(57)【要約】      （修正有）【課題】ナノファイバー重量に対してポリオキシ酸が任意量含まれるシルクとポリオキシ酸から製造でき、ビーズ形態が含まれず微細でバラツキの少ない繊維径のシルク複合ナノファイバー及びその製造方法を提供する。【解決手段】シルク複合ナノファイバー重量に対してポリオキシ酸が任意量含まれるシルクとポリオキシ酸との混合物をトリフルオロ酢酸（TFA)あるいはヘキサフルオロイソプロパノール（HFIP)から選ばれる少なくとも1種の溶液に溶解し、エレクトロスピニングすることによりシルク複合ナノファイバーを製造する。このシルク複合ナノファイバーは細胞足場材としても好適に利用できる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
シルクとポリオキシ酸とが任意の組成比でなるシルク複合ナノファイバー。
【請求項２】
前記シルクは、家蚕由来のシルクフィブロイン及び野蚕由来のシルクフィブロインであることを特徴とする請求項１記載のシルク複合ナノファイバー。
【請求項３】
シルク複合ナノファイバー重量に対してポリオキシ酸が任意量含まれるシルクとポリオキシ酸との混合物をトリフルオロ酢酸（TFA)あるいはヘキサフルオロイソプロパノール（HFIP)から選ばれる少なくとも1種の溶液に溶解し、エレクトロスピニングしてなることを特徴とする請求項１または２記載のシルク複合ナノファイバー。
【請求項４】
シルクとポリオキシ酸との任意の組成比からなり、繊維径が100nmから1000nmであるシルク複合ナノファイバーからなる細胞足場材。
【請求項５】
前記シルク複合ナノファイバーは、シルク複合ナノファイバー重量に対してポリオキシ酸が任意量含まれるシルクとポリオキシ酸との混合物をトリフルオロ酢酸（TFA)あるいはヘキサフルオロイソプロパノール（HFIP)から選ばれる少なくとも1種の溶液に溶解し、エレクトロスピニングしてなる請求項４記載の細胞足場材。
【請求項６】
酵素による分解挙動の制御ならびに細胞の増殖制御が可能な請求項４または５記載の細胞足場材。
【請求項７】
前記シルク複合ナノファイバー表面で培養した細胞(MC3T3-E1)の分化機能の維持・発現が可能な請求項４または５記載の細胞足場材。
【請求項８】
シルク複合ナノファイバー重量に対してポリオキシ酸が任意量含まれるシルクとポリオキシ酸との混合物をトリフルオロ酢酸（TFA)あるいはヘキサフルオロイソプロパノール（HFIP)から選ばれる少なくとも1種の溶液に溶解し、エレクトロスピニングしてなることを特徴とする請求項１、２または３記載のシルク複合ナノファイバーの製造方法。
【請求項９】
濃度が70%〜95%のアルコール水溶液で浸漬処理することによりシルクナノファイバーあるいはシルク複合ナノファイバー水に対して不溶化させることを特徴とする請求項８記載のシルク複合ナノファイバーの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カイコのシルクフィブロイン（以下シルクと略記することもある）とポリオキシ酸とからなるシルク複合ナノファイバー及びその製造方法に関するものであり、シルク複合ナノファイバー重量に対してポリオキシ酸が任意量含有されてなるシルク複合ナノファイバーとその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
再生医療実現のための技術開発が進んでいる。幹細胞生物学が発展し、細胞の集合体である組織をどのようにして再構築させるかが重要な課題である。このような再生医療を可能とさせるための基盤技術は、細胞を効率良く経済的に付着・増殖させることが可能な細胞足場材の開発である。例えば、生分解性でしかも生体吸収性の高分子材からなる理想的な細胞足場材が開発できれば、素材表面で効率的に経済的に有用な細胞、例えばマウス頭蓋冠由来骨芽細胞を付着、増殖させることが可能となり、その結果、結合組織を中心とした骨や軟骨の再生を効率的に行うことができ、理想的な再生医療が飛躍的に発展することになるものと期待される。
【０００３】
再生医療における最先端分野で各種のバイオマテリアルをいかに活用するかが重要課題である。再生医療の目的は、損傷した患者の臓器や組織を元の機能を有する状態に再生することであるり、そのためには、細胞足場材料表面で細胞を効率的に経済的に並べて細胞が結合した細胞シートの製造が必要不可欠である。かくして製造できる細胞シートを患者に移植する方法が再生医療では有用と考えられる。こうした視点からも生体適合性であり生分解性に優れた細胞足場材の開発が強く望まれる。
【０００４】
近年、再生医学、組織工学分野における技術的な進展は目覚ましいものがある。この技術の基幹材料となるものが細胞の増殖時に細胞が３次元組織構造をつくる足場材料である。細胞足場材表面で増殖した細胞を効率的に回収する従来技術は、トリプシンなどのタンパク質分解酵素を作用させることで細胞-細胞間、細胞-細胞外マトリックス間のタンパク質を分解して増殖した細胞を回収する方法が採られてきた。しかし、従来法でタンパク質分解酵素を用いると細胞同士の結合が緩み細胞がバラバラとなってしまい細胞シートとして回収することができないという問題があった。
細胞間接着を維持したまま、細胞シートを効率的に回収することが必要不可欠である。理想的な細胞足場材が開発できれば、細胞を経済的に効果的にに増殖させることができ、目的とする形状と機能を持つ細胞シートが製造でき、その結果、身体組織を再生させることが可能となる。
【０００５】
細胞医療や再生医療を支える基盤材料として生分解性の生体高分子ナノファイバーが利活用されている。比表面積が大きく、生体親和性を有する有機生体高分子を有機溶媒に溶解しエレクトロスピニングすることで生体高分子のナノファイバーが製造できる。ナノファイバーの優れた生化学特性を活かし、再生医療分野では生体外において効率よく細胞を培養できる細胞足場材の開発が進むようになった。細胞足場材として利用できるナノファイバーは、繊維径が微細で、繊維径のばらつきが小さい形態特性を有することが望まれる。
生体高分子で細胞足場材として細胞培養を効率的に経済的に行うことが可能なナノファイバーはカイコの絹たんぱく質であるシルクフィブロイン（シルクと略記することもある）とポリオキシ酸である。カイコ由来の絹たんぱく質は、生体安全性、生分解性を呈し、医用分野で最近着目されている。ポリ乳酸及びポリグリコール酸はポリオキシ酸と総称され生体安全性であり生分解性に優れているため、体内埋め込み材、デリバリー用材料あるいは医薬品の徐放担体として広く利用されている。
【０００６】
カイコ由来の絹たんぱく質を用い、繊維径300-400nmの微細なシルクナノファイバーは、精練済みの絹フィブロイン繊維をトリフルオロ酢酸（TFAと略記することもある）水和物に溶解したTFA溶液をエレクトロスピニングすることで製造できる(特許文献１）。また、精練絹フィブロイン繊維を中性塩水溶液で溶解し脱塩し水溶液を蒸発乾燥固化することでなる再生絹シルク膜を室温の1,1,1,3,3,3-ヘキサフルオロ-2-プロパノール （HFIPと略記）に溶解したシルクHFIP溶液をエレクトロスピニングして製造する方法がある（特許文献２）
【０００７】
シルクとポリオキシ酸とからなるシルク複合ナノファイバーは、精練絹フィブロイン繊維を中性塩水溶液で溶解し脱塩し水溶液を凍結乾燥してなるシルクスポンジを蟻酸に溶解したシルク蟻酸溶液とポリオキシ酸をクロロホルム溶液、あるいはシルク蟻酸溶液とポリオキシ酸のジクロロメタン溶液とを混合（複合ともいう）してなるシルク複合溶液をエレクトロスピニングすることによりシルクとポリオキシ酸とからなるシルク複合ナノファイバーを製造することができる（特許文献３）。
【０００８】
シルクナノファイバーを細胞増殖用の細胞足場材として利用する方法として、家蚕カイコ由来の絹フィブロイン繊維を98％蟻酸で3時間、引き続きヘキサフルオルイソプロパノール（HFIP）で１週間処理して溶解させ、エレクトロスピニングしてなるシルクナノファイバーを細胞足場材として細胞の付着・増殖用に供する技術が公開された（非特許文献１）。家蚕絹フィブロインから製造したシルクスポンジを98%蟻酸に溶解させたシルク蟻酸溶液をエレクトロスピニングしてシルクナノファイバーを製造し、マウスの繊維芽細胞(3T3)を増殖させた技術公開もある（非特許文献２）。また、クロロホルムとアセトンの容積比１：２の混合溶液にポリ乳酸（PLAと略記することもある）を溶解した溶液をエレクトロスピニングして製造したPLAナノファイバー、またはシルクフィブロインとゼラチンからなる複合蟻酸溶液をエレクトロスピニングして製造したナノファイバー表面にマウス由来の線維芽細胞を培養し付着増殖性を確認した例（非特許文献３）がある。
【０００９】
柞蚕シルクフィブロインとPLAとをHFIPに溶解し、それをエレクトロスピニングしてシルク複合ナノファイバーを製造する技術開示において、PLAの含量が増加すると複合ナノファイバーの分子形態はランダムコイルからベータ構造に転移すること、PLAをシルクに15%複合するとシルク複合ナノファイバーの繊維径は増大し、標準偏差も増加することが報告されている（非特許文献４）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開２００４−６８１６１号公報
【特許文献２】米国特許 ５,２５２,２８５号
【特許文献３】特開２０１１−２０８２８６号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Study on the structure of SF fiber mats electrospun with HFIP and FAand cells behavior, Feng Zhang Bao Q Zuo, Lun Bai, J Mater Sci (2009)44:5682-5687
【非特許文献２】Electrospun three-dimentional silk fibroin nanofibrous scaffold,ChangSeok Ki, Jong Wook Kim, Jin Ho Hyun, Ki Hoon Lee, Masahiro Hattori, Dong Kyun  Rah, Young Hwan Park, Journalof Applied Polymer Science, 106, 1922-3928 (2007)
【非特許文献３】Study of the electrospun PLA/Silk fibroin -gelatin compositenanofibrous scaffold for tissue enginering,  Yin Gui-Bo, Zhang You-Zhu,Wang Shu-Dong, Shi De-Bing, Dong Zhi-Hui, Fu Wei-Gou, J Biomed Mater Res 93A:158-163, 2010
【非特許文献４】Structure and properties of novel electrospun tussah silkfibroin/poly(lactic acid) composite nanofibers, Jianxin He, Yongrui Qin,Shizhong Cui, Yaying Gao, Shanyuna Wang, J Mater Sci. (2011) 46:2938-2946
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明者は、生体適合性でかつ生分解性機能を有するシルクタンパク質、ポリ乳酸のナノファイバーあるいはシルクとポリ乳酸が複合してなる複合ナノファイバーを細胞足場材として用い、これらのナノファイバー表面での骨芽細胞の付着、増殖性が良好であることを初めて見出し、さらに、本発明の細胞足場材料から細胞シートを製造する上で重要な要件となる酵素による分解挙動を明らかにすることに成功し、本発明を完成させた。
【００１３】
従来技術によるとシルクとポリ乳酸とからなるシルク複合ナノファイバーは、シルクの蟻酸溶液とポリオキシ酸のクロロホルム溶液、あるいはシルクの蟻酸溶液とポリオキシ酸のジクロロメタン溶液とを混合しエレクロトロスピニングすることで製造できる（特許文献３）。この従来法では、シルクを溶解させる溶媒と、ポリオキシ酸を溶解させる溶媒が異なるため次のような不都合さが伴う。特許文献３の技術開示内容によると、シルク複合ナノファイバー重量に対してポリオキシ酸含有量を増やそうとして、シルクの蟻酸溶液に加えるポリオキシ酸のクロロホルム溶液の混合量を増加させ、あるいはシルクの蟻酸溶液に加えるポリオキシ酸のジクロロメタン溶液の混合量を増加させようとすると、シルクの蟻酸溶液とポリオキシ酸のクロロホルム溶液、あるいはシルクの蟻酸溶液とポリオキシ酸のジクロロメタン溶液が均一に混合し難くなり、２種類の溶液が層状に分離し、時にはゲル化してしまいエレクトロスピニングが不可能となるという問題が生じた。
【００１４】
上記記載の内容を具体的な例で補足する。シルク複合ナノファイバー重量に対してポリ乳酸の含有量が40%以上となるように10wt%シルクの蟻酸溶液に７wt%ポリ乳酸のジクロロメタン溶液を混合すると２種類の溶液がゲル化し、エレクトロスピニングで複合ナノファイバーが製造できなくなる問題があった。そのため、従来法で製造できるシルク複合ナノファイバーは、シルク複合ナノファイバー重量に対してポリ乳酸の含量が一定量に制約されてしまう（特許文献３）。
そこでシルクとポリオキシ酸を溶解することが可能な、しかも試料を複合しても溶液がゲル化しない、シルクとポリオキシ酸とを同一の溶媒、すなわち共溶媒を用いて試料を溶解することが強く望まれてきた。
【００１５】
エレクトロスピニングで所望されるナノファイバーを製造するには、エレクトロスピニングに用いる試料溶液を調整する段階で試料溶液がゲル化しないこと、溶液が均一に混合し、分離しないでことが重要な要件である。さもないと、エレクトロスピニン紡糸口で試料溶液がゲル化し目詰まりし試料ジェットが安定的に噴射されない。その結果、エレクトロスピニング状態が不安定になり、繊維径がばらつき、微細な繊維径のナノファイバーを製造することが不可能となる。シルク溶液とポリオキシ酸溶液とを混合したシルク複合溶液をエレクトロスピニングしてシルク複合ナノファイバー製造するには、シルクとポリオキシ酸とを同一の共溶媒で使用する技術開発、すなわち共溶媒を使用することが強く望まれてきた。同時に、シルク複合ナノファイバーを細胞足場材として利用するには、シルク複合ナノファイバー重量に対してポリ乳酸が任意量含まれるシルク複合ナノファイバーを製造することが望まれてきた。
本発明は、シルク複合ナノファイバー重要に対してポリオキシ酸が任意量含まれ、しかも繊維径が微細で繊維径のバラツキが小さいシルク複合ナノファイバーを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明に係るシルク複合ナノファイバーの製造方法は、シルクフィブロイン（シルクと略記することもある）あるいはポリオキシ酸を溶解することができるTFA溶液あるいはHFIP溶液にシルクとポリオキシ酸の混合物を溶解し、それをエレクトロスピニングすることによりシルクとポリオキシ酸とからなるシルク複合ナノファイバーを製造することを特徴とする。
本願発明のシルクとポリオキシ酸とからなるシルク複合ナノファイバーを製造するには、TFA溶液あるいはHFIP溶液を共溶媒として用いるため溶液が分離すること、ゲル化を起こすことがなく、シルク複合ナノファイバー重量に対してポリオキシ酸が任意量含まれ、微細な繊維径で繊維径が揃ったシルク複合ナノファイバーを製造することができる。
【００１７】
バラツキの少ない微細繊維径を持つシルクナノファイバーを製造するための溶媒には蟻酸溶液あるいはHFIP溶液が使用できるが、HFIP の代わりに蟻酸を使用するとシルクナノファイバーの繊維径は細くなる傾向があるため蟻酸が好ましく用いられる。バラツキのない微細繊維径でしかもビーズ形態を含まないシルクナノファイバーを製造するにはシルク蟻酸濃度は8-12wt%が適しており、10-11wt%が最も好ましい。微細繊維径のポリオキシ酸のナノファイバーを製造するには、TFAあるいはHFIPを用いることができる。HFIPの代わりにTFAを使用すると製造できるポリオキシ酸ナノファイバーの繊維径は細くなり繊維径のバラツキが少なく、ビーズ形態を含まないナノファイバーが得られる。微細繊維径でバラツキのないシルクナノファイバーを製造するにはPLAのTFA濃度は10-12wt%が最も好ましい。
