(57)【要約】【課題】簡便に腫瘍性のリンパ球を検出し、正常な白血球に対する分類および計数の精度を向上させることが可能な血球分析方法、血球分析装置およびプログラムを提供する。【解決手段】血球分析方法は、検体に含まれる赤血球を溶血させ、白血球の核酸を蛍光染色するために、検体と試薬とを混合し白血球分類用の測定試料を調製する調製工程と、調製された測定試料をフローセルに流し、測定試料中の各血球から発せられた蛍光および角度の異なる２種類の散乱光を検出し、蛍光信号と２種類の散乱光信号を取得する検出工程と、取得された蛍光信号および２種類の散乱光信号に基づいて、蛍光と２種類の散乱光とに関する少なくとも３種のパラメータによる解析を実行することにより、腫瘍性リンパ球を検出するとともに、白血球を少なくとも４つに分類する分類工程と、を有する。【選択図】図７
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体に含まれる赤血球を溶血させ、白血球の核酸を蛍光染色するために、検体と試薬とを混合し白血球分類用の測定試料を調製する調製工程と、
調製された測定試料をフローセルに流し、測定試料中の各血球から発せられた蛍光および角度の異なる２種類の散乱光を検出し、蛍光信号と２種類の散乱光信号を取得する検出工程と、
取得された蛍光信号および２種類の散乱光信号に基づいて、蛍光と２種類の散乱光とに関する少なくとも３種のパラメータによる解析を実行することにより、腫瘍性リンパ球を検出するとともに、白血球を少なくとも４つに分類する分類工程と、を有する、
ことを特徴とする血球分析方法。
【請求項２】
請求項１に記載の血球分析方法において、
前記分類工程は、蛍光と第１の散乱光に関するパラメータによる解析により白血球を分類する第１分類工程と、蛍光、第１の散乱光および第２の散乱光に関するパラメータによる解析により、腫瘍性リンパ球を検出するとともに、白血球を分類する第２分類工程と、を含む、
ことを特徴とする血球分析方法。
【請求項３】
請求項２に記載の血球分析方法において、
前記第１分類工程の結果が所定の条件を満たす場合に、前記第２分類工程が実行される、
ことを特徴とする血球分析方法。
【請求項４】
請求項１ないし３の何れか一項に記載の血球分析方法において、
前記解析により得られた白血球に関する測定結果を表示部に表示させる表示工程をさらに含む、
ことを特徴とする血球分析方法。
【請求項５】
請求項４に記載の血球分析方法において、
前記表示工程は、白血球の分類結果として、２次元以上の白血球分布図を前記表示部に表示させる工程を含む、
ことを特徴とする血球分析方法。
【請求項６】
請求項５に記載の血球分析方法において、
前記表示工程は、前記測定結果として、前記３種のパラメータから選ばれた２種のパラメータの組合せによる第１の白血球分布図と、前記組合せとは異なる２種のパラメータの組合せによる第２の白血球分布図を、前記表示部に表示させる、
ことを特徴とする血球分析方法。
【請求項７】
請求項６に記載の血球分析方法において、
前記第１の白血球分布図は、蛍光に関するパラメータを含み、
前記第２の白血球分布図は、２種類の散乱光に関するパラメータを含む、
ことを特徴とする血球分析方法。
【請求項８】
請求項５ないし７の何れか一項に記載の血球分析方法において、
前記白血球分布図において、白血球の分類ごとに異なる色で、白血球の分布が示される、
ことを特徴とする血球分析方法。
【請求項９】
請求項８に記載の血球分析方法において、
前記白血球分布図において、腫瘍性リンパ球の分布が正常なリンパ球と同じ色で示される、
ことを特徴とする血球分析方法。
【請求項１０】
請求項８に記載の血球分析方法において、
前記白血球分布図において、腫瘍性リンパ球の分布が他の血球と異なる色で示される、ことを特徴とする血球分析方法。
【請求項１１】
請求項４ないし１０の何れか一項に記載の血球分析方法において、
前記分類工程は、各分類に含まれる血球の数を計数する工程を含み、
前記表示工程は、計数された各分類の血球の数に関する情報を前記表示部に表示させる、
ことを特徴とする血球分析方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の血球分析方法において、
前記分類工程は、腫瘍性リンパ球の数を計数する工程を含み、
前記表示工程は、計数された腫瘍性リンパ球の数に関する情報を前記表示部に表示させる、
ことを特徴とする血球分析方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の血球分析方法において、
前記表示工程は、所定数の腫瘍性リンパ球が計数された場合に、検体に腫瘍性リンパ球が含まれる可能性があることを示す情報を前記表示部に表示させる、
ことを特徴とする血球分析方法。
【請求項１４】
検体と試薬とを混合し測定試料を調製する調製工程と、
調製された測定試料をフローセルに流し、測定試料中の各血球から発せられた蛍光および角度の異なる２種類の散乱光を検出し、蛍光信号と２種類の散乱光信号を取得する検出工程と、
取得された蛍光信号および２種類の散乱光信号に基づいて、蛍光と２種類の散乱光とに関する少なくとも３種のパラメータによる解析を実行することにより、腫瘍性リンパ球を検出する検出工程と、
検出された腫瘍性リンパ球に関する情報を表示部に表示させる表示工程と、を有する、ことを特徴とする血球分析方法。
【請求項１５】
検体に含まれる赤血球を溶血させ、白血球の核酸を蛍光染色するために、検体と試薬とを混合し白血球分類用の測定試料を調製する試料調製部と、
調製された測定試料をフローセルに流し、測定試料中の各血球から発せられた蛍光および角度の異なる２種類の散乱光を検出して、蛍光信号と２種類の散乱光信号を出力する測定部と、
前記測定部から出力される蛍光信号および２種類の散乱光信号に基づいて、蛍光と２種類の散乱光とに関する少なくとも３種のパラメータによる解析を実行することにより、腫瘍性リンパ球を検出するとともに、白血球を少なくとも４つに分類するデータ解析部と、を備える、
ことを特徴とする血球分析装置。
【請求項１６】
測定試料をフローセルに流して得られた検出信号に基づいて血球の分析を行う血球分析装置のコンピュータに、白血球を分類するための機能を付与するプログラムであって、
前記フローセルから発せられる蛍光および角度の異なる２種類の散乱光の検出信号に基
づいて、蛍光と２種類の散乱光とに関する少なくとも３種のパラメータによる解析を実行することにより、腫瘍性リンパ球を検出するとともに、白血球を少なくとも４つに分類する処理工程を含む、
ことを特徴とするプログラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、検体中の白血球を分類し計数する血球分析方法、血球分析装置およびプログラムに関する。
【背景技術】
【０００２】
正常な白血球は、通常、リンパ球、単球、好塩基球、好酸球および好中球の５種類に分類される。正常な末梢血においては、これらの血球がそれぞれ一定の割合で存在している。しかし、被験者に疾患が存在する場合、特定の血球数が増加または減少することがある。それゆえ、臨床検査の分野においては、白血球の分類および計数を行うことにより、疾患の診断に極めて有用な情報を得ることができる。
【０００３】
一方、疾患を有する患者の末梢血中には、正常な末梢血中には存在しない細胞が出現する。たとえば、慢性リンパ性白血病、悪性リンパ腫等の疾患では、腫瘍性の成熟リンパ球が末梢血中に出現する。急性の白血病では、未成熟な白血球である「芽球（骨髄芽球、リンパ芽球）」が末梢血中に出現する。さらに、ウイルス感染症や、薬物アレルギー等では、抗原刺激により活性化したリンパ球である「異型リンパ球（atypical lymphocyte）」
が末梢血中に出現する。このため、白血球を精度良く分類するためには、これらの異常細胞を他の正常な白血球と区分して検出する必要がある。
【０００４】
特許文献１には、血液試料を溶血剤および色素化合物と混合することにより測定試料を調製し、フローサイトメータを用いて測定試料中の血球から生じる散乱光および蛍光を測定し、測定データに基づいて白血球を５つに分類するとともに、当該測定データに基づいて、異型リンパ球、骨髄芽球等の異常細胞を正常白血球と区分して検出することが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００６−９１０２４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、特許文献１の技術では、異常細胞として腫瘍性の成熟リンパ球は検出できていない。このため、腫瘍性の成熟リンパ球を検出して白血球の分類精度を向上させることが望まれている。
