(57)【要約】【課題】新規ヘパラナーゼ活性阻害剤の提供。【解決手段】カノコソウエキス、ヒノキエキス、キウイエキス、レモンエキス、トマトエキス、ニンニクエキス、ユリエキス、長命草（ボタンボウフウ）エキス、ムクロジエキス、パセリエキス、タイソウエキス、チンピエキス、およびイラクサエキスの中から選ばれる１種または２種以上からなるヘパラナーゼ活性阻害剤の提供。【選択図】図９
2014208720.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
皮膚に存在するヘパラナーゼの働きを制御することを特徴とする、しわを防止または改善する美容方法。
【請求項２】
皮膚に存在するヘパラナーゼの働きを制御する方法として、遺伝子発現を抑制する物質を適用することを特徴とする、しわを防止または改善する美容方法。
【請求項３】
皮膚に存在するヘパラナーゼの働きを制御する方法として、遺伝子の翻訳を抑制する物質を適用することを特徴とする、しわを防止または改善する美容方法。
【請求項４】
皮膚に存在するヘパラナーゼの働きを制御する方法として、酵素活性を阻害する物質を適用することを特徴とする、しわを防止または改善する美容方法。
【請求項５】
皮膚に存在するヘパラナーゼの働きを制御する方法として、酵素の活性化を阻害する物質を適用することを特徴とする、しわを防止または改善する美容方法。
【請求項６】
皮膚に存在するヘパラナーゼの働きを抑制する物質を、経口、注射、外用塗布などの方法にて投与することを特徴とする、しわを防止または改善する美容方法。
【請求項７】
皮膚に存在するヘパラナーゼの働きを制御する物質を有効成分として含有する、しわを防止または改善するための経口投与薬剤。
【請求項８】
皮膚に存在するヘパラナーゼの働きを制御する物質を有効成分として含有する、しわを防止または改善するための注射剤。
【請求項９】
皮膚に存在するヘパラナーゼの働きを制御する物質を有効成分として含有する、しわを防止または改善するための皮膚外用剤。
【請求項１０】
前記ヘパラナーゼ抑制物質が、スラミン(Suramin)であることを特徴とする、請求項７〜９のいずれか１項に記載の経口投与薬剤、注射剤又は皮膚外用剤。
【請求項１１】
スラミンからなるしわ改善剤。
【請求項１２】
前記物質が、スラミンであることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ヘパラナーゼ抑制物質が４−（１Ｈ−ベンゾイミダゾール−２−イル）−フェニルアミン又はその誘導体であることを特徴とする、請求項７〜９のいずれか１項に記載の経口投与薬剤、注射剤又は皮膚外用剤。
【請求項１４】
４−（１Ｈ−ベンゾイミダゾール−２−イル）−フェニルアミン又はその誘導体からなるしわ改善剤。
【請求項１５】
前記物質が、４−（１Ｈ−ベンゾイミダゾール−２−イル）−フェニルアミン又はその誘導体であることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記ヘパラナーゼ抑制物質がカノコソウエキス、ヒノキエキス、キウイエキス、レモンエキス、トマトエキス、ニンニクエキス、ユリエキス、長命草（ボタンボウフウ）エキス、トウヒエキス、ムクロジエキス、パセリエキス、タイソウエキス、チンピエキス、およびイラクサエキスの中から選ばれる１種または２種以上からなるヘパラナーゼ活性阻害剤であることを特徴とする、請求項７〜９のいずれか１項に記載の経口投与薬剤、注射剤又は皮膚外用剤。
【請求項１７】
カノコソウエキス、ヒノキエキス、キウイエキス、レモンエキス、トマトエキス、ニンニクエキス、ユリエキス、長命草（ボタンボウフウ）エキス、トウヒエキス、ムクロジエキス、パセリエキス、タイソウエキス、チンピエキス、およびイラクサエキスの中から選ばれる１種または２種以上からなるヘパラナーゼ活性阻害剤からなるしわ改善剤。
【請求項１８】
前記物質が、カノコソウエキス、ヒノキエキス、キウイエキス、レモンエキス、トマトエキス、ニンニクエキス、ユリエキス、長命草（ボタンボウフウ）エキス、トウヒエキス、ムクロジエキス、パセリエキス、タイソウエキス、チンピエキス、およびイラクサエキスの中から選ばれる１種または２種以上からなるヘパラナーゼ活性阻害剤であることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
ヒトまたは動物の皮膚、皮膚組織または細胞に被験物質を接触させ、前記皮膚におけるヘパラナーゼの酵素活性、遺伝子発現レベルまたはヘパラン硫酸鎖を検出し、ヘパラナーゼの酵素活性、遺伝子発現レベルまたはヘパラン硫酸鎖の変化を指標として被験物質の抗しわ効果を評価することを特徴とする、抗しわ効果の評価方法。
【請求項２０】
表皮角化細胞を用いることを特徴とする請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
真皮線維芽細胞を用いることを特徴とする請求項１９記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、しわを防止しまたは改善するための経口、注射、皮膚外用剤および美容方法、ならびに抗しわ効果の評価方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
年をとるにつれて皮膚老化の１つの現象としてしわが増加するが、美容等の観点から特に女性においてしわの防止および改善に対する関心が非常に高まっている。しわは、その発生部位や発生メカニズム等によって、大じわ、小じわ、ちりめんじわに大きく分類される。大じわは主に光老化によって額や首の後ろ等に生じる深いしわであり、小じわは目尻や口元に生じる比較的浅いしわであり、またちりめんじわは老人の腹部等の非露光部に生じるひだ状のしわである。
【０００３】
中でも小じわに関しては、しわ面積率が角層水分量の少ない肌状態の人で高い値を示すことが報告され（芋川ら、Fragrance Journal; 1992(11) 29-42（非特許文献１）参照）、小じわが、肌荒れや乾燥による角層水分量の低下によって悪化することが明らかになっている。現代女性はエアコンの普及により夏場でも肌が常に乾燥した環境下に置かれており、小じわに対する悩みが増大し、小じわへの関心も高まっている。
【０００４】
これまで小じわを改善するには、低下した角層水分量を回復させるため、グリセリンやＮＭＦ（natural moisturizing factor）関連成分、コラーゲン誘導体等の保湿成分を肌に塗布して皮膚の水分保持を高める方法等が提案されているが、保湿作用以上の優れた小じわ改善効果を有する薬剤はほとんど開発されていないのが現状であった。
【０００５】
しかし近年、小じわモデルが確立され、皮膚における生化学的変化が解明されつつある（松永ら、British Journal of Dermatology、2007、May;156(5):884-91（非特許文献２）参照）。その一つとして、表皮でのADAM(A Disintegrin And Metalloproteinase)の活性化と、それに伴うHB-EGF(ヘパリン結合性EGF様増殖因子;heparin-binding epidermal growth factor-like growth factor)およびAmphiregulin等の表皮細胞の膜に結合した増殖因子の遊離が表皮肥厚、真皮肥厚を引き起こし、小じわ形成を促進することが明らかになっている。この小じわ形成を防ぐために、例えばTAPI-1または4-メトキシベンゾヒドロキサム酸等のADAM活性阻害剤を配合した皮膚の老化を抑制するための組成物が提案されている（特開2006-137744（特許文献１）、特開2007-119444（特許文献２）参照）。
【０００６】
しかしながら、小じわが生じた皮膚における、タンパクレベル、遺伝子レベル等の各種生化学レベルの変化に関する詳細な検討は十分に行われておらず、このような詳細な検討に基づき、より効果的に小じわを防止・改善することができる経口、注射、外用剤や美容方法が強く望まれていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開2006-137744
【特許文献２】特開2007-119444
【特許文献３】特表2003-502054
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Fragrance Journal; 1992(11) 29-42
【非特許文献２】British Journal of Dermatology、2007、May;156(5):884-91
【非特許文献３】Semin Cancer Biol., 2002;12(2):121-129
【非特許文献４】Mol Cancer Ther., 2004;3(9):1069-1077
