示され得る。
【０１７１】
本発明の組成物は、所望される場合には、有効成分を含有する１つまたは複数の単位投薬形態物を含有し得るパックまたはディスペンサーデバイス（例えば、ＦＤＡ承認キットなど）で提供され得る。パックは、例えば、金属箔またはプラスチック箔を含むことができ、例えば、ブリスターパックなどである。パックまたはディスペンサーデバイスには、投与のための説明書が添付され得る。パックまたはディスペンサーにはまた、医薬品の製造、使用または販売を規制する政府当局により定められた形式で容器に付けられた通知が伴うことがあり、この場合、そのような通知は、組成物の形態またはヒトもしくは動物への投与の当局による承認を反映する。そのような通知は、例えば、処方薬物についての米国食品医薬品局により承認されたラベル書きであり得るか、または承認された製品添付文書であり得る。
【０１７２】
本発明の接着性細胞は、製造物として好適に包装され得る医薬組成物として好適に配合することができる。そのような製造物は、組織における血管形成を増大させること、虚血を処置すること、ならびに／あるいは、結合組織の再生および／または修復を必要とする病理を処置することにおける使用のための表示を含む包装材を含み、この場合、包装材により、本発明の接着性細胞が包装される。
【０１７３】
本発明の接着性細胞は免疫抑制および／または寛容性を対象において誘導することができる。したがって、本発明の接着性細胞は、免疫抑制および／または寛容性を必要とする何らかの状態を処置するために使用することができる。そのような状態には、心臓血管疾患、リウマチ様疾患、腺疾患、胃腸疾患、皮膚疾患、肝疾患、神経学的疾患、筋疾患、腎疾患、生殖に関連づけられる疾患、結合組織疾患および全身性疾患（これらに限定されない）を含めて、様々な自己免疫疾患および炎症性疾患（急性および慢性の炎症性疾患を含む）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１７４】
自己免疫性心臓血管疾患の例には、アテローム性動脈硬化（Ｍａｔｓｕｕｒａ  Ｅ．他、Ｌｕｐｕｓ、１９９８、７（Ｓｕｐｐｌ  ２）：Ｓ１３５）、心筋梗塞（Ｖａａｒａｌａ  Ｏ．、Ｌｕｐｕｓ、１９９８、７（Ｓｕｐｐｌ  ２）：Ｓ１３２）、血栓症（Ｔｉｎｃａｎｉ  Ａ．他、Ｌｕｐｕｓ、１９９８、７（Ｓｕｐｐｌ  ２）：Ｓ１０７〜９）、ヴェーゲナー肉芽腫症、高安動脈炎、川崎症候群（Ｐｒａｐｒｏｔｎｉｋ  Ｓ．他、Ｗｉｅｎ  Ｋｌｉｎ  Ｗｏｃｈｅｎｓｃｈｒ、２０００（Ａｕｇ  ２５）、１１２（１５−１６）：６６０）、抗第ＶＩＩＩ因子自己免疫疾患（Ｌａｃｒｏｉｘ−Ｄｅｓｍａｚｅｓ  Ｓ．他、Ｓｅｍｉｎ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈｅｍｏｓｔ、２０００、２６（２）：１５７）、壊死性小血管血管炎、顕微鏡的多発血管炎、チャーグ・ストラウス症候群、寡免疫性巣状壊死性および半月体形成性の糸球体腎炎（Ｎｏｅｌ  ＬＨ．、Ａｎｎ  Ｍｅｄ  Ｉｎｔｅｒｎｅ（Ｐａｒｉｓ）、２０００（Ｍａｙ）、１５１（３）：１７８）、抗リン脂質症候群（Ｆｌａｍｈｏｌｚ  Ｒ．他、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ａｐｈｅｒｅｓｉｓ、１９９９、１４（４）：１７１）、抗体誘導による心不全（Ｗａｌｌｕｋａｔ  Ｇ．他、Ａｍ  Ｊ  Ｃａｒｄｉｏｌ、１９９９（Ｊｕｎ  １７）、８３（１２Ａ）：７５Ｈ）、血小板減少性紫斑病（Ｍｏｃｃｉａ  Ｆ．、Ａｎｎ  Ｉｔａｌ  Ｍｅｄ  Ｉｎｔ、１９９９（Ａｐｒ−Ｊｕｎ）、１４（２）：１１４；Ｓｅｍｐｌｅ  ＪＷ．他、Ｂｌｏｏｄ、１９９６（Ｍａｙ  １５）、８７（１０）：４２４５）、自己免疫性溶血性貧血（Ｅｆｒｅｍｏｖ  ＤＧ．他、Ｌｅｕｋ  Ｌｙｍｐｈｏｍａ、１９９８（Ｊａｎ）、２８（３−４）：２８５；Ｓａｌｌａｈ  Ｓ．他、Ａｎｎ  Ｈｅｍａｔｏｌ、１９９７（Ｍａｒ）、７４（３）：１３９）、シャーガス病における心臓自己免疫性（Ｃｕｎｈａ−Ｎｅｔｏ  Ｅ．他、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ、１９９６（Ｏｃｔ  １５）、９８（８）：１７０９）、および、抗ヘルパーＴリンパ球自己免疫性（Ｃａｐｏｒｏｓｓｉ  ＡＰ．他、Ｖｉｒａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９９８、１１（１）：９）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１７５】
自己免疫性リウマチ様疾患の例には、リウマチ様関節炎（Ｋｒｅｎｎ  Ｖ．他、Ｈｉｓｔｏｌ  Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌ、２０００（Ｊｕｌ）、１５（３）：７９１；Ｔｉｓｃｈ  Ｒ．、ＭｃＤｅｖｉｔｔ  ＨＯ．、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ｕｎｉｔｓ  ＳＡ、１９９４（Ｊａｎ  １８）、９１（２）：４３７）、および、強直性脊椎炎（Ｊａｎ  Ｖｏｓｗｉｎｋｅｌ他、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｅｓ、２００１、３（３）：１８９）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１７６】
自己免疫性腺疾患の例には、膵臓疾患、Ｉ型糖尿病、甲状腺疾患、グレーヴズ病、甲状腺炎、自発性自己免疫性甲状腺炎、橋本甲状腺炎、特発性粘液水腫、卵巣自己免疫性、自己免疫性抗精子不妊症、自己免疫性前立腺炎およびＩ型自己免疫性多腺性症候群が含まれるが、これらに限定されない。疾患には、膵臓の自己免疫疾患、Ｉ型糖尿病（Ｃａｓｔａｎｏ  Ｌ．およびＥｉｓｅｎｂａｒｔｈ  ＧＳ．、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、８：６４７；Ｚｉｍｍｅｔ  Ｐ．、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｒｅｓ  Ｃｌｉｎ  Ｐｒａｃｔ、１９９６（Ｏｃｔ）、３４（Ｓｕｐｐｌ）：Ｓ１２５）、自己免疫性甲状腺疾患、グレーヴズ病（Ｏｒｇｉａｚｚｉ  Ｊ．、Ｅｎｄｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ  Ｃｌｉｎ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍ、２０００（Ｊｕｎ）、２９（２）：３３９；Ｓａｋａｔａ  Ｓ．他、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、１９９３（Ｍａｒ）、９２（１）：７７）、自発性自己免疫性甲状腺炎（Ｂｒａｌｅｙ−Ｍｕｌｌｅｎ  Ｈ．およびＹｕ  Ｓ、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、２０００（Ｄｅｃ  １５）、１６５（１２）：７２６２）、橋本甲状腺炎（Ｔｏｙｏｄａ  Ｎ．他、Ｎｉｐｐｏｎ  Ｒｉｎｓｈｏ、１９９９（Ａｕｇ）、５７（８）：１８１０）、特発性粘液水腫（Ｍｉｔｓｕｍａ  Ｔ．、Ｎｉｐｐｏｎ  Ｒｉｎｓｈｏ、１９９９（Ａｕｇ）、５７（８）：１７５９）、卵巣自己免疫性（Ｇａｒｚａ  ＫＭ．他、Ｊ  Ｒｅｐｒｏｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９９８（Ｆｅｂ）、３７（２）：８７）、自己免疫性抗精子不妊症（Ｄｉｅｋｍａｎ  ＡＢ．他、Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｐｒｏｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、２０００（Ｍａｒ）、４３（３）：１３４）、自己免疫性前立腺炎（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ  ＲＢ．他、Ｕｒｏｌｏｇｙ、１９９７（Ｄｅｃ）、５０（６）：８９３）およびＩ型自己免疫性多腺性症候群（Ｈａｒａ  Ｔ．他、Ｂｌｏｏｄ、１９９１（Ｍａｒ  １）、７７（５）：１１２７）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１７７】
自己免疫性胃腸疾患の例には、慢性炎症性腸疾患（Ｇａｒｃｉａ  Ｈｅｒｏｌａ  Ａ．他、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  Ｈｅｐａｔｏｌ、２０００（Ｊａｎ）、２３（１）：１６）、セリアック病（Ｌａｎｄａｕ  ＹＥ．およびＳｈｏｅｎｆｅｌｄ  Ｙ．Ｈａｒｅｆｕａｈ、２０００（Ｊａｎ  １６）、１３８（２）：１２２）、大腸炎、回腸炎およびクローン病が含まれるが、これらに限定されない。
【０１７８】
自己免疫性皮膚疾患の例には、自己免疫性水疱性皮膚疾患、例えば、尋常性天疱瘡、水疱性類天疱瘡および落葉状天疱瘡（これらに限定されない）などが含まれるが、これらに限定されない。
【０１７９】
自己免疫性肝疾患の例には、肝炎、自己免疫性慢性活動性肝炎（Ｆｒａｎｃｏ  Ａ．他、Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ、１９９０（Ｍａｒ）、５４（３）：３８２）、原発性胆汁性肝硬変（Ｊｏｎｅｓ  ＤＥ．、Ｃｌｉｎ  Ｓｃｉ（Ｃｏｌｃｈ）、１９９６（Ｎｏｖ）、９１（５）：５５１；Ｓｔｒａｓｓｂｕｒｇ  ＣＰ．他、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  Ｈｅｐａｔｏｌ、１９９９（Ｊｕｎ）、１１（６）：５９５）および自己免疫性肝炎（Ｍａｎｎｓ  ＭＰ．、Ｊ  Ｈｅｐａｔｏｌ、２０００（Ａｕｇ）、３３（２）：３２６）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１８０】
自己免疫性神経学的疾患の例には、多発性硬化症（Ｃｒｏｓｓ  ＡＨ．他、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ、２００１（Ｊａｎ  １）、１１２（１−２）：１）、アルツハイマー病（Ｏｒｏｎ  Ｌ．他、Ｊ  Ｎｅｕｒａｌ  Ｔｒａｎｓｍ  Ｓｕｐｐｌ、１９９７、４９：７７）、重症筋無力症（Ｉｎｆａｎｔｅ  ＡＪ．およびＫｒａｉｇ  Ｅ、Ｉｎｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９９９、１８（１−２）：８３；Ｏｓｈｉｍａ  Ｍ．他、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９９０（Ｄｅｃ）、２０（１２）：２５６３）、神経障害、運動神経障害（Ｋｏｒｎｂｅｒｇ  ＡＪ．、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、２０００（Ｍａｙ）、７（３）：１９１）、ギラン・バレー症候群および自己免疫性神経障害（Ｋｕｓｕｎｏｋｉ  Ｓ．、Ａｎｎ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｓｃｉ、２０００（Ａｐｒ）、３１９（４）：２３４）、筋無力症、ランバート・イートン無筋力症症候群（Ｔａｋａｍｏｒｉ  Ｍ．、Ａｍ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｓｃｉ、２０００（Ａｐｒ）、３１９（４）：２０４）、腫瘍随伴性神経学的疾患、小脳萎縮、腫瘍随伴性小脳萎縮およびスティッフマン症候群（Ｈｉｅｍｓｔｒａ  ＨＳ．他、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ｕｎｉｔｓ  ＳＡ、２００１（Ｍａｒ  ２７）、９８（７）：３９８８）；腫瘍非随伴性スティッフマン症候群、進行性小脳萎縮、脳炎、ラスムッセン脳炎、筋萎縮性側索硬化症、シドナム舞踏病、ジル・ド・ラ・ツレット症候群および自己免疫性多腺性内分泌障害（Ａｎｔｏｉｎｅ  ＪＣ．およびＨｏｎｎｏｒａｔ  Ｊ．、Ｒｅｖ  Ｎｅｕｒｏｌ（Ｐａｒｉｓ）、２０００（Ｊａｎ）、１５６（１）：２３）；免疫異常神経障害（Ｎｏｂｉｌｅ−Ｏｒａｚｉｏ  Ｅ．他、Ｅｌｅｃｔｒｏｅｎｃｅｐｈａｌｏｇｒ  Ｃｌｉｎ  Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌ  Ｓｕｐｐｌ、１９９９、５０：４１９）；後天性神経性筋強直症、先天性多発性関節拘縮症（Ｖｉｎｃｅｎｔ  Ａ．他、Ａｎｎ  ＮＹ  Ａｃａｄ  Ａｃｉ、１９９８（Ｍａｙ  １３）、８４１：４８２）、神経炎、視神経炎（Ｓｏｄｅｒｓｔｒｏｍ  Ｍ．他、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｌ  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ、１９９４（Ｍａｙ）、５７（５）：５４４）および神経変性疾患が含まれるが、これらに限定されない。
【０１８１】
自己免疫性筋疾患の例には、筋炎、自己免疫性筋炎および原発性シェーグレン症候群（Ｆｅｉｓｔ  Ｅ．他、Ｉｎｔ  Ａｒｃｈ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、２０００（Ｓｅｐ）、１２３（１）：９２）および平滑筋自己免疫疾患（Ｚａｕｌｉ  Ｄ．他、Ｂｉｏｍｅｄ  Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ、１９９９（Ｊｕｎ）、５３（５−６）：２３４）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１８２】
