(57)【要約】【課題】皮膚の肌理を整える化粧料や皮膚外用剤を提供する。【解決手段】β−Ｌ−リボースを構成糖とするニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）類縁体である３−（アミノカルボニル）−１−［５−Ｏ−［［１−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−１−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノース−５−Ｏ−イル］ホスホニルオキシ（オキシラト）ホスフィニル］−β−Ｌ−リボフラノシル］ピリジニウムを含む化粧料や皮膚外用剤を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
３−（アミノカルボニル）−１−［５−Ｏ−［［１−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−１−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノース−５−Ｏ−イル］ホスホニルオキシ（オキシラト）ホスフィニル］−β−Ｌ−リボフラノシル］ピリジニウムである化合物又はその薬理学的に許容される塩を含有する化粧料。
【請求項２】
３−（アミノカルボニル）−１−［５−Ｏ−［［１−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−１−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノース−５−Ｏ−イル］ホスホニルオキシ（オキシラト）ホスフィニル］−β−Ｌ−リボフラノシル］ピリジニウムである化合物又はその薬理学的に許容される塩を含有する皮膚外用剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、化粧料や皮膚外用剤、より詳しくは、ニコチンアミドモノヌクレオチド部分の構成糖がβ−Ｌ−リボースである、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）類縁体を含有する化粧料や皮膚外用剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
脳損傷、脊髄損傷などにより神経回路網が傷害を受け、切断あるいは神経細胞死に陥ると、支配神経下の生理・運動機能は失われると同時に神経回路の復活は極めて困難である。しかし、失われたさまざまな機能回復・復活のためには生残する神経細胞間のネットワーク再構築が不可欠で、このために生残する神経細胞からの神経軸索と、それから伸張する神経突起の新生が必要である。神経突起伸長作用を有する物質としては、神経細胞から分泌される神経成長因子（ＮＧＦ）が注目を集めている。ＮＧＦは、神経組織の成長及び機能維持にとって重要かつ必要な因子であり、末梢神経における知覚及び交感神経の成熟、分化に不可欠であり、脳損傷時の神経細胞の変性を防ぐという作用を示すが、血液脳関門（ＢＢＢ）透過性を持たないため、末梢からまたは経口投与では脳内に移行できないといわれている。
【０００３】
従来、非ペプチド系の神経突起の伸長剤、伸長誘導剤、伸長促進剤等としては、５−アシル−２−アミノ−１，３−セレナゾール類縁体を含有する神経細胞の神経突起伸長を促進する作用を有する神経栄養因子（特許文献１参照）、神経細胞のマイトジェン活性化蛋白キナーゼ（ＥＲＫ１／２）のリン酸化を促進する作用を有するエブセレンを含有する神経細胞の神経突起伸長を促進する作用を有する神経栄養因子（特許文献２参照）、カフェ酸またはその誘導体からなる群より選択される少なくとも１種の化合物を有効成分として含有する神経突起伸長剤（特許文献３参照）、カルノシン酸を含有するローズマリーおよびセージからなる群より選択される少なくとも１種の植物由来の抽出物を有効成分として含有する神経突起伸長剤（特許文献４参照）、神経細胞の神経突起伸長作用を有するリゾホスファチジルエタノールアミンを含有することを特徴とする細胞死抑制物質（特許文献５参照）、モネンシン、コンカナマイシンＡなど細胞内小器官アルカリ化剤を主成分とする運動神経細胞の神経突起を伸長するための神経突起伸長組成物（特許文献６参照）、ノビレチン、タンゲレチン等のポリアルコキシフラボノイドを含有する神経突起伸長剤（特許文献７参照）、グリコサミノグリカン誘導体を含有する神経突起伸長活性剤（特許文献８参照）、ラクタシスチン誘導体を含有する神経突起伸長剤（特許文献９参照）、小分子複素環式ケトンまたはチオエステル化合物を含有する神経突起伸長剤（特許文献１０参照）、ＧＭ１、ＧＤ１ａ、ＧＤ１ｂおよびＧＴ１ｂガングリオシドのヒドロキシル、シアリン酸並びにセラミド基でのパー硫酸化誘導体を除き、サッカライド、シアリン酸またはセラミド残基の少なくとも１つのヒドロキシル基が硫酸でエステル化されている、ガングリオシドおよびＮ−アシル−Ｎ−リゾ−ガングリオシド、Ｎ’−アシル−Ｎ’−リゾ−ガングリオシド並びにＮ，Ｎ’−ジ−またはポリ−アシル−Ｎ，Ｎ’−ジリゾ−ガングリオシドの誘導体を含有する神経突起伸長剤（特許文献１１参照）、ＧｌｃＵＡ（２Ｓ）−ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ）（Ｂユニット）の二糖を含むコンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸ハイブリッド鎖を含有する神経突起伸長剤（特許文献１２参照）、バイセクティングＧｌｃＮＡｃを有する糖鎖、該糖鎖を構造中に有する複合糖質、該糖鎖の誘導体等を含有する神経突起伸長誘導剤（特許文献１３参照）、低分子合成化合物を有効成分とする神経突起伸長誘導剤（特許文献１４参照）などが知られている。
【０００４】
また、β−Ｄ−リボースを構成糖とするニコチンアミドモノヌクレオチドである天然物のＮＡＤについては、太陽光線照射に伴う紅斑を減退させるための、局所適用によるニコチンアミドアデノシンジヌクレオチドの化粧品的使用（特許文献１５参照）が提案されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００８−１００９５４号公報
【特許文献２】特開２００８−７４４６号公報
【特許文献３】特開２００７−２３０９４６号公報
【特許文献４】特開２００７−２３０９４５号公報
【特許文献５】特開２００７−２２９６６号公報
【特許文献６】特開２００６−５２１９２号公報
【特許文献７】特開２００２−６０３４０号公報
【特許文献８】特開平１１−３１０６０２号公報
【特許文献９】特開平８−２３１５０１号公報
【特許文献１０】特表２００３−５１４８９３号公報
【特許文献１１】特表平８−５０７３０７号公報
【特許文献１２】ＷＯ２００５／１０３０８９号公報
【特許文献１３】ＷＯ２００５／０９７１５５号公報
【特許文献１４】特開２００９−１３２６２２号公報
【特許文献１５】特開平０６−０２４９５３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、お肌の肌理を整え、すべすべした肌を実現させ、また、肌荒れを改善することができる化粧料や皮膚外用剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討し、３−（アミノカルボニル）−１−［５−Ｏ−［［１−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−１−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノース−５−Ｏ−イル］ホスホニルオキシ（オキシラト）ホスフィニル］−β−Ｌ−リボフラノシル］ピリジニウム（以下、「ＮＡＤ類縁体」と呼ぶことがある）が、ＮＡＤ類縁体を添加して培養した場合、表皮の辺縁帯成分であって、角質細胞の細胞膜を裏打ちする役割を果たすロリクリン（loricrin）が有意に発現し、ＮＡＤ類縁体の添加が、皮膚の細胞の生育を促進し、外界からの刺激・紫外線や有害化学物質等のストレスに対する保護手段として働くことを示唆することを確認した。