(57)【要約】【課題】乳酸トランスポーター遺伝子が過剰発現され、乳酸分解が抑制された微生物、及びそれを利用した乳酸生産方法を提供する。【解決手段】乳酸生産能が向上した微生物に係り、乳酸を細胞内外に輸送するタンパク質である乳酸トランスポーターを過剰発現させる場合、乳酸生産能が向上する。また、乳酸酸化酵素の活性を抑制させ、ピルビン酸デカルボキシラーゼの活性を抑制させる場合、乳酸生産能が向上する。かように製造された形質転換微生物を利用する場合、乳酸生産収率を向上させることができ、産業的に非常に有用に利用される。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳酸トランスポーターを高レベルに発現させる乳酸生産微生物。
【請求項２】
前記微生物は、Ｓ．cerevisiaeである、請求項１に記載の乳酸生産微生物。
【請求項３】
前記乳酸トランスポーターは、Ｊｅｎ１またはＡｄｙ２である、請求項１または２に記載の乳酸生産微生物。
【請求項４】
前記乳酸トランスポーターは、配列番号１のアミノ酸配列、または配列番号１のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の乳酸生産微生物。
【請求項５】
前記乳酸トランスポーターは、配列番号３のアミノ酸配列、または配列番号３のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の乳酸生産微生物。
【請求項６】
前記微生物は、乳酸酸化還元酵素の活性が抑制されている、請求項１〜５のいずれか１項に記載の乳酸生産微生物。
【請求項７】
前記乳酸酸化還元酵素をコーディングする遺伝子は、シトクロムｂ２（ｃｙｂ２）である、請求項６に記載の乳酸生産微生物。
【請求項８】
前記ｃｙｂ２遺伝子は、配列番号５のヌクレオチド配列である、請求項７に記載の乳酸生産微生物。
【請求項９】
前記乳酸酸化還元酵素の活性の抑制は、乳酸酸化還元酵素をコーディングする遺伝子のヌクレオチドに対する置換、部分欠失または全体欠失、付加あるいはこれらの組み合わせによって、乳酸酸化還元酵素の機能が抑制された、請求項６〜８のいずれか１項に記載の乳酸生産微生物。
【請求項１０】
前記微生物は、ピルビン酸デカルボキシラーゼの活性が抑制されている、請求項１〜９のいずれか１項に記載の乳酸生産微生物。
【請求項１１】
前記ピルビン酸デカルボキシラーゼをコーディングする遺伝子は、ｐｄｃ１（pyruvate decarboxylase １）である、請求項１０に記載の乳酸生産微生物。
【請求項１２】
前記微生物は、乳酸デヒドロゲナーゼを高レベルに発現させる、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の乳酸生産微生物。
【請求項１３】
前記乳酸デヒドロゲナーゼは、配列番号６のアミノ酸配列、または配列番号６のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列である、請求項１２に記載の乳酸生産微生物。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の微生物を培養する段階を含む、乳酸生産方法。
【請求項１５】
前記培養は、嫌気条件で培養する段階を含む、請求項１４に記載の乳酸生産方法。
【請求項１６】
前記嫌気条件は、溶存酸素濃度が０〜１０体積％である、請求項１５に記載の乳酸生産方法。
【請求項１７】
前記微生物は、乳酸酸化還元酵素の活性が抑制されている、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の乳酸生産方法。
【請求項１８】
前記微生物は、ピルビン酸デカルボキシラーゼの活性が抑制されている、請求項１４〜１７のいずれか１項に記載の乳酸生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、乳酸生成能が向上した形質転換された微生物（transgenic microorganism）、及びそれを利用して乳酸を生産する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