自己免疫性腎疾患の例には、腎炎および自己免疫性間質性腎炎（Ｋｅｌｌｙ  ＣＪ．、Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｎｅｐｈｒｏｌ、１９９０（Ａｕｇ）、１（２）：１４０）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１８３】
生殖に関連づけられる自己免疫疾患の例には、繰り返される胎児消失（ｆｅｔａｌ  ｌｏｓｓ）（Ｔｉｎｃａｎｉ  Ａ．他、Ｌｕｐｕｓ、１９９８、７（Ｓｕｐｐｌ  ２）：Ｓ１０７〜９）が含まれるが、これに限定されない。
【０１８４】
自己免疫性結合組織疾患の例には、耳疾患、自己免疫性耳疾患（Ｙｏｏ  ＴＪ．他、Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９９４（Ａｕｇ）、１５７（１）：２４９）および内耳の自己免疫疾患（Ｇｌｏｄｄｅｋ  Ｂ．他、Ａｎｎ  ＮＹ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ、１９９７（Ｄｅｃ  ２９）、８３０：２６６）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１８５】
自己免疫性全身疾患の例には、全身性エリテマトーデス（Ｅｒｉｋｓｏｎ  Ｊ．他、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｓ、１９９８、１７（１−２）：４９）および全身性硬化症（Ｒｅｎａｕｄｉｎｅａｕ  Ｙ．他、Ｃｌｉｎ  Ｄｉａｇｎ  Ｌａｂ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９９９（Ｍａｒ）、６（２）：１５６；Ｃｈａｎ  ＯＴ．他、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ、１９９９（Ｊｕｎ）、１６９：１０７）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１８６】
さらに、接着性細胞は、移植片拒絶、慢性的移植片拒絶、亜急性移植片拒絶、超急性移植片拒絶、急性移植片拒絶および移植片対宿主病（これらに限定されない）を含めて、移植片の移植に関連する様々な疾患を処置するために使用することができる。
【０１８７】
本明細書中で使用される用語「約」は、±１０％を示す。
【０１８８】
本発明の追加の目的、利点及び新規な特徴は、下記実施例を考察すれば、当業技術者には明らかになるであろう。なおこれら実施例は本発明を限定するものではない。さらに、先に詳述されかつ本願の特許請求の範囲の項に特許請求されている本発明の各種実施態様と側面は各々、下記実施例の実験によって支持されている。
【実施例】
【０１８９】
下記の実施例が参照されるが、下記の実施例は、上記の説明と一緒に、本発明を非限定様式で例示する。
【０１９０】
本願で使用される用語と、本発明で利用される実験方法には、分子生化学、微生物学および組み換えＤＮＡの技法が広く含まれている。これらの技法は文献に詳細に説明されている。例えば以下の諸文献を参照されたい：「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」Ｓａｍｂｒｏｏｋ他（１９８９）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．編「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻（１９９４）、Ａｕｓｕｂｅｌ他著；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，米国メリーランド州バルチモア（１９８９）；Ｐｅｒｂａｌ著「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，米国ニューヨーク（１９８８）；Ｗａｔｓｏｎ他、「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ」Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ、米国ニューヨーク；Ｂｉｒｒｅｎ他編「Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ」１〜４巻、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、米国ニューヨーク（１９９８）；米国特許の４６６６８２８号、４６８３２０２号、４８０１５３１号、５１９２６５９号および５２７２０５７号に記載される方法；Ｃｅｌｌｉｓ，Ｊ．Ｅ．編「Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ」Ｉ〜ＩＩＩ巻（１９９４）；Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｊ．Ｅ．編「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻（１９９４）；Ｓｔｉｔｅｓ他編「Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（第８版）、Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ＆  Ｌａｎｇｅ、米国コネティカット州ノーウォーク（１９９４）；ＭｉｓｈｅｌｌとＳｈｉｉｇｉ編「Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｗ．Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．、米国ニューヨーク（１９８０）；また利用可能な免疫検定法は、例えば以下の特許と科学文献に広範囲にわたって記載されている：米国特許の３７９１９３２号、３８３９１５３号、３８５０７５２号、３８５０５７８号、３８５３９８７号、３８６７５１７号、３８７９２６２号、３９０１６５４号、３９３５０７４号、３９８４５３３号、３９９６３４５号、４０３４０７４号、４０９８８７６号、４８７９２１９号、５０１１７７１号および５２８１５２１号；Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．編「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（１９８４）；Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．編「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」（１９８５）；Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．編「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」（１９８４）；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．編「Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ」（１９８６）；「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ」ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９８６）；「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ．著（１９８４）および「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」１〜３１７巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；「ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、米国カリフォルニア州サンディエゴ（１９９０）；Ｍａｒｓｈａｋ他、「Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ」、ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ、（１９９６）；なおこれらの文献の全ては、あたかも本願に完全に記載されているように援用するものである。その他の一般的な文献は、本明細書を通じて提供される。それらの文献に記載の方法は当業技術界で周知であると考えられ、読者の便宜のために提供される。それらの文献に含まれるすべての情報は本願に援用するものである。
【０１９１】
実施例１
骨髄、胎盤組織および脂肪組織からの接着性細胞の作製および培養
接着性細胞を、３Ｄ担体を含有するバイオリアクターにおいて培養して、特異的な細胞マーカー発現プロフィルにより特徴づけられる３Ｄ接着性細胞を作製した。成長効率を細胞計数によって調べた。これらの細胞の分化能を、分化培地で培養することによって調べた。
【０１９２】
材料および実験手順
骨髄接着性細胞−骨髄（ＢＭ）接着性細胞を、開心術またはＢＭ生検を受ける血液学的に健康なドナーの吸引された胸骨骨髄から得た。骨髄吸引物をハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ；ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）で３倍希釈し、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（Ｒｏｂｂｉｎｓ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏｒｐ．、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）密度勾配遠心分離に供した。その後、骨髄単核細胞（１．０７７ｇｍ／ｃｍ３未満）を集め、ＨＢＳＳで３回洗浄し、成長培地［１０％のＦＣＳ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）、１０−４Ｍのメルカプトエタノール（Ｍｅｒｃｋ、Ｗｈｉｔｅ  Ｈｏｕｓｅ  Ｓｔａｔｉｏｎ、ＮＪ）、Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ−ナイスタチン混合物（１００Ｕ／ｍｌ：１００μｇ／ｍｌ：１．２５ｕｎ／ｍｌ；Ｂｅｉｔ  Ｈａ’Ｅｍｅｋ）、２ｍＭのＬ−グルタミン（Ｂｅｉｔ  Ｈａ’Ｅｍｅｋ）が補充されたＤＭＥＭ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｂｅｉｔ  Ｈａ’ｅｍｅｋ、イスラエル）］に再懸濁した。個々のドナーからの細胞を、培養培地を毎週交換しながら、３７℃（５％ＣＯ２）で組織培養フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ａｃｔｏｎ、ＭＡ）において別々にインキュベートした。細胞を、０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｂｅｉｔ  Ｈａ’Ｅｍｅｋ）を使用して３〜４日毎に剥がした。２〜４０回の継代培養の後、６０〜８０％のコンフルエンスに達したとき、細胞を、分析のために、または、バイオリアクターにおける培養のために集めた。
【０１９３】
胎盤由来の接着性細胞。満期出産胎盤の内側部分（Ｂｎｅｉ  Ｚｉｏｎメディカルセンター、Ｈａｉｆａ、イスラエル）を無菌条件下で切断し、ハンクス緩衝液により３回洗浄し、０．１％のコラゲナーゼ（１ｍｇ／ｍｌ組織；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｅｗｉｓ、ＭＯ）とともに３７℃で３時間インキュベートした。その後、穏やかなピペッティングを使用して、懸濁された細胞を、１０％のＦＣＳ、Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ−ナイスタチン混合物（１００Ｕ／ｍｌ：１００μｇ／ｍｌ：１．２５ｕｎ／ｍｌ）および２ｍＭのＬ−グルタミンが補充されたＤＭＥＭにより洗浄し、７５ｃｍ２フラスコに播種し、５％ＣＯ２を伴う加湿条件のもとで組織培養インキュベーターにおいて３７℃でインキュベートした。その後、細胞をプラスチック表面に７２時間接着させ、その後、培地を３〜４日毎に交換した。６０〜８０％のコンフルエンスに達したとき（通常、１０〜１２日）、細胞を、０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡを使用して成長フラスコから剥離し、新しいフラスコに播種した。その後、培養細胞を、分析のために、または、バイオリアクターにおける培養のために集めた。
【０１９４】
