(57)【要約】【課題】ホップの葉を利用した免疫機能増強作用材、血中中性脂肪低下作用材、血糖値低下作用材、又は、メタボリック症候群改善作用材を提供する。【解決手段】本発明は、ホップ（Ｈｕｍｕｌｕｓ  ｌｕｐｕｌｕｓ）の葉及びホップの葉の抽出物のうちの少なくとも一方を含むものである。ホップの葉は、例えば、そのまま又は乾燥させて切断又は粉末にして用いてもよく、また、例えば、ホップの葉から水又はアルコール等の溶媒によりホップの葉の成分を抽出した抽出物を用いてもよい。抽出物は、例えば、乾燥させて溶媒を除去して粉末化したものを用いてもよいし、濃縮して濃縮エキスとして用いてもよいし、又は、粉末化したものを溶媒に溶解して濃縮エキスとして用いてもよい。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホップ（Ｈｕｍｕｌｕｓ  ｌｕｐｕｌｕｓ）の葉及びホップの葉の抽出物のうちの少なくとも一方を含むことを特徴とする免疫機能増強作用材、血中中性脂肪低下作用材、血糖値低下作用材、又は、メタボリック症候群改善作用材。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫機能を増強させる作用を有する免疫機能増強作用材、血中中性脂肪を低下させる作用を有する血中中性脂肪低下作用材、血糖値を低下させる作用を有する血糖値低下作用材、又は、メタボリック症候群を改善する作用を有するメタボリック症候群改善作用材に関する。
【背景技術】
【０００２】
ホップ（学名：Ｈｕｍｕｌｕｓ  ｌｕｐｕｌｕｓ）は、アサ科の多年草で、雌雄異株の蔓性植物である。ホップの球花（毬花）は、従来より、ビールの原料として用いられており、苦味、香り、泡の要素であり、また、雑菌の繁殖を抑制して保存性を高める働きがある。更に、ホップの球花は、生薬としても健胃・鎮静効果があるとされ、またハーブの一種としてヨーロッパでは民間薬として用いられてきた。球花には、苦味成分や香り成分の他、キサントフモール、イソキサントフモール、8-プレニルナリンゲニンといった機能性を持つ物質が多く含まれていことが報告されており、エストロゲン様作用による更年期障害の改善作用やイソフムロンの肥満予防効果、ホップフラボノールに花粉症症状を軽減する効果などが示されている。このように、球花の機能性物質や芳香成分に関する研究は多くの蓄積がある。
【０００３】
一方で、ホップの葉は特に苦味や芳香がないため、これまでほとんど利用されることなく落葉しているのが現状であり、成分や機能性の研究も行われていない。なお、出願人は、ホップの葉の利用を促進するために、ホップの葉と球花とを混合して用いたホップ茶を開発した（特許文献１参照）が、更なる利用の開発が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１１−８３２６６号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、このような問題に基づきなされたものであり、ホップの葉を利用した免疫機能増強作用材、血中中性脂肪低下作用材、血糖値低下作用材、又は、メタボリック症候群改善作用材を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の免疫機能増強作用材、血中中性脂肪低下作用材、血糖値低下作用材、又は、メタボリック症候群改善作用材は、ホップの葉及びホップの葉の抽出物のうちの少なくとも一方を含むものである。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、ホップの葉及びホップの葉の抽出物のうちの少なくとも一方を含むようにしたので、高い効果を得ることができ、例えば、サプリメントや健康食品素材として広く用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】高脂肪食を与えて飼育したマウスの体重変化を表す図である。
【図２】高脂肪食を与えて飼育したマウスの食餌摂取量を表す図である。
【図３】高脂肪食を与えて飼育したマウスの肝臓及び脾臓の重量を表す図である。
【図４】高脂肪食を与えて飼育したマウスの腎臓、脂肪組織及び肺の重量を表す図である。
【図５】高脂肪食を与えて飼育したマウスの心臓及び脳の重量を表す図である。
【図６】高脂肪食を与えて飼育したマウスの血清の中性脂肪量を表す図である。
【図７】高脂肪食を与えて飼育したマウスの血清の遊離脂肪酸量を表す図である。
【図８】高脂肪食を与えて飼育したマウスの血清の総コレステロール含量、ＨＤＬ−コレステロール含量、及び、ＬＤＬ−コレステロール含量を表す図である。
【図９】高脂肪食を与えて飼育したマウスの血清の血糖値を表す図である。
【図１０】高脂肪食を与えて飼育したマウスの血清のＡＳＴ値及びＡＬＴ値を表す図である。
【図１１】高脂肪食を与えて飼育したマウスの血清のインスリン濃度を表す図である。
