(57)【要約】【課題】がん中の細胞外ＬＯＸの活性を低減させる。【解決手段】がんを治療するための治療法および物質は、天然に存在しないレベルで同位体修飾されたリジンを利用するまたは生成させうる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ’）の化合物
【化１】
2014185163.tif 000007
（式中、Ｄは重水素である）、
式（ＩＩ）もしくは（ＩＩＩ）の化合物
【化２】
2014185163.tif 000008
（式中、Ｄは重水素である）、または
該式（Ｉ’）、（ＩＩ）、もしくは（ＩＩＩ）の化合物をアミノ酸残基として含む、ペプチドまたはタンパク質
を含み、
該式（Ｉ’）、（ＩＩ）、または（ＩＩＩ）の炭素が炭素−１３であってもよく、
該化合物は、天然に存在する該化合物と比較して、該炭素−１３および／または重水素を、少なくとも２０％を超えて保有しており、
哺乳動物の対象に繰り返し投与してリジル酸化酵素により乳がんまたは線維症を治療するための組成物。
【請求項２】
前記投与が、前記式（Ｉ’）、（ＩＩ）、もしくは（ＩＩＩ）の化合物またはそれらの残基の、リジル酸化酵素による酸化を減少することを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
食品、栄養補助食品または医薬組成物の形態として投与されることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
腫瘍の増殖を減少することを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記腫瘍が原発腫瘍または転移腫瘍であることを特徴とする、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
乳がんを阻害することを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
線維症を阻害することを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記線維症が、肝線維症、肺線維症、腎線維症、心臓線維症または強皮症である、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記腎線維症が、糖尿病性ネフロパシー、糸球体硬化症、糖尿病性ネフロパシー、膀胱尿管逆流現象、尿細管間質性腎線維症、または糸球体腎炎である、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
細胞外マトリックスの形成を抑制することを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
リジル酸化酵素の酸化の活性を完全にはブロックしないことを特徴とする、請求項２に記載の組成物。
【請求項１２】
前記化合物が、対象の食事の一部として摂取されることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記対象がヒトであることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
前記化合物が対象の体内に取り込まれることを特徴とする、請求項１３に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、米国仮出願番号第６１／０３６，８４１号（Ａｔｔｙ  Ｄｏｃｋｅｔ  Ｎｏ．ＲＥＴＯＰ．００２ＰＲ）の優先権を主張し、これを参照により本明細書に援用する。
【背景技術】
【０００２】
