(57)【要約】      （修正有）【課題】活性剤を細胞、特に哺乳類細胞にインビボ、インビトロ、またはエキソビボ送達するための改良された非ウイルス担体システムの提供。【解決手段】イオン相互作用によって脂質集合体との複合体を形成するトランスフェクションエンハンサー要素（ＴＥＥ）を含む脂質集合体。ＴＥＥは次式［疎水性部分−ｐＨ感受性親水性部分］で示され、ｐＨ感受性親水性部分は、ｐｋａ２〜６の弱酸、又は酸性基と弱塩基との組合せを含むｐＫａ３〜８の双性イオン構造である脂質（脂質−ＴＥＥ）。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（Ｉ）：
脂質部分−［疎水性部分−ｐＨ感受性親水性部分］    （Ｉ）
に従う、脂質部分および１種または複数のトランスフェクションエンハンサー要素を含む脂質（脂質−ＴＥＥ）であって、
前記１種または複数のトランスフェクションエンハンサー要素（ＴＥＥ）は一般式（ＩＩ）：
疎水性部分−ｐＨ感受性親水性部分    （ＩＩ）
を有し、
式中、各ＴＥＥのｐＨ感受性親水性部分は独立に、ｐｋａ２〜６の弱酸、または酸性基と弱塩基との組合せを含むｐＫａ３〜８の双性イオン構造であり、ただし前記脂質が、次の構造（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、または（Ｖ）のうちの１つではないことを条件とする脂質。
ＰＥ−アミド結合−Ｘ−ＣＯＯＨ    （ＩＩＩ）
（式中、ＰＥは、ホスファチジルエタノールアミン部分であり、Ｘは、３〜２０個の原子の鎖長を有し、場合によっては１個または複数のヘテロ原子を含む置換または非置換の飽和または不飽和炭素含有直鎖である）；
【化１】
2014208687.tif 000104
（式中、Ｙは、２〜１０個のＣ原子の鎖長を有する飽和直鎖アルキル基であり、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、およびＲｄは独立に、０〜６個の不飽和部位を有する直鎖状または分枝状の非置換または置換Ｃ１〜２３アルキル基、アシル基、アルキレン基、ヘテロアルキル基、環状基、またはアリール基であり、前記基は０〜５個のヘテロ原子を含み、置換基は−Ｏ−（ＣＨ２）ｅ−ＣＨ３；−Ｓ−（ＣＨ２）ｅ−ＣＨ３；Ａ−（ＣＨ２）ｅ（式中、Ａはハロゲン化物である）、および−Ｎ（（ＣＨ２）ｅ−ＣＨ３）２であり、置換基のアルキル基は、０〜２個のヘテロ原子を含み、ｅは０〜４であり、さらにＲａおよびＲｂは独立に、Ｈとすることができ、ｄは１〜６である）；または
【化２】
2014208687.tif 000105
（式中、ＲｅおよびＲｆは独立に、水素原子、または二重および三重結合を場合によっては含むＣ１〜Ｃ２４直鎖状もしくは分枝状アルキル鎖もしくはアシル鎖であり、Ｚは、アリール環、３〜６個の炭素原子を有するシクロアルキル、ヒドロキシル、および／または１個もしくは複数のさらなるカルボン酸基で場合によっては置換されていてもよい、６〜２０個の炭素原子を有する脂肪族および／または脂環式炭化水素鎖である）。
【請求項２】
前記ＴＥＥが、疎水性部分および１種または複数のｐＨ感受性親水性部分を特徴とする、請求項１に記載の脂質。
【請求項３】
前記ＴＥＥが、次の一般式のうちの１つを有する、請求項１または請求項２に記載の脂質。
【化３】
2014208687.tif 000106
（式中、Ｒｅｐｉ基はそれぞれ独立に、１〜８個のＣ原子を有する非分枝状、分枝状、または環状の置換または非置換アルキル基、アルケニル基、アルキレン基、アルキニル基、またはアリール基であり、
前記置換基は、１種または複数のｐＨ感受性親水性部分、低級アルキル、アルキレン、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルコキシアルキル、アルキルチオ、およびアルキルチオアルキルから選択され、
Ｌｊ、Ｌｋ、またはＬｌは独立に、存在しないか、あるいは
−ＣＨ２−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）−、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＣＨ＝Ｎ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｎ＝ＣＨ−  −Ｓ−Ｓ−、−ＮＨ−、−Ｎ（Ｒ１３）（Ｒ１４）−（ただし、Ｒ１３およびＲ１４は独立に、Ｈもしくは低級アルキルであり、またはＲ１３もしくはＲ１４の一方は、存在しなくてもよい）、
【化４】
2014208687.tif 000107
アミノ酸、α−ヒドロキシ酸、またはβ−ヒドロキシ酸から選択され、
前記ＴＥＥ中のＣ原子の総数は、６〜４０個であり、ｐは≦４０である）；または
−ステロール    （ＶＩＩ）
（式中、前記ステロールは、１種または複数の親水性部分、−ＯＨ、−ＳＨ、または低級アルキル、アルキレン、アルケニル、もしくはアルキニル、アルコキシ、アルキルアルコキシ、アルキルチオ、もしくはアルキルアルキルチオで置換されていてもよい）。
【請求項４】
一般式ＶＩにおける前記アミノ酸が、プロリン、グリシン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、チロシン、トリプトファン、フェニルアラニン、およびメチオニン、またはそれらのペプチドから選択され、一般式ＶＩにおける前記α−およびβ−ヒドロキシ酸が、グリコール酸、乳酸、およびヒドロキシ酪酸から選択される、請求項３に記載の脂質。
【請求項５】
前記ｐＨ感受性親水性部分が弱酸であり、前記弱酸が、次の構造のうちの１つから選択されるカルボン酸、バルビツル酸もしくは誘導体、キサンチンもしくは誘導体、またはウラシルもしくは誘導体である、請求項１〜請求項４のいずれか一項に記載の脂質。
【化５】
2014208687.tif 000108
（式中、点線は、任意選択である二重結合を表し、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は独立に、ＴＥＥの疎水性部分、水素、０〜５個の不飽和部位を有する直鎖状、分枝状、もしくは環状の非置換もしくは置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、アルキレン、またはヘテロアルキル、あるいはアリール基であり、前記基は、−Ｏ−または−Ｓ−から選択される０〜５個のヘテロ原子を含み、前記ヘテロ原子は、前記基中の第１の原子ではなく、前記置換基は、ヒドロキシ基、メルカプト基、オキソ基、ホルミル基、ニトロ基、シアノ基、ハロ基、またはトリハロメチル基から選択され、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は、代替としてかつ独立にアルコキシ基、アルコキシアルキル基、アルキルチオ基、アルキルチオアルキル基、ヒドロキシ基、メルカプト基、オキソ基、ホルミル基、ニトロ基、シアノ基、ハロ基、またはトリハロメチル基とすることができ、Ｄは、Ｃ、または０〜３個の不飽和部位を有し、かつ−Ｏ−、−Ｓ−から選択される０〜５個のヘテロ原子を含む非置換もしくは置換環状アルキル基もしくアリール基であり、前記置換基は、アルキル基、アルキレン基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基、アルコキシアルキル基、アルキルチオ基、アルキルチオアルキル基、ヒドロキシ基、メルカプト基、オキソ基、ホルミル基、シアノ基、ハロ基、またはトリハロメチル基から選択され、
Ｙ１、Ｙ２、およびＹ３は独立に、ＯまたはＳであり、
Ｇは、ＣまたはＮとすることができ、ＧがＮであるとき、Ｒ１またはＲ２の一方は、存在しなくてもよく、Ｒ１およびＲ２はＲ４と定義される）；
あるいは
【化６】
2014208687.tif 000109
（式中、点線は、任意選択である二重結合を表し、
Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、またはＲ９は、独立にＴＥＥの疎水性部分、水素、０〜５個の不飽和部位を有する直鎖状、分枝状、もしくは環状の非置換もしくは置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、アルキレン、またはヘテロアルキル、あるいはアリール基とすることができ、前記基は、−Ｏ−または−Ｓ−から選択される０〜５個のヘテロ原子を含み、前記ヘテロ原子は、前記基中の第１の原子ではなく、前記置換基は、ヒドロキシ基、メルカプト基、オキソ基、ホルミル基、ニトロ基、シアノ基、ハロ基、またはトリハロメチル基から選択され、
Ｒ８はＯまたはＳＨであり、
Ｍ３はＮまたはＣであり、
Ｍ２はＣまたは−Ｏ−であり、Ｍ２が−Ｏ−である場合、Ｒ６は存在せず、
Ｍ１はＮまたはＣまたは−Ｏ−であり、Ｍ１が−Ｏ−である場合、Ｒ５は存在せず、
Ｍ１、Ｍ２、またはＭ３がＣであるとき、Ｒ５、Ｒ６、またはＲ７は、さらにアルコキシ基、アルコキシアルキル基、アルキルチオ基、アルキルチオアルキル基、ヒドロキシ基、メルカプト基、オキソ基、ホルミル基、ニトロ基、シアノ基、ハロ基、またはトリハロメチル基とすることができ、Ｒ５、Ｒ６、またはＲ７と定義されたさらなる置換基Ｒ５’、Ｒ６’、またはＲ７’は、Ｃ原子に結合していてもよい）；
あるいは
【化７】
2014208687.tif 000110
（式中、
Ｒ１０は、ＴＥＥの疎水性部分とすることができ、Ｒ１１およびＲ１２は独立に、水素、ヒドロキシ基、メルカプト基、ホルミル基、ニトロ基、シアノ基、またはハロ基、またはトリハロメチル基とすることができるが、Ｒ１１およびＲ１２の少なくとも一方はＨ以外であり、
Ｙ１＊およびＹ２＊は独立に、ＯまたはＳである）。
【請求項６】
前記双性イオン構造の前記弱塩基が、イミダゾール、モルホリン、ピリジン、ピペラジン、または非環状アミンの群から選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の脂質。
【請求項７】
前記ＴＥＥの前記１種または複数のｐＨ感受性親水性部分がカルボン酸基である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の脂質。
【請求項８】
前記疎水性部分がアルキル直鎖である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の脂質。
【請求項９】
前記脂質−ＴＥＥが次の一般式：
脂質部分−［（Ｌ２）−（ＴＥＥ）］ｒ
（式中、Ｌ２は、存在しないか、または−ＣＨ２−、−Ｏ−；−Ｓ−；−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）−；−Ｃ（Ｏ）Ｏ−；−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）−；−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）−；−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｏ−；−ＮＨ−；−Ｎ（Ｒ１３）（Ｒ１４）−（ただし、Ｒ１３およびＲ１４は独立に、Ｈもしくは低級アルキルであり、またはＲ１３もしくはＲ１４の一方は、存在しなくてもよい）；−ＣＨ＝Ｎ−；−ＯＣ（Ｏ）−；−Ｎ＝ＣＨ−；および−Ｓ−Ｓ−から選択される連結基であり；ｒは１〜５の整数である）
を有する、請求項１から８のいずれか一項に記載の脂質。
【請求項１０】
前記脂質部分が、−ＯＨ基で置換されていてもよいリン脂質およびそのリゾ型、スフィンゴ脂質およびそのリゾ型、コレステロールのようなステロールおよびその誘導体、ジアシルグリセロール／ジアルキルグリセロール、モノアシルグリセロール／モノアルキルグリセロール、グリセリン酸のモノエステル、ジエステル、モノエーテル、もしくはジエーテル、スフィンゴシン／フィトスフィンゴシン／スフィンガニンおよびそれらのＮ置換誘導体、セラミド、１，２−ジアシル−３−アミノプロパン／１，２−ジアルキル−３−アミノプロパン、１−もしくは２−モノアシル−３  アミノプロパン／１−もしくは２−モノアルキル−３−アミノプロパン、ジアルキルアミン、モノアルキルアミン、脂肪酸、ジカルボン酸アルキルエステル、トリカルボン酸ジアルキルエステル、または酒石酸と長鎖アルコールとのエステル、もしくは酒石酸と長鎖カルボン酸とのエステルを含む群から選択される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の脂質。
【請求項１１】
一般式（ＸＩＩＩ）〜（ＸＩＸ）のうちの１つを有する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の脂質。
【化８】
2014208687.tif 000111
（式中、ＲｘおよびＲｙは独立に、０、１、または２個のエチレン性不飽和結合を含むＣ８〜Ｃ３０アルキル鎖またはアシル鎖であり、あるいはＲｘまたはＲｙの一方は、Ｈとすることができ、Ｒｚは、Ｈ、＝Ｏ、−ＮＨ２、−ＯＨであり、
Ｘａは、−ＯＰＯ３−；−ＯＰＯ２−ＣＨ２−；−ピロホスフェート−；−ＯＳＯ３−；−ＯＳＯ２−；−Ｏ−；−ＮＨ−；−Ｓ−；−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）−；−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）−；−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｏ−；−ＯＣ（Ｏ）−；−Ｃ（Ｏ）Ｏ−；−Ｎ＝ＣＨ−；−ＣＨ＝Ｎ−；−ＣＨ２−；−Ｓ−Ｓ−；−Ｎ（Ｒ１３）（Ｒ１４）−（ただし、Ｒ１３およびＲ１４は独立に、Ｈもしくは低級アルキルであり、またはＲ１３もしくはＲ１４の一方は、存在しなくてもよい）；または
【化９】
2014208687.tif 000112
であり、
Ｙａは存在しないか、または非分枝状、分枝状、もしくは環状の置換もしくは非置換アルキル、アルケニル；１〜８個のＣ原子を有するアルキレン基もしくはアルキニル基もしくはアリール基であり、ここで前記置換基は、１種または複数の−ＯＨ；−ＮＨ２；−Ｎ（Ｒ１３）（Ｒ１４）（ただし、Ｒ１３およびＲ１４は、上記で定義される）；−ＣＯＯＨ；糖から選択され、あるいはＹａは糖；アミノ酸；ジ−もしくはトリペプチド；α−ヒドロキシ酸もしくはβ−ヒドロキシ酸、またはジヒドロキシ酸であり、Ｚａは存在しないか、または−Ｏ−；−Ｓ−；−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）−；−Ｃ（Ｏ）Ｏ−；−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）−；−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）−；−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｏ−；−ＮＨ−；−Ｎ（Ｒ１３）（Ｒ１４）−（Ｒ１３およびＲ１４は上記のように定義する）；−ＣＨ＝Ｎ−；−ＯＣ（Ｏ）−；−Ｎ＝ＣＨ−；−Ｓ−Ｓ−から選択される基であり、あるいはＺａは、−ＮＨ２；−（ＮＨ３）＋；−（Ｎ（Ｒ１３）（Ｒ１４）（Ｒ１５））＋（ただし、Ｒ１３、Ｒ１４、およびＲ１５は、上記のＲ１３およびＲ１４のように定義される）；−Ｃ（Ｏ）ＯＨ；−ＯＨ；−Ｃ（Ｏ）Ｈ；−Ｃ（Ｏ）ＯＲ１６（ただし、Ｒ１６は低級アルキルである）；−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２の群から選択され、点線は、１種または複数のＴＥＥのあり得るグラフト位置を表す）；
【化１０】
2014208687.tif 000113
（式中、Ｘａはステロールの３’位において結合しており、上記のように定義され、
ＹａおよびＺａは、上記で定義され、ステロールは、コレステロール、シトステロール、カンペステロール、デスモステロール、フコステロール、２２−ケトステロール、２０−ヒドロキシステロール、スチグマステロール、２２−ヒドロキシコレステロール、２５−ヒドロキシコレステロール、ラノステロール、７−デヒドロコレステロール、ジヒドロコレステロール、１９−ヒドロキシコレステロール、５α−コレスト−７−エン３β−オール、７−ヒドロキシコレステロール、エピコレステロール、エルゴステロール、および／またはデヒドロエルゴステロールから選択され、好ましくは前記ステロールは、コレステロールであり、点線は、１種または複数のＴＥＥのあり得るグラフト位置を表す）；
【化１１】
2014208687.tif 000114
【化１２】
2014208687.tif 000115
（式中、Ｒｘ、Ｒｙ、Ｘａ、Ｙａ、またはＺａは、上記で定義され、点線は、１種または複数のＴＥＥのあり得るグラフト位置を表す）；
【化１３】
2014208687.tif 000116
（式中、ＲｘおよびＲｙは、上記で定義され、点線は、１種または複数のＴＥＥのあり得るグラフト位置を表す）；
あるいは
【化１４】
2014208687.tif 000117
（式中、Ｒｘ＊およびＲｙ＊は独立に、０、１、または２個のエチレン性不飽和結合を含むＣ８〜Ｃ３０アルキル鎖であり、あるいはＲｘ＊またはＲｙ＊の一方は、Ｈとすることができ、ＷおよびＧは独立に、ＨＯ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｏ−であり、点線は、１種または複数のＴＥＥのあり得るグラフト位置を表す）；
【化１５】
2014208687.tif 000118
（式中、Ｒｘ○およびＲｙ○は独立に、０、１、または２個のエチレン性不飽和結合を含むＣ８〜Ｃ３０アシル鎖であり、あるいはＲ１またはＲ２の一方は、Ｈとすることができ、ＭはＨまたは−ＯＨであり、Ｘａ、Ｙａ、Ｚａは、上記で定義され、点線は、１種または複数のＴＥＥのあり得るグラフト位置を表す）。
【請求項１２】
前記脂質が、２種以上の親水性極性頭部基または様々な位置において置換を可能にする複雑な親水性頭部基を含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の１種または複数のトランスフェクションエンハンサー要素を含む脂質。
【請求項１３】
前記脂質が、酒石酸と長鎖アルコールとのエステル；マレイン酸の誘導体；脂肪酸とグルコース、スクロース、もしくはマルトースなどの糖とのエステル；ドデシル−β−グルコピラノシドまたはドデシル−β−マルトシドなどアルキルグリコシドおよびその誘導体；Ｂｒｉｊ３５、Ｇｅｎａｐｏｌシリーズ、Ｔｈｅｓｉｔなどアルキル−エチレングリコール洗浄剤の誘導体、またはホスファチジルイノシトールおよびその誘導体を含む群から選択される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の１種または複数のトランスフェクションエンハンサー要素を含む脂質。
【請求項１４】
前記脂質が、下記の化合物を含む群から選択される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の１種または複数のトランスフェクションエンハンサー要素を含む脂質。
【表１−１】
2014208687.tif 000119
【表１−２】
2014208687.tif 000120
（式中、ＲｘおよびＲｙは独立に、０、１、または２個のエチレン性不飽和結合を含むＣ８〜Ｃ３０アルキル鎖またはアシル鎖であり、あるいはＲｘまたはＲｙの一方は、Ｈとすることができ、Ｒ３＊およびＲ４＊は独立に、ＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルである）。
【請求項１５】
前記脂質が、下記の化合物を含む群から選択される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の１種または複数のトランスフェクションエンハンサー要素を含む脂質。
【化１６】
2014208687.tif 000121
（式中、ＲｘおよびＲｙは独立に、０、１、または２個のエチレン性不飽和結合を含むＣ８〜Ｃ３０アルキル鎖またはアシル鎖であり、あるいはＲｘまたはＲｙの一方は、Ｈとすることができ、Ｒ＊は、０、１、もしくは２個のエチレン性不飽和結合を含むＣ８〜Ｃ３０アルキル鎖である）。
【請求項１６】
前記脂質が、下記の化合物を含む群から選択される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の１種または複数のトランスフェクションエンハンサー要素を含む脂質。
【化１７】
2014208687.tif 000122
（式中、ＲｘおよびＲｙは独立に、０、１、または２個のエチレン性不飽和結合を含むＣ８〜Ｃ３０アルキル鎖またはアシル鎖であり、あるいはＲｘまたはＲｙの一方は、Ｈとすることができる）。
【請求項１７】
前記脂質が、下記の化合物を含む群から選択される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の１種または複数のトランスフェクションエンハンサー要素を含む脂質。
【化１８】
2014208687.tif 000123
（式中、ＲｘおよびＲｙは独立に、０、１、または２個のエチレン性不飽和結合を含むＣ８〜Ｃ３０アルキル鎖またはアシル鎖であり、あるいはＲｘまたはＲｙの一方は、Ｈとすることができ、ｍ＝６〜４０である）；
【化１９】
2014208687.tif 000124
（式中、ＲｘおよびＲｙは独立に、０、１、または２個のエチレン性不飽和結合を含むＣ８〜Ｃ３０アルキル鎖またはアシル鎖であり、あるいはＲｘまたはＲｙの一方は、Ｈとすることができ、ｍ＝６〜４０である）；
【化２０】
2014208687.tif 000125
（式中、ＲｘおよびＲｙは独立に、０、１、または２個のエチレン性不飽和結合を含むＣ８〜Ｃ３０アルキル鎖またはアシル鎖であり、あるいはＲｘまたはＲｙの一方は、Ｈとすることができ、ｍ１およびｍ２は独立に、６〜４０である）；
【化２１】
2014208687.tif 000126
（式中、ＲｘおよびＲｙは独立に、０、１、または２個のエチレン性不飽和結合を含むＣ８〜Ｃ３０アルキル鎖またはアシル鎖であり、あるいはＲｘまたはＲｙの一方は、Ｈとすることができ、ｍ＝６〜４０である）；
【化２２】
2014208687.tif 000127
（式中、ＲｘおよびＲｙは独立に、０、１、または２個のエチレン性不飽和結合を含むＣ８〜Ｃ３０アルキル鎖またはアシル鎖であり、あるいはＲｘまたはＲｙの一方は、Ｈとすることができる）；
【化２３】
2014208687.tif 000128
（式中、ｍ＝６〜４０である）；
【化２４】
2014208687.tif 000129
（式中、ＲｘおよびＲｙは独立に、０、１、または２個のエチレン性不飽和結合を含むＣ８〜Ｃ３０アルキル鎖またはアシル鎖であり、あるいはＲｘまたはＲｙの一方は、Ｈとすることができ、ｍ＝６〜４０である）；
【化２５】
2014208687.tif 000130
（式中、ＲｘおよびＲｙは独立に、０、１、または２個のエチレン性不飽和結合を含むＣ８〜Ｃ３０アルキル鎖またはアシル鎖であり、あるいはＲｘまたはＲｙの一方は、Ｈとすることができ、ｍ＝６〜４０である）；
【化２６】
2014208687.tif 000131
（式中、ＲｘおよびＲｙは独立に、０、１、または２個のエチレン性不飽和結合を含むＣ８〜Ｃ３０アルキル鎖またはアシル鎖であり、あるいはＲｘまたはＲｙの一方は、Ｈとすることができ、Ｒ３＊およびＲ４＊は独立に、ＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルであり、ｍ＝１１〜４０である）。
【請求項１８】
脂質集合体であって、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の１種もしくは複数の脂質、またはイオン相互作用によって前記脂質集合体との複合体を形成するトランスフェクションエンハンサー要素（ＴＥＥ）を含み、前記ＴＥＥは、次式：
疎水性部分−ｐＨ感受性親水性部分    （ＩＩ）
（各ＴＥＥの前記ｐＨ感受性親水性部分は独立に、ｐｋａ２〜６の弱酸、または酸性基と弱塩基との組合せを含むｐＫａ３〜８の双性イオン構造である）
を有する、脂質集合体。
【請求項１９】
前記脂質集合体が、リポソーム、ミセル、逆ミセル、立方もしくは六方脂質相、渦巻形、エマルジョン、ダブルエマルジョン、および実質的に脂質、油、もしくは両親媒性物質からなる他の多量体集合体から選択される、請求項１８に記載の脂質集合体。
【請求項２０】
前記ＴＥＥが、ポリカチオン性要素との複合体を形成し、アニオン性脂質集合体と組み合わせられる、請求項１８または１９に記載の脂質集合体。
【請求項２１】
前記ポリカチオン性要素が、ポリエチレンイミン、ポリアリルアミン、スペルミン、ジスペルミン、トリスペルミン、テトラスペルミン、オリゴスペルミン、テルミン、スペルミジン、プトレシン、およびリシン、オルニチン、またはアルギニンからのポリマーまたはオリゴマーから選択される、請求項２０に記載の脂質集合体。
【請求項２２】
前記ＴＥＥが、ポリアニオン性要素との複合体を形成し、カチオン性脂質集合体と組み合わせられる、請求項１８または１９に記載の脂質集合体。
【請求項２３】
前記ポリアニオン性要素が、アクリル酸、メタクリル酸、グルタミン酸、またはアスパラギン酸のポリマーおよびオリゴマーから選択される、請求項２２に記載の脂質集合体。
【請求項２４】
前記脂質集合体が、中性および／またはカチオン性および／またはアニオン性脂質をさらに含む脂質相から形成される、請求項１８〜２３のいずれか一項に記載の脂質集合体。
【請求項２５】
前記脂質集合体の総電荷が、中性、カチオン性、またはアニオン性である、請求項１８〜２４のいずれか一項に記載の脂質集合体。
【請求項２６】
前記中性脂質が、ホスファチジルコリン；ホスファチジルエタノールアミン；スフィンゴ脂質；セラミド；セレブロシド；ステロール系脂質、例えばコレステロール；および／またはこのような脂質の誘導体を含む群から選択される、請求項２４または請求項２５に記載の脂質集合体。
【請求項２７】
前記中性脂質が、ＤＭＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＳＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＣ、ＤＭＰＥ、ＤＰＰＥ、ＤＳＰＥ、ＰＯＰＥ、ＤＯＰＥ、ジフィタノイル−ＰＥ、スフィンゴミエリン、セラミド、および／またはコレステロールを含む群から選択される、請求項２６に記載の脂質集合体。
【請求項２８】
前記カチオン性脂質が、ＤＯＴＡＰ、ＤＭＴＡＰ、ＤＰＴＡＰ、ＤＣ−Ｃｈｏｌ、ＤＡＣ−Ｃｈｏｌ、ＤＯＤＡＰ、ＤＯＥＰＣ、ＴＣ−Ｃｈｏｌ、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＲＩＥ、ＤＤＡＰ、ＣＴＡＢ、ＣＰｙＣ、ＤＰＩＭ、ＣＨＩＭ、ＭｏＣｈｏｌ、ＨｉｓＣｈｏｌ、ＢＧＳＣ、ＢＧＴＣ、ＤＯＳＰＥＲ、ＤＯＳＣ、ＤＯＧＳＤＯ、ＤｍＣ４Ｍｏ２、ＤｍＣ３Ｍｏ２、Ｃ３Ｍｏ２、Ｃ３Ｍｏ３、Ｃ４Ｍｏ４、Ｃ５Ｍｏ２、Ｃ６Ｍｏ２、Ｃ８Ｍｏ２、ＰｉｐＣ２Ｃｈｏｌ、ＭｏＣ２Ｃｈｏｌ、ＭｏＣ３Ｃｈｏｌ、Ｎ−メチル−ＰｉｐＣｈｏｌ、ＰｙｒｒｏＣ２Ｃｈｏｌ、ＰｙＣ２Ｃｈｏｌ、ＩｍＣ３Ｃｈｏｌ、ＰｉｐｅＣ２Ｃｈｏｌ、およびこのような脂質の誘導体を含む群から選択される、請求項２４または請求項２５に記載の脂質集合体。
【請求項２９】
前記アニオン性脂質が、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、ｃｈｅｍｓおよび別のアニオン性ステロール誘導体、セチルホスフェート、ジアシルグリセロールヘミスクシネート、およびカルジオリピン、ならびに／またはこのような脂質の誘導体を含む群から選択される、請求項２４または請求項２５に記載の脂質集合体。
【請求項３０】
前記脂質集合体が、ＤＯＰＥ、リゾ脂質、もしくは遊離脂肪酸、またはそれらの混合物を含む群から選択される融合性脂質を含む、請求項１８〜２９のいずれか一項に記載の脂質集合体。
【請求項３１】
１種または複数のトランスフェクションエンハンサー要素を含む前記１種または複数の脂質の量が、全脂質相の０．１モル％〜９０モル％である、請求項１８〜３０のいずれか一項に記載の脂質集合体。
【請求項３２】
前記脂質集合体が、両性特性を有する脂質相から形成される、請求項１８〜３１のいずれか一項に記載の脂質集合体。
【請求項３３】
前記脂質集合体が、様々な粒径およびラメラ性のリポソームまたは両性リポソームである、請求項１８〜３１のいずれか一項に記載の脂質集合体。
【請求項３４】
両性特性を有する脂質相から形成された脂質集合体であって、前記集合体は、一般式（Ｉ）：
脂質部分−［疎水性部分−ｐＨ感受性親水性部分］    （Ｉ）
に従う、１種または複数のトランスフェクションエンハンサー要素を含む脂質（脂質−ＴＥＥ）を含み、
前記トランスフェクションエンハンサー要素（ＴＥＥ）は、一般式（ＩＩ）：
疎水性部分−ｐＨ感受性親水性部分    （ＩＩ）
（式中、前記ＴＥＥの前記ｐＨ感受性親水性部分は、ｐｋａ２〜６の弱酸、または酸性基と弱塩基との組合せを含むｐＫａ３〜８の双性イオン構造である）
を有する脂質集合体。
【請求項３５】
前記ＴＥＥが、疎水性部分および１種または複数のｐＨ感受性親水性要素を特徴とする、請求項３４に記載の脂質集合体。
【請求項３６】
ＴＥＥが、次の一般式のうちの１つを有する、請求項３４または請求項３５に記載の脂質集合体。
【化２７】
2014208687.tif 000132
（式中、Ｒｅｐｉ基はそれぞれ独立に、１〜８個のＣ原子を有する非分枝状、分枝状、または環状の置換または非置換アルキル基、アルケニル基、アルキレン基、アルキニル基、またはアリール基であり、前記置換基は、１種または複数のｐＨ感受性親水性部分、低級アルキル、アルキレン、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルコキシアルキル、アルキルチオ、およびアルキルチオアルキルから選択され、
Ｌｊ、Ｌｋ、またはＬｌはそれぞれ独立に、存在しないか、あるいは
−ＣＨ２−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）−、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＣＨ＝Ｎ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｎ＝ＣＨ−  −Ｓ−Ｓ−、−ＮＨ−、−Ｎ（Ｒ１３）（Ｒ１４）−（ただし、Ｒ１３およびＲ１４は独立に、ＨもしくはＣ１〜Ｃ６アルキルであり、またはＲ１３もしくはＲ１４の一方は、存在しなくてもよい）、
【化２８】
2014208687.tif 000133
アミノ酸、α−ヒドロキシ酸、およびβ−ヒドロキシ酸から選択され、
ＴＥＥ中のＣ原子の総数は、６〜４０個であり、ｐは≦４０である）；あるいは
−ステロール    （ＶＩＩ）
（式中、前記ステロールは、１種または複数の親水性部分、−ＯＨ、−ＳＨ、または低級アルキル、アルキレン、アルケニル、もしくはアルキニル、アルコキシ、アルキルアルコキシ、アルキルチオ、およびアルキルアルキルチオで置換されていてもよい）。
【請求項３７】
１種または複数のトランスフェクションエンハンサー要素を含む前記１種または複数の脂質の量が、全脂質相の０．１モル％〜９０モル％である、請求項３４〜３６のいずれか一項に記載の脂質集合体。
