(57)【要約】      （修正有）【課題】脂肪移植片中の細胞膜に対する損傷を防止するために用いることができるポリマーの提供。【解決手段】ポロキシマーＰ１８８などのトリブロックコポリマーを、対象に移植する脂肪細胞または脂肪組織と混合することは、細胞膜を安定化させ、これにより軟部組織の再建または増大での脂肪移植の成功を高める。かかる方法はまた、成人幹細胞または脂肪組織由来の他の細胞の移植においても用いることができる。リポ酸などの他の剤も、細胞移植のためのポリマー／細胞組成物に加えることができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂肪由来細胞を移植するための方法であって、
脂肪由来細胞とトリブロックコポリマーとの組成物を対象に投与することを含み、ここで該コポリマーは２つの親水性尾部が側面に配置された中心疎水性コアを含み、また該コポリマーは該細胞を損傷から保護し、細胞死を防止する、前記方法。
【請求項２】
ポリマーが細胞膜を封止する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ポリマーが細胞膜を安定化する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
脂肪由来細胞が脂肪細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
脂肪由来細胞が幹細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
脂肪由来細胞が自己細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ポリマーがポリエーテルである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ポリマーがポリアルキルエーテルである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
ポリマーが、ポリアルキルエーテルと第２のポリアルキルエーテルのコポリマーである、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
ポリマーが、ポリエチレングリコールと第２のポリマーのコポリマーである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
第２のポリマーが、ポリエチレングリコールより疎水性である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ポリマーが、ポリプロピレングリコールと第２のポリマーのコポリマーである、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
第２のポリマーが、ポリプロピレングリコールより親水性である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ポリマーが、ポリエチレングリコール−ポリプロピレングリコール−ポリエチレングリコールの形態のトリブロックコポリマーである、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
ポリマーがポロキサマーＰ１８８である、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
ポリマーがポロキサマーＰ１０８である、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
ポリマーがポロキサマー１１０７である、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
ポリマーの分子量が、約１，０００ｇ／モル〜約１０，０００ｇ／モルの範囲である、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
ポリマーの分子量が、約２，０００ｇ／モル〜約１０，０００ｇ／モルの範囲である、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
ポリマーの分子量が、約３，０００ｇ／モル〜約１０，０００ｇ／モルの範囲である、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
ポリマーの分子量が、約５，０００ｇ／モル〜約１０，０００ｇ／モルの範囲である、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
ポリマーが非イオン性である、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
細胞とポリマーの組成物が、リポ酸をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
組成物が、細胞１ｍＬ当たり約１ｍｇ〜約２０ｍｇのポリマーを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
組成物が、細胞１ｍＬ当たり約５ｍｇ〜約１５ｍｇのポリマーを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
組成物が、細胞１ｍＬ当たり約１５ｍｇのポリマーを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
組成物が、細胞１ｍＬ当たり約１０ｍｇのポリマーを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
ポリマーが、少なくとも９５％の純度である、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
ポリマーが、少なくとも９８％の純度である、請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
ポリマーが、少なくとも９９％の純度である、請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
対象が哺乳動物である、請求項１に記載の方法。
【請求項３２】
対象がヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項３３】
脂肪細胞とポロキサマーＰ１８８の組成物を対象に投与することを含む、脂肪細胞を移植するための方法。
【請求項３４】
脂肪移植片の再吸収を防止するための方法であって、脂肪由来細胞とトリブロックコポリマーの組成物を対象に投与することを含み、ここで該コポリマーは、２つの親水性尾部が側面に配置された中心疎水性コアを含む、前記方法。
【請求項３５】
脂肪由来細胞の細胞膜を封止するための方法であって、脂肪由来細胞を、細胞膜を封止するのに十分な量のトリブロックコポリマーと接触させることを含み、ここで該コポリマーは、２つの親水性尾部が側面に配置された中心疎水性コアを含む、前記方法。
【請求項３６】
細胞が脂肪細胞である、請求項３４または３５に記載の方法。
【請求項３７】
細胞が幹細胞である、請求項３４または３５に記載の方法。
【請求項３８】
ポリマーがポロキサマーＰ１８８である、請求項３４または３５に記載の方法。
【請求項３９】
脂肪組織を移植するための方法であって、
脂肪組織とトリブロックコポリマーの組成物を対象に投与することを含み、ここで該コポリマーは２つの親水性尾部が側面に配置された中心疎水性コアを含み、また該コポリマーは該脂肪組織の細胞を損傷から保護し、細胞死を防止する、前記方法。
【請求項４０】
ポリマーがポロキサマーＰ１８８である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
脂肪由来細胞とポロキサマーＰ１８８を含む組成物。
【請求項４２】
脂肪由来細胞が脂肪細胞である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
脂肪由来細胞が幹細胞である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
脂肪由来細胞が脂肪細胞と幹細胞の組み合わせである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４５】
ポロキサマーＰ１８８と脂肪細胞を含む組成物。
【請求項４６】
脂肪細胞が、組成物中の細胞の少なくとも８０％である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
脂肪細胞が、組成物中の細胞の少なくとも９０％である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
脂肪細胞が、組成物中の細胞の少なくとも９５％である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４９】
ポロキサマーＰ１８８と脂肪組織を含む組成物。
【請求項５０】
脂肪移植に有用なポリマーを同定するための方法であって、
脂肪細胞を、細胞を安定化するのに十分な濃度の試験ポリマーと接触させること；および
細胞死または毒性についてアッセイすること；
を含む、前記方法。
【請求項５１】
脂肪移植に有用なポリマーを同定するための方法であって、
脂肪細胞を、細胞を安定化するのに十分な濃度の試験ポリマーと接触させること；
細胞／ポリマー組成物を試験動物中に移植すること；および
移植の成功を評価すること；
を含む、前記方法。
【請求項５２】
試験動物がげっ歯動物である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
試験動物がヌードマウスである、請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
評価のステップが、移植された細胞の評価を、重量、容積、細胞死の程度、ミトコンドリアレベル、アポトーシスのマーカー、ＤＮＡ含量、またはレプチンもしくはＰＰＡＲγ２のレベルにより行うことを含む、請求項５１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連分野
本出願は、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）のもとで、２００８年１０月２１日に出願された米国特許仮出願USSN 61/107,023に基づく優先権を主張し、それは参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
外傷に続発する軟部組織損傷および形成異常、先天的欠陥、感染症、および腫瘍切除は、患者における重大な病的状態のソースである。現在、自己遊離皮弁再建または局所前進皮弁は、重大な軟部組織および骨の欠損に対する再建モダリティの中心である。有茎皮弁および遊離皮弁再建は、再建に対する強力なツールを提供する一方で、これらは潜在的に、重篤な副作用およびドナー部位の病的状態なしではあり得ない。
【０００３】
自己脂肪移植は軟部組織の再建に用いられてきたが、これは予測することができない。脂肪吸引した脂肪を用いる利点は２つある：１）最小のドナー部位病的状態により、安全で容易にアクセス可能な自己細胞（autologous cells）のソースを提供すること；および２）これらの手順が、虚血性合併症および血管新生遊離皮弁に関連する初期の移植失敗についての心配なしに、比較的容易に実施できること。しかし今日まで、遊離脂肪移植片は、予測不可能な高レベルの再吸収およびそれによる不規則性（異常）に悩まされてきた。遊離脂肪移植の失敗および容積の減少は、採取による膜損傷をもたらす機械的ストレス、初期の虚血変化、および移植片に対する栄養枯渇と不十分な血管供給に関連するようである。これらのストレッサーはアポトーシスおよび細胞死をもたらす。続いて移植片の再吸収が、血管再生後の死んだ細胞デブリの除去から生じる。これは、軟部組織再建のためには不整合で望ましくない結果をもたらす。脂肪移植が１８９３年にNeuberにより最初に記載されて以来、遊離脂肪移植の結果はほとんど改善されていない。これまで、十分な血管形成が確立できるまで初期の虚血傷害細胞を低減するための努力は、ささやかな成果しか得られていない。したがって、脂肪移植の血管供給を改善するのみでは、脂肪移植の結果の大幅な改善に十分ではない可能性がある。脂肪移植片の調達、取扱い、および／または移植の間の細胞に対する損傷を防止することもまた、重要である。
【０００４】
美容整形および再建手術における、脂肪組織または脂肪組織由来の細胞（たとえば脂肪細胞、幹細胞）の、より成功する移植の必要性が存在する。軟部組織再建のために大量の自己脂肪組織を移行できることは、潜在的に何百万もの患者に対して、関連するドナー部位病的状態のない新規な再建オプションを提供する。さらに、ドナー部位オプションが限られている患者に対して、および皮弁再建に必要な長い手術時間に耐えられない患者に対して、強力なツールを提供する。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、脂肪組織および脂肪細胞の、予測可能で成功する移植の必要性からもたらされる。本発明は少なくとも部分的に、脂肪移植片の損傷された細胞はアポトーシスとなり、最終的にレシピエントの身体に再吸収されてしまうとの発見からもたらされる。かかる移植片の細胞、特に細胞膜の損傷を防止すれば、より成功し予測可能な移植が可能となる。移植片の細胞の損傷を防止するために、本発明において細胞膜は、移植片の調達、移植片の取扱い（例えば洗浄、貯蔵）、および／または最終的に移植手順の間、損傷から保護される。種々の膜安定剤を試験して、脂肪移植片における経時的な細胞死を減少させる剤を同定した。２つの親水性部分が側面に配置された中心疎水性部分を有するトリブロックコポリマー（例えば図１に示すポロキサマーＰ１８８）は、細胞膜を安定化し、脂肪移植片における経時的な細胞死を減少させることが見出された。移植する脂肪組織または脂肪細胞と混合されたかかるポリマーは、予測可能で永久的な脂肪移植をもたらす。他のポリマー、例えばジブロックコポリマー、テトラブロックコポリマー、およびポリエチレングリコールなども試験したが、細胞を損傷から保護しないか、または細胞を溶解することが見出された。したがって本発明は、トリブロックコポリマー、特にＰ１８８を、軟部組織再建または増大のための脂肪移植において用いるための組成物、方法、およびキットを提供する。
【０００６】
細胞膜は、疎水性ドメインと親水性ドメインを有するリン脂質を含む。これらのリン脂質は、細胞を囲む連続した脂質二重層を形成する。この二重層の完全性は、細胞に対する損傷を防止するのに重要である。本発明は、細胞膜を封止および／または安定化し細胞の損傷を防止する、トリブロックコポリマーの組成物を提供する。典型的には、かかるポリマーは細胞のリン脂質二重層と相互作用し、外傷を受けた細胞膜の穴を埋める。さらに、かかるポリマーは、膜の粘性を低下させることが示された。細胞粘性の低下は、外傷を受けた細胞をより可溶性にし、これは損傷した膜に対する圧力を低下させる。本発明はまた、かかる組成物を脂肪組織および脂肪細胞、または他の組織および細胞（例えば幹細胞）の移植において用いる方法を提供する。
【０００７】
１つの側面において、本発明は、細胞の封止および／または安定化を促進するトリブロックコポリマーを提供する。好ましくは、本発明で用いるポリマーは、生体適合性および／または生分解性である。ポリマーは細胞の溶解を引き起こしてはならない。ある態様において、ポリマーは非イオン性ポリマーである。ある態様において、ポリマーはポリエーテルである。ある態様において、ポリマーはポリアルキルエーテルである。ある態様において、ポリマーはポリアルキルエーテルと他のポリマー（例えばポリアルキルエーテル）のコポリマーである。特に、ポロキシマー（poloxymer）（ポロキサマー（poloxamer）としても知られている）は、細胞膜を封止し安定化するのに有用であることが見出された。次の化学構造に示されるように、ポロキシマーは、ポリオキシエチレン（ＰＯＥ）（ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）としても知られている）の２つの親水性鎖が側面に配置されたポリオキシプロピレン（ＰＯＰ）（ポリプロピレングリコールとしても知られている）の中心疎水性鎖から構成される、非イオン性トリブロックコポリマーである。ある態様において、２つの親水性尾部が側面に配置された疎水性コアを有するトリブロックコポリマーは、脂肪移植に好ましい。
【化１】
2014208654.tif 000002