乳酸（lactic acid）は、食品、製薬、化学、電子など多様な産業分野で幅広く使われる有機酸である。乳酸は、無色、無臭であり、水に良好に溶解される低揮発性物質である。乳酸は、人体に毒性がなく、香味剤、酸味剤、保存剤などに活用されている。また、環境親和的な代替高分子物質である生分解性（biodegradable）プラスチックポリ乳酸（ＰＬＡ：polylactic acid）の原料である。
【０００３】
ＰＬＡは、技術的には、高分子重合のために、ダイマーであるラクチド（lactide）に転換され、開環重合したポリエステル系樹脂であり、フィルム、シート、ファイバ、射出などの多様な加工が可能である。従って、ポリエチレン（ＰＥ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリスチレン（ＰＳ）など、既存汎用石油化学プラスチックと代替することができるバイオプラスチックとして、最近需要が大きく増加している。
【０００４】
また、乳酸は、水酸基とカルボン酸基とを同時に有しており、反応性が非常に高く、それによって、乳酸エステル、アセトアルデヒド（acetaldehyde）、プロピレングリコールなど、工業的に重要な化合物への転換が容易であるので、化学工業分野においても、次世代代替化学原料として注目されている。
【０００５】
現在、乳酸は、合成されるか、生物工学的手法を用いた醗酵により生産されている。石油化学的な合成は、原油に由来したエチレンを酸化させ、アセトアルデヒドを経て、シアン化水素添加反応によって、ラクトニトリルを作った後、蒸溜させて精製し、塩酸や硫酸を使用して、加水分解することによって製造される。また、生物工学的手法を用いた醗酵は、澱粉、スクロース（sucrose）、マルトース（maltose）、グルコース（glucose）、フラクトース（fructose）、キシロース（xylose）のような再生可能な炭水化物を基質にして乳酸を製造することができる。
【０００６】
一般化学反応式で、さまざまな段階を経て乳酸を得ることができる物質であるが、それを微生物を利用して生産する場合、さらに効率的に所望物質を生産することができる。かような場合、コスト面や時間面で、一般化学合成工程より効率的であるので、それに係わる多くの研究が行われている。しかし、微生物は所望の代謝産物のみを生成するものではなく、特定代謝産物が過剰に生成される場合、かえって成長が抑制されたり、それ以上所望の代謝産物を生成しなくなったり、あるいは所望のところではない副産物を生成することもある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明が解決しようとする課題は、乳酸を効率的に生産する微生物を開発することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前記課題を解決するために、本発明は、乳酸トランスポーターを高レベルに発現させる微生物を提供する。
【０００９】
前記課題を解決するために、本発明はまた、乳酸トランスポーターを高レベルに発現させ、乳酸分解経路が抑制された微生物を提供する。
【００１０】
前記課題を解決するために、本発明はまた、前記微生物を利用して、乳酸を生産する方法を提供する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の微生物により、乳酸生産効率を高めることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】乳酸（ＬＡ：lactic acid）生産経路を示した図面である。
【図２】乳酸（ＬＡ：lactic acid）生産経路を示した図面である。
【図３】乳酸トランスポーター（Ｊｅｎ１）をコードする遺伝子を組み込んだ発現ベクター（transporter over-expression vector）を示した図面である。
【図４】乳酸トランスポーター（Ａｄｙ２）をコードする遺伝子を組み込んだ発現ベクターを示した図面である。
【図５】遺伝子欠失のために使用される、ＬＤＨ（配列番号７）をコードするベクターを示した図面である。