リジル酸化酵素（ＬＯＸ、ＬＯＸＬ、ＬＯＸＬ２等；アミン酸化酵素ファミリー）は、銅依存性酵素で、リジンを酸化してアリシン（α−アミノアジピン酸−δ−セミアルデヒド）にする［Ｋａｇａｎ  ＨＭら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００３年；第８８巻：６６０ページ］。ＬＯＸは、間質コラーゲンおよびエラスチンにおける架橋形成に関わっている。ＬＯＸは、低酸素腫瘍中で上昇し、細胞運動、腫瘍成長、および転移の進行に影響を及ぼす［Ｋｉｒｓｃｈｍａｎｎ  ＤＡら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００２年；第６２巻：４４７８ページ］。この上昇は、乳がんの転移や浸潤にとって、並びに結腸や食道を含むその他のがんにおいても、機構的に重要であり［Ｆｏｎｇ  ＳＦら、ｇｅｎｅｓ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ  Ｃａｎｃｅｒ、２００７年、第６巻：６４４ページ］、またシッフ塩基結合（アルデヒド＋アミン）またはアルドール縮合生成物（アルデヒド＋アルデヒド）の形成に基づき、がん細胞が別の細胞／組織に付着するのを可能にしている。転移の進行にＬＯＸが関係する、例えば、骨髄由来細胞の動員など、いわゆる前転移性ニッチ形成（ｐｒｅｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｎｉｃｈｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）と呼ばれるその他の機構が存在する［Ｅｒｌｅｒ  ＪＴら、Ｎａｔｕｒｅ、２００６年；第４４０巻：１２２２〜１２２６ページ；Ｅｒｌｅｒ  ＪＴら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、２００６年；第６６巻：１０２３８ページ；Ｅｒｌｅｒ  ＪＴら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ、２００９年；第１５巻：３５〜４４ページ］。
【０００３】
ＬＯＸは、コラーゲン、エラスチン、およびその他のタンパク質のリジンを酸化してアリシン、および／または
【０００４】
【化１】
2014185163.tif 000002
【０００５】
５−ヒドロキシリジンにする。次に、これらは、例えば下記：
【０００６】
【化２】
2014185163.tif 000003
【０００７】
に示すように、転移発現で重要な反応である、架橋を形成することができる。従って、がん中のリジル酸化酵素の活性を低減させることが望ましい。いかなるがん治療とも同様に、この低減は、生理学のその他の側面に対する副作用を最小限に抑えるように、酵素活性を完全にブロックしないことも好ましい。
【０００８】
従って、がん中の細胞外ＬＯＸの活性を低減させることが望ましい。現在のアプローチとして、ＬＯＸ阻害剤（例えば、β−アミノプロピオニトリル［Ｊａｃｋｓｏｎ  ＬＥ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９９１年；第１７９巻：９３９ページ］）、銅の封鎖、および抗体の使用［Ｅｒｌｅｒ  ＪＴら、Ｎａｔｕｒｅ  ２００６年；第４４０巻：１２２２ページ］等、いくつか挙げられる。但し、あらゆるがん治療の場合と同様に、この低減は、生理学のその他の側面への副作用を最小限に抑えるように、酵素活性を完全にブロックしないことが、やはり好ましい。例えば、ＬＯＸの阻害は、血管等の弾性増大の原因となり、動脈瘤を引き起すことが知られている。その上、このような方法は、免疫原性である可能性がある他、毒性などの更なる合併症をもたらすおそれがある。
【０００９】
化学結合を切断または形成するいくつかの反応の速度は、結合に関与する原子の同位体の性質により影響を受ける。一般的に、端部に重同位体を有する結合は、端部により軽同位体を有する結合よりも開裂しにくい。特筆すべきは、水素原子とその他の原子との間の結合は、水素が１Ｈのときよりも２Ｈのときの方が断裂しにくいということである。同様の効果が、炭素原子と別の原子との間の結合開裂速度を比較したときに認められ、１３Ｃを有する結合は、１２Ｃを有する結合よりも開裂しにくい。これは速度論的同位体効果（Kinetic Isotope Effect）として知られており、十分に説明されている。Ｉｓｏｔｏｐｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｉｎ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ．（Ｃ．Ｊ．Ｃｏｌｌｉｎｓ、Ｎ．Ｓ．Ｂｏｗｍａｎ編、１９７０年）に記載されているように、多くの同位体がこの効果を示すことが知られている。また、Ｉｓｏｔｏｐｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｎ  ｅｎｚｙｍｅ−ｃａｔａｌｙｚｅｄ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ（Ｃｌｅｌａｎｄ、Ｗ．Ｗ．，Ｍ．Ｈ．Ｏ‘Ｌｅａｒｙ、およびＤ．Ｂ．Ｎｏｒｔｈｒｏｐ編、１９７６年）に記載されているように、このような効果は、酵素触媒反応でも認められることが知られている。