【非特許文献５】Bioorg. Med. Chem. Lett., 2006;(16):409-412.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、上記のような事情に鑑み、皮膚における小じわ形成に関与する生化学的変化を解明し、かつその変化を抑制することができる物質を特定し、その物質を用いて、より効果的にしわを防止または改善できる、経口、注射、皮膚外用剤または美容方法を提供することを目的とするものである。さらに、本発明は、上記の生化学的変化の抑制を指標として、より効率的かつ簡便に被験物質の抗しわ効果を評価できる方法を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、小じわモデルによって誘導されるしわ形成過程を生化学的に解析した結果、しわ形成過程において、ヘパラナーゼの発現が増加し、基底膜のヘパラン硫酸プロテオグリカンであるパールカンのヘパラン硫酸鎖が分解されることを見出し、ヘパラナーゼの活性を阻害する物質を塗布することによって、しわ形成を抑制できることを発見したことに基づくものである。
したがって、本願以下の発明を包含する。
（１）皮膚に存在するヘパラナーゼの働きを制御することを特徴とする、しわを防止または改善する美容方法。
（２）皮膚に存在するヘパラナーゼの働きを制御する方法として、遺伝子発現を抑制する物質を適用することを特徴とする、しわを防止または改善する美容方法。
（３）皮膚に存在するヘパラナーゼの働きを制御する方法として、遺伝子の翻訳を抑制する物質を適用することを特徴とする、しわを防止または改善する美容方法。
（４）皮膚に存在するヘパラナーゼの働きを制御する方法として、酵素活性を阻害する物質を適用することを特徴とする、しわを防止または改善する美容方法。
（５）皮膚に存在するヘパラナーゼの働きを制御する方法として、酵素の活性化を阻害する物質を適用することを特徴とする、しわを防止または改善する美容方法。
（６）皮膚に存在するヘパラナーゼの働きを抑制する物質を、経口、注射、外用塗布などの方法にて投与することを特徴とする、しわを防止または改善する美容方法。
（７）皮膚に存在するヘパラナーゼの働きを制御する物質を有効成分として含有する、しわを防止または改善するための経口投与薬剤。
（８）皮膚に存在するヘパラナーゼの働きを制御する物質を有効成分として含有する、しわを防止または改善するための注射剤。
（９）皮膚に存在するヘパラナーゼの働きを制御する物質を有効成分として含有する、しわを防止または改善するための皮膚外用剤。
（１０）前記ヘパラナーゼ抑制物質が、スラミン(Suramin)であることを特徴とする、（７）〜（９）のいずれかの経口投与薬剤、注射剤又は皮膚外用剤。
（１１）スラミンからなるしわ改善剤。
（１２）前記物質が、スラミンであることを特徴とする、（１）〜（６）のいずれかの方法。
（１３）前記ヘパラナーゼ抑制物質が４−（１Ｈ−ベンゾイミダゾール−２−イル）−フェニルアミン又はその誘導体であることを特徴とする、（７）〜（９）のいずれかの経口投与薬剤、注射剤又は皮膚外用剤。
（１４）４−（１Ｈ−ベンゾイミダゾール−２−イル）−フェニルアミン又はその誘導体からなるしわ改善剤。
（１５）前記物質が、４−（１Ｈ−ベンゾイミダゾール−２−イル）−フェニルアミン又はその誘導体であることを特徴とする、（１）〜（６）のいずれかの方法。
（１６）前記ヘパラナーゼ抑制物質がカノコソウエキス、ヒノキエキス、キウイエキス、レモンエキス、トマトエキス、ニンニクエキス、ユリエキス、長命草（ボタンボウフウ）エキス、トウヒエキス、ムクロジエキス、パセリエキス、タイソウエキス、チンピエキス、およびイラクサエキスの中から選ばれる１種または２種以上からなるヘパラナーゼ活性阻害剤であることを特徴とする、（７）〜（９）のいずれかの経口投与薬剤、注射剤又は皮膚外用剤。
（１７）カノコソウエキス、ヒノキエキス、キウイエキス、レモンエキス、トマトエキス、ニンニクエキス、ユリエキス、長命草（ボタンボウフウ）エキス、トウヒエキス、ムクロジエキス、パセリエキス、タイソウエキス、チンピエキス、およびイラクサエキスの中から選ばれる１種または２種以上からなるヘパラナーゼ活性阻害剤からなるしわ改善剤。
（１８）前記物質が、カノコソウエキス、ヒノキエキス、キウイエキス、レモンエキス、トマトエキス、ニンニクエキス、ユリエキス、長命草（ボタンボウフウ）エキス、トウヒエキス、ムクロジエキス、パセリエキス、タイソウエキス、チンピエキス、およびイラクサエキスの中から選ばれる１種または２種以上からなるヘパラナーゼ活性阻害剤であることを特徴とする、（１）〜（６）のいずれかの方法。
（１９）ヒトまたは動物の皮膚、皮膚組織または細胞に被験物質を接触させ、前記皮膚におけるヘパラナーゼの酵素活性、遺伝子発現レベルまたはヘパラン硫酸鎖を検出し、ヘパラナーゼの酵素活性、遺伝子発現レベルまたはヘパラン硫酸鎖の変化を指標として被験物質の抗しわ効果を評価することを特徴とする、抗しわ効果の評価方法。
（２０）表皮角化細胞を用いることを特徴とする（１９）の方法。
（２１）真皮線維芽細胞を用いることを特徴とする（１９）の方法。
【００１１】
本発明の経口、注射、皮膚外用剤を適応することによって、また、本発明の美容方法によって、皮膚に存在するヘパラナーゼを制御し、非常に効果的に、しわ、特に小じわを防止または改善することが可能である。また、本発明の評価方法によって、効率的かつ簡便に、より高い効果を有する抗しわ物質を特定することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、ヘパラナーゼの遺伝子発現の変化を示す。結果は、平均値＋標準偏差で示した。＊：p＜0.01。
【図２】図２は、ヘパラナーゼによる表皮基底膜上のヘパラン硫酸鎖の分解の経時変化を示す、パールカンコアタンパク質およびヘパラン硫酸鎖に対する特異的抗体を用いた免疫染色写真である。（Ａ）-（Ｃ）：パールカンコアタンパク質特異的抗体にて免疫染色した皮膚：Ｄａｙ０，Ｄａｙ２，Ｄａｙ７。（Ｄ）-（Ｆ）：ヘパラン硫酸特異的抗体にて免疫染色した皮膚：Ｄａｙ０，Ｄａｙ２，Ｄａｙ７。
【図３】図３は、ヘパラナーゼ阻害剤、スラミンの抗しわ効果を示す。＊：P＜0.05、n=5〜6。
【図４】図４は、スラミンの表皮基底膜ヘパラン硫酸鎖の保護効果を示す、顕微鏡写真である。（Ａ）-（Ｄ）：皮膚をヘパラン硫酸特異的抗体にて免疫染色した顕微鏡写真。（Ｅ）−（Ｈ）：1mM スラミン塗布した皮膚をヘパラン硫酸特異的抗体にて免疫染色した顕微鏡写真。
【図５】図５は、ヘパラナーゼ阻害剤、1-[4-(1H-ベンゾイミダゾール-2-イル)-フェニル]-3-[4-(1H-ベンゾイミダゾール-2-イル)-フェニル]-ユレアの抗しわ効果を示す。＊＊：P＜0.001、n=6。
【図６】図６は、1-[4-(1H-ベンゾイミダゾール-2-イル)-フェニル]-3-[4-(1H-ベンゾイミダゾール-2-イル)-フェニル]-ユレアの表皮基底膜ヘパラン硫酸鎖の保護(分解抑制）効果を示す、パールカンコアタンパク質およびヘパラン硫酸鎖特異的抗体にて免疫染色した顕微鏡写真である。（Ａ）： 50％エタノールを塗布した皮膚をパールカン特異的抗体にて染色した顕微鏡写真。（Ｂ）：1mM 1-[4-(1H-ベンゾイミダゾール-2-イル)-フェニル]-3-[4-(1H-ベンゾイミダゾール-2-イル)-フェニル]-ユレアを塗布した皮膚をパールカン特異的抗体にて染色した顕微鏡写真。（Ｃ）： 50％エタノールを塗布した皮膚をヘパラン硫酸特異的抗体にて染色した顕微鏡写真。（Ｄ）：1mM 1-[4-(1H-ベンゾイミダゾール-2-イル)-フェニル]-3-[4-(1H-ベンゾイミダゾール-2-イル)-フェニル]-ユレアを塗布した皮膚をヘパラン硫酸鎖特異的抗体にて染色した顕微鏡写真。
【図７】図７は、4-（1H‐ベンゾイミダゾール-2-イル）-フェニルアミンのヘパラナーゼ活性阻害の評価結果を示す。
【図８】図８は、4-（1H‐ベンゾイミダゾール-2-イル）-フェニルアミンの、HT1080細胞を用いた創傷治癒アッセイの結果を示すHT1080細胞の顕微鏡観察写真。（Ａ）：スクラッチ直後の写真。（Ｂ）：DMSOを添加した培地に交換した後、スクラッチを行い12時間後の写真。（Ｃ-E）：4-（1H‐ベンゾイミダゾール-2-イル）-フェニルアミンを（1μM；Ｃ, 10μM;D, 100μM;E）添加した培地に交換した後、スクラッチを行い12時間後の写真。
【図９】図９は、（Ａ）、（Ｂ）ともに実施例におけるヘパラナーゼ活性阻害のスクリーニングの結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
ヘパラナーゼは、種々の細胞に存在し、様々なヘパラン硫酸プロテオグリカンのヘパラン硫酸鎖を特異的に分解する酵素である。皮膚では、表皮を構成する表皮角化細胞および真皮の線維芽細胞、血管内皮細胞などが産生する。各種癌細胞でも産生が高まっていることが知られ、癌の悪性度との関連も示唆されている。癌細胞でヘパラナーゼの産生が高いと転移性が高く、血管新生の誘導能も高いことが知られている（Vlodavsky I., et. al., Semin Cancer Biol., 2002;12(2):121-129（非特許文献３）参照）。本発明では、小じわモデルにて、ヘパラナーゼの発現および活性が亢進し、ヘパラン硫酸鎖を分解することを新たに見出した。
