(57)【要約】【課題】  本発明は、従来の生物発光を用いたバイオアッセイで必須とされた細胞溶解工程を省略し、リガンド刺激から直接発光測定でき、かつ高感度のバイオアッセイを可能とする生物発光用反応バッファーを提供することを目的とする。【解決手段】  本発明では、細胞溶解で用いられる細胞溶解液と、発光測定時に用いられていた反応溶液の組合せを検討して、基本バッファーとしてTris-バッファー及びHBSSバッファーを含み、界面活性剤としてNP-40及びTW80を含む生物発光用反応バッファーを用いることで、細胞溶解工程を経ることなく、リガンド刺激から直接発光測定できる生物発光バイオアッセイが可能となった。さらにPEG等の高分子、金属イオン、糖成分、ハロゲンイオンなどを添加することで、さらに高感度のバイオアッセイを可能とした。【選択図】  図１
2014085311.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生細胞に対して細胞溶解工程を経ずに、生物発光を用いたバイオアッセイを行うための生物発光用反応バッファーであって、
下記(１)及び(２)を含むことを特徴とする生物発光用反応バッファー；
（１）Tris-バッファー及びHBSSバッファーを含む基本バッファー、
（２）NP-40及びTW80を含む界面活性剤。
【請求項２】
前記(２)の界面活性剤として、さらにSDSを含む、請求項１に記載の生物発光用反応バッファー。
【請求項３】
さらに、少なくとも下記(３)〜(６)のいずれか１つの添加剤を配合することを特徴とする、請求項１又は２に記載の生物発光用反応バッファー；
（３）PEG及びPPGから選択された少なくとも１種の高分子化合物、
（４）Mg(II)、Fe(III)，Cu(II)，Mo(VI)及びZn(II)から選択された少なくとも１種の多価イオン、
（５）Br-及びＩ-から選択された少なくとも１種のハロゲンイオン、
（６）スクロース、グルコース、及びグリシンから選択されたポリオール類。
【請求項４】
前記(１)の基本バッファー中のTris-バッファー及びHBSSバッファーの配合比が、容量(v/v)％で20〜50：50〜20であって、かつ
前記(２)の界面活性剤中のNP-40及びTW80の配合比が、容量(v/v)％で1：1〜10であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の生物発光用反応バッファー。
【請求項５】
生物発光を用いたバイオアッセイが、男性ホルモン、女性ホルモン、又はストレスホルモンから選択されたステロイドホルモンに応答する生物発光プローブを用いたバイオアッセイであることを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の生物発光用反応バッファー。
【請求項６】
生細胞を、細胞溶解工程を経ることなく、生物発光用反応バッファーに懸濁させ、得られた懸濁液中の生物発光強度を測定する、生物発光を用いたバイオアッセイ法であって、
下記(１)及び(２)を含む生物発光用反応バッファーを用いることを特徴とする、バイオアッセイ法；
（１）Tris-バッファー及びHBSSバッファーを含む基本バッファー、
（２）NP-40及びTW80を含む界面活性剤。
【請求項７】
バイオアッセイ法が、男性ホルモン、女性ホルモン、又はストレスホルモンから選択されたステロイドホルモンに応答する生物発光プローブを用いたバイオアッセイ法であることを特徴とする、請求項６に記載のバイオアッセイ法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物発光を用いるアッセイを行う際、必要な最適反応溶液に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
バイオアッセイにおける適切な反応溶液の選択・使用は結果を左右する重要条件である。特に反応溶液の選択が重視されるバイオアッセイとしては、(１)レポータージーンアッセイ(reporter-gene assay)、(２)ツーハイブリットアッセイ(two-hybrid assay)、(３)酵素結合免疫吸着法(enzyme-linked immunosorbent assay)、(４)放射免疫アッセイ(ラジオイムノアッセイ、RIA)等を取り上げられる(非特許文献１、非特許文献２)。
また、その他のバイオアッセイとして、所謂「分子プローブ」を用いるバイオアッセイ法があり反応溶液の選択が結果を大きく左右する。例えば、細胞内での蛋白質−蛋白質相互作用を発色でイメージングする方法であり、(１)蛍光蛋白質間蛍光共鳴エネルギー転移を利用したフレット法(FRET)(非特許文献３)や、(２)蛍光蛋白質や発光蛋白質を２分割し、その蛋白質断片間の再結合による発光回復を特徴とする２分子型相補法(２-molecule-format protein complementation assay(PCA))等が開発されていた(非特許文献４)。本発明者らによっても蛋白質組継ぎ反応を用いたアッセイ法が開発された(protein splicing assay (PSA))(非特許文献５)。
その後、本発明者らによって、(１)一分子型生物発光プローブ(integrated-molecule-format bioluminescent probe；又は簡単にsingle-chain probe)が開発され、単一融合分子内蛋白質-蛋白質間の相互作用が検出できるようになり(非特許文献６、特許文献１)、その派生手法として、(２)発光酵素の遺伝子配列を円順列置換(circular permutation)したことを特徴とする生物発光プローブも開発された(非特許文献７、特許文献２)。更に、本発明者らにより、(３)発光酵素に人為的な歪みをかけることによって起こる酵素活性の相違を指標とした分子歪みセンサー(molecular tension-indexed bioluminescent probe)が開発された(非特許文献８、特許文献３)。
最近本発明者らは、レポータージーンアッセイと一分子型生物発光プローブを合体した多重認識型生物発光プローブ(multiple recognition-type bioluminescent probe)を開発した(非特許文献９)。このプローブは、一つの検量物質に対して２回センシングすることを特徴とする。更に２色の一分子型生物発光プローブを組み合わせることによってマルチカラー生物発光イメージングプローブセットを開発した(特許文献４)。このプローブは、検体の多面的な生理活性の多色イメージングできることを特徴とする。
【０００３】
バイオアッセイは必ず反応溶液を必要とし、その発光信号の種類によって、(１)蛍光蛋白質を利用する手法と、(２)生物発光酵素(ルシフェラーゼ)を用いる手法に大別される。蛍光蛋白質を利用する場合には、自己蛍光によってバックグラウンドが非常に高くなることに加え、外部光源が必要となる。蛍光を測定するためには精密な分光フィルターを取り付けた、比較的大型の発光検出器(例、蛍光顕微鏡)が必要となるという問題点がある(非特許文献５)。一方、生物発光的な手法の場合は、前記問題は生じないが、蛍光に比べて弱光であり、基質を必ず必要とする問題点があった。また、発光酵素に依存するため、塩濃度、温度、pH、重金属イオンの濃度等によって発光量が容易に変動する問題がある。蛍光を基盤とした手法においても同様な問題点を有する。したがって、pHを固定し発光反応条件を最適化するために、蛍光法・発光法ともに幅広く反応溶液が使用されている。
このような背景から、従来の蛍光や生物発光に基づいた様々なアッセイ法において最適バッファー条件の決定は、アッセイ法の成否を左右する重要な決め手である。また、バイオアッセイの特徴に応じて、十分な検出感度、選択性、信号安定性が得られるように、反応溶液および添加物の最適化が強く求められていた。
反応溶液(アッセイバッファー)には、アッセイ効果を向上させるために様々な添加物が使用されてきた。添加物に求められる機能としては、(１)プロテアーゼによる蛋白質の分解を阻止し、(２)干渉物質の影響を抑え、(３)緩衝溶液として働いてもらうことによって安定的な信号発信をサポートし、(４)細胞膜を穏やかに壊すなど、homogenousなアッセイ条件を整えるものであり、(５)蛋白質を安定化させ、(６)発光反応の中核になるプローブの性能には阻害しないことが求められる。
【０００４】
反応溶液における主な添加物のうち、塩類としては、NaCl，KCl,(NH4)2SO4などを添加し、SH試薬としてメルカプトエタノール、DTT等を添加し、ポリオールとしてグリセロールやスクロース等を添加し、キレート試薬としてEGTA、EDTA等を添加する。
界面活性剤としては、polyoxyethylene(10)octylphenyl ether (TritonX-100；TX100)，Nonidet P-40 (NP40)，polyoxyethylene sorbitan monolaurate (Tween20；TW20)，polyoxyethylene sorbitan monooleate (Tween80；TW80)，polyoxyethylene(20)cetyl ether (Brij58)，sodium dodecyl sulfate (SDS)等を添加する。界面活性剤の選択にあたっては、親水度の度合いが、TW20＞Brij58＞TW80＞TX100＞NP40の順であり、界面活性度の度合いがNP40＞TX100＞Brij58＞TW20＞TW80の順であることを参考として、適宜選択してきた。
