(57)【要約】【課題】一般性が高くより簡便な食品中の乳脂肪含有量の測定法を提供すること。【解決手段】食品試料中に含まれる１，２−ジパルミトイル−３−ブチロイル−ｓｎ−グリセロール（ｓｎ−ＰＰＢｕ）及び１−ブチロイル−２，３−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロール（ｓｎ−ＢｕＰＰ）をＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより定量する工程；ｓｎ−ＰＰＢｕ及びｓｎ−ＢｕＰＰの測定値から以下の［式１］により乳脂肪含量を算出する工程；食品試料中の１，３−ジパルミトイル−２−ブチロイル−ｓｎ−グリセロール（ｓｎ−ＰＢｕＰ）を検出する工程；を順次備えた食品中の乳脂肪含量の測定法。  乳脂肪含量（ｇ／１００ｇ）＝｛ｓｎ−ＰＰＢｕ測定値（ｇ）＋ｓｎ−ＢｕＰＰ測定値（ｇ）｝／Ｋ×１００［式１］  （但し、Ｋは、乳脂肪１００ｇ中に含まれるｓｎ−ＰＰＢｕ及びｓｎ−ＢｕＰＰの含有量）【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程（ａ）及び（ｂ）を順次備えた、食品中の乳脂肪含量の測定法。
（ａ）食品試料中に含まれる１，２−ジパルミトイル−３−ブチロイル−ｓｎ−グリセロール（ｓｎ−ＰＰＢｕ）及び１−ブチロイル−２，３−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロール（ｓｎ−ＢｕＰＰ）を定量する工程；
（ｂ）ｓｎ−ＰＰＢｕ及びｓｎ−ＢｕＰＰの測定値から次式により乳脂肪含量を算出する工程；
乳脂肪含量（ｇ／１００ｇ）＝｛ｓｎ−ＰＰＢｕ測定値（ｇ）＋ｓｎ−ＢｕＰＰ測定値（ｇ）｝／Ｋ×１００
（但し、Ｋは、乳脂肪１００ｇ中に含まれるｓｎ−ＰＰＢｕ及びｓｎ−ＢｕＰＰの含有量）
【請求項２】
工程（ａ）において、ｓｎ−ＰＰＢｕ及びｓｎ−ＢｕＰＰをＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより定量することを特徴とする請求項１記載の食品中の乳脂肪含量の測定法。
【請求項３】
工程（ａ）において、内部標準を用いることを特徴とする請求項１又は２記載の食品中の乳脂肪含量の測定法。
【請求項４】
工程（ａ）において、食品試料から油脂を単離することなく、食品試料を有機溶剤で直接希釈して、ｓｎ−ＰＰＢｕ及びｓｎ−ＢｕＰＰを定量することを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の食品中の乳脂肪含量の測定法。
【請求項５】
さらに、（ｃ）食品試料中の１，３−ジパルミトイル−２−ブチロイル−ｓｎ−グリセロール（ｓｎ−ＰＢｕＰ）を検出する工程；を備えたことを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載の食品中の乳脂肪含量の測定法。
【請求項６】
工程（ｂ）のに前に、Ｃ２８カラム又はＣ３０カラムを用いた逆相液体クロマトグラフィーにより、ｓｎ−ＰＰＢｕ及びｓｎ−ＢｕＰＰとｓｎ−ＰＢｕＰとを分離することを特徴とする請求項５記載の食品中の乳脂肪含量の測定法。
【請求項７】
対照としての１，２−ジパルミトイル−３−ブチロイル−ｓｎ−グリセロール（ｓｎ−ＰＰＢｕ）と１−ブチロイル−２，３−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロール（ｓｎ−ＢｕＰＰ）との任意の比の混合物を含む標準溶液を備えたことを特徴とする食品中の乳脂肪含量を測定するためのキット。
【請求項８】
ｓｎ−ＰＰＢｕとｓｎ−ＢｕＰＰとの任意の比の混合物が、１，２−ジパルミトイル−３−ブチロイル−ｒａｃ−グリセロール（ｒａｃ−ＰＰＢｕ）であることを特徴とする請求項７記載の食品中の乳脂肪含量を測定するためのキット。
【請求項９】
標準溶液が、さらに１，３−ジパルミトイル−２−ブチロイル−ｓｎ−グリセロール（ｓｎ−ＰＢｕＰ）を含むことを特徴とする請求項７又は８記載の食品中の乳脂肪含量を測定するためのキット。
【請求項１０】
ｓｎ−ＰＰＢｕとｓｎ−ＢｕＰＰとの任意の比の混合物を含む標準溶液、若しくはｒａｃ−ＰＰＢｕ標準溶液を含む標準溶液、又はｓｎ−ＰＢｕＰを含む標準溶液が、内部標準を含む標準溶液であることを特徴とする請求項７〜９のいずれか記載の食品中の乳脂肪含量を測定するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、食品中の乳脂肪含量の測定法に関し、さらに詳細には、液体クロマトグラフィーとタンデム型質量分析法を組み合わせた方法（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）により、食品中に含まれる１,２−ジパルミトイル−３−ブチロイル−ｓｎ−グリセロール（ｓｎ−ＰＰＢｕ）及び１−ブチロイル−２，３−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロール（ｓｎ−ＢｕＰＰ）を定量し、かかるｓｎ−ＰＰＢｕ及びｓｎ−ＢｕＰＰの測定値から食品中に含まれる乳脂肪の含有量を算出する方法や、食品中の乳脂肪含量の測定に用いるためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
バター等の乳脂肪は、重要な食用油脂の一つであり、特徴的なフレーバーをもつことから、クッキーやビスケット、パンなどの食品には風味向上のため、乳脂肪が使われている。マーガリンをはじめとする加工油脂製品にも、バターが添加してあるものがある。
【０００３】
このような食品中の乳脂肪含有量は商品価値に影響するため、その含有量を知ることはメーカーや販売者にとって必要かつ重要である。
【０００４】
乳脂肪は、酪酸、カプロン酸などの短鎖脂肪酸が豊富に含まれており、これが他の油脂には無い乳脂肪の特徴である。従来の乳脂肪含有量の測定方法としては、Iverson, J. and Sheppard, A. J. J. of the AOAC 1977年60巻284-288頁に開示されるように、油脂をエステル交換で誘導体化し、酪酸エステルの量をガスクロマトグラフィー（ＧＣ）で測定する方法が一般化している。しかし、このような酪酸エステルへと誘導化する方法では、酪酸エステル等の短鎖脂肪酸エステルは揮発性が高く、水に溶けやすいため、誘導体化処理の際に損失してしまい、正確な乳脂肪含有量が求められないことがあるという問題がある。
【０００５】
