(57)【要約】【課題】サイトカインがチトクロムＰ４５０の代謝能に及ぼす影響を評価する方法に、株化肝細胞を利用する手法を提供する。【解決手段】サイトカインがチトクロムＰ４５０の代謝能に及ぼす影響を評価する方法であって、培養空間１１を有する培養容器１０を用いて株化肝細胞を培養してスフェロイド９を形成し、スフェロイド形状の株化肝細胞と、サイトカインを含む試験溶液とを培養容器内で１時間以上９６時間未満接触させた後に、チトクロムＰ４５０の誘導または減衰の有無を評価する。【選択図】図５Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
サイトカインがチトクロムＰ４５０の代謝能に及ぼす影響を評価する方法であって、
スフェロイド形状の株化肝細胞と、サイトカインを含む試験溶液とを培養容器内で１時間以上９６時間未満接触させた後に、チトクロムＰ４５０の代謝機能の誘導または減衰の有無を評価する方法。
【請求項２】
前記株化肝細胞から形成されたスフェロイドの直径の平均値が５０μｍ以上２００μｍ未満であって、かつ、半値幅範囲内の直径を有するスフェロイドが全スフェロイドの７０％以上であることを特徴とする請求項１の方法。
【請求項３】
前記試験溶液が無血清培地であることを特徴とする請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
前記試験溶液のサイトカイン濃度が、健常人のサイトカインの血中濃度の平均値の０．１倍から５０倍の範囲のうちの一つの濃度を基準に、前記基準の少なくとも１倍、１０倍、１００倍の３濃度の前記サイトカインを含む各試験溶液を用いることを特徴とする請求項１乃至３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記試験溶液のサイトカインの濃度が、前記サイトカインが分泌される疾患患者の血中濃度の平均値の０．１倍から５０倍の範囲のうちの一つの濃度を基準に、前記基準の少なくとも１倍、１０倍、１００倍の３濃度のサイトカインを含む各試験溶液を用いることを特徴とする請求項１乃至３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記株化肝細胞をスフェロイド形状に培養する工程と、スフェロイド形状の前記株化肝細胞と前記サイトカインを含む前記試験溶液とを１時間以上９６時間未満接触させる工程とを、同一のウェル内で行うことを特徴とする請求項１乃至５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記培養容器として、複数のウェルを有する培養プレートの一つのウェルを用い、
前記一つのウェル内に１０％血清を含む培地で前記株化肝細胞のスフェロイドを形成させる工程と、
前記一つのウェルから前記培地を吸い取る工程と、
前記一つのウェルへ、前記サイトカインを含む前記試験溶液を添加する工程と、
前記一つのウェル内で、前記サイトカインを含む前記試験溶液と、前記スフェロイドとを１時間以上９６時間未満接触させる工程と、を行うこと特徴とする請求項１乃至６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記培養容器は、複数のウェルを有する培養プレートの各ウェル内に、複数の培養空間を有するように形成され、
各培養空間は、相当直径の長さを有する面と、高さとからなる空間であり、前記高さを前記相当直径割った値が０．３から２の範囲であり、
前記培養空間の底に、前記相当直径が１００μｍから１０００μｍの範囲の培養空間が少なくとも２個以上配置されていることを特徴とする請求項１乃至９のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
【請求項９】
前記複数の培養空間は、隣り合う前記培養空間を隔てる壁の厚さが２μｍから５０μｍの範囲であることを特徴とする請求項１乃至８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記培養空間を隔てる壁の上面と側面とがなす角度が９０度から１３５度の範囲であることを特徴とする請求項１乃至８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記複数の培養空間の底の表面が、ガラス処理により、水接触角を４５度以下になるように処理されたことを特徴とする請求項１乃至１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記複数の培養空間の底の表面が、プラズマ処理により官能基を形成させて、水接触角を４５度以下になるように処理されたことを特徴とする請求項１乃至１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記培養容器の表面は、ポリマー温度、光のいずれかにより親水性と疎水性とが変化するポリマー、細胞接着を阻害する親水性のポリマー鎖、リン脂質、リン脂質・高分子複合体、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）（ＰＨＥＭＡ）、ポリビニルアルコール、アガロース、キトサン、ポリエチレングリコール、及びアルブミンのグループから選択される一つ、または組合せからなるポリマーが、固定化されていること特徴とする請求項１乃至１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記培養容器の表面は、細胞接着を阻害する親水性のポリマー鎖、リン脂質、リン脂質・高分子複合体、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）（ＰＨＥＭＡ）、ポリビニルアルコール、アガロース、キトサン、ポリエチレングリコール、及びアルブミンのグループから選択される一つ、またはこれら組合せからなるポリマーと、細胞接着性を促進するポリマーである、ポリ−Ｌ−リシン、ポリ−Ｌ−リシン、コラーゲン、ラミニン、及びフィブロネクチンから選択される一つ、またはこれら組合せからなるポリマーとの混合物が固定化されていることを特徴とする請求項１乃至１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記培養容器が、アクリル系樹脂、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、スチレン系樹脂、アクリル・スチレン系共重合樹脂、ポリカーボネート系樹脂、ポリエステル系樹脂、ポリビニルアルコール系樹脂、エチレン・ビニルアルコール系共重合樹脂、熱可塑性エラストマー、塩化ビニル系樹脂、及びシリコン樹脂のグループから選択される一つまたはこれらの組み合わせからなる樹脂成形品であることを特徴とする請求項１乃至１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記培養容器の底部を構成するポリマーの全光線透過率が８５％以上９９％未満であることを特徴とする請求項１乃至１５のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サイトカインとチトクロムＰ４５０との相互作用を評価する方法であり、例えば、サイトカインによるチトクロムＰ４５０の薬物代謝機能の誘導及び減衰を評価する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、サイトカインに関して様々な研究が行われている。
例えば、炎症時に血中に分泌されるサイトカイン類によりＣＹＰ３Ａ４の代謝機能が低下するため薬剤が排泄されず、結果として重篤な副作用が起こることが示されている（非特許文献１）。また、サイトカインは創薬ターゲットとして注目されるようになってきている。市場に出されている医薬品の例としては、腫瘍壊死因子やウイルス性肝炎の治療に用いられるインターフェロンがある。これらの状況を受けて、様々な手法を用いてサイトカインと薬物代謝酵素の反応性に関する研究が行われるようになってきた。
【０００３】
その手法のひとつとして動物実験が挙げられる。しかし、ヒトと動物には種差があるため生体内の反応を正確に予測できないという問題がある（非特許文献２）。加えて、動物実験のようなｉｎ  ｖｉｖｏの試験は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ系と比較してスループット性に劣る。このため、多くの化合物を同時に評価するような医薬品のスクリーニングには適さないという問題がある。
