(57)【要約】【課題】リウマチ関節炎の症状を改善することが可能となるリウマチ関節炎治療剤およびこれを含有する医薬品を提供する。【解決手段】リウマチ関節炎治療剤は、平均分子量５０万以上のヒアルロン酸および／またはその塩を有効成分として含有する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
平均分子量が５０万以上のヒアルロン酸および／またはその塩を有効成分として含有する、リウマチ関節炎治療剤。
【請求項２】
ヒトまたはヒト以外の動物が経口的に摂取することにより、ＳＯＣＳ３の発現が促進される結果、リウマチ関節炎の症状が緩和される、請求項１に記載のリウマチ関節炎治療剤。
【請求項３】
前記ヒアルロン酸および／またはその塩の平均粒子径が５０〜５００μｍである、請求項１または２に記載のリウマチ関節炎治療剤。
【請求項４】
請求項１ないし３のいずれか１項に記載のリウマチ関節炎治療剤を有効成分として含有する医薬品。
【請求項５】
一日当たり１０〜１０００ｍｇ摂取する、請求項４記載の医薬品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リウマチ関節炎治療剤およびこれを含有する医薬品に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、食生活および生活習慣の急激な変化によって、炎症性疾患を患う患者が増加している。炎症性疾患の一例として、自己免疫性疾患が挙げられる。自己免疫疾患とは、本来は細菌・ウイルスや腫瘍などの自己と異なる異物を認識し排除するための役割を持つ免疫系が、自分自身の正常な細胞や組織に対してまで過剰に反応し攻撃を加えてしまうことで症状を来す疾患の総称であり、この原因として、Ｔ細胞、Ｂ細胞およびマクロファージなど免疫担当細胞の異常が原因とされている。
【０００３】
また、多くの自己免疫疾患の症状は慢性的に経過し、難治性であるため、日本では公費負担の対象として定められた特定疾患に含まれている疾患も多い。治療法は疾患により異なるが、免疫異常が疾患の原因となっていることから、多くの疾患でステロイドと免疫抑制剤が第一選択の薬剤として用いられる。しかしながら、これらの薬剤には少なからず副作用があることが知られており、副作用の少ない免疫異常改善薬が求められている。
【０００４】
特許文献１には、高分子のヒアルロン酸が、炎症を促進するインターロイキン１２の発現を抑制することが記載されている。インターロイキン１２は自己免疫疾患において、炎症を促進するサイトカインのひとつである。しかしながら、自己免疫疾患は多様な部位に多様な症状を発症するため、単一のサイトカインのみを制御しても免疫疾患を総合的に改善することは難しい。
【０００５】
また、炎症性疾患の他の一例として、関節炎が挙げられる。関節炎のなかでも、自己免疫性関節炎は自己免疫疾患のひとつであり、この自己免疫性関節炎に対して、サイトカインを介するシグナル伝達を調節するSuppressor of cytokine signaling ３（ＳＯＣＳ３）が、自己免疫性関節炎でみられる骨の破壊を大幅に減少することが報告されている（非特許文献１）。すなわち、ＳＯＣＳ３の発現が促進されると、サイトカインシグナル伝達の阻害が起こり、自己免疫性関節炎を総合的に改善する可能性が示唆されている。さらに、ＳＯＣＳ３は、ヒト大腸炎や関節炎などの慢性炎症性疾患において強く発現するといわれている（非特許文献２）。
【０００６】
加えて、ＳＯＣＳ３は、先天性免疫細胞内のToll様受容体（Toll-like receptor）を間接的に制御することが報告されている（非特許文献３）。
【０００７】
したがって、ＳＯＣＳ３の発現を促進することができれば、炎症性疾患の治療や予防に役立つと考えられるが、炎症性疾患におけるＳＯＣＳ３の発現調節に関する検討はこれまでほとんどなされていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】ＷＯ２００２−０７４３１８号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Takanori Shouda, Takafumi Yoshida, Toshikatsu Hanada, Toru Wakioka, Masanobu Oishi, Kanta Miyoshi, Setsuro Komiya, Ken-ichiro Kosai, Yasushi Hanakawa, Koji Hashimoto, Kensei Nagata, and Akihiko Yoshimura, “Induction of the cytokine signal regulator SOCS3/CIS3 as a therapeutic strategy for treating inflammatory arthritis”, J.Clin.Invest., Vol. 108, No.12, 1781-1788, December 2001
【非特許文献２】高木宏美、真田貴人、蓑田泰昌、吉村昭彦、「ＳＯＣＳによるサイトカインとToll-like receptorシグナルの制御」、日本臨牀、第６２巻１２号（２００４−１２）、２１８９−２１９６
【非特許文献３】Andrea Baetz, Markus Frey, Klaus Heeg, and Alexander H. Dalpke, “Suppressor of Cytokine Signaling (SOCS) Proteins Indirectly Regulate Toll-like Receptor Signaling in Innate Immune Cells”, J. Biol. Chem., Vol. 279, Issue 52, 54708-54715, December 24, 2004.
【発明の開示】
【００１０】
そこで、本発明は、炎症性疾患（リウマチ関節炎）に対して総合的な改善を行うことができるリウマチ関節炎治療剤およびこれを含有する医薬品を提供する。
【００１１】
本発明者らは、ＳＯＣＳ３の発現に関して鋭意研究を重ねた結果、平均分子量５０万以上のヒアルロン酸および／またはその塩を摂取することにより、意外にも、ＳＯＣＳ３の発現が促進されることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
本発明の一態様に係るリウマチ関節炎治療剤は、平均分子量が５０万以上のヒアルロン酸および／またはその塩を有効成分として含有する。
【００１３】
上記リウマチ関節炎治療剤において、ヒトまたはヒト以外の動物が経口的に摂取することにより、ＳＯＣＳ３の発現が促進される結果、リウマチ関節炎の症状が緩和されることができる。
【００１４】
上記リウマチ関節炎治療剤において、前記ヒアルロン酸および／またはその塩の平均粒子径が５０〜５００μｍであることができる。
【００１５】
本発明の一態様に係る医薬品は、上記リウマチ関節炎治療剤を有効成分として含有する。この場合、上記医薬品は、一日当たり１０〜１０００ｍｇ摂取されることができる。
【００１６】
上記リウマチ関節炎治療剤によれば、平均分子量５０万以上のヒアルロン酸および／またはその塩を経口摂取することによってＳＯＣＳ３の発現を促進し、炎症性疾患（リウマチ関節炎）の症状を総合的に改善することが可能となる。
【００１７】
したがって、副作用がない、またはきわめて小さい炎症性疾患改善用医薬品を提供できるとともに、ヒアルロン酸および／またはその塩の更なる利用拡大が期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、実施例１において、ＲＴ−ＰＣＲによるＳＯＣＳ３遺伝子発現を調べた電気泳動の写真である。左より、蒸留水摂取群、試作品Ａ摂取群、試作品Ｂ摂取群の結果を示す。
【図２】図２は、実施例１において、ヒアルロン酸またはその塩を経口摂取したマウスの小腸上皮表面の写真である。
【図３】図３は、実施例１において、ヒアルロン酸またはその塩を経口摂取したマウスの大腸上皮表面の写真である。
【図４】図４は、実施例１において、ヒアルロン酸またはその塩を経口摂取したマウスの大腸上皮表面（二重染色処理後）の写真である。
【図５】図５は、実施例１において、蒸留水またはヒアルロン酸試作品を飲水投与したマウスの頸部リンパ節の写真である。
【図６】図６は、実施例２において、ＲＴ−ＰＣＲによるＳＯＣＳ３遺伝子発現を調べた電気泳動の写真である。左より、ヒアルロン酸の添加なし、試作品Ａ添加、試作品Ｂ添加の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、本発明の一実施形態に係るＳＯＣＳ３発現促進剤、これを含有する医薬品および食品、ならびにＳＯＣＳ３の発現を促進する方法、さらには、プロイオト ロフィン発現抑制剤、これを含有する医薬品および食品、ならびにプロイオトロフィンの発現を抑制する方法について詳細に説明する。
【００２０】
なお、本発明において「％」は「質量％」を意味する。
【００２１】
１．ＳＯＣＳ３発現促進剤、これを含有する医薬品および食品、ならびにＳＯＣＳ３の発現を促進する方法
１．１．ＳＯＣＳ３発現促進剤
本発明の一実施形態に係るＳＯＣＳ３発現促進剤は、平均分子量５０万以上のヒアルロン酸および／またはその塩を有効成分として含有することを特徴とする。
【００２２】
ここで、「ヒアルロン酸」とは、グルクロン酸とＮ−アセチルグルコサミンとの二糖からなる繰り返し構成単位を１以上有する多糖類をいう。また、「ヒアルロン酸の塩」としては、特に限定されないが、食品または薬学上許容しうる塩であることが好ましく、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、亜鉛塩、マグネシウム塩、アンモニウム塩等が挙げられる。
【００２３】
また、本実施形態に係るＳＯＣＳ３発現促進剤で使用するヒアルロン酸および／またはその塩の平均分子量は５０万以上であり、好ましくは６０万以上、より好ましくは５０万〜１６０万、さらに好ましくは６０万〜１６０万である。ヒアルロン酸および／またはその塩の平均分子量が５０万未満であると、炎症性疾患の症状を改善しにくく、免疫系の機能を低下させる場合がある。また、ヒアルロン酸および／またはその塩の平均分子量が１６０万を超える場合、溶解し難く、その効果を十分に発揮できない場合や、食品等に配合し難い場合がある。
【００２４】
本発明で規定される平均分子量の測定方法について説明する。
【００２５】
即ち、約０．０５ｇの精製ヒアルロン酸を精密に量り、０．２ｍｏｌ／Ｌ濃度の塩化ナトリウム溶液に溶かし、正確に１００ｍＬとした溶液およびこの溶液８ｍＬ、１２ｍＬ並びに１６ｍＬを正確に量り、それぞれに０．２ｍｏｌ／Ｌ濃度の塩化ナトリウム溶液を加えて正確に２０ｍＬとした溶液を試料溶液とする。この試料溶液および０．２ｍｏｌ／Ｌ濃度の塩化ナトリウム溶液につき、日本薬局方（第十四改正）一般試験法の粘度測定法（第１法毛細管粘度測定法）により３０．０±０．１℃で比粘度を測定し（式（１））、各濃度における還元粘度を算出する（式（２））。還元粘度を縦軸に、本品の換算した乾燥物に対する濃度（ｇ／１００ｍＬ）を横軸にとってグラフを描き、各点を結ぶ直線と縦軸との交点から極限粘度を求める。ここで求められた極限粘度をＬａｕｒｅｎｔの式（式（３））に代入し、平均分子量を算出する（T.C. Laurent, M. Ryan, A. Pietruszkiewicz,:B.B.A., 42, 476-485(1960)）。
【００２６】
（式１）
比粘度 ＝ {(試料溶液の所要流下秒数)/(0.2moｌ/L塩化ナトリウム溶液の所要流下秒数)}−1
【００２７】
（式２）
還元粘度 = 比粘度/(本品の換算した乾燥物に対する濃度(g/100mL)) 
【００２８】
（式３）
極限粘度 ＝ ３．６×１０−４Ｍ０．７８
Ｍ：平均分子量
【００２９】
本実施形態に係るＳＯＣＳ３発現促進剤に含まれるヒアルロン酸としては、基本的にはβ−Ｄ−グルクロン酸の１位とβ−Ｄ−Ｎ−アセチル−グルコサミンの３位とが結合した２糖単位を少なくとも１個含む２糖以上のものでかつβ−Ｄ−グルクロン酸とβ−Ｄ−Ｎ−アセチル−グルコサミンとから基本的に構成されるものであり、２糖単位が複数個結合したもの、またはそれらの要素が結合した糖であってもよく、またこれらの誘導体、例えば、アシル基等の加水分解性保護基を有したもの等も使用し得る。該糖は不飽和糖であってもよく、不飽和糖としては、非還元末端糖、通常、グルクロン酸の４，５位炭素間が不飽和のもの等が挙げられる。
【００３０】
ヒアルロン酸および／またはその塩は、動物等の天然物（例えば鶏冠、さい帯、皮膚、関節液などの生体組織など）から抽出されたものでもよく、または、微生物もしくは動物細胞を培養して得られたもの（例えばストレプトコッカス属の細菌等を用いた発酵法）、化学的もしくは酵素的に合成されたものなどいずれも使用することができる。
【００３１】
本実施形態に係るＳＯＣＳ３発現促進剤で使用するヒアルロン酸は、市販品を使用することができるが、例えば、以下の製造法１および２に従って製造することもできる。
【００３２】
１．１．１．製造法１（鶏冠からの抽出）
まず、鶏冠に加熱処理を施す。これは、鶏冠に含まれる蛋白質を熱変性させたり、酵素失活させたりするためである。加熱処理は如何なる方法をとってもよいが、熱水中に鶏冠を浸漬する方法をとると効率よく行うことができる。加熱温度や時間は、鶏冠中の蛋白質が変性したり、酵素が失活したりする範囲内であれば、特に制限がなく、熱水による加熱法を採用する場合は、６０〜１００℃の熱水中に原料を２０〜９０分間浸漬するとよい。
【００３３】
なお、凍結した鶏冠を用いる場合には、鶏冠をそのまま加熱してもよいが、凍結鶏冠を流水中等に入れ緩慢解凍した後、加熱処理を施したほうが一定品位のものが得られやすく、好ましい。
【００３４】
次に、加熱処理した鶏冠をペースト化する。このペースト化によりヒアルロン酸の収率が向上する。ペースト化に先立ち、加熱処理後の鶏冠を細断機により薄く切断したり、または肉挽き用チョッパー等で細断したりしておくと、ペースト化がしやすくなる。ペースト化の一例を示すと、鶏冠に対して約１〜５倍量の清水を加え、ホモゲナイザーにて１０〜６０分間ホモゲナイズを行うことで、鶏冠は破砕・微粒子化され、ペーストに仕上げることができる。なお、ペースト化には、ホモゲナイザーの他に、高速撹拌機や擂潰機を用いてもよい。
