(57)【要約】【課題】高い免疫賦活作用を有する、キコブタケ属のメシマコブ（Phellinus linteus）の菌糸体を大量に得るための液体培養方法を提供すること。【解決手段】メシマコブの菌糸体の液体培養において、硫酸マグネシウム及び硫酸亜鉛を添加した炭素源と窒素源を含む液体培地、特に炭素源がデンプン、デキストリン、ラクトース等の液体培地でメシマコブ菌糸体を培養することにより高い免疫賦活能を有する菌糸体を大量に取得する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫賦活作用を有するメシマコブ菌糸体の調製方法であって、硫酸マグネシウム及び硫酸亜鉛を添加した炭素源と窒素源を含む液体培地でメシマコブ菌糸体を培養することを特徴とするメシマコブ菌糸体の調製方法。
【請求項２】
液体培地が、硫酸マグネシウムを０．０８〜０．１２％含むことを特徴とする請求項１記載のメシマコブ菌糸体の調製方法。
【請求項３】
液体培地が、炭素源に対して硫酸亜鉛を１００〜６００ｍｇ／ｋｇ含むことを特徴とする請求項１又は２記載のメシマコブ菌糸体の調製方法。
【請求項４】
炭素源として、デンプン、デキストリン、及びラクトースから選ばれる１種又は２種以上を用いることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載のメシマコブ菌糸体の調製方法。
【請求項５】
デンプンが、トウモロコシデンプンであることを特徴とする請求項４記載のメシマコブ菌糸体の調製方法。
【請求項６】
炭素源を培養初期に１〜２％、培養中期に１〜２％添加することを特徴とする請求項１〜５のいずれか記載のメシマコブ菌糸体の調製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、キコブタケ属のメシマコブ（Phellinus linteus）菌糸体の調製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
キコブタケ属に属するメシマコブ（Phellinus linteus）は漢方では桑黄と呼ばれ、免疫賦活作用の優れていることが判明したために需要が増え、自然栽培のメシマコブの入手は困難となっている。また、メシマコブ子実体は、成長するまで数年を有すため、大量に採取することが難しい。そのために、大量に培養する方法が種々検討され、例えば、特許文献１〜４に記載されているような培養法が報告されている。
【０００３】
特許文献１には、担子菌類の培養培地（炭素源にグルコース、ガラクトース、マンノース、フラクトース等、窒素源としてポリペプトン、酵母エキス、アミノ酸等の有機窒素化合物、マグネシウム塩、リン酸塩等の無機塩等）を使用すること、メシマコブ菌糸体を接種して３０℃付近、ｐＨ５〜８で培養することが記載されている。
【０００４】
特許文献２には、液体培地にメシマコブ菌糸体を接種して２２〜３５℃で培養すること、液体培地の炭素源にグルコース、マンノース、ガラクトース、スクロース、トレハロース、セロビオース、マルトース、ラクトース、ラフィノースから選択された１以上の糖類を使用すること、好気的条件下で培養すること、培養開始時の培地のｐＨを４．５〜６．５とすること等の条件で培養することが記載されている。
【０００５】
特許文献３には、ヤマグワ及び桑の木の幹、枝、葉、根から熱水抽出によって得られる抽出物を添加してメシマコブ菌糸体を液体培養する方法が記載されている。
【０００６】
特許文献４には、オカラ粉末または豆乳を配合することを特徴とするメシマコブの液体培養培地が記載されている。
【０００７】
