(57)【要約】【課題】メタノール等からクエン酸を生産するための一連の技術を提供する。【解決手段】メチロトローフである宿主微生物に対して、２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性の増強、及びコハク酸デヒドロゲナーゼの活性の欠損若しくは抑制からなる群より選ばれた少なくとも１つが行われるように遺伝子が改変され、メタン、メタノール、メチルアミン、ギ酸、ホルムアルデヒド、及びホルムアミドからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物からコハク酸を生産可能である変異微生物が提供される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
メチロトローフである宿主微生物に対して、２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性の増強、及びコハク酸デヒドロゲナーゼの活性の欠損若しくは抑制からなる群より選ばれた少なくとも１つが行われるように遺伝子が改変され、
メタン、メタノール、メチルアミン、ギ酸、ホルムアルデヒド、及びホルムアミドからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物からコハク酸を生産可能である変異微生物。
【請求項２】
メチロトローフである宿主微生物に対して、フマル酸リダクターゼ活性の増強、ピルビン酸カルボキシラーゼ活性の増強、及びホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ活性の増強からなる群より選ばれた少なくとも１つが行われるように遺伝子が改変され、
メタン、メタノール、メチルアミン、ギ酸、ホルムアルデヒド、及びホルムアミドからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物からコハク酸を生産可能である変異微生物。
【請求項３】
さらに、乳酸デヒドロゲナーゼ活性の欠損若しくは抑制、アセチルＣｏＡハイドロラーゼ活性の欠損若しくは抑制、及びピルビン酸ギ酸リアーゼ活性の欠損若しくは抑制からなる群より選ばれた少なくとも１つが行われるように遺伝子が改変された請求項１又は２に記載の変異微生物。
【請求項４】
メチロトローフである宿主微生物に対して、乳酸デヒドロゲナーゼ活性の欠損若しくは抑制、アセチルＣｏＡハイドロラーゼ活性の欠損若しくは抑制、及びピルビン酸ギ酸リアーゼ活性の欠損若しくは抑制からなる群より選ばれた少なくとも１つが行われるように遺伝子が改変され、
メタン、メタノール、メチルアミン、ギ酸、ホルムアルデヒド、及びホルムアミドからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物からコハク酸を生産可能である変異微生物。
【請求項５】
ホルムアルデヒドの固定化経路として、セリン経路、リブロースモノリン酸経路、及びキシロースモノリン酸経路からなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１炭素同化経路を有する請求項１〜４のいずれかに記載の変異微生物。
【請求項６】
３−ヘキスロース６リン酸合成酵素をコードする遺伝子と、６−ホスホ−３−ヘキスロイソメラーゼをコードする遺伝子とがさらに導入され、当該遺伝子が宿主微生物内で発現する請求項１〜５のいずれかに記載の変異微生物。
【請求項７】
メチロトローフがメタノール資化性酵母であり、メタノールを脱水素反応によってホルムアルデヒドに変換する酵素をコードする遺伝子がさらに導入され、当該遺伝子が宿主微生物内で発現する請求項１〜６のいずれかに記載の変異微生物。
【請求項８】
宿主微生物に、メタノール及び／又はギ酸をホルムアルデヒドに変換する機能を付与する遺伝子と、ホルムアルデヒド固定化能を付与する遺伝子とが導入され、かつ当該遺伝子が宿主微生物内で発現し、
２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性の増強、及びコハク酸デヒドロゲナーゼの活性の欠損若しくは抑制からなる群より選ばれた少なくとも１つが行われるように遺伝子が改変され、
メタン、メタノール、メチルアミン、ギ酸、ホルムアルデヒド、及びホルムアミドからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物からコハク酸を生産可能である変異微生物。
【請求項９】
宿主微生物に、メタノール及び／又はギ酸をホルムアルデヒドに変換する機能を付与する遺伝子と、ホルムアルデヒド固定化能を付与する遺伝子とが導入され、かつ当該遺伝子が宿主微生物内で発現し、
フマル酸リダクターゼ活性の増強、ピルビン酸カルボキシラーゼ活性の増強、及びホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ活性の増強からなる群より選ばれた少なくとも１つが行われるように遺伝子が改変され、
メタン、メタノール、メチルアミン、ギ酸、ホルムアルデヒド、及びホルムアミドからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物からコハク酸を生産可能である変異微生物。
【請求項１０】
さらに、乳酸デヒドロゲナーゼ活性の欠損若しくは抑制、アセチルＣｏＡハイドロラーゼ活性の欠損若しくは抑制、及びピルビン酸ギ酸リアーゼ活性の欠損若しくは抑制からなる群より選ばれた少なくとも１つが行われるように遺伝子が改変された請求項８又は９に記載の変異微生物。
【請求項１１】
宿主微生物に、メタノール及び／又はギ酸をホルムアルデヒドに変換する機能を付与する遺伝子と、ホルムアルデヒド固定化能を付与する遺伝子とが導入され、かつ当該遺伝子が宿主微生物内で発現し、
乳酸デヒドロゲナーゼ活性の欠損若しくは抑制、アセチルＣｏＡハイドロラーゼ活性の欠損若しくは抑制、及びピルビン酸ギ酸リアーゼ活性の欠損若しくは抑制からなる群より選ばれた少なくとも１つが行われるように遺伝子が改変され、
メタン、メタノール、メチルアミン、ギ酸、ホルムアルデヒド、及びホルムアミドからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物からコハク酸を生産可能である変異微生物。
【請求項１２】
ホルムアルデヒド固定化能を付与する遺伝子は、３−ヘキスロース６リン酸合成酵素をコードする遺伝子及び６−ホスホ−３−ヘキスロイソメラーゼをコードする遺伝子である請求項８〜１１のいずれかに記載の変異微生物。
【請求項１３】
ホルムアルデヒドの固定化経路として、セリン経路、リブロースモノリン酸経路、及びキシロースモノリン酸経路からなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１炭素同化経路を有する請求項８〜１１に記載の変異微生物。
【請求項１４】
リブロースモノリン酸経路を有する宿主微生物に、メタノール及び／又はギ酸をホルムアルデヒドに変換する機能を付与する遺伝子が導入され、かつ当該遺伝子が宿主微生物内で発現し、
２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性の増強、及びコハク酸デヒドロゲナーゼの活性の欠損若しくは抑制からなる群より選ばれた少なくとも１つが行われるように遺伝子が改変され、
メタン、メタノール、メチルアミン、ギ酸、ホルムアルデヒド、及びホルムアミドからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物からコハク酸を生産可能である変異微生物。
【請求項１５】
リブロースモノリン酸経路を有する宿主微生物に、メタノール及び／又はギ酸をホルムアルデヒドに変換する機能を付与する遺伝子が導入され、かつ当該遺伝子が宿主微生物内で発現し、
フマル酸リダクターゼ活性の増強、ピルビン酸カルボキシラーゼ活性の増強、及びホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ活性の増強からなる群より選ばれた少なくとも１つが行われるように遺伝子が改変され、
メタン、メタノール、メチルアミン、ギ酸、ホルムアルデヒド、及びホルムアミドからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物からコハク酸を生産可能である変異微生物。
【請求項１６】
さらに、乳酸デヒドロゲナーゼ活性の欠損若しくは抑制、アセチルＣｏＡハイドロラーゼ活性の欠損若しくは抑制、及びピルビン酸ギ酸リアーゼ活性の欠損若しくは抑制からなる群より選ばれた少なくとも１つが行われるように遺伝子が改変された請求項１４又は１５に記載の変異微生物。
【請求項１７】
リブロースモノリン酸経路を有する宿主微生物に、メタノール及び／又はギ酸をホルムアルデヒドに変換する機能を付与する遺伝子が導入され、かつ当該遺伝子が宿主微生物内で発現し、
乳酸デヒドロゲナーゼ活性の欠損若しくは抑制、アセチルＣｏＡハイドロラーゼ活性の欠損若しくは抑制、及びピルビン酸ギ酸リアーゼ活性の欠損若しくは抑制からなる群より選ばれた少なくとも１つが行われるように遺伝子が改変され、
メタン、メタノール、メチルアミン、ギ酸、ホルムアルデヒド、及びホルムアミドからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物からコハク酸を生産可能である変異微生物。
【請求項１８】
３−ヘキスロース６リン酸合成酵素をコードする遺伝子と、６−ホスホ−３−ヘキスロイソメラーゼをコードする遺伝子とがさらに導入され、当該遺伝子が宿主微生物内で発現する請求項８、９、１０、１１、１３、１４、１５、１６又は１７に記載の変異微生物。
【請求項１９】
