(57)【要約】【課題】ＡＬＳの患者において、ＶＥＧＦ  ＨＲＥまたはコーディング配列の変異は確認されておらず、循環ＶＥＧＦレベルの低さの有意性は依然として測定されていない。【解決手段】本発明は、神経細胞損傷もしくは神経細胞死、または軸索変性、特に筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）などの神経変性疾患によって特徴付けられる疾患または状態を治療するための使用、またはその断片もしくは変種に関する。本発明はまた、神経変性疾患表現型、特にＡＬＳ表現型に関連したヒトアンジオゲニン遺伝子における複数の変異について記載する。個体が神経損傷もしくは神経細胞死、または軸索変性によって特徴付けられる疾患または状態に罹患したかどうか、または発症することが遺伝的に予測されるかどうかを評価する方法もまた記載する。【選択図】図１
2014185178.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経変性疾患を治療または予防するための医薬品の製造における、野生型ヒトアンジオゲニン、または１個、２個若しくは３個のアミノ酸残基の置換若しくは欠失によって野生型ヒトアンジオゲニンから誘導され、且つ野生型ヒトアンジオゲニンと少なくとも９８％のアミノ酸配列相同性を有するその神経保護作用変種の使用であり、前記神経変性疾患が、運動ニューロン疾患、プリオン疾患、ハンチントン舞踏病、パーキンソン病、アルツハイマー病、多発性硬化症（ＭＳ）、遺伝性神経障害および小脳変性症が関与する疾患；筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）または運動ニューロン疾患、または原発性側索硬化症および脊髄性筋萎縮症を含むその変種を含む群から選択されることを特徴とする使用。
【請求項２】
タンパク質を直接クモ膜下腔内送達することによって、個体をアンジオゲニン（またはその神経保護作用変種）で治療することを特徴とする請求項１に記載の使用。
【請求項３】
神経変性疾患を治療または予防するための医薬品の製造における、野生型ヒトアンジオゲニンをコードする核酸分子、または１個、２個若しくは３個のアミノ酸残基の置換若しくは欠失によって野生型ヒトアンジオゲニンから誘導され、且つ野生型ヒトアンジオゲニンと少なくとも９８％のアミノ酸配列相同性を有するアンジオゲニンの神経保護作用変種をコードする核酸分子の使用であり、前記神経変性疾患が、運動ニューロン疾患、プリオン疾患、ハンチントン舞踏病、パーキンソン病、アルツハイマー病、多発性硬化症（ＭＳ）、遺伝性神経障害および小脳変性症が関与する疾患；筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）または運動ニューロン疾患、または原発性側索硬化症および脊髄性筋萎縮症を含むその変種を含む群から選択されることを特徴とする使用。
【請求項４】
前記核酸分子はＤＮＡ分子であることを特徴とする請求項３に記載の使用。
【請求項５】
前記ＤＮＡ分子は配列番号１７で示されるヌクレオチド配列を有することを特徴とする請求項３に記載の使用。
【請求項６】
野生型ヒトアンジオゲニン、または１個、２個若しくは３個のアミノ酸残基の置換若しくは欠失によって野生型ヒトアンジオゲニンから誘導され、且つ野生型ヒトアンジオゲニンと少なくとも９８％のアミノ酸配列相同性を有するその断片を含むことを特徴とする神経変性疾患によって特徴付けられる疾患または症状を治療又は予防するための医薬製剤であり、前記神経変性疾患が、運動ニューロン疾患、プリオン疾患、ハンチントン舞踏病、パーキンソン病、アルツハイマー病、多発性硬化症（ＭＳ）、遺伝性神経障害および小脳変性症が関与する疾患；筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）または運動ニューロン疾患、または原発性側索硬化症および脊髄性筋萎縮症を含むその変種を含む群から選択されることを特徴とする医薬製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経細胞損傷もしくは神経細胞死（neuronal injury or death）、または軸索変性、特に筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）によって特徴付けられる疾患または状態の治療または予防の方法に関する。本発明はまた、個体がＡＬＳに罹患しているかどうかを評価する方法に関する。本発明はまた、いくつかのＡＬＳ特異的突然変異体を提供する。
【０００２】
本出願は、特願２００７−５４２４９６号の分割出願である特願２０１２−１６７６１３号の分割出願である。
【背景技術】
【０００３】
ＡＬＳは、神経変性の典型例であり、若年および中年成人に最も一般的な神経変性障害である。アイルランドにおけるＡＬＳの発症率は、２．６／１０００００である。ＡＬＳ患者の１０％は、常染色体優性遺伝形式の家族歴を有し、ＳＯＤ１遺伝子の機能獲得型変異はこれらの２０％を占める。病因は分かっていないが、遺伝的に決定された感受性因子が、ＡＬＳおよびその他の非家族性神経変性疾患の両方の発症に寄与し得るという証拠がある。
【０００４】
血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）の低酸素症応答因子（ＨＲＥ）を欠損したマウスでは、ＡＬＳ表現型と類似して、神経発現が４０％減少しており、成人発症型の運動ニューロン変性が見られる。血管新生特性に加えて、ＶＥＧＦは、運動ニューロンおよびその他の中枢神経に直接、神経栄養作用および神経保護作用を有する。これらの所見は、ＶＥＧＦ依存性神経栄養援助の不十分さが、この動物モデルにおけるＡＬＳの病因に重要であり得ることを示唆している。
【０００５】
北ヨーロッパの１９００人以上の個体の遺伝子型メタ分析によると、ＶＥＧＦプロモーター／リーダー配列の２種のハプロタイプがホモ接合である対象ではＡＬＳ発症の相対的危険率が１．８であることが確認された。危険な状態のハプロタイプは、ＶＥＧＦ転写を減少させ、血清ＶＥＧＦレベルの低下を引き起こす。今まで、ＡＬＳの患者において、ＶＥＧＦ  ＨＲＥまたはコーディング配列の変異は確認されておらず、循環ＶＥＧＦレベルの低さの有意性は依然として測定されていない。
【０００６】
ＡＬＳについて今日までに発見されている証拠に基づく治療法はリルゾールのみで、これは平均余命を約３カ月延長させる。リルゾールの生存効果は、１８カ月の治療中に弱まる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】欧州特許出願公開第０３３５２４３号明細書
【特許文献２】米国特許出願第４９６６８４９号明細書
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】J. M. Stewart and J. D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd edition, Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois (1984)
【非特許文献２】M. Bodanzsky and A. Bodanzsky, The Practice of Peptide Synthesis, Springer Verlag, New York (1984)
【非特許文献３】Ignacio et al, Ann. N.Y. Acad. Sci. 2005, 1053: 121-136)