さらに、老人性色素斑組織では露光部皮膚と比較して、基底膜のヘパラン硫酸が分解していることを明らかにされた。ヘパラン硫酸の分解に伴い、表皮で発現している血管内皮細胞増殖因子−Ａ（VEGF-A）の制御が破綻し、これにより真皮の血管やリンパ管の変化により炎症を生じさせ、メラノサイトを活性化させる。また、真皮で発現している線維芽細胞増殖因子-７（FGF‐7）の制御が破綻することで、メラノサイトから表皮細胞でメラノソームの受け渡しが促進される。すなわち、ヘパラナーゼ活性化に伴うヘパラン硫酸の分解は、炎症によるメラノサイトの活性化とFGF-7制御の破綻によるメラノサイト受け渡し促進により、相乗的にメラノサイトがケラチノサイトに蓄積すると考えられる。
【００１４】
ヘパラン硫酸プロテオグリカンはヘパリン結合性増殖因子（bFGF, HGF, VEGF, HB-EGF等）を細胞外に蓄積させる働きをする。ヘパラン硫酸プロテオグリカンの１種であるパールカンは、表皮と真皮の境界部に存在する表皮基底膜にも存在し、皮膚では、ヘパリン硫酸結合性増殖因子を表皮基底膜に結合させることによって、表皮、真皮間の増殖因子の移動を制御している。また、表皮基底膜に存在するパールカンは、基底膜に結合している表皮基底細胞に対する増殖因子の作用も制御しており、表皮の良好な増殖・分化に必須であることが明らかにされている。
【００１５】
したがって、ヘパラナーゼの活性化または発現亢進によるパールカンのヘパラン硫酸鎖の分解は、蓄積された増殖因子の放出ならびに表皮、真皮間の増殖因子の制御を崩壊させ、表皮の分化・増殖制御の破綻および真皮の肥厚を生じさせることが、小じわ形成の１つの重要な機構であると考えられる。そこで、ヘパラナーゼの活性を抑制するスラミンを外用塗布することによって、皮膚におけるヘパラナーゼ活性を抑制することを試みた結果、ヘパラン硫酸鎖の分解が抑えるとともに、しわ、特に小じわ形成が抑制されることを見出した。
【００１６】
皮膚のバリア破壊に伴って増加するヘパラナーゼを遺伝子発現、翻訳、酵素の活性化、および活性化酵素を抑制することが、皮膚の継続バリア破壊によって起こるしわ形成を抑制できることより、ヘパラナーゼを制御することで、本発明のしわを防止または改善するための美容方法、そして、ヘパラナーゼの制御剤を経口、注射、皮膚外用等の経路で皮膚に到達させることによってしわ形成の防止および改善剤が完成する。
【００１７】
本発明のしわを防止または改善する物質としては、皮膚に存在するヘパラナーゼの活性を阻害する物質、発現を阻害する物質、翻訳を阻害する物質、活性化を阻害する物質等のヘパラナーゼ制御物質を有効成分として含有することを特徴とする。
【００１８】
また、本発明のしわを防止または改善する美容方法は、皮膚に存在するヘパラナーゼに対して上記ヘパラナーゼ制御物質を経口、注射または外用の方法で投与し、皮膚のヘパラナーゼを制御することを特徴とする。
【００１９】
また、そのようなヘパラナーゼ制御物質の例としてヘパラナーゼの活性を阻害する物質、例えばスラミンが挙げられる。
【００２０】
本発明は、スラミンからなるしわ改善剤も提供する。これら化合物は、ヘパラナーゼの活性を阻害することによって、しわ形成を防止し、または、形成されたしわを改善する作用を有する。
【００２１】
本明細書において、「ヘパラナーゼの制御」とは、ヘパラナーゼの酵素活性を阻害するのみならず、遺伝子の発現やタンパク質生合成を阻害する、ヘパラナーゼの活性化を阻害する等、皮膚におけるヘパラナーゼの働きを抑制する任意の作用を含む。
【００２２】
本発明の抗しわ効果の評価方法は、ヒトまたは動物の皮膚、皮膚組織、細胞または酵素に被験物質を接触させ、前記皮膚、組織または細胞におけるヘパラナーゼの酵素活性、遺伝子発現レベルまたはヘパラン硫酸鎖の変化を指標として抗しわ効果を評価することを特徴とする。
【００２３】
本明細書において、「抗しわ効果」とは、しわの形成を防止し、または形成されたしわを改善する任意の効果を意味する。
【００２４】
本発明のしわを防止または改善する美容方法において、上記のヘパラナーゼを制御する物質は、本発明の目的を達成できる限り、任意の形態で適用することができ、また単独で適用しても、あるいは他の任意の成分と共に配合して適用してもよい。皮膚への適用する場合には、皮膚の場所も限定されず、頭皮を含む体表面のあらゆる皮膚を含む。
本発明の抗しわ効果の評価方法は、ヒトまたは動物の皮膚、皮膚組織、細胞または酵素に被験物質を接触させる工程を含む。
【００２５】
本評価方法で用いることができるヒトまたは動物の皮膚は、本発明の目的を達成できる限り特に限定はされない。本発明の評価方法において、例えば、小じわモデルにおいて亢進された遺伝子発現を低下させる物質、ヘパラン硫酸鎖の分解を阻害する物質を特定することによって、抗しわ物質を効率的に特定できると考えられる。
【００２６】
ヘパラナーゼの活性を指標とする一次評価は、例えば下記の実施例において詳細に記載した通り、ビオチン化したヘパラン硫酸を96ウェルに固定化した後、薬剤や生薬存在下にてヘパラナーゼを作用させ、ビオチン化ヘパラン硫酸の減少量をパーオキシダーゼ標識したアビジンを作用させ、発色させることでヘパラナーゼ活性を評価することで行うことができる。一次評価にてヘパラナーゼ活性阻害効果があった薬剤は、一次評価とは異なったヘパラナーゼ活性を指標とした二次評価系にて再現性および濃度依存性の評価を行うことができる。二次評価は、ヘパラナーゼを発現しているHT1080細胞を用いて評価を行うことができる。HT1080細胞は、コンフレントに培養した後に細胞をスクラッチすると、ヘパラナーゼ活性依存的に細胞が遊走することが知られている（Ishida K., et. al., Mol Cancer Ther., 2004;3(9):1069-1077.参照（非特許文献４））。そこで評価薬剤を添加することで、スクラッチ部位の遊走（回復）の程度からヘパラナーゼ阻害活性を評価する。
【００２７】
その結果、ヘパラナーゼ活性を有意に抑制する化合物として4‐（1H-ベンゾイミダゾール-2-イル）-フェニルアミンが見出された。4-（1H-ベンゾイミダゾール-2-イル）-フェニルアミン及びその誘導体はヘパラナーゼ活性阻害作用や抗老化作用を示すことが従来技術において全く知られていない。なお「抗老化」とは、加齢や光老化による基底膜プロテオグリカンのヘパラン硫酸の分解によるヘパラン硫酸結合性増殖因子の遊離に伴う皮膚変化、具体的には表皮分化異常、真皮血管新生、リンパ管拡張、エラスチン分解を抑制することで、皮膚のしわ、たるみ、硬化等を防止、改善し、弾力のある若々しい健康な肌の状態を維持することを意味する。
【００２８】
また、さらなるスクリーニングの結果、ヘパラナーゼ活性を有意に抑制する生薬カノコソウエキス、ヒノキエキス、キウイエキス、レモンエキス、トマトエキス、ニンニクエキス、ユリエキス、長命草（ボタンボウフウ）エキス、トウヒエキス、ムクロジエキス、パセリエキス、タイソウエキス、チンピエキス、およびイラクサエキスが見出された。これらの生薬についても、ヘパラナーゼ活性阻害作用や抗老化作用を示すことが従来技術において全く知られていない。
【００２９】
カノコソウエキスは、オミナエシ科カノコソウ属（Valeriana）に属する多年草であるカノコソウ（V. fauriei）またはその他の近縁種の根および根茎から抽出して得られる抽出液である。上記近縁種としてはツルカノコソウ（V. flaccidissima）、セイヨウカノコソウ（V. officinalis）等が挙げられる。
【００３０】
ヒノキエキスは、ヒノキ科のヒノキ属（Chamaecyparis）やアスナロ属（Thujopsis）に属する植物で、天然ヒノキ、天然ヒバ等といわれている樹木の葉、枝および材部から抽出して得られるヒノキチオールを主成分とした抽出液である。ヒノキチオールには抗菌・殺菌・防虫・防カビ・防腐などの効果がある。上記天然ヒノキとしては、具体的には日本産ヒノキ（Chamaecyparis obtuse）、台湾の中央山脈に分布するタイワンヒノキ（Chamaecyparis obtuse var. formosana、あるいはC. taiwanensis）等が好ましく用いられる。上記天然ヒバとしては、アスナロ（Thujopsis delabrata）やその変種であるヒバ（T. d. var. hondae）等が好ましく用いられる。天然ヒバは青森県に生えるいわゆる津軽ヒバ（陸奥ヒバ、青森ヒバともいう）が有名である。
【００３１】
キウイエキスは、マタタビ科マタタビ属（Actinidia）に属するキウイ（A. chinensis）の果実から抽出して得られる抽出液である。ビタミンＣのほか、タンパク質分解酵素、アミノ酸、タンニン、糖類などの天然の植物成分を含み、保湿作用、収斂作用、皮膚柔軟化作用、抗酸化作用がある。
【００３２】
レモンエキスは、ミカン科ミカン属（Citrus）に属するレモン（C. limon）の果実から抽出して得られる抽出液である。ビタミンＡ、ビタミンＢ、ビタミンＣ、ビタミンＰなどが含まれる。美白、消炎効果がある。
【００３３】
トマトエキスは、ナス科トマト属（Lycopersicon）に属するトマト（L. esculentum）の果皮や果実から抽出して得られる抽出液である。特に果皮にはトマト特有のポリフェノールを含み、抗アレルギー活性がある。
【００３４】
ニンニクエキスは、ユリ科ネギ属（Allium）に属するニンニク（A. sativum、あるいはA. scorodoplasum）の鱗茎から抽出して得られる抽出液である。アリシン、スコルジン、酵素、ビタミン類などを含み、疲労回復・健胃・整腸作用などがある。ニンニクのアリシンには、強力な殺菌、抗菌力があり、スコルジンは、強壮作用や新陳代謝を盛んにし、ビタミンＢ１の効果を高める働きもある。