また、近年では、油脂を誘導体化せず、直接ＧＣに導入する方法が報告されている。Buchgraber, M., Androni, S., and Anklam, E. J. Agric. Food Chem. 2007年55巻3275-3283頁には、酪酸を含有しているトリアシルグリセロール、例えば１−パルミトイル−２−ステアロイル−３−ブチロイル-グリセロール（ＰＳＢ）を指標とする、乳脂肪含有量の測定方法が開示されている。しかし、ＰＳＢを直接ＧＣに導入し乳脂肪含有量を測定する方法においては、トリアシルグリセロールの熱分解を防ぎＧＣに導入するための特殊な設備が必要である。
【０００６】
この他にも、Kemppinen, A., and Kalo, P. J. Chromatogr. A 2006年1134巻260-283頁には、バター中のトリアシルグリセロールをガスクロマトグラフィーと質量分析とを組み合わせた測定法（ＧＣ−ＭＳ）で、トリアシルグリセロールの含量を測定する方法が開示されている。しかしながら、このようなＧＣ−ＭＳを用いる方法で、バター中の乳脂肪の総量を決定するには、複数のトリアシルグリセロールの含量を測定する必要があり、正確性に欠けるという問題がある。
【０００７】
また、近年の油脂加工技術の進展から、高度なエステル交換技術により、エステル交換による油脂加工も可能である。しかし、上記のＧＣを用いる方法では、トリアシルグリセロールの位置異性体を分離することができないため、エステル交換による油脂加工工程の有無を検出することは不可能である。
【０００８】
トリアシルグリセロールの位置異性体を分離して、それぞれの位置異性体の含量を測定する方法としては、ＧＣによる測定とＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる測定とを組み合わせる方法が、国際公開２００８／０１０５４３号パンフレット及び特開２００９−１５３４２５号公報に開示されている。これらに示された方法では、油脂組成物中の各トリアシルグリセロールの含有量をＧＣで測定した後に、オレイルジパルミトイルグリセロールの各位置異性体、すなわち３−オレイル−１，２−ジパルミトイルグリセロール（ＰＰＯ）及び２−オレイル−１，３−ジパルミトイルグリセロール（ＰＯＰ）の存在比をＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる測定で決定し、油脂組成分中のＰＰＯ及びＰＯＰの含有量を決定する方法が開示されている。
【０００９】
一方、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳのみを用いることで乳脂肪含有量を測定する方法もKalo, P., Kemppinen, A., Ollilainen, V., and Kuksis, A. Lipids 2004年39巻915-928頁に開示されている。この方法は、順相のカラムを用いた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）と電子イオン化法を用いたＬＣ−ＭＳ／ＭＳを利用する方法であり、エステル交換反応によって調製した短鎖脂肪酸を含むトリアシルグリセロール混合品から、molar correction factor（ＭＣＦ）という係数を計算し、これを用いて食品サンプル中の乳脂肪の含有量を定量できるというものである。この方法によると、食品サンプル中の乳脂肪は、抽出後にシリカゲルのフラッシュカラムを用いて４つの画分に分けられ、それらをＬＣ−ＭＳ／ＭＳに供し、検出されたそれぞれのピークとＭＣＦを比較することで、各イオンの対応するトリアシルグリセロールの量を決定することで、サンプル中の乳脂肪の含有量を決定している。一方、この方法では合成したトリアシルグリセロール混合品の各種トリアシルグリセロール異性体比をＧＣによって測定するなど、複雑な操作が必要であり、汎用性に乏しい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】国際公開２００８／０１０５４３号パンフレット
【特許文献２】特開２００９−１５３４２５号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Iverson, J. and Sheppard, A. J. J. of the AOAC 1977年60巻284-288頁
【非特許文献２】Buchgraber, M., Androni, S., and Anklam, E. J. Agric. Food Chem. 2007年55巻3275-3283頁
【非特許文献３】Kemppinen, A, and Kalo, P. J. Chromatogr. A 2006年1134巻260-283頁
【非特許文献４】Kalo, P., Kemppinen, A., Ollilainen, V., and Kuksis, A. Lipids 2004年39巻915-928頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
上記に示すように、従来の食品中の乳脂肪含有量の測定方法は、誘導体化を必要とするもの、特別な装置を必要とするもの、多段階の測定法を組み合わせるもの、又は複雑な測定が必要とされる方法である。また、従来の食品中の乳脂肪含有量の測定方法では、乳脂肪含有量を測定する際に、食品からFolch法などによる脂質成分の抽出が必要とされていた。このため、一般性が高くより簡便な乳脂肪含有量の測定法の開発が望まれていた。すなわち、本発明の課題は、一般性が高くより簡便な食品中の乳脂肪含有量の測定法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討し、乳脂肪中のｓｎ−ＰＰＢｕ及びｓｎ−ＢｕＰＰ含量が一定値となるとの知見を得て、ｓｎ−ＰＰＢｕ及びｓｎ−ＢｕＰＰを指標とし、食品中のｓｎ−ＰＰＢｕ及びｓｎ−ＢｕＰＰ含量をＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより定量して、この定量値から食品中の乳脂肪含有量を算出しうることを見いだし、本発明を完成するに至った。
【００１４】
すなわち、本発明は
（１）以下の工程（ａ）及び（ｂ）を順次備えた、食品中の乳脂肪含量の測定法
（ａ）食品試料中に含まれるｓｎ−ＰＰＢｕ及びｓｎ−ＢｕＰＰを定量する工程；
（ｂ）ｓｎ−ＰＰＢｕ及びｓｎ−ＢｕＰＰの測定値から次式１により乳脂肪含量を算出する工程；
乳脂肪含量（ｇ／１００ｇ）＝｛ｓｎ−ＰＰＢｕ測定値（ｇ）＋ｓｎ−ＢｕＰＰ測定値（ｇ）｝／Ｋ×１００  ［式１］
（但し、Ｋは、乳脂肪１００ｇ中に含まれるｓｎ−ＰＰＢｕ及びｓｎ−ＢｕＰＰの含有量）
