(57)【要約】【課題】サイトカインと相互に作用する薬剤のスクリーニング方法に、株化肝細胞を利用する手法を提供する。【解決手段】薬剤のスクリーニング方法は、（Ａ）サイトカイン及び薬剤を含まない第１の試験溶液と、（Ｂ）サイトカインを含み、薬剤を含まない第２の試験溶液、及び（Ｃ）サイトカイン及び薬剤を含む第３の試験溶液、を用意し、培養空間１１を有する培養容器１０を用いて株化肝細胞を培養してスフェロイド９を形成し、第１乃至第３の試験溶液とスフェロイド形状の株化肝細胞とを接触させ、チトクロムＰ４５０の薬物代謝酵素の機能を測定して、第１乃至第３の試験溶液それぞれに対応する第１乃至第３の測定値を測定し、第１の測定値が第２の測定値より大きく、かつ、第２の測定値が第３の測定値より小さい場合、薬剤がチトクロムＰ４５０の薬物代謝機能を回復させると判定する。【選択図】図５Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
サイトカインと相互に作用する薬剤のスクリーニング方法であって、
（Ａ）前記サイトカイン及び前記薬剤を含まない第１の試験溶液、（Ｂ）前記サイトカインを含み、前記薬剤を含まない第２の試験溶液、及び（Ｃ）前記サイトカイン及び前記薬剤を含む第３の試験溶液、を用意し、
前記第１乃至第３の試験溶液とスフェロイド形状の株化肝細胞とを接触させ、
前記第１の試験溶液と接触させた前記株化肝細胞のチトクロムＰ４５０の薬物代謝酵素の機能を測定して第１の測定値を取得し、同様に、前記第２及び第３の試験溶液と接触させた前記株化肝細胞のチトクロムＰ４５０の薬物代謝酵素の機能を測定して第２及び第３の測定値を取得し、
前記第１の測定値が前記第２の測定値より大きく、かつ、前記第２の測定値が前記第３の測定値より小さい場合、前記薬剤がチトクロムＰ４５０の薬物代謝機能を回復させると判定するスクリーニング方法。
【請求項２】
前記株化肝細胞から形成されたスフェロイドの直径の平均値が５０μｍ以上２００μｍ未満であって、かつ、半値幅範囲内の直径を有するスフェロイドが全スフェロイドの７０％以上であることを特徴とする請求項１のスクリーニング方法。
【請求項３】
前記試験溶液の溶媒が無血清培地であることを特徴とする請求項１または２記載のスクリーニング方法。
【請求項４】
前記第３の測定値は、前記第２の測定値の３倍である場合に、チトクロムＰ４５０の薬物代謝機能を回復させると判定することを特徴とする請求項１乃至３のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
【請求項５】
前記第２及び第３試験溶液のサイトカインの濃度は、健常人のサイトカインの血中濃度の平均値の０．１倍から５０倍の範囲のうちの一つの濃度を基準とし、前記基準の少なくとも１倍、１０倍、１００倍の３濃度の前記サイトカインを含み、前記薬剤を含まない溶液を前記株化肝細胞と接触させ、チトクロムＰ４５０の薬物代謝酵素の機能を測定した測定値が、前記第１の測定値より小さくなる濃度を選択することを特徴とする請求項１乃至４のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
【請求項６】
前記第２及び第３の試験溶液のサイトカインの濃度は、前記サイトカインが分泌される疾患患者の血中濃度の０．１倍から５０倍の範囲のうちの一つの濃度を基準とし、前記基準の少なくとも１倍、１０倍、１００倍の３濃度の前記サイトカインを含み、前記薬剤を含まない溶液を前記株化肝細胞と接触させ、チトクロムＰ４５０の薬物代謝酵素の機能を測定した測定値が、前記第１の測定値より小さくなる濃度を選択することを特徴とする請求項１乃至４のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
【請求項７】
前記株化肝細胞をスフェロイド形状に培養する工程と、スフェロイド形状の前記株化肝細胞と前記第１乃至第３の試験溶液とを接触させる工程とを、培養プレートの同一のウェル内で行うことを特徴とする請求項１乃至６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記第１乃至第３の試験溶液とスフェロイド形状の前記株化肝細胞とを１時間以上９６時間未満接触させることを特徴とする請求項１乃至７のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
【請求項９】
前記培養容器として、複数のウェルを有する培養プレートの一つのウェルを用い、
前記一つのウェル内に１０％血清を含む培地で前記株化肝細胞のスフェロイドを形成させる工程と、
前記一つのウェルから前記培地を吸い取る工程と、
前記一つのウェルへ、前記第１乃至第３の試験溶液のうちの一つを添加する工程と、
前記一つのウェル内で、前記第１乃至第３の試験溶液のうちの一つと、前記スフェロイドとを１時間以上９６時間未満接触させる工程と、を行うこと特徴とする請求項１乃至９のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
【請求項１０】
前記培養容器は、複数のウェルを有する培養プレートの各ウェル内に、複数の培養空間を有するように形成され、
各培養空間は、相当直径の長さを有する面と、高さとからなる空間であり、前記高さを前記相当直径で割った値が０．３から２の範囲であり、
前記培養空間の底に、前記相当直径が１００μｍから１０００μｍの範囲の培養空間が少なくとも２個以上配置されていることを特徴とする請求項１乃至９のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
【請求項１１】
前記複数の培養空間は、隣り合う前記培養空間を隔てる壁の厚さが２μｍから５０μｍの範囲であることを特徴とする請求項１乃至１０のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
【請求項１２】
前記培養空間を隔てる壁の上面と側面とがなす角度が９０度から１３５度の範囲であることを特徴とする請求項１乃至１１のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
【請求項１３】
前記複数の培養空間の底の表面が、ガラス処理により、水接触角を４５度以下になるように処理されたことを特徴とする請求項１乃至１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記複数の培養空間の底の表面が、プラズマ処理により官能基を形成させて、水接触角を４５度以下になるように処理されたことを特徴とする請求項１乃至１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記培養容器の表面は、ポリマー温度、光のいずれかにより親水性と疎水性とが変化するポリマー、細胞接着を阻害する親水性のポリマー鎖、リン脂質、リン脂質・高分子複合体、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）（ＰＨＥＭＡ）、ポリビニルアルコール、アガロース、キトサン、ポリエチレングリコール、及びアルブミンのグループから選択される一つ、または組合せからなるポリマーが、固定化されていること特徴とする請求項１乃至１４のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
【請求項１６】
前記培養容器の表面は、細胞接着を阻害する親水性のポリマー鎖、リン脂質、リン脂質・高分子複合体、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）（ＰＨＥＭＡ）、ポリビニルアルコール、アガロース、キトサン、ポリエチレングリコール、及びアルブミンのグループから選択される一つ、またはこれら組合せからなるポリマーと、細胞接着性を促進するポリマーである、ポリ−Ｌ−リシン、ポリ−Ｌ−リシン、コラーゲン、ラミニン、及びフィブロネクチンから選択される一つ、またはこれら組合せからなるポリマーとの混合物が固定化されていることを特徴とする請求項１乃至１４のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
【請求項１７】
前記培養容器が、アクリル系樹脂、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、スチレン系樹脂、アクリル・スチレン系共重合樹脂、ポリカーボネート系樹脂、ポリエステル系樹脂、ポリビニルアルコール系樹脂、エチレン・ビニルアルコール系共重合樹脂、熱可塑性エラストマー、塩化ビニル系樹脂、及びシリコン樹脂のグループから選択される一つまたはこれらの組み合わせからなる樹脂成形品であることを特徴とする請求項１乃至１６のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
【請求項１８】
前記培養容器の底部を構成するポリマーの全光線透過率が８５％以上９９％未満であることを特徴とする請求項１乃至１７のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サイトカインと相互に作用する薬剤のスクリーニング方法であり、例えば、血中のサイトカイン濃度の上昇、またはチトクロムＰ４５０を抑制するインタートイキンや成長因子といったサイトカインに類する医薬品の投与が要因で低下したチトクロムＰ４５０の代謝機能を回復する薬剤のスクリーニング方法である。
【背景技術】
【０００２】
近年、サイトカインに関して様々な研究が行われている。
