(57)【要約】【課題】インフルエンザウイルスの４つの株に由来する抗原を含むワクチンの提供。【解決手段】本発明のワクチンはインフルエンザウイルスの少なくとも４つの株を含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、卵中よりもむしろ細胞培養物中で産生される。いくつかの実施形態では、ワクチンは、アジュバントを含む。いくつかの実施形態では、ワクチンはスプリットウイルス粒子ワクチンや全ウイルス粒子ワクチンではなく、生糖タンパク質ワクチンまたは糖タンパク質ワクチンである。いくつかの実施形態では、ワクチンは、実質的に同一の質量の各インフルエンザウイルス株の血球凝集素（ＨＡ）を含む。いくつかの実施形態では、４つの株は、２つのインフルエンザＡウイルス株および２つのインフルエンザＢウイルス株を含むであろう（「Ａ−Ａ−Ｂ−Ｂ」）。【選択図】図１
2014015486.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願明細書に記載された発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書中に引用した全ての文献は、その全体が本明細書中で参考として援用される。
【０００２】
技術分野
本発明は、インフルエンザウイルス感染からの防御のためのワクチン、特に、３つを超えるウイルス株由来の抗原を含むワクチンの分野にある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
発明の開示
出願人は、現在の３価ワクチンの多くの不足がその製造中の卵の使用に起因すると認識している。卵ベースの製造は、準備期間および能力の両方に関して、特定の季節に必要な抗原量を増加させるのにあまり適切ではない。現在の卵ベースの製造では、ウイルスを卵中での増殖に適合させる必要があり、このため、製造開始時の消費期間を加え、ワクチン株と拡まっている株との間の適合を軽減する選択圧を導入する。さらに、インフルエンザＢウイルス株は、卵中で十分に増殖せず、高増殖リアソータントは利用不可能である。現在の手順における卵増殖の絶対条件は、２００３／０４年シーズンにおいてはＨ３Ｎ２ミスマッチによって十分に証明されており、これは主に関連するＦｕｊｉ様株が卵を使用して最初に単離されなかったので起こった。これらの不足を克服するために、卵の代わりに細胞培養物をウイルス増殖のために使用することができる。したがって、いくつかの実施形態では、本発明のワクチンを、卵中よりもむしろ細胞培養物中で増殖させたウイルスから産生する。
【０００４】
卵ベースの技術では特定の季節に産生された抗原の量を増加させることができないことに、ワクチン中の抗原量を減少させることによって取り組むこともできる。１つの抗原量を減少させる方法は、アジュバントを使用することである。したがって、いくつかの実施形態では、本発明のワクチンはアジュバントを含む。
【０００５】
いくつかの実施形態では、ワクチンは、実質的に同一の質量の各インフルエンザウイルス株の血球凝集素（ＨＡ）を含む（例えば、約１：１：１：１）。１株あたりのＨＡの質量は、約１５μｇ／用量であり得るか、いくつかの実施形態では、１５μｇ／用量未満（例えば、１０μｇ／用量未満）または１５μｇ／用量超（例えば、＞２０μｇ／用量、＞２５μｇ／用量（約３０μｇ／用量など））であり得る。他の実施形態では、ワクチンは、異なる質量の異なる株のＨＡを含む。
【０００６】
いくつかの実施形態では、ワクチンは、スプリットウイルス粒子不活化ワクチンや全ウイルス粒子不活化ワクチンではなく、生糖タンパク質ワクチンまたは精製糖タンパク質ワクチンである。
【０００７】
したがって、本発明は、株の少なくとも１つが細胞培養物中で増殖した、インフルエンザウイルスの少なくとも４つの株由来の抗原を含むワクチンを提供する。好ましくは、全株を、細胞培養物中で増殖させた。
【０００８】
本発明はまた、ワクチンがオボアルブミンを含まない、インフルエンザウイルスの少なくとも４つの株由来の抗原を含むワクチンを提供する。組成物はまた、他の卵タンパク質（例えば、オボムコイド）およびニワトリＤＮＡを含まなくてよい。
【０００９】
本発明はまた、（ｉ）４つの異なるインフルエンザウイルス株を細胞培養物中で増殖させる工程；（ｉｉ）工程（ｉ）で増殖した各ウイルスから抗原組成物を調製する工程；および（ｉｉｉ）抗原組成物を（例えば、薬学的キャリアと）組み合わせてワクチンを得る工程を含む、ワクチンの調製方法を提供する。
【００１０】
本発明はまた、インフルエンザウイルスの少なくとも４つの株由来の抗原を含み、かつアジュバントを含むワクチンを提供する。
【００１１】
本発明はまた、（ｉ）４つの異なるインフルエンザウイルス株を増殖させる工程；（ｉｉ）工程（ｉ）で増殖した各ウイルスから抗原組成物を調製する工程；ならびに（ｉｉｉ）抗原組成物をアジュバントおよび薬学的キャリアと組み合わせてワクチンを得る工程を含む、ワクチンの調製方法を提供する。
【００１２】
本発明はまた、抗原がスプリットウイルス粒子でも全ウイルス粒子でもない、インフルエンザウイルスの少なくとも４つの株由来の抗原を含むワクチンを提供する。抗原は、生インフルエンザウイルスであり得るか、精製糖タンパク質であり得る（すなわち、ワクチンはインフルエンザウイルスの少なくとも４つの株由来の精製血球凝集素を含むであろう）。
【００１３】
本発明はまた、（ｉ）４つの異なるインフルエンザウイルス株を増殖させる工程；（ｉｉ）工程（ｉ）で増殖した各ウイルスから抗原組成物を調製する工程であって、抗原組成物がスプリットウイルス粒子でも全ウイルス粒子でもない、工程；および（ｉｉｉ）抗原組成物を薬学的キャリアと組み合わせてワクチンを得る工程を含む、ワクチンの調製方法を提供する。
【００１４】
本発明はまた、ワクチンが実質的に同一の質量の各インフルエンザウイルス株の血球凝集素（ＨＡ）を含む、インフルエンザウイルスの少なくとも４つの株由来の抗原を含むワクチンを提供する。各株のＨＡの質量は、１株あたりのＨＡの平均質量の１０％以内であろう。質量は、好ましくは、１５μｇＨＡ／株未満である。
【００１５】
本発明はまた、インフルエンザウイルスの少なくとも４つの株由来の抗原を含むワクチンであって、ワクチンが、ａμｇの第１の株由来の血球凝集素（ＨＡ）、ｂμｇの第２の株由来のＨＡ、ｃμｇの第３の株由来のＨＡ、およびｄμｇの第４の株由来のＨＡを含み、ａおよびｂが実質的に同一であり、ｃおよびｄが実質的に同一であるが、ａおよびｃは実質的に異なる、ワクチンを提供する。ａおよびｂの値は、ａおよびｂの平均（「ａ／ｂ平均」）の１０％以内であろう。ｃおよびｄの値は、ｃおよびｄの平均（「ｃ／ｄ平均」）の１０％以内であろう。ａ／ｂ平均およびｃ／ｄ平均は、ａ／ｂ平均およびｃ／ｄ平均の低い方の少なくとも２５％異なるであろう（例えば、少なくとも３３％、少なくとも４０％、少なくとも５０％）。
【００１６】
本発明はまた、インフルエンザウイルスの少なくとも４つの株由来の抗原を含むワクチンであって、ワクチンが、ａμｇの第１の株由来の血球凝集素（ＨＡ）、ｂμｇの第２の株由来のＨＡ、ｃμｇの第３の株由来のＨＡ、およびｄμｇの第４の株由来のＨＡを含み、ａ、ｂ、およびｃが互いに実質的に同一であるが、ｄと実質的に異なる、ワクチンを提供する。ａ、ｂ、およびｃの値は、ａ、ｂ、およびｃの平均（「ａ／ｂ／ｃ平均」）の１０％以内であろう。ｄの値は、ａ／ｂ／ｃ平均とａ／ｂ／ｃ平均の少なくとも２５％異なるであろう（例えば、少なくとも３３％、少なくとも４０％、少なくとも５０％）。
【００１７】
本発明はまた、インフルエンザウイルスの少なくとも４つの株由来の抗原を含むワクチンであって、ワクチンがｘμｇの株あたりの平均ＨＡ量を有し、（ａ）４つの株のうちの２つのＨＡ量がｘより少なくとも１０％低く、他の２つの株のＨＡ量がｘより少なくとも１０％高いか、（ｂ）４つの株のうちの３つのＨＡ量がｘより少なくとも１０％低く、他の株のＨＡ量がｘより少なくとも１０％高いか、（ｃ）４つの株のうちの３つのＨＡ量がｘより少なくとも１０％高く、他の株のＨＡ量がｘより少なくとも１０％低い、ワクチンを提供する。「少なくとも１０％」は、少なくとも２５％、少なくとも３３％、少なくとも４０％、少なくとも５０％などであり得る。
【００１８】
本発明はまた、（ｉ）４つの異なるインフルエンザウイルス株を増殖させる工程と；（ｉｉ）工程（ｉ）で増殖した各ウイルスから抗原組成物を調製する工程であって、抗原組成物が血球凝集素を含む、工程；および（ｉｉｉ）ワクチン中で、各インフルエンザウイルス株について実質的に同一の質量の血球凝集素が得られる比率にて抗原組成物を薬学的キャリアと組み合わせてワクチンを得る工程を含む、ワクチンの調製方法を提供する。
【００１９】
いくつかの実施形態では、４つの株は、２つのインフルエンザＡウイルス株および２つのインフルエンザＢウイルス株を含むであろう。他の実施形態では、４つの株は、３つのインフルエンザＡウイルス株および１つのインフルエンザＢウイルス株を含むであろう。
【００２０】
株の選択
ワクチンで用いるインフルエンザウイルス株は、季節毎に変化する。現在の流行間の期間では、３価ワクチンは、２つのインフルエンザＡ株（Ｈ１Ｎ１およびＨ３Ｎ２）および１つのインフルエンザＢ株を含む。本発明のワクチンは、インフルエンザウイルスの少なくとも４つの株を含む。異なる株を、典型的には個別に増殖させ、ウイルスを回収して抗原を調製した後に混合する。したがって、本発明の過程は、１つを超えるインフルエンザ株由来の抗原を混合する工程を含むことができる。
【００２１】
いくつかの実施形態では、４つの株は、２つのインフルエンザＡウイルス株および２つのインフルエンザＢウイルス株（「Ａ−Ａ−Ｂ−Ｂ」）を含むであろう。他の実施形態では、４つの株は、３つのインフルエンザＡウイルス株および１つのインフルエンザＢウイルス株（「Ａ−Ａ−Ａ−Ｂ」）を含むであろう。
【００２２】
インフルエンザＡウイルスは、現在、以下の１６種のＨＡサブタイプが示されている：Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、およびＨ１６。本発明は、１つまたは複数のインフルエンザＡウイルスＮＡサブタイプＮ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ８、またはＮ９から防御することができる。たった２つのインフルエンザＡウイルス株を含むワクチンでは、これらは、通常、１つのＨ１株（例えば、Ｈ１Ｎ１株）および１つのＨ３株（例えば、Ｈ３Ｎ２株）であろう。しかし、いくつかの実施形態では、１つの流行株および１つのＨ１株、または１つの流行株および１つのＨ３株が存在し得る。４価インフルエンザワクチンは、Ｈ１Ｎ１株、Ｈ３Ｎ２株、Ｈ５株（例えば、Ｈ５Ｎ１株）、およびインフルエンザＢ株を含むことができる。
【００２３】
３つのインフルエンザＡウイルス株を含むワクチンでは、これらは、１つのＨ１株（例えば、Ｈ１Ｎ１株）および２つのＨ３株（例えば、２つのＨ３Ｎ２株）であろう。２つのＨ３株は、抗原的に異なるＨＡタンパク質（例えば、Ａ／Ｍｏｓｃｏｗ／１０／９９と交差反応する１つのＨ３Ｎ２株およびＡ／Ｆｕｊｉａｎ／４１１／２００２と交差反応する１つのＨ３Ｎ２株）を有するであろう。２つのＨ３株は、異なるクレイド（Ｈ３Ｎ２株のクレイドＡ、Ｂ、およびＣは、参考文献１で開示されている）に由来し得る。しかし、いくつかの実施形態では、これらの株の１つ（すなわち、Ｈ１または２つのＨ３株のうちの１つ）を、流行株と置換することができる。
【００２４】
流行インフルエンザ株の特徴は、以下である：（ａ）現在拡まっているヒト株中の血球凝集素と比較して新規の血球凝集素（すなわち、１０年間にわたってヒト集団において明らかにされていない株（例えば、Ｈ２）またはヒト集団において以前に全く見られていない株（例えば、一般的にトリ集団においてのみ発見されたＨ５、Ｈ６、またはＨ９））を含み、その結果、ワクチンレシピエントおよび一般的ヒト集団が株の血球凝集素に免疫学的にナイーブであること、（ｂ）ヒト集団中で水平に伝播することができること、および（ｃ）ヒトに病原性を示すこと。流行株であるＨ２、Ｈ５、Ｈ７、またはＨ９サブタイプ株（例えば、Ｈ５Ｎ１、Ｈ５Ｎ３、Ｈ９Ｎ２、Ｈ２Ｎ２、Ｈ７Ｎ１、およびＨ７Ｎ７株）。Ｈ５サブタイプ内で、ウイルスは、ＨＡクレイド１、ＨＡクレイド１’、ＨＡクレイド２、またはＨＡクレイド３（参考文献２）に分類することができ、クレイド１および３が特に関連する。
【００２５】
インフルエンザＢウイルスは、現在、異なるＨＡサブタイプが示されていないが、インフルエンザＢウイルス株は２つの異なる系列に分類されている。これらの系列は１９８０年代後期に出現し、互いに抗原的および／または遺伝的に識別することができるＨＡを有する（参考文献３）。現在のインフルエンザＢウイルス株は、Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様またはＢ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様のいずれかである。本発明のワクチンが２つのインフルエンザＢ株を含む場合、１つのＢ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様株および１つのＢ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様株が含まれるであろう。これらの株は、通常、抗原的に識別されるが、２つの系列の識別のためのアミノ酸配列の相違も説明されている（例えば、Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様株はしばしば（しかし、常にではない）は、「Ｌｅｅ４０」ＨＡ配列に対して番号付けしたアミノ酸残基１６４が欠損したＨＡタンパク質を有する（参考文献４））。
【００２６】
したがって、本発明の好ましいＡ−Ａ−Ｂ−Ｂワクチンは、以下の株に由来の抗原（好ましくは、血球凝集素）を含むであろう：（ｉ）Ｈ１Ｎ１株；（ｉｉ）Ｈ３Ｎ２株；（ｉｉｉ）Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様株；および（ｉｖ）Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様株。
【００２７】
本発明のいくつかの実施形態では、２つ以上のインフルエンザＢウイルス株由来の抗原が存在する場合、少なくとも２つのインフルエンザＢウイルス株は、異なる血球凝集素であるが、関連するノイラミニダーゼを有することができる。例えば、これらは、共にＢ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様ノイラミニダーゼを有することができるか（参考文献５）、共にＢ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様ノイラミニダーゼを有することができる。例えば、２つの両Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様ノイラミニダーゼは、１つまたは複数の以下の配列特性を有することができる：（１）残基２７はセリンではなく、好ましくはロイシンであること；（２）残基４４はグルタミン酸ではなく、好ましくはリジンであること；（３）残基４６はトレオニンではなく、好ましくはイソロイシンであること；（４）残基５１はプロリンではなく、好ましくはセリンであること；（５）残基６５はアルギニンではなく、好ましくはヒスチジンであること；（６）残基７０はグリシンではなく、好ましくはグルタミン酸塩であること；（７）残基７３はロイシンではなく、好ましくはフェニルアラニンであること；および／または（８）残基８８はプロリンではなく、好ましくはグルタミンであること。同様に、いくつかの実施形態では、ノイラミニダーゼは、残基４３に欠失を有することができるか、トレオニンを有することができ、ＮＡ遺伝子のトリヌクレオチド欠失を生じる残基４３の欠失は、Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様株の特徴として報告されているが、最近の株は、Ｔｈｒ−４３が回復している（参考文献５）。逆に、勿論、反対の特徴を、２つのＢ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様ノイラミニダーゼで共有することができる（例えば、Ｓ２７、Ｅ４４、Ｔ４６、Ｐ５１、Ｒ６５、Ｇ７０、Ｌ７３、および／またはＰ８８）。これらのアミノ酸は、「Ｌｅｅ４０」ノイラミニダーゼ配列に対して番号付けしている（参考文献６）。したがって、本発明のＡ−Ａ−Ｂ−ＢワクチンはＨＡと抗原的に異なる２つのＢ株（一方はＢ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様、他方はＢ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様）を使用することができるが、ＮＡに関連する（共にＢ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様または共にＢ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様）。
【００２８】
本発明の好ましいＡ−Ａ−Ａ−Ｂワクチンは、以下の株に由来の抗原（好ましくは血球凝集素）を含むであろう：（ｉ）Ｈ１Ｎ１株；（ｉｉ）Ａ／Ｍｏｓｃｏｗ／１０／９９様Ｈ３Ｎ２株；（ｉｉｉ）Ａ／Ｆｕｊｉａｎ／４１１／２００２様Ｈ３Ｎ２株；および（ｉｖ）インフルエンザＢウイルス株（Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様またはＢ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様であり得る）。
【００２９】
本発明は、４価のワクチンに制限されず、５価、６価、７価などのワクチンを含む。５価のワクチンの一例としては、３つのインフルエンザＡ株（例えば、上記で考察した１つのＨ１株および２つのＨ３株）＋２つのインフルエンザＢ株を挙げることができる。例えば、Ａ−Ａ−Ａ−Ｂ−Ｂワクチンは、以下の株に由来の抗原（好ましくは、血球凝集素）を含むことができる：（ｉ）Ｈ１Ｎ１株；（ｉｉ）Ａ／Ｍｏｓｃｏｗ／１０／９９様Ｈ３Ｎ２株；（ｉｉｉ）Ａ／Ｆｕｊｉａｎ／４１１／２００２様Ｈ３Ｎ２株；（ｉｖ）Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様株；および（ｖ）Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様株。別のＡ−Ａ−Ａ−Ｂ−Ｂワクチンは、以下由来の抗原（好ましくは、血球凝集素）を含むことができる：（ｉ）Ｈ１Ｎ１株；（ｉｉ）Ｈ３Ｎ２株；（ｉｉｉ）Ｈ５Ｎ１株などのＨ５インフルエンザＡウイルス株；（ｉｖ）Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様株；および（ｖ）Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様株。Ａ−Ａ−Ａ−Ａ−Ｂワクチンは、以下の株に由来の抗原（好ましくは、血球凝集素）を含むことができる：（ｉ）Ｈ１Ｎ１株；（ｉｉ）Ａ／Ｍｏｓｃｏｗ／１０／９９様Ｈ３Ｎ２株；（ｉｉｉ）Ａ／Ｆｕｊｉａｎ／４１１／２００２様Ｈ３Ｎ２株；（ｉｖ）Ｈ５Ｎ１株などのＨ５インフルエンザＡウイルス株；および（ｖ）インフルエンザＢウイルス株。Ａ−Ａ−Ａ−Ａ−Ｂ−Ｂワクチンは、以下の株に由来の抗原（好ましくは、血球凝集素）を含むことができる：（ｉ）Ｈ１Ｎ１株；（ｉｉ）Ａ／Ｍｏｓｃｏｗ／１０／９９様Ｈ３Ｎ２株；（ｉｉｉ）Ａ／Ｆｕｊｉａｎ／４１１／２００２様Ｈ３Ｎ２株；（ｉｖ）Ｈ５Ｎ１株などのＨ５インフルエンザＡウイルス株；（ｖ）Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様株；および（ｖｉ）Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様株。