に関し、
（２）工程（ａ）において、ｓｎ−ＰＰＢｕ及びｓｎ−ＢｕＰＰをＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより定量することを特徴とする上記（１）記載の食品中の乳脂肪含量の測定法に関し、
（３）工程（ａ）において、内部標準を用いることを特徴とする（１）又は（２）記載の食品中の乳脂肪含量の測定法に関し、
（４）工程（ａ）において、食品試料から油脂を単離することなく、食品試料を有機溶剤で直接希釈して、ｓｎ−ＰＰＢｕ及びｓｎ−ＢｕＰＰを定量することを特徴とする上記（１）〜（３）のいずれか記載の食品中の乳脂肪含量の測定法に関し、
（５）さらに、（ｃ）食品試料中のｓｎ−ＰＢｕＰを検出する工程；を備えたことを特徴とする上記（１）〜（４）のいずれか記載の食品中の乳脂肪含量の測定法に関し、
（６）工程（ｂ）のに前に、Ｃ２８カラム又はＣ３０カラムを用いた逆相液体クロマトグラフィーにより、ｓｎ−ＰＰＢｕ及びｓｎ−ＢｕＰＰとｓｎ−ＰＢｕＰとを分離することを特徴とする上記（５）記載の食品中の乳脂肪含量の測定法に関し、
（７）対照としてのｓｎ−ＰＰＢｕとｓｎ−ＢｕＰＰとの任意の比の混合物を含む標準溶液を備えたことを特徴とする食品中の乳脂肪含量を測定するためのキットに関し、
（８）ｓｎ−ＰＰＢｕとｓｎ−ＢｕＰＰとの任意の比の混合物が、１，２−ジパルミトイル−３−ブチロイル−ｒａｃ−グリセロール（ｒａｃ−ＰＰＢｕ）であることを特徴とする上記（７）記載の食品中の乳脂肪含量を測定するためのキットに関し、
（９）さらに、ｓｎ−ＰＢｕＰを含む標準溶液を備えたことを特徴とする上記（７）又は（８）記載の食品中の乳脂肪含量を測定するためのキットに関し、
（１０）ｓｎ−ＰＰＢｕとｓｎ−ＢｕＰＰとの任意の比の混合物を含む標準溶液、若しくは、ｒａｃ−ＰＰＢｕを含む標準溶液、又はｓｎ−ＰＢｕＰを含む標準溶液が、内部標準を含む標準溶液であることを特徴とする上記（７）〜（９）のいずれか記載の食品中の乳脂肪含量を測定するためのキットに関する。
【発明の効果】
【００１５】
従来の食品中に含有される乳脂肪の測定法、例えば、非特許文献１に記載された酪酸ブチルを指標とした乳脂肪含有量の測定法では、定容した食品サンプルに水酸化ナトリウムのｎ−ブタノール溶液加え、トリフッ化ホウ素−ブタノール試薬を用いて処理し、遠心分離を用いて抽出した酪酸ブチルを再度定容することで試料溶液を調製するといった煩雑な前処理が必要である。また、非特許文献２に示されたトリアシルグリセロールを直接ＧＣに供する方法では、ＧＣのインジェクションのためにコールドオンカラム注入法を用いなければならず、特殊な設備が必要とされる。この他にも、非特許文献４に記載されたＬＣ−ＭＳ／ＭＳを利用する、乳脂肪中のトリアシルグリセロール含有量の測定法では、バター中の乳脂肪を、シリカゲル薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）又はシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーを用いてトリアシルグリセロール成分だけを抽出し、このトリアシルグリセロール成分をＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いて分析する方法が示されている。
【００１６】
さらに、従来法での食品中の乳脂肪含有量の測定のためには、Folch法等により食品中の脂質成分を、懸濁、溶出、遠心分離等の操作を行うことで抽出した試料サンプルを用いる等の煩雑な前処理が必要であった。
【００１７】
これに対して、本発明の乳脂肪含量の測定法によると、対象とする乳脂肪を含有する食品等を、必要に応じて粉砕し、定容するという非常に簡便な前処理だけで、食品中の乳脂肪含有量の測定を行うことができる。また、ｓｎ−ＰＰＢｕ及びｓｎ−ＢｕＰＰの量を測定するだけで、食品中の乳脂肪含有量を算出することができる。さらに、ｓｎ−ＰＰＢｕ及びｓｎ−ＢｕＰＰの位置異性体、すなわちｓｎ−ＰＢｕＰを利用することで、エステル交換による油脂加工工程の有無を定性的に検出することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】試料溶液の調製方法の概略を示す図である。方法Ａ−従来法による抽出法、及び方法Ｂ−ワンポット抽出法。
【図２】実施例１に示したｒａｃ−ＰＰＢｕ（r．ｔ． １７．４ｍｉｎ）及びｓｎ−ＰＢｕＰ（ｒ．ｔ．１５．７ｍｉｎ）を含有する標準溶液のクロマトグラムである。
【図３】実施例１の方法Ａで求めたｒａｃ−ＰＰＢｕの検量線である。
【図４】実施例１の方法Ｂで求めたｒａｃ−ＰＰＢｕの検量線である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
［食品中の乳脂肪含量の測定法］
本発明の食品中の乳脂肪含量の測定法としては、食品試料中に含まれるｓｎ−ＰＰＢｕ及びｓｎ−ＢｕＰＰを定量する工程（ａ）と、ｓｎ−ＰＰＢｕ及びｓｎ−ＢｕＰＰの測定値から次式１により乳脂肪含量を算出する工程（ｂ）を順次備えた方法であれば特に制限されず、ここで食品とは、飲料をも含む食品製品、食品素材、食品原料をいい、その形態としては、液体状、固体状、ゲル状、顆粒状、粉末状、タブレット状等を挙げることができる。また、乳脂肪とは、牛等の反芻動物の乳由来の脂質であり、特に牛の乳由来の脂質を好適に例示することができる。乳脂肪は、バターやバターオイルの原材料として用いることができる。
【００２０】
乳脂肪含量（ｇ／１００ｇ）＝｛ｓｎ−ＰＰＢｕ測定値（ｇ）＋ｓｎ−ＢｕＰＰ測定値（ｇ）｝／Ｋ×１００  ［式１］
【００２１】
式１において、Ｋ値は乳脂肪１００ｇ中に含まれるｓｎ−ＰＰＢｕ及びｓｎ−ＢｕＰＰの合計含有量のことであり、別途、乳脂肪原料１００ｇ中に含まれるｓｎ−ＰＰＢｕ及びｓｎ−ＢｕＰＰの合計含有量を本発明の乳脂肪含量の測定法の工程（ａ）により定量することにより、Ｋ値を求めるができる。
【００２２】
Ｋ値は、例えば、本明細書中の実施例３においては、３種類のバターオイルについて、試料溶液の調製方法として方法Ａを用いたときはＫ＝３．９１であり、試料溶液の調製方法として方法Ｂを用いたときはＫ＝３．９９である。また、実施者が独自に求めることも可能であり、特に食品中に含まれる乳脂肪原料が既知である場合は、同じ原料のＫ値を求めることで、該食品中の乳脂肪の含量を正確に求めることができる。また、乳脂肪原料が未知である場合には、前記の本明細書中の実施例記載の方法で求めたＫ値を用いることもできる。
【００２３】
