(57)【要約】【課題】投与後時間がたったときでも、腫瘍への集積性が高く、腫瘍から発せられる光音響信号強度が大きい、ＩＣＧ含率の高い化合物を提供することを目的とする。【解決手段】ポリエチレングリコールとＩＣＧ誘導体が結合したヒアルロン酸誘導体を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（１）で表される単位からなる重合体を含む化合物であって、
下記一般式（１）中、Ｒ１は、単位ごとにそれぞれ独立であって、
前記重合体中、一般式（１）におけるＲ１として下記一般式（２）または下記一般式（２５）を有する単位、および下記一般式（３）を有する単位をそれぞれ１以上含むことを特徴とする化合物、
【化１】
2014185333.tif 000046
【化２】
2014185333.tif 000047
【化３】
2014185333.tif 000048
【化４】
2014185333.tif 000049
ただし、上記一般式（２）、上記一般式（３）及び上記一般式（２５）においてＬは単位ごとにそれぞれ独立であるリンカーを表し、＊は上記一般式（１）中のＮとの結合部位を指し、上記一般式（３）においてＲ２はＨ、ＯＨ、ＯＭｅ、ＮＨ２、およびＣＯＯＨのいずれかであり、ｋは２０以上２００以下の整数である。
【請求項２】
前記重合体中、Ｒ１として前記一般式（２）または前記一般式（２５）を有する単位の数をｘ、前記重合体の全単位の数をＮとしたときに、ｘ，Ｎが下記式（１）の関係を満たすことを特徴とする請求項１に記載の化合物。
０．１３＜ｘ／Ｎ≦０．７８    式（１）
【請求項３】
前記一般式（１）で表される単位からなる重合体を含む化合物であって、
前記一般式（１）中、Ｒ１は、単位ごとにそれぞれ独立であって、
Ｒ１は下記一般式（２）から（５）、下記一般式（２５）及び一般式（２９）より選ばれ、
前記重合体は、少なくとも一般式（２）または一般式（２５）、および（３）をＲ１として有する単位をそれぞれ１以上含むことを特徴とする化合物、
【化５】
2014185333.tif 000050
【化６】
2014185333.tif 000051
【化７】
2014185333.tif 000052
【化８】
2014185333.tif 000053
【化９】
2014185333.tif 000054
【化１０】
2014185333.tif 000055
【化１１】
2014185333.tif 000056
ただし、一般式（２）から（５）、一般式（２５）及び一般式（２９）においてＬは単位ごとにそれぞれ独立であるリンカーを表し、＊は一般式（１）中のＮとの結合部位を指し、
一般式（３）においてＲ２はＨ、ＯＨ、ＯＭｅ、ＮＨ２、およびＣＯＯＨのいずれかであり、ｋは２０以上２００以下の整数であり、
一般式（５）においてＲ３はＮ３、Ｈ、ＣＨ３、ＮＨ２、ＳＨ、ＣＯＯＨのいずれかである。
【請求項４】
重合体中、一般式（２）または一般式（２５）をＲ１として有する単位の数をｘ、一般式（３）をＲ１として有する単位の数をｙ、一般式（４）または一般式（２９）をＲ１として有する単位の数をｚとしたときに、ｘ，ｙ，ｚが下記式（２）の関係を満たすことを特徴とする請求項３に記載の化合物。
０．１３＜ｘ／（ｘ＋ｙ＋ｚ）≦０．７８    式（２）
【請求項５】
重合体中、一般式（４）または一般式（２９）をＲ１として有する単位を少なくとも１つ含むことを特徴とする請求項３または４のいずれかに記載の化合物。
【請求項６】
一般式（６）から（９）一般式（２８）及び（３０）のいずれかで表わされる単位からなる重合体を含む化合物であって、前記重合体は一般式（６）または一般式（２８）、および一般式（７）で表わされる単位をそれぞれ１以上含むことを特徴とする化合物、
【化１２】
2014185333.tif 000057
【化１３】
2014185333.tif 000058
【化１４】
2014185333.tif 000059
【化１５】
2014185333.tif 000060
【化１６】
2014185333.tif 000061
【化１７】
2014185333.tif 000062
【請求項７】
前記重合体中、一般式（６）または一般式（２８）で表わされる単位の数をｘ、一般式（７）で表わされる単位の数をｙ、一般式（８）または（９）または（３０）で表わされる単位の数をｚとしたときに、ｘ、ｙ、ｚが下記式（２）の関係を満たすことを特徴とする請求項６に記載の化合物。
０．１３＜ｘ／（ｘ＋ｙ＋ｚ）≦０．７８  式（２）
【請求項８】
一般式（１）で表される単位からなる重合体を主鎖として有する化合物であって、
Ｒ１は単位ごとに独立であって、
Ｒ１として、ＩＣＧ類縁体、または両親媒性分子が結合している化合物、
【化１８】
2014185333.tif 000063
ただし、ＩＣＧ類縁体をＲ１に有する単位の数をｘ、重合体の全単位の数をＮとしたときに、
ｘ，Ｎは下記式（１）の関係を満たす。
０．１３＜ｘ／Ｎ≦０．７８  …式（１）
【請求項９】
請求項１乃至８のいずれか１項に記載の化合物を有する粒子。
【請求項１０】
請求項１乃至８のいずれか１項に記載の化合物および分散媒を有することを特徴とする光音響イメージング用造影剤。
【請求項１１】
粒子の平均粒径が１０ｎｍ以上１８０ｎｍ以下であることを特徴とする請求項９に記載の粒子。
【請求項１２】
請求項９に記載の粒子と、粒子の分散媒とを有することを特徴とする光音響イメージング用造影剤。
【請求項１３】
両親媒性分子の存在下で、ＩＣＧ誘導体とヒアルロン酸を反応させることを特徴とするヒアルロン酸誘導体の製造方法。
【請求項１４】
前記両親媒性分子がポリエチレングリコールであることを特徴とする請求項１３に記載のヒアルロン酸誘導体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、近赤外色素結合ヒアルロン酸誘導体、および、前記ヒアルロン酸誘導体を有する光イメージング用造影剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体内部の情報を可視化する装置の１つとして、光音響トモグラフィー（Ｐｈｏｔｏａｃｏｕｓｔｉｃ  ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ、以下ＰＡＴと略すことがある）装置が知られている。ＰＡＴ装置を用いる測定においては、被測定体に光を照射したときに被測定体内部で光を吸収した物質（光吸収体）が発する光音響信号の強度と発生時刻を測定することにより、被測定体内部の物質分布を演算した画像を得ることができる。
【０００３】
光吸収体としては、生体内で光を吸収して音響波を発するものであればいかなるものをも用いることができる。例えば人体内の血管や悪性腫瘍などを光吸収体とすることが可能である。その他にも、インドシアニングリーン（Ｉｎｄｏｃｙａｎｉｎｅ  Ｇｒｅｅｎ、以下ＩＣＧと略すことがある）などの分子を体内に投与し、造影剤として利用することもできる。ＩＣＧは、人体に投与した際の影響が少なくかつ生体への透過性が高い近赤外波長領域の光をよく吸収することから、ＰＡＴ装置における造影剤として好適に用いることができる。なお、本明細書において、ＩＣＧとは下記の構造で示される化合物を指す。
【化１】
2014185333.tif 000002
ただし、対イオンはＮａ＋でなくてもよく、Ｈ＋あるいはＫ＋など任意の対イオンをもちいることができる。
【０００４】
またＩＣＧは近赤外光を吸収して近赤外蛍光を発する化合物であることから、蛍光イメージングにも用いられる。つまり、ＩＣＧを被測定体に投与し、一定時間後に光を外部から照射したときに被測定体内部で光を吸収したＩＣＧが発する蛍光信号を測定することにより、被測定体内部のＩＣＧ分布を画像化することができ、たとえば、センチネルリンパ節の可視化が可能である。
【０００５】
しかし、ＩＣＧは血中での半減期が数分程度と非常に短いことが知られている。
【０００６】
そこで、非特許文献１では、上記ＩＣＧの親水性誘導体（ＩＣＧ−ＯＳｕ）を天然多糖である分子量４万のヒアルロン酸に結合させて平均粒子径１８８ナノメートルのナノ粒子を形成させており、リンパ節や腫瘍の蛍光インビボイメージングを行った例が報告されている。この報告によると、単独のＩＣＧに比べて、血中を長時間滞留し、リンパ節や腫瘍へも集積していることが示されている。
【０００７】
特許文献１では親水性の近赤外色素であるＩＲ７８３をヒアルロン酸に結合させており、リンパ節の蛍光インビボイメージングを行った例が報告されている。
【０００８】
特許文献２ではフルオレセインを共有結合させたヒアルロン酸誘導体を報告しており、グリコサミノグリカン分解酵素の活性測定方法に用いている。
【０００９】
非特許文献２では、疎水化した分子量２５０万のヒアルロン酸にポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ、以下ＰＥＧと略すことがある）を結合させたヒアルロン酸誘導体のナノ粒子を報告している。さらにこのナノ粒子に親水性の近赤外色素Ｃｙ５．５を共有結合させることで、ＰＥＧと近赤外色素が結合した疎水化ヒアルロン酸誘導体のナノ粒子を報告しており、蛍光インビボイメージングの例が報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】米国特許出願公開２００８／００５６９９９号明細書
【特許文献２】特開２００６−２５６２５号公報
【特許文献３】特開２００９−１５５４８６号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｈ．Ｍｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，４８，ｐｐ．８６２８−８６３０（２０１２）
【非特許文献２】Ｋ．Ｙ．Ｃｈｏｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，３２，ｐｐ．１８８０−１８８９（２０１１）
【非特許文献３】Ｔ．Ｈｉｒａｔａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，６，ｐｐ．２１７９（１９９８）
【非特許文献４】Ｆ．Ｐａｌｕｍｂｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｐｏｌｙｍ．６６，ｐｐ．３７９（２００６）
【非特許文献５】Ｍ．Ｈ．Ｏｕｄｓｈｏｏｒｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｏｌｙｍｅｒ，４８，ｐｐ．１９１５（２００７）
【非特許文献６】Ｂ．Ｃａｒｂｏｎｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，５８，ｐ．ｐ．３７３６（１９９３）
【非特許文献７】Ｋ．Ｍｉｋｉ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，３１，ｐｐ．９３４（２０１０）
【非特許文献８】Ｍ．Ｂｒｅｉｄｅｎｂａｃｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０７，ｐｐ．３９８８（２０１０）
【非特許文献９】Ｇ．Ｈｕｅｒｔａ−Ａｎｇｅｌｅｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｐｏｌｙｍ．，８４，ｐｐ．１２９３（２０１１）
【非特許文献１０】Ｇ．Ｔｅｓｔａ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．，３７８，ｐｐ．８６（２００９）．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
光イメージング用造影剤として高感度に用いるためには、化合物のＩＣＧ含有率が高いことが必要である。化合物のＩＣＧ含有率が低い場合、標的組織へのＩＣＧ輸送量が減少し、造影感度が不十分になり、その結果、ＩＣＧ含有化合物を大量に投与する必要が生じることになる。患者に過度の負担を与えないためにも、ＩＣＧ含有率が高いＩＣＧ含有化合物が求められていた。また、該ＩＣＧ含有化合物は適度な血中滞留性を有し、腫瘍などの標的組織へ効率よく到達できることが望まれていた。
【００１３】
非特許文献１に開示された親水性のＩＣＧ誘導体を含有する化合物は、ＩＣＧ含有率が１０％程度と低い。また特許文献１に開示された親水性ＩＲ７８３含有ヒアルロン酸誘導体は、色素導入率は不明であり、また生体内で安定化させるためのポリエチレングリコールによる修飾もされていない。特許文献２で開示されたフルオレセインを結合したヒアルロン酸誘導体では、近赤外色素ではないため生体内に存在するヒアルロン酸誘導体を効率よく検出することが困難である。また、分子量４万のヒアルロン酸に対し２０当量の色素を仕込んでいることから、反応が１００％進行しても、色素含率は最大でも２０％である。
【００１４】