【非特許文献４】Azzouz et al., Nat Med. 2005; 11(4): 429-33
【非特許文献５】Kieran et al., Nat Med 2004; 10(4): 402
【非特許文献６】Reinholz et al., Exp Neurol. 1999; 159(1): 2 04-16
【非特許文献７】Sathasivam et al., 2005 Neuropath App Neurobiol; 31(5): 467
【非特許文献８】Kieran and Greensmith, 2004 Neurosci 125(2): 4 27-39
【非特許文献９】Nature, VoI 429 (2004), P413-417
【非特許文献１０】Nature Medicine Vol 6 (2000) No 4 P405-413
【非特許文献１１】Azzouz et al., Nat Med. 2005; 11 (4): 429-33
【非特許文献１２】Wu and Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262: 4429-4432
【非特許文献１３】Langer, Science 249:1527-1533 (1990)
【非特許文献１４】Treat et al, in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 353-365 (1989)
【非特許文献１５】Lopez-Berestein, ibid, pp. 317-327
【非特許文献１６】Langer, supra; Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed., Eng. 14:201 (1987)
【非特許文献１７】Buchwald et al., Surgery 88:75 (1980)
【非特許文献１８】Saudek et al., N. Engl. J. Med. 321:574 (1989)
【非特許文献１９】Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, FIa. (1974)
【非特許文献２０】Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984)
【非特許文献２１】Ranger and Peppas, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61 (1983)
【非特許文献２２】Levy et al, Science 228:190 (1985)
【非特許文献２３】During et al., Ann. Neurol. 25:351 (1989)
【非特許文献２４】Howard et al., J. Neuiosurg. 71:105 (1989)
【非特許文献２５】Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138 (1984)
【非特許文献２６】Langer, Science 249:1527-1533 (1990)
【非特許文献２７】"Remington's Pharmaceutical Sciences" by E. W. Martin
【非特許文献２８】Greenway, MJ. et al. Neurology. 63, 1936-1938 (2004)
【非特許文献２９】Hayward, C. et al Nuerology. 52, 1899-901 (1991)
【非特許文献３０】Fett, J.W. et al. Biochem. 24, 5480-5486 (1985)
【非特許文献３１】Shapiro, R., Riordan, J.F. & Vallee, BL. Biochem. 25, 3527-3532 (1986)
【非特許文献３２】Shapiro, R., Fox, E.A & Riordan, J.F. Biochem 28, 1726-1732 (1989)
【非特許文献３３】Shapiro, R & Vallee, B.L. Biochem. 28, 7401-7408 (1989)
【非特許文献３４】Morioanu, J. & Riordan, J.F. Proc. Natl Acad Sci USA. 91, 1667-1681 (1994)
【非特許文献３５】Kishimoto, K., Liu, S., Tsuji, T., Olson, K.A. & Hu, G.F. Oncogene. 24, 445-456 (2005)
【非特許文献３６】Acharya, K. R., Shapiro, R., Allen, S.C., Riordan, J.F.& Vallee, BL. Proc. Natl. Acad. Sci USA. 91, 2915-2919 (1994)
【非特許文献３７】Shapiro, R., Riordan, J.F. & Vallee, BL. Biochem. 25, 3527-3532 (1986)
【非特許文献３８】Shapiro, R., Fox, E.A. & Riordan, J.F. Biochem. 28, 7401-7408 (1989)
【非特許文献３９】Bond, M.D. & Vallee, BL. Biochem. 29, 3341-3349 (1990)
【非特許文献４０】Shapiro, R. & Vallee, BL. Biochem. 31, 12477-12485 (1992)
【非特許文献４１】Oosthuyse, B et al. Nat Genet. 28, 131-138 (2001)
【非特許文献４２】Azzouz M. et al. Nature. 429 413-417 (2004)
【非特許文献４３】Storkebam, E, et al Nat Neurosci 8, 85-92 (2005)
【非特許文献４４】Kieran and Greensmith, Neuroscience 2004, Vol. 125: 427-439
【非特許文献４５】Gurney et al, 1994 Science 264: 1772-5
【非特許文献４６】Kieran et al., Nat Med, 10: 402-5
【非特許文献４７】Ignacio et al., Ann. N.Y. Acad, Sci. 2005, 1053: 121-136
【非特許文献４８】Kieran et al, 2005
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、前記問題の少なくとも１つを克服することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
したがって、本発明は、神経細胞損傷もしくは神経細胞死、または軸索変性によって特徴付けられる疾患または状態の治療または予防の方法に関する。本発明の方法は、アンジオゲニンタンパク質またはその神経保護作用断片もしくは変種で個体を治療するステップを含む。適切には、アンジオゲニンまたはその変種もしくは断片は、疾患または状態を治療または予防するのに有効な量で投与される。本発明が治療に関するとき、予防とは対照的に、個体は一般的にこのような治療を必要とする個体である。この疾患または状態は、神経変性疾患、一般的にＡＬＳまたは運動ニューロン疾患、または原発性側索硬化症および脊髄性筋萎縮症を含むその変種が適切である。
【００１１】