【００３５】
次に、ペースト化した鶏冠に、塩酸、硫酸等の酸剤、または水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等のアルカリ剤を添加し酸処理またはアルカリ処理してヒアルロン酸を低分子化し、処理後のヒアルロン酸の平均分子量が５０万以上となるように調整する。調製方法としては、酸剤あるいはアルカリ剤の濃度、添加量および 処理時間等を適宜組み合わせて、処理後のヒアルロン酸が所望の分子量となるようにすればよいが、アルカリ処理による方法がヒアルロン酸の分子量をコントロールし易く好ましい。アルカリ処理による一例を示すと、ペースト化した鶏冠に、鶏冠に対し１０〜３０％濃度のアルカリ水溶液を約１〜５％添加し、２５〜７０℃で約１５〜９０分間処理を行った後、塩酸等で中和し、分子量を調整する。
【００３６】
次に、分子量を調整した原料に蛋白分解酵素を添加して、プロテアーゼ処理する。使用する蛋白分解酵素は、市販しているものであれば種類を問わず使用することができ、例えば、ペプシン、トリプシン、パパイン、プロメリン等が挙げられる。蛋白分解酵素の添加量は、鶏冠に対して０．０１〜１％が適当である。また、プロテアーゼ処理の温度と時間は、３５〜６５℃で１〜１０時間の範囲が適当である。
【００３７】
最後に、得られたプロテアーゼ処理物からヒアルロン酸を分取して、粗製のヒアルロン酸を得た後、このヒアルロン酸を精製することにより純度９０％以上、平均分子量５０万以上のヒアルロン酸が得られる。
【００３８】
ここで、ヒアルロン酸の分取・精製は、常法に従って行うことができる。例えば、まず、プロテアーゼ処理した原料を濾過して固形物を除去して、粗製のヒアルロン酸を含有した濾液を得る。なお、濾過に先立ち、脱臭・脱色や一部の蛋白分解物を除去する目的で、プロテアーゼ処理物に活性炭を添加し処理してもよい。そして得られた濾液に食塩を溶解させた後、エタノールを添加してヒアルロン酸を沈殿させ、沈殿物を分取する。その後、この沈殿物にエタノール濃度約８０〜９５容量％の含水エタノールを添加し、ホモゲナイザーで洗浄し、沈殿物を分取する。この含水エタノールによる洗浄を２〜１０回程度繰り返し、分取した沈殿物を乾燥することで、製造例１のヒアルロン酸を得ることができる。
【００３９】
１．１．２．製造法２（微生物発酵法）
ヒアルロン酸算出ストレプトコッカス属の微生物（Streptococcus Zoopidemicus）の培養液に活性炭を添加して脱臭・脱色処理を行った後、濾過処理する。得られた濾液に食塩を溶解させた後、エタノールを添加してヒアルロン酸を沈殿させ、沈殿物を分取する。その後、この沈殿物にエタノール濃度約８０〜９５容量％の含水エタノールを添加し、ホモゲナイザーで洗浄し、沈殿物を分取する。この含水エタノールによる洗浄を２〜１０回程度繰り返し、分取した沈殿物を乾燥することで、製造例２のヒアルロン酸（平均分子量５０万以上）を得ることができる。
【００４０】
なお、本発明において使用するヒアルロン酸の純度は、医薬品または食品で使用できるレベルであればよく、好ましくは９０％以上であればよく、より好ましくは９５％以上であればよい。この純度は乾物換算で１００％よりヒアルロン酸以外の不純物を除いた値として定義される。ここで、不純物としては、蛋白分解物、脂肪分（粗脂肪）、コンドロイチン硫酸等が挙げられる。具体的に鶏冠を原料とするヒアルロン酸の純度は、以下式（４）で求めることができる。
【００４１】
（式４）
ヒアルロン酸の純度（％）＝１００−蛋白分解物（％）−粗脂肪（％）−コンドロイチン硫酸（％）
【００４２】
式４中、蛋白分解物（％）はＬｏｗｒｙ法により求めた値であり、粗脂肪（％）は新・食品分析法（光琳（株）発行）「第１章一般成分および関連成分、１−４脂質、１−４−２エーテル抽出法」により求めた値であり、また、コンドロイチン硫酸（％）は、以下に説明する方法により得た値である。
【００４３】
まず、ヒアルロン酸を乾燥し、その５０ｍｇを精密に量り、精製水を加えて溶かし、正確に１００ｍＬとして試験溶液とし、その試験溶液４ｍＬを試験管にとり、０．５ｍｏｌ／Ｌ濃度の硫酸１ｍＬを加えて混和し、水浴中で１０分間加熱し、その後冷却して得られた溶液に０．０４ｍｏｌ／Ｌ濃度の臭化セチルトリメチルアンモニウムを０．２ｍＬ加えて混和し、室温で１時間放置し、層長１０ｍｍ、波長６６０ｎｍにおける吸光度を測定する。
【００４４】
次に、得られた吸光度データをコンドロイチン硫酸の検量線に適用して精製ヒアルロン酸中のコンドロイチン硫酸量（％）を求める。ここで、その検量線は、クジラ軟骨由来のコンドロイチン硫酸Ａナトリウム塩（ＳＧ（Special Grade）、生化学工業株式会社製）を乾燥（減圧、五酸化リン、６０℃、５時間）させたものを精密に量り、精製水を加えて溶かし、１ｍＬ中に１０μｇ、２０μｇ、３０μｇ、４０μｇのコンドロイチン硫酸Ａナトリウム塩を含む溶液をそれぞれ調製し、それぞれの溶液４ｍｌについて、０．５ｍｏｌ／Ｌ濃度の硫酸１ｍＬを加えて混和した後、０．０４ｍｏｌ／Ｌ濃度の臭化セチルトリメチルアンモニウムを０．２ｍＬ加えて混和し、室温で１時間放置した後、同様に吸光度を測定し、その吸光度を縦軸に、対応するコンドロイチン硫酸Ａナトリウム塩溶液（μｇ／ｍＬ）を横軸にプロットすることによって作成したものである。
【００４５】
なお、ヒトまたはヒト以外の動物の細胞または組織におけるＳＯＣＳ３の発現促進は、例えば、ノーザンブロッティング、ＤＮＡアレイ、ＤＮＡチップ等によるＳＯＣＳ３遺伝子の検出または定量、ならびに、ウエスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、アフィニティクロマトグラフィー等によるＳＯＣＳ３の検出または定量等の公知の生化学的分析方法により確認することができる。
【００４６】
本発明の一実施形態に係るＳＯＣＳ３発現促進剤は、平均分子量５０万以上のヒアルロン酸および／またはその塩を通常０．１質量％以上含有するものであり、好ましくは０．５〜１００質量％含有する。
【００４７】
また、ヒアルロン酸および／またはその塩の平均粒子径は５０〜５００μｍであることが好ましく、８０〜５００μｍであることがより好ましく、２００〜５００μｍであることがさらに好ましい。
【００４８】
平均分子量５０万以上（好ましくは６０万以上、より好ましくは６０万〜１６０万）のヒアルロン酸および／またはその塩（以下、この段落において「ヒアルロン酸」と表記する。）の平均粒子径が５０〜５００μｍであることにより、経口摂取された粉末状のヒアルロン酸および／またはその塩が胃液に適度な速度にて溶解するため、ヒアルロン酸が胃液中で加水分解されるのを抑えて、所定の分子量を維持した状態でヒアルロン酸を腸管から吸収させ、患部に到達させることができる。ここで、ヒアルロン酸の平均粒子径が５０μｍ未満であると、ヒアルロン酸が胃液に速やかに溶解し、胃液中で加水分解が進行する結果、分子量が低下する場合がある。低分子量化されたヒアルロン酸（例えば分子量５０万以下）は上述したように、炎症性疾患の症状を改善しにくく、免疫系の機能を低下させる場合がある。一方、ヒアルロン酸の平均粒子径が５００μｍを超えると、摂取した際にヒアルロン酸が体内で完全には溶解せず、摂取量に対して吸収量が少なくなることがある。その結果、炎症性疾患の症状を改善するための十分な効果を得られない場合がある。