【００３０】
本発明と共に使用されるインフルエンザウイルスはリアソータント株であり得、逆遺伝学技術によって得ることができる。逆遺伝学技術（例えば、参考文献７〜１１）によって、所望のゲノムセグメントを有するインフルエンザウイルスをプラスミドを使用してｉｎ
ｖｉｔｒｏで調製することが可能である。典型的には、逆遺伝学技術は、（ａ）例えば、ｐｏｌＩプロモーターまたはバクテリオファージＲＮＡポリメラーゼプロモーター由来の所望のウイルスＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ分子、および（ｂ）例えば、ｐｏｌＩＩプロモーター由来のウイルスタンパク質をコードするＤＮＡ分子を発現させる工程を含み、その結果、細胞中の両ＤＮＡ型の発現によって完全でインタクトな感染性ウイルス粒子が構築される。ＤＮＡは、好ましくは、全てのウイルスＲＮＡおよびタンパク質を提供するが、いくつかのＲＮＡおよびタンパク質を提供するためにヘルパーウイルスを使用することも可能である。各ウイルスＲＮＡの産生に個別プラスミドを使用するプラスミドベースの方法を使用することができ（参考文献１２〜１４）、これらの方法は、全てまたはいくつかの（例えば、ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、およびＮＰタンパク質のみ）ウイルスタンパク質を発現するためのプラスミドの使用も含むであろう。いくつかの方法では、１２個までのプラスミドを使用する。必要なプラスミド数を減少させるために、最近のアプローチ（参考文献１５）は、同一のプラスミド上の複数のＲＮＡポリメラーゼＩ転写カセット（例えば、１、２、３、４、５、６、７、または８個全てのインフルエンザＡ  ｖＲＮＡセグメントをコードする配列）（ウイルスＲＮＡ合成用）および別のプラスミド上のＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターを有する複数のタンパク質コード領域（例えば、１、２、３、４、５、６、７、または８個全てのインフルエンザＡ  ｍＲＮＡ転写物をコードする配列）を組み合わせている。参考文献１５の好ましい態様は以下を含む：（ａ）１つのプラスミド上のＰＢ１、ＰＢ２、およびＰＡ  ｍＲＮＡコード領域、ならびに（ｂ）１つのプラスミド上の８個全てのｖＲＮＡコードセグメント。一方のプラスミド上にＮＡおよびＨＡセグメントを含み、他方のプラスミド上に６個の他のセグメントを含むことによっても、問題を容易にすることができる。
【００３１】
ウイルスＲＮＡセグメントをコードするｐｏｌＩプロモーター使用に代わる手段として、バクテリオファージポリメラーゼプロモーターを使用することが可能である（参考文献１６）。例えば、ＳＰ６、Ｔ３、またはＴ７ポリメラーゼのプロモーターを都合良く使用することができる。ｐｏｌＩプロモーターの種特異性により、細胞を外因性ポリメラーゼ酵素をコードするプラスミドでもトランスフェクトしなければならないにもかかわらず、バクテリオファージポリメラーゼプロモーターは多数の細胞型（例えば、ＭＤＣＫ）により都合が良い。
【００３２】
他の技術では、二重のｐｏｌＩおよびｐｏｌＩＩプロモーターを使用して、ウイルスＲＮＡを同時にコードし、１つのテンプレートからｍＲＮＡを発現することが可能である（参考文献１７、１８）。
【００３３】
したがって、インフルエンザＡウイルスは、Ａ／ＰＲ／８／３４ウイルス由来の１つまたは複数のＲＮＡセグメントを含むことができる（典型的には、Ａ／ＰＲ／８／３４由来の６セグメントであり、ＨＡおよびＮセグメントはワクチン株に由来する（すなわち、６：２リアソータント））。これは、ワクチン調製のためのリアソータントウイルスの精製に有用なＡ／ＷＳＮ／３３ウイルスまたは任意の他のウイルス株由来の１つまたは複数のＲＮＡセグメントを含むこともできる。インフルエンザＡウイルスは、ＡＡ／６／６０インフルエンザウイルス由来の６つ未満（すなわち、０、１、２、３、４、または５つ）のウイルスセグメントを含むことができる（Ａ／Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ／６／６０）。インフルエンザＢウイルスは、ＡＡ／１／６６インフルエンザウイルス由来の６つ未満（すなわち、０、１、２、３、４、または５つ）のウイルスセグメントを含むことができる（Ｂ／Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ／６／６６）。典型的には、本発明は、ヒト−ヒト伝播が可能な株から防御する。したがって、株のゲノムは、通常、哺乳動物（例えば、ヒト）インフルエンザウイルスを起源とする少なくとも１つのＲＮＡセグメントを含むであろう。株のゲノムは、トリインフルエンザウイルスを起源とするＮＳセグメントを含むことができる。
【００３４】
その抗原を組成物中に含めることができる株は、抗ウイルス療法に耐性を示し得（例えば、オセルタミビル（参考文献１９）および／またはザナミビルに耐性を示し得る）、株には、耐性流行株（参考文献２０）が含まれる。
【００３５】
特に有用な株は、患者からの単離と細胞培養系中の複製との間を含めたいかなる段階においても卵を介して継代されない株である。単離からウイルス複製までの全工程についてＭＤＣＫ細胞の排他的使用は、本発明の１つの好ましい実施形態である。
【００３６】
したがって、いくつかの実施形態では、本発明と共に使用される株は、Ｓｉａ（α２，３）Ｇａｌ末端二糖を有するオリゴ糖と比較してＳｉａ（α２，６）Ｇａｌ末端二糖を有するオリゴ糖に対する結合優先度を有する血球凝集素を有するであろう。ヒトインフルエンザウイルスは、Ｓｉａ（α２，６）Ｇａｌ末端二糖（ガラクトースにα２，６結合したシアル酸）を有する受容体オリゴ糖に結合するが、卵およびベロ細胞はＳｉａ（α２，３）Ｇａｌ末端二糖を有する受容体オリゴ糖を有する。ＭＤＣＫなどの細胞中でのヒトインフルエンザの増殖により、卵継代と異なり、天然のＳｉａ（α２，６）Ｇａｌ結合を維持するための血球凝集素に対する選択圧が得られる。
【００３７】
ウイルスがＳｉａ（α２，３）Ｇａｌ末端二糖を有するオリゴ糖と比較してＳｉａ（α２，６）Ｇａｌ末端二糖を有するオリゴ糖に対する結合優先度を有するかどうかを決定する場合、種々のアッセイを使用することができる。例えば、参考文献２１には、インフルエンザウイルス受容体結合活性についての固相酵素結合アッセイについて記載している。これは、親和定数を高感度で定量的に測定する。参考文献２２には、２つの異なるシアリル糖タンパク質へのウイルスの結合を評価する固相アッセイを使用し（オボムコイド（Ｓｉａ（α２，３）Ｇａｌ決定基を含む）；およびブタα２マクログロブリン（Ｓｉａ（α２，６）Ｇａｌ決定基を含む））、以下の２つの受容体アナログに対するウイルスの結合を評価するアッセイについても記載している：遊離シアル酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）および３’−シアリルラクトース（Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ）。参考文献２３では、グリカンアレイを使用したアッセイを報告している。これにより、α２，３またはα２，６結合についての受容体優先度を明確に区別することができた。参考文献２４では、Ｓｉａ（α２，６）ＧａｌまたはＳｉａ（α２，３）Ｇａｌのいずれかを含むように酵素的に修飾されたヒト赤血球の凝集に基づいたアッセイを報告している。アッセイ型に応じて、アッセイを、ウイルス自体を使用して直接実施することができるか、ウイルスから精製した血球凝集素を使用して間接的に実施することができる。
【００３８】
いくつかの実施形態では、本発明と共に使用されるインフルエンザ株は、卵由来ウイルス由来の異なるグリコシル化パターンを有する糖タンパク質（血球凝集素が含まれる）を有する。したがって、糖タンパク質には、ニワトリ卵で見られないグリコフォーム（ｇｌｙｃｏｆｏｒｍ）が含まれるであろう。
【００３９】
いくつかの実施形態では、本発明は、Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／６／８６（Ｈ１Ｎ１）株、Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／３５３／８９（Ｈ３Ｎ２）株、Ｂ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／１／８７株、およびＢ／Ｐａｎａｍａ／４５／９０株の組み合わせ（特にこれら４つの株由来のスプリット抗原の組み合わせおよび／または１５μｇＨＡ／株）を使用しない。他の実施形態では、本発明は、Ａ／Ｔａｉｗａｎ／１／８６（Ｈ１Ｎ１）株、Ａ／Ｇｕｉｚｈｏｕ／５４／８９（Ｈ３Ｎ２）株、Ｂ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／１／８７株、およびＢ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８株の組み合わせ（特に、これら４つの株由来の全ウイルス粒子の組み合わせではない）を使用しない。
【００４０】
ワクチン調製物
種々のインフルエンザウイルスワクチン形態を現在利用可能であり、ワクチンは、一般に、生ウイルスまたは不活化ウイルスのいずれかに基づく。不活化ワクチンは、全ウイルス粒子、「スプリット」ウイルス粒子、または精製表面抗原に基づき得る。インフルエンザ抗原は、ビロソームの形態で存在することもできる。本発明を、任意のこれらのワクチン型と共に使用することができる。
【００４１】
既存の生ワクチンには、ＭｅｄＩｍｍｕｎｅのＦＬＵＭＩＳＴ（商標）（３価生ウイルス）が含まれる。ワクチンを、適切な基質上でのウイルスの増殖およびその後のウイルス粒子含有流動物からのウイルス粒子の精製を含む過程によって調製する。例えば、流動物を、遠心分離によって明澄化し、緩衝液（例えば、スクロース、リン酸カリウム、およびグルタミン酸１ナトリウムを含む）を使用して安定化することができる。
【００４２】
不活化ウイルスを使用する場合、ワクチンは、全ウイルス粒子、スプリットウイルス粒子、または精製表面抗原（血球凝集素が含まれ、さらに、通常、ノイラミニダーゼも含まれる）を含むことができる。ウイルスの化学的不活化手段には、有効量の１つまたは複数の以下の薬剤での処理が含まれる：界面活性剤、ホルムアルデヒド、β−プロピオラクトン、メチレンブルー、ソラレン、カルボキシフラーレン（Ｃ６０）、２成分エチルアミン、アセチルエチレンイミン、またはその組み合わせ。非化学的なウイルス不活化方法は、当該分野で公知である（例えば、紫外線またはγ線照射など）。
【００４３】
ウイルス粒子を、種々の方法によってウイルス含有流動物から回収することができる。例えば、精製過程は、ウイルス粒子を破壊するための界面活性剤を含む線形スクロース勾配溶液を使用したゾーン遠心分離を含むことができる。次いで、任意選択的な希釈後、ダイアフィルトレーションによって抗原を精製することができる。
【００４４】
スプリットウイルス粒子を、界面活性剤（例えば、エチルエーテル、ポリソルベート８０、デオキシコーラ酸塩、リン酸トリ−Ｎ−ブチル、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、ＴｒｉｔｏｎＮ１０１、セチルトリメチルアンモニウムブロミド、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ  ＮＰ９など）を使用して精製ウイルス粒子を処理し、それにより、サブウイルス粒子調製物を産生すること（「Ｔｗｅｅｎ−エーテル」分解過程が含まれる）によって得る。インフルエンザウイルスの分解方法は、当該分野で周知である（例えば、参考文献２５〜３０９を参照のこと）。ウイルスの分解を、典型的には、全ウイルス（感染性、非感染性のいずれでも）の破壊濃度の分解剤での破壊または断片化によって行う。破壊により、ウイルスタンパク質が完全または部分的に可溶化し、ウイルスの完全性が変化する。好ましい分解剤は、非イオン性およびイオン性（例えば、陽イオン性）界面活性剤（例えば、アルキルグリコシド、アルキルチオグリコシド、アシル糖、スルホベタイン、ベタイン、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、Ｎ，Ｎ−ジアルキル−グルカミド、Ｈｅｃａｍｅｇ、アルキルフェノキシ−ポリエトキシエタノール、第四級アンモニウム化合物、サルコシル、ＣＴＡＢ（セチルトリメチルアンモニウムブロミド）、リン酸トリ−Ｎ−ブチル、Ｃｅｔａｖｌｏｎ、ミリスチルトリメチルアンモニウム塩、リポフェクチン、リポフェクタミン、およびＤＯＴ−ＭＡ、オクチル−またはノニルフェノキシポリオキシエタノール（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ界面活性剤（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００またはＴｒｉｔｏｎＮ１０１など））、ポリオキシエチレンソルビタンエステル（Ｔｗｅｅｎ界面活性剤）、ポリオキシエチレンエーテル、ポリオキシエチレンエステルなど）である。１つの有用な分解手順は、デオキシコール酸ナトリウムおよびホルムアルデヒドの連続的影響を使用し、最初のウイルス粒子精製（例えば、スクロース密度勾配溶液）の間に分解が起こり得る。したがって、分解過程は、ウイルス粒子含有物質の明澄化（非ウイルス粒子物質を除去するため）、採取したウイルス粒子の濃縮（例えば、ＣａＨＰＯ４吸着などの吸着法の使用）、非ウイルス粒子物質からの全ウイルス粒子の分離、密度勾配遠心分離工程において分解剤を使用したウイルス粒子の分解（例えば、デオキシコール酸ナトリウムなどの分解剤を含むスクロース勾配を使用）、および濾過（例えば、限外濾過）による望ましくない物質の除去を含むことができる。スプリットウイルス粒子を、有用には、リン酸ナトリウム緩衝化等張塩化ナトリウム溶液中に再懸濁することができる。ＢＥＧＲＩＶＡＣ（商標）、ＦＬＵＡＲＩＸ（商標）、ＦＬＵＺＯＮＥ（商標）、およびＦＬＵＳＨＩＥＬＤ（商標）製品は、スプリットワクチンである。
【００４５】
精製表面抗原ワクチンは、インフルエンザ表面抗原である赤血球凝集素を含み、典型的にはノイラミニダーゼも含む。精製形態のこれらのタンパク質の調製過程は、当該分野で周知である。ＦＬＵＶＩＲＩＮ（商標）、ＡＧＲＩＰＰＡＬ（商標）、およびＩＮＦＬＵＶＡＣ（商標）製品は、サブユニットワクチンである。
【００４６】
別の不活化インフルエンザ抗原形態は、ビロソーム（参考文献３１）（核酸遊離ウイルス様リポソーム粒子）である。ビロソームを、界面活性剤でのインフルエンザウイルスの可溶化およびその後のヌクレオカプシドの除去およびウイルス糖タンパク質を含む膜の再構成によって調製することができる。別のビロソームの調製方法は、過剰量のリン脂質にウイルス膜糖タンパク質を添加して、その膜中にウイルスタンパク質を含むリポソームを得る工程を含む。本発明を使用して、ＩＮＦＬＥＸＡＬ  Ｖ（商標）およびＩＮＶＡＶＡＣ（商標）製品のように大量のビロソームを保存することができる。
【００４７】
インフルエンザウイルスを弱毒化することができる。インフルエンザウイルスは、温度感受性を示し得る。インフルエンザウイルスは、低温適応することができる。これら３つの特徴は、抗原として生ウイルスを使用する場合に特に有用である。
【００４８】
ＨＡは、現在の不活化インフルエンザワクチンにおけるの主な免疫原であり、ワクチン用量を、典型的にはＳＲＩＤによって測定したＨＡレベルを参照して標準化する。既存のワクチンは、典型的には、１株あたり約１５μｇのＨＡを含むが、例えば、小児、流行状況、またはアジュバントを使用する場合、より低い用量を使用することができる。より高い用量（例えば、３倍または９倍の用量（参考文献３２、３３））を有する場合、１／２（すなわち、７．５μｇ  ＨＡ／株）、１／４、および１／８などの分割用量を使用することができる（参考文献６８、６９）。したがって、ワクチンは、インフルエンザ株１株あたり０．１μｇと１５０μｇの間のＨＡ、好ましくは０．１μｇと５０μｇとの間（例えば、０．１〜２０μｇ、０．１〜１５μｇ、０．１〜１０μｇ、０．１〜７．５μｇ、０．５〜５μｇなど）を含むことができる。特定の用量には、例えば、１株あたり約４５、約３０、約１５、約１０、約７．５、約５、約３．８、約１．９、約１．５などが含まれる。例えば、各株のＨＡの質量が１株あたりの平均ＨＡ質量の１０％以内、好ましくは平均の５％以内であるように、ワクチン中に含まれる実質的に同一の質量の各株のＨＡを使用することが好ましい。
【００４９】
生ワクチンについて、ＨＡ含有量よりもむしろ５０％組織培養感染量の中央値（ＴＣＩＤ５０）によって用量を測定し、１株あたり１０６と１０８との間（好ましくは、１０６．５〜１０７．５）のＴＣＩＤ５０が典型的である。
【００５０】
本発明と共に使用される株は、野生型ウイルスで認められる天然のＨＡまたは修飾ＨＡを有することができる。例えば、トリ種中でウイルスを高度に病原性にする決定基（例えば、ＨＡ１／ＨＡ２切断部位周囲の高塩基性領域）を除去するためにＨＡを修飾することが公知である。本発明と共に使用されるインフルエンザＢウイルスのＨＡは、好ましくは、アミノ酸１９７にＡｓｎを有し、これにより、グリコシル化部位が得られる。（参考文献３４）。
【００５１】
細胞株
ウイルス増殖のための基質としてＳＰＦ卵を使用することよりもむしろ、インフルエンザウイルスの複製を支持する細胞株を使用することが好ましい。細胞株は、典型的には、哺乳動物起源であろう。適切な哺乳動物起源の細胞には、ハムスター、ウシ、霊長類（ヒトおよびサルが含まれる）、およびイヌの細胞が含まれるが、これらに限定されない。しかし、霊長類細胞の使用は好ましくない。種々の細胞型（腎臓細胞、線維芽細胞、網膜細胞、肺細胞など）を使用することができる。適切なハムスター細胞の例は、ＢＨＫ２１またはＨＫＣＣという名称を有する細胞株である。適切なサル細胞は、例えば、アフリカミドリザル細胞（ベロ細胞株のような腎臓細胞など）である（参考文献３５〜３７）。適切なイヌ細胞は、例えば、ＣＬＤＫおよびＭＤＣＫ細胞株のような腎臓細胞である。
【００５２】
したがって、適切な細胞株には、以下が含まれるが、これらに限定されない：ＭＤＣＫ；ＣＨＯ；ＣＬＤＫ；ＨＫＣＣ；２９３Ｔ；ＢＨＫ；ベロ；ＭＲＣ−５；ＰＥＲ．Ｃ６（参考文献３８）；ＦＲｈＬ２；ＷＩ−３８など。適切な細胞株は、例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（ＡＴＣＣ）収集物（参考文献３９）、Ｃｏｒｉｅｌｌ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｉｅｓ（参考文献４０）、またはＥｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）から広範に利用可能である。例えば、ＡＴＣＣは、カタログ番号ＣＣＬ−８１、ＣＣＬ−８１．２、ＣＲＬ−１５８６、およびＣＲＬ−１５８７で種々の異なるベロ細胞を提供しており、カタログ番号ＣＣＬ−３４でＭＤＣＫ細胞を提供している。ＰＥＲ．Ｃ６は、寄託番号９６０２２９４０でＥＣＡＣＣから利用可能である。
【００５３】