【図１２】高脂肪食を与えて飼育したマウスの血清のＳＯＤ活性を表す図である。
【図１３】高脂肪食を与えて飼育したマウスの肝臓の中性脂肪量を表す図である。
【図１４】高脂肪食を与えて飼育したマウスの肝臓のコレスレロール含量を表す図である。
【図１５】高脂肪食を与えて飼育したマウスの肝臓の遊離脂肪酸含量を表す図である。
【図１６】高脂肪食を与えて飼育したマウスの肝臓におけるＧｐａｍ、Ｓｃｄ１、Ｆａｓｎ、Ａｃｏｘ１の遺伝子発現量を表す図である。
【図１７】高脂肪食を与えて飼育したマウスの脾臓におけるＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１２、ＩＮＦ−γの遺伝子発現量を表す図である。
【図１８】高脂肪食を与えて飼育したマウスの脾臓におけるＴ−ｂｅｔ、ＧＡＴＡ−３、Ｆｏｘｐ３の遺伝子発現量を表す図である。
【図１９】高脂肪食を与えて飼育したマウスの脂肪組織におけるＰＰＡＲγ、Ｃｅｂｐｂ、Ａｃａｃｂ、Ｓｃｄ１、Ｆａｓｎ、Ａｄｉｐｏｑの遺伝子発現量を表す図である。
【図２０】高脂肪食を与えて飼育したマウスの脂肪組織におけるＣｅｂｐｄ、Ｇｐａｍ、Ｃｅｂｐａ、Ａｃｏｘ１、Ｔｎｆ、ＦＡＢＰ４の遺伝子発現量を表す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
以下、本発明の実施の形態について図面を参照して詳細に説明する。
【００１０】
本実施の形態の免疫機能増強作用材、血中中性脂肪低下作用材、血糖値低下作用材、又は、メタボリック症候群改善作用材は、ホップ（Ｈｕｍｕｌｕｓ  ｌｕｐｕｌｕｓ）の葉及びホップの葉の抽出物のうちの少なくとも一方を含むものである。ホップの葉は、例えば、そのまま又は乾燥させて切断又は粉末にして用いてもよい。ホップの葉の抽出物は、例えば、ホップの葉に溶媒として水又はアルコールを添加してホップの葉の成分を溶媒に抽出したものである。抽出物は、例えば、乾燥させて溶媒を除去して粉末化したものを用いてもよいし、濃縮して濃縮エキスとして用いてもよいし、又は、粉末化したものを溶媒に溶解して濃縮エキスとして用いてもよい。
【００１１】
なお、ホップの葉の抽出物は、例えば、ホップの葉に溶媒として水またはアルコールを添加してホップの葉の成分を溶媒に抽出した後、ホップの葉を分離して除去することにより得られる。ホップの葉はそのまま用いてもよく、必要に応じて、細かく切断して用いてもよい。ホップの葉の成分の抽出は、例えば、ホップの葉と溶媒との混合物を適宜撹拌することにより行い、時間は３０分から３時間程度行うことが好ましい。また、溶媒は常温でも加熱してもよく、加熱する場合には、加熱したものを添加してもよく、添加した後、抽出時に加熱するようにしてもよい。ホップの葉の分離除去は、例えば、ホップの葉と溶媒との混合物を必要に応じて遠心分離し、その上層を濾過し、濾過物を回収することにより行う。更に、遠心分離した下層に溶媒を加え、撹拌した後、遠心分離して、その上層を濾過し、その濾過物を回収するようにしてもよい。乾燥は、凍結乾燥、減圧乾固、またはスプレードライヤーによるなどのどのような方法でもよい。また、必要に応じて、溶媒を乾燥または濃縮した後、または、ホップの葉を分離除去した後に乾燥または濃縮する前に、精製するようにしてもよい。
【００１２】
この免疫機能増強作用材、血中中性脂肪低下作用材、血糖値低下作用材、又は、メタボリック症候群改善作用材は、例えば、ホップの葉及びホップの葉の抽出物のうちの少なくとも一方のみにより構成するようにしてもよく、更に他の物質を含んでいてもよい。形状は、粉末状、顆粒状、錠剤状、液状、ゼリー状、又は、ゲル状等、どのような形状でもよい。また、この免疫機能増強作用材、血中中性脂肪低下作用材、血糖値低下作用材、又は、メタボリック症候群改善作用材は、例えば、サプリメントや健康食品素材として広く用いることができる。
【実施例】
【００１３】
（実験材料及び方法）
１．マウスの飼育・食餌条件
ホップ葉投与群として、４週齢の雄性ＩＣＲマウスに牛脂を重量比３０％とホップ葉粉末を２％添加した無脂肪精製飼料（Ｔａｂｌｅ  １．Ａ−Ｃ：日本クレア）を与えて１２週齢まで８週間飼育し、血清、肝臓及び精巣上体脂肪、脾臓、腎臓、肺、心臓、脳を採取した。また、コントロール群として、牛脂重量比３０％を添加し、ホップ葉粉末を添加しない無脂肪精製飼料を与えたことを除き、他はホップ葉投与群と同様にしてマウスを飼育し、血清等を採取した。更に、緑茶投与群として、ホップ葉粉末に変えて、緑茶粉末を２％添加した無脂肪精製飼料を与えたことを除き、他はホップ葉投与群と同様にしてマウスを飼育し、血清等を採取した。マウスの数は、ホップ葉投与群、コントロール群、及び、緑茶投与群のいずれも、各１０匹とし、体重は毎週測定した。表１から表３に実験飼料の組成を示す。
【００１４】
【表１】
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【００１５】