【０００７】
このような課題に鑑み、本発明は、簡便に腫瘍性のリンパ球を検出し、正常な白血球に対する分類および計数の精度を向上させることが可能な血球分析方法、血球分析装置およびプログラムを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の第１の態様は、血球分析方法に関する。この態様に係る血球分析方法は、検体に含まれる赤血球を溶血させ、白血球の核酸を蛍光染色するために、検体と試薬とを混合し白血球分類用の測定試料を調製する調製工程と、調製された測定試料をフローセルに流し、測定試料中の各血球から発せられた蛍光および角度の異なる２種類の散乱光を検出し、蛍光信号と２種類の散乱光信号を取得する検出工程と、取得された蛍光信号および２種類の散乱光信号に基づいて、蛍光と２種類の散乱光とに関する少なくとも３種のパラメータによる解析を実行することにより、腫瘍性リンパ球を検出するとともに、白血球を少な
くとも４つに分類する分類工程と、を有する。
【０００９】
本態様に係る血球分析方法によれば、腫瘍性リンパ球が腫瘍性でない他の血球と区分して検出されるため、正常白血球の分類精度を高めることができ、当該分類に基づく疾患の診断を、より適正に行うことができる。また、腫瘍性リンパ球は他の血球から区分して検出されるため、慢性リンパ性白血病や、悪性リンパ腫等の疾患の診断に有用な情報をユーザに提供することができる。
【００１０】
本態様に係る血球分析方法において、前記分類工程は、蛍光と第１の散乱光に関するパラメータによる解析により白血球を分類する第１分類工程と、蛍光、第１の散乱光および第２の散乱光に関するパラメータによる解析により、腫瘍性リンパ球を検出するとともに、白血球を分類する第２分類工程と、を含み得る。
【００１１】
この場合、本態様に係る血球分析方法は、第１分類工程の結果が所定の条件を満たす場合に、前記第２分類工程が実行されるよう調整され得る。こうすると、第１分類工程の結果が所定の条件を満たさない場合には、第１分類工程のみが実行され、２つのパラメータによる解析が行われるため、白血球の分類のための処理負担を軽減することができる。
【００１２】
また、本態様に係る血球分析方法は、前記解析により得られた白血球に関する測定結果を表示部に表示させる表示工程をさらに含み得る。
【００１３】
ここで、前記表示工程は、白血球の分類結果として、２次元以上の白血球分布図を前記表示部に表示させる工程を含み得る。こうすると、ユーザは、白血球分布図を参照することにより、分類された各血球の分布状態を容易に把握することができ、診断に有用な情報を円滑に取得することができる。
【００１４】
この場合、前記表示工程は、前記測定結果として、前記３種のパラメータから選ばれた２種のパラメータの組合せによる第１の白血球分布図と、前記組合せとは異なる２種のパラメータの組合せによる第２の白血球分布図を、前記表示部に表示させても良い。こうすると、２種の２次元分布図によって、白血球の分布状態を分かり易く表示することができる。
【００１５】
ここで、前記第１の白血球分布図は、蛍光に関するパラメータを含み、前記第２の白血球分布図は、２種類の散乱光に関するパラメータを含み得る。こうすると、第１の白血球分布図により、蛍光を用いて検出可能な核酸の活性度が高い血球（たとえば幼若な血球等）の分布を表示させることができ、第２の白血球分布図により、腫瘍性リンパ球が他の血球から区画された血球の分布を表示させることができる。
【００１６】
なお、前記白血球分布図においては、白血球の分類ごとに異なる色で、白血球の分布が示されるのが好ましい。こうすると、各血球の分布がより容易に把握され得る。
【００１７】
この場合、前記白血球分布図において、腫瘍性リンパ球の分布が正常なリンパ球と同じ色で示されると、さらに好ましい。こうすると、腫瘍性リンパ球も含めてリンパ球の分布が把握され易くなる。
【００１８】
この場合、前記白血球分布図において、腫瘍性リンパ球の分布が他の血球と異なる色で示されると、さらに好ましい。こうすると、腫瘍性リンパ球の分布がより把握され易くなり、慢性リンパ性白血病や悪性リンパ腫等の疾患の診断が行われ易くなる。
【００１９】
本態様に係る血球分析方法において、前記分類工程は、各分類に含まれる血球の数を計
数する工程を含み、前記表示工程は、計数された各分類の血球の数に関する情報を前記表示部に表示させるよう調整され得る。こうすると、ユーザは、各分類にどの程度血球が含まれるかを定量的に把握することができる。
【００２０】
この場合、前記分類工程は、腫瘍性リンパ球の数を計数する工程を含み、前記表示工程は、計数された腫瘍性リンパ球の数に関する情報を前記表示部に表示させるよう調整され得る。こうすると、ユーザは、測定試料に腫瘍性リンパ球がどの程度含まれるかを定量的に把握することができる。
【００２１】
さらに、前記表示工程は、所定数の腫瘍性リンパ球が計数された場合に、検体に腫瘍性リンパ球が含まれる可能性があることを示す情報を前記表示部に表示させるよう調整され得る。こうすると、ユーザは、腫瘍性リンパ球に基づく疾患の可能性をさらに容易に確認することができる。
【００２２】
本発明の第２の態様は、血球分析方法に関する。この態様に係る血球分析方法は、検体と試薬とを混合し測定試料を調製する調製工程と、調製された測定試料をフローセルに流し、測定試料中の各血球から発せられた蛍光および角度の異なる２種類の散乱光を検出し、蛍光信号と２種類の散乱光信号を取得する検出工程と、取得された蛍光信号および２種類の散乱光信号に基づいて、蛍光と２種類の散乱光とに関する少なくとも３種のパラメータによる解析を実行することにより、腫瘍性リンパ球を検出する検出工程と、検出された腫瘍性リンパ球に関する情報を表示部に表示させる表示工程と、を有する。
【００２３】
本態様に係る血球分析方法によれば、腫瘍性リンパ球が検出され、検出された腫瘍性リンパ球に関する情報が表示部に表示されるため、慢性リンパ性白血病や、悪性リンパ腫等の疾患の診断に有用な情報をユーザに提供することができる。
【００２４】
本発明の第３の態様は、血球分析装置に関する。この態様に係る血球分析装置は、検体に含まれる赤血球を溶血させ、白血球の核酸を蛍光染色するために、検体と試薬とを混合し白血球分類用の測定試料を調製する試料調製部と、調製された測定試料をフローセルに流し、測定試料中の各血球から発せられた蛍光および角度の異なる２種類の散乱光を検出して、蛍光信号と２種類の散乱光信号を出力する測定部と、前記測定部から出力される蛍光信号および２種類の散乱光信号に基づいて、蛍光と２種類の散乱光とに関する少なくとも３種のパラメータによる解析を実行することにより、腫瘍性リンパ球を検出するとともに、白血球を少なくとも４つに分類するデータ解析部と、を備える。
【００２５】
本態様に係る血球分析装置によれば、腫瘍性リンパ球が腫瘍性でない他の血球と区分して検出されるため、正常白血球の分類精度を高めることができ、当該分類に基づく疾患の診断を、より適正に行うことができる。また、腫瘍性リンパ球は他の血球から区分して検出されるため、慢性リンパ性白血病や、悪性リンパ腫等の疾患の診断に有用な情報をユーザに提供することができる。
【００２６】
本発明の第４の態様は、測定試料をフローセルに流して得られた検出信号に基づいて血球の分析を行う血球分析装置のコンピュータに、白血球を分類するための機能を付与するプログラムに関する。この態様に係るプログラムは、前記フローセルから発せられる蛍光および角度の異なる２種類の散乱光の検出信号に基づいて、蛍光と２種類の散乱光とに関する少なくとも３種のパラメータによる解析を実行することにより、腫瘍性リンパ球を検出するとともに、白血球を少なくとも４つに分類する処理工程を含む。
【００２７】
本態様に係るプログラムによれば、上記第１の態様と同様の効果が奏され得る。
【発明の効果】
【００２８】
以上のとおり、本発明によれば、簡便に腫瘍性のリンパ球を検出し、正常な白血球に対する分類および計数の精度を向上させることが可能な血球分析方法、血球分析装置およびプログラムを提供することができる。
【００２９】