例えば、炎症性の自己免疫疾患の患者のインターロイキンの血中濃度は健常人より高く、チトクロムＰ４５０の代謝機能は健常人と比較して低い（非特許文献１）。このような患者にチトクロムＰ４５０の代謝を受ける医薬品（Ｄ１）を投与する場合、該当患者の代謝機能の低下分を見越して健常人よりも少ない量を投与する。このような患者に対し、インターロイキンの受容体をブロックするような、サイトカインと相互に作用する薬剤（Ｄ２）（例えば、分子標的医薬品）を併用すると、低下したチトクロムＰ４５０の代謝機能が回復し、医薬品（Ｄ１）の代謝が促進される。その結果、医薬品（Ｄ１）の作用が減弱化することが臨床研究で示された（非特許文献２）。このような背景から、分子標的医薬品のような薬剤とチトクロムＰ４５０の代謝を受ける医薬品のサイトカインを介した相互作用の研究が注目されるようになってきた。
また、インターロイキンに代表されるサイトカイン類は創薬ターゲットとしても注目されるようになり、近年では、薬剤とサイトカインとの相互作用を評価するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ系が求められるようになってきた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Kenneth W. Renton著、"Cytochrome P450 Regulation and Drug Biotransformation During Inflammation and Infection"、Current Drug Metabolism、２００４年５月、ｐｐ．２３５−２４３
【非特許文献２】Leslie J. Dickmann, Sonal K. Patel, Dan A. Rock, Larry C. Wienkers, and J. Greg Slatter著、"Effects of Interleukin-6 (IL-6) and an Anti-IL-6 Monoclonal Antibody on Drug-Metabolizing Enzymes in Human Hepatocyte Culture"、DRUG METABOLISM AND DISPOSITION 39、２０１１年、ｐｐ．１４１５−１４２２
【非特許文献３】C Schmitt, B Kuhn1, X Zhang, AJ Kivitz3 and S Grange著、"Disease-Drug-Drug Interaction Involving Tocilizumab and Simvastatin in Patients With Rheumatoid Arthritis"、Clinical Pharmacology & Therapeutics、VOLUME 89 NUMBER 5、２０１１年５月、ｐｐ．７３５−７４０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏの試験として、例えば非特許文献３ではヒト初代肝細胞を用いた方法が開示されている。しかし、ヒト初代肝細胞はドナーの遺伝子多型や環境要因に起因する薬物動態遺伝子の発現量及びその誘導能についてのロット間差が大きいため、生体内の挙動を正確に把握するためには複数ロットの細胞を用いる必要がある。加えて、ヒト初代肝細胞は入手経路が限られているためコストが高い。そのため、多くの薬剤を一度に評価するような薬剤のスクリーニングに利用できないという問題があった。
一方、株化肝細胞は、増殖させることが可能である。従って、ヒト由来の株化肝細胞が利用できれば、安価にかつ再現性のある結果が得られる。しかしながら、株化肝細胞の代謝機能は低く、初代肝細胞と同様の挙動（化合物やサイトカイン等による代謝酵素の誘導や減衰）を示す株化肝細胞を得ることは容易でない。細胞を培養する底部の表面が平坦な培養容器を用いて培養した場合、薬物代謝機能が低いためにサイトカインによる代謝機能の減衰及び薬剤添加による代謝機能の回復が検出できないという問題がある。このような背景から、チトクロムＰ４５０の代謝機能を回復する薬剤のスクリーニング方法は開発されていなかった。
発明者らは、サイトカインと相互に作用する薬剤のスクリーニング方法に、株化肝細胞を利用する手法を発見した。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
発明者らは、スフェロイド形状の株化肝細胞とサイトカインと薬剤とのいずれかを含む試験溶液を接触させた後のチトクロムＰ４５０の代謝能を測定する方法で上述した問題を解決した。
本発明に係るサイトカインと相互に作用する薬剤のスクリーニング方法の一態様は、
（Ａ）前記サイトカイン及び前記薬剤を含まない第１の試験溶液、
（Ｂ）前記サイトカインを含み、前記薬剤を含まない第２の試験溶液、及び
（Ｃ）前記サイトカイン及び前記薬剤を含む第３の試験溶液、を用意し、
前記第１乃至第３の試験溶液とスフェロイド形状の株化肝細胞とを接触させ、
前記第１の試験溶液と接触させた前記株化肝細胞のチトクロムＰ４５０の薬物代謝酵素の機能を測定して第１の測定値を取得し、同様に、前記第２及び第３の試験溶液と接触させた前記株化肝細胞のチトクロムＰ４５０の薬物代謝酵素の機能を測定して第２及び第３の測定値を取得し、
前記第１の測定値が前記第２の測定値より大きく、かつ、前記第２の測定値が前記第３の測定値より小さい場合、前記薬剤がチトクロムＰ４５０の薬物代謝機能を回復させると判定する。
この方法により、サイトカインと相互に作用する薬剤のスクリーニング方法に、株化肝細胞を利用することが可能となることを見いだした。
【０００６】
また、本発明に係るスクリーニング方法において、前記株化肝細胞から形成されたスフェロイドの直径の平均値が５０μｍ以上２００μｍ未満であって、かつ、半値幅範囲内の直径を有するスフェロイドが全スフェロイドの７０％以上であることが好ましい。スフェロイドの直径の大きさが所定の範囲内であり、かつ、スフェロイドの直径の大きさのばらつきが小さくなることにより、代謝機能の判定の精度を向上させることができる。
【０００７】
さらに、本発明に係るスクリーニング方法において、前記試験溶液の溶媒が無血清培地であることが好ましい。
加えて、前記第３の測定値は、前記第２の測定値の３倍である場合に、チトクロムＰ４５０の薬物代謝機能を回復させると判定することが好ましい。
さらに加えて、前記第２及び第３試験溶液のサイトカインの濃度は、健常人のサイトカインの血中濃度の平均値の０．１倍から５０倍の範囲のうちの一つの濃度を基準とし、前記基準の少なくとも１倍、１０倍、１００倍の３濃度の前記サイトカインを含み、前記薬剤を含まない溶液を前記株化肝細胞と接触させ、チトクロムＰ４５０の薬物代謝酵素の機能を測定した測定値が、前記第１の測定値より小さくなる濃度を選択することが好ましい。また、前記第２及び第３の試験溶液のサイトカインの濃度は、前記サイトカインが分泌される疾患患者の血中濃度の０．１倍から５０倍の範囲のうちの一つの濃度を基準とし、前記基準の少なくとも１倍、１０倍、１００倍の３濃度の前記サイトカインを含み、前記薬剤を含まない溶液を前記株化肝細胞と接触させ、チトクロムＰ４５０の薬物代謝酵素の機能を測定した測定値が、前記第１の測定値より小さくなる濃度を選択することが好ましい。
【０００８】
本発明に係るスクリーニング方法において、前記株化肝細胞をスフェロイド形状に培養する工程と、スフェロイド形状の前記株化肝細胞と前記第１乃至第３の試験溶液とを接触させる工程とを、培養プレートの同一のウェル内で行うことが好ましい。
加えて、前記第１乃至第３の試験溶液とスフェロイド形状の前記株化肝細胞とを１時間以上９６時間未満接触させることが好ましい。
さらに加えて、前記培養容器として、複数のウェルを有する培養プレートの一つのウェルを用いて以下の各構成を行うことが好ましい。
（１）前記一つのウェル内に１０％血清を含む培地で前記株化肝細胞のスフェロイドを形成させる工程と、
（２）前記一つのウェルから前記培地を吸い取る工程と、
（３）前記一つのウェルへ、前記第１乃至第３の試験溶液のうちの一つを添加する工程と、
（４）前記一つのウェル内で、前記第１乃至第３の試験溶液のうちの一つと、前記スフェロイドとを１時間以上９６時間未満接触させる工程。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、サイトカインと相互に作用する薬剤のスクリーニング方法に、株化肝細胞を利用することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明の一実施形態で用いる培養プレートの全体を示す図である。
【図２Ａ】図１に示す培養プレートのＩＩ−ＩＩ線断面図である。
【図２Ｂ】図１に示す培養プレートの他のＩＩ−ＩＩ線断面図である。
【図３】本発明の一実施形態で用いる培養容器の全体を示す図である。
【図４】図３に示す培養容器のＩＶ−ＩＶ線断面図である。
【図５Ａ】培養空間でスフェロイドを培養する状態を表す概略図である。
【図５Ｂ】培養空間で培養したスフェロイドの好ましいサイズの一例を説明する模式図を示す図である。
【図６Ａ】培養空間の他の形状例を示す図である。
【図６Ｂ】培養空間のさらに他の形状例を示す図である。
【図７Ａ】培養空間の他の側面の形状例を示す断面図である。
【図７Ｂ】培養空間のさらに他の側面の形状例を示す断面図である。
【図７Ｃ】培養空間のさらに他の側面の形状例を示す断面図である。
【図８】実施例で用いる培養プレートの一例を示す写真である。
【図９】スフェロイド形状の株化肝細胞と、サイトカインを含む試験溶液とを接触させる時間の長さとチトクロムＰ４５０の代謝機能の反応性との関係を示す試験結果を示す図である。
【図１０】試験溶液のサイトカインの濃度とＣＹＰ３Ａ４タンパク量との関係を検討した試験結果を示す図である。
