(57)【要約】      （修正有）【課題】副作用を軽減した新規がん治療用の医薬組成物又は組合せ剤の提供。【解決手段】有効成分として、（ａ）下記Ｉで表されるブロック共重合体とシスプラチンからなる配位化合物及び（ｂ）塩酸ゲムシタビン；を含んでなる、医薬組成物又は組合せ剤。2014208694.tif 000006【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効成分として、
（ａ）下記Ｉ又はＩＩで表されるブロック共重合体とシスプラチンからなる配位化合物:
【化１】
2014208694.tif 000005
（上記式ＩおよびＩＩにおいて、Ｒ1は、独立して、水素原子又は、官能基又は置換基により置換されていてもよいアルキル基を示し、Ａは、独立して、ＮＨ、ＣＯ、Ｒ5（ＣＨ2）pＲ6または直接結合を示し、ここでＲ5はＯ、ＯＣＯ、ＯＣＯＮＨ、ＮＨＣＯ、ＮＨＣＯＯ、ＮＨＣＯＮＨ、ＣＯＮＨまたはＣＯＯであり、Ｒ6はＮＨまたはＣＯであり、そしてｐは１〜６の整数であり；Ｒ2は、独立して、水素原子、アルカリ金属、アルキル基またはアラルキル基を示し、Ｒ3は、独立して、水素原子、水酸基または疎水性残基を示し、ｍは、独立して、40〜450の整数を示し、そしてｎは、独立して、20〜80の整数を示す）；及び
（ｂ）塩酸ゲムシタビン；
を含んでなる、医薬組成物又は組合せ剤。
【請求項２】
前記ブロック共重合体が、式Ｉであり、Ｒ2が水素原子またはアルカリ金属である、請求項１に記載の医薬組成物又は組合せ剤。
【請求項３】
肺がん、前立腺がん、すい臓がん、大腸がん及び乳がんからなる群より選択されるがんの治療用である、請求項１に記載の医薬組成物又は組合せ剤。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の医薬組合せ剤からなる癌の治療用キットであって、
（ｉ）Ｉ又はＩＩで表されるブロック共重合体とシスプラチンからなる配位化合物の少なくとも一つ；
（ｉｉ）塩酸ゲムシタビン；及び
（ｉｉｉ）癌の種類に応じて同時または連続して投与される様に（一定の間隔をおいて順次患者に投与される様に）指示する投与スケジュール指示書；
を含んでなる、癌の治療用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ブロック共重合体とシスプラチンからなる配位化合物と塩酸ゲムシタビンとを含んでなる、又は組合せてなる、がん治療用の医薬組成物又は組合せ剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、がんは最大の死亡原因である。しかし、外科的手術、放射線療法など多岐にわたる治療法の研究にもかかわらずがんは克服されておらず、現在も多くの研究が多額の費用と時間をかけて行なわれている。
【０００３】
その中で化学療法は大きな柱の一つであり、多くの抗がん剤が研究・開発されている。例えば、がんの化学療法剤として、アルキル化剤、白金製剤、代謝拮抗剤、植物アルカロイドなど種々の抗がん剤が知られている。
【０００４】
塩酸ゲムシタビン［ジェムザール（登録商標）］は、代謝拮抗剤に属するフッ化ピリミジン系の抗がん剤であり、細胞内で代謝されて活性型のヌクレオチドである二リン酸化物及び三リン酸化物となり、これらがDNA合成を直接的及び間接的に阻害することにより殺細胞作用を示すことが知られている。塩酸ゲムシタビンは、日本において、すい臓癌、非小細胞肺がん、胆道がんへの適応、諸外国においては、乳がん、膀胱がん、卵巣がん及び子宮頸がんへの適応も承認されている。
【０００５】
他方、近年、投与する薬物を生体内の薬物が作用すべき特異的部位へ、時間と量を制御して送達し、効果の増強や副作用の低減を達成するための技術、ドラッグデリバリーシステム（DDS）が盛んに研究されている。DDSの具体的な手段としては、リポソーム、エマルジョン、またはナノパーティクルなどを薬物運搬体として利用する方法、高分子合成ポリマーミセルなどの高分子運搬体に薬物を包含させる方法、あるいは合成高分子や天然多糖類に薬物を共有結合させる方法等が用いられている。
【０００６】
それらのうち、WO02/26241A1には、ポリ（エチレングリコール）−ポリ（グルタミン酸）からなるブロック共重合体のカルボキシアニオンにシスプラチンが配位結合した配位化合物が開示されている。該配位化合物は、水性媒体中で高分子ミセルを形成し、動物実験において、シスプラチンに由来する腎毒性を低減できることが報告されており［Br J Cancer 19 93(6) 678-87（2005）］、現在臨床試験の段階にある。
【０００７】
しかし、種々の抗がん剤の研究開発にもかかわらず、依然としてがんは克服されておらず、抗がん剤の単剤による治療では、その正常細胞への強い毒性のために投与量の限界があり、一部の癌を除いては、奏功率および副作用の観点から、必ずしも十分であるとはいえない。従って、種々の抗がん剤を組合せた併用療法が盛んに試みられている。例えば、A.M. Bergman et. al, Clin. Cancer Res, 2 (1996) 521-530）には、塩酸ゲムシタビンとシスプラチンの併用効果が報告されている。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、現在の化学療法の問題点である副作用を軽減し、より高い奏功率を発揮させる為になされたものである。
【０００９】
従って、本発明は、以下の態様を含む。
［１］有効成分として、
（ａ）下記Ｉ又はＩＩで表されるブロック共重合体とシスプラチンからなる配位化合物：