また、カルシウム結合タンパク質であるカルモジュリン（calmodulin）様のタンパク質やプロリンリッチタンパク質（proline-rich protein、protein 2C、protein 2Gなど）も有意に発現しており、プロリンリッチタンパク質（proline-rich protein、protein 2C、protein 2Gなど）は皮膚を構成するタンパク質で重要なコラーゲンなどの中心となるタンパク質であるため、本件ＮＡＤ類縁体は皮膚コラーゲンの新生にも作用していることを確認し、さらに、ＮＡＤ類縁体を肌に適用した場合、お肌の肌理を整え、すべすべした肌を実現させ、また、肌荒れを改善することができることを見い出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち本発明は、［１］３−（アミノカルボニル）−１−［５−Ｏ−［［１−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−１−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノース−５−Ｏ−イル］ホスホニルオキシ（オキシラト）ホスフィニル］−β−Ｌ−リボフラノシル］ピリジニウムである化合物又はその薬理学的に許容される塩を含有する化粧料や、［２］３−（アミノカルボニル）−１−［５−Ｏ−［［１−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−１−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノース−５−Ｏ−イル］ホスホニルオキシ（オキシラト）ホスフィニル］−β−Ｌ−リボフラノシル］ピリジニウムである化合物又はその薬理学的に許容される塩を含有する皮膚外用剤に関する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によると、肌のかさつきを改善し、肌理を整え、すべすべした肌を実現させ、また、肌荒れを改善することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ＮＡＤ類縁体を０、５、１５μｇ／ｍＬ添加し、紫外線を５０秒照射した紫外線照射角質化細胞、及び紫外線を照射しなかった紫外線非照射角質化細胞（コントロール）の培養後４８時間の増殖を示すグラフである。
【図２】ＮＡＤ類縁体を０、５、１５μｇ／ｍＬ添加し、紫外線を５０秒照射した紫外線照射角質化細胞、及び、紫外線を照射しなかった紫外線非照射角質化細胞（コントロール）の培養後４８時間後の細胞の形態を示す図である。
【図３】実施例懸濁液塗布側及びコントロール懸濁液塗布側の皮膚にセロハンテープを貼り、テープに付着した剥離・脱落した表皮を顕微鏡にて観察した様子を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は、３−（アミノカルボニル）−１−［５−Ｏ−［［１−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−１−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノース−５−Ｏ−イル］ホスホニルオキシ（オキシラト）ホスフィニル］−β−Ｌ−リボフラノシル］ピリジニウムである化合物又はその薬理学的に許容される塩を含有する化粧料や皮膚外用剤や、３−（アミノカルボニル）−１−［５−Ｏ−［［１−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−１−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノース−５−Ｏ−イル］ホスホニルオキシ（オキシラト）ホスフィニル］−β−Ｌ−リボフラノシル］ピリジニウムである化合物又はその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する化粧料や皮膚外用剤であれば特に制限されず、本発明における上記化合物（ＮＡＤ類縁体）は、以下の式（VII）として例示することもできる。
【００１２】
【化１】
2014024836.tif 000002
【００１３】