最も好ましい細胞株は、哺乳動物型グリコシル化を有する細胞株である。哺乳動物細胞株のあまり好ましくない代替細胞株として、ウイルスをトリ細胞株（アヒル（例えば、アヒル網膜）またはニワトリ由来の細胞株が含まれる）で増殖させることができる（例えば、参考文献４１〜４３）。トリ細胞株の例には、トリ胚幹細胞（参考文献４１、４４）およびアヒル網膜細胞（参考文献４２）が含まれる。適切なトリ胚幹細胞には、ニワトリ胚幹細胞由来のＥＢｘ細胞株（ＥＢ４５、ＥＢ１４、およびＥＢ１４−０７４）が含まれる（参考文献４５）。ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）も使用することができる。しかし、トリ細胞の使用よりもむしろ、哺乳動物細胞の使用は、ワクチンがトリＤＮＡおよび卵タンパク質（オボアルブミンおよびオボムコイドなど）を含み得ず、それにより、アレルゲン性を軽減することができることを意味する。
【００５４】
インフルエンザウイルス増殖のための最も好ましい細胞株は、Ｍａｄｉｎ  Ｄａｒｂｙイヌ腎臓由来のＭＤＣＫ細胞株（参考文献４６〜４９）である。元のＭＤＣＫ細胞株は、ＡＴＣＣからＣＣＬ−３４として利用可能であるが、この細胞株の誘導体も使用することができる。例えば、参考文献４６では、懸濁培養物中での増殖に適合したＭＤＣＫ細胞株を開示している（ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２２１９として受託された「ＭＤＣＫ  ３３０１６」）。同様に、参考文献５０では、無血清培養において懸濁液中で増殖するＭＤＣＫ由来細胞株を開示する（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７４４９として受託された「Ｂ−７０２」）。参考文献５１では、非発癌性ＭＤＣＫ細胞（「ＭＤＣＫ−Ｓ」（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６５００）、「ＭＤＣＫ−ＳＦ１０１」（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６５０１）、「ＭＤＣＫ−ＳＦ１０２」（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６５０２）、および「ＭＤＣＫ−ＳＦ１０３」（ＰＴＡ−６５０３）が含まれる）を開示している。参考文献５２では感染に対する感受性が高いＭＤＣＫ細胞株（「ＭＤＣＫ．５Ｆ１」細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１２０４２）が含まれる）を開示している。任意のこれらのＭＤＣＫ細胞株を使用することができる。
【００５５】
ウイルスは、接着培養物上または懸濁液中で増殖することができる。マイクロキャリア培養物を使用することもできる。したがって、いくつかの実施形態では、細胞を、懸濁液中での増殖に適合させることができる。
【００５６】
細胞株を、好ましくは、無血清培養培地および／または無タンパク質培地中で増殖させる。ヒトまたは動物起源の血清を添加しない培地を、本発明の文脈では無血清培地という。かかる培地中で増殖する細胞は、天然に、タンパク質自体を含むが、無タンパク質培地は、タンパク質、成長因子、他のタンパク質添加物、および非血清タンパク質を除いて細胞が増殖する培地を意味すると理解される。しかし、この培地は、任意選択的に、ウイルス増殖に必要であり得るトリプシンまたは他のプロテアーゼなどのタンパク質を含むことができる。
【００５７】
インフルエンザウイルス複製を支持する細胞株を、ウイルス複製中に、好ましくは、３７℃未満（参考文献５３）（例えば、３０〜３６℃、または約３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃）で増殖させる。
【００５８】
培養培地中でインフルエンザウイルスを増殖する方法は、一般に、増殖させるべき株の接種材料を細胞培養物に接種する工程、接種された細胞をウイルス増殖に望ましい期間（例えば、ウイルス力価および抗原発現によって決定された期間など（例えば、接種から２４時間後と１６８時間後との間））培養する工程、および増殖したウイルスを回収する工程を含む。培養細胞に、１：５００〜１：１、好ましくは１：１００〜１：５、より好ましくは１：５０〜１：１０のウイルス（ＰＦＵまたはＴＣＩＤ５０によって測定）対細胞比で接種する。ウイルスを細胞懸濁液に添加するか細胞の単層に適用し、ウイルスを、細胞上に少なくとも６０分間、通常３００分未満、好ましくは９０分と２４０分との間にて２５℃〜４０℃、好ましくは２８℃〜３７℃で吸収させる。感染細胞培養物（例えば、単層）を、凍結融解または酵素作用によって除去して、回収した培養上清のウイルス含有量を増加させることができる。次いで、回収した流動物を、不活化するか凍結保存する。培養細胞を、約０．０００１〜１０、好ましくは０．００２〜５、より好ましくは０．００１〜２の感染多重度（「ｍ．ｏ．ｉ．」）で感染させることができる。さらにより好ましくは、細胞を、約０．０１のｍ．ｏ．ｉで感染させる。感染細胞を、感染から３０〜６０分後に回収することができる。好ましくは、細胞を、感染から３４〜４８時間後に回収する。さらにより好ましくは、細胞を、感染から３８〜４０時間後に回収する。一般に、細胞培養物中にプロテアーゼ（典型的には、トリプシン）を添加してウイルスを放出させ、培養中の任意の適切な段階（例えば、接種前、接種と同時、または接種後）でプロテアーゼを添加することができる（参考文献５３）。
【００５９】
好ましい実施形態では、特にＭＤＣＫ細胞では、細胞株をマスターワーキングセルバンクから４０集団倍加レベルを超えて継代しない。
【００６０】
ウイルス接種材料およびウイルス培養物は、好ましくは、単純ヘルペスウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、パラインフルエンザウイルス３、ＳＡＲＳコロナウイルス、アデノウイルス、ライノウイルス、レオウイルス、ポリオーマウイルス、ビルナウイルス、サーコウイルス、および／またはパルボウイルスを含まない（すなわち、これらを試験し、これらによる夾雑について負の結果が得られる）（参考文献５４）。単純ヘルペスウイルスの不在が特に好ましい。
【００６１】
宿主細胞ＤＮＡ
ウイルスを細胞株錠で増殖させた場合、最終ワクチン中の残存細胞株ＤＮＡを最小にして、いかなるＤＮＡの発癌活性も最小にすることが標準的な実務である。
【００６２】
したがって、本発明によって調製されるワクチン組成物は、好ましくは、１０ｎｇ未満（好ましくは１ｎｇ未満、より好ましくは１００ｐｇ未満）の残存宿主細胞ＤＮＡ／用量を含むが、微量の宿主細胞ＤＮＡが存在しても良い。
【００６３】
１５μｇの赤血球凝集素あたり＜１０ｎｇ（例えば、＜１ｎｇ、＜１００ｐｇ）の宿主細胞ＤＮＡを含むワクチン好ましく、０．２５ｍｌの体積あたり＜１０ｎｇ（例えば、＜１ｎｇ、＜１００ｐｇ）の宿主細胞ＤＮＡを含むワクチンも同様である。５０μｇの赤血球凝集素あたり＜１０ｎｇ（例えば、＜１ｎｇ、＜１００ｐｇ）の宿主細胞ＤＮＡを含むワクチンがより好ましく、０．５ｍｌの体積あたり＜１０ｎｇ（例えば、＜１ｎｇ、＜１００ｐｇ）の宿主細胞ＤＮＡを含むワクチンも同様である。
【００６４】
任意の残存宿主細胞ＤＮＡの平均長が５００ｂｐ未満（例えば、４００ｂｐ未満、３００ｂｐ未満、２００ｂｐ未満、１００ｂｐ未満など）であることが好ましい。
【００６５】
夾雑ＤＮＡを、標準的な精製手順（例えば、クロマトグラフィなど）を使用してワクチン調製中に除去することができる。残存宿主細胞ＤＮＡの除去を、例えば、ＤＮアーゼの使用によるヌクレアーゼ処置によって増強することができる。従来の宿主細胞ＤＮＡ夾雑の減少方法を、参考文献５５および５６に開示し、これは、２工程処理（ウイルス増殖中に使用することができるＤＮアーゼ（例えば、ベンゾナーゼ）の最初の使用およびウイルス粒子破壊中に使用することができる陽イオン性界面活性剤（例えば、ＣＴＡＢ）の使用）を含む。β−プロピオラクトン処理による除去も使用することができる。
【００６６】
残存宿主細胞ＤＮＡの測定は、現在、生物製剤の日常的な規制基準であり、当業者の通常の能力の範囲内に含まれる。ＤＮＡ測定に使用されるアッセイは、典型的には、有効なアッセイであろう（参考文献５７、５８）。有効なアッセイのパフォーマンス特性を、数学的および定量的事項において記載することができ、その起こり得るエラーの起源が同定されている。アッセイは、一般に、精度、正確さ、特異性などの特徴について試験されている。一旦アッセイが（例えば、宿主細胞ＤＮＡの既知の標準量に対して）較正され、試験されると、定量的ＤＮＡ測定を日常的に行うことができる。以下の３つの主なＤＮＡ定量技術を使用することができる：ハイブリッド形成方法（サザンブロットまたはあスロットブロット（参考文献５９）など）；免疫アッセイ法（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ（商標）システム（参考文献６０）など）；および定量的ＰＣＲ（参考文献６１）。これらの方法は、当業者に非常に良く知られているが、各方法の正確な特徴は、問題の宿主細胞（例えば、ハイブリッド形成用プローブの選択、増幅用プライマーおよび／またはプローブの選択）に依存し得る。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  のＴｈｒｅｓｈｏｌｄ（商標）システムは、ピコグラムレベルの総ＤＮＡのための定量的アッセイであり、生物医薬品中の夾雑ＤＮＡレベルのモニタリングのために使用されている（参考文献６０）。典型的なアッセイは、ビオチン化ｓｓＤＮＡ結合タンパク質と、ウレアーゼ抱合抗ｓｓＤＮＡ抗体と、ＤＮＡとの間の反応複合体の非配列特異的形成を含む。全アッセイ成分は、製造者から利用可能なｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｔｏｔａｌ  ＤＮＡ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ中に含まれる。種々の製造者は、残存宿主細胞ＤＮＡの検出のための定量的ＰＣＲアッセイ（例えば、ＡｐｐＴｅｃ（商標）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＢｉｏＲｅｌｉａｎｃｅ（商標）、Ａｌｔｈｅａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓなど）を提供している。ヒトウイルスワクチンの宿主細胞ＤＮＡ夾雑を測定するための化学発光ハイブリッド形成アッセイおよび総ＤＮＡ  Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ（商標）システムの比較を、参考文献６２に見出すことができる。
【００６７】
薬学的組成物
本発明の組成物は、薬学的に許容可能である。組成物は、抗原に加えて成分を含む。例えば、組成物は、典型的には、１つまたは複数の薬学的キャリアおよび／または賦形剤を含む。下記のように、アジュバントも含むことができる。かかる成分の徹底的な考察は、参考文献６３で利用可能である。
【００６８】
組成物は、一般に、水性形態であろう。
【００６９】
組成物は、チオメルサールまたは２−フェノキシエタノールなどの防腐剤を含むことができる。しかし、ワクチンは、水銀材料を実質的に含まない（すなわち、５μｇ／ｍｌ未満）（例えば、無チオメルサール）ことが好ましい（参考文献２９、６４）。水銀を含まないワクチンがより好ましい。無防腐剤ワクチンが特に好ましい。水銀化合物の代わりにコハク酸α−トコフェロールを含めることができる（参考文献２９）。
【００７０】
毒性を調節するために、ナトリム塩などの生理学的塩を含むことが好ましい。塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）が好ましく、１ｍｇ／ｍｌと２０ｍｇ／ｍｌとの間で存在し得る。存在することができる他の塩には、塩化カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸ジナトリウム２水和物、塩化マグネシウム、塩化カルシウムなどが含まれる。
【００７１】
組成物は、一般に、２００ｍＯｓｍ／ｋｇと４００ｍＯｓｍ／ｋｇとの間、好ましくは２４０〜３６０ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧を有するであろう。より好ましくは、２９０〜３１０ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲内であろう。浸透圧は、ワクチン接種に起因する疼痛に影響を及ぼさないと以前に報告されているが（参考文献６５）、それでもなおこの範囲の浸透圧を維持することが好ましい。
【００７２】
組成物は、１つまたは複数の緩衝液を含むことができる。典型的な緩衝液には、Ｔｒｉｓ緩衝液；ホウ酸緩衝液；コハク酸緩衝液；ヒスチジン緩衝液（特に、水酸化アルミニウムアジュバントを含む）；またはクエン酸緩衝液が含まれる。緩衝液は、典型的には、５〜２０ｍＭの範囲で含まれるであろう。
【００７３】
組成物のｐＨは、一般に、５．０と８．１との間、より典型的には６．０と８．０との間（例えば、６．５と７．５との間または７．０と７．８との間）であろう。したがって、本発明の過程は、パッケージング前にバルクワクチンのｐＨを調整する工程を含むことができる。
【００７４】
組成物は、好ましくは無菌である。組成物は、好ましくは、無発熱物質である（例えば、＜１ＥＵ（内毒素単位、標準測定値）／用量、好ましくは＜０．１ＥＵ／用量を含む）。組成物は、好ましくは、グルテンを含まない。
【００７５】
本発明の組成物は、界面活性剤（例えば、特に、スプリットまたは表面抗原ワクチンのためのポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（「Ｔｗｅｅｎ」として公知）、オクトキシノール（オクトキシノール−９（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）またはｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノールなど）、臭化セチルトリメチルアンモニウム（「ＣＴＡＢ」）、またはデオキシコール酸ナトリウムなど）を含むことができる。界面活性剤は、微量でのみ存在することができる。したがって、ワクチンは、オクトキシノール−１０およびポリソルベート８０をそれぞれ１ｍｇ／ｍｌ未満含むことができる。微量の他の残存成分は、抗生物質（例えば、ネオマイシン、カナマイシン、ポリミキシンＢ）であり得る。
【００７６】
組成物は、単回免疫化のための物質を含むことができか、複数回免疫化のための物質（すなわち、「複数回投与」キット）を含むことができる。複数回投与の処理で防腐剤を含むことが好ましい。複数回投与組成物中に防腐剤を含める（または付加する）代わりに、組成物を、物質の除去のための無菌アダプターを有する容器に含めることができる。
【００７７】
インフルエンザワクチンを、典型的には、約０．５ｍｌの投薬体積で投与するが、半分の用量（すなわち、０．２５ｍｌ）を小児に投与することができる。
【００７８】
組成物およびキットを、好ましくは、２℃と８℃との間で保存する。これらは凍結すべきではない。これらは、理想的には、直射日光を遮断すべきである。
【００７９】
アジュバント
本発明の組成物は、有利には、アジュバントを含むことができる。アジュバントは、組成物を投与する患者で誘発される免疫応答（体液性および／または細胞性）を増強するように機能することができる。インフルエンザワクチンとのアジュバントの使用は以前に記載されている。参考文献６６および６７では、水酸化アルミニウムを使用し、参考文献６８では、水酸化アルミニウムとリン酸アルミニウムとの混合物を使用していた。参考文献６９は、アルミニウム塩アジュバントの使用も記載していた。Ｃｈｉｒｏｎ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  のＦＬＵＡＤ（商標）は、水中油型乳濁液を含む。
【００８０】
本発明と共に使用することができるアジュバントには、以下が含まれるが、これらに限定されない。
【００８１】
・ミネラル含有組成物（カルシウム塩およびアルミニウム塩（またはその混合物）が含まれる）。カルシウム塩には、リン酸カルシウム（例えば、参考文献７０に開示の「ＣＡＰ」粒子）が含まれる。アルミニウム塩には、水酸化物、リン酸塩、硫酸塩などが含まれ、この塩は任意の適切な形態（例えば、ゲル、血漿、無定形など）を取る。これらの塩への吸着が好ましい。ミネラル含有組成物を、金属塩の粒子として処方することもできる（７１）。アルミニウム塩アジュバントを、以下により詳細に記載する。
【００８２】
・水中油型乳濁液（より詳細には以下を参照のこと）。
【００８３】
・サポニン（参考文献９７の第２２章）。サポニンは、広範な植物種の樹皮、葉、幹、根、および花で見出されるステロールグルコシドおよびトリテルペノイドグリコシドの異種群である。シャボンノキの樹皮由来のサポニンは、アジュバントとして広範に研究されている。スミラックス・オルナタ（Ｓｍｉｌａｘ  ｏｒｎａｔａ）（サルサプリラ）、ジブソフィラ・パニクラタ（Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌｌａ  ｐａｎｉｃｕｌａｔａ）（シュッコンカスミソウ）、およびサポナリア・オフィシアナリス（Ｓａｐｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉａｎａｌｉｓ）（サボンソウ）由来のサポニンを購入することもできる。サポニンアジュバント処方物には、精製処方物（ＱＳ２１など）および液体処方物（ＩＳＣＯＭなど）が含まれる。ＱＳ２１は、Ｓｔｉｍｕｌｏｎ（商標）として販売されている。サポニン組成物は、ＨＰＬＣおよびＲＰ−ＨＰＬＣで精製されている。これら３つの技術を使用して、特定の精製画分が同定されている（ＱＳ７、ＱＳ１７、ＱＳ１８、ＱＳ２１、ＱＨ−Ａ、ＱＨ−Ｂ、およびＱＨ−Ｃが含まれる）。好ましくは、サポニンはＱＳ２１である。ＱＳ２１の生成方法は、参考文献７２に開示されている。サポニン処方物はまた、コレステロールなどのステロールを含むことができる（参考文献７３）。サポニンおよびコレステロールの組成物を使用して、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）と呼ばれる固有の粒子を形成することができる（参考文献９７の第２３章）。ＩＳＣＯＭには、典型的には、ホスファチジルエタノールアミンまたはホスファチジルコリンなどのリン脂質も含まれる。任意の公知のサポニンを、ＩＳＣＯＭ中で使用することができる。好ましくは、ＩＳＣＯＭは、１つまたは複数のＱｕｉｌＡ、ＱＨＡ、およびＱＨＣを含む。ＩＳＣＯＭは、参考文献７３〜７５にさらに記載されている。任意選択的に、ＩＳＣＯＭは、さらなる界面活性剤を欠くことができる（参考文献７６）。サポニンに基づくアジュバント開発の概説を、参考文献７７および７８に見出すことができる。
【００８４】
・脂肪性アジュバント（より詳細には以下を参照のこと）。
【００８５】
・細菌ＡＤＰ−リボシル化毒素（例えば、大腸菌熱不安定性エンテロトキシン「ＬＴ」、コレラ毒素「ＣＴ」、または百日咳毒素「ＰＴ」）およびその解毒誘導体（ＬＴ−Ｋ６３およびＬＴ−Ｒ７２として公知の変異毒素など）（参考文献７９）。粘膜アジュバントとしての解毒ＡＤＰ−リボシル化毒素の使用は、参考文献８０に記載されており、非経口アジュバントは参考文献８１に記載されている。
【００８６】
・生体接着剤および粘膜接着剤（エステル化ヒアルロン酸ミクロスフィア（参考文献８２）およびキトサンならびにその誘導体（参考文献８３）。
【００８７】
・サイトカイン誘導薬（より詳細には以下を参照のこと）。
【００８８】
