(57)【要約】【課題】キシロオリゴ糖からエタノールを効率よく生産し得る遺伝子組み換え酵母、そのような遺伝子組み換え酵母の選別方法、及びそのような遺伝子組み換え酵母を使用するセルロース系バイオマスを原料とするエタノール製造方法を提供すること。【解決手段】本発明の遺伝子組み換え酵母は、β−キシロシダーゼ遺伝子、エンドキシラナーゼ遺伝子、アラビノフラノシダーゼ遺伝子、アセチルキシランエステラーゼ遺伝子、キシロースレダクターゼ遺伝子、キシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子、及びキシルロキナーゼ遺伝子が、染色体組み込みにより導入された遺伝子組み換え酵母である。【選択図】図２
2014064484.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
β−キシロシダーゼ遺伝子、エンドキシラナーゼ遺伝子、アラビノフラノシダーゼ遺伝子、アセチルキシランエステラーゼ遺伝子、キシロースレダクターゼ遺伝子、キシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子、及びキシルロキナーゼ遺伝子が染色体組み込みにより導入されている、キシロオリゴ糖からエタノールを生産し得る遺伝子組み換え酵母。
【請求項２】
β−キシロシダーゼ、エンドキシラナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、及びアセチルキシランエステラーゼが表層提示されている、請求項１に記載の遺伝子組み換え酵母。
【請求項３】
二倍体化された遺伝子組み換え酵母である、請求項１又は２に記載の遺伝子組み換え酵母。
【請求項４】
β−キシロシダーゼ遺伝子、エンドキシラナーゼ遺伝子、アラビノフラノシダーゼ遺伝子、アセチルキシランエステラーゼ遺伝子、キシロースレダクターゼ遺伝子、キシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子、及びキシルロキナーゼ遺伝子を染色体組み込みにより酵母に導入し、遺伝子組み換え酵母を作製する作製工程と、
作製された遺伝子組み換え酵母にイオンビームを照射する照射工程と、
照射工程後の遺伝子組み換え酵母を、発酵阻害物を添加した培地中で継代培養することによって、キシロオリゴ糖からエタノールを高効率で生産し得る菌株を選別する選別工程と、
を有する遺伝子組み換え酵母の選別方法。
【請求項５】
前記作製工程において、二倍体化された遺伝子組み換え酵母を作製する、請求項４に記載の遺伝子組み換え酵母の選別方法。
【請求項６】
セルロース系バイオマスを熱水処理することによって、セルロース系バイオマスに含有されているヘミセルロースをC5糖類に糖化するヘミセルロース糖化工程と、
セルロース系バイオマスを熱水処理することによって、セルロース系バイオマスに含有されているセルロースをC6糖類に糖化するセルロース糖化工程と、
前記ヘミセルロース糖化工程で得られたC5糖化液と、前記セルロース糖化工程で得られたC6糖化液とを濃縮する濃縮工程と、
前記濃縮工程で得られた濃縮C5糖化液及びC6糖化液を、β−キシロシダーゼ遺伝子、エンドキシラナーゼ遺伝子、アラビノフラノシダーゼ遺伝子、アセチルキシランエステラーゼ遺伝子、キシロースレダクターゼ遺伝子、キシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子、及びキシルロキナーゼ遺伝子が染色体組み込みにより導入されている、キシロオリゴ糖からエタノールを生産し得る遺伝子組み換え酵母を用いて発酵させ、エタノールを生産させる発酵工程と、
を有するエタノール製造方法。
【請求項７】
前記発酵工程で用いる遺伝子組み換え酵母が、β−キシロシダーゼ、エンドキシラナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、及びアセチルキシランエステラーゼが表層提示されている遺伝子組み換え酵母である、請求項６に記載のエタノール製造方法。
【請求項８】
前記発酵工程で用いる遺伝子組み換え酵母が、二倍体化された遺伝子組み換え酵母である、請求項６又は７に記載のエタノール製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、キシロオリゴ糖からエタノールを高効率で生産し得る遺伝子組み換え酵母、そのような遺伝子組み換え酵母の選別方法、及びそのような遺伝子組み換え酵母を用いてバイオマスから得られた糖化液を発酵させるエタノール製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、地球温暖化防止のためのCO2削減策として、バイオエタノールの輸送用燃料への利用が検討されている。その一方で、従前のバイオエタノールは、糖蜜又はデンプン資源から生産されるため、食糧との競合が問題視されている。このような問題を回避するため、木本又は草本のようなセルロース系バイオマスからエタノールを製造する方法が注目されている。