メタノールをホルムアルデヒドに変換する機能を付与する遺伝子は、メタノールデヒドロゲナーゼ又はアルコールオキシダーゼをコードする遺伝子であり、ギ酸をホルムアルデヒドに変換する機能を付与する遺伝子は、ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子である請求項８〜１８のいずれかに記載の変異微生物。
【請求項２０】
メタンをメタノールに変換する機能を付与する遺伝子がさらに導入され、当該遺伝子が宿主微生物内で発現する請求項８〜１９のいずれかに記載の変異微生物。
【請求項２１】
メタンをメタノールに変換する機能を付与する遺伝子は、メタンモノオキシゲナーゼをコードする遺伝子である請求項２０に記載の変異微生物。
【請求項２２】
前記遺伝子の改変が、ゲノム上に導入されている請求項１〜２１のいずれかに記載の変異微生物。
【請求項２３】
コハク酸の細胞外排出を促進する輸送体タンパク質をコードする遺伝子が導入され、当該遺伝子が発現する請求項１〜２２のいずれかに記載の変異微生物。
【請求項２４】
請求項１〜２３のいずれかに記載の変異微生物を、メタン、メタノール、メチルアミン、ギ酸、ホルムアルデヒド、及びホルムアミドからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物を炭素源として用いて培養し、当該変異微生物にコハク酸を生産させるコハク酸の生産方法。
【請求項２５】
請求項１〜２３のいずれかに記載の変異微生物に、メタン、メタノール、メチルアミン、ギ酸、ホルムアルデヒド、及びホルムアミドからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物を接触させ、当該変異微生物に前記Ｃ１化合物からコハク酸を生産させるコハク酸の生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、メタノール等からコハク酸を生産可能な変異微生物、及び当該変異微生物を用いるコハク酸の生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
コハク酸は、樹脂原料、医療原料、メッキ薬、写真現像薬、調味料等に使用されている。コハク酸は、食品用を除いて、その大部分が石油から製造される無水マレイン酸の水素添加によって生産されている。しかしながら、近年、石油に依存した化学品プロセスの持続性が懸念される中、石油に依存しないコハク酸の製造法の確立が期待されている。
【０００３】
一方、コハク酸はＴＣＡ（トリカルボン酸）サイクルにおける代謝中間体の１つである。そして、微生物を用いたコハク酸の生産技術が開発されている。ここで、微生物によるコハク酸の生産性を向上させるためには、ＴＣＡサイクルの炭素供給量の向上と、ＴＣＡサイクル内でのコハク酸の蓄積が重要であるとされている。
【０００４】
ＴＣＡサイクルへの炭素供給を促すための技術として、乳酸デヒドロゲナーゼの活性抑制若しくは欠損（特許文献１，２）、アセチルＣｏＡハイドロラーゼの活性抑制（特許文献３）、ピルビン酸ギ酸リアーゼの活性抑制若しくは欠損（特許文献４，５）、等の手法が知られている。
【０００５】
好気的条件下でＴＣＡサイクル内でのコハク酸の蓄積を促すための技術として、２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性の増強（特許文献６）、コハク酸デヒドロゲナーゼ活性の抑制（特許文献７）、等の手法が知られている。
一方、嫌気的（還元的）条件下、重炭酸イオンもしくは炭酸ガスを含む糖溶液内等で機能する還元型ＴＣＡサイクルにおけるコハク酸の蓄積を促すための技術として、フマル酸リダクターゼ活性の増強（特許文献２）、ピルビン酸カルボキシラーゼ活性の増強（特許文献１，８）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ活性の増強（特許文献９）、等の手法が知られている。
【０００６】
ところで、Ｃ１化合物の中でも、メタノールは、天然ガス、及びバイオマスや都市ゴミ等の廃棄物を焼却することにより得られる一酸化炭素、二酸化炭素、及び水素の混合ガスである合成ガス等から安価に製造される。天然ガスは化石資源の中でも多量に存在し、かつＣＯ2の発生量が比較的少ないことから次世代エネルギー源として注目され、従来の石油から天然ガスへの移行が進んでいる。メタノールは、水に可溶であること等、取り扱いや貯蔵が容易である上、微生物培養の炭素源としても適している。
【０００７】
メチロトローフ（Methylotroph）とは、分子内にＣ−Ｃ結合を有さない炭素化合物、例えばメタン、メタノール、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン等を唯一の炭素源、エネルギー源として利用するＣ１化合物資化性微生物の総称名である。メサノトローフ（Methanotroph）、メタン酸化細菌、メタノール資化性細菌、メタノール資化性酵母、メタノール資化性微生物等と呼ばれる微生物は、全てメチロトローフに属するものである。細菌であるメチロトローフには、メタンを資化できるものも多く、これらはしばしばメサノトローフと呼ばれる。
【０００８】
メチロトローフは、メタノールをホルムアルデヒドに変換後、ホルムアルデヒドをＣ−Ｃ結合を有する有機物に変換する反応を中心代謝とする。図１に示されるように、ホルムアルデヒドを介した炭素同化代謝経路として、セリン経路、リブロースモノリン酸経路（ＲｕＭＰ経路）、及びキシルロースモノリン酸経路（ＸｕＭＰ経路）が知られている。細菌に分類されるメチロトローフ（メチロトローフ細菌）は、セリン経路又はＲｕＭＰ経路を保有している。一方、酵母に分類されるメチロトローフ（メチロトローフ酵母）は、ＸｕＭＰ経路を保有している。
【０００９】
また、メチロトローフ細菌は、メタノール要求性の違いから、偏性メチロトローフ（obligate methylotroph）と、他の炭素化合物も利用できる通性メチロトローフ（facultative methylotroph）とに分類される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】国際公開第２００５／０１０１８２号
【特許文献２】特開２００５−９５１６９号公報
【特許文献３】国際公開第２００５／１１３７４４号
【特許文献４】特表２０１２−５２１１９０号公報
【特許文献５】特開２０１０−２６３９１１号公報
【特許文献６】国際公開第２００７／０９９８６７号
【特許文献７】特開２０１１−１２０５０８号公報
【特許文献８】特開２００７−１２５０３０号公報
【特許文献９】国際公開第２００９／０７２５６２号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
再生可能資源からの生産プロセスについて、その従来技術のほとんどは、上記コハク酸生産技術を含めて、有機物、特に糖、グルセロールもしくは油成分等に依存した、微生物による生産法である。しかし、石油に由来する数多くの基幹化学品の世界的な生産量を賄うには、植物資源等に由来する現状使用可能な糖質、グリセリンや油成分の量では、微生物の炭素源として不足するのは必須である。すなわち、糖質や油成分に依存する微生物による基幹化学品の生産量は、将来に渡っても限定的である。また、このようなプロセスは、食との競合も懸念される。
【００１２】
上記現状に鑑み、本発明は、メタノール等からコハク酸を生産するための一連の技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記した課題を解決するための本発明の１つの様相は、メチロトローフである宿主微生物に対して、２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性の増強、及びコハク酸デヒドロゲナーゼの活性の欠損若しくは抑制からなる群より選ばれた少なくとも１つが行われるように遺伝子が改変され、メタン、メタノール、メチルアミン、ギ酸、ホルムアルデヒド、及びホルムアミドからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物からコハク酸を生産可能である変異微生物である。
【００１４】
上述のように、微生物によってコハク酸を生産させる場合において、好気的条件下でＴＣＡサイクル内でのコハク酸の蓄積を促すために、２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性を増強したり、コハク酸デヒドロゲナーゼ活性を抑制することが有用である。そして本発明の変異微生物は、メチロトローフである宿主微生物に対して、２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性を増強、及び／又は、２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性の欠損若しくは抑制が行われるように遺伝子が改変されたものであり、ＴＣＡサイクルにおけるコハク酸の蓄積が向上している。本発明の変異微生物によれば、メチロトローフが本来的に有する「メタノール及び／又はギ酸をホルムアルデヒドに変換する機能」と「ホルムアルデヒド固定化能」を基礎とし、特に好気的条件下で、前記したＣ１化合物から効率的にコハク酸を生産することができる。
【００１５】
宿主微生物とは、遺伝子改変の対象となるオリジナルの微生物（野生株等）を指す。
【００１６】
酵素活性の「増強」とは、非改変微生物（例えば野生株、宿主微生物）と比較して当該酵素活性が高いことを指す。また、酵素活性の「抑制」とは、非改変微生物（例えば野生株、宿主微生物）と比較して当該酵素活性が低いことを指す。また、酵素活性の「欠損」とは、当該酵素活性が消失していることを指す。
【００１７】
「遺伝子の改変」には、少なくとも、既存の遺伝子に対する改変、既存の遺伝子と別の遺伝子との置換、及び新たな遺伝子の導入（付加）が含まれる。
【００１８】
