(57)【要約】      （修正有）【課題】グルコシノレートレベルの増加を付与する転写因子Ｍｙｂ２８遺伝子座と密接に関係する分子マーカーの同定およびグルコシノレートレベルが増加したアブラナ科野菜植物を産生するための方法の提供。【解決手段】グルコシノレートレベルが増加したアブラナ科野菜植物の核酸のサンプルまたはその一部分を得るステップおよびグルコシノレートレベルの増加と遺伝的に関係するＭｙｂ２８遺伝子座での多型を前記核酸において検出するステップを含む。該植物の特定の配列に存在する多型を増幅及び／もしくはそれにハイブリダイズするプライマーまたはプローブを使用する。子孫植物を、それ自体または第３の植物と交雑させ、次世代の子孫植物を産生するステップを含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルコシノレートレベルが増加したアブラナ科野菜植物の遺伝子型を決定するための方法であって、前記植物由来の核酸のサンプルまたはその一部分を得るステップおよびグルコシノレートレベルの増加と遺伝的に関係するＭｙｂ２８遺伝子座での多型を前記核酸において検出するステップを含む方法。
【請求項２】
検出するステップが、ＰＣＲを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
遺伝子型の決定が、共優性アッセイを含む、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
検出するステップが、ＤＮＡハイブリダイゼーションを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
多型が、
ａ）配列番号：１のヌクレオチド８３、１３６、２２６、５６３、６１０、８３０、９９５、１１１６、１５１３、１５７７、１６０６、１６２０、１８２５、１８６３、１８７７、もしくは２０２６に対応する位置の一塩基多型（ＳＮＰ）または
ｂ）配列番号：１のヌクレオチド３２３〜３３２、ヌクレオチド５２１〜５２４、ヌクレオチド７８３〜７８６、ヌクレオチド９０９〜９１４、ヌクレオチド１３６５〜１３６９、１８１１〜１８２１、もしくはヌクレオチド２０４６〜２０５６に存在するヌクレオチドの番号における多型または
ｃ）配列番号：１のヌクレオチド８３６〜８３７、ヌクレオチド８６７〜８６８、もしくはヌクレオチド９４３〜９４４に存在するヌクレオチドの番号における多型
のうちの少なくとも１つを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
多型が、（ａ）配列番号：１のヌクレオチド８３、１３６、２２６、５６３、６１０、８３０、９９５、１１１６、１５１３、１５７７、１６０６、１６２０、１８２５、１８６３、１８７７、もしくは２０２６に対応する位置の一塩基多型（ＳＮＰ）のうちの少なくとも１つまたはその組み合わせ、（ｂ）配列番号：１のヌクレオチド３２３〜３３２、ヌクレオチド５２１〜５２４、ヌクレオチド７８３〜７８６、ヌクレオチド９０９〜９１４、ヌクレオチド１３６５〜１３６９、１８１１〜１８２１、もしくはヌクレオチド２０４６〜２０５６に存在するヌクレオチドの１つもしくは複数の欠失、（ｃ）配列番号：１のヌクレオチド３２３〜３３２、ヌクレオチド５２１〜５２４、ヌクレオチド７８３〜７８６、ヌクレオチド９０９〜９１４、ヌクレオチド１３６５〜１３６９、１８１１〜１８２１、もしくはヌクレオチド２０４６〜２０５６に存在するヌクレオチドのすべての欠失、（ｄ）配列番号：１のヌクレオチド３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、５２２、５２３、７８４、７８５、９１０、９１１、９１２、９１３、１３６６、１３６７、１３６８、１８１２、１８１３、１８１４、１８１５、１８１６、１８１７、１８１８、１８１９、１８２０、２０４７、２０４８、２０４９、２０５０、２０５１、２０５２、２０５３、２０５４、または２０５５に対応する位置での少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、（ｅ）以下の位置：配列番号：１の３２４〜３３１、５２２〜５２３、７８４〜７８５、９１０〜９１３、１３６６〜１３６８、１８１２〜１８２０、もしくは２０４７〜２０５５またはその組み合わせでのヌクレオチドの欠失、または（ｆ）配列番号：１のヌクレオチド８３６〜８３７、８６７〜８６８、もしくは９４３〜９４４の１つもしくは複数のヌクレオチドの挿入を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
（ａ）ヌクレオチド８３６〜８３７の挿入が、２つのヌクレオチドである、（ｂ）ヌクレオチド８３６〜８３７の挿入が、ＴＴである、（ｃ）ヌクレオチド８６７〜８６８の挿入が、１つのヌクレオチドである、（ｄ）ヌクレオチド８６７〜８６８の挿入が、Ａである、（ｅ）ヌクレオチド９４３〜９４４の挿入が、１３ヌクレオチド以下である、または（ｆ）ヌクレオチド９４３〜９４４の挿入が、ＴＡＴＴＡＡＡＡＡＡＧＴＡである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
多型が、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２、および配列番号：２３からなる群から選択される少なくとも１つの第１の配列の使用を含むスクリーニング法によって検出される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
グルコシノレートのレベルの増加についてアブラナ科野菜植物の表現型をアッセイするステップをさらに含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
グルコシノレートが、４−メチルスルフィニルブチルグルコシノレート（ＭＳＢ）、３−メチルスルフィニルプロピルグルコシノレート（ＭＳＰ）、またはその組み合わせである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
アブラナ科野菜植物が、少なくとも１０マイクロモル／乾燥重量ｇの量の、少なくとも１つのグルコシノレートを含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
アブラナ科野菜植物が、少なくとも１０マイクロモル／乾燥重量ｇの量の４−メチルスルフィニルブチルグルコシノレート（ＭＳＢ）、３−メチルスルフィニルプロピルグルコシノレート（ＭＳＰ）、またはその組み合わせを含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
アブラナ科野菜植物が、ブロッコリーである、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
グルコシノレートレベルのＭｙｂ２８媒介性の増加を有するアブラナ科野菜植物を産生するための方法であって、グルコシノレートレベルの増加と遺伝的に関係するＭｙｂ２８遺伝子座に多型を含む第１の子孫植物を選択するステップを含む方法。
【請求項１５】
（ａ）グルコシノレートレベルが増加したアブラナ科野菜植物を第２のアブラナ科野菜と交雑させるステップおよび（ｂ）グルコシノレートレベルの増加と遺伝的に関係するＭｙｂ２８遺伝子座に多型を含む少なくとも１つの第１の子孫アブラナ科野菜植物を選択するステップを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
選択するステップが、ＰＣＲを含む、請求項１４または請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
選択するステップが、ＤＮＡハイブリダイゼーションを含む、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
ｍｙｂ２８対立遺伝子が、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２、および配列番号：２３からなる群から選択される配列を含むオリゴヌクレオチドの使用を含むスクリーニング法によって検出される、請求項１４〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
選択が、共優性遺伝子マーカーを検出することを含む、請求項１４〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
第１の子孫の選択が、少なくとも１つの第１のさらなる形質と遺伝的に関係する、第２のアブラナ科野菜植物由来の１つまたは複数の遺伝子マーカーの存在に基づいて子孫を選択することをさらに含む、請求項１５〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
さらなる形質が、収量、耐病性、出芽活力、生長活力、ストレス耐性、草丈、花部品質、花部直径、花部重量、花部サイズ、花部形状、花部色、および開花までの日数からなる群から選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
多型が、
ａ）配列番号：１のヌクレオチド８３、１３６、２２６、５６３、６１０、８３０、９９５、１１１６、１５１３、１５７７、１６０６、１６２０、１８２５、１８６３、１８７７、もしくは２０２６に対応する位置の一塩基多型（ＳＮＰ）または
ｂ）配列番号：１のヌクレオチド３２３〜３３２、ヌクレオチド５２１〜５２４、ヌクレオチド７８３〜７８６、ヌクレオチド９０９〜９１４、ヌクレオチド１３６５〜１３６９、１８１１〜１８２１、もしくはヌクレオチド２０４６〜２０５６に存在するヌクレオチドの番号における多型または
ｃ）配列番号：１のヌクレオチド８３６〜８３７、ヌクレオチド８６７〜８６８、もしくはヌクレオチド９４３〜９４４に存在するヌクレオチドの番号における多型
のうちの少なくとも１つを含む、請求項１４〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
多型が、（ａ）配列番号：１のヌクレオチド８３、１３６、２２６、５６３、６１０、８３０、９９５、１１１６、１５１３、１５７７、１６０６、１６２０、１８２５、１８６３、１８７７、もしくは２０２６に対応する位置の一塩基多型（ＳＮＰ）のうちの少なくとも１つまたはその組み合わせを含む、（ｂ）配列番号：１のヌクレオチド３２３〜３３２、ヌクレオチド５２１〜５２４、ヌクレオチド７８３〜７８６、ヌクレオチド９０９〜９１４、ヌクレオチド１３６５〜１３６９、１８１１〜１８２１、もしくはヌクレオチド２０４６〜２０５６に存在するヌクレオチドの１つもしくは複数の欠失を含む、（ｃ）配列番号：１のヌクレオチド３２３〜３３２、ヌクレオチド５２１〜５２４、ヌクレオチド７８３〜７８６、ヌクレオチド９０９〜９１４、ヌクレオチド１３６５〜１３６９、１８１１〜１８２１、もしくはヌクレオチド２０４６〜２０５６に存在するヌクレオチドのすべての欠失を含む、（ｄ）配列番号：１のヌクレオチド３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、５２２、５２３、７８４、７８５、９１０、９１１、９１２、９１３、１３６６、１３６７、１３６８、１８１２、１８１３、１８１４、１８１５、１８１６、１８１７、１８１８、１８１９、１８２０、２０４７、２０４８、２０４９、２０５０、２０５１、２０５２、２０５３、２０５４、もしくは２０５５に対応する位置での少なくとも１つのヌクレオチドの欠失を含む、（ｅ）以下の位置：配列番号：１の３２４〜３３１、５２２〜５２３、７８４〜７８５、９１０〜９１３、１３６６〜１３６８、１８１２〜１８２０、もしくは２０４７〜２０５５またはその組み合わせでのヌクレオチドの欠失を含む、または（ｆ）配列番号：１のヌクレオチド８３６〜８３７、８６７〜８６８、もしくは９４３〜９４４の１つもしくは複数のヌクレオチドの挿入を含む、請求項１４〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
（ａ）ヌクレオチド８３６〜８３７の間の挿入が、２つのヌクレオチドである、（ｂ）ヌクレオチド８３６〜８３７の間の挿入が、ＴＴである、（ｃ）ヌクレオチド８６７〜８６８の間の挿入が、１つのヌクレオチドである、（ｄ）ヌクレオチド８６７〜８６８の間の挿入が、Ａである、（ｅ）ヌクレオチド９４３〜９４４の間の挿入が、１３個までのヌクレオチドである、または（ｆ）ヌクレオチド９４３〜９４４の間の挿入が、ＴＡＴＴＡＡＡＡＡＡＧＴＡである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
（ｃ）子孫植物を、それ自体または第３の植物と交雑させ、次世代の子孫植物を産生するステップをさらに含む、請求項１４〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
（ｄ）次世代の子孫植物を、それ自体または第２の植物と交雑させるステップおよび（ｅ）さらなる３〜１０世代についてステップ（ｃ）および（ｄ）を繰り返し、レベルが増加したグルコシノレートを含む同系交配アブラナ科野菜植物を産生するステップをさらに含み、少なくとも１つの次世代の子孫植物が、グルコシノレート産生に遺伝的に関係するＭｙｂ２８遺伝子座での多型の存在についてスクリーニングされる、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
次世代の前記子孫植物が、グルコシノレートおよび所望の形質の存在に基づいて交雑のために選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
次世代の子孫植物が、グルコシノレートレベルの増加および所望の形質の存在に基づいて交雑のためにそれぞれの世代で選択される、請求項２６または２７に記載の方法。
【請求項２９】
ステップ（ｅ）が、グルコシノレートの増加の形質を含み、他の点では第２のアブラナ科野菜植物の農業形質を含む同系交配アブラナ科野菜植物を得るために、十分な同系交配により繰り返される、請求項２６〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
グルコシノレートが、４−メチルスルフィニルブチルグルコシノレート（ＭＳＢ）、３−メチルスルフィニルプロピルグルコシノレート（ＭＳＰ）、またはその組み合わせである、請求項１４〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
アブラナ科野菜植物が、少なくとも１０マイクロモル／乾燥重量ｇの量の、少なくとも１つのグルコシノレートを含む、請求項１４〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
アブラナ科野菜植物が、少なくとも１０マイクロモル／乾燥重量ｇの量の４−メチルスルフィニルブチルグルコシノレート（ＭＳＢ）、３−メチルスルフィニルプロピルグルコシノレート（ＭＳＰ）、またはその組み合わせを含む、請求項１４〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
アブラナ科野菜植物が、ブロッコリーである、請求項１４〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
多型が、請求項５〜７または２２〜２４のいずれか一項に記載の多型の５ｃＭ以内にある多型である、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
植物が、
ｄ）配列番号：１のヌクレオチド８３、１３６、２２６、５６３、６１０、８３０、９９５、１１１６、１５１３、１５７７、１６０６、１６２０、１８２５、１８６３、１８７７、もしくは２０２６に対応する位置の一塩基多型（ＳＮＰ）または
ｅ）配列番号：１のヌクレオチド３２３〜３３２、ヌクレオチド５２１〜５２４、ヌクレオチド７８３〜７８６、ヌクレオチド９０９〜９１４、ヌクレオチド１３６５〜１３６９、１８１１〜１８２１、もしくはヌクレオチド２０４６〜２０５６に存在するヌクレオチドの番号における多型または