ある態様において、ポロキシマーＰ１８８を用いて、脂肪移植片の細胞膜を封止および／または安定化させる。ポロキシマーＰ１８８は、脂肪細胞の損傷した膜を修復すること、および損傷した脂肪細胞の生存度と生存の可能性を改善することに特に有効であることが見出された。特定の理論に拘束されることを意図せず、細胞膜のＰ１８８による修復の、提唱されたメカニズムを図２に説明する。損傷した細胞膜は、中心脂質層（すなわち膜の疎水性部分）の一部を周囲に暴露する。Ｐ１８８の中心疎水性部分は、膜のこの疎水性の層と相互作用し、Ｐ１８８の側面に配置された親水性端部は、細胞膜の外側親水性表面に沿って自らを位置させる。この封止／修復プロセスは、従来の自動車タイヤのプラグ修復と似ており、ここでは、柔軟なゴム製プラグの中心をタイヤの小さな穴に押し入れて、外側のトレッドに沿って位置するプラグの端部でこの穴を封止する。損傷膜の穴を封止するには、１つより多くのＰ１８８分子が必要となる場合もある。ある態様において、ポロキシマーＰ１８８は、脂肪移植片の細胞の損傷を防止する。ポロキサマーはＢＡＳＦよりPLURONIC（登録商標）の商品名で販売されている。特に、ポロキサマー１８８（Ｐ１８８）は、PLURONIC（登録商標）Ｆ６８である。ポリマーを形成するブロックの長さをカスタム化することができるため、異なる特性の多数の異なるポロキサマーが存在する。これらのコポリマーは、通常、室温でのポロキサマーの状態についての文字（「Ｐ」は粉末、「Ｌ」は液体、「Ｆ」はフレーク）と続く３桁の数字で名付けられる。最初の２桁×１００は、疎水性ポリオキシプロピレンコアのおよその分子量を示し、最後の数字×１０は、ポリオキシエチレン含量のパーセンテージを示す。ポロキサマー１８８は、ポリオキシプロピレンの分子量が１８００ｇ／モルで、８０％のポリオキシエチレン含量のポロキシマーであり、ポロキサマー１８８は、平均分子量７６８０〜９５１０ｇ／モルを有する。「Ｐｘｘｙ」名称を、商品名「Ｆｚｚ」に変換するには、「Ｐｘｘｙ」のｘｘを約３倍する、すなわちＰ１８８はＦ６８である。本発明で有用となり得るその他のポリキシマーとしては、ポロキサマー１０８（PLURONIC（登録商標）Ｆ３８）、Ｐ１８４（PLURONIC（登録商標）Ｌ６４）、Ｐ４０１、Ｐ４０２、Ｐ４０７（PLURONIC（登録商標）Ｆ１２７）、およびＰ４０８（PLURONIC（登録商標）Ｆ１０８）が挙げられる。より小さい分子量で、同程度または低いＰＥＧ含量の他のポロキサマーは、本発明に有用となり得る。典型的には、細胞がドナーから取り出されたら、ポリマーをできるだけ早く加えて、速やかに膜の損傷を防止および／または修復する。ポリマーは、移植片の細胞に、１ｍＬの細胞当たり約１ｍｇ〜約２０ｍｇの濃度範囲で加える。ある態様において、ポリマーのミリモル濃度を、移植用のポリマー／細胞組成物に用いる。典型的には、所望の膜安定性をもたらすポリマーの最低濃度を用いる。当業者が理解するように、組成物中のポリマーの濃度は、移植する細胞を安定化するために用いるポリマーに依存する。
【０００８】
移植する細胞または組織を適切な濃度のポリマーと混合し、これを次にレシピエント（例えばヒト）の所望の移植部位（例えば顔、唇、乳房）に移植する。本発明の技術を用いて、任意の細胞または組織を移植することができる。ある態様において、組織は脂肪組織である。ある態様において、細胞は脂肪質組織に由来する。ある態様において、細胞は、異なる型の細胞を含む脂肪移植片（例えば脂肪組織）の一部であり、該異なる型の細胞としては、限定することなく、脂肪細胞、間質細胞、上皮細胞、内皮細胞、線維芽細胞、および血球を含む。ある態様において、細胞は間質細胞である。ある態様において、細胞は内皮細胞である。ある態様において、細胞は幹細胞である。ある態様において、細胞は脂肪組織由来の幹細胞である。細胞は、採取時にポリマーと混合してよい。ある態様においては、組織がドナーから取り出される前に、脂肪組織が取り出されるべき部位にポリマーを含む組成物を注入する。他の態様においては、ポリマーは、細胞がドナーから取り出された後に該細胞に加える。ポリマーは、加工または貯蔵時に細胞に加えてもよく、または細胞は、移植の直前にポリマーと混合してもよい。細胞または組織は、ポリマーを含む組成物で洗浄するか、またはその他で加工してもよい。ある態様において、ポリマーを、移植前に移植片から洗い流す。
【０００９】
細胞／ポリマー組成物はまた、その他の剤も含むことができる。例えば組成物は、移植する細胞をさらに保護するかまたは安定化する剤を含むことができ、または剤は、ポリマーを保護することができる。ある態様において、組成物は、ビタミン、ミネラル、抗酸化剤、浸透圧保護剤、粘性増強剤、コエンザイム、膜安定剤、脂質、炭水化物、ホルモン、増殖因子、抗炎症剤、ポリヌクレオチド、タンパク質、ペプチド、アルコール、有機酸、有機小分子などを含む。脂肪移植における特に有用な組合わせは、Ｐ１８８とリポ酸である（以下にその還元および酸化形態を示す）。ある態様において、リポ酸の還元形態を用いる。他の態様において、リポ酸の酸化形態を用いる。さらに他の態様において、２つの形態の混合物を用いる。
【化２】
2014208654.tif 000003
【００１０】
本発明は、脂肪移植に用いるための脂肪細胞とポリマー（例えばＰ１８８）の組成物を提供する。ある態様において、本発明は、幹細胞とポリマー（例えばＰ１８８）の組成物を提供する。幹細胞は、脂肪質組織由来の成人幹細胞であってよい。脂肪質組織由来の他の細胞（例えば幹細胞、線維芽細胞、内皮細胞、間質細胞）も、本発明に用いることができる。本発明の細胞／ポリマー組成物は、本明細書に記載されているような、膜破壊および／または遊離基形成を最小化する他の剤（例えば、抗酸化剤、ビタミン、脂質、タンパク質、ペプチド、ホルモン、増殖因子、炭水化物、医薬剤）を含むこともできる。
【００１１】
他の側面において、本発明は、本発明の組成物および方法を用いた、脂肪移植に有用なキットを提供する。キットは、対象に対して脂肪または脂肪由来細胞を移植するのに必要な全成分の全てまたはそのサブセットを含むことができる。キットは、例えば、ポリマー（例えばＰ１８８）、細胞洗浄のための１または２以上の緩衝液、細胞洗浄のための装置、細胞、シリンジ、針、カップ、容器、アルコール綿棒、麻酔薬、抗生物質、抗酸化剤、ビタミン、脂質、炭水化物、ホルモン、増殖因子などを含む。ある態様において、細胞の採取に用いる容器またはシリンジは、その中にポリマー（例えばＰ１８８）を有してもよく、こうして採取した細胞は直ちに膜安定剤と接触させられる。ある態様において、細胞は、細胞を受け取る患者自身から得られる（すなわち、自己移植片）。ある態様において、キットの成分は、外科医または他の医療従事者が便利に用いるために、滅菌して包装される。キットはまた、ポリマー（例えばＰ１８８）と他の剤を採取／移植手順において用いるための使用説明書も含むことができる。キットは、一回の使用に必要な成分を提供することができる。キットはまた、包装材および、医薬品および／または医療機器を規制する政府監督機関が要求する情報も含むことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、Ａは、ポリマーＰ１８８のポリオキシエチレン（ＰＯＥ）親水性サブユニットを示す。Ｂは、２つのＰＯＥ親水性尾部にまたがる疎水性ポリオキリプロピレン（ＰＯＰ）サブユニットを有するトリブロックＰ１８８の構造を示す。
【００１３】
【図２】図２は、推定されるＰ１８８の膜挿入を示す。Ｐ１８８の疎水性領域は、その長い水和化された疎水性尾部を損傷された膜の孔に挿入し、膜を超えて伸ばして細胞の粘性を低下させ、膜のイオン性漏出を安定化させると考えられている。
【００１４】
【図３】図３は、Ａは、１つの無傷の脂肪細胞の電子顕微鏡検査（ＥＭ）の図であり、無傷の脂質二重層を示す。Ｂは、膜の孔を有する脂肪細胞の細胞二重層の拡大ＥＭの図であり、サイズは膜表面に沿ってナノメーター単位で示されている（矢印）。
【００１５】
【図４】図４は、細胞／ポロキシマーＰ１８８、細胞／デキストラン、または細胞／生理食塩水の組成物１ｍＬの移植６週間後の再吸収を示す図である。
【００１６】
【図５】図５は、細胞／ポロキシマーＰ１８８、細胞／デキストラン、または細胞／生理食塩水の組成物０．６ｍＬの移植６週間後の再吸収を示す図である。
【００１７】
【図６】図６は、６日目における、生理食塩水とＰ１８８で処置した脂肪移植片（１．０ｃｃ、１．０ｇ）の共焦点顕微鏡画像である。細胞は、免疫化学ＦＬＩＶＯ赤色ポリカスパーゼ活性化アポトーシス特異的染料を用いて標識した。生理食塩水で処置した対照も示す。（上図）は、大量の、赤色標識されたアポトーシス小胞を示す。一方、６日目に、Ｐ１８８で処置した試料は比較的少量の赤色標識されたアポトーシス液胞を示す（緑色の細胞質は、正常な自己蛍光の結果である）。
【００１８】
【図７】図７は、移植初期におけるアポトーシス事象を示す図である。移植初期の脂肪移植片におけるアポトーシスレベル。Ｐ１８８は、生理食塩水で処置した対照と比べて、６日目にアポトーシス事象における統計的に有意な減少を示す。
【００１９】
【図８】図８は、Ｐ１８８と比較した、種々の剤による移植前後の期間のアポトーシス事象の増加を示す図である。種々のポリマーおよび添加剤をＰ１８８と比較した。上図の系列は、剤がＰ１８８より劣っていた４つの１０日間実験を示す。移植初期の期間にアポトーシスを増加させる剤は、脂肪細胞に毒性であり、移植片の増大には適さない。（注記：ＰＥＧ８０００、Ｔ１１０７実験（左下）は、MitoPTアポトーシス標識を使用し、一方、他の実験ではPromegaのApo-Oneアポトーシスアッセイを用いた。Apo-Oneアポトーシスアッセイは、平均して１０倍高いシグナルを生成し、MitoPTシグナルは我々のアッセイ法では輝度が低い。これは純粋にアッセイの差であり、アポトーシスの程度における差を示すものではない。）
【００２０】
【図９】図９は、リポ酸が初期のアポトーシスを低減する相加効果を有することを示す。リポ酸で処置した脂肪移植片は、生理食塩水処置の対照と比べて、移植期間の間にアポトーシスの減少を示した。アポトーシスにおけるこれらの改善は、６週目での長期移植性能の改善をもたらす。
【００２１】
【図１０】図１０は、処置および移植後の時間の関数としての重量を示す図である。移植後の最初の１０日間、脂肪移植片は毎日計量した。移植片が〜２５％脱水した第１日目の後、無血管期間の間の重量は全群の間で安定であった；一方、同じ期間のアポトーシス活性には顕著な差があった。誤差のバーは標準偏差を示し、これは初期では〜０．０５ｇであった；重量についての試験における全体の標準偏差は〜０．１０ｇであった。デキストランを初期の対照として用いたが、これは、Ｐ１８８およびＰＥＧ８０００と同様の分子量を有しているからである。デキストランでは差が示されなかった後で、生理食塩水のみをさらなる実験の対照群として用いた。
【００２２】
【図１１】図１１は、６週間の重量の累積値を示す（Ｐ１８８対生理食塩水）。Ｐ１８８で処置した脂肪移植片は、生理食塩水で処置した対照と比べて、６週目に統計的に有意な重量の増加を示す。
【００２３】
【図１２】図１２は、６週目における重量での再吸収を示す。脂肪移植片のＰ１８８による処置は、生理食塩水で処置した対照と比べて、６週目において移植片の再吸収の５０％の減少をもたらす。
【００２４】
【図１３】図１３は、種々のポリマーと比較した、６週目における再吸収を示す。Ｐ１８８を、異なるサイズのプルロニックおよびＰＥＧの種々のサイズおよび混合物に対して測定した。重量でのＰ１８８は、ポリマーの中で最も高性能であったが、重量のみでは、Ｐ１８８といくつかの他のプルロニックの間の差は小さかった。これらの小葉（lobule）の組織学的検体は、いくつかの試料では重大な炎症性浸潤物を、他の試料では重篤な線維形成を示す。このように、重量のみでは、脂肪移植片の性能改善の明確な指標になり得ない。
【００２５】
【図１４】図１４は、処置および移植の６週間後における、種々のポリマーを用いた場合の生細胞シグナルを示す（１．０ｃｃ／１．０ｇ）。Ｐ１８８は、６週目におけるCell-Titer Blue生存度アッセイにより、その他のプルロニックより優れた生細胞シグナルを示す。Ｆ１２７およびＬ６４は、生理食塩水と同等またはそれ以上の生存度レベルを示したが、統計的な有意性はない。
【００２６】
【図１５】図１５は、処置および移植２ヶ月後の生細胞シグナルを示す。Ｐ１８８は、処置および移植２ヶ月後に、種々のサイズと組み合わせのＰＥＧより優れた細胞生存度を示す。注目すべきことには、ＰＥＧは、生理食塩水で処置された対照より低いレベルの細胞生存度を示した。
【００２７】
【図１６】図１６は、移植および処置の６週間後のＤＮＡ含量を示す（１．０ｃｃ／１．０ｇ）。６週目におけるＤＮＡ含量を測定し比較した。高いＤＮＡ含量は、高い細胞計数およびより多くの脂肪細胞と関連する。６週目でのＰ１８８は、他のプルロニックと比べて最も高いＤＮＡレベルを示した。６週目においていくつかの重量で観察される小さな差にもかかわらず、Ｐ１８８はＤＮＡ含量について、試験した全ての他のポリマーより優れていた。
【００２８】
【図１７】図１７は、生理食塩水処置の対照およびＰ１８８処置の脂肪移植片についての、６週目における組織学的検査の図である。
【００２９】
【図１８】図１８は、生理食塩水対照、Ｐ１８８、および他のプルロニックについての６週目における組織学的スコアを示す。試料は、正常脂肪、炎症性浸潤、および線維形成について４人の試験者によりブラインドの様式でスコア付けされた。左図では、Ｐ１８８を生理食塩水対照と比較する。正常脂肪含量の統計的に有意な増加、および線維形成の減少が示された。他のポリマーと比較すると、Ｌ６４およびＦ１２７は統計的に有意な差なしで類似のスコアであり、残りは、生理食塩水からのいくらかの改善から、明白な毒性までを示した。
【００３０】
【図１９】図１９は、処置後６週目における重量での再吸収パーセントを示す。
【００３１】
定義
本明細書において「脂肪組織」とは、脂肪細胞からなる組織を指す。脂肪組織は典型的には、脂肪細胞からなる疎性結合組織である。身体での主要な役割は、脂肪の形態でエネルギーを貯蔵することである；しかし、脂肪組織はまた身体を隔離して保護し、さらに内分泌器官としても作用する。脂肪組織は、白色脂肪組織または褐色脂肪組織であることができる。用語「脂肪組織（adipose tissue）」は、「脂肪質組織（fat tissue）」と交換可能に用いられる。
【００３２】
本明細書において「抗炎症剤」とは、炎症の１または２以上の兆候または症状を阻害する任意の物質を指す。
【００３３】
用語「約」は数字に関する場合、一般に、該数字の両方向（該数字より大きいかまたは小さい）の５％以内の範囲の数字を含むが、ただし、別に記載されているか、文脈からその他が明らかな場合は除く（かかる数字が可能な値の１００％を超える場合は除く）。
【００３４】
「生体適合性」とは、用いる場所および量においてレシピエントの細胞に実質的に非毒性の材料であって、用いる場所においてレシピエントの身体に顕著に有害または望ましくない効果、例えば許容し得ない免疫学的反応または炎症反応、許容し得ない瘢痕組織形成などを引き出したり引き起こしたりしない、前記材料を指す。
【００３５】
「生分解性」とは、材料が対象の細胞内または身体内で、物理的および／または化学的に、例えば生理学的条件下での加水分解により、および／または天然の生物学的プロセス、例えば細胞内もしくは身体内に存在する酵素の作用など、および／または溶解、分散などにより、分解され得ることを意味し、こうして典型的には代謝可能なより小さい化学種を形成し、そして任意に、身体により用いられ、および／または排出され、またはその他で処分されることを意味する。本発明の目的のために、時間とともにin vivoでモノマーの数の減少によりその分子量が減少するポリマーまたはヒドロゲルは、生分解性であると考えられる。
【００３６】