さらに、非特許文献２で開示されたヒアルロン酸誘導体のナノ粒子では、ポリエチレングリコールによる修飾がされているものの、色素導入率は不明であり、その最適値についても何ら示していない。以上の先行技術からは、ヒアルロン酸に近赤外色素、たとえばＩＣＧ誘導体を高含有させるための方法ならびに分子設計、さらには血中滞留性や腫瘍集積性を向上させるための分子設計について何ら示されていない。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、下記一般式（１）で表される単位からなる重合体を含むヒアルロン酸誘導体であって、下記一般式（１）中、Ｒ１は、単位ごとにそれぞれ独立であって、重合体中、一般式（１）におけるＲ１として下記一般式（２）または下記一般式（２５）を有する単位、およびまたは下記一般式（３）を有する単位をそれぞれ１以上含むことを特徴とするヒアルロン酸誘導体を提供する。
【化２】
2014185333.tif 000003
【化３】
2014185333.tif 000004
【化４】
2014185333.tif 000005
【００１６】
【化５】
2014185333.tif 000006
ただし、上記一般式（２）、上記一般式（３）及び上記一般式（２５）においてＬは単位ごとにそれぞれ独立であるリンカーを表し、＊は上記一般式（１）中のＮとの結合部位を指し、
上記一般式（３）においてＲ２はＨ、ＯＨ、ＯＭｅ、ＮＨ２、およびＣＯＯＨのいずれかであり、ｋは２０以上２００以下の整数である。
【発明の効果】
【００１７】
ヒアルロン酸に対して、ＩＣＧ誘導体とＰＥＧを同時に反応させることでヒアルロン酸へのＩＣＧ含有率を高めることができることを初めて見出し、ＩＣＧ含有率の高いヒアルロン酸誘導体の創製に成功した。ＩＣＧを単独で生体に投与した場合に比べて、本発明に係るヒアルロン酸誘導体は血液での滞留性、あるいは腫瘍への集積性が高く、血液あるいは腫瘍から発せられる光音響信号強度が大きい。また、ＩＣＧ含率が高いため、ヒアルロン酸あたりの光音響信号強度が大きい。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】（ａ）近赤外色素を含むヒアルロン酸誘導体の構造式（ｂ）近赤外発光性化合物ＩＣＧ−ａｌｋｙｎｅの合成スキーム（ｃ）ＩＣＧ−ａｌｋｙｎｅの紫外−可視−近赤外吸収スペクトル。
【図２】ヒアルロン酸のテトラブチルアンモニウム塩ＨＡ−ＮＢｕ４の合成スキーム。
【図３】（ａ）アジド基を有するヒアルロン酸誘導体３の合成スキーム。（ｂ）アジド基を有するアミンのヒアルロン酸への導入スキーム。
【図４】（ａ）ＩＣＧのみを有するヒアルロン酸誘導体ＨＡ−ＩＣＧの合成スキーム。（ｂ）ＩＣＧおよびＰＥＧを有するヒアルロン酸誘導体１の合成スキーム。
【図５】（ａ）粒子径とＩＣＧ含有率の関係を示すグラフ（ｂ）粒子径とヒアルロン酸の分子量との関係を示すグラフ。
【図６】ＩＣＧ、ＰＥＧおよびＧＡを有するヒアルロン酸誘導体２の合成スキーム。
【図７】マウスへの投与量に対する色素残存率のグラフ。
【図８】（ａ）投与９時間後ならびに２４時間後の血中の色素残存率と各サンプルのＩＣＧ含率との関係を示すグラフ（ｂ）投与９時間後ならびに２４時間後の血中の色素残存率と各サンプルのＰＥＧ含率との関係を示すグラフ。
【図９】１ａ，１ｂ，１ｃ，１ｈ，１ｉ，１ｋ，１ｌ，２ａ（ＧＡ），２ａｓ（ＧＡｓ），２ｂ（ＧＡ２），２ｄ（ＧＡ３），ならびに２ｃ（ＧＡ４）の投与後２４時間目のマウスの蛍光イメージ。
【図１０】（ａ）投与後２４時間目のマウス腫瘍イメージのＳＮＲを示すグラフ（ｂ）腫瘍集積性を示すグラフ。
【図１１】腫瘍集積性と各サンプルのＩＣＧ含率、ＰＥＧ含率との関係を示すグラフ。
【図１２】３（カルボキシル基の変換率は＞９９％）の１Ｈ−ＮＭＲチャート。
【図１３】１ａの１Ｈ−ＮＭＲチャート。
【図１４】２ａ（ＧＡ）の１Ｈ−ＮＭＲチャート。
【図１５】ヒアルロン酸誘導体１ａの水溶液濃度と散乱光強度の関係。
【図１６】（ａ）１ａ，１ｂ，１ｃ，２ａｓ（ＧＡｓ）ならびに比較のためのＩＣＧの吸収スペクトル。（ｂ）１ａのレーザー波長７９０ｎｍにおける光音響信号（電圧）の時間変化スペクトル。
【図１７】本発明の化合物ならびに比較のためのＩＣＧの吸光度規格化した光音響信号の強度を示すグラフ。
【図１８】本発明の化合物について、ヒアルロン酸ユニットのみかけの分子量、ヒアルロン酸へのＩＣＧ結合数、ポリマー全体の分子量、７９０ｎｍにおけるヒアルロン酸誘導体の吸収係数のまとめ。
【図１９】（ａ）分子量５Ｋのヒアルロン酸を用いて合成したヒアルロン酸誘導体１および２におけるｃａｃとＰＥＧ含有率の関係（ｂ）分子量８Ｋのヒアルロン酸を用いて合成したヒアルロン酸誘導体１および２におけるｃａｃとＰＥＧ含有率の関係。
【図２０】（ａ）ヒアルロン酸誘導体２ｂ（ＧＡ２）のＴＥＭ観察による粒径分布（ｂ）ヒアルロン酸誘導体２ｂ（ＧＡ２）のＴＥＭ観察像（ｃ）ヒアルロン酸誘導体２ｅ（ＧＡ５）のＴＥＭ観察による粒径分布。
【図２１】（ａ）スルホニル基を有する近赤外色素を含むヒアルロン酸誘導体４の構造式。（ｂ）近赤外色素ＩＣＧ−Ｓ−ａｌｋｙｎｅの合成と（ｃ）ＩＣＧ−Ｓ−ａｌｋｙｎｅの紫外-可視-近赤外吸収スペクトル。
【図２２】ＩＣＧ−ＳおよびＰＥＧを有するヒアルロン酸誘導体４の合成スキーム。
【図２３】（ａ）ＰＥＧ−５Ｋを有する近赤外色素含有ヒアルロン酸誘導体５の構造式（ｂ）ＰＥＧ−５Ｋ−ａｌｋｙｎｅの合成スキーム。
【図２４】（ａ）ＩＣＧおよびＰＥＧ−５Ｋを有するヒアルロン酸誘導体５の合成スキーム（ｂ）近赤外色素を有する高分子量ヒアルロン酸誘導体６の合成スキーム。
【図２５】（ａ）ヒアルロン酸誘導体４ａ，４ｂ，４ｃ，５ａ，５ｂ，ならびに６ｂを投与したマウスの投与後２４時間目の蛍光イメージを示すグラフ。（ｂ）ヒアルロン酸誘導体４ａ，４ｂ，４ｃ，５ａ，５ｂ，ならびに６ｂを投与したマウスの投与後２４時間目のマウス腫瘍イメージのＳＮＲを示すグラフ。
【図２６】（ａ）ヒアルロン酸誘導体４ａ，４ｂ，４ｃ，５ａ，５ｂ，ならびに６ｂの腫瘍集積性と血中色素残存率を示すグラフ（ｂ）ヒアルロン酸誘導体４ａ，４ｂ，４ｃ，５ａ，５ｂ，ならびに６ｂの光音響信号の相対強度を示すグラフ。
【図２７】ＩＣＧ、ＰＥＧおよびＲＧＤを有するヒアルロン酸誘導体７（一般式（３１））の合成スキーム。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明の実施形態について説明する。本実施形態に係る化合物は、ＰＥＧを有するヒアルロン酸にＩＣＧ誘導体が結合した構造を有し、ＰＥＧならびにＩＣＧ誘導体は該ヒアルロン酸骨格のグルクロン酸単位に存在するカルボキシル基にリンカー分子を介して結合している。
【００２０】
本発明の実施形態は、下記一般式（１）で表される単位からなる重合体を含むヒアルロン酸誘導体であって、下記一般式（１）中、Ｒ１は、単位ごとにそれぞれ独立であって、前記重合体中、一般式（１）におけるＲ１として一般式（２）または下記一般式（２５）を有する単位、および下記一般式（３）を有する単位をそれぞれ１以上含むことを特徴とするヒアルロン酸誘導体である。
【化６】
2014185333.tif 000007
【化７】
2014185333.tif 000008
【化８】
2014185333.tif 000009
【化９】
2014185333.tif 000010
ただし、上記一般式（２）、上記一般式（３）及び上記一般式（２５）においてＬは単位ごとにそれぞれ独立であるリンカーを表し、＊は上記一般式（１）中のＮとの結合部位を指し、
上記一般式（３）においてＲ２はＨ、ＯＨ、ＯＭｅ、ＮＨ２、およびＣＯＯＨのいずれかであり、ｋは２０以上２００以下の整数である。
また、一般式（２）、（３）および（２５）におけるリンカーＬは、各々同じであってもよいし、異なってもよい。リンカーＬの例として、置換されていてもよい炭素数１乃至１０の直鎖又は分岐のアルキル基や、下記一般式（２２）乃至（２４）で示される構造が挙げられる。アルキル基の置換基として炭素数１以上３以下のアルキル基やハロゲン原子、アミノ基が挙げられる。
【化１０】
2014185333.tif 000011
一般式（２２）においてａ、ｂ、ｃはそれぞれ独立に１から１０の整数である。
【化１１】
2014185333.tif 000012
一般式（２３）においてｄ、ｅはそれぞれ独立に１から１０の整数である。
【化１２】
2014185333.tif 000013
一般式（２４）においてｆ、ｇはそれぞれ独立に１から１０の整数である。
【００２１】
Ｒ１として一般式（２）または（２５）を有する単位の数をｘ、重合体の全単位の数をＮとしたときに、ｘ，Ｎが下記式（ｉ）の関係を満たすことが望ましい。
０．１３＜ｘ／Ｎ≦０．７８  …式（ｉ）
また、Ｒ１として一般式（３）を有する単位の数をｙ、重合体の全単位の数をＮとしたときに、ｙ，Ｎが下記式（ｉｉｉ）を満たすことが望ましい。
０．２２＜ｙ／Ｎ≦０．９９  …式（ｉｉｉ）  
【００２２】
また、本発明の実施形態は、一般式（１）で表される単位からなる重合体を含むヒアルロン酸誘導体であって、上記一般式（１）中、Ｒ１は単位ごとにそれぞれ独立であって、Ｒ１は上記一般式（２）（３）（２５）および下記一般式（４）（５）（２９）より選ばれ、重合体は、少なくとも上記一般式（２）または（２５）、及び（３）をＲ１として有する単位をそれぞれ１以上含むことを特徴とするヒアルロン酸誘導体である。
【化１３】
2014185333.tif 000014
【化１４】
2014185333.tif 000015
【化１５】
2014185333.tif 000016
ただし、上記一般式（２）から（５）、（２５）及び（２９）においてＬは単位ごとにそれぞれ独立であるリンカーを表し、＊は一般式（１）中のＮとの結合部位を指し、一般式（３）においてＲ２はＨ、ＯＨ、ＯＭｅ、ＮＨ２、およびＣＯＯＨのいずれかであり、ｋは２０以上２００以下の整数であり、一般式（５）においてＲ３はＮ３、Ｈ、ＣＨ３、ＮＨ２、ＳＨ、ＣＯＯＨのいずれかである。一般式（２）から（５）、（２５）及び（２９）におけるリンカーＬは、各々同じであってもよいし、異なってもよい。リンカーＬの例として、置換されていてもよい炭素数１乃至１０の直鎖又は分岐のアルキル基や、上記一般式（２２）乃至（２４）で示される構造が挙げられる。アルキル基の置換基として炭素数１以上３以下のアルキル基やハロゲン原子、アミノ基が挙げられる。
【００２３】
さらに、本実施形態に係るヒアルロン酸誘導体は、一般式（２）または（２５）をＲ１として有する単位の数をｘ、一般式（３）をＲ１として有する単位の数をｙ、一般式（４）または（２９）をＲ１として有する単位の数をｚとしたときに、ｘ，ｙ，ｚが下記式（ｉｉ）の関係を満たすことが望ましい。
０．１３＜ｘ／（ｘ＋ｙ＋ｚ）≦０．７８  …式（ｉｉ）
また、下記式（ｉｉｉ）を満たすことが望ましい。
０．２２＜ｙ／（ｘ＋ｙ＋ｚ）≦０．９９  …式（ｉｉｉ）
【００２４】
また、本実施形態に係るヒアルロン酸誘導体は一般式（４）または（２９）をＲ１として有する単位を少なくとも１つ含むことが好ましい。
【００２５】
本発明のさらなる実施形態は、一般式（６）から（９）、（２８）及び（３０）のいずれかで表わされる単位からなる重合体を含むヒアルロン酸誘導体であって、重合体は一般式（６）または（２８）、および（７）で表わされる単位をそれぞれ１以上含むことを特徴とするヒアルロン酸誘導体である。
【化１６】
2014185333.tif 000017
【化１７】
2014185333.tif 000018
【化１８】
2014185333.tif 000019
【化１９】
2014185333.tif 000020
【化２０】
2014185333.tif 000021
【化２１】
2014185333.tif 000022
【００２６】
また、重合体中、一般式（６）または（２８）で表わされる単位の数をｘ、一般式（７）で表わされる単位の数をｙ、一般式（８）、（９）または（３０）で表わされる単位の数をｚとしたときに、ｘ、ｙ、ｚが下記式（ｉｉ）の関係を満たすことが好ましい。
０．１３＜ｘ／（ｘ＋ｙ＋ｚ）≦０．７８    式（ｉｉ）
また、下記式（ｉｉｉ）を満たすことが好ましい。
０．２２＜ｙ／（ｘ＋ｙ＋ｚ）≦０．９９  式（ｉｉｉ）
【００２７】
本発明のさらなる実施形態は、上記一般式（１）で表される単位からなる重合体を主鎖として有するヒアルロン酸誘導体であって、Ｒ１は単位ごとに独立であって、Ｒ１として、ＩＣＧ類縁体、または両親媒性分子が結合しているヒアルロン酸誘導体である。
【００２８】
ただし、ＩＣＧ類縁体をＲ１に有する単位の数をｘ、重合体の全単位の数をＮとしたときに、ｘ，Ｎは下記式（１）の関係を満たす。
０．１３＜ｘ／Ｎ≦０．７８…式（１）
【００２９】
本発明の実施形態は、本発明の化合物を有する粒子、本発明の化合物および分散媒を有する光イメージング用造影剤、さらには、上記粒子と分散媒とを有する光造影剤を含む。粒子の大きさは特に限定されないが、平均粒径が１０ｎｍ以上１８０ｎｍ以下であることが好ましく、１０ｎｍ以上１００ｎｍ以下であることがさらに好ましい。