【０００３】
セルロース系バイオマスからエタノールを製造する方法としては、セルロース系バイオマスに含有されるセルロース又はヘミセルロースのような多糖類を、硫酸のような強酸又は酵素を用いて加水分解して糖化液を得、その糖化液を酵母により発酵させる方法（硫酸法又は酵素法）がある。しかし、濃硫酸法では糖化に用いた強酸の除去及び処分、酵素法では酵素製剤に多大な費用がかかり、糖化に2〜3日要することが、実用化の障害となっている。
【０００４】
そこで、セルロース系バイオマスに含有されるセルロース又はヘミセルロースを亜臨界水又は超臨界水で加水分解する方法も検討されている。例えば、特許文献１は、セルロース粉末を240〜340℃の加圧熱水と接触させて加水分解することを特徴とする非水溶性多糖類の製造方法を開示している。特許文献２は、細片されたバイオマスを140〜230℃で飽和水蒸気圧以上に加圧した熱水で所定時間加水分解してヘミセルロースを分解抽出し、その後セルロースの分解温度以上に加熱した加圧熱水で加水分解してセルロースを分解抽出する方法を開示している。特許文献３は、平均重合度100以上のセルロースを、温度250℃以上450℃以下、圧力15MPa以上450MPa以下の超臨界水又は亜臨界水と0.01秒以上5秒以下接触反応させ、その後冷却して温度250℃以上350℃以下、圧力15MPa以上450MPa以下の亜臨界水と1秒以上10分以下接触させて加水分解することを特徴とするグルコース及び／又は水溶性セロオリゴ糖の製造方法を開示している。
【０００５】
セルロース又はヘミセルロースを亜臨界水又は超臨界水で加水分解する場合には、希薄な酸触媒を使用することにより、加水分解効率が高まることも知られている。一方、特許文献１〜３に開示されているような亜臨界水又は超臨界水を利用する方法では、糖化液がセルロース及びヘミセルロースに由来する発酵阻害物（例えば、酢酸又は蟻酸のような有機酸；5-HMF又は2-フルフラールのような糖の分解生成物）を含有するため、通常の醸造用酵母又は五炭糖（C5糖）及び六炭糖（C6糖）の同時発酵が可能な非組み換え酵母（例えば、Pichia stipitis）を用いた場合には、発酵効率が低いという問題がある。
【０００６】
このため、遺伝子組み換え技術によって、セルロースを分解する酵素を表面に提示させた遺伝子組み換え酵母、及びキシロース発酵効率の高い遺伝子組み換え酵母が研究されている。例えば、特許文献４は、β−グルコシダーゼ遺伝子、キシロース代謝関連遺伝子（キシロースリダクターゼ遺伝子、キシリトールデヒドロゲナーゼ及びキシルロキナーゼ）、及びβ−キシロシダーゼ遺伝子をゲノムに導入された遺伝子組み換え酵母を開示している。特許文献５は、キシロースレダクターゼ遺伝子、キシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子及びキシルロキナーゼ遺伝子が染色体組み込みによって導入されている遺伝子組み換え酵母を開示している。特許文献６は、セルロース加水分解様式が異なる少なくとも２種のセルロース分解酵素をコードする遺伝子を有し、該酵素の組合せが、（Ａ）エンドグルカナーゼ及び（Ｂ）β−グルコシダーゼであり、該遺伝子の比（Ａ）／（Ｂ）が２以上である、向上したセルロース分解性を有する酵母を開示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０００−１８６１０２号公報
【特許文献２】特開２００２−５９１１８号公報
【特許文献３】特開２００３−２１２８８８号公報
【特許文献４】特開２０１２−６５６０４号公報
【特許文献５】特開２００９−１９５２２０号公報
【特許文献６】特開２０１１−３０５６３号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Tajima M, Nogi Y, Fukasawa T (1985) Primary structure of the Saccharomyces cerevisiae GAL7gene. Yeast 1:67-77
【非特許文献２】Yamada R, Tanaka T, Ogino C, Fukuda H, Kondo A: Novel strategy for yeast construction using delta-integration and cell fusion to efficiently produce ethanol from raw starch. Appl Microbiol Biotechnol 2009, 85:1491-1498.