用語「ポリヌクレオチド」、「核酸」、または「オリゴヌクレオチド」は、ヌクレオチドのポリマーを指す。用語「ポリヌクレオチド」、「核酸」、および「オリゴヌクレオチド」は、交換可能に用いることができる。典型的には、ポリヌクレオチドは少なくとも２つのヌクレオチドを含む。ＤＮＡおよびＲＮＡは、ポリヌクレオチドである。ポリマーは、天然のヌクレオチド（すなわち、アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシン、およびデオキシシチジン）、ヌクレオシド類似体（例えば、２−アミノアデノシン、２−チオチミジン、イノシン、ピロロ−ピリミジン、３−メチルアデノシン、Ｃ５−プロピニルシチジン、Ｃ５−プロピニルウリジン、Ｃ５−ブロモウリジン、Ｃ５−フルオロウリジン、Ｃ５−ヨードウリジン、Ｃ５−メチルシチジン、７−デアザアデノシン、７−デアザグアノシン、８−オキソアデノシン、８−オキソグアノシン、Ｏ（６）−メチルグアニン、および２−チオシチジン）；化学修飾塩基；生物学的修飾塩基（例えばメチル化塩基）；挿入塩基（intercalated base）；修飾糖（例えば２’−フルオロリボース、２’−メトキシリボース、２’−アミノリボース、リボース、２’−デオキシリボース、アラビノース、およびヘキソース）；または修飾リン酸基（例えばホスホロチオアートおよび５’−Ｎ−ホスホロアミダイト結合）を含むことができる。天然または修飾ヌクレオシドのエナンチオマーも用いることができる。核酸はまた、核酸ベースの治療剤、例えば、核酸リガンド、ｓｉＲＮＡ、低分子ヘアピンＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、アプタマー、およびSPIEGELMERS（登録商標）、Wlotzka et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2002, 99(13): 8898（この全内容は参照により本明細書に組み込まれる）に記載のオリゴヌクレオチドリガンドも含む。
【００３７】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、または「タンパク質」は、ペプチド結合により一緒に結合された少なくとも３つのアミノ酸のストリングを含む。用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は交換可能に用いてよい。ペプチドは、個々のペプチドまたはペプチドの集合を指すことができる。本発明のペプチドは、天然アミノ酸のみを含むのが好ましいが、非天然のアミノ酸（すなわち、天然には存在しないが、ポリペプチド鎖に組み込むことができる化合物）および／または当分野に知られたアミノ酸類似体も、代替的に用いることができる。さらに、ペプチド中の１または２以上のアミノ酸は修飾されてもよく、例えば炭水化物基、リン酸基、ファルネシル基、イソファルネシル基、脂肪酸基、抱合用のリンカーなどの化学的実体の付加により、機能化により、または他の修飾などにより修飾されることができる。１つの態様において、ペプチドの修飾はより安定なペプチドをもたらす（例えば、in vivoでのより長い半減期）。これらの修飾には、ペプチドの環化、Ｄアミノ酸の組み込み、または他の修飾を含むことができる。これらの修飾のいずれもが、ペプチドの所望の生物学的活性を実質的に妨害してはならない。
【００３８】
用語「多糖類」および「炭水化物」は交換可能に用いてよい。多くの炭水化物は、多数のヒドロキシル基を通常分子の各炭素原子に１つずつ有する、アルデヒドまたはケトンである。炭水化物は、一般に分子式ＣｎＨ２ｎＯｎを有する。炭水化物は、単糖類、二糖類、三糖類、オリゴ糖、または多糖類であってよい。最も基本的な炭水化物は単糖類であり、例えばグルコース、スクロース、ガラクトース、マンノース、リボース、アラビノース、キシロース、およびフルクトースである。二糖類は、結合された２つの単糖類である。例示の二糖類には、スクロース、マルトース、セロビオース、およびラクトースが挙げられる。典型的には、オリゴ糖は３〜６個の単糖類単位（例えばラフィノース、スタキオース）を含み、多糖類は６または７以上の単糖類単位を含む。例示の多糖類としては、デンプン、グリコーゲン、およびセルロースが挙げられる。炭水化物は修飾糖類単位を含んでもよく、例えば、ヒドロキシル基が除去された２’−デオキシリボース、ヒドロキシル基がフッ素で置き換えられた２’−フルオロリボース、またはＮ−アセチルグルコサミン、グルコースの窒素含有形態（例えば２’−フルオロリボース、デオキシリボース、およびヘキソース）などである。炭水化物は多くの異なる形態で存在することができ、例えば、配座異性体、環式形態、非環式形態、立体異性体、互変異性体、アノマー、および異性体である。
【００３９】
「小分子」は、比較的低い分子量を有し、タンパク質、ポリペプチドまたは核酸ではない、天然または人工的に（例えば、化学的合成により）作製された有機化合物を指す。小分子は典型的には、繰り返し単位を有するポリマーではない。ある態様において、小分子は約１５００ｇ／ｍｏｌ未満の分子量を有する。ある態様において、ポリマーの分子量は約１０００ｇ／ｍｏｌ未満である。また、小分子は、典型的には複数の炭素−炭素結合を有し、複数の立体中心および官能基を有することができる。
【００４０】
本明細書において、「対象」は、例えば実験、診断、および／または治療目的のために剤を送達する個人を指す。好ましい対象は哺乳動物であり、特に家畜化された哺乳動物（例えばイヌ、ネコなど）、霊長類、またはヒトである。ある態様において、対象はヒトである。ある態様において、対象は実験動物、例えばマウスまたはラットである。内科医または他の医療事業者のケアのもとにある対象は、「患者」と呼ぶことができる。
【００４１】
「医薬剤」（「薬剤」とも呼ばれる）は本明細書において、対象に対して、疾患、障害、または対象に有害であるその他の臨床的に認識されている病態を処置するために、または予防目的のために投与され、疾患、障害、または病態を処置または予防するための臨床的に重大な身体への効果を有する剤を指すのに用いる。治療剤としては、限定することなく、United States Pharmacopeia (USP), Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10th Ed., McGraw Hill, 2001；Katzung, B. (ed.) Basic and Clinical Pharmacology, McGraw-Hill/Appleton & Lange; 8th edition (September 21, 2000)；Physician's Desk Reference (Thomson Publishing)、および／またはThe Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 17th ed. (1999)、またはこれに続く18th ed (2006)、Mark H. Beers and Robert Berkow (eds.), Merck Publishing Group、または動物の場合はThe Merck Veterinary Manual, 9th ed., Kahn, C.A. (ed.), Merck Publishing Group, 2005にリストされている剤が挙げられる。
【００４２】
発明のある態様の詳細な説明
本発明は、美容整形および再建手術における脂肪組織または脂肪細胞の移植を、細胞膜を安定化するポリマーを移植片に添加することにより改善できるとの認識からもたらされる。特定の理論により拘束されることを意図せず、ポリマーは細胞膜と相互作用し、膜の欠損を封止または防止して、これにより細胞の損傷（例えばイオン漏出）を防止または最小化すると考えられる。細胞の損傷の防止は、移植片におけるアポトーシスおよび細胞死の程度を低下させ、軟部組織の再建、再構築、または増大における脂肪移植片の成功と完全性の改善を促進する。本発明は、対象（例えばヒト）における脂肪移植を改善するための、ポリマー、組成物、方法、およびキットを提供する。
【００４３】
ポリマー
本発明は、脂肪移植における細胞、または脂肪組織由来の細胞（例えば幹細胞、間質細胞、線維芽細胞、内皮細胞、上皮細胞）の細胞膜を安定化する、一定のポリマーの発見に基づく。ポリマーを、細胞膜を安定化し損傷から保護しおよび／または既に損傷された膜を封止するのに十分な濃度で、細胞と混合する。かかるポリマーは、脂肪移植の成功を改善する他の方法と組み合わせて用いてよく、例えば、移植片の血管供給を改善すること、または移植する細胞に対する損傷の防止を支援する他の剤（例えばリポ酸）を加えることなどである。
【００４４】
細胞膜と相互作用し安定化する任意のポリマーを、脂肪移植に用いる細胞に加えることができる；しかし、２つの親水性尾部が側面に配置された疎水性中心部分を有するトリブロックコポリマーは、脂肪移植片の改善に特に有用であることが見出された。ある態様において、ポリマーは合成ポリマー（すなわち、天然に産生されないポリマー）である。他の態様において、ポリマーは天然のポリマー（例えばタンパク質、多糖類、ゴム）である。ある態様において、ポリマーは界面活性ポリマーである。ある態様において、ポリマーは非イオン性ポリマーである。ある態様において、ポリマーは非イオン性ブロックコポリマーである。
【００４５】
ある態様において、ポリマーはポリエーテル部分を含む。ある態様において、ポリマーはポリアルキルエーテル部分を含む。ある態様において、ポリマーはポリエチレングリコール尾部を含む。ある態様において、ポリマーはポリプロピレングリコール中心部分を含む。ある態様において、ポリマーはポリブチレングリコールを中心部分として含む。ある態様において、ポリマーはポリペンチレングリコールを中心部分として含む。ある態様において、ポリマーはポリヘキシレングリコールを中心部分として含む。ある態様において、ポリマーは、本明細書に記載のポリマーの１つのトリブロックコポリマーである。
【００４６】
ある態様において、ポリマーは、ポリアルキルエーテル（例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール）と他のポリマーのトリブロックコポリマーである。ある態様において、ポリマーは、ポリアルキルエーテルと他のポリアルキルエーテルのトリブロックコポリマーである。ある態様において、ポリマーは、ポリエチレングリコールと他のポリアルキルエーテルのトリブロックコポリマーである。ある態様において、ポリマーは、ポリプロピレングリコールと他のポリアルキルエーテルのトリブロックコポリマーである。ある態様において、ポリマーは、少なくとも１単位のポリアルキルエーテルを有するトリブロックコポリマーである。ある態様において、ポリマーは、２つの異なるポリアルキルエーテルのトリブロックコポリマーである。ある態様において、ポリマーは、ポリエチレングリコール単位を含むトリブロックコポリマーである。ある態様において、ポリマーは、ポリプロピレングリコール単位を含むトリブロックコポリマーである。ある態様において、ポリマーは、さらに２つの親水性単位が側面に配置されたさらなる疎水性単位のトリブロックコポリマーである。ある態様において、複数の親水性単位は同種のポリマーである。ある態様において、ポリマーは、さらに２つの親水性単位が側面に配置されたポリプロピレングリコール単位を含む。ある態様において、ポリマーは、さらなる疎水性単位を囲んでいる、２つのポリエチレングリコール単位を含む。ある態様において、ポリマーは、２つのポリエチレングリコール単位が側面に配置されたポリプロピレングリコール単位のトリブロックコポリマーである。ある態様において、ポリマーは、化学式：
【化３】
2014208654.tif 000004
で表され、式中、ｎは２〜２００の整数（両端の数値を含む）であり；およびｍは、２〜２００の整数（両端の数値を含む）である。ある態様において、ｎは１０〜１００の整数（両端の数値を含む）である。ある態様において、ｍは、５〜５０の整数（両端の数値を含む）である。ある態様において、ｎはｍの約２倍である。ある態様において、ｎは約７０であり、ｍは約３５である。ある態様において、ｎは約５０であり、ｍは約３０である。ある態様において、ポリマーはポロキサマーＰ１８８であり、これはＢＡＳＦからPLURONIC（登録商標）Ｆ６８の商品名で市販されている。本発明で有用となり得る他のPLURONIC（登録商標）ポリマーとしては、限定することなく以下が挙げられる：PLURONIC（登録商標）Ｆ１０８、PLURONIC（登録商標）Ｆ１２７、PLURONIC（登録商標）Ｆ３８、PLURONIC（登録商標）Ｆ６８、PLURONIC（登録商標）Ｆ７７、PLURONIC（登録商標）Ｆ８７、PLURONIC（登録商標）Ｆ８８、PLURONIC（登録商標）Ｆ９８、PLURONIC（登録商標）Ｌ１０、PLURONIC（登録商標）Ｌ１０１、PLURONIC（登録商標）Ｌ１２１、PLURONIC（登録商標）Ｌ３１、PLURONIC（登録商標）Ｌ３５、PLURONIC（登録商標）Ｌ４３、PLURONIC（登録商標）Ｌ４４、PLURONIC（登録商標）Ｌ６１、PLURONIC（登録商標）Ｌ６２、PLURONIC（登録商標）Ｌ６４、PLURONIC（登録商標）Ｌ８１、PLURONIC（登録商標）Ｌ９２、PLURONIC（登録商標）Ｎ３、PLURONIC（登録商標）Ｐ１０３、PLURONIC（登録商標）Ｐ１０４、PLURONIC（登録商標）Ｐ１０５、PLURONIC（登録商標）Ｐ１２３、PLURONIC（登録商標）Ｐ６５、PLURONIC（登録商標）Ｐ８４、およびPLURONIC（登録商標）Ｐ８５。ポロキサマーは一般に、最初に酸化プロピレンを、次に酸化エチレンを、順番にプロピレングリコールに加えることにより合成される。
【００４７】
以下の例で実証されるように、トリブロックコポリマーは、外傷を受けた脂肪細胞の膜に自身を挿入する能力を有し、膜の安定化を可能とする（図２参照）。さらに、かかるポリマーはその高度に水和化されたグリコール尾部により、膜の粘性を低下させることが知られている。細胞の粘性を低下させることで、これは外傷された細胞をより可溶性にし、こうして損傷された膜への圧力を低下させる。特に、市販のトリブロックコポリマーであるＰ１８８は、損傷された膜を修復するのに、および損傷された脂肪細胞の生存度と生存可能性を改善するのに、特に有効であることが示されている。Ｐ１８８の、移植前後の期間（採取から安定な移植までの時間）における損傷脂肪細胞の救助における有効性を以下の例で実証し、これは、組織学的検査、脂肪移植片の経時的重量、アポトーシス事象、細胞生存度、および生のＤＮＡ含量に注目する。Ｐ１８８は、試験された全ての他のポリマーよりも有効であることが示され、同じ順序のブロックを有するより小さなおよび大きなトリブロックコポリマーも機能しない。ジブロックおよびテトラブロックコポリマーは、移植片に対して毒性さえ示すようである。
【００４８】
Ｐ１８８は、脂肪組織にあまり溶解しないことが示されており、無傷の、損傷なしの膜には良好に吸収されない。Ｐ１８８は、採取プロセスからの機械的せん断損傷で傷ついた脂肪細胞が、その正常な膜の力学を維持することを可能とする。一旦これらの細胞が、二重層におけるリン脂質の量を増加することによりその膜を修復することができると、Ｐ１８８は機械的に排出される［Agarwal, J., A. Walsh, and R.C. Lee, Multimodal strategies for resuscitating injured cells. Ann N Y Acad Sci, 2005. 1066:295-309；本明細書に参照により組み込まれる］。Ｐ１８８の排出は、膜間表面圧力の増加により引き起こされる。移植された細胞から排出されると、Ｐ１８８は腎臓によって基本的に変換されることなく排泄され、同時に少量が胆汁腸内系を介して排泄される［Singh-Joy, S.D. and V.C. McLain, Safety assessment of poloxamers 101, 105, 108, 122, 123, 124, 181, 182, 183, 184, 185, 188, 212, 215, 217, 231, 234, 235, 237, 238, 282, 284, 288, 331, 333, 334, 335, 338, 401, 402, 403, and 407, poloxamer 105 benzoate, and poloxamer 182 dibenzoate as used in cosmetics. Int J Toxicol, 2008. 27 Suppl 2:93-128；本明細書に参照により組み込まれる］。脂肪移植において有用な濃度での、Ｐ１８８の副作用の証拠または安全性への懸念は存在しない。
【００４９】