同様の課題を解決するための本発明の他の様相は、メチロトローフである宿主微生物に対して、フマル酸リダクターゼ活性の増強、ピルビン酸カルボキシラーゼ活性の増強、及びホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ活性の増強からなる群より選ばれた少なくとも１つが行われるように遺伝子が改変され、メタン、メタノール、メチルアミン、ギ酸、ホルムアルデヒド、及びホルムアミドからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物からコハク酸を生産可能である変異微生物である。
【００１９】
上述のように、嫌気的（還元的）条件下では還元型ＴＣＡサイクルが機能する。そして、微生物によってコハク酸を生産させる場合において、還元型ＴＣＡサイクルにおけるコハク酸の蓄積を促すために、フマル酸リダクターゼ活性、ピルビン酸カルボキシラーゼ活性、又はホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ活性を増強することが有用である。そして本発明の変異微生物は、メチロトローフである宿主微生物に対して、これらの酵素活性の少なくとも１つが増強されるように遺伝子が改変されたものであり、還元型ＴＣＡサイクルにおけるコハク酸の蓄積が向上している。
本発明の変異微生物によれば、メチロトローフが本来的に有する「メタノール及び／又はギ酸をホルムアルデヒドに変換する機能」と「ホルムアルデヒド固定化能」を基礎とし、特に嫌気的条件下で、前記したＣ１化合物から効率的にコハク酸を生産することができる。
【００２０】
好ましくは、さらに、乳酸デヒドロゲナーゼ活性の欠損若しくは抑制、アセチルＣｏＡハイドロラーゼ活性の欠損若しくは抑制、及びピルビン酸ギ酸リアーゼ活性の欠損若しくは抑制からなる群より選ばれた少なくとも１つが行われるように遺伝子が改変されている。
【００２１】
上述のように、微生物によってコハク酸を生産させる場合において、ＴＣＡサイクルへの炭素供給を促すために、乳酸デヒドロゲナーゼの活性、アセチルＣｏＡハイドロラーゼの活性、又はピルビン酸ギ酸リアーゼの活性を抑制することが有用である。そして本発明の変異微生物は、さらに、これらの酵素活性の少なくとも１つが欠損若しくは抑制されるように遺伝子が改変されたものであり、ＴＣＡサイクルへの炭素供給量が向上している
本発明の変異微生物によれば、前記したＣ１化合物から、より効率的にコハク酸を生産することができる。
【００２２】
同様の課題を解決するための本発明の他の様相は、メチロトローフである宿主微生物に対して、乳酸デヒドロゲナーゼ活性の欠損若しくは抑制、アセチルＣｏＡハイドロラーゼ活性の欠損若しくは抑制、及びピルビン酸ギ酸リアーゼ活性の欠損若しくは抑制からなる群より選ばれた少なくとも１つが行われるように遺伝子が改変され、メタン、メタノール、メチルアミン、ギ酸、ホルムアルデヒド、及びホルムアミドからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物からコハク酸を生産可能である変異微生物である。
【００２３】
上述のように、微生物によってコハク酸を生産させる場合において、ＴＣＡサイクルへの炭素供給を促すために、乳酸デヒドロゲナーゼの活性、アセチルＣｏＡハイドロラーゼの活性、又はピルビン酸ギ酸リアーゼの活性を抑制することが有用である。そして本発明の変異微生物は、メチロトローフである宿主微生物に対して、これらの酵素活性の少なくとも１つが欠損若しくは抑制されるように遺伝子が改変されたものであり、ＴＣＡサイクルへの炭素供給量が向上している。そして、本発明の変異微生物は、メタン、メタノール、メチルアミン、ギ酸、ホルムアルデヒド、及びホルムアミドからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物からコハク酸を生産可能である。
本発明の変異微生物によれば、メチロトローフが本来的に有する「メタノール及び／又はギ酸をホルムアルデヒドに変換する機能」と「ホルムアルデヒド固定化能」を基礎とし、前記したＣ１化合物からコハク酸を効率的に生産することができる。
【００２４】
好ましくは、ホルムアルデヒドの固定化経路として、セリン経路、リブロースモノリン酸経路、及びキシロースモノリン酸経路からなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１炭素同化経路を有する。
【００２５】
好ましくは、３−ヘキスロース６リン酸合成酵素をコードする遺伝子と、６−ホスホ−３−ヘキスロイソメラーゼをコードする遺伝子とがさらに導入され、当該遺伝子が宿主微生物内で発現する。
【００２６】
かかる構成により、リブロースモノリン酸経路によるホルムアルデヒド固定化能が付与又は増強される。
【００２７】
好ましくは、メチロトローフがメタノール資化性酵母であり、メタノールを脱水素反応によってホルムアルデヒドに変換する酵素をコードする遺伝子がさらに導入され、当該遺伝子が宿主微生物内で発現する。
【００２８】
一般に、酵母ではメタノールからホルムアルデヒドへの変換反応をアルコールオキシダーゼが担っている。そのため、当該変換反応には酸素が必要であり、具体的には培養時に激しく通気する必要がある。そこで本様相では「メタノールを脱水素反応によってホルムアルデヒドに変換する酵素」をコードする遺伝子を導入し、酸素に頼ることなくメタノールからホルムアルデヒドへの変換反応が行われるようにしている。
【００２９】
同様の課題を解決するための本発明の他の様相は、宿主微生物に、メタノール及び／又はギ酸をホルムアルデヒドに変換する機能を付与する遺伝子と、ホルムアルデヒド固定化能を付与する遺伝子とが導入され、かつ当該遺伝子が宿主微生物内で発現し、２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性の増強、及びコハク酸デヒドロゲナーゼの活性の欠損若しくは抑制からなる群より選ばれた少なくとも１つが行われるように遺伝子が改変され、メタン、メタノール、メチルアミン、ギ酸、ホルムアルデヒド、及びホルムアミドからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物からコハク酸を生産可能である変異微生物である。
【００３０】
本発明の変異微生物は、宿主微生物に「メタノール及び／又はギ酸をホルムアルデヒドに変換する機能を付与する遺伝子」と「ホルムアルデヒド固定化能を付与する遺伝子」が導入され、さらに、２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性の増強、及びコハク酸デヒドロゲナーゼの活性の欠損若しくは抑制からなる群より選ばれた少なくとも１つが行われるように遺伝子が改変されている。そして、メタン、メタノール、メチルアミン、ギ酸、ホルムアルデヒド、及びホルムアミドからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物からコハク酸を生産可能である。
すなわち本発明の変異微生物は、「メタノール及び／又はギ酸をホルムアルデヒドに変換する機能を付与する遺伝子」と「ホルムアルデヒド固定化能を付与する遺伝子」が導入されているので、メチロトローフと同様の特性を有している。そして、これらの外来遺伝子によって付与された「メタノール及び／又はギ酸をホルムアルデヒドに変換する機能」と「ホルムアルデヒド固定化能」を基礎とし、特に好気的条件下で、前記したＣ１化合物からコハク酸を効率的に生産することができる。
【００３１】
同様の課題を解決するための本発明の他の様相は、宿主微生物に、メタノール及び／又はギ酸をホルムアルデヒドに変換する機能を付与する遺伝子と、ホルムアルデヒド固定化能を付与する遺伝子とが導入され、かつ当該遺伝子が宿主微生物内で発現し、フマル酸リダクターゼ活性の増強、ピルビン酸カルボキシラーゼ活性の増強、及びホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ活性の増強からなる群より選ばれた少なくとも１つが行われるように遺伝子が改変され、メタン、メタノール、メチルアミン、ギ酸、ホルムアルデヒド、及びホルムアミドからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物からコハク酸を生産可能である変異微生物である。
【００３２】
本発明の変異微生物は、宿主微生物に「メタノール及び／又はギ酸をホルムアルデヒドに変換する機能を付与する遺伝子」と「ホルムアルデヒド固定化能を付与する遺伝子」が導入され、さらに、フマル酸リダクターゼ活性の増強、ピルビン酸カルボキシラーゼ活性の増強、及びホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ活性の増強からなる群より選ばれた少なくとも１つが行われるように遺伝子が改変されている。そして、メタン、メタノール、メチルアミン、ギ酸、ホルムアルデヒド、及びホルムアミドからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物からコハク酸を生産可能である。
すなわち本発明の変異微生物も、メチロトローフと同様の特性を有している。そして、外来遺伝子によって付与された「メタノール及び／又はギ酸をホルムアルデヒドに変換する機能」と「ホルムアルデヒド固定化能」を基礎とし、特に嫌気的条件下で、前記したＣ１化合物からコハク酸を効率的に生産することができる。
【００３３】
好ましくは、さらに、乳酸デヒドロゲナーゼ活性の欠損若しくは抑制、アセチルＣｏＡハイドロラーゼ活性の欠損若しくは抑制、及びピルビン酸ギ酸リアーゼ活性の欠損若しくは抑制からなる群より選ばれた少なくとも１つが行われるように遺伝子が改変されている。
【００３４】
かかる構成により、前記したＣ１化合物から、より効率的にコハク酸を生産することができる。
【００３５】