【非特許文献３】Yamada, R., Tanaka, T., Ogino, C., Fukuda, H., Kondo, A. (2010) Novel strategy for yeast construction using δ-integration and cell fusion to efficiently produce ethanol from raw starch., Applied Microbiology and Biotechnology, 85, 1491-1498
【非特許文献４】Katahira, S., Mizuike, A., Fukuda, H., and Kondo, A. (2006) Ethanol Fermentation from Lignocellulosic Hydrolysate by a Recombinant Xylose- and Cellooligosaccharide-Assimilationg Yeast Strain., Applied Microbiology and Biotechnology, 72, 1136-1143.
【非特許文献５】Chen DC, Yang BC, Kuo TT: One-step transformation of yeast in stationary phase. Curr Genet 1992, 21:83-84.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
特許文献１〜３に開示されているような亜臨界水又は超臨界水を利用する方法によって得られる糖化液は、ヘミセルロース由来のキシロオリゴ糖の比率が高く、酵母による発酵効率が低いという問題もあった。しかし、特許文献４〜６に開示されている遺伝子組み換え酵母によっても、キシロオリゴ糖からエタノールを効率よく生産することは不可能であった。
【００１０】
本発明は、キシロオリゴ糖からエタノールを効率よく生産し得る遺伝子組み換え酵母、そのような遺伝子組み換え酵母の選別方法、及びそのような遺伝子組み換え酵母を使用するセルロース系バイオマスを原料とするエタノール製造方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者等は、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、β−キシロシダーゼ遺伝子、エンドキシラナーゼ遺伝子、アラビノフラノシダーゼ遺伝子、アセチルキシランエステラーゼ遺伝子、キシロースレダクターゼ遺伝子、キシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子、及びキシルロキナーゼ遺伝子という7種類の遺伝子を、染色体組み込みにより酵母に導入することにより、キシロオリゴ糖からエタノールを高効率で生産し得る遺伝子組み換え酵母が得られることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１２】
具体的に、本発明は、
β−キシロシダーゼ遺伝子、エンドキシラナーゼ遺伝子、アラビノフラノシダーゼ遺伝子、アセチルキシランエステラーゼ遺伝子、キシロースレダクターゼ遺伝子、キシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子、及びキシルロキナーゼ遺伝子が染色体組み込みにより導入されている、キシロオリゴ糖からエタノールを生産し得る遺伝子組み換え酵母に関する。
【００１３】
これまではひとつの遺伝子を導入した後、その形質が発現されていることを確認し、次の遺伝子を導入する作業を繰り返すため非常に多大な時間と労力を要していたが、複数種の遺伝子を同時に導入する本発明の遺伝子組み換え酵母を用いることにより、大幅に時間及び労力を低減することができる。
【００１４】
本発明の遺伝子組み換え酵母は、β−キシロシダーゼ、エンドキシラナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、及びアセチルキシランエステラーゼ、という4種類の酵素が、表層に提示されている（すなわち、これら4種類の酵素が細胞表面に発現している）ことが好ましい。
【００１５】
酵素製剤を投入する、又は酵素を分泌する微生物を利用する従来の方法では、発酵処理毎に酵素を投入するか、又は酵素を生産させる必要があった。酵素を表層提示させた本発明の遺伝子組み換え酵母では、エタノール発酵のために酵母を遠心分離し、再利用することにより、酵素も回収及び再利用できることから、効率的な糖化が可能となる。
【００１６】
本発明の遺伝子組み換え酵母は、二倍体化された遺伝子組み換え酵母であることが好ましい。