本発明で用いるポリマーの分子量は、約５００ｇ／モル〜約５０，０００ｇ／モルまでの範囲をとり得る。ある態様において、ポリマーの分子量は、約１，０００ｇ／モル〜約３０，０００ｇ／モルの範囲である。ある態様において、ポリマーの分子量は、約２，０００ｇ／モル〜約１５，０００ｇ／モルの範囲である。ある態様において、ポリマーの分子量は、約２，０００ｇ／モル〜約１２，０００ｇ／モルの範囲である。ある態様において、ポリマーの分子量は、約１，０００ｇ／モル〜約５，０００ｇ／モルの範囲である。ある態様において、ポリマーの分子量は、約５，０００ｇ／モル〜約１０，０００ｇ／モルの範囲である。ある態様において、ポリマーの分子量は、約７，５００ｇ／モル〜約１０，０００ｇ／モルの範囲である。ある態様において、ポリマーの分子量は、約１０，０００ｇ／モル〜約１５，０００ｇ／モルの範囲である。ある態様において、ポリマーの分子量は、約１５，０００ｇ／モル〜約２０，０００ｇ／モルの範囲である。ある態様において、ポリマーの分子量は、約２０，０００ｇ／モル〜約２５，０００ｇ／モルの範囲である。ある態様において、ポリマーの平均分子量は約５，０００ｇ／モル、約５，５００ｇ／モル、約６，０００ｇ／モル、約６，５００ｇ／モル、７，０００ｇ／モル、約７，５００ｇ／モル、約８，０００ｇ／モル、約８，５００ｇ／モル、約９，０００ｇ／モル、約９，５００ｇ／モル、または約１０，０００ｇ／モルである。ある態様において、Ｐ１８８の平均分子量は約８，４００ｇ／モルである。他の市販のポロキサマーの平均分子量は、当分野に知られている。
【００５０】
本発明で用いられるポリマーの組成物は、典型的にはヒトおよび／または他の動物において用いる医薬品グレードの材料である。ある態様において、ポリマーはヒトでの使用および獣医学的使用に承認されている。いくつかの態様において、ポリマーは米国食品医薬品局により承認されている。いくつかの態様において、ポリマーは医薬品グレード材料である。いくつかの態様において、ポリマーは、米国薬局方（ＵＳＰ）、ヨーロッパ薬局方（ＥＰ）、英国薬局方、および／または国際薬局方の基準を満たす。ある態様において、ポリマーは少なくとも９０％の純度である。ある態様において、ポリマーは少なくとも９５％の純度である。ある態様において、ポリマーは少なくとも９８％の純度である。ある態様において、ポリマーは少なくとも９９％の純度である。ある態様において、ポリマーは少なくとも９９．５％の純度である。ある態様において、ポリマーは少なくとも９９．９％の純度である。ある態様において、ポリマーは少なくとも９９．９９％の純度である。ある態様において、ポリマーは毒性材料または非生体適合性材料を含有しない。
【００５１】
本発明において有用なポリマーは、典型的に、in vivoで非毒性の分解産物に分解されるか、身体によって安全に排泄される。ポリマーは好ましくは生体適合性であり、実質的に望ましくないどのような副作用ももたらさない。ポリマーのin vivoでの半減期は、約１日〜約１ヶ月の範囲をとり得る。ある態様において、ポリマーのin vivoでの半減期は、約１日〜約１週間の範囲である。ある態様において、ポリマーのin vivoでの半減期は、約１週間〜約２週間の範囲である。ある態様において、ポリマーのin vivoでの半減期は、約３週間〜約４週間の範囲である。
【００５２】
ポリマーは脂肪移植での使用のために、試験ポリマーを移植する脂肪細胞と混合し、得られた組成物をマウスまたは他のげっ歯動物に移植することにより試験して、脂肪移植の成功を経時的に確認することができる（以下の例に記載のように）。脂肪移植片は、種々の生化学的および病理学的測定により評価することができ、例えば、移植片の重量、移植片の容積、組織学的検査、アポトーシスおよび／または細胞死のマーカーの評価、生細胞の数の計測、ミトコンドリアＡＴＰレベルの評価、ＤＮＡレベルの評価、またはレプチン、ＰＰＡＲγ２もしくはその他のマーカーのレベルを決定するためのリアルタイムＰＣＲによる。ある態様において、試験はヌードマウスにおいて実施する。ポリマーはまた、in vitroで細胞を試験ポリマーと混合し、細胞をアポトーシスまたは細胞死のマーカーについてアッセイし、細胞を毒性についてアッセイすることなどによってもスクリーニングすることができる。ある態様において、試験ポリマーを用いた結果を、対照からの結果と比較する。ある態様において、対照ポリマーはＰ１８８である。ある態様において、対照ポリマーはデキストランである。ある態様において、対照脂肪移植片は、生理食塩水で処置する。
【００５３】
ポリマーは、他の生物学的活性剤および／または薬学的に許容し得る賦形剤と組み合わせて、移植する細胞への添加に有用な組成物を形成することができる。かかる生物学的活性剤はまた、脂肪移植片において細胞死を防止するように働くことができる。賦形剤は、ポリマーを移植する細胞との混合における、および／または得られたポリマー／細胞組成物の取扱いおよび貯蔵における支援に用いることができる。
【００５４】
移植する細胞にポリマーと共に加えることができる生物学的活性剤としては、限定することなく、抗酸化剤、ビタミン、膜安定剤、ミネラル、浸透圧保護剤、コエンザイム、粘性増強剤、および増殖因子を含む。移植細胞での細胞死の原因については多数のメカニズムの関与があるとされ、例えば膜の破壊および遊離基形成などである。抗酸化剤は、脂肪移植において、遊離基形成を低減するために用いることができる。抗酸化剤は、遊離基を取り除き、活性酸素種により引き起こされる損傷を防止する。ある態様において、ポリマー／細胞組成物は、さらに抗酸化剤を含む。ポリマーおよび抗酸化剤は、細胞の保護を改善し、これにより脂肪移植の結果を改善すると考えられている。抗酸化剤は、酵素または非酵素の抗酸化剤であってよい。酵素抗酸化剤としては、例えばスーパーオキシドジスムターゼ、グルタチオンペルオキシダーゼ、およびカタラーゼを含む。例示の非酵素抗酸化剤としては、アルファ−トコフェロール（ビタミンＥ）、ビタミンＡ、グルタチオン、カロテノイド（例えばリコペン、ルテイン、ポリフェノール、β−カロテン）、フラボノイド、フラボン、フラボノール、グルタチオン、Ｎ−アセチルシステイン、システイン、リポ酸、ユビキナール（ubiquinal）（コエンザイムＱ）、ユビキノン（コエンザイムＱ１０）、メラトニン、リコペン、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、安息香酸塩、メチルパラベン、プロピルパラベン、プロアントシアニジン、マンニトール、およびエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）が挙げられる。ある態様において、抗酸化剤は金属抗酸化剤である。ある態様において、抗酸化剤はセレニウムである。ある態様において、抗酸化剤は亜鉛である。ある態様において、抗酸化剤は銅である。ある態様において、抗酸化剤はゲルマニウムである。
【００５５】
ある態様において、ポリマー／細胞組成物はさらにビタミンを含む。ビタミンは抗酸化剤であってよい。ある態様において、ビタミンはアルファ−トコフェロール（ビタミンＥ）である。ある態様において、ビタミンはコエンザイムＱ１０である。ある態様において、ビタミンはベータ−カロテンである。本発明のポリマー／細胞組成物に添加できるその他のビタミンとしては、ビタミンＡ、ビタミンＢ１（チアミン）、ビタミンＢ２（リボフラビン）、ビタミンＢ３（ナイアシン）、ビタミンＢ４（アデニン）、ビタミンＢ５（パントテン酸）、ビタミンＢ６（ピリドキシン）、ビタミンＢ７（ビオチン）、ビタミンＢ９（葉酸）、ビタミンＢ１２（シアノコバラミン）、ビタミンＤ（エルゴカルシフェロール）、およびビタミンＫが挙げられる。
【００５６】
ある態様において、ポリマー／細胞組成物は、ホルモンまたは増殖因子をさらに含む。ある態様において、ホルモンまたは増殖因子は、インスリン、グリタゾン、コレステロール、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ、ＥＧＦ、ＰＤＧＦなどである。ある態様において、ポリマー／細胞組成物は、有機酸（例えばリポ酸）をさらに含む。ある態様において、ポリマー／細胞組成物は、チオール含有またはジスルフィド含有分子（例えばリポ酸、グルタチオン）をさらに含む。ある態様において、ポリマー／細胞組成物は、有機小分子（例えばアントシアニン、カプサイシン）をさらに含む。
【００５７】
ある態様において、脂肪細胞を、対象への移植のためにｐ１８８およびグルタチオンと組み合わせる。ある態様において、脂肪細胞を、対象への移植のためにｐ１８８およびリポ酸と組み合わせる。ある態様において、脂肪細胞を、対象への移植のためにｐ１８８およびビタミンＥと組み合わせる。
【００５８】
本明細書に記載のポリマーの製剤は、製薬分野で知られているかまたは今後開発される任意の方法により、調製することができる。一般に、かかる調製方法は、ポリマーを１または２以上の賦形剤および／または１または２以上の他の生物学的活性剤と関連させるステップを含む。本発明の組成物中の、ポリマー、薬学的に許容し得る１または２以上の賦形剤、および／または任意の追加の剤の相対的な量は、ポリマーの素生、ポリマーのサイズ、移植部位、および／または対象に依存して変化する。例として、移植する細胞と混合する組成物は、１％〜９９％（ｗ／ｗ）の間のポリマーを含むことができる。
【００５９】
ポリマーの製剤は、薬学的に許容し得る賦形剤を含むことができ、これには、本明細書において、所望の特定の製剤に適する任意の全ての溶媒、分散媒、希釈剤、またはその他の液体ベヒクル、分散または懸濁補助剤、界面活性剤、等張剤、増粘剤または乳化剤、保存剤、固体結合剤、潤滑剤などが含まれる。RemingtonのThe Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, A. R. Gennaro（Lippincott, Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2006；参照により本明細書に組み込まれる）には、医薬組成物を製剤化するのに用いられる種々の賦形剤および、その調製のための既知の技術が開示されている。任意の従来の賦形剤が物質またはその誘導体と、任意の望ましくない生物学的効果を生成するか、または医薬組成物の任意の他の成分（単数または複数）と有害な様式で相互作用することにより、不適合でない限り、その使用は本発明の範囲内であることが意図される。
【００６０】
いくつかの態様において、薬学的に許容し得る賦形剤は、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の純度である。いくつかの態様において、賦形剤は、ヒトでの使用および獣医学的使用に承認されている。いくつかの態様において、賦形剤は米国食品医薬品局により承認されている。いくつかの態様において、賦形剤は医薬品グレードである。いくつかの態様において、賦形剤は、米国薬局方（ＵＳＰ）、ヨーロッパ薬局方（ＥＰ）、英国薬局方、および／または国際薬局方の基準を満たす。
【００６１】
ポリマー組成物の製造に用いる薬学的に許容し得る賦形剤としては、限定することなく、不活性希釈剤、分散剤、界面活性剤および／または乳化剤、崩壊剤、保存剤、緩衝剤、潤滑剤、および／または油が挙げられる。かかる賦形剤は、任意に本発明の製剤に含むことができる。着色剤などの賦形剤は、配合者の判断により、組成物中に存在させることができる。
【００６２】
例示の希釈剤としては、限定することなく、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、リン酸カルシウム、リン酸二カルシウム、硫酸カルシウム、リン酸水素カルシウム、リン酸ナトリウム、ラクトース、スクロース、セルロース、微結晶性セルロース、カオリン、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、塩化ナトリウム、乾燥デンプン、コーンスターチ、粉砂糖など、およびこれらの組み合わせが挙げられる。
【００６３】
例示の分散剤は、限定することなく、ジャガイモデンプン、コーンスターチ、タピオカデンプン、デンプングリコール酸ナトリウム、粘土、アルギン酸、グアーゴム、シトラスパルプ、寒天、ベントナイト、セルロースおよび木製品、天然スポンジ、陽イオン交換樹脂、炭酸カルシウム、ケイ酸塩、炭酸ナトリウム、架橋ポリ（ビニルピロリドン）（クロスポビドン）、カルボキシメチルデンプンナトリウム（デンプングリコール酸ナトリウム）、カルボキシメチルセルロース、架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム（クロスカルメロース）、メチルセルロース、アルファ化デンプン（デンプン１５００）、微結晶性デンプン、不水溶性デンプン、カルボキシメチルセルロースカルシウム、ケイ酸アルミニウム・マグネシウム（Veegum）、ラウリルリン酸ナトリウム、第四アンモニウム化合物など、およびこれらの組み合わせを含む。
【００６４】
例示の保存剤としては、抗酸化剤、キレート剤、抗菌保存剤、抗真菌保存剤、アルコール性保存剤、酸性保存剤、およびその他の保存剤を含んでよい。例示の抗酸化剤は、限定することなく、アルファトコフェロール、アスコルビン酸、パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、モノチオグリセロール、メタ重亜硫酸カリウム、プロピオン酸、没食子酸プロピル、アスコルビン酸ナトリウム、重亜硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、および亜硫酸ナトリウムを含む。例示のキレート剤としては、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、クエン酸一水和物、エデト酸二ナトリウム、エデト酸二カリウム、エデト酸、フマル酸、リンゴ酸、リン酸、エデト酸ナトリウム、酒石酸、およびエデト酸三ナトリウムを含む。例示の抗菌保存剤としては、限定することなく、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、ベンジルアルコール、ブロノポール、セトリミド、塩化セチルピリジニウム、クロロヘキシジン、クロロブタノール、クロロクレゾール、クロロキシレノール、クレゾール、エチルアルコール、グリセリン、ヘキセチジン、イミドウレア、フェノール、フェノキシエタノール、フェニルエチルアルコール、硝酸フェニル水銀、プロピレングリコール、およびチメロサールを含む。例示の抗真菌保存剤としては、限定することなく、ブチルパラベン、メチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベン、安息香酸、ヒドロキシ安息香酸、安息香酸カリウム、ソルベート酸カリウム、安息香酸ナトリウム、プロピオン酸ナトリウム、およびソルビン酸を含む。例示のアルコール性保存剤としては、限定することなく、エタノール、ポリエチレングリコール、フェノール、フェノール化合物、ビスフェノール、クロロブタノール、ヒドロキシ安息香酸塩、およびフェニルエチルアルコールを含む。例示の酸性保存剤としては、限定することなく、ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＥ、ベータカロテン、クエン酸、酢酸、デヒドロ酢酸、アスコルビン酸、ソルビン酸、およびフィチン酸を含む。その他の保存剤としては、限定することなく、トコフェロール、酢酸トコフェロール、デテロキシムメシラート（deteroxime mesylate）、セトリミド、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、エチレンジアミン、ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＬＳ）、ラウリルエーテル硫酸ナトリウム（ＳＬＥＳ）、重亜硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸カリウム、メタ重亜硫酸カリウム、Glydant Plus（登録商標）、Phenonip（登録商標）、メチルパラベン、Germall 115、Germaben II、Neolone（商標）、Kathon（商標）、およびEuxyl（登録商標）を含む。ある態様において、保存剤は抗酸化剤である。他の態様において、保存剤はキレート剤である。
【００６５】
例示の緩衝剤としては、限定することなく、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、塩化アンモニウム、炭酸カルシウム、塩化カルシウム、クエン酸カルシウム、グルビオン酸カルシウム、カルシウムグルセプテート、グルコン酸カルシウム、Ｄ−グルコン酸、グリセロリン酸カルシウム、乳酸カルシウム、プロパン酸、レブリン酸カルシウム、ペンタン酸、第二リン酸カルシウム、リン酸、第三リン酸カルシウム、水酸化リン酸カルシウム（calcium hydroxide phosphate）、酢酸カリウム、塩化カリウム、グルコン酸カリウム、カリウム混合物、第二リン酸カリウム、第一リン酸カリウム、リン酸カリウム混合物、酢酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、第二リン酸ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸ナトリウム混合物、トロメタミン、水酸化マグネシウム、水酸化アルミニウム、アルギン酸、パイロジェン非含有水、等張食塩水、リンガー溶液、エチルアルコール等、およびこれらの組み合わせを含む。