【００３５】
ユリエキスは、ユリ科ユリ属（Lilium）に属するニワシロユリ（L. candidum。別名マドンナ・リリー）の球根から抽出して得られる抽出液である。アントシアニン、オキシダーゼのほか、多量のでんぷんを含み、保湿作用、保護作用、柔軟化作用がある。
【００３６】
長命草（ボタンボウフウ）エキスは、セリ科カワラボウフウ属（Peucedanum）に属する植物で、沖縄県に自生する常緑多年草である長命草（ボタンボウフウ）（P. japonicum）の葉および茎から抽出して得られる抽出液である。カロチン、ビタミンＣ、ビタミンＥを多く含み、抗酸化作用がある。
【００３７】
トウヒエキスは、ミカン科ミカン属（Citrus）に属するダイダイ（C. aurantium）の果皮から抽出して得られる抽出液である。ダイダイの成熟果皮を橙皮（トウヒ）という。トウヒエキスにはヘリモネン、スペリジン、油性成分などが含まれる。鎮静効果、肌機能活性化効果がある。
【００３８】
ムクロジエキスは、ムクロジ科ムクロジ属（Sapindus）に属するムクロジ(S. mukorossi）の果皮から抽出して得られる抽出液である。天然の界面活性剤であるムクロジサポニンを含み、洗浄効果があるほか、抗炎症作用、抗菌作用もある。
【００３９】
パセリエキスは、セリ科オランダゼリ属（Petroselinum）に属するヨーロッパ原産の多年草であるパセリ(P. crispum）の葉から抽出して得られる抽出液である。主成分として、アピオール、ミリスチシンなどを含む。アピオールには利尿作用がある。
【００４０】
タイソウエキスは、クロウメモドキ科ナツメ属（Ziziphus）に属するナツメ（Z. jujuba var. inermis）の果実から抽出して得られる抽出液である。主成分として、サポニンやフルクトースなどの糖類、有機酸類の他に核酸関連物質であるサイクリックＡＭＰなどを含む。このサイクリックＡＭＰは皮脂組織タンパク質の新生（再生）や皮脂分泌調整等の働きがある。
【００４１】
チンピエキスは、漢方薬のチンピ（陳皮）で、日本ではミカン科ミカン属（Citrus）に属するウンシュウミカン（C. unshiu）、中国ではC. chachiensisなどの果皮から抽出して得られる抽出液である。ポリフェノールが極めて多く、抗炎症作用、血行促進作用がある。
【００４２】
イラクサエキスは、イラクサ科イラクサ属（Urtica）に属し、山地の陰地に自生する多年草であるイラクサ（U. thunbergiana、あるいはU. dioica）の葉から抽出して得られる抽出液である。収斂作用、消臭作用がある。
【００４３】
上記各植物エキスは常法により得ることができ、例えば、各エキスの起源となる植物を抽出溶媒とともに浸漬または加熱還流した後、濾過し、濃縮して得ることができる。抽出溶媒としては、通常抽出に用いられる溶媒であれば任意に用いることができ、例えば、水、メタノール、エタノール、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、グリセリン等のアルコール類、含水アルコール類、クロロホルム、ジクロルエタン、四塩化炭素、アセトン、酢酸エチル、ヘキサン等の有機溶媒等を、それぞれ単独あるいは組み合わせて用いることができる。上記溶媒で抽出して得られたエキスをそのまま、あるいは濃縮したエキスを吸着法、例えばイオン交換樹脂を用いて不純物を除去したものや、ポーラスポリマー（例えばアンバーライトＸＡＤ−２）のカラムにて吸着させた後、メタノールまたはエタノールで溶出し、濃縮したものも使用することができる。また、抽出して得られたエキスに水蒸気蒸留や分配法、例えば水／酢酸エチルで抽出する方法を組み合わせて得られたエキス等も用いられる。
【００４４】
上記各植物エキスは、安全性が高く、優れたヘパラナーゼ活性阻害作用を有する。したがって、ヘパラナーゼ活性を原因とする種々の症状や疾病、病態等の治療、予防、改善等に役立つ。特に、皮膚におけるヘパラナーゼ活性の阻害に基づく抗老化に好適に適用される。より詳しくは、加齢や光老化等による基底膜プロテオグリカンのヘパラン硫酸鎖の分解によるヘパリン結合性増殖因子（ＨＢＧＦ）のコントロールの破綻、およびそれによるＨＢＧＢの遊離（放出）に伴う皮膚変化を抑制し、皮膚のしわ、たるみ、硬化等を防止、改善し、弾力のある若々しい健康な肌の状態を維持すること等に好適に適用される。
【００４５】
本発明のヘパラナーゼ活性阻害剤を皮膚外用剤に配合する場合、上記各ヘパラナーゼ活性阻害剤配合量は外用剤全量中、乾燥質量（固形分質量）として0.0001〜1質量％が好ましく、特には0.0001〜0.2質量％である。0.0001質量％未満では本発明の効果が十分に発揮され難く、一方、１質量％を超えて配合してもさほど大きな効果の向上は認められず、また製剤化が難しくなるので好ましくない。
【００４６】
本発明のヘパラナーゼ活性阻害剤を、例えば皮膚外用剤に適用する場合、上記必須成分以外に、本発明の効果を損わない範囲内で、通常化粧品や医薬品等の外用剤に用いられる成分、例えば、美白剤、保湿剤、酸化防止剤、油性成分、紫外線吸収剤、界面活性剤、増粘剤、アルコール類、粉末成分、色剤、水性成分、水、各種皮膚栄養剤等を必要に応じて適宜配合することができる。
【００４７】
さらに、エデト酸二ナトリウム、エデト酸三ナトリウム、クエン酸ナトリウム、ポリリン酸ナトリウム、メタリン酸ナトリウム、グルコン酸等の金属イオン封鎖剤、メチルパラベン、エチルパラベン、ブチルパラベン等の防腐剤、カフェイン、タンニン、ベラパミル、トラネキサム酸およびその誘導体、甘草抽出物、グラブリジン、カリンの果実の熱水抽出物、各種生薬、酢酸トコフェロール、グリチルリチン酸およびその誘導体またはその塩等の薬剤、ビタミンＣ、アスコルビン酸リン酸マグネシウム、アスコルビン酸グルコシド、アルブチン、コウジ酸等の美白剤、グルコース、フルクトース、マンノース、ショ糖、トレハロース等の糖類、レチノイン酸、レチノール、酢酸レチノール、パルミチン酸レチノール等のビタミンＡ誘導体類なども適宜配合することができる。
【００４８】
またこの皮膚外用剤は、外皮に適用される化粧料、医薬部外品等、特に好適には化粧料に広く適用することが可能であり、その剤型も、皮膚に適用できるものであればいずれでもよく、溶液系、可溶化系、乳化系、粉末分散系、水−油二層系、水−油−粉末三層系、軟膏、化粧水、ゲル、エアゾール等、任意の剤型が適用される。
【００４９】
使用形態も任意であり、例えば化粧水、乳液、クリーム、パック等のフェーシャル化粧料やファンデーション、口紅、アイシャドウ等のメーキャップ化粧料、芳香化粧料、浴用剤等に用いることができる。
【００５０】
また、メーキャップ化粧品であれば、ファンデーション等、トイレタリー製品としてはボディーソープ、石けん等の形態に広く適用可能である。さらに、医薬部外品であれば、各種の軟膏剤等の形態に広く適用が可能である。そして、これらの剤型および形態に、本発明のヘパラナーゼ活性阻害剤の採り得る形態が限定されるものではない。
【００５１】
本発明のヘパラナーゼ活性阻害剤を医薬製剤として用いる場合、該製剤は経口的にあるいは非経口的（静脈投与、腹腔内投与、等）に適宜に使用される。剤型も任意で、例えば錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等の経口用固形製剤や、内服液剤、シロップ剤等の経口用液体製剤、または、注射剤などの非経口用液体製剤など、いずれの形態にも公知の方法により適宜調製することができる。これらの医薬製剤には、通常用いられる結合剤、崩壊剤、増粘剤、分散剤、再吸収促進剤、矯味剤、緩衝剤、界面活性剤、溶解補助剤、保存剤、乳化剤、等張化剤、安定化剤やｐＨ調製剤などの賦形剤を適宜使用してもよい。
【実施例】
【００５２】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に限定されるものではない。
【００５３】
ヘパラナーゼ阻害剤スラミンの抗しわ効果の評価
小じわモデル（非特許文献２）を用いて、ヘパラナーゼ阻害剤であるスラミンの抗しわ効果について検討した。
図１に示すように、小じわモデルでは、ヘパラナーゼ遺伝子の発現が上昇した。7日目の皮膚では、図２に示すように、表皮・真皮接合部に存在する表皮基底膜上のヘパラン硫酸鎖の染色がほぼ消失した。
【００５４】
小じわが形成される2週間、週3回、スラミンを1mMになるように50%エタノール水溶液に溶解させ、小じわモデルの皮膚に100μlずつ塗布した。溶媒対照として50％エタノール水溶液を塗布した。
【００５５】
２週間後のしわの発生状況を視感判定によりスコア化した。しわの発生状況の評価基準は「しわなし；０」、「うすいしわ；１」、「明らかなしわ；２」、「深いしわ；３」とし、0.5刻みで点数化した。評点が大きいほどしわが深いことを示す。各群の平均値および標準偏差を算出し、結果を図３に示した。溶媒対照のスコアが平均値で0.78なのに対して、スラミンは0.31であり、溶媒対照と比較して有意なしわ抑制効果を示した。すなわち、しわスコアは、1mM スラミンを塗布することによって、 50％エタノールを塗布した溶媒対照と比較して有意にしわ形成を阻害した。 