工程（ａ）において食品中のｓｎ−ＰＰＢｕ及びｓｎ−ＢｕＰＰの定量は、（ｉ）まずｓｎ−ＰＰＢｕとｓｎ−ＢｕＰＰ任意の割合の混合物を一定量含む標準溶液、好ましくはｓｎ−ＰＰＢｕ：ｓｎ−ＢｕＰＰ＝１：１であるｒａｃ−ＰＰＢｕを一定量含む標準溶液をＬＣ−ＭＳ／ＭＳに供することで検量線を作製し、（ii）定容した食品試料をＬＣ−ＭＳ／ＭＳに供し、食品試料中に含まれるｓｎ−ＰＰＢｕ及びｓｎ−ＢｕＰＰの定量を前記検量線と比較することで行うことができる。
【００２４】
上記（ｉ）の検量線の作成方法としては、通常用いられる、いかなる方法を用いても構わない。例えば、Ｘ軸にｒａｃ−ＰＰＢｕの濃度を、Ｙ軸にＬＣ−ＭＳ／ＭＳで観測されたｒａｃ−ＰＰＢｕのピーク強度をプロットすることにより、検量線を作成することができる。検出限界と定量限界は、ピーク強度とノイズの比（ｓｎ比）から計算することができる。また、この検量線作成には、外部標準法又は内部標準法のどちらを用いても構わないが、内部標準法を用いることが好ましい。
【００２５】
上記（ii）の食品試料中に含まれるｓｎ−ＰＰＢｕ及びｓｎ−ＢｕＰＰの定量法としては、検量線の作成と同条件で食品試料中に含まれるｓｎ−ＰＰＢｕ及びｓｎ−ＢｕＰＰ含量をＬＣ−ＭＳ／ＭＳで測定し、得られたｓｎ−ＰＰＢｕ及びｓｎ−ＢｕＰＰ含量の値を検量線上にプロットすることによって、食品試料中のｓｎ−ＰＰＢｕ及びｓｎ−ＢｕＰＰ含量を決定できる。
【００２６】
（液体クロマトグラフィー）
工程（ａ）における食品試料中のｓｎ−ＰＰＢｕ及びｓｎ−ＢｕＰＰの定量方法としては、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ、液体クロマトグラフィーと質量分析法を組み合わせた方法（ＬＣ−ＭＳ）、ガスクロマトグラフィーと質量分析法を組み合わせた方法（ＧＣ−ＭＳ）、ガスクロマトグラフィー法（ＧＣ）、液体クロマトグラフィー法（ＬＣ）、超臨界流体クロマトグラフィー法（ＳＦＣ）など特に制限されないが、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳが好ましい。かかるＬＣ−ＭＳ／ＭＳにおける液体クロマトグラフィー（ＬＣ）で用いるカラムとしては、ｓｎ−ＰＰＢｕ及びｓｎ−ＢｕＰＰを他の成分と分離しうるカラム、好ましくはｓｎ−ＰＰＢｕ及びｓｎ−ＢｕＰＰとｓｎ−ＰＢｕＰとを分離しうるカラムであれば、順相又は逆相のいずれのカラムを用いることができるが、逆相系のカラムを用いることが好ましい。逆相系のカラムとしては、担体が直鎖の炭化水素基で修飾されたシリカゲルであるカラムが好ましく、炭化水素基の炭素数は８〜３２、好ましくは１８〜３２、より好ましくは２８〜３０である。カラムのグレードとしては、ｓｎ−ＰＰＢｕ及びｓｎ−ＢｕＰＰを他の成分と分離、好ましくはｓｎ−ＰＰＢｕ及びｓｎ−ＢｕＰＰとｓｎ−ＰＢｕＰとを分離できれば、いかなるグレードのカラムを用いても問題なく、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）用のカラムを用いることが好ましい。
【００２７】
なお、ｓｎ−ＰＰＢｕとｓｎ−ＢｕＰＰは鏡像体（エナンチオマー）の関係にあるため、ＬＣでは同じ挙動を示し、同一のピークとして検出される。同様に、これらは以下のＭＳ／ＭＳにおいても同じ挙動を示す。
【００２８】
工程（ａ）のＬＣで用いる溶離溶媒は、特に制限されないが、順相のカラムを用いる際には、例えばヘキサン、ヘプタン、酢酸エチル、アセトン、テトラヒドロフラン、テトラヒドロピラン、ジエチルエーテル、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル、トルエン、ベンゼン、キシレン、四塩化炭素、クロロホルム、ジクロロメタン、ジメチルホルムアミド、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、ｔｅｒｔ−ブタノール、アセトニトリル、プロピオニトリル等を単独で、またはこれらの混合溶媒として用いることができる。
【００２９】
また、逆相のカラムを用いる際には、溶離溶媒としては、例えば水、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、ｔｅｒｔ−ブタノール、アセトニトリル、プロピオニトリル等を単独で、またはこれらの混合溶媒として用いることができる。また、必要であれば、これらの溶媒に蟻酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、メタンスルホン酸等の有機酸、又はトリエチルアミン、トリブチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン、Ｎ−メチルモルホリン等の塩基を添加することができる。中でも、溶離溶媒としてはアセトン／アセトニトリルの混合溶媒系が好ましく、その混合比は体積比でアセトン／アセトニトリル−２０：１〜２：１、より好ましくは１０：１〜３：１、さらに好ましくは８：１〜４：１、最も好ましくは４：１である。
【００３０】
（タンデム質量分析）
工程（ａ）で用いるタンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）におけるイオン化法としては、ｓｎ−ＰＰＢｕ及びｓｎ−ＢｕＰＰのイオンピークが検出できるイオン化法であれば特に制限はなく、例えば、電子イオン化（ＥＩ）法、化学イオン化（ＣＩ）法、電解脱離（ＦＤ）法、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）法、大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ）法等を用いることができ、好ましいイオン化法は、ＣＩ法、ＦＤ法、ＥＳＩ法、ＡＰＣＩ法、より好ましくはＥＳＩ法、ＡＰＣＩ法、最も好ましくはＡＰＣＩ法である。
【００３１】
ｓｎ−ＰＰＢｕ及びｓｎ−ＢｕＰＰのイオンピークとしては、ｍ／ｚがｓｎ−ＰＰＢｕ及びｓｎ−ＢｕＰＰの分子イオンピークであるＭ＋＝６３９として検出される。この他にも、イオン化法によってはアンモニアの付加したイオンピークである［Ｍ＋ＮＨ４］＋＝６５６等のピークや、分子イオンピークから酪酸基が脱離したイオンピーク（ｍ／ｚ＝５５１）、分子イオンピークからパルミトイル基が脱離したイオンピーク（ｍ／ｚ＝３８３）、プロトン化イオンピークである［Ｍ＋Ｈ］＋＝６４０、ナトリウム化イオンピークである［Ｍ＋Ｎａ］＋＝６６２、分子イオンピークにＬＣで用いた溶媒の分子量が加算されたイオンピーク等が検出されることがある。これらプロダクトイオンをモニターする手法としては、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）又は選択反応モニタリング（ＳＲＭ）、好ましくはＭＲＭを挙げることができる。