【請求項３８】
前記両性脂質相が１種または複数の両性脂質を含む、請求項３４〜３７に記載の脂質集合体。
【請求項３９】
前記両性脂質が、ＨｉｓｔＣｈｏｌ、ＨｉｓｔＤＧ、ｉｓｏＨｉｓｔＳｕｃｃＤＧ、アシルカルノシン、ＨＣＣｈｏｌ、Ｈｉｓｔ−ＰＳ、およびＥＤＴＡ−Ｃｈｏｌから選択される、請求項３８に記載の脂質集合体。
【請求項４０】
前記両性脂質相が、（ｉ）安定なカチオン性脂質および帯電可能なアニオン性脂質、（ｉｉ）帯電可能なカチオン性脂質および帯電可能なアニオン性脂質、または（ｉｉｉ）安定なアニオン性脂質および帯電可能なカチオン性脂質から選択される両性脂質混合物を含む、請求項３４〜３７に記載の脂質集合体。
【請求項４１】
前記脂質相が、２０〜９０モル％の前記両性脂質混合物、２〜２０モル％のＤｅｃａ−ＰＥ、ｗ１２−ＰＥ、Ｐａｌ−ＰＥ、ｗ２１−ＰＥ、ｗ１２−ＤＰＴＡＰ、ｗ１６−ＤＰＴＡＰ、ｗ２０−ＤＰＴＡＰ、ｗ１２−Ａｍｉｄ−ＰＥ、およびｗ１６−Ａｍｉｄ−ＰＥから選択される１種または複数のＴＥＥを含む１種または複数の脂質、および場合によっては中性または双性イオン性脂質を含む、請求項４０に記載の脂質集合体。
【請求項４２】
前記両性脂質混合物が「両性Ｉ」脂質対であり、カチオン性脂質とアニオン性脂質のモル比（Ｃ／Ａ比）が０．３〜０．７である、請求項４０または４１に記載の脂質集合体。
【請求項４３】
前記両性脂質混合物が「両性ＩＩ」脂質対であり、カチオン性脂質とアニオン性脂質のモル比（Ｃ／Ａ比）が０．３〜３である、請求項４０または４１に記載の脂質集合体。
【請求項４４】
前記両性脂質混合物が、ＤＯＴＡＰ／Ｃｈｅｍｓ、ＤＯＴＡＰ／ＤＭＧ−Ｓｕｃｃ、ＤＯＴＡＰ／ＤＯＧ−Ｓｕｃｃ、ＤＯＤＡＰ／Ｃｈｅｍｓ、ＤＯＤＡＰ／ＤＭＧ−Ｓｕｃｃ、ＤＯＤＡＰ／ＤＯＧ−Ｓｕｃｃ、ＤＤＡＢ／Ｃｈｅｍｓ、ＤＤＡＢ／ＤＭＧ−Ｓｕｃｃ、ＤＤＡＢ／ＤＯＧ−Ｓｕｃｃ、ＤＣ−Ｃｈｏｌ／Ｃｈｅｍｓ、ＤＣ−Ｃｈｏｌ／ＤＭＧ−Ｓｕｃｃ、ＤＣ−Ｃｈｏｌ／ＤＯＧ−Ｓｕｃｃ、ＤＡＣ−Ｃｈｏｌ／Ｃｈｅｍｓ、ＤＡＣ−Ｃｈｏｌ／ＤＭＧ−Ｓｕｃｃ、ＤＡＣ−Ｃｈｏｌ／ＤＯＧ−Ｓｕｃｃ、ＴＣ−Ｃｈｏｌ／Ｃｈｅｍｓ、ＴＣ−Ｃｈｏｌ／ＤＭＧ−Ｓｕｃｃ、ＴＣ−Ｃｈｏｌ／ＤＯＧ−Ｓｕｃｃ、ＭｏＣｈｏｌ／Ｃｈｅｍｓ、ＭｏＣｈｏｌ／ＤＭＧ−Ｓｕｃｃ、ＨｉｓＣｈｏｌ／ＤＯＧ−Ｓｕｃｃ、ＨｉｓＣｈｏｌ／Ｃｈｅｍｓ、ＨｉｓＣｈｏｌ／ＤＭＧ−Ｓｕｃｃ、ＨｉｓＣｈｏｌ／ＤＯＧ−Ｓｕｃｃ、Ｃｈｉｍ／Ｃｈｅｍｓ、Ｃｈｉｍ／ＤＭＧ−Ｓｕｃｃ、Ｃｈｉｍ／ＤＯＧ−Ｓｕｃｃ、ＤｍＣ４Ｍｏ２／Ｃｈｅｍｓ、ＤｍＣ４Ｍｏ２／ＤＭＧ−Ｓｕｃｃ、およびＤｍＣ４Ｍｏ２／ＤＯＧ−Ｓｕｃｃから選択される、請求項４２または４３に記載の脂質集合体。
【請求項４５】
前記脂質集合体が両性リポソームである、請求項３４〜４３のいずれか一項に記載の脂質集合体。
【請求項４６】
前記両性リポソームが、ユニラメラ、オリゴラメラ、またはマルチラメラであり、前記両性リポソームの粒径が、５０〜１０００ｎｍ、好ましくは５０〜５００ｎｍ、より好ましくは７０〜２５０ｎｍで異なる、請求項４５に記載の脂質集合体。
【請求項４７】
脂質相が、約１０〜２０％のホスファチジルコリン、２０〜３５％のＤＣ−Ｃｈｏｌ、４０〜６０％のＣＨＥＭＳまたはＤＭＧＳｕｃｃ、および約５〜１５％のＰａｌ−ＰＥまたはＤｅｃａ−ＰＥを含む、請求項４０〜４６のいずれか一項に記載の脂質集合体。
【請求項４８】
前記脂質集合体がリポソームであり、脂質相が下記から選択される組合せを含む、請求項１８〜４７のいずれか一項に記載の脂質集合体。
【表２−１】
2014208687.tif 000134
【表２−２】
2014208687.tif 000135
【表２−３】
2014208687.tif 000136
【表２−４】
2014208687.tif 000137
【請求項４９】
前記脂質集合体が、少なくとも１種の医薬品有効成分を隔絶する、請求項１８〜４８に記載の脂質集合体。
【請求項５０】
前記医薬品有効成分が、ＤＮＡプラスミド、ポリヌクレオチド、およびオリゴヌクレオチドから選択される核酸系薬物である、請求項４９に記載の脂質集合体。
【請求項５１】
前記核酸が、脊椎動物細胞において１種または複数のＲＮＡへと転写されることが可能であり、前記ＲＮＡが、ｍＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはリボザイムであり、前記ｍＲＮＡは１種または複数のタンパク質またはポリペプチドをコードする、請求項５１に記載の脂質集合体。
【請求項５２】
前記核酸が、環状ＤＮＡプラスミド、直鎖ＤＮＡ構築物、またはｍＲＮＡである、請求項５２に記載の脂質集合体。
【請求項５３】
前記核酸がオリゴヌクレオチドである、請求項５０に記載の脂質集合体。
【請求項５４】
前記オリゴヌクレオチドが、デコイオリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、転写に影響を及ぼす作用剤、スプライシングに影響を及ぼす作用剤、リボザイム、ＤＮＡザイム、またはアプタマーである、請求項５３に記載の脂質集合体。
【請求項５５】
前記オリゴヌクレオチドが、腫瘍標的に向けられている、請求項５３または請求項５４に記載の脂質集合体。
【請求項５６】
前記腫瘍標的が、ＣＥＡＣＡＭ６、ＢＣＬ−２、ＥＰＨＡ２、ＣＴＮＮＢ１、ＲｈｏＡ、ＰＬＫ１、ＸＩＡＰ、テロメラーゼ、サイクリンＤ１、Ｋ−Ｒａｓ、ＥＧ５、Ｋｉ６７、アンドロゲン受容体、ＦｏｘＭ１、Ａｋｔ１、ＶＥＧＦ、ＫＳＢ、およびＣＤＣ２５Ｂから選択される、請求項５５に記載の脂質集合体。
【請求項５７】
請求項１８〜５６のいずれか一項に記載の脂質集合体に隔絶されている医薬品活性成分、およびそのための医薬として許容されるビヒクルを含む医薬組成物。
【請求項５８】
ヒトまたは非ヒト動物の炎症性、免疫もしくは自己免疫障害、および／または癌の治療または予防のための医薬品の製造における請求項５７に記載の医薬組成物の使用。
【請求項５９】
治療上有効量の請求項５７〜５８のいずれか一項に記載の医薬組成物を投与することによってヒトまたは非ヒト動物を治療する方法であって、前記脂質集合体は活性剤を隔絶し、特定の１つもしくは複数の臓器、腫瘍、または感染もしくは炎症の部位を標的にする方法。
【請求項６０】
前記脂質集合体は、一般式（Ｉ）：
脂質部分−［疎水性部分−ｐＨ感受性親水性部分］    （Ｉ）
に従う、１種または複数のトランスフェクションエンハンサー要素を含む脂質（脂質−ＴＥＥ）を含み、
前記トランスフェクションエンハンサー要素（ＴＥＥ）は、一般式（ＩＩ）：
疎水性部分−ｐＨ感受性親水性部分    （ＩＩ）
（前記ＴＥＥの前記ｐＨ感受性親水性部分は、ｐｋａ２〜６の弱酸、または酸性基と弱塩基との組合せを含むｐＫａ３〜８の双性イオン構造である）
を有する、細胞のインビボ、インビトロ、またはエキソビボトランスフェクションのための脂質集合体の使用。
【請求項６１】
前記ＴＥＥが、疎水性部分および１種または複数のｐＨ感受性親水性要素を特徴とする、請求項６０に記載の脂質集合体。
【請求項６２】
前記脂質集合体は、ホスファチジルコリン、スフィンゴミレイン、セラミド、もしくはセレブロシド、またはそれらの混合物の群から選択される中性脂質と、コレステロールもしくはホスファチジルエタノールアミン、またはそれらの混合物との混合物を含む脂質相から形成され、混合物のモル比は１：３〜３：１である、請求項６１または６２に記載の脂質集合体の使用。
【請求項６３】
前記脂質相が、ＤＯＰＥまたはコレステロールの群から選択される１種または複数の脂質と組み合わせて、ＤＳＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＭＰＣ、ＰＯＰＣ、またはＤＯＰＣから選択されるホスファチジルコリンの混合物を含む、請求項６２に記載の脂質集合体の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規の脂質であって、脂質部分、およびこのような脂質またはこのような脂質を組み込んでいる脂質集合体（例えば、リポソーム）と生体膜、特に細胞膜との融合性を向上させることができる１種または複数の構造要素を含む脂質に関する。このような構造要素は、電荷および親水性の点からｐＨ感受性であり、低ｐＨに曝露させたとき、極性−無極性変化を受ける。本発明は、イオン相互作用によりこのような構造要素と脂質との複合体を形成することによって、このような脂質の融合性を改善するためのその構造要素の使用も包含する。
【背景技術】
【０００２】
膜融合は、生体系においてよくある事象であり、そのための洗練された機序を自然が編み出してきた。例えば、細胞のウイルスによる感染は、膜融合が重要な役割を果たす一事象である。
【０００３】
したがって、ウイルスの細胞膜またはエンドソーム膜との融合を促進する能力によって、組換えウイルス遺伝子送達システムの開発がもたらされたことは意外なことではない。最も顕著なシステムは、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、または単純ヘルペスウイルスベクターを利用し、世界の遺伝子療法臨床試験の７０％超で使用されている。ウイルス系遺伝子送達システムは非常に効率的であるが、注入後、免疫に関連した副作用を呈する。この重大な欠点によって、これらのシステムの安全性、ひいてはヒトにおけるその適用が制限される（例えば、非特許文献１）。
【０００４】
代替策は、非ウイルスベクターを使用して、遺伝子試料を細胞に送達することである。非ウイルスベクターシステムは、例えばカチオン性ポリマーおよびリポソームを含む。リポソームは、水性コアを有し、両親媒性分子から形成される人工の一枚膜、オリゴ膜、または多重膜の小胞体である。カーゴは、リポソームのコアに捕捉されていてもよく、または膜層もしくは膜表面に設置されていてもよい。今日、リポソームベクターは、非ウイルス送達システムの最も重要な群である。より具体的には、カチオン性リポソームまたは脂質が動物試験および／または臨床試験で広く使用されてきた。カチオン性システムは高負荷効率をもたらすが、特に体液と接触した後、コロイド安定性が欠けている。タンパク質および／または他の生体高分子とのイオン相互作用によって、細胞外マトリックスまたは細胞表面と、その場で凝集体形成が起こる。カチオン性脂質は、非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４によって明らかにされたように、毒性があることがわかっている場合が多い。
【０００５】
両性リポソームは、ｐＨ７．５でアニオン電荷または中性電荷を有し、ｐＨ４でカチオン電荷を有する最近記載されたリポソームのクラスを表す。特許文献１、特許文献２、および特許文献３（すべてPanzner, et al.に付与、参照により本明細書に組み込まれる）には、両性リポソームおよびそれに適した脂質の詳細な説明が記載されている。さらに、このような両性リポソームを製造するための別のｐＨ感受性脂質が記載されている特許文献４および特許文献５（これらもPanzner, et al.に付与、参照により本明細書に組み込まれる）が開示されている。
【０００６】
両性リポソームは、カチオン性リポソームと等しく高効率的に、核酸分子を封入することができる。有利に、両性リポソームは、カチオン性リポソームより、インビボ投与で耐容性がはるかに良好であり、良好な生体内分布を示す。
【０００７】
ウイルス遺伝子送達ベクターに比べて、非ウイルスシステムははるかに安全である。これらは、高用量で忍容性が良好であり、免疫応答を誘発しない。したがって、これらのシステムは、反復投与することができる。それにもかかわらず、ウイルスシステムは、トランスフェクション効率の点から優れている。ウイルス表面糖タンパク質をリポソームに組み込む試みがなされてきた（非特許文献５）が、これらのハイブリッド系には、やはり免疫に関連した副作用という欠点がある。
【０００８】
したがって、非ウイルスシステムの改良が依然として求められている。
【０００９】
先行技術では、リガンドまたは活性成分をリポソームに移植するために、ｐＨ感受性親水性部分を使用できることが知られている。例えば、Kung, et al.の特許文献６には、タンパク質などの表面結合分子を結合させるためのカップリング基を外側の２重層領域に含むリポソーム組成物が開示されている。Kung, et al.によって開示されたカップリング試薬には、ホスファチジルエタノールアミン脂質部分、２０個までの原子を有する炭素含有スペーサーアーム、および末端カルボキシル基が含まれる。末端カルボキシル基は、カップリング基として使用され、疎水性部分は、脂質二重層と前記カップリング基の間で空間的分離をもたらす。
【００１０】
１０個までの炭素原子を有するアルキル連結基、例えばカルボキシアルキル基を有するＲｏｓｅｎｔｈａｌ阻害剤（ＲＩ）コア構造を有するカチオン性脂質に関するWheelerの特許文献７に、関連した手法が開示されている。追加のカルボキシアルキル基を含むＲＩ構造が、例えば細胞取り込みのためのリガンド、カチオン性脂質の極性電荷密度を増大させることができる治療分子または基でさらなる機能を付与するための中間体として開示されている。
【００１１】
特許文献８には、親水性基（）のない長い疎水性部分を含む脂質が記載されている。これらの構造は、ｐＨの変化に反応しない。
【００１２】
Tournier et al.の特許文献９には、水、緩衝液、および生体液体に懸濁しているリポソーム小胞体を、経時的破壊および融合に対して安定化させるためのホスファチジン酸エステルが開示されている。このようなエステルは、封入能を増大させ、捕捉された物質のキャリア液体への漏れに対して小胞体膜を安定化させるとも言われている。
【００１３】
Eiblの特許文献１０には、グリセロール誘導体が開示されている。
【００１４】
先行技術は、リポソームおよび隔絶活性成分の細胞取り込みおよび細胞質内送達を向上させるための構造要素（ＩＩ）または脂質（Ｉ）の使用および最適化について言及していない。先行技術は、疎水性部分とｐＨ感受性親水性部分との組合せがこのような機能に重大な状態をもたらすことを教示していない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】WO 02/066490
【特許文献２】WO 02/066012
【特許文献３】WO-A-03/070735
【特許文献４】WO-A-03/070220
【特許文献５】WO-A-03/066489
【特許文献６】WO-A-86/04232
【特許文献７】WO-A-97/19675
【特許文献８】US-A-6294191
【特許文献９】WO-A-00/11007
【特許文献１０】EP-A-0099068
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】Thomas et al., Nature Reviews, Genetics, 4, 346-358, 2003
【非特許文献２】Filion, et al. in BBA, 1329(2), 345-356, 1997
【非特許文献３】Dass in J. Pharm. Pharmacol, 54(5), 593-601, 2002
【非特許文献４】Hirko, et al. in Curr. Med. Chem., 10(14), 1185-1193, 2003
【非特許文献５】Miller N, Vile R., FASEB J, 9, 190-199, 1995
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
したがって、本発明の一般的な目的は、活性剤を細胞、特に哺乳類細胞にインビボ、インビトロ、またはエキソビボ送達するための改良された非ウイルス担体システムを提供することである。
【００１８】
特に、本発明の目的は、核酸（例えば、オリゴヌクレオチドおよびプラスミド）および治療特性を有する他の活性剤、例えば「生物製剤」を細胞に送達するための改良された非ウイルス担体システムを提供することである。
【００１９】
本発明の別の目的は、このような活性剤の細胞への取り込みが改善された非ウイルス担体システムを提供することである。
【００２０】
本発明の別の目的は、活性剤を封入または隔絶するリポソームおよび他の脂質ベースの担体システムの細胞への取り込みを改善することである。したがって、本発明のさらに別の目的は、脂質集合体の細胞への取り込みを改善するための、例えばリポソームなどの脂質集合体に組み込むことができる化合物を提供することである。
【００２１】
特に、本発明の目的は、このような脂質集合体と生体膜、特に細胞膜との融合性を改善するための、脂質集合体に組み込むことができる化合物を提供することである。
【００２２】
本発明のさらに別の目的は、活性剤または他の成分を送達するためのキャリアとしてのリポソームを含む、細胞への取り込みが改善された医薬組成物を提供することである。
【００２３】
本発明のさらに別の目的は、ヒトまたは非ヒト動物の炎症性、免疫もしくは自己免疫障害、および／または癌を治療または予防するための改良された医薬組成物を提供することである。
【００２４】
本発明のさらに別の目的は、活性剤を含む医薬組成物が特定の１つもしくは複数の臓器、腫瘍、または感染もしくは炎症の部位を標的にする、ヒトまたは非ヒト動物を治療するための改良された組成物および方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２５】
したがって、本発明の一態様によれば、一般式（Ｉ）：
（Ｉ）脂質−［疎水性部分−ｐＨ感受性親水性部分］
に従う、脂質部分および１種または複数のトランスフェクションエンハンサー要素（ＴＥＥ）を含む脂質であって、
前記１種または複数のトランスフェクションエンハンサー要素（ＴＥＥ）は、一般式（ＩＩ）：
（ＩＩ）疎水性部分−ｐＨ感受性親水性部分
を有し、
式中、各ＴＥＥのｐＨ感受性親水性部分は独立に、ｐＫａ２〜６の弱酸、または酸性基と弱塩基との組合せを含むｐＫａ３〜８の双性イオン構造であり、ただし前記脂質が、次の構造（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、または（Ｖ）のうちの１つではないことを条件とする、脂質が提供される。
ＰＥ−アミド結合−Ｘ−ＣＯＯＨ    （ＩＩＩ）
式中、ＰＥは、ホスファチジルエタノールアミン部分であり、Ｘは、３〜２０個の原子の鎖長を有し、場合によっては１個または複数のヘテロ原子を含む置換または非置換の飽和または不飽和炭素含有直鎖である；
【化１】
2014208687.tif 000002
式中、Ｙは、２〜１０個のＣ原子の鎖長を有する飽和直鎖アルキル基であり、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、およびＲｄは独立に、０〜６個の不飽和部位を有する直鎖状または分枝状の非置換または置換Ｃ１〜２３アルキル基、アシル基、アルキレン基、ヘテロアルキル基、環状基、またはアリール基であり、前記基は０〜５個のヘテロ原子を含み、置換基は−Ｏ−（ＣＨ２）ｅ−ＣＨ３；−Ｓ−（ＣＨ２）ｅ−ＣＨ３；Ａ−（ＣＨ２）ｅ（式中、Ａはハロゲン化物である）、および−Ｎ（（ＣＨ２）ｅ−ＣＨ３）２であり、置換基のアルキル基は、０〜２個のヘテロ原子を含み、ｅは０〜４であり、さらにＲａおよびＲｂは独立に、Ｈとすることができ、ｄは１〜６である；または
【化２】
2014208687.tif 000003
式中、ＲｅおよびＲｆは独立に、水素原子、または二重および三重結合を場合によっては含むＣ１〜Ｃ２４直鎖状もしくは分枝状アルキル鎖もしくはアシル鎖であり、Ｚは、アリール環、３〜６個の炭素原子を有するシクロアルキル、ヒドロキシル、および／または１個もしくは複数のさらなるカルボン酸基で場合によっては置換されていてもよい、６〜２０個の炭素原子を有する脂肪族および／または脂環式炭化水素鎖である。
【００２６】
したがって、そのまたはそれぞれのＴＥＥ部分は、脂質分子に組み込まれている。そのまたはそれぞれの脂質分子内の親水性部分の位置は異なってもよい。いくつかの態様では、親水性部分は、脂質部分とＴＥＥとの結合部から遠くに位置することがある。あるいは、親水性部分は、ＴＥＥ内の中心に位置することがある。
【００２７】
本発明は、別の態様では、脂質集合体と生体膜、特に細胞膜との融合性を改善するための脂質集合体におけるトランスフェクションエンハンサー要素（ＴＥＥ）の使用であって、トランスフェクションエンハンサー要素（ＴＥＥ）は、脂質分子に組み込まれていてもよく、またはイオン相互作用によって脂質集合体との複合体を形成してもよく、前記ＴＥＥは式（ＩＩ）：
（ＩＩ）疎水性部分−ｐＨ感受性親水性部分
（式中、ＴＥＥのｐＨ感受性親水性部分は、ｐＫａ２〜６の弱酸、または酸性基と弱塩基との組合せを含み、ｐＫａ３〜８である双性イオン構造である）
を有する使用も包含する。
【００２８】
１種または複数のトランスフェクションエンハンサー要素が脂質分子に組み込まれている場合、前記分子は式（Ｉ）：
（Ｉ）脂質−［疎水性部分−ｐＨ感受性親水性部分］
を有してもよい。
【００２９】
したがって、本発明の別の態様では、脂質集合体であって、本発明による１種もしくは複数の脂質、またはイオン相互作用によって前記脂質集合体との複合体を形成するトランスフェクションエンハンサー要素（ＴＥＥ）を含み、前記ＴＥＥは、次式：
疎水性部分−ｐＨ感受性親水性部分    （ＩＩ）
（各ＴＥＥの前記ｐＨ感受性親水性部分は独立に、ｐｋａ２〜６の弱酸、または酸性基と弱塩基との組合せを含むｐＫａ３〜８の双性イオン構造である）
を有する脂質集合体が提供される。
【００３０】
本発明のさらに別の態様では、両性特性を有する脂質相から形成された脂質集合体であって、前記集合体は、式（Ｉ）：
脂質部分−［疎水性部分−ｐＨ感受性親水性部分］    （Ｉ）
に従う、１種または複数のトランスフェクションエンハンサー要素を含む脂質（脂質−ＴＥＥ）を含み、
前記トランスフェクションエンハンサー要素（ＴＥＥ）は、一般式（ＩＩ）：
疎水性部分−ｐＨ感受性親水性部分    （ＩＩ）
（前記ＴＥＥの前記ｐＨ感受性親水性部分は、ｐｋａ２〜６の弱酸、または酸性基と弱塩基との組合せを含むｐＫａ３〜８の双性イオン構造である）
を有する脂質集合体が提供される。
【００３１】
前記脂質集合体は、医薬品有効成分を隔絶することができる。一実施形態において、前記医薬品成分は、ＤＮＡプラスミド、ポリヌクレオチド、およびオリゴヌクレオチドのような核酸系薬物である。
１種または複数のトランスフェクションエンハンサー要素（ＴＥＥ）を組み込み、またはイオン相互作用によって１種または複数の個々のトランスフェクションエンハンサー要素との複合体を形成する１種または複数の脂質を含む脂質集合体、特にリポソームを効率的に使用して、インビトロ、インビボ、またはエキソビボで細胞をトランスフェクトできることが明らかになった。
【００３２】
本発明は、環境の酸性化に応答する親水性−疎水性変化に基づいて医薬品有効成分の非ウイルス担体システムの改良をもたらす。このような機序は、自然界でも知られている。例えば、インフルエンザウイルスは、特定の融合機序を利用する。ウイルスが受容体媒介エンドサイトーシスによって細胞内部に取り入れられた後、ウイルスエンベロープはエンドソーム膜と融合し、そのウイルスゲノムが感染細胞のサイトゾルへ放出される。この融合事象は、ウイルスエンベロープ糖タンパク質の赤血球凝集素を触媒とする。融合の引き金は、赤血球凝集素の立体構造変化を招くエンドソーム区画内の酸性ｐＨである。同時に、ＨＡ２鎖のＮ末端融合ペプチドは、アミノ酸側鎖におけるカルボキシル基のプロトン化のため、疎水性シフトを起こす。疎水性ペプチドは、標的膜に挿入することができ、不安定化、続いて融合を招く（例えば、Stegmann et al., EMBO J., 9(13), 4231-4241, 1990)。
【００３３】
いくつかの実施形態において、本発明のＴＥＥのｐＨ応答性親水性部分は、ｐＫａ３〜５の弱酸を含むことがある。前記弱酸は、カルボキシル基、バルビツル酸およびその誘導体、キサンチンおよびその誘導体から選択することができる。
【００３４】
他の実施形態において、前記ｐＨ応答性親水性部分は、弱または強酸性基と弱塩基との組合せ（後者のｐＫａは４．５〜７である）を含む双性イオン構造とすることができる。好適には、前記双性イオン構造は、アニオン基、およびカチオン基としてのヘテロ環式窒素原子から形成することができる。
【００３５】
前記親水性部分の特定のｐＫａを実現するためには、前記ｐＨ応答性親水性部分は、ヒドロキシメチル基、ヒドロキシエチル基、メトキシメチル基、メトキシエチル基、エトキシメチル基、エトキシエチル基、チオメチル基、チオエチル基、メチルチオメチル基、メチルチオエチル基、エチルチオメチル基、エチルチオエチル基、クロリド基、クロルメチル基、ビニル基、フェニル基、ベンジル基、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、およびｔｅｒｔ−ブチル基、またはシクロヘキシル基を含む群から選択される構造要素で置換されていてもよい。
【００３６】
いくつかの実施形態において、前記疎水性部分は、最小鎖長が６個の元素である直鎖状、分枝状、または環状鎖を含む。この実施形態の一態様では、前記疎水性部分は、７個以上、かつ４０個までの元素を含み、第２の態様では、前記疎水性部分は６〜２０個の元素を含み、第３の態様では、前記疎水性部分は２０〜４０個の元素を含む。
【００３７】
前記疎水性部分の鎖の元素は、炭素原子とすることができる。一実施形態において、前記疎水性部分は飽和していてもよく、または不飽和結合を含んでいてもよい。他の実施形態において、前記疎水性部分は置換されていてもよい。
【００３８】
いくつかの実施形態において、前記疎水性部分の主鎖の分枝は、かなり小さいビルディングブロックを含むことができる。好ましいビルディングブロックは、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、メトキシ基、エトキシ基、メトキシメチル基、エトキシメチル基、メトキシエチル基、エトキシエチル基、およびビニル基、もしくはハロゲン基、またはそれらの混合物を含む。
【００３９】
あるいは、前記疎水性部分は、ステロールに由来してもよく、前記ステロールは、さらに置換されていてもよい。
【００４０】
１個または複数のヘテロ原子または化学基をｐＨ応答性トランスフェクションエンハンサー要素（ＴＥＥ）の疎水性部分に挿入することが可能である。このようなヘテロ原子または化学基は、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｈ）−、−Ｎ（Ｈ）−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−、−ＣＨ＝Ｎ−、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−、−Ｎ＝ＣＨ−、および／または−Ｓ−Ｓ−、アミノ酸もしくはその誘導体、α−ヒドロキシ酸、またはβ−ヒドロキシ酸から選択することができる。
【００４１】
ＴＥＥは、環境の酸性化に応答する親水性−疎水性変化を起こす。この変化は、ｐＨに対して応答する上述した親水性部分によって媒介される。
【００４２】
本発明のいくつかの実施形態において、トランスフェクションエンハンサー要素は、ｌｏｇＤ（４．０）−ｌｏｇＤ（７．４）≧１であり、ｐＨ７．４におけるｌｏｇＤは１〜１０である。
【００４３】
本発明の大部分の態様では、前記ｐＨ応答性トランスフェクションエンハンサー要素（ＴＥＥ）のｐＨ４におけるｌｏｇＤは、０を超える。
【００４４】
言うまでもなく、前記ｐＨ応答性トランスフェクションエンハンサー要素（ＴＥＥ）は、２つ以上のｐＨ応答性親水性部分を含むことができる。
【００４５】
トランスフェクションエンハンサー要素が、本発明に従って脂質部分に化学結合している場合、ＴＥＥは、前記脂質部分の極性頭部基に結合またはグラフトすることができる。別の実施形態において、脂質は、グラフトとｐＨ感受性トランスフェクションエンハンサー要素の間に化学リンカーを含むことができる。さらに、脂質部分の極性頭部基は、さらに置換されていてもよい。この態様のさらに別の実施形態において、前記脂質は、２種以上の親水性極性頭部基、または親水性に影響を及ぼすことなく様々な位置において置換を可能にする複雑な親水性頭部基を含むことができる。
【００４６】
本発明の脂質集合体は、中性および／またはカチオン性および／またはアニオン性脂質をさらに含む脂質相から形成することができ、前記脂質集合体の総電荷は、中性、カチオン性、またはアニオン性とすることができる。
【００４７】
本発明の一態様では、脂質集合体はリポソームであり、この態様の特定の一実施形態において、リポソームは、様々な粒径およびラメラ性を有する両性リポソームである。前記両性リポソームは、１種もしくは複数の両性脂質を含む脂質相、または（ｉ）安定なカチオン性脂質および帯電可能なアニオン性脂質、（ｉｉ）帯電可能なカチオン性脂質および帯電可能なアニオン性脂質、もしくは（ｉｉｉ）安定なアニオン性脂質および帯電可能なカチオン性脂質を含む脂質相から形成することができる。
【００４８】
本発明に従ってイオン相互作用を利用して、前記ＴＥＥが前記脂質集合体との複合体を形成する場合、前記ＴＥＥを、ポリカチオン性要素に結合させ、アニオン性脂質集合体と組み合わせてもよく、またはポリアニオン性要素に結合させ、カチオン性脂質集合体と組み合わせてもよい。
【００４９】
本発明の脂質集合体は、医薬品有効成分を隔絶することができ、特定の一実施形態において、前記医薬品成分は、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、またはＤＮＡプラスミドのような核酸系薬物である。
【００５０】
本発明の好ましい実施形態において、前記脂質は、下記の化合物（３０）〜（６９）を含む群から選択される。
【００５１】
本発明のさらに別の態様では、本発明による活性剤隔絶脂質集合体または両性リポソーム、およびそのための医薬として許容されるビヒクルを含む医薬組成物が提供される。
【００５２】
さらに別の態様では、本発明は、本発明による医薬組成物のヒトまたは非ヒト動物の炎症性、免疫もしくは自己免疫障害、および／または癌を治療または予防するための使用を包含する。
【００５３】
明確にするために、本発明の重要な用語について、次の定義および知識を使用する。
【００５４】
トランスフェクション
生体膜にわたる濃度勾配の消失を具体的に記載するために広く使用される。これは、前記過程が起こる実際の機序にかかわりなく、生体膜にわたる輸送、またはそれにわたる拡散、その透過もしくは浸透を含む。
【００５５】
ＬｏｇＰ
平衡状態で二相系の１−オクタノールおよび水に分配された化合物の各濃度の比である。オクタノール−水分配係数（ｌｏｇＰ）は、化合物の親油性または疎水性を記載するために使用される。
【００５６】
ＬｏｇＤ
１−オクタノール中の分子のすべての（非イオン化およびイオン化）種の平衡濃度と水相中の同じ種の平衡濃度の比である。
解離性混合物の分配係数ｌｏｇＤは、以下の通り定義される。
ｌｏｇＤ  ＝  ｌｏｇ  （Σ（ｃｉＨ２Ｏ）／  Σ  （ｃｉｏｒｇ））、式中
ｃｉＨ２Ｏは、水中のｉ番目の微細種の濃度であり、
ｃｉｏｒｇは、有機相中のｉ番目の微細種の濃度である。
【００５７】
ＬｏｇＤは、イオン化種が分子の中性の形と同様にみなされるという点でｌｏｇＰと異なる。したがって、ＬｏｇＤは、媒体の所与のｐＨにおけるｌｏｇＰである。ｐＨ７．４におけるＬｏｇＤは、血漿のｐＨにおける薬物の親油性の指標を示すために引用されることが多い。