・生分解性および非毒性の材料（例えば、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルソエステル、ポリ酸無水物、ポリカプロラクトンなどであるが、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）が好ましい）から形成され、任意選択的に、負電荷の表面（例えば、ＳＤＳを有する）または正電荷の表面（例えば、ＣＴＡＢなどの陽イオン性界面活性剤を有する）を有するように処理された微粒子（すなわち、直径約１００ｎｍ〜約１５０μｍ、より好ましくは直径約２００ｎｍ〜約３０μｍ、または直径約５００ｎｍ〜約１０μｍの粒子）。
【００８９】
・リポソーム（参考文献９７の第１３章および第１４章）。アジュバントとしての使用に適切なリポソーム処方物の例を、参考文献８４〜８６に記載する。
【００９０】
・ポリオキシエチレンエーテルおよびポリオキシエチレンエステル（参考文献８７）。かかる処方物には、さらに、オクトキシノール（参考文献８８）と組み合わせたポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤およびオクトキシノールなどの少なくとも１つのさらなる非イオン性界面活性剤と組み合わせたポリオキシエチレンアルキルエーテルまたはエステル界面活性剤（参考文献８９）が含まれる。好ましいポリオキシエチレンエーテルは、以下の群から選択される：ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル（ラウレス９）、ポリオキシエチレン−９−ステオリルエーテル、ポリオキシエチレン−８−ステオリルエーテル、ポリオキシエチレン−４−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−３５−ラウリルエーテル、およびポリオキシエチレン−２３−ラウリルエーテル。
【００９１】
・ムラミルペプチド（Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（「ｔｈｒ−ＭＤＰ」）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ノル−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルグルコサミル−Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−Ａｌ−Ｄ−イソグル−Ｌ−Ａｌａ−ジパルミトキシプロピルアミド（「ＤＴＰ−ＤＰＰ」または「Ｔｈｅｒａｍｉｄｅ（商標））、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（「ＭＴＰ−ＰＥ」）など）。
【００９２】
・第２のグラム陰性由来のリポ糖調製物と組み合わせた第１のグラム陰性細菌から調製した外膜タンパク質プロテオソーム調製物。ここで、外膜タンパク質プロテオソームおよびリポ糖調製物は安定な非共有結合性アジュバント複合体を形成する。かかる複合体には、「ＩＶＸ−９０８」（髄膜炎菌外膜およびリポ多糖から構成される複合体）が含まれる。これらは、インフルエンザワクチンのアジュバントとして使用されている（参考文献９０）。
【００９３】
・メチルイノシン５’−モノリン酸（「ＭＩＭＰ」）（参考文献９１）。
【００９４】
・ポリヒドロキシル化ピロリジジン化合物（参考文献９２）（以下の式：
【００９５】
【化１】
2014015486.tif 000003
（式中、Ｒは、水素、直鎖または分岐鎖、非置換または置換、飽和または不飽和のアシル基、アルキル基（例えば、シクロアルキル基）、アルケニル基、アルキニル基、およびアリール基を含む群から選択される）を有する化合物などまたはその薬学的に許容可能な塩もしくは誘導体。例には、カスアリン、カスアリン−６−α−Ｄ−グルコピラノース、３−エピ−カスアリン、７−エピ−カスアリン、３，７−ジエピ−カスアリンなどが含まれるが、これらに限定されない。
【００９６】
・ガンマイヌリン（参考文献９３）またはその誘導体（アルガムリンなど）。
【００９７】
これらおよび他のアジュバント活性物質は、参考文献９７および９８により詳細に考察されている。
【００９８】
組成物は、２つ以上のアジュバントを含むことができる。例えば、組成物は、水中油型乳濁液およびサイトカイン誘導薬の両方を有利に含むことができる。この組成物は、インフルエンザワクチンによって誘発されたサイトカイン応答（インターフェロンγ応答など）を改良するからであり、その改良は、乳濁液または薬剤のいずれかを単独で使用した場合に認められる改良よりもはるかに高い。
【００９９】
組成物中の抗原およびアジュバントは、典型的には、混合物であろう。
【０１００】
水中油型乳濁液アジュバント
水中油型乳濁液は、インフルエンザウイルスワクチンの補助での使用に特に有用であることが見出されている。種々のかかる乳濁液が公知であり、乳濁液は、典型的には、少なくとも１つの油および少なくとも１つの界面活性剤を含み、油および界面活性剤は、生分解性（代謝性）および生体適合性を示す。乳濁液中の油滴は、一般に、直径５μｍ未満であり、さらにサブミクロンの直径を有することができ、マイクロフルイダイザーを使用してこれらの小さなサイズにし、安定な乳濁液を得る。濾過滅菌に供することができるので、２２０ｎｍ未満のサイズの液滴が好ましい。
【０１０１】
本発明を、動物（魚類など）または植物起源の油などの油と共に使用することができる。植物油の供給源には、堅果、種子、および穀物が含まれる。例としてラッカセイ油、ダイズ油、ココナッツ油、およびオリーブ油が含まれ、最も一般的に利用されるのは堅果油である。例えば、ホホバ豆から得られるホホバ油を使用することができる。種子油には、ベニバナ油、綿実油、ヒマワリ種子油、およびゴマ種子油などが含まれる。穀物群では、トウモロコシ油が最も容易に利用可能であるが、他の穀類の油（コムギ、カラスムギ、ライムギ、コメ、テフ、ライ小麦など）も使用することができる。グリセロールおよび１，２−プロパンジオールの６〜１０炭素脂肪酸エステルは、種子油中に天然に存在しないが、これを、堅果油および種子油から出発する適切な材料の加水分解、分離、およびエステル化によって調製することができる。哺乳動物の乳由来の脂肪および油は代謝性を示す。したがって、これを本発明の実務で使用することができる。動物供給源から純粋な油を得るのに必要な分離手順、精製手順、ケン化手順、および他の手段は、当該分野で周知である。ほとんどの魚類は、容易に回収することができる代謝性油を含む。例えば、タラ肝油、サメ肝油、および鯨蝋などの鯨油は、本明細書中で使用することができるいくつかの魚油の例である。多数の分岐鎖油を、５−炭素イソプレン単位中で生化学的に合成し、これを一般にテルペノイドという。サメ肝油は、本発明で特に好ましいスクアレン（２，６，１０，１５，１９，２３−ヘキサメチル−２，６，１０，１４，１８，２２−テトラコサヘキサエン）として公知の分岐不飽和テルペノイドを含む。スクアラン（スクアレンの飽和アナログ）も好ましい油である。魚油（スクアレンおよびスクアランが含まれる）は、販売者から容易に利用可能であるか、当該分野で公知の方法によって得ることができる。他の好ましい油は、トコフェロールである（以下を参照のこと）。油の混合物を使用することができる。
【０１０２】
界面活性剤を、その「ＨＬＢ」（親水性物質／親油性物質バランス）によって分類することができる。本発明の好ましい界面活性剤は、少なくとも１０、好ましくは少なくとも１５、より好ましくは少なくとも１６のＨＬＢを有する。本発明を、以下の界面活性剤と共に使用することができる：ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（一般にＴｗｅｅｎと呼ばれる）（特に、ポリソルベート２０およびポリソルベート８０）；エチレンオキシド（ＥＯ）、プロピレンオキシド（ＰＯ）、および／またはブチレンオキシド（ＢＯ）のコポリマー（ＤＯＷＦＡＸ（商標）で販売、直鎖ＥＯ／ＰＯブロックコポリマーなど）；エトキシ（オキシ−１，２−エタンジイル）基の反復数が変化し得るオクトキシノール（オクトキシノール−９（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、すなわちｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）が特に興味深い）；（オクチルフェノキシ）ポリエトキシエタノール（ＩＧＥＰＡＬ  ＣＡ−６３０／ＮＰ−４０）；リン脂質（ホスファチジルコリン（レシチン）など）；ノニルフェノールエトキシラート（Ｔｅｒｇｉｔｏｌ（商標）ＮＰシリーズなど）；ラウリル、セチル、ステアリル、およびオレイルアルコール（Ｂｒｉｊ界面活性剤として公知）由来のポリオキシエチレン脂肪エーテル（トリエチレングリコールモノラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ  ３０）など）；およびソルビタンエステル（一般に、ＳＰＡＮとして公知）（トリオレイン酸ソルビタン（Ｓｐａｎ８５）およびモノラウリン酸ソルビタンなど）が含まれるが、これらに限定されない。非イオン性界面活性剤が好ましい。乳濁液中に含めるのに好ましい界面活性剤は、Ｔｗｅｅｎ８０（モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン）、Ｓｐａｎ８５（トリオレイン酸ソルビタン）、レシチン、およびＴｒｉｔｏｎＸ−１００である。
【０１０３】
界面活性剤の混合物を使用することができる（例えば、Ｔｗｅｅｎ８０／Ｓｐａｎ８５混合物）。ポリオキシエチレンソルビタンエステル（モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン（Ｔｗｅｅｎ８０）など）およびオクトキシノール（ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）など）も適切である。別の有用な組み合わせは、ラウレス９＋ポリオキシエチレンソルビタンエステルおよび／またはオクトキシノールを含む。
【０１０４】
界面活性剤の好ましい量（重量％）は以下である：ポリオキシエチレンソルビタンエステル（Ｔｗｅｅｎ８０など）０．０１〜１％、特に約０．１％；オクチル−またはノニルフェノキシポリオキシエタノール（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、またはＴｒｉｔｏｎシリーズ中の他の界面活性剤）０．００１〜０．１％、特に０．００５〜０．０２％；ポリオキシエチレンエーテル（ラウレス９など）０．１〜２０％、好ましくは０．１〜１０％、特に０．１〜１％または約０．５％。
【０１０５】
本発明で有用な特定の水中油型乳濁液アジュバントには、以下が含まれるが、これらに限定されない。
【０１０６】
・スクアレン、Ｔｗｅｅｎ８０、およびＳｐａｎ８５のサブミクロン乳濁液。乳濁液の組成物は、体積で、約５％スクアレン、約０．５％ポリソルベート８０、および約０．５％Ｓｐａｎ８５であり得る。重量では、これらの比は、４．３％スクアレン、０．５％ポリソルベート８０、および０．４８％Ｓｐａｎ８５になる。このアジュバントは、参考文献９７の第１０章および参考文献９８の第１２章により詳細に記載のように、「ＭＦ５９」（参考文献９４〜９６）として公知である。ＭＦ５９乳濁液は、有利には、クエン酸イオンを含む（例えば、１０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液）。
【０１０７】
・スクアレン、トコフェロール、およびＴｗｅｅｎ８０の乳濁液。乳濁液は、リン酸緩衝化生理食塩水を含むことができる。乳濁液は、Ｓｐａｎ８５（例えば、１％）および／またはレシチンも含むことができる。これらの乳濁液は、２〜１０％スクアレン、２〜１０％トコフェロール、および０．３〜３％Ｔｗｅｅｎ８０を有することができ、スクアレン：トコフェロール比は、好ましくは１以下であり、これにより、より安定な乳濁液が得られる。スクアレンおよびＴｗｅｅｎ８０は、約５：２の体積比で存在することができる。１つのかかる乳濁液を、ＰＢＳ中でＴｗｅｅｎ８０を溶解して２％溶液を得て、９０ｍｌのこの溶液を（５ｇのＤＬ−α−トコフェロールおよび５ｍｌスクアレン）の混合物と混合し、混合物を顕微溶液化することによって作製することができる。得られた乳濁液は、例えば、平均直径が１００ｎｍと２５０ｎｍとの間、好ましくは約１８０ｎｍのサブミクロン油液滴を有することができる。
【０１０８】
・スクアレン、トコフェロール、およびＴｒｉｔｏｎ界面活性剤（例えば、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）の乳濁液。乳濁液は、３ｄ−ＭＰＬも含むことができる（下記を参照のこと）。乳濁液は、リン酸緩衝液を含むことができる。
【０１０９】
・ポリソルベート（例えば、ポリソルベート８０）、Ｔｒｉｔｏｎ界面活性剤（例えば、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）、およびトコフェロール（例えば、コハク酸α−トコフェロール）を含む乳濁液。乳濁液は、質量比約７５：１１：１０（例えば、７５０μｇ／ｍｌポリソルベート８０、１１０μｇ／ｍｌＴｒｉｔｏｎＸ−１００、および１００μｇ／ｍｌコハク酸α−トコフェロール）のこれら３つの成分を含むことができ、これらの濃度は、抗原由来のこれらの成分が任意に寄与すべきである。乳濁液は、スクアレンも含むことができる。乳濁液は、３ｄ−ＭＰＬも含むことができる（下記を参照のこと）。水相は、リン酸緩衝液を含むことができる。
【０１１０】
・スクアラン、ポリソルベート８０、およびポロクサマー４０１（「プルロニック（商標）Ｌ１２１」）の乳濁液。乳濁液を、リン酸緩衝化生理食塩水（ｐＨ７．４）中に処方することができる。この乳濁液は、ムラミルジペプチドのための有用な送達ビヒクルであり、「ＳＡＦ−１」アジュバント（参考文献９９）（０．０５〜１％Ｔｈｒ−ＭＤＰ、５％スクアラン、２．５％プルロニックＬ１２１、および０．２％ポリソルベート８０）中でトレオニル−ＭＤＰと共に使用されている。「ＡＦ」アジュバント（参考文献１００）（５％スクアラン、１．２５％プルロニックＬ１２１、および０．２％ポリソルベート８０）などの場合、これを、Ｔｈｒ−ＭＤＰを使用せずに使用することもできる。顕微溶液化が好ましい。
【０１１１】
・スクアレン、水性溶媒、ポリオキシエチレンアルキルエーテル親水性非イオン性界面活性剤（例えば、ポリオキシエチレン（１２）セトステアリルエーテル）、および疎水性非イオン性界面活性剤（例えば、ソルビタンエステルまたはマンニドエステル（モノオレイン酸ソルビタンまたは「Ｓｐａｎ８０」など））を含む乳濁液。乳濁液は、好ましくは熱可逆性を示し、そして／または少なくとも９０％の２００ｎｍ未満のサイズの油滴（体積）を有する（参考文献１０１）。乳濁液は、１つまたは複数の以下も含むことができる：アルジトール；凍結保護剤（例えば、ドデシルマルトシドおよび／またはスクロースなどの糖）；および／またはアルキルポリグリコシド。かかる乳濁液を凍結乾燥することができる。
【０１１２】
・スクアレン、ポロクサマー１０５、およびＡｂｉｌ−Ｃａｒｅの乳濁液（参考文献１０２）。アジュバント化ワクチン中のこれらの成分の最終濃度（重量）は、５％スクアレン、４％ポロクサマー１０５（プルロニックポリオール）、および２％Ａｂｉｌ−Ｃａｒｅ８５（Ｂｉｓ−ＰＥＧ／ＰＰＧ−１６／１６  ＰＥＧ／ＰＰＧ−１６／１６  ジメチコン；カプリル酸／カプリン酸トリグリセリド）である。
【０１１３】
・０．５〜５０％の油、０．１〜１０％のリン脂質、および０．０５〜５％の非イオン性界面活性剤を有する乳濁液。参考文献１０３に記載のように、好ましいリン脂質成分は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、スフィンゴミエリン、およびカルジオリピンである。サブミクロン液体サイズが有利である。
【０１１４】
・非代謝性油（軽鉱物油など）および少なくとも１つの界面活性剤（レシチン、Ｔｗｅｅｎ８０、またはＳｐａｎ８０など）のサブミクロン水中油型乳濁液。ＱｕｉｌＡサポニン、コレステロール、サポニン−親油性物質抱合体（グルクロン酸のカルボキシル基を介したデスアシルサポニンへの脂肪族アミノの付加によって精製された、参考文献１０４に記載のＧＰＩ−０１００など）、ジメチルジオクダデシルアンモニウムブロミド、および／またはＮ，Ｎ−ジオクタデシル−Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）プロパンジアミンなどの添加物を含めることができる。
【０１１５】
・サポニン（例えば、ＱｕｉｌＡまたはＱＳ２１）およびステロール（例えば、コレステロール）をらせん状ミセルとして会合させた乳濁液（参考文献１０５）。
【０１１６】
・鉱物油、非イオン性親油性エトキシル化脂肪アルコール、および非イオン性親水性界面活性剤（例えば、エトキシル化脂肪アルコールおよび／またはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー）を含む乳濁液（参考文献１０６）。
【０１１７】
・鉱物油、非イオン性親水性エトキシル化脂肪アルコール、および非イオン性親油性界面活性剤（例えば、エトキシル化脂肪アルコールおよび／またはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー）を含む乳濁液（参考文献１０６）。
【０１１８】
乳濁液を、送達時に抗原と即座に混合することができる。したがって、アジュバントおよび抗原を、使用時の最終処方に備えてパッケージングまたは割り当てたワクチン中に個別に保持することができる。ワクチンが最終的に２つの液体の混合によって調製されるように、抗原は、一般に、水性形態であろう。混合のための２つの液体の体積比は変化し得るが（例えば、５：１と１：５との間）、一般に、約１：１である。
【０１１９】
抗原およびアジュバントを混合した後、赤血球凝集素抗原は、一般に、水溶液中に残存するであろうが、それ自体が油／水界面周辺に分布することができる。一般に、赤血球凝集素は、乳濁液の油相にほとんど侵入しないであろう。
【０１２０】
組成物がトコフェロールを含む場合、任意のα、β、γ、δ、ε、またはζトコフェロールを使用することができるが、α−トコフェロールが好ましい。トコフェロールは、いくつかの形態を取ることができる（例えば、異なる塩および／または異性体）。塩には、有機塩（コハク酸塩、酢酸塩、ニコチン酸塩など）が含まれる。Ｄ−α−トコフェロールおよびＤＬ−α−トコフェロールの両方を使用することができる。トコフェロールを、高齢患者（例えば、６０歳以上）で用いるワクチン中に含めることが有利である。なぜなら、ビタミンＥは、この患者群における免疫応答に正の影響を及ぼすことが報告されているからである（参考文献１０７）。トコフェロールはまた、乳濁液の安定化を補助することができる抗酸化性を有する（参考文献１０８）。好ましいα−トコフェロールはＤＬ−α−トコフェロールであり、このトコフェロールの好ましい塩はコハク酸塩である。コハク酸塩は、ｉｎ  ｖｉｖｏでＴＮＦ関連リガンドと協力することが見出されている。さらに、コハク酸α−トコフェロールは、インフルエンザワクチンと適合し、水銀化合物の代替物として有用な防腐剤であることが公知である（参考文献２９）。
【０１２１】
サイトカイン誘導薬
本発明の組成物中に含めるためのサイトカイン誘導薬は、患者に投与した場合、免疫系を誘発してサイトカイン（インターフェロンおよびインターロイキンが含まれる）を放出することができる。サイトカイン応答は、インフルエンザ感染に対する宿主防御の初期および重要な段階に関与することが公知である（参考文献１０９）。好ましい薬剤は、１つまたは複数の以下の放出を誘発することができる：インターフェロン−γ；インターロイキン−１；インターロイキン−２；インターロイキン−１２；ＴＮＦ−α；ＴＮＦ−β；およびＧＭ−ＣＳＦ。好ましい薬剤は、Ｔｈ１型免疫応答に関連するサイトカイン（例えば、インターフェロン−γ、ＴＮＦ−α、インターロイキン−２）の放出を誘発する。インターフェロン−γおよびインターロイキン−２の両方の刺激が好ましい。