【００３２】
工程（ａ）においてＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いる利点としては次の点があげられる。食品試料中のｓｎ−ＰＰＢｕ及びｓｎ−ＢｕＰＰを測定する際に、食品中には様々なトリアシルグリセロールが含まれるため、ＬＣを用いるだけではｓｎ−ＰＰＢｕ及びｓｎ−ＢｕＰＰを単一のピークとして分離することは困難である。しかし、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いると、食品中のｓｎ−ＰＰＢｕ及びｓｎ−ＢｕＰＰはＬＣにおいて他のトリアシルグリセロールと分離され、その後にＭＳ／ＭＳに供されるため、仮にＬＣで分離した際にｓｎ−ＰＰＢｕ及びｓｎ−ＢｕＰＰのピークに他の化合物が含まれていたとしても、ｓｎ−ＰＰＢｕ及びｓｎ−ＢｕＰＰの含量を測定することができる。この原理は、以下のようになる。
【００３３】
ＭＳ／ＭＳは、質量分析計（ＭＳ）が２台直列に配置され、その間に衝突活性化室を持つ装置である。本発明で用いるＬＣ−ＭＳ／ＭＳにおいて、ＬＣで分離された各ピークは、まず1台目のＭＳで試料をイオン化させた後、ｓｎ−ＰＰＢｕ及びｓｎ−ＢｕＰＰ由来の特定の質量数のイオンのみを選択し、２台目のＭＳで検出することができる。このため、仮にＬＣで分離したｓｎ−ＰＰＢｕ及びｓｎ−ＢｕＰＰのピークに、他の化合物が含まれていたとしても、この化合物由来のイオンピークは２台目のＭＳ導入される際に選択されない。このことから、ＬＣ後にｎ−ＰＰＢｕ及びｓｎ−ＢｕＰＰに他の成分が混入していたとしても、ＭＳ／ＭＳを用いることで、ｎ−ＰＰＢｕ及びｓｎ−ＢｕＰＰだけを測定したデータと同じ得ることができる。
【００３４】
（内部標準法）
工程（ａ）において、ｓｎ−ＰＰＢｕ及びｓｎ−ＢｕＰＰの定量を容易にするために、必要に応じて内部標準法を用いることもできる。内部標準法を用いた乳脂肪含有量の測定法としては、ｓｎ−ＰＰＢｕとｓｎ−ＢｕＰＰ任意の割合の混合物、好ましくはそれらの等量混合物であるｒａｃ−ＰＰＢｕを含む標準溶液、及び試料溶液に、同じ内部標準を加えることが好ましい。
【００３５】
内部標準としては、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いた際にｓｎ−ＰＰＢｕ及びｓｎ−ＢｕＰＰの定量が行えれば特に制限されず、好ましくは天然の油脂には存在しない奇数の総アシル炭素数を有するトリアシルグリセロールである。内部標準としてのトリアシルグリセロールとしては、市販のトリアシルグリセロールを用いても良いし、用途に応じて調製したものでもよい。調製する際には、その簡便さから、３つのアシル基が全て同じトリアシルグリセロールが好ましく、Ｃ９、Ｃ１１、Ｃ１３、Ｃ１５のアシル基を有するトリアシルグリセロールがより好ましく、Ｃ１１、Ｃ１３のアシル基を有するトリアシルグリセロールがさらに好ましく、Ｃ１１のアシル基を有するトリアシルグリセロール（トリウンデカノイン）が最も好ましい。一方、偶数鎖脂肪酸からなる総アシル炭素数が偶数であるトリアシルグリセロールは天然に多く含まれるため、これらの内部標準としての使用は避けたほうが良いと考えられるが、これらの使用を禁じるものではない。
【００３６】
（試料の調製）
工程（ａ）において、食品試料中からの脂質成分の抽出法としては、脂質成分が十分抽出される限り特に制限されず、例えば、従来型の抽出法（方法Ａ）と、本発明で開発されたワンポット抽出法（方法Ｂ）を用いることができる。図１には、本発明の乳脂肪含有量の測定法における、食品試料からの模式的な試料溶液作製法（方法Ａ及び方法Ｂ）を示した。
【００３７】
上記方法Ａとしては、試料の質量を正確に測定した後に、該試料を有機溶媒で抽出、水系溶媒で洗浄した後に、濃縮し、正確に体積を測定した該濃縮物の溶液とすることで、本発明の乳脂肪含有量の測定に供する試料溶液を得ることができる。
【００３８】
試料からの脂質成分の抽出法としては、脂質成分が減じることがなければいかなる抽出法を用いることができるが、例えばFolchの方法やBligh＆Dyerの方法などを用いることができる。抽出溶媒としては、これらに限られないが、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、ジエチルエーテル、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジクロロメタン、クロロホルム、ペンタン、ヘキサン、石油エーテル、アセトン、酢酸エチル、ベンゼン、トルエン等を単独で又は混合して用いることができる。中でも、Folchの方法やBligh＆Dyerの方法を用いる際には、抽出溶媒としてはクロロホルム／メタノール−２：１（ｖ／ｖ）混合溶媒が用いられる。一方、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド等の不揮発性又は高沸点の溶媒の使用は避けたほうが良いと考えられるが、これらの使用を禁じるものではない。
【００３９】
抽出後の溶液は、油相を水系溶媒で洗浄した後に濃縮する。この洗浄操作により、塩や糖などの夾雑物を除くことができる。油相と水相の分離方法としては、分液漏斗を用いる方法や、油相と水相が分離しにくい場合であれば、遠心分離を用いても良い。水洗後の油相は、乾燥剤で脱水した後に濃縮することが好ましく、脱水剤として、無水硫酸ナトリウムや無水硫酸マグネシウム等を用いても良い。抽出溶液の濃縮方法としては、エバポレーターを用いた濃縮や、アルゴンや窒素等の不活性ガスを抽出溶液に吹き付けることで溶媒を揮発させる方法があげられる。
【００４０】
濃縮後の残渣は、測定溶媒に溶解することで試料溶液とすることができる。試料溶液を作製する際には、メスフラスコ等を用いることで溶液の体積を正確に調製する必要がある。この際、用いることのできる溶媒としては、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、アセトン、アセトニトリル等があげられ、好ましくはエタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、アセトン、より好ましくは２−プロパノール、アセトン、最も好ましくは２−プロパノールである。
【００４１】