本発明の効果ないし意義は、以下に示す実施の形態の説明により更に明らかとなろう。ただし、以下に示す実施の形態は、あくまでも、本発明を実施化する際の一つの例示であって、本発明は、以下の実施の形態により何ら制限されるものではない。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】実施の形態に係る血球分析装置の外観を示す斜視図である。
【図２】実施の形態に測定ユニットの構成を模式的に示す図である。
【図３】実施の形態に係る光学検出器の構成を模式的に示す平面図である。
【図４】実施の形態に係る情報処理ユニットの構成を示す図である。
【図５】実施の形態に係る第１スキャッタグラムおよび第１スキャッタグラム上のクラスタを示す図である。
【図６】実施の形態に係る測定ユニットと情報処理ユニットによる処理を示すフローチャート、および第１スキャッタグラム上において２つのクラスタが密接している部分を示す例示図である。
【図７】実施の形態に係る３次元スキャッタグラムを示す図、および第２の分画処理を説明する図である。
【図８】実施の形態に係る分析結果画面の構成を示す図である。
【図９】実施の形態に係る分析結果画面の構成を示す図である。
【図１０】実施の形態に係る分析結果画面に表示される第１および第２スキャッタグラムを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
本実施の形態は、血液に関する検査および分析を行うための血球分析装置に本発明を適用したものである。以下、本実施の形態に係る血球分析装置について、図面を参照して説明する。
【００３２】
図１は、本実施の形態に係る血球分析装置１の外観を示す斜視図である。
【００３３】
血球分析装置１は、血液検体に含まれる白血球、赤血球、血小板等を検出し、各血球を計数する多項目血球分析装置である。血球分析装置１は、測定ユニット２と、測定ユニット２の前面側に配置された搬送ユニット３と、情報処理ユニット４とを備えている。患者から採取された末梢血である血液検体は、検体容器（採血管）Ｔに収容される。複数の検体容器ＴがサンプルラックＬに支持され、このサンプルラックＬが搬送ユニット３により搬送されて、血液検体が測定ユニット２へ供給される。
【００３４】
情報処理ユニット４は、表示部４１と入力部４２を備えており、測定ユニット２と、搬送ユニット３と、ホストコンピュータ５（図２参照）に対して、通信可能に接続されている。情報処理ユニット４は、測定ユニット２と搬送ユニット３の動作を制御し、測定ユニット２で行われた測定結果に基づいて解析を行い、解析結果をホストコンピュータ５（図２参照）に送信する。
【００３５】
図２は、測定ユニット２の構成を模式的に示す図である。
【００３６】
測定ユニット２は、ハンド部２１と、検体容器セット部２２と、バーコードユニット２３と、検体吸引部２４と、試料調製部２５と、検出部２６とを備えている。検体吸引部２
４は、ピアサ２４ａを備えており、検体容器Ｔから検体を吸引する。試料調製部２５は、混合チャンバＭＣとヒータＨを備えており、検体に試薬を混和することにより測定に用いられる測定試料を調製する。検出部２６は、光学検出器Ｄを備えており、測定試料から血球を検出する。測定ユニット２の各部は、情報処理ユニット４により制御される。
【００３７】
搬送ユニット３により位置Ｐ１に位置付けられた検体容器Ｔは、ハンド部２１により把持され、サンプルラックＬから上方向に抜き出される。そして、ハンド部２１が揺動されることにより、検体容器Ｔ内の検体が撹拌される。攪拌が終了した検体容器Ｔは、ハンド部２１により、位置Ｐ１に位置付けられた検体容器セット部２２にセットされる。しかる後、この検体容器Ｔは、検体容器セット部２２により位置Ｐ２まで搬送される。
【００３８】
検体容器Ｔが位置Ｐ２に位置付けられると、位置Ｐ２の近傍に設置されたバーコードユニット２３により、検体容器Ｔに貼付されたバーコードラベルから検体番号が読み取られる。しかる後、この検体容器Ｔは、検体容器セット部２２により位置Ｐ３まで搬送される。検体容器Ｔが位置Ｐ３に位置付けられると、検体吸引部２４によりピアサ２４ａを介して検体容器Ｔから所定量の検体が吸引される。検体の吸引が終了すると、この検体容器Ｔは、検体容器セット部２２により前方に搬送され、ハンド部２１により元のサンプルラックＬの支持位置に戻される。ピアサ２４ａを介して吸引された検体は、ピアサ２４ａが混合チャンバＭＣの位置へ移送された後、検体吸引部２４により混合チャンバＭＣに所定量だけ吐出される。
【００３９】
試料調製部２５は、第１試薬を収容する試薬容器２５１と、第２試薬を収容する試薬容器２５２と、シース液（希釈液）を収容する試薬容器２５３に、チューブを介して接続されている。また、試料調製部２５はコンプレッサ（図示せず）に接続されており、このコンプレッサにより発生される圧力により試薬容器２５１〜２５３から、それぞれの試薬を分取することが可能となっている。試料調製部２５は、混合チャンバＭＣ内で、血液検体と、第１試薬と、第２試薬とを混合し、この混合液を所定時間だけヒータＨにより加温して、測定試料を調製する。試料調製部２５で調製された測定試料は、検出部２６の光学検出器Ｄに供給される。
【００４０】
検出部２６は、シース液（希釈液）を収容する試薬容器２５３に、チューブを介して接続されている。また、検出部２６はコンプレッサ（図示せず）に接続されており、このコンプレッサにより発生される圧力により試薬容器２５３からシース液（希釈液）を分取することが可能となっている。
【００４１】
図３は、光学検出器Ｄの構成を模式的に示す図である。光学検出器Ｄは、フローセルＤ１と、シースフロー系Ｄ２、ビームスポット形成系Ｄ３、前方散乱光受光系Ｄ４、側方散乱光受光系Ｄ５、蛍光受光系Ｄ６を有している。
【００４２】
シースフロー系Ｄ２は、フローセルＤ１内に測定試料をシース液に包まれた状態で送り込み、フローセルＤ１中に液流を発生させるように構成されている。ビームスポット形成系Ｄ３は、半導体レーザＤ３１から照射された光が、コリメータレンズＤ３２とコンデンサレンズＤ３３とを通って、フローセルＤ１に照射されるよう構成されている。これにより、フローセルＤ１内を通過する液流に含まれる血球にレーザ光が照射される。また、ビームスポット形成系Ｄ３は、ビームストッパＤ３４も備えている。
【００４３】
前方散乱光受光系Ｄ４は、前方への散乱光（前方散乱光）を前方集光レンズＤ４１によって集光し、ピンホールＤ４２を通った光をフォトダイオードＤ４３で受光するように構成されている。フォトダイオードＤ４３は、受光した前方散乱光のピーク値に基づいて前方散乱光信号（ＦＳＣ）を出力する。側方散乱光受光系Ｄ５は、側方への散乱光（側方散
乱光）を側方集光レンズＤ５１にて集光するとともに、一部の光をダイクロイックミラーＤ５２で反射させ、フォトダイオードＤ５３で受光するよう構成されている。フォトダイオードＤ５３は、受光した側方散乱光のピーク値に基づいて側方散乱光信号（ＳＳＣ）を出力する。
【００４４】
光散乱は、光の進行方向に血球のような粒子が障害物として存在すると、粒子により光がその進行方向を変えることによって生じる現象である。この散乱光を検出することによって、粒子の大きさと材質に関する情報を得ることができる。特に、前方散乱光からは、粒子（血球）の大きさに関する情報を得ることができる。また、側方散乱光からは、粒子内部の情報を得ることができる。血球粒子にレーザ光が照射された場合、側方散乱光強度は細胞内部の複雑さ（核の形状、大きさ、密度および顆粒の量）に依存する。
【００４５】
蛍光受光系Ｄ６は、側方散乱光のうちダイクロイックミラーＤ５２を透過した光（蛍光）をさらに分光フィルタＤ６１に通し、アバランシェフォトダイオードＤ６２で受光するよう構成されている。アバランシェフォトダイオードＤ６２は、受光した蛍光のピーク値に基づいて蛍光信号（ＳＦＬ）を出力する。
【００４６】
蛍光物質により染色された血球に光を照射すると、照射した光の波長より長い波長の蛍光を発する。蛍光の強度はよく染色されていれば強くなり、この蛍光強度を測定することによって血球の染色度合いに関する情報を得ることができる。
【００４７】
図２に戻り、光学検出器Ｄにより取得された前方散乱光信号と、側方散乱光信号と、蛍光信号は、情報処理ユニット４に送信される。情報処理ユニット４は、受信したこれら信号に基づいて解析を実行する。この解析では、血液検体中に存在する白血球が、４つのサブクラス（リンパ球（ＬＹＭＰＨ）、単球（ＭＯＮＯ）、好中球（ＮＥＵＴ）と好塩基球（ＢＡＳＯ）とによってなる血球群、および好酸球（ＥＯ）に分類される。