【０１２２】
したがって、本発明の組成物の投与の結果として、患者は、インフルエンザ抗原で刺激された場合、抗原特異的様式で所望のサイトカインを放出するＴ細胞を有するであろう。例えば、その血液から精製されたＴ細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでインフルエンザウイルス赤血球凝集素に曝露した場合、γ−インターフェロンを放出するであろう。末梢血単核球（ＰＢＭＣ）におけるかかる応答の測定方法は当該分野で公知であり、ＥＬＩＳＡ、ＥＬＩＳＰＯＴ、フローサイトメトリー、およびリアルタイムＰＣＲが含まれる。例えば、参考文献１１０は、破傷風トキソイドに対する抗原特異的Ｔ細胞性免疫応答、特にγ−インターフェロン応答をモニタリングする研究を報告しており、ＥＬＩＳＰＯＴが抗原特異的ＴＴ誘導性応答を自発的応答と区別するための最も感度の高い方法であるが、フローサイトメトリーによる細胞質内サイトカイン検出が再刺激効果の検出に最も有効な方法であることを見出した。
【０１２３】
適切なサイトカイン誘導薬には、以下が含まれるが、これらに限定されない。
【０１２４】
・免疫刺激性オリゴヌクレオチド（ＣｐＧモチーフ（リン酸結合によってグアノシンと結合した非メチル化シトシンを含むジヌクレオチド配列）、二本鎖ＲＮＡ、回文配列を含むオリゴヌクレオチド、またはポリ（ｄＧ）配列を含むオリゴヌクレオチドを含むものなど）。
【０１２５】
・３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリル脂質Ａ（「３ｄＭＰＬ」、「ＭＰＬ（商標）」としても公知）（参考文献１１１〜１１４）。
【０１２６】
・イミダゾキノリン化合物（イミキモド（「Ｒ−８３７」）（参考文献１１５、１１６）、レシキモド（「Ｒ−８４８」）（参考文献１１７）、およびそのアナログなど）およびその塩（例えば、塩酸塩）。免疫刺激性イミダゾキノリンについてのさらなる詳細を、参考文献１１８〜１２２に見出すことができる。
【０１２７】
・チオセミカルバゾン化合物（参考文献１２３に開示のものなど）。活性化合物の処方、製造、およびスクリーニング方法も、参考文献１２３に記載されている。チオセミカルバゾンは、ＴＮＦ−αなどのサイトカインの産生のためのヒト末梢血単核球の刺激で特に有効である。
【０１２８】
・トリプタントリン化合物（参考文献１２４に開示のものなど）。活性化合物の処方、製造、およびスクリーニング方法も、参考文献１２４に記載されている。チオセミカルバゾンは、ＴＮＦ−αなどのサイトカインの産生のためのヒト末梢血単核球の刺激で特に有効である。
【０１２９】
・以下などのヌクレオシドアナログ：（ａ）イサトラビン（ＡＮＡ−２４５；７−チア−８−オキソグアノシン）：
【０１３０】
【化２】
2014015486.tif 000004
およびそのプロドラッグ；（ｂ）ＡＮＡ９７５；（ｃ）ＡＮＡ−０２５−１；（ｄ）ＡＮＡ３８０；（ｅ）参考文献１２５〜１２７に開示の化合物；（ｆ）式：
【０１３１】
【化３】
2014015486.tif 000005
（式中、
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、Ｈ、ハロ、−ＮＲａＲｂ、−ＯＨ、Ｃ１〜６アルコキシ、置換Ｃ１〜６アルコキシ、ヘテロシクリル、置換ヘテロシクリル、Ｃ６〜１０アリール、置換Ｃ６〜１０アリール、Ｃ１〜６アルキル、または置換Ｃ１〜６アルキルであり、
Ｒ３は存在しないか、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、置換Ｃ１〜６アルキル、Ｃ６〜１０アリール、置換Ｃ６〜１０アリール、ヘテロシクリル、または置換ヘテロシクリルであり、
Ｒ４およびＲ５は、それぞれ独立して、Ｈ、ハロ、ヘテロシクリル、置換ヘテロシクリル、Ｃ（Ｏ）−Ｒｄ、Ｃ１〜６アルキル、置換Ｃ１〜６アルキルであるか、互いに結合してＲ４〜５のような５員環を形成し、
【０１３２】
【化４−１】
2014015486.tif 000006
ここで、
【０１３３】
【化４−２】
2014015486.tif 000007
によって示した結合で結合し、
Ｘ１およびＸ２は、それぞれ独立して、Ｎ、Ｃ、Ｏ、またはＳであり、
Ｒ８は、Ｈ、ハロ、−ＯＨ、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、−ＯＨ、−ＮＲａＲｂ、−（ＣＨ２）ｎ−Ｏ−Ｒｃ、−Ｏ−（Ｃ１〜６アルキル）、−Ｓ（Ｏ）ｐＲｅ、または−Ｃ（Ｏ）−Ｒｄであり、
Ｒ９はＨ、Ｃ１〜６アルキル、置換Ｃ１〜６アルキル、ヘテロシクリル、置換ヘテロシクリル、またはＲ９ａであり、
Ｒ９ａは、
【０１３４】
【化５−１】
2014015486.tif 000008
であり、
ここで、
【０１３５】
【化５−２】
2014015486.tif 000009
によって示した結合で結合し、
Ｒ１０およびＲ１１は、それぞれ独立して、Ｈ、ハロ、Ｃ１〜６アルコキシ、置換Ｃ１〜６アルコキシ、−ＮＲａＲｂ、または−ＯＨであり、
各ＲａおよびＲｂは、独立して、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、置換Ｃ１〜６アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｒｄ、Ｃ６〜１０アリールであり、
各Ｒｃは、独立して、Ｈ、ホスファート、ジホスファート、トリホスファート、Ｃ１〜６アルキル、または置換Ｃ１〜６アルキルであり、
各Ｒｄは、独立して、Ｈ、ハロ、Ｃ１〜６アルキル、置換Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６アルコキシ、置換Ｃ１〜６アルコキシ、−ＮＨ２、−ＮＨ（Ｃ１〜６アルキル）、−ＮＨ（置換Ｃ１〜６アルキル）、−Ｎ（Ｃ１〜６アルキル）２、−Ｎ（置換Ｃ１〜６アルキル）２、Ｃ６〜１０アリール、またはヘテロシクリルであり、
各Ｒｅは、独立して、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、置換Ｃ１〜６アルキル、Ｃ６〜１０アリール、置換Ｃ６〜１０アリール、ヘテロシクリル、または置換ヘテロシクリルであり、
各Ｒｆは、独立して、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、置換Ｃ１〜６アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｒｄ、ホスファート、ジホスファート、またはトリホスファートであり、
各ｎは、独立して、０、１、２、または３であり、
各ｐは、独立して、０、１、または２である）を有する化合物、または（ｇ）（ａ）〜（ｆ）のいずれかの薬学的に許容可能な塩、（ａ）〜（ｆ）のいずれかの互変異性体、もしくは互変異性体の薬学的に許容可能な塩。
【０１３６】
・ロキソリビン（７−アリル−８−オキソグアノシン）（参考文献１２８）。
【０１３７】
・参考文献１２９に開示の化合物（アシルピペラジン化合物、インドールジオン化合物、テトラヒドライソキノリン（ＴＨＩＱ）化合物、ベンゾシクロジオン化合物、アミノアザビニル化合物、アミノベンズイミダゾールキノリノン（ＡＢＩＱ）化合物（参考文献１３０、１３１）、ヒドラフタルアミド化合物、ベンゾフェノン化合物、イソキサゾール化合物、ステロール化合物、キナジリノン化合物、ピロール化合物（参考文献１３２）、アントラキノン化合物、キノキサリン化合物、トリアジン化合物、ピラザロピリミジン化合物、およびベンザゾール化合物（参考文献１３３）が含まれる）。
【０１３８】
・ポリオキシドニウムポリマー（参考文献１３４、１３５）または他のＮ酸化ポリエチレン−ピペラジン誘導体。
【０１３９】
・参考文献１３６に開示の化合物。
【０１４０】
・アミノアルキルグルコサミニドリン酸誘導体（ＲＣ−５２９など）（参考文献１３７、１３８）。
【０１４１】
・ホスファゼン（例えば、参考文献１３９および１４０に記載のポリ［ジ（カルボキシラトフェノキシ）ホスファゼン］（「ＰＣＰＰ」）など）。
【０１４２】
・ＣＤ１ｄリガンド（α−グリコシルセラミド（参考文献１４１〜１４８）（例えば、α−ガラクトシルセラミド）、フィトスフィンゴシン含有α−グリコシルセラミド、ＯＣＨ、ＫＲＮ７０００［（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−１−Ｏ−（α−Ｄ−ガラクトピラノシル）−２−（Ｎ−ヘキサコサノイルアミノ）−１，３，４−オクタデカントリオール］、ＣＲＯＮＹ−１０１、３’’−Ｏ−スルホ−ガラクトシルセラミドなど）。
【０１４３】
・以下などの小分子免疫賦活薬（ＳＭＩＰ）：
Ｎ２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
Ｎ２，Ｎ２−ジメチル−１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
Ｎ２−エチル−Ｎ２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
Ｎ２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−Ｎ２−プロピル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
１−（２−メチルプロピル）−Ｎ２−プロピル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
Ｎ２−ブチル−１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
Ｎ２−ブチル−Ｎ２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
Ｎ２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−Ｎ２−ペンチル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
Ｎ２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−Ｎ２−プロプ−２−エニル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
１−（２−メチルプロピル）−２−［（フェニルメチル）チオ］−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミン
１−（２−メチルプロピル）−２−（プロピルチオ）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミン
２−［［４−アミノ−１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２−イル］（メチル）アミノ］エタノール
２−［［４−アミノ−１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２−イル］（メチル）アミノ］酢酸エチル
４−アミノ−１−（２−メチルプロピル）−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２−オン
Ｎ２−ブチル−１−（２−メチルプロピル）−Ｎ４，Ｎ４−ビス（フェニルメチル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
Ｎ２−ブチル−Ｎ２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−Ｎ４，Ｎ４−ビス（フェニルメチル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
Ｎ２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−Ｎ４，Ｎ４−ビス（フェニルメチル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
Ｎ２，Ｎ２−ジメチル−１−（２−メチルプロピル）−Ｎ４，Ｎ４−ビス（フェニルメチル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
１−｛４−アミノ−２−［メチル（プロピル）アミノ］−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル｝−２−メチルプロパン−２−オール
１−［４−アミノ−２−（プロピルアミノ）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル］−２−メチルプロパン−２−オール
Ｎ４，Ｎ４−ジベンジル−１−（２−メトキシ−２−メチルプロピル）−Ｎ２−プロピル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン。
【０１４４】
本発明で使用されるサイトカイン誘導薬は、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）のモジュレーターおよび／またはアゴニストであり得る。例えば、これらは、１つまたは複数のヒトＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、および／またはＴＬＲ９タンパク質のアゴニストであり得る。好ましい薬剤は、ＴＬＲ７（例えば、イミダゾキノリン）および／またはＴＬＲ９（例えば、ＣｐＧオリゴヌクレオチド）のアゴニストである。これらの薬剤は、先天免疫経路の活性化に有用である。
【０１４５】
サイトカイン誘導薬を、その生成中の種々の段階で組成物に添加することができる。例えば、これは抗原組成物の範囲内であり得、この混合物を水中油型乳濁液に添加することができる。別の方法として、これは水中油型乳濁液の範囲内であり得、この場合、薬剤を乳化前に乳濁液成分に添加するか、乳化後に乳濁液に添加することができる。同様に、薬剤を、乳濁液滴内にコアセルベート化することができる。最終組成物内のサイトカイン誘導薬の位置および分布は、親水性／親油性に依存するであろう。例えば、薬剤を、水相中、油相中、および／または油−水界面に配置することができる。
【０１４６】
サイトカイン誘導薬を、個別の薬剤（抗原（例えば、ＣＲＭ１９７）など）に抱合することができる。小分子抱合技術の一般的な概説は、参考文献１４９に記載されている。別の方法として、アジュバントを、疎水性またはイオン性の相互作用などによってさらなる薬剤と非共有結合することができる。
【０１４７】
２つの好ましいサイトカイン誘導薬は、（ａ）免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよび（ｂ）３ｄＭＰＬである。免疫刺激性オリゴヌクレオチドには、ヌクレオチド修飾物／アナログ（ホスホロチオアート修飾物など）が含まれ得、二本鎖または（ＲＮＡを除く）一本鎖であり得る。参考文献１５０、１５１、および１５２は、可能なアナログ置換物（例えば、グアノシンの２’−デオキシ−７−デアザグアノシンとの置換）を開示する。ＣｐＧオリゴヌクレオチドのアジュバント効果は、参考文献１５３〜１５８にさらに考察されている。ＣｐＧ配列は、ＴＬＲ９（モチーフＧＴＣＧＴＴまたはＴＴＣＧＴＴなど）に指向することができる（参考文献１５９）。ＣｐＧ配列は、Ｔｈ１免疫応答の誘導体に特異的であり得るか（ＣｐＧ−Ａ  ＯＤＮ（オリゴデオキシヌクレオチド）など）、Ｂ細胞応答の誘導により特異的であり得る（ＣｐＧ−Ｂ  ＯＤＮなど）。ＣｐＧ−ＡおよびＣｐＧ−Ｂ  ＯＤＮは、参考文献１６０〜１６２に考察されている。好ましくは、ＣｐＧはＣｐＧ−Ａ  ＯＤＮである。好ましくは、ＣｐＧオリゴヌクレオチドを、５’末端が受容体認識のために接近可能なように構築する。任意選択的に２つのＣｐＧオリゴヌクレオチド配列をその３’末端に結合して、「イムノマー（ｉｍｍｕｎｏｍｅｒ）」を形成することができる。例えば、参考文献１５９および１６３〜１６５を参照のこと。有用なＣｐＧアジュバントはＣｐＧ７９０９であり、ＰｒｏＭｕｎｅ（商標）（Ｃｏｌｅｙ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．）としても公知である。
【０１４８】
ＣｐＧ配列使用の別の方法としてかそれに加えて、ＴｐＧ配列を使用することができる（１６６）。これらのオリゴヌクレオチドは、非メチル化ＣｐＧモチーフを含まなくてよい。
【０１４９】
免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、ピリミジンリッチであり得る。例えば、これは、１つを超える連続チミジンヌクレオチドを含むことができ（例えば、参考文献１６６に開示のＴＴＴＴ）、そして／または＞２５％チミジン（例えば、＞３５％、＞４０％、＞５０％、＞６０％、＞８０％など）を有するヌクレオチド組成物を有することができる。例えば、これは、１つを超える連続シトシンヌクレオチドを含むことができ（例えば、参考文献１６６に開示のＣＣＣＣ）、そして／または＞２５％  シトシン（例えば、＞３５％、＞４０％、＞５０％、＞６０％、＞８０％など）を有するヌクレオチド組成物を有することができる。これらのオリゴヌクレオチドは、非メチル化ＣｐＧモチーフを含まなくて良い。
【０１５０】
免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、典型的には、少なくとも２０ヌクレオチドを含むであろう。これらは、１００個未満のヌクレオチドを含むことができる。
【０１５１】
特に有用なアジュバントベースの免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、ＩＣ３１（商標）として公知である（参考文献１６７）。したがって、本発明と共に使用されるアジュバントは、（ｉ）少なくとも１つの（好ましくは複数の）ＣｐＩモチーフを含むオリゴヌクレオチド（例えば、１５〜４０ヌクレオチド）および（ｉｉ）少なくとも１つの（好ましくは複数の）Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓトリペプチド配列を含むポリカチオン性ポリマー（オリゴペプチド（例えば、５〜２０アミノ酸）など）の混合物を含むことができる。オリゴヌクレオチドは、２６量体配列５’−（ＩＣ）１３−３’（配列番号１）を含むデオキシヌクレオチドであり得る。ポリカチオン性ポリマーは、１１量体アミノ酸配列ＫＬＫＬＬＬＬＬＫＬＫ（配列番号２）を含むペプチドであり得る。
【０１５２】
３ｄＭＰＬ（３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリル脂質Ａまたは３−Ｏ−デスアシル−４’モノホスホリル脂質Ａとしても公知）は、モノホスホリル脂質Ａ中の還元末端グルコサミンの３位が脱アシル化されたアジュバントである。３ｄＭＰＬは、サルモネラ・ミネソタ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｍｉｎｎｅｓｏｔａ）のヘプトースレス変異体から調製されており、脂質Ａと化学的に類似しているが、酸不安定性ホスホリル基および塩基不安定性アシル基を欠く。これは、単球／マクロファージ系列の細胞を活性化し、いくつかのサイトカイン（ＩＬ−１、ＩＬ−１２、ＴＮＦ−α、およびＧＭ−ＣＳＦが含まれる）の放出を刺激する（参考文献１６８も参照のこと）。３ｄＭＰＬの調製は、参考文献１６９に最初に記載された。