本発明はまた、医薬品として使用するためのアンジオゲニンまたはその神経保護作用断片または変種に関する。この医薬品は、神経変性疾患、特にＡＬＳまたは運動ニューロン疾患、または原発性側索硬化症および脊髄性筋萎縮症を含むその変種の治療または予防のためであることが適切である。
【００１２】
本発明はまた、神経細胞損傷もしくは神経細胞死、または軸索変性によって特徴付けられる疾患または状態を治療または予防するための医薬品の製造における、アンジオゲニンまたはその神経保護作用断片もしくは変種、あるいはアンジオゲニンまたはその断片もしくは変種をコードする核酸分子の使用に関する。特に、本発明は、ＡＬＳまたは運動ニューロン疾患、または、原発性側索硬化症および脊髄性筋萎縮症を含むその変種を治療または予防するための医薬品の製造における、アンジオゲニンまたはその神経保護作用断片もしくは変種、あるいはアンジオゲニンまたはその断片もしくは変種をコードする核酸分子の使用に関する。
【００１３】
本出願人は、ＡＬＳに関連することが示されたアンジオゲニン遺伝子におけるいくつかの変化を同定した。これらの変化を以後変異と称する。したがって、本発明はまた、配列番号１から７を含む群から選択された核酸配列を含む単離核酸分子に関する。この配列のそれぞれは、遺伝子の変異型の配列である。提供された配列は、終止コドン（ｔａａ）を含むが、これは除外してよい。さらに、この配列はシグナルペプチド（ヌクレオチド１〜７２）のコード配列を含むが、配列番号１から７と同一であるがシグナルペプチド（ヌクレオチド１〜７２）のコード配列を除く配列も本発明の一部である。
【００１４】
遺伝子の変異型に対応するポリペプチド配列も提供される。したがって、更なる態様では、本発明は、配列番号８から１４を含む群から選択されたアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドに関する。配列表に挙げられたアミノ酸配列には、シグナルペプチド（ＭＶＭＧＬＧＶＬＬＬＶＦＶＬＧＬＧＬＴＰ）が含まれる。しかし、本発明はまた、配列番号１から７の１つと同一であるが、シグナルペプチドを含まないアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドに関する。
【００１５】
アンジオゲニン遺伝子における変異の具体的な詳細および変異ポリペプチドに生じたアミノ酸変化を表１に挙げる。
【００１６】
本発明はまた、個体が神経細胞損傷もしくは神経細胞死または軸索変性によって特徴付けられる疾患または状態に罹患しているかどうか、あるいは発症する遺伝的素因があるかどうかを評価する方法であって、個体の生物学的試料を、表１に示した変異のいずれかの存在について測定するステップを含む方法に関する。本発明はまた、個体が神経細胞損傷もしくは神経細胞死、または軸索変性によって特徴付けられる疾患または状態に罹患しているかどうか、あるいは発症する遺伝的素因があるかどうかを評価するキットであって、個体の生物学的試料を、表１に示した変異のいずれかの存在について検定する手段を含む方法に関する。典型的には、評価手段には、本発明のオリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーが含まれる。
【００１７】
本発明はまた、個体が神経細胞損傷もしくは神経細胞死、または軸索変性によって特徴付けられる疾患または状態に罹患しているかどうか、または発症する遺伝的素因があるかどうかを評価する方法であって、
−  個体から得られた試料中の循環アンジオゲニンの血清レベルを決定するステップと、
−  個体の循環アンジオゲニンの血清レベルと対照アンジオゲニンレベルの予め決定された範囲とを比較するステップの比較ステップを含み、
予め決定された対照範囲と比較して個体におけるアンジオゲニンの血清レベルの減少が、その個体が神経細胞損傷もしくは神経細胞死、または軸索変性によって特徴付けられる疾患または状態に罹患しているか、または発症する遺伝的素因があることを示唆する方法に関する。典型的には、予め測定された対照範囲は、神経細胞損傷もしくは神経細胞死、または軸索変性によって特徴付けられる疾患または状態に罹患していないか、または発症する遺伝的素因がない個体群から得られる。好ましい実施形態では、この診断または予後方法は、神経変性疾患、特にＡＬＳまたは運動ニューロン疾患、または原発性側索硬化症および脊髄性筋萎縮症を含むその変種の診断または予後を特に指向する。この診断／予後方法は、循環アンジオゲニンの血清レベルの測定によって明確に定められるが、全血、リンパ液、脳脊髄液、尿、唾液、精液などのその他の生体液中のアンジオゲニンレベルの測定によっても具体化され得ることは理解されよう。
【００１８】
典型的には、循環アンジオゲニンの血清レベルは、ＥＬＩＳＡ試験を使用して測定される。このような試験の１つは、ＱＵＡＮＴＩＫＩＮＥ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ５５４１３、ＵＳＡ）の商標名で、カタログ番号ＤＡＮ００として市販されている。
【００１９】
本発明はまた、個体が神経変性疾患に罹患しているかどうか、または神経変性疾患を発症する遺伝的素因があるかどうかを評価するのに使用するための、個体における循環アンジオゲニンの血清レベルを決定するキットに関する。典型的には、神経変性疾患は、ＡＬＳまたは運動ニューロン疾患、または原発性側索硬化症および脊髄性筋萎縮症を含むその変種である。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】選択されたＡＮＧ変異を有する患者の系図を示す図である。変異は、１文字アミノ酸コードを使用して示される。発端者は矢印で示されており、丸は女性、四角は男性、中抜きは非罹患、影付きは罹患、対角線は減少、Ｃｏは対照、アステリスクは変異を表している。現在の年齢および死亡年齢および死因も示す。Ｄｍｔは認知症、ＭＩは心筋梗塞、ＥＭＧは正常な筋電図を表す。
【図２】モデル化された変異、Ｑ１２Ｌ、Ｋ１７Ｅ、Ｋ１７Ｉ、Ｒ３１Ｋ、Ｋ４０ＩおよびＩ１４６Ｖをボールおよびスティック表現で表したＡＮＧの３次元構造を示す図である。この図は、ＰｙＭＯＬプログラム（ＤｅＬａｎｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓａｎ  Ｃａｒｌｏｓ、ＣＡ）を使用して作製された。
【図３】ＭＴＴ検定の結果を示す図である。ＭＴＴ検定は、運動ニューロン変性のｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルにおけるアンジオゲニン処理の神経保護効果を決定するために使用された。処理培養物における細胞生存率を未処理姉妹培養物（対照）における細胞生存率の割合として表した。図に示すように、ＡＭＰＡに対して曝露すると細胞生存率の有意な減少が生じたが、アンジオゲニン（１００ｎｇ／ｍｌ）の共処理または予備処理では細胞生存率が有意に増加した。アンジオゲニンまたはＢＳＡ単独に曝露しても細胞生存率に有意な影響はなかった（値＝平均値、エラーバー＝Ｓ．Ｅ．Ｍ．、Ｎ＝２４）。
【図４】リン酸化Ａｋｔのウェスタンブロット。ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路の活性化は、リン酸化Ａｋｔのウェスタンブロットによって調べた。図に示すように、アンジオゲニンで共処理した、または予備処理したＡＭＰＡ曝露培養物では、ホスホ−Ａｋｔ発現が強く増加している。このことは、アンジオゲニンの神経保護効果が、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔシグナル伝達経路によるシグナル伝達に関係することを示唆している。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
