(57)【要約】【課題】ＤＮＡ技術を用いた組換えインフルエンザワクチンを調製するための方法。【解決手段】得られるワクチンは、多価、好ましくは３価の、伝染病の可能性のあるインフルエンザウイルスからクローン化された組換え血球凝集素抗体の混合物に基づくインフルエンザワクチンである。組換え血球凝集素抗体は、全長で、分解されておらず（ＨＡ０）、培養された昆虫細胞中でのバキュロイルス発現ベクターから生成され、非変成条件下で精製された。好ましい実施態様においては、クローン化されたＨＡ遺伝子は、続いて天然疎水性シグナルペプチド配列が欠失され、またそれらを新規バキュロイルスキチナーゼシグナルペプチドで置き換えることにより改変される。昆虫細胞中で生成された組換えＨＡタンパク質の十分な抽出および精製方法の一般的な方法もまた、Ａ亜型およびＢ型インフルエンザウイルスからのｒＨＡタンパク質の精製のために提供する。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
培養昆虫細胞においてバキュロウイルス発現系によって産生された組換えグリコシル化インフルエンザ血球凝集素タンパク質を含むワクチン組成物であって、前記血球凝集素タンパク質が、９５％より高い純度まで精製されておりかつ免疫原性であり、ワクチンとして用いられた場合に防御免疫反応を誘導することを特徴とするワクチン組成物。
【請求項２】
アジュバント剤をさらに含むことを特徴とする請求項１記載のワクチン組成物。
【請求項３】
前記インフルエンザが、インフルエンザＡ株およびインフルエンザＢ株より成る群から選択されることを特徴とする請求項１または２記載のワクチン組成物。
【請求項４】
培養昆虫細胞においてバキュロウイルス発現系によって産生された組換えグリコシル化インフルエンザ血球凝集素タンパク質の有効量を、動物（ヒトを除く）に投与することを含み、前記血球凝集素タンパク質が、９５％より高い純度まで精製されておりかつ免疫原性であり、ワクチンとして用いられた場合に防御免疫反応を誘導することを特徴とする、インフルエンザに対して動物にワクチン接種する方法。
【請求項５】
アジュバント剤と組み合わせて前記タンパク質を前記動物に投与することを含む請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記インフルエンザが、インフルエンザＡ株およびインフルエンザＢ株より成る群から選択されることを特徴とする請求項４または５記載の方法。
【請求項７】
前記動物が哺乳類であることを特徴とする請求項４から６いずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般に組換えインフルエンザワクチンの領域にある。
【背景技術】
【０００２】
卵中での繁殖を要求しないインフルエンザワクチンの製造方法は、好ましくない免疫反応を引き起こす恐れの少ないであろうより純粋な製品という結果となる。さらに、より純粋なワクチン繁殖は、ウイルスの不活性化またはウイルス膜成分の有機的抽出を要求しないであろうから、それにより、抗原性エピトープの変性およびワクチン中の残存化合物による安全性の懸念を回避するものである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
付加的には、卵繁殖なしで生産されたインフルエンザワクチンは、卵を通しての適応および継代の間に生じる遺伝的非相同性を回避するであろう。これにより、インフルエンザ伝染病株により適合したワクチンという結果となり、改善された効率となるであろう。
【０００４】
従って、卵中での複製を必要としないインフルエンザワクチンの製造方法を提供することが本発明の目的である。
【０００５】
迅速で、経費効率が良く、高度に精製された、インフルエンザの１次給源からのワクチン製造を可能とするインフルエンザワクチンの製造方法を提供することが本発明のさらなる目的である。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
組換えインフルエンザ血球凝集素タンパク質の、バキュロイルス発現系を用いた昆虫細胞中での発現による調製方法を提供する。
【０００７】