【図６】トランスポーターを過剰発現させた場合、及びトランスポーターを過剰発現させて分解経路を抑制した場合の乳酸生産量を示したグラフである。
【図７】ＬＤＨ（lactate dehydrogenase）を過剰発現させた菌株に、乳酸トランスポーターであるＪｅｎ１及びＡｄｙ２を過剰発現させた場合の乳酸生産量を示したグラフであり、ＳＰ１００１菌株は、ｐｄｃ１遺伝子が欠失されて活性がなく、ＬＤＨが過剰発現される菌株であり、ＳＰ１００２菌株は、ｐｄｃ１遺伝子及びｃｙｂ２遺伝子が欠失されて活性がなく、ＬＤＨが過剰発現される菌株である。
【図８】ＬＤＨの発現量による乳酸生産量を示したグラフであり、ＬＤＨ遺伝子が追加導入されることにより、乳酸の生産量が１．５倍増加し、ＳＰ１００３菌株は、ｐｄｃ１遺伝子及びｃｙｂ２遺伝子が欠失されて活性がなく、ＬＤＨが２コピー挿入されて過剰発現される菌株である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明の望ましい実施例について詳細に説明する。
【００１４】
乳酸を高レベルで生産する微生物を製造するために、一態様は、乳酸トランスポーターを高レベルに発現する乳酸生産微生物を提供する。
【００１５】
図１は乳酸生産経路を示した図面である。図１において、乳酸トランスポーターは、細胞膜に存在し、細胞外からの細胞内への乳酸の輸送を行う。細胞内に輸送された乳酸は、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ：lactate dehydrogenase）によりピルビン酸に変換される。ピルビン酸は、ピルビン酸デカルボキシラーゼによりアセトアルデヒドに変換される。
【００１６】
乳酸トランスポーターは、Ｊｅｎ１またはＡｄｙ１であることが好ましい。
【００１７】
乳酸トランスポーターは、配列番号１のアミノ酸配列である、または、乳酸トランスポーターは、配列番号１のアミノ酸配列と、好ましい順に８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上または９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列であることが好ましい。配列番号１は、ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＢ６０２９１．１に相当する。この際、配列番号１のアミノ酸配列と８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上または９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列である乳酸トランスポーターは、乳酸を膜内に移送するトランスポーターの機能を維持する。
【００１８】
また、Ｊｅｎ１は配列番号１のアミノ酸配列を有することができ、好ましくは配列番号１のアミノ酸配列である。
【００１９】
乳酸トランスポーターは、配列番号３のアミノ酸配列である、または、乳酸トランスポーターは、配列番号３のアミノ酸配列と、好ましい順に８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上または９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列であることが好ましい。配列番号３は、ＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：  ＮＰ＿００９９３６．１に相当する。この際、配列番号３のアミノ酸配列と８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上または９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列である乳酸トランスポーターは、乳酸を膜内に移送するトランスポーターの機能を維持する。
【００２０】
また、Ａｄｙ２は、配列番号３のアミノ酸配列を有することができ、好ましくは配列番号３のアミノ酸配列である。
【００２１】
