(57)【要約】【課題】シュウ酸濃度が低減された植物体の製造法を提供する。【解決手段】植物に放射線を照射すること、および放射線が照射された前記植物を栽培することにより、シュウ酸含有量が低減された植物体を製造する。【選択図】図１
2014150763.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物に放射線を照射すること、および放射線が照射された前記植物を栽培することを含む、シュウ酸含有量が低減された植物体を製造する方法。
【請求項２】
前記植物が、タデ科、カタバミ科、セリ科、キク科、ヒユ科、スベリヒユ科、トウダイグサ科、またはヒガンバナ科の植物である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記植物が、タデ科の植物である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記タデ科の植物が、エゾノギシギシである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記植物が、セリ科の植物である、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記セリ科の植物が、パセリである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記放射線が、植物の種子に照射される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記放射線が、ガンマ線である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
放射線の照射線量が、１０Ｇｙ〜５００Ｇｙである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法により製造される植物体を含む飲食品。
【請求項１１】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法により製造される植物体を含む飼料。
【請求項１２】
請求項１１に記載の飼料を家畜に投与することを含む、家畜を飼育する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シュウ酸濃度が低減された植物体の製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
シュウ酸（蓚酸（oxalic acid））は、構造式 HOOC-COOH（Mw 90.03）で表される最も
単純なジカルボン酸である。シュウ酸は、漢字名に示される様に、例えばタデ科の植物に多く含まれる物質である。
【０００３】
植物には、シュウ酸を、シュウ酸ナトリウム等の水溶性シュウ酸として含有するものや、シュウ酸カルシウム等の不溶性シュウ酸塩の形で含有するものがある。例えば、サトイモ科の植物の汁（とろろ）が皮膚につくと痒みを生じるのは、シュウ酸カルシウムの結晶が肌に刺さるためであることはよく知られている。
【０００４】
シュウ酸は、植物においては、被食防御や根圏のアルミニウムなどの金属イオン耐性などに役立つ生理活性物質であることが報告されている（非特許文献１）。一方、人や家畜にとっては、シュウ酸は、消化器粘膜への刺激、体内のカルシウムと結合することによるカルシウム欠乏症状、腎臓でのシュウ酸カルシウム結晶による尿管閉塞などの原因となり、重篤な場合は死に至る（非特許文献２〜４）。そのため、シュウ酸は、医薬用外劇物に指定されている。
【０００５】
現在、食用あるいは家畜の飼料用として用いられている植物には、シュウ酸を高蓄積する種も多く存在する（表１）。近年、健康維持への関心が高まり、食料から摂取するシュウ酸量の低減策の開発が望まれている。
【０００６】
【表１】
2014150763.tif 000003
【０００７】
例えば、シュウ酸含量が植物の生育条件に左右されることに注目し、生育の際に与える栄養素を調節することによってシュウ酸量を低減させようとする手法がある。しかしながら、この手法では、植物種ごとに生育に必要な栄養組成が異なるため、植物種ごとに条件
を最適化する必要がある。
【０００８】
また、交配育種により、シュウ酸含量が低い品種を得る手法がある。しかしながら、この手法では、交配を繰り返す必要があり、育成に長い時間がかかる。
【０００９】
また、シュウ酸オキシダーゼ等の酵素を利用して植物体や植物抽出物中のシュウ酸を分解除去する手法（特許文献１）や、シュウ酸分解細菌の摂取により人や家畜のシュウ酸レベルを低減する手法（特許文献２、３）も知られている。しかしながら、これらの手法では、酵素処理に伴うコストや、細菌の使用に伴う安全性の確保等の点で課題が残る。