上記方法Ｂとしては、試料の質量を正確に測定した後に、直接ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析に供する溶媒で抽出することで、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析に供する試料溶液を簡便に得ることができる。この際、用いることのできる溶媒としては、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、アセトン、アセトニトリル等があげられ、好ましくはエタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、アセトン、より好ましくは２−プロパノール、アセトン、最も好ましくは２−プロパノールである。
【００４２】
（乳脂肪の特徴）
乳脂肪は、酪酸、カプロン酸などの短鎖脂肪酸が豊富に含まれており、これが他の油脂には無い乳脂肪の特徴である。また、乳脂肪には、ｓｎ−ＰＰＢｕ及びｓｎ−ＢｕＰＰが含まれるが、その位置異性体であるｓｎ−ＰＢｕＰは含まれない。一方、エステル交換による油脂加工工程を経た油脂組成物には、ｓｎ−ＰＰＢｕ及びｓｎ−ＢｕＰＰとｓｎ−ＰＢｕＰが共に含まれるため、本発明の乳脂肪含量の測定法にｓｎ−ＰＢｕＰを検出する工程（ｃ）を備えることで、エステル交換による油脂加工工程の有無を定性的に判断することができる。
【００４３】
工程（ｃ）における、エステル交換による油脂加工工程の有無の定性的な判断は、上記工程（ａ）において、ｓｎ−ＰＰＢｕとｓｎ−ＢｕＰＰ任意の割合の混合物、好ましくはｒａｃ−ＰＰＢｕを含む標準溶液に、ｓｎ−ＰＢｕＰを添加し、ＬＣに用いるカラムをＣ２８カラム又はＣ３０カラムを用いた逆相液体クロマトグラフィーとすることで行うことができる。このとき、ｓｎ−ＰＰＢｕ及びｓｎ−ＢｕＰＰとｓｎ−ＰＢｕＰとは、溶離液をアセトン／アセトニトリル系の混合溶媒としたときに良好な分離を示し、その混合比は体積比でアセトン／アセトニトリル−２０：１〜２：１、より好ましくは１０：１〜３：１、さらに好ましくは８：１〜４：１、最も好ましくは４：１である。
【００４４】
また、工程（ｃ）においても、工程（ａ）と同様にｓｎ−ＰＰＢｕ及びｓｎ−ＢｕＰＰの定量を行うことができ、定量を行う際に内部標準法を用いることもできる。内部標準法を用いる際には、ｓｎ−ＰＰＢｕとｓｎ−ＢｕＰＰ任意の割合の混合物、好ましくはｒａｃ−ＰＰＢｕとｓｎ−ＰＢｕＰとを含む標準溶液及び試料溶液に、同じ内部標準を加えることが好ましい。
【００４５】
さらに、マーガリン等の植物油脂由来のトリアシルグリセロールはｓｎ−ＰＰＢｕやｓｎ−ＢｕＰＰを含まないため、ｓｎ−ＰＰＢｕ及びｓｎ−ＢｕＰＰを指標とする本発明を用いることで、バターとマーガリン等を混合して用いる食品（例えばクッキー、ビスケット、サブレ、パンなど）に含有される乳脂肪の測定する際にも、簡単に食品中の乳脂肪含有量を測定することができる。
【００４６】
［食品中の乳脂肪含量を測定するためのキット］
本発明の食品中の乳脂肪含量を測定するためのキットとしては、ｓｎ−ＰＰＢｕとｓｎ−ＢｕＰＰの任意の割合の混合物、好ましくはｒａｃ−ＰＰＢｕを含む標準溶液を備えたキットであれば特に制限されないが、さらにｓｎ−ＰＢｕＰを含むものとすることができる。上記標準溶液にｓｎ−ＰＢｕＰが含まれる場合、ｓｎ−ＰＰＢｕとｓｎ−ＢｕＰＰの任意の割合の混合物、好ましくはｒａｃ−ＰＰＢｕとｓｎ−ＰＢｕＰとの混合比は、モル比で、好ましくは９：１〜１：９、より好ましくは４：６〜６：４、さらに好ましくは等量混合物である。
【００４７】
上記ｓｎ−ＰＰＢｕやｓｎ−ＢｕＰＰやｓｎ−ＰＢｕＰは、天然由来のものや合成されたものを用いることができ、ｒａｃ−ＰＰＢｕは合成されたものを用いることができる。さらに上記標準溶液を、前述した内部標準を含む標準溶液とすることができる。また、本発明のキットには、本発明の食品中の乳脂肪含量の測定法が説明されている添付文書を備えることができる。
【００４８】
（ｒａｃ−ＰＰＢｕの合成）
ｒａｃ−ＰＰＢｕ、ｓｎ−ＰＰＢｕの合成法としては、例えば次にあげる方法を例示することができるが、これらに限られるものではない。
ｒａｃ−ＰＰＢｕを化学的に合成する方法としては、１，２−ジパルミトイル−ｒａｃ−グリセリンと酪酸とをエステル化する方法や、１，２−ジパルミトイル−ｒａｃ−グリセリンと酪酸クロリドとを塩基条件下で縮合する方法がある。この他にも、ｒａｃ−１−モノブチリンとパルミチン酸とをエステル化する方法や、ｒａｃ−１−モノブチリンとパルミトイルクロリドとを塩基条件下で縮合することでも合成できる。一般的な合成方法としては、不活性ガス雰囲気下において、有機溶媒中に基質を溶解し、脱水剤、縮合剤又は塩基を作用させることで目的のｒａｃ−ＰＰＢｕを合成することができる。ここで、不活性ガスとしては、アルゴンや乾燥した窒素等を用いることができる。使用できる有機溶媒としては、これらに限られないが、ジクロロメタン、クロロホルム、トルエン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド等があげられ、好ましくはジクロロメタンである。脱水剤としては、濃硫酸、パラトルエンスルホン酸等の酸系の脱水剤を用いることができる。縮合剤としてはカルボジイミド系の縮合剤等を用いることができ、必要であれば、ピリジン、４−Ｎ，Ｎ−ジメチルピリジン、４−ピロリジノピリジン等を用いても良い。塩基としては、トリエチルアミン、トリブチルアミン、エチルジイソプロピルアミン、Ｎ−メチルモルホリン、ピリジン等の有機塩基を用いることができる。
【００４９】
（ｓｎ−ＰＰＢｕの合成）
上記合成方法において、１，２−ジパルミトイル−ｒａｃ−グリセリン又はｒａｃ−１−モノブチリンに代えて、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセリンのエナンチオマーを用いることで、ｓｎ−ＰＰＢｕのエナンチオマーを合成することもできる。
【００５０】
（ｓｎ−ＰＢｕＰの合成）
ｓｎ−ＰＢｕＰを合成する方法としては、２−モノブチリンとパルミチン酸とをエステル化する方法や２−モノブチリンとパルミトイルクロリドとを塩基条件下で縮合すること等があげられる。反応条件としては、ｒａｃ−ＰＰＢｕを合成する方法と同様の条件を用いることができる。
【００５１】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
［実施例］
実施例では、以下に示す分析機器を用いた。
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ
ＬＣシステム：Alliance e2695（Waters Corporation製）