ｆ）配列番号：１のヌクレオチド８３６〜８３７、ヌクレオチド８６７〜８６８、もしくはヌクレオチド９４３〜９４４に存在するヌクレオチドの番号における多型
からなる群から選択される少なくとも１つの多型を除いて配列番号：１を含むｍｙｂ２８遺伝子により形質転換される、請求項１４に記載の方法。
【請求項３６】
植物が、配列番号：２４を含むｍｙｂ２８遺伝子または配列番号：２４と少なくとも９７％（少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％など）の同一性を有する配列により形質転換される、請求項２４に記載の方法。
【請求項３７】
請求項１４〜３６のいずれか一項に記載の方法によって産生される植物またはその一部分。
【請求項３８】
請求項３７に記載のまたは請求項１４〜３７のいずれか一項に記載の方法によって産生される植物の種子。
【請求項３９】
コンピュータ読み取り可能な媒体上に、多型を検出するステップの結果を保存するステップをさらに含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
請求項３９に記載の方法によって産生されるコンピュータ読み取り可能な媒体。
【請求項４１】
アブラナ科野菜植物（たとえばブロッコリー植物）の可食部を産生するための方法であって、（ａ）請求項３７に記載の植物を得るステップおよび（ｂ）植物によって産生されるアブラナ科野菜植物の可食部（たとえばブロッコリー植物の花部）を収集するステップを含む方法。
【請求項４２】
配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２、および配列番号：２３からなる群から選択される配列を含む単離核酸。
【請求項４３】
配列番号：１のヌクレオチド８３、１３６、２２６、５６３、６１０、８３０、９９５、１１１６、１５１３、１５７７、１６０６、１６２０、１８２５、１８６３、１８７７、もしくは２０２６に対応する位置の少なくとも１つの多型を増幅するおよび／もしくはそれにハイブリダイズするまたは配列番号：１のヌクレオチド３２３〜３３２、ヌクレオチド５２１〜５２４、ヌクレオチド７８３〜７８６、ヌクレオチド９０９〜９１４、ヌクレオチド１３６５〜１３６９、１８１１〜１８２１、もしくはヌクレオチド２０４６〜２０５６に対応する位置に存在する多型を増幅するおよび／もしくはそれにハイブリダイズするまたは配列番号：１のヌクレオチド８３６〜８３７、ヌクレオチド８６７〜８６８、もしくはヌクレオチド９４３〜９４４に存在する多型を増幅するおよび／もしくはそれにハイブリダイズするプライマーまたはプローブ。
【請求項４４】
配列番号：１のヌクレオチド８３６〜８３７、８６７〜８６８、または９４３〜９４４の１つまたは複数のヌクレオチドの挿入を含む多型を増幅するおよび／またはそれにハイブリダイズする、請求項４３に記載のプライマーまたはプローブ。
【請求項４５】
（ａ）ヌクレオチド８３６〜８３７の間の挿入が、２つのヌクレオチドである、（ｂ）ヌクレオチド８３６〜８３７の間の挿入が、ＴＴである、（ｃ）ヌクレオチド８６７〜８６８の間の挿入が、１つのヌクレオチドである、（ｄ）ヌクレオチド８６７〜８６８の間の挿入が、Ａである、（ｅ）ヌクレオチド９４３〜９４４の間の挿入が、１３個までのヌクレオチドである、（ｆ）ヌクレオチド９４３〜９４４の間の挿入が、ＴＡＴＴＡＡＡＡＡＡＧＴＡである、請求項４４に記載のプライマーまたはプローブ。
【請求項４６】
アライメントされた場合に、配列番号：１および配列番号：２４の間で保存される、少なくとも１８の隣接ヌクレオチドの配列を含む単離核酸。
【請求項４７】
実施例および図に関連して本明細書において全般的に記載される方法または植物または種子またはプライマーまたはプローブまたは単離核酸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、その全体が参照によって本明細書において組み込まれる、２０１２年９月１３日に提出された米国仮特許出願第６１／７００，７３１号の利益を主張する。
【０００２】
配列表の組み込み
マイクロソフトウィンドウズ（登録商標）オペレーティングシステムで２１キロバイトと計測され、２０１２年９月１２日に作成された「ＳＥＭＢ００９ＵＳ＿ＳＴ２５」という名のファイルに含まれる配列表は、電子的に本明細書と共に提出され、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００３】
技術分野
本発明は、グルコシノレートレベルの増加を付与する転写因子Ｍｙｂ２８遺伝子座と密接に関係する分子マーカーの同定およびグルコシノレートレベルが増加したアブラナ科野菜植物を産生するための方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
アブラナ科野菜植物（ブロッコリーのようなブラシカ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物など）は、４−メチルスルフィニルブチルグルコシノレート（グルコラファニン）および３−メチルスルフィニルブチルグルコシノレート（グルコイベリン）を蓄積する。これらのグルコシノレートは、イソチオシアネートに加水分解される。疫学的研究により、アブラナ科野菜が豊富な食事は、癌の危険性の低下と関連づけられている。国際公開第９９／５２３４５号パンフレットおよび国際出願ＧＢ２００９／００１６４８号明細書において記載されるように、高グルコシノレートアブラナ科野菜（たとえば高グルコシノレートブロッコリー）が開発された。アブラナ科野菜植物におけるグルコシノレートの産生は、図４において示される植物における硫黄フラックスのマップから分かるように、複雑である。本発明に先立って、メチルチオアルキルマレートシンターゼ（ＭＡＭ）代謝または分子マーカーが、育種プログラムにおいて使用された。ＭＡＭ１およびＭＡＭ３は、高グルコシノレート形質と密に関連することが知られていた。
【０００５】
発明者らは、驚くべきことに、高グルコシノレート（たとえばグルコラファニン）表現型を有するいくつかのブラシカ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）栽培品種が、その形質と関連することが考えられるＭＡＭマーカー対立遺伝子（アレル）を有しなかったことを観察し、したがって、ＭＡＭマーカーが、必ずしも、高グルコシノレートプロファイルと密に関係するわけではなくまたはその鍵となるわけではなく、そのため、育種におけるマーカーとしてのそれらの使用が、この形質の追跡にとって信頼できるものではないと結論付けた。
【０００６】
そのため、本発明者らは、グルコシノレートレベルが増加した植物の遺伝子型を決定するために、信頼して、そして一貫して使用することができる、高グルコシノレートについてのマーカーを検索した。
【発明の概要】
【０００７】
発明の概要
本発明の独創性に富んだ発見は、転写因子Ｍｙｂ２８遺伝子座が、アブラナ科野菜植物（ブラシカ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物、たとえばブロッコリーなど）における、レベルが増加したグルコシノレート、特に４−メチルスルフィニルブチルグルコシノレート（グルコラファニン）および３−メチルスルフィニルブチルグルコシノレート（グルコイベリン）の産生において重要な遺伝子座であるということである。
【０００８】
初めて、本発明者らは、高グルコシノレートアブラナ科野菜植物（たとえばブラシカ・ビロサ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｖｉｌｌｏｓａ））および高グルコシノレート表現型を示さないアブラナ科野菜植物（たとえばブラシカ・オレラセア）の間で転写因子Ｍｙｂ２８遺伝子座において多型を観察することができることならびにこれらの多型を、グルコシノレートレベルの修飾（たとえば増加）について、アブラナ科野菜植物（ブラシカ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物、たとえばブロッコリーなど）の遺伝子型を決定するための分子マーカーとしておよび／またはグルコシノレートレベルが修飾された（たとえば増加した）植物についてのマーカー利用育種（ｍａｒｋｅｒ  ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｂｒｅｅｄｉｎｇ）において使用することができることを示した。
【０００９】
本発明の第１の態様において、グルコシノレートレベルが増加したアブラナ科野菜植物の遺伝子型を決定するための方法であって、前記植物由来の核酸のサンプルまたはその一部分を得るステップおよびグルコシノレートレベルの増加と遺伝的に関係するＭｙｂ２８遺伝子座での多型を前記核酸において検出するステップを含む方法が提供される。
【００１０】
本発明のさらなる態様は、グルコシノレートレベルのＭｙｂ２８媒介性の増加を有するアブラナ科野菜植物を産生するための方法であって、グルコシノレートレベルの増加と遺伝的に関係するＭｙｂ２８遺伝子座に多型を含む第１の子孫植物を選択するステップを含む方法を提供する。
【００１１】
さらなる態様において、本発明は、本発明の方法によって産生される植物またはその一部分（たとえば花部）を提供する。
【００１２】
本発明は、本発明の植物の種子または本発明の方法によって産生される植物の種子をさらに提供する。
【００１３】
さらなる態様において、本発明は、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２、および配列番号：２３からなる群から選択される配列を含む単離核酸を提供する。
【００１４】
他の態様において、本発明は、配列番号：１のヌクレオチド８３、１３６、２２６、５６３、６１０、８３０、９９５、１１１６、１５１３、１５７７、１６０６、１６２０、１８２５、１８６３、１８７７、もしくは２０２６に対応する位置の少なくとも１つの多型を増幅するおよび／もしくはそれにハイブリダイズするまたは配列番号：１のヌクレオチド３２３〜３３２、ヌクレオチド５２１〜５２４、ヌクレオチド７８３〜７８６、ヌクレオチド９０９〜９１４、ヌクレオチド１３６５〜１３６９、１８１１〜１８２１、もしくはヌクレオチド２０４６〜２０５６に対応する位置に存在する多型を増幅するおよび／もしくはそれにハイブリダイズするまたは配列番号：１のヌクレオチド８３６〜８３７、ヌクレオチド８６７〜８６８、もしくはヌクレオチド９４３〜９４４に存在する多型を増幅するおよび／もしくはそれにハイブリダイズするプライマーまたはプローブを提供する。
【００１５】
ある実施形態において、検出するまたは選択するステップが、ＰＣＲおよび／またはＤＮＡハイブリダイゼーションを含む。
【００１６】
いくつかの実施形態において、遺伝子型の決定が、共優性アッセイを含む。
【００１７】
一実施形態において、スクリーニング法が、共優性遺伝子マーカーを検出するステップを含む。
【００１８】
一実施形態において、多型が、
ａ．配列番号：１のヌクレオチド８３、１３６、２２６、５６３、６１０、８３０、９９５、１１１６、１５１３、１５７７、１６０６、１６２０、１８２５、１８６３、１８７７、もしくは２０２６に対応する位置の一塩基多型（ＳＮＰ）または
ｂ．配列番号：１のヌクレオチド３２３〜３３２、ヌクレオチド５２１〜５２４、ヌクレオチド７８３〜７８６、ヌクレオチド９０９〜９１４、ヌクレオチド１３６５〜１３６９、１８１１〜１８２１、もしくはヌクレオチド２０４６〜２０５６に存在するヌクレオチドの番号における多型または
ｃ．配列番号：１のヌクレオチド８３６〜８３７、ヌクレオチド８６７〜８６８、もしくはヌクレオチド９４３〜９４４に存在するヌクレオチドの番号における多型
のうちの少なくとも１つを含む。
【００１９】
一実施形態において、多型が、配列番号：１のヌクレオチド８３、１３６、２２６、５６３、６１０、８３０、９９５、１１１６、１５１３、１５７７、１６０６、１６２０、１８２５、１８６３、１８７７、もしくは２０２６に対応する位置の一塩基多型（ＳＮＰ）のうちの少なくとも１つまたはその組み合わせを含む。
【００２０】
他の実施形態において、多型が、配列番号：１のヌクレオチド３２３〜３３２、ヌクレオチド５２１〜５２４、ヌクレオチド７８３〜７８６、ヌクレオチド９０９〜９１４、ヌクレオチド１３６５〜１３６９、１８１１〜１８２１、またはヌクレオチド２０４６〜２０５６に存在するヌクレオチドのうちの１つまたは複数の欠失を含む。
【００２１】
他の実施形態において、多型が、配列番号：１のヌクレオチド３２３〜３３２、ヌクレオチド９０９〜９１４、ヌクレオチド１３６５〜１３６９、１８１１〜１８２１、またはヌクレオチド２０４６〜２０５６に存在するヌクレオチドのうちの２つ以上の欠失を含む。
【００２２】
他の実施形態において、多型が、配列番号：１のヌクレオチド３２３〜３３２、ヌクレオチド９０９〜９１４、１８１１〜１８２１、またはヌクレオチド２０４６〜２０５６に存在するヌクレオチドのうちの３つ以上の欠失を含む。
【００２３】
他の実施形態において、多型が、配列番号：１のヌクレオチド３２３〜３３２、１８１１〜１８２１、またはヌクレオチド２０４６〜２０５６に存在するヌクレオチドのうちの４つ以上（たとえば５つ以上または６つ以上または７つ以上）の欠失を含む。
【００２４】
他の実施形態において、多型が、配列番号：１の１８１１〜１８２１またはヌクレオチド２０４６〜２０５６に存在するヌクレオチドのうちの８つ以上の欠失を含む。
【００２５】
他の実施形態において、多型が、配列番号：１のヌクレオチド３２３〜３３２に存在するすべてのヌクレオチド、またはヌクレオチド５２１〜５２４に存在するすべてのヌクレオチド、またはヌクレオチド７８３〜７８６に存在するすべてのヌクレオチド、またはヌクレオチド９０９〜９１４に存在するすべてのヌクレオチド、またはヌクレオチド１３６５〜１３６９に存在するすべてのヌクレオチド、またはヌクレオチド１８１１〜１８２１に存在するすべてのヌクレオチド、またはヌクレオチド２０４６〜２０５６に存在するすべてのヌクレオチドの欠失を含む。
【００２６】
他の実施形態において、多型が、配列番号：１のヌクレオチド３２３〜３３２に存在するヌクレオチドのうちの少なくとも１つ、もしくはヌクレオチド５２１〜５２４に存在するヌクレオチドのうちの少なくとも１つ、もしくはヌクレオチド７８３〜７８６に存在するヌクレオチドのうちの少なくとも１つ、もしくはヌクレオチド９０９〜９１４に存在するヌクレオチドのうちの少なくとも１つ、もしくはヌクレオチド１３６５〜１３６９に存在するヌクレオチドのうちの少なくとも１つ、もしくはヌクレオチド１８１１〜１８２１に存在するヌクレオチドのうちの少なくとも１つ、もしくはヌクレオチド２０４６〜２０５６に存在するヌクレオチドのうちの少なくとも１つまたはその組み合わせの欠失を含む。
【００２７】
さらなる実施形態において、多型が、配列番号：１のヌクレオチド３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、５２２、５２３、７８４、７８５、９１０、９１１、９１２、９１３、１３６６、１３６７、１３６８、１８１２、１８１３、１８１４、１８１５、１８１６、１８１７、１８１８、１８１９、１８２０、２０４７、２０４８、２０４９、２０５０、２０５１、２０５２、２０５３、２０５４、または２０５５に対応する位置に少なくとも１つのヌクレオチドの欠失を含む。
【００２８】
一実施形態において、多型が、以下の位置：配列番号：１の３２４〜３３１、５２２〜５２３、７８４〜７８５、９１０〜９１３、１３６６〜１３６８、１８１２〜１８２０、もしくは２０４７〜２０５５またはその組み合わせにヌクレオチドの欠失を含む。
【００２９】
一実施形態において、多型が、配列番号：１のヌクレオチド８３６〜８３７、８６７〜８６８、または９４３〜９４４に１つまたは複数のヌクレオチドの挿入を含む。
【００３０】
多型が、ヌクレオチド８３６〜８３７の間の１つまたは複数のヌクレオチドの挿入である場合、適切には、その挿入は、２つのヌクレオチドである。２つのヌクレオチドが、ヌクレオチド８３６〜８３７の間に挿入される場合、適切には、ヌクレオチドは、ＴＴであってもよい。