【００５８】
ＬｏｇＰ値およびｌｏｇＤ値は、オクタノール／水系における分子またはそのイオン化した形の分配を測定することによって実験で確定することができる。実験値は、大量の個々の化合物について生成されており、エキスパートシステムを用いて、新規の種のｌｏｇＰ値およびｌｏｇＤ値を外挿によって求めることが可能である。このような１つのエキスパートシステムは、ＡＣＤ／ＬｏｇＰまたはＡＣＤ／ｌｏｇＤモジュールを備えたＡＣＤ／Ｌａｂｓであり、この開示内の計算には、ＡＣＤ／Ｌａｂｓ  ７．０６が使用された。
【００５９】
「核酸」または「ポリヌクレオチド」
本明細書では、任意の核酸含有分子を指し、これには、ＤＮＡまたはＲＮＡが含まれるが、これらに限定されない。ポリヌクレオチドという用語は、一般に任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドを指し、これは、未修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡでも、修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡでもよい。したがって、本明細書では、例えばポリヌクレオチドは、とりわけ一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖および二本鎖の領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、ならびに一本鎖および二本鎖の領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖領域、またはさらに典型的には二本鎖領域、または一本鎖および二本鎖の領域の混合物とすることができるＤＮＡおよびＲＮＡを含む混成分子を指す。
【００６０】
オリゴヌクレオチド
本明細書では、２個以上、しばしば４個以上、通常は１１個以上のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを含む分子と定義される。オリゴヌクレオチドの正確なサイズは、オリゴヌクレオチドの最終的な機能または使用を含めて、多くの要因に依存する。オリゴヌクレオチドは、例えば適切な配列のクローニングおよび制限、ならびにNarang et al., Meth. Enzymol., 68, 90-99, 1979のホスホトリエステル方法；Brown et al., Method Enzymol., 68, 109-151, 1979のホスホジエステル方法；Beaucage et al., Tetrahedron Lett., 22, 1859-1862, 1981のジエチルホスホラミダイト方法；Matteucci et al., J. Am. Chem. Soc., 103, 3185-3191, 1981のトリエステル方法；または自動合成方法；およびUS 4,458,066の固体支持方法などの方法による直接化学合成を含めて、任意の適当な方法で調製することができる。
【００６１】
脂質集合体
両親媒性分子を含む超分子集合体である。ある態様では、両親媒性物質は、脂質または洗浄剤と呼ばれ、別の態様では、このような物質は、生体膜を形成すること、または生体膜に挿入することが知られている。超分子集合体は、さらに無極性分子からの油を含んでもよい。したがって、本発明の超分子集合体は、様々な粒径およびラメラ性のリポソーム、ミセル、逆ミセル、立方もしくは六方脂質相、渦巻形、エマルジョン、ダブルエマルジョン、または実質的に脂質、油、もしくは両親媒性物質から構築される他の多量体集合体を含む。
【発明を実施するための形態】
【００６２】
上述されたように、細胞を効率的にトランスフェクトするために、１種または複数のトランスフェクションエンハンサー要素を含む１種または複数の脂質を含む脂質集合体を使用してもよいことが明らかになった。機構的には、ＴＥＥのｐＨ感受性親水性部分は、酸性ｐＨでプロトン化される。これは、官能基の極性の低下を招く。脂質（Ｉ）またはその一部分、例えばその全体のＴＥＥまたはその一部分は、トランスで提供されている脂質二重層に挿入でき、それによって融合事象を促進することが可能である。酸性化時に構造要素（ＩＩ）は、それ自身の脂質二重層に挿入し、それによって融合性および細胞トランスフェクションを改善する構造欠陥を生じることも可能である。
【００６３】
薬物（例えば、核酸）の細胞の細胞質へのリポソームによる送達は、非常に多くの場合、酸性ｐＨを有するエンドソームからの脱出に成功する必要がある。したがって、本発明の範囲内で、構造要素（ＩＩ）を含むこのような脂質は、リポソームのトランスフェクション能力を、その電荷にかかわりなく付与または改善することができる。
【００６４】
いくつかの説明を本発明の発見を説明するために記載することができるが、融合またはトランスフェクションの向上が実現される正確な機序の理解は、本発明を実施するためには必要でなく、本明細書に記載されていない他の機序さえ、関与する可能性がある。
【００６５】
ＴＥＥの親水性部分
本発明の一態様では、親水性部分は、ｐＨ値約４と生理的ｐＨの７．４との間において親水性で応答する弱酸である。表１ａの式（１）〜（３）のカルボキシル基、バルビツル酸またはその誘導体、特にキサンチンまたはその誘導体は、このようなｐＨ応答性親水性部分を表すが、これらに限定されない。
【００６６】
【表１−ａ】
2014208687.tif 000004
【００６７】
（１）〜（３）に由来する親水性頭部基のＬｏｇＤ値は、低ｐＨで高く、中性またはより高いｐＨで低い。
キサンチン、ピリミジン（ウラシル）、またはバルビツル酸の他の誘導体を、下記の表１ｂに開示し、ｐＨ４．０およびｐＨ７．４におけるそれらのｌｏｇＤ値に関して分析する。（１００）〜（１２９）の化合物のメトキシエチル部分は、上述されたようにＴＥＥの疎水性部分を表し、またはそれで置換されていてもよい。
【００６８】
【表１−ｂ】
2014208687.tif 000005
【表１−ｃ】
2014208687.tif 000006
【表１−ｄ】
2014208687.tif 000007
【表１−ｅ】
2014208687.tif 000008
【表１−ｆ】
2014208687.tif 000009
【００６９】
本発明の別の態様では、親水性部分は、環境のｐＨの変化に応答する双性イオン基を含む。双性イオン構造は、カチオン基とアニオン基が両方とも帯電しているｐＨ値で存在する。一般化ｌｏｇＤプロットを図１に示す。双性イオンは、帯電した親基より高いｌｏｇＤ値を有することが明らかである。
【００７０】
酸性化時のｌｏｇＤの所望の増加は、ｌｏｇＤ曲線の右側で表わされ、カチオン電荷基のｐＫａに依存する。これは、アニオン基自体のｐＫａからむしろ独立している。一例として、アニオン基は、カルボキシル基とすることができ、カチオン基は、その基から炭素原子２〜５個離れたヘテロ環の窒素原子とすることができる（例えば、化合物１０または１１）。ピリジルカルボン酸、イミダゾールカルボン酸、または同類のものは、このようなｐＨ応答性親水性部分の少数の表現である。双性イオンは、ｐＨ４〜ｐＨ７で存在し、それによって、本発明のｐＨ応答性親水性の頭部基が提供される。これに反して、約９という高ｐＫａの単純なアミノ基（例えば、化合物１３）、または有効なｐＫａをもたないが一定の陽電荷を提供する第四級アンモニウム基（例えば、化合物１２）は、双性イオンが存在するｐＨ値の範囲を広げ、親水性の変化は、所望のｐＨ領域（ｐＨ２〜９、または上記に示すより好ましい範囲）では全く起こらない（図１および表２を参照のこと）。
【００７１】
【表２】
2014208687.tif 000010
【００７２】
親水性部分は、さらに極性基または無極性基で置換されていてもよい。本発明の一態様では、置換は、親水性部分の特定のｐＫａを実現するように選択される。このようなｐＫａ値調整を実現するための規則は、当業者に周知であり、例えば構造のｐＫを低下させるための、バルビツル酸またはキサンチンの窒素原子におけるヒドロキシメチル基、ヒドロキシエチル基、メトキシメチル基、メトキシエチル基、エトキシメチル基、エトキシエチル基、チオメチル基、チオエチル基、メチルチオメチル基、メチルチオエチル基、エチルチオメチル基、エチルチオエチル基、クロロ基、クロロメチル基、ビニル基、フェニル基、もしくはベンジル基、またはそれらの混合物による置換を含む。式（２）または（３）のＲｍ、Ｒｎ、またはＲｏの位置における置換は、特にこのようなｐＫ値のシフトを実現するのに適している。
【００７３】
言うまでもなく、ｐＫ値は、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、およびｔｅｒｔ−ブチル基、もしくはシクロヘキシル基、またはそれらの混合物を含む置換基で、より高い値にシフトすることができる。置換キサンチンおよびそのそれぞれのｐＫ値に関する優れた概説は、Kulikowska et al., Biochim. Acta Pol., 51, 493-531, 2004に見出される。
【００７４】
カルボキシル基のｐＫａ値も、空間的に近接した置換または化学的変更で影響を受けることが知られている。アクリル酸誘導体、安息香酸、ピリジニルカルボン酸、α−もしくはβ−ヒドロキシカルボン酸、またはα−もしくはβ−チオカルボン酸などの芳香族カルボン酸は、ハロゲン化カルボン酸と共に、親化合物より低いｐＫａ値を有する。一方、＋Ｉ効果をもつ置換によって、例えばシクロヘキシルカルボン酸におけるカルボキシル基のｐＫａがより高い値に変化する。
【００７５】
置換親水性部分の具体例としては、表３の式（４）〜（９）（ただし、Ｒで、ＴＥＥの疎水性部分が特定される）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００７６】
【表３】
2014208687.tif 000011
【００７７】
親水性部分の別の化学的表現は、弱酸の群から、物質のｌｏｇＤ、ｐＨ、およびｐＫａとの関係を使用して特定することができる。酸について、これは以下の通り表すことができる。
ｌｏｇＤ＝ｌｏｇＰ＋ｌｏｇ（１＋１０（ｐＨ−ｐＫａ））；
式中、ｌｏｇＰは非イオン化の形の分配係数である。式は、ゼロイオン強度の条件を反映し、ｌｏｇＤの極めて低い値は、高ｐＨにおける酸について計算されている。イオン強度が約０．１５Ｍである生理的条件下で、塩形成は、このようなｌｏｇＤの極値を限定している。
【００７８】
図２は、いくつかの親水性部分について、ｌｏｇＤの計算値を示す。
ｐＨ−ｐＫａに対して曲線をプロットすると、別の分析によって、ｌｏｇＤの同一のシフトが明らかになる（図３を参照のこと）。
【００７９】
それらのｐＫａ値に関して標準化すると、本明細書で分析されたすべての親水性部分についてｌｏｇＤプロットが同様になる。ｌｏｇＤの最大差である３．７５単位は、単一親水性部分のイオン化で実現することができる。双性イオン形成の最大振幅は、ｌｏｇＤの約２．５単位である。
【００８０】
全振幅は、ｐＨの約６単位のかなり大きいシフトを必要とする。本発明の多くの態様で考慮されたΔｐＨ約３．４（ｐＨ７．４〜ｐＨ４）の実用範囲内で、ｌｏｇＤの最大差は、ｐＫａ約４では約３単位である。ｐＨがｐＫａより０〜４単位高いときはいつでも、ｌｏｇＤは、非常に感受性が高く反応し、最も感受性の高い反応は、ｐＫａより１〜２．５単位高いｐＨ値において起こる。この反応は、図４でも分析されている。
【００８１】
実際的には、親水性部分の理想的ｐＫａは約４である。ｐＫａ２〜６の親水性部分（最大振幅約１．５単位）が好ましく、ｐＫａ３〜５の親水性部分（最大振幅約２．５単位）がより好ましい。本発明の範囲内の他の親水性部分は、ｐＫａ値が１〜７であり得る。
【００８２】
ＴＥＥの疎水性部分
本発明のＴＥＥは、生体脂質膜の透過に寄与する疎水性部分を含む。このような疎水性部分の化学的表現としては、最小鎖長が６個の元素である直鎖状、分枝状、または環状鎖が挙げられる。本発明の多くの態様では、鎖元素は炭素原子である。本発明のいくつかの態様では、鎖元素は、２個以上の他の鎖元素と共有結合を形成することができるヘテロ原子を含むことができる。水素原子またはハロゲン原子は、鎖に置換することができるが、鎖の元素ではない。疎水性部分は、７個以上の元素を含むことができ、４０個までの元素を含んでもよい。本発明のいくつかの態様では、疎水性部分は、６〜１２個の元素を含む。本発明の他の態様では、疎水性部分は、１２〜２０個の元素を含む。本発明のさらに他の態様では、疎水性部分は実に２０〜４０個の元素を含む。
【００８３】
一態様では、主鎖の分枝は、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、メトキシ基、エトキシ基、メトキシメチル基、エトキシメチル基、メトキシエチル基、エトキシエチル基、およびビニル基、もしくはハロゲン基、またはそれらの混合物など１種または複数のかなり小さいビルディングブロックを含む。
【００８４】
疎水性部分は、飽和とすることができ、または不飽和結合を含むことができる。
【００８５】
別の態様では、より複雑な分枝状およびまたは環状の環系は、疎水性部分の化学的表現とすることができる。このような態様の一実施形態において、疎水性部分はステロールに由来する。言うまでもなく、ステロールは、さらにメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、メトキシ基、エトキシ基、メトキシメチル基、エトキシメチル基、メトキシエチル基、エトキシエチル基、およびビニル基、もしくはハロゲン基、またはそれらの混合物で置換されていてもよい。本発明の別の態様では、疎水性部分は、ヒドロキシル基など１種または複数の親水性基で置換されているステロールを含むことができる。好ましい実施形態において、ステロールは、３、７、および１２の位置の１つまたは複数においてヒドロキシル基を含む。好ましい態様では、ステロールはコレスタンであり、さらに好ましい実施形態において、コレスタンは、３、７、または１２の位置の１つまたは複数においてヒドロキシル化されている。
【００８６】
１個または複数のヘテロ原子または化学基を疎水性部分に挿入することが可能である。本発明の一実施形態において、疎水性部分は、５個以下のヘテロ原子または化学基を含み、別の実施形態において、２個以下のヘテロ原子または化学基を含む。
【００８７】
ヘテロ原子または化学基は、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｈ）−、−Ｎ（Ｈ）−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−、−ＣＨ＝Ｎ−、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−、−Ｎ＝ＣＨ−、および／または−Ｓ−Ｓ−を含む群から選択することができる。
【００８８】
いくつかの態様では、前記ヘテロ原子および／または化学基は、アミノ酸、α−ヒドロキシ酸、またはβ−ヒドロキシ酸に由来する。
【００８９】
一実施形態において、前記アミノ酸ビルディングブロックは、プロリン、グリシン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、チロシン、トリプトファン、フェニルアラニン、もしくはメチオニン、またはそれらのペプチドの群から選択され、前記α−およびβ−ヒドロキシ酸は、グリコール酸、乳酸、またはヒドロキシ酪酸を含む群から選択される。
【００９０】
このような態様の別の実施形態において、２個以上のエーテル基が存在し、エーテル結合間の間隔は、ポリ−エチレングリコールまたはポリ−プロピレングリコール中のモノマー元素を表す２個の炭素原子である。
【００９１】
ＴＥＥの構造
ＴＥＥの構成は、その物理化学的パラメータによって支配されている。ＴＥＥは、環境の酸性化に応答して親水性−疎水性変化を起こす。この変化は、ｐＨに対して応答する上述した親水性部分によって媒介される。このような応答は、最小振幅が０．５  ｌｏｇＤであるべきであり、それによってｌｏｇＤのより高い絶対値は、より低いｐＨで実現される。一態様では、このような振幅は、１  ｌｏｇＤより大きく、これは、このようなＴＥＥの水相から膜の疎水性内部への分布が１０倍より好ましくなることを意味する。別の態様では、このような振幅は、１．５より大きく、いくつかの態様では、親水性の形と疎水性の形との間の振幅は、２  ｌｏｇＤ単位より大きい。
本発明の一態様では、親水性部分は、生理的ｐＨとわずかに酸性条件のおよそｐＨ４との間のｐＨ値に応答する。このようなわずかに酸性条件は、エンドソームまたはリソソームのような細胞小臓器内で見られる。したがって、ＴＥＥは、細胞へのエンドサイトーシスによる取り込み後に、脂質凝集体またはリポソームのエンドソーム脱出を媒介することができる可能性がある。進行中の炎症の腫瘍組織または領域も、わずかに酸性の環境を提供し、したがってＴＥＥは、これらの領域内に脂質凝集体またはリポソームを蓄積するのに有用であり得る。蓄積は、具体的には腫瘍もしくは間質細胞、または免疫系の細胞、または炎症性領域に存在する線維芽細胞で起こり得る。
【００９２】
上述されたように、親水性のシフトの支配的ｐＫａは、カルボン酸、バルビツル酸、またはキサンチンなど弱酸性基のｐＫａとすることができる。好ましい実施形態において、本質的に弱酸によって生成（ｄｒｉｖｅｎ）されたＴＥＥのｐＫは、ｐＨ７．４における親水性とｐＨ４における疎水性の差を最大にするように最適化することができる。好ましい態様では、このような親水性部分のｐＫａは２〜６である。より好ましい態様では、このｐＫａは３〜５である。
【００９３】
親水性のシフトが双性イオン形成によって引き起こされる場合では、支配的ｐＫａは、ピリジン、イミダゾール、モルホリン、またはピペラジンなどの弱塩基のｐＫａである。双性イオンでは、塩基のｐＫａは、３〜８、好ましくは４．５〜７、より好ましくは５〜６．５である。
【００９４】
ＴＥＥは、１種または複数の親水性部分を含むことがあり、親水性部分の相対および絶対位置決めは異なってもよい。場合によっては、隣接効果が生じることがある。親水性基内での効果としては、とりわけ、ｐＫシフトおよび双性イオン形成が挙げられる。親水性基間での効果としては、それぞれのｐＫ値のシフトを挙げることもできる。これは、当業者に周知であり、例えば基間の間隔が２〜５個の炭素原子であるとき、ごく接近したカルボン酸間で頻繁に観察される。
【００９５】
より複雑な親水性部分のいくつかの例を下記に示す（表４）。
【００９６】
【表４】
2014208687.tif 000012
【００９７】
２つ以上の親水性部分を含むＴＥＥは、その中性状態とわずかに酸性状態の間で親水性の振幅がより大きい。言うまでもなく、親水性部分の混合物を単一の疎水性部分と組み合わせることができる。このような混合物は、疎水性シフトの振幅およびｐＨ感受性のより正確な調整を可能にすることができる。しかし、いくつかの親水性部分が大きすぎると、ＴＥＥの親水性がもはや疎水性シフトで補償することができない値に増加する。
【００９８】
したがって、異なるｐＨ値間での親水性の振幅に加えて、第１のｐＨにおけるＴＥＥの絶対親水性は、本発明の非常に重要な態様を表す。
【００９９】
絶対親水性の点から、ＴＥＥ自体のｌｏｇＤは、中性または生理的ｐＨの条件でのわずかに親水性と幾分疎水性との間で異なってもよい。言い換えれば、ＴＥＥは、ｐＨ７．４におけるｌｏｇＤが−２〜１０である。
好ましい態様では、ｌｏｇＤ（７．４）は１より大きく、いくつかの態様では、ｌｏｇＤ（７．４）は３より大きい。本発明の他の態様では、ＴＥＥのｌｏｇＤ（７．４）は、１０より小さく、いくつかの態様では、ｌｏｇＤ（７．４）は７より小さい。
【０１００】
ｐＨ７．４におけるその絶対ｌｏｇＤから独立に、ｐＨ４．０におけるＴＥＥのｌｏｇＤは、０を超える必要がある。
【０１０１】
負のｌｏｇＤ（７．４）のＴＥＥは、疎水性シフトの振幅が大きいことが必要であり、このような大きい振幅は、１種または複数のカルボキシル基、キサンチン基、またはバルビツル酸基を含む親水性部分によって提供することができる。
【０１０２】
本発明の一実施形態において、ＴＥＥは、次の一般式のうちの１つを有する。
【化３】
2014208687.tif 000013
式中、ＲｅｐｉからのＲｅｐはいずれも独立に、１〜８個のＣ原子を有する非分枝状、分枝状、または環状の置換または非置換アルキル基、アルケニル基、アルキレン基、アルキニル基、またはアリール基であり、
前記置換基は、１種または複数のｐＨ感受性親水性部分、低級アルキル、アルキレン、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルコキシアルキル、アルキルチオ、またはアルキルチオアルキルから選択され、「低級」は１〜６個の原子を意味し、
Ｌｊ、Ｌｋ、またはＬｌからのＬはいずれも独立に、存在しないか、あるいは独立に−ＣＨ２−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）−、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＣＨ＝Ｎ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｎ＝ＣＨ−、−Ｓ−Ｓ−、−ＮＨ−、−Ｎ（Ｒ１３）（Ｒ１４）−（ただし、Ｒ１３およびＲ１４は独立に、ＨもしくはＣ１〜Ｃ６アルキルであり、またはＲ１３もしくはＲ１４の一方は、存在しなくてもよい）、または
【化４】
2014208687.tif 000014
【化５】
2014208687.tif 000015
またはアミノ酸、α−ヒドロキシ酸、またはβ−ヒドロキシ酸を含む群から選択され、
ＴＥＥ中のＣ原子の総数は、６〜４０個であり、ｐは≦４０である；
あるいは
−ステロール    （ＶＩＩ）
式中、前記ステロールは、１種または複数の親水性部分、−ＯＨ、−ＳＨ、または低級アルキル、アルキレン、アルケニル、もしくはアルキニル、アルコキシ、アルコキシアルキル、アルキルチオ、もしくはアルキルチオアルキルで置換されていてもよく、「低級」は１〜６個の原子を意味する。
【０１０３】
この実施形態の一態様では、一般式ＶＩ中のアミノ酸は、プロリン、グリシン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、チロシン、トリプトファン、フェニルアラニン、もしくはメチオニン、またはそれらのペプチドの群から選択され、一般式ＶＩ中のα−およびβ−ヒドロキシ酸は、グリコール酸、乳酸、またはヒドロキシ酪酸を含む群から選択される。
【０１０４】
好ましくは、ｐＨ感受性親水性部分は、次の一般式のうちの１つを有するｐｋａが１〜７、好ましくは２〜６、より好ましくは３〜５の弱酸である。
【化６】
2014208687.tif 000016
【化７】
2014208687.tif 000017
式中、点線は、任意選択である二重結合を表し、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は独立に、ＴＥＥの疎水性部分、水素、０〜５個の不飽和部位を有する直鎖状、分枝状、もしくは環状の非置換もしくは置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、アルキレン、またはヘテロアルキル、あるいはアリール基であり、前記基は、−Ｏ−または−Ｓ−から選択される０〜５個のヘテロ原子を含み、前記ヘテロ原子は、前記基中の第１の原子ではなく、前記置換基は、ヒドロキシ基、メルカプト基、オキソ基、ホルミル基、ニトロ基、シアノ基、ハロ基、またはトリハロメチル基から選択され、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は、代替としてかつ独立にアルコキシ基、アルコキシアルキル基、アルキルチオ基、アルキルチオアルキル基、ヒドロキシ基、メルカプト基、オキソ基、ホルミル基、ニトロ基、シアノ基、ハロ基、またはトリハロメチル基とすることができ、Ｄは、Ｃ、または０〜３個の不飽和部位を有し、かつ−Ｏ−、−Ｓ−から選択される０〜５個のヘテロ原子を含む非置換もしくは置換環状アルキル基もしくアリール基であり、前記置換基は、アルキル基、アルキレン基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基、アルコキシアルキル基、アルキルチオ基、アルキルチオアルキル基、ヒドロキシ基、メルカプト基、オキソ基、ホルミル基、シアノ基、ハロ基、またはトリハロメチル基から選択され、Ｙ１、Ｙ２、およびＹ３は独立に、ＯまたはＳであり、
Ｇは、ＣまたはＮとすることができ、ＧがＮであるとき、Ｒ１またはＲ２の一方は、存在しないことがあり、Ｒ１およびＲ２はＲ４と定義される；
あるいは
【化８】
2014208687.tif 000018
式中、点線は、任意選択である二重結合を表し、
Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、またはＲ９は、独立にＴＥＥの疎水性部分、水素、０〜５個の不飽和部位を有する直鎖状、分枝状、もしくは環状の非置換もしくは置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、アルキレン、またはヘテロアルキル、あるいはアリール基とすることができ、前記基は、−Ｏ−または−Ｓ−から選択される０〜５個のヘテロ原子を含み、前記ヘテロ原子は、前記基中の第１の原子ではなく、前記置換基は、ヒドロキシ基、メルカプト基、オキソ基、ホルミル基、ニトロ基、シアノ基、ハロ基、またはトリハロメチル基から選択され、
Ｒ８はＯまたはＳＨであり、
Ｍ３はＮまたはＣであり、
Ｍ２はＣまたは−Ｏ−であり、Ｍ２が−Ｏ−である場合、Ｒ６は存在せず、
Ｍ１はＮまたはＣまたは−Ｏ−であり、Ｍ１が−Ｏ−である場合、Ｒ５は存在せず、
Ｍ１、Ｍ２、またはＭ３がＣであるとき、Ｒ５、Ｒ６、またはＲ７は、さらにアルコキシ基、アルコキシアルキル基、アルキルチオ基、アルキルチオアルキル基、ヒドロキシ基、メルカプト基、オキソ基、ホルミル基、ニトロ基、シアノ基、ハロ基、またはトリハロメチル基とすることができ、Ｒ５、Ｒ６、またはＲ７と定義されたさらなる置換基Ｒ５’、Ｒ６’、またはＲ７’は、Ｃ原子に結合していてもよい；
あるいは
【化９】
2014208687.tif 000019
式中、Ｒ１０は、ＴＥＥの疎水性部分とすることができ、Ｒ１１およびＲ１２は独立に、水素、ヒドロキシ基、メルカプト基、ホルミル基、ニトロ基、シアノ基、またはハロ基、またはトリハロメチル基とすることができるが、Ｒ１１およびＲ１２の少なくとも一方はＨ以外であり、
Ｙ１＊およびＹ２＊は独立に、ＯまたはＳである。
【０１０５】
あるいは、ＴＥＥの前記ｐＨ感受性親水性部分は、酸性化時に双性イオンを形成し、前記双性イオンのカチオン電荷は、ｐｋａが３〜８、好ましくは４．５〜７、より好ましくは５〜６．５の弱塩基の窒素原子であることが好ましい。一態様では、前記弱塩基は、イミダゾール、モルホリン、ピリジン、またはピペラジンである。あるいは、前記弱塩基は非環状アミンである。
このような弱塩基のｐｋａは、窒素原子のβ位もしくはγ位のヘテロ原子によって、または空間的に近接した置換、例えば窒素原子のα位もしくはβ位での置換によって影響される可能性があることが当技術分野で知られている。好ましいヘテロ原子は−Ｏ−または−Ｓ−である。−Ｉ効果をもつ置換基は、このような弱塩基のｐｋａを低下させることができ、アルコキシ基、アルキルチオ基、ヒドロキシ基、メルカプト基、オキソ基、ホルミル基、ニトロ基、シアノ基、ハロ基、またはトリハロメチル基が挙げられるが、これらに限定されるものではない。＋Ｉ効果をもつ置換基は、このような弱塩基のｐｋａを増大させることができ、例えばアルキル基が挙げられる。窒素原子のβ位またはγ位におけるヘテロ原子、および窒素原子のα位またはβ位における置換基は、ＴＥＥの疎水性部分の一部分でもよい。
【０１０６】
前記双性イオンのアニオン電荷は、カルボキシル基、ホスフェート基、ホファイト基、スルホ基、またはスルフィノ基から選択される酸性基である。カルボキシル基が好ましい。アニオン電荷は、双性イオンのカチオン電荷から炭素原子２〜５個離れている。
【０１０７】
好ましいＴＥＥの具体例
ＴＥＥの次の化学的表現は、さらに本発明の教示を説明するはずである。しかし、本発明の範囲は、下記に示す具体例に決して限定されない。好ましいＴＥＥは、次の属性を有する。
疎水性部分の鎖元素の数：８〜４０
ｌｏｇＤ（７．４）：１〜１０
ｌｏｇＤ（７，４）−ｌｏｇＤ（４）：＞１
弱酸のｐＫａ：２〜６
双性イオン形成のための能力をもつ弱塩基のｐＫａ：４．５〜７
【０１０８】
Ａ．カルボン酸をベースにしたＴＥＥ
本発明の一態様では、ＴＥＥは、親水性部分として１種または複数のカルボン酸基を含む。
【０１０９】
このような態様のいくつかの実施形態において、疎水性部分は、炭素原子の直鎖を含む。いくつかの表現では、このような鎖はアルキル直鎖である。
【０１１０】
下記の表５は、異なる鎖長のカルボン酸について、ｐＨ４およびｐＨ７．４におけるｌｏｇＤを分析している。
【０１１１】
【表５】
2014208687.tif 000020
【０１１２】
メチレン基による鎖伸長によって、ｌｏｇＤが約０．５単位増大することが明らかになる。６〜２６個のＣ原子を有するカルボン酸は、上記に示す選択基準に従って好ましいＴＥＥを表す。
【０１１３】
カルボン酸基の位置効果は、あまり重要ではなく、カルボン酸基は、強制ではないが、疎水性部分の末端基である。
【０１１４】
いくつかの態様では、疎水性部分の主鎖の１つまたは複数の位置を置換（Ｒ−）することができ、いくつかの置換の影響を、ヘキサデカン酸（パルミチン酸）誘導体について下記で分析する（表６）。
【０１１５】
【表６】
2014208687.tif 000021
【０１１６】
Ｒ＝メチルの場合、Ｒはそれぞれ、約０．３５単位のｌｏｇＤ増加をもらす。Ｒ＝エチルの場合、このような増加は１置換につき約０．８８であり、Ｒ＝プロピルの場合、増加は１置換につき約１．４１である。主鎖での場合と同様に、側鎖でメチレン基を加えることによっても、ｌｏｇＤが約０．５単位増大することが明らかになる。
【０１１７】
他の態様では、Ｒは、ヘテロ原子、特に酸素原子を含み、いくつかの置換の影響を、ヘキサデカン酸（パルミチン酸）誘導体について下記で分析する（表７）。
【０１１８】
【表７】
2014208687.tif 000022
【０１１９】
Ｒ＝メトキシの場合、Ｒはそれぞれ、約−１．４単位のｌｏｇＤ低下をもたらす。Ｒ＝エトキシの場合、追加のメチレン基はｌｏｇＤの約０．５単位をもたらし、得られた効果は、ｌｏｇＤの約−０，９単位である。Ｒ＝メトキシエチルの場合、１置換につき平均的影響は、ｌｏｇＤの約−０．４単位である。
【０１２０】
側鎖上の他の置換は、異なる影響によって鎖のｌｏｇＤをさらに変化させることができ、Ｒのいくつかの例を、下記の表８に示す（ヘキサデカン酸に基づく分析）。
【０１２１】
【表８】
2014208687.tif 000023
【０１２２】
置換基自体は、ｐＨ応答性でなく、したがってＴＥＥのｐＨ応答に寄与しない。また、Ｒの影響はｐＨに無関係である。しかし、先に指摘した通り、Ｒは、親水性部分のｐＫａに影響を及ぼすことができ、それによって生理的ｐＨとｐＨ４…５の間でのｌｏｇ（Ｄ）の振幅が変化する。
【０１２３】
