(57)【要約】      （修正有）【課題】細胞による免疫療法（例えば、免疫処置又はワクチン接種）の改良の提供。【解決手段】分泌型の修飾されたｇｐ９６熱ショックタンパク質及び抗原の双方を同時発現する、あるいは抗原のみを発現する同種癌細胞をヒト対象へ頻回投与し、特異的な免疫応答を誘発する免疫療法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト対象を免疫処置する方法であって、当該方法が、
（ａ）修飾されたｇｐ９６熱ショックタンパク質を分泌する同種癌細胞の免疫原性組成物を前記ヒト対象に投与するステップであって、前記修飾が小胞体（ＥＲ）用の保留シグナルを含む、天然型ｇｐ９６のドメインを少なくとも除去するステップと、
（ｂ）修飾されたｇｐ９６熱ショックタンパク質を分泌する同種癌細胞の別の免疫原性組成物を前記ヒト対象に投与するステップであって、前記修飾が小胞体用の保留シグナルを含む、天然型ｇｐ９６のドメインを少なくとも除去するステップと、
を具え、前記免疫原性組成物を投与するステップと、前記別の免疫原性組成物を投与するステップとの間が２週間未満であることを特徴とする方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法において、前記免疫原性組成物を投与するステップと、前記別の免疫原性組成物を投与するステップとの間が１週間以下であることを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法において、各々が前記修飾されたｇｐ９６熱ショックタンパク質を分泌する同種癌細胞からなる少なくとも９の免疫原性組成物が、前記ヒト対象に少なくとも毎週投与されることを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項１ないし３のうちのいずれか１項に記載の方法において、ＥＲ保留シグナルを含むドメインをＩｇＧ１又はＩｇＧ２の１以上の重鎖定常領域で少なくとも置換することによって、前記天然型ｇｐ９６が修飾されることを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項１ないし３のうちのいずれか１項に記載の方法において、ＥＲ保留シグナルを含むドメインをＩｇＧ１又はＩｇＧ２のＦｃドメインで少なくとも置換することによって、前記天然型ｇｐ９６が修飾されることを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項１ないし５のうちのいずれか１項に記載の方法において、前記癌細胞がＨＬＡ−Ａ１又はＨＬＡ−Ａ２を発現することを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項１ないし６のうちのいずれか１項に記載の方法において、少なくとも、前記修飾されたｇｐ９６熱ショックタンパク質がウシパピローマウイルスからの１以上の制御シグナルからなるベクターによってコード化されることを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項１ないし７のうちのいずれか１項に記載の方法において、前記癌細胞が細胞腫に由来することを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項１ないし７のうちのいずれか１項に記載の方法において、前記癌細胞が肺癌に由来することを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項１ないし３のうちのいずれか１項に記載の方法において、ＡＤ１００が、
ＥＲ保留シグナルを含むドメインをＩｇＧ１又はＩｇＧ２のＦｃドメインで少なくとも置換することによって修飾される天然型ｇｐ９６（ｇｐ９６−Ｉｇ）と、
ＨＬＡ−Ａ１又はＨＬＡ−Ａ２と、
をコード化し、かつ、ウシパピローマウイルスからの１以上の制御シグナルからなる１又は２の発現ベクタを形質移入することを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項１ないし１０のうちのいずれか１項に記載の方法が、前記免疫原性組成物の初回投与前及び／又は投与中に、対象のＢ細胞を枯渇させるステップを更に具えることを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項１ないし１０のうちのいずれか１項に記載の方法が、前記免疫原性組成物の少なくとも１の投与前及び／又は投与中に、対象のＢ細胞を枯渇させるステップを更に具えることを特徴とする方法。
【請求項１３】
修飾されたｇｐ９６熱ショックタンパク質を分泌する同種癌細胞を用いてヒト対象の免疫処置又はワクチン接種を改良する方法であって、天然型ｇｐ９６の修飾が小胞体（ＥＲ）用の保留シグナルを含むドメインを少なくとも除去し、前記改良が、
前記同種癌細胞を頻回投与するステップであって、同種癌細胞が２週間未満の時間を置いて対象に投与されるステップか、
前記同種癌細胞の少なくとも１の投与前及び又は投与中に前記対象中のＢ細胞を枯渇させるステップか、あるいは、
前記同種癌細胞を頻回投与するステップ、及び前記対象中のＢ細胞を枯渇させるステップの双方、
を具えることを特徴とする方法。
【請求項１４】
修飾されたｇｐ９６熱ショックタンパク質を分泌する同種癌細胞を含む免疫原性組成物の使用であって、天然型ｇｐ９６の修飾がヒト対象の免疫療法のために、小胞体（ＥＲ）用の保留シグナルを含むドメインを少なくとも除去し、少なくとも２の免疫原性組成物は同種癌細胞が２週間未満の時間を置いて対象に投与されるか、前記同種癌細胞の少なくとも１の投与前及び又は投与中に前記対象中のＢ細胞を枯渇させるか、あるいはその双方であることを特徴とする使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本出願は２００８年３月３日出願の米国特許出願第６１／０３３，４２５号の利益を主張し、引用によって組み込まれる。
【０００２】
［米国支援の研究又は開発］
米国政府は、米国保健社会福祉省からのＮＩＨのコントラクトＣＡ０３９２０１で提供されるように、本発明において特定の権利を有している。
【背景技術】
【０００３】
本発明は、修飾された熱ショックタンパク質を分泌する同種癌細胞のヒト対象への投与からなる癌細胞による免疫療法（例えば、免疫処置又はワクチン接種）を改良することに関する。それは同種癌細胞の対象への頻回投与か、同種癌細胞の初回投与又は少なくとも１の投与前及び／又は投与中の対象内のＢ細胞の枯渇か、あるいはその双方によって改良される。
【０００４】