【００３１】
多型が、ヌクレオチド８６７〜８６８の間の１つまたは複数のヌクレオチドの挿入である場合、適切には、その挿入は、１つのヌクレオチドである。１つのヌクレオチドが、ヌクレオチド８６７〜８６８の間に挿入される場合、適切には、ヌクレオチドは、Ａであってもよい。
【００３２】
多型が、ヌクレオチド９４３〜９４４の間の１つまたは複数のヌクレオチドの挿入である場合、適切には、その挿入は、１３個までのヌクレオチドである。１３個のヌクレオチドが、ヌクレオチド９４３〜９４４の間に挿入される場合、適切には、ヌクレオチドは、ＴＡＴＴＡＡＡＡＡＡＧＴＡ（配列番号：２５）であってもよい。
【００３３】
いくつかの実施形態において、多型が、１つを超える（適切には２つを超える、適切には３つを超える、適切には４つを超える、適切には５つを超える、適切にはすべての）以下の多型
ａ．配列番号：１のヌクレオチド８３、１３６、２２６、５６３、６１０、８３０、９９５、１１１６、１５１３、１５７７、１６０６、１６２０、１８２５、１８６３、１８７７、もしくは２０２６に対応する位置の一塩基多型（ＳＮＰ）または
ｂ．配列番号：１のヌクレオチド３２３〜３３２、ヌクレオチド５２１〜５２４、ヌクレオチド７８３〜７８６、ヌクレオチド９０９〜９１４、ヌクレオチド１３６５〜１３６９、１８１１〜１８２１、もしくはヌクレオチド２０４６〜２０５６に存在するヌクレオチドの番号における多型または
ｃ．配列番号：１のヌクレオチド８３６〜８３７、ヌクレオチド８６７〜８６８、もしくはヌクレオチド９４３〜９４４に存在するヌクレオチドの番号における多型
である。
【００３４】
特定の実施形態において、多型が、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２、および配列番号：２３からなる群から選択される少なくとも１つの第１の配列の使用を含むスクリーニング法によって検出される。
【００３５】
一実施形態において、アブラナ科野菜植物を産生するための方法が、（ａ）グルコシノレートレベルが増加したアブラナ科野菜植物を第２のアブラナ科野菜と交雑させるステップおよび（ｂ）グルコシノレートレベルの増加と遺伝的に関係するＭｙｂ２８遺伝子座に多型を含む少なくとも１つの第１の子孫アブラナ科野菜植物を選択するステップを含む。
【００３６】
一実施形態において、第１の子孫の選択が、少なくとも１つの第１のさらなる形質と遺伝的に関係する、第２のアブラナ科野菜植物由来の１つまたは複数の遺伝子マーカーの存在に基づいて子孫を選択することを含む。方法のさらなる実施形態において、さらなる形質が、収量、耐病性、出芽力（ｅｍｅｒｇｅｎｃｅ  ｖｉｇｏｕｒ）、生長力（ｖｅｇｅｔａｔｉｖｅ  ｖｉｇｏｕｒ）、ストレス耐性、草丈（ｐｌａｎｔ  ｈｅｉｇｈｔ）、花部品質、花部直径、花部重量、花部サイズ、花部形状、花部色、および開花までの日数からなる群から選択されてもよい。
【００３７】
一実施形態において、グルコシノレートレベルのＭｙｂ２８媒介性の増加を有するアブラナ科野菜を産生するための方法が、（ｃ）子孫植物を、それ自体または第３の植物と交雑させ、次世代の子孫植物を産生するステップをさらに含んでいてもよく、（ｄ）次世代の子孫植物を、それ自体または第２の植物と交雑させるステップならびに（ｅ）さらなる３〜１０世代についてステップ（ｃ）および（ｄ）を繰り返し、レベルが増加したグルコシノレートを含む同系交配アブラナ科野菜植物を産生するステップをさらに含んでいてもよく、少なくとも一世代次の子孫植物が、グルコシノレート産生に遺伝的に関係するＭｙｂ２８遺伝子座での多型の存在についてスクリーニングされる。一実施形態において、次世代の子孫植物が、グルコシノレートおよび所望の形質の存在に基づいて交雑のために選択される。方法において、ステップ（ｅ）は、グルコシノレートの増加の形質を含み、他の点では第２のブロッコリー植物の農業形質を含む同系交配アブラナ科野菜植物を得るために、十分な同系交配により繰り返される。
【００３８】
特定の実施形態において、本発明の方法が、グルコシノレートのレベルの増加についてブロッコリー植物の表現型をアッセイするステップをさらに含んでいてもよい。
【００３９】
本発明の好ましい一実施形態において、グルコシノレートが、４−メチルスルフィニルブチルグルコシノレート（ＭＳＢ）である。
【００４０】
好ましい一実施形態において、アブラナ科野菜植物（たとえばブロッコリーなどのようなブラシカ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物）が、少なくとも１０マイクロモル／乾燥重量ｇの量の、少なくとも１つのグルコシノレートを含む。
【００４１】
一実施形態において、アブラナ科野菜植物が、少なくとも１０マイクロモル／乾燥重量ｇの量の４−メチルスルフィニルブチルグルコシノレート（ＭＳＢ）、３−メチルスルフィニルプロピルグルコシノレート（ＭＳＰ）、またはその組み合わせを含む。
【００４２】
一実施形態において、アブラナ科野菜植物が、少なくとも１０マイクロモル／乾燥重量ｇの量の４−メチルスルフィニルブチルグルコシノレート（ＭＳＢ）を含む。
【００４３】
一実施形態において、「グルコシノレートレベルが増加したアブラナ科野菜植物」という用語は、少なくとも１０マイクロモル／乾燥重量ｇの量の４−メチルスルフィニルブチルグルコシノレート（ＭＳＢ）、３−メチルスルフィニルプロピルグルコシノレート（ＭＳＰ）、またはその組み合わせを含むアブラナ科野菜植物を意味する。
【００４４】
一実施形態において、「グルコシノレートレベルが増加したアブラナ科野菜植物」という用語は、少なくとも１０マイクロモル／乾燥重量ｇの量の４−メチルスルフィニルブチルグルコシノレート（ＭＳＢ）を含むアブラナ科野菜植物を意味する。
【００４５】
一実施形態において、本発明によるアブラナ科野菜植物は、ブラシカ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物である。
【００４６】
一実施形態において、本発明によるアブラナ科野菜植物は、ブロッコリーである。
【００４７】
さらに他の態様において、本発明は、本発明に従って検出される、少なくとも１つの第１の多型について、植物または植物の集団の遺伝子型をコンピュータ読み取り可能な媒体上に記録するステップを含む方法を提供する。本発明はまた、そのような情報を含有する、コンピュータ読み取り可能な媒体も提供する。
【００４８】
さらなる態様において、本発明は、アブラナ科野菜植物（たとえばブロッコリーなどのようなブラシカ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物）の可食部を産生するための方法であって、（ａ）本発明の方法によって植物を得るステップおよび（ｂ）植物によって産生される可食部（たとえば花部）を収集するステップを含む方法を提供する。
【００４９】
本発明のさらなる態様において、アライメントされた場合に、配列番号：１および配列番号：２４の間で保存される、少なくとも１８の隣接ヌクレオチドの配列を含む単離核酸が提供される。
【００５０】
本発明は、配列番号：１の少なくとも１８の隣接ヌクレオチドの配列を含む単離核酸であって、その配列が、配列番号：２４内に存在しない、単離核酸をさらに提供する。
【００５１】
さらなる態様において、本発明は、配列番号：２４の少なくとも１８の隣接ヌクレオチドの配列を含む単離核酸であって、その配列が、配列番号：１内に存在しない、単離核酸を提供する。
【００５２】
疑問を回避するために、本明細書において使用される、ヌクレオチド位置のナンバリングはすべて、配列番号：１においてまたは配列番号：１とのアライメントによって与えられるヌクレオチドナンバリングと対応する。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１−１】図１は、グルコシノレートのレベルが増加したブロッコリー、たとえばＢ．ビロサについてのＭｙｂ２８遺伝子座（ＦＴ６９）のコンセンサス配列およびグルコシノレートのレベルが増加していないブロッコリー、たとえばＢ．オレラセアについてのＭｙｂ２８遺伝子座（Ｏｌｅｒａｃｅａ）のコンセンサス配列の間の配列アライメントを示す図である。合計２６の単一特徴多型（ｓｉｎｇｌｅ  ｆｅａｔｕｒｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）（ＳＦＰ）（１６のＳＮＰおよび１０のインデルがある）が、２２０２ｂｐの全長を有する配列において検出される。図１において示される配列アライメントにおいてＳＦＰに網掛けする。これらのＳＦＰは、Ｂ．ビロサ遺伝子移入を示す。
【図１−２】図１−１に同じ。
【図１−３】図１−１に同じ。
【図２ａ】図２ａは、配列番号：１；グルコシノレートレベルが増加していないブラシカ・オレラセア（ブロッコリー）由来のＭｙｂ２８遺伝子座を含む核酸断片の配列を示す図である。ＳＦＰ（ＳＮＰおよびインデル、たとえば欠失させることができるヌクレオチドを含む）に網掛けする。間にＳＦＰ（インデル挿入）が挿入されてもよいヌクレオチドに下線を引く。
【図２ｂ】図２ｂは、配列番号：２；グルコシノレートレベルが増加していないブラシカ・オレラセア（ブロッコリー）由来のＭｙｂ２８遺伝子座を含む核酸断片の配列を示す図である。ＳＦＰ（ＳＮＰおよびインデル、たとえば欠失させることができるヌクレオチドを含む）に網掛けする。角括弧＜＞中の断片（および小文字のヌクレオチド）は、ブラシカ・オレラセア配列におけるＳＦＰ（挿入であるインデル）に対応し、これらの挿入は、高グルコシノレートブロッコリー（たとえばブラシカ・ビロサ）において見つけられる。
【図３】図３は、ブロッコリー栽培品種（すべて高グルコシノレート−たとえば高グルコラファニン−栽培品種である１１９９、１６３９、およびＨＧ１栽培品種）の葉におけるＭｙｂ２８発現を示す図である。
【図４】図４は、ブラシカ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物における硫黄フラックスの概略図を示す図である。黄色の代謝産物は、主なＳプールである。
【図５】図５は、配列番号：２４；グルコシノレートレベルが増加したブラシカ・ビロサＦＴ６９（ブロッコリー）由来のＭｙｂ２８遺伝子座を含む核酸断片の配列を示す図である。網掛けのヌクレオチドは、配列番号：１とアライメントした場合のＳＦＰ（ＳＮＰおよびインデルを含む）を示す。
【図６】図６は、生殖質パネルにおいて表現型を追跡する際に、マーカー有効性を検証する、ブラシカ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）におけるＭｙｂ２８について設計されたＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイ由来のデータを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００５４】
発明の好ましい実施形態の詳細な説明
特に定義されない限り、本明細書において使用される技術用語および科学用語はすべて、本開示が属する当技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ  ＯＦ  ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ  ＡＮＤ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，  ２０  ＥＤ．，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９９４）およびＨａｌｅ  ＆  Ｍａｒｈａｍ，  ＴＨＥ  ＨＡＲＰＥＲ  ＣＯＬＬＩＮＳ  ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ  ＯＦ  ＢＩＯＬＯＧＹ，  Ｈａｒｐｅｒ  Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ，  ＮＹ  （１９９１）は、本開示において使用される多くの用語の一般的な辞書を当業者に提供する。
【００５５】
本開示は、本明細書において開示される例示的な方法および材料によって限定されず、本明細書において記載されるものに類似するまたはそれと等価であるいかなる方法および材料も、本開示の実施形態の実施または試験において使用することができる。
【００５６】
数値の範囲は、範囲を定めている数を含める。値の範囲が提供される場合、文脈が明確に指示しない限り、その範囲の上限値および下限値の間の、下限値の単位の１０分の１までのそれぞれの介在値（ｉｎｔｅｒｖｅｎｉｎｇ  ｖａｌｕｅ）もまた、具体的に開示されることが理解されるであろう。明示される範囲における任意の明示される値または介在値およびその明示される範囲における任意の他の明示される値または介在値の間のそれぞれのより小さな範囲が、本発明の範囲内に包含される。
【００５７】
本明細書において提供される項目は、全体として本明細書に対する参照によって知ることができる本開示の様々な態様または実施形態を限定するものではない。したがって、直下に定義される用語は、全体として本明細書に対する参照によって、より完全に定義される。
【００５８】
用語の他の定義は、本明細書の全体にわたって現れてもよい。例示的な実施形態がより詳細に記載される前に、本開示が、記載される特定の実施形態に限定されず、そのため、もちろん、変更されてもよいことが理解されるべきである。本開示の範囲は添付の請求項によってのみ限定されるので、本明細書において使用される術語は、特定の実施形態を説明する目的のみのものであり、限定するようには意図されないこともまた、理解されるべきである。
【００５９】
本明細書および添付の請求項において使用されるように、文脈が明確に指示しない限り、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、複数形の指示物を含むことに注意されなければならない。
【００６０】
本明細書において論じられる刊行物は、本出願の出願日前のそれらの開示について単に提供される。そのような刊行物が先行技術を構成するという、本明細書に添付される請求項に対する許可として解釈されるものは本明細書にはない。
【００６１】
本発明は、植物への、グルコシノレートレベルの増加の付与に密に関係する転写因子遺伝子である、増幅可能で、アッセイすることができる多型遺伝子座Ｍｙｂ２８の同定に関する。この多型遺伝子座は、「Ｍｙｂ２８−ＦＴ６９」または「ＦＴ６９」遺伝子座または「ブラシカ・ビロサ」遺伝子座と称される場合がある。ＤＮＡ多型（複数可）、たとえば１つまたは複数の一塩基多型（ＳＮＰ）または挿入／欠失（「インデル」）などのような、この遺伝子座の１つまたは複数の遺伝子マーカーは、したがって、高グルコシノレート形質遺伝子座の存在を検出するために遺伝子マーカー（複数可）として使用することができる。
【００６２】
多型遺伝子座は、グルコシノレートのレベルの増加についての表現型に遺伝的に関係し、それを同定する対立遺伝子またはグルコシノレートのレベルの増加の不在についての表現型に遺伝的に関係し、それを同定する対立遺伝子を含むこととして定義されてもよい。
【００６３】
したがって、本発明は、グルコシノレートレベル増加遺伝子対立遺伝子の存在または不在と関連する、Ｍｙｂ２８遺伝子座の特異的な分子ハプロタイプを提供する。
【００６４】
一実施形態において、Ｍｙｂ２８−ＦＴ６９（グルコシノレートの増加）配列が、図１において示されるＦＴ６９配列として示される。
【００６５】
他の実施形態において、Ｍｙｂ２８−ＦＴ６９（グルコシノレートの増加）配列が、配列番号：２４（図５において）として示されるＦＴ６９配列として示される。
【００６６】