さらに他の態様では、ヘテロ原子は、疎水性部分の主鎖の一部分とすることができる。他の態様では、主鎖は、不飽和結合を含んでもよい。さらに他の態様では、主鎖は、側鎖における置換と組み合わせて、ヘテロ原子を含んでもよい。このような変化は、ＴＥＥのｌｏｇＤに影響を及ぼす可能性があり、主鎖のいくつかの変形を、ヘキサデカン酸について分析した（表９）。
【０１２４】
【表９】
2014208687.tif 000024
【０１２５】
したがって、二重結合１つは、ｌｏｇＤを約−０．４〜０．５単位低下させ、ポリ−エチレングリコールに由来する反復構造で見られる主鎖中のエーテル結合は、ｌｏｇＤを約２．５単位低下させ、前記効果は、追加のメチル基をポリ−プロピレングリコールからの反復構造中などのエーテル結合の隣に加えることによって、約１．６単位に低下する。
【０１２６】
主鎖上の他の置換は、異なる影響によって鎖のｌｏｇＤをさらに変化させることができ、いくつかの例を、下記の表１０に示す（ヘキサデカン酸に基づく分析）。
【０１２７】
【表１０】
2014208687.tif 000025
【０１２８】
置換基自体は、ｐＨ応答性でなく、したがってＴＥＥのｐＨ応答に寄与しない。また、Ｒの影響はｐＨに無関係である。しかし、先に指摘した通り、Ｒは、親水性部分のｐＫａに影響を及ぼすことができ、それによって生理的ｐＨとｐＨ４…５の間でのｌｏｇ（Ｄ）の振幅が変化する。
【０１２９】
上記に示した例および分析は、特にＴＥＥとしての構造要素を特定するために本発明を実施するための指針を与える。アイソフォームおよび位置異性体は、本発明の開示内である。本開示で先に記載された通り、置換基間の隣接効果が生じ得る。しかし、これらの効果は、当業者に周知であり、標準化学文献、データベース、またはＡＣＤ／Ｌａｂｓなどの化学ソフトウェアの一部分であるものに記載されている。
【０１３０】
環系
いくつかの態様では、疎水性部分は、シクロアルカン、シクロアルケン、もしくはシクロアルキンなどの環状構造、または芳香族環構造を形成することができる。
下記の表で、環状要素の少数の表現を分析し、他の要素の既知の構造寄与から、より多くの環状要素を開発することができる。言うまでもなく、環状要素を、特に上記で分析した基でさらに置換することが可能である。
【０１３１】
【表１１】
2014208687.tif 000026
【０１３２】
ステロール
本発明の特定の変形では、疎水性部分の環系は、ステロール中などのより複雑な環系とすることができる。この場合も、さらなる置換は、ステロール主鎖に存在することができ、下記に示す分析は、ステロールの天然誘導体、例えばステラン主鎖の３位、７位、および１２位におけるヒドロキシル基置換について、ｌｏｇＤのいくつかの局面を詳述している。
【０１３３】
また、ＴＥＥ中のステロールの配向は異なってもよく、胆汁酸中などの２６位におけるカルボキシル基の存在、またはコレステロールヘミスクシネート（ＣＨＥＭＳ）中などの３位へのグラフトは、本発明のいくつかの例を表す（表１２および１３）。
【０１３４】
表１２：ＴＥＥとして使用した胆汁酸誘導体のｌｏｇＤの分析。分析の目的で、３’ヒドロキシル基をメチル化して、有望な薬物の結合のモデルを作製したと想定した。
【０１３５】
【表１２】
2014208687.tif 000027
【０１３６】
表１３：ＴＥＥとして使用したＣＨＥＭＳ誘導体のｌｏｇＤの分析。分析の目的で、２６位のカルボキシル基をメタノールでエステル化して、有望な薬物の結合のモデルを作製した。この分析では、３’位をコハク酸でエステル化し、それによってＴＥＥの親水性部分としての非置換カルボキシル基がもたらされる。
【０１３７】
【表１３】
2014208687.tif 000028
【０１３８】
Ｂ．バルビツル酸およびキサンチンをベースにしたＴＥＥ
上記の考察は、言うまでもなく、構造的に異なる親水性部分を含むＴＥＥに移すことができる。ＴＥＥの疎水性部分の構造要素の寄与は、１種または複数の親水性部分の化学的性質にかかわりなく同一でない場合、類似している。バルビツル酸またはキサンチンを含むＴＥＥのいくつかの特定の化学的表現は、開示のこの部分を限定することなく、このようなＴＥＥの構成を示すことができる（化合物１７〜２３）。
【化１０】
2014208687.tif 000029
【化１１】
2014208687.tif 000030
【化１２】
2014208687.tif 000031
【化１３】
2014208687.tif 000032
【化１４】
2014208687.tif 000033
【化１５】
2014208687.tif 000034
【化１６】
2014208687.tif 000035
【０１３９】
ＴＥＥ構造内の親水性部分の位置は異なってもよい。いくつかの態様では、親水性部分は、分子とＴＥＥとの間の結合から遠くに位置している。他の態様では、親水性部分は、ＴＥＥ内の中心に位置している。
【０１４０】
ＴＥＥの使用
ＴＥＥは、本発明内では脂質集合体と総称されるミセル、リポプレックス、渦巻形、エマルジョン滴など脂質、またはリポソーム、または他の超分子凝集体に組み合わせる必要がある。
【０１４１】
ＴＥＥと脂質集合体との組合せには、いくつかの異なる手法を採用することができる。これらの手法としては、化学結合、物理的引力、または他の相互作用、例えばキレート結合が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１４２】
本発明の一態様では、ＴＥＥは、化学結合によって脂質に直接結合することができる。ＴＥＥを含む脂質を下記でさらに詳細に説明する。
本発明の別の態様では、脂質集合体を生成した後、ＴＥＥをこのような集合体にグラフトすることができる。このようなカップリングを実施するための化学結合技法および方法は、文献、例えばG. T. Hermanson, Bioconjugate Techniques, Academic Press, 1996に広範に報告されている。
本発明の別の態様では、ＴＥＥは、例えばビオチンとビオチン結合タンパク質との分子認識、２つの相補的または部分相補的オリゴヌクレオチドの分子認識、またはシクロデキストリンとシクロデキストリンの結合ポケットに適合する分子との分子認識を使用して、DeGrip et al., Biochem. J., 330, 667-674, 1998に開示されている様々な脂質または洗浄剤、WO 06/105361に開示されているステロールまたはアダマンタン単位、WO 06/105361に開示されているステロイドまたはアダマンタン単位などの他のステロールなど脂質集合体系との複合体を形成することができる。
【０１４３】
別の態様では、ＴＥＥは、イオンまたは静電的相互作用を使用して脂質集合体との複合体を形成することができる。このような態様の一実施形態において、ポリカチオン性要素をさらに含むＴＥＥは、アニオン性脂質集合体と組み合わせられる。別の実施形態において、ポリアニオン性要素をさらに含むＴＥＥは、カチオン性脂質集合体と組み合わせられる。ポリカチオン性要素としては、例えばポリエチレンイミン、ポリアリルアミン、スペルミン、テルミン、スペルミジン、ジスペルミン、トリスペルミン、テトラスペルミン、オリゴスペルミン、プトレシン、またはリシン、オルニチン、もしくはアルギニンからのポリマーもしくはオリゴマーなどが挙げられるが、これらにに限定されない。ポリアニオン性要素としては、例えばアクリル酸、メタクリル酸、グルタミン酸、アスパラギン酸などのポリマーまたはオリゴマーが挙げられるが、これらに限定されるものではない。脂質集合体とポリイオンを組み合わせるための技法および実験プロトコルは、WO 01/64330に開示されている。
【０１４４】
このような使用のためのＴＥＥ誘導体としては、化合物２４〜２９が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１４５】
【表１４−１】
2014208687.tif 000036
【表１４−２】
2014208687.tif 000037
【表１４−３】
2014208687.tif 000038
【０１４６】
ＴＥＥを含む脂質
本発明の一実施形態において、１種または複数のＴＥＥを含む脂質は、次の一般式を有することができる。
脂質−（Ｌ２）ｒ−（ＴＥＥ）ｒ    （ＸＩＩ）
式中、Ｌ２は、存在しないか、または−ＣＨ２−、−Ｏ−；−Ｓ−；−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）−；−Ｃ（Ｏ）Ｏ−；−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）−；−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）−；−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｏ−；−ＮＨ−、−ＣＨ＝Ｎ−；−ＯＣ（Ｏ）−；−Ｎ＝ＣＨ−；−Ｓ−Ｓ−、−Ｎ（Ｒ１３）（Ｒ１４）−から選択される連結基であり、Ｒ１３およびＲ１４は独立に、ＨもしくはＣ１−Ｃ６アルキルであり、またはＲ１３もしくはＲ１４の一方は、存在しなくてもよく、ｒは１〜５の整数である。
【０１４７】
ＴＥＥを本発明に従って結合させることができる脂質は、−ＯＨ基で置換されていてもよいリン脂質およびそのリゾ型、スフィンゴ脂質およびそのリゾ型、コレステロールのようなステロールおよびその誘導体、ジアシルグリセロール／ジアルキルグリセロール、モノアシルグリセロール／モノアルキルグリセロール、グリセリン酸のモノエステル、ジエステル、モノエーテル、もしくはジエーテル、スフィンゴシン／フィトスフィンゴシン／スフィンガニンおよびそれらのＮ置換誘導体、セラミド、１，２−ジアシル−３−アミノプロパン／１，２−ジアルキル−３−アミノプロパン、１−もしくは２−モノアシル−３  アミノプロパン／１−もしくは２−モノアルキル−３−アミノプロパン、ジアルキルアミン、モノアルキルアミン、脂肪酸、ジカルボン酸アルキルエステル、トリカルボン酸ジアルキルエステル、または酒石酸と長鎖アルコールとのエステル、もしくは酒石酸と長鎖カルボン酸とのエステルを含む群から選択することができるが、これらに限定されない。
【０１４８】
好ましい実施形態において、両親媒性脂質物質のアシル鎖およびアルキル鎖は独立に、８〜３０個の炭素原子、および０、１、または２個のエチレン性不飽和結合を含む。他の好ましい実施形態において、両親媒性脂質物質は、ステロール誘導体、好ましくはコレステロールおよびその誘導体を含む。
【０１４９】
本発明の一実施形態において、１種または複数のＴＥＥを結合させることができる脂質は、次の一般式のうちの１つから選択することができる。
【化１７】
2014208687.tif 000039
式中、ＲｘおよびＲｙは独立に、０、１、または２個のエチレン性不飽和結合を含むＣ８〜Ｃ３０アルキル鎖またはアシル鎖であり、あるいはＲｘまたはＲｙの一方は、Ｈとすることができ、ＲｚはＨ、＝Ｏ、−ＮＨ２、−ＯＨであり、
Ｘａは、−ＯＰＯ３−−；−ＯＰＯ２−ＣＨ２−；−ピロホスフェート−；−ＯＳＯ３−；−ＯＳＯ２−；−Ｏ−；−ＮＨ−；−Ｓ−；−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）−；−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）−；−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｏ−；−ＯＣ（Ｏ）−；−Ｃ（Ｏ）Ｏ−；−Ｎ＝ＣＨ−；−ＣＨ＝Ｎ−；−ＣＨ２−；−Ｓ−Ｓ−；−Ｎ（Ｒ１３）（Ｒ１４）−（ただし、Ｒ１３およびＲ１４は独立に、ＨもしくはＣ１〜Ｃ６アルキルであり、またはＲ１３もしくはＲ１４の一方は、存在しなくてもよい）；または
【化１８】
2014208687.tif 000040
であり、
Ｙａは存在しないか、または非分枝状、分枝状、もしくは環状の置換もしくは非置換アルキル、アルケニル；１〜８個のＣ原子を有するアルキレン基もしくはアルキニル基もしくはアリール基であり、ここで前記置換基は、１種または複数の−ＯＨ；−ＮＨ２；−Ｎ（Ｒ１３）（Ｒ１４）（ただし、Ｒ１３およびＲ１４は、上記で定義される）；−ＣＯＯＨ；糖から選択され、あるいはＹａは糖；アミノ酸；ジ−もしくはトリペプチド；α−ヒドロキシ酸もしくはβ−ヒドロキシ酸、またはジヒドロキシ酸であり、
Ｚａは存在しないか、または−Ｏ−；−Ｓ−；−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）−；−Ｃ（Ｏ）Ｏ−；−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）−；−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）−；−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｏ−；−ＮＨ−；−Ｎ（Ｒ１３）（Ｒ１４）−（Ｒ１３およびＲ１４は上記のように定義する）；−ＣＨ＝Ｎ−；−ＯＣ（Ｏ）−；−Ｎ＝ＣＨ−；−Ｓ−Ｓ−から選択される基であり、あるいはＺａは、−ＮＨ２；−（ＮＨ３）＋；−（Ｎ（Ｒ１３）（Ｒ１４）（Ｒ１５））＋（ただし、Ｒ１３、Ｒ１４、およびＲ１５は、上記のＲ１３およびＲ１４のように定義する）；−Ｃ（Ｏ）ＯＨ；−ＯＨ；−Ｃ（Ｏ）Ｈ；−Ｃ（Ｏ）ＯＲ１６（ただし、Ｒ１６はＣ１〜Ｃ６アルキルである）；−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２の群から選択され、点線は、１種または複数のＴＥＥのあり得るグラフト位置を表す；
【化１９】
2014208687.tif 000041
式中、Ｘａはステロールの３’位において結合しており、上記のように定義され、ＹａおよびＺａは、上記で定義され、ステロールは、コレステロール、シトステロール、カンペステロール、デスモステロール、フコステロール、２２−ケトステロール、２０−ヒドロキシステロール、スチグマステロール、２２−ヒドロキシコレステロール、２５−ヒドロキシコレステロール、ラノステロール、７−デヒドロコレステロール、ジヒドロコレステロール、１９−ヒドロキシコレステロール、５α−コレスト−７−エン３β−オール、７−ヒドロキシコレステロール、エピコレステロール、エルゴステロール、および／またはデヒドロエルゴステロールから選択され、好ましくは前記ステロールは、コレステロールであり、点線は、１種または複数のＴＥＥのあり得るグラフト位置を表す；
【化２０】
2014208687.tif 000042
【化２１】
2014208687.tif 000043
式中、Ｒｘ、Ｒｙ、Ｘａ、Ｙａ、またはＺａは、上記で定義され、点線は、１種または複数のＴＥＥのあり得るグラフト位置を表す；
【化２２】
2014208687.tif 000044
式中、ＲｘおよびＲｙは、上記で定義され、点線は、１種または複数のＴＥＥのあり得るグラフト位置を表す；
【化２３】
2014208687.tif 000045
式中、Ｒｘ＊およびＲｙ＊は独立に、０、１、または２個のエチレン性不飽和結合を含むＣ８〜Ｃ３０アルキル鎖であり、あるいはＲｘ＊またはＲｙ＊の一方は、Ｈとすることができ、ＷおよびＧは独立に、ＨＯ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｏ−であり、点線は、１種または複数のＴＥＥのあり得るグラフト位置を表す；
【化２４】
2014208687.tif 000046
式中、Ｒｘ○およびＲｙ○は独立に、０、１、または２個のエチレン性不飽和結合を含むＣ８〜Ｃ３０アシル鎖であり、あるいはＲｘ○またはＲｘ○の一方は、Ｈとすることができ、ＭはＨまたは−ＯＨであり、Ｘａ、Ｙａ、Ｚａは、上記で定義され、点線は、１種または複数のＴＥＥのあり得るグラフト位置を表す。
【０１５０】
グラフト位置
本発明のＴＥＥを、脂質に化学結合またはグラフトすることができる。多くの態様では、水に露出した極性脂質頭部基は、１種または複数のＴＥＥをグラフトするのに好ましい位置である。
【０１５１】
グラフトとＴＥＥとの間の化学リンカーとしては、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｈ）−、−Ｎ（Ｈ）−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−、−ＣＨ＝Ｎ−、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−、−Ｎ＝ＣＨ−、−Ｓ−Ｓ−、１〜６個のＣ原子を有し、１種もしくは複数の−ＯＨ、−ＮＲ２、−ＣＯＯＨ、もしくは糖で置換されていてもよい非分枝状、分枝状、もしくは環状アルキル、アルケニル、アルキレン、もしくはアルキニル、またはそれらの混合物；−ＰＯ４−−；−ＰＯ３−−；−ＰＯ３−ＣＨ２−ピロホスフェート；−ＳＯ４−；−ＳＯ３−；−ＮＨ−；−ＮＲ−；糖およびその誘導体；アミノ酸；ジ−もしくはトリペプチド、α−ヒドロキシ酸もしくはβ−ヒドロキシ酸、またはジヒドロキシ酸を含む（include and comprise）ことができるが、これらに限定されない。
【０１５２】
本発明の好ましい実施形態において、脂質頭部基および化学リンカー基の構造単位は、実質的極性を維持する。いくつかの態様では、この構造単位は電荷を帯びている。これは、以前の頭部基から保存された電荷、または新たに発生した電荷、例えば還元的アミノ化によって生ずるアミン基とすることができる。
【０１５３】
他の態様では、（Ｉ）の極性領域は、脂質の膜アンカーの外側および実際のＴＥＥの外側の（連続）構造単位と定義され、前記構造単位は、実質的極性を維持する。実質的極性は、水中で水素結合を形成する能力を示す。実質的極性は、ｌｏｇＤ＜０、いくつかの態様ではｌｏｇＤ＜−２、他の態様ではｌｏｇＤ＜−４を意味する。
【０１５４】
本発明のいくつかの実施形態において、ＴＥＥを、帯電した極性頭部基を含む脂質にグラフトする。グラフト位置は前記帯電した極性頭部基であり、その基の電荷を少なくとも実質的程度まで維持する。脂質のこのような親水性極性頭部基の例は、リン酸（ＤＯＰＡのような脂質中）、ホスホエタノール（ＤＯＰＥのような脂質中）、ホスホグリセロール（ＰＯＰＧのような脂質中）、ホスホグリセロールアルデヒド、ホスホグリセリン酸、アミノ基（例えば、１，２−ジアシルまたは１，２  ジアルキル−３アミノプロパン由来）を含むが、これらに限定されない。
【０１５５】
ＴＥＥを含むこのような脂質の化学的表現としては、化合物３０〜４３が挙げられるが、これらに限定されるものではない。ＲｘおよびＲｙは独立に、０、１、または２個のエチレン性不飽和結合を含むＣ８〜Ｃ３０アルキル鎖またはアシル鎖であり、あるいはＲｘまたはＲｙの一方は、Ｈとすることができ、Ｒ３＊およびＲ４＊は独立に、ＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルである。
【０１５６】
【表１５−１】
2014208687.tif 000047
【表１５−２】
2014208687.tif 000048
【０１５７】
本発明の別の実施形態において、ＴＥＥを、親水性極性頭部基を含む脂質にグラフトする。グラフト位置は前記親水性基であるが、ＴＥＥと脂質との間の化学結合によって、極性頭部基が帯電しなくなる。例としては、−Ｎ（Ｈ）−Ｃ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｈ）−Ｃ（Ｏ）Ｏ−が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１５８】
ＴＥＥを含むこのような脂質の化学的表現としては、化合物４４〜４７が挙げられるが、これらに限定されるものではない。ＲｘおよびＲｙは独立に、０、１、または２個のエチレン性不飽和結合を含むＣ８〜Ｃ３０アルキル鎖またはアシル鎖であり、あるいはＲｘまたはＲｙの一方は、Ｈとすることができる。
【０１５９】
【表１６】
2014208687.tif 000049
【０１６０】
言うまでもなく、いかなる場合でも、置換基は脂質頭部基に結合していてもよい。さらに、前述のように、連結基を、脂質頭部基と結合しているＴＥＥとの間に挿入することができる。いくつかの態様では、連結基も同様に置換されている。
【０１６１】
好ましい実施形態において、置換基または連結基は、ＴＥＥの脂質頭部基への結合によって、頭部基の極性の低下、続いて脂質の両親媒性の喪失が起こるときに使用することができる。例えば、コレステロールとＴＥＥとしてのＣ１６−ジカルボン酸とのエステル化は、無極性エステル結合を生じ、したがって好ましくない。しかし、極性連結基、例えば酒石酸をコレステロールとＴＥＥとしてのＣ１６−ジカルボン酸との間に挿入すると、ＴＥＥが結合した後も、脂質の両親媒性構造が保存される。
【０１６２】
いくつかの実施形態において、脂質頭部基に結合することができる置換基は、極性であり、−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、−ＮＨ２、−ＮＨＲ、−ＮＲ２、糖およびその誘導体、アミノ酸およびその誘導体、−ＯＰＯ３２−、−ＯＰＯ２２−、−ＯＳＯ３−；−ＯＳＯ２−のような基、またはそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１６３】
頭部基とＴＥＥとの間に連結基を有するこのような脂質の化学的表現としては、化合物４８〜４９が挙げられるが、これらに限定されるものではない。ＲｘおよびＲｙは独立に、０、１、または２個のエチレン性不飽和結合を含むＣ８〜Ｃ３０アルキル鎖またはアシル鎖であり、あるいはＲｘまたはＲｙの一方は、Ｈとすることができる。
【０１６４】
【表１７】
2014208687.tif 000050
【０１６５】
この態様のさらに別の実施形態において、脂質は、２種以上の親水性極性頭部基、または親水性に影響を及ぼすことなく様々な位置において置換を可能にする複雑な親水性頭部基を含むことができる。例としては、酒石酸と長鎖アルコールとのエステル、マレイン酸の誘導体、または脂肪酸とグルコース、スクロース、もしくはマルトースなど糖とのエステルが挙げられるが、これらに限定されるものではない。さらなる例としては、ドデシル−β−Ｄ−グルコピラノシドまたはドデシル−β−Ｄ−マルトシドなどアルキルグリコシドおよびその誘導体、アルキル−エチレングリコール洗浄剤の誘導体（Ｂｒｉｊ３５、Ｇｅｎａｐｏｌシリーズ、Ｔｈｅｓｉｔなど）、またはホスファチジルイノシトールおよびその誘導体が挙げられるが、これらに限定されるものではない。ＴＥＥがこのような極性頭部基の異なる位置にグラフトされている異性体は、本発明の範囲内である。
【０１６６】
２個以上の親水性頭部基、またはＴＥＥを含む複雑な頭部基を含むこのような脂質の化学的表現としては、化合物５０〜５５が挙げられるが、これらに限定されるものではない。ＲｘおよびＲｙは独立に、０、１、または２個のエチレン性不飽和結合を含むＣ８〜Ｃ３０アルキル鎖またはアシル鎖であり、あるいはＲｘまたはＲｙの一方は、Ｈとすることができる。Ｒ＊は、０、１、または２個のエチレン性不飽和結合を含むＣ８〜Ｃ３０アルキル鎖である。
【０１６７】
【表１８】
2014208687.tif 000051
【０１６８】
本発明のいくつかの変形では、２種以上のＴＥＥを、１種の脂質に結合することができる。
【０１６９】
２種以上のＴＥＥを含むこのような脂質の化学的表現としては、化合物５６〜６０が挙げられるが、これらに限定されるものではない。ＲｘおよびＲｙは独立に、０、１、または２個のエチレン性不飽和結合を含むＣ８〜Ｃ３０アルキル鎖またはアシル鎖であり、あるいはＲｘまたはＲｙの一方は、Ｈとすることができる。
【０１７０】
【表１９】
2014208687.tif 000052
【０１７１】
本発明のいくつかの態様では、脂質−ＴＥＥ（一般式（Ｉ）に従う構造）は、次の構造（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、または（Ｖ）のうちの１つではない場合がある。
ＰＥ−アミド結合−Ｘ−ＣＯＯＨ  （ＩＩＩ）
式中、Ｘは、３〜２０個の原子の鎖長を有し、様々な飽和度および／またはヘテロ原子組成物および／または置換基、ならびにＣＯＯＨ−基を有する炭素含有直鎖である；
あるいは
【化２５】
2014208687.tif 000053
式中、Ｙは、２〜１０個のＣ原子の鎖長を有する直鎖状飽和アルキル鎖であり、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、およびＲｄは独立に、０〜６個の不飽和部位を有する直鎖状または分枝状の非置換または置換Ｃ１〜２３アルキル基、アシル基、アルキレン基、ヘテロアルキル基、環状基、およびアリール基であり、これらの基は、０〜５個のヘテロ原子を含み、置換基は、−Ｏ−（ＣＨ２）ｅ−ＣＨ３；−Ｓ−（ＣＨ２）ｅ−ＣＨ３；Ａ−（ＣＨ２）ｅ（式中、Ａはハロゲン化物である）、および−Ｎ（（ＣＨ２）ｅ−ＣＨ３）２であり、置換基のアルキル基は、０〜２個のヘテロ原子を含み、ｅは０〜４であり、さらにＲａおよびＲｂは独立に、Ｈとすることができ、ｄは１〜６であり；
あるいは
【化２６】
2014208687.tif 000054
式中、ＲｅおよびＲｆは独立に、水素原子、または二重および三重結合を場合によっては含むＣ１〜Ｃ２４直鎖状もしくは分枝状アルキル鎖もしくはアシル鎖であり、Ｚは、アリール環、３〜６個の炭素原子を有するシクロアルキル、ヒドロキシル、および／またはさらなるカルボン酸官能基で場合によっては置換されていてもよい、６〜２０個の炭素原子を有する脂肪族および／または脂環式炭化水素鎖である。
【０１７２】
本発明の他の態様では、化合物（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、または（Ｖ）を含む脂質集合体のインビボ、インビトロ、またはエキソビボにおける細胞トランスフェクションのための使用が好ましいことがある。
【０１７３】
本発明によるリン脂質の具体例としては、下記が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１７４】
リン脂質およびスフィンゴ脂質：
【化２７】
2014208687.tif 000055
式中、ＲｘおよびＲｙは独立に、０、１、または２個のエチレン性不飽和結合を含むＣ８〜Ｃ３０アルキル鎖またはアシル鎖であり、あるいはＲｘまたはＲｙの一方は、Ｈとすることができ、ｍ＝６〜４０である。
【化２８】
2014208687.tif 000056
式中、ＲｘおよびＲｙは独立に、０、１、または２個のエチレン性不飽和結合を含むＣ８〜Ｃ３０アルキル鎖またはアシル鎖であり、あるいはＲｘまたはＲｙの一方は、Ｈとすることができ、ｍ＝６〜４０である。
【化２９】
2014208687.tif 000057
式中、Ｒ１およびＲ２は独立に、０、１、または２個のエチレン性不飽和結合を含むＣ８〜Ｃ３０アルキル鎖またはアシル鎖であり、あるいはＲ１またはＲ２の一方は、Ｈとすることができ、ｍ１およびｍ２は独立に、６〜４０である。
【化３０】
2014208687.tif 000058
式中、ＲｘおよびＲｙは独立に、０、１、または２個のエチレン性不飽和結合を含むＣ８〜Ｃ３０アルキル鎖であり、あるいはＲｘまたはＲｙの一方は、Ｈとすることができ、ｍ＝６〜４０である。
【化３１】
2014208687.tif 000059
式中、ＲｘおよびＲｙは独立に、０、１、または２個のエチレン性不飽和結合を含むＣ８〜Ｃ３０アルキル鎖またはアシル鎖であり、あるいはＲｘまたはＲｙの一方は、Ｈとすることができる。
【０１７５】
本発明によるステロール系脂質の具体例としては、下記が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０１７６】
ステロール系脂質：
【化３２】
2014208687.tif 000060
【０１７７】
本発明によるジアシルグリセロール／ジアルキルグリセロール系脂質の具体例としては、下記が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１７８】
ジアシルグリセロール／ジアルキルグリセロール系脂質：
【化３３】
2014208687.tif 000061
式中、ＲｘおよびＲｙは独立に、０、１、または２個のエチレン性不飽和結合を含むＣ８〜Ｃ３０アルキル鎖またはアシル鎖であり、あるいはＲｘまたはＲｙの一方は、Ｈとすることができ、ｍ＝６〜４０である。
【化３４】
2014208687.tif 000062
式中、ＲｘおよびＲｙは独立に、０、１、または２個のエチレン性不飽和結合を含むＣ８〜Ｃ３０アルキル鎖またはアシル鎖であり、あるいはＲｘまたはＲｙの一方は、Ｈとすることができ、ｍ＝６〜４０である。
【０１７９】
本発明による１，２−ジアシル−３−アミノプロパン／１，２−ジアルキル−３−アミノプロパン系脂質の具体例としては、下記が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０１８０】
１，２−ジアシル−３−アミノプロパン／１，２−ジアルキル−３−アミノプロパン：
【化３５】
2014208687.tif 000063
式中、ＲｘおよびＲｙは独立に、０、１、または２個のエチレン性不飽和結合を含むＣ８〜Ｃ３０アルキル鎖またはアシル鎖であり、あるいはＲｘまたはＲｙの一方は、Ｈとすることができ、Ｒ３＊およびＲ４＊は独立に、ＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルであり、ｍ＝１１〜４０である。
【０１８１】
上述される１種または複数のトランスフェクションエンハンサー要素を含む脂質を合成する方法には、当業者によく知られており、使用する出発材料およびカップリング成分に応じて異なってもよいカップリング反応が含まれる。典型的反応は、エステル化、アミド化、エーテル化、または還元的アミノ化である。
【０１８２】
特に好ましい分子は、プロセスに従うことによって調製することができるが、これらのカップリング反応に限定されない。
ｉ）ホスファチジルエタノールアミンによるω−カルボキシ−ケトンの還元的アミノ化
ｉｉ）リン脂質、例えばＰＣ、ＰＥ、ＰＳ中のホスフェート基のエステル化
ｉｉｉ）ω−ジカルボン酸と脂質の遊離ヒドロキシル基とのエステル化
ｉｖ）ホスファチジルセリンと末端イソプロピル基内にカルボキシル基を有するコレステロール誘導体の３’ヒドロキシル基とのエステル化
ｖ）３−アミノ−１，２−プロパンジオールジエステルのアミド化またはアルキル化
ｖｉ）ホスファチジルグリセロールの酸化およびその後の還元的アミノ化
【０１８３】
脂質集合体
脂質集合体は、両親媒性分子を含む超分子集合体である。ある態様では、両親媒性物質は、脂質または洗浄剤と呼ばれ、別の態様では、このような物質は、生体膜を形成すること、または生体膜に挿入することが知られている。超分子集合体は、さらに無極性分子からの油を含んでもよい。したがって、本発明の超分子集合体は、様々な粒径およびラメラ性のリポソーム、ミセル、逆ミセル、立方もしくは六方脂質相、渦巻形、エマルジョン、ダブルエマルジョン、または実質的に脂質、油、もしくは両親媒性物質から構築される他の多量体集合体を含む。
【０１８４】
本発明のいくつかの実施形態において、１種または複数のトランスフェクションエンハンサー要素を含む１種または複数の脂質を含む脂質集合体は、中性および／またはカチオン性および／またはアニオン性脂質をさらに含む脂質相から形成することができる。脂質集合体の総電荷は、中性、カチオン性、またはアニオン性とすることができる。
【０１８５】