国際公開第９９／４２１２１号は細胞型のワクチンを開示し、形質移入された発現コンストラクトによってコード化される修飾された熱ショックタンパク質が分泌される。そのワクチンは癌又は感染症を治療又は予防するのに有効になりうる。組換え型癌細胞の１回の注入、及び２週間の間隔を開けた、組換え型癌細胞の２回の注入が記載された。自己癌細胞が好適であった。対照的に、本発明は同種癌細胞を用いる。
【０００５】
国際公開第２００５／０３０１３６号は、遺伝子学的に修飾された肺癌細胞を投与してＣＤ８０及びＨＬＡを発現することによって、腫瘍を抑制することを開示した。その癌細胞は修飾された熱ショックタンパク質を分泌しない。
【０００６】
癌は一般的には、癌細胞を死滅させるために腫瘍の外科的切除、放射線、又は薬剤、あるいはその組合せによって治療される。免疫系は癌細胞の増殖及び拡がりを抑制できる。しかしながらそれらは、非免疫原性となり（例えば、非小細胞肺癌）、それが免疫応答の初回抗原刺激を遮断して、有効な応答を生成することによって、あるいは免疫原性となる（例えば、黒色腫）が、免疫応答のエフェクター相を遮断することによって、免疫監視を免れうる。代替的には、初回抗原刺激の遮断は、免疫抑制メディエータを分泌するか若しくはケモカインを寛容化する腫瘍、及び／又は、制御性細胞、寛容原性の抗原提示細胞、若しくは骨髄性サプレッサー細胞の刺激が原因である。同種癌細胞を投与することによる能動的な免疫療法は、遮断を回避し、生得性及び／又は適応性の免疫応答を初回刺激できる。腫瘍特異性のＣＤ８陽性Ｔ細胞の応答の誘発及び増幅は特に、癌細胞の細胞崩解、又は癌細胞によって刺激されるインターフェロンガンマの分泌によって評価される場合に所望される。
【０００７】
Ｒａｅｚら（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２２：２８００−２８０７，２００４）は、進行型転移性疾患を伴う、患者の非小細胞肺癌に対する、同種癌細胞によるワクチンの第Ｉ相試験について述べた。腺癌細胞株ＡＤ１００は形質移入されて、ＣＤ８０及びＨＬＡ−Ａ１又はＡ２を発現した。患者は２週ごとに１回、５×１０７の細胞で、皮内で免疫処置された。３の免疫処置は１の治療経過を提示した。患者が初回の免疫処置に対し無応答でない限り、合計で９の免疫処置のために最大で３の治療経過が施された。この細胞型のワクチンを用いて取得される有望な結果は、免疫処置の頻度を増加させ、少なくとも１の免疫処置前及び／又は処置中にＢ細胞を枯渇させることによって改良できるであろう。
【０００８】
従って、免疫療法（例えば、免疫処置又はワクチン接種）の改良を提供することが本発明の目的であり、頻回投与による、修飾された熱ショックタンパク質を分泌する同種癌細胞をヒト対象に投与するステップか、初回又は少なくとも１の投与前及び／又は投与中のＢ細胞の枯渇か、あるいはその双方を具える。他の利点及び改良は以下に記載されているか、本明細書中の開示から明らかになるであろう。
【発明の概要】
【０００９】
本発明は免疫処置及びワクチン接種用の同種癌細胞による免疫療法の改良を提供する。「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は治療的、予防的、あるいは単に対症的であってもよい。
【００１０】
ヒト対象は修飾された熱ショックタンパク質（例えば、ｇｐ９６）を分泌する同種癌細胞を投与することによって治療される。本明細書中で「同種（ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ）」は、投与される細胞及び治療される対象が１以上の主要組織適合抗原複合体（ＭＨＣ）分子ごとに異なることを意味する。熱ショックタンパク質は小胞体用の保留シグナルを含むドメインを除去することによって修飾してもよい。選択的に、ドメインはヒト又はマウスの免疫グロブリンＩｇＧ１又はＩｇＧ２の１以上の重鎖定常領域（例えば、Ｆｃドメイン）で置換してもよい。修飾された熱ショックタンパク質は、発現ベクターによって形質移入されるか、ウイルスベクターによって感染した癌細胞内部の核酸から発現される。ベクターはウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）由来の１以上の制御シグナル（例えば、転写開始及び停止、ドナー及び受容体のスライス、ポリアデニル化、複製の開始点）に基づいていてもよい。ベクターは好適には、ＢＰＶのＥ５、Ｅ６、及びＥ７遺伝子を含まない。従って、癌細胞は、それを産生するのに用いられる技術によって「組換え型（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ）」であると見なされうる。
【００１１】
抗原（例えば、新生抗原又は腫瘍抗原から得られる、同種又は同系癌細胞のエピトープ）は、対象内で生得性あるいは適応性の免疫応答を誘発しうる。特に、ＣＤ８陽性Ｔ細胞の応答の誘発及び増幅が所望される。ＣＤ８陽性細胞は癌細胞を死滅させるか、あるいは特異的にインターフェロンガンマを分泌しうる。
【００１２】
選択的に、癌細胞は、少なくとも１のＭＨＣ分子を発現することによって、対象で発現せずに、発現ベクターによって形質移入されるか、ウイルスベクターによって感染した癌細胞内部の核酸から、同種に産生してもよい。修飾された熱ショックタンパク質及びＨＬＡ分子は、同一のベクター又は異なるベクターによって少なくとも部分的にコード化してもよい。
【００１３】
ヒト対象は同種癌細胞で数倍に免疫化できる。細胞による免疫原性組成物の２の連続的投与の間隔は、２週間未満である。別の改良は、細胞による免疫原性組成物の少なくとも１の投与前及び／又は投与中の対象のＢ細胞の枯渇であってもよい。
【００１４】
本発明の更なる目的及び利点の態様は、以下の特定の実施形態及び特許請求の範囲の記載、ならびにそれらの一般化で当該技術分野の当業者に明らかとなるであろう。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
対象は同種癌細胞を含む免疫原性組成物を投与され、それは形質移入された発現ベクター又は感染したウイルスベクターによって少なくとも部分的にコード化された修飾された熱ショックタンパク質（小胞体用の天然型の保留配列を欠く熱ショックタンパク質）を細胞に分泌できる。新生ポリペプチド鎖として、修飾された熱ショックタンパク質は自身又は別のタンパク質のシグナル配列を有して、分泌経路を標的としてもよい。そして、Ｎ末端のシグナル配列の逆位に、ヒト免疫グロブリンの重鎖（例えば、ＩｇＧ１又はＩｇＧ２）の１以上の定常領域を含むペプチドタグがあってもよい。選択的に癌細胞は、（例えば、同一又は異なるベクターによって少なくとも部分的にコード化される）同種の主要組織適合抗原複合体（ＭＨＣ）分子を発現する。癌細胞は、（例えば、同一又は異なるベクターによって少なくとも部分的にコード化される）ＣＤ８０を発現しても、しなくてもよい。様々な癌細胞株における修飾された熱ショックタンパク質、ＨＬＡ−Ａ、及びＣＤ８０の発現の更なる詳細は、国際公開第９９／４２１２１号、及び国際公開第２００５／０３０１３６号に提供され、引用によって組み込まれている。