【図１１】第１乃至第３の試験溶液をスフェロイドに接触させたときのＣＹＰ３Ａ４の  ｍＲＮＡの発現量を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、実施形態について、図面を参照しながら説明する。説明の明確化のため、以下の記載及び図面は、適宜、省略、及び簡略化がなされている。各図面において同一の構成または機能を有する構成要素および相当部分には、同一の符号を付し、その説明は省略する。
【００１２】
発明者らは、サイトカインと相互に作用する薬剤のスクリーニング方法（以降適宜、「スクリーニング方法」と称する）を、次の手順により実現可能であることを発見した。（Ａ）サイトカイン及び薬剤を含まない第１の試験溶液と、（Ｂ）サイトカインを含み、薬剤を含まない第２の試験溶液、及び（Ｃ）サイトカイン及び薬剤を含む第３の試験溶液を用意する。また、培養空間を有する培養容器を用いて株化肝細胞を培養してスフェロイドを形成する。そして、第１乃至第３の試験溶液とスフェロイド形状の株化肝細胞とを接触させ、第１の試験溶液と接触させた株化肝細胞のチトクロムＰ４５０の薬物代謝酵素の機能を測定して第１の測定値を取得し、同様に、第２及び第３の試験溶液と接触させた株化肝細胞のチトクロムＰ４５０の薬物代謝酵素の機能を測定して第２及び第３の測定値を取得する。測定した結果、第１の測定値が第２の測定値より大きく、かつ、第２の測定値が第３の測定値より小さい場合、薬剤がチトクロムＰ４５０の薬物代謝機能を回復させると判定する。
【００１３】
用語「サイトカイン」は、細胞から放出され、種々の細胞間相互作用を媒介するタンパク質性因子を総称するものであり、例えば、免疫系の調節、炎症反応の惹起、抗腫瘍作用、細胞増殖、分化、抑制といった生体の恒常性維持に役割を果たす物質である。一実施形態では、サイトカインは、その存在によって、肝臓の機能の変動（誘導、減衰）の起因となる場合を特に対象とし、例えば、増殖因子、インターフェロン、腫瘍壊死因子などを含む。
用語「スフェロイド」は、細胞が多数凝集して細胞塊を形成し、３次元状態になったものである。
用語「チトクロムＰ４５０（ＣＹＰ）」は、細菌から植物，哺乳動物に至るまでのほとんどすべての生物に存在する、異物（薬物）代謝の役割を果たす酵素である。動物では、主に肝臓に存在する。
用語「サイトカインと相互に作用する薬剤」（以降適宜、「薬剤」とも称する）は、サイトカインが存在すると相互に作用する薬剤であり、特に、サイトカインと相互作用によって、チトクロムＰ４５０の代謝機能を変動させる薬剤である。例えば、体内のタンパク質や遺伝子などを利用したバイオ医薬品、低分子医薬品などを含む。
以下の説明において、「値Ａから値Ｂの範囲」という場合には、特に明記していない限り、「値Ａ以上値Ｂ以下」を意味する。
【００１４】
以下、一実施形態のスクリーニング方法について、最初に株化肝細胞を培養する培養容器について説明し、次に、株化肝細胞を培養して判定するまでの培養・判定方法について説明する。
１．培養容器
＊  培養容器の概略
図１は、本発明の一実施形態で用いる培養プレートの全体を示す図である。図２Ａは、図１に示す培養プレートのＩＩ−ＩＩ線断面図であり、図２Ｂに、他の態様の断面図を示す。培養プレート１は、複数のウェル２１を備える。複数のウェル２１は、仕切り部２２によって、隣り合うウェル２１と隔てられる。複数のウェル２１それぞれには、培養容器１０が形成されている。
図３に、本発明の実施形態で用いる培養容器の構成例を示す。図４は、図３に示す培養容器のＩＶ−ＩＶ線断面図である。
培養容器１０は、培養空間１１と、壁１２と、底部１３とを有する。
培養空間１１は、壁１２と底部１３とで仕切られた領域であり、細胞を培養する三次元の空間領域（培養領域）となる。培養空間１１は、単に「空間」、または「マイクロ空間」とも称する。
壁１２は、培養空間１１を仕切る隔壁であり、培養容器１０に凹凸パターンを形成する凸部ともいえる。培養空間１１が仕切り部２２に隣接する場合、壁１２は、図２Ａに示すように、仕切り部２２の壁面の一部分と同じになってもよいし、図２Ｂに示すように、仕切り部２２の壁面に隣接して壁１２が配置されてもよい。
底部１３は、培養容器１０の基板として機能するとともに、培養空間１１が配置される側の表面は、培養領域（培養表面）の一部となる。底部１３は、培養プレート１に形成された各ウェル２１の底部と同じ領域であり、各ウェル２１の底部が用いられる。底部１３は、培養空間１１の底を形成する。底部１３のうち、培養空間１１を形成する面の一部分であり、かつ、培養領域となる底部の表面を、「底部培養面１４」とも称する。
【００１５】
図３，４では、培養容器１０に形成される培養空間１１に関して、相当直径Ｄ、高さ（深さ）Ｈ、壁１２の幅（厚さ）Ｗ、及び、底部１３の厚さＴを示す。図３，４では、底部１３は、壁１２と一体として作製された場合を示している。
相当直径Ｄは、培養空間１１に内接する内接円の直径をいう。より詳しくは、相当直径Ｄは、培養空間１１の底部１３と平行する面の形状（正面の形状）、言い換えると、培養空間１１の高さＨの方向と垂直になる面の形状の内接円の直径をいう。培養空間１１の正面の形状が、高さＨに応じて異なる場合、株化肝細胞を培養する空間領域の最大値を相当直径の相当直径とする。
高さＨは、培養空間１１の底（底部培養面１４）から壁１２の上面までの長さであり、培養空間１１の深さでもあるともいえる。また、底部培養面１４が平面の場合、高さＨは、壁１２の高さと同じである。
壁１２の幅Ｗは、壁１２の厚さであるとともに、隣接する培養空間１１間を隔てる距離であるともいえる。
【００１６】
培養容器１０内（言い換えると、各ウェル２１内）において、複数の培養空間１１は、図３に示すようにアレイ状に配置される。培養容器１０に含まれる培養空間１１の数または大きさは、培養プレート１に作製されるウェル２１の数（ウェル２１の大きさ）と培養空間１１及び壁１２の大きさに依存するものである。具体的には、ウェル２１の数が多くなるに従って、培養空間１１の数または大きさが小さくなる関係にある。図１乃至４では、構成をわかりやすく説明するため、培養空間１１の数を少なくして表した概略図であり、培養容器１０に含まれる培養空間１１の数は実際とは異なる。加えて、図３，４では、９個の培養空間１１を示している。これは説明のために示したものであり、実際の培養容器１０（各ウェル２１）に含まれる培養空間１１の数に対応するものではない。
【００１７】
発明者らは、相当直径Ｄが所望するスフェロイドの直径の１〜５倍であり、高さＨが相当直径Ｄの０．３倍〜５倍である培養空間１１を複数有するとともに、該培養空間表面の水接触角が４５度以下である培養容器１０を使用し、各培養空間１１で株化肝細胞を培養することによって、均一な直径の株化肝細胞のスフェロイドを培養することができることを見出した。従って、所望するスフェロイドの大きさに応じて、培養容器１０に配置される培養空間１１の大きさを選択することにより、培養するスフェロイドの大きさを制御することが可能になる。一実施形態では、株化肝細胞として、ヒト由来の株化肝細胞を培養してスフェロイド形成させる。以下に詳細を説明する。
【００１８】
図１乃至４を参照して、所望のスフェロイドを形成させるためのマイクロオーダの培養空間１１の大きさ、形状等と、培養表面の特性を説明する。
＊  培養空間の大きさ、形状等
培養空間１１の相当直径Ｄについて、スフェロイドの大きさが、細胞が増殖するに従いその直径が大きくなることを考慮する必要がある。そこで重要なことは、スフェロイドが隣り合う培養空間１１の細胞と接触しないような培養空間１１を確保することである。このため、培養空間１１の相当直径Ｄは、所望するスフェロイドの直径の１〜５倍の範囲が好ましく、１．５〜３倍の範囲がより好ましい。
例えば、直径１００μｍの株化肝細胞のスフェロイドを形成させるために、所望するスフェロイドの直径の１〜５倍の範囲、即ち、相当直径Ｄが１００〜５００μｍの範囲で、高さＨが相当直径の０．３〜２倍の範囲の培養空間１１が規則的に配置されている底部１３を有する培養容器１０を用いる。
【００１９】
一例として、株化肝細胞であるがん細胞を培養する場合を検討する。
株化肝細胞培養空間１１の表面との細胞接着性を強めることで、増殖・維持させているような場合は、十分に細胞が底面に接着性していることから培地交換時に細胞が剥離することがない。そのため、本実施形態のような、培養空間１１の相当直径Ｄが所望するスフェロイドの直径の１〜５倍の範囲、高さＨが相当直径Ｄの０．３〜２倍の範囲という、深い空間は必要ないため、そのような空間での培養は行わない。
一方、一実施形態では、後述するように細胞接着性を抑制しているため、アミノ酸や酸素などの供給が可能、かつ、スフェロイドが脱離しない最適な高さＨを設計する必要がある。後述する好ましい大きさの範囲のスフェロイドを形成させるために、適切な高さＨ、相当直径Ｄを検討した。その結果、細胞増殖によりスフェロイドが過剰に大きくなることを防ぐためには、相当直径Ｄが１００μｍ〜２００μｍの範囲、高さＨが５０μｍ〜１００μｍの範囲が好ましいことを見いだした。培養空間１１の底までアミノ酸等の栄養分を十分に供給するため、かつ老廃物の蓄積を防ぐために、培養空間１１の高さＨは、培地交換や試験溶液交換時にスフェロイドが剥離しない限り低い方が好ましい。具体的には、培養空間１１の高さＨを相当直径Ｄで割った値が０．３〜２の範囲が好ましく、０．５〜１の範囲がより好ましいことを見いだした。
【００２０】
一実施形態では、試験溶液をスフェロイド中心部まで拡散または輸送させるためには、スフェロイドの直径は最大２００μｍ未満、好ましくは１５０μｍ以下が好ましい。さらに加えて、細胞間の相互作用を最大限に引き出すためには、スフェロイドの直径は、最小５０μｍが好ましく、６０μｍ〜１５０μｍの範囲がより好ましい。ここで、細胞間の相互作用は、被験物質（例えば、サイトカイン）とチトクロムＰ４５０との相互作用である。