【００５６】
次に、２日、１週間、２週間後の皮膚に関して、ヘパラン硫酸鎖の免疫染色を行い、染色結果を図４に示した。溶媒対照の皮膚は、２日から１週間後にかけて、基底膜のヘパラン硫酸鎖の染色が低下するが、スラミン塗布によって基底膜のヘパラン硫酸鎖の染色性が保護されていた。
【００５７】
これらの結果から、スラミンは、ヘパラナーゼ酵素を阻害することにより、小じわ形成が抑制されることが明らかとなった。
【００５８】
ヘパラナーゼ阻害剤1-[4-(1H-ベンゾイミダゾール-2-イル)-フェニル]-3-[4-(1H-ベンゾイミダゾール-2-イル)-フェニル]-ユレアの抗しわ効果の評価
ヘパラナーゼ特異的阻害剤として知られている1-[4-(1H-ベンゾイミダゾール-2-イル)-フェニル]-3-[4-(1H-ベンゾイミダゾール-2-イル)-フェニル]-ユレア（W. Pan, et. al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 2006;(16):409-412.（非特許文献５））の抗しわ効果について検討した。
1-[4-(1H-ベンゾイミダゾール-2-イル)-フェニル]-3-[4-(1H-ベンゾイミダゾール-2-イル)-フェニル]-ユレアはスラミンと同様に、1mMになるように50%エタノール水溶液に溶解させ、皮膚に100μlずつ塗布した。溶媒対照として50％エタノール水溶液を塗布した。
【００５９】
２週間後のしわの発生状況を視感判定によりスコア化した。しわの発生状況の評価基準は「しわなし；０」、「うすいしわ；１」、「明らかなしわ；２」、「深いしわ；３」とし、0.5刻みで点数化した。評点が大きいほどしわが深いことを示す。各群の平均値および標準偏差を算出し、結果を図５に示した。溶媒対照（50％エタノール水溶液）塗布のスコアが平均値で1.31なのに対して、1-[4-(1H-ベンゾイミダゾール-2-イル)-フェニル]-3-[4-(1H-ベンゾイミダゾール-2-イル)-フェニル]-ユレアは0.36であり、有意にしわ形成を抑制した。
【００６０】
次に皮膚中のヘパラン硫酸鎖及びパールカンコアタンパク質の免疫染色を行い、染色結果を図６に示した。溶媒対照では、基底膜のヘパラン硫酸鎖の染色性が著しく低下するが、1-[4-(1H-ベンゾイミダゾール-2-イル)-フェニル]-3-[4-(1H-ベンゾイミダゾール-2-イル)-フェニル]-ユレア塗布群では、基底膜のヘパラン硫酸鎖の染色性が保護されていた。
【００６１】
これらの結果から、1-[4-(1H-ベンゾイミダゾール-2-イル)-フェニル]-3-[4-(1H-ベンゾイミダゾール-2-イル)-フェニル]-ユレアは、ヘパラナーゼ酵素を阻害することにより小じわ形成を抑制した。
【００６２】
ヘパラナーゼ活性阻害のスクリーニング（１）
一次評価
ヘパラナーゼ活性阻害を指標とした評価
A431細胞（浸潤性ヒト上皮ガン細胞）を10％血清入りDMEM培地にて培養した。培養細胞はLysis Buffer（50mM Tris, 0.5% TritonX-100, 0.15M NaCl, pH4.5）にて可溶化し、スクレイパーにて回収した後、ピペッティングを行いon iceで30分間静置させた。その後10,000rpmで10分遠心することで、不溶解物を除去して上清を細胞抽出液とした。細胞抽出液中のタンパク量はBCA Protein Assay Kit（PIERCE、CA46141）にて測定した。
【００６３】
細胞抽出液をアッセイBuffer（50mM HEPES, 50mM CH3COONa, 150mM NaCl, 9mM CaCl2, 0.1% BSA）にて所定の濃度に希釈し、4-（1H‐ベンゾイミダゾール-2-イル）-フェニルアミンを添加、混合してから、ビオチン化ヘパラン硫酸固定化プレートに100μL/wellで播種した。37℃で2時間反応させ、PBS-Tで3回洗浄してから、10,000倍希釈HRP-avidin（Vector、A-2004）/PBS-T を100μL/wellで播種して37℃で1時間反応させた。再度3回PBS-Tにて洗浄を行い、TMB試薬（BIO-RAD、172-1066）を100μL/wellで播種して反応させ、1N H2SO4にて反応を止めた後、OD475nmを測定した（特表2003-502054参照（特許文献３））。
ヘパラナーゼ活性は、A431細胞抽出液の検量線から活性を算出し、薬剤抽出物を添加していない資料（コントロール）に対する相対的な値を持って、阻害率（％）を示した。
【００６４】
その結果、4-（1H‐ベンゾイミダゾール-2-イル）-フェニルアミンが濃度依存的にヘパラナーゼ活性を効果的に抑制することが明らかとなった。この結果を図７に示す。コントロールは、候補薬剤の変わりにDMSOを作用させたものである。
ＩＣ５０＝256μＭ
【００６５】
二次評価
HT1080細胞を用いた創傷治癒アッセイ
HT1080細胞を6well plateに50万細胞／wellで播種し、24時間後に各薬剤を添加した培地に置換し、1000μLチップにて垂直にスクラッチした。6時間後に写真を撮影し、スクラッチ部位の変化を観察した。その結果、4-（1H‐ベンゾイミダゾール-2-イル）-フェニルアミン添加郡にて濃度依存的に細胞遊走活性が低下しており、ヘパラナーゼ活性を抑制していることが明らかとなった。この結果を図８に示す。コントロールは、候補薬剤の変わりにDMSOを作用させたものである。
【００６６】
ヘパラナーゼ活性阻害のスクリーニング（２）
１．試料の調製
（１）植物エキス
表１に示すように、各植物をそれぞれ室温で１週間、同表に記す溶媒に浸漬し、抽出液を得た。この抽出液を濃縮して各植物エキスを得た。
【００６７】
【表１】
2014208720.tif 000003
【００６８】
（２）試料溶液
上記植物エキスをジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に濃度１質量％となるよう溶解して、植物エキス含有溶液とした。
【００６９】
この植物エキス含有溶液をそれぞれ、測定用緩衝液（０．４Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＣａＣｌ2を含むｐＨ７．４の０．１Ｍトリス）で希釈して、それぞれ０．０５ｖ／ｖ％、０．５ｖ／ｖ％、５ｖ／ｖ％となるよう濃度を調整し、これらを試料溶液として用い、以下の実験を行った。
【００７０】
２．ヘパラナーゼ阻害効果の評価方法およびその結果
4-（1H‐ベンゾイミダゾール-2-イル）-フェニルアミンの代わりに上記植物エキスの試料溶液を用い、上記一次及び二次評価方法に従い、それら植物エキスについてヘパラナーゼ阻害効果の評価を行った。
【００７１】
結果を図１（Ａ）、（Ｂ）に示す。
【００７２】
図１（Ａ）、（Ｂ）に示す結果から明らかなように、本発明で用いるカノコソウエキス、ヒノキエキス、キウイエキス、レモンエキス、トマトエキス、ニンニクエキス、ユリエキス、長命草（ボタンボウフウ）エキス、トウヒエキス、ムクロジエキス、パセリエキス、タイソウエキス、チンピエキス、およびイラクサエキスが、ヘパラナーゼ活性を効果的に抑制することが確認された。
【００７３】
以下にさらに処方例を示す。なお以下において「ＰＯＥ」は「ポリオキチエチレン」を意味する。
【００７４】
（配合処方例１：  クリーム）
（配  合  成  分）                                  （質量％）
（１）ステアリン酸                                        ３．０
（２）ステアリルアルコール                                ５．０
（３）イソプロピルミリステート                          １８．０
（４）グリセリンモノステアリン酸エステル                  ３．０
（５）プロピレングリコール                              １０．０
（６）本ヘパラナーゼ活性阻害剤〔カノコソウエキス（５０％エタノール水
抽出物。固形分換算）〕                            １．０
（７）苛性カリ                                            ０．２
（８）亜硫酸水素ナトリウム                                ０．０１
（９）防腐剤                                              適量
（１０）香料                                              適量
（１１）イオン交換水                                      残余
（製法）
（１１）に（５）〜（７）を加え溶解し、加熱して７０℃に保つ（水相）。（１）〜（４）、（８）〜（１０）を混合し加熱融解して７０℃に保つ（油相）。水相に油相を徐々に加え、全部加え終わってからしばらくその温度に保ち反応を起こさせる。その後、ホモミキサーで均一に乳化し、よくかきまぜながら３０℃まで冷却する。
【００７５】
（配合処方例２：  クリーム）