得られたタンパク質は、伝染性である可能性を有するインフルエンザウイルスからクローン化された組換え血球凝集素抗原の混合物に基づく多価インフルエンザワクチンを作成するのに有用である。組換え血球凝集素抗原は、全長で、ＨＡ１およびＨＡ２の両方のサブユニット（ＨＡ０）を有する、非変性条件下で９５％より高い純度、好ましくは９９％の純度まで精製された分解されていない（ＨＡ０）糖タンパク質である。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１はインフルエンザＡ株由来のＨＡ遺伝子のウイルスＲＮＡ調製物からのクローニング、発現されたｒＨＡの精製、およびｒＨＡの生物学的な活性を示す図である。略語：ＦＤＡ、食品薬品局；ＭＤＣＫ、マディン ダービー（Ｍａｄｉｎ Ｄａｒｂｙ）イヌ腎臓；ＴＰＣＫ、トシルフェニルアラニルクロロメチルケトン；ＲＮＡ、リボ核酸；ＨＡ、血球凝集素；ＦＢＳ、胎児ウシ血清；ＰＣＲ複製連鎖反応；ＢＶ、バキュロイルス。
【図２】図２は、インフルエンザＡ／テキサス／３６／９１株のＨＡ遺伝子のクローニングおよび発現に応用された図１の方法のより詳細な図である。インフルエンザＨＡ遺伝子は、インフルエンザＡ／テキサス／３６／９１株に感染したＭＤＣＫ細胞から精製されたＲＮＡより、逆転写酵素およびユニバーサルプライマー（配列番号１）を用いて、続いて２ラウンドのＰＣＲ増幅およびクローニングにより得られた。示されているように、第１のラウンドのＰＣＲ反応においては、５’末端プライマー配列番号２および３’末端プライマー配列番号３が用いられた。第２ラウンドのＰＣＲ反応においては、５’末端プライマー配列番号４および３’末端プライマー配列番号５が用いられた。バキュロイルス組換えベクターはポリヘドリン（ｐｏｌｙｈｅｄｒｉｎ）プロモーター、および成熟ＨＡタンパク質の完全コード配列が続いているバキュロイルス６１Ｋ遺伝子（約６１０００の分子量を有するシグナルペプチドをコードしているバキュロイルス遺伝子）由来のシグナルペプチド配列を含んで構築された。この組合せのベクターは、続いてこのウイルス株からＨＡを生産するバキュロイルス発現ベクターを作成するために用いられた、
【図３】図３は、４２日、ｎ＝５のマウスにおける抗ＨＡ免疫反応のグラフであり、ｒＨＡ０−ニート（ｎｅａｔ）；Ｆｌｕｚｏｎｅ（登録商標）ワクチンおよびｒＨＡ−アルム（ａｌｕｍ）についての抗体価を、投与量０．５μｇ（黒いバー）、０．１μｇ（影付きバー）、０．０２μｇ（水玉バー）、０．００４μｇ（白いバー）で図示している。
【図４ａ】図４ａは、ｒＨＡまたは許可された３価ワクチン（１９９４ー１９９５規格）で免疫化されたマウスにおける抗ＨＡ免疫反応を、ワクチン化後の期間（週）に対するＨＩＡ力価で示す。ｒＨＡ（ＨＡＩ Ａ／テキサス／３６／９１）（菱形）および卵中で培養された弱毒化ワクチンＦＬＵＶＩＲＯＮ（登録商標）（正方形）に関して図示する。
【図４ｂ】図４ｂは、ｒＨＡまたは許可された３価ワクチン（１９９４ー１９９５規格）で免疫化されたマウスにおける抗ＨＡ免疫反応を、ワクチン化後の期間（週）に対するＨＩＡ力価で示す。ｒＨＡ（ＨＡＩ Ａ／シャンドン（Ｓｈａｎｇｄｏｎｇ）／９／９３）（菱形）および卵中で培養された弱毒化ワクチンＦＬＵＶＩＲＯＮ（登録商標）（正方形）に関して図示する。
【図４ｃ】図４ｃは、ｒＨＡまたは許可された３価ワクチン（１９９４ー１９９５規格）で免疫化されたマウスにおける抗ＨＡ免疫反応を、ワクチン化後の期間（週）に対するＨＩＡ力価で示す。ｒＨＡ（ＨＡＩ Ｂ／パナマ／４５／９０）（菱形）および卵中で培養された弱毒化ワクチンＦＬＵＶＩＲＯＮ（登録商標）（正方形）に関して図示する。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
組換えインフルエンザワクチンの調製方法について記載する。インフルエンザウイルス由来の、全長の、分解されていない（ＨＡ０）血球凝集素抗原がバキュロイルス発現系により昆虫細胞中で産生され、非変性条件下で精製された。インフルエンザＡおよび／またはインフルエンザＢ株由来の２またはより多くの精製された血球凝集素を一緒に混合して、多価インフルエンザワクチンを形成した。組換え抗原は、効率を高めるためにアジュバント担体と組み合わされても良い。
【００１０】