同様の課題を解決するための本発明の他の様相は、宿主微生物に、メタノール及び／又はギ酸をホルムアルデヒドに変換する機能を付与する遺伝子と、ホルムアルデヒド固定化能を付与する遺伝子とが導入され、かつ当該遺伝子が宿主微生物内で発現し、乳酸デヒドロゲナーゼ活性の欠損若しくは抑制、アセチルＣｏＡハイドロラーゼ活性の欠損若しくは抑制、及びピルビン酸ギ酸リアーゼ活性の欠損若しくは抑制からなる群より選ばれた少なくとも１つが行われるように遺伝子が改変され、メタン、メタノール、メチルアミン、ギ酸、ホルムアルデヒド、及びホルムアミドからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物からコハク酸を生産可能である変異微生物である。
【００３６】
本発明の変異微生物は、宿主微生物に「メタノール及び／又はギ酸をホルムアルデヒドに変換する機能を付与する遺伝子」と「ホルムアルデヒド固定化能を付与する遺伝子」が導入され、さらに、乳酸デヒドロゲナーゼ活性の欠損若しくは抑制、アセチルＣｏＡハイドロラーゼ活性の欠損若しくは抑制、及びピルビン酸ギ酸リアーゼ活性の欠損若しくは抑制からなる群より選ばれた少なくとも１つが行われるように遺伝子が改変されている。そして、メタン、メタノール、メチルアミン、ギ酸、ホルムアルデヒド、及びホルムアミドからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物からコハク酸を生産可能である。
すなわち本発明の変異微生物も、メチロトローフと同様の特性を有している。そして、外来遺伝子によって付与された「メタノール及び／又はギ酸をホルムアルデヒドに変換する機能」と「ホルムアルデヒド固定化能」を基礎とし、前記したＣ１化合物からコハク酸を効率的に生産することができる。
【００３７】
好ましくは、ホルムアルデヒド固定化能を付与する遺伝子は、３−ヘキスロース６リン酸合成酵素をコードする遺伝子及び６−ホスホ−３−ヘキスロイソメラーゼをコードする遺伝子である。
【００３８】
かかる構成により、リブロースモノリン酸経路によるホルムアルデヒド固定化能が付与される。
【００３９】
好ましくは、ホルムアルデヒドの固定化経路として、セリン経路、リブロースモノリン酸経路、及びキシロースモノリン酸経路からなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１炭素同化経路を有する。
【００４０】
同様の課題を解決するための本発明の他の様相は、リブロースモノリン酸経路を有する宿主微生物に、メタノール及び／又はギ酸をホルムアルデヒドに変換する機能を付与する遺伝子が導入され、かつ当該遺伝子が宿主微生物内で発現し、２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性の増強、及びコハク酸デヒドロゲナーゼの活性の欠損若しくは抑制からなる群より選ばれた少なくとも１つが行われるように遺伝子が改変され、メタン、メタノール、メチルアミン、ギ酸、ホルムアルデヒド、及びホルムアミドからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物からコハク酸を生産可能である変異微生物である。
【００４１】
同様の課題を解決するための本発明の他の様相は、リブロースモノリン酸経路を有する宿主微生物に、メタノール及び／又はギ酸をホルムアルデヒドに変換する機能を付与する遺伝子が導入され、かつ当該遺伝子が宿主微生物内で発現し、フマル酸リダクターゼ活性の増強、ピルビン酸カルボキシラーゼ活性の増強、及びホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ活性の増強からなる群より選ばれた少なくとも１つが行われるように遺伝子が改変され、メタン、メタノール、メチルアミン、ギ酸、ホルムアルデヒド、及びホルムアミドからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物からコハク酸を生産可能である変異微生物である。
【００４２】
好ましくは、さらに、乳酸デヒドロゲナーゼ活性の欠損若しくは抑制、アセチルＣｏＡハイドロラーゼ活性の欠損若しくは抑制、及びピルビン酸ギ酸リアーゼ活性の欠損若しくは抑制からなる群より選ばれた少なくとも１つが行われるように遺伝子が改変されている。
【００４３】
同様の課題を解決するための本発明の他の様相は、リブロースモノリン酸経路を有する宿主微生物に、メタノール及び／又はギ酸をホルムアルデヒドに変換する機能を付与する遺伝子が導入され、かつ当該遺伝子が宿主微生物内で発現し、乳酸デヒドロゲナーゼ活性の欠損若しくは抑制、アセチルＣｏＡハイドロラーゼ活性の欠損若しくは抑制、及びピルビン酸ギ酸リアーゼ活性の欠損若しくは抑制からなる群より選ばれた少なくとも１つが行われるように遺伝子が改変され、メタン、メタノール、メチルアミン、ギ酸、ホルムアルデヒド、及びホルムアミドからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物からコハク酸を生産可能である変異微生物である。
【００４４】
これらの様相は、例えば、リブロースモノリン酸経路を有する非メチロトローフが宿主微生物である態様に相当するものである。
【００４５】
好ましくは、３−ヘキスロース６リン酸合成酵素をコードする遺伝子と、６−ホスホ−３−ヘキスロイソメラーゼをコードする遺伝子とがさらに導入され、当該遺伝子が宿主微生物内で発現する。
【００４６】
好ましくは、メタノールをホルムアルデヒドに変換する機能を付与する遺伝子は、メタノールデヒドロゲナーゼ又はアルコールオキシダーゼをコードする遺伝子であり、ギ酸をホルムアルデヒドに変換する機能を付与する遺伝子は、ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子である。
【００４７】
メタノールデヒドロゲナーゼ（Methanol dehydrogenase）とアルコールデヒドロゲナーゼ（Alcohol dehydrogenase）は、いずれもメタノールをホルムアルデヒドに変換する作用を有する。また、ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ（Formaldehyde dehydrogenase）はギ酸をホルムアルデヒドに変換する作用を有する。これらの酵素は、いずれも細菌に属するメチロトローフにおけるメタン代謝酵素の１つである。一方、酵母に属するメチロトローフはメタン酸化活性を有さず、アルコールオキシダーゼ（Alcohol oxidase）の働きによってメタノールをホルムアルデヒドへ変換する作用を有する。酵母もギ酸をホルムアルデヒドへ変換する酵素活性を有する。
【００４８】
好ましくは、メタンをメタノールに変換する機能を付与する遺伝子がさらに導入され、当該遺伝子が宿主微生物内で発現する。
【００４９】
好ましくは、メタンをメタノールに変換する機能を付与する遺伝子は、メタンモノオキシゲナーゼをコードする遺伝子である。
【００５０】
メタンモノオキシゲナーゼ（Methane monooxygenase）はメタンをメタノールに変換する作用を有する。メタンモノオキシゲナーゼも、メチロトローフにおけるメタン代謝酵素の１つである。
【００５１】
好ましくは、前記遺伝子の改変が、ゲノム上に導入されている。
【００５２】
好ましくは、コハク酸の細胞外排出を促進する輸送体タンパク質をコードする遺伝子が導入され、当該遺伝子が発現する。
【００５３】
かかる構成により、生産されたコハク酸が効率よく細胞外に排出される。
【００５４】
本発明の他の様相は、上記の変異微生物を、メタン、メタノール、メチルアミン、ギ酸、ホルムアルデヒド、及びホルムアミドからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物を炭素源として用いて培養し、当該変異微生物にコハク酸を生産させるコハク酸の生産方法である。
【００５５】
本発明はコハク酸の生産方法に係るものである。本発明では、上記した変異微生物をメタン、メタノール、メチルアミン、ギ酸、ホルムアルデヒド、及びホルムアミドからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物を炭素源として培養することにより、当該変異微生物にコハク酸を生産させる。本発明によれば、メタノール等からコハク酸を生産することができる。
【００５６】
本発明の他の様相は、上記の変異微生物に、メタン、メタノール、メチルアミン、ギ酸、ホルムアルデヒド、及びホルムアミドからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物を接触させ、当該変異微生物に前記Ｃ１化合物からコハク酸を生産させるコハク酸の生産方法である。
【００５７】
本発明では、上記した変異微生物に、メタン、メタノール、メチルアミン、ギ酸、ホルムアルデヒド、及びホルムアミドからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物を接触させ、当該Ｃ１化合物からコハク酸を生産させる。本発明によっても、メタノール等からコハク酸を生産することができる。
【発明の効果】
【００５８】
本発明の変異微生物によれば、メタン、メタノール、メチルアミン、ギ酸、ホルムアルデヒド、又はホルムアミドからコハク酸を効率的に生産することができる。
【００５９】
本発明のコハク酸の生産方法についても同様であり、メタン、メタノール、メチルアミン、ギ酸、ホルムアルデヒド、又はホルムアミドからコハク酸を効率的に生産することができる。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】ホルムアルデヒドを介した炭素同化代謝経路を表す説明図である。
【発明を実施するための形態】
【００６１】