蛋白質分解を阻止するために使うProtease Inhibitorとしては、アプロチニン(分子量6.5kD)、ロイペプチン(分子量：427)、ペプスタチンＡ(pepstatin，分子量：686)、phenylmetylsulfonyl Fluoride(PMSF、分子量：174)、アンチパイン(Antipain，分子量：605)、キモスタチン(chymostatin，分子量：608)等が使われる。他に、Pefabloc SC(AEBSF，240 Da)，DFP(184 Da)，p-APMSF(216 Da)，STI(20,100 Da)，Leupeptin(460 Da)，N-Tosyl-L-phenylalaninechloromethylketone，3,4-dichloroisocoumarin(215 Da)，EDTA-Na2(372 Da)，EGTA(380 Da)，1,10-phenanthroline(198 Da)，phosphoramidon(580 Da)，Dithiobis(2-amino-4-methylpentane)，E-64(357 Da)，cystatin，bestatin，Epibestatin hydrochloride，aprotinin，minocycline，ALLN(384 Da)等の蛋白質分解阻害剤として利用されてきた。
また、以下の機能性化学物質を添加することもある。Sodium molybdateを添加することによって受容体を安定化させ、分解から守る役割を得られる。Glycerolは蛋白質のブロッキング剤などで使えるものであり、ジチオトレイトール(dithiothreitol，DTT)は還元剤として使われてきた。
また、バッファー剤として、p-Toluenesulphonic acid，tartaric acid，citric acid，phthalate，glycine，trans-aconitic acid，formic acid，3,3-dimethylglutaric acid，phenylacetic acid，sodium acetate，succinic acid，sodium cacodylate，sodium hydrogen maleate，maleic acid，sodium phosphate，KH2PO4，imidazole，2,4,6-trimethylpyridine，Triethanolamine hydrochloride，sodium 5,5-diethylbarbiturate，N-ethylmorpholine，sodium pyrophosphate，Tris(hydroxymethyl)aminomethane，bicine，2-amino-2-methylpropane-1,3-diol，diethanolamine，potassium p-phenolsulphonate，boric acid，sodium borate，ammonia，glycine，Na2CO3/NaHCO3，sodium borate，またはこの組み合わせが使われてきた。
このような背景から、反応溶液に添加する添加物の選択は極めて重要であり、既存のバイオアッセイを遂行するために添加物の適切な選択および反応溶液の最適化が強く求められていた。
【０００５】
一方で、従来のバイオアッセイをこなすためには、いくつかの反応バッファーを用いなければならない問題点もあり、方法の煩雑さやコスト増加の原因となっていた。また、使用者側の作業工程を煩雑にする原因でもあった。
例えば、レポータージーンアッセイの場合、まずマイクロプレート上の培養細胞にレポータージーンを含むプラスミドを導入する。その後、リガンド刺激を12時間程度行い、培地を捨てた後phosphate buffered saline(PBS)バッファー(１番目に必要なバッファー)で細胞を一回洗浄する。次にマイクロプレート上の細胞を細胞溶解バッファー(２番目に必要なバッファー)で20分溶解する。この細胞溶解バッファーと基質入りのアッセイバッファー(３番目に必要なバッファー)を一定割合で混合し直ちに発光値を測定する。即ち、少なくとも３つのバッファーと長い測定工程を必要とした。
また、「一分子型生物発光プローブ」を使用する場合においても同様の測定工程を踏まなければならなかった。まず、マイクロプレートに培養した真核細胞に「一分子型生物発光プローブ」の発現ベクターを導入し、16時間再培養する。その細胞にリガンド刺激を20-30分行い、最後に培地を捨てPBSバッファー(１番目に必要なバッファー)で１−２回洗浄する。残った細胞を溶解バッファー(２番目に必要なバッファー)で20分処理する。その後、溶解液に基質入りのアッセイバッファー(３番目に必要なバッファー)と抵当な割合で混合し発光反応を引き起こす。発光値を直ちにルミノメーターで測定する(非特許文献８、非特許文献９)。
前記いずれの従来法においても、複数の反応バッファーを使用しており、煩雑な測定工程と長い時間を要するものであったため、測定工程を省け測定時間を短縮する改良が強く求められてきた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】ＷＯ２００８／０８４８６９
【特許文献２】米国公開第２００９−０２６９７８１号公報
【特許文献３】特開２０１１−０６７１９０号公報
【特許文献４】米国公開２００９−０１２３９５４号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】S．B．Kim，H．Tao，and Y．Umezawa eds.，"Cellular and Biomolecular Recognition"，Edited by R．Jelinek，p．299．((2009) (Wiley-VCH，Darmstadt)).
【非特許文献２】W．Li and N．B．Caberoy，Applied Microbiology and Biotechnology 85 (4)，909 (2010).
【非特許文献３】A．Miyawaki，T．Nagai，and H．Mizuno，Curr．Opin．Chem．Biol．7 (5)，557 (2003).
【非特許文献４】S．W．Michnick，P．H．Ear，C．Landry et al.，Meth．Enzymol．470，335 (2010).
【非特許文献５】S．B．Kim，T．Ozawa，S．Watanabe et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．U．S．A．101 (32)，11542 (2004).
【非特許文献６】S.B．Kim，Y．Otani，Y．Umezawa et al.，Anal．Chem．79 (13)，4820 (2007).
【非特許文献７】S．B．Kim，M．Sato，and H．Tao，Bioconjugate Chem．19 (12)，2480 (2008).
【非特許文献８】S．B．Kim，M．Sato，and H．Tao，Bioconjugate Chem．20 (12)，2324 (2009).
【非特許文献９】S．B．Kim，Y．Takenaka，and M．Torimura，Bioconjugate Chem．22 (9)，1835 (2011).
【非特許文献１０】S．B．Kim  Protein Eng．Des．Sel.，25(6)，261-269 (2012).
【非特許文献１１】S．B．Kim，Y．Umezawa，H．Tao  Anal．Sci．25，1415-1420 (2009)．
【非特許文献１２】S．B．Kim，Y．Umezawa，A．Kanno，H．Tao ACS Chem．Biol．3(6)，359-372 (2008).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、バイオアッセイのための反応条件を最適化する反応溶液とその添加物を提供しようとするものであり、この反応溶液の最適化によって従来の複数の反応溶液(細胞溶解バッファー(Lysis buffer)とアッセイバッファー(assay buffer)など)の使用による煩雑なプロトコールを要せず、素早く簡便に測定できるような測定工程の圧縮、高感度かつ安定的な発光測定を可能にしようとするものである。
すなわち、本発明は、特に従来の生物発光を用いたバイオアッセイを生細胞に適用する際に必須とされた細胞溶解工程を省略し、リガンド刺激から直接発光測定しても高感度のバイオアッセイが可能な生物発光用反応バッファーを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明では、細胞溶解で用いられる細胞溶解液と、発光測定時に用いられていた反応溶液の組合せを検討して、基本バッファーとしてTris-バッファー及びHBSSバッファーを含み、界面活性剤としてNP-40及びTW80を含む生物発光用反応バッファーを用いることで、細胞溶解工程を経ることなく、リガンド刺激から直接発光測定できる生物発光バイオアッセイが可能となった。さらにPEG等の高分子、金属イオン、糖成分、ハロゲンイオンなどを添加することで、さらに高感度のバイオアッセイを可能とした。