脂肪由来の接着性細胞−接着性細胞を脂肪吸引法のヒト脂肪組織から得た（Ｒａｍｂａｍ  Ｈａｉｆａ、イスラエル）。脂肪組織を等体積のＰＢＳにより徹底的に洗浄し、コラゲナーゼ（２０ｍｇ／ｍｌ）により３７℃で３０分間消化した。その後、細胞を、１０％のＦＣＳ、Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ−ナイスタチン混合物（１００Ｕ／ｍｌ：１００μｇ／ｍｌ：１．２５ｕｎ／ｍｌ）およびＬ−グルタミンを含有するＤＭＥＭにより洗浄し、１２００ｒｐｍにおいて室温（ＲＴ）で１０分間遠心分離し、溶解液（１：１０；Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｂｅｉｔ  Ｈａ’ｅｍｅｋ、イスラエル、赤血球を除くために）により再懸濁し、遠心分離し、１０％のＦＣＳ、Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ−ナイスタチン混合物（１００Ｕ／ｍｌ：１００μｇ／ｍｌ：１．２５ｕｎ／ｍｌ）およびＬ−グルタミンを含有するＤＭＥＭにより再懸濁した。その後、洗浄された細胞を無菌の組織培養培地フラスコに３〜１０×１０７細胞／フラスコで播種した。翌日、細胞をＰＢＳにより洗浄して、残留ＲＢＣおよび死細胞を除いた。細胞を、５％ＣＯ２を伴う加湿条件のもとで組織培養インキュベーターにおいて３７℃で保った。培地を３〜４日毎に交換した。６０〜８０％のコンフルエンスで、細胞を、０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡを使用して成長フラスコから剥離し、新しいフラスコに播種した。２〜４０回の継代培養の後、６０〜８０％のコンフルエンスに達したとき、細胞を、分析のために、または、バイオリアクターにおける培養のために集めた。
【０１９５】
ＰｌｕｒｉＸ（商標）プラグフローバイオリアクター−ＰｌｕｒｉＸ（商標）プラグフローバイオリアクター（Ｐｌｕｒｉｓｔｅｍ、Ｈａｉｆａ、イスラエル；図１Ｇに例示されるようなもの；米国特許第６９１１２０１号もまた参照のこと）に、ポリエステルの不織布マトリックスから作製された１〜１００ｍｌの充填された３Ｄポロシブ担体（直径、４ｍｍ）を負荷した。これらの担体は大きい細胞数の増殖を比較的小さい体積において可能にする。ガラス器具はＰｌｕｒｉｓｔｅｍ（Ｐｌｕｒｉｓｔｅｍ、Ｈａｉｆａ、イスラエル）によって設計および製造された。バイオリアクターは３７℃のインキュベーターにおいて維持され、流量がバルブ（図１Ｇにおける６ａ）および蠕動ポンプ（図１Ｇにおける９）によって調節およびモニターされた。バイオリアクターは、細胞の連続した播種を可能にするサンプリングおよび注入点（図１Ｇにおける４）を含有する。培養培地がリザーバー（図１Ｇにおける１）からｐＨ６．７〜７．４で供給された。リザーバーには、空気／ＣＯ２／Ｏ２を異なる割合で含有するろ過されたガス混合物（図１Ｇにおける２、３）が、バイオリアクターにおける細胞密度に依存して供給された。Ｏ２の割合は、モニター（図１Ｇにおける６）によって求められるバイオリアクターの出口での溶存Ｏ２のレベルに合わせられた。ガス混合物がシリコーンチューブまたはディフューザー（Ｄｅｇａｎｉａ  Ｂｅｔ，Ｅｍｅｋ  Ｈａｙａｒｄｅｎ、イスラエル）を介してリザーバーに供給された。培養培地は、循環している非接着性細胞の捕集を可能にする分離用容器（図１Ｇにおける７）に通された。培地の循環が蠕動ポンプ（図１Ｇにおける９）によって得られた。バイオリアクターはさらに、さらなるサンプリング点（図１Ｇにおける１０）、および、連続した培地交換のための容器を備えた。
【０１９６】
３Ｄ接着性細胞の作製−上記のように成長させた非コンフルエントな初代ヒト接着性２Ｄ細胞培養物をトリプシン処理し、洗浄し、１０％のＦＣＳ、Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ−ナイスタチン混合物（１００Ｕ／ｍｌ：１００μｇ／ｍｌ：１．２５ｕｎ／ｍｌ）および２ｍＭのＬ−グルタミンが補充されたＤＭＥＭに再懸濁し、注入点を介して無菌のプラグフローバイオリアクター（図１Ｇ参照）における３Ｄ担体に播種した（１０３〜１０５細胞／ｍｌ）。接種前に、バイオリアクターはＰＢＳ−Ｃａ−Ｍｇ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｂｅｉｔ  Ｈａ’ｅｍｅｋ、イスラエル）で満たされ、オートクレーブ処理され（１２０℃、３０分）、１０％の熱不活化ウシ胎児血清およびＰｅｎ−Ｓｔｒｅｐ−ナイスタチン混合物（１００Ｕ／ｍｌ：１００μｇ／ｍｌ：１．２５ｕｎ／ｍｌ）を含有するダルベッコ成長培地により洗浄された。流れが０．１〜５ｍｌ／分の速度で保たれた。播種プロセスでは、２〜４８時間にわたる循環の中断が伴い、それにより、細胞が担体に留まることを可能になった。バイオリアクターは、無菌の空気およびＣＯ２が必要に応じて供給されるインキュベーターを使用して、制御された温度（３７℃）およびｐＨ（ｐＨ＝６．７〜７．４）の条件のもとで保たれた。成長培地を週に２〜３回取り替えた。循環培地を、４時間毎〜７日毎に、新鮮なＤＭＥＭ培地により取り替えた。１×１０６〜１×１０７細胞／ｍｌの密度で（１２〜４０日の成長の後）、全培地体積をバイオリアクターから取り出し、バイオリアクターおよび担体をＰＢＳにより３〜５回洗浄した。その後、３Ｄ接着性細胞をトリプシン−ＥＤＴＡ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｂｅｉｔ  Ｈａ’ｅｍｅｋ、イスラエル；穏やかな撹拌とともに３〜１５分、１〜５回）により担体から剥離し、その後、ＤＭＥＭに再懸濁し、凍結保存した。
【０１９７】
３Ｄ接着性細胞の性状の生物学的アッセイ−凍結保存された３Ｄ接着性細胞を解凍し、計数した。細胞生存能の評価のために、２×１０５個の細胞を１５０ｃｍ２組織培養フラスコに播種し、その接着能および再増殖を播種後７日以内に評価した。その後、３Ｄ接着性細胞の膜マーカー表現型を、蛍光モノクローナル抗体フローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、ＣＡ）を使用して分析した。
【０１９８】
フローサイトメトリーアッセイを使用する３Ｄ培養の接着性細胞および２Ｄ培養の接着性細胞の細胞膜マーカープロフィルの比較−２Ｄ培養および３Ｄフローシステム培養からの１０００００〜２０００００個の接着性細胞を５ｍｌのチューブにおいて０．１ｍｌの培養培地に懸濁し、下記ＭＡｂ、ＦＩＴＣコンジュゲート化抗ヒトＣＤ９０（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｃ．、Ｔｅｍｅｃｕｌａ、ＣＡ）、ＰＥコンジュゲート化抗ヒトＣＤ７３（Ｂａｃｔｌａｂ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ、Ｃｅａｓａｒｅａ、イスラエル）、ＰＥコンジュゲート化抗ヒトＣＤ１０５（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、ＦＩＴＣコンジュゲート化抗ヒトＣＤ２９（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、Ｃｙ７−ＰＥコンジュゲート化抗ヒトＣＤ４５（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＰＥコンジュゲート化抗ヒトＣＤ１９（ＩＱＰｒｏｄｕｃｔｓ、Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ、オランダ）、ＰＥコンジュゲート化抗ヒトＣＤ１４  ＭＡｂ（ＩＱＰｒｏｄｕｃｔｓ）、ＦＩＴＣコンジュゲート化抗ヒトＣＤ１１ｂ（ＩＱＰｒｏｄｕｃｔｓ）およびＰＥコンジュゲート化抗ヒトＣＤ３４（ＩＱＰｒｏｄｕｃｔｓ）のそれぞれの飽和濃度と、または、ＦＩＴＣコンジュゲート化抗ヒトＨＬＡ−ＤＲ  ＭＡｂ（ＩＱＰｒｏｄｕｃｔｓ）とインキュベートした（４℃、３０分、暗所）。インキュベート後、細胞を、１％の熱不活化ＦＣＳを含有する氷冷ＰＢＳで２回洗浄し、５００μｌホルムアルデヒド（０．５％）に再懸濁し、ＦＣ−５００フローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、ＣＡ）を使用して分析した。
【０１９９】
質量分析法による分析を使用する３Ｄ培養の接着性細胞および２Ｄ培養の接着性細胞のタンパク質プロフィルの比較−２Ｄ由来培養手法および３Ｄ由来培養手法の接着性細胞を上記のように胎盤から作製した。簡単に記載すると、２Ｄ培養物を、０．３〜０．７５×１０６個の細胞を、６０〜８０％のコンフルエンスに達するまで、加湿５％ＣＯ２雰囲気のもと、３７℃で、１７５ｃｍ２フラスコにおいて４日間培養することによって作製した。２〜１０×１０６細胞／ｍｌを、２０００個の担体を含有するバイオリアクターに播種し、１８日間培養することによって、３Ｄ培養物を作製した。回収後、細胞を（３回）洗浄して、全血清を除き、ペレット化し、凍結した。タンパク質を製造者のプロトコルに従ってペレットから単離した［Ｔｒｉ試薬キット（Ｓｉｇｍａ、Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ、米国）を使用し、トリプシンにより消化し、ｉＴＲＡＱ試薬（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）により標識した］。簡単に記載すると、ｉＴＲＡＱ試薬は、非ポリマーの、等重核のタグ化試薬である。それぞれのサンプルに含まれるペプチドが、それらのＮ末端および／またはリシン側鎖を介して４つの等重核の同位体コードタグのうちの１つにより標識される。４つの標識されたサンプルが混合され、ペプチドが質量分析法により分析される。ペプチドがフラグメント化されたとき、それぞれのタグが、異なった質量レポーターイオンを放出する。従って、４つのレポーターの比率により、サンプルにおける所与ペプチドの相対的な存在量が与えられる（ｈｔｔｐ：／／ｄｏｃｓ．ａｐｐｌｉｅｄｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ．ｃｏｍ／ｐｅｂｉｏｄｏｃｓ／００１１３３７９．ｐｄｆにおける情報）。
【０２００】
胎盤由来接着性細胞の２Ｄ培養対３Ｄ培養のプロテオミックス分析を、ＱＴＯＦ−ＰｒｅｍｉｅｒでのＬＣ−ＭＳ／ＭＳ（Ｗａｔｅｒｓ、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）を使用してＳｍｏｌｅｒプロテオミックセンター（Ｂｉｏｌｏｇｙ部門、Ｔｅｃｈｎｉｏｎ、Ｈａｉｆａ、イスラエル）において行い、同定および分析をｎｒデータベースのヒト部分に対してＰｅｐ−Ｍｉｎｅｒソフトウエア［Ｂｅｅｒ，Ｉ．ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ、４、９５０〜６０（２００４）］によって行った。分析されたタンパク質は、ヘテロ核リボヌクレオタンパク質Ｈ１（Ｈｎｒｐｈ１、ＧｅｎｅＢａｎｋアクセション番号ＮＰ＿００５５１１）、Ｈ２Ａヒストンファミリー（Ｈ２ＡＦ、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＰ＿０３４５６６．１）、真核生物翻訳伸長因子２（ＥＥＥＦ２、ＧｅｎｅＢａｎｋアクセション番号ＮＰ＿０３１９３３．１）、レチクロカルビン３、ＥＦ−ハンドカルシウム結合ドメイン（ＲＣＮ２、ＧｅｎｅＢａｎｋアクセション番号ＮＰ＿０６５７０１）、ＣＤ４４抗原イソ型２前駆体（ＧｅｎｅＢａｎｋアクセション番号ＮＰ＿００１００１３８９）、カルポニン１塩基性平滑筋（ＣＮＮ１、ＧｅｎｅＢａｎｋアクセション番号ＮＰ＿００１２９０）、３ホスホアデノシン５ホスホ硫酸シンターゼ２イソ型ａ（Ｐａｐｓｓ２、ＧｅｎｅＢａｎｋアクセション番号ＮＰ＿００４６６１）、リボソームタンパク質Ｌ７ａ（ｒｐＬ７ａ、ＧｅｎｅＢａｎｋアクセション番号ＮＰ＿０００９６３）およびアルデヒドデヒドロゲナーゼＸ（ＡＬＤＨ  Ｘ、ＧｅｎｅＢａｎｋアクセション番号Ｐ４７７３８）であった。すべての実験が２回行われた。分析の性質のために、すべてのタンパク質は、サンプルにおいて現れたペプチドの数に従って分析された（それぞれの分析において１つのタンパク質から２〜２０個のペプチドが出現した）。
【０２０１】
ＥＬＩＳＡを使用する３Ｄ培養の接着性細胞および２Ｄ培養の接着性細胞における分泌タンパク質の比較−胎盤から作製された２Ｄ由来培養手法および３Ｄ由来培養手法の接着性細胞を上記のように作製した（３Ｄ培養物は２４日の期間にわたった）。その後、馴化培地を集め、Ｆｌｔ−３リガンド、ＩＬ−６、トロンボポエチン（ＴＰＯ）および幹細胞因子（ＳＣＦ）について、３回の独立した実験で、ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）を使用して分析した。結果を１×１０６細胞／ｍｌについて正規化した。
【０２０２】
骨芽細胞分化培地−細胞を、１０％のＦＣＳ、１００ｎＭのデキサメタゾン、０．０５ｍＭのアスコルビン酸２−リン酸、１０ｍＭのＢ−グリセロリン酸が補充されたＤＭＥＭを含有する骨芽細胞分化培地で３週間の期間、培養することによって、骨形成性分化を評価した。石灰化したマトリックスがアリザリンレッドＳ染色によって示され、アルカリホスファターゼがアルカリホスファターゼアッセイキットによって検出された（すべての試薬がＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｅｗｉｓ、ＭＯ）から得られた）。
【０２０３】
実験結果
ＰｌｕｒｉＸ（商標）バイオリアクターシステムは生理学的な類似する微小環境をもたらす。
接着性細胞のための効率的な培養条件を与えるために、生理学的に類似する微小環境（図１Ａに示す）が、ＰｌｕｒｉＸ（商標）バイオリアクター（Ｐｌｕｒｉｓｔｅｍ、Ｈａｉｆａ、イスラエル；担体が図１Ｇに例示され、播種前が図１Ｂに示される）を使用して人工的に作製された。図１Ｃ〜Ｆに示されるように、播種後の２０日（図１Ｃ〜Ｄ、それぞれ１５０倍および２５０倍に拡大）および４０日（図１Ｅ〜Ｆ、それぞれ３５０倍および５００倍に拡大）において、骨髄から作製された３Ｄ接着性細胞が首尾良く培養され、３Ｄマトリックス上で拡大培養された。
【０２０４】