【００１６】
対象は投薬につき１×１０７ないし１０×１０７の範囲の同種癌細胞を投与されうる。全部で１ないし１０×１０８の細胞数が対象に投与されうる。同種癌細胞は、少なくとも１日２回、毎日、隔日、週２回、毎週、隔週、あるいは毎月といった、任意の２の連続的投与の間隔で投与してもよい。少なくとも全部で９、１８、又は２７回の同種癌細胞の投薬が施される。投薬は２週未満、１週以下、少なくとも週２回、少なくとも隔日、少なくとも毎日、又は少なくとも１日２回施されてもよい。治療は少なくとも６週、１０週、１５週、１８週、２２週、又は２６週（例えば、１ないし６月）間、連続してもよい。このような治療期間中に、細胞は２週未満、１週以下、少なくとも週２回、少なくとも隔日、少なくとも毎日、又は少なくとも１日２回の間隔で投与してもよい。細胞は少なくとも皮内、静脈内、腹腔内、又は皮下経路で注入できる。各々の投薬は、単一投薬を含む個別注入用に一定分量に分割してもよい。治療は頻回のワクチン接種、Ｂ細胞の枯渇、又はその双方によって改良できる。
【００１７】
抗原（例えば、新生抗原又は腫瘍抗原から得られる、同種又は同系癌細胞のエピトープ）は対象中の特異的な免疫応答を誘発できる。例えば、分泌型の熱ショックタンパク質との免疫原性複合体に結合されるエピトープは、分泌型のｇｐ９６と抗原との双方を同時発現する同種癌細胞から、あるいは抗原のみを発現する対象の同系癌細胞から取得してもよい。後者は、修飾された熱ショックタンパク質がｇｐ９６が合成されたのと異なる癌細胞に取り込まれ、及び抗原が合成される癌細胞に複合体が形成されることを推定上必要とする。免疫処置は、対象が機能的なＣＤ４陽性Ｔ細胞又はリンパ節を有することを要求しなくともよい。従って、ＥＲ保留シグナルの除去を含むｇｐ９６の総ての修飾後に、修飾されたｇｐ９６は更に免疫原性複合体にエピトープを結合しなければならない。任意の修飾はＮ末端の追加及び欠失、Ｃ末端の追加、１ないし３の近接するアミノ酸の点突然変異、あるいは１ないし１０のアミノ酸の内的な追加又は欠失を含む。
【００１８】
対象はヒト対象にできる。癌細胞はヒト対象から取得してもよい。免疫原又はワクチンは、癌細胞を提供する同一の対象、又は異なる対象に投与してもよい。同種癌細胞は、細胞を受け取る対象と比較して、移植抗原が異なる対象から取得したものでもよい。選択的には、主要組織適合抗原複合体分子（例えば、ＨＬＡ−Ａ１、ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ａ３、ＨＬＡ−Ａ２７といった１以上のＭＨＣクラスＩ分子）は、発現ベクターの形質移入、又はウイルスベクターの感染によって癌細胞中に発現させてもよい。修飾又は組織型（ｈｉｓｔｏ−ｔｙｐｅ）がそれぞれ、相同組換えによる癌細胞の内在性遺伝子に導入されうるため、ベクターの核酸は、修飾された熱ショックタンパク質又は同種のＭＨＣ分子を少なくとも部分的にコード化することを必要とする。
【００１９】
Ｂ細胞は当該技術分野で生体外でのアフェレーシスといった既知の技術によって除去されてもよく、あるいはＢ細胞受容体に特異的な抗体（例えば、抗ＣＤ１９、抗ＣＤ２０、抗ＣＤ２２、抗ＢＬｙＳ）、Ｂ細胞受容体を架橋結合する二量体化されたリガンド（例えば、アプタマーダイマー）、免疫抑制薬（例えば、シクロホスファミド又はプレドニゾロン）の投与が用いられてもよい。しかし、リンパ腫又は自己免疫疾患を治療するためのリツキシマブの使用と対照的に、免疫療法に関連するＢ細胞の枯渇は、本発明に関しては免疫系の他の部分を節約して、癌の細胞による免疫療法を有効にする。例えば、１００ｍｇ／ｍ２ないし５００ｍｇ／ｍ２（あるいは２００ｍｇ／ｍ２ないし３００ｍｇ／ｍ２、あるいは３５０ｍｇ／ｍ２ないし４００ｍｇ／ｍ２）の用量でのリツキシマブは、１回以上（例えば、２週ないし２月の間、週に１回）、１時間につき５０ｍｇないし１時間につき４００ｍｇの割合で患者に投与できる。リツキシマブはシクロホスファミド及びプレドニゾロンで補うことができる。Ｂ細胞は免疫療法（例えば、免疫処置又はワクチン接種）の前に除去してもよい。Ｂ細胞のレベルは免疫療法中、モニタリングしてもよく、枯渇は標準（すなわち、非除去）レベルの１％、５％、又は１０％より上である場合に反復してもよい。
【００２０】
異常増殖を起こす対象の癌細胞は、新生物又は腫瘍（例えば、細胞腫、肉腫、白血病、リンパ腫）、特に肺癌であってもよい。癌は、胃腸管系（例えば、食道、結腸、腸、回腸、直腸、肛門、肝臓、膵臓、胃）、尿生殖器（例えば、膀胱、腎臓、前立腺）、筋骨格系、肺性（例えば、肺）、あるいは生殖性（例えば、子宮頸部、卵巣、精巣）の器官系で発生するものを含む。例えば、肺癌は非小細胞肺癌（例えば、腺癌、扁平細胞細胞腫、又は大細胞癌）、小細胞肺癌、及びカルチノイドであってもよい。癌細胞は、治療を受ける対象から、あるいは対象以外の別の個体から得てもよい。前者の場合については、同種性（ａｌｌｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）は形質移入された発現ベクター又は感染したウイルスベクターから無関係な主要組織適合抗原複合体のクラスＩ分子を発現することによって与えられる。癌細胞は、修飾された熱ショックタンパク質を分泌するように操作される限り、非免疫原性であるか、低い免疫原性を有してもよい。癌細胞は細胞腫に由来してもよい。例示的な肺癌細胞はＡＤ１００腺癌であり、細胞株が得られる患者と、その患者のＭＨＣハプロタイプを共有するわずかな個体とを除く総ての対象に対し同種である。その誘導体は国際公開第２００５／０３０１３６号に記載されている。ＡＤ１００はＨＬＡ−Ａ１、ＨＬＡ−Ａ２、又はＣＤ８０を発現しない。膵癌はＡＴＣＣ  ＣＲＬ１４２０の、ｇｐ９６−Ｉｇを分泌するＭＩＡ  ＰａＣａ−２で治療してもよく、卵巣癌はＩＣＬＣ  ＨＴＬ９７００４の、ｇｐ９６−Ｉｇを分泌するＯＶＣＡＲ−３で治療してもよい。
【００２１】
治療の有効性は、症状の低減、病気の進行の遅延又は退行、生存の延長によって評価できる。また、癌細胞のＣＤ８陽性Ｔ細胞の細胞崩解、あるいはそれによって刺激されるインターフェロンガンマのアッセイは、生体外で測定してもよい。能動的な免疫療法の改良は、外科、放射線療法、及び／又は化学療法の組合せで癌を治療するのに用いてもよい。追加の免疫は、１ないし２年間に少なくとも月１回、免疫原性複合体を投与することによって生じさせてもよい。