本発明に従って脂質集合体を形成するために使用することができる脂質としては、下記の表２０および２１に記載する脂質が挙げられるが、これらに限定されるものではない。脂質について使用する略語はすべて、主に文献での標準的用法を指し、有用な参照として表２０に含まれる。
【０１８６】
本発明の一実施形態において、脂質集合体は、天然または合成ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴ脂質、セラミド、セレブロシド、ステロール系脂質、例えばコレステロール、およびこのような脂質の誘導体を含む群から選択される１種または複数の中性脂質を含む。中性脂質の具体例としては、ＤＭＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＳＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＣ、卵黄ＰＣ、ダイズＰＣ、ＤＭＰＥ、ＤＰＰＥ、ＤＳＰＥ、ＰＯＰＥ、ＤＯＰＥ、ジフィタノイル−ＰＥ、スフィンゴミエリン、セラミド、およびコレステロールが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１８７】
別の実施形態において、脂質集合体は、１種または複数のカチオン性脂質を単独で、または中性および／もしくはアニオン性脂質と組み合わせて含む。カチオン性脂質としては、ＤＯＴＡＰ、ＤＭＴＡＰ、ＤＰＴＡＰ、ＤＣ−Ｃｈｏｌ、ＤＡＣ−Ｃｈｏｌ、ＤＯＤＡＰ、ＤＯＥＰＣ、ＴＣ−Ｃｈｏｌ、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＲＩＥ、ＤＤＡＰ、ＣＴＡＢ、ＣＰｙＣ、ＤＰＩＭ、ＣＨＩＭ、ＭｏＣｈｏｌ、ＨｉｓＣｈｏｌ、ＢＧＳＣ、ＢＧＴＣ、ＤＯＳＰＥＲ、ＤＯＳＣ、ＤＯＧＳＤＯ、ＤｍＣ４Ｍｏ２、ＤｍＣ３Ｍｏ２、Ｃ３Ｍｏ２、Ｃ３Ｍｏ３、Ｃ４Ｍｏ４、Ｃ５Ｍｏ２、Ｃ６Ｍｏ２、Ｃ８Ｍｏ２、ＰｉｐＣ２Ｃｈｏｌ、ＭｏＣ２Ｃｈｏｌ、ＭｏＣ３Ｃｈｏｌ、Ｎ−メチル−ＰｉｐＣｈｏｌ、ＰｙｒｒｏＣ２Ｃｈｏｌ、ＰｙＣ２Ｃｈｏｌ、ＩｍＣ３Ｃｈｏｌ、ＰｉｐｅＣ２Ｃｈｏｌ、およびそれらの誘導体を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
【０１８８】
本発明のさらに別の実施形態において、脂質集合体は、１種または複数のアニオン性脂質を単独で、または中性および／もしくはカチオン性脂質と組み合わせて含む。アニオン性脂質としては、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、ＣＨＥＭＳおよび別のアニオン性ステロール誘導体、セチルホスフェート、ヘミコハク酸ジアシルグリセロール、およびカルジオリピン、ならびにそれらの誘導体を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。具体例としては、ＤＭＰＧ、ＤＰＰＧ、ＤＳＰＧ、ＤＯＰＧ、ＰＯＰＧ、ＤＭＰＳ、ＤＰＰＳ、ＤＯＰＳ、ＰＯＰＳ、ＤＭＰＡ、ＤＰＰＡ、ＤＯＰＡ、ＰＯＰＡ、ＣＨＥＭＳ、セチルホスフェート、ＤＭＧ−Ｓｕｃｃ、ＤＰＧ−Ｓｕｃｃ、ＤＳＧ−Ｓｕｃｃ、ＤＯＧ−Ｓｕｃｃ、ＰＯＧ−Ｓｕｃｃ、Ｃｈｏｌ−スルフェート、Ｃｈｏｌ−ホスペートが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１８９】
一態様では、本発明で使用するための脂質集合体は、例えばＤＯＰＥ、リゾ脂質、もしくは遊離脂肪酸などの融合性脂質、または前記融合性脂質と上記の中性および／もしくはカチオン性および／もしくはアニオン性脂質との混合物を含むことができる。
【０１９０】
驚くべきことに、脂質集合体の融合性に及ぼすＴＥＥを含む脂質の影響は異なってもよく、実施例１４に示すように、脂質集合体の形成に使用される中性脂質に依存することが明らかになった。
【０１９１】
本発明の一実施形態において、１種または複数のＴＥＥを含む１種または複数の脂質を含むリポソームは、ホスファチジルコリン、スフィンゴミレイン、セラミド、もしくはセレブロシド、またはそれらの混合物の群から選択される中性脂質と、コレステロールもしくはホスファチジルエタノールアミン、またはそれらの混合物との混合物から形成され、混合物のモル比は１：３〜３：１、好ましくは１：２〜２：１である。この実施形態の一態様では、脂質集合体は、さらにアニオン性、カチオン性、もしくは両性脂質、またはそれらの混合物を含んでもよい。しかし、帯電した脂質の存在は、強制ではない。
この実施形態の別の態様では、ホスファチジルコリンとコレステロールの混合物、またはホスファチジルコリンとホスファチジルエタノールアミンの混合物が好ましい。ＤＳＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＭＰＣ、ＰＯＰＣ、またはＤＯＰＣから選択されるホスファチジルコリンの１種または複数をＤＯＰＥまたはコレステロールの群から選択される１種または複数の脂質と組み合わせて含む組成物がより好ましい。
この実施形態の別の態様では、効率的に細胞をトランスフェクトするために、これらの脂質集合体を使用してもよい。
【０１９２】
言うまでもなく、当技術分野で知られている脂質集合体を、本発明のＴＥＥを含む脂質と共に使用することができる。このような脂質集合体の一部は、例えばWO 05/105152；WO 06/069782；Morrissey et al., Nature Biotechnology, 23(8), 1002-1007, 2005；WO 05/007196；Wheeler et al., Gene Therapy, 6(2), 271-281, 1999；WO 02/34236；Budker et al., Nature Biotechnology, 14(6), 760-764, 1996；US 5,965,434；US 5,635,487；Spagnou et al., Biochemistry, 43(42), 13348-13356, 2004；US 6,756,054；WO 06/016097およびUS 5,785,992；WO 04/035523に開示されている。
【０１９３】
あるいは、１種または複数のトランスフェクションエンハンサー要素を含む１種または複数の脂質を含む脂質集合体は、両性特性を有する脂質相から形成することができる。一態様では、前記脂質集合体は両性リポソームである。両性リポソームは、約ｐＨ７．５でアニオン電荷または中性電荷を有し、ｐＨ４でカチオン電荷を有する最近記載されたリポソームのクラスを表す。WO 02/066490、WO 02/066120、およびWO 03/070220には、両性リポソームおよびそれに適した脂質の詳細な説明が記載されている。
【０１９４】
本明細書では「両性」は、アニオン性とカチオン性の両方の帯電した基を含む物質、物質の混合物、または超分子複合体（例えば、リポソーム）を意味し、
（ｉ）帯電した基の少なくとも１つは、ｐＫが４〜８であり、
（ｉｉ）カチオン電荷は、ｐＨ４で優勢であり、かつ
（ｉｉｉ）アニオン電荷は、ｐＨ８で優勢であり、
ｐＨ４〜ｐＨ８で中性の実効電荷の等電点が生じる。双性イオンはｐＫが上記の範囲でないので、この定義によれば、両性特性は双性イオン性と異なる。結果として、双性イオンは、様々なｐＨ値にわたって本質的に中性に帯電する。ホスファチジルコリンおよびホスファチジルエタノールアミンは、双性イオン性の中性脂質である。
【０１９５】
本発明のいくつかの実施形態において、前記両性リポソームは、１種または複数の両性脂質を含む脂質相から形成することができる。
【０１９６】
適当な両性脂質は、WO 02/066489およびWO 03/070735に開示されている。好ましくは、前記両性脂質は、ＨｉｓｔＣｈｏｌ、ＨｉｓｔＤＧ、ｉｓｏＨｉｓｔＳｕｃｃＤＧ、アシルカルノシン、ＨＣＣｈｏｌ、Ｈｉｓｔ−ＰＳ、およびＥＤＴＡ−Ｃｈｏｌからなる群から選択される。
【０１９７】
さらに別の実施形態において、脂質相は、互いに組み合わせて両性特性を有する複数の帯電した両親媒性物質を含んでもよい。
【０１９８】
この実施形態の一態様では、前記１種または複数の帯電した両親媒性物質は、ｐＨ感受性アニオン性脂質およびｐＨ感受性カチオン性脂質を含む。本明細書で、帯電可能なカチオンと帯電可能なアニオンのこのような組合せは、「両性ＩＩ」脂質対と呼ばれる。好適には、前記帯電可能なカチオンは、ｐＫａ値が約４〜約８、好ましくは約５．５〜約７．５である。好適には、前記帯電可能なアニオンは、ｐＫａ値が約３．５〜約７、好ましくは約４〜約６．５である。例としては、ＭｏＣｈｏｌ／ＣＨＥＭＳ、ＤＰＩＭ／ＣＨＥＭＳ、およびＤＰＩＭ／ＤＧＳｕｃｃが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１９９】
この実施形態の第２の態様では、前記１種または複数の帯電した両親媒性物質は、安定なカチオンおよび帯電可能なアニオンを含み、「両性Ｉ」脂質対と呼ばれる。例としては、ＤＤＡＢ／ＣＨＥＭＳ、ＤＯＴＡＰ／ＣＨＥＭＳ、ＤＣ−Ｃｈｏｌ／ＣＨＥＭＳ、およびＤＯＴＡＰ／ＤＭＧＳｕｃｃ、ＤＯＤＡＰ／Ｃｈｅｍｓ、ＤＯＤＡＰ／ＤＭＧＳｕｃｃが挙げられるが、これらに限定されるものではない。さらなる例としては、ＤＣ−Ｃｈｏｌ／Ｃｈｏｌ−Ｃ３、ＤＣ−Ｃｈｏｌ／Ｃｈｏｌ−Ｃ５、ＤＣ−Ｃｈｏｌ／Ｃｈｏｌ−Ｃ６、もしくはＤＣ−Ｃｈｏｌ／Ｃｈｏｌ−Ｃ８、またはカチオンとしてＤＤＡＢ、ＤＯＤＡＰ、もしくはＤＯＴＡＰを使用する類似の組成物を挙げることができる。
【０２００】
この実施形態の第３の態様では、前記１種または複数の帯電した両親媒性物質は、安定なアニオンおよび帯電可能なカチオンを含み、「両性ＩＩＩ」脂質対と呼ばれる。例としては、ＭｏＣｈｏｌ／ＤＯＰＧおよびＭｏＣｈｏｌ／Ｃｈｏｌ−ＳＯ４が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０２０１】
言うまでもなく、両親媒性ジカルボン酸、ホスファチジン酸、両親媒性ピペラジン誘導体など多重電荷をもつ両親媒性物質を使用することが可能である。このような多重帯電した両親媒性物質は、ｐＨ感受性両親媒性物質または安定なアニオンもしくはカチオンに入ることができ、あるいは混じり合った特性を有することがある。
【０２０２】
前記トランスフェクションエンハンサー要素を含有する脂質の量は、好ましくは脂質集合体またはリポソームの全脂質相の０．１％〜９０％である。一実施形態において、前記トランスフェクションエンハンサー要素を含有する脂質の量は、全脂質相の１％〜５０％である。別の実施形態において、前記トランスフェクションエンハンサー要素を含有する脂質の量は、脂質集合体またはリポソームの全脂質相の２％〜２０％である。
【０２０３】
本発明によるリポソームの具体例としては、下記が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２０４】
【化３６】
2014208687.tif 000064
【化３７】
2014208687.tif 000065
【化３８】
2014208687.tif 000066
【化３９】
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【化４０】
2014208687.tif 000068
【０２０５】
本発明の一実施形態において、脂質集合体の脂質相は、約１０〜２０モル％のホスファチジルコリン、２０〜３５モル％のＤＣ−Ｃｈｏｌ、４０〜６０モル％のＣＨＥＭＳまたはＤＭＧＳｕｃｃ、および約５〜１５モル％のＰａｌ−ＰＥまたはＤｅｃａ−ＰＥを含む。特定の実施形態では、前記集合体はリポソームである。
【０２０６】
本発明の一実施形態において、脂質集合体の脂質相は、２０〜９０モル％、好ましくは４０〜８０モル％の両性脂質混合物、２〜２０モル％、好ましくは５〜１０モル％の１種または複数のＴＥＥを含む１種または複数の脂質、および必要に応じて、適量のホスファチジルコリン、スフィンゴ脂質、ホスファチジルエタノールアミン、またはコレステロールの１種または複数から選択される中性または双性イオン性脂質を含む。好ましくは、１種または複数のＴＥＥを含む前記脂質は、Ｄｅｃａ−ＰＥ、ｗ１２−ＰＥ、Ｐａｌ−ＰＥ、ｗ２１−ＰＥ、ｗ１２−ＤＰＴＡＰ、ｗ１６−ＤＰＴＡＰ、ｗ２０−ＤＰＴＡＰ、ｗ１２−Ａｍｉｄ−ＰＥ、またはｗ１６−Ａｍｉｄ−ＰＥの群から選択される。
【０２０７】
この実施形態の一態様では、前記両性脂質混合物は、カチオン性脂質とアニオン性脂質のモル比（Ｃ／Ａ比）が好ましくは０．３〜０．７である「両性Ｉ」脂質対である。好ましくは、前記カチオン性脂質は、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＤＡＰ、ＤＤＡＢ、ＤＣ−Ｃｈｏｌ、ＤＡＣ−Ｃｈｏｌ、またはＴＣ−Ｃｈｏｌの１種または複数から選択され、前記アニオン性脂質は、Ｃｈｅｍｓ、ＤＭＧ−Ｓｕｃｃ、またはＤＯＧ−Ｓｕｃｃの１種または複数から選択される。より好ましい前記「両性Ｉ」脂質対は、次の組合せのうちの１つから選択される。ＤＯＴＡＰ／Ｃｈｅｍｓ、ＤＯＴＡＰ／ＤＭＧ−Ｓｕｃｃ、ＤＯＴＡＰ／ＤＯＧ−Ｓｕｃｃ、ＤＯＤＡＰ／Ｃｈｅｍｓ、ＤＯＤＡＰ／ＤＭＧ−Ｓｕｃｃ、ＤＯＤＡＰ／ＤＯＧ−Ｓｕｃｃ、ＤＤＡＢ／Ｃｈｅｍｓ、ＤＤＡＢ／ＤＭＧ−Ｓｕｃｃ、ＤＤＡＢ／ＤＯＧ−Ｓｕｃｃ、ＤＣ−Ｃｈｏｌ／Ｃｈｅｍｓ、ＤＣ−Ｃｈｏｌ／ＤＭＧ−Ｓｕｃｃ、ＤＣ−Ｃｈｏｌ／ＤＯＧ−Ｓｕｃｃ、ＤＡＣ−Ｃｈｏｌ／Ｃｈｅｍｓ、ＤＡＣ−Ｃｈｏｌ／ＤＭＧ−Ｓｕｃｃ、ＤＡＣ−Ｃｈｏｌ／ＤＯＧ−Ｓｕｃｃ、ＴＣ−Ｃｈｏｌ／Ｃｈｅｍｓ、ＴＣ−Ｃｈｏｌ／ＤＭＧ−Ｓｕｃｃ、ＴＣ−Ｃｈｏｌ／ＤＯＧ−Ｓｕｃｃ。
【０２０８】
この実施形態の第２の態様では、前記両性脂質混合物は、カチオン性脂質とアニオン性脂質のモル比（Ｃ／Ａ比）が好ましくは０．３〜３である「両性ＩＩ」脂質対である。好ましくは、前記カチオン性脂質は、ＭｏＣｈｏｌ、ＨｉｓＣｈｏｌ、Ｃｈｉｍ、ＤｍＣ４Ｍｏ２の１種または複数から選択され、前記アニオン性脂質は、Ｃｈｅｍｓ、ＤＭＧ−Ｓｕｃｃ、またはＤＯＧ−Ｓｕｃｃの１種または複数から選択される。より好ましい前記「両性ＩＩ」脂質対は、次の組合せのうちの１つから選択される。ＭｏＣｈｏｌ／Ｃｈｅｍｓ、ＭｏＣｈｏｌ／ＤＭＧ−Ｓｕｃｃ、ＨｉｓＣｈｏｌ／ＤＯＧ−Ｓｕｃｃ、ＨｉｓＣｈｏｌ／Ｃｈｅｍｓ、ＨｉｓＣｈｏｌ／ＤＭＧ−Ｓｕｃｃ、ＨｉｓＣｈｏｌ／ＤＯＧ−Ｓｕｃｃ、Ｃｈｉｍ／Ｃｈｅｍｓ、Ｃｈｉｍ／ＤＭＧ−Ｓｕｃｃ、Ｃｈｉｍ／ＤＯＧ−Ｓｕｃｃ、ＤｍＣ４Ｍｏ２／Ｃｈｅｍｓ、ＤｍＣ４Ｍｏ２／ＤＭＧ−Ｓｕｃｃ、ＤｍＣ４Ｍｏ２／ＤＯＧ−Ｓｕｃｃ。
【０２０９】
この実施形態の第３の態様では、前記脂質集合体は、好ましくは両性リポソームである。
【０２１０】
本発明のいくつかの実施形態において、本発明による脂質集合体は、細胞表面の標的受容体に結合する細胞標的リガンドを表面上に含んでもよい。リガンドとしては、抗体またはその断片、糖、ホルモン、ビタミン、ａｒｇ−ｇｌｙ−ａｓｐ（ＲＧＤ）などのペプチド、増殖因子、ビリルビン、トランスフェリン、ホレート、または他の成分を挙げることができるが、これらに限定されない。
【０２１１】
本発明のリポソームは、当業者に知られている適当な方法を使用して製造することができる。このような方法としては、規定孔径の膜に通した押出、封入対象のカーゴを含有する水相へのアルコール性脂質溶液の注入、または高圧均質化が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２１２】
薬物（例えば、オリゴヌクレオチド）の溶液を、中性のｐＨで脂質相と接触させ、それによって、溶液の一定の割合の体積を封入させることができる。約５０ｍＭ〜約１５０ｍＭの範囲の高濃度の脂質が、活性剤を実質的に封入するのに好ましい。
【０２１３】
両性リポソームは、核酸をその等電点以下で結合し、それによってこれらの活性剤をリポソーム膜において濃縮する顕著な利点をもたらす。このプロセスは、先端充填手順と呼ばれ、WO 02/066012により詳細に記載されている。
【０２１４】
本発明の一実施形態において、１種または複数のトランスフェクションエンハンサー要素を含む１種または複数の脂質を含む両性リポソームは、脂質膜押出プロセスと組み合わせて前記先端充填手順を使用することによって調製することができる。簡潔に言えば、脂質を有機溶媒に溶解し、溶媒を蒸発乾固することによって、脂質膜を生成する。例えば核酸を含有するｐＨ＜６、好ましくは３〜５．５の水相で、脂質膜を水和する。続いて、多重膜リポソーム懸濁液を、規定孔径の膜（例えば、ポリカーボネート）に通して押し出す。その後、懸濁液のｐＨを＞７に上げる。
【０２１５】
本発明の別の実施形態において、１種または複数のトランスフェクションエンハンサー要素を含む１種または複数の脂質を含む両性リポソームは、例えば核酸を含有する水相へのアルコール性脂質溶液の注入と組み合わせて前記先端充填手順を使用することによって調製する。このプロセスは、複数のステップを含むことができる。
ａ）脂質混合物を水混和性溶媒、好ましくはアルコールにとかした溶液を準備するステップ、ただし前記溶液は、場合によっては酸性化してもよい。
ｂ）核酸薬物の水溶液を準備するステップ、ただし前記溶液は、場合によっては酸性化してもよい。
ａ）およびｂ）の溶液の少なくとも１つは、ｐＨ＜６、好ましくはｐＨ３〜５．５に酸性化しなければならない。
ｃ）１種または複数の混合装置を場合によっては使用して、脂質混合物のアルコール性溶液を核酸の水溶液に、またはその逆に核酸の水溶液を脂質混合物のアルコール性溶液に注入することによって、あるいはａ）およびｂ）の溶液の２つの制御流れを組み合わせることによって、規定量のａ）およびｂ）の溶液を混合するステップ。
ｄ）任意選択である希釈ステップ。
ｅ）ｐＨを７より高くすることによって、またはイオン強度を高め、続いてｐＨを７より高くすることによって、両性リポソームと核酸との間の相互作用を解消するステップ。
ｆ）封入されていない薬物を除去し、かつ／またはリポソーム懸濁液を濃縮し、かつまたは水相を変え、かつ／または水混和性溶媒を除去するステップ、ただしこれらのステップはそれぞれ独立に、任意選択である。
ｇ）任意選択であるリポソームの無菌化濾過ステップ。
【０２１６】
ステップｃ）とｄ）の間、および／またはステップｄ）とｅ）の間、および／またはステップｅ）とｆ）の間、および／またはステップｆ）とｇ）の間で、リポソームの押出をプロセスの一部分とすることができる。
ステップｅ）とｆ）の間、および／またはステップｆ）およびｇ）の間で、リポソームの１種または複数の凍結／融解サイクルをプロセスの一部分とすることができる。
【０２１７】
ステップｇ）の後、リポソームの１種もしくは複数の凍結／融解サイクルおよび／または凍結乾燥をプロセスの一部分とすることができる。
【０２１８】
好ましくは、前記アルコールは、場合によっては緩衝液または酸を使用して酸性化されたエタノール、プロパノール、またはイソプロパノールから選択することができるが、これらに限定されない。
【０２１９】
先端充填手順で使用する酸性溶液のｐＨを、アセテート緩衝液またはシトレート緩衝液のような既知の緩衝物質で調整することがある。あるいは、ｐＨは、酸（例えば、ＨＣｌ、酢酸、またはクエン酸）を使用して調整することがある。好ましくは、酢酸、クエン酸、またはグリシンのような医薬として許容される緩衝液を使用する。
【０２２０】
本発明のリポソームを作製するために使用した実際の生成方法にかかわりなく、いくつかの実施形態において、封入されていない薬物は、リポソームが気密容器として形成される最初の生成ステップの後に、リポソームから除去することができる。さらに、本明細書に含まれている技術文献および参考文献には、このような方法が詳細に記載されており、適当なプロセスステップとしては、サイズ排除クロマトグラフィー、沈降、透析、限外濾過、および透析濾過を挙げることができるが、これらに限定されない。
【０２２１】
しかし、本発明の実行には、いずれの封入されていない薬物の除去も必要でなく、いくつかの実施形態において、リポソーム組成物は、遊離の薬物も封入された薬物も含むことができる。
【０２２２】
本発明によるリポソームは、ユニラメラ、オリゴラメラ、またはマルチラメラとすることができる。
【０２２３】
本発明の一態様では、リポソームの粒径は、５０〜１０００ｎｍ、好ましくは５０〜５００ｎｍ、より好ましくは７０〜２５０ｎｍで異なってもよい。
他の態様では、リポソームの粒径は、７０〜１５０ｎｍで異なってもよく、さらに他の態様では、リポソームの粒径は、１３０〜２５０ｎｍで異なってもよい。
【０２２４】
表２０：脂質の略語は、主に文献での標準的用法を指し、有用な参照としてここに含まれる。
【０２２５】
【表２０−１】
2014208687.tif 000069
【表２０−２】
2014208687.tif 000070
【表２０−３】
2014208687.tif 000071
【表２０−４】
2014208687.tif 000072
【表２０−５】
2014208687.tif 000073
【０２２６】
表２１：本発明による組成物での使用に適した脂質の例（ただし、これらに限定されるものではない）。脂質の膜アンカーの例を示すが、本発明の脂質を例示するものにすぎず、それを限定するものではない。
【０２２７】
【表２１】
2014208687.tif 000074
【０２２８】
トランスフェクション
本発明によれば、インビトロ、インビボ、またはエキソビボで細胞をトランスフェクトするために、トランスフェクションエンハンサー要素を含む脂質を含む脂質集合体を使用してもよい。このような使用に限定することなく、本発明に記載する脂質集合体（例えば、リポソーム）は、例えばオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、およびＤＮＡプラスミドなど核酸系薬物のための担体としての使用によく適している。これらの薬物は、タンパク質、ポリペプチド、またはＲＮＡのための１種または複数の特定配列をコードする核酸、ならびにタンパク質発現レベルを特異的に制御し、またはとりわけスプライシングおよび人為的切断との干渉によってタンパク質構造に影響を及ぼすことができるオリゴヌクレオチドに分類される。
【０２２９】
したがって、本発明のいくつかの実施形態において、核酸系治療薬は、脊椎動物細胞において１種または複数のＲＮＡへと転写されることが可能な核酸を含んでもよく、これらのＲＮＡは、ｍＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはリボザイムとすることができ、このようなｍＲＮＡは１種または複数のタンパク質またはポリペプチドをコードする。このような核酸治療薬は、環状ＤＮＡプラスミド、WO 98/21322もしくはDE 19753182に開示されるＭＩＤＧＥベクター（Ｍｉｎｉｍａｌｉｓｔｉｃ  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃａｌｌｙ  Ｄｅｆｉｎｅｄ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）のような直鎖ＤＮＡ構築物、または翻訳の準備ができているｍＲＮＡ（例えば、EP 1392341）とすることができる。
【０２３０】
本発明の別の実施形態において、現存する細胞内核酸またはタンパク質を標的にすることができるオリゴヌクレオチドを使用してもよい。前記核酸は、前記オリゴヌクレオチドが、転写を減衰もしくは調節し、転写物のプロセシングを改変し、またはその他の方法でタンパク質の発現に干渉するように適合されるように、特定の遺伝子をコードすることができる。「標的核酸」という用語は、特定の遺伝子をコードするＤＮＡ、およびこのようなＤＮＡに由来するすべてのＲＮＡ（ｍＲＮＡ前駆体またはｍＲＮＡである）を包含する。標的核酸と、このような配列に向けられた１種または複数のオリゴヌクレオチドとの特定のハイブリッド形成によって、タンパク質発現の抑制または調節をもたらすことができる。このような特定の標的化を実現するために、オリゴヌクレオチドは、好適には標的核酸の配列に実質的に相補である一続きのヌクレオチドを含むべきである。
【０２３１】
上記の基準を満たすオリゴヌクレオチドは、いくつかの異なる化学的性質および立体的配置で構築される可能性がある。オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ロックト核酸（ＬＮＡ）、２’Ｏ−メチルＲＮＡ（２’Ｏｍｅ）、２’Ｏ−メトキシエチルＲＮＡ（２’ＭＯＥ）（それらのホスフェートもしくはホスホチオエートの形）、またはモルホリノもしくはペプチド核酸（ＰＮＡ）を含む（ただし、これらに限定されるものではない）天然または修飾ヌクレオシドを含んでもよい。オリゴヌクレオチドは、一本鎖でも、二本鎖でもよい。
【０２３２】
オリゴヌクレオチドは、８〜６０個の電荷を有するポリアニオン性構造である。大部分の場合、これらの構造は、ヌクレオチドを含むポリマーである。本発明は、オリゴヌクレオチドの特定の作用機序に限定されず、機序の理解は本発明を実施するのに必要ではない。
【０２３３】
オリゴヌクレオチドの作用機序は異なってもよく、とりわけスプライシング、転写、核−細胞質輸送、および翻訳に及ぼす効果を含む可能性がある。
【０２３４】
本発明の好ましい実施形態において、一本鎖オリゴヌクレオチドを使用することができ、これには、一般的にアンチセンスオリゴヌクレオチドと呼ばれるＤＮＡ系オリゴヌクレオチド、ロックト核酸、２’−修飾オリゴヌクレオチドなどが挙げられるが、これらに限定されない。主鎖または塩基または糖修飾としては、ホスホチオエートＤＮＡ（ＰＴＯ）、２’Ｏ−メチルＲＮＡ（２’Ｏｍｅ）、２’フルオロＲＮＡ（２’Ｆ）、２’Ｏ−メトキシエチル−ＲＮＡ（２’ＭＯＥ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、Ｎ３’−Ｐ５’ホスホアミデート（ＮＰ）、２’フルオロアラビノ核酸（ＦＡＮＡ）、ロックト核酸（ＬＮＡ）、モルホリンホスホアミデート（モルホリノ）、シクロヘキセン核酸（ＣｅＮＡ）、トリシクロ−ＤＮＡ（ｔｃＤＮＡ）などを挙げることができるが、これらに限定されない。さらに、混成した化学的性質は当技術分野で知られており、コポリマー、ブロックコポリマー、もしくはギャップマーとして、または他の配置で２種以上のヌクレオチド種から構築される。
【０２３５】
上記のオリゴヌクレオチドに加えて、相補的配列モチーフを含む二本鎖ＲＮＡ分子を使用して、タンパク質発現を抑制することもできる。このようなＲＮＡ分子は、当技術分野でｓｉＲＮＡ分子と呼ばれる（例えば、WO 99/32619またはWO 02/055693）。他のｓｉＲＮＡは、一本鎖ｓｉＲＮＡ、または１本の非連続鎖を有する二本鎖ｓｉＲＮＡを含む。この場合も、様々な化学的性質をこのクラスのオリゴヌクレオチドに適合させた。また、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド系が当技術分野で知られている。
【０２３６】
本発明の別の実施形態において、デコイオリゴヌクレオチドを使用することができる。これらの二本鎖ＤＮＡ分子およびその化学修飾体は、核酸ではなく転写因子を標的にする。これは、デコイオリゴヌクレオチドが、配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質と結合し、転写に干渉する（例えば、Cho-Chung, et al. in Curr. Opin. Mol. Ther., 1999）。
【０２３７】
本発明の別の実施形態において、遺伝子のプロモーター領域と生理的条件下でハイブリッド形成することによって転写に影響を及ぼすことができるオリゴヌクレオチドを使用してもよい。この場合も、様々な化学的性質をこのクラスのオリゴヌクレオチドに適合させることができる。
【０２３８】
本発明のさらに別の代替形態において、ＤＮＡザイムを使用してもよい。ＤＮＡザイムは、一本鎖オリゴヌクレオチド、および酵素活性によるその化学修飾体である。「１０−２３」モデルと呼ばれる典型的なＤＮＡザイムは、生理的条件下で一本鎖ＲＮＡを特定部位で切断することができる。ＤＮＡザイムの１０−２３モデルは、ＲＮＡ上の標的配列に相補的な２個の基質認識ドメインで両側を挟まれた、１５個の高度に保存されたデオキシリボヌクレオチドの触媒ドメインを有する。標的ｍＲＮＡの切断は、その破壊をもたらす可能性があり、ＤＮＡザイムは複数の基質を再生利用および切断する。
【０２３９】
さらに本発明の別の実施形態において、リボザイムを使用することができる。リボザイムは、一本鎖オリゴリボヌクレオチド、および酵素活性によるその化学修飾体である。これらは、触媒コアを形成する保存されたステムループ構造と、および所与のＲＮＡ転写物の標的部位を取り囲む配列に逆相補であるフランキング配列の２つの成分に分けることができる。フランキング配列は、特異性を付与することができ、一般に、選択される標的部位の両側に伸びる合計で１４〜１６ｎｔを構成する。
【０２４０】
本発明のさらに別の実施形態において、タンパク質を標的にするために、アプタマーを使用してもよい。アプタマーは、ＲＮＡまたはＤＮＡなどの核酸、および特定の分子標的に密接に結合するその化学修飾体から構成された巨大分子であり、典型的には１５〜６０ｎｔの長さである。ヌクレオチド鎖は、分子を複雑な三次元形状に折り畳む分子内相互作用を形成することができる。アプタマーの形状によって、酸性タンパク質、塩基性タンパク質、膜タンパク質、転写因子、および酵素が挙げられるが、これらに限定されるものではない標的分子の表面への密接な結合が可能になる。アプタマー分子の結合は、標的分子の機能に影響を及ぼすことができる。
【０２４１】
上記のオリゴヌクレオチドはすべて、１本の鎖当たりのヌクレオチド長がわずか５、好ましくは８〜５０の間で異なってもよい。より具体的には、オリゴヌクレオチドは、その標的配列のＲＮＡｓｅＨ媒介分解を触媒し、または翻訳を阻止し、またはスプライシングを再指示し、またはアントゴｍｉｒ（ａｎｔｏｇｏｍｉｒ）として作用する、８〜５０のヌクレオチド長を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドとすることができる。これらは、１５〜３０の塩基対長を有するｓｉＲＮＡとすることができる。これらは、さらに１５〜３０の塩基対長を有するデコイオリゴヌクレオチドを表すことができ、１５〜３０のヌクレオチド長を有するゲノムＤＮＡの転写に影響を及ぼす相補的オリゴヌクレオチドとすることができる。これらは、さらに２５〜５０のヌクレオチド長さを有するＤＮＡザイム、または２５〜５０のヌクレオチド長を有するリボザイム、または１５〜６０のヌクレオチド長を有するアプタマーを表すことができる。オリゴヌクレオチドのこのような下位クラスは、機能的に定義されることが多く、同一でも、異なってもよく、あるいは本発明の教示に実質的に影響を及ぼすことなく、それらの化学的性質または構造の一部ではあるが全部ではない特性を共有することができる。オリゴヌクレオチドと標的配列との適合は、一続きの上記のいくつかのオリゴヌクレオチド全体にわたって標的核酸上のその相補的塩基と塩基対を形成するオリゴヌクレオチドの各塩基では、完全であることが好ましい。あまり好ましくはないが、配列の対には、前記一続きの塩基対内に１個または複数のミスマッチが含まれている可能性がある。一般に、このような核酸のタイプおよび化学組成は、インビボであろうとインビトロであろうと、ビヒクルとしての本発明のリポソームの性能にほとんど影響を及ぼさず、当業者は、本発明の脂質集合体との組合せに適した他のタイプのオリゴヌクレオチドまたは核酸を見い出すことができる。
