(57)【要約】【課題】神経細胞の遊走の程度に基づく疾患の判定や薬物の遊走能への効果の測定をする上で結果の信頼性および再現性が十分なインビトロ細胞遊走アッセイを提供することを課題とする。【解決手段】神経細胞の凝集塊を、精製アルブミンを含むバッファー液中でインキュベートすることにより、上記の課題を解決する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体から採取した脳組織から神経細胞を取得する工程と、
得られた神経細胞の凝集塊を形成させる工程と、
形成された凝集塊を、精製アルブミンを含むバッファー液中でインキュベートし、遊走させる工程と
神経細胞の遊走の程度を測定する工程と、
遊走の程度に基づいて、前記生体が神経細胞の遊走障害を伴う疾患であるか否かを判定する工程と
を含むことを特徴とする、
神経細胞の遊走障害を伴う疾患の判定方法。
【請求項２】
神経細胞の遊走障害を伴う疾患の生体から採取した脳組織から神経細胞を取得する工程と、
得られた神経細胞の凝集塊を形成させる工程と、
形成された凝集塊を、試験物質および精製アルブミンを含むバッファー液中でインキュベートし、遊走させる工程と、
神経細胞の遊走の程度を測定する工程と、
遊走の程度に基づいて、前記試験物質が神経細胞の遊走活性に与える影響を評価する工程と
を含むことを特徴とする、
試験物質の神経細胞の遊走活性に与える影響の評価方法。
【請求項３】
前記精製アルブミンが、有機溶媒を用いる沈殿、アルコール分画、熱処理および低温処理、低ｐＨ処理、結晶化、クロマトグラフィ、電気泳動、およびチャコール処理から選択される少なくとも１つの方法により精製されたアルブミンである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記精製アルブミンが、グロブリンを実質的に含まない血清アルブミンである、請求項１〜３のいずれか１つに記載の方法。
【請求項５】
前記神経細胞の遊走障害を伴う疾患が、遊走に関連する機能を有する遺伝子の変異に起因する、請求項１〜４のいずれか１つに記載の方法。
【請求項６】
前記神経細胞の遊走障害を伴う疾患が、ＬＩＳ１遺伝子の変異に起因する、請求項１〜５のいずれか１つに記載の方法。
【請求項７】
前記神経細胞の遊走障害を伴う疾患が、滑脳症である、請求項１〜６のいずれか１つに記載の方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１つに記載の方法において用いられる、精製アルブミンを含むバッファー液。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経細胞の遊走障害を伴う疾患の判定方法に関する。
また、本発明は、試験物質の神経細胞の遊走活性に与える影響の評価方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
滑脳症は、脳回（大脳皮質のしわ）の欠如、神経細胞の層構造の異常を伴う中枢神経系の先天的な遺伝子疾患の１つであり、知能障害やてんかん、麻痺を伴い、根治療法はいまだ確立されていない。日本では、新生児１５０００人に１人の割合で発症する。古典的Ｉ型滑脳症は、約６０％が１７番染色体に存在するＬＩＳ１遺伝子のヘテロ変異に起因し、当該変異によるＬＩＳ１の機能不全が神経細胞の遊走の異常を引き起こすことで発症すると考えられている。
【０００３】
非特許文献１において、本発明者は、カルパイン阻害剤を用いるインビトロ細胞遊走アッセイにより、滑脳症モデル（ＬＩＳ１遺伝子ヘテロ欠損）マウスの細胞内におけるＬＩＳ１タンパク質の発現量を正常レベルまで回復させ、その滑脳症（様）症状を個体レベルで改善すると共に、野生型マウスに対する副作用がほとんどないことを示している。このことから、非特許文献１に記載されるような細胞遊走アッセイを神経細胞の遊走の程度に基づく疾患の判定や薬物の遊走能への効果の測定に利用し、滑脳症の治療方法を確立することに対する期待が高まっている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Yamada M.ら、Nature Medicine, 2009, vol.15, p.1202-1208
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、従来の神経細胞の遊走アッセイでは、神経細胞の遊走活性を維持したまま均一な凝集塊を形成させることが困難であった。神経細胞の遊走アッセイは、通常、凝集塊の状態から開始するので、凝集塊の形成は当該アッセイにおいて重要な工程である。また、遊走アッセイでは、一般に、細胞の遊走の程度に基づいて該細胞の遊走能などを評価するが、従来のアッセイでは、遊走することが既知の神経細胞と遊走しないことが既知の神経細胞との間で遊走の程度の差が十分に大きくないため、評価結果の信頼性に影響を及ぼす。したがって、従来の神経細胞の遊走アッセイは、神経細胞の遊走の程度に基づく疾患の判定や薬物の遊走能への効果の測定に利用するには、結果の信頼性および再現性が十分に満足できるものではなかった。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、鋭意研究を重ねた結果、神経細胞の凝集塊を、精製アルブミンを含むバッファー液中でインキュベートすることにより、上記の課題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明によれば、