【００１０】
また、ホウレンソウについて、ガンマ線やイオンビームを種子に照射することにより、シュウ酸濃度の低減された変異体を創出する試みがなされている（非特許文献５）。しかしながら、遺伝的にシュウ酸濃度の低減した株は得られておらず、また、照射当代におけるシュウ酸濃度については何ら記載されていない。
【００１１】
このように、植物のシュウ酸濃度を低減する効果的な手法は知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特開2000-032926
【特許文献２】特表2009-531275
【特許文献３】特表2009-519333
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ma, J. F. et al., (2001). Trend in Plant Science, 6, 273-278
【非特許文献２】Reig, R. et al., (1990). Veterinary and Human Toxicology, 32, 468-470
【非特許文献３】Dickie, C. W. et al., (1978). Journal of the American Veterinary Medical Association, 173, 73-74
【非特許文献４】Panciera, R. J. et al., (1990). Journal of the American Veterinary Medical Association, 196, 1981-1984
【非特許文献５】Hata et al., (2006). Scientific Reports of the Faculty of Agriculture Okayama University, 95, 21-28
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は、シュウ酸濃度が低減された植物体の製造法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本願発明者らは鋭意検討の末、植物の種子にガンマ線を照射して生育させることによりシュウ酸濃度が低減された植物体を製造できることを見出し、本発明を完成させた。
【００１６】
すなわち、本発明は以下の通り例示できる。
［１］
植物に放射線を照射すること、および放射線が照射された前記植物を栽培することを含む、シュウ酸含有量が低減された植物体を製造する方法。
［２］
前記植物が、タデ科、カタバミ科、セリ科、キク科、ヒユ科、スベリヒユ科、トウダイグサ科、またはヒガンバナ科の植物である、前記方法。
［３］
前記植物が、タデ科の植物である、前記方法。
［４］
前記タデ科の植物が、エゾノギシギシである、前記方法。
［５］
前記植物が、セリ科の植物である、前記方法。
［６］
前記セリ科の植物が、パセリである、前記方法。
［７］
前記放射線が、植物の種子に照射される、前記方法。
［８］
前記放射線が、ガンマ線である、前記方法。
［９］
放射線の照射線量が、１０Ｇｙ〜５００Ｇｙである、前記方法。
［１０］
前記方法により製造される植物体を含む飲食品。
［１１］
前記方法により製造される植物体を含む飼料。
［１２］
前記飼料を家畜に投与することを含む、家畜を飼育する方法。
【発明の効果】
【００１７】
本発明により、シュウ酸濃度が低減された植物体を製造できる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、エゾノギシギシの種子に 0〜500 Gy のガンマ線を照射した際の、第3葉のシュウ酸含有量を示す図である。シュウ酸含有量は、CE-MSで定量し、照射線量ごとに平均値として示した。
【図２】図２Ａは、シュウ酸含有量の低下の程度が小さい10個体（高シュウ酸個体）とシュウ酸含有量の低下の程度が大きい10個体（低シュウ酸個体）についての、主要代謝産物のヒートマップである。図２Ｂは、ヒートマップのデータをもとに階層的クラスター解析を行って作成した樹形図である。
【図３】図３は、パセリの種子に 0〜600 Gy のガンマ線を照射した際の、発芽率および致死率を示す図である。
【図４】図４は、パセリの種子に 0〜300 Gy のガンマ線を照射した際の、第3葉のシュウ酸含有量を示す図である。シュウ酸含有量は、CE-MSで定量し、照射線量ごとに平均値として示した。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２０】
本発明は、シュウ酸濃度が低減された植物体を製造する方法を提供する。以下、同方法を「本発明の方法」ともいう。