本発明の実施形態に係る粒子は、本発明の実施形態に係る化合物が複数集まり、主に、色素部分（ＩＣＧ誘導体）が粒子の内側、ＰＥＧ部分が粒子の外側に位置するようにして、粒子状になっていると考えられる。
【００３０】
以下、本発明の実施形態の詳細について、具体例を用いて説明する。
【００３１】
本発明の実施形態のヒアルロン酸誘導体の一例として、一般式（１１）、（１２）または（３１）で示される化合物を挙げることができる。
【化２２】
2014185333.tif 000023
【化２３】
2014185333.tif 000024
【化２４】
2014185333.tif 000025
【００３２】
一般式（１１）、（１２）及び（３１）において、ＩＣＧ、ＰＥＧ、ＲＧＤはそれぞれ下記一般式（１３）、一般式（１４）、ならびに一般式（３２）で示される構造である。式（１４）において、ｋは２０〜２００の整数である。
【００３３】
式（１１）において、ｐはＩＣＧを有するヒアルロン酸単位分率で０より大きく１００未満の値であり、ｑはＰＥＧを有するヒアルロン酸単位分率で０より大きく１００未満の値であり、ｒはアジド基を有するヒアルロン酸単位分率で０あるいは０より大きく１００未満の値である。ｐ、ｑ、ｒの合計は１００である。
【００３４】
すなわち、上記式（ｉｉ）におけるｘとｙとｚとの和を１００としたときのｘ、ｙ、ｚの値がｐ、ｑ、ｒとなる。
【００３５】
上記一般式（１２）において、ＧＡは下記一般式（１５）である。
上記一般式（３１）において、ＲＧＤは、下記一般式（３２）である。
【００３６】
上記一般式（１２）において、ｐはＩＣＧを有するヒアルロン酸単位分率、ｑはＰＥＧを有するヒアルロン酸単位分率、ｒはグルコサミン（以後、ＧＡと略すことがある）基または上記ＲＧＤ（アルギニン−グリシン−アスパラギン酸ペプチド、Ａｒｇｉｎｉｎｅ−ｇｌｙｃｉｎｅ−ａｓｐａｒｔｉｃ  ａｃｉｄ  （ＲＧＤ）−ｐｅｐｔｉｄｅ））を有するヒアルロン酸単位分率、を表し、ｐ、ｑ、ｒはそれぞれ０より大きく１００未満の値であり、ｐ、ｑ、ｒの合計は１００である。
【００３７】
【化２５】
2014185333.tif 000026
【００３８】
【化２６】
2014185333.tif 000027
【００３９】
【化２７】
2014185333.tif 000028
【化２８】
2014185333.tif 000029
【００４０】
本実施形態に係る化合物において、一般式（１１）、（１２）、及び（３１）におけるｐは３以上７８以下のいずれかの値であることが好ましく、１０以上４０以下であることがさらに好ましく、１３より大きいことが特に好ましい。
【００４１】
本実施形態に係る化合物において、式（１１）、（１２）、及び（３１）におけるｑは０以上であり、９７以下である。２０以上９０以下であることがさらに好ましい。実施例で示すように、ＰＥＧ含率が高くなると、血中滞留性が増加する傾向が見られた。すなわち、ＩＣＧ含率とＰＥＧ含率を制御することで、任意の血中滞留性を有する本発明に係るヒアルロン酸誘導体を得ることができる。
【００４２】
（ヒアルロン酸）
本実施形態に係る化合物は、ヒアルロン酸を骨格としている。様々な分子量のヒアルロン酸を利用でき、分子量２５００から１１万の範囲が好ましく、５０００から２５０００が特に好ましい。５００００以上の分子量では粘性が高いことや溶媒への溶解性低下により、低分子化されたヒアルロン酸が好適に用いられる。合成の再現性の観点からは、分子量５０００から８０００のものが特に好適に用いられる。
【００４３】
本発明においては、ＩＣＧやＰＥＧを導入するため、ヒアルロン酸を修飾する。ヒアルロン酸のグルクロン酸由来のカルボキシル基に対して、アジド基を有するリンカー分子を結合させることで、下記一般式（１６）で示されるアジド基を有するヒアルロン酸誘導体を得ることができる。
【化２９】
2014185333.tif 000030
【００４４】
（ＩＣＧ誘導体）
本実施形態に係る化合物は、ヒアルロン酸にＩＣＧ誘導体が結合している。近赤外色素であるＩＣＧ誘導体は、本明細書では、トリカルボシアニン系の化合物のことをいう。本実施形態において、トリカルボシアニン系の化合物の構造は、例えば、一般式（１７）で表される。
【化３０】
2014185333.tif 000031
【００４５】
一般式（１７）において、Ｚは水素原子、スルホ基、またはＺに結合したインドール環と共にベンズ［ｅ］インドール環、ベンズ［ｆ］インドール環、またはベンズ［ｇ］インドール環からなる環状芳香族環を形成し、さらに該環状芳香族環の水素原子は炭素数１乃至１０のアルキル基、炭素数１乃至１０のアルコキシ基、スルホ基で置換されていてもよい。一般式（１７）において＊が結合する構造は特に限定されないが、下記一般式（１８）や一般式（１９）の同位置の構造における窒素に結合したものが例として挙げられる。
【００４６】
式（１７）において、Ｒ４は、炭素数１乃至１０のアルキル基、−（ＣＨ２）ｉ−ＳＯ３−（ｉは１乃至１０のいずれかの整数）のいずれかである。Ｒ４がアルキル基である場合、ハロゲンイオン、または有機酸イオンが対イオンとして含まれていても良い。Ｒ５、Ｒ６はそれぞれ独立に、水素原子、炭素数１乃至１０のアルキル基、炭素数１乃至１０のアルコキシ基、−（ＣＨ２）ｉ−ＳＯ３−（ｉは１乃至１０のいずれかの整数）、−（ＣＨ２）ｉ−ＳＯ３Ｘ（ｉは１乃至１０の整数であり、Ｘはナトリウム、カリウム、アンモニウム、トリエチルアンモニウム、リジン、アルギニンのいずれかである）のいずれかである。式（１３）において、ｈは１乃至１０のいずれかの整数である。式（１７）において、ｎは３である。
【００４７】
上記一般式（１７）の例として、下記一般式（１８）で示されるＩＣＧ誘導体（ＩＣＧ−ＡＴＴ）や下記一般式（２６）で示されるＩＣＧ誘導体（ＩＣＧ−Ｓ−ＯＳｕ）が好ましい。
【化３１】
2014185333.tif 000032
【化３２】
2014185333.tif 000033
【００４８】
アジド基を有するヒアルロン酸へＩＣＧ誘導体を結合させるために、アルキンを有するＩＣＧ誘導体を利用することができる。たとえば、下記式（１９）や下記式（２７）に示される化合物を用いることができる。
【化３３】
2014185333.tif 000034
【化３４】
2014185333.tif 000035
【００４９】
（ＰＥＧ）
本実施形態に係る化合物は、ヒアルロン酸にＰＥＧが結合している。本実施形態に係る化合物を調製するために用いるＰＥＧは、水溶性の高分子であり、タンパク質の血清半減期の増加や免疫原性の低下などの効果を奏する。本実施形態において、アジド基を有するヒアルロン酸誘導体へＰＥＧを結合させるために、アルキンを有するＰＥＧ誘導体を利用することができる。たとえば、下記一般式（２０）に示される化合物を用いることができる。式（２０）中のｋはＰＥＧの繰り返し単位数を表しており、特に制限されないが、２０から１０００の範囲のものを用いることができる。特に５０〜１２５程度が好ましい。つまり、ＰＥＧの分子量として、およそ１０００から４００００の範囲であり、特に２０００〜５０００が好ましい。
【化３５】
2014185333.tif 000036
【００５０】
（捕捉分子）
また、本実施形態に係る化合物は、標的部位に特異的に結合する捕捉分子を有していてもよい。本実施形態における捕捉分子とは、腫瘍などの標的部位に特異的に結合する物質、標的部位の周辺に存在する物質に特異的に結合する物質などであり、生体分子や医薬品等の化学物質などから任意に選択することができる。具体的には、抗体、抗体フラグメント、酵素、生物活性ペプチド、グリコペプチド、糖鎖、脂質、核酸、分子認識化合物などが挙げられる。これらの物質は単独で用いることもできるし、あるいは複数を組み合わせて用いることもできる。捕捉分子が化学結合された本実施形態に係る化合物を用いることで、標的部位の特異的な検出、標的物質の動態、局在、薬効、代謝等の追跡を行うことができる。
【００５１】
本実施形態において、アジド基を有するヒアルロン酸誘導体へ捕捉分子を結合させるために、アルキンを有する捕捉分子を利用することができる。たとえば、下記一般式（２１）に示されるグルコサミン誘導体を用いることができる。グルコサミン誘導体はグルコサミンのトランスポーター、あるいはグルコースのトランスポーターへの親和性を有しており、これらのトランスポーターを発現している細胞へのターゲッティング能を本発明に係る化合物に付与することができる。
【化３６】
2014185333.tif 000037
【００５２】
（化合物の調製方法）
本実施形態における化合物は、ＰＥＧならびにＩＣＧ誘導体を、ヒアルロン酸誘導体の官能基を介して公知のカップリング反応によって結合することによって調製することができる。たとえば、ＰＥＧならびにＩＣＧ誘導体を、ヒアルロン酸誘導体のアジド基を介してクリック反応によって結合することによって調製することができる。具体的には、アルキン化されたＩＣＧ誘導体、ならびにＰＥＧ誘導体を、ヒアルロン酸に予め修飾しておいたアジド基とクリック反応させる。反応は、ＩＣＧ含率を高めるために、アルキン化ＩＣＧ誘導体とアルキン化ＰＥＧ誘導体を同時に反応させることが好ましい。アルキン化ＩＣＧ誘導体とアルキン化ＰＥＧ誘導体に加え、アルキン化捕捉分子を反応させることで、補足分子を結合させたＩＣＧとＰＥＧを結合したヒアルロン酸誘導体を得ることができる。ＩＣＧとＰＥＧを結合したヒアルロン酸誘導体は、透析法、限外濾過法、サイズ排除カラムクロマトグラフィー法等の公知の精製法により洗浄、精製することができる。ＩＣＧ誘導体、ＰＥＧ、ならびに捕捉分子とヒアルロン酸との結合は、種々の架橋剤（クロスリンカー）を介して結合されていても良い。たとえば、ヒアルロン酸への捕捉分子の結合のために、ＰＥＧ分子を介して結合させることができる。
【００５３】
（光イメージング用造影剤）
本実施形態に係る光イメージング用造影剤は、本実施形態に係る化合物と、分散媒とを有する。また、本実施形態に係る光イメージング用造影剤は、必要に応じて本実施形態に係る化合物の他に薬理上許容できる添加物、例えば血管拡張剤などを有していても良い。
【００５４】
分散媒は、本実施形態に係る化合物を分散させるための液状の物質であり、例えば生理食塩水、注射用蒸留水、リン酸緩衝生理食塩水、ブドウ糖水溶液などが挙げられる。本実施形態に係る光イメージング用造影剤は、上記本実施形態に係る化合物をこの分散媒に予め分散させておいてもよいし、本実施形態に係る粒子と分散媒とをキットにしておき、生体内に投与する前に粒子を分散媒に分散させて使用してもよい。
【００５５】
本実施形態において光イメージングとは、光を照射することで、イメージング（画像化）することを意味する。すなわち、本実施形態に係る光イメージング用造影剤に光が照射されることで、音響波や蛍光などを発する。発せられた音響波を検出することで光音響イメージングをすることができ、発せられた蛍光を検出することで蛍光イメージングをすることができる。なお、光音響イメージングは、光音響トモグラフィー（断層撮影法）を含む概念である。本実施形態に係る光イメージング用造影剤が蛍光イメージングに用いられる場合、蛍光イメージング用造影剤、光音響イメージングに用いられる場合、光音響イメージング用造影剤と呼ぶことがある。
【００５６】
本実施形態に係る光イメージング用造影剤は、ＥＰＲ効果を利用することで、生体内に投与したときに、生体内の正常部位に比べて腫瘍部位により多く集積させることができる。その結果、本実施形態に係る光イメージング用造影剤を生体内に投与した後、生体に光を照射して、生体からの音響波を検出するときに、腫瘍部位から発せられる音響波を正常部位から発せられる音響波よりも大きくすることができる。
【００５７】
また、本実施形態に係る光イメージング用造影剤は血管、リンパ管、リンパ節等の造影に用いることもできる。さらに、センチネルリンパ節の造影剤に用いることが特に好ましい。これはＩＣＧ単独と比べてもサイズが大きいためにセンチネルリンパ節により留まりやすく集積性が向上されることが期待されるからである。
【００５８】
（光音響イメージング方法）
生体内に投与された本実施形態に係る化合物を、光音響イメージング装置を用いて検出する方法について説明する。本実施形態に係る化合物を検出する方法は以下の（ａ）、（ｂ）の工程を有する。但し、本実施形態に係る光音響イメージング方法は、以下に示す工程以外の工程を含んでいても良い。
（ａ）本実施形態に係る化合物が投与された検体に６００ｎｍ乃至１３００ｎｍの波長領域の光を照射する工程
（ｂ）前記検体内に存在する前記化合物から発生する音響波を検出する工程
また、本実施形態に係る化合物を検出する方法は、前記（ｂ）で得られた音響波の波長、位相および時間情報等から空間的な光音響信号強度分布を再構成する工程を有していてもよい。なお、前記（ｂ）の工程で得られた光音響信号の波長、位相および時間情報を基に３次元的な画像再構成を行うことができる。画像再構成によって得られるデータは光音響信号の強度分布の位置情報が把握できるものであればどのような形態を取っても構わない。例えば３次元空間上に光音響信号強度が表現されるようなものでも構わないし、２次元平面上に光音響信号強度に表現されるようなものでも構わない。また、同一の観察対象に対して異なる撮像方法で情報を取得し、それらの情報と光音響信号の強度分布の位置的な対応関係を取得することも可能である。