【００１７】
二倍体化することにより、継代培養したときに、各種酵素の生産及び五炭糖の発酵のような特性を、一倍体より安定的に発現させることができる。
【００１８】
本発明はまた、
β−キシロシダーゼ遺伝子、エンドキシラナーゼ遺伝子、アラビノフラノシダーゼ遺伝子、アセチルキシランエステラーゼ遺伝子、キシロースレダクターゼ遺伝子、キシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子、及びキシルロキナーゼ遺伝子を染色体組み込みにより酵母に導入し、遺伝子組み換え酵母を作製する作製工程と、
作製された遺伝子組み換え酵母にイオンビームを照射する照射工程と、
照射工程後の遺伝子組み換え酵母を、発酵阻害物を添加した培地中で継代培養することによって、キシロオリゴ糖からエタノールを高効率で生産し得る菌株を選別する選別工程と、
を有する遺伝子組み換え酵母の選別方法に関する。
【００１９】
本発明の選別方法は、照射工程によって、紫外線又は薬剤を使った変異促進よりも、高効率に変異を進めることができる。さらに、発酵阻害物添加培地を用いて酵母を選別することにより、種々の発酵阻害物を含有している、亜臨界水又は超臨界水で加水分解することによって得られた糖化液に適した酵母を短期間で選別することができる。
【００２０】
前記作製工程においては、二倍体化された遺伝子組み換え酵母を作製することが好ましい。
【００２１】
本発明はまた、
セルロース系バイオマスを熱水処理することによって、セルロース系バイオマスに含有されているヘミセルロースをC5糖類に糖化するヘミセルロース糖化工程と、
セルロース系バイオマスを熱水処理することによって、セルロース系バイオマスに含有されているセルロースをC6糖類に糖化するセルロース糖化工程と、
前記ヘミセルロース糖化工程で得られたC5糖化液と、前記セルロース糖化工程で得られたC6糖化液とを濃縮する濃縮工程と、
前記濃縮工程で得られた濃縮C5糖化液及びC6糖化液を、β−キシロシダーゼ遺伝子、エンドキシラナーゼ遺伝子、アラビノフラノシダーゼ遺伝子、アセチルキシランエステラーゼ遺伝子、キシロースレダクターゼ遺伝子、キシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子、及びキシルロキナーゼ遺伝子が染色体組み込みにより導入されている、キシロオリゴ糖からエタノールを生産し得る遺伝子組み換え酵母を用いて発酵させ、エタノールを生産させる発酵工程と、
を有するエタノール製造方法に関する。
【発明の効果】
【００２２】
本発明の遺伝子組み換え酵母によれば、キシロオリゴ糖の含有率が高い糖化液であっても、エタノール発酵の発酵効率が高い。本発明の遺伝子組み換え酵母の選別方法によれば、発酵阻害物質の影響を受けにくい遺伝子組み換え酵母を選別し得る。本発明のエタノール製造方法によれば、セルロース又はヘミセルロースの加水分解後に処理すべき廃酸が少なく、糖化液に含有されるキシロオリゴ糖をエタノールの原料として有効利用し得る。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】形質転換された酵母株の構築スキームを示す。
【図２】遺伝子組み換え酵母MN8140/XXAAIIの機能を説明する概念図を示す。
【図３】予備的発酵試験の結果を示す。
【図４】発酵試験の結果を示す。
【図５】発酵阻害物として乳酸0.05MをC5糖化液に添加した場合の発酵試験の結果を示す。
【図６】変異株6種のエタノール生産量を示す。
【図７】変異株6種のキシリトール生産量を示す。
【図８】変異株6種のキシロース消費量を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
以下、本発明を実施するための形態について、適宜図面を参照しながら説明する。本発明は、以下の記載に限定されない。
【００２５】
Ａ．糖化液の調製
＜セルロース系バイオマスの前処理＞
セルロース系バイオマスとして稲わらを使用した。稲藁1.0kgを剪断式の裁断機で粒径10mm以下となるように裁断した後、乾式ジェット粉砕機（セイシン企業）によって粒径20μm以下に粉砕した。粉砕装置としては、これ以外にボールミル、ロッドミル、ハンマーミル、カッターミル、ローラミル、ディスクミル又は解砕機も使用し得る。
【００２６】
＜ヘミセルロース糖化工程＞
粉砕後の稲藁1.0kgに、水及び酸触媒として硫酸を加えて攪拌し、スラリー化した。スラリーの固形分濃度は2.48質量％であり、硫酸濃度は0.29質量％であった。酸触媒として、ここでは硫酸を使用したが、硫酸以外の鉱酸又は有機酸も使用し得る。鉱酸の具体例は、塩酸、硝酸又はリン酸であり、有機酸の具体例は、酢酸又は乳酸である。スラリーの酸濃度は、水素イオン濃度として10-3mol/L以上10-0.5mol/L以下となるように調整されることが好ましい。