乳酸トランスポーターを細胞内で高レベルに発現するために、乳酸トランスポーターをコーディングする遺伝子を細胞内に導入する。乳酸トランスポーターをコーディングする遺伝子は、ベクターに挿入されて細胞内に導入される。細胞内に導入された乳酸トランスポーター遺伝子は、ベクター内で発現され、乳酸トランスポーターを生産することができる。または、細胞内に導入された乳酸トランスポーター遺伝子は、宿主のクロモソームに挿入されて発現される。
【００２２】
乳酸トランスポーターをコーディングする遺伝子は、Ｊｅｎ１遺伝子またはＡｄｙ１遺伝子でもある。
【００２３】
Ｊｅｎ１遺伝子の配列は、配列番号２である、あるいは、配列番号２と、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上または９９％以上の相同性を有するヌクレオチド配列であることが好ましい。
【００２４】
Ａｄｙ１遺伝子の配列は、配列番号４のヌクレオチド配列である、あるいは、配列番号４と、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上または９９％以上の相同性を有するヌクレオチド配列であることが好ましい。
【００２５】
乳酸トランスポーター遺伝子は、乳酸トランスポーターを発現することができるプロモーターと作動自在に連結される。プロモーターは、常に活性化されてもいる。また、プロモーター誘導物質（inducer）によって活性が誘発されもする。このとき、誘導物質は、ＩＰＴＧ（isopropryl-1-thio-β-D-galactopyranoside）でもある。
【００２６】
乳酸生産微生物は、サッカロマイセス（Saccharomyces）、バチルス（Bacillus）、ラクトバチルス（Lactobacillus）、ラクトコッカス（Lactococcus）、ストレプトコッカス（Streptococcus）及びクルイベロマイセス（Kluyveromyces）から選択されるいずれか一つであることが好ましい。また、乳酸生産微生物は、サッカロマイセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）であることがより好ましい。
【００２７】
他の態様は、乳酸トランスポーターを高レベルに発現するだけではなく、乳酸分解に関与する酵素の活性が抑制された乳酸生産微生物を提供する。
【００２８】
乳酸分解に関与する酵素は、乳酸をピルビン酸（pyruvate）に転換する酵素、またはピルビン酸をアセトアルデヒドに転換する酵素であることが好ましい。乳酸をピルビン酸に転換する酵素は、乳酸酸化還元酵素（乳酸デヒドロゲナーゼ）であることが好ましい。また、ピルビン酸をアセトアルデヒドに転換する酵素はピルビン酸デカルボキシラーゼであることが好ましい。
【００２９】
乳酸デヒドロゲナーゼの活性の抑制は、乳酸デヒドロゲナーゼをコーディングする遺伝子の塩基に対する置換、部分欠失または全体欠失、付加、あるいはこれらの組み合わせによって、乳酸デヒドロゲナーゼの機能が抑制されたものでもある。乳酸デヒドロゲナーゼの活性の抑制は、乳酸分解活性がない遺伝子を、微生物内の乳酸デヒドロゲナーゼと置換して遂行されもする。または、乳酸デヒドロゲナーゼの活性の抑制は、乳酸分解遺伝子に核酸を挿入して遂行されもする。挿入される核酸は、抗生物質耐性遺伝子でもある。
【００３０】
乳酸酸化還元酵素は、シトクロムｂ２（ＣＹＢ２：cytochrome ｂ２；Ｌ−lactate cytochrome −Ｃ oxidoreductase）であることが好ましい。すなわち、乳酸酸化還元酵素をコーディングする遺伝子はｃｙｂ２であることが好ましい。ＣＹＢ２は乳酸をピルビン酸に変換する酵素である。図２は、乳酸（ＬＡ：lactic acid）生産経路を示した図面である。このうち、図２中「ＣＹＢ」とは乳酸酸化還元酵素であるシトクロムｂ２を示し、これを抑制することにより、微生物の乳酸生産能が向上する。
【００３１】
ｃｙｂ２遺伝子の配列は、配列番号５のヌクレオチド配列であることが好ましい。
【００３２】