【００１８】
シルクとポリオキシ酸との組成比が異なるシルク複合ナノファイバーは、シルクとポリオキシ酸とが所定の組成比となるように秤量し、共溶媒であるTFAあるいはHFIPを用いて溶解してなるシルクとポリオキシ酸との混合物の溶液をエレクトロスピニングすることにより製造できる。微細繊維径でバラツキのないシルク複合ナノファイバーを製造するにはシルクとポリオキシ酸とを含む混合物の溶液濃度は9-11wt%が最も好ましい。
【００１９】
前記シルクナノファイバー及びシルク複合ナノファイバーを細胞足場材に利用するには、エレクトロスピニングしてなるシルクナノファイバーあるいはシルク複合ナノファイバーを濃度70%〜100%のアルコール水溶液に浸漬して水に対して不溶化させることが必要不可欠である。
ポリオキシ酸のTFA溶液あるいはHFIP溶液をエレクトロスピニングして製造できるポリオキシ酸ナノファイバーは水には不溶であるため、シルクナノファイバー及びシルクとポリオキシ酸とからなるシルク複合ナノファイバーを細胞足場材として利用するには水不溶化することが必要である。
【００２０】
シルクナノファイバーあるいはシルク複合ナノファイバーを水に対して不溶化させるには、濃度 50〜100%のアルコール水溶液に浸漬した後、軽く乾燥するとよい。アルコールとしては、メタノール、エタノール、プロノールが利用でき、メタノールが特に好ましく利用できる。水に不溶化させるための最適なアルコール濃度は50〜100%であるが、最も好ましい濃度は60-95%である。アルコール濃度が50%以下であるとシルクナノファイバーあるいはシルク複合ナノファイバーが過度に吸水してしまい、水不溶化の効果が発揮できないし、実施例５に示すとおりアルコール浸漬処置後の乾燥過程でナノファイバーのサイズが目立って収縮し、初期設定のサイズを保持することができないという問題がある。アルコール濃度が100%に近づくとアルコールによる脱水効果が減少し、シルクナノファイバーあるいはシルク複合ナノファイバーの水不溶化程度が弱まる。アルコール水溶液に浸漬する時間は、３０秒〜１５分が適当であり、さらに好ましくは、1〜１０分である。時間が著しく短いと水不溶化の効果が少なく、長すぎることは経済的に効率的な視点から好ましくない。
【００２１】
細胞工学分野で有用な細胞足場材としては、多様な細胞付着・増殖の機能を持つ素材が所望される。細胞によっては、細胞足場材に細胞培養の初期で付着するもの、あるいは培養養中期で付着するものがある。このように細胞が細胞足場材に付着するには、細胞の増殖特性に見合った細胞足場材の種類を広範なものにしておくとよい。本願発明のようにシルク複合ナノファイバー重量に対してポリオキシ酸を任意量含まれてなるシルク複合ナノファイバーが製造できることは、多様な細胞を効率よく培養するための細胞足場材として有利である。
【００２２】
エレクトロスピニングにより繊維径が50nm以下のシルクナノファイバーでバラツキが無く形態的に均一なシルクナノファイバーを安定的に製造することは技術的には困難である。また繊維径が1000nm以上のシルクナノファイバー表面での細胞の付着、増殖状態は実施例１８で明らかなように良好ではない。
有用な細胞足場材としてのシルク複合ナノファイバーの繊維径は、実施例９及び実施例10に記載するように100〜1000nmである。特に好ましくは
繊維径は200〜500nmである。実施例12に記載のように繊維径のオーダーがナノオーダーよりもはるかに大きいミクロンサイズのオーダーとなると細胞足場材としての機能は低下する。
本願発明のシルクとポリオキシ酸とからなるシルク複合ナノファイバーは、シルクが備える優れた形成性と強度等の力学的特性、生体親和性ならびに生分解特性と、ポリオキシ酸が備えるシルクと同様の生体親和性、無毒で良好な生分解性とを相乗的に兼ね備えており、細胞足場材として優れた機能を有する。
本発明に係るシルク複合ナノファイバーを細胞足場材として利用できる対象細胞は、一般の有用細胞であれば種を問うものではなく、セルラインが確立している細胞であればいずれの細胞でも更に好ましく利用できる。好対象の細胞としては、マウス ATDC-5 (軟骨前駆細胞）、ヒトMG63 (骨肉腫細胞）、ヒトのES細胞、あるいはマウスの繊維芽細胞が例示できる。
【発明の効果】
【００２３】
本発明に係るシルク複合ナノファイバーの製造方法によればシルク複合ナノファイバーの重量に対してポリオキシ酸が任意量含まれるシルク複合ナノファイバーが製造でき、繊維径のばらつきを抑えた微細なシルク複合ナノファイバーを提供することが可能となる。その結果、細胞足場材等として好適に利用できる材料を提供することができる。
さらに、本発明の細胞足場材は、比表面積が大きく、生分解性と生体親和性を兼ね備えており、特に骨芽細胞に見られる細胞付着と増殖率が優れているため、組織再生のための足場材料、すなわちバイオ材料として効率的に利用できる。本発明の細胞足場材は骨再生用材料として優れた機能を持つため、骨の再生を早期に達成できることとなり、人工骨等の人工組織製造の際の細胞の足場として用いることもできる。本発明に係るファイバーシルク複合ナノファイバーは、有用な細胞足場材として利用できる。
細胞培養後に細胞を回収するに際して、タンパク質分解酵素のトリプシン処理を行う従来公知の技術によると細胞培養基材と細胞との結合が切断してしまい、時には細胞間の結合をも切断する可能性が高い。これに対して、本発明ではこうした懸念が無く、本発明の細胞培養基材表面に付着増殖した細胞から細胞シートを効率的に製造することができる。
さらに、本発明に係るファイバーシルク複合ナノファイバーは、有用な細胞足場材として利用でき、細胞の増殖制御が可能となり、本発明のシルク複合ナノファイバー表面で培養した細胞の分化機能の維持・発現が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】濃度が異なるメタノール水溶液に浸漬したシルクナノファイバー形態の観察のためのSEM画像である。アルコール濃度(％)：(a)未処理(b)50% (c)70% (d)90%
【図２】生理食塩水に時間を変えて浸漬したシルクナノファイバーのSEM画像である。浸漬時間 (時間)：  (a) 0  (b)24
【図３】生理食塩水に時間を変えて浸漬したシルクとポリ乳酸とからなるシルク複合ナノファイバーのＳＥＭ画像である。浸漬時間 (時間）：(a)24  (b)72
【図４】各種ナノファイバー細胞足場材における培養時間とマウス骨芽細胞の付着・増殖状態を示すＳＥＭ画像を示す図である。SF: シルクナノファイバー、PLA: ポリ乳酸、SF PLA: シルクとポリ乳酸のシルク複合ナノファイバー
【図５】シルク繊維（Ｓ繊維）及び組織培養用基材(TCD)表面における骨芽細胞の付着・増殖形態を示すＳＥＭ画像である。スケール長は 200μmに相当試料：(a)：シルク繊維  (b)：ＴＣＤ
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本発明に係るシルク複合ナノファイバーの製造に関わるシルクについて先ず説明する。
シルク：
本願発明で利用可能なカイコの絹タンパク質は、家蚕（Bombyx mori）幼虫から得られる家蚕の絹フィブロイン（シルクとも略記する）、又は野蚕に属する柞蚕（Antheraea pernyi）、天蚕（Antheraea yamamai）、タサール蚕（Antheraea militta）,ムガ蚕（Antheraea assama）、エリ蚕、シンジュ蚕等の幼虫から得られる野蚕絹フィブロイン（野蚕シルクともいう）である。
【００２６】