ヒトアンジオゲニンタンパク質の核酸配列は、ＮＣＢＩデータベースにおいて、アクセッション番号Ｍ１１５６７番として提供されている。成熟タンパク質をコードする配列は、ヌクレオチド１８８１から２２４９にわたる。シグナルペプチドを含まない成熟タンパク質の配列を以下に挙げる。
【００２２】
ＱＤＮＳＲＹＴＨＦＬＴＱＨＹＤＡＫＰＱＧＲＤＤＲＹＣＥＳＩＭＲＲＲＧＬＴＳＰＣＫＤＩＮＴＦＩＨＧＮＫＲＳＩＫＡＩＣＥＮＫＮＧＮＰＨＲＥＮＬＲＩＳＫＳＳＦＱＶＴＴＣＫＬＨＧＧＳＰＷＰＰＣＱＹＲＡＴＡＧＦＲＮＶＶＶＡＣＥＮＧＬＰＶＨＬＤＱＳＩＦＲＲＰ（配列番号１５）
【００２３】
シグナルペプチドを含む完全な転写物の配列は、配列番号１６に提供され、完全な転写物（成熟タンパク質およびシグナルペプチド）をコードするヒト遺伝子のｃＤＮＡ配列は配列番号１７に提供される。
【００２４】
一般的に、本発明の方法および生成物に使用されるアンジオゲニンは、詳細に報告されたアイソフォームのいずれかのヒトアンジオゲニンである。しかし、その他の哺乳類アンジオゲニン遺伝子から得られた、またはそれらをベースとしたアンジオゲニンも本発明の範囲内に含まれる。好ましくは、このアンジオゲニンは組換えアンジオゲニンであり、最も好ましくは組換えヒトアンジオゲニンである。組換えヒトアンジオゲニンは、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＵＳＡ）からカタログ番号２６５−ＡＮ−２５０として市販されている。
【００２５】
アンジオゲニンタンパク質の「断片」とは、少なくともアミノ酸５個、好ましくは少なくともアミノ酸６個のアミノ酸残基が隣接した鎖（contiguous stretch）を意味する。一般的に、「断片」は、少なくとも１０個、好ましくは少なくとも２０個、より好ましくは少なくとも３０個、理想的には少なくとも４０個の隣接したアミノ酸を含む。この点に関して、タンパク質の断片を作製し、以下に説明する運動ニューロン変性のｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏモデルを使用してこのような断片の神経保護活性を評価することは、比較的簡単な仕事であろう。
【００２６】
アンジオゲニンタンパク質の「変種」は、野生型アンジオゲニンタンパク質、典型的には、ヒト野生型アンジオゲニンと実質的に同一なアミノ酸配列を有するタンパク質を意味するものと考えられる。したがって、例えば、この用語は１個または複数のアミノ酸残基に関して変更されたタンパク質またはポリペプチドを含むものと考えられる。好ましくは、このような変更は、５個以下、より好ましくは４個以下、さらにより好ましくは３個以下、最も好ましくは１個または２個のみのアミノ酸の挿入、付加、欠失および／または置換を含む。天然および修飾されたアミノ酸の挿入、付加および置換も包含される。この変種は保存的アミノ酸変化を有し、導入されたアミノ酸は置換されたものと構造的、化学的または機能的に類似している。典型的には、触媒的に重要な残基の置換または欠失によって変更されたアンジオゲニンタンパク質は、「変種」という用語から除外される。このような触媒的に重要な残基の詳細は、アンジオゲニンタンパク質モデリングの分野の当業者には周知である。一般的に、この変種は、野生型アンジオゲニン、典型的には成熟野生型ヒトアンジオゲニン（前記のようにシグナルペプチドを除外する）とのアミノ酸配列相同性が少なくとも７０％、好ましくは配列相同性が少なくとも８０％、より好ましくは配列相同性が少なくとも９０％、理想的には配列相同性が少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％である。このような関係においては、配列相同性には、配列同一性および類似性の両方が含まれ、すなわち、野生型ヒトアンジオゲニンと７０％のアミノ酸相同性を共有するポリペプチド配列は、整列した残基の任意の７０％が野生型ヒトアンジオゲニンの対応する残基と同一であるか、または保存的置換体であるポリペプチド配列である。本発明の範囲に含まれる具体的な変種は、特許文献１で同定された変異アンジオゲニンタンパク質であり、理想的には特許文献２で開示された変異アンジオゲニンタンパク質である。これらの文書の両方の内容およびそれらで開示されたアンジオゲニン変異体および変種は、本明細書に参照として取り込まれる。
【００２７】
「変種」という用語はまた、アンジオゲニンの化学的誘導体、すなわち、アンジオゲニンの１個または複数の残基が側鎖官能基の反応によって化学的に誘導体化されているものを含むことを意図する。この用語に含まれる変種はまた、天然に生じるアミノ酸残基がアミノ酸類縁体で置換されたアンジオゲニン分子である。
【００２８】
アンジオゲニンの断片または変種は、本明細書で説明した神経変性のｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルにおいて、この断片または変種を使用すると細胞生存率が対照と比較して増加するとき、「神経保護的」であると考えられる。
【００２９】
本発明の、および本発明で使用するためのタンパク質およびポリペプチド（その変種および断片を含む）は、化学合成によって、または核酸からの発現によって全部または部分的に生成することができる。本発明の、および本発明で使用するためのタンパク質およびペプチドは、当業界で公知のよく確立された、標準的液相、または、好ましくは固相ペプチド合成法によって容易に調製することができる（例えば、非特許文献１および非特許文献２参照）。
【００３０】
本発明の治療方法および治療用生成物は、神経細胞損傷もしくは神経細胞死、または軸索変性によって特徴付けられる疾患または状態を対象とする。本発明の一実施形態では、神経細胞損傷もしくは神経細胞死、または軸索変性によって特徴付けられる疾患または状態は神経変性疾患である。典型的には、神経変性疾患は、運動ニューロン疾患、プリオン疾患、ハンチントン舞踏病、パーキンソン病、パーキンソンプラス病、タウオパシー、第１７番染色体痴呆症、アルツハイマー病、多発性硬化症（ＭＳ）、遺伝性神経障害、および小脳変性症が関与する疾患を含む群から選択される。本発明の特に好ましい実施形態では、神経変性疾患は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）または運動ニューロン疾患、または原発性側索硬化症および脊髄性筋萎縮症を含むその変種である。本発明の方法は、特にＡＬＳを治療または予防するために適している。「神経細胞損傷もしくは神経細胞死、または軸索変性によって特徴付けられる疾患または状態」という用語は、理想的には、虚血または外傷によって引き起こされるもの（すなわち、脳卒中）、および糖尿病の個体における糖尿病に関連した神経学的合併症（すなわち、糖尿病性神経障害および糖尿病性網膜症）などの中枢神経系（ＣＮＳ）損傷を原則的に除外するものと考えるべきである。
【００３１】
他の実施形態では、神経細胞死によって特徴付けられる疾患または状態は、多発性硬化症（ＭＳ）、てんかん、統合失調症および代謝の先天性異常に関連した疾患または状態を含む群から選択される。
【００３２】