このような背景から、正確に生体内の反応が予測できるｉｎ  ｖｉｔｒｏの試験による評価法が求められるようになってきた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Kenneth W. Renton著、"Cytochrome P450 Regulation and Drug Biotransformation During Inflammation and Infection"、Current Drug Metabolism、２００４年５月、ｐｐ．２３５−２４３
【非特許文献２】C Schmitt, B Kuhn1, X Zhang, AJ Kivitz3 and S Grange著、"Disease-Drug-Drug Interaction Involving Tocilizumab and Simvastatin in Patients With Rheumatoid Arthritis"、Clinical pharmacology & Therapeutics、VOLUME 89 NUMBER 5、２０１１年５月、ｐｐ．７３５−７４０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏの試験として、非特許文献２ではヒト初代肝細胞を用いた方法が開示されている。しかし、ヒト初代肝細胞はドナーの遺伝子多型や環境要因に起因する薬物動態遺伝子の発現量及びその誘導能についてのロット間差が大きい。その上、入手経路が限られているためコストが高く、取り扱いが困難である。そのため、多種のサイトカインを用いて同じロットの細胞で複数のチトクロムＰ４５０を一度に評価することは困難、もしくは多大なコストを要するという問題があった。
一方、株化肝細胞は、増殖させることが可能である。従って、サイトカインがチトクロムＰ４５０の代謝能に及ぼす影響を評価する方法に、ヒト由来の株化肝細胞が利用できれば、安価にかつ再現性のある結果を得ることが期待される。しかしながら、株化肝細胞の代謝機能の持つ肝細胞の機能は、初代肝細胞と比較して非常に低いことが知られている。例えば、細胞を培養する底部表面が平坦な培養容器を用いて株化肝細胞を培養した場合、チトクロムＰ４５０の代謝能が測定限界値以下となり分析できないことがある。このような場合、たとえサイトカインを添加していないコントロール群で代謝機能を検出できたとしても、サイトカインを添加した場合の代謝機能の減衰量を測定することは極めて困難である。この問題を克服するために様々な三次元培養が研究されているが、操作が煩雑、特殊な装置を用いる必要がある、または、高コストであるといった問題がある。このような背景から、株化肝細胞を用いてサイトカインがチトクロムＰ４５０の代謝能に及ぼす影響を評価する方法は開発されていなかった。
発明者らは、サイトカインがチトクロムＰ４５０の代謝能に及ぼす影響を評価する方法に、株化肝細胞を利用する手法を発見した。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
発明者らは、スフェロイド形状の株化肝細胞とサイトカインを含む試験溶液を１時間以上９６時間未満接触させた後のチトクロムＰ４５０の代謝能を測定する方法で上述した問題を解決した。
本発明に係るサイトカインがチトクロムＰ４５０の代謝能に及ぼす影響を評価する方法の一態様は、スフェロイド形状の株化肝細胞と、サイトカインを含む試験溶液とを培養容器内で１時間以上９６時間未満接触させた後に、チトクロムＰ４５０の代謝機能の誘導または減衰の有無を評価する。スフェロイド形状の株化肝細胞を形成し、形成したスフェロイド形状の株化肝細胞を適切な時間、試験溶液に接触させることにより、代謝機能の測定が可能であることを見出した。この方法によれば、チトクロムＰ４５０の代謝能に及ぼすサイトカインの影響を測定し、評価することが可能になる。
【０００７】
また、本発明に係るサイトカインがチトクロムＰ４５０の代謝能に及ぼす影響を評価する方法の一態様において、前記株化肝細胞から形成されたスフェロイドの直径の平均値が５０μｍ以上２００μｍ未満であって、かつ、半値幅範囲内の直径を有するスフェロイドが全スフェロイドの７０％以上であることが好ましい。スフェロイドの直径の大きさが所定の範囲内であり、かつ、スフェロイドの直径の大きさのばらつきが小さくなることにより、代謝機能の判定の精度を向上させることができる。
【０００８】
さらに、本発明に係るサイトカインがチトクロムＰ４５０の代謝能に及ぼす影響を評価する方法の一態様において、前記試験溶液が無血清培地であることが好ましい。
加えて、前記試験溶液のサイトカイン濃度が、健常人のサイトカインの血中濃度の平均値の０．１倍から５０倍の範囲のうちの一つの濃度を基準に、前記基準の少なくとも１倍、１０倍、１００倍の３濃度の前記サイトカインを含む各試験溶液を用いることが好ましい。また、前記試験溶液のサイトカインの濃度が、前記サイトカインが分泌される疾患患者の血中濃度の平均値の０．１倍から５０倍の範囲のうちの一つの濃度を基準に、前記基準の少なくとも１倍、１０倍、１００倍の３濃度のサイトカインを含む各試験溶液を用いることが好ましい。
【０００９】
本発明に係る方法の一態様において、前記株化肝細胞をスフェロイド形状に培養する工程と、スフェロイド形状の前記株化肝細胞と前記サイトカインを含む前記試験溶液とを１時間以上９６時間未満接触させる工程とを、同一のウェル内で行うことが好ましい。
例えば、前記培養容器として、複数のウェルを有する培養プレートの一つのウェルを用いて以下の各構成を行うことが好ましい。
（１）前記一つのウェル内に１０％血清を含む培地で前記株化肝細胞のスフェロイドを形成させる工程、
（２）前記一つのウェルから前記培地を吸い取る工程、
（３）前記一つのウェルへ、前記サイトカインを含む前記試験溶液を添加する工程、
（４）前記一つのウェル内で、前記サイトカインを含む前記試験溶液と、前記スフェロイドとを１時間以上９６時間未満接触させる工程。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、サイトカインがチトクロムＰ４５０の代謝能に及ぼす影響を評価する方法に、株化肝細胞を利用することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明の一実施形態で用いる培養プレートの全体を示す図である。
【図２Ａ】図１に示す培養プレートのＩＩ−ＩＩ線断面図である。
【図２Ｂ】図１に示す培養プレートの他のＩＩ−ＩＩ線断面図である。
【図３】本発明の一実施形態で用いる培養容器の全体を示す図である。
【図４】図３に示す培養容器のＩＶ−ＩＶ線断面図である。
【図５Ａ】培養空間でスフェロイドを培養する状態を表す概略図である。
【図５Ｂ】培養空間で培養したスフェロイドの好ましいサイズの一例を説明する模式図を示す図である。
【図６Ａ】培養空間の他の形状例を示す図である。
【図６Ｂ】培養空間のさらに他の形状例を示す図である。
【図７Ａ】培養空間の他の側面の形状例を示す断面図である。
【図７Ｂ】培養空間のさらに他の側面の形状例を示す断面図である。
【図７Ｃ】培養空間のさらに他の側面の形状例を示す断面図である。
【図８】実施例で用いる培養プレートの一例を示す写真である。
【図９】スフェロイド形状の株化肝細胞と、サイトカインを含む試験溶液とを接触させる時間の長さとチトクロムＰ４５０の代謝機能の反応性との関係を示す試験結果を示す図である。
【図１０】上皮成長因子を添加した時のＣＹＰ３Ａ４の遺伝子発現量を測定した結果を示す図である。
【図１１】ヘパリン結合性上皮増殖因子様増殖因子を添加した時のＣＹＰ３Ａ４の遺伝子発現量を測定した結果を示す図である。
【図１２】インターロイキン‐１βを添加した時のＣＹＰ３Ａ４の遺伝子発現量を測定した結果を示す図である。
【図１３】腫瘍壊死因子を添加した時のＣＹＰ３Ａ４の遺伝子発現量を測定した結果を示す図である。
【図１４】腫瘍壊死因子を添加した時のＣＹＰ２Ｃ９の遺伝子発現量を測定した結果を示す図である。
【図１５】インターロイキン‐６を添加した時のＣＹＰ２Ｃ９の遺伝子発現量を測定した結果を示す図である。
【図１６】インターロイキン‐６の試験でＣＹＰ３Ａ４のタンパク量と代謝活性の試験結果を示す図である。
【図１７】サイトカインの濃度依存性の試験結果を判定した結果を示すテーブルである。