家蚕幼虫が作る絹糸を用いて絹フィブロイン繊維を調製する場合には、カイコが吐糸した家蚕繭糸を炭酸ナトリウム等のアルカリ水溶液で煮沸することでセリシンを除去してなる絹フィブロイン繊維を原料に用いる。30gの絹フィブロイン繊維を100mLの9M臭化リチウム水溶液に入れ55℃で20分処理して完全に溶解させ、セルロース製の透析膜に入れ、水道水で2日〜5日間透析処理を行うと濃度2.2%の絹フィブロイン水溶液が製造できる。この絹フィブロイン水溶液50mLに5mLのメタノールを添加して-80℃で凍結乾燥することで家蚕由来のシルクスポンジが製造できる。
【００２７】
上記家蚕由来のシルクの代わりに野蚕幼虫が作る絹糸を用いても野蚕由来のシルクスポンジが製造できる。柞蚕絹糸又は天蚕絹糸等の野蚕絹糸から絹フィブロイン繊維を調製するには、野蚕繭糸の重量に対して50倍量の0．1％過酸化ナトリウム水溶液に野蚕絹糸を浸漬し、98℃で1時間処理してセリシンを除去してなる野蚕絹フィブロイン繊維を、チオシアン酸リチウム等の溶解性の高い中性塩で溶解する。これを家蚕絹糸と同様に透析処理して脱塩することで野蚕絹フィブロイン水溶液が調製できる。この絹フィブロイン水溶液に微量なアルコールを加えて凍結乾燥することで多孔質状態の野蚕のシルクスポンジが製造できる。
【実施例】
【００２８】
次に本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの例によってのみ限定されるものではない。
実施例で使用する試料、溶媒、エレクトロスピニング、繊維径の計測、細胞培養について先ず説明する。
【００２９】
シルクフィブロイン：
実施例では特記しない限りシルクとは家蚕由来の絹フィブロインを意味する。
ポリオキシ酸：
本願発明の実施例では、特記しない限りカネボウ合繊（株）製で高分子量（20万）のポリ乳酸（カネボウ合繊（株）製、商品名）を用いており、H-PLAと略記することにする。本願実施例では、ポリオキシ酸の代表としてポリ乳酸(H-PLA)を使用するが、この他のポリオキシ酸としては下記のような物質がある。
ポリ乳酸 (PLA-0005, PLA-0010, PLA-0020)ならびに乳酸とグリコール酸とからなる共重合物ポリマー(PLGA-5005, PLGA-5010, PLGA-5015)。これらは、和光純薬工業（株）製の商品として入手できるPLA-0020の分子量は数万程度であり、本明細書ではL-PLAと略記する。
【００３０】
溶媒：
シルクの溶液は蟻酸（約98%）（FAと略記）である。ポリオキシ酸を溶解する溶媒は、HFIPあるいはTFAである。いずれも和光純薬工業株式会社製の試薬を使用した。有機溶媒中に含まれる試料濃度の単位は全てwt%である。
シルクとポリオキシ酸を同一の溶媒（共溶媒という）で溶解するには、シルク複合ナノファイバー重量に対してシルクとポリ乳酸との組成比が５０％となるように調整したシルクとポリ乳酸複合物をTFAあるいはHFIPに溶解し、それをエレクトロスピニングする。
【００３１】
エレクトロスピニング：
エレクトロスピニング装置を用いてシルクナノファイバー、ポリオキシ酸ナノファイバー、シルク複合ナノファイバーを製造した。エレクトロスピニングによりナノファイバーを製造する原理は次の通りである。ナノファイバーの原料であるポリマー溶液をシリンジに入れ、紡糸口（ノズル）と陰極板に高電圧を印加することにより静電引力がポリマー溶液の表面張力を超えると、ポリマー溶液がノズルから噴射されナノファイバーが陰極板上で堆積する。
【００３２】
実施例では、カトーテック株式会社製のナノファイバーエレクトロスピニングユニットを使用してナノファイバーを製造した。紡糸容器にはトップシリンジ（株式会社トップ製）5mLを使用した。紡糸ノズルにはノンベベル針（テルモ株式会社製）22 G×11/2"（0.70×38mm）を使用した。シリンジポンプ速度は20μl/min, 印加電圧は20kVもしくは30kV、紡糸距離は15cmである。
実施例でのエレクトロスピニングは、特記しないかぎり、印加電圧、紡糸距離、シリンジポンプ速度は20kV, 15cm, 20μl/minで行った。
【００３３】
ナノファイバー形態と繊維径の観察：
シルクナノファイバーの形態は、異なる１０視野で合計１００箇所のナノファイバーを対象にして走査型電子顕微鏡(SEM)観察を行いナノファイバーの繊維形態を観察した。繊維径は画像解析ソフトのIMAJE-J（フリーソフト）により、手動でナノファイバーを100個測定し、平均繊維径と標準偏差（ＳＤと略記する）を求めた。ナノファイバー表面における細胞の形態は株式会社日立ハイテクノロジーズ製の走査電子顕微鏡SU1510により観察した。
【００３４】
細胞培養方法：
マウス頭蓋冠由来骨芽細胞株MC3T3−E1（RCB1126,Riken  Cell  Bank）を、a−MEM培地「Alpha-Minimal Essential Medium(GIBCO) ,streptomycin(WAKO)  ,penicillin(WAKO) , aHCO3(WAKO) ,10% fetal bovine serum
(FBS, GIBCO)」に懸濁し（1×104cells/mL）、組織培養用ディッシュ（TCD、f90mm：NUNC）に10mL播種後、炭酸ガスインキュベーター（CO2  INCUBATOR  IT-63：YAMATO SCIENTIFIC 、37℃ , 5％CO2）の中で、培養を行い、2〜3日ごとに通常の継代操作を行った。 組織培養用のディッシュはNUNC社のTCD（φ30mm、90mm）を使用した。
【００３５】
上記の培地条件で1.5×105cells/mlのMC3T3−E1懸濁液を調製し、基材に2mlずつ注入し、MC3T3−E1を炭酸ガスインキュベーター中で培養した。所定時間培養後(1h、3h、24h)、培地を除去し、PBS（−）で3回洗浄した。続いて、2.5%グルタルアルデヒド水溶液を添加し、冷蔵庫（4℃）で一晩固定した。その後、蒸留水で3回洗浄し、濃度勾配エタノール法（50、60、70、80、90、99% EtOHの順に10分間ずつ浸漬）により脱水を行った。脱水終了後、t−ブチルアルコールで2回置換（60分間ずつ2回）後、−20℃の冷凍庫内で凍結し、凍結乾燥を行った。凍結乾燥後の基材の底面を1cm四方に切り出し、伝導カーボン両面テープ（応研商事株式会社）を用いて試料台に接着し、ドータイト（D-550；藤倉化成株式会社）を少量塗り、アルゴン雰囲気下で90秒、Ag−Pdイオンスパッタコーティング（E-1010；HITACHI）を行った後、走査型電子顕微鏡（SU1510；HITACHI）によりナノファイバーの形状を観察した。
【００３６】
細胞(MC3T3-E1)の増殖率：
Tetra  Color  ONE（生化学工業）は高水溶性ホルマザン産物を生成するテトラゾリウム塩を含む生細胞測定試薬である。テトラゾリウム塩は細胞内脱水素酵素により還元されてホルマザンを生成し、その生成量が生細胞の数と比例するため培養液中の生細胞数を測定することができる。細胞(MC3T3−El)を所定時間培養し、培地を除去し、DMEM培地[13．37g／L Dulbecco’s modified eagle medium（DMEM, GIBCO）, 0.1392g/L streptomycin（生化学用、和光純薬）,0.0698g/L penicillin（生化学用、和光純薬）、0．11g/L sodium pyruvate（生化学用、和光純薬）、3.7g/L  NaHCO3（特級：和光純薬）、10％ fetal bovine serum（FBS、GIBCO）]で一回洗浄後、500μlのDMEM培地を注入し、10μlのTetraColorONEを添加し、2時間反応させた。
反応後の溶液を100μlずつ96wellプレート（NUNC、TCD）に移し替え、マイクロプレートリーダー（Mode1550；BIORAD）を用いて450nmの吸光度を測定した（対照波長630nm）。また、細胞数を0.6, 1.3, 2.5, 5.0 10万cells／wellで播種し、2時間培養後、同様に細胞数を測定することにより検量線を作成した。この検量線よりディッシュ1枚あたりの細胞数を算出した。
【００３７】
細胞(MC3T3-E1)のALP活性の測定：