（配  合  成  分）                                  （質量％）
（１）ステアリン酸                                        ２．０
（２）ステアリルアルコール                                ７．０
（３）水添ラノリン                                        ３．０
（４）スクワラン                                          ４．０
（５）２−オクチルドデシルアルコール                      ６．０
（６）ＰＯＥ（２５モル）セチルアルコールエーテル          ３．０
（７）グリセリンモノステアリン酸エステル                  ２．０
（８）プロピレングリコール                                ６．０
（９）本ヘパラナーゼ活性阻害剤〔ヒノキエキス（７０％エタノール水
抽出物。固形分換算）〕                            ０．２
（１０）亜硫酸水素ナトリウム                              ０．０３
（１１）エチルパラベン                                    ０．３
（１２）香料                                              適量
（１３）イオン交換水                                      残余
（製法）
（１３）に（８）を加え、加熱して７０℃に保つ（水相）。（１）〜（７）、（９）〜（１２）を混合し加熱融解して７０℃に保つ（油相）。水相に油相を加え予備乳化を行い、ホモミキサーで均一に乳化した後、よくかきまぜながら３０℃まで冷却する。
【００７６】
（配合処方例３：  クリーム）
（配  合  成  分）                                  （質量％）
（１）固形パラフィン                                      ５．０
（２）ミツロウ                                          １０．０
（３）ワセリン                                          １５．０
（４）流動パラフィン                                    ４１．０
（５）グリセリンモノステアリン酸エステル                  ２．０
（６）ＰＯＥ（２０モル）ソルビタンモノラウリン酸エステル  ２．０
（７）石けん粉末                                          ０．１
（８）硼砂                                                ０．２
（９）本ヘパラナーゼ活性阻害剤〔キウイエキス（エタノール抽出物。
固形分換算）〕                                    ０．５
（１０）亜硫酸水素ナトリウム                              ０．０３
（１１）エチルパラベン                                    ０．３
（１２）香料                                              適量
（１３）イオン交換水                                      残余
（製法）
（１３）水に（７）、（８）を加え、加熱溶解して７０℃に保つ（水相）。（１）〜（６）、（９）〜（１２）を混合し加熱融解して７０℃に保つ（油相）。水相に油相をかきまぜながら徐々に加え反応を行う。反応終了後、ホモミキサーで均一に乳化し、乳化後よくかきまぜながら３０℃まで冷却する。
【００７７】
（配合処方例４：  乳液）
（配  合  成  分）                                  （質量％）
（１）ステアリン酸                                        ２．５
（２）セチルアルコール                                    １．５
（３）ワセリン                                            ５．０
（４）流動パラフィン                                    １０．０
（５）ＰＯＥ（１０モル）モノオレイン酸エステル            ２．０
（６）ポリエチレングリコール１５００                      ３．０
（７）トリエタノールアミン                                １．０
（８）カルボキシビニルポリマー                            ０．０５
（９）本ヘパラナーゼ活性阻害剤〔レモンエキス（５０％１，３−ブチレン
グリコール水抽出物。固形分換算）〕                ０．０３
（１０）亜硫酸水素ナトリウム                              ０．０１
（１１）エチルパラベン                                    ０．３
（１２）香料                                              適量
（１３）イオン交換水                                      残余
（製法）
少量の（１３）に（８）を溶解する（Ａ相）。残りの（１３）に（６）、（７）を加え、加熱溶解して７０℃に保つ（水相）。（１）〜（５）、（９）〜（１２）を混合し加熱融解して７０℃に保つ（油相）。水相に油相を加え予備乳化を行い、Ａ相を加えホモミキサーで均一乳化し、乳化後よくかきまぜながら３０℃まで冷却する。
【００７８】
（配合処方例５：  乳液）
（配  合  成  分）                                  （質量％）
（１）マイクロクリスタリンワックス                        １．０
（２）ミツロウ                                            ２．０
（３）ラノリン                                          ２０．０
（４）流動パラフィン                                    １０．０
（５）スクワラン                                          ５．０
（６）ソルビタンセスキオレイン酸エステル                  ４．０
（７）ＰＯＥ（２０モル）ソルビタンモノオレイン酸エステル  １．０
（８）プロピレングリコール                                ７．０
（９）本ヘパラナーゼ活性阻害剤〔トマトエキス（７０％１，３−ブチレン
グリコール水抽出物。固形分換算）                  ０．２
（１０）亜硫酸水素ナトリウム                              ０．０１
（１１）エチルパラベン                                    ０．３
（１２）香料                                              適量
（１３）イオン交換水                                      残余
（製法）
（１３）に（８）を加え、加熱して７０℃に保つ（水相）。（１）〜（７）、（９）〜（１２）を混合し、加熱融解して７０℃に保つ（油相）。油相をかきまぜながらこれに水相を徐々に加え、ホモミキサーで均一に乳化する。乳化後よくかきまぜながら３０℃まで冷却する。
【００７９】
（配合処方例６：  ジェル）
（配  合  成  分）                                  （質量％）
（１）９５％エタノール                                  １０．０
（２）ジプロピレングリコール                            １５．０
（３）ＰＯＥ（５０モル）オレイルアルコールエーテル        ２．０
（４）カルボキシビニルポリマー                            １．０
（５）苛性ソーダ                                          ０．１５
（６）Ｌ−アルギニン                                      ０．１
（７）本ヘパラナーゼ活性阻害剤〔ニンニクエキス（５０％エタノール水
抽出物。固形分換算）〕                            １．０
（８）２−ヒドロキシ−４−メトキシベンゾフェノン
スルホン酸ナトリウム                            ０．０５
（９）エチレンジアミンテトラアセテート・３Ｎａ・２Ｈ2Ｏ   ０．０５