【表２】
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【００１６】
【表３】
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【００１７】
２．血清中性脂肪の測定
採取した血清を用いて、酵素法による中性脂肪の測定を行った。試薬はトリグリセライドＥ−テスト  ワコー（和光純薬）を用い、マイクロプレートリーダー用にスケールを変えて行った。９６ｗｅｌｌ  ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅにスタンダードとサンプルを５μｌずつ入れ、２００μｌの発色試液を加え、３０秒間撹拌後、３７℃で５分間保温し、マイクロプレートリーダーで５９５ｎｍの吸光度を測定した。
【００１８】
３．血清コレステロールの測定
採取した血清を用いて、酵素法によるコレステロールの測定を行った。試薬はコレステロールＥ−テスト  ワコー（和光純薬）を用い、マイクロプレートリーダー用にスケールを変えて行った。９６ｗｅｌｌ  ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅにスタンダードとサンプルを５μｌずつ入れ、２００μｌの発色試液を加え、３０秒間撹拌後、インキュベーターに入れ、３７℃で５分間保温し、マイクロプレートリーダーで５９５ｎｍの吸光度を測定した。
【００１９】
４．血清ＨＤＬ−コレステロールの測定
採取した血清を用いて、酵素法によるコレステロールの測定を行った。試薬はＨＤＬ−コレステロールＥ−テスト  ワコー（和光純薬）を用い、マイクロプレートリーダー用にスケールを変えて行った。ｅｐｐｅｎ  ｔｕｂｅにサンプルを２０μｌとり、沈殿試液を２０μｌ加え撹拌した。室温で１０分間放置した後、３０００ｒｐｍ、２０℃で１０分間遠心分離した。９６ｗｅｌｌ  ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅにスタンダードと上清３．５μｌずつ入れ、２００μｌの発色試液を加え、３０秒間撹拌後、インキュベーターに入れ、３７℃で５分間保温し、マイクロプレートリーダーで５９５ｎｍの吸光度を測定した。
【００２０】
５．血清遊離脂肪酸の測定
採取した血清を用いて、酵素法による遊離脂肪酸の測定を行った。試薬はＮＥＦＡ  Ｃ−テスト  ワコー（和光純薬）を用い、マイクロプレートリーダー用にスケールを変えて行った。９６ｗｅｌｌ  ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅに７０μｌの発色試液Ａを入れ、スタンダードとサンプルを５μｌずつ入れ、1分間撹拌後、インキュベーターに入れ、３７℃で１０分間保温した。その後、発色試液Ｂを１４０μｌ加え、１分間撹拌後、インキュベーターに入れ、３７℃で１０分間保温し、マイクロプレートリーダーで６５５ｎｍを対照として５４０ｎｍの吸光度を測定した。
【００２１】
６．血清グルコース濃度（血糖値）の測定
採取した血清を用いて、酵素法による血清グルコース濃度（血糖値）の測定を行った。試薬はグルコース  ＣII−テスト  ワコー（和光純薬）を用い、マイクロプレートリーダー用にスケールを変えて行った。９６ｗｅｌｌ  ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅにスタンダードとサンプルを３μｌずつ入れ、２００μｌの発色試液を加え、３０秒間撹拌後、インキュベーターに入れ、３７℃で５分間保温し、マイクロプレートリーダーで６３０ｎｍを対照として４９０ｎｍの吸光度を測定した。
【００２２】
７．血清ＡＳＴ（アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ）の測定
採取した血清を用いて、酵素法によるＡＳＴ（アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ）の測定を行った。試薬はトランスアミナーゼＣII−テストワコー（和光純薬）を用い、マイクロプレートリーダー用にスケールを変えて行った。９６ｗｅｌｌ  ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅにスタンダードとサンプルを４μｌずつ入れ、４０μｌのＧＯＴ基質酵素液をサンプルのｗｅｌｌに加え、３０秒間撹拌後、インキュベーターに入れ、３７℃で５分間保温した。その後、４０μｌの発色試薬を加え、４０μｌのＧＯＴ基質酵素液をスタンダードのｗｅｌｌに加え、３０秒間撹拌後、インキュベーターに入れた。３７℃で２０分間保温し、反応停止液を１４０μｌ加え、３０秒間撹拌後、マイクロプレートリーダーで５４０ｎｍの吸光度を測定した。
【００２３】
８．血清ＡＬＴ（アラニンアミノトランスフェラーゼ）の測定