配列番号６は、バキュロイルス６１Ｋシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に結合したＡ／北京／３２／９２のＨＡをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸配列である。配列番号７は対応するアミノ酸配列であり、バキュロイルス６１Ｋシグナルペプチド（アミノ酸１−１８）に結合したＨＡのアミノ酸配列を示す。
【００１１】
配列番号８は、バキュロイルス６１Ｋシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に結合したＡ／テキサス／３６／９１のＨＡをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸配列である。配列番号９は対応するアミノ酸配列であり、バキュロイルス６１Ｋシグナルペプチド（アミノ酸１−１８）に結合したＨＡのアミノ酸配列を示す。
【００１２】
配列番号１０は、Ｂ／パナマ／４５／９０のＨＡをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸配列である。配列番号１１は対応するアミノ酸配列である。
【００１３】
配列番号１２は、バキュロイルス６１Ｋシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に結合したＢ／オランダ／１３／９４のＨＡをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸配列である。配列番号１３は対応するアミノ酸配列であり、バキュロイルス６１Ｋシグナルペプチド（アミノ酸１−１８）に結合したＨＡのアミノ酸配列を示す。
【００１４】
配列番号１４は、バキュロイルス６１Ｋシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に結合したＡ／山東／９／９３のＨＡをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸配列である。配列番号１５は対応するアミノ酸配列であり、バキュロイルス６１Ｋシグナルペプチド（アミノ酸１−１８）に結合したＨＡのアミノ酸配列を示す。
【００１５】
配列番号１６は、バキュロイルス６１Ｋシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に結合したＢ／上海／４／９４のＨＡをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸配列である。配列番号１７は対応するアミノ酸配列であり、バキュロイルス６１Ｋシグナルペプチド（アミノ酸１−１８）に結合したＨＡのアミノ酸配列を示す。
【００１６】
配列番号１８は、Ｂ／ハルビン／７／９４のＨＡをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸配列である。配列番号１９は対応するアミノ酸配列である。
【００１７】
配列番号２０は、バキュロイルス６１Ｋシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に結合したＡ／ヨハネスブルグ／３３／９４ＨＡをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸配列である。配列番号２１は対応するアミノ酸配列であり、バキュロイルス６１Ｋシグナルペプチド（アミノ酸１−１８）に結合したＨＡのアミノ酸配列を示す。
【実施例】
【００１８】
実施例１
インフルエンザウイルスの繁殖と精製
以下のインフルエンザワクチン株が、ＦＤＡから鶏卵尿液中に得られた：
Ａ／北京／３５３／８９様（Ｈ３Ｎ２）
Ａ／北京／３２／９２様（Ｈ３Ｎ２）
Ａ／テキサス／３６／９１様（Ｈ１Ｎ１）
Ｂ／パナマ／４５／９０
【００１９】
実施例２
インフルエンザＡ／テキサス／３６／９１ ＨＡ遺伝子のクローニング
インフルエンザＨＡ遺伝子の１つのためのクローニングの手順の特別な例が図２に示されている。
【００２０】
実施例３
細菌プラスミドへのＨＡ遺伝子のクローニング