以下、本発明の実施形態について説明する。なお、本発明において「遺伝子」という用語は、全て「核酸」あるいは「ＤＮＡ」という用語に置き換えることができる。
【００６２】
本発明の変異微生物は、基本的に、「メタノール及び／又はギ酸をホルムアルデヒドに変換する機能」と「ホルムアルデヒド固定化能」とを有する宿主微生物に、コハク酸合成に関与する酵素の活性が欠損若しくは抑制、又は増強されるような遺伝子改変が施されたものである。
【００６３】
本発明で採用される宿主微生物としては、メチロトローフである宿主微生物と、非メチロトローフを含めた広範囲の宿主微生物の両方がある。
【００６４】
上述したように、メチロトローフとは、分子内にＣ−Ｃ結合を有さない炭素化合物、例えばメタン、メタノール、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン等を唯一の炭素源、エネルギー源として利用するＣ１化合物資化性微生物を指す。一般にメチロトローフは、ホルムアルデヒドを介した炭素同化代謝経路、具体的には、メタノール及び／又はギ酸をホルムアルデヒドに変換する機能（経路）とホルムアルデヒド固定化能（ホルムアルデヒドの固定化経路）とを、本来的に保有している。
【００６５】
ホルムアルデヒドの固定化経路としては、図１に示すセリン経路、リブロースモノリン酸経路（ＲｕＭＰ経路）、キシルロースモノリン酸経路（ＸｕＭＰ経路）が挙げられる。一般に、メチロトローフは、ホルムアルデヒドを介した炭素同化代謝経路として、セリン経路、ＲｕＭＰ経路、又はＸｕＭＰ経路を保有している。
【００６６】
ここで、各々のホルムアルデヒド固定化経路（図１）について説明する。
セリン経路によるホルムアルデヒド固定に重要な反応は、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ（serine hydroxymethyltransferase）によるグリシンと５，１０−メチレン−テトラヒドロ葉酸からのセリン生成反応である。５，１０−メチレン−テトラヒドロ葉酸は、ホルムアルデヒドとテトラヒドロ葉酸の結合によって生じる。セリン経路では、１分子のホルムアルデヒドから１分子のアセチルＣｏＡが直接生成する。
【００６７】
ＲｕＭＰ経路によるホルムアルデヒド固定に重要な反応は、３−ヘキスロース６リン酸合成酵素（3-hexulose-6-phosphate synthase、以下「ＨＰＳ」と略記することがある）によるリブロース５リン酸（Ｒｕ５Ｐ）とホルムアルデヒドからのＤ−アラビノ３ヘキスロース６リン酸の生成反応と、６−ホスホ−３−ヘキスロイソメラーゼ（6-phosphate-3-hexuloisomerase、以下「ＰＨＩ」と略記することがある）によるＤ−アラビノ３ヘキスロース６リン酸からのフルクトース６リン酸（Ｆ６Ｐ）の生成反応である。
本経路で生成するＦ６Ｐ等は解糖系へも供され、その後アセチルＣｏＡや、グリセルアルデヒド３リン酸（Ｇ３Ｐ）及びピルビン酸を生成する。Ｆ６Ｐの場合、１分子あたり、２分子のＧ３Ｐに変換され、次いで２分子のピルビン酸を経て２分子のアセチルＣｏＡが生成する。
【００６８】
ＸｕＭＰ経路によるホルムアルデヒド固定に重要な反応は、ジヒドロキシアセトンシンターゼ（dihydroxyacetone synthase）によるキシルロース５リン酸（Ｘｕ５Ｐ）とホルムアルデヒドからのジヒドロキシアセトン（ＤＨＡ）及びグリセルアルデヒド３リン酸（Ｇ３Ｐ）の生成反応である。本経路で生成したＧ３Ｐは解糖系にも供され、ピルビン酸とアセチルＣｏＡに変換される。ジヒドロキシアセトンもリン酸化によって解糖系へ供され、Ｇ３Ｐ、ピルビン酸、及びアセチルＣｏＡへと変換され得る。
【００６９】
本発明の変異微生物は、メタン、メタノール、メチルアミン、ギ酸、ホルムアルデヒド、及びホルムアミドからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物からコハク酸を生産可能なものである。例えば、メタノールデヒドロゲナーゼやアルコールオキシダーゼを有する変異微生物の場合には、メタノールをホルムアルデヒドに変換することができる。
【００７０】
また、メタノールデヒドロゲナーゼやアルコールオキシダーゼに加えてメタンモノオキシゲナーゼを有する変異微生物の場合には、メタンをメタノールに変換し、続いてメタノールをホルムアルデヒドに変換することができる。
【００７１】
さらに、ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼを有する変異微生物の場合には、ギ酸をホルムアルデヒドに変換することができる。
【００７２】
一般に、細菌に分類されるメチロトローフ（メチロトローフ細菌）は、メタンモノオキシゲナーゼとメタノールデヒドロゲナーゼを有しているので、メタン又はメタノールからホルムアルデヒドを合成することができる。また、酵母に分類されるメチロトローフ（メチロトローフ酵母）は、アルコールオキシダーゼを有しているので、メタノールからホルムアルデヒドを合成することができる。また、メチロトローフはホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼを有しており、ギ酸をホルムアルデヒドに変換することができる。
【００７３】
上記メタノールデヒドロゲナーゼには、グラム陰性細菌のメチロトローフに見出されるピロロキノリンキノン（ＰＱＱ: pyrroloquinoline quinone）依存型メタノールデヒドロゲナーゼ、グラム陽性細菌のメチロトローフに見出されるＮＡＤ（Ｐ）依存型メタノールデヒドロゲナーゼ及びアルコールデヒドロゲナーゼ、グラム陽性細菌のメチロトローフに見出されるＤＭＮＡ（N,N'-dimethyl-4-nitrosoaniline）依存型メタノールオキシドリダクターゼ（Park H. et al., Microbiology 2010, 156, 463-471）が含まれ、酵母でのメタノールからホルムアルデヒドへの変換は、通常、酸素依存型であるアルコールオキシダーゼによって触媒される。
【００７４】
また、アミンオキシダーゼ（amine oxidase）やメチルアミンデヒドロゲナーゼ（methylamine dehydrogenase）を有する変異微生物の場合には、メチルアミンをホルムアルデヒドに変換することができる。これらの酵素については、一部のメチロトローフやArthrobacter属細菌が有していることが知られている（Anthony C., The Biochemistry of Methylotroph, 1982, Academic Press Inc.）。
またホルムアミドをホルムアルデヒドに変換する酵素が、一部の微生物で見出されている（Anthony C., The Biochemistry of Methylotroph, 1982, Academic Press Inc.）。
【００７５】
そして、ホルムアルデヒドを経由してコハク酸を生産することができる。
【００７６】
宿主微生物として用いられるメチロトローフの種類としては、特に限定はないが、例えば細菌や酵母に分類されるものを採用することができる。
【００７７】
メチロトローフ細菌としては、例えば、Methylacidphilum属、Methylosinus属、Methylocystis属、Methylobacterium属、Methylocella属、Methylococcus属、Methylomonas属、Methylobacter属、Methylobacillus属、Methylophilus属、Methylotenera属、Methylovorus属、Methylomicrobium属、Methylophaga属、Methylophilaceae属、Methyloversatilis属、Mycobacterium属、Arthrobacter属、Bacillus属、Beggiatoa属、Burkholderia属、Granulibacter属、Hyphomicrobium属、Pseudomonas属、Achromobactor属、Paracoccus属、Crenothrix属、Clonothrix属、Rhodobacter属、Rhodocyclaceae属、Silicibacter属、Thiomicrospira属、Verrucomicrobia属、などに属する細菌が挙げられる。
【００７８】
メチロトローフ酵母としては、例えば、Pichia属、Candida属、Saccharomyces属、Hansenula属、Torulopsis属、Kloeckera属、などに属する酵母が挙げられる。Pichia属酵母の例としては、P. haplophila、P. pastoris、P. trehalophila、P. lindnerii、などが挙げられる。Candida属酵母の例としては、C. parapsilosis、C. methanolica、C. boidinii、C. alcomigas、などが挙げられる。Saccharomyces属酵母の例としては、Saccharomyces metha-nonfoams、などが挙げられる。Hansenula属酵母の例としては、H. wickerhamii、H. capsulata、H. glucozyma、H. henricii、H. minuta、H. nonfermentans、H. philodendra、H. polymorpha、などが挙げられる。Torulopsis属酵母の例としては、T. methanolovescens、T. glabrata、T. nemodendra、T. pinus、T. methanofloat、T. enokii、T. menthanophiles、T. methanosorbosa、T. methanodomercqii、などが挙げられる。
【００７９】