しかしこれらの培養方法はメシマコブ菌糸体を効率良く大量に取得することにしか着眼していない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開昭４８-４０９９７号公報
【特許文献２】特開２００１-１７８４４８号公報
【特許文献３】特開２００３−２５９８５７号公報
【特許文献４】特開２００６−２７１３３９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の課題は、高い免疫賦活作用を有するメシマコブ菌糸体を大量に得るための液体培養方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、メシマコブ菌糸体を液体培養した場合、培養条件により免疫賦活作用が変化することを見いだした。そこで、高い免疫賦活作用を有する菌糸体を大量に取得することのできる液体培養方法について鋭意検討した結果、硫酸マグネシウム及び硫酸亜鉛を添加した、炭素源と窒素源を含む液体培地でメシマコブ菌糸体を培養することで、特に炭素源としてトウモロコシデンプン、デキストリン、ラクトースを用いた液体培地でメシマコブ菌糸体を培養することで、大量だけではなく、高い免疫賦活作用を有する菌糸体を取得することができることを見いだし、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち本発明は、（１）免疫賦活作用を有するメシマコブ菌糸体の調製方法であって、硫酸マグネシウム及び硫酸亜鉛を添加した炭素源と窒素源を含む液体培地でメシマコブ菌糸体を培養することを特徴とするメシマコブ菌糸体の調製方法や、（２）液体培地が、硫酸マグネシウムを０．０８〜０．１２％含むことを特徴とする上記（１）記載のメシマコブ菌糸体の調製方法や、（３）液体培地が、炭素源に対して硫酸亜鉛を１００〜６００ｍｇ／ｋｇ含むことを特徴とする上記（１）又は（２）記載のメシマコブ菌糸体の調製方法や、（４）炭素源として、デンプン、デキストリン、及びラクトースから選ばれる１種又は２種以上を用いることを特徴とする上記（１）〜（３）のいずれか記載のメシマコブ菌糸体の調製方法や、（５）デンプンが、トウモロコシデンプンであることを特徴とする上記（４）記載のメシマコブ菌糸体の調製方法や、（６）炭素源を培養初期に１〜２％、培養中期に１〜２％添加することを特徴とする上記（１）〜（５）のいずれか記載のメシマコブ菌糸体の調製方法に関する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によると、高い免疫賦活作用を有するメシマコブの菌糸体を大量に取得することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】硫酸マグネシウムを０．０５％又は０．１％添加し、培養したときのメシマコブ菌糸体収量への影響を示す図である。
【図２】硫酸マグネシウムを０．０５％又は０．１％添加し、培養し得られたメシマコブ菌糸体のＴＮＦ−α誘導活性を調べた結果を示す図である。
【図３】硫酸マグネシウムを０．０５％又は０．１％添加し、培養し得られたメシマコブ菌糸体のＩＦＮ−γ誘導活性を調べた結果を示す図である。
【図４】硫酸亜鉛を、２５０ｍｇ／ｋｇグルコース又は５００ｍｇ／ｋｇグルコースとなるように添加し、培養したときのメシマコブ菌糸体収量への影響を示す図である。