【００４９】
本発明において、ヒアルロン酸および／またはその塩の平均粒子径は、レーザ回折散乱法により測定されたものである。また、ヒアルロン酸および／またはその塩の平均粒子径の調整は、例えば粉砕や篩い分け等の通常用いられる方法によって行うことができる。
【００５０】
１．２．医薬品
本発明の一実施形態に係る医薬品は、本実施形態に係るＳＯＣＳ３発現促進剤を有効成分として含有する。より具体的には、本実施形態に係る医薬品は、本実施形態に係るＳＯＣＳ３発現促進剤を５〜１００質量％含有することができる。
【００５１】
本実施形態に係る医薬品は、平均分子量が５０万以上のヒアルロン酸および／またはその塩をヒトまたはヒト以外の動物に経口的に摂取させることによって、ヒトまたはヒト以外の動物においてＳＯＣＳ３の発現を促進することができる。これにより、炎症性疾患（例えば、リウマチ関節炎(ＲＡ)；喘息；鼻炎等のアレルギー性疾患；血管疾患；血栓症または有害な血小板凝集；血栓溶解後の再閉塞；再潅流傷害；乾癬、湿疹、接触皮膚炎およびアトピー性皮膚炎等の皮膚炎症性 疾患；糖尿病(例えば、インスリン依存型糖尿病、自己免疫型糖尿病)；多発性硬化症；全身性ループスエリテマトーデス(ＳＬＥ)；潰瘍性大腸炎、クローン病(局所性腸炎)および嚢炎(例えば、直腸結腸切除および回腸肛門吻合後に生じる腸疾患)等の炎症性腸疾患；小児脂肪便症、非熱帯性スプルー、血清反応陰 性関節症に関連した腸疾患、リンパ球性または膠原性大腸炎、および好酸球性胃腸炎等の胃腸管への白血球浸潤が関与する疾患；皮膚、尿路、気道および関節滑膜等の他の上皮皮膜組織への白血球浸潤に関連した疾患；膵炎；乳腺炎(乳腺)；肝炎；胆嚢炎；胆管炎または胆管周囲炎(胆管および肝臓の周囲組織)；気管 支炎；副鼻腔炎；過敏性肺炎等の間質性線維症を生じる肺の炎症性疾患；膠原病；サルコイドーシス；骨粗鬆症；骨関節症；アテローム性動脈硬化症;新生物の転移または癌性増殖を含む新生物疾患；外傷（外傷治癒強化）；網膜剥離、アレルギー性結膜炎；自己免疫性、ブドウ膜炎等のある種の眼病；シェーグレン症候群；臓器移植後の拒絶反応（慢性および急性）；宿主対移植片または移植片対宿主疾患；内膜肥厚；動脈硬化症(移植後の移植片動脈硬化症を含む)；経皮的経 管冠動脈血管形成術(ＰＴＣＡ)あるいは経皮的経管動脈再疎通術等の手術後の再梗塞または再狭窄；腎炎；腫瘍血管新生；悪性腫瘍；多発性骨髄腫；骨髄腫誘発骨吸収；敗血症；脳卒中、外傷性脳損傷および脊髄損傷等の中枢神経傷害；およびメニエール病からなる群から選ばれる病態）に罹患した患者（ヒトまたはヒト以外の動物）の症状を改善することができる。なかでも、リウマチ関節炎(ＲＡ)、膠原病等の自己免疫性疾患の症状を有意に改善することができる。なお、ヒト以外の動物としては、例えばヒト以外の哺乳類が挙げられる。
【００５２】
平均分子量が５０万以上のヒアルロン酸および／またはその塩をヒトまたはヒト以外の動物に経口的に摂取させることにより、例えば局所投与する場合に生じる可能性がある投与部位の疼痛、腫脹、水腫、発赤、熱感、重苦しさ、しびれ感の発生を防止しつつ、炎症性疾患を総合的に改善することができる。
【００５３】
１．３．食品
また、本発明の一実施形態に係る食品は、本実施形態に係るＳＯＣＳ３発現促進剤を含有する。より具体的には、本実施形態に係る食品は、本実施形態に係るＳＯＣＳ３発現促進剤を０．１〜１００質量％含有することができる。
【００５４】
本実施形態に係る食品（食料品および飲料）は、上記患者が長期にわたって無理なく摂取することによって、治療の一環として、または治療の補助として、炎症性疾患の症状の緩和および改善を図ることができる。
【００５５】
ヒアルロン酸および／またはその塩を経口摂取することによってＳＯＣＳ３の発現が促進される作用機序については必ずしも明らかではないが、ヒアルロン酸またはその塩を経口摂取したマウスの腸管上皮表面にヒアルロン酸が観察され（図２および図３参照）、腸管上皮表面の受容体であるＴＬＲ−４の局在とヒアルロン酸の局在が一致していることから（図４参照）、腸管上皮表面の受容体を通じて、ヒアルロン酸および／またはその塩がＳＯＣＳ３の発現を促進することによるものであると推察される。
【００５６】
本実施形態に係る医薬品は、ＳＯＣＳ３発現促進剤である、ヒアルロン酸および／またはその塩以外に、本発明の効果を損なわない範囲で、その他の原料を含むことができる。そのような原料の例としては水、賦形剤、抗酸化剤、防腐剤、湿潤剤、粘稠剤、緩衝剤、吸着剤、溶剤、乳化剤、安定化剤、界面活性剤、滑沢剤、水溶性高分子、甘味料、矯味剤、酸味料、アルコール類等が挙げられる。
【００５７】
本実施形態に係る医薬品の剤形は特に限定されないが、該医薬品を経口摂取する場合、例えば錠剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤、丸剤等の固形製剤、水剤、懸濁剤、シロップ剤、乳剤等の液剤等の経口投与剤が挙げられる。
【００５８】
本実施形態に係る食品は、ＳＯＣＳ３発現剤である、ヒアルロン酸および／またはその塩を有効成分として含有する。上記食品の態様は特に限定されないが、例えば、ガム、キャンディー、グミキャンディー、トローチ様食品、ゼリー飲料、米飯加工食品、製パン類、レトルト缶詰、冷凍食品、惣菜、乾燥食品、マヨネーズ等調味料、飲料、菓子、デザート類、サプリメント類等の一般食品全般、生理機能を表現することを許可された特定保健用食品全般が挙げられ、このうち、利便性に優れている点で、サプリメント類が好ましい。
【００５９】
また、サプリメント類の形態としては、例えば、錠剤状、散剤状、細粒状、顆粒状、カプセル状（ハードカプセル、ソフトカプセル）等の固形状、液状、懸濁液状、ゼリー状、シロップ状等の流動状が挙げられる。
【００６０】
上記食品を経口摂取することによって、ＳＯＣＳ３の発現を促進する効果を発揮し、炎症性疾患の症状を総合的に緩和させる。また、上記食品を、炎症性疾患の食事に添加または混合することによって、摂取することもできる。
【００６１】
上記の通り任意の食料品および飲料に、本実施形態に係る食品を含有させることができるが、炎症性疾患の症状の緩和を図るためには、本実施形態に係るＳＯＣＳ３発現促進剤を継続的に摂取するのが望ましいため、日常的に摂取する食品および飲料に本実施形態に係るＳＯＣＳ３発現促進剤を含有させるのが望ましい。
【００６２】