この明細書では、「有効量」という用語は、神経細胞損傷もしくは神経細胞死、または軸索変性の臨床的に有意な減少または予防をもたらす量を意味するものと考えられる。適切には、アンジオゲニンまたはその変種もしくは断片は、１ｍｌ当たり１マイクログラムと１０ミリグラムとの間、好ましくは１ｍｌ当たり１０マイクログラムと５ミリグラムとの間、より好ましくは１ｍｌ当たり１００マイクログラムと２ミリグラムとの間の用量で投与される。典型的には、ボーラス投与として投与される。しかし、クモ膜下腔内ポンプなどによる連続注入を使用するとき、タンパク質またはその断片もしくは変種は５と２０μｇ／ｋｇ／分との間、好ましくは７と１５μｇ／ｋｇ／分との間の投与速度で投与してよい。本発明の治療的態様の場合、「それらを必要とする個体」という用語は、神経細胞変性もしくは神経細胞死、または軸索変性が関与する疾患または状態に罹患した個体を意味するものと考えられる。ＡＬＳまたは（ルーゲーリック病としても知られている）運動ニューロン疾患などの神経変性疾患および本明細書で説明したその変種は、このような疾患の例である。
【００３３】
本発明の一実施形態では、個体は、静脈内輸送、経口輸送、筋肉内輸送、クモ膜下腔内輸送および吸入輸送の群から選択された手段によるタンパク質の直接輸送によって、アンジオゲニンで治療される。これらの輸送手段を実施する方法は、薬剤輸送の当業者には周知である。具体的な例を以下に示す。
・  ミニ浸透圧ポンプによるクモ膜下腔内への輸送（例えば、非特許文献３参照）。
・  筋肉内−シリンジまたはミニ浸透圧ポンプによる筋肉内へのＡｎｇ直接輸送（例えば、非特許文献４参照）。
・  腹腔内−Ａｎｇの全身投与用。シリンジまたはミニ浸透圧ポンプによる腹膜への直接投与（例えば、非特許文献５参照）。
・  皮下−Ａｎｇの全身投与用。シリンジによる皮下への直接投与（例えば、非特許文献６参照）。
・  脳室内−注射による、または浸透圧ポンプに装着された小カテーテルを使用した、脳室への直接投与（例えば、非特許文献７参照）。
・  移植−ａｎｇを放出する移植片（例えば、小シリコン移植片）内にａｎｇを調製することができる。移植片は、筋肉または脊髄上に配置することができる（例えば、非特許文献８参照）。
【００３４】
他の実施形態では、個体は、例えばウイルスベクターなどのアンジオゲニン発現ベクターをこの個体に形質移入することによってアンジオゲニンで処理することができる。適切な発現ベクターは、レンチウイルスベクターである。典型的には、本発明の方法で使用したアンジオゲニンは、組換えアンジオゲニンである。組換えアンジオゲニンの作製方法および組換え型のタンパク質を発現する発現ベクターは、当業者には周知で（例えば、非特許文献９、１０、１１参照）、これらの文献では、レンチウイルス発現ベクターを使用した動物モデルへの組換ＶＥＧＦ輸送方法について説明されている。遺伝治療による取組みの実施形態には、ａｎｇのコード化およびウイルスに結合したマーカータンパク質（例えば、蛍光タンパク質）が関係し、これが動物に投与され、細胞に取り込まれ、これによってゲノムに組み込まれ、ａｎｇを発現させる（現在、ａｎｇを過剰発現させることが考案されており、それには、多くのコピー数をもたらすためにウイルスにおいて何回もａｎｇ配列を反復させることが必要である）。
【００３５】
本発明の一実施形態では、この方法には、個体をＶＥＧＦ、特に組換えＶＥＧＦタンパク質で処理するステップがさらに含まれる。したがって、本発明はまた、アンジオゲニンまたはその神経保護作用断片もしくは変種、およびＶＥＧＦタンパク質またはそのアイソフォームを含む医薬品を提供する。本発明はまた、神経細胞損傷もしくは神経細胞死、または軸索変性、特に神経変性疾患によって特徴付けられる疾患または状態の予防または治療のための医薬品の製造における本発明の医薬品の使用に関する。
【００３６】
本発明の治療の一実施形態では、アンジオゲニンタンパク質（またはその断片もしくは変種）を結合相手、例えば、エフェクター分子、標識、薬剤、毒素および／または担体または輸送分子に結合させる。本発明のペプチドをペプチジルおよび非ペプチジル結合相手の両方に結合する技術は当業界では周知である。
【００３７】
前述のように、本出願人はまた、神経変性疾患表現型、特にＡＬＳ表現型に関連するヒトアンジオゲニンの遺伝子内のいくつかのヌクレオチド配列変更（以後、「変異」）を発見した。遺伝子変異の詳細およびタンパク質内の対応する変異を以下の表１に示す。
【００３８】
【表１】
2014185178.tif 000003
【００３９】
変異遺伝子の核酸配列（シグナルペプチドのコード配列も含む）を配列番号１から７に示す。前記変異遺伝子によってコードされた変異タンパク質のアミノ酸配列を配列番号８から１４に示す。疾患関連変異の詳細は、個体の遺伝子の変異型を検出するために使用できる核酸プローブまたはプライマーの設計に有用である。例えば、１個または複数の変異を含む遺伝子の配列に特異的に結合する（すなわち、変異遺伝子に特異的に結合し、野生型遺伝子には結合しないか、または野生型よりも変異遺伝子に優先的に結合する）核酸プローブを設計することができる。典型的には、プローブは、表１で確認した１個または複数の変異を含む遺伝子の配列に相補的な核酸配列である。適切には、このプローブは、適切な厳密さの条件下で、少なくとも１個の変異を含むアンジオゲニン遺伝子の配列の少なくとも７個、好ましくは少なくとも１４個、より好ましくは少なくとも２５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０または４００個の連続したヌクレオチドにハイブリダイズする核酸配列を含む。
【００４０】
したがって、本発明の他の実施形態では、表１に示した変異の少なくとも１個を含むアンジオゲニン遺伝子の配列に相補的なオリゴヌクレオチドを提供する。典型的には、このオリゴヌクレオチドはプローブまたはプライマーである。理想的には、このプライマーは、ＰＲＣ核酸増幅、理想的にはＲＴ  ＰＣＴ増幅のプライマーである。一実施形態では、このオリゴヌクレオチドは、好ましくは少なくとも７個、好ましくは少なくとも１４個、より好ましくは少なくとも２５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０または４００個の連続したヌクレオチドから成る。本発明はまた、個体が神経細胞損傷もしくは神経細胞死、または軸索変性、特にＡＬＳまたは運動ニューロン疾患などの神経変性疾患、またはその変種によって特徴付けられる疾患または状態に罹患しているかどうか、または発症する遺伝的素因があるかどうかの評価における、本発明のプローブまたはプライマーの使用に関する。例えば、個体の神経細胞の試料を単離し、ＤＮＡを抽出し、次に表１に示した変異の１つの存在について本発明のプローブを使用して検定した。同様に、本発明のオリゴヌクレオチドプライマーは、ＤＮＡ試料のＲＴ  ＰＣＲを実施するために使用することができる。このプライマーは、所望する変異が存在するときのみ標的ＤＮＡに結合するように設計されているので、変異が存在するときにのみ増幅が引き起こされる。本発明のプライマーおよびプローブの設計ならびに試料中における表１の変異のいずれかの存在の測定におけるその使用は、当業者には周知であろう。
【００４１】
本発明は、このような治療を必要とする対象に、治療または予防有効量のアンジオゲニンまたはその変種もしくは断片（以後、「治療薬」）を投与することによって治療および予防する方法を提供する。対象は好ましくは動物であり、限定はしないが、サル、ウシ、ブタ、ウマ、ニワトリ、ネコ、イヌなどの動物が含まれ、好ましくは哺乳類、最も好ましくはヒトである。
【００４２】