【００６６】
本発明のポリマーは移植する細胞と組み合わせられる上に、１または２以上の生物学的活性剤と組み合わせることができる。ある態様において、ポリマーは抗酸化剤と組み合わせる。ある態様において、ポリマーはビタミンと組み合わせる。ある態様において、ポリマーは脂質と組み合わせる。ある態様において、ポリマーは膜安定剤と組み合わせる。ある態様において、ポリマーは医薬剤と組み合わせる。ある態様において、ポリマーは抗炎症剤と組み合わせる。ある態様において、ポリマーは抗生物質と組み合わせる。ある態様において、ポリマーはタンパク質またはペプチドと組み合わせる。ある態様において、ポリマーはホルモンと組み合わせる。ある態様において、ポリマーは増殖因子と組み合わせる。ある態様において、ポリマーは炭水化物と組み合わせる。ある態様において、ポリマーは、ポリマー／細胞組成物の投与のために液体賦形剤と組み合わせる。ある態様において、賦形剤は水溶液である。ある態様において、賦形剤は緩衝水溶液である。ある態様において、賦形剤はリン酸緩衝生理食塩水である。ある態様において、賦形剤は細胞外液と等張性である。
【００６７】
使用
本発明は、ポリマーまたはポリマー組成物を、移植の前に移植する細胞と関連させる方法を提供する。本発明のシステムは、移植の成功の改善に、または脂肪組織もしくは脂肪組織由来の細胞の移植の成功の改善に、特に有用である。移植する細胞は、細胞膜を安定化し移植の間の細胞の損傷を防止するのに十分な濃度で、ポリマーと混合する。ポリマーは、膜と関連することにより、細胞膜の損傷を調整または防止すると考えられる。細胞または細胞の組成物を、ポリマーまたはポリマーを含む組成物と、対象への移植の前に混合する。ポリマーは細胞と、細胞を調達するときに、細胞の貯蔵または取扱いの間に、または細胞を対象に移植する直前に、混合することができる。
【００６８】
ポリマーは、移植する組織または細胞と、調達、取扱い、加工、または移植片の移植の間の任意の時間に混合することができる。ある態様において、細胞または組織を取り出す部位に、細胞または組織をドナーの部位から採取する前に、ポリマーの組成物を注入する。例えば、ポリマーは、脂肪採取の間、tumescent注射液（すなわち、脂肪吸引の前にドナー部位に注入する液体）に含めることができる。ある態様において、移植する細胞または組織を、これらを採取した後できるだけ早くポリマーと接触させて、これらを損傷から保護する。例えば、脂肪質組織をドナーから採取した後（例えば脂肪吸引により、または針による吸引により）、組織を直ちにポリマーと接触させてよい。ある態様において、ポリマーを脂肪吸引容器中に含める。ある態様において、移植する細胞は、これを受ける同じ人から採取する（すなわち、自己ドネーション）。ある態様において、細胞はドナーの胃、大腿、または臀部から採取する。ある態様において、脂肪組織は、ポリマーまたはポリマー組成物を既に含んでいるシリンジまたは他の容器中に採取する。他の態様において、脂肪組織は採取して直ちにポリマーの組成物に加えるか、またはポリマーの組成物を脂肪質組織に加える。得られたポリマー／細胞組成物は、対象への移植の前に、さらに加工することができる。例えば、細胞は、対象への移植の前に、洗浄し、精製し、抽出し、またはその他で処置することができる。ある態様において、細胞または組織は、移植のための細胞の加工の間を通して、過剰なポリマーと接触させて保持される。ある態様において、過剰なポリマーまたはポリマー溶液は、移植する組織または細胞から、例えば遠心分離により除去する。ある態様において、ポリマーは、移植前に移植片から洗浄する。
【００６９】
ある態様において、移植する細胞を、移植の直前にポリマーと接触させる。例えば、細胞は、対象に移植する直前に、手術室またはクリニックでポリマーと混合することができる。無菌ポリマーまたはその組成物を、移植する細胞と混合する。
【００７０】
細胞は典型的には、１ｍＬの細胞当たり約１〜２０ｍｇの濃度範囲のポリマーと混合する。当業者に理解されているように、移植する細胞の膜を十分安定化するのに必要なポリマーの濃度は、用いるポリマー、対象、移植部位などに応じて変化し得る。ある態様において、濃度は１ｍＬの細胞当たり約１〜１０ｍｇのポリマーの範囲である。ある態様において、濃度は１ｍＬの細胞当たり約１〜５ｍｇのポリマーの範囲である。ある態様において、濃度は１ｍＬの細胞当たり約５〜１０ｍｇのポリマーの範囲である。ある態様において、濃度は１ｍＬの細胞当たり約１０〜１５ｍｇのポリマーの範囲である。ある態様において、濃度は１ｍＬの細胞当たり約１５〜２０ｍｇのポリマーの範囲である。ある態様において、濃度は１ｍＬの細胞当たり約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５ｍｇのポリマーである。ある態様において、ポロキシマーＰ１８８を用いる場合、濃度は１ｍＬの細胞当たり約１０ｍｇのポリマーである。
【００７１】
細胞をポリマーと接触させた後、細胞／ポリマー組成物を、対象に投与するかまたは移植する。ある態様において、細胞はレシピエントに、採取の０．５〜６時間以内に移植する。ある態様において、対象はヒトである。ある態様において、対象は哺乳動物である。ある態様において、対象はマウス、ラット、ウサギまたはイヌなどの試験動物である。細胞／ポリマー組成物は典型的には、脂肪移植を必要とする患者に投与する。対象は、再建術または美容整形術を受けていてもよい。ある態様において、脂肪移植を用いてシワを取り除く。ある態様において、脂肪移植を軟部組織置換または増大に用いる。ある態様において、脂肪移植を用いて、唇、頬、乳房、顔、臀部、ふくらはぎ、胸筋、および陰茎を増大させる。典型的には、自己脂肪細胞をドナーに対して、細胞を採取したのとは異なる部位に移植して戻す。細胞または組織は、任意の方法または技術（例えば注入、外科的移植）を用いて、移植または投与することができる。
【００７２】
脂肪質組織は、脂肪細胞の他に幹細胞のソースであることが見出された（Gimble et al., “Adipose-Derived Stem Cells for Regenerative Medicine” Circulation Research 100:1249-1260, 2007；本明細書に参照により組み込まれる）。したがって、本発明のシステムは、幹細胞または脂肪組織由来の他の細胞の損傷を安定化し防止するのに有用でありえる。ある態様において、本発明のシステムは、成人幹細胞の移植に有用である。ある態様において、本発明のシステムは、線維芽細胞の移植に有用である。脂肪組織に見出されるその他の細胞としては、限定することなく、間質細胞、平滑筋細胞、血球（例えばマクロファージ）、上皮細胞、および内皮細胞を含む。本発明は、任意のかかる細胞の移植を提供する。
【００７３】
キット
本発明はまた、本明細書に記載の１または２以上のポリマーまたはポリマー成分を容器に含む、パッケージまたはキットも提供する。例えば、容器は、脂肪移植に使える状態のポリマーまたはポリマー組成物を含むことができる。パッケージはまた、容器に関連する通知書を、典型的には、医療機器および／または医薬品の製造、使用、または販売を規制する政府機関により規定された形態において含んでよく、これにより、通知書は、組織移植におけるヒトまたは獣医学的投与に対する、該機関による組成物の承認を反映する。ポリマーの使用についての使用説明書も含むことができる。かかる使用説明書は、ポリマーまたはポリマー／細胞組成物の患者への投与に関連する情報を含むことができる。特に、使用説明書は、ポリマーを細胞または組織と接触させること、および細胞／ポリマー組成物を患者に投与することについての情報を含んでよい。パッケージはまた、投与前にポリマー／細胞組成物に含まれるべき生物学的活性剤（１または２以上）を含む、１または２以上の容器も含むことができる。
【００７４】
パッケージは、ポリマー／細胞組成物の調製のための装置またはレセプタクルも含んでよい。装置は、例えば、測定または混合装置であってよい。
【００７５】
パッケージはまた任意に、本発明のポリマー／細胞組成物を投与するための装置を含むことができる。例示の装置としては、特別のシリンジ、針、および種々の咽頭鏡デザインに適合するカテーテルを含む。
【００７６】
キットの成分は、１つの大きな容器、例えばプラスチックまたはスチロフォームのボックス内に、比較的厳重に封止して提供することができる。典型的には、キットは、医療従事者の使用に便利であるように包装される。ある態様において、キットの成分は、手術室または診療所などの無菌環境において用いるために、無菌包装される。
【００７７】
例
例１：ポロキサマーＰ１８８の処置による脂肪移植における脂肪保護と生存の増強
緒言：自己脂肪移植は、軟部組織再建の重要なツールである。しかし、損傷された細胞およびアポトーシス細胞は、最終的には身体に再吸収され、軟部組織再建に不整合で望ましくない結果を提供する。ポロキサマーＰ１８８は、損傷細胞膜と相互作用し、自身を脂質単層に挿入する剤である。この非イオン性界面活性剤は、損傷細胞の膜を効果的に封止し、外傷とアポトーシスから保護することが示されている。脂質膜と相互作用するポロキサマーの能力から、我々は、脂肪採取の間に損傷された脂肪細胞の部分を封止することにより、損傷細胞の構造的完全性を再建し保護して、細胞の生存を改善できるとの仮説をたてた。この例では、Ｐ１８８が損傷組織を効果的に再建および保護し、細胞の生存を改善し、移植結果を改善する能力について調べる。
【００７８】
方法：脂肪は脂肪吸引により得て、手術室での採取の１時間以内にヌードマウスに移植した。０．６ｍＬの脂肪を、各マウスの右の背の皮下に入れた。試験は次の３群を含む：（１）１０ｍｇ／ｍＬ濃度のＰ１８８で処置した脂肪；（２））１０ｍｇ／ｍＬ濃度のデキストランで処置した脂肪；および（３）生理食塩水で処置した脂肪。６週間後、マウスを安楽死させ、脂肪移植片を採取した。脂肪移植片は、移植の前と後に、重量、容積、生存／死亡アッセイ、ミトコンドリアＡＴＰレベル、およびレプチンとＰＰＡＲγ２レベルのためのリアルタイムＰＣＲにより評価した。
【００７９】
結果：移植された脂肪は、６週間後に各動物において、良好に限局性の区切られた小結節に発達した。生理食塩水対照は、重量および容積に基づき３０％までの再吸収を示した。デキストラン処置の脂肪移植片は、同様の再吸収率を示した。Ｐ１８８で処置した脂肪移植片は、再吸収における６７％の減少を示した。図５参照のこと。これは統計的に有意な減少である（ｐ＜０．００１）。差はまた分子レベルおよび組織学的にも観察され、脂肪細胞の割合の顕著な増加と、空胞領域または線維形成の減少を示した。
【００８０】
結論：この例において、ヒト脂肪移植片の有効性および生存を、移植のヌードマウスモデルを用いて試験した。非イオン性界面活性剤であるポロキサマーＰ１８８は、脂肪移植片の再吸収を顕著に低減し、細胞の生存を改善した。対照的に、同等の分子量の対照であるデキストランによる処置は、生理食塩水と同様な結果を与えた。Ｐ１８８の使用は脂肪移植片を再建して保護し、細胞の生存を改善し、脂肪移植片の再吸収を低減させた。
【００８１】
例２：脂肪移植についてのＰ１８８と他の剤の比較
緒言
外傷に続発する軟部組織損傷および形成異常、先天的欠陥、感染症、および腫瘍切除は、患者における重要な病的状態のソースである。現在、自己遊離皮弁再建または局所前進皮弁は、重大な軟部組織および骨欠損に対する再建モダリティの中心である。有茎皮弁および遊離皮弁再建は、再建に対する強力なツールを提供する一方で、これらは潜在的に、重篤な副作用およびドナー部位の病的状態なしではあり得ない。これら欠陥を再建するために、大量の自己脂肪組織を移行できることは、潜在的に何百万もの患者に対して、関連するドナー部位病的状態なしで新規な再建オプションを提供する。さらに、ドナー部位オプションが限られている患者に対して、および皮弁再建に必要な長い手術時間に耐えられない患者に対して、強力なツールを提供する。
【００８２】
リポ吸収脂肪を用いる利点は２つある：１）最小のドナー部位病的状態により、安全で容易にアクセス可能な自己細胞のソースを提供すること；および２）これらの手順が、虚血性合併症および血管新生遊離皮弁に関連する初期の移植失敗についての心配なしに、比較的容易に実施できること。しかし今日まで、遊離脂肪移植片は、予測不可能な高レベルの再吸収およびそれによる不規則性（異常）に悩まされてきた。遊離脂肪移植の失敗および容積の減少は、採取からの機械的ストレス、初期の虚血変化、および栄養の欠乏に関連するようにみえる。これらのストレッサーはアポトーシスをもたらす。続いて、移植片の再吸収が、再血管新生後の死んだ細胞デブリの除去から生じる。
【００８３】
これまでのところ、十分な血管分布が確立されるまで初期の虚血性傷害を弱め、細胞を保護する努力は、ささやかな結果しか得られていない。再吸収は、長期の脂肪移植片の生存に重大な障害となり、軟部組織創傷再建に対してより大きな努力を生じさせる。そのため、我々はポリマーを含む膜安定剤を幅広く調査した。これらのポリマーのいくつかは、我々の研究室においてアポトーシス細胞死を減少させ、これにより経時的により大容量の脂肪移植片をもたらすことが示された。これらポリマーの混合物は、予測可能で永久的な遊離脂肪移植をもたらす、細胞蘇生の解法を提供することができる。
【００８４】
Ｐ１８８は、２つのより長いポリオキシエチレン親水性尾部（ＰＯＥ単位、図１Ａ参照）にわたる中心ポリオキシプロピレン疎水性領域（ＰＯＰ単位、図１Ｂ参照）を有するトリブロックコポリマーである。我々は、機械的外傷および虚血ストレスが、正常な脂肪細胞の細胞膜の損傷をもたらすと考える。この損傷は最初に空隙率の増加として現れ、正常な膜イオン勾配の減少を引き起こす。膜の電気的完全性の損失は、アポトーシスカスケードの既知の強力なアクチベーターである。次にプログラムされた細胞死を受け、脂肪滴の集合として移植片中に残る細胞は、後に再吸収されて、移植片容積の損失をもたらす。このようにＰ１８８は、外傷を受けた脂肪細胞膜に入る能力を有し、膜の安定化を可能とする（図２参照）。さらに、Ｐ１８８は、その高度に水和化されたＰＯＥ尾部で膜の粘性を低下させることが知られている。細胞の粘性を低下させることにより、外傷を受けた細胞をより可溶性にすることができ、こうして損傷された膜に対する圧力を低下させる。
【００８５】
ポロキサマーＰ１８８は、損傷された膜の修復および損傷脂肪細胞の生存度および生存の可能性を改善するのに、特に有効であることが実証されている。この修復メカニズムについての可能性のある構成を図２に示す。損傷された細胞膜は、中心脂質層の一部を周囲に暴露し得る。近くにあるＰ１８８鎖の中心疎水性部分は、この疎水性脂質層と相互作用することができ、Ｐ１８８鎖は、鎖の親水性末端が細胞膜の外側親水性表面に沿って位置するように「折りたたまれる」ことができる。この封止／修復プロセスは、従来の自動車タイヤのプラグ修復と類似しており、ここで、柔軟なゴム製プラグの中心をタイヤの小さな穴に押し入れて封止し、この時プラグの端部は外側トレッドに沿って位置している。複数のＰ１８８鎖が集合して、異なる大きさの損傷領域を有する複数の損傷膜の封止を支援することができる。
【００８６】
我々独自の脂肪吸収アポトーシスモデルから離れても、研究により、この細胞膜サルベージプロセスは、エレクトロポレーションモデル［Lee et al., Surfactant-induced sealing of electropermeabilized skeletal muscle membranes in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A, 1992. 89(10):4524-8；本明細書に参照により組み込まれる］およびイオン化放射モデル［Hannig et al., Surfactant sealing of membranes permeabilized by ionizing radiation. Radiat Res, 2000. 154(2):171-7；本明細書に参照により組み込まれる］の両方において実証されている。さらに、鈍い外傷（blunt trauma）後の神経損傷を調べる新しい研究により、Ｐ１８８による膜保護は、機械的な膜の安定性を提供することによって、せん断損傷の初期において細胞を蘇生させることが示された［Marks et al., Amphiphilic, tri-block copolymers provide potent membrane-targeted neuroprotection. FASEB J, 2001. 15(6):1107-9；Serbest, G., J. Horwitz, and K. Barbee, The effect of poloxamer-188 on neuronal cell recovery from mechanical injury. J Neurotrauma, 2005. 22(1):119-32；Serbest et al., Mechanisms of cell death and neuroprotection by poloxamer 188 after mechanical trauma. FASEB J, 2006. 20(2):308-10；これらの各々は、本明細書に参照により組み込まれる］。この研究は、我々のものと同様、損傷後のアポトーシスの減少と細胞生存度の増加を実証している。興味深いことには、ここでも、処置された細胞は処置なしの損傷細胞と比較して、損傷されない、すなわち元々の神経細胞と似ていたことである。