生体から採取した脳組織から神経細胞を取得する工程と、
得られた神経細胞の凝集塊を形成させる工程と、
形成された凝集塊を、精製アルブミンを含むバッファー液中でインキュベートし、遊走させる工程と
神経細胞の遊走の程度を測定する工程と、
遊走の程度に基づいて、前記生体が神経細胞の遊走障害を伴う疾患であるか否かを判定する工程と
を含むことを特徴とする、
神経細胞の遊走障害を伴う疾患の判定方法が提供される。
【０００８】
また、本発明によれば、
神経細胞の遊走障害を伴う疾患の生体から採取した脳組織から神経細胞を取得する工程と、
得られた神経細胞の凝集塊を形成させる工程と、
形成された凝集塊を、試験物質および精製アルブミンを含むバッファー液中でインキュベートし、遊走させる工程と、
神経細胞の遊走の程度を測定する工程と、
遊走の程度に基づいて、前記試験物質が神経細胞の遊走活性に与える影響を評価する工程と
を含むことを特徴とする、
試験物質の神経細胞の遊走活性に与える影響の評価方法が提供される。
【０００９】
更に、上記精製アルブミンを含むバッファー液自体もまた、本発明の範囲内である。
【発明の効果】
【００１０】
本発明は、神経細胞の遊走の程度に基づく疾患の判定や薬物の遊走能への効果の測定に利用するには、結果の信頼性および再現性が十分な神経細胞の遊走障害を伴う疾患の判定方法および試験物質の神経細胞の遊走活性に与える影響の評価方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１Ａおよび図１Ｂは、カルパイン阻害薬が神経顆粒細胞の遊走活性に与える影響を示す写真およびグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の測定方法の第１工程は、生体から採取した脳組織から神経細胞を取得する工程である。
生体としては、特に限定されず、哺乳類（例えば、ヒト、マウス、ラット、イヌ、ウサギ）などが挙げられる。好ましくは、生体は、ヒトまたはマウスのような哺乳動物である。脳組織としては、小脳が特に好ましい。神経細胞としては、顆粒細胞が特に好ましい。
組織から細胞を調製する方法としては、特に限定されず、トリプシンおよびDNase Iを含む適切なバッファーで処理する方法などが挙げられる。
【００１３】
本発明の測定方法の第２工程である凝集塊の形成は、例えば、上記のようにして得られた神経細胞を培地中で培養することにより行うことができる。
培地は、神経細胞を培養可能なものであれば特に限定されず、Basal Medium Eagle (BME)培地(Gibco, Sigma, Cat. 21010)、10%のウマ血清(Horse serum(HS), invitrogen)を含む10% HS/BME培地などが挙げられる。
培養温度は、好ましくは３０〜４０℃であり、より好ましくは３５〜３７℃である。
培養時間は、好ましくは７〜１０時間であり、より好ましくは８〜９時間である。
凝集塊の形成は、細胞同士の接着を容易にするために、細胞接着分子を用いて行うことが好ましい。そのような細胞接着分子としては、当該技術において、培養において足場として用いられるものであれば特に限定されず、ポリ-L-リジン、ポリ-D-リジン、ラミニン、コラーゲンなどが挙げられる。
【００１４】
精製アルブミンとは、当業者に公知の精製方法により精製されたアルブミンを意味し、好ましくはグロブリンを実質的に含まない血清アルブミンである。
アルブミンは、特に限定されず、当業者に公知のものを用いることができる。アルブミンは、公知の市販製品であってもよいし、哺乳動物（例えばヒト、ウシ、ウマ、ヤギなど）の血清などから調製したものであってもよい。
精製方法は、アルブミンを精製可能なものであれば特に限定されず、有機溶媒を用いる沈殿（例えばアルコール沈殿など）、アルコール分画（例えばコーンの低温アルコール分画など）、熱処理および低温処理、低ｐＨ処理、結晶化、クロマトグラフィ（イオン交換クロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィなど）、電気泳動、およびチャコール処理から選択される少なくとも１つの方法が挙げられる。
なお、精製アルブミンは、市販の製品であってもよい。そのような製品としては、例えばAlbumin essentially globulin-free (Sigma, A3156)などが挙げられる。
【００１５】