採取した血清を用いて、酵素法によるＡＬＴ（アラニンアミノトランスフェラーゼ）の測定を行った。試薬はトランスアミナーゼＣII−テストワコー（和光純薬）を用い、マイクロプレートリーダー用にスケールを変えて行った。９６ｗｅｌｌ  ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅにスタンダードとサンプルを４μｌずつ入れ、４０μｌのＧＰＴ基質酵素液をサンプルのｗｅｌｌに加え、３０秒間撹拌後、インキュベーターに入れ、３７℃で５分間保温した。その後、４０μｌの発色試薬を加え、４０μｌのＧＰＴ基質酵素液をスタンダードのｗｅｌｌに加え、３０秒間撹拌後、インキュベーターに入れた。３７℃で２０分間保温し、反応停止液を１４０μｌ加え、３０秒間撹拌後、マイクロプレートリーダーで５４０ｎｍの吸光度を測定した。
【００２４】
９．血清ＳＯＤ活性の測定
採取した血清を用いて、ＳＯＤ活性の測定を行った。試薬はＳＯＤテストワコー（和光純薬）を用い、マイクロプレートリーダー用にスケールを変えて行った。９６ｗｅｌｌ  ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅに蒸留水とサンプルを１０μｌずつ入れ、発色試薬と酵素液を各１００μｌ加えた。また、別のｗｅｌｌに蒸留水とサンプルを１０μｌずつ入れ、発色試液とブランク液を各１００μｌ加えた。３０秒間撹拌後、インキュベーターに入れ、３７℃で２０分間保温し、マイクロプレートリーダーで５９５ｎｍの吸光度を測定した。
【００２５】
１０．血清インスリン濃度の測定
採取した血清を用いて、血清インスリン濃度の測定を行った。試薬はＭｏｕｓｅ  Ｉｎｓｕｌｉｎ  ＥＬＩＳＡ（Ｍｅｒｃｏｄｉａ）を用いた。９６ｗｅｌｌ  ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅにスタンダードとサンプルを２５μｌずつ入れ、発色試薬Ａを加えて３０秒撹拌後、室温で２時間保温し、Ｗａｓ  ｂｕｆｆｅｒで各ｗｅｌｌを５回洗浄した。洗浄後、タッピングでＷａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒを除き、発色試薬Ｂを２００μｌずつ加え、３０秒撹拌後遮光して室温で１５分保温し、反応停止液を５０μｌずつ加えて１０秒撹拌後、マイクロプレートリーダーで４５０ｎｍの吸光度を測定した。
【００２６】
１１．Ｂｌｉｇｈ＆Ｄｙｅｒ法による肝臓の脂質抽出と測定サンプルの調製
Ｂｌｉｇｈ＆Ｄｙｅｒ法による肝臓の脂質抽出を行った（稲垣宏之，杉谷政則，瀬戸口裕子，伊藤良一，織谷幸太，西村栄作，佐藤進，加藤正俊，齋政彦，山本（前田）万里，亀井優徳（２００９）高脂肪飼料摂取マウスにおける「べにふうき」緑茶の脂肪蓄積抑制効果  Ｎｉｐｐｏｎ  Ｓｈｏｋｕｈｉｎ  Ｋａｇａｋｕ  Ｋｏｇａｋｕ  Ｋａｉｓｈｉ
５６，４０３−４１１）。マウスの肝臓０．１ｇを９００μｌの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ  ｐＨ７．４を添加し、ポリトロンホモジナイザーでホモジナイズした。ホモジネート２００μｌに０．２ｍｌ  １Ｍ  ＫＣｌ、１ｍｌメタノール、０．５ｍｌ  ＣＨＣｌ３を加え２分間撹拌し、さらに０．５ｍｌ  １Ｍ  ＫＣｌ、０．５ｍｌ  ＣＨＣｌ３を加え２分間撹拌した。２０００ｒｐｍで５分間遠心した後、下層を抽出した。さらに残った上層に１ｍｌ  ＣＨＣｌ３を加え、２分間撹拌した後、５分間遠心し、下層を抽出した（抽出は計３回）。抽出したものを窒素乾固し、０．５ｍｌ  Ｈ２Ｏを加えて超音波処理を５分行って溶かし、測定サンプルとした。
【００２７】
１２．肝臓中性脂肪（ＴＧ）の測定
調製したサンプル用いて、酵素法による中性脂肪（ＴＧ）の測定を行った。試薬はトリグリセライドＥ−テスト  ワコー（和光純薬）を用い、マイクロプレートリーダー用にスケールを変えて行った。９６ｗｅｌｌ  ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅにスタンダードとサンプルを５μｌずつ入れ、２００μｌの発色試液を加え、３０秒間撹拌後、インキュベーターに入れ、３７℃で５分間保温し、マイクロプレートリーダーで５９５ｎｍの吸光度を測定した。
【００２８】
１３．肝臓コレステロールの測定
調製したサンプルを用いて、酵素法によるコレステロールの測定を行った。試薬はコレステロールＥ−テスト  ワコー（和光純薬）を用い、マイクロプレートリーダー用にスケールを変えて行った。９６ｗｅｌｌ  ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅにスタンダードを５μｌ、サンプルを３０μｌ入れ、２００μｌの発色試液を加え、３０秒間撹拌後、インキュベーターに入れ、３７℃で５分間保温し、マイクロプレートリーダーで５９５ｎｍの吸光度を測定した。