以下に例示した具体的な送達系とは別に、リポソームへの封入、微粒子、マイクロカプセル、治療薬を発現できる組換え細胞、受容体媒介エンドサイトーシス（例えば、非特許文献１２参照）、レトロウイルスベクターまたはその他のベクターの一部としての治療用核酸の構築などの様々な送達系が知られており、本発明の治療薬の投与に使用することができる。導入方法には、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外および経口経路が含まれるが、これらに限定されない。化合物は、任意の便利な経路によって、例えば、注入またはボーラス注射によって、上皮または粘膜皮膚表面（例えば、口腔粘膜、結腸および小腸粘膜など）からの吸収によって投与することができ、その他の生物学的活性薬剤と一緒に投与することができる。投与は全身または局所であってよい。さらに、本発明の医薬組成物は、脳室内およびクモ膜下腔内注射を含む任意の適切な経路によって中枢神経系に導入することが望ましく、脳室内注射は、例えば、Ｏｍｍａｙａ貯蔵体などの貯蔵体に装着した脳室内カテーテルによって容易にすることができる。肺投与はまた、例えば、吸入器またはネブライザーおよび噴霧化剤を含む製剤によって使用することができる。
【００４３】
具体的な実施形態では、治療を必要とする領域に局所的に本発明の医薬組成物を投与することが望ましく、これは、例えば、移植片によって実施することができ、前記移植片は、サイアラスティック膜（sialastic membranes）などの膜または繊維を含む多孔性、非多孔性またはゼラチン性の物質である。
【００４４】
他の実施形態では、治療薬は小胞、特にリポソームで送達することができる（例えば、非特許文献１３、１４、１５参照）。
【００４５】
さらに他の実施形態では、治療薬は制御放出系で送達することができる。一実施形態では、ポンプを使用することができる（例えば、非特許文献１６、１７、１８）。他の実施形態では、ポリマー材料を使用することができる（例えば、非特許文献１９、２０、２１、２２、２３、２４参照）。さらに他の実施形態では、制御放出系は、治療標的に接近して配置することができ、したがって、全身用用量の一部のみが必要となる（例えば、非特許文献２５参照）。その他の制御放出系は、総説に記載されている（例えば、非特許文献２６参照）。
【００４６】
治療薬がタンパク質治療物質をコードする核酸である具体的な実施形態では、この核酸は本明細書で説明した遺伝子治療方法によって投与することができる。
【００４７】
本発明はまた、アンジオゲニンまたはその変種もしくは断片を含む医薬組成物を提供する。このような組成物は、治療薬の治療有効量および薬剤として許容される担体を含む。具体的な実施形態では、「薬剤として許容される」という用語は、連邦または州政府の規制機関によって承認されており、合衆国薬局方、または動物において、より具体的にはヒトにおいて使用するためのその他の一般的に認識されている薬局方に挙げられていることを意味する。
【００４８】
「担体」という用語は、治療薬と一緒に投与する希釈剤、補助剤、賦形剤またはビヒクルのことである。このような医薬担体は、水および油などの滅菌液体であることができ、石油、動物、植物または合成由来のもの、例えば、ラッカセイ油、大豆油、鉱油、ゴマ油などが含まれる。水は、医薬組成物が静脈内に投与されるときに好ましい担体である。生理食塩水溶液および水性デキストロースおよびグリセロール溶液はまた、特に注射可能な溶液のための液体担体として使用することができる。適切な医薬賦形剤には、澱粉、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノールなどが含まれる。
【００４９】
所望するならば、組成物はまた、微量の湿潤剤もしくは乳化剤またはｐＨ緩衝剤を含有できる。これらの組成物は、溶液、懸濁液、エマルジョン、錠剤、丸剤、カプセル、粉末、持続放出製剤などの形態をとることができる。
【００５０】
この組成物は、従来の結合剤およびトリグリセリドのような担体と共に坐剤として製剤することができる。経口用製剤は、医薬品等級のマンニトール、ラクトース、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準的担体を含むことができる。適切な医薬品担体の例は、例えば、非特許文献２７に記載されている。このような組成物は、患者に適切に投与するための形態を提供するために、適切な量の担体と一緒に、好ましくは精製された状態で治療薬の治療有効量を含有する。この製剤は、投与様式に適しているべきである。
【００５１】
好ましい実施形態では、組成物はヒトに静脈投与するために適合した医薬組成物として、通常の方法に従って製剤化される。典型的には、静脈投与用組成物は、滅菌等張水性緩衝液の溶液である。必要ならば、この組成物はまた、可溶化剤、注射部位の痛みを軽減するためのリグノカインなどの局所麻酔薬を含んでよい。一般的に、これらの成分は、別々に、または単位投与形態中に一緒に混合して、例えば、活性薬剤の量を示したアンプルまたはサシェなどの密閉容器に乾燥した凍結乾燥粉末または水を含まない濃縮物として供給される。この組成物を注入によって投与する場合、滅菌した医薬品等級の水または生理食塩水を含有する注入瓶に分配することができる。この組成物を注射によって投与する場合、投与前に成分を混合することができるように、注射用滅菌水または生理食塩水のアンプルを提供することができる。
【００５２】
本発明の治療薬は、中性または塩の形態として製剤化することができる。薬剤として許容される塩には、塩化水素酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などから誘導されたもののような遊離アミノ基で形成されたもの、および水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、水酸化鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどから誘導されたもののような遊離カルボキシル基で形成されたものが含まれる。
【００５３】
特定の障害または状態の治療に有効な本発明の治療薬の量は、その障害または状態の性質に左右され、標準的臨床技術によって決定することができる。さらに、最適な投薬範囲の予測を助けるために、ｉｎ  ｖｉｖｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ検定法を場合によって使用することができる。製剤で使用される正確な用量はまた、投与経路、疾患または障害の重症度に左右され、医師の判断およびそれぞれの患者の事情によって決定されるべきである。
【００５４】
本発明はまた、本発明の医薬組成物の１種または複数の成分を充填した１個または複数の容器を含む医薬品パックまたはキットを提供する。場合によってこのような容器に付随させるものは、医薬品または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府機関によって指示された形態の通知書で、この通知書はヒト投与のための製造、使用または販売が機関によって承認されたことを反映している。
【実施例】
【００５５】
遺伝子型解析データ
本出願人は、アイルランド人およびスコットランド人集団における筋萎縮性側索硬化症の候補領域として染色体１４ｑ１１．２を先に同定し（例えば、非特許文献２８、２９参照）、アイルランド人のＡＬＳ集団において、ＡＬＳとｒｓ１１７０１一塩基多形との関係を報告した（例えば、非特許文献２８）。独立した５種の集団のＡＬＳの個体１６２９人および対照１２６４人におけるｒｓ１１７０１ＳＮＰの遺伝子型解析（表２）によって、米国、英国またはスウェーデン人集団には関連性が認められなかったが、アイルランド人とスコットランド人のＡＬＳ集団には関連性が確認された。ｒｓ１１７０１ＳＮＰは、ＡＮＧ、即ち１エキソン遺伝子であって、その産物が運動ニューロンで発現し、ＲＮアーゼＡ活性を備えた血管新生因子であるもの、における同義の置換である。
【００５６】