【００１０】
概要
ＫＩＥは、リジル酸化酵素の活性をブロックせずに低減させるのに利用可能である。本発明の実施形態は、２，６−ジアミノ−６，６−ジジューテロヘキサン酸；２，６−ジアミノ−５，５，６，６−テトラジューテロヘキサン酸、またはそれらのエステル、またはアミドを提供し、またリジル酸化酵素が重要である疾患治療における、そのような化合物の利用を提供する。
【００１１】
本発明の実施形態は、安定化リジンについて記載した下記の式Ｉ、ＩＩ、またはＩＩＩに基づき、天然存在の場合よりも多くの同位体量を含むあらゆる化合物による補給食品の投与も提供し、このような投与により、体内のリジン含有部分に、天然存在の場合よりも多くの重同位体が取り込まれ、これによる速度論的同位体効果によってリジンの安定化がもたらされる。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
一つの態様では、化合物は式（Ｉ）の構造を有する
【００１３】
【化３】
2014185163.tif 000004
【００１４】
式中、Ｄ１もしくはＤ２、またはＤ１およびＤ２の両方が重水素（２Ｈ）であり、Ｒ１はＨまたはブロッキング基（ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｇｒｏｕｐ）であり、Ｒ２はアミノ酸、ペプチド、タンパク質、もしくはタンパク質の一部、または脂肪族の、芳香族の、置換脂肪族の、もしくは置換芳香族のアシル基である。
【００１５】
この組成物は、リジンまたはリジン誘導体等の天然組成物ではなく、成分混合物を含み、重同位体と軽同位体とを含む。この組成物中の重同位体の保有率は、天然存在のものよりも多く、例えば、天然存在重同位体よりも２０％を超えて高く濃縮されている。重同位体の濃縮は、１箇所または複数箇所での濃縮でありうる。
【００１６】
用語「ブロッキング基」とは、アミノ基またはカルボキシ基に結合可能で、ｉｎ  ｖｉｖｏで酵素的または化学的に開裂してフリーのアミン、またはカルボン酸をそれぞれ生成する傾向があり、またはｉｎ  ｖｉｖｏで置換されて、天然のアミノ酸代謝物を生成することが可能なあらゆる基であることを、当業者は理解するであろう。このような基には、アミノ酸、ペプチド、タンパク質またはタンパク質の一部、エステル（例えば、Ｒ２がアルコールまたはフェノールに結合したもの）、アミド（例えば、Ｒ２がアミンに、またはＲ１がカルボキシ基に結合したもの）、またはＢＯＣ、Ｆｍｏｃ、もしくはその他の良く知られた基等のその他のより複雑な基が含まれうる。
【００１７】
いくつかの実施形態中で用いられる用語「重水素」とは、調製物中の分子の大部分が分子の関連する位置に２Ｈを有し、但し、その位置に１Ｈを有する少量の分子が当該調製物中に存在する場合を意味することを、当業者は理解するであろう。
【００１８】
更なる実施形態では、本発明は、重水素で保護された別の炭素原子を有する、式ＩＩ、および式ＩＩＩの化合物も提供する。
【００１９】
【化４】
2014185163.tif 000005
【００２０】
ＫＩＥを更に増強するために、炭素−１２の代わりに炭素−１３を、例えばリジン炭素原子の６位で、または１、２、３、４、５または６位について用いることも望ましい場合もある。
【００２１】
更なる実施形態では、式（Ｉ〜ＩＩＩ）の化合物または化合物の混合物が、食品中で使用可能であり、また、がんの発症遅延、またはリジン分解酵素の活性増大、もしくはリジンそのものの分解生成物に関連した他の疾患の発症遅延に有用である。
【００２２】