【００５９】
上記（ａ）の工程において、経口投与や注射等の方法によって本実施形態に係る化合物を投与された検体を用いることができる。
【００６０】
また、上記（ｂ）の工程において、検体に照射する光を発生させる装置、本実施形態に係る化合物から発せられる光音響信号を検出する装置は特に限定されない。
上記（ｂ）の工程において検体に光を照射する光源としては、前記検体に対し６００ｎｍ乃至１３００ｎｍの範囲から選択される少なくとも１つの波長のレーザーパルス光を照射させることのできるものであれば限定されない。レーザーパルス光を照射する装置として、例えば、チタンサファイアレーザー（ＬＴ−２２１１−ＰＣ、Ｌｏｔｉｓ社製）、ＯＰＯレーザー（ＬＴ−２２１４  ＯＰＯ、Ｌｏｔｉｓ社製）、アレキサンドライトレーザーが挙げられる。
【００６１】
音響波を検出する装置は特に制限されず種々のものを用いることが可能である。例えば、市販の光音響イメージング装置（Ｎｅｘｕｓ１２８，Ｅｎｄｒａ  Ｉｎｃ．製）を用いて行うことができる。
【００６２】
本実施形態に係る化合物を用いたイメージング方法は、上記（ａ）、（ｂ）の工程を経ることで腫瘍、リンパ節あるいは血管などの目的とする部位を造影することができる。
【００６３】
（ヒアルロン酸誘導体の製造方法）
本実施形態における、ヒアルロン酸誘導体の製造方法は、両親媒性分子の存在下で、ＩＣＧ誘導体とヒアルロン酸を反応させることを特徴とする。両親媒性分子としてポリエチレングリコールが好ましい。
ＩＣＧ類縁体をヒアルロン酸に結合させるときに、両親媒性分子が存在することで、ヒアルロン酸の凝集が抑制される。その結果、ＩＣＧ誘導体がヒアルロン酸に多く結合する。
【実施例】
【００６４】
以下に、本発明の特徴をさらに明らかにするために実施例に沿って本発明を説明するが、本発明はこの実施例によって制限されるものではない。なお、本明細書および図面中の化学構造式においては、慣用的な表現法に従い、炭素原子や水素原子を省略して示していることもある。
【００６５】
（実施例１：近赤外色素を含むヒアルロン酸誘導体の合成）
ヒアルロン酸誘導体として、１および２を以下のスキームで合成した（図１（ａ））。原料として、分子量の異なる６種類の低分子量ヒアルロン酸ナトリウム塩（ＨＡ−Ｎａ）を用いた（分子量ＭＷ（ＨＡ−Ｎａ）＝２．５Ｋ、５Ｋ、８Ｋ、２５Ｋ、５０Ｋ、１１０Ｋ）。なお、分子量２．５Ｋ、１１０ＫのＨＡ−Ｎａは、キッコーマンバイオケミファ株式会社製マイクロヒアルロン酸ＦＣＨおよびキッコーマンバイオケミファ株式会社製ヒアルロン酸ＦＣＨを利用した。また、分子量５Ｋ、８Ｋ、２５Ｋ、５０ＫのＨＡ−Ｎａは、既知の手法（特許文献３）を用いてヒアルロン酸ＦＣＨ（分子量１１０Ｋ）を低分子量化し、原料として用いた。
【００６６】
分子量５Ｋ、８Ｋ、２５Ｋ、５０ＫのＨＡ−Ｎａは、以下に示す手法で低分子量化により得られた。ＨＡ−Ｎａ  ５．２ｇ（１３ｍｍｏｌ）を純水（１５０ｍＬ）に溶解させた。６．６ＮＨＣｌ水溶液（１５ｍｌ）を加え、７０℃で撹拌した。所定時間後１０％ＮａＯＨ水溶液で中和し、溶媒を留去した。得られた白色固体を水に溶解させ、排除分子量１Ｋの透析膜（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｉｎｃ．製Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ  ６）を用いて、２４時間透析した。続いて凍結乾燥を行い、ＨＡ−Ｎａを白色固体２．９ｇ（５５％）として得た。分子量５Ｋ、８Ｋ、２５Ｋ、５０ＫのＨＡ−Ｎａは、ＨＡ−Ｎａの酸処理を各々反応時間６時間、４時間、３時間、２時間行うことで得られる。
ヒアルロン酸の分子量は、サイズ排除クロマトグラフィーにより決定した。測定条件は以下の通り。溶離液：０．２Ｍ  ＮａＣｌ水溶液、流速：０．５ｍｌ／ｍｉｎ、カラム：Ｓｈｏｄｅｘ  ＳＢ−８０３  ＨＱ（昭和電工株式会社製）、標準物質：プルラン（昭和電工株式会社製ＳＴＤ−Ｐシリーズ）。なお、キッコーマンバイオケミファ株式会社から購入の低分子ヒアルロン酸（ＦＣＨ−ＳＵ、分子量１１０Ｋ）およびマイクロヒアルロン酸ＦＣＨ（分子量２．５Ｋ）は、上記条件下でいずれも対応する数平均分子量を示した。
【００６７】
（実施例１（１）近赤外発光性化合物ＩＣＧ−ａｌｋｙｎｅの合成）
近赤外発光性化合物ＩＣＧ−ａｌｋｙｎｅの合成スキームを図１（ｂ）に示す。詳細は以下の通りである。５０ｍｌ一つ口ナス型フラスコに、既知のインドシアニングリーン誘導体ＩＣＧ−ＡＴＴ（非特許文献３）０．１０ｇ（０．３２ｍｍｏｌ）を入れ、アセトニトリル２ｍｌに溶解させた。ここにプロパルギルアミン（２５μＬ，０．３９ｍｍｏｌ）を０℃で加え、２時間攪拌した。この溶液に０．１Ｎ塩酸１０ｍｌを加え、水層をＣＨ２Ｃｌ２で抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄した後、硫酸マグネシウムで乾燥させた。溶媒を減圧留去し、得られた濃緑色固体を遠心沈降（ＣＨ２Ｃｌ２／Ｅｔ２Ｏ）により精製した。濃緑色固体を少量の酢酸エチルで洗浄し、減圧乾燥後、ＩＣＧ−ａｌｋｙｎｅを濃緑色固体８２ｍｇ（８２％）として得た。同定は１Ｈ−ＮＭＲ、ＦＡＢ−ＭＳにより行った。結果は、次の通りであった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３、２５℃、ＴＭＳ）δ／ｐｐｍ；１．４７（ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，３Ｈ），１．５７−１．７０（ｍ，２Ｈ），１．７８−１．８６（ｍ，２Ｈ），１．８６−１．９６（ｍ，２Ｈ），１．９６（ｓ，６Ｈ），２．００（ｓ，６Ｈ），２．１５（ｔ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，１Ｈ），２．４２（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，２Ｈ），４．０４（ｄｄ，Ｊ＝２．４，５．４Ｈｚ，２Ｈ），４．１０−４．２８（ｍ，４Ｈ），６．１１−６．２０（ｍ，１Ｈ），６．４０−６．５８（ｍ，１Ｈ），６．６２−６．７６（ｍ，１Ｈ），６．８５−６．９６（ｍ，１Ｈ），７．０４−７．１３（ｍ，１Ｈ），７．３１（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ），７．３９（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ），７．４３−７．４９（ｍ，２Ｈ），７．５６−７．６３（ｍ，２Ｈ），７．８８−７．９７（ｍ，６Ｈ），８．０６−８．１４（ｍ，２Ｈ）．ＦＡＢ−ＨＲＭＳｍ／ｅ６６０．３９６４［Ｍ］＋。なお、ＩＣＧ−ａｌｋｙｎｅの近赤外領域における光吸収スペクトルは図１（ｃ）に示すとおりである（溶媒：クロロホルム（１．０×１０−６Ｍ））。８０２ｎｍに吸収極大を有する。モル吸光係数は１．８×１０５（Ｍ−１ｃｍ−１）であった。
【００６８】
（実施例１（２）ヒアルロン酸のテトラブチルアンモニウム塩ＨＡ−ＮＢｕ４の合成）
高分子量のＨＡ−Ｎａは有機溶媒への溶解度が低く、対応するアンモニウム塩に変換し、様々な変換反応に付される（非特許文献４、非特許文献５）。本発明で利用した低分子ヒアルロン酸ナトリウム塩ＨＡ−Ｎａも有機溶媒に対し難溶であったため、同様にアンモニウム塩に変換し、縮合反応に利用した。ヒアルロン酸のテトラブチルアンモニウム塩ＨＡ−ＮＢｕ４の合成概略を以下に示す（図２）。１００ｍｌ一つ口ナス型フラスコに、低分子ヒアルロン酸ナトリウム塩ＨＡ−Ｎａ  ０．８０ｇ（ＭＷ（ＨＡ−Ｎａ）＝８Ｋ、単位ユニット換算で２．０ｍｍｏｌ）を入れ、水５ｍｌに溶解させた。ここに、水酸化テトラブチルアンモニウムでカチオン交換されたカチオン交換樹脂ＤＯＷＥＸ（１．９ｇ、４．０ｍｍｏｌ相当）を加え、室温で終夜攪拌した。グラスフィルターによりＤＯＷＥＸを除去した後、凍結乾燥により、ヒアルロン酸のテトラブチルアンモニウム塩ＨＡ−ＮＢｕ４を白色固体１．１ｇ（８５％）として得た。同定は１Ｈ−ＮＭＲにより行った。（１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ、２５℃）δ／ｐｐｍ；０．８１−０．８５（ｂｒ  ｍ，１２Ｈ），１．２２−１．２７（ｂｒ  ｍ，８Ｈ），１．５３−１．５４（ｂｒ  ｍ，８Ｈ），１．８８（ｓ，３Ｈ），３．０６−３．１０（ｂｒ  ｍ，８Ｈ），３．３１−３．９２（ｍ，１０Ｈ），４．４５（ｂｒ  ｓ，２Ｈ）．）。
【００６９】
同様の反応を、分子量２．５Ｋ、５ＫのＨＡ−Ｎａを用いて行い、対応する生成物を得た。それぞれ収率は８３％、９９％であった。しかし、分子量２５Ｋ、５０Ｋ、１１０ＫのＨＡ−Ｎａは水への溶解性が悪く、対応するアンモニウム塩を得るためには用いる水の量を増やす必要がある。それぞれの収率は、６２％、６８％、６４％であった。
【００７０】
（実施例１（３）アジド基を有するヒアルロン酸誘導体３の合成）
近赤外色素やＰＥＧ、ＧＡなどを修飾する足場となるアジド基を有するヒアルロン酸誘導体３の合成を以下に示す（図３（ａ））。窒素雰囲気下、５０ｍｌシュレンク管にＨＡ−ＮＢｕ４  ０．２５ｇ（ＭＷ（ＨＡ−Ｎａ）＝８Ｋ、単位ユニット換算で０．４０ｍｍｏｌ）を入れ、無水ＤＭＳＯ  ４．０ｍｌに溶解させた。ここに（ｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌ−１−ｙｌｏｘｙ）ｔｒｉｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｏｐｈｏｓｐｈｏｎｉｕｍ  ｈｅｘａｆｌｕｏｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＰｙＢＯＰ）１．７ｇ（３．２ｍｍｏｌ）と１−ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ（ＨＯＢｔ）０．４３ｇ（３．２ｍｍｏｌ）を加えた後、３−ａｚｉｄｏ−１−ｐｒｏｐｙｌａｍｉｎｅ（非特許文献６）０．６４ｇ（６．４ｍｍｏｌ）を加え、室温で２０時間攪拌した。この溶液に水を加え、水層をＣＨ２Ｃｌ２により洗浄し、水層を排除分子量３．５Ｋの透析膜を用いて、２４時間透析した。続いて凍結乾燥を行い、アジド基を有するヒアルロン酸誘導体３を白色固体０．１３ｇ（７０％）として得た。同定は１Ｈ−ＮＭＲにより行った。（１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ、２５℃）δ／ｐｐｍ；１．６７（ｓ，２Ｈ），１．８７（ｓ，３Ｈ），３．０５−３．８０（ｍ，１４Ｈ），４．３７（ｍ，２Ｈ））。図１２に３のＮＭＲチャートを代表例として示した。
【００７１】
同様の反応を、分子量２．５Ｋ、５Ｋ、２５Ｋ、５０Ｋ、１１０ＫのＨＡ−Ｎａを用いて行い、対応する生成物を得た。それぞれ８５％、６６％、９９％、９９％、９９％であった（カルボキシル基の変換率は＞９９％）。しかし、上記同条件下における分子量２．５Ｋ、１１０ＫのＨＡ−ＮＢｕ４の反応では、カルボキシル基の変換率の再現性が乏しい。また、分子量１１０ＫのＨＡ−ＮＢｕ４の反応では、ＤＭＳＯを１５ｍｌ用いる必要があり、縮合反応に対する反応性も他に比べて低い。これらの結果から、本発明の近赤外色素を含むヒアルロン酸誘導体の合成においては、分子量は５Ｋから５０Ｋが好ましいことがわかった。
【００７２】
（実施例１（４）アジド基を有するアミンのヒアルロン酸への導入率の調節）
実施例１（３）で示すように、用いる３−ａｚｉｄｏ−１−ｐｒｏｐｙｌａｍｉｎｅと縮合剤の当量数を各々１６当量、８当量とすることで、ヒアルロン酸に含まれるカルボキシル基をほぼ完全に変換できる。一方、用いる３−ａｚｉｄｏ−１−ｐｒｏｐｙｌａｍｉｎｅと縮合剤の当量数を減らすことで、３−ａｚｉｄｏ−１−ｐｒｏｐｙｌａｍｉｎｅの導入効率を調節することが可能である（図３（ｂ）および表１）。なお、図３（ｂ）中の中括弧は、３−ａｚｉｄｏ−１−ｐｒｏｐｙｌａｍｉｎｅがランダムに導入されていることを示す。３−ａｚｉｄｏ−１−ｐｒｏｐｙｌａｍｉｎｅの導入効率は、ヒアルロン酸に含まれるＮ−アセチル基の３Ｈ（１．８７ｐｐｍ）と導入される３−ａｚｉｄｏ−１−ｐｒｏｐｙｌａｍｉｎｅの２位の２Ｈ（１．６７ｐｐｍ）の比より算出した。また収率は、１Ｈ−ＮＭＲより求めた導入効率を基に算出される分子量を用いて決定した。
【００７３】
【表１】
2014185333.tif 000038
【００７４】
（比較例１：ＩＣＧを有するヒアルロン酸誘導体ＨＡ−ＩＣＧの合成）