【図１８】評価処理で説明した手法に基づいて試験結果を判定した結果を示すテーブルである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、実施形態について、図面を参照しながら説明する。説明の明確化のため、以下の記載及び図面は、適宜、省略、及び簡略化がなされている。各図面において同一の構成または機能を有する構成要素および相当部分には、同一の符号を付し、その説明は省略する。
【００１３】
発明者らは、サイトカインがチトクロムＰ４５０の代謝能に及ぼす影響を評価する方法（以降適宜、「評価方法」と称する）に、スフェロイド形状の株化肝細胞とサイトカインを含む試験溶液を１時間以上９６時間未満接触させた後のチトクロムＰ４５０の代謝能を測定し、サイトカインによるチトクロムＰ４５０の代謝能を評価する手法により、上述した問題を解決した。より詳細には、評価方法は、ヒト由来の株化肝細胞を培養してスフェロイドを形成し、スフェロイド形状の株化肝細胞と、サイトカインを含む試験溶液とを培養容器内で１時間以上９６時間未満接触させ、株化肝細胞のチトクロムＰ４５０の値を測定する。測定結果に基づいて、チトクロムＰ４５０の代謝能の評価、言い換えると、サイトカインによるチトクロムＰ４５０の代謝能の誘導または減衰の有無を、チトクロムＰ４５０の値が上昇しているときに「サイトカインによりチトクロムＰ４５０の代謝機能が誘導される」と判定し、チトクロムＰ４５０の値が減少しているときに「サイトカインによりチトクロムＰ４５０の代謝機能が減衰される」と判定する。
【００１４】
用語「サイトカイン」は、細胞から放出され、種々の細胞間相互作用を媒介するタンパク質性因子を総称するものであり、例えば、免疫系の調節、炎症反応の惹起、抗腫瘍作用、細胞増殖、分化、抑制といった生体の恒常性維持に役割を果たす物質である。一実施形態では、サイトカインは、その存在によって、肝臓の機能の変動（誘導、減衰）の起因となる場合を特に対象とし、例えば、増殖因子、インターフェロン、腫瘍壊死因子などを含む。
用語「スフェロイド」は、細胞が多数凝集して細胞塊を形成し、３次元状態になったものである。
用語「チトクロムＰ４５０（ＣＹＰ）」は、細菌から植物，哺乳動物に至るまでのほとんどすべての生物に存在する、異物（薬物）代謝の役割を果たす酵素である。動物では、主に肝臓に存在する。
以下の説明において、「値Ａから値Ｂの範囲」という場合には、特に明記していない限り、「値Ａ以上値Ｂ以下」を意味する。
用語「チトクロムＰ４５０の値」は、総チトクロムＰ４５０量の値ではなく、チトクロムＰ４５０のもつ代謝機能を表す値であり、例えば代謝活性値、遺伝子発現量、タンパク量を意味する。
【００１５】
以下、一実施形態の評価方法について、最初に株化肝細胞を培養する培養容器について説明し、次に、株化肝細胞を培養して評価するまでの培養・評価方法について説明する。
１．培養容器
＊  培養容器の概略
図１は、本発明の一実施形態で用いる培養プレートの全体を示す図である。図２Ａは、図１に示す培養プレートのＩＩ−ＩＩ線断面図であり、図２Ｂに、他の態様の断面図を示す。培養プレート１は、複数のウェル２１を備える。複数のウェル２１は、仕切り部２２によって、隣り合うウェル２１と隔てられる。複数のウェル２１それぞれには、培養容器１０が形成されている。
図３に、本発明の実施形態で用いる培養容器の構成例を示す。図４は、図３に示す培養容器のＩＶ−ＩＶ線断面図である。
培養容器１０は、培養空間１１と、壁１２と、底部１３とを有する。
培養空間１１は、壁１２と底部１３とで仕切られた領域であり、細胞を培養する三次元の空間領域（培養領域）となる。培養空間１１は、単に「空間」、または「マイクロ空間」とも称する。
壁１２は、培養空間１１を仕切る隔壁であり、培養容器１０に凹凸パターンを形成する凸部ともいえる。培養空間１１が仕切り部２２に隣接する場合、壁１２は、図２Ａに示すように、仕切り部２２の壁面の一部分と同じになってもよいし、図２Ｂに示すように、仕切り部２２の壁面に隣接して壁１２が配置されてもよい。
底部１３は、培養容器１０の基板として機能するとともに、培養空間１１が配置される側の表面は、培養領域（培養表面）の一部となる。底部１３は、培養プレート１に形成された各ウェル２１の底部と同じ領域であり、各ウェル２１の底部が用いられる。底部１３は、培養空間１１の底を形成する。底部１３のうち、培養空間１１を形成する面の一部分であり、かつ、培養領域となる底部の表面を、「底部培養面１４」とも称する。
【００１６】
図３，４では、培養容器１０に形成される培養空間１１に関して、相当直径Ｄ、高さ（深さ）Ｈ、壁１２の幅（厚さ）Ｗ、及び、底部１３の厚さＴを示す。図３，４では、底部１３は、壁１２と一体として作製された場合を示している。
相当直径Ｄは、培養空間１１に内接する内接円の直径をいう。より詳しくは、相当直径Ｄは、培養空間１１の底部１３と平行する面の形状（正面の形状）、言い換えると、培養空間１１の高さＨの方向と垂直になる面の形状の内接円の直径をいう。培養空間１１の正面の形状が、高さＨに応じて異なる場合、株化肝細胞を培養する空間領域の最大値を相当直径の相当直径とする。
高さＨは、培養空間１１の底（底部培養面１４）から壁１２の上面までの長さであり、培養空間１１の深さでもあるともいえる。また、底部培養面１４が平面の場合、高さＨは、壁１２の高さと同じである。
壁１２の幅Ｗは、壁１２の厚さであるとともに、隣接する培養空間１１間を隔てる距離であるともいえる。
【００１７】
培養容器１０内（言い換えると、各ウェル２１内）において、複数の培養空間１１は、図３に示すようにアレイ状に配置される。培養容器１０に含まれる培養空間１１の数または大きさは、培養プレート１に作製されるウェル２１の数（ウェル２１の大きさ）と培養空間１１及び壁１２の大きさに依存するものである。具体的には、ウェル２１の数が多くなるに従って、培養空間１１の数が小さくなる関係にある。同じ大きさのウェル２１のとき、ウェル２１の中の培養空間１１の数は、相当直径Ｄが大きい場合や幅Ｗが大きい場合に小さくなる関係にある。図１乃至４では、構成をわかりやすく説明するため、培養空間１１の数を少なくして表した概略図であり、培養容器１０に含まれる培養空間１１の数は実際とは異なる。加えて、図３，４では、９個の培養空間１１を示している。これは説明のために示したものであり、実際の培養容器１０（各ウェル２１）に含まれる培養空間１１の数に対応するものではない。
【００１８】
発明者らは、相当直径Ｄが所望するスフェロイドの直径の１〜５倍であり、高さＨが相当直径Ｄの０．３倍〜５倍である培養空間１１を複数有するとともに、該培養空間表面の水接触角が４５度以下である培養容器１０を使用し、各培養空間１１で株化肝細胞を培養することによって、均一な直径の株化肝細胞のスフェロイドを培養することができることを見出した。従って、所望するスフェロイドの大きさに応じて、培養容器１０に配置される培養空間１１の大きさを選択することにより、培養するスフェロイドの大きさを制御することが可能になる。一実施形態では、株化肝細胞として、ヒト由来の株化肝細胞を培養してスフェロイド形成させる。以下に詳細を説明する。
【００１９】
図１乃至４を参照して、所望のスフェロイドを形成させるためのマイクロオーダの培養空間１１の大きさ、形状等と、培養表面の特性を説明する。
＊  培養空間の大きさ、形状等
培養空間１１の相当直径Ｄについて、スフェロイドの大きさが、細胞が増殖するに従いその直径が大きくなることを考慮する必要がある。そこで重要なことは、スフェロイドが隣り合う培養空間１１の細胞と接触しないような培養空間１１を確保することである。このため、培養空間１１の相当直径Ｄは、所望するスフェロイドの直径の１〜５倍の範囲が好ましく、１．２〜４倍の範囲がより好ましい。
例えば、直径１００μｍの株化肝細胞のスフェロイドを形成させるために、所望するスフェロイドの直径の１〜５倍の範囲、即ち、相当直径Ｄが１００〜５００μｍの範囲で、高さＨを相当直径Ｄで割った値が０．３〜２の範囲の培養空間１１が規則的に配置されている底部１３を有する培養容器１０を用いる。
【００２０】
株化肝細胞培養空間１１の表面との細胞接着性を強めることで、増殖・維持させているような場合は、十分に細胞が底面に接着性していることから培地交換時に細胞が剥離することがない。そのため、本実施形態のような、培養空間１１の相当直径Ｄが所望するスフェロイドの直径の１〜５倍の範囲、高さＨが相当直径Ｄの０．３〜２倍の範囲という、深い空間は必要ないため、そのような空間での培養は行わない。