【図５】各炭素源を用いて培養したときのメシマコブ菌糸体収量への影響を示す図である。〔１〕はグルコース、〔２〕はトウモロコシデンプン、〔３〕はマルトース、〔４〕はマンノース、〔５〕はキシロオリゴ糖、〔６〕はイソマルトオリゴ糖、〔７〕はスクロース、〔８〕はガラクトース、〔９〕はアラビノース、〔１０〕はビートオリゴ糖、〔１１〕はデキストリン、〔１２〕はマンニトール、〔１３〕はリボース、〔１４〕はラクトース、〔１５〕はトレハロースを炭素源として用い培養したときの結果を示す。
【図６】各炭素源を用いて培養したときのＴＮＦ−α誘導活性への影響を示す図である。〔１〕はグルコース、〔２〕はトウモロコシデンプン、〔３〕はマルトース、〔４〕はマンノース、〔５〕はキシロオリゴ糖、〔６〕はイソマルトオリゴ糖、〔７〕はスクロース、〔８〕はガラクトース、〔９〕はアラビノース、〔１０〕はビートオリゴ糖、〔１１〕はデキストリン、〔１２〕はマンニトール、〔１３〕はリボース、〔１４〕はラクトース、〔１５〕はトレハロースを炭素源として用い培養し、得られたメシマコブの乾燥菌糸体当たりのＴＮＦ−α誘導活性量の結果を示す。（−）はメシマコブ菌糸体無添加のコントロールを示す。
【図７】各炭素源を用いて培養し、得られた培養液当たりのＴＮＦ−α誘導活性量を示す図である。〔１〕はグルコース、〔２〕はトウモロコシデンプン、〔３〕はマルトース、〔４〕はマンノース、〔５〕はキシロオリゴ糖、〔６〕はイソマルトオリゴ糖、〔７〕はスクロース、〔８〕はガラクトース、〔９〕はアラビノース、〔１０〕はビートオリゴ糖、〔１１〕はデキストリン、〔１２〕はマンニトール、〔１３〕はリボース、〔１４〕はラクトース、〔１５〕はトレハロースを炭素源として用い培養したメシマコブ菌糸体を用いたときの培養液当たりのＴＮＦ−α誘導活性量の結果を示す。
【図８】グルコースを培養途中に１％又は２％添加し、培養したときのメシマコブ菌糸体収量への影響を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明のメシマコブ菌糸体の調製方法としては、硫酸マグネシウム及び硫酸亜鉛を添加した炭素源と窒素源を含む液体培地でメシマコブ菌糸体を培養する、免疫賦活作用を有するメシマコブ菌糸体の調製方法であれば特に制限されず、ここで免疫賦活作用とは、免疫機能を高めることと、免疫機能低下を改善することを意味し、例えば、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、Ｔ細胞が活性化して放出するＴＮＦ−αやＩＦＮ−γ等のサイトカインの放出量等によって評価することができる。
【００１５】
上記液体培地の炭素源としては、グルコース、マンノース、ガラクトース、スクロース、アラビノース、リボース、トレハロース、セロビオース、マルトース、ラクトース、ラフィノース、キシロオリゴ糖、イソマルトオリゴ糖、ビートオリゴ糖、デンプン、デキストリン、マンニトール、糖蜜等を例示することができるが、デンプン、マンノース、キシロオリゴ糖、イソマルトオリゴ糖、スクロース、ガラクトース、アラビノース、ビートオリゴ糖、デキストリン、マンニトール、リボース、ラクトース、トレハロースを挙げることができ、デンプン、デキストリン、ラクトースが好ましく、デンプンがより好ましい。例えば、デンプン、キシロオリゴ糖、イソマルトオリゴ糖、デキストリン、ラクトースを炭素源として用いると、グルコースを用いた場合よりメシマコブ菌糸体収量が増加し、デンプン、マンノース、スクロース、ガラクトース、アラビノース、ビートオリゴ糖、デキストリン、マンニトール、リボース、ラクトース、トレハロースを炭素源として用いると、グルコースを用いた場合より菌体重量あたり高い免疫賦活作用を有するメシマコブ菌糸体を取得することができる。さらに、デンプン、マンノース、デキストリン、マンニトール、ラクトースを炭素源として用いると、グルコースよりも、高い培養液当たりのＴＮＦ−α誘導能を示すメシマコブ菌糸体を取得することができる。