【００１０】
【化１】
2014208694.tif 000002
【００１１】
（上記式ＩおよびＩＩにおいて、Ｒ1は、独立して、水素原子又は、官能基又は置換基により置換されていてもよいアルキル基を示し、Ａは、独立して、ＮＨ、ＣＯ、Ｒ5（ＣＨ2）pＲ6または直接結合を示し、ここでＲ5はＯ、ＯＣＯ、ＯＣＯＮＨ、ＮＨＣＯ、ＮＨＣＯＯ、ＮＨＣＯＮＨ、ＣＯＮＨまたはＣＯＯであり、Ｒ6はＮＨまたはＣＯであり、そしてｐは１〜６の整数であり；Ｒ2は、独立して、水素原子、アルカリ金属、アルキル基またはアラルキル基を示し、Ｒ3は、独立して、水素原子、水酸基または疎水性残基を示し、ｍは、独立して、40〜450の整数を示し、そしてｎは、独立して、20〜80の整数を示す）；及び
（ｂ）塩酸ゲムシタビン；
を含んでなる、医薬組成物又は組合せ剤。
［２］前記ブロック共重合体が、式Ｉであり、Ｒ2が水素原子またはアルカリ金属である、［１］に記載の医薬組成物又は組合せ剤。
［３］肺がん、前立腺がん、すい臓がん、大腸がん及び乳がんからなる群より選択されるがんの治療用である、［１］に記載の医薬組成物又は組合せ剤。
［４］上記［１］〜［３］に記載の医薬組合せ剤からなる癌の治療用キットであって、
（ｉ）Ｉ又はＩＩで表されるブロック共重合体とシスプラチンからなる配位化合物の少なくとも一つ；
（ｉｉ）塩酸ゲムシタビン；及び
（ｉｉｉ）癌の種類に応じて同時または連続して投与される様に（一定の間隔をおいて順次患者に投与される様に）指示する投与スケジュール指示書；
を含んでなる、癌の治療用キット。
【００１２】
驚くべきことに、本願発明の式Ｉ又はＩＩで表されるブロック共重合体とシスプラチンからなる配位化合物と塩酸ゲムシタビンを含んでなる医薬組成物又は組合せ剤とすることで、シスプラチンと塩酸ゲムシタビンを含んでなる医薬組成物又は組合せ剤よりもはるかに高い相乗効果と安全性を確保できることを見出した。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】ヒト前立腺癌PC-3細胞に対するCDDPと塩酸ゲムシタビンの組合せによるインビトロ増殖抑制効果を示すグラフである（３ウェルの平均値±SD）。図中、○はCDDP単独の濃度変化による細胞の増殖を示し、黒ひし形、黒正三角、黒正方形及び黒丸は、それぞれ、CDDP濃度を0.2μg/mL、0.6μg/mL、1.9μg/mL及び5.6μg/mLの濃度で固定し、塩酸ゲムシタビンの濃度を変化させた場合の細胞の増殖を表し、△は塩酸ゲムシタビン単独の濃度変化による細胞の増殖を示す。縦軸は細胞増殖率、横軸は塩酸ゲムシタビン濃度を表す。但し、CDDP単独時（○）の場合は、CDDP濃度を表す。
【図２】ヒト前立腺癌PC-3細胞に対するCDDPと塩酸ゲムシタビンの組合せによるGI50の関係を示すグラフである。縦軸は塩酸ゲムシタビン濃度、横軸はCDDP濃度を表す。
【図３】CDDP耐性ヒト肺癌MOR/CPR細胞に対するCDDPと塩酸ゲムシタビンの組合せによるインビトロ増殖抑制効果を示すグラフである（３ウェルの平均値±SD）。図中、○はCDDP単独の濃度変化による細胞の増殖を示し、黒ひし形、黒正三角、黒正方形及び黒丸は、それぞれ、CDDP濃度を0.2μg/mL、0.6μg/mL、1.9μg/mL及び5.6μg/mLの濃度で固定し、塩酸ゲムシタビンの濃度を変化させた場合の細胞の増殖を表し、△は塩酸ゲムシタビン単独の濃度変化による細胞の増殖を示す。縦軸は細胞増殖率、横軸は塩酸ゲムシタビン濃度を表す。但し、CDDP単独時（○）の場合は、CDDP濃度を表す。
【図４】CDDP耐性ヒト肺癌MOR/CPR細胞に対するCDDPと塩酸ゲムシタビンの組合せによるGI50の関係を示すグラフである。縦軸は塩酸ゲムシタビン濃度、横軸はCDDP濃度を表す。
【図５】CDDP耐性ヒト肺癌MOR/CPR細胞に対するCDDP配位化合物と塩酸ゲムシタビンの組合せによるインビトロ増殖抑制効果示すグラフである（３ウェルの平均値±SD）。○はCDDP配位化合物単独の濃度変化による細胞の増殖を示し、黒ひし形、黒正三角、黒正方形及び黒丸は、それぞれ、CDDP配位化合物濃度を3.1μg/mL、9.3μg/mL、27.8μg/mL及び83.3μg/mLの濃度で固定し、塩酸ゲムシタビンの濃度を変化させた場合の細胞の増殖を表し、△は塩酸ゲムシタビン単独の濃度変化による細胞の増殖を示す。縦軸は細胞増殖率、横軸は塩酸ゲムシタビン濃度を表す。但し、CDDP配位化合物単独時（○）の場合は、CDDP換算濃度を表す。
【図６】CDDP耐性ヒト肺癌MOR/CPR細胞に対するCDDP配位化合物またはCDDPと塩酸ゲムシタビンの組合せによるGI50の関係を示すグラフである。縦軸は塩酸ゲムシタビン濃度、横軸は、CDDP配位化合物またはCDDPの濃度を示し、黒丸はCDDP配位化合物を示し、黒正方形はCDDPを示す。
【図７】ヒト前立腺癌PC-3移植ヌードマウスにおけるシスプラチン配位化合物と塩酸ゲムシタビンの併用の腫瘍縮小効果を示すグラフである（平均値±SE）。＊は、コントロール（未投与）、黒正方形、黒ひし形及び黒丸は、それぞれ、塩酸ゲムシタビン33mg/kg、50mg/kg及び75mg/kg  とCDDP配位化合物5mg/kgでの併用を示し、◇は、CDDP配位化合物5mg/kgでの単独投与を示し、○はCDDP3.3mg/kgでの単独投与を示し、黒正三角はCDDP3.3mg/kgと塩酸ゲムシタビン50mg/kgでの併用を示し、△と□はそれぞれ、塩酸ゲムシタビン50mg/kg及び75mg/kgでの単独投与を示す。縦軸は投与開始日の腫瘍体積を100％とした時の相対比率、横軸は投与開始日以降の日数を表す。