本発明においては、まず、従来に使われてきたバイオアッセイ用反応溶液類の組成から各添加剤(重金属イオン、ハロゲンイオン、高分子添加剤、ポリオール、グリコール類等)の寄与度を検討した。また細胞溶解剤(SDS，NP-40,TW80，Triton等)の性能も検討した。この研究によって、バイオアッセイの性能向上に寄与する添加物とその有効濃度例を確認できた。また、従来、細胞溶解ステップ(Step１)とアッセイステップ(Step２)のそれぞれの工程で用いられていた細胞溶解液と発光測定用反応溶液との組合せの検討から、基本バッファーとしてTris-バッファー及びHBSSバッファーを含み、界面活性剤としてNP-40及びTW80を含む生物発光用反応バッファーを用いることで、細胞溶解工程の省略が可能となり、リガンド刺激から直接発光測定できる生物発光バイオアッセイ用反応バッファーを提供することができた。
上記、バイオアッセイ用添加剤の検討結果と併せて、生物発光バイオアッセイ用反応バッファー及びそれを用いた生物発光バイオアッセイ法に係る本発明を完成させた。
【００１０】
本発明の完成に至った経緯を具体的に説明すると、以下の通りである。
従来、バイオアッセイは「細胞溶解バッファー(Lysis Buffer)」、「洗浄バッファー(Wash Buffer)」、「アッセイバッファー(Assay Buffer)」に分けてアッセイを行ってきた。このことに配慮して、最初の実施例では最適な細胞溶解バッファーとアッセイバッファー間の相性を調べた(実施例１)。観察された発光の輝度や安定性を比べた結果、Promega製以外では、C3の細胞溶解バッファーが人工生物発光酵素(ALuc)に適したバッファー条件を提供することが確認できた。C3は、Tris-HClバッファーを基本とし、NP-40、アジ化ナトリウム、MgCl2及びNaClを配合している。また、C3と組み合わせるアッセイバッファーとしては、HBSSやTEバッファー(polyethylene glycol molecular weight 400(PEG400)添加)がよいことが確認できた(図１Ａ、Ｂ)。以下、C3を基本のバッファーとして選択することとし、他のバッファー成分の組み合わせを検討した。その際、HBSSやTE-PEGバッファーの組み合わせが良いことを考慮した。
ところで、本発明においては、全ての発光酵素を対象とするものであるが、バッファー成分の最適な組み合わせを検討するための実施例では、主として、高輝度かつ持続的に観察可能な人工発光酵素(ALuc)を用いた。(なお、当該ALucは、本発明者らが新たに開発した人工発光酵素であり、本出願と同日付で特許出願している。)
まず、人工発光酵素(ALuc)を用いて、C3の細胞溶解バッファーと組み合わせのよい一連のアッセイバッファーを調べてみた(実施例２)。観察された発光の輝度や安定性を比べた結果、C3といい相性を持つアッセイバッファーは、PBSバッファー、HBSSバッファー、TE-PEGバッファーであることが確認できた(図２)。
次いで、最も効果の高かったC3細胞溶解液とHBSSアッセイバッファーとを組み合わせた系により、更なるバッファー添加剤に関する検討を行った(実施例３)。重金属添加による発光効果は、アッセイバッファーにアルミニウムイオン、銅イオン、鉄イオン、Moイオン、亜鉛イオンなどが有効な添加剤であることが確認できた(図３)。
さらに、C3細胞溶解液とHBSSアッセイバッファーとを組み合わせた系を、本発明者が新たに開発した一分子型生物発光プローブ(ALuc)を用いた実際の検出実験(男性ホルモン)に適用し、ポリエチレングリコール(PEG)の添加効果を調べた(実施例４)。その結果、PEGの添加は有効であり、特にPEG400やPEG620において著しい効果が見込まれることが分かったが、その添加割合は1％程度が望ましいことが確認された(図４)。この一分子型生物発光プローブ(ALuc)に適用した同一の系により、アッセイバッファーに対するハロゲンイオンの添加効果を更に調べた(実施例５)ところ、ハロゲンイオンの添加は一定の有効な結果が見込まれることが分かった。ハロゲンイオンの中では、KIがKBrより全般的に効果がよく、特に最終濃度が50mM程度が良かった。KBrの場合は、最終濃度が100mM程度で効果が高い(図５)。同一の系により、アッセイバッファーに対する糖類添加効果を調べた(実施例６)ところ、一部の糖類の添加において一定の有効な結果が確認できた。スクロースやグルコースの添加によって全般的に効果がよかった。糖類ではないがGlycineによってもよい効果が得られた。添加濃度は2mg/mL(最終濃度)が全般的によい結果につながった(図６)。
以上のような細胞溶解バッファー、反応バッファーおよび添加剤に関する基礎研究を積み重ねた結果、細胞溶解(lysis)時間を必要としないone-shot反応溶液の開発の可能性が高まった。
【００１１】
従来の細胞溶解バッファーとアッセイバッファーに分けた煩雑なバイオアッセイにおける煩雑なプロトコールを回避するために、本発明で見出した添加物を反映した形での新規バッファーを組み立てた。
具体的にはC14からC22までの組成および図７と図８で示したように、本発明の上記実施例で見出した細胞溶解とアッセイ用のバッファーを合体する検証を行った。特にC19−C22の結果(図７)から分かるように２つ以上の界面活性剤を混合して使う手法は極めて有効であり、またC23-C26の結果(図８)で分かるようにバッファーの混合比(界面活性剤の混合比ともなる)によってより有効な場合があることが分かった。このような工夫から、発光反応を害することなく生細胞から瞬時に発光測定にまで持っていける、新規発光反応溶液(one-shotバッファーと称する)を完成した。
【００１２】
本発明のバッファーの特徴は、界面活性剤の特徴を十分に生かし、それぞれの短所を補う形で反応溶液の組成を組み立てたことである。
より具体的には、以下に説明する。まず、界面活性剤の「親水度の度合い」は、TW20＞Brij58＞TW80＞TX100＞NP40の順で、「界面活性度」はNP40＞TX100＞Brij58＞TW20＞TW80の順であることを参考に、少量のSDSに加え、界面活性度の両端にあるNP40とTW80を混合することによって、強力な溶解力を持たせながらそれぞれの界面活性剤が持つ弱点を相互補うように工夫した。その結果、発光反応を害することなく細胞を短時間で溶解しながら同時に発光測定も可能なone-shot反応溶液を完成した。
このone-shot反応溶液の効果は、実施例９と１０に具体的に示されている。男性ホルモンに応答する一分子型プローブを発現する真核細胞にステロイドホルモンや化学物質刺激を行い、本発明のone-shotバッファー添加後、間もなく発光測定を行った(実施例９、１０)。その結果、男性ホルモン受容体を含む一分子型プローブの場合、男性ホルモンにもっとも強く反応した(図９)。また女性ホルモン受容体を含む一分子型プローブは女性ホルモン抗がん剤(OHT)に強く反応した(図１０)。これらの結果は、細胞を瞬時に溶解しながら発光測定も可能とする当該one-shotバッファーの利点を克明に示している結果であった。
これらの知見を得たことで、本発明を完成した。
【００１３】
すなわち、本発明は、以下の通りである。
〔１〕  生細胞に対して細胞溶解工程を経ずに、生物発光を用いたバイオアッセイを行うための生物発光用反応バッファーであって、
下記(１)及び(２)を含むことを特徴とする生物発光用反応バッファー；
（１）Tris-バッファー及びHBSSバッファーを含む基本バッファー、
（２）NP-40及びTW80を含む界面活性剤。
〔２〕  前記(２)の界面活性剤として、さらにSDSを含む、前記〔１〕に記載の生物発光用反応バッファー。
〔３〕  さらに、少なくとも下記(３)〜(６)のいずれか１つの添加剤を配合することを特徴とする、前記〔１〕又は〔２〕に記載の生物発光用反応バッファー；
（３）PEG及びPPGから選択された少なくとも１種の高分子化合物、
（４）Mg(II)、Fe(III)，Cu(II)，Mo(VI)及びZn(II)から選択された少なくとも１種の多価イオン、
（５）Br-及びＩ-から選択された少なくとも１種のハロゲンイオン、
（６）スクロース、グルコース、及びグリシンから選択されたポリオール類。
〔４〕  前記(１)の基本バッファー中のTris-バッファー及びHBSSバッファーの配合比が、容量(v/v)％で20〜50：50〜20であって、かつ、
前記(２)の界面活性剤中のNP-40及びTW80の配合比が、容量(v/v)％で1：1〜10であることを特徴とする、前記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の生物発光用反応バッファー。
〔５〕  生物発光を用いたバイオアッセイが、男性ホルモン、女性ホルモン、又はストレスホルモンから選択されたステロイドホルモンに応答する生物発光プローブを用いたバイオアッセイであることを特徴とする、前記〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の生物発光用反応バッファー。
〔６〕  生細胞を、細胞溶解工程を経ることなく、生物発光用反応バッファーに懸濁させ、得られた懸濁液中の生物発光強度を測定する、生物発光を用いたバイオアッセイ法であって、
下記(１)及び(２)を含む生物発光用反応バッファーを用いることを特徴とする、バイオアッセイ法；
（１）Tris-バッファー及びHBSSバッファーを含む基本バッファー、
（２）NP-40及びTW80を含む界面活性剤。
〔７〕  バイオアッセイ法が、男性ホルモン、女性ホルモン、又はストレスホルモンから選択されたステロイドホルモンに応答する生物発光プローブを用いたバイオアッセイ法であることを特徴とする、前記〔６〕に記載のバイオアッセイ法。