【００２１】
壁１２の幅Ｗは、培養空間１１と隣接する培養空間１１を隔てる壁１２の厚みである。従って、壁１２の幅Ｗは、壁１２の上面での細胞増殖を防ぐため、かつ、細胞が培養空間１１内に入りやすくするため、２〜５０μｍの範囲がよく、好ましくは、細胞体１個以下の大きさ、即ち５〜３０μｍの範囲が好ましく、５〜１０μｍの範囲がより好ましい。さらに、同様の観点から、壁１２の上面と培養空間１１の側面とのなす角θは、９０〜１３５度の範囲が好ましく、９０度〜１２０度の範囲がより好ましい。
【００２２】
図５Ａに、培養空間１１でスフェロイドを培養する状態を表す概略図を示す。図５Ａでは、図４に示す断面図を用い、スフェロイド９を、○印で示す。スフェロイド９は、複数の培養空間１１それぞれにおいて培養される。
図１に示す培養プレート１で培養する場合、ウェル２１毎に培養条件の設定、培地の交換等を実施することになる。そのため、各ウェル２１に複数の培養空間１１を形成するため、各ウェル２１において、同条件で複数のスフェロイドを培養することが可能になる。加えて、ウェルプレートを用いてスフェロイドを培養することができるため、従来の細胞培養で用いる装置等を利用することが可能になる。
スフェロイド９の直径ＤＳＰを値ｄｓｐ（ｄｓｐは正の数値）とすると、培養空間１１の相当直径Ｄは、値ｄｓｐから値ｄｓｐの５倍の範囲（ｄｓｐ≦Ｄ≦５ｄｓｐ）が好ましい範囲となる。また、培養空間１１の高さＨは、値ｄｓｐの０．３倍から値ｄｓｐの２５倍（５×５）の範囲（０．３ｄｓｐ≦Ｈ≦２５ｄｓｐ）が好ましい範囲となる。
【００２３】
図５Ｂに、培養空間で培養したスフェロイドの好ましいサイズの一例を説明する模式図を示す。図５Ｂは、スフェロイド９の相当直径Ｄに沿って切断した切断部端面を模式的に示した図である。上述したように、スフェロイドの直径の平均が５０μｍ以上２００μｍ未満であることが好ましく、特に、６０μｍ〜１５０μｍの範囲が好ましい。図５Ｂでは、スフェロイド９の切断部端面が５個の細胞８により形成されている様子を示す。例えば、細胞８の直径ＤＣＬが２０μｍであり、スフェロイド９の直径ＤＳＰが６０μｍのスフェロイド９を形成する場合には、例えば、細胞８が直線上に３個並ぶことにより形成される。同様に、スフェロイド９の直径ＤＳＰが１５０μｍのスフェロイド９を形成する場合には、例えば、細胞８が直線上に５個並ぶことにより形成される。図５Ｂは説明を容易にするために細胞８を直線上に並べて模式的に示したものであり、細胞８は必ずしも直線上に並ぶとは限らない。
【００２４】
加えて、１試験領域（１ウェル、１シャーレ）にあるスフェロイドは、その直径が半値幅の範囲内にあるものが全体の７０％以上含まれることが好ましい。言い換えると、スフェロイドの直径の大きさがそろっていることが好ましい。その理由は以下の通りである。まず、スフェロイドの大きさによって代謝活性値が異なることが知られていることから、様々な直径のスフェロイドが混在していると精度の高い結果が得られない。また、小さい（５０μｍ以下の）スフェロイドの代謝機能は極端に低いことが知られている。そのため、このようなスフェロイドが多く含まれている場合、代謝機能を減衰させるようなサイトカインを評価する際に測定限界値以下となり、代謝機能の減衰の有無が判定できない可能性がある。
「半値幅の範囲」とは、１試験領域にあるスフェロイドの総個数ＮＴうち、直径の大きさと存在する個数との対応を取ったときに、存在する個数が最大となる直径Ｄ１の個数Ｎ１に対して、個数Ｎ１の半分の個数（Ｎ１／２）となる複数の直径のうち、最小の直径Ｄ２から最大の直径Ｄ３までの範囲に存在するスフェロイドの個数Ｎ２をいう。
スフェロイドの大きさを一様にするために、上述した総個数ＮＴに対して個数Ｎ２が７０％以上であることが好ましく、総個数ＮＴに対する個数Ｎ２の割合が高くなることがより好ましい。
【００２５】
培養空間１１の形状（正面の形状）、あるいは、底部１３と平行な面の形状は、図３に示す形状に限定されるものではなく、例えば、図６Ａ〜６Ｂに示すような形状であっても、その他の形状（楕円や菱形など）であってもよい。より高密度で均一な直径を有するスフェロイドを形成させるためには、左右対称構造であることが好ましい。
培養空間１１の側面の形状は、図４に示す形状に限定されるものではなく、例えば、図７Ａ〜７Ｃに示すような形状であってもよい。
【００２６】
培養容器１０を構成する材料としては、アクリル系樹脂、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、スチレン系樹脂、アクリル・スチレン系共重合樹脂、ポリカーボネート系樹脂、ポリエステル系樹脂、ポリビニルアルコール系樹脂、エチレン・ビニルアルコール系共重合樹脂、熱可塑性エラストマー、塩化ビニル系樹脂、及びシリコン樹脂のうちの１つまたはこれらの組み合わせから選択される。
【００２７】
培養容器１０の底部１３の厚さＴは、観察性の観点から、１ｍｍ以下が好ましい。ただし、顕微鏡での観察に支障をきたさない限り、１ｍｍ以上であってもよく、底部１３の厚さＴを限定するものではない。培養容器の底部１３の観察性を確保することにより、培養プレートをそのまま用いて、培養したスフェロイドを観察することが可能になる。培養容器の観察性を確保することにより、培養容器をそのまま用いて、免疫組織学法による蛍光染色観察や、Green Fluorescent Protein（ＧＦＰ）などのレポータ遺伝子を使用したin situ法が可能となる。
【００２８】
＊  培養表面の特性
次に、細胞を培養する培養表面、すなわち、培養空間１１を囲む壁１２及び底部培養面１４の特性、特に親水化処理について説明する。培養表面は、各培養空間１１内に培地を入れるため、また、コーティング溶液を用いる場合には、その溶液が培養空間１１内に入り込まなければ表面を覆うことができない。このため、水接触角を４５度以下にすることが好ましい。より好ましくは０度〜２０度の範囲である。また、水接触角の値は、培養空間１１と壁１２の凹凸パターンが形成されていない平板を、培養容器１０と同条件で作製して測定した値を前提とする。
【００２９】
培養空間１１をアレイ状に配置した表面に関して、当該表面の疎水性が高く水接触角が４５度を超えると、すなわち濡れ性が低い場合は、培地やコート溶液を添加した際、空間に気泡が入りやすくなり、細胞が培養できない空間が生じることがある。そのため、水接触角が４５度以下になるよう、親水化を行うことが必要である。親水化する方法としては、ＳｉＯ２を蒸着する方法や、プラズマ処理を行う方法が挙げられる。
【００３０】
加えて、培養容器１０で効率よくスフェロイドを形成させるため、細胞接着性を抑制することが好ましい。細胞接着性を抑制するためには、水接触角が４５度以下、好ましくは４０度以下、より好ましくは２０度以下になるような表面を用いることで可能になる。細胞接着性を抑制することと、水接触角との関係については、例えば、Y Ikada著、"Surface modification of polymers for medical applications"、 Biomaterials 1994, vol.15 No.10, pp725-736に記載されている。
水接触角を４５度以下にする方法としては、ガラスを底部培養面１４に蒸着する方法、プラズマ処理法を用いて、表面に官能基を形成させる方法が挙げられる。プラズマ処理などにより、表面に官能基を形成させる。
また、水接触角を４５度以下にすることで、細胞接着性を抑制する物質をコートしてより接着性を抑制することにより、効率よくスフェロイドを形成させることができる。例えば、プラズマ処理を施し、水接触角を４５度以下にした後、リン脂質・高分子複合体やポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）をコートしてもよい。
【００３１】
２．株化肝細胞の培養・判定方法
次に、株化肝細胞を培養し、サイトカインがチトクロムＰ４５０の代謝能に及ぼす影響を評価するまでの方法について説明する。
＊  培養・評価方法の概略
一実施形態の培養から判定までには、例えば、次の（Ａ）から（Ｆ）の工程を実施する。
（Ａ）ヒト由来の株化肝細胞を培養し、スフェロイドを形成させる工程（スフェロイド形成処理）。
（Ｂ）同じ一つのウェル２１から培地を吸い取る工程（培地吸引処理）。
（Ｃ）同じ一つのウェル２１へ、第１乃至第３の試験溶液を添加する工程（試験溶液添加処理）。
（Ｄ）同じ一つのウェル２１内で、サイトカインを含む試験溶液と、スフェロイド形状の株化肝細胞とを１時間以上９６時間未満、接触させる工程（接触処理）。
（Ｅ）チトクロムＰ４５０の代謝機能を分析（測定）する工程(分析処理)。
（Ｆ）分析した結果を判定する工程（判定処理）。
【００３２】
ここで、第１の試験溶液は、サイトカイン及び薬剤を含まない溶液である（サイトカイン及び薬剤無）。第２の試験溶液は、サイトカインを含み、薬剤を含まない溶液である（サイトカイン有、薬剤無）。第３の試験溶液は、サイトカイン及び薬剤を含む溶液である（サイトカイン及び薬剤有）。また、第１乃至第３の試験溶液と、スフェロイド形状の株化肝細胞とを接触させ、チトクロムＰ４５０の代謝機能を測定した結果を、第１乃至第３の測定値とする。
一実施形態の判定方法は、操作性の観点から、複数のウェルを備える培養プレートを用いることが好ましい。特に、株化肝細胞をスフェロイド形状に培養するスフェロイド形成処理（工程Ａ）と、第１乃至第３の試験溶液を所定の時間、培養した細胞に接触させる接触処理（工程Ｄ）とを同一のウェル内で行うことがより好ましい。そのため、一実施形態では、図１に示す培養プレート１の複数のウェル２１を用い、複数のウェル２１のうち、一つのウェル２１内でスフェロイド形成処理から接触処理までの各工程を実施する。言い換えると、一つのウェル内で培養から評価までの処理において、各工程の途中で細胞を別のウェル２１に移動させることはない。