【００２２】
免疫原性組成物は、同種癌細胞と、薬学的に許容可能な担体及び／又は賦形剤とからなる。例えば、担体はアルギン酸塩、又はＰＬＧＡビーズ、又はウイルス粒子であってもよく、賦形剤は注入用の水あるいは緩衝生理食塩溶液であってもよい。組成物を調合する前に、担体又は賦形剤は病原体及び発熱物質がないことを確認されうる。細胞は放射線照射され、０．５％のヒト血清アルブミンを含む緩衝食塩水に懸濁されうる。組成物は注入又は補給による全身又は局所投与が好適である。組成物は投与前に細菌及びウイルス混入なしで試験されることが好ましい。推定される汚染源を避けるように、無血清合成培地の同種癌細胞を培養することが好適である。細胞は凍結保存剤として２０％のジメチルスルホキシドを追加した同一の培地中で保存できる。
【実施例】
【００２３】
抗腫瘍のワクチン接種は天然型の腫瘍のないマウスに投与する場合に非常に有効であり、後の課題では腫瘍の増殖を防御する。防御は一般的には長く続き、特異的な腫瘍は適応性の免疫応答の関与を示した。この状況はワクチンが既に樹立腫瘍の治療上の処置のために用いられる場合に急激に変化する。防御免疫を有効に樹立できる同一用量のワクチンは一般的には、治療上の利点を提供できない。治療用のワクチン接種のこの効果不足の理由は、腫瘍誘発性のサプレッサー細胞の誘発、制御性細胞の産生、Ｔ細胞アネルギー又は耐性の誘発、あるいはその組合せに由来すると考えられる。どのような腫瘍誘発性の免疫抑制の正確なメカニズムでも、癌治療に対するワクチン療法の成功は、これらの腫瘍誘発性の抑制効果を克服あるいは中和することに依存する。
【００２４】
熱ショックタンパク質のｇｐ９６結合型ペプチドが樹状細胞によってＣＤ８陽性細胞に交差提示されることを示したＳｒｉｖａｓｔａｖａ及びＲａｍｍｅｎｓｅｅの研究室による先駆者的研究に基づいて、我々は抗腫瘍療法に好適なワクチン接種系を開発した。ｇｐ９６−ＩｇＧ１−Ｆｃ融合タンパク質を腫瘍細胞に形質移入することにより、シャペロン化された腫瘍ペプチドと複合体化したｇｐ９６−Ｉｇの分泌を生じさせる。ｇｐ９６−Ｉｇを分泌する腫瘍の非経口投与は生得性の免疫系の活性と併用して、強い抗原特異性のＣＤ８陽性のＣＴＬ増殖を引き起こす。腫瘍分泌型のｇｐ９６が、ＤＣ細胞及びＮＫ細胞のｇｐ９６分泌部位への漸増を生じさせ、ＣＤ９１ならびにＴＬＲ２及びＴＬＲ４への結合を介してＤＣ活性を媒介する。ｇｐ９６及びそのシャペロン化されたペプチドのエンドサイトーシス取り込みは、ＭＨＣクラスＩを介したペプチド交差提示と、ＣＤ４陽性細胞から独立した、同種の強いＣＤ８活性とを引き起こす。このモデル系において、ＣＤ８陽性のＣＴＬ増殖は、養子移植されたＴＣＲ遺伝子導入型の、ｇｆｐで標識されたＣＤ８陽性Ｔ細胞の使用によって、ワクチン接種の４ないし５日以内に正確に定量化できる。この試験系を用いて、我々のモデル系において腫瘍誘発性の免疫抑制が抗原非特異性であり、頻回免疫処置によって、あるいはＢ細胞の欠如によって、克服できることをここで示す。
【００２５】
［対象、細胞株、及び抗体］
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（Ｂ６）マウスはＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社又はＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社から購入した。Ｂ６基礎環境を有するＩｇのμ鎖欠損マウスはＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社から購入した。
【００２６】
Ｇｆｐ（ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ：緑色蛍光タンパク質）マウスはそれらの産生株から取得された。遺伝子導入型のＣ５７ＢＬ／６Ｊ  ＯＴ−Ｉマウス（Ｍ．Ｂｅｖａｎ博士から取得）はＨ−２Ｋｂ制限型のトリ卵白アルブミン由来ペプチド２５７ないし２６４（ＳＩＩＮＦＥＫＬ）に特異的なＴＣＲ（Ｖα２Ｖβ５．１．２）を発現する。ＧｆｐマウスはＯＴ−Ｉマウスと交雑させて、マイアミ大学の動物施設で施設ガイドラインに従って、ｇｆｐ−ＯＴ−Ｉマウスを産生した。後代マウスはｏｖａ−ＴＣＲ遺伝子の発現について、及び蛍光によってｇｆｐについて、スクリーニングした。総てのマウスは６ないし１２週齢で用いられた。
【００２７】
ＥＧ７の細胞株（Ｍ．Ｂｅｖａｎ博士から取得）は、ｇｐ９６−Ｉｇを含むベクターのｐＣＭＧ−Ｈｉｓで形質移入された。コントロール細胞はベクターのみで形質移入された。ルイス肺癌（ＬＬＣ）細胞はアメリカ培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から取得され、ｐＡＣ−ｎｅｏ−ｏｖａ中の卵白アルブミンで、あるいは卵白アルブミンのベクター及びｇｐ９６−Ｉｇを含むｐＣＭＧ−Ｈｉｓの双方で、形質移入された。総ての細胞は１０％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ）及びゲンタマイシン（ＧＩＢＣＯ社）を有するＩＭＤＭ培地（ＧＩＢＣＯ社）で培養された。形質移入された細胞を維持するために、選択用の抗生物質（Ｇ４１８又はＬ−ヒスチジノール、ミズーリ州セントルイスのＳｉｇｍａ社）が培養物に添加された。
【００２８】
以下の抗体が染色用に用いられ；抗ＣＤ１６／３２（２．４Ｇ２）、ＣｙＣｈｒｏｍｅ−抗ＣＤ３ε（１４５−２Ｃ１１）、−抗ＣＤ５（ＵＣＨＴ２）、−抗ＣＤ８ａ（５３−６．７）、ＰＥ−ＣＤ１９（４Ｇ７）、ＰＥ又はＦＩＴＣ−抗ＮＫ１．１（ＰＫ１３６）、及びＰＥ又はＦＩＴＣ−抗ＣＤ１１ｃ（ＨＬ３）はＢＤ  ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ社から購入した。
【００２９】
［ｇｆｐ−ＯＴ−Ｉ細胞及びＣＤ１９陽性Ｂ細胞の精製及び養子移植］
脾細胞及びリンパ節（ＬＮ）細胞の単一細胞懸濁液はｇｆｐ−ＯＴ−Ｉマウスから取得され、貯蔵された。それらは塩化アンモニウム溶解によって赤血球が枯渇された。ｇｆｐ−ＯＴ−Ｉ細胞は、抗ＣＤ８αの磁気ミクロビーズを用いた能動的なカラム選択と、製造者の指示に従ったＭＡＣＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社）とによって、選別された。分離されたＯＴ−Ｉ細胞の純度は、フローサイトメトリー分析によって決定される場合、９５％より高かった。精製された細胞上のＶα２及びＶβ５．１．２の発現は、フローサイトメトリーによって定量化された。Ｂ細胞の精製用に、ＣＤ１９陽性細胞は抗ＣＤ１９ミクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社）で精製された。ＢＣＤＭマウス中のＢ細胞を再構成するために、１０７の精製された細胞が、腫瘍細胞の移植前に２日間、尾静脈を通して養子移植された。