【０１５３】
３ｄＭＰＬは、そのアシル化によって変化する関連分子の混合物の形態を取ることができる（例えば、３、４、５、または６個のアシル鎖を有し、長さは異なっていても良い）。２つのグルコサミン（２−デオキシ−２−アミノグルコースとしても公知）単糖は、２位の炭素（すなわち、２位および２’位）でＮ−アシル化され、また、３’位にＯ−アシル化が存在する。炭素２に結合する基は、式−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２−ＣＲ１Ｒ１’を有する。炭素２’に結合する基は、式−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２−ＣＲ２Ｒ２’を有する。炭素３’に結合する基は、式−Ｏ−ＣＯ−ＣＨ２−ＣＲ３Ｒ３’を有する。代表的な構造は以下である。
【０１５４】
【化６】
2014015486.tif 000010
Ｒ１基、Ｒ２基、およびＲ３基は、それぞれ独立して、−（ＣＨ２）ｎ−ＣＨ３である。値ｎは、好ましくは８と１６との間、より好ましくは９と１２との間であり、最も好ましくは１０である。
【０１５５】
Ｒ１’基、Ｒ２’基、およびＲ３’基は、それぞれ独立して、以下であり得る：（ａ）−Ｈ；（ｂ）−ＯＨ；または（ｃ）−Ｏ−ＣＯ−Ｒ４（式中、Ｒ４は−Ｈまたは−（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ３のいずれかであり、値ｍは、好ましくは８と１６との間、より好ましくは１０、１２、または１４である）。２位では、ｍは好ましくは１４である。２’位では、ｍは好ましくは１０である。３’位では、ｍは好ましくは１２である。したがって、Ｒ１’基、Ｒ２’基、およびＲ３’基は、好ましくは、ドデカン酸、テトラデカン酸、またはヘキサデカン酸由来の−Ｏ−アシル基である。
【０１５６】
Ｒ１’、Ｒ２’、およびＲ３’の全てが−Ｈである場合、３ｄＭＰＬはたった３つのアシル鎖を有する（２位、２’位、および３’位のそれぞれに１つ）。Ｒ１’、Ｒ２’、およびＲ３’のたった２つが−Ｈである場合、３ｄＭＰＬは４つのアシル鎖を有することができる。Ｒ１’、Ｒ２’、およびＲ３’のたった１つが−Ｈである場合、３ｄＭＰＬは５つのアシル鎖を有することができる。Ｒ１’、Ｒ２’、およびＲ３’がいずれも−Ｈでない場合、３ｄＭＰＬは６つのアシル鎖を有することができる。本発明で使用される３ｄＭＰＬアジュバントは、３〜６つのアシル鎖を有するこれらの形態の混合物であり得るが、特に、ヘキサアシル鎖形態が総３ｄＭＰＬの少なくとも１０重量％（例えば、≧２０％、≧３０％、≧４０％、≧５０％、またはそれ以上）を作製することを確実にするために、混合物中に６つのアシル鎖を有する３ｄＭＰＬを含むことが好ましい。６アシル鎖を有する３ｄＭＰＬは、最もアジュバント活性な形態であることが見出されている。
【０１５７】
したがって、本発明の組成物中に含めるのに最も好ましい３ｄＭＰＬ形態は、以下の式（ＩＶ）を有する。
【０１５８】
【化７】
2014015486.tif 000011
３ｄＭＰＬを混合物形態で使用する場合、本発明の組成物中の３ｄＭＰの量または濃度は、混合物中の組み合わせ３ｄＭＰＬ種という。
【０１５９】
水性条件では、３ｄＭＰＬは、異なるサイズ（例えば、直径＜１５０ｎｍまたは＞５００ｎｍ）を有するミセル凝集体または粒子を形成することができる。これらのいずれかまたは両方を、本発明と共に使用することができ、より良好な粒子を、日常的なアッセイによって選択することができる。より小さな粒子（例えば、３ｄＭＰＬの透明な水性懸濁液を得るのに十分に小さい）は、その優れた活性により、本発明の使用に好ましい（参考文献１７０）。好ましい粒子は、平均直径が２２０ｎｍ未満、より好ましくは２００ｎｍ未満、１５０ｎｍ未満、または１２０ｎｍ未満であり、１００ｎｍ未満の平均直径でさえ有することができる。しかし、ほとんどの場合、平均直径は、５０ｎｍ未満ではないであろう。これらの粒子は、濾過滅菌に十分に適切な小ささである。粒子の直径を、平均粒子直径が明らかとなる日常的な動的光散乱技術によって評価することができる。粒子は直径ｘｎｍを有すると言われる場合、一般に、この平均付近の粒子が分布するが、少なくとも数値で５０％（例えば、≧６０％、≧７０％、≧８０％、≧９０％、またはそれを超える）の粒子が、ｘ±２５％の範囲内の直径を有するであろう。
【０１６０】
３ｄＭＰＬを、有利には、水中油型乳濁液と組み合わせて使用することができる。実質的に、全ての３ｄＭＰＬが乳濁液の水相中に存在することができる。
【０１６１】
３ｄＭＰＬを、単独か、１つまたは複数のさらなる化合物と組み合わせて使用することができる。例えば、ＱＳ２１サポニン（参考文献１７１）（水中油型乳濁液中に含まれる（参考文献１７２））、免疫刺激性オリゴヌクレオチド、ＱＳ２１および免疫刺激性オリゴヌクレオチドの両方、リン酸アルミニウム（参考文献１７３）、水酸化アルミニウム（参考文献１７４）、またはリン酸アルミニウムおよび水酸化アルミニウムの両方と組み合わせて３ｄＭＰＬを使用することが公知である。
【０１６２】
脂肪アジュバント
本発明と共に使用することができる脂肪アジュバントには、上記の水中油型乳濁液が含まれ、例えば、以下も含まれる。例えば、：
・参考文献１７５に定義の式Ｉ、ＩＩ、またはＩＩＩの化合物またはその塩：
【０１６３】
【化８】
2014015486.tif 000012
（「ＥＲ８０３０５８」、「ＥＲ８０３７３２」、「ＥＲ８０４０５３」、「ＥＲ８０４０５８」、「ＥＲ８０４０５９」、「ＥＲ８０４４４２」、「ＥＲ８０４６８０」、「ＥＲ８０４７６４」、「ＥＲ８０３０２２」、または「ＥＲ８０４０５７」（例えば、
【０１６４】
【化９】
2014015486.tif 000013
【０１６５】
【化１０】
2014015486.tif 000014
など）
・ＯＭ−１７４などの大腸菌由来の脂質Ａの誘導体（参考文献１７６および１７７に記載）。
【０１６６】
・カチオン性脂質および（通常、中性の）コリピド（ｃｏ−ｌｉｐｉｄ）の処方物（アミノプロピル−ジメチル−ミリストレイルオキシ−プロパンアンモニウムブロミド−ジフィタノイルホスファチジル−エタノールアミン（「Ｖａｘｆｅｃｔｉｎ（商標）」）またはアミノプロピル−ジメチル−ビス−ドデシルオキシ−プロパンアンモニウムブロミド−ジオレオイルホスファチジル−エタノールアミン（「ＧＡＰ−ＤＬＲＩＥ：ＤＯＰＥ」）など）。（±）−Ｎ−（３−アミノプロピル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ビス（シン−９−テトラデセネイルオキシ）−１−プロパンアミニウム塩を含む処方物が好ましい（参考文献１７８）。
【０１６７】
・３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリル脂質Ａ（上記を参照のこと）。
【０１６８】
・リン酸含有非環式骨格に結合した脂質を含む化合物（ＴＬＲ４アンタゴニストＥ５５６４（１７９、１８０）など）：
【０１６９】
【化１１】
2014015486.tif 000015
アルミニウム塩アジュバント
水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウムとして公知のアジュバントを使用することができる。これらの名称は従来の名称であり、便宜のみを目的として使用されるが、存在する実際の化合物を正確に説明していない（例えば、参考文献９７１８１の第９章を参照のこと）。本発明は、一般にアジュバントとして使用する任意の「水酸化物」または「リン酸塩」アジュバントを使用することができる。
【０１７０】
「水酸化アルミニウム」として公知のアジュバントは、典型的には、酸化水酸化アルミニウム塩であり、これは、通常少なくとも部分的に結晶である。式ＡｌＯ（ＯＨ）によって示すことができる酸化水酸化アルミニウムを、他のアルミニウム化合物（水酸化アルミニウムＡｌ（ＯＨ）３など）と、赤外（ＩＲ）分光法、特に、１０７０ｃｍ−１の吸収バンドおよび３０９０〜３１００ｃｍ−１の強いショルダーの存在によって区別することができる（参考文献９７の第９章）。水酸化アルミニウムアジュバントの結晶化度は、半分の高さでの回折バンドの幅（ＷＨＨ）を反映し、不十分な結晶の粒子は、より小さな結晶サイズに起因して広がったより大きなラインを示す。ＷＨＨの増加につれて表面積が増加し、より高いＷＨＨ値を有するアジュバントは、抗原吸着能力がより高いと考えられる。繊維性の形態（例えば、透過電子顕微鏡写真で認められる）は、水酸化アルミニウムアジュバントに典型的である。水酸化アルミニウムアジュバントのｐＩは、典型的には、約１１である（すなわち、アジュバント自体が生理学的ｐＨで正の表面電荷を有する）。水酸化アルミニウムアジュバントについてｐＨ７．４で１ｍｇのＡｌ＋＋＋あたり１．８〜２．６ｍｇの吸着能力が報告されている。
【０１７１】
「リン酸アルミニウム」として公知のアジュバントは、典型的には、水酸化リン酸アルミニウムであり、しばしば、少量の硫酸塩を含む（すなわち、水酸化リン酸アルミニウム硫酸塩）。これらを、沈殿によって得ることができ、沈殿時の反応条件および濃度は塩中の水酸基のリン酸基への置換の程度に影響を受ける。水酸化リン酸基は、一般に、ＰＯ４／Ａｌモル比が０．３と１．２との間である。水酸化リン酸基を、ヒドロキシル基の存在によってＡｌＰＯ４と厳密に区別することができる。例えば、３１６４ｃｍ−１（例えば、２００℃に加熱時）のＩＲスペクトルバンドは、構造的ヒドロキシルの存在を示す（参考文献９７の第９章）。
【０１７２】
リン酸アルミニウムアジュバントのＰＯ４／Ａｌ３＋モル比は、一般に、０．３と１．２との間、好ましくは０．８と１．２との間、より好ましくは０．９５±０．１であろう。リン酸アルミニウムは、一般に、特に水酸化リン酸塩について無定形であろう。典型的なアジュバントは、ＰＯ４／Ａｌモル比が０．８４と０．９２との間であり、０．６ｍｇ
Ａｌ３＋／ｍｌを含む無定形の水酸化リン酸アルミニウムである。リン酸アルミニウムは、一般に、粒子であろう（例えば、透過電子顕微鏡写真で認められるように、プレート様形態）。任意の抗原吸着後の粒子の典型的な直径は、０．５〜２０μｍ（例えば、約５〜１０μｍ）である。リン酸アルミニウムアジュバントについて、ｐＨ７．４で１ｍｇのＡｌ＋＋＋あたり０．７〜１．５ｍｇのタンパク質の吸着能力が報告されている。
【０１７３】
リン酸アルミニウムの電荷ゼロ点（ｐｏｉｎｔ  ｏｆ  ｚｅｒｏ  ｃｈａｒｇｅ）（ＰＺＣ）は、水酸基のリン酸基への置換度に反比例し、この置換度は、沈殿による塩の調製のために使用される反応条件および反応物の濃度に応じて変化し得る。ＰＺＣはまた、溶液中の遊離リン酸イオン濃度の変化（より多くのリン酸基＝より酸性のＰＺＣ）またはヒスチジン緩衝液（ＰＺＣをより塩基性にする）などの緩衝液の添加によって変化する。本発明で使用されるリン酸アルミニウムのＰＺＣは、４．０と７．０との間、より好ましくは５．０と６．５との間（例えば、約５．７）であろう。
【０１７４】
本発明の組成物の調製のために使用されるアルミニウム塩の懸濁液は、緩衝液（例えば、リン酸緩衝液、ヒスチジン緩衝液、またはＴｒｉｓ緩衝液）を含むことができるが、これは必ずしも必要とは限らない。懸濁液は、好ましくは、滅菌または発熱物質を含まない。懸濁液は、遊離水性リン酸イオンを含むことができ、例えば、１．０ｍＭと２０ｍＭとの間、好ましくは５ｍＭと１５ｍＭとの間、より好ましくは約１０ｍＭの濃度で存在することができる。懸濁液はまた、塩化ナトリウムを含むことができる。
【０１７５】
本発明は、水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウムの混合物を使用することができる（参考文献６８）。この場合、水酸化物よりもリン酸アルミニウムの方が多くてよい（例えば、少なくとも２：１の重量比（例えば、≧５：１、≧６：１、≧７：１、≧８：１、≧９：１など））。
【０１７６】
患者に投与するための組成物中のＡｌ＋＋＋濃度は、好ましくは１０ｍｇ／ｍｌ未満（例えば、≦５ｍｇ／ｍｌ、≦４ｍｇ／ｍｌ、≦３ｍｇ／ｍｌ、≦２ｍｇ／ｍｌ、≦１ｍｇ／ｍｌなど）である。好ましい範囲は、０．３ｍｇ／ｍｌと１ｍｇ／ｍｌとの間である。最大で＜０．８５ｍｇ／用量が好ましい。
【０１７７】
１つまたは複数のアルミニウム塩アジュバントを含めるのと同様に、アジュバント成分は、１つまたは複数のさらなるアジュバントまたは免疫賦活剤を含むことができる。かかるさらなる成分には、３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリル脂質Ａアジュバント（「３ｄ−ＭＰＬ」）および／または水中油型乳濁液が含まれるが、これらに限定されない。３ｄ−ＭＰＬは、３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリル脂質Ａまたは３−Ｏ−デスアシル４’モノホスホリル脂質Ａとも呼ばれている。この名称は、モノホスホリル脂質Ａ中の還元末端グルコサミンの３位が脱アシル化されていることを示す。これはＳ．ミネソタのヘプトースレス変異体から調製されており、脂質Ａと化学的に類似しているが、酸不安定性ホスホリル基および塩基不安定性アシル基を欠く。これは、単球／マクロファージ系列の細胞を活性化し、いくつかのサイトカイン（ＩＬ−１、ＩＬ−１２、ＴＮＦ−α、およびＧＭ−ＣＳＦが含まれる）の放出を刺激する。３ｄＭＰＬの調製は、参考文献１６９に最初に記載され、製品が製造されており、Ｃｏｒｉｘａ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎからＭＰＬ（商標）として販売されている。さらなる詳細は、参考文献１１１〜１１４に見出すことができる。
【０１７８】
本発明のキット
本発明の組成物を、送達時、特にアジュバント使用時に調製することができる。したがって、本発明は、混合のために準備された種々の成分を含むキットを提供する。キットは、使用するまでアジュバントおよび抗原を個別に保持することが可能である。この配置は、水中油型乳濁液アジュバントを使用する場合に有用であり得る。
【０１７９】
成分は、キット内で互いに物理的に分離されており、この分離を種々の方法で行うことができる。例えば、２つの成分は、２つの個別の容器（バイアルなど）に存在することができる。次いで、２つのバイアルの内容物を、例えば、一方のバイアルの内容物を取り出して他方のバイアルに添加することまたは両方バイアルの内容物と個別に取り出して第３の容器中で混合することによって混合することができる。
【０１８０】
好ましい配置では、キット成分の一方がシリンジ中に存在し、他方がバイアルなどの容器中に存在する。シリンジを（例えば、ニードルと共に）使用して、混合のためにその内容物を第２の容器に挿入し、次いで、混合物をシリンジに吸引することができる。次いで、シリンジの混合した内容物を、典型的には新規の滅菌ニードルによって患者に投与することができる。シリンジ中の１成分の包装により、患者への投与のために別のシリンジを使用する必要がなくなる。
【０１８１】
別の好ましい配置では、２つのキット成分を同一シリンジ中に一緒であるが個別に保持する（例えば、参考文献１８２〜１８９に開示のシリンジなどの二室シリンジ）。シリンジを作動させた場合（例えば、投与中）、二室の内容物が混合される。この配置は、使用時の個別の混合工程が回避される。
【０１８２】
キット成分は、一般に、水性形態であろう。いくつかの配置では、成分（典型的には、アジュバント成分よりもむしろ抗原成分）は、乾燥形態（例えば、凍結乾燥形態）であり、他の成分は水性形態である。２成分を混合して、乾燥成分を再活性化し、患者に投与するための水性成分を得ることができる。凍結乾燥成分を、典型的には、シリンジよりもむしろバイアル内に配置するであろう。乾燥成分は、ラクトース、スクロース、またはマンニトールおよびその混合物（例えば、ラクトース／スクロース混合物、スクロース／マンニトール混合物など）の安定剤を含むことができる。１つの可能な配置は、水性アジュバント成分を含む充填済みシリンジシリンジおよび凍結乾燥抗原成分を含むバイアルを使用する。
【０１８３】
組成物またはキット成分の包装
本発明の組成物（またはキット成分）に適切な容器には、バイアル、シリンジ（使い捨てシリンジ）、鼻腔用スプレーなどが含まれる。これらの容器は、無菌であるべきである。
【０１８４】
組成物／成分がバイアル中に存在する場合、バイアルは、好ましくは、ガラス製またはプラスチック製である。組成物をバイアルに添加する前に、好ましくは、バイアルを滅菌する。ラテックス感受性患者が伴う問題を回避するために、バイアルを、好ましくは、無ラテックスストッパーで密封し、全ての包装材料中にラテックスが存在しないことが好ましい。バイアルは、単回用量のワクチンを含むことができるか、１回分を超える用量（「複数回投与」バイアル）（例えば、１０回）を含むことができる。好ましいバイアルは、無色ガラス製である。
【０１８５】
バイアルは、充填済みシリンジをキャップに挿入し、シリンジの内容物をバイアルに排出し（例えば、バイアル中の凍結乾燥物質を再構成するため）、バイアルの内容物をシリンジに戻すことができるように対応したキャップ（例えば、Ｌｕｅｒロック）を有することができる。シリンジをバイアルから除去した後、ニードルを取り付け、組成物を患者に投与することができる。キャップを、好ましくは、シールまたはカバーの内部に配置し、その結果、キャップが接近することができる前にシールまたはカバーが除去されなければならない。バイアルは、特に複数回投与バイアルについて、その内容物を無菌的に取り出すことが可能なキャップを有することができる。
【０１８６】
成分をシリンジにパッケージングする場合、シリンジはシリンジに取り付けたニードルを有することができる。ニードルを取り付けない場合、組み立てて使用するための個別のニードルをシリンジと共に供給することができる。かかるニードルを鞘に収めることができる。セーフティニードルが好ましい。１インチ２３ゲージ、１インチ２５ゲージ、および５／８インチ２５ゲージのニードルが典型的である。シリンジを、記録管理が容易なようにロット番号、インフルエンザの季節、および内容物の期限を印刷することができる剥ぎ取り式のラベルと共に提供することができる。シリンジ中のプランジャは、好ましくは、吸引中にプランジャが偶然に除去されるのを防止するためのストッパーを有する。シリンジは、ラテックスラバーキャップおよび／またはプランジャを有することができる。使い捨てシリンジは、単回用量のワクチンを含む。シリンジは、一般に、ニードルの取り付け前にチップを密封するためのチップキャップを有し、チップキャップは、好ましくは、ブチルラバー製である。シリンジおよびニードルを個別に包装する場合、好ましくは、ニードルにブチルラバー保護物を取り付ける。有用なシリンジは、商標名「Ｔｉｐ−Ｌｏｋ」（商標）で販売されるシリンジである。
【０１８７】
容器は、例えば、小児への送達を容易にするために、半量を記すことができる。例えば、０．５ｍｌの用量を含むシリンジは、０．２５ｍｌの体積を示すマークを有することができる。
【０１８８】
ガラス容器（例えば、シリンジまたはバイアル）を使用する場合、ソーダ石灰ガラスよりもむしろホウケイ酸ガラスでできている容器を使用することが好ましい。
【０１８９】
キットまたは組成物を、ワクチンの詳細（例えば、投与の説明）、ワクチン内の抗原の詳細などを含むリーフレットと共に（例えば、同一ボックス中に）包装することができる。説明書はまた、例えば、ワクチン接種後などのアナフィラキシー反応の場合に容易に利用可能なアドレナリン溶液を保持するための警告を含むことができる。
【０１９０】
治療方法およびワクチン投与
本発明の組成物はヒト患者への投与に適切であり、本発明は、本発明の組成物を患者に投与する工程を含む、患者の免疫応答を惹起する方法を提供する。
【０１９１】