【００２１】
本発明の方法は、植物に放射線を照射する工程（以下、「照射工程」ともいう）を含む。
【００２２】
放射線としては、特に制限されないが、アルファ線、ベータ線、ガンマ線、中性子線、Ｘ線、イオンビームが挙げられる。放射線は、例えば、アルファ線、ベータ線、ガンマ線、中性子線、Ｘ線からなる群より選択されてもよい。放射線としては、ガンマ線が好ましい。これらの放射線は、単独で用いてもよく、2種またはそれ以上を組み合わせて用いて
もよい。
【００２３】
放射線源としては、所望の放射線を照射するものを用いることができる。例えば、ガンマ線源としては、コバルト60を用いることができる。
【００２４】
放射線の照射線量は、放射線の種類や植物の種類等の諸条件に応じて適宜設定することができる。放射線の照射線量は、例えば、1 Gy 以上、10 Gy 以上、50 Gy 以上、100 Gy 以上、150 Gy 以上、または 190 Gy 以上であってよい。放射線の照射線量は、例えば、1000 Gy 以下、700 Gy 以下、600 Gy 以下、500 Gy 以下、400 Gy 以下、または 300 Gy 
以下であってよい。放射線の照射線量は、例えば、1 Gy〜10 Gy、10 Gy〜30 Gy、30 Gy〜50 Gy、50 Gy〜100 Gy、100 Gy〜150 Gy、150 Gy〜200 Gy、200 Gy〜250 Gy、250 Gy〜300 Gy、300 Gy〜350 Gy、350 Gy〜400 Gy、400 Gy〜450 Gy、450 Gy〜500 Gy、500 Gy〜550 Gy、550 Gy〜600 Gy、600 Gy〜650 Gy、650 Gy〜700 Gy、700 Gy〜750 Gy、750 Gy〜800 Gy、800 Gy〜850 Gy、850 Gy〜900 Gy、900 Gy〜950 Gy、または 950 Gy〜1000 Gyであってよい。放射線の照射線量は、具体的には、例えば、10 Gy〜500 Gy、100 Gy〜500 Gy
、150 Gy〜500 Gy、190 Gy〜500 Gy、100 Gy〜300 Gy、150 Gy〜300 Gy、または 190 Gy
〜300 Gyであってよい。また、放射線の照射線量は、例えば、対象の植物について LD50 となる線量の、5 % 以上、10 % 以上、30 % 以上、50 % 以上、または 70 % 以上の線量
であってもよい。また、放射線の照射線量は、例えば、対象の植物について LD50 となる線量の、500 % 以下、300 % 以下、250 % 以下、200 % 以下、または 150 % 以下の線量
であってもよい。
【００２５】
放射線の照射時間は、放射線源の強度と放射線の照射線量に応じて決定できる。
【００２６】
放射線は、植物の種子に照射してもよく、発芽後の植物体に照射してもよい。
【００２７】
放射線は、植物の全体に照射してもよく、植物の一部の部位に照射してもよい。放射線を照射する部位は、植物の種類や植物の利用目的等の諸条件に応じて適宜設定することができる。一部の部位としては、例えば、葉や茎が挙げられる。
【００２８】
放射線の照射前に、植物を前処理に供してもよい。例えば、放射線の照射前に、種子を低温処理に供してもよい。低温処理としては、例えば、0℃〜10℃で、10分〜24時間処理
することが挙げられる。
【００２９】
放射線は、1回のみ照射してもよく、2回またはそれ以上照射してもよい。2回またはそ
れ以上照射する場合、各回の放射線の種類、照射部位、および照射線量等の照射条件は、同一であってもよく、そうでなくてもよい。2回またはそれ以上照射する場合、例えば、
照射線量の合計が上記例示した照射線量となるように照射してもよく、各回の照射線量が上記例示した照射線量となるように照射してもよい。
【００３０】
本発明の方法は、照射工程後に、放射線が照射された植物を栽培する工程（以下、「栽培工程」ともいう）を含む。「放射線が照射された植物を栽培する」とは、放射線を植物の種子に照射した場合には、放射線が照射された種子を栽培することをいい、放射線を発芽後の植物体に照射した場合には、放射線が照射された植物体をさらに栽培することをいう。照射工程後の栽培期間は、植物の種類や植物の利用目的等の諸条件に応じて適宜設定することができる。栽培は、例えば、植物体が食用および／または家畜の飼料用に適した状態になるまで行ってよい。植物体は、栽培工程後に、適宜収穫することができる。
【００３１】
放射線を照射する時期は、上記栽培工程の前に放射線の照射が行われる限り、特に制限されない。放射線を照射する時期は、放射線の種類や植物の種類等の諸条件に応じて適宜