【図８】ヒト前立腺癌PC-3移植ヌードマウスにおけるシスプラチン配位化合物と塩酸ゲムシタビンの併用の体重変化を示すグラフである（平均値±SE）。それぞれのシンボルは、図７と同様である。縦軸は投与開始日の体重を100％とした時の相対比率、横軸は投与開始日以降の日数を表す。
【図９】シスプラチン耐性肺癌MOR/CPR移植ヌードマウスにおけるシスプラチン配位化合物と塩酸ゲムシタビンの併用の腫瘍縮小効果を示すグラフである（平均値±SE）。○は、コントロール（未投与）を示し、黒ひし形は、CDDP配位化合物5mg/kgでの単独投与を示し、黒正方形は、塩酸ゲムシタビン75mg/kgとCDDP配位化合物5mg/kgでの併用を示し、黒正三角はCDDP3.3mg/kgでの単独投与を示し、黒丸は、CDDP3.3mg/kg及び塩酸ゲムシタビン75mg/kgでの併用を示し（但し、４回目の投与は行っていない）、□は、塩酸ゲムシタビン75mg/kgでの単独投与を示す。縦軸は投与開始日の腫瘍体積を100％とした時の相対比率、横軸は投与開始日以降の日数を表す。
【図１０】シスプラチン耐性肺癌MOR/CPR移植ヌードマウスにおけるシスプラチン配位化合物と塩酸ゲムシタビンの併用の体重変化を示すグラフである（平均値±SE）。それぞれのシンボルは図９と同様である。縦軸は投与開始日の体重を100％とした時の相対比率、横軸は投与開始日以降の日数を表す。
【図１１】ヒトすい臓癌BxPC-3細胞に対するCDDP配位化合物と塩酸ゲムシタビンの組合せによるインビトロ増殖抑制効果示すグラフである（３ウェルの平均値±SD）。○はCDDP配位化合物単独の濃度変化による細胞の増殖を示し、黒丸、黒正三角、黒正方形及び黒星は、それぞれ、CDDP配位化合物濃度（CDDP換算）を0.11μg/mL、0.34μg/mL、1.0μg/mL及び3.1μg/mLの濃度で固定し、塩酸ゲムシタビンの濃度を変化させた場合の細胞の増殖を表し、△は塩酸ゲムシタビン単独の濃度変化による細胞の増殖を示す。縦軸は細胞増殖率、横軸は塩酸ゲムシタビン濃度を表す。但し、CDDP配位化合物単独時（○）の場合は、CDDP換算濃度を表す。
【図１２】すい臓癌BxPC-3細胞に対するCDDP配位化合物と塩酸ゲムシタビンの組合せによるGI50の関係を示すグラフである。縦軸は塩酸ゲムシタビン濃度、横軸は、CDDP配位化合物の濃度（CDDP換算）を示す。
【図１３】ヒト乳癌MDA-MB-231細胞に対するCDDP配位化合物と塩酸ゲムシタビンの組合せによるインビトロ増殖抑制効果示すグラフである（３ウェルの平均値±SD）。○はCDDP配位化合物単独の濃度変化による細胞の増殖を示し、黒丸、黒正三角、黒正方形及び黒星は、それぞれ、CDDP配位化合物濃度（CDDP換算）を1.0μg/mL、3.1μg/mL、9.3μg/mL及び28μg/mLの濃度で固定し、塩酸ゲムシタビンの濃度を変化させた場合の細胞の増殖を表し、△は塩酸ゲムシタビン単独の濃度変化による細胞の増殖を示す。縦軸は細胞増殖率、横軸は塩酸ゲムシタビン濃度を表す。但し、CDDP配位化合物単独時（○）の場合は、CDDP換算濃度を表す。
【図１４】ヒト乳癌MDA-MB-231細胞に対するCDDP配位化合物と塩酸ゲムシタビンの組合せによるGI50の関係を示すグラフである。縦軸は塩酸ゲムシタビン濃度、横軸は、CDDP配位化合物の濃度（CDDP換算）を示す。
【図１５】ヒト大腸癌LS174T細胞に対するCDDP配位化合物と塩酸ゲムシタビンの組合せによるインビトロ増殖抑制効果示すグラフである（３ウェルの平均値±SD）。○はCDDP配位化合物単独の濃度変化による細胞の増殖を示し、黒丸、黒正三角、黒正方形及び黒星は、それぞれ、CDDP配位化合物濃度（CDDP換算）を0.11μg/mL、0.34μg/mL、1.0μg/mL及び3.1μg/mLの濃度で固定し、塩酸ゲムシタビンの濃度を変化させた場合の細胞の増殖を表し、△は塩酸ゲムシタビン単独の濃度変化による細胞の増殖を示す。縦軸は細胞増殖率、横軸は塩酸ゲムシタビン濃度を表す。但し、CDDP配位化合物単独時（○）の場合は、CDDP換算濃度を表す。
【図１６】ヒト大腸癌LS174T細胞に対するCDDP配位化合物と塩酸ゲムシタビンの組合せによるGI50の関係を示すグラフである。縦軸は塩酸ゲムシタビン濃度、横軸は、CDDP配位化合物の濃度（CDDP換算）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明において、式Ｉ又はＩＩで表されるブロック共重合体は、式Ｉであることが好ましい。式Ｉ又はＩＩのＲ1にいう、アルキル基とは、Ｃ1-6のアルキル基を意味し、官能基又は置換基としては、保護されていてもよいヒドロキシル基、カルボキシル基、アルデヒド基、アミノ基、メルカプト基、マレイミド基などが挙げられる。Ａは、ブロック共重合体の合成方法により変化するため特に限定されるものではないが、式Ｉの場合、Ｒ5（ＣＨ2）pＲ6であり、Ｒ5はＯであり、Ｒ6はＮＨであり、そしてｐは１〜６の整数であることが好ましく、式ＩＩの場合、ＣＯ又は直接結合であることが好ましい。Ｒ2は、いずれの式の場合も水素原子またはアルカリ金属であることが好ましく、特にアルカリ金属のうちでもＮａであることが好ましい。Ｒ3は、式Ｉの場合には、水素原子またはＣ8-16アルキルカルボニル、フェニルアセチル、ジフェニルアセチル及びピレンスルホニルであり、他方、式ＩＩの場合は水酸基または、Ｃ8-16アルキル、ベンジル、ベンズヒドリル、アダマンチル及びコレステリルからなる群より選択される疎水性残基を示し、特に式Ｉの場合は、水素原子が好ましく、式ＩＩの場合は水酸基が好ましい。ｍは、独立して、40〜450の整数を示し、好ましくは60〜410の整数が好ましく、特に110〜340の整数が好ましい。そしてｎは、独立して、20〜80の整数を示し、特に30〜50の整数であることが好ましい。