【００４８】
なお、本実施の形態では説明を省略したが、血球分析装置１は、血液検体を所定の試薬と混合して、白血球の数を計数し、好塩基球を個別に検出するための測定試料を調製する。この測定試料を光学検出器Ｄで測定することによって、白血球の数を取得すると共に、好中球と好塩基球の分類を行うことができる。
【００４９】
図４は、情報処理ユニット４の構成を示す図である。
【００５０】
情報処理ユニット４は、パーソナルコンピュータからなり、本体４０と、表示部４１と、入力部４２から構成されている。本体４０は、ＣＰＵ４０１と、ＲＯＭ４０２と、ＲＡＭ４０３と、ハードディスク４０４と、読出装置４０５と、画像出力インターフェース４０６と、入出力インターフェース４０７と、通信インターフェース４０８を有する。
【００５１】
ＣＰＵ４０１は、ＲＯＭ４０２に記憶されているコンピュータプログラムおよびＲＡＭ４０３にロードされたコンピュータプログラムを実行する。ＲＡＭ４０３は、ＲＯＭ４０２およびハードディスク４０４に記録されているコンピュータプログラムの読み出しに用いられる。また、ＲＡＭ４０３は、これらのコンピュータプログラムを実行するときに、ＣＰＵ４０１の作業領域としても利用される。
【００５２】
ハードディスク４０４には、オペレーティングシステム、ＣＰＵ４０１に実行させるためのコンピュータプログラム、およびコンピュータプログラムの実行に用いるデータが記憶されている。また、ハードディスク４０４には、図６（ａ）に示す情報処理ユニット４の処理を実行させるためのプログラム４０４ａが記憶されている。読出装置４０５は、ＣＤドライブまたはＤＶＤドライブ等によって構成されており、記録媒体４０５ａに記録さ
れたコンピュータプログラムおよびデータを読み出すことができる。なお、上記プログラム４０４ａが記録媒体４０５ａに記録されている場合には、読出装置４０５により記録媒体４０５ａから読み出されたプログラム４０４ａが、ハードディスク４０４に記憶される。
【００５３】
画像出力インターフェース４０６は、画像データに応じた映像信号を表示部４１に出力し、表示部４１は、画像出力インターフェース４０６から出力された映像信号に基づいて画像を表示する。ユーザは入力部４２を介して指示を入力し、入出力インターフェース４０７は、入力部４２を介して入力された信号を受け付ける。通信インターフェース４０８は、測定ユニット２と、搬送ユニット３と、ホストコンピュータ５に接続されており、ＣＰＵ４０１は、通信インターフェース４０８を介して、これら装置との間で指示信号およびデータの送受信を行う。
【００５４】
なお、試料調製部２５では、赤血球を溶血させ、白血球の細胞膜に蛍光色素が透過できる程度の損傷を与え、白血球の核酸を染色するために、血液検体と試薬とが混合されて測定試料が調製される。具体的には、以下の第１試薬と第２試薬が血液検体に混合されて測定試料が調製される。
【００５５】
第１試薬は、核酸を染色可能な蛍光色素を含有し、後述する第２試薬で処理された血液試料中の有核細胞の核酸を蛍光染色するための試薬である。血液試料を第１試薬で処理することにより、白血球等の核酸を有する血球が染色される。
【００５６】
蛍光色素は、核酸を染色できるのであれば特に限定されず、光源（半導体レーザＤ３１）から照射される光の波長に応じて適宜選択することができる。そのような蛍光色素としては、たとえば、プロピジウムアイオダイド、エチジウムブロマイド、エチジウム−アクリジンヘテロダイマー、エチジウムジアジド、エチジウムホモダイマー−１、エチジウムホモダイマー−２、エチジウムモノアジド、トリメチレンビス［［３‐［［４‐［［（３‐メチルベンゾチアゾール‐３‐イウム）‐２‐イル］メチレン］‐１，４‐ジヒドロキノリン］‐１‐イル］プロピル］ジメチルアミニウム］・テトラヨージド（ＴＯＴＯ−１）、４‐［（３‐メチルベンゾチアゾール‐２（３Ｈ）‐イリデン）メチル］‐１‐［３‐（トリメチルアミニオ）プロピル］キノリニウム・ジヨージド（ＴＯ−ＰＲＯ−１）、Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'‐テトラメチル‐Ｎ，Ｎ'‐ビス［３‐［４‐［３‐［（３‐メチルベ
ンゾチアゾール‐３‐イウム）‐２‐イル］‐２‐プロペニリデン］‐１，４‐ジヒドロキノリン‐１‐イル］プロピル］‐１，３‐プロパンジアミニウム・テトラヨージド（ＴＯＴＯ−３）、または２‐［３‐［［１‐［３‐（トリメチルアミニオ）プロピル］‐１，４‐ジヒドロキノリン］‐４‐イリデン］‐１‐プロペニル］‐３‐メチルベンゾチアゾール‐３‐イウム・ジヨージド（ＴＯ−ＰＲＯ−３）および以下の一般式（Ｉ）で表される蛍光色素が挙げられる。それらの中でも、一般式（Ｉ）で表される蛍光色素が好ましい。
【００５７】
【化１】
2014106059.tif 000003
【００５８】
上記の式（Ｉ）中、Ｒ１およびＲ４は、互いに同一または異なっており、水素原子、ア
ルキル基、ヒドロキシ基を有するアルキル鎖、エーテル基を有するアルキル鎖、エステル基を有するアルキル鎖、または置換基を有していてもよいベンジル基である。また、Ｒ２およびＲ３は、互いに同一または異なっており、水素原子、ヒドロキシル基、ハロゲン、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基、アルキルスルホニル基またはフェニル基である。また、Ｚは、硫黄原子、酸素原子、またはメチル基を有する炭素原子であり、ｎは、０、１、２または３であり、Ｘ−はアニオンである。
【００５９】
本実施の形態では、アルキル基は直鎖状または分枝鎖状のいずれであってもよい。また、上記の式（Ｉ）中、Ｒ１およびＲ４のいずれか一方が炭素数６〜１８のアルキル基である場合、他方は水素原子または炭素数６未満のアルキル基であることが好ましい。炭素数６〜１８のアルキル基の中でも、炭素数が６、８または１０のアルキル基が好ましい。
【００６０】
また、上記の式（Ｉ）中、Ｒ１およびＲ４のベンジル基の置換基として、たとえば、炭素数１〜２０のアルキル基、炭素数２〜２０のアルケニル基または炭素数２〜２０のアルキニル基が挙げられる。それらの中でも、メチル基またはエチル基が特に好ましい。
【００６１】
また、上記の式（Ｉ）中、Ｒ２およびＲ３のアルケニル基として、たとえば、炭素数２〜２０のアルケニル基が挙げられる。Ｒ２およびＲ３のアルコキシ基としては、炭素数１〜２０のアルコキシ基が挙げられる。それらの中でも、特にメトキシ基またはエトキシ基が好ましい。
【００６２】
また、上記の式（Ｉ）中、アニオンＸ−として、Ｆ−、Ｃｌ−、Ｂｒ−およびＩ−のようなハロゲンイオン、ＣＦ３ＳＯ３−、ＢＦ４−などが挙げられる。
【００６３】
また、第１試薬中の蛍光色素は１種類であってもよいし、２種類以上であってもよい。
【００６４】
また、第１試薬中の蛍光色素の濃度は、蛍光色素の種類に応じて適宜設定できるが、通常０．０１〜１００ｐｇ／μＬ、好ましくは、０．１〜１０ｐｇ／μＬである。たとえば、第１試薬の蛍光色素として、上記の式（Ｉ）で表される蛍光色素を用いる場合、第１試薬中の該蛍光色素の濃度は、好ましくは０．２〜０．６ｐｇ／μＬであり、より好ましくは０．３〜０．５ｐｇ／μＬである。
【００６５】
また、第１試薬は、上記の蛍光色素を上記の濃度になるように適切な溶媒に溶解させることにより得ることができる。溶媒としては、上記の蛍光色素を溶解させることができれば特に限定されないが、たとえば、水、有機溶媒およびこれらの混合物が挙げられる。有機溶媒としては、たとえば、アルコール、エチレングリコール、ジメチルスルホキシド（DMSO）などが挙げられる。なお、蛍光色素は、水溶液中での保存安定性が悪い場合があるので、有機溶媒に溶解させることが好ましい。
【００６６】
また、第１試薬として、市販の白血球分類用の染色試薬を用いてもよい。そのような染色試薬としては、たとえば、シスメックス株式会社製のストマトライザ（登録商標）ー４ＤＳが挙げられる。ストマトライザー４ＤＳは、上記の式（Ｉ）で示される蛍光色素を含む染色試薬である。
【００６７】
第２試薬は、赤血球を溶血させ、白血球の細胞膜に上記第１試薬中の蛍光色素が透過できる程度の損傷を与えるための界面活性剤、すなわち、カチオン性界面活性剤および／またはノニオン性界面活性剤を含有する。さらに、第２試薬は、２０ｍＭ以上５０ｍＭ以下の濃度で芳香族の有機酸を含有する。ここで、第２試薬は、芳香族の有機酸の濃度が２０ｍＭ以上３０ｍＭ未満の場合は、第２試薬のｐＨが５．５以上６．４以下であり、芳香族の有機酸の濃度が３０ｍＭ以上５０ｍＭ以下の場合は、第２試薬のｐＨが５．５以上７．