ＦＴ−６９系は、３−メチルチオプロピルグルコシノレート（ＭＳＰ）（グルコイベリン）のレベルが上昇している、Ｊｏｈｎ  Ｉｎｎｅｓ  Ｃｅｎｔｅｒ、ＵＫによって開発された系である。それは、栽培植物化ブロッコリー、ブラシカ・ビロサの近縁野生種を、栽培植物化ブロッコリー、ブラシカ・オレラセアと交雑させることによって作り出された。ＦＴ−６９は、その改良ブロッコリー植物系ＢＲＭ  ５１−１９に戻し交雑された。それぞれの交雑の後に、植物は、反復親ＢＲＭ  ５１−１９に対する表現型の類似性に基づいて選択され、ＭＳＰおよびさらなる植物化学物質４−メチルスルフィニルブチルグルコシノレート（ＭＳＢ）（グルコラファニン）のレベルについて分析された。完成系は、ＢＲＭ  ５１−１１６２と命名された。
【００６７】
本発明者らは、ブロッコリー（ブラシカ・オレラセア）が、標的グルコシノレート、たとえば４−メチルスルフィニルブチルグルコシノレート（ＭＳＢ）（グルコラファニン）を産生するための遺伝子に寄与し、Ｂ．ビロサが、標的グルコシノレートの濃度を増加させるための遺伝子に寄与することを決定した。
【００６８】
本発明は、したがって、中でも収量、耐病性、出芽活力（ｅｍｅｒｇｅｎｃｅ  ｖｉｇｏｒ）、生長活力（ｖｅｇｅｔａｔｉｖｅ  ｖｉｇｏｒ）、ストレス耐性、草丈、花部品質、花部直径、花部重量、花部サイズ、花部形状、花部色、および開花までの日数などのような他の形質に対する高い淘汰圧下でさえ、グルコシノレートレベルが増加した植物を効率的に選択するための、Ｍｙｂ２８遺伝子座の多型部位の使用を可能にする。
【００６９】
本発明はまた、ＰＣＲプライマーおよび反応条件も提供し、それによって、レベルが増加したグルコシノレートを含む植物に対して特異的なＳＮＰまたはインデルなどのようなマーカーを、優性または共優性の方式において検出することができる。マーカーの使用を通して、当業者は、アブラナ科野菜植物（たとえばブロッコリーなどのようなブラシカ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物）の育種の間にレベルが増加したグルコシノレートについて選択してもよい。
【００７０】
高グルコシノレート形質に関係する、以前に記載されたマーカーは、たとえば、以前に記載されたマーカーが、グルコシノレートレベルの増加に密接に関係しないので、適切な選択ツールを提供しない。
【００７１】
他の態様において、本発明は、アブラナ科野菜植物（たとえばブロッコリーなどのようなブラシカ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物）の中にグルコシノレートレベルの増加を遺伝子移入するための方法であって、（ａ）グルコシノレートレベルが増加したアブラナ科野菜植物を第２のアブラナ科野菜と交雑させ、分離集団を形成するステップおよび（ｂ）グルコシノレート形質の増加を示す集団のうちの少なくとも１つのメンバーを選択するステップを含み、選択が、Ｍｙｂ２８−ＦＴ６９遺伝子座の検出可能なハプロタイプの存在に基づく、方法を提供する。一態様において、グルコシノレート増加形質を有するコショウ系が、少なくとも２世代について、第２のアブラナ科野菜植物（たとえばブロッコリーなどのようなブラシカ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物）系と交雑される（たとえば、Ｆ２またはＢＣ１Ｓ１集団を作り出す）。他の態様において、植物が、交雑に先立って、グルコシノレート表現型が増加しているとして同定される。一態様において、分離集団が、自己交雑され、次の集団が、グルコシノレートレベルの増加についてスクリーニングされる。
【００７２】
本明細書において使用されるように、「マーカー」は、少なくとも１つの表現型、遺伝子型、または多型の存在についての指標である。マーカーは、一塩基多型（ＳＮＰ）、切断可能な増幅多型配列（ｃｌｅａｖａｂｌｅ  ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）（ＣＡＰＳ）、増幅断片長多型（ＡＦＬＰ）、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）、単純配列反復（ＳＳＲ）、挿入（複数可）／欠失（複数可）（ＩＮＤＥＬ（複数可））、単純配列反復間配列（ｉｎｔｅｒ−ｓｉｍｐｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｒｅｐｅａｔ）（ＩＳＳＲ）、配列特徴付け増幅領域（ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  ｒｅｇｉｏｎ）（ＳＣＡＲ）マーカー、および無作為増幅多型ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）配列を含むが、これらに限定されない。
【００７３】
マーカーは、環境分散成分なし、すなわち、１の遺伝率で、共優性の様式において遺伝してもよい（二倍体ヘテロ接合体の遺伝子座の両方の対立遺伝子が容易に検出可能である）。
【００７４】
本明細書において使用される「核酸マーカー」は、グルコシノレートレベルの増加と関連する多型、表現型、またはその両方を検出するためのマーカーとすることができる核酸分子を意味する。
【００７５】
Ｍｙｂ２８遺伝子座のマーカーの使用は、候補系の迅速で信頼できる分子スクリーニングを提供し、表現型植物化学アッセイの必要性を伴うことなく、グルコシノレートレベルの増加についての、アブラナ科野菜（たとえばブロッコリーなどのようなブラシカ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物）育種系の遺伝子型スクリーニングを可能にする。
【００７６】
一旦、グルコシノレートレベルが増加した植物が産生されたら、植物は、それら自体、従来の手順に従って栽培することができる。子孫は、有性生殖を通して得られてもよい。有性生殖から生じる種子は、グルコシノレートレベルが増加した植物から回収し、繁殖の手段として蒔くまたは別の方法で成長させることができる。子孫はまた、無性生殖を通して植物から得られてもよい。プロトプラストまたは珠芽（たとえば挿し木、接ぎ穂、もしくは台木）は、グルコシノレートレベルが増加した植物またはその一部から回収することができ、グルコシノレートレベルが増加した植物を繁殖させるために用いられてもよい。
【００７７】
本発明はまた、今記載される方法によって産生される、グルコシノレートレベルが増加した植物の子孫を提供する。本明細書において使用されるように、子孫は、限定を伴うことなく、２つの植物の間の任意の交雑（戻し交雑であれ、他の方法であれ）の産物だけではなく、その系統がもとの交雑種に由来するすべての子孫をも含む。本発明の一態様において、子孫は、グルコシノレートレベルが増加した植物由来の約５０％、２５％、１２．５％、またはそれ以下の核ＤＮＡを含有し、グルコシノレートレベルの増加をもたらす遺伝物質を発現する。
【００７８】
本明細書において使用されるように、核酸マーカー配列およびグルコシノレートレベルの増加などのような所望の形質を与える遺伝子座の核酸配列を含む、２つの核酸配列の関係は、遺伝的なものまたは物理的なものまたはその両方であってもよい。
【００７９】
本発明の一態様において、核酸マーカーおよびグルコシノレート増加の形質を付与する遺伝子座が、遺伝的に関係し、たとえば、Ｌａｎｄｅｒ  ａｎｄ  Ｂｏｔｓｔｅｉｎ，  １９８９  （Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １２１：  １８５−１９９）によって記載される最尤法に基づいて、グルコシノレート増加の形質について区間マッピング法によって判断され、ソフトウェアパッケージＭＡＰＭＡＫＥＲ（たとえばＬａｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８７）  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  １：  １７４−１８１；デフォルトパラメータ）において実行されるように、２．０を超えるＬＯＤスコアを示す。他の実施形態において、マーカーおよびグルコシノレート増加の形質を付与する領域が、遺伝的に関係し、３．０を超えるＬＯＤスコアまたは６．０、９．０、１２．０、１５．０、もしくは１８．０を超えるＬＯＤスコアを示す。
【００８０】
他の態様において、核酸分子が、Ｍｙｂ２８遺伝子座に物理的に関係していてもよい。いくつかの態様において、核酸マーカーが、Ｍｙｂ２８遺伝子座内にある配列を有する核酸分子に特異的にハイブリダイズする。
【００８１】
本明細書において使用されるように、２つの分子が逆平行二本鎖核酸構造を形成することができる場合、２つの核酸分子は、互いにハイブリダイズすることができると表現される。従来のストリンジェンシー条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８９）  （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ２ｎｄ  Ｅｄ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．）によっておよびＨａｙｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８５）  （Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，  Ｄ．Ｃ．）によって記載される。そのため、完全な相補性から逸脱しても、そのような逸脱が二本鎖構造を形成する分子の能力を完全に妨げない限り、許容可能である。したがって、核酸分子がプライマーまたはプローブとして果たすために、用いられる特定の溶媒および塩濃度下で安定した二本鎖構造を形成することができるように、配列において十分に相補的であることのみが必要とされる。
【００８２】
ＤＮＡハイブリダイゼーションを促進する適切なストリンジェンシー条件、たとえば、約４５℃での６．０＊塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）、その後に続く５０℃での２．０＊ＳＳＣの洗浄が、当業者らに知られているまたはＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８９）  （Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎ．Ｙ．），  Ｓｅｃｔｉｏｎ  ６．３．１−６．３．６において見つけることができる。いくつかの実施形態において、ハイブリダイゼーション条件が、高度なストリンジェンシー条件、中程度のストリンジェンシー条件、または低度のストリンジェンシー条件とすることができる。例示的な条件は、５０％ホルムアミド、５．０＊ＳＳＣ、１％ＳＤＳ、および１４時間の４２℃でのインキュベーション、その後に続く０．２＊ＳＳＣ、１％ＳＤＳを使用する洗浄および６５℃でのインキュベーションを使用するものを含む。
【００８３】
ハイブリダイゼーションの特異性は、ハイブリダイゼーション後の洗浄によって影響を及ぼされ得る。たとえば、洗浄ステップにおける塩濃度は、５０℃での約２．０＊ＳＳＣの低度のストリンジェンシー〜５０℃での約１．０＊ＳＳＣの中程度のストリンジェンシー〜５０℃での約０．２＊ＳＳＣの高度なストリンジェンシーから選択することができる。さらに、洗浄ステップにおける温度は、室温、約２２℃の低度のストリンジェンシー条件から約５０℃の中程度のストリンジェンシー条件まで、約６５℃の高度なストリンジェンシー条件まで増加させることができる。温度および塩濃度の両方を変化させてもよい、または他方の変数を変更しながら、温度または塩濃度を一定に保持してもよい。いくつかの態様において、洗浄ステップを、５、１０、１５、２０、２５、３０分間、またはそれ以上実行することができる。他の態様において、洗浄ステップが、約２０分間実行される。さらに他の態様において、洗浄ステップを、選択される塩濃度、温度、および時間を使用して、１、２、３、４回、またはそれ以上繰り返すことができる。他の態様において、洗浄ステップが、２回繰り返される。
【００８４】
植物の遺伝子マーカープロファイルは、その同系交配を使用して産生される雑種の農業形質を予測するものであってもよい。たとえば、遺伝子マーカープロファイルおよび表現型が知られている同系交配植物を、遺伝子マーカープロファイルおよび表現型が知られている第２の同系交配体と交雑させる場合、親同系交配体の遺伝子マーカープロファイルの組み合わせに基づいてＦ１雑種の表現型を予測することが可能である。遺伝子マーカーデータから雑種の能力を予測する方法は、米国特許第５，４９２，５４７号において開示され、この開示は、その全体が参照によって本明細書において明確に組み込まれる。そのような予測は、任意の適した遺伝子マーカー、たとえばＳＳＲ、ＩＮＤＥＬ、ＲＦＬＰ、ＡＦＬＰ、ＳＮＰ、ＩＳＳＲ、またはアイソザイムを使用して生成されてもよい。
【００８５】
Ｍｙｂ２８媒介性のグルコシノレートレベルの増加に遺伝的に関係するまたは関連づけられるＳＳＲ、ＡＦＬＰマーカー、ＲＦＬＰマーカー、ＲＡＰＤマーカー、表現型マーカー、ＳＮＰ、ＳＣＡＲマーカー、アイソザイムマーカー、またはマイクロアレイ転写プロファイルなどのようなさらなるマーカーを利用することができる。そのようなマーカーを単離するための方法は、当技術分野において知られている。
【００８６】
たとえば、遺伝子座特異的ＳＳＲは、Ｍｙｂ２８−ＦＴ６９のゲノミッククローン上に見つけられる配列に対して特異的なマーカーについてゲノムライブラリーをスクリーニングし、「ポジティブ」クローンを配列決定し、繰り返し体の側面に位置するプライマーを設計し、これらのプライマーによりゲノムＤＮＡを増幅することによって得ることができる。
【００８７】
本明細書において使用されるように、子孫は、限定を伴うことなく、２つの植物の間の任意の交雑（戻し交雑であれ、他の方法であれ）の産物だけではなく、その系統がもとの交雑種に由来するすべての子孫をも含む。詳細には、限定を伴うことなく、そのような子孫は、２つの最初に交雑した植物の一方に由来する５０％、２５％、１２．５％、またはそれ以下の核ＤＮＡを有する植物を含む。
【００８８】
本明細書において使用されるように、第２の植物の系統が第１の植物を含む場合、第２の植物は、第１の植物に由来する。
【００８９】
本発明は、本明細書において記載されるアブラナ科野菜（たとえばブロッコリーなどのようなブラシカ（Ｂｒａｓｓｉｃａ））系の遺伝的な相補体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）を提供する。相補体が、本明細書において記載される、選び抜かれた同系交配アブラナ科野菜（たとえばブロッコリーなどのようなブラシカ（Ｂｒａｓｓｉｃａ））系由来の１倍体の遺伝的な相補体および他の１倍体の遺伝的な相補体の組み合わせによって形成される、雑種の遺伝的な相補体が、さらに提供される。そのような遺伝的な相補体を決定するための手段は、当技術分野においてよく知られている。
【００９０】
本明細書において使用されるように、語句「遺伝的な相補体」は、ヌクレオチド配列の集合体を意味し、その発現は、ブロッコリー植物またはその植物の細胞もしくは組織などのような植物の表現型を定義する。例として、ブロッコリー植物は、それが有する遺伝性マーカーの代表的なサンプルを決定するために遺伝子型が同定される。マーカーは、共優性の様式において遺伝してもよく、二倍体遺伝子座の両方の対立遺伝子の存在が容易に検出可能となり、それらは環境変異がない、すなわち、それらの遺伝率は、１に近いまたはそれに等しい。この遺伝子型同定は、好ましくは、興味のある形質（複数可）についての数値もまた決定される、少なくとも１世代の後代植物に対して実行される。単一の遺伝子座遺伝子型についてのアレイは、二倍体植物についてはそれぞれの遺伝子座に２つのマーカー対立遺伝子のプロファイルとして発現される。それぞれの遺伝子座のマーカー対立遺伝子組成は、ホモ接合性またはヘテロ接合性となり得る。ホモ接合性は、遺伝子座の両方の対立遺伝子が、遺伝子座のゲノムの同じ状態によって特徴付けられる状態である（たとえば同じヌクレオチド配列）。ヘテロ接合性は、遺伝子座のゲノムの異なる状態を指す。可能性として、任意のタイプの遺伝子マーカー、たとえば、単純配列反復（ＳＳＲ）、挿入／欠失多型（ＩＮＤＥＬ）、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）、増幅断片長多型（ＡＦＬＰ）、一塩基多型（ＳＮＰ）、およびアイソザイムを使用することができる。