【発明の効果】
【００１４】
本発明により、細胞溶解(lysis)時間を必要としない、バイオアッセイ用のone-shot反応溶液であって、安定でかつ感度も優れた、最適化された反応溶液を提供できた。
バイオアッセイ用反応溶液の最適化によって、アッセイ時のバックグラウンド光が押さえられるため、信号強度の増加、輝度の増加が見込まれる。また、実験手順が簡便化・省略できたため、時間と労働力の節約が可能である。その結果、バイオアッセイにおけるS/N比の改善、再現性の向上、コストダウンに繋がる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】細胞溶解バッファーとアッセイバッファーの最適な組み合わせの検討。（Ａ）バッファーの組み合わせによる発光値の比較イメージ。C3バッファーによる細胞溶解とHBSSやTEバッファーによるアッセイが最も有効な組み合わせであることを示す。（Ｂ）バッファーの組み合わせによる発光値の比較グラフ。
【図２】C3の細胞溶解バッファーと一連のアッセイバッファーとの組み合わせの検討。（Ａ）アッセイバッファーによる発光輝度の比較イメージ。（Ｂ）アッセイバッファーによる発光輝度の比較グラフ。C3といい相性を持つアッセイバッファーは、PBSバッファー、HBSSバッファー、TE-PEGバッファーであった。棒グラフの上に示す％数字は、最初の発光強度を100％にした場合、8分後の残留発光強度の割合を示す。
【図３】バッファー添加剤として重金属イオン添加による発光効果の比較。（Ａ）重金属添加による発光輝度のイメージ。（Ｂ）重金属添加による発光輝度のグラフ。アッセイバッファーにアルミイオン、銅イオン、鉄イオン、Moイオン、亜鉛イオンなどが有効な添加剤であった。棒グラフの上に示す％数字は、最初の発光強度を100％にした場合、８分後の残留発光強度の割合を示す。
【図４】一分子型生物発光プローブを用いた発光反応におけるポリエチレングリコール(PEG)添加効果の比較。（Ａ）本実施例で用いた一分子型プローブの分子構造と作動原理。（Ｂ）PEG類を添加したバッファー条件下でホルモン認識能の比較。１％PEGの添加はその他の場合に比べて高いS/N比を示した。Polyethylene glycol mw.400(PEG400)の添加が特に有効であった。バーグラフ上の「−」と「＋」記号はそれぞれ男性ホルモン(DHT)有り無しの条件での測定を意味する。
【図５】一分子型生物発光プローブを用いた発光反応におけるハロゲンイオン添加効果の比較。（Ａ）本実施例で用いた一分子型プローブの分子構造と作動原理。（Ｂ）ハロゲンイオン添加による発光輝度のグラフ。I-イオンの添加によって高いS/N比が得られた。バーグラフ上の「−」と「＋」記号はそれぞれ男性ホルモン(DHT)有り無しの条件での測定を意味する。
【図６】一分子型生物発光プローブを用いた発光反応における多糖類添加効果の比較。（Ａ）本実施例で用いた一分子型プローブの分子構造と作動原理。（Ｂ）多糖類添加による発光輝度のグラフ。グルコース、スクロース、グリシン添加が有効であった。バーグラフ上の「−」と「＋」記号はそれぞれ男性ホルモン(DHT)有り無しの条件での測定を意味する。
【図７】One-shotバッファー性能の確認実験。（Ａ）cSimgr8のプローブの分子構造。ALucは自分たちが樹立した人工生物発光酵素(artificial luciferase)を意味する。GR LBDはストレスホルモン受容体を意味する。（Ｂ）pcSimgr8ベクターを有するCOS-7細胞にストレスホルモン有り無しの条件で20分間刺激したあと、各one-shotバッファー(C14−22)で発光強度を測定した。RLU ratios(+/-)は、刺激なしに比べて刺激有りの発光強度比を表す。バーグラフ上の「−」と「＋」記号はそれぞれ男性ホルモン(DHT)有り無しの条件での測定を意味する。
【図８】One-shotバッファー性能の確認実験。（Ａ）cSimgr8のプローブの分子構造。ALucは自分たちが樹立した人工生物発光酵素(artificial luciferase)を意味する。GR LBDはストレスホルモン受容体を意味する。（Ｂ）pcSimgr8ベクターを有するCOS-7細胞にストレスホルモン有り無しの条件で20分間刺激したあと、各one-shotバッファー(C23−26)で発光強度を測定した。RLU ratios(+/-)は、刺激なしに比べて刺激有りの発光強度比を表す。バーグラフ上の「−」と「＋」記号はそれぞれ男性ホルモン(DHT)有り無しの条件での測定を意味する。
【図９】One-shotバッファー性能の確認実験。（Ａ）Leu-richプローブの分子構造。AR LBDは、男性ホルモン受容体(androgen receptor ligand binding domain)を意味する。FLucはホタルルシフェラーゼ(fireflyluciferase)を意味する。（Ｂ）pLeu-richベクターを有する細胞にDHT，OHT，E2，DDT，PCBで20分間刺激を行い、コントロール(0.1％ DMSO)刺激と比較した。その結果、男性ホルモンに高い発光応答を示した。バーグラフ上の「−」と「＋」記号はそれぞれ男性ホルモン(DHT)有り無しの条件での測定を意味する。
【図１０】One-shotバッファー性能の確認実験。（Ａ）Simer-r2プローブの分子構造。ER LBDは、女性ホルモン受容体(estrogen receptor ligand binding domain)を意味する。CB Redはコメツキムシ由来の発光酵素レッドを意味する。（Ｂ）pSimer-r2ベクターを有する細胞にDHT，OHT，E2，DDT，PCBで20分間刺激を行い、コントロール(0.1％ DMSO)刺激と比較した。その結果、乳がん抗がん剤(OHT)に高い発光応答を示した。バーグラフ上の「−」と「＋」記号はそれぞれ男性ホルモン(DHT)有り無しの条件での測定を意味する。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
１．バイオアッセイ用バッファー
（１−１）ライシスバッファー(細胞溶解液)とアッセイバッファー(反応液)
従来、バイオアッセイはライシスバッファー(細胞溶解液)とアッセイバッファー(反応液)に分けてアッセイを行ってきた。細胞を速やかに溶解するためには、高い溶解力、発光酵素への低い阻害性が必須であると考えられ、一方、バイオアッセイ反応の際には安定したアッセイ条件及びバックグラウンドを下げるために、自己発光を誘発する成分の除去や検討が必須であると考えられていたことによる。
従来、プロメガ(Promega)社でも、ライシスバッファー及びアッセイバッファーをそれぞれ、製品名Luciferase Assay Buffer(カタログ番号：E290A)及び製品名Luciferase Lysis Buffer(カタログ番号：E291A)として販売しており、NEB社でもそれぞれ製品名Luciferase Assay Buffer(カタログ番号：E3300S)及びLuciferase Lysis Buffer(カタログ番号：B3321)として販売している。なお、プロメガ(Promega)社、NEB社の市販品の成分組成は公表されていないが、いずれもアッセイバッファーとライシスバッファーに分けた複雑なプロトコールを提示している。
本発明では、前述のように、上記複雑なプロトコールの解消及び反応の安定性と感度向上の目的で、下記の各バッファー成分の組成の検討を行っている。
（ａ）界面活性剤：polyoxyethylene octylphenyl ether(TritonX-100；TX100)，Nonidet P-40(NP40)，polyoxyethylene sorbitan monolaurate(Tween20；TW20)，polyoxyethylene sorbitan monooleate(TW80)，polyoxyethylene cetyl ether(Brij58)，sodium dodecyl sulfate(SDS)等。
親水度の度合いとしては、TW20＞Brij58＞TW80＞TX100＞NP40、界面活性度の度合いとしてはNP40＞TX100＞Brij58＞TW20＞TW80の順であるとされている。
（ｂ）塩類：NaCl，KCl,(NH4)2SO4など
（ｃ）SH試薬：メルカプトエタノール、DTT等
（ｄ）ポリオール：グリセロール、グルコース、スクロース等
（ｅ）グリコール類：ポリエチレングリコール(PEG)、ポリプロピレングリコール(PPG)
（ｆ）キレート試薬：EGTA、EDTA等
（ｇ）Protease Inhibitor：アプロチニン(分子量6.5kD)、ロイペプチン(分子量：427)、ペプスタチンＡ(pepstatin，分子量：686)、phenylmetylsulfonyl Fluoride(PMSF、分子量：174)、アンチパイン(Antipain，分子量：605)、キモスタチン(chymostatin，分子量：608)、pefabloc SC(AEBSF，240 Da)，DFP(184 Da)，p-APMSF(216 Da)，STI(20,100 Da)，Leupeptin(460 Da)，N-Tosyl-L-phenylalaninechloromethylketone，3,4-dichloroisocoumarin(215 Da)，EDTA-Na2(372 Da)，EGTA(380 Da)，1,10-phenanthroline(198 Da)，phosphoramidon(580 Da)，Dithiobis(2-amino-4-methylpentane)，E-64(357 Da)，cystatin，bestatin，Epibestatin hydrochloride，aprotinin，minocycline，ALLN(384 Da)等