アルカリホスファターゼ(ALP)は主に細胞膜に存在し、様々のリン酸モノエステル基質をアルカリ領域で分解する加水分解酵素の一つである。ALPは、骨芽細胞の初期分化マーカーであり、骨芽細胞の分化（増殖、骨基質の生産及び分泌など）に伴い、上昇することが明らかとなっている。
ALP活性はSIGMA FASTTM p-nitrophynyl phosphate tablet Setsを用いて以下の様に測定を行った。
細胞(MC3T3・El)を所定時間培養し、培地を除去し、PBS(-)で3回洗浄した。続いて、p−nitrophenylphosphateとtris  bufferの錠剤を20mlの蒸留水に溶解したALP基質溶液を250μlずつ各wellに注入し、37℃で10分間インキュベー卜した後、0．2NNaOH水溶液250μlを加え酵素反応を停止させた。この溶液を100μlずつ96wellプレートに移し替え、プレートリーダーで410nmの吸光度を測定した。また、p−ニトロフェノールの0.01〜0.05 mmol/Lの水溶液を作製し、プレートリーダーを用いて検量線を作成した。この検量線を用いてp−ニトロフェノール生成量を算出し、1分間当たりの活性を求めた。さらに培養増殖した細胞数より、細胞10，000個当たりのALP活性値を求めた。
【００３８】
（実施例１）溶媒の試料濃度とナノファイバーの形態
シルク、ポリ乳酸(H-PLA)、及びシルクとポリ乳酸との組成比が５０％となるように調整したシルクとポリ乳酸複合物を所定濃度となるように各種の有機溶媒に溶解し、それをエレクトロスピニングしてナノファイバーを製造した。各種のナノファイバーを走査型電子顕微鏡によりナノファイバーの形態を調べた。観察結果を表１に示す。
【００３９】
【表１】
2014015702.tif 000002
【００４０】
上記表でH-PLA, SF/H-PLA, SFとは、ポリ乳酸、シルクとポリ乳酸とからなるシルク複合物をエレクトロスピニングしてなるシルク複合物、シルクを表記載の溶媒に溶かして所定の濃度にした試料溶液をエレクトロスピニングしてなるナノファイバーである。これらナノファイバーのSEM 観察結果に基づき、ナノファイバーにビーズ形状が含まれるか、あるいは微細径のナノファイバーがどの程度存在するかを評価した結果を「形態」欄に集約した。
表１で＊印を付けたナノファイバーにはビーズ形態のものが含まれず、繊維径が細く良好な形態のナノファイバーであるため、実施例１０で述べるように細胞足場材として用いることにした。
【００４１】
表１の「形態」表記の略語は次の通りである。
Bead+nf:
エレクトロスピニングで製造できるナノファイバーにはビーズ形態の他にナノファイバー形態のものが含まれる。
Beads  rich:
エレクトロスピニングで製造できるナノファイバーにはビーズ形態のもの
が９０％以上を占める。
nf  rich:
エレクトロスピニングで製造できるナノファイバーにはビーズ形態のものが含まれず比較的細い繊維径のナノファイバー形態のものが多く含まれる。
nf  rich +bead：
エレクトロスピニングで製造できるナノファイバーには細い繊維径のナノファイバー形態に加えてビーズ形態のものが一部含まれる。
nf  rich  fine：
エレクトロスピニングで製造できるナノファイバーには微細径を持つナノファイバー形態のものが多く含まれ、形態的にはきわめて良好な微細径のナノファイバーであり細胞足場材として所望される。
【００４２】
表１から次のことが明らかである。シルクとポリ乳酸とからなり微細な繊維径のシルク複合ナノファイバーは、濃度8%のシルクとポリ乳酸を含むシルク複合物のTFA溶液をエレクトロスピニングすることで製造できる。TFAの代わりにHFIPを使用すると、濃度7%で微細径のシルク複合ナノファイバーが得られる。シルクのナノファイバーは、濃度10wt%のシルク蟻酸溶液をエレクトロスピニングすると微細径のナノファイバーが得られる。繊維径が微細な良好な形態のポリ乳酸(H-PLA)ナノファイバーは、濃度12wt%のH-PLAのTFA溶液をエレクトロスピニングすることにより製造できる。
【００４３】
（実施例２）ナノファイバー繊維径と試料濃度
シルク、ポリ乳酸 (H-PLA)、及びシルクとポリ乳酸との組成比が５０％となるように調整したシルクとポリ乳酸複合物の３種類を所定濃度となるように各種の有機溶媒に溶解し、それをエレクトロスピニングしてナノファイバーを製造した。これら各種のナノファイバーをＳＥＭ観察して繊維径と繊維径のばらつきに対応する標準偏差(SD)を測定した。表２に測定結果を纏めた。なお、シルクとポリ乳酸からなるシルク複合ナノファイバーではシルク複合ナノファイバー重量に対してポリ乳酸が50%含有されている。
【００４４】
【表２】
2014015702.tif 000003
【００４５】
例えば、濃度が6%と8% のシルクHFIP溶液をエレクトロスピニングしてなるシルクナノファイバーの繊維径はそれぞれ1271nmと2133nmとなり、試料濃度が増大すると標準偏差も大きな値となった。このように試料濃度と繊維径とは密接な関連があることが明かである。
表２によると、シルクの蟻酸溶液を使用すると、微細な繊維径で繊維径のバラツキが小さいシルクナノファイバーが製造できる。シルクのHFIP溶液をエレクトロスピニングすると繊維径が太めでミクロンオーダーのナノファイバーが製造できる。シルクとポリ乳酸とからなるシルク複合ナノファイバーの繊維径は、共溶媒としてTFA溶液を使用すると、共溶媒としてHFIP溶液を使用するよりも減少し、微細径で繊維径のバラツキが小さくなる。
本願発明のシルクとポリオキシ酸とからなるシルク複合ナノファイバーは、シルク複合ナノファイバーの重量に対してポリオキシ酸が任意量含有されており、しかも繊維径が細く繊維径のバラツキが小さいという特徴がある。
【００４６】
（実施例３）
家蚕由来のシルクスポンジの代わりに柞蚕絹糸を溶解して製造してなる柞蚕シルクスポンジを蟻酸に溶解してなる柞蚕シルクの蟻酸溶液、ならびに柞蚕シルクとポリ乳酸とからなりシルクとポリ乳酸との組成比が50%となるようにして製造した柞蚕シルク複合溶液をエレクトロスピニングすることにより柞蚕シルクナノファイバーならびに柞蚕シルクの複合ナノファイバーが製造できた。試料濃度とシルクナノファイバーの繊維径と繊維径のばらつきの傾向は表１と同様であった。
【００４７】
（実施例４）
家蚕由来のシルクの代わりに、野蚕である柞蚕由来のシルクをTFAあるいはHFIPに溶解し各種濃度の試料溶媒をエレクトロスピニングしたところ、表２記載のSF/H-PLAと同様の結果が得られた。H-PLAの代わりにポリ乳酸 (PLA-0010)を用いて同様の実験を行っても表２のSF/H-PLAと同様の結果が得られた。
【００４８】
（実施例５）アルコールによるナノファイバーの水不溶化
シルクナノファイバー、H-PLAナノファイバーならびにシルクとH-PLAとからなるシルク複合ナノファイバーを細胞足場材して細胞培養に使用するには、ナノファイバーが細胞培地の中で溶解しないこと、すなわち水に不溶であることが必要条件である。H-PLAナノファイバーは水不溶であるから、シルクナノファイバー及びシルクとPLAのシルク複合ナノファイバーでシルクを不溶化させるとよい。
【００４９】
シルクを濃度の異なるアルコール水溶液に浸漬することでナノファイバーが不溶化する
かどうかを確認することにした。アルコール水溶液処理にともなうナノファイバーのサイズが大幅に変化するため併せて評価することにした。
エレクトロスピニングしてなるシルクナノファイバーを各種濃度(50, 70, 90, 100%)のメタノール水溶液に5分間浸漬し、メタノール水溶液から取り出したシルクナノファイバーをポリスチレン板に広げ自然乾燥させることでシルクナノファイバーの不溶化処理を行った。50%メタノール水溶液に浸漬するとシルクナノファイバーの一部が溶解してしまい
水不溶化ができなかった。次に、70、90、100%のメタノール水溶液でシルクナノファイバーを浸漬したところ、シルクナノファイバーは水には全く溶解せず、アルコールから取りだし乾燥する過程ではシルクナノファイバーは収縮することなる試料寸法の変化が起こらず、細胞足場材としてのシルクナノファイバーは、水不溶化処理前後で試料寸法の変化が