【００９１】
かなりの遺伝子情報が、共優性マーカー系を使用して、完全に分類されたＦ２集団から得ることができる（たとえばＭａｔｈｅｒ，  １９３８  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ  ｏｆ  Ｌｉｎｋａｇｅ  ｉｎ  Ｈｅｒｅｄｉｔｙ：  Ｍｅｕｔｈｕｅｎ  ＆  Ｃｏ）。Ｆ２集団は、雑種の種子が産生された後の、自家受粉または同胞（ｓｉｂ）受粉の第一世代である。通常、単一のＦ１植物は、自家受粉または同胞受粉され、メンデル（１：２：１）式で核コード遺伝子が分離される集団を生成する。
【００９２】
共優性マーカーの使用とは対照的に、優性マーカーの使用は、ヘテロ接合性の個体を同定するために後代検定（たとえばＦ３または戻し交配自己ファミリー）を必要とすることが多い。集められた情報は、完全に分類されたＦ２集団において得られるものと等価になり得る。その後、マーカー支援選択は、マーカー−形質マップアソシエーション（Ｆ２、Ｆ３）に基づいて次の子孫に対して適用することができ、ここで、関係は、組換え事象によって完全には引き離されなかった（すなわち最大の非平衡）。
【００９３】
組換え同系交配系（ＲＩＬ）（遺伝的に関係する系；通常＞Ｆ５）は、マッピング集団として使用することができる。ＲＩＬは、Ｆ２植物を同系交配させ、結果として生ずるＦ３植物を同系交配させ、この世代同系交配プロセスを繰り返し、それによってホモ接合性を増加させることによって開発することができる。優性マーカーから得られる情報は、遺伝子座がすべてホモ接合性であるまたはほぼホモ接合性であるので、ＲＩＬを使用することによって最大限にすることができる。密接な関係の条件（すなわち約＜１０％の組換え）下で、ＲＩＬ集団において評価される優性および共優性マーカーは、戻し交雑集団におけるいずれのマーカータイプよりも、個体当たり多くの情報を提供する（たとえばＲｅｉｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９２  （Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  （ＵＳＡ）  ８９：  １４７７−１４８１）。しかしながら、マーカーの間の距離がより大きくなる（すなわち、遺伝子座がより非依存性となる）につれて、ＲＩＬ集団における情報は、共優性マーカーと比較した場合、劇的に減少する。
【００９４】
戻し交雑集団は、マッピング集団として利用することができる。戻し交雑集団（ＢＣ）は、Ｆ１をその親の一方に交雑させることによって作り出すことができる。典型的に、戻し交雑集団は、ドナーと呼ばれることが多い第２の親系由来の１つまたは少数の形質を追加しながら、反復親系（戻し交雑において用いられる親）から望ましい形質（ほとんどの遺伝子を含んでいてもよい）を取り戻すために作り出される。反復親への一連の戻し交雑は、反復親の望ましい形質のほとんどを取り戻すために行うことができる。したがって、ほぼ反復親のような個体からなる集団が、作り出され、個体はそれぞれ、様々な量または寄せ集めの、ドナー親由来のゲノム領域を持つ。戻し交雑集団は、特に、反復親における遺伝子座がすべてホモ接合性であり、ドナーおよび反復親が対照的な多型マーカー対立遺伝子を有する場合、優性マーカーをマッピングするのに有用になり得る（Ｒｅｉｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９２）。
【００９５】
共優性または優性マーカーを使用して、戻し交雑集団から得られる情報は、２つではなく、１つの配偶子を伴う組換え事象が植物ごとにサンプリングされるので、完全に分類されたＦ２集団から得られるものよりも少ない。しかしながら、戻し交雑集団は、関係する遺伝子座の間の距離が、ＲＩＬ集団において増加するにつれて（すなわち約１５％の組換え）、ＲＩＬと比較した場合、より有益となる（低度のマーカー飽和度（ｍａｒｋｅｒ  ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ）で）。組換えの増加は、密接な関係の分析にとって有益になり得るが、低度のマーカー飽和度のマップの構築において望ましくないかもしれない。
【００９６】
調査中の形質またはゲノム領域を除いて遺伝組成がほぼ同一である多くの個体を産生するために多くの戻し交雑によって作り出された近同質遺伝子系統（ＮＩＬ）は、マッピング集団として使用することができる。ＮＩＬによるマッピングにおいて、遺伝子座の一部分のみが、親系の間で多型であり、高度にホモ接合性のＮＩＬ集団において分離することが予想されるであろう。しかしながら、ＮＩＬ集団において多型であるそれらの遺伝子座は、興味のある形質に関係する可能性がある。
【００９７】
本発明の方法を使用して生成される植物は、育種プログラムの一部とすることができるまたは育種プログラムから生成することができる。育種方法の選択は、植物生殖の様式、改善される形質（複数可）の遺伝率、および商業的に使用される栽培品種のタイプ（たとえばＦ１雑種栽培品種、純系栽培品種など）に依存する。本発明の植物を育種するために選択される非限定的なアプローチは、下記に記載される。育種プログラムは、任意の交雑種の子孫のマーカー支援選択を使用して増強することができる。育種プログラムにおいて、任意の商業的なおよび非商業的な栽培品種を利用することができることがさらに理解される。たとえば、収量、耐病性、出芽活力、生長活力、ストレス耐性、草丈、花部品質、花部直径、花部重量、花部サイズ、花部形状、花部色、および開花までの日数などのような因子が、一般に、選択肢を決定するであろう。
【００９８】
高度に遺伝的な形質について、単一の位置で評価される優れた個体植物の選択は、有効になるであろうが、低度の遺伝率を有する形質については、選択は、関係する植物のファミリーの反復評価から得られる統計解析（たとえば平均値）に基づくべきである。よく知られた選択方法は、一般に、系統選択、修飾された系統選択、集団選択、および循環選抜を含む。好ましい実施形態において、戻し交雑または反復育種プログラムが、行われる。
【００９９】
遺伝の複雑性は、育種方法の選択に影響を及ぼす。戻し交雑育種は、高度に遺伝的な形質についての１つまたは少数の好ましい遺伝子を望ましい栽培品種の中に移入するために使用することができる。様々な循環選抜技術は、多数の遺伝子によってコントロールされる遺伝形質を量的に改善するために使用される。作物を自家受粉させる際の循環選抜の使用は、受粉の容易さ、それぞれの受粉からの雑種の成功の頻度、およびそれぞれの成功した交雑からの雑種の子の数に依存する。
【０１００】
育種系は、試験することができ、２世代以上について、商業的な標的エリア（複数可）を代表する環境における適切な標準物と比較することができる。最良の系は、新しい商業的な栽培品種のための親としての候補となり、形質がなお欠損しているものは、雑種のための親としてまたはさらなる選択のための新しい集団を産生するために使用されてもよい。
【０１０１】
優れた植物を同定するための１つの方法は、他の実験植物および広範囲に育っている標準的な栽培品種と比べたその能力を観察することである。１回の観察が決定的ではない場合、反復観察により、その遺伝的な価値のよりよい推定をもたらすことができる。育種者は、２つ以上の親系を選択し、交雑し、その後に続いて、自家受粉または同胞受粉および選択を繰り返し、多くの新しい遺伝的な組み合わせを産生することができる。
【０１０２】
新しいアブラナ科野菜（たとえばブロッコリーなどのようなブラシカ（Ｂｒａｓｓｉｃａ））系の開発は、アブラナ科野菜（たとえばブロッコリーなどのようなブラシカ（Ｂｒａｓｓｉｃａ））変種の開発および選択、これらの変種の交雑、ならびに優れた雑種交雑種の選択を必要とする。雑種の種子は、選択される雄性稔性親間の手作業の交雑によってまたは雄性不稔性系を使用することによって産生することができる。雑種は、ある単一の遺伝子形質について選択することができる。親系についてのさらなるデータおよび雑種の表現型は、特定の雑種交雑を継続するかどうかについての育種者の決定に影響を及ぼす。
【０１０３】
系統育種法および循環選抜育種法は、育種集団から栽培品種を開発するために使用することができる。育種プログラムは、２つ以上の栽培品種または様々な広い領域にわたる供給源由来の望ましい形質を組み合わせて、育種プールの中に入れ、これから、栽培品種が、同系交配および所望の表現型の選択によって開発され、親系の中に入れられる。これらの系は、新しい栽培品種を産生するために使用される。新しい栽培品種は、どれが商業的な可能性を有するかを決定するために評価することができる。
【０１０４】
系統育種は、自家受粉作物の改善のために一般に使用される。好ましい相補的な形質を有する２つの親が交雑され、Ｆ１を産生する。Ｆ２集団は、１つまたはいくつかのＦ１集団を同系交配させることによって産生される。最良のファミリーにおける最良の個体の選択が実行される。ファミリーの反復試験は、低度の遺伝率を有する形質についての選択の有効性を改善するためにＦ４世代において開始することができる。同系交配が進んだ段階で（すなわちＦ６およびＦ７）、最良の系または表現型が類似する系の混合物は、新しい栽培品種としての発売の可能性について試験される。
【０１０５】
戻し交雑育種および交雑育種は、反復親である望ましいホモ接合性の栽培品種または同系交配系に、単純遺伝性の高度に遺伝的な形質の遺伝子を移入するために使用された。移入されることとなる形質の供給源は、ドナー親と呼ばれる。戻し交雑プログラムの成功から得られる、結果として生じる植物は、反復親（たとえば栽培品種）の特質およびドナー親から移入された望ましい形質を有することが予想される。最初の交雑の後に、ドナー親の表現型を有する個体を選択し、反復親に繰り返し交雑させる（戻し交雑する）。選択を伴う複数の戻し交雑世代の後に、結果として生じる系は、反復親（たとえば栽培品種）の特質およびドナー親から移入された望ましい形質を有することが予想される。
【０１０６】
本発明によって生成される植物は、単粒系統法を使用して生成されてもよい。単粒系統法は、厳密な意味においては、分離集団の種をまき、その後、この世代およびそれぞれの次世代において１つの植物を選択し、同系交配させ、次世代を作り出すことを指す。集団が、Ｆ２から同系交配の所望のレベルまで進んだ場合、系が由来する植物は、それぞれ異なるＦ２個体までさかのぼるであろう。集団における植物の数は、いくつかの種子が発芽しなかったりまたはいくつかの植物が少なくとも１つの種子を産生しなかったりするために、それぞれの世代で減少する。その結果として、集団において最初にサンプリングされたＦ２植物のすべてが、世代進行が終了する場合に、子孫によって示されるとは限らないであろう。
【０１０７】
異なる形質および作物について一般に使用される他の育種方法の説明は、入手可能ないくつかの参考図書のうちの１つにおいて見つけることができる（たとえばＦｅｈｒ，  １９８７，  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｃｕｌｔｉｖａｒ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｖｏｌ．  １，  ｐｐ．  ２−３）。
【０１０８】
他の態様において、グルコシノレートレベルが増加したアブラナ科野菜（たとえばブロッコリーなどのようなブラシカ（Ｂｒａｓｓｉｃａ））系を、興味のあるさらなる形質とグルコシノレートレベルの増加を組み合わせるために育種プログラムにおいて使用することができる。
【０１０９】
本明細書において使用されるように、グルコシノレートのレベルが増加したアブラナ科野菜（グルコシノレートのレベルが増加したブロッコリーなど）および／またはその少なくとも１つの誘導体についての言及は、４−メチルスルフィニルブチルグルコシノレート、３−メチルスルフィニルプロピルグルコシノレート、４−メチルチオブチルグルコシノレート；３−メチルチオプロピルグルコシノレート、スルホラファン、エルシン、サチビン、イベリン、β−フェニルエチルイソチオシアネート（ＰＥ−ＩＴＣ）、３−メチルチオプロピルイソチオシアネートを含むリストから選択される、少なくとも１つの植物化学物質のレベルが増加したブロッコリーを指す。
【０１１０】
高レベルのグルコシノレートを有するアブラナ科野菜（たとえばブロッコリー）は、国際公開第９９／５２３４５号パンフレットおよび国際出願ＧＢ２００９／００１６４８号明細書において記載され、これらの両方は、参照によって本明細書において組み込まれる。
【０１１１】
適切には、グルコシノレートレベルが増加したアブラナ科野菜（グルコシノレートレベルが増加したブラシカ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）またはブロッコリーなど）は、レベルが増加した１つもしくは複数のグルコシノレートおよび／または１つもしくは複数のイソチオシアネートを含んでいてもよい。
【０１１２】
一実施形態において、本発明において使用するための、グルコシノレートレベルが増加したアブラナ科野菜（グルコシノレートレベルが増加したブラシカ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）またはブロッコリーなど）が、レベルが増加した、１つまたは複数の以下の化合物：４−メチルスルフィニルブチルグルコシノレート（ＭＳＢ）、３−メチルスルフィニルプロピルグルコシノレート（ＭＳＰ）、４−メチルチオブチルグルコシノレート；３−メチルチオプロピルグルコシノレートを含む。
【０１１３】
一実施形態において、本発明において使用するための、グルコシノレートレベルが増加したアブラナ科野菜（グルコシノレートレベルが増加したブラシカ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）またはブロッコリーなど）が、レベルが増加した４−メチルスルフィニルブチルグルコシノレート（ＭＳＢ）および／または３−メチルスルフィニルプロピルグルコシノレート（ＭＳＰ）を含む。
【０１１４】
好ましくは、グルコシノレートレベルが増加したアブラナ科野菜（グルコシノレートレベルが増加したブラシカ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）またはブロッコリーなど）は、同様の条件下で育てられた標準的なアブラナ科野菜（標準的なブラシカ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）または標準的なブロッコリーなど）において見つけられる４−メチルスルフィニルブチルグルコシノレート（ＭＳＢ）のレベルの２〜３倍である、４−メチルスルフィニルブチルグルコシノレート（ＭＳＢ）のレベルを有する。
【０１１５】
適切には、グルコシノレートレベルが増加したアブラナ科野菜（グルコシノレートレベルが増加したブラシカ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）またはブロッコリーなど）は、同様の条件下で育てられた標準的なアブラナ科野菜（標準的なブラシカ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）または標準的なブロッコリーなど）において見つけられる４−３−メチルスルフィニルプロピルグルコシノレート（ＭＳＰ）のレベルの２〜３倍である、４−３−メチルスルフィニルプロピルグルコシノレート（ＭＳＰ）のレベルを有していてもよい。
【０１１６】
適切には、グルコシノレートレベルが増加したアブラナ科野菜（グルコシノレートレベルが増加したブラシカ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）またはブロッコリーなど）は、少なくとも１０マイクロモル／乾燥重量ｇの量の、少なくとも１つのグルコシノレートを含んでいてもよい。より好ましくは、少なくとも約１４μモル／乾燥重量ｇ、少なくとも約１６μモル／乾燥重量ｇ、少なくとも約２０μモル／乾燥重量ｇ、少なくとも約２５μモル／乾燥重量ｇ、少なくとも約３０μモル／乾燥重量ｇ、少なくとも約５０μモル／乾燥重量ｇ、または少なくとも約７５μモル／乾燥重量ｇ。