設定することができる。放射線の照射は、例えば、栽培終了の 1日前、3日前、1週間前、2週間前、1ヶ月前、または 2ヶ月前までに行ってよい。また、放射線の照射は、例えば、総栽培期間の 90 % の期間の経過以前、70 % の期間の経過以前、または 50 % の期間の
経過以前に行ってよい。ここでいう「総栽培期間」とは、播種してから収穫するまでの期間をいう。また、放射線の照射は、栽培開始前に、すなわち、種子に対して行うのが好ましい。
【００３２】
植物の栽培は、通常、植物の栽培に用いられる条件で行うことができる。具体的には、例えば、光と水の存在下で栽培を行うことができる。栽培の際には、適宜、肥料等の成分を用いてもよい。
【００３３】
本発明の方法が適用される植物の種類は特に制限されない。本発明の方法は、特に、本来的にシュウ酸濃度が高い植物に好適に適用できる。
【００３４】
植物としては、食用または家畜の飼料用として用いられるものが好ましい。植物は、本来的に食用または家畜の飼料用として用いられるものであってもよい。また、植物は、本来は食用または家畜の飼料用として用いられないが、シュウ酸濃度が低減された結果、食用または家畜の飼料用として好適となるものであってもよい。
【００３５】
植物としては、特に制限されないが、例えば、タデ科（Polygonaceae）植物、アカザ科（Chenopodiaceae）植物、カタバミ科（Oxalidaceae）植物、セリ科（Apiaceae）植物、
キク科（Asteraceae）植物、ヒユ科（Amaranthaceae）植物、スベリヒユ科（Portulacaceae）植物、トウダイグサ科（Euphorbiaceae）植物、ヒガンバナ科（Amaryllidaceae）植
物が挙げられる。
【００３６】
タデ科植物としては、ギシギシ属（Rumex）植物が挙げられる。ギシギシ属植物として
は、スイバ、ヒメスイバ、ギシギシ、エゾノギシギシが挙げられる。
【００３７】
アカザ科植物としては、アカザ属（Chenopodium）植物、ホウレンソウ属（Spinacia）
植物、フダンソウ属（Beta）植物が挙げられる。アカザ属植物としては、アカザ、シロザが挙げられる。ホウレンソウ属植物としては、ホウレンソウが挙げられる。フダンソウ属植物としては、テンサイ（ビート）が挙げられる。
【００３８】
カタバミ科植物としては、カタバミ属（Oxalis）植物が挙げられる。カタバミ属植物としては、カタバミが挙げられる。
【００３９】
セリ科植物としては、セロリ属（Apium）植物、ミツバ属（Cryptotaenia）植物、ニン
ジン属（Daucus）植物、セリ属（Oenanthe）植物、オランダゼリ属（Petroselinum）植物が挙げられる。セロリ属植物としては、セロリが挙げられる。ミツバ属植物としては、ミツバが挙げられる。ニンジン属植物としては、ニンジンが挙げられる。セリ属植物としては、セリが挙げられる。オランダゼリ属植物としては、パセリ、イタリアンパセリが挙げられる。
【００４０】
キク科植物としては、アキノノゲシ属（Lactuca）植物が挙げられる。アキノノゲシ属
植物としては、レタスが挙げられる。
【００４１】
ヒユ科植物としては、ヒユ属（Amaranthus）植物が挙げられる。ヒユ属植物としては、アマランサスが挙げられる。
【００４２】
スベリヒユ科植物としては、スベリヒユ属（Portulaca）植物が挙げられる。スベリヒ
ユ属植物としては、スベリヒユが挙げられる。
【００４３】
トウダイグサ科植物としては、イモノキ属（Manihot）植物が挙げられる。イモノキ属
植物としては、キャッサバが挙げられる。
【００４４】
ヒガンバナ科植物としては、ネギ属（Allium）植物が挙げられる。ネギ属植物としては、チャイブ（セイヨウアサツキ）が挙げられる。
【００４５】
植物は、ホウレンソウ以外の植物であってもよい。
【００４６】
本発明の方法により、シュウ酸濃度が低減された植物体が得られる。本発明の方法により得られるシュウ酸濃度が低減された植物体を「本発明の植物体」ともいう。
【００４７】
本発明において、「シュウ酸濃度が低減された」とは、本発明の植物体のシュウ酸濃度が、対照の植物体のシュウ酸濃度と比較して、低下していることをいう。対照の植物体としては、例えば、得られた植物体と同種の植物体であって、本発明の方法を適用していないものを用いることができる。「シュウ酸濃度が低減された」とは、本発明の植物体のシュウ酸濃度が、対照の植物体のシュウ酸濃度と比較して、低下していれば特に制限されないが、例えば、本発明の植物体のシュウ酸濃度が、対照の植物体のシュウ酸濃度の 90 % 以下、80 % 以下、70 % 以下、60 % 以下、または 50 % 以下に低下していることであっ
てよい。
【００４８】