無いことが所望される。シルクナノファイバーは、濃度70〜100%のメタノール水溶液で5分程度浸漬することで水不溶化が起こることが分かった。
【００５０】
（実施例６）水不溶化シルクナノファイバーのＳＥＭ測定
シルクナノファイバーを水に対して不溶化させるためのメタノール水溶液最適濃度を調べた。10% シルク 蟻酸溶液をエレクトロスピニングし、1〜2cm2サイズのシルクナノファイバーをメタノールに蒸留水を加えて各種濃度(40/60, 50/50、70/30、90/10、100/0）に調整したメタノール水溶液に５分間、浸漬し、その後ポリスチレン板にシルクナノファイバーを拡げて室温で乾燥させた。異なる濃度のメタノール水溶液による浸漬処理前後のシルクナノファイバーのＳＥＭ画像を測定した。図１は、得られたシルクナノファイバーのＳＥＭ画像である。
【００５１】
50%メタノール水溶液でシルクナノファイバーを浸漬処理するとシルクナノファイバーが吸水し、シルクナノファイバーが収縮してしまい、浸漬前の形が変形し塊状に変形してしまい細胞足場材としての利用価値は減少してしまった(図１(b))。メタノール濃度が70%、90%のメタノール水溶液でシルクナノファイバーを浸漬処理するといずれのナノファイバーは水に溶解することなく、微細な繊維径を維持したままナノファイバーが水に対して不溶化した (図1 (c)、(d))。シルクナノファイバーを水に対して不溶化させるメタノール水溶液の最適濃度は70〜95%である。
アルコール濃度が40％以下のメタノール水溶液にシルクナノファイバーを浸漬すると試料に水が多量に吸収し、シルクナノファイバーは水に溶解してしまう。またメタノール水溶液の濃度が高すぎるとアルコールによる脱水反応は進むがその速度は遅いため、シルクが結晶化し難くなってしまう。以下の実施例においては、シルクナノファイバーの水不溶化は、メタノール水溶液濃度は80%で5分間行うことにした。
【００５２】
（実施例７）生理食塩水に浸漬した水不溶化シルクナノファイバーの形態
シルクナノファイバーを細胞足場材として利用することを想定し、10% シルク蟻酸溶液をエレクトロスピニングしてなる1〜2cm2サイズのシルクナノファイバーを濃度80%のメタノール水溶液に5分間浸漬して水不溶化したシルクナノファイバーを20℃の生理食塩水に24時間浸漬し、浸漬前後のシルクナノファイバーの形態変化をＳＥＭにより観察した。
得られたＳＥＭ画像を図２に示す。シルクナノファイバーは生理食塩水に24時間浸漬しても浸漬前の微細な繊維径のナノファイバーの形状を維持しておりシルクナノファイバーの形態変化は観察されなかった(図２(b))。
【００５３】
（実施例８）シルク複合ナノファイバーのＳＥＭ画像
シルクとポリ乳酸（H-PLA）とが組成比５０％となるようにシルクとポリ乳酸（H-PLA）を溶解した10wt% のシルク複合溶液をエレクトロスピニングしてなるシルクとポリ乳酸とからるシルク複合ナノファイバーを1〜2cm2のサイズに切断し、濃度80%メタノール水溶液に5分間浸漬して水不溶化処理を行った後、20℃の生理食塩水に24時間及び72時間浸漬した。生理食塩水に浸漬する前後におけるシルク複合ナノファイバーの形態変化をSEM測定で観察した。得られた結果を図３に示す。
図３に示すように、生理食塩水に24時間あるいは72時間浸漬してもシルク複合ナノファイバーは溶解することなく、ナノファイバーの微細な繊維径変化も観察されなかった（図３(a)、(b)）。
【００５４】
（実施例９）シルク複合ナノファイバーの製造
微細で繊維径のバラツキが少なく、ビーズ形態を含まないナノファイバーを細胞足場材に用いて実験を行うことにした。ビーズ形態が含まれないナノファイバーを実施例１から、繊維径が微細で繊維径のバラツキが少ない条件に合致するナノファイバーを実施例２から探索したところ、実施例２の表２に記載したとおり、SF/H-PLA*1, SF*2, H-PLA*3であった。
【００５５】
細胞足場材として使用したナノファイバーは下記の３種類である。表２記載で*印をマークした試料である。試料溶液調整のための溶媒、濃度、ナノファイバーの繊維径と繊維径のバラツキ（ＳＤ）を表３に纏めた。
ナノファイバーの製造条件を再度説明する。
（１）シルクの10wt% 蟻酸溶液をエレクトロスピニングしたシルクナノファイバー（表３ではSF*2と略記）。
（２）シルクとポリ乳酸（H-PLA）とが組成比５０％となるように、シルクとポリ乳酸（H-PLA）を溶解し10wt% のシルク複合物をＴＦＡ溶液に溶解してなる10%のシルク複合物のＴＦＡ溶液をエレクトロスピニングして製造したシルクとポリ乳酸とからるシルク複合ナノファイバー（表３ではSF/H-PLA*1と略記）
（３）ポリ乳酸（H-PLA）の12% TFA溶液をエレクトロスピニングして製造したポリ乳酸のナノファイバー（表３ではH-PLA*3と略記）。
【００５６】
【表３】
2014015702.tif 000004
【００５７】
（実施例１０）細胞足場材としてのシルク複合ナノファイバー
シルクナノファイバー、ポリ乳酸ナノファイバー及びシルクとポリ乳酸とからなるシルク複合ナノファイバーが細胞足場材として適しているかを明らかにするため細胞培養実験を行った。細胞足場材として用いた試料は、実施例９記載の３種類のナノファイバー、SF/H-PLA*1, SF*2, H-PLA*3である。
ナノファイバーは、上記（１）〜（３）のサンプル（サイズ、１〜２cm2）を80%メタノール水溶液に5分間浸漬し、メタノール水溶液から取り出し、ポリスチレン板上に広げて自然乾燥させることでを水に対して不溶化できた。
ナノファイバーを細胞足場材として使用するには、次のような方法で細胞培養用のディッシュの底面に付着固定させた。
【００５８】
不溶化処理後のサンプルを細胞培養用のディッシュ底面に軽く付着させる。ナノファイバーに微量に含まれる使用溶解時の溶媒を極力除くため、40℃の蒸留水で5分間の浸漬を10回繰り返し、更に常温の蒸留水で1時間の浸漬を10回繰り返した。最後に半日間、常温の蒸留水への浸漬を2回行った。ポリ乳酸ナノファイバーは撥水性が強いため、エタノール水溶液に浸漬するに際して水が良く浸透するように留意した。
【００５９】
３種のナノファイバー、SF*2, H-PLA*3, SF/H-PLA*1のナノファイバーを用いてマウス頭蓋冠由来骨芽細胞の細胞培養実験を行った。各ナノファイバーを細胞足場材として所定時間培養した後、ナノファイバー表面におけるマウス骨芽細胞の培養状態をＳＥＭ画像で観察し、その結果に基づいて素材表面における細胞付着・増殖状態と細胞培養時間との関係を分析した。得られた結果を図４に示す。但し、図４におけるSF*2, H-PLA*3, SF/H-PLA*1の３種類のナノファイバーをそれぞれSF,
PLA, SF PLAと略記する。
【００６０】
シルクナノファイバー（SF*2：図４のSF）では、細胞培養1時間で、細胞の付着及び伸展が起こっており細胞培養3時間で細胞の伸展状態は良好となった。培養３時間での細胞増殖あるいは伸展状態とほぼ同様となり、細胞培養24時間では、細胞の伸展部位の細胞の厚みが増し、細胞が良好に成長していた。
シルクとポリ乳酸とからなるシルク複合ナノファイバー（SF/H-PLA*1；図４のSF PLA）では、細胞培養1時間でシルクナノファイバーと同様に、細胞の付着及び伸展が認められるが、伸展の程度は必ずしも良好ではない。細胞培養3時間でも細胞の伸展に大きな差はみられなかったが、細胞培養24時間では、シルク単独のナノファイバーでの培養時と同様、伸展部位の細胞の厚みが増しており、細胞の成長が確認できた。
【００６１】
ポリ乳酸ナノファイバー（H-PLA*3：図４のPLA）表面では、細胞培養１時間で一部の細胞が付着、伸展しているにすぎず、培養に使用した細胞が持つ本来の丸い形状を保った播種時の細胞が数多く観察された。細胞培養3時間では、細胞の状態は1時間培養した試料と同様であったが、細胞培養24時間では、大部分の細胞の伸展が認められ正常に細胞増殖が進んでいる。
【００６２】