一方、一実施形態では、後述するように細胞接着性を抑制しているため、アミノ酸や酸素などの供給が可能、かつ、スフェロイドが脱離しない最適な高さＨを設計する必要がある。００１８に記載の好ましい範囲のスフェロイドを形成させるために好ましい高さＨ、相当直径Ｄを検討した結果、細胞増殖によりスフェロイドが過剰に大きくなることを防ぐためには、相当直径Ｄが１００μｍ〜２００μｍの範囲、高さＨが５０μｍ〜１００μｍの範囲が好ましい。培養空間１１の底までアミノ酸等の栄養分を十分に供給するため、かつ老廃物の蓄積を防ぐために、培養空間１１の高さＨは、培地交換や試験溶液交換時にスフェロイドが剥離しない限り低い方が好ましい。具体的には、培養空間１１の高さＨを相当直径Ｄで割った値が０．３〜２の範囲が好ましく、０．５〜１の範囲がより好ましいことを見いだした。
【００２１】
一実施形態では、試験溶液をスフェロイド中心部まで拡散または輸送させるためには、スフェロイドの直径は最大２００μｍ未満、好ましくは１５０μｍ以下が好ましい。さらに加えて、細胞間の相互作用を最大限に引き出すためには、スフェロイドの直径は、最小５０μｍが好ましく、６０μｍ〜１５０μｍの範囲がより好ましい。ここで、細胞間の相互作用は、被験物質（例えば、サイトカイン）とチトクロムＰ４５０との相互作用である。
【００２２】
壁１２の幅Ｗは、培養空間１１と隣接する培養空間１１を隔てる壁１２の厚みである。従って、壁１２の幅Ｗは、壁１２の上面での細胞増殖を防ぐため、かつ、細胞が培養空間１１内に入りやすくするため、２〜５０μｍの範囲がよく、好ましくは、細胞体１個以下の大きさ、即ち５〜３０μｍの範囲が好ましく、５〜１０μｍの範囲がより好ましい。さらに、同様の観点から、壁１２の上面と培養空間１１の側面とのなす角θは、９０〜１３５度の範囲が好ましく、９０度〜１２０度の範囲がより好ましい。
【００２３】
図５Ａに、培養空間１１でスフェロイドを培養する状態を表す概略図を示す。図５Ａでは、図４に示す断面図を用い、スフェロイド９を、○印で示す。スフェロイド９は、複数の培養空間１１それぞれにおいて培養される。
図１に示す培養プレート１で培養する場合、ウェル２１毎に培養条件の設定、培地の交換等を実施することになる。そのため、各ウェル２１に複数の培養空間１１を形成するため、各ウェル２１において、同条件で複数のスフェロイドを培養することが可能になる。加えて、ウェルプレートを用いてスフェロイドを培養することができるため、従来の細胞培養で用いる装置等を利用することが可能になる。
スフェロイド９の直径ＤＳＰを値ｄｓｐ（ｄｓｐは正の数値）とすると、培養空間１１の相当直径Ｄは、値ｄｓｐから値ｄｓｐの５倍の範囲（ｄｓｐ≦Ｄ≦５ｄｓｐ）が好ましい範囲となる。また、培養空間１１の高さＨは、値ｄｓｐの０．３倍から値ｄｓｐの２５倍（５×５）の範囲（０．３ｄｓｐ≦Ｈ≦２５ｄｓｐ）が好ましい範囲となる。
【００２４】
図５Ｂに、培養空間で培養したスフェロイドの好ましいサイズの一例を説明する模式図を示す。図５Ｂは、スフェロイド９の相当直径Ｄに沿って切断した切断部端面を模式的に示した図である。上述したように、スフェロイドの直径の平均が５０μｍ以上２００μｍ未満であることが好ましく、特に、６０μｍ〜１５０μｍの範囲が好ましい。図５Ｂでは、スフェロイド９の切断部端面が５個の細胞８により形成されている様子を示す。例えば、細胞８の直径ＤＣＬが２０μｍであり、スフェロイド９の直径ＤＳＰが６０μｍのスフェロイド９を形成する場合には、例えば、細胞８が直線上に３個並ぶことにより形成される。同様に、スフェロイド９の直径ＤＳＰが１５０μｍのスフェロイド９を形成する場合には、例えば、細胞８が直線上に５個並ぶことにより形成される。図５Ｂは説明を容易にするために細胞８を直線上に並べて模式的に示したものであり、細胞８は必ずしも直線上に並ぶとは限らない。
【００２５】
加えて、１試験領域（１ウェル、１シャーレ）にあるスフェロイドは、その直径が半値幅の範囲内にあるものが全体の７０％以上含まれることが好ましい。言い換えると、スフェロイドの直径の大きさがそろっていることが好ましい。その理由は以下の通りである。まず、スフェロイドの大きさによって代謝活性値が異なることが知られていることから、様々な直径のスフェロイドが混在していると精度の高い結果が得られない。また、小さい（５０μｍ以下の）スフェロイドの代謝機能は極端に低いことが知られている。そのため、このようなスフェロイドが多く含まれている場合、代謝機能を減衰させるようなサイトカインを評価する際に測定限界値以下となり、代謝機能の減衰の有無が判定できない可能性がある。
「半値幅の範囲」とは、１試験領域にあるスフェロイドの総個数ＮＴうち、直径の大きさと存在する個数との対応を取ったときに、存在する個数が最大となる直径Ｄ１の個数Ｎ１に対して、個数Ｎ１の半分の個数（Ｎ１／２）となる複数の直径のうち、最小の直径Ｄ２から最大の直径Ｄ３までの範囲に存在するスフェロイドの個数Ｎ２をいう。
スフェロイドの大きさを一様にするために、上述した総個数ＮＴに対して個数Ｎ２が７０％以上であることが好ましく、総個数ＮＴに対する個数Ｎ２の割合が高くなることがより好ましい。
【００２６】
培養空間１１の形状（正面の形状）、あるいは、底部１３と平行な面の形状は、図３に示す形状に限定されるものではなく、例えば、図６Ａ〜６Ｂに示すような形状であっても、その他の形状（楕円や菱形など）であってもよい。より高密度で均一な直径を有するスフェロイドを形成させるためには、左右対称構造であることが好ましい。
培養空間１１の側面の形状は、図４に示す形状に限定されるものではなく、例えば、図７Ａ〜７Ｃに示すような形状であってもよい。
【００２７】
培養容器１０を構成する材料としては、アクリル系樹脂、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、スチレン系樹脂、アクリル・スチレン系共重合樹脂、ポリカーボネート系樹脂、ポリエステル系樹脂、ポリビニルアルコール系樹脂、エチレン・ビニルアルコール系共重合樹脂、熱可塑性エラストマー、塩化ビニル系樹脂、及びシリコン樹脂のうちの１つまたはこれらの組み合わせから選択される。
【００２８】
培養容器１０の底部１３の厚さＴは、観察性の観点から、１ｍｍ以下が好ましい。ただし、顕微鏡での観察に支障をきたさない限り、１ｍｍ以上であってもよく、底部１３の厚さＴを限定するものではない。培養容器の底部１３の観察性を確保することにより、培養プレートをそのまま用いて、培養したスフェロイドを観察することが可能になる。培養容器の観察性を確保することにより、培養容器をそのまま用いて、免疫組織学法による蛍光染色観察や、Green Fluorescent Protein（ＧＦＰ）などのレポータ遺伝子を使用したin situ法が可能となる。
【００２９】
＊  培養表面の特性
次に、細胞を培養する培養表面、すなわち、培養空間１１を囲む壁１２及び底部培養面１４の特性、特に親水化処理について説明する。培養表面は、各培養空間１１内に培地を入れるため、また、コーティング溶液を用いる場合には、その溶液が培養空間１１内に入り込まなければ表面を覆うことができない。このため、水接触角を４５度以下にすることが好ましい。より好ましくは０度〜２０度の範囲である。また、水接触角の値は、培養空間１１と壁１２の凹凸パターンが形成されていない平板を、培養容器１０と同条件で作製して測定した値を前提とする。
【００３０】
培養空間１１をアレイ状に配置した表面に関して、当該表面の疎水性が高く水接触角が４５度を超えると、すなわち濡れ性が低い場合は、培地やコート溶液を添加した際、空間に気泡が入りやすくなり、細胞が培養できない空間が生じることがある。そのため、水接触角が４５度以下になるよう、親水化を行うことが必要である。親水化する方法としては、ＳｉＯ２を蒸着する方法や、プラズマ処理を行う方法が挙げられる。
【００３１】
加えて、培養容器１０で効率よくスフェロイドを形成させるため、細胞接着性を抑制することが好ましい。細胞接着性を抑制するためには、水接触角が４５度以下、好ましくは４０度以下、より好ましくは２０度以下になるような表面を用いることで可能になる。細胞接着性を抑制することと、水接触角との関係については、例えば、Y Ikada著、"Surface modification of polymers for medical applications"、 Biomaterials 1994, vol.15 No.10, pp725-736に記載されている。水接触角を４５度以下にする方法としては、ガラスを底部培養面１４に蒸着する方法、プラズマ処理法を用いて、表面に官能基を形成させる方法が挙げられる。プラズマ処理などにより、表面に官能基を形成させる。