【００１５】
上記ブロック共重合体の合成方法は所望のブロック共重合体が得られる限り特に限定されないが、例えば、ＭｅＯ−ＰＥＧ−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2−ＮＨ2を開始剤として、脱水の有機溶媒中で、Ｎ−カルボキシ−γ−ベンジル−Ｌ−グルタミン酸無水物(BLG-NCA)を所望の重合度（重合度はアミノ酸ユニット数、即ち、式ＩおよびＩＩにおけるｎで示される）となるように添加して反応させ、アルカリ加水分解によりベンジル基を除去することにより得ることができる。
【００１６】
本発明における組合せ剤とは、（ａ）式Ｉ又はＩＩで表されるブロック共重合体とシスプラチンからなる配位化合物からなる成分および（ｂ）塩酸ゲムシタビンを含んでなる成分の組合せのことであり、前記成分（ａ）と前記成分（ｂ）を同時に、または時間を変えて（または連続的に）投与することを意味する。
【００１７】
本発明には前記成分（ａ）と前記成分（ｂ）を同時に、または時間を変えて（または連続的に）患者に投与することからなる、がんの治療方法が含まれる。尚、この場合、前記成分（ａ）と前記成分（ｂ）の投与の順番は、がんの種類により適宜選択される。更に、本発明には、がん治療用の本発明の医薬組成物または、医薬組合せ剤を製造するための前記成分（ａ）と前記成分（ｂ）の使用、前記成分（ａ）と前記成分（ｂ）を含んでなる治療用キット及び当該キットを製造するための前記成分（ａ）と前記成分（ｂ）の使用も含まれる。
【００１８】
前記本発明の医薬組成物は、前記成分（ａ）と前記成分（ｂ）を含有している一つの医薬組成物であって、前記成分（ａ）と前記成分（ｂ）はこれらの有効成分そのものを用いて医薬組成物としてもよいし、前記成分（ａ）を有効成分として含有する製剤および前記成分（ｂ）を有効成分として含有する製剤を用いて医薬組成物としてもよい。また、前記成分（ａ）と前記成分（ｂ）の一方の成分そのものを用いて、そして、他方を予め製剤化したものを用いて医薬組成物としてもよい。本発明の医薬組成物の製剤としては、液剤、凍結乾燥製剤などが挙げられ、特に凍結乾燥製剤が好ましい。
【００１９】
また、本発明の医薬組合せ剤において、通常それぞれ別々に予め製剤化したもの即ち、前記成分（ａ）を有効成分として含有する製剤及び前記成分（ｂ）を有効成分として含有する製剤を同時に、または時間を変えて（または連続的に）投与する。
【００２０】
本発明の医薬組成物、医薬組合せ剤の何れにおいても製剤化のために一般に用いられる希釈剤、賦形剤、等張剤、ｐＨ調整剤などを用いることができる。
【００２１】
本発明の医薬組成物または医薬組合せ剤の投与ルートとしては、静脈内注射が好ましい。
【００２２】
本発明の医薬組成物または組合せ剤の投与量は、用法、患者の年齢、性別、患者の状態およびその他の条件により適宜選択される。限定されるものではないが、医薬組成物（混剤）の場合、１回の投与に使用される製剤中に含まれる、成分（ａ）のシスプラチン配位化合物の量は、シスプラチン換算で、患者の体表面積１平方メートル当り、約１〜400mg程度とするのがよく、好ましくは、10〜300ｍｇ程度とするのがよい。一方、成分（ｂ）である塩酸ゲムシタビンは、患者の体表面積１平方メートル当り約50〜1300mg程度、好ましくは、200〜1000ｍｇ程度とするのがよい。
【００２３】
また、組合せ剤の場合、成分（ａ）のシスプラチン配位化合物の量は、シスプラチン換算で、患者の体表面積１平方メートル当り、約10〜400mg程度とするのがよく、好ましくは、30〜300ｍｇ程度とするのがよい。一方、成分（ｂ）である塩酸ゲムシタビンは、患者の体表面積１平方メートル当り約100〜1300mg程度、好ましくは、400〜1000ｍｇ程度とするのがよい。
【００２４】
医薬組成物（混剤）の場合、限定されるものではないが、３日に一回〜８週間に一回程度の投与が好ましい。
【００２５】
組合せ剤の投与は、同時投与の場合、成分（ａ）のシスプラチン配位化合物と成分（ｂ）である塩酸ゲムシタビンが時間を置かずに又は混合されて投与される。時間を変えて（連続的に）投与する場合、成分（ａ）または成分（ｂ）の何れかを投与し、１日〜２週間後にもう一方の成分を投与すること（即ち、交互に投与すること）を１サイクルとしてこれを繰り返すことができる。また、成分（ａ）または成分（ｂ）の何れかの投与を３日〜２週の間隔で２回〜５回繰り返した後、もう一方の成分を投与し、これを１サイクルとして繰り返し行うことができる。この際、もう一方の成分も３日〜２週の間隔で２回〜５回繰り返し行うことを１サイクルとしてもよい。尚、いずれの場合も、１サイクルの間隔は３日〜５週間空けることができ、患者の状況をみて、休薬期間を設けることができる。
【実施例】
【００２６】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
比較例１
ヒト前立腺癌PC-3細胞に対するインビトロ細胞増殖抑制効果：
シスプラチン（以下、CDDPと略記することがある）は、CDDP注射液 [ランダ（登録商標）注、日本化薬（株）]（CDDP濃度：0.5mg /mL）を用いた。塩酸ゲムシタビン ［ジェムザール（登録商標）］は日本イーライリリー（株）から購入した。ヒト前立腺癌PC-3細胞は（財）ヒューマンサイエンス振興財団研究資源バンクから購入した。