（ｇ）バッファー剤：p-Toluenesulphonic acid，tartaric acid，citric acid，phthalate，glycine，trans-aconitic acid，formic aicd，3,3-dimethylglutaric acid，phenylacetic acid，sodium acetate，succinic acid，sodium cacodylate，sodium hydrogen maleate，maleic acid，sodium phosphate，KH2PO4，imidazole，2,4,6-trimethylpyridine，Triethanolamine hydrochloride，sodium 5,5-diethylbarbiturate，N-ethylmorpholine，sodium pyrophosphate，Tris(hydroxymethyl)aminomethane，bicine，2-amino-2-methylpropane-1,3-diol，diethanolamine，potassium p-phenolsulphonate，boric acid，sodium borate，ammonia，グリシン(glycine)，Na2CO3/NaHCO3，sodium borate，またはこれらの組み合わせ
（ｈ）その他：Sodium molybdate(受容体の安定化)、ジチオトレイトール(dithiothreitol，DTT)(還元剤)
【００１７】
（１−２）本発明の基本となるバッファー成分−１(HBSSバッファー)
本発明では、HBSSバッファー(Hanks' Balanced Salt Solution)を基本組成物として用いる。その調製手法は、公知のプロトコール(例えば、独立行政法人医薬基盤研究所のホームページhttp://cellbank.nibio.go.jp/legacy/sheet/att00011.htm)に従い、以下のように調製した。
まず以下の４種類の溶液をあらかじめ調製し，混合して利用する。
溶液１    1.4％ NaHCO3 溶液 
溶液２    NaCl 80.0g，KCl 4.0g，MgSO4・7H2O 2.0 g，Na2HPO4・2H2O 0.6g，glucose
10.0g，KH2PO4 0.6gを水800mlに溶かした溶液。
溶液３    CaCl2 1.4 gを水100mlに溶解した溶液。
溶液４    Phenol red 0.4gを秤量し，少量の水でペースト状にし，ついで水を加えて150          mlとする。
水酸化ナトリウム溶液(N/20)でpHを7.0に調整し全量を200mlとする。
使用する際には、87.5mlの滅菌水に溶液１を2.5ml、溶液２を8ml、溶液３を1ml、溶液４を1ml、それぞれ加えたものを使用する。Phenol redを使わない場合には、溶液４の混合を省略できる。
【００１８】
（１−３）本発明の基本となるバッファー成分−２(Tris−バッファー)
トリスバッファーそのものは従来から広く使われているバッファー成分(ここでいうトリスはトリスヒドロキシメチルアミノメタンの略称であり、一般的な組成はトリス塩10mMにHClでpHを調整したもので、添加剤としてEDTA 1mMを入れる場合もある)であり、生体適合性が高い理由で、さまざまなバイオ研究で用いられている。しかし、トリスバッファーが生物発光反応に与える影響に関する研究は今まで十分されてなかった。
本発明ではトリスバッファーが生物発光に好適に使えるものであり、細胞溶解(Lysis)用にもアッセイ用にも用いられる基礎バッファー成分であることを見出した。
【００１９】
（１−４）本発明におけるバッファー組成
上記基本的なバッファー成分のHBSSバッファー及びTris−バッファーを組み合わせて用いるが、その際両者を容量(v/v)％で20〜50：50〜20、好ましくは40〜60：60〜40、最も好ましくは、60：40で配合する。
界面活性剤としては、NP-40及びTW80、さらにSDSを組み合わせて用いるが、その際、NP-40：TW80：SDSを容量(v/v)％で1：0.1〜1：0〜0.5、好ましくは、1〜2：0.5〜2：0.1〜1、最も好ましくは、1：1：0.1の比で配合する。
界面活性剤のTW80を他の界面活性剤と組み合わせて含有させるが、その際の濃度が1〜10(v/v)％、好ましくは5〜10(v/v)％範囲で配合する。
ポリオールとしては、ポリエチレングリコール(PEG)及び糖成分(スクロース，グルコース)を組み合わせるが、PEG400が0.01〜10(v/v)％範囲、糖成分(スクロース，グルコース)は0〜20 mg/mL範囲で配合するが、好ましくはそれぞれPEG400が0.1〜10(v/v)％範囲、糖成分(スクロース，グルコース)は2〜10 mg/mL範囲で配合する。
重金属として、(Fe(III)，Cu(II)，Mo(VI)やZn(II))を単独又は組み合わせて含有させるが、その際の濃度が0.01〜1PPM範囲で、好ましくは１PPM配合する。
ハロゲンイオン(Br-やＩ)を単独又は組み合わせて含有させるが、その際の濃度が1〜100mM、好ましくは50〜100mMの範囲で配合する。
その他、発光安定性を向上させるためにビタミンCなどの還元剤を適宜配合すると、さらによい。
【００２０】
本実施例のうち、細胞溶解工程を設けた後の生物発光測定工程において優れた成績を上げたバッファー組成は、基本的には、細胞溶解液としてC3バッファーを用いた場合であった。C3バッファーでは、Tris-HClバッファーを基本とし、界面活性性の優れたNP-40と、生理適合性の高いMgCl2との組合せが好成績の原因と考えられた。特に好成績を挙げた組合せは以下の通りである。
１．C3バッファーで細胞溶解後、C8やC10のアッセイバッファーを用いた場合。
２．C3バッファーで細胞溶解後、C6のアッセイバッファーを用いた場合。
３．C3バッファーで細胞溶解後、HBSSバッファーにAl(III)，Ca(II)，Cu(II)，Fe(III),またはMg(II)を添加したアッセイバッファーを用いた場合。
４．C3バッファーで細胞溶解後、HBSSバッファーに1％のPEGやPPGを添加したアッセイバッファーを用いた場合。
５．C3バッファーで細胞溶解後、HBSSバッファーにKI 50mMやKBr 100mMを添加したアッセイバッファーを用いた場合。
６．C3バッファーで細胞溶解後、HBSSバッファーに2mg/mLのD(+)glucoseやGlycineを添加したアッセイバッファーを用いた場合。
以上の結果から、one-shot反応溶液として好ましいバッファー組成を以下のように絞り込んだ。
すなわち、素早い溶解性が求められ、かつ高輝度での観察性が要求される、生物発光酵素利用技術における「one-shot反応溶液」の場合の基本的な組成としては、C3バッファーで基本としたTris-HClバッファーに、HBSSバッファーを組合せ、界面活性剤のNP-40、又はSDS、塩類のAl(III)，Ca(II)，Cu(II)，Fe(III),またはMg(II)、PEG又はPPG、ハロゲンイオン類(I-、Br-)、D(+)glucose又はGlycineを組み合わせて構築すればよいことがわかった。
そのような発想に基づき、「one-shot反応溶液」として、C3バッファーとHBSSバッファーとの組合せを基本としたC14〜C18バッファーを構築したが、生物発光プローブに適用したところ、好ましい結果が得られず、HBSSバッファーに代えてTW80を組み合わせたC19〜C22バッファーを用いた場合に、SDSを加えず、TW80を1〜10％範囲でC3と組み合わせた、「C19、C21、C22」が高速測定可能なone-shotバッファーとなることが確認できた。この際、TW80を選んだ理由としては、界面活性剤の親水性・界面活性度においてNP-40とバランスを取る位置にあることから追加添加剤として選択した。
また、本発明者らの別の発光酵素を用いた実験では、Tris-HClバッファーに配合する界面活性剤としてNP-40と共に、SDSを配合すると発光強度が高くなるという知見を得ていたので(結果を図示せず)、Tris-HClバッファーとNP-40を基本としたC3バッファーに代えて、両者の組み合わせにさらにSDSが配合されているC4バッファーを用いて以下の実験を行った。すなわち、C4バッファーを基本としてTW80及びHBSSバッファーとの配合比を変えたC23〜C26バッファーをone-shotバッファーとして用いた実験において、「C23、C24、C25」のいずれも、N/S比が高い優れた高速測定結果が得られた。
このように、C4バッファーに、HBSSを基本とするC13バッファーを組合せ、TW80を用い、基質のD-ルシフェリンを加えた、生物発光酵素用のone-shot反応バッファーを構築することができた。
【００２１】
（１−５）本発明の実施例で用いたバッファー溶液
本発明の実施例で用いたバッファー溶液の組成を以下に示す。
【００２２】
【表１】
2014085311.tif 000003
【００２３】
【表２】
2014085311.tif 000004
【００２４】
２．本発明の対象とするバイオアッセイ