【００２９】
１４．肝臓遊離脂肪酸の測定
調製したサンプルを用いて、酵素法による遊離脂肪酸の測定を行った。試薬はＮＥＦＡ  Ｃ−テスト  ワコー（和光純薬）を用い、マイクロプレート用にスケールを変えて行った。９６ｗｅｌｌ  ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅに７０μｌの発色試液Ａを入れ、スタンダードを５μｌ、サンプルを１０μｌ入れ、１分間撹拌後、インキュベーターに入れ、３７℃で１０分間保温した。その後、発色試液Ｂを１４０μｌ加え、１分間撹拌後、インキュベーターに入れ、３７℃で１０分間保温し、マイクロプレートリーダーで６５５ｎｍを対照として５４０ｎｍの吸光度を測定した。
【００３０】
１５．マウスの肝臓、脾臓、脂肪組織からのＲＮＡの抽出
マウスの臓器（肝臓及び脾臓は０．１ｇ、脂肪組織は０．２ｇ）をｅｐｐｅｎ  ｔｕｂｅ取り１ｍｌのＴＲＩｚｏｌ（ＧＩＢＣＯ）を加えて、ポリトロンホモジナイザーでホモジナイズした。ホモジネートを５分間室温で放置後、２００μｌのクロロホルムを加え１５秒混ぜた。３分間室温で放置後、１５０００ｒｐｍ、４℃で１５分間遠心し、上層６００μｌを新しいｅｐｐｅｎ  ｔｕｂｅに取った。ｉｓｏｐｒｏｐｙｌａｌｃｈｏｌ  ５００μｌを加え、１５秒混ぜた後、１０分間室温で放置し、１５０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心した。その後、ｄｅｃａｎｔａｔｉｏｎで上層を捨て、１ｍｌの７５％エタノールを加えタッチミキサーで混ぜ、１００００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心し、ｄｅｃａｎｔａｔｉｏｎで上層を捨て、遠心エバポレーターで２５℃、５分間遠心し、乾燥させた。その後にＤＥＰＣｗａｔｅｒ１００μｌを加えて溶かしたものを、−８０℃で保存した。
【００３１】
１６．Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡのｃＤＮＡへの調製
実験には、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ  Ｍｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｐｅｒｆｅｃｔ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ）キット（タカラバイオ）を用いた。５×ｐｒｉｍｅｒ  ｓｃｒｉｐｔ  ＲＴ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  ５μｌ、ＲＮＡ  ｓａｍｐｌｅ  ２０μｌをＰＣＲｔｕｂｅに加え、３７℃で１５分間、８５℃で５秒間反応させて調製したものを、−３０℃で保存した。
【００３２】
１７．Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ−ＰＣＲ法によるｍＲＮＡ発現の測定
実験には、ＳＹＢＲ  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ  ２（Ｔｌｉ  ＲＮａｓｅＨ  Ｐｌｕｓ）キット（タカラバイオ）を使用した。ＰＣＲｔｕｂｅにＳＹＢＲ  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ  １２．５μｌ、ＤＥＰＣ  ｗａｔｅｒ  １０．３μｌ、５０μＭのＰｒｉｍｅｒ（Ｆｏｒｗａｒｄ,Ｒｅｖｅｒｓｅ）各０．１μｌを入れ、β−ａｃｔｉｎ、ＰＰＡＲγ、ＦＡＢＰ４はＤＥＰＣｗａｔｅｒ１０．４μｌ、１００μＭのＰｒｉｍｅｒ（Ｆｏｒｗａｒｄ，Ｒｅｖｅｒｓｅ）各０．０５μｌを入れ、スタンダードとサンプル（ｃＤＮＡ  ｔｅｍｐｌａｔｅ）を２μｌずつ加え、Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ−ＰＣＲ反応にかけた。Ｐｒｉｍｅｒはβ−ａｃｔｉｎ、Ｇｐａｍ、Ｓｃｄ１、Ｆａｓｎ、Ａｃｏｘ１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１２、ＩＮＦ−γ、Ｔ−ｂｅｔ、ＧＡＴＡ−３、Ｆｏｘｐ３、Ｃｅｂｐｄ、Ａｄｉｐｏｑ、Ｃｅｂｐｂ、Ｃｅｂｐａ、Ｔｎｆ、Ａｃａｃｂ、ＰＰＡＲγ、ＦＡＢＰ４を用いた（表４参照）。反応時間は、９５℃で３０秒間保持した後、９５℃５秒、６０℃３０秒を４０サイクル行った。
【００３３】
【表４】
2014024823.tif 000005
【００３４】
（実験結果）
１．マウスの体重・臓器重量に及ぼす影響
体重の変化を図１に示す。無添加のコントロール群や緑茶摂取群と比較してホップ葉摂取群では有意に高い体重増加が見られた。最終的にコントロール群と比較してホップ葉摂取群は１２週齢で体重が約６％多かった。１２週齢のコントロール群のマウスの体重は４６．７８±１．４８ｇ、ホップ葉摂取群は４９．８０±１．８８ｇ、緑茶摂取群は４６．０４±１．７０ｇであった。