更なる実施形態では、式（Ｉ）の化合物または化合物の混合物の使用は、疾患治療用の栄養補助食品中で利用可能である。そのような補助食品は、実質的に式（Ｉ）の化合物からなりうるが、また式（Ｉ）の化合物が、補助食品中で重量としてリジンの大部分を占める場合には、そのような化合物を微量成分として含みうる。
【００２３】
更なる実施形態では、本発明は、疾患治療に有用な式（Ｉ）の化合物を含む薬剤を提供する。この薬剤は、医薬として許容される塩の状態にある、式（Ｉ）の化合物、または化合物の混合物からなりうる。また、この薬剤は、増量剤または充填剤、賦形剤、式（Ｉ）の化合物の溶解補助剤または溶解抑制剤、味覚修正剤またはマスク剤、錠剤またはカプセルの製造における補助剤、胃腸内移動中の化合物のための保護剤、および製剤の技術分野において通常の技量を備える者に既知のその他の材料も含みうる。この薬剤は、粉末剤、錠剤、カプセル、注射に適した液体または注射剤、スプレー、クリーム、軟膏、エアロゾル、坐薬の形態、または当業者に周知のその他の形態でありうる。
【００２４】
更なる実施形態では、本発明には、式Ｉ、ＩＩ、またはＩＩＩからなる安定化した組成物がもたらされるように、自然には生じないレベルの重同位体を、対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）に投与または投薬する方法が含まれる。対象には、ヒト、家畜、および実験動物、例えばマウス、ラット、ウサギ、サル等の哺乳動物、またはその他下等動物が含まれうる。
【００２５】
例えば、公知の抗がん治療、または抗線維症治療と共に行われる併用療法も検討される。
【００２６】
いくつかの実施形態では、天然存在組成物からなる食事由来のリジンと競合し、またはこれを上回るように、対象には、例えば、リジンの平均食物含有量の約１０％、２０％、５０％、２００％または１０００％が投与されうる。食物からの通常の摂取レベルは、約２〜３ｇ／日であり、もちろん食事によって変化する。例えば、対象には、本明細書に記載するリジンまたはリジン誘導体、約０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８または０．９ｇ／日の触媒量が、重同位体天然存在量よりも多く；本明細書に記載するリジンまたはリジン誘導体、約１、２、３または４ｇ／日の競合量が、重同位体天然存在量よりも多く；または本明細書に記載するリジンまたはリジン誘導体、約４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００ｇ／日の過剰量が、重同位体天然存在量よりも多く投与されうる。
【００２７】
本発明の更なる態様は、本明細書に記載する化合物または組成物の医薬組成物を提供する。
【００２８】
活性成分を含む医薬組成物は、経口用途に適した形態、例えば、錠剤、トローチ、トローチ剤、水性もしくは油性懸濁剤、水中油型乳剤、可分散型粉末剤もしくは顆粒剤、乳剤、硬カプセル剤もしくは軟カプセル剤、またはシロップもしくはエリキシル剤の形態を取りうる。そのような組成物は、増量剤、可溶化剤、味覚マスキング剤、安定化剤、着色剤、防腐剤、および製剤の技術分野における当業者に公知のその他薬剤を含みうる。
【００２９】
活性成分を含む医薬組成物は、薬剤を直腸投与するために坐薬の形態で投与することも可能である。このような組成物は、常温で固体であるが直腸温度では液体であり、従って、直腸内で融解して薬剤を放出する、適当な非刺激性の賦形剤と共に薬剤を混合することにより調製されうる。そのような材料として、ココアバターおよびポリエチレングリコールが挙げられる。
【００３０】
医薬組成物は、鼻、喉または肺での吸入による送達にも適しうる。そのような組成物は、その他の材料と共に、本発明の化合物を吸入に適する粒子に予成形することにより、またはエアロゾルを形成するのに適した材料に、本発明の化合物を溶解することにより調製されうる。
【００３１】