【００１６】
上記デンプンとしては高等植物由来のデンプンであればいずれも用いることができ、例えば、トウモロコシ、じゃがいも、米、麦、タピオカ等由来のデンプンを挙げることができるが、特に好ましい例としてトウモロコシデンプンを挙げることができる。
【００１７】
炭素源の添加濃度としては２〜５％が好ましい。添加の方法としては一度に添加してもよいが、初発の糖濃度を抑え培養中期、例えば培養総日数が２８日の場合は培養１４日目に１〜２％添加し、最終添加濃度が２〜５％となるようにすることが好ましい。なお、本発明において、培地成分の添加量（％）は、すべて質量／容量で表されている。
【００１８】
上記液体培地の窒素源としては、酵母エキス、きなこ、ポリペプトン、Bacterio-N、カゼイン、コーン・スチープ・リカー、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム等を用いることができる。窒素源の添加濃度としてはこれら成分の添加総量が０．４〜０．７％となるようにすることが好ましい。
【００１９】
硫酸マグネシウムは、培地濃度が０．０８〜０．１２％、特に０．１％となるように添加することが好ましく、また、硫酸亜鉛は、炭素源に対して１００〜６００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは２００〜３００ｍｇ／ｋｇ、特に２５０ｍｇ／ｋｇとなるように添加することが好ましい。
【００２０】
上記液体培地に、硫酸マグネシウム及び硫酸亜鉛に加えて、さらに他の硫酸塩、マグネシウム塩、リン酸塩等の無機塩類、ビタミン類等を添加しても良い。
【００２１】
上記液体培地のｐＨとしては、４．０〜７．０、好ましく４．５〜６．５であり、培養温度は、通常の糸状菌の培養に用いられる温度範囲で行うことができるが、好ましくは２２〜３５℃、更に好ましくは２５〜３２℃が挙げられる。また、液体培養は、通気撹拌条件下で２〜３０日間行うことができる。
【実施例】
【００２２】
以下、実施例等により本発明を説明するが、本発明の技術的範囲はかかる実施例に限定されるものではない。なお、基本培地としては、公知の大量培養に用いられている、グルコース２％、酵母エキス０．５％、きなこ０．１％、ＫＨ２ＰＯ４０．１％の組成の培地を用いた。
［実施例１］
【００２３】
［硫酸マグネシウムの添加効果］
基本培地に、硫酸マグネシウムを０％、０．０５％、０．１％となるように添加した培地を５００ｍｌ容三角フラスコに２５０ｍｌずつ分注し、オートクレーブ滅菌後（１２１℃、１５分間）、室温まで冷却した。冷却後、５ｍｍ角に切り取ったメシマコブ菌糸体片を１０片接種し、大型恒温振とう培養器（タイテック株式会社）を用い、２８℃、１００ｒｐｍの条件で１４日間振とう培養した。培養終了後、吸引濾過機で菌糸体を分離し、得られた菌糸体を凍結乾燥後、その重量を測定した。その結果、図１に示すように、硫酸マグネシウム無添加（対照）に比べて、硫酸マグネシウム０．０５％添加により８．６％、０．１％添加により５．１％それぞれ乾燥菌糸体量が増加した。
【００２４】
次に、凍結乾燥菌糸体の免疫賦活能を以下の方法で測定した。すなわち、ＲＡＷ２６４細胞株を用いてＴＮＦ−α誘導活性を、ＤＢＡ／２マウス脾臓細胞を用いてＩＦＮ−γ誘導活性を測定した。
【００２５】
（ＴＮＦ−α誘導活性）