【００３０】
［生体内のＣＤ８陽性のＣＴＬ増殖の分析］
ＣＤ８陽性のＣＴＬ増殖を測定するために、マウスは１０６のｇｆｐ−ＯＴ−Ｉで養子移植され、１ないし４×１０６の非照射ＥＧ７−ｇｐ９６−Ｉｇ細胞の腹腔内（ｉ．ｐ．）注入によって２日後に免疫化される。免疫処置に続いて、細胞は定期的な間隔で、腹膜腔、腸間膜の傍大動脈リンパ節（ｄＬＮ）、及び末梢血から収集された。赤血球は塩化アンモニウム溶解によってサンプルから除去された。１００万の細胞が４℃で１０分間インキュベートされ、ＰＢＳ中の抗ＣＤ１６／３２  ｍＡｂが０．５％のＢＳＡ（ＰＢＡ）を含んで、ＦｃＲ結合を遮断した。細胞はその後、指示された抗体とともに３０分間インキュベートされた。サンプルはＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）上でＣＥＬＬ  Ｑｕｅｓｔソフトウェア（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いて分析された。各組織ごとの指示された免疫細胞の全数は、各組織中の標的細胞及び全細胞数の割合で算出された。
【００３１】
［腫瘍接種及び治療プロトコル］
非照射のＥＧ７、ＬＬＣ、又はＬＬＣ−ｏｖａ細胞は、２００μｌのＰＢＳでマウスの側腹部に皮下注入された。ＬＬＣ−ｏｖａ細胞の接種５日後（日数５）に、０．３ｍｌのＰＢＳ量における１０６の精製されたｇｆｐ−ＯＴ−Ｉが尾静脈を通して注入された。２日後、マウスは、グラフに示されたスケジュールによる、０．５ｍｌのＰＢＳ量での１０６の非照射のＬＬＣ−ｏｖａ−ｇｐ９６−Ｉｇ又はＥＧ７−ｇｐ９６−Ｉｇ細胞の腹腔内注入によって免疫化された。コントロールマウスはＰＢＳ、ＥＧ７、又はＬＬＣ−ｏｖａで治療された。側腹部中の腫瘍の寸法は、少なくとも２０日の間、週に２回、２次元で測定された。
【００３２】
［統計的解析］
有意性はｔ検定によって評価された。ｐ＜０．０５の計算値は、統計的有意性を示すと見なされた。
【００３３】
［樹立腫瘍がＴＣＲ特異性と別個に、ｇｐ９６を媒介したＣＤ８のＣＴＬ増殖を抑制する］
熱ショック融合蛋白質ｇｐ９６−Ｉｇの腫瘍細胞への形質移入によって、ｇｐ９６でシャペロン化されたペプチドとともにｇｐ９６−Ｉｇの分泌が生じた。ｇｐ９６−Ｉｇは、ｇｐ９６の小胞体保留シグナル（ＫＤＥＬ）の、ＩｇＧ１のＦｃ部分との置換によって産生される、修飾タンパク質である。マウスでのｇｐ９６−Ｉｇを分泌する腫瘍細胞の注入によって、腫瘍特異性の免疫及び記憶の誘発と、同一であるが形質移入されない腫瘍での後の攻撃の防御とが生じる。分泌型のｇｐ９６−Ｉｇによって産生される腫瘍免疫は、ＥＬ４特異性の抗原といった腫瘍内在性抗原から得られるペプチドを含む、ｇｐ９６でシャペロン化されたペプチドに対して、及び、ＥＬ４（ＥＧ７）又はＬＬＣ（ＬＬＣ−ｏｖａ）に形質移入される卵白アルブミンといった代替抗原に対して特異的である。卵白アルブミンの代替抗原は、卵白アルブミン特異性のＯＴ−Ｉ  ＴＣＲ遺伝子導入型ＣＤ８陽性細胞の養子移植を介して、生体内でＣＤ８陽性のＣＴＬ増殖を正確に決定する方法を提供する。
【００３４】
樹立腫瘍はＣＴＬ増殖に対し抑制性であることが知られる。樹立腫瘍の有無でのＣＴＬ応答を測定するために、卵白アルブミンで形質移入された同系又は同種の腫瘍がｇｐ９６−Ｉｇ−ｏｖａを分泌するのに、遺伝子導入型ＣＤ８陽性のＣＴＬが応答するＴＣＲ導入型ＯＴ−Ｉ系を我々は用いた。移植可能な腫瘍モデルとして、我々は、卵白アルブミンの形質移入によるＥＬ４から得られ、免疫原性及び高い腫瘍原性として分類されるＥＧ７を用いた。加えて、更に低い免疫原性及び高い腫瘍原性であると見なされるルイス肺癌（ＬＬＣ及びＬＬＣ−ｏｖａ）を我々は用いた。双方の細胞株の分割速度は非常に速く、培養時の８ないし１２時間の倍加時間である。
【００３５】
１００万のＥＧ７−ｇｐ９６−Ｉｇ細胞の単回の腹腔内免疫処置後に、１０６の細胞につき６０ないし８０ｎｇのｇｐ９６−Ｉｇを２４時間で分泌し、ＯＴ−ＩはＣＤ８陽性ゲートにおける低い免疫前レベル（〜０．２％）から、腫瘍のないマウスにおける高頻度（１５ないし４０％）まで増殖する。ｇｐ９６−Ｉｇを分泌しない非照射のＥＧ７の投与は有意なＯＴ−Ｉの増殖を生じさせることができない。しかし、側腹部中の遠位部位にある、皮下に樹立されたＥＧ７腫瘍は、腹膜腔において、かつ脾臓及びリンパ節において全身的に、ＯＴ−Ｉのｇｐ９６ワクチン誘発型の増殖を有意に抑制する。ＥＧ７腫瘍は卵白アルブミンを分泌し、Ｋｂ−ｏｖａを発現する。従って、腫瘍床又は腫瘍を排出するリンパ節を通して、再循環時に養子移植されたＯＴ−Ｉは、Ｋｂ−ｏｖａ特異性のＴＣＲを通してシグナルを受け取る一方で、共刺激のシグナル２を受け取らないために、アネルギー性となることが可能である。この仮説を評価するために、いずれも卵白アルブミンを発現しない同系腫瘍ＥＬ４及びＬＬＣは、遠位部位で皮下に樹立された。次いで、ＯＴ−Ｉは静脈内（ｉ．ｖ．）で養子移植され、マウスはＥＧ７−ｇｐ９６−Ｉｇを用いて腹腔内で免疫化された。樹立されたＥＬ４及びＬＬＣは、抑制が腫瘍中の好適なＴＣＲ抗原Ｋｂ−ｏｖａに依存しないことを示す樹立されたＥＧ７と同様に、分泌型のｇｐ９６−ｏｖａによるＯＴ−Ｉの増殖を抑制する場合に有効であった。ＯＴ−Ｉの増殖は、腹膜腔において、かつ全身的に、遠位部位でのＬＬＣ及びＥＬ４の存在によって抑制されたが、腹腔内のＥＧ７−ｇｐ９６−Ｉｇの免疫処置での腹膜腔中への全細胞の漸増は、腫瘍のないマウスと比較すると事実上増加した。
【００３６】
他で更に報告されるように、樹立腫瘍が抗原非特異性のＣＴＬ増殖の抑制を誘発できることをデータは示す。この抑制の誘発は、腹膜腔中のワクチン部位に対する細胞漸増の増加と相関する。腫瘍を有するマウスから腫瘍のないマウスへのワクチン誘発型腹膜細胞の移植は、レシピエントマウスが制御又はサプレッサー細胞の存在を示す場合に、ＯＴ−Ｉの増殖を抑制した。従って、ＣＤ８陽性Ｔ細胞は、抗原と別個の腫瘍を有するマウスにおける細胞性の抑制応答のため反応しない。
【００３７】
抗原非特異性の免疫抑制を克服するために、頻回反復される、ワクチン接種によるＣＤ８陽性のＣＴＬの抗原特異性の刺激が、腫瘍を有するマウスに見られる抑制活性を相殺できるかどうかを、我々は評価した。
【００３８】
［樹立腫瘍の拒絶は頻回のｇｐ９６−Ｉｇ免疫処置を要求する］