同じ集団でヒトアンジオゲニン遺伝子（以後ＡＮＧ）を配列解析して、家族性ＡＬＳ４人および「孤発性」ＡＬＳ１１人の１５人の個体において７個のミスセンス変異を同定した（表３）。これらの個体はすべて、スーパーオキシドジスムターゼ１変異が陰性であった。５集団すべての個体に変異は存在したが、１５人のうち１２人の罹患個体は、スコットランドまたはアイルランドの家系であった（表３）。出願人の知る限りでは、ＡＮＧ変種は今まではヒト疾患に関連してこなかった。ＡＬＳに関連した変異は、民族が同じ対照の染色体２５２８個において同定されておらず、１家族で疾患が分離された（図１）。ＡＮＧ変異を有する個体の予測割合（６０％）より多くが延髄発症型疾患を有していたが、この研究に参加した患者はすべて、典型的なＡＬＳであった。しかし、特定の変異が発症部位に関連しておらず、Ｃ３９Ｗ変異が２人の兄弟で認められ、そのうちの１人で四肢型およびその他の延髄発症型ＡＬＳの臨床的特徴が確認された。
【００５７】
【表２】
2014185178.tif 000004
【００５８】
【表３】
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【００５９】
３種の共通のハプロタイプが、それぞれＫ１７Ｉ（Ｓ３、Ｓ４）、Ｋ４０Ｉ（Ｓ８、Ｓ９およびＳ１０）およびＩ４６Ｖ（Ｓ１１、Ｆ２およびＦ３）変異を有するアイルランド人およびスコットランド人の個体のＡＮＧ座および隣接領域に認められ、各症例における基礎的な影響が示唆された。Ｋ１７Ｅ変異に共通な特有のハプロタイプがスウェーデン人および北アイルランド民族の個体（Ｓ５およびＳ６）に確認された。
【００６０】
ＡＮＧ、アミノ酸１２３個、タンパク質１４．１ｋＤａは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける血管新生の潜在的誘導因子であり、膵臓リボヌクレアーゼＡ（ＲＮアーゼＡ）スーパーファミリーの構成要素である（例えば、非特許文献３０参照）。ＡＮＧのＲＮアーゼ活性は、その生物学的活性に重要である（例えば、非特許文献３１）。ＲＮアーゼ活性が減少したＡＮＧ変種は、常に血管新生活性が減少している（例えば、非特許文献３２、３３）。ＡＮＧは、神経軸索で発現する。しかし、その作用機構はまだ確立されていない。内皮細胞では、ＡＮＧは管様構造に向けて細胞形成を組織化し、第２メッセンジャーを誘導し、内皮細胞の接着および拡大をサポートする。血管新生に重要な段階では、ＡＮＧは内皮細胞によって内部移行し、核に輸送され（例えば、非特許文献３４）、そこでリボソーム生合成、タンパク質翻訳および細胞増殖における律速段階であるｒＲＮＡ転写を刺激する。内在性ＡＮＧは、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）などのその他の血管新生タンパク質によって誘導される細胞増殖に必要である（例えば、非特許文献３５参照）。低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）およびアンチセンスオリゴヌクレオチドによるＡＮＧの下方制御は、ＶＥＧＦで誘導されるｒＲＮＡ転写を減少させ、ＡＮＧの核転座の阻害によってＶＥＧＦの血管新生活性が消失する（例えば、非特許文献３５参照）。
【００６１】
ＡＮＧの血晶構造解析によって、ＲＮアーゼＡの溝およびＨ１３、Ｋ４０およびＨ１１４の触媒３要素の保存の明白な証拠がもたらされた（例えば、非特許文献３６）。ＡＬＳの個体１１人で同定されたミスセンス変異５個は、ＡＮＧおよびＲＮアーゼＡの中の進化上保存性の高い機能的に重要な残基に影響を及ぼす（Ｑ１２Ｌ、Ｋ１７Ｉ、Ｋ１７Ｅ、Ｃ３９ＷおよびＫ４０Ｉ）（図２）。ＡＮＧのＫ４０は、触媒作用に関与する重要な残基である（例えば、非特許文献３７参照）。ＱでＫ４０を置換するか、またはＲで保存的に置換すると、リボヌクレオチド分解活性がそれぞれ２×１０倍（例えば、非特許文献３０参照）および５０倍減少する（非特許文献３８参照）。理論には結びつけないが、Ｋ４０Ｉ置換の分子モデリングによって、いくつかの鍵となる相互作用が変異によって失われことが示唆され、リボヌクレオチド分解活性の消失が予測される（図２）。Ｃ３９Ｗは、Ｃ９２のジスルフィド結合形成の消失による著しい構造変化を引き起こす（図２）。このジスルフィド結合の崩壊は、タンパク質の折り畳み構造に影響を及ぼし、リボヌクレオチド分解活性の低下をもたらすと思われる。Ｑ１２は、天然の構造における活性部位残基Ｋ４０と相互作用する（図２）。Ｑ１２Ｌ置換は、この相互作用を中断させ、酵素的に活性を減少させる。ＡＮＧの残基Ｋ１７は、分子表面上のループ内の活性部位から離れて位置する（図２）。Ｋ１７のＩまたはＥへの変種は、構造に著しい影響を有さないようである。しかし、ＡＮＧ−ＲＮアーゼＡハイブリッドに関する以前の研究では、Ｋ１７を含有する保存領域は、完全なリボソームに対するＡＮＧの活性に関与することが示された。このことは、Ｋ１７のＩ／Ｅ変種は、ＡＮＧ活性を変更できることを示唆する（例えば、非特許文献３９参照）。
【００６２】
触媒中心に加えて、ＡＮＧは、内皮細胞によって取り込まれた後、核へのＡＮＧの輸送に関与する配列（31ＲＲＲＧＬ35）を含有する核移行部位を有する。Ｒ３１Ａは、天然タンパク質よりも移行の効率が非常に悪い（例えば、非特許文献４０）。Ｒ３１Ｋ変種は核移行において役割を果たすことができるが、構造にはほんのわずかな混乱しか引き起こさないことが予測される。Ｉ４６は、完全には保存されず、引き起こされる構造変化は最小であることが予測される。
【００６３】
ＶＥＧＦのように、ＡＮＧは、低酸素症によって血管新生の惹起を誘導し、運動ニューロンで発現する。ＶＥＧＦプロモーターの低酸素応答因子を除去すると、マウスにおいて運動ニューロン疾患表現型が生じ（例えば、非特許文献４１参照）、ＶＥＧＦを置換することは、ＳＯＤG93A齧歯類モデルにおいて有益である（例えば、非特許文献４２、４３）。ＶＥＧＦ発現レンチウイルスベクターＭｏＮｕＤｉｎ（登録商標）を使用した遺伝子をベースにした治療は、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａによってヒト使用のために開発されている。ＶＥＧＦは、ＡＬＳの修飾剤と推測されるが、この遺伝子における変異は、ＡＬＳの患者では発見されていない。対照的に、本出願人は、ＡＬＳ発症の明白な感受性因子として機能欠如性ＡＮＧ変異を同定した。ＡＮＧ変異は、常染色体優性ＡＬＳおよび「孤発性」ＡＬＳによく似た浸透性の低い疾患の原因となり得る。
【００６４】
運動ニューロン変性の細胞モデル
方法
運動ニューロン変性のｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルとして、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける７日目の運動ニューロン初代培養物を培地中においてＡＭＰＡ  ５０μＭに２４時間曝露した（例えば、非特許文献４４参照）。アンジオゲニンの可能性のある神経保護効果を調べるために、培地中で、アンジオゲニン（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）によるｉ）予備処理およびｉｉ）共処理の効果を２５ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌおよび５００ｎｇ／ｍｌの濃度で調べた。対照として、アンジオゲニンに曝露していないか、または（前述と同濃度で）曝露した、またはＢＳＡ（ウシ血清アルブミン、Ｓｉｇｍａ）に曝露した姉妹培養物を使用した。
【００６５】