コンフルエント（confluent）のＲＡＷ２６４細胞株をトリプシン処理によりディッシュより剥離し、細胞を回収後、１×１０５ cells/wellとなるように、ＦＢＳ（シグマアルドリッチ社製）を１０％含有するＲＰＭＩ １６４０（シグマアルドリッチ社製）培地を添加した９６well F plateに播種した。硫酸マグネシウム添加、無添加培養で得られたメシマコブ菌糸体を、終濃度５０μｇ／ｍｌとなるよう添加し、３７℃、５％ＣＯ２下で２４時間培養した。メシマコブ菌糸体無添加で培養したものをコントロールとした。培養上清を回収し、Ｍｏｕｓｅ  ＴＮＦ−α（Ｍｏｎｏ／Ｍｏｎｏ）測定用ＥＬＩＳＡキット（ＢＤ社製）を用いてＴＮＦ−α濃度の測定を行った。
結果を図２に示す。
【００２６】
（ＩＦＮ−γ誘導活性）
ＤＢＡ／２マウス（♀、５週齢）を安楽死させた後、脾臓を摘出した。脾臓をほぐし、脾臓細胞を回収し、トリス緩衝液にて洗浄処理を行った。５×１０５ cells/wellとなるように９６well F plateに脾臓細胞を、ＦＢＳ（シグマアルドリッチ社製）を１０％含有するＲＰＭＩ １６４０（シグマアルドリッチ社製）培地に播種した。硫酸マグネシウム添加、無添加培養で得られたメシマコブ菌糸体を、終濃度５μｇ／ｍｌとなるよう添加し、３７℃、５％ＣＯ２下で４８時間培養した。メシマコブ菌糸体無添加で培養したものをコントロールとした。培養上清を回収し、Ｍｏｕｓｅ  ＩＦＮ−γ測定用ＥＬＩＳＡキット（ＢＤ社製）を用いＩＦＮ−γ濃度の測定を行った。結果を図３に示す。
【００２７】
図２及び３からわかるように、硫酸マグネシウムを添加することにより濃度依存的にＴＮＦ−α及びＩＦＮ−γ産生量の増加が認められた。硫酸マグネシウム濃度０％と比較すると、０．１％添加においてＴＮＦ−αが約４倍、ＩＦＮ−γについては若干の増加傾向が確認された。
［実施例２］
【００２８】
［硫酸亜鉛の添加効果］
基本培地に、グルコースに対して、２５０、５００ｍｇ／ｋｇ糖となるように硫酸亜鉛を添加し、実施例１と同様にして、乾燥菌糸体量の増加効果を調べた。その結果、図４に示すように、２５０ｍｇ／ｋｇ糖となるように硫酸亜鉛を添加することによりメシマコブ菌糸体の収量増加が認められた。また、免疫賦活に関しても無添加より硫酸亜鉛を添加することにより同等以上の効果が認められた。さらに、２０００Ｌタンクで培養を行ったときの乾燥菌糸体収量は、硫酸亜鉛無添加では約１３ｋｇであったのに対し、２５０ｍｇ／ｋｇ糖の添加では約１６ｋｇメシマコブ乾燥菌糸体を取得することができた。
［実施例３］
【００２９】
［各種炭素源の効果］
液体培地に硫酸マグネシウムや硫酸亜鉛を添加した場合、菌糸体収量の増加に加えて、ＴＮＦ−αやＩＦＮ−γの産生量の増加が認められたことから、免疫賦活作用を有するメシマコブ菌糸体が得られることがわかったので、各種炭素源を用いて、硫酸マグネシウムと硫酸亜鉛との併用添加効果について調べた。
【００３０】
（予備試験）
培地の炭素源として、〔１〕グルコース、〔２〕トウモロコシデンプン、〔３〕マルトース、〔４〕マンノース、〔５〕キシロオリゴ糖、〔６〕イソマルトオリゴ糖、〔７〕スクロース、〔８〕ガラクトース、〔９〕アラビノース、〔１０〕ビートオリゴ糖、〔１１〕デキストリン、〔１２〕マンニトール、〔１３〕リボース、〔１４〕ラクトース、〔１５〕トレハロースを用いて、実施例１の培養条件で培養を行った。その結果、〔２〕トウモロコシデンプン、〔５〕キシロオリゴ糖、〔６〕イソマルトオリゴ糖、〔１１〕デキストリン、〔１４〕ラクトースを用いた場合にグルコースよりも高い菌糸体収量を得ることができた。
【００３１】
（硫酸マグネシウムと硫酸亜鉛との併用効果）