比較例としてのＩＣＧのみを有するヒアルロン酸誘導体ＨＡ−ＩＣＧの合成を以下に示す（図４（ａ））。窒素雰囲気下、２５ｍｌシュレンク管に３を４１ｍｇ（ＭＷ（ＨＡ−Ｎａ）＝８Ｋ、単位ユニット換算で０．１０ｍｍｏｌ、アジ化効率〜１０％）入れ、無水ＤＭＦ２ｍｌに溶解させた。ここにＩＣＧ−Ａｌｋｙｎｅ  １４ｍｇ（２０μｍｏｌ）を加えた後、ＣｕＩ  ３．８ｍｇ（２０μｍｏｌ）、１，８−ｄｉａｚａｂｉｃｙｃｌｏ［５．４．０］ｕｎｄｅｃ−７−ｅｎｅ（ＤＢＵ）３．０ｍｇ（２０μｍｏｌ）を加え、６０°Ｃで終夜攪拌した。この溶液に水２ｍｌを加え、これを排除分子量１Ｋの透析膜を用いて、２４時間水に対し透析した。フィルター（細孔径：０．４５μｍ）を用いて得られた水溶液をろ過し、凍結乾燥することで、ＩＣＧを有するヒアルロン酸誘導体ＨＡ−ＩＣＧ−ａ  ２２ｍｇ（５１％）を淡緑色固体として得た。同定は１Ｈ−ＮＭＲにより行った。（１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ、２５℃）δ／ｐｐｍ；１．６０−１．７０（ｍ，０．２３Ｈ），１．８９（ｂｒ  ｓ，３Ｈ），３．２０−３．８５（ｍ，１１Ｈ），４．３０−４．５０（ｍ，２Ｈ））。
【００７５】
なおＩＣＧ部位の導入率は、ＩＣＧを有するヒアルロン酸誘導体のＤＭＦ−Ｈ２Ｏ（１：１）混合溶液のＵＶスペクトルを測定し、ＩＣＧ−ａｌｋｙｎｅを標準物質として用い、最大吸収波長（７９０ｎｍ付近）の吸光度を基に決定した。また収率は、ＩＣＧ部位の導入率を基に算出される分子量を用いて決定した。ＨＡ−ＩＣＧ−ｂはＩＣＧ部位の導入率が低いため（分子あたりの導入率１％）、粒子の形成は確認されなかった（動的光散乱（ｄｙｎａｍｉｃ  ｌｉｇｈｔ  ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ：ＤＬＳ）において散乱光がほとんど確認されなかった）。
【００７６】
銅化合物およびＤＢＵの量を１当量以下にすると、ＩＣＧ部位はほとんど導入されない。また、本反応は再現性に乏しく、全くＩＣＧ部位が導入されないことも多い。同様の反応は、分子量５Ｋの３を用いても進行するが、同様に再現性に乏しい。
ヒアルロン酸誘導体が形成する自己集合体のＤＬＳによる粒径の測定は、大塚電子株式会社製ＦＰＡＲ−１０００を用い行った。サンプルはＭｉｌｌｉＱ水に溶解させ、測定前にＰＶＤＦフィルター（孔径０．４５μｍ）を用い、ろ過した（サンプル濃度：１〜２ｇ／Ｌ）。散乱角９０°の散乱光測定を２５℃で３分間行った。測定は各三回ずつ行い、再現性を確認している。ヒアルロン酸誘導体が形成する自己集合体の静的光散乱法（ｓｔａｔｉｃ  ｌｉｇｈｔ  ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ：ＳＬＳ）による臨界凝集濃度（ｃｒｉｔｉｃａｌ  ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ：ｃａｃ）の決定は、大塚電子株式会社製ＳＬＳ−６０００を用いて行った。サンプルはＭｉｌｌｉＱ水に溶解させ、測定前にＰＶＤＦフィルター（孔径０．４５μｍ）を用い、ろ過した。様々な濃度のヒアルロン酸誘導体水溶液の散乱角９０°の散乱光測定を２５℃で３分間ずつ行った。測定は各３回ずつ行い、再現性を確認している。代表的なＳＬＳ測定結果を図１５に示す。
【００７７】
ＤＬＳより測定したヒアルロン酸誘導体の粒径は、１２０〜１５０ｎｍ程度であった。ＩＣＧの導入率が低いＨＡ−ＩＣＧ−ｂは、粒径の測定ができなかった。ＨＡ−ＩＣＧ−ａとＨＡ−ＩＣＧ−ｃのｃａｃは、非常に小さい値となり、希薄環境でも安定な粒子を形成することが分かった。
【００７８】
（実施例１（５）ＩＣＧおよびＰＥＧを有するヒアルロン酸誘導体１の合成）
アジド基を有するヒアルロン酸誘導体３に対し、ＩＣＧ−ＡｌｋｙｎｅとＰＥＧ−Ａｌｋｙｎｅ（非特許文献７）を同時に作用させることで、ＩＣＧおよびＰＥＧを有する様々なヒアルロン酸誘導体１を得ることができる（図４（ｂ）および表２）。代表的な合成例を以下に示す。窒素雰囲気下、２５ｍｌシュレンク管に３  ２３ｍｇ（ＭＷ（ＨＡ−Ｎａ）＝８Ｋ、単位ユニット換算で５０μｍｏｌ、アジ化効率＞９９％）を入れ、無水ＤＭＦ２ｍｌに溶解させた。ここにＩＣＧ−Ａｌｋｙｎｅ  ８．８ｍｇ（１３μｍｏｌ）、ＰＥＧ−Ａｌｋｙｎｅ  ０．１８ｇ（８８μｍｏｌ）を加えた後、ＣｕＩ  ２．９ｍｇ（１５μｍｏｌ）、ＤＢＵ  ２．３ｍｇ（１５μｍｏｌ）を加え、６０℃で終夜攪拌した。この溶液に水２ｍｌを加え、これを排除分子量２５Ｋの透析膜を用いて、２４時間水に対し透析した。フィルター（細孔径：０．４５μｍ）を用いて得られた水溶液をろ過し、凍結乾燥することで、ＩＣＧおよびＰＥＧを有するヒアルロン酸誘導体１  ４８ｍｇ（６０％）を深緑色固体として得た。同定は１Ｈ−ＮＭＲにより行った。（１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ、２５℃）δ／ｐｐｍ；１．８０−２．１５（ｍ，３Ｈ），３．１０−３．９０（ｍ，１８３Ｈ），４．３０−４．５０（ｍ，２Ｈ），７．９３（ｂｒ  ｓ，０．９６Ｈ））。図１３に１の１Ｈ−ＮＭＲチャートを代表例として示した。
【００７９】
なお環化反応の転換率は、１Ｈ−ＮＭＲより３−ａｚｉｄｏ−１−ｐｒｏｐｙｌａｍｉｎｅの２位の２Ｈ（１．６７ｐｐｍ）の減少率を基に算出した。ＩＣＧ部位の導入率は、ＩＣＧおよびＰＥＧを有するヒアルロン酸誘導体のＤＭＦ溶液のＵＶスペクトルを測定し、ＩＣＧ−ａｌｋｙｎｅを標準物質として用い、最大吸収波長（７９０ｎｍ付近）の吸光度を基に決定した。ＰＥＧ部位の導入率は、アジド基の転換率とＩＣＧ部位の導入率から算出した。また収率は、ＩＣＧおよびＰＥＧ部位の導入率を基に算出される分子量を用いて決定した。
【００８０】
表２に示すように、ＩＣＧ導入率の高いヒアルロン酸誘導体が得られている。一方、上記比較例１（ＩＣＧを有するヒアルロン酸誘導体ＨＡ−ＩＣＧの合成）で示されたように、ＰＥＧ−ａｌｋｙｎｅを用いず、アジド基を有するヒアルロン酸誘導体３にＩＣＧ−ａｌｋｙｎｅを作用させることで、ＩＣＧのみを有するヒアルロン酸誘導体の合成を試みたが、ＩＣＧ導入率の高いヒアルロン酸誘導体の合成は困難であり、最大１０％程度の導入率にとどまった。つまり、ＩＣＧ導入率の高いヒアルロン酸誘導体を得るためには、ＰＥＧをヒアルロン酸に導入することが必須であり、かつＩＣＧ−ＡｌｋｙｎｅとＰＥＧ−Ａｌｋｙｎｅを同時に反応させることが重要であることを見出した。また、ＤＬＳから測定された粒子径も、１００から２００ナノメートル程度であり、ＥＰＲ効果による腫瘍ターゲッティング剤としての条件を満たしていることがわかった。
【００８１】
なお、ＩＣＧ導入率５３％、６６％、７８％のヒアルロン酸誘導体１ｂ、１ｃおよび１ｄは、水に難溶である。１ｂと１ｃは、ＤＭＦに溶解させたポリマー溶液を水に分散させることで、粒子を形成させることができる。しかし、１ｄは同様の手法で調製した場合でも、水に不溶な固体が析出し、サンプル全体を均一に溶解させることは困難であった。不溶な固体を除去した後の水溶液に含まれるポリマーは、収率６６％（ＩＣＧ含有率５７％）に相当し、ＩＣＧ含有率の高いヒアルロン酸誘導体が水に不溶となり析出したと考えられる。一方、ＩＣＧの導入率が０％、すなわちＰＥＧのみで修飾されたヒアルロン酸誘導体１ｅは、水中で粒子の形成は確認できなかったが、ＩＣＧの導入率１％のヒアルロン酸誘導体１ｆでは、直径１５７ｎｍの粒子の形成を確認できた。これらを踏まえ、ＩＣＧとＰＥＧで修飾されたヒアルロン酸誘導体について、水中でナノ粒子を形成するためのＩＣＧの導入率は、１％から６５％程度までであると言える。
【００８２】
ｃａｃは、分子量が８Ｋよりも５Ｋの方が全体的に小さい値となり、安定な粒子を形成しやすいことが分かった。また、ＰＥＧ導入率の大きなヒアルロン酸誘導体ほど安定な粒を形成することも分かった。
【００８３】
粒子の形状は、日本電子株式会社製透過型電子顕微鏡（Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ：ＴＥＭ）ＪＥＭ−１４００により観察した。サンプルは、ヒアルロン酸誘導体１の水溶液（１ｍｇ／ｍｌ）を日新ＥＭ株式会社製コロジオン膜貼付メッシュ（２００メッシュ）に載せ、風乾させることで準備した。加速電圧１２０ｋＶのもと、ＴＥＭモードにてサンプルを観察した。粒子径分布は、一サンプルあたり１００個以上の粒子像を観察し、その粒子径をもとに平均粒子径と標準偏差を算出した。透過型電子顕微鏡観察による１ａ、１ｈ、１ｎの平均粒子径±標準偏差は、それぞれ、４１±１８ｎｍ、１１７±２８ｎｍ、２６±１０ｎｍであった。
【００８４】
図５（ａ）は粒子径とＩＣＧ含有率の関係を示したものである（表２からのデータ）。図５（ａ）より、ＩＣＧ含有率が高いと粒子径が小さくなる傾向があることがわかった。これはＩＣＧ含有率の増加は疎水性が強くなり、水中における会合能が高まったこと、あるいはミセルやベシクルのような会合体の形状が異なることが原因と考えられる。この結果より、ＩＣＧ含有率を高めることは、造影剤の感度向上に寄与するのみならず、粒子サイズを小さくすることにも寄与し、後述する実施例で示されたように、良好な体内動態を発揮させるために重要であることがわかった。
【００８５】
凍結乾燥後固体状態でしばらく保管したヒアルロン酸誘導体１は、水に対する溶解度が極端に低下する。１の水溶液は、凍結乾燥後に調製することが望ましい。水に対する溶解度の低い１は、ＤＭＦに溶解させ、このＤＭＦ溶液を同容量の水に分散させた溶液を水に対し透析、凍結乾燥することで、水に対し溶解性の高いヒアルロン酸誘導体を再度得ることができる。
【００８６】
表２で示すように、同様の反応は、分子量５Ｋの３を用いて行い、対応する生成物を得ることができる。しかし、上記同条件下における分子量２５Ｋの３を用いる反応では、うまく反応が進行することもあるが（ヒアルロン酸誘導体１ｎ）、収率も低く再現性は低い。また、分子量５０Ｋの３を用いる反応は、ほとんど進行しなかった。
【００８７】
表３に、比較例１ならびに実施例１（５）の結果より、ヒアルロン酸誘導体の合成収率と再現性をまとめた。表３からわかるように、本合成法を用いてＩＣＧおよびＰＥＧを有するヒアルロン酸誘導体を効率良く合成するためには、用いるヒアルロン酸の分子量は５Ｋから２５Ｋ程度が適しており、５Ｋから８Ｋがより望ましい。図５（ｂ）には粒子径とヒアルロン酸分子量の関係を示したものであり、８Ｋの方が５Ｋに比べて粒子径が小さくなる傾向があることが分かった。
【００８８】
【表２】
2014185333.tif 000039
【００８９】
【表３】
2014185333.tif 000040
【００９０】
（実施例１（６）ＩＣＧ、ＰＥＧおよびＧＡを有するヒアルロン酸誘導体２の合成）
アジド基を有するヒアルロン酸誘導体３に対し、ＩＣＧ−Ａｌｋｙｎｅ、ＰＥＧ−ＡｌｋｙｎｅおよびＧＡ−Ａｌｋｙｎｅ（非特許文献８）を同時に作用させることで、ＩＣＧ、ＰＥＧおよびＧＡを有する様々なヒアルロン酸誘導体２を得ることができる（図６および表４）。代表的な合成例を以下に示す。窒素雰囲気下、２５ｍｌシュレンク管に３  ２３ｍｇ（単位ユニット換算で５０μｍｏｌ、アジ化効率＞９９％）を入れ、無水ＤＭＦ２ｍｌに溶解させた。ここにＩＣＧ−Ａｌｋｙｎｅ  １４ｍｇ（２０μｍｏｌ）、ＰＥＧ−Ａｌｋｙｎｅ  ４０ｍｇ（２０μｍｏｌ）、ＧＡ−ａｌｋｙｎｅ  ５．２ｍｇ（２０μｍｏｌ）を加えた後、ＣｕＩ  ２．９ｍｇ（１５μｍｏｌ）、ＤＢＵ  ２．３ｍｇ（１５μｍｏｌ）を加え、６０℃で終夜攪拌した。この溶液に水２ｍｌを加え、これを排除分子量２５Ｋの透析膜を用いて、２４時間水に対し透析した。フィルター（細孔径：０．４５μｍ）を用いて得られた水溶液をろ過し、凍結乾燥することで、ＩＣＧ、ＰＥＧおよびＧＡを有するヒアルロン酸誘導体２  ７２ｍｇ（８７％）を深緑色固体として得た。同定は１Ｈ−ＮＭＲにより行った。（１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ、２５℃）δ／ｐｐｍ；１．７５−２．１５（ｍ，３Ｈ），２．５５（ｂｒ  ｓ，０．３８Ｈ），２．８０−３．１０（ｍ，０．９３Ｈ），３．１０−４．００（ｍ，１０２Ｈ），４．２５−４．５０（ｍ，２．４Ｈ），７．６８（ｓ，０．３８Ｈ），７．９３（ｂｒ  ｓ，０．５８Ｈ））。図１４に２ａ（ＧＡ）の１Ｈ−ＮＭＲチャートを示した。
【００９１】
なお環化反応の転換率は、１Ｈ−ＮＭＲより３−ａｚｉｄｏ−１−ｐｒｏｐｙｌａｍｉｎｅの２位の２Ｈ（１．６７ｐｐｍ）の減少率を基に算出した。ＧＡを結合したトリアゾール環のプロトンの化学シフト（７．６８ｐｐｍ）は、ＩＣＧやＰＥＧを有するトリアゾール環のプロトンと化学シフト（７．９３ｐｐｍ）と異なって観測された。これを利用し、反応したアジド基のうち、ＧＡを有するトリアゾール環に変換された比率とアジド基の転換率を基にＧＡ部位の導入率を算出した。ＩＣＧ部位の導入率は、ＩＣＧ、ＰＥＧおよびＧＡを有するヒアルロン酸誘導体のＤＭＦ溶液のＵＶスペクトルを測定し、ＩＣＧ−ａｌｋｙｎｅを標準物質として用い、最大吸収波長（７９０ｎｍ付近）の吸光度を基に決定した。ＰＥＧ部位の導入率は、アジド基の転換率、ＧＡとＩＣＧ部位の導入率から算出した。また収率は、ＩＣＧ、ＰＥＧおよびＧＡ部位の導入率を基に算出される分子量を用いて決定した。