ヒアルロン酸および／またはその塩は生体物質であるため、多量に摂取しても副作用がない、またはきわめて低いと考えられるが、医薬品として摂取するヒアルロン酸および／またはその塩の量は、一日当たり１０ｍｇ〜１０００ｍｇ、好ましくは１００〜５００ｍｇを目安とすることができる。投与回数は、症状に応じて一日当たり一回もしくは複数回を選択できる。また、食品として摂取する本発明のヒアルロン酸および／またはその塩の量は、一日当たり１〜１０００ｍｇ、好ましくは１５〜３００ｍｇを目安とすることができる。また、本発明のヒアルロン酸および／またはその塩を含有する飲料の場合は、本実施形態に係るＳＯＣＳ３発現促進剤を飲料中に０．００１〜１重量％、好ましくは０．０１〜０．５重量％含有させることができる。
【００６３】
２．プロイオトロフィン発現抑制剤、これを含有する医薬品および食品、ならびにプレイオトロフィンの発現を抑制する方法
本発明の一実施形態に係るプロイオトロフィン発現抑制剤は、上記ヒアルロン酸および／またはその塩を有効成分として含有する。すなわち、本実施形態に係るプロイオトロフィン発現抑制剤に含まれるヒアルロン酸および／またはその塩としては、平均分子量が５０万以上のヒアルロン酸および／またはその塩であって、上記ＳＯＣＳ３発現促進剤の欄で例示されたヒアルロン酸および／またはその塩と同様のものを使用することができる。
【００６４】
自己免疫性脳脊髄炎の発症により、プレイオトロフィンの発現が促進されることが報告されている（Liu X, Mashour GA, Webster HF, Kurtz A, “Basic FGF and FGF receptor1 are expressed in microglia during experimenral autoimmune encephalomyelitis:temporally distinct expression of midkine and pleiotrophin”, Glia., 24, 390-397, 1998.）。また、リウマチのような炎症性疾患においても、プレイオトロフィンの発現が促進されることも報告されている（Pufe T, Bartscher M, Petersen W, Tillmann B, Mentlein R, “Expression of pleiotrophin, an embryonic growth and differentiation factor, in rheumatoid arthritis”, Arthritis Rheum., 48, 660-667, 2003.）。
【００６５】
本発明の一実施形態に係るプロイオトロフィン発現抑制剤は、平均分子量が５０万以上のヒアルロン酸および／またはその塩を有効成分として含有することにより、例えば経口摂取によりプロイオトロフィン発現を抑制することができる。
【００６６】
プロイオトロフィンの発現抑制は例えば、後述する実施例で示されるように、ＤＮＡアレイによるプロイオトロフィン遺伝子の発現の度合いによって評価することができる。
【００６７】
また、本発明の一実施形態に係るプロイオトロフィン発現抑制剤を含有する医薬品および食品およびその添加量（配合量）としては、上記ＳＯＣＳ３発現促進剤を含有する医薬品および食品として例示したものが挙げられる。
【００６８】
さらに、本発明の一実施形態に係るプレイオトロフィンの発現を抑制する方法は、平均分子量が５０万以上のヒアルロン酸および／またはその塩をヒトまたはヒト以外の動物に経口的に摂取させることを含む。
【００６９】
３．実施例
以下、実施例によって本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は実施例に限定されない。なお、以下の実施例において、粉末の平均粒子径は、該粉末をエタノールに分散し、ＳＡＬＤ−２０００Ａ（株式会社島津製作所製）を使用して測定された値である。
【００７０】
３．１．実施例１
実施例１では、ＭＲＬマウスに本発明のヒアルロン酸を飲水投与し、本発明のヒアルロン酸および／またはその塩を含有するＳＯＣＳ３発現促進剤による、 ＳＯＣＳ３の遺伝子発現について調査した。ＭＲＬマウスは、リウマチなどの自己免疫疾患を自然発症する病態モデルマウスであり、自己免疫疾患により、種々の症状が生じることが知られている。
【００７１】
１４週令（体重約２７〜３７ｇ）のＭＲＬ ｌｐｒ／ｌｐｒ系（ＳＰＦ）の雌マウス１２匹（日本チャールズリバー株式会社）を実験に用いた。２２±３℃、相対湿度５０±２０％に設定した飼育室にてマウスを飼育し、ラット・マウス用固形型飼料ＣＥ−２（日本クレア株式会社）を飼料として与えた。下記の表１の通りに、上述の製造法で調製されたヒアルロン酸（以下「ヒアルロン酸試作品」ともいう）を蒸留水で希釈したものを試験物質として、自由摂取させて与えた。試験物質の詳細は、以下の通りである。
１群：蒸留水（大塚蒸留水、株式会社大塚製薬工場製）
２群：低分子ヒアルロン酸（上記製造法１に準じて平均分子量が２０００となるよう調製したもの（平均分子量が４００〜２万の範囲にあるもの、平均粒子径：６７μｍ）、試作品Ａ）
３群：ヒアルロン酸（上記製造法２に準じて平均分子量が９０万となるよう調製したもの（平均分子量が６０万〜１６０万の範囲にあるもの、平均粒子径：７５μｍ）、試作品Ｂ）
これらの試験物質は、室温にてクリーンベンチを用いて無菌的に調製した。調製には注射用蒸留水を用いて所定濃度に調製し、使用時まで冷蔵保存した。
【００７２】
【表１】
2014185176.tif 000002
【００７３】
ヒアルロン酸試作品の投与量として、飲水投与で効果が期待される２００ｍｇ／ｋｇ／日を設定した。マウスの１日当たりの飲水量は、予備検討の結果６ｍＬ／匹であり、ＭＲＬマウスの体重が約３３ｇであることから、試作品Ａおよび試作品Ｂの濃度を１．１ｍｇ／ｍＬに設定した。
【００７４】
また、ＭＲＬマウスではリンパ節腫大などの病態が自然発症することが知られている。本実施例では病態の初期段階である１４週令から投与を開始した。投与期間は、飲水投与での薬効を評価するのに適切と考えられる２８日間試験を続けた。
【００７５】
２８日間の摂取試験の後、マウスを安楽死せしめ、小腸、大腸および頸部リンパ節を摘出した。これらのサンプルを使用して、（１）ＤＮＡアレイによるＳＯＣＳ３遺伝子発現の確認、（２）ＲＴ−ＰＣＲによるＳＯＣＳ３遺伝子発現の確認、（３）腸内のヒアルロン酸の局在、（４）頸部リンパ節の重量について調査した。
【００７６】
（１）ＤＮＡアレイによるＳＯＣＳ３遺伝子発現の確認
摘出した大腸から、パイエル氏板を含む部位（サンプル）を約１ｃｍ採取し、GeneChipMouse Genome 430 2.0 Array（AFFYMETRIX社製）を使用したＤＮＡアレイに供して、ＳＯＣＳ３遺伝子の発現を調べた。
【００７７】