シュウ酸濃度は、本発明の植物体の全体において低下していてもよく、本発明の植物体の一部の部位においてのみ低下していてもよい。本発明の植物体の一部の部位においてのみシュウ酸濃度が低下する場合、少なくとも食用または家畜の飼料用として用いられる部位においてシュウ酸濃度が低下しているのが好ましい。
【００４９】
シュウ酸濃度が低減された植物体が得られたことは、得られた植物体の全体または一部の部位におけるシュウ酸濃度を測定し、対照の植物体の全体または一部の部位におけるシュウ酸濃度と比較することにより確認できる。シュウ酸濃度の測定は、当業者によく知られた手法により行うことができる。そのような手法としては、HPLC、LC-MS、GC-MS、CE-MSが挙げられる。また、市販のシュウ酸定量キットを用いてもよい。
【００５０】
本発明の方法は、さらに、放射線が照射された植物を継代する工程を含んでいてもよい。以下、放射線が照射された世代を「照射当代」ともいう。照射当代の植物を継代することにより、シュウ酸濃度が低減された植物体を再生産することができる。すなわち、本発明の植物体には、照射当代の植物体に限られず、シュウ酸濃度が低減されている限りにおいて、照射当代の植物から継代して得られる後代の植物体も含まれる。継代は、1回のみ
行われてもよく、2回またはそれ以上行われてもよい。
【００５１】
継代は、例えば、照射当代の植物体から得られた種子を栽培することによって行うことができる。また、継代は、照射当代の植物体を挿し木や組織培養により増殖させることによっても行うことができる。また、このようにして得られた後代の植物体から、同様の手順でさらに継代を行うことができる。なお、継代は、シュウ酸濃度が低減された植物体が再生産される限りにおいて、シュウ酸濃度が低減された植物体と対照の植物体とを掛け合わせることを含んでいてもよい。よって、具体的には、例えば、本発明の植物体には、シュウ酸濃度が低減されている限りにおいて、照射当代の植物から得られた種子を栽培することによって得られた植物体、照射当代の植物体から挿し木や組織培養により得られたクローン植物体、およびそれらの後代の植物体も含まれる。
【００５２】
本発明の植物体は、例えば、食用として利用してよい。すなわち、本発明は、本発明の植物体を含む飲食品（以下、「本発明の飲食品」ともいう）を提供する。
【００５３】
本発明の飲食品は、本発明の植物体のみからなるものであってもよく、他の原料を含むものであってもよい。「他の原料」としては、経口摂取可能なものであれば特に制限されず、例えば、飲食品や医薬品に配合して利用されるものを利用できる。本発明の植物体は、そのまま利用してもよく、適宜加工して利用してもよい。
【００５４】
飲食品の種類は特に制限されない。飲食品としては、例えば、果汁、野菜汁、アルコール飲料、スープなどの飲料、加工食品、パン類、麺類、菓子類、薬味、香辛料、調味料等が挙げられる。本発明の飲食品は、本発明の植物体を原料として用いること以外は、通常の飲食品と同様の原料を用い、同様の方法によって製造することができる。
【００５５】
本発明の飲食品は、シュウ酸の摂取が原因となる症状の予防、改善、および／または治療用の飲食品として利用できる。よって、本発明の飲食品は、例えば、シュウ酸の摂取が原因となる症状の予防、改善、および／または治療に有効である旨を容器や包装に表示した飲食品として提供されてよい。そのような症状としては、腎結石や尿路結石が挙げられる。
【００５６】
本発明の植物体は、例えば、家畜の飼料用として利用してよい。すなわち、本発明は、本発明の植物体を含む飼料（以下、「本発明の飼料」ともいう）を提供する。
【００５７】
家畜としては、乳用、肉用、卵用、毛用、皮革用、または労働力用の動物や、イヌ、ネコ等のペット（愛玩動物）が挙げられる。家畜として、具体的には、例えば、牛、豚、鶏、馬、七面鳥、羊、山羊、イヌ、ネコが挙げられる。
【００５８】
本発明の飼料は、本発明の植物体のみからなるものであってもよく、他の原料を含むものであってもよい。「他の原料」としては、家畜が経口摂取可能なものであれば特に制限されず、例えば、飼料や医薬品に配合して利用されるものを利用できる。本発明の植物体は、そのまま利用してもよく、適宜加工して利用してもよい。
【００５９】
本発明の飼料は、本発明の植物体を原料として用いること以外は、通常の飼料と同様の原料を用い、同様の方法によって製造することができる。
【００６０】
また、本発明は、本発明の飼料を家畜に投与することを含む家畜を飼育する方法を提供する。本発明の飼料は、単独で家畜に投与されてもよく、他の飼料と組み合わせて家畜に投与されてもよい。飼料は、自由摂取により家畜に投与されてもよく、強制摂取により家畜に投与されてもよい。
【実施例】
【００６１】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。