【００３５】
２．食餌摂取量の変化の比較
高脂肪食を与えて飼育したマウスの食餌摂取量を図２に示す。各週によって摂食量の増減はあったものの、各群において摂食量に大きな差は見られなかった。各群とも飼育２週目まで急激に摂食量が増え、その後はほぼ一定であった。
【００３６】
３．各種臓器重量の比較
高脂肪食を与えて飼育した１２週齢の各群のマウスの肝臓、脾臓、腎臓、脂肪組織、肺、心臓、脳を採取して重量を測定した。肝臓及び脾臓の重量を図３に示す。肝臓重量では有意差が見られなかったが、脾臓重量はコントロール群及び緑茶摂取群に比べて、ホップ葉摂取群では有意に重い結果であった。腎臓、脂肪組織及び肺の重量を図４に示す。各群において有意差は見られなかった。心臓及び脳の重量を図５に示す。こちらも各群で有意な差は見られなかった。
【００３７】
４．血清中性脂肪量の比較
高脂肪食を与えて飼育した１２週齢の各群のマウスの血清の中性脂肪量を図６に示す。ホップ葉摂取群はコントロール群に比べて中性脂肪量は有意に減少した。それぞれの群の血清中性脂肪量はコントロール群１２２．５±１９．４ｍｇ／ｄＬ、ホップ葉摂取群９４．７±６．３ｍｇ／ｄＬ、緑茶摂取群は１１３．６±１３．４ｍｇ／ｄＬであった。
【００３８】
５．血清中遊離脂肪酸の比較
高脂肪食を与えて飼育した１２週齢の各群のマウスの血清の遊離脂肪酸量を図７に示す。各群で有意差は見られなかった。
【００３９】
６．血清コレステロールの比較
高脂肪食を与えて飼育した１２週齢の各群のマウスの血清の総コレステロール含量を図８（Ａ）に示す。コントロール群と比較してホップ葉摂取群も緑茶摂取群も有意差は見られなかった。血清コレステロール含量はコントロール群１７５．０±９．７ｍｇ／ｄＬ、ホップ葉摂取群１６７．７±４．９ｍｇ／ｄＬ、緑茶摂取群１５１．６±７．５ｍｇ／ｄＬであった。
【００４０】
各群のマウスの血清のＨＤＬ−コレステロール含量を図８（Ｂ）に示す。コントロール群と比較してホップ葉摂取群も緑茶摂取群も有意差は見られなかった。血清ＨＤＬ−コレステロール含量はコントロール群９６．１±５．８ｍｇ／ｄＬ、ホップ葉摂取群９２．４±６．９ｍｇ／ｄＬ、緑茶摂取群８３．４±６．３ｍｇ／ｄＬであった。
【００４１】
各群のマウスの血清のＬＤＬ−コレステロール含量を計算によって求めた。得られた結果を図８（Ｃ）に示す。計算方法はＬＤＬ−コレステロール（ｍｇ／ｄｌ）＝総コレステロール  −  ＨＤＬ−コレステロール  −  ＴＧ／５で求めた。コントロール群及びホップ葉摂取群と比較して、緑茶摂取群の血清中のＬＤＬ−コレステロール含量が有意に低い値を示した。血清ＬＤＬ−コレステロール含量はコントロール群５４．５±５．９ｍｇ／ｄＬ、ホップ葉摂取群５６．４±６．１ｍｇ／ｄＬ、緑茶摂取群４５．５±４．７ｍｇ／ｄＬであった。
【００４２】
７．血清グルコース濃度（血糖値）の比較
高脂肪食を与えて飼育した１２週齢の各群のマウスの血清の血糖値を図９に示す。コントロール群と比較してホップ葉摂取群と緑茶摂取群が有意に低い値を示したが各群とも高血糖であった。ホップ葉摂取群はコントロール群に比べて血糖値は１５％減少した。各群の血糖値はコントロール群３１１．５±８．４ｍｇ／ｄＬ、ホップ葉摂取群２６４．０±７．１ｍｇ／ｄＬ、緑茶摂取群２６９．５±１８．５ｍｇ／ｄＬであった。
【００４３】
８．血清ＡＳＴ（アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ）の比較
高脂肪食を与えて飼育した１２週齢の各群のマウスの血清のＡＳＴ値を図１０（Ａ）に示す。各群において有意差は見られなかった。血清ＡＳＴの値はコントロール群１４．６８±１．５７ＩＵ／Ｌ、ホップ葉摂取群１４．１５±１．３７ＩＵ／Ｌ、緑茶摂取群１６．０３±１．９１ＩＵ／Ｌであった。
【００４４】
９・血清ＡＬＴ（アラニンアミノトランスフェラーゼ）の比較
高脂肪食を与えて飼育した１２週齢の各群のマウスの血清のＡＬＴ値を図１０（Ｂ）に示す。各群において有意差は見られなかった。血清ＡＬＴの値はコントロール群２．４９±０．３７ＩＵ／Ｌ、ホップ摂取与群２．２５±０．３０ＩＵ／Ｌ、緑茶摂取群２．７９±０．３２ＩＵ／Ｌであった。
【００４５】
１０．血清インスリン濃度の比較
高脂肪食を与えて飼育した１２週齢の各群のマウスの血清のインスリン濃度を図１１に示す。コントロール群と比較してホップ葉摂取群と緑茶摂取群において血清中のインスリン濃度が有意に低い値を示した。ホップ葉摂取群はコントロール群と比較してインスリン濃度は４２％減少した。各群のインスリン濃度はコントロール群２．４３±０．４４μｇ／ｌ、ホップ葉摂取群１．３９±０．２６μｇ／ｌ、緑茶摂取群１．５９±０．３８μｇ／ｌであった。
【００４６】
１１．血清ＳＯＤ活性の比較