カラム：Sunrise C28, 4.6 mm I.D.×250 mm, 5 μm,（ChromaNik Technologies Inc.製）
ＵＶ−可視光検出器：2489 UV Visible Detector（Waters Corporation製）
ＡＰＣＩ／ＭＳシステム：Quattro micro API（Waters Corporation製）
解析ソフト：MassLynx Ver. 4.1（Waters Corporation製）
ＧＣ
ＧＣシステム：HP6890（Agilent Technologies製）
カラム：CP-WAX 52 CB, 30m x 0.25mm I.D.（Varian製）
検出器：Flame ionization detector (Agilent Technologies製)
【実施例１】
【００５２】
検量線の作成
等量のｒａｃ−ＰＰＢｕとｓｎ-ＰＢｕＰを２−プロパノールに溶解し、それぞれの終濃度を２５０，２００，１５０，１００，５０，１０，および１μｇ／ｍＬとした、７種類の濃度の標準溶液を調製した。それぞれの標準溶液にはトリウンデカノインを終濃度１０μｇ／ｍＬとなるように添加し、内部標準とした。調製した標準溶液１０μＬをＬＣ−ＭＳ／ＭＳに供した。ＬＣでのｒａｃ−ＰＰＢｕとｓｎ−ＰＢｕＰの分離は図１に示すとおりであり、それぞれのピークは良好な分離を示した。
ＭＳ／ＭＳのイオン化は大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ）法で行い、データ収集モードとしては多重反応モニタリング（ＭＲＭ）を用いた。検出イオンはこれらのアンモニア付加分子イオン、［Ｍ＋ＮＨ４］＋＝６５６である。この結果を元に、ｘ軸に標準溶液の濃度を、ｙ軸にｒａｃ−ＰＰＢｕ又はｓｎ−ＰＢｕＰとトリウンデカノインのイオン強度の比をプロットすることで、ｒａｃ−ＰＰＢｕ及びｓｎ−ＰＢｕＰの検量線を作成した（図３及び図４）。検出限界と定量限界は、ピーク強度とノイズの比（ｓｎ比）から計算され、それぞれｓｎ＝３及び１０であった。
【００５３】
検量線作成時のＬＣ−ＭＳ／ＭＳの測定は以下の条件で行った。
ＬＣ
溶媒：アセトン／アセトニトリル−８０：２０（ｖ／ｖ）
流速：１ｍＬ／分
カラム温度：１５℃
ＭＳ
イオン源：polarity, APCI positive; corona current, 3.0 μＡ
イオン源温度：１２０℃
脱溶媒和温度：４５０℃
cone gas flow：５０Ｌ／時間
desolvation gas flow：２００Ｌ／時間
データ収集モード：多重反応モニタリング（ＭＲＭ）
【実施例２】
【００５４】
ｒａｃ−ＰＰＢｕの合成
アルゴンで置換した容量１００ｍＬの四つ口フラスコに１，２−ジパルミトイル−ｒａｃ−グリセリン（１ｇ）、酪酸（０．１７ｇ）、４−ジメチルアミノピリジン（０．２４ｇ）、及びジクロロメタン（１０ｍＬ）を加えた。そこへ、Ｎ−エチルジイソプロピルアミン（０．２５ｇ）と１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド  ハイドロクロライド（０．３７ｇ）を加え、−２０℃で一晩撹拌を行った。反応溶液を直接濃縮することで得た油状化合物をフラッシュカラムクロマトグラフィーに供することで、無色油状のｒａｃ−ＰＰＢｕ（０．８ｇ、収率７２％）を得た。
ＣＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ  ５５１（４５％），３８４（１００％）
ＡＰＣＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ  ６５６［Ｍ＋ＮＨ４］＋
【００５５】
ＰＢｕＰの合成
不活性ガス(アルゴン)で置換した容量１００ｍＬの四つ口フラスコに１，３−ジパルミチン（１ｇ）、酪酸（０．１７ｇ）、４−ジメチルアミノピリジン（０．２４ｇ）、及びジクロロメタン（１０ｍＬ）を加えた。そこへ、Ｎ−エチルジイソプロピルアミン（０．２５ｇ）と１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド  ハイドロクロライド（０．３７ｇ）を加え、−２０℃で一晩撹拌を行った。反応溶液を直接濃縮することで得た油状化合物をフラッシュカラムクロマトグラフィーに供することで、無色油状のｓｎ−ＰＢｕＰ（０．５ｇ、収率４５％）を得た。
ＣＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ  ５５１（２５％），３８４（１００％）
ＡＰＣＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ  ６５６［Ｍ＋ＮＨ４］＋
【実施例３】
【００５６】
バター中のｓｎ−ＰＰＢｕ含有量の測定
【００５７】
方法Ａ
測定試料として、市販の３種類のバターから、それぞれＦｏｌｃｈの方法で脂質を抽出した。まず、バターを蒸留水で９倍（体積比）に希釈し、スクリュー栓付きの試験管中の倍量のクロロホルム／メタノール溶液（体積比２：１）に加えた。この混合液をボルテックスミキサーを用いて激しく混合し、１，５００Ｇで１０分間遠心分離を行った。下層を集めた後、室温で窒素気流を用いて濃縮し、脂質の重さを量り、バターオイルとした。このバターオイルを２−プロパノールに溶解し終濃度５ｍｇ／ｍＬとなるように試料溶液を調製した。同時に、試料溶液にはトリウンデカノインを終濃度１０μｇ／ｍＬとなるように添加し、内部標準とした。この試料溶液をＬＣ−ＭＳ／ＭＳに供し、得られたイオンピークと実施例１の検量線（図３）から、バターオイル中のｓｎ−ＰＰＢｕ及びｓｎ−ＢｕＰＰの含有量を表１に示すように決定することができた。このとき、ｒａｃ−ＰＢｕＰは検出されなかった。
【００５８】
方法Ｂ
測定試料として、方法Ａで用いたバターと同じ市販の３種類のバターを２−プロパノールに溶解し、それぞれ終濃度５ｍｇ／ｍＬとなるように試料溶液を調製した。同時に、試料溶液にはトリウンデカノインを終濃度１０μｇ／ｍＬとなるように添加し、内部標準とした。この試料溶液をＬＣ−ＭＳ／ＭＳに供し、得られたイオンピークと実施例１の検量線（図４）から、バターオイル中のｓｎ−ＰＰＢｕ及びｓｎ−ＢｕＰＰの含有量を表１に示すように決定することができた。このとき、ｒａｃ−ＰＢｕＰは検出されなかった。
【００５９】
【表１】
2014048173.tif 000002
【実施例４】
【００６０】
市販のマーガリン（バター１５％使用）の乳脂肪含有量の測定
【００６１】
方法Ａ