医薬組成物は、スプレー、クリーム、軟膏、ローションとして、またはパッチ、救急絆、または創傷被覆材の成分、もしくは添加剤として、局所適用による送達にも適しうる。更に、この化合物は、機械的手段により疾患部位に送達可能であり、あるいはリポソーム（罹患組織に対する親和性をリポソームに付与する化学修飾を含む／含まない）、抗体、アプタマー、レクチン等の全身標的技法（ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の利用、または正常組織にはあまり豊富でない、もしくは存在しない罹患組織の特質に親和性を有する化学配位子の利用を通じて、疾患部位を標的とすることができる。
【００３２】
また、本発明の医薬組成物は、注射による投与に適した形態でもありうる。そのような組成物は、溶液、懸濁液または乳剤の形態でありうる。そのような組成物は、安定化剤、抗菌剤または薬剤の機能を改善するその他の材料を含みうる。本発明は、本発明の化合物のドライ形態、乾燥または凍結乾燥形態も含み、これらは、簡単に、注射による投与、または経口もしくは局所用途に適した溶液、懸濁液または乳剤に形成可能であり、あるいはそのように再溶解可能である。
【実施例】
【００３３】
重水素化リジンは、以下に示す通り、Ｌ−リジンから合成された。
【００３４】
【化５】
2014185163.tif 000006
【００３５】
例１  （Ｓ）−６−トリフルオロアセチルアミノ−２−アミノへキサン酸（２）
ナトリウム（４．６ｇ；０．２モル）を、２００ｍｌのエタノール（無水）に溶解した。この溶液に、１８．２５ｇ（０．１モル）のリジン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）塩酸を、攪拌しながら徐々に添加した。この混合物を１時間攪拌し、析出物をろ過して取り除いた。氷冷した残りの溶液に、２１．３ｇ（０．１５モル）のトリフルオロ酢酸エチルを、激しく攪拌しながら徐々に添加した。この溶液を室温に戻し、更に２時間攪拌した。６ｇ（０．１モル）のＡｃＯＨを添加し、生成した析出物をＥｔＯＨおよびアセトンで洗浄した。収量：１５ｇ（６２％）。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ、ポジティブモード：２４２．４５５（ＭＩ＋１；６７％）。
【００３６】
例２  （Ｓ）−６−トリフルオロアセチルアミノ−２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−ヘキサン酸（３）
４０ｍｌのＤＭＦＡに懸濁した化合物（２）（３．６３ｇ；０．０１５モル）に、３．０３ｇ（０．０３モル）のＴＥＡおよび３．６ｇ（０．０１６５モル）のジ−ｔｅｒｔ−ブチルカルボネートを添加し、この反応混合物を室温で３時間攪拌した。次に、この混合物を、水で３倍に希釈し、ＨＣｌでｐＨ２になるまで酸性化した。生成物をＥｔＯＡｃ（１００ｍｌ）で抽出し、水、ブラインで洗浄し、乾燥（ＭｇＳＯ４）した。溶媒を減圧除去し、４．７ｇ（９２％）の表記化合物を得た。（３）の分析データは、文献で報告されたものと同一であった。
【００３７】
例３  （Ｓ）−２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−５−シアノペンタン酸（４）
４０ｍｌの水に溶かした０．５６ｇ（０．０１４モル）のＮａＯＨの溶液に、２．３９ｇ（０．００７モル）の化合物（３）、０．２ｇのＮｉＳＯ４×７Ｈ２Ｏ、および３．３３ｇ（０．０１４モル）の過硫酸ナトリウムを添加した。３時間かけて、この溶液に、１．１２ｇ（０．０２８モル）のＮａＯＨを、攪拌しながら少量ずつ添加した。得られた混合物を一晩攪拌した。過剰の酸化剤を、亜硫酸ナトリウムで中和した。この混合物を、ＨＣｌでｐＨ２になるまで酸性化した。生成物をＥｔＯＡｃ（１００ｍｌ）で抽出し、水、ブラインで洗浄し、乾燥（ＭｇＳＯ４）した。この化合物をシリカゲル上でのＣＣ（溶離液：クロロホルム）により精製した。収量：１．４２ｇ（８２％）を得た。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ、ポジティブモード：２６２．９７８（ＭＩ＋Ｎａ；４３％）。
【００３８】
例４  （Ｓ）−６−アミノ−６，６−ジジューテロ−２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−ヘキサン酸（５）