０以下であることを特徴とする。
【００６８】
本実施の形態では、第２試薬中の芳香族の有機酸の濃度が２０ｍＭ以上３０ｍＭ未満の場合、第２試薬のｐＨは５．５以上６．４以下が好ましく、５．５以上６．２以下がより好ましい。また、第２試薬中の芳香族の有機酸の濃度が３０ｍＭ以上５０ｍＭ以下、好ましくは４０ｍＭ以上５０ｍＭ以下である場合、第２試薬のｐＨが５．５以上７．０以下である。さらに好ましくは、第２試薬中の芳香族の有機酸の濃度が４０ｍＭ以上５０ｍＭ以下である場合、第２試薬のｐＨが５．５以上６．２以下である。
【００６９】
また、本実施の形態では、芳香族の有機酸とは、分子中に少なくとも１つの芳香環を有する酸およびその塩を意味する。芳香族の有機酸としては、たとえば、芳香族カルボン酸、芳香族スルホン酸などが挙げられる。本実施の形態では、フタル酸、安息香酸、サリチル酸、馬尿酸、p-アミノベンゼンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸およびそれらの塩が好適に用いられる。なお、第２試薬中の芳香族の有機酸は１種類であってもよいし、２種類以上であってもよい。第２試薬中に芳香族の有機酸を２種類以上含む場合、それらの濃度の合計が２０ｍＭ以上５０ｍＭ以下であればよい。
【００７０】
カチオン性界面活性剤として、第四級アンモニウム塩型界面活性剤、または、ピリジニウム塩型界面活性剤を用いることができる。
【００７１】
第四級アンモニウム塩型界面活性剤としては、たとえば以下の式（ＩＩ）で表される、全炭素数が９〜３０の界面活性剤が挙げられる。
【００７２】
【化２】
2014106059.tif 000004
【００７３】
上記の式（ＩＩ）中、Ｒ１は、炭素数６〜１８のアルキル基またはアルケニル基である。また、Ｒ２およびＲ３は、互いに同一または異なっており、炭素数１〜４のアルキル基またはアルケニル基である。Ｒ４は、炭素数１〜４のアルキル基もしくはアルケニル基、またはベンジル基であり、Ｘ−はハロゲン原子である。
【００７４】
上記の式（ＩＩ）中、Ｒ１としては、炭素数が６、８、１０、１２および１４のアルキル基またはアルケニル基が好ましく、特に直鎖のアルキル基が好ましい。より具体的なＲ１としては、オクチル基、デシル基およびドデシル基が挙げられる。Ｒ２およびＲ３としては、メチル基、エチル基およびプロピル基が好ましい。Ｒ４としては、メチル基、エチル基およびプロピル基が好ましい。
【００７５】
ピリジニウム塩型界面活性剤としては、たとえば以下の式（ＩＩＩ）で表される界面活性剤が挙げられる。
【００７６】
【化３】
2014106059.tif 000005
【００７７】
上記の式（ＩＩＩ）中、Ｒ１は、炭素数６〜１８のアルキル基またはアルケニル基であり、Ｘ−はハロゲン原子である。
【００７８】
上記の式（ＩＩＩ）中、Ｒ１としては、炭素数が６、８、１０、１２および１４のアルキル基またはアルケニル基が好ましく、特に直鎖のアルキル基が好ましい。より具体的なＲ１としてはオクチル基、デシル基およびドデシル基が挙げられる。
【００７９】
第２試薬中のカチオン性界面活性剤の濃度は、界面活性剤の種類により適宜調節できるが、通常１０〜１００００ｐｐｍ、好ましくは１００〜１０００ｐｐｍである。
【００８０】
ノニオン性界面活性剤として、以下の式（ＶＩ）で表されるポリオキシエチレン系ノニオン界面活性剤が好ましい。
【００８１】
Ｒ１−Ｒ２−(ＣＨ２ＣＨ２Ｏ)ｎ−Ｈ    （ＶＩ）
【００８２】
上記の式（ＶＩ）中、Ｒ１は炭素数８〜２５のアルキル基、アルケニル基またはアルキニル基であり、Ｒ２は酸素原子、−ＣＯＯ−または
【００８３】
【化４】
2014106059.tif 000006
【００８４】
であり、ｎは１０〜５０の整数である。
【００８５】
上記のノニオン性界面活性剤の具体例としては、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンステロール、ポリオキシエチレンヒマシ油、ポリオキシエチレンソルビット脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルアミン、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテルなどが挙げられる。
【００８６】
第２試薬中のノニオン性界面活性剤の濃度は、通常１０〜１０００００ｐｐｍ、好ましくは１００〜１００００ｐｐｍ、より好ましくは１０００〜５０００ｐｐｍである。
【００８７】
第２試薬は、ｐＨを一定に保つために緩衝剤を含んでいてもよい。そのような緩衝剤としては、たとえば、クエン酸塩、HEPESおよびリン酸塩などが挙げられる。なお、上記の
芳香族の有機酸が緩衝作用を示す場合がある。そのような芳香族の有機酸を用いる場合は、第２試薬への緩衝剤の添加は任意である。
【００８８】
また、第２試薬の浸透圧は特に限定されないが、赤血球を効率よく溶血させる観点から２０〜１５０ｍＯｓｍ／ｋｇであることが好ましい。
【００８９】
また、第２試薬は、上記の界面活性剤および芳香族の有機酸またはその塩と、所望により上記の緩衝剤とを、上記の芳香族の有機酸濃度になるように適切な溶媒に溶解し、ｐＨをＮａＯＨ、ＨＣｌなどを用いて調製することにより得ることができる。溶媒としては、上記の成分を溶解させることができれば特に限定されないが、たとえば、水、有機溶媒およびそれらの混合物が挙げられる。有機溶媒としては、たとえば、アルコール、メタノール、エチレングリコール、DMSOなどが挙げられる。
【００９０】
また、第２試薬として、市販の白血球分類用の溶血試薬を用いてもよい。そのような溶血試薬としては、たとえば、シスメックス株式会社製のストマトライザー４ＤＬが挙げられる。ストマトライザー４ＤＬは、上述のカチオン性界面活性剤とノニオン性界面活性剤を含む溶血試薬である。
【００９１】
上記のように構成された第２試薬により、赤血球が溶血され、白血球の細胞膜に第１試薬中の蛍光色素が通過できる程度の損傷が与えられる。また、上記のように構成された第１試薬により、第２試薬によって細胞膜に損傷を受けた白血球が染色される。これにより、光学検出器Ｄにおいて、白血球の４つのサブクラスの検出を行うことが可能となる。
【００９２】
情報処理ユニット４による解析において、正常な検体から得られた血液検体中の白血球が分類される手順について説明する。
【００９３】
情報処理ユニット４では、まず、図５（ａ）に示すような第１スキャッタグラムが作成される。具体的には、第１スキャッタグラムは、個々の血球に関する側方散乱光信号と蛍光信号に基づいて、横軸を側方散乱光信号とし縦軸を蛍光信号とする２次元の分布図上に、個々の血球に対応する点がプロットされることにより作成される。なお、このように蛍光信号を軸として含む２次元の分布図は、核酸の活性度が高い血球（たとえば幼若な血球等）が含まれることを検出するために、従来用いられてきたものである。
【００９４】
次に、第１スキャッタグラム上にプロットされた点から、溶血した赤血球等からなる赤血球ゴーストに相当する点が除外される。具体的には、図５（ｂ）の模式図に示すような、あらかじめ設定された所定の領域ＡＧ１に含まれる点が除外される。続いて、領域ＡＧ１の血球が除外された第１スキャッタグラム上の点が、白血球の４つのサブクラスにそれぞれ対応する４つのクラスタ（リンパ球のクラスタＡ１１、単球のクラスタＡ１２、好中球と好塩基球とによってなる血球群のクラスタＡ１３、および好酸球のクラスタＡ１４）の何れかに分類される。
【００９５】
具体的には、第１スキャッタグラム上にプロットされた各血球に対応する点と、あらかじめ設定された各クラスタの重心位置との距離から、各血球の各クラスタへの帰属度が得られる。そして、これらの帰属度に応じて、各血球が各クラスタに割り当てられる。このような各血球の分類方法は、特開平５−１４９８６３号公報（対応米国特許Ｎｏ．ＵＳ５５５５１９６）に詳細に記載されている。
【００９６】
各血球が白血球の４つのサブクラスに対応する４つのクラスタの何れかに分類されると、図５（ａ）に示す第１スキャッタグラム上にプロットされた各点は、図５（ｂ）に示すクラスタＡ１１〜Ａ１４のように区分されることになる。
【００９７】