宿主微生物が非メチロトローフである場合には、メタノール等をホルムアルデヒドに変換する経路を有しているとは限らないので、少なくとも「メタノール及び／又はギ酸をホルムアルデヒドに変換する機能」を付与する必要がある。さらに、「メタンをメタノールに変換する機能」を付与することが好ましい。これらの機能付与は、上記した酵素をコードする遺伝子を宿主微生物に導入することにより、実現することができる。
【００８０】
例えば、メタノールをホルムアルデヒドに変換する機能を付与する遺伝子として、メタノールデヒドロゲナーゼ(例えば、EC1.1.1.244, EC1.1.2.7）をコードする遺伝子やアルコールオキシダーゼ（例えばEC1.13.13）をコードする遺伝子を用いることができる。また、ギ酸をホルムアルデヒドに変換する機能を付与する遺伝子として、ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ(例えばEC1.2.1.46）をコードする遺伝子を用いることができる。さらに、メタンをメタノールに変換する機能を付与する遺伝子として、メタンモノオキシゲナーゼをコードする遺伝子を用いることができる。
【００８１】
また、メタノール資化性を付与するプラスミドが知られている。例えば、Bacillus methanolicusのメタノール資化性は、メタノール代謝に関わる酵素群をコードするプラスミドに依存している（Brautaset T. et al., J. Bacteriology 2004, 186(5), 1229-1238）。このようなプラスミドを近縁の非メチロトローフに導入することで、メタノール資化能を付与することが可能である。さらには、このようなプラスミドを改変することで、様々な非メチロトローフにメタノール資化性を付与することも可能である。
【００８２】
上記のようにして非メチロトローフに対して「メタノール及び／又はギ酸をホルムアルデヒドに変換する機能」を付与し、さらに「ホルムアルデヒドの固定化能」を付与することにより、非メチロトローフをメチロトローフと同様に取り扱うことが可能となる。ホルムアルデヒド固定化能の付与は、例えば、上記したセリン経路、ＲｕＭＰ経路、又はＸｕＭＰ経路で作用する酵素をコードする遺伝子を非メチロトローフに導入することにより、実現することができる。
【００８３】
１つの好ましい実施形態では、宿主細胞がメタノール資化性酵母であり、メタノールを脱水素反応によってホルムアルデヒドに変換する酵素をコードする遺伝子がさらに導入され、当該遺伝子が宿主微生物内で発現する。例えば、メタノール資化性を備えたPichia属酵母を宿主細胞として用い、さらにメタノールデヒドロゲナーゼ遺伝子を導入することにより、目的の変異微生物を取得することができる。本実施形態によれば、酸素に頼らずにメタノールをホルムアルデヒドに変換できる、コハク酸を生産可能な変異微生物を得ることができる。
【００８４】
ＲｕＭＰ経路を付与する場合を例として、さらに説明する。ＲｕＭＰ経路の付与は、例えば、上記した３−ヘキスロース６リン酸合成酵素（ＨＰＳ；例えばEC4.1.2.43）遺伝子と、６−ホスホ−３−ヘキスロイソメラーゼ（ＰＨＩ；例えばEC5.3.1.27）遺伝子を導入することにより、実現することができる。すなわち、ＨＰＳ／ＰＨＩによるホルムアルデヒド固定化反応の基質又は生成物である、リブロース５リン酸（Ｒｕ５Ｐ）とフルクトース６リン酸（Ｆ６Ｐ）は、ペントースリン酸経路、及びカルビン回路の代謝中間体として全ての生物に普遍的に存在する。したがって、ＨＰＳ／ＰＨＩの導入により、大腸菌（Escherichia coli）、枯草菌（Bacillus subtilis）、及び酵母等をはじめとする全ての生物にホルムアルデヒド固定化能を付与することが可能である。
【００８５】
元々ＲｕＭＰ経路を有している宿主微生物に、ＨＰＳ遺伝子とＰＨＩ遺伝子を導入してもよい。これにより、ＲｕＭＰ経路によるホルムアルデヒド固定化能を増強することができる。例えば、枯草菌のように、元々ＲｕＭＰ経路もしくはこれと同質の経路を有する微生物に、例えばメタノールデヒドロゲナーゼ (例えば、EC1.1.1.244, EC1.1.2.7）等のアルコール脱水素酵素、３−ヘキスロース６リン酸合成酵素（ＨＰＳ；例えばEC4.1.2.43）、６−ホスホ−３−ヘキスロイソメラーゼ（ＰＨＩ；例えばEC5.3.1.27）、等の酵素をコードする遺伝子を導入することで、メタノールをホルムアルデヒドに変換する機能（すなわちメタノール資化性）を付与すると共に、ホルムアルデヒド固定化能を増強することができる。
【００８６】
なお、メチロトローフである宿主微生物に、ＨＰＳ遺伝子とＰＨＩ遺伝子を導入してもよい。すなわち、セリン経路、ＲｕＭＰ経路、あるいはＸｕＭＰ経路を有するメチロトローフへＨＰＳ／ＰＨＩを導入することで、ＲｕＭＰ経路によるホルムアルデヒド固定化能を増強することができる。その結果、変異微生物のホルムアルデヒド耐性を高めることができ、結果的にメタノールやギ酸に対する耐性及び資化能を高めることが可能となる。これにより、変異微生物の培養効率やコハク酸の生産効率を向上させることが可能となる。
【００８７】
一方、セリン経路によるホルムアルデヒド固定化能を付与する場合には、上記したセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ（例えばEC2.1.2.1）遺伝子を用いることができる。例えば、非メチロトローフに、メタノールデヒドロゲナーゼ等のアルコール脱水素酵素遺伝子、５，１０-メチレンテトラヒドロ葉酸（5,10-methylenetetrahydrofolate）(CH2=H4F) 合成酵素遺伝子、及びセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ (例えばEC2.1.2.1）遺伝子等を導入することで、メタノール資化性と、セリン経路によるホルムアルデヒド固定化能を付与することが可能となる。
【００８８】
本発明の変異微生物では、宿主微生物に対して以下（ａ）〜（ｃ）に示す１又は複数の遺伝子改変が施されている。具体的には、「（ａ）の少なくとも１つ」、「（ｂ）の少なくとも１つ」、「（ｃ）の少なくとも１つ」、「（ａ）の少なくとも１つ及び（ｃ）の少なくとも１つ」、又は「（ｂ）の少なくとも１つ及び（ｃ）の少なくとも１つ」からなる遺伝子改変が施されている。
【００８９】
（ａ）好気的条件下でＴＣＡサイクル内でのコハク酸の蓄積を向上させる遺伝子改変：
（ａ−１）２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性の増強、
（ａ−２）コハク酸デヒドロゲナーゼの活性の欠損若しくは抑制
【００９０】
（ｂ）嫌気的条件下で還元型ＴＣＡサイクル内でのコハク酸の蓄積を向上させる遺伝子改変：
（ｂ−１）フマル酸リダクターゼ活性の増強、
（ｂ−２）ピルビン酸カルボキシラーゼ活性の増強、
（ｂ−３）ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ活性の増強
【００９１】
（ｃ）ＴＣＡサイクルへの炭素供給を促す遺伝子改変：
（ｃ−１）乳酸デヒドロゲナーゼ活性の欠損若しくは抑制、
（ｃ−２）アセチルＣｏＡハイドロラーゼ活性の欠損若しくは抑制、
（ｃ−３）ピルビン酸ギ酸リアーゼ活性の欠損若しくは抑制
【００９２】
２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ（2-oxoglutarate dehydrogenase）は、２−オキソグルタル酸をスクシニルＣｏＡに変換する酵素である。コハク酸デヒドロゲナーゼ（Succinate dehydrogenase）は、コハク酸をフマル酸に変換する酵素である。２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性を増強することにより、あるいはコハク酸デヒドロゲナーゼを欠損若しくは抑制することにより、ＴＣＡサイクルにおけるコハク酸の蓄積を促進することが可能となる。２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性の増強とコハク酸デヒドロゲナーゼの欠損若しくは抑制については、いずれか一方のみ行ってもよいし、両方を行ってもよい。
【００９３】
フマル酸リダクターゼ（Fumarate reductase）は、フマル酸をコハク酸に変換する酵素である。ピルビン酸カルボキシラーゼ（Pyruvate carboxylase）は、ピルビン酸をオキザロ酢酸に変換する酵素である。ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（Phosphoenolpyruvate carboxykinase）は、オキザロ酢酸を脱炭酸してホスホエノールピルビン酸を合成する反応、及びその逆反応を触媒する酵素である。
上述したように、嫌気的（還元的）条件下では還元型ＴＣＡサイクルが機能する。そのため、嫌気的条件下において還元型ＴＣＡサイクルにおけるコハク酸の蓄積を促すために、フマル酸リダクターゼ活性、ピルビン酸カルボキシラーゼ活性、又はホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ活性を増強することで、ＴＣＡ回路の中間代謝産物であるコハク酸を多量蓄積させることが可能となる。
これら３種の酵素活性の増強は、１つの酵素のみについて行ってもよいし、２つ以上の酵素について行ってもよい。
【００９４】
乳酸デヒドロゲナーゼ（Lactate dehydrogenase）は、ピルビン酸を乳酸に変換する酵素である。アセチルＣｏＡハイドロラーゼ（Acetyl-CoA hydrolase）は、アセチルＣｏＡと水から酢酸を生成する酵素である。ピルビン酸ギ酸リアーゼ（Pyruvate formate lyase）は、ピルビン酸と補酵素ＣｏＡからアセチルＣｏＡとギ酸を生成させる酵素である。これらの酵素の活性を欠損若しくは抑制することによって、コハク酸の大量生産に重要であるＴＣＡサイクルへの炭素流入を高レベルに保つことが可能となる。また、ギ酸や酢酸の生成は細胞増殖を強く阻害するので、アセチルＣｏＡハイドロラーゼ活性とピルビン酸ギ酸リアーゼ活性を欠損若しくは抑制することによって、細胞増殖の阻害を回避できる。