上記シトクロムｂ２の活性が抑制された微生物としては、後述の実施例に記載の菌株ＳＰ１００２（寄託機関名：韓国生命工学研究院、受託番号：ＫＣＴＣ１２３１１ＢＰ、受託日：２０１２年１１月１５日）、菌株ＳＰ１００３（寄託機関名：韓国生命工学研究院、受託番号：ＫＣＴＣ１２３１２ＢＰ、受託日：２０１２年１１月１５日）が挙げられる。したがって、本発明の好適な一実施形態は、上記ＳＰ１００２、ＳＰ１００３において、乳酸トランスポーターを高レベルに発現させた微生物である。
【００３３】
ピルビン酸デカルボキシラーゼの活性の抑制は、ピルビン酸デカルボキシラーゼをコーディングする遺伝子の塩基に対する置換、部分欠失または全体欠失、付加によって、ピルビン酸デカルボキシラーゼの機能が抑制されたものでもある。ピルビン酸デカルボキシラーゼの活性の抑制は、ピルビン酸脱炭素活性のない遺伝子を、微生物内のピルビン酸デカルボキシラーゼと置換して遂行されもする。または、ピルビン酸デカルボキシラーゼの活性の抑制は、ピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子の内部に核酸を挿入して遂行されもする。挿入される核酸は、抗生物質耐性遺伝子でもある。
【００３４】
前記ピルビン酸デカルボキシラーゼをコーディングする遺伝子は、ｐｄｃ１（pyruvate decarboxylase １）でもある。
【００３５】
上記ピルビン酸デカルボキシラーゼの活性が抑制された微生物としては、後述の実施例に記載の菌株ＳＰ１００１（寄託機関名：韓国生命工学研究院、受託番号：ＫＣＴＣ１２３１０ＢＰ、受託日：２０１２年１１月１５日）、菌株ＳＰ１００２（寄託機関名：韓国生命工学研究院、受託番号：ＫＣＴＣ１２３１１ＢＰ、受託日：２０１２年１１月１５日）、菌株ＳＰ１００３（寄託機関名：韓国生命工学研究院、受託番号：ＫＣＴＣ１２３１２ＢＰ、受託日：２０１２年１１月１５日）が挙げられる。したがって、本発明の好適な一実施形態は、上記ＳＰ１００１、ＳＰ１００２、ＳＰ１００３において、乳酸トランスポーターを高レベルに発現させた微生物である。
【００３６】
さらに他の態様は、乳酸トランスポーターを高レベルに発現させ、乳酸分解に関与する酵素の活性が抑制され、乳酸デヒドロゲナーゼを高レベルに発現させるものである乳酸生産微生物を提供する。
【００３７】
ここで発現される乳酸デヒドロゲナーゼは、ピルビン酸を乳酸に転換する酵素であることが好ましい。乳酸デヒドロゲナーゼは、配列番号６のアミノ酸配列、または配列番号６のアミノ酸配列と、好ましい順に８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上または９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列であることが好ましい。この際、配列番号６のアミノ酸配列と８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上または９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列であるタンパク質は、乳酸デヒドロゲナーゼ活性を有する。
【００３８】
また、乳酸デヒドロゲナーゼをコーディングする遺伝子は、配列番号７の配列であることが好ましい。
【００３９】
本発明の好適な一実施形態は、上記ＳＰ１００１、ＳＰ１００２、ＳＰ１００３において、乳酸トランスポーターを高レベルに発現させた微生物である。
【００４０】
さらに他の態様は、上記乳酸生産能が向上した微生物を利用して乳酸を生産する方法に係わるものである。
【００４１】
一実施形態は、乳酸トランスポーターを高レベルに発現させる乳酸生産微生物を培養する段階を含む乳酸生産方法を提供する。
【００４２】
さらに他の一実施形態は、乳酸トランスポーターを高レベルに発現させるだけではなく、乳酸分解に関与する酵素の活性が抑制された乳酸生産微生物を培養する段階を含む乳酸生産方法を提供する。
【００４３】
さらに他の一実施形態は、乳酸トランスポーターを高レベルに発現させ、乳酸分解に関与する酵素の活性が抑制され、乳酸デヒドロゲナーゼを高レベルに発現させるものである乳酸生産微生物を培養する段階を含む乳酸生産方法を提供する。
【００４４】