ここで、患者から採取された血液検体には、腫瘍性リンパ球が含まれている場合がある。たとえば、患者が、慢性リンパ性白血病、悪性リンパ腫等に罹患していると、この患者から得られた血液検体には腫瘍性リンパ球が含まれる可能性がある。
【００９８】
図５（ｃ）は、成人Ｔ細胞白血病リンパ腫（ＡＴＬＬ）に罹患している患者から採取さ
れた血液検体に基づいて作成された第１スキャッタグラムを示す図である。この場合も、上記正常な検体の場合と同様にして、各血球が白血球の４つのサブクラスの何れかに分類される。しかしながら、成人Ｔ細胞白血病リンパ腫（ＡＴＬＬ）に罹患している患者の血液検体には腫瘍性リンパ球が含まれている場合があり、この場合、腫瘍性リンパ球に対応する点は、図５（ｂ）において破線で示す領域に出現し、正常なリンパ球または単球に対応する点としてクラスタＡ１１またはクラスタＡ１２に含まれてしまう。そのため、腫瘍性リンパ球のみを区分して検出することができない。また、正常なリンパ球のみを区分することも、単球のみを区分することもできない。
【００９９】
そこで、本件出願の発明者は、各血球に対応する点を、上記のように側方散乱光信号と蛍光信号からなる２次元空間に展開するのではなく、前方散乱光信号と、側方散乱光信号と、蛍光信号からなる３次元空間に展開することを考えた。そして、本件出願の発明者は、臨床検体に基づくデータを検証した結果、上記３つの信号からなる３次元空間においては、腫瘍性リンパ球の位置が他の血球に対して離間していることを見出した。こうして、本件出願の発明者は、上記３次元空間において腫瘍性リンパ球の位置が他の血球に対して離間していることに基づいて、３次元空間において各血球を区分することにより、腫瘍性リンパ球のみを精度良く区分することができた。以下、上記３つの信号からなる３次元の分布を用いることにより、腫瘍性リンパ球を区分すると共に、白血球の４つのサブクラスを区分する手法について説明する。
【０１００】
図６（ａ）は、測定ユニット２と情報処理ユニット４による処理を示すフローチャートである。
【０１０１】
まず、測定ユニット２は、血液検体に含まれる赤血球を溶血させ、白血球の核酸を蛍光染色するために、測定試料の調製処理を行う（Ｓ１）。具体的には、上述したように、血液検体と、第１試薬と、第２試薬とが混合され、この混合液がヒータＨにより加温されることにより、測定試料が作製される。続いて、測定ユニット２は、測定試料に基づいて血球の検出処理を行う（Ｓ２）。具体的には、上述したように、光学検出器Ｄにより、各血球に関する前方散乱光信号と、側方散乱光信号と、蛍光信号とが取得される。測定ユニット２により取得された信号は、情報処理ユニット４に送信される（Ｓ３）。
【０１０２】
次に、情報処理ユニット４のＣＰＵ４０１は、上述したように、測定ユニット２から、各血球に関する前方散乱光信号と、側方散乱光信号と、蛍光信号とを受信して（Ｓ１１）、受信した信号をハードディスク４０４に記憶する。続いて、ＣＰＵ４０１は、受信した信号に基づいて、第１スキャッタグラムを作成し、作成した第１スキャッタグラムにおいて第１の分画処理を行う（Ｓ１２）。第１の分画処理は、図５（ａ）〜（ｃ）を参照して説明した手法によって行われる。
【０１０３】
続いて、ＣＰＵ４０１は、ＲＡＭ４０３またはハードディスク４０４に記憶している判定フラグの値に０をセットする（Ｓ１３）。そして、ＣＰＵ４０１は、第１の分画処理により作成されたリンパ球のクラスタＡ１１と、単球のクラスタＡ１２とが密接しているか否かを判定することにより、再分画が必要か否かを判定する（Ｓ１４）。
【０１０４】
図６（ｂ）は、第１スキャッタグラム上において、クラスタＡ１１、Ａ１２が密接している部分を示す例示図である。なお、左側の丸い点は、クラスタＡ１１に含まれる点、すなわち、第１の分画処理によってリンパ球に分類された点を示しており、右側の矩形の点は、クラスタＡ１２に含まれる点、すなわち、第１の分画処理によって単球に分類された点を示している。
【０１０５】
上記の密接判定では、まず、リンパ球に分類された全ての点（クラスタＡ１１の全ての
点）について、それぞれ、単球に分類された点と隣り合うかが判定される。たとえば、リンパ球に分類された点Ｐ１１は、単球に分類された点Ｐ２１と隣り合うが、リンパ球に分類された点Ｐ１２は、単球に分類された何れの点とも隣り合わない。こうして、リンパ球に分類された全ての点について、単球に分類された点と隣り合うかが判定され、隣り合うと判定された点の個数に基づいて、クラスタＡ１１、Ａ１２が密接しているか否かが判定される。
【０１０６】
図６（ａ）に戻り、クラスタＡ１１、Ａ１２が密接しない場合、たとえば、図５（ａ）、（ｂ）に示すような場合、ＣＰＵ４０１は、Ｓ１４においてＮＯ、すなわち、この血液検体が正常であると判定する。そして、ＣＰＵ４０１は、クラスタＡ１１〜Ａ１４に含まれる点の個数（各クラスタに属する血球数）を計数する（Ｓ１５）。これにより、リンパ球、単球、好中球と好塩基球とによってなる血球群、および好酸球の血球の数が得られる。
【０１０７】
他方、クラスタＡ１１、Ａ１２が密接する場合、たとえば、図５（ｃ）に示すような場合、ＣＰＵ４０１は、Ｓ１４においてＹＥＳ、すなわち、この血液検体が腫瘍性リンパ球を含む可能性があると判定する。この場合、ＣＰＵ４０１は、判定フラグの値に１をセットする（Ｓ１６）。そして、ＣＰＵ４０１は、Ｓ１１で受信した信号に基づいて、前方散乱光信号と、側方散乱光信号と、蛍光信号からなる３次元の分布図（以下、「３次元スキャッタグラム」という）を作成し、作成した３次元スキャッタグラムにおいて第２の分画処理を行う（Ｓ１７）。
【０１０８】
図７（ａ）は、３次元スキャッタグラムを示す図であり、図７（ｂ）は、第２の分画処理を説明する図である。
【０１０９】
図７（ａ）を参照して、３次元スキャッタグラムは、個々の血球に関する前方散乱光信号と、側方散乱光信号と、蛍光信号に基づいて、各信号に対応する３次元の分布図上に、個々の血球に対応する点がプロットされることにより作成される。なお、図７（ａ）に示す３つの軸は、図７（ｃ）に示すように設定されている。図７（ａ）は、図７（ｃ）において実線で示された３つの面を省略して、図７（ｃ）の内部を観察した図である。
【０１１０】
次に、３次元スキャッタグラム上にプロットされた点から、上記第１の分画処理と同様、溶血した赤血球等からなる赤血球ゴーストに相当する点が除外される。具体的には、図７（ｂ）の模式図に示すような、あらかじめ設定された所定の領域ＡＧ２に含まれる点が除外される。なお、図７（ｂ）は、図７（ｃ）の箱の内部を下面から透視した図である。続いて、領域ＡＧ２の血球が除外された３次元スキャッタグラム上の点が、白血球の４つのサブクラスにそれぞれ対応する４つのクラスタ（リンパ球のクラスタＡ２１、単球のクラスタＡ２２、好中球と好塩基球とによってなる血球群のクラスタＡ２３、および好酸球のクラスタＡ２４）と、腫瘍性リンパ球に対応するクラスタＡ２５の何れかに分類される。
【０１１１】
具体的には、３次元スキャッタグラム上にプロットされた各血球に対応する点と、あらかじめ設定された各クラスタの重心位置との距離から、各血球の各クラスタへの帰属度が得られる。ここでは、白血球の４つのサブクラスにそれぞれ対応する４つのクラスタ（リンパ球のクラスタＡ２１、単球のクラスタＡ２２、好中球と好塩基球とによってなる血球群のクラスタＡ２３、および好酸球のクラスタＡ２４）の他、腫瘍性リンパ球に対応するクラスタＡ２５についても、３次元空間上において、あらかじめ重心位置が設定される。そして、これら重心位置と、３次元スキャッタグラム上にプロットされた各血球に対応する点との距離から、各血球の各クラスタへの帰属度が得られる。帰属度の算出は、特開平５−１４９８６３号公報（対応米国特許Ｎｏ．ＵＳ５５５５１９６）に記載された２次元
平面上の帰属度の算出手法を、３次元空間上に拡張的に適用することにより実行される。
【０１１２】
各血球が、白血球の４つのサブクラスと、腫瘍性リンパ球の何れかに分類されると、図７（ａ）に示す３次元スキャッタグラム上にプロットされた各点は、図７（ｂ）に示すクラスタＡ２１〜Ａ２５のように区分されることになる。また、図７（ｂ）では、クラスタＡ２１〜Ａ２５が隣のクラスタと重なっているように図示されている箇所があるが、実際には、３次元空間において互いに重なっていない。また、クラスタＡ２１〜Ａ２５は、３次元空間において、図６（ｂ）に示すように互いに密接するものではない。
【０１１３】