多くのワクチン接種のストラテジーは、分泌型のｇｐ９６−Ｉｇを含み、腫瘍及び腫瘍抗原に対しマウス内で防御免疫を樹立できるが、治療用のワクチン接種による既存の樹立腫瘍を拒絶することは更に困難である。ＣＤ８の増殖の抗原非特異性の抑制を観察するために、我々はワクチン接種の異なるスケジュールがどのように腫瘍の拒絶及び／又は腫瘍の増殖に影響を与えるかを分析した。
【００３９】
我々は最初に、腫瘍の移植と同日にワクチン接種を開始することによって、治療用のワクチン接種の効果を分析した。１００万のＥＧ７腫瘍細胞が同系マウスの側腹部中に皮下移植された。同日（日数０）に、１００万のｇｐ９６−Ｉｇ分泌型のＥＧ７ワクチン細胞（ＥＧ７−ｇｐ９６−Ｉｇ、６０ないし８０ｎｇ／１０６細胞数×２４時間の速度で、ｇｐ９６−Ｉｇを分泌する）は、ワクチンとして腹腔内に投与され、ワクチン接種は日数３、７、１０及び１４で反復された。治療を受けないマウスと比較して、腫瘍の増殖は、４のＥＧ７−ｇｐ９６−Ｉｇのワクチン接種が腫瘍の移植と同日に開始することによって減少する。治療上の効果はｇｐ９６及び抗原依存性である。非照射のＥＧ７は、ｇｐ９６−Ｉｇ又はＬＬＣ−ｇｐ９６−Ｉｇを分泌せず、ＥＧ７抗原を発現せず、ＥＧ７−ｇｐ９６−Ｉｇと同一速度でｇｐ９６−Ｉｇを分泌するが、ＥＧ７−ｇｐ９６−Ｉｇと同一用量及びスケジュールでワクチンとして腹腔内投与される場合に腫瘍を抑制できない。ＥＧ７−ｇｐ９６−Ｉｇでのワクチン接種が、ＥＧ７接種の２日以上後に開始される場合、同一のワクチン接種スケジュールを用いた治療上の効果は実質的に減少する。２日後の樹立腫瘍でさえもワクチン接種によって制御するのは、新しく移植された腫瘍よりも困難であることを、これらのデータは示している。
【００４０】
我々は次いで、樹立腫瘍がそれ以上の頻回のワクチン接種のスケジュールによって制御できるかどうかを評価した。１００万のＥＧ７腫瘍細胞は、側腹部に皮下移植され、３ないし７日間樹立できるようにし、少なくとも７以上の腫瘍細胞の倍加を可能にした。この期間中、視覚的に検出可能な腫瘍小結節の血管新生が生じる。マウスは次いで、１００万のＥＧ７−ｇｐ９６−Ｉｇ細胞で、又は、特異性のコントロールにおいてＬＬＣ−ｇｐ９６−Ｉｇ細胞もしくは非照射のＥＧ７細胞と同一スケジュール及び用量で、腹腔内に毎日ワクチン接種されるか、あるいはワクチン接種されなかった。ＥＧ７−ｇｐ９６−Ｉｇでの毎日のワクチン接種は、３日間で樹立されていたＥＧ７の増殖を有効に制御したが、非照射のＥＧ７での、あるいはＬＬＣ−ｇｐ９６−Ｉｇでの毎日のワクチン接種は樹立されたＥＧ７の増殖に有効ではなかった。更なる研究において、我々は移植されたＥＧ７腫瘍を、ＥＧ７−ｇｐ９６−Ｉｇでのワクチン接種を開始する前に５及び７日間で樹立するのを可能にした。毎日の２のワクチン接種は、この腫瘍樹立後の段階で腫瘍の増殖を遅らせるのに必要であった。頻回の免疫処置がマウスで２４日間、腫瘍の増殖を抑制できることをこのデータは示す。更なる研究は、連続した長期間のワクチン接種のスケジュールが腫瘍を完全に根絶するかどうかを決定するのに必要とされる。
【００４１】
免疫原性のＥＧ７リンパ腫で取得されたデータを検証するために、実験はわずかな免疫原性の樹立されたＬＬＣを用いて反復された。腫瘍の移植３日後に開始する、ＬＬＣ−ｇｐ９６−Ｉｇでの腹腔内免疫処置（日数３、７、１０、１４）の反復によって、ＬＬＣの腫瘍の進行の遅延が生じた。ＬＬＣに対する毎日の免疫処置は腫瘍の遅延により有効ではなかった。免疫処置の効果は、ＥＧ７−ｇｐ９６−Ｉｇのワクチン接種がＬＬＣの腫瘍の増殖を制御できない場合に腫瘍特異性であった。腫瘍の増殖の制御は更に、非照射のＬＬＣで得られないが、ｇｐ９６−Ｉｇの分泌に依存した。
【００４２】
分泌型のｇｐ９６−Ｉｇ及びそのシャペロン化されたペプチドによって抗原交差提示と併用される頻回のＤＣ及びＮＫ活性が、樹立腫瘍誘発型で抗原非特異性の免疫抑制を克服することをこれらのデータは示唆する。
【００４３】
［ｇｐ９６媒介型のＤＣ及びＮＫの漸増及びＣＤ８のＣＴＬ増殖がＢ細胞欠損マウスで増加する］
Ｔｈ１抗腫瘍応答が、野生型マウスと比較してＢ細胞欠損マウス（ＢＣＤＭ）で増加することが、いくつかのグループによって報告されてきた。従って、我々はｇｐ９６媒介型のＣＴＬ増殖及び抗腫瘍免疫におけるＢ細胞の役割を研究した。腹膜腔はＣＤ５陰性ＣＤ１９陽性のＢ細胞で、及びＣＤ５陽性ＣＤ１９陽性のＢ１Ｂ細胞で埋められ、後者はＩｇＭを産生し、活性時にアイソタイプスイッチを受けない。ＥＧ７−ｇｐ９６−Ｉｇでの腹腔内免疫処置で、ＣＤ５陰性ＣＤ１９陽性の集団は免疫処置後の日数４で約５倍に増加するが、ＣＤ５陽性のＢ１Ｂ細胞は中程度に増加する。ｇｐ９６媒介型のＯＴ−Ｉの増殖は免疫処置後の日数４及び５で最大になる。それは、ワクチン接種部位である腹膜腔でのＤＣ細胞及びＮＫ細胞の漸増及び活性に先行される。Ｂ細胞欠損マウスにおいては、ＤＣ、特にＮＫ細胞の漸増は３の別個の実験で増加し、漸増した細胞は腹膜腔中でより長く残った。その際は有意性に到達しなかったが、再現性があった。野生型Ｂ細胞のＢＣＤＭへの養子移植は、ＤＣ細胞及びＮＫ細胞の漸増の増加を消滅させた。その知見は、Ｂ細胞が生得性の免疫細胞のｇｐ９６誘発型の漸増に影響を与えることを示唆し、Ｂ細胞が更にＣＤ８陽性のＣＴＬ増殖を制御又は抑制することに関与しうることを示唆する。
【００４４】
従って、我々はｇｆｐで標識されたＯＴ−Ｉの増殖がＢＣＤＭで増加したかどうかを評価した。ＢＣＤＭにおけるｇｐ９６免疫処置後のＯＴ−Ｉの増殖は、日数４での野生型マウスに見られる増殖の約２倍の強さであった。重要なことに、ＯＴ−Ｉは腹膜腔において、及び流入領域リンパ節において、免疫処置後の日数７及び１２で有意に高頻回で持続した。免疫処置前の、野生型Ｂ細胞のＢＣＤＭへの養子移植は、ＯＴ−Ｉの増殖を野生型マウスに見られる増殖のレベル以下に低減した。ＩＬ−１０欠損マウスがＢＣＤＭに見られるような増殖の増加ではなく、野生型マウスに似たＯＴ−Ｉの増殖を呈するため、Ｂ細胞の存在によるＯＴ−Ｉの増殖の抑制はＩＬ−１０の産生によって媒介されない。
【００４５】
［ｇｐ９６媒介型の樹立腫瘍の拒絶はＢ細胞の不存在で増加する］
上に示したように、野生型マウスにおいて樹立されたＥＧ７の増殖制御は最小限で毎日のｇｐ９６免疫処置を要求する。同様に、ＬＬＣの進行は頻回の免疫処置で遅延できる。ＥＧ７及びＥＬ４細胞はＢＣＤＭ中で拒絶され、腫瘍を樹立しないが、しかしながら、ＬＬＣ及びＬＬＣ−ｏｖａは野生型マウスよりも遅い速度で増殖するもののＢＣＤＭに樹立できる。ＬＬＣ−ｏｖａはＢＣＤＭで、及び野生型マウスで７日間、側腹部に皮下で樹立された。ＯＴ−Ｉは静脈内に養子移植され、２日後に、ＬＬＣ−ｏｖａ−ｇｐ９６−Ｉｇは単一用量で腹腔内投与され、腫瘍の増殖がモニタリングされた。ＢＣＤＭにおいては、単一の免疫処置によって、３のラットにおける、樹立される７日間のＬＬＣ−ｏｖａ腫瘍の完全な拒絶と、２のラットにおける有意な腫瘍の縮小とを生じた。無治療においては、ＬＬＣ−ｏｖａは野生型マウスよりも遅い速度であるとはいえ、ＢＣＤＭで進行的に増殖し続けた。ＢＣＤＭのＢ細胞の再構成は野生型マウスに見られるのと同様のワクチン接種の効果、すなわち進行の遅延を与えた。