【００２７】
CDDP、塩酸ゲムシタビン及び両者の組合せの細胞増殖抑制活性に関し、PC-3細胞を用い、WST法に従い、以下のように評価した。96ウェルプレート上、１ウェルあたり約5000個の細胞を播き、RPMI1640(GibcoTM, Invitrogen)+10%FBS (Fetal Bovine Serum、BioWest)培地を添加し、計90μLとした。続いて、培地で順に３倍希釈した薬物（10μL、ただし、組合せの場合に限り20μL）を添加し、必要に応じて培地10μLを加えることで液量を110μLに補正した後、５％CO2下、37℃にて72時間培養した。その後、WST Reagent（同仁化学研究所）を添加（10 μL）し、５％CO2下、37℃にて約72時間培養を続けた。各ウェルの450nmにおける吸光度（Abs450）を測定し、下式に基づき細胞増殖率（% cell growth）を計算した。
【００２８】
【数１】
2014208694.tif 000003
【００２９】
CDDPと塩酸ゲムシタビンの組合せによる効果を調べる際、CDDP濃度を４種設定し、その設定した一定CDDP濃度の下、塩酸ゲムシタビン濃度を変化させた時の塩酸ゲムシタビン濃度−細胞増殖率曲線を図１に示した。CDDP 0.2μg/mL存在下では非存在下と近似した結果が得られたが、同じ塩酸ゲムシタビン濃度で比較する時、CDDPが0.6μg/mL以上共存するときは、CDDP濃度の増加に伴い、細胞増殖率が低下した。図１中のそれぞれの塩酸ゲムシタビン濃度−増殖率曲線におけるGI50（細胞の50％増殖阻害濃度）を求め、図２にプロットした。単剤でのGI50（ｘ軸切片、ｙ軸切片に対応）を結んだ直線よりも原点に近い領域に点が存在するので、CDDPと塩酸ゲムシタビンの相乗効果が示唆された。
比較例２
CDDP耐性ヒト肺癌MOR/CPR細胞に対するインビトロ細胞増殖抑制効果：
MOR/CPR細胞は大日本住友製薬（株）を通じて、European Collection of Cell Cultures (ECACC)から入手した。CDDP、塩酸ゲムシタビン及び両者の組合せの細胞増殖抑制活性は、細胞をMOR/CPR細胞に変えた以外は、比較例１と同様に評価した。
【００３０】
CDDPと塩酸ゲムシタビンの組合せ効果を調べるため、CDDP濃度を４種設定し、その設定した一定CDDP濃度の下、塩酸ゲムシタビン濃度を変化させた時の塩酸ゲムシタビン濃度−細胞増殖率曲線を図３に示した。同じ塩酸ゲムシタビン濃度で比較する時、共存するCDDP濃度の増加に伴い、細胞増殖率が低下した。図３中のそれぞれの塩酸ゲムシタビン濃度−増殖率曲線におけるGI50を求め、図４にプロットした。但し、塩酸ゲムシタビン単剤でのGI50を約10μg/mLと見積もった。図４から、MOR/CPR細胞に対してもCDDPと塩酸ゲムシタビンが相乗的に作用することが示唆された。
実施例１：
シスプラチン配位化合物の調製：
シスプラチン配位化合物の調製に使用したブロック共重合体は、下記の構造であり、Ｒ1はメチル基、ｍは平均値として272の整数、Ａは−ＯＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＮＨ−、ｎは平均値として40の整数、Ｒ3は水素原子、Ｒ2は全てがＮａであるものを用いた。
【００３１】
【化２】
2014208694.tif 000004
【００３２】
上記ブロック共重合体を用いて、WO02/26241号公報に記載の方法に準じてシスプラチン配位化合物を調製した。
実施例２
CDDP耐性ヒト肺癌MOR/CPR細胞に対するインビトロ細胞増殖抑制効果：
実施例１で得られたシスプラチン配位化合物を、CDDP換算で、2.5 mg/mLとなるように、終濃度が５％のマンニトール溶液として調製した。塩酸ゲムシタビン及び両者の組合せの細胞増殖抑制活性をMOR/CPR細胞を用い、比較例１と同様の方法で評価した。尚、シスプラチン配位化合物の濃度または投与量は、全てCDDP換算の濃度または投与量として記載している。
【００３３】
シスプラチン配位化合物と塩酸ゲムシタビンの組合せ効果を調べるため、シスプラチン配位化合物濃度を４種設定し、その設定した一定のシスプラチン配位化合物の濃度の下、塩酸ゲムシタビン濃度を変化させた時の塩酸ゲムシタビン濃度−細胞増殖率曲線を図５に示した。同じ塩酸ゲムシタビン濃度で比較する時、共存するシスプラチン配位化合物の濃度の増加に伴い、細胞増殖率が低下した。図５中のそれぞれの塩酸ゲムシタビン濃度−増殖率曲線におけるGI50を求め、図６にプロットした。但し、塩酸ゲムシタビン単剤でのGI50を約10 μg/mLと見積もった。図６から、MOR/CPR細胞に対して、シスプラチン配位化合物と塩酸ゲムシタビンの組合せは相乗的に作用することが示唆された。
実施例３
ヒト前立腺癌PC-3細胞を用いた薬効試験：
PC-3細胞をRPMI1640+10%FBS培地を用い、５％CO2下、37℃にて培養し、移植に必要とする細胞数になるまで増殖させた後、PC-3細胞を生理食塩水50μLに懸濁し、雄性ヌードマウス[Balb nu/nu、５週齢、日本チャールス・リバー（株）] １匹当たり２×106個の細胞を背部皮下に接種した。その後14日間ヌードマウスを飼育し、腫瘍体積が38±1.3 mm3 (Average±SE)になったところで薬剤の投与を開始した。投与スケジュールは４日おきに計３回の尾静脈内投与とし、以下の９群（ｎ＝７）で腫瘍体積および体重の経時変化を測定した。