方法１．２ｍｌのＡｃＯＤ（同位体純度９８％）に、１００ｍｇ（０．４１モル）のニトリル（４）を溶解した溶液に、１５ｍｇ（１５重量％）のＰｔＯ２を添加した。この混合物を、Ｄ２（同位体純度９８％）雰囲気内で、室温において３時間攪拌、ろ過し、および減圧下でエバポレーションした。残渣物を精製した（ＣＣ、シリカ；溶離液：クロロホルム−ＭｅＯＨ−ＡｃＯＨ）。収量：油状６５ｍｇ（６３％）。同位体純度は、ＮＭＲシグナル比（２．７ｍｄおよび３．６ｍｄ；リジンに関して、比は２：１であるが、Ｄ２−Ｌｙｓは、２．７ｍｄにおいてシグナルを有さないはずである）により判断し、約９０％と決定された。
【００３９】
方法２．３０ｍｌのＡｃＯＤ（同位体純度９７％）にニトリル（４）（１．５ｇ、６．２モル）を溶解した溶液に、２４２ｍｇ（１５重量％）のＰｔＯ２を添加した。反応混合物を、Ｄ２（同位体純度９７％）雰囲気内で、室温において２０時間攪拌、ろ過し、および減圧下でエバポレーションした。残渣物を精製した（ＣＣ、シリカ；溶離液：クロロホルム−ＭｅＯＨ−ＡｃＯＨ）。収量：油状１．２ｇ（７９％）。同位体純度は、ＮＭＲシグナル比により判断し、＞８５％であると決定された（方法１を参照）。
【００４０】
例５  （Ｓ）−２，６−ジアミノ−６，６−ジジューテロヘキサン酸（６）
ＥｔＯＨ（５ｍｌ）に１．２ｇ（４．８８モル）の重水素化Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（５）を溶解した溶液に、濃ＨＣｌ（２ｍｌ）を添加した。この反応混合物を５０℃まで加温し、３０分間攪拌し、溶媒を減圧下で取り除いた。残渣物を２０ｍｌのＥｔＯＨに溶解し、沸騰させ、０．５ｇ（６．３ミリモル）のＰｙを滴下添加した。この混合物を冷却し、＋４℃で一晩放置した。収量：白色結晶状の生成物０．３３ｇ（３７％；乾燥後）。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ、ポジティブモード：１４９．２８６（ＭＩ＋Ｈ；７３％）。
【００４１】
例６  リコンビナントＬＯＸの発現、精製、およびフォールディング
処理済の酵素（アミノ酸コーディネート１６３〜４１１）に対応するマウスＬＯＸ  ｃＤＮＡを、マウス心臓全ＲＮＡ、およびプルーフリーディングＤＮＡポリメラーゼを用いて、ＲＴ−ＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲ産物を、ＢａｍＨ  Ｉ部位で、ｐＱＥ３０発現（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）ベクターにクローニングした。対数期Ｅ．Ｃｏｌｉ細胞に１ｍＭ  ＩＰＴＧを添加し、３７℃で４時間インキュベーションすることで発現を誘発した。細胞を、６Ｍ尿素バッファー中で溶解し、遠心分離により清透化し、ＮＴＡ−Ｎｉ２＋−アガロース（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）と共にインキュベーションした。アガロースを６Ｍ尿素で徹底洗浄し、結合タンパク質を６Ｍ尿素中のイミダゾールで溶出した。リフォールディングでは、［Ｊｕｎｇ  ＳＴら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｅｒ  Ｐｕｒｉｆ．２００３年；第３１巻：２４０〜２４６ページ］に記載されている透析プロトコールを使用したが、正しいフォールディングを支援するために、Ｎ−ラウロイルサルコシンの出発濃度は高く設定され、グルタチオンによる追加の透析ステップが加わった。
【００４２】
例７  ＬＯＸ酵素活性の機能的、非放射性分析
ビオチン化試薬との反応を用いて、固体支持体上の酸化されたリジン残基の検出、および酵素分析を可能にする、非放射性架橋分析法を開発した。冷水魚から得られたコラーゲンをＥＩＡプレート（Ｃｏｓｔａｒ）上に固定化し、ヒドロキシルアミンと短時間インキュベーションし、徹底洗浄し、酸素源である空気と自由に接するようにして、リン酸バッファー中のリコンビナントＬＯＸとインキュベーションした。これには、洗浄、ビオチンヒドラジド、ＥｘｔｒＡｖｉｄｉｎ−ペルオキシダーゼとの反応、およびオルトフェニルエチレンジアミンによる現像が続いた。必要な場合は常に、γ−アミノプロピオニトリルが、ＬＯＸの阻害剤として使用された。