【０２４２】
本発明の一実施形態において、オリゴヌクレオチドは、腫瘍標的に向けられている。好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ＣＥＡＣＡＭ６、ＢＣＬ−２、ＥＰＨＡ２、ＣＴＮＮＢ１、ＲｈｏＡ、ＰＬＫ１、ＸＩＡＰ、テロメラーゼ、サイクリンＤ１、Ｋ−Ｒａｓ、ＥＧ５、Ｋｉ６７、アンドロゲン受容体、ＦｏｘＭ１、Ａｋｔ１、ＶＥＧＦ、ＫＳＢ、ＣＤＣ２５Ｂを含む群から選択される腫瘍標的に向けられている。ＰＬＫ１、ＲｈｏＡ、ＥＧ５、ＦｏｘＭ１、ＣＤＣ２５ＢまたはＫｉ６７に向けられたオリゴヌクレオチドが特に好ましい。
【０２４３】
本発明の別の態様は、１種または複数のトランスフェクションエンハンサー要素を含む１種または複数の脂質を含む脂質集合体を、核酸薬物などの薬物を含めて、活性剤または材料、例えばオリゴヌクレオチドおよびプラスミドの標的送達のための担体として含む医薬組成物に関する。本発明の医薬組成物は、適当な薬理学的に許容されるビヒクル中で製剤することができる。このために、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水などのビヒクルは、当業者によく知られている。
【０２４４】
いくつかの実施形態において、ヒトまたは非ヒト動物の炎症性、免疫もしくは自己免疫障害、および／または癌の治療または予防のための前記医薬組成物を使用してもよい。
【０２４５】
本発明のさらに別の態様は、トランスフェクションエンハンサー要素をその膜中に含む脂質を有するリポソームを活性剤または材料のための担体として含む前記医薬組成物が特定の１つもしくは複数の臓器、腫瘍、または感染もしくは炎症の部位を標的にする、ヒトまたは非ヒト動物の治療方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【０２４６】
【図１】化合物１０〜１４についてのｌｏｇＤ応答を示す図である。
【図２】ＴＥＥ構造中の異なる親水性物質について、ｌｏｇＤとｐＨの関係を示す図である。すべての親水性部分は、アルキル鎖の末端部に位置している。ＬｏｇＤは、ｐＫａとおおよそ等しいｐＨ値で下降し始め、このような下降は、生理的イオン強度でのイオン対形成によって制限される。
【図３】ＴＥＥ構造中の異なる親水性物質について、ｐＨ−ｐＫａをｘ軸として使用するｌｏｇＤの標準化曲線を示す図である。すべての親水性部分は、アルキル鎖の末端部に位置している。３−クロロオクタン酸はオクタン酸と同一であり、図示していない。
【図４】ｌｏｇＤの増分対ｐＨの分析を示す図である。個々の親水性部分のｐＫａから独立している共通のディスクリプタとしてｐＨ−ｐＫａを使用して、曲線を標準化した。
【図５】製剤Ｌ−１、Ｌ−２、およびＬ−３でトランスフェクトされたＨｅｌａ−細胞の２４時間後の蛍光顕微鏡画像を示す図である（４０倍）（倍率：４００倍）。
【図６】製剤Ｌ−４、Ｌ−５、およびＬ−６でトランスフェクトされたＨｅｌａ−細胞の２４時間後の蛍光顕微鏡画像を示す図である（４０倍）（倍率：４００倍）。
【図７】製剤Ｌ−７〜Ｌ−１０でトランスフェクトされたＨｅｌａ細胞の蛍光顕微鏡画像を示す図である（４０倍）（倍率：４００倍）。
【図８】製剤Ｌ−１２〜Ｌ−１５でトランスフェクトされたＨｅｌａ細胞の蛍光顕微鏡画像を示す図である（４０倍）（倍率：４００倍）。
【図９】製剤Ｌ−１７〜Ｌ−２０でトランスフェクトされたＨｅｌａ細胞の蛍光顕微鏡画像を示す図である（４０倍）（倍率：４００倍）。
【図１０】製剤Ｌ−２１〜Ｌ−２４でトランスフェクトされたＨｅｌａ細胞の蛍光顕微鏡画像を示す図である（４０倍）（倍率：４００倍）。
【図１１】遊離カルボキシフルオレセイン（Ｃ１）またはアニオン性のリポソーム標準製剤（ＤＰＰＣ：ＤＰＰＧ：Ｃｈｏｌ  ５０：１０：４０）（Ｃ２）でトランスフェクトされたＨｅｌａ細胞の蛍光顕微鏡画像を示す図である（１０倍）（倍率：１００倍）。
【図１２】リポソーム製剤Ｌ−２５およびＬ−２６を静脈内注射した担腫瘍マウスの腫瘍組織の凍結切片を示す図である。
【図１３】処置群Ｌ−４６（Ｐｌｋ１）、Ｌ−４７（ｓｃｒ）、および生理食塩水の試験期間にわたる腫瘍体積を示す図である。
【図１４】試験の終わりに動物を屠殺した後の処置群Ｌ−４６（Ｐｌｋ１）、Ｌ−４７（ｓｃｒ）、および生理食塩水の最終腫瘍重量を示す図である。
【図１５】ＰＯＰＣ／Ｃｈｏｌ  １：１および逓増量（０〜１０％）の記載する異なるＴＥＥ−脂質からのリポソームの融合の強度を示す（７．５〜２．５のｐＨ範囲にわたって測定されたすべてのＦｒｅｔシグナルのΣＦＲＥＴで表す）図である。
【図１６】ＰＯＰＣ／ＤＯＰＥ  １：３および逓増量（０〜１０％）の記載する異なるＴＥＥ−脂質からのリポソームの融合の強度を示す（７．５〜２．５のｐＨ範囲にわたって測定されたすべてのＦｒｅｔシグナルのΣＦＲＥＴで表す）図である。
【図１７】製剤Ｌ−４６またはＬ−４７でそれぞれトランスフェクトされたＨｅｌａ細胞の蛍光顕微鏡画像を示す図である（１０倍）（倍率：１００倍）（図１７ＡおよびＢ）。
【図１８】製剤Ｌ−４８またはＬ−４９でそれぞれトランスフェクトされたＨｅｌａ細胞の蛍光顕微鏡画像を示す図である（１０倍）（倍率：１００倍）（図１８ＡおよびＢ）。
【図１９】製剤Ｌ−５０〜Ｌ−５３（５〜４０ｎＭ  Ｐｌｋ１−ｓｉＲＮＡまたはスクランブルｓｉＲＮＡ）でトランスフェクトされたＨｅｌａ細胞の細胞増殖を示す（細胞増殖（％）で表す）図である。
【図２０】それぞれＴＥＥ−脂質を含まない、または１０％の異なるＴＥＥ−脂質もしくは対照脂質（Ｃ６−ＰＥ〜Ｃ２０−ＰＥ）を含む、ＰＯＰＣ／Ｃｈｏｌ  １：１からのリポソームの融合の強度を示す（７．５〜２．５のｐＨ範囲にわたって測定されたすべてのＦｒｅｔシグナルのΣＦＲＥＴで表す）図である。ＴＥＥ−脂質を含むリポソームを、ＴＥＥ−脂質を含まないＰＯＰＣ／ＤＯＰＥ  １：３からのリポソームと融合させた。
【図２１】Ｐｌｋ１−ｓｉＲＮＡまたはスクランブルｓｉＲＮＡを封入した製剤Ｌ−５４〜Ｌ−６９でトランスフェクトされたＨｅｌａ細胞の相対的細胞増殖を示す図である。
【図２２】Ｐｌｋ１−ｓｉＲＮＡまたはスクランブルｓｉＲＮＡ（１０〜４０ｎＭ  ｓｉＲＮＡ）を封入した製剤Ｌ−５４〜Ｌ−６１でトランスフェクトされたＨｅｌａ細胞の相対的細胞増殖を示す図である。
【実施例】
【０２４７】
本発明を次の実施例でさらに説明するが、これは本発明の範囲を限定するものではない。
【０２４８】
実施例１
（１６−｛２−［２，３−ビス−ヘキサデカノイルオキシ−プロポキシ）−ヒドロキシ−ホスホリル−オキシ］−エチルアミノ｝−ヘキサデカン酸）（Ｐａｌ−ＰＥまたはｗ１６−ＰＥ）の合成
反応スキーム：
【化４１】
2014208687.tif 000075
【０２４９】
第１ステップ（ａ）：１６−ヒドロキシ−ヘキサデカン酸の１６−オキソ−ヘキサデカン酸への酸化
Ｎ２雰囲気下、１０ｇの化合物１（１６−ヒドロキシ−ヘキサン酸）（１当量）を、１０００ｍｌのジクロロメタン中、１６ｇのＰＣＣ（クロロクロム酸ピリジニウム）で４０℃において１５分間酸化した。溶媒を除去し、残渣を酢酸エチルエステルと、その後に続くシリカゲルクロマトグラフィーステップ（溶離液：酢酸エチルエステル）で分離した。
【０２５０】
第２ステップ（ｂ）：化合物２のジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）による還元的アミノ化
Ｎ２雰囲気下、１１．８ｇのＤＰＰＥ（３）および１６ｇのシアノ水素化ほう素ナトリウム（ＮａＣＮＢＨ３）を８００ｍｌのＣＨＣｌ３／ＣＨ３ＯＨ  １：１に溶解し、６５℃に加熱した。９．４４ｇのピリジンを混合物に添加した。４．６ｇの化合物２（１６−オキソ−ヘキサデカン酸）を４００ｍｌのＣＨＣｌ３／ＣＨ３ＯＨ  １：１に溶解し、最後にさらに反応混合物に滴下した。３時間後、溶媒を除去し、固体を水で２回洗浄した後、再び２００ｍｌのＣＨＣｌ３／ＣＨ３ＯＨ／Ｈ２Ｏ  ５００：１００：４に溶解した。２相を分離した後、有機相の溶媒を除去した。粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィーで精製した（溶離液：ＣＨＣｌ３／ＣＨ３ＯＨ／Ｈ２Ｏ  ５００：１００：４）。生成物を、１Ｈ−ＮＭＲ、ＨＰＬＣ、および薄層クロマトグラフィーによって特徴付けた。
【０２５１】
実施例２
化合物（１０−｛２−［２，３−ビス−ヘキサデカノイルオキシ−プロポキシ）−ヒドロキシ−ホスホリルオキシ］−エチルアミノ｝−デカン酸）（Ｄｅｃａ−ＰＥまたはｗ１０−ＰＥ）の合成
この合成は、ステップａで１０−ヒドロキシデカン酸を使用する代わりに実施例１に従って行った。
【０２５２】
実施例３
Ｃｙ３標識アンチセンスオリゴヌクレオチドを封入した両性リポソームの調製
次のリポソーム調製物を下記に示すように調製した。
【０２５３】
【表２２】
2014208687.tif 000076
【０２５４】
脂質の保存溶液をクロロホルム中で混合し、最後に丸底フラスコ中、真空下で蒸発乾固した。ＰＢＳ（ｐＨ７．５）にとかしたＣｙ３標識アンチセンスオリゴヌクレオチド溶液１ｍｌ（０．５ｍｇ／ｍｌ）で脂質膜を水和した。得られた脂質濃度は５０ｍＭであった。懸濁液を水浴中、室温で４５分間水和し、５分間音波処理し、続いて−７０℃で凍結／融解サイクルを３回行った。融解した後、リポソーム懸濁液を、孔径８００／２００／８００または２００／２００ｎｍのポリカーボネート膜に１９回通して押し出した。封入されていないオリゴヌクレオチドを沈降で除去した。
改変したプロセスで、１つの製剤を調製した。
【０２５５】
【表２３】
2014208687.tif 000077
【０２５６】
簡潔に言えば、脂質を丸底フラスコに量り入れ、クロロホルムに溶解した。次いで、ロータリーエバポレータを使用して、溶媒を蒸発させることによって、脂質膜を生成した。クロロホルム残渣を真空下で終夜除去した。１０ｍＭ  ＮａＡｃ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ４．５）にとかしたＣｙ３標識アンチセンスオリゴヌクレオチド溶液１ｍｌ（０．３５ｍｇ／ｍｌ）で脂質膜を水和している間に、多重膜小胞体が生成した。凍結融解ステップの後、多重膜リポソームを、８００／２００／８００ｎｍのポリカーボネート膜に１９回通して押し出した。押出の後、リポソーム懸濁液のｐＨを１／１０体積の１Ｍ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ８で直ちにシフトさせた。封入されていないオリゴヌクレオチドを沈降で除去した。
【０２５７】
脂質回収率および濃度を有機ホスフェートアッセイで分析した。Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  ３０００ＨＡＳを用いて、動的光散乱法で粒径を測定した。封入効率を蛍光分光法で測定した。
【０２５８】
結果
【０２５９】
【表２４】
2014208687.tif 000078
【０２６０】
実施例４
カルボキシフルオレセイン（ＣＦ）を封入した両性リポソームの調製
次のリポソーム調製物を下記に示すように調製した。
【０２６１】
【表２５】
2014208687.tif 000079
【０２６２】
脂質の保存溶液をクロロホルム中で混合し、最後に丸底フラスコ中、真空下で蒸発乾固した。ＰＢＳ（ｐＨ７．５）にとかした１００ｍＭ  ＣＦで脂質膜を水和した。得られた脂質濃度は２０ｍＭであった。懸濁液を水浴中、室温で４５分間水和し、５分間音波処理し、続いて−７０℃で凍結／融解サイクルを３回行った。融解した後、リポソーム懸濁液を、孔径８００／２００／８００ｎｍのポリカーボネート膜に１５回通して押し出した。封入されていないＣＦをゲル濾過で除去したが、一方リポソームを３倍に希釈した。脂質回収率および濃度を有機ホスフェートアッセイで分析した。Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  ３０００ＨＡＳを用いて、動的光散乱法で粒径を測定した。
【０２６３】
結果
【０２６４】
【表２６】
2014208687.tif 000080
【０２６５】
実施例５
Ｃｙ３標識アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはカルボキシフルオレセイン（ＣＦ）を封入したリポソームによるインビトロトランスフェクション実験
ＨｅＬａ−細胞は、ＤＳＭＺ（Ｇｅｒｍａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏ  Ｏｒｇａｎｉｓｍ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）から入手し、ＤＭＥＭ中で維持した。培地は、Ｇｉｂｃｏ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入し、５％  ＣＯ２中、１０％  ＦＣＳを３７℃で補充した。細胞を２×１０４個の細胞／ｍｌの密度で播種し、１００μｌの培地中で培養した。１６時間後、培地を、全量５０〜２００ｎｇのＣｙ３標識オリゴヌクレオチドまたは０．５ｍＭ  ＣＦ／ウェルを含むリポソーム（Ｌ１〜Ｌ２４）を含有するＯｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ（Ｇｉｂｃｏ）に置換した。細胞培養皿を、４５０ｇ、３７℃で１時間遠心し、続いて５％  ＣＯ２中、３７℃で３時間インキュベートした。トランスフェクション混合物を上記の培地で置換し、細胞をさらに２４〜４８時間インキュベートした。光学および蛍光顕微鏡法で、１０倍または４０倍の倍率の対物レンズ（Ａｘｉｏｎｖｅｒｔ  Ｓ  １００，  Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  Ｉｎｃ．）を使用して、トランスフェクション効率および細胞分布を４時間または２４時間後に決定した。
【０２６６】
結果
Ｃｙ３標識オリゴヌクレオチドを封入したリポソームによるＨｅＬａ−細胞のトランスフェクション
図５は、製剤Ｌ−１、Ｌ−２、およびＬ−３でトランスフェクトされたＨｅｌａ−細胞の蛍光顕微鏡画像を示す。リポソーム製剤Ｌ−３のトランスフェクション効率は、トランスフェクションエンハンサー要素を含む脂質をリポソーム膜中に含める（Ｌ−１およびＬ−２）ことによって改善できることがわかる。
【０２６７】
図６は、製剤Ｌ−４、Ｌ−５、およびＬ−６でトランスフェクトされたＨｅｌａ−細胞の蛍光顕微鏡画像を示す。リポソーム製剤Ｌ−６のトランスフェクション効率は、トランスフェクションエンハンサー要素を含む脂質をリポソーム膜中に含める（Ｌ−４およびＬ−５）ことによって改善できることがわかる。
【０２６８】
カルボキシフルオレセインを封入したリポソームによるＨｅＬａ−細胞のトランスフェクション
カルボキシフルオレセインは、酸性環境（例えば、エンドソーム）中では蛍光シグナルを示さないｐＨ感受性蛍光プローブである。
【０２６９】
図７は、製剤Ｌ−７〜Ｌ−１０でトランスフェクトされたＨｅｌａ細胞の蛍光顕微鏡画像を示す。製剤はすべて、サイトゾルまたは核中で蛍光シグナルを示す。１０％  Ｐａｌ−ＰＥまたはＤｅｃａ−ＰＥをその膜中に有する製剤（Ｌ−７およびＬ−９）では、蛍光シグナルが改善されている。
【０２７０】
図８は、製剤Ｌ−１２〜Ｌ−１５でトランスフェクトされたＨｅｌａ細胞の蛍光顕微鏡画像を示す。この場合、Ｐａｌ−ＰＥをその膜中に有する製剤Ｌ−１２およびＬ−１３については、カルボキシフルオレセインの蛍光シグナルがより強い。Ｐａｌ−ＰＥの量（４％または１０％）は、蛍光シグナルに影響を及ぼさない。
【０２７１】
図９は、製剤Ｌ−１７〜Ｌ−２０でトランスフェクトされたＨｅｌａ細胞の蛍光顕微鏡画像を示す。この場合、Ｐａｌ−ＰＥまたは１０％  Ｄｅｃａ−ＰＥをその膜中に有する製剤Ｌ−１７およびＬ−１９については、カルボキシフルオレセインの蛍光シグナルがより強い。
【０２７２】
図１０は、製剤Ｌ−２１〜Ｌ−２４でトランスフェクトされたＨｅｌａ細胞の蛍光顕微鏡画像を示す。製剤はすべて、サイトゾルまたは核中で蛍光シグナルを示す。１０％  Ｐａｌ−ＰＥまたはＤｅｃａ−ＰＥをその膜中に有する製剤（Ｌ−２１およびＬ−２３）では、蛍光シグナルが改善されている。
【０２７３】
図１１は、遊離カルボキシフルオレセインまたはアニオン性リポソーム標準製剤（ＤＰＰＣ：ＤＰＰＧ：Ｃｈｏｌ  ５０：１０：４０）でトランスフェクトされたＨｅｌａ細胞の蛍光顕微鏡画像を示す。両製剤とも、いずれの蛍光シグナルも示さない。
【０２７４】
実施例６
腫瘍異種移植片を有するマウスにおける両性リポソームの生体内分布
Ｃ５．５アンチセンスオリゴヌクレオチドを封入したリポソームの調製
リポソームは、アルコール注入方法で製造した。独得の処方に従って、脂質混合物を、適切なアルコール（Ｌ−２５ではエタノール、およびＬ−２６ではイソプロパノール／１％  ＨＣｌ）に８ｍｌの体積および適切な濃度（Ｌ−２５では４０ｍＭ、およびＬ−２６では２０ｍＭ）で溶解した。２０ｍＭ  ＨＡｃ、３００ｍＭ  スクロースの緩衝液（ｐＨ４．５）にとかした適切な濃度（Ｌ−２５では５７μｇ／ｍｌ、およびＬ−２６では６７μｇ／ｍｌ）のＣｙ５．５標識アンチセンスオリゴヌクレオチド溶液７２ｍｌの体積を、丸底フラスコに移した。ポンプを備えた注入装置を使用して、両方の溶液を混合した。得られたリポソーム懸濁液を、１Ｍ  トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）ＨＣｌ（ｐＨ８）を用いて全体積の１／１０でｐＨ７．５にシフトさせ、ＰＢＳに対し透析して、封入されていないＣｙ５．５標識アンチセンスオリゴヌクレオチドを除去し、続いて濃縮した。
【０２７５】
【表２７】
2014208687.tif 000081
【０２７６】
空のリポソームの調製
空のリポソーム用の脂質混合物を、エタノール（Ｌ−２７）またはイソプロパノール／１％  ＨＣＬ（Ｌ−２８）に濃度５０ｍＭで溶解した。有機溶媒中の脂質と水性緩衝液（ＰＢＳまたは１０ｍＭ  Ｈａｃ、３００ｍＭ  スクロース、１００ｍＭ  トリス、ｐＨ７．５）を混合することによって、空のリポソームを調製した。リポソーム懸濁液を、ＰＢＳに対し透析し、続いて濃縮した。
【０２７７】
【表２８】
2014208687.tif 000082
【０２７８】
Ｃｙ５．５アンチセンスオリゴヌクレオチド充填リポソームと空のリポソームを混合して、最終脂質濃度を６０ｍＭにした。
【０２７９】
生体内分布試験
５０μｇのリポソームＣｙ５．５標識アンチセンスオリゴヌクレオチド（２ｍｇ／ｋｇ）を、異種移植片腫瘍（ヒト肝癌）（直径６〜８ｍｍ）を有するＣＤ１ヌードマウスの尾静脈に静脈内注射した。群のサイズは、マウス２匹／製剤とした。対照群に対し、１５０μｌのＰＢＳを静脈内投与した。２４時間後に、マウスを屠殺し、腫瘍を回収し、凍結した。
【０２８０】
深冷凍結腫瘍を、部分的にＯＣＴ（Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ）に包埋し、Ｃｒｙｏｓｔａｔ  Ｃｒｙｏ−Ｓｔａｒ  ＨＭ５６０（Ｍｉｃｒｏｍ−Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，  Ｗａｌｌｄｏｒｆ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、−２０℃で１０μｍの切片を作製した。切片を回収し、Ｓｕｐｅｒ  Ｆｒｏｓｔ（登録商標）Ｐｌｕｓ  Ｇｏｌｄ  ｓｌｉｄｅｓ（Ｍｅｎｚｅｌ，  Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）で乾燥し、４℃で貯蔵した。
【０２８１】
臓器スライス凍結切片の画像処理をＬＩ−ＣＯＲ  Ｏｄｙｓｓｅｙ  Ｉｎｆｒａｒｅｄ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（ＬＩ−ＣＯＲ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＧｍｂＨ、Ｂａｄ  Ｈｏｍｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で行った。
【０２８２】
結果
リポソーム製剤Ｌ−２５およびＬ−２６に封入したＣｙ５．５標識アンチセンスオリゴヌクレオチドを静脈内に適用した後、腫瘍組織における蓄積が認められた。図１２は、群の両方の動物の腫瘍組織の凍結切片を示す。製剤Ｌ−２５に比べて、Ｐａｌ−ＰＥ製剤Ｌ−２６は、腫瘍組織における蓄積が５．４倍改善されたことを示す。ＰＢＳ緩衝液を投与された動物の腫瘍組織はいずれの蛍光シグナルも示さない。
【０２８３】
実施例７
腫瘍異種移植片を有するマウスにおける両性リポソームによる腫瘍治療
ｓｉＲＮＡ標的Ｐｌｋ１または非標的スクランブル（ｓｃｒ）ｓｉＲＮＡを封入したリポソームの調製
リポソームを、イソプロパノール注入方法で製造した。脂質混合物を、イソプロパノール／１％  ＨＣｌに２３８ｍｌの体積および適切な濃度（１０ｍＭ）で溶解した。１０ｍＭ  ＨＡｃ、３００ｍＭ  スクロース（ｐＨ４．０）（ＮａＯＨで調整されたｐＨ）にとかした適切な濃度（３６μｇ／ｍｌ）のＰｌｋ１またはｓｃｒ  ｓｉＲＮＡ溶液５５４ｍｌの体積を、丸底フラスコに移した。ポンプを備えた注入装置を使用して、両方の溶液を混合した。得られたリポソーム懸濁液を、１３６ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１００ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ９．０）の２倍の体積でｐＨ７．５にシフトさせ、１００ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１５０ｍＭ  スクロース（ｐＨ７．５）に対し３回透析して封入されていないｓｉＲＮＡを除去し、続けて９．６ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、２．４ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、２８０ｍＭ  スクロース（ｐＨ７．５）で３回透析し、最後に濃縮した。
【０２８４】
【表２９】
2014208687.tif 000083
【０２８５】
インビボ試験での処置群は、以下の通り名付けた。
第１群：生理食塩水（ＰＢＳ）
第２群：Ｌ−４６  Ｐｌｋ１、５ｍｇ／ｓｉＲＮＡ（ｋｇ）、９７６μｍｏｌ／脂質（ｋｇ）
第３群：Ｌ−４７  スクランブル、５ｍｇ／ｋｇ、６１６μｍｏｌ／脂質（ｋｇ）
【０２８６】
使用したｓｉＲＮＡの配列
１．Ｐｌｋ１  ｓｉＲＮＡ：センス  ５’−ａｇａｃｃｕａｃｃｕｃｃｇｇａｕｃａａ（ｄＴｄＴ）−３’
アンチセンス  ５’−ｕｕｇａｕｃｃｇｇａｇｇｕａｇｇｕｃｕ（ｄＴｄＴ）−３’
２．Ｓｃｒ  ｓｉＲＮＡ：センス  ５’−ａａｃｕｇｇｇｕａａｇｃｇｇｇｃｇｃａ（ｄＴｄＴ）−３’
アンチセンス  ５’−ｕｇｃｇｃｃｃｇｃｕｕａｃｃｃａｇｕｕ（ｄＴｄＴ）−３’
【０２８７】
腫瘍治療
１２５μｇのリポソーム活性Ｐｌｋ１またはスクランブルｓｉＲＮＡ（５ｍｇ／ｋｇ）を、異種移植片腫瘍（ヒト肝癌、Ｈｕｈ７）（直径５ｍｍ）を有するＣＤ１ヌードマウスの尾静脈に１週間に２回、１日および４日に３週間静脈内注射した。群のサイズは、マウス５〜７匹／製剤または対照とした。対照群に対し、２００μｌの生理食塩水を静脈内投与した。注射の日ごとに、腫瘍の体積を測定した。腫瘍重量は実験の終わりに確定した。最後の注射の７２時間後に、マウスを屠殺し、腫瘍を回収し、凍結した。
【０２８８】
結果
Ｌ−４６に封入したＰｌｋ１  ｓｉＲＮＡを３週間にわたって６回静脈内に適用した後、腫瘍増殖の抑制は、生理食塩水またはｓｃｒ  ｓｉＲＮＡ（Ｌ−４７）での処置に比べて明らかである（図１３）。第２群（Ｌ−４６  Ｐｌｋ１）の最終腫瘍重量は、それぞれ対照群１または３（生理食塩水またはＬ−４７スクランブル）に比べて明らかに低下している（図１４）。
【０２８９】
実施例８
ＴＥＥを含む脂質を含むリポソームの融合性
脂質融合をＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー転移）シグナルの出現によってモニターするために、蛍光標識リポソームの対検体を調製した。０．３モル％のＮＢＤ−ＰＥをドナーリポソームに添加し、０．３モル％のローダミン−ＰＥをレセプターリポソームに添加した。すべての脂質をイソプロパノールに濃度２０ｍＭで溶解し、下記に示す混合物を個別に調製した。次いで、個別のアルコール性脂質検体５０μｌをそれぞれ、下記の緩衝液のいずれかと急速に混合した。
Ａ）３６０μｌの２０ｍＭ  酢酸／水酸化ナトリウム、ｐＨ４
Ｂ）３６０μｌの２０ｍＭ  酢酸／水酸化ナトリウム、ｐＨ４、さらに１５μｇのｓｉＲＮＡを含む。
Ｃ）３８０μｌの１０ｍＭ  酢酸／１０ｍＭ  リン酸／水酸化ナトリウム、ｐＨ７．５。
【０２９０】
したがって、リポソームを、低ｐＨまたは中性ｐＨで、重要な活性成分のクラスを構成するオリゴヌクレオチドであるｓｉＲＮＡの存在または非存在下に形成した。次いで、少量の１Ｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４を用いて、Ａ）またはＢ）中のリポソームを中和した。
【０２９１】
【表３０】
2014208687.tif 000084
【０２９２】
次いで、ＮＢＤ−ＰＥおよびローダミン−ＰＥ標識リポソームの両方を混合し、この混合検体を少量（ｓｍａｌｌ  ａｌｉｑｕｏｔｓ）ずつ、下降するｐＨを有する緩衝液に曝露した。これらの緩衝液は、２０ｍＭ  クエン酸および４０ｍＭ  リン酸を含んでおり、０．５ｐＨの間隔でｐＨ２〜ｐＨ８で調整した。
【０２９３】
ｐＨ誘導性融合は、３７℃で２時間起こることが可能になり、ＮＢＤ／ローダミン：４６０／５９０ｎｍおよびＮＢＤ／ＮＢＤ：４６０／５３０ｎｍの２組のフィルターを使用して、すべての検体の蛍光を測定した。膜融合のシグナルとしてのＦＲＥＴを、発光（５９０ｎｍ）／発光（５３０ｎｍ）の比で表した。０．５より小さい値は、バックグラウンド蛍光を示し、より高い値はすべて、リポソーム間の融合を示す。
表３１のデータから、試験製剤の大部分は融合性であったことが明らかになる。カチオン性脂質成分としてＤＣ−Ｃｈｏｌを含む製剤は、中間のｐＨ値で極めて融合性であるが、中性のｐＨと酸性のｐＨとにおいて、安定なリポソームを形成することがわかった。リポソームが中性のｐＨで生成され、したがって測定の前に酸性のｐＨに曝露されなかったかどうか、またはこのようなリポソームが酸性のｐＨで生成され、使用する前に中性にしたかどうかはあまり重要ではなかった。また、ｓｉＲＮＡなどのカーゴ分子の存在は、リポソームの融合挙動に影響を与えなかった。
【０２９４】
【表３１−１】
2014208687.tif 000085
【表３１−２】
2014208687.tif 000086
【０２９５】
実施例９
ＴＥＥを含むリポソームのインビボでの使用
この試験では、ｓｉＲＮＡ充填両性リポソームは、標的遺伝子としてＡｐｏＢを使用して製造した。非標的スクランブルｓｉＲＮＡを対照のために使用した。
【０２９６】
脂質混合物Ｌ−４４（ＰＯＰＣ：ＤＯＴＡＰ：ＣＨＥＭＳ：Ｐａｌ−ＰＥ、１５：２８：４７：１０）またはＬ−４５（ＰＯＰＣ：ＤＣ−Ｃｈｏｌ：ＤＭＧＳ：Ｐａｌ−ＰＥ、１５：２８：４７：１０）を、１０ｍＭ  ＨＣｌを含有するイソプロパノールに、Ｌ−４４の場合は３５ｍＭまたはＬ−４５の場合は２５ｍＭの濃度で溶解した。適切な体積のｓｉＲＮＡ保存溶液を、１０ｍＭ  ＨＡｃ、３００ｍＭ  スクロース／Ｔｒｉｓ（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ）（ｐＨ４）に希釈した。有機溶液および水溶液を３：７の比で混合し、リポソーム懸濁液を１５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）でｐＨ＞７．５に直ちにシフトさせた。
接線流法を使用して、ポリエーテルスルホン膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，  Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，  ＭＡ）を備えたＰｅｌｌｉｃｏｎ（登録商標）ＸＬカセットで、製剤を２０または３０倍濃縮した。１００ｍＭ  トリス／Ｈ３ＰＯ４、１５０ｍＭ  スクロース（ｐＨ７．４）の５倍の体積を連続添加し、続いてＨ３ＰＯ４によってｐＨ７．４に滴定された２０ｍＭ  トリス、２８０ｍＭ  スクロースの緩衝液を連続添加することによって、外側の緩衝液を交換した。
【０２９７】
インビボ試験の処置スケジュールは以下の通りであった。Ｃ５７  ＢＣ／６マウスの雄合計５匹／処置群に対し、それぞれの製剤をＡｐｏＢまたはスクランブルｓｉＲＮＡ投与量８ｍｇ／ｋｇおよび注入量２５０μｌで０、１、および２日に静脈内注射した（静脈内投与）（下記の処置群のリストを参照のこと）。生理食塩水の注射は対照とした。最後の処置の２４時間後に、マウスを屠殺し、全血を回収し、血漿を分離した。すべてのマウスの血漿をＡＳＴおよびＡＬＴについて分析した。多くの１０μｌの血漿と、血漿中のＡｐｏＢの分析用の５０ｍＭ  ＤＴＴを含有するＮｕＰａｇｅ（登録商標）ＬＤＳサンプル緩衝液（４倍）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）４０μｌを混合した。血漿中のＡｐｏＢをウエスタンブロットによって分析した。ｍＲＮＡ分析では、約１００ｍｇの肝組織を、ＲＮＡｌａｔｅｒ（登録商標）緩衝液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）（１ｍｌ）の１０倍の体積に回収した。Ｑｕａｎｔｉｇｅｎｅ  Ａｓｓａｙ  （Ｐａｎｏｍｉｃｓ，  ＣＡ）を使用して、すべての肝臓検体中のｍＲＮＡを定量した。
【０２９８】
インビボ試験の処置群は、以下の通り名付けた。
第１群：生理食塩水（ＰＢＳ）
第２群：Ｌ−４４  ＡｐｏＢ、８ｍｇ／ｓｉＲＮＡ（ｋｇ）、４４０μｍｏｌ／脂質（ｋｇ）
第３群：Ｌ−４４  スクランブル、８ｍｇ／ｋｇ、３７０μｍｏｌ／脂質（ｋｇ）
第４群：Ｌ−４５  ＡｐｏＢ、８ｍｇ／ｋｇ、５２０μｍｏｌ／脂質（ｋｇ）
第５群：Ｌ−４５  スクランブル、８ｍｇ／ｋｇ、５６０μｍｏｌ／脂質（ｋｇ）
動物に対し、１、２、および３日に注射し、４日に屠殺した。
【０２９９】
処置によって、Ａｐｏ血漿タンパク質レベルは４０％（Ｌ−４４  ＡｐｏＢ）または４５％（Ｌ−４５  ＡｐｏＢ）低下した。肝臓中のｍＲＮａは、６５％（Ｌ−４４  ＡｐｏＢ）または７５％（Ｌ−４５  ＡｐｏＢ）低下した。肝酵素ＡＳＴおよびＡＬＴは、集中処置の後でさえ変化しないことがわかり、これは、インビボで製剤の忍容性が良好であることを示した。
【０３００】
実施例１０
ＴＥＥの疎水性部分の鎖長の影響
中性または双性イオン性脂質および逓増量のＴＥＥ−脂質（０モル％、２．５モル％、５モル％、または１０モル％）を含む混合物から、リポソームを調製した。ここで、使用したＴＥＥの疎水性部分の鎖長は６〜２０で異なった。
Ａ．ＰＯＰＣ／ＤＯＰＥ＝０．３
Ｂ．ＰＯＰＣ／Ｃｈｏｌ＝１
【０３０１】
実験で使用したＴＥＥ−脂質
ｗ６−ＰＥ      ｗ６−ＤＰＴＡＰ
ｗ１０−ＰＥ
ｗ１２−ＰＥ    ｗ１２−ＤＰＴＡＰ