また、水接触角を４５度以下にすることで、細胞接着性を抑制する物質をコートしてより接着性を抑制することにより、効率よくスフェロイドを形成させることができる。例えば、プラズマ処理を施し、水接触角を４５度以下にした後、リン脂質・高分子複合体やポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）をコートしてもよい。
【００３２】
２．株化肝細胞の培養・評価方法
次に、株化肝細胞を培養し、サイトカインがチトクロムＰ４５０の代謝能に及ぼす影響を評価するまでの方法について説明する。
＊  培養・評価方法の概略
一実施形態の培養から評価までには、例えば、次の（Ａ）から（Ｆ）の工程を実施する。
（Ａ）ヒト由来の株化肝細胞を培養し、スフェロイドを形成させる工程（スフェロイド形成処理）。
（Ｂ）同じ一つのウェル２１から培地を吸い取る工程（培地吸引処理）。
（Ｃ）同じ一つのウェル２１へ、サイトカインを含む試験溶液またはコントロール溶液を添加する工程（試験溶液添加処理）。
（Ｄ）同じ一つのウェル２１内で、サイトカインを含む試験溶液と、スフェロイド形状の株化肝細胞とを１時間以上９６時間未満、接触させる工程（接触処理）。
（Ｅ）チトクロムＰ４５０の代謝機能を分析する工程(分析処理)。
（Ｆ）分析した結果を評価する工程（評価処理）。
【００３３】
一実施形態の評価方法は、操作性の観点から、複数のウェルを備える培養プレートを用いることが好ましい。特に、株化肝細胞をスフェロイド形状に培養するスフェロイド形成処理（工程Ａ）と、サイトカインを含む試験溶液を所定の時間、培養した細胞に接触させる接触処理（工程Ｄ）とを同一のウェル内で行うことがより好ましい。そのため、一実施形態では、図１に示す培養プレート１の複数のウェル２１を用い、複数のウェル２１のうち、一つのウェル２１内でスフェロイド形成処理から接触処理までの各工程を実施する。言い換えると、一つのウェル内で培養から評価までの処理において、各工程の途中で細胞を別のウェル２１に移動させることはない。
【００３４】
＊工程Ａ  スフェロイド形成処理
工程Ａのスフェロイド形成処理では、上述した培養容器１０を用いて、１０％血清を含む培地でヒト由来の株化肝細胞を培養し、所望のサイズのスフェロイドを形成させる。
形成されたスフェロイドは、少なくともその一部分が壁１２または底部培養面１４に接着している。
スフェロイド形状の株化肝細胞を得る方法として、ローラーボトル培養、スピナーフラスコ培養、ハンギングドロップ培養など特に限定されない。しかし、これらの方法では培養方法に応じた装置を使用するため、スフェロイド形成処理と接触処理とを別々の容器で行う必要が生じる。発明者らは、上述した培養容器１０が形成されたウェル２１を用いることにより、同一の容器でスフェロイド形成処理と接触処理とを実施できることを発見した。これにより、操作が簡便になり、形成したスフェロイドを移動させることなく、細胞をサイトカインと接触させることが可能になる。特に、多くの化合物を一度に評価するような医薬品のスクリーニングにおいて、自動培養装置に利用することが可能となる。加えて、細胞の損傷や汚染を防止することが可能になる。
【００３５】
スフェロイドを形成するための培養容器１０の好ましいサイズについては上述したが、スフェロイド形成処理から接触処理を実施する場合には、特に次の培養容器１０のサイズが好ましいことを発見した。
培養容器１０は、高さＨを相当直径Ｄで割った値が０．３〜２の範囲であって、相当直径Ｄが１００μｍ〜１０００μｍの範囲の培養空間１１が、少なくとも２個以上配置されていることが好ましい。加えて、培養空間１１を隔てる壁１２の幅Ｗは２μｍから５０μｍの範囲であることが好ましい。このような培養容器１０を用いることで、簡単にかつ均一な直径のスフェロイドを得ることができる。
【００３６】
培養空間１１を有する培養容器１０で効率よくスフェロイドを形成させるためには、細胞接着を抑制する方が好ましい。一方、培地交換や試験溶液交換の際にスフェロイドが培養空間１１から離脱することを防ぐ目的から、スフェロイドの一部は培養表面（壁１２の表面または底部培養面１４）に接着している方が好ましい。そのため、培養表面への細胞の接着を阻害するポリマーと、培養表面への細胞の接着を促進するポリマーとの混合物との混合物を培養表面にコートしてもよい。培養表面への細胞の接着を阻害するポリマーは、細胞接着を阻害する親水性のポリマー鎖、リン脂質、リン脂質・高分子複合体、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）（ＰＨＥＭＡ）、ポリビニルアルコール、アガロース、キトサン、ポリエチレングリコール、及びアルブミン、のグループから選択される一つまたはこれら組合せからなるポリマーである。細胞接着性を促進するポリマーは、ポリ−Ｌ−リシン、ポリ−Ｄ−リシン、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチンのグループからから選択される一つまたはこれら組合せからなるポリマーである。コート溶液の一例として、リン脂質、リン脂質・高分子複合体である２−メタ  クリロイルオキシエチルホスホリスコリン（ＭＰＣ）ポリマーとポリ−Ｌ−リシン溶液との混合物が挙げられる。ＭＰＣ溶液濃度は０．００１％〜１％の範囲が好ましく、０．０１％〜０．１％の範囲がより好ましい。ポリ−Ｌ−リシン溶液の濃度は０．００１〜０．１％の範囲が好ましく、０．００５〜０．０１５％の範囲がより好ましい。ＭＰＣ溶液とポリ−Ｌ−リシン溶液の混合比は５０：５０〜１００：０の範囲が好ましく、７５：２５〜９０：１０の範囲がより好ましい。
【００３７】
培養容器１０を用いてスフェロイド形成を行う場合の細胞播種密度は特に限定されないが、５０００個／ｃｍ２〜１，０００，０００個／ｃｍ２の範囲が好ましく、５０〜１５０μｍの直径のスフェロイドを形成させるためには、５０個〜２５０個の細胞が１１の区画に存在していることが好ましいことから、１００，０００個／ｃｍ２〜５００，０００個／ｃｍ２の範囲がより好ましい。スフェロイドを形成させるための培養時間は１日〜１５日であればよい。
【００３８】
＊  工程Ｂ  吸引処理
培地の吸引は、例えば、パスツールピペットを用いて吸引する。スフェロイド形成処理で用いた培地は、全量を吸引することが好ましい。これは、培地に含まれる血清の影響を除去するためである。加えて、培地の吸引では、培養空間１１に形成されたスフェロイドが、培養空間１１の壁１２または底部培養面１４と接着している状態を維持するように留意する。スフェロイドが壁１２または底部培養面１４に接着している状態を維持することにより、他の培養空間１１に形成されたスフェロイドと接着することを防止できるからである。加えて、試験溶液を交換する際及びそのための洗浄操作により細胞が剥離すると試験できなくなるので細胞を培養空間１１に接着させておいた方がよい。
【００３９】
＊  工程Ｃ  試験溶液添加処理
工程Ｃの試験溶液添加処理では、試験溶液とコントロール溶液とのいずれかをウェル２１へ添加する。コントロール溶液は、試験溶液を添加する実施例に対する比較例として用いる。
試験溶液は、血清中に含まれるサイトカインによる細胞への影響を排除するために血清を含まないことが好ましい。一方で、試験溶液と細胞を４８時間以上接触させる場合は細胞の生理機能を保つため０．１〜１％の範囲の血清を加えても良い。
試験溶液の溶媒は２００〜３１５ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧であって、ｐＨ域が６．８〜８．４に緩衝作用があればよい。加えて、細胞の生理機能を一定に保つためには、グルコース及びアミノ酸、ビタミン類などの栄養素が含まれているものを使用することが好ましい。例えばダルベッコ変法イーグル培地（DMEM: Dulbecco's modified Eagle medium）とNutrient Mixture F-12の混合培地を用いることで生理機能が一定に保たれる。
コントロール溶液は、上述した試験溶液からサイトカインを除いた溶液であり、他の条件は試験溶液と同一とする。
【００４０】