【００２７】
硫酸を添加されたスラリーは、東洋高圧製ラボスラリー連続式試験装置の外部加熱式反応管内に9L/hの速度で供給され、連続して糖化処理された。外部加熱式反応管内で、スラリーが180℃で4.3分間加熱されることにより、セルロース系バイオマス中のヘミセルロースは、糖化分解（加水分解）され、主にC5糖を成分とする可溶性糖となる。反応後、スラリーを脱水ろ過することにより、C5糖化液が得られた。
【００２８】
＜セルロース糖化工程＞
ヘミセルロース糖化工程後の脱水ろ過残渣は、再度固形分濃度2.48質量％、硫酸濃度0.74質量％のスラリーとされた後、外部加熱式反応管に供給され、9L/hの速度で連続して糖化処理された。外部加熱式反応管内で、スラリーが240℃で1分間加熱されることにより、セルロース系バイオマス中のセルロースは、糖化分解（加水分解）され、主にC6糖を成分とする可溶性糖となる。反応後、スラリーを脱水ろ過することにより、C6糖化液が得られた。
【００２９】
酸触媒として、ここでは硫酸を使用したが、硫酸以外の鉱酸又は有機酸を使用し得る。鉱酸の具体例は、塩酸、硝酸又はリン酸であり、有機酸の具体例は、酢酸又は乳酸である。スラリーの酸濃度は、水素イオン濃度として10-2mol/L以上10-0.3mol/L以下となるように調整されることが好ましい。
【００３０】
＜濃縮工程＞
C5糖化液及びC6糖化液は、それぞれ活性炭（日本エンバイロケミカル、XS7100H-3）によって吸着処理し、含有される夾雑物を吸着除去した。さらに、逆浸透膜（GE、型番DK、平膜）及びフロー式平膜試験装置（マルヤマエクセル）を用いて濃縮した。濃縮されたC5糖化液及びC6糖化液の組成は、それぞれ表１及び表２に示される通りであった。表１及び表２中の5-HMFは、5-ヒドロキシメチル-2-フルフラールを意味している。
【００３１】
【表１】
2014064484.tif 000003
【００３２】
【表２】
2014064484.tif 000004
【００３３】
Ｂ．遺伝子組み換え酵母の製造
＜作製工程＞
（１．使用酵母）
遺伝子組み換えを行う酵母として、非特許文献１に開示されているS. cerevisiae MT8-1、及び非特許文献２に開示されているS. cerevisiae NBRC1440ΔHUWLを使用した。
【００３４】
（２．酵母形質転換用プラスミド）
酵母を形質転換させるためのプラスミドとして、表３に示されるプラスミドを使用した。表３のpIHX1X2XKは、P. stipitis由来のキシロースレダクターゼ遺伝子及びキシリトールデヒドロゲナーゼ、並びにS. cerevisiae由来のキシルロキナーゼ遺伝子という3種類の遺伝子を発現させるプラスミドである。
【００３５】
【表３】
2014064484.tif 000005
【００３６】
（３．プラスミドの構築）
S. cerevisiaeゲノムDNAをテンプレートとし、表４に示されるプライマーを用い、PCR法によりPGKプロモーター、分泌シグナル配列、アンカータンパク質及びターミネーターのDNAを増幅した。増幅した3つのDNA断片を、XhoI/NotIによって制限酵素処理したプラスミドpRS406(Stratagene)に、Infusionキット(Clontech, CA, USA)を用いてクローニングし、プラスミドPGK406-AGを構築した。
【００３７】
【表４】
2014064484.tif 000006
【００３８】
次に、プラスミドPGK406-AGをXhoI/NotIによって制限酵素処理して得られるPGKプロモーター‐分泌シグナル配列‐アンカータンパク質及びターミネーターのDNA断片を、非特許文献３に開示されている、SalI/NotIによって制限酵素処理したプラスミドpδU及びpδWにInfusionキットを用いてクローニングし、プラスミドpδUPGSecAG及びpδWPGSecAGを構築した。
【００３９】
Aspergillus oryzae、Trichoderma reesei、及びAspergillus nigerのcDNAをテンプレートとし、表４に示されるプライマーを用い、PCR法によって、β-キシロシダーゼ遺伝子、エンドキシラナーゼ遺伝子、アラビノフラノシダーゼ遺伝子、及びアセチルキシランエステラーゼ遺伝子を増幅した。増幅した4種類の遺伝子を、SalI/BspEIで制限酵素処理したpδUPGSecAG及びpδWPGSecAGにInfusionキットを用いてクローニングし、プラスミドpδUGPAGXylA、pδWGPAGXylA、pδUPGAGXynII、pδWPGAGXynII、pδUPGAGAnabf、pδWPGAGAnabf、pδUPGAGAoaxe、pδWPGAGAoaxeを構築した。