図６（ａ）に戻り、３次元スキャッタグラムにおける第２の分画処理が完了すると、ＣＰＵ４０１は、クラスタＡ２１〜Ａ２５に含まれる点の個数（各クラスタに属する血球数）を計数する（Ｓ１８）。そして、ＣＰＵ４０１は、腫瘍性リンパ球の個数（クラスタＡ２１に含まれる点の個数）が所定値以上であるかを判定する（Ｓ１９）。腫瘍性リンパ球の個数が所定値以上であると（Ｓ１９：ＹＥＳ）、ＣＰＵ４０１は、この血液検体が腫瘍性リンパ球を含み得ると判定し、判定フラグの値に２をセットする（Ｓ２０）。他方、腫瘍性リンパ球の個数が所定値未満であると（Ｓ１９：ＮＯ）、ＣＰＵ４０１は、この血液検体は腫瘍性リンパ球を含み得ると判定し、処理がＳ２１に進められる。なお、Ｓ１９では、全血球に対する腫瘍性リンパ球の比率が所定の閾値を超える場合に、血液検体が腫瘍性リンパ球を含み得ると判定されても良い。
【０１１４】
次に、ＣＰＵ４０１は、図８、９に示すような表示部４１に分析結果画面６を表示する（Ｓ２１）。分析結果画面６は、領域６１〜６５を含んでいる。領域６１は、白血球（ＷＢＣ）の数と共に、好中球（ＮＥＵＴ）と、正常なリンパ球（ＬＹＭＰＨ）と、単球（ＭＯＮＯ）と、好酸球（ＥＯ）と、好塩基球（ＢＡＳＯ）の個数と白血球数に対する比率を表示する領域である。領域６２は、腫瘍性リンパ球の個数と白血球数に対する比率を表示する領域である。そして、ＣＰＵ４０１は、判定フラグの値に応じて分析結果画面６の表示を行う。
【０１１５】
判定フラグの値が２の場合（Ｓ２２：ＹＥＳ）、ＣＰＵ４０１は、図８に示すように、領域６３に腫瘍性リンパ球が含まれ得ることを示す警告を表示する（Ｓ２３）。そして、ＣＰＵ４０１は、Ｓ１８における計数結果に基づいて、図８に示すように、領域６１、６２に測定結果を表示し、領域６４、６５に第１および第２スキャッタグラムを表示する（Ｓ２４）。なお、第２スキャッタグラムは、第１スキャッタグラムと略同様に作成される。すなわち、第２スキャッタグラムは、個々の血球に関する側方散乱光信号と前方散乱信号に基づいて、横軸を側方散乱光信号とし縦軸を前方散乱信号とする２次元の分布図上に、個々の血球に対応する点がプロットされることにより作成される。
【０１１６】
判定フラグの値が１の場合（Ｓ２５：ＹＥＳ）、ＣＰＵ４０１は、図９に示すように、領域６３の表示を行わず、図８に示すように、Ｓ１８における計数結果に基づいて、領域６１、６２に測定結果を表示し、領域６４、６５に第１および第２スキャッタグラムを表示する（Ｓ２４）。判定フラグの値が０の場合（Ｓ２５：ＮＯ）、ＣＰＵ４０１は、図９に示すように、領域６２、６３の表示は行わず、Ｓ１２における計数結果に基づいて、領域６１に測定結果を表示し、領域６４、６５に第１および第２スキャッタグラムを表示する（Ｓ２６）。
【０１１７】
なお、ＣＰＵ４０１は、Ｓ２４において、領域６４、６５に第１および第２スキャッタグラムを表示する際には、Ｓ１８の計数結果に基づいて、クラスタＡ２１〜Ａ２５に含まれる各点の分類が分かるように、これら各点に色が付けられた状態で表示する。また、ＣＰＵ４０１は、Ｓ２６において、領域６４、６５に第１および第２スキャッタグラムを表示する際には、Ｓ１５の計数結果に基づいて、クラスタＡ１１〜Ａ１４に含まれる各点の
分類が分かるように、これら各点に色が付けられた状態で表示する。
【０１１８】
図１０（ａ）、（ｃ）、（ｅ）は、分析結果画面６の領域６４に表示される第１スキャッタグラムを示す図であり、図１０（ｂ）、（ｄ）、（ｆ）は、分析結果画面６の領域６５に表示される第２スキャッタグラムを示す図である。
【０１１９】
図１０（ａ）、（ｂ）は、正常な血液検体に基づいて作成された第１および第２スキャッタグラムである。この場合、図６（ａ）のＳ１２において第１の分画処理により各点がクラスタＡ１１〜Ａ１４に分類される。第１スキャッタグラムは、クラスタＡ１１〜Ａ１４を、側方散乱光信号（ＳＳＣ）と蛍光信号（ＳＦＬ）からなる２次元上に表示したものであり、第２スキャッタグラムは、クラスタＡ１１〜Ａ１４を、側方散乱信号（ＳＳＣ）と前方散乱光信号（ＦＳＣ）からなる２次元上に表示したものである。
【０１２０】
このとき、図１０（ａ）の第１スキャッタグラム上に表示されるクラスタＡ１１〜Ａ１４に含まれる点は、それぞれ、異なる色で表示される。たとえば、クラスタＡ１１〜Ａ１４に含まれる点が、それぞれ、紫色、黄緑色、水色、茶色で表示される。また、図１０（ｂ）の第２スキャッタグラム上に表示されるクラスタＡ１１〜Ａ１４に含まれる点も、それぞれ、図１０（ａ）のクラスタＡ１１〜Ａ１４に含まれる点と同様の色で表示される。
【０１２１】
図１０（ｃ）、（ｄ）は、成人Ｔ細胞白血病リンパ腫（ＡＴＬＬ）に罹患している血液検体に基づいて作成された第１および第２スキャッタグラムである。この場合、図６（ａ）のＳ１７おいて第２の分画処理により各点がクラスタＡ２１〜Ａ２５に分類される。第１スキャッタグラムは、クラスタＡ２１〜Ａ２５を、側方散乱光信号（ＳＳＣ）と蛍光信号（ＳＦＬ）からなる２次元上に表示したものであり、第２スキャッタグラムは、クラスタＡ２１〜Ａ２５を、側方散乱信号（ＳＳＣ）と前方散乱光信号（ＦＳＣ）からなる２次元上に表示したものである。
【０１２２】
このとき、図１０（ｃ）の第１スキャッタグラム上に表示されるクラスタＡ２１〜Ａ２５に含まれる点は、それぞれ、異なる色で表示される。たとえば、クラスタＡ２１〜Ａ２５に含まれる点が、それぞれ、紫色、黄緑色、水色、茶色、赤色で表示される。また、図１０（ｄ）の第２スキャッタグラム上に表示されるクラスタＡ２１〜Ａ２５に含まれる点も、それぞれ、図１０（ｃ）のクラスタＡ２１〜Ａ２５に含まれる点と同様の色で表示される。
【０１２３】
なお、上述したように、血液検体に腫瘍性リンパ球が含まれる場合、３次元スキャッタグラムによれば、血球に対応する各点は、図７（ｂ）に示すクラスタＡ２１〜Ａ２５に区分される。この場合、図１０（ｃ）に示す第１スキャッタグラムによれば、ユーザは、３次元スキャッタグラム上で５つに区分された状態を示すクラスタＡ２１〜Ａ２５を、互いに分離された状態として視認することはできない。しかしながら、図１０（ｄ）に示す第２スキャッタグラムによれば、ユーザは、３次元スキャッタグラム上で５つに区分された状態を示すクラスタＡ２１〜Ａ２５を、互いに分離された状態として視認することができる。
【０１２４】
図１０（ｅ）、（ｆ）は、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）に罹患している血液検体に基づいて作成された第１および第２スキャッタグラムである。この場合も、第２の分画処理により各点がクラスタＡ２１〜Ａ２５に分類される。このとき、図１０（ｅ）の第１スキャッタグラム上に表示されるクラスタＡ２１〜Ａ２５に含まれる点は、それぞれ、異なる色で表示され、図１０（ｆ）の第２スキャッタグラム上に表示されるクラスタＡ２１〜Ａ２５に含まれる点も、それぞれ、図１０（ｅ）のクラスタＡ２１〜Ａ２５に含まれる点と同様の色で表示される。
【０１２５】
また、この場合も、図１０（ｅ）に示す第１スキャッタグラムによれば、ユーザは、３次元スキャッタグラム上で５つに区分された状態を示すクラスタＡ２１〜Ａ２５を、互いに分離された状態として視認することができないものの、図１０（ｆ）に示す第２スキャッタグラムによれば、ユーザは、３次元スキャッタグラム上で５つに区分された状態を示すクラスタＡ２１〜Ａ２５を、互いに分離された状態として視認することができる。
【０１２６】
以上、本実施の形態によれば、クラスタＡ１１、Ａ１２が密接するような場合（Ｓ１４：ＹＥＳ）、図７（ａ）に示す３次元スキャッタグラムにおける各点が、図７（ｂ）に示すようにクラスタＡ２１〜Ａ２５に区分される。これにより、血液検体中に含まれる腫瘍性リンパ球を、他の血球と区別して検出することができる。よって、正常な白血球（リンパ球、単球、好中球と好塩基球とによってなる血球群、および好酸球）の分類精度を高めることができ、当該分類に基づく疾患の診断を、より適正に行うことができる。また、慢性リンパ性白血病や、悪性リンパ腫等の疾患の診断に有用な情報をユーザに提供することができる。
【０１２７】
また、本実施の形態によれば、第１分画処理に基づいて、再分画の要否、すなわち、腫瘍性リンパ球が含まれる可能性があるかが判定される（Ｓ１４）。そして、再分画の必要がある場合（Ｓ１４：ＹＥＳ）に、３次元スキャッタグラムにおいて第２の分画処理が行われる（Ｓ１７）。これにより、腫瘍性リンパ球が含まれる可能性がない場合には、３次元の解析となる第２の分画処理が行われないため、白血球の分類のための処理負担を軽減することができる。