本発明はバッファー組成に関するものであり、以下のようなバイオアッセイへの応用が想定できる。レポータージーンアッセイ(reporter-gene assay)、ツーハイブリットアッセイ(two-hybrid assay)、蛋白質相補法(protein complementation assay)、インテインを介した蛋白質スプライシング法(intein-mediated protein splicing assay)、一分子型生物発光プローブ法(single-chain probe-based assay)を行う際に「細胞溶解ステップ」を踏まずに培養細胞から直接測定に持っていく。
例えば、レポータージーンアッセイを行う際、96穴プレート上のレポーター発現ベクターを持つ細胞にリガンド刺激を行う。その後、細胞を発光させるときに当該反応溶液50μLを添加して直ちに測定すればよい。
また、一分子型生物発光プローブを用いる場合、96穴プレート上の一分子型生物発光プローブを発現する細胞にリガンド刺激を行い、刺激後、当該反応溶液50μLを添加して直ちに測定すればよい。
【００２５】
３．本発明のバイオアッセイに用いるための発光酵素
本発明のバイオアッセイに用いるための発光酵素は、全ての発光酵素を対象とするものである。例えば、昆虫由来および海洋動物由来の生物発光酵素であり、典型的には、firefly luicferase、click beetle luciferase、Renilla luciferase、カイアシ類ルシフェラーゼ(Metridia longa luciferase、Metridia pacifica luciferase)などがあげられる。
本発明において、「カイアシ類ルシフェラーゼ」というとき、既知のカイアシ類に由来するルシフェラーゼと共通した酵素活性上及び構造上の特徴を有するルシフェラーゼをいう。具体的には、至適pH約5〜8、至適温度約4〜25℃を有し、「セレンテラジン」を基質として発光反応を触媒する酵素活性を有するルシフェラーゼであって、構造的には２つの酵素活性ドメインを有し、N末端に分泌シグナルを有し、分子量が20ｋD程度(18kD−28kD)で他の発光酵素と比較して最も小さい分子量を有するルシフェラーゼである。
また、本発明において、バッファー成分の最適な組み合わせを検討するための各実施例では、主として、カイアシ類ルシフェラーゼの１種である高輝度かつ持続的に観察可能な人工発光酵素(ALuc)を用いた。(なお、当該ALucは、本発明者らが新たに開発した人工発光酵素であり、本出願と同日付で特許出願している。)
具体的には、当該ALucは、以下の(ア)〜(オ)のいずれかに記載のアミノ酸配列を含み、カイアシルシフェラーゼ活性を有するポリペプチドである。
（ア）配列番号１〜７のいずれかに示されたアミノ酸配列、
（イ）配列番号１〜７のいずれかに示されたアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列、
なお、ここで数個とは、1〜20個、好ましくは1〜10個、より好ましくは1〜5個を表す。
（ウ）配列番号１〜１７のいずれかに示されたアミノ酸配列と90％以上の同一性を有するアミノ酸配列、
ここで、95％以上の同一性を有するアミノ酸配列であればさらに好ましい。
（エ）配列番号８に示されたアミノ酸配列、又は
（オ）配列番号８に示されたアミノ酸配列のうち、1-20位、又は211-215位の少なくともいずれかの領域において、１個以上のアミノ酸が欠損しているアミノ酸配列。
配列番号８に示されたアミノ酸配列のうち、Xaaで表されるアミノ酸について、以下に詳細に説明する。
配列番号８中のXaaで表されるアミノ酸のうち、3，22，26，27，30，33，35，37-39，62，63，67，71-75，87，127，138，140-142，155，185，197位のアミノ酸はどのようなアミノ酸であってもよく、そのうちの71−75位、140-142位のアミノ酸はその一部又は全部欠失していてもよい。親水性アミノ酸のうちで好ましい場合は、3位、22位、27位、33位、127位、140位、141位、155位はEであり、26位、30位、62位、67位、185位はDであり、35位、87位はKであり、37位はSであり、38位、39位、138位、142位、197位はTであり、63位はNであり、71位はRであり、そして73位はD又はHである。疎水性アミノ酸のうちで好ましい場合は、3位、37位、67位、72位、74位、75位、138位、197位はGであり、22位、27位、141位はIであり、30位はVであり、33位、39位、62位、63位、127位、140位、155位、185位はAであり、87位はLであり、そして26位、38位はFである。
また、同4，6，7，10，11，13，15，16，20，31，34，36，61，66，81，168位のアミノ酸は疎水性アミノ酸であって、好ましくは、4位がI又はVであり、6位がV又はLであり、7位がI又はLであり、10位がV又はLであり、11位がI又はLであり、13位がV又はFであり、15位がV又はLであり16位がV又はAであり、20位がA又はPであり、31位がL又はGであり、34位はI又はGであり36位はF又はGであり、61位はV又はLであり、66位はA又はGであり、81位はL又はMであり、そして168位はV又はAである。
同5，24，25，60，64，65，70，95，108，153，200，208位のアミノ酸は親水性アミノ酸であって、好ましくは、5位がQ又はKであり、24位がK又はEであり、25位がD又はNであり、60位がD又はNであり、64位がN又はSであり、65位がD又はRであり、70位がK又はRであり、95位がK又はRであり、108位がK又はHであり、153位がE又はDであり200位がD又はSであり、そして208位がK，H又はTである。
【００２６】
３．本発明において用いる測定方法、測定装置
リガンド活性の測定は、通常の生物発光アッセイに準じて実施すればよく、特に制限なく従来のプロトコールが適用できる。
生物発光強度を測定するためには、ルミノメーター(例、MiniLumat LB 9506 (Berthold)；GloMax 20/20n(Promega))が一般的に利用されてきた。プレート上で培養された細胞にライセートバッファーをかけることによって細胞溶解液を作り、基質と混合した後の発光値を即時に測定する。
96穴プレート上に培養された細胞を対象にリガンド活性を計測する場合には、既製の生物発光プレートリーダー(例、Mithras LB 940(Berthold)；SH-9000(Corona))を用いることができる。リガンド共存下で、発現されたプローブによる生物発光は、前記プレートリーダーに付いている自動基質溶液インジェクターを用いることによって瞬時に基質導入・発光測定ができる。
【００２７】
４．スクリーニング方法の対象被検物質
これらのスクリーニング方法の対象となる被検物質には、例えば、有機または無機の化合物(特に低分子量の化合物)、生物活性を持つ蛋白質、ペプチド等が含まれる。これらの物質は、機能や構造が既知のものであっても未知のものであってもよい。また、「コンビナトリアルケミカルライブラリー」は、目的物質を効率的に特定するための被検物質群として有効な手段である。コンビナトリアルケミカルライブラリーの調製およびスクリーニングは、当該技術分野において周知である(例えば、米国特許第6,004,617号；5,985,365号を参照)。さらには、市販のライブラリー(例えば、米国ComGenex社製、ロシアAsinex社製、米国Tripos，Inc.社製、ロシアChemStar，Ltd社製、米国3D Pharmaceuticals社製、Martek Biosciences社製などのライブラリー)を使用することもできる。また、コンビナトリアルケミカルライブラリーを、本プローブを発現する細胞の集団に適用することによって、いわゆる「ハイスループットスクリーニング」を実施することもできる。
【００２８】
５．本発明で用いる用語、概念について
本発明におけるその他の用語や概念は、発明の実施形態の説明や実施例において詳しく規定する。なお、用語は基本的にはIUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclatureによるものであり、あるいは当該分野において慣用的に使用される用語の意味に基づくものである。また発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。例えば、遺伝子工学および分子生物学的技術はJ．Sambrook，E．F．Fritsch & T．Maniatis，"Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd edition)"，Cold Spring Harbor
Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York(1989)；D．M．Glover et al．ed.，"DNA Cloning"，2nd ed.，Vol.1 to 4，(The Practical Approach Series)，IRL Press，Oxford University Press(1995)；Ausubel，F．M．et al.，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，New York，N.Y，1995；日本生化学会編、「続生化学実験講座１、遺伝子研究法II」、東京化学同人(1986);日本生化学会編、「新生化学実験講座２、核酸III(組換えDNA技術)」、東京化学同人(1992)；R．Wu ed.，"Methods in Enzymology"，Vol.68(Recombinant DNA)，Academic Press，New York(1980)；R．Wu et al．ed.，"Methods in Enzymology"，Vol.100(Recombinant DNA，Part B) & 101(Recombinant DNA，Part C)，Academic Press，New York(1983)；R．Wu et al．ed.，"Methods in Enzymology"，Vol.153(Recombinant DNA，Part D)，154(Recombinant DNA，Part E) & 155(Recombinant DNA，Part F)，Academic Press，New York(1987)などに記載の方法あるいはそこで引用された文献記載の方法またはそれらと実質的に同様な方法や改変法により行うことができる。また、本発明で使用する各種蛋白質やペプチド、あるいはそれらをコードするDNAについては、既存のデータベース(URL：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/等)から入手することができる。
【実施例】
【００２９】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。
本発明におけるその他の用語や概念は、当該分野において慣用的に使用される用語の意味に基づくものであり、本発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。また、各種の分析などは、使用した分析機器又は試薬、キットの取り扱い説明書、カタログなどに記載の方法を準用して行った。
なお、本明細書中に引用した技術文献、特許公報及び特許出願明細書中の記載内容は、本発明の記載内容として参照されるものとする。
【００３０】
本実施例で使われた組成物質の化学構造の例：
【化１】
2014085311.tif 000005
Propylene glycol(mw 76)
【化２】
2014085311.tif 000006
Glycine(mw 75)
【化３】
2014085311.tif 000007
D(+)-galactose mw 180.2)，Wako 075-0035
【化４】
2014085311.tif 000008
D(+)-glucose(mw 180)
【化５】
2014085311.tif 000009
Sucrose，small granules(mw 342.3)，Wako 193.09545
【００３１】
（実施例１）ライシスバッファーとアッセイバッファーの組み合わせの検討
本実施例では、従来のバイオアッセイに使われる、ライシスバッファーとアッセイバッファーの組み合わせによる発光輝度の比較を行った(図１)。まず、COS-7細胞を96穴プレートに培養し、人工生物発光酵素(Aluc)を発現するベクターを導入し、さらに8時間培養した。その後、培地を捨てたのち、細胞をPBSバッファーで１回洗った。図１で示しているように、一連の細胞溶解バッファー( Promega社製品Luciferase Lysis Buffer(cat．E291A)、NEB製Lysis buffer(cat．B3321)、C1〜C4)のそれぞれを50μLで20分間細胞溶解を行った。プレート上各ウェルに、基質入りの3種類のアッセイバッファー(C8：HBSSバッファー、C10：TrisバッファーにEDTAとPEG400を添加した溶液(即ち、TE PEG400) 、C5：H2O)50μLを同時に垂らし、それからの発光強度をイメージ測定器(LAS-4000，FujiFilm)で測定した。
この結果から、プロメガ製Luciferase Lysis Buffer(cat．E291A)やC3の細胞溶解液による系では発光輝度が極めて高かった。また、アッセイバッファーにおいてHBSSやTE PEGバッファーが有効であることが確認できた。特にプロメガ製細胞溶解液(cat．E291A)に対してHBSSやTE PEGバッファーをアッセイバッファーとして採用した場合、高い発光安定性(89％〜92％)が見られた(図１Ｂ)。この％の値はアッセイバッファーを導入した最初に比べて5分後の発光値を示す。また、C3の溶解バッファーに加えて、HBSSバッファーをアッセイバッファーとして採用した場合、高い輝度と発光安定性(71％)が得られた。
【００３２】
（実施例２）C3と組み合わせ可能な最適アッセイバッファーの探索
実施例１の結果からC3が有効な細胞溶解バッファーであったことから、C3と組み合わせできる最適アッセイバッファーを更に探索した(図２)。まず、COS-7細胞を96穴プレートに培養し人工生物発光酵素(ALuc)発現用プラスミドを導入した。16時間CO２インキュベーターで培養した後、各ウェルに50μLのC3溶液で細胞溶解を20分間実施した。このライセットに対して、図２で示したように基質入りのアッセイバッファー50μLを同時に入れ、直ちにLAS-4000(FujiFilm)で相対的な発光輝度を測定した。更に基質入りのアッセイバッファー導入後、8分、16分経過後の発光値を測定し発光安定性を検証した。
その結果、図２Ａで分かるように、C3と相性のよいアッセイバッファーとしてPBS、HBSS、Tris-PEGバッファーがよいことが分かった。発光安定性においても図２Ｂで示すように PBS、HBSS、Tris−MgCl2などが比較的によいことが分かった。一方、PBSバッファーにBSAを添加した場合、発光輝度と安定性が悪くなることからbovine serum albumin(BSA)添加はアッセイバッファーに添加してはならない添加物であることが分かった。
【００３３】
（実施例３）アッセイバッファーの添加剤としての重金属イオンの効果の検証
前記実施例１及び２の結果からC3が有効な細胞溶解バッファーであり、PBSやHBSSが有力なアッセイバッファーであることが分かった。
本実施例ではアッセイバッファーの添加剤として重金属イオンの効果を検証した(図３)。まず、COS-7細胞を96穴プレートに培養し人工生物発光酵素(ALuc)発現用プラスミドを導入した。16時間CO２インキュベーターで培養した後、各ウェルに50μLのC3溶液で細胞溶解を20分間実施した。このライセットに対して、図３で示した各重金属イオン1 PPMと基質入りのHBSSバッファー50μLを同時に入れ、直ちにLAS-4000で相対的な発光輝度を測定した。更に
基質入りのアッセイバッファー導入後、8分、16分経過後の発光値を測定し発光安定性を検証した。
その結果、図３Ａで分かるように、C3と HBSSに加えるに適した重金属添加剤は、Al(III)、Ca(II)、Cu(II)、Fe(III)、Mg(II)などが適していることが分かった。また発光輝度と安定性を総合的に判断した場合、 Al(III)、Cu(II)、Fe(III)、Mo(VI)、Zn(II)などがよい添加剤であることが分かった。また、Cd(II)、Co(II)、Ni(II)などは発光輝度を著しく損なうことから、添加してはならない重金属であることが分かった。
【００３４】
（実施例４）バイオアッセイ用反応溶液におけるグリコール類の添加効果
本実施例では、実際に発光プローブを用い、バイオアッセイ用反応溶液におけるグリコール類の添加効果を調べた(図４)。
まず、本発明者らが開発した一分子型生物発光プローブの製造法(非特許文献１０)に従って、新たな一分子型生物発光プローブを開発した。発光酵素においては多数のフランクトン由来の発光ルシフェラーゼを束ね、更にその中から熱力学的に安定性の高い配列を抽出する手法で、本発明者が新たに開発した人工生物発光酵素(ALuc)(本出願と同日付で出願)を二分割し、その間に男性ホルモン受容体(AR LBD)を挿入した(図４Ａ)。このプローブは男性ホルモン共存下で分子構造が変わるように設計されており、結果的に2分割した酵素断片が再結合される。
この実験のためにまず、COS-7細胞を96穴プレートに培養し、前記一分子型生物発光プローブをコードするプラスミドを導入した。16時間CO２インキュベーターで培養した後、各ウェルに50μLのC3溶液で細胞溶解を20分間実施した。このライセットに対して、図４Ｂで示した分量のPPGやPEGと基質を入れたHBSSバッファー50μLを調製してマルチチャンネルピペットで同時に入れ、直ちに従来のルミノメーター(GloMax 20/20n；Promega)を用いて発光値を測定した。
その結果、PPGやPEGの添加は有効な結果が見込まれることが分かった。更に添加量としては、アッセイバッファーの1％程度が適当であることが確認できた。
【００３５】
（実施例５）バイオアッセイ用反応溶液におけるハロゲンイオン添加効果
本実施例では、バイオアッセイ用反応溶液におけるハロゲンイオン添加効果を調べた(図５)。前記実施例４で作製した一分子型生物発光プローブを用い、当該発光プローブが男性ホルモン認識をする際に用いる反応溶液中へのハロゲンイオン(Br-やI-)添加による効果を検討した。
まず、前記一分子型生物発光プローブをコードするプラスミドを、TransIT-LT1を用いて96穴プレートに培養したCOS-7細胞に導入した。16時間CO２インキュベーターで培養した後、各ウェルに50μLのC3溶液で細胞溶解を20分間実施した。このライセットに対して、図５Ｂで示した分量のKBrやKIと基質を入れたHBSSバッファー50μLを調製してマルチチャンネルピペットで同時に入れ、直ちに従来のルミノメーター(GloMax 20/20n；Promega)を用いて発光値を測定した。