これら３種の酵素活性の欠損や抑制は、１つの酵素のみについて行ってもよいし、２つ以上の酵素について行ってもよい。
【００９５】
上述したように、酵素活性の「増強」とは、非改変微生物（例えば野生株、宿主微生物）と比較して当該酵素活性が高いことを指す。好ましくは、非改変微生物と比較して酵素活性が５〜１０倍以上である。
【００９６】
上述したように、酵素活性の「抑制」とは、非改変微生物（例えば野生株、宿主微生物）と比較して当該酵素活性が低いことを指す。好ましくは、非改変微生物と比較して酵素活性が２０％以下である。また、酵素活性の「欠損」とは、当該酵素活性が消失していることを指す。
【００９７】
上記酵素の具体例を以下に挙げる。
【００９８】
・２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ(2-oxoglutarate dehydrogenase；例えば、EC 1.2.4.2、EC 1.2.1.52)
遺伝子の例（Uni-Prot/Swiss-Prot No.で表示）：P20967(Saccharomyces cerevisiae); P23129 (Bacillus subtilis); P0AFG3 (E.coli); Q8NRC3(Corynebacterium glutamicum); 等
【００９９】
・コハク酸デヒドロゲナーゼ（succinate dehydrogenase；例えばEC 1.3.5.1）
遺伝子の例（Uni-Prot/Swiss-Prot No.で表示）：P69054 (E. coli); P0AC41 (E. cli); P07014 (E. coli); P33421 (Saccharomyces cerevisiae); P37298 (Saccharmomyces cerevisiae); Q08230 (Saccharmomyces cerevisiae)等
【０１００】
・フマル酸リダクターゼ (Fumarate reductase；例えばEC 1.3.1.6, EC 1.3.5.4等)
遺伝子の例（Uni-Prot/Swiss-Prot No.で表示）：P0A8Q3 (E. coli); P0A8Q0 (E. coli); P0A8Q4 (E. coli); P00363 (E. coli); P0AC47 (E. coli); Q4QM68 (Haemophilus influenza); A5UDP2 (Haemophilus influenza); A5UHY2 (Haemophilus influenza)等
【０１０１】
・ピルビン酸カルボキシラーゼ (Pyruvate carboxylase；例えばEC 6.4.4.1)
遺伝子の例（Uni-Prot/Swiss-Prot No.で表示）：P9KWU4 (Bacillus subtilis); P32327 (Saccharomyces cerevisiae); P11154 (Saccharomyces cerevisiae); P78992 (Pichia pastoris)等
【０１０２】
・ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（Phosphoenolpyruvate carboxykinase；例えば EC 4.1.1.32）
遺伝子の例（Uni-Prot/Swiss-Prot No.で表示）：P22259 (E. coli); P54418 (Bacillus subtilis); P10963 (Saccharomyces cerevisiae); Q4QM91 (Haemophilus influenza); Q3KJP4 (Pseudomonas fluorescens); A4QHQ4 (Corynebacterium glutamicum)等
【０１０３】
・乳酸デヒドロゲナーゼ(Lactate dehydrogenase；例えば EC1.1.2.3, 1.1.2.4, 1.1.1.27,1.1.1.28)
遺伝子の例（UniProt KB/Swiss-Prot No.で表示）：P06149 (E. coli); P33232 (E. coli); P52643 (E. coli); P13714 (Bacillus subtilis); P00175(Saccharomyces cerevisiae)等
【０１０４】
・アセチルＣｏＡハイドロラーゼ(acetyl CoA hydrolase；例えば EC 3.1.2.1)
遺伝子の例（UniProt KB/Swiss-Prot No.で表示）：Q81S17 (Bacillus anthracis); P32316 (Saccharomyces cerevisiae); C4R404(Pichia pastoris)等
【０１０５】
・ピルビン酸ギ酸リアーゼ(Pyruvate formate lyase；例えば EC 2.3.1.54)
遺伝子の例（UniProt KB/Swiss-Prot No.で表示）：P09373 (E. coli); P32674 (E. coli); Q7A7X6 (Staphylrococcus aureus); P43753 (Haemophilus influenzae)等
【０１０６】
上述したように、「遺伝子の改変」には、既存の遺伝子に対する改変、既存の遺伝子と別の遺伝子との置換、新たな遺伝子の導入（付加）、の３つが少なくとも含まれる。
【０１０７】
上記酵素の活性を欠損、抑制、又は増強させる遺伝子改変の手法としては、発現する酵素の分子数を増減させる手法と、発現する酵素自体の活性を増減させる手法の２つが大きく挙げられる。前者の例としては、標的酵素遺伝子の発現量を転写レベルあるいは翻訳レベルで増減させる手法が挙げられる。具体的には、プロモーター配列やシャインダルガルノ（ＳＤ）配列等の発現調節配列を改変することが挙げられる。
後者の例としては、ゲノム上の標的酵素遺伝子に変異を導入することが挙げられる。
【０１０８】
酵素活性を欠損若しくは抑制する場合には、宿主微生物が有する既存の酵素遺伝子を別の酵素遺伝子に置換する態様が好ましく採用される。例えば、ゲノム上にある既存の酵素遺伝子を、フレームシフトを生じさせた配列、点変異を生じさせた配列、標的酵素の部分断片遺伝子、等に置換することにより、酵素活性の欠損や抑制を実現することができる。
なお、酵素活性を増強したい場合には、既存の酵素遺伝子を、例えばコドン改変等によって酵素活性が増強された遺伝子に置換すればよい。
【０１０９】
遺伝子の置換は、例えば相同組換えにより行うことができる。相同組換えに求められる塩基配列の相同性は、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上である。なお、相同組換え法による遺伝子操作法は多くの細菌等ですでに確立されており、直鎖状ＤＮＡを用いる方法や、プラスミドを用いる方法等がある（米国特許第６３０３３８３号；特開平０５−００７４９１号公報）。
【０１１０】
宿主微生物に変異誘発剤等による変異処理を行うことによっても、目的の遺伝子改変を行うことができる。例えば、放射線照射や、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）や亜硝酸等の変異剤によって宿主微生物を処理し、標的酵素の活性が欠損、抑制、又は増強された変異微生物を選抜することができる。
【０１１１】
宿主微生物に対して新たな遺伝子を導入（付加）することによっても、目的の変異微生物を得ることができる。この態様は、主に標的酵素の活性を増強したい場合に有用である。例えば、宿主微生物が元々有する酵素遺伝子と同じ遺伝子を外部からさらに導入し、遺伝子のコピー数を増加させることが挙げられる。その他、宿主微生物に適したコドンに改変した酵素遺伝子を導入することが挙げられる。導入する酵素遺伝子は、宿主微生物と同じ由来のものが好ましいが、別の由来であってもかまわない。原核生物由来、真核生物由来のいずれであってもよい。使用可能な酵素の種類、遺伝子配列、アミノ酸配列、活性等の情報は、例えば酵素情報システム“Enzyme Database-BRENDA”（http://www.brenda-enzymes.info/）より入手可能である。
【０１１２】
細胞内でコハク酸濃度が高まるとコハク酸生成の抑制がかかる。これを改善するには、余剰に生成するコハク酸の細胞外排出を促進する機能を有することが好ましい。そこで、好ましい実施形態では、コハク酸の細胞外排出を促進する輸送体タンパク質をコードする遺伝子が導入され、当該遺伝子が変異微生物内で発現する。
【０１１３】
当該輸送体タンパク質としては、原核細胞においてコハク酸その他のジカルボン酸等を細胞外へ排出させることが可能な物性と機能を有するものであれば、その種類や由来生物種は特に限定されない。好ましくは、糖鎖付加等の翻訳後修飾を受けずに、原核生物でも機能するものであり、例えば細菌由来、さらに好ましくはグラム陽性細菌由来のものである。
コハク酸の細胞外排出に適した輸送体タンパク質の例としては、原核生物由来では、Drug/metabolite transporter (DMT)、C4-dicarboxylate ABC transporter (ABC)、MFS family major facilitator transporter (MFS)、C4-dicarboxylate transporter A (DctA)、C4-dicarboxylate uptake B (DcuB)、L-tartrate/succinate antiporter (TtdT、YgjE)、Dicarboxylate amino acid-cation symporter (DAACS)、Divalent anion sodium symporter (DASS)、Tripartite ATP-independent periplasmic (TRAP)、CitMHS、MaeN等のファミリーに属する輸送体タンパク質、及びその変異体が挙げられる。