【００６２】
実施例１：シュウ酸濃度が低減されたエゾノギシギシの作出
本実施例では、エゾノギシギシの種子にガンマ線を照射することにより、シュウ酸濃度が低減されたエゾノギシギシの作出を行った。
【００６３】
（１）材料と方法
（１−１）植物材料と処理
4℃で低温処理した花被片無しのエゾノギシギシの種子にガンマ線 (0、150、200、300
、500、700、1000、1500、2000、3000 Gy) を照射した。ガンマ線照射の際は、種子をチ
ューブに入れ、コバルト60を線源として照射を行った。照射後の種子は水で湿らせた濾紙を敷いたプラスチックシャーレ (非滅菌) 上に播いた。シャーレはインキュベーター (60
μmol photon/m2s、連続光、22℃) に入れ、種子を発芽させた。発芽後、種子を Jiffy-7 (φ3 cm × 4 cm、Jiffy Products International AS、Norway) に植え替え、培養室 (60 μmol photon/m2s、連続光、22℃) で育成した。発芽 1ヶ月後に第3葉を回収し、液体窒素で急速冷凍した。
【００６４】
（１−２）CE-MS による代謝物の測定
凍らせた葉を液体窒素で冷やしながら乳鉢と乳棒を用いてすり潰した。サンプル 50 mg
に対し、メタノール 200 μl を加えてタンパク質を不活性化させた。さらに、内部標準として 50 μM ピペラジン-1,4-ビス(2-エタンスルホン酸) 及び 50 μM メチオニンスルホンを含むミリQ水を加えてボルテックスで攪拌し、その後遠心分離 (15000 rpm、5 min
、4℃) を行った。得られた上清を分画分子量 3 kDa の限外濾過フィルター (Millipore
、Japan) に移して遠心分離 (12000 rpm、30 min、4℃) し、高分子化合物を取り除いた
。得られた濾液 13 μl を測定試料として Agilent ChemStation Software を搭載した CE-MS (キャピラリー電気泳動−質量分析装置；Agilent Technologies、Waldbronn、Germany) で代謝物の濃度を測定した。
【００６５】
CE-MS での解析は、有機酸及びリン酸化合物の場合は陰イオンモード、アミノ酸の場合は陽イオンモードで行われた。
【００６６】
すなわち、陰イオン性代謝物（有機酸及びリン酸化合物）の測定では、緩衝液として 20 mM の酢酸アンモニウム溶液 (pH 8.5) を使用し、ポリエチレングリコールコーテッド
キャピラリー (DB-WAX、J&W scientific、Folsom、CA、USA、100 cm × 50 μm i.d.) を用いて -24 kV で泳動した。質量分析装置 (MS) の安定化のため、シース液として 5 mM の酢酸アンモニウム入り 50 % メタノールを、1：100 のスプリッターを装備した Agilent 1100 シリーズ HPLC ポンプによってキャピラリーに 8 μl/min で投与した。
【００６７】
アミノ酸の測定では、緩衝液として 1 M のギ酸溶液 (pH 1.9) を使用し、石英ガラス
キャピラリー (90 cm × 50 μm i.d.) を用いて 24 kV で泳動した。シース液として 0.1 % のギ酸入り 50 % メタノールを使用した。
【００６８】
いずれの場合も、MS のキャピラリー電圧 (±3500 V) と窒素ガスの流速 (8 l/min) は
15〜20 分の間一定とした。対応する代謝物の定量は、Agilent ChemStation software 
を用いて選択された既知濃度の代謝物を測定することによって行った。
【００６９】
（１−３）代謝物データの解析
得られた代謝物データを用いて、主成分分析及びユークリッド平方距離・平均連結法による階層的クラスター解析を行った。階層的クラスター解析には、Statistical Package for the Social Sciences (SPSS v19.0) を使用した。代謝物データのヒートマップは Microsoft Excel 2007 を用いて作成した。多変量解析に用いた代謝物データはいずれも Z 値で正規化した。有意性 (p < 0.05、p < 0.01) は、スチューデント t 検定に従って判
定した。
【００７０】
（２）実験結果
（２−１）ガンマ線を照射したエゾノギシギシの成長調査
ガンマ線での放射線育種の際、変異の程度と致死個体数の割合などを複合的に考慮して
LD (= Lethal Dose) 50 となる線量が最適線量とされることが多い。そのため、ガンマ
線照射によるシュウ酸濃度が低減されたエゾノギシギシの作出にあたり、LD50 となる線