【００８７】
この例において我々は、Ｐ１８８の、移植前後の期間（採取から安定した移植までの時間）での損傷された脂肪細胞の救助における有効性を示す。さらに、我々は、サイズおよび構造がＰ１８８と近く関連するポリマーも、Ｐ１８８ほどではないが同様の効果を有することも実証する。
【００８８】
方法
アポトーシスの同定：免疫化学的アポトーシス特異的蛍光標識FLIVO（商標）およびMT Mito（商標）を用いて、脂肪細胞でのアポトーシスを同定した。脂肪移植片を外植し、Blendzyme（Roche Applied Science Liberase Blendzyme 3）を用いて３８℃で２０分間処置し、１００ミクロンの細胞ストレーナを通過させた（消化後に残された細胞外間質成分を除去するため）。これらの細胞を次に３８℃で１時間インキュベートし、標識化の後に１回洗浄した。次に細胞を９６ウェル黒色プレートに入れ、プレートリーダー（Molecular Devices, SpectraMax M2)）で染料特異的な発光および励起波長（FLIVO-red、励起５６５／発光＞５９０、MITO-PT、励起４８８／発光：green５３０、red５９０）において読み取った。
【００８９】
PICO Green：InvitrogenからのQuant-iT PicoGreen（登録商標）ｄｓＤＮＡアッセイキットを、細胞数の代理としてのＤＮＡの定量化に用いた。それぞれの外植した小葉を、１．０ｃｃのBlendzyme中３８℃で３０分間消化した。次にBlendzyme反応を１．０ｃｃのＦＢＳ含有細胞培養培地を用いて停止させた。定量化のために、７５μＬの消化脂肪を除去し、Qiagen Mini-prepスピンカラム単離キットを用いて処理した。抽出したＤＮＡ試料を次に、試薬Ａ（PicoGreen（登録商標）蛍光体）、Ｂ（トリス緩衝液）、および標準用の成分Ｃ（LambdaのｄｓＤＮＡ標準、１００μｇ／ｍｌ濃度）を用いて、キットのプロトコルに従ってインキュベートした。これらの試料を次に、プレートリーダーで黒色９６ウェルプレートを用いて読み取った。
【００９０】
脂肪処理：脂肪吸引物は手術室で直接採取した。これを３０ｃｃのアリコートに分配し、等容量の生理食塩水で１回洗浄して、血液および細胞デブリを除去した。その後、試験管を２００Ｇで遠心分離し、中間層を分離して、種々の剤で処置した。これらの剤を３０ｃｃの洗浄液中、３０ｃｃの脂肪を用いて３７℃で３０分間処置した。このインキュベーションは、虚血時間を最小にし、一方で処置剤との十分な混合を可能とするために選択された。インキュベーションと洗浄の後、脂肪を再度２００Ｇで遠心分離した。中間脂肪層を再度分離し、ヌードマウス側腹部への注入用の１．０ｃｃ、１．０ｇのアリコートに入れた。これは非同定の廃棄組織の使用についてのＩＲＢ承認のもとで実施した。注意すべきことは、採取カニューレおよび採取圧力はケース毎、外科医毎に異なった。脂肪は、温虚血時間を最小化するために、手術室での採取後２時間以内に動物に移植した。
【００９１】
実験モデル：ヌードマウスに、１．０ｃｃ／１．０ｇ（＋／−０．０１ｇ）の脂肪移植片を１つの小葉として移植した。これらのマウスには、臨床的に関連する１ｃｃ注射を模すために、１４ゲージの血管カテーテルで注射した。２つの小葉を、試験に用いたヌードマウスの各々の両方の側腹部に移植した。１４ゲージの血管カテーテルを選択して、注射中の脂肪移植片の外傷を最小化した。多くの臨床医は、１６および１４ゲージカテーテルを脂肪移植に現在用いており、したがってこのサイズのカテーテルを、臨床診療を近似するために用いた。
【００９２】
初めに、小葉を毎日外植し、重量およびアポトーシス活性を測定した。初期の曲線を作成した後は、小葉は３日、６日、および９日目に、アポトーシスレベルの初期測定のために外植した。さらに、これらの試料を計量し、組織学的検査に送って、ＤＮＡ含量を測定した。初めの１０日間のエンドポイントを、６週目でのエンドポイントと比較して、移植片の性能が初期のアポトーシスおよび細胞死によって正確に予測できるかどうかを決定した。
【００９３】
各実験は、マウスの初期群および後期群からなる。各群に、一人の患者からの同一の脂肪を１日で注入した。初期時点について、各群２匹の動物を各サンプリングの日に安楽死させた（各時点毎にｎ＝４の小葉）。さらに、これら同一群からの動物を６週目の時点で、後期エンドポイントの検討のために安楽死させた（８匹の動物からの１６小葉を、後期時点の各群について用いた）。ひとたび動物を安楽死させた場合、両方の小葉を採取して分析し、この動物を検討から取り除いた。
【００９４】
試験する剤：この検討においては、一連の種々の剤を試験した。具体的には、種々のポリマーを選択して、異なるプルロニック（Pluronic）サブユニット鎖の長さおよび構造の効果を検討した。
【００９５】
プルロニック：プルロニックを、一定範囲の大きさ、異なるＰＥＧ組成（親水性）、およびブロック構造にわたり試験した。これらは、非産業的使用に対して最も広く市販されているポロキサマーである。これらは全て、２５ｃｃの生理食塩水中５０μＭの用量で試験した。試験した剤は、Ｐ１８８（〜８０００ＫＤａ／８０％のＰＥＧ含量）、Ｆ３８（４，７００ＫＤａ／８０％のＰＥＧ含量）、Ｆ１０８（１４，６００ＫＤａ／８０％のＰＥＧ含量）、Ｆ１２７（１２，６００ＫＤａ／７０％のＰＥＧ含量）、Ｌ６４（２，９００ＫＤａ／４０％のＰＥＧ含量）、Ｔ１１０７（７０％のＰＥＧ、より大きいテトラブロックポロキサマー）、およびＰ３１Ｒ１（３２５９ＫＤａ、逆のブロック順序）である。また、ジブロック（ＰＥＧ−ブロック−ポリ−カプロラクトン−ブロック）も試験した。
【００９６】
非イオン性：長い疎水性尾部（オレイン酸）と親水性頭部（ポリエトキシル化ソルビタン）を有するポリマー、Polysorbate 80（Tween 80）を、Ｐ１８８と同じモル濃度（２５ｃｃの生理食塩水中５０μＭ）で試験した。コレステロールも同じモル濃度で試験した。
【００９７】
カチオン性およびアニオン性：ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ＨＣＴＡ、カチオン性）およびセチルトリメチルアンモニウムクロリド（ＣＴＡ、アニオン性）の非プルロニック荷電界面活性剤を、２５ｃｃの生理食塩水中５０μＭにて試験した。これらの分子は〜３６０ＫＤａの大きさの範囲であり、荷電アンモニウム塩頭部の疎水性短鎖を有する。
【００９８】
両性イオン性：いくつかの正常細胞膜に存在する両性イオン界面活性剤であるホスファチジルコリン（ＰＣ、７９０ｋＤａ）を試験した。両性イオン界面活性剤は、ｐＨに依存して荷電または非荷電特性を有することができる。
【００９９】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）：ＰＥＧ８００を、これがＰ１８８と同じ分子量を有するため、１０ｍｇ／ｍｌで試験した。さらにＰＥＧ６００およびＰＥＧ３３５０を別々に、および組み合わせて、それぞれ１．３％および１．５％で、冷凍保存用途での軟骨細胞膜保護について文献に公開されているようにして試験した。ＰＥＧの後の数字は、その分子量を表す。ＰＥＧはポロキサマーの成分であり、完全に親水性である。
【０１００】
添加剤：Ｐ１８８に対するいくつかの添加剤を試験した。ビタミンＣを１０％〜１％の濃度で試験し、リポ酸を５００ｍＭにて１００ｍｇ／脂肪１ｋｇ（ラット虚血再灌流モデルで用いた用量）で試験し、レスベラトロール（２５ｃｃの生理食塩水中５０μＭで）、フルクタン（広い温度範囲を受ける植物膜を保護することが示された有機分子）を試験した。また、シクロスポリン（ＣｓＡ）も試験した（強力な免疫抑制薬）。
【０１０１】
統計：試料は、ＡＮＯＶＡまたはスチューデントｔ検定を用いて、群間の統計的有意性について解析した。有意性は９５％信頼区間に設定し、Ｐ＜０．０５を統計的に有意とした。
【０１０２】
結果
電子顕微鏡検査：新鮮な脂肪吸引物からの脂肪細胞を固定し、透過電子顕微鏡下で検討した。これらの試料は、脂肪吸引採取による膜損傷の存在について試験した。電子顕微鏡下で、我々は採取直後の無処置の脂肪細胞の膜における孔に気づいた。これらの孔は３０〜６００ｎｍの範囲であった（図３参照）。また、これらの孔は脂肪細胞のミトコンドリアに近接していることにも気づいた。
【０１０３】
アポトーシス
共焦点顕微鏡検査：初期の実験からの試料を、共焦点顕微鏡検査用に外植した。これらの小葉をBlendzyme中で消化し、アポトーシス特異的標識FLIVO-redで標識した；インキュベーション後、これらの細胞を４％のパラホルムアルデヒド中に固定し、共焦点顕微鏡下でアポトーシスレベルの定量的評価のために試験した。FLIVO-redＳＲ（励起５６０ｎｍ、発光５９０ｎｍ）を用いて脂肪細胞を視覚化し、処置と未処置群の間に有意な差を見出した（図６参照）。生理食塩水処置試料は、細胞膜全体に大きな赤いアポトーシス小胞を示した。対照的に、Ｐ１８８で処置した試料は、６日目に比較的少数の赤いアポトーシス小胞を示した。
【０１０４】
アポトーシスの定量化：初めに小葉を毎日外植し、Mito-PTを用いてアポトーシスレベルを測定した。毎日の試験の後、アポトーシスのピークレベルは５〜７日目の間に起こり、次にまた下がる傾向にあることがわかった。これらの値はほぼベルの形状の曲線で減少した。ひとたびこの曲線を決定したので、続く試料は０、３、６、および９日目に、初期のアポトーシスのサンプリングのために試験した（図７参照）。
【０１０５】
Ｐ１８８を、アポトーシス特異的標識を用いて生理食塩水処置の対照と比較すると、アポトーシス事象における統計的に有意な減少が６日目に示された。試料間で差がないことを仮定してスチューデントｔ検定を用いたこの差は、ｐ値０．０３を示した。６日目に、生理食塩水（ＮＳ）は４１，０００ＲＦＵであり、対してＰ１８８は２４，０００ＲＦＵ（平均値の標準誤差は、ＮＳ：＋／−５，７２０ＲＦＵ、Ｐ１８８：４４８５ＲＦＳ）であった。これはＰ１８８処置の脂肪移植片において、生理食塩水処置の対照と比較した場合、アポトーシス事象における平均４０％の減少を表す。
【０１０６】
Ｐ１８８を、いくつかの他の処置剤と、そのアポトーシスレベルへの影響について比較した（図８参照）。Ｐ１８８をＨＣＴＡおよびＣＴＡで表されるアニオン性およびカチオン性ポリマーと比較した場合、アポトーシスの顕著に低いレベルを示した（６日目、ＨＣＴＡ：４１，０３７ＲＦＵ、ＣＴＡ：３５，３３８ＲＦＵ、およびＰ１８８：３２，１５８ＲＦＵ）。さらに、ＨＣＴＡおよびＣＴＡは、より早い時点において生理食塩水対照より高いレベルのアポトーシスを示した（３日目：ＮＳ：２５，９８７ＲＦＵに対して、ＨＣＴＡ：３１，０７６ＲＦＵ、およびＣＴＡ：３５，３３８ＲＦＵ）。これらの結果は、アニオン性およびカチオン性ポリマーによる初期の細胞死の増加および全体的な脂肪移植片の毒性と整合する。
【０１０７】
次に、Ｐ１８８を逆トリブロックコポリマーＰ３１Ｒ１と比較した。このポリマーは、Ｐ１８８とほぼ同じサイズである；しかし、これは疎水性尾部と親水性コアからなる（Ｐ１８８と逆）。Ｐ３１Ｒ１処置の脂肪におけるアポトーシスレベルをＰ１８８および生理食塩水処置の対照と比較した場合、Ｐ３１Ｒ１でもまた、３、６および９日目にアポトーシス事象の増加が見られた（３日目、３４，０００ＲＦＵ、６日目、４４，０００ＲＦＵ、および４７，０００ＲＦＵ、これに対してそれぞれ、ＮＳ：８０００ＲＦＵ、５７，０００ＲＦＵ、および１１，０００ＲＦＵ、Ｐ１８８：８，０００ＲＦＵ、１６，０００ＲＦＵ、および１０，０００ＲＦＵ）。この同じ実験において、ホスファチジルコリン（非イオン性界面活性リン脂質であり、多くの細胞膜の成分）を、そのアポトーシスへの効果について評価した。ホスファチジルコリンも、Ｐ１８８に比べてアポトーシスレベルの上昇を示した。ホスファチジルコリンは、生理食塩水と比べてアポトーシスの増加を示さなかった（ＰＣ、３日目、５２，０００ＲＦＵ、６日目、２９，０００ＲＦＵ、図８、右上参照）。注目すべきは、免疫抑制剤であるシクロスポリン（ＣｓＡ）もアポトーシス活性について試験した。ＣｓＡも、脂肪移植片におけるアポトーシスレベルを減少させることができなかった。ＣｓＡは、１〜９日目に一定して生理食塩水処置対照より高いアポトーシスレベルを示した。Ｐ３１Ｒ１およびＣｓＡは脂肪移植片に対して毒性のようであり、ＰＣは生理食塩水よりもいくらかアポトーシスレベルの減少を示す可能性があるが、Ｐ１８８より減少させるものではない。
【０１０８】
Ｐ１８８をまた、ポリエチレングリコール８０００（ＰＥＧ８０００）およびテトラブロックコポリマーＴ１１０７と比較した。この系列の実験においては、古いアポトーシスアッセイ法を用いた（Apo-Oneに対してMitoPT）。古いMitoPTアッセイ法は、Apo-Oneよりもおよそ１０倍低いＲＦＵ値を示す。Ｐ１８８は再度、Ｐ１８８と比較して、アポトーシスの減少を示した（図８、左下参照）。Ｐ１８８を同様のサイズおよび構造のポリマーの組み合わせと比較した場合、これらもまた、アポトーシスレベルをさらに改善できなかった。Ｐ１８８とＦ１２７とＬ６４の組み合わせは、Ｐ１８８のみおよび生理食塩水処置対照よりも高いアポトーシスレベルを示した。これらの所見は、ＰＥＧ８０００、Ｔ１１０７、およびポリマーの組み合わせ（Ｐ１８８、Ｆ１２７、Ｌ６４）による初期の毒性を示す。
【０１０９】
さらに、Ｐ１８８をリポ酸と、およびビタミンＣと一緒に、それらのアポトーシスへの効果について試験した。Ｐ１８８をビタミンＣと組み合わせると、アポトーシスの増加を示した；しかしビタミンＣのみも、高レベルのアポトーシスを生み出した（図８、左下参照）。Ｐ１８８とビタミンＣの組み合わせは、ビタミンＣのみより低いアポトーシスを示した。Ｐ１８８とリポ酸の組み合わせは、生理食塩水処置対照と比べて、アポトーシスの減少を示した（これらの実験もまた、低い輝度のMito-PT標識を用いた、図９参照）。
【０１１０】
重量
初期：実験の初めの１０日間、脂肪小葉を、重量変化について試験した。この期間で注目されるのは、移植直後の、全群における２０〜２５％の重量減少である。我々の研究では、最初の２４時間に全体で２３．６重量％の再吸収をもたらし、平均重量は０．７４ｇ（＋／−０．８ｇ）であった。１日目のこの重量減少の後は有意な差を同定することはできず、初めの１０日間、処置群の間で重量の変化はほとんどなかった（図１０参照）。
【０１１１】
Ｐ１８８：生理食塩水と比べてＰ１８８は、６週目において統計的に有意な重量の改善を示した。６週目に、１群当たり６５個の小葉を分析し、Ｐ１８８で処置した移植片は平均重量０．７０ｇであり、生理食塩水処置の移植片は０．６４ｇであり、標準偏差はそれぞれ０．０８ｇと０．１２ｇであった（図１１参照）。さらに、再吸収率を水和化移植片重量と比べた場合、初期のサンプル期間の終わりに、Ｐ１８８は対照と比べて再吸収における５０％の減少を示した（図１２参照）。
【０１１２】
その他のプルロニックポリマー：他のプルロニックと比べた場合、６週目での重量は以下である：Ｆ１２７、０．７４＋／−０．０７ｇ；Ｌ６４、０．６８＋／−０．０６ｇ；Ｈ３８、０．６１＋／−０．２２ｇ；Ｆ１０８、０．７６＋／−０．１０ｇ；Ｔ１１０７、０．６２＋／−０．１５ｇ；Ｐ３１Ｒ１、０．７４＋／−０．０５ｇ；ジブロック、０．４４＋／−０．１６ｇ；Tween 80、０．３０＋／−０．１２ｇ。再吸収率は図１３に示す。
【０１１３】
ポリエチレングリコール：Ｐ１８８は、ＰＥＧ６００、ＰＥＧ３３５０、ＰＥＧ８０００、およびＰＥＧ６００＋３３５０と比べて、重量において統計的に有意な改善を示した。ＰＥＧ６００で処置した試料は６週目に平均で０．６４＋／−０．１１ｇの重量であった（生理食塩水は０．６４＋／−０．１２ｇ）、ＰＥＧ３３５０は０．５８＋／−０．２１ｇ、ＰＥＧ８０００は０．５３＋／−０．０６ｇ、およびＰＥＧ６００＋３３５０の混合物は０．５８＋／−０．２２ｇであった。再吸収率を図１３に示す。