ＰｌｕｒｉＸバイオリアクターシステムで成長させた細胞は著しく拡大培養された。胎盤由来３Ｄ接着性細胞の種々の製造ロットをＰｌｕｒｉＸバイオリアクターシステムで成長させた。播種密度は１３３００細胞／担体であった（合計で２×１０６細胞）。播種後１４日で、細胞密度は１５倍になり、およそ２０００００細胞／担体に達し（図２）、すなわち、１５０個の担体のバイオリアクターにおいて３０×１０６個に達した。異なる実験において、細胞が１．５×１０４細胞／ｍｌの密度でバイオリアクターに播種され、播種後３０日で、担体は、５０倍を超える大きい細胞数、すなわち、およそ０．５×１０６細胞／担体または０．５×１０７細胞／ｍｌを含有した。成長カラムの様々なレベルでの担体上の細胞密度は一致していた。このことは、細胞への酸素および栄養分の均一な移動を示している。従って、この３Ｄ培養システムは、生着および成功した移植を支持するという目的のために十分な量に効率的に成長させることができる、高密度の間葉系細胞培養の成長および長期にわたる維持のための支持条件を提供することが判明した。
【０２０５】
３Ｄ接着性細胞は特異な膜マーカー特徴を示す。骨環境を模倣する３Ｄ培養手法によって行われたとき、可溶性分子の分泌プロフィルおよびタンパク質産生における違いを明確にするために、ＦＡＣＳ分析を行った。図３Ａに示すように、細胞マーカーのＦＡＣＳ分析は、３Ｄ接着性細胞が、２Ｄ条件で成長させた接着性細胞とは異なるマーカー発現パターンを呈示することを示す。２Ｄ培養の細胞は、３Ｄ培養の細胞と比較して、陽性の膜マーカー（ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ７３およびＣＤ２９の膜マーカー）のレベルが著しく上昇した。例えば、ＣＤ１０５は、２Ｄ培養の細胞における８７％に対して、３Ｄ培養の細胞では５６％の発現を示した。２Ｄおよび３Ｄの両方の胎盤培養の接着性細胞は造血系の膜マーカーを何ら発現しなかった（図３Ｂ）。
【０２０６】
３Ｄ接着性細胞は可溶性因子の特異なプロフィルを示す。造血陥凹部は、大量のサイトカイン、ケモカインおよび増殖因子を産生するサポーター細胞を含む。２Ｄ培養の接着性細胞と、３Ｄ培養の接着性細胞との違いをさらに明確にするために、２Ｄおよび３Ｄの接着性細胞培養物の馴化培地における４つの主要な造血系分泌タンパク質のプロフィルをＥＬＩＳＡによって行った。図４Ａ〜Ｃは、３Ｄ条件で成長させられた細胞が、より高いレベルのＦｌｔ−３リガンド（図４Ａ）、ＩＬ−６０（図４Ｂ）およびＳＣＦ（図４Ｃ）を含む馴化培地をもたらし、一方、低いレベルのＩＬ−６、ゼロに近いレベルのＦｌｔ−３リガンドおよびＳＣＦが２Ｄ培養物の馴化培地において検出されたことを示す。トロンボポエチン（ＴＰＯ）の産生は両方の培養物において非常に低く、等しかった。
【０２０７】
３Ｄ接着性細胞は特異なタンパク質プロフィルを質量分析法による分析において示す。２Ｄ培養の接着性細胞と、３Ｄ培養の接着性細胞との違いをさらに明確にするために、これらの細胞のタンパク質プロフィルを質量分析法によって分析した。図４Ｄは、２Ｄ培養の接着性細胞および３Ｄ培養の接着性細胞が顕著に異なるタンパク質発現プロフィルを示すことを示す。下記の表１に示されるように、３Ｄ培養の細胞では、Ｈ２ＡＦおよびＡＬＤＨ  Ｘの発現レベルがはるかにより大きいこと（それぞれ、９倍超および１２倍超）、また、ＥＥＥＦ２、ＲＣＮ２およびＣＮＮ１のタンパク質のレベルがより大きいこと（それぞれ、約３倍、２．５倍および２倍）が示される。加えて、３Ｄ培養の細胞では、Ｈｎｒｐｈ１およびＣＤ４４抗原イソ型２前駆体のタンパク質の発現レベルが約１／２であり、Ｐａｐｓｓ２およびｒｐＬ７ａの発現レベルが約１／３であることが示される。
2014208682.tif 000002
【０２０８】
３Ｄ接着性細胞は、骨芽細胞に分化する能力を有する。−３Ｄ接着性細胞をさらに特徴づけるために、細胞を骨芽細胞分化培地で３週間の期間、培養した。その後、カルシウム沈殿を行った。分化した細胞は、カルシウム（これは図５Ａ〜Ｂにおいて赤色に示される）を産生することが示され、これに対して、コントロール細胞は線維芽細胞様の表現型を維持し、石灰化を示さなかった（図５Ｃ〜Ｄ）。これらの結果は、胎盤由来の３Ｄ接着性細胞が、骨芽細胞にインビトロで分化する能力を有することを示す。
【０２０９】
実施例２
ＨＳＣの生着を改善する胎盤由来の３Ｄ接着性細胞の能力の評価
３Ｄ接着性細胞がＨＳＣ生着を支持することを、亜致死量の放射線が照射された免疫欠損ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウス、または、化学療法により前処理された免疫欠損ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスにおいて検出されるヒト造血細胞（ｈＣＤ４５＋）のレベルによって評価した。
【０２１０】
材料および実験手順
ＣＤ３４＋細胞の単離−臍帯血サンプルを出産時に無菌条件下で採取し（Ｂｎｅｉ  Ｚｉｏｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ、Ｈａｉｆａ、イスラエル）、単核細胞を、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（Ａｘｉｓ−Ｓｈｉｅｌｄ  ＰｏＣ  Ａｓ、Ｏｓｌｏ、ノルウェー）密度勾配遠心分離を使用して分画し、冷凍保存した。解凍した単核細胞を洗浄し、抗ＣＤ３４抗体とインキュベートし、ｍｉｄｉＭＡＣＳ（Ｍｉｌｔｅｎｙｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｂｅｒｇｉｓｈ  Ｇｌａｄｂａｃｈ、ドイツ）を使用して単離した。２つ以上のサンプルからの細胞を、所望の数（５００００〜１０００００個の細胞）を達成するためにプールした。
【０２１１】
放射線照射マウスにおける移植細胞の検出−７週齢のオスおよびメスのＮＯＤ−ＳＣＩＤマウス（ＮＯＤ−ＣＢ１７−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ／Ｊ；Ｈａｒｌａｎ／Ｗｅｉｚｍａｎｎ  Ｉｎｓｔ．、Ｒｅｈｏｖｏｔ、イスラエル）を無菌の開放系ケージにおいて維持し、無菌の餌およびオートクレーブ処理の酸性水が与えられた。マウスには、亜致死量の放射線（３５０ｃＧｙ）が照射され、その後（放射線照射後４８時間で）、５００００〜１０００００個のｈＣＤ３４＋細胞が、胎盤組織または脂肪組織に由来するさらなる接着性細胞（０．５×１０６個〜１×１０６個）とともに、または、伴うことなく（それぞれの群において３〜７匹のマウス）、側尾静脈への静脈内注入によって移植された。移植後４〜６週間で、マウスを脱臼によって屠殺し、ＢＭを、大腿骨および脛骨の両方をＦＡＣＳ緩衝液（５０ｍｌのＰＢＳ、５ｍｌのＦＢＳ、０．５ｍｌの５％アジ化ナトリウム）により洗い流すことによって集めた。マウスＢＭにおけるヒト細胞をフローサイトメトリーによって検出し、処置されたＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスにおけるヒトおよびマウスのＣＤ４５造血細胞マーカー発現細胞の割合を、細胞を抗ヒトＣＤ４５−ＦＩＴＣ（ＩＱ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ、オランダ）とインキュベートすることによって求めた。明確なヒト生着についての最低の閾値が０．５％で示された。
【０２１２】
化学療法により処置されたマウスにおける移植細胞の検出−６．５週齢のオスのＮＯＤ−ＳＣＩＤマウス（ＮＯＤ．ＣＢ１７／ＪｈｋｉＨｓｄ−ｓｃｉｄ；Ｈａｒｌａｎ、Ｒｅｈｏｖｏｔ、イスラエル）を、放射線照射マウスについて本明細書中上記で記載されたように維持し、ブスルファンを腹腔内注射した（２５ｍｇ／ｋｇ、２日間連続）。２回目のブスルファン注射の２日後、マウスには、ＣＤ３４＋細胞が単独で、または、胎盤から作製された０．５×１０６個の接着性細胞と一緒に注入された。移植後３．５週間で、マウスを屠殺し、ヒト造血細胞の存在を、放射線照射マウスについて本明細書中上記で記載されたように求めた。
【０２１３】
実験結果
３Ｄ接着性細胞は放射線照射マウスにおいてＨＳＣの生着を改善した−ヒトＣＤ３４＋造血細胞と、胎盤組織または脂肪組織に由来する３Ｄ接着性細胞とを、放射線照射されたＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスに同時移植した。生着効率を同時移植後４週間で評価し、ＨＳＣが単独で移植されたマウスと比較した。表２に示すように、３Ｄ接着性細胞およびＵＣＢ  ＣＤ３４＋細胞の同時移植は、ＵＣＢ  ＣＤ３４＋細胞だけにより処置されたマウスと比較したとき、レシピエントマウスのＢＭにおける相当高い生着率およびより高いレベルのヒト細胞をもたらした。
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【０２１４】
３Ｄ接着性細胞は、化学療法により処置されたマウスにおいてＨＳＣの生着を改善した−ヒトＣＤ３４＋造血細胞を、化学療法により前処置されたＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスに、胎盤に由来する５０００００個の２Ｄ接着性細胞または３Ｄ接着性細胞とともに同時移植した。生着効率を同時移植後３．５週間で評価し、ＨＳＣだけが移植されたマウスと比較した。表３および図６に示すように、接着性細胞およびＵＣＢ  ＣＤ３４＋細胞の同時移植は、ＵＣＢ  ＣＤ３４＋細胞の単独と比較したとき、レシピエントマウスのＢＭにおいてより高い生着レベルをもたらした。そのうえ、表３に示すように、生着の平均レベルが、ＰｌｕｒｉＸバイオリアクターシステムで成長させた胎盤由来の接着性細胞（３Ｄ接着性細胞）が同時移植されたマウスの方が、従来の静的な２Ｄ培養条件（フラスコ）で成長させた、同じドナーからの細胞によるマウス同時移植の場合よりも大きかった。
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【０２１５】
図７Ａ〜Ｂに示すＦＡＣＳ分析結果により、接着性細胞をｈＨＳＣと同時移植することの利点（図７Ｂ）、および、接着性細胞はＨＳＣ移植後の造血系の回復を改善することができることが明らかになる。
【０２１６】
まとめると、これらの結果は、接着性細胞が、ＨＳＣ移植（自家または同種）の後の造血回復を改善するための支持細胞として役立ち得ることを示す。ＨＳＣ移植後の造血幹細胞および／または前駆体細胞の生着を高める３Ｄ接着性細胞の能力は、移植された細胞のホーミング能、自己再生能および増殖能を改善し得るＨＳＣ支持サイトカインを分泌する３Ｄ接着性細胞の能力から生じ得るか、または、移植可能なＨＳＣのホーミングおよび増殖のために必要とされる損傷した造血微小環境を再建するそのような細胞の能力から生じ得る。
【０２１７】
実施例３
２Ｄ培養の接着性細胞および３Ｄ培養の接着性細胞によるリンパ球応答の抑制
接着性細胞、具体的には、３Ｄ接着性細胞は、ヒト臍帯血単核細胞の免疫反応をＭＬＲアッセイにおいて抑制することが見出された。
【０２１８】
材料および実験手順
混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイ−胎盤から作製された、２Ｄ由来培養手法の接着性細胞および３Ｄ由来培養手法の接着性細胞の免疫抑制特性および免疫特権特性を、応答（増殖性）細胞および刺激（非増殖性）細胞の混合培養における不適合リンパ球の増殖率によって行われるような、ＨＬＡ座における組織適合性を測定するＭＬＲアッセイによって求めた。ヒト臍帯血（ＣＢ）単核細胞（２×１０５個）を応答細胞として使用し、等量（１０５個）の放射線照射（３０００Ｒａｄ）されたヒト末梢血由来単球（ＰＢＭＣ）と、あるいは、胎盤から作製された２Ｄ培養もしくは３Ｄ培養の接着性細胞、または、接着性細胞およびＰＢＭＣの組合せと同時培養することによって刺激した。それぞれのアッセイを３回繰り返した。細胞を９６ウエルプレートにおいてＲＰＭＩ１６４０培地（２０％のＦＢＳを含有する）で（加湿５％ＣＯ２雰囲気のもと、３７℃で）４日間にわたって同時培養した。プレートを、培養の最後の１８時間、１μＣの３Ｈ−チミジンによりパルス処理した。その後、細胞をガラス繊維フィルター上に集め、チミジンの取り込みをシンチレーションカウンターにより定量した。
【０２１９】
実験結果
図８Ａは、ＰＢＭＣにより刺激されたとき、これらの細胞の増殖の高まりによって表されるようなＣＢ細胞の免疫応答を示す。これは、理論によって拘束されることはないが、おそらくは、ＨＬＡ不適合性に対する応答におけるＴ細胞の増殖に関連する。しかしながら、相当低いレベルの免疫応答が、本発明の接着性細胞とインキュベートされたとき、これらの細胞によって示された。そのうえ、ＰＢＭＣに対するＣＢの免疫応答が、これらの接着性細胞と同時インキュベートされたとき、実質的に減少した。従って、ＭＳＣに類似した様式で、接着性細胞は、ＧｖＨＤに典型的なドナー細胞のＴ細胞増殖を減少させる潜在的能力を有することが見出された。両方の培養物（２Ｄおよび３Ｄ）はリンパ球の免疫応答を減少させたが、また、本明細書中上記で記載される３Ｄ接着性細胞の他の利点と一致して、３Ｄ接着性細胞はより免疫抑制的である。
【０２２０】
（実施例４）
Ｃｅｌｌｉｇｅｎによって製造される３Ｄ接着性細胞と比較される、Ｐｌｕｒｉｘによって製造される３Ｄ接着性細胞
大規模３Ｄ接着性細胞を提供するために、本明細書中ではＣｅｌｌｉｇｅｎとして示される新しい製造システムを利用した。
【０２２１】
材料および実験方法
ＰｌｕｒｉＸ（商標）プラグフローバイオリアクター−本明細書中上記の実施例１において記載される通り。
【０２２２】
Ｐｌｕｒｉｘによる３Ｄ接着性細胞（ＰＬＸ細胞）の作製−本明細書中上記の実施例１において記載される通り。
【０２２３】
Ｃｅｌｌｉｇｅｎ（商標）プラグフローバイオリアクター−Ｃｅｌｌｉｇｅｎ（商標）による接着性細胞（ＰＬＸ−Ｃ細胞）の作製は、図８Ｂに例示されるようないくつかの主要な工程から構成される。このプロセスは、胎盤を予定された満期での帝王切開から集めることによって始まる。
【０２２４】