上記の結果を下記の通り集約する。シルクナノファイバー（SF*2）の表面では細胞の付着増殖性が最も良好であり、伸展速度が早く、増殖性も優れていることが確認された。これに対して、ポリ乳酸ナノファイバー（H-PLA*3）の表面では細胞の伸展速度は遅いものの、細胞を24時間培養すると細胞の伸展は着実に進んでいた。シルク・ポリ乳酸複合ナノファイバー（SF/H-PLA*1）では、ポリ乳酸ナノファイバー（H-PLA*3）に見られた細胞の伸展速度が遅いという問題点が改善され、細胞付着増殖性はシルクナノファイバー並みとなった。したがって、シルク並びにシルクとポリ乳酸とからなるシルク複合ナノファイバーは、細胞に対して親和性を有することが明らかとなり、シルク複合ナノファイバーは、シルクとポリ乳酸それぞれが単独で持つ生化学的特性を兼ね揃えた新しい複合素材として応用できる素材である。
【００６３】
（実施例１１）ナノファイバー表面における骨芽細胞の増殖性
細胞足場材の対象区となるTCD、ならびに３種類のナノファイバー（シルクナノファイバー(SF)、シルクとポリ乳酸の複合ナノファイバー(SF/PLA)、及びポリ乳酸ナノファイバー(PLA）)を細胞培養容器底面に付着させ、実施例１０と同様に骨芽細胞の増殖実験を行った。細胞増殖数と細胞培養時間との関係を表４に示す。ただし、表４に記された数値の１万倍が細胞増殖数となる。
【００６４】
【表４】
2014015702.tif 000005
【００６５】
表４から次のことが明らである。
TCD表面における細胞増殖数は、最も優れた高い値を示しており、細胞培養初期から細胞培養時間4日までの間、細胞増殖数は急激に増加し、それ以後の細胞培養時間で細胞増殖数が飽和状態に達した。
シルクナノファイバー(SF)表面における細胞増殖数はTCDに次いで優れた値を示した。すなわち、細胞培養時間１日では、細胞増殖数が培養初期と大差は無いが,細胞培養時間3日で急激に増加し、その後、細胞培養時間7日までなだらかに増加し、細胞培養10時間で細胞増殖数は飽和状態になった。
ポリ乳酸ナノファイバー(PLA)における細胞培養数は、使用した対象試料の中で最も緩慢な培養結果となり、細胞培養時間１時間では、細胞増殖数は培養初期と大差は無いが,細胞培養1時間から培養時間14日まで細胞増殖数は極めて緩慢に増加する。
シルク・ポリ乳酸複合ナノファイバー(SF/PLA)における細胞培養数は、上記シルクナノファイバーとポリ乳酸ナノファイバー表面における細胞増殖数の中間値を示した。
【００６６】
（実施例１２）酵素によるナノファイバーの分解挙動
シルクナノファイバー(SF)、シルクとポリ乳酸の複合ナノファイバー(SF/PLA)、及びポリ乳酸ナノファイバー(PLA)をProteinase  K(和光純薬工業株式会社、コードNo. 164-14004)を用いて分解実験を行った。試料の分解挙動は細胞容器の底に沈めた５枚のナノファイバーを目視で観察し試料が溶解したかどうかの指標とした。なお、生分解挙動の具体的な測定条件は次の通りである。
pH8.6に調製したTris/HCl bufferにProteinase Kを溶解させ、0.008mg/mL(0.17units/mL)のProteinase K溶液を調整した。上記記載のナノファイバーを1cm×1cmに切り、24well dishの底に付着させた。各well毎に1mLのProteinase  K溶液を加える。37℃（大気中）で所定時間処理した。
得られた結果は次のように集約できる。SFは７時間、SF/PLAは７時間、PLAは１２時間で試料形状が完全に消滅した。SFに比べてPLAはProteinase Kでは難分解性を呈することが分かった。
かくして、シルクとポリ乳酸とからなる複合ナノファイバーの生分解挙動は、シルクとポリ乳酸との組成比を変えることで制御することが可能であることが示唆された。
【００６７】
（実施例１３）ナノファイバーにおける細胞(MC3T3-E1)のALP活性値
実施例１０で用いた３種類のナノファイバー表面における骨芽細胞の培養実験を行った。細胞培養時間が10日目における各細胞足材上で培養した細胞(MC3T3-E1)のALP活性値を評価したところ、いずれの場合にもほぼ同一の値となった。このことは、いずれの細胞足場材でも骨芽細胞が付着増殖し、しかる後、細胞一細胞間の相互作用が強まると、細胞表層に含まれるカドヘリンやコネキシンなどの細胞間接着タンパク質がシグナル伝達経路を介して細胞内へと伝達されることを示唆するものである。ナノファイバー試料間での差は少ないものといえる。
【００６８】
（実施例１４）酵素を作用させたナノファイバーのＳＥＭ画像
シルクナノファイバー、シルクとポリ乳酸の複合ナノファイバー、及びポリ乳酸ナノファイバーをProteiaze Kによる分解実験を行った。細胞培養時間と試料ナノファイバーの形態との関係をSEM画像から分析した。
シルクとポリ乳酸の複合ナノファイバー及び細胞培養時間と試料ナノファイバーの形態との関係は次のように集約できる。
シルクナノファイバーは、Proteinase Kの加水分解の作用で７時間まではナノファイバーの形態を保つがそれ以降では完全にナノファイバー形態が消滅してしまう。酵素作用の時間が３時間まではナノファイバーの形態は変化せず、ナノファイバーの繊維径の増加も起きない。酵素処理時間が３時間以上となると繊維交錯点が融合した形となり個々のナノファイバーの形態はちょうど梳いた和紙のような状態となる。
ポリ乳酸ナノファイバーをProteinase Kによる分解実験によると、酵素処理時間が３時間までは酵素作用の時間が３時間まではナノファイバーの形態は変化しない。酵素処理時間が３時間以上となるとSFで見られた繊維交錯点が融合した形が極めて顕著となった。
【００６９】
（実施例１５）酵素によるシルク膜の生分解性挙動
シルクナノファイバーを製造する原液、すなわちシルクTFAをガラス板状に拡げ乾燥固化するとシルク膜が製造できる。実施例１４と同様にシルク膜にProteinase Kを作用してシルク膜の分解実験を行った。シルク膜は、Proteinase Kの酵素作用を与えても酵素処理時間12時間では試料形態には全く変化が無かった。シルクナノファイバーが同様の酵素作用を与えると酵素処理時間7時間で試料形態が消滅することとは対照的であった。
【００７０】
（実施例１６）
実施例９で使用した家蚕由来のシルクの代わりに、柞蚕絹糸を溶解して製造してなる野蚕シルクスポンジを蟻酸に溶解してなる柞蚕シルクスポンジ蟻酸溶液をエレクトロスピニングして製造した柞蚕シルクナノファイバー、ならびに、柞蚕シルクとポリ乳酸（H-PLA）とが組成比５０％となるように、柞蚕シルクとポリ乳酸（H-PLA）を溶解した10wt% のシルク複合溶液をエレクトロスピニングしてなるシルク複合ナノファイバーを種細胞足場材として細胞培養実験を行ったところ、実施例１０の図４と同様の結果が得られた。また、H-PLAの代わりにポリ乳酸 (PLA-0010)を用いて同様の実験を行っても実施例１０の図４と同様の結果が得られた。
【００７１】
（実施例１７）繊維径の大きいフィブロイン繊維への細胞付着
実施例１０ではエレクトロスピンニングで製造した極細繊維径のナノファイバーを細胞足場材として用いた。繊維径が50μmのカイコの絹フィブロイン繊維（Ｓ繊維と略記）への細胞付着・増殖実験を行った。すなわち、家蚕カイコが吐糸した繊維径がミクロンオーダの繭繊維を精練によりセリシンを除去した繊維径が50μmのＳ繊維表面における骨芽細胞：MC3T3−E1あるいはマウス線維芽細胞：L929培養を行った。繊維表面における細胞の付着・増殖あるいは細胞数計測あるいは生細胞の数計測を行った。実施例９で使用したシルクナノファイバー（表3ＳＦ*2）の繊維径が200-500nmであったのに対して、後の実施例１８で使用するＳ繊維（図5 (a)）の繊維径が約50μmでありナノファイバー繊維径の200倍大きな繊維径を有する点に留意する必要がある。
【００７２】
骨芽細胞、継代培養、培養試験は次の通りであった。
骨芽細胞(MC3T3−E1)：