量を以下の手順で決定した。
【００７１】
まず、0〜3000 Gy のガンマ線を照射した種子を発芽させ、発芽率を播種後14日目まで
毎日調査した。その結果、150〜2000 Gy のガンマ線を照射した群の播種後14日目までの
発芽率はすべて 90 % を超え、非照射群（0 Gy）との差異は見られなかった。一方、3000
Gy のガンマ線を照射した群の播種後14日目までの発芽率は 65 % 程度まで低下した。
【００７２】
次に、発芽個体の成長調査を行った。1000〜3000 Gy のガンマ線を照射した個体は、子葉の段階まで成長したが、本葉を形成することが出来なかった。すなわち、1000〜3000 Gy のガンマ線を照射したすべての個体は、発芽後30日目までに子葉が赤く変色し、その後枯死した。また、300 Gy のガンマ線を照射した個体では、いくつかの個体で発芽後30日
目までに本葉が形成されたが、第2葉以降の葉を形成出来たものは僅かであり、多くの個
体は子葉の段階で赤く変色し枯死した。一方、150 および 200 Gy のガンマ線を照射した個体では、非照射 (0 Gy) の場合よりは劣るものの、高い割合で第2葉以降の葉も形成さ
れた。なお、漏斗型の葉や、左右非対称に変形した葉も、たまに見られた。第1葉に漏斗
型に変形した葉が見られることが多く、このような個体ではほぼ第2葉の形成が出来なか
った。
【００７３】
以上より、発芽後本葉の形成に異変が起こり枯死する個体が多いため、発芽しない種子の割合から致死率を求めることは出来ないことが明らかになった。そのため、種子の発芽後約30日目に致死個体数を数え、線量ごとの致死率を求めた。致死個体数を数える際は、第2葉以降の葉を形成出来ない個体を致死個体とみなした。700〜3000 Gy を照射した個体の致死率は100 %となった。そこで、致死率が 100 % 未満の 0 から 500 Gy の範囲で近
似曲線の式を求め、LD50 となる線量を計算した。その結果、LD50 は 213 Gy と算出された。
【００７４】
（２−２）CE-MSによる代謝物の測定
エゾノギシギシの低シュウ酸個体を選抜するために、質量分析器を用いて、0〜500 Gy のガンマ線を照射した個体の第3葉のシュウ酸含有量を測定した。シュウ酸含有量の測定
には、イオン性代謝物の測定が容易なキャピラリー電気泳動−質量分析装置 (CE-MS) を
用いた。各線量のガンマ線を照射した群のシュウ酸含有量の平均値を図１に示す。ガンマ線非照射群に比べ、ガンマ線照射群では、葉のシュウ酸含有量が低下していた。具体的には、ガンマ線非照射群のシュウ酸含量 (約 100 μmol/gFW) と比較して、150〜500 Gy のガンマ線を照射した群のシュウ酸含量は 5 割前後 (約 40〜60 μmol/gFW) にまで低下していた。また、照射された線量が大きいほど、シュウ酸含有量が低下する傾向があった。
【００７５】
次に、シュウ酸含有量の違いがその他の代謝物に及ぼす影響を明らかにするため、シュウ酸含有量の低下の程度が小さい10個体（高シュウ酸個体）とシュウ酸含有量の低下の程度が大きい10個体（低シュウ酸個体）について、メタボローム解析を行い、主要代謝産物のヒートマップを作成して、代謝物データの個体間の違いを可視化した（図２Ａ）。図２Ａにおいて、白（淡色）は他の個体よりも多い代謝物であり、黒（濃色）は少ない代謝物であることを表す。さらに、代謝物間の関係を調べるために、ヒートマップのデータをもとに階層的クラスター解析を行い、図２Ｂに示す樹形図を作成した。その結果、代謝物群は大きく２つのグループに分けられた。図２Ｂの上側のクラスターには、アスパラギン酸、アスパラギン、メチオニン、グルタミン酸、グルタミン、ヒスチジンなどのアミノ酸、図２Ｂの下側のクラスターにはシュウ酸やクエン酸などの有機酸が多く含まれていた。また、ヒートマップより、低シュウ酸個体では、高シュウ酸個体に比べて、上側のクラスターを形成するアミノ酸等の代謝物群の含有量が高いことが示された。逆に、高シュウ酸個体では、下側のクラスターを形成する有機酸等の代謝物群の含有量が低いことが示された。
【００７６】
（３）考察
以下、理論を交えて本実施例の結果を考察するが、本願発明は、いかなる意味においても、下記の理論に拘束されるものではない。
【００７７】
（３−１）ガンマ線の植物への影響
0〜3000 Gy のガンマ線を種子に照射したところ、高線量を照射した場合にも高い発芽
率を示した。しかしながら、照射線量が高いほど、子葉の段階までしか成長できずに枯死する個体が多く観察された。これは、照射した放射線量が高くなると形態形成に関わる多くの遺伝子に損傷を与えることになり、本葉を形成出来なくなったためであると考えられる。一方子葉は、種子形成の段階で胚の一部分として既に形成されているため、高線量を照射した個体でも子葉を展開する段階までは成長することができたと考えられる。その後、子葉が赤く変色したのは、放射線によるストレスで葉にアントシアニンが蓄積したことが原因であると考えられる。