（１０）メチルパラベン                                    ０．２
（１１）香料                                              適量
（１２）イオン交換水                                      残余
（製法）
（１２）に（４）を均一に溶解する（水相）。一方、（１）に（７）、（３）を溶解する（アルコール相）。該アルコール相を水相に添加する。次いで、ここに（２）、（８）〜（１１）を加えたのち、（５）、（６）で中和させ増粘する。
【００８０】
（配合処方例７：  美容液）
（配  合  成  分）                                  （質量％）
（Ａ相）
（１）９５％エタノール                                  １０．０
（２）ＰＯＥ（２０モル）オクチルドデカノール              １．０
（３）パントテニールエチルエーテル                        ０．１
（４）本ヘパラナーゼ活性阻害剤〔ユリエキス（５０％１，３−ブチレン
グリコール水抽出物。固形分換算）〕                ０．０２２５
（５）メチルパラベン                                      ０．１５
（Ｂ相）
（６）水酸化カリウム                                      ０．１
（Ｃ相）
（７）グリセリン                                          ５．０
（８）ジプロピレングリコール                            １０．０
（９）亜硫酸水素ナトリウム                                ０．０３
（１０）カルボキシビニルポリマー                          ０．２
（１１）精製水                                            残余
（製法）
Ａ相、Ｃ相をそれぞれ均一に溶解し、Ｃ相にＡ相を加えて可溶化する。次いでＢ相を加えたのち充填を行う。
【００８１】
（配合処方例８：  パック）
（配  合  成  分）                                  （質量％）
（Ａ相）
（１）ジプロピレングリコール                              ５．０
（２）ＰＯＥ（６０モル）硬化ヒマシ油                      ５．０
（Ｂ相）
（３）本ヘパラナーゼ活性阻害剤〔長命草エキス（７０％エタノール水
抽出物。固形分換算）〕                            ０．０００５
（４）オリーブ油                                          ５．０
（５）酢酸トコフェロール                                  ０．２
（６）エチルパラベン                                      ０．２
（７）香料                                                ０．２
（Ｃ相）
（８）亜硫酸水素ナトリウム                                ０．０３
（９）ポリビニルアルコール（ケン化度90、重合度2,000）   １３．０
（１０）タノール                                          ７．０
（１１）精製水                                            残余
（製法）
Ａ相、Ｂ相、Ｃ相をそれぞれ均一に溶解し、Ａ相にＢ相を加えて可溶化する。次いでこれをＣ相に加えたのち充填を行う。
【００８２】
（配合処方例９：  固形ファンデーション）
（配  合  成  分）                                  （質量％）
（１）タルク                                            ４３．１
（２）カオリン                                          １５．０
（３）セリサイト                                        １０．０
（４）亜鉛華                                              ７．０
（５）二酸化チタン                                        ３．８
（６）黄色酸化鉄                                          ２．９
（７）黒色酸化鉄                                          ０．２
（８）スクワラン                                          ８．０
（９）イソステアリン酸                                    ４．０
（１０）モノオレイン酸ＰＯＥソルビタン                    ３．０
（１１）オクタン酸イソセチル                              ２．０
（１２）本ヘパラナーゼ活性阻害剤〔トウヒエキス（エタノール抽出物。
固形分換算）〕                                  ０．００００１
（１３）防腐剤                                            適量
（１４）香料                                              適量
（製法）
（１）〜（７）の粉末成分をブレンダーで十分混合し、これに（８）〜（１１）の油性成分、（１２）、（１３）、（１４）を加えよく混練した後、容器に充填、成型する。
【００８３】
（配合処方例１０：  乳化型ファンデーション（クリームタイプ））
（配  合  成  分）                                  （質量％）
（粉体部）
（１）二酸化チタン                                      １０．３
（２）セリサイト                                          ５．４
（３）カオリン                                            ３．０
（４）黄色酸化鉄                                          ０．８
（５）ベンガラ                                            ０．３
（６）黒色酸化鉄                                          ０．２
（油相）
（７）デカメチルシクロペンタシロキサン                  １１．５
（８）流動パラフィン                                      ４．５
（９）ＰＯＥ変性ジメチルポリシロキサン                    ４．０
（水相）
（１０）精製水                                          ４６．５
（１１）１，３−ブチレングルコール                        ４．５
（１２）本ヘパラナーゼ活性阻害剤〔ムクロジエキス（３０％１，３−ブチレン
グリコール水抽出物。固形分換算）〕              ０．００２５
（１３）ソルビタンセスキオレイン酸エステル                ３．０
（１４）防腐剤                                            適量
（１５）香料                                              適量
（製法）
水相を加熱撹拌後、十分に混合粉砕した粉体部を添加してホモミキサー処理する。更に加熱混合した油相を加えてホモミキサー処理した後、撹拌しながら香料を添加して室温まで冷却する。
【００８４】
（配合処方例１１：  乳液）
（配  合  成  分）                                  （質量％）
（１）ジイソステアリン酸グリセリン                      １５．０
（２）スクワラン                                          ２．０
（３）ジメチコン                                          ２．０
（４）ステアリルアルコール                                ３．０
（５）本ヘパラナーゼ活性阻害剤〔パセリエキス（９０％エタノール水
抽出物。固形分換算）〕                            １．０
（６）ステアロイルメチルタウリンナトリウム                １．０
（７）ＰＯＥ（２０）ベヘニルエーテル                      ０．５