【００４６】
単一の免疫処置による、ＢＣＤＭにおいて樹立されたＬＬＣの最適な腫瘍制御は、有意に多数の腫瘍特異性のＣＴＬ前駆体（ＯＴ−Ｉ）、及び抗原特異性の免疫処置（ＬＬＣ−ｏｖａ−ｇｐ９６−Ｉｇ）の双方によって支持される。ＢＣＤＭにおいては、ｇｐ９６免疫処置のない、１００万の養子移植されたＯＴ−Ｉの存在によって、大多数のマウスにおける腫瘍の拒絶を生じない。同様に、ＯＴ−１の移植なしでの単独のｇｐ９６免疫処置はその組合せよりも効果が低い。
【００４７】
［非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）における同種癌ワクチンの臨床試験］
同種の肺癌細胞株ＡＤ１００はｇｐ９６−Ｉｇ及びＨＬＡ−Ａ１を形質移入される。細胞のうち少なくとも７０％が、１００万の細胞から２４時間ごとに６０ｎｇより多くのｇｐ９６−Ｉｇを発現する。組換え型癌細胞は非照射され、その後、進行性、再発性、又は転移性のＮＳＣＬＣ（ステージＩＩＩＢ／ＩＶ）に罹患する患者に皮内注入された。ＨＬＡの適合は要求されない。毒性についての懸念が生じない場合は、患者は１７週にわたり毎週又は２週に１回、５×１０７の同種癌細胞でワクチン接種される。代替的に、全部で４．５×１０８の同種癌細胞は（ａ）１８週にわたる９の注入、（ｂ）１８週にわたる１８の注入、あるいは（ｃ）１８週にわたる３６の注入によって送達してもよい。
【００４８】
［考察］
樹立腫瘍が抗腫瘍免疫を抑制することが十分に理解されよう。腫瘍特異性のＴ細胞は樹立腫瘍の存在下でアネルギー性となる。その研究で用いられたＢ細胞リンパ腫に対するアネルギーは抗原特異性であり、ＭＨＣで限定され、ＭＨＣ合致型で骨髄由来の抗原提示細胞の存在に依存した。他の研究においては、抗原非特異性で骨髄性のサプレッサー細胞及び制御性Ｔ細胞は抗腫瘍免疫の抑制に結びつけられた。生体内でのＣＴＬ応答の抑制が抗原と別個の経路を通して樹立腫瘍によって得られうることを、我々の研究は示す。ｇｐ９６−ｏｖａのワクチン接種に応じたＯＴ−Ｉの増殖は、腫瘍による卵白アルブミンの発現と別個に、樹立腫瘍によって抑制される。この型の抑制は制御性Ｔ細胞によって、あるいは骨髄性サプレッサー細胞又はＭ２マクロファージといった、他のサプレッサー細胞によって得られうる。この仮説によると、抑制活性はｇｐ９６ワクチン接種により腫瘍を有するマウスに誘発された腹膜細胞の移植によって、腫瘍のないマウスに移植可能である。
【００４９】
ｇｐ９６−ｏｖａの免疫処置に対するＯＴ−Ｉ応答は、樹立腫瘍の存在下で強く抑制されるが、完全に遮断されるわけではなく、このことは樹立腫瘍による免疫抑制と、分泌型のｇｐ９６−ｏｖａによって刺激された活性化ＤＣによる抗原交差提示を通したＣＤ８のＣＴＬ活性との間にバランスがあることを示唆する。天然型腫瘍マウスで、ｇｐ９６−ｏｖａによってＮＫ及びＤＣの漸増及び活性化が生じ、ＯＴ−Ｉの増殖がその後に生じることを、我々は以前に示した。樹立腫瘍は、ＬＬＣ−ｇｐ９６−Ｉｇのワクチン接種により腹膜腔中への細胞の漸増を実質的に増加させるが、ＯＴ−Ｉの増加は抑制され、樹立腫瘍の存在下で漸増した細胞の多くがサプレッサー細胞になりうることを示唆する。ｇｐ９６−ｏｖａでの頻回の免疫処置は、ｇｐ９６媒介性のＤＣ及びＮＫ刺激の反復、抗原交差提示の増加、及びＣＴＬの初回抗原刺激を通して、抑制から免疫活性の増加へとバランスをシフトすることによって抑制活性を克服できることを、この仮説は予測する。実際に、頻回の免疫処置は腫瘍の進行の遅延に有意な効果を有する。樹立されたＥＧ７の場合においては、毎日又は１日２回のワクチン接種は腫瘍の進行を停止するのにより有効であった。ＬＬＣについては、免疫処置は隔日又は３日ごとで十分であり、毎日の免疫処置の方が効果が大きくなかった。これらの腫瘍特異性の差異は、サプレッサー細胞が末梢性腫瘍の存在により産生される速度に関連しうる。代替的に、腫瘍がサプレッサー細胞の誘発を媒介するメカニズム、あるいは誘発されたサプレッサー細胞の性質にその差異は依存しうる。これらの問題は現在研究中である。
【００５０】
腫瘍分泌型のｇｐ９６−ｏｖａでの腹腔内免疫処置に対するＯＴ−Ｉ応答を研究することによって、大多数のＢ細胞が腹膜腔内に漸増することを我々は認めた。Ｂ細胞はｇｐ９６媒介性のＯＴ−Ｉの増殖におけるそれらの役割に関する問題を促す抗腫瘍免疫に対し、抑制性であると報告された。Ｂ細胞欠損マウスを用いると、ｇｐ９６−ｏｖａの免疫処置に続くＮＫ及びＤＣの漸増と、ＯＴ−Ｉの増殖との双方を抑制することが、即時に明確になった。Ｂ細胞を再構成したＢＣＤＭは、ｇｐ９６−ｏｖａ媒介性のＯＴ−Ｉの増殖に対し野生型マウスのように応答し、Ｂ細胞の欠損は、Ｂ細胞の欠如と関連しない方法で、ＢＣＤＭのｇｐ９６−ｏｖａ免疫処置に対する応答性を修飾する可能性を除外した。Ｂ細胞の欠損によって、単一のｇｐ９６−Ｉｇの免疫処置のみの後でさえも、ＯＴ−Ｉの増殖の増加、及び７日間で樹立されたＬＬＣ−ｏｖａの腫瘍の腫瘍拒絶の強い増加が生じた。サプレッサー細胞の腫瘍媒介性の誘発がＢ細胞の不存在下で大きく減少するか、あるいはＢ細胞自体がサプレッサー細胞として作用することをこのデータは示唆する。Ｂ細胞はサプレッサー細胞の誘発に関与するか否か、あるいはＢ細胞自体がＣＴＬ応答に対し免疫抑制性であるか否かは、更なる研究を必要とするが、しかしながら、ＩＬ−１０は腫瘍免疫のＢ細胞媒介性の抑制に関与するとは思われない。現行の研究において、ＯＸ４０−Ｌ欠損型のＢ細胞が抗腫瘍免疫応答を抑制する機能の低減を示すことを我々は見出した。Ｂ細胞上に発現したＯＸ４０−Ｌが、どのようにｇｐ９６による抗腫瘍免疫及びＣＴＬ増殖の抑制を媒介するかを決定することは残されたままである。
【００５１】
我々の研究は、抗原とは別個の免疫抑制が研究、更には規定できるモデルを提供する。特にこのプロセスにおけるＢ細胞の役割は非常に興味深い。加えて、我々の研究は抗腫瘍ワクチンがより有効にできる方法を示唆する。抗体でのＢ細胞の枯渇、及び、例えば腫瘍分泌型のｇｐ９６ワクチンでの、その後の頻回のワクチン接種によって、従来のワクチン接種方法で見られるものよりも、更に有効な腫瘍の増殖の制御が生じうる
【００５２】
特許、特許出願、書籍及び本明細書中に引用される他の刊行物は、全体として引用によって組み込まれる。特に、本明細書に記載の改良は米国特許出願第１１／８７８，４６０号の癌細胞ワクチンの投与に応用でき、引用によって組み込まれている。