【００４０】
次に、プラスミドpRS403(Stratagene)をNaeI/SacIIで制限酵素処理し、HIS3遺伝子を含むDNA断片を取得した。取得したDNA断片を、非特許文献４に開示されているプラスミドpIUX1X2XKのNaeI/SacIIサイトにLigation high（Toyobo, Osaka, Japan）を用いて連結し、プラスミドpIHX1X2XKを構築した。
【００４１】
（４．酵母の形質転換）
酵母の形質転換は、非特許文献５に開示されている酢酸リチウム法により行った。図１は、形質転換された酵母株の構築スキームを示す。まず、酵母MT8-1株を、ロイシン要求性を相補するプラスミドpRS405を用いて形質転換し、MT8-1/pRS405株を作製した。次に、MT8-1/pRS405株及びNBRC1440ΔHUWL株を、表３に示されるプラスミドpδUGPAGXylA、pδWGPAGXylA、pδUPGAGXynII、pδWPGAGXynII、pδUPGAGAnabf、pδWPGAGAnabf、pδUPGAGAoaxe、pδWPGAGAoaxe、及びpIHX1X2XKを用いて形質転換し、それぞれMT8-1/XXAAII株及び1440/XXAAII株を作製した。MT8-1/XXAAII株のアデニン要求性と、1440/XXAAII株のロイシン要求性とを利用し、これら２つの酵母を接合させて、栄養非要求性株として二倍体酵母MN8140/XXAAII株を取得した。
【００４２】
遺伝子組み換え酵母MN8140/XXAAII株を、SD培地(6.7 g/L yeast nitrogen base without amino acids (Difco Laboratories, MI, USA) and 20 g/L glucose (Nacalai Tesque, Kyoto, Japan))を用いて24時間種培養した。その後、この培養液1 mLを50 mLのYPD培地(10 g/L yeast extract (Nacalai Tesque), 20 g/L peptone (Difco Laboratories) and 20 g/l glucose)に植菌し、24時間培養した。その後、菌体を全量回収し、発酵試験に供した。
【００４３】
図２は、遺伝子組み換え酵母MN8140/XXAAIIの機能を説明する概念図を示す。MN8140/XXAAIIの表面（表層）には、β−キシロシダーゼ、エンドキシラナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、及びアセチルキシランエステラーゼが表層提示されており、キシロースレダクターゼ、キシリトールデヒドロゲナーゼ及びキシルロキナーゼが菌体内に発現している。糖化液に含有されるキシロオリゴ糖は、MN8140/XXAAII表面の4種類の酵素によってキシロースへと変換された後、菌体内に取り込まれ、さらにキシリトール→キシルロース→キシルロース5-リン酸へと変換され、最終的には解糖系によってエタノールに変換される。糖化液に含有されるグルコースは、MN8140/XXAAIIに取り込まれた後、直接解糖系によってエタノールへと変換される。
【００４４】
（５．試薬糖液を用いた予備的発酵試験）
遺伝子組み換え酵母MN8140/XXAAII株について、表５に示されるグルコース及びキシロースを含有する試薬糖液を用いて予備的発酵試験を行った。試薬糖液のpHは4.0、温度は30℃に調整された。なお、酢酸は、発酵阻害物のモデルとして添加されている。50mLの酵母培養液を遠心分離し、沈降した酵母を回収し、表５に示される試薬糖液に投入し、予備的発酵試験を行った。
【００４５】
【表５】
2014064484.tif 000007
【００４６】
図３は、酢酸濃度を0.05Mとした予備的発酵試験の結果を示す。発酵開始72時間で全ての糖が消費され、約18 g/Lのエタノールが生産された。理論値に対するエタノール収率は、75.1％となった。酢酸の添加量を変化させて実験を行った結果、表６に示されるように、酢酸を0.05 M添加した場合には、添加しない場合よりもエタノール収率が約15％増加した。このことから、遺伝子組み換え酵母MN8140/XXAAII株は、発酵阻害物である酢酸に耐性を有していることが確認された。
【００４７】
【表６】
2014064484.tif 000008
【００４８】
＜発酵工程（実糖化液を用いた発酵試験）＞