【０１１７】
適切には、一実施形態において、グルコシノレートレベルが増加したアブラナ科野菜（グルコシノレートレベルが増加したブラシカ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）またはブロッコリーなど）は、少なくとも１０マイクロモル／乾燥重量ｇの量の、４−メチルスルフィニルブチルグルコシノレート（ＭＳＢ）および／または３−メチルスルフィニルプロピルグルコシノレート（ＭＳＰ）を有していてもよい。より好ましくは、少なくとも約１４μモル／乾燥重量ｇ、少なくとも約１６μモル／乾燥重量ｇ、少なくとも約２０μモル／乾燥重量ｇ、少なくとも約２５μモル／乾燥重量ｇ、少なくとも約３０μモル／乾燥重量ｇ、少なくとも約５０μモル／乾燥重量ｇ、または少なくとも約７５μモル／乾燥重量ｇ。
【０１１８】
グルコシノレートは、硫黄、窒素、およびグルコースに由来する基を含有する有機化合物のクラスである。それらは、アブラナ科野菜などのようなアブラナ目（とりわけアブラナ科における）の多くの植物の二次代謝産物として生じる。
【０１１９】
グルコシノレートは、水溶性のアニオンで、グルコシドに属する。すべてのグルコシノレートは、硫黄原子を介してグリコン（ｇｌｙｃｏｎｅ）基（硫酸化ケトオキシムを生成）に、また、窒素原子を介して硫酸基に結合する、中央の炭素原子を含有する。さらに、中央の炭素は、側鎖基に結合し、異なるグルコシノレートは、異なる側鎖基を有する。
【０１２０】
約１２０の異なるグルコシノレートが、植物において自然に生じることが知られている。
【０１２１】
本発明に従うグルコシノレートは、好ましくは、脂肪族である。
【０１２２】
本発明において、１つまたは複数の以下のグルコシノレート：４−メチルスルフィニルブチルグルコシノレート、３−メチルスルフィニルプロピルグルコシノレート、４−メチルチオブチルグルコシノレート、および３−メチルチオプロピルグルコシノレートが、重要であってもよいと考えられる。
【０１２３】
一実施形態において、グルコシノレートは、好ましくは、４−メチルスルフィニルブチルグルコシノレート（ＭＳＢ）および／または３−メチルスルフィニルプロピルグルコシノレート（ＭＳＰ）である。
【０１２４】
一実施形態において、グルコシノレートは、好ましくは、４−メチルスルフィニルブチルグルコシノレート（ＭＳＢ）である。
【０１２５】
多くの有用な形質は、形質転換技術によって導入することができる。そのため、形質転換は、選択される導入遺伝子を、本発明のブラシカ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物の中に挿入するために使用されてもよい、またはその代わりに、戻し交雑によって導入することができる導入遺伝子の調製のために使用されてもよい。ブラシカ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）を含む植物の形質転換のための方法は、当業者らによく知られている。
【０１２６】
ベクターが、細胞において、挿入されたＤＮＡを発現することができる限り、植物細胞の形質転換に使用されるベクターは、限定されない。たとえば、ブラシカ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）細胞における構成的遺伝子発現のためのプロモーター（たとえばカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター）および外因性の刺激によって誘導されるプロモーターを含むベクターを使用することができる。適したベクターの例は、ｐＢＩバイナリーベクターを含む。ベクターが導入されることとなる「ブラシカ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）細胞」は、培養細胞懸濁物、プロトプラスト、葉切片、およびカルスなどのようなブラシカ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）細胞の様々な形態を含む。
【０１２７】
ベクターは、ポリエチレングリコール法、ポリカチオン法、エレクトロポレーション、粒子銃、アグロバクテリウム媒介形質転換、およびプロトプラストによる直接ＤＮＡ取り込みなどの既知の方法により、ブラシカ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）細胞に導入される。
【０１２８】
エレクトロポレーションによる形質転換を行うために、細胞の懸濁培養等の脆弱な組織、または胚形成カルスを用いてもよく、あるいは、未熟な胚または他の組織化された組織を直接形質転換してもよい。この技術においては、選択した細胞の細胞壁を、ペクチン分解酵素（ペクトリアーゼ（ｐｅｃｔｏｌｙａｓｅ））に暴露することによって部分的に分解するか、または制御された方法で組織を機械的に傷つけるのがよい。
【０１２９】
形質転換ＤＮＡセグメントを植物細胞へ送達するための効率的な方法は、微粒子銃である。この方法においては、粒子を核酸で被覆し、推進力によって細胞内へ送達する。代表的な粒子としては、タングステン、白金、および好ましくは金によって構成されるものが挙げられる。撃ち込み（ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）のために、懸濁状態の細胞をフィルターまたは固形培地上で濃縮する。あるいは、未熟な胚または他の標的細胞を固形培地上に準備してもよい。撃たれる細胞を、適切な距離でマクロプロジェクタイル（ｍａｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ）停止プレートの下に置く。微粒子銃の技術は広く適用可能であり、事実上あらゆる植物種を形質転換するために用い得るものである。
【０１３０】
アグロバクテリウム媒介移入は、植物細胞へ遺伝子座を導入するために広く適用できる別のシステムである。該方法の利点は、ＤＮＡを植物組織全体に導入することができ、それによりプロトプラストからインタクトな植物を再生させる必要を回避できることである。近代のアグロバクテリウム形質転換ベクターは、大腸菌およびアグロバクテリウム（および他の根粒菌）において複製する能力があり、容易な操作を可能にしている。さらに、アグロバクテリウム媒介遺伝子導入用のベクターにおける近年の技術進歩により、様々なポリペプチドをコードする遺伝子を発現することができるベクターの構築を促進するよう、ベクター中の遺伝子および制限部位の配置が改良されている。記載されるベクターは、挿入されるポリペプチドコード遺伝子の直接発現のためのプロモーターおよびポリアデニル化部位と隣接する便利なマルチリンカー領域を有している。さらに、武装（ａｒｍｅｄ）および非武装（ｄｉｓａｒｍｅｄ）両方のＴｉ遺伝子を含むアグロバクテリウムを、形質転換のために用いることができる。
【０１３１】
アグロバクテリウム媒介形質転換が効率的である植物系統においては、遺伝子座移入の容易かつ定義された性質のため、これが最適な方法である。ＤＮＡを植物細胞へ導入するためのアグロバクテリウム媒介植物組込みベクターの使用は、当該技術分野において周知である（米国特許第５，５６３，０５５号）。例えば、米国特許第５，３４９，１２４号は、アグロバクテリウム媒介形質転換を用いて植物細胞を形質転換する方法を記載する。鱗翅類の幼虫に対して毒性の蛋白質を発現する完全長Ｂ．ｔ．トキシンをコードするＤＮＡコーディング配列を有するキメラ遺伝子を挿入することにより、そのような昆虫に抵抗性を有する植物をもたらす。
【０１３２】
多数のプロモーターが、これらに限定されないが、選択可能なマーカー、点数化可能なマーカー、有害生物（ｐｅｓｔ）耐性、病害抵抗性、栄養強化のための遺伝子、および農業上興味の対象となるあらゆる他の遺伝子を含むあらゆる目的遺伝子の、植物遺伝子発現のために有用である。ブラシカ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物遺伝子発現に有用な構成的プロモーターの例としては、これらに限定されないが、単子葉植物（例えばＤｅｋｅｙｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、１９９０；Ｔｅｒａｄａ  ａｎｄ  Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ、１９９０を参照）を含むほとんどの植物組織において構成的な高レベル発現をもたらすカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）Ｐ−３５Ｓプロモーター；ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーターの直列重複バージョン、増強された３５Ｓプロモーター（Ｐ−ｅ３５Ｓ）、ノパリン合成酵素プロモーター、オクトピン合成酵素プロモーター；および米国特許第５，３７８，６１９号に記載のゴマノハグサモザイクウイルス（Ｐ−ＦＭＶ）プロモーターおよびＰ−ＦＭＶのプロモーター配列が直列に重複したＦＭＶプロモーターの増強されたバージョン（Ｐ−ｅＦＭＶ）、カリフラワーモザイクウイルス１９Ｓプロモーター、サトウキビ桿状ウイルスプロモーター、ツユクサ黄斑ウイルスプロモーター、ならびに植物細胞において発現することが知られている他の植物ＤＮＡウイルスプロモーターが挙げられる。
【０１３３】
本発明の植物へ導入し得る代表的な核酸としては、例えば、別の種からのＤＮＡ配列または遺伝子、または同じ種に由来するかもしくは同じ種の中に存在するが、伝統的な繁殖または育種技術ではなく遺伝子操作法によって受容細胞へ取り込まれる遺伝子または配列が挙げられる。しかし、「外来性」の用語は、形質転換される細胞に通常は存在しない遺伝子、またはおそらく単に形質転換するＤＮＡセグメントもしくは遺伝子において見出されるのと同じ形や構造等において存在しない遺伝子、または通常存在し、天然の発現パターンとは異なる様式で発現させること、例えば、過剰発現させることを望む遺伝子をも意味する。したがって、「外来性」遺伝子またはＤＮＡの用語は、同様の遺伝子が受容細胞中に既に存在しているかどうかに関わらず、受容細胞に導入されるあらゆる遺伝子またはＤＮＡセグメントを意味する。外来性ＤＮＡに含まれるＤＮＡの型には、植物細胞に既に存在しているＤＮＡ、別の植物からのＤＮＡ、異なる生物からのＤＮＡ、または外部で生成されたＤＮＡ、例えば遺伝子のアンチセンスメッセージ（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｍｅｓｓａｇｅ）を含むＤＮＡ配列、または遺伝子の合成もしくは改変されたバージョンをコードするＤＮＡ配列が含まれ得る。
【０１３４】
数千とは言わないまでも数百の異なる遺伝子が知られており、これらは潜在的に本発明のブラシカ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物へ導入することができるであろう。
【０１３５】
一実施形態において、本明細書において教示される、１つまたは複数の多型を有するｍｙｂ２８遺伝子が、前記遺伝子によりブラシカ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物を形質転換することによってブラシカ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物の中に導入されてもよい。
【０１３６】
一実施形態において、本発明は、
ａ）配列番号：１のヌクレオチド８３、１３６、２２６、５６３、６１０、８３０、９９５、１１１６、１５１３、１５７７、１６０６、１６２０、１８２５、１８６３、１８７７、もしくは２０２６に対応する位置の一塩基多型（ＳＮＰ）または
ｂ）配列番号：１のヌクレオチド３２３〜３３２、ヌクレオチド５２１〜５２４、ヌクレオチド７８３〜７８６、ヌクレオチド９０９〜９１４、ヌクレオチド１３６５〜１３６９、１８１１〜１８２１、もしくはヌクレオチド２０４６〜２０５６に存在するヌクレオチドの番号における多型または
ｃ）配列番号：１のヌクレオチド８３６〜８３７、ヌクレオチド８６７〜８６８、もしくはヌクレオチド９４３〜９４４に存在するヌクレオチドの番号における多型
からなる群から選択される少なくとも１つの多型を除いて配列番号：１を含むｍｙｂ２８遺伝子によるブラシカ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物の形質転換に関する。
【０１３７】
一実施形態において、本発明は、配列番号：２４を含むｍｙｂ２８遺伝子または配列番号：２４と少なくとも９７％（少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％など）の同一性を有する配列によるブラシカ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物の形質転換に関する。
【０１３８】
いくつかの実施形態において、例として、バチルス・チューリンゲンシス（Ｂ．ｔ．）遺伝子などのような昆虫耐性についての１つまたは複数の遺伝子、真菌病制御についての遺伝子などのような有害生物耐性、グリフォセート耐性を付与する遺伝子などのような除草剤耐性、および収量、栄養の増強、環境もしくはストレス耐性、または植物生理、成長、発達、形態、もしくは植物産物（複数可）における任意の望ましい変化などのような、品質改良についての遺伝子を含む、さらなる遺伝子および対応する表現型が、ブラシカ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物の中に導入されてもよい。たとえば、構造遺伝子は、その全体が参照によって本明細書において組み込まれる国際公開第９９／３１２４８号パンフレット、その全体が参照によって本明細書において組み込まれる米国特許第５，６８９，０５２号、その全体が参照によって本明細書において組み込まれる米国特許第５，５００，３６５号および米国特許第５，８８０，２７５号において記載されるようなバチルス昆虫防除タンパク質遺伝子を含むが、これらに限定されない、昆虫耐性を付与する任意の遺伝子を含むであろう。他の実施形態において、構造遺伝子は、その全体が参照によって本明細書において組み込まれる米国特許第５，６３３，４３５号において記載されるアグロバクテリウム株ＣＰ４グリフォセート抵抗性ＥＰＳＰ遺伝子（ａｒｏＡ：ＣＰ４）またはその全体が参照によって本明細書において組み込まれる米国特許第５，４６３，１７５号において記載されるグリフォセートオキシドレダクターゼ遺伝子（ＧＯＸ）を含むが、これらに限定されない遺伝子によって付与されるような、除草剤グリフォセートに対する耐性を付与することができる。
【０１３９】
その代わりに、ＤＮＡコード配列は、たとえばアンチセンスまたは同時抑制媒介性のメカニズムを介して内因性遺伝子の発現の標的阻害を引き起こす非翻訳可能ＲＮＡ分子をコードすることによって、表現型に影響を及ぼすことができる。ＲＮＡはまた、所望の内因性ｍＲＮＡ産物を切断するように遺伝子操作された触媒ＲＮＡ分子（すなわちリボザイム）とすることもできる。したがって、興味のある表現型または形態の変化を発現するタンパク質またはｍＲＮＡを産生する任意の遺伝子は、本発明において使用されてもよい。
【０１４０】
グルコシノレートのレベルの増加
適切には「グルコシノレートレベルが増加したアブラナ科野菜植物」または「グルコシノレートレベルが増加したブロッコリー」という用語は、それぞれ、従来の様々なそのアブラナ科野菜またはブロッコリーと比較して、グルコシノレートのレベルが増加したアブラナ科野菜またはブロッコリー植物を意味する。ブロッコリーにおいて、従来の品種は、Ｂ．オレラセアＧＤ３３、育種者系（ｂｒｅｅｄｅｒ  ｌｉｎｅ）５６０２１６、または育種者ＩＤフィールド番号（ｂｒｅｅｄｅｒ  ＩＤ  ｆｉｅｌｄ  ｎｕｍｂｅｒ）２１５３であってもよい。