【００９２】
【表４】
2014185333.tif 000041
【００９３】
表４から、ＩＣＧ、ＰＥＧに加えＧＡを有するヒアルロン酸誘導体は、ＩＣＧ、ＰＥＧを有するヒアルロン酸誘導体と比べ、小さい粒子を形成するものが多いことがわかった。ヒアルロン酸誘導体２ａ（ＧＡ）については、水に溶解させたところ、直径約３５ｎｍの粒子を得ることができた。以後、このサンプルを２ａｓ（ＧＡｓ）と表す。ＤＭＦ中で十分に分散された２ａ（ＧＡ）を水へ再分散させた場合、直径１５８ｎｍ程度の粒子を形成した。以後、この１５８ｎｍの粒子を２ａ（ＧＡ）と表す。このようにナノ粒子の形成法により粒径を制御できることが示唆される。２ｂ（ＧＡ２）や２ｇ（ＧＡ７）では、ＤＭＦを用いる粒子形成法により、直径１００ｎｍ以下の粒子が得られた。２ｄ（ＧＡ３）や２ｆ（ＧＡ６）のように水やＤＭＦを用いる粒子形成法では、散乱強度が低く粒子の形成を確認できないサンプルも存在したが、ヒアルロン酸誘導体のＣＨＣｌ３溶液を水に分散させた後、ＣＨＣｌ３を留去する手法は、どのサンプルにも適応でき、粒子の形成が確認された。しかし、いずれの場合も粒径１２０ｎｍ以上と比較的大きな粒子の形成にとどまった。以上の結果から、ＩＣＧの導入率を高くするか、もしくはＩＣＧ導入率が１５％程度と低い場合ＰＥＧの導入率を高くすると、比較的小さな直径の粒子が得られることがわかった。
【００９４】
図１９（ａ）および図１９（ｂ）は、分子量５Ｋおよび８Ｋのヒアルロン酸を原料として合成したヒアルロン酸誘導体におけるｃａｃとＰＥＧ含有率の関係を示したものである（表２および表４からのデータ）。いずれの結果からもＰＥＧ含有率が高いとｃａｃが小さくなる傾向があることがわかった。
【００９５】
粒子の形状は、日本電子株式会社製透過型電子顕微鏡ＪＥＭ−１４００により観察した。サンプルは、ヒアルロン酸誘導体２の水溶液（１ｍｇ／ｍｌ）を日新ＥＭ株式会社製コロジオン膜貼付メッシュ（２００メッシュ）に載せ、風乾させることで準備した。加速電圧１２０ｋＶのもと、ＴＥＭモードにてサンプルを観察した。粒子径分布は、一サンプルあたり１００個以上の粒子像を観察し、その粒子径をもとに平均粒子径と標準偏差を算出した。図２０（ａ）および図２０（ｂ）に示すように、２ｂ（ＧＡ２）では大小二種類の粒子分布が得られ、水に溶解させて調製したサンプルを用いるＤＬＳの測定結果と一致した。一方、それ以外のサンプルでは、図２０（ｃ）に代表されるような一種類の粒径分布となった。透過型電子顕微鏡観察による２ａ（ＧＡ）、２ｂ（ＧＡ２）、２ｃ（ＧＡ４）、２ｄ（ＧＡ３）、２ｅ（ＧＡ５）、２ｆ（ＧＡ６）、２ｇ（ＧＡ７）の平均粒子径±標準偏差は、それぞれ、２８±２３ｎｍ、２４±１２ｎｍと８５±１５ｎｍ（二峰性）、７５±２２ｎｍ、６４±１９ｎｍ、７４±２１ｎｍ、３５±８ｎｍ、ならびに６６±２４ｎｍであった。
【００９６】
（比較例２：ＩＣＧおよびＰＥＧを有するヒアルロン酸誘導体１の水中での合成）
アジド基を持つヒアルロン酸と末端アルキンを持つ誘導体との環化反応は、硫酸銅とアスコルビン酸ナトリウムを組み合わせる水中での触媒系を利用することで進行することが報告されている（非特許文献９、非特許文献１０）。これを踏まえ、アジド基を持つヒアルロン酸誘導体３に対して、ＩＣＧ−ａｌｋｙｎｅとＰＥＧ−ａｌｋｙｎｅを硫酸銅とアスコルビン酸ナトリウムを組み合わせた触媒条件下反応を試みた。
【００９７】
ＰＥＧの導入に関する実験例を以下に示す３（ＭＷ（ＨＡ−Ｎａ）＝８Ｋ、アジ化効率１００％）の水溶液（５ｍｌ）に、ＰＥＧ−Ａｌｋｙｎｅ（３ｅｑｕｉｖ）を加えた後、アスコルビン酸ナトリウム（２０ｍｏｌ％）、硫酸銅五水和物（４０ｍｏｌ％）のＤＭＦ溶液（５ｍｌ）を加え、２７℃で終夜攪拌した。この溶液を排除分子量３．５Ｋの透析膜を用いて、２４時間水に対し透析した。凍結乾燥し、ｈｅｘａｎｅ／ＣＨＣｌ３（７：１０）で再沈降させることで精製し、ＰＥＧを有するヒアルロン酸誘導体（５８％）を淡茶色固体として得た。このようにＰＥＧの導入は可能であった。
【００９８】
一方、ＩＣＧ−ａｌｋｙｎｅは全く反応しなかった。以下に実験例を示す。３（ＭＷ（ＨＡ−Ｎａ）＝８Ｋ、アジ化効率１００％）の水溶液（３ｍｌ）に、ＰＥＧ−Ａｌｋｙｎｅ（１．５ｅｑｕｉｖ）ＩＣＧ−Ａｌｋｙｎｅ（１．５ｅｑｕｉｖ）、アスコルビン酸ナトリウム（２０ｍｏｌ％）、硫酸銅五水和物（４０ｍｏｌ％）のＤＭＦ溶液（３ｍｌ）を加え、２７℃で終夜攪拌した。この溶液を排除分子量３．５Ｋの透析膜を用いて、２４時間水に対し透析した。フィルター（細孔径：０．４５μｍ）を用いて得られた水溶液をろ過し、凍結乾燥することで、ヒアルロン酸誘導体を淡茶色固体として得た。ヒアルロン酸誘導体３に含まれるアジド基のうち８３％にＰＥＧが導入されたものの、残り１７％は未反応のままであり、またＩＣＧも導入されなかった。
【００９９】
結論として、水中でのＩＣＧおよびＰＥＧを有するヒアルロン酸誘導体１の合成において、ＰＥＧの導入は確認されたものの、ＩＣＧは全く導入されなかった。これはＩＣＧ−ａｌｋｙｎｅの水への溶解性が低いことが原因であると推測される。つまり、本発明のＩＣＧおよびＰＥＧを有するヒアルロン酸誘導体は従来公知の水中での合成方法では合成困難であり、本発明に係るＣｕＩ／ＤＭＦを用いる新規な合成方法はこれまでに報告されておらず、かつその有効性が示された。上述したように、ＣｕＩ／ＤＭＦを用いる合成方法は、ヒアルロン酸へＩＣＧ誘導体のみならず、ＩＣＧ誘導体とＰＥＧを同時に効率よく定量的に導入することを可能とするものである。
【０１００】
（実施例２：血中滞留性評価）
上記で調製した化合物の血中滞留性を評価するために、雌の非近交系ＢＡＬＢ／ｃ  Ｓｌｃ−ｎｕ／ｎｕマウス（７〜９週齢、日本エスエルシー株式会社）に対して、各化合物を尾静脈に投与し、各時間における血中の色素残存率を測定した。投与１、３、９、２４時間後にマウス尾静脈から血液を採取し、９６ウェルプラスチックプレート内で血液、１％Ｔｒｉｔｏｎ、ＤＭＦを２：９：９で混合した。ＩＶＩＳ（登録商標）ＩｍａｇｉｎｇＳｙｓｔｅｍ  ２００  Ｓｅｒｉｅｓ（ＸＥＮＯＧＥＮ社製）を用いて、９６ウェルプラスチックプレート内の血液溶液の蛍光強度を測定することで血中の色素残存率を測定した。各時間における、投与量に対する色素残存率（％ｉｎｊｅｃｔｅｄ  ｄｏｓｅ：％ＩＤと略す）を図７に示した。１ｇについては、十分な蛍光強度が得られなかったため、評価できなかった。色素残存率の測定から、１ａ，１ｈ〜１ｍ，２ａ（ＧＡ）が２４時間後においてもサンプルは血中に残存しており、血中滞留性に優れることが明らかとなった。一方、ＰＥＧを有さないＩＣＧのみ有するヒアルロン酸誘導体ＨＡ−ＩＣＧ−ａ，ＨＡ−ＩＣＧ−ｂ，ならびにＨＡ−ＩＣＧ−ｃ（比較例サンプル）は全て２４時間後には血中には残存しておらず、血中滞留性は低いことがわかった。本結果より、ＩＣＧを有するヒアルロン酸誘導体について、ＩＣＧ含率を高めるため、ならびに血中滞留性を高めるために、ＰＥＧを含有させることが必須であり、そのＰＥＧ含率により血中滞留性を制御できることが示された。
【０１０１】
図８（ａ）には、投与９時間後ならびに２４時間後の血中の色素残存率と各サンプルのＩＣＧ含率との関係を示した。ＩＣＧ含率が１０から４０％の範囲で、血中残存率が高くなることが分かった。
【０１０２】
図８（ｂ）には、投与９時間後ならびに２４時間後の血中の色素残存率と各サンプルのＰＥＧ含率との関係を示した。ＰＥＧ含率が大きくなるに従って、血中残存率が高くなることが分かった。
【０１０３】
（実施例３：蛍光イメージングによる腫瘍造影能評価）
上記実施例１で得られた化合物の腫瘍造影能を評価した。腫瘍造影能の評価のために、ヒアルロン酸誘導体を投与した担癌マウスの蛍光イメージングを行った。蛍光イメージング実験においては、雌の非近交系ＢＡＬＢ／ｃ  Ｓｌｃ−ｎｕ／ｎｕマウス（購入時６週齢）（日本エスエルシー株式会社）を用いた。マウスに担癌させる前の１週間、京都大学医学部（京都府、日本）の動物施設で、標準的な食餌、寝床を用い、自由に食餌および飲料水を摂取できる環境下でマウスを順応させた。イメージング実験の約１週間前に１×１０６個のｃｏｌｏｎ２６マウス腸癌細胞（理研）を、マウスの肩と大腿部に皮下注射した。投与量はマウス当たり、色素量として０．２５ｎｍｏｌであり、１００μＬのＰＢＳ溶液としてマウス尾静脈に注射した。ヒアルロン酸誘導体１ａ，１ｂ，１ｃ，１ｈ，１ｉ，１ｋ，１ｌ，２ａ（ＧＡ），２ａｓ（ＧＡｓ），２ｂ（ＧＡ２），２ｄ（ＧＡ３），ならびに２ｃ（ＧＡ４）を投与したマウスの全身蛍光像を、ＩＶＩＳ（登録商標）Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ  ２００  Ｓｅｒｉｅｓ（ＸＥＮＯＧＥＮ）を用いて、投与２４時間後にマウスの明視野像と蛍光像を取得した。図９は投与後２４時間目のマウスの蛍光イメージである。図９中、白矢印で示される腫瘍部位での蛍光信号が認められた。この結果より、本発明のヒアルロン酸誘導体は腫瘍を造影することが可能であり、腫瘍の光イメージング用造影剤としての有効性が示された。
【０１０４】
図１０（ａ）は、図９で示される蛍光イメージングデータから、腫瘍部（計測面積０．５×０．５ｃｍ）の蛍光強度と足の付け根の蛍光強度（正常部位として選択、計測面積０．５×０．５ｃｍ）の比をとったものであり、ＳＮＲ（ｓｉｇｎａｌ−ｔｏ−ｎｏｉｓｅ  ｒａｔｉｏ）として数値化したものである。すなわちＳＮＲは、それぞれの化合物の腫瘍描出力を示すパラメータであり、ＳＮＲが高いほど腫瘍の光イメージング用造影剤として有効であることになる。図１０（ａ）より、全ての化合物のＳＮＲは１．５以上であり、また粒子サイズの小さい２ａ（ＧＡｓ）が最もＳＮＲが高かった。
【０１０５】
（実施例４：腫瘍集積性の評価）
実施例３で実施した腫瘍造影実験のマウスの腫瘍中色素量を定量することで、ヒアルロン酸誘導体１ａ，１ｂ，１ｃ，１ｈ，１ｉ，１ｋ，１ｌ，２ａ（ＧＡ），２ａｓ（ＧＡｓ），２ｂ（ＧＡ２），２ｄ（ＧＡ３），ならびに２ｃ（ＧＡ４）の腫瘍集積性を評価した。腫瘍集積性は、腫瘍１ｇあたりの全投与量に対する腫瘍への移行率（％ＩＤ／ｇ）で表わした。まず、投与２４時間後にマウスを炭酸ガスで安楽死させた後、腫瘍を外科的に摘出した。腫瘍をプラスチックチューブに移し、腫瘍重量に対し１．２５倍量の１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００水溶液を添加し、プラスチックペッスルを用いて破砕した。次いで、腫瘍組織重量の２０．２５倍量のジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を加えた。ＩＶＩＳ（登録商標）Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ  ２００  Ｓｅｒｉｅｓ（ＸＥＮＯＧＥＮ）を用いて、プラスチックチューブの状態で、腫瘍破砕溶液の蛍光強度を測定することで腫瘍中の色素量を定量した。その結果を図１０（ｂ）に示す。本発明に係るヒアルロン酸誘導体を投与した腫瘍では色素が検出され、腫瘍への集積が確認された。腫瘍集積性は４％から１４％であり、１ａでは最も高い腫瘍集積性１４．８％ＩＤ／ｇを示した。図１１に、腫瘍集積性と各サンプルのＩＣＧ含率、ＰＥＧ含率との関係を示した。ＰＥＧ含率が大きくなるに従って、腫瘍集積性が高くなる傾向が見られた。一方、ＩＣＧ含率では、１５％程度で腫瘍集積性が高くなる傾向が見られた。ＩＣＧ含率を２０％以上にしても腫瘍集積性の低下は見られなかった結果より、ＩＣＧを高含率として、つまり感度を増強したまま腫瘍への集積性を維持できる化合物であることが示された。
【０１０６】
（実施例５：光音響信号の測定）