ＮＡＤ類縁体の薬理学的に許容される塩としては、薬理学的に許容される酸付加塩、金属塩、アンモニウム塩、有機アミン付加塩、アミノ酸付加塩等を挙げることができる。薬理学的に許容される酸付加塩としては、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、ホウ酸等の各無機酸塩や、有機酸としてはギ酸、酢酸、プロピオン酸、フマル酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、酒石酸、安息香酸等の各カルボン酸塩類や、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸等のスルホン酸類、グルタミン酸、アスパラギン酸等の各アミノ酸塩類などを挙げることができ、薬理学的に許容される金属塩としては、リチウム、ナトリウム、カリウム等の各アルカリ金属塩や、マグネシウム、カルシウム等の各アルカリ土類金属塩や、アルミニウム、亜鉛等の各金属塩などを挙げることができる。また、薬理学的に許容されるアンモニウム塩としては、アンモニウム、テトラメチルアンモニウム等の各塩を、薬理学的に許容される有機アミン塩としては、トリエチルアミン、ピペリジン、モルホリン、トルイジン等の各塩を、薬理学的に許容されるアミノ酸付加塩としては、グルタミン酸、リジン、グリシン、アラニン等の付加塩などを挙げることができる。
【００１４】
ＮＡＤ類縁体又はその薬理学的に許容される塩を含有する化粧料としては、化粧水、乳液、クリーム、美容液、美容オイル、パック、ハンドクリーム等のスキンケア化粧料や、リップスティック、リップグロス、リップクリーム等の口唇化粧料や、油性ファンデーション、油中水型及び水中油型乳化リキッドファンデーション等のファンデーションや、マニキュア、ネイルコート等の美爪料や、アイカラー、アイライナー、マスカラ等のメイクアップ化粧料や、リンス、コンディショナー、ヘアパック等のヘアケア製品を挙げることができる。なお、本発明の化粧料は、医薬部外品を含む。
【００１５】
本発明の化粧料や皮膚外用剤におけるＮＡＤ類縁体又はその薬理学的に許容される塩の配合量は、特に限定されないが、化粧料や皮膚外用剤などの総量に対して０．００１〜５質量％が好ましく、０．０１〜０．５質量％がより好ましく、０．０５〜０．１質量％がさらに好ましい。
【００１６】
本発明の化粧料や皮膚外用剤の形態としては、水、ローション、クリーム、ゲル等にＮＡＤ類縁体が添加されているものであれば特に制限されないが、両親媒性物質が形成する二分子膜構造を有した閉鎖小胞（ベシクル）に内包させたベシクル分散組成物の形態とすることが好ましい。上記両親媒性物質としては、生体への安全性の面からリン脂質が好ましく、上記ベシクル分散組成物は、リポソーム分散組成物含有化粧料や皮膚外用剤として用いることができる。
【００１７】
上記リン脂質としては、大豆や卵などから得られるレシチン、リゾレシチンなどの中性リン脂質又はこれらの水素添加物や、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、スフィンゴミエリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルセリンを挙げることができる。これらリン脂質は、単独で使用することもでき、２種以上を併用することもできる。
【００１８】
さらに、リポソームの膜安定化剤として、例えば、コレステロール、ジヒドロコレステロール、コレステロールエステル、フィトステロール、シトステロール、コレスタノール等のステロール（類）を用いることもできる。
【００１９】
上記リポソーム分散組成物の調製方法としては、公知の方法を用いることができ、例えば、リポソームの二分子膜構成成分であるリン脂質として、ホスファチジルコリンを用い、フラスコにホスファチジルコリン及びコレステロールを溶媒であるクロロフォルムを加えて溶解し、ロータリーエバポレーターを用いて減圧下でクロロフォルムを除去しつつフラスコ内壁にホスファチジルコリン−コレステロール薄膜を形成させ、次いで薄膜が形成されたフラスコにＮＡＤ類縁体の溶液を添加し、ガラスビーズをフラスコに入れてＶｏｒｔｅｘミキサーを用いて激しく撹拌することで薄膜を剥離させ、その後、リポソームを分散させるために生理食塩水を添加することにより、ＮＡＤ類縁体を内封するリポソーム懸濁液を調製する方法を挙げることができる。