ＤＮＡアレイに供するターゲットの調製、ハイブリダイゼーション、およびＤＮＡアレイの解析は、GeneChip Eukaryotic Target Preparation & Hybridization Manual（AFFYMETRIX社）にしたがって行った。より具体的には、サンプル中のＲＮＡに対するｃＤＮＡを合成し、GeneChip Sample Cleanup Module Kit（AFFYMETRIX社製）を用いて二本鎖ｃＤＮＡを精製し、Ge neChip Expression 3’-Amplefication Reagents for IVT Labeling Kit（AFFYMETRIX社製）を用いて二本鎖ｃＤＮＡをビオチン標識化してビオチン標識化ｃＲＮＡを合成し、GeneChip Expression Sample Cleanup Module Kit（AFFYMETRIX社製）を用いてビオチン標識化ｃＲＮＡを精製し、断片化した。次に、この試料にGeneChip Eukaryotic Hybridization Control Kit（AF FYMETRIX社）を用いてハイブリダイゼーションコントロールを添加し、GeneChip Hybridization Oven 640（AFFYMETRIX社）を用いて４５℃にて１６時間６０ｒｐｍでハイブリダイゼーションを行った。次いで、GeneChip Fluidic Station 450（AFFYMETRIX社）を用いて洗浄およびストレプトアビジン−フィコエリスリン（分子プローブ）染色を行った。さらに、レーザスキャナ（GeneChip Scanner 3000 7G（AFFYMETRIX社））を用いて得られたＤＮＡアレイを走査し、得られた画像を専用のソフトウエア（GeneChip Operating Software ver. 1.4（AFFYMETRIX社）））を用いて解析した。その結果、試作品Ｂ摂取群ではＳＯＣＳ３遺伝子増強が認められた。
【００７８】
ＤＮＡアレイに固定されたプローブの遺伝子配列を、配列番号１から１１に示す。なお、これらのプローブ情報は、下記のウェブサイトより確認可能である。
https://www.affymetrix.com/site/login/login.affx
(5´) TCACTTTTATAAAAATCCACCTCCA (3´) （配列番号１） 
(5´) GAGGCTGTCTGAAGATGCTTGAAAA (3´) （配列番号２） 
(5´) GAAGATGCTTGAAAAACTCAACCAA (3´) （配列番号３） 
(5´) GATGCTTGAAAAACTCAACCAAATC (3´) （配列番号４） 
(5´) TTGAAAAACTCAACCAAATCCCAGT (3´) （配列番号５） 
(5´) TCAACCAAATCCCAGTTCAACTCAG (3´) （配列番号６） 
(5´) CAACCAAATCCCAGTTCAACTCAGA (3´) （配列番号７） 
(5´) ACCAAATCCCAGTTCAACTCAGACT (3´) （配列番号８） 
(5´) CAAATCCCAGTTCAACTCAGACTTT (3´) （配列番号９） 
(5´) TCAACTCAGACTTTGCACATATATT (3´) （配列番号１０） 
(5´) ACTCAGACTTTGCACATATATTTAT (3´) （配列番号１１） 
【００７９】
ＳＯＣＳ３遺伝子の発現を調べた結果について、表２にまとめた。なお、表２において、各群の発現相対比は、蒸留水摂取群の蛍光強度に対する各群の蛍光強度であり、ＤＮＡアレイによる蛍光強度（平均値）は、配列番号１〜１１の各プローブに対する蛍光強度の平均値である。
【００８０】
【表２】
2014185176.tif 000003
【００８１】
表２に示すように、蒸留水を飲水したマウスに比べて、試作品Ｂ（平均分子量９０万のヒアルロン酸）を投与した群は、ＳＯＣＳ３の遺伝子発現が約２倍となっていた。一方、試作品Ａ（平均分子量２０００のヒアルロン酸）を投与した群は、ＳＯＣＳ３の遺伝子発現が抑制されていた。したがって、平均分子量が５０万以上のヒアルロン酸試作品の経口摂取により、ＳＯＣＳ３の発現が促進されていることが示唆された。
【００８２】
（２）ＲＴ−ＰＣＲによるＳＯＣＳ３遺伝子発現の確認
摘出した大腸から、パイエル氏板を含む部位（サンプル）を採取し、ｍＲＮＡを抽出し、OneStep RT-PCR Kit（QIAGEN社）を使用したＲＴ−ＰＣＲに供して、ＳＯＣＳ３遺伝子の発現を調べた。まず、逆転写によってサンプル中のｍＲＮＡに対するｃＤＮＡを合成し、これをＰＣＲ反応により、増幅を行った。具体的には、まず５０℃、３０分間でｍＲＮＡの逆転写を行い、次に９５℃、１５分間でＰＣＲ初期活性化を行った。次いで、９２℃、３０秒間でＤＮＡを変性させた後、６０℃、３０秒間でアニーリングを行い、７２℃、３０秒間でエクステンションした。上記の変性、アニーリング、エクステンションを３０サイクル実施し、最後のエクステンションの条件は７２℃、１０分間とし、ＤＮＡの増幅を行った。この試料を、１．５％アガロース/ＴＡＥバッファーを使用した電気泳動に供し、エチジウムブロマイドで染色した。なお、プライマーとして、配列番号１２および１３に示される遺伝子配列を有するオリゴヌクレオチドを使用した。
(5´) TAGACTTCACGGCTGCCAAC (3´) （配列番号１２）
(5´) TCGCTTTTGGAGCTGAAGGT (3´) （配列番号１３）
【００８３】
ＳＯＣＳ３遺伝子の発現を調べた結果について、表３にまとめた。また、電気泳動の結果について図１に示す。表３において、Relative Optical Intensityは、配列番号１２および１３の各プローブに対するRelative Optical Intensityの平均値である。
【００８４】
【表３】
2014185176.tif 000004
【００８５】
表３および図１に示すように、蒸留水を飲水したマウスに比べて、試作品Ｂ（平均分子量９０万のヒアルロン酸）を投与した群は、ＳＯＣＳ３の遺伝子発現が約１．３倍となっていた。一方、試作品Ａ（平均分子量２０００のヒアルロン酸）を投与した群は、蒸留水投与群と比較して、ＳＯＣＳ３の遺伝子発現は同等であった。したがって、平均分子量が５０万以上のヒアルロン酸試作品の経口摂取により、ＳＯＣＳ３の発現が促進されていることが示唆された。
【００８６】
（３）腸内のヒアルロン酸の局在
摘出した大腸および小腸を使用して、ヒアルロン酸の局在について調べた。
【００８７】
（３−１）．大腸および小腸上皮のヒアルロン酸の染色
ＭＲＬマウスの大腸標本を６μｍ厚さに切り出し、３０分間風乾した。このサンプルを１０％中性緩衝ホルマリン溶液に３０分間浸漬して取り出し、ＰＢＳにて５分間洗浄した。この洗浄工程を３回繰り返した後、１００ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ６．０）に３７℃で１５分間浸漬し、前処理を行った。前処理後のサンプルを、２００ＴＲＵ／ｍＬのヒアルロニダーゼ（放線菌由来、天野エンザイム）を含有する１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）に６０℃で１２０分間浸漬し、ヒアルロン酸を断片化した。これをＰＢＳにて５分間洗浄し、この洗浄工程を３回繰り返した。これを、Streptavidin-biotin Blocking Kit（VECTOR社）にて処理し、内在性ビオチンのブロッキングを行った。具体的には、室温下、ストレプトアビジン液に１５分間浸漬後、ＰＢＳにて５分間、３回洗浄し、さらにこれをビオチン液に１５分間浸漬した後、ＰＢＳにて５分間、３回洗浄した。この内在性ビオチンのブロッキング処理の後、１％ＢＳＡ／ＰＢＳに６０分間浸漬した。これを、HABP-Biotin（生化学工業（株））の１μｇ／ｍＬ溶液（１％ＢＳＡ／ＰＢＳ）中に４℃で一晩浸漬し、ＰＢＳにて５分間、３回洗浄した。