その結果、ハロゲンイオンの添加が有効な添加剤であることが分かった。具体的にはKIであれば何れも良くて特に50mM程度入れた方が良かった。KBrであれば100mM程度を入れた方がよいことが分かった。
【００３６】
（実施例６）バイオアッセイ用反応溶液における多糖類添加効果
本実施例では、バイオアッセイ用反応溶液における多糖類添加効果を調べた(図６)。前記実施例４で作製した一分子型生物発光プローブを用い、当該発光プローブが男性ホルモン認識をする際に用いる反応溶液中への多糖類添加効果を検討した。
まず、前記一分子型生物発光プローブをコードするプラスミドを、TransIT-LT1を用いて96穴プレートに培養したCOS-7細胞に導入した。16時間CO２インキュベーターで培養した後、各ウェルに50μLのC3溶液で細胞溶解を20分間実施した。このライセットに対して、図で示した分量の多糖類と基質を入れたHBSSバッファー50μLを調製してマルチチャンネルピペットで同時に入れ、直ちに従来のルミノメーター(GloMax 20/20n；Promega)を用いて発光値を測定した。
その結果、スクロースやグルコースの添加が特に有効であることが分かった。また、多糖類ではなくても、グリシンの添加が有効であることが分かった。入れる量は2mg/mLが適正であることが分かった。
【００３７】
（実施例７）一分子型生物発光プローブ(cSimgr8)によるストレスホルモンアッセイ試験−１
本発明のOne-shot bufferの好適性能を立証するために、ストレスホルモン受容体(the ligand binding domain of glucocorticoid receptor；GR LBD)を骨格とする一分子型生物発光プローブ(cSimgr8)に、本発明のC14〜C22の反応バッファーを適用したバイオアッセイを行った(図７)。なお、cSimgr8は、実施例４で示したように独自に開発した人工生物発光酵素(ALuc)を好適に２分割して円順列置換した後、その外側にストレスホルモン受容体(the ligand binding domain of glucocorticoid receptor；GR LBD)とその特異的な結合配列を繋げた形態の新規一分子型生物発光プローブである。
まず、COS-7細胞を96穴プレートに培養し、cSimgr8を導入した。更に16時間培養後、プレート上のCOS-7細胞を２つに分け、一方の細胞に10-5Mのストレスホルモン(cortisol)で20分間刺激し、もう一方の細胞にはコントロール(0.1％DMSO)で20分刺激した。その後、プレート上の培地を廃棄し細胞だけを残した。One-shotバッファーとして、C14〜C22の組成を持つバッファーを準備した。発光測定機器は、Promega製の高感度ルミノメーター(GloMax 20/20ｎ；Promega)を用いた。
アッセイの手順としては、まず培地除去した前記プレートの各ウェルに、前記C14〜C22いずれの溶液50μLを入れ数回ピペッティングした後、全量を1.6mLのエッペンチューブに移して、そのまま前記ルミノメーターで３秒間光量測定を行った。各バッファー別の結果を図７で示す。
【００３８】
（実施例８）一分子型生物発光プローブ(cSimgr8)によるストレスホルモンアッセイ試験−２
(実施例７)と同じ一分子型生物発光プローブ(cSimgr8)によるストレスホルモンアッセイ試験を、本発明のC23〜C26の反応バッファーを適用して行った(図８)。
(実施例７)と同様に、COS-7細胞を96穴プレートに培養し、cSimgr8を導入した。更に16時間培養後、プレート上のCOS-7細胞を２つに分け、一方の細胞に10-5Mのストレスホルモン(cortisol)で20分間刺激し、もう一方の細胞にはコントロール(0.1％DMSO)で20分刺激した。その後、プレート上の培地を廃棄し細胞だけを残した。One-shotバッファーとして、C14〜C22の組成を持つバッファーを準備した。発光測定機器は、Promega製の高感度ルミノメーター(GloMax 20/20ｎ；Promega)を用いた。
アッセイの手順としては、まず培地除去した前記プレートの各ウェルに、前記C23〜C26いずれの溶液50μLを入れ数回ピペッティングした後、全量を1.6mLのエッペンチューブに移して、そのまま前記ルミノメーターで3秒間光量測定を行った。各バッファー別の結果を図８で示す。
【００３９】
（実施例９） 一分子型生物発光プローブ(pLeu-rich)による男性ホルモンアッセイ試験
本発明のOne-shot bufferの好適性能を立証するために、男性ホルモン受容体(the ligand binding domain of androgen receptor；AR LBD)を骨格とする一分子型生物発光プローブ(pLeu-rich)に本バッファーを適用した。なお、pLeu-richは本発明者らがホタル由来発光ルシフェラーゼを用いて以前開発した一分子型生物発光プローブ(非特許文献１１)である。
まず、COS-7細胞を96穴プレートに培養し、pLeu-richを導入した。更に16時間培養後、プレート上のCOS-7細胞を２つに分け、一部の細胞に10-5Mの5α-dihydrotestosterone(DHT)，4-hydroxytamoxifen(OHT)，17β-estradiol(E2)，dichlorodiphenyltrichloroethane(DDT)，Polychlorinated biphenyls(PCB)で20分間刺激した。その後、培地を廃棄することによって細胞側のアッセイ準備を終えた。一方、反応バッファーにおいては、C29溶液にD-luciferinを混合した溶液を用いた。発光測定機器は、Promega製の高感度ルミノメーター(GloMax 20/20ｎ；Promega)を用いた。
アッセイの手順は、まず培地除去した前記プレートに、前記C16溶液50μLを入れ数回ピペッティングした後、全量を1.6mLのエッペンチューブに移して前記ルミノメーターで光量測定を行った。
その結果、図９で示している結果を得た。まず、DHTやE2に対して一定の検出能(バックグラウンドより約3-5倍)を示していることが分かった。しかも細胞溶解から測定に至るまでの時間が瞬時(数秒以内)にできることが分かった。この結果は、従来30分以上かかり、煩雑だった手順を非常に単純化しており、このような点から当該反応バッファーの優位性を示している結果である。
【００４０】
（実施例１０）一分子型生物発光プローブ(pSimer-r2)による女性ホルモンアッセイ試験
前記反応バッファー(One-shot buffer)の性能を立証するために、女性ホルモン受容体(the ligand binding domain of estrogen receptor；ER LBD)を骨格とする一分子型生物発光プローブ(pSimer-r2)に本バッファーを適用した。なお、pSimer-r2は本発明者らがコメツキムシ由来発光ルシフェラーゼ(click beetle luciferase；CBLuc)を用いて以前開発した一分子型生物発光プローブ(非特許文献１２)である。
まず、COS-7細胞を96穴プレートに培養し、pSimer-r2を導入した。更に16時間培養後、プレート上のCOS-7細胞を２つに分け、一部の細胞に10-5Mの5α-dihydrotestosterone(DHT)，4-hydroxytamoxifen(OHT)，17β-estradiol(E2)，dichlorodiphenyltrichloroethane(DDT)，Polychlorinated biphenyls(PCB)で20分間刺激した。残りの細胞は対照群(コントロール)として用いた。その後、培地を廃棄することによって細胞側のアッセイ準備を終えた。一方、One-shot反応バッファーにおいては、C16を用いた。発光測定機器は、Promega製の高感度ルミノメーター(GloMax 20/20；Promega)を用いた。
アッセイの手順は、まず培地除去した前記プレートに、前記C16溶液50μLを入れ数回ピペッティングした後、全量を1.6mLのエッペンチューブに移して前記ルミノメーターで光量測定を行った。
その結果、図１０で示している結果を得た。まず、4-hydroxytamoxifen(OHT)に対して一定の検出能(バックグラウンドより約5倍)を示していることが分かった。しかも細胞溶解から測定に至るまでの時間が瞬時(数秒以内)にできることが分かった。この結果は、従来30分以上かかり、煩雑だった手順を非常に単純化しており、このような点から当該反応バッファーの優位性を示している結果である。
【図１】
2014085311.tif 000010
【図２】
2014085311.tif 000011
【図３】
2014085311.tif 000012
【図４】
2014085311.tif 000013
【図５】
2014085311.tif 000014
【図６】
2014085311.tif 000015
【図７】
2014085311.tif 000016
【図８】
2014085311.tif 000017
【図９】
2014085311.tif 000018
【図１０】
2014085311.tif 000019
【配列表】
2014085311000001.app