バッファー液は、上記の精製アルブミンを適切な溶媒に溶解させたものである。
溶媒は、神経細胞の生存および活性に影響を及ぼさないものであれば特に限定されず、当業者に公知の任意のものを用いることができるが、好ましくはMason's Mediumである。
バッファー液中の精製アルブミンの含有量は、取得した細胞の状態などに応じて適宜設定できるが、通常は５〜２５mg/mL、好ましくは８〜２０mg/mL、より好ましくは１０〜１５mg/mLである。
バッファー液は、任意にその他の成分を含んでいてもよい。そのような成分としては、例えばN2-Supplement (Gibco, Cat. 17502-048)のような栄養ストック液、ペニシリンおよびストレプトマイシンのような抗生物質などが挙げられる。
バッファー液中のその他の成分の含有量は、当業者が適宜設定することができる。
【００１６】
本発明の測定方法の第３工程であるインキュベーション・遊走工程は、上記の精製アルブミンを含むバッファー液中で神経細胞をインキュベートすることにより行う。
インキュベーション時の温度は、３０〜４０℃、好ましくは３５〜３８℃、より好ましくは３６〜３７℃である。
インキュベーション時間は、１〜２４時間、好ましくは３〜１２時間、より好ましくは６〜９時間である。
インキュベーション・遊走工程は、下記の遊走距離の測定を容易にするために、固体支持体上で行うことが好ましい。固体支持体としては、特に限定されず、カバーガラス（例えばMatsunami；24mm×24mm）、スライドガラス、培養皿などが挙げられる。
【００１７】
その後、任意に、下記の第４工程の前に、上記神経細胞の遊走活性に影響し得る因子、例えば遺伝子またはＲＮＡなどを導入する工程を行ってもよい。そのような因子の導入方法としては、特に限定されず、当業者に公知の任意の形質導入法、例えばNeon(登録商標)を用いるエレクトロポレーションなど、およびＲＮＡ干渉を用いる方法などが挙げられる。
【００１８】
本発明の判定方法の第４工程は、神経細胞の遊走の程度を測定する工程である。
本明細書において、「遊走の程度」とは、遊走した細胞の数、および細胞の遊走距離またはこれに基づいて算出される面積から取得される、細胞の遊走能を示すデータを意図する。距離としては、例えば、凝集塊の辺縁からの距離、凝集塊の中心からの距離などが挙げられる。面積としては、例えば、各細胞が遊走した領域の面積、遊走した全細胞を包含する領域の面積などが挙げられる。
【００１９】
本発明の好ましい実施形態においては、略円形となるように置かれた神経細胞の凝集塊を円と仮定してその周を０μｍとし、当該仮定した円の半径をｒμｍとしたときに、（ｒ＋２０ｎ）μｍの半径を有する同心円内に存在する遊走後の神経細胞数から、（ｒ＋２０（ｎ−１））μｍの半径を有する同心円内に存在する遊走後の神経細胞数を減算することにより得られた値を（２０ｎ−１０）μｍの遊走距離を示す細胞数の全細胞数に対する割合（％）として遊走の程度を表す。但し、ｎは１〜１１の整数であり、ｎ≧１２のときに得られる細胞数は、ｎ＝１１のときの細胞数に含めることとする。
【００２０】
本発明の別の好ましい実施形態においては、公知の共焦点レーザー顕微鏡及び画像解析ソフトを用いて、２０μｍごとの半径で描いた各同心円の区画内において、染色された細胞核の数を細胞数としてカウントし、全細胞数に対する割合（％）として遊走の程度を表す。画像解析ソフトとしては、例えば、TCS-SP5共焦点レーザー顕微鏡(Leica)に搭載された解析ソフトが挙げられる。
【００２１】
遊走の程度の測定の際、任意に染色用試薬を用いて細胞を染色してもよい。そのような試薬としては、特に限定されず、Hoechst、DAPIなどの当業者に公知の細胞核染色用試薬、ならびに当業者に公知の酵素、蛍光物質、発光物質、放射性同位体元素、ビオチンおよびアビジンなどで標識された標識抗体などが挙げられる。
遊走の程度の測定に用いる顕微鏡としては、特に限定されず、共焦点型顕微鏡、例えばTCS-SP5共焦点レーザー顕微鏡(Leica)、および倒立型顕微鏡などが挙げられる。
【００２２】
本発明の判定方法の第５工程は、遊走の程度に基づいて、生体が神経細胞の遊走障害を伴う疾患を有する否かを判定する工程である。
判定の手法としては、遊走の程度が小さいとき、生体が神経細胞の遊走障害を伴う疾患を有すると判定する。この判定は、神経細胞の遊走の程度に関するデータの蓄積により経験的に行うことができるが、より高い精度で判定するために、所定の閾値との比較により判定することが好ましい。そのような閾値は、例えば、遊走することが既知の細胞および遊走しないことが既知の細胞の遊走の程度に基づいて適宜決定することができる。本発明の好ましい実施形態においては、第４工程で得られる遊走距離に基づいて、１０〜２１０μｍの遊走距離を示す細胞数を１００％と設定し、１０μｍの遊走距離を示す細胞数が５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上であるとき、生体が神経細胞の遊走障害を伴う疾患を有すると判定する。