ＰＣＲ増幅されたｒＨＡ遺伝子はｐＵＣ様プラスミドベクター中にＴＡクローニングシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｉｎｃ．）を用いてクローン化された。
【００２１】
実施例４
組換えＨＡ遺伝子の昆虫細胞中での発現
クローン化されたＨＡ遺伝子を含むキメラ組換えプラスミドを精製し、２μｇを、１μｇのＡｃＮＰＶ野生型ＤＮＡと混合した。
【００２２】
実施例５
組換えＨＡの生産および精製
インフルエンザＡ／北京／３５３／８９の遺伝子を含むバキュロイルス発現ベクター、Ａ８６１１が、Ａ／北京／３２／９２血液凝集素をポリヘドリンプロモーターについて上に記載されたものと実質的に同様に作られ、Ｓ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞を感染させるために用いられた。
【００２３】
実施例６
ｒＨＡプロテアーゼ抵抗性の分析
成熟ＨＡは、ＨＡモノマーを分解するトリプシンを含む酵素に対して抵抗性である３次構造に集合する（Ｍｕｒｐｈｙ ａｎｄ Ｗｅｂｓｔｅｒ、１９９０）。
【００２４】
実施例７
標準化されたマウス効力アッセイを用いたｒＨＡの免疫原性
ある抗原の免疫原性を測定するための方法の１つに、マウス中において検出可能な抗体反応を誘導するために必要な量を決定することがある（マウス効力アッセイ）。
【００２５】
実施例８
アジュバントと組合せたｒＨＡの投与および入手可能なインフルエンザワクチンとの比較
インフルエンザＡ／北京／３５３／８９由来の精製されたｒＨＡのマウス効力がアルムとともに、またはアルム無し（ニート）で試験され、市販のインフルエンザワクチンで、インフルエンザＡ／北京／３５３／８９を含んでいるＦｌｕｚｏｎｅ（登録商標）（Ｃｏｎｎａｕｇｈｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．Ｓｗｉｆｔｗａｔｅｒ、ＰＡ）と比較した。
【００２６】
実施例９
血液凝集素阻害の研究
血液凝集素阻害（ＨＡＩ）抗体は、４つの公知の抗体のうちの３つに結合し、インフルエンザの赤血球を凝集する能力を妨害する（Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，”Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ ａｔ ３Å ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ”Ｎａｔｕｒｅ、２８９：３６６−３７８（１９８１））。
【００２７】
実施例１０
１９９３／１９９４インフルエンザワクチンの系統的記述および診療効率
一連のヒト臨床試験が、組換えＨＡを含む実験インフルエンザワクチンのヒトでの安全性および免疫原性を特徴づけるために、および、そのようなワクチンの伝染病の季節の間の天然感染に対しての防御効果についての予備的データを得るために行われた。
【００２８】
実施例１１
改善されたＨＡ０クローニングベクターを作成するための方法
成熟ＨＡの発現のための改善されたクローニングベクターであって、ＨＡをコードする遺伝子がキチナーゼシグナルペプチドの配列をコードする配列の直後に配置されているものが設計された。
【００２９】
実施例１２
１９９５−１９９６インフルエンザウイルスワクチンＡおよびＢ３価型の調製および効果
インフルエンザウイルスワクチン、精製された組換え血球凝集素、３価、ＡおよびＢ型（Ａ／テキサス／３６／９２／１（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／ヨハネスブルグ／３３／９４（Ｈ３Ｎ２）およびＢ／ハービン／７／９４）は、精製された組換えインフルエンザ血球凝集素抗原（ＨＡ）から派生された非感染性サブユニットである。
【００３０】
【表１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
2014111650.tif 000034
【図４ｃ】
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【配列表】
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