【０１４１】
用語「グルコシノレートレベルの増加」は、一実施形態において、アブラナ科野菜（ブロッコリーなど）が、同様の条件下で育てられた標準的な（従来の品種の）アブラナ科野菜（標準的な［従来の品種の］ブロッコリーなど）において見つけられる４−メチルスルフィニルブチルグルコシノレート（ＭＳＢ）および／またはメチルスルフィニルプロピルグルコシノレート（ＭＳＰ）のレベルの２〜３倍である、４−メチルスルフィニルブチルグルコシノレート（ＭＳＢ）および／またはメチルスルフィニルプロピルグルコシノレート（ＭＳＰ）のレベルを有することを意味する。
【０１４２】
適切には、用語「グルコシノレートレベルの増加」は、一実施形態において、アブラナ科野菜（ブロッコリーなど）が、約１０〜約１００μモル／乾燥重量ｇを含むことを意味する。適切には、用語「グルコシノレートレベルの増加」は、アブラナ科野菜（ブロッコリーなど）が、少なくとも約１０μモル／乾燥重量ｇ、適切には、少なくとも約１４μモル／乾燥重量ｇ、適切には、少なくとも約１６μモル／乾燥重量ｇ、適切には、少なくとも約２０μモル／乾燥重量ｇ、適切には、少なくとも約２５μモル／乾燥重量ｇ、適切には、少なくとも約３０μモル／乾燥重量ｇ、適切には、少なくとも約５０μモル／乾燥重量ｇ、適切には、少なくとも約７５μモル／乾燥重量ｇを含むことを意味する。グルコシノレートレベルが増加したアブラナ科野菜（ブロッコリーなど）は、Ｍｉｔｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ  Ｔｈｅｏｒ．  Ａｐｐｌ．  Ｇｅｎｅｔ．  （２００３）  １０６，  ７２７−７３４；Ｓａｒｉｋａｍｉｓ  ｅｔ  ａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  （２００６）  １８，  ２１９−２２８、または国際公開第９９／５２３４５号パンフレット（参照によって本明細書において組み込まれる）において記載される。
【０１４３】
一実施形態において、グルコシノレートレベルが増加したアブラナ科野菜（ブロッコリーなど）が、約１０〜約１００μモル／乾燥重量ｇ、適切には、約１４〜約１００μモル／乾燥重量ｇ、適切には、約１６〜約１００μモル／乾燥重量ｇ、適切には、約２０〜約１００μモル／乾燥重量ｇ、適切には、約３０〜約１００μモル／乾燥重量ｇ、適切には、約５０〜約１００μモル／乾燥重量ｇの濃度の４−メチルスルフィニルブチルグルコシノレートおよび／または３−メチルスルフィニルプロピルグルコシノレートを含んでいてもよい。
【０１４４】
たとえば、グルコシノレートレベルが増加したアブラナ科野菜（ブロッコリーなど）における４−メチルスルフィニルブチルグルコシノレートのレベルは、たとえば約８〜約５５μモル／乾燥重量ｇ、適切には、約１０〜約５５μモル／乾燥重量ｇ、適切には、約１０〜約４０μモル／乾燥重量ｇであってもよい。適切には、グルコシノレートレベルが増加したアブラナ科野菜（ブロッコリーなど）における４−メチルスルフィニルブチルグルコシノレートのレベルは、たとえば少なくとも約８μモル／乾燥重量ｇ、適切には、少なくとも約１０μモル／乾燥重量ｇ、適切には、少なくとも約１５μモル／乾燥重量ｇであってもよい。これは、典型的に、４〜５μモル／乾燥重量ｇの範囲のこのグルコシノレートのレベルを有する、小売り店から入手可能なアブラナ科野菜（特にブロッコリー）とはっきりと対照をなす。
【０１４５】
たとえば、グルコシノレートレベルが増加したアブラナ科野菜（ブロッコリーなど）における３−メチルスルフィニルプロピルグルコシノレートのレベルは、たとえば約１．５〜約１０μモル／乾燥重量ｇ、適切には、約２〜約１０μモル／乾燥重量ｇ、適切には、約２〜約８μモル／乾燥重量ｇであってもよい。適切には、グルコシノレートレベルが増加したアブラナ科野菜（ブロッコリーなど）における３−メチルスルフィニルプロピルグルコシノレートのレベルは、たとえば少なくとも約１．５μモル／乾燥重量ｇ、適切には、少なくとも約２μモル／乾燥重量ｇ、適切には、少なくとも約３μモル／乾燥重量ｇ、適切には、少なくとも約４μモル／乾燥重量ｇ、適切には、少なくとも約５μモル／乾燥重量ｇであってもよい。これは、典型的に、０．５〜１μモル／乾燥重量ｇの範囲のこのグルコシノレートのレベルを有する、小売り店から入手可能なアブラナ科野菜（ブロッコリーなど）とはっきりと対照をなす。
【０１４６】
一実施形態において、アブラナ科野菜（ブロッコリーなど）におけるグルコシノレートのレベルが、ブロッコリーについての花部および食用の茎の両方などのような、植物の食用の部分すべてを検査することによって決定される。他の実施形態において、アブラナ科野菜（ブロッコリーなど）におけるグルコシノレートのレベルが、葉のみまたは花部のみまたは根のみを検査することによって決定される。
【０１４７】
たとえば、アブラナ科野菜が、たとえばロケット、ルッコラ、ロボウガラシ、野生のロケット、ケール、またはキャベツなどのように、葉が主に食べられるものである場合、好ましくは、アブラナ科野菜におけるグルコシノレートのレベルは、葉のみを検査することによって決定される。
【０１４８】
アブラナ科野菜が、たとえばブロッコリー、芽キャベツ、またはカリフラワーなどのように、花部が主に食べられるものである場合、好ましくは、アブラナ科野菜におけるグルコシノレートのレベルは、花部のみを検査することによって決定される。
【０１４９】
アブラナ科野菜が、たとえばラディッシュまたはカブなどのように、根が主に食べられるものである場合、好ましくは、アブラナ科野菜におけるグルコシノレートのレベルは、根のみの食用の部分を検査することによって決定される。
【０１５０】
好ましくは、それは、少なくとも本発明において使用されるブロッコリー花部（またはブロッコリー花部のみ）である。
【０１５１】
一実施形態において、用語「増加したグルコシノレートレベル」は、アブラナ科野菜花部または食用の根または食用の葉が、たとえば約１０〜約１００μモル／乾燥重量ｇの増加したグルコシノレートレベルを含有することを意味する。この実施形態において、適切には、用語「増加したグルコシノレートレベル」は、アブラナ科野菜花部または根または葉が、少なくとも約１０μモル／乾燥重量ｇ、適切には、少なくとも約１４μモル／乾燥重量ｇ、少なくとも約１６μモル／乾燥重量ｇ、適切には、少なくとも約２０μモル／乾燥重量ｇ、適切には、少なくとも約２５μモル／乾燥重量ｇ、適切には、少なくとも約３０μモル／乾燥重量ｇ、適切には、少なくとも約５０μモル／乾燥重量ｇ、適切には、少なくとも約７５μモル／乾燥重量ｇを含むことを意味する。
【０１５２】
一実施形態において、用語「増加したグルコシノレートレベル」は、ブロッコリー花部が、たとえば約１０〜約１００μモル／乾燥重量ｇの、高レベルのグルコシノレートを含有することを意味する。本実施形態において、適切には、用語「増加したグルコシノレートレベル」は、ブロッコリー花部が、少なくとも約１０μモル／乾燥重量ｇ、適切には、少なくとも約１４μモル／乾燥重量ｇ、少なくとも約１６μモル／乾燥重量ｇ、適切には、少なくとも約２０μモル／乾燥重量ｇ、適切には、少なくとも約２５μモル／乾燥重量ｇ、適切には、少なくとも約３０μモル／乾燥重量ｇ、適切には、少なくとも約５０μモル／乾燥重量ｇ、適切には、少なくとも約７５μモル／乾燥重量ｇを含むことを意味する。
グルコシノレートレベルが増加したアブラナ科野菜（グルコシノレートレベルが増加したブロッコリーなど）という用語は、その新鮮な自然の状態の、すなわち、ブロッコリー花部および茎などのような頭部全体としての植物材料だけではなく、たとえば小房化（ｆｌｏｒｅｔｉｎｇ）、個別急速凍結（ＩＱＦ）、浸軟、均質化、乾燥、凍結、圧縮などのような、１つまたは複数のさらなる加工ステップにかけられた場合のアブラナ科野菜（ブロッコリーなど）をも指すことが理解されるであろう。
【０１５３】
アブラナ科野菜
当業者は、高グルコシノレートブロッコリー以外の、グルコシノレートを含む植物が知られていることに気づくであろう。グルコシノレートは、フウチョウソウ目由来の植物において存在する。この目は、約１８の科を含み、このうちでアブラナ科およびフウチョウソウ科の２つが最も大きい。
【０１５４】
グルコシノレートを含有するアブラナ科由来のアブラナ科野菜（たとえばアブラナ科野菜作物）は、以下のアブラナ科野菜作物を含む：
＊ブロッコリー
＊ロケット（カキネガラシ（Ｓｉｓｙｍｂｒｉｕｍ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ）；エルーカ・サティバ（Ｅｒｕｃａ  ｓａｔｉｖａ）（ルッコラ）、ディプロタクシス・エルコイデス（Ｄｉｐｌｏｔａｘｉｓ  ｅｒｕｃｏｉｄｅｓ）（ロボウガラシ）、ディプロタクシス・テヌイフォリア（Ｄｉｐｌｏｔａｘｉｓ  ｔｅｎｕｉｆｏｌｉａ）（野生のロケット）、およびブニアス・オリエンタリス（Ｂｕｎｉａｓ  ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）（トルコロケット（Ｔｕｒｋｉｓｈ  Ｒｏｃｋｅｔ））を含む）；ならびに
＊オランダガラシ（ロリパ・ナスタルチウム・アクアチカム（Ｒｏｒｉｐｐａ  ｎａｓｔｕｒｔｉｕｍ  ａｑｕａｔｉｃｕｍ）およびナスタルチウム・オフィシナーレ（Ｎａｓｔｕｒｔｉｕｍ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ）を含む）。
＊カリフラワー、
＊ケール、
＊カブ、
＊コラード、
＊コールラビ、
＊芽キャベツ、
＊ハクサイ、
＊キャノーラ、
＊キャベツ、および
＊ラディッシュ。
【０１５５】
当業者らは、本発明によって提供される方法および組成物の多くの利点を十分に理解するであろう。以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を実証するために含まれる。続く実施例において開示される技術は、本発明の実施において十分に機能するように、発明者らによって発見された技術を示し、したがって、その実施のための好ましいモードを構成すると考えることができることが、当業者らによって十分に理解されたい。しかしながら、当業者らは、本開示を考慮して、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、多くの変形が、開示される特定の実施形態において成され、同様のまたは類似する結果をなお得ることができることを十分に理解されたい。本明細書において引用される参考文献はすべて、それらが、本明細書において用いられる方法論、技術、または組成物を補足する、説明する、その背景を提供する、または教示する程度まで参照によって本明細書において組み込まれる。
【実施例】
【０１５６】
アブラナ科野菜におけるグルコシノレートの産生は、複雑である。図４は、ブラシカ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）における硫黄フラックスの概略図を示す。グルコシノレートのレベルが増加したアブラナ科野菜（たとえばグルコシノレートのレベルが増加したブロッコリー）は、たとえば、国際公開第９９／５２３４５号パンフレットおよび国際出願ＧＢ２００９／００１６４８号明細書（参照によって本明細書において組み込まれる）において記載されるように開発された。
【０１５７】
ブラシカ・ビロサは、非常に高レベルの３−メチルチオプロピルグルコシノレートを有する。ブロッコリー（ブラシカ・オレラセア）と交雑した場合、これは、４−メチルスルフィニルブチルグルコシノレート（グルコラファニン）に変換される。本発明者らは、Ｂ．ビロサが、ブラシカ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物において産生されるグルコシノレートの量を増加させる遺伝子に寄与することを決定した。
【０１５８】
高グルコラファニン形質は、優性であり、したがって、雑種に向けて一方の同系交配体／倍加半数体の親の中に遺伝子移入することのみ必要とされることが分かる。栽培品種Ｇｒｅｅｎ  Ｄｕｋｅに由来する倍加半数体ブロッコリー育種系（ＧＤ  ＤＨと呼ばれる、Ｂｏｕｈｕｏｎ，  Ｅ．  Ｊ．  Ｒ．，  Ｋｅｉｔｈ，  Ｄ．  Ｊ．，  Ｐａｒｋｉｎ，  Ｉ．  Ａ．  Ｐ．，  Ｓｈａｒｐｅ，  Ａ．  Ｇ．，  ＆  Ｌｙｄｉａｔｅ，  Ｄ．  Ｊ．  （１９９６）  Ｔｈｅｏｒ．  Ａｐｐｌ．  Ｇｅｎｅｔ．  ９３，  ８３３−８３９）が入手可能である。
【０１５９】
本発明に先立って、メチルチオアルキルマレートシンターゼ（ＭＡＭ）代謝または分子マーカーが、育種プログラムにおいて使用された。ＭＡＭ１およびＭＡＭ３は、高グルコシノレート形質と密に関連することが知られていた。
【０１６０】
しかしながら、本発明者らは、驚くべきことに、高グルコシノレート（たとえばグルコラファニン）表現型を有するいくつかのブラシカ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）栽培品種が、その形質と関連することが考えられるＭＡＭマーカー対立遺伝子を有しなかったことを観察し、したがって、ＭＡＭマーカーが、必ずしも、高グルコシノレートプロファイルと密に関係するわけではなくまたはその鍵となるわけではなく、そのため、育種におけるマーカーとしてのそれらの使用が、この形質の追跡にとって信頼できるものではないと結論付けた。
【０１６１】
そのため、本発明者らは、グルコシノレートレベルが増加した（特にグルコラファニンが増加した）植物の遺伝子型を決定するために、信頼して、そして一貫して使用することができる、高グルコシノレートについてのマーカーを捜した。
【０１６２】
本発明者らは、驚くべきことに、アブラナ科野菜（たとえばブロッコリー）におけるメチオニン誘発性のグルコシノレート生合成を調節する重要な遺伝子座として転写因子Ｍｙｂ２８遺伝子座を同定した。
【０１６３】
実施例１
Ｍｙｂ２８のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ
Ｍｙｂ２８配列は、ＢＲＡＤブラシカ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）データベースでＭｙｂ２８（Ｂｒａ０２９３１１）についてＢ．ラパ配列を使用して、ＢＬＡＳＴ検索によって同定した（Ｃｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１  ＢＲＡＤ，  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｆｏｒ  Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｐｌａｎｔｓ．  ＢＭＣ  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２０１１；１１：１３６．  ｄｏｉ：  １０．１１８６／１４７１−２２２９−１１−１３６）。アッセイは、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｖ２（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して設計した。プライマーならびに５’−ＦＡＭおよび３’−ＴＡＭＲＡ修飾を有するＴａｑＭａｎプローブは、ＭＷＧ  ＵＫから購入し、配列（配列番号：２６〜２８）は、
Ｍｙｂ２８  Ｆｏｒ  ５’−ＣＴＣＴＴＣＣＴＣＴＴＴＣＣＴＣＧＧＧＴＴＴ−３’、
Ｍｙｂ２８  Ｒｅｖ  ５’−  ＴＧＣＡＡＣＴＣＡＡＧＧＡＡＣＣＴＣＴＣＴＧＡ−３’、
Ｍｙｂ２８  プローブ  ５’−ＡＡＣＣＣＧＧＴＴＴＣＣＧＡＧＡＴＣＡＣＣＡＣＡＣ−３’である。
【０１６４】