ｗ１６−ＰＥ    ｗ１６−ＤＰＴＡＰ
ｗ２０−ＤＰＴＡＰ
【０３０２】
【表３２−１】
2014208687.tif 000087
【表３２−２】
2014208687.tif 000088
【０３０３】
ＦＲＥＴに基づく脂質混合アッセイを使用して、脂質混合物の融合性を調査した。脂質融合をＦＲＥＴシグナルの出現によってモニターするために、０．７５モル％のＮＢＤ−ＰＥ（Ｎ−（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）−１，２−ジヘキサデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノール−アミン、トリエチルアンモニウム塩）またはローダミン−ＰＥ（Ｌｉｓｓａｍｉｎｅ（商標）ローダミンＢ  １，２−ジヘキサデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、トリエチルアンモニウム塩）でそれぞれ単一標識されたリポソームを調製した。
【０３０４】
脂質をイソプロパノールに溶解し、混合した。緩衝液（酢酸１０ｍＭ、リン酸１０ｍＭ、ＮａＯＨ、ｐＨ７．５）をアルコール性脂質ミックスに添加し、最終脂質濃度を１．６ｍＭ、および最終イソプロパノール濃度を１２．２％にすることによって、リポソームを生成した。リポソームの調製では、液体ハンドリングロボット（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，  Ｍｕｌｔｉｐｒｏｂｅ  ＩＩ  Ｅｘ）を使用した。ＮＢＤ標識リポソームとＲｈ標識リポソームを１：１の比で混合し、続いて上記の緩衝液で１：１で希釈した。最後に、この混合検体を少量（ｓｍａｌｌ  ａｌｉｑｕｏｔｓ）ずつ、逓減する特定のｐＨ（ＨＡｃ５０ｍＭ、リン酸５０ｍＭ、ＮａＯＨ、ｐＨ７．５；６．５；５．５；４．５；３．５；２．５）にし、３７℃で２時間インキュベートした。リポソームを、このステップで再び１：１で希釈した。
【０３０５】
ＮＢＤ／ローダミン：４６０／５９０ｎｍおよびＮＢＤ／ＮＢＤ：４６０／５３０ｎｍの２組のフィルターを使用して、検体の蛍光を測定した。膜融合のシグナルとしてのＦＲＥＴを、発光（５９０ｎｍ）／発光（５３０ｎｍ）の比で表した。バックグラウンドの０．３５はバックグラウンド蛍光を示し、したがってＦＲＥＴシグナルから減じた。
【０３０６】
融合と単なる凝集を識別するために、懸濁液をｐＨ７．５に中和し、ＦＲＥＴシグナルを再び測定した。リポソームの融合時の残留アルコール含有量３％の起こり得る干渉は、予備実験により排除した。
【０３０７】
融合は、ｐＨ２．５〜ｐＨ７．５において測定されたＦＲＥＴシグナルすべての合計であるΣＦＲＥＴで表すことができる。
【０３０８】
図１５および１６は、逓増量のＴＥＥ−脂質を含む中性または双性イオン性脂質混合物のΣＦＲＥＴで表された融合を示す。結果は、ＴＥＥの疎水性部分の鎖長が長いほど、リポソームの融合が強くなることを明らかに示す。
【０３０９】
実施例１１
カルボキシフルオレセイン（ＣＦ）を封入したリポソームによるインビトロトランスフェクション実験
リポソームの調製
次のリポソーム調製物を実施例４に示すように調製した。リポソーム懸濁液を、孔径８００／８００ｎｍのポリカーボネート膜に１９回通して押し出した。
【０３１０】
【表３３】
2014208687.tif 000089
【０３１１】
インビトロトランスフェクション
ＨｅＬａ−細胞は、ＤＳＭＺ（Ｇｅｒｍａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏ  Ｏｒｇａｎｉｓｍ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）から入手し、ＤＭＥＭ中で維持した。培地は、Ｇｉｂｃｏ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入し、５％  ＣＯ２中、１０％  ＦＣＳを３７℃で補充した。細胞を４×１０４個の細胞／ｍｌの密度で播種し、１００μｌの培地中で培養した。１６時間後、培地を、全量０．０５ｍＭ  ＣＦ／ウェルを含むリポソーム（Ｌ−４６〜Ｌ−４９）を含有するＯｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ（Ｇｉｂｃｏ）に置換した。細胞培養皿を、５％  ＣＯ２中、３７℃で４時間インキュベートした。蛍光顕微鏡法で露光時間時間を５秒にし、１０／１００倍対物レンズ（Ａｘｉｏｎｖｅｒｔ  Ｓ  １００，  Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  Ｉｎｃ．）を使用して、トランスフェクション効率および細胞分布を４時間後に決定した。画像処理する前に、細胞をＰＢＳ（ｐＨ７．４）で数回（５回）洗浄し、直接（インキュベーション時間２０〜３０秒）５０μｌのＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で分析した。対照として、ＰＢＳ中の遊離ＣＦ（０．１ｍＭ）を細胞に添加した。
【０３１２】
結果
【０３１３】
【表３４】
2014208687.tif 000090
【０３１４】
カルボキシフルオレセインを封入したリポソームによるＨｅＬａ−細胞のトランスフェクション
カルボキシフルオレセインは、酸性環境（例えば、エンドソーム）では蛍光シグナルを示さないｐＨ感受性蛍光プローブである。
【０３１５】
図１７ＡおよびＢと図１８ＡおよびＢは、製剤Ｌ−４６〜Ｌ−４９でトランスフェクトされたＨｅｌａ細胞の蛍光顕微鏡画像を示す。１０％  Ｐａｌ−ＰＥをその膜中に有する製剤Ｌ−４７およびＬ−４９については、カルボキシフルオレセインの蛍光シグナルがより強い。遊離ＣＦでは、蛍光シグナルは観察されなかった（データ図示せず）。
【０３１６】
実施例１２
ｓｉＲＮＡ標的Ｐｌｋ−１または非標的スクランブル（ｓｃｒ）ｓｉＲＮＡを封入したリポソームによるインビトロトランスフェクション実験
リポソームの調製
リポソームを、イソプロパノールまたはエタノール注入方法で製造した。脂質混合物を、イソプロパノール／１％  ＨＣｌ（Ｌ−５０およびＬ−５１））またはエタノール（Ｌ−５２およびＬ−５３）に脂質濃度６．７ｍＭで溶解した。脂質溶液を、１０ｍＭ  ＨＡＣ、３００ｍＭ  スクロース（ｐＨ４．０）（Ｔｒｉｓで調整したｐＨ）にとかした適切なｓｉＲＮＡ溶液（１６９μｇ／ｍｌ）に注入し、最終アルコール濃度を３０％にした。生成したリポソーム懸濁液を、１５０ｍＭ  ＴＲＩＳ（ｐＨ８．０）（ＨＣｌで調整したｐＨ）の２倍の体積でｐＨ７．５にシフトさせ、次いで２０ｍＭ  トリス、２８０ｍＭ  スクロース（ｐＨ７．４）（ＨＣｌで調整したｐＨ）に対し透析して、封入されていないｓｉＲＮＡおよびアルコールを除去した。
【０３１７】
【表３５】
2014208687.tif 000091
【０３１８】
トランスフェクションプロトコル
ＨｅＬａ細胞は、ＤＳＭＺ（Ｇｅｒｍａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏ  Ｏｒｇａｎｉｓｍ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）から入手し、ＤＭＥＭ中で維持した。培地は、Ｇｉｂｃｏ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入し、５％  ＣＯ２中、１０％  ＦＣＳを３７℃で補充した。細胞を１．５×１０４個の細胞／ｍｌの密度で播種し、１００μｌの培地中で培養した。１６時間後、ｓｉＲＮＡを含むリポソームをＯｐｔｉｍｅｍ  Ｉ（Ｇｉｂｃｏ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に希釈し、１０μｌを細胞に添加した（最終体積１１０μｌ、および９．１％  ＦＣＳ／ウェル）（５〜４０ｎＭ  Ｐｌｋ１またはスクランブルｓｉＲＮＡ）。１０μｌのＯｐｔｉｍｅｍ  Ｉを、無処置細胞にも、細胞を含まないウェルにも添加した。さらに、対照として、細胞に遊離ｓｉＲＮＡ（１０〜８０ｎＭ  Ｐｌｋ−１またはスクランブルｓｉＲＮＡ）を添加した。細胞培養皿を、５％  ＣＯ２中、３７℃で７２時間インキュベートした。細胞増殖能／生存率アッセイを使用して、トランスフェクション効率を分析した。
【０３１９】
細胞増殖能／生存率アッセイ
ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｂｌｕｅ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，  ＵＳ）を使用することによって、細胞増殖能／生存率を確定した。要するに、トランスフェクションの７２時間後に、２０μｌのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｂｌｕｅ試薬をウェルに添加した。３７℃で２．５時間インキュベートした後、１００μｌの培地を黒色マイクロタイタープレート（ＮＵＮＣ，  Ｄｅｎｍａｒｋ）のウェルに移した。蛍光プレートリーダーを使用して（励起５５０ｎｍ／発光５９０ｎｍ）、蛍光を記録した。各プレートには、次の対照を含めた。ｉ）細胞を含まないが培地を含むウェル（培地バックグラウンド蛍光のための対照）、およびｉｉ）細胞を含むウェル（無処置細胞＝モックのトランスフェクトされた細胞）。計算のため、実験ウェル（トランスフェクトされた細胞およびモックのトランスフェクトされた細胞）のすべての値から、培地バックグラウンドの平均蛍光値を減じた。各レプリケートトランスフェクションからの平均蛍光値を、モックのトランスフェクトされた細胞からの平均蛍光値にノーマライズし、これを１００％と設定した。
【０３２０】
結果
【０３２１】
【表３６】
2014208687.tif 000092
【０３２２】
ｓｉＲＮＡ標的Ｐｌｋ−１または非標的スクランブル（ｓｃｒ）ｓｉＲＮＡを封入したリポソームによるＨｅｌａ細胞のトランスフェクション
図１９は、製剤Ｌ−５０〜Ｌ５３によるＨｅｌａ細胞のトランスフェクション後の細胞増殖（％）を示す。１０％のＴＥＥ−脂質Ｐａｌ−ＰＥを含み、Ｐｌｋ−１  ｓｉＲＮＡを封入した製剤Ｌ−５０によって、細胞増殖が明らかに増殖約２０％に低下することが明らかになる。細胞増殖の低下は用量依存的である。一方、ＴＥＥ−脂質を含まず、Ｐｌｋ−１  ｓｉＲＮＡを封入した製剤Ｌ−５２は、Ｈｅｌａ細胞の細胞増殖を細胞増殖約８０％にしか低下することができない。スクランブルｓｉＲＮＡを封入した製剤Ｌ−５１とＬ−５３はどちらも、Ｈｅｌａ細胞の増殖にわずかにしか影響を及ぼさない。
【０３２３】
実施例１３
ＴＥＥを含む脂質を含むリポソームの融合性
中性または双性イオン性脂質（ＰＯＰＣ／Ｃｈｏｌ  １：１）および１０モル％のＴＥＥ−脂質を含む混合物から、リポソームを調製した。ここで、使用したＴＥＥの疎水性部分の鎖長は６〜２０で異なった。対照として、ＴＥＥ−脂質を含まないリポソーム、およびｐＨ感受性親水性部分としてのカルボキシル基がないアルキル鎖を有する脂質を含むリポソーム（Ｃ６−ＰＥ、Ｃ１２−ＰＥ、Ｃ１６−ＰＥ、Ｃ２０−ＰＥ）を調製した。
【０３２４】
実験に使用したＴＥＥ−脂質
w6-PE    w6-DPTAP      C6-PE
w12-PE    w12-DPTAP      C12-PE
w16-PE    w16-DPTAP      C16-PE
w20-DPTAP      C20-PE
【０３２５】
【表３７−１】
2014208687.tif 000093
【表３７−２】
2014208687.tif 000094
【０３２６】
ＦＲＥＴに基づく脂質混合アッセイを使用して、脂質混合物の融合性を調査した。上述のリポソーム混合物を、０．７５モル％のＮＢＤ−ＰＥ（Ｎ−（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）−１，２−ジヘキサデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノール−アミン、トリエチルアンモニウム塩）の存在下で調製した。さらに、０．７５モル％のローダミン−ＰＥ（Ｌｉｓｓａｍｉｎｅ（商標）ローダミンＢ  １，２−ジヘキサデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、トリエチルアンモニウム塩）で単一標識されたＴＥＥ−脂質を含まない中性リポソーム（ＰＯＰＣ／ＤＯＰＥ  １：３）を調製した。ＮＢＤ−ＰＥ単一標識リポソームとローダミン−ＰＥ単一標識ＰＯＰＣ／ＤＯＰＥ（１：３）リポソームを混合した。ＦＲＥＴシグナルの出現によって、脂質融合をモニターした。
【０３２７】
脂質をイソプロパノールに溶解し、混合した。緩衝液（酢酸１０ｍＭ、リン酸１０ｍＭ、ＮａＯＨ、ｐＨ７．５）をアルコール性脂質ミックスに添加し、最終脂質濃度を１．６ｍＭ、および最終イソプロパノール濃度を１２．２％にすることによって、リポソームを生成した。ＮＢＤ標識リポソームとＲｈ標識リポソームを１：１の比で混合し、続いて上記の緩衝液で１：１で希釈した。最後に、この混合検体を少量（ｓｍａｌｌ  ａｌｉｑｕｏｔｓ）ずつ、逓減する特定のｐＨ（ＨＡｃ５０ｍＭ、リン酸５０ｍＭ、ＮａＯＨ、ｐＨ７．５〜２．５）にし、３７℃で２時間インキュベートした。リポソームを、このステップで再び１：１で希釈した。
【０３２８】
ＮＢＤ／ローダミン：４６０／５９０ｎｍおよびＮＢＤ／ＮＢＤ：４６０／５３０ｎｍの２組のフィルターを使用して、検体の蛍光を測定した。膜融合のシグナルとしてのＦＲＥＴを、発光（５９０ｎｍ）／発光（５３０ｎｍ）の比で表した。バックグラウンドの０．３５はバックグラウンド蛍光を示し、したがってＦＲＥＴシグナルから減じた。
【０３２９】
融合は、ｐＨ２．５〜ｐＨ７．５において測定されたＦＲＥＴシグナルすべての合計であるΣＦＲＥＴで表すことができる。
【０３３０】
図２０は、純粋なＰＯＰＣ／ＤＯＰＥ（１：３）リポソームを用いて、それぞれ１０モル％のＴＥＥ−脂質を含むＰＯＰＣ／Ｃｈｏｌ（１：１）リポソームまたは上述の対照脂質の融合能力を検出するための実験の結果を示す。カルボキシル基がないアルキル鎖を有する脂質を含むリポソーム（Ｃ６−ＰＥ〜Ｃ２０−ＰＥ）は、ＴＥＥを含む脂質を含むリポソームに比べて融合性が低いことが明らかになる。
【０３３１】
実施例１４
ＴＥＥ−脂質を含むリポソームの融合性
ＦＲＥＴに基づく脂質混合アッセイを使用して、脂質混合物の融合性を調査した。脂質融合をＦＲＥＴシグナルの出現によってモニターするために、０．７５モル％のＮＢＤ−ＰＥ（Ｎ−（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）−１，２−ジヘキサデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノール−アミン、トリエチルアンモニウム塩）またはローダミン−ＰＥ（Ｌｉｓｓａｍｉｎｅ（商標）ローダミンＢ  １，２−ジヘキサデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、トリエチルアンモニウム塩）でそれぞれ単一標識されたリポソームを調製した。
【０３３２】
脂質をイソプロパノールに溶解し、混合した。緩衝液（酢酸１０ｍＭ、リン酸１０ｍＭ、ＮａＯＨ、ｐＨ７．５）をアルコール性脂質ミックスに添加し、最終脂質濃度を１．４６ｍＭ、および最終イソプロパノール濃度を１３．２％にすることによって、リポソームを生成した。リポソームの調製では、液体ハンドリングロボット（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，  Ｍｕｌｔｉｐｒｏｂｅ  ＩＩ  Ｅｘ）を使用した。ＮＢＤ標識リポソームとＲｈ標識リポソームを１：１の比で混合し、続いて上記の緩衝液で１：１で希釈した。最後に、この混合検体を少量（ｓｍａｌｌ  ａｌｉｑｕｏｔｓ）ずつ、逓減する特定のｐＨ（ＨＡｃ５０ｍＭ、リン酸５０ｍＭ、ＮａＯＨ、ｐＨ７．５；６．５；５．５；４．５；３．５；２．５）にし、３７℃で２時間インキュベートした。リポソームを、このステップで再び１：１で希釈した。
【０３３３】
ＮＢＤ／ローダミン：４６０／５９０ｎｍおよびＮＢＤ／ＮＢＤ：４６０／５３０ｎｍの２組のフィルターを使用して、検体の蛍光を測定した。膜融合のシグナルとしてのＦＲＥＴを、発光（５９０ｎｍ）／発光（５３０ｎｍ）の比で表した。バックグラウンドの０．３５はバックグラウンド蛍光を示し、したがってＦＲＥＴシグナルから減じた。
【０３３４】
融合は、ｐＨ２．５〜ｐＨ７．５において測定されたＦＲＥＴシグナルすべての合計であるΣＦＲＥＴで表すことができる。
【０３３５】
リポソームの融合性に及ぼすＴＥＥ−脂質の影響を評価するために、異なる脂質混合物および異なるＴＥＥ−脂質を用いた選別を、上述されたように行った。各両性脂質対について表３８に示すように、４８個の異なる製剤を融合選別で試験したが、一方両性脂質対と中性脂質のモル比は０．６６に設定した。
【０３３６】
【表３８】
2014208687.tif 000095
【０３３７】
結果
リポソーム製剤の融合性に及ぼすＴＥＥ−脂質の影響率は、各製剤の０％  ＴＥＥ−脂質と１０％  ＴＥＥ−脂質との間のΣＦＲＥＴの勾配を算出することによって実験データから確定することができる。表３８中のほぼすべての製剤の融合性は、脂質混合物中のＴＥＥ−脂質によって改善することができる。
【０３３８】
異なる中性脂質系の勾配を比較すると、リポソーム製剤の融合性に及ぼすＴＥＥ−脂質の影響は、製剤中で使用した中性脂質に依存する可能性があることが明らかになる。表３８に示したすべての製剤について算出した、中性脂質系の０％  ＴＥＥ−脂質および１０％  ＴＥＥ−脂質の平均影響率および平均ΣＦＲＥＴを表３９にまとめる。ＤＯＰＥまたは高量のＤＯＰＥとの混合物など非常に融合性の高い六方相形成脂質を含む脂質混合物に及ぼすＴＥＥ−脂質の影響は、特定の量の安定なホスファチジルコリン、およびＣｈｏｌなどの六方相形成脂質を含む脂質混合物に及ぼす影響より低いことが明らかになる。中性脂質としてＰＯＰＣなど安定なホスファチジルコリンしか含まない脂質混合物は、同様にＴＥＥ−脂質によって改善することができるが、ＣｈｏｌまたはＤＯＰＥなど特定の量の六方相形成脂質を含む混合物より低い程度でしか改善することができない。
【０３３９】
【表３９】
2014208687.tif 000096
【０３４０】
実施例１５
ｓｉＲＮＡ標的Ｐｌｋ−１または非標的スクランブル（ｓｃｒ）ｓｉＲＮＡを封入したリポソームによるインビトロトランスフェクション実験
リポソームの調製
リポソームを、イソプロパノール注入方法で製造した。脂質をイソプロパノールに溶解し、混合した。ＮａＡｃ２０ｍＭ、スクロース３００ｍＭ（ｐＨ４．０）（ＨＡｃで調整したｐＨ）にとかしたｓｉＲＮＡ溶液（１６３．２または８１．５μｇ／ｍｌ）をアルコール性脂質ミックスに添加し、最終アルコール濃度を３０％にすることによって、リポソームを生成した。生成したリポソーム懸濁液を、１３６ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１００ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ９）の２倍の体積でｐＨ７．５にシフトさせ、最終脂質濃度を１．４ｍＭ、および最終イソプロパノール濃度を１０％にした。リポソームの調製では、液体ハンドリングロボット（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，  Ｍｕｌｔｉｐｒｏｂｅ  ＩＩ  Ｅｘ）を使用した。
【０３４１】
【表４０】
2014208687.tif 000097
【０３４２】
トランスフェクションプロトコル
ＨｅＬａ細胞は、ＤＳＭＺ（Ｇｅｒｍａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏ  Ｏｒｇａｎｉｓｍ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）から入手し、ＤＭＥＭ中で維持した。培地は、Ｇｉｂｃｏ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入し、５％  ＣＯ２中、１０％  ＦＣＳを３７℃で補充した。細胞を２×１０４個の細胞／ｍｌの密度で播種し、１００μｌの培地中で培養した。１６時間後、ｓｉＲＮＡを含むリポソームをＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に希釈し、１０μｌを細胞に添加した（最終体積１１０μｌ、および９．１％  ＦＣＳ／ウェル）（５〜８０ｎＭ  Ｐｌｋ１またはスクランブルｓｉＲＮＡ）。１０μｌのＰＢＳを、無処置細胞にも、細胞を含まないウェルにも添加した。さらに、対照として、細胞に遊離ｓｉＲＮＡ（１０〜８０ｎＭ  Ｐｌｋ−１またはスクランブルｓｉＲＮＡ）を添加した。細胞培養皿を、５％  ＣＯ２下、３７℃で７２時間インキュベートした。細胞増殖能／生存率アッセイを使用して、トランスフェクション効率を分析した。
【０３４３】
細胞増殖能／生存率アッセイ
ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｂｌｕｅ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，  ＵＳ）を使用することによって、細胞増殖能／生存率を確定した。要するに、トランスフェクションの７２時間後に、２０μｌのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｂｌｕｅ試薬をウェルに添加した。３７℃で２．５時間インキュベートした後、１００μｌの培地を黒色マイクロタイタープレート（ＮＵＮＣ，  Ｄｅｎｍａｒｋ）のウェルに移した。蛍光プレートリーダーを使用して（励起５５０ｎｍ／発光５９０ｎｍ）、蛍光を記録した。各プレートには、次の対照を含めた。ｉ）細胞を含まないが培地を含むウェル（培地バックグラウンド蛍光のための対照）、およびｉｉ）細胞を含むウェル（無処置細胞＝モックのトランスフェクトされた細胞）。計算のため、実験ウェル（トランスフェクトされた細胞およびモックのトランスフェクトされた細胞）のすべての値から、培地バックグラウンドの平均蛍光値を減じた。各トランスフェクションからの蛍光値を、モックのトランスフェクトされた細胞からの平均蛍光値にノーマライズし、これを１００％と設定した。
【０３４４】
結果
図２１は、製剤Ｌ−５４〜Ｌ６９によるＨｅｌａ細胞のトランスフェクション後の相対的細胞増殖を示す。ｗ１６−ＰＥを含み、Ｐｌｋ−１  ｓｉＲＮＡを封入した製剤はすべて、細胞増殖を低下させる。図２２は、細胞増殖の低下が用量依存的であることを示す。一方、ＴＥＥ−脂質を含まず、Ｐｌｋ−１  ｓｉＲＮＡを封入した製剤は、Ｈｅｌａ細胞の細胞増殖により低い程度でしか影響を及ぼさない。スクランブルｓｉＲＮＡを封入した製剤は、Ｈｅｌａ細胞増殖に影響を及ぼさない。
【０３４５】
実施例１６
６−｛２−［２，３−ビス−ヘキサデカノイルオキシ−プロポキシ）−ヒドロキシ−ホスホリル−オキシ］−エチルアミノ｝−ヘキサン酸（ｗ６−ＰＥ）の合成
ステップａ．６−オキソヘキサン酸の合成
実施例１のステップａに記載されているように、１０ｇの６−ヒドロキシカプロン酸（１当量）を３２．６ｇのＰＣＣ（クロロクロム酸ピリジニウム）（２当量）で３７℃において約２０分間酸化した。
【０３４６】
ステップｂ．ｗ６−ＰＥの合成
第２ステップでは、１．１１ｇの６−オキソヘキサン酸、４．７２ｇのＤＰＰＥ、６．０ｇのシアノ水素化ほう素ナトリウム（ＮａＣＮＢＨ３）、および３．７８ｇのピリジンを使用して、実施例１のステップｂに記載されている還元的アミノ化によって、ｗ６−ＰＥを合成した。４時間後に、溶媒を除去し、残渣を２．５リットルのクロロホルム／メタノール／Ｈ２Ｏ（５００：１００：４）に溶解し、１００ｍｌのＨ２Ｏを添加した。２相を分液した後、有機相の溶媒を除去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：クロロホルム／メタノール／Ｈ２Ｏ  ５００：３００：４）で精製した。溶媒を除去し、残渣を１０ｍｌのＨ２Ｏで洗浄した。混合物をフリットにし、粗生成物を２つの別のシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液１：クロロホルム／メタノール／Ｈ２Ｏ  ５００：３００：４；溶離液２：クロロホルム／メタノール／Ｈ２Ｏ  ５００：１００：４）で精製した。生成物の純度を、薄層クロマトグラフィー、１Ｈ−ＮＭＲ、およびＬＣ−ＭＳによって判定した。
【０３４７】
実施例１７
１２−｛２−［２，３−ビス−ヘキサデカノイルオキシ−プロポキシ）−ヒドロキシ−ホスホリル−オキシ］−エチルアミノ｝−ドデカン酸（ｗ１２−ＰＥ）の合成
ステップａ．１２−オキソ−ドデカン酸の合成
実施例１のステップａに記載されているように、１４ｇの１２−ヒドロキシドデカン酸（１当量）を２７．９ｇのＰＣＣ（クロロクロム酸ピリジニウム）（２当量）で３７℃において約２５分間酸化した。
【０３４８】
ステップｂ．ｗ１２−ＰＥの合成
第２ステップでは、１．２ｇの１２−オキソ−ドデカン酸、３．８８ｇのＤＰＰＥ、４．９３ｇのシアノ水素化ほう素ナトリウム（ＮａＣＮＢＨ３）、および３．１ｇのピリジンを使用して、実施例１のステップｂに記載されている還元的アミノ化によって、ｗ１２−ＰＥを合成した。５時間後に、溶媒を除去し、残渣に１００ｍｌのＨ２Ｏを添加し、次いで混合物を音波処理した。遠心ステップの後に、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：クロロホルム／メタノール／Ｈ２Ｏ  ５００：１００：４）で精製した。生成物の純度を、薄層クロマトグラフィー、１Ｈ−ＮＭＲ、およびＨＰＬＣによって判定した。
【０３４９】
実施例１８
２１−｛２−［（２，３−ビス−ヘキサデカノイルオキシ−プロポキシ）−ヒドロキシ−ホスホリルオキシ］−エチルアミノ｝−ヘニコサン酸（ｗ２１−ＰＥ）の合成
ステップａ．１１−ヨードウンデカン酸の合成
１１−ヨードウンデカン酸を、Bergbreiter, J.Org.Chem., 40 (6), (1975)779-782に従って合成した。簡潔に言えば、Ｎ２雰囲気下で、２５０ｇの１１−ブロモウンデカン酸、３２５ｇのヨウ化ナトリウム、および２リットルのアセトンを２４時間還流した。混合物を分割し、それぞれ４リットルのＨ２Ｏに添加した。混合物をフリットにし、粗生成物をメタノールから再結晶し、最後に融点によって特徴付けた。
【０３５０】
ステップｂ．１１−ヨード−ウンデカン酸エチルエステルの合成
１１−ヨード−ウンデカン酸エチルエステルを、Bergbreiter, J.Org.Chem., 40 /6, (1975)779に従って合成した。簡潔に言えば、２４６．６ｇの１１−ヨードウンデカン酸、４４０ｍｌの乾燥エタノール、４４０ｍｌの乾燥トルオール、および５ｍｌのＨ２ＳＯ４（９８％）を混合した。混合物を蒸留し、それによって約４００ｍｌの共沸混合物を７５℃または７６℃でそれぞれ除去した。次いで、１５ｇのＫ２ＣＯ３を添加し、５分後に、混合物を濾過し、最後に浴温度１１５℃で蒸留した。得られた茶色油を、シリカゲル充填フリットに通す濾過（溶離液：酢酸エチルエステル／石油エーテル  １：７）によって精製した。最終生成物を、１Ｈ−ＮＭＲおよび薄層クロマトグラフィーによって特徴付けた。
【０３５１】
ステップｃ．ドコス−２１−エン酸エチルエステルの合成
ドコス−２１−エン酸エチルエステルを、Bergbreiter et al., J. Org. Chem, 40 (6), (1975), 779-782に従って合成した。
グリニャール試薬
１．５５ｇのマグネシウムを、Ｎ２雰囲気下、２０ｍｌの乾燥テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）およびヨウ素結晶と混合した。次いで、１１．０９ｇの１１−クロロ−１−ウンデセンを２２ｍｌの乾燥ＴＨＦに溶解し、この溶液を３０℃でマグネシウム混合物に徐々に滴下した。さらにヨウ素結晶を添加した後、混合物を４５分間還流した。次いで、混合物を反応させ、２５分後、再び４５分間還流した。
主反応
Ｎ２雰囲気下、１１．１９ｇのヨウ化銅（Ｉ）および１００ｍｌのＴＨＦを混合し、−７８℃に冷却した。次いで、３６．７３ｍｌのメチルリチウム（エーテル中１．６Ｍ）を滴下した。混合物を０℃にし、次いで再び−７８℃に冷却した。グリニャール試薬を滴下した後、混合物を１時間撹拌した。次いで、温度を段階的に２０℃まで上げ、再び−７８℃まで下げた。ステップｂからの１１−ヨード−ウンデカン酸エチルエステルを２０ｍｌの乾燥ＴＨＦに溶解し、反応混合物に滴下し、次いで約１時間撹拌させた。次いで、混合物を融解し、一夜後、３００ｍｌの飽和ＮＨ４Ｃｌ溶液および２００ｍｌのエーテルに添加した。固体を濾過によって除去し、濾液の相を分液し、水相をエーテルで３回洗浄した。合わせた有機相を塩水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。次いで、有機溶媒をロータリーエバポレータで除去し、粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：１．石油エーテル；２．酢酸エチルエステル／石油エーテル  １：２０）で精製し、続いてエタノールから再結晶した。最後に、生成物の純度を、薄層クロマトグラフィー、および１Ｈ−ＮＭＲによって判定した。
【０３５２】
ステップｄ．２２−ヒドロキシ−ドコサン酸の合成
２２−ヒドロキシ−ドコサン酸を、Mori et al., Liebigs Ann.Chem., (1991), 253-257に従って合成した。簡潔に言えば、Ｎ２雰囲気下、６．６ｇのドコス−２１−エン酸エチルエステルおよび３０ｍｌのＴＨＦを混合し、０℃に冷却した。次いで、０．５当量（９ｍｌ）のボラン／ＴＨＦ錯体を滴下し、混合物を室温で２時間撹拌させた。１．２ｍｌのＨ２Ｏを添加した後、懸濁液再び０℃に冷却し、１５ｍｌの３Ｍ  ＮａＯＨおよび２ｍｌの３５％  Ｈ２Ｏ２を添加した。混合物を５０℃で１時間撹拌した。次いで、温度を室温にし、ｐＨを、２Ｎ  ＨＣｌでｐＨ２〜３に調整した。固体をフリットにし、Ｈ２Ｏで洗浄し、ＣＨＣｌ３で３回共蒸留し、ＣＨＣｌ３から再結晶した。さらにＴＨＦ中５０℃においてＮａＯＨ（Ｈ２Ｏ中３Ｍ）で１．５日にわたって処置した後、ｐＨを再びｐＨ２〜３に調整し、粗生成物をフリットにし、Ｈ２Ｏで洗浄し、ＣＨＣｌ３で２回共蒸留した。生成物を、薄層クロマトグラフィーおよび１Ｈ−ＮＭＲによって特徴付けた。
【０３５３】
ステップｅ．２２−オキソ−ドコサン酸の合成
実施例１のステップａに記載されているように、３．９ｇの２２−ヒドロキシ−ドコサン酸（１当量）を、４．７２ｇのＰＣＣ（クロロクロム酸ピリジニウム）（２当量）で還流下に約２時間酸化した。
【０３５４】
ステップｆ．ｗ２１−ＰＥの合成
このステップでは、０．６２ｇの２２−オキソ−ドコサン酸、１．２１ｇのＤＰＰＥ、１．５４ｇのシアノ水素化ほう素ナトリウム（ＮａＣＮＢＨ３）、および０．９７ｇのピリジンを使用して、実施例１のステップｂに記載されている還元的アミノ化によって、ｗ２１−ＰＥを合成した。５時間後に、溶媒を除去し、残渣に４０ｍｌのＨ２Ｏを添加し、次いで混合物を音波処理した。固体をフリットにした後、粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：クロロホルム／メタノール／Ｈ２Ｏ  ５００：１００：４）で精製した。生成物の純度を、薄層クロマトグラフィー、１Ｈ−ＮＭＲ、およびＨＰＬＣによって判定した。