【００８８】
この試料を、Streptavidin HRPに室温で６０分接触せしめ、ＰＢＳで５分間、３回洗浄した後、さらにＤＡＢと接触せしめた。これを、蒸留水で洗浄した後、発色の確認を行った。
【００８９】
（３−２）．大腸上皮のヒアルロン酸および受容体（ＴＬＲ−４）の二重染色
（ヒアルロン酸の染色方法）
大腸上皮のサンプルを使用して、（３）−１記載の方法にて、HABP-Biotin処理までを行った。これを、遮光下、AlexaFluor488（Moleculer Probe社）の１６００倍希釈液（１％ＢＳＡ／ＰＢＳ）に室温で６０分間浸漬した。
【００９０】
（ＴＬＲ−４の染色方法）
以下の手順は、全て遮光下で行った。まず、ヒアルロン酸染色後の標本をＰＢＳにて５分間、３回洗浄した後、１０％Donkey serum／ＰＢＳに６０分間浸漬し、ブロッキングを行った。これを４μｇ／ｍＬの抗ＴＬＲ−４抗体（１０％Donkey serum／ＰＢＳ）に４℃で一晩浸漬した後、ＰＢＳにて５分間、３回洗浄した。これをAlexaFluor594（MoleculerProbe社）の４００倍希釈液（１０％Donkey serum／ＰＢＳ）に浸漬し、室温下で６０分間浸漬した。これをＰＢＳにて５分間、３回洗浄した。
【００９１】
（撮影方法）
Leica DMI4000Bを使用して、４８８ｎｍ（ＨＡ）および５９４ｎｍ（ＴＬＲ−４）で標本の撮影を行い、ＨＡおよびＴＬＲ−４の局在を確認した。
【００９２】
図２および図３に示すように、試作品Ｂ（平均分子量９０万のヒアルロン酸）を投与した群の小腸および大腸の上皮表面にはヒアルロン酸が存在することがわかる（図２および図３において、矢印はヒアルロン酸を示す）。また、腸管上皮表面のヒアルロン酸およびＴＬＲ−４の二重染色の結果、ヒアルロン酸の局在が、ＴＬＲ−４の局在と同様であることがわかった（図４参照）。この現象から、平均分子量が５０万以上のヒアルロン酸試作品の経口摂取により、腸管上皮表面に存在するヒアルロン酸受容体にヒアルロン酸が結合することにより、ＳＯＣＳ３の発現が促進され、プレイオトロフィンの発現が抑制されると推察される。
【００９３】
（４）頸部リンパ節の重量測定
摘出した頸部リンパ節の重量測定および写真撮影を行った。頸部リンパ節の重量測定結果を表４に、頸部リンパ節の写真を図１に、小腸上皮表面の写真を図２に、大腸上皮表面の写真を図５に示す。
【００９４】
【表４】
2014185176.tif 000005
【００９５】
表４に示すように、蒸留水を飲水したマウス群の頸部リンパ節の重量に比べて、試作品Ｂ（平均分子量９０万のヒアルロン酸）を投与した群の頸部リンパ節の重量は、約６割となり、有意（ｐ＝０．０５、Ｆｉｃｈｅｒ多重比較検定）に小さかった。一方、試作品Ａ（平均分子量２０００のヒアルロン酸）を投与した群の頸部リンパ節の重量は、蒸留水を飲水したマウス群の頸部リンパ節の重量に比べて、大きく減少しなかった。図１からも明らかな通り、試作品Ｂ（平均分子量９０万のヒアルロン酸）を投与した群の頸部リンパ節の腫脹が抑制されていることがわかる。この現象から、平均分子量が５０万以上のヒアルロン酸試作品の経口摂取によりＳＯＣＳ３の発現が促進され、それにより、炎症性疾患（自己免疫疾患）の症状が軽減したものと推察される。
【００９６】
３．２．実施例２
実施例２では、ヒト大腸上皮由来の細胞株であるＨＴ２９細胞を使用し、本発明のヒアルロン酸および／またはその塩を含有するＳＯＣＳ３発現促進剤による、ＳＯＣＳ３の遺伝子発現について調査した。
【００９７】
ＨＴ２９細胞の培養を以下の条件で行った。
【００９８】
実施例１にて使用した、試作品Ａおよび試作品Ｂを使用し、培地中のヒアルロン酸濃度が１００ｎｇ／ｍＬとなるように添加した。２４時間培養後、実施例１の手順と同様に、ＲＴ−ＰＣＲに供した。なお、プライマーとして、配列番号１４および１５に示される遺伝子配列を有するオリゴヌクレオチドを使用し、増幅サイクルを３８サイクルとした。
(5´) GCCACCTACTGAACCCTCCT (3´) （配列番号１４）
(5´) ACGGTCTTCCGACAGAGATG (3´) （配列番号１５）
【００９９】
結果を図６に示す。
【０１００】
図６の結果より、平均分子量９０万のヒアルロン酸存在下にてＨＴ２９細胞を培養することによって、ＳＯＣＳ３の発現が促進されていることがわかる。一方、平均分子量２０００のヒアルロン酸存在下では、対照と比較してＳＯＣＳ３の発現が促進されてはいないことがわかる。以上より、平均分子量５０万以上のヒアルロン酸および／またはその塩の存在下では、大腸上皮細胞において、ＳＯＣＳ３の発現が促進されることが示唆された。
【０１０１】
３．３．実施例３
実施例１の試作品Ｂ（平均分子量９０万のヒアルロン酸）をそのままＳＯＣＳ３発現促進剤として使用して、内容物が下記の配合であるソフトカプセルを製した。
【０１０２】
＜配合割合＞
ＳＯＣＳ３発現促進剤（実施例１の試作品Ｂ） ２０％
オリーブ油 ５０％
ミツロウ １０％
中鎖脂肪酸トリグリセリド １０％
乳化剤 １０％
――――――――――――――――――――――――――――――
１００％
【０１０３】
３．４．実施例４
実施例１の試作品Ｂ（平均分子量９０万のヒアルロン酸）をそのままＳＯＣＳ３発現促進剤として使用して、下記の配合の散剤（顆粒剤）を製した。
【０１０４】
＜配合割合＞
ＳＯＣＳ３発現促進剤（実施例１の試作品Ｂ） １０％
乳糖 ６０％
トウモロコシデンプン ２５％
ヒプロメロース ５％
――――――――――――――――――――――――――――――
１００％
【０１０５】
３．５．実施例５
実施例１の試作品Ｂ（平均分子量９０万のヒアルロン酸）をそのままＳＯＣＳ３発現促進剤として使用して、下記の配合の錠剤を製した。
【０１０６】
＜配合割合＞
ＳＯＣＳ３発現促進剤（実施例１の試作品Ｂ） ２５％
乳糖 ２４％
結晶セルロース ２０％
トウモロコシデンプン １５％
デキストリン １０％
乳化剤 ５％
二酸化ケイ素 １％
――――――――――――――――――――――――――――――
１００％
【０１０７】
３．６．実施例６
実施例１で評価したサンプルと同じサンプルについて、実施例１のＤＮＡアレイによるＳＯＣＳ３遺伝子発現の確認と同様の方法にて、プレイオトロフィン遺伝子発現の確認を行った。
【０１０８】
ＤＮＡアレイに固定されたプローブの遺伝子配列を、配列番号１６から２６に示す。なお、これらのプローブ情報は、下記のウェブサイトより確認可能である。
https://www.affymetrix.com/site/login/login.affx
(5´) AATGTATACCATAGTACCAGTAGGG (3´) （配列番号１６）
(5´) AGGAAGTTGAACTCTGTAGTACATA (3´) （配列番号１７）