その後、接着性細胞が胎盤全体から単離され、組織培養フラスコにおいて成長させられ（２Ｄ培養）、集められ、２Ｄ細胞ストック（２ＤＣＳ）として液体窒素中に貯蔵され、そして、適量の２ＤＣＳが３Ｄ培養としてのさらなる拡大のために解凍され、洗浄され、バイオリアクター内の担体上に播種される。１週間〜３週間のバイオリアクターにおける成長の後、細胞が集められ、ＰＬＸ−Ｃとして液体窒素の気相中に凍結保存される。
【０２２５】
ヒト組織の受け取り
得られたすべての胎盤を、医療施設のヘルシンキ委員会の承認のもと、産科病室から受け取った。したがって、すべての胎盤ドナーがインフォームドコンセントに署名し、ドナースクリーニングおよびドナー試験が行われた（ＩＰＣ１）。胎盤を（帝王切開手技中に）ドナーから受け取った後直ちに、胎盤は無菌のプラスチックバッグに入れられ、その後、氷嚢とともにＳｔｙｒｏｆｏａｍボックスに入れられた。胎盤が届けられ、品質管理（ＱＣ）および品質保証（ＱＡ）によって使用が解除されるまで隔離区域に直ちに置かれた。マイコプラズマ検査結果のＱＣ承認が届き、細胞が２Ｄ細胞成長のために取り出されるまでその後の作製工程のすべてが、隔離区域のクリーンルーム施設で行われた。
【０２２６】
接着性細胞の回収および処理
プロセスを開始するために、胎盤全体を層流フード下の無菌条件のもとで切り刻み、ハンクス緩衝溶液により洗浄し、０．１％のコラゲナーゼ（１ｍｇコラゲナーゼ／ｍｌ組織）とともに３７℃で３時間インキュベーションした。２Ｄ細胞培地（１０％のＦＢＳ、０．２５μｇ／ｍｌのファンギゾンおよび５０μｇ／ｍｌのゲンタマイシンが補充されたＤＭＥＭを含む２Ｄ培地）を加え、消化された組織を無菌の金属性漉し器で粗くろ過し、無菌ビーカーに集め、遠心分離した（１０分間、１２００ＲＰＭ、４℃）。その後、穏やかなピペッティングを使用して、懸濁された細胞を、抗生物質が補充された２Ｄ培地により洗浄し、８０ｃｍ２フラスコに播種し、５％ＣＯ２が補充された加湿条件のもと、組織培養インキュベーターにおいて３７℃でインキュベーションした。細胞がフラスコ表面に接着させられた２日間〜３日間の後、細胞をＰＢＳにより洗浄し、２Ｄ培地を加えた。
【０２２７】
二次元（２Ｄ）細胞成長
最初の継代の前に、隔離区域にある総フラスコ数の１０％の成長培地サンプルをマイコプラズマ検査（ＩＰＣ２）のためにプールし、採取した。細胞が、マイコプラズマについて陰性であることが見出されたならば（ＥＺ−ＰＣマイコプラズマキット、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、イスラエル）、細胞を隔離区域から取り出した。１回〜２回のさらなる継代の後、細胞を２Ｄ作製用クリーンルーム（２ＤＰ）に移した。２ＤＰ室に入れられると、培養をさらに３回〜５回の継代のために続けた。ＩＰＣ−３サンプルを４代目の継代の後で免疫表現型のために採取した。このプロセスの始めから終わりまで、培養物は、３７℃で、５％のＣＯ２を伴う加湿条件のもとでの組織培養インキュベーターにおいて、抗生物質を含まない２Ｄ培地で成長させられた。合計で６回〜８回の継代（９回〜１６回の細胞倍加）の後、細胞を集め、２Ｄ細胞ストック（２ＤＣＳ）として凍結保存した。
【０２２８】
最初の継代が通常、１０日後〜１５日後に行われた。２代目の継代から始め、６代目〜８代目の継代まで継続して、細胞を、培養が７０％〜８０％のコンフルエンスに達したときに、通常の場合には３日〜５日（１．５〜２の倍加）の後で継代した。細胞を、０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ（３７℃で４分）を使用してフラスコから剥がし、３±０．２×１０３細胞／ｃｍ２の培養密度で播種した。組織培養フラスコのサイズを、継代が進むにつれて大きくした。培養プロセスが８０ｃｍ２の組織培養フラスコにおいて始まり、１７５ｃｍ２において継続し、その後、５００ｃｍ２（Ｔｒｉｐｌｅフラスコ）において継続し、最後に、細胞がＣｅｌｌ  Ｆａｃｔｏｒｙ１０トレー（６３２０ｃｍ２）に播種された。
【０２２９】
凍結保存の前において、２ＤＳＣ成長期間が終了したとき、成長培地を集め、サンプルを調製して、マイコプラズマ検査（ＩＰＣ４）のための認可されたＧＬＰ研究室に送った。
【０２３０】
２Ｄ細胞ストック製造物のための凍結保存手順
２ＤＳＣの凍結保存のために、２Ｄ培養された細胞を、０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡを使用して無菌条件のもとで集めた。細胞を遠心分離し（１２００ＲＰＭ、１０’、４℃）、計数し、２Ｄ培地に再懸濁した。
【０２３１】
凍結のために、細胞懸濁物を２Ｄ凍結用混合物により１：１で希釈した（最終濃度は、１０％ＤＭＳＯ、４０％ＦＢＳおよび５０％２Ｄ培地であった）。およそ１．５〜２．５×１０９個の細胞が１つの胎盤から製造された。４ｍｌの細胞を５ｍｌの凍結保存用ポリプロピレンバイアルにおいて１０×１０６個／ｍｌの最終濃度で貯蔵した。バイアルに印を付け、バイアルを段階的な温度低下プロセス（１℃／分）のための制御された速度の冷凍庫に移し、その後で、細胞を、低温貯蔵室に置かれた液体窒素冷凍庫の気相中での貯蔵に移した。この材料が２Ｄ細胞ストック（２ＤＣＳ）として示された。
【０２３２】
３次元（３Ｄ）培養手順の開始
３Ｄ培養を開始するために、２ＤＣＳからの適量（１５０±３０×１０６個）の細胞を２ＤＰ室において解凍し、３Ｄ培地（１０％のＦＢＳおよび２０ｍＭのＨｅｐｅｓを含むＤＭＥＭ）により洗浄して、事前に準備されたバイオリアクターシステムにおける播種の前にＤＭＳＯを除いた。それぞれの２ＤＣＳバイアルの内容物をピペットで取り、予め加温された（３７℃の）３Ｄ培地により１：９で希釈した。細胞を遠心分離し（１２００ＲＰＭ、１０’、４℃）、２５０ｍｌの無菌ボトルにおける５０ｍｌ〜１００ｍｌの予め加温された（３７℃の）３Ｄ培地に再び再懸濁した。細胞数および細胞生存性を求めるために、サンプルを採取し、細胞を、トリパンブルー染色を使用して計数した。細胞懸濁物を層流フードのもとで０．５Ｌの播種用ボトルに移した。この播種用ボトルから、細胞懸濁物を、無菌の配管を介して重力作用によってバイオリアクターに移した。
【０２３３】
Ｃｅｌｌｉｇｅｎバイオリアクターにおける３Ｄ接着性細胞（ＰＬＸ−Ｃ）の作製
バイオリアクターの説明
３Ｄ成長期が、図８Ｃに示される自動のＣｅｌｌｉＧｅｎ  Ｐｌｕｓ（登録商標）バイオリアクターシステムまたはＢＩＯＦＬＯ３１０バイオリアクターシステム［（Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ＮＢＳ））を使用して行われた。このバイオリアクターシステムを、条件が高い細胞濃度のために好適であった細胞培養の培養のために使用した。培養プロセスを、バイオリアクターを灌流モードで使用して行った。この実験室規模のバイオリアクターは、２つの主要なシステムから、すなわち、制御システムおよびバイオリアクター自体（槽および付属品）から構築された。プロセスのパラメーターが、プローブ、モーターおよびポンプのためのコネクター、溶存酸素（ＤＯ）、ｐＨ、灌流および撹拌（モーターによる）のための制御ループ、ガス制御システム、温度制御のための水循環および加熱システム、ならびに、操作者インターフェースを含む制御卓によってモニターされ、制御された。制御されたプロセスパラメーター（例えば、温度、ｐＨ、ＤＯなど）は操作者インターフェースに表示することができ、示された制御装置によってモニターすることができる。
【０２３４】
バイオリアクターにおける細胞培養成長手順
本明細書中上記の節で記されたように、凍結保存された２ＤＳＣからの１５０±３０×１０６個の細胞が解凍され、洗浄され、無菌のバイオリアクターに播種された。バイオリアクターは、ポリエステルおよびポリプロピレンから作製された３０ｇ〜５０ｇの担体（ＦｉｂｒａＣｅｌ（登録商標）ディスク、ＮＢＳ）と、１．５±０．１Ｌの３Ｄ培地とを含有した。バイオリアクターにおける成長培地は下記の条件で保たれた：３７℃、７０％溶存酸素（ＤＯ）およびｐＨ７．３。ろ過されたガス（空気、ＣＯ２、Ｎ２およびＯ２）が、ＤＯ値を７０％で保ち、かつ、ｐＨ値を７．３で保つために、制御システムによって決定されるように供給された。最初の２４時間は培地を５０回転／分（ＲＰＭ）で撹拌し、２日目までに２００ＲＰＭにまで増大させた。最初の２日間〜３日間、細胞を回分様式で成長させた。灌流を、培地のグルコース濃度が５５０ｍｇ／ｌ未満に低下したときに開始した。培地を、無菌のシリコーン配管を使用して供給容器からバイオリアクターにポンプ送液した。すべての配管接続が、無菌コネクターを使用して層流下で行われた。灌流は、グルコース濃度をおよそ５５０±５０ｍｇ／ｌで一定に保つために毎日調節された。成長培地のサンプルを、グルコース、乳酸、グルタミン、グルタミン酸およびアンモニウムの濃度測定（ＢｉｏＰｒｏｆｉｌｅ４００分析計、Ｎｏｖａ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）のために１日毎〜２日毎に採取した。細胞培養のグルコース消費速度および乳酸形成速度は、細胞成長速度を測定することを可能にした。これらのパラメーターを使用して、回収時期を蓄積された実験データに基づいて決定した。
【０２３５】
バイオリアクターからの３Ｄ成長させたＰＬＸ−Ｘ細胞の回収
細胞回収プロセスを、成長期（４日〜１０日）が終了したときに開始した。成長培地の２つのサンプルを集めた。１つのサンプルが、ＵＳＰおよびＥｕの基準に従ったマイコプラズマ検査のための認可されたＧＬＰ研究室に送るために調製され、もう一方のサンプルが、再度のマイコプラズマ検査験が必要であった場合に備えて、段階的な温度低下プロセス（１℃／分）のための制御された速度の冷凍庫に移され、その後で、細胞が、低温貯蔵室に置かれた液体窒素冷凍庫の気相中での貯蔵に移された。これらの培地サンプルは最終製造物のマイコプラズマ検査の一部として考慮され、それらの結果が製造物の使用解除のための判断基準の一部として考慮された。
【０２３６】
３Ｄ成長させた培養物を下記のように３ＤＰ室におけるクラス１００の層流区域において回収した：
バイオリアクター槽を、廃棄物容器への配管により重力作用を使用して空にした。槽を、ヘッドプレートを外すことによって開け、担体を、無菌の鉗子を使用してバスケットから上部バスケットネットに無菌で移した（図８Ｃを参照のこと）。その後、バイオリアクター槽を閉じ、１．５Ｌの予め加温されたＰＢＳ（３７℃）で再充填した。撹拌速度を、２分間、１５０ＲＰＭに上げた。ＰＢＳを、圧力または重力によって配管を介して廃液ボトルに排出した。この洗浄手順を２回繰り返した。
【０２３７】
細胞を担体から遊離させるために、３７℃に予め加温された１．５Ｌのトリプシン−ＥＤＴＡ（０．２５％トリプシン、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）をバイオリアクター槽に加え、担体を３７℃において１５０ＲＰＭで５分間撹拌した。細胞懸濁物を、２５０ｍｌのＦＢＳを含有する５Ｌの無菌容器に集めた。細胞懸濁物を４つの５００ｍｌ無菌遠心分離チューブに分け、マイコプラズマ検査サンプルを抜き取った。閉じた遠心分離チューブを、細胞が無菌的に充填され、ＰＬＸ−Ｃとして凍結保存されたクラス１００００の充填室（ＦＲ１）に３ＤＰの作動している通し窓を介して移した。
【０２３８】
細胞周期分析。Ｃｅｌｌｉｇｅｎによって得られるＰＬＸ−Ｃ細胞、および、Ｐｌｕｒｉｘによって得られるＰＬＸ細胞を７０％ＥｔＯＨにより一晩固定処理し、遠心分離し、２μｇ／ｍｌのＰＩ（Ｓｉｇｍａ）、０．２ｍｇ／ｍｌのＲｎａｓｅ  Ａ（Ｓｉｇｍａ）および０．１％（ｖ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎ（Ｓｉｇｍａ）を含有するヨウ化プロピジウム（ＰＩ）溶液に３０分間再懸濁した。細胞周期をＦＡＣＳによって分析した。
【０２３９】
遺伝子発現アレイ（マイクロアレイ）。接着性細胞をヒトの満期胎盤から得て、ＰｌｕｒｉｘまたはＣｅｌｌｉｇｅｎによって拡大した。３つの異なるバッチの細胞をさらなる実験のために拡大方法のそれぞれから得た。
【０２４０】
ＲＮＡを細胞から抽出し（Ｑｉａｇｅｎ−Ｒｎｅａｓｙミクロキット）、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社の全ゲノム発現アレイに加えた。チップは、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）ヒトエキソン１．０ＳＴアレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、アメリカ合衆国）を使用した。
【０２４１】