【００３４】
(1)コントロール（無処理）、(2)シスプラチン配位化合物  ５mg/kg (MTDの2/3)＋塩酸ゲムシタビン 33mg/kg、(3)シスプラチン配位化合物  ５mg/kg＋塩酸ゲムシタビン 50mg/kg、(4)シスプラチン配位化合物  ５mg/kg＋塩酸ゲムシタビン 75mg/kg、(5)シスプラチン配位化合物  ５mg/kg、(6)CDDP 3.3mg/kg (MTDの2/3)、(7)CDDP 3.3mg/kg＋塩酸ゲムシタビン 50mg/kg、(8)塩酸ゲムシタビン 50mg/kg、(9)塩酸ゲムシタビン 75mg/kg （但し、シスプラチン配位化合物の投与量はCDDP換算量）。
【００３５】
腫瘍体積は電子ノギス［（株）ミツトヨ］で腫瘍の長径（ａ mm)と短径(ｂ mm)を測定し、下式に基づき、計算した。
【００３６】
腫瘍体積 (mm3) = ａ×ｂ2/２
シスプラチン配位化合物の投与量を５ mg/kg (MTDの2/3)に固定し、塩酸ゲムシタビンの併用量を33、50 (MTDの1/2)、75mg/kgと変化させた。検体投与開始後の腫瘍体積の時間推移を図７に、体重変化を図８に示した。シスプラチン配位化合物の単独投与と比較すると、塩酸ゲムシタビンの併用量の増加に伴い、腫瘍増殖抑制効果が強くなった。すなわち、抗腫瘍効果はT/C値で0.4-0.5（NC-6004単独）から、塩酸ゲムシタビンの併用量33、50、75 mg/kgの時、T/C値はおよそ0.2-0.3、0.1-0.2、0.1以下でそれぞれ推移した。同様に、MTDの2/3の投与量の時、CDDP単独(3.3mg/kg)では0.5-0.6のT/C値で腫瘍体積が推移し、塩酸ゲムシタビン 50mg/kg併用時、T/C値はおよそ0.2-0.3に低下した。一方、塩酸ゲムシタビン単独では0.3-0.5程度のT/C値であった。以上の結果から、シスプラチン配位化合物又はCDDPと塩酸ゲムシタビンとの併用により、腫瘍増殖抑制効果が増強し、その増強の程度はシスプラチン配位化合物との併用の方が強い傾向が認められた。
【００３７】
一方、副作用の指標である体重減少に関しても、塩酸ゲムシタビン 50mg/kgの併用時、シスプラチン配位化合物との併用群で、最大7.0%であった。一方、CDDPと塩酸ゲムシタビンとの併用時は最大で14.1%の体重減少が観察された。
実施例４
シスプラチン耐性ヒト肺癌MOR/CPR細胞を用いた薬効試験：
MOR/CPR細胞をRPMI1640+10%FBS培地を用い、５％CO2下、37℃にて培養し、移植に必要とする細胞数になるまで増殖させた。但し、CDDP耐性を維持するため、継代２回につき１回の割合で、最終CDDP濃度が１μg/mLになるよう、CDDPを培地に添加した。雄性ヌードマウス(Balb nu/nu)１匹当たり２×10６個の細胞を生理食塩水50μLに懸濁し、背部皮下に接種した。その後９日間ヌードマウスを飼育し、腫瘍体積が87±3.3 mm3 (Average±SE)になったところで薬剤の投与を開始した。投与スケジュールは４日毎に計４回の尾静脈内投与とし、以下の６群（ｎ＝７）で腫瘍体積および体重を週３回測定した。腫瘍体積は実施例３と同様の方法で測定及び計算した。
【００３８】
(1)コントロール（無処理）、(2)シスプラチン配位化合物  ５mg/kg (MTDの2/3)、(3)シスプラチン配位化合物  ５mg/kg＋塩酸ゲムシタビン 75mg/kg (MTDの3/4)、(4)CDDP 3.3mg/kg (MTDの2/3)、(5)CDDP 3.3mg/kg＋塩酸ゲムシタビン 75mg/kg、(6)塩酸ゲムシタビン 75mg/kg（但し、シスプラチン配位化合物の投与量はCDDP換算量） 
シスプラチン配位化合物の投与量を５mg/kg (MTDの2/3)に、塩酸ゲムシタビンの併用量を75mg/kg (MTDの3/4)に固定して、他の組合せ及び単剤と比較した。検体投与開始後の腫瘍体積の時間推移を図９に、体重変化を図10に示した。図９から、シスプラチン配位化合物と塩酸ゲムシタビンの組合せが、T/C値0.1-0.2前後で推移し、他の組合せや単剤よりも優れた腫瘍増殖抑制効果を有することが明らかとなった。CDDPと塩酸ゲムシタビンの組合せもT/C値0.3前後で有効であったものの、図10に示すように、３回目の投与後、最大約22％の体重減少が観察されたため、４回目の投与は中止し、計３回の投与で以降の評価を続行した。この組合せ以外の投与群に関しては、いずれの群でも体重減少は10％未満であった。以上の結果から、腫瘍増殖抑制効果と副作用の両面から、シスプラチン配位化合物と塩酸ゲムシタビンの組合せはシスプラチン耐性ヒト肺癌MOR/CPRに対し、CDDPと塩酸ゲムシタビンの組合せよりも優れていることが分かった。
実施例５
ヒトすい臓癌BxPC-3細胞に対するインビトロ細胞増殖抑制効果：
BxPC-3細胞は大日本住友製薬（株）を通じて、European Collection of Cell Cultures (ECACC)から入手した。実施例１で得られたシスプラチン配位化合物、塩酸ゲムシタビン及び両者の組合せの細胞増殖抑制活性を細胞をBxPC-3細胞に変え、比較例１と同様の方法で評価した。尚、前述の通り、シスプラチン配位化合物の濃度は、全てCDDP換算の濃度として記載している。
【００３９】