遺伝子組み換え酵母MN8140/XXAAII株について、上述した濃縮工程で得られた濃縮されたC5糖化液を用いて発酵試験を行った。濃縮されたC5糖化液のpHは4.0、温度は30℃に調整された。50mLの酵母培養液を遠心分離し、沈降した酵母を回収し、濃縮されたC5糖化液40mLに添加し、蒸留水を用いて全量50mLに調整した後、発酵工程を行った。
【００４９】
図４は、発酵試験の結果を示す。図５は、発酵阻害物として乳酸0.05Mを濃縮されたC5糖化液に添加した場合の発酵試験の結果を示す。図４及び図５より、発酵開始72時間でほぼ全ての糖が消費され、約10 g/Lのエタノールが生産された。理論値に対するエタノール収率は、それぞれ、71.9％（乳酸無添加）及び72.7％（乳酸0.05M添加）となった。このことから、遺伝子組み換え酵母MN8140/XXAAII株は、発酵阻害物である乳酸にも耐性を有していることが確認された。また、本発明によれば、実糖化液からも高収率でエタノールを生産できることが確認された。
【００５０】
＜照射工程＞
遺伝子組み換え酵母MN8140/XXAAII株の発酵能をさらに向上させるため、タンデム型静電加速器（National Electrostatic Corporation, USA、Tandem PELLETRON 5SDH-2）を用いて酵母にイオンビームを照射し、変異を導入した。加速粒子はC3+であり、0.5mLの酵母培養液を真空凍結乾燥させた試料（乾燥酵母）が入った試験管を照射チャンバー内に設置した後、33Gy、50Gy、67Gy、100Gy、及び167Gyの照射線量で照射した。
【００５１】
＜選別工程＞
変異を導入された株の安定化及び発酵能向上変異株のスクリーニングのため、SX（Synthetic Xylose)培地（6.7 g/L yeast nitrogen base without amino acids, 20 g/L xylose）又は酢酸添加SD（Synthetic Dextrose)培地（6.7 g/L yeast nitrogen base without amino acids, 20 g/L glucose, 0.05M acetic acid）を用いて3回継代培養を行った。継代培養後、実糖化液（上述した濃縮されたC5糖化液）を炭素源とした寒天培地上にシングルコロニー化し、コロニーサイズの大きなものから、それぞれ93株を選抜した。選抜された93株について、96ウェルプレートを用いて30℃で発酵試験を行った。
【００５２】
まず、96ウェルプレート中で、SX培地又は酢酸添加SD培地1.2mLを用いて、30℃で48時間培養した後、菌体を回収した。回収された菌体について、実糖化液0.6mLを用いて96ウェルプレート中で、30℃で48時間発酵試験を行った。発酵終了後、ウェル内の溶液中のエタノール濃度を、F-kit ethanol（Roche Diagnostics KK, Tokyo, Japan）を用いて測定した。
【００５３】
その結果、イオンビームを照射しなかったコントロール株と比較して、ウェル内エタノール濃度が高い、すなわち発酵能が向上した変異株が数種存在することが確認された。そのうち、上位6株について、20mL発酵ビン中で、実糖化液を対照として30℃で72時間の発酵試験を行った。
【００５４】
実糖化液を用いた発酵試験の結果、図６に示されるように、酢酸添加SD培地で継代した2株（KSD150G及びKSD300G）のみが、未照射株（Control）と比較してエタノール生産能が向上していることが確認された。この結果から、酢酸添加SD培地を用いて継代することにより、糖化液からの発酵能が向上した変異株を効率的に取得できる可能性が示唆された。
【００５５】
これら2株は、図７に示されるように、未照射株と比較して副産物であるキシリトールの生産量が減少していた。一方、これら2株は、図８に示されるように、未照射株と比較してキシロースの消費量が増加していた。これらの結果から、KSD150G及びKSD300Gについては、イオンビーム変異によってキシロース消費能が向上し、キシリトール生産能が低下したことが、エタノール生産能向上に寄与したと考察された。
【産業上の利用可能性】
【００５６】
本発明は、バイオエタノール製造分野において、特に有用である。
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図１】
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【図２】
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【配列表】
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