膜マーカーのＦＡＣＳ分析。細胞を、以前に記載されたようにモノクローナル抗体により染色した。要約すれば、４０００００個〜６０００００個の細胞を５ｍｌの試験管において０．１ｍｌのフローサイトメーター緩衝液に懸濁し、下記のモノクローナル抗体（ＭＡｂ）のそれぞれと暗所において室温（ＲＴ）で１５分間インキュベーションした：ＦＩＴＣコンジュゲート化抗ヒトＣＤ２９  ＭＡｂ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＰＥコンジュゲート化抗ヒトＣＤ７３  ＭＡｂ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、ＰＥコンジュゲート化抗ヒトＣＤ１０５  ＭＡｂ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＰＥコンジュゲート化抗ヒトＣＤ９０  ＭＡｂ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、ＦＩＴＣコンジュゲート化抗ヒトＣＤ４５  ＭＡｂ（ＩＱＰｒｏｄｕｃｔｓ）、ＰＥコンジュゲート化抗ヒトＣＤ１９  ＭＡｂ（ＩＱＰｒｏｄｕｃｔｓ）、ＰＥコンジュゲート化抗ヒトＣＤ１４  ＭＡｂ（ＩＱＰｒｏｄｕｃｔｓ）、ＦＩＴＣコンジュゲート化抗ヒトＨＬＡ−ＤＲ  ＭＡｂ（ＩＱＰｒｏｄｕｃｔ）、ＰＥコンジュゲート化抗ヒトＣＤ３４  ＭＡｂ（ＩＱＰｒｏｄｕｃｔｓ）、ＦＩＴＣコンジュゲート化抗ヒトＣＤ３１  ＭＡｂ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＦＩＴＣコンジュゲート化抗ヒトＫＤＲ  ＭＡｂ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）、抗ヒト線維芽細胞マーカー（Ｄ７−ＦＩＢ）ＭＡｂ（ＡＣＲＩＳ）、ＦＩＴＣコンジュゲート化抗ヒトＣＤ８０  ＭＡｂ（ＢＤ）、ＦＩＴＣコンジュゲート化抗ヒトＣＤ８６  ＭＡｂ（ＢＤ）、ＦＩＴＣコンジュゲート化抗ヒトＣＤ４０  ＭＡｂ（ＢＤ）、ＦＩＴＣコンジュゲート化抗ヒトＨＬＡ−ＡＢＣ  ＭＡｂ（ＢＤ）、ＦＩＴＣコンジュゲート化されたイソ型ＩｇＧ１（ＩＱ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）、ＰＥコンジュゲート化されたイソ型ＩｇＧ１（ＩＱ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）。
【０２４２】
細胞をフローサイトメーター緩衝液により２回洗浄し、５００μｌのフローサイトメーター緩衝液に再懸濁し、ＦＣ−５００フローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用するフローサイトメトリーによって分析した。陰性コントロールを、関連性があるイソ型の蛍光分子により調製した。
【０２４３】
混合リンパ球反応（ＭＬＲ）
２×１０５個の末梢血（ＰＢ）由来ＭＮＣ（ドナーＡ由来）を等量の放射線照射（３０００ｒａｄ）されたＰＢ由来ＭＮＣ（ドナーＢ由来）により刺激した。増大する量のＰＬＸ−Ｃを培養物に加えた。それぞれの群の３つの反復反応物を９６ウエルプレートに播種した。細胞を、２０％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ１６４０培地において培養した。プレートを、５日間の培養の最後の１８時間、１μＣの３Ｈ−チミジンによりパルス処理した。細胞をガラス繊維フィルターで集め、チミジン取り込みをシンチレーションカウンターにより定量した。
【０２４４】
ＣＦＳＥ染色のために、ＰＢ−ＭＮＣ細胞を培養前の増殖測定のためのＣＦＳＥ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）について染色した。細胞を５日後に集め、ＣＦＳＥ染色の強度をフローサイトメトリーによって検出した。
【０２４５】
ＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡを、以前に記載されたように行った。要約すれば、（末梢血から単離された）ＭＮＣを、３７℃で、加湿された５％ＣＯ２雰囲気のもと、ＰＬＸ−Ｃの存在下において、５μｇ／ｍｌのＣｏｎＡ（Ｓｉｇｍａ）、０．５μｇ／ｍｌのＬＰＳ（ＳＩＧＭＡ）または１０μｇ／ｍｌのＰＨＡ（ＳＩＧＭＡ）により刺激した。上清を集め、ＩＦＮγ用ＥＬＩＳＡキット（ＤＩＡＣＬＯＮＥ）、ＴＮＦα用ＥＬＩＳＡキット（ＤＩＡＣＬＯＮＥ）およびＩＬ−１０用ＥＬＩＳＡキットを使用するサイトカイン分析に供した。
【０２４６】
実験結果
Ｐｌｕｒｉｘと比較したときの、Ｃｅｌｌｉｇｅｎによる製造における変化は、（下記の表４にまとめられる）いくつかの大きな違いをもたらした。
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【０２４７】
製造プロセスにおけるこれらの変化は、得られた３Ｄ接着性細胞の特性における様々な変化をもたらした。これらの違いが下記にまとめられる。
【０２４８】
Ｃｅｌｌｉｇｅｎによって製造されるＰＬＸ−Ｃと比較される、Ｐｌｕｒｉｘによって製造されるＰＬＸの細胞周期分析。細胞周期の異なる期における細胞の分布を調べるために、Ｃｅｌｌｉｇｅｎによって得られるＰＬＸ−Ｃ細胞を、Ｐｌｕｒｉｘによって得られるＰＬＸ細胞と比較した。図９Ａ〜図９Ｂから明らかであるように、Ｃｅｌｌｉｇｅｎによって拡大されたＰＬＸ−Ｃ細胞は、典型的な増殖プロフィル（細胞周期の異なる期における細胞の分布）を示した。具体的には、細胞の２８％がＳ期およびＧ２／Ｍ期であった（図９Ａ）。これらの結果は、細胞が増殖期間中に回収されたこと、および、Ｃｅｌｌｉｇｅｎバイオリアクターの条件は細胞成長を支援したことを示していた。
【０２４９】
Ｐｌｕｒｉｘにより得られた細胞と、Ｃｅｌｌｉｇｅｎにより得られた細胞との間におけるマイクロアレイ比較。遺伝子発現アレイは、Ｐｌｕｒｉｘ（ＰＬＸ）またはＣｅｌｌｉｇｅｎ（ＰＬＸ−Ｃ）によって拡大された、ヒトの満期胎盤に由来する接着性細胞のゲノム全域にわたる発現プロフィルを同時にモニターすることを可能にした。これらの結果は、これらの異なる成長方法によって得られる細胞の間における表現型変化の根底にある分子的機構を評価することを可能にした（下記の表５を参照のこと）。
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【０２５０】
ＰＬＸ−Ｃ細胞表面における細胞マーカーの発現。ＰＬＸ−Ｃによって発現される表面抗原を、モノクローナル抗体を使用して調べた。結果は、ＰＬＸ−Ｃ細胞が、ＣＤ７３、ＣＤ２９およびＣＤ１０５の陽性マーカー、ならびに、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１９、ＣＤ１４およびＨＬＡ−ＤＲの陰性マーカーによって特徴づけられたことを示していた（データは示されず）。免疫表現型試験の各項目は、すべての陽性マーカーについては９０％以上として設定され、すべての陰性マーカーについては３％以下として設定された。
【０２５１】
さらに、図１０Ａ〜図１０Ｂに示されるように、ＰＬＸ−Ｃ培養物は、ＣＤ３１およびＫＤＲの２つの内皮マーカーについての陰性の染色によって示されるように、内皮マーカーを発現していなかった。しかしながら、線維芽細胞に典型的なマーカーのＰＬＸ−Ｃ発現が明白であった（Ｄ７−ｆｉｂの発現、図１０Ｃ）。
【０２５２】
ＰＬＸ−Ｃ細胞の免疫原性および免疫調節性。ＰＬＸ−Ｃは、胎盤に由来する接着性細胞から構成されるので、身体のすべての細胞によって発現され、そして、同種反応性の免疫応答を誘導することが知られているＩ型ＨＬＡを発現することが予想される。ＩＩ型ＨＬＡおよび他の共刺激分子は典型的には、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面でのみ発現される。
【０２５３】
得られたＰＬＸ−Ｃ細胞の免疫原性を調べるために、これらの細胞膜の表面における共刺激分子の発現を行った。ＦＡＣＳ分析では、ＣＤ８０、ＣＤ８６およびＣＤ４０がＰＬＸ−Ｃ細胞膜に存在しないことが明らかにされた（図１１Ａ〜図１１Ｃ）。そのうえ、ＰＬＸ−Ｃは、ＨＬＡ  Ａ／Ｂ／Ｃについて染色することによって検出されるように、低いレベルのＨＬＡクラスＩを発現した（図１１Ｄ）。刺激分子および共刺激分子の発現は、（図１１Ａ〜図１１Ｄに示されるように）骨髄（ＢＭ）由来のＭＳＣと類似していた。
【０２５４】
ＰＬＸ−Ｃ細胞の免疫原性、ならびに、免疫調節特性をさらに調べるために、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）試験を行った。図１２Ａ〜図１２Ｂに示されるように、ＰＬＸ−Ｃ細胞は非自己認識（ａｌｌｏｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ）を逃れ、かつ、チミジン取り込みによって測定されるように、Ｔ細胞応答を低下させる。さらに、リンパ球増殖における低下が、（ＣＰＭ測定によって評価された場合）、ＰＬＸ−Ｃ細胞の数が増大するにつれて、（用量依存的な様式で）大きくなった。ＰＬＸ−Ｃはまた、リンパ球の増殖を、有糸分裂促進刺激剤（例えば、コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ、図１２Ｂ）およびフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）など）の後で、また、抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８による非特異的刺激の後で低下させた（データは示されず）。
【０２５５】
ＰＬＸ−Ｃがリンパ球増殖を免疫調節する作用機構を調べるために、また、この作用が細胞間の相互作用またはサイトカインの分泌を介して媒介されるかを確認するために、ＰＢ由来の単核細胞（ＭＮＣ）を、（細胞同士の接触を妨げ、しかし、２つの区画の間におけるサイトカインの拡散を可能にする）トランスウエル法を使用してＰＨＡによって刺激した。結果は、細胞同士の接触が阻害されたときでさえ、増殖の阻害が維持されたことを示した（データは示されず）。
【０２５６】
サイトカインの分泌。本明細書中上記で示されたように、ＰＬＸ−Ｃは、おそらくは可溶性因子により、リンパ球の増殖速度を低下させる。ＰＬＸ−Ｃに応答してリンパ球によって分泌されるサイトカインのさらなる調査を、ＰＬＸ−Ｃの作用機構を解明するために行った。図１３Ａ〜図１３Ｂに示されるように、単核細胞をＰＬＸ−Ｃとともに培養することにより、（少量のＰＬＸ−Ｃの存在下でさえ）、前炎症性サイトカインＩＦＮγの分泌が減少し、ＴＮＦαの分泌が劇的に減少する。加えて、リポ多糖（ＬＰＳ）刺激の後では、ＩＬ−１０の、ＰＢ由来ＭＮＣからの分泌がＰＬＸ−Ｃの存在下で増大し、一方、ＴＮＦαの分泌レベルが低下し、これらは用量依存的な様式であった（図１３Ｃ）。
【０２５７】
（実施例５）
ＰＬＸ−Ｃの体内分布
材料および実験方法
ルシフェラーゼ発現ベクターによるＰＬＸ−Ｃ細胞のトランスフェクション
ＰＬＸ−Ｃ細胞に、ルシフェラーゼ遺伝子をＣＭＶプロモーターの制御下で発現するレンチウイルス構築物（図１４）を安定的に感染させた。
【０２５８】
感染性ウイルスの作製
２９３ＴＮ産生株細胞を、血清および抗生物質が補充されたＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ）において、トランスフェクション前の２日間〜３日間成長させた（５０％〜７０％のコンフルエンシー）。１０μｇのパッケージングプラスミドおよび２μｇの発現構築物の混合物と、２０μｌのＰｌｕｓ（商標）試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とを、補充物を含まない４００μｌのＤＭＥＭに加えた。混合物を室温（ＲＴ）で１５分間インキュベーションし、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）（４００μｌのＤＭＥＭにおける３０μｌ希釈物）が加えられた。混合物をＲＴで１５分間インキュベーションした。２９３ＴＮ細胞を洗浄し、２％血清培地に移し、トランスフェクション混合物を加えた。細胞をＣＯ２インキュベーターにおいて３７℃で一晩インキュベーションし、培地を感染後２４時間〜６０時間で集めた。最大のウイルス産生が４８時間後に達成された。培地を集め、室温において３０００ｒｐｍで５分間遠心分離して、細胞破片をペレット化した。遠心分離後、上清をＭｉｌｌｅｘ−ＨＶの０．４５μｍのＰＶＤＦフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｃａｔ．＃ＳＬＨＶＲ２５ＬＳ）によりろ過した。
【０２５９】
ＰＬＸ−Ｃの感染
ＰＬＸ−Ｃ細胞を、ウイルス感染の２４時間前に、完全培地においてウエルあたり０．６〜１×１０５細胞の密度で２４ウエルプレートに播種した。２４時間後、０．５ｍｌのウイルス懸濁物（Ｐｏｌｙｂｒｅｎｅを５〜８μｇ／ｍｌの最終濃度で伴う完全培地で希釈されたもの）を加えた。細胞を２４時間インキュベーションし、その後、培地を完全ＤＭＥＭ培地によって置き換え、細胞を３７℃で５％ＣＯ２とともに一晩インキュベーションした。４日目に、培養はコンフルエンシーに達し、培養物を１：３〜１：５によって分割し、細胞を完全ＤＭＥＭにおいて４８時間成長させ、その後、細胞をルシフェラーゼ発現について分析した。
【０２６０】
感染効率比率は１００％に近かった。生細胞および生存マウスにおけるルミネセンスの評価を、ルシフェラーゼのルミネセンスシグナルを捕獲する高感度ＣＣＤカメラを含む、ＩＶＩＳ  Ｌｕｍｉｎａ  Ｉｍａｇｉｎｇシステムを使用して行った。
【０２６１】
感染の２週間後、２×１０６個の細胞を、ＳＣＩＤ／Ｂｅｉｇｅマウス、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス、ＳＣＩＤマウスおよびＢａｌｂ／ＣマウスにＩＭ注射またはＩＶ注射した。注射を受けたマウスを、記載されたＩＶＩＳシステムを使用してモニターした。
【０２６２】
実験結果
結果から明白であるように、ＣＸＬ細胞は感染後も分裂し続け、成長している細胞におけるルシフェラーゼの発現レベルは、強く、かつ、安定したままであった（図１５）。
【０２６３】
ＰＬＸ−Ｃ細胞がＢａｌｂ／Ｃマウスに注射されると、体内分布パターンが調べられた。結果から明白であるように、細胞がＩＭ注射後７２時間で消失した（データは示されず）。しかしながら、ＰＬＸ−Ｃ細胞は、インビトロでは、一定の高レベルのルシフェラーゼ発現を３週間以上にわたって保持した（データは示されず）。
【０２６４】
図１６Ａ〜図１６Ｄに示されるように、ＳＣＩＤ／Ｂｅｉｇｅマウスの免疫不全マウスにＩＭ注射された細胞は５日までは注射部位に留まり、それ以降は観測されなかった。ＳＣＩＤ／ＢｅｉｇｅマウスにＩＶ注射されたＣＸＬ細胞は２４時間後には肺に遊走し、その後、注射部位に遊走した（これは、おそらくは傷害部位へのホーミングであった）。その後、細胞は徐々に消失し、３週間後〜４週間後には観測されなかった。