乳酸分解に関与する酵素は、乳酸を他の物質に転換する酵素を含む。乳酸を他の物質に転換する酵素は、乳酸をピルビン酸に転換する酵素、ピルビン酸をアセトアルデヒドまたはオキサロ酢酸に転換する酵素であることが好ましい。
【００４５】
形質転換された微生物から乳酸を収得するために、培養条件を適切に調節することができる。形質転換された微生物は、増殖のために、好気性条件（aerobic condition）で培養する。その後、乳酸を生産するためには、嫌気条件（anaerobic condition）で培養することが好ましい。嫌気条件は、溶存酸素（ＤＯ）濃度が０〜１０体積％でもある。
【００４６】
用語、「培養条件」は、微生物を培養するための条件を意味する。このような培養条件は、例えば、微生物が利用する炭素源、窒素源または酸素条件でもある。微生物が利用することができる炭素源は、単糖類、二糖類または多糖類などが含まれる。具体的には、グルコース（glucose）、フラクトース（fructose）、マンノース（mannose）、ガラクトース（galactose）などが利用されもする。微生物が利用することができる窒素源は、有機窒素化合物、無機窒素化合物などでもある。具体的には、アミノ酸、アミド、アミン、硝酸塩、アムモニウム塩などでもある。微生物を培養する酸素条件には、正常酸素分圧の好気性条件、大気中に０．１〜１０体積％の酸素を含む低酸素条件、または酸素がない嫌気性条件がある。代謝経路は、微生物が実際に利用可能な炭素源及び窒素源に合わせて修正されもする。
【００４７】
以下、実施例を介して、本発明についてさらに詳細に説明する。それら実施例は、ただ本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲がそれら実施例によって制限されるものであると解釈されるものではないということは、当業界で当業者に自明である（図１及び図２参照）。
【実施例】
【００４８】
実施例１．乳酸トランスポーターを過剰発現させる菌株の制作
乳酸トランスポーター過剰発現のために、Ｊｅｎ１遺伝子（配列番号２）、Ａｄｙ２遺伝子（配列番号４）を選択し、それをＳ．cerevisiaeで発現が可能なベクター組み込みベクターを制作した（ｐＲＳ４２６ＧＰＤ−Ｊｅｎ１（図３参照）、ｐＲＳ４２６ＧＰＤ−Ａｄｙ２（図４参照））。形質転換させる菌株としては、乳酸生産のためにＬＤＨ遺伝子（配列番号７）が導入されたＳ．cerevisiae（ＳＰ１００１（ＫＣＴＣ１２３１０ＢＰ）、ＳＰ１００２（ＫＣＴＣ１２３１１ＢＰ）またはＳＰ１００３（ＫＣＴＣ１２３１２ＢＰ））を基本菌株として利用した。これらの菌株に図３または図４で示されるベクターを導入した。ここで、使用されたＳ．cerevisiaeの遺伝型は、次の通りである。
【００４９】
【表１】
2014150800.tif 000003
【００５０】
実施例２．乳酸トランスポーター及びＬＤＨを過剰発現させる菌株の制作
ＬＤＨ遺伝子の追加導入による乳酸生産向上効果を調べるために、ＳＰ１００１株を基に、Ｃｙｂ２遺伝子が除去され、ＬＤＨ（配列番号７）を同時に挿入した菌株を制作した（この菌株の制作には、図５のベクターを用い、ｃｙｂ２の除去とＬＤＨの挿入を同時に行った。）。なお、遺伝子操作を行う前の微生物には、ＬＤＨは存在せず、Ｃｙｂ２は存在する。
【００５１】
得られた菌株を用いて（ＳＰ１００３（ＫＣＴＣ１２３１２ＢＰ）））＜実施例１＞のように、図３（ｐＲＳ４２６ＧＰＤ−Ｊｅｎ１）または図４で示されるベクター（ｐＲＳ４２６ＧＰＤ−Ａｄｙ２）を導入した。
【００５２】
【表２】
2014150800.tif 000004
【００５３】
実施例３．乳酸トランスポーター過剰発現させ、乳酸分解経路抑制させた菌株を利用した乳酸生産量測定
乳酸トランスポーターを過剰発現させ、乳酸分解経路を抑制させることによって、乳酸生産量の向上効果を確認するために、＜実施例１＞で制作された菌株を利用して乳酸生産を測定した。培養は、好気条件下で培養した後、嫌気条件下（溶存酸素濃度０〜１０％）で培養した。結果を下記表３および図７に示す。また、図６に、Ｊｅｎ１を過剰発現させたＳＰ１００１株（ＴＲＡＮＳＰＯＲＴＥＲ過剰発現）およびＪｅｎ１を過剰発現させたＳＰ１００２株（ＴＲＡＮＳＰＯＲＴＥＲ過剰発現＋分解経路抑制）の乳酸生産の時間的経過を示す。下記表３にて「Ｅｍｐｔｙ」とは、ＳＰ１００１またはＳＰ１００２菌株自体の生産を示すものである。