上記実施例１で得られた化合物の光音響信号を測定した。比較例としてＩＣＧ水溶液も同様に測定した。光音響信号の計測は、パルスレーザー光をサンプル水溶液に照射し、圧電素子を用いてサンプルから光音響信号を検出し，高速プリアンプで増幅後，デジタルオシロスコープで取得した。具体的な条件は以下の通りである。光源として、チタンサファイアレーザ（Ｌｏｔｉｓ社製）を用いた。レーザー波長は７２０ｎｍと７９０ｎｍ、比較のためのＩＣＧ水溶液について、波長は７１０ｎｍと７８０ｎｍとした。これはサンプル水溶液の吸収帯が２つあり、例えば上記実施例１で得られた化合物では、７２０ｎｍと７９０ｎｍに吸収ピークが認められる。図１６（ａ）に代表的なサンプル１ａ，１ｂ，１ｃ，２ａｓ（Ｇａｓ）ならびに比較のためのＩＣＧの吸収スペクトルを示した。エネルギー密度は１２ｍＪ／ｃｍ２、パルス幅は２０ナノ秒、パルス繰返しは１０Ｈｚの条件とした。超音波トランスデューサとしては、型式Ｖ３０３（Ｐａｎａｍｅｔｒｉｃｓ−ＮＤＴ社製）を用いた。中心帯域は１ＭＨｚ、エレメントサイズはφ０．５、測定距離は２５ｍｍ（Ｎｏｎ−ｆｏｃｕｓ）、アンプは＋３０ｄＢ（超音波プリアンプ  Ｍｏｄｅｌ  ５６８２  オリンパス社製）の条件である。測定容器としては、ポリスチレン製キュベットで、光路長０．１ｃｍ、サンプル容量は約２００μｌであった。溶媒は水を用いた。計測器は、ＤＰＯ４１０４（テクトロニクス社製）を用いて、トリガー：光音響光をフォトダイオードで検出、Ｄａｔａ  ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ：１２８回（１２８パルス）平均の条件で測定を行った。図１６（ｂ）に、代表的なサンプル１ａのレーザー波長７９０ｎｍにおける光音響信号（電圧）の時間変化スペクトルを示す。また図１７には本発明の化合物ならびに比較のためのＩＣＧの吸光度規格化した光音響信号の強度を示した。ここで、吸光度規格化とは、実際に得られた電圧値（Ｖ）を照射レーザー強度（Ｊ）ならびにレーザー波長におけるサンプルの吸光度で割ったものである。図１７から明らかなように、全ての本発明の化合物において、光音響信号を発信することが可能であり、比較のＩＣＧと同等あるいはそれ以上の光音響信号強度を得ることが可能であることがわかった。ＩＣＧに比べて光音響信号が高くなる理由は、上記実施例１で得られた本発明の化合物は疎水性のＩＣＧ誘導体を用いており、その色素自身の熱変換効率がＩＣＧに比べて高いことが考えられる。ほかの原因として、疎水性のため色素同士が強く凝集すること、あるいはヒアルロン酸で色素が媒体の水から覆われていることによる熱の閉じ込め効果が寄与している可能性が考えられる。本実施例の結果より、本発明の化合物は光音響造影剤として機能することが確認された。
【０１０７】
図１８には、本発明の化合物について、ヒアルロン酸ユニットのみかけの分子量、ヒアルロン酸へのＩＣＧ結合数、ポリマー全体の分子量、７９０ｎｍにおけるヒアルロン酸の吸収係数を示した。本発明では、ヒアルロン酸へ多数のＩＣＧを結合できることで、ヒアルロン酸に高い光吸収能を付与させることができた結果、強い光音響信号を発することができる化合物を得ることに成功した。本発明のヒアルロン酸誘導体は、さらにナノ粒子を形成できるため、ナノ粒子としての吸収係数は著しく高くなる。すなわち、ナノ粒子にはヒアルロン酸誘導体分子が少なくとも１０から１０００本は含まれると考えられるため、ヒアルロン酸誘導体分子の１０から１０００倍の吸収係数を有するナノ粒子となる。具体的には、１０の６乗から８乗のオーダーの吸収係数を有する粒子であると思われる（ヒアルロン酸誘導体分子の体積を１１０００ｎｍ３程度として計算した場合）。
【０１０８】
本実施例から明らかなように、ヒアルロン酸に対して、ＩＣＧ誘導体とＰＥＧを同時に反応させることでヒアルロン酸へのＩＣＧ含有率を高めることができることを初めて見出し、ＩＣＧ含有率の高いヒアルロン酸誘導体の創製に成功した。非特許文献１に開示された親水性のＩＣＧ誘導体を含有するヒアルロン酸は、ＩＣＧ含率が１２％程度と低いが、本発明のヒアルロン酸誘導体ではＩＣＧ含率を１３％より大きくできている。一方で、その最大値は７８％であった。したがって、本発明のヒアルロン酸誘導体のＩＣＧ含率の範囲は１３％より大きく、７８％以下であることが好ましい。
【０１０９】
（実施例６：スルホニル基を有する近赤外色素含有ヒアルロン酸誘導体４の合成）
スルホニル基を有する近赤外色素ＩＣＧ−Ｓ−ａｌｋｙｎｅを使用した以外は、実施例１と同様のスキームでスルホニル基を有する近赤外色素含有ヒアルロン酸誘導体４を合成した。図２１（ａ）にその構造式を示す。原料として、分子量５ＫのＨＡ−Ｎａを用いた。
【０１１０】
（実施例６（1）近赤外色素ＩＣＧ−Ｓ−ａｌｋｙｎｅの合成）
近赤外色素ＩＣＧ−Ｓ−ａｌｋｙｎｅの合成を図２１（ｂ）に示す。まず、５０ｍｌ一つ口ナス型フラスコに、特開１９９７−１２４５９９号公報に開示されたインドシアニングリーン誘導体ＩＣＧ−Ｓ−ＯＳｕ  ０．６２ｇ（０．７５ｍｍｏｌ）を入れ、アセトニトリル  ２ｍｌに溶解させた。ここにプロパルギルアミン（５８μｌ，０．９０ｍｍｏｌ）を０℃で加え、２時間攪拌した。この溶液に０．１Ｎ塩酸１０ｍｌを加え、水層をＣＨ２Ｃｌ２で抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄した後、硫酸マグネシウムで乾燥させた。溶媒を減圧留去し、得られた濃緑色固体を遠心沈降（ＣＨ２Ｃｌ２／Ｅｔ２Ｏ）させ、精製した。濃緑色固体を少量の酢酸エチルで洗浄し、減圧乾燥後、ＩＣＧ−Ｓ−ａｌｋｙｎｅを濃緑色固体 ０．６３ｇ（９３％）として得た。同定は１Ｈ−ＮＭＲ、ＦＡＢ−ＭＳにより行った。
結果は以下の通りであった。（１Ｈ−ＮＭＲ （４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ、２５℃，ＴＭＳ） δ／ｐｐｍ； １．５１（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ），１．７１（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，２Ｈ），１．８６（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ），１．９１−２．１５（ｍ，２Ｈ），２．００（ｓ，１２Ｈ），２.２２（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），２．６７（ｓ，１Ｈ），２．９１（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ），３．４０−３．５７（ｍ，２Ｈ），３．９０（ｄ，Ｊ＝２．３Ｈｚ，２Ｈ），４．１０−４．３２（ｍ，４Ｈ），６．２１−６．３６（ｍ，１Ｈ），６．３６−６．４９（ｍ，１Ｈ），６．５３−６．７６（ｍ，２Ｈ），７．３９−７．５１（ｍ，２Ｈ），７．５４（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，１Ｈ），７．５７−７．７８（ｍ，３Ｈ），７．８８−８．１３（ｍ，６Ｈ），８．１３−８．３８（ｍ，２Ｈ）．ＦＡＢ−ＨＲＭＳ ｍ/ｅ ７６７．３７５７ ［Ｍ］＋。
ＩＣＧ−Ｓ−ａｌｋｙｎｅの近赤外領域における光吸収スペクトル（クロロホルム中、色素濃度１．０×１０−６Ｍ）吸収強度は図２１（ｃ）に示すとおりであり、８０４ｎｍに吸収極大を有する。この最大吸収波長におけるモル吸光係数は１．２×１０５Ｍ−１×ｃｍ−１であった。
【０１１１】
（実施例６（２）ＩＣＧ−ＳおよびＰＥＧを有するヒアルロン酸誘導体４の合成）
アジド基を有するヒアルロン酸類縁体３に対し、ＩＣＧ−Ｓ−ＡｌｋｙｎｅとＰＥＧ−Ａｌｋｙｎｅを同時に作用させることで、ＩＣＧ−ＳおよびＰＥＧを有する様々なヒアルロン酸誘導体４を得ることができる（図２２および表５）。代表的な合成例を以下に示す。窒素雰囲気下、２５ｍｌシュレンク管に３を２３ｍｇ（ＭＷ（ＨＡ−Ｎａ）＝５Ｋ、単位ユニット換算で５０μｍｏｌ、アジ化効率＞９９％）を入れ、無水ＤＭＦ  ２ｍｌに溶解させた。ここにＩＣＧ−Ｓ−Ａｌｋｙｎｅ  ３８ｍｇ  （５０μｍｏｌ）、ＰＥＧ−Ａｌｋｙｎｅ  ０．１０ｇ（５０μｍｏｌ）を加えた後、ＣｕＩ  ２．９ｍｇ（１５μｍｏｌ）、ＤＢＵ  ２．３ｍｇ（１５μｍｏｌ）を加え、６０℃で終夜攪拌した。この溶液に水２ｍｌを加え、これを排除分子量２５Ｋの透析膜を用いて、２４時間水に対し透析した。フィルター（細孔径：０．４５μｍ）を用いて得られた水溶液をろ過し、凍結乾燥することで、ＩＣＧ−ＳおよびＰＥＧを有するヒアルロン酸誘導体４ｂ  ８３ｍｇ（７９％）を深緑色固体として得た。同定は１Ｈ−ＮＭＲにより行った。（１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ、２５℃）  δ／ｐｐｍ；１．８０−２．１６（ｍ，３Ｈ），３．１０−４．０１（ｍ，６３３Ｈ），４．２５−４．６０（ｍ，１Ｈ），７．９３（ｂｒ  ｓ，０．９８Ｈ））。
なお環化反応の転換率は、１Ｈ−ＮＭＲより３−ａｚｉｄｏ−１−ｐｒｏｐｙｌａｍｉｎｅの２位の２Ｈ（１．６７ｐｐｍ）の減少率を基に算出した。ＩＣＧ部位の導入率は、ＩＣＧ−ＳおよびＰＥＧを有するヒアルロン酸誘導体のＤＭＦ溶液のＵＶスペクトルを測定し、ＩＣＧ−ａｌｋｙｎｅを標準物質として用い、最大吸収波長（７９０ｎｍ付近）の吸光度を基に決定した。ＰＥＧ部位の導入率は、アジド基の転換率とＩＣＧ−Ｓ部位の導入率から算出した。また収率は、ＩＣＧ−ＳおよびＰＥＧ部位の導入率を基に算出される分子量を用いて決定した。
ヒアルロン酸誘導体４ａ、４ｂ、４ｃのｃａｃは、それぞれ、２．６、３．０、３．９（×１０−４ｇ／Ｌ）であった。
【０１１２】
【表５】
2014185333.tif 000042
ａ  ＩＣＧ−ＳおよびＰＥＧ部位の導入率を基にした分子量より算出．
ｂ １Ｈ−ＮＭＲの積分値およびＵＶ−ｖｉｓ測定における吸光度より算出．
ｃ  ポリマーを水に溶解させ、動的光散乱法により決定．
ｄ  ポリマーをＤＭＦに溶解させ、等量の水と混合し、透析によりＤＭＦを除去後、動的光散乱法により決定．
ｅ  二種類の粒子の散乱強度比率は１：４．
【０１１３】
（実施例７：分子量５ＫのＰＥＧを有する近赤外色素含有ヒアルロン酸誘導体５の合成）
分子量５ＫのＰＥＧ誘導体ＰＥＧ−５Ｋ−ａｌｋｙｎｅを使用した以外は、実施例１（５）と同様のスキームで分子量５ＫのＰＥＧを有するヒアルロン酸誘導体５（図２３（ａ））を合成した。原料として、分子量５ＫのＨＡ−Ｎａを用いた。
【０１１４】
（実施例７（１）ＰＥＧ−５Ｋ−ａｌｋｙｎｅの合成）
ＰＥＧ−５Ｋ−ａｌｋｙｎｅの合成を以下に示す（図２３（ｂ））。２００ｍｌ二つ口ナス型フラスコに、市販のｍＰＥＧ５０００  １０ｇ（２．０ｍｍｏｌ）を入れ、これを１００℃で終夜減圧下乾燥させた。５５℃まで放冷し、ＴＨＦ  ８０ｍｌに溶解させた。ここに４−ペンチン酸（０．７９ｇ，８．０ｍｍｏｌ）を加えた後、ＤＣＣ  ０．８３ｇ（４．０ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ  ７３ｍｇ（０．６ｍｍｏｌ）を加え、５５℃で終夜攪拌した。室温まで放冷した後、ガラスフィルターにより不溶の固体を除去した。濾液に過剰量のジエチルエーテルを加えることで、白色固体が生じた。ガラスフィルターを用いてこれをろ液と分離し、ジエチルエーテルで洗浄することで、ＰＥＧ−５Ｋ−ａｌｋｙｎｅ ８．１ｇ（８１％）を白色固体として得た。同定は１Ｈ−ＮＭＲにより行った。結果は（１Ｈ−ＮＭＲ （４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３、２５℃，ＴＭＳ） δ／ｐｐｍ；１．９７−２．０１（ｍ，１Ｈ），２．４７−２．５５（ｍ，２Ｈ），２．５５−２．６４（ｍ，２Ｈ），３．４０−３．９２（ｍ，５９１Ｈ），４．２６（ｔ，Ｊ＝５．０Ｈｚ，２Ｈ））であった。
【０１１５】
（実施例７（２）ＩＣＧおよびＰＥＧ−５Ｋを有するヒアルロン酸誘導体５の合成）
アジド基を有するヒアルロン酸類縁体３に対し、ＩＣＧ−ＡｌｋｙｎｅとＰＥＧ−５Ｋ−Ａｌｋｙｎｅを同時に作用させることで、ＩＣＧおよびＰＥＧ−５Ｋを有する様々なヒアルロン酸誘導体５を得ることができる（図２４（ａ）および表６）。代表的な合成例を以下に示す。窒素雰囲気下、２５ｍｌシュレンク管に３を２３  ｍｇ  （ＭＷ（ＨＡ−Ｎａ）＝５Ｋ、単位ユニット換算で５０μｍｏｌ、アジ化効率＞９９％）を入れ、無水ＤＭＦ  ２ｍｌに溶解させた。ここにＩＣＧ−Ａｌｋｙｎｅ  ２６ｍｇ（３８μｍｏｌ）、ＰＥＧ−５Ｋ−Ａｌｋｙｎｅ  ０．３１ｇ（６３μｍｏｌ）を加えた後、ＣｕＩ  ２．９ｍｇ（１５μｍｏｌ）、ＤＢＵ  ２．３ｍｇ（１５μｍｏｌ）を加え、６０℃で終夜攪拌した。この溶液に水  ２ｍｌを加え、これを排除分子量２５Ｋの透析膜を用いて、２４時間水に対し透析した。フィルター（細孔径：０．４５μｍ）を用いて得られた水溶液をろ過し、凍結乾燥することで、ＩＣＧおよびＰＥＧ−５Ｋを有するヒアルロン酸誘導体５  ０．２７ｇ（６３％）を深緑色固体として得た。同定は１Ｈ−ＮＭＲにより行った。（１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ、２５℃）δ／ｐｐｍ；１．６５−２．１０（ｍ，３Ｈ），２．５４（ｂｒ  ｓ，０．６Ｈ），２．８２−３．０５（ｍ，１．３Ｈ），３．１５−４．００（ｍ，３９５Ｈ），４．２５−４．５０（ｍ，２Ｈ），７．７２（ｓ，０．６５Ｈ），７．９３（ｂｒ  ｓ，０．１５Ｈ））。
なお環化反応の転換率は、１Ｈ−ＮＭＲより３−ａｚｉｄｏ−１−ｐｒｏｐｙｌａｍｉｎｅの２位の２Ｈ（１．６７ｐｐｍ）の減少率を基に算出した。ＩＣＧ部位の導入率は、ＩＣＧおよびＰＥＧ−５Ｋを有するヒアルロン酸誘導体のＤＭＦ溶液のＵＶスペクトルを測定し、ＩＣＧ−Ｓ−ａｌｋｙｎｅを標準物質として用い、最大吸収波長（７９０ｎｍ付近）の吸光度を基に決定した。ＰＥＧ−５Ｋを結合したトリアゾール環のプロトンの化学シフト（７．７２ｐｐｍ）は、ＩＣＧを有するトリアゾール環のプロトンと化学シフト（７．９３ｐｐｍ）と異なって観測された。ＰＥＧ部位の導入率は、アジド基の転換率とＩＣＧ部位の導入率からも算出できるが、これを利用し、反応したアジド基のうちＰＥＧ−５Ｋを有するトリアゾール環に変換された比率とアジド基の転換率を基に算出することもできる。また収率は、ＩＣＧおよびＰＥＧ−５Ｋ部位の導入率を基に算出される分子量を用いて決定した。