シスプラチン配位化合物と塩酸ゲムシタビンの組合せ効果を調べるため、シスプラチン配位化合物濃度を４種設定し、設定した一定濃度の下、塩酸ゲムシタビン濃度を変化させた時の塩酸ゲムシタビン濃度−細胞増殖率曲線を図11に示した。同じ塩酸ゲムシタビン濃度で比較する時、共存するシスプラチン配位化合物濃度の増加に伴い、細胞増殖率が低下した。図11中のそれぞれの塩酸ゲムシタビン濃度−増殖率曲線におけるGI50を求め、図12にプロットした。図12から、BxPC-3細胞に対してもシスプラチン配位化合物と塩酸ゲムシタビンが相乗的に作用することが示唆された。
実施例６
ヒト乳癌MDA-MB-231細胞に対するインビトロ細胞増殖抑制効果：
MDA-MB-231細胞は大日本住友製薬（株）を通じて、European Collection of Cell Cultures (ECACC)から入手した。実施例１で得られたシスプラチン配位化合物、塩酸ゲムシタビン及び両者の組合せの細胞増殖抑制活性を細胞をMDA-MB-231細胞に変え、比較例１と同様の方法で評価した。尚、前述の通り、シスプラチン配位化合物の濃度は、全てCDDP換算の濃度として記載している。
【００４０】
シスプラチン配位化合物と塩酸ゲムシタビンの組合せ効果を調べるため、シスプラチン配位化合物濃度を４種設定し、設定した一定濃度の下、塩酸ゲムシタビン濃度を変化させた時の塩酸ゲムシタビン濃度−細胞増殖率曲線を図13に示した。同じ塩酸ゲムシタビン濃度で比較する時、共存するシスプラチン配位化合物濃度の増加に伴い、細胞増殖率が低下した。図13中のそれぞれの塩酸ゲムシタビン濃度−増殖率曲線におけるGI50を求め、図14にプロットした。図14から、MDA-MB-231細胞に対してもシスプラチン配位化合物と塩酸ゲムシタビンが相乗的に作用することが示唆された。
実施例７
ヒト大腸癌LS174T細胞に対するインビトロ細胞増殖抑制効果：
LS174T細胞は大日本住友製薬（株）を通じて、European Collection of Cell Cultures (ECACC)から入手した。実施例１で得られたシスプラチン配位化合物、塩酸ゲムシタビン及び両者の組合せの細胞増殖抑制活性を細胞をLS174T細胞に変え、比較例１と同様の方法で評価した。尚、前述の通り、シスプラチン配位化合物の濃度は、全てCDDP換算の濃度として記載している。
【００４１】
シスプラチン配位化合物と塩酸ゲムシタビンの組合せ効果を調べるため、シスプラチン配位化合物濃度を４種設定し、設定した一定濃度の下、塩酸ゲムシタビン濃度を変化させた時の塩酸ゲムシタビン濃度−細胞増殖率曲線を図15に示した。同じ塩酸ゲムシタビン濃度で比較する時、共存するシスプラチン配位化合物濃度の増加に伴い、細胞増殖率が低下した。図15中のそれぞれの塩酸ゲムシタビン濃度−増殖率曲線におけるGI50を求め、図16にプロットした。図16から、LS174T細胞に対してもシスプラチン配位化合物と塩酸ゲムシタビンが相乗的に作用することが示唆された。
【図１】
2014208694.tif 000007
【図２】
2014208694.tif 000008
【図３】
2014208694.tif 000009
【図４】
2014208694.tif 000010
【図５】
2014208694.tif 000011
【図６】
2014208694.tif 000012
【図７】
2014208694.tif 000013
【図８】
2014208694.tif 000014
【図９】
2014208694.tif 000015
【図１０】
2014208694.tif 000016
【図１１】
2014208694.tif 000017
【図１２】
2014208694.tif 000018
【図１３】
2014208694.tif 000019
【図１４】
2014208694.tif 000020
【図１５】
2014208694.tif 000021
【図１６】
2014208694.tif 000022
【手続補正書】
【提出日】平成26年8月6日(2014.8.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効成分として、
（ａ）下記Ｉ又はＩＩで表されるブロック共重合体とシスプラチンからなる配位化合物:
【化１】
2014208694.tif 000023
【化２】
2014208694.tif 000024
（上記式ＩおよびＩＩにおいて、Ｒ1は、独立して、水素原子又は、官能基又は置換基により置換されていてもよいアルキル基を示し、ここで当該官能基又は置換基はヒドロキシル基、カルボキシル基、アルデヒド基、アミノ基、メルカプト基及びマレイミド基から成る群から選ばれ、Ａは、独立して、ＮＨ、ＣＯ、Ｒ5（ＣＨ2）pＲ6または直接結合を示し、ここでＲ5はＯ、ＯＣＯ、ＯＣＯＮＨ、ＮＨＣＯ、ＮＨＣＯＯ、ＮＨＣＯＮＨ、ＣＯＮＨまたはＣＯＯであり、Ｒ6はＮＨまたはＣＯであり、そしてｐは１〜６の整数であり；Ｒ2は、独立して、水素原子、アルカリ金属、アルキル基またはアラルキル基を示し、Ｒ3は、独立して、水素原子、水酸基または疎水性残基を示し、ｍは、独立して、40〜450の整数を示し、そしてｎは、独立して、20〜80の整数を示す）；及び
（ｂ）塩酸ゲムシタビン；
を含んでなる、医薬組成物又は組合せ剤。
【請求項２】
前記ブロック共重合体が、式Ｉであり、Ｒ2が水素原子またはアルカリ金属である、請求項１に記載の医薬組成物又は組合せ剤。
【請求項３】
肺がん、前立腺がん、すい臓がん、大腸がん及び乳がんからなる群より選択される癌の治療用である、請求項１に記載の医薬組成物又は組合せ剤。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の医薬組合せ剤からなる癌の治療用キットであって、