市販のバター１５％使用マーガリンのｓｎ−ＰＰＢｕ及びｓｎ−ＢｕＰＰの含有量を実施例３の方法Ａと同条件で測定したところ、概マーガリン抽出油１００ｇ中にｓｎ−ＰＰＢｕは０．５８±０．０１ｇ含まれることが分かった。これを式１に当てはめたところ、市販のバター１５％使用マーガリンの乳脂肪含有量は１４．７６± ０．２６ｇとなり、このマーガリンには表示の値とほぼ同じ量のバターが含まれていることが分かった。
【００６２】
方法Ｂ
市販のバター１５％使用マーガリンのｓｎ−ＰＰＢｕ含有量を実施例３の方法Ｂと同条件で測定したところ、概マーガリン抽出油１００ｇ中にｓｎ−ＰＰＢｕは０．５９±０．０１ｇ含まれることが分かった。これを式１に当てはめたところ、市販のバター１５％使用マーガリンの乳脂肪含有量は１４．８１± ０．１９ｇとなり、このマーガリンには表示の値とほぼ同じ量のバターが含まれていることが分かった。
【００６３】
［参考実験１］
ＧＣ法（酪酸測定法）によるバター中の酪酸含有量の測定
実施例１で用いた市販の３種類のバター１００ｍｇを２ｍＬのｎ−ヘキサンに溶解し、１ｍＬのイソ吉草酸ブチルのｎ−ヘキサン標準溶液（０．５ｍｇ／ｍＬ）及び２Ｍの水酸化カリウムのｎ−ブタノール溶液加えた。前期溶液をボルテックスミキサーで激しく撹拌した後に蒸留水を加え、３，０００Ｇで１０分間遠心分離を行った。ｎ−ヘキサン層を集めた後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、試料溶液を調製した。この試料溶液をＧＣに供し、バターオイル中の酪酸の含有量を表２に示すように決定することができた。
【００６４】
【表２】
2014048173.tif 000003
【実施例５】
【００６５】
バターオイル（ＢＯ）、マーガリンオイル（ＭＯ）混合サンプル中の乳脂肪含有量の測定
【００６６】
方法Ａ
市販のバターとマーガリンを実施例３の方法Ａと同様にFolchの方法で脂質を抽出し、バターオイル（ＢＯ）とマーガリンオイル（ＭＯ）を調製した。このＢＯとＭＯとを重量比（ＢＯ：ＭＯ）で５：９５，２０：８０，５０：５０，及び８０：２０で混合した４種類の試料を、それぞれ２−プロパノールに溶解し終濃度５ｍｇ／ｍＬとなるように試料溶液を調製した。同時に、試料溶液にはトリウンデカノインを終濃度１０μｇ／ｍＬとなるように添加し、内部標準とした。この試料溶液をＬＣ−ＭＳ／ＭＳに供し、得られたイオンピークと実施例１の検量線（図３）から、各試料溶液中のｓｎ−ＰＰＢｕの含有量を決定することができた。この結果、各試料中の乳脂肪の含有量を表３に示すように決定することができた。
【００６７】
ＧＣ法（酪酸測定法）
上記４種類の試料各１００ｍｇを２ｍＬのｎ−ヘキサンに溶解し、１ｍＬのイソ吉草酸ブチルのn−ヘキサン標準溶液（０．５ｍｇ／ｍＬ）及び２Ｍの水酸化カリウムのｎ−ブタノール溶液加えた。前期溶液をボルテックスミキサーで激しく撹拌した後に蒸留水を加え、３，０００Ｇで１０分間遠心分離を行った。ｎ−ヘキサン層を集めた後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、試料溶液を調製した。この試料溶液をＧＣに供し、各試料溶液中の酪産ブチルの含有量を定量することで、各試料中の乳脂肪の含有量を表３に示すように決定することができた。
【００６８】
【表３】
2014048173.tif 000004
【００６９】
方法Ａ、ＧＣ法を用いて求めた、バターオイルとマーガリンオイルとの混合試料中の乳脂肪含有量ほぼ同じ値を示し、それらは混合試料中の乳脂肪量（計算値）ともほぼ一致した。このことから、本手法が食品中の乳脂肪含有量を測定する方法として、極めて有効であるということが分かる。
【実施例６】
【００７０】
市販のバタークッキー（バター３％使用）の乳脂肪含有量
【００７１】
方法Ａ
市販のパッケージにバター３％使用との表示がなされているバタークッキーについて、前記バタークッキー１ｇを砕き、蒸留水で９倍（体積比）に希釈し、スクリュー栓付きの試験管中の倍量のクロロホルム／メタノール溶液（体積比２：１）に加えた。この混合液をボルテックスミキサーを用いて激しく混合し、１，５００Ｇで１０分間遠心分離を行った。下層を集めた後、室温で窒素気流を用いて濃縮し、脂質の重さを量り、バターオイルとした。このバターオイルを２−プロパノールに溶解し終濃度５ｍｇ／ｍＬとなるように試料溶液を調製した。同時に、試料溶液にはトリウンデカノインを終濃度１０μｇ／ｍＬとなるように添加し、内部標準とした。この結果、バタークッキー抽出油１００ｇ中にはｓｎ−ＰＰＢｕが０．３８±０．０２ｇ含まれており、また、実施例３で求めたＫＡ＝３．９１と式Ｉからバタークッキー１００ｇの乳脂肪含有量は９．６４±０．４２ｇであると求められた。
【００７２】
方法Ｂ
前記バタークッキー１ｇを砕き、２−プロパノールで希釈して４０ｍｇ／ｍＬの試料溶液とした。同時に、試料溶液にはトリウンデカノインを終濃度１０μｇ／ｍＬとなるように添加し、内部標準とした。この試料溶液を０．４５μｍのメンブレンフィルターで濾過した後にＬＣ−ＭＳ／ＭＳに供し、バタークッキー１００ｇ中のｓｎ−ＰＰＢｕ含有量が０．３９±０．００ｇであることを確認した。また、実施例３で求めたＫＢ＝３．９９と式Ｉからバタークッキー１００ｇの乳脂肪含有量は９．７３ｇ±０．１０であると求められた。
【００７３】
方法Ａ、方法Ｂともにバタークッキー中の乳脂肪含有量はパッケージに記載されている含有量とほぼ同じであり、本手法が食品成分中の乳脂肪料を測定する方法として、適していることがわかる。
【産業上の利用可能性】
【００７４】
本発明の乳脂肪の含量の測定法は、液体クロマトグラフィーとタンデム型質量分析法を組み合わせること（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）により、食品中に含まれるｓｎ−ＰＰＢｕ及びｓｎ−ＢｕＰＰを定量し、食品中に含まれる乳脂肪の含量を簡便に測定することができる。このため、従来の食品中の乳脂肪の含量の測定法が煩雑な前処理、誘導体化、又は特別な装置を必要とするもの、多段階の測定法を組み合わせるもの、さらには複雑な測定が必要とされる方法であったことに対して、本発明の乳脂肪の含量の測定法は、乳脂肪を含有する食品等を、必要に応じて粉砕し、定容するという非常に簡便な前処理だけで、食品中の乳脂肪含有量の測定を行うことができるために、作業効率を大幅に向上することができる。
このように、本発明は食品産業において有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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