【００２３】
本発明のもう１つの態様は、
神経細胞の遊走障害を伴う疾患の生体から採取した脳組織から神経細胞を取得する工程と、
得られた神経細胞の凝集塊を形成させる工程と、
形成された凝集塊を、試験物質および精製アルブミンを含むバッファー液中でインキュベートし、遊走させる工程と、
神経細胞の遊走の程度を測定する工程と、
遊走の程度に基づいて、前記試験物質が神経細胞の遊走活性に与える影響を評価する工程と
を含むことを特徴とする、
試験物質の神経細胞の遊走活性に与える影響の評価方法である。
【００２４】
神経細胞の遊走障害を伴う疾患としては、特に限定されず、遊走に関連する機能を有する遺伝子（例えばヒト１７番染色体に存在するＬＩＳ１、X染色体上のダブルコルチン（DCX）、リーリン(Reln)、14-3-3εなど）の変異、欠失および置換などに起因する疾患である。このような疾患の例としては、滑脳症、多小脳回、脳室周囲異所性灰白質、丸石様皮質異形成などが挙げられる。
本発明の１つの実施形態において、神経細胞の遊走障害を伴う疾患は、ヒトの１７番染色体に存在するＬＩＳ１遺伝子のヘテロ変異（ハプロ不全）に起因する滑脳症である。
【００２５】
本発明の評価方法の第１工程は、生体が、上記神経細胞の遊走障害を伴う疾患を罹患するものに限定されることを除いては、上記の測定方法の第１工程と同様である。
本発明の評価方法の第２工程は、上記の測定方法の第２工程と同様である。
【００２６】
本発明の評価方法の第３工程は、形成された凝集塊を、試験物質および精製アルブミンを含むバッファー液中でインキュベートし、遊走させる工程である。
試験物質は、特に限定されず、当業者に公知の任意の化合物またはその塩、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなどが挙げられ、神経細胞の遊走障害に対する影響を評価するために添加される。試験物質は、好ましくはシステインプロテアーゼ阻害薬またはカルパイン阻害薬であり、より好ましくはカルパイン阻害薬である。
その後、任意に、上記神経細胞の遊走活性に影響し得る因子の導入工程を行ってもよい。
本発明の評価方法の第４工程は、上記の判定方法の第４工程と同様である。
【００２７】
本発明の評価方法の第５工程は、測定した距離に基づいて、前記試験物質が神経細胞の遊走の程度に与える影響を評価する工程である。
評価の手法としては、試験物質を添加しない場合の神経細胞の遊走の程度と比較して、試験物質を添加する場合の神経細胞の遊走の程度が増大するとき、当該試験物質が神経細胞の遊走の程度に影響を与えたと評価する。本発明の好ましい実施形態においては、上記の第４工程で得られる遊走距離に基づいて、１０〜２１０μｍの遊走距離を示す細胞数を１００％と設定し、試験物質を添加しない場合と比較して、試験物質を添加する場合に１０μｍの遊走距離を示す細胞数が３０％以上、好ましくは４０％以上、より好ましくは５０％以上低減するとき、当該試験物質が神経細胞の遊走の程度に影響を与えたと評価する。
【００２８】
以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００２９】
実施例１：マウス小脳由来の顆粒細胞凝集塊を用いたインビトロ神経細胞遊走活性測定法
（材料）
・マウス；生後2-6日（C57BL/6）
・CF-HBSS
HBSS (Hank's Balanced Salt Solution; Sigma, Cat. H8264)     200 ml
1M MgCl2 (最終濃度5ｍM)                                       1 ml
グルコース (最終濃度4ｍg/ml)                                  0.8 g
Penicillin/Streptomycin (Gibco, Cat. 15140-122)               2 ml
【００３０】
・Trypsin-HBSS                                                    10 ml
CF-HBSS                                                      10 ml
2.5% trypsin (最終濃度0.025 %)                              100 μl
10 mg/ml DNaseI (最終濃度0.0013 %)                            6.3 μl
【００３１】
・DNase Medium                                                     5 ml
BME (Basal Medium Eagle; Gibco, Sigma, Cat. 21010)            4.5 ml