本発明はまた、薬物用として使用するための本発明のキットまたは組成物を提供する。
【０１９２】
本発明はまた、患者に免疫応答を惹起するための薬物の製造における、４つの異なるインフルエンザウイルス株由来の抗原の使用を提供する。いくつかの実施形態では、抗原を、細胞培養で増殖させたウイルスから調製する。いくつかの実施形態では、アジュバントを製造でも使用する。いくつかの実施形態では、抗原は、スプリット抗原でも全抗原でもなく、生ウイルスまたは精製表面糖タンパク質である。いくつかの実施形態では、実質的に同一の質量の各インフルエンザウイルス株の血球凝集素を含むワクチンを製造する。
【０１９３】
一般にこれらの方法および用途を使用して、抗体応答、好ましくは防御的抗体応答が得られるであろう。インフルエンザウイルスワクチン接種後の抗体応答、中和能力、および防御の評価方法は、当該分野で周知である。ヒト研究により、ヒトインフルエンザウイルスの血球凝集素に対する抗体力価が防御と相関することが示されている（約３０〜４０の血清サンプルの血球凝集阻害力価は、同種ウイルスによる感染を約５０％防御する）（参考文献１９０）。抗体応答を、典型的には、血球凝集阻害、マイクロ中和試験（ｍｉｃｒｏｎｅｕｔｒａｌｉｓａｔｉｏｎ）、一元放射免疫拡散法（ｓｉｎｇｌｅ  ｒａｄｉａｌ  ｉｍｍｕｎｏｄｉｆｆｕｓｉｏｎ（ＳＲＩＤ）、および／または一元放射溶血試験（ｓｉｎｇｌｅ  ｒａｄｉａｌ  ｈｅｍｏｌｙｓｉｓ）（ＳＲＨ）によって測定する。これらのアッセイ技術は、当該分野で周知である。
【０１９４】
本発明の組成物を、種々の方法で投与することができる。最も好ましい免疫化経路は、筋肉内注射（例えば、腕または脚）であるが、他の利用可能な経路には、皮下注射、鼻腔内（参考文献１９１〜１９３）、経口（参考文献１９４）、皮内（参考文献１９５、１９６）、経皮、経真皮（参考文献１９７）などが含まれる。
【０１９５】
本発明にしたがって調製されたワクチンを使用して、小児および成人の両方を治療することができる。インフルエンザワクチンは、小児免疫化および成人免疫化（６ヶ月から）での使用が現在推奨されている。したがって、患者は、１歳未満、１〜５歳、１５〜５５歳、または少なくとも５５歳であり得る。ワクチン投与に好ましい患者は、高齢（例えば、５０歳以上、６０歳以上、および好ましくは６５歳以上）、若年者（５歳以下）、入院患者、医療従事者、軍人および軍関係者、妊婦、慢性的体調不良、免疫不全患者、ワクチン投与７日前に抗ウイルス化合物（例えば、オセルタミビルまたはザナミビル化合物；以下を参照のこと）を投与された患者、卵アレルギーの者、海外旅行者である。ワクチンは、これらの群に唯一適切なのではないが、より一般的に、集団で使用することができる。
【０１９６】
１つを超えるインフルエンザＢウイルス株由来の抗原を含むワクチンが、０〜１５歳の群の患者の治療に特に有用である。
【０１９７】
本発明の好ましい組成物は、有効性についてのＣＰＭＰ基準１、２、または３を満たす。成人（１８〜６０歳）では、これらの基準は以下である：（１）７０％以上の血清防御；（２）４０％以上の血清反応反転；および／または（３）２．５倍以上のＧＭＴ増加。高齢者（６０歳超）では、これらの基準を以下である：（１）６０％以上の血清防御；（２）３０％以上の血液反応反転；および／または（３）２倍以上のＧＭＴ増加。これらの基準は、少なくとも５０人の患者を用いた非盲検研究に基づく。
【０１９８】
治療は、単回用量投与スケジュールまたは複数回用量投与スケジュールによる治療であり得る。複数回用量を、一次免疫スケジュールおよび／または追加免疫スケジュールで使用することができる。複数回用量投与スケジュールでは、種々の用量を同一経路または異なる経路（例えば、非経口一次免疫および粘膜追加免疫、粘膜一次免疫および非経口追加免疫など）によって投与することができる。１回を超える用量（典型的には、２回）は、免疫学的にナイーブな患者（例えば、インフルエンザワクチンを以前に一度も投与したことのない者）または新規のＨＡサブタイプを含むワクチンに特に有用である。複数回用量を、典型的には、少なくとも１週間間隔（例えば、約２週間、約３週間、約４週間、約６週間、約８週間、約１２週間、約１６週間など）で投与するであろう。
【０１９９】
本発明によって産生されたワクチンを、他のワクチンと実質的に同時に（例えば、麻疹ワクチン、ムンプスワクチン、風疹ワクチン、ＭＭＲワクチン、水痘ワクチン、ＭＭＲＶワクチン、ジフテリアワクチン、破傷風ワクチン、百日咳ワクチン、ＤＴＰワクチン、抱合型インフルエンザ菌ｂ型ワクチン、不活化ポリオウイルスワクチン、Ｂ型肝炎ウイルスワクチン、髄膜炎菌抱合体ワクチン（（４価Ａ−Ｃ−Ｗ１３５−Ｙワクチン）、呼吸器合胞体ウイルスワクチン、肺炎球菌ワクチンなどと実質的に同時）投与することができる（例えば、医療相談時、または医療関係者またはワクチンセンターへの訪問時）。肺炎球菌ワクチンおよび／または髄膜炎菌ワクチンと実質的に同時の投与は、高齢患者で特に有用である。
【０２００】
同様に、本発明のワクチンを、抗ウイルス化合物、特にインフルエンザウイルスに対して活性な抗ウイルス化合物（例えば、オセルタミビルおよび／またはザナミビル）と実質的に同時に投与することができる（例えば、医療相談時または医療関係者訪問時）。これらの抗ウイルス剤には、ノイラミニダーゼインヒビター（（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−４−アセチルアミノ−５−アミノ−３（１−エチルプロポキシ）−１−シクロヘキセン−１−カルボン酸または５−（アセチルアミノ）−４−［（アミノイミノメチル）−アミノ］−２，６−アンヒドロ−３，４，５−トリデオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクトノン−２−エノン酸（そのエステル（例えば、エチルエステル）およびその塩（例えば、リン酸塩）が含まれる）など）が含まれる。好ましい抗ウイルス薬は、（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−４−アセチルアミノ−５−アミノ−３（１−エチルプロポキシ）−１−シクロヘキセン−１−カルボン酸、エチルエステル、リン酸塩（１：１）、リン酸オセルタミビル（ＴＡＭＩＦＬＵ（商標））としても公知）である。
【０２０１】
インフルエンザＢウイルス株の季節による変化
本発明の１つの態様は、いかなる疫学的分析と無関係に、ある季節におけるＢ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様株と次の季節におけるＢ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様株との間で株が変化する、それぞれの連続的インフルエンザウイルスシーズンのための（北半球の北）インフルエンザＢウイルス株の選択方法を提供する。これらのワクチンは、３価または３価超であり得るが、インフルエンザＢウイルスのためのＢ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様抗原またはＢ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様抗原のみを含み、両方を含まない。
【０２０２】
したがって、本発明は、各シーズンのためのワクチンが１つのインフルエンザＢウイルス株由来の抗原を含む、３つの連続したシーズン（北半球のシーズンまたは南半球のシーズンのいずれか）のインフルエンザワクチンの調製方法であって、第１シーズンのためのワクチンはＢ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様株由来の抗原を含み、第２シーズンのためのワクチンはＢ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様株由来の抗原を含み、第３シーズンのためのワクチンはＢ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様株由来の抗原を含む、方法を提供する。
【０２０３】
同様に、本発明は、各シーズンのためのワクチンが１つのインフルエンザＢウイルス株由来の抗原を含む、３つの連続したシーズン（北半球のシーズンまたは南半球のシーズンのいずれか）のインフルエンザワクチンの調製方法であって、第１シーズンのためのワクチンはＢ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様株由来の抗原を含み、第２シーズンのためのワクチンはＢ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様株由来の抗原を含み、第３シーズンのためのワクチンはＢ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様株由来の抗原を含む、方法を提供する。
【０２０４】
より一般的には、本発明は、少なくとも３つの連続するシーズン（北半球のシーズンまたは南半球のシーズンのいずれか）のインフルエンザワクチンの調製方法であって、（ａ）各シーズンのためのワクチンが１つのインフルエンザＢウイルス株由来の抗原を含み、（ｂ）第１シーズンのためのワクチンはＢ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様株またはＢ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様株由来の抗原を含み、（ｂ）各連続シーズン後のワクチンが、前のシーズンのワクチンがＢ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様株由来の抗原を含む場合にＢ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様株を含むか、前のシーズンのワクチンがＢ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様株由来の抗原を含む場合にＢ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様株由来の抗原を含む、調製方法を提供する。したがって、抗原を、第１シーズンでは、Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様株またはＢ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様株由来の抗原から選択し、その後の各シーズンの抗原をこの２つの間で交互にする。この交互サイクルを、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０シーズン連続して行うことができる。好ましくは、第１シーズンは、２００７／０８年以降である。
【０２０５】
Ｈ５株を含む多価ワクチン
本発明は、少なくとも１つの流行インフルエンザＡウイルス株、少なくとも１つの非流行インフルエンザＡウイルス株（例えば、Ｈ１および／またはＨ３由来）、および少なくとも１つのインフルエンザＢウイルス株由来の抗原を含む３価または３価を超えるインフルエンザワクチンを提供する。流行株は、現在の予想に基づいて、Ｈ５株であろう。したがって、ワクチンは、Ｈ５抗原、非Ｈ５インフルエンザＡ抗原、およびインフルエンザＢ抗原を含むであろう。ワクチンの他の特徴は、本明細書中の他の場所に記載のとおりである。
【０２０６】
したがって、本発明は、１つのＨ５インフルエンザＡウイルス株、１つのＨ３Ｎ２インフルエンザＡウイルス株、および１つのインフルエンザＢウイルス株由来の抗原を含む３価インフルエンザウイルスワクチンを提供する。
【０２０７】
本発明はまた、１つのＨ１Ｎ１インフルエンザＡウイルス株、１つのＨ５インフルエンザＡウイルス株、および１つのインフルエンザＢウイルス株由来の抗原を含む３価インフルエンザウイルスワクチンを提供する。
【０２０８】
現在の季節性ワクチンを、流行または潜在的流行インフルエンザウイルス株由来の抗原を含むように有利に適合させることができる。公衆衛生の見通しから、流行株に対するワクチン接種の論理は、個別の季節性ワクチンおよび流行ワクチンの配給よりもさらに容易であろう。さらに、患者は、季節性株および流行株の両方を対象とする単一ワクチンを投与され、それにより、より良好な安全プロフィールが得られ、患者の投薬順守が改善されるであろう。かかるワクチンを、通常の３価季節性ワクチンおよび個別の１価流行ワクチンの製造ならびに単一組成物として投与する前の使用時のこれらのワクチンの混合によって作製することができる。代替法として、４つの抗原バルクを調製し、包装および分配前に混合することができる。
【０２０９】
したがって、本発明はまた、Ｈ１Ｎ１インフルエンザＡウイルス株、Ｈ３Ｎ２インフルエンザＡウイルス株、流行インフルエンザＡウイルス株（例えば、Ｈ５Ｎ１などのＨ５株）、およびインフルエンザＢウイルス株由来の抗原を含む４価インフルエンザウイルスワクチンを提供する。
【０２１０】
これらのワクチンは、有利には、水中油型乳濁液（本発明の他の場所に記載）などのアジュバントを含む。アジュバントは、流行株によって誘発される免疫学的ナイーブな患者の免疫応答の改善に有用である。
【０２１１】
これらの４価ワクチンでは、Ａ−Ｈ１Ｎ１、Ａ−Ｈ３Ｎ２、およびＢの抗原用量は互いに実質的に同一であり得る（例えば、１５μｇ／用量）。流行株の抗原用量は、その用量未満（１０μｇ／用量未満）であり得る。Ａ−Ｈ１Ｎ１、Ａ−Ｈ３Ｎ２、およびＢの平均ＨＡ用量がｄμｇ／用量である場合、流行株のＨＡ用量は、０．７５ｘ  ｄμｇ／用量未満（例えば、０．７ｘ、０．６ｘ、０．５ｘ、０．４ｘ、０．３ｘ、０．２５ｘ、０．２ｘ、または０．１ｘ）であろう。各Ａ−Ｈ１Ｎ１、Ａ−Ｈ３Ｎ２、およびＢ株の個別のＨＡ用量は、好ましくは、ｄの±１０％以内である。１つの実施形態では、用量あたりのＨＡ量は、３つの季節性株については１５〜２０μｇ、流行株については約７．５〜１０μｇの範囲である（例えば、約１５μｇ／株であるが、流行株については約７．５μｇである）。
【０２１２】
本発明はまた、かかるワクチンを調製するためのキットを提供する。したがって、本発明は、（ｉ）Ｈ１Ｎ１インフルエンザＡウイルス株、Ｈ３Ｎ２インフルエンザＡウイルス株、およびインフルエンザＢウイルス株由来の抗原を含むインフルエンザワクチンを含む第１の容器；および（ｉｉ）流行株（例えば、Ｈ５Ｎ１などのＨ５株）由来の抗原を含むインフルエンザワクチンを含む第２の容器を含むキットを提供する。第１および第２の容器の内容物を、使用時（合わせたワクチンとして患者に投与する前）に混合することができる。類似のキットを、インフルエンザＢウイルスワクチンの通常の季節性ワクチンとの同時投与のために使用することができる。
【０２１３】
かかるキットのいくつかの実施形態では、第１の容器はワクチンアジュバントを含まないが、第２の容器はワクチンアジュバント（例えば、水中油型乳濁液）を含む。組み合わせ後、最終ワクチンはアジュバントを含む。
【０２１４】
本発明はまた、（ｉ）Ａ−Ｈ１Ｎ１インフルエンザＡウイルス由来のバルク抗原を調製する工程；（ｉｉ）Ａ−Ｈ３Ｎ２インフルエンザＡウイルス由来のバルク抗原を調製する工程；（ｉｉｉ）流行インフルエンザＡウイルス（Ｈ５Ｎ１インフルエンザＡウイルスなど）由来のバルク抗原を調製する工程；（ｉｖ）インフルエンザＢウイルス由来のバルク抗原を調製する工程；および（ｖ）バルク抗原を組み合わせ、希釈して、所望の濃度の各抗原を有する組み合わせたワクチンを得る工程を含む、組み合わせたインフルエンザワクチンの調製プロセスを提供する。本明細書中の他の場所に記載のように、抗原を容器に充填し、患者への投与のために流通させることができる。
【０２１５】
通則
用語「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「〜含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および  「〜からなる」を含む。例えば、Ｘ「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」組成物は、排他的にＸからなり得るか、さらなる添加物を含むことができる（例えば、Ｘ＋Ｙ）。
【０２１６】
用語「実質的に」は、「完全に」を排除しない。例えば、Ｙを「実質的に含まない」組成物は、Ｙを完全に含まなくてよい。必要に応じて、用語「実質的に」を、本発明の定義から省略することができる。
【０２１７】
数値ｘに関する用語「約」は、例えば、ｘ±１０％を意味する。
【０２１８】
特に言及しない限り、２つ以上の成分を混合する工程を含むプロセスは、いかなる特定の混合順序も必要としない。したがって、成分を任意の順序で混合することができる。３つの成分が存在する場合、２つの成分を互いに組み合わせ、次いで、組み合わせを第３の成分などと組み合わせることができる。
【０２１９】
動物（特に、ウシ）材料を細胞培養で使用する場合、これらを、伝染性海綿状脳症（ＴＳＥ）、特に、ウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）を含まない供給源から得るべきである。全体的に、動物由来材料が全く存在しない細胞を培養することが好ましい。
【０２２０】
化合物を組成物の一部として身体に投与する場合、もう１つの方法として、化合物を適切なプロドラッグと置換することができる。
【０２２１】
細胞基質を再集合、逆遺伝学手順、またはウイルス増殖のために使用する場合、例えば、Ｐｈ  Ｅｕｒジェネラルチャプター５．２．３のようなヒトワクチン産生での使用が承認されている細胞基質が好ましい。
したがって、本発明は、以下の項目を提供する：
（項目１）  インフルエンザウイルスの少なくとも４つの株由来の抗原を含むワクチンであって、該ワクチンはオボアルブミンを含まない、ワクチン。
（項目２）  インフルエンザウイルスの少なくとも４つの株由来の抗原を含むワクチンであって、該株の少なくとも１つが細胞培養物中で増殖している、ワクチン。
（項目３）  アジュバントを含む、項目１または項目２に記載のワクチン。
（項目４）  上記抗原が、スプリットウイルス粒子でも全ウイルス粒子でもない、項目１〜３のいずれか１項に記載のワクチン。
（項目５）  実質的に同一の質量の上記４つのインフルエンザウイルス株各々の血球凝集素（ＨＡ）を含む、項目１〜４のいずれか１項に記載のワクチン。
（項目６）  上記４つの株が２つのインフルエンザＡウイルス株および２つのインフルエンザＢウイルス株を含む、項目１〜５のいずれか１項に記載のワクチン。
（項目７）  （ｉ）Ｈ１Ｎ１株などのＨ１インフルエンザＡウイルス株；（ｉｉ）Ｈ３Ｎ２株などのＨ３インフルエンザＡウイルス株；（ｉｉｉ）Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様インフルエンザＢウイルス株；および（ｉｖ）Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様インフルエンザＢウイルス株由来の抗原を含む、項目６に記載のワクチン。
（項目８）  上記４つの株が３つのインフルエンザＡウイルス株および１つのインフルエンザＢウイルス株を含む、項目１〜項目５のいずれか１項に記載のワクチン。
（項目９）  （ｉ）Ｈ１Ｎ１株などのＨ１インフルエンザＡウイルス株；（ｉｉ）Ａ／Ｍｏｓｃｏｗ／１０／９９と交差反応する血球凝集素を有するＨ３インフルエンザＡウイルス株；（ｉｉｉ）Ａ／Ｆｕｊｉａｎ／４１１／２００２と交差反応する血球凝集素を有するＨ３インフルエンザＡウイルス株；および（ｉｖ）Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様インフルエンザＢウイルス株またはＢ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６様インフルエンザＢウイルス株由来のインフルエンザＢウイルス株由来の抗原を含む、項目８に記載のワクチン。