（ｉ）Ｉ又はＩＩで表されるブロック共重合体とシスプラチンからなる配位化合物の少なくとも一つ；
（ｉｉ）塩酸ゲムシタビン；及び
（ｉｉｉ）癌の種類に応じて同時または連続して投与される様に（一定の間隔をおいて順次患者に投与される様に）指示する投与スケジュール指示書；
を含んでなる、癌の治療用キット。
【請求項５】
有効成分として、
（ａ）下記Ｉ又はＩＩで表されるブロック共重合体とシスプラチンからなる配位化合物:
【化１】
2014208694.tif 000025
【化２】
2014208694.tif 000026
（上記式ＩおよびＩＩにおいて、Ｒ1は、独立して、水素原子又は、官能基又は置換基により置換されていてもよいアルキル基を示し、ここで当該官能基又は置換基はヒドロキシル基、カルボキシル基、アルデヒド基、アミノ基、メルカプト基及びマレイミド基から成る群から選ばれ、Ａは、独立して、ＮＨ、ＣＯ、Ｒ5（ＣＨ2）pＲ6または直接結合を示し、ここでＲ5はＯ、ＯＣＯ、ＯＣＯＮＨ、ＮＨＣＯ、ＮＨＣＯＯ、ＮＨＣＯＮＨ、ＣＯＮＨまたはＣＯＯであり、Ｒ6はＮＨまたはＣＯであり、そしてｐは１〜６の整数であり；Ｒ2は、独立して、水素原子、アルカリ金属、アルキル基またはアラルキル基を示し、Ｒ3は、独立して、水素原子、水酸基または疎水性残基を示し、ｍは、独立して、40〜450の整数を示し、そしてｎは、独立して、20〜80の整数を示す）；及び
（ｂ）塩酸ゲムシタビン；
を含んでなる、医薬品として使用するための医薬組成物又は組合せ剤。
【請求項６】
有効成分として、
（ａ）下記Ｉ又はＩＩで表されるブロック共重合体とシスプラチンからなる配位化合物:
【化１】
2014208694.tif 000027
【化２】
2014208694.tif 000028
（上記式ＩおよびＩＩにおいて、Ｒ1は、独立して、水素原子又は、官能基又は置換基により置換されていてもよいアルキル基を示し、ここで当該官能基又は置換基はヒドロキシル基、カルボキシル基、アルデヒド基、アミノ基、メルカプト基及びマレイミド基から成る群から選ばれ、Ａは、独立して、ＮＨ、ＣＯ、Ｒ5（ＣＨ2）pＲ6または直接結合を示し、ここでＲ5はＯ、ＯＣＯ、ＯＣＯＮＨ、ＮＨＣＯ、ＮＨＣＯＯ、ＮＨＣＯＮＨ、ＣＯＮＨまたはＣＯＯであり、Ｒ6はＮＨまたはＣＯであり、そしてｐは１〜６の整数であり；Ｒ2は、独立して、水素原子、アルカリ金属、アルキル基またはアラルキル基を示し、Ｒ3は、独立して、水素原子、水酸基または疎水性残基を示し、ｍは、独立して、40〜450の整数を示し、そしてｎは、独立して、20〜80の整数を示す）；及び
（ｂ）塩酸ゲムシタビン；
を含んでなる、肺がん、前立腺がん、すい臓がん、大腸がん及び乳がんからなる群より選択される癌の治療において使用するための医薬組成物又は組合せ剤。
【請求項７】
有効成分として、
（ａ）下記Ｉ又はＩＩで表されるブロック共重合体とシスプラチンからなる配位化合物:
【化１】
2014208694.tif 000029
【化２】
2014208694.tif 000030
（上記式ＩおよびＩＩにおいて、Ｒ1は、独立して、水素原子又は、官能基又は置換基により置換されていてもよいアルキル基を示し、ここで当該官能基又は置換基はヒドロキシル基、カルボキシル基、アルデヒド基、アミノ基、メルカプト基及びマレイミド基から成る群から選ばれ、Ａは、独立して、ＮＨ、ＣＯ、Ｒ5（ＣＨ2）pＲ6または直接結合を示し、ここでＲ5はＯ、ＯＣＯ、ＯＣＯＮＨ、ＮＨＣＯ、ＮＨＣＯＯ、ＮＨＣＯＮＨ、ＣＯＮＨまたはＣＯＯであり、Ｒ6はＮＨまたはＣＯであり、そしてｐは１〜６の整数であり；Ｒ2は、独立して、水素原子、アルカリ金属、アルキル基またはアラルキル基を示し、Ｒ3は、独立して、水素原子、水酸基または疎水性残基を示し、ｍは、独立して、40〜450の整数を示し、そしてｎは、独立して、20〜80の整数を示す）；及び
（ｂ）塩酸ゲムシタビン；
を含んでなる、成分（ａ）及び成分（ｂ）の同時に、又は時間を変えて、又は連続的に患者に投与することによる癌の治療において使用するための医薬組成物又は組合せ剤であって、ここで癌は肺がん、前立腺がん、すい臓がん、大腸がん及び乳がんからなる群より選択され、また成分（ａ）及び成分（ｂ）の順番は癌の種類に応じて選択される、医薬組成物又は組合せ剤。
【請求項８】
前記成分（ａ）のシスプラチン配合化合物の量が、シスプラチン換算で、患者の体表面積１平方メートル当たり１ｍｇ以上であり、成分（ｂ）である塩酸ゲムシタビンが、患者の体表面積１平方メートル当たり50ｍｇ以上である、請求項１〜３又は請求項５〜７のいずれか１項に記載の医薬組成物又は組合せ剤。
【請求項９】
前記成分（ａ）のシスプラチン配合化合物の量が、シスプラチン換算で、患者の体表面積１平方メートル当たり10ｍｇ以上であり、成分（ｂ）である塩酸ゲムシタビンが、患者の体表面積１平方メートル当たり200ｍｇ以上である、請求項１〜３又は請求項５〜７のいずれか１項に記載の医薬組成物又は組合せ剤。
【請求項１０】
前記成分（ａ）のシスプラチン配合化合物の量が、シスプラチン換算で、５ｍｇ以上であり、成分（ｂ）である塩酸ゲムシタビンが、75ｍｇ以上であり、ここで当該量はマウスに対する投与量である、請求項１〜３又は請求項５〜７のいずれか１項に記載の医薬組成物又は組合せ剤。
【請求項１１】
前記成分（ａ）のシスプラチン配合化合物の量が、シスプラチン換算で、患者の体表面積１平方メートル当たり15ｍｇ以上であり、成分（ｂ）である塩酸ゲムシタビンが、患者の体表面積１平方メートル当たり225ｍｇ以上である、請求項１〜３又は請求項５〜７のいずれか１項に記載の医薬組成物又は組合せ剤。