【００５３】
数値範囲を述べる場合に、範囲内の総ての値が更に記載されていると理解すべきである（例えば、１ないし１０は１ないし１０の間の各整数値、ならびに２ないし１０、１ないし５及び３ないし８といった総ての中間範囲を含む）。用語「約（ａｂｏｕｔ）」は、当該技術分野の当業者が発明の運用あるいはその特許性に影響しないと理解する、測定値に関する統計的不確実性と、数量における変動性のことである。
【００５４】
特許請求の範囲の趣旨及びその法的な等価物の範囲内にある総ての修飾及び置換は、それらの範囲内に包含すべきである。「具える、含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」を記述する請求項は、請求項の範囲内にある他の要素を含むことを許容し、「具える、含む」の用語を記述する代わりに、接続語「〜から実質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」（すなわち、本発明の運用に実質的に影響しない場合に請求項の範囲内にある他の要素の含有を許容する）又は「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」（すなわち、本発明に通常関連する、不純物又は重要でない活性以外の請求項に列挙された要素のみを許容する）を記述するこのような特許請求の範囲によっても、本発明は記載される。これらの３の接続語のいずれも本発明を主張するのに用いられうる。
【００５５】
本明細書中に記載の要素は特許請求の範囲に明確に記述されない限りにおいては、請求項の発明を限定すると解釈すべきではないと理解すべきである。従って、認可された請求項は、特許請求の範囲に読み込まれる明細書によって限定するのではなく、法的保護の範囲を決定する土台である。比較対照すると、従来技術は、本発明、ないし請求項の発明に先行しかつ新規性を消失させる特定の実施形態の範囲を明確に除外する。
【００５６】
更に、請求項の複数の限定間の特定の関係は、このような関係が請求項に明確に記述されない限り意図されていない（例えば、物に関する請求項における構成の配置又は方法に関する請求項におけるステップの順序はそうであることが明確に述べられない限りにおいては、請求項の限定ではない）。本明細書中に開示の別個の要素の総ての可能な組合せ及び並べ換えは、本発明の態様であると見なされる。同様に、本発明の記載の一般化は本発明の一部であると見なされる。
【００５７】
前述のことから、本発明がその精神又は本質的な特徴から離れることなく、他の特異的な形態で具体化されうることは、当該技術分野の当業者に明らかである。本発明で提供される法的保護の範囲は、この明細書によってではなく、添付の特許請求の範囲によって示されるため、記載の実施形態は例示としてのみ考慮すべきであり、限定として考慮すべきではない。
【手続補正書】
【提出日】平成26年7月31日(2014.7.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象にできた腫瘍の治療において使用するｇｐ９６を分泌する細胞を含む医薬組成物において、前記細胞が前記対象に対して同種異系であり、少なくとも６週間以上１週１度投与する投与計画に応じて前記対象に投与されることを特徴とする、医薬組成物。
【請求項２】
対象にできた腫瘍の治療において使用するｇｐ９６を分泌する細胞を含む医薬組成物において、
前記細胞が前記対象に対して同種異系であり、６週間以上少なくとも９回投与する投与計画に応じて前記対象に投与され、
前記対象にできた腫瘍に新生血管ができ、前記腫瘍部位における抑制遺伝子または制御性細胞の存在を増やすことにより、細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）膨張の抗原非特異的抑制を誘発し、
前記投与計画が、前記対象にできた腫瘍によって誘発されたＣＴＬ膨張の抗原非特異的抑制を阻害するのに有効である、
ことを特徴とする医薬組成物。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の医薬組成物において、前記各投与が１千万乃至１億個の細胞を含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項４】
請求項１乃至３のいずれか１項に記載の医薬組成物において、前記各投与が、前記対象に異なる部位で投与される複数のアリコートに分かれることを特徴とする医薬組成物。
【請求項５】
請求項１乃至４のいずれか１項に記載の医薬組成物において、前記投与が対象へ皮内投与されることを特徴とする医薬組成物。
【請求項６】
請求項１乃至４のいずれか１項に記載の医薬組成物において、前記投与が対象へ皮下投与されることを特徴とする医薬組成物。
【請求項７】
請求項１乃至４のいずれか１項に記載の医薬組成物において、前記投与が対象へ腹腔内投与されることを特徴とする医薬組成物。
【請求項８】
請求項１に記載の医薬組成物において、少なくとも９回の投与が前記対象に行われることを特徴とする医薬組成物。
【請求項９】
請求項１乃至７のいずれか１項に記載の医薬組成物において、少なくとも１８回の投与が前記対象に行われることを特徴とする医薬組成物。
【請求項１０】
請求項１乃至７のいずれか１項に記載の医薬組成物において、少なくとも２７回の投与が前記対象に行われることを特徴とする医薬組成物。
【請求項１１】
請求項１乃至９のいずれか１項に記載の医薬組成物において、前記投与が少なくとも１０週間以上、前記対象に行われることを特徴とする医薬組成物。
【請求項１２】
請求項１乃至９のいずれか１項に記載の医薬組成物において、前記投与が少なくとも１８週間以上、前記対象に行われることを特徴とする医薬組成物。
【請求項１３】
請求項１乃至９のいずれか１項に記載の医薬組成物において、前記投与が少なくとも２６週間以上、前記対象に行われることを特徴とする医薬組成物。
【請求項１４】
請求項１乃至１３のいずれか１項に記載の医薬組成物において、前記細胞が、少なくとも第１タンパク質をエンコードする第１核酸を含む第１ベクターで核酸導入されたものであることを特徴とする医薬組成物。
【請求項１５】
請求項１４に記載の医薬組成物において、前記第１タンパク質が、ｇｐ９６ポリペプチドから分泌されたものであることを特徴とする医薬組成物。
【請求項１６】
請求項１４に記載の医薬組成物において、前記細胞が、少なくとも前記第１タンパク質と異なる第２タンパク質をエンコードする第２核酸を含む第２ベクターで核酸導入されたものであることを特徴とする医薬組成物。
【請求項１７】
請求項１６に記載の医薬組成物において、前記第２タンパク質が主要組織適合性遺伝子複合体分子であることを特徴とする医薬組成物。