【００５４】
【表３】
2014150800.tif 000005
【００５５】
Ａｄｙ２トランスポーターを過剰発現させた場合、ＳＰ１００１菌株では、対照群に比べて、１．０９ｇ／Ｌの向上効果を示した。また、ＳＰ１００２菌株では、対照群に比べて、１．２１ｇ／Ｌの向上効果を示した。
【００５６】
特に、乳酸分解経路を抑制するために、乳酸を分解するのに関与するＣＹＢ２の活性を抑制させたＳＰ１００２菌株では、対照群に比べて、乳酸生産量が顕著に増加した。Ｊｅｎ１を過剰発現させた場合に、ＳＰ１００１は、４．６６ｇ／Ｌの乳酸を生産したが、ＳＰ１００２は、８．５３ｇ／Ｌの乳酸を生産した。すなわち、ＣＹＢ２酵素活性が抑制された場合、８３％以上乳酸生産量が増加した。
【００５７】
Ａｄｙ２を過剰発現させた場合、ＳＰ１００１は、５．１４ｇ／Ｌの乳酸を生産したが、ＳＰ１００２は、９．２９ｇ／Ｌの乳酸を生産した。すなわち、ＣＹＢ２酵素活性が抑制された場合、８０％以上乳酸生産量が増加した（図７参照）。
【００５８】
また、乳酸分解経路が抑制された場合、乳酸トランスポーターを過剰発現させた場合も、乳酸生産量が増加した。Ｊｅｎ１を過剰発現させた場合、約５％以上乳酸生産量が増加し、Ａｄｙ２を過剰発現させた場合には、約１５％ほど乳酸生産量が増加したということが分かる。
【００５９】
結果として、トランスポーターを過剰発現させ、かつ分解経路を同時に抑制させる場合、対照群（ＳＰ１００１；Ｅｍｐｔｙ）に比べて、Ｊｅｎ１遺伝子を過剰発現させる場合、１１０％（ＳＰ１００２；Ｊｅｎ１）、Ａｄｙ２遺伝子を過剰発現させる場合、１２９％（ＳＰ１００２；Ａｄｙ２）以上乳酸生産量が増加するということを確認した。
【００６０】
実施例４．ＬＤＨ遺伝子の追加導入による乳酸生産向上
ＬＤＨの遺伝子を追加導入し、乳酸生産量に及ぼす影響を確認した。それを確認するために、実施例１及び実施例２で製造された微生物を利用した。結果を下記表４および図８に示す。
【００６１】
【表４】
2014150800.tif 000006
【００６２】
その結果、ＬＤＨがＳＰ１００２菌株に比べて、１コピーさらに多く導入されたＳＰ１００３菌株は、乳酸生産量が増加するということを確認した。Ｊｅｎ１遺伝子が過剰発現される場合には、乳酸生産量が５５％増加し、Ａｄｙ２遺伝子が過剰発現される場合には、乳酸生産量が４３％増加した（図８参照）。
【００６３】
乳酸の生産コストを節減するために、生産効率を高めることが切実である。微生物を利用して乳酸を生産する場合、生産コストを低くし、産業的に活用可能性が高くなる。ただし、微生物は、乳酸を一定濃度以上に生産することができないので、生産収率が増加された微生物は、産業的に利用可能性が大きい。具体例において開示された形質転換された微生物の場合、乳酸の生産量が増加するので、具体例に開示された微生物、及びそのような微生物を利用した乳酸生産方法は、産業上利用可能性が非常に高い。
【受託番号】
【００６４】
寄託機関名：韓国生命工学研究院
受託番号：ＫＣＴＣ１２３１０ＢＰ
受託日：２０１２１１１５
寄託機関名：韓国生命工学研究院
受託番号：ＫＣＴＣ１２３１１ＢＰ
受託日：２０１２１１１５
寄託機関名：韓国生命工学研究院
受託番号：ＫＣＴＣ１２３１２ＢＰ
受託日：２０１２１１１５
【産業上の利用可能性】
【００６５】
本発明の乳酸トランスポーター遺伝子が過剰発現され、乳酸分解が抑制された微生物、及びそれを利用した乳酸生産方法は、例えば、環境にやさしい代替高分子関連の技術分野に効果的に適用可能である。
【図１】
2014150800.tif 000007
【図２】
2014150800.tif 000008
【図３】
2014150800.tif 000009
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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