真核生物由来では、Mitochondrial succinate/fumarate carrier (SFC)、Sodium/dicarboxylate co-transporter、Tonoplast dicarboxylate transporter (TDT)、Aluminum-activated malate transporter (ALMT)等のファミリーに属する輸送体タンパク質、及びこれらの変異体が挙げられる。
なお、各種輸送体機能は、細胞内外コハク酸濃度のみならず、酸化還元電位、ｐＨ、カチオン濃度、アニオン濃度、及びリン酸濃度等にも依存するため、培養条件検討との組合せによって効率の良いコハク酸の細胞外排出が達成できる場合もある。
【０１１４】
宿主微生物に遺伝子を導入する方法としては特に限定はなく、宿主微生物の種類等によって適宜選択すればよい。例えば、宿主微生物に導入可能でかつ組み込まれた遺伝子を発現可能なベクターを用いることができる。
例えば、宿主微生物が細菌等の原核生物の場合には、当該ベクターとして、宿主微生物において自立複製可能ないしは染色体中への組み込みが可能で、挿入された上記遺伝子を転写できる位置にプロモーターを含有しているものを用いることができる。例えば、当該ベクターを用いて、プロモーター、リボソーム結合配列、上記遺伝子、および転写終結配列からなる一連の構成を宿主微生物内で構築することが好ましい。
【０１１５】
例えば、メチロトローフ細菌の染色体への組み込み方法としては、リブロースモノリン酸経路を有するMethylobacillus flagellatusや、セリン経路を有するMethylobacterium extorquencsで、目的遺伝子の破壊操作によって例が示されている（Chistoserdova L. et al., Microbiology 2000, 146, 233-238; Chistoserdov AY., et al., J. Bacteriol 1994, 176, 4052-4065）。これらは環状ＤＮＡを用いたゲノムへの遺伝子導入法であるが、Methylophilus属細菌等では、直鎖状ＤＮＡを用いたゲノムへの遺伝子導入法も開発されている（特開２００４−２２９６６２号公報）。一般に、宿主微生物による分解を受けにくい場合は、直鎖状ＤＮＡによるゲノム組換えの方が、環状ＤＮＡによるよりも効率的である。また通常、相同組換え法は、inverted-repeat sequence等のように、ゲノム上に多コピー存在する遺伝子を標的することが好ましい。また、ゲノムに多コピー導入する手法としては、相同組換え以外に、トランスポゾンに搭載する方法もある。メチロトローフ細菌へのプラスミドによる遺伝子導入法としては、例えば、広宿主域ベクターであるpAYC32 (Chistoserdov AY., et al., Plasmid 1986, 16, 161-167)、pRP301 (Lane M., et al., Arch. Microbiol. 1986, 144(1), 29-34)、pBBR1、pBHR1 (Antoine R. et al., Molecular Microbiology 1992, 6, 1785-1799)、pCM80 (Marx CJ. et al., Microbiology 2001, 147, 2065-2075）、等がある。
【０１１６】
メチロトローフ酵母における遺伝子導入方法としては、主にPichia pastorisで確立されており、pPIC3.5K、pPIC6、pGAPZ、pFLD（インビトロジェン社）等のベクターが市販されている。
【０１１７】
Bacillus属細菌への遺伝子導入にできる使用プラスミドとしては、Bacillus subtilisには、pMTLBS72 (Nquyen HD. Et al., Plasmid 2005, 54(3), 241-248)、pHT01（フナコシ社）、pHT43（フナコシ社）等が、Bacillus megateriumには、p3STOP1623hp （フナコシ社）、pSPYocHhp（フナコシ社）等が、Bacillus brevisには、pNI DNA（タカラバイオ社）等がある。
【０１１８】
またベクターを用いて複数種の遺伝子を宿主微生物に導入する場合、各遺伝子を１つのベクターに組み込んでもよいし、別々のベクターに組み込んでもよい。さらに１つのベクターに複数の遺伝子を組み込む場合には、各遺伝子を共通のプロモーターの下で発現させてもよいし、別々のプロモーターの下で発現させてもよい。
複数種の遺伝子を導入する例としては、フマル酸リダクターゼ遺伝子、ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子、及びホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ遺伝子からなる群より選ばれた２以上の遺伝子が挙げられる。
他の例としては、フマル酸リダクターゼ遺伝子、ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子、及びホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ遺伝子からなる群より選ばれた少なくとも１つの遺伝子と、コハク酸輸送体タンパク質遺伝子とを導入する態様が挙げられる。
他の例としては、２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ遺伝子と、コハク酸輸送体タンパク質遺伝子とを導入する態様が挙げられる。
【０１１９】
以上のようにメチロトローフ等で使用できる既知のベクターを示したが、プロモーター、ターミネーター等の転写制御、複製領域等に関わる領域を、目的に応じて改変することができる。改変方法としては各宿主微生物、もしくはその近縁種における天然の他の遺伝子配列に変更してもよく、また人工の遺伝子配列に変更してもよい。
【０１２０】
また、以上の遺伝子導入による改変に加え、突然変異、ゲノムシャッフリング等の変異手法をも組み合わせることで、宿主微生物での導入遺伝子の発現量、宿主微生物のクエン酸排出機能、クエン酸耐性、等を向上させることにより、クエン酸の生産性をさらに向上させることが可能となる。
【０１２１】
本発明の変異微生物においては、上記以外の遺伝子がさらに導入されていてもよい。導入する遺伝子としては、例えば、上記したメタノールデヒドロゲナーゼ遺伝子、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子、メタンモノオキシダーゼ遺伝子、ＨＰＳ／ＰＨＩ遺伝子、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ遺伝子、５，１０-メチレンテトラヒドロ葉酸合成酵素遺伝子、及びセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ遺伝子、等が挙げられる。
【０１２２】
本発明のクエン酸の生産方法の１つの様相では、上記した変異微生物を、メタン、メタノール、メチルアミン、ギ酸、ホルムアルデヒド、及びホルムアミドからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物を炭素源として用いて培養し、当該変異微生物にクエン酸を生産させる。炭素原として用いるこれらのＣ１化合物については、１つのみを用いてもよいし、２つ以上を組み合わせて用いてもよい。また、これらのＣ１化合物は、主たる炭素原として用いることが好ましく、唯一の炭素原であることがより好ましい。
【０１２３】
なお、偏性メチロトローフの場合は、Ｃ１化合物を唯一の炭素源とする合成培地を用いることが基本であるが、これに酵母エキス、コーンスティープリカー、肉エキス等の天然培地やビタミン類を少量加えることによっても菌の増殖は促進される。通性メチロトローフである場合は、菌体増殖ステージでは糖質、脂質等のＣ１化合物以外の物質を炭素源としてもよく、コハク酸生産ステージで炭素源を上記Ｃ１化合物に変更すればよい。微生物の培養法としては、目的に応じて好気、微好気、もしくは嫌気条件で培養可能である。またバッチ培養、流加培養、連続培養のいずれの方法でもよい。
炭素源として例えばメタノールを用いる場合は、通常、細菌の場合は１．０％（ｖ/ｖ）濃度、酵母の場合は３．０％（ｖ/ｖ）濃度以下で用いるが、人為的にこれらに対する耐性を改良した場合は、それ以上の濃度でも培養可能である。
【０１２４】
本発明のコハク酸の生産方法の別の様相では、上記した変異微生物に、メタン、メタノール、メチルアミン、ギ酸、ホルムアルデヒド、及びホルムアミドからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物を接触させ、当該変異微生物に前記Ｃ１化合物からコハク酸を生産させる。すなわち、細胞分裂（細胞増殖）を伴うか否かにかかわらず、変異微生物に前記したＣ１化合物を接触させて、コハク酸を生産させることができる。例えば、固定化した変異微生物に前記したＣ１化合物を連続的に供給し、コハク酸を連続的に生産させることができる。
本様相においても、これらのＣ１化合物については、１つのみを用いてもよいし、２つ以上を組み合わせて用いてもよい。
【０１２５】
生産されたコハク酸は、細胞内に蓄積されるか、細胞外に放出される。例えば、細胞外に放出されたコハク酸を回収し、単離精製することにより、純化されたコハク酸を取得することができる。
【図１】
2014150747.tif 000003