【００２０】
本発明の化粧料や皮膚外用剤等には、通常、化粧料や皮膚外用剤等に使用される成分、例えば、アルコール類、保湿剤、ゲル化剤、粉体、紫外線吸収剤、防腐剤、抗菌剤、酸化防止剤、ｐＨ調整剤、美肌用成分、外用薬剤等を本発明の効果を損なわない範囲で任意成分として適宜配合することができ、これらの成分は、ＮＡＤ類縁体又はその薬理学的に許容される塩とは別に化粧料や皮膚外用剤等に配合することもできる。
【００２１】
上記アルコール類としては、例えばエタノール、イソプロパノール等の低級アルコールや、グリセリン、ジグリセリン、ポリグリセリン、ジエチレングリコール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、ポリプロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、エリスリトール等の多価アルコールや、ソルビトール、マルトース、キシリトール、マルチトール等の糖アルコールや、コレステロール、シトステロール、フィトステロール、ラノステロール等のステロール類などを挙げることができる。
【００２２】
上記保湿剤としては、例えば、尿素、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、ピロリドンカルボン酸塩等を挙げることができる。
【００２３】
上記ゲル化剤としては、水性ゲル化剤又は油性ゲル化剤であれば特に制限されず、例えば、水性ゲル化剤としては、アラビアガム、トラガカントガム、ガラクタン、キャロブガム、グァーガム、カラヤガム、カラギーナン、ペクチン、寒天、クインスシード（マルメロ等由来の）、デンプン（コメ、トウモロコシ、バレイショ、コムギ等由来の）、アルゲコロイド、トラントガム、ローカストビーンガム等の植物系高分子や、キサンタンガム、デキストラン、サクシノグルカン、プルラン等の微生物系高分子や、コラーゲン、カゼイン、アルブミン、ゼラチン等の動物系高分子や、カルボキシメチルデンプン、メチルヒドロキシプロピルデンプン等のデンプン系高分子や、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、セルロース硫酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム等のセルロース系高分子や、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸プロピレングリコールエステル等のアルギン酸系高分子や、ポリアクリル酸ナトリウム、カルボキシビニルポリマー、アルキル変性カルボキシビニルポリマー、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン等のビニル系高分子や、ポリエチレングリコール、エチレンオキサイドプロピレンオキサイド共重合体、ベントナイト、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、ラポナイト、ヘクトライト、無水ケイ酸等の無機系ゲル化剤などを挙げることができる。
【００２４】
上記粉体としては、例えば、無機粉体、有機粉体、金属石鹸粉末、有色顔料、パール顔料、金属粉末、タール色素、天然色素等を挙げることができ、その粒子形状（球状、針状、板状等）や、粒子径（煙霧状、微粒子、顔料級等）や、粒子構造（多孔質、無孔質等）を問わない。これらの粉体はそのまま使用してもよいが、２種以上の粉体を複合化したものを用いてもよく、油剤、シリコーン化合物、フッ素化合物等で表面処理を施してもよい。
【００２５】
上記紫外線吸収剤としては、例えば、パラアミノ安息香酸等の安息香酸系紫外線吸収剤や、アントラニル酸メチル等のアントラニル酸系紫外線吸収剤や、サリチル酸メチル等のサリチル酸系紫外線吸収剤や、パラメトキシケイ皮酸オクチル等のケイ皮酸系紫外線吸収剤や、２，４−ジヒドロキシベンゾフェノン等のベンゾフェノン系紫外線吸収剤や、ウロカニン酸エチル等のウロカニン酸系紫外線吸収剤などを挙げることができる。