コラーゲンを大量に生産する接着性細胞であり、C57BL/6マウスの頭頂骨から樹立された骨芽細胞前駆細胞株である。線維芽細胞様の形態を示し、高いアルカリホスファターゼ活性を有し、石灰化能をもつ骨芽細胞に分化する特性を持つ。MC3T3−E1細胞は種々の刺激に対し破骨細胞分化促進因子RANKLと阻害因子osteoprotegerinを生産するため、骨芽細胞による破骨細胞分化の制御機構の解析にも使用される。
【００７３】
継代培養：
培養液：10％ウシ胎児血清（FBS）を添加した、α−MEM培地[10.2g/L Alpha-Minimal Essential  Medium(GIBCO)、0.1g/L streptomycin(生化学用、和光純薬)、0.0698g/L penicillin(生化学用、和光純薬)、2.0g/L NaHCO3(特級：和光純薬)]
培養条件：37℃、5％CO2条件下。培地交換を週に２〜３回行い、1:2〜1:8に希釈継代する。１週間に２回程度の頻度で継代する。
【００７４】
培養試験：
10%FBSを添加したα-MEM培地を用い5×104cells/wellの細胞を、検体を底面に敷き詰めた24ウェルマルチプレートに播種し、所定時間37℃、5％CO2で培養を行った。
骨芽細胞への分化、石灰化を誘導する際は、培地交換を週に２〜３回行い培養を継続した。
なお、各種基材上（シルク、羊毛、キュプラ、レーヨン、TCD）の接着率測定にはマウス線維芽細胞(L929  （5×104 cells/well）を用いた。L929細胞の培養にはMEM培地(5%血清)を使用した。
組織培養用基材(TCD)とＳ繊維表面においてMC3T3−E1培養による増殖率の経時変化（０〜７日）を表５に示す。
【００７５】
【表５】
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【００７６】
表５から次のことがわかる。
TCD表面におけるMC3T3−E1は、細胞培養時間１日以降、増殖率は次第に増加し始め、３日で急激に増加するが５日以降の増殖率は飽和状態となる。一方、Ｓ繊維表面では、培養時間が延長しても細胞に増殖率は培養初期の状態に大差は無く、Ｓ繊維表面での骨芽細胞(MC3T3−E1)の増殖率は良好ではない。実施例１０におけるシルクナノファイバーで骨芽細胞(MC3T3−E1)の増殖が良好であったことと対照的である。骨芽細胞(MC3T3−E1)の増殖には、シルクナノファイバー（繊維径が100から800 nm）が極めて有効であることが明らかとなった。
【００７７】
各種基材（シルク、羊毛、キュプラ、レーヨン、TCD）表面におけるマウス線維芽細胞(L929)の接着率を求めた。測定結果を表６に示す。
TCD表面においてL929は、細胞培養時間24時間で接着率が最大となる。これを100とするとＳ繊維と羊毛ではTCD並の94％、92％であるのに対し、キュプラ、レーヨン表面での細胞接着率は64％、32%と、TCDに比べてかなり低い値となった。
【００７８】
【表６】
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【００７９】
L929を播種してから24時間におけるＳ繊維とTCDにおけるL929の生細胞数を水溶性ホルマザンの吸光度測定により評価した。得られた結果を表７に示す。
【００８０】
【表７】
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【００８１】
表７から、TCD表面でのL929培養24時間における生細胞数は、0.23と良好な値であるが、Ｓ繊維では0.05と極めて低い。繊維径が40μmの太繊維径のＳ繊維表面に付着するMC3T3−E1の細胞数はTCDに比べると極めて少なく劣悪である（表５）。Ｓ繊維表面におけるL929細胞の接着率はTCDに比べてほぼ同等の値であったが（表６）、上記記述のとおり素材表面での生細胞数を水溶性ホルマザンの吸光度により求めたところ、Ｓ繊維表面でのL929細胞の生細胞数はTCDに比べて劣悪である。
【００８２】
上記表５と表７に示す測定結果は、シルクナノファイバーあるいはシルク複合ナノファイバー表面では細胞の付着増殖状態が良かったとの測定結果と対照的である。これはＳ繊維とシルクナノファイバーの繊維径の違いによるものである。表５と表７は、繊維径がシルクナノファイバーより200倍大きなＳ繊維表面での細胞付着・増殖程度は良くなく、Ｓ繊維が効率的な細胞足場材とはならず、Ｓ繊維におけるMC3T3−E1及びL929細胞の接着性はTCDに比べて劣悪となり、試料表面における生細胞数は少ないことを示唆している。
【００８３】
（実施例１８）基材表面における生細胞数の評価
骨芽細胞(MC3T3−E1)を使用し、基材上における生細胞数（Tetra color ONE の測定原理）を計測する実験を行った。
テトラゾリウム塩（WST-8）は細胞内脱水素酵素により還元され、水溶性のホルマザンが生成される。このホルマザンの吸光度をマイクロプレートリーダー（450nm/630nm）で直接測定することにより、生細胞数が計測できる。培養48時間後、シルク及び組織培養用基材(TCD)表面における 骨芽細胞・MC3T3−E1の付着・増殖形態を図５に示す。Ｓ繊維とＴＣＤ表面における細胞の付着状態のＳＥＭ画像がそれぞれ図５（ａ）と図５（ｂ）である。
細胞の形態観察から、TCDに比べ、Ｓ繊維表面における細胞は付着・増殖状態を呈する前の球状形態を呈して存在しており、骨芽細胞・MC3T3−E1の増殖には繊維径が200-300
nm程度のシルクナノファイバーあるいはシルクとポリオキシ酸とからなるシルク複合ナノファイバーが細胞足場材として極めて効率的である。
MC3T3−E1は接着依存性の細胞であり、基材に接着・伸展することにより生存・増殖する。TCD上に比べ、Ｓ繊維表面の細胞は48時間後においても球状形態を呈して存在しておることから、骨芽細胞・MC3T3−E1の増殖には、繊維径がナノオーダーのシルクナノファイバーが極めて効率的である。
【００８４】
本発明に係るシルク複合ナノファイバーの製造方法により、微細な繊維径を有し繊維径のバラツキが小さく、細胞足場材として有効な機能を有するシルクとポリオキシ酸とからなるシルク複合ナノファイバーが製造できる。シルクが有する優れた生分解性、生化学特性、並びに良好な成形性に加え、ポリオキシ酸が有するシルクと同様に良好な生分解性を兼ね備え、かつ細胞付着・増殖性ではシルクとポリオキシ酸の機能を相乗した効果を有する。さらに、シルクとポリオキシ酸の特性を超え、それぞれが有する特性の相乗効果の機能を有するシルク複合ナノファイバーとして提供することができ、細胞足場材を始め、医療分野等において広く利用することが可能である。
【００８５】
本発明に係るシルク複合ナノファイバーは、ファイバー表面で細胞が効率的に付着し増殖状態も優れるという特徴と、生体適合性に優れ、非表面積が非常に大きいため、再生医療工学、創傷材料等のヘルスケア一分野、バイオテクノロジー分野、エネルギー分野において広く活用が可能である。本発明に係るシルク複合ナノファイバーは、シルクフィブロインとポリオキシ酸とが任意の組成比を持つという秀でた特徴を持つ。
【００８６】
細胞足場材に付着、増殖する細胞あるいは足場材表面で分化する細胞は、細胞の種類により特性が異なる場合がある。培養初期段階で付着する細胞、細胞培養の中期で付着する細胞等がある。シルクナノファイバー表面では細胞の付着増殖性が最も良好であり、伸展速度が早く、増殖性も優れている。一方、ポリ乳酸ナノファイバーの表面では細胞の伸展速度は若干遅れるが細胞を24時間培養すると細胞の伸展は着実に進むという特徴がある。本願発明のシルク複合ナノファイバーに含まれるポリオキシ酸はシルク複合ナノファイバー重量に対して任意の組成比で含有させることができる。シルクナノファイバー、ポリ乳酸ナノファイバーあるいはシルク複合ナノファイバーの足場材としての機能は、シルクとポリ乳酸の組成比を変えることで制御できる。本願発明のナノファイバーは、細胞を増殖させるための足場材として極めて有効に利用できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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