高脂肪食を与えて飼育した１２週齢の各群のマウスの血清のＳＯＤ活性を図１２に示す。コントロール群と比較してホップ葉摂取群と緑茶摂取群のＳＯＤ活性が有意に低い結果となった。ホップ葉摂取群はコントロール群と比較してＳＯＤ活性は４０％減少した。各群のＳＯＤ活性はコントロール群４６．３±３．５％ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ、ホップ葉摂取群２７．８±２．５％ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ、緑茶摂取群３６．３±３．９％ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎであった。
【００４７】
１２．肝臓中性脂肪の比較
高脂肪食を与えて飼育した１２週齢の各群のマウスの肝臓を取り出し、肝臓の脂質を抽出して肝臓１ｇ当たりの中性脂肪量を図１３に示す。ホップ葉摂取群はコントロール群と比べて中性脂肪量は５４％増加した。緑茶摂取群はコントロール群に比べて中性脂肪量は有意に減少した。肝臓１ｇ当たりの中性脂肪値はコントロール群１１．２±１．９ｍｇ／ｇ  ｔｉｓｓｕｅ、ホップ葉摂取群１７．３±２．５ｍｇ／ｇ  ｔｉｓｓｕｅ、緑茶摂取群７．５±１．５ｍｇ／ｇ  ｔｉｓｓｕｅであった。
【００４８】
１３．肝臓コレステロールの比較
高脂肪食を与えて飼育した１２週齢の各群のマウスの肝臓を取り出し、肝臓の脂質を抽出して肝臓１ｇ当たりの肝臓のコレステロール含量を図１４に示した。ホップ葉摂取群はコントロール群に比べてコレステロール含量は３３％増加した。肝臓１ｇ当たりのコレステロール値はコントロール群２．８±０．２ｍｇ／ｇ  ｔｉｓｓｕｅ、ホップ葉摂取群３．７±０．３ｍｇ／ｇ  ｔｉｓｓｕｅ、緑茶摂取群３．０±０．４ｍｇ／ｇ  ｔｉｓｓｕｅであった。
【００４９】
１４．肝臓遊離脂肪酸の比較
高脂肪食を与えて飼育した１２週齢の各群のマウスの肝臓を取り出し、肝臓の脂質を抽出して肝臓１ｇ当たり肝臓の遊離脂肪酸含量を図１５に示す。緑茶摂取群はコントロール群に比べて遊離脂肪酸含量は２６％減少した。肝臓１ｇ当たりの遊離脂肪酸含量はコントロール群５．３９±０．４０μＥｑ／Ｌ、ホップ葉摂取群５．９３±０．４μＥｑ／Ｌ、緑茶摂取群３．９７±０．２７μＥｑ／Ｌであった。
【００５０】
１５．マウス肝臓におけるｍＲＮＡ発現
ホップ葉及び緑茶を添加した高脂肪飼料を長期間投与したマウスの肝臓における、脂質合成系の遺伝子発現に及ぼす影響を調べた。得られた結果を図１６に示す。Ｇｐａｍ、Ｓｃｄ１、Ｆａｓｎ、Ａｃｏｘ１の遺伝子発現を調べたところ、コントロール群と比較して、ホップ葉摂取群の発現量が高い傾向が見られた。
【００５１】
１６．マウスの脾臓におけるｍＲＮＡ発現（１）
ホップ葉及び緑茶を添加した高脂肪飼料を長期間投与したマウスの脾臓における遺伝子発現をリアルタイムＰＣＲ法を用いて調べた。その結果を図１７に示す。Ｔｈ細胞から生産されるサイトカインであるＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１２、ＩＮＦ−γの遺伝子発現を調べたところ、ホップ葉摂取群のＩＬ−２の発現が他の群と比べて高い傾向があり、ＩＬ−４及びＩＬ−１２は差は見られなかった。ＩＮＦ−γはコントロール群において高い結果であった。
【００５２】
１７．マウスの脾臓におけるｍＲＮＡ発現（２）
ホップ葉及び緑茶を添加した高脂肪飼料を長期間投与したマウスの脾臓における転写因子発現をリアルタイムＰＣＲ法を用いて調べた。その結果を図１８に示す。Ｔｈ細胞の分化に関する転写因子であるＴ−ｂｅｔ、ＧＡＴＡ−３、Ｆｏｘｐ３の遺伝子発現を調べたところ、調べたすべての転写因子においてホップ葉摂取群が他の群と比べて発現が高い傾向があった。
【００５３】
１８．マウスの脂肪組織におけるｍＲＮＡ発現
ホップ葉及び緑茶を添加した高脂肪飼料を長期間投与したマウスの脂肪組織における、脂肪形成に関与するｍＲＮＡの発現をリアルタイムＰＣＲ法を用いて調べた。その結果を図１９及び図２０に示す。ＰＰＡＲγ、Ｓｃｄ１は緑茶群が他の２群と比較して発現が高い傾向にあり、逆にＣｅｂｐｂは緑茶群は他の２群と比較して発現が低い傾向であった。Ａｃａｃｂはコントロール群と比較してホップ葉摂取群及び緑茶摂取群において発現が高い傾向であった。Ｆａｓｎはホップ葉摂取群が他の２群と比較して発現がやや高い傾向であった。Ｃｅｂｐｄ、Ｇｐａｍ、Ｃｅｂｐａ、Ａｃｏｘ１、Ｔｎｆ、ＦＡＢＰ４は大きな差は見られなかった。
【００５４】
１９．その他
各実験結果の比較において、統計手法は、一元配置の分散分析後、各群間をＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの多重比較法で検定し、Ｐ＜０．０５を有意差ありと判定した。有意差ありと判定した結果については、統計的有意差を表すａ、ｂを図中に示した。
【００５５】