【００２６】
上記防腐剤や抗菌剤としては、例えば、パラオキシ安息香酸エステル、安息香酸、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、フェノキシエタノール、サリチル酸、石炭酸、ソルビン酸、パラクロルメタクレゾール、ヘキサクロロフェン、塩化ベンザルコニウム、塩化クロルヘキシジン、トリクロロカルバニリド、感光素、イソプロピルメチルフェノール、１，２−ペンタンジオール等を挙げることができる。
【００２７】
上記酸化防止剤としては、例えば、トコフェロール、ブチルヒドロキシアニソール、ジブチルヒドロキシトルエン等を挙げることができる。
【００２８】
上記ｐＨ調整剤としては、例えば、乳酸、乳酸塩、クエン酸、クエン酸塩、グリコール酸、コハク酸、酒石酸、リンゴ酸、炭酸カリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素アンモニウム等を挙げることができる。
【００２９】
上記美肌用成分としては、例えば、アルブチン、グルタチオン、ユキノシタ抽出物等の美白剤や、ロイヤルゼリー、感光素、コレステロール誘導体、幼牛血液抽出液等の細胞賦活剤・肌荒れ改善剤や、ノニル酸ワレニルアミド、ニコチン酸ベンジルエステル、ニコチン酸β−ブトキシエチルエステル、カプサイシン、ジンゲロン、カンタリスチンキ、イクタモール、カフェイン、タンニン酸、α−ボルネオール、ニコチン酸トコフェロール、イノシトールヘキサニコチネート、シクランデレート、シンナリジン、トラゾリン、アセチルコリン、ベラパミル、セファランチン、γ−オリザノール等の血行促進剤や、酸化亜鉛、タンニン酸等の皮膚収斂剤や、イオウ、チアントロール等の抗脂漏剤などを挙げることができる。
【００３０】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００３１】
［紫外線照射した正常ヒト皮膚由来角質化細胞に対する効果］
正常ヒト皮膚由来角質化細胞（コード番号：１６０８７５４１）及びその専用培養液（コード番号：１６０８７５４０）をコージンバイオ株式会社（埼玉県坂戸市）より購入し、プロトコールに従って上記細胞を３７℃にて、５％ＣＯ２存在下で培養して細胞数を６×１０３〜９×１０３／ｍＬに調整した後、２４穴マルチプレートに１ｍＬ毎に分注して前培養を１８時間行った。その後に培地交換を行ったものを紫外線照射試験に供した。
【００３２】
試験には市販の殺菌用紫外線ランプ（１５ｗ）を使用した。ランプの照射距離は培養液表面から１０ｃｍとし、この条件で紫外線照射時間を検討した。この結果、上記正常ヒト皮膚由来角質化細胞に６０秒間以上紫外線を照射すると、細胞は回復不可能なダメージを受けることが確認されたため、上記正常ヒト皮膚由来角質化細胞に５０秒間紫外線を照射して、紫外線照射角質化細胞を調製した。かかる紫外線を照射した角質化細胞にＮＡＤ類縁体を０、５、１５μｇ／ｍＬ添加した上記専用培養液において培養を開始し、３７℃にて５％ＣＯ２存在下で培養した。紫外線を照射しなかった紫外線非照射角質化細胞についてもＮＡＤ類縁体を添加しない専用培養液にて培養し、ＮＡＤ類縁体非添加コントロール細胞とした。紫外線照射後２４時間及び４８時間における細胞数をメチレンブルー取込みによる生細胞数測定法で測定するとともに、細胞の形態を顕微鏡写真撮影した。結果を図１及び図２に示す。
【００３３】
（結果）
図１より明らかなとおり、上記紫外線照射角質化細胞にＮＡＤ類縁体を添加した場合、添加量に比例して細胞は増殖した。例えば、ＮＡＤ類縁体を１５μｇ／ｍＬに添加した場合、紫外線照射角質化細胞であっても、ＮＡＤ類縁体非添加コントロール細胞とほぼ同等程度に増殖することが確認された。図２においても、ＮＡＤ類縁体を１５μｇ添加した場合、上記紫外線照射角質化細胞が４８時間後には、ＮＡＤ類縁体非添加コントロール細胞と同等程度に増殖することが示されている。この結果より、ＮＡＤ類縁体はダメージを受けた細胞の活性化と保護作用を発揮していると考える。皮膚組織は基底層をなす角質化細胞（ケラチノサイト）が増殖して有棘層、顆粒層へと分化し、最終的に無核の角層へと移行する。従って角質化細胞は皮膚を構成する上で最も重要な基礎細胞である。過剰に紫外線を浴びると皮膚は炎症を起こし、長期間それが継続されると皮膚の「はり」や「潤い」が失われ、皮膚がんを起こすことも知られている。本研究で開発した合成標品は紫外線のダメージを受けた角質化細胞の増殖をサポートしたことから、様々な要因でダメージを受けた皮膚組織（角質化細胞）の回復に効果的であることが強く示唆される。