【００３３】
＊工程Ａ  スフェロイド形成処理
工程Ａのスフェロイド形成処理では、上述した培養容器１０を用いて、１０％血清を含む培地でヒト由来の株化肝細胞を培養し、所望のサイズのスフェロイドを形成させる。
形成されたスフェロイドは、少なくともその一部分が壁１２または底部培養面１４に接着している。
スフェロイド形状の株化肝細胞を得る方法として、ローラーボトル培養、スピナーフラスコ培養、ハンギングドロップ培養など特に限定されない。しかし、これらの方法では培養方法に応じた装置を使用するため、スフェロイド形成処理と接触処理とを別々の容器で行う必要が生じる。発明者らは、上述した培養容器１０が形成されたウェル２１を用いることにより、同一の容器でスフェロイド形成処理と接触処理とを実施できることを発見した。これにより、操作が簡便になり、形成したスフェロイドを移動させることなく、細胞をサイトカインと接触させることが可能になる。特に、多くの化合物を一度に評価するような医薬品のスクリーニングにおいて、自動培養装置に利用することが可能となる。加えて、細胞の損傷や汚染を防止することが可能になる。
【００３４】
スフェロイドを形成するための培養容器１０の好ましいサイズについては上述したが、スフェロイド形成処理から接触処理を実施する場合には、特に次の培養容器１０のサイズが好ましいことを発見した。
培養容器１０は、高さＨを相当直径Ｄで割った値が０．３〜２の範囲であって、相当直径Ｄが１００μｍ〜１０００μｍの範囲の培養空間１１が、少なくとも２個以上配置されていることが好ましい。加えて、培養空間１１を隔てる壁１２の幅Ｗは２μｍから５０μｍの範囲であることが好ましい。このような培養容器１０を用いることで、簡単にかつ均一な直径のスフェロイドを得ることができる。
【００３５】
培養空間１１を有する培養容器１０で効率よくスフェロイドを形成させるためには、細胞接着を抑制する方が好ましい。一方、培地交換や試験溶液交換の際にスフェロイドが培養空間１１から離脱することを防ぐ目的から、スフェロイドの一部は培養表面（壁１２の表面または底部培養面１４）に接着している方が好ましい。そのため、培養表面への細胞の接着を阻害するポリマーと、培養表面への細胞の接着を促進するポリマーとの混合物との混合物を培養表面にコートしてもよい。培養表面への細胞の接着を阻害するポリマーは、細胞接着を阻害する親水性のポリマー鎖、リン脂質、リン脂質・高分子複合体、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）（ＰＨＥＭＡ）、ポリビニルアルコール、アガロース、キトサン、ポリエチレングリコール、及びアルブミン、のグループから選択される一つまたはこれら組合せからなるポリマーである。細胞接着性を促進するポリマーは、ポリ−Ｌ−リシン、ポリ−Ｄ−リシン、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチンのグループからから選択される一つまたはこれら組合せからなるポリマーである。コート溶液の一例として、リン脂質、リン脂質・高分子複合体である２−メタ  クリロイルオキシエチルホスホリスコリン（ＭＰＣ）ポリマーとポリ−Ｌ−リシン溶液との混合物が挙げられる。ＭＰＣ溶液濃度は０．００１％〜１％の範囲が好ましく、０．０１％〜０．１％の範囲がより好ましい。ポリ−Ｌ−リシン溶液の濃度は０．００１〜０．１％の範囲が好ましく、０．００５〜０．０１５％の範囲がより好ましい。ＭＰＣ溶液とポリ−Ｌ−リシン溶液の混合比は５０：５０〜１００：０の範囲が好ましく、７５：２５〜９０：１０の範囲がより好ましい。
【００３６】
培養容器１０を用いてスフェロイド形成を行う場合の細胞播種密度は特に限定されないが、５０００個／ｃｍ２〜１，０００，０００個／ｃｍ２の範囲が好ましく、５０〜１５０μｍの直径のスフェロイドを形成させるためには、５０個〜２５０個の細胞が１１の区画に存在していることが好ましいことから、１００，０００個／ｃｍ２〜５００，０００個／ｃｍ２の範囲がより好ましい。スフェロイドを形成させるための培養時間は１日〜１５日であればよい。
【００３７】
＊  工程Ｂ  吸引処理
培地の吸引は、例えば、パスツールピペットを用いて吸引する。スフェロイド形成処理で用いた培地は、全量を吸引することが好ましい。これは、培地に含まれる血清の影響を除去するためである。加えて、培地の吸引では、培養空間１１に形成されたスフェロイドが、培養空間１１の壁１２または底部培養面１４と接着している状態を維持するように留意する。スフェロイドが壁１２または底部培養面１４に接着している状態を維持することにより、他の培養空間１１に形成されたスフェロイドと接着することを防止できるからである。加えて、試験溶液に交換する際及びそのための洗浄操作により細胞が剥離すると試験できなくなるので接着しておいた方がよい。
【００３８】
＊  工程Ｃ  試験溶液添加処理
工程Ｃの試験溶液添加処理では、第１乃至第３の試験溶液のいずれかをウェル２１へ添加する。各試験溶液は、血清中に含まれるサイトカインによる細胞への影響を排除するために血清を含まないことが好ましい。一方で、各試験溶液と細胞を４８時間以上接触させる場合は細胞の生理機能を保つため０．１〜１％の範囲の血清を加えても良い。
各試験溶液の溶媒は２００〜３１５ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧であって、ｐＨ域が６．８〜８．４に緩衝作用があればよい。加えて、細胞の生理機能を一定に保つためには、グルコース及びアミノ酸、ビタミン類などの栄養素が含まれているものを使用することが好ましい。例えばダルベッコ変法イーグル培地（DMEM: Dulbecco's modified Eagle medium）とNutrient Mixture F-12の混合培地を用いることで生理機能が一定に保たれる。
【００３９】
第２及び第３の試験溶液のサイトカイン濃度は、事前に次の手順で決定する。
基準値を設定し、基準値に対して少なくとも３種類の異なる濃度を用いて、工程Ａから工程Ｆの各処理を実施して、チトクロムＰ４５０の代謝機能を分析して測定値を得る。
基準値は、健常人のサイトカインまたは疾患患者のサイトカインの血中濃度の平均値の０．１倍〜５０倍の範囲の濃度を基準に設定する。基準値の少なくとも１倍、１０倍、１００倍の３濃度のサイトカインを含み、薬剤を含まない、３種類の溶液（言い換えると、３種類の第２の試験溶液）と、サイトカイン及び薬剤を含まない溶液（第１の試験溶液）とを用意し、スフェロイド形状の株化肝細胞と接触させる。複数種類の溶液に接触させた複数の株化肝細胞のチトクロムＰ４５０の代謝機能を測定する。測定した結果、複数のサイトカインの濃度のうち、第１の試験溶液を接触させた細胞の測定値より小さくなる濃度を第２及び第３の試験溶液のサイトカイン濃度に採用する。
【００４０】
加えて、サイトカイン濃度を決定する場合、生存率が８０％以上であって、かつ、第１の試験溶液にスフェロイド形状の株化肝細胞を接触させたときのチトクロムＰ４５０の代謝機能の値（第１の測定値）に対し、第２の試験溶液にスフェロイド形状の株化肝細胞を１時間以上９６時間未満接触させた時のチトクロムＰ４５０の代謝機能の値（第２の測定値）が３分の１以下であればよく、５分の１以下がより好ましい。サイトカイン濃度の決定に当たっては、濃度依存的にチトクロムＰ４５０の薬物代謝機能が減衰するように調整することが好まししい。
第１の試験溶液の測定値より小さくなるサイトカイン濃度を選択することにより、チトクロムＰ４５０の代謝機能への影響が生じる環境を作る。そして、第３の試験溶液を用いる試験により、サイトカインの存在によってチトクロムＰ４５０の代謝機能が減衰する状況であっても、薬剤がチトクロムＰ４５０の代謝機能に影響するか否かを検出することができる環境を生成する。減衰と回復を正確に判定するためには、第２の測定値が第１の測定値に対して有意に小さい値でなければならない。約±３０％のばらつきを想定した場合、第２の測定値の平均値が第１の測定値の平均値の６０％の値以下であれば明らかにサイトカインにより薬物代謝酵素の機能が減衰していると判断できる。この結果を踏まえて、第２の測定値が第１の測定値の３分の１以下であることが好ましいと考えた。ただし、有意差検定（例えばｔ検定）により減衰、回復を判定することができ、この範囲（３分の１以上）である必要はない。
【００４１】
第３の試験溶液の薬剤の濃度は、任意の薬剤の濃度の溶液を、１時間から９６時間の範囲で細胞と接触させ、生存率が８０％を超える濃度を採用する。濃度が低すぎる場合は薬剤によるチトクロムＰ４５０の回復が見られない場合も想定されるため、生存率が８０％を下回らない範囲でできる限り高い薬剤濃度の試験溶液を用いることが好ましい。
なお、サイトカイン及び薬剤の濃度を決定するための試験にあたっては、工程Ａから工程Ｆの各工程の処理を実施例または比較例と同様に実施する。
【００４２】
＊  工程Ｄ  接触処理
試験溶液と細胞を接触させる時間（接触時間）はサイトカインの細胞毒性の度合いによって決められる。細胞毒性は、細胞死を引き起こす強さである。接触時間は、あらかじめ試験に供する第２及び第３の試験溶液を用いて、１時間から９６時間の範囲で細胞と接触させ、生存率が８０％以上となる時間を採用する。サイトカインの濃度を決定するときに、生存が８０％以上になるように適切な濃度を選択すればよい。
いずれの時間においても生存率が８０％以下となった場合は、サイトカイン濃度の基準値を低く設定し、生存率が９０％以上となる反応時間を採用する。各試験溶液とスフェロイド形状の株化肝細胞とを接触させる時間は、第１乃至第３の試験溶液それぞれの接触時間が同じであればよく、かつ、生存率が８０％を超える範囲であればよい。