（項目１０）  （ｉ）Ｈ１Ｎ１株などのＨ１インフルエンザＡウイルス株；（ｉｉ）Ｈ３Ｎ２株などのＨ３インフルエンザＡウイルス株；（ｉｉｉ）Ｈ５Ｎ１株などのＨ５インフルエンザＡウイルス株；および（ｉｖ）Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様インフルエンザＢウイルス株またはＢ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様インフルエンザＢウイルス株由来のインフルエンザＢウイルス株由来の抗原を含む、項目８に記載のワクチン。
（項目１１）  少なくとも５つのインフルエンザウイルス株由来の抗原を含む、項目１〜項目６のいずれか１項に記載のワクチン。
（項目１２）  （ｉ）Ｈ１Ｎ１株などのＨ１インフルエンザＡウイルス株；（ｉｉ）Ａ／Ｍｏｓｃｏｗ／１０／９９と交差反応する血球凝集素を有するＨ３インフルエンザＡウイルス株；（ｉｉｉ）Ａ／Ｆｕｊｉａｎ／４１１／２００２と交差反応する血球凝集素を有するＨ３インフルエンザＡウイルス株；（ｉｖ）Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様インフルエンザＢウイルス株由来のインフルエンザＢウイルス株；および（ｖ）Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様インフルエンザＢウイルス株由来の抗原を含む、項目１１に記載のワクチン。
（項目１３）  （ｉ）Ｈ１Ｎ１株などのＨ１インフルエンザＡウイルス株；（ｉｉ）Ａ／Ｍｏｓｃｏｗ／１０／９９またはＡ／Ｆｕｊｉａｎ／４１１／２００２と交差反応する血球凝集素を有するＨ３インフルエンザＡウイルス株；（ｉｉｉ）Ｈ５インフルエンザＡウイルス；（ｉｖ）Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様インフルエンザＢウイルス株由来のインフルエンザＢウイルス株；および（ｖ）Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様インフルエンザＢウイルス株由来の抗原を含む、項目１１に記載のワクチン。
（項目１４）  （ｉ）インフルエンザＡウイルスのＨ１Ｎ１株；（ｉｉ）インフルエンザＡウイルスのＡ／Ｍｏｓｃｏｗ／１０／９９様Ｈ３Ｎ２株；（ｉｉｉ）インフルエンザＡウイルスのＡ／Ｆｕｊｉａｎ／４１１／２００２様Ｈ３Ｎ２株；（ｉｖ）Ｈ５Ｎ１株などのＨ５インフルエンザＡウイルス株；（ｖ）Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様インフルエンザＢウイルス株由来のインフルエンザＢウイルス株；および（ｖｉ）Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様インフルエンザＢウイルス株由来の抗原を含む、項目１〜項目６のいずれか１項に記載のワクチン。
（項目１５）  （ｉ）インフルエンザＡウイルスのＨ１Ｎ１株；（ｉｉ）インフルエンザＡウイルスのＡ／Ｍｏｓｃｏｗ／１０／９９様Ｈ３Ｎ２株；（ｉｉｉ）インフルエンザＡウイルスのＡ／Ｆｕｊｉａｎ／４１１／２００２様Ｈ３Ｎ２株；（ｉｖ）Ｈ５Ｎ１株などのＨ５インフルエンザＡウイルス株；および（ｖ）Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様インフルエンザＢウイルス株またはＢ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様インフルエンザＢウイルス株由来のインフルエンザＢウイルス株由来の抗原を含む、項目１〜項目５のいずれか１項に記載のワクチン。
（項目１６）  各インフルエンザＡウイルスがＡ／ＰＲ／８／３４ウイルス由来の１つまたは複数のＲＮＡセグメントを含む、項目１〜１５のいずれか１項に記載のワクチン。
（項目１７）  各血球凝集素が、Ｓｉａ（α２，３）Ｇａｌ末端二糖を有するオリゴ糖と比較してＳｉａ（α２，６）Ｇａｌ末端二糖を有するオリゴ糖と優先的に結合する、項目１〜１６のいずれか１項に記載のワクチン。
（項目１８）  各血球凝集素が、ニワトリ卵中に認められないグリコフォームを有する、項目１〜１７のいずれか１項に記載のワクチン。
（項目１９）  上記ウイルス株をＭＤＣＫ細胞中で増殖させる、項目１〜１８のいずれか１項に記載のワクチン。
（項目２０）  （ｉ）上記Ｈ１株、Ｈ３株、およびＢ株のそれぞれの血球凝集素用量が、これら３つの株の平均用量の１０％以内であり、（ｉｉ）上記Ｈ５株の血球凝集素用量が該Ｈ１株、Ｈ３株、およびＢ株の平均用量の７５％未満である、項目１０に記載のワクチン。
（項目２１）  アジュバントを含む、インフルエンザウイルスの少なくとも４つの株由来の抗原を含むワクチン。
（項目２２）  上記アジュバントが、サブミクロンの液滴を含む水中油型乳濁液を含む、項目３〜項目２１のいずれか１項に記載のワクチン。
（項目２３）  上記油がスクアレンを含む、項目２２に記載のワクチン。
（項目２４）  上記アジュバントが、（ｉ）少なくとも１つのＣｐＩモチーフを含むオリゴヌクレオチドおよび（ｉｉ）ポリカチオン性オリゴペプチドの混合物を含む、項目３〜項目２１のいずれか１項に記載のワクチン。
（項目２５）  （ｉ）第１の容器中にインフルエンザウイルス抗原を含む第１の成分を含み、（ｉｉ）第２の容器中に水中油型乳濁液を含む第２の成分を含む、項目２２に記載のワクチンを調製するためのキット。
（項目２６）  上記株の少なくとも１つを細胞培養物中で増殖させている、項目２１に記載のワクチン。
（項目２７）  上記抗原がスプリットウイルス粒子でも全ウイルス粒子でもない、項目２１または項目２６に記載のワクチン。
（項目２８）  実質的に同一の質量の上記４つのインフルエンザウイルス株各々の血球凝集素（ＨＡ）を含む、項目２１、項目２６、または項目２７に記載のワクチン。
（項目２９）  インフルエンザウイルスの少なくとも４つの株由来の抗原を含むワクチンであって、該抗原がスプリットウイルス粒子でも全ウイルス粒子でもない、ワクチン。
（項目３０）  上記抗原が生インフルエンザウイルスまたは精製糖タンパク質である、項目２９に記載のワクチン。
（項目３１）  上記株の少なくとも１つを細胞培養物中で増殖させている、項目２９または３０に記載のワクチン。
（項目３２）  アジュバントを含む、項目２９、項目３０、または項目３１に記載のワクチン。
（項目３３）  実質的に同一の質量の上記４つのインフルエンザウイルス株各々の血球凝集素（ＨＡ）を含む、項目２９〜項目３２のいずれか１項に記載のワクチン。
（項目３４）  患者に項目１〜３３のいずれか１項に記載のワクチンを投与する工程を含む、該患者の免疫応答を惹起する方法。
（項目３５）  （ｉ）Ｈ１Ｎ１インフルエンザＡウイルス株、Ｈ３Ｎ２インフルエンザＡウイルス株、および第１のインフルエンザＢウイルス株由来の抗原を含むインフルエンザワクチンを含む第１の容器；および（ｉｉ）第２のインフルエンザＢウイルス株由来の抗原を含むインフルエンザワクチンを含む第２の容器を含み、該第１および第２のインフルエンザＢウイルス株の一方がＢ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様株であり、他方がＢ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様株である、キット。
（項目３６）  患者の免疫応答を惹起するための薬物の製造におけるインフルエンザウイルスの４つの異なる株由来の抗原の使用。
（項目３７）  上記抗原を、細胞培養物中で増殖したウイルスから調製する、項目３６に記載の使用。
（項目３８）  上記薬物が項目１〜項目３３のいずれか１項に記載のワクチンである、項目３６または項目３７に記載の方法。
（項目３９）  インフルエンザウイルスに対して患者を免疫化する方法であって、該方法は、（ｉ）Ｈ１Ｎ１インフルエンザＡウイルス株、Ｈ３Ｎ２インフルエンザＡウイルス株、および第１のインフルエンザＢウイルス株由来の抗原を含むインフルエンザワクチンを含む第１のワクチン；ならびに（ｉｉ）第２のインフルエンザＢウイルス株由来の抗原を含む第２のワクチンを該患者に同時に投与する工程を包含し、該第１および第２のインフルエンザＢウイルス株の一方がＢ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様株であり、他方がＢ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様株である、方法。
【図面の簡単な説明】
【０２２２】
【図１】図１は、（１）２〜８℃、（２）２３〜２７℃、または（３）３５〜３９℃での保存時のワクチン安定性を示す。Ｘ軸上の数字は、図１では月数、図２および３では日数を示す。Ｙ軸はＨＡレベルを示し、横線は季節性抗原（上）および流行抗原（下）についての安定性の閾値を示す。図１および３では、３つのバー群は、左から右に、ＦＬＵＡＤ（商標）；４価；およびＡＦＬＵＮＯＶ（商標）である。図２では、２つの群は、ＦＬＵＡＤ（商標）および４価である。各時点で、データは、関連する場合、Ｈ１Ｎ１（横線のストライプ）、Ｈ３Ｎ２（薄い影）、Ｂ（白色）、またはＨ５Ｎ１（交差線の影）について示す。
【図２】図２は、（１）２〜８℃、（２）２３〜２７℃、または（３）３５〜３９℃での保存時のワクチン安定性を示す。Ｘ軸上の数字は、図１では月数、図２および３では日数を示す。Ｙ軸はＨＡレベルを示し、横線は季節性抗原（上）および流行抗原（下）についての安定性の閾値を示す。図１および３では、３つのバー群は、左から右に、ＦＬＵＡＤ（商標）；４価；およびＡＦＬＵＮＯＶ（商標）である。図２では、２つの群は、ＦＬＵＡＤ（商標）および４価である。各時点で、データは、関連する場合、Ｈ１Ｎ１（横線のストライプ）、Ｈ３Ｎ２（薄い影）、Ｂ（白色）、またはＨ５Ｎ１（交差線の影）について示す。
【図３】図３は、（１）２〜８℃、（２）２３〜２７℃、または（３）３５〜３９℃での保存時のワクチン安定性を示す。Ｘ軸上の数字は、図１では月数、図２および３では日数を示す。Ｙ軸はＨＡレベルを示し、横線は季節性抗原（上）および流行抗原（下）についての安定性の閾値を示す。図１および３では、３つのバー群は、左から右に、ＦＬＵＡＤ（商標）；４価；およびＡＦＬＵＮＯＶ（商標）である。図２では、２つの群は、ＦＬＵＡＤ（商標）および４価である。各時点で、データは、関連する場合、Ｈ１Ｎ１（横線のストライプ）、Ｈ３Ｎ２（薄い影）、Ｂ（白色）、またはＨ５Ｎ１（交差線の影）について示す。
【発明を実施するための形態】
【０２２３】
Ａ−Ａ−Ｂ−Ｂワクチン
近年、インフルエンザＢウイルスのＶｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様系列およびＹａｍａｇａｔａ／１６／８８様系列（「Ｖ」および「Ｙ」系列）が同時に流行し、季節性流行病の負担全体に対するそれぞれの寄与は年々変化している。近年使用されているワクチンは、Ｖ系列またはＹ系列のいずれかを含んでいる。２００１／０２シーズンから、ワクチンが他の系列を含んでいたなら潜在的に回避できたかもしれない全ての米国におけるインフルエンザ症例の比率は０〜２９．９％の範囲であった。２００１／０２から開始した５年間のうちの４年間での不適合Ｂウイルスに起因するインフルエンザ症例の比率は、Ａ／Ｈ１Ｎ１ウイルスに寄与し得る比率よりも実際により高かった。
【０２２４】
【表１】
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Ｎはインフルエンザの症例数である；比率は、その症例をい担うウイルス型を示す；インフルエンザＢについての下線を引いた数値は、そのシーズンのワクチン中に存在した系列を示す；「喪失率」は、そのシーズンのワクチン中に存在しなかったインフルエンザＢウイルス系列に起因するインフルエンザ症例の比率である。
【０２２５】
したがって、４価ワクチンを形成するための「喪失（ｍｉｓｓｉｎｇ）」Ｂウイルス系列の添加により、最近５年間のシーズンあたりのインフルエンザ症例の３０％までを防止することができただろうが、卵ベースの製造技術がかかるワクチンの産生を妨げていた。細胞培養技術は、この問題を克服することができる。
【０２２６】
Ａ−Ａ−Ａ−Ｂワクチン
１９９９年〜２００４年にサンプリングされたＨ３Ｎ２インフルエンザＡウイルス株のゲノム分析により、２００２年に単離したウイルスの大部分が単一の系統発生群（クレイドＡ）に分類されたことを示していたにもかかわらず、複数の同時流行ウイルス系列が特定の時点で存在していた（１）。２００３〜０４年インフルエンザシーズンでは、北半球および南半球の両方で主なドリフト変異体（すなわち、Ａ／Ｆｕｊｉａｎ／４１１／２００２様変異体）出現した。２００１／０２年の米国でのインフルエンザは主にＨ３Ｎ２に起因し、全ての抗原的に特徴づけられた単離物は、Ａ／Ｍｏｓｃｏｗ／１０／１９９９ワクチン株に適合した。次のシーズンでは、疾患がＨ１およびインフルエンザＢで占められた場合、少数の抗原的に特徴づけられたＨ３Ｎ２単離物はＭｏｓｃｏｗ／１０／１９９９様ワクチン株と異なっており、これはおそらくＦｕｊｉａｎ株の出現と同時に起こったためである。２００３／０４年の北半球のインフルエンザシーズンもＦｕｊｉａｎ株で占められたが、前年由来のＨ３Ｎ２（Ａ／Ｐａｎａｍａ／２００７／１９９９）を含むワクチン株を使用した。この株はＦｕｊｉａｎ株との抗原的適合が低く、ワクチン有効性を減少させた。最初に卵中で単離され（参考文献１９８、１９９）、抗原的に類似の卵単離株を利用できないので、Ｆｕｊｉａｎ株はＦＤＡによって拒絶されている。卵単離および／または継代の必要性を排除することによってこの状況が防止され、細胞培養技術はこの問題を克服する。さらに、インフルエンザワクチン中に２つのＨ３Ｎ２株を含めることにより、Ａ／Ｍｏｓｃｏｗ／１０／９９様株とＡ／Ｆｕｊｉａｎ／４１１／２００２様株との間の交差反応性の欠如によって生じるいかなる問題も回避されるであろう。
【０２２７】
季節性株および流行株を含むワクチン
現在の季節性インフルエンザワクチンは、インフルエンザＡウイルスの１つのＨ１Ｎ１株、インフルエンザＡウイルスの１つのＨ３Ｎ２株、およびインフルエンザＢウイルスの１つの株由来の血球凝集素抗原を含む。この季節性組み合わせに、インフルエンザウイルスのＨ５Ｎ１株（すなわち、インフルエンザ流行を引き起こす可能性がある株）由来の抗原を補助した。
【０２２８】
それぞれのＡ／Ｎｅｗ  ＣａｌｅｄｏｎｉＨ１Ｎ１株、Ａ／ＷｉｓｃｏｎｓｉｎＨ３Ｎ２株、およびＢ／Ｍａｌａｙｓｉａ株由来の精製表面糖タンパク質を含む季節性ワクチンを調製した。抗原用量は、３０μｇ／ｍｌであり、１５μｇ／株／用量が得られるが、１５％過剰であった。バルク抗原を、２倍強度で混合し、ＭＦ５９水中油型乳濁液アジュバントで１：１の体積比に希釈して最終３価ワクチンを得た。これは商標名ＦＬＵＡＤ（商標）で販売されている。
【０２２９】
インフルエンザＡウイルスのＨ５Ｎ１株由来の精製表面糖タンパク質に基づいて、プレ流行ワクチンを調製した。抗原用量は１５μｇ／ｍｌであり、これによって７．５μｇ／用量が得られるが、１５％過剰であった。バルク抗原を、２倍強度で混合し、ＭＦ５９水中油型乳濁液アジュバントで１：１の体積比に希釈して最終ワクチンを得た（ＡＦＬＵＮＯＶ（商標））。
【０２３０】
同一の４つのウイルス抗原を含む４価ワクチンを調製した。季節性抗原は、ＦＬＵＡＤ（商標）と同一のＨＡ濃度を含むが、Ｈ５Ｎ１抗原が７．５μｇ／用量含まれていた（過剰量なし）。抗原を、２倍強度で混合し、ＭＦ５９水中油型乳濁液アジュバントで１：１の比に希釈して最終４価ワクチンを得た。このワクチンは、ＦＬＵＡＤ（商標）およびＡＦＬＵＮＯＶ（商標）の簡潔な混合物と異なる。これは、抗原が０．５ｍｌの体積中にその総用量で存在するのに対して、簡潔な混合物は１ｍｌの体積中で総用量が得られるからである。
【０２３１】
安定性研究のために、ワクチンを全て以下で保存した：（１）冷蔵（２〜８℃）で少なくとも３ヶ月間；（２）室温（２３〜２７℃）で少なくとも１４日間；（３）高温（３５か３９℃、少なくとも７日間。安定性をチェックするために、抗原レベルを、保存中の種々の時点でアッセイした。組成物は、研究期間中の抗原レベルが標的レベルの２０％を超えて低下する場合、不安定と見なされる。図１〜３は、結果を示す。
【０２３２】
図１は、ＦＬＵＡＤ（商標）処方物中の抗原が冷蔵した場合に６ヶ月間まで安定であり、Ｈ５Ｎ１株の添加は３ヶ月の研究期間でいかなる季節性抗原も安定性閾値未満に低下させなかったことを示す。同様に、ＡＦＬＵＮＯＶ（商標）処方物は、９ヶ月まで安定であり、季節性抗原の添加は３ヶ月の研究期間でＨ５Ｎ１抗原を安定性閾値未満に低下させなかった。
【０２３３】
図２は、ＦＬＵＡＤ（商標）処方物中の抗原が室温で７日間安定であるが、インフルエンザＢ抗原によって１４日目に安定性閾値未満に低下したことを示す。抗原はまた、Ｈ５Ｎ１株の存在下で７日間安定であった。Ｈ５Ｎ１抗原は、少なくとも１４日間４価組成物中で安定なままであった。
【０２３４】
図３は、ＦＬＵＡＤ（商標）処方物中の抗原が高温で１日間安定であるが、インフルエンザＢ抗原によって３日目に安定性閾値未満に低下したことを示す。ＡＦＬＵＮＯＶ（商標）処方物は７日間安定であった。Ｈ５Ｎ１抗原は、４価組成物中で７日間安定なままであったが、季節性抗原を、ＦＬＵＡＤ（商標）処方物中よりも急速に閾値未満に低下させなかった。
【０２３５】
したがって、Ｈ５Ｎ１抗原を、アジュバントの存在下で、いかなる４つの抗原の安定性を低下させることなく季節性抗原と組み合わせることができる。  
【０２３６】
個別の有効性研究では、ＡＧＲＩＰＰＡＬ（商標）季節性ワクチンおよびアジュバント化ＡＦＬＵＮＯＶ（商標）Ｈ５Ｎ１ワクチンをヒト患者に個別または同時に投与するか、混合して組み合わせワクチンとして投与する。患者を、それぞれ５０人の８群に分割する。群１〜３に、時間ゼロでワクチンを同時に投与する。群４〜６に時間ゼロで組み合わせワクチンを投与する。群７に時間ゼロでＡＦＬＵＮＯＶ（商標）を投与する。群８に時間ゼロでＡＧＲＩＰＰＡＬ（商標）を投与する。
【０２３７】
２１日目に、群１および４にさらなるワクチンを投与しないが、全ての他の群に第２のワクチンを投与する。群２および群５に組み合わせワクチンを投与する。群３、６、および８にＡＦＬＵＮＯＶ（商標）を投与する。群７にＡＧＲＩＰＰＡＬ（商標）を投与する。
【０２３８】
３６５日目に、全群ＡＦＬＵＮＯＶ（商標）を投与し、免疫応答を評価する。
【０２３９】
本発明を例示のみを目的として記載してきたが、本発明の範囲および精神の範囲内のままで修正形態を実施することができると理解されるであろう。
【０２４０】
参考文献（これらの内容は、参考として本明細書に援用される）
【０２４１】
【化１２】
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【０２４２】
【化１３】
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【０２４３】
【化１４】
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【０２４４】
【化１５】
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【０２４５】
【化１６】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
2014015486000001.app
【外国語明細書】
2014015486000001.pdf