10 % ウマ血清(Horse Serum; HS)                                0.5 ml
2.5% trypsin (最終濃度0.025 %)                              100 μl
10 mg/ml DNaseI (最終濃度25 μg/ml)                          12.5 μl
【００３２】
・Mason's Medium                                                  100 ml
Nutrient Stock (N2-Supplement; Gibco, Cat. 17502-048)          1.0 ml
ウシ血清由来精製アルブミン (Albumin essentially globulin-free (Sigma, A3156
))
1.0ｇ
Penicillin/Streptomycin                                        1 ml
【００３３】
カバーガラスのコーティング
予め、カバーガラス(Matsunami; 24mm X 24mm)を1ｍM 塩酸で洗浄後、大量の流水ですすぎ、70％EtOHに浸した後に乾燥させた。0.0002％のPoly-D-lysine (Sigma; Cat. P4707)を用いて室温で１時間、その後Laminin (Sigma, Cat； L2020)を用いて室温で１時間カバーガラスをコーティングした後、2回の振り洗いを含めて計10回洗浄した。
【００３４】
（方法）
正常または滑脳症モデル（ＬＩＳ１遺伝子ヘテロ変異モデル）の新生マウスから小脳を摘出し、10個程度の破片にした。これらの小脳片を崩さないように、チューブ(15 ml)に移した。CF-HBSS (5 ml)中に懸濁し、500 rpm x 1分間遠心し、上清を除去した。Trypsin-HBSS (10 ml)を加えて、37℃で20分間、時々タッピングしながらインキュベーションした後、500 rpm x 1分間遠心し、上清を除去した。１０％ウマ血清(HS, invitrogen)を含む５mlのBME培地(10%HS/BME)で、2回洗浄(500 rpmで遠心)した。DNase Medium (2 ml)を加えて、30回程度ピペッティングした。DNase Medium (3 ml)を加えて、1分間放置した。70 μmのメッシュ(Cell strainer, Becton Dickinson)を通した。コートしていない培養皿の上で37℃、20分間インキュベーションした。塊を崩さないように、再びチューブ(15 ml)に移し、1,500 rpm x 1分間遠心し、上清を除去した。10%HS/BME (5 ml) を加えて、500 rpm x 1分間遠心し、上清を除去した。適当な量(数ml)の10%HS/BMEを加えて、コートしていない培養皿の上で37℃、8時間インキュベーションして凝集塊を再形成させた。マイクロチューブ(1.5 ml)に丁寧に懸濁液を移し、1分間放置した後、上清を除去した。1.0〜1.2 mlのMason's Mediumを加えて、Poly-D-Lysin (SIGMA)とLaminin (SIGMA)でコートした35 mm Glass Base Dish (IWAKI)上に細胞の塊をのせて、200μＭのカルパイン阻害薬を添加したか、または添加せずに、37℃で12時間培養した。その後、Hoechstを加えて核染色し、L15(Leibivitz; Gibco)にMediumを交換して共焦点レーザー顕微鏡(TCS-SP5, Leica)にて観察した。共焦点レーザー顕微鏡(TCS-SP5, Leica)の解析ソフトを用いて、２０μｍごとの半径で描いたそれぞれの同心円の区画内の核数を細胞数として数えて全細胞数に対する割合(%)で表した。
【００３５】
結果を図１Ａおよび図１Ｂに示す。
薬剤を添加しない場合、正常な神経顆粒細胞の遊走が見られる一方、ＬＩＳ１ヘテロ変異細胞の遊走距離は小さく、大部分が１０μｍの遊走距離を示す。このことから、本発明のインビトロ細胞遊走アッセイを、神経細胞の遊走障害を伴う疾患の判定に利用できることがわかった。
また、薬剤を添加した場合、正常細胞では遊走距離に変化はあまり見られなかった一方、ＬＩＳ１ヘテロ変異細胞では、遊走した細胞の数（ｎ）が増大し、１０μｍの遊走距離を示す細胞の数は低減した。このことから、本発明のインビトロ細胞遊走アッセイを、試験物質の神経細胞の遊走活性に与える影響の評価に利用できることがわかった。
同様の実験を10回行った。これらの実験は、安定して図１Ａおよび図１Ｂと類似の結果を再現した。
【産業上の利用可能性】
【００３６】
本発明のインビトロ細胞遊走アッセイは、結果の信頼性および再現性が十分であるため、神経細胞の遊走の程度に基づく疾患の判定や薬物の遊走能への効果の測定などに利用することができる。
【図１】
2014150734.tif 000003