【００３４】
（紫外線照射を行った正常ヒト表皮ケラチノサイトに対する効果）
正常成人ヒト表皮ケラチノサイト細胞（NHEK-Ad）及びヒト表皮ケラチノサイト細胞用培養液（KGM-GoldTM-BulletKitTM）をLonza Japan株式会社から購入し、プロトコールに従って上記細胞を３７℃にて、５％ＣＯ２存在下で培養して細胞数を２×１０４〜６×１０４個／ｍＬに調整した。２４穴マルチプレートに１ｍＬ毎に分注して培養を行い、およそ８０％コンフルエントになった時点で培地交換を行った。
【００３５】
市販の殺菌用紫外線ランプ（１５ｗ）を培養液表面から１０ｃｍの距離に設置し、上記正常ヒト表皮ケラチノサイト(成人)細胞に４０秒間紫外線を照射して、紫外線照射ケラチノサイト細胞を調製した。上記ヒト表皮ケラチノサイト細胞用培養液にＮＡＤ類縁体を０又は１０μg／ｍＬ添加し、上記ＮＡＤ類縁体を３７℃にて、５％ＣＯ２存在下で培養した。紫外線を照射しなかった紫外線非照射ケラチノサイト細胞についてもＮＡＤ類縁体を０又は１０μg／ｍＬ添加し、上記ヒト表皮ケラチノサイト細胞用培養液にて培養した。培養開始から２４時間及び７２時間経過後に各細胞からＲＮＡを抽出し、抽出されたＲＮＡを、ＤＮＡマイクロアレイ解析に供した。なお、ＤＮＡマイクロアレイ解析は株式会社セルイノベーター（福岡市）に委託した（http://www.cell-innovator.com/）。
【００３６】
上記ＤＮＡマイクロアレイのデータ解析により生物学的な機能を有する類似の遺伝子群がクラスターとして統括・分類され、スコアが高いクラスターとして表示された。ｐ＜０．０５が統計的に有意であると判断される。以下の表１では、ＮＡＤ類縁体の添加により特に表皮の形成（epidermis development）、外胚葉性細胞の形成（ectoderm development）、表皮細胞分化（epidermal cell differentiation）、上皮細胞分化（epithelial cell differentiation）、及び上皮形成（epithelium development）に関係する機能が有意にエンリッチされていることが確認された。
【００３７】
【表１】
2014024836.tif 000003
【００３８】
上記機能に含まれていて有意な発現変動がみられた５遺伝子を以下の表２に示す。皮膚の構成細胞の増殖や分化に関係する５種類の重要な遺伝子が対照と比較して、有意に発現していることが確認された。紫外線照射を行った細胞にＮＡＤ類縁体を添加して培養した場合、表皮の辺縁帯成分であって、角質細胞の細胞膜を裏打ちする役割を果たすロリクリン（loricrin）が有意に発現しており、ＮＡＤ類縁体の添加が、皮膚の細胞の生育を促進し、外界からの刺激・紫外線や有害化学物質等のストレスに対する保護手段として働くことを示唆するものといえる。カルシウム結合タンパク質であるカルモジュリン（calmodulin）様のタンパク質も有意に発現している。また、基底層から出発した角質化細胞は分裂・成熟の過程で様々なペプチダーゼが作用し、最終的には細胞の脱核がおこり、表皮から脱落するが、インヒビターはペプチダーゼの作用を制御すると考えられている。プロリンリッチタンパク質（proline-rich protein、protein 2C、protein 2Gなど）は皮膚を構成するタンパク質で重要なコラーゲンなどの中心となるタンパク質であるため、本件ＮＡＤ類縁体は皮膚コラーゲンの新生にも作用していることが示唆される。
【００３９】
【表２】
2014024836.tif 000004
【００４０】
（ＮＡＤ類縁体含有リポソームの製造）