（８）グリセリン                                          ５．０
（９）１，３−ブチレングリコール                          ５．０
（１０）カルボキシビニルポリマー                          ０．２
（１１）防腐剤                                            適量
（１２）精製水                                            残余
（製法）
（８）〜（１２）を均一溶解したものを６０℃に加熱し、ここに、（１）〜（７）を７０℃で混合したものを撹拌しながら添加して均一分散し、３０℃に冷却して乳液を得る。
【００８５】
（配合処方例１２：  化粧水）
（配  合  成  分）                                  （質量％）
（１）エタノール                                          ５．０
（２）グリセリン                                          ０．５
（３）ジプロピレングリコール                              ２．０
（４）１，３−ブチレングリコール                          ５．５
（５）クエン酸                                            ０．０２
（６）クエン酸ナトリウム                                  ０．０８
（７）ヘキサメタリン酸ナトリウム                          ０．０３
（８）ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン          ０．１
（９）本ヘパラナーゼ活性阻害剤〔タイソウエキス（７０％１，３−ブチレン
グリコール水抽出物。固形分換算）〕                ０．０１５
（１０）ラベンダー油                                      ０．１
（１１）アルギン酸ナトリウム                              ０．００１
（１２）精製水                                            残余
（製法）
上記の各成分を常法に従い混合溶解し、化粧水を得る。
【００８６】
（配合処方例１３：  乳液）
（配  合  成  分）                                  （質量％）
（１）ジメチルポリシロキサン                              ３．０
（２）デカメチルシクロペンタシロキサン                    ４．０
（３）エタノール                                          ５．０
（４）グリセリン                                          ６．０
（５）１，３−ブチレングリコール                          ５．０
（６）ＰＯＥメチルグルコシド                              ３．０
（７）スクワラン                                          ２．０
（８）水酸化カリウム                                      ０．１
（９）ヘキサメタリン酸ナトリウム                          ０．０５
（１０）本ヘパラナーゼ活性阻害剤〔チンピエキス（７０％エタノール水
抽出物。固形分換算）〕                          ０．０００２
（１１）キサンタンガム                                    ０．３
（１２）カルボキシビニルポリマー                          ０．１
（１３）アクリル酸・メタクリル酸アルキル共重合体          ０．１
（１４）メチルパラベン                                    適量
（１５）香料                                              適量
（１６）精製水                                            残余
（製法）
（１６）に（９）、（１２）、（１３）を加えて溶解し、さらに（１０）および（４）〜（６）を混合する。ここに、（３）に（１４）、（１１）、（１５）を加えて溶解したものを加えて混合し、さらに（１）、（２）、（７）の混合液を加えて乳化、（８）により中和させ増粘させる。
【００８７】
（配合処方例１４：  乳液）
（配  合  成  分）                                  （質量％）
（１）ワセリン                                            １．０
（２）ジメチルポリシロキサン                              ３．０
（３）メチルフェニルポリシロキサン                        ３．０
（４）ステアリルアルコール                                ０．５
（５）グリセリン                                          ７．０
（６）ジプロピレングリコール                              ３．０
（７）１，３−ブチレングリコール                          ７．０
（８）スクワラン                                          １．０
（９）イソステアリン酸                                    ０．５
（１０）ステアリン酸                                      ０．５
（１１）モノステアリン酸ポリオキシエチレングリセリン      １．０
（１２）モノステアリン酸グリセリン                        ２．０
（１３）水酸化カリウム                                    ０．０５
（１４）本ヘパラナーゼ活性阻害剤〔（イラクサエキス（エタノール抽出物。
固形分換算）〕                                  １．０
（１５）ＥＤＴＡ・３ナトリウム                            ０．０５
（１６）カルボキシビニルポリマー                          ０．１
（１７）フェノキシエタノール                              適量
（１８）香料                                              適量
（１９）精製水                                            残余
（製法）
（１９）に（６）、（７）、（１３）を加え、加熱して７０℃に保つ（水相）。一方、（１）〜（４）、（８）〜（１２）および（１７）を混合し、加熱溶融して７０℃に保つ（油相）。水相を攪拌しながら油相を徐々に加え、さらに（１５）、（１６）、（１８）、（５）および（１４）を加えてホモミキサーで均一に乳化し、乳化後よく攪拌しながら３０℃まで冷却する。
【図１】
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【図３】
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【図５】
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【図７】
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【図９】
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【図２】
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【図４】
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【図６】
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【図８】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年8月15日(2014.8.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
カノコソウエキス、ヒノキエキス、キウイエキス、レモンエキス、トマトエキス、ニンニクエキス、ユリエキス、長命草（ボタンボウフウ）エキス、ムクロジエキス、パセリエキス、タイソウエキス、チンピエキス、およびイラクサエキスの中から選ばれる１種または２種以上からなるヘパラナーゼ活性阻害剤であって、しわ改善剤を除く。