【０３５５】
実施例１９
ヘキサデカン酸１−｛［（５−カルボキシ−ペンチル）−ジメチル−アンモニウム］メチル−２−ヘキサデカノイルオキシ−エチルエステル（ｗ６−ＤＰＴＡＰ）の合成
反応スキーム
【化４２】
2014208687.tif 000098
【化４３】
2014208687.tif 000099
【化４４】
2014208687.tif 000100
【０３５６】
ステップａ：ヘキサデカン酸１−ジメチルアミノメチル−２−ヘキサデカノイルオキシ−エチルエステルの合成
４３．１７ｇの３−（ジメチルアミノ）−１，２−プロパンジオールを１０００ｍｌのジクロロメタンに溶解した。７３．３ｇのトリエチルアミンおよび０．０１ｇの４−ジメチルアミノピリジンを添加した後、混合物を０℃に冷却した。次いで、１００ｍｌのジクロロメタンに溶解した１９９．１８ｇのヘキサデカン酸クロリドを滴下した。さらに１００ｍｌのジクロロメタンを添加した後、混合物を室温にし、終夜撹拌させた。混合物を濾過し、残渣を３００ｍｌのジクロロメタンで洗浄した。ロータリーエバポレータを使用して、濾液の溶媒を除去し、粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：酢酸エチルエステル／石油エーテル  １：１）で精製した。生成物を１Ｈ−ＮＭＲによって特徴付けた。
【０３５７】
ステップｂ：（２，３−ビス−ヘキサデカノイルオキシ−プロピル）−（６−ヒドロキシヘキシル）−ジメチル−アンモニウムブロミドの合成
Ｎ２雰囲気下、３２．３９ｇのヘキサデカン酸１−ジメチルアミノメチル−２−ヘキサデカノイルオキシ−エチルエステル、９．８４ｇの６−ブロモ−１−ヘキサノール、および５００ｍｌのアセトニトリルを混合し、約１日還流した。次いで、混合物を５℃に冷却し、約７時間後に、白色固体を濾過し、酢酸エチルエステルから再結晶した。生成物の純度を、薄層クロマトグラフィーによって判定した。
【０３５８】
ステップｃ：ｗ６−ＤＰＴＡＰの合成
８．３１ｇの（２，３−ビス−ヘキサデカノイルオキシ−プロピル）−（６−ヒドロキシヘキシル）−ジメチル−アンモニウムブロミドを４０ｍｌのジクロロメタンに懸濁し、撹拌下、２０ｍｌのジクロロメタンにとかした０．０３５ｇのＴＥＭＰＯを添加した。０．２６８ｇのＫＢｒを３ｍｌのＨ２Ｏに溶解し、反応に添加した。０．２２ｇのＡｌｉｑｕａｔ  ３３６（商標）を添加した後、混合物を氷浴で冷却し、６７ｍｌの次亜塩素酸ナトリウム溶液に溶解した１ｇのＮａＨＣＯ３を滴下した。２００ｍｌのＣＨＣｌ３を添加する前に、混合物を室温で５時間撹拌した。相を分液し、有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥した。溶媒を除去し、粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：クロロホルム／メタノール  ４：１）で精製した。生成物を、１Ｈ−ＮＭＲおよびＬＣ−ＭＳによって特徴付けた。
【０３５９】
実施例２０
ヘキサデカン酸１−｛［（１１−カルボキシ−ウンデシル）−ジメチル−アンモニウム］メチル−２−ヘキサデカノイルオキシ−エチルエステル（ｗ１２−ＤＰＴＡＰ）の合成
ステップａ：（２，３−ビス−ヘキサデカノイルオキシ−プロピル）−（１２−ヒドロキシドデシル）−ジメチル−アンモニウムブロミドの合成
実施例１９のステップｂに記載されているように、２２．４７ｇのヘキサデカン酸１−ジメチルアミノメチル−２−ヘキサデカノイルオキシ−エチルエステル、１０ｇの１２−ブロモ−１−ドデカノール、および５００ｍｌのアセトニトリルを使用して、合成を行った。粗生成物を酢酸エチルエステル／メタノール（９：１）から再結晶し、生成物の純度を薄層クロマトグラフィーおよび１Ｈ−ＮＭＲによって判定した。
【０３６０】
ステップｂ：ｗ−１２−ＤＰＴＡＰの合成
実施例１９のステップｃに記載されているように、９．２１ｇの（２，３−ビス−ヘキサデカノイルオキシ−プロピル）−（１２−ヒドロキシドデシル）−ジメチル−アンモニウムブロミド、０．０３５ｇのＴＥＭＰＯ、０．２６８ｇのＫＢｒ、０．２２ｇのＡｌｉｑｕａｔ（商標）、および６７ｍｌの次亜塩素酸ナトリウムに溶解した１ｇのＮａＨＣＯ３を使用して、ｗ−１２−ＤＰＴＡＰを合成した。粗生成物を２つのシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液１：クロロホルム／メタノール  ４：１；溶離液２：クロロホルム／メタノール  ８：１）で精製した。生成物を、１Ｈ−ＮＭＲおよびＬＣ−ＭＳによって特徴付けた。
【０３６１】
実施例２１
ヘキサデカン酸１−｛［（１５−カルボキシ−ペンタデシル）−ジメチル−アンモニウム］メチル−２−ヘキサデカノイルオキシ−エチルエステル（ｗ１６−ＤＰＴＡＰ）の合成
ステップａ：（２，３−ビス−ヘキサデカノイルオキシ−プロピル）−（１６−ヒドロキシヘキサデシル）−ジメチル−アンモニウムブロミドの合成
実施例１９のステップｂに記載されているように、１８．５５ｇのヘキサデカン酸１−ジメチルアミノメチル−２−ヘキサデカノイルオキシ−エチルエステル、１０ｇの１６−ブロモ−１−ドデカノール、および５００ｍｌのアセトニトリルを使用して、合成を行った。粗生成物を酢酸エチルエステル／メタノール（１０：１）から再結晶し、生成物の純度を薄層クロマトグラフィーおよび１Ｈ−ＮＭＲによって判定した。
【０３６２】
ステップｂ：ｗ−１６−ＤＰＴＡＰの合成
実施例１９のステップｃに記載されているように、１４ｇの（２，３−ビス−ヘキサデカノイルオキシ−プロピル）−（１６−ヒドロキシヘキサデシル）−ジメチル−アンモニウムブロミド、０．０５ｇのＴＥＭＰＯ、０．３８２ｇのＫＢｒ、０．３ｇのＡｌｉｑｕａｔ（商標）、および９５．６ｍｌの次亜塩素酸ナトリウムに溶解した１．４３ｇのＮａＨＣＯ３を使用して、ｗ−１６−ＤＰＴＡＰを合成した。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：クロロホルム／メタノール  ８：１）で精製した。生成物を、１Ｈ−ＮＭＲおよびＬＣ−ＭＳによって特徴付けた。
【０３６３】
実施例２２
ヘキサデカン酸１−｛［（１９−カルボキシ−ノナデシル）−ジメチル−アンモニウム］メチル−２−ヘキサデカノイルオキシ−エチルエステル（ｗ２０−ＤＰＴＡＰ）の合成
ステップａ：イコサン−１，２０−ジオールの合成
イコサン−１，２０−ジオールを、Yoon et al., J. Org. Chem. 1973, 38(16), 2786-2792に従って合成した。簡潔に言えば、Ｎ２雰囲気下、２５ｇのエイコサン二酸に、１００ｍｌのＴＨＦを添加した。次いで、４７４．５ｍｌのボラン／ＴＨＦ錯体を１．５時間にわたって滴下した。２００ｍｌのＴＨＦ／Ｈ２Ｏ（１：１）を滴下する前に、混合物を終夜還流した。さらに撹拌下、２５０ｍｌのＨ２Ｏに溶解した１００ｇのＮａＨＣＯ３を添加し、２時間後に、１０００ｍｌのＨ２Ｏを混合物に添加し、沈殿物を濾過によって除去した。翌日およびその次の日に、白色沈殿物を濾過によって混合物から除去し、乾燥し、酢酸エチルエステルから再結晶した。生成物を、薄層クロマトグラフィーおよび１Ｈ−ＮＭＲによって特徴付けた。
【０３６４】
ステップｂ：２０−ブロモ−イコサン−１−オールの合成
２０−ブロモ−イコサン−１−オールを、Uneyama et al, Tetrahedron Letters, 1991, 32(11), 1459-1462に従って合成した。簡潔に言えば、２４０ｍｌの石油エーテル、２０．３４ｇのイコサン−１，２０−ジオール、および２８０ｍｌのＨＢｒ（Ｈ２Ｏ中４８％）を添加する前に、４００ｍｌの石油エーテルを加熱した。混合物を終夜還流し、室温でさらに１日インキュベートした。次いで、沈殿物を濾過によって除去し、３００ｍｌのジクロロメタンに溶解した。溶液をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、シリカゲルに通して濾過した。溶媒を除去し、最後に粗生成物を石油エーテルから再結晶した。生成物の純度を、１Ｈ−ＮＭＲによって判定した。
【０３６５】
ステップｃ：（２，３−ビス−ヘキサデカノイルオキシ−プロピル）−（２０−ヒドロキシ−イコシル）−ジメチル−アンモニウムブロミドの合成
実施例１９のステップｂに記載されているように、１７．８９ｇのヘキサデカン酸１−ジメチルアミノメチル−２−ヘキサデカノイルオキシ−エチルエステル、１１．３３ｇの２０−ブロモ−イコサン−１−オール、および５００ｍｌのアセトニトリルを使用して、合成を行った。粗生成物をクロロホルム／メタノール（３：１）から再結晶し、生成物の純度を、薄層クロマトグラフィーおよび１Ｈ−ＮＭＲによって判定した。
【０３６６】
ステップｄ：ｗ−２０  ＤＰＴＡＰの合成
実施例１９のステップｃに記載されているように、１１．４５ｇの（２，３−ビス−ヘキサデカノイルオキシ−プロピル）−（２０−ヒドロキシ−イコシル）−ジメチル−アンモニウムブロミド、０．０３９ｇのＴＥＭＰＯ、０．２９４ｇのＫＢｒ、０．２ｇのＡｌｉｑｕａｔ（商標）、および７３．７ｍｌの次亜塩素酸ナトリウムに溶解した１．１ｇのＮａＨＣＯ３を使用して、ｗ−２０−ＤＰＴＡＰを合成した。粗生成物をシリカゲルに通して濾過し、クロロホルム／メタノール（４：１）による洗浄ステップの後、生成物を、１Ｈ−ＮＭＲおよびＬＣ−ＭＳによって特徴付けた。
【０３６７】
実施例２３
ヘキサデカン酸３−｛［２−（１５−カルボキシ−ペンタデカノイルアミノ）−エトキシ］−ヒドロキシ−ホスホリルオキシ｝−２−ヘキサデカノイルオキシ−プロピルエステル（ｗ１６−Ａｍｉｄ−ＰＥ）の合成
反応スキーム：
【化４５】
2014208687.tif 000101
【化４６】
2014208687.tif 000102
【０３６８】
ステップａ：オキサシクロヘプタデカン−２，１７−ジオンの合成
３ｇのヘキサデカンジカルボン酸および４．５ｍｌの無水酢酸酸を終夜還流した。次いで、溶媒を除去し、粗生成物をアセトニトリルから再結晶した。
【０３６９】
ステップｂ：ｗ１６−Ａｍｉｄ−ＰＥの合成
Ｎ２雰囲気下、８ｇのＤＰＰＥ、１６０ｍｌのクロロホルム、３．１ｇのオキサシクロヘプタデカン−２，１７−ジオン、４．５７ｇのピリジン、および０．１ｇのジメチルアミノピリジンを混合し、７０℃で終夜撹拌した。次いで、溶媒をロータリーエバポレータで除去し、超音波処理下で、残渣を１６０ｍｌの１Ｎ  ＨＣｌに再懸濁した。翌日に、混合物をフリットにし、固体を８０ｍｌの１Ｎ  ＨＣｌで洗浄し、次いでクロロホルム／メタノール／Ｈ２Ｏ（６５：２５：４）に溶解した。水相を除去し、有機溶媒をロータリーエバポレータで除去した。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：クロロホルム／メタノール  ９：１）で精製した。生成物を、１Ｈ−ＮＭＲおよびＬＣ−ＭＳによって特徴付けた。
【０３７０】
実施例２３
オクタン二酸モノコレステリルエステル（コレステロールヘミスベレート）の合成
ステップａ：オキソナン−２，９−ジオンの合成
Ｎ２雰囲気下、５０ｇのスベリン酸および１００ｍｌの無水酢酸酸を２時間還流した。溶媒を蒸発させ、２００ｍｌのアセトニトリルを残渣に添加し、混合物を冷凍器に終夜保持した。次いで、混合物をフリットにし、得られた残渣を５０ｍｌのアセトニトリルで洗浄し、乾燥した。
【０３７１】
ステップｂ：オクタン二酸モノコレステリルエステルの合成
３５ｇのコレステロールおよび２１．２ｇのオキセパン−２，７−ジオンを丸底フラスコに量り入れた。Ｎ２雰囲気下、２５０ｍｌのトルオール、１４．３ｍｌのピリジン、および０．２２ｇの４−ジメチルアミノピリジンを添加した。反応を１日還流した。次いで、溶媒を蒸発させ、残渣をジクロロメタン／酢酸エチルエステル（９６：４）に溶解し、フリットによってシリカゲルで精製した（溶離液：ジクロロメタン／酢酸エチルエステル（９６：４））。生成物を１Ｈ−ＮＭＲによって特徴付けた。
【０３７２】
実施例２４
Ｎ−（３−アミノ−プロピル）−Ｎ’−［３−（４−｛３−［４−（３−アミノプロピルアミノ）−ブチルアミノ］−プロピルアミノ｝−ブチルアミノ）−プロピル］−ブタン−１，４−ジアミン（化合物４）の合成
反応スキーム：
【化４７】
2014208687.tif 000103
【０３７３】
ステップａ：｛４−［（３−アミノ−プロピル）−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ］−ブチル｝−（３−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノプロピル）−カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（化合物６）の合成
Geall et al., Chem. Commun. 1998, 2035に従って、化合物を合成した。簡潔に言えば、１０．１２ｇのスペルミンおよび１５０ｍｌのメタノールを撹拌し、−７５℃に冷却した。次いで、５．９５ｍｌのトリフルオロ酢酸エチルエステル（９９％）を滴下した。温度を０℃に上げ、４２．８ｍｌの二炭酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（ＢＯＣ２Ｏ）を添加し、反応を室温で終夜撹拌した。約５０ｍｌの溶媒をロータリーエバポレーションで除去し、５０ｍｌのＨ２Ｏで置換し、２００ｍｌのジエチルエーテルで３回抽出した。有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、真空下で蒸発させた。無色油の粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液１：ジクロロメタン／メタノール／ＮＨ４ＯＨ（２５％）７０：１０：１；溶離液２：ジクロロメタン／メタノール／ＮＨ４ＯＨ（２５％）５０：１０：１）で精製した。生成物を、１Ｈ−ＮＭＲおよびＬＣ−ＭＳによって特徴付けた。
【０３７４】
ステップｂ：コハク酸ビス−（４−ニトロ−フェニル）エステル（化合物１０）の合成
丸底フラスコ中で、３６．３ｇのＤＣＣ（Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド）、０．２ｇの４−ジメチルアミノピリジン、４６．７ｇのｐ−ニトロフェノール、および１６ｇの無水コハク酸、および６００ｍｌの酢酸エチルエステルを混合し、室温で３日間撹拌した。溶媒をロータリーエバポレーションで除去し、黄色の残渣を１５０ｍｌのクロロホルムから再結晶した。白色生成物をクロロホルムで洗浄し、乾燥し、薄層クロマトグラフィーおよび１Ｈ−ＮＭＲによって特徴付けた。
【０３７５】
ステップｃ：化合物１１の合成
Graminski et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 2002, 35-40に従って、化合物１１を合成した。簡潔に言えば、８．８ｇの化合物６を１００ｍｌのジメチルホルムアミドに溶解した。次いで、１．９５  Ｎ−メチルモルホリンおよび２．８４ｇの化合物１０を添加し、混合物を室温で終夜撹拌させた。溶媒をロータリーエバポレーションで除去し、黄色油の粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：酢酸エチルエステル／メタノール  ９：１）で精製した。溶媒を除去し、残渣を１００ｍｌの酢酸エチルエステルおよび１００ｍｌの石油エーテルに溶解した。混合物を１５０ｍｌのＨ２Ｏで３回洗浄し、有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥した。濾過した後、溶媒をロータリーエバポレーションで除去し、生成物を薄層クロマトグラフィー、ＬＣ−ＭＳ、および１Ｈ−ＮＭＲによって特徴付けた。
【０３７６】
ステップｄ：化合物１２の合成
Ｎ２雰囲気下、４．６８ｇの化合物１１を４０ｍｌのテトラヒドロフランに溶解し、反応混合物を氷浴で冷却した。次いで、１０．８ｍｌのボラン−ジメチルスルフィド錯体（テトラヒドロフラン中２Ｍ）を添加し、反応を室温で終夜撹拌させた。１００ｍｌの石油エーテル、２０ｍｌの酢酸エチルエステルおよび２ｍｌのメタノールを添加した後、溶液をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（フラッシュクロマトグラフィー；溶離液：酢酸エチルエステル）にかけた。溶媒を除去し、無色油の粗生成物を別のシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：酢酸エチルエステル）で精製した。生成物を、ＬＣ−ＭＳおよび１Ｈ−ＮＭＲによって特徴付けた。
【０３７７】
ステップｅ：化合物４の合成
０．９２ｇの化合物１２を１０ｍｌのメタノールに溶解した。溶液を還流した後、１５ｍｌのＨＣｌ（３７％）と２０ｍｌのＨＣｌ（２Ｎ）の混合物を滴下した。反応混合物を終夜還流した。１０ｍｌのＨ２Ｏを添加した後、混合物を５０ｍｌのジクロロメタンで２回抽出した。水相の溶媒を除去し、生成物を１Ｈ−ＮＭＲおよびＬＣ−ＭＳによって特徴付けた。
【０３７８】
実施例２５
ＴＥＥによる化合物４の誘導体化
５０ｍｇ（０．１ｍｍｏｌ）の化合物４の検体をω−ブロモ−α−カルボン酸でアルキル化した。簡潔に言えば、０．３ｍｍｏｌもしくは０．６ｍｍｏｌの６−ブロモヘキサン酸もしくは１０−ブロモデカン酸、またはこれら２つの等モル混合物を２ｍｌの乾燥ＤＭＦに溶解し、０．１ｍｍｏｌの化合物４をそれぞれの反応に添加した。混合物を５０℃で終夜インキュベートし、室温に冷却し、アルキル化度を質量分析法で確定した。
【図１】
2014208687.tif 000138
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１７】
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【図１８】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年7月3日(2014.7.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１種以上のトランスフェクションエンハンサー要素（ＴＥＥ）と共有結合した少なくとも１つの脂質部分を含有する組成物を含む製剤であって、
前記少なくとも１つの脂質部分はステロールを含み、１種以上のＴＥＥは以下の式：
疎水性部分−ｐＨ感受性親水性部分      （Ｉ）
により規定され、
前記１種以上のＴＥＥの各々のｐＨ感受性親水性部分は、２〜６のｐＫａを有する弱酸であり、前記脂質部分とＴＥＥとの間の結合から遠位に位置し、ここで、前記１種以上のＴＥＥの各々の疎水性部分は、独立して、１２〜２０個の炭素原子を含むアルキル炭素鎖であり；
前記組成物は、一般式（ＸＩＶ）：
【化１】
2014208687.tif 000160
を有し、
式中、Ｘａは、ステロールの３’位で結合しており、そして、−ＯＰＯ３−；−ＯＰＯ２−ＣＨ２−；−ピロホスフェート−；−ＯＳＯ３−；−ＯＳＯ２−；−Ｏ−；−ＮＨ−；−Ｓ−；−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）−；−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）−；−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｏ−；−ＯＣ（Ｏ）−；−Ｃ（Ｏ）Ｏ−；−Ｎ＝ＣＨ−；−ＣＨ＝Ｎ−；−ＣＨ２−；−Ｓ−Ｓ−；−Ｎ（Ｒ１３）（Ｒ１４）−；
【化２】
2014208687.tif 000161
であり、
Ｒ１３およびＲ１４は、独立してＨまたは低級アルキルであり、及び、Ｒ１３もしくはＲ１４のいずれか一方は存在しなくてよく、
Ｙａは、存在しないか、または非分枝状、分枝状、または環状の置換もしくは非置換の１〜８個の炭素原子を有するアルキル基、アルケニル基、アルキレン基、アルキニル基もしくはアリール基であり、ここで、Ｙａは、−ＯＨ；−ＮＨ２；−Ｎ（Ｒ１３）（Ｒ１４）；−ＣＯＯＨ；糖；アミノ酸；ジ−もしくはトリペプチド；α−ヒドロキシ酸、β−ヒドロキシ酸またはジヒドロキシ酸から選択される１以上の基で置換されており；ここで、Ｒ１３およびＲ１４は上記で定義したものであり；
Ｚａは、存在しないか、または−Ｏ−；−Ｓ−；−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）−；−Ｃ（Ｏ）Ｏ−；−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）−；−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）−；−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｏ−；−ＮＨ−；−Ｎ（Ｒ１３）（Ｒ１４）−；−ＣＨ＝Ｎ−；−ＯＣ（Ｏ）−；−Ｎ＝ＣＨ−；−Ｓ−Ｓ−；−ＮＨ２；−（ＮＨ３）−；−（Ｎ（Ｒ１３）（Ｒ１４）（Ｒ１５））−；−Ｃ（Ｏ）ＯＨ；−ＯＨ；−Ｃ（Ｏ）Ｈ；−Ｃ（Ｏ）ＯＲ１６；または−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２から選択され；ここで、Ｒ１５は、上記のＲ１３およびＲ１４として定義したものであり、および、Ｒ１６は低級アルキルであり；
ここで、前記ステロールは、コレステロール、シトステロール、カンペステロール、デスモステロール、フコステロール、２２−ケトステロール、２０−ヒドロキシステロール、スチグマステロール、２２−ヒドロキシコレステロール、２５−ヒドロキシコレステロール、ラノステロール、７−デヒドロコレステロール、ジヒドロコレステロール、１９−ヒドロキシコレステロール、５α−コレスト−７−エン３β−オール、７−ヒドロキシコレステロール、エピコレステロール、エルゴステロール、および／またはデヒドロエルゴステロールから選択され；そして
点線は、１種以上のＴＥＥの可能なグラフト位置を表す、製剤。
【請求項２】
前記組成物が、リポソーム、ミセル、逆ミセル、立方もしくは六方脂質相、渦巻形、エマルジョン、ダブルエマルジョン、および脂質、油および／もしくは両親媒性物質から実質的に構成される他の多量体集合体から選択される脂質集合体を形成する、請求項１に記載の製剤。
【請求項３】
中性および／またはカチオン性および／またはアニオン性脂質をさらに含む、請求項１に記載の製剤。
【請求項４】
前記中性脂質が、ホスファチジルコリン；ホスファチジルエタノールアミン；スフィンゴ脂質；セラミド；セレブロシド；ステロール系脂質；およびそれらの誘導体から選択される、請求項３に記載の製剤。
【請求項５】
前記中性脂質が、ＤＭＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＳＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＣ、ＤＭＰＥ、ＤＰＰＥ、ＤＳＰＥ、ＰＯＰＥ、ＤＯＰＥ、ジフィタノイル−ＰＥ、スフィンゴミエリン、セラミド、および／またはコレステロールから選択される、請求項４に記載の製剤。
【請求項６】
前記カチオン性脂質が、ＤＯＴＡＰ、ＤＭＴＡＰ、ＤＰＴＡＰ、ＤＣ−Ｃｈｏｌ、ＤＡＣ−Ｃｈｏｌ、ＤＯＤＡＰ、ＤＯＥＰＣ、ＴＣ−Ｃｈｏｌ、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＲＩＥ、ＤＤＡＰ、ＣＴＡＢ、ＣＰｙＣ、ＤＰＩＭ、ＣＨＩＭ、ＭｏＣｈｏｌ、ＨｉｓＣｈｏｌ、ＢＧＳＣ、ＢＧＴＣ、ＤＯＳＰＥＲ、ＤＯＳＣ、ＤＯＧＳＤＯ、ＤｍＣ４Ｍｏ２、ＤｍＣ３Ｍｏ２、Ｃ３Ｍｏ２、Ｃ３Ｍｏ３、Ｃ４Ｍｏ４、Ｃ５Ｍｏ２、Ｃ６Ｍｏ２、Ｃ８Ｍｏ２、ＰｉｐＣ２Ｃｈｏｌ、ＭｏＣ２Ｃｈｏｌ、ＭｏＣ３Ｃｈｏｌ、Ｎ−メチル−ＰｉｐＣｈｏｌ、ＰｙｒｒｏＣ２Ｃｈｏｌ、ＰｙＣ２Ｃｈｏｌ、ＩｍＣ３Ｃｈｏｌ、ＰｉｐｅＣ２Ｃｈｏｌおよびそれらの誘導体から選択される、請求項３に記載の製剤。
【請求項７】
前記アニオン性脂質が、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、ＣＨＥＭＳ、アニオン性ステロール誘導体、セチルホスフェート、ジアシルグリセロールヘミスクシネート、カルジオリピンおよび／またはそれらの誘導体を含む群から選択される、請求項３に記載の製剤。
【請求項８】
前記組成物の量が０．１モル％〜９０モル％である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項９】
前記脂質集合体が両性リポソームである、請求項２〜８のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１０】
１種以上の両性脂質をさらに含む、請求項９に記載の製剤。
【請求項１１】
前記両性脂質が、ＨｉｓｔＣｈｏｌ、ＨｉｓｔＤＧ、ｉｓｏＨｉｓｔＳｕｃｃＤＧ、アシルカルノシン、ＨＣＣｈｏｌ、Ｈｉｓｔ−ＰＳ、およびＥＤＴＡ−Ｃｈｏｌから選択される、請求項１０に記載の製剤。
【請求項１２】
（ｉ）安定なカチオン性脂質および帯電可能なアニオン性脂質、（ｉｉ）帯電可能なカチオン性脂質および帯電可能なアニオン性脂質、または（ｉｉｉ）安定なアニオン性脂質および帯電可能なカチオン性脂質から選択される両性脂質混合物をさらに含む、請求項９に記載の製剤。
【請求項１３】
２０〜９０モル％の前記両性脂質混合物、および２〜２０モル％の前記組成物を含む、請求項１２に記載の製剤。
【請求項１４】
安定なカチオン性脂質の帯電可能なアニオン性脂質に対するモル比（Ｃ／Ａ比）が０．３〜０．７である、請求項１２または１３に記載の製剤。
【請求項１５】
帯電可能なカチオン性脂質の帯電可能なアニオン性脂質のモル比（Ｃ／Ａ比）が０．３〜３である、請求項１２または１３に記載の製剤。
【請求項１６】
前記両性脂質混合物が、ＤＯＴＡＰ／Ｃｈｅｍｓ、ＤＯＴＡＰ／ＤＭＧ−Ｓｕｃｃ、ＤＯＴＡＰ／ＤＯＧ−Ｓｕｃｃ、ＤＯＤＡＰ／Ｃｈｅｍｓ、ＤＯＤＡＰ／ＤＭＧ−Ｓｕｃｃ、ＤＯＤＡＰ／ＤＯＧ−Ｓｕｃｃ、ＤＤＡＢ／Ｃｈｅｍｓ、ＤＤＡＢ／ＤＭＧ−Ｓｕｃｃ、ＤＤＡＢ／ＤＯＧ−Ｓｕｃｃ、ＤＣ−Ｃｈｏｌ／Ｃｈｅｍｓ、ＤＣ−Ｃｈｏｌ／ＤＭＧ−Ｓｕｃｃ、ＤＣ−Ｃｈｏｌ／ＤＯＧ−Ｓｕｃｃ、ＤＡＣ−Ｃｈｏｌ／Ｃｈｅｍｓ、ＤＡＣ−Ｃｈｏｌ／ＤＭＧ−Ｓｕｃｃ、ＤＡＣ−Ｃｈｏｌ／ＤＯＧ−Ｓｕｃｃ、ＴＣ−Ｃｈｏｌ／Ｃｈｅｍｓ、ＴＣ−Ｃｈｏｌ／ＤＭＧ−Ｓｕｃｃ、ＴＣ−Ｃｈｏｌ／ＤＯＧ−Ｓｕｃｃ、ＭｏＣｈｏｌ／Ｃｈｅｍｓ、ＭｏＣｈｏｌ／ＤＭＧ−Ｓｕｃｃ、ＨｉｓＣｈｏｌ／ＤＯＧ−Ｓｕｃｃ、ＨｉｓＣｈｏｌ／Ｃｈｅｍｓ、ＨｉｓＣｈｏｌ／ＤＭＧ−Ｓｕｃｃ、ＨｉｓＣｈｏｌ／ＤＯＧ−Ｓｕｃｃ、Ｃｈｉｍ／Ｃｈｅｍｓ、Ｃｈｉｍ／ＤＭＧ−Ｓｕｃｃ、Ｃｈｉｍ／ＤＯＧ−Ｓｕｃｃ、ＤｍＣ４Ｍｏ２／Ｃｈｅｍｓ、ＤｍＣ４Ｍｏ２／ＤＭＧ−Ｓｕｃｃ、およびＤｍＣ４Ｍｏ２／ＤＯＧ−Ｓｕｃｃから選択される、請求項１２または１３に記載の製剤。
【請求項１７】
前記両性リポソームがユニラメラ、オリゴラメラ、またはマルチラメラであり、前記両性リポソームの粒径が５０〜１０００ｎｍである、請求項９に記載の製剤。
【請求項１８】
少なくとも１種の医薬品活性成分をさらに含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１９】
前記医薬品活性成分が、ＤＮＡプラスミド、ポリヌクレオチド、およびオリゴヌクレオチドから選択される核酸系薬物である、請求項１８に記載の製剤。
【請求項２０】
前記核酸系薬物が、脊椎動物細胞において１種以上のＲＮＡへと転写されることが可能であり、前記ＲＮＡが、ｍＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはリボザイムであり、前記ｍＲＮＡは１種以上のタンパク質またはポリペプチドをコードする、請求項１９に記載の製剤。
【請求項２１】
前記核酸系薬物が、環状ＤＮＡプラスミド、直鎖ＤＮＡ構築物またはｍＲＮＡである、請求項１９に記載の製剤。
【請求項２２】
前記核酸系薬物が、オリゴヌクレオチドである、請求項１９に記載の製剤。
【請求項２３】
前記オリゴヌクレオチドが、デコイオリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、転写に影響を及ぼす作用剤、スプライシングに影響を及ぼす作用剤、リボザイム、ＤＮＡザイム、またはアプタマーである、請求項２２に記載の製剤。
【請求項２４】
前記オリゴヌクレオチドが、腫瘍標的に向けられている、請求項２２に記載の製剤。
【請求項２５】
前記腫瘍標的が、ＣＥＡＣＡＭ６、ＢＣＬ−２、ＥＰＨＡ２、ＣＴＮＮＢ１、ＲｈｏＡ、ＰＬＫ１、ＸＩＡＰ、テロメラーゼ、サイクリンＤ１、Ｋ−Ｒａｓ、ＥＧ５、Ｋｉ６７、アンドロゲン受容体、ＦｏｘＭ１、Ａｋｔ１、ＶＥＧＦ、ＫＳＢ、およびＣＤＣ２５Ｂから選択される、請求項２４に記載の製剤。
【請求項２６】
請求項１８に記載の製剤、およびそのための医薬上許容されるビヒクルを含む、医薬組成物。
【請求項２７】
１種以上のＴＥＥ中のｐＨ感受性親水性部分が、カルボン酸であるか、または下記一般式：
【化３】
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［式中、点線は場合により二重結合であってよいことを表し；
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、独立して、１種以上のＴＥＥの疎水性部分の疎水性部分、水素、０〜５個の不飽和部位を有する直鎖状、分枝状、もしくは環状の非置換もしくは置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、アルキレン、アルコキシ基、アルコキシアルキル基、アルキルチオ基、アルキルチオアルキル基、ヒドロキシ基、メルカプト基、オキソ基、ホルミル基、ニトロ基、シアノ基、ハロ基、またはトリハロメチル基またはヘテロアルキル基、あるいはアリール基であり、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３のいずれかは場合により−Ｏ−または−Ｓ−から選択される０〜５個のヘテロ原子を含み；
Ｄは、炭素原子、または０〜３個の不飽和部位を有し、かつ−Ｏ−、−Ｓ−から選択される０〜５個のヘテロ原子を含む非置換もしくは置換環状アルキル基もしくアリール基であり、前記Ｄの置換基は、アルキル基、アルキレン基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基、アルコキシアルキル基、アルキルチオ基、アルキルチオアルキル基、ヒドロキシ基、メルカプト基、オキソ基、ホルミル基、シアノ基、ハロ基、またはトリハロメチル基から選択される］
を含む、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項２８】
前記組成物が、以下の構造：
【化４】
2014208687.tif 000163
を含む、請求項１に記載の製剤。
【請求項２９】
前記組成物が、以下の構造：
【化５】
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を含む、請求項1に記載の製剤。
【外国語明細書】
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