試験溶液のサイトカイン濃度は、基準値を設定し、基準値に対して少なくとも３種類の異なる濃度を用いる。基準値は、対象とする疾患患者のサイトカインの血中濃度の平均値を基準に、０．１倍〜５０倍の範囲の濃度を設定する。一方、疾患患者の血中サイトカイン濃度が明らかでない場合には、基準値は、健常人のサイトカインの血中濃度の平均値の０．１倍〜５０倍の範囲の濃度を設定する。そして、基準値に対して少なくとも３種類の異なる濃度、例えば、１倍、１０倍、１００倍の３種類の濃度のサイトカインを含む試験溶液を用いる。対象とする疾患患者のサイトカインの血中濃度を基準とすることにより、サイトカインによるチトクロムＰ４５０の減衰または誘導を評価し、サイトカインの影響を把握することにより疾患患者の投薬量の調整等に役立てることができる。加えて、基準値に対して複数の異なる濃度を用いることにより、サイトカインによるチトクロムＰ４５０の減衰または誘導がサイトカインの濃度に依存するかを評価することができる。さらに加えて、基準値の設定方法について、生体内でのサイトカインによる代謝酵素の影響を反映させるためには、生体内での濃度で評価することが好ましいからである。
【００４１】
＊  工程Ｄ  接触処理
試験溶液またはコントロール溶液と細胞を接触させる時間（接触時間）はサイトカインの細胞毒性の度合いによって決められる。細胞毒性は、細胞死を引き起こす強さである。接触時間は、あらかじめ試験に供するサイトカイン濃度の最大値の試験溶液を用いて、１時間から９６時間の範囲で細胞と接触させ、生存率が８０％以上となる時間を採用する。例えば、１，１０，１００倍の３種類の濃度を用いる場合、基準値の１００倍のサイトカインを含む試験溶液を用いて生存率を測定する。
いずれの時間においても生存率が８０％以下となった場合は、サイトカイン濃度の基準値を低く設定し、生存率が９０％以上となる反応時間を採用する。
【００４２】
図９にスフェロイド形状の株化肝細胞と、サイトカイン（インターロイキン−１β）を含む試験溶液とを接触させる時間の長さと、チトクロムＰ４５０の反応性との関係を示す試験結果を示す。インターロイキン−１βを０時間、４時間、８時間接触させた時、経時的にＣＹＰ３Ａ４の遺伝子発現量が減少する。誤差は２０〜３０％程度であった。図９のように近似曲線を作成して接触時間１時間の値を算出した。近似曲線は、図９に示す数式を用いた。誤差２０％の時、接触時間１時間より短い場合は接触時間０時間の値に対して、有意差が見られないことが予想された。そのため、細胞とサイトカインを接触させる時間を、最低１時間とした。接触時間は評価期間を短縮するためには短いほどよい。加えて、コストも削減できる。
培養には栄養を含む培地を使用しているものの、血清を含まないため、細胞の生理機能が低下する可能性がある。また、通常培地交換は、倍地中の栄養分が完全に消費されない頻度、かつ、老廃物が蓄積して生理機能に影響を及ぼさない頻度で実施する。例えば、３〜４日毎に培地を交換する必要がある。即ち、５日以上の培養は細胞の生理活性を維持する観点から適していない。そのため、細胞とサイトカインを接触させる時間を、最大９６時間とした。
【００４３】
＊  工程Ｅ  分析処理
工程Ｅの分析処理では、試験溶液またはコントロール溶液に接触させた後の細胞を使ってチトクロムＰ４５０の代謝機能を分析する。
チトクロムＰ４５０の分析方法として、ＰＣＲ法による遺伝子発現量の測定、ウェスタンブロッティング法によるタンパク解析、または、液体クロマトグラフィー質量分析法（LC/MS/MS: Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometry）や高速液体クロマトグラフィー（HPLC: High performance liquid chromatography）を用いた代謝活性測定、などどのような手法を用いても良い。
【００４４】
＊  工程Ｆ  評価処理
工程Ｆの評価処理では、工程Ｅの分析処理で分析した代謝機能の値（測定値）に基づいて、次のように判定する。工程Ｅで分析した代謝機能の数値を、試験溶液に接触させた細胞の分析結果を「値Ｔ」、コントロール溶液に接触させた細胞の分析結果を「値Ｃ」とすると、次のように評価する。
値Ｔが値Ｃより大きい（値Ｔ＞値Ｃ）ときに、"被験物質によりチトクロムＰ４５０の代謝機能が誘導される"、と判定する。チトクロムＰ４５０の分析結果の値が増加していることにより、サイトカインがチトクロムＰ４５０の代謝機能を誘導していることがわかる。
一方、値Ｔが値Ｃより小さい（値Ｔ＜値Ｃ）ときに、"被験物質によりチトクロムＰ４５０が減衰される"と判定する。チトクロムＰ４５０の分析結果の値が減少していることにより、サイトカインがチトクロムＰ４５０の代謝機能を減衰させていることがわかる。
値Ｔと値Ｃが同じときに、"被験物質によりチトクロムＰ４５０が影響を受けない"、と判定する。
【００４５】
加えて、評価処理では、１倍、１０倍、１００倍の３種類の濃度の試験溶液と細胞を接触させた後のチトクロムＰ４５０の機能の分析結果が濃度依存的に増加したときに、"サイトカインによりチトクロムＰ４５０の代謝機能が誘導される"、または減少したときに、"サイトカインによりチトクロムＰ４５０の代謝機能が減衰される"と判定されることが好ましい。
しかし濃度依存性がない場合であっても、サイトカインを含まない試験溶液に対してチトクロムＰ４５０の機能の値が優位に高い時に"サイトカインによりチトクロムＰ４５０の代謝機能が誘導される"、または優位に低いときに、"サイトカインによりチトクロムＰ４５０の代謝機能が減衰される"と判定してもよい。
【００４６】
上述したように、一実施形態の評価方法は、ヒト由来の株化肝細胞を用い、当該株化肝細胞を培養して増殖させ、所望のサイズのスフェロイドを形成し、該スフェロイドを被験物質と接触させることによってチトクロムＰ４５０の代謝機能への影響を評価する。チトクロムＰ４５０の評価は、試験溶液またはコントロール溶液に接触させたスフェロイドの代謝機能を測定した測定値に基づいて、被験物質がチトクロムＰ４５０の代謝能に影響するかについて、減衰、誘導、影響なしのいずれかに判定される。判定結果の種類については、減衰、誘導、影響なしの評価に限られるものではなく、被験物質の影響を示す他の判定結果を用いても構わない。
【実施例】
【００４７】
実施例及び比較例について説明する。
１．細胞の準備（スフェロイド形成処理）
［実施例］
（１−１）培養容器及び細胞
図８に示す複数のウェル２１ａを有する培養プレート１ａを使用した。各ウェル２１ａの底部培養面には複数の培養容器１０ａが形成されている。各培養容器１０ａは、相当直径Ｄが２００μｍ、高さＨが１００μｍで形成される培養空間１１ａを有する。また、壁１２ａの幅Ｗは１０μｍである。
培養する細胞は日本人由来の株化肝細胞であるＦＬＣ−４細胞を使用した。
（１−２）培養容器の準備
０．０１％ＭＰＣ溶液と０．０１％のポリ−Ｌ−リシン（ＳＩＭＧＡ社製）を９：１の割合で混合した溶液をコート剤として使用した。
各ウェルにコート溶液を０．３ｍＬ入れ、クリーンベンチ内で乾燥させた。
使用前にリン酸緩衝整理食塩水（PBS: phosphate-buffered saline）で洗浄した。
（１−３）細胞培養
培地は、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を使用した。細胞播種密度が１６×１０５個／ｍＬになるように細胞懸濁液を調整した。
１つのウェルあたり５００μＬの細胞懸濁液を加えた。
ＣＯ２インキュベータ内で１０日から１１日間、細胞を培養した。培地交換は３日に１回で行った。
培地交換の際、すべて培地を吸い取らず約１００μＬを残し、あらたに５００μＬの培地を加えた。
【００４８】
［比較例］
培養容器は市販の培養面が平坦な２４ウェルプレートを使用した。培養プレートのグレードは細胞培養グレードを用いた。
上記以外は実施例と同じ条件で実施した。
【００４９】
２．試験条件（培地吸引処理、試験溶液添加処理、接触処理）
実施例、比較例ともに次の条件で試験を実施した。
（２−１）手順
培養した細胞を次の手順で処理した。
・各ウェルから、古い培地の全量をピペットで吸引した（培地吸引処理）。
・各ウェルへ、試験溶液またはコントロール溶液を添加した（試験溶液添加処理）。
・８時間、２４時間または４８時間、３７℃、ＣＯ２インキュベータ内で細胞をインキュベートした（接触処理）。
（２−２）試験溶液、コントロール溶液の調整
試験溶液は、血清を含まないＤＭＥＭ／Ｆ１２の溶液（ＤＭＥＭ／Ｅ１２  ＦＢＳ  （−））に、表１の濃度になるようにサイトカインを溶解した。
コントロール溶液は、血清を含まないＤＭＥＭ／Ｆ１２の溶液を用い、サイトカイン濃度を０ｍＭとした。
（２−３）分析
表１に記載の分析方法で、ＣＹＰ３Ａ４の代謝機能を分析した。ＴＮＦ−αについては、ＣＹＰ３Ａ４に加えてＣＹＰ２Ｃ９の機能も分析した。
【００５０】
【表１】
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【００５１】