実施例１で効果の認められた硫酸マグネシウムと、実施例２で効果の認められた硫酸亜鉛とを各種炭素源の基本培地に添加し、再度乾燥菌糸体収量及び菌糸体の免疫賦活能への影響を調べた。すなわち、培地として炭素源２％、酵母エキス０．５％、きなこ０．１％、ＫＨ２ＰＯ４０．１％、硫酸マグネシウム０．１％、硫酸亜鉛２５０ｍｇ／ｋｇ糖（ｐＨ５．５）を用いて、実施例１と同様に培養を行い、実施例１と同様な手法にて、乾燥菌糸体収量及びＴＮＦ−α誘導活性を調べた。
【００３２】
各種炭素源を用いた場合の乾燥菌糸体収量の結果を図５に示す。その結果、上記予備実験との比較から、硫酸マグネシウムと硫酸亜鉛とを併用した場合の各種炭素源における乾燥菌糸体収量は、無添加の場合とほぼ同じ傾向を示した。すなわち、〔２〕トウモロコシデンプン、〔５〕キシロオリゴ糖、〔６〕イソマルトオリゴ糖、〔１１〕デキストリン、〔１４〕ラクトースを用いた場合に〔１〕グルコースよりも高い菌糸体収量を得ることができた。
【００３３】
各種炭素源を用いた場合の、メシマコブの乾燥菌糸体当たりのＴＮＦ−α誘導活性量（ｐｇ／μｇ）の測定結果を図６に示す。図６に示すように、〔２〕トウモロコシデンプン、〔４〕マンノース、〔７〕スクロース、〔８〕ガラクトース、〔９〕アラビノース、〔１０〕ビートオリゴ糖、〔１１〕デキストリン、〔１２〕マンニトール、〔１３〕リボース、〔１４〕ラクトース、〔１５〕トレハロースデキストリンを炭素源として用いた場合、〔１〕グルコースよりも、高い乾燥菌糸体当たりのＴＮＦ−α誘導能を示すメシマコブ菌糸体を取得することができた。特に〔２〕トウモロコシデンプンを炭素源として用いた場合、高いＴＮＦ−α誘導能を示すメシマコブ菌糸体を取得することができた。
【００３４】
各種炭素源を用いた場合の、培養液当たりのＴＮＦ−α誘導活性量（ｎｇ／Ｌ）の測定結果を図７に示す。図７に示すように、〔２〕トウモロコシデンプン、〔４〕マンノース、〔１１〕デキストリン、〔１２〕マンニトール、〔１４〕ラクトースを炭素源として用いた場合、グルコースよりも、高い培養液当たりのＴＮＦ−α誘導能を示すメシマコブ菌糸体を取得することができた。特に〔２〕トウモロコシデンプン、〔１１〕デキストリン、〔１４〕ラクトース、中でも〔２〕トウモロコシデンプンを炭素源として用いた場合、〔１〕グルコースよりも、高い培養液当たりのＴＮＦ−α誘導能を示すメシマコブ菌糸体を取得することができた。
【００３５】
［実施例４］
［グルコースの途中添加効果］
メシマコブの菌糸体培養のために基本培地（グルコース２％、酵母エキス０．５％、きなこ０．１％、ＫＨ２ＰＯ４０．１％、ｐＨ５．５）を用いた。具体的には、基本培地を５Ｌ容ミニジャーに２Ｌずつ分注し、オートクレーブ滅菌後（１２１℃、１５分間）、室温まで冷却して用いた。冷却後、基本培地で振とう培養したメシマコブ菌糸体を１０ｍｌ接種し、培養温度２８℃、エア流量１〜２Ｌ／ｍｉｎ、攪拌速度１００ｒｐｍの条件で培養を行った。培養１４日目に、グルコースを最終濃度１％又は２％となるよう添加し、更に１４日間培養を行った。培養終了後、吸引濾過機で菌糸体を分離し、得られた菌糸体を凍結乾燥後、その重量を測定した。その結果、図８に示すように、培養中期にグルコースを添加しない従来の方法と比較し、グルコース１％添加で１．７倍、２％添加で２．１倍の乾燥菌糸体収量を得ることができた。したがって、実施例１〜３の条件において用いる炭素源をこのグルコース添加と同様の条件で添加することによりさらに免疫活性の高い菌株を大量に取得することができる。
【産業上の利用可能性】
【００３６】
本発明は、キノコ育成産業や漢方薬の分野で有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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