【００４３】
図９にスフェロイド形状の株化肝細胞と、サイトカイン（インターロイキン−１β）を含む試験溶液とを接触させる時間の長さと、チトクロムＰ４５０の反応性との関係を示す試験結果を示す。インターロイキン−１βを０時間、４時間、８時間接触させた時、経時的にＣＹＰ３Ａ４の遺伝子発現量が減少する。誤差は２０〜３０％程度であった。図９のように近似曲線を作成して接触時間１時間の値を算出した。近似曲線は、図９に示す数式を用いた。誤差２０％の時、接触時間１時間より短い場合は接触時間０時間の値に対して、有意差が見られないことが予想された。そのため、細胞とサイトカインを接触させる時間を、最低１時間とした。接触時間は評価期間を短縮するためには短いほどよい。加えて、コストも削減できる。
培養には栄養を含む培地を使用しているものの、血清を含まないため、細胞の生理機能が低下する可能性がある。また、通常培地交換は、倍地中の栄養分が完全に消費されない頻度、かつ、老廃物が蓄積して生理機能に影響を及ぼさない頻度で実施する。例えば、３〜４日毎に培地を交換する必要がある。即ち、５日以上の培養は細胞の生理活性を維持する観点から適していない。そのため、細胞とサイトカインを接触させる時間を、最大９６時間とした。
【００４４】
＊  工程Ｅ  分析処理
工程Ｅの分析処理では、第１乃至第３の試験溶液に接触させた後の株化肝細胞を使ってチトクロムＰ４５０の代謝機能を分析する。第１の試験溶液と接触させた株化肝細胞のチトクロムＰ４５０の薬物代謝酵素の機能を測定して第１の測定値を取得する。同様に、第２及び第３の試験溶液と接触させた株化肝細胞のチトクロムＰ４５０の薬物代謝酵素の機能を測定して第２及び第３の測定値を取得する。
チトクロムＰ４５０の分析方法として、ＰＣＲ法による遺伝子発現量の測定、ウェスタンブロッティング法によるタンパク解析、または、液体クロマトグラフィー質量分析法（LC/MS/MS: Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometry）や高速液体クロマトグラフィー（HPLC: High performance liquid chromatography）を用いた代謝活性測定、などどのような手法を用いても良い。
【００４５】
＊  工程Ｆ  判定処理
工程Ｆの判定処理では、工程Ｅの分析処理で分析した第１乃至第３の測定値に基づいて、第１の測定値が第２の測定値より大きく、かつ、第２の測定値が第３の測定値より小さい場合、薬剤がチトクロムＰ４５０の薬物代謝機能を回復させると判定する。数式で示すと、"第１の測定値＞第２の測定値"、かつ、"第２の測定値＜第３の測定値"、となる場合である。特に、第３の測定値が、第２の測定値の３倍以上である場合、薬物代謝機能を回復させると判定することが好ましい。その理由は、上述した通りであり、減衰と回復を正確に判定するためには、第２の測定値が第１の測定値に対して有意に小さい値でなければならないからである。
【実施例】
【００４６】
実施例及び比較例について説明する。
１．細胞の準備（スフェロイド形成処理）
［実施例］
（１−１）培養容器及び細胞
図８に示す複数のウェル２１ａを有する培養プレート１ａを使用した。各ウェル２１ａの底部培養面には複数の培養容器１０ａが形成されている。各培養容器１０ａは、相当直径Ｄが２００μｍ、高さＨが１００μｍで形成される培養空間１１ａを有する。また、壁１２ａの幅Ｗは１０μｍである。
培養する細胞は日本人由来の株化肝細胞であるＦＬＣ−４細胞を使用した。
（１−２）培養容器の準備
０．０１％ＭＰＣ溶液と０．０１％のポリ−Ｌ−リシン（ＳＩＭＧＡ社製）を９：１の割合で混合した溶液をコート剤として使用した。
各ウェルにコート溶液を０．３ｍＬ入れ、クリーンベンチ内で乾燥させた。
使用前にリン酸緩衝整理食塩水（PBS: phosphate-buffered saline）で洗浄した。
（１−３）細胞培養
培地は、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を使用した。細胞播種密度が１６×１０５個／ｍＬになるように細胞懸濁液を調整した。
１つのウェルあたり５００μＬの細胞懸濁液を加えた。
ＣＯ２インキュベータ内で１０日から１１日間、細胞を培養した。培地交換は３日に１回で行った。
培地交換の際、すべて培地を吸い取らず約１００μＬを残し、あらたに５００μＬの培地を加えた。
【００４７】
［比較例］
培養容器は市販の培養面が平坦な２４ウェルプレートを使用した。培養プレートのグレードは細胞培養グレードを用いた。
上記以外は実施例と同じ条件で実施した。
【００４８】
２．試験溶液のサイトカイン濃度の検討
実施例、比較例ともに以下の手順で実施した。
（２−１）試験溶液の準備
サイトカインは、表皮増殖因子（EFG: Epidermal Growth Factor）を使用した。
試験溶液の溶媒は、血清を含まないＤＭＥＭ／Ｆ１２（ＤＭＥＭ／Ｅ１２  ＦＢＳ  （−））を用いた。
第２の試験溶液及び第３の試験溶液のサイトカインの濃度を検討するため、ＥＧＦ濃度が０．１ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬの試験溶液を作製した。なお、事前に各試験溶液で細胞を培養して細胞生存率を得て、これらの濃度での細胞生存率は８０％以上であることを確認した。
（２−２）手順
培養した細胞を次の手順で処理した。
・各ウェルから、古い培地の全量をピペットで吸引した（培地吸引処理）。
・各ウェルへ、サイトカインの濃度を検討するための試験溶液を添加した（試験溶液添加処理）。
・８時間、２４時間または４８時間、３７℃、ＣＯ２インキュベータ内で細胞をインキュベートした（接触処理）。
・分析は、ウェスタンブロッキング法により実施した。
（２−３）結果
図１０に試験溶液のサイトカインの濃度を検討した試験結果を示す。図中、実施例は"ＭＩＣＲＯ−ＳＰＡＣＥ"、比較例は"ＣＯＮＦＬＵＥＮＴ"で示す。ＥＧＦの濃度、０、０．１、１、１０ｎｇ／ｍＬそれぞれのＣＹＰ３Ａ４  タンパク量をウェスタンプロッティング法で分析した結果がバンドとして示されている。
実施例では、ＥＧＦの濃度が大きくなるに従い、バンドが薄くなっていることから、濃度依存的にＣＹＰ３Ａ４の機能の低下が確認される。試験溶液のサイトカインの濃度として、濃度１０ｎｇ／ｍＬを第２及び第３の試験溶液に採用することにした。
比較例では、濃度依存性が確認できなかった。実施例と比較するため、濃度１０ｎｇ／ｍＬを採用することにした。
【００４９】
３．試験条件（培地吸引処理、試験溶液添加処理、接触処理）
実施例、比較例ともに次の条件で試験を実施した。
（３−１）試験１
第１の試験溶液と第２の試験溶液とを、スフェロイド形状の株化肝細胞に接触させたときのチトクロムＰ４５０の薬物代謝酵素の機能の値を比較する試験を実施した。
試験としては、２．試験溶液の濃度の検討で実施した試験結果を用いた。試験手順は上述した通りである。
（３−２）試験２
第１乃至第３の試験溶液を、スフェロイド形状の株化肝細胞に接触させたときのチトクロムＰ４５０の薬物代謝酵素の機能の値を比較する試験を実施した。
比較例は、試験１の結果において、第１の試験溶液と第２の試験溶液との試験結果がほぼ同じとなり、条件を満たさなかったため実施しなかった。試験１の結果については後述する。
サイトカインは、表皮増殖因子（EFG: Epidermal Growth Factor）を使用した。
薬剤は、ゲフィチニブ（Gefitinib）を使用した。
試験溶液の溶媒は、血清を含まないＤＭＥＭ／Ｆ１２（ＤＭＥＭ／Ｅ１２  ＦＢＳ  （−））を用いた。
サイトカインの濃度は、１０ｎｇ／ｍＬを採用した。
第１の試験溶液は、０ｍＭのＥＧＦと、０ｍＭのゲフィチニブとを含む。
第２の試験溶液は１０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦと、０ｍＭのゲフィチニブとを含む。
第３の試験溶液濃度は、１０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦと、５μＭのゲフィチニブとを含む。
培養した細胞を次の手順で処理した。
・各ウェルから、古い培地の全量をパスツールピペットで吸引した（培地吸引処理）。
・各ウェルへ、第１乃至第３の試験溶液を添加した（試験溶液添加処理）。
・８時間、２４時間または４８時間、３７℃、ＣＯ２インキュベータ内で細胞をインキュベートした（接触処理）。
・分析は、遺伝子解析により実施した。
４．分析方法
（３−１）遺伝子解析法（RT-qPCR）
ＲＮＡ抽出は、培養プレート１ａの２ウェル２１ａ分を１サンプルとして、NucleoSpin RNAII (Macherey-Nagel)のプロトコルに従って抽出した。DNnase処理の部分のみ改変して、DNaseI recombinant, RNase-free (Roche , Branchburg, NJ, USA)を使用した。全ＲＮＡ（Total RNA）はHigh-Capacity cDNA Reverse Transcription Kits (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)および付属のrandom hexamer primer を用いて逆転写反応し、first strand cDNAを合成した。
解析は、全量２０μＬ中に、 ９．６μＬ EagleTaq Master Mix with ROX (Roche, Branchburg, NJ, USA)、 ０．９６μＬ  ２０×Assays-on-DemandTM Gene Expression Assay Mix (Applied Biosystems) 、７．１μＬ  sterilized MiliQ waterおよび5倍希釈したcDNA １．８μＬを加えたものを反応液としてReal-time PCRで測定した。