（考察）
ホップ葉を摂取した群はコントロール群と緑茶摂取群と摂食量のほとんど差がなかったが、高脂肪食による体重の増加が促進された。肝臓、腎臓、脂肪組織、肺、心臓、脳の重量を比較したところ、各群においてほとんど差が見られなかったが、脾臓重量はホップ葉摂取群において有意に増加した。脾臓はリンパ器官としては体内で最大のもので、免疫に大きな働きをしており、ホップ葉の摂取によって免疫機能が増進した可能性が考えられる。
【００５６】
血清の分析では、中性脂肪量においてホップ葉摂取群がコントロール群と比較して有意に低い値であった。血糖値はコントロール群と比較してホップ葉摂取群と緑茶摂取群が有意に低い値を示したが、各群とも高血糖であった（図９参照）。血清のインスリン濃度もコントロール群と比較してホップ葉摂取群と緑茶摂取群が有意に低い濃度を示した。近年の研究成果から内臓脂肪の蓄積・肥大によりアディポカインの分泌に異常をきたしインスリン抵抗性などを引き起こし高血糖となることが分かっている。ホップ葉及び緑茶摂取群は血糖値がコントロール群と比べて低かったため、インスリン濃度も低いのではないかと考えられる。
【００５７】
血清のＡＳＴ値及びＡＬＴ値は肝臓に異常がある場合に上昇するため、肝臓毒性を確かめるうえで有力な指標である。ＡＳＴ値、ＡＬＴ値は各群において差がほとんどなかったことから毒性は無かったと考えられる。
【００５８】
肝臓中の中性脂肪、コレステロール、遊離脂肪酸は、コントロール群と比較してホップ葉摂取群が高い値を示した（図１３から図１５参照）。肝臓の脂質合成系遺伝子の発現を調べたところ、脂質合成酵素であるＧｐａｍ、飽和脂肪酸を一価不飽和脂肪酸に変換する酵素であるＳｃｄ１、脂肪酸合成酵素であるＦａｓｎ、ペルオキシソームにおける長鎖脂肪酸のβ酸化に関する酵素のＡｃｏｘ１の４種類すべてにおいてホップ葉群での発現が高い傾向にあった。これらから、ホップ葉を摂取することで肝臓での脂質合成が増進されていると考えられる。一方で脂肪組織の遺伝子発現ではコントロール群とホップ葉群を比較して顕著な差は観察されなかった。
【００５９】
脾臓の遺伝子発現を解析したところ、Ｔ細胞を分化誘導する転写因子の中で細胞性免疫を担当するＴｈ１細胞へ分化させるＴ−ｂｅｔと調節性T細胞（Ｔｒｅｇ）へ分化させるＦｏｘｐ３のｍＲＮＡ発現が増加しており、細胞免疫を活性化させるサイトカインであるＩＬ−２の発現も増加していた。ＩＬ−２はＴｈ１細胞から生産されるサイトカインであり、ホップ葉の摂取によりナイーブＴｈ細胞からＴｈ１細胞への分化が促進され、細胞性免疫機能が増進されたと考えられる。細胞性免疫とは体内に抗原が入るとＴｈ１細胞が増殖・活性化されて直接に抗原と特異的に反応する免疫であり、ガンに対する生体防御に重要な役割を果たしている。Ｔｈ１細胞と液性免疫を担当するＴｈ２細胞は互いの細胞から分泌されるサイトカインにより促進・抑制し合いバランスが保たれており、このＴｈ１細胞とＴｈ２細胞のバランス異常が、アレルギー性疾患や自己免疫疾患などの病気の発生に密接に関連している（Ｎｇｕｙｅｎ  Ｔｈｉ  Ｘｕａｎ，  Ｅｋａｔｅｒｉｎａ  Ｓｈｕｍｉｌｉｎａ，  Ｅｒｉｃｈ  Ｇｕｌｂｉｎs，  Ｓｈｕｃｈｅｎ  Ｇｕ，  Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ  Ｇｏ“ｔｚ，  Ｆｌｏｒｉａｎ  Ｌａｎｇ（２０１０）Ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｂｙ  ｘａｎｔｈｏｈｕｍｏｌ．  Ｍｏｌ．  Ｎｕｔｒ．  Ｆｏｏｄ  Ｒｅｓ．  ５４，２１４−２２４、野間剛（２０１０）ヘルパーＴ細胞パラダイム−Ｔｈ１７細胞とＴｒｅｇ細胞による疾患形成と制御−Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３３，２６２−２７１）。Ｔｒｅｇは免疫系の崩壊を抑制し、免疫異常から生体を守っており、炎症や腫瘍免疫、感染免疫などについても抑制作用を示す。これらからホップ葉には免疫機能増強作用があると考えられる（図２１参照）。
【００６０】
また、ホップ葉をマウスに長期投与したが、マウスの生体に特に害のある結果は出なかった。すなわち、ホップ葉又はホップ葉の成分を抽出したホップ葉抽出物を免疫機能増強作用材、血中中性脂肪低下作用材、血糖値低下作用材、又は、メタボリック症候群改善作用材として用いることができることが分かった。
【００６１】
以上、実施の形態を挙げて本発明を説明したが、本発明は上記実施の形態に限定されるものではなく、種々変形可能である。
【産業上の利用可能性】
【００６２】
サプリメントや健康食品素材として広く利用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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