（１）井上らの方法（野島、砂本、井上．リポソームの調整、リポソーム（２６〜３７頁）、南江堂、１９８８）にしたがってリポソームを調製した。リポソームの二分子膜構成成分であるリン脂質としては、卵黄ホスファチジルコリン（和光純薬製）を用いた。処方を以下の表３に示す。
【００４１】
【表３】
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【００４２】
５０ｍＬ容量のナス型フラスコにホスファチジルコリン２０ｍｇ及びコレステロール３．９ｍｇを溶媒であるクロロフォルム２ｍＬを加えて溶解し、ロータリーエバポレーターを用いて減圧下でクロロフォルムを除去しつつフラスコ内壁にホスファチジルコリン−コレステロール薄膜を形成させた。次いでフラスコにＮＡＤ類縁体溶解液（１０ｍｇ/４ｍＬ蒸留水）を添加し、直径５ｍｍのガラスビーズ３個をフラスコに入れてＶｏｒｔｅｘミキサーを用いて激しく撹拌することで薄膜を剥離させた。その後、リポソームを分散させるため、６ｍＬの生理食塩水を添加してＮＡＤ類縁体を内封するリポソームの実施例懸濁液を得た。本件ＮＡＤ類縁体の終濃度は１ｍｇ/ｍＬとした。また、ＮＡＤ類縁体を内封していないリポソームの懸濁液をコントロールとした。
【００４３】
（官能評価）
４３歳から５８歳の健康な女性ボランティア２０名の協力を得て平成２５年２月〜３月の３週間にわたり以下の試験を行った。目尻〜眼下の膨隆部に上記実施例懸濁液を朝夕の洗顔後に塗布した。顔の右側は実施例懸濁液を、左側はコントロールの懸濁液を数滴とり、朝夕の洗顔後に５００円玉大程度の広さに塗布した。塗布開始後３週間経過時に各被検者のコントロール懸濁液を塗布した顔の左側の目尻〜眼下の膨隆部の肌の様子と比較して、各被検者の本件実施例懸濁液を塗布した顔の右側の目尻〜眼下の膨隆部の肌の様子について評価した。結果を以下の表４に示す。
【００４４】
【表４】
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【００４５】
（結果）
上記被検者は、大部分は、特に肌に関する障害や悩みを特に有する者ではなかったが、ＮＡＤ類縁体を添加した懸濁液を塗布した肌においては、コントロールの懸濁液を塗布した場合と比較して、明らかにすべすべ感や肌の張りが顕著に増加したものが多数いた。また、ＮＡＤ類縁体を添加した懸濁液を塗布した場合において、痒み・違和感や発赤・吹出物の発症などの侵襲性は認められず、ＮＡＤ類縁体が皮膚に対して安全であることも確認された。これらの結果は、ＮＡＤ類縁体が皮膚の細胞の生育を促進し、外界からの刺激・紫外線や有害化学物質等のストレスに対する保護に対しても有用であり、皮膚を構成するタンパク質で重要とされるコラーゲンなどタンパク質の産生も促進し、細胞膜を裏打ちする役割を果たすロリクリンが高発現するという、上記の遺伝子解析による結果とも一致し、本発明のＮＡＤ類縁体が化粧品としても有意な効果を有することが確認された。
【００４６】
（角質化細胞の顕微鏡観察）
上記右側（実施例懸濁液塗布側）及び左側（コントロール懸濁液塗布側）それぞれの眼下隆起部の皮膚にセロハンテープを貼り、静かに剥してテープに付着した剥離・脱落した表皮を顕微鏡にて観察した（２００倍）。コントロール懸濁液塗布部位では表皮は大きな塊として剥離・脱落している様子が観察されるが、実施例懸濁液塗布部位では、広い範囲での剥離・脱落がみられなかった（図３参照）。
【００４７】
（まとめ）
本発明のＮＡＤ類縁体を含有するクリームは、使用性に優れながらも、肌荒れや、角質の剥離を防止し、かさつきを改善し、肌理を整え、すべすべした肌を実現させ、また、安全性、安定性や感触的にも優れた皮膚化粧料であることが確認された。このことは紫外線によるダメージを受けた細胞で、上記ＮＡＤ類縁体は細胞の再生・復活に関係する遺伝子群を有意に発現させることに裏付けされるものである。これらの結果から、ＮＡＤ類縁体は化粧品の素材として応用が可能と考える。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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