【００７８】
（３−２）ガンマ線を照射したエゾノギシギシのメタボローム解析
ガンマ線を照射したエゾノギシギシにおいて、照射された線量が大きいほど、葉のシュウ酸含有量が低下する傾向が見られた。これは、ガンマ線を照射したことによって直接的あるいは間接的にシュウ酸合成にかかわる遺伝子群が損傷したため、シュウ酸の合成が抑制されたためであると考えられる。
【００７９】
主成分分析によるヒートマップ及び階層的クラスター解析の結果において、葉のシュウ酸含有量の少ない個体では共通してアミノ酸含有量が多くなり、有機酸含有量が少なくなるという傾向が見られた。低シュウ酸個体において減少した代謝物としては、シュウ酸以外に、リンゴ酸、2OG (2-オキソグルタル酸) などが挙げられる。これらは TCA サイクルに属する有機酸であり、TCA サイクルの代謝物の含有量がガンマ線の影響で減少したと考えられる。一方、低シュウ酸個体において増加した代謝物としては、グルタミン、グルタミン酸、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸などが挙げられる。グルタミン、グルタミン酸、アルギニンなどは 2OG から、アスパラギン、アスパラギン酸などはオキサ
ロ酢酸から、それぞれ生成されるアミノ酸である。つまり、これらは TCA サイクルに繋
がる別の経路の代謝物である。このことから、TCA サイクルからアスパラギン酸及びグルタミン酸方向への反応がガンマ線の照射によって促進されたと考えられる。
【００８０】
シュウ酸と似た挙動を示す代謝物として、2OG が挙げられる。シュウ酸と 2OG はどち
らもイソクエン酸から合成されるものである。イソクエン酸の合成量が減少したために、イソクエン酸−グリオキシル酸−シュウ酸及び 2OG−グルタミン酸の反応が進まなかった可能性がある。もしくは、2OG からグルタミン酸への反応がガンマ線によって促進されるため、2OG が減少しているということも考えられる。
【００８１】
本実施例においては、エゾノギシギシの種子にガンマ線を照射することにより、葉のシュウ酸含有量が減少することが明らかになった。
【００８２】
実施例２：シュウ酸濃度が低減されたパセリの作出
実施例１では、ガンマ線を照射したエゾノギシギシ種子から発芽させた個体では、葉のシュウ酸含有量が低下するという結果が得られた。そこで、本実施例では、他の植物種でも同様の効果があるかを調べるため、パセリを用いて同様の実験を行った。
【００８３】
（１）ガンマ線を照射したパセリの成長調査
0〜600 Gy (0、100、190、300、600 Gy) のガンマ線を照射したパセリの種子を発芽さ
せ、成長調査を行った。発芽率を調べたところ、300 Gy 以上のガンマ線を照射した群で
は発芽率の低下が見られ、特に、600 Gy のガンマ線を照射した群では発芽率が顕著に低
下した（図３）。また、発芽後約40日目に第2葉以降の葉を形成出来ない個体を致死個体
として致死率を求めたところ、発芽率と同様に、300 Gy 以上のガンマ線を照射した群で
は致死率の増加が見られ、600 Gy のガンマ線を照射した群では 100 ％ が致死であった
（図３）。
【００８４】
（２）シュウ酸含有量測定
さらに、発芽後約40日目に第3葉を回収し、CE-MS を用いてシュウ酸含有量を測定した
（図４）。CE-MSによる測定条件は実施例１と同一である。100 Gy のガンマ線を照射した群とガンマ線非照射群の間では、シュウ酸含有量に有意差は認められなかった。一方、190 Gy 以上のガンマ線を照射した群では、ガンマ線非照射群と比較して、シュウ酸含有量
が有意に低下した（P < 0.01）。
【００８５】
本実施例においては、パセリの種子にガンマ線を照射することにより、葉のシュウ酸含有量が減少することが明らかになった。このことから、エゾノギシギシ以外の植物種でもガンマ線照射によるシュウ酸含有量の低下が引き起こされる可能性が示唆された。
【００８６】
これらの実施例により、ガンマ線が、シュウ酸濃度が低減された植物体の製造に有用であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００８７】
本発明により、シュウ酸濃度が低減された植物体を製造できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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