【０１１４】
リポ酸：この試験における平均の１０日目の重量は、生理食塩水０．７６ｇ＋／−０．０９ｇ；Ｐ１８８、０．７６ｇ＋／−０．０９ｇ；およびリポ酸、０．７２ｇ＋／−０．０９ｇであった（最初に１．０ｇ＋／−０．１０ｇを移植）。処置群を次に６週目に再度試験した；ここで重量に有意な差が見られた。６週目に、群当たりの平均重量は、生理食塩水０．５８ｇ＋／−０．０７ｇ；Ｐ１８８、０．７１ｇ＋／−０．０６ｇ；およびリポ酸、０．６５ｇ＋／−０．０９ｇであった；およびＰ１８８＋ＬＡ、０．６１ｇ＋／−０．１６ｇであった。初期と後期の変化を比較するのに、初めの１０日間の試料の水和化重量と６週目の最終重量を用いて、再吸収率を計算した。Ｐ１８８およびリポ酸は、生理食塩水と比べて、再吸収において統計的に有意な差を示した（ｐ値＜０．０５）（図１９参照）。
【０１１５】
種々の添加剤：他の剤を、Ｐ１８８に対する潜在的添加効果について試験した場合、６週目における重量は以下であった：レスベラトール、０．７３＋／−０．０３ｇ；コレステロール、０．７３＋／−０．０４ｇ；イヌリン、０．４７＋／−０．２１ｇ；オリゴフルクトサッカリド、０．７２＋／−０．０８ｇ（この群の実験において、生理食塩水の性能は良好で平均重量は０．７４＋／−０．０４ｇであった）。これらの剤は、実験において生理食塩水より良好に機能することができず、組織学的検査により多くは毒性であることが見出された（以下参照）。
【０１１６】
細胞の生存度
６週目に採取した試料を、代謝的に活性な生細胞において濃縮され赤い蛍光を発する染料に変換される青色染料である、Cell−Titer Blueを用いてアッセイした。染料の変換は代謝活性を示し、試料中の細胞数に関連する。Ｐ１８８を種々の鎖長の他のプルロニックと６週間後に比較すると、シグナルにおける統計的に有意な増加を示した（図１４参照）。Ｐ１８８は、１２，９７１＋／−２７８５ＲＦＵであり、一方生理食塩水対照は４７２７＋／−７６８ＲＦＵであった。残りのポリマーは以下であった：Ｆ１２７、４３０１＋／−２７８５ＲＦＵ；Ｆ１０８、３５２９＋／−３７３ＲＦＵ；Ｆ３８、３１８８＋／−３４６ＲＦＵ；Ｌ６４、６１３７＋／−１９３３ＲＦＵ；Ｔ１１０７、５０６３＋／−１４９６ＲＦＵ；Tween 80、４３４６＋／−１２３１ＲＦＵ。ジブロックコポリマー（ポリエチレングリコールメチルエーテルブロックポリ−カプロラクトン）および逆トリブロックプルロニック（Ｐ３１Ｒ１）もアッセイした。これらのポリマーも、Ｐ１８８より劣っていた：ジブロック、１，６６６＋／−１２８３ＲＦＵ；Ｐ３１Ｒ１、１４５３＋／−７０３ＲＦＵ。
【０１１７】
Ｐ１８８をさらに、種々のサイズのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と比較した；これらは、我々のモデルにおける細胞生存度について、他の研究で軟骨細胞を保護することが示されていた。６週目において、Ｐ１８８は再度、優れた細胞生存度を示した（図１５参照）。ＰＥＧは次の細胞生存度シグナルを示した：ＰＥＧ６００、２８９２＋／−１１１０ＲＦＵ；ＰＥＧ３３５０、１１０９＋／−３０１ＲＦＵ；ＰＥＧ６００＋３３５０、１２９１＋／−２８９ＲＦＵ（図１５参照）。
【０１１８】
ＤＮＡ含量
外植試料を、細胞数の間接的測度としてのＤＮＡ含量についてアッセイした。消化した試料を、初期および後期時点の両方において試験した。重量測定と同様、ＤＮＡ含量にも、最初の１０日間の試料の間に有意な差はなかった。
【０１１９】
Ｐ１８８対生理食塩水対照：Ｐ１８８をＤＮＡ含量について、生理食塩水対照と６週目に比較した場合、結果は以下であった：生理食塩水対照、０．１２９＋／−０．０５２μｇＤＮＡ；Ｐ１８８、０．３２０＋／−０．０６０μｇＤＮＡ。これらの結果はスチューデントｔ検定のＰ＝０．０３で統計的に有意であった。
【０１２０】
プルロニック：次にＰ１８８を他のプルロニックと比較した場合、Ｐ１８８と他のポリマーの間に統計的に有意な差が認められた（ＡＮＯＶＡ解析ｐ＝０．０００４、Ｆｃｒｉｔｉｃａｌ＝２．２９９）。ＤＮＡ含量は以下の通りである：Ｆ１２７、０．２３６＋／−０．０４３μｇＤＮＡ；Ｆ１０８、０．０８２＋／−０．０３３μｇＤＮＡ；Ｆ３８、０．０２５＋／−０．００７μｇＤＮＡ；Ｌ６４、０．１６８＋／−０．０６２ｍｃｇＤＮＡ；Ｔ１１０７、０．１２４＋／−０．０４８μｇＤＮＡ；Tween 80、０．１３４＋／−０．０２３μｇＤＮＡ。
【０１２１】
ＰＥＧ：ＰＥＧをＤＮＡ含量について試験した場合、ＰＥＧ８０００は０．２８０＋／−０．０２４μｇＤＮＡを示した。ＰＥＧ６００、ＰＥＧ３３５０、およびＰＥＧ６００＋３３５０も試験した。
【０１２２】
組織学的検査
外植された脂肪小葉を固定し、脂肪構造についてのスコア付けのためにＨ＆Ｅで染色した。正常な脂肪含量における統計的に有意な改善が、生理食塩水処置対照と比べてＰ１８８処置された試料において見られた。Ｐ１８８について、正常脂肪、炎症性浸潤物についてのスコア、および線維形成のスコアは以下であった：平均して、５８％正常脂肪、３０％浸潤物、および１３％線維形成（１０個の小葉、１小葉あたり２つのスライド）。生理食塩水対照のスコアは以下であった：平均して、４１％正常脂肪、３８％浸潤物、および２１％線維形成（１０個の小葉、１小葉あたり２つのスライド）。スチューデントｔ検定を行った場合Ｐ＝０．０４であった。
【０１２３】
その他のプルロニック：他のポロキサマーのうち、Ｌ６４およびＦ１２７は最良のスコアであった：Ｌ６４、６５％正常脂肪、３１％浸潤物、および４％線維形成；Ｆ１２７、５２％正常脂肪、３８％浸潤物、および１０％線維形成。これらの差は、Ｐ１８８と比較した場合、統計的な有意性には達しなかった。残りのポロキサマーのスコアは以下であった：Ｆ３８、４５％正常脂肪、４４％浸潤物、および１１％線維形成；Ｆ１０８、５０％正常脂肪、４２％浸潤物、および７％線維形成；Ｔ１１０７、１５％正常脂肪、４１％浸潤物、および４３％線維形成；Tween 80、１７％正常脂肪、６７％浸潤物、および１６％線維形成（図１８、右側参照）。
【０１２４】
ポリエチレングリコール：ＰＥＧで処置された脂肪移植片は、高レベルの炎症性浸潤物と、破壊された脂肪構造を示した。ＰＥＧ８０００のスコアは、４２％正常脂肪、４５％浸潤物、および１４％線維形成であった。
【０１２５】
リポ酸：Ｐ１８８にリポ酸（ＰＬＡ）を加えたものも試験してスコアを得た。ＰＬＡは、９０％正常脂肪、９％浸潤物、および１％線維形成（ｎ＝２）であった。
【０１２６】
種々の添加剤：試験した残りの全ての添加剤は、重篤な線維形成および炎症性浸潤物とともに毒性を示した。
【０１２７】
考察
Ｐ１８８は、２つのより長いポリオキシエチレン親水性尾部（ＰＯＥ単位）にわたる中心ポリオキシプロピレン疎水性領域（ＰＯＰ単位、図１参照）を有するトリブロックコポリマーである。我々は、機械的外傷および虚血ストレスが、正常な脂肪細胞の細胞膜の損傷をもたらすと考える。この損傷は最初に空隙率の増加として現れ、正常な膜イオン勾配の減少を引き起こす。膜の電気的完全性の損失は、アポトーシスカスケードの既知の強力なアクチベーターである。プログラムされた細胞死を受ける細胞は、脂肪滴の集合として移植片に残る。これらの滴は次に再吸収されて、移植片容積の減少をもたらす。トリブロックコポリマーは、自身を外傷を受けた脂肪細胞膜に挿入し、膜の安定化を可能にする能力を有する。さらにトリブロックコポリマーは、その水和化ＰＯＥ尾部で膜の粘性を低下させることが知られている。細胞粘性を低下させることにより、コポリマーは外傷を受けた細胞をより可溶性にし、こうして損傷された膜に対する圧力を低下させる。
【０１２８】
Ｐ１８８は脂肪にあまり溶解せず、無傷で損傷のない膜に良好に吸収されないことが示されている。Ｐ１８８は、採取プロセスで機械的せん断損傷を受けた脂肪細胞が、その正常な膜力学を維持することを可能とする。これらの細胞が一旦その膜を修復することができれば、二重層でのリン脂質の量を増加することにより、Ｐ１８８は機械的に押し出される［Agarwal, J., A. Walsh, and R.C. Lee, Multimodal strategies for resuscitating injured cells. Ann N Y Acad Sci, 2005. 1066:295-309］。Ｐ１８８の押し出しは、膜貫通表面圧力の増加により引き起こされる。さらに、Ｐ１８８は次に、胆汁腸管系を介して少量が排出されると共に、実質的に無変化のままで腎臓により排泄されるらしいことも、指摘すべきである。我々は、これらの用量でのＰ１８８は、ヒトにおける使用について、副作用または安全性への懸念の証拠は存在しないと考えている［Singh-Joy, S.D. and V.C. McLain, Safety assessment of poloxamers 101, 105, 108, 122, 123, 124, 181, 182, 183, 184, 185, 188, 212, 215, 217, 231, 234, 235, 237, 238, 282, 284, 288, 331, 333, 334, 335, 338, 401, 402, 403, and 407, poloxamer 105 benzoate, and poloxamer 182 dibenzoate as used in cosmetics. Int. J. Toxicol., 2008. 27 Suppl 2:93-128］。
【０１２９】
さらに、Ｐ１８８の安全性を評価するために実施された毒性学的分析において、５０ｍｇ／ｋｇまでの用量をＩＶにてイヌに投与し、その器官をＰ１８８について分析した［Singh-Joy, S.D. and V.C. McLain, Safety assessment of poloxamers 101, 105, 108, 122, 123, 124, 181, 182, 183, 184, 185, 188, 212, 215, 217, 231, 234, 235, 237, 238, 282, 284, 288, 331, 333, 334, 335, 338, 401, 402, 403, and 407, poloxamer 105 benzoate, and poloxamer 182 dibenzoate as used in cosmetics. Int J Toxicol, 2008. 27 Suppl 2:93-128］。これらの実験において、Ｐ１８８は脂肪組織に可溶性ではないようであり、脂肪組織において放射標識されたＰ１８８はほとんど見られなかった。これは提唱された作用メカニズムをさらに支持し、それによれば、Ｐ１８８は脂肪細胞内に入ることなく、損傷された脂肪細胞膜上に吸収される。さらに、細胞膜が自己封止して表面圧力が増加すると、Ｐ１８８が細胞膜から押し出されることを実証する多くの研究がある［Wu et al., Interaction between lipid monolayers and poloxamer 188: an X-ray reflectivity and diffraction study. Biophys J, 2005. 89(5):3159-73；Zhang, Z., M. al-Rubeai, and C.R. Thomas, Effect of Pluronic F-68 on the mechanical properties of mammalian cells. Enzyme Microb Technol, 1992. 14(12):980-3；Maskarinec et al., Direct observation of poloxamer 188 insertion into lipid monolayers. Biophys J, 2002. 82(3):1453-9；Agarwal, J., A. Walsh, and R.C. Lee, Multimodal strategies for resuscitating injured cells. Ann N Y Acad Sci, 2005. 1066:295-309；これらの各々は本明細書に参照により組み込まれる］。
【０１３０】
イオン損失を防止し、損傷された細胞がアポトーシスに進むことを防ぐこの能力は、脂肪細胞に、軟部組織充填材として作用するその能力を保持することを許容する。細胞膜の安定化なしには、これらの細胞はイオンを漏出し、最終的には死亡する［Hannig et al., Surfactant sealing of membranes permeabilized by ionizing radiation. Radiat Res, 2000. 154(2):171-7；Serbest et al., Mechanisms of cell death and neuroprotection by poloxamer 188 after mechanical trauma. FASEB J, 2006. 20(2):308-10；Mina et al., Poloxamer 188 copolymer membrane sealant rescues toxicity of amyloid oligomers in vitro. J Mol Biol, 2009. 391(3):577-85；これらの各々は本明細書に参照により組み込まれる］。その結果、脂肪移植片は予測不可能な割合で再吸収される。この遊離脂肪移植に固有の予測不能性は、軟部組織再建および増大に対する脂肪移植片の効用を低下させる［Coleman, Structural fat grafts: the ideal filler? Clin Plast Surg, 2001. 28(1):111-9；Gutowski, Current applications and safety of autologous fat grafts: a report of the ASPS fat graft task force. Plast Reconstr Surg, 2009. 124(1):272-80；これらの各々は本明細書に参照により組み込まれる］。
【０１３１】
Ｐ１８８処置された脂肪移植片は、他の脂肪移植片群と比べた場合、正常な移植されたものではない脂肪のように見える。これは、Ｐ１８８処置の脂肪組織がほぼ天然の脂肪のように見える、６週目での組織学的検査により最も良好に実証される（Cell-Titer Blueおよびチアゾリルブルーテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）による、高い細胞生存度の実証に加えて）。生理食塩水処置の脂肪組織は、多量の線維形成により実証されるように、損傷されているように見える。ＰＥＧ（Ｐ１８８の成分であり、一定の細胞型の保護に効果的であることが別に示されている）およびテトラブロックコポリマー（Ｐ１８８に類似し、追加の親水性尾部を有する）は、高〜中程度の線維形成レベルの炎症性浸潤物をもたらす。
【０１３２】
移植前後の期間の間に脂肪細胞を機械的に保存する能力は、組織学的および生化学的分析で正常脂肪のように見える脂肪移植片をもたらす。その反対に、対照の未処置の脂肪移植片は、線維性となりその正常な脂肪構造を失う（図１７参照）。ニューロンについて実施された同様の研究において、細胞を機械的に損傷させた後に、Ｐ１８８処置の細胞は、損傷なしのニューロンに近い振舞いをすることが実証された［Marks et al., Amphiphilic, tri-block copolymers provide potent membrane-targeted neuroprotection. FASEB J, 2001. 15(6):1107-9；Serbest, G., J. Horwitz, and K. Barbee, The effect of poloxamer-188 on neuronal cell recovery from mechanical injury. J Neurotrauma, 2005. 22(1):119-32；これらの各々は本明細書に参照により組み込まれる］。基本的に、機械的な膜の安定化は、神経シグナリングとアキソン機能の保存をもたらしたが、細胞の正常な機能の生理学的変化はもたらさなかった。
【０１３３】