この研究で、ＭＭＴ細胞生存率測定を実施した。ＰＢＳに溶解し（５ｍｇ／ｍｌ）、培地で１：１０に希釈したＭＴＴ（Ｓｉｇｍａ）を培養物に添加し、３７℃で４時間インキュベートした。インキュベーション後、培地をＨＣｌ０．０４Ｍを含有するイソプロパノールで置換した。次に、発光値は、マイクロＥＬＩＳＡプレートリーダーで５７０ｎｍで読み取った。処理培養物における細胞生存率を未処理姉妹培養物（１００％）における細胞生存率の割合として表し、マンホイットニーのＵ検定を使用して結果の有意性を比較した。
【００６６】
アンジオゲニンの神経保護効果の媒介に関与するシグナル伝達経路を調べるために、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路の活性化をウェスタンブロットを用いて調べた。特に、そのリン酸化によって示されるような、Ａｋｔの活性化を調べた。（前述のように）ＡＭＰＡ、ＡＭＰＡおよびアンジオゲニン、またはアンジオゲニン単独に曝露した運動ニューロン初代培養物を溶解し、タンパク質を抽出した。各実験条件におけるタンパク質濃度は、Ｍｉｃｒｏ  ＢＣＡ  Ａｓｓａｙ（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して決定した。試料を１０％ＳＤＳゲルで泳動し、ニトロセルロース膜に移し、Ａｋｔおよびホスホ−Ａｋｔ（いずれもＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ）に対する抗体で調べた。ブロットは、ＥＣＬシステムを使用して視覚化した。アルファ−チューブリンに対する抗体（Ｓｉｇｍａ）でブロットを再度調べることによって、同量のタンパク質添加物を確認した。
【００６７】
結果
１．運動ニューロン変性および脳卒中のｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルにおけるアンジオゲニンの神経保護効果。
【００６８】
ａ）ＭＴＴ細胞生存率検定を使用して、運動ニューロン初代培養物をＡＭＰＡ  ５０μＭに２４時間曝露した運動ニューロン変性のｉｎ−ｖｉｔｒｏモデルにおいてアンジオゲニンの濃度増加の効果が調べられた。神経保護効果を示すアンジオゲニンの最適濃度は１００ｎｇ／ｍｌであることがわかった。運動ニューロン初代培養物をＡＭＰＡ  ５０μＭに２４時間曝露することは、運動ニューロン変性のｉｎ−ｖｉｔｒｏモデルで詳しく記載されている（例えば、非特許文献４４）。図３に示したように、ＡＭＰＡに曝露すると、細胞生存率の５８．５％への有意な減少が生じた（±３．３Ｓ．Ｅ．Ｍ．、ｎ＝２４、ｐ＜０．０５）。しかし、アンジオゲニン１００ｎｇ／ｍｌで共処理または予備処理すると、細胞生存率はそれぞれ８２．５％（±３．９Ｓ．Ｅ．Ｍ．、ｎ＝２４）および９２．３％（±４．８Ｓ．Ｅ．Ｍ．、ｎ＝２４）に有意に増加した（ｐ＜０．０５）。運動ニューロン初代培養物をアンジオゲニンまたはＢＳＡで処理しても、細胞生存率に有意な効果はなかった。
【００６９】
２．アンジオゲニンシグナル伝達におけるＡｋｔの役割
ウェスタンブロッティングを使用して、アンジオゲニンの神経保護効果の媒介に関与する細胞生存経路を調べた。特に、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ細胞生存経路の活性化は、Ａｋｔの活性型（リン酸化Ａｋｔ）の発現を調べることによって調査した。図４に示すように、活性化Ａｋｔ（リン酸化Ａｋｔ）のレベルは、ＡＭＰＡ単独またはアンジオゲニン単独で処理した培養物と比較して、アンジオゲニンで共処理したＡＭＰＡ曝露培養物では増加していた。このＡｋｔの活性型の増加は、運動ニューロン変性のこのｉｎ−ｖｉｔｒｏモデルにおけるアンジオゲニンの神経保護効果にはＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路の活性化が関与することを示している。
【００７０】
神経変性の動物モデル
処理計画：
アンジオゲニン（ａｎｇ）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＵＳＡ、カタログ番号２６５−ＡＮ−２５０）を、ＡＬＳ／ＭＮＤのマウスモデルである変異ＳＯＤ１（ｍＳＯＤ１）マウスに投与する（例えば、非特許文献４５参照）。これらのマウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｍａｉｎｅ、ＵＳＡから入手することができる。これらのマウスは、臨床症状が非常によく似ている進行型運動ニューロン変性および後肢麻痺のＡＬＳ様表現型を発症する。この疾患は、これらのマウスで迅速に進行し、約１２５日の寿命を非常に縮める（例えば、非特許文献４６）。異なる疾患段階でのａｎｇ処理開始の効果を調べる。これらの段階は、ｉ）症候前段階（３５日から）、ｉｉ）症候初期段階（７０日から）、ｉｉｉ）症候後期段階（９０日から、患者は中後期、すなわち、麻痺が歴然としてから患者は神経科医とのみ会うので、この時点で臨床状況は最もよく似ている。）である。結果を混乱させる性差を回避するために、アンジオゲニンは、いくつかの同腹子の同性の動物に投与される。
【００７１】
投与経路
１．クモ膜下腔内−脊髄へのａｎｇの直接送達
動物のクモ膜下腔内に、シリンジでａｎｇを投与する。これには、麻酔した動物の脊髄を、上に重なる椎骨に「穴」を創出するために椎弓切除を実施することによって露出し、次にこの穴を通して髄膜から脊髄周辺の空間にシリンジを挿入することが必要である。このシリンジは脊髄に貫通させない。
【００７２】
別法では、動物のクモ膜下腔内にミニ浸透圧ポンプでａｎｇを輸送する。動物を麻酔し、椎弓切除を実施して小さなカテーテルをクモ膜下腔内に挿入する。このカテーテルにはアンジオゲニンを含有するミニ浸透圧ポンプが装着されている。これらのポンプは、大きさが非常に小さく、マウスなどの小さな齧歯類に挿入するのに適している。このポンプを脊髄の上に重ねて配置し、ポンプの大きさおよび保持できる量に応じてａｎｇを規定した期間にわたって放出する（例えば、非特許文献４７参照）。
【００７３】
組換えａｎｇを投与する場合では、最初に異なる濃度の効果、次いで最適な送達計画（すなわち、連続的（このために浸透圧ポンプを使用可能である）、毎日、１日２回、毎週、隔週、その他の日数間隔などで投与する）を調べる。連続注入では、組換えアンジオゲニンは５と２０μｇ／ｋｇ／分との間の用量範囲で注入する。別法では、アンジオゲニンは０．１と２ｍｇ／ｋｇとの間の用量範囲で投与する。
【００７４】
処理効果の決定
ａｎｇ処理がｍＳＯＤ１マウスで効果的かどうかを決定するために、処理したｍＳＯＤ１マウスの疾患進行および寿命を未処理ｍＳＯＤ１同腹子と比較する。疾患進行のモニターには、歩行運動能力および筋肉機能の機能的評価、ならびに体重、一般的外見および運動ニューロン生存率（例えば、非特許文献４８、４４参照）が含まれる。寿命は、動物が生存する日数の尺度である。
【００７５】
結果：アンジオゲニンは、ポンプおよびシリンジから放出され、脊髄中の細胞によって取り込まれる。これは、Ａｎｇタンパク質に蛍光マーカーのタグを付けることによってモニターされる。Ａｎｇを脊髄に直接投与すると、全身的Ａｎｇ投与と比較して、発癌作用を有するＡｎｇ投与の可能性が減少する。
【００７６】
本発明は、前述した実施形態によっては制限されず、本発明の精神を逸脱せずに、構成および詳細を変化させることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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