【００５０】
（３−３）ウェスタンブロッティング法（ＷＢ）
３〜６ウェル分の細胞を０．１％のprotease inhibitor cocktailおよび１ｍＭ  ＰＭＳＦ （Phenylmethyl sulfonyl fluoride）を含むLysis bufferでソニケーションした後、１２０００ｇで１５分間遠心し、その上清を全細胞抽出液とした。得られた全細胞抽出液（10-15 μg/lane）を１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離したのち、ニトロセルロース膜に２時間、５４Ｖの電圧で転写した。転写後のニトロセルロース膜は５％  スキムミルクを加えた０．０５％Tweem２０含有ＰＢＳ（PBST）を用いて、室温で１時間振とうしてブロッキングを行った。一次抗体はanti-human CYP3A antibody (monoclonal, BD Gentest) を、３％ＢＳＡを加えたＰＢＳＴで６０００倍に希釈したものを用いて４℃で一晩インキュベートした。二次抗体はanti-mouse IgG-peroxydase antibody (Sigma-Aldrich) を、３％ＢＳＡを加えたＰＢＳＴで５０００倍に希釈したものを用い、室温で１時間振とうした。タンパクはImmunoStar LD (和光純薬)を使用し、LAS-1000 plus (Fujifilm, Tokyo)で検出した。
【００５１】
５．試験結果
（５−１）試験１の結果
図１０に示す試験溶液濃度の検討の試験結果を用いて判定した。図１０の試験結果のうち、実施例、比較例ともに、ＥＧＦの濃度が０ｎｇ／ｍＬである第１の試験溶液の結果及びＥＧＦの濃度が１０ｎｇ／ｍＬである第２の試験溶液の結果（図１０に示す点線で囲んだ４つのバンド、ＣＹＰ３Ａ４  タンパク量）を比較して判定する。第１の試験溶液とスフェロイドを接触させたときのＣＹＰ３Ａ４のタンパク量を、実施例ではＭ０、比較例ではＣ０とし、第２の試験溶液とスフェロイドを接触させたときのＣＹＰ３Ａ４のタンパク量を、実施例ではＭ１０、比較例ではＣ１０とする。
実施例では、第２の試験溶液のバンドが第１の試験溶液のバンドより薄くなっている。言い換えると、Ｍ０がＭ１０より大きい（Ｍ０＞Ｍ１０）。
一方、比較例では、第１の試験溶液のバンドと第２の試験溶液のバンドとの間で差が検出できない。言い換えると、Ｃ０とＣ１０とがほぼ同じである（Ｃ０≒Ｃ１０）。
（５−２）試験２の結果
図１１に第１乃至第３の試験溶液をスフェロイド形状の株化肝細胞に接触させたときのＣＹＰ３Ａ４の  ｍＲＮＡの発現量をＲＴ−ｑＰＣＲで分析した結果を示す。図１１では、ＣＹＰ３Ａ４  ｍＲＮＡの発現量を、第１の試験溶液の場合を（Ａ）、第２の試験溶液の場合を（Ｂ）、第３の試験溶液の場合を（Ｃ）で示す。図１１の結果では、ＣＹＰ３Ａ４の代謝機能の値が、第１の試験溶液（サイトカイン及び薬剤無）の場合に比べ、第２の試験溶液（サイトカイン有、薬剤無）の場合が低くなっている。加えて、第２の試験溶液の場合に比べ、第３の試験溶液（サイトカイン及び薬剤有）の場合が３倍以上に高くなっている。この結果から、薬剤がチトクロムＰ４５０の薬物代謝機能を回復させると判定できる。
【００５２】
上述した実施例で用いたサイトカインは一例であり、他のサイトカインであっても一実施形態のスクリーン方法を適用することができることは言うまでもない。
【００５３】
なお、本発明は上記に示す実施形態に限定されるものではない。本発明の範囲において、上記実施形態の各要素を、当業者であれば容易に考えうる内容に変更、追加、変換することが可能である。
【符号の説明】
【００５４】
１、１ａ  培養プレート
８  細胞
９  スフェロイド
１０、１０ａ  培養容器
１１、１１ａ  培養空間
１２  壁
１３  底部
１４  底部培養面
２１、２１ａ  ウェル
２２  仕切り部
【図１】
2014064545.tif 000003
【図２Ａ】
2014064545.tif 000004
【図２Ｂ】
2014064545.tif 000005
【図３】
2014064545.tif 000006
【図４】
2014064545.tif 000007
【図５Ａ】
2014064545.tif 000008
【図５Ｂ】
2014064545.tif 000009
【図６Ａ】
2014064545.tif 000010
【図６Ｂ】
2014064545.tif 000011
【図７Ａ】
2014064545.tif 000012
【図７Ｂ】
2014064545.tif 000013
【図７Ｃ】
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【図８】
2014064545.tif 000015
【図９】
2014064545.tif 000016
【図１０】
2014064545.tif 000017
【図１１】
2014064545.tif 000018
【手続補正書】
【提出日】平成26年1月24日(2014.1.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サイトカインと相互に作用する薬剤のスクリーニング方法であって、
（Ａ）前記サイトカイン及び前記薬剤を含まない第１の試験溶液、（Ｂ）前記サイトカインを含み、前記薬剤を含まない第２の試験溶液、及び（Ｃ）前記サイトカイン及び前記薬剤を含む第３の試験溶液、を用意し、
株化肝細胞を培養してスフェロイド形状の株化肝細胞を形成し、
前記第１乃至第３の試験溶液と前記スフェロイド形状の株化肝細胞とを１時間以上９６時間未満接触させ、
前記第１の試験溶液と接触させた前記株化肝細胞のチトクロムＰ４５０の薬物代謝酵素の機能を測定して第１の測定値を取得し、同様に、前記第２及び第３の試験溶液と接触させた前記株化肝細胞のチトクロムＰ４５０の薬物代謝酵素の機能を測定して第２及び第３の測定値を取得し、
前記第１の測定値が前記第２の測定値より大きく、かつ、前記第２の測定値が前記第３の測定値より小さい場合、前記薬剤がチトクロムＰ４５０の薬物代謝機能を回復させると判定するスクリーニング方法。
【請求項２】
前記株化肝細胞から形成されたスフェロイドの直径の平均値が５０μｍ以上２００μｍ未満であって、かつ、半値幅範囲内の直径を有するスフェロイドが全スフェロイドの７０％以上であることを特徴とする請求項１のスクリーニング方法。
【請求項３】
前記試験溶液の溶媒が無血清培地であることを特徴とする請求項１または２記載のスクリーニング方法。
【請求項４】
前記第３の測定値は、前記第２の測定値の３倍以上である場合に、チトクロムＰ４５０の薬物代謝機能を回復させると判定することを特徴とする請求項１乃至３のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
【請求項５】
前記第２及び第３の試験溶液のサイトカインの濃度は、健常人のサイトカインの血中濃度の平均値の０．１倍から５０倍の範囲のうちの一つの濃度を基準とし、前記基準の少なくとも１倍、１０倍、１００倍の３濃度の前記サイトカインを含み、前記薬剤を含まない溶液を前記株化肝細胞と接触させ、チトクロムＰ４５０の薬物代謝酵素の機能を測定した測定値が、前記第１の測定値より小さくなる濃度を選択することを特徴とする請求項１乃至４のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
【請求項６】
前記第２及び第３の試験溶液のサイトカインの濃度は、前記サイトカインが分泌される疾患患者の血中濃度の０．１倍から５０倍の範囲のうちの一つの濃度を基準とし、前記基準の少なくとも１倍、１０倍、１００倍の３濃度の前記サイトカインを含み、前記薬剤を含まない溶液を前記株化肝細胞と接触させ、チトクロムＰ４５０の薬物代謝酵素の機能を測定した測定値が、前記第１の測定値より小さくなる濃度を選択することを特徴とする請求項１乃至４のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
【請求項７】
前記株化肝細胞をスフェロイド形状に培養する工程と、スフェロイド形状の前記株化肝細胞と前記第１乃至第３の試験溶液とを接触させる工程とを、培養プレートの同一のウェル内で行うことを特徴とする請求項１乃至６のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
【請求項８】
前記第１乃至第３の試験溶液とスフェロイド形状の前記株化肝細胞とを１時間以上９６時間未満接触させることを特徴とする請求項１乃至７のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
【請求項９】
前記培養容器として、複数のウェルを有する培養プレートの一つのウェルを用い、
前記一つのウェル内に１０％血清を含む培地で前記株化肝細胞のスフェロイドを形成させる工程と、
前記一つのウェルから前記培地を吸い取る工程と、
前記一つのウェルへ、前記第１乃至第３の試験溶液のうちの一つを添加する工程と、
前記一つのウェル内で、前記第１乃至第３の試験溶液のうちの一つと、前記スフェロイドとを１時間以上９６時間未満接触させる工程と、を行うことを特徴とする請求項１乃至８のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
【請求項１０】
前記培養容器は、複数のウェルを有する培養プレートの各ウェル内に、複数の培養空間を有するように形成され、
各培養空間は、相当直径の長さを有する面と、高さとからなる空間であり、前記高さを前記相当直径で割った値が０．３から２の範囲であり、