【０１２８】
また、本実施の形態によれば、血液検体中に含まれる腫瘍性リンパ球を、他の血球と区別して検出すると共に、血液検体中に含まれる血球を、白血球の４つのサブクラスに分類することができる。この場合の検出と分類は、血液検体に第１試薬と第２試薬を混和することにより調製された測定試料だけを用いて行われ得る。すなわち、腫瘍性リンパ球を検出するために別途測定試料の調製を行うことなく、白血球を分類するために調製した測定試料により、上記検出と分類を行うことができる。
【０１２９】
また、本実施の形態によれば、腫瘍性リンパ球が含まれる場合（図５（ｃ）参照）、Ｓ１２の第１の分画処理により、図５（ｂ）に示すように、腫瘍性リンパ球が、正常なリンパ球と分類されてしまうことがある。しかしながら、Ｓ１７の第２の分画処理によれば、腫瘍性リンパ球が、正常なリンパ球とは別に分類されるため、正常なリンパ球を適正に分類することができ、白血球の分類精度を高めることができる。
【０１３０】
また、本実施の形態によれば、分析結果画面６には、第１および第２スキャッタグラムが表示される。これにより、ユーザは、第１および第２スキャッタグラムを参照することにより、分類された各血球の分布状態を容易に把握することができ、診断に有用な情報を円滑に取得することができる。
【０１３１】
また、本実施の形態によれば、第１スキャッタグラムは、側方散乱光信号と蛍光信号からなる２次元の分布図であり、第２スキャッタグラムは、側方散乱光信号と前方散乱光信号からなる２次元の分布図である。このように、用いられた信号の組合せが異なるため、ユーザは、白血球の分布状態をさらに容易に把握することができる。
【０１３２】
また、本実施の形態によれば、第１スキャッタグラムの縦軸は蛍光信号であるため、蛍光を用いて検出可能な核酸の活性度が高い血球（たとえば幼若な血球等）の分布を表示させることができる。また、図１０（ｄ）、（ｆ）に示す第２スキャッタグラムによれば、ユーザは、図７（ｂ）に示すように５つに区分された状態を示すクラスタＡ２１〜Ａ２５
を、互いに分離された状態として視認することができる。
【０１３３】
また、本実施の形態によれば、分析結果画面６に表示される第１および第２スキャッタグラムでは、図１０（ａ）〜（ｆ）を参照して説明したとおり、血球に対応する各点が、分類に応じて異なる色で表示される。これにより、分類された各血球の分布がより容易に把握され得る。また、この場合に、腫瘍性リンパ球に対応する点が、他の血球と異なる色（赤色）で表示されるため、腫瘍性リンパ球の分布がより把握され易くなり、慢性リンパ性白血病や悪性リンパ腫等の疾患の診断が行われ易くなる。
【０１３４】
なお、腫瘍性リンパ球もリンパ球の一種であるため、腫瘍性リンパ球に対応する点を、正常リンパ球に対応する点と同じ色で表示してもよい。すなわち、図１０（ｄ）、（ｆ）の第２スキャッタグラムにおいて、クラスタＡ２５に含まれる点を、クラスタＡ２１に含まれる点と同じ色で表示しても良い。
【０１３５】
また、本実施の形態によれば、Ｓ１５、Ｓ１８において、各分類に含まれる血球の数が計数される。また、白血球の４つのサブクラスに分類された血球の個数と比率は、分析結果画面６の領域６１に表示され、腫瘍性リンパ球に分類された血球の個数と比率は、分析結果画面６の領域６２に表示される。これにより、ユーザは、測定試料中に、白血球の４つのサブクラスに分類された血球がどの程度含まれるか、および、腫瘍性リンパ球がどの程度含まれるかを定量的に把握することができる。
【０１３６】
なお、本実施の形態では、領域６２には、リンパ球の数として、腫瘍性リンパ球が含まれない正常リンパ球の個数と比率が表示されている。しかしながら、これに限られず、正常リンパ球および腫瘍性リンパ球をまとめてリンパ球として計数し、領域６２に、リンパ球の個数として、腫瘍性リンパ球の個数と正常リンパ球の個数の総数を表示し、リンパ球の比率として、かかる総数の全体の血球に対する比率を表示してもよい。
【０１３７】
また、本実施の形態によれば、Ｓ１９において、腫瘍性リンパ球の数が所定値以上であると、分析結果画面６の領域６３に、血液検体に腫瘍性リンパ球が含まれる可能性があることを示す情報が表示される。こうすると、ユーザは、腫瘍性リンパ球に基づく疾患の可能性をさらに容易に確認することができる。
【０１３８】
以上、本発明の実施の形態について説明したが、本発明の実施の形態はこれらに限定されるものではない。
【０１３９】
たとえば、上記実施の形態では、判定フラグの値に拘わらず、分析結果画面６には第１および第２スキャッタグラムが表示されたが、判定フラグの値に応じて、第１および第２スキャッタグラムの何れかが表示されるようにしても良い。また、３次元スキャッタグラムにおいて第２の分画処理が行われた場合には、分析結果画面６に３次元スキャッタグラムが表示されるようにしても良い。この場合の３次元スキャッタグラム上の各点は、図１０（ｃ）〜（ｆ）と同様、分類に応じた色で表示される。
【０１４０】
また、上記実施の形態では、３次元スキャッタグラムにおいて第２の分画処理が行われると（Ｓ１７）、クラスタＡ２１〜Ａ２５に含まれる点が計数され（Ｓ１８）、この計数結果に基づいて、白血球の４つのサブクラスの個数と比率、および、腫瘍性リンパ球の個数と比率が、分析結果画面６に表示された（Ｓ２４）。しかしながら、これに替えて、３次元スキャッタグラムにおいて、腫瘍性リンパ球に対応するクラスタＡ２５に含まれる点のみを抽出し、この点を第１スキャッタグラムから除くことにより、腫瘍性リンパ球を含まない状態の第１スキャッタグラムを再構成することができる。この場合、再構成された第１スキャッタグラムに対して上記第１の分画処理を再度行い、白血球の４つのサブクラ
スに対応する各クラスタに含まれる点を再度求めても良い。そして、これらクラスタに含まれる点と、３次元スキャッタグラムのクラスタＡ２５に含まれる点を計数し、この計数結果に基づいて、各血球の個数と比率が分析結果画面６に表示されるようにしても良い。
【０１４１】
また、上記実施の形態では、第２スキャッタグラムによれば、ユーザは、３次元スキャッタグラムにおいて５つに区分された状態を示すクラスタＡ２１〜Ａ２５を、図１０（ｄ）、（ｆ）に示すように、互いに分離された状態として視認することができる。このことから、図６（ａ）のＳ１７において、３次元スキャッタグラムにおける第２の分画処理に替えて、第２スキャッタグラムにおける分画処理が行われるようにしても良い。なお、白血球の４つのサブクラスと腫瘍性リンパ球の分類を精度良く行うためには、上記実施の形態のように、３次元にスキャッタグラムに基づいて第２の分画処理が行われることが望ましい。
【０１４２】
また、上記実施の形態では、核酸を染色するための第１試薬と、赤血球を溶血させ、白血球の細胞膜に蛍光色素が透過可能な程度の損傷を与えるための第２試薬とを用いて測定試料が調製されているが、本発明はこれに限られない。核酸を染色することができるとともに、赤血球を溶血させ、白血球の細胞膜に損傷を与えることができる一つの試薬を用いて測定試料を調製してもよい。
【０１４３】
この他、本発明の実施の形態は、特許請求の範囲に示された技術的思想の範囲内において、適宜、種々の変更が可能である。
【符号の説明】
【０１４４】
１  …  血球分析装置
２  …  測定ユニット
２５…  試料調製部
２５１、２５２  …  試薬容器
２６  …  検出部
ＭＣ  …  混合チャンバ
Ｄ  …  光学検出器
Ｄ１  …  フローセル
４  …  情報処理ユニット
４０１  …  ＣＰＵ
４０４  …  ハードディスク
４０４ａ  …  プログラム
４１  …  表示部
６  …  分析結果画面
６１〜６５  …  領域
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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【図５】
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【図７】
2014106059.tif 000013
【図８】
2014106059.tif 000014
【図９】
2014106059.tif 000015
【図１０】
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