我々のデータが証拠付けるように、Ｐ１８８処置の脂肪移植片は、その最初の重量、細胞機能（代謝活性、ＡＴＰレベルなどにより評価）、および正常な構造を、生理食塩水洗浄細胞よりも良好に保持している。これは、移植の間の細胞の保存を実証し、これらが新しい位置において正常な脂肪細胞として機能することを可能とする。具体的には、Ｐ１８８を生理食塩水処置の対照と比較した場合、６週目に統計的に有意な重量の増加を示し、これは再吸収における５０％の減少と相関する（ｎ＝１７０、Ｐ＝０．０３）。さらにＰ１８８は、最初の１０日間におけるアポトーシス事象の統計的に有意な減少、６週目における細胞生存度の有意な増加、６週目におけるＤＮＡ含量の有意な増加、および６週目における組織学的検査による正常細胞の統計的に有意な増加を示す。
【０１３４】
Ｐ１８８を他のプルロニックと比較した場合も、優れた結果を示す。この研究で調査した２つの他のポリマーはＰ１８８と類似の性能であったが、全体的にはＰ１８８より劣っていた。これらのポリマーはＬ６４とＦ１２７であった。Ｌ６４は室温で液体であり、分子量は２９００ｋＤａで、４０％ＰＥＧおよび６０％ＰＯＥである。Ｆ１２７はＰ４０７であり、Ｆ１２７は１２６００ｋＤａで７０％のＰＥＧ含量である。これら２つの剤は両方とも、Ｐ１８８と同様の再吸収プロファイルを示し（図１３参照）、また細胞生存度の改善を示し（Ｌ６４対生理食塩水、図１４参照、Ｆ１２７は生理食塩水より高い傾向であったが、平均では対照と同様であった）、ただし生理食塩水対照と比較して統計的に有意ではなかった。さらに、Ｌ６４とＦ１２７は、生理食塩水対照と比較してＤＮＡ含量におけるいくらかの改善を示したが（本ｎ値においては、近いが有意ではなかった）、Ｐ１８８処置試料より劣っていた（図１６参照）。これらの剤は、組織学的に試験した場合、正常脂肪、線維形成および浸潤物の存在についてのスコアでは、Ｐ１８８の性能に近づいていた。しかし、実証されたより低い細胞生存度およびより低いＤＮＡ含量により、これらの移植片はＰ１８８より劣っていた。これらの移植片は全体としてより低い脂肪細胞数を有するが、組織学的には比較的健康であり、Ｐ１８８と同様の重量を有する。
【０１３５】
これらのポリマーは、異なるトリブロックコポリマーのサイズの範囲と、膜封止特性に対する効果を示す。Ｌ６４は小さく（２９００ｋＤａ）、より疎水性であり；Ｆ１２７は大きく（〜１３，０００ｋＤａ）、より親水性である。Ｐ１８８はこれら２つの剤の中間であり、〜８０００ｋＤａの重量および８０％のＰＥＧ含量である。したがってＰ１８８は、Ｆ１２７より長い親水性尾部と、少し短い疎水性領域を有する。Ｌ６４はより短いＰＥＧ鎖のより軽い分子である。疎水性領域は、膜の孔の暴露された疎水性領域における膜封止活性に必須である。しかし、一旦分子が暴露された孔に配置されると、親水性鎖が追加の保護を提供するようである。これらの鎖は、表面の可溶性を増加させることにより、膜に対する圧力の低下を促進する（図２参照）。
【０１３６】
Ｐ１８８をポロキサマーＦ３８およびＦ１０８（Ｐ９８およびＰ３０８）と比較した場合、これらの剤はより高い再吸収性、低い細胞生存度、および低いＤＮＡ含量を示した。これらの剤は両方とも８０％ＰＥＧであるが、そのサイズは大きく異なる。Ｆ３８はＰ１８８の半分の重量であるが、同じＰＥＧ含量を維持している。これは疎水性と親水性の比率を維持し、すなわちＦ３８はより小さいが、Ｐ１８８と同じＰＥＧ（親水性）含量を有する。Ｆ１０８は〜１５，０００ｋＤａであり、したがってより大きいが、やはり同一の親水性組成を有する。このように、両方の鎖長における改変は、脂肪細胞における膜封止効果に影響する。組織学的検査により、これらの剤両方は、Ｐ１８８および生理食塩水対照よりも高いレベルの損傷を引き起こした。鎖長の増加は、膜の可溶性を高め、究極的にはＦ１０８による洗浄剤効果（細胞膜溶解）を引き起こし、一方Ｆ３８は小さすぎるようである。Ｌ６４はさらに小さいが、しかしその増加した疎水性含量は、開いた孔中に集積することを可能とするようである。
【０１３７】
より高い親水性含量のポリキサマーに見られるこの膜溶解効果は、純粋なＰＥＧで処置された脂肪移植片に見られる結果に翻訳される。ＰＥＧ６００、３３５０、および８０００を試験した。これらのＰＥＧは、ＰＥＧ重量の範囲を示す（例えばＰＥＧ６００＝６００ｋＤａのポリエチレングリコール）。前の研究において、ＰＥＧ６００と３３５０の混合物は、冷凍軟骨細胞を保存することが示された。米国特許出願US2009/0017438。我々の研究においては、脂肪細胞は軟骨細胞より、洗浄剤効果の影響を受けやすいようである。ＰＥＧ（およびＰＥＧの組み合わせ）で処置された全ての群は、Ｐ１８８および生理食塩水対照と比較して劣った結果を示した。ＰＥＧ３３５０およびＰＥＧ８０００は、生理食塩水処置対照より高い再吸収率と（図１３参照）、細胞生存度の減少を示した（図１５参照）。さらに、組織学的検査により、この試料は多量の浸潤物と破壊された脂肪構造を示した。ＰＥＧ６００は最も毒性が低かった。これは、生理食塩水対照と同様の再吸収率（重量による）と、同様の細胞生存度（図１３および１５参照）を示した。結果として、ＰＥＧ６００は、軟骨細胞保護で記載された用量において毒性効果を有するには小さすぎるようである。より大きなＰＥＧ３３５０とＰＥＧ８０００は、トリブロックコポリマーのような疎水性領域が欠如しており、細胞膜を溶解し、細胞溶解をもたらす可能性がある。
【０１３８】
その他のコポリマー、ジブロックコポリマー、逆トリブロックコポリマー（例えばＰ３１Ｒ１）、およびテトラブロックコポリマー（例えばＴ１１０７）を分析した場合、これらも細胞毒性（ジブロック、および逆トリブロック）を示すか、または効果がなかった（テトラブロック）。逆トリブロックコポリマーＰ３１Ｒ１（３，３００ｋＤａ）は、中心親水性ブロックおよび側面に配置された２つの疎水性尾部を有する。Ｐ１８８および生理食塩水と比較した場合、Ｐ３１Ｒ１は移植前後のほぼ全期間を通してアポトーシスを誘発する（図８、右上参照）。さらに、重量での比較的低い再吸収率を有するにも関わらず（図１３参照）、低い生存シグナル（生理食塩水対照の４，０００ＲＦＵに対して１４５４ＲＦＵ）および劣った組織学的結果を示した。組織学的分析による増加した重量は、正常な脂肪の欠乏と共に、線維形成および炎症性浸潤物を示した。このように、ポリマーの構造はその膜封止特性に重要である。ジブロックコポリマーは石鹸と同じ構造を有する；親水性頭部と疎水性尾部である。これらは洗浄剤として作用するようであり、重量での最も高い再吸収率を有した。非イオン性非プルロニック性Tween 80もまた、同様の結果であった（図１３参照）。Tween 80は、組織学的スコアにおいて最高レベルの損傷をもたらし、脂肪移植片に対して明らかに毒性であった（図１８Ｂ参照）。テトラブロックコポリマーＴ１１０７は、４つのＰＯＥ鎖に放射状に（車輪の周りのスポークのように）付着した４つのＰＥＧ鎖を有する。このポリマーは、重量、ＤＮＡ含量、および細胞生存度について生理食塩水対照より劣っていた。しかしＴ１１０７を組織学検査によりスコア付けると、正常脂肪は最小である。このように、比較的正常に見える生存度およびＤＮＡ含量は、移植片内で正常脂肪を置き換えている炎症性細胞を反映するのみである。両親媒性ホスファチジルコリンは、臨床的に脂肪吸引における脂肪溶解剤として用いられてきた。我々の１０日間の分析では、Ｐ１８８と同じ濃度において、これはいくらかの保護効果を有するようであるが、Ｐ１８８と同様の程度ではない（図８、右上参照）。
【０１３９】
Ｌ６４とＦ１２７はいくらかの保護効果を有するようなので、これらをＰ１８８と混合して、初期のアポトーシスモデルにおいて分析した。我々は、有効なポリマーの組み合わせは、脂肪移植片に対して相乗効果を有するのではないかと考えた。しかしそうではなく、このポリマーの混合物は毒性を示すようである。高レベルのアポトーシスが、１０日間のサンプリング期間中を通して見られた（図８、右下参照）。したがって、ポリマーの混合物はさらなる試験から除外した。
【０１４０】
Ｐ１８８への添加剤も検討した。フルクタンは、植物細胞膜を大きな温度変化から保護することが示された、植物由来のオリゴ糖である。しかし我々の研究においては、これらの剤は多量の脂肪細胞損傷（組織学的検査により）および高レベルの再吸収（重量ベース）を誘発した。ビタミンＣ（アスコルビン酸）も、ある用量範囲にわたり細胞毒性を示した。興味深いことには、１０日間のモデルにおいて、Ｐ１８８はビタミンＣで処置した細胞にいくらかの保護を提供したようであった（図６、右下参照）。ビタミンＣ処置試料とビタミンＣプラスＰ１８８の間のアポトーシスの減少は、６日目に見られる。
【０１４１】
最後に、リポ酸もＰ１８８の添加剤として試験した。リポ酸を加えた場合、アポトーシスの減少に相乗効果があるようである（図７参照）。この組み合わせは、Ｐ１８８のみよりも少ないアポトーシス事象を６日目にもたらした。リポ酸は強力な抗酸化剤であり、酸化ストレス（虚血再灌流損傷）のもとでミトコンドリア保護効果を有する。我々の電子顕微鏡検査により示されるように、脂肪細胞のミトコンドリアは脂肪膜の孔近くに存在する（図３参照）。したがって、膜がＰ１８８により安定化されると、リポ酸は損傷されたミトコンドリアに対して追加の保護を提供する。混合物はまた、顕著に改善された再吸収（重量ベース）とＤＮＡ含量の改善を、６週目にもたらした。
【０１４２】
結論
この例において我々は、脂肪移植に対する、ポリマーに基づく膜保護の効果を試験した。我々は、ある範囲のポロキサマーのサイズ（〜２５００ｋＤａから１４，０００ｋＤａ）、ある範囲の疎水性（４０％ＰＥＧ〜８０％ＰＥＧ）、種々の他のコポリマー（ジブロック、トリブロック、逆トリブロック、およびテトラブロック）、アニオン性、カチオン性、および両親媒性ポリマー、加えてＰＥＧのみ、組み合わせ、および種々の添加剤を試験した。初期のエンドポイントおよび後期のエンドポイントの両方で、Ｐ１８８は、アポトーシスにおける顕著な減少、改善された重量での再吸収、ＤＮＡ含量の増加、および細胞構造の改善を、その他の全ての群および生理食塩水処置の対照との比較において示した。
【０１４３】
Ｐ１８８のサイズは重要な因子のようである；Ｆ３８（より小さい）およびＦ１０８（より大きい）は同じようには作用しない。疎水性の増加は、小さいポロキサマー（Ｌ６４）およびより大きくやや疎水性のポロキサマー（Ｆ１２７）を援助する；しかし、Ｐ１８８はこれらより優れている。また、構造および順序も重要であり、逆トリブロックコポリマーＰ３１Ｒ１およびジブロックコポリマー（ＰＥＧ−ポリカプロラクトン）も、移植片に毒性である。さらに、テトラブロックコポリマーＴ１１０７は、毒性および重い炎症性浸潤物をもたらすようである。
【０１４４】
ポリマーが全体が親水性で大きい場合（ＰＥＧ３３５０、ＰＥＧ８０００）、これらは脂肪移植片に毒性である。小さなＰＥＧ（ＰＥＧ６００）は生理食塩水より劣る。非ブロック非イオン性界面活性剤（Tween 80）も脂肪に対して毒性である。ＰＥＧに見られる高い親水性は、洗浄剤効果により膜の溶解を引き起こすようである。Tween 80は長い疎水性尾部と小さな親水性頭部を有する。この分子もおそらく典型的な洗浄剤として作用し、細胞膜を溶解する。
【０１４５】
種々の添加剤は全て、リポ酸を除き、毒性であるか、または効果がなかった。フルクタン、レスベラトール、コレステロール、およびビタミンＣは全て、この試験において毒性であることが見出された。興味深いことには、Ｐ１８８はビタミンＣによる損傷に対していくらかの保護を提供するようである。さらに、リポ酸はＰ１８８と組み合わせて用いられた場合に、潜在的な相乗効果を提供するようである。したがって、Ｐ１８８処置された脂肪移植片には、追加のミトコンドリア保護が有用であるらしい。
【０１４６】
この研究は、脂肪細胞膜の損傷を封止するＰ１８８の有効性を実証する。サイズが大きく異なる分子は、その疎水性を増加させない限り、作用しないようである；しかし、これらがＰ１８８と同じようには作用しないために、サイズも重要であり続ける。リポ酸は完全に異なる機構のもとで作用するが、これはＰ１８８と組み合わせた場合に相乗効果を有し得る。
【０１４７】
等価物および範囲
当業者は、ルーチンの実験を超えるものを用いることなく、本明細書に記載の特定の態様の多くの等価物を認識し、または確認することができる。本発明の範囲は上記の説明に限定されることを意図せず、むしろ付属のクレームに記載の通りである。
【０１４８】
クレームにおいて、「１つの（a）」、「１つの（an）」および「その（the）」などの冠詞は、逆が示されているかまたは文脈から別であることが明らかでない限り、１または２以上を意味することができる。１つの群の１つまたは２つ以上のメンバーの間に「または」を含むクレームや記述は、逆が示されているかまたは文脈から別であることが明らかでない限り、該群の１つの、１つより多くの、または全てのメンバーが、与えられた産物または方法に存在するか、用いられるか、またはその他で関連する場合に、満たされていると考えられる。本発明は、群の正確に１つのメンバーが、与えられた産物または方法に存在するか、用いられるか、またはその他で関連する態様を含む。本発明は、群の１つより多くの、または全てのメンバーが、与えられた産物または方法に存在するか、用いられるか、またはその他で関連する態様も含む。さらに、本発明は、１または２以上のクレームからまたは記述の関連する部分からの１または２以上の限定、要素、条項、記述用語等が他のクレームに導入されている、全ての変形物、組み合わせ、および変更を包含することが理解される。例えば、他のクレームに従属する任意のクレームは、同じ基本クレームに従属する任意の別のクレームに見出される１または２以上の限定を含むように、修正することができる。さらに、クレームが組成物を挙げる場合、本明細書に開示された任意の目的のために該組成物を用いる方法も含まれること、本明細書に開示された任意の製造方法または当分野に知られている他の方法による、該組成物を作製する方法も含まれることが理解されるが、ただし、その他が示されているか、または矛盾もしくは不整合が生じることが当業者に明らかである場合を除く。例えば、本発明の任意の組成物は、軟部組織修復または増大のために使用可能であることが理解される。本明細書に開示された組成物調製方法により製造された任意の組成物は、軟部組織修復または増大のために使用可能であることも理解される。さらに、本発明は、本明細書に開示された組成物調製のための任意の方法によって製造された組成物を包含する。
【０１４９】
要素がリストとして示されている場合、例えばマルクーシュグループ・フォーマットで示されている場合、要素の各サブグループもまた開示され、任意の１または２以上の要素を群から取り除けることが理解される。用語「含む」は、開かれていることを意図し、追加の要素またはステップの包含を許容することも指摘する。一般に、発明または発明の側面が、特定の要素、特徴、ステップなどを含むといわれる場合、発明のある態様または発明の側面は、かかる要素、特徴、ステップなどからなるか、または実質的にこれらからなることが理解される。簡単にするために、これらの態様は本明細書にこの通りの言葉で特定的に明記されてはいない。したがって、１または２以上の要素、特徴、ステップなどを含む本発明の各態様について、本発明はさらに、これらの要素、特徴、ステップなどからなるか、実質的にこれらかなる態様もまた提供する。
【０１５０】
範囲が与えられている場合、両端点が含まれる。さらに、他に指定されていたり、文脈および当業者の理解からその他が明らかでない限り、範囲として表された値は、発明の異なる態様において、提示された前記範囲内の任意の特定の値を、前記範囲の下限の単位の十分の一までの単位でとり得ることが理解されるが、ただし文脈から明確にそれ以外が指示されている場合を除く。また、他に指定されていたり、文脈および当業者の理解からその他が明らかでない限り、範囲として表された値は、与えられた範囲内の任意の下部範囲をとることができ、ここで前記下部範囲の両端点は、前記範囲の下限の単位の十分の一と同程度の精度で表されることも理解される。
【０１５１】
さらに、本発明の任意の特定の態様は、任意の１または２以上のクレームから明示的に除外されてよいことが理解される。本発明の組成物および／または方法の任意の態様、要素、特徴、用途、または側面は、任意の１または２以上のクレームから除外されることができる。簡潔さのために、１または２以上の要素、特徴、目的、または側面が除外された全ての態様は、本明細書に明示的に示されてはいない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年6月27日(2014.6.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂肪由来細胞を移植するための方法であって、
脂肪由来細胞とトリブロックコポリマーとの組成物を対象に投与することを含み、ここで該コポリマーは２つの親水性尾部が側面に配置された中心疎水性コアを含み、また該コポリマーは該細胞を損傷から保護し、細胞死を防止する、前記方法。
【外国語明細書】
2014208654000001.pdf