前記培養空間の底に、前記相当直径が１００μｍから１０００μｍの範囲の培養空間が少なくとも２個以上配置されていることを特徴とする請求項１乃至９のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
【請求項１１】
前記複数の培養空間は、隣り合う前記培養空間を隔てる壁の厚さが２μｍから５０μｍの範囲であることを特徴とする請求項１０記載のスクリーニング方法。
【請求項１２】
前記培養空間を隔てる壁の上面と側面とがなす角度が９０度から１３５度の範囲であることを特徴とする請求項１０または１１記載のスクリーニング方法。
【請求項１３】
前記複数の培養空間の底の表面が、ガラス処理により、水接触角を４５度以下になるように処理されたことを特徴とする請求項１０項に記載のスクリーニング方法。
【請求項１４】
前記複数の培養空間の底の表面が、プラズマ処理により官能基を形成させて、水接触角を４５度以下になるように処理されたことを特徴とする請求項１０または１１記載のスクリーニング方法。
【請求項１５】
前記培養容器の表面は、ポリマー温度、光のいずれかにより親水性と疎水性とが変化するポリマー、細胞接着を阻害する親水性のポリマー鎖、リン脂質、リン脂質・高分子複合体、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）（ＰＨＥＭＡ）、ポリビニルアルコール、アガロース、キトサン、ポリエチレングリコール、及びアルブミンのグループから選択される一つ、または組合せからなるポリマーが、固定化されていること特徴とする請求項１乃至１４のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
【請求項１６】
前記培養容器の表面は、細胞接着を阻害する親水性のポリマー鎖、リン脂質、リン脂質・高分子複合体、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）（ＰＨＥＭＡ）、ポリビニルアルコール、アガロース、キトサン、ポリエチレングリコール、及びアルブミンのグループから選択される一つ、またはこれら組合せからなるポリマーと、細胞接着性を促進するポリマーである、ポリ−Ｌ−リシン、コラーゲン、ラミニン、及びフィブロネクチンから選択される一つ、またはこれら組合せからなるポリマーとの混合物が固定化されていることを特徴とする請求項１乃至１４のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
【請求項１７】
前記培養容器が、アクリル系樹脂、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、スチレン系樹脂、アクリル・スチレン系共重合樹脂、ポリカーボネート系樹脂、ポリエステル系樹脂、ポリビニルアルコール系樹脂、エチレン・ビニルアルコール系共重合樹脂、熱可塑性エラストマー、塩化ビニル系樹脂、及びシリコン樹脂のグループから選択される一つまたはこれらの組み合わせからなる樹脂成形品であることを特徴とする請求項１乃至１６のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
【請求項１８】
前記培養容器の底部を構成するポリマーの全光線透過率が８５％以上９９％未満であることを特徴とする請求項１乃至１７のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００７】
さらに、本発明に係るスクリーニング方法において、前記試験溶液の溶媒が無血清培地であることが好ましい。
加えて、前記第３の測定値は、前記第２の測定値の３倍以上である場合に、チトクロムＰ４５０の薬物代謝機能を回復させると判定することが好ましい。
さらに加えて、前記第２及び第３試験溶液のサイトカインの濃度は、健常人のサイトカインの血中濃度の平均値の０．１倍から５０倍の範囲のうちの一つの濃度を基準とし、前記基準の少なくとも１倍、１０倍、１００倍の３濃度の前記サイトカインを含み、前記薬剤を含まない溶液を前記株化肝細胞と接触させ、チトクロムＰ４５０の薬物代謝酵素の機能を測定した測定値が、前記第１の測定値より小さくなる濃度を選択することが好ましい。また、前記第２及び第３の試験溶液のサイトカインの濃度は、前記サイトカインが分泌される疾患患者の血中濃度の０．１倍から５０倍の範囲のうちの一つの濃度を基準とし、前記基準の少なくとも１倍、１０倍、１００倍の３濃度の前記サイトカインを含み、前記薬剤を含まない溶液を前記株化肝細胞と接触させ、チトクロムＰ４５０の薬物代謝酵素の機能を測定した測定値が、前記第１の測定値より小さくなる濃度を選択することが好ましい。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４９】
３．試験条件（培地吸引処理、試験溶液添加処理、接触処理）
実施例、比較例ともに次の条件で試験を実施した。
（３−１）試験１
第１の試験溶液と第２の試験溶液とを、スフェロイド形状の株化肝細胞に接触させたときのチトクロムＰ４５０の薬物代謝酵素の機能の値を比較する試験を実施した。
試験としては、２．試験溶液の濃度の検討で実施した試験結果を用いた。試験手順は上述した通りである。
（３−２）試験２
第１乃至第３の試験溶液を、スフェロイド形状の株化肝細胞に接触させたときのチトクロムＰ４５０の薬物代謝酵素の機能の値を比較する試験を実施した。
比較例は、試験１の結果において、第１の試験溶液と第２の試験溶液との試験結果がほぼ同じとなり、条件を満たさなかったため実施しなかった。試験１の結果については後述する。
サイトカインは、表皮増殖因子（EFG: Epidermal Growth Factor）を使用した。
薬剤は、ゲフィチニブ（Gefitinib）を使用した。
試験溶液の溶媒は、血清を含まないＤＭＥＭ／Ｆ１２（ＤＭＥＭ／Ｅ１２  ＦＢＳ  （−））を用いた。
サイトカインの濃度は、１０ｎｇ／ｍＬを採用した。
第１の試験溶液は、０ｍＭのＥＧＦと、０ｍＭのゲフィチニブとを含む。
第２の試験溶液は１０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦと、０ｍＭのゲフィチニブとを含む。
第３の試験溶液濃度は、１０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦと、５μＭのゲフィチニブとを含む。
培養した細胞を次の手順で処理した。
・各ウェルから、古い培地の全量をパスツールピペットで吸引した（培地吸引処理）。
・各ウェルへ、第１乃至第３の試験溶液を添加した（試験溶液添加処理）。
・８時間、２４時間または４８時間、３７℃、ＣＯ２インキュベータ内で細胞をインキュベートした（接触処理）。
・分析は、遺伝子解析により実施した。
４．分析方法
（４−１）遺伝子解析法（RT-qPCR）
ＲＮＡ抽出は、培養プレート１ａの２ウェル２１ａ分を１サンプルとして、NucleoSpin RNAII (Macherey-Nagel)のプロトコルに従って抽出した。DNnase処理の部分のみ改変して、DNaseI recombinant, RNase-free (Roche , Branchburg, NJ, USA)を使用した。全ＲＮＡ（Total RNA）はHigh-Capacity cDNA Reverse Transcription Kits (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)および付属のrandom hexamer primer を用いて逆転写反応し、first strand cDNAを合成した。
解析は、全量２０μＬ中に、 ９．６μＬ EagleTaq Master Mix with ROX (Roche, Branchburg, NJ, USA)、 ０．９６μＬ  ２０×Assays-on-DemandTM Gene Expression Assay Mix (Applied Biosystems) 、７．１μＬ  sterilized MiliQ waterおよび5倍希釈したcDNA １．８μＬを加えたものを反応液としてReal-time PCRで測定した。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５０】
（４−２）ウェスタンブロッティング法（ＷＢ）
３〜６ウェル分の細胞を０．１％のprotease inhibitor cocktailおよび１ｍＭ  ＰＭＳＦ （Phenylmethyl sulfonyl fluoride）を含むLysis bufferでソニケーションした後、１２０００ｇで１５分間遠心し、その上清を全細胞抽出液とした。得られた全細胞抽出液（10-15 μg/lane）を１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離したのち、ニトロセルロース膜に２時間、５４Ｖの電圧で転写した。転写後のニトロセルロース膜は５％  スキムミルクを加えた０．０５％Tweem２０含有ＰＢＳ（PBST）を用いて、室温で１時間振とうしてブロッキングを行った。一次抗体はanti-human CYP3A antibody (monoclonal, BD Gentest) を、３％ＢＳＡを加えたＰＢＳＴで６０００倍に希釈したものを用いて４℃で一晩インキュベートした。二次抗体はanti-mouse IgG-peroxydase antibody (Sigma-Aldrich) を、３％ＢＳＡを加えたＰＢＳＴで５０００倍に希釈したものを用い、室温で１時間振とうした。タンパクはImmunoStar LD (和光純薬)を使用し、LAS-1000 plus (Fujifilm, Tokyo)で検出した。