ヒアルロン酸誘導体５ａ、５ｂのｃａｃは、それぞれ、２．１、３．８  （  Ｘ  １０−４ｇ／Ｌ）であった。
【０１１６】
【表６】
2014185333.tif 000043
ａ  ＩＣＧおよびＰＥＧ−５Ｋ部位の導入率を基にした分子量より算出．
ｂ １Ｈ−ＮＭＲの積分値およびＵＶ−ｖｉｓ測定における吸光度より算出．
ｃ  ポリマーを水に溶解させ、動的光散乱法により決定．
【０１１７】
（実施例８：近赤外色素を有する高分子量ヒアルロン酸誘導体６の合成）
原料として、分子量２５ＫのＨＡ−Ｎａを用いた以外は、実施例１と同様のスキームで近赤外色素を有するヒアルロン酸誘導体６を合成した。
アジド基を有するヒアルロン酸類縁体３に対し、ＩＣＧ−ＡｌｋｙｎｅとＰＥＧ−Ａｌｋｙｎｅを同時に作用させることで、ＩＣＧおよびＰＥＧを有する高分子量ヒアルロン酸誘導体６を得ることができる（図２４（ｂ）および表７）。代表的な合成例を以下に示す。窒素雰囲気下、２５ｍｌシュレンク管に３を２３ｍｇ（ＭＷ（ＨＡ−Ｎａ）＝２５Ｋ、単位ユニット換算で５０μｍｏｌ、アジ化効率＞９９％）を入れ、無水ＤＭＦ  ２ｍｌに溶解させた。ここにＩＣＧ−Ａｌｋｙｎｅ  １７ｍｇ（２５μｍｏｌ）、ＰＥＧ−Ａｌｋｙｎｅ  ０．１５ｇ（７５μｍｏｌ）を加えた後、ＣｕＩ  ２．９ｍｇ（１５μｍｏｌ）、ＤＢＵ  ２．３ｍｇ（１５μｍｏｌ）を加え、６０℃で終夜攪拌した。この溶液に水  ２ｍｌを加え、これを排除分子量２５Ｋの透析膜を用いて、２４時間水に対し透析した。フィルター（細孔径：０．４５μｍ）を用いて得られた水溶液をろ過し、凍結乾燥することで、ＩＣＧおよびＰＥＧを有するヒアルロン酸誘導体６  ４２ｍｇ（３５％）を深緑色固体として得た。同定は１Ｈ−ＮＭＲにより行った。（１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ、２５℃）δ／ｐｐｍ；１．７１−２．１３（ｍ，３Ｈ），３．２２−４．００（ｍ，３９０Ｈ），４．３０−４．５３（ｍ，２Ｈ），７．９３（ｂｒ  ｓ，  ０．９９Ｈ））。
本環化反応は再現性に乏しい。また用いたＩＣＧの量に対する導入量が低いことも特徴的である。
なお環化反応の転換率は、１Ｈ−ＮＭＲより３−ａｚｉｄｏ−１−ｐｒｏｐｙｌａｍｉｎｅの２位の２Ｈ（１．６７ｐｐｍ）の減少率を基に算出した。ＩＣＧ部位の導入率は、ＩＣＧおよびＰＥＧを有するヒアルロン酸誘導体のＤＭＦ溶液のＵＶスペクトルを測定し、ＩＣＧ−ａｌｋｙｎｅを標準物質として用い、最大吸収波長（７９０ｎｍ付近）の吸光度を基に決定した。ＰＥＧ部位の導入率は、アジド基の転換率とＩＣＧ部位の導入率から算出した。また収率は、ＩＣＧおよびＰＥＧ部位の導入率を基に算出される分子量を用いて決定した。
ヒアルロン酸誘導体６ａ、６ｂのｃａｃは、それぞれ、１４、１８（×１０−４ｇ／Ｌ）であった。
【０１１８】
【表７】
2014185333.tif 000044
ａ  ＩＣＧおよびＰＥＧ部位の導入率を基にした分子量より算出．
ｂ １Ｈ−ＮＭＲの積分値およびＵＶ−ｖｉｓ測定における吸光度より算出．
ｃ  ポリマーを水に溶解させ、動的光散乱法により決定．
ｄ  二種類の粒子の散乱強度比率は１：２．
ｅ  ポリマーをＤＭＦに溶解させ、等量の水と混合し、透析によりＤＭＦを除去後、動的光散乱法により決定．
【０１１９】
（実施例９：蛍光イメージングによる腫瘍造影能評価）
上記実施例６〜８で得られた化合物の腫瘍造影能を上記実施例３と同様の方法で評価した。ヒアルロン酸誘導体４ａ，４ｂ，４ｃ，５ａ，５ｂ，ならびに６ｂを投与したマウスの全身蛍光像を、ＩＶＩＳ（登録商標）Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ  ２００  Ｓｅｒｉｅｓ（ＸＥＮＯＧＥＮ）を用いて、投与２４時間後にマウスの明視野像と蛍光像を取得した。投与量はマウス当たり、色素量として５０ｎｍｏｌであり、１００μＬのＰＢＳ溶液としてマウス尾静脈に注射した。図２５（ａ）は投与後２４時間目のマウスの蛍光イメージである。全てのサンプルにおいて、図２５（ａ）中、白矢印で示される腫瘍部位での蛍光信号が認められた。この結果より、本発明のヒアルロン酸誘導体は腫瘍を造影することが可能であり、腫瘍の光イメージング用造影剤としての有効性が示された。
図２５（ｂ）は、図２５（ａ）で示される蛍光イメージングデータから、腫瘍部（計測面積０．５×０．５ｃｍ）の蛍光強度と足の付け根の蛍光強度（正常部位として選択、計測面積０．５×０．５ｃｍ）の比をとったものであり、ＳＮＲ（ｓｉｇｎａｌ−ｔｏ−ｎｏｉｓｅ  ｒａｔｉｏ）として数値化したものである。すなわちＳＮＲは、それぞれの化合物の腫瘍描出力を示すパラメータであり、ＳＮＲが高いほど腫瘍の光イメージング用造影剤として有効であることになる。図２５（ｂ）より、全ての化合物のＳＮＲは１．５以上であり、また４ｂや６ｂでは特にＳＮＲが高く、腫瘍造影能に優れた化合物であることが示された。
【０１２０】
（実施例１０：腫瘍集積性と血中色素残存率の評価）
実施例９で実施した腫瘍造影実験のマウスの腫瘍中色素量と血中色素量を定量することで、ヒアルロン酸誘導体４ａ，４ｂ，４ｃ，５ａ，５ｂ，ならびに６ｂの腫瘍集積性と血中色素残存率を評価した。腫瘍集積性は実施例４と同じ方法で評価した。血中の色素残存率は、実施例２と同じ方法で評価した。その結果を図２６（ａ）に示す。本発明に係るヒアルロン酸誘導体を投与した腫瘍では色素が検出され、腫瘍への集積が確認された。腫瘍集積性は１．７％から１８．５％であり、６ｂでは最も高い腫瘍集積性１８．５％ＩＤ／ｇを示した。ＩＣＧ−ＳおよびＰＥＧを有するヒアルロン酸誘導体４では、血中色素残存率が低いにもかかわらず、腫瘍集積性が比較的高いため、腫瘍選択性の高い化合物であることがわかった。ＩＣＧ含率が高いと腫瘍集積性が低下する傾向が見られた。ＩＣＧおよびＰＥＧ−５Ｋを有するヒアルロン酸誘導体５では、ＰＥＧ分子量２Ｋの化合物（例えば１ｉ）と比べて、血中色素残存率が向上した一方で腫瘍集積性は低下した。近赤外色素を有する高分子量ヒアルロン酸誘導体６では、腫瘍集積性と血中濃度が高かった。血中滞留性が非常に高いため、腫瘍集積性も高くなったと思われる。
【０１２１】
（実施例１１：光音響信号の測定）
実施例５と同様にして、ヒアルロン酸誘導体４ａ，４ｂ，４ｃ，５ａ，５ｂ，ならびに６ｂの光音響信号を測定した。比較例としてＩＣＧ水溶液も同様に測定した。図２６（ｂ）にはＩＣＧの光音響信号強度に対する本発明の化合物の光音響信号の相対強度を示した。図２６（ｂ）から明らかなように、４ａ，４ｂ，４ｃ，５ａ，５ｂ，ならびに６ｂは、光音響信号を発信することが可能であり、ＩＣＧ以上の光音響信号強度を得ることが可能であることがわかった。特にＩＣＧ−ＳおよびＰＥＧを有するヒアルロン酸誘導体４において、ＩＣＧに比べて１．３〜１．４倍の光音響信号の増加が認められた。信号強度増加のメカニズムとしては、色素自身の熱変換効率がＩＣＧに比べて高いこと、色素同士が強く凝集し色素が媒体の水から覆われていることにより熱が閉じ込められることなどが考えられる。本実施例の結果より、本発明の化合物は光音響造影剤として機能することが確認された。
【０１２２】
（実施例１２：担ガンマウスの腫瘍部からの光音響信号強度の計測）
担ガンマウスの腫瘍部位からの光音響信号強度は以下のように計測した。市販の光音響イメージング装置（Ｎｅｘｕｓ１２８，Ｅｎｄｒａ．Iｎｃ．製）を用いた。レーザーの波長は７９０ｎmとした。本発明の化合物を投与する前、ならびに投与後２４時間目において、それぞれ、腫瘍部の光音響信号を測定し、それぞれの３次元再構成データを得た。得られた３次元再構成データを用いてソフトウェア（ＧＥＨＣ  ＭＩＣＲＯＶＩＥＷ，  ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により関心領域（ＲＯＩ：Ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）として全計測領域（２ｃｍｘ２ｃｍｘ２ｃｍ）の光音響強度を計測した。担ガンマウスは、実施例３に記載のマウスを用いた。本発明の実施例に係る化合物１ａ，１ｃ，１i，２ｃ，２ｇ，４ａ，４ｂ、ならびにコントロールとして生理食塩水を投与した。化合物の投与量は、ＩＣＧ  ５０ｎｍｏｌをマウスに投与した。
表８には、投与前と投与後２４時間目の腫瘍部の光音響信号の比を示したものである。全ての化合物において、コントロールと比較して、投与後における光音響信号の増加が認められた。この結果より、本発明の化合物は腫瘍の光音響イメージングが可能であることが示された。
【０１２３】
【表８】
2014185333.tif 000045
【０１２４】
（実施例１３：ＩＣＧ、ＰＥＧおよびＲＧＤを有するヒアルロン酸誘導体７の合成）
実施例１（４）で得られた３−ａｚｉｄｏ−１−ｐｒｏｐｙｌａｍｉｎｅをＨＡに部分的に導入したヒアルロン酸誘導体３（表１、エントリー３）に対し、未反応のＨＡのカルボキシル基部位に環状ＲＧＤペプチドを導入することでアジド基およびＲＧＤを有するヒアルロン酸誘導体を合成し、次いで、これにＩＣＧとＰＥＧを結合させた（図２７）。具体例を以下に示す。
表１のエントリー番号３の条件で得られた、３−ａｚｉｄｏ−１−ｐｒｏｐｙｌａｍｉｎｅを９０％結合させたヒアルロン酸誘導体１２ｍｇ（ＭＷ（ＨＡ−Ｎａ）＝８Ｋ，単位ユニット換算で３０μｍｏｌ）を、実施例１（２）で示す反応に付し、カチオン交換を行った。続いて、窒素雰囲気下、２５ｍＬシュレンク管に得られた白色固体９．７ｍｇ（単位ユニット換算で２０μｍｏｌ）を入れ、無水ＤＭＳＯ  ０．５０ｍｌに溶解させた。ここにＰｙＢＯＰ  ９．５ｍｇ（１８μｍｏｌ）とＨＯＢｔ  ２．４ｍｇ（１８μｍｏｌ）を加えた後、環状ＲＧＤペプチド（ＲＧＤ−ＮＨ２）  １１ｍｇ（１８μｍｏｌ）のＤＭＳＯ溶液１．１ｍｌを加え、室温で１８時間攪拌した。この溶液に水を加え、水層をＣＨ２Ｃｌ２により洗浄し、水層を排除分子量３．５Ｋの透析膜を用いて、２４時間透析した。凍結乾燥を行い、アジド基およびＲＧＤの導入効率がそれぞれ９０％および１０％のヒアルロン酸誘導体を二段階で白色固体  ６．５ｍｇ（４３％）として得た。同定は１Ｈ−ＮＭＲにより行った。なお、ＲＧＤの導入効率は、ヒアルロン酸に含まれるＮ−アセチル（Ａｃ）基の３Ｈ（１．８７ｐｐｍ）とＲＧＤのフェニルアラニンに含まれるフェニル（Ｐｈ）基の５Ｈ（７．０５−７．２８ｐｐｍ）の比より算出した。結果は（１Ｈ−ＮＭＲ （４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ，２５℃）δ／ｐｐｍ； １．６９（ｓ，１．８Ｈ），１．８８（ｓ，３Ｈ），３．００−３．８５（ｍ，１４Ｈ），４．３９（ｍ，２Ｈ），７.０５−７．２８（ｍ，０．５０Ｈ）であった。
次に、上記で得られたアジド基およびＲＧＤを有するヒアルロン酸誘導体に対し、実施例１（５）と同様の反応条件でＩＣＧ−ａｌｋｙｎｅおよびＰＥＧ−ａｌｋｙｎｅを作用させることで、ＩＣＧ、ＰＥＧおよびＲＧＤを有するヒアルロン酸誘導体７を収率５３％で得た（図２７）。ＩＣＧ、ＰＥＧ、ＲＧＤの導入率は１７：７３：１０であった。同定は１Ｈ−ＮＭＲにより行った。（１Ｈ−ＮＭＲ （４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ，２５℃）δ／ｐｐｍ；１．７０−２．１５（ｍ，３Ｈ），３．１０−４．００（ｍ，２６１Ｈ），４．２５−４．５０（ｍ，２Ｈ），７．９４（ｂｒ  ｓ，０．８９Ｈ））。なお環化反応の転換率は、本願明細書［００７９］に示す手法で決定した。得られた化合物が水中で形成する自己集合体の粒径は、９４±６８ｎｍであり、臨界凝集濃度は４．０×１０−４ｇ/ｌであった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図８】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２６】
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【図２７】
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【図７】
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【図９】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図２０】
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【図２５】
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