Ｍｙｂ２８  ｍＲＮＡレベルは、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  Ｓｔｅｐ  Ｏｎｅ  Ｐｌｕｓ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって決定した。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ反応は、Ｔａｑｍａｎ（登録商標）  ＲＮＡ−ＴＯ−ＣＴ  １−Ｓｔｅｐ  ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘ  ｒｅａｇｅｎｔ  ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、２０ｎｇ全ＲＮＡ、０．２５Ｕｕｌ−１  Ｍｕｌｔｉｓｃｒｉｂｅ（登録商標）、ならびに最適化された濃度のプライマーおよびプローブを含有する、ウェル当たり２０μｌの全容量で、ｍｉｃｒｏａｍｐオプティカル９６ウェルプレートにおいて実行した。
【０１６５】
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ条件は、以下のとおりとした：３０分間４８℃の１サイクル、１０分間９５℃の１サイクル、その後に続く１５秒間９５℃での４０サイクルおよび１分間６０℃での１サイクル。
【０１６６】
Ｍｙｂ２８データは、あるアイアンマン（Ｉｒｏｎｍａｎ）植物由来の全ＲＮＡの段階希釈溶液によって生成した標準曲線を使用して分析した。
【０１６７】
図３は、ブロッコリー栽培品種（すべてグルコシノレートレベルが増加した栽培品種である１１９９、１６３９、およびＨＧ１栽培品種−たとえばグルコラファニンが増加した栽培品種の葉におけるＭｙｂ２８発現を示す。
【０１６８】
ＭＹＢ２８配列決定
Ｍｙｂ２８配列は、ＢＲＡＤブラシカ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）データベースでＭｙｂ２８（Ｂｒａ０２９３１１）についてＢ．ラパ配列を使用して、ＢＬＡＳＴ検索によって同定する（Ｃｈｅｎｇ，  Ｆ．；  Ｌｉｕ，  Ｓ．；  Ｗｕ，  Ｊ．；  Ｆａｎｇ，  Ｌ．；  Ｓｕｎ，  Ｓ．；  Ｌｉｕ，  Ｂ．；  Ｌｉ，  Ｐ．；  Ｈｕａ，  Ｗ．；  Ｗａｎｇ，  Ｘ．，  ＢＲＡＤ，  Ｔｈｅ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｆｏｒ  Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｐｌａｎｔｓ．  ＢＭＣ  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２０１１，  １１，  １３６）。
【０１６９】
プライマーは、Ｐｒｉｍｅｒ３  ｖｅｒｓｉｏｎ  ０．４．０を使用して設計し（Ｒｏｚｅｎ  Ｓ，  Ｓ．  Ｈ．  Ｊ．，  Ｐｒｉｍｅｒ３  ｏｎ  ｔｈｅ  ＷＷＷ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｕｓｅｒｓ  ａｎｄ  ｆｏｒ  ｂｉｏｌｏｇｉｓｔ  ｐｒｏｇｒａｍｍｅｒｓ．  Ｉｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｋｒａｗｅｔｚ  Ｓ，  Ｍ．  Ｓ．，  Ｅｄ．  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ：  Ｔｏｔｏｗａ，  ＮＪ，  ２０００；  ｐｐ  ３６５−３８６）、ＭＷＧ  ＵＫから購入する。
【０１７０】
ＤＮＡは、ＱＩＡＧＥＮ  ＤＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍａｘｉ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して、葉材料から抽出する。ＭＹＢ２８  Ｆｏｒ  ５’−ＴＣＡＣＧＡＡＣＡＴＧＧＡＧＡＡＧＧＴＧ−３’（配列番号：３）、ＭＹＢ２８  ＲＥＶ  ５’−ＴＧＡＧＣＴＴＧＡＣＣＧＧＧＡＧＴＡＴＣ−３’（配列番号４）。
【０１７１】
ＰＣＲ反応は、１×Ｇｒｅｅｎ  ＧｏＴａｑ（登録商標）  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、２．５  ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．２  ｍＭ  ｄＮＴＰ、０．２μＭプライマー、０．５ユニット  ＧｏＴａｑ（登録商標）  ＤＮＡポリメラーゼ、および１５〜５０ｎｇ  ＤＮＡを含有する２０μｌの全容量で実行する。
【０１７２】
ＰＣＲ条件は以下のとおりとする：２分間９５℃、その後に続く、３０秒間９５℃、１分間５３℃、および１分間７２℃の３５サイクル、最後の伸長前に５分間７２℃。ＰＣＲ産物は、アガロースゲル上にゲル電気泳動によって流し、配列決定のためにＴＧＡＣ（Ｎｏｒｗｉｃｈ、ＵＫ）に送る前にＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して精製する。
【０１７３】
実施例２
Ｂ．ビロサおよびＢ．オレラセア育種系の間のＭＹＢ２８コード領域における多型の同定
ブラシカ・オレラセア変種イタリカ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａ  ｖａｒ  ｉｔａｌｉｃａ）Ｒ２Ｒ３（ＮＣＢＩ受託番号ＧＱ４７８９９２．１）由来のＭＹＢ２８  ｍＲＮＡ全コード配列を使用して、３００〜５００ｂｐの断片を増幅するために、プライマーを手で設計した（表１）。
【０１７４】
【表１−１】
2014064567.tif 000002
【表１−２】
2014064567.tif 000003
【０１７５】
表１におけるプライマーは、本明細書において、それぞれ、配列番号：３〜配列番号：２３と指定する。これらのプライマーを使用して、Ｂ．ビロサ由来のＦＴ６９対立遺伝子を含有する個体およびＢ．オレラセア対立遺伝子を含有する個体から断片を増幅した。Ｂ．オレラセア対立遺伝子を同定するために使用した個体は、育種材料から無作為に選んだ。ＦＴ６９  Ｂ．ビロサ対立遺伝子およびＢ．オレラセア対立遺伝子を含有する個体から、コード配列の様々なセグメントを増幅した、
【０１７６】
ＤＮＡは、Ｗｈａｔｍａｎフィルタープレートを使用して、葉材料から抽出した。ＰＣＲ反応は、ＭｇＣｌ２を含有する１×ＰＣＲバッファー、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ、０．１μＭプライマー、０．４ユニット  ＤｒｅａｍＴａｑ（登録商標）  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）、および５０〜１００ｎｇのＤＮＡを含有する２０μｌの全容量で実行した。
【０１７７】
以下のＰＣＲ条件：２分間９５℃、その後に続く３０秒間９５℃、３０秒間５６℃、および１分間７２℃の３５サイクル、最後の伸長前に５分間７２℃。ＰＣＲ産物は、ＢｉｇＤｙｅ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してそれらを配列決定する前に、ＥｘｏヌクレアーゼおよびＳＡＰを使用して精製した。
【０１７８】
セグメント配列は、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ  ５．０（Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用し、２０塩基対の最小限のオーバーラップおよび９０％の最小限のマッチを使用して、２つのコンティグ（ＦＴ６９およびオレラセア）にアライメントした。高ＭＳＢおよびＭＳＰ系はすべて、Ｂ．ビロサＦＴ６９対立遺伝子由来のＭｙｂ２８断片を含有し、コントロール系は、Ｂ．オレラセア対立遺伝子を含有する個体を構成することが明確である。
【０１７９】
Ｂ．オレラセア系に使用する個体は：
ＧＤ３３
育種系統５６０２１６
育種系統ＩＤフィールド番号２１５３とする。
【０１８０】
Ｂ．ビロサＦＴ６９対立遺伝子を含有する、使用した個体は：
育種系統５６０５２６（ＭＳＰ）
育種系統５８０３３３（ＭＳＢ）
育種系統ＢＲＭ  ５１−１１６２（ＭＳＰ）
育種系統ＢＲＭ５１−１２１０（ＭＳＰ）とする。
【０１８１】
Ｂ．オレラセア対立遺伝子を同定するために使用した個体は、育種材料から無作為に選んだ。
【０１８２】
これらの配列アライメントを比較することによって、最適なＭｙｂ２８対立遺伝子を選択するためにマーカーベースの選択に使用することができる多型を発見した（図１を参照されたい）。
【０１８３】
合計２６の多型（たとえば単一特徴多型（ＳＦＰ）−１６のＳＮＰおよび１０のインデルがある）が、２２０２ｂｐの全長を有する配列において検出される。これらは、グルコシノレートのレベルが増加したブロッコリー、たとえばＢ．ビロサについてのＭｙｂ２８遺伝子座（ＦＴ６９）のコンセンサス配列およびグルコシノレートのレベルが増加していないブロッコリー、たとえばＢ．オレラセアについてのＭｙｂ２８遺伝子座（Ｏｌｅｒａｃｅａ）のコンセンサス配列の間のアライメントを示す図１において示される。これらのＳＦＰは、Ｂ．ビロサ遺伝子移入を示す。
【０１８４】
図２ａは、配列番号：１；グルコシノレートレベルが増加していないブラシカ・オレラセア（ブロッコリー）由来のＭｙｂ２８遺伝子座を含む核酸断片の配列を示す。ＳＦＰ（ＳＮＰおよびインデル、たとえば欠失させることができるヌクレオチドの両方を含む）に網掛けする。間にＳＦＰ（インデル挿入）が挿入されてもよいヌクレオチドに下線を引く。
【０１８５】
図２ｂは、配列番号：２；グルコシノレートレベルが増加していないブラシカ・オレラセア（ブロッコリー）由来のＭｙｂ２８遺伝子座を含む核酸断片の配列を示す。ＳＦＰ（ＳＮＰおよびインデル、たとえば欠失させることができるヌクレオチドの両方を含む）に網掛けする。角括弧＜＞中の断片（および小文字のヌクレオチド）は、ブラシカ・オレラセア配列におけるＳＦＰ（挿入であるインデル）に対応し、これらの挿入は、高グルコシノレートブロッコリー（たとえばブラシカ・ビロサ）において見つけられる。
【０１８６】
検出される多型は、
ａ．配列番号：１のヌクレオチド８３、１３６、２２６、５６３、６１０、８３０、９９５、１１１６、１５１３、１５７７、１６０６、１６２０、１８２５、１８６３、１８７７、もしくは２０２６に対応する位置の一塩基多型（ＳＮＰ）および
ｂ．配列番号：１のヌクレオチド３２３〜３３２、ヌクレオチド５２１〜５２４、ヌクレオチド７８３〜７８６、ヌクレオチド９０９〜９１４、ヌクレオチド１３６５〜１３６９、１８１１〜１８２１、もしくはヌクレオチド２０４６〜２０５６に存在するヌクレオチドの番号における多型および
ｃ．配列番号：１のヌクレオチド８３６〜８３７、ヌクレオチド８６７〜８６８、もしくはヌクレオチド９４３〜９４４に存在するヌクレオチドの番号における多型である。
【０１８７】
実施例３
新しいマーカーの検証
ＴａｑＭａｎアッセイ（ＮＢＯＬＩ００９１１１３７０）は、実施例２において同定された配列多型のうちの１つに基づいて設計した。
【０１８８】
ＮＢＯＬＩ００９１１１３７０配列（配列番号：２９）：
ＧＡＣＣＡＣＣＴＡＡＡＧＡＣＡＡＧＡＡＴＡＧＴＧＡＡＡＧＡＧＡＴＡＡＧＡＴＧＧＡＡＧＡＣＣＡＡＡＧＴＴＡＡＴＣＡＡＡＴＴＴＡＴＴＴＴＧＡＡＧＣＴＴＴＴ［Ｃ／Ｔ］ＴＡＴＧＧＡＡＴＡＧＡＧＡＣＴＡＡＡＡＴＧＡＴＧＴＧＴＧＣＴＡＴＴＧＣＡＡＴＴＴＴＴＡＧＴＣＡＣＡＴＡＴＴＧＣＴＡＡＴＣＡＡＡＣＡＣＡＴＡＴＴＴＴＧＣＡＴＣＡＧＡＧＡＡＴＴＧＴＣＡＡＡＴＡＣＡＴＧＡＡＡＡＡＡＡＴＡＡＡＧＡＡＴＡＡＴＴＴＴＴ
【０１８９】
フォワードプライマー（配列番号：３０）：ＧＴＧＡＡＡＧＡＧＡＴＡＡＧＡＴＧＧＡＡＧＡＣＣＡＡＡＧＴ
リバースプライマー（配列番号：３１）：ＧＴＧＡＣＴＡＡＡＡＡＴＴＧＣＡＡＴＡＧＣＡＣＡＣＡＴＣＡ
Ｖｉｃプローブ（配列番号：３２）：ＣＴＡＴＴＣＣＡＴＡＧＡＡＡＡＧＣ
Ｆａｍプローブ（配列番号：３３）：ＣＴＡＴＴＣＣＡＴＡＡＡＡＡＡＧＣ
【０１９０】
５ｕＬ容量の２０ｎｇのＤＮＡ鋳型をプレートにロードする。１０ｕＬマスターミックス（それぞれ１×ＰＣＲミックス、０．４３７ｕＬ水、２．５ｕＬのＱ  ＰＣＲ（ＲＯＸ）ミックス、０．０６３ｕＬアッセイミックス、５ｎｇ／ｕＬの２ｕＬプライマーを２部）を、それぞれのウェルに追加し、１５ｕＬの最終容量にする。
【０１９１】
ＰＣＲ条件は以下のとおりとする：２分間５０℃、その後に続く２分間９５℃、その後、１５秒間９５℃の４０サイクル、１分間６０℃。
【０１９２】
このＴａｑｍａｎアッセイは、１０２系の代表的な生殖質パネル上で実行した（図６）。Ｂ．ビロサ遺伝子移入の予想される存在に基づいて、このマーカーが、Ｂ．ビロサ対立遺伝子の存在に基づいて高グルコシノレート表現型を１００％予測することが決定された。
【０１９３】
実施例４
新しいマーカーの開発
ＦＴ６９対立遺伝子およびＢ．オレラセア対立遺伝子の間の保存配列（ＳＦＰの中間の配列）を決定した、また、これらは、Ｍｙｂ２８コード領域の外側の配列および多型決定のために、Ｓｉｅｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９５）  （Ａｎ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ＰＣＲ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｗａｌｋｉｎｇ  ｉｎ  ｕｎｃｌｏｎｅｄ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２３：  １０８７−１０８８）  によって記載されるようにプライマー設計およびゲノムウォーキングに使用することができる。ゲノムウォーキングのこの方法から決定されたさらなる多型は、本明細書において記載される他のマーカーに対するそれらの物理的に近い距離および遺伝的な関係により、高グルコシノレート形質を追跡するのにさらに有用となるであろう。これらのマーカーは、Ｍｙｂ２８に対して１、３、５、または１０ｃＭ以内にあってもよく、高グルコシノレート表現型を追跡するのに有用なさらなるマーカーアッセイを提供してもよい。
【０１９４】
そのため、一実施形態において、本発明は、アライメントされた場合に、配列番号：１および配列番号：２４の間で保存される、少なくとも１８の隣接ヌクレオチドの配列を含む単離核酸を提供する。保存配列は、配列番号：１の少なくとも１８の隣接ヌクレオチドの配列を含む単離核酸を調製するために使用され、その配列が、配列番号：２４内に存在しない。その代わりに、保存配列は、配列番号：２４の少なくとも１８の隣接ヌクレオチドの配列を含む単離核酸を調製するために使用され、その配列が、配列番号：１内に存在しない。
【０１９５】
上記の本明細書において言及される刊行物はすべて、参照によって本明細書において組み込まれる。本発明の記載される方法および系の様々な修飾および変形は、本発明の範囲および精神から逸脱することなく、当業者らに明らかになるであろう。本発明は、特定の好ましい実施形態に関して記載したが、主張される本発明がそのような特定の実施形態に不当に限定されないことが理解されたい。実際、生化学およびバイオテクノロジーまたは関係する分野における当業者らに明らかな、本発明を実行するための記載されるモードの様々な修飾は、以下の特許請求の範囲内にあるように意図される。
【図１−１】
2014064567.tif 000004
【図１−２】
2014064567.tif 000005
【図１−３】
2014064567.tif 000006
【図２ａ】
2014064567.tif 000007
【図２ｂ】
2014064567.tif 000008
【図３】
2014064567.tif 000009
【図４】
2014064567.tif 000010
【図５】
2014064567.tif 000011
【図６】
2014064567.tif 000012
【配列表】
2014064567000001.app
【外国語明細書】
2014064567.tif 000013
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【配列表】
2014064567000002.app