３．分析方法
（３−１）代謝活性測定法
反応後の上澄みを除去した後、５０μＭ  トリアゾラム（triazolam）を含む分析用溶液を添加し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で２４時間インキュベートした。回収した培地１５０μＬを試験管にとり、内部標準物質としてオキザゼパム（oxazepam）(0.2μg/ｍＬ in methanol)を５０μＬ添加した後、氷冷したアセトニトリル（acetonitrile）（和光純薬工業）３００μＬを加えて攪拌し、遠心分離（3000r.p.m.，１０分，４℃）することによりタンパクを沈降させた。その後、減圧エバポレーターを用いてアセトニトリルを蒸発させ、上清をフィルターろ過して得られた溶液７０μＬをＨＰＬＣに注入した。検量線用サンプルとしては、１０、４０、８０、１６０および３２０ｐｍｏｌのα-および4-hydroxytriazolamを含むメタノール溶液各１０μＬを１３０μＬの培地に加えたものを用いた。α-および4-hydroxytriazolamはＨＰＬＣにより定量した。検量線は検量線用サンプルの内部標準物質に対するα-および4-hydroxytriazolamのピークの高さの比を最小二乗法により直線回帰を行うことにより求めた。
【００５２】
（３−２）遺伝子解析法（RT-qPCR）
ＲＮＡ抽出は、培養プレート１ａの２ウェル２１ａ分を１サンプルとして、NucleoSpin RNAII (Macherey-Nagel)のプロトコルに従って抽出した。Dnase処理の部分のみ改変して、DNaseI recombinant, RNase-free (Roche , Branchburg, NJ, USA)を使用した。全ＲＮＡ（Total RNA）はHigh-Capacity cDNA Reverse Transcription Kits (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)および付属のrandom hexamer primer を用いて逆転写反応し、first strand cDNAを合成した。
解析は、全量２０μＬ中に、 ９．６μＬ EagleTaq Master Mix with ROX (Roche, Branchburg, NJ, USA)、 ０．９６μＬ  ２０×Assays-on-DemandTM Gene Expression Assay Mix (Applied Biosystems) 、７．１μＬ  sterilized MiliQ waterおよび5倍希釈したcDNA １．８μＬを加えたものを反応液としてReal-time PCRで測定した。
【００５３】
（３−３）ウェスタンブロッティング法（ＷＢ）
３〜６ウェル分の細胞を０．１％のprotease inhibitor cocktailおよび１ｍＭ  ＰＭＳＦ （Phenylmethyl sulfonyl fluoride）を含むLysis bufferでソニケーションした後、１２０００ｇで１５分間遠心し、その上清を全細胞抽出液とした。得られた全細胞抽出液（10-15 μg/lane）を１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離したのち、ニトロセルロース膜に２時間、５４Ｖの電圧で転写した。転写後のニトロセルロース膜は５％  スキムミルクを加えた０．０５％Tweem２０含有ＰＢＳ（PBST）を用いて、室温で１時間振とうしてブロッキングを行った。一次抗体はanti-human CYP3A antibody (monoclonal, BD Gentest) を、３％ＢＳＡを加えたＰＢＳＴで６０００倍に希釈したものを用いて４℃で一晩インキュベートした。二次抗体はanti-mouse IgG-peroxydase antibody (Sigma-Aldrich) を、３％ＢＳＡを加えたＰＢＳＴで５０００倍に希釈したものを用い、室温で１時間振とうした。タンパクはImmunoStar LD (和光純薬)を使用し、LAS-1000 plus (Fujifilm, Tokyo)で検出した。
【００５４】
４．試験結果
図１０乃至１８に試験結果を示す。図中、実施例は"ＭＩＣＲＯ−ＳＰＡＣＥ"、比較例は"ＣＯＮＦＬＵＥＮＴ"で示す。また、細胞へコントロール溶液を添加した場合（非添加群）を、"ＵＮＴ"（Untreated）と示し、試験溶液を添加した場合を、添加したサイトカインの濃度（例えば、０．１ｎｇ／ｍＬ）で示す。図１０乃至１５に示す結果は、正副３回の独立した実験の標平均値に標準偏差を加えた値である。
図１０の試験結果を得た操作では、ＦＬＣ−４細胞を１０日間培養した。培養した細胞へ、コントロール溶液または０．１ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ、及び１０ｎｇ／ｍＬの上皮成長因子（EFG: Epidermal Growth Factor）を含む試験溶液を添加し、２４時間培養した。図１０は、培養後の４種類のＥＧＦ濃度の細胞について、ＣＹＰ３Ａ４  ｍＲＮＡの発現量をＲＴ−ｑＰＣＲで分析した結果を示す。
図１１の試験結果を得た操作では、ＦＬＣ−４細胞を１０日間培養した。培養した細胞へ、コントロール溶液または１ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、及び１００ｎｇ／ｍＬのヘパリン結合性上皮増殖因子様増殖因子（HB-EGF）を含む試験溶液を添加し、２４時間培養した。図１１は、培養後の４種類のＨＢ−ＥＧＦ濃度の細胞について、ＣＹＰ３Ａ４  ｍＲＮＡの発現量をＲＴ−ｑＰＣＲで分析した結果を示す。
【００５５】
図１２の試験結果を得た操作では、ＦＬＣ−４細胞を１０日間培養した。培養した細胞へ、コントロール溶液または１ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、及び１００ｎｇ／ｍＬのインターロイキン‐１β（IL-1β）を含む試験溶液を添加し、２４時間培養した。図１２は、培養後の４種類のＩＬ−1β濃度の細胞について、ＣＹＰ３Ａ４  ｍＲＮＡの発現量をＲＴ−ｑＰＣＲで分析した結果を示す。
図１３、１４の試験結果を得た操作では、ＦＬＣ−４細胞を１０日間培養した。培養した細胞へ、コントロール溶液または０．１ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ、及び１０ｎｇ／ｍＬの腫瘍壊死因子（TNF-α:Tumor Necrosis Factor-α）を含む試験溶液を添加し、２４時間培養した。図１３、１４は、培養後の４種類のＥＧＦ濃度の細胞について、ＣＹＰ３Ａ４（図１３）及びＣＹＰ２Ｃ９（図１４）  ｍＲＮＡの発現量をＲＴ−ｑＰＣＲで分析した結果を示す。
【００５６】
図１５の試験結果を得た操作では、ＦＬＣ−４細胞を１０日間培養した。培養した細胞へ、コントロール溶液または０．１ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ、及び１０ｎｇ／ｍＬのインターロイキン‐６（IL-6: Interluekin-6）を含む試験溶液を添加し、２４時間培養した。図１５は、培養後の４種類のＩＬ−６濃度の細胞について、ＣＹＰ３Ａ４  ｍＲＮＡの発現量をＲＴ−ｑＰＣＲで分析した結果を示す。
図１６の試験結果を得た操作では、ＦＬＣ−４細胞を１０日間培養した。培養した細胞へ、コントロール溶液または０．１ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ、及び１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−６を含む試験溶液を添加し、４８時間培養し、その後５０μｇ／ｍＬのトリアゾラム（triazolam）を添加し、２４時間培養した。図１５は、培養後の４種類のＩＬ−６濃度の細胞について、ＣＹＰ３Ａ４  タンパク量をウェスタンプロッティング法で分析した結果を示す。
【００５７】
図１７に、サイトカインの濃度依存性の試験結果を示す。
図１８に、評価処理で説明した手法に基づいて試験結果を判定した結果を示す。図１８中、項目「サイトカインの影響」は、試験溶液を添加した細胞（サイトカイン添加群）とコントロール溶液を添加した細胞（非添加群）との比較から判定した試験結果であり、項目「濃度依存性」は、異なるサイトカイン濃度の試験結果に基づいて、濃度依存性を判定した試験結果を示す。図１８中、「−」は判定できなかったことを示す。