【０２６５】
（実施例６）
接着性細胞は肢虚血をインビボで処置することができる
胎盤由来接着性細胞の移植により、虚血性損傷が軽減され、かつ、臨床的機能および運動機能が改善され得るかどうかを明らかにするために、後肢虚血モデルを下記のように使用した。
【０２６６】
材料および実験方法
後肢虚血モデル。後肢虚血を、８週齢〜１０週齢の、免疫不全でない２０匹のオスのＢａｌｂ／Ｃマウス（体重、およそ２５ｇ±２０％）において誘導した。動物の取扱いは国立衛生研究所（ＮＩＨ）および実験動物管理公認協会（ＡＡＡＬＡＣ）に従った。動物は標準的な実験室条件のもとで収容された。動物は、温度および湿度が制御された環境で飼育された。温度範囲が２０℃〜２４℃の間であり、相対湿度（ＲＨ）が３０％〜７０％の間であり、１２時間の照明および１２時間の消灯のサイクルが伴った。
【０２６７】
動物を、コンピューター作製乱数生成プログラム「Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｒａｎｄｏｍｉｚｅｒ」を使用してランダム化し、１０匹の動物からなる２つの群に分けた。一方の群が１×１０６個の胎盤由来接着性細胞（ＰＬＸ−Ｃ細胞）の筋肉内（ＩＭ）注射を受け、もう一方の群がコントロールとして役立ち、これには、ＰＢＳが注射された。
【０２６８】
手術手順。１ｃｍ〜１．５ｃｍの切開を鼠蹊部領域における皮膚において行った。大腿動脈を６−０絹糸により２回結紮し、結紮の遠位側で横切開した。創傷部を３−０絹糸により閉じ、マウスを回復させた。一方の大腿動脈の手術による切除の５時間後、マウスは１×１０６個の胎盤由来接着性細胞（ＰＬＸ−Ｃ）のＩＭ注射を２つの投与部位に５０μｌの総体積で受けた。コントロール群の動物には、ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）が同じように注射された。下記の表６を参照のこと。
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【０２６９】
経過観察。両側からの足における血流を、手術後、ならびに、手術後６日目、９日目、１４日目および２１日目に非接触式レーザードップラーにより３回連続して測定した。血流が、正常肢における流れに対する虚血肢における流れの比率して表される［Ｔｏｋａｉ．Ｊ．他］。
【０２７０】
虚血重篤度の肉眼評価。虚血肢を、壊死領域についての下記のグレードによる形態学的尺度を使用することによって研究終了まで、１日目、６日目、９日目、１４日目、２１日目に肉眼により評価した；グレード０：壊死の非存在、グレードＩ：足指に限定的な壊死（足指喪失）、グレードＩＩ：足背に広がる壊死（足喪失）、グレードＩＩＩ：すねに広がる壊死（膝喪失）、グレードＩＶ：腿に広がる壊死（後肢全喪失）［Ｔｏｋａｉ．Ｊ．他］。
【０２７１】
肢機能および虚血性損傷のインビボ評価。虚血肢の損なわれた使用の半定量的評価を下記のように連続的に行った：３＝足の引きずり、２＝引きずりがないが、足底屈もない、１＝足底屈、および、０＝足指を曲げて、尾の穏やかな牽引に抵抗する（Ｒｕｔｈｅｒｆｏｒｄ他、１９９７）。
【０２７２】
分子的分析および生化学的分析。臨床的評価に加えて、分子的および生化学的なサンプルを、胎盤由来接着性細胞（ＰＬＸ−Ｃ）注射群における改善された治癒の根底にある分子的機構をより良く理解するために２１日目に得た。これらは現在、分析中である。
【０２７３】
実験結果
胎盤由来接着性細胞の移植は虚血後肢モデルの腰および足における血流を著しく誘導する。接着性細胞の効力をインビボで試験するために、マウスを動脈結紮に供し、その後、胎盤由来接着性細胞を筋肉内注射して、血流を、処置後の所定の期間で、非接触式レーザードップラーを使用して腰および足（身体の両側）において測定した。図１７に示されるように、ＰＬＸ−Ｃの注射は、血流の評価、肢機能における増大、毛細管密度における増大、酸化ストレスおよび内皮損傷における低下によって明らかにされるように、損傷を受けた肢に対する血流（ＢＦ）を顕著に改善させた。血流に関して、効果が注射後９日で明らかにされ、全研究期間を通して観測された。ＰＬＸ−Ｃ処置群では、腰／移植領域において、ＢＦが２４±２．３％から８０±４．７％にまで増大し、一方、コントロールのビヒクル処置群では、ＢＦが３５±２％〜５４±４．５％の範囲にあった（それぞれ、０日目対２１日目）。腰領域と同様に、しかし、より小さい程度であったが、ＢＦにおける増大がまた、ＰＬＸ−Ｃ処置マウスの足領域において明らかにされた。例えば、図１７に示されるように、ビヒクル処置群では、ＢＦが１２±０．６％から４６±４．９％にまで増大し、一方、ＰＬＸ−Ｃ群では、ＢＦが１０±０．７％から５２±５．５％にまで増大した（それぞれ、０日目対２１日目）。
【０２７４】
接着性細胞は肢機能をインビボで改善することができる。胎盤由来接着性細胞のインビボ効果をさらに評価するために、処置されたマウスにおける肢機能を、本明細書中上記の材料および実験方法のところで記載されたスコア化システムを使用して評価した。図１８に示されるように、接着性細胞により処置されたマウスは肢機能における著しい改善を示した（２．５±０．２対２．１±０．２、それぞれ、コントロール群対ＰＬＸ−Ｃ群；処置後２１日目における著しい効果に留意すること）。しかしながら、２１日間の観察の期間中での肢機能における改善の程度は同程度であった。このことは、ＰＬＸ−Ｃが、本研究の条件のもとでは、機能回復の大きな変化を示さなかったことを示唆する。
【０２７５】
虚血重篤度の肉眼評価では、コントロールのビヒクル処置群において、足指に限定される壊死が６日目に２匹の動物において観測されたことが明らかにされた。ＰＬＸ−Ｃ処置群では、足指に限定される壊死が、１匹の動物においてだけで、しかも、１４日後にだけ観測された。ＰＬＸ−Ｃにより処置された肢の死後の免疫組織化学的分析では、肢に供給し、かつ、ＰＬＸ−Ｃが、血管形成を促進させる能力を有することを示唆する新しい毛細管（血管）の数における著しい増大が示された（図１９）。
【０２７６】
最後に、処置された動物における低下した酸化ストレスおよび内皮炎症における低下（これは、改善された内皮機能についての代替パラメーターであった）が、ＰＬＸ−Ｃ処置マウスにおいて観測された（図２０Ａ〜図２０Ｂ）。これは、ＰＢＳにより処置されたコントロールマウスにおいてではなく、ＰＬＸ−Ｃ細胞により処置されたマウスにおける増大した酸素供給に起因すると考えられた。
【０２７７】
結論として、コントロールのＰＢＳ注射マウスと比較されたとき、ＰＬＸ−Ｃ注射を受けたマウスはどれも、筋肉内（ｉ．ｍ．）の細胞投与に対する応答において何らかの有害な臨床的徴候または症状を示さなかった。したがって、ＰＬＸ−Ｃは血流における増大を誘導し、これは、損傷を受けた肢の組織学的評価によって裏付けられるように、血管形成から生じると考えられる。加えて、壊死の発生における遅れ、および、影響を受けた動物の数における差は、臨床的応答を示唆する。
【０２７８】
胎盤由来接着性細胞の移植
別の効力研究がＢａｌｂ／Ｃマウスにおいて行われ、これは、上記の材料および方法の節で記載されたように、安全性の終点（すなわち、全体的な検死、および、選択された器官の組織病理学的分析）を含んでいた。
【０２７９】
この研究では、各群が１０匹のオスのＢａｌｂ／Ｃマウス（虚血後肢）からなる７つのマウス群が、本明細書中下記の表７に詳しく記載されるように使用された。１０匹のマウスからなる１つの群だけは、（正常で、健康な動物におけるＰＬＸ−Ｃ細胞の全体的な安全性および寛容性を試験するために）虚血が誘導されなかった。虚血を誘導した後、コントロール緩衝液またはＰＬＸ−Ｃ細胞が、影響を受けた肢にｉ．ｍ．投与され、マウスが投与後１ヶ月までの期間にわたって観察された。１つのマウス群だけが、影響を受けた肢における２つの別の注射を１週間離して受けた（１日目および８日目）。血流をレーザードップラー分析によってモニターし、虚血重篤度を投与後３０日まで肉眼および行動により評価し、投与後３０日でマウスを屠殺し、組織を組織学的分析のために保持した。
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【０２８０】
この研究では、３つの濃度での異なるＰＬＸ−Ｃバッチが投与された。結果は、０．１×１０６個および０．５×１０６個のＰＬＸ−Ｃがわずかな治療的効果を有したことを示した。血流における注目に値する改善が、１×１０６個により処置された動物において２９日目（実験終了）までに観測された。血流におけるこの改善は、コントロールのビヒクル注射マウスとの比較では２Ｍ群（バッチＧ．Ｃ２５）において有意であった（ｐ＜０．０５）。加えて、１回だけの注射と比較して、同じバッチの細胞の２回目の注射は１５日目においてＢＦを著しく改善した（それぞれ、３１±１２．９％および２７±１２．５％と比較して、５５±２４％）。虚血重篤度の肉眼評価では、１×１０６個を受ける群（１Ｍおよび２Ｍ）における改善についての傾向がコントロールのビヒクル処置群（６Ｍ）との比較において認められたことが明らかにされた。
【０２８１】
全体的に見ると、これらの結果は、血管新生（例えば、血流）を誘導すること、および、肢機能を改善することにおける接着性細胞の効力を後肢虚血マウスモデルにおいて明らかにしており、また、虚血性肢疾患を処置するためのこれらの細胞（例えば、胎盤由来接着性細胞）の使用を示唆している。
【０２８２】
（実施例７）
脳卒中の処置のためのＰＬＸ−Ｃ
本研究の目的は、全身的（静脈内）ヒトＰＬＸ−Ｃの治療的効力、すなわち、脳卒中の処置における胎盤由来接着性細胞の移植を評価することであった。
【０２８３】
材料および実験方法
被験体、手術および移植
高血圧、高コレステロール血症、糖尿病および微小血管障害を患うオスの自然発症高血圧ラットを使用した。動物は、温度、空気湿度および照明／消灯サイクルに関する一定の条件のもとで飼育された。被験体を実験群にランダムに割り当てた（下記の表８を参照のこと）。
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【０２８４】
動物は、異なるバッチの１×１０６個のＰＬＸ−Ｃの１回だけの投与または２回の投与を受けた。すべての移植手順が静脈内に行われた。２回の注入を受けた群は、脳虚血の１０時間後および２４時間後に移植が行われ、一方、１回だけの移植は脳卒中の２４時間後に行われた。すべての移植された細胞は蛍光色素ＰＨＫ２６により事前に標識された。
【０２８５】
実験的脳虚血が右大脳動脈の永続的閉塞によって行われた。１匹の動物が麻酔後に死亡したことに留意すること。
【０２８６】
磁気共鳴調査（ＭＲＩ）
病変発達のＭＲＩを、１．５Ｔのスキャナー（Ｐｈｉｌｉｐｓ）を使用して、１日目、８日目、２９日目および６０日目に行った。梗塞体積測定および脳萎縮が測定され、冠状Ｔ２シーケンスを使用して、実験内容が知らされていない３名の研究者によって得られた値の平均として計算された。
【０２８７】
行動試験
機能的変化を、２つの独立した行動試験アレイを使用することによって測定した。梁歩行（Ｂｅａｍ  Ｗａｌｋ）試験は、感覚・運動欠損を定量するために使用される一般的な試験である。ラットを、ラットのホームケージが終点にある水平の固定された棒を渡るように条件づけした。通過時間が５回について測定され、昼間平均値として記録された。梁からのぶら下がりを２０秒により評価し、落下を３０秒により評価した。測定を最初の１週間においては毎日行い、観測期間の終了までは７日毎に行った。
【０２８８】
第２の試験、すなわち、改変された神経学的重篤度スコア（ｍＮＳＳ）は、感覚、運動および反射のさらなる項目を含有した。ｍＮＳＳの結果が１〜１８の間のスコアとして表され、１〜６の間の点数が軽度を意味し、７〜１２が中程度を意味し、１３〜１８が重篤な傷害を意味した。ｍＮＳＳスコアの評価を、脳虚血後１日目、４日目、７日目、１４日目、２１日目、２８日目、３５日目、４２日目、４９日目および５６日目に行った。
【０２８９】
組織学
実験期間終了後、すべてのラットを屠殺し、心臓を介して４％ホルマリン溶液により灌流した。摘出された脳を凍結保存し、３０μｍ厚の切片に切断した。神経膠反応の評価のために、免疫組織化学的調査を、ＧＦＡＰに対する一次抗体により行った。７５０μｍの広い領域を、ＧＦＡＰ＋の細胞の密度について梗塞境界の近くで（半定量的に）調べた。星状膠細胞の反応性の調査については、１５の領域が０．６ｍｍの平均間隔により含まれた。
【０２９０】
統計学
体重、ＭＲＩ分析および組織学的検査に関するすべてのデータがガウス分布について調べられ、また、ＡＮＯＶＡ、従って、順位でのＡＮＯＶＡを使用して統計学的有意差について分析された。
【０２９１】
梁歩行試験およびｍＮＳＳ試験で集められたデータは、被験体の反復測定について、同様にまた、被験体の時間的発達について個々に考慮する詳細な統計学的分析（階層化分析）に供された。脳損傷の程度に関する個体間の差を相殺するために、ランダム・インターセプト・モデルを使用した。したがって、梁歩行試験において集められたデータはカテゴリー的システムに変換しなければならなかった。ここでは、５秒未満の時間値がカテゴリー（０）と見なされ、５秒〜１０秒がカテゴリー（１）と見なされ、１０秒〜１５秒がカテゴリー（２）と見なされ、１５秒〜２０秒がカテゴリー（３）と見なされ、ぶら下がりがカテゴリー（４）と見なされ、落下がカテゴリー（５）と見なされた。
【０２９２】
実験結果
体重
定期的な体重測定は被験体の全身的な健康状態の良好な推定を可能にした。体重の初期減少が、麻酔および手術介入のためにすべての群において観測された（データは示されず）。その後、体重の迅速な正常化、および、６０日目での実験終了までの安定した経過が観測された（データは示されず）。実験群は体重の一致する進行を示した。