(5´) GATTGAGGTAAGTTTTTTGGTGTTG (3´) （配列番号１８）
(5´) GTGATATTTCACATTTAAATCTTTT (3´) （配列番号１９）
(5´) ATGTTTTCTCTTGTGCATCAATTTA (3´) （配列番号２０）
(5´) GTGCATCAATTTAAATGTTACAACC (3´) （配列番号２１）
(5´) AACCATGTAAACTACTTCTCTTGTT (3´) （配列番号２２）
(5´) AAACTACTTCTCTTGTTAGATAGAT (3´) （配列番号２３）
(5´) GATAGATTTTCACCTAGACTTTTTT (3´) （配列番号２４）
(5´) AGAGGCAGAGCAACGATGTAGTGAA (3´) （配列番号２５）
(5´) AACATGAAATCCTTTCACTTTGGCA (3´) （配列番号２６）
【０１０９】
【表５】
2014185176.tif 000006
【０１１０】
表５において、ＤＮＡアレイによる蛍光強度（平均値）とは、配列番号５〜１６の各プローブに対する蛍光強度の平均値である。
【０１１１】
表５によれば、試作品Ｂの摂取によって、プレイオトロフィンの発現が抑制されていることがわかる。
【０１１２】
３．７．実施例７
ＳＯＣＳ３の発現促進によって、サイトカインシグナル伝達の阻害が起こり、炎症性サイトカインの発現が抑制されることが予想される。そこで、本発明に係るヒアルロン酸（実施例１で使用した試作品Ｂ）を摂取したマウスの大腸を使用してサイトカインアレイを行うことにより、表６に示す炎症性サイトカインの発現について調査した。
【０１１３】
RayBio Mouse Cytokine Antibody Array 3（RayBiotech, Inc.）を使用して、実施例１でマウスから採取した血清を１０μＬ使用し、表６に示す炎症性サイトカインの発現について調べた。より具体的には、まず、マウス由来の各種サイトカインに対する抗体が結合したガラススライドの担体に血清を接触させた。これにより、血清中の各種サイトカインと該抗体との抗原抗体反応が生じる。そこへ、ビオチン標識したマウス由来の各種抗サイトカイン抗体（二次抗体）を接触させた後、さらにストレプトアビジン−蛍光色素を添加し該二次抗体に結合させて、蛍光強度を測定することにより、各種サイトカインの発現を確認した。蛍光強度は、ポジティブコントロールを対照とした発現比率として算出した。その結果を表６に示す。
【０１１４】
【表６】
2014185176.tif 000007
【０１１５】
上記実施例１および実施例２によれば、試作品Ｂの摂取によりＳＯＣＳ３の発現が促進され、炎症性疾患を軽減できることが理解できる。また、本実施例によれば、本発明に係るヒアルロン酸（試作品Ｂ）の摂取により、抗炎症性サイトカインであるIL-10の発現が促進されたことが分かる（表６参照）。これらの結果から、試作品Ｂの摂取によりＳＯＣＳ３の発現が促進もしくはプレイオトロフィンの発現が抑制される結果、抗炎症性サイトカイン（IL-10）の発現が促進されて、炎症性疾患を軽減することができたことが推察される。
【０１１６】
一方、表６によれば、本発明に係るヒアルロン酸（試作品Ｂ）の摂取により、炎症性サイトカイン（MCP-5、MIP-2、P-Selectin、 RANTES、SCF、VEGF）の発現は低下した。この結果から、本発明に係るヒアルロン酸（試作品Ｂ）の摂取によって炎症が抑えられたため、炎症性サイトカインの発現が抑制されたことが理解できる。
【０１１７】
３．８．実施例８
低ｐＨである胃液にヒアルロン酸が溶解すると、加水分解によりヒアルロン酸の低分子化が進行し、経口摂取時の分子量と比較してヒアルロン酸の分子量が低下する場合があるため、炎症性疾患の改善効果が低下する可能性がある。
【０１１８】
そこで、本実施例では、ヒアルロン酸の平均粒子径の違いによる溶解性の違いを評価した。
【０１１９】
３．８．１．評価方法
平均粒子径が異なる、平均分子量８０万のヒアルロン酸を使用して、人工胃液中での溶解速度を評価した。具体的には、平均分子量８０万のヒアルロン酸を篩い分けして表７に記載の各平均粒子径を有するヒアルロン酸を調製した。
【０１２０】
平均分子量８０万のヒアルロン酸を使用して、篩い分けは、篩１（６５メッシュ（目開き２０８μｍ））、篩２（１５０メッシュ（目開き１０４μｍ））、篩３（２５０メッシュ（目開き６１μｍ））の篩を用いた。
【０１２１】
篩１を通過したが篩２を通過しなかった粒子を試験例１の粒子とし、篩２を通過したが篩３を通過しなかった粒子を試験例２の粒子とし、篩１を通過しなかった粒子を試験例３の粒子とし、篩３を通過した粒子を比較試験例１の粒子とした。
【０１２２】
また、平均分子量８千のヒアルロン酸についても同様に篩い分けを行い、表８に記載の各平均粒子径を有するヒアルロン酸を調製した（参考例１〜４の粒子の調製方法はそれぞれ、試験例１〜３および比較試験例１の調製方法に準じた。）。
【０１２３】
各ヒアルロン酸０．３ｇを人工胃液（ｐＨ１．２のＮａＣｌ０．２％水溶液）１００ｍＬに加え、同時に攪拌を行い、目視で完全溶解するまでの時間（溶解時間）を測定した。試験例１〜３、比較試験例１および参考例１〜４のヒアルロン酸の溶解時間を表７、表８に示す。
【０１２４】
【表７】
2014185176.tif 000008
【０１２５】
【表８】
2014185176.tif 000009
【０１２６】
３．８．２．評価結果
以上の結果から、比較試験例１（平均粒子径５０μｍ未満）のヒアルロン酸に対して、試験例１〜３のヒアルロン酸（平均粒子径５０〜５００μｍ）の胃液中への溶解性が低いことがわかる。さらに、試験例１および３のヒアルロン酸（平均粒子径８０〜５００μｍ）の溶解性がより低く、試験例３のヒアルロン酸（平均粒子径２００〜５００μｍ）の溶解性がさらに低い。このことから、平均粒子径５０〜５００μｍである試験例１〜３のヒアルロン酸は、平均粒子径５０μｍ未満である比較試験例１のヒアルロン酸と比べて胃液中での加水分解を受けにくく、低分子化されにくいことがわかる。
【０１２７】
一方、ヒアルロン酸の平均分子量が８千である参考例１〜４においては、平均粒子径と溶解速度の相関性が大きくないことがわかる。このことから、平均分子量が５０万以上のヒアルロン酸では、胃液への溶解性が平均粒子径に依存するのに対して、平均分子量が５０万未満のヒアルロン酸は、胃液への溶解性が平均粒子径に依存しないといえる。なお、分子量５０万未満のヒアルロン酸が、分子量５０万以上のヒアルロン酸と比べて、炎症性疾患の治療効果が低いことは、上述の実施例１に示されている。
【０１２８】
以上により、平均粒子径２００〜５００μｍである平均分子量５０万以上のヒアルロン酸は胃液による加水分解を受けにくく、低分子化されにくいため、分子量を維持した状態で腸管から吸収されて患部に到達するため、炎症性疾患の治療効果が優れていると推察される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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