【００５８】
実施例ではいずれのサイトカインも、コントロール（サイトカイン濃度０ｍＭ）に対し優位にＣＹＰ３Ａ４の遺伝子発現量の減少が確認できた。
比較例ではコントロール（サイトカイン濃度０ｍＭ）に対し優位にＣＹＰ３Ａ４の遺伝子発現量が減少することはなかった。
上述した実施例で用いたサイトカインは一例であり、他のサイトカインであっても一実施形態の評価方法を適用することができることは言うまでもない。
【００５９】
なお、本発明は上記に示す実施形態に限定されるものではない。本発明の範囲において、上記実施形態の各要素を、当業者であれば容易に考えうる内容に変更、追加、変換することが可能である。
【符号の説明】
【００６０】
１、１ａ  培養プレート
８  細胞
９  スフェロイド
１０、１０ａ  培養容器
１１、１１ａ  培養空間
１２  壁
１３  底部
１４  底部培養面
２１、２１ａ  ウェル
２２  仕切り部
【図１】
2014064544.tif 000004
【図２Ａ】
2014064544.tif 000005
【図２Ｂ】
2014064544.tif 000006
【図３】
2014064544.tif 000007
【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
2014064544.tif 000013
【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図９】
2014064544.tif 000016
【図１７】
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【図１８】
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【図８】
2014064544.tif 000019
【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年1月24日(2014.1.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サイトカインがチトクロムＰ４５０の代謝能に及ぼす影響を評価する方法であって、
株化肝細胞を培養してスフェロイド形状の株化肝細胞を形成し、前記スフェロイド形状の株化肝細胞と、サイトカインを含む試験溶液とを培養容器内で１時間以上９６時間未満接触させた後に、チトクロムＰ４５０の代謝機能の誘導または減衰の有無を評価する方法。
【請求項２】
前記株化肝細胞から形成されたスフェロイドの直径の平均値が５０μｍ以上２００μｍ未満であって、かつ、半値幅範囲内の直径を有するスフェロイドが全スフェロイドの７０％以上であることを特徴とする請求項１の方法。
【請求項３】
前記試験溶液が無血清培地であることを特徴とする請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
前記試験溶液のサイトカイン濃度が、健常人のサイトカインの血中濃度の平均値の０．１倍から５０倍の範囲のうちの一つの濃度を基準に、前記基準の少なくとも１倍、１０倍、１００倍の３濃度の前記サイトカインを含む各試験溶液を用いることを特徴とする請求項１乃至３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記試験溶液のサイトカインの濃度が、前記サイトカインが分泌される疾患患者の血中濃度の平均値の０．１倍から５０倍の範囲のうちの一つの濃度を基準に、前記基準の少なくとも１倍、１０倍、１００倍の３濃度のサイトカインを含む各試験溶液を用いることを特徴とする請求項１乃至３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記株化肝細胞をスフェロイド形状に培養する工程と、スフェロイド形状の前記株化肝細胞と前記サイトカインを含む前記試験溶液とを１時間以上９６時間未満接触させる工程とを、同一のウェル内で行うことを特徴とする請求項１乃至５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記培養容器として、複数のウェルを有する培養プレートの一つのウェルを用い、
前記一つのウェル内に１０％血清を含む培地で前記株化肝細胞のスフェロイドを形成させる工程と、
前記一つのウェルから前記培地を吸い取る工程と、
前記一つのウェルへ、前記サイトカインを含む前記試験溶液を添加する工程と、
前記一つのウェル内で、前記サイトカインを含む前記試験溶液と、前記スフェロイドとを１時間以上９６時間未満接触させる工程と、を行うことを特徴とする請求項１乃至６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記培養容器は、複数のウェルを有する培養プレートの各ウェル内に、複数の培養空間を有するように形成され、
各培養空間は、相当直径の長さを有する面と、高さとからなる空間であり、前記高さを前記相当直径で割った値が０．３から２の範囲であり、
前記培養空間の底に、前記相当直径が１００μｍから１０００μｍの範囲の培養空間が少なくとも２個以上配置されていることを特徴とする請求項１乃至７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記複数の培養空間は、隣り合う前記培養空間を隔てる壁の厚さが２μｍから５０μｍの範囲であることを特徴とする請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記培養空間を隔てる壁の上面と側面とがなす角度が９０度から１３５度の範囲であることを特徴とする請求項８または９記載の方法。
【請求項１１】
前記複数の培養空間の底の表面が、ガラス処理により、水接触角を４５度以下になるように処理されたことを特徴とする請求項８乃至１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記複数の培養空間の底の表面が、プラズマ処理により官能基を形成させて、水接触角を４５度以下になるように処理されたことを特徴とする請求項８乃至１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記培養容器の表面は、ポリマー温度、光のいずれかにより親水性と疎水性とが変化するポリマー、細胞接着を阻害する親水性のポリマー鎖、リン脂質、リン脂質・高分子複合体、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）（ＰＨＥＭＡ）、ポリビニルアルコール、アガロース、キトサン、ポリエチレングリコール、及びアルブミンのグループから選択される一つ、または組合せからなるポリマーが、固定化されていること特徴とする請求項１乃至１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記培養容器の表面は、細胞接着を阻害する親水性のポリマー鎖、リン脂質、リン脂質・高分子複合体、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）（ＰＨＥＭＡ）、ポリビニルアルコール、アガロース、キトサン、ポリエチレングリコール、及びアルブミンのグループから選択される一つ、またはこれら組合せからなるポリマーと、細胞接着性を促進するポリマーである、ポリ−Ｌ−リシン、コラーゲン、ラミニン、及びフィブロネクチンから選択される一つ、またはこれら組合せからなるポリマーとの混合物が固定化されていることを特徴とする請求項１乃至１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記培養容器が、アクリル系樹脂、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、スチレン系樹脂、アクリル・スチレン系共重合樹脂、ポリカーボネート系樹脂、ポリエステル系樹脂、ポリビニルアルコール系樹脂、エチレン・ビニルアルコール系共重合樹脂、熱可塑性エラストマー、塩化ビニル系樹脂、及びシリコン樹脂のグループから選択される一つまたはこれらの組み合わせからなる樹脂成形品であることを特徴とする請求項１乃至１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記培養容器の底部を構成するポリマーの全光線透過率が８５％以上９９％未満であることを特徴とする請求項１乃至１５のいずれか一項に記載の方法。