【０２９３】
梁歩行試験
すべての実験群が梁歩行カテゴリーの著しい低下を実験の経過中に示した（データは示されず）。梁歩行カテゴリーの著しいより低い低下が、実験群１（ＰＬＸ−Ｃ、バッチ１、１回だけの投与）において、コントロール群と比較して観測された（それぞれ、−０．０１２４７対−０．０２９３１）。統計学的有意差についての証拠が、実験群３（ＰＬＸ−Ｃ、バッチ２、１回だけの投与）と、コントロール群との間には認められなかった（データは示されず）。
【０２９４】
改変された神経学的重篤度スコア（ｍＮＳＳ）
すべての実験群が神経学的スコア点数の著しい低下を示した（データは示されず）。ＰＬＸ−２（ＰＬＸ−Ｃの２回の投与）により処置された被験体のｍＮＳＳ結果を比較することにより、統計学的に著しい優越が、コントロール群と比較して明らかにされた。バッチ２の二重移植（群３）は、同じバッチの１回だけの注射と比較して、ｍＮＳＳ試験における著しい改善を示した（データは示されず）。
【０２９５】
梗塞体積測定
磁気共鳴画像化は、脳損傷の程度および失われた組織をインビボで推定するための非常に精巧な方法である。個体間の変動を考慮に入れて、梗塞体積の発達が、１日目での梗塞体積の百分率として個々に示された。１日目での梗塞体積は実験群の間で著しく異ならなかった。梗塞体積の全体的な発達は、１日目と、８日目との間で、５０％のおおよその低下を示した。これは主に、初期脳水腫の退行のためであった。ＭＲＩを使用するインビボでの病変発達の検査は、群４（ＰＬＸ−Ｃ、バッチ２、２回の投与）の被験体が、著しく低下した梗塞商を６０日目に示したことを明らかにした（それぞれ、０．４８±０．０２対０．６０±０．０３、データは示されず）。
【０２９６】
まとめると、これらの結果は、ＰＬＸ−Ｃの静脈内投与が脳卒中の処置における両方の行動試験において機能的回復における著しい改善をもたらしたことを示している。そのうえ、ＰＬＸ−Ｃを２回移植することの、相当、かつ、しかも、統計学的に有意な優越が、類似した１回だけの注射と比較して観測された。
【０２９７】
測定された行動改善の、ＭＲＩによる裏付けが、ＰＬＸ−Ｃにより２回処置された被験体において明白であった。加えて、梗塞体積および脳萎縮の著しい減少が実験終了時に観測された。そのうえ、両方の機能的試験では、ＰＬＸ−Ｃの２回施された移植の後での機能回復の安定した改善が、コントロール、および、１回だけの注射での確認できない効果と比較して観測された。
【０２９８】
（実施例８）
結合組織の再生および／または修復を必要とする病理の処置
骨の再生および／または修復を必要とする病理を、本発明の接着性細胞を使用して処置すること
動物モデル（例えば、成熟したニュージーランド白ウサギ）が、大腿骨における臨界的サイズの部分的欠損の治癒に対する、（胎盤組織または脂肪組織に由来し、３Ｄ培養から得られる）本発明の接着性細胞（例えば、ＰＬＸ−Ｃ細胞）の影響を調べるために使用される。動物が３つの群の１つにランダムに割り当てられる。Ａ群の動物には、１〜１０×１０６個の接着性細胞（ＰＬＸ−Ｃ細胞）が欠損部位内に注射される。Ｂ群の動物には、ＰＢＳが注射される。Ｃ群の動物においては、欠損部が処置されないままにされた。Ｘ線写真が手術直後および１週間間隔で撮影される。１２週で、動物は屠殺され、関与した大腿骨が取り出され、欠損部および隣接する骨からの非脱灰の組織学的切片が調製される。機構的研究、組織学的研究および組織形態学的研究が、欠損部の治癒および骨の形成を欠損部位およびその回りにおいて調べるために行われる。加えて、逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）が、Ｉ型コラーゲンおよびＩＩ型コラーゲンのｍＲＮＡを検出するために行われる。
【０２９９】
腱の再生および／または修復を必要とする病理を、本発明の接着性細胞を使用して処置すること
動物モデル（例えば、骨格的に成熟したニュージーランド白ウサギ）が、腱の治癒に対する本発明の接着性細胞（例えば、ＰＬＸ−Ｃ細胞）の影響を調べるために使用される。長母趾腱が２．５ｍｍの直径の踵骨トンネルの中に移動させられる。骨トンネルがＰＬＸ−Ｃにより処置されるか、または、ＰＬＸ−Ｃを用いることなく処置される。動物が３つの群の１つにランダムに割り当てられる。Ａ群の動物には、１〜１０×１０６個のＰＬＸ−Ｃ細胞が欠損部位内に注射されるか、または、ＩＶ注射される。Ｂ群の動物には、ＰＢＳが注射される。Ｃ群の動物においては、欠損部が処置されないままにされる。それぞれの群からの３つの試料が、手術後２週間、４週間および６週間で集められ、骨界面に対する治癒途中の腱の形態学的特徴についての評価が、従来の組織学、ならびに、Ｉ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲンおよびＩＩＩ型コラーゲンの免疫組織化学的位置特定の使用によって行われる。
【０３００】
軟骨の再生および／または修復を必要とする病理を、本発明の接着性細胞を使用して処置すること
動物モデル（例えば、骨格的に成熟したニュージーランド白ウサギ）が、軟骨の治癒に対する本発明の接着性細胞（例えば、ＰＬＸ−Ｃ細胞）の影響を調べるために使用される。左遠位大腿の膝蓋骨溝の関節軟骨の全層欠損が行われる。約６ｍｍの皮弁が、大腿四頭筋に重なる筋膜から除かれ、６−０腸線により人為的欠損部の周辺の縁に縫合される。動物が３つの群の１つにランダムに割り当てられる。Ａ群の動物には、１〜１０×１０６個のＰＬＸ−Ｃ細胞が欠損部位内に注射されるか、または、ＩＶ注射される。Ｂ群の動物には、ＰＢＳが注射される。Ｃ群の動物においては、欠損部が処置されないままにされる。動物が屠殺される。ＰＬＸ−Ｃ細胞が骨軟骨の欠損部に移植された１４週間後、遠位大腿が切除され、組織学的評価が行われ、試料が、修復組織の優勢な性質、マトリックス染色、表面の規則性、構造的一体性、修復部の厚さ、修復された軟骨と、周囲の正常な軟骨との間での付着、変性徴候が修復組織にないこと、および、周囲の正常な軟骨の変性変化がないことに基づいて半定量的に階級評価される。
【０３０１】
靱帯の再生および／または修復を必要とする病理を、本発明の接着性細胞を使用して処置すること
動物モデル（例えば、骨格的に成熟したニュージーランド白ウサギ）が、靱帯の治癒に対する本発明の接着性細胞（例えば、ＰＬＸ−Ｃ細胞）の影響を調べるために使用される。直径が８ｍｍの単皮質（ｕｎｉｃｏｒｔｉｃａｌ）円形欠損が行われる。動物が３つの群の１つにランダムに割り当てられる。Ａ群の動物には、１〜１０×１０６個のＰＬＸ−Ｃ細胞が欠損部位内に注射されるか、または、ＩＶ注射される。Ｂ群の動物には、ＰＢＳが注射される。Ｃ群の動物においては、欠損部が処置されないままにされる。動物が、靱帯欠損部へのＰＬＸ−Ｃ細胞の移植の１４週間後に屠殺される。組織学的評価が行われ、試料が、修復組織の優勢な性質に基づいて半定量的に階級評価される。
【０３０２】
明確にするため別個の実施態様で説明されている本発明の特定の特徴は単一の実施態様に組み合わせて提供することもできることは分かるであろう。逆に、簡潔にするため単一の実施態様で説明されている本発明の各種の特徴は別個にまたは適切なサブコンビネーションで提供することもできる。
【０３０３】
本発明はその特定の実施態様によって説明してきたが、多くの別法、変更および変形があることは当業者には明らかであることは明白である。従って、本発明は、本願の請求項の精神と広い範囲の中に入るこのような別法、変更および変形すべてを包含するものである。本明細書中で言及した刊行物、特許および特許願ならびにＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号はすべて、個々の刊行物、特許もしくは特許願またはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号が各々あたかも具体的にかつ個々に引用提示されているのと同程度に、全体を本明細書に援用するものである。さらに、本願で引用または確認したことは本発明の先行技術として利用できるという自白とみなすべきではない。
【０３０４】
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【図１Ａ−Ｇ】
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【図２】
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【図３Ａ−Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５Ａ−Ｄ】
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【図６】
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【図７Ａ−Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ−Ｃ】
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【図１１Ａ−Ｄ】
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【図１２Ａ−Ｂ】
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【図１３Ａ−Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ−Ｂ】
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【図１６Ｃ−Ｄ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９Ａ−Ｃ】
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【図２０Ａ−Ｂ】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年7月1日(2014.7.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
虚血を処置することにおける使用のための医薬品を製造するための、胎盤組織および脂肪組織からなる群から選択される組織の接着性細胞の使用であって、接着性細胞が、二次元接着性細胞選択、およびそれに続く三次元マトリックス上での接着性培養によって単離されたものである、使用。
【請求項２】
虚血を処置することにおける使用のための表示を含む包装材を含む製造物であって、前記包装材により、胎盤組織および脂肪組織からなる群から選択される組織の接着性細胞の医薬的に効果的な量が包装され、接着性細胞が、二次元接着性細胞選択、およびそれに続く三次元マトリックス上での接着性培養によって単離されたものである、製造物。
【請求項３】
前記接着性細胞は免疫反応を対象において抑制することができる、請求項１に記載の使用。
【請求項４】
前記接着性細胞の少なくとも１０％が増殖期にある、請求項１に記載の使用。
【請求項５】
前記虚血は末梢動脈疾患（ＰＡＤ）である、請求項１に記載の使用。
【請求項６】
前記末梢動脈疾患（ＰＡＤ）は虚血肢である、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
前記末梢動脈疾患（ＰＡＤ）は重症虚血肢（ＣＬＩ）である、請求項５に記載の使用。
【請求項８】
前記虚血は中枢神経系（ＣＮＳ）の虚血を含む、請求項１に記載の使用。
【請求項９】
前記虚血が、虚血性血管疾患、虚血性心臓疾患、虚血性脳疾患、虚血性腎臓疾患および虚血性胎盤からなる群から選択される、請求項１に記載の使用。
【請求項１０】
前記接着性培養が灌流下で行われる、請求項１に記載の使用。
【請求項１１】
前記バイオリアクターが、合成接着性材料を含む、請求項１に記載の使用。
【請求項１２】
前記接着性材料が、ポリエステルおよびポリプロピレンからなる群から選択される、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
前記接着性培養が少なくとも３日間にわたって行われる、請求項１に記載の使用。
【請求項１４】
前記接着性培養が、前記細胞の少なくとも１０％が増殖中になるまで行われる、請求項１に記載の使用。
【請求項１５】
前記接着性細胞は、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ２９およびＣＤ１０５からなる群から選択される細胞マーカーを発現する、請求項１に記載の使用。
【請求項１６】
前記接着性細胞は、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ４５、ＣＤ８０、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１９およびＣＤ７９からなる群から選択される細胞マーカーを発現しない、請求項１に記載の使用。
【請求項１７】
前記接着性細胞は、間質幹細胞表現型を含む細胞を含む、請求項１に記載の使用。
【請求項１８】
前記間質幹細胞表現型はＴ細胞抑制活性を含む、請求項１７に記載の使用。
【請求項１９】
前記接着性細胞は、胎盤からのものである、請求項１に記載の使用。
【請求項２０】
前記接着性細胞は、脂肪組織からのものである、請求項１に記載の使用。
【請求項２１】
前記医薬品の製造の前に、前記バイオアクターから前記接着性細胞を除去することをさらに含む、請求項１に記載の使用。
【請求項２２】
前記医薬品が同種医薬品である、請求項１に記載の使用。
【請求項２３】
前記医薬品が、数日間から数週間にわたる処置を伴う複数回の投与のためのものである、請求項１に記載の使用。
【請求項２４】
前記医薬品が、免疫